(57)【要約】本発明は「基質」核酸の構造を第１の状態から第２の状態へと変化させることが可能な酵素またはエンジインの活性を決定するための方法に関するものであり、酵素またはエンジインの活性は、「基質」核酸またはこれに相補的なオリゴヌクレオチドまたはその酵素またはエンジイン産物に結合される化学発光標識を用いてモニターされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の状態から第２の状態へと核酸の構造を変化させることが可能な物質の活性を決定するための方法であって、
（ａ）試験試料中に、
（ｉ）前記物質と、
（ｉｉ）前記核酸と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）前記第１または第２の状態にある場合に前記核酸に対して少なくとも部分的に相補的な１以上のオリゴヌクレオチドとを与える工程；該オリゴヌクレオチドまたは核酸の一方もしくは両方は出力シグナルを与えることが可能な標識を有し、分解に対する前記標識の安定性は前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれにあるかに応じて異なる；と、
（ｂ）前記試験試料を分解条件に曝す工程と、
（ｃ）前記出力シグナルを検出することによって前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれに少なくとも主としてあるかを判定する工程と、
（ｄ）前記物質の活性を決定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドまたは前記核酸は前記標識を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質は、リガーゼ、ヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、プライマーゼ、ヘリカーゼ、ジャイレース、ポリメラーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、及びエンジインからなる群から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸は一本鎖または複鎖であることを特徴とする請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
前記物質はリガーゼであり、前記基質核酸は複鎖であって、前記（ａ）工程は更に、前記複鎖核酸が一本鎖に分離することによって、ライゲートされている核酸鎖またはその相補鎖がすべて前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能となるような温度に前記試料を曝すことを更に含む請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記物質はリガーゼであり、前記オリゴヌクレオチドは前記試験試料には含まれず、複鎖である前記核酸は前記標識を有し、前記（ａ）工程は、ライゲートされていない核酸のすべてが少なくとも部分的に一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを更に含む請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記温度は、前記ライゲートされていない核酸は分離するがライゲートされている核酸は分離しないように選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸は、前記酵素によってライゲートされることが可能な少なくとも２個のライゲートされていない部分からなる中断鎖を有することを特徴とする請求項６、７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記物質はヘリカーゼであり、前記基質核酸は複鎖であって、前記（ａ）工程は更に、前記核酸が少なくとも部分的に巻き戻されるような環境に前記試料を曝すことを更に含む請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドは前記試験試料には含まれず、前記核酸は前記標識を有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記物質はポリメラーゼであり、前記核酸はオリゴヌクレオチド及び／またはヌクレオチドの形態であって、前記（ａ）工程は更に、前記オリゴヌクレオチド及び／または前記ヌクレオチドが連結されて鎖を形成し、これに前記相補的オリゴヌクレオチドが結合することが可能となるような環境に前記試料を曝すことを特徴とする請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１３】
前記物質は逆転写酵素またはプライマーゼであり、前記核酸はヌクレオシド三リン酸の形態であって、前記（ａ）工程は更に、前記ヌクレオシド三リン酸が連結されて鎖を形成し、これに前記相補的オリゴヌクレオチドが結合することが可能となるような環境に前記試料を曝すことを更に含む請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料は更に核酸鋳型分子を含むことを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記鋳型分子は一本鎖であることを特徴とする請求項１４に記載に方法。
【請求項１６】
前記物質はヌクレアーゼであり、前記オリゴヌクレオチドは前記試料には含まれず、複鎖であって部位特異的開裂点を有する前記核酸は前記標識を有し、前記（ａ）工程は更に、開裂した核酸がすべて一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを更に含む請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１７】
前記物質はヌクレアーゼであり、前記核酸は複鎖であるとともに部位特異的開裂点を有し、前記（ａ）工程が更に、開裂した核酸がすべて一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを更に含むことによって前記鎖の少なくとも選択された１本に前記相補的オリゴヌクレオチドが結合可能となる請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１８】
前記物質はエンジインであり、前記オリゴヌクレオチドは前記試料に含まれず、複鎖であって開裂点を有する前記核酸は前記標識を有し、前記（ａ）工程は更に、開裂した核酸がすべて一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを更に含む請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１９】
前記物質はエンジインであり、前記核酸は複鎖であるととともに開裂点を有し、前記（ａ）工程が更に、開裂した核酸がすべて一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを更に含むことによって前記鎖の少なくとも選択された１本に前記相補的オリゴヌクレオチドが結合可能となる請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２０】
前記温度は、前記開裂した核酸は分離するが開裂していない核酸は分離しないように選択されることを特徴とする請求項１６、１７、１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記物質はインテグラーゼであり、前記オリゴヌクレオチドは前記試料に含まれず、前記核酸は、分子間及び分子内相補配列を有する少なくとも２個のオリゴヌクレオチドからなることと、前記配列の１つは前記標識を有し、前記（ａ）工程は更に、標識を取り込んでいないオリゴヌクレオチドはすべて分離または脱落する温度に前記試料を曝すことを更に含むこととを特徴とする請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識は前記物質が活性である部位から離れた位置にあることによって前記標識が前記物質の活性に干渉することがないことを特徴とする請求項７、１６、１８または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記物質はトポイソメラーゼであり、前記基質核酸は５’末端または３’末端側に延長部分を有する二本鎖分子であり、前記オリゴヌクレオチドは前記酵素の活性によって生成される前記５’末端または３’末端側の延長部分に相補的な鎖である再ライゲートされた鎖であることを特徴とする請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項２４】
前記出力シグナルの検出には、比色定量法、蛍光測定法、及び化学発光法の１以上を使用することを特徴とする請求項１乃至２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記標識は蛍光分子または化学発光分子であることを特徴とする請求項１乃至２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記標識はアクリジニウム塩であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
複数の物質の活性を決定する請求項１乃至２６のいずれかに記載の方法であって該方法は、
（ａ）試験試料中に、
（ｉ）複数の物質と、
（ｉｉ）前記複数の物質の核酸と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）前記第１または第２の状態にある場合に前記核酸に対して少なくとも部分的に相補的な１以上のオリゴヌクレオチドとを与える工程；該オリゴヌクレオチドまたは核酸の一方もしくは両方はそれぞれ出力シグナルを与えることが可能な複数の標識を有し、該シグナルは前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれにあるかによって分解の影響に対して安定であり、各標識の出力シグナルが異なることによって各物質の活性の区別が可能である；と、
（ｂ）前記試験試料を分解条件に曝す工程と、
（ｃ）各標識の出力シグナルを検出することによって前記複数の核酸が前記第１または第２の状態のいずれに少なくとも主としてあるかを判定する工程と、
（ｄ）前記複数の物質のそれぞれの活性を決定する工程とを含む方法。
【請求項２８】
前記物質に関して、薬剤を調節活性についてスクリーニングするための請求項１乃至２７のいずれかに記載の方法の用途であって、前記方法は更に前記（ａ）部分において前記試験試料中に試験を行う前記薬剤を与えることを更に含むことを特徴とする用途。
【請求項２９】
前記薬剤は薬理活性についてスクリーニングされることを特徴とする請求項２８に記載の用途。
【請求項３０】
前記物質は抗細菌活性についてスクリーニングされることを特徴とする請求項２８または２９に記載の用途。
【請求項３１】
前記物質は抗ウイルス活性についてスクリーニングされることを特徴とする請求項２８または２９に記載の用途。
【請求項３２】
試料中の基質核酸の構造が変化して第１の状態または第２の状態のいずれにあるかを検出するための請求項１乃至２７のいずれかに記載の方法の用途。
【請求項３３】
核酸の構造を第１の状態から第２の状態へと変化させることが可能な物質に関して、薬剤を調節活性についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）試験試料中に、
（ｉ）前記物質と、
（ｉｉ）前記核酸と、
（ｉｉｉ）試験する薬剤と、必要に応じて、
（ｉｖ）前記第１または第２の状態にある場合に前記核酸に対して少なくとも部分的に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとを与える工程；該オリゴヌクレオチド及び核酸の一方もしくは両方は出力シグナルを与えることが可能な標識を有し、分解に対する前記標識の安定性は前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれにあるかに応じて異なる；と、
（ｂ）前記試験試料を分解条件に曝す工程と、
