(57)【要約】ケラチンを含有する保護コーティングを含む医療デバイス（およびこの医療デバイスを作製する方法）。この保護コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。この結合領域は、基材表面に結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含み、この生物活性領域は、ケラチンの反応性ペンダント基に結合した有機成分を含む。医療デバイスは、好ましくは、組織工学構成、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療デバイスであって、以下：
ケラチンを含む保護コーティングを含む基材であって、該保護コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む、基材；
該基材の表面に結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含む該結合領域；および
該ケラチンの反応性ペンダント基に結合した該有機シランの有機成分を含む該生物活性領域
を含む、医療デバイス。
【請求項２】
請求項１に記載の医療デバイスであって、前記有機シラン化合物の前記シラン成分が、前記基材の表面と共有結合している、医療デバイス。
【請求項３】
請求項２に記載の医療デバイスであって、前記生物活性領域が、前記有機シラン化合物の前記シラン成分に共有結合した前記ケラチンの反応性ペンダント基を含む、医療デバイス。
【請求項４】
請求項１に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞によって示される骨マトリクス形成を増加させるのに有効である、医療デバイス。
【請求項５】
組織工学構築物、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される、請求項３に記載の医療デバイス。
【請求項６】
組織工学構築物、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される、請求項４に記載の医療デバイス。
【請求項７】
医療移植片を含む、請求項１に記載の医療デバイス。
【請求項８】
医療移植片を含む、請求項３に記載の医療デバイス。
【請求項９】
医療移植片を含む、請求項４に記載の医療デバイス。
【請求項１０】
医療移植片を含む、請求項５に記載の医療デバイス。
【請求項１１】
医療移植片を含む、請求項６に記載の医療デバイス。
【請求項１２】
請求項１に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
【請求項１３】
請求項７に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
【請求項１４】
請求項８に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
【請求項１５】
請求項９に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
【請求項１６】
請求項１０に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
【請求項１７】
請求項１１に記載の医療デバイスであって、前記基材が、生体適合性物質を含む、医療デバイス。
【請求項１８】
請求項１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項１９】
請求項１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項２０】
請求項１２に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
【請求項２１】
請求項１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項２２】
請求項１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項２３】
請求項１４に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
【請求項２４】
請求項１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項２５】
請求項１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項２６】
請求項１５に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
【請求項２７】
請求項１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項２８】
請求項１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項２９】
請求項１６に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
【請求項３０】
請求項１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項３１】
請求項１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、
チタンおよびヒドロキシアパタイトからなる群から選択される、医療デバイス。
【請求項３２】
請求項１７に記載の医療デバイスであって、前記生体適合性物質が、シリコンを含む、医療デバイス。
【請求項３３】
請求項１２に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療デバイス。
【請求項３４】
請求項１７に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療デバイス。
【請求項３５】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、毛髪、毛皮、羽毛、角、蹄、嘴および足からなる群から選択される物質由来である、医療デバイス。
【請求項３６】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、毛髪由来である、医療デバイス。
【請求項３７】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、ヒトの毛髪ケラチンである、医療デバイス。
【請求項３８】
請求項３５に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
【請求項３９】
請求項３６に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
【請求項４０】
請求項３７に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、還元ケラチンを含む、医療デバイス。
【請求項４１】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
【請求項４２】
請求項３５のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
【請求項４３】
請求項３６いずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
【請求項４４】
請求項３９に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
【請求項４５】
請求項４０に記載の医療デバイスであって、前記ケラチンが、約５０ｋＤａ〜約８５ｋＤａの分子量を有する高分子量ケラチン（ＨＭＷＫ）を含む、医療デバイス。
【請求項４６】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
【請求項４７】
請求項４１に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
【請求項４８】
請求項４４に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
【請求項４９】
請求項４３に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
【請求項５０】
請求項４５に記載の医療デバイスであって、前記保護コーティングが、培養２Ｔ３マウス骨芽細胞による骨マトリクス形成を促進するのに有効である、医療デバイス。
【請求項５１】
医療移植片を含む、請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療デバイス。
【請求項５２】
医療移植片を含む、請求項４１に記載の医療デバイス。
【請求項５３】
医療移植片を含む、請求項４３に記載の医療デバイス。
【請求項５４】
医療移植片を含む、請求項４４に記載の医療デバイス。
【請求項５５】
医療移植片を含む、請求項４５に記載の医療デバイス。
【請求項５６】
医療移植片を含む、請求項４６に記載の医療デバイス。
【請求項５７】
請求項５２に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
【請求項５８】
請求項５３に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
【請求項５９】
