(57)【要約】本発明は、ケシ科のもの、特にケシから由来し、２種のタンパク質サブフラクションＡおよびＢからなり、その分子量は１１６.４ｋＤａまたは１１４.１ｋＤａにあり、８.７もしくは６.７の等電点ｐＩを有し、かつｐＨ８.０もしくは５.５において加水分解活性最適値を有する、ホスホリパーゼＤ−活性を有する植物性タンパク質フラクションを請求する。両方のフラクションは、特にＺｎ２＋イオンにより活性化可能であり、かつ２種のイソ酵素を有する。特に、このタンパク質フラクションはリン脂質およびそのリゾ型の加水分解および／またはトランスホスファチジル化のために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）２種のタンパク質サブフラクションＡおよびＢからなり、
ｂ）Ｚｎ２＋イオンにより活性化可能であり、かつ
ｃ）サブフラクションＡおよび／またはＢが炭水化物部分を有し、かつ
その際、タンパク質サブフラクションＡが加水分解活性のみを有する、
ケシ科のものから由来する、ホスホリパーゼＤ−活性を有する植物性タンパク質フラクション。
【請求項２】
ケシに由来し、特に有利には発芽する芽におよび／または胚乳に由来する、請求項１記載のタンパク質フラクション。
【請求項３】
サブフラクションＡが分子量１１６〜１１８ｋＤａ、等電点ｐＩ８.５〜８.９を有し、かつｐＨ−値７.８〜８.２において加水分解活性最適値を有し、かつサブフラクションＢが分子量１１２〜１１５ｋＤａ、等電点ｐＩ６.５〜６.９を有し、かつｐＨ−値５.０〜６.０において加水分解活性最適値を有する、請求項１または２記載のタンパク質フラクション。
【請求項４】
サブフラクションＡが分子量１１６.４ｋＤａ、等電点ｐＩ８.７を有し、かつｐＨ８.０において加水分解活性最適値を有する、請求項１から３までのいずれか１項記載のタンパク質フラクション。
【請求項５】
サブフラクションＢが分子量１１４.１ｋＤａ、等電点ｐＩ６.７を有し、かつｐＨ５.５において加水分解活性最適値を有する、請求項１から４までのいずれか１項記載のタンパク質フラクション。
【請求項６】
サブフラクションＢがＺｎ２＋−イオン濃度１.０〜１０ｍＭ、特に有利には５ｍＭにおいて活性化能最適値を有する、請求項１から５までのいずれか１項記載のタンパク質フラクション。
【請求項７】
サブフラクションＡおよびＢがイソ酵素である、請求項１から６までのいずれか１項記載のタンパク質フラクション。
【請求項８】
トランスホスファチジル化活性が加水分解活性より強く現れている、請求項１から７までのいずれか１項記載のタンパク質フラクション。
【請求項９】
リン脂質および／またはそのリゾ型の加水分解および／またはトランスホスファチジル化のための、請求項１から８までのいずれか１項記載のタンパク質フラクションの使用。
【請求項１０】
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルイノシット、ホスファチド酸、ホスファチジルセリンおよびそれらのリゾ型を合成するための、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
ホスファチジルイノシットの加水分解の形でのおよび／またはホスファチジルイノシットでの頭部基交換の形での、請求項９または１０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象はホスホリパーゼＤ−活性を有する植物性タンパク質フラクションである。
【０００２】
ホスファチジルコリン−コリンヒドロラーゼ（ＥＣ３.１.４.４）であるホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、リン脂質代謝の重要な酵素であり、天然に広く分布している。
【０００３】
ホスホリパーゼＤは、脂質と水との間の界面で反応を触媒することができるので、そのメンバーが不均一系において水不溶性の基質を変換することができる酵素群に属する。この両親媒性の挙動によりホスホリパーゼＤは科学のために特に興味深いものとなっているので、最近の数十年間、多数の異なるホスホリパーゼＤ（−種）が種々の異なる源から単離することができた。特に、ＰＬＤは細胞間の信号交換との関連において細胞制御活性への関与が記載されている。ＰＬＤ−酵素はその加水分解活性に加えて、アルコール上にホスファチジル基を移送することができる。従って、一般にＰＬＤ−変異体（Variante）をリン脂質の頭部基の生体触媒による交換のために使用する。
