(57)【要約】本発明は、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の14の明確に区別される抗原に由来するCTLエピトープペプチドおよびポリエピトープペプチドを提供する。前記ペプチドは世界の様々な民族集団において最も広く行き渡っているクラスＩ対立遺伝子HLAにより拘束される。これらのエピトープはCTLエピトープに基づくHCMVワクチンのための重要な足場を提供する。本発明はさらに、前記エピトープおよびポリエピトープペプチドを含有するワクチン組成物、ならびにヒトのワクチン接種方法およびヒト被験者へのHCMV特異的Ｔ細胞の養子移入方法を提供する。本発明はさらに、被験者のHCMV状態またはHCMV特異的免疫のレベルを測定するための試薬および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、前記抗原がpp28、pp50、pp65、pp71、pp150、gB、gH、IE-1、IE-2、US2、US3、US6、US11およびUL18からなる群より選択され、前記ペプチドが前記抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、ここにおいて、
(iv)  前記pp65のCTLエピトープは、配列番号22 (SQEPMSIYVY); 配列番号23 (ATVQGQNLKY); 配列番号24 (IRETVELRQY); 配列番号25 (IGDQYVKVY); 配列番号26 (TVQGQNLKY); 配列番号27 (YRIQGKLEY); 配列番号28 (QVIGDQYVK); 配列番号29 (LLLQRGPQY); 配列番号30 (RVTGGGAMA); 配列番号31 (GVMTRGRLK); 配列番号32 (VYALPLKML); 配列番号33 (QYDPVAALF); 配列番号34 (VYYTSAFVF); 配列番号35 (DVPSGKLFM); 配列番号36 (DIDLLLQRG); 配列番号37 (YVKVYLESF); 配列番号38 (TVQGQNLKY); 配列番号39 (EPMSIYVYAL); 配列番号40 (HVRVSQPSL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号43 (QPKRRRHRQ); 配列番号44 (LCPKSIPGL); 配列番号45 (YRIQGKLEY); 配列番号46 (YSEHPTFTSQY); 配列番号47 (SEHPTFTSQY); 配列番号48 (CEDVPSGKLF); 配列番号49 (NEIHNPAVF); 配列番号50 (RETVELRQY); 配列番号51 (QEPMSIYVY); 配列番号52 (QMWQARLTV); 配列番号53 (LMNGQQIFL); 配列番号54 (ILARNLVPM); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号57 (QEFFWDANDI); 配列番号58 (QYRIQGKLE); 配列番号59 (RKHRHLPVADAV); 配列番号60 (DPVAALFFF); 配列番号61 (PGKISHIMLDVA); 配列番号62 (TRATKMQVI); 配列番号63 (QAIRETVEL); 配列番号64 (YHRTWDRHEGA); 配列番号65 (FMRPHERNGFTV); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号67 (LNIPSINVHHYPSAAERKHR); 配列番号68 (ATVQGQNLKYQEFFWDANDI); 配列番号69 (QEFFWDANDIYRIFAELEGV); 配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号71 (SQYRIQGKLEYRHTWDRHDE); 配列番号72 (VFTWPPWQAGILARNLVPMV); 配列番号73 (ILARNLVPMVATVQGQNLKY); 配列番号74 (DQYVKVYLESFCEDVPSGKL); 配列番号75 (YPSAAERKHRHLPVADAVIH); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号78 (AHELVCSMENTRATKMQVIG); 配列番号79 (TRATKMQVIGDQYVKVYLES); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号82 (LTVSGLAWTRQQNQWKEPDV); 配列番号83 (WQPAAQPKRRRHRQDALPGP); 配列番号84 (YRHTWDRHDEGAAQGDDDVW); 配列番号85 (TSAGRKRKSASSATACTSGV); 配列番号86 (HRQDALPGPCIASTPKKHRG); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号88 (VTTERKTPRVTGGGAMAGAS); 配列番号89 (QPFMRPHERNGFTVLCPKNM); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); 配列番号91 (IYVYALPLKMLNIPSINVHH); 配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT); 配列番号93 (GAAQGDDDVWTSGSDSDEEL); 配列番号94 (TGGGAMAGASTSAGRKRKSA); および配列番号95 (KDVALRHVVCAHELVCSMEN)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、
(v)  前記IE-1のCTLエピトープは、配列番号96 (SLLSEFCRV); 配列番号97 (VLAELVKQI); 配列番号98 (ILGADPLRV); 配列番号99 (TMYGGISLL); 配列番号100 (LLSEFCRVL); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号102 (CLQNALDIL); 配列番号103 (ILDEERDKV); 配列番号104 (IKEHMLKKY); 配列番号105 (DEEEAIVAY); 配列番号106 (KLGGALQAK); 配列番号107 (QYILGADPL); 配列番号108 (KYTQTEEKF); 配列番号109 (KARAKKDEL); 配列番号110 (VMKRRIEEI); 配列番号111 (RHRIKEHML); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号114 (ELKRKMMYM); 配列番号115 (RRKMMYMCY); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号117 (CSPDEIMAYAQKIFKILDEE); 配列番号118 (SEPVSEIEEVAPEEEEDGAE); 配列番号119 (VLCCYVLEETSVMLAKRPLI); 配列番号120 (RRKMMYMCYRNIEFFTKNSA); および配列番号121 (NIEFFTKNSAFPKTTNGCSQ)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、
(vi)  前記pp150のCTLエピトープは、配列番号122 (GQTEPIAFV); 配列番号130 (RPSTPRAAV); 配列番号131 (SPWAPTAPL); 配列番号132 (KARDHLAVL); 配列番号133 (WPRERAWAL); 配列番号134 (NVRRSWEEL); 配列番号138 (RIEENLEGV); 配列番号139 (PLIPTTAVI); 配列番号140 (LIEDFDIYV); 配列番号141 (KMSVRETLV); 配列番号142 (FLGARSPSL); 配列番号143 (ALVNAVNKL); 配列番号144 (ALVNFLRHL); 配列番号145 (NILQKIEKI); 配列番号146 (ERAWALKNPHLA); 配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR); 配列番号148 (STSQKPVLGKRVATPHASAR); および配列番号149 (HANTALVNAVNKLVYTGRLI)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、
ことを特徴とする、上記の単離されたペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記抗原の約8〜約12個連続したアミノ酸からなる、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A23、HLA A24、HLA A26、HLA A29、HLA A30、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B41、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
HLAスーパタイプ特異性を有する、請求項4に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドがCD4+を発現している細胞と結合する配列をさらに含む、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項７】
前記抗原の約20個連続したアミノ酸からなる、請求項5に記載の単離されたペプチド。
【請求項８】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp28抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項8に記載の単離されたペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3およびHLA B27からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項9に記載の単離されたペプチド。
【請求項１１】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp28抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号150 (LLIDPTSGL); 配列番号151 (LLVEPCARV); 配列番号152 (LLLIVTPVV); 配列番号153 (FLLSHDAAL); 配列番号154 (PLREYLADL); 配列番号155 (GLLGASMDL); 配列番号156 (LVEPCARVY); 配列番号157 (GIKHEGLVK); 配列番号158 (ELLAGGRVF); 配列番号159 (RLLDLAPNY); 配列番号160 (ELLGRLNVY); 配列番号161 (CRYKYLRKK); および配列番号162 (ARVYEIKCR)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項１２】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp28抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号150 (LLIDPTSGL); 配列番号151 (LLVEPCARV); 配列番号152 (LLLIVTPVV); 配列番号153 (FLLSHDAAL); 配列番号154 (PLREYLADL); 配列番号155 (GLLGASMDL); 配列番号156 (LVEPCARVY); 配列番号157 (GIKHEGLVK); 配列番号158 (ELLAGGRVF); 配列番号159 (RLLDLAPNY); 配列番号160 (ELLGRLNVY); 配列番号161 (CRYKYLRKK); および配列番号162 (ARVYEIKCR)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項１３】
前記ペプチドが配列番号150 (LLIDPTSGL)に示すアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の単離されたペプチド。
【請求項１４】
前記ペプチドが配列番号162 (ARVYEIKCR)に示すアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の単離されたペプチド。
【請求項１５】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp50抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項15に記載の単離されたペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA B27およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項16に記載の単離されたペプチド。
【請求項１８】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp50抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号163 (LLNCAVTKL); 配列番号164 (QLRSVIRAL); 配列番号165 (VTEHDTLLY); 配列番号166 (RGDPFDKNY); 配列番号167 (GLDRNSGNY); 配列番号168 (TLLNCAVTK); 配列番号169 (TVRSHCVSK); 配列番号170 (YEQHKITSY); 配列番号171 (TRVKRNVKK); 配列番号172 (SEDSVTFEF); および配列番号173 (TRLSEPPTL)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項１９】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp50抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号163 (LLNCAVTKL); 配列番号164 (QLRSVIRAL); 配列番号165 (VTEHDTLLY); 配列番号166 (RGDPFDKNY); 配列番号167 (GLDRNSGNY); 配列番号168 (TLLNCAVTK); 配列番号169 (TVRSHCVSK); 配列番号170 (YEQHKITSY); 配列番号171 (TRVKRNVKK); 配列番号172 (SEDSVTFEF); および配列番号173 (TRLSEPPTL)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドが配列番号163 (LLNCAVTKL); 配列番号165 (VTEHDTLLY); 配列番号166 (RGDPFDKNY); 配列番号167 (GLDRNSGNY); および配列番号170 (YEQHKITSY)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項19に記載の単離されたペプチド。
【請求項２１】
前記ペプチドが配列番号165 (VTEHDTLLY)に示すアミノ酸配列を有する、請求項20に記載の単離されたペプチド。
【請求項２２】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp65抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号22 (SQEPMSIYVY); 配列番号23 (ATVQGQNLKY); 配列番号24 (IRETVELRQY); 配列番号25 (IGDQYVKVY); 配列番号26 (TVQGQNLKY); 配列番号27 (YRIQGKLEY); 配列番号28 (QVIGDQYVK); 配列番号: 29 (LLLQRGPQY); 配列番号30 (RVTGGGAMA); 配列番号31 (GVMTRGRLK); 配列番号32 (VYALPLKML); 配列番号33 (QYDPVAALF); 配列番号34 (VYYTSAFVF); 配列番号35 (DVPSGKLFM); 配列番号36 (DIDLLLQRG); 配列番号37 (YVKVYLESF); 配列番号38 (TVQGQNLKY); 配列番号39 (EPMSIYVYAL); 配列番号40 (HVRVSQPSL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号43 (QPKRRRHRQ); 配列番号44 (LCPKSIPGL); 配列番号47 (SEHPTFTSQY); 配列番号48 (CEDVPSGKLF); 配列番号49 (NEIHNPAVF); 配列番号50 (RETVELRQY); 配列番号51 (QEPMSIYVY); 配列番号52 (QMWQARLTV); 配列番号53 (LMNGQQIFL); 配列番号54 (ILARNLVPM); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号57 (QEFFWDANDI); 配列番号58 (QYRIQGKLE); 配列番号59 (RKHRHLPVADAV); 配列番号60 (DPVAALFFF); 配列番号61 (PGKISHIMLDVA); 配列番号62 (TRATKMQVI); 配列番号63 (QAIRETVEL); 配列番号64 (YHRTWDRHEGA); 配列番号65 (FMRPHERNGFTV); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号67 (LNIPSINVHHYPSAAERKHR); 配列番号68 (ATVQGQNLKYQEFFWDANDI); 配列番号69(QEFFWDANDIYRIFAELEGV); 配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号71
(SQYRIQGKLEYRHTWDRHDE); 配列番号72 (VFTWPPWQAGILARNLVPMV); 配列番号73 (ILARNLVPMVATVQGQNLKY); 配列番号74 (DQYVKVYLESFCEDVPSGKL); 配列番号75 (YPSAAERKHRHLPVADAVIH); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号78 (AHELVCSMENTRATKMQVIG); 配列番号79 (TRATKMQVIGDQYVKVYLES); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号82 (LTVSGLAWTRQQNQWKEPDV); 配列番号83 (WQPAAQPKRRRHRQDALPGP); 配列番号84 (YRHTWDRHDEGAAQGDDDVW); 配列番号85 (TSAGRKRKSASSATACTSGV); 配列番号86 (HRQDALPGPCIASTPKKHRG); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号88 (VTTERKTPRVTGGGAMAGAS); 配列番号89 (QPFMRPHERNGFTVLCPKNM); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); 配列番号91 (IYVYALPLKMLNIPSINVHH); 配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT); 配列番号93 (GAAQGDDDVWTSGSDSDEEL); 配列番号94 (TGGGAMAGASTSAGRKRKSA); および配列番号95 (KDVALRHVVCAHELVCSMEN)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項２３】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項22に記載の単離されたペプチド。
【請求項２４】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A24、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項23に記載の単離されたペプチド。
【請求項２５】
HLAスーパータイプ特異性を有する、請求項24に記載の単離されたペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドがHLA A1およびHLA A2に拘束される、請求項25に記載の単離されたペプチド。
【請求項２７】
前記ペプチドがHLA B57およびHLA B58に拘束される、請求項25に記載の単離されたペプチド。
【請求項２８】
CD4+を発現している細胞と結合する配列をさらに含む、請求項23に記載の単離されたペプチド。
【請求項２９】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp65抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号22 (SQEPMSIYVY); 配列番号23 (ATVQGQNLKY); 配列番号24 (IRETVELRQY); 配列番号25 (IGDQYVKVY); 配列番号26 (TVQGQNLKY); 配列番号27 (YRIQGKLEY); 配列番号28 (QVIGDQYVK); 配列番号29 (LLLQRGPQY); 配列番号30 (RVTGGGAMA); 配列番号31 (GVMTRGRLK); 配列番号32 (VYALPLKML); 配列番号33 (QYDPVAALF); 配列番号34 (VYYTSAFVF); 配列番号35 (DVPSGKLFM); 配列番号36 (DIDLLLQRG); 配列番号37 (YVKVYLESF); 配列番号38 (TVQGQNLKY); 配列番号39 (EPMSIYVYAL); 配列番号40 (HVRVSQPSL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号43 (QPKRRRHRQ); 配列番号44 (LCPKSIPGL); 配列番号47 (SEHPTFTSQY); 配列番号48 (CEDVPSGKLF); 配列番号49 (NEIHNPAVF); 配列番号50 (RETVELRQY); 配列番号51 (QEPMSIYVY); 配列番号52 (QMWQARLTV); 配列番号53 (LMNGQQIFL); 配列番号54 (ILARNLVPM); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号57 (QEFFWDANDI); 配列番号58 (QYRIQGKLE); 配列番号59 (RKHRHLPVADAV); 配列番号60 (DPVAALFFF); 配列番号61 (PGKISHIMLDVA); 配列番号62 (TRATKMQVI); 配列番号63 (QAIRETVEL); 配列番号64 (YHRTWDRHEGA); 配列番号65 (FMRPHERNGFTV); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号67 (LNIPSINVHHYPSAAERKHR); 配列番号68 (ATVQGQNLKYQEFFWDANDI); 配列番号69 (QEFFWDANDIYRIFAELEGV); 配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号71 (SQYRIQGKLEYRHTWDRHDE); 配列番号72 (VFTWPPWQAGILARNLVPMV); 配列番号73 (ILARNLVPMVATVQGQNLKY); 配列番号74 (DQYVKVYLESFCEDVPSGKL); 配列番号75 (YPSAAERKHRHLPVADAVIH); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号78 (AHELVCSMENTRATKMQVIG); 配列番号79 (TRATKMQVIGDQYVKVYLES); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号82 (LTVSGLAWTRQQNQWKEPDV); 配列番号83 (WQPAAQPKRRRHRQDALPGP); 配列番号84 (YRHTWDRHDEGAAQGDDDVW); 配列番号85 (TSAGRKRKSASSATACTSGV); 配列番号86 (HRQDALPGPCIASTPKKHRG); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号88 (VTTERKTPRVTGGGAMAGAS); 配列番号89 (QPFMRPHERNGFTVLCPKNM); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); 配列番号91 (IYVYALPLKMLNIPSINVHH); 配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT); 配列番号93 (GAAQGDDDVWTSGSDSDEEL); 配列番号94 (TGGGAMAGASTSAGRKRKSA); および配列番号95 (KDVALRHVVCAHELVCSMEN)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項３０】