請求項５５に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
【請求項６０】
請求項５６に記載の医療移植片であって、前記保護コーティングが、ケラチンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む、医療移植片。
【請求項６１】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項６２】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項６３】
請求項６２に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
【請求項６４】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項６５】
請求項５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項６６】
請求項５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項６７】
請求項６６に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
【請求項６８】
請求項５２に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項６９】
請求項５３に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項７０】
請求項３４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項７１】
請求項５３に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
【請求項７２】
請求項５３に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項７３】
請求項５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項７４】
請求項５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項７５】
請求項７４に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
【請求項７６】
請求項５４に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項７７】
請求項５５に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項７８】
請求項５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項７９】
請求項７８に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
【請求項８０】
請求項５５に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項８１】
請求項５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項８２】
請求項５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項８３】
請求項８２に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
【請求項８４】
請求項５６に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項８５】
請求項６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項８６】
請求項６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランの前記有機成分が、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項８７】
請求項８６に記載の医療移植片であって、前記アミン基が、アルキルアミン基である、医療移植片。
【請求項８８】
請求項６０に記載の医療移植片であって、前記有機成分が、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される部分を含む、医療移植片。
【請求項８９】
請求項１〜３３および請求項３４のいずれか１項に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
【請求項９０】
請求項５２に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
【請求項９１】
請求項５３に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
【請求項９２】
請求項５４に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
【請求項９３】
請求項５５に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
【請求項９４】
請求項５６に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
【請求項９５】
請求項６０に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
【請求項９６】
請求項８８に記載の医療移植片であって、前記有機シランが、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む、医療移植片。
【請求項９７】
保護コーティングを用いて医療デバイスをコーティングする方法であって、該方法が、以下：
結合領域を生成する該医療デバイスの１つ以上の表面にカップリング剤を結合させる工程；および
該結合領域にケラチンを結合させる工程
を包含する、方法。
【請求項９８】
請求項９７に記載の方法であって、前記結合領域にケラチンを結合させる工程が、以下：
溶媒にケラチンを溶解する工程；および
ケラチン混合物を生成するために、第２の無水溶媒を添加する工程；
該ケラチン混合物に該結合領域を曝露し、ケラチンコーティング結合領域を生成する工程；および
前記生物活性領域を生成するのに有効な条件下で、該ケラチンコーティング結合領域を硬化する工程を包含する、方法。
【請求項９９】
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を洗浄する工程をさらに包含する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を酸化する工程をさらに包含する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記１つ以上の表面に前記カップリング剤を結合させる前に、該１つ以上の表面を酸化する工程をさらに包含する、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項９９に記載の方法であって、前記洗浄工程が、最初に無水溶媒中で、前記１つ以上の表面に超音波処理し、そして該１つ以上の表面を水中で超音波処理する工程を包含する、方法。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の方法であって、前記第１の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
【請求項１０４】
請求項１０２に記載の方法であって、前記最初の無粋溶媒が、ジクロロメタンである、方法。
【請求項１０５】
請求項１０１に記載の方法であって、前記洗浄が、最初に無水溶媒で、前記１つ以上の表面に超音波をあて、そして前記１つ以上の表面を水で超音波処理する工程を包含する、方法。
【請求項１０６】
請求項１０５に記載の方法であって、前記第１の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
【請求項１０７】
請求項１０６に記載の方法であって、前記最初の無粋溶媒が、ジクロロメタンである、方法。
【請求項１０８】
請求項１０５に記載の方法であって、前記水が、脱イオン水である、方法。
【請求項１０９】
請求項１０７に記載の方法であって、前記水が、脱イオン水である、方法。
【請求項１１０】
請求項１０９に記載の方法であって、前記ケラチンが、還元／還元ケラチンである場合、前記溶媒が水である、方法。
【請求項１１１】
請求項１０９に記載の方法であって、前記ケラチンが、酸化／還元ケラチンである場合、前記溶媒が塩基含有水溶液を含む、方法。
【請求項１１２】
請求項１１１に記載の方法であって、前記塩基が、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項１１３】
請求項１１１に記載の方法であって、前記塩基が、水酸化アンモニウムである、方法。
【請求項１１４】
請求項９８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
【請求項１１５】
請求項９８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
【請求項１１６】
請求項１０５に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