（ｃ）前記出力シグナルを検出することによって前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれに少なくとも主としてあるかを判定する工程と、
（ｄ）前記物質の活性、したがって前記薬剤の調節活性を決定する工程とを含む方法。
【請求項３４】
請求項３０に記載の方法によって同定される、核酸の構造を第１の状態から第２の状態へと変化させることが可能な物質の活性を調節する薬剤。
【請求項３５】
請求項３４に記載の薬剤の治療薬としての使用。
【請求項３６】
核酸の第１の状態から第２の状態への変換が関与する状態を治療するための治療薬の製造における請求項３４に記載の薬剤の使用。
【請求項３７】
前記核酸の前期変換が本明細書に述べられたものであるような請求項３６に記載の薬剤の使用。
【請求項３８】
所定の酵素の活性の検出において基質として使用するための基質核酸であって、基質核酸と標識とから形成される複合体からなり、該基質核酸が前記酵素によって作用を受けるものであることによって、前記酵素が活性である場合に前記基質核酸は第１の状態から第２の状態に変化して標識の安定性を変化させることを特徴とする基質核酸。
【請求項３９】
所定の物質の活性の検出に使用するための核酸であって、該核酸は前記物質と反応可能であるとともに標識を有し、該標識の位置及び核酸の配置は、使用時において前記物質が前記核酸に対して活性を有する場合に、核酸の状態を第１の状態から第２の状態へと変化させるように選択されることと、後の反応における分解に対する前記標識の安定性が前記核酸が前記第１の状態または第２の状態のいずれにあるかに応じて異なることとを特徴とする核酸。
【請求項４０】
前記物質は、リガーゼ、ヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、プライマーゼ、ヘリカーゼ、ジャイレース、ポリメラーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、またはエンジインからなる群から選択されることを特徴とする請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
中断核酸鎖を修復することが可能な酵素の、修復核酸鎖を形成する活性または存在を試料中で検出するための方法であって、
（ａ）試料中に、
（ｉ）活性である前記酵素によってライゲートされることが可能な少なくとも２個の中断部分からなる中断標的鎖を有する複鎖基質核酸を与える工程と、
（ｂ）修復されていない中断鎖の中断部分の少なくとも１個の溶解温度よりも高いが、修復された中断鎖の溶解温度よりは低い温度に試料を曝す工程；これにより標的鎖の修復されていない中断部分の少なくとも１個は相補鎖にほとんどあるいはまったくハイブリダイズしない；と、
（ｃ）前記酵素の活性または存在の少なくとも一方を決定する工程とを含む方法。
【請求項４２】
複鎖基質核酸の少なくとも１本の標的鎖にニックまたは他の不連続部分を形成して中断標的鎖を生成することが可能な酵素の活性または存在を試料中で検出するための方法であって、
（ａ）前記試料中に、
（ｉ）ニックまたは不連続部分を生成または形成することが可能な部位を有する複鎖基質核酸を提供する工程と、
（ｂ）中断標的鎖が存在する場合にそのライゲートされていない部分の少なくとも１個の溶解温度よりも高い温度に試料を曝す工程；これにより前記中断鎖のライゲートされていない部分の少なくとも１個は相補鎖とほとんどあるいはまったくハイブリダイズしない；と、
（ｃ）前記酵素の活性または存在の少なくとも一方を決定する工程とを含む方法。
【請求項４３】
前記決定工程は、前記基質核酸の前記相補鎖の少なくとも一部に相補的な標識化オリゴヌクレオチドを前記試料中に導入することによって、修復された、すなわち中断していない鎖と前記相補鎖とのハイブリダイゼーションの存在または量を検出することを含む請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記決定工程は、前記中断鎖のフラグメントの１個に相補的な標識化オリゴヌクレオチドを前記試料中に導入することによってハイブリダイゼーションの存在または量を検出することを含む請求項４１または４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝物質の改変に関与する酵素の活性を検出及び／または定量するための方法に関する。本方法は、標識した核酸の使用に基づいたものであって、該標識が例えば蛍光または化学発光分子であり、ａｂ  ｉｎｉｔｉｏまたはハイブリダイゼーション工程の結果として標識が置かれる核酸の状態に応じて該標識の化学的性質を改変することを可能とする方法である。本発明は更に薬剤のスクリーニングにおける前記方法の使用、これによって同定される薬剤、及び合成核酸酵素基質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）分子の、複製、組換え、修復といった改変は、すべて遺伝物質の構造変化をともなっており、すべての生物にとって基本的な重要性を有するものである。こうしたプロセスの例として、リガーゼ、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、ヘリカーゼ、ジャイレース、ポリメラーゼ、プライマーゼ、及び逆転写酵素による酵素反応があげられる。例えば、ＤＮＡリガーゼは生物の核酸の改変に関与する酵素であり、（ｉ）ＡＴＰ依存型である真核細胞及びウイルスの酵素、（ｉｉ）ＮＡＤＨ依存型である原核細胞のＤＮＡリガーゼの２つのクラスに分けることができる。更に原核細胞のリガーゼは平滑末端化されたフラグメントはライゲートすることができないが、原核細胞酵素のこうした特徴のためこれらの酵素は選択的抗生作用の格好の標的となる。真核細胞系での研究によってもヒトにおけるリガーゼ活性の欠損が特定の病理状態と相関することが示されている。
【０００３】
したがってこれらの酵素の活性の評価を行うことが重要であることから、核酸に影響を与える因子を検出するためのアッセイシステムが開発されてきた。細菌またはウイルスの酵素活性をモニターすることによって、これらの酵素の阻害能に基づく抗細菌または抗ウイルス特性について単一または組合わせの新規化合物のスクリーニングを行うことが可能である点は特に興味深い。
（従来技術の説明）
これらの酵素、例えばリガーゼなどの活性を評価するため現在用いられているアッセイ（図１）では、酵素中間体の測定や、基質及び／または生成物の構造のキャラクタライズを行う。これらのアッセイの大半では更に放射性物質を使用するために、実験に注意を要し、廃棄物の処理コストが発生する。最近のアッセイでは、放射性物質の使用を酵素基質に対する蛍光標識に代える試みがなされている。また、ＤＮＡリガーゼ活性についての生物学的アッセイも開発されているが、こうしたアッセイは時間がかかり（最低でも２日）、複雑で、定量的ではなく寧ろ定性的なものである。より迅速な生物学的アッセイが開発されている（米国特許第５９７６８０６号明細書）が、このアッセイはＤＮＡリガーゼの他に、リポーター遺伝子産物（例、ルシフェラーゼ）を発現させる転写／翻訳組合わせ系を使用することから、この多酵素／多段階のアッセイは潜在的医薬化合物の高スループットスクリーニングには適さない。
【０００４】
二本鎖の核酸を巻き戻すヘリカーゼについてのアッセイも報告されている。一例（米国特許第５９５８６９６号明細書）では、一方の鎖を放射性同位体標識した二本鎖核酸の固相誘導体を調製する。ヘリカーゼ活性は、分離測定が可能な標識鎖を溶液相中に遊離させる酵素の能力によって検出される。更なる一例では、特定のマーカーが、一本鎖ではなく複鎖（例、二本鎖）核酸に選択的に結合する性質を利用する。したがってこのマーカーはヘリカーゼ活性によって巻き戻された物質とは結合しない。
【０００５】
感染性生物のＲＮＡを定量化するための直接化学発光標識したオリゴヌクレオチドプローブの使用についても述べられている（米国特許第５２８３１７４号明細書、米国特許第５３９９４９１号明細書）。これらの方法は、特定の分子が二本鎖の核酸分子と結合した場合に分解から保護され、分解を受ける分子と比較して特徴的性質を保持するという事実を利用していることから、標的核酸配列の検出において有用である。特定の例では、化学発光分子が加水分解され化学ルミネセンスが消失するような化学的条件下に化学発光標識したオリゴヌクレオチドを置く。しかし相補鎖との二本鎖分子の形成（ハイブリダイゼーション）が起こった場合には、二本鎖分子の環境による保護のために加水分解を行った後にも化学発光は維持される。４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトースから炭水化物残基が開裂する（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｋａｔｏ，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８（Ｓｕｐｐｌ．７）１９７８）場合のように、構造の改変によって蛍光分子の蛍光性が変化することが知られており、同じ原理が蛍光分子にも当てはまる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
前述の従来技術に対し、本発明者等は反応の基質を構成する核酸と、該核酸に作用する酵素の作用によって生成する生成物分子との区別が可能なシステムを開発したものである。こうした作用によってこれらの酵素は基質の状態に変化をもたらすものである。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態は、基質の見かけ上小さな構造変化に対して極めて高い感度を有するように構成されている。例えば、好ましい実施形態では核酸に欠損している核酸がない場合でも核酸内の「ニック」（ｎｉｃｋ）を検出することが可能である。しかしながらこうしたニックが形成されたりその修復が行われなかったりする場合にはＤＮＡ及びＲＮＡの複製、組換え、及び修復に重大な影響を及ぼす可能性がある点は認識されよう。同様に本発明の好ましい実施形態は、ＤＮＡやＲＮＡの１以上の塩基または配列の挿入、欠失、転位、ならびにＤＮＡやＲＮＡの非共有結合構造の変化を検出することを可能とするものである。
【０００８】
すなわち本発明はその一局面において、第１の状態から第２の状態へと核酸の構造を変化させることが可能な物質の活性を決定するための方法であって、
（ａ）試験試料中に、
（ｉ）前記物質と、
（ｉｉ）前記核酸と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）前記第１または第２の状態にある場合に前記核酸に対して少なくとも部分的に相補的な１以上のオリゴヌクレオチドとを与える工程；該オリゴヌクレオチドまたは核酸の一方もしくは両方は出力シグナルを与えることが可能な標識を有し、分解に対する前記標識の安定性は前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれにあるかに応じて異なる；と、
（ｂ）前記試験試料を分解条件に曝す工程と、
（ｃ）前記出力シグナルを検出することによって前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれに少なくとも主としてあるかを判定する工程と、
（ｄ）前記物質の活性を決定する工程とを含む方法を提供するものである。
【０００９】
上記の方法は基本的に物質活性によって引き起こされる核酸の状態の変化を検出するものである。
【００１０】
ここで云う「活性」なる用語には、前記物質の活性が高いか、低いか、あるいはゼロである場合が含まれる。
【００１１】
本発明の実施形態は、核酸の代謝、特に遺伝物質の修復及び複製に関与する物質の活性または活性の阻害を測定するための効率的かつ信頼度の高い手段を提供するものである。好ましい実施形態では、本方法は標識化オリゴヌクレオチド配列を使用する。
【００１２】
ある実施形態では、標識化オリゴヌクレオチド配列は、生成物（第２の状態）分子に選択的に結合（ハイブリダイズ）し、これにより発光分子の化学的性質に変化をもたらすことによってこれらの物質に特有の第１及び第２の状態の核酸分子（核酸の２つの状態）を区別するようなものである。別の実施形態では、標識化オリゴヌクレオチド配列は、改変されていない（第１の状態）分子に選択的にハイブリダイズするものである。更なる別の実施形態では、標識化オリゴヌクレオチド配列は、核酸分子中に標識化オリゴヌクレオチドが既に存在するものとみなすことができるような設計された核酸として予め調製される。
【００１３】
