(57)【要約】本発明は、傷害を受けたかまたは損傷した所定の型の細胞を有する哺乳動物（例えば、ヒト患者）中で、所定の型の機能的細胞（例えば、膵臓のインスリン産生細胞、血液細胞、脾臓細胞、脳細胞、心臓細胞、血管組織細胞、胆管の細胞、または皮膚細胞）の数を増加または維持するための方法を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の型の機能的細胞の数を、（i）傷害を受けたかもしくは損傷した該所定の型の細胞を有するか、または該所定の型の細胞の欠損を有し、かつ（ii）自己免疫疾患を有さない哺乳動物中で増加または維持するための方法であって、該方法は、リンパ球減少症を誘導しかつ該動物中で該所定の細胞型の細胞の数を増加させる組成物を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
組成物が、所定の細胞型の細胞の表面上、または哺乳動物において該所定の細胞型の細胞に分化する前駆細胞の表面上の受容体を活性化する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
所定の細胞型の細胞を哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
所定の細胞型の細胞に分化する前駆細胞を哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物中の所定の型の細胞に損傷を誘導する工程、または該所定の型の細胞が所望される哺乳動物の部位に損傷を誘導する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
以下の工程を包含する、哺乳動物中で確立された自己免疫疾患を治療または安定化させるための方法：
（a）哺乳動物中で細胞死に対する増加した感受性を有する血液細胞を選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞を殺傷する第1の組成物を哺乳動物に投与する工程；
（b）1回または複数回工程（a）を反復する工程；ならびに
（c）哺乳動物中のグルコースレベルを2回もしくはそれ以上モニタリングし、および/または正常範囲内に哺乳動物中の血糖値を維持する工程。
【請求項７】
哺乳動物中で細胞死に対する増加した感受性を有する血液細胞を選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞を殺傷する第2の組成物を該哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物が、工程（a）の前に第1の組成物に対する増加した感受性を有する血液細胞の亜集団を有するか否かを決定する工程をさらに包含する、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程を包含する、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法：
（a）哺乳動物中の刺激された血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激された血液細胞を殺傷する組成物を哺乳動物に投与する工程；および
（b）工程（a）の前、後、または同時に、該所定の型の細胞にインビボで分化する1種または複数種の前駆細胞を哺乳動物に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
前駆細胞が幹細胞であり、工程（a）が工程（b）に先立って実行される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
以下の工程を包含する、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持するための方法：
（a）血液起源または内皮起源の1種または複数種の細胞を哺乳動物に投与する工程；および
（b）工程（a）の前、後、または同時に、哺乳動物中の刺激された血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激された血液細胞を殺傷する組成物を哺乳動物に投与する工程。
【請求項１２】
自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患の増加したリスクを有する哺乳動物中で所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法であって、該方法は、インビボで該所定の型の1種もしくは複数種の細胞に分化するか、またはインビボで該所定の型の内因性細胞の増殖を促進する、1種または複数種の前駆細胞を該哺乳動物に投与する工程を包含する方法であり、ここで、該分化した細胞は、MHCクラスIおよびペプチドを提示し、かつ該MHCクラスIは該哺乳動物によって発現されるMHCクラスI対立遺伝子と一致する少なくとも1つの対立遺伝子を有する、方法。
【請求項１３】
以下の工程を包含する、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法：
（a）該所定の型の1種または複数種の細胞を哺乳動物に投与する工程；および
（b）工程（a）の前、後、または同時に、哺乳動物中の刺激されていない血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激されていない血液細胞を殺傷する組成物を哺乳動物に投与する工程。
【請求項１４】
以下の工程を包含する、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法：
（a）該所定の型の1種または複数種の細胞をインビボで分化させる1種または複数種の前駆細胞を哺乳動物に投与する工程；および
（b）工程（a）の前、後、または同時に、哺乳動物中の刺激されていない血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激されていない血液細胞を殺傷する組成物を哺乳動物に投与する工程。
【請求項１５】
（a）哺乳動物中の血液細胞の第1の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で、血液細胞を殺傷する第1の組成物を哺乳動物に投与する工程；および
（b）工程（a）の前、後、または同時に、哺乳動物中の刺激された血液細胞の第2の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で、血液細胞を殺傷する第2の組成物を哺乳動物に投与する工程
を包含する、哺乳動物中における疾患、障害、または状態を治療、安定化、または予防するための方法であって、該第1の亜集団および該第2の亜集団は、部分的に重複している亜集団であるか、または重複していない亜集団であるかのいずれかである、方法。
【請求項１６】
第1の亜集団および第2の亜集団が分化の異なる段階にある、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
第1の亜集団および第2の亜集団が細胞周期の異なる段階にある、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
第1の亜集団および第2の亜集団が細胞死の異なる誘導物質に感受性である、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
第1の亜集団および第2の亜集団が異なる経路を通して細胞死を受ける、請求項15に記載の方法。
【請求項２０】
一方の亜集団がアポトーシスを通して細胞死を受け、他方の亜集団がネクローシスを通して細胞死を受ける、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
以下の工程を包含する、哺乳動物中における疾患、障害、または状態を治療、安定化、または予防するための方法：
（a）哺乳動物中の刺激されていない血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激されていない血液細胞を殺傷する第1の組成物を哺乳動物に投与する工程；および
（b）工程（a）の前、後、または同時に、哺乳動物中の刺激された血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激された血液細胞を殺傷する第2の組成物を哺乳動物に投与する工程。
【請求項２２】
哺乳動物が所定の細胞型の傷害を受けた細胞または損傷した細胞を有する、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
所定の型の1種もしくは複数種の細胞に分化する潜在能力を有するか、または所定の細胞である、1種または複数種の細胞を哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
所定の細胞型の前駆細胞または所定の細胞型の細胞の増殖を促進する細胞を投与する工程をさらに包含する、請求項1、6、9、11〜15、および21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
細胞が内皮細胞である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
所定の型の細胞が、インスリンを産生する膵島細胞、血液細胞、脾臓細胞、軟骨細胞、脳細胞、心臓細胞、血管組織細胞、胆管の細胞、上皮細胞、内皮細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞、間葉細胞、間葉起源の細胞、または皮膚細胞である、請求項3、9、および11〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
インビボで所定の型の細胞に分化する細胞が、脾細胞、骨髄由来細胞、ヘキスト33342ポジティブ細胞、脳細胞、CNSポジティブ細胞、肝細胞、または胎児細胞である、請求項4、9、12、または14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
インビボで所定の型の細胞に分化する細胞が半同種異系である、請求項4、9、12、または14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
インビボで所定の型の細胞に分化する細胞がFasまたはFasLを発現し損なう、請求項4、9、12、または14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
血液細胞がT細胞、B細胞、またはマクロファージである、請求項6、9、11、13、14、または15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３１】
組成物がMHCクラスIおよびペプチドであり、かつMHCクラスIが、哺乳動物によって発現されるMHCクラスI対立遺伝子と一致する少なくとも1つの対立遺伝子を有する、請求項4、12、または14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
MHCクラスIおよびペプチドが半同種異系である、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
MHCクラスIおよびペプチドが同系である、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
組成物が未処理のT細胞のT細胞受容体（TCR）を架橋させる化合物である、請求項4、12、または14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
組成物がTNFα、TNFαアゴニスト、またはTNFα誘導物質である、請求項1、9、15、または21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
組成物が細胞死受容体に結合するかまたはそれを活性化する、請求項1、9、または15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３７】
TNFα誘導物質が、完全フロイントアジュバント、ISS-ODN、LPS様活性を有する細胞壁成分、コレラ粒子、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、レシチンベシクルで複合体化した大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、ISCOMS-免疫促進複合体のような微生物アジュバント、ポリエチレングリコールおよびポリ(N-2-(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)のような化学アジュバント、CpGモチーフまたはCpAモチーフを含む合成オリゴヌクレオチド、モノホスホリルリピドAのようなリピドA誘導体、MPL、ムラミルジペプチド誘導体、カルメット-ゲラン桿菌、組織プラスミノーゲン活性化因子、LPS、インターロイキン-1、インターロイキン-2、UV光、リンホトキシン、カケクチン、TNFR-2アゴニスト、TNFαシグナル伝達経路の細胞内メディエーター、NFκB誘導物質、リンホトキシン、カケクチン、IRF-1、STAT1、ICS-2lgASプロモーターエレメントのアゴニスト、リンホカイン、LPS、またはTNFαおよびTNFR-1抗体の組み合わせである、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物にプロテアソーム活性促進物質を投与する工程をさらに包含する、請求項1、9、11〜15、または21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
プロテアソーム活性促進物質がγインターフェロンである、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
FlkまたはFltの発現または機能を増加させる薬剤を哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項1、9、11〜15、または21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
VEGF、VEGF1、VEGF2、VEGF1R、またはVEGF2Rの発現または機能を増加させる薬剤を哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項1、9、11〜15、または21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
薬剤がVEGFポリペプチドまたはVEGFポリペプチドをコードする核酸分子である、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
FasまたはFasLの発現またはシグナル伝達の阻害剤を哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項1、9、11〜15、または21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物が自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患のリスクの増加を有する、請求項9、11、13、または14に記載の方法。
【請求項４５】
自己免疫疾患が、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集疾患、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋肉痛-線維筋炎、グレーヴズ病、ギラン-バレー症候群、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、または重症筋無力症である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
所定の型の細胞の傷害もしくは損傷、または自己免疫疾患に起因する任意の代謝障害が制御される、請求項1、9、11〜15、または21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物における血糖値を正常範囲に維持する工程をさらに包含する、請求項6、9、11〜15、または21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４８】
哺乳動物がヒトである、請求項1、6、9〜15、または21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４９】
サイトカイン、ケモカイン、または増殖因子を哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項24に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、ヒトにおいて損傷を受けた組織を修復および再生することに関する。このような損傷は、既存の自己免疫疾患から生じ得るか、または自己免疫疾患でない傷害の結果であり得る。本発明者らは、自己免疫細胞を除去することおよび免疫系を再誘導することが自己免疫疾患の有効な治療の重要な構成要素であることを以前に示した（米国特許出願第09/521,064号、同09/768,769号、およびRyuら、Journal of Clinical Investigations、「Reversal of Established Autoimmune Diabetes by Restoration of Endogenous Beta Cell Function」、108:31〜33、2001（これは参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている）。自己免疫疾患は首尾よく治療され得るのに対して、それにも関わらず、個体は、以前の自己免疫攻撃の結果として顕著な組織損傷を有する。
【０００２】
多くの組織は、一旦傷害を引き起こす損傷が除去されると組織自体を修復する生得の能力を有するが、損傷を修復するこの能力は、傷害の期間と相関して減少する。例えば、内因性の膵島の再生能力は長期間のI型糖尿病（すなわち、この疾患を15年より長く有する患者）において実質的に除去される。内因性組織がその再生能力を喪失した場合において、損傷は個体に外因性組織（例えば、移植片）を供給することによって修復され得る。糖尿病のための有望な治療である膵島の移植は10年間以上の間ヒトの臨床実験の対象であった。動物において膵島移植は多くの成功をおさめたが、これらは、動物が天然の疾患ではなく化学処理による糖尿病である場合に起こった。非バリアかつ非毒性の方法を使用し、および天然に糖尿病のマウスにおいて膵島移植片を用いて成功を示す唯一の実証された当業者らに評価された研究は、同系（自己）膵島を使用する。同系膵島は、活性糖尿病を有する肥満でない糖尿病（NOD）マウスに移植された。これらは、TNFα（腫瘍壊死因子α）；BCG（カルメット-ゲラン桿菌、ウシ型結核菌（mycobacterium bovis）の弱毒化株）；またはCFA（完全フロイントアジュバント）（これはTNFαの誘導物質である）（Rabinovitchら、J. Immunol. 159:6298〜6303, 1997）で前処理された。このアプローチは、主として同系の膵島が利用可能でなかったので、臨床的に適用可能ではなかった。さらに、既存の細胞置き換えの戦略は末期疾患を妨害しなかったか、または永続的に膵島炎を逆転した。膵島移植の同種異系移植片設定において、移植片は、免疫抑制を用いてでさえ最終的に拒絶される。さらに、身体照射および骨髄移植のような糖尿病宿主治療は容認できない程毒性であり、インスリン療法の短期的代替物をより魅力的にする。
【０００３】
最近、膵島移植は、臨床試験において限られた成功（例えば、多剤免疫抑制治療と組み合わせた同種異系移植片について観察されるようなもの）を達成してしており、1型糖尿病患者に6ヶ月の期間にわたって正常血糖への持続的な回復をもたらす。これらの結果は、連続的かつ場合によっては毒性の薬物治療を用いて、しばしば同時の救命的腎移植の設定で得られてきた。しかし、これらの中程度の首尾よい膵島移植は約1年後に失敗を示し、これは、それ自体インスリン抵抗性を誘導する薬物療法に部分的に起因すると推測される。1型糖尿病における膵島移植の初期の失敗は、膵島移植を受容する糖尿病でない患者と比較して（例えば、彼らの膵臓が除去された癌患者において）、免疫抑制治療が自己免疫の防止よりも移植拒絶のためにより大きな効力を示すことの関心を惹起する。これらの関心に対して、肥満でない糖尿病（NOD）マウスを使用する動物研究における同種異系または異種間の膵島移植の移植拒絶の防止のための免疫抑制治療の非効率性の観察が信憑性を与える。
【０００４】
本発明者らは、同種異系組織または異種組織を免疫抑制されていない宿主に導入するための移植方法を以前に記載し、ここでは、ドナーの抗原が宿主の免疫系から隠蔽されるように細胞は改変される（米国特許出願第5,283,058号、これは参照として本明細書に組み入れられる）。一般的に、マスクされた膵島またはMHCクラスI分子を除去されたトランスジェニック膵島は、NODマウスにおいて再発性の自己免疫から部分的にのみ防御される（Markmannら、Transplantation 54:1085〜1089, 1992）。自己免疫攻撃から生じる組織損傷に適用可能であるのみならず、自己免疫から誘導されたのではない損傷にもまた適用可能である、損傷された組織を再生する方法についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）における組織再生のための方法を特徴とする。従って、第1の局面において、本発明は、所定の型の機能的細胞の数を哺乳動物中で増加または維持するための方法を特徴とし、上記哺乳動物は（i）上記所定の型の傷害を有するかもしくは損傷した細胞、または上記所定の型の細胞の欠損を有し（例えば、これらの細胞の通常の数よりも少ない細胞を有する哺乳動物、またはこれらの細胞を欠く哺乳動物）、かつ（ii）自己免疫疾患を有さない。この方法は、リンパ球減少症を引き起こしかつ上記動物中で上記所定の細胞型の細胞の数を増加する組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。望ましい態様において、上記組成物は、所定の細胞型の細胞の表面上、まなたは哺乳動物において上記所定の細胞型の細胞に分化する前駆細胞の表面上の受容体を活性化する。望ましくは、この方法はまた、所定の細胞型の細胞を哺乳動物に投与する工程を包含する。望ましい態様において、この方法は、発生の順番を再現する細胞を投与する工程を包含する（例えば、関心対象の組織の再生を促進するために、中胚葉と共に内胚葉；外胚葉と共に内胚葉；または中胚葉と共に外胚葉）。いくつかの態様において、この方法はまた、所定の細胞型の細胞に分化する前駆細胞を哺乳動物に投与する工程を包含する。特定の態様において、この方法はまた、哺乳動物中の所定の型の細胞に損傷を誘導する工程、または所定の型の細胞が所望される哺乳動物の部位に損傷を誘導する工程を包含する。例えば、損傷は、所定の型の細胞中に誘導され得るか、または所定の型の細胞が所望される位置の10インチ、5インチ、1インチ、10cm、5cm、1cm、10mm、もしくは1mm以内の別の型の細胞に誘導され得る。
【０００６】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中で確立された自己免疫疾患を治療または安定化するための方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第1の組成物を上記哺乳動物に投与する工程；（b）1回または複数回工程（a）を反復する工程；および（c）任意で、上記哺乳動物中のグルコースレベルを2回以上モニタリングする工程。望ましくは、この方法はまた、上記哺乳動物中で血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第2の組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。いくつかの態様において、この方法は、工程（a）の前に、上記哺乳動物が、第1の組成物に対して通常の感受性よりもより高い感受性を有する血液細胞の亜集団を有するか否かを決定する工程を包含する。
【０００７】
関連する局面において、本発明は、哺乳動物中で確立された自己免疫疾患を治療または安定化するための治療または安定化するための別の方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第1の組成物を上記哺乳動物に投与する工程；（b）1回または複数回工程（a）を反復する工程；および（c）選択的に、正常範囲内の上記哺乳動物中の血糖値を維持する工程。望ましくは、この方法はまた、上記哺乳動物中で血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第2の組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。いくつかの態様において、この方法は、工程（a）の前に、上記哺乳動物が、第1の組成物に対して通常の感受性よりもより高い感受性を有する血液細胞の亜集団を有するか否かを決定する工程を包含する。
【０００８】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患（例えば、確立された自己免疫疾患）を治療、安定化、もしくは予防するため、および/または哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加もしくは維持するための方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程；および（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記所定の型にインビボで分化する潜在能力を有する哺乳動物細胞、または上記所定の細胞型である哺乳動物細胞を、上記哺乳動物に投与する工程。1つの態様において、この方法は、工程（a）の前に、上記哺乳動物の血液が、投与される組成物に対する通常の感受性よりも高い血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含し；そうである場合、組成物を利用するという決定が強化される。