【請求項１１７】
請求項１０５に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
【請求項１１８】
請求項１０７に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選択される、方法。
【請求項１１９】
請求項１１８に記載の方法であって、前記第２の無水溶媒が、ジメチルスルホキシドである、方法。
【請求項１２０】
触媒およびインヒビターからなる群から選択される活性化剤と前記ケラチン混合物を混合する工程をさらに包含する、請求項９９〜１１８および請求項１１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
請求項１２０に記載の方法であって、前記活性化剤が、ビニル官能化シランであり、そして該活性化剤が、フリーラジカルを生成するのに有効である、方法。
【請求項１２２】
請求項１２１に記載の方法であって、前記活性化剤が、アントラキノン−２−スルホン酸を含む、方法。
【請求項１２３】
請求項９８に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
【請求項１２４】
請求項１２０に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
【請求項１２５】
請求項１２１に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
【請求項１２６】
請求項１２２に記載の方法であって、前記条件が、前記生物活性領域を生成するのに有効な期間、前記ケラチンコーティング結合領域をエネルギー源に曝露する工程を包含する、方法。
【請求項１２７】
請求項１２３に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
【請求項１２８】
請求項１２４に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の方法を包含する、方法。
【請求項１２９】
請求項１２５に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
【請求項１３０】
請求項１２６に記載の方法であって、前記条件が、前記活性化剤の存在を包含する、方法。
【請求項１３１】
請求項１２３に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
【請求項１３２】
請求項１２６に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
【請求項１３３】
請求項１２７に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
【請求項１３４】
請求項１３０に記載の方法であって、前記期間が、約１時間〜約２４時間である、方法。
【請求項１３５】
請求項１２６に記載の方法であって、前記期間が、約２４時間である、方法。
【請求項１３６】
請求項１３０に記載の方法であって、前記期間が、約２４時間である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、係属中の米国仮出願番号６０／３３９，０３９（２００２年７月２５日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本願は、医療デバイスのためのコーティングに関し、好ましくは、医療移植片のためのコーティングに関する。より具体的には、本願は、生物活性コーティングに関し、好ましくは、骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）特性を有するケラチンを含む生物活性コーティングに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
医療デバイス表面を保護する目的で、多くの異なる型のコーティングが開発されている。コラーゲン、ヒドロキシアパタイトおよびより最近には、いわゆるＲＧＤペプチドの全てが、整形外科移植片適用におけるコーティングとして研究されている。これらの物質全ては、少なくとも骨伝導性（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）であると示されているが、骨誘導性であるとは示されていない。骨誘導特性を有し、ヒト免疫系から移植片をマスクし得る保護コーティングが必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（簡単な要旨）
本願は、ケラチンを含有する保護コーティングを含む医療移植片を提供する。この保護コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。前記結合領域は、前記基材表面に結合したシラン成分を含む少なくとも１つの有機シラン化合物を含む。この生物活性領域は、ケラチンの反応性ペンダント基（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｅｎｄａｎｔ  ｇｒｏｕｐ）に結合した前記有機シランの有機成分を含む。
【０００５】
（詳細な要旨）
本願は、ケラチンを含有する保護コーティングを含む基材を提供する。好ましい実施形態において、この保護コーティングは、骨誘導特性を含む。さらに好ましい実施形態において、この保護コーティングは、骨伝導特性と骨誘導特性の両方を含む。
【０００６】
この基材は、好ましくは、医療デバイス上に存在し、さらに好ましくは、医療移植片上に存在する。この医療デバイスは、好ましくは、組織工学構造物、整形外科移植片、歯科移植片および心室補助デバイスからなる群から選択される。
【０００７】
この基材は、生体適合性物質を含む。この生体適合性物質は、好ましくは、シリコン、金属、合金およびセラミックからなる群から選択される。好ましい金属は、チタンを含み、そして、チタン金属またはその合金であり得る。好ましいセラミックは、ヒドロキシアパタイトを含む。
【０００８】
好ましい実施形態において、保護コーティングは、ケラチンならびに骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される１つ以上の生物活性因子を含む。このケラチンは、毛髪、毛皮、羽毛、角、蹄、嘴または足からなる群から選択される物質由来である。ケラチンは、好ましくは、毛髪由来であり、より好ましくはヒト毛髪由来であり、これは、「ヒト毛髪ケラチン」と呼ばれ得る。ケラチンはまた、好ましくは、還元ケラチンを含む。
【０００９】
好ましくは、この保護コーティングは、結合領域および生物活性領域を含む。この結合領域は、移植片表面の結合とケラチン上の反応性ペンダント基の結合の両方に適合される物質を含む。好ましくは、この結合領域は、少なくとも１つのシラン化合物を含み、さらに好ましくは、有機シランを含む。
【００１０】
好ましくは、この有機シランは、シラン成分および有機成分を含む。この結合領域は、医療デバイス表面に結合したシラン成分を含み、そしてこの生物活性領域は、有機シランの有機成分に結合したケラチンを含む。この有機シランについて適切な有機成分は、ケラチン上の反応性ペンダント基との反応に適合される。好ましくは、この有機シランは、
エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む有機成分を含む。好ましい有機成分は、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む。さらに好ましい有機成分は、エポキシ基、アクリレート基、アルコキシ基、ビニル基およびアルキルアミン基からなる群から選択される。最も好ましい有機部分は、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される。好ましくは、この有機シランは、約１個〜３個のハロゲンおよび約１個〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む。好ましいハロゲンは、塩素である。
【００１１】
また、基材を保護基材でコーティングする方法を、提供する。この方法は、以下：前記基材とカップリング物質を結合して結合領域を生成する工程；および前記結合領域とケラチンを結合する工程を包含する。さらに好ましくは、この方法は、前記基材とカップリング物質を結合する前に、この基材表面を酸化する工程を包含する。
【００１２】
好ましい実施形態において、この基材とカップリング物質を結合する前に、この基材を洗浄する。さらに好ましくは、この洗浄工程は、無水溶媒中での超音波処理および水中での超音波処理を包含する。適切な無水溶媒には、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無水溶媒は、ジクロロメタンである。好ましくは、水は、脱イオン水である。
【００１３】
前記結合領域にケラチンを結合させる工程は、適切な溶媒にケラチンを溶解して、無水溶媒を添加してケラチン混合物を生成する工程、前記ケラチン混合物に前記結合領域を曝露する工程；そして前記生物活性領域を生成するのに有効な条件下で硬化させる工程を包含する。
【００１４】
還元／還元ケラチンについて、適切な溶媒は、水である。酸化／還元ケラチンについて、適切な溶媒は、塩基含有水溶液を含む。適切な塩基には、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウムおよび／または水酸化カリウムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい塩基は、水酸化アンモニウムである。