前記ペプチドが、配列番号25 (IGDQYVKVY); 配列番号26 (TVQGQNLKY); 配列番号27 (YRIQGKLEY); 配列番号40 (HVRVSQPSL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号53 (LMNGQQIFL); 配列番号54 (ILARNLVPM); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号57 (QEFFWDANDI); 配列番号58 (QYRIQGKLE); 配列番号59 (RKHRHLPVADAV); 配列番号60 (DPVAALFFF); 配列番号61 (PGKISHIMLDVA); 配列番号63 (QAIRETVEL); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号67 (LNIPSINVHHYPSAAERKHR); 配列番号68 (ATVQGQNLKYQEFFWDANDI); 配列番号69 (QEFFWDANDIYRIFAELEGV); 配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号71 (SQYRIQGKLEYRHTWDRHDE); 配列番号72 (VFTWPPWQAGILARNLVPMV); 配列番号73 (ILARNLVPMVATVQGQNLKY); 配列番号75 (YPSAAERKHRHLPVADAVIH); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); および配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項29に記載の単離されたペプチド。
【請求項３１】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp71抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項３２】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項31に記載の単離されたペプチド。
【請求項３３】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A24およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項32に記載の単離されたペプチド。
【請求項３４】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp71抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号174 (QLLIPKSFTL); 配列番号175 (TLVIPSWHV); 配列番号176 (LLIPKSFTL); 配列番号177 (DLVPLTVSV); 配列番号178 (CSDPNTYIHK); 配列番号179 (EYIVQIQNAF); および配列番号180 (AEVVARHNPY)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項３５】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp71抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号174 (QLLIPKSFTL); 配列番号175 (TLVIPSWHV); 配列番号176 (LLIPKSFTL); 配列番号177 (DLVPLTVSV); 配列番号178 (CSDPNTYIHK); 配列番号179 (EYIVQIQNAF); および配列番号180 (AEVVARHNPY)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項３６】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp150抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号122 (GQTEPIAFV); 配列番号130 (RPSTPRAAV); 配列番号131 (SPWAPTAPL); 配列番号132 (KARDHLAVL); 配列番号133 (WPRERAWAL); 配列番号134 (NVRRSWEEL); 配列番号138 (RIEENLEGV); 配列番号139 (PLIPTTAVI); 配列番号140 (LIEDFDIYV); 配列番号141 (KMSVRETLV); 配列番号142 (FLGARSPSL); 配列番号143 (ALVNAVNKL); 配列番号144 (ALVNFLRHL); 配列番号145 (NILQKIEKI); 配列番号146 (ERAWALKNPHLA); 配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR); 配列番号148 (STSQKPVLGKRVATPHASAR); および配列番号149 (HANTALVNAVNKLVYTGRLI)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項３７】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項36に記載の単離されたペプチド。
【請求項３８】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA B7およびHLA B8からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項37に記載の単離されたペプチド。
【請求項３９】
CD4+を発現している細胞と結合する配列をさらに含む、請求項37に記載の単離されたペプチド。
【請求項４０】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp150抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号122 (GQTEPIAFV); 配列番号130 (RPSTPRAAV); 配列番号131 (SPWAPTAPL); 配列番号132 (KARDHLAVL); 配列番号133 (WPRERAWAL); 配列番号134 (NVRRSWEEL); 配列番号138 (RIEENLEGV); 配列番号139 (PLIPTTAVI); 配列番号140 (LIEDFDIYV); 配列番号141 (KMSVRETLV); 配列番号142 (FLGARSPSL); 配列番号143 (ALVNAVNKL); 配列番号144 (ALVNFLRHL); 配列番号145 (NILQKIEKI); 配列番号146 (ERAWALKNPHLA); 配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR); 配列番号148 (STSQKPVLGKRVATPHASAR); および配列番号149 (HANTALVNAVNKLVYTGRLI)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項４１】
前記ペプチドが配列番号146 (ERAWALKNPHLA)に示すアミノ酸配列を有する、請求項40に記載の単離されたペプチド。
【請求項４２】
前記ペプチドが配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR)に示すアミノ酸配列を有する、請求項40に記載の単離されたペプチド。
【請求項４３】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgB抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項４４】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項43に記載の単離されたペプチド。
【請求項４５】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A24、HLA A29、HLA B41、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項44に記載の単離されたペプチド。
【請求項４６】
CD4+を発現している細胞と結合する配列をさらに含む、請求項44に記載の単離されたペプチド。
【請求項４７】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgB抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号123 (AYEYVDYLF); 配列番号124 (SYENKTMQL); 配列番号125 (AYIYTTYLL); 配列番号126 (NTDFRVLEL); 配列番号127 (ATSTGDVVY); 配列番号128 (LDEGIMVVY); 配列番号129 (VKESPGRCY); 配列番号135 (IMREFNSYK); 配列番号136 (KMTATFLSK); 配列番号137 (CYSRPVVIF); 配列番号181 (RIWCLVVCV); 配列番号182 (QMLLALARL); 配列番号183 (GLDDLMSGL); 配列番号184 (IILVAIAVV); 配列番号185 (DLDEGIMVV); 配列番号186 (NLFPYLVSA); 配列番号187 (AVGGAVASV); 配列番号188 (YINRALAQI); 配列番号189 (YAYIYTTYL); 配列番号190 (VFETSGGLVV); 配列番号191 (DDYSNTHSTRYV); 配列番号192 (RSYAYIYTTYLLGSNTEYVA); 配列番号193 (TYEKYGNVSVFETSGGLVVF); 配列番号194 (FETSGGLVVFWQGIKQKSLV); および配列番号195 (MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項４８】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgB抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号123 (AYEYVDYLF); 配列番号124 (SYENKTMQL); 配列番号125 (AYIYTTYLL); 配列番号126 (NTDFRVLEL); 配列番号127 (ATSTGDVVY); 配列番号128 (LDEGIMVVY); 配列番号129 (VKESPGRCY); 配列番号135 (IMREFNSYK); 配列番号136 (KMTATFLSK); 配列番号137 (CYSRPVVIF); 配列番号181 (RIWCLVVCV); 配列番号182 (QMLLALARL); 配列番号183 (GLDDLMSGL); 配列番号184 (IILVAIAVV); 配列番号185 (DLDEGIMVV); 配列番号186 (NLFPYLVSA); 配列番号187 (AVGGAVASV); 配列番号188 (YINRALAQI); 配列番号189 (YAYIYTTYL); 配列番号190 (VFETSGGLVV); 配列番号191 (DDYSNTHSTRYV); 配列番号192 (RSYAYIYTTYLLGSNTEYVA); 配列番号193 (TYEKYGNVSVFETSGGLVVF); 配列番号194 (FETSGGLVVFWQGIKQKSLV); および配列番号195 (MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項４９】
配列番号187 (AVGGAVASV); 配列番号189 (YAYIYTTYL); 配列番号190 (VFETSGGLVV); 配列番号191 (DDYSNTHSTRYV); 配列番号192 (RSYAYIYTTYLLGSNTEYVA); 配列番号193 (TYEKYGNVSVFETSGGLVVF); および配列番号195 (MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項48に記載の単離されたペプチド。
【請求項５０】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgH抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項５１】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項50に記載の単離されたペプチド。
【請求項５２】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A24、HLA A26、HLA B7、HLA B27およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項51に記載の単離されたペプチド。
【請求項５３】
CD4+を発現している細胞と結合する配列をさらに含む、請求項51に記載の単離されたペプチド。
【請求項５４】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgH抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号196 (YLMDELRYV); 配列番号197 (YLTVFTVYL); 配列番号198 (TLTEDFFVV); 配列番号199 (LLMMSVYAL); 配列番号200 (YLLYRMLKT); 配列番号201 (ILFDGHDLL); 配列番号202 (LIFGHLPRV); 配列番号203 (SLVRLVYIL); 配列番号204 (LLYPTAVDL); 配列番号205 (ALDPYNEVV); 配列番号206 (LMLLKNGTV); 配列番号207 (SAIIGIYLL); 配列番号208 (ITSLVRLVY); 配列番号209 (HHEYLSDLY); 配列番号210 (AIIGIYLLY); 配列番号211 (QTEKHELLV); 配列番号212 (ATDSRLLMM); 配列番号213 (FLDAALDFNY); 配列番号214 (DTQGVINIMY); 配列番号215 (LRENTTQCTY); 配列番号216 (SAIIGIYLLY); 配列番号217 (SLRNSTVVR); 配列番号218 (ALALFAAAR); 配列番号219 (QLNRHSYLK); 配列番号220 (RLFPDATVP); 配列番号221 (RLNTYALVSK); 配列番号222 (LVRLVYILSK); 配列番号223 (YLMDELRYVK); 配列番号224 (ELYLMGSLVH); 配列番号225 (ALTVSEHVSY); 配列番号226 (NYLDLSALL); 配列番号227 (SYVVTNQYL); 配列番号228 (SYLKDSDFL); 配列番号229 (TYALVSKDL); 配列番号230 (SYRSFSQQL); 配列番号231 (TYGRPIRFL); 配列番号232 (YYVFHMPRCL); 配列番号233 (MYMHDSDDVL); 配列番号234 (ETFPDLFCL); 配列番号235 (DLTETLERY); 配列番号236 (SPRTHYLML); 配列番号237 (FPDLFCLPL); 配列番号238 (SPRTHYLMLL); 配列番号239 (MPRCLFAGPL); 配列番号240 (TPMLLIFGHL); 配列番号241 (APYQRDNFIL); 配列番号242 (GRCQMLDRR); 配列番号243 (RRDHSLERL); 配列番号244 (SEALDPHAF); 配列番号245 (RENTTQCTY); 配列番号246 (DDVLFALDPY); 配列番号247 (HELLVLVKKAQL); 配列番号248 (LTVSEHVSYVVT); 配列番号249 (RQTEKHELLVLVKKAQLNRH); および配列番号250 (ALTVSEHVSYVVTNQYLIKG)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項５５】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgH抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号196 (YLMDELRYV); 配列番号197 (YLTVFTVYL); 配列番号198 (TLTEDFFVV); 配列番号199 (LLMMSVYAL); 配列番号200 (YLLYRMLKT); 配列番号201 (ILFDGHDLL); 配列番号202 (LIFGHLPRV); 配列番号203 (SLVRLVYIL); 配列番号204 (LLYPTAVDL); 配列番号205 (ALDPYNEVV); 配列番号206 (LMLLKNGTV); 配列番号207 (SAIIGIYLL); 配列番号208 (ITSLVRLVY); 配列番号209 (HHEYLSDLY); 配列番号210 (AIIGIYLLY); 配列番号211 (QTEKHELLV); 配列番号212 (ATDSRLLMM); 配列番号213 (FLDAALDFNY); 配列番号214 (DTQGVINIMY); 配列番号215 (LRENTTQCTY); 配列番号216 (SAIIGIYLLY); 配列番号217 (SLRNSTVVR); 配列番号218 (ALALFAAAR); 配列番号219 (QLNRHSYLK); 配列番号220 (RLFPDATVP); 配列番号221 (RLNTYALVSK); 配列番号222 (LVRLVYILSK); 配列番号223 (YLMDELRYVK); 配列番号224 (ELYLMGSLVH); 配列番号225 (ALTVSEHVSY); 配列番号226 (NYLDLSALL); 配列番号227 (SYVVTNQYL); 配列番号228 (SYLKDSDFL); 配列番号229 (TYALVSKDL); 配列番号230 (SYRSFSQQL); 配列番号231 (TYGRPIRFL); 配列番号232 (YYVFHMPRCL); 配列番号233 (MYMHDSDDVL); 配列番号234 (ETFPDLFCL); 配列番号235 (DLTETLERY); 配列番号236 (SPRTHYLML); 配列番号237 (FPDLFCLPL); 配列番号238 (SPRTHYLMLL); 配列番号239 (MPRCLFAGPL); 配列番号240 (TPMLLIFGHL); 配列番号241 (APYQRDNFIL); 配列番号242 (GRCQMLDRR); 配列番号243 (RRDHSLERL); 配列番号244 (SEALDPHAF); 配列番号245 (RENTTQCTY); 配列番号246 (DDVLFALDPY); 配列番号247 (HELLVLVKKAQL); 配列番号248 (LTVSEHVSYVVT); 配列番号249 (RQTEKHELLVLVKKAQLNRH); および配列番号250 (ALTVSEHVSYVVTNQYLIKG)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項５６】
配列番号247 (HELLVLVKKAQL)に示すアミノ酸配列を有する、請求項55に記載の単離されたペプチド。
【請求項５７】
配列番号249 (RQTEKHELLVLVKKAQLNRH)に示すアミノ酸配列を有する、請求項55に記載の単離されたペプチド。
【請求項５８】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のIE-1抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号96 (SLLSEFCRV); 配列番号97 (VLAELVKQI); 配列番号98 (ILGADPLRV); 配列番号99 (TMYGGISLL); 配列番号100 (LLSEFCRVL); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号102 (CLQNALDIL); 配列番号103 (ILDEERDKV); 配列番号104 (IKEHMLKKY); 配列番号105 (DEEEAIVAY); 配列番号106 (KLGGALQAK); 配列番号107 (QYILGADPL); 配列番号108 (KYTQTEEKF); 配列番号109 (KARAKKDEL); 配列番号110 (VMKRRIEEI); 配列番号111 (RHRIKEHML); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号114 (ELKRKMMYM); 配列番号115 (RRKMMYMCY); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号117 (CSPDEIMAYAQKIFKILDEE); 配列番号118 (SEPVSEIEEVAPEEEEDGAE); 配列番号119 (VLCCYVLEETSVMLAKRPLI); 配列番号120 (RRKMMYMCYRNIEFFTKNSA); および配列番号121 (NIEFFTKNSAFPKTTNGCSQ)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項５９】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項58に記載の単離されたペプチド。
【請求項６０】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A23、HLA A24、HLA A30、HLA B7、HLA B8およびHLA B27からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項59に記載の単離されたペプチド。
【請求項６１】
HLAスーパータイプ特異性を有する、請求項60に記載の単離されたペプチド。
【請求項６２】
前記ペプチドがHLA A23、HLA A24およびHLA A30に拘束される、請求項61に記載の単離されたペプチド。
【請求項６３】
前記ペプチドがHLA B7およびHLA B8に拘束される、請求項61に記載の単離されたペプチド。
【請求項６４】
CD4+を発現している細胞と結合する配列をさらに含む、請求項59に記載の単離されたペプチド。
【請求項６５】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のIE-1抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号96 (SLLSEFCRV); 配列番号97 (VLAELVKQI); 配列番号98 (ILGADPLRV); 配列番号99 (TMYGGISLL); 配列番号100 (LLSEFCRVL); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号102 (CLQNALDIL); 配列番号103 (ILDEERDKV); 配列番号104 (IKEHMLKKY); 配列番号105 (DEEEAIVAY); 配列番号106 (KLGGALQAK); 配列番号107 (QYILGADPL); 配列番号108 (KYTQTEEKF); 配列番号109 (KARAKKDEL); 配列番号110 (VMKRRIEEI); 配列番号111 (RHRIKEHML); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号114 (ELKRKMMYM); 配列番号115 (RRKMMYMCY); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号117 (CSPDEIMAYAQKIFKILDEE); 配列番号118 (SEPVSEIEEVAPEEEEDGAE); 配列番号119 (VLCCYVLEETSVMLAKRPLI); 配列番号120 (RRKMMYMCYRNIEFFTKNSA); および配列番号121 (NIEFFTKNSAFPKTTNGCSQ)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項６６】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のIE-2抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項６７】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項66に記載の単離されたペプチド。