【０００９】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患（例えば、確立された自己免疫疾患）を治療、安定化、もしくは予防するため、および/または哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加もしくは維持するための方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で刺激された所定の血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で刺激された血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第1の組成物を上記哺乳動物に投与する工程；（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記哺乳動物中で刺激されていない血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で刺激されていない血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第2の組成物を上記哺乳動物に投与する工程；および（c）工程（a）または（b）の前、後、または同時に、上記所定の型に分化する潜在能力を有する哺乳動物細胞、または上記所定の細胞型である哺乳動物細胞を投与する工程。1つの態様において、この方法は、工程（a）の前に、上記哺乳動物の血液が、第1の組成物に対する感受性の増加を有する刺激された血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含し；そうである場合、第1の組成物を利用するという決定が強化される。別の態様において、この方法は、工程（b）の前に、上記哺乳動物の血液が、第2の組成物に対する感受性の増加を有する刺激されていない血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含し；そうである場合、第2の組成物を利用するという決定が強化される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患（例えば、確立された自己免疫疾患）を治療、安定化、または予防するための方法を特徴とする。この方法は、上記哺乳動物中で刺激されていない血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で刺激されていない血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。1つの態様において、この方法は、上記哺乳動物の血液が、投与される組成物に対する感受性の増加を有する刺激されていない血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含し；そうである場合、上記組成物を利用するという決定が強化される。
【００１１】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患（例えば、確立された自己免疫疾患）を治療、安定化、または予防するための方法を特徴とする。この方法は、上記哺乳動物中で刺激された血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で刺激された血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。1つの態様において、この方法は、上記哺乳動物の血液が、投与される組成物に対する感受性の増加を有する刺激された血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含し；そうである場合、上記組成物を利用するという決定が強化される。
【００１２】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患（例えば、確立された自己免疫疾患）を治療、安定化、または予防するための方法を特徴とする。この方法は、上記哺乳動物中で血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。1つの態様において、この方法は、上記哺乳動物の血液が、投与される組成物に対する感受性の増加を有する血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含し；そうである場合、上記組成物を利用するという決定が強化される。
【００１３】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で刺激された血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で刺激された血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程；および（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記所定の型にインビボで分化する潜在能力を有する哺乳動物細胞、または上記所定の細胞型である哺乳動物細胞を投与する工程。1つの態様において、この方法は、工程（a）の前に、上記哺乳動物の血液が、投与される組成物に対して増加した感受性を有する刺激された血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含し；そうである場合、組成物を利用するという決定が強化される。いくつかの態様において、上記哺乳動物は、上記組成物の投与後に通常の機能的活性の増加を有する傷害を受けたかまたは疾患を有する器官を有する。
【００１４】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で刺激された血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で刺激された血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程；および（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記所定の型の細胞にインビボで分化する1種または複数種の前駆細胞を上記哺乳動物に投与する工程。望ましくは、上記前駆細胞は幹細胞であり、工程（a）は工程（b）の前に実行される。他の態様において、膵島以外の細胞が糖尿病の治療および予防のために投与される。特定の態様において、この方法はまた、例えば、グルコースクランプ（glucose clamp）または投与されたインスリンを使用して、糖尿病患者における血糖レベルを調節する工程を包含する。望ましくは、刺激されていない血液細胞を殺傷する組成物は、患者において刺激されていない血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で患者に投与される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持するための方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）血液起源または内皮起源の1種または複数種の細胞を上記哺乳に投与する工程、および（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記哺乳動物中の刺激された血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激された血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程。いくつかの態様において、患者は自己免疫疾患（例えば、糖尿病）を有するか、または自己免疫疾患のリスクの増加を有する。望ましくは、刺激されていない血液細胞を殺傷する組成物は、患者における刺激されていない血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で上記患者に投与される。
【００１６】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持するための方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）血液起源、または内皮起源、中胚葉起源、もしくは外胚葉起源の1種または複数種の細胞を上記哺乳に投与する工程、および（b）工程（a）の前、後、または同時に、宿主における細胞分化の胚性のプログラムを促進または反復する組成物を上記哺乳動物に投与する工程。望ましい態様において、この方法は、γ-インターフェロンのようなプロテアソーム活性促進物質を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。いくつかの態様において、この方法は、FlkまたはFltの発現または機能を増加させる薬剤を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。例としては、これらの機能を達成することが知られている薬剤を使用する、TNFα、IL-1β、HAT、もしくはNF-κBの誘導、またはcAMP阻害が挙げられる。他の例には、AP-2、EGF-1、Sp1、AP-1、NFκB、PECAM-1の誘導を伴うGATA刺激、アクチベータータンパク質-2、CTリッチSp1結合活性、PDGF-A、PDGF-2、単球化学誘因タンパク質-1、TF、Ets1、SCL/Tal-1、FGF、HAT P/CAF、CBP/p300、およびHIF-2α（HRF、EPAS、HLF）の刺激が含まれる。これらの機能はまた、TGF-β阻害、TGF-β受容体遮断薬、またはCREB（キャンプ応答エレメント結合タンパク質）の阻害によって達成され得る。特定の態様において、この方法は、VEGF、VEGF1、VEGF2、VEGF1R、またはVEGF2Rの発現または機能を増加させる物質（例えば、VEGFポリペプチドまたはVEGFポリペプチドをコードする核酸分子またはVEGFタンパク質受容体のプロモーターを活性化する物質）を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。VEGFポリペプチドは、全長VEGFタンパク質ならびに生物学的に活性なVEFG断片を含む。これらの薬剤は、いくつかの場合において、分化のための中胚葉性/内胚葉性の活性化のために好ましい。壁の分化（通常、神経堤起源または心膜起源の細胞）のために、PDGFまたはPDGF-BBを用いる宿主処理が、望ましくはこの方法に含まれ得る。BV内皮分化または組織の再成長のために、FGFおよび/またはIGF-1での宿主の処理が所望され得る。さらに、再生の促進は、いくつかの場合においては、多能性細胞と一緒に、または多能性細胞を伴わずに投与した、1種のみの薬剤を使用して、または2種以上の薬剤を用いて達成され得る。
【００１７】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持するための方法を特徴とする。この方法は、上記哺乳動物中で刺激された血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激された血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。1つの態様において、この方法は、上記哺乳動物の血液が、投与される組成物に対する通常の感受性よりも高い感受性を有する刺激された血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含し；そうである場合、上記組成物を利用するという決定が強化される。いくつかの態様において、上記哺乳動物細胞は、上記組成物の投与後に通常の機能的活性を増加させた、傷害を受けたかまたは疾患を有する器官を有する。
【００１８】
別の局面において、本発明は、自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患の増加したリスクを有する哺乳動物中で所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法を特徴とする。この方法は、インビボで上記所定の型の1種もしくは複数種の細胞に分化するか、またはインビボで上記所定の型の内因性細胞の増殖を促進する、1種または複数種の前駆細胞を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。上記分化した細胞は、最終的にMHCクラスIおよびペプチドを提示し、そして上記MHCクラスIは該哺乳動物によって発現されるMHCクラスI対立遺伝子と一致する少なくとも1つの対立遺伝子を有する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中で所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で所定の型の1種または複数種の細胞を上記哺乳動物に投与する工程；および（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記哺乳動物中で刺激されていない血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激されていない血液細胞を殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。1つの態様において、この方法は、工程（a）の前に、上記哺乳動物の血液が、投与される組成物に対して通常の感受性より高い感受性を有する刺激されていない血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含する。いくつかの態様において、上記哺乳動物は、上記組成物の投与後に通常の機能的活性の増加を有する傷害を受けたかまたは疾患を有する器官を有する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中で所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法を特徴とする。この方法は、上記哺乳動物中で刺激された血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激された血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。1つの態様において、この方法は、上記哺乳動物が、投与される組成物に対する通常の感受性よりも高い感受性を有する刺激された血液細胞の亜集団を有するか否かを決定する工程を包含する。いくつかの態様において、上記哺乳動物は、上記組成物の投与後に通常の機能的活性の増加を有する傷害を受けたかまたは疾患を有する器官を有する。
【００２１】
なお別の局面において、本発明は、哺乳動物中で所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）インビボで所定の型の1種または複数種の細胞に分化する1種または複数種の前駆細胞を上記哺乳動物に投与する工程；および（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記哺乳動物中で刺激されていない血液細胞の所定の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で、刺激されていない血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する組成物を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。1つの態様において、この方法は、上記哺乳動物の血液が、投与される組成物に対して通常の感受性より高い感受性を有する刺激されていない血液細胞の亜集団を含むか否かを決定する工程を包含する。いくつかの態様において、上記哺乳動物は、上記組成物の投与後に通常の機能的活性の増加を有する傷害を受けたかまたは疾患を有する器官を有する。
【００２２】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物における疾患、障害、または状態を治療、安定化、または予防するための方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で血液細胞の第1の亜集団を少なくとも10％、好ましくは75％選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第1の組成物を上記哺乳動物に投与する工程；および（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記哺乳動物中で血液細胞の第2の亜集団を少なくとも10％、好ましくは75％選択的に殺傷するのに十分な量で血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第2の組成物を上記哺乳動物に投与する工程。第1の亜集団および第2の亜集団は、部分的に重複する亜集団であるか、または重複しない亜集団であるかのいずれかである。望ましくは、第1の亜集団および第2の亜集団は分化の異なる段階にある。いくつかの態様において、第1の亜集団および第2の亜集団は細胞周期の異なる段階にある。種々の態様において、第1の亜集団および第2の亜集団は細胞死の異なる誘導物質に感受性である。いくつかの態様において、第1の亜集団および第2の亜集団は異なる経路を通して細胞死を受ける。特定の態様において、一方の集団がアポトーシスを通して細胞死を受け、他方の集団がネクローシスを通して細胞死を受ける。いくつかの態様において、患者は関節炎（例えば、慢性関節リウマチ）を有する。特定の態様において、関節炎を有する患者は、いかなる細胞も投与されない。他の態様において、患者は、軟骨細胞または軟骨細胞に分化する細胞を投与される。いくつかの態様において、患者は、所定の細胞型の、障害を受けたかまたは損傷した細胞を有する。望ましくは、この方法はまた、所定の型の1種もしくは複数種の細胞に分化する潜在能力を有するか、または所定の細胞型である、1種または複数種の細胞を哺乳動物に投与する工程を包含する。細胞は、第1の組成物および/または第2の組成物の投与の前、その後、または同時に投与され得る。
【００２３】
別の局面において、本発明は、哺乳動物中における疾患、障害、または状態を治療、安定化、または予防するための方法を特徴とする。この方法は以下の工程を包含する：（a）上記哺乳動物中で刺激されていない血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で刺激されていない血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第1の組成物を上記哺乳動物に投与する工程；および（b）工程（a）の前、後、または同時に、上記哺乳動物中で刺激された血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で刺激された血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第2の組成物を上記哺乳動物に投与する工程。いくつかの態様において、患者は、所定の細胞型の、障害を受けたかまたは損傷した細胞を有する。特定の態様において、この方法は、所定の型の1種もしくは複数種の細胞に分化する潜在能力を有するか、または所定の細胞型である、1種または複数種の細胞を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、ヒト患者における所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する方法に関する。この方法は、患者において、損傷を誘導するか、または所定の型の細胞に内因性の損傷（例えば、移植された細胞の移植を促進する損傷）をさらす工程を包含する。内因性の損傷は、例えば、血液試験（例えば、肝機能試験、グルコースレベルについての試験、神経学的試験、もしくは血液細胞試験）、視覚的試験もしくはX線写真試験、または機能的試験を使用して測定され得る。刺激されていない血液細胞の所定の亜集団を選択的に殺傷する第1の組成物は、上記患者において刺激されていない血液細胞の亜集団を少なくとも10％、好ましくは少なくとも75％選択的に殺傷するのに十分な量で上記患者に投与される。第1の組成物の投与の前、後、または同時に、刺激された血液細胞を殺傷する第2の組成物は、上記患者において刺激された血液細胞の亜集団を選択的に殺傷するのに十分な量で上記患者に投与される。先の工程の前、後、または同時に、所定の型の1種もしくは複数種の細胞に分化する潜在能力を有するか、または所定の細胞である1種または複数種の細胞が患者に投与される。
【００２５】
別の局面において、本発明は、傷害を受けたかもしくは損傷した所定の型の細胞を有するか、または所定の型の細胞の欠損を有しヒト患者における所定の型の機能的細胞（例えば、インスリンを産生する膵臓細胞、脳細胞、心臓細胞、血管組織細胞、胆管の細胞、軟骨細胞、または皮膚細胞）の数を増加または維持する方法に関する。この方法は以下の工程を包含する：（a）MHCクラスIおよびペプチド（例えば、可溶性のMHCクラスIおよびペプチド、または細胞の表面上に存在するMHCクラスIおよびペプチド）を患者に投与する工程；（b）工程（a）の前、後、または同時に、所定の型に分化する潜在能力を有するか、または所定の細胞型である細胞を哺乳動物に投与する工程；ならびに（c）工程（b）の前、後、または同時に、患者において、または患者に再投与される、患者からの血液試料中において一過性のリンパ球減少症を誘導する工程。いくつかの態様において、工程（a）および（b）は、MHCクラスIおよびペプチドを提示する能力を有する細胞、ならびに所定の型に分化する潜在能力を有する細胞、または所定の型である細胞を投与することによって同時に実行される。
【００２６】
別の局面において、本発明は、ヒト患者において所定の型の機能的細胞の数を増加または維持する別の方法を特徴とする。この方法は、以下の工程を包含する：患者において、所定の型の細胞の内因性損傷を同定するか、または所定の型の細胞に損傷を誘導する工程、（b）MHCクラスIおよびペプチドに対して上記患者を曝露する工程、（c）工程（b）の前、後、または同時に、所定の型に分化する潜在能力を有するか、または所定の細胞型である細胞を患者に投与する工程；ならびに（d）工程（c）の前、後、または同時に、患者において、または患者に再投与される、患者からの血液試料中において一過性のリンパ球減少症を誘導する工程。いくつかの態様において、工程（b）および（c）は、MHCクラスIおよびペプチドを提示する能力を有する細胞、ならびに所定の型に分化する潜在能力を有する細胞、または所定の型である細胞を投与することによって同時に実行される。
【００２７】
本発明の任意の局面の望ましい態様において、この方法は、前駆細胞、または所望の再生の部位における所定の細胞型の細胞、または所定の細胞型にそれ自体分化し得る細胞の増殖を促進する細胞（例えば、内皮細胞または間葉細胞）を哺乳動物に投与する工程を包含する。望ましくは、この方法はまた、ケモカイン、サイトカイン、または増殖因子を哺乳動物に投与する工程を包含する。あるいは、この方法はまた、それらの哺乳動物への投与の前に、内皮細胞または間葉細胞のケモカイン、サイトカイン、または増殖因子での前処理を含み得る。典型的な所定の型の細胞は、インスリンを産生する膵島細胞、血液細胞、脾臓細胞、脳細胞、軟骨細胞、心臓細胞、血管組織細胞、胆管の細胞、上皮細胞、内皮細胞、内胚葉細胞、中胚葉細胞、間葉細胞、間葉起源の細胞、または皮膚細胞である。インビボで所定の型の細胞に分化する所望の細胞は、脾細胞、骨髄由来細胞、ヘキスト33342ポジティブ細胞、脳細胞、CNSポジティブ細胞、肝細胞、間葉細胞、中胚葉細胞、内皮細胞、壁細胞、および胎児細胞である。いくつかの態様において、インビボで所定の型の細胞に分化する細胞は、半同種異系であるかまたは同系である。種々の態様において、インビボで所定の型の細胞に分化する細胞はFasまたはFasLを発現し損なう。所望の血液細胞は、T細胞、B細胞、またはマクロファージである。血液、脾臓、または骨髄に由来し、およびHox11+、CD90+、Flk低、CD34-、またはCD45+として定義される間葉細胞が高度に所望される。他の所望される細胞は、それらが投与される時点でMHCクラスIおよびペプチドを発現しないが、移植後、例えば、適切な抗原を用いる刺激によってインビボでそうする能力を有する細胞である。いくつかの態様において、MHCクラスIおよびペプチドは、半同種異系であるかまたは同系である。特定の態様において、本発明の組成物は、T細胞受容体（TCR）またはT細胞上の他の表面タンパク質を架橋するかまたはこれに結合する化合物である。種々の態様において、この組成物はTNFα、TNFαアゴニスト、またはTNFα誘導物質である。いくつかの態様において、この組成物は、細胞死受容体を結合するかまたはこれを活性化する。典型的なTNFα誘導物質には、完全フロイントアジュバント（CFA）、ISS-ODN、LPS様活性を有する細胞壁成分、コレラ粒子、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、レシチンベシクルで複合体化した大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、ISCOMS-免疫促進複合体のような微生物アジュバント、ポリエチレングリコールおよびポリ(N-2-(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)のような化学アジュバント、CpGまたはCpAモチーフを含む合成オリゴヌクレオチド、モノホスホリルリピドAのようなリピドA誘導体、MPL、ムラミルジペプチド誘導体、カルメット-ゲラン桿菌（BCG）、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、リポポリサッカリド（LPS）、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、UV光、リンホトキシン、カケクチン、転写因子様核レギュレーター-2（TNFR-2）様のアゴニスト、Bリンパ球刺激物質（BLyS）受容体または可溶性タンパク質に対する天然のブロッキング抗体、TNFαシグナル伝達経路の細胞内メディエーター、NFκB誘導物質、リンホトキシン、カケクチン、IRF-1、STAT1、ICS-2lgASプロモーターエレメ���トのアゴニスト、リンホトキシン、LPS、またはTNFαスーパーファミリー受容体もしくはTNFαスーパーファミリー可溶性型に対するアゴニスト（例えば、抗体）、TNFαおよび抗TNFR-1抗体の組み合わせ、またはTNFαおよび抗TNFR抗体の組み合わせ、が挙げられる。
【００２８】
望ましい態様において、この方法は、γインターフェロンのようなプロテアソーム活性促進物質を哺乳動物に投与する工程を包含する。いくつかの態様において、この方法は、FlkまたはFltの発現または機能を増加する薬剤を哺乳動物に投与する工程を包含する。例としては、TNFα、IL-1β、HAT、もしくはNF-κBの誘導、またはcAMP阻害が挙げられる。特定の態様において、この方法は、VEGF、VEGF1、VEGF2、VEGF1R、またはVEGF2Rの発現または機能を増加させる薬剤、例えば、VEGFポリペプチド、VEGFポリペプチドをコードする核酸分子、またはVEGF受容体のプロモーターを活性化する物質を上記哺乳動物に投与する工程を包含する。いくつかの態様において、この方法は、FasまたはFasLの発現またはシグナル伝達の阻害剤を哺乳動物に投与する工程を包含する。望ましくは、この方法は、正常範囲内にある哺乳動物の血糖値を維持する工程を包含する。特定の態様において、骨髄細胞または前駆（多能性）細胞（例えば、臍帯血細胞）が治癒プロセスを急がせるために投与される。これらの細胞は、内胚葉に対する中胚葉の決定的な相互作用、内胚葉および外胚葉の相互作用、ならびに中胚葉および外胚葉の相互作用（これらのすべてが器官再生のために決定的である）を急がせることによって、成体動物における胚性プロセスを反復する。