本発明で用いる核酸の定義には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、例えば二本鎖や三本鎖などの複鎖ＤＮＡ、及びこれらの核酸の混合物が含まれる。ここで用いる「核酸」なる用語には、更に、ＤＮＡの個々の鎖や、短い配列、更にはライゲートされていない個別の核酸塩基の集団が含まれるものである。
【００１４】
核酸の「状態」、及び、ある状態から別の状態への核酸の変化とは、例えば、核酸の鎖が無傷であるかニックを有するか、核酸の選択された塩基または配列が１本以上の鎖に転位しているか、二本鎖が巻き戻されているか、二本鎖が開裂しているか、非共有結合構造が変化しているか、核酸の鎖がインテグレートされているか、核酸の鎖がライゲートされているか、関連する塩基の集団が所定の配列にアセンブルされているか、といった特徴を指すものである。ここでは便宜上、物質の活性の作用を一旦受けたならば核酸の状態は変化しないものとみなす。したがってニックを有する二本鎖が酵素リガーゼによって修復される場合、この二本鎖は第１の（ニックを有する）状態から第２の（修復された）状態へと変化したと云うことができる。本明細書中で述べる方法において修復された二本鎖核酸の２本の鎖がその後で分離される場合、これらの鎖は第２の状態にあるものと依然みなされる。
【００１５】
「ハイブリダイズ」なる用語は、相補的な一本鎖分子間での安定的な二本鎖または他の複鎖分子の形成を意味する。
【００１６】
本発明のある実施形態は、核酸の代謝に影響を及ぼす物質の活性を測定するための単純、迅速で耐久性の高いアッセイを提供するものである。これらのアッセイは、こうした活性の評価が必要とされる多くの状況において有用であるが、前記物質の活性を阻害する潜在的な抗菌ならびに抗ウイルス化合物のスクリーニングに特に適している。
【００１７】
物質の活性を評価する場合、前記物質として、リガーゼ、ヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、プライマーゼ、ヘリカーゼ、ジャイレース、ポリメラーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、またはエンジインの１以上を使用することができる。
【００１８】
エンジインは制限エンドヌクレアーゼとして機能する自然界に存在する有機分子である（例、カリケアマイシンやエスペラマイシン）。エンジインは二本鎖の核酸を切断する能力を有し、核酸分子を第１の状態から第２の状態に変換するこの能力のためにこれらの分子は本発明の範囲に含まれるものである。エンジインの反応は非触媒的であるが、核酸分子に対して１：１に反応する。エンジインのクラスに属する分子については次の文献に詳細に述べられている（Ｂｏｒｄｅｒｓ  Ｄ  Ｂ  ＆  Ｄｏｙｌｅ  Ｔ  Ｗ  １９９５  ‘Ｅｎｅｄｉｙｎｅ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ａｓ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｕｒ  Ａｇｅｎｔｓ’（Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ））。また制限エンドヌクレアーゼの活性を模倣するエンジインの能力については次の論文に述べられている（Ｂｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ９７  １３５３７−１３５４２）。
【００１９】
したがってエンジインは核酸分子を第１の状態から第２の状態へと変換することが可能であり、本明細書で開示する技術を用いることによってこれらの分子の活性をアッセイすることが可能であることから、本発明の範囲に包含される物質である。更に、本明細書に記載される発明を用いることによって試料中のこれらの分子の存在、ひいてはその活性の存在を特定することも可能である。更に、核酸分子の分子構造を第１の状態から第２の状態へと変換するこれらの分子の能力を考慮すると、本明細書に記載される発明を用いることによってエンジインの活性を調節する分子についてスクリーニングを行うことが可能であり、これによりそのアゴニストまたはアンタゴニストとしての薬理学的な活性を有する分子または薬剤を同定することが可能である。
【００２０】
リガーゼの活性をモニターするための特定の一実施形態では、前記核酸は複鎖であり、前記（ａ）工程では、二本鎖核酸にリガーゼを作用させ、リガーゼを作用させた後に、試料を高温に曝してライゲートしていない核酸に少なくとも部分的に一本鎖を形成させる。
【００２１】
ライゲートしていない核酸フラグメントを選択的に溶解、または選択的に再ハイブリダイズさせるために温度調節を行うことによって、ライゲートした核酸とライゲートしていない核酸とを区別する適切な方法が与えられる。一方法では、ライゲートしていない核酸は少なくとも部分的に分離するが、ライゲートしている核酸は分離しないように前記高温を調節する。
【００２２】
上述したように本発明を使用して異なる広範な酵素をモニターすることが可能である。すなわち、ヘリカーゼ活性をモニターするための別の一実施形態では、核酸は複鎖であり、前記（ａ）工程では、該核酸が少なくとも部分的に巻き戻されるような環境下で核酸にヘリカーゼを作用させる。
【００２３】
ヘリカーゼの活性を決定するための好ましい一方法では、試験試料に上記のオリゴヌクレオチドが含まれず、代わりに前記核酸を前記標識で標識する。
【００２４】
前記核酸が複鎖であり、酵素がヘリカーゼである場合、核酸は、
（ｉ）該核酸の鎖の内の１本の少なくとも一部を別の鎖から分離して一本鎖部分を与え、更に必要に応じて、
（ｉｉ）試料を前記オリゴヌクレオチドの内の１つと接触させることによって第１と第２の状態との間で変化させる。このとき、前記オリゴヌクレオチドまたは前記核酸の１つには前記標識が結合しており、前記オリゴヌクレオチドは前記核酸の前記一本鎖部分とハイブリダイズすることが可能である。
【００２５】
ポリメラーゼまたはプライマーゼの活性をモニターするための更なる別の一実施形態では、前記核酸はヌクレオチドまたはその短いフラグメントであり、前記（ａ）部分では、前記塩基及び／または前記核酸の鎖の連結を可能とする環境下で前記核酸にポリメラーゼを作用させる。
【００２６】
本アッセイ法は、２つの異なる終了点の一方を与えるように設計することが可能であることは認識されよう。すなわち一方では、前記核酸に状態の変化が起きている場合に前記標識化核酸の標識が比較的に影響を受け、他方では、前記核酸に状態の変化が起きている場合に前記標識化核酸の標識は比較的に影響されない。
【００２７】
活性である前記酵素が複鎖核酸の中断鎖のニックや他の不連続点の少なくとも１つを修復するように作用して修復鎖を与える場合、前記（ａ）部分は、
（ｉ）前記中断鎖が他方の鎖もしくは残りの各鎖から分離するのに必要な温度を上回る温度に試料の温度を上昇させる（中断鎖が修復されているか否かとは関係なく）工程と、
（ｉｉ）修復鎖にハイブリダイズ可能な前記標識化オリゴヌクレオチドと前記試料を接触させる工程と、
（ｉｉｉ）前記修復鎖を含む二本鎖分子の溶解点よりも低い温度であるが、前記中断鎖の非修復部分を含む二本鎖分子の溶解点よりは高い温度に前記試料の温度を低下させることによって前記修復された中断鎖が存在する場合にこれと前記標識化オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程と、
（ｂ）この後、前記試料を前記分解条件下に置いてから前記標識の活性を検出する工程とを含むことにより、該検出工程において、比較的影響されていない標識の存在もしくはその量によって前記修復酵素の活性の存在もしくはその量が示される。
【００２８】
この構成では、修復鎖が存在する場合に標識化オリゴヌクレオチドの修復鎖へのハイブリダイズによって、標識が消化から比較的保護された複合体が形成される。
【００２９】
無論のこと、ニックや不連続点を修復する代わりに、同様の方法を用いて、活性である酵素が複鎖核酸の少なくとも１本の標的鎖に塩基間の切断によって少なくとも１個のニックや他の不連続点を形成することによって中断標的鎖を生成することも可能である。この場合には、前記（ａ）部分は、
（ｉ）前記核酸の標的鎖が他方の鎖もしくは残りの各鎖から分離するのに必要な温度を上回る温度に試料の温度を上昇させる（酵素が中断標的鎖を生成する活性を有するかとは関係なく）ことと、
（ｉｉ）中断されていない状態にあるときに前記標的鎖とハイブリダイズすることが可能な標識化オリゴヌクレオチドと試料を接触させることと、
（ｉｉｉ）前記中断されていない標的鎖が前記標識ヌクレオチドとハイブリダイズする温度よりも低い温度であるが、標的鎖の分離した中断部分が前記核酸の前記残りの鎖とハイブリダイズすることが可能な温度よりも高い温度に前記試料の温度を低下させることによって前記中断されていない標的鎖が存在する場合にこれと前記標識化オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせることと、
（ｂ）この後、前記試料を前記分解条件下に置いてから前記標識の活性を検出することとを含むことにより、該検出工程において、比較的影響されている標識の存在もしくはその量によって開裂分子を生成することが可能な前記酵素の存在もしくは量が示される。
【００３０】
このアッセイでは、試料中に中断されていない鎖が存在する場合に、前記（ｉｉｉ）工程において標識化オリゴヌクレオチドがこれとハイブリダイズして標識が比較的保護された複合体を形成する。
【００３１】
上記の各場合において、温度を上昇させる工程（（ｉ）工程）の前後で試料を標識化オリゴヌクレオチドと接触させることが可能である。
【００３２】
本発明の別の局面もしくは実施形態では、前記標識化核酸は前記核酸と標識とからなる複合体であり、この核酸が特定の物質の作用を受けるものであることによって、該物質が活性を有する場合に核酸が前記第１の状態から第２の状態に変化して標識の安定性を変化させる。こうした複合体を本明細書では設計基質と呼ぶこととする。
【００３３】
別の一実施形態では、前記核酸は遊離（ライゲートされていない）ヌクレオチドの集団であり、前記酵素は、選択された遊離ヌクレオチドが連結されてヌクレオチドが少なくとも１本の核酸生成物の鎖を形成した第２の状態となるような活性を有するものであり、前記（ａ）部分では前記核酸生成物とハイブリダイズするように設計された標識化オリゴヌクレオチドと前記試料とを接触させる。
【００３４】
別の一実施形態では、前記物質はヌクレアーゼまたはエンジインであり、前記オリゴヌクレオチドが前記試料に含まれず、前記核酸は複鎖であり開裂点を含むとともに前記標識を有し、前記（ａ）工程は更に、あらゆる開裂核酸が一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを含む。また、本発明のこの実施形態は、前記試料から前記オリゴヌクレオチドが省略されておらず、したがって前記核酸が前記標識を有さないように改変することも可能である。本発明のこの実施形態では、前記ヌクレアーゼまたはエンジインが前記核酸に作用してこれを開裂することにより、すべての開裂核酸が一本鎖に分離するような温度に前記試料が曝された場合に、アッセイを行う目的で選択される前記鎖の１本に前記標識化オリゴヌクレオチドが結合することが可能である。
【００３５】
この標識アッセイからの出力シグナルの検出には、比色定量法、蛍光測定法、及び化学発光法の１以上を使用することが可能である。
【００３６】
標識としては蛍光分子やアクリジニウム塩などの化学発光分子を使用すると便利である。
【００３７】
本明細書で開示する方法は、物質の活性の検出だけではなく、調節活性のスクリーニングに使用することも可能である。すなわち別の一態様において本発明は、調節活性について薬剤をスクリーニングするための方法であって、核酸の構造を第１の状態から第２の状態へと変化させることが可能な物質に対してスクリーニングを行う方法において、
（ａ）試験試料中に、
（ｉ）前記物質と、
（ｉｉ）前記核酸と、
（ｉｉｉ）試験すべき薬剤と、必要に応じて、
（ｉｖ）前記第１または第２の状態にある場合に前記核酸に対して少なくとも部分的に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとを与える工程；該オリゴヌクレオチド及び核酸の一方もしくは両方は出力シグナルを与えることが可能な標識を有し、分解に対する前記標識の安定性は前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれにあるかに応じて異なる；と、
