(57)【要約】１種または２種以上の生体分子を検出するアレイおよび方法であって、この方法は、一般的に、１種または２種以上の試薬を固定化した第１支持体を供給するステップと、１種または２種以上のリガンドを固定化した第２支持体を供給するステップと、第１支持体に固定化された試薬を第２支持体に固定化されたリガンドと接触させることによって、１種または２種以上の試薬が１種または２種以上のリガンドと結合するステップと、第１支持体を第２支持体から分離した後、１種または２種以上の結合された試薬が第２支持体における１種または２種以上のリガンドとの結合を維持するステップとを含む。ある好適な方法においては、タンパク質は、該タンパク質が、別の支持体に固定化されたその他のタンパク質との結合後などの一定条件下で、支持体から解離され得るに足る強度で支持体と結合される。たとえば、本発明に従って形成された抗体アレイは、タンパク質溶解物におけるタンパク質発現を検出するために用いることが可能であり、細胞中のタンパク質の有無および位置を明らかにするために免疫染色において用いることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または２種以上の生体分子を検出する方法であって、
１種または２種以上の試薬が固定化される第１支持体を供給するステップと、
１種または２種以上のリガンドが固定化される第２支持体を供給するステップと、
第１支持体に固定化された試薬を第２支持体に固定化されたリガンドと接触させることによって、１種または２種以上の試薬が１種または２種以上のリガンドに結合するステップと、
第１支持体を第２支持体から分離するステップと、
前記第２支持体における１種または２種以上の試薬を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記試薬は、前記接触ステップにおいて前記試薬を固定化するとともに、前記分離ステップにおいて前記結合された試薬を前記第１支持体から解離可能にするに足る強度で前記第１支持体に固定化されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記試薬は、１種または２種以上の抗体を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記試薬は、１種または２種以上のＤＮＡプローブを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドは、前記第２支持体に固定化される前に相互に分離されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドは、少なくとも部分的に分子量に基づくゲル電気泳動を用いて相互に分離されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドは、少なくとも部分的に等電点に基づくゲル電気泳動を用いて相互に分離されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドは、少なくとも部分的に１つもしくは２つ以上の分子量および等電点、または分子量および等電点の両方に基づくゲル電気泳動を用いて相互に分離されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドは免疫学的に相互に分離されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンドは１種または２種以上の抗体アレイを用いて相互に分離されることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記試薬は、円形状、細長い形状、および多角形状からなる群から選択される１つまたは２つ以上の形状で前記第１支持体に固定化されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬は、抗体、組換えタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、炭水化物および小さい化学物質からなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
１種または２種以上の前記試薬は、前記第１支持体において１つまたは２つ以上の所定位置で固定化されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬は、前記第１支持体における所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬は、抗体であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
１種または２種以上の前記抗体は、１種または２種以上の翻訳後修飾されたタンパク質に特異的であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
１種または２種以上の前記抗体は、１種または２種以上のリン酸化タンパク質に特異的であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
５〜１００，０００の異なる種類の試薬が、前記第１支持体において１つまたは２つ以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
２００〜１０，０００の異なる種類の試薬が、前記第１支持体において１つまたは２つ以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
５０〜１，０００の異なる種類の試薬が、前記第１支持体において１つまたは２つ以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
５〜５００の異なる種類の試薬が、前記第１支持体において１つまたは２つ以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
２〜５０の異なる種類の試薬が、前記第１支持体において１つまたは２つ以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
１種または２種以上の試薬が固定化される前記第１支持体を供給する前記ステップが、１種または２種以上の中間物を前記第１支持体に施すステップであって、１種または２種以上の前記中間物はプロテインＡ、プロテインＧおよびこれらの突然変異体からなる群から選択される種種ステップと、種種１種または２種以上の前記試薬が１種または２種以上の前記中間物と相互作用するように、１種または２種以上の前記試薬を前記第１支持体に施すステップとを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記第１支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ガラスまたは合成樹脂と、これらの誘導体とからなる群から選択された材料を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記第１支持体は、ナイロンおよびナイロンの誘導体からなる群から選択される材料を含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
細胞中の１種または２種以上の生体分子を検出する方法であって、
（ａ）抗体が固定化される位置によって抗体が同定され得るように、前記第１支持体において所定位置で供給される１種または２種以上の抗体を、第１支持体に固定化するステップと、
（ｂ）第２支持体に前記細胞を配置するステップと、
（ｃ）前記抗体を前記細胞中の対応するいずれの抗原にも結合可能にするために、前記第１支持体における前記抗体を前記第２支持体における前記細胞と接触させるステップと、
（ｄ）前記第１支持体を前記第２支持体から分離した後、１種または２種以上の前記結合抗体が、対応する生体分子との結合を維持するステップと、
（ｅ）前記第２支持体における前記細胞中の前記生体分子に結合した前記抗体を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記細胞は、前記第２支持体に固定されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞は、１または２以上の組織切片であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
１種または２種種以上の前記抗体は、１種または２種以上の翻訳後修飾されたタンパク質に特異的であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
１種または２種以上の前記抗体は、１種または２種以上のリン酸化タンパク質に特異的であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
異なる５〜１００，０００種の試薬が、前記第１支持体において１または２以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
異なる２００〜１０，０００種の試薬が、前記第１支持体において１または２以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
異なる５０〜１，０００種の試薬が、前記第１支持体において１または２以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
異なる５〜５００種の試薬が、前記第１支持体において１または２以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３５】
異なる２〜５０種の試薬が、前記第１支持体において１または２以上の所定位置でそれぞれ固定化されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
前記第１支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ガラス、合成樹脂、およびこれらの誘導体からなる群から選択された材料を含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３７】
前記第１支持体は、ナイロンおよびナイロンの誘導体からなる群から選択された材料を含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
前記試薬は、円形状、細長い形状および多角形状からなる群から選択された１つまたは２つ以上の形状で前記第１支持体に固定化されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項３９】
前記第１支持体は、アレイを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項４０】
前記アレイは、複数の全体的または部分的な毛細管を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体を固定化する前記ステップは、１種または２種以上の中間物を前記第１支持体に施すステップと、１種または２種以上の前記抗体が１種または２種以上の前記中間物と相互作用するように１種または２種以上の前記抗体を前記第１支持体に施すステップとを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項４２】
１種または２種以上の前記中間物は、プロテインＡ、プロテインＧおよびこれらの突然変異体からなる群から選択されることを特徴とする請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記検出ステップは、１種または２種以上の前記抗体が一方または両方の支持体に存在するか否かを検出するステップと、前記分離ステップ後、前記抗体の１つまたは２つ以上の位置を同定するステップと、前記抗体の１つまたは２つ以上の数量を決定するステップと、抗体の１つまたは２つ以上のタイプを同定するステップとからなる群から選択する１つまたは２つ以上の検出ステップを含むことを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項４４】
１種または２種以上の生体分子を検出する方法であって、
（ａ）第１支持体に１種または２種以上の試薬を固定化するステップと、
（ｂ）１種または２種以上の前記試薬と相互作用するように構成される１種または２種以上のリガンドを第２支持体に固定化するステップと、
（ｃ）前記試薬の１種または２種以上を１種または２種以上の前記リガンドと結合可能にするために前記試薬を前記リガンドに接触させるステップと、
（ｄ）前記試薬の１種または２種以上を１種または２種以上の前記リガンドと架橋するステップと、
（ｅ）１種または２種以上の前記リガンドと結合される１種または２種以上の前記試薬を前記第１支持体から解離可能にするために、前記第１支持体を前記第２支持体から分離するステップと、
（ｆ）前記試薬またはリガンドの１種または２種以上を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項４５】
１種または２種以上の前記リガンドおよび試薬は、少なくとも部分的に１種または２種以上のアルデヒドを用いて架橋されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
１種または２種以上の前記アルデヒドは、ホルムアルデヒドおよびグルタルデヒドからなる群から選択されることを特徴とする請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
１種または２種以上の生体分子の検出に用いるアレイであって、
１種または２種以上の試薬を固定化するように構成される第１支持体であって、１種または２種以上のリガンドが固定化される第２支持体と接触して配置されるように構成される第１支持体を含み、
１種または２種以上の前記試薬は、１種または２種以上の前記リガンドと結合し、次いで前記第１支持体から解離し、前記第２支持体において前記リガンドとの結合を維持することが可能にされることを特徴とするアレイ。
【請求項４８】
前記第１支持体は、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライド、ガラス、合成樹脂およびこれらの誘導体からなる群から選択された１種または２種以上の材料を含むことを特徴とする請求項４７記載のアレイ。
【請求項４９】
前記第１支持体は１つまたは２つ以上の毛細管の全部または一部を含むことを特徴とする請求項４７記載のアレイ。
【請求項５０】
１種または２種以上の前記試薬は、円形状、細長い形状、および多角形状からなる群から選択された１つまたは２つ以上の形状で固定化されることを特徴とする請求項４７記載のアレイ。
【請求項５１】
１種または２種以上の前記試薬は、抗体を含むことを特徴とする請求項４７記載のアレイ。
【請求項５２】
１種または２種以上の前記試薬は、ＤＮＡプローブを含むことを特徴とする請求項４７記載のアレイ。
【請求項５３】
１種または２種以上の前記試薬は、抗体、組換えタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ，オリゴヌクレオチド、炭水化物および小さい化学物質からなる群から選択されることを特徴とする請求項４７記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般に、複数のタンパク質を検出する新規な方法およびアレイに関し、さらに特に、複数のタンパク質の発現、活性および機能を検出する方法およびアレイに関する。
【０００２】
多数の生物試薬、たとえば数十万のクローン化ＤＮＡ配列や、多数の抗体および組換えタンパク質や、組換え化学合成によって得られた数百万の化合物の利用可能性は、生物研究、臨床診断および医薬開発においてこれらの試薬を利用する技術の発展を促進させた。位置をアドレス可能な、生物試薬の特別なアレイが設計されてきたが、このアレイにおいて、各試薬が位置によって後に同定されることができるように、各試薬は所定の位置に配置される。たとえば、ＤＮＡアレイにおいて、多数のｃＤＮＡまたはオリゴを、それぞれ所定の位置で固定化し、該位置によって後に同定することができる。ＤＮＡアレイは、遺伝子発現の監視のような用途に関する大規模なハイブリッド形成検定法に用いられる（Schena et al., 1995, Science 270: 467-470; DeRisi et al., 1996, Nature Genetics 14: 457-460）。発現ベクターにおけるＤＮＡクローンのアレイは、哺乳類の細胞中でコード化されたタンパク質を発現させるために用いられる（Ziauddin and Sabatini, 2001, Nature 411, 107-110）。
【０００３】
タンパク質アレイにおいて、多くのタンパク質を、それぞれ所定の位置で支持体に固定化し、続いてこの独特な位置によって同定することができる。２つのタイプのタンパク質アレイ、抗体アレイと組換えタンパク質アレイとが特に用いられる。これらは、それぞれ複数の抗体および複数の組換えタンパク質を含有する。なぜなら抗体アレイは、細胞タンパク質と結合することができ、これらはｉｎ  ｖｉｖｏ活性でタンパク質を明らかにするのに特に有用である。したがって、この技術は、単一のアッセイにおいて多数の細胞タンパク質の性質研究を可能にする。特に、抗体アレイは、ｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質・タンパク質相互作用、タンパク質翻訳後修飾およびタンパク質発現パターンを研究するのに用いられた（米国特許第６，１９７，５９９号）。
【０００４】
加えて、細胞、組織、脂質、ポリマー、医薬およびその他の化学物質は、医療診断、医薬発見、分子生物学、免疫学および毒物学における大規模なスクリーニングアッセイ用に調製される（Kononen et al., Nature Medicine, 4:844-7, 1998）。
【０００５】
タンパク質は、細胞の重要な構成要素であり、様々な細胞過程における実際の主役であり、大抵の医薬のターゲットである。ヒトゲノム全体は約４０，０００種のタンパク質をコード化する。任意の細胞はすべてのタンパク質をコード化するＤＮＡを含有し得るけれども、これらの一部のみを通常発現する。細胞系は約１０，０００種のタンパク質を通常発現し、さらに多くの数が組織中で発現される。細胞のタンパク質発現パターンは、細胞の形状および機能を決定し、異常なタンパク質発現は疾患を引起す。したがって、プロテオミクスの１つの主要タスクは、任意の発現元で発現されたタンパク質を同定することである。
【０００６】
タンパク質（同一の一次アミノ酸を有する。）は、主として翻訳後修飾に起因して細胞中で異なる形態で存在し得る。多くの場合、特別な翻訳後修飾されたタンパク質のみが、活性化されるとともに、細胞過程に直接関係していることから、細胞中でのこれらの活性化されたタンパク質の存在の検出は、細胞過程における価値ある情報の提供を可能にする。
【０００７】
リン酸化、グリコシル化、およびユビキチン化のような多くの異なるタンパク質翻訳後修飾が存在する。そして、これらはタンパク質活性を調節するのに重要な役割を果たす。セリン、トレオニンまたはチロシン残基におけるリン酸化は、情報伝達の重要なメカニズムである。異常なタンパク質のリン酸化は多くのヒトの疾患に寄与する。タンパク質のリン酸化を検出する方法の中で、放射性同位元素を有する細胞の代謝標識と、リンタンパク質に対する抗体による免疫検出とが最も広く用いられている。しかしながら、これらの方法は、一度に１種または数種のタンパク質の分析に通常応用できるのみである。ＰＹ２０および４Ｇ１０のようなリン酸化アミノ酸に特異的な抗体は、複数のリン酸化タンパク質を明らかにすることができるけれども、これらのみでは個別のリン酸化タンパク質を同定することができない。複数のリン酸化タンパク質またはその他の修飾されたタンパク質の有無を同時に検出する新規な方法は、情報伝達研究および臨床診断のために相当望ましい。
【０００８】
タンパク質発現の定量化は、生物医学研究や、疾患診断や、治療用マーカーおよびターゲットの同定を含む様々な分野において、ならびに毒素および医薬に対する細胞応答のプロフィルにおいて応用される。基本的な生物医学研究において、特定の細胞中、または特定の条件下で、どのようなタンパク質が発現されるかを知ることが通常望まれる。そして、異なる細胞のタイプ間のタンパク質発現プロフィルを比較することによって、発現および活性が特定の細胞のタイプを特徴付けるこれらのタンパク質を同定することができる。多くの情報伝達経路において特定のタンパク質が特異的に活性化され、これらの活性タンパク質、たとえばリン酸化タンパク質の検出は、特定の情報伝達経路の活性化における重要な情報を提供することができる。
【０００９】
多くの疾患は、タンパク質発現を変化させ、多くの場合異常なタンパク質発現はこれらの疾患の原因である。したがって、タンパク質発現プロフィルの決定、および正常生体試料と異常生体試料との発現プロフィルの比較は疾患メカニズムを理解するために有用である。タンパク質の存在の検出は、臨床診断に有用でもある。たとえば、血液試料中の１種のみのウィルスタンパク質の代わりに数種のウィルスタンパク質の有無を検査することは、ウイルス感染に関するより信頼できる診断方法である。タンパク質のプロフィルは、早期癌および現実の殺人者である悪性の転移癌細胞から正常な細胞を識別するのに非常に有益であろう。さらに、タンパク質発現プロフィルは、医薬ターゲット選択、毒物学、および医薬応答の代用マーカーの同定のような、医薬開発の重要領域において有用である。
【００１０】
あらゆる個別のタンパク質の発現レベルと、生体試料中の各タンパク質の異なる形態とを信頼かつ再現可能な方法で定量することができる技術を開発することは、分子生物学者の長年の目標であった。しかしながら、このことを達成することは極めて困難であることが判明した。伝統的には、１種または少数のタンパク質は、免疫学的方法、たとえばウエスタンブロッティングおよび酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって検出されることができる。２次元ゲル電気泳動は、試料中で発現されたタンパク質を分析するために用いることができる。しかしながら、これは複雑な手続を要求し、２次元ゲルに表示されたタンパク質の同一性を決定することが必要であり、これを達成することはほとんどのタンパク質に関して困難である。近年、タンパク質アレイは、タンパク質発現パターンの研究に用いられる。１つの戦略において（米国特許第６，１９７，５９９号；Haab, et al., Genome Biol.2, research0004.1-0004.13, 2001）、抗体アレイをタンパク質試料とインキュベーションし、インキュベーションおよび洗浄後、該アレイにおいてそれぞれの抗体と特異的に結合されたタンパク質を検出する。
【００１１】
免疫化学的染色は、抗体の有無および位置の両方を決定する多用途の技術であり（Harlow and Lane, Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, 1988）、この情報は、生物医学研究および臨床医学において莫大な値である。抗体溶液と細胞とをインキュベーションするステップを用いる現在の方法の多くは、一度に１種または数種の抗体によって細胞を染色することを可能にするのみである。これらの方法は、多数の異なるタンパク質の発現と亜細胞局在性との検査を必要とする用途に適していない。したがって、このような目的で、多数の異なる抗体によって細胞を染色可能な新規な方法が必要とされる。
【００１２】
本発明の目的は、アレイ支持体において試薬の位置を維持することを可能にするとともに、該試薬は、別の支持体に固定化される相互作用のパートナーに接触して配置されるときに、前記支持体から解離することを可能にする生物試薬のアレイを提供することである。
【００１３】
また、本発明の目的は、他のリガンドの中から、一度に１種または２種以上のタンパク質を検出する生物試薬の新規なアレイを形成かつ使用する方法を提供することである。本発明の好適な方法は、前記アレイを形成かつ使用するための様々な支持体材料と固定化方法とに適合される。
【００１４】
さらに、本発明の目的は、タンパク質およびこれらの性質を検出するために、特に、細胞内の１種または２種以上のタンパク質の有無および亜細胞位置を検出かつ比較するために、生物試薬のアレイを使用することを可能にする方法およびアレイを提供することである。
【００１５】
本発明の方法およびアレイは、タンパク質およびその他の生体分子の検出の分野において、生物アレイの用途を実質的に拡張するように設計される。たとえば、好ましくは固体の第１支持体に固定化された抗体のアレイは、１種または２種以上の抗体がそれぞれの抗原と結合するように第２支持体に固定化されたタンパク質試料と接触し、結合後、これらの抗体は、第２支持体における抗原との関連を維持すると同時に、第１支持体から解離される。
【００１６】
１種または２種以上の生体分子を検出する本発明の好適な方法は、一般的に、１種または２種以上の試薬が固定化される第１支持体を供給するステップと、１種または２種以上のリガンドが固定化される第２支持体を供給するステップと、第１支持体に固定化された試薬を第２支持体に固定化されたリガンドと接触させることによって、１種または２種以上の試薬が１種または２種以上のリガンドに結合するステップと、第１支持体を第２支持体から分離するステップと、前記第２支持体における１種または２種以上の試薬を検出するステップとを含む。前記試薬は、好ましくは、前記接触ステップにおいて前記試薬を固定化するとともに、前記分離ステップにおいて前記結合された試薬を前記第１支持体から解離可能にするに足る強度で前記第１支持体に固定化される。前記第１支持体に固定化された試薬は、１種または２種以上の抗体を含み得る。
【００１７】
リガンドは、前記第２支持体に固定化される前に、少なくとも部分的に分子量に基づくゲル電気泳動と、少なくとも部分的に等電点に基づくゲル電気泳動と、少なくとも部分的に分子量および等電点の一方または両方に基づく２次元ゲル電気泳動と、１個または２個以上の抗体アレイを用いるなどの免疫学的方法とを含むがこれらに限定されない様々な方法を用いて、相互に分離され得る。前記試薬は、抗体、組換えタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、炭水化物および小さい化学物質からなる群から選択され得る。これらの試薬は、前記第１支持体において１つまたは２つ以上の所定位置で固定化され得る。もし、選択された試薬が１種または２種以上の抗体であれば、抗体は、リン酸化タンパク質のような翻訳後修飾されたタンパク質に特異的になり得る。
【００１８】
１種または２種以上の試薬は、支持体において１つまたは２つ以上の所定位置でそれぞれ固定化され得る。いずれの任意の支持体においても異なる種類の試薬の数は、好ましくは、２〜５０、５〜１００，０００、２００〜１０，０００、５０〜１，０００、５〜５００、５〜１００、および５〜５０である。
【００１９】
第１および第２支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ガラスまたは合成樹脂と、これらの誘導体とからなる群から選択された材料を含み得る。
【００２０】
細胞中の１種または２種以上の生体分子を検出する本発明の別の好適な方法は、一般的に、（ａ）抗体が固定化される位置によって抗体が同定され得るように、前記第１支持体において所定位置で供給される１種または２種以上の抗体を、第１支持体に固定化するステップと、（ｂ）第２支持体に前記細胞を配置するステップと、（ｃ）前記抗体を前記細胞中の対応するいずれの抗原にも結合可能にするために、前記第１支持体における前記抗体を前記第２支持体における前記細胞と接触させるステップと、（ｄ）前記第１支持体を前記第２支持体から分離した後、１種または２種以上の前記結合された抗体が、対応する抗原との結合を維持するステップと、（ｅ）前記第２支持体における前記細胞中の抗原に結合した前記抗体を検出するステップとを含む。この方法は、前記第２支持体において固定化される細胞を利用することができ、前記細胞は、１個または２個以上の組織切片を含み得る。
【００２１】
抗体は、リン酸化タンパク質のような翻訳後修飾されたタンパク質に特異的となり得る。１つまたは２つ以上の所定位置に固定化され得る異なる種類の試薬の数は、５〜１００，０００、２００〜１０，０００、５０〜１，０００、５〜５００および２〜５０を含み得る。支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ガラス、または合成樹脂と、これらの誘導体とからなる群から選択された材料を含み得る。抗体のようなタンパク質は、円形状、細長い形状および多角形状からなる群から選択された１つまたは２つ以上の形状で前記支持体に固定化され得る。
【００２２】
第１および第２支持体は、アレイを含み得る。このアレイは、多数の全体的または部分的な毛細管を含むがこれに限定されない様々な材料を用いて形成され得る。
【００２３】
抗体は、修飾されたプロテインＡと修飾されたプロテインＧとからなる群から選択された１種または２種以上の中間物を前記支持体に施し固定化することが可能である。プロテインＡまたはプロテインＧは、結合親和性を変化させるために修飾される。１種または２種以上の前記抗体は、１種または２種以上の前記修飾されたタンパク質に連結するように構成される少なくとも１つの定常領域と、１種または２種以上の抗原に対する結合に利用可能な少なくとも１つの可変領域とを有し得る。
【００２４】
前記検出ステップは好ましくは、１種または２種以上の前記抗体が一方または両方の支持体に存在するか否かを決定するステップと、前記分離ステップ後に前記抗体の１つまたは２つ以上の位置を同定するステップと、前記抗体の１つまたは２つ以上の数量を決定するステップと、抗体の１つまたは２つ以上のタイプを同定するステップとからなる群から選択された１つまたは２つ以上の検出ステップを含む。
【００２５】
１種または２種以上の生体分子を検出する本発明の別の好適な方法は、（ａ）第２支持体に１種または２種以上のリガンドを固定化するステップと、（ｂ）１種または２種以上の前記リガンドと相互作用するように適合される１種または２種以上の試薬を第１支持体に固定化するステップと、（ｃ）１種または２種以上の前記試薬を１種または２種以上の前記リガンドと結合可能にするために前記試薬を前記リガンドに接触させるステップと、（ｄ）１種または２種以上の前記試薬を１種または２種以上の前記リガンドに架橋するステップと、（ｅ）１種または２種以上の前記リガンドと結合される１種または２種以上の前記試薬を前記第１支持体から解離可能にするために、前記第１支持体を前記第２支持体から分離するステップと、（ｆ）前記第２支持体において１種または２種以上の前記試薬を検出するステップとを含む。
【００２６】
１種または２種以上の前記リガンドおよび前記試薬は、好ましくはホルムアルデヒドおよびグルタルデヒドであるがこれらに限定されない１種または２種以上のアルデヒドを少なくとも部分的に用いて架橋され得る。
【００２７】
生体分子の検出に用いる本発明のアレイの好適な一実施形態は、一般的に、１種または２種以上の試薬を少なくとも一時的に固定化するように適合されるとともに、１種または２種以上のリガンドが固定化される第２支持体と接触して配置されるように適合される第１支持体を含み、１種または２種以上の前記試薬は、１種または２種以上の前記リガンドと結合可能にされ、続いて前記第１支持体から解離し、かつ前記第２支持体において前記リガンドとの結合を維持可能にされる。
【００２８】
前記支持体は、ナイロン、ニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオライド、ガラスまたは合成樹脂およびこれらの誘導体のうち１種または２種以上の材料を含むがこれらに限定されない様々な材料を含み得る。たとえば、前記支持体は、１つもしくは２つ以上のナイロン膜、または１つもしくは２つ以上の毛細管の全体もしくは一部を含み得る。支持体に固定化される１種または２種以上の前記試薬は、円形状、細長い形状および多角形状からなる群から選択された１つまたは２つ以上の形状で固定化され得る。
【００２９】
本発明は、生物試薬の新規なアレイと、該アレイの形成および使用方法とに関する。この方法は、１種または２種以上の試薬を固定化する第１支持体を供給するステップと、１種または２種以上のリガンドを固定化する第２支持体を供給するステップと、前記試薬を前記リガンドに接触させることによって、１種または２種以上の試薬が前記リガンドに結合するステップと、結合後前記支持体を分離することによって、結合された試薬が前記リガンドとの結合を維持するステップと、様々な生物ターゲットを検出および／または比較するステップとを特徴とする。
【００３０】
前記方法の１つは、固体支持体に固定化された試薬が別の支持体に固定化される相互作用のパートナーに結合することを可能にする。特に、抗体アレイは、固定化された抗体が、第２支持体に固定化されるそれぞれの抗原に結合した後に前記支持体から解離可能に形成される。各抗体・抗原の結合は、予め決定された位置で生じる。
【００３１】
ここで用いる用語「試薬」は、生物関連のあらゆる分子、たとえば抗体、組換えタンパク質、合成ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドおよび小さい化学物質を指す。
【００３２】
ここで用いる用語「リガンド」は、１種または２種以上の試薬と相互作用するあらゆる生体分子を指す。
【００３３】
ここで用いる用語「アレイ」は、固体支持体および複数の試薬またはリガンドを含むがこれらに限定されないデバイスを指す。たとえば、抗体は、各抗体を支持体における特定の位置によって同定可能なように所定の各位置で支持体に固定化されることができる。
【００３４】
ここで用いる用語「固定化」は、支持体における試薬の拘束を指し、ゆえに該支持体における試薬の動作は制限される。たとえば抗体が支持体に固定化されるときに、抗体は該支持体に付着されるため該支持体から解離されず、該支持体における抗体の動作はまた制限される。しかしながら、いくつかの条件下で、本発明に記載されたように、固定化された試薬は、前記支持体から解離されることができる。この固定化の物理的性質および化学的性質は、固定化された試薬が前記支持体から解離し得るか否かと、解離がどれほど効果的であるかとを決定する。
【００３５】
ここで用いる用語「支持体」は、明細書および特許請求の範囲に関して、生物試薬が沈着かつ固定化される構造を意味する。好適な実施形態において、この支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）もしくはこれらの誘導体から形成される硬いプレート（ガラスまたは合成樹脂）または膜であるがこれらに限定されない。膜はより扱いやすく、試薬を容易に固定化することができる。ガラスまたは合成樹脂のプレートは硬い支持体を供給し、いくつかの用途において必要とされる。
【００３６】
好ましくは、固体支持体は、これらに沈着される生物試薬が特定用途に適合した強度で固定され得るように、前処理される。固体支持体処理の１つの方法は、次には非特異的な非共有結合によって生物試薬と相互作用するであろうポリマー層で被覆することである。たとえば、ポリリシンまたはポリエチレンイミンを含むポリマーを、生体分子の固定化に使用されるスライドガラスまたはカバースリップを被覆するために用いることが可能である。
【００３７】
たとえばLehnrachなど（Hybridization fingerprinting in genome mapping and sequencing, genome analysis, Vol.1, Davies and Tilgham, Eds, Cold Spring Harbor Press, pp.39-81, 1990）およびBrownなど(米国特許第５，８０７，５２２号)によって記載されたようないくつかの技術は、複数の生物試薬を固体支持体に沈着かつ固定化するのに利用可能である。前述の各論文は、全体的に参照して組込まれる。たとえば、水溶液中の数ナノリットルの抗体は、ロボットアレイヤを用いてスライドガラス上にプリントされることができる。したがって、生物試薬のアレイは、平坦な固体支持体に複数の試薬を、一度に１種または数種の試薬を、所定位置に各試薬を沈着することによって形成される。
【００３８】
抗体の固定化は、吸着によってなされ得る（Trevan, 1980, Immobilized Enzymes: an introduction and their application in biotechnology. Wiley, Chichester）。関係する吸着力は、非特異的な疎水性またはイオン性の相互作用でよい。主として、用いられる吸着材料は、粘土、木炭、ヒドロキシアパタイト、および最も多くはＤＥＡＥセファデックス(DEAE-Sephadex)のようなイオン交換体を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
エントラップメントは抗体を固定化するための別の方法である（Trevan, 1980, Immobilized Enzymes: an introduction and their application in biotechnology. Wiley, Chichester）。このエントラップされた抗体はポリマーに付着されず、これらの自由な拡散が単に抑制されるのみである。１つの広く用いられるマトリクスは、ポリアクリルアミドゲルである。ある好適な実施形態において、毛細管は、生物試薬のアレイ形成および固定化を容易にする。この用語「毛細管」は、生物試薬を含有および支持可能な、全体または部分的に囲まれた細長いあらゆる構造を意味して用いられる。毛細管は合成樹脂およびガラスのような材料から形成され、これらは好ましくは生物試薬の特性に干渉しない。毛細管の高さは、数マイクロメートルから数メートルまで異なるであろう。生物試薬は、溶液状で毛細管中に通常充填される。充填後、試薬溶液は凝固され、該試薬は固定化される。固定化の強度は、任意の用途によって左右され得る。
【００４０】
試薬は、固体支持体に直接または間接に固定化される。たとえば、試薬は支持体において高い密度で直接沈着され、支持体は顕微鏡のスライドと同じ位小さくすることができる。類似技術は、高密度ＤＮＡマイクロアレイを形成するために開発された（Shalon et al., Genome Reseatch, 1996 Jul; 6(7): 639-645）。試薬はまた、支持体に間接に固定化され得る。たとえばプロテインＡもしくはプロテインＧまたはこれらの突然変異体は、中間物として支持体にまずプリントされることができる。抗体はその後プロテインＡまたはＧとの相互作用によって支持体に固定化される。本発明の１つの利点は、抗体の定常領域がプロテインＡまたはＧに連結することによって、抗体（抗原結合ドメイン）の可変領域は完全に露出され、かつ抗原との結合のために利用可能となることである。別の利点は、抗体の結合親和性を変化させるようにプロテインＡまたはＧを修飾可能であることから、プロテインＡまたはＧの入念に設計された突然変異体が用いられるとき、抗体は所望の強度で支持体に固定化され得ることである。したがって、抗体は、一方で位置情報を失うことなしに支持体に固定化されることができ、他方で支持体から分離するとともに、より高い親和性のその他のリガンドに結合することができる。組換え融合タンパク質は、これらのタンパク質のタグと、支持体に付着されたリガンドとの間の相互作用によって固定化されることができる。たとえば、リガンド（たとえばグルタチオンまたはニッケル）は、まず支持体に共有結合して付着されることができ、その後タグ（たとえばＧＳＴまたは６ｘＨｉｓ）を含有する組換え融合タンパク質が、前記リガンドとの相互作用によって同支持体に固定化される。タグおよびリガンドは、これらの親和性を変化させるように修飾されることができ、ゆえに固定化は所望の強度を有することができる。
【００４１】
抗体は、通常円形点状で支持体に通常沈着される。しかしながら、抗体はその他の形状で沈着されることもできる。たとえば、抗体は、細長い形状、たとえば、数ミクロン〜数センチメートルの幅と、数ミクロン〜数センチメートルの長さの長方形で固定化されることができる。このような形状で固定化された抗体は、様々な方法に従って分離後に抗原と結合するために用いられることができる。
【００４２】
抗原に特異的な抗体は支持体における特定位置に固定化され得る。一般に、抗体は、抗体がタンパク質試料と接触するときに各抗体がそれ自身の抗原に接触するであろう位置で固定化される。したがって、特定の抗体は、抗原の位置によって決定される特定の位置に固定化され得る。たとえば、抗原がまず２次元ゲル電気泳動によって分離されるとともに、支持体に移動かつ固定される。各抗原はその分子量および等電点によって決定された特定の位置に固定化される。したがって、各抗体は、支持体における抗原の位置に従って固定化される。
【００４３】
ここで用いられる用語「タンパク質試料」は、様々なタンパク質およびタンパク質混合体を指す。たとえば、これは、細胞系または組織からの溶解物でもよい。または、これは、無傷の細胞、もしくは支持体に固定された細胞であってもよい。タンパク質試料は、たとえば、培養された細胞系、ヒトもしくは動物の組織、または血液であるがこれらに限定されない異なるソースからでもよい。
【００４４】
ある好適な実施形態において、タンパク質試料はスライドガラスに配置されかつ固定化され得る培養された細胞または組織切片である。使用前に、これらの細胞は、タンパク質を露出するために、固定され、かつ透過性にされ得る。これらの固定された細胞は特定の細胞の形態を保持し、多くのタンパク質はこれらの当初の細胞位置で留まっている。細胞および組織を固定し、かつ透過性にする方法は複数存在する（Harlow and Lane, Antibodies, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press, 1988.）。広く用いられている固定液は、ホルムアルデヒドまたはグルタルデヒド溶液である。別の広く用いられている固定液は、代替的にメタノールを含有する。
【００４５】
リンパ球などの浮遊細胞は、支持体に沈降して、これに固定化される。これらは、パラフィン、コラーゲンまたはゼラチンなどの媒体に埋込まれた後、支持体において切片化され、かつ配置される。多くの既知の方法が、細胞試料を調製するために利用可能である（Jones, T.C, Ward, J.M., Mohr, U. and Hunt, R.D.(editors), 1990, Hemopoietic System. Berlin, Springer-Verlag; Polak, J.M. and Van Noorden, S., 1997, Introduction to Immunocytochemistry. New York, Springer）。
【００４６】
別の好適な実施形態において、タンパク質試料は、溶解によって細胞または組織から調製される。典型的な溶解緩衝液は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトン(Triton)Ｘ−１００などの界面活性剤を含有する。タンパク質試料の固定化は、共有結合または非共有結合によってもよく、固定化の方法は当該技術分野において知られている。タンパク質試料が支持体に固定化される領域の寸法は、用途、ならびに固定化されたタンパク質試料の体積および量によって異なる。たとえば、膜が支持体として用いられる場合、もし膜の結合能力が１平方センチメートルあたり１０ｍｇのタンパク質であれば、その後最大１０ｍｇのタンパク質溶解物が１センチメートル平方の寸法の膜に固定化されることができる。
【００４７】
タンパク質溶解物は、支持体に均一に配置され、これに固定化され得る。しかしながら、他の用途に関して、タンパク質は、まず分離された後、支持体に固定化され得る。タンパク質の分離に関する多くの方法が当該技術分野において知られている。たとえば、タンパク質は、分子量に従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離されてもよく、または分子量および等電点の両方に従って２次元電気泳動によって分離されてもよい。電気泳動による分離後、タンパク質は支持体に移動かつ固定化されることができる。
【００４８】
別の好適な実施形態において、タンパク質試料は、免疫学的方法、たとえば抗体アレイによる分離によって、分離されることができる。タンパク質試料は、第１に、抗体が該タンパク質試料中に存在する抗原を捕捉して分離可能なように、第１支持体において抗体アレイとインキュベーションされる。結合していないタンパク質を洗い流した後、各位置で捕捉されたタンパク質は抗体から解離されるとともに、第２支持体に移動され、かつこれに固定化される。抗体と第１固体支持体との間の相互作用は、抗体と抗原との間の相互作用よりも相当強くすることができる。したがって、条件は、抗体・抗原相互作用を分裂する一方で第１支持体における抗体の固定化を無傷のままにするように求められる。このような条件下において、抗体を除いた抗原は第２支持体に移動され、かつこれに固定化され得る。第１固体支持体から抗体が解離するのを防ぐために、抗体は支持体に共有結合で固定される。
【００４９】
典型的な移動では、抗体および抗原を含有する第１支持体は、第２支持体と接触される。その後、これらは抗原と抗体との間の相互作用を分裂し得る緩衝液中に置かれる。そして、同時に、解離されたタンパク質が第１支持体から第２支持体まで移動するように電流を加える。完成後、２つの支持体が分離される。この移動および固定化は、同時に（タンパク質が同時に移動かつ固定化される。）、または連続して（タンパク質が移動された後固定化される。）行われる。そして、もし固定化が所望よりも弱い場合は、タンパク質はたとえば共有結合によってさらに固定化されてもよい。固体支持体におけるタンパク質の共有結合による固定化に関する方法は、当該技術分野において知られている。
【００５０】
一旦調製されると、タンパク質試料は、別の抗体アレイと接触される。好ましくは、特異的な結合を可能にするために各抗体が対応する抗原と接触するように、接触が行われる。このアレイにおける抗体は、支持体から解離される。したがって、抗体アレイ支持体とタンパク質試料支持体との分離後、抗原に結合する抗体は試料支持体上に存在するであろう。抗体を検出することによって、試料中の抗原の有無および存在量が検出される。
【００５１】
前記方法の一部は、一方の支持体に固定化された抗体が他方の支持体に固定化された抗原と結合可能となるように適合される。１つの好適な方法において、一方の支持体に固定化された抗体は、接触するように二つの支持体をともに配置することによって、第２支持体に固定化された抗原と相互作用可能にされる。一定時間のインキュベーションの後、２つの支持体は分離される。抗体と抗原との間の相互作用次第で、いくつかの抗体は、第１支持体から解離するとともに、抗原が固定化する第２支持体と結合するであろう。第１支持体における抗体固定化の強度は、好ましくは抗体と抗原との間の相互作用よりも弱く、また、第２支持体における抗原の固定化の強度よりも弱い。電界のような条件は支持体からの抗体の解離を容易にするように適用され得る。
【００５２】
抗原および抗体の結合後、抗原・抗体複合体は共有結合架橋を用いて安定化され得る。架橋は、好ましくは、抗体・抗原複合体が架橋される一方で、抗体が支持体に架橋されないようにして行われる。これは抗体に特異的な架橋物質および特別な支持体を選択することによって達成される。数百の既知の架橋物質が存在し、様々な方法がタンパク質を架橋するためにこれらを用いるべく開発された（Wong, Shan S., Chemistry of protein conjugation and cross-linking. Boca Raton: CRC Press, 1993）。たとえば、広く用いられる架橋物質は、たとえばホルムアルデヒドおよびグルタルデヒドであるがこれらに限定されないアルデヒドを含む。
【００５３】
抗原に結合された抗体はその後検出される。多くの知られている方法が抗体の検出に用いられることができる。ありふれた方法は、酵素複合二次抗体、たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ複合抗ウサギヤギ抗体および抗マウスヤギ抗体を用いることである。蛍光標識二次抗体を用いてもよい。使用可能なその他の技術は、ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ法（Sano et al., 1992, Science 258, 120-122）、ローリングサークルＤＮＡ増幅技術（Schweitzer et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 10113-10119）、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって増幅された免疫検出（Zhang et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.98, 5497-5502）を含む。
【００５４】
本発明のアレイの好適な一実施形態において、抗体のアレイは細胞を染色するために用いられ、このことは図１に概略的に示す。細胞は、カバースリップに播種され、培養され、固定され、かつ抗原を露出するために透過性にされる。その後、細胞調製物は、抗体が対応する抗原に結合可能となるように抗体アレイとインキュベーションされる。結合後、抗体アレイ支持体と細胞支持体とは分離される。抗体の一部は、抗原との相互作用に起因して細胞支持体に移動されるであろう。結合かつ移動された抗体の量は、細胞中に存在する抗原の量に関係するであろう。
【００５５】
細胞支持体にトラップされた抗体の有無および数量を検出することによって、細胞中の抗原の有無および数量を決定することができる。もし抗体が酵素と複合される場合、これらの抗体を酵素反応によって明らかにすることができる。アルカリホスファターゼは広く用いられ、既知の基質は、反応後に不溶性の有色産生物を生じさせるであろう。さらに、もし抗体が蛍光分子で標識付けされる場合、抗体は直接に蛍光顕微鏡検査によって観察されてもよい。多くの場合、蛍光または酵素複合二次抗体を、一次抗体の有無を明らかにするために用いることができる。
【００５６】
抗原の有無および数量を明らかにする目的で、染色は、低倍率で容易に観察され得る。しかしながら、亜細胞の局在性など、抗原のその他の特性を明らかにするために、染色は好ましくは高倍率で観察される。
【００５７】
２種のタンパク質の同時染色（二重染色）は２種の機能的に関連したタンパク質を研究するための独特のツールである。たとえば、タンパク質相互作用の証拠は、タンパク質が同じ細胞構造においてともに局在化するという証明をしばしば含む。２種以上の抗体は、抗体アレイの同じ位置で固定化されることができ、ゆえに２種以上の抗原が同時に同じ位置で検出され得る。
【００５８】
抗体に代わってＤＮＡプローブが細胞中の特異的なＤＮＡまたはＲＮＡの有無を検出するために配列かつ使用され得る。そうするために、ＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、固体支持体に固定化される。好ましくは、プローブの固定化は、支持体におけるプローブ位置を維持する程度の強度を有する一方で、好ましくはプローブとターゲットとの間の相互作用よりも弱く、ゆえにプローブがターゲットに結合するとき、プローブは支持体から解離され得る。この方法は、１または数個のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を通常検出するのみであるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法を超える多くの利点を有する。本発明に従って形成されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブのアレイが用いられるとき、多数のＤＮＡまたはＲＮＡ配列の有無および位置が、形態保存された組織切片または細胞調製物中で、所定の各位置において検出されることができる。支持体に配列されるＤＮＡまたはＲＮＡプローブを調製する方法、および組織または細胞を調製する方法は当該技術分野において知られている（Ian A. Darby(Editor), In Situ Hybridization Protocols (Methods in Molecular Biology, 123), by Humana Press; ISBN:0896036863; 2nd edition, 2000）。
【００５９】
別の好適な実施形態において、抗体アレイを、タンパク質溶解物中のタンパク質を検出するために用いる。そうするために、第１支持体に固定化された抗体アレイは、第２支持体に固定化されたタンパク質溶解物とインキュベーションされる。一定時間のインキュベーションの後、抗体は、第２支持体に固定化される溶解物中で対応する抗原と結合するであろう。その後、第１支持体は第２支持体から分離される。特定の条件下で、抗原が結合した抗体は第１支持体から解離され、かつ抗原が固定化される第２支持体に留まるであろう。第２支持体に移動された抗体の量は、抗原のタンパク質溶解物中の存在量に比例するであろう。したがって、第２支持体における抗体の量の検出は、抗原のタンパク質試料中の存在量を明らかにするであろう。
【００６０】
多くの用途において、タンパク質を、第１に分離し、かつ／または集中することができ、少量のタンパク質を検出することが必要となり得る。一実施形態において、タンパク質は、１次元ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって第１に分離され、膜支持体に移動され、各タンパク質は分子量によって決定される位置で支持体に固定される。その後、溶解物膜が抗体アレイと接触し、抗体は特定位置で細長い形状で固定化され、ゆえに各抗体は、抗原の分子量によって決定された特定位置で抗原と接触することができるであろう。
【００６１】
タンパク質は、２次元ゲル電気泳動によって分離されるとともに、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜のような支持体に移動されてもよい。その後、溶解物膜は抗体アレイと接触し、該抗体アレイは所定位置にそれぞれ固定化され得る複数の抗体を含有し、ゆえに各抗体は対応する抗原と接触するであろう。
【００６２】
タンパク質を、免疫学的方法によって分離し、かつ集中してもよい。これを達成するための１つの方法は、抗体アレイを用いることである。たとえば、第１の抗体アレイをタンパク質試料とインキュベーションすることができ、ゆえにタンパク質はアレイに固定化された各抗体によって捕捉かつ分離される。この第１のアレイにおける抗体は、好ましくは共有結合によって強く固定化される。その後、抗原は、抗体から解離されるとともに、第２支持体に移動かつ固定化される。この工程は、いくつかの既知の方法によって行われ得る。第２の抗体アレイは、その後、抗原を検出するために用いられる。第２のアレイにおける抗体は、対応する抗原との結合後に抗体がアレイ支持体から解離され得るようにして固定化される。同じ抗原に対する第１および第２のアレイにおける抗体は、対応する位置で固定化されることができ、これらは一致または相違し得る。
【実施例】
【００６３】
以下の実施例は、図面のみに関するものであり、決して本発明を限定するために意図されるものではない。実施例は、本発明に従って抗体アレイの使用を記載するけれども、抗体以外の生物試薬のアレイに関する類似の用法は、当該技術に精通している人々にとって明らかである。このような生物試薬のアレイは、組換えタンパク質、組換え抗体、単鎖抗体、核酸、オリゴ、ｃＤＮＡプローブ、炭水化物、脂質、および小さい化学物質のアレイを含むがこれらに限定されない。たとえば、固定化されたｃＤＮＡプローブのアレイは細胞中で複数のｍＲＮＡの発現を明らかにするためにｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成法で用いられ得る。
【００６４】
（実施例１：抗体アレイの形成）
商業的出所からの抗体（約０．５μｇ／μＬ）を、ロボットアレイヤを用いて、ナイロン膜（アメルシャムライフサイエンス(Amersham Life Science)社製）に配列した。８０ｎＬ溶液中の約４０ｎｇの抗体を、６００μｍ間隔で空けられた各スポットで０．６ｍｍソリッドピンを用いて沈着した。抗体を、ナイロン膜と抗体との間で非共有結合によって固定化した。抗体アレイは、直ちに用いられるか、または使用前４８時間未満４℃で貯蔵されるかのいずれかをされた。
【００６５】
（実施例２：免疫化学染色における抗体アレイの使用）
この実施例は、免疫化学染色について開示した方法によって調製された抗体アレイの使用を明らかにするものである。異なる細胞タンパク質に対する２００種の抗体によって実施例１において形成された抗体アレイを用いた。
【００６６】
ＭＤＣＫ(Madin Darby Canine Kidney)細胞を培養皿に播種し、融合まで２日間培養した。その後これらを１０分間、−２０℃でメタノール／アセトン（１：１）で固定し、かつ透過性にした。リン酸緩衝液サリン（ＰＢＳ）で洗浄後、ＭＤＣＫ細胞を約１時間抗体アレイと接触させた。細胞をリン酸緩衝液サリンで再び洗浄し、アルカリホスファターゼ標識二次抗体を３０分加えた。洗浄後、染色は、基質としての５−ブロモ−４−クロロ−インドリル−ホスファターゼ（ＢＣＩＰ）およびニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）との呈色反応によって視覚化された。この酵素反応はＰＢＳで基質を洗い落とすことによって止められ、画像は平床式スキャナでスキャニングすることによって得られた（図２）。多くの位置における細胞を抗体で染色したが、固定化された抗体間の領域での染色の欠如によって判断されるように、抗体の混合はほとんど存在しなかった。染色されたスポットの通常パターンは、抗体がプリントされたパターンと適合する。
【００６７】
（実施例３：蛍光免疫化学染色における抗体アレイの使用）
本実施例において、１０ｎＬ溶液中に約５ｎｇの抗体を、隣接するスポット間の間隔を３００μｍ空けたナイロン膜上の各スポットで０．３ｍｍソリッドピンを用いて沈着した。その後、蛍光標識二次抗体を用いたこと、および染色を蛍光顕微鏡で観察したことを除いては図１に概略的に示し、かつ図２に記載した方法によって、Ａ４３１細胞を染色するために抗体を用いた（図３）。蛍光顕微鏡による低倍率観察は、各染色スポットが直径約３００μｍであること、および４００の細胞のクラスターから成ることを示した（図３ａ，図３ｃ，図３ｅ，図３ｇ）。染色された領域と染色されていない領域との間には、明らかな境界線が存在する。高倍率観察は、詳細な染色パターン、たとえばＩＲＦ１の核局在化（図３ｂ）、１４−３−３β（図３ｄ）およびＥｔｓ−１（図３ｆ）の細胞質染色、ならびにベータ−カテニン（図３ｈ）の細胞・細胞接触染色を明らかにした。染色は、標準の免疫染色手順によって得られるものと区別できない。
【００６８】
（実施例４：毛細管中に形成された抗体アレイ）
本実施例は、細胞を染色するために毛細管によって形成された抗体アレイを用いるものである。各抗体を、低融点アガロース溶液と混合し、高さ１ｃｍ、外周２ｍｍ、および厚さ約０．２ｍｍの合成樹脂製毛細管に注入した。ゲルが固体になった後、毛細管は、束にされ、高さ約１ｍｍの抗体を産生するための部分を横断された。
【００６９】
その後、抗体アレイをガラス支持体に配置するとともに、抗体が抗原と結合可能にするために別のガラス支持体に固定される細胞と接触させた。抗原に結合した抗体を、蛍光標識二次抗体によって検出し、図３にあるような顕微鏡で観察した。
【００７０】
（実施例５：蛍光免疫染色用に毛細管中に形成された抗体アレイ）
第１に蛍光標識抗体を高温で低融点アガロース溶液で混合し、次いで毛細管アレイを形成するために、これらの抗体溶液を毛細管に注入した。毛細管中でこれらの溶液が凝固するように温度を下げた。これらの毛細管を、高さ１ｍｍ未満の薄いアレイを形成するために切断するとともに、合成樹脂固体支持体に置いて接着した。抗体が抗原と接触可能にするために、アレイを、カバーガラスに配置された固定された細胞と接触させた。その後、細胞と抗体アレイとを２時間３７℃でインキュベーションした。その後、温度を下げ、アレイと細胞とを分離した。カバーガラス上の細胞をその後ＰＢＳで洗浄し、顕微鏡で観察した。
【００７１】
（実施例６：二重染色における抗体アレイの使用）
１００のスポットを有する抗体アレイを形成し、各スポットは１種または２種の抗体を含有した。２つの異なる抗体が固定化されたスポットでは、これらの抗体のうち一方がマウスモノクローナル抗体であり、他方がウサギポリクローナル抗体であった。このアレイは、カバーガラスに播種されたＡ４３１細胞を染色するために用いられた。染色後、Ａ４３１細胞を、Ｃｙ２標識抗ウサギヤギ二次抗体、およびＣｙ３標識抗マウスヤギ二次抗体とインキュベーションした。抗原の有無および位置を、蛍光顕微鏡によって検査した（図４ａ，図４ｂ）。２種の抗体が存在する位置に、２種の対応する抗原が観察された。２種の抗体／抗原は異なる標識および異なる細胞局在化によって区別され得る。たとえば、図４においてタンパク質ＹＹ１の核局在化とタンパク質ｐ１３０ｃａｓの膜局在化とは個別に（図４ａの左および中央）、かつ一緒に（図４ａの右および図４ｂ）示された。
【００７２】
（実施例７：細胞試料間のタンパク質発現を比較するための抗体アレイ染色の使用）
様々なシグナル経路に関係する２４０種のタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体およびウサギポリクローナル抗体の両方を含有する抗体アレイを、前述の実施例に記載されたように産生した。そして、２４０種のタンパク質の有無を検出し、研究に広く用いられる２つのヒト癌細胞系、Ａ４３１細胞およびＭＥ１８０細胞の間で比較した。この結果は、２つの細胞試料が相当異なるタンパク質発現パターンを有することを示した。２４０種のターゲットタンパク質の多くは、Ａ４３１細胞およびＭＥ１８０細胞において異なって発現された（図５）。たとえば、Ａ４３１細胞はＭＥ１８０細胞よりも、Ｃｂｌ、ｃｏｒｔａｃｔｉｎ、Ｎｅｕ、ＨＳＰ７０、ＪＮＫ１、ｐ５３、Ｒａｆ−１およびＳｔａｔ１を多く発現する一方で、ＧＳＫ−３α、Ｓｋｐ２ｐ４５、Ｐｌｋ３、およびＳｔａｔ５ａを少なく発現する。これらのタンパク質の発現はウエスタンブロッティングによっても検査された（図６）。そしてこの結果は、２つの相互に関連している方法で得られ、抗体アレイ染色がタンパク質発現をプロフィルする有効な方法であることを示唆している。
【００７３】
（実施例８：抗体アレイによる経路活性化の検出）
活性化したタンパク質（リン酸タンパク質）に特異的な抗体は、抗体アレイを形成するために用いられ、これらのアレイは生体試料中の活性化したタンパク質の有無を検査するために用いられた。活性化したタンパク質の有無は、一定の情報伝達経路が試料中で活性化されることを示唆した。
【００７４】
（実施例９：タンパク質溶解物中の特定のタンパク質の検出）
本実施例において、Ｓｔａｔ１組換えタンパク質を含有する５０μｇの細菌溶解物は、１平方センチメートルのニトロセルロース膜に固定化した。その後、溶解物膜を、ナイロン膜においてＳｔａｔ１抗体を含む複数の抗体を含有する抗体アレイと接触させた。
【００７５】
１〜２時間のインキュベーションの後、いくつかの抗体は、前記溶解物中で対応する抗原と結合した。溶解物膜と抗体アレイとが物理的に分離したとき、いくつかの抗体を、抗体アレイ支持体から解離するとともに、抗原との相互作用が起因して溶解物支持体に結合した。溶解物スライドに結合された抗体の量は、溶解物に存在する抗原の存在量に左右される。抗体を、ＨＲＰ複合二次抗体によって検出し、増強化学発光（ＥＣＬ）反応によって視覚化した。
【００７６】
（実施例１０：ＨＲＰ複合一次抗体によるＳｔａｔ１タンパク質の検出）
本実施例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合Ｓｔａｔ１一次抗体が、酵素複合二次抗体が検出に必要とされないように用いられる点を除いては実施例９と類似する。
【００７７】
（実施例１１：タンパク質Ａ突然変異体を介して固定化された抗体アレイによる染色）
本実施例において、１つの抗体結合ドメインを有する組換えタンパク質Ａ突然変異体を、第１に支持体に固定化し、次いでＨＲＰ複合抗体を、抗体アレイを形成するタンパク質Ａ突然変異体との相互作用を介して該支持体に固定化した。このようにして形成された抗体アレイを、別の支持体に固定化されたタンパク質溶解物と接触させた。１時間のインキュベーションの後、抗体アレイを除去するとともに、タンパク質試料支持体に結合した抗体をＥＣＬ反応を介して検出した。
【００７８】
（実施例１２：ＳＤＳ／ＰＡＧＥによるタンパク質試料の分離）
本実施例において、カーテンゲルを用いるＳＤＳ／ＰＡＧＥによって、Ａ４３１のタンパク質溶解物を分離するとともに、ＰＶＤＦ膜に移動した。よく研究されたタンパク質に対する１２種の抗体を含有する抗体アレイは、ナイロン膜を支持体として用いて形成され、このアッセイに用いられた。抗体を、長方形に固定化するとともに、形成されたアレイがＰＶＤＦ膜に固定化されたタンパク質溶解物と接触するときに抗体が対応する抗原と結合し得るように、アレイに入念に配置した。抗体と抗原との結合後、ナイロン膜支持体をＰＶＤＦ膜から除去した。対応する抗原との相互作用を介してＰＶＤＦ膜に付着した抗体を、ＨＲＰ複合二次抗体を用いて検出し、ＥＣＬ反応によって明らかにした。図７に示すように、数種の抗体をＡ４３１細胞中で発現したように検出した。そしてこれらは予期される分子量の位置でＰＶＤＦ膜において検出される。誤った位置で意図的に固定化された抗体は比較的低い信号を与え、この方法がタンパク質発現を有効にプロフィルすることを示唆する。
【００７９】
（実施例１３：２次元ゲル電気泳動によるタンパク質試料の分離）
本実施例は、タンパク質が２次元ゲル電気泳動によって分離されるとともに、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に移動される点を除いて、実施例１２と類似する。その後、溶解物膜を、複数の抗体を含有し、かつ各抗体が抗原と接触するように所定位置で抗体をそれぞれ固定化した抗体アレイと接触させた。
【００８０】
（実施例１４：抗体アレイによるタンパク質試料の分離）
本実施例において、タンパク質は抗体アレイによって第１に分離され、かつ集中される。共有結合で支持体に抗体を固定することによって抗体アレイを形成し、次いで該アレイを、タンパク質がアレイに固定化された各抗体によって捕捉かつ分離されるようにタンパク質試料とインキュベーションした。その後、抗原を、抗体から解離するとともに、試料支持体に移動かつ固定化した。抗体が共有結合で固定化されたことから、試料支持体に移動したものは全くないか、またはほんの少しであった。その後、同じ抗原の抗体が抗体が第１抗体アレイに存在するのと同じ対応位置に存在するようにして、二次抗体アレイを形成した。第２抗体アレイが、抗原が固定化された試料支持体と接触したときに、各抗体は、対応する抗原と接触し、かつ結合した。結合後、アレイを試料支持体から分離した。いくつかの抗体がこれらの抗原と結合したことから、抗体はアレイ支持体から解離するとともに、試料支持体に結合した。
【００８１】
いくつかの図において本発明の特徴を示すけれども、これはあくまで、便宜のためだけであって、何らかの特徴を本発明に従った他のいずれかのまたは他のすべての特徴と組合わせてもよい。他の実施形態および変形は、当業者に想到されるであろうし、特許請求の範囲に記載された請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】複数のタンパク質を検出するための本発明の好適な方法を概略的に示す図である。
【図２】複数のタンパク質を検出するための本発明の好適な方法およびアレイを用いた後の結果を示す。この例において、ＭＤＣＫ細胞を、２００種の抗体のアレイによって染色した。この染色を、アルカリホスファターゼを媒介した基質としてのＢＣＩＰ／ＮＢＴとの呈色反応によって観察した。
【図３ａ】蛍光染色を用いる本発明の好適な方法およびアレイを用いた後の結果を示す。２００種のウサギポリクローナル抗体を用いた。１つの位置でのタンパク質ＩＲＦ１の染色を３００μｍの目盛で示す。
【図３ｂ】３０μｍの目盛での図３ａの画像の部分拡大図である。
【図３ｃ】蛍光染色を用いる本発明の好適な方法およびアレイを用いた後の結果を示す。２００種のウサギポリクローナル抗体を用いた。１つの位置での目印の分子１４−３−３βの染色を示す。
【図３ｄ】図３ｃの画像の部分拡大図である。
【図３ｅ】蛍光染色を用いる本発明の好適な方法およびアレイを用いた後の結果を示す。２００種のウサギポリクローナル抗体を用いた。１つの位置での細胞接着性タンパク質β−カテニンの染色を示す。
【図３ｆ】図３ｅの画像の部分拡大図である。
【図３ｇ】蛍光染色を用いる本発明の好適な方法及びアレイを用いた後の結果を示す。２００種のウサギポリクローナル抗体を用いた。１つの位置での転写因子Ｅｔｓ−１の染色を示す。
【図３ｈ】図３ｇの画像の部分拡大図である。
【図４ａ】Ａ４３１細胞を、ウサギ抗ＹＹ１抗体（左側緑）、マウス抗ｐ１３０ｃａｓ抗体（中央赤）、ならびにＹＹ１抗体（右側緑）およびｐ１３０ｃａｓ抗体（右側赤）の両方を隣接する位置で含有するアレイによって染色した本発明の好適な方法およびアレイを用いた後の結果を示す。抗ウサギＣｙ２標識ヤギ二次抗体と、抗マウスＣｙ３標識ヤギ二次抗体とを用いた。
【図４ｂ】図４ａで示すＹＹ１（緑）およびｐ１３０ｃａｓ（赤）の二重染色の拡大図である。
【図５】２つの生体試料においてタンパク質発現を検出する本発明の好適な方法およびアレイを用いた後の結果を示す。ＭＥ１８０細胞におけるタンパク質発現は左に示し、Ａ４３１細胞におけるタンパク質発現は右に示す。２４０種の抗体を有する抗体アレイをこの実施例に用いる。染色を、アルカリホスファターゼを媒介した基質としてのＢＣＩＰ／ＮＢＴとの呈色反応によって観察した。
【図６】図５に示すタンパク質発現の相違を決定するためにウエスタンブロッティングを用いた結果を示す。ウエスタンブロッティングによって検出されたＭＥ１８０細胞中（左側レーン）およびＡ４３１細胞中（右側レーン）の１９のタンパク質の発現を示す。試験されたタンパク質は、Ａ，Ｃｂｌ（１２０ｋＤ）、Ｂ，Ｃｂｃ２（３４ｋＤ）、Ｃ，Ｃｏｒｔａｃｔｉｎ（８０ｋＤ）、Ｄ，Ｎｅｕ（１８５ｋＤ）、Ｅ，ＥＲＫ１（４４ｋＤ）、Ｆ，Ｅｔｓ−１（５１ｋＤ）、Ｇ，ＧＳＫ−３α（５１ｋＤ）、Ｈ，ＨＳＰ７０（７０ｋＤ）、Ｉ，ＪＮＫ１（４６ｋＤ）、Ｊ，Ｌｙｎ（５６ｋＤ）、Ｋ，ＮＦｋＢ ｐ５０（５０ｋＤ）、Ｌ，Ｓｋｐ２ ｐ４５（４５ｋＤ）、Ｍ，ｐ５３（５３ｋＤ）、Ｎ，Ｐｌｋ３（７０ｋＤ）、Ｏ，ＳＨ−ＰＴＰ２（６０ｋＤ）、Ｐ，Ｒａｆ−１（７４ｋＤ）、Ｑ，Ｒｂ ｐ１０７（１０７ｋＤ）、Ｒ，Ｓｔａｔ１（８４ｋＤ）、およびＳ，Ｓｔａｔ５ａ（９５ｋＤ）である。図５の各抗体に対応する位置を上端に示す。等しい培養領域を占めるＡ４３１およびＭＥ１８０細胞のタンパク質溶解物を各レーンに入れる。
【図７】ＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離されたＡ４３１細胞のタンパク質溶解物中のタンパク質発現を検出する本発明の好適な方法およびアレイを用いた後の結果を示す。１２種のタンパク質に対する抗体が特定の位置で固定化された。検査されたタンパク質は、１，ＩＫＫｂｅｔａ、２，Ｅ２Ｆ１、３，ＥＲＫ２、４，１４−３−３、５，Ｒｂ ｐ１０７、６，ＥＲＫ１ｃｏｎｔｒｏｌ（抗体は抗原の存在しない位置で固定化された。）、７，Ｅｔｓ−１、８，ＥＲＫ１、９，Ｓｔａｔ１、１０，１４−３−３ｃｏｎｔｒｏｌ、１１，ＪＮＫ１、１２，Ｓｔａｔ２、１３，Ｌｙｎ、および１４，ｐ３８である。各抗体に対応する位置を、対応するスポットの右側に示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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