【０００４】
こうして、例えば、甜菜、ほうれん草またはキャベツの葉のプラスチドからの酵素フラクション、並びにニンジンの有色体からの酵素フラクションは公知である。ホスホリパーゼＤ−活性を有する相応するフラクションは、同様に未成熟のピーナッツの種子のミトコンドリアおよびミクロソームから、並びにトウゴマ属の種子、アブラナ科の種およびトマトからも得られる。
【０００５】
相応する酵素を脱脂した綿実粉から抽出することも成功している。
【０００６】
植物性由来のものの他に微生物に由来するものも使用され、この際、特にコリネバクテリウム（Corynebacterium ovis）、大腸菌、イースト細胞およびストレプトミセス科（Streptomyces hachijoensis）を挙げることができる。
【０００７】
しかしながら、ホスホリパーゼは哺乳動物の細胞、例えばヒトの好酸球およびラットの脳ミクロソームからも単離することができる。
【０００８】
分子量に関して、公知ホスホリパーゼＤは異種の像を提供する：
こうして、綿実から単離された溶解性の酵素は分子量７１０００  ３０００Ｄａを示す；ピーナッツ種子からのホスホリパーゼＤは分子量２０００００  １００００Ｄａおよびヒトの好酸球からのＰＬＤは約６００００Ｄａの分子量を有する。
【０００９】
相応するバクテリア酵素、例えばCorynebacterium ovisから単離することができるような酵素は約９００００Ｄａの分子量を有する。
【００１０】
等電点に関しては、ピーナッツ種子からのホスホリパーゼＤに関してはｐＩ−値４.６５が公知であり、これに対してヒトの好酸球からの粗抽出物のｐＩ−値は４.８〜５.０にあり、付加的な精製により５.８〜６.２の値になることができる。
【００１１】
キャベツからのＰＬＤの２工程での精製をR. Lambrecht等は記載している（"A facile purification procedure of phospholipase D from cabbage and its characterization";(1992) Biol. Chem. Hoppe Seyler Vol 373(2) 81-88）。この方法は、硫酸アンモニウム−沈殿および引き続くＣａ＋−媒介アフィニティークロマトグラフィーを包含する。
【００１２】
I.Schaeffner等の刊行物（"Genomic structure, cloning and expression of two phospholipase D isoenzymes from white cabbage."; Eur. J. Lipid Sci. Technol. 104, 79-87(2002); 相応する学位論文（２００１））からは、組換えホスホリパーゼＤ−活性イソ酵素をキャベツからクローニング法を介して如何に獲得することができるか、およびこのイソ酵素をｐＨ−値およびＣａ２＋−濃度に依存する加水分解比活性に関して、並びにそのトランスホスファチジル化特性に関して、如何に特徴付けすることができるかを読み取ることができる。
【００１３】
ホスホリパーゼＤに関する知識に関しての一般的な概観は、Advanced Lipid Research, 1978, Band 16, p267-326にMichael Hellerによる概要論文がある。
【００１４】
A. Lerchner等は、“Identification of two isoenzymes of phospholipase D from opium poppy” （Direct submission (2001) NCBI Gen Bank, accessions nos. AAL48261-AAK48264 und Multipler Sequenzvergleich）中に、ケシからの２つの切断した（trunkierte）ホスホリパーゼＤ１ポリペプチド並びにその他の２つの切断したホスホリパーゼＤ２ポリペプチドを記載している。複数配列比較から明らかなように、タンパク質Ｄ１およびＤ２の部分アミノ酸配列は相互に９８％の配列同一性を有する。更に、この記載されている部分配列は、十分に特徴付けされている  −タイプのホスホリパーゼＤ−変種に高い相同性（７０〜８４％）を有する。しかしながら、５′−末端の配列調査が完全ではないので、ホスホリパーゼＤ１−およびＤ２−ポリペプチドを定義された酵素に分類することは不可能である。
