(57)【要約】  本発明は、ノミの頭部、神経索、後腸、およびマルピーギ細管のタンパク質；ノミの頭部、神経索、後腸、およびマルピーギ細管の核酸分子（ノミの頭部、神経索、後腸、およびマルピーギ細管のタンパク質をコードする核酸分子を含む）；ノミの頭部、神経索、後腸、およびマルピーギ細管のタンパク質に対して惹起される抗体；ならびにノミの頭部、神経索、後腸、およびマルピーギ細管のタンパク質活性を阻害する化合物に関する。本発明はまた、このようなタンパク質、核酸分子、抗体、および阻害化合物を得るための方法を包含する。本発明のタンパク質、核酸分子、抗体および本発明のタンパク質に由来するタンパク質保護化合物を含む治療的組成物、ならびノミの外寄生から動物を保護するためのこのような治療的組成物の使用もまた、本発明に包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：（ａ）３７℃の温度で、へリックス不安定化剤の非存在下において１×ＳＳＣを含む溶液中でハイブリダイズすること、および（ｂ）４７．５℃の温度で、へリックス不安定化剤の非存在下において１×ＳＳＣを含む溶液で洗浄すること、を包含する条件下で、表Ｉの核酸配列、表ＩＩの核酸配列、表Ｉの核酸配列に相補的な核酸配列および表ＩＩの核酸配列に相補的な核酸配列からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズする、単離された核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸であって、前記核酸分子が、表Ｉの核酸配列および表ＩＩの核酸配列からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸であって、前記核酸分子が、表Ｉの核酸配列および表ＩＩの核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項４】
転写制御配列に作動可能に連結される請求項１に記載の核酸分子を含む、組換え分子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項７】
以下：（ａ）３７℃の温度で、へリックス不安定化剤の非存在下において１×ＳＳＣを含む溶液中でハイブリダイズすること、および（ｂ）４７．５℃の温度で、へリックス不安定化剤の非存在下において１×ＳＳＣを含む溶液で洗浄すること、を包含する条件下で、表Ｉの核酸配列に相補的な核酸配列および表ＩＩの核酸配列に相補的な核酸配列からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズする核酸分子によりコードされるタンパク質を生成する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記核酸分子が、表Ｉの核酸配列および表ＩＩの核酸配列からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列を含む、方法。
【請求項９】
請求項７に記載の核酸であって、前記核酸分子が、表Ｉの核酸配列および表ＩＩの核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む、方法。
【請求項１０】
以下：（ａ）３７℃の温度で、へリックス不安定化剤の非存在下において１×ＳＳＣを含む溶液中でハイブリダイズすること、および（ｂ）４７．５℃の温度で、へリックス不安定化剤の非存在下において１×ＳＳＣを含む溶液で洗浄すること、を包含する条件下で、表Ｉの核酸配列に相補的な核酸配列および表ＩＩの核酸配列に相補的な核酸配列からなる群より選択される核酸配列にハイブリダイズする核酸分子によりコードされる単離されたタンパク質、からなる群より選択される、単離されたタンパク質。
【請求項１１】
請求項１０に記載のタンパク質であって、前記核酸分子が、表Ｉの核酸配列および表ＩＩの核酸配列からなる群より選択される核酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１２】
請求項１０に記載のタンパク質であって、前記核酸分子が、表Ｉの核酸配列および表ＩＩの核酸配列からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも７０％同一である核酸配列を含む、タンパク質。
【請求項１３】
請求項１０に記載のタンパク質に選択的に結合する、単離された抗体。
【請求項１４】
請求項１０に記載の単離されたタンパク質の活性を阻害し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
請求項１０に記載の単離されたタンパク質と推定阻害性化合物を、該化合物の非存在下では、該タンパク質が活性を有する条件下で、接触させる工程；および
該推定阻害性化合物が、該活性を阻害するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の単離されたタンパク質の活性を阻害し得る化合物を同定するためにキットであって、該試験キットは、以下：
請求項１０に記載の単離されたタンパク質、および
推定阻害性化合物の存在下での該活性の阻害の程度を決定するための手段、
を含む、キット。
【請求項１６】
賦形剤、ならびに以下：（ａ）請求項１に記載の単離された核酸分子、（ｂ）請求項１０に記載の単離されたタンパク質、および（ｃ）請求項１３に記載の単離された抗体、からなる群より選択される化合物を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ノミの頭部および神経束から単離された核酸分子、ノミの後腸およびマルピーギ管から単離された核酸分子、このような核酸分子にコードされるタンパク質、このようなタンパク質に対して惹起された抗体、およびこのようなタンパク質のインヒビターに関する。本発明はまた、このような核酸分子、タンパク質、抗体、および／または他のインヒビターを含む治療用組成物、ならびにその使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
動物のノミ外寄生は、ペットの飼い主の健康上および経済的な関心事である。特に、ノミがかむことは、ペットとして飼われる動物に関する問題である。なぜなら、外寄生は、ペットだけでなく、家が概して昆虫で汚染されているのが見出され得るペットの飼い主に関しても問題である。ノミは、種々の疾患（アレルギーを含む）を直接的に引き起こし、そしてまた、内部寄生性生物（例えば、線虫、条虫、吸虫および原生動物）、細菌およびウイルスを含むがこれらに限定されない種々の感染因子を運搬することが公知である。とりわけ、ノミは、それらが動物上にいる場合だけでなく、動物の環境全体にいる場合にも問題となる。
【０００３】
ノミによる咬傷は、多くの動物において特に問題となる。なぜなら、これらは、疾患として顕在化される、動物における過敏性応答を引き起こし得るからである。例えば、ノミによる咬傷は、ノミアレルギー性（またはアレルギー）皮膚炎（ＦＡＤ）と呼ばれるアレルギー性疾患を引き起こし得る。動物における過敏性応答は、代表的に、局在化した組織炎症および損傷を生じ、その動物に対する実質的な不快感を引き起こす。
【０００４】
ノミの外寄生の医療的重大性は、ノミ外寄生を制御し得る試薬の開発を促してきた。ノミ外寄生を制御するための一般的に遭遇する方法は、一般的に殺虫剤の使用に集中しており、殺虫剤の使用は、以下の理由の１つ以上のためにしばしば失敗する：（１）飼い主が従順でないこと（頻繁な投与が必要とされる）；（２）殺虫剤製品または投与手段に対してペットが行動的にまたは生理学的に耐えられないこと；および（３）所定の用量の殺虫剤に対して耐性のノミ集団の発生。
【０００５】
従って、動物をノミ外寄生から保護するための試薬および方法を開発する必要性が残存している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、ノミ外寄生から動物を保護するための新規な産物およびプロセスに関する。
【０００７】
本発明は、ノミ頭部および神経束（ＨＮＣ）タンパク質およびノミ後腸およびマルピーギ管（ＨＭＴ）タンパク質；ノミＨＮＣタンパク質およびノミＨＭＴタンパク質このようなタンパク質に対して惹起された抗体（すなわち、それぞれ抗ノミＨＮＣ抗体および抗ノミＨＭＴ抗体）；このようなタンパク質または抗体のミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）；ならびにノミＨＮＣ活性またはノミＨＭＴ活性を阻害する化合物（すなわち、阻害性化合物またはインヒビター）を提供する。
【０００８】
本発明はまた、このようなタンパク質、ミメトープ、核酸分子、抗体および阻害性化合物を得る方法を包含する。本発明はまた、このような阻害性化合物を同定するためのタンパク質および抗体の使用、ならびにこのような阻害性化合物を同定するためのアッセイキットを包含する。本発明のタンパク質、ミメトープ、核酸分子、抗体および阻害性化合物（ＨＮＣタンパク質および／またはＨＭＴタンパク質の活性を阻害する、本発明のタンパク質から誘導される保護的化合物を含む）を含む治療用組成物もまた本発明に包含され；ノミ外寄生を低減するためのこのような治療用化合物の使用もまた包含される。
【０００９】
本発明の一実施形態は、３０％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、表Ｉおよび／もしくは表ＩＩの核酸配列、または表Ｉおよび／もしくは表ＩＩの核酸配列に相補的な核酸配列からなる群から選択される核酸分子にハイブリダイズする単離された核酸分子である。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、表Ｉおよび／もしくは表ＩＩの核酸配列またはその相補体に対して少なくとも７０％同一である核酸配列、ならびにこのような配列のフラグメントを有する単離された核酸分子である。
【００１１】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含む、組換え分子、組換えウイルスおよび組換え細胞に関する。このような核酸分子、組換え分子、組換えウイルスおよび組換え細胞を産生する方法もまた含まれる。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、表Ｉおよび／もしくは表ＩＩの核酸配列にコードされるアミノ酸配列に少なくとも７０％同一である単離されたノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質、ならびにそのフラグメントを包含し、ここでこのようなフラグメントは、それぞれのノミタンパク質に対して免疫応答を誘発し得るか、またはそれぞれのノミタンパク質に匹敵する活性を有し得る。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、３０％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、表Ｉおよび／もしくは表ＩＩの核酸配列の相補体にハイブリダイズする核酸分子にコードされる単離されたタンパク質を包含する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ノミの頭部および／または神経束から単離された核酸分子、ノミの後腸および／またはマルピーギ管から単離された核酸分子、このような核酸分子によりコードされるタンパク質、このようなタンパク質に対して惹起された抗体、およびこのようなタンパク質のインヒビターを提供する。本明細書中で使用される場合、ノミの頭部および／または神経束から単離された核酸分子ならびにこのような核酸分子にコードされるタンパク質はまた、それぞれ、ノミＨＮＣおよび核酸分子およびノミＨＮＣタンパク質、またはＨＮＣ核酸分子およびＨＮＣタンパク質と呼ばれ；そしてノミの後腸および／またはマルピーギ管から単離された核酸分子ならびにこのような核酸にコードされるタンパク質は、それぞれ、ノミＨＭＴ核酸分子およびノミＨＭＴタンパク質、またはＨＭＴ核酸およびＨＭＴタンパク質と呼ばれる。本発明のＨＮＣ核酸分子およびＨＭＴ核酸分子は、それぞれ、ノミＨＮＣ組織およびノミＨＭＴ組織において主に発現される核酸分子であるが、これらは、ＨＮＣおよびＨＭＴ以外のノミ組織由来の細胞において発現され得る。本発明のＨＮＣおよびＨＭＴの核酸分子およびタンパク質は、ノミから単離され得るか、または組換え的にまたは合成的に調製され得る。本発明のＨＭＴ核酸分子およびＨＮＣ核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得；核酸分子の例としては、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、ゲノムＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ分子、ＨＭＴ組織およびＨＮＣ組織由来のメッセンジャーＲＮＡに特異的なタグであるＤＮＡ分子、ならびに対応するｍＲＮＡ分子が挙げられるがこれらに限定されない。とりわけ、本発明のノミ核酸分子は、このような核酸分子が含まれる染色体全体をいうことを意図されないが、本発明のノミＨＭＴｃＤＮＡまたはＨＮＣｃＤＮＡは、全ての領域を含み得る（例えば、このようなｃＤＮＡによりコードされるノミペリトロフィン（ｐｅｒｉｔｒｏｐｈｉｎ）タンパク質の産生を制御する調節領域（例えば、転写制御領域、翻訳制御領域、または翻訳後制御領域であるがこれらに限定されない）、ならびにコード領域自体、および任意のイントロンまたは非翻訳コード領域）。本明細書中で使用される場合、句「ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質」ならびに「ＨＭＴタンパク質およびＨＮＣタンパク質」とは、ノミＨＭＴ組織、ノミＨＮＣ組織、またはノミＨＭＴ組織とノミＨＮＣ組織の両方により発現されるタンパク質をいう。本明細書中で使用される場合、句「ＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子」ならびに「ＨＭＴ核酸分子およびＨＮＣ核酸分子」とは、ＨＭＴｃＤＮＡライブラリー、ＨＮＣｃＤＮＡライブラリー、またはこれら両方のライブラリーから単離され得る核酸分子か、またはそれらに対応する遺伝子をいう。
【００１５】
本発明はまた、ＨＭＴ組織およびＨＮＣ組織に由来するメッセンジャーＲＮＡ分子に特異的なタグである、ＨＭＴＤＮＡ分子およびＨＮＣＤＮＡ分子を提供する。このようなＤＮＡ分子は、メッセンジャーＲＮＡの配列全体または部分配列に対応し得、従って、このようなメッセンジャーＲＮＡ分子に対応するＤＮＡ分子（すなわち、ｃＤＮＡ分子）は、全長タンパク質または部分長のタンパク質をコードし得る。部分長タンパク質をコードする核酸分子は、直接プローブとして使用され得るか、または間接的に、対応するかまたは構造的に関連した全長タンパク質をコードするｃＤＮＡ核酸分子を同定および／または単離するためのプライマーを生成するために使用され得る。このような部分的ｃＤＮＡ核酸分子はまた、同様の様式で使用されて、ゲノム核酸分子（例えば、調節領域、エキソンおよびイントロンを含む完全な遺伝子を含む核酸分子）を同定し得る。部分的ＨＭＴｃＤＮＡ分子およびＨＮＣｃＤＮＡ分子ならびに配列を使用して全長転写物および対応するｃＤＮＡ分子を単離するための方法は、本明細書中以下の実施例に記載される。
【００１６】
本発明のタンパク質および核酸分子は、天然供給源から得られ得るか、または例えば組換え核酸技術または化学的合成を使用して産生され得る。これらのタンパク質および核酸分子ならびにそれらに対する抗体および阻害性化合物の、動物をノミ外寄生から保護するための治療的組成物としての使用ならびに他の（例えば、以下に開示される）適用における使用もまた、本発明に含まれる。
【００１７】
本発明のノミＨＭＴタンパク質およびノミＨＭＴ核酸分子ならびにノミＨＮＣタンパク質およびノミＨＮＣ核酸分子は、抗節足動物ワクチンおよび化学療法薬の新規な標的となるので、有用性を有する。本発明の産物およびプロセスは、ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質が関与する節足動物の発生、変態、摂食、消化および／または再生のプロセスの阻害を可能にするので有利である。
【００１８】
ノミの頭部および神経束（触角、脳、側心体、アラタ体、および下食道（ｓｕｂｅｓｏｐｈａｇｅａｌ）神経節組織および腹部神経節組織を含む）は、興味深い。なぜなら、このような組織は、ニューロン標的および内分泌標的ならびに化学的感覚の受容および機械的感覚の受容に関与する標的をコードする転写物が高度に富化されているからである。ノミ頭部および神経束の核酸配列（本明細書中でＨＮＣ核酸配列と呼ばれる）が富化されたライブラリー由来のｃＤＮＡフラグメントを配列決定することにより、遺伝子およびそれらの各々の全長コード領域（ノミの神経機能および内分泌機能に一体的に関与する）が同定される。一端同定されると、これらの遺伝子は、さらに特徴付けられ、そして特定の干渉ストラテジーが設計される。とりわけ、本発明のノミＨＮＣタンパク質およびノミＨＮＣ核酸分子は、抗節足動物ワクチンおよび化学療法薬のための新規な標的となるので有用性を有する。
【００１９】
ノミのような血液摂食昆虫は、その体重に対して大量の血液を摂取し、そして、とりわけ、急速な水の排除により摂取した血液食の体積を減少させるように適合される。さらに、血液食中のナトリウムイオン、カリウムイオン、および塩化物イオンの濃度は、ノミの血液リンパ中の濃度よりも高くなり、これらのイオンの過剰量を排泄する必要がある。血液リンパからマルピーギ管および後腸の管腔へのこれらのイオンの能動輸送は、これらの器官への水および他の血液リンパ内容物の受動輸送を駆動する。これらの器官を通過しながら、血液リンパからの老廃物は、排泄され、そして必要な栄養素、水および塩は再吸収される。とりわけ、これらの必須のプロセスに干渉することは、ノミ集団を制御するための製品を開発するための重要なストラテジーである。後腸およびマルピーギ管の核酸配列（本明細書中でＨＭＴ核酸配列と呼ばれる）を富化されたライブラリー由来のｃＤＮＡフラグメントを配列決定することにより、これらのプロセスに総体的に関与する遺伝子、およびそれらの各全長コード領域が同定される。一旦同定されると、これらの遺伝子は、さらに特徴付けられ、そして特定の干渉ストラテジーが設計され得る。とりわけ、本発明のノミＨＭＴタンパク質およびノミＨＭＴ核酸分子は、抗節足動物ワクチンおよび化学療法薬の新規な標的となるので有用性を有する。
【００２０】