（ｂ）前記試験試料を分解条件に曝す工程と、
（ｃ）前記出力シグナルを検出することによって前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれに少なくとも主としてあるかを判定する工程と、
（ｄ）前記物質の活性、ひいては前記薬剤の調節活性を決定する工程とを含む方法を提供するものである。
【００３８】
上記の方法を用いて薬理活性について物質をスクリーニングすることができる。
【００３９】
本発明には更に特定の物質の活性の検出に使用される核酸も含まれる。この核酸は前記の物質との反応性を有し、付随する標識を有するものである。この標識の位置ならびに核酸の配置は、使用時、前記物質が前記核酸に作用する際に、該物質によって核酸の状態が第１の状態から第２の状態へと変化するように選択される。後の反応における消化に対する前記標識の安定性は、前記核酸が第１の状態にあるか第２の状態にあるかに応じて異なる。
【００４０】
本発明には更に、試料中の核酸に、第１の状態から第２の状態へと該核酸を変化させるような事象が発生したか否かを検出する方法が含まれる。
【００４１】
上述したように選択的な温度管理を行うことによって、特定の酵素が基質としての核酸にニックを形成するかあるいはこれを修復するかを検出する重要な方法が与えられる。
【００４２】
別の一局面において本発明は、中断された核酸鎖を修復して修復核酸鎖を形成することが可能な酵素の、試料中での活性または存在を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料中に、
（ｉ）活性である前記酵素によってライゲートすることが可能な少なくとも２つの中断部分からなる中断標的鎖を有する複鎖核酸を与える工程と、
（ｂ）未修復の中断標的鎖の前記中断部分の少なくとも１つの溶解温度よりも高いが、修復された中断鎖の溶解温度よりも低い温度に前記試料を曝す工程であって、これにより標的鎖の未修復の中断部分の少なくとも１つと相補鎖とのハイブリダイゼーションがほとんどまたはまったく起こらない工程と、
（ｃ）これにより前記酵素の活性または存在の少なくとも一方を決定する工程とを含む方法を提供するものである。
【００４３】
別の一局面において本発明は、複鎖核酸の少なくとも１本の標的鎖にニックまたは他の不連続部分を形成することによって中断標的鎖を生成することが可能な酵素の、試料中での活性または存在を検出するための方法であって、
（ａ）前記試料中に、
（ｉ）ニックまたは不連続部分が形成される部位を含んだ複鎖核酸を与える工程と、
（ｂ）中断標的鎖のライゲートされていない部分（存在する場合）の少なくとも１つの溶解温度よりも高い温度に前記試料を曝す工程であって、これにより中断鎖のライゲートされていない部分の前記少なくとも１つと相補鎖とのハイブリダイゼーションがほとんどまたはまったく起こらない工程と、
（ｃ）これにより前記酵素の活性または存在の少なくとも一方を決定する工程とを含む方法を提供するものである。
【００４４】
上記の決定工程のいずれにおいても、その方法としては、前記核酸の前記相補鎖の少なくとも一部に対して相補的な標識化オリゴヌクレオチドを前記試料中に導入することによって、修復または未修復鎖と前記相補鎖とのハイブリダイゼーションの存在または量を検出する。また、前記決定工程において、中断鎖のフラグメントの少なくとも１個に対して相補的な標識化オリゴヌクレオチドを試料中に導入することによって、ハイブリダイゼーションの存在や量を検出することも可能である。
【００４５】
一実施形態では前記核酸は、下記の３つの異なる溶解温度が存在するように中断フラグメントまたは活性部位に関して選択される。すなわち、
（ｉ）基質の中断鎖の第１のフラグメントの溶解温度、
（ｉｉ）基質の中断鎖の第２のフラグメントの溶解温度、
（ｉｉｉ）基質の中断されていない鎖の溶解温度。
【００４６】
各フラグメントの溶解温度及びそれらの長さは、例えばフラグメントの相対的長さや選択されたミスマッチを配列中に導入するなど、異なる方法で調節することが可能である点は認識されよう。
【００４７】
異なる実施形態の詳細な説明
一実施形態では、化学発光分子でオリゴヌクレオチド配列を標識する。この化学発光分子は、１以上の結合の解離によって化学発光性を消失させることが可能であるが、標識化オリゴヌクレオチドが例えば二本鎖などの複鎖核酸の一部を構成する場合には前記の解離から保護されるようなものである。本発明者等は、化学発光分子を解離させるのに使用される条件下では、ライゲートされていない鎖を有する核酸が解離からの保護を与えないことを期せずして発見したものである。
【００４８】
そこで下記に述べる実施形態では、対象とする配列に相補的な標識化化学発光オリゴヌクレオチドを合成する。対象とする配列は、対象とする酵素またはエンジインの生成物または基質となるものである。標識化オリゴヌクレオチドの溶液をハイブリダイゼーションを許容する条件下で前記対象配列の溶液と混合する。この反応混合物を、化学発光分子を解離させて化学発光を消失させることが知られる化学的、酵素的、及び／または物理的分解条件に曝す。次いで反応容器を照度計に入れ、試薬を加えて化学発光反応を起こして放射光を観測する。また、化学発光反応の反応速度が充分に遅い場合には、反応容器を照度計に入れる前に化学発光を開始させてもよい。対象配列が存在し、標識化オリゴヌクレオチドと二本鎖分子を形成することによって化学発光が維持されるのに対して、対象配列が存在せずに標識化オリゴヌクレオチドが二本鎖分子を形成できないと化学発光は消失する。この結果、対象配列の相対量を求めることが可能である。
【００４９】
基質及び生成物分子は、ライゲートされているまたはライゲートされていない配列によって異なることから、一実施形態では、リガーゼまたは酵素ヌクレアーゼまたはエンジインについてのアッセイを提供する。すなわち、例えば「ニック」を有するＤＮＡをリガーゼ活性を有する調製物と接触させた場合、化学発光標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション及び例えば複合体を形成しなかった化学発光標識を加水分解しうるような条件から保護されることによる化学発光の維持によってライゲート産物が生成したことが分かる。
【００５０】
好ましくは試料中の核酸をリガーゼに接触させ、リガーゼとの接触後に試料を高温に曝して試料中の核酸を変性すなわち分離させ、この後温度を低下させて核酸を再びハイブリダイズさせる。
【００５１】
使用する高温条件は、ライゲートされなかった核酸は分離するがライゲートされた核酸は分離しないような充分に高い温度であることが好ましい。使用する温度は、ハイブリダイゼーション反応の化学量論にしたがって調節することが好ましい。
【００５２】
驚くべき発見として、多くの場合、酵素やエンジインはこれが作用する核酸が標識部分を有していても機能し得たことがある。したがって上述した本発明の更なる一局面は、予め生成された標識化酵素またはエンジインの「基質」（「設計基質」と呼ぶ）であって、鎖の一本が上述したような加水分解可能な化学発光標識を有する例えば二本鎖などの複鎖オリゴヌクレオチド配列からなる基質の使用に関するものである。
【００５３】
必要に応じて前記の他方の鎖は「ニック」を有する。例えば高温に曝した場合、ライゲートされていない二本鎖分子は化学発光標識を加水分解から保護することができないが、リガーゼ活性によって形成されるライゲートされた二本鎖分子は化学発光標識を加水分解から保護するのである。
【００５４】
本明細書で説明する実施形態は、潜在的薬理活性を有する化合物のスクリーニングの潜在的ターゲットとなる遺伝物質のライゲート型と非ライゲート型との相互変換を引き起こす酵素の活性を評価する方法を開示するものである。
【００５５】
同様に、特定の遺伝子配列内での別個のヌクレオチド配列の挿入（インテグラーゼ）や転位（トランスポザーゼ）を触媒する酵素のアッセイにも同様な原理が適用できる。その場合、生成物配列とはハイブリダイズ可能であるが基質配列とはハイブリダイズできない適当な標識化オリゴヌクレオチド配列を利用する。これにより、インテグラーゼまたはトランスポザーゼ調製物の活性の評価が可能であるばかりか、反応混合物に加えられる化合物が酵素活性を阻害し、したがって医薬品としての有用性を有するか否かを判定することが可能である。
【００５６】
ヌクレアーゼ、リガーゼ、インテグラーゼ、及びトランスポザーゼを例とする酵素のクラスは、遺伝物質の共有結合の改変を触媒するという共通の特徴をすべてが有している。
【００５７】
ヘリカーゼを例とするような、遺伝物質の２次構造の変化を触媒する酵素も存在している。これらの酵素の活性によって「巻き戻された」核酸の部分が形成される。ここでは、こうした酵素活性によって生成する「巻き戻し」産物としての核酸配列が、基質としての二本鎖核酸配列と異なり、相補的な標識オリゴヌクレオチド配列によって結合されることを利用する。
【００５８】
上述したように、二本鎖核酸を含み、発光標識したオリゴヌクレオチド配列を既に有し、発光標識が二本鎖核酸内でのその位置のために分解（例、加水分解）から保護されている、予め生成した基質を使用することが望ましい。ここでヘリカーゼ活性の存在によって二本鎖核酸が巻き戻されて発光標識が加水分解を受ける。この場合、発光の強度はヘリカーゼ活性と反比例する。
【００５９】
本発明の更なる好ましい一実施形態では、核酸を構成する鎖が巻き戻されるような環境下で核酸をヘリカーゼと接触させ、試料中にはヘリカーゼの活性を変化させるような物質が含まれており、上記の巻き戻された核酸の一方の鎖に相補的な標識化オリゴヌクレオチドの存在下で鎖が再ハイブリダイズするような条件を与える。
【００６０】
特定の状況では、酵素反応を行った後に標識化オリゴヌクレオチド配列の結合を利用する状況の変形例として、酵素反応の生成物ではなく基質に結合する標識化オリゴヌクレオチド配列を設計することが適当である。
【００６１】
ここで述べる新規な原理は、個々の塩基のように小さな前駆物質から核酸生成物が生成するような状況にも適用が可能であるが、これは酵素反応の生成物が標識された相補的オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるのに対して反応物はそうではないことによる。こうした酵素の例としては、プライマーゼ、ポリメラーゼ、及び逆転写酵素が挙げられる。
【００６２】
本発明の別の一実施形態では、核酸／鎖が結合するような条件下で核酸／鎖をポリメラーゼと接触させ、該結合した核酸／鎖に相補的である１以上の核酸／鎖が前記試料中に含まれ、前記結合した相補的核酸／鎖がハイブリダイズするような条件を与える。
【００６３】
正常な酵素活性によって、相補的な標識化オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが可能な核酸が生成し、これによって形成される二本鎖分子が分解から標識を保護する。この酵素を阻害すると二本鎖分子が形成されないために標識は誘導される分解から保護されなくなる。したがって化学発光または蛍光標識などのオリゴヌクレオチドのマーカーの発光を後で測定することによって対象とする酵素の活性などの定量的な指標が与えられる。
【００６４】
更に発光標識は、「多チャンネル」アッセイを構成できるという利点を有する。波長による区別と時間的な区別の両方を利用して標識の混合物を同時かつ独立に定量できることが文献に報告されている（米国特許第５，８２７，６５６号明細書）。同様の原理を、本発明の教示において例えばリガーゼやインテグラーゼに対する阻害活性について複数の化合物を同時にスクリーニングすることが望ましい場合に適用することが可能である。本明細書の開示に基づけば好適な多チャンネルアッセイをいかに設計、使用すべきかは当業者にとって容易に認識されよう。
【００６５】
本発明の異なる実施形態では、基質核酸の鎖の内の一本（状態の変化によって直接影響を受ける鎖であってもなくてもよい）と、後の分解工程における分解に対する保護が、基質核酸が第１の状態にあるか第２の状態にあるかによって異なるように設計された標識化オリゴヌクレオチドとからなる複合体を形成させることによって基質核酸の状態の変化を検出する。分解工程を行った後、使用した標識に適した方法で標識シグナルを検出し、ここから基質核酸の状態を決定することが可能である。
【００６６】
こうした様々な手法の理解を助けるため、図面の中の模式図を参照しながら多くの異なるスキームについて以下に説明する。