【請求項６８】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA B8、HLA B35およびHLA B41からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項67に記載の単離されたペプチド。
【請求項６９】
CD4+を発現している細胞と結合する配列をさらに含む、請求項67に記載の単離されたペプチド。
【請求項７０】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のIE-2抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号251 (FLMEHTMPV); 配列番号252 (LMQKFPKQV); 配列番号253 (NLALSTPFL); 配列番号254 (IIYTRNHEV); 配列番号255 (IIYTRNHEVK); 配列番号256 (LLGALNLCL); 配列番号257 (KPEPDFTIQY); 配列番号258 (IMKDKNTPF); 配列番号259 (PRKKKSKRI); 配列番号260 (FEQPTETPP); 配列番号261 (FEQPTETP); 配列番号262 (FEQPTETPPE); 配列番号263 (EQPTETPPE); 配列番号264 (QFEQPTETPPE); 配列番号265 (SDYNMIIHA); 配列番号266 (YRNMIIHAAT); 配列番号267 (CLPLMQKFP); 配列番号268 (IDEVSRMFRNTNRS); 配列番号269 (TAAKAYAVGQFEQPTETPPE); 配列番号270 (FEQPTETPPEDLDTLSLAIE); 配列番号271 (MLPLIKQEDIKPEPDFTIQY); 配列番号272 (THQLCPRSSDYRNMIIHAAT); 配列番号273 (YRNMIIHAATPVDLLGALNL); 配列番号274 (TGPRKKKSKRISELDNEKVR); 配列番号275 (PVDLLGALNLCLPLMQKFPK); 配列番号276 (IQIIYTRNHEVKSEVDAVRC); 配列番号277 (VKSEVDAVRCRLGTMCNLAL); 配列番号278 (RVKIDEVSRMFRNTNRSLEY); 配列番号279 (SSSSSSCSSASDSESESEEM); 配列番号280 (ASSPSTGSGTPRBTSPTHPL); 配列番号281 (PRVTSPTHPLSQMNHPPLPD); 配列番号282 (PLGRPDEDSSSSSSSSCSSA); 配列番号283 (SDSESESEEMKCSSGGGASV); 配列番号284 (KCSSGGGASVTSSHHGRGGF); 配列番号285 (CTPNVQTRRGRVKIDEVSRM); 配列番号286 (FRNTNRSLEYKNLPFTIPSM); 配列番号287 (HQVLDEAIKACKTMQVNNKG); 配列番号288 (CKTMQVNNKGIQIIYTRNHE); 配列番号289 (KAAWSLKELHTHQLCPRSSD); および配列番号290 (CLPLMQKFPKQVMVRIFSTN)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項７１】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のIE-2抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号251 (FLMEHTMPV); 配列番号252 (LMQKFPKQV); 配列番号253 (NLALSTPFL); 配列番号254 (IIYTRNHEV); 配列番号255 (IIYTRNHEVK); 配列番号256 (LLGALNLCL); 配列番号257 (KPEPDFTIQY); 配列番号258 (IMKDKNTPF); 配列番号259 (PRKKKSKRI); 配列番号260 (FEQPTETPP); 配列番号261 (FEQPTETP); 配列番号262 (FEQPTETPPE); 配列番号263 (EQPTETPPE); 配列番号264 (QFEQPTETPPE); 配列番号265 (SDYNMIIHA); 配列番号266 (YRNMIIHAAT); 配列番号267 (CLPLMQKFP); 配列番号268 (IDEVSRMFRNTNRS); 配列番号269 (TAAKAYAVGQFEQPTETPPE); 配列番号270 (FEQPTETPPEDLDTLSLAIE); 配列番号271 (MLPLIKQEDIKPEPDFTIQY); 配列番号272 (THQLCPRSSDYRNMIIHAAT); 配列番号273 (YRNMIIHAATPVDLLGALNL); 配列番号274 (TGPRKKKSKRISELDNEKVR); 配列番号275 (PVDLLGALNLCLPLMQKFPK); 配列番号276 (IQIIYTRNHEVKSEVDAVRC); 配列番号277 (VKSEVDAVRCRLGTMCNLAL); 配列番号278 (RVKIDEVSRMFRNTNRSLEY); 配列番号279 (SSSSSSCSSASDSESESEEM); 配列番号280 (ASSPSTGSGTPRBTSPTHPL); 配列番号281 (PRVTSPTHPLSQMNHPPLPD); 配列番号282 (PLGRPDEDSSSSSSSSCSSA); 配列番号283 (SDSESESEEMKCSSGGGASV); 配列番号284 (KCSSGGGASVTSSHHGRGGF); 配列番号285 (CTPNVQTRRGRVKIDEVSRM); 配列番号286 (FRNTNRSLEYKNLPFTIPSM); 配列番号287 (HQVLDEAIKACKTMQVNNKG); 配列番号288 (CKTMQVNNKGIQIIYTRNHE); 配列番号289 (KAAWSLKELHTHQLCPRSSD); および配列番号290 (CLPLMQKFPKQVMVRIFSTN)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項７２】
配列番号254 (IIYTRNHEV); 配列番号255 (IIYTRNHEVK); 配列番号260 (FEQPTETPP); 配列番号261 (FEQPTETP); 配列番号262 (FEQPTETPPE); 配列番号263 (EQPTETPPE); 配列番号264 (QFEQPTETPPE); 配列番号269 (TAAKAYAVGQFEQPTETPPE); 配列番号270 (FEQPTETPPEDLDTLSLAIE); および配列番号276 (IQIIYTRNHEVKSEVDAVRC)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項71に記載の単離されたペプチド。
【請求項７３】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUL18抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項７４】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項73に記載の単離されたペプチド。
【請求項７５】
前記ペプチドがHLA A2またはHLA B44を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項74に記載の単離されたペプチド。
【請求項７６】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUL18抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号291 (GEINITFIHY); 配列番号292 (TENGSFVAGY); 配列番号293 (TMWCLTLFV); および配列番号308 (LELEIALGY)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項７７】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUL18抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号291 (GEINITFIHY); 配列番号292 (TENGSFVAGY); 配列番号293 (TMWCLTLFV); および配列番号308 (LELEIALGY)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項７８】
配列番号292 (TENGSFVAGY)に示すアミノ酸配列を有する、請求項77に記載の単離されたペプチド。
【請求項７９】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS2抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項８０】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項79に記載の単離されたペプチド。
【請求項８１】
前記ペプチドがHLA A2またはHLA A24を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項80に記載の単離されたペプチド。
【請求項８２】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS2抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号294 (LLVLFIVYV); 配列番号295 (SMMWMRFFV); 配列番号296 (TLLVLFIVYV); および配列番号297 (VYVTVDCNL)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項８３】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS2抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号294 (LLVLFIVYV); 配列番号295 (SMMWMRFFV); 配列番号296 (TLLVLFIVYV); および配列番号297 (VYVTVDCNL)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項８４】
配列番号295 (SMMWMRFFV)に示すアミノ酸配列を有する、請求項83に記載の単離されたペプチド。
【請求項８５】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS3抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項８６】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項85に記載の単離されたペプチド。
【請求項８７】
前記ペプチドがHLA A2またはHLA A24を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項86に記載の単離されたペプチド。
【請求項８８】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS3抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号298 (YLFSLVVLV); 配列番号299 (TLLVYLFSL); 配列番号300 (LLFRTLLVYL); および配列番号301 (VYLFSLVVL)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項８９】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS3抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号298 (YLFSLVVLV); 配列番号299 (TLLVYLFSL); 配列番号300 (LLFRTLLVYL); および配列番号301 (VYLFSLVVL)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項９０】
配列番号298 (YLFSLVVLV)に示すアミノ酸配列を有する、請求項89に記載の単離されたペプチド。
【請求項９１】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS6抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項９２】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項91に記載の単離されたペプチド。
【請求項９３】
前記ペプチドがHLA A24を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項92に記載の単離されたペプチド。
【請求項９４】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS6抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号303 (LYLCCGITL)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項９５】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS6抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号303 (LYLCCGITL)に示すアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項９６】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS11抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、前記抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項９７】
前記ペプチドがCD8+を発現しているMHCクラスI細胞と結合する、請求項96に記載の単離されたペプチド。
【請求項９８】
前記ペプチドがHLA A2、HLA A24、HLA B7およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子を発現しているCD8+細胞と結合する、請求項97に記載の単離されたペプチド。
【請求項９９】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS11抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、
(i)  配列番号302 (YYVECEPRC); 配列番号304 (TLFDEPPPLV); 配列番号305 (TPRVYYQTL); 配列番号306 (APVAGSMPEL); および配列番号307 (SESLVAKRY)、
(ii)  上記(i)の誘導体、および
(iii)  上記(i)の機能的に同等の変異体、
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項１００】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS11抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドであって、配列番号302 (YYVECEPRC); 配列番号304 (TLFDEPPPLV); 配列番号305 (TPRVYYQTL); 配列番号306 (APVAGSMPEL); および配列番号307 (SESLVAKRY)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたペプチド。
【請求項１０１】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の同一のまたは異なる抗原の2以上の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、前記抗原がpp28、pp50、pp65、pp71、pp150、gB、gH、IE-1、IE-2、US2、US3、US6、US11およびUL18からなる群より選択され、前記ペプチドが前記抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、ここにおいて、
(i)  前記pp65のCTLエピトープは、配列番号22 (SQEPMSIYVY); 配列番号23 (ATVQGQNLKY); 配列番号24 (IRETVELRQY); 配列番号25 (IGDQYVKVY); 配列番号26 (TVQGQNLKY); 配列番号27 (YRIQGKLEY); 配列番号28 (QVIGDQYVK); 配列番号29 (LLLQRGPQY); 配列番号30 (RVTGGGAMA); 配列番号31 (GVMTRGRLK); 配列番号32 (VYALPLKML); 配列番号33 (QYDPVAALF); 配列番号34 (VYYTSAFVF); 配列番号35 (DVPSGKLFM); 配列番号36 (DIDLLLQRG); 配列番号37 (YVKVYLESF); 配列番号38 (TVQGQNLKY); 配列番号39 (EPMSIYVYAL); 配列番号40 (HVRVSQPSL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号43 (QPKRRRHRQ); 配列番号44 (LCPKSIPGL); 配列番号45 (YRIQGKLEY); 配列番号46 (YSEHPTFTSQY); 配列番号47 (SEHPTFTSQY); 配列番号48 (CEDVPSGKLF); 配列番号49 (NEIHNPAVF); 配列番号50 (RETVELRQY); 配列番号51 (QEPMSIYVY); 配列番号52 (QMWQARLTV); 配列番号53 (LMNGQQIFL); 配列番号54 (ILARNLVPM); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号57 (QEFFWDANDI); 配列番号58 (QYRIQGKLE); 配列番号59 (RKHRHLPVADAV); 配列番号60 (DPVAALFFF); 配列番号61 (PGKISHIMLDVA); 配列番号62 (TRATKMQVI); 配列番号63 (QAIRETVEL); 配列番号64 (YHRTWDRHEGA); 配列番号65 (FMRPHERNGFTV); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号67 (LNIPSINVHHYPSAAERKHR); 配列番号68 (ATVQGQNLKYQEFFWDANDI); 配列番号69 (QEFFWDANDIYRIFAELEGV); 配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号71 (SQYRIQGKLEYRHTWDRHDE); 配列番号72 (VFTWPPWQAGILARNLVPMV); 配列番号73 (ILARNLVPMVATVQGQNLKY); 配列番号74 (DQYVKVYLESFCEDVPSGKL); 配列番号75 (YPSAAERKHRHLPVADAVIH); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号78 (AHELVCSMENTRATKMQVIG); 配列番号79 (TRATKMQVIGDQYVKVYLES); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号82 (LTVSGLAWTRQQNQWKEPDV); 配列番号83 (WQPAAQPKRRRHRQDALPGP); 配列番号84 (YRHTWDRHDEGAAQGDDDVW); 配列番号85 (TSAGRKRKSASSATACTSGV); 配列番号86 (HRQDALPGPCIASTPKKHRG); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号88 (VTTERKTPRVTGGGAMAGAS); 配列番号89 (QPFMRPHERNGFTVLCPKNM); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); 配列番号91 (IYVYALPLKMLNIPSINVHH); 配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT); 配列番号93 (GAAQGDDDVWTSGSDSDEEL); 配列番号94 (TGGGAMAGASTSAGRKRKSA); および配列番号95 (KDVALRHVVCAHELVCSMEN)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、
(ii)  前記IE-1のCTLエピトープは、配列番号96 (SLLSEFCRV); 配列番号97 (VLAELVKQI); 配列番号98 (ILGADPLRV); 配列番号99 (TMYGGISLL); 配列番号100 (LLSEFCRVL); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号102 (CLQNALDIL); 配列番号103 (ILDEERDKV); 配列番号104 (IKEHMLKKY); 配列番号105 (DEEEAIVAY); 配列番号106 (KLGGALQAK); 配列番号107 (QYILGADPL); 配列番号108 (KYTQTEEKF); 配列番号109 (KARAKKDEL); 配列番号110 (VMKRRIEEI); 配列番号111 (RHRIKEHML); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号114 (ELKRKMMYM); 配列番号115 (RRKMMYMCY); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号117 (CSPDEIMAYAQKIFKILDEE); 配列番号118 (SEPVSEIEEVAPEEEEDGAE); 配列番号119 (VLCCYVLEETSVMLAKRPLI); 配列番号120 (RRKMMYMCYRNIEFFTKNSA); および配列番号121 (NIEFFTKNSAFPKTTNGCSQ)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなり、
(iii)  前記pp150のCTLエピトープは、配列番号122 (GQTEPIAFV); 配列番号130 (RPSTPRAAV); 配列番号131 (SPWAPTAPL); 配列番号132 (KARDHLAVL); 配列番号133 (WPRERAWAL); 配列番号134 (NVRRSWEEL); 配列番号138 (RIEENLEGV); 配列番号139 (PLIPTTAVI); 配列番号140 (LIEDFDIYV); 配列番号141 (KMSVRETLV); 配列番号142 (FLGARSPSL); 配列番号143 (ALVNAVNKL); 配列番号144 (ALVNFLRHL); 配列番号145 (NILQKIEKI); 配列番号146 (ERAWALKNPHLA); 配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR); 配列番号148 (STSQKPVLGKRVATPHASAR); および配列番号149 (HANTALVNAVNKLVYTGRLI)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、