本発明の一実施形態は、ノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質を含む単離されたタンパク質である。用語（「ａ」または「ａｎ」）実体とは、１つ以上の実体をいう；例えば、タンパク質、核酸分子、抗体、そして治療組成物とは、「１つ以上」または少なくとも１つの」タンパク質、核酸分子、抗体および治療組成物をそれぞれいう。とりわけ、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書中において交換可能に使用され得る。用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、交換可能に使用され得ることにも留意すべきである。本発明によれば、単離されたかまたは生物学的に純粋なタンパク質は、天然環境から取り出されたタンパク質である。とりわけ、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、タンパク質が精製された程度を反映する必要はない。本発明の単離されたタンパク質は、その天然供給源から得られ得るか、組換えＤＮＡ技術を使用して産生され得るか、または化学的合成により産生され得る。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、本発明の単離されたノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質は、全長タンパク質またはこのようなタンパク質の任意のホモログであり得る。本発明の単離されたタンパク質（ホモログを含む）は、ノミＨＭＴタンパク質および／ＨＮＣタンパク質に対して免疫応答を誘発するタンパク質の能力によって、またはタンパク質のＨＭＴ活性および／またはＨＮＣ活性によって、直接的な様式で同定され得る。ノミＨＭＴホモログタンパク質およびＨＮＣホモログタンパク質の例としては、アミノ酸が欠失した（例えば、短縮型のタンパク質（例えば、ペプチド））、挿入された、反転した、置換されたおよび／または誘導体化された（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、および／またはグリセロホスファチジルイノイシトールの付加による）ノミＨＭＴタンパク質およびＨＮＣタンパク質が挙げられ、その結果、このホモログは、ノミＨＭＴタンパク質またはＨＮＣタンパク質に対して免疫応答を誘発し得、そして／あるいはノミＨＭＴタンパク質またはＨＮＣタンパク質に対して指向された抗体に結合し得る少なくとも１つのエピトープを含む。すなわち、このホモログが当業者に公知の技術を使用して、免疫原として動物に投与される場合、この動物は、天然のノミＨＭＴタンパク質またはＨＮＣタンパク質の少なくとも１つのエピトープに対して免疫応答を生じる。タンパク質が免疫応答をもたらす能力は、当業者に公知の技術を使用して測定され得る。本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」とは、抗体の抗原結合部位またはＴ細胞レセプターに選択的に結合し得るタンパク質または他の抗原の最も小さな部分をいう。最小のサイズのタンパク質エピトープが、約４〜６個のアミノ酸であることは、当業者によって十分に受け入れられている。当業者によって理解されるように、エピトープとしては、天然において互いに連続するアミノ酸、ならびに天然のタンパク質の３次構造に起因して、十分に密接に近位にあり、エピトープを形成するアミノ酸が挙げられ得る。本発明に従って、エピトープは、少なくとも４アミノ酸長、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも３５アミノ酸長、少なくとも４０アミノ酸長、または少なくとも５０アミノ酸長を含むタンパク質の部分を含む。
【００２２】
本発明の１つの実施形態において、ノミホモログタンパク質は、ＨＭＴ活性またはＨＮＣ活性を有する。すなわち、このホモログは、その天然の対応物に類似の活性を示す。このような活性を検出および測定するための方法は、当業者に公知である。
【００２３】
ノミＨＭＴホモログタンパク質および／またはＨＮＣホモログタンパク質は、天然の対立遺伝子改変または天然の変異の結果であり得る。本発明のノミＨＭＴタンパク質ホモログおよび／またはＨＮＣタンパク質ホモログはまた、例えば、ランダムな変異誘発または標的化された変異誘発をもたらすための古典的技術または組換えＤＮＡ技術を使用する、タンパク質に対する直接的な改変またはこのタンパク質をコードする遺伝子の改変を含む（これらに限定されない）当該分野で公知の技術を使用して作製され得る。
【００２４】
本発明のノミＨＭＴタンパク質およびＨＮＣタンパク質は、それぞれ、ノミＨＭＴ核酸分子およびＨＮＣ核酸分子によってコードされる。本明細書中で使用される場合、ノミＨＭＴ核酸分子およびＨＮＣ核酸分子は、天然のノミＨＭＴ遺伝子およびＨＮＣ遺伝子、好ましくは、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓＨＭＴ遺伝子およびＨＮＣ遺伝子に関連する核酸を含む。本明細書中で使用される場合、ノミＨＭＴ遺伝子およびＨＮＣ遺伝子は、このような遺伝子によってコードされるノミＨＭＴタンパク質およびＨＮＣタンパク質の産生を制御する調節領域（例えば、限定しないが、転写制御領域、翻訳制御領域または翻訳後制御領域）、ならびにそのコード領域、ならびに任意のイントロンまたは非翻訳コード領域のような全ての領域を含む。本明細書中で使用される場合、配列を「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」核酸分子は、１つの連続したアレイでその配列を含み得るか、またはノミ遺伝子についてしばしば見出されるようなフラグメント化エキソンとしてその配列を含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「コード領域」とは、タンパク質に翻訳される連続した線形アレイのヌクレオチドをいう。全長コード領域は、全長に翻訳されるコード領域（すなわち、任意の翻訳後改変の前の、その天然の環境において最初に翻訳される完全なタンパク質）である。表Ｉは、本発明の種々のノミＨＮＣ核酸分子を示す。
【００２５】
【表１】
2005512520.tif 000002
表ＩＩは、本発明の種々のノミＨＭＴ核酸分子を示す。
【００２６】
【表２】
2005512520.tif 000003
2005512520.tif 000004
2005512520.tif 000005
2005512520.tif 000006
2005512520.tif 000007
表ＩＩＩは、本発明の核酸分子についての最も高いＢｌａｓｔヒットを示す。
【００２７】
【表３】
2005512520.tif 000008
2005512520.tif 000009
2005512520.tif 000010
2005512520.tif 000011
2005512520.tif 000012
2005512520.tif 000013
2005512520.tif 000014
2005512520.tif 000015
１つの実施形態において、本発明の遺伝子または他の核酸分子は、表Ｉおよび／または表ＩＩのＣ．ｆｅｌｉｓ核酸配列、あるいはその相補体に類似するが同一ではない配列を含む対立遺伝子改変体であり得る。例えば、配列番号１を含むＣ．ｆｅｌｉｓ遺伝子の対立遺伝子改変体は、配列番号１を含む遺伝子と、ゲノムにおいて本質的に同じ遺伝子座にて存在するが、例えば、変異または組換えによって引き起こされる天然のバリエーションに起因して、類似するが同一ではない配列を有する遺伝子である。天然の選択は、代表的に、機能に影響する変更を選択するので、対立遺伝子改変体（すなわち、引用される核酸配列に対応する対立遺伝子、または引用される核酸配列の対立遺伝子）は、通常、これらが比較される遺伝子によってコードされるタンパク質の活性に類似の活性を有するタンパク質をコードする。遺伝子または核酸分子の対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の５’非翻訳領域または３’非翻訳涼気（すなわち、調節制御領域）に変更を含み得るか、または初期の転写物の選択的スプライシングと、それによって、代替的なエキソンを近位にもってくることを含み得る。対立遺伝子改変体は、当該分野において周知であり、所定のノミ（例えば、Ｃ．ｆｅｌｉｓ）において天然に生じることが期待される。なぜなら、このゲノムは、二倍体であり、性生殖が、対立遺伝子の再分類（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を生じるからである。
【００２８】
本発明の１つの実施形態において、単離されたＨＭＴタンパク質および／ＨＮＣタンパク質は、それぞれ、ノミＨＭＴタンパク質およびＨＮＣタンパク質をコードする遺伝子または他の核酸分子に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる。本発明のＨＭＴタンパク質およびＨＮＣタンパク質の最小のサイズは、対応する天然のタンパク質をコードする核酸分子の相補的配列との安定なハイブリッドを形成し得る（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る）核酸分子によってコードされるのに十分な大きさである。このようなタンパク質をコードする核酸分子のサイズは、核酸の組成、およびノミＨＭＴ核酸分子またはＨＮＣ核酸分子と相補的な核酸配列との間の相同性の％に依存する。ストリンジェントな条件下で安定なハイブリッドを形成するのに必要とされる相同性の程度は、相同な配列が所定の核酸全体ににわたって散在するか、または所定の核酸分子の異なる領域にクラスター化される（すなわち、局在化する）かに依存して変化し得ることが容易に理解され得る。
【００２９】
ノミＨＭＴタンパク質またはＨＮＣタンパク質をコードする遺伝子と安定なハイブリッドを形成し得る核酸分子の最小のサイズは、代表的に、核酸分子がＧＣ−リッチである場合、少なくとも約１２〜約１５ヌクレオチド長であり、そしてＡＴリッチである場合、少なくとも約１５〜約１７塩基である。本発明のＨＭＴタンパク質ホモログまたはＨＮＣタンパク質ホモログをコードするために使用される核酸分子の最小のサイズは、約１２〜約１８ヌクレオチド長である。従って、本発明のＨＭＴタンパク質ホモログまたはＨＮＣタンパク質ホモログの最小のサイズは、約４〜約６アミノ酸長である。本発明のノミＨＭＴタンパク質またはＨＮＣタンパク質をコードする核酸分子の最大サイズについて、実際的な制限以外に制限はない。なぜなら、本発明の核酸分子は、遺伝子の一部、遺伝子全体、または複数の遺伝子を含み得るからである。本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質の好ましいサイズは、このようなタンパク質の全長、融合、多価、または機能性部分が望ましいか否かに依存する。
【００３０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、核酸分子がハイブリダイズされる遺伝子の規定の物理的特性に基づいて決定され、そして数学的に規定され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者が、異種核酸分子間の有意な類似性を同定し得る実験的パラメーターである。これらの条件は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ，ａｎｄ  Ｍｅｉｎｋｏｔｈら，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８，２６７−２８４を参照のこと（これらの各々は、本明細書中において、その全体が参考として援用される）。引用参考文献に詳細に記載されるように、ハイブリダイゼーション条件の決定は、イオン強度（Ｍ、モル／リットル）、ハイブリダイゼーション温度（℃）、核酸螺旋不安定化剤（例えば、ホルムアミド）の濃度、最も短いハイブリッド二重鎖の平均長（ｎ）、および未知の核酸分子がハイブリダイズされるフラグメントのＧ＋Ｃの組成の％を含む１セットの変数の操作を含む。少なくとも約１５０ヌクレオチドの核酸分子について、これらの変数は、所定の核酸分子の融解温度（すなわちＴｍ）を計算するための標準的な数学的式に挿入される。以下の式に規定されるように、Ｔｍは、２つの相補的な核酸分子鎖が解離する温度であり、２つの鎖間の１００％の相補性を想定する：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６ｌｏｇＭ＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−５００／ｎ−０．６１（％ホルムアミド）。
約５０ヌクレオチドより小さい核酸分子について、ハイブリッド安定性は、解離温度（Ｔｄ）によって規定され、これは、５０％の２重鎖が解離する温度として規定される。これらの小さな分子について、標準的なイオン強度における安定性は、以下の式によって規定される：
Ｔｄ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）。
Ｔｄより５℃下の温度は、完全に一致した分子間のハイブリダイゼーションを検出するために使用される。
【００３１】
どのような塩基対のミスマッチ（すなわち、比較される２つの核酸分子間の違い（所定の位置における塩基の非相補性、および比較される核酸分子のいずれかの所定の位置における１つ以上の塩基の挿入または欠失に起因したギャップを含む））が、異なるサイズの核酸分子についてのＴｍまたはＴｄに影響するかもまた、当業者に周知である。例えば、Ｔｍは、約１５０ｂｐより大きいハイブリッドについて、各１％ミスマッチした塩基対につき約１℃低下し、そしてＴｄは、約５０ｂｐ未満のハイブリッドについて、各ミスマッチした塩基対につき約５℃減少する。約５０塩基対と約１５０塩基対の間のハイブリッドについての条件は、当業者に周知の標準的な実験室手順を使用して、過度な実験なしに、経験的に決定され得る。これらの単純な手順によって、当業者は、ハイブリダイゼーション条件を（例えば、塩濃度、螺旋不安定化化合物濃度、または温度を変えることによって）設定し得、その結果、特定の％の塩基対ミスマッチよりも大きい核酸ハイブリッドのみがハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約３０％（すなわち、少なくとも約７０％の同一性）以下の塩基対ミスマッチを可能にする実験条件であると当業者によって通常理解される。当業者は、試験される所定の核酸分子が、約５０ヌクレオチドより小さいかまたは大きいかを容易に決定し得、従って、ハイブリダイゼーション条件を決定するために適切な式を選択し得るので、この当業者は、この核酸分子が、所定の遺伝子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズスルか否か、および同様に、核酸分子が所望量の塩基対ミスマッチを可能にするように設計された条件下でハイブリダイズするか否かを決定し得る。
【００３２】
ハイブリダイゼーション反応は、しばしば、ハイブリダイズされる核酸分子を固体支持体（例えば、膜）に結合し、次いで、ハイブリダイゼーション溶液中に懸濁された標識された核酸分子（代表的には、プローブと呼ばれる）とハイブリダイズすることによって、実施される。通常のハイブリダイゼーション反応技術の例としては、周知のサザンブロット手順およびノザンブロット手順が挙げられるが、これらに限定されない。代表的には、実際のハイブリダイゼーション反応は、非ストリンジェントな条件下で（すなわち、より低い温度および／またはより高い塩濃度で）実施され、次いで、高いストリンジェンシーは、所望のストリンジェンシーを達成するために、より高い温度および／またはより低い塩濃度の溶液中で膜を洗浄することによって、達成される。
【００３３】
例えば、当業者が、約１５０ｂｐ長以上のノミ核酸分子と、３０％以下の対ミスマッチを可能にする条件下でハイブリダイズする核酸分子を同定することを望む場合、好ましくは、以下の条件が使用され得る。ノミＤＮＡの平均Ｇ＋Ｃ含有量は、公知のノミ核酸配列から計算される場合、約３７％である。未知の核酸分子が支持膜に結合され、そして１５０ｂｐのプローブが、例えば、放射性タグを用いて標識される。ハイブリダイゼーション反応は、約３７℃（低ストリンジェンシー条件）の温度で、螺旋安定化剤の非存在下で、２×ＳＳＣを含む溶液中で実施され得る。異なる濃度のＳＳＣ溶液は、所望の濃度のＳＳＣを得るために、２０×ＳＳＣのストック溶液（１リットルの水中の１７５．３ｇのＮａＣｌおよび約８８．２ｇのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７）を希釈することによって、当業者によって作製され得る。当業者は、３０％までの塩基対ミスマッチを可能にするのに必要とされる洗浄条件を計算する。例えば、螺旋不安定化化合物の非存在下で、１×ＳＳＣを含む洗浄溶液において、完全なハイブリッドのＴｍは、約７７℃である：
８１．５℃＋１６．６ｌｏｇ（０．１５Ｍ）＋（０．４１×０．３７）−（５００／１５０）−（０．６１×０）＝７７．５℃。
従って、約３０％塩基対ミスマッチを有する核酸分子とのハイブリダイゼーションを達成するために、ハイブリダイゼーション洗浄は、４７．５℃以下の温度で実施される。従って、本明細書中に開示される所望の割合の塩基対ミスマッチ、式およびＧ／Ｃ含有量に基づいて、さらなるハイブリダイゼーション温度を計算することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、本明細書中に詳述される配列を有する本発明の核酸分子に対するハイブリダイゼーションについて試験された核酸分子が、１５０ヌクレオチドより長くなるので、３０％までの塩基対ミスマッチを可能にするハイブリダイゼーション反応のＴｍは、４７．５℃から有意に変化しないことが当業者によって理解される。
【００３４】