【００６７】
スキームＡ（図３）
第２の鎖１２に対して相補的な第１のヌクレオチド鎖１０を有する第１のオリゴヌクレオチド二本鎖分子を合成する。核酸の二本鎖分子中で第１の鎖と結合して存在する場合、第２の鎖は無傷な（ライゲートされた）鎖１２Ｌか、あるいは「ニック」を有するライゲートされていない鎖１２Ｕとして存在し得る。リガーゼ活性、またはこうした活性に影響する因子を検出するように設計された本スキームの目的上、第２の鎖１２Ｕがニックを有するかライゲートされていないような核酸の二本鎖分子を合成する。ライゲートされていない第２の鎖１２Ｕはリガーゼの酵素基質として機能する鎖の少なくとも一部分を表し、酵素の作用によってライゲートされた鎖１２Ｌへと変換される。このアッセイにおいて基質核酸の２つの状態とは、第２の鎖がライゲートされていない状態と、第２の鎖がライゲートされている状態のことである（ｉｉ）。
【００６８】
第１の鎖１０と同じ（したがって第２の鎖１２に対して相補的）であるが、化学発光または蛍光発光分子１８を結合させることが可能な「リンカー」部分１６を更に有する第３のオリゴヌクレオチド１４を合成する。特定の応用例では、第３のオリゴヌクレオチドは第１の鎖と同じである必要はなく、第３のオリゴヌクレオチドが第２の鎖に安定してハイブリダイズ可能であるならば塩基のミスマッチがあってもよい。
【００６９】
スキームＡは以下の段階からなる。括弧内のローマ数字は図３に示した工程と対応している。
【００７０】
（ｉ）第１の鎖１０が、「ニック」を有するかライゲートされていない第２の鎖１２Ｕにハイブリダイズした二本鎖からなる試薬を与える。
【００７１】
（ｉｉ）前記（ｉ）工程の試薬を、阻害剤及び補因子の存在下または非存在下で酵素リガーゼと接触させる（図の左側は酵素活性がある条件を、図の右側は活性のない条件を示す。これは以下の図３〜図８でも同様である。）。
【００７２】
（ｉｉｉ）標識化オリゴヌクレオチド１４を試料に導入し、試料の温度を上げて第１の鎖と第２の鎖を分離させる。
【００７３】
（ｉｖ）ライゲートした（無傷の）鎖１２Ｌのハイブリダイゼーション温度よりも低いが第２の鎖１２Ｕのライゲートされていないフラグメントのハイブリダイゼーション温度よりも高い温度にまで温度を低下させると、ライゲートされた第２の鎖１２Ｌの一部が、第１の鎖１０の代わりに標識化オリゴヌクレオチド１４とハイブリダイズする。しかし、ライゲートされていない短い標的鎖のハイブリダイゼーション温度よりも温度が高いためにライゲートされていない１２Ｕのフラグメントは標識化オリゴヌクレオチド１４にはハイブリダイズしない。
【００７４】
（ｖ）次いで、標識の加水分解や解離によって標識１８が分解される条件に試料を曝す（以下、分解条件と一般的に呼ぶ）。この標識化オリゴヌクレオチドは、無傷の鎖１２Ｌに標識化オリゴヌクレオチドがハイブリダイズした場合には標識１８からの出力シグナルが実質影響されないという性質を有するものである。これに対し、標識化オリゴヌクレオチドがハイブリダイズしなかった場合（または部分的にしかハイブリダイズしなかった場合）には、分解条件から保護されずに出力シグナル光が変化する（シグナルが存在しないか変化する）。
【００７５】
（ｖｉ）化学発光反応を開始し、標識の性質に応じて出力光を測定するかまたは蛍光を測定する。
【００７６】
（ｖｉｉ）出力シグナル光はリガーゼ活性に比例する。
【００７７】
スキームＢ−（図４）
このスキームは第１の鎖１０と、ライゲート型（１２Ｌ）か非ライゲート型（１２Ｕ）のいずれかである第２の鎖１２を使用し、更に標識化オリゴヌクレオチドを使用する点でスキームＡと似ている。しかしながらこの例では標識化オリゴヌクレオチド１４は第２の鎖ではなく第１の鎖１０にハイブリダイズするように設計されている。
【００７８】
（ｉ）ライゲートされていない第２の鎖１２Ｕとハイブリダイズした第１の鎖１０からなる基質二本鎖を試料中に与える。
【００７９】
（ｉｉ）阻害剤、補因子などの存在下または非存在下で試料をリガーゼと接触させる。
【００８０】
（ｉｉｉ）ライゲートされていない第２の鎖１２Ｕを第１の鎖から分離させるだけ充分に高いがライゲートされた第２の鎖１２Ｌが分離するほどには高くない温度に試料の温度を上げる。
【００８１】
（ｉｖ）第１の鎖に相補的な標識化オリゴヌクレオチド１４と試料を接触させ、ハイブリダイズしていない第１の鎖１０のすべてをハイブリダイズさせる。
【００８２】
（ｖ）ハイブリダイズしていない標識化オリゴヌクレオチド１４の化学発光または蛍光活性は影響されるが、相補鎖（この場合では第１の鎖１０）にハイブリダイズした標識化オリゴヌクレオチド１４の活性は実質影響されないような分解条件に試料を曝す。
【００８３】
（ｖｉ）化学発光反応を開始し、標識の性質に応じて出力光を測定するかまたは蛍光を測定する。
【００８４】
（ｖｉｉ）出力シグナル光はリガーゼ活性と反比例する。
【００８５】
スキームＣ−（図５）
このスキームでは、設計基質核酸として二本鎖分子２０を作成した。
【００８６】
（ｉ）基質核酸二本鎖分子２０は、ニックを有するかライゲートされていない第２の鎖２４Ｕにハイブリダイズした第１の鎖２２からなる。標識２８はリンカー部分２６によって第１の鎖２２に連結されている。設計基質核酸としての二本鎖分子２０は、第２の鎖がライゲートされていない時には標識が分解条件から比較的保護されず、第２の鎖が酵素活性によってライゲートされている場合には標識が分解状態から比較的保護されるよう、ライゲートされていない鎖２４Ｕのニックに対して標識２８の位置が決められるように設計されている。模式図では標識はニックの丁度反対となる位置に示されているが、標識とライゲートされていない鎖のニックとの相対位置は異なり得るものであって、ニックは対向する鎖の標識の位置から塩基数個分離れた位置にあってもよい。標識及び設計基質の末端に対するニックの好ましい位置は、米国特許第５，２８３，１７４号明細書及び同第５，３９９，４９１号明細書の開示に基づき、経験的に決定することができる。
【００８７】
（ｉｉ）設計基質２０を阻害剤、補因子などの存在下または非存在下でリガーゼと接触させる。リガーゼ活性の存在下では、ライゲートされていない第２の鎖２４Ｕは修復されてライゲートされた鎖２４Ｌを与える。酵素活性の非存在下では第２の鎖２４Ｕは修復されない。
【００８８】
（ｉｉｉ）次いで，ライゲートされていない第２の鎖２４Ｕを第１の鎖２２から分離させるだけ充分に高いがライゲートされている第２の鎖２４Ｌが第１の鎖２２から分離するほどには高くない温度にまで試料の温度を上げる。次に試料を分解条件に曝すと第１の鎖がライゲートされた第２の鎖２４Ｌによって保護されていない場合には標識２８の活性が失われる。
【００８９】
（ｉｖ）化学発光反応を開始し、標識の性質に応じて出力光を測定するかまたは蛍光を測定する。
【００９０】
（ｖ）出力シグナル光はリガーゼ活性と比例する。
【００９１】
スキームＤ−（図６）
このスキームは二本鎖を分離させるＤＮＡヘリカーゼなどの酵素活性をモニターすることを目的としたものである。
【００９２】
（ｉ）リンカー部分によって標識３４が結合された第１の鎖３２を有する設計二本鎖分子３０を与える。第１の鎖３２は第２の鎖３８とハイブリダイズしている。
【００９３】
（ｉｉ）設計基質分子３０を阻害剤、補因子などの存在下または非存在下でヘリカーゼと接触させる。活性ヘリカーゼの存在下では、第１の鎖３２と第２の鎖３８は酵素活性によって分離されて二本鎖分子の状態が変化するが、こうした活性の非存在下では設計基質分子３０の状態は変化しない。
【００９４】
（ｉｉｉ）試料を分解条件に曝して化学発光または蛍光標識３４の活性を消失させる。第１の鎖３２が第２の鎖３８から分離している場合には標識３４の活性は低下するが、酵素が活性でない場合には標識３４は比較的保護される。
【００９５】
（ｉｖ）保護されていない場合に化学発光または蛍光活性を消失させる条件に試料を曝す。
【００９６】
（ｖ）出力シグナル光はヘリカーゼ活性と反比例する。
【００９７】
スキームＥ−（図７）
このスキームは、「構造単位」としてのリボヌクレオシド三リン酸４０を核酸配列４２にアセンブルするＲＮＡポリメラーゼなどの酵素の酵素活性をモニターするのに適している。
【００９８】
（ｉ）リボヌクレオシド三リン酸４０、試験を行う酵素、及び必要な補因子や阻害剤とともに適当な二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの鋳型分子（図示せず）を試料に加える。
【００９９】
（ｉｉ）酵素が阻害されない場合には酵素によって一本鎖のリボヌクレオチド産物４２が生成するが、そうでない場合にはリボヌクレオシド三リン酸４０は分離したままとなる。
【０１００】
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の酵素活性の産物に相補的な標識化オリゴヌクレオチド４４を試料に導入する。
【０１０１】
（ｉｖ）生成した産物４２が存在すれば標識化オリゴヌクレオチド４４がこれにハイブリダイズする。
【０１０２】
（ｖ）試料を分解条件に曝して化学発光または蛍光活性を消失させる。標識化オリゴヌクレオチド４４が産物４２にハイブリダイズしている場合には、標識化ヌクレオチドがハイブリダイズできる生成鎖が存在しない場合と比較して標識４６の安定性は比較的影響されない。
【０１０３】
（ｖｉ）化学発光反応を開始し、標識の性質に応じて出力光を測定するかまたは蛍光を測定する。
【０１０４】
（ｖｉｉ）出力シグナル光は酵素活性と比例する。
【０１０５】
スキームＦ
このスキームは逆転写酵素やプライマーゼなどの酵素の活性をモニターするように設計されている。
【０１０６】
（ｉ）試料は、ヌクレオシド三リン酸５０、試験を行う酵素、及び必要に応じて１以上の補因子や阻害剤とともに、一本鎖の鋳型分子４８を含んだものである。
【０１０７】
（ｉｉ）酵素が活性である場合には鋳型分子４８上に相補的な標的鎖５２が形成されるが、不活性である場合には相補鎖は形成されない。
【０１０８】
（ｉｉｉ）酵素によって合成された標的鎖５２に相補的な標識化オリゴヌクレオチド５４を試料に導入する。
【０１０９】
（ｉｖ）温度をサイクル変化させて鋳型４８と酵素合成された標的鎖５２とを分離させ、次いでハイブリダイゼーションが可能な温度にまで温度を低下させる。標的鎖５２が存在する場合にはその一部が標識化オリゴヌクレオチド５４にハイブリダイズする。
【０１１０】
（ｖ）ハイブリダイズしていない標識化オリゴヌクレオチドが活性を失うように試料を分解条件に曝して化学発光または蛍光活性を消失させる。
【０１１１】
（ｖｉ）化学発光反応を開始し、標識の性質に応じて出力光を測定するかまたは蛍光を測定する。
【０１１２】
（ｖｉｉ）標識５０からの出力信号光は酵素活性と比例する。
【０１１３】
スキームＧ（図９）
部位特異的開裂点を有するＤＮＡ二本鎖分子を先ず合成する。次に、標識が酵素ヌクレアーゼ活性に干渉しないように、二本鎖分子の一方の鎖の開裂点から充分に離れた部位に化学発光標識（ＡＥ標識）を結合させる。標識はそれ自体と酵素ヌクレアーゼとの間で立体障害が生じないような位置に結合されることが最も理想的である。開裂剤または酵素ヌクレアーゼが存在しない場合には標識化二本鎖分子は実質無傷のままである（図９の左側）。あるいは、開裂剤または酵素ヌクレアーゼが存在する場合にはこれが部位特異的開裂点に作用してＤＮＡを開裂する。したがって次にこのＤＮＡを適宜選択した溶解温度に曝すと開裂した鎖がその相補鎖から分離して化学発光標識が露出する。この後、加水分解条件に曝すことで化学発光標識は破壊される。これに対し、酵素が存在しないか不活性である場合には、二本鎖分子の開裂は起こらず、したがって化学発光標識は二本鎖分子のコイル内で加水分解の影響から保護されるためにその機能が保たれる。このようにすると化学発光シグナルの出力は開裂活性と反比例する。したがって酵素ヌクレアーゼの存在量または活性が増大することによって開裂が増加すると、より多くの化学発光標識が破壊されて化学発光シグナルが低下する。
【０１１４】
スキームＧは更にエンジイン開裂アッセイに含まれる工程を示している。上述したようにエンジインの存在下では標識化二本鎖分子は開裂され、後に溶解条件に曝した際に開裂が生じていると、開裂鎖はその相補鎖から分離して化学発光標識が露出する。この後、加水分解条件に曝すと化学発光標識は破壊される。したがってこのアッセイ法はエンジインの活性または存在についてアッセイを行ううえで同様に効果的である。
【０１１５】