【００２９】
本発明の種々の局面のいずれかの望ましい態様において、未処置のT細胞を殺傷する組成物はMHCクラスIおよびペプチドであり、このMHCクラスIは、患者によって発現されるMHCクラスI対立遺伝子と一致する少なくとも1つの対立遺伝子を有する。いくつかの態様において、MHCクラスIまたはペプチドは、可溶性のMHCクラスIおよびペプチド、または細胞の表面上に存在するMHCクラスIおよびペプチドである。いくつかの態様において、未処理のT細胞を殺傷するための細胞の投与ならびにMHCクラスIおよびペプチドの投与は、所望の型に分化する潜在能力を有するか、または所定の型であるMHCクラスIおよびペプチドを提示する能力を有する細胞を投与することによって同時に実行される。いくつかの態様において、病理的なT細胞（例えば、未処理のT細胞）を殺傷する組成物は、未処理のT細胞（例えば、抗体またはアゴニストによって結合された場合に死滅する自己免疫細胞または病理的な細胞に別の状況では分化し得る未処理のT細胞）のT細胞受容体（TCR）を架橋する化合物（例えば、抗体もしくは抗体断片、サイトカイン、リンホカイン、低分子アンタゴニスト、T細胞マイトジェン、または共同受容体）である。いくつかの態様において、未処理のT細胞の亜集団を殺傷する化合物はBCGではないか、またはFASではない。他の態様において、T細胞（例えば、未処理のT細胞）の亜集団を殺傷する化合物は、BCG、FAS、またはプロテインキナーゼを調節する化合物である。未処理のT細胞の所望でない亜集団を選択的に殺傷する典型的な化合物は、α-CD3抗体、選択的TCR刺激剤である。未処理の/刺激されていないT細胞の再選択のための方法の例には、疾患を引き起こすT細胞の直接的な殺傷、欠損MHCクラスIおよび自己ペプチド（例えば、BCG）を用いる単球/マクロファージの抗原提示細胞の直接的な殺傷、ならびにMHCクラスIおよび自己ペプチド断片を正確に提示する細胞の再導入が含まれる。
【００３０】
望ましい態様において、哺乳動物細胞は、自己免疫疾患を有するか、または自己免疫疾患のリスクの増加を有する。典型的な自己免疫疾患には以下が含まれる：円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集疾患、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋肉痛-線維筋炎、グレーヴズ病、ギラン-バレー症候群、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、または重症筋無力症。いくつかの態様において、所定の型の細胞の傷害もしくは損傷に起因するか、または自己免疫疾患に起因する任意の代謝的障害が制御される。いくつかの態様において、哺乳動物は確立した自己免疫疾患を有する（例えば、哺乳動物は自己免疫疾患の徴候を有する）。いくつかの態様において、哺乳動物は、癌またはAIDSを有しない。望ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３１】
MHCクラスIおよびペプチドは、同時に（一緒にまたは別々に）または互いに24時間以内にのいずれかで投与され得る。いくつかの態様において、患者によって発現されるMHCクラスI対立遺伝子に一致する異なる対立遺伝子を各々含む2種またはそれ以上のMHCクラスI分子が患者に投与される。いくつかの態様において、MHCクラスIおよびペプチドは、ドナー細胞または所定の型の細胞に抵抗性を誘導するのに十分な量で投与される。望ましくは、患者における自己免疫細胞（例えば、自己反応性抗体を産生するB細胞、または提示された自己エピトープによって活性化されるT細胞）の数は、少なくとも5、10、20、30、40、50、60、80、90、95、または100％減少する。
【００３２】
上記の局面の種々の態様において、MHCクラスIおよびペプチドは、MHCクラスIおよびペプチドを発現する細胞、および所定の型に分化する潜在能力を有するか、または所定の細胞型であるかのいずれかである細胞を投与することによって患者に投与される。他の態様において、患者によって発現される対立遺伝子と一致する少なくとも1つの対立遺伝子を有し、かつペプチドを提示するMHCクラスIを発現する生きているかまたは死滅している（例えば、照射された）細胞の集団が患者に投与され、そして細胞の第1の集団とは異なりかつ所定の型に分化する潜在能力を有するかまたは所定の細胞型である別の細胞の集団が患者に投与される。この後者の細胞の集団は、MHCクラスIおよびペプチドを提示してもよいし、または提示しなくてもよく、そして発現された場合に、MHCクラスIは患者の対立遺伝子と一致する1つまたは複数の対立遺伝子を含んでもよいし、含まなくてもよい。いくつかの態様において、患者によって発現される対立遺伝子と一致する異なるMHCクラスIを各々有する細胞の2つの集団が投与される。
【００３３】
特定の態様において、MHCクラスIおよびペプチドの複合体は、MHCクラスIの細胞外領域（例えば、可溶性Fab断片）を1種または複数種のペプチド（例えば、細胞溶解物、またはランダムペプチド、合成ペプチド、もしくは天然に存在するペプチドのライブラリーからのペプチド）とインキュベートすることによって形成される。MHCクラスIは高い親和性でペプチドを結合するので、可溶性MHCクラスI断片は溶液中でペプチドを結合する。他の態様において、MHCクラスIおよびペプチドの複合体は、例えば、プロテアーゼを使用して、MHCクラスI発現細胞（例えば、患者のそれと一致する少なくとも1つのMHCクラスI対立遺伝子を有する健常リンパ球）から切断される。なお他の態様において、アセンブリーを伴う潜在的な問題に起因してペプチドと複合体化しないかもしれないMHCクラスIを発現する細胞は患者から単離される。MHCクラスIの断片は細胞から切断されかつ1種または複数種のペプチドとともにインキュベートされ、そして得られるMHCクラスIおよびペプチドの複合体が、細胞が得られたのと同じ患者、または異なる患者に投与される。
【００３４】
上記の局面の任意のいくつかの態様において、リンパ球減少症は、非特異的である薬剤、すなわち、新しい細胞分布に起因して、リンパ球またはリンパ球減少症の特定のサブセットを標的化するのではなく、一般的にリンパ球に毒性である薬剤を患者に投与することによって誘導される。リンパ球減少症のこのような誘導物質の例には、TNFαおよびTNFαを誘導する物質（例えば、完全フロイントアジュバント（CFA）、ISS-ODN、LPS様活性を有する細胞壁成分、コレラ粒子、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、レシチンベシクルで複合体化した大腸菌熱不安定性エンテロトキシン、ISCOMS-免疫促進複合体のような微生物アジュバント、ポリエチレングリコールおよびポリ(N-2-(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)のような化学アジュバント、CpGまたはCpAモチーフを含む合成オリゴヌクレオチド、モノホスホリルリピドAのようなリピドA誘導体、MPL、ムラミルジペプチド誘導体、カルメット-ゲラン桿菌（BCG）、他のワクチン接種、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、リポポリサッカリド（LPS）、インターロイキン-1（IL-1）、インターロイキン-2（IL-2）、UV光、リンホトキシン、カケクチン、TNFR-2アゴニスト、NFκB誘導物質、リンホトキシン、カケクチン、IRF-1、STAT1、ICS-2lgASプロモーターエレメントのアゴニスト、またはTNFαおよびTNFR-1抗体の組み合わせである。リンパ球減少症のこのような誘導物質は、亜集団を特異的に殺傷するのに十分であるがすべての血液細胞を非特異的に殺傷するのに十分でない用量で投与される場合に、血液細胞（例えば、T細胞の亜集団）を特異的に殺傷し得る。例えば、自己免疫患者は、細胞死に対して感受性が増加している血液細胞の亜集団を有する：従って、少ない用量のこれらの化合物がこれらの細胞を殺傷するために必要とされる。非特異的リンパ球減少症が望ましい場合（例えば、自己免疫疾患を伴わない哺乳動物の治療のような場合）、より多くの用量が投与され得る。非特異的な薬剤はまた、TNFαシグナル伝達経路のメディエーター（例えば、NFκB、Jun N末端キナーゼ（「JNK」）、TRAILR2、FasL、TRADD、FADD、TRAF2、RIP、MAPK、キナーゼアクチベーター、カスパーゼ、またはプロカスパーゼ）であり得る。シグナル伝達経路の刺激には、例えは、TNFスーパーファミリーの受容体、またはこれらの経路の細胞内メディエーターが含まれ得る。リンパ球減少症を誘導する化合物の他の例には、TNF受容体スーパーファミリーの1つまたは複数のメンバーを結合するか、またはそれを活性化する化合物（例えば、TNF受容体1または2、Trail-R1、Trail-R2、Trail-R3、Trail-R4、OPG、Rank、Fn14、DR6、Hvem、LtβR、DcR3、Tramp、Fas、CD40、CD30、CD27、4-1BB、OX40、Gitr、Ngfr、BCMA、Taxi、Baff-r、EDAR、Xedar、Troy、Relf、またはCD95L）が含まれる。治療用薬剤には、TNF受容体スーパーファミリーサイトカインアゴニストまたはサイトカインアゴニスト抗体が含まれ得る。TNFαを直接的または間接的に増加させるさらなる化合物は、TNFαの発現レベルまたはその活性についての日常的なスクリーニングアッセイを使用して容易に同定され得る。所望されるように、リンパ球減少症の誘導物質はまた、器官形成を促進し、ドナー細胞（例えば、血液細胞）の所望の細胞型への分化を促進し、および/または、所望の器官へのドナー細胞の取り込みを容易に���るために所定の細胞型の宿主細胞に損傷を誘導する。いくつかの態様において、一過性のリンパ球減少症が、自己免疫細胞の少なくとも10、20、30、40、50、60、80、90、95、または100％を破壊するのに十分な時間の間、患者において誘導される（例えば、自己反応性抗体を産生するB細胞、提示された自己エピトープによって活性化されるT細胞、または欠損性の抗原提示を伴う抗原提示細胞のサブセット）。いくつかの態様において、未処理のT細胞を殺傷する薬剤はBCGまたはFASではない。
【００３５】
いくつかの態様において、1種または複数種の以下のTNFスーパーファミリーリガンドが哺乳動物に投与されるか、または哺乳動物に対する別の化合物の投与によってアップレギュレートされる：Trail(Apo2L)、RANKL、TWEAK、TNF、LT、LIGHT、LT、TL1A、FASL、CD40L、CD30L、CD27L、CD27L、4-1BBL(CD137L)、OX40L(CD134L)、GITRL、APRIL、BAFF、EDA1、またはEDA2。特定の態様において、1種または複数種の以下のTNFαスーパーファミリー受容体が哺乳動物に対する化合物の投与によって活性化される：TRAIL-R1(DR4)、TRAIL-R2(DR5)、TRAIL-R3(DCR1)、TRAIL-R4(DCR2)、OPG、RANK、RN14、DR6、THF-R2(CD120B)、TNF-R1(CD120A)、FVEM、LIBETAR、DCR3、TRAMP(DR3)、FAS(CD95)、CD40、CD30、CD27、4-1BB(CD137)、CD134(OX40)、GITR、NGFR、BCMA、TACI、BAFFR、EDAR、XEDAR、TROY、またはRELT。望ましくは、1種または複数種の以下のデスカスケードのメンバーが活性化される：FAS(CD95)を伴うFASL(CD95L:CD178)、TRAIL-R1(DR4)を伴うTRAIL(APO-2L)、TRAIL R2(DR5)を伴うTRAIL(APO2L)、またはTNFR1を伴うTNF。
【００３６】
望ましくは、以下の1種または複数種が哺乳動物に投与される：IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-18、INF-α、IFN-β、IFN-γ、TFG-β、PDGF、および/またはVEGF。TLR1、TLR2、TLR6、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、および/またはTLR9の低分子または抗体アゴニストが望ましく投与される。典型的なTNFスーパーファミリーメンバーおよびそれらの受容体アゴニストには以下が含まれる：TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4、OPG、RANK、Fn14、DR6、TNF-R2、TNF-R1、HVEM、LtβR、DcR3、TRAMP、Fas、CD30、CD27、4-1BB、OX40、GITR、NGFR、BCMA、TACI、EDAR、XEDAR、Troy、およびRELT。多様な組成物の生物製剤、例えば、BCG、BLP、フィブロネクチンドメインA、リポアラビノマンナン、LPS結合タンパク質、LPS、リポテイコ酸、マクロファージ刺激リポペプチド2、マンノシル化ホスファチジルイノシトールペプチドグリカン、呼吸器合胞体ウイルスタンパク質F、および可溶性結核因子もまた、望ましい場合に投与され得る。
【００３７】
任意の広範な種々の細胞が本発明に従って患者に投与され得る。この細胞は、所望の機能的細胞と比較した場合、比較的未分化である細胞であり得；すなわち、これらは、例えば、胚性または胎児組織、成体幹細胞の供給源、多能性細胞のサブセットを有する成体組織、または臍帯血に由来する幹細胞であり得る。あるいは、投与される細胞は、比較的より分化した細胞、例えば、未成熟の造血細胞の核を染色する染色剤ヘキスト33342でポジティブに染まる細胞；脳由来の細胞；脳でないCNS組織由来の細胞（例えば、脊髄）；肝細胞；軟骨細胞；脾細胞；骨髄由来の細胞；血液もしくはリンパ系由来の細胞；または実質細胞であり得る。特定の態様において、投与される細胞は、膵島細胞ではなく、β細胞ではなく、またはインスリン産生β細胞ではない。種々の態様において、所定の細胞型以外の細胞が患者に投与され、インビボで所定の細胞型を形成する。例えば、いくつかの態様において、膵島細胞以外の細胞が患者に投与され、インビボでインスリン産生膵島細胞を形成する。望ましくは、細胞は、それが得られたのと同じ人に投与されるか、または別の人に投与される。他の哺乳動物からのドナー細胞が使用され得ることもまた意図される。典型的なドナー哺乳動物細胞は、ブタまたはサルのような霊長類由来である。
【００３８】
いくつかの態様において、患者（例えば、自己免疫疾患を有する患者）は、自発的な細胞死に対する抵抗性の減少を示すように、遺伝子操作されたか（例えば、Fas、FasL、もしくはカスパーゼのような細胞死ドメインをコードする遺伝子の除去によって）、化学的に前処理されたか、または生物学的に前処理された（例えば、FasもしくはFasLと反応性の抗体もしくは抗体断片で処置される）細胞を投与される。特定の態様において、FasまたはFasLの発現レベルまたは活性を減少させる化合物が、ドナー細胞または宿主に投与される。いくつかの態様において、細胞は同種異系であるか、半同種異系であるか、または同系である。本発明において使用され得る典型的なMHCクラスI発現細胞には、単球、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、ランゲルハンス細胞、上皮細胞、間葉細胞、および実質細胞が含まれる。他の細胞はMHCクラスIをより低いレベルで発現し、かつ本発明においてもまた使用され得る。望ましくは、少なくとも20、40、60、80、90、95、または100％の投与された細胞がペプチドと複合体形成したMHCクラスIを発現する。いくつかの態様において、細胞は、それらが患者に投与される前のみにMHCクラスIおよびペプチドを提示する。他の態様において、細胞は、それらが患者に投与される後のみにMHCクラスIおよびペプチドを提示する。いくつかの場合において、細胞は、MHCクラスIおよびペプチドを提示する細胞にインビトロで分化する。
【００３９】
いくつかの態様において、移植された細胞の死を妨害するために、1種または複数種の細胞死受容体（例えば、図5に列挙される細胞死受容体）がドナー細胞上で不活性化されるか、または細胞死を媒介する1種または複数種の細胞内シグナル伝達タンパク質がドナー細胞中で不活性化される。例えば、FLIPはFas/FasL発現をダウンレギュレートするために使用され得る。他の態様において、IL2の細胞外阻害または減少（例えば、化学物質または抗生物質による阻害）が使用されてFLIPをアップレギュレートし、これは次いでFASをダウンレギュレートする。他の態様において、ドナー細胞はIL2Rの妨害（例えば、化学物質（例えば、非溶解性抗体断片）のIL2Rへの結合）を有し、IL2RへのIL2の結合を阻害し、従って、IL2によって媒介されるFASのアップレギュレーションを阻害する。他の態様において、FAS活性化のための細胞内経路の1つまたは複数のメンバーが、移動の前にドナー細胞中で阻害される。例としては、cFOS、cJAN、PKC、Lck、Zap70、MAPK、Itk(IL-2誘導性T細胞キナーゼ)、およびJNKのような転写因子の翻訳の阻害が含まれる。特定の態様において、転写因子の転写または翻訳は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、またはRNA干渉（RNAi）によって一過性に阻害される。
【００４０】
本発明に従って維持される機能的細胞の数は、プロテアソーム活性を増加させる物質を用いて患者をさらに治療することによって増加され得る；この治療は、イムノプロテアソームサブユニットLMP2、LMP7、およびLMP10を特異的に増加させ得、細胞または宿主細胞を、細胞再生のために重要であるVEGF経路またはNFκB経路の活性を促進する増殖に対してより応答性にする。プロテアソーム増強物質の投与は、本発明の方法の間の任意の時点で実行され得る；例えば、細胞ならびに/またはMHCクラスIおよびペプチドの投与の前、または後；あるいは一過性のリンパ球減少症の導入の前、または後である。プロテアソーム活性増大物質は、例えば、γインターフェロン；VEGFまたはVEGFのレベルもしくは活性を増大させる物質（例えば、VEGFまたはその活性断片をコードする核酸分子）；胎児肝臓キナーゼ-1/キナーゼドメイン領域（Flk-1/KDR）またはFlkのレベルもしくは活性を増大させる物質；あるいは、fms様チロシンキナーゼ-1（Flt-1）またはFltのレベルもしくは活性を増大させる物質であり得る。さらなるプロテアソーム活性増大物質には、FasもしくはFasLの発現もしくはシグナル伝達を阻害する化合物（例えば、抗Fas抗体もしくは抗FasL抗体）、および/または内因性もしくは外因性に投与された多能性細胞の生存度を促進する化合物が含まれる。
【００４１】
望ましくは、本発明の方法を使用する処理後少なくとも1日、1週間、1ヶ月、または1年間存在する所望の細胞型の細胞の数は、処理前の患者に存在する細胞型の細胞の数、または対照被験体（例えば、ビヒクル対照またはプラセボを受けた被験体）において存在する細胞の数と比較して、少なくとも20、30、50、75、100、200、500、または1000％も増加する。いくつかの態様において、処理した患者における所望の細胞型の細胞の数は、これらの細胞に欠損を有さない健康な患者における、対応する細胞の量の少なくとも50、60、70、80、90、または100％である。いくつかの態様において、ドナー起源の細胞は、処理後少なくとも1日、1週間、1ヶ月、または1年間、患者に存在する。例えば、本方法を使用して処理される糖尿病患者は、望ましくは、処理後彼らの膵臓中にドナー起源の細胞を含む。
【００４２】
いくつかの態様において、本発明の方法は、器官、筋肉、もしくは他の身体の構造における細胞の損傷もしくは欠損を処理するために、または器官、筋肉、もしくは他の身体の構造を形成するために使用される。所望の器官には、膀胱、脳、神経系組織、血管、皮膚、眼構造、腸（gut）、骨、筋肉、靱帯、食道、卵管、心臓、膵臓、腸（intestine）、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、胃、尿道、および子宮が含まれる。これらの応用のために、ドナーの分化した細胞（例えば、これらの器官のいずれかからの細胞）、または未分化の細胞（例えば、胚性幹細胞もしくは成体幹細胞）が患者に投与される。望ましい態様において、膵臓は再生されるか、またはランゲルハンスの膵島を表すオルガネラが再び現れる。いくつかの態様において、修復されるかまたは置き換えられる器官、筋肉、または他の身体構造は、少なくとも部分的には、加齢プロセスによって損傷された。いくつかの態様において、再生された器官（例えば、胆管、膵臓の内分泌腺部分、もしくは全体の膵臓）、筋肉、または他の身体構造の細胞の少なくとも20、40、60、80、90、95、または100％がドナー起源である。特定の態様において、前駆細胞は雌性に提供される。
【００４３】
本発明の方法は、自己免疫疾患および自己免疫疾患以外の疾患または状態（例えば、特定のクラスの細胞に対する損害を関連する疾患および傷害）を、治療、予防、または安定化するために使用され得る。例えば、これらの方法は、以下を含むがこれらに限定されない自己免疫疾患を治療、予防、または安定化するために使用され得る：インスリン依存性糖尿病、狼瘡、シェーグレン病、慢性関節リウマチ、尋常性天疱瘡、多発性硬化症、甲状腺機能低下、グレーヴズ病、乾癬、未熟性卵巣不全（POF）、および筋無力症。自己免疫疾患の他の例は本明細書中に記載されている。これらの手順において、レシピエント自身の免疫系によって攻撃される細胞は、所望の細胞型であるか、またはインビボで所望の細胞型に分化するかのいずれかである移植された細胞によって置き換えられ得る。I型糖尿病またはII型糖尿病の治療のために、インスリン産生膵島細胞（例えば、患者と一致する少なくとも1つの対立遺伝子を有し、かつペプチドを提示するMHCクラスIを発現する膵島細胞）、またはインビボでインスリン産生膵島細胞に分化する細胞（例えば、脾細胞から生じる細胞、骨髄細胞起源の細胞、血液起源の細胞、または線維芽細胞）が患者に移植され得る。望ましくは、患者のグルコースレベルは、200mg/dl未満、150mg/dl未満、または120mg/dl未満（好ましさはこの順番で増加する）に減少する。
【００４４】
これらの方法のための他の医学的応用の例には、神経学的な疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン病、またはALS；または脊髄損傷）を治療、予防、または安定化するための、ヒト神経系中の適切な領域への神経細胞または神経細胞に分化する細胞の投与が含まれる。例えば、変性神経細胞または傷害を受けた神経細胞は移植細胞によって置き換えられ得る。未分化のドナー細胞が、例えば、全身的または局所的に投与され得る。
【００４５】
自己免疫状態以外の状態の治療のための好ましい態様において、リンパ球減少症の投与された誘導物質（例えば、TNFα）による幹細胞の破壊を阻害する化合物が、望ましくは患者に投与される。このような化合物の例には抗Fas抗体が含まれる。いくつかの態様において、幹細胞およびインビボで幹細胞を形成する細胞が、リンパ球減少症またはリンパ球再分布の誘導物質の投与後に投与される（例えば、内因性自己免疫細胞の破壊後、例えば、リンパ球減少症の7〜14日後）。
【００４６】
本発明の治療方法に関して、患者への1種または複数種の化合物（例えば、生成されたドナー細胞もしくは未精製のドナー細胞、MHCクラスIおよびペプチド、ならびにリンパ球減少症の誘導物質）の投与が、投与の特定の様式、投薬量、または投薬の頻度に限定されないことは意図されない；本発明は、投与のすべての様式を意図し、これには、筋肉内、静脈内、腹腔内、小胞内、関節内、傷害内、皮下、または、所望の細胞の数を増加させるのに十分な用量を提供するために十分な他の任意の経路が含まれる。化合物は、単回用量または複数回用量で患者に投与され得る。複数回用量が投与される場合、その用量は、互いに、例えば1日、1週間、1ヶ月、または1年間分けられ得る。例えば、リンパ球減少症を誘導する化合物は、例えば、1週間に1度、または2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、10週間、15週間、20週間、またはそれ以上に1度投与され得る。任意の特定の被験体にとって、特定の投薬量計画が個体の必要性および組成物を投与するかまたは投与を監督する人の専門的な判断に従って、長期間にわたって調整されるべきであることが理解される。例えば、ドナー細胞の投薬量は、より多くの特定の細胞型の細胞が必要である場合、例えば、糖尿病患者のグルコースレベルが正常に戻っていないか、または進行中のプロセスが所定の細胞型の細胞の数もしくは活性を減少させる場合に、増加され得る。リンパ球減少症を誘導する化合物の投薬量はまた、自己免疫細胞が患者に残存している場合、例えば、患者からの血液細胞が自己抗体を含むか、またはTNFαに対する感受性の増加を有する（自己免疫細胞がなお患者中に存在することを示す）細胞を含む場合に増加され得る。逆に、ドナー細胞またはリンパ球減少症を誘導する化合物の投薬量は、所望の細胞の数が患者中に存在するか、または自己免疫細胞がもはや存在しない場合に減少し得る。望ましければ、従来的な治療を本発明の療法と組み合わせて使用してもよい。例えば、食事療法および運動が、糖尿病患者におけるグルコースレベルの制御を容易にするために使用され得る。
【００４７】
本方法の他の態様は、2000年3月8日に出願された米国特許出願番号第09/521,064号、および2001年1月23日に出願された同第09/768,769号、および2000年9月14日に公開されたPCT国際公開公報第00/53209号（これらは参照として組み入れられる）に開示されている。
【００４８】
定義
「疾患、障害、または状態を治療、安定化、または予防する」とは、疾患、障害、または状態の最初の発生または引き続く発生を予防または遅延させること；状態の消失とその再発生との間に疾患がない生存時間の増加；状態と関連する有害な徴候の安定化もしくは減少；疾患の進行の速度を遅くすること；または、状態の進行を阻害もしくは安定化することを意味する。望ましくは、少なくとも10、20、30、40、60、80、90、または95％の治療した被験体が完全な回復を有し、そこではすべての疾患の証拠が消失する。別の好ましい態様において、1つの症状で診断されかつ本発明の療法で治療された後で、患者が疾患の徴候がないままである時間の長さは、（i）未治療の患者が疾患の徴候がないままである平均の時間の長さ、または（ii）別の療法で治療された患者が疾患の徴候がないままである平均の時間の長さよりも少なくとも10％、20％、40％、60％、80％、100％、200％、または500％も高い。望ましくは、疾患によって発生する白血球の数は、少なくとも10％、20％、30％、40％、60％、80％、95％、または100％減少する。