【００１５】
適切な無水溶媒には、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無水溶媒は、ジメチルスルホキシドである。
【００１６】
この方法は、触媒および開始剤からなる群から選択される試薬とケラチン混合物とを混合する工程を包含する。ビニル官能化シランカップリング剤を使用する場合、適切な開始剤または触媒は、フリーラジカルを生成する。好ましいフリーラジカル開始剤は、アントラキノン−２−スルホン酸またはアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）からなる群から選択される。
【００１７】
硬化は、このケラチン混合物に曝露される基材を、このコーティングを硬化させるのに十分な期間にわたって有効なエネルギー供給源に曝露する工程を包含する。好ましくは、この硬化は、前記触媒または前記開始剤の存在下で生じる。この硬化期間は、代表的には、約１時間〜約２４時間であり、好ましくは約２４時間である。
【００１８】
（詳細な説明）
ケラチンは、傷害または損傷なしで容易に提供され得るヒトタンパク質の、唯一ではないにしても数少ないファミリーの１つである。この独特の構造タンパク質のファミリーは、非常に多くの脊椎動物組織において見出され得、最も著しくは毛髪および毛皮において見出され得る。何百トンというヒト毛髪が、毎日破棄されている。１００以上の相同体を有するファミリーのように、ケラチンの生体適合性は、その構造改変体によって予め決定される。どのヒトタンパク質も、この程度の構造および組成の多様性を示さず、それゆえ、免疫系による耐性を示さない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本願は、ヒト毛髪繊維からケラチンを選択的に抽出し、医療デバイス物質（例えば、金属およびセラミック）表面上に分子コーティングを生成する浸漬プロセスにおいて、このケラチンを使用する。この方法は、この移植片表面とケラチン上の反応性ペンダント基の両方に結合するのに適合したカップリング剤を使用する。好ましくは、この結合領域は、少なくとも１つのシラン化合物を含み、さらに好ましくは、有機シランを含む。好ましくは、この有機シランは、シラン成分および有機成分を含み、ここでこの結合領域は、医療デバイス表面に結合したシラン成分およびケラチン上の反応性部分と結合した有機成分を含む。好ましい実施形態において、この有機シランのシラン成分は、医療デバイス表面と共有結合しており、この有機シランの有機成分はケラチン上の反応性部分と共有結合している。
【００２０】
水接触角およびＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）によるこれらのコーティングの特性決定から、非常に異なった表面特性が示された。このオングストロームの薄さのケラチンコーティングは、頑強であり、そしてグリットブラストされたチタンディスクの標準形態の妨げにはならなかった。これらの表面特性は、培養中のケラチンコーティングされたチタンディスク上の２Ｔ３マウス骨芽細胞の付着、増殖および分化につながることが示された。
【００２１】
一般的に、このコーティング方法は、代表的には、金属およびセラミック表面を有する医療デバイス物質に、適用可能である。このコーティング方法は、宿主の受容性を促進して、そして／または組織増殖を加速する、より生体適合性の界面を生成して、最終的には、生物学的に活性な表面を生成する能力を有する。
【００２２】
（ケラチン）
ヒト毛髪は、角質として知られる鱗状の重なった形に配置される扁平細胞からなる剛健な管状外層から構成される。この毛髪の内部バルクは、皮質として知られており、繊維状ケラチンにより高密度に充填された細長い細胞から構成されている。α−ヘリカルケラチンのミクロフィブリルコイルドコイルを含む、この繊維状ケラチンは、束状に配置され、マクロフィブリルと呼ばれる。この構造の中間フィラメント（ＩＦ）は、非晶質ケラチンマトリックス物質と一緒に結合している。このマトリックスおよびＩＦは、機能および組成において異なる。このマトリックスは、ＩＦを一緒に維持する「接着剤」である。この接着剤は、硫黄含量が高く、低分子量ケラチン（ＬＭＷＫ）（代表的には、１０〜１５ｋＤａ未満）からなる。このＩＦは、相対的に低い硫黄含量ではあるが、高分子量のケラチン（高分子量ケラチンすなわちＨＭＷＫ）を含み、ほぼ５０〜８５ｋＤａである。
【００２３】
ケラチンの１つの際立った特徴は、ポリペプチド鎖の３次元ネットワークを形成するジスルフィド架橋の存在により、ケラチンに、大部分において構造の完全性を与える。このネットワーク構造は、ケラチンが不溶性であることを示す。しかしながら、ケラチンは、ジスルフィド結合切断を介する３次元構造の破壊により、可溶性になり得る。ジスルフィド結合切断は、酸化的、還元的に行なわれるか、またはこの２つの組み合わせによって行なわれ得る。
【００２４】
制御された条件下でのジスルフィド結合切断および選択的抽出により、ＨＭＷＫからＬＭＷＫが単離される。このプロセスは、角質をばらばらにすることなく皮質タンパク質を取り外すのに用いる。毛髪繊維の内部構造を、角質に対して実質的な障害を与えずに取り外す。この抽出プロセスによるＨＭＷＫは、ゲル電気泳動により、分子量６６ｋＤａおよび４３ｋＤａで２つの広いタンパク質バンドを生じる。これらのケラチンは、構造的生体適合性物質（セラミックおよび金属表面のコーティングを含む）として有用である。
【００２５】
成長因子（例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β））は、毛髪濾胞に存在し、コーティングにより送達可能であり、このコーティングに骨誘導性および骨伝導性の特性を提供する。
【００２６】
ケラチンは、一般的に、式：
【００２７】
【化１】
2005537831.tif 000002
を有するアミノ酸を含む。表１は、例えば、ヒト毛髪に見出されるアミノ酸残基を要約し、各残基に対応する「Ｒ１」基を示す。
【００２８】
【表１−１】
2005537831.tif 000003
【００２９】
【表１−２】
2005537831.tif 000004
ヒト毛髪における最も多いアミノ酸は、システインであり、これは、ジスルフィド架橋されたシステイン基の形態で見出される。上に議論したように、この基は、他の硫黄含有部分（最も著しくは、チオール）に変換され得る。チオールは、以下に記載されるような多くの化学技術を使用してカップリング物質の反応性末端と反応し得る：Ｓ．Ｐａｔａｉ（Ｅｄ．），ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｏｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐａｒｔｓ  １  ａｎｄ  ２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７４）（これは、本明細書中で参考として援用される）。他の反応シナリオ（例えば、ポリマー合成に関するもの）はまた、チオールを利用して所望の架橋の組み合わせを形成するのに役立つ（例えば、これは、Ｒｅｍｐｐ，Ｐ．およびＭｅｒｒｉｌｌ，Ｅ．Ｗ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｈｕｅｔｈｉｎｇ＆Ｗｅｐｆ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂａｓｅｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（１９８６）；Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｏｖｅｌｌ，Ｐ．Ａ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９１）；Ｏｄｉａｎ，Ｇ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）に記載され、本明細書中で参考として援用される）。
【００３０】
システインに加えて、以下のアミノ酸は、反応性ペンダント基として有用であり得る、窒素または酸素を含むペンダント基を有する；アルギニン、セリン、グルタミン酸、スレオニン、アスパラギン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン。タンパク質が、α−ケラチンである場合、架橋のための反応性ペンダント基を含む好ましいアミノ酸残基は、システイン、アルギニン、セリンおよびグルタミン酸であり、最も好ましくは、シスチンおよびアルギニンである。
【００３１】
（ジスルフィド結合切断およびケラチン抽出）
ケラチンは、多くの方法でプロセシングされ得、および／または単離され得る。好ましくは、このプロセシングは、得られるタンパク質を水溶性にするのに十分である。適切なプロセシング技術としては、プロセシングが、ペプチド結合の有意な加水分解なしにタンパク質を水溶性にする限り、公知の酸化技術、還元技術、および／またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３２】