さらに、２つの核酸配列またはタンパク質配列間の類似性の程度を決定するための市販のコンピュータプログラムが存在することが当該分野において公知である。これらのコンピュータプログラムは、ハイブリッド核酸分子またはタンパク質間の同一性％およびギャップの数および長さを決定するための種々の公知の方法を含む。アミノ酸配列間および核酸配列間の同一性％を決定するための好ましい方法としては、核酸配列またはアミノ酸配列を比較および分析するために設計された１つ以上の市販のコンピュータプログラムを使用する分析を含む。これらのコンピュータプログラムとしては、限定しないが、以下が挙げられる：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから市販される、ＳｅｑＬａｂ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰａｃｋａｇｅＴＭ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０−ＵＮＩＸ（登録商標）配列分析ソフトウェア（本明細書中において、以後、「ＳｅｑＬａｂ」と呼ぶ）；およびＨｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｂｒｕｎｏ，ＣＡから市販される、ＤＮＡｓｉｓ（登録商標）配列分析ソフトウェア，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０。このようなソフトウェアプログラムは、アルゴリズムを使用するためのグラフィカルユーザインターフェースと対にされたアルゴリズムのコレクションを表す。例えば、ＤＮＡｓｉｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０ソフトウェアおよびＳｅｑＬａｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０−ＵＮＩＸ（登録商標）ソフトウェアは、同一性％スコアを得るために、特定のアルゴリズム（２つの配列間のペアの比較を実施するためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム）を使用する。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ  Ｗｕｎｃｈ，Ｃ．Ｄ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３（これは、その全体が、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと。このようなアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む）は、配列を比較するために、核酸およびアミノ酸の配列決定の分野における当業者によって通常、使用される。アミノ酸配列間および核酸配列間の同一性％を決定するための好ましい方法は、ＳｅｑＬａｂ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０−ＵＮＩＸ（登録商標）ソフトウェア（本明細書中において以後「ＳｅｑＬａｂ」）において入手可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用すること、ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリクス、デフォルト値として設定されたギャップ作成ペナルティーおよびギャップ伸長ペナルティー、ならびに最大に設定されたギャップシフト制限（本明細書中において以後、「ＳｅｑＬａｂデフォルトパラメーター」と呼ばれる）を用いるＰａｉｒｗｉｓｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ／Ｇａｐ関数を使用することを含む。アミノ酸配列間および核酸配列間の同一性％を決定するためのさらなる好ましい方法は、５に設定されたギャップペナルティー、５に設定されたトップダイアゴナルの数、１０に設定された固定ギャップペナルティー、２に設定されたｋ−タプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）、５に設定されたウィンドウサイズ、および１０に設定されたフローティ��グギャップペナルティーを用いて、ＤＮＡｓｉｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０ソフトウェア（本明細書中において以後「ＤＮＡｓｉｓ」）において入手可能なＨｉｇｇｉｎｓ−Ｓｈａｒｐアルゴリズムを使用することを含む。アミノ酸配列間および核酸配列間の同一性％を決定するための特に好ましい方法は、ＳｅｑＬａｂデフォルトパラメーターを使用して、ＳｅｑＬａｂソフトウェアにおいて入手可能なＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用することを含む。
【００３５】
好ましいノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質は、表Ｉおよび／または表ＩＩの核酸配列に相補的な核酸配列からなる群より選択される核酸分子と、好ましくは、３０％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、好ましくは、２５％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、好ましくは、２０％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、好ましくは、１５％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、好ましくは、１０％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、好ましくは、５％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、ハイブリダイズする核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、（ａ）ヘリックス不安定化化合物の非存在下で、３７℃の温度で、１×ＳＳＣを含有する溶液中でハイブリダイズさせる工程、および（ｂ）ヘリックス不安定化化合物の非存在下で、４７．５℃の温度で、１×ＳＳＣを含有する溶液中で洗浄する工程を含む条件で、表Ｉおよび／または表ＩＩの核酸配列に相補的な核酸配列からなる群より選択される、単離された核酸分子とハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、ノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質を包含する。
【００３７】
本発明の別の好ましいノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質としては、表Ｉおよび／または表ＩＩの核酸配列を有する核酸分子と、好ましくは少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、好ましくは少なくとも９０％同一、そして好ましくは少なくとも９５％同一である、核酸分子によってコードされるタンパク質が挙げられる；また好ましいものは、少なくとも１８ヌクレオチドの核酸分子によってコードされるようなタンパク質のフラグメント（すなわち、部分）である。同一性の百分率は、本明細書中において使用される場合、デフォルトパラメータを使用するプログラムＤＮＡｓｉｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１において最大に整合させることによって、比較関数を使用して決定される。
【００３８】
本発明のさらなる好ましいノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質としては、表Ｉおよび／または表ＩＩの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質、ならびに表Ｉおよび／または表ＩＩの核酸配列によってコードされるタンパク質のホモログを含むタンパク質が挙げられ、ここで、このようなホモログは、表Ｉおよび／または表ＩＩの核酸配列によってコードされるタンパク質に対して免疫応答を引き起こす、少なくとも１つのエピトープを含む。
【００３９】
１つの実施形態において、好ましいノミＨＭＴまたはＨＮＣタンパク質は、少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、好ましくは少なくとも２５アミノ酸、好ましくは少なくとも３０アミノ酸、好ましくは少なくとも３５アミノ酸、好ましくは少なくとも４０アミノ酸、好ましくは少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、好ましくは少なくとも２００アミノ酸、好ましくは少なくとも２５０アミノ酸、好ましくは少なくとも３００アミノ酸、好ましくは少なくとも３５０アミノ酸、そして好ましくは少なくとも３７５アミノ酸の、アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、好ましいノミＨＭＴおよびＨＮＣタンパク質は、全長タンパク質（すなわち、全長コード領域によってコードされるタンパク質、またはその翻訳後修飾されたタンパク質（例えば、開始メチオニンおよび／またはシグナル配列もしくは「ｐｒｏ」配列が除去された、成熟タンパク質））を含む。
【００４０】
本発明のＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質のフラグメントは、好ましくは、少なくとも５アミノ酸長、好ましくは少なくとも１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５アミノ酸長、好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも２５アミノ酸長、好ましくは少なくとも３０アミノ酸長、好ましくは少なくとも３５アミノ酸長、好ましくは少なくとも４０アミノ酸長、好ましくは少なくとも４５アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５５アミノ酸長、好ましくは少なくとも６０アミノ酸長、好ましくは少なくとも６５アミノ酸長、好ましくは少なくとも７０アミノ酸長、好ましくは少なくとも７５アミノ酸長、好ましくは少なくとも８０アミノ酸長、好ましくは少なくとも８５アミノ酸長、好ましくは少なくとも９０アミノ酸長、好ましくは少なくとも９５アミノ酸長、そして好ましくは少なくとも１００アミノ酸長を含む。
【００４１】
別の実施形態において、本発明の好ましいノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質は、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも３５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも６５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも７５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド長、そして好ましくは少なくとも１１００ヌクレオチド長を含む核酸分子によってコードされる。別の実施形態において、本発明の好ましいノミＨＭＴおよびＨＮＣタンパク質は、それぞれほぼ全長のＨＭＴまたはＨＮＣコード領域を含む核酸分子（すなわち、ほぼ全長のＨＭＴまたはＨＮＣタンパク質をコードする核酸分子）によってコードされる。
【００４２】
本発明の好ましいノミＨＭＴおよびＨＮＣタンパク質は、有効な様式で動物に投与される場合にノミ外寄生からその動物を保護し得る、インヒビターを開発するために使用され得る。本発明に従って、本発明のインヒビターが動物をノミ外寄生から保護する能力とは、そのタンパク質が、例えば、ノミによって引き起こされる外寄生を処置、軽減および／または予防する能力をいう。特に、句「動物をノミ外寄生から保護する」とは、動物およびその周囲でのノミの集団の成長の可能性を低下させること（すなわち、ノミの負荷量を低下させること）をいう。好ましくは、ノミの集団の大きさは、最適には、その動物がノミによってもはや悩まされない程度まで、減少される。宿主動物とは、本明細書中において使用される場合、ノミがその動物に付着し、そしてその動物の皮膚を通して栄養摂取することによって、栄養摂取し得る動物をいう。ノミおよび他の外部寄生生物は、長期間にわたって宿主動物上で生存し得るか、または栄養摂取のために動物に一時的に付着し得る。任意の所定の時点で、ノミ集団の特定の割合が、宿主動物上に存在し得、一方で残りは、その動物の環境内に存在し得る。このような環境としては、成体ノミのみでなく、ノミの卵および／またはノミの幼虫を含み得る。この環境は、この環境中のノミが宿主動物に飛び上がり得、そして宿主動物から飛び降り得るような任意の大きさであり得る。例えば、動物の環境は、ノミが動物に外寄生し得る植物（例えば、穀物）を含み得る。従って、動物自体におけるノミの負荷量を低下させることのみでなく、その動物の環境におけるノミの負荷量を低下させることもまた、望ましい。
【００４３】
標的とするために適切なノミとしては、本発明のインヒビターを投与された動物において本質的に疾患を引き起こし得ない、任意のノミが挙げられる。従って、標的とするノミとしては、ノミＨＭＴまたはＨＮＣタンパク質機能を阻害する阻害性化合物によって標的化され得、それによって、寄生生物が動物において疾患を引き起こす能力を減少させるタンパク質を産生する任意のノミが挙げられる。標的とするために好ましいノミとしては、以下の属のノミが挙げられる：Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ、Ｃｙｏｐｓｙｌｌｕｓ、Ｄｉａｍａｎｕｓ（Ｏｒｏｐｓｙｌｌａ）、Ｅｃｈｉｄｎｏｐｈａｇａ、Ｎｏｓｏｐｓｙｌｌｕｓ、Ｐｕｌｅｘ、Ｔｕｎｇａ、およびＸｅｎｏｐｓｙｌｌａであり、以下の種：Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｃａｎｉｓ、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ、Ｄｉａｍａｎｕｓ  ｍｏｎｔａｎｕｓ、Ｅｃｈｉｄｎｏｐｈａｇａ  ｇａｌｌｉｎａｃｅａ、Ｎｏｓｏｐｓｙｌｌｕｓ  ｆａｃｉａｔｕｓ、Ｐｕｌｅｘ  ｉｒｒｉｔａｎｓ、Ｐｕｌｅｘ  ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｔｕｎｇａ  ｐｅｎｅｔｒａｎｓおよびＸｅｎｏｐｓｙｌｌａ  ｃｈｅｏｐｉｓのものがより好ましく、Ｃ．ｆｅｌｉｓが好ましい。このようなノミは、本発明のタンパク質または核酸分子の単離のためにもまた好ましい。
【００４４】
本発明のノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質の１つの実施形態は、１つ以上の融合セグメントに結合したノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質含有ドメインを含む、融合タンパク質である。本発明において使用するために適切な融合セグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質の安定性を増強し得るセグメント、ノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質に対する免疫応答を増強するための免疫増強物質として作用し得るセグメント；ならびに／あるいはノミＨＭＴ／ＨＮＣタンパク質の精製（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる）を補助し得るセグメント。適切な融合セグメントは、所望の機能（例えば、増加した安定性を付与する、タンパク質に増加した免疫原性を付与する、および／またはタンパク質の精製を簡単にする）を有する任意の大きさのドメインであり得る。融合セグメントは、タンパク質のノミＨＭＴ含有ドメインおよび／またはノミＨＮＣ含有ドメインの、アミノ末端および／またはカルボキシル末端に結合し得、そしてノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質の直接的な回収を可能にするために、切断に対して感受性であり得る。融合タンパク質は、好ましくは、ＨＭＴ含有ドメインおよび／またはＨＮＣ含有ドメインのカルボキシル末端および／またはアミノ末端のいずれかに結合した融合セグメントを含むタンパク質をコードする、融合核酸分子で形質転換された組換え細胞を培養することによって産生される。好ましい融合セグメントは、金属結合ドメイン（例えば、ポリヒスチジンセグメント）；免疫グロブリン結合ドメイン（例えば、プロテインＡ；プロテインＧ；Ｔ細胞；Ｂ細胞；Ｆｃレセプターまたは相補的タンパク質抗体結合ドメイン）；糖結合ドメイン（例えば、マルトース結合ドメイン）；および／または「タグ」ドメイン（例えば、β−ガラクトシダーゼの少なくとも一部、ｓｔｒｅｐタグペプチド、Ｔ７タグペプチド、ＦｌａｇＴＭペプチド、またはそのドメインに結合する化合物を使用して精製され得る他のドメイン（例えば、モノクローナル抗体））を含む。より好ましい融合セグメントは、金属結合ドメイン（例えば、ポリヒスチジンセグメント）；マルトース結合ドメイン；ｓｔｒｅｐタグペプチド（例えば、Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｔａｍｐａ，ＦＬから入手可能なもの）；およびＳ１０ペプチドを含む。
【００４５】
本発明はまた、本発明のノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質のミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を包含する。本明細書中において使用される場合、本発明のノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質のミメトープとは、このようなＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質の活性を模倣し得る（しばしば、ミメトープは、特定のＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質を模倣する構造を有するので）任意の化合物をいう。ミメトープは、以下であり得るが、これらに限定されない：全てＤの逆ペプチド（ｒｅｔｒｏ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のような、分解に対する感受性を低下させるように改変されたペプチド；抗イディオタイプ抗体および／もしくは触媒抗体、またはそのフラグメント；単離されたタンパク質の非タンパク質性免疫原性部分（例えば、炭水化物構造）；ならびに合成または天然の有機分子（核酸が挙げられる）。このようなミメトープは、本発明のタンパク質のコンピュータで作成された構造を使用して、設計され得る。ミメトープはまた、分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたは他の有機分子）の無作為なサンプルを作製し、そしてこのようなサンプルを、対応する結合パートナーを使用するアフィニティークロマトグラフィー技術によって、スクリーニングすることによって、得られ得る。