【００４９】
「自己免疫疾患」とは、免疫系応答が自己のエピトープに対して産生される疾患を意味する。自己免疫疾患のいくつかの例には以下が含まれる：円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ-ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集疾患、クローン病、円板状狼瘡、本態性混合クリオグロブリン血症、線維筋肉痛-線維筋炎、グレーヴズ病、ギラン-バレー症候群、橋本甲状腺炎、甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgA腎症、インスリン依存性糖尿病、若年性関節炎、扁平苔癬、狼瘡、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多腺症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症、および重症筋無力症。
【００５０】
「MHCクラスIおよびペプチド」は、免疫系の通常の機能と関連して細胞の表面にそれが天然に提示される場合のMHC/ペプチド複合体を意味するものとして一般的に理解される。細胞質抗原は、細胞質プロテアーゼおよびプロテアソーム（Lmp2、Lmp7、およびLmp10のタンパク質が会合した多触媒性プロテイナーゼ複合体）によってペプチドにプロセスされる。本明細書中で使用される場合、用語「MHCクラスIおよびペプチド」は、このような天然に存在する複合体を含み、さらに天然の抗原由来のペプチドとは異なるが、それにも関わらず、本発明に従って機能的細胞を維持するために有効であるクラスIと複合体を形成することが可能であるペプチドを含む。天然の抗原由来のペプチドとは異なる典型的なペプチドは、非天然アミノ酸（例えば、D-アミノ酸）ならびに天然に存在するアミノ酸を含み得る。好ましいMHCクラスIおよびペプチドの複合体は、8残基と10残基との間の長さのアミノ酸の鎖がMHCクラスI分子と正確に複合体化し、半同種異系であるか（すなわち、ドナーとレシピエントとの間で、少なくとも1つのMHCクラスI対立遺伝子がミスマッチであり、少なくとも1つのMHCクラスI対立遺伝子が一致する）、または同系であるか（すなわち、すべてのMHCクラスI対立遺伝子がドナーとレシピエントとの間で一致し、ここで、MHCクラスIおよびペプチドの複合体は免疫系の再訓練または再選択に寄与する）のいずれかである。
【００５１】
いくつかの態様において、MHCクラスIおよびペプチドは患者に投与される細胞の表面に存在する。他のMHCクラスI/ペプチド複合体は、細胞の表面では発現しない可溶性複合体である。特定の態様において、MHCクラスIの細胞外領域（例えば、MHCクラスIのFab断片）、または可溶性の全長MHCクラスIが、ペプチドがMHCクラスI断片に結合することを可能にする条件下で、公知の方法に従って1種または複数種のペプチドをインキュベートされ、得られるMHCクラスIおよびペプチドの複合体が患者に投与される。他の態様において、MHCクラスIおよびペプチドの混合物が患者に投与され、MHCクラスIおよびペプチドが患者への投与後にインビボで結合する。いくつかの態様において、投与されるMHCクラスIは、患者によって発現されるMHCクラスIに少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、または100％の配列同一性を有する、1、2、3、または4の対立遺伝子を有する。配列同一性は、配列分析ソフトウェアを使用して、そこで特定されるデフォルトパラメーターを用いて代表的には測定される（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705の配列分析ソフトウェアパッケージ）。このソフトウェアプログラムは、種々の置換、欠失、および他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることによって類似の配列を一致させる。
【００５２】
「機能的細胞」とは、それらの通常のインビボでの活性を実行する細胞を意味する。本発明の特定の望ましい態様において、その細胞はMHCクラスIの文脈で内因性自己ペプチドを発現することができる。
【００５３】
「所定の型」とは、機能的細胞と関連して使用される場合、規定された細胞型を意味する。例えば、当業者は、膵臓における機能的膵島細胞の数を増加または維持するために、本発明の方法を実行することを決定し得る。この例において、所定の型の細胞は、膵島細胞または膵島前駆細胞である。
【００５４】
標準的なアッセイ法が、投与された細胞がインビボで所定の細胞型の細胞を形成するか否かを決定するために使用され得る。例えば、細胞は、標準的なウェスタン分析もしくは免疫蛍光分析を使用して特定のタンパク質（例えば、所定の細胞型に特異的なタンパク質）の発現について、またはcDNAアレイを使用して特定のmRNA分子（例えば、所定の細胞型に特異的なmRNA分子）の発現について、分析され得る（Ausubelら、前出）。投与された細胞型が所望の細胞型に転換されたか否かを決定するために分析され得るそれらの投与された細胞の他の特性の例には、細胞のサイズ、細胞の形態学、原形質の体積、および細胞機能（例えば、インスリンまたは他のホルモンの産生）が挙げられる。
【００５５】
「半同種異系」とは、少なくとも1つのマーカー（例えば、同じ種の異なる個体からの同じ型の細胞間のMHCクラス対立遺伝子）の一致を意味する。望ましくは、少なくとも2種または3種のMHCクラスI対立遺伝子は、ドナーと宿主間で一致する。標準的な方法が、ドナーの細胞によって発現されたMHCクラスI対立遺伝子がレシピエントによって発現されたMHCクラスI対立遺伝子と一致するか否かを決定するために使用され得る。例えば、特定のMHCクラスI対立遺伝子に特異的な抗体が、何の対立遺伝子が発現されているかを決定するために使用され得る。代替的には、MHCクラスI対立遺伝子をコードする核酸のPCR増幅が使用され得る。
【００５６】
「同系（syngeneic）ドナー細胞」または「同系（isogeneic）ドナー細胞」とは、（i）レシピエントの細胞に、HLA領域で遺伝的に同一であるか、もしくは一致する（すなわち、共通して少なくとも4、好ましくは6すべての標準的マーカーを有する）ドナー細胞、または（ii）それが得られたのと同じ患者に再投与されるドナー細胞を意味する。
【００５７】
「TNFα誘導物質」とは、望ましくは、内因性TNFαの発現を生じ、TNFαの分泌を増強し、またはTNFαの生物学的利用能または安定性を増強する化合物である。しかし、TNFαアゴニスト、TNFαシグナル伝達を刺激するかもしくは受容体の後のTNFα作用を増強する薬剤、または自己免疫細胞の細胞死の加速を引き起こす経路に作用する薬剤もまた、この定義に含まれる。TNFα誘導の刺激（例えば、CFAの投与による）は、望ましくは、インビボでの細胞の投与の前、その後、またはその間に実行される。
【００５８】
「リンパ球減少症」とは、哺乳動物からの血液試料中のリンパ球の総数の減少を意味する。いくつかの態様において、この減少は、リンパ球（例えば、T細胞、B細胞、および/またはマクロファージ）の死滅に起因する。特定の態様において、この減少は、リンパ球の再分配に起因する。
【００５９】
「非特異的」とは、リンパ球減少症との関連において、個体におけるリンパ球の総数の減少を意味し、リンパ球のサブセットに限定されない。
【００６０】
「血液細胞を選択的に殺傷する」とは、刺激されていない細胞または刺激された細胞の亜集団のような血液細胞（例えば、T細胞またはB細胞のような自己反応性リンパ系細胞または欠損性抗原提示細胞）の数または相対的割合を直接的または間接的に減少させることを意味する。望ましい態様において、その亜集団は、T細胞、B細胞、またはマクロファージのサブセットである。望ましくは、殺傷される記憶T細胞は自己免疫T細胞、すなわち、提示された自己エピトープによって活性化されるT細胞である。望ましい態様において、殺傷される未処理のT細胞は、さもなくば自己免疫T細胞になる細胞である。望ましくは、自己免疫T細胞またはさもなくば自己免疫T細胞になる細胞の数は、健常な非自己免疫T細胞が減少する数よりも、少なくとも25％。50％、100％、200％、または500％多く減少する。いくつかの態様において、自己免疫T細胞またはさもなくば自己免疫T細胞になる細胞の数は、標準的な方法を使用して測定された場合に、少なくとも25％。50％、75％、80％、90％、95％、または100％減少する。T細胞は、任意の経路、例えば、アポトーシス、ネクローシス、および/または活性化によって誘導される細胞死によって殺傷され得る。アポトーシスは、カスパーゼ依存性の細胞収縮、核の凝縮、またはDNAの核内分解を検出することによってアッセイされ得る。ネクローシスは、カスパーゼ非依存性の細胞膨潤、細胞分解、または細胞質物質の放出によって認識され得る。ネクローシスは、後期のミトコンドリアの損傷を生じるが、シトクロムC放出は生じない。いくつかの態様において、記憶T細胞はアポトーシスによって殺傷され、未処理のT細胞はネクローシスによって殺傷される。狼瘡の治療のために、B細胞が望ましくは殺傷され、代替的には、これらは発生的に成熟される。
【００６１】
「刺激された血液細胞」とは、抗原に曝露された血液細胞（例えば、記憶T細胞、B細胞、またはマクロファージ）を意味する。
【００６２】
「刺激されていない血液細胞」とは、抗原に曝露されていない血液細胞（例えば、未処理のT細胞、B細胞、またはマクロファージ）を意味する。
【００６３】
「病理的なT細胞」とは、自己免疫応答または障害に関与するか、またはそれに関与する潜在能力を有するT細胞を意味する。
【００６４】
刺激された細胞は、刺激されていない細胞よりもより後期の成熟の段階にあるか、細胞周期を通って活性な進行にあるか、および/または疾患を有するかもしくは損傷した器官もしくは組織に浸透する傾向がある。刺激されていない細胞は、細胞周期の進行より遅いか、または全くそれを進行しない傾向がある。記憶T細胞は、未処理のT細胞よりも高密度（例えば、10〜20％高い密度）のIL-2受容体を発現する傾向がある。未処理のT細胞は、記憶T細胞よりも、高密度（例えば、5〜20％高い密度）のCD45RB高、CD95、および/またはCD62Lを発現する傾向がある。
【００６５】
「精製された」とは、天然ではそれに付随している他の構成成分から分離されていることをいう。代表的には、因子（例えば、タンパク質、低分子、または細胞）は、それが少なくとも重量で50％、それに天然では付随していたタンパク質、抗体、および天然に存在する有機分子を含まない場合に、実質的に純粋である。望ましくは、その因子は、重量で少なくとも75％、より望ましくは少なくとも90％、および最も望ましくは99％、純粋である。実質的に純粋な因子は、化学合成、天然の供給源からのその因子の分離、または天然にはその因子を産生しない組換え宿主細胞中でのその因子の産生によって得られ得る。タンパク質、ベシクル、染色体、核、他のオルガネラ、および細胞は、Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2000）によって記載されるような標準的な技術を使用して、当業者によて精製され得る。その因子は、望ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学密度、HPLC分析、またはウェスタン分析（Ausubelら、前出）を使用して測定した場合に、出発物質よりも少なくとも2倍、5倍、または10倍純粋である。好ましい精製の方法には、免疫沈殿、カラムクロマトグラフィー（例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィー）、磁気ビーズイムノアフィニティー精製、およびプレート結合抗体を用いるパニングが含まれる。
【００６６】
詳細な説明
本発明者らは、損傷した膵臓を有する動物中で機能している器官（膵臓の島細胞）を再生することに成功し、かつ、その器官の目に見える部分のほぼ全体ならびに胆管の大きな部分がドナー起源であるこをと示した。
【００６７】
患者における所定の細胞型の機能的細胞の数を増加させるための本方法は、多くの利点を有する。例えば、本発明の方法は頑強でありかつ耐久性がある。本方法は、その器官と同じ細胞型またはその器官と異なる細胞型のドナー細胞を使用して、内因性器官の大部分またはすべてを置き換えるために使用される。この方法はまた、自己免疫細胞の非特異的不活性化または死滅のための免疫抑制を伴うことなく実行され得る。
【００６８】
これらの以下の実施例は、本発明を例証する目的のために提供され、限定として解釈されるべきではない。
【００６９】
材料および方法
マウスの診断および処理
雌性NODマウスをTaconic Farms（Germantown, NY）またはJackson Laboratory（Bar Harbor, ME）のいずれかから入手した。C57BL/6JマウスをJackson Laboratoryから入手した。すべてのマウスを病原体のない条件下で維持した。
【００７０】
NODマウスを、それらの体重および血糖レベルをモニタリングすることによって糖尿病の発症についてスクリーニングした。糖尿病の診断のための判断基準には、400mg/dlを超える2回の連続した血糖濃度が含まれた。高血糖に起因する即時の死滅を防止するために、400mg/dlを上回る血糖レベルを有するマウスに、体重の各100gに対して、中性プロタミンハーゲドロン（Neutral Protamine Hagedorn）（NPH）ヒトインスリン1.0〜1.5ユニットを毎日注射した。疾患の発症後比較的後期でのこのような重篤な糖尿病のマウスの使用は、内因性の膵島がドナー膵島細胞の移植の前に完全に破壊されたことを確証する。
【００７１】
脾細胞ドナーには以下が含まれた：正常なC57マウス、C57β2M-/-マウス（それらの細胞がそれらの表面上でのMHCクラスIおよびペプチドを発現する能力が、シャペロンタンパク質β2ミクログロブリンの除去によって減少しているが、正常マウス血清に曝露された場合にはMHCクラスIおよび自己ペプチドを発現し得る）、C57β2M-/-TAP1-/-マウス（これは、MHCクラスIおよび自己ペプチドを再発現する能力が減少している）、およびMHCクラスII-/-マウス（ここでは、C57株における内因性の欠損のために、I-A遺伝子が破壊され、およびMHCクラスIIについてのE遺伝子座が発現されない）。一般的に、9×106細胞の用量の脾細胞を、1週間に2回、尾静脈を通して何体かのNODレシピエントに注射した。TNFα（これは、Genentech（South San Francisco, CA）、Hoffman-LaRoche（Basel, Switzerland）、Boehringer Ingelheim（Germany）Asahi Chemical Industry（日本）、およびSigma-Aldrich（St. Louis, MO）を含む種々の業者から市販されている）を、自己反応性細胞を除去するため、および血管内皮の胚性プログラムを再現することによって（すなわち、NFκBおよび/またはVEGFの誘導）宿主における再生を促進するために、腹腔内に（1〜20μg/用量、1週間に2〜3回）投与した。CFA（Difco Laboratory, Detroit, MI）を等量の生理学的生理食塩水と混合し、約1〜50μlを、膵島移植の時点で、または最初の脾細胞注射の後に、各後足の足蹠に注射した。
【００７２】
膵島移植
膵島をドナーC57マウスまたは6〜8週齢前糖尿病雌性NODマウスから単離し、これは、グルコースクランプならびにMHCクラスIおよび自己ペプチドの供給源として働いた。密度勾配遠心分離、続いて膵島の手作業による選択を実行して、両方の調製物が膵島で高度に富化されたことを確証し、および移植された膵島の数を正確に決定した。約500〜600の特別に選択した膵島を、各糖尿病NODレシピエントの左の腎臓の被膜の下に移植した。膵島のカプセル化のために、900〜1100の膵島を0.2〜0.5cm直径のアルギン酸球に封入し、これを糖尿病マウスの腹膜腔に外科的に挿入した。移植は、非絶食血糖濃度が手術後24時間以内に正常に戻った場合に成功と見なした。レシピエント血液のグルコース濃度を、Glucometer Elite装置（Bayer Corp., Pittsburgh PA）を用いて移植後3回モニタリングした。同種異系移植片は、血糖濃度が2回のモニタリングの時点の間で250mg/dlより多くまで増加した場合に、拒絶されたと見なされた。同種異系移植片を拒絶したレシピエントは、組織学的検査およびフローサイトメトリー研究のために識別された。
【００７３】
血糖濃度の対照における内因性膵島の効果を決定するために、腎臓の下の膵島移植片を外科的に除去および分析した。同様に、必要に応じて、解剖顕微鏡を使用して直接的な局在化の後で腹膜腔からアルギン酸球中に封入された膵島を除去した。膵臓および同種異系移植片の組織学的分析が、（i）リンパ系浸潤の評価のためのヘマトキシリンおよびエオシンを用いる染色、ならびに（ii）インスリン島細胞含量についてのアルデヒド-フクシンを用いる染色によって実行された。脾臓から十二指腸の付着物までの全体の膵臓を除去し、固定し、および連続的な切片化（通常切片あたり10μm）に供した。
【００７４】
実施例1
NODマウスにおけるCFA処理および膵島移植
移植実験のための宿主は重篤な糖尿病の雌性NODマウスであり、通常20週齢より大きく、これは、少なくとも7日間400mg/dlより高い血糖濃度を示し、および、その時間の長さの間、毎日のインスリン投与によって処理された。膵島移植片を腎臓の被膜中で片側に配置し、非致死的な除去および組織学的試験を容易にした。6〜8週齢の前糖尿病ドナー雌性マウスまたは正常なC57ドナーマウスからの膵島は、すべての場合において、通常9日目までに糖尿病NODマウスによって迅速に拒絶された。クラスIの一過性の除去を有するC57ドナー膵島は、免疫抑制されていない糖尿病宿主および非自己免疫糖尿病宿主において無制限に生存するが、糖尿病NOD雌性マウスにおけるβ2M-/-C57膵島についての生存時間は、正常C57膵島のそれの約2〜3倍のみである。この観察は、ドナー細胞の除去が現在の疾患に関連すること、および同種異系移植片拒絶と関連しないことを確証する。CFA処理は糖尿病NOD宿主における同系膵島移植片の生存を延長したが、C57BL/6膵島の生存には最小限の効果を有し、これは移植後約11日で均一に拒絶された。しかし、CFA処理とβ2M C57膵島移植片の組み合わせは、14の糖尿病宿主のうちの5例において120日間より長い持続した正常血糖を生じた。治療の開始前の高血糖の期間はこれらのコホート中で7日間と20日間の間で変動しているが、この期間の長さは処理後の持続した正常血糖の期間とは統計学的に関連しなかった。持続した正常血糖を有するこの研究における動物はまた、決して糖尿病にならなかったNOD雌性宿主コホートにおけるそれと同様の進行性の体重増加を有した。血糖濃度の正常化は処理の成功の尺度である。
【００７５】
CFAおよびMHCクラスI提示自己ペプチドを有しない同系NOD移植片で処理されたNODマウスにおける高血糖の再発後、同種異系移植片を含む腎臓を組織学的に試験した。移植の部位において腎臓被膜の下にマクロファージおよびT細胞特異的浸潤が見られ、これは再発している自己免疫疾患に特徴的なものであった。さらに、膵臓において無傷の膵島は検出されなかった。宿主は膵臓中に島細胞の残渣を有することもあったが、これらは浸潤しているリンパ球の高密度のポケットにおって大部分覆われていた。NOD移植片の後のこの高血糖の再発は、NODマウス中のこの経路におけるエラーのために、NOD移植片中でMHCクラスIがペプチドを提示することができないことに起因し得る。MHCクラスI細胞によって提示されるペプチドの欠如は、移植された細胞が耐性を誘導することを妨害する場合がある。あるいは、NOD膵島がMHCクラスIおよびペプチドを提示する場合でさえ、実質細胞の単回の曝露が不十分であることがあり得る。従って、宿主NODマウスは移植された細胞を破壊する自己免疫T細胞を生成する。
【００７６】
同様の組織学的特性（移植部位および膵臓においての両方で浸潤するリンパ球を含む）が、C57ドナーからの半同種異系移植片と組み合わせたCFAを受容した糖尿病NODマウスにおいて見られた。予想外に、長期的な正常血糖を有するすべてのNODマウスについて、β2M-/-C57膵島の除去後、およびCFA処理後に、動物がこのプロトコールを使用する移植後129日間より多く試験された場合に、腎臓被膜の下で生存している同種異系移植片は検出されなかった。対照的に、これらの5例のレシピエントの各々において、アルデヒド-フクシンを用いて染色された場合に、完全に顆粒化した外見の良好に形成された膵島を示した。本発明者らの結果は、この膵島はリンパ球を含まず、リンパ球は膵島の周囲にのみ存在したことを示す。周囲にリンパ球を伴うが、膵島に侵入しない、このリンパ球蓄積のパターンは、非進行性または中断されたβ細胞自己免疫と関連してきた。検出可能な移植された膵島組織の非存在下での正常血糖への回復は、浸潤しているリンパ球を大部分欠いている膵臓における膵島の存在とともに、自己免疫が妨害されたことだけではなく、内因性β細胞の機能が回復したこともまた示す。この自己免疫の破壊は、少なくとも部分的には、投与されたCFAによるTNFαの誘導、および生じたTNFαによる自己免疫T細胞の破壊に起因すると考えられる。さらに、宿主と一致する対立遺伝子を有するMHCクラスIおよびペプチドのドナー細胞による発現は、おそらく移植された細胞および再生している器官の破壊をまた妨害するネクローシスおよびアポトーシスの両方によって、T細胞再選択による耐性を誘導する。
【００７７】
内因性β細胞活性の回復に対する内因性細胞およびドナー細胞の相対的な寄与を、β細胞活性の増加が宿主の前駆細胞からの内因性の再生の結果であるか、または、以下に実証されるように、ドナーのリンパ系細胞もしくはドナーの膵島の、宿主の膵島への転換の結果であるかを決定することによって測定した。以下に記載されるように、救出は初期の糖尿病および後期の糖尿病の逆転において役割を果たし得るが、投与されたドナー細胞は宿主膵臓β細胞になり得る細胞であった。正常に近い膵島組織学の回復は、β2M-/-同種異系移植片およびCFA処理の両方を受けた糖尿病NODマウスにおいてのみ観察された。膵島は、CFAおよび同系NOD膵島を用いて処理されたいかなる糖尿病NODマウスにおいても検出されなかった。同系NOD膵島のレシピエントにおける正常血糖の持続は、明らかに侵襲性の膵島炎を常に示す移植された膵島にのみ起因する。ここで、同系NODと一緒にCFAを用いる処理は疾患の再発を遅くし得るが、持続性の自己免疫は保持される。本発明者らはまた、回復した内因性の膵島および移植された膵島の、CFAおよびβ2M-/-C57ドナーからの同種異系移植片を用いて処理されたNODマウスにおける正常血糖の維持に対する相対的な寄与を評価した。内因性の膵島の相対的な寄与は、5匹の動物のグループから、ならびに同種異系移植片を受容していない対照グループからの正常血糖の120日後の膵島移植片を含む腎臓を除去することによって決定された。同系異種移植片を受容した5匹のマウスすべてが、これらが3〜60日後に屠殺されるまで、腎摘出後に正常血糖のままであった。移植片を受容していない腎臓の組織学的分析は、同定可能な膵島構造の完全な喪失を示した。対照的に、5匹の同種異系移植片レシピエントについての膵臓は、リンパ系浸潤なしまたは周囲に分布したリンパ球のみを伴うかのいずれの場合も、十分に形成した膵島を含んだ。従って、腎摘出後の正常血糖は、内因性の膵島によってのみ維持された。現在本発明者らは、この膵島が救出ならびに内因性もしくは外因性の供給源の両方によって宿主中に再出現したことを認識している。
【００７８】
これらの結果は、CFAおよび同系NOD膵島を受容した2匹のマウスにおける移植後の正常血糖の期間の間に実行された腎摘出の分析によって確認された。この場合において、この処理は高血糖への急速な戻りを生じ、このことは、この処理グループにおける血糖の制御は移植された膵島組織によってのみ媒介されたことを実証している。糖尿病NODマウスはまた、C57マウスからの膵島を移植された。このC57マウスにおいては、β2M遺伝子およびTAP1遺伝子の両方からの遺伝子が欠失していた。TAP2と一緒に、TAP1は、MHCクラスI分子とのアセンブリーのために細胞質ゾルから小胞体のルーメンへの内因性ペプチドの輸送を媒介する。β2MおよびTAP1の両方の遺伝子が欠失していたC57を使用する本発明者らのデータは、これらのマウスが、β2M遺伝子における変異のみを有するものよりもMHCクラスI自己抗原の提示をより欠損していることを示した。β2MおよびTAP1の両方を欠くこれらのダブルノックアウトC57膵島の移植は、CFAの注射と組み合わせて、ある動物において14日以内に高血糖の戻りを生じる。ダブルノックアウトクラスI細胞を用いて処理された6匹のNODマウスのうちの2匹は、処理の40日後に正常血糖を有した。膵臓の生理学的試験は、未処理の糖尿病NODマウスにおいて典型的に見られるパターンを示した。このプロトコールの効率の減少は、正しくアセンブルされかつ投与されたMHCクラスIおよびペプチドの複合体の重要な役割を支持する。
【００７９】
これらの結果に基づいて、ドナーMHC分子のペプチド提示の一過性の妨害または一過性の欠損MHCクラスIが自己免疫の抑止のために重要である。この一過性の除去またはMHCクラスIの減少またはドナーMHCクラスIの永続的な提示もまた、これらの細胞が他の細胞型に転換することを可能にする特徴であるようである。対照的に、このプロセスの持続性の妨害は、耐性の再確立および内因性膵島の完全性の回復を妨害する。正常MHCクラスIおよび自己ペプチドまたは短寿命細胞の反復投与は、同様の効力を示した。
【００８０】
CFAおよびβ2M-/-C57膵島で処理した糖尿病NOD宿主における正常血糖の回復が膵島移植片によるインスリンの継続的な分泌に依存することができないと仮定して、本発明者らは、ここで、膵島以外のC57ドナー細胞型が治療的役割を果たし得るか否かを調べた。本発明者らは、C57ドナー細胞がMHCクラスIおよび自己ペプチドを供給することを予測する実験を実行した。以下の結果によって示されるように、ドナーリンパ系細胞は宿主中でインスリンを分泌するβ細胞に実際に転換し、または宿主の損傷した細胞もしくは宿主の隣接細胞と融合する。これらの実験において、9匹の糖尿病NODマウスを単回のCFAの両側注射で処理し、続いてC57脾細胞の隔週の静脈内注射の40日措置を行った。これらのリンパ系細胞はMHCクラスIタンパク質およびMHCクラスIIタンパク質の両方を発現し、移植片拒絶と推定される理由により、NOD宿主中においてのみ一過性に生存する。しかし、これは単に一過性の処理であるという以前の仮定とは反対に、これらのドナー細胞は、宿主における免疫抑制の必要なしに長期間生存する。脾細胞の反復注射は、宿主がこれらの細胞の表面上の抗原提示複合体に継続して曝露されたことを確実にした。レシピエントを3〜4日毎に高血糖についてモニタリングし、正常血糖が戻らない限りインスリンを毎日投与した。4匹の糖尿病NODマウスの対照グループは、インスリン注射のみを毎日受けた。4匹すべての対照グループは、対照の乏しい血糖および結果として生じるケトアシドーシスの結果として、実験期間の25日目またはそれより前に死亡した。対照的に、CFAおよびC57脾細胞で処理されたマウスのいくつかは40日以後も生存し、これらの動物のうちの3匹が正常血糖およびインスリン非依存性になった。