【００１５】
A. Lerchner等のデータバンク記載、“Identification of two isoenzymes of phospholipase D from opium poppy” （Direct submission (2001) NCBI Gen Bank, accessions nos. AF451979-AF451982）は前記両方のポリペプチドＰＬＤ１およびＰＬＤ２に対する核酸配列を記載している。
【００１６】
ケシの種子に関して、これが著しい量の二次代謝産物を形成することができることが公知である。こうして、発芽の数日後に、アルカロイド例えばテバインをケシの種子中に検出することができ、このことは特に阿片獲得に関してもケシの種子を興味深くさせる。
【００１７】
ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）は、産業上利用されるグリセロホスホリピド、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）のホスファチド酸（ＰＡ）への触媒による加水分解に常に重要な役割を果たすが、更にリン脂質の頭部基交換のためのトランスホスファチジル化工程においても重要な役割を果たすので、本発明のためにケシ科の植物から由来する新規のホスホリパーゼＤ−活性を有する植物性タンパク質フラクションを単離するという、課題が立てられた。
【００１８】
この課題は、
ａ）２種のタンパク質サブフラクションＡおよびＢからなり、
ｂ）Ｚｎ２＋イオンにより活性化可能であり、かつ
ｃ）サブフラクションＡおよび／またはＢが炭水化物部分を有し、かつ
その際、タンパク質サブフラクションＡは加水分解活性のみを有することを特徴とする相応するタンパク質フラクションにより解決する。
【００１９】
以下に使用する概念“タンパク質フラクション”とは、相応するＰＬＤ−活性を有する全ての実際のタンパク質フラクションおよびタンパク質並びにその可能な変異体、および全ての酵素および酵素変異体である。
【００２０】
意外にも、この植物性タンパク質フラクションにおいて、これが２種のイソ酵素単位を含有し、この２種は比較的狭い分子質量スペクトルを有し、それらの活性最適値は、１つは強く酸性にあるが、他方は僅かに塩基性にある。更に、ケシからのＰＬＤ−活性を有するイソ酵素が亜鉛−活性化性であることは、従来公知のＰＬＤを考えると予期することができなかった。そしてこのことはＣａ−イオンと多くの場合に不溶性の複合体を形成することが公知であるリン脂質の製造の際のその使用に関して特に利点である。更に、植物起源のホスホリパーゼＤに関する従来の知識のために、相応する活性を有するタンパク質フラクションがケシ科の植物中に見いだされることを前提として出発することはできなかった。
【００２１】
本発明は、特にケシ（Schlafmohn）から由来し、特に有利には発芽する芽におよび／または胚乳に由来する、タンパク質フラクションを請求する。勿論、タンパク質フラクションがケシ属から間接的に由来する、すなわちタンパク質フラクションが組換え法により得られ、かつ特に相応するタンパク質フラクションに関する遺伝子を含有する組換え微生物を用いる組換え法により得られる変異体も考えられる。
【００２２】
すでに記載したように、本発明の観点は、請求した植物性タンパク質フラクションが２種のイソ酵素を有するという事実に向けられている。こうして、本発明において、サブフラクションＡが分子量１１６〜１１８ｋＤａ、等電点ｐＩ８.５〜８.９を有し、かつｐＨ−値７.８〜８.２において加水分解活性最適値を有し、かつサブフラクションＢが分子量１１２〜１１５ｋＤａ、等電点ｐＩ６.５〜６.９を有し、かつｐＨ−値５.０〜６.０において加水分解活性の最適値を有するタンパク質フラクションが有利である。
【００２３】
等電点に関しては、単離されたフラクションを更に精製することにより、一定の定義された値が得られる。
【００２４】
本発明のタンパク質フラクションはこの理由から、特に、サブフラクションＡが等電点ｐＩ８.７、分子量１１６.４ｋＤａを有し、かつｐＨ−値８.０において加水分解活性の最適値を有することを特徴とする。サブフラクションＢの相応して有利な値は、分子量に関しては１１４.１ｋＤａ、等電点ｐＩに関しては６.７を有し、かつｐＨ−値５.５において加水分解活性の最適値を有する。この特徴部も本発明により包含される。