【００４６】
本発明の別の実施形態は、ノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子を含む単離された核酸分子（すなわち、ＨＭＴ  ｃＤＮＡライブラリーから、ＨＮＣ  ｃＤＮＡライブラリーから、またはこれらの両方のライブラリーから単離され得る核酸分子）である。本明細書中において使用される場合、ＨＭＴおよびＨＮＣ核酸分子は、ＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子と同じ意味を有する。このような核酸分子の同定特徴は、現在までに記載されている。本発明の核酸分子は、単離された天然のノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣ遺伝子またはそのホモログを含み得、これらのうちの後者は、以下にさらに詳細に記載される。本発明の核酸分子は、１つ上の調節領域、全長もしくは部分のコード領域、またはこれらの組み合わせを含み得る。本発明の核酸分子の最小の大きさは、別の核酸分子の相補配列との安定なハイブリッドの形成（すなわち、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーション）を可能にするために十分な大きさである。従って、本発明のＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子の最小の大きさは、１２〜１８ヌクレオチド長である。本発明の核酸分子が単離される、適切な好ましいノミは、本明細書中に開示される。特に好ましいＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子としては、Ｃ．ｆｅｌｉｓ  ＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子である。
【００４７】
本発明に従って、単離された核酸分子は、その天然の環境から除去された（すなわち、ヒトの操作に供された）核酸分子であり、そしてＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体が挙げられ得る。従って、「単離された」とは、核酸分子が精製された程度を反映しない。本発明の単離されたノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子、あるいはそのホモログは、天然の供給源から単離され得るか、あるいは組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはクローニング）または化学合成を使用して産生され得る。単離されたノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子、ならびにそのホモログとしては、例えば、天然の対立遺伝子改変体、ならびに改変が本発明のＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質をコードする核酸分子の能力を実質的に妨害しないような様式で、ヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および／または反転によって改変された核酸分子が挙げられ得る。
【００４８】
ノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子のホモログは、当業者に公知の多数の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書（その全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）を使用して産生され得る。例えば、核酸分子は、種々の技術（古典的な変異誘発および組換えＤＮＡ技術、例えば、部位特異的変異誘発、化学的処理、制限酵素切断、核酸フラグメントの連結、ＰＣＲ増幅、オリゴヌクレオチド混合物の合成、および混合物群を連結して核酸分子の混合物を「構築」すること、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して、改変され得る。核酸分子のホモログは、ノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子とハイブリダイゼーションさせることによってか、あるいは核酸分子によってコードされるタンパク質の機能（例えば、ノミＨＭＴまたはＨＮＣタンパク質の少なくとも１つのエピトープに対して免疫応答を引き起こす能力、あるいはＨＭＴまたはＨＮＣ活性をもたらす能力）をスクリーニングすることによって、選択され得る。
【００４９】
本発明の単離された核酸分子は、本発明の少なくとも１つのノミＨＭＴまたはＨＮＣタンパク質をコードする核酸配列を含み得、このようなタンパク質の例は、本明細書中に開示される。句「核酸分子」とは、主として、物理的な核酸分子をいい、そして句「核酸配列」とは、主として、核酸分子におけるヌクレオチドの配列をいうが、これら２つの句は、特にノミＨＭＴまたはＨＮＣタンパク質をコードし得る核酸分子（または核酸配列）に関して、交換可能に使用され得る。
【００５０】
本発明の好ましい核酸分子は、動物に投与される場合、ノミの外寄生からその動物を保護し得る。以下にさらに詳細に開示されるように、このような核酸分子は、アンチセンスＲＮＡ、三重ヘリックス形成が可能な分子、リボザイム、または他の核酸ベースの薬物化合物であり得るか、またはこれらをコードし得る。さらなる実施形態において、本発明の核酸分子は、保護タンパク質（例えば、本発明のＨＭＴまたはＨＮＣタンパク質）をコードし得、この核酸分子は、例えば、直接注入（すなわち、遺伝子ワクチン）によって、またはビヒクル中（例えば、組換えウイルスワクチンもしくは組換え細胞ワクチン）で、この動物に送達される。
【００５１】
本発明の１つの実施形態において、好ましいノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子は、好ましくは３０％以下の塩基対ミスマッチ、好ましくは２５％以下の塩基対ミスマッチ、好ましくは２０％以下の塩基対ミスマッチ、好ましくは１５％以下の塩基対ミスマッチ、好ましくは１０％以下の塩基対ミスマッチ、そして好ましくは５％以下の塩基対ミスマッチを可能にする条件下で、表Ｉおよび／もしくは表ＩＩの核酸分子、ならびに／または表Ｉおよび／もしくは表ＩＩの核酸分子に相補的な核酸分子とハイブリダイズする、単離された核酸分子を含む。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、ＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子が、１×ＳＳＣを含有する溶液中で、ヘリックス不安定化化合物の非存在下で、４７．５℃の温度で、表Ｉまたは表ＩＩの単離された核酸分子、および／あるいは表Ｉまたは表ＩＩの核酸分子に相補的な核酸分子にハイブリダイズする、ＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子を包含する。本発明のさらなる好ましい核酸分子は、単離された核酸分子のオリゴヌクレオチドを含む、ここで、この核酸分子は、１×ＳＳＣを含有する溶液中で、ヘリックス不安定化化合物の非存在下で、４７．５℃の温度で、表Ｉまたは表ＩＩの単離された核酸分子、および／あるいは表Ｉまたは表ＩＩの核酸分子に相補的な核酸分子にハイブリダイズし、ここで、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１８のヌクレオチドを含む。
【００５３】
本発明のさらなる好ましいノミＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子はとしては、表Ｉまたは表ＩＩの核酸配列、ならびに／あるいは表Ｉまたは表ＩＩの核酸配列と相補的な核酸配列に対して、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、そして好ましくは少なくとも９５％同一な核酸配列を含む、核酸配列が挙げられる。また好ましいものは、このような核酸分子のいずれかのオリゴヌクレオチドである。同一性の百分率は、デフォルトパラメータを使用して、ＳｅｑＬａｂ配列分析ソフトウェアを使用して、決定され得る。
【００５４】
本発明の別の好ましい核酸分子は、表Ｉまたは表ＩＩの核酸配列の少なくとも一部、ならびにこれらの核酸配列を有する核酸分子の対立遺伝子改変体およびこれらの核酸配列を有する核酸分子のホモログを含む；好ましくは、このようなホモログは、表Ｉおよび／または表ＩＩの核酸配列によってコードされるタンパク質に対して免疫応答を引き起こす、少なくとも１つのエピトープをコードする核酸分子をコードするか、またはこの核酸分子に相補的である。このような核酸分子としては、配列番号に含まれるものに加えて、全長遺伝子、全長コード領域、融合タンパク質をコードする核酸分子、または多価保護化合物をコードする核酸分子のようなヌクレオチドが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明のＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子は、表Ｉおよび／または表ＩＩの配列を有する核酸分子によってコードされるタンパク質に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、そして好ましくは少なくとも１００％同一のタンパク質をコードする。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明のＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子は、表Ｉおよび／または表ＩＩの配列を有する核酸分子によってコードされるタンパク質に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、そして好ましくは少なくとも１００％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本発明はまた、表Ｉおよび／または表ＩＩの配列を有する核酸分子によってコードされるタンパク質の少なくとも一部を有するタンパク質をコードするＨＭＴおよび／またはＨＮＣ核酸分子、ならびにこれらの配列を有するタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体を含み、核酸分子が発現される細胞のコドン利用特性に適合するように改変された核酸分子が挙げられる。
【００５７】
別の実施形態において、本発明の好ましいノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも３５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも４５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも５５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも６５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも７５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド長、そして好ましくは少なくとも１１００ヌクレオチド長を含む核酸分子を含む。
【００５８】
別の実施形態において、好ましいノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子は、少なくとも５アミノ酸長、好ましくは少なくとも６アミノ酸長、好ましくは少なくとも１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５アミノ酸長、好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、好ましくは少なくとも２５アミノ酸長、好ましくは少なくとも３０アミノ酸長、好ましくは少なくとも４０アミノ酸長、好ましくは少なくとも５０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長、好ましくは少なくとも２００アミノ酸長、好ましくは少なくとも３００アミノ酸長、そして好ましくは少なくとも３５０アミノ酸長を含むタンパク質をコードする。
【００５９】
別の実施形態において、本発明の好ましいノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子は、明らかに全長のＨＭＴコード領域および／またはＨＮＣコード領域を含む。すなわち、好ましい核酸分子は、明らかに全長のＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質、あるいはその翻訳後修飾タンパク質をコードする。１実施形態において、本発明の好ましいＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子は、成熟タンパク質をコードする。
【００６０】
本発明の特定のノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子の核酸配列を知ることは、当業者が例えば以下を行うことを可能にする：（ａ）これらの核酸分子のコピーを作製すること、（ｂ）このような核酸分子（例えば、全長遺伝子、全長コード領域、調節制御配列、短縮コード領域を含む核酸分子）の少なくとも一部を含む核酸分子を得ること、ならびに（ｃ）他のノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子を得ること。このような核酸分子は、本発明の抗体を用いて適切な発現ライブラリーをスクリーニングすること；適切なライブラリーをスクリーニングするための、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用する従来のクローニング技術；および本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、適切なライブラリーまたはＤＮＡのＰＣＲ増幅、を包含する種々の方法で獲得され得る。核酸分子がスクリーニングまたは増幅される好ましいライブラリーとしては、ノミ１齢幼虫、３齢幼虫、歩き回る（ｗａｎｄｅｒｉｎｇ）幼虫、前蛹幼虫、蛹、および全成虫のノミｃＤＮＡライブラリーならびにゲノムＤＮＡライブラリーが挙げられる。同様に、核酸分子がスクリーニングまたは増幅される好ましいＤＮＡ供給源としては、ノミ前蛹ｃＤＮＡ、成虫ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが挙げられる。遺伝子をクローニングおよび増幅するための技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書において開示される。
【００６１】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸分子（例えば、Ｃ．ｆｅｌｉｓ  ＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子あるいは他のノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子を含む）の他の（好ましくはより長い）相補的領域とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである核酸分子を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそのいずれかの誘導体であり得る。このようなオリゴヌクレオチドの最少サイズは、オリゴヌクレオチドと本発明の核酸分子上の相補的配列との間の安定なハイブリッドの形成に必要なサイズである。本発明の好ましいオリゴヌクレオチドは、好ましくは１００〜２００ヌクレオチドの最大サイズを有する。本発明は、例えば、核酸分子を同定するためのプローブ、核酸分子を生成するためのプライマー、またはノミＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の生成もしくは活性を阻害するための治療試薬（例えば、アンチセンスベースの試薬、三重鎖形成ベースの試薬、リボザイムベースの試薬、および／またはＲＮＡ薬物ベースの試薬）として使用され得るオリゴヌクレオチドを含む。本発明はまた、１つ以上のこのような技術を使用する、疾患から動物を保護するためのこのようなオリゴヌクレオチドの使用を含む。適切なオリゴヌクレオチド含有治療組成物は、当業者に公知の技術を使用して動物に投与され得る。
【００６２】
本発明の１実施形態は、宿主細胞へと核酸分子を送達し得る任意のベクター中に挿入された、本発明の少なくとも１つの単離された核酸分子を含む、組換えベクターを含む。このようなベクターは、異種核酸配列を含み、この異種核酸配列は、本発明の核酸分子に隣接して天然に見いだされることのない核酸分子であり、そして好ましくは、この核酸分子が由来する種以外の種に由来する。このベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか、原核生物または真核生物のいずれかであり得、そして代表的には、ウイルスまたはプラスミドである。組換えベクターは、本発明のノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子のクローニング、配列決定、および／または他の操作において有用であり得る。
【００６３】