【００８１】
対照マウスの膵臓は、いかなる残りの構造をも覆う明白なリンパ球浸潤を示すのに対して、CFAおよびC57脾細胞で処理され、生存しているが高血糖でかつインスリン依存性のままである4匹のNODマウスの膵臓は、まれな膵島構造の周辺またはそれに隣接して位置するリンパ系浸潤の数の著しい減少を示した。インスリン注射の中断後に正常血糖のままであるC57脾細胞およびCFAで処理された3匹のNODマウスにおいて、膵臓は、侵襲性の膵島炎または周辺のリンパ球とのみ結合している膵島を含まない豊富な膵島を示した。C57リンパ球への再曝露と組み合わせたCFAの処理は、約30％のNODレシピエントにおける糖尿病の完全な逆転、および宿主のさらなる約40％のβ細胞機能の部分的回復を生じた。
【００８２】
引き続く実験を、系の効力が宿主中での血糖制御によって改善され得るか否かを決定するために行った。CFAによるNODマウスにおける糖尿病の逆転およびC57脾細胞への反復する曝露は、内因性の膵島機能の回復が、膵島移植なしで、およびインスリン注射によって達成される乏しい血糖制御にも関わらず達成可能であることを示した。内因性β細胞機能の回復が血糖のより良好な制御とより一致して達成され得るか否かを決定するために、インスリン注射を、アルギン酸カプセル化C57マウス膵島の腹腔内移植で置き換えた。アルギン酸カプセル化は、ドナー組織と宿主T細胞との間の直接的接触を妨害し、このような移植片は、40日間の間、約78％の自己免疫NODレシピエントにおいてほぼ正常血糖制御を提供することが示された。アルギン酸カプセル化C57膵島を受容したほとんどすべての糖尿病NODマウスが、グルコース調節の改善または正常血糖を示した。アルギン酸球を移植後40〜50日で除去し、血糖濃度をモニタリングした。アルギン酸カプセル化膵島でのみ処理された7匹のマウス、CFAの単回の両側注射を受容した6匹のマウス、C57脾細胞の隔週注射で処理された3匹のマウスは、すべて急速な高血糖への戻り、および移植片の除去後の早期の死を示した。アルギン酸カプセル化膵島のみを受容したNODマウスの膵臓は、無傷の膵島またはリンパ系浸潤の徴候を示さなかった。CFAおよびアルギン酸カプセル化膵島で処理されたNOD宿主の膵臓は、著しい侵襲性の膵島炎および覆われた膵島構造を示した。対照的に、CFAおよびC57脾細胞を受容した9匹の糖尿病NOD宿主のうちの7匹が、アルギン酸カプセル化膵島の除去後40日間より長く正常血糖のままであった。これらの動物の膵臓は、周辺に分布したリンパ球を伴う大きな膵島を含んでいた。少なくとも80日間の疾患の逆転後の膵島の重量は、もともとの値の約50％であると見積もられた。一連の組織学的切片によって決定されたように、対照BALB/Cマウスからの膵臓は約25〜35個の膵島を含んでおり、首尾よく処理されたNODマウスからの膵臓は約12〜20個の膵島を含んでいた。
【００８３】
さらに、処理に起因する正常血糖の維持は、永続的に高血糖が治癒した糖尿病マウスの割合を増加させた。本発明者らは、ポジティブな結果の産生に寄与したこの治療措置の特徴を同定した。上記に注記されるように、CFAはTNFα、ならびに、自己免疫の除去のためおよび再生を促進するために有益であると考えられている他のサイトカインの内因性産生を誘導するために使用された。それゆえに、糖尿病の治療におけるTNFαの役割を、C57脾細胞、CFA、およびアルギン酸カプセル化膵島で処理した糖尿病NOD宿主において、最初の10日間、約1.5mg/日の用量の、サイトカインTNFαに対するラットIgG1モノクローナル抗体の静脈内投与によって調べた。このように処理された5匹のNODマウスすべてが、CFAの有益な効果におけるTNFαの役割と一致して、移植後50〜70日でのアルギン酸膵島の除去に際して高血糖への急速な戻りを示した。関連する実験において、抗TNFα抗体（クローンMP6-X73）を、CFA、C57脾細胞、およびアルギン酸カプセル化膵島の腸尿病NODマウス（n=5）への投与後10日間、約1.5mg/日の用量で投与した。40日目でのアルギン酸カプセル化膵島の除去後、5匹すべてのマウスですぐに高血糖が戻った。抗TNFα抗体の投与以外は同様に処理したマウスにおいては、アルギン酸ビーズの除去後、9匹のNODマウスのうちの7匹で正常血糖が維持された。抗TNFαモノクローナル抗体によって誘導された効果の特異性は、ヒトT細胞受容体β1鎖と反応性の対照ラットIgG1モノクローナル抗体が治療効果を生じることの失敗によって確証された。
【００８４】
CFAの投与に起因するTNFαレベルの増加を実証するために、TNFαのレベルを、ドナーリンパ球を含むまたは含まない、CFAの単回注射後にNODマウスにおいて測定した。表1のように、わずかに上昇したレベルのTNFαが、脾細胞を含むまたは含まないCFAの単回注射後2〜5日間、NODマウスにおいて一過性に検出可能であった。CFAの単回用量後2〜8日間のNODマウスはまた、30,000〜60,000/mm3から減少した血小板レベルを有する。このデータは、NODマウスにおけるTNFαのCFAによる誘導を支持する。
【００８５】
（表1）CFAを用いるNODマウスの処理により生じる血漿TNFαの上昇
2005535732.tif 000002
TNFα濃度はサンドイッチ技術を使用する固相ELISAによって測定した。この技術は、mTNFαに対する2種の異なるモノクローナル抗体を用い、そのうちの一方は西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化された（Sigma, St. Louis, MO）。検出限界は0.2ユニット/mlであった。
【００８６】
上記に提示したデータは、CFAの注射、TNFαの内因性誘導、またはTNFαの投与がTNFα感受性細胞の永続的な除去を直接的に生じさせ、その大部分は以前に見られた膵島細胞抗原を有する。有益なアポトーシス性細胞死またはリンパ系に対する効果に加えて、本発明者らはまた、TNFαが、血管内皮、分化のための補完的マトリックス、および膵島前駆細胞または膵島β細胞それ自体のTNF受容体2に直接的に結合し、それによっておそらく膵臓における再生もまた促進することを実証した。本発明者らはさらに、正常膵島細胞または正常リンパ球のいずれかの表面でのMHCクラスIペプチド複合体発現の導入が、長期的な記憶細胞の量の増加をもたらす、部分的であるが安定な、NODからのT細胞集団の再選択を生じることを示した。MHCクラスIおよび自己ペプチドの再導入は、膵島細胞抗原とのおそらくより少ない刺激を有するが、自己反応性については等価な潜在性を有する細胞の再選択のために重要である（例えば、2000年3月8日に出願された米国特許出願第09/521,064号、および2001年1月23日に出願された米国特許出願第09/768,769号、および2000年9月14日に公開されたPCT国際公開公報第00/53209号を参照されたい。これらの各々は参照として組み入れられる）。さらに、本明細書中に提供されるさらなる研究が、これらの細胞が宿主中で実際に長期間持続することを示す。本発明者らは、宿主に対していかなる免疫抑制をも伴わず、半同種異系MHCクラスI脾細胞起源細胞または脾細胞存在細胞、ならびに脾臓からの膵島に分化した半同種異系細胞が、免疫抑制の必要なく宿主中で長期間持続することを実証する。さらに、任意の不十分に制御された代謝条件の逆転が、再生プロセスおよび確立した疾患の逆転を促進すると思われる。
【００８７】
実施例2
糖尿病NODマウスにおける治療用療法の最適化
CFA、BCG、TNAα、および脾細胞の投与の差次的な効果を調べるために、後期ステージのNODマウス（>15週齢）を4つの処理グループ、すなわち：CFAの1回注射、BCG（4mg/kg）の1回注射、10μg TNFαの1回注射、正常ドナーから得られたF1脾細胞（1×106細胞、IV）の1つにランダムに割り当てた。処理されたNODマウスは2日目、7日目、および14日目に連続して屠殺した（表2）。膵臓組織学の試験は、侵襲性の膵島炎への効果を評価した（表3）。
【００８８】
表2は、2日目でのCFAの単回注射および低用量TNFα（10μg）の1回注射の療法がインビトロでTNFα感受性を有する細胞のすべての亜集団を完全に除去したことを示す。7日目および14日目では、このTNFαの集団は再度明白であった。同時に行ったこれらのコホートの膵臓の組織学により、膵島炎の劇的な減少、および膵島炎に関連する、14日目を超えて続く長引く効果が確認された（表3）。
【００８９】
（表2） 種々のインビボ処理後の、残存するTNFαアポトーシス感受性NOD脾細胞の割合
2005535732.tif 000003
この研究におけるNODマウスは、18週齢の後期前糖尿病の疾患段階にあり、少なくとも1つの200mg/dLよりも高い血糖を有した。種々の免疫調節介入で処理したNODマウスのフローサイトメトリー研究によって、後期アポトーシス性細胞を、処理開始後の示した日数での動物の屠殺後の脾細胞で定量した。これらのフローサイトメトリー研究について、後期アポトーシスは、TNFα（20ng/mL）へのインビトロ曝露の24時間後にアネキシンV+PI+細胞およびアネキシンV+PI-細胞を表す。
【００９０】
（表3）種々のインビボ処理後の、残存する侵襲性膵島炎を有するNOD膵島の割合
2005535732.tif 000004
表3のマウスは表2に示されたのと同じマウスに対応する。
【００９１】
F1脾細胞およびBCGへの応答は、CFAおよびTNFαで見られたものとは著しく異なっており、そして互いにいくぶん異なっていた。F1脾細胞の治療効果はNODリンパ細胞の除去であり、本発明者らは、これは直接的または間接的なメカニズムを通した、病原性未処理細胞を表すと考えている（表2）。TNFα感受性は残存し、かつF1脾細胞の治療的影響は14日目を超えて続いた。組織学は、残存する侵襲性膵島炎を有するNOD膵島の数に対するさほど劇的ではない影響を示した。さらに、F1脾細胞は、TNFαまたはCFAのいずれかに特徴的である膵島炎のより均一な中心の除去の代わりに、膵島あたり侵襲性の膵島炎の「コード（cord）」を除去した（示さず）。
【００９２】
予想と違って、TNFαの既知の誘導物質であるBCGは、組織培養の（未処理の）感受性病原性細胞の除去に対して、それが病原性記憶細胞の除去に対して有したよりもより大きな影響を有した。単回の、低用量のBCGの注射の治療的効果は、14日間の時間経過を超えて急速に減少した（表2）。NOD膵臓の組織学的分析により、膵島炎の部分的除去が確認された（表3）。MHCクラスIおよび自己ペプチドが再導入された場合の最終的な結果と同様に、細胞の組織培養感受性亜集団が除去された。
【００９３】
これらのデータは、NODマウスにおける疾患を「逆転させる」ために2つの部分の介入（すなわち、TNFαおよびF1脾細胞）の使用に関する本発明者らの初期の刊行物におけるデータと一致する。本発明者らのデータは、これらの介入が、識別できる測定可能な影響を、脾臓中の特定のリンパ系細胞集団に生じ得ることを示す。これらの2つの部分の各々が、高められたアポトーシス感受性を有する病原性細胞の異なる亜集団を標的化するようである。重要なことに、培養物およびインビトロのTNFαに応答するT細胞の変化は、減少した侵襲性の膵島炎の膵臓の組織学に対応する。
【００９４】
内因性TNFα放出のその報告された誘導に起因すると当初考えられていたNODマウスにおけるBCGの作用は、優勢的には、欠損性MHCクラスI提示を有する単球/マクロファージの直接的な殺傷による、およびより低い程度では、TNFα感受性を有する記憶細胞の測定可能な負荷の減少による、未処理細胞の選択に対する間接的な影響に起因するように思われる。BCGはマクロファージ/単球に感染することが知られており、このBCGが無毒である場合、マクロファージ/単球の溶解を誘導し、従って、ツベルクリン粒子の継続的な産生の妨害を減少させる。マクロファージ/単球の溶解はTNFを局所的に放出し、感染した細胞は通常、このサイトカインの豊富な細胞質内濃度を含んでいる。NODマウスにおいて、無毒なBCG株は、加速した様式で単球/マクロファージの特定の亜集団の溶解を引き起こす。これらの細胞は、その表面に発現された低いレベルのMHCクラスI-自己ペプチドを伴う、発生的に「未成熟」であるようである。このことは、最も迅速にヒトまたはマウスの自己免疫単球を溶解する株のインビトロ選択に由来する、最も低い毒性を有するBCG亜種が、自己免疫傷害を治療するための最良のBCG株であることを示唆する。さらに、これらのデータは、未処理のT細胞を同定および除去するための次の3つの戦略を示唆する：細胞上の感受性受容体を通したT細胞の直接的細胞死受容体刺激；細胞または複合体を提示する矯正された抗原の導入；自己ペプチドもしくは自己ペプチド/MHCクラスI複合体を用いるか、または抗原提示/プロセシングにおいて最も重大な欠損を有する単球/マクロファージの直接的な死滅を引き起こし、それによって欠損性エジュケーター細胞を除去する、BCG様の薬剤もしくはアジュバントの導入。これらの3つすべての戦略において、十分な抗原提示を有する内因性単球/マクロファージは、元の通常の再選択優性に向けて、T細胞レパートリーを偏らせる。
【００９５】
実施例3
重篤な糖尿病NODマウスにおける通常血糖の回復に対するドナー細胞照射の機能的影響
重篤な高血糖であるNODマウスを最初にCFAで処理してTNFαを誘導し、同時にMHCクラスI分子の機能的複合体および目に見える脾細胞または膵島のいずれかに提示された同種異系ペプチドに曝露した。40日間の処理期間の正常血糖（このアプローチの決定的なパラメーター）が、一時的なアルギン酸カプセル化膵島または腎臓の下に配置された同系膵島移植片のいずれかの移植によって誘導された。グルコース制御の両方の方法が、回復した内因性膵臓機能を試験するために外科的に除去され得る。すべての最初の実験は重篤な高血糖を有する確立されたNOD雌性マウスを処理するために設計され、40日間の厳重な人為的グルコース制御を含んだ。この一時的なグルコース制御の利用は、内因性膵臓の再増殖を十分に可能にし、以前の高血糖性NODコホートの最大78％において正常血糖を維持し、かつ内因性膵臓インスリン分泌を回復した。
【００９６】
NOD疾患逆転に対するメカニズムを分析するために、照射されたドナー細胞ならびにMHCクラスIおよび自己ペプチドを発現する生きている細胞が研究された。これらの実験は、自己抗原についての寛容性の永続的な逆転における、長期的なドナー細胞の生存の役割およびドナー細胞機能（例えば、抗原プロセシング）の役割を試験した。これらの実験において使用されるNOD宿主は、少なくとも7日間、400mg/dlより多い血糖濃度を示した、代表的には20週齢より上の重篤な糖尿病NODマウスであった。疾患のこの後期の段階におけるすべての糖尿病NOD宿主は、疾患の重篤さのために2週間以内に死亡した。アルギン酸カプセル化膵島は40日間腹腔内に移植され、宿主は、CFA単独、または照射したC57BL/6脾細胞の隔週静脈内注射と組み合わせたCFAのいずれかを無作為に受容した。この時点において、C57BL/6脾細胞はNOD宿主に対して半同種異系であるのみであり；脾細胞はH2KbDbであり、かつNODマウスはH2KdDbである。
【００９７】
本発明者らが以前に実証したように、生C57BL/6脾細胞で免疫したNODマウスの新しいコホートは正常血糖の回復を実証した。9匹の新たに処理したNODコホートのうちの7匹が、アルギン酸カプセル化されたC57マウス膵島の外科的除去後に正常血糖のままであった。自己免疫の逆転は永続的であり、7匹のNOD宿主は、それらが屠殺された時点の80日間を超えた観察期間の間、正常血糖のままであった。8匹のさらなるNODマウスを同じ措置で、しかし照射したC57BL/6脾細胞を用いて処理した。8匹すべての場合において、高血糖は、40日間の処理期間の間、グルコースクランプとして働くアルギン酸カプセル化膵島の除去後、2〜7日間以内に戻った。生C57脾細胞を受容したNODマウスの膵臓は、9匹のマウスのうち7匹において豊富な膵島を示した。活性自己免疫の徴候である、侵襲性の膵島リンパ系浸潤の徴候は存在しなかった。膵島が存在する場合、10％未満の膵島周辺のリンパ系細胞が膵島を富化した。驚くべきことに、高血糖のままであり、かつ照射されたドナーの脾細胞を一貫して受容したNODマウスの膵臓は、膵臓における膵島を示したが、連続的な膵臓切片によって評価されるような全体の存在度の減少を伴った。これらの膵臓における膵島には、相当の大きさの周辺の膵島の浸潤を伴ったが、膵島構造それ自体中にはリンパ球を欠いた。これは、侵襲性膵島炎といわれる組織学的パターンである。例えば、生脾細胞で処理され、回復した正常血糖を有するNODマウスからの膵臓は、各々連続的な組織学的切片を有する約6〜8膵島を含んだのに対して、照射した脾細胞で処理され、かつ永続的な高血糖を有するNODマウスからの膵臓は、連続的な組織学的切片あたり4〜6膵島を含んだ。照射した脾細胞および生脾細胞の両方が、侵襲性かつ破壊的な膵島炎の糖尿病宿主を取り除くように見えた。しかし、膵島の存在度の増加および回復したインスリン分泌は、生脾細胞で処理したNODコホートにおいてのみ観察された。
【００９８】
MHCクラスIおよび自己ペプチドを発現する照射されたドナー細胞の導入後、十分なインスリン分泌を伴わない破壊的な膵島炎の見かけの組織学的除去の有意さを評価する際に、さらなる糖尿病NODマウスを処理した。これらの実験のために、本発明者らは、ドナーのMHCクラスIおよび自己ペプチド処理の40日間の処理期間を使用したが、人工的に回復した正常血糖の「グルコースクランプ期間」を40日間から120日間に延長した。この実験の理論的根拠は、より非効率的な照射されたドナー脾細胞の処理に、より完全な宿主膵臓救出および膵島の再生のための機会を与えることであった。25匹の重篤な糖尿病NODマウスのコホートを、生きているかまたは照射した静脈内MHCクラスIおよび自己ペプチド発現細胞の同じ処理プロトコールに対して、120日間移植されていたグルコースクランプと共に、40日間ランダムに割り振った。両方のグループのすべての処理されたNODコホートは、クランプ除去後の内因性膵臓機能について延長された観察時間に従った。アルギン酸カプセル化膵島を含むグルコースクランプの移植40日後の失敗率は自己免疫宿主において50％を上回るので、これらの糖尿病宿主のために使用されるグルコースクランプは腎臓被膜の下に移植された。本発明者は、移植120日後、腎摘出によってこのグルコースクランプを除去した。
【００９９】
120日に延長されたグルコースクランプの配置は、照射されたMHCクラスIおよび自己ペプチド発現細胞の、以前には代謝的に有効でなかった治療と組み合わせた場合に著しく有益な効果を生じ、続いて40日目の初期の評価を行った。機能的には、生きているMHCクラスIおよび自己ペプチド発現脾細胞を受容した12匹のNOD宿主のうちの11匹が、120日のグルコースクランプの除去後、180日〜250日を超えた観察時間の間、正常血糖のままであり続けた。照射されたMHCクラスIおよびペプチド発現細胞を受容した13匹のNODマウスのうちの11匹が、同様の観察時間、正常血糖のままであった。生きているか、または照射されたMHCクラスIおよびペプチド発現細胞のいずれかを受容する両方のNOD処理グループは、膵臓の組織学的切片を使用してアッセイされたように、生理学的に等価な膵島密度を有した。これらの2つの後者のグループのすべてのコホートにおける膵島を、回復した正常血糖後180〜250日間に、逆転した疾患の長期的再調査後に試験した。照射されたドナーのリンパ系注射後に正常血糖を有した以前に糖尿病であったNODは、健常かつ豊富な膵島を有したが、これらは、印象的な周辺のリンパ球浸潤を一貫して伴った。この組織学的な特徴は、生きているMHCクラスIおよび自己ペプチドのドナー細胞を受容した、処理されたNODコホートには存在しなかった。それゆえに、照射されたMHCクラスIおよび自己ペプチドを発現するドナー細胞は、インスリン分泌に起因する長期的な正常血糖を回復する際には有効であったが、目に見える非進行性の周辺の膵島炎が、膵臓の長期的再調査の間に明白であった。組織学的な差異に関わらず、両方の実験的なNOD処理グループ（25すべてのコホート）は侵襲性の膵島炎を含まない膵島を有し、活性な疾患の非存在を確証した。
【０１００】
本発明者らはまた、剖検の時点での膵臓、血液、および脾細胞におけるインスリン分泌β細胞の実際の組成を同定して、ドナー細胞の、長期的キメラ現象または膵臓β細胞への転換に対する寄与を決定するためにこれらのコホートを分析した。生細胞と照射された細胞に対して比較する最初の実験は、生細胞が照射された細胞よりもいくつか利点を有したことを示唆した。第1に、生細胞は、照射された細胞よりもはるかにより迅速に糖尿病を矯正する。この結果は、膵臓の再生能力がおそらくより明らかではなかった長期的な糖尿病の場合において、β細胞に転換する能力を有する生細胞の導入が利点であり得ることを示唆した。他方、膵島に再生する能力を有しない照射された細胞は、より大きな安全性のために、新しい糖尿病の発生において利点を有し得る。また、生細胞で処理されたマウスにおける膵島は、死滅した細胞で処理されたものに対して、以下の点で組織学に異なって見えた。生細胞で処理されたマウスは、多くの場合において非常に印象的な周辺の膵島炎を有した照射された細胞で処理されたマウスよりも、周辺の膵島炎が有意により少なかった。しかし、本発明者らは、照射された細胞を用いる処理後に周辺の膵島炎が最終的に活性な疾患に進行すると考える理由はない。
【０１０１】
ドナー起源である再生組織に対して少なくとも1つまたは複数の利点が存在し得る。多くの処理されたNODマウスにおいて、同系膵島移植が腎臓被膜の下で行われた。多くの場合において、完全な疾患の逆転後でさえ、同系移植片は、明白な膵島周辺の膵島炎を示し、対照的に、膵臓中で再生された半同種異系膵島は、ほぼ完全に周辺の膵島炎を含まなかった。これらのデータは、同系膵島それ自体が、完全に再訓練されたリンパ系の存在下でさえ、異常な免疫応答を促進するいくつかのなお未同定の欠損を有することを示唆する。
【０１０２】
実施例4
回復したT細胞訓練のための細胞へのMHCクラスI複合体の再導入
処理結果に対する、一致しているかまたはミスマッチのMHCクラスIペプチド複合体を発現する細胞の導入の組織学的影響もまた分析した。本明細書中に記載されるように、TNFα誘導物質（例えば、CFA）、および、実質細胞またはリンパ細胞のいずれかでMHCクラスIペプチド複合体を発現する細胞を用いる処理は、いくつかの重篤な糖尿病NODマウスにおいて疾患の逆転を生じた。対照的に、MHCクラスIIペプチド複合体を発現する細胞を用いる免疫は必須でなかった。
【０１０３】
本発明者らは、H2Kb対立遺伝子およびH2Db対立遺伝子（一致するMHCクラスI対立遺伝子およびミスマッチのMHCクラスI対立遺伝子）および自己ペプチド複合体を有するC57BL/6株からのMHCクラスIを発現する膵島または脾細胞の治療的有効性を実証した。本発明者らは、治療的効果が一致するかまたはミスマッチのMHCクラスIおよびペプチド分子に制限されるか、あるいはこの効果が安定な自己免疫疾患の逆転のための対立遺伝子特異性の要件を有するか否かを調べた。NODマウスは、H2Kd対立遺伝子およびH2Db対立遺伝子を有する2つの異なるMHCクラスI遺伝子を有し、NODマウスリンパ系細胞は、正常な密度のいずれかの自己ペプチドMHCクラスI構造を発現することに失敗する。重篤な糖尿病NODマウスを、アルギン酸中でカプセル化した腹腔内に配置したグルコースクランプと、または腎臓の下に移植された同系膵島と組み合わせてCFAで処理した。糖尿病NOD宿主は、線維芽細胞（例えば、H-2 MHC組換えドナー細胞株からの線維芽細胞）上で完全にNOD適合性MHCクラスI複合体を発現する実質細胞株、または線維芽細胞上で完全にNOD不適合性MHCクラスI複合体を発現する実質細胞株を用いて、隔週で同時に免疫を受容した。すべてのコホートを、移植開始後約40〜45日で、膵臓の組織学的評価のために屠殺した。線維芽細胞株は腫瘍細胞株を意味するので、これらの実験において使用された細胞は、静脈内免疫または注射の前に照射した。
【０１０４】
内因性膵島における組織学的な結果は、MHCクラスIの完全に一致するかまたはミスマッチのペプチド複合体を受容するNODコホートにおいて異なった。MHCクラスIおよび自己ペプチドにミスマッチの細胞（H2KkDk）をランダムに受容させたNODコホートは、5匹のNODマウスの5匹において、大量の侵襲性のリンパ系浸潤を伴う膵島を有する。膵臓の全体にわたって侵襲性の膵島炎が存在しただけでなく、コホートのいずれもが、膵島炎を伴わない膵島構造、または独占的に周辺のリンパ系蓄積を伴う膵島を示さなかった。一致するドナー線維芽細胞H2KdおよびH2DdクラスIおよび自己ペプチド構造の静脈内注射で処理された糖尿病NODコホートを用いて得られた組織学的結果は、劇的に異なっていた。MHCクラスI一致細胞を用いる処理は、14のNODコホートのうちの14すべてにおいて、膵島における侵襲性の膵島炎を除去した；14の処理したコホートのうちの2つは、いかなる侵襲性または周辺の膵島炎をも全体的に欠いている膵島を有し、14の処理したコホートのうちの12は、穏やかなものから中程度のものまでの周辺の浸潤を伴う膵島を有した。
【０１０５】
上記に示されるように、照射されたドナー細胞の使用は、しばしば膵島の再出現を生じるが、一貫して、細胞の供給源に関わらずこれらの膵島には、膵島構造に隣接するが侵襲性でない周辺のリンパ系浸潤が伴った。侵襲性の膵島炎によって規定される活性な膵島を指向する自己免疫を組織学的に除去する、一致するH2KdDb線維芽細胞の能力は、同種異系H2Kb遺伝子座の非特異的効果を有するC57BL/6発現細胞の治療効果を確認したが、おそらく同様に、一致するH2Db遺伝子座によって、宿主の特異的T細胞受容体または細胞表面受容体（例えば、CD3）の関与を通して、MHCクラスI再導入から恩恵を受けた。それゆえに、治療の標的はおそらく宿主T細胞である。さらに、BALB/CおよびC57の交雑に由来する照射されていないF1脾細胞（すなわち、CB6F1/J細胞）は、CFAの単回用量を受容する以前に糖尿病であったNOD宿主の約75〜80％において、同様に長期の正常血糖を回復した。照射された、ミスマッチのMHCクラスIおよび自己ペプチド発現細胞は、確立された糖尿病を逆転させる際に均一に効果がなかった。それゆえに、確立された自己免疫NODコホートに投与されるこの細胞治療は以下を有した：（a）単一のMHCクラスI対立遺伝子の一致のみを用いて治療的効果が達成され得ることの実証；（b）同種異系MHCクラスIおよび自己ペプチド構造の存在下または非存在下で細胞が投与され得ることの実証；（c）糖尿病NOD宿主に注射される細胞は、生きているかまたは照射されたドナー細胞であり得ることの実証；（d）細胞は実質細胞またはリンパ系起源であり得ることの実証；ならびに（e）線維芽細胞、MHCクラスIIネガティブ細胞型、およびリンパ球が等しい効力を示したことによる、細胞効果が、MHCクラスIIおよび自己ペプチド複合体を発現する、ドナーMHCクラスIドナー細胞に非依存的であり得るという実証。