【００２５】
すでに記載したように、ホスホリパーゼＤ−活性を有するタンパク質フラクションは通常カルシウムイオン依存性である。しかしながら、この顕著な依存性は、強制的にＺｎ２＋−イオンが活性化可能である請求したケシ科からの植物性タンパク質フラクションに関しては、確認されていない。しかしながら、このタンパク質フラクションの活性最適値はカルシウムイオン濃度の存在においても達せられ、こうしてこの濃度は通常４０  Ｍ〜１００ｍＭの間であり、この際相応する酵素活性は２〜２０ｍＭおよび５〜１５ｍＭの濃度において生じる。
【００２６】
サブフラクションＢに関しては、本発明は１.０〜１０ｍＭ、特に有利には５ｍＭのＺｎ２＋−イオン濃度の存在において活性化能最適値が生じるタンパク質変異体を請求する。
【００２７】
本発明において、サブフラクションＡおよび／またはＢが炭水化物部分を有し、こうしてＮ−結合糖タンパク質としてグリコシル化形で存在し、かつサブフラクションＡおよびＢがイソ酵素であることは、特に発明の本質的な部分である。
【００２８】
サブフラクションＡ（加水分解のみ）およびサブフラクションＢ（顕著なトランスホスファチジル化）の驚くべき異なる活性特性に相応して、本発明はその加水分解活性よりトランスホスファチジル化活性を全体としてより強力に示すタンパク質フラクションの変異体も包含する。このことは特にサブフラクションの個別の活性により説明することができ、従来公知のＰＬＤ−変異体に関しても、これに対して新規タンパク質フラクションは相応する加水分解活性に対して１００倍までの顕著なトランスホスファチジル化活性を有するということは重要である。
【００２９】
本発明は、タンパク質フラクション自体の他に、このタンパク質フラクションのリン脂質および／またはそのリゾ型の加水分解および／またはトランスホスファチジル化のための使用、この際特にホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルイノシット、ホスファチド酸、ホスファチジルセリン、そのリゾ型及び任意の混合物の合成も請求している。これとの関連において、本発明によるタンパク質フラクションが、ホスファチジルイノシットを加水分解することができ、もしくはＰＩで頭部基交換を実施することができるということ（このことは従来公知のＰＬＤにより同様に公知ではなかった）は特記すべきことである。この際、反応実施法は全体として厳密ではないが、反応媒体としては有機および／または水性相及びリン脂質源としてはホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンが非常に好適であるとして証明されている。
【００３０】
全体としては、ケシ科のものからホスホリパーゼＤ−活性を有するこの新規植物性タンパク質フラクションを用いてＰＬＤの単離が成功し、これは全体として顕著なトランスホスファチジル化活性を有し、その両方のイソ酵素サブフラクションは加水分解活性を、特にホスファチジルコリンに対して有し；両方のサブフラクションはＰＬＤに公知のようにカルシウムイオンにより活性化可能であり、この新規タンパク質フラクションは他の植物からの公知ホスホリパーゼＤ−変異体とは異なり、特にＺｎ２＋−イオンにより活性化可能である、ということが確認された。
【００３１】
こうして、新規タンパク質フラクションは従来公知の植物性ＰＬＤとは基本的に異なっており、その特性はその遺伝子配列がすでに知られているＰＬＤとは明らかに異なる。
【００３２】
次に実施例につき、ホスホリパーゼＤ−活性を有する請求した植物性タンパク質フラクションの特徴を明らかにする。
【実施例】
【００３３】
植物材料の処理（酵素獲得）
ケシ（Papaver somniferum）の種子をナイロン布でカバーされたペトリシャーレ中の層厚１０ｍｍのポリウレタンフォーム層上で、蒸留水中で発芽させた。発芽の工程は２５℃で７０〜８０相対湿度で、暗所で実施した。発芽後二日目に芽から胚乳を取り除いた。
【００３４】
新鮮なケシの種子１０ｇから得られた胚乳を僅かな量の冷アセトンと乳鉢中で擦り、引き続き固体ＣＯ２  ３００ｇを含有する冷アセトン３００ｍｌと共にホモジナイズする。引き続き、このようにして得られた沈殿を冷アセトンで濾過液が無色透明になるまで洗浄する。真空乾燥した残分は粉末状で４℃で数ヶ月安定であった。