本明細書中で組換え分子と称される１つの型の組換えベクターは、発現ベクターに作動可能に連結された本発明の核酸分子を含む。句、作動可能に連結される、とは、核酸分子が、宿主細胞中に形質転換された場合に発現され得るような様式で、発現ベクター中にこの分子を挿入することをいう。本明細書中で使用する場合、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し得、そして特定の核酸分子の発現をもたらし得る、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製可能である。発現ベクターは、原核生物または真核生物のいずれかであり得、そして代表的にはウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、本発明の組換え細胞（細菌細胞、真菌細胞、寄生生物細胞、昆虫細胞、他の動物細胞および植物細胞を含む）中で機能する（すなわち、遺伝子発現を指向する）、任意のベクターを含む。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞、そして好ましくは本明細書中に開示される細胞型において遺伝子発現を指向し得る。
【００６４】
特に、本発明の発現ベクターは、調節配列（例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および組換え細胞に適合性であり、かつ本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列）を含む。特に、本発明の組換え分子は、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長および終結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、転写開始を制御する配列（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列およびリプレッサー配列）である。適切な転写制御配列としては、本発明の組換え細胞の少なくとも１つにおいて機能し得る任意の転写制御配列が挙げられる。種々のこのような転写制御配列は、当業者に公知である。好ましい転写制御配列としては、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞および哺乳動物細胞において機能する配列が挙げられ、以下があるが、これらに限定されない：ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージλ（例えば、λｐＬおよびλｐＲ、ならびにこのようなプロモーターを含む融合物）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、α接合因子、Ｐｉｃｈｉａアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アライグマポックスウイルス、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（例えば、最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス長末端反復、ラウス肉腫ウイルス、ヒートショック、ホスフェート転写制御配列およびニトレート転写制御配列、ならびに原核生物細胞または真核生物細胞において遺伝子発現を制御し得る他の配列。さらなる適切な転写制御配列としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。本発明の転写調節配列はまた、ノミ（例えば、Ｃ．ｆｅｌｉｓ）転写調節配列と天然に関連する、天然に存在する転写制御配列を含み得る。
【００６５】
本発明の組換えベクターに含めるのに適切かつ好ましい核酸分子は、本明細書中に開示されるような核酸分子である。組換えベクター、および特に組換え分子に含めるのに好ましい核酸分子としては、表Ｉおよび／または表ＩＩの配列を有する核酸分子が挙げられる。
【００６６】
本発明の組換え分子はまた、（ａ）分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）を含んで、本発明の発現されたノミタンパク質が、このタンパク質を産生する細胞から分泌されることを可能にし、そして／または（ｂ）融合タンパク質としての本発明の核酸分子の発現を導く融合配列を含む。適切なシグナルセグメントの例としては、本発明のタンパク質の分泌を指向し得る任意のシグナルセグメントが挙げられる。好ましいシグナルセグメントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性およびウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメント。融合セグメント核酸によってコードされる適切な融合セグメントは、本明細書中に開示される。さらに、本発明の核酸分子は、コードされたタンパク質をプロテオソームに指向させる融合セグメント（例えば、ユビキチン融合セグメント）に連結され得る。真核生物組換え分子はまた、本発明の核酸分子の核酸配列を取り囲むか、そして／または本発明の核酸分子の核酸配列内の、介在配列および／または非翻訳配列を含み得る。
【００６７】
本発明の別の実施形態は、１つ以上の本発明の組換え分子で形質転換された宿主細胞を含む組換え細胞を含む。細胞への核酸分子の形質転換は、核酸分子が細胞中に挿入され得る任意の方法によって達成され得る。形質転換技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着およびプロトプラスト融合。組換え細胞は、単細胞のままであり得るか、あるいは組織、器官または多細胞組織へと増殖し得る。細胞株とは、トランスジェニック動物ではない本発明の任意の組換え細胞をいうことが、留意されるべきである。本発明の形質転換した核酸分子は、染色体外に残り得るか、またはこの核酸分子が発現される能力を保持するような様式で、形質転換された（すなわち、組換えられた）細胞の染色体内の１つ以上の部位に組み込まれ得る。細胞を形質転換するために好ましい核酸分子としては、本明細書中に開示されるＣ．ｆｅｌｉｓ  ＨＭＴ核酸分子およびＨＮＣ核酸分子が挙げられる。細胞を形質転換するために好ましい核酸分子としては、表Ｉおよび／または表ＩＩの配列を有する核酸分子が挙げられる。
【００６８】
形質転換するのに適切な宿主細胞としては、本発明の核酸分子で形質転換され得る任意の細胞が挙げられる。宿主細胞は、形質転換されていない細胞、あるいは少なくとも１つの核酸分子（例えば、本発明の１つ以上のタンパク質および／または多価ワクチンの生成において有用な他のタンパク質をコードする核酸分子）ですでに形質転換された細胞のいずれかであり得る。本発明の宿主細胞は、本発明のノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質を内因的に（すなわち、天然に）生成し得るか、あるいは本発明の少なくとも１つの核酸分子で形質転換された後に、このようなタンパク質を生成し得るかのいずれかであり得る。本発明の宿主細胞は、本発明の少なくとも１つのタンパク質を生成し得る任意の細胞であり得、そして細菌細胞、真菌（酵母を含む）細胞、寄生生物（蠕虫、原生生物および外寄生生物を含む）細胞、他の昆虫細胞、他の動物細胞および他の植物細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞としては、細菌細胞、ミコバクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。より好ましい宿主細胞としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、ＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞株）、ＣＲＦＫ細胞（Ｃｒａｎｄｅｌｌネコ腎臓細胞株）、ＣＶ−１細胞（例えば、アライグマポックスウイルスを培養するために使用される、アフリカモンキー腎臓細胞株）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）細胞およびＶｅｒｏ細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２誘導体を含む）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ＵＫ−１χ３９８７およびＳＲ−１１χ４０７２のような弱毒化株を含む）；Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ；ＢＨＫ細胞；ＭＤＣＫ細胞；ＣＲＦＫ細胞；ＣＶ−１細胞；ＣＯＳ細胞；Ｖｅｒｏ細胞；および非腫瘍原性マウス筋芽細胞Ｇ８細胞（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １２４６）である。さらなる適切な哺乳動物細胞宿主としては、他の腎臓細胞株、他の繊維芽細胞細胞株（例えば、ヒト、マウスまたはニワトリの胚繊維芽細胞株）、骨髄腫細胞株、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＬＭＴＫ３１細胞および／またはＨｅＬａ細胞が挙げられる。１実施形態において、これらのタンパク質は、免疫グロブリンプロモーターを使用して、骨髄腫細胞株において異種タンパク質として発現され得る。
【００６９】
組換え細胞は、好ましくは、１つ以上の組換え分子で宿主細胞を形質転換することによって生成され、その各々が、１つ以上の転写制御配列を含む発現ベクターに作動可能に連結された本発明の１つ以上の核酸分子を含み、これらの例は、本明細書中に開示される。句、作動可能に連結される、は、核酸分子が宿主細胞へと形質転換される場合に発現されるのを可能にするような様式で、発現ベクター中にこの分子が挿入されることをいう。
【００７０】
本発明の組換え細胞は、本発明の任意の核酸分子の少なくとも１つで形質転換された任意の細胞を含む。細胞に移入される、適切かつ好ましい核酸分子ならびに適切かつ好ましい組換え分子は、本明細書中に開示される。
【００７１】
本発明の組換え細胞はまた、本明細書中に開示されるような、本発明の１つ以上のタンパク質をコードするノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子を含む１つ以上の組換え分子、ならびに（例えば、多価ワクチンを生成するための）１つ以上の他の保護的化合物をコードする他の核酸分子で、同時形質転換され得る。
【００７２】
組換えＤＮＡ技術は、例えば、宿主細胞内の形質転換した核酸分子のコピー数、これらの核酸分子が転写される効率、得られた転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換した核酸分子の発現を改善するために使用され得る。本発明の核酸分子の発現を増大させるために有用な組換え技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸分子を、高コピー数プラスミドに作動可能に連結させること、１つ以上の宿主細胞染色体への、核酸分子の組み込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御配列（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御配列（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガルノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン用法に対応するような、本発明の核酸分子の改変、転写物を不安定化させる配列の欠失、ならびに発酵の間に、組換え酵素生成から組換え細胞の増殖を時間的に分離する制御シグナルの使用。本発明の発現された組換えタンパク質の活性は、このようなタンパク質をコードする核酸分子を、フラグメント化、改変または誘導体化することによって、改善され得る。
【００７３】
本発明の単離されたノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質は、天然のタンパク質の生成および回収、組換えタンパク質の生成および回収、ならびにタンパク質の化学合成を含む種々の方法で生成され得る。１実施形態において、本発明の単離されたタンパク質は、タンパク質を効率的に生成する条件下で、このタンパク質を発現し得る細胞を培養し、そしてこのタンパク質を回収することによって生成される。培養に好ましい細胞は、本発明の組換え細胞である。効率的な培養条件としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タンパク質生成を可能にする、効率的な培地、バイオリアクタ、温度、ｐＨおよび酸素の条件。効率的な培地とは、本発明のノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質を生成するために細胞が培養される任意の培地をいう。このような培地は、代表的に、同化可能な炭素、窒素およびリン供給源、ならびに適切な塩、鉱物、金属および他の栄養素（例えば、ビタミン）を含む水性培地を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクタ、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿において培養され得る。培養は、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含量で実施され得る。このような培養条件は、当業者の技術範囲内である。適切な条件の例は、実施例の節に含まれる。
【００７４】
生成のために使用されるベクターおよび宿主系に依存して、得られた本発明のタンパク質は、組換え細胞内で維持され得るか；発酵培地中に分泌され得るか；２つの細胞膜の間の空間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔）に分泌され得るか；または細胞もしくはウイルスの膜の外部表面上に保持され得る。
【００７５】
句「タンパク質を回収する」、ならびに類似の句は、タンパク質を含む全発酵培地を収集することをいい、分離または精製のさらなる工程を含意する必要はない。本発明のタンパク質は、種々の標準的なタンパク質精製技術（例えば、限定ではなく、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、等電点電気泳動および差示的可溶化）を使用して精製され得る。本発明のタンパク質は、好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書中で使用する場合、「実質的に純粋」とは、治療組成物または診断剤としてのこのタンパク質の有効な使用を可能にする純度をいう。例えば、動物用の治療組成物は、実質的な毒性を示すべきではなく、そして好ましくは、処置された動物において抗体の産生を刺激することができるべきである。
【００７６】
本発明はまた、本発明のノミＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質またはそのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）に選択的に結合する、単離された（すなわち、その天然の環境から回収された）抗体（例えば、抗Ｃ．ｆｅｌｉｓ  ＨＭＴ抗体または抗Ｃ．ｆｅｌｉｓ  ＨＮＣ抗体）を包含する。本明細書中で使用する場合、用語、ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質「に選択的に結合する」とは、本発明の抗体が、本発明の特定のタンパク質およびそのミメトープに優先的に結合する能力をいう。結合は、以下を含む当該分野で標準的な種々の方法を使用して、測定され得る：酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、イムノブロットアッセイなど；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書およびＨａｒｌｏｗら、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと；Ｈａｒｌｏｗら、同書は、その全体が本明細書中で参考として援用される。本発明の抗ＨＭＴ抗体または抗ＨＮＣ抗体は、好ましくは、そのタンパク質の機能を阻害するような方法で、それぞれ、ノミＨＭＴタンパク質またはＨＮＣタンパク質に選択的に結合する。
【００７７】
本発明の単離された抗体としては、血清中の抗体、または種々の程度に生成された抗体が挙げられ得る。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得、抗体フラグメントおよび遺伝子操作された抗体（単鎖抗体または１つ以上のエピトープに結合し得るキメラ抗体が挙げられる）のような機能的等価物であり得る。
【００７８】
本発明の抗体を生成するための好ましい方法は、有効量の本発明のタンパク質、ペプチド、そのミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）を動物に投与して、抗体を生成する工程、および（ｂ）その抗体を回収する工程を包含する。別の方法において、本発明の抗体は、本発明のＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質を生成するためにこれまで開示されたような技術を使用して、組換え生成される。所定のタンパク質またはミメトープに対して惹起された抗体は、有利であり得る。なぜなら、このような抗体は、他の物質に対する抗体で実質的に汚染されず、他の場合には、診断アッセイにおける妨害も、治療的組成物において使用される場合に副作用も引き起こさないからである。
【００７９】
本発明の抗体は、本発明の範囲内である種々の潜在的な用途を有する。例えば、このような抗体は、（ａ）このような抗体による処置に感受性の強いノミ類から動物を防御するために、動物を受動的に免疫するための治療的組成物として、および／または（ｂ）発現ライブラリーをスクリーニングするためのおよび／または本発明の所望のタンパク質を、タンパク質と他の夾雑物の混合物から回収するためのツールとして、使用され得る。さらに、本発明の抗体は、ノミ類を直接死滅するために、このようなノミ類に対する細胞毒性薬剤を標的化するために使用され得る。標的化は、当業者に公知の技術を使用して、このような抗体を細胞毒性薬剤に結合体化する（すなわち、安定に結合する）ことによって、達成され得る。適切な細胞毒性薬剤は、当業者に公知である。
【００８０】