【０１０６】
本発明者らはまた、膵島を指向する自己反応性の逆転のために、MHCクラスIおよび自己ペプチドの別々の治療的効果、およびCFA/TNFαの治療的効果の規定のために、細胞傷害性Tリンパ球アッセイを実行した。上記に詳述したように、確立された自己免疫を逆転するための有効な治療には、MHCクラスIおよび自己ペプチドの両方が一致した細胞の導入、およびCFAまたは別のTNFα誘導物質の投与が含まれた。ここで、導入されたMHCクラスIおよび自己ペプチド複合体が、自己反応性に対する潜在能力を有する不十分に訓練された未処理の細胞を再選択することが提案された。確かに、末梢の寛容性ホメオスタシスは、MHCクラスIおよび自己ペプチド複合体によって維持されるようであり、そしてこれは、未処理の細胞の存在度または未刺激のT細胞の存在度（前糖尿病NODマウスまたは高血糖の発症後の未処理のNODマウスにおいて見られる特徴）を抑制する。対照的に、本明細書中に提示されたデータは、自己反応性の記憶T細胞または抗原刺激された細胞への曝露を有する細胞が、必須の内因性TNFα誘導におそらく起因してCFAに選択的に感受性であり、かつNFκBシグナル伝達の欠損に起因して引き続くアポトーシスに感受性であることを示す。
【０１０７】
これらの観察が単に細胞数の変化によって説明することができなかったことを示すために、本発明者らは、CD45、CD62L、またはCD95の全体の存在度を観察した。記憶における未処理のCD45RB高密度細胞（CD45高）の特異的な機能的役割、および自己反応性におけるCD45RB低密度（CD45RB低）NOD T細胞の役割を、膵島標的に対する細胞傷害性Tアッセイにおいてインビトロで試験した。本発明者らは未処理細胞としてCD45高、および記憶細胞としてCD45RB低を参照するが、これらの細胞は未処理細胞対記憶細胞を表すのではなく、しかしむしろ、抗原への曝露に依存する活性化の異なる段階における細胞を表す。概略すれば、本発明者らは、大部分、刺激された細胞または刺激されていない細胞としてこれらの細胞を参照するが、しかし場合により、本発明者らはこれらの細胞を未処理細胞または記憶細胞としても参照する。脾細胞ドナー（CTLの供給源）は、未処理のNOD宿主、CFAのみで処理したNOD宿主、ならびにMHCクラスIおよび自己ペプチドならびにCFAの両方を用いて処理したNOD宿主（長期の疾患の逆転を伴う）であった。8週齢のNOD雌性ドナーからの分散したNOD膵島をレスポンダー細胞として使用した。本発明者らはインスリン酵素ELISAを使用して、標的からのインスリン放出を有する同系膵島のT細胞溶解を検出し、ならびに分光光度計によるインスリンの比色定量を行った。受容体T細胞をこのアッセイ法の前に2つのプールにソートした：未刺激のT細胞をCD3ポジティブ、CD45RB高と規定し、および刺激されたT細胞をCD3ポジティブ、CD45RB低と規定した。多くの受容体対標的細胞比を試験した。これらのデータに基づいて、37℃での24時間培養の同時インキュベーションアッセイにおける最適化されたT細胞エフェクター対膵島標的の比が得られた。比色定量の読み取りならびに直接的なインスリンの読み取りを使用して、本発明者らは、生β細胞から放出されたインスリンの相対量を決定し、およびELISAアッセイを使用して、本発明者らは、培養上清中に放出されたインスリンの実際の量を決定した。これらの結果は、糖尿病NOD由来のCD3細胞が、記憶型または刺激型または未刺激型のいずれかで、同時培養の24時間後に分散した膵島細胞を同等に溶解したことを示した。
【０１０８】
比色定量アッセイおよび放出されたインスリンの実際の定量の両方は、同系膵島細胞に対する自己反応性を示す場合の糖尿病NOD細胞集団の病原性を確証した。刺激されたCD45RB低T細胞の病原性は選択的に変化され得る。確かに、アッセイ法の25日前にCFA単独で処理されたNODコホートからの脾細胞は、同系の分散された膵島細胞を溶解する能力を有する刺激された細胞集団のみの自己反応性の選択的除去を示した。CFA処理されたNODコホートは、未処理のNOD脾細胞ドナーにおいて見られるのと等価な膵島自己反応性を有する未刺激のCD45RB高T細胞集団を維持した。CFA治療単独が、その得られるTNFαの内因性誘導を用いて、糖尿病NODマウスにおいて存在および後期段階の自己免疫疾患の除去に成功しなかったことを考えると、CTLの結果は、自己反応性細胞の2つの同定可能な亜集団が疾患の逆転のためにインビボで操作される必要があり得るという考えと一致した。著しい対照が、同系で一致したMHCクラスI自己ペプチド発現細胞およびCFAの両方を受容した首尾よく処理されたNODコホートから得られた、未刺激のCD45RB高細胞および刺激されたCD45RB低細胞の分離された亜集団において見られる。これらのマウスは、同系膵島に指向される自己反応性を有する、刺激された自己反応性T細胞および未刺激の自己反応性T細胞の両方の、完全かつ安定な長期的除去を示す。
【０１０９】
まとめると、CTLアッセイの結果は、糖尿病NOD宿主において、CD45RB高を有する同定可能な未刺激のT細胞およびCD45RB低を発現する刺激されたT細胞は、膵島細胞傷害性または膵島細胞傷害性の潜在能力を有することを示す。自己反応性T細胞記憶亜集団は、CFA単独を用いて選択的に除去されたのに対して、自己反応性の刺激された亜集団および未刺激の亜集団の両方が、同系MHCクラスIおよび自己ペプチドならびにCFAを用いて除去された。自己反応性の潜在能力を有する刺激された細胞および未刺激の細胞の両方の存在のために、治療の両方の局面が、存在する自己反応性の除去のために必要とされ得る。従って、選択処理は、別々の細胞集団を標的化および除去するために設計され得る。確かに、この仮説は、残存した自己反応性NOD細胞集団が糖尿病ドナー脾細胞のTNFα処理を変化させる（これはおそらく、これらの細胞がこれらの表現型を変化させ、および膵島曝露後にTNFα感受性になる能力のためである）ことを示す、本発明者らのより初期の養子移入データによって支持された。
【０１１０】
実施例5
MHCクラスIおよび提示された自己ペプチドへの暴露によるT細胞再訓練
確立されたNOD自己免疫の逆転がT細胞のMHCクラスI訓練に関連することを実証するために、本発明者らは、多様な治療の前後でNODマウスをモニタリングし、回復したCD8 T細胞選択に向かう流れを測定した。図2A〜2Cに図示されるように、未処理のマウスまたはCFAのみで処理したNODマウスは、高レベルのCD62L、CD45RB高、およびCD95ポジティブなCD8細胞を有する。CFAおよびC57BL/6脾細胞またはクラスII-/-脾細胞を用いる処理は、CD62LのT細胞発現レベルを減少させ、CD45RB高およびCD95 CD8細胞のレベルを部分的に正常化した（図2A〜2C）。重要なことには、見かけのT細胞の訓練/選択の正常化は、CFA治療単独で処理したNODマウスにおいては観察されなかった（図2A〜2C）。記憶T細胞の通常の数の確立は、糖尿病NODがCFAおよびC57BL/6 β2m-/-TAP1-/-脾細胞（ペプチドが満ちた表面クラスI構造が減少している細胞株）で処理された場合には観察されなかった（図2A〜2C）。長期記憶は、自己主要組織適合性複合体分子の表面発現を必要とし、導入されたクラスI発現脾細胞によるこのポジティブ選択は、正常に向かうT細胞選択を回復する。
【０１１１】
以前に公開されたデータは、CD8遺伝子発現が適切な末梢性のMHCクラスI提示によって維持されるという概念を支持する。クラスI訓練が中断される場合、0.4％プロナーゼを用いるCD8細胞の処理、続く48時間の培養は、CD8レベルの低い表面再発現を生じる（Pestano、Science 284:1184〜1191, 1999）。確かに、C57BL/6脾細胞は、インビトロプロナーゼ処理後にCD8レベルを完全に回復した：CD8密度の変化はプロナーゼ後には観察されなかった（図3Aおよび3B）。対照的に、プロナーゼ処理後のNOD脾細胞は、CD8表面レベルを十分に再発現しなかった（図3Aおよび3B）。この結果は、NODマウスにおける中断されたMHCクラスI提示の以前に公開された研究を確証する。糖尿病がインビボでC57BL/6またはC57BL/6クラスII-/-脾細胞およびCFAを用いて首尾よく処理されたNODマウスに由来する脾細胞は、インビトロでのプロナーゼ処理後、CD8再合成を改善した。対照的に、CFAのみ用いて、またはCFAおよびクラスI欠損性C57BL/6脾細胞を用いて処理したNODマウスは、未処理のNODマウスに類似したCD8再合成を伴う持続した問題を有した。このことは、MHCクラスI構造によるT細胞選択の中断の持続を確証する。同時に実行した対照実験は、多様な処理グループのNODマウスからの脾細胞およびC57BL/6マウスからの脾細胞が、比較し得る速度でCD3表面タンパク質を再合成することを確証した（図3Aおよび3B）。それゆえに、誤ったMHCクラスI提示による中断されたCD8訓練の4つの確立されたパラメーター（CD45RB高、CD62L、cD95、およびCD8再合成）は、疾患の逆転を有するNODマウスが、T細胞選択のCD8表現型の矯正を部分的にしなくてはならないことを確証する。
【０１１２】
実施例6
腎臓の下に移植された膵島および内因性の膵島の両方により示される、両方の部位での等価なインサイチュー膵島再生
この研究において、本発明者らは、有効な治療が、照射されたかまたは生きているMHCクラスI一致細胞と組み合わせた、CFAのTNFα誘導を利用できることを実証した。この組み合わせは、78％を上回る処理されたNOD宿主の糖尿病を治癒した。さらに、本発明者らは、機能的膵臓の回復はMHCクラスI自己ペプチドを発現する照射された細胞を受容したコホートの膵臓においてはより遅かったが、長期的かつ安定な回復は120日を超える追跡調査では等しい頻度で起こることを以下に実証する。再増殖した内因性膵島と比較した、移植された膵島の疾患に対する長期的な抵抗性を評価するために、糖尿病NODコホートのさらなるセットに、グルコースクランプとして働く同系膵島移植と組み合わせた、脾細胞を発現する生きているかまたは死んでいるMHCクラスIおよびペプチドを受容させた。腎臓被膜の下のこの異所性膵島移植片は、膵臓において見られるものと比較した、疾患の再発および異所性膵島再生を本発明者らが評価することを可能にした。蛍光免疫化学を使用して、膵臓の膵島を腎臓の下に配置された膵島と比較した。これらの実験において、本発明者らは、インスリンに対する染色およびBrdUの組み合わせを利用して、2つの部位で増殖している膵島の重量を定量し、そして移植された膵島および内因性の膵臓の膵島の、再発疾患に対する抵抗性のあり得る違いを比較した。本発明者らはまた、2つの首尾よい治療のバージョンにおける2つの部位での膵島細胞および/またはそれらの前駆体の潜在的な増殖を定量することができる。それらの局所的に隣接する膵臓前駆細胞を伴わない移植された膵島は最終段階の細胞であるという仮定が存在するので、これらの実験は、長期的な膵島の生存が独占的に膵臓に特徴であるという仮説を試験した。これらの長期的なNODコホートは、重篤な糖尿病NODマウスと比較された。このマウスは実験の8日前に腎臓の下に同系膵島移植を受けたが、所望のCFAおよびMHCクラスIおよび自己ペプチドを受けなかった。最近糖尿病になったマウスの腎臓の下および膵臓の膵島のヘマトキシリンおよびエオシンの染色は、印象的かつ大きなリンパ系浸潤を示した。ほぼ全体的な新たに移植されたNOD膵島の消失、および同様に侵襲性のリンパ系による膵臓の膵島の消失が見られた。さらに、インスリンポジティブ細胞についての腎臓部位および膵臓部位の両方の対応する検査は、ほぼ全体的なネガティブな結果を示した。両方の部位でのBrdUによって評価された増殖している細胞の染色はまた、膵臓における膵島の欠如、およびいかなる増殖の欠如をも示した。このことは、侵襲性かつ自己攻撃性の膵島炎が再発したこと、あるいは、進行する疾患は局所的なリンパ系増殖には起因しておらず、しかしむしろ膵島部位へのこれらの自己攻撃性細胞の移動に起因することを示唆した。換言すれば、BrdUポジティブ細胞は活性な拒絶応答においてはより高度にポジティブではなかった。このことは活性細胞がその部位に移動したことを示唆する。
【０１１３】
上記に示したように、各膵臓切片は、照射したMHCクラスIおよび自己ペプチド発現細胞を受容したNOD宿主が健常な膵臓および印象的な周辺のリンパ系浸潤で囲まれている腎臓の下の膵島細胞を有することを示した。これらのリンパ系蓄積は、長期間の追跡調査においてさえ浸潤性の膵島パターンに進行せず、これらは長期間の間に大きくなって現れることもない。膵島の免疫細胞化学は、首尾よく処理されたNODマウスが腎臓の下および膵臓にインスリンポジティブ細胞を有することを示す。さらに、長期間矯正されたNOD宿主の膵臓および腎臓の下の部位の両方の膵島の塊の中で、頻繁ではないが増殖しているインスリンポジティブ細胞が、インスリンおよびBrdUを用いた同時染色を明確に示す黄色の細胞によって実証されるように観察された。本発明者らは、インスリンおよびBrdUを同時染色するために2種の異なる色素（すなわち、それぞれ赤色および緑色）を使用したため、同時染色細胞は黄色である。さらに、完全に分化した膵島β細胞は増殖せず、代わりに前駆細胞から生成するいう報告された考えに基づくと、BradUとのインスリン同時染色（すなわち、免疫細胞化学によって見られる黄色）は、おそらく増殖相にある前駆細胞を表す。これらの結果は、長期的内因性および異所性腎臓下の膵島の生存は、根底にある自己免疫が逆転される後で可能であることを実証する。重要なことに、首尾よい疾患の逆転の後のこの非常に遅い段階における本発明者らの分析の観点から、BrdUおよびインスリンの同時染色によって規定される膵島の再生は起こり得るが、膵臓および腎臓の下に移植された同系膵島においては低い頻度である。
【０１１４】
同様の免疫組織化学技術を使用して、本発明者らは長期間矯正されたコホートからの膵臓も調べ、膵臓におけるインスリン分泌β細胞が内因性細胞からの膵臓の再生にのみ起因したのか否か、または再生された膵臓の膵島はまたドナーの供給源（例えば、注射された脾細胞）から生じ得たのか否かを決定した。これらの実験において、本発明者らは、重篤な高血糖の発症後に、（i）CFA、および40日間隔週の注射で投与された雄性ドナーからの新鮮なF1脾細胞を用いて処理し、（ii）120日間、腎臓の下の同系膵島移植片を移植し、かつ（iii）移植片が除去された際に、長期間正常血糖を保持した、以前に糖尿病であったNODマウスコホートを使用した。これらのマウスは、安定な正常血糖の種々の時間間隔で（通常60日間より長い）、引き続き屠殺された。これらの動物の膵臓は、これらが40日間の治療期間の間の隔週で投与された、照射された雄性ドナー脾細胞を受容した以外は、同じ処理措置を受けた動物の膵臓と比較された。次いで、これらの細胞を2色の免疫蛍光を用いて染色し、ここでインスリンを赤色蛍光で標識し、およびY染色体マーカーを緑色マーカーで標識した。すべての脾細胞ドナーは雄性起源であり、それゆえにこの蛍光アッセイを使用して、膵臓におけるインスリンポジティブ細胞のいずれかが雄性Y染色体起源であったか否かを決定した。本発明者らはさらに、膵島において見られ得るY染色体が膵島起源であったこと、およびドナーリンパ系起源でなかったことを証明するためにインスリン同時染色を実行した（図1）。黄色細胞は、単一のポジティブ細胞中でのインスリンの同時染色およびY染色体マーカーを示した：黄色細胞は生きているF1脾細胞を受容したコホートにおいてのみ見られ、照査されたドナー幹細胞を受容したコホートの膵島においては見られなかった。
【０１１５】
さらに、Y染色体染色を有するドナー起源の二重ポジティブ（黄色）膵島細胞は膵臓の内分泌腺組織においてのみ見られ、外分泌腺組織においては見られなかった。このことは、再生が損傷した標的組織においてのみ起こったことを示唆する。さらに、照射された細胞を受容した動物において、緑色ポジティブ細胞（すなわち、Y染色体含有細胞）は、膵臓のインスリン分泌細胞または膵臓の外分泌腺組織のいずれにおいても見られなかった。さらに、照射された細胞を受容したコホートはまた、膵臓の外分泌腺組織または内分泌腺組織において黄色細胞を発現しなかった。それゆえにこのことは、Y染色体ポジティブ細胞がそれらの治療措置の一部として照射された細胞を受容した動物において存在しなかったことを確証した。
【０１１６】
ドナー起源の細胞を含む膵島の組織学的分析は、全体の膵島がドナー起源であった場合もあり、かつ膵島の末梢のβ細胞が大部分ドナー起源であった場合もあることを示した。全体として、代表的な膵臓において、膵臓の全体の膵島集団の30％〜50％までがドナー起源と見られ、このことは、これが血液の膵島起源への分化の偶発的現象ではなく、実際は全く劇的な知見であったことを示唆する。これらすべての免疫組織化学データは、通常本来の膵島移植後または本来の脾細胞注射後約120日に決定されるような、長期の正常血糖を有するコホートに由来した。
【０１１７】
膵島の再生のためにNODマウスで実行した実験は、本発明の方法のために有益である転写因子の数、および器官/組織の再生の徴候であるタンパク質発現パターンの数を明らかにした。NODマウスは、活発な膵島再生の部位において、VEGF発現の増加、Flk-1発現の増加、および局所的高レベルのプロテアソーム機能（高レベルのLMP-2およびINFγを含む）を有する。再生プロセスを加速するために、TNFα、TNFRアゴニスト、またはγインターフェロンのような薬剤が再生の開始の前に宿主に投与され得る。TNFα発現、IL-1B発現、HAT、NF-κB、AP-2、EGF-1、Sp1、AP-1、GATA、PECAM-1、アクチベータータンパク質-2、CTリッチSp1結合活性、PDGF-A、PDGF-B、単球化学誘因タンパク質-1、TF、Ets1、SCL/Tal-1、FGF、HATs、P/CAF、PDGF、CBP/p300、およびHIF-2-α（HRF、EPAS、HLF）を誘導するサイトカインの投与もまた、膵島再生の加速のために有用であり得る。特定の場合において、膵島再生はVEGF、VEGF断片、FGF、IGF-1の投与によって、またはBV内皮分化もしくは組織再増殖によって補助され得る。
【０１１８】
他の場合において、1種もしくは複数種の細胞死受容体（例えば、表5に列挙されている細胞死受容体）がドナー細胞上で不活性化されるか、または1種もしくは複数種の細胞死を媒介する細胞内シグナル伝達タンパク質が不活性化されて、移植された細胞の死を防止する。例えば、FLIPをFas/FasL発現をダウンレギュレートするために使用してもよい。他の態様において、IL2の細胞外阻害または減少（例えば、化学物質または抗体による阻害）がFLIPをアップレギュレートし、これが次にFASをダウンレギュレートする。他の態様において、ドナー細胞は、IL2Rへの化学物質の結合（例えば、非溶解性抗体断片）のようなIL2Rの遮断を有し、IL2からIL2Rへの結合、および従ってFASのIL2媒介アップレギュレーションを阻害する。他の態様において、FAS活性化のための細胞内経路の1つまたは複数のメンバーが移動の前にドナー細胞中で阻害される。例としては、cFOS、cJAN、PKC、Lck、Zap70、MAPK、Itk（IL-2誘導性T細胞キナーゼ）、およびJNKのような転写因子の翻訳阻害が挙げられる。特定の態様において、転写因子の転写および翻訳は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して、またはRNA干渉（RNAi）によって一時的に阻害される。
【０１１９】
膵島再生の促進は、多能性細胞と共にまたは多能性細胞を伴わずに投与する、1種または複数の薬剤を使用して達成することができる。膵島再生の進行は、薬剤の投与後、転写の誘導または抑制に関するプローブのRT-PCR分析を使用してモニタリングすることができる。
【０１２０】
実施例7
血液中にもまた存在するドナー由来細胞
膵臓における、膵島に転換するドナー起源のF1細胞の本発明者らの劇的な知見のために、本発明者らは、血液および脾細胞もまたドナー起源であったか否かを見るためこれらのコホート由来の血液および脾細胞の両方も連続して試験した。この長期の記述の約8つのコホートを、末梢血中のKbポジティブリンパ細胞の存在について試験した；屠殺の時点での脾細胞もまた試験した。上記に注記されるように、Kb細胞はB6起源でなくてはならない。なぜなら、NODマウスがKd起源であるからである。本発明者らは、フローサイトメトリー分析を使用して、これらのコホートからの末梢血リンパ球を分析し、および末梢血中で、12.6％、8.3％、10％、0.9％、4.4％、および5.8％のリンパ球がドナー起源であったことを見い出した。対照的に、照射された細胞を受容したコホートは、ここでは染色ｈ内因性染色（すなわち、バックグラウンド染色）のみを表し、ドナー細胞起源の2.9％のリンパ球を有した。従って、これらのコホートの多くが、末梢血中にドナー起源のリンパ球の割合を有し、これは有意にバックグラウンドよりも上であり、そして、2つの異なる遺伝起源の血液細胞および2つの別個の遺伝起源の膵臓細胞の長期的な共存を有した。
【０１２１】
免疫抑制せずにドナー由来細胞および内因性細胞のこの共存をより良好に規定するために、皮膚移植もまた、B6ドナーからのこれらの長期的コホート上で実行した。本発明者らは、血液キメラ現象が存在し、かつ現在膵臓のキメラ現象が存在したので、皮膚移植は長期間生存すると推測した。本発明者らが驚いたことには、B6コホートからの皮膚移植物の生存は、安定な血液キメラ現象および膵島のキメラ現象を保持するコホートにおいて長続しなかったか、または目に見えて長続きしなかった。このことは、この種のキメラ現象が、全身照射および引き続く骨髄再構築から生じるキメラ現象と別個のものであることを示す。
【０１２２】
それにも関わらず、本明細書中に記載される方法は、免疫抑制の必要なく細胞を移植するための顕著な方法を提供する。本発明の前の移植分野における標準的な知見の観点から、キメラである（本質的に異なるMHC遺伝子を有するドナー雄性起源であり、かつ膵島に著しく転換する）だけではなく、半同種異系でもあるドナー細胞が拒絶されることが予測される。なぜなら、宿主はCFAまたはTNFαを受容したが、その宿主は免疫抑制処理を受けていなかったからである。しかし、本発明者らの結果によって示されるように、本発明者らは、長期のキメラ現象を維持することができた。様々な意味において、処理の終了後180日を超えて持続し得る安定なキメラ現象は妊娠に類似している。ここでは胎児由来F1細胞は、胎児が除去された後長期間、母の中で長期間生存し得る。
【０１２３】
実施例8
GFP C57BL/6マウスにおける器官再生
上記に記述されたように、確立された糖尿病を有するマウス（例えば、NODマウス）を使用して本明細書中に記載されたデータは、膵臓において膵島細胞を再増殖させる能力を実証する。実験結果は優秀でありかつ移植を達成するための強固かつ持続した能力を実証する。これらの結果を再現することを試みるため、およびこの顕著な減少が起こることを可能にするパラメーターを決定するために、本発明者らは、NODマウスに、ドナー血液細胞からのその膵島を再増殖させることを可能にするパラメーターを規定するための試験系を設定した。この試験モデルは、グリーン蛍光タンパク質（GFP）をすべての組織において発現するGFP BL/6（B6）マウスからの細胞を、B6コホートへの導入のためのドナー細胞として使用した。最初に、本発明者らは正常血糖宿主に注射されたGFP B6脾細胞を使用した。次いで、本発明者らは、種々の間隔で、膵臓、肺、および血液のキメラ現象についてこれらの宿主を試験した。90日後、ドナー起源のキメラ現象は見られなかった。これらの知見に基づいて、本発明者らは、宿主の膵臓が傷害を有する必要がある（例えば、GFPポジティブB6ドナーリンパ球細胞が膵臓を標的化し、かつまたそれを再生することを可能にするストレプトゾトシンの同時投与）という可能性を試験することを決定した。それゆえに、フローサイトメトリーによって得られた脾細胞および骨髄細胞（ヘキスト33342/SPポジティブ細胞）からのGFPポジティブB6細胞、ならびに肝細胞起源の細胞を、5×105〜5×107細胞の用量で40日間にわたって投与し、次いでコホートを40〜195日間後に、目からの出血または屠殺とそれに続く脾細胞の試験によって調べた。
【０１２４】
これらの実験において、膵臓への傷害が存在するが、宿主動物における長期的なキメラ現象の持続はほとんどなかった。時折、GFP起源の膵臓ポジティブ細胞が観察されたが、このデータは大部分ネガティブであった。このことは、本発明者らがNODマウスにおいても同じように成功した実験を正確に再現したものではないことを示唆する。この実験の失敗またはNODマウスにおける実験の成功についての1つの潜在的な理由は、本発明者らは膵島に傷害を誘導したが、これらの動物は重篤に高血糖であったことである。本発明者らの以前のデータに基づいて、重篤な高血糖は再生を妨害する。
【０１２５】
重篤な高血糖が膵臓の再生を妨害したか否かを決定するために、本発明者らは、ストレプトゾトシン誘導された損傷および腎臓下（subrenal）の膵島を伴うグルコースクランプを使用して実験を反復し、次いでGFPポジティブB6細胞ドナーからのドナー脾細胞またはドナー骨髄を使用した。この処理に対する応答において、キメラ現象はなお部分的で長期的ではなく、かつ膵島組織の顕著な再生を表さなかった。
【０１２６】
本発明者らはさらに、別のセットのB6コホートにストレプトゾトシンを投与すること、腎臓の下に移植された同系膵島を有するグルコースクランプを誘導すること、および、ドナーリンパ系細胞注射と同時にTNFαまたはCFAを同時投与することによって処理を最適化した。本発明者らは、内因性膵島の再生をおそらく促進するために、膵島上での高いTNF受容体2発現または増殖受容体を生じさせるために膵島への傷害が必要であると考えたため、このプロトコールを使用した。さらに、本発明者らは、血液からのTNF受容体2および前駆細胞もまた内因性GFPポジティブB6膵島再生を促進すること、ならびに、CFAおよびTNFαが別の様式で有益であり得ると考えた。本発明者らは、以前に、CFAまたはTNFαが宿主において重篤な一過性のリンパ球減少症を誘導することを示すデータを得た。これは、ヒトの臨床試験において得られたデータと類似している。それゆえに、本発明者らは、ストレプトゾトシンおよび膵島移植を用いるだけでなく、末梢血キメラ現象を促進し得る重篤な一過性のリンパ球減少症を誘導するためにCFAまたはTNFαもまた用いて、6匹の宿主に注射した。さらに、本発明者らは、40日間、隔週で脾細胞を注射した。これらの実験の結果は、はるかにより有望であるように見えた。2〜10％のキメラ現象が注射の完了後に末梢血において検出されたからである。さらに、ドナー起源のGFPポジティブ細胞が、まれではあるものの、膵島において活発に発現された。
【０１２７】