【００３５】
このアセトン粉末２ｇを０.１モル濃度の酢酸ナトリウム緩衝液／１０ｍＭ ＣａＣｌ２／６ｍＭシステイン塩酸塩からなる混合物（ｐＨ５.５）５０ｍｌ中でホモジナイズし、４℃で１２０００ｇで１０分間遠心分離した。これから得られた抽出物を（ＮＨ４）２ＳＯ４（６０％飽和）で処理し、２６０００ｇおよび４℃で４５分間遠心分離した。引き続き、沈殿物をできるだけ少量の０.１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液／１０ｍＭ ＣａＣｌ２／６ｍＭシステイン塩酸塩からなる混合物（ｐＨ５.５）中に取り込む。０.０１モル濃度の酢酸ナトリウム緩衝液／５０ｍＭ ＣａＣｌ２からなる混合物（ｐＨ５.５）に対して透析した後、この酵素溶液をオクチル−セファロースＣＬ−４Ｂ−カラム上に担持する。次の溶液でタンパク質を流速９ｍｌ／時間で３段階で溶離した：０.０１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液／５０ｍＭ ＣａＣｌ２；０.００５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液／３０ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ５.５）；０.００５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液／０.１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ５.５。酵素活性をホスファチジル−ｐ−ニトロフェノール（ＰｐＮＰ）でｐＨ値５.５および８.０で測定し、合した活性フラクションを１００ｋＤａ−膜を用いて濃縮した。
【００３６】
タンパク質測定：
タンパク質含量をM.M.Bradford（Anal. Biochem. 72 1976, 248-254）の標準法に則ってウシ血清−アルブミンを標準として用いて測定した。
【００３７】
水性系中の加水分解活性
このようにして得られたホスホリパーゼＤ−活性を有する植物性タンパク質フラクションの加水分解活性を、水性系中で調べた。その際、ＰｐＮＰから遊離したｐ−ニトロベンゼンを測定した（P. D'Arrigo, V. Piergianni, D. Scarcelli, S. Serviによる方法, "A Spectrophotometric Essay for Phospholipase D", Anal. Chim. Acta, 304, 1995, 249-254）。
【００３８】
ＰＬＤ−サブフラクションＡおよびＢのそれぞれの活性の特徴付けのために反応を、ＣａＣｌ２１０ｍＭの存在下に異なるｐＨ−値で、異なる濃度のＣａＣｌ２の存在でｐＨ−値５.５もしくは８.０で、並びに異なる濃度のＺｎＣｌ２の存在でｐＨ値５.５で実施した。
【００３９】
二相系でのトランスホスファチジル化活性および加水分解活性
N. Dittrich およびＲ. Ulbrich-Hofmann（"Transphosphatidylation by immobilised Phospholipase D in aqueous media", Biotechnol. Appl. Biochem. 34, 2001, 189-194）による方法に相応して、二相系でトランスホスファチジル化活性および加水分解活性を測定した。相応する反応媒体はホスファチジルコリンを含有するジエチルエーテル、グリセリン（トランスホスファチジル化活性の測定のため）または水（加水分解活性の測定のため）並びにトリス−ＨＣｌ／ＣａＣｌ２からなる混合物または酢酸ナトリウム緩衝液／ＣａＣｌ２からなる混合物および精製した酵素（ＰＬＤ−ＡおよびＰＬＤ−Ｂ）からなる。それぞれの反応をテフロン−シリコン−セプテン（Septen）で閉鎖した反応容器中で３０℃で振盪振動数２５０／分で実施した。反応の間、有機相の部分量をＨＰＴＬＣにより分析した。リン脂質含量はホスファチジルコリン、ホスファチド酸およびホスファチジルグリセリンからなる標準混合物に対して５５０ｎｍでデンシトメトリーにより測定した、その際ホスファチジルグリセリンまたはホスファチド酸の上昇から酵素活性を計算した。
【００４０】
酵素特徴の測定