本発明の１つの実施形態は、ノミ類外寄生を受けやすい動物に投与される場合に、ノミ類外寄生からその動物を防御し得る治療的組成物である。本発明の治療的組成物は、以下の防御性分子のうちの少なくとも１つを含む：単離されたノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質；単離されたノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質のミメトープ；単離されたノミ類ＨＭＴ核酸分子および／もしくはＨＮＣ核酸分子；ならびに／またはＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を阻害する上記単離されたノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質に由来する化合物。本発明の治療的組成物は、賦形剤、キャリア、および／またはアジュバントの群から選択される成分をさらに含み得る；これらの成分は、本明細書中でさらに記載される。本明細書中で使用される場合、防御性分子または防御性化合物とは、有効な様式で動物に投与される場合、ノミ類外寄生を処置、緩和、および／または予防し得る化合物をいう。標的となる好ましいノミ類は、以前に開示される。防御性分子の１つの例は、ワクチン（例えば、裸の核酸ワクチン、組換えウイルスワクチン、組換え細胞ワクチン、および組換えタンパク質ワクチンが挙げられるが、これらに限定されない）である。防御性分子の別の例は、ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性を阻害する化合物（例えば、ノミ類ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質に選択的に結合する単離された抗体、ノミ類ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の基質アナログ、アンチセンスベースの化合物、三重らせん形成ベースの化合物、リボザイムベースの化合物、および／またはＲＮＡ薬物ベースの化合物）、あるいはＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を阻害する他の無機分子もしくは有機分子である。ノミ類ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性の阻害は、化合物が、ノミ類ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の活性を低減させる能力をいい得る。ノミ類ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性の阻害はまた、化合物が、ノミ類におけるノミ類ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の量を低下させる能力をいい得る。
【００８１】
本発明の別の実施形態は、ノミ類外寄生を受けやすい動物におけるノミ類外寄生を低減するための方法を包含する。このような方法は、以下からなる群より選択される防御性化合物を含む治療的分子を動物に投与する工程を包含する：（ａ）単離されたノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質；（ｂ）単離されたノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質のミメトープ；（ｃ）単離されたノミ類ＨＭＴ核酸分子および／もしくはＨＮＣ核酸分子；ならびに（ｄ）ＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を阻害する、単離されたノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質に由来する化合物。
【００８２】
本発明の治療的組成物は、ノミ類外寄生を受けやすい任意の動物（好ましくは、哺乳動物、および好ましくは、イヌ、ネコ、ヒト、フェレット、ウマ、ウシ、ヒツジ、および他の愛玩動物、家畜（ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｆｏｏｄ  ａｎｉｍａｌ）、作業用動物および／または動物園の動物）に投与され得る。ノミ類外寄生に対して防御される好ましい動物としては、イヌ、ネコ、ヒト、およびフェレットが挙げられ、イヌおよびネコが特に好ましい。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、用語、〜由来の、または用語、〜から由来する、とは、本発明のノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質、またはノミ類ＨＭＴ核酸分子および／もしくはＨＮＣ核酸分子から得られるか、またはこれらを使用して得られた、ペプチド、抗体、ミメトープ、核酸分子、または他の化合物をいう。本発明のＨＭＴ分子および／もしくはＨＮＣ分子から誘導体を得る方法は、当該分野で公知であり、よって、活性部位（すなわち、他の分子と相互作用する部位）を決定するためのＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の分子モデリング、ならびにこれらの活性部位を保持および／もしくは模倣する、より小さなフラグメントおよび／もしくはミメトープをこれらの活性部位から推定し、それにより、ＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を阻害し；本発明のＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質に対するペプチドもしくは低分子化合物ライブラリーをスクリーニングし；そして本発明のＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質を特異的に結合する抗体を見いだすための、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体をスクリーニングすることが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明のＨＭＴタンパク質インヒビターおよび／またはＨＮＣタンパク質インヒビターは、ノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質に結合し、改変し、その他の点ではこれらと相互作用し、それによってＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の活性を阻害するその能力によって同定される。ＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性の適切なインヒビターは、以下の種々の方法のうちの少なくとも１つにおいて、ＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を阻害する化合物である：（ａ）ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の部位に結合するか、そうでなければこれらと相互作用するか、そうでなければ改変することによる；（ｂ）ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質に結合し、従って溶液中のＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質のアベイラビリティーを低下させることによる；ならびに（ｃ）ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の他の領域と相互作用して、ＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を阻害することによる（例えば、アロステリック相互作用による）。
【００８５】
ノミ類ＨＭＴタンパク質インヒビターおよび／もしくはＨＮＣタンパク質インヒビターは、動物を処置するために、本発明の組成物中の化合物として、このような化合物が、処置される宿主動物に対して有害でない限り、直接使用され得る。本発明の好ましいＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質のインヒビターとしては、ノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の基質アナログ、ならびにノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の活性が阻害されるような様式にて、ノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質に（例えば、アロステリック部位に）結合する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の基質アナログとは、ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の活性部位と相互作用し（例えば、結合し、会合し、改変する）化合物をいう。好ましいＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の基質アナログは、ＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を阻害する。ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の基質アナログは、任意の無機組成物または有機組成物であり得る。ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の基質アナログは、ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の天然の基質に構造的に類似であり得るが、それらがそのＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の活性部位と相互作用し得る限り、必ずしもその必要はない。ＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質の基質アナログは、本発明のＨＭＴおよび／もしくはＨＮＣタンパク質のコンピューターにより生成された構造、またはＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の天然の基質のコンピューター構造を使用して、設計され得る。モデルを作製するための好ましい部位は、ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の活性部位のうちの１つ以上を含む。基質アナログはまた、分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣化合物、または他の無機分子もしくは有機分子）のランダムなサンプルを作製し、このようなサンプルを、ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質とそれらの基質との間の相互作用を妨害するそれらの能力についてスクリーニングすることによって、例えば、アフィニティークロマトグラフィー技術によって、得られ得る。好ましいＨＭＴおよび／またはＨＮＣタンパク質の基質アナログは、ＨＭＴタンパク質模倣化合物および／もしくはＨＮＣタンパク質模倣化合物（すなわち、本発明のＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の天然の基質に、特に、ＨＭＴタンパク質活性部位および／もしくはＨＮＣタンパク質活性部位と相互作用する基質の領域に、構造的におよび／もしくは機能的に類似しているが、ＨＭＴタンパク質活性部位および／もしくはＨＮＣタンパク質活性部位と相互作用する際に、ＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を阻害する化合物）である。
【００８６】
本発明はまた、１つ以上の感染因子に対して防御性の少なくとも１つのさらなる化合物と組み合わせた、本発明の少なくとも１つの防御性分子を含む治療的組成物を包含する。
【００８７】
１つの実施形態において、本発明の治療的組成物は、外寄生を予防するために、ノミ類に対してこのような組成物を投与することによって、ノミ類外寄生から動物を防御するために使用され得る。ノミ類および／または動物に対するこのような投与は、経口であり得、または動物の体表面への塗布（例えば、局所的に斑点状に塗布するまたは動物にスプレーする）によって、または環境への適用（例えば、スプレーする）によるものであり得る。このような組成物の例としては、少なくとも１つの本発明の治療的組成物を生成し得るトランスジェニックベクターが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、ノミ類は、本発明の治療的組成物を投与した宿主動物の表面またはその動物の血液中に存在する治療的組成物、またはその産物を摂取し得る。
【００８８】
本発明に従って、宿主動物（すなわち、ノミ類が感染するまたは感染し得る動物）は、組成物自体（例えば、ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質、ＨＭＴ核酸分子および／もしくはＨＮＣ核酸分子、ＨＭＴタンパク質インヒビターおよび／もしくはＨＮＣタンパク質インヒビター、ＨＭＴタンパク質合成サプレッサおよび／もしくはＨＮＣタンパク質合成サプレッサ（すなわち、ノミ類におけるＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質の生成または半減期を低下させる化合物）、ＨＭＴタンパク質ミメトープおよび／もしくはＨＮＣタンパク質ミメトープ、または抗ＨＭＴ抗体および／もしくはＨＮＣ抗体）あるいはその組成物の投与に応答して動物によって生成される産物（例えば、ノミ類ＨＭＴタンパク質および／もしくはＨＮＣタンパク質またはノミ類ＨＭＴ核酸分子および／もしくはＨＮＣ核酸分子の投与に応答して生成される抗体、あるいは不活性インヒビター「プロドラッグ」の活性なＨＭＴタンパク質インヒビターおよび／もしくはＨＮＣタンパク質インヒビターへの変換）が最終的にノミ類に入る様式にて、本発明の治療的組成物を動物に投与することによって処置される。宿主動物は、好ましくは、化合物またはその産物が、動物の体表面に存在するか、または動物の血流に入る様式にて、処置される。次いで、ノミ類は、動物から栄養摂取する場合に、その組成物または産物に曝される。例えば、動物に投与されるノミ類ＨＭＴタンパク質インヒビターおよび／もしくはＨＮＣタンパク質インヒビターは、そのインヒビターが、動物の血流（ここで、そのインヒビターは、ノミ類に摂取されることによって取り込まれる）に入る様式にて投与される。
【００８９】
本発明はまた、ノミ類が、本発明の治療的組成物を投与した宿主動物から摂取する場合に、ノミ類によって取り込まれた血液中の本発明の化合物の少なくとも一部またはその産物が、ノミ類によって糞便中に排泄され、続いて、これらは、ノミ類の幼虫によって摂食されるという点で、幼虫のノミ類外寄生を減少させる能力を包含する。特に、ノミ類の幼虫は、大部分は、全てではなくとも、それらの栄養を、ノミ類の糞便から得ることに注意のこと。
【００９０】
本発明に従って、ノミ類におけるＨＭＴタンパク質活性および／もしくはＨＮＣタンパク質活性を減少させることは、処置される動物およびそれらの周辺環境に対するノミ類の負担を減少させるという多くの結果をもたらし得る。このような結果としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）処置された動物から摂食したノミ類の生存性を減少させること、（ｂ）処置した動物から摂食した雌のノミ類の繁殖力を低下させること、（ｃ）処置した動物から摂食した雄のノミ類の生殖能力を低下させること、（ｄ）処置した動物から摂食した雌のノミ類から生まれた卵の生存性を低下させること、（ｅ）処置した動物から摂食したノミ類の血液摂取行動を改変すること（例えば、ノミ類が、１回の摂食あたりより少ない容積を取り込むか、またはより少ない頻度で摂食する）、（ｆ）ノミ類の幼虫の生存性を低下させること（例えば、処置した動物から摂食したノミ類の糞便からの幼虫の摂食に起因して）、（ｇ）ノミ類の幼虫の発生を改変すること（例えば、摂食行動の減少、成長阻害、脱皮を阻害すること（例えば、遅延もしくはブロックすること）および／もしくはそうでなければ、成体への成熟を阻害すること）、ならびに／あるいは（ｈ）ノミ類もしくはノミ類の幼虫が乾燥血液を消化する能力を改変または低下させること。
【００９１】
ノミ類外寄生から動物を防御するために、本発明の治療的組成物は、その組成物が、ノミ類外寄生から動物を防御し得るように有効な様式で、その動物に投与される。本発明の治療的組成物は、外寄生を予防するために、外寄生の前に動物に投与され得（すなわち、予防ワクチンとして）、そして／または外寄生後に動物に投与され得る。例えば、タンパク質、そのミメトープ、およびその抗体は、免疫治療的薬剤として使用され得る。
【００９２】
本発明の治療的組成物は、処置される動物が許容し得る賦形剤中に処方され得る。このような賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、および他の水性生理学的平衡化塩類溶液が挙げられる。非水性のビヒクル（例えば、不揮発性油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリド）もまた、使用され得る。他の有用な処方物としては、増粘剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン）を含有する懸濁液が挙げられる。賦形剤はまた、微量の添加物（例えば、等張性および化学的安定性を増強する物質）を含み得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、炭酸水素塩緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液が挙げられる一方、保存剤の例としては、チメロサール、またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。標準的な処方物は、液体注入可能物または注入用の懸濁液もしくは溶液として適切な液体中に取り込まれ得る固体のいずれかであり得る。従って、非液体処方物において、賦形剤としては、デキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤などが挙げられ得、これに対して、滅菌水または滅菌生理食塩水が添加されて、その後投与され得る。
【００９３】