ことを特徴とする、上記の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０２】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の同一のまたは異なる抗原の約25〜30の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる、請求項101に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０３】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の同一のまたは異なる抗原の26または27の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープからなる、請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０４】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A11、HLA A23、HLA A24、HLA A26、HLA A29、HLA A30、HLA A68、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B41、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるMHCクラスI対立遺伝子を発現している細胞と結合する、請求項101に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０５】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の同一のまたは異なる抗原の2以上の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、前記エピトープのそれぞれが、配列番号46 (YSEHPTFTSQY); 配列番号165 (VTEHDTLLY); 配列番号5 (NLVPMVATV); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号7 (RIFAELEGV); 配列番号254 (IIYTRNHEV); 配列番号135 (IMREFNSYK); 配列番号21 (TTVYPPSSTAK); 配列番号1 (SVLGPISGHVLK); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号33 (QYDPVAALF); 配列番号2 (FTSQYRIQGKL); 配列番号37 (YVKYVYESF); 配列番号15 (DIYRIFAEL); 配列番号3 (FVFPTKDVALR); 配列番号134 (NVRRSWEEL); 配列番号132 (KARDHLAVL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号8 (TPRVTGGGAM); 配列番号109 (KARAKKDEL); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号162 (ARVYEIKCR); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号4 (FPTKDVAL); 配列番号55 (IPSINVHHY); 配列番号260 (FEQPTETPP); 配列番号189 (YAYIYTTYL); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号170 (YEQHKITSY); 配列番号51 (QEPMSIYVY); 配列番号47 (SEHPTFTSQY); および配列番号63 (QAIRETVEL)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるが、ただし、前記ポリエピトープペプチド中の前記配列の少なくとも１つは、配列番号1 (SVLGPISGHVLK); 配列番号2 (FTSQYRIQGKL); 配列番号3 (FVFPTKDVALR); 配列番号4 (FPTKDVAL); 配列番号5 (NLVPMVATV); 配列番号7 (RIFAELEGV); 配列番号8 (TPRVTGGGAM); 配列番号46 (YSEHPTFTSQY); 配列番号15 (DIYRIFAEL); 配列番号21 (TTVYPPSSTAK); および配列番号55 (IPSINVHHY)からなる群より選択される配列とは別の配列である、上記の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０６】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A11、HLA A23、HLA A24、HLA A26、HLA A30、HLA A68、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B41、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるMHCクラスI対立遺伝子を発現している細胞と結合する、請求項105に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０７】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の同一の抗原または異なる抗原の2以上の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたポリエピトープペプチドであって、前記エピトープのそれぞれが、配列番号165 (VTEHDTLLY); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号254 (IIYTRNHEV); 配列番号135 (IMREFNSYK); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号33 (QYDPVAALF); 配列番号37 (YVKYVYESF); 配列番号15 (DIYRIFAEL); 配列番号134 (NVRRSWEEL); 配列番号132 (KARDHLAVL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号109 (KARAKKDEL); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号162 (ARVYEIKCR); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号260 (FEQPTETPP); 配列番号189 (YAYIYTTYL); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号170 (YEQHKITSY); 配列番号51 (QEPMSIYVY); 配列番号47 (SEHPTFTSQY); および配列番号63 (QAIRETVEL)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、上記の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０８】
前記ペプチドがHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A23、HLA A24、HLA A26、HLA A30、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B41、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるMHCクラスI対立遺伝子を発現している細胞と結合する、請求項107に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１０９】
前記ポリエピトープペプチドのエピトープがHLAスーパータイプ特異性を有する、請求項107に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１１０】
HLAスーパータイプ特異性を有するエピトープが配列番号116であり、HLAスーパータイプがHLA A23とHLA A24とHLA A30である、請求項109に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１１１】
HLAスーパータイプ特異性を有するエピトープが配列番号109であり、HLAスーパータイプがHLA B7とHLA B8である、請求項109に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１１２】
HLAスーパータイプ特異性を有するエピトープが配列番号63であり、HLAスーパータイプがHLA B57とHLA B58である、請求項109に記載の単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１１３】
配列番号309; 配列番号310; 配列番号311; 配列番号312; 配列番号313; 配列番号314; 配列番号315; 配列番号316; 配列番号317; および配列番号318からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離されたポリエピトープペプチド。
【請求項１１４】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、有効量の請求項１に記載の単離されたペプチドを、製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバントと共に含有する上記組成物。
【請求項１１５】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp28抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１１６】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号150 (LLIDPTSGL); 配列番号151 (LLVEPCARV); 配列番号152 (LLLIVTPVV); 配列番号153 (FLLSHDAAL); 配列番号154 (PLREYLADL); 配列番号155 (GLLGASMDL); 配列番号156 (LVEPCARVY); 配列番号157 (GIKHEGLVK); 配列番号158 (ELLAGGRVF); 配列番号159 (RLLDLAPNY); 配列番号160 (ELLGRLNVY); 配列番号161 (CRYKYLRKK); および配列番号162 (ARVYEIKCR)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１１７】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp50抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１１８】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号163 (LLNCAVTKL); 配列番号164 (QLRSVIRAL); 配列番号165 (VTEHDTLLY); 配列番号166 (RGDPFDKNY); 配列番号167 (GLDRNSGNY); 配列番号168 (TLLNCAVTK); 配列番号169 (TVRSHCVSK); 配列番号170 (YEQHKITSY); 配列番号171 (TRVKRNVKK); 配列番号172 (SEDSVTFEF); および配列番号173 (TRLSEPPTL)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１１９】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号22 (SQEPMSIYVY); 配列番号23 (ATVQGQNLKY); 配列番号24 (IRETVELRQY); 配列番号25 (IGDQYVKVY); 配列番号26 (TVQGQNLKY); 配列番号27 (YRIQGKLEY); 配列番号28 (QVIGDQYVK); 配列番号29 (LLLQRGPQY); 配列番号30 (RVTGGGAMA); 配列番号31 (GVMTRGRLK); 配列番号32 (VYALPLKML); 配列番号33 (QYDPVAALF); 配列番号34 (VYYTSAFVF); 配列番号35 (DVPSGKLFM); 配列番号36 (DIDLLLQRG); 配列番号37 (YVKVYLESF); 配列番号38 (TVQGQNLKY); 配列番号39 (EPMSIYVYAL); 配列番号40 (HVRVSQPSL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号43 (QPKRRRHRQ); 配列番号44 (LCPKSIPGL); 配列番号47 (SEHPTFTSQY); 配列番号48 (CEDVPSGKLF); 配列番号49 (NEIHNPAVF); 配列番号50 (RETVELRQY); 配列番号51 (QEPMSIYVY); 配列番号52 (QMWQARLTV); 配列番号53 (LMNGQQIFL); 配列番号54 (ILARNLVPM); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号57 (QEFFWDANDI); 配列番号58 (QYRIQGKLE); 配列番号59 (RKHRHLPVADAV); 配列番号60 (DPVAALFFF); 配列番号61 (PGKISHIMLDVA); 配列番号62 (TRATKMQVI); 配列番号63 (QAIRETVEL); 配列番号64 (YHRTWDRHEGA); 配列番号65 (FMRPHERNGFTV); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号67 (LNIPSINVHHYPSAAERKHR); 配列番号68 (ATVQGQNLKYQEFFWDANDI); 配列番号69 (QEFFWDANDIYRIFAELEGV); 配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号71 (SQYRIQGKLEYRHTWDRHDE); 配列番号72 (VFTWPPWQAGILARNLVPMV); 配列番号73 (ILARNLVPMVATVQGQNLKY); 配列番号74 (DQYVKVYLESFCEDVPSGKL); 配列番号75 (YPSAAERKHRHLPVADAVIH); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号78 (AHELVCSMENTRATKMQVIG); 配列番号79 (TRATKMQVIGDQYVKVYLES); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号82 (LTVSGLAWTRQQNQWKEPDV); 配列番号83 (WQPAAQPKRRRHRQDALPGP); 配列番号84 (YRHTWDRHDEGAAQGDDDVW); 配列番号85 (TSAGRKRKSASSATACTSGV); 配列番号86 (HRQDALPGPCIASTPKKHRG); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号88 (VTTERKTPRVTGGGAMAGAS); 配列番号89 (QPFMRPHERNGFTVLCPKNM); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); 配列番号91 (IYVYALPLKMLNIPSINVHH); 配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT);配列番号93 (GAAQGDDDVWTSGSDSDEEL); 配列番号94 (TGGGAMAGASTSAGRKRKSA); および配列番号95 (KDVALRHVVCAHELVCSMEN)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１２０】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のpp71抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１２１】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号174 (QLLIPKSFTL); 配列番号175 (TLVIPSWHV); 配列番号176 (LLIPKSFTL); 配列番号177 (DLVPLTVSV); 配列番号178 (CSDPNTYIHK); 配列番号179 (EYIVQIQNAF); および配列番号180 (AEVVARHNPY)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１２２】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号122 (GQTEPIAFV); 配列番号130 (RPSTPRAAV); 配列番号131 (SPWAPTAPL); 配列番号132 (KARDHLAVL); 配列番号133 (WPRERAWAL); 配列番号134 (NVRRSWEEL); 配列番号138 (RIEENLEGV); 配列番号139 (PLIPTTAVI); 配列番号140 (LIEDFDIYV); 配列番号141 (KMSVRETLV); 配列番号142 (FLGARSPSL); 配列番号143 (ALVNAVNKL); 配列番号144 (ALVNFLRHL); 配列番号145 (NILQKIEKI); 配列番号146 (ERAWALKNPHLA); 配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR); 配列番号148 (STSQKPVLGKRVATPHASAR); および配列番号149 (HANTALVNAVNKLVYTGRLI)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１２３】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgB抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１２４】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号123 (AYEYVDYLF); 配列番号124 (SYENKTMQL); 配列番号125 (AYIYTTYLL); 配列番号126 (NTDFRVLEL); 配列番号127 (ATSTGDVVY); 配列番号128 (LDEGIMVVY); 配列番号129 (VKESPGRCY); 配列番号135 (IMREFNSYK); 配列番号136 (KMTATFLSK); 配列番号137 (CYSRPVVIF); 配列番号181 (RIWCLVVCV); 配列番号182 (QMLLALARL); 配列番号183 (GLDDLMSGL); 配列番号184 (IILVAIAVV); 配列番号185 (DLDEGIMVV); 配列番号186 (NLFPYLVSA); 配列番号187 (AVGGAVASV); 配列番号188 (YINRALAQI); 配列番号189 (YAYIYTTYL); 配列番号190 (VFETSGGLVV); 配列番号191 (DDYSNTHSTRYV); 配列番号192 (RSYAYIYTTYLLGSNTEYVA); 配列番号193 (TYEKYGNVSVFETSGGLVVF); 配列番号194 (FETSGGLVVFWQGIKQKSLV); および配列番号195 (MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１２５】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のgH抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１２６】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号196 (YLMDELRYV); 配列番号197 (YLTVFTVYL); 配列番号198 (TLTEDFFVV); 配列番号199 (LLMMSVYAL); 配列番号200 (YLLYRMLKT); 配列番号201 (ILFDGHDLL); 配列番号202 (LIFGHLPRV); 配列番号203 (SLVRLVYIL); 配列番号204 (LLYPTAVDL); 配列番号205 (ALDPYNEVV); 配列番号206 (LMLLKNGTV); 配列番号207 (SAIIGIYLL ); 配列番号208 (ITSLVRLVY); 配列番号209 (HHEYLSDLY); 配列番号210 (AIIGIYLLY); 配列番号211 (QTEKHELLV); 配列番号212 (ATDSRLLMM); 配列番号213 (FLDAALDFNY); 配列番号214 (DTQGVINIMY); 配列番号215 (LRENTTQCTY); 配列番号216 (SAIIGIYLLY); 配列番号217 (SLRNSTVVR); 配列番号218 (ALALFAAAR); 配列番号219 (QLNRHSYLK); 配列番号220 (RLFPDATVP); 配列番号221 (RLNTYALVSK); 配列番号222 (LVRLVYILSK); 配列番号223 (YLMDELRYVK); 配列番号224 (ELYLMGSLVH); 配列番号225 (ALTVSEHVSY); 配列番号226 (NYLDLSALL); 配列番号227 (SYVVTNQYL); 配列番号228 (SYLKDSDFL); 配列番号229 (TYALVSKDL); 配列番号230 (SYRSFSQQL); 配列番号231 (TYGRPIRFL); 配列番号232 (YYVFHMPRCL); 配列番号233 (MYMHDSDDVL); 配列番号234 (ETFPDLFCL); 配列番号235 (DLTETLERY); 配列番号236 (SPRTHYLML); 配列番号237 (FPDLFCLPL); 配列番号238 (SPRTHYLMLL); 配列番号239 (MPRCLFAGPL); 配列番号240 (TPMLLIFGHL); 配列番号241 (APYQRDNFIL); 配列番号242 (GRCQMLDRR); 配列番号243 (RRDHSLERL); 配列番号244 (SEALDPHAF); 配列番号245 (RENTTQCTY); 配列番号246 (DDVLFALDPY); 配列番号247 (HELLVLVKKAQL); 配列番号248 (LTVSEHVSYVVT); 配列番号249 (RQTEKHELLVLVKKAQLNRH);および配列番号250 (ALTVSEHVSYVVTNQYLIKG)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１２７】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号96 (SLLSEFCRV); 配列番号97 (VLAELVKQI); 配列番号98 (ILGADPLRV); 配列番号99 (TMYGGISLL); 配列番号100 (LLSEFCRVL); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号102 (CLQNALDIL); 配列番号103 (ILDEERDKV); 配列番号104 (IKEHMLKKY); 配列番号105 (DEEEAIVAY); 配列番号106 (KLGGALQAK); 配列番号107 (QYILGADPL); 配列番号108 (KYTQTEEKF); 配列番号109 (KARAKKDEL); 配列番号110 (VMKRRIEEI); 配列番号111 (RHRIKEHML); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号114 (ELKRKMMYM); 配列番号115 (RRKMMYMCY); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号117 (CSPDEIMAYAQKIFKILDEE); 配列番号118 (SEPVSEIEEVAPEEEEDGAE); 配列番号119 (VLCCYVLEETSVMLAKRPLI); 配列番号120 (RRKMMYMCYRNIEFFTKNSA); および配列番号121 (NIEFFTKNSAFPKTTNGCSQ)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１２８】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のIE-2抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１２９】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号251 (FLMEHTMPV); 配列番号252 (LMQKFPKQV); 配列番号253 (NLALSTPFL); 配列番号254 (IIYTRNHEV); 配列番号255 (IIYTRNHEVK); 配列番号256 (LLGALNLCL); 配列番号257 (KPEPDFTIQY); 配列番号258 (IMKDKNTPF); 配列番号259 (PRKKKSKRI); 配列番号260 (FEQPTETPP); 配列番号261 (FEQPTETP); 配列番号262 (FEQPTETPPE); 配列番号263 (EQPTETPPE ); 配列番号264 (QFEQPTETPPE); 配列番号265 (SDYNMIIHA); 配列番号266 (YRNMIIHAAT); 配列番号267 (CLPLMQKFP); 配列番号268 (IDEVSRMFRNTNRS); 配列番号269 (TAAKAYAVGQFEQPTETPPE); 配列番号270 (FEQPTETPPEDLDTLSLAIE); 配列番号271 (MLPLIKQEDIKPEPDFTIQY); 