精製したタンパク質の分子量の測定を、ポリアクリルアミドゲルの使用下に、Bio-Rad Mini Protein II Gel-Elektrophoresezelleを用いてＳＤＳの存在下に電気泳動を用いて実施した。
【００４１】
ＰＬＤサブフラクションＡおよびＢの等電点はPhastGel IEF 3-9 on FastSystem Separation and Controll Unit (Pharmacia LKB Biotechnology社)を用いて測定し、その際、較正のためにｐＩ  ＩＥＦ−マーカー（liquid mix3-10）を使用した。このタンパク質をクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０を用いて染色した。
【００４２】
糖タンパク質−測定のために、ＰＬＤ−Ａ、ＰＬＤ−Ｂおよびペルオキシダーゼ（グリコシル化タンパク質のための標準として）並びにアルドラーゼ（非グリコシル化タンパク質の標準として）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ゲルをニトロセルロース膜と３００Ｖおよび５ｍＡ／ｃｍ２において１８０分間の期間にわたって接触させた。タンパク質の移動の後、全炭化水素含量をＥＣＬ−糖タンパク質−検出モジュールで測定した。
【００４３】
４９２ｃＬＣ−タンパク質−シークエンサー（PE Applied Biosystems）を用いて、Ｎ−末端アミノ酸の配列決定を実施した。
【００４４】
結果：
R. Lambrecht, R. Ulbrich-Hofmann（"A facile purification procedure of phospholipase D from cabbage and its characterization", Biol. Chem. Hoppe-Seyler 373, 1992, 81-88）に相応するＰＬＤの精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて得られた２種の酵素型はｐＨ８.０（ＰＬＤ−Ａ）もしくはｐＨ５.５（ＰＬＤ−Ｂ）において活性であった。緩衝溶液中で、ＣａＣｌ２をＺｎＣｌ２に代えることにより、同じ精製結果を達成することができた。両方の酵素サブフラクションはＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ゲル中で均質であった。第１表は精製データを明らかにしており、この際両方のイソ酵素の精製ファクターは、８４.７（ＰＬＤ−Ａ）もしくは９４.１（ＰＬＤ−Ｂ）を有した。
【００４５】
両方のサブフラクションのタンパク質測定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて、１１６.４もしくは１１４.１ｋＤａのＰＬＤ−サブフラクションＡおよびＰＬＤ−サブフラクションＢの分子量を決定した。これらの等電点は８.７（ＰＬＤ−Ａ）および６.７（ＰＬＤ−Ｂ）にある。Ｎ−グリコシダーゼＦを用いるプラスのデグリコシル化反応が両方のサブフラクションに関してＮ−結合炭水化物の存在を示したので、ＰＬＤ−ＡもＰＬＤ−Ｂもグリコシル型で存在することを証明することができた。両方のサブフラクションでのＮ−末端配列決定法が機能しないので、両方の場合においてＮ−末端変性が存在することを前提とする。
【００４６】
ｐＨ−活性プロフィール
ＰｐＮＰに対するＰＬＤ−サブフラクションＡおよびＢの加水分解活性に関して、この活性はｐＨ−値の関数として明らかに異なっている。サブフラクションＡはｐＨ８.０において鋭いｐＨ−最適値を有し、これに対してこのｐＨ値においてサブフラクションＢの活性は顕著ではない。これに対してサブフラクションＢのｐＨ−最適値はｐＨ５.５にあり、このｐＨ値においてはサブフラクションＡはほとんど活性を示さない。それぞれの最適な条件下に、サブフラクションＢはサブフラクションＡに対して約３８％強力な活性を示す。
【００４７】
金属イオンの影響
ＰＬＤ−変異体から公知のＣａ２＋−イオンによる活性化に関しては、ケシからの新規サブフラクションＡおよびＢに関してもカルシウムイオン依存性が確認され、この際活性最大を１０ｍＭ ＣａＣｌ２−濃度で達成することができた。Ｍｇ２＋−イオンでは両方のサブフラクションは非常に僅かな活性化を達成することができるに過ぎない、これに対してＺｎ２＋−イオンはＰＬＤ−サブフラクションＡを、特にＢをカルシウムイオンより強く活性化する。最適なＺｎ２＋−イオン濃度（５ｍＭ）では、サブフラクションＢを、最適なＣａ２＋−イオン濃度を用いる場合より、数倍以上に強力に活性化することができた。