多くの還元化学は、ケラチンのジスルフィド結合切断について公知である：Ｗａｒｄｅｌｌ，Ｊ．Ｌ．，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｉｏｌｓ」ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｉｏｌ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐａｔａｉ，Ｓ．（Ｅｄｉｔｏｒ），ｐｐ．１６３−３５３，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７４）を参照のこと。これは、本明細書中で参考として援用される。ＨＭＷＫは、少なくとも２つの還元性抽出を使用して毛髪から抽出され得る（例えば、Ｃｒｅｗｔｈｅｒ，Ｗ．Ｇ．，Ｆｒａｓｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｂ．，Ｌｅｎｎｏｘ，Ｆ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｌｉｎｄｌｅｙ，Ｈ．，「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｋｅｒａｔｉｎｓ」Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎｆｉｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｊｒ．，Ａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｅｄｓａｌｌ，Ｊ．Ｔ．，およびＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．（Ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１９１−３４６（１９９５）に記載され、本明細書中に参考として援用される）。
【００３３】
以下の方法は、コーティングを作製する際に使用するため、ケラチンをプロセシングするのに適している：
（−酸化／還元）
ケラチンを供給源物質（例えば、ヒト毛髪）として使用する好ましい実施形態において、毛髪を、適切な酸化剤により酸化する。適切な酸化剤としては、過酸化水素、過酢酸、過カルボン酸、過硫酸、二酸化塩素、ナトリウム過酸化物およびカルシウム過酸化物、過ホウ酸塩ならびに次亜塩素酸塩が、挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。最も好ましい酸化剤は、過酸化水素である。このオキシダントを、約３５％までの濃度で、好ましくは、約０．１％〜約１０％の濃度で使用する。この酸化は好ましくは、還流温度で生じる。
【００３４】
好ましい実施形態において、角質をばらばらにして、ケラチン供給源物質を増やすために、毛髪は、約０．１％〜約１０％の濃度の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を用いて処理される。このプロセスはまた、幾つかのシスチン残基の分画を硫酸基に変換する。他の酸化反応条件を一定に保持したままで、酸化時間を変えることにより、好ましくは、約０時間〜約４時間で、酸化量を制御し得る。これらの条件としては、オキシダントの濃度および型、温度、ならびに抽出培地とケラチン供給源物質との比が挙げられる。反応が完了した後、酸化した毛髪を濾過して、好ましくは脱イオン水を用いてリンスする。この濾液を破棄し、毛髪を乾燥させた。
【００３５】
他の酸化の条件が一定に維持される場合、シスチンの硫酸残基への変換速度は、酸化に使用された時間量に大まかに比例している。得られる酸化ケラチン固体中の残留シスチンを、還元技術を使用して硫黄を含む他の部分に変換する。好ましくは、ジスルフィド架橋されるシスチン基を、それ自体で有用であるか、または種々の化学技術を使用して改変され得るチオール基に変換する。
【００３６】
酸化された毛髪を、好ましくは還元剤で処理する。適切な還元剤としては、チオグリコール酸およびその塩、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、チオ乳酸、グルタチオン、システイン、硫化ナトリウムならびに硫化水素ナトリウムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい還元剤は、チオグリコール酸およびメルカプトエタノールであり、最も好ましくは、チオグリコール酸である。
【００３７】
酸化した毛髪を、還元剤で処理するために、予め酸化した毛髪を、代表的には約１０Ｎまでの濃度、好ましくは、約０．１Ｎ〜１Ｎの濃度の還元剤；約７より大きいｐＨ、好ましくは、ｐＨ９以上、最も好ましくは、ｐＨ９で；約２５℃〜約８０℃の温度、好ましくは、約６０℃の温度にて、好ましくは、約１時間〜約７２時間かけて、最も好ましくは、約２４時間かけて懸濁する。この反応は、不活性雰囲気、好ましくは窒素下で生じる。この液体分画を、公知の方法（例えば、濾過もしくはカニュレーションおよび／または遠心分離が挙げられ、必ずしもこれらに限定はされず、好ましくは、不活性雰囲気下である）を使用して、残りの固体から分離する。好ましい分離方法は、濾過である。一旦、この固体を除去すると、可溶性ケラチンタンパク質は、水混和性非溶媒の添加またはスプレー乾燥により、この溶液から分離される。水混和性非溶媒には、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン等が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、この場合も不活性雰囲気下である。好ましい非溶媒は、エタノールである。沈殿物を、公知の技術を使用して、好ましくは、濾過および非溶媒のさらなるアリコートを使用するリンスによって、非溶媒から分離する。得られたケラチンタンパク質を、公知の技術を使用して、好ましくは、室温にて一晩減圧下で乾燥させる。このプロセスは、スルホン酸基およびチオール基の両方を有するケラチンを生じる。
【００３８】
最も好ましい反応において、清浄な乾燥したヒト毛髪を、過酸化水素を用いて、加熱しながら、好ましくは還流で、ジスルフィド結合を切断するのに有効な期間、代表的には、約１８０分間かけて処理する。この毛髪を、好ましくは、濾過によって液体から分離し、溶液を廃棄した。毛髪を、好ましくは、大量の水でリンスし、風乾させた。次いで、この乾燥させた酸化毛髪を、還元剤、好ましくは、ｐＨ９（水酸化アンモニウムで調整する）の１Ｍ  チオグリコール酸を用いてで処理し、この混合物を、不活性ガス、好ましくは、窒素雰囲気下で、一定の時間、好ましくは２４時間かけて、好ましくは約６０℃まで加熱する。還元性抽出後、この固体を、好ましくは、遠心分離により溶液から分離する。この濾過した液体を、過剰のエタノール、好ましくは、約８倍量過剰のエタノールに、添加、好ましくは滴下し、それによりケラチン沈殿物を形成させる。この沈殿したケラチンを、濾過により分離し、減圧下で乾燥する。乳鉢および乳棒を使用して、ケラチンを微粉末に挽く。
【００３９】
（還元／還元抽出）
別の実施形態において、選択的にマトリックスケラチンを抽出するのに有効な第１の条件下で、第１の還元剤を用いて毛髪を処理して、可溶性の還元マトリックスケラチン（ＬＭＷＫ）を含む第１の溶液を生成し、そして毛髪固体（ＨＭＷＫ）を維持することにより、第１の還元性抽出を行う。ＬＭＷＫを本明細書中に記載の技術に供して、コーティングを生成し得るが、本明細書中の技術における用途に好ましいタンパク質は、ＨＭＷＫであり、これは、好ましくは、２回目の抽出の間に単離される。残りの毛髪固体および第１の溶液を分離して、この残りの毛髪固体を、α−ケラチンを可溶化するのに有効な第２の条件下で、可溶性の還元α−ケラチン（ＨＭＷＫ）および固体角質を含む第２の溶液を生成して、２回目の抽出溶液に曝露する。
【００４０】
適切な還元剤としては、この場合も、チオグリコール酸およびその塩、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、チオグリセロール、チオ乳酸、グルタチオン、システイン、硫化ナトリウムならびに水硫化ナトリウムが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい還元剤は、チオグリコール酸およびメルカプトエタノールであり、最も好ましくは、チオグリコール酸である。
【００４１】
所望のタンパク質を、選択的に還元および抽出するために、毛髪（または他のタンパク質源）を、約０．１Ｍ〜約１０Ｍの濃度、好ましくは約１．０Ｍの還元剤に、懸濁する。毛髪繊維を穏やかに膨張させて、ｐＨを約９以上（好ましくは、ｐＨを約９〜約１０．５）にする。従って、最初の還元は、約２０℃〜約１００℃の温度で、好ましくは、約２５℃で生じる。最初の還元を達成するのに必要とされる時間は、約８時間〜約３６時間、最も好ましくは、約２４時間である。この反応は、不活性雰囲気、好ましくは窒素下で生じる。この液体分画を、公知の方法（例えば、濾過、カニュレーションおよび／または遠心分離が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、好ましくは、不活性雰囲気下）を使用して、残りの固体から分離する。好ましい分離方法は、濾過である。
【００４２】
２回目の抽出を、適切な膨張剤、好ましくは、尿素および／または塩基（例えば、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム）を使用して行う。この２回目の抽出のための最も好ましい膨張剤は、濃尿素である。２回目の抽出は、約１Ｍ〜約１０Ｍ尿素、好ましくは、約７Ｍ尿素で、少なくとも約１時間、好ましくは約１時間〜約７２時間、より好ましくは２０時間以上、最も好ましくは約２４時間の時間で生じる。２回目の抽出は、室温で生じるが、約２０℃〜約１００℃の温度、好ましくは２５℃で行われ得る。液体分画を、公知の方法を使用して空のインタクトな角質から分離する。適切な方法としては、濾過、カニュレーションおよび／または遠心分離が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、好ましくは、不活性雰囲気下である。好ましい分離方法は濾過である。