本発明の１つの実施形態において、治療的組成物は、アジュバントを含み得る。アジュバントは、特定の抗原に対する動物の免疫応答を増強し得る薬剤である。適切なアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：サイトカイン、ケモカイン、ならびにサイトカインおよびケモカインの生成を誘導する化合物（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆｌｔ−３リガンド、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロンγ、インターフェロンγ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスホーミング増殖因子β、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１β）、ならびにＬｅｉｓｈｍａｎｉａ伸長開始因子（ＬＥＩＦ））；細菌成分（例えば、内毒素、特に、スーパー抗原、体外毒素、および細胞壁成分）；アルミニウムベースの塩類；カルシウムベースの塩類；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウイルスコートタンパク質；ブロックコポリマーアジュバント（例えば、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  ＴｉｔｅｒｍａｘＴＭ  アジュバント（ＶａｘｃｅｌＴＭ，Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；ならびにサポニンおよびその誘導体（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。本発明のタンパク質アジュバントは、本明細書中に記載の方法を使用して、タンパク質自体の形態またはこのようなタンパク質をコードする核酸分子の形態で送達され得る。
【００９４】
本発明の１つの実施形態において、治療的組成物は、キャリアを含み得る。キャリアとしては、処置される動物における治療組成物の半減期を増大する化合物が挙げられる。適切なキャリアとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリマー性徐放ビヒクル、生分解性インプラント、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステル、およびグリコール。
【００９５】
本発明の１つの実施形態は、本発明の組成物を動物へゆっくりと放出し得る徐放処方物である。本明細書中で使用される場合、徐放処方物は、徐放ビヒクル中に本発明の組成物を含む。適切な徐放ビヒクルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：生体適合性ポリマー、他のポリマー性マトリクス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア（ｌｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）、および経皮送達システム。本発明の他の徐放処方物としては、動物に投与する際に、インサイチュで固体またはゲルを形成する液体が挙げられる。好ましい徐放処方物は、生分解性（すなわち、生体分解性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ））である。
【００９６】
本発明の好ましい徐放処方物は、ノミ類外寄生から動物を防御するために、組成物の治療的用量レベルに達するに十分な、一定速度にて、処置される動物の血液に、本発明の組成物を放出し得る。この治療的組成物は、好ましくは、約１ヶ月〜約１２ヶ月の範囲の期間にわたって放出される。本発明の徐放処方物は、好ましくは、少なくとも１ヶ月間、好ましくは、少なくとも３ヶ月間、好ましくは、少なくとも６ヶ月間、好ましくは、少なくとも９ヶ月間、および好ましくは、少なくとも１２ヶ月間、処置を実行し得る。
【００９７】
有効な様式にて治療的組成物を投与するための受容可能なプロトコルは、個々の用量サイズ、用量の数、用量投与の頻度、および投与様式を含む。このようなプロトコルの決定は、当業者によって達成され得る。適切な単一用量は、適切な期間にわたって１回以上投与される場合、動物を疾患から防御し得る用量である。例えば、タンパク質、ミメトープまたは抗体、治療的組成物（組換えタンパク質ワクチンを含む）の好ましい単一用量は、動物の体重１ｋｇあたり、約１マイクログラム（１μｇ）〜約１０ミリグラム（ｍｇ）の治療的組成物である。ブースターワクチン接種は、最初に投与してから、約２週間後〜数年後の間に投与され得る。ブースター投与は、好ましくは、動物の免疫応答が、その動物を疾患から防御するに不十分となる場合に投与される。好ましい投与スケジュールは、動物の体重１ｋｇあたり、約１０μｇ〜約１ｍｇの治療的組成物が、約２週間〜約１２ヶ月の期間にわたって約１回〜約２回投与されるスケジュールである。投与様式としては、皮下経路、皮内経路、静脈内経路、鼻内経路、経口経路、経皮経路、眼内経路、鼻内経路、結膜経路、および筋肉内経路が挙げられ得るが、これらに限定されない。他の治療的化合物の投与方法は、当業者によって決定され得、１日１回以上、１週間に１回以上、１ヶ月に１回以上、または１年に１回以上のレジメンでの治療的組成物の投与を包含し得る；投与経路は、当業者によって決定され得、任意の経路を含み得る。ノミ類に投与する場合、阻害性化合物の好ましい投与経路は、ノミ類が、動物に付着している場合に阻害性化合物に遭遇するように、動物の体表面に投与される局所的処方物、または「スポット−オン」処方物であり；阻害性化合物の別の好ましい投与経路は、動物に摂食された場合に、その動物の血流に入り、次いで、動物から摂食すると同時にノミ類に移行する経口処方物である。
【００９８】
本発明の組換えタンパク質ワクチンは、本発明の組換え産生されたノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質を含み、このワクチンは、動物自身をノミの侵入から防御するのに十分な免疫応答を惹起する動物を生じるプロトコルに従って動物に投与される。このようなプロトコルは、当業者によって決定され得る。
【００９９】
１つの実施形態に従って、本発明の核酸分子は、動物における、核酸分子の保護タンパク質または保護ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、三重鎖らせん形態またはＲＮＡ薬物）への発現を可能にするような様式で動物に投与され得る。核酸分子は、以下の工程を含むがこれらに限定されない種々の方法において動物に送達され得る：（ａ）裸の（すなわち、ウイルスコートまたは細胞膜中にパッケージングされない）核酸を遺伝子ワクチンとして（例えば、裸のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子（例えば、Ｗｏｌｆｆら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７、１４６５〜１４６８において教示されるような））投与する工程、あるいは（ｂ）パッケージされた核酸分子を組換えウイルスワクチンまたは組換え細胞ワクチンとして投与する工程（すなわち、核酸分子は、ウイルスビヒクルまたは細胞ビヒクルによって送達される）。
【０１００】
本発明の遺伝子（すなわち、裸の核酸）ワクチンは、本発明の核酸分子を含み、好ましくは複製能のある、そうでなければ、増幅能のある、本発明の組換え分子を、好ましくは含む。本発明の遺伝的ワクチンは、例えば、二シストロン性組換え分子の形態で、本発明の１つ以上の核酸分子を含み得る。好ましい遺伝子ワクチンは、ウイルスゲノム（すなわち、ウイルスベクター）の少なくとも一部を含む。好ましいウイルスベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、疱疹ウイルス、ピコルナウイルス、およびレトロウイルスに基づくウイルスが挙げられ、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスまたはセムリキ森林ウイルス）に基づくウイルス、種特異的疱疹ウイルスおよびポックスウイルスが、特に好ましい。任意の適切な転写制御配列が使用され得、これらとしては、タンパク質産生のために適切として開示された配列が挙げられる。特に好ましい転写制御配列としては、サイトメガロウイルス最初期配列（好ましくは、ＩｎｔｒｏｎーＡと共に）、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、および組織特異的転写制御配列ならびに、ウイルスベクターが使用される場合、ウイルスベクターに対して内因性の転写制御配列が挙げられる。「強い」ポリアデニル化シグナルの組込みもまた、好ましい。
【０１０１】
本発明の遺伝子ワクチンは、種々の方法で投与され得、筋内的、皮下的、皮内的、経皮的、結膜的、眼内的、鼻内的および経口的な、投与経路が、好ましい。遺伝子ワクチンの好ましい単回用量は、約１ｎｇから約６００μｇの範囲にわたり、当業者によって容易に決定され得るように、投与の経路および／または送達方法に依存する。適切な送達方法としては、例えば、注射によって、ドロップとして、エーロゾル適用、そして／または局所的に、を含む。本発明の遺伝的ワクチンは、水性賦形剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）に単独で含まれ得るかまたはキャリア（例えば、脂質ベースのビヒクル）中に含まれ得る。
【０１０２】
本発明の組換えワイルスワクチンは、本発明の組換え分子を含み、ウイルスコートにパッケージ化され、投与の後に動物中で発現され得る。好ましくは、組換え分子は、パッケージ化欠損または複製欠損であり、そして／または減弱ウイルスをコードする。多くの組換えウイルスが使用され得、これらとしては、アルファウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、疱疹ウイルス、ピコルナウイルス、およびレトロウイルスに基づくウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい組換えウイルスワクチンは、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルス）、アライグマポックスウイルス、種特異的疱疹ウイルス、および種特異的ポックスウイルスに基づくウイルスである。アルファウイルス組換えウイルスワクチンを産生および使用するための方法の例は、ＸｉｏｎｇおよびＧｒｉｅｖｅに対する米国特許第５，７６６，６０２号に開示され、これは、その全体として本明細書中に参考として援用される。
【０１０３】
動物に対して投与される場合、本明細書中に開示されるように、本発明の組換えウイルスワクチンは、免疫動物内の細胞に感染し、ノミの侵入から動物を保護し得る保護タンパク質またはＲＮＡ核酸分子の産生を指向する。例えば、本発明のノミＨＭＴ核酸分子および／またはＨＮＣ核酸分子を含む組換えウイルスワクチンは、ノミの侵入から動物自身を保護するのに十分な免疫応答を産生する動物を生じるプロトコルに従って、投与される。本発明の組換えウイルスワクチンの好ましい単回用量は、動物の体重１ｋｇ当たり、約１×１０４〜約１×１０８ウイルスプラーク形成単位（ｐｆｕ）である。投与プロトコルは、タンパク質ベースのワクチンについて、本明細書中に記載されるプロトコルと同様であり、皮下的、筋内的、鼻内的、眼内的、結膜的、および経口的、投与経路が好ましい。
【０１０４】
本発明の組換え細胞ワクチンは、本発明の組換え細胞を含み、本発明の少なくとも１つのタンパク質を発現する。この実施形態に対する好ましい組換え細胞としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含む）、ＢＨＫ、ＣＶ−１、筋芽細胞Ｇ８、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、Ｖｅｒｏ、ＭＤＣＫおよびＣＲＦＫの、組換え細胞が挙げられる。本発明の組換え細胞ワクチンは、種々の方法で投与され得るが、好ましくは、体重１ｋｇ当たり約１０８〜１０１２細胞の範囲の用量で、経口投与され得る利点を有する。投与プロトコルは、タンパク質ベースのワクチンについて、本明細書中に記載されるプロトコルと同様である。組換え細胞ワクチンは、細胞全体、細胞壁を剥ぎ取った細胞または細胞溶解物を含み得る。
【０１０５】
本発明の治療組成物のノミの侵入から動物を保護する効率は、以下を含むがこれらに限定されない種々の方法で試験され得る：保護抗体の検出（例えば、本発明のタンパク質またはミメトープを使用する）、処置される動物内での細胞免疫性の検出、または処置された動物をノミでチャレンジしこの処置された動物が進入に対して耐性であるかどうかを決定すること。チャレンジ研究は、処置された動物に対するノミの直接投与を含み得る。１つの実施形態において、治療組成物は、マウスのような動物モデルにおいて試験され得る。このような技術は、当業者に公知である。
【０１０６】
本発明の１つの治療組成物は、ノミＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性のインヒビター（すなわち、ノミＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性のインヒビターによって、阻害に感受性であるノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の機能を実質的に阻害し得る化合物）を含む。ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性のインヒビターは、本発明のノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質を使用して同定され得る。ＨＭＴタンパク質機能および／またはＨＮＣタンパク質機能のインヒビターは、本発明のノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質を使用して同定され得る。ＨＭＴタンパク質機能および／またはＨＮＣタンパク質機能の好ましいインヒビターは、ノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の機能に実質的に干渉し得る化合物であり、このインヒビターは、宿主動物タンパク質に実質的に干渉しない。本明細書中で使用される場合、宿主動物タンパク質を実質的に阻害しないかまたは実質的に干渉しない化合物は、宿主動物に投与される場合、宿主動物が、化合物に起因する有意な有害な効果を示さず、効果的な様式で動物に投与される場合、ノミの侵入から動物を保護し得る。
【０１０７】
本発明の１つの実施形態は、ノミのＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性を阻害し得る化合物を同定する方法である。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）単離されたノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質（好ましくは、本発明のＣ．ｆｅｌｉｓＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質）を、この化合物の非存在下で、タンパク質が、ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性を有する条件下で、推定阻害化合物と接触させる工程、ならびに（ｂ）推定阻害化合物が活性を阻害するかどうかを決定する工程。ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性は、当該分野で公知の種々の方法において決定され得、これらとしては、ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の基質を結合するか、そうでなければ気質と相互作用する能力を決定することが挙げられるがこれらに限定されない。ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質が、ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性を有するこのような条件としては、ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質が、生理学的条件（すなわち、生理学的ｐＨ、生理学的イオン濃度および生理学的温度）下で、正しい三次元折りたたみ構造を有する条件が挙げられる。
【０１０８】
スクリーニングするための推定阻害化合物としては、抗体（そのフラグメントおよびミメトープを含む）、推定基質アナログ、および他の分子、好ましくは低分子、有機分子または無機分子が挙げられる。ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性を決定するための方法は、当業者に公知である；例えば、本願の実施例のセクションを参照のこと。推定阻害化合物の、本発明のＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質に対する結合を決定するための方法は、当業者に公知であり、この方法としては、例えば、表面プラズモン共鳴（例えば、インヒビターまたはタンパク質と、ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質あるいはインヒビターと、それぞれ接触させる前および後に、ＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質のインヒビターによる光散乱を決定すること）を使用して分子量の変化を決定する工程、またはＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質と基質との間の相互作用を阻害する化合物をスクリーニングする工程を包含する。
【０１０９】
ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性を阻害し得る化合物を同定するための好ましい方法としては、表Ｉおよび／または表ＩＩの核酸分子によってコードされるノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質を；（ｂ）（ａ）に示されるような配列の連続したアミノ酸部分に対して配列が同一な少なくとも２５連続アミノ酸部分を含むタンパク質であって、このタンパク質が、ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性を有する、タンパク質；（ｃ）（ａ）に示されるようなタンパク質のフラグメントを含むタンパク質であって、このフラグメントがＨＭＴ分子および／またはＨＮＣ分子に対して結合することならびにＨＭＴタンパク質基質および／またはＨＮＣタンパク質基質を加水分解することからなる群から選択される活性を有する、タンパク質；ならびに（ｄ）（ａ）（ｂ）、または（ｃ）のいずれかのタンパク質をコードする核酸分子の対立遺伝子改変体によってコードされるタンパク質を、この化合物の非存在下で、タンパク質が、ＨＭＴタンパク質活性および／またはＨＮＣタンパク質活性を有する条件下で、推定阻害化合物と接触させる工程；ならびに推定阻害化合物が、活性を阻害するかどうかを決定する工程、を包含する。
【０１１０】
本発明の別の実施形態は、本発明のノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質のインヒビターを同定するためのアッセイキットである。このキットは、本発明のノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質、ならびにノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の活性の阻害を決定するための手段を包含し、ここで、この手段は、阻害の検出を可能にする。ノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の阻害の検出は、ノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質のインヒビターである、推定インヒビターを同定する。ノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の阻害を決定するための手段としては、推定インヒビターのノミＨＭＴ分子および／またはＨＮＣ分子に対する結合を検出するアッセイ系、ならびにノミＨＭＴタンパク質および／またはＨＮＣタンパク質の基質を加水分解する能力の推定インヒビターによる干渉を検出するアッセイ系を含む。手段および方法は、本明細書中に記載され、そして当業者に公知である。
【０１１１】
以下の実施例は、例示の目的のために提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない。以下の実施例は、当業者に公知の多くの組換えＤＮＡ技術およびタンパク質化学技術を含む；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）、を参照のこと。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
この実施例は、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓの後腸およびマルピーギ管（ＨＭＴ）からのＲＮＡの単離ならびにサブトラクティッドサンプル（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）ｃＤＮＡライブラリーおよびアンサブトラクティッド（ｕｎｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）ｃＤＮＡライブラリーを構築するために単離されたＲＮＡの使用を記載する。
【０１１３】
約１０，０００の、後腸およびマルピーギ管を、雄雌比が１対４である、等数のネコ血液を与えられた成体Ｃ．ｆｅｌｉｓおよび与えられない成体Ｃ．ｆｅｌｉｓから切断し、全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート溶解緩衝液を使用して抽出し、標準的手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって記載される。ポリＡ富化ｍＲＮＡを、Ｐａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手可能なｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを、製造業者のプロトコルに従って使用して、上記の全ＲＮＡから精製した。同じ手順を使用して、全ＲＮＡを抽出し、切開されたＣ．ｆｅｌｉｓ体からポリＡ富化ｍＲＮＡを単離し、その後ＨＭＴを取り出した（本明細書中以下「非ＨＭＴ  ｍＲＮＡ」といわれる）。
【０１１４】
ポリＡ富化ｍＲＮＡを、使用して、以下に示されるサブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサプレッションＰＣＲを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築する。サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサプレッションＰＣＲを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡから入手可能なＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを、製造業者の指示書に従って、使用して実施した。簡潔には、このキットは、サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサプレッションＰＣＲを使用して、テスターｃＤＮＡ中に存在しドライバーｃＤＮＡ中に存在しないｃＤＮＡ配列を特異的に増幅し、テスター特異的配列について富化する。サブトラクションプロセスの効率を、半定量的ＰＣＲによって、製造業者のプロトコルのセクションＶ．Ｄ．中に記載されるように、アガロースゲル上での、サブトラクティッドサンプルおよびアンサブトラクティッドサンプルのエチジウムブロマイド染色パターンを比較することによって、評価し得る。半定量的ＰＣＲについて、ＨＭＴ組織の外側に発現されることが公知のｍＲＮＡを有する３つの遺伝子を使用して、特定のサブトラクションについて試験した。これらの遺伝子は、推定アクチン、Ｎ−アミノペプチダーゼ、およびセリンプロテアーゼタンパク質をコードした。
【０１１５】
サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびサプレッションＰＣＲを、以下の条件下で実施した。２μｇのＨＭＴ  ｍＲＮＡを、テスター物質の合成のためのテンプレートとして使用して、２μｇの非ＨＭＴ  ｍＲＮＡを、この反応におけるドライバー物質の合成のためのテンプレートとして使用した。選択的増幅工程において使用されるサイクルの数を、製造業者のプロトコルを使用して、最適化した。最適化によって、標準的な２７サイクルの一次ＰＣＲではなく２４サイクルを、標準的な１２サイクルではなく１５サイクルの二次ＰＣＲと組み合わせて使用した。
【０１１６】
サプレッシブＰＣＲ反応からの生成物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能なｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＯｒｉｇｉｎａｌ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）  Ｋｉｔを使用して連結した。次いで、連結反応を使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＩＮＶαＦ’  Ｏｎｅ  ＳｈｏｔＴＭコンピテント細胞を形質転換し、これを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能な１ｍｌ当たり５０μｇ（μｇ／ｍｌ）アンピシリンおよびＦｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪから入手可能な５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を含むＬｕｒｉａブロス（ＬＢ）上にプレートした。形質転換されたコロニーを、増幅し、ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）によって記載された標準的なアルカリ溶解手順を使用して単離した。
【０１１７】
ＤＮＡサンプルの自動化されたサイクルの配列決定を、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なＰＲＩＳＭＴＭ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＰＲＩＳＭＴＭ  ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔまたはＰＲＩＳＭＴＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、製造業者のプロトコルに従って反応を実施した後に、Ｐｅｒｋｉｎｓ  Ｅｌｍｅｒから入手可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  Ｍｏｄｅｌ  ３７７およびＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能なＸＬアップグレードＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して、実施した（本明細書中以下、「標準的配列決定方法」）。得られた配列を、表ＩＩに示す。配列分析を、デフォルトパラメーターを使用して、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから入手可能なＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭ配列分析ソフトウェアおよびＳｅｑＬａｂ配列分析ソフトウェアを使用して、実施した。いずれかの末端のベクター配列の各配列読み取りを、切り取り、ＢＬＡＳＴネットワークを使用して、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤによって検索に供した。このデータベースは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＧｅｎＰｅｐｔ＋ＧＰＵｐｄａｔｅ＋ＰＤＢｄａｔａｂａｓｅを含む。この検索を、ｘＢＬＡＳＴ機能を使用して実施し、これは、データベースに含まれるタンパク質配列に対して、６つ全てのリーディングフレーム中の翻訳された配列を比較する。
【０１１８】
アンサブトラクティッドＨＭＴ  ｃＤＮＡライブラリーを、以下のように構築した。約１０，０００のＨＭＴ組織を、雄雌比が１対４である、等数のネコ血液を与えられた成体Ｃ．ｆｅｌｉｓおよび与えられない成体Ｃ．ｆｅｌｉｓから切断した。全ＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、に記載されるグアニジンイソチオシアネート溶解緩衝液および手順を使用して抽出し、その後、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｍＲＮＡ精製キットを、製造業者のプロトコルに従って単離した。ライブラリーを、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）ｃＤＮＡ合成キットを使用して５μｇの単離されたｍＲＮＡを用いて構築し、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ（登録商標）Ｇｉｇａｐａｃｋ（登録商標）ｇｏｌｄクローニングキットを使用して、パッケージ化した。両方は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能である。得られたＨＭＴライブラリーを、１ｍｌ当たり約５×１０９のプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）の力価まで増幅した。単一クローン切断を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＥｘ−ＡｓｓｉｓｔＴＭヘルパーファージを使用して実施し、以下を除いて製造業者のプロトコルを使用して、配列決定のための二本鎖プラスミドテンプレートを作製するために使用した。清浄化ファージ溶解物を用いてＳＯＬＲ細胞のインキュベーションの後、この混合物をＬＢブロスを播種するために使用し、この混合物を一晩インキュベートし、次いで、上記のサブトラクティッドＨＭＴライブラリーに対して記載するようにミニプレッププラスミド調製および配列決定に供した。
【０１１９】
（実施例２）
この実施例は、Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓの頭部および神経索（ＨＮＣ）からのＲＮＡの単離ならびにサブトラクティッドサンプル（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）ｃＤＮＡライブラリーおよびアンサブトラクティッド（ｕｎｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）ｃＤＮＡライブラリーを構築するために単離されたＲＮＡの使用を記載する。
【０１２０】
約４，０００の、頭部および付着する神経索（末端腹部神経節を含む）を、雄雌比が１〜４である、等数のネコ血液を与えられた成体Ｃ．ｆｅｌｉｓおよび与えられない成体Ｃ．ｆｅｌｉｓから切断し、全ＲＮＡを、グアニジンイソチオシアネート溶解緩衝液を使用して抽出し、標準的手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって記載される。約６１８μｇの全ＲＮＡを回収した。ポリＡ富化ｍＲＮＡを、Ｐａｒｍａｃｉａから入手可能なｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを、製造業者のプロトコルに従って使用して、上記の全ＲＮＡから精製した。約１３μｇのｍＲＮＡを単離した。同じ手順を使用して、全ＲＮＡを抽出し、切開されたＣ．ｆｅｌｉｓ体からポリＡ富化ｍＲＮＡを単離し、その後ＨＮＣ組織を取り出した（本明細書中以下「非ＨＮＣ  ｍＲＮＡ」といわれる）。
【０１２１】
サプレッションサブトラクティブＰＣＲを、以下の条件下で、実施例１に記載されるように、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なＰＣＲ−ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して実施した。２μｇのＨＮＣ  ｍＲＮＡを、テスター物質の合成のためのテンプレートとして使用して、２μｇの非ＨＭＴ  ｍＲＮＡを、この反応におけるドライバー物質の合成のためのテンプレートとして使用した。選択的増幅工程において使用されるサイクルの数を、製造業者のプロトコルを使用して、最適化した。最適化によって、標準的な２７サイクルの一次ＰＣＲではなく２４サイクルを、１２サイクルまたは１５サイクルの二次ＰＣＲと組み合わせて使用した。
【０１２２】
種々のＰＣＲサイクルの組み合わせからのｃＤＮＡプールを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＴＡクローニングキットを使用して、ＴＡベクターに連結した。連結反応のアリコートを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから入手可能なＵｌｔｒａｍａｘ  ＤＨ５∝ＴＭに形質転換した。形質転換混合物の一部を使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス培養液に播種した。一晩培養物をプレートし、別個のコロニーを生成し、これらをプラスミド調製のための一晩培養のために個々に使用した。形質転換されたコロニーを、増幅し、ＤＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（同書）、に記載される標準的アルカリ溶解手順を使用して単離した。
【０１２３】
ＤＮＡサンプルの自動化されたサイクル配列決定を、実施例１に記載される標準的な配列決定法を使用して実施した。得られた配列を、表Ｉに示す。配列分析を、デフォルトパラメーターを使用して、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴから入手可能なＭａｃＶｅｃｔｏｒＴＭ配列分析ソフトウェアおよびＳｅｑＬａｂ配列分析ソフトウェアを使用して、実施した。
【０１２４】
アンサブトラクティッド  ｃＤＮＡライブラリーを、以下のように構築した。約６４００の頭部および神経索を、Ｃ．ｆｅｌｉｓから切開し、ポリＡＯＲＮＡを、上記のように単離した。約７μｇのＨＮＣ−ポリＡＯＲＮＡを使用して、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのλＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キットおよびプロトコルを使用して、ｃＤＮＡライブラリを構築した。得られたＨＮＣライブラリーを、１ｍｌ当たり約５×１０９のプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）の力価まで増幅した。単一クローン切断を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＥｘ−Ａｓｓｉｓｔヘルパーファージを使用して実施し、以下を除いて製造業者のプロトコルを使用して、配列決定のための二本鎖プラスミドテンプレートを作製するために使用した。清浄化ファージ溶解物を用いてＳＯＬＲ細胞のインキュベーションの後、この混合物をＬＢブロスを播種するために使用し、この混合物を一晩インキュベートし、次いで、上記のサブトラクティッドライブラリーに対して記載するようにミニプレッププラスミド調製および配列決定に供した。
【０１２５】
本発明の種々の実施形態が詳細に記載されるが、これらの実施形態の改変および適合が当業者に思い浮かぶことが明らかである。しかし、このような改変および適合が、添付の特許請求の範囲に示されるように、本発明の範囲内にあることは、明白に理解されるべきである。
【配列表】
2005512520.tif 000016
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