図１０に示したスキームの改変例では、化学発光標識を二本鎖分子に結合させずに、二本鎖分子の一部に少なくとも部分的に相補的な別のオリゴヌクレオチドに結合させることによって、酵素またはエンジインの存在下では二本鎖分子が開裂してオリゴヌクレオチドが二本鎖分子の相補部分に結合することが可能となる。したがってスキームＧのこの改変例では、二本鎖分子のフラグメントへの標識化オリゴヌクレオチドの結合によって酵素またはエンジインの存在が示され、結合は酵素またはエンジインの活性と比例する。
【０１１６】
スキームＨ（図１０）
このスキームは酵素インテグラーゼの活性をモニターするように設計されている。
【０１１７】
この酵素の基質は２個のオリゴヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズすることによって図に示すような２次構造を形成することが可能な分子間及び分子内相補配列を有している。インテグラーゼがこの構造を開裂及びライゲートすることによって２個のオリゴヌクレオチドの大きい方に化学発光（ＡＥ）標識が取り込まれる。これを高温に曝すと標識を取り込んでいない、すなわち小さい方のオリゴヌクレオチドは脱落する。次いで大きな方のオリゴヌクレオチドを加水分解条件に曝すと、インテグラーゼによって長い方の鎖にライゲートされた化学発光標識は二本鎖の核酸のコイル内で保護されるために分解を免れる。
【０１１８】
このスキームでは化学発光標識のシグナルは酵素インテグラーゼの活性に直接比例する。したがって酵素の活性が高いほどより多くの化学発光標識が二本鎖分子に取り込まれ、加水分解の分解作用から化学発光標識がより保護されることになる。
【０１１９】
スキームＩ（図１１）
このスキームは酵素トポイソメラーゼの活性をモニターするように設計されている。
【０１２０】
先ず５’末端側の延長部分を有する二本鎖核酸を作成する。この二本鎖分子の一方の鎖は酵素トポイソメラーゼによる特異的開裂部位を更に含んでいる。トポイソメラーゼが存在するか活性である場合、酵素は開裂部位において二本鎖分子に作用して５’末端側の延長部分を有する二本鎖分子を形成する。
【０１２１】
次いでこの５’末端側の延長部分に相補的な化学発光標識したオリゴヌクレオチドをアッセイに加える。トポイソメラーゼはこのオリゴヌクレオチドをライゲートして化学発光標識化二本鎖分子を生成する。
【０１２２】
これを加水分解のための分解条件に曝すと化学標識は二本鎖分子のコイル内で加水分解から保護される。これに対してライゲートされていないオリゴヌクレオチドは破壊される。
【０１２３】
このアッセイでは化学発光標識のシグナル強度は酵素トポイソメラーゼの活性に直接比例する。したがってシグナルの量は酵素が作用してオリゴヌクレオチド標識が延長二本鎖分子に取り込まれるのにしたがって増大する。
【０１２４】
発明の詳細な説明
スキームＡに基づいた間接的リガーゼ活性アッセイ
ここではニックを有するかライゲートされていない第２の（標的）鎖に相補的なヌクレオチドの配列を有する第１のオリゴヌクレオチド鎖を合成する。ライゲートされていない第２の鎖は、酵素リガーゼの基質として機能する鎖の少なくとも一部であり、この酵素の作用によって修復またはライゲートされた鎖へと変換される。この鎖は、ライゲートされていない鎖の２個の部分の相対長さの比が４を越えないような位置に「ニック」を有することが好ましい。ニックの位置の可能な範囲はニックを有する鎖の全体の長さによって制限される。第３のオリゴヌクレオチド鎖は、第１のオリゴヌクレオチド鎖と同じであるが化学発光または蛍光発光分子を結合させることが可能な「リンカー」部分を更に有するヌクレオチド鎖を有する。こうした標識化オリゴヌクレオチドの合成はよく確立された技術である。第１のオリゴヌクレオチド鎖及び第３のオリゴヌクレオチド鎖は塩基１０〜６０個、好ましくは塩基２０から４０個からなるヌクレオチド鎖であることが好ましい。発光分子は好ましくは化学発光分子であり、より好ましくは化学発光性アクリジニウム塩である。
【０１２５】
スキームＡの（ｉ）工程における二本鎖分子と同様のニックを有する二本鎖分子が得られるように第１の鎖と第２の鎖を混合することによって好適なリガーゼ基質を調製する。実際には第２の鎖は、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いた適当な方法によって一方の鎖の遊離５’末端をリン酸化した２本の短い鎖からなる。好ましくは１０〜１００ｎｍｏｌの各鎖を適当なバッファー、好ましくはコハク酸リチウム（１〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、０．１〜１ｍｌ）中で好ましくは０．５〜２時間６０℃でハイブリダイズさせる。次いでこの基質の適当な量を所望量の酵素と混合し、通常の条件下で適当な時間反応を行う。
【０１２６】
標識した第３のオリゴヌクレオチド鎖は特定のバッファー媒体に溶解する。このバッファーは、標識鎖と第２のオリゴヌクレオチド鎖とのハイブリダイズを可能とし、ハイブリダイズ反応の間の試薬の安定性を維持する点で標識鎖に適合したものである。こうしたバッファーの処方はこの分野では確立されたものである。一般にバッファーのイオンは好ましくは１〜１００ｍｍｏｌ／ｌの範囲の濃度の有機及び／または無機塩からなり、溶液には界面活性剤及び／または保存料などの他の溶質が含まれていてもよく、ｐＨは好ましくは７以下である。使用する標識化オリゴヌクレオチドの量は、アッセイで求められる標識の検出感度及び標的鎖の検出感度に応じて異なる。一般に化学発光は従来の蛍光よりも高感度で検出が可能であり、したがって極めて高い感度の検出が必要とされる場合には蛍光プローブは不適当であることが知られている。個々の判定で使用する標識化オリゴヌクレオチドの量は一般的に１０−１８〜１０−９ｍｏｌ、より好ましくは１０−１５〜１０−１２ｍｏｌの範囲である。これは１μｌ〜１ｍｌの範囲の量のバッファに加えてもよいが、状況によってはこの量は１μｌ未満である。
【０１２７】
この標識化プローブの溶液を個別の試験管などの適当な反応容器か、９６、３８４、または１５３６穴マイクロタイタープレートなどの反応容器のアレイ中で分析用試料と混合する。または、不動化したマイクロアレイを用いた固相システムが多くの分析法で利用されていることは周知であり、従来の標識化プローブアッセイの使用法とならんで、本明細書で述べる手段がこうしたシステムにも拡張されるものであることは了承されよう。
【０１２８】
ハイブリダイズ反応は、一般に４〜８０℃、より好ましくは３０〜６０℃の範囲の温度で、一般に１分〜２４０分、より一般的には５分〜３０分の範囲で行う。
【０１２９】
この最初のインキュベーション後に分解工程を行う。この分解工程では、標識部分の１以上の結合を解離させる分解試薬を反応混合物に加えるが、標識が無傷な二本鎖分子の一部である場合には標識は解離反応から保護される。この解離反応も一般に高温で行う必要がある。分解試薬としては標識部分を加水分解することが可能な、ｐＨが７よりも大きいバッファー溶液を使用することができる。本発明はこうした加水分解の応用に限定されるものではなく、光放射標識が無傷な二本鎖分子の一部であるか否かに応じて光放射標識の発光能を選択的に阻害する他の方法にも拡張されるものである。こうした選択的解離反応を行う他の方法の例が文献に開示されている（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｋａｔｏ）。この方法では化学発光の強度は、ライゲートされていない核酸に対するライゲートされた核酸の比と比例している。
【０１３０】
特定のＤＮＡ酵素基質によってリガーゼ活性を決定するための上記のアッセイでは、上記のハイブリダイズ反応の前に、酵素が存在する場合にその作用によって核酸の構造を変化させる反応工程を行う。リガーゼの場合ではこの工程で核酸の「ニック」が修復される。次いで核酸を加熱してハイブリダイズした鎖を変性、すなわち分離させ、その後に冷却することによって鎖を再びハイブリダイズさせる。特定の化合物または化合物の混合物が酵素活性を阻害または活性化するか否かを判定したい場合には、前記の酵素を前記の化合物または化合物の混合物と接触させて、アッセイによって求められるその活性または活性の欠如を、化合物と接触させない酵素のアッセイによる酵素活性と比較する。同様にして、「基質」の生成物へのこうした変換を引き起こす任意の化学的または物理的システムの活性、及びその阻害剤や活性化剤の活性を求めることが可能である。
【０１３１】
スキームＣに基づいた直接的リガーゼ活性のアッセイ
２０個〜６０個の塩基対を有する二本鎖のオリゴヌクレオチド鎖からなり、一方の鎖が少なくとも１個の「ニック」を有してライゲートされていないような「設計」酵素基質を作成する。更にニックを有する鎖の一方は上述したようなリンカーと加水分解可能な化学発光標識を有する。この基質をリガーゼ酵素活性についてのアッセイで使用する。このアッセイでは、使用される特定の酵素リガーゼに適した条件下で基質と酵素を混合し、二本鎖の基質は酵素反応の際に一本鎖に解離することはない。
【０１３２】
基質を酵素に接触させた後、反応混合物を一般に３５〜７５℃、より好ましくは４５〜６５℃の高温に曝して保護されていない化学発光標識をすべて加水分解する。必要な場合、事前に適当なバッファー溶液を加えて反応混合物のｐＨを好ましくは７〜９の範囲に上げることによってこの加水分解反応を促進する。
【０１３３】
この選択的加水分解工程の後、反応混合物を照度計に入れて化学発光を開始してこれを測定する。化学発光反応を開始させる方法は使用される特定の化学発光標識に依存し、当業者には周知のものである。標識が化学発光性のアクリジニウム塩であるような一例では、一般に過酸化水素とアルカリを加えることによって反応を開始させる。化学発光検出に適した機器は多くのものが市販されている。
【０１３４】
上記に述べた手法はリガーゼ活性のモニタリングに関するものであるが、こうした手法は、ライゲートされた核酸とライゲートされていない核酸の間の相互変換を促進するすべての酵素で使用することが可能である。これらの手法は、反応が行われるうえで必要な条件下かつ反応に必要なすべての補因子の存在下で、試験する酵素を核酸基質と混合する方法にて開始するか、あるいはこうした方法を先に行う。この時点かこれよりも先の時点で、特定の物質を加えてこの物質が酵素の活性に与える影響について調べることも可能である。
【０１３５】
特定の酵素の活性に適合した反応条件は文献で確立されているものであり、本明細書の教示に適用することが可能である。更に、酵素と阻害剤との相互作用を引き起こす好ましい態様を代表する一般的な手法はよく知られたものである。したがって本明細書で開示する方法は、本明細書で説明する酵素の活性に影響するあらゆる化学的または物理的変量の研究が可能であるように適合させることが可能である。
【０１３６】
最後に、化学発光の強度は、ライゲートされていない鎖に対するライゲートされた鎖の濃度の比に比例しており（方法に応じて直接または間接に）、したがって系に存在する酵素の活性、不活性、または活性の阻害の指標、尺度となるものである。
【０１３７】
ここで述べた方法は、核酸の改変を引き起こし、その全体の機能の一部としてライゲーション及び／または開裂を行う広範な酵素の活性を調べるための手段として応用することが可能である。そのため上記の加水分解工程を行う温度は、ライゲートされていない二本鎖分子は溶解するがライゲートされている二本鎖分子は無傷に維持されることでハイブリダイゼーションによる保護が促進されるように適切に選択される必要がある。適切な温度は異なる鎖で異なり、特定の鎖に対してこの温度を最適化するには経験的なアプローチが必要である。
【０１３８】
同様の実験プロトコールを酵素ヘリカーゼまたはその阻害剤の活性のアッセイに用いることが可能であるが、こうした場合では、標識化オリゴヌクレオチド鎖が、各酵素活性の産物を構成する「巻き戻された」遺伝物質に結合可能であるが、核酸二本鎖分子に代表されるような基質に結合することはできないように設計されている点が異なっている。特定の化合物または化合物の混合物による酵素阻害の際に見られるような酵素活性の消失によって標識化オリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーションの標的が失われる。
【０１３９】