【００４８】
二相系中でのトランスホスファチジル化活性および加水分解活性
基質としてホスファチジルコリンおよびアクセプターアルコールとしてグリセリンを含有する酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５）またはトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）および４０ｍＭ ＣａＣｌ２、ジエチルエーテルからなる二相系において、サブフラクションＡおよびＢのトランスホスファチジル化能をＨＰＴＬＣおよび反応生成物のデンシトメトリーによる定量により測定する。ＰＬＤ−サブフラクションＢはｐＨ５.５において大きなトランスホスファチジル化能を有する、それというのも２４０分間後に、８０％を上回るホスファチジルコリンをトランスホスファチジル化生成物であるホスファチジルグリセリンに変換させたためである。これに対して、この反応条件下に全くホスファチド酸を検出することはできなかった。ｐＨ値８.０においてＰＬＤ−Ｂに関して全くトランスホスファチジル化も、加水分解も確認することができなかった。ＰＬＤ−サブフラクションＡはｐＨ５.５でもｐＨ８.０でもトランスホスファチジル化活性を示さなかった。しかしながら、予期されていたように、ｐＨ８.０で顕著な加水分解活性を示した。
【００４９】
【表１】
2005537026.tif 000002
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月9日(2004.6.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
分子量に関して、公知ホスホリパーゼＤは異種の像を提供する：
こうして、綿実から単離された溶解性の酵素は分子量７１０００±３０００Ｄａを示す；ピーナッツ種子からのホスホリパーゼＤは分子量２０００００±１００００Ｄａおよびヒトの好酸球からのＰＬＤは約６００００Ｄａの分子量を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
A. Lerchner等は、“Identification of two isoenzymes of phospholipase D from opium poppy” （Direct submission (2001) NCBI Gen Bank, accessions nos. AAL48261-AAK48264 und Multipler Sequenzvergleich）中に、ケシからの２つの切断した（trunkierte）ホスホリパーゼＤ１ポリペプチド並びにその他の２つの切断したホスホリパーゼＤ２ポリペプチドを記載している。複数配列比較から明らかなように、タンパク質Ｄ１およびＤ２の部分アミノ酸配列は相互に９８％の配列同一性を有する。更に、この記載されている部分配列は、十分に特徴付けされているα−タイプのホスホリパーゼＤ−変種に高い相同性（７０〜８４％）を有する。しかしながら、５′−末端の配列調査が完全ではないので、ホスホリパーゼＤ１−およびＤ２−ポリペプチドを定義された酵素に分類することは不可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
すでに記載したように、ホスホリパーゼＤ−活性を有するタンパク質フラクションは通常カルシウムイオン依存性である。しかしながら、この顕著な依存性は、強制的にＺｎ２＋−イオンが活性化可能である請求したケシ科からの植物性タンパク質フラクションに関しては、確認されていない。しかしながら、このタンパク質フラクションの活性最適値はカルシウムイオン濃度の存在においても達せられ、こうしてこの濃度は通常４０μＭ〜１００ｍＭの間であり、この際相応する酵素活性は２〜２０ｍＭおよび５〜１５ｍＭの濃度において生じる。


【国際調査報告】
2005537026.tif 000003
2005537026.tif 000004
2005537026.tif 000005
2005537026.tif 000006