手短に言えば、脾細胞はインスリン分泌β細胞に分化し、β細胞と融合し、または再生のための因子を提供した。本発明者らは、C57BL/6宿主において、CFAまたはTNFαがドナー細胞と同時に投与されないことが望ましいとの結論に達した。それゆえに、同種異系移植片の代わりに同系移植片を使用するこれらの実験、および膵島傷害の人工モデルを使用するこれらの実験は、器官の傷害または活性疾患が、疾患の除去後の再生プロセスを促進することを示唆する。重篤な高血糖がこの処理の有効性を妨害すると思われるため、代謝的に正常な状態もまた重要であり、かつ維持される必要があり得る。本発明者らの結果はまた、TNFαまたはCFAが処理の有効性を促進し得ることを示す。これらの結果は、おそらく二重の効果、すなわち、NODマウスにおけるCFAの自己免疫の除去だけではなく、重篤なリンパ球減少症のCFAの誘導をも表し、これは次に、ドナー細胞のキメラ現象、ならびに膵臓における引き続くキメラ現象および分化を促進し得る。また、TNFαの誘導または投与は、標的組織または前駆細胞が促進する再生に対して有益な効果を有する。さらに、成功率の比（92％ 対 72％）、ならびにキメラ現象/再生の割合の程度（約87％ 対 54％）に基づいて、最も良好な宿主再生の誘導がなおCFAの投与によって得られ、これは、TNFα単独の投与よりも幾分か優れていることが知られている。一旦動物が、いずれかの薬剤で首尾よく処理されるならば、疾患逆転の安定性は等価であることに注意するべきである。これらの結果は用量応答減少に起因し得るが、CFAとのINFγの同時誘導が、再生プログラムを反復するために宿主血管内皮を条件付けする際に直接的に有益であることもまた観察される。確かに、INFγは、高いLMP2および血管の漏れを促進する他のプロテアソームサブユニットを誘導し、これは、推定の中胚葉性の細胞の移動および分化に必要な段階である。
【０１２８】
上記の実験は糖尿病の治療に関連するが、これらの技術はまた、宿主の修復が望ましい他の疾患にも明らかに適用可能であり、免疫抑制の必要なく細胞を移植するための新規な方法を提供する。
【０１２９】
実施例9
GFP C57BL/6マウスにおける器官再生
実施例7において記述されるように、NODマウスにおいて観察された膵島細胞の顕著な再増殖をさらに理解および特徴付けするために、NOD遺伝子型ではない正常マウスを使用して、さらなる実験を行った。
【０１３０】
図9は、類似のドナー細胞移植および成体器官/オルガネラ（例えば、ランゲルハンス島）の可能性のある再増殖を達成するために種々の治療を用いて処理されたC57/BL/6マウスを要約する。これらすべてのC57BL/6宿主は、標準的なプロトコールを使用して、ストレプトゾトシンを用いて糖尿病を作製した。これらの実験において、グルコースレベルはインスリン注射または一時的なグルコースクランプを使用して調節されなかった。望ましければ、インスリン注射または一時的なグルコースクランプは、以下に記載される方法のいずれかにおいて、膵島細胞再生を最適化するために使用され得る。NOD宿主において、糖尿病または後期段階の膵島破壊が膵島再増殖のため、従って膵島の傷害の類似のモデルを作製するために必要であることが本発明者らによって観察され、傷害がドナー細胞の導入の前にストレプトゾトシンを用いて誘導された。
【０１３１】
グループ1マウスは、GFP-アクチン蛍光を有する同系C57BL/6ドナー（C57BL/6-GFP）からのドナー雄性脾細胞を受容した雌性C57BL/6マウスであった。従って、ドナー細胞は、内因性細胞から区別され得る。なぜなら、ドナー細胞は雄性起源であり（すなわち、XY染色体を有する）、内因性細胞は雌性起源である（すなわち、XX染色体を有する）からである。さらに、その細胞は、フローサイトメトリー分析を使用して容易に検出可能であるGFP蛍光を示す。この宿主からの血液の除去およびPBLの分析は、末梢血がわずか0.59％のGFP+細胞を有したことを示した。これは、脾細胞起源の細胞の導入が、試験された条件下では高レベルのキメラ現象を確立するためには不十分であったことを実証する。また、0.59％の値は、GFPを発現するドナー脾細胞の最後の隔週注射の約4日後のキメラ現象の程度を表し、低レベルのC57BL/6-GFP細胞が残存していることを示唆する。
【０１３２】
グループ2 C57BL/6マウスは、グループ1宿主について記載されたように処理された。処理されたマウスの脾臓およびPBLを処理開始から150日後に分析した。この処理措置は、処理後最初の40日間、107細胞の隔週注射を含んだ。グループ2宿主のPBLもまた、低レベルのドナー細胞を有した。脾臓は、わずかに高いがなお低いレベルのC57BL/6-GFP細胞を有した。サブセット分析は、GFPを発現する血液細胞が任意の選択系統に制限されなかったことを示唆するようであった。グループ2 910、911、および903NOD宿主は、蛍光のフロー画像を再ゲートすることによって再分析され、低レベルのキメラ現象の同様の傾向を有した。
【０１３３】
グループ2マウス931、939、932、および933もまた、C57BL/6脾細胞の移植後87〜98日間研究された。これらの動物の脾臓は、4.7〜13.3％の範囲の高度なキメラ現象を有した、この結果は、検出可能なレベルのキメラ現象を示唆するが、このキメラ現象は長く続かなかった。なぜならは、さらなる100日までキメラ現象の程度は再び低かったからである。
【０１３４】
グループ3および4のC57BL/6マウスは、グループ3および4のマウスが脾細胞の代わりに宿主の骨髄細胞を受容したという点でのみ、グループ2および3のマウスと異なった。脾細胞は、骨髄ドナー細胞よりも宿主により良好に移植することができた。グループ5 C57BL/6宿主はヘキスト333242ポジティブ脾細胞を受容した；これは、幹細胞特性を停止させることが科学文献によって主張されている細胞型である。C57BL/6宿主へのこれらの細胞の移入は最小限のみ成功であって、宿主の骨髄または骨の脾細胞よりも成功しなかった。
【０１３５】
最後に、グループ7およびグループ9 C57BL/6宿主は107のCNS前駆細胞または肝細胞（HC）を受容し、その宿主は細胞移植後約100日で屠殺された。宿主の脾臓はPBLよりもより良好な移植を示し、かつCNS細胞またはドナーの肝細胞は、骨髄またはHoecchst33342細胞よりもより良好に宿主に移植可能であり得る。
【０１３６】
すべてのグループにおけるすべてのこれらの実験について、本発明者らがドナー細胞処理を用いて糖尿病の逆転を見なかったこと、および本発明者らが膵臓における膵島の明確な再生をバックグラウンドレベルよりも上に観察しなかったことに注意するべきである。膵臓の可能な再増殖は、一時的でさえ、おそらくこの実験設計を用いると検出されなかった。なぜなら、マウスの屠殺は大部分の場合において遅かったからである。従って、NODと同様に、同時の強固な血糖の対照が、実験的観察の期間の間に膵島再増殖を促進するために、または標的器官におけるキメラ現象を永続化するために必要であったか否かを見るために、将来にむけた実験を行った。
【０１３７】
疾患逆転および膵島再増殖のNODモデルにおいて、データは、CFAおよびドナーF1脾細胞の両方を受容した糖尿病NODマウスが膵島再生を示すことを示す（図10）。グルコースクランプを使用して、グルコースレベルを調節し、および膵島再生を増強した。データは、非常に低い用量のTNFα（例えば、2μg/隔週の用量）でさえもまた、疾患プロセスの逆転を促進し得ることを示す。さらなる実験は、CFAのTNFαでの置き換えは、10〜20μg/隔週のTNF用量を必要とした。NODデータはまた、CFA単独またはドナー脾細胞単独が、試験した期間の間、疾患の除去または膵島再増殖のいずれにおいても、長く続く効果を伴わなかったことを明確に示した。
【０１３８】
図10の第2の部分はここで、NODの器官再生の成功をC57BL/6再生モデルに変換することを試みる。これは、再生を促進する決定的な構成成分を規定することを補助した。これらのグループにおけるすべてのC57BL/6マウスにおいて、ストレプトゾトシンを使用して組織損傷を誘導し、および糖尿病マウスを作製した。上記に記述されるように、組織損傷は再増殖を促進する。繰り返すが、標的器官再生を有するように見えるグループは、ドナー脾細胞およびTNFαを受容するグループである。これらの実験において、本発明者らは、受容体IまたはIIを含む場合の再生についての経路または受容体のマッピングを試みる。少なくとも受容体II刺激について、TNFα受容体Iを不活性化する変異を有するC57BL/6マウスの使用を用いて、本発明者らは、特定の程度まで、膵島再生の持続を見ることができ、このことは、膵島再生がこの後者の経路によって促進され得ることを示唆する。完全な実験は相反する様式では行うことができなかった。なぜならば、C57BL/6 RII-/-マウスに投与されたTNFαの用量が非常に低かったとしても、直後の死を招いたためである。TNFα毒性は、少なくとも対照マウスにおいて、この受容体Iを介すると考えられる。
【０１３９】
図10の最後の部分では、NODマウスにおける、膵島増殖の一過性促進および侵襲性膵島炎の迅速な除去に対するTNFの効果を試験する。上昇する用量のTNFを用いて、侵襲性膵島炎の除去だけでなく、膵島再生もまた見ることができる。これらのNODコホートは典型的に、TNF処理の過程の最後の約40〜50日に試験した。TNFRII発現についての組織学的切片の試験に基づいて、再生している膵島はこの受容体のアップレギュレーションを実証したが、なおある程度の組織損傷が存在した。TNFRIIのこのアップレギュレーションは、再生におけるTNFの有益な効果を促進し得る。例えば、TNFの20μg用量はすべての膵島炎を除去し、そして最も著しい程度まで膵島の再生を生じた。40日間の期間の終了より前のより早い時点で20μg TNFで処理されたNODマウスの試験は高いTNFRII発現を示すようであり、これは、膵島再生が完了するので、40日間の期間の終了までに除去される。また、ヒトTNFα（マウスにおける唯一のTNFRIのアゴニスト）を用いたNODマウスの処理は、膵島再生を生じなかった。このことは、器官再生に対するTNFαの有益な効果はTNFRIIのアゴニストとしてのTNFα効果の作用であったことを示唆する。
【０１４０】
図11は、NODマウスを提示する宿主または正常C57BL/6宿主に依存する多様な実験および結果を要約する。脾細胞起源、血液起源、またはHCの細胞の使用が有利であり得る。なぜならこれらの器官は多様な細胞型を含み、かつ動員されているがなお完全には分化されていない内皮、中胚葉、または外胚葉の再導入が、成体における器官再生を促進する胎児組織の相互作用の必要な再現を促進し、容易にし、または加速し得る。以下のデータは上記の仮説を支持する。正常な胚性膵島発生の間に、中胚葉がBV内皮（内胚葉）と相互作用する。この相互作用は、VEGF発現、ならびにFlk-1受容体のアップレギュレーションを促進し得る。成体における器官特異的な再生のこのプロセスを促進するために、多くの工程が続くことが望ましい。第1に、本来の発生的な接触の細胞は、望ましくは、IV注射によって投与されるか、または直接的に再生の部位に適用される。膵島細胞を再生するために、血管（BV）内皮が、VEFG、NFκB、または関連する事象（例えば、プロテアソーム活性の増加またはTNFR2発現）の胚性発現を促進することによって再生部位で活性化されることが望ましく、次いで、成体起源であったとしても、投与された中胚葉細胞と接触される。例えば、注射された中胚葉細胞は内因性内胚葉（例えば、膵臓中または身体の他の領域中の内胚葉細胞）と接触し得、これは、胎児のパターニングの再現を促進する（すなわち、BV内皮および内胚葉出芽が肝細胞の島を産生する）。確かに、この特定の臨床的設定において、再生を促進する際のドナー脾細胞起源細胞の能力は、より豊富な血液細胞よりも脾臓の中胚葉細胞に起因し得る。他の組織の再増殖のために、外胚葉、中胚葉、および/または内胚葉の投与が望ましいと思われる。さらに、標的器官の再増殖のために、一過性のVFGFのアップレギュレーションが望ましいと思われる。このアップレギュレーションは、例えば、TNFα、INFγ、または阻害性のcAMPを投与することによって誘導してもよい。また、IL-2の投与は、BV内皮に引き続き結合するTNFαを促進し得り、VEGFアップレギュレーションおよびNFκBアップレギュレーション、ならびに次いで器官再生を引き起こすと考えられる。TNFR2は内皮細胞上で優先的に発現されるので、この受容体は、標的器官再生のために操作されることが望ましい。NODマウスが膵島を再生する能力は、本明細書中に実証されるように、少なくとも部分的には、プロテアソームのLMP2サブユニットの膵島特異的アップレギュレーションに起因し得る。LMP2のアップレギュレーションは、ここで本発明者らがLMP2-/-マウスのその減少した効果によって実証するように、NFκBアップレギュレーションを用いてVEGF/Flk-1/TNFαの効果を促進する際に非常に影響力がある。本発明者らは、NODマウスにおいて促進され、およびLMP2-/-マウスにおいて除去されたこの再生プロセスを実証し、従って、この経路を確認する。
【０１４１】
望ましければ、上記の方法のいずれかが、より頻繁におよび/またはより長い時間の間、ドナー細胞を投与することによって増強され得る。
【０１４２】
実施例10
ヒト糖尿病末梢血リンパ球のアッセイ法の開発
自己免疫疾患を伝達する際のドナーNOD脾細胞の相対的な効力は周知であり、かつNOD血液は、未処理のコホートに疾患を伝達する際のリンパ球の供給源として非常に非効率的であるので、NOD脾細胞からのT細胞における強度と比較した、末梢血からの病原性NOD T細胞においてTNFαによって誘導されたアポトーシスの強度を定量した。
【０１４３】
表4に示されるように、NOD脾細胞における加速した細胞死は、初期および後期のアポトーシスの両方として測定される、46％の細胞死を生じた。同じNODマウスにおける末梢血リンパ球（PBL）に対する効果は、12％のみのアポトーシスの誘導であった。病原性アポトーシス感受性細胞の分布は、末梢血においてより低く、脾臓においてより高いようである。
【０１４４】
（表4）NODマウスにおけるPBL 対 脾細胞のTNFα感受性*
2005535732.tif 000005
*T細胞のアポトーシスは、フローサイトメトリー研究を使用して、CD3+T細胞上の、アネキシンV+PI+細胞およびアネキシンV+PI-細胞として規定される、初期および後期のアポトーシスを表す。
【０１４５】
表5のデータは、フローサイトメトリーによって測定した場合の、培養物およびTNFαを用いた、ヒト糖尿病PBLのT細胞死の加速の程度を示す。アポトーシスを、ヨウ化プロピジウム染色を用いるかまたは用いずに、12時間のインビトロ培養後またはTNFα（20ng/mL）、ActDを含むTNFα（1ng/mL）、もしくは、抗アポトーシス性であり迅速なタンパク質の合成を阻害することによってTNFαシグナル伝達のプロ-アポトーシス経路を増幅することが知られている他のタンパク質阻害剤への曝露後に、フローサイトメトリーでアネキシンVをモニタリングすることにより定量した。すべてのアッセイ法は、新たに調製したPBLおよび同時調製した対照試料上で行った。初期および後期の両方のアポトーシスの結果をこれらのデータからプールしたが、初期および後期のアポトーシスの各々がI型糖尿病における各カテゴリーにおいてそれ自体十分であり、TNFαを用いる培養を通して、加速された細胞死の高度に統計学的に有意な値を生じた。フローサイトメトリーのデータでは、相対的な平均死の大きな変化を任意の所定の日で観察することができ、従って患者試料は常に同時に研究され、および対照試料に対する対応t検定で比較した。ヒトにおけるTNFα誘導性アポトーシス欠損の強度は、現在のフローサイトメトリー技術を用いて検出可能であり（8〜10％）、NODマウスにおけるPBLにおける結果と一致する。55例の1型糖尿病患者は、55対のランダムな（自己免疫疾患の病歴がないか、または家族のその病歴がない）対照と比較して、未処理のT細胞（培養を用いて）のより高い細胞死を有した（p=0.0008）。アクチノマイシンDは、TNFαとともに使用される場合、アポトーシスのアクセレーターである。図5に示されるように、アポトーシスを誘導したTNFαおよびTNFαおよびアクチノマイシンD（p=0.0007）もまた、対照T細胞におけるよりもヒト糖尿病T細胞が有意に高かった（それぞれ、p=0.0154およびp=0.0007）。このデータは、欠損が1型糖尿病において広範囲に及び、患者の大部分はT細胞の検出可能な異常を示す（相対的に大きなT細胞の画分が高まったTNFα感受性を有する）。
【０１４６】
NODマウスと同様に、2つの細胞死の媒介する事象（組織培養調製物を用いる自発的な細胞死、および直接的なTNFα誘導性の選ばれたT細胞亜集団の死）があるらしいこともまた言及されるべきである。自発的な細胞死は、細胞の単球/マクロファージ系統に位置付けられ、直接的なTNFα死は両方の種のT細胞に位置付けられる。自発的な死は、細胞死受容体の受容体活性化に起因し得るか、、剪断ストレスに起因し得るか、または代替的には、自己免疫患者における異常な増殖性もしくは抗アポトーシス性である異常な血清因子の除去に起因し得る。
【０１４７】
（表5）対照と比較した、I型糖尿病およびII型糖尿病の末梢血リンパ球のTNF誘導性アポトーシス
2005535732.tif 000006
【０１４８】
実施例11
糖尿病以外の疾患の治療、安定化、または予防
NODマウスはまた、糖尿病に加えて、他の自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、狼瘡、多発性硬化症、シェーグレン症候群、多発性硬化症、および自己免疫性溶血性貧血）に罹患する。特に、本発明の方法はまた、NODマウスにおけるこれらの他の自己免疫疾患および/またはこれらの疾患の進行の停止と関連する症候を改善した。以下の処理が試験され、唾液腺の再増殖を増強すること、造血性異常を減少させること、多発性硬化症および慢性関節リウマチの進行を停止すること、ならびに狼瘡自己抗体のレベルを減少させることが示された：（i）40日間のMHCクラスIおよびペプチドを発現する107脾細胞の隔週注射（i.v.）、（ii）40日間の2、4、10、または20μgのTNFαまたはIL-1の隔週注射（i.v.）、（iii）1つの足蹠に、BCGの1mg/mL溶液5μLの単回注射、（iv）CFAの単回注射、（v）上記の用量での脾細胞およびTNFαを用いる併用治療、ならびに（vi）上記の用量での脾細胞およびCFAを用いる併用治療。
【０１４９】
C57BL6マウスのようなマウスを、他の細胞、組織、または器官（例えば、皮膚、肝臓、または脳細胞）の再生のための動物モデルとして使用することができる。
【０１５０】
実施例12
器官再生の効力に影響を与える因子
GFPマウスを使用する本発明者らのデータはまた、本発明者らが多くの異なる型の注射されたドナー細胞を用いてこれらの実験を反復した際、末梢血キメラ現象の程度だけではなく、これらの異なるドナー細胞によって誘導された末梢血キメラ現象の持続性においても、違いが存在することを実証した。上記に記述したように、本発明者らが入手しかつ注射したGFPポジティブドナーには、脾細胞、骨髄由来細胞、細胞選別により入手したヘキスト33342ポジティブ細胞、脳細胞、CNS由来細胞、および肝細胞が含まれた。脾細胞の分析のための動物を屠殺した後の末梢血リンパ球の分析に基づいて、CFA処理の非存在下でのキメラ現象の持続期間は、異なる細胞型で劇的に異なった。試験された異なる細胞型のうちで、結果的に脾細胞が、最も高い程度のキメラ現象を100日間より長い期間維持した。比較として、ドナー骨髄細胞は効果が低く、かつ他の細胞型は最も効果が低く、このことは、ドナー細胞起源が成体ドナー由来であったとしても、キメラ現象の持続に影響を有し得ることを示唆する。
【０１５１】
自己免疫宿主において、多くのサイトカイン内の任意のものの投与は、アポトーシスまたは細胞死に抵抗する固有のエラーを有する病原性リンパ系細胞に起因する、これらの病原性リンパ系細胞の亜集団の死またはアポトーシスを誘導する。従って、この処理は、内因性細胞を損ねることなく宿主から病原性細胞を除去する。さらに、導入されたサイトカインおよび内因性のサイトカインは損傷された標的器官の再生プロセスを促進する。標的器官が炎症性である場合、外因性サイトカインに曝露された場合、または増加したプロテアソーム活性（例えば、LMP2、LMP7、もしくはLMP10のサブユニット、γ応答性遺伝子、またはTNFα応答性遺伝子の過剰発現に起因する増加した活性）を有する場合、標的器官は指数関数的な速度で再生する。プロテアソーム活性の増加は、VEGFの作用（これは、VEGF受容体FlkおよびFltと一緒に組織再生において機能する）において役割を果たすようである。研究は、VEGFが発達中の器官に結合すること、およびこれが、おそらくFlk受容体またはFlt受容体への結合によって、最終的な器官を再生することを示した。本発明者らは、増強されたプロテアソーム活性が増強されたVEGF活性を生じることを示した。これらの結果の観点から、自己免疫宿主において、おそらく一旦疾患が取り除かれ、かつインサイチュー増殖が所望されると、幹細胞は自己免疫攻撃下にあった標的器官に戻り、かつこの器官中で優先的に増殖する。プロテアソーム活性のアップレギュレートおよび/またはγインターフェロンを用いるプロテアソームサブユニットのアップレギュレーションは、組織損傷を有する非自己免疫宿主において使用されて幹細胞によるこの損傷組織の標的化を促進し得る。さらに、同じくプロテアソーム活性を促進する他の化学物質およびサイトカインを、器官再生法において使用してもよい。例えば、このような方法において、プロテアソーム活性のプロモーターが、成体血液から得られた幹細胞またはリンパ球を投与するのと同時、その前に、またはその後に投与され得る。幹細胞の付加後、局所的再生が、CREB阻害を介してFlk-1受容体を増加させることによって、またはTNFα、HAT、もしくはNFκBの活性化によって、またはVEGF阻害剤の投与によって促進され得る。VEGF分泌は、プロテアソーム増強、TNFα投与、cAMP阻害によって、IL-1βもしくはIL-2の投与によって、または剪断ストレスの適用によって促進され得る。
【０１５２】
実施例13
本発明の方法における使用のための典型的な薬剤
選択した自己免疫細胞死は、通常は細胞死から自己免疫細胞を保護する経路を破壊する薬剤を投与することによって達成され得り、これには、自己反応性T細胞上のCD28、自己免疫細胞の保護に関与するB細胞上のCD40、およびTリンパ球上のCD95またはCD95L（すなわち、FaL）のような可溶性型の抗原受容体が含まれる。他のこのような薬剤には、p75N TNFおよびリンホトキシンβ受容体（LtβR）が含まれる。また、これらの受容体と反応性である抗体または抗体の断片が有用な治療剤である。このような薬剤は文献に記載されている。
【０１５３】
本発明は、組み合わせたTNFα誘導治療、またはTNFαおよびIL-1の組み合わせを含む直接的化合物投与に限定されないが、以下を含む：例えばTNFα誘導治療の任意の組み合わせ、例えばBCGを用いるワクチン接種、ウイルス感染、LPS、通常TNFαを産生する細胞（すなわち、マクロファージ、B細胞、およびC細胞）の活性化、走化性ペプチドfMet-Leu-Pheの投与、NFκBを活性化する細菌タンパク質およびウイルスタンパク質の投与、適応性の免疫応答に関与するシグナル伝達経路（すなわち、B細胞およびT細胞上の抗原受容体、T細胞上のCD28、B細胞上のCD40）を誘導する薬剤の投与、特異的自己反応性細胞細胞死受容体（すなわち、TNF、Fas(CD95)、CD40、p75NF、およびリンホトキシンβ受容体（LtβR））を刺激する薬剤、ならびにTNFα前駆体を切断するTNFα転換酵素（TACE）を刺激する物質の投与（すなわち、増強された産生または増強された分泌後のサイトカインの寿命を刺激し得る生物学的活性を提供する）。このような薬剤は文献に記載されている。
【０１５４】
好ましい態様において、TNFαアゴニストとして働くモノクローナル抗体が投与され得る。このような抗体は、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495 (1975) によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して、腫瘍壊死因子α受容体1（TNFR1）または腫瘍壊死因子α受容体2（TNFR2）をマウスにおける免疫原として使用して作製され得る。このような抗体はまた、組換えDNA法によってもまた作製され得る［Cabillyら、米国特許第4,816,567号］。このような抗体は、Brockhausら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:3127〜31 (1990) によって調製されかつ記載されている。産生される抗体の中で、アゴニスト活性を有するものが、細胞傷害性、線維芽細胞増殖、インターロイキン-6分泌、または転写因子NFκBの活性化を測定するアッセイ法においてTNF様活性についてスクリーニングすることによって同定される。代替的には、このような抗体は、アゴニストが、リンパ腫を有するかまたは新たに2型糖尿病と診断された患者から得られる活性化されたT細胞を殺傷する、それらの活性によって同定されるアッセイ法を使用して、インビトロでスクリーニングされ得る。
【０１５５】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基といわれ、代表的には、「インポート」可変ドメインから取られる。本発明の方法において使用される抗体において、インポート可変ドメインは、上記で作製されたTNFR1抗体およびTNFR2抗体由来である。ヒト化は、例えば、Winterおよび共同研究者の方法［Jonesら、Nature 321:522〜525 (1986); Riechmannら、Nature 332:323〜327 (1988); およびVerhoeyenら、Science 239:1534〜1536 (1988)］に従って、齧歯類のCDR配列またはCDR配列をヒト抗体の対応する配列で置換することによって実行され得る。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（Cabilly、前出）、ここで、実質的により少ない無傷のヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置き換えられている。実際には、ヒト化抗体は代表的にはヒト抗体であり、ここではいくつかのCDR残基、および、いくつかの場合において、いくつかのFR残基が、齧歯類抗体の類似の部位からの残基によって置き換えられている。
【０１５６】