更にスキームＤで述べたように、ヘリカーゼアッセイにおいて、基質二本鎖分子の鎖の一方がそれ自体標識されていることにより、二本鎖分子が酵素によって「巻き戻されて」いる場合に標識の性質が異なるような「設計基質」を使用することが可能である。こうした設計基質二本鎖分子は例えばアクリジニウムエステルで標識することが可能である。アクリジニウムエステルの加水分解速度は、アクリジニウムエステルが結合した核酸鎖の部分がヘリカーゼの作用によってその相補鎖から分離する際に増大する。上述したようにここで物理的／化学的条件を変化させることによって、ヘリカーゼ反応の生成物中に存在するアクリジニウム塩は選択的に加水分解されるが、未反応基質として存在するものには実質影響を及ぼさないようにする。この場合、化学発光の強度は酵素活性に反比例する。
【０１４０】
同様の実験プロトコールを酵素インテグラーゼ及びトランスポザーゼまたはその阻害剤の活性のアッセイに使用することができる。その場合、（酵素活性後の）生成物である核酸鎖にはハイブリダイズできるが改変されていない基質核酸鎖にはハイブリダイズできない、またはその逆である標識化オリゴヌクレオチドを使用することができる。
【０１４１】
標識化オリゴヌクレオチド鎖を結合させる基質または生成物が二本鎖分子として存在する場合、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズを行う前にこの二本鎖分子を解離させる必要がある場合がある。こうした解離反応を行うための多くの方法が当該分野では確立されている。
【０１４２】
以下の実施例は本明細書で具体化される教示の原理をその応用に関して限定することなく説明するためのものである。
【０１４３】
実施例１
１．化学発光アクリジニウムエステルで標識したオリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーション保護を利用したＤＮＡリガーゼアッセイ
【０１４４】
確立された方法を用いて３種類のオリゴヌクレオチドを調製した。これらの鎖は以下のようなものである。
【０１４５】
（ｉ）  ５’−ＧＧＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＧＣＴ ＡＴＴ ＡＣＧ ＣＣＡ ＧＣＴ−３’
（ｉｉ）  ３’−ＣＣＧ ＧＡＧ ＡＡＧ ＣＧＡ−５’
（ｉｉｉ）  ３’−ＴＡＡ ＴＧＣ ＧＧＴ ＣＧＡ−５’
更に発表されている方法によって以下のような（ｉ）の化学発光性誘導体を調製した（＊は化学発光標識の位置を示す）。
（ｉｖ）  ５’−ＧＧＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＧＣＴ＊ＡＴＴ ＡＣＧ ＣＣＡ ＧＣＴ−３’
（ｉｉ）の遊離５’末端を確立された方法でリン酸化した。このリン酸化によって鎖は確実にニックされる。リン酸化した（ｉｉ）を等モル量の（ｉ）及び（ｉｉｉ）と１時間、６０℃でコハク酸リチウムバッファー中でハイブリダイズさせることによってストック用の二本鎖分子を生成した。この二本鎖分子（６ｐｍｏｌ）とＴ４  ＤＮＡリガーゼ（８０単位）との混合物に必要に応じて潜在的阻害剤を混合したものを用いてリガーゼ活性を調べた。
【０１４６】
以下のようにして反応生成物をライゲートされた生成物について分析した。
【０１４７】
ハイブリダイゼーション保護アッセイによる分析用にリガーゼ生成物の反応混合物の試料をＴｒｉｓバッファー（０．０１ｍｏｌ／ｌ，ｐＨ８．３）で１０００倍に希釈した。１００μｌの希釈液を、５００μｌの微小遠心管中で反応バッファー（１２５ｍｍｏｌ／ｌ  水酸化リチウム、９５ｍｍｏｌ／ｌ  コハク酸、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＧＴＡ、１．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ、８．５％  ラウリル硫酸リチウム、ｐＨ５．２）に希釈した標識化プローブ（ｉｖ）（５０ｆｍｏｌ）に加えた。この遠心管を９５℃で５分インキュベートしてから６０℃で３０分インキュベートした。遠心管を４℃に冷却し、各遠心管の内容物を１００μｌずつ、対応した１２×７５ｍｍのポリスチレン製試験管に移した。次いで加水分解試薬（１９０ｍｍｏｌ／ｌ  ホウ酸ナトリウム、５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ７．６）（３００μｌ）を加え、試験管を６０℃で１０分インキュベートした。これらの試験管を氷浴中に1分置き、次いで、検出試薬Ｉ及びＩＩ（ジェンプローブ社  サンディエゴ  米国）を各２００μｌずつ順次注入しかつ読取り時間５秒となるようにプログラムされた照度計（ストラテック・バイオメディカルシステムズ社  フォルツハイム  ドイツ）に入れた。
【０１４８】
図９は、既知のリガーゼ阻害剤（エチレンジアミンテトラ酢酸、ＥＤＴＡ）の酵素に対する影響を示したものである。
【０１４９】
２．化学発光性アクリジニウムエステルで標識した二本鎖分子基質のハイブリダイゼーション保護を利用したＤＮＡリガーゼアッセイ
【０１５０】
実施例１で得られたオリゴヌクレオチド（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を上記で鎖（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）で用いたのと同様の方法でハイブリダイズした。このストック用標識化二本鎖分子をリガーゼアッセイで直接使用した。
上記と同じようにして加水分解試薬を加え、上述したように化学発光の測定を行った。
【０１５１】
実施例２
逆転写酵素（ＲＴ）：ジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）の阻害
【０１５２】
アッセイの鋳型分子を、連続プライマー、Ｔ７ウイルスＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ、及びリポーター配列からなるヌクレオチド８１個のＤＮＡ（ナンセンス）オリゴヌクレオチドでプレプライミングした。プレハイブリダイズした短鎖のセンス鎖プライマーのＲＴ依存型伸長反応によって二本鎖の基準プロモーター／リポーターが生成し、リポーターとしてのｍＲＮＡ転写産物のＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる生成をＲＴによって調節することが可能となる。ｒＴＮＰ（２ｍＭ）、ｄＴＮＰ（０．１ｍＭ）、トリ骨髄芽球症ウイルスＲＴ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びｄｄＴＴＰの連続希釈液を含んだバッファ中で鋳型分子をインキュベートした。次いでレポーターとしてのｍＲＮＡ産物をＨＰＡ（ハイブリダイズ保護アッセイ）によって測定した。簡単に述べると、基質鎖に相補的なオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖を、溶解温度に曝した後に対応するＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせたのである。
【０１５３】
上記と同じようにして加水分解試薬を加え、上述したように化学発光の測定を行った。
【０１５４】
実施例３
ＤＮＡヘリカーゼ：３つの異なる酵素：基質比における鎖分離の時間的変化
【０１５５】
ＡＥ標識した二本鎖基質を酵素の存在下でインキュベートした。分離されていない基質がＡＥにハイブリダイゼーション保護を与えることから、信号強度は酵素活性に反比例する。
【０１５６】
実施例４
Ｔ７ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡの生成：ＥＤＴＡを用いた阻害用量応答
【０１５７】
鋳型分子として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、リポーター標的配列を有するヌクレオチド２９５個からなるｍＲＮＡ転写産物をコードした直線化ＤＮＡをＰＣＲで生成したものを用いた。鋳型分子を酵素とともにモデル阻害剤としてのＥＤＴＡの連続希釈液中でインキュベートした。この後、レポーターとしてのｍＲＮＡ産物をハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）で測定した。簡単に述べると、新たに形成された鎖に相補的な標識化オリゴヌクレオチドをこの新たな鎖にハイブリダイズさせたのである。上記と同じようにして加水分解試薬を加え、上述したように化学発光の測定を行った。
【０１５８】
実施例５
Ｅ  ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼ：リファンピシンによる阻害
【０１５９】
コンセンサス配列であるＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びリポーターｍＲＮＡ転写産物を連続的にコードした（３’−５’ナンセンス）ヌクレオチド６４個からなる合成オリゴヌクレオチドからストックの鋳型分子を構築した。短鎖のセンス鎖プライマーを３’末端にアニールし、ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼを用いて完全な二本鎖分子を伸長した。ホロ酵素であるＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡポリメラーゼを用い、ＤＭＳＯによる阻害剤の連続希釈液とともにアッセイバッファー中で鋳型分子をインキュベートした。この後、レポーターとしてのｍＲＮＡ産物をハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）によって測定した。簡単に述べると、標識化オリゴヌクレオチドを新たに形成された鎖にハイブリダイズさせたのである。上記と同じようにして加水分解試薬を加え、上述したように化学発光の測定を行った。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】酵素リガーゼの作用を示す模式図であり、核酸配列の一部がライゲートされる様子が示されている。
【図２】酵素ヘリカーゼの作用を示す模式図であり、二本鎖核酸の個々の鎖が「巻き戻されて」いる様子が示されている。
【図３】リガーゼ活性をアッセイするための本発明の第１の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図４】やはりリガーゼ活性をアッセイするための本発明の第２の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図５】設計標識化基質としての核酸を使用してリガーゼ活性をアッセイする本発明の第３の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図６】ＤＮＡヘリカーゼなどの酵素の活性についてアッセイするための本発明の第４の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図７】複鎖ＤＮＡ鋳型分子に作用するＲＮＡポリメラーゼなどの酵素についてアッセイするための本発明の第５の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図８】一本鎖鋳型分子に作用する逆転写酵素やプライマーゼなどの酵素の活性についてアッセイするための本発明の第６の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図９】複鎖ＤＮＡに作用するエンジインまたはヌクレアーゼなどの酵素の活性についてアッセイするための本発明の第７の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図１０】オリゴヌクレオチドに作用するインテグラーゼなどの酵素の活性についてアッセイするための本発明の第８の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図１１】二本鎖の核酸分子に作用するトポイソメラーゼなどの酵素の活性についてアッセイするための本発明の第９の実施形態に含まれる工程を示した模式図。
【図１２】酵素リガーゼの阻害剤としてＥＤＴＡを使用した実施例１の実験結果を示す図。
【図１３】逆転写酵素の阻害剤としてジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）を使用した実施例２の実験結果を示す図。
【図１４】ヘリカーゼの活性を３つの異なる酵素：基質比にて測定した実施例３の実験結果を示す図。
【図１５】ウイルス性ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ酵素の阻害剤としてＥＤＴＡを使用した実施例４の結果を示す図。