【００４３】
一旦、角質を取り除くと、この水溶性ケラチンタンパク質を、さらなる使用のために溶液中に保持し得、あるいはこれを、水混和性非溶媒への添加またはスプレー乾燥によって、この溶液から単離し得る。水混和性非溶媒としては、エタノール、メタノール、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン等が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されず、この場合も不活性雰囲気下である。好ましい非溶媒は、エタノールである。沈殿物を、公知の方法を使用し、好ましくは、濾過および非溶媒のさらなるアリコートを使用するリンスによって、非溶媒から分離する。沈殿したタンパク質を、公知の方法を使用し、好ましくは、室温にて一晩、減圧下で乾燥する。抽出された水溶性ケラチンタンパク質（本明細書中において、集合的に「水溶性タンパク質」という）は、チオールまたはチオール基を含む。
【００４４】
（コーティングプロセス）
（表面を洗浄する工程）
基材をコーティングする前に、任意の適切な手順を使用して、表面を洗浄する。適切な手順の例は、無水溶媒および水中の連続した超音波処理である。適切な無水溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトンまたはテトラヒドロフランが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無水溶媒は、ジクロロメタンである。水は、好ましくは、脱イオン水であり、その後、乾燥し、好ましくは風乾する。
【００４５】
（結合領域を形成する工程）
洗浄後、移植片を、カップリング物質、好ましくは有機シランの溶液に浸す。表面コーティングにおけるシラン化合物の使用は、公知の工業プロセスである。Ａｒｋｅｌｓ  Ｂ．「Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｌａｎｅｓ」．Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  １９７７；７６６−７７８（本明細書中に、参考として援用される）。有機シランは、表面化学を保護し、変化させ得るだけでなく、カップリング剤として使用されて、さらに別の化合物と基材の外側表面との結合を容易にさせ得る。
【００４６】
種々の化学官能基を有する市販の有機シランには、多くの異なる型がある。有機シランは、好ましくは、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基、アミン基、イソシアネート基およびカルボキシル基からなる群から選択される部分を含む有機成分を含む。好ましい有機成分は、エポキシ基、アルコキシ基、ビニル基およびアミン基からなる群から選択される部分を含む。さらに好ましい有機成分は、エポキシ基、メタクリレート基、アルコキシ基、ビニル基およびアルキルアミン基からなる群から選択される。最も好ましい有機部分は、ビニル基およびエポキシ基からなる群から選択される。
【００４７】
有機シランは、好ましくは、約１〜３個のハロゲンおよび約１〜３個のアルコキシ基からなる群から選択される置換基を含む。好ましいハロゲンは、塩素である。
【００４８】
好ましい有機シランは、特に表面がチタンの場合、ビニルメチルジクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ）である。有機シランは、有機溶媒中である。有機溶媒は、実質的に、結合プロセスに負の影響を与えることなしに、溶液中の有機シランを維持するのに有効な、任意の有機溶媒である。有機溶媒は、好ましくは、酸素および／または窒素以外の元素を含む。適切な有機溶媒の例としては、アルカン、アルキレンクロライド、クロロホルム、キシレンおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましいアルカンはヘキサンであり、好ましいアルキレンクロライドは、メチレンクロライドである。最も好ましい有機溶媒は、ヘキサンである。有機溶媒中の有機シランのパーセンテージは、約１〜約１０重量パーセンテージまで変動し得、好ましくは、約１重量パーセントである。
【００４９】
基材を、コーティングを形成するのに十分な時間、適切には約１〜約３０分間、代表的には約１０分間、溶媒中に維持する。次いで、この基材を溶液から取り出し、大量の新たな有機溶媒でリンスして、風乾させた。
【００５０】
（生物活性領域を形成する工程）
生物活性領域を形成するために、上記のように得られたケラチン粉末を、適切な溶媒に溶解する。還元／還元ケラチンについて、適切な溶媒は水である。酸化／還元ケラチンについて、適切な溶媒は、塩基を含む水溶液を含む。適切な塩基としては、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウムおよび／または水酸化カリウムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい塩基は、水酸化アンモニウムである。好ましい実施形態において、約１５グラムのケラチン粉末を、約３０ｍＬの３Ｎ水酸化アンモニウムに溶解する。
【００５１】
無水溶媒を加える。適切な無水溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、アセトン、またはテトラヒドロフランが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。好ましい無水溶媒は、ジメチルスルホキシドである。ケラチンおよび塩基の前記の重量および容積に、約２７０ｍＬのジメチルスルホキシドを加える。この混合物を、穏やかに加熱しながら、ケラチンが溶解するまで攪拌する。
【００５２】
好ましくは、適切な触媒または開始剤を使用する。例えば、ビニル官能化シランカップリング剤を使用する場合、フリーラジカルを生成するために適切な開始剤または触媒を使用する。そのような開始剤の例は、ＵＶ活性化された光開始剤（例えば、アントラキノン−２−スルホン酸またはアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）である。前記の重量および容積に、約１．５グラムのアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物を加える。得られる溶液を、シランコーティング移植片に、これを完全に浸すように注ぐ。次いで、効果的なエネルギー源（例えば、加熱ランプ、オートクレーブ、マイクロ波、またはＵＶランプ）を使用して、浸した基材のコーティングを硬化する。好ましいエネルギー源は、ＵＶランプ（λ＝３６５ｎｍ、１．０５ａｍｐｓ）である。硬化は、コーティングを硬化するのに十分な時間（代表的には、約１時間〜約２４時間、好ましくは、約２４時間）継続される。硬化後、基材を溶液から取り出して、好ましくは、多量の脱イオン水を用いてリンスし、乾燥し、好ましくは風乾する。
【００５３】
当業者は、前記のパラメータ（例えば、重量、容積、および時間）が、移植片の表面領域、使用される特定の結合材料および他の因子に依存して変化し得ることを認知する。
【００５４】
本願は、以下の実施例（これは、単に説明であり、特許請求の範囲を特定の実施形態に制限するものとして構成されるべきではない）を参照してよりよく理解される。以下の材料と方法を、以下に記載する実施例において使用した：
（材料と方法）
（ケラチンの調製）
代表的な反応において、５００ｇの清浄な乾燥したヒト毛髪を、１２Ｌ丸底フラスコに入れた。１重量パーセント／体積の過酸化水素８，３５０ｍＬを加え、この反応物を加熱して１８０分間還流した。この毛髪を、濾過により液体から分離し、この液体を廃棄した。毛髪を多量の水でリンスして、風乾させた。１００ｇの乾燥した、酸化した毛髪を、２０００ｍｌ丸底フラスコに入れた。ｐＨ９にて（水酸化アンモニウムで調節する）、１０００ｍＬの１Ｍチオグリコール酸を加え、この混合物を窒素雰囲気下、２４時間にわたって６０℃まで加熱した。還元抽出後、固体を遠心分離により液体から分離した。濾過した液体を、８倍の容量過剰のエタノールに滴下し、それによってケラチンの沈殿を形成させた。形成したケラチンを濾過によって分離し、減圧下で乾燥した。ケラチンを乳鉢と乳棒を使用して微粉末に挽いた。
【００５５】
細胞応答に使用するために非常に制御され、かつ十分に特性化された表面を有するグリットブラストチタン試験ディスクを、調製した。選択された材料は、医療等級で市販されている純粋なチタンである（Ｃ．Ｐ．Ｔｉ）。この材料を、大きなシート（約５フィート×４フィート×０．０５０インチ、全てのサンプルセットについて金属同質性を確保するため）として、Ｔｉｍｅｔ（Ｏ’Ｆａｌｌｏｎ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【００５６】
１フィート×１フィートシートを、元の大きな単一シートから切り取った。各ディスクについて、一貫した表面の仕上がりを確保するために、これらのシートにおいて表面調製を行なった。各１フィート×１フィートシートを、＃２０グリット酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）粉末を粗い表面の仕上がりのために使用し、圧縮空気を用いた酸化アルミニウムグリットブラストプロセスに供した；グリッドブラストは、Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって行なわれた。