配列番号272 (THQLCPRSSDYRNMIIHAAT); 配列番号273 (YRNMIIHAATPVDLLGALNL); 配列番号274 (TGPRKKKSKRISELDNEKVR); 配列番号275 (PVDLLGALNLCLPLMQKFPK); 配列番号276 (IQIIYTRNHEVKSEVDAVRC); 配列番号277 (VKSEVDAVRCRLGTMCNLAL); 配列番号278 (RVKIDEVSRMFRNTNRSLEY); 配列番号279 (SSSSSSCSSASDSESESEEM); 配列番号280 (ASSPSTGSGTPRBTSPTHPL); 配列番号281 (PRVTSPTHPLSQMNHPPLPD); 配列番号282 (PLGRPDEDSSSSSSSSCSSA); 配列番号283 (SDSESESEEMKCSSGGGASV); 配列番号284 (KCSSGGGASVTSSHHGRGGF); 配列番号285 (CTPNVQTRRGRVKIDEVSRM); 配列番号286 (FRNTNRSLEYKNLPFTIPSM); 配列番号287 (HQVLDEAIKACKTMQVNNKG); 配列番号288 (CKTMQVNNKGIQIIYTRNHE); 配列番号289 (KAAWSLKELHTHQLCPRSSD); および配列番号290 (CLPLMQKFPKQVMVRIFSTN)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１３０】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUL18抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１３１】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号291 (GEINITFIHY); 配列番号292 (TENGSFVAGY); 配列番号293 (TMWCLTLFV); および配列番号308 (LELEIALGY)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１３２】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS2抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１３３】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号294 (LLVLFIVYV); 配列番号295 (SMMWMRFFV); 配列番号296 (TLLVLFIVYV); および配列番号297 (VYVTVDCNL)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１３４】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS3抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１３５】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号298 (YLFSLVVLV); 配列番号299 (TLLVYLFSL); 配列番号300 (LLFRTLLVYL); および配列番号301 (VYLFSLVVL)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１３６】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS6抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１３７】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号303 (LYLCCGITL)に示すアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１３８】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のUS11抗原の約9〜約20個連続したアミノ酸からなる単離されたペプチドであって、該抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなるもの、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１３９】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、
(i) 有効量の、配列番号302 (YYVECEPRC); 配列番号304 (TLFDEPPPLV); 配列番号305 (TPRVYYQTL); 配列番号306 (APVAGSMPEL); および配列番号307 (SESLVAKRY)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離されたペプチド、および、
(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、
を含有する上記組成物。
【請求項１４０】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチド、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１４１】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の請求項106に記載の単離されたポリエピトープペプチド、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１４２】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の請求項108に記載の単離されたポリエピトープペプチド、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１４３】
ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出すための予防用または治療用ワクチン組成物であって、(i) 有効量の請求項114に記載の単離されたポリエピトープペプチド、および(ii) 製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤またはアジュバント、を含有する上記組成物。
【請求項１４４】
前記アジュバントがサポニンまたはサポニン画分を含むサポニンアジュバントを含む、請求項114に記載の予防用または治療用ワクチン組成物。
【請求項１４５】
前記アジュバントがサポニンまたはサポニン画分を含むサポニンアジュバントを含む、請求項140に記載の予防用または治療用ワクチン組成物。
【請求項１４６】
前記アジュバントがサポニンまたはサポニン画分を含むサポニンアジュバントを含む、請求項141に記載の予防用または治療用ワクチン組成物。
【請求項１４７】
前記アジュバントがサポニンまたはサポニン画分を含むサポニンアジュバントを含む、請求項142に記載の予防用または治療用ワクチン組成物。
【請求項１４８】
前記アジュバントがサポニンまたはサポニン画分を含むサポニンアジュバントを含む、請求項143に記載の予防用または治療用ワクチン組成物。
【請求項１４９】
ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法であって、該被験者のCTLまたはCTL前駆体を活性化するのに十分な、有効量の請求項１に記載の単離されたペプチドを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１５０】
ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法であって、該被験者のCTLまたはCTL前駆体を活性化するのに十分な、有効量の請求項115に記載の予防用または治療用ワクチン組成物を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１５１】
前記被験者が、(i)潜伏HCMV感染を有する被験者、(ii)活動的なHCMV感染を有する被験者、(iii)免疫抑制状態の被験者、(iv)免疫無防備状態の被験者、(v)移植のレシピエント、および(vi) HCMV感染から生じる合併症を併発する危険のある被験者からなる群より選択される、請求項149または150に記載の方法。
【請求項１５２】
前記移植のレシピエントが骨髄移植のレシピエントである、請求項151に記載の方法。
【請求項１５３】
前記被験者が生殖能のある女性または妊娠女性である、請求項151に記載の方法。
【請求項１５４】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTから選択されるアッセイを含む方法を行なうことによりCTL活性化を判定することをさらに含む、請求項149または150に記載の方法。
【請求項１５５】
前記ペプチドまたはワクチン組成物を、CD8+ T細胞の増殖を誘発するまたは増強するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり投与する、請求項149または150に記載の方法。
【請求項１５６】
前記ペプチドまたはワクチン組成物を、前記被験者においてHCMV特異的細胞性免疫(CMI)を増強するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり投与する、請求項149または150に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ペプチドまたはワクチン組成物を注射により投与する、請求項149または150に記載の方法。
【請求項１５８】
ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法であって、前記被験者のCTLまたはCTL前駆体を活性化するのに十分な、有効量の請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチドを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１５９】
ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法であって、前記被験者のCTLまたはCTL前駆体を活性化するのに十分な、有効量の請求項141に記載の予防用または治療用ワクチン組成物を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１６０】
前記被験者が、(i)潜伏HCMV感染を有する被験者、(ii)活動的なHCMV感染を有する被験者、(iii)免疫抑制状態の被験者、(iv)免疫無防備状態の被験者、(v)移植のレシピエント、および(vi) HCMV感染から生じる合併症を併発する危険のある被験者からなる群より選択される、請求項158または159に記載の方法。
【請求項１６１】
前記移植のレシピエントが骨髄移植のレシピエントである、請求項160に記載の方法。
【請求項１６２】
前記被験者が生殖能のある女性または妊娠女性である、請求項160に記載の方法。
【請求項１６３】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTから選択されるアッセイを含む方法を行なうことによりCTL活性化を判定することをさらに含む、請求項158または159に記載の方法。
【請求項１６４】
前記ペプチドまたはワクチン組成物を、CD8+ T細胞の増殖を誘発するまたは増強するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり投与する、請求項158または159に記載の方法。
【請求項１６５】
前記ペプチドまたはワクチン組成物を、前記被験者においてHCMV特異的細胞性免疫(CMI)を増強するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり投与する、請求項158または159に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ペプチドまたはワクチン組成物を注射により投与する、請求項158または159に記載の方法。
【請求項１６７】
ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法であって、ヒト被験者から得られたＴ細胞に、該Ｔ細胞にHCMV反応性を賦与するのに十分な、有効量の請求項１に記載の単離されたペプチドをex vivoで接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項１６８】
ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法であって、ヒト被験者から得られたＴ細胞に、該Ｔ細胞にHCMV反応性を賦与するのに十分な、有効量の請求項115に記載の予防用または治療用ワクチン組成物をex vivoで接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項１６９】
反応性Ｔ細胞を自己由来として前記被験者に、または同種異系として別のヒト被験者に導入することをさらに含む、請求項167または168に記載の方法。
【請求項１７０】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項167または168に記載の方法。
【請求項１７１】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項170に記載の方法。
【請求項１７２】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項170に記載の方法。
【請求項１７３】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項167または168に記載の方法。
【請求項１７４】
ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法であって、ヒト被験者から得られたＴ細胞に、該Ｔ細胞にHCMV反応性を賦与するのに十分な、有効量の請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチドをex vivoで接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項１７５】
ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法であって、ヒト被験者から得られたＴ細胞に、該Ｔ細胞にHCMV反応性を賦与するのに十分な、有効量の請求項141に記載の予防用または治療用ワクチン組成物をex vivoで接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項１７６】
反応性Ｔ細胞を自己由来として前記被験者に、または同種異系として別のヒト被験者に導入することをさらに含む、請求項174または175に記載の方法。
【請求項１７７】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項174または175に記載の方法。
【請求項１７８】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項177に記載の方法。
【請求項１７９】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項177に記載の方法。
【請求項１８０】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項174または175に記載の方法。
【請求項１８１】
未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与または増強する方法であって、該被験者に、将来のHCMV感染に対する免疫記憶を賦与するのに十分な、有効量の請求項１に記載の単離されたペプチドを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１８２】
未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与または増強する方法であって、該被験者に、将来のHCMV感染に対する免疫記憶を賦与するのに十分な、有効量の請求項115に記載の予防用または治療用ワクチンを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１８３】
前記被験者が、(i)免疫抑制状態の被験者、(ii)免疫無防備状態の被験者、(iii)移植のレシピエント、および(iv) HCMV感染から生じる合併症を併発する危険のある被験者からなる群より選択される、請求項181または182に記載の方法。
【請求項１８４】
前記移植のレシピエントが骨髄移植のレシピエントである、請求項183に記載の方法。
【請求項１８５】
前記被験者が生殖能のある女性または妊娠女性である、請求項183に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ペプチドまたはワクチン組成物を注射により投与する、請求項181または182に記載の方法。
【請求項１８７】
未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与または増強する方法であって、該被験者に、将来のHCMV感染に対する免疫記憶を賦与するのに十分な、有効量の請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチドを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１８８】
未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与または増強する方法であって、該被験者に、将来のHCMV感染に対する免疫記憶を賦与するのに十分な、有効量の請求項141に記載の予防用または治療用ワクチンを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１８９】
前記被験者が、(i)免疫抑制状態の被験者、(ii)免疫無防備状態の被験者、(iii)移植のレシピエント、および(iv) HCMV感染から生じる合併症を併発する危険のある被験者からなる群より選択される、請求項187または188に記載の方法。
【請求項１９０】
前記移植のレシピエントが骨髄移植のレシピエントである、請求項189に記載の方法。
【請求項１９１】
前記被験者が生殖能のある女性または妊娠女性である、請求項189に記載の方法。
【請求項１９２】
前記ペプチドまたはワクチン組成物を注射により投与する、請求項187または188に記載の方法。
【請求項１９３】
未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与または増強する方法であって、ヒト被験者から得られたＴ細胞に、該Ｔ細胞にHCMV反応性を賦与するのに十分な、有効量の請求項１に記載の単離されたペプチドをex vivoで接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項１９４】
未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与または増強する方法であって、ヒト被験者から得られたＴ細胞に、該Ｔ細胞にHCMV反応性を賦与するのに十分な、有効量の請求項115に記載の予防用または治療用ワクチン組成物をex vivoで接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項１９５】
前記被験者において将来のHCMV感染に対する免疫記憶を賦与するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり、反応性Ｔ細胞を自己由来として前記被験者に、または同種異系として別のヒト被験者に導入することをさらに含む、請求項193または194に記載の方法。
【請求項１９６】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項193または194に記載の方法。
【請求項１９７】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項196に記載の方法。
【請求項１９８】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項196に記載の方法。
【請求項１９９】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項193または194に記載の方法。
【請求項２００】
未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与または増強する方法であって、ヒト被験者から得られたＴ細胞に、該Ｔ細胞にHCMV反応性を賦与するのに十分な、有効量の請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチドをex vivoで接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項２０１】
未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与または増強する方法であって、ヒト被験者から得られたＴ細胞に、該Ｔ細胞にHCMV反応性を賦与するのに十分な、有効量の請求項141に記載の予防用または治療用ワクチン組成物をex vivoで接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項２０２】
前記被験者において将来のHCMV感染に対する免疫記憶を賦与するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり、反応性Ｔ細胞を自己由来として前記被験者に、または同種異系として別のヒト被験者に導入することをさらに含む、請求項200または201に記載の方法。
【請求項２０３】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項200または201に記載の方法。
【請求項２０４】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項203に記載の方法。
【請求項２０５】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項203に記載の方法。
【請求項２０６】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項200または201に記載の方法。
【請求項２０７】
被験者が以前にHCMVに感染したことがあるか否かを判定するための方法であって、被験者から得られたＴ細胞に、請求項１に記載の単離されたペプチドで抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)をex vivoで接触させ、CTLまたはCTL前駆細胞の活性化を判定することを含んでなり、その際、CTLまたはCTL前駆細胞が活性化されれば、該被験者が以前にHCMVに感染したことがあることを示す、上記方法。
【請求項２０８】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTからなる群より選択されるアッセイを含む方法を行なうことにより、CTLまたはCTL前駆細胞の活性化を判定する、請求項207に記載の方法。
【請求項２０９】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項207に記載の方法。
【請求項２１０】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項209に記載の方法。
【請求項２１１】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項209に記載の方法。
【請求項２１２】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項207に記載の方法。
【請求項２１３】
被験者が以前にHCMVに感染したことがあるか否かを判定するための方法であって、被験者から得られたＴ細胞に、請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチドで抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)をex vivoで接触させ、CTLまたはCTL前駆細胞の活性化を判定することを含んでなり、その際、CTLまたはCTL前駆細胞が活性化されれば、該被験者が以前にHCMVに感染したことがあることを示す、上記方法。
【請求項２１４】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTからなる群より選択されるアッセイを含む方法を行なうことにより、CTLまたはCTL前駆細胞の活性化を判定する、請求項213に記載の方法。