【図１６】細菌性ＤＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼ酵素の阻害剤としてリファンピシンを使用した実施例５の結果を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月19日(2004.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の状態から第２の状態へと核酸の構造を変化させることが可能な細菌またはウイルス酵素の活性を決定するための方法であって、
（ａ）試験試料中に、
（ｉ）リガーゼ、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーゼ、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トポイソメラーゼ、トランスポザーゼ、及びジャイレースからなる群から選択される酵素と、
（ｉｉ）前記核酸と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）前記第１または第２の状態にある場合に前記核酸に対して少なくとも部分的に相補的な１以上のオリゴヌクレオチドとを与える工程；該オリゴヌクレオチドまたは核酸の一方もしくは両方は出力シグナルを与えることが可能な標識を有し、分解に対する前記標識の安定性は前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれにあるかに応じて異なる；と、
（ｂ）前記試験試料を分解条件に曝す工程と、
（ｃ）前記出力シグナルを検出することによって前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれに少なくとも主としてあるかを判定する工程と、
（ｄ）前記酵素の活性を決定する工程とを含む方法。
【請求項２】
前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸は一本鎖または複鎖であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素はリガーゼであり、前記核酸はその第１の状態では複鎖であって、前記（ａ）工程は更に、前記複鎖核酸が一本鎖に分離することによって、ライゲートされている核酸鎖またはその相補鎖がすべて前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能となるような温度に前記試料を曝すことを更に含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素はリガーゼであり、前記オリゴヌクレオチドは前記試験試料には含まれず、複鎖である前記核酸は前記標識を有し、前記（ａ）工程は更に、ライゲートされていない核酸のすべてが少なくとも部分的に一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを更に含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記温度は、前記ライゲートされていない核酸は分離するがライゲートされている核酸は分離しないように選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸は、前記酵素によってライゲートされることが可能な少なくとも２個のライゲートされていない部分からなる中断鎖を有することを特徴とする請求項４、５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記物質はヘリカーゼであり、前記核酸はその第１の状態では複鎖であって、前記（ａ）工程は更に、前記核酸が少なくとも部分的に巻き戻されるような環境に前記試料を曝すことを更に含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドは前記試験試料には含まれず、前記核酸は前記標識を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素はポリメラーゼであり、前記核酸はオリゴヌクレオチド及び／またはヌクレオチドの形態であって、前記（ａ）工程は更に、前記オリゴヌクレオチド及び／または前記ヌクレオチドが連結されて鎖を形成し、これに前記相補的オリゴヌクレオチドが結合することが可能となるような環境に前記試料を曝すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記酵素は逆転写酵素またはプライマーゼであり、前記核酸はヌクレオシド三リン酸の形態であって、前記（ａ）工程は更に、前記ヌクレオシド三リン酸が連結されて鎖を形成し、これに前記相補的オリゴヌクレオチドが結合することが可能となるような環境に前記試験試料を曝すことを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料は更に核酸鋳型分子を含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記鋳型分子は一本鎖であることを特徴とする請求項１２に記載に方法。
【請求項１４】
前記酵素はヌクレアーゼであり、前記オリゴヌクレオチドは前記試料には含まれず、複鎖であって部位特異的開裂点を有する前記核酸は前記標識を有し、前記（ａ）工程は更に、開裂した核酸がすべて一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素はヌクレアーゼであり、前記核酸は複鎖であるとともに部位特異的開裂点を有し、前記（ａ）工程が更に、開裂した核酸がすべて一本鎖に分離するような温度に前記試料を曝すことを更に含むことによって前記鎖の少なくとも選択された１本に前記相補的オリゴヌクレオチドが結合可能となる請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度は、前記開裂した核酸は分離するが開裂していない核酸は分離しないように選択されることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素はインテグラーゼであり、前記オリゴヌクレオチドは前記試料に含まれず、前記核酸は、分子間及び分子内相補配列を有する少なくとも２個のオリゴヌクレオチドからなることと、前記配列の１つは前記標識を有し、前記（ａ）工程は更に、標識を取り込んでいないオリゴヌクレオチドはすべて分離または脱落する温度に前記試料を曝すことを更に含むこととを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識は前記酵素が活性である部位から離れた位置にあることによって前記標識が前記酵素の活性に干渉することがないことを特徴とする請求項５、１４または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素はトポイソメラーゼであり、前記核酸はその第１の状態では５’末端または３’末端側に延長部分を有する二本鎖分子であり、前記オリゴヌクレオチドは前記酵素の活性によって生成される前記５’末端または３’末端側の延長部分に相補的な鎖である再ライゲートされた鎖であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記出力シグナルの検出には、比色定量法、蛍光測定法、及び化学発光法の１以上を使用することを特徴とする請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識は蛍光分子または化学発光分子であることを特徴とする請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識はアクリジニウム塩であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
複数の酵素の活性を決定する請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の方法であって該方法は、
（ａ）試験試料中に、
（ｉ）複数の酵素と、
（ｉｉ）前記複数の酵素の核酸と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）前記第１または第２の状態にある場合に前記核酸に対して少なくとも部分的に相補的な１以上のオリゴヌクレオチドとを与える工程；該オリゴヌクレオチドまたは核酸の一方もしくは両方はそれぞれ出力シグナルを与えることが可能な複数の標識を有し、該シグナルは前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれにあるかによって分解の影響に対して安定であり、各標識の出力シグナルが異なることによって各酵素の活性の区別が可能である；と、
（ｂ）前記試験試料を分解条件に曝す工程と、
（ｃ）各標識の出力シグナルを検出することによって前記複数の核酸が前記第１または第２の状態のいずれに少なくとも主としてあるかを判定する工程と、
（ｄ）前記複数の酵素のそれぞれの活性を決定する工程とを含む方法。
【請求項２４】
前記酵素に関して、薬剤を調節活性についてスクリーニングするための請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の方法の用途であって、前記方法の前記（ａ）工程は更に、前記試験試料中に試験を行う前記薬剤を与えることを更に含むことを特徴とする用途。
【請求項２５】
前記薬剤は薬理活性についてスクリーニングされることを特徴とする請求項２４に記載の用途。
【請求項２６】
前記薬剤は抗細菌活性についてスクリーニングされることを特徴とする請求項２４または２５に記載の用途。
【請求項２７】
前記薬剤は抗ウイルス活性についてスクリーニングされることを特徴とする請求項２４または２５に記載の用途。
【請求項２８】
試料中の基質核酸の構造が変化して第１の状態または第２の状態のいずれにあるかを検出するための請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の方法の用途。
【請求項２９】
核酸の構造を第１の状態から第２の状態へと変化させることが可能な細菌またはウイルス酵素に関して、薬剤を調節活性についてスクリーニングするための方法であって、
（ａ）試験試料中に、
（ｉ）リガーゼ、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーゼ、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トポイソメラーゼ、トランスポザーゼ、及びジャイレースからなる群から選択される酵素と、
（ｉｉ）前記核酸と、
（ｉｉｉ）試験する薬剤と、必要に応じて、
（ｉｖ）前記第１または第２の状態にある場合に前記核酸に対して少なくとも部分的に相補的な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとを与える工程；該オリゴヌクレオチド及び核酸の一方もしくは両方は出力シグナルを与えることが可能な標識を有し、分解に対する前記標識の安定性は前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれにあるかに応じて異なる；と、
（ｂ）前記試験試料を分解条件に曝す工程と、
（ｃ）前記出力シグナルを検出することによって前記核酸が前記第１または第２の状態のいずれに少なくとも主としてあるかを判定する工程と、
（ｄ）前記酵素の活性、したがって前記薬剤の調節活性を決定する工程とを含む方法。
【請求項３０】
リガーゼ、ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーゼ、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トポイソメラーゼ、トランスポザーゼ、及びジャイレースからなる群から選択される所定の細菌またはウイルス酵素の活性の決定において使用するための基質核酸であって、核酸と標識との複合体からなり、該核酸が前記酵素によって作用を受けるものであることによって、前記酵素が活性である場合に前記基質核酸は第１の状態から第２の状態に変化して分解に対する標識の安定性に影響を与えることを特徴とする基質核酸。
【国際調査報告】
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