【００５７】
表面の仕上がり操作の品質制御を行い、これを、表面の粗さの均一性測定により評価した。ダイヤモンド針接触側面計を使用して、表面の粗さを、各１フィート×１フィートのプレート上の異なる１０個の位置で測定した。この粗さ測定を、あらゆる方向で行なった。平均Ｒａは、９．５６μｍであり、標準偏差は１．６３μｍであった。
【００５８】
直径１４．７５ｍｍおよび厚さ０．８０ｍｍを有するディスクを、細胞アッセイのために調製した。ディスクを、洗浄剤溶液で３回洗浄し、各洗浄の間にＤＩ水で２回リンスした。最後のリンスの後、エタノールをディスクに注ぎ、過剰な水を除去した。ディスクを風乾した。
【００５９】
（チタンディスクのコーティング）
代表的な手順において、チタンディスクを、ジクロロメタンおよび脱イオン水中での連続した超音波処理により洗浄した後、風乾した。ディスクを、ヘキサン中１重量％のビニルメチルジクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ  Ｉｎｃ．，Ｔｕｌｌｙｔｏｗｎ，ＰＡ）溶液に１０分間浸した。各ディスクを、個別に溶液から取り出して、多量の新たなヘキサンでリンスし、風乾させた。
【００６０】
代表的なケラチンコーティング工程において、１５グラムのケラチン粉末を、３０ｍＬの３Ｎ水酸化アンモニウムに溶解した。２７０ｍＬのジメチルスルホキシドを加えて、この混合物を穏やかに加熱しながら、ケラチンが溶解するまで攪拌した。１．５グラムのアントラキノン−２−スルホン酸ナトリウム塩一水和物（Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を加えて、この溶液を、シランコーティングされたチタンディスクサンプルに注ぎ、ディスクサンプルを、浅いガラス皿に完全に浸した。このガラス皿を、ＵＶランプ（λ＝３６５ｎｍ、１．０５ａｍｐｓ）下に２４時間、置いた。ＵＶ曝露後、各ディスクを溶液から取り出して、多量の脱イオン水でリンスし、風乾させた。
【００６１】
（水接触角）
水平な表面に１滴の超純水１００μＬを置くことによって、接触角を、光学コンパレータ上で測定した。測定値を得る前に、界面エネルギーを３０秒間平衡化させた。
【００６２】
（Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ））
Ａｌ単色源（１４８６．６ｅＶにてＡｌ  Ｋα放射）を備える物理電子工学ＰＨＩ５７００ＥＳＣＡシステムを使用して、ＸＰＳデータを得た。分析の間、ＸＰＳ超高真空チャンバ中の基本圧力は、２×１０−１０トールであった。０．１ｅＶの工程サイズおよび１１．７５ｅＶのパスエネルギーを用いて、高解像スキャンを得た。シランおよびケラチンコーティングの存在を、これらの各コーティングのみに存在する元素の原子濃度を探知することによってモニターした。シランコーティングには、シリコンを使用し、ケラチンコーティングには、窒素を使用した。硫黄がまた、ケラチン中に存在し、ＸＰＳにより検出されるが、硫黄のシグナルとノイズの比が、ほぼ１．５であり；それゆえ、硫黄シグナルについて計算される原子の濃度は、エラーバーと同じオーダーにあったので、本研究では硫黄を使用しなかった。
【００６３】
ＸＰＳはまた、フィルム厚さを測定するために使用した。清浄な基材のシグナルが公知である場合、フィルムを上に有するこの基材由来のＸＰＳシグナルは、以下の標準減衰式を使用して、計算され得る：
Ｎ＝Ｎ０・ｅｘｐ［−ｔ／（λ・ｓｉｎθ）］
ここで、Ｎは、フィルムを上に有する基材のＸＰＳシグナル（ピーク下の領域）であり、Ｎ０は、清浄な基材のＸＰＳシグナルであり、ｔは、フィルムの厚さであり、λは、フィルム中の光電子の平均自由光路（本研究において、２０Åであると想定される）であり、θは、ＸＰＳ検出器と表面の間の角度であり、この場合、４５°に等しい。Ｃ．Ｓ．Ｆａｄｌｅｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８４；１６：２７５−３８８（本明細書中で参考として援用される）。
【００６４】
（骨芽細胞培養アッセイ）
α−最小基本培地（α−ＭＥＭ）をＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から、胎児ウシ血清（ＦＢＳ）をＳｕｍｍｉｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ，ＵＳＡ）から購入した。ホルマリンをＥｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ）から得た。全ての他の試薬を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。
【００６５】
骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）プロモータにより駆動された２Ｔ３細胞株は、トランスジェニックマウスから単離され、クローン化されている。Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  Ｎ，Ｗｉｎｄｌｅ  ＪＪ，Ｋｏｏｐ  ＢＡ，Ｈａｒｒｉｓ  ＭＡ，Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，ＤＬ，Ｗｏｚｎｅｙ  ＪＭ，Ｍｕｎｄｙ  ＧＲ，およびＨａｒｒｉｓ  ＳＥ．「Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ＢＭＰ２−Ｔ−ａｎｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １９９６；１３７：３３１−３３９（本明細書中に参考として援用される）。
【００６６】
これらの細胞は、インビトロで骨マトリックス形成を起こす。２Ｔ３細胞を、１群あたり１プレートの１２−ウェルプレートにおいて、各チタンディスク上にプレートした。１０％ＦＢＳで補充したα−ＭＥＭを用いて、細胞が９０％コンフルーエンスに達するまで（約５日）培養した。培地を、１日おきに変えた。一旦、細胞がコンフルーエンスに達すると、培地を、処理群について５％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＡｓＡ）および５ｍＭ  β−グリセロリン酸（β−ＧＰ）含有α−ＭＥＭに変え、コントロール群についてＡｓＡおよびβＧＰ無しの５％ＦＢＳα−ＭＥＭに変えた。この培地を、３日おきに変えて、処理期間の最終日である１４日までに新たな試薬を加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【００６７】
（Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色）
Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ細胞染色を、以前に出版された手順から改変した。Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ  ＪＮ，Ｇｒａｖｅｓ  ＳＥ，およびＳｍｏｏｔｈｙ  ＣＡ、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｎｏｄｕｌｅｓ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ？」。Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．１９９３；４５：１６３−７８。
【００６８】
２Ｔ３細胞を、チタンディスク上に固定するために、最初に細胞を、ＰＢＳ出洗浄して、１０％リン酸緩衝ホルマリン中で１０分間固定した。このホルマリン溶液を吸引し、細胞を、脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）でリンスした。新たな２％硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を、細胞に加え、次いで、細胞を有するチタンディスクを、１０分間直射日光下に置いた。１０分後、ＡｇＮＯ３を取り除いて、２Ｔ３細胞を、ｄＨ２Ｏの安定な気流下でリンスした。５％チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）溶液を、細胞に３分間にわたって添加した。Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を取り除いて、細胞をｄＨ２Ｏで再びリンスした。以下のエタノール（ＥｔＯＨ）シリーズを、細胞に適用した：３０秒間の９５％ＥｔＯＨ、もう一度これを繰り返した後、各３０秒間の１００％ＥｔＯＨ適用を２回行なう。次いで、細胞を風乾させた。
【００６９】
（走査型電子顕微鏡検査）
表面形態学の画像を得るために、細胞を有するチタンディスクを、１０秒間スパッタコータ−で、金／パラジウム（Ａｕ／Ｐｄ）コーティングした。チタン表面の画像を、Ａｍｒａｙ走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ａｍｒａｙ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に、１５ｋＶにて得た。画像を、３つの倍率：１００×、５００×および１，０００×
で得た。