ヒト化抗体は、望ましくは、抗原を免疫するための高い親和性を保持し、従って、望ましくは、三次元モデリングによる親の配列およびヒト化配列の分析を含む公知のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者に知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定の三次元高次構造的構造を図示および表示するコンピュータプログラムは利用可能である。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のあり得る役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようにして、FR残基が選択され得、コンセンサス配列およびインポート配列を組み合わせ得、その結果、所望の抗体特性（例えば、標的抗原に対する親和性の増加）が達成される。一般的に、CDR残基は、抗原結合に影響を与えることに、直接的かつ最も実質的に関与している。さらなる詳細については、米国特許第5,821,337号を参照されたい。
【０１５７】
代替的には、内因性免疫グロブリン産生の非存在下における免疫化の際にヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおいて抗体重鎖結合領域（JH）のホモ接合性検出（これは、内因性抗体産生の完全な阻害を生じる）が記載されている。このような生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を生じる。例えば、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551〜255 (1993); Jakobovitsら、Nature 362:255〜258 (1993)を参照されたい。
【０１５８】
TNF受容体アゴニスト抗体の使用において、患者は、TNFα様効果を誘発するために十分な量が投与されるように投薬される。このような抗体、または抗体の混合物の有効な用量は、耐性を確認するために低用量で開始し、続いて、循環しているリンパ球の所望の変化を産生するように用量の増大を行うことによって決定する。例えば、治療用量は、毎週または隔週で、0.025mg/kg、0.075mg/kg、または0.150mg/kg（抗体/患者）のレベルであり得る。
【０１５９】
抗体投与に続いて、疾患活性を各患者のカテゴリーにおいてモニタリングする。糖尿病については、モニタリングは、正常血糖を維持するために必要であるインスリンの量、またはCペプチドレベルの再出現におけるポジティブな傾向の集計を含み得る。モノクローナル抗体治療の間およびその後のすべての患者は、抗TNFR抗体に対するヒト抗マウス抗体応答、ならびにヒト抗ヒト応答の存在についてモニタリングされる。
【０１６０】
別の好ましい態様において、本発明は、細胞表面受容体に結合すること、または細胞内タンパク質と相互作用することによって細胞死を誘導し、かつ自己免疫細胞を妨害する薬物の同定を可能にする。例えば、IL-1経路を活性化する薬物、または集中している経路と相互作用する薬物（例えば、Fas、FasL、TACI、ATAR、RANK、DR5、DR4、DCR2、DCR1、DR3、TALL-4、またはTHANK）である。タンパク質合成またはプロテインキナーゼを付与することによって、自己免疫細胞の加速された細胞死もまた増強され得る。例えば、加速されたTNFまたはFASの死は、迅速に作られたTNFα媒介細胞内阻害剤をブロックするタンパク質合成阻害剤（例えば、ActD）への短い曝露によって増強される。同様に、キナーゼ阻害剤はまた、TNFα媒介事象を増強する。本発明の薬物は、それらのみが、細胞死経路において選択的欠損を有する自己免疫細胞を殺傷するという点において特徴付けされ得る。この経路は、2つの別個の表現型によって特徴付けされ得る：（1）リンパ系訓練の欠損および（2）アポトーシスに対する感受性。
【０１６１】
他の宿主処理方法が自己免疫細胞を除去するために同様に使用してもよく、例えば、CFAの投与、インターロイキン-1（IL-1）、プロテアソーム阻害剤、TNFスーパーファミリーアゴニスト、NFκB阻害剤、抗炎症薬物、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）、リポポリサッカリド、UV光、またはTNFαシグナル伝達経路の細胞内メディエーターがある。
【０１６２】
実施例14
治療
本明細書中に記載される治療は前糖尿病（すなわち、I型糖尿病に進行すると診断されたが、まだ高血糖ではない患者）を治療する際に有効であると考えられるが、本発明者らは、本発明の方法が、哺乳動物（例えば、I型糖尿病または他の何らかの自己免疫疾患を有するヒト）の治療のためにも使用され得ることに注目する。すでに高血糖を有し、それゆえに顕著かつ全体的な膵島破壊を有する患者を治療する能力は、本治療の有意な利点である。
【０１６３】
一般的に、患者を治療する前に、任意で患者から血液を入手してもよく、その患者が2つの疾患の表現型を有することを決定する。第1の疾患の表現型は、血液中の循環しているCD45RAポジティブ細胞の数の増加である（CD95、CD62L、または未処理もしくは未刺激の細胞の他のマーカーについてポジティブな細胞の数の変化としてもまた規定される）。CD45、CD95、およびCD62Lは、すべてフローサイトメトリーによってモニタリングされ得り、かつ年齢が一致した対照と比較され得る細胞表面抗原である。本発明者らは、糖尿病または他の何らかの自己免疫疾患を有する被験体の末梢血中にこれらの未処理または未刺激の細胞が豊富にあることを予測する。第2の表現型は、アポトーシスまたはネクローシスを通した細胞死に対する感受性が増強されたリンパ球の亜集団の存在である。例えば、細胞の亜集団は、TNFα、TCR受容体架橋剤、T細胞特異的抗体（例えば、αTCRもしくはαCD3）、またはBCGを用いる非特異的刺激によって引き起こされる細胞死に対して増強された感受性を有し得る。本発明者らは、これらの患者からリンパ球を単離すること、これらをインビトロでTNFαを用いて処理すること、およびリンパ球が、TNFα、他のサイトカイン、化学薬剤、または表面タンパク質を選択するための抗体に曝露された場合に、アポトーシスまたはネクローシスを受ける亜集団を含むことを示すことによって、このような細胞の存在についてアッセイし得る。望ましくは、対照ドナーリンパ球はこれらの薬剤に対して感受性を示さない。この表現型は、細胞内シグナル伝達経路を変化させた病原性起源のリンパ球が優勢であることの結果である。この変化は、高められた死の感受性を生じる。この表現型を有するすべての細胞の除去または転換は、自己免疫の永続的な除去のために望ましい。これらの欠損の浸透性は、糖尿病患者または他の自己免疫疾患患者において比較的高いようであり、I型糖尿病においては、おそらく95％を上回る浸透度を有する第1の表現型、および50％を上回る浸透度を有する第2の表現型を伴う。
【０１６４】
従って、I型糖尿病または他の自己免疫疾患状態を有する被験体の治療を開始する前に、本発明者らは、血液分析単独から、その被験体がこれらの表現型のいずれかまたはその両方を有するか否か、従って治療に対して受け入れ可能か否かを決定し得る。第1の表現型（すなわち、循環しているCD45RAポジティブ細胞の数の増加）を治療するために、MHCクラスIおよび自己ペプチドに対する耐性の再確立が必要である可能性がある。本発明者らは、本発明者らの結果から、機能的MHCクラスIおよび自己ペプチド複合体の欠如が、末梢における過剰な未処理T細胞を生じさせ、または少なくとも、これを引き起こす表現型の1つを生じさせると結論付ける。従って、この表現型を治療するために、本発明者らは、MHCクラスIおよび自己ペプチド複合体に対して半同種異系的一致または完全な同種異系的一致である血液または骨髄を投与することができる。さらに、血液もしくは骨髄に由来する細胞、または不死化された線維芽細胞でさえもが、望ましくは正常なMHCクラスIおよび自己ペプチド複合体の提示を有し得る。換言すれば、これらは疾患を有する患者に由来するべきではない。これらの表現型は治療の前に容易にモニタリングされ、この治療におけるドナー細胞の適合性が決定される。例えば、高次構造的に特異的なMHCクラスIおよび自己ペプチド抗体は、その複合体が正しく満たされていることを示すために使用され得る。さらに、本発明者らは、本発明のこの局面において、宿主のHLAクラスI対立遺伝子に対する一致の数の増加は、疾患の逆転の持続時間の増加を生じることを認識している。少なくとも2つ、および望ましくは4つすべてのドナー細胞からのHLAクラスI対立遺伝子（例えば、HLA A対立遺伝子およびHLA B対立遺伝子）が一致することが望ましい。従って、これらのドナー細胞は完全に一致し得るか、またはこれらは半同種異系であり得る（すなわち、個々の細胞上で部分的な一致のみを有する）。
【０１６５】
治療は、所定の任意のクラスIハプロタイプの任意の所定のドナーの1×107細胞の隔週の静脈内注入を含み得る。投与される細胞が、新たに単離されかつ貯蔵または凍結により加工されていないことが望ましい。本発明の方法において使用され得る細胞は、例えば、血液銀行から入手され得る。さらに、半同種異系細胞が、患者の近親者（例えば、親または兄弟姉妹）から入手され得る。さらに、投与される血液およびリンパ球の量を減少させるために、赤血球を調製物から除去させることが有利である。本発明者らはまた、半同種異系または完全な同系の照射された細胞がこの治療において使用され得るが、照射された細胞の使用は矯正のためにより長い時間経過を生じることを決定した。
【０１６６】
MHCクラスIおよびペプチドの投与の代替として、未処理のT細胞を不活性化または殺傷する別の薬剤を投与することができる。典型的な薬剤には、未処理のT細胞上のT細胞受容体に結合してそれを不活性化する抗体、または結合することによって病原性細胞のみの選択的な死を誘発するものが含まれる。いくつかの態様において、抗体は、それが記憶T細胞の活性を阻害するよりも、少なくとも2倍、5倍、10倍、または15倍多く未処理T細胞の活性を阻害する。
【０１６７】
ドナー細胞の投与と同時に、カルメット-ゲラン桿菌（BCG）もしくは他の免疫アジュバント（例えば、CFA）のいずれかを用いる刺激を通して、またはTNFαの直接投与によって、内因性TNFα産生を誘導することもまた望ましい。例えば、少なくとも隔週、または望ましくは、1週間に3回、BCGを投与し得る。繰り返すが、当業者は、病原性細胞の表現型の除去の証拠について1週間に2回、血液試料を分析することによって、細胞およびTNFαまたはBCGの用量を個々に決定することができる。例えば、ドナーのMHCクラスI発現細胞の正確な用量を決定するために、本発明者らは末梢血中の豊富な未処理細胞の除去について探索してもよく、またTNFαまたはBCGの正確な用量を決定するために、本発明者らはTNFαのインビトロ感受性の除去について探索してもよい。
【０１６８】
治療の第2の局面に関して、TNFα、BCG、または別の非特異的型の免疫刺激が内因性TNFαの誘導を促進し得る。例えば、TNFαは筋肉内、嚢内、または静脈内に投与され得る。さらに、ヒトTNFαまたはTNF受容体2アゴニストのような新規な薬物が使用され得る。このような化合物は2つの効果を有しており、一方は、モニタリングされ得る末梢におけるアポトーシスまたは細胞死に感受性である細胞の除去であり、他方は、内因性β細胞再生ならびに新しいドナー血液からの可能な分化の促進である。患者に投与され得るTNFαの典型的な用量は、約40μg/m2または200μg/m2である。他の典型的な用量には、1週間で毎日2回の投薬のための、2×106mgと2×106mgとの間の用量が含まれる。自己免疫疾患を有する患者は、より高い用量のTNFαに耐え得り、および/または治療のためにより低い用量を必要とし得る。TNFαに対する代替として、耐性が、TCRを架橋することによって、または同じ経路を通した非特異的ワクチン接種（例えば、BCGワクチン接種）によって得られ得る。患者に直接的にリンパ球減少症の誘導物質（例えば、TNFα）を投与することに対する代替として、リンパ球減少症の誘導物質は、患者から得られた血液（例えば、電気泳動の間に得られた血液）に投与され得り、その処理された血液が患者に再投与され得る。短い半減期を有するリンパ球減少症の誘導物質（例えば、TNFα）のために、少量の（もしあるならば）機能的化合物が、患者に再導入される血液中に残っている。従って、この方法は、その化合物の何らかの潜在的に有害な、副作用の発生率または重篤度を減少させるはずである。
【０１６９】
本明細書中に記載されるいずれかの併用治療（例えば、MHCクラスI発現細胞およびTNFα誘導を使用する治療）は、疾患が首尾よく治療されるまで投与され得る。例えば、この治療は、約40日間継続され得る；しかし、この期間は、観察された表現型に基づいて容易に調整され得る。さらに、TNFαの用量は、TNFαに対する感受性の増加（これは残存している自己免疫細胞の量を示す）を有する患者からの血液試料における細胞の割合に基づいて調整され得る。さらに、I型糖尿病を治療する際に、患者は可能な限り正常血糖に近い状態を維持することが望ましいと思われる。マウスのデータは、血糖の著しい変動が、膵臓の正常な再生能力を妨害することを実証した。それゆえに、これらの患者は、疾患の典型的な逆転治療の40日間だけでなく、120日間の間、再生プロセスを最適化するためにインスリンポンプ上に配置され得る。長期的な糖尿病の膵臓（すなわち、15年よりも長い間糖尿病を有するもの）は、前駆細胞がもはや存在しないような程度まで減少した膵臓の再生能力を有し得る。これらの患者において、治療は、治療の長さ以外は同一であり得る。例えば、ドナーの血液または骨髄は、これらの細胞が正しい組織型（例えば、膵臓のβ細胞）に転換するために生きていなければならない。
【０１７０】
上記に言及されるように、本発明のいくつかの態様は中胚葉細胞を利用し、これは、正常ドナーから単離され得る（例えば、骨髄、脾臓、または末梢血から）。代表的には、この細胞は、検出可能な程度まで、CD90+、CD44+、またはCD29+を発現するが、感知できるほどの量のCD45またはCD34を発現しない。この正常ドナー細胞は、炎症、傷害、または疾患の部位への迅速な移動を可能にするために、好ましくは、静脈内または腹腔内で、ヒトに投与される。望ましくは、この細胞は、活動自己免疫を有するヒトに投与される。代替的には、この細胞は、自己免疫を有しないヒト、または静止状態の自己免疫を有するヒトに投与され得る。ヒト（宿主）における活性な自己免疫の非存在は、再生部位で炎症性応答または傷害を開始するための宿主の前処理が必要であり得る。さらに、ドナー細胞の前処理もまた、必要であり得る。この宿主は、TNFα、IFN-γ、IL-2、VEGF、FGF、またはIGF-1を用いて処理され得り、動員された中胚葉細胞との最適な相互作用のための血管内皮を調製する。さらに、内皮細胞に対するVEGF刺激された発現の経路は、PI-3キナーゼの選択的阻害剤を用いて増強され得る。代替的には、この宿主は、動員された中胚葉細胞との最適な相互作用のために、壁細胞（例えば、神経堤または心外膜由来）に由来する血小板由来増殖因子で前処理され得る。この型の治療は、多様な器官またはオルガネラ（脳、皮膚、ランゲルハンス島、心臓、肺、肝臓、筋肉、腸、膵臓、骨、軟骨、および脂肪を含む）の再生のために有益であることが想定される。
【０１７１】
宿主への注射前に新鮮な間葉細胞を最適化することもまた可能であり得る。これは、TNFα曝露、IL-1β曝露、または新生を増加させるための他の化学物質/薬物処理を用いて達成され得る。
【０１７２】
器官または組織の損傷を有するが、根本的な自己免疫を有さない患者のために、免疫アジュバント（例えば、TNFα）の投与の延長を避けることが有益であり得る。なぜなら、このような薬剤は、幹細胞の枯渇を生じ得るからである。その代わりに、望ましくは、TNFαまたは任意の他の非特異的試薬を用いて一過性のリンパ球減少症を誘導してこの試薬を除去し、器官または組織を再生するために細胞（例えば、幹細胞）を加えてもよい。さらに、加えられた幹細胞または前駆細胞は、TNFα感受性を減少するように変化してもよく、またはプロテアソーム活性を増加し、またはTNFもしくはFasを通じて細胞死感受性を減少していてもよい。さらに、宿主は、幹細胞の投与と同時に、その前に、またはその後に、LMP2、LMP7、またはプロテアソーム活性を増加する薬剤（例えば、γインターフェロン）を用いて前条件付けしてもよい。Flt、Flk、VEGFの発現または活性、低酸素症、GATA-2、低血糖、IL-1β、またはcAMPの阻害を増加させる化合物もまた、使用してもよい。さらに、TNFαの投与は、FasまたはFasLのアップレギュレーションに起因する細胞死を生じさせるので、根本的な自己免疫を有する患者およびそれを有しない患者の両方において、TNFαまたは他の免疫アジュバント治療の間に、Fas/FasL発現または機能の阻害剤を用いて、宿主を前条件付けすることが有益であり得る。
【０１７３】
対照的に、自己免疫条件の治療の間のTNFαの投与は代表的には幹細胞の数を増加させ、従って、幹細胞の破壊を阻害する工程、または幹細胞を置き換える工程は不要である。TNFαは、NODマウスにおいて幹細胞を枯渇させない。なぜならこれらのマウスにおける多くの幹細胞が、FasおよびFasL発現における固有の欠点を有しているからである。TNFαによって誘導されるFas/FasLアップレギュレーションに起因して死滅し得る正常細胞とは対照的に、NOD幹細胞は生存する。種々のヒト自己免疫疾患において、Fas/FasLダウンレギュレーションは、TNFαの存在下で、これらのヒト細胞の生存を可能にし、または拡大さえも可能にする。
【０１７４】
自己免疫疾患を有する宿主において、シグナル伝達経路は攪乱され、およびサイトカインの投与は複数の効果を有し得る。第1に、投与されたサイトカインは、アポトーシス抵抗性における固有のエラーに起因する、病理学的なリンパ系細胞の亜集団のアポトーシスを誘導する。従って、これらの細胞が病原性であると同定される。さらに、導入されたサイトカインおよび内因性のサイトカインもまた、おそらく標的器官の再生を促進する。さらに、標的器官が炎症を有し、かつ投与されたサイトカインに曝露されるか、またはプロテアソーム機能の過剰発現における内因性のエラーが処理される場合（例えば、LMP2/7サブユニット発現、γ応答性遺伝子、またはTNF応答性遺伝子）、器官再生が促進される。特定の理論に本発明が制限されることを意味するものではないが、インサイチュー再生の可能性のあるメカニズムはプロテアソームの活性化がVEGFの作用のために重要であり、VEGFの作用はFlk活性のために重要であることである。内皮細胞はこのプロセスを促進し得り、プロテアソームの活性化を用いてVEGF作用が加速され、従ってFlk作用が増強される。外因性に加えられた幹細胞は、例えば、独立した増殖もしくは細胞との融合によって、または系統特異的細胞型への分化によって、このプロセスを指数関数的に促進し得る。それゆえに、インサイチュー器官再生を促進するために、プロテアソーム阻害剤を避けることが望ましい。自発的な自己免疫宿主（ここでは、標的器官でのLMP2および/またはLMP7の過剰発現が頻繁である）もまた、加速された器官再生を有し得る。器官再生はまた、LMP2/7過剰発現を、例えば、γインターフェロン、TNF、またはこれらの遺伝子のプロモーターを活性化する化合物（例えば、Statl、LMP2プロモーターにおけるICS-2/GASエレメントのアゴニスト、インターフェロン調節因子1（IRF1）、TNFα、またはNFκBのプロモーター）を用いて促進することによって加速され得る。
【０１７５】
逆に、プロテアソーム阻害剤の投与は、増殖性疾患のための治療として働き得る。すなわち、プロテアソーム阻害剤が投与され得り、これは、例えば、癌細胞のような増殖性細胞に対する自己免疫応答に影響を与えるが、正常細胞については、比較的減少した自己免疫応答を生じる。最も望ましくは、抗増殖性プロテアソーム阻害剤は、投与に際して正常細胞に対する自己免疫は生じない。さらなる例において、抗自己免疫治療は、プロテアソーム阻害剤の投与と同時に、またはその後で投与され得る。プロテアソーム阻害剤によって治療され得る他の疾患には、例えば、敗血症またはアテローム性動脈硬化症のような急性炎症性プロセスが含まれる。
【０１７６】
血管内皮増殖因子（VEGF）は、血管の浸透性を高め、かつ細胞増殖を促進する強力な血管形成タンパク質である。VEGFは2つの型のチロシンキナーゼ受容体、すなわち、fms様チロシンキナーゼ-1（Flt-1）および胎児肝臓キナーゼ-1/キナーゼドメイン領域（Flk-1/KDR）を刺激する。FGF（線維芽細胞増殖因子）、TNF、および高度にコンフルエントは細胞培養は、細胞中でFlk-1/FDR発現を誘導するのに対して、トランスホーミング増殖因子1（TGF-1）はそれを減少させる。従って、再生を促進するために、FGFおよびTNFが使用されて、TGFは望ましくは避けられる。正常宿主における再生のために、ドナー細胞は、望ましくはあまり初期にはTNF様物質に曝露させない。なぜなら、これらの物質は細胞死を加速し得るからである。対照的に、その宿主細胞は、インサイチュー再生における再生プロセスおよび/または相互作用を促進するために、TNF様物質またはNFκBもしくはVEGFの誘導物質に曝露されて、Flk-1様発現またはシグナル伝達を増加させ得る。それゆえに、正常ドナー細胞は、内因性TNF様物質に曝露される場合に、細胞死を妨害するために移動の前に前処理され得る。代替的には、宿主は、最適な増殖のための環境を作るために、細胞の移動の前に、TNF-様物質（例えば、TNF、VEGF、FGF、またはおよびNFκB刺激物質）を用いて再条件付けされ得る。上記に記述されるように、VEGF作用はプロテアソーム発現性LMP2に依存し、従って、プロテアソーム機能を誘導する薬剤は再生のために有益である。このような薬剤の1つはINF（インターフェロン）であり、これは、最適なVEGF作用のために、必須の誘導可能なプロテアソームサブユニット（例えば、LMP2）をアップレギュレートする。
【０１７７】
他の態様
前述の記載から、本明細書中に記載された本発明を種々の使用法および条件に適合させるために、変化および改変が本発明になされ得ることは明白である。このような態様もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【０１７８】
本明細書中に言及されたすべての刊行物は、あたかも各々の独立した刊行物、特許、または特許出願が、詳細にかつ個別に参照として組み入れられることが示されるのと同程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
出願書類は、カラーで作製した図面（図1）を含む。カラーの図面付きのこの特許または特許出願のコピーは、請求および必要な費用の支払いの際に事務所より提供される。
【０１８０】
【図１】疾患の逆転を有する成体雌性NODマウス膵島におけるY染色体ポジティブ細胞の存在を実証する表である。カラム1およびカラム2は、高血糖の逆転、その後の膵臓におけるインスリン分泌細胞の再生として規定されるそれらの疾患の長期的な相関を有する、2匹の異なる雌性NODマウスを表す。各動物からのすべての組織学的切片は免疫組織化学によって染色され、かつ同時に切断された標本由来であった。第1行はインスリン抗体を用いた膵臓の染色を示し、疾患を有さないきれいな膵島の再出現を実証する。第2行は、同じ膵島のY染色体染色が膵島組織および付随する管組織中にのみ、Y染色体の区切られた暗いピンクの染色を生じるが、膵臓の付随する外分泌腺部分中には染色を生じないことを実証する。この結果は、再出現する膵島の起源が雄性ドナーの脾細胞であることの確定的な証拠である。第3行は、Y細胞が膵島に存在したのみならず管組織にも存在したことを示す、付随する管の拡大図である。管にドナー細胞は再び存在し、膵島中での再増殖よりも均一性は低かった。一般的に、これらのマウスの膵臓中でのほとんどすべての膵島組織は、すべての細胞における均一なY染色体の存在によって実証されるようにドナー起源であった。これらの動物の膵臓における管は、完全に雌性起源、または雌性細胞と雄性細胞の両方からなる混合起源であり得る。第4行は、初期の膵島再生の発生マーカーがPDX-1であることを実証する。膵臓切片の染色は、再生している膵島において独占的に明るいPDX-1染色を示すが、付随する膵臓の外分泌部分においては染色を示さなかった。
【図２】図2A〜2Cは、CFAで処理したかまたは処理していない、およびドナー脾細胞で処理したかまたは処理していない、CD8 CD45RB高細胞、CD8 CD62L細胞、およびCD8 CD95細胞の割合を示すグラフである。
【図３】図3Aおよび3Bは、CFAで処理したかまたは処理していない、およびドナー脾細胞で処理したかまたは処理していない、マウスにおける平均抗原密度の変化の割合のグラフである。。
【図４】20〜35週齢の糖尿病マウスにおいて膵島炎を抑制するTNFαの複数回用量の能力を示す表である。
【図５】典型的な細胞死受容体のリストである。
【図６】移植されたドナー細胞の死滅または内因性の健常細胞の死滅を妨害するために使用され得る典型的な細胞死の阻害剤のリストである（Oncogene Research Products, 2002/2003カタログ、San Diego, California）。ネクローシスの典型的な阻害剤はゲルダノマイシンであり、アポトーシスの典型的な阻害剤はzVAD-fmkである。
【図７】細胞死のレベルを測定するために使用され得る標準的なキットのリストである（Oncogene Research Products, 2002/2003カタログ、San Diego, California）。
【図８】細胞死を誘導する典型的な化合物のリストである（Oncogene Research Products, 2002/2003カタログ、San Diego, California）。
【図９】隔週で40日間、107ドナー細胞を注射したマウス由来の脾細胞またはPBLの分析を要約する表である。少数の細胞もまた、とりわけ細胞がよりしばしば投与されるか、および/またはより長く投与される場合に、本発明の方法における各注射において使用され得る。カラム「全GFP+％」は、蛍光性である脾細胞またはPBL細胞の割合を列挙し、これはこれらの細胞がドナー起源であることを示す。カラム「H-2kb+GFP+」は、蛍光性であり、かつドナー細胞と同じクラスI遺伝子座を発現する分析された細胞の割合を列挙する。カラム「CD3++GFP+」は、蛍光性であり、かつT細胞上でのみ発現されるCD3を発現する分析された細胞の割合を列挙する。カラム「B220+GFP+」は、蛍光性であり、かつB細胞上でのみ発現されるB220を発現する分析された細胞の割合を列挙する。カラム「Mac-1+GFP+」は、蛍光性であり、かつマクロファージ上でのみ発現されるMac-1を発現する分析された細胞の割合を列挙する。
【図１０】本発明の種々の方法を用いて処理されたマウスの特徴を要約する表である。「TNFα低用量」は、2μgのTNFα用量をいう。「Sp」は脾細胞を示し、そして「Bm」は骨髄ドナー細胞を示す。「(-)」は未処理の対照マウスと比較して有意差がないことを示し、「(+)」、「(++)」、および「(+++)」は、未処理の対照マウスと比較して増加する差（例えば、活性の増加または細胞数の増加）を示す。
【図１１】再生を促進する条件を要約する表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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