【請求項２１５】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項213に記載の方法。
【請求項２１６】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項215に記載の方法。
【請求項２１７】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項215に記載の方法。
【請求項２１８】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項213に記載の方法。
【請求項２１９】
被験者が以前にHCMVに感染したことがあるか否かを判定するための方法であって、被験者から得られたＴ細胞に、請求項115に記載の予防用または治療用ワクチン組成物で抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)をex vivoで接触させ、CTLまたはCTL前駆細胞の活性化を判定することを含んでなり、その際、CTLまたはCTL前駆細胞が活性化されれば、該被験者が以前にHCMVに感染したことがあることを示す、上記方法。
【請求項２２０】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTからなる群より選択されるアッセイを含む方法を行なうことにより、CTLまたはCTL前駆細胞の活性化を判定する、請求項219に記載の方法。
【請求項２２１】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項219に記載の方法。
【請求項２２２】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項221に記載の方法。
【請求項２２３】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項221に記載の方法。
【請求項２２４】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項219に記載の方法。
【請求項２２５】
被験者が以前にHCMVに感染したことがあるか否かを判定するための方法であって、被験者から得られたＴ細胞に、請求項141に記載の予防用または治療用ワクチン組成物で抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)をex vivoで接触させ、CTLまたはCTL前駆細胞の活性化を判定することを含んでなり、その際、CTLまたはCTL前駆細胞が活性化されれば、該被験者が以前にHCMVに感染したことがあることを示す、上記方法。
【請求項２２６】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTからなる群より選択されるアッセイを含む方法を行なうことにより、CTLまたはCTL前駆細胞の活性化を判定する、請求項225に記載の方法。
【請求項２２７】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項225に記載の方法。
【請求項２２８】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項227に記載の方法。
【請求項２２９】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項227に記載の方法。
【請求項２３０】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項225に記載の方法。
【請求項２３１】
ヒト被験者におけるHCMV特異的細胞性免疫のレベルを測定するための方法であって、被験者から得られたＴ細胞に、請求項１に記載の単離されたペプチドで抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)をex vivoで接触させ、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルを測定することを含んでなり、その際、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルが該被験者のHCMV特異的細胞性免疫のレベルと相関する、上記方法。
【請求項２３２】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTからなる群より選択されるアッセイを含む方法を行なうことにより、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルを測定する、請求項231に記載の方法。
【請求項２３３】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項231に記載の方法。
【請求項２３４】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項233に記載の方法。
【請求項２３５】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項233に記載の方法。
【請求項２３６】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項231に記載の方法。
【請求項２３７】
ヒト被験者におけるHCMV特異的細胞性免疫のレベルを測定するための方法であって、被験者から得られたＴ細胞に、請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチドで抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)をex vivoで接触させ、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルを測定することを含んでなり、その際、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルが該被験者のHCMV特異的細胞性免疫のレベルと相関する、上記方法。
【請求項２３８】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTからなる群より選択されるアッセイを含む方法を行なうことにより、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルを測定する、請求項237に記載の方法。
【請求項２３９】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項237に記載の方法。
【請求項２４０】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項239に記載の方法。
【請求項２４１】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項239に記載の方法。
【請求項２４２】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項237に記載の方法。
【請求項２４３】
ヒト被験者におけるHCMV特異的細胞性免疫のレベルを測定するための方法であって、被験者から得られたＴ細胞に、請求項115に記載の予防用または治療用ワクチンで抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)をex vivoで接触させ、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルを測定することを含んでなり、その際、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルが該被験者のHCMV特異的細胞性免疫のレベルと相関する、上記方法。
【請求項２４４】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTからなる群より選択されるアッセイを含む方法を行なうことにより、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルを測定する、請求項243に記載の方法。
【請求項２４５】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項243に記載の方法。
【請求項２４６】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項245に記載の方法。
【請求項２４７】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項245に記載の方法。
【請求項２４８】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項243に記載の方法。
【請求項２４９】
ヒト被験者におけるHCMV特異的細胞性免疫のレベルを測定するための方法であって、被験者から得られたＴ細胞に、請求項141に記載の予防用または治療用ワクチンで抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)をex vivoで接触させ、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルを測定することを含んでなり、その際、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルが該被験者のHCMV特異的細胞性免疫のレベルと相関する、上記方法。
【請求項２５０】
MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生のアッセイ、サイトカインアッセイ、クロム放出アッセイ、およびELISPOTからなる群より選択されるアッセイを含む方法を行なうことにより、CTLまたはCTL前駆細胞活性化のレベルを測定する、請求項249に記載の方法。
【請求項２５１】
前記Ｔ細胞がヒト被験者から得られた生物学的検体中に含まれている、請求項249に記載の方法。
【請求項２５２】
生物学的検体が骨髄または胸腺を含んでなる、請求項251に記載の方法。
【請求項２５３】
前記検体が血液、末梢血単核細胞(PBMC)、またはバフィーコートを含んでなる、請求項251に記載の方法。
【請求項２５４】
前記被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項249に記載の方法。
【請求項２５５】
HCMV特異的CTLの作製方法であって、(i)Ｔ細胞を、請求項１に記載の単離されたペプチド、または該ペプチドで抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)、または該ペプチドで感作された自己リンパ芽球様細胞株(LCL)と接触させ、(ii)該Ｔ細胞を培養し、(iii)増殖するＴ細胞を選択する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項２５６】
HCMV特異的CTLを作製するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり、有効量の前記ペプチドを動物に投与することを含む方法により、CTLを作製する、請求項255に記載の方法。
【請求項２５７】
HCMV特異的CTLを作製するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり、Ｔ細胞に、前記ペプチド、または前記ペプチドで抗原刺激を受けたAPC、または前記ペプチドで感作された自己LCLをex vivoで接触させることを含む方法により、CTLを作製する、請求項255に記載の方法。
【請求項２５８】
被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項257に記載の方法。
【請求項２５９】
健康なHCMV血清反応陽性ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)を、前記ペプチドで感作された自己リンパ芽球様細胞株(LCL)で刺激することを含む方法を含んでなる、請求項257に記載の方法。
【請求項２６０】
前記Ｔ細胞またはAPCまたはLCLをサイトカインの存在下でペプチドと接触させる、請求項255に記載の方法。
【請求項２６１】
サイトカインがIL-2である、請求項260に記載の方法。
【請求項２６２】
請求項255に記載の方法により作製されたHCMV特異的CTLクローン。
【請求項２６３】
HCMV特異的CTLの作製方法であって、(i)Ｔ細胞を、請求項102に記載の単離されたポリエピトープペプチド、または該ペプチドで抗原刺激を受けた抗原提示細胞(APC)、または該ペプチドで感作された自己リンパ芽球様細胞株(LCL)と接触させ、(ii)該Ｔ細胞を培養し、(iii)増殖するＴ細胞を選択する、ことを含んでなる上記方法。
【請求項２６４】
HCMV特異的CTLを作製するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり、有効量の前記ペプチドを動物に投与することを含む方法により、CTLを作製する、請求項263に記載の方法。
【請求項２６５】
HCMV特異的CTLを作製するのに十分な条件下で、十分な期間にわたり、Ｔ細胞に、前記ペプチド、または前記ペプチドで抗原刺激を受けたAPC、または前記ペプチドで感作された自己LCLをex vivoで接触させることを含む方法により、CTLを作製する、請求項263に記載の方法。
【請求項２６６】
被験者からＴ細胞を含む検体を取得することをさらに含む、請求項265に記載の方法。
【請求項２６７】
健康なHCMV血清反応陽性ドナー由来の末梢血単核細胞(PBMC)を、前記ペプチドで感作された自己リンパ芽球様細胞株(LCL)で刺激することを含む方法を含んでなる、請求項265に記載の方法。
【請求項２６８】
前記Ｔ細胞またはAPCまたはLCLをサイトカインの存在下でペプチドと接触させる、請求項263に記載の方法。
【請求項２６９】
サイトカインがIL-2である、請求項268に記載の方法。
【請求項２７０】
請求項263に記載の方法により作製されたHCMV特異的CTLクローン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトメガロウイルス(CMV)に対するCTL応答を惹起させるための単離されたペプチドエピトープおよびそれを含む組成物に関する。特に、本発明は、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)由来の1以上のCTLエピトープを含む単離されたペプチド、ならびにCMV感染からヒトを予防または治療処置するための該エピトープを含むワクチン組成物に関する。本発明はまた、HCMVペプチドエピトープを認識することができる単離されたＴ細胞、ならびにそのようなＴ細胞を作製する方法を提供する。単離されたペプチドエピトープおよびＴ細胞は、様々な臨床的背景（例えば、移植）での免疫応答のモニタリングに、また、HCMV感染の診断に、特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
1.  一般情報
本明細書には、要約書の後に提示される、PatentIn Version 3.1を使って作成したアミノ酸配列情報が含まれる。各配列は配列表において数値表示<210>、これに続く配列識別子（例えば、<210>1、<210>2など）により同定される。各配列の長さおよび起源生物は、それぞれ数値表示分野<211>および<213>に提供される情報により示される。本明細書中で言及する配列は、「配列番号」という語と、これに続く配列識別子により規定される（例えば、配列番号１は<400>1と指定された配列をさす）。
【０００３】
本明細書中で用いる「から誘導された」または「由来の」とは、特定された完全体(integer)が、必ずしも直接的でなくてもよいが、特定の源から得られることを示すと解釈される。
【０００４】
本明細書中に単数の完全体、ステップまたは要素として記載される本発明の完全体、ステップまたは要素は、特に断らないかぎり、単数形と複数形の両方の記載された完全体、ステップまたは要素を包含するものとする。
【０００５】
本明細書全体を通して、特に断らないかぎり、「含む」という語、またはその変形である「含んでなる」もしくは「含有する」などの語は、記載された1つのステップ、要素または完全体、あるいはグループとしてのステップ、要素または完全体を含めることを意味するが、他のどのようなステップ、要素または完全体またはそれらのグループをも排除するものでないことが理解されよう。
【０００６】
当業者であれば、本明細書に記載した本発明が特に記載したもの以外の改変および修飾を受け入れることができることを認識するであろう。本発明はすべてのそのような改変および修飾を含むことを理解すべきである。本発明はまた、本明細書中で言及されるまたは示されるステップ、特徴、組成物および化合物のすべてを個々にまたは集合的に含み、また、前記ステップまたは特徴の2以上の任意のまたはすべての組合せを含むものである。
【０００７】
本発明は本明細書に記載される特定の実施例によってその範囲が限定されるものではない。機能的に同等の産物、組成物および方法は、明らかにここに記載する本発明の範囲内にある。
【０００８】
本出願で引用される全ての文献は、参考として本明細書に特に含めるものとする。
【０００９】
本発明は、特に断らないかぎり、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えDNA法、液相ペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の慣用技法を用いて、過度の実験を行なうことなく実施される。そのような手法は例えば、参考として本明細書に組み入れられる以下の文献に記載されている：
1.    Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vols I, IIおよびIIIの全体;
2.    DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. IおよびII (D. N. Glover編, 1985), IRL Press, Oxford, 文献全体;
3.    Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach  (M. J. Gait編, 1984) IRL Press, Oxford, 文献全体、特にGait, pp1-22; Atkinsonら, pp35-81; Sproatら, pp 83-115; およびWuら, pp 135-151に記載の論文;
4.    Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins編, 1985) IRL Press, Oxford, 文献全体;
5.    Animal Cell Culture: Practical Approach, 第3版 (John R.W. Masters編, 2000), ISBN 0199637970, 文献全体;
6.    Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, 文献全体;
7.    Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);
8.    Methods In Enzymology (S. ColowickおよびN. Kaplan編, Academic Press, Inc.), シリーズ全体;
9.    J.F. Ramalho Ortigao, “The Chemistry of Peptide Synthesis” In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (バーチャル実験室ウェブサイトへのアクセスの情報データベース) (Interactiva, Germany);
10.    Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342;
11.    Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154;
12.    Barany, G.およびMerrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E.およびMeienhofer, J.編), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York.
13.    Wunsch, E.編 (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muler, E.編), vol. 15, 4th edn., パート1および2, Thieme, Stuttgart.
14.    Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.
15.    Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.
16.    Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474.
17.    Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編, 1986, Blackwell Scientific Publications).
【００１０】
2.  関連技術の説明
HCMVはヘルペスウイルス科のβ亜科に分類され、厳格に宿主種特異的な大型のDNAウイルスで、約170〜200の抗原的に明確に区別されるポリペプチドをコードしている。HCMVはあらゆる地域のあらゆる社会経済層に普遍的に見出されており、成人の50〜85％が感染している (AlfordおよびBritt, In: Virology, 第2版, Fieldsら編, Raven Press, 1990)。
【００１１】
生後一次HCMV感染を獲得する大部分の健康な人々の場合は、症状がほとんど現れず、長期的な健康上の問題もまったく存在しない。時折、一次HCMV感染にかかっている一部の成人に、長期発熱を伴う単核症様症候群の症状と軽い肝炎が認められる。いったんHCMVに感染すると、ウイルスは潜伏感染細胞の貯蔵所（これらの細胞からウイルス増殖(溶解)周期への慢性的な低度の再活性化が生涯を通して起こる）を確立することによって休止状態に入る。潜伏性および再活性化を制御している因子は十分には理解されていないが、生体細胞により媒介される免疫系が、薬物による免疫抑制処置または特定の病原体による感染のいずれかにより損なわれると、ウイルスがきまって再活性化される (ZaiaおよびForman, Infect Dis Clin North Am 9, 879-900, 1995)。
【００１２】
HCMV感染が死亡率の主な原因となる臨床状態が存在する。例えば、HCMV感染は子宮内の胎児、子供と一緒に仕事をしている人たち、HIV-1に感染している人や臓器移植を受けた人などの免疫無防備状態の個体には重大な健康上のリスクを伴う (Britt, Trends Microbiol 4, 34-81, 1996; Plotkin, Pediatr Infect Dis J 18, 313-325, 1999)。
【００１３】
特に子宮内の胎児への健康上のリスクに関して、それらのリスクは妊娠中に初めて感染することとなった非免疫母体にもっぱら関係していると考えられる (Fowlerら, New Engl J Med 326, 663-667, 1992; Murphら, In: Epidemiology of congenital cytomegalovirus infection: maternal risk factors and molecular analysis cytomegalovirus strains. 1998)。疫学的な調査から、先天的HCMV感染を獲得する発育中の胎児の80〜90％は、生後2,3年以内に、難聴、視覚障害、精神遅滞をはじめとする様々なパターンの病理学的余病を呈することが分かっている。誕生時に感染しているものの症状が現れていない別の5〜10％の幼児は、その後、様々な程度の聴覚上の、また、精神もしくは協調行為上の問題を抱えることとなろう。1996年だけで、ヨーロッパと米国においてHCMVに起因する余病または死亡の症例が17,000例を上回ると推定された (Plotkin, Pediatr Infect Dis J 18, 313-325, 1999)。
【００１４】
さらに、最近の研究は、冠動脈形成術を受けたHCMV血清反応陽性個体が血清反応陰性患者よりも高頻度で再狭窄を起こすことを提起している (Field, Antivir Chem Chemother 10, 219-232, 1999)が、因果関係はまだ解明されていない。
【００１５】
また、こうした高リスクグループに属している個体の場合は、HCMV負荷量(load)を減らすことにより大きな治療上の効果が得られる可能性が存在している。したがって、そのようなHCMV負荷量の減少をもたらす有効なワクチンが必要とされている。
【００１６】
これまでに、弱毒化HCMV株またはサブユニットワクチンのいずれかを用いて、HCMVに対するワクチンを設計しようとする試みがいくつかなされている(Britt, Trends Microbiol 4, 34-81, 1996; Plotkin, Pediatr Infect Dis J 18, 313-325, 1999を参照のこと)。
【００１７】
HCMVに対する最初のワクチンは、例えば、Towne株やAD-169株のようなHCMVの弱毒化株を用いる免疫感作に基づいていた (ElekおよびStern, Lancet 1, 1-5, 1974; Neffら, Proc Soc Exp Biol Med 160, 32-37, 1979)。両方の弱毒化ウイルスとも細胞性および体液性免疫応答を引き出すことが見出されたが、どちらのワクチンも一次HCMV感染を経験する妊娠女性において胎児感染を予防できなかった。さらに、ワクチンを接種された健常ボランティアは、HCMV Toledo株を用いたウイルスチャレンジに対して限られた防御を示した (Quinnanら, Ann Intern Med 101, 478-483, 1984; Adlerら, Pediatr Infect Dis J. 17, 200-206, 1998)。
【００１８】
サブユニットワクチンは、例えば、全長糖タンパク質B（gB）ポリペプチドをMF59アジュバントと組み合わせたもの(Chiron)、あるいはまた、ウイルスベクターを用いて発現させた組換え全長gBポリペプチドといった、単一HCMV抗原製剤に基づくものであった (Passら, J Infect Dis 180, 970-975, 1999; Adlerら, J Infect Dis 180, 843-846, 1999)。さらに、最近では、全長組換えHCMV pp65ポリペプチドを発現するカナリア痘ウイルスが臨床試験にかけられて、この抗原に対して強力なCTLおよび抗体応答を惹起することが示された (Gyulaiら, Proceedings of the Seventh International Cytomegalovirus Workshop, Brighton, UK, March 7-9, 1999, abstract)。
【００１９】
しかしながら、1以上の全長HCMV抗原に基づくワクチン製剤はいくつかの制限を課すように思われる。例えば、pp65のようなHCMVタンパク質の発現は、関連するキナーゼ活性によりIE-1のプロテアソームプロセッシングを阻害することがある (Gilbertら, Nature 383, 720, 1996)。さらに、初期のHCMV感染と関連する他の遺伝子も、MHCクラスIプロセッシング経路および提示の様々な段階を妨げることが知られている (Reddehase, Curr. Opin. Immunol. 12, 390-396, 2000)。
【００２０】
CTLエピトープに基づくワクチンは、全長HCMV抗原の使用と関係していると考えられる制限を克服するための代替法を提供する。しかし、ヒト集団におけるHLA多型の程度が大きいため、このことが規定CTLエピトープをワクチンとして実際に使用することの大きな障害となっている。pan-HLA-DRヘルパーＴ細胞エピトープと1以上のパルミチン酸分子に連結された単一のHCMV pp65特異的CTLエピトープ(NLVPMVATV; 配列番号５)に基づいたワクチンが目下研究されつつある (Zaiaら, Hematol. (Am. Soc. Hematol. Educat. Program.) 339-355, 2000; La Rosaら, Blood 97,  1776-1786, 2001)。
【００２１】
HCMVに対するサブユニットワクチンに関しては、HCMVに対する防御が単一のビリオン抗原に対する細胞性免疫を引き出すことによって達成可能であると一応考えられる。健康なHCMVウイルス保持者においては、pp150、IE-1およびgH（これらもHCMV再活性化を制御するうえで重大な役割を果たしうる）のような他のビリオン抗原に対しても亜優性(subdominant)Ｔ細胞応答が誘導されるという証拠が存在する (Britt, Trends Microbiol 4, 34-38, 1996; Ito, Nippon Rinsho 56, 62-68, 1998を参照のこと)。
【００２２】
明らかに、HCMVに対する有効なワクチンの開発には、細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)防御応答を活性化するウイルス抗原の解明ならびにこうした抗原内部の免疫優性(immunodominant)CTLエピトープの決定が必要である。
【００２３】
CTLエピトープは2つの免疫優性HCMVポリペプチド、特にpp65およびIE-1について記載されている (Borysiewiczら, J. Exp. Med. 168, 919, 1988; Sissons, J. Royal. Coll. Phys., Lond. 20, 40, 1986; Willsら, J. Virol. 70, 7569, 1996; Kernら, Intervirology 42, 322, 1999; Weekesら, J. Virol. 73, 2099, 1999; Reddehase, Curr. Opin. Immunol. 12, 390-396, 2000)。
【００２４】
HCMV pp65から誘導される代表的な公知のCTLエピトープは配列番号１〜17および55に関連づけて本明細書に記載される。配列番号１〜17に示すエピトープは下記のHLA拘束をもつとして記載される：
1.    SVLGPISGHVLK (配列番号１) はHLA A*11xxに拘束される (Diamond, USSN 6,074,645, June 13, 2000);
2.    FTSQYRIQGKL (配列番号２) はHLA A*2402に拘束される (Longmateら, Immunogenet. 52, 165-173, 2000);
3.    FVFPTKDVALR (配列番号３) はHLA A*68xxに拘束される (Longmateら, Immunogenet. 52, 165-173, 2000);
4.    FPTKDVAL (配列番号４) はHLA B*35xxに拘束される (Diamond USSN 6,074,645, June 13, 2000);
5.    NLVPMVATV (配列番号５) はHLA A*02xxに拘束される (Willsら, J. Virol. 70, 7569-7579, 1996);
6.    MLNIPSINV (配列番号６) はHLA A*0201に拘束される (Solacheら, J. Immunol. 163, 5512-5518, 1999);
7.    RIFAELEGV (配列番号７) はHLA A*0201に拘束される (Diamondら, Blood 90, 1751-1767, 1997);
8.    TPRVTGGGGAM (配列番号８) はHLA B*07xxに拘束される (Willsら, J. Virol. 70, 7569-7579, 1996; Kernら, Nature Med. 4, 975-978, 1998; Diamond USSN 6,074,645, June 13, 2000);
9.    RPHERNGFTVL (配列番号９) はHLA B*07xxに拘束される (Weekesら, J. Virol. 73, 2099-2108, 1999; Diamond USSN 6,074,645, June 13, 2000);
10.    RLLQTGIHV (配列番号10) はHLA A*0201に拘束される (Solacheら, J. Immunol. 163, 5512-5518, 1999);
11.    VIGDQYVKV (配列番号11) はHLA A*0201に拘束される (Solacheら, J. Immunol. 163, 5512-5518, 1999);
12.    ALFFFDIDL(配列番号12) はHLA A*0201に拘束される (Solacheら, J. Immunol. 163, 5512-5518, 1999);
13.    YSEHPTFTSQY (配列番号13) HLA A*01xxに拘束される (Diamond, USSN 6,074,645, June 13, 2000);
14.    VLCPKNMII (配列番号14) はHLA A*0201に拘束される (Solacheら, J. Immunol. 163, 5512-5518, 1999);
15.    DIYRIFAEL (配列番号15) はHLA A*0201に拘束される (Solacheら, J. Immunol. 163, 5512-5518, 1999);
16.    ILARNLVPMV (配列番号16) はHLA A*0201に拘束される (Diamondら, Blood 90, 1751-1767, 1997; Solacheら, J. Immunol. 163, 5512-5518, 1999); および
17.    EFFWDANDIY (配列番号17) はHLA B*44xxに拘束される (Longmateら, Immunogenet. 52, 165-173, 2000)。
【００２５】
配列番号55に示すエピトープは、Gavinら, J Immunol. 151, 3971-3980, 1993に記載されたものである。
【００２６】
HCMV IE-1から誘導される代表的な公知のCTLエピトープは配列番号18〜20に関連づけて本明細書に記載される。これらのエピトープはそれぞれ下記のHLA拘束性をもつとして記載される：
1.    YILEETSVM (配列番号18) はHLA A*02xxに拘束される (Retiereら, J. Virol. 74, 3948-3952, 2000);
2.    CVETMCNEY (配列番号19) はHLA B*18xxに拘束される (Retiereら, J. Virol. 74, 3948-3952, 2000); および
3.    RRIEEICMK (配列番号20) はHLA B*27xxに拘束される (Salquinら, Eur. J. Immunol. 30, 2531-2539, 2000)。
【００２７】
また、pp65またはIE-1以外のHCMV抗原（例えば、HCMV pp150およびHCMV gB）がHCMV感染のCTL防御を引き出すのに有用でありうることを示唆する証拠がいくつかあるにはあるが、こうした抗原の有用性に関する情報は限られている (Gyulaiら, J. Infect. Dis. 181, 537-546, 2000)。HCMV pp150由来の代表的な公知のCTLエピトープは、下記のHLA拘束をもつとして配列番号21に記載される：
1.    TTVYPPSSTAK (配列番号21) はHLA A*0301に拘束される (Longmateら, Immunogenet. 52, 165-173, 2001)。
【発明の開示】
【００２８】
発明の概要
本発明へと至る研究において、本発明者らは、異なる感染段階で発現されてHCMV関連疾患の全体的な病因に重要な役割を担っている多種多様なHCMV抗原、特にpp28、pp50、pp65、pp150、pp71、gH、gB、IE-1、IE-2、US2、US3、US6、US11およびUL18に対するCTL応答を包括的にマッピングしようとした。
【００２９】
予測アルゴリズムELISPOTおよび細胞傷害性アッセイの使用に基づいた非常に効率がよくしかも迅速なストラテジーを用いて、24人の健康なウイルス保持者の集団においてHCMVに対するHLAクラスI拘束性CTL応答を包括的にプロファイリングした。コンピュータに基づくアルゴリズムおよびペプチド安定化アッセイを用いた、これらのHCMV抗原配列の予備的な分析により、これらの抗原はCTLエピトープを含んでいることが強く示唆された。その後、血清反応陽性ドナー由来の末梢血Ｔ細胞においてCTL活性を誘導する合成ペプチドの能力について、ELISPOTでのIFN-γ産生により測定して、試験した。
【００３０】
本発明者らはまた、細胞傷害性アッセイで強い応答を示した血清反応陽性ドナーからの多クローン性CTLとクローン化CTLの両方を単離し、それにより合成ペプチドで感作した、あるいは個々のHCMV抗原をコードする組換えワクシニアを感染させた標的細胞に対する強力な細胞溶解活性を確認した。
【００３１】
上記のアプローチを用いて、本発明者らは、新規なHCMV CTLエピトープを多数同定し、これらのエピトープは、HCMVに対するワクチンを処方したり、他の方法でHCMV免疫防御を調節したりするために利用でき、また、HCMVをアッセイするための診断用試薬として、あるいは移植後もしくは妊娠中のHCMV特異的Ｔ細胞媒介免疫の回復に利用できる。いくつかの以前に記載されたCTLエピトープの同定も本発明者らによって確認された。本発明者らは、HCMVに対するCD8+ CTL応答が、pp65、IE-1またはpp150にのみ制限されない複数の抗原特異的活性をしばしば含んでいることを明らかにした。事実、40％を上回るCTLエピトープがpp65およびIE-1（これらは以前にはCTL防御のための一次抗原であると考えられた）以外の抗原に位置づけられる。多数のHCMV抗原が本発明者らによって初めてHCMV特異的細胞性免疫の標的として同定された。興味深いことに、これらの活性はUS2、US3およびUL18のようなHCMVコード化免疫調節物質に対する亜優性Ｔ細胞応答も含んでいた。クローン分析は、例えば、pp28、pp50、pp65、pp150、gB、gH、US2、IE-1およびIE-2などの抗原に対する新規な個々の応答を明らかにした。健康なウイルス保持者の集団からのHCMV特異的CTL応答の全レパートリーは、試験したほとんどの抗原にわたって分配されている。
【００３２】
新規なCTLエピトープにより認識されるいくつかのHLA拘束性決定基が、以前に記載された特定のHCMV CTLエピトープの新しいHLA拘束性決定基に加えて、明確に規定された。
【００３３】
本発明者らはまた、ワクチン製剤において使用するための、複数のHCMVエピトープを含む新規なポリエピトープをデザインした。
【００３４】
本発明者らはまた、本発明の新規なエピトープおよびポリエピトープに基づくワクチン製剤をデザインした。好ましくは、ヒト集団においてHCMVからの広範な保護をもたらす有効なCTLエピトープに基づいたHCMVワクチンは、pp65およびIE-1由来のエピトープだけでなく、初期、後期および潜伏感染時に発現されるその他のゲノム領域をも含有する。
【００３５】
したがって、本発明の一つの態様は、HCMV抗原の１以上のCTLエピトープを含む免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体またはその機能的に同等の変異体に関し、好ましくは、前記ペプチドはヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を惹起することができるものである。前記ペプチドは、HCMVに感染したヒト細胞を認識して溶解するヒト被験者のCTLを誘導し、それによってHCMVに対する細胞性免疫を賦与または増強することが好ましい。望ましくは、前記の免疫学的に活性なペプチドは、MHCクラスI分子と会合して、健康なHCMV血清反応陽性被験者または潜伏もしくは不活性HCMV感染を有する被験者のCTLにより認識される。
【００３６】
好ましくは、本発明の免疫学的に活性なペプチドはHLAスーパータイプ（超型）特異性を呈示するものである。そのようなエピトープは明らかにワクチン製剤で使用するのに好適である。なぜなら、かかるエピトープは民族・人種にかかわりなく集団の大多数をカバーするのに必要なエピトープの総数を減らし、それによりワクチン処方上の困難を最小限に抑えるからである。
【００３７】
望ましくは、本発明の免疫学的に活性なペプチドは、HCMVに感染したヒト被験者の抗原提示細胞(APC)の表面上のMHCクラスII分子のもとでヘルパーＴ細胞機能を促進するのに十分な、１以上のCD4+決定基をさらに含むものである。例えば、本発明者らは、本明細書において、連続するまたは重複するCTLエピトープとヘルパーＴ細胞エピトープの機能を有する数種の20-merペプチドを提供するが、これらのペプチドの能力はそれらがCD4+細胞とCD8+細胞の両方に結合できることで証明される。そのようなペプチドは、ワクチン製剤中に外因性のヘルパーＴ細胞エピトープを必ずしも含める必要がないという、最小CTLエピトープに優る利点を有している。
【００３８】
第二の態様において、本発明は、HCMV抗原のポリエピトープ（すなわち、2つ以上の明確に区別されるエピトープ）を含む免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体またはその機能的に同等の変異体に関し、好ましくは、前記ペプチドはヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を惹起することができるものである。
【００３９】
好ましくは、前記ポリエピトープは単一のMHCクラスIハプロタイプに拘束されない。さらに一層好ましくは、前記ポリエピトープは、人種の起源や民族にかかわりなく、一般集団の少なくとも約35％、好ましくは少なくとも約55％、より好ましくは少なくとも約75％、さらに一層好ましくは少なくとも約95％をカバーするのに十分な数のMHCクラスI分子に対して特異的である。当業者であれば、本明細書中に提供されるHLA特異性データから、所与の集団をカバーするのに必要な個々のHCMV CTLエピトープの数を容易に決定できるだろう。単一のエピトープの場合と同様に、本発明のポリエピトープはHLAスーパータイプ特異性を呈示し、かつ／または、HCMVに感染したヒト被験者においてヘルパーＴ細胞機能を促進するのに十分な１以上のCD4+決定基を含むことが好ましい。
【００４０】
本発明の別の態様は、ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を惹起するための予防用または治療用ワクチン組成物に関する。前記組成物は、本発明の免疫学的に活性なペプチド（すなわち、エピトープまたはポリエピトープ）を製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤および／またはアジュバントと共に含有する。ワクチン組成物は2種以上のエピトープまたはポリエピトープを含んでいてもよい。本発明のワクチン組成物は、1種以上の免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体またはその機能的に同等の変異体を含むサブユニットワクチン、あるいは、適当なベクター（例えば、ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、または他の真核生物ウイルスベクター）にクローニングされた、免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体をコードする核酸（例えば、DNAまたはRNA）を含む核酸ベースのワクチンであり得る。あるいはまた、前記ペプチドまたは誘導体または変異体は、表面に該ペプチドを提示するように処理された自己由来または同種異系の抗原提示細胞(APC)または樹状細胞の投与によって細胞性ワクチンとして製剤化される。
【００４１】
関連する実施形態において、本発明は、ヒト被験者における潜伏HCMV感染の治療的処置を含めて、ヒト被験者におけるHCMV感染の予防または治療的処置に使用するためのワクチン組成物の製造における、本発明の免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体の使用を提供する。
【００４２】
関連する実施形態において、本発明は、移植前、移植中または移植後のヒト被験者の免疫機能を高めるのに使用するためのワクチン組成物の製造における、本発明の免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体の使用を提供する。ただし、前記被験者は潜伏HCMV感染を有するか、またはHCMVに感染する危険があるヒトである。
【００４３】
本発明の別の態様は、ヒト被験者の免疫系を高める方法に関し、該方法は、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物を、該被験者のCTLおよび／またはCTL前駆細胞を活性化するのに十分な条件下でかつ十分な期間にわたり、投与することを含んでなる。
【００４４】
関連する実施形態において、本発明は、ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を高める方法に関し、該方法は、ヒト被験者から得られたＴ細胞と、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物とを、該Ｔ細胞にHCMV活性を賦与するのに十分な条件下でかつ十分な期間にわたり、ex vivo接触させることを含んでなる。
【００４５】
本発明の別の態様は、未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与するまたは高める方法に関し、該方法は、該被験者に、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物を、将来のHCMV感染に対する免疫学的記憶を提供するのに十分な条件下でかつ十分な期間にわたり、投与することを含んでなる。
【００４６】
本発明の別の態様は、未感染のヒト被験者においてHCMVに対する免疫を高めるまたは賦与する方法に関し、該方法は、ヒト被験者から得られたＴ細胞と、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物とを、該Ｔ細胞にHCMV活性を賦与するのに十分な条件下でかつ十分な期間にわたり、ex vivo接触させることを含んでなる。
【００４７】
本明細書中の記載から明らかなように、本発明の免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物は、in vitroでCTLまたは前駆細胞CTLを直接刺激するのに有用である。当業者に公知の適切なアッセイ法を用いると、本発明のペプチドまたはその誘導体もしくは機能的に同等の変異体、あるいは該ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含む組成物は、ヒト被験者におけるHCMV特異的免疫のレベルを測定するのに有用であり、前記被験者は、一次HCMV感染を有するか、またはHCMV感染もしくはHCMV感染の再活性化の危険があるヒト、例えば、移植患者、HIV感染者、生殖能のある女性または妊娠女性である。関連する実施形態において、本発明のペプチドまたは組成物は、HCMVにまだ曝されていない個体（すなわち、血清反応陰性個体）から血清反応陽性個体を識別するのにも有用である。
【００４８】
したがって、本発明の別の態様は、ヒト被験者においてHCMV特異的Ｔ細胞免疫を定性的または定量的にモニタリングするための診断方法に関し、該方法は、ヒト被験者から得られたＴ細胞と、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性なペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物で抗原刺激を受けたAPCとを、ex vivo接触させ、CTLまたは前駆細胞CTLの活性化を測定することを含んでなり、その際、前記CTLまたは前駆細胞CTLの活性化により、該被験者が以前にHCMVに感染していることが示される。
【００４９】
本発明の別の態様は、HCMVに感染したヒト細胞と結合するまたは該ヒト細胞を溶解する能力がある単離されたCTLまたは前駆細胞CTLを作製する方法に関し、該方法は、Ｔ細胞と、本発明の単離されたペプチドまたは本発明の単離されたペプチドで抗原刺激を受けたAPCとを接触させ、該Ｔ細胞を培養して、増殖するＴ細胞を選択することを含んでなる。場合により、Ｔ細胞はIL-2のようなサイトカインの存在下でペプチドと接触させてもよい。
【００５０】
明らかに、本発明は、本明細書に記載の新規な免疫学的に活性なペプチドを用いて作製されたＴ細胞クローン、ならびに、ヒト被験者、例えば、臓器移植（例えば、BMT）前、移植中、移植後、または妊娠中のヒト被験者においてHCMV感染、HCMV感染の潜伏性、HCMV感染の可能性をモニタリングするための診断、予防または治療法における前記Ｔ細胞クローンの使用にまで及んでいる。
【００５１】
好ましい実施形態の詳細な説明
1.  単離されたHCMVエピトープ
本発明の一つの態様は、pp28、pp50、pp65、pp71、pp150、gB、gH、IE-1、IE-2、US2、US3、US6、US11およびUL18からなる群より選択されるヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の抗原の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含んでなる単離されたペプチドまたは該ペプチドの誘導体もしくは機能的に同等の変異体を提供し、前記ペプチドは前記抗原の約9〜約20個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列からなり、ここにおいて、
(i)  pp65のCTLエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：配列番号22 (SQEPMSIYVY); 配列番号23 (ATVQGQNLKY); 配列番号24 (IRETVELRQY); 配列番号25 (IGDQYVKVY); 配列番号26 (TVQGQNLKY); 配列番号27 (YRIQGKLEY); 配列番号28 (QVIGDQYVK); 配列番号29 (LLLQRGPQY); 配列番号30 (RVTGGGAMA); 配列番号31 (GVMTRGRLK); 配列番号32 (VYALPLKML); 配列番号33 (QYDPVAALF); 配列番号34 (VYYTSAFVF); 配列番号35 (DVPSGKLFM); 配列番号36 (DIDLLLQRG); 配列番号37 (YVKVYLESF); 配列番号38 (TVQGQNLKY); 配列番号39 (EPMSIYVYAL); 配列番号40 (HVRVSQPSL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号43 (QPKRRRHRQ); 配列番号44 (LCPKSIPGL); 配列番号45 (YRIQGKLEY); 配列番号46 (YSEHPTFTSQY); 配列番号47 (SEHPTFTSQY); 配列番号48 (CEDVPSGKLF); 配列番号49 (NEIHNPAVF); 配列番号50 (RETVELRQY); 配列番号51 (QEPMSIYVY); 配列番号52 (QMWQARLTV); 配列番号53 (LMNGQQIFL); 配列番号54 (ILARNLVPM); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号57 (QEFFWDANDI); 配列番号58 (QYRIQGKLE); 配列番号59 (RKHRHLPVADAV); 配列番号60 (DPVAALFFF); 配列番号61 (PGKISHIMLDVA); 配列番号62 (TRATKMQVI); 配列番号63 (QAIRETVEL); 配列番号64 (YHRTWDRHEGA); 配列番号65 (FMRPHERNGFTV); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号67 (LNIPSINVHHYPSAAERKHR); 配列番号68 (ATVQGQNLKYQEFFWDANDI); 配列番号69 (QEFFWDANDIYRIFAELEGV); 配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号71 (SQYRIQGKLEYRHTWDRHDE); 配列番号72 (VFTWPPWQAGILARNLVPMV); 配列番号73 (ILARNLVPMVATVQGQNLKY); 配列番号74 (DQYVKVYLESFCEDVPSGKL); 配列番号75 (YPSAAERKHRHLPVADAVIH); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号78 (AHELVCSMENTRATKMQVIG); 配列番号79 (TRATKMQVIGDQYVKVYLES); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号82 (LTVSGLAWTRQQNQWKEPDV); 配列番号83 (WQPAAQPKRRRHRQDALPGP); 配列番号84 (YRHTWDRHDEGAAQGDDDVW); 配列番号85 (TSAGRKRKSASSATACTSGV); 配列番号86 (HRQDALPGPCIASTPKKHRG); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号88 (VTTERKTPRVTGGGAMAGAS); 配列番号89 (QPFMRPHERNGFTVLCPKNM); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); 配列番号91 (IYVYALPLKMLNIPSINVHH); 配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT); 配列番号93 (GAAQGDDDVWTSGSDSDEEL); 配列番号94 (TGGGAMAGASTSAGRKRKSA); および配列番号95 (KDVALRHVVCAHELVCSMEN);
【００５２】
(ii)  IE-1のCTLエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：配列番号96 (SLLSEFCRV); 配列番号97 (VLAELVKQI); 配列番号98 (ILGADPLRV); 配列番号99 (TMYGGISLL); 配列番号100 (LLSEFCRVL); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号102 (CLQNALDIL); 配列番号103 (ILDEERDKV); 配列番号104 (IKEHMLKKY); 配列番号105 (DEEEAIVAY); 配列番号106 (KLGGALQAK); 配列番号107 (QYILGADPL); 配列番号108 (KYTQTEEKF); 配列番号109 (KARAKKDEL); 配列番号110 (VMKRRIEEI); 配列番号111 (RHRIKEHML); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号114 (ELKRKMMYM); 配列番号115 (RRKMMYMCY); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号117 (CSPDEIMAYAQKIFKILDEE); 配列番号118 (SEPVSEIEEVAPEEEEDGAE); 配列番号119 (VLCCYVLEETSVMLAKRPLI); 配列番号120 (RRKMMYMCYRNIEFFTKNSA); および配列番号121 (NIEFFTKNSAFPKTTNGCSQ);
【００５３】
(iii)  pp150のCTLエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：配列番号122 (GQTEPIAFV); 配列番号130 (RPSTPRAAV); 配列番号131 (SPWAPTAPL); 配列番号132 (KARDHLAVL); 配列番号133 (WPRERAWAL); 配列番号134 (NVRRSWEEL); 配列番号138 (RIEENLEGV); 配列番号139 (PLIPTTAVI); 配列番号140 (LIEDFDIYV); 配列番号141 (KMSVRETLV); 配列番号142 (FLGARSPSL); 配列番号143 (ALVNAVNKL); 配列番号144 (ALVNFLRHL); 配列番号145 (NILQKIEKI); 配列番号146 (ERAWALKNPHLA); 配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR); 配列番号148 (STSQKPVLGKRVATPHASAR); および配列番号149 (HANTALVNAVNKLVYTGRLI)。
【００５４】
特に好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、長さが約8〜12アミノ酸または約19〜21アミノ酸からなり、より好ましくは、長さが9または10または11または20残基からなる。
【００５５】
本明細書中で用いる「CTLエピトープ」とは、以下の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、天然には存在しない少なくとも約9アミノ酸長のペプチドまたはポリペプチドまたは抗原を意味するものと解釈される：
(i)  MHCクラスI結合エピトープを決定するための予測アルゴリズム、例えば、ドイツ国チュービンゲン大学のSYFPEITHIアルゴリズム、または米国国立衛生研究所のバイオインフォマティクスおよび分子解析セクション(BIMAS)のHLAペプチド結合予測プログラムのアルゴリズムを用いて決定される、MHCクラスI対立遺伝子と有意なレベルで相互作用する配列；
(ii)  抗原提示細胞(APC)が実質的に単離された形態（例えば、ヒト被験者から得られたサンプルのPBMC画分またはバフィーコート画分中に存在）であるか、あるいはその天然の状態であるかにかかわりなく、APCの表面上のMHCクラスI分子と結合し、かつ／または、該分子を安定化する配列；
(iii)  Ｔ細胞が実質的に単離された形態（例えば、ヒト被験者から得られたサンプルのPBMC画分またはバフィーコート画分中に存在）であるか、あるいはその天然の状態であるかにかかわりなく、記憶CTL応答を誘発し、またはＴ細胞、例えば、CD8+Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞(CTL)、またはエフェクターＴ細胞もしくは記憶Ｔ細胞によるIFN-γ発現を引き出す配列；
(iv)  標準的な細胞傷害性アッセイでCTL活性を刺激する配列。
【００５６】
好ましくは、本明細書で定義するCTLエピトープは、上記の項目(ii)から(iv)に挙げた3つの機能的基準の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは全部を満たす配列を含んでなる。より一層好ましくは、本明細書で定義するCTLエピトープは、上記の基準(i)をさらに満たす配列を含んでなる。
【００５７】
本発明の特に好ましいCTLエピトープは、例えば、HCMVに感染したヒト細胞を認識して溶解することによりHCMVに対する細胞性免疫を賦与または増強することで、ヒト細胞または組織においてインタクトのHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出す能力を有する。
【００５８】
本明細書中で用いる「pp28」または「HCMV pp28」または「pp28抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号NC 001347として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; およびBankierら, DNA Seq 2, 1-12, 1991)、好ましくは、DNアーゼの機能を有するHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するヒトのHCMVもしくは他のβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。当業者は、HCMVのpp28ポリペプチドが「UL98」とも呼ばれていることを知っているだろう。
【００５９】
「NCBI」は、米国国立衛生研究所（Bethesda, MD 20894）の国立医学図書館にある国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のデータベースを意味する。
【００６０】
pp28の好ましいエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：配列番号150 (LLIDPTSGL); 配列番号151 (LLVEPCARV); 配列番号152 (LLLIVTPVV); 配列番号153 (FLLSHDAAL); 配列番号154 (PLREYLADL); 配列番号155 (GLLGASMDL); 配列番号156 (LVEPCARVY); 配列番号157 (GIKHEGLVK); 配列番号158 (ELLAGGRVF); 配列番号159 (RLLDLAPNY); 配列番号160 (ELLGRLNVY); 配列番号161 (CRYKYLRKK); および配列番号162 (ARVYEIKCR)。
【００６１】
より一層好ましくは、pp28のCTLエピトープは、配列番号150 (LLIDPTSGL)または配列番号162 (ARVYEIKCR)に示すアミノ酸配列を有し、さらにより一層好ましくは、配列番号162に示すアミノ酸配列を有する。
【００６２】
本明細書中で用いる「pp50」または「HCMV pp50」または「pp28抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号QQBEV2またはP16790として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990)、好ましくは、LeachおよびMocarski, J. Virol., 63, 1783-1791, 1989に記載されるようなDNAポリメラーゼプロセッシビティー因子またはポリメラーゼアクセサリータンパク質の機能を有するHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。当業者は、HCMVのpp50ポリペプチドが「UL44」とも呼ばれていることを知っているだろう。
【００６３】
pp50の好ましいエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：配列番号163 (LLNCAVTKL); 配列番号164 (QLRSVIRAL); 配列番号165 (VTEHDTLLY); 配列番号166 (RGDPFDKNY); 配列番号167 (GLDRNSGNY); 配列番号168 (TLLNCAVTK); 配列番号169 (TVRSHCVSK); 配列番号170 (YEQHKITSY); 配列番号171 (TRVKRNVKK); 配列番号172 (SEDSVTFEF); および配列番号173 (TRLSEPPTL)。
【００６４】
より一層好ましくは、pp50のエピトープは、配列番号163 (LLNCAVTKL); 配列番号165 (VTEHDTLLY); 配列番号166 (RGDPFDKNY); 配列番号167 (GLDRNSGNY); および配列番号170 (YEQHKITSY)からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。さらに一層好ましくは、pp50のエピトープは配列番号165に示すアミノ酸配列を有する。
【００６５】
本明細書中で用いる「pp65」または「HCMV pp65」または「pp65抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号WMBETWとして登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990；およびPandeら, Virol., 82, 220-228, 1991)、好ましくは、Pandeら, Virol., 82, 220-228, 1991に記載されるような下部マトリックスリンタンパク質またはテグメント(tegument)タンパク質の機能を有するHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。
【００６６】
特に好ましいpp65のエピトープは、本明細書において先に挙げたアミノ酸配列からなり、より好ましくは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：配列番号25 (IGDQYVKVY); 配列番号26 (TVQGQNLKY); 配列番号27 (YRIQGKLEY); 配列番号40 (HVRVSQPSL); 配列番号41 (QARLTVSGL); 配列番号42 (RRRHRQDAL); 配列番号53 (LMNGQQIFL); 配列番号54 (ILARNLVPM); 配列番号56 (QEFFWDANDIY); 配列番号57 (QEFFWDANDI); 配列番号58 (QYRIQGKLE); 配列番号59 (RKHRHLPVADAV); 配列番号60 (DPVAALFFF); 配列番号61 (PGKISHIMLDVA); 配列番号63 (QAIRETVEL); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY); 配列番号67 (LNIPSINVHHYPSAAERKHR); 配列番号68 (ATVQGQNLKYQEFFWDANDI); 配列番号69 (QEFFWDANDIYRIFAELEGV); 配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号71 (SQYRIQGKLEYRHTWDRHDE); 配列番号72 (VFTWPPWQAGILARNLVPMV); 配列番号73 (ILARNLVPMVATVQGQNLKY); 配列番号75 (YPSAAERKHRHLPVADAVIH); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); および配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT)。
【００６７】
本明細書中で用いる「pp71」または「HCMV pp71」または「pp71抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号NP 040017またはWMBES1として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; Rugerら, J. Virol., 61, 446-453, 1987; およびBankierら, DNA Seq 2, 1-12, 1991)、好ましくは、Rugerら, J. Virol., 61, 446-453, 1987に記載されるような上部マトリックスリンタンパク質の機能を有するHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。当業者は、HCMVのpp71ポリペプチドが「UL82」とも呼ばれていることを知っているだろう。
【００６８】
特に好ましいpp71のエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：配列番号174 (QLLIPKSFTL); 配列番号175 (TLVIPSWHV); 配列番号176 (LLIPKSFTL); 配列番号177 (DLVPLTVSV); 配列番号178 (CSDPNTYIHK); 配列番号179 (EYIVQIQNAF); および配列番号180 (AEVVARHNPY)。
【００６９】
本明細書中で用いる「pp150」または「HCMV pp150」または「pp150抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号XPBEA9として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990)、好ましくは、Jahnら, J. Virol., 61, 1358-1367, 1987に記載されるような大きな（およそ150 kDa）構造リンタンパク質の機能を有するHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。
【００７０】
特に好ましいpp150のエピトープは、本明細書において先に挙げたアミノ酸配列からなり、より好ましくは、配列番号146 (ERAWALKNPHLA)または配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR)に示すアミノ酸配列からなる。
【００７１】
本明細書中で用いる「gB」または「HCMV gB」または「gB抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号P06473として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; Cranageら, EMBO J. 5, 3057-3063, 1986; Kouzaridesら, Virol., 157, 397-413, 1987; Kouzaridesら, J. Virol., 61, 125-133, 1987)、好ましくは、DNAポリメラーゼの機能を有するか、もしくはKouzaridesら, J. Virol., 61, 125-133, 1987に記載されるような糖タンパク質であるHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。当業者は、HCMVのgBポリペプチドが「UL55」とも呼ばれていることを知っているだろう。
【００７２】
特に好ましいgBのエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：配列番号123 (AYEYVDYLF); 配列番号124 (SYENKTMQL); 配列番号125 (AYIYTTYLL); 配列番号126 (NTDFRVLEL); 配列番号127 (ATSTGDVVY); 配列番号128 (LDEGIMVVY); 配列番号129 (VKESPGRCY); 配列番号135 (IMREFNSYK); 配列番号136 (KMTATFLSK); 配列番号137 (CYSRPVVIF); 配列番号181 (RIWCLVVCV); 配列番号182 (QMLLALARL); 配列番号183 (GLDDLMSGL); 配列番号184 (IILVAIAVV); 配列番号185 (DLDEGIMVV); 配列番号186 (NLFPYLVSA); 配列番号187 (AVGGAVASV); 配列番号188 (YINRALAQI); 配列番号189 (YAYIYTTYL); 配列番号190 (VFETSGGLVV); 配列番号191 (DDYSNTHSTRYV); 配列番号192 (RSYAYIYTTYLLGSNTEYVA); 配列番号193 (TYEKYGNVSVFETSGGLVVF); 配列番号194 (FETSGGLVVFWQGIKQKSLV); および配列番号195 (MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK)。
【００７３】
より一層好ましくは、gBのエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：配列番号187 (AVGGAVASV); 配列番号189 (YAYIYTTYL); 配列番号190 (VFETSGGLVV); 配列番号191 (DDYSNTHSTRYV); 配列番号192 (RSYAYIYTTYLLGSNTEYVA); 配列番号193 (TYEKYGNVSVFETSGGLVVF); および配列番号195 (MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK)。
【００７４】
本明細書中で用いる「gH」または「HCMV gH」または「gH抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号P12824として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; Cranageら, J. Virol., 62, 1416-1422, 1988)、好ましくは、Cranageら, J. Virol., 62, 1416-1422, 1988に記載されるような糖タンパク質であるHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。当業者は、HCMVのgHポリペプチドが「UL75」とも呼ばれていることを知っているだろう。
【００７５】
特に好ましいgHのエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：配列番号196 (YLMDELRYV); 配列番号197 (YLTVFTVYL); 配列番号198 (TLTEDFFVV); 配列番号199 (LLMMSVYAL); 配列番号200 (YLLYRMLKT); 配列番号201 (ILFDGHDLL); 配列番号202 (LIFGHLPRV); 配列番号203 (SLVRLVYIL); 配列番号204 (LLYPTAVDL); 配列番号205 (ALDPYNEVV); 配列番号206 (LMLLKNGTV); 配列番号207 (SAIIGIYLL); 配列番号208 (ITSLVRLVY); 配列番号209 (HHEYLSDLY); 配列番号210 (AIIGIYLLY); 配列番号211 (QTEKHELLV); 配列番号212 (ATDSRLLMM); 配列番号213 (FLDAALDFNY); 配列番号214 (DTQGVINIMY); 配列番号215 (LRENTTQCTY); 配列番号216 (SAIIGIYLLY); 配列番号217 (SLRNSTVVR); 配列番号218 (ALALFAAAR); 配列番号219 (QLNRHSYLK); 配列番号220 (RLFPDATVP); 配列番号221 (RLNTYALVSK); 配列番号222 (LVRLVYILSK); 配列番号223 (YLMDELRYVK); 配列番号224 (ELYLMGSLVH); 配列番号225 (ALTVSEHVSY); 配列番号226 (NYLDLSALL); 配列番号227 (SYVVTNQYL); 配列番号228 (SYLKDSDFL); 配列番号229 (TYALVSKDL); 配列番号