【００７０】
（統計的方法）
示される場合、サンプル群間の違いを、不均等分散で生徒の両側スチューデントｔ−検定を使用して決定した。統計的有意差を、０．０５未満のｐ値に設定した。
【実施例】
【００７１】
（実施例１）
本研究において、フリーラジカル付加化学を使用して、ケラチンを、コーティングされたガラスおよびチタン基材上に移植するために、ビニル官能化シランカップリング剤を使用した。ＵＶ活性化光開始剤（アントラキノン−２−スルホン酸）を、フリーラジカル生成のために使用したが、別の触媒による熱開始反応もまた、使用され得る。このプロセスの最初の工程において、基材の優れたコーティングを、シランのヘキサン溶液に浸漬することによって達成した。図１に示されるように、チタンディスクの水接触角において得られた増加は、平均して３８°だった。処理群としては、光開始剤（図１において「ｃａｔ．（触媒）」と示される）の存在下、および非存在下の両方において、シランカップリングを有するケラチンコーティングおよびシランカップリングを有さないケラチンコーティングの種々の組み合わせが挙げられる。これは、２工程コーティングアプローチの有効性を確かめるために行なわれた。全てのサンプル群は、コントロールチタン群の接触角（ｐ≦０．０５の統計的有意差）と異なる接触角を生じたが、シランコーティングの全処理後のケラチンの共有結合接合により、非処理のコントロールと比べて、接触角の最も効果的な減少を生じた。完全に処理したチタンディスクサンプルは、７．６°の平均接触角を有した。ガラス基材についての結果は、非処理のコントロールと完全に処理されたサンプルとの間の接触角の１６．５°の減少と同様である。ケラチン処理されたガラスは、９．０°の平均接触角を有した。これらのデータを、図２に示す。一旦、チタンディスクおよびガラス顕微鏡スライドの両方が、コーティングされ得ることが決定されると、チタンディスクのみを、さらなる評価に使用した。
【００７２】
前に述べたように、チタンディスクを、シランのヘキサン溶液に浸漬することによって、首尾よいコーティングを得た。非処理のチタンディスクおよびシランコーティングされたチタンディスク由来のＸＰＳ  Ｓｉ２ｐシグナルを、図３Ａに示す。約２０％の原子濃度に相当するコーティングされたディスク由来のＳｉシグナルは、非処理のディスクの３％未満の原子濃度と比べると、明かに、シランコーティングの存在を示している。非処理のディスク上の少量のＳｉは、おそらく表面汚染のためであった。ケラチンの添加により、約３％（非処理ディスクにおけるバックグランドレベル）から８．５％までの窒素原子濃度が増加した。図３Ｂは、非処理チタンディスク由来の代表的なＮ１ｓ  ＸＰＳシグナルならびにシラン、触媒およびケラチンでコーティングされたサンプルの代表的なＮ１ｓ  ＸＰＳシグナルを示す。異なる処理群において測定されたＳｉおよびＮの原子濃度を、図４に示す。これら２つの元素の濃度は、有機シランおよびケラチンの存在と非常によく相関していた。
【００７３】
シランコーティングにおける触媒およびケラチンの添加により、Ｓｉの原子濃度が減少した。これは、異なったさらなるコーティングによるシリコンシグナルの減衰に起因する。チタンＸＰＳシグナルを、上記の減衰式に使用して、全フィルムの厚さを計算した。結果を、図５に示す。シラン＋「触媒」またはケラチンを有するフィルムの厚さの変化は、おそらく、シランフィルム自体の厚さの変化のためである。それにもかかわらず、触媒＋ケラチンフィルムおよびケラチンのみのフィルムから、シランコーティング存在下で、ケラチンフィルムはより頑丈であることが明らかである。
【００７４】
シランフィルムの変化をなくして、ケラチンコーティングの厚さをさらに正確に決定するために、基材としてシランを処理して、シランコーティングされたディスク由来のシリコンシグナルを使用した減衰式を使用して、シランフィルム表面のケラチンコーティングの厚さを計算した。シランのみでコーティングされたディスク由来のＳｉ２ｐ  ＸＰＳシグナルを、この場合において、清浄な基材のシグナルとして使用した。幾つかの異なるサンプルの結果を、図５の括弧内に示す。このデータは、ケラチンコーティングの平均の厚さが、約８．５Åであることを示す。
【００７５】
ケラチンコーティングされたチタンディスク上の骨芽細胞の分化および石灰化を、ディスク表面のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ分析によって実証した。小結節形成が、インビトロでの石灰化に重要な工程であると考えられる。
【００７６】
１００μｇ／ｍｌアスコルビン酸および５ｍＭ  β−グリセロリン酸の存在（＋）下または非存在（−）下で、細胞を、５％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で培養した。ＡｓＡおよびβ−ＧＰ無し（−）のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ分析により実証されたように（パネルＡおよびＣ）、骨芽細胞の分化および石灰化は、より小さく僅かな小結節を示した。２週間後、２Ｔ３細胞は、１００μｇ／ｍｌ  ＡｓＡおよび５ｍＭ  β−ＧＰの存在（＋）下で、移植片表面上に大きな小結節を石灰化することが観察された（パネルＢおよびＤ）。画像ＡおよびＢは、１００×倍率（スケールバー＝１００μｍ）で得られ、画像ＣおよびＤは、１，０００×倍率（スケールバー＝１０μｍ）で得られた。
【００７７】
インビトロでの小結節の石灰化は、インビボで生成される線維性骨に似ているように見える。２週間後、２Ｔ３細胞は、ＡｓＡおよびβ−ＧＰを有する、または有さない移植片表面上の培養において、石灰化することが観察された。２週目におけるＡｓＡおよびβ−ＧＰなしの細胞のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色は、より小さくわずかな小結節を示した（図６Ａおよび６Ｃ）。対照的に、ＡｓＡおよびβ−ＧＰで処理したディスクには、より多くの大きな小結節が存在した（図６Ｂおよび６Ｄ）。コラーゲンコーティング基材上の２Ｔ３骨芽細胞における小結節形成を誘導するＡｓＡおよびβ−ＧＰの能力は、以前に報告されている。本研究において、本発明者らは、ケラチンコーティング基材について類似の結果を見出し、従って、これは、生体適合性を示す。
【００７８】
チタン基材上にケラチンコーティングを適用するための２工程の浸漬プロセスは、それぞれ水接触角およびＸＰＳスペクトルデータにより実証されるように、親水性かつ頑強なフィルムを生じた。このプロセスは、ケラチンが表面に共有結合するために、より生体安定なコーティングを生じるはずである。このコーティングプロセスは、シランおよびケラチンの両方の非常に薄い層を生じ、表面の粗いチタン移植片表面への細胞の接着を促進するために、移植片の製造業者によりしばしば使用される表面形態学と干渉しないと予測される。２Ｔ３骨芽細胞アッセイは、コーティングが、接着、増殖および分化を促進したことを示した。これらの細胞の、骨マトリックスを生成する能力は、ケラチンコーティング骨伝導性特性を示す。さらなる研究において、本発明者らは、これらのケラチンコーティングが骨の増殖速度を加速し得ることを示すことを意図している。
【００７９】
当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、上記の本発明に対して多くの改変がなされ得ることを理解する。本明細書中に記載される実施形態は、例示のみを意味し、添付の特許請求の範囲において規定される本発明を制限するものとして理解されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、ケラチンコーティングされたチタンディスクの水接触角を示すグラフであり、これは、本願の工程に供されたディスク（シランコーティングに続いてケラチンを接合させたディスク）が、得られる最も低い接触角を有したことを説明する。
【図２】図２は、チタンとガラスの両方が、浸漬プロセスを使用して効率的にコーティングされることを示すケラチンコーティングされた基材の水接触角を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、非処理のチタンディスクとシランコーティングディスクとの間のＸＰＳスペクトル（Ｓｉ２ｐ  スペクトル）を比較するチャートである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、非処理のチタンディスクと生理食塩水、触媒およびケラチンで処理されたディスクとの間のＸＰＳスペクトル（Ｎ１ｓ  スペクトル）を比較するチャートである。
【図４】図４は、ケラチンコーティングされたチタンディスクのＳｉおよびＮ  ＸＰＳ原子濃度を示すグラフである。
【図５】図５は、推定されたチタンディスク上コーティングの厚さであり、ここで、括弧内の数字は、シランコーティング上フィルムの厚さを示す。
【図６】図６は、２Ｔ３細胞が、ケラチンコーティングされたチタンディスクに付着し、そして分化することを示す顕微鏡写真である。
【図１】
2005537831.tif 000005
【図２】
2005537831.tif 000006
【図３Ａ】
2005537831.tif 000007
【図３Ｂ】
2005537831.tif 000008
【図４】
2005537831.tif 000009
【図５】
2005537831.tif 000010
2005537831.tif 000011
【国際調査報告】
2005537831.tif 000012
2005537831.tif 000013
2005537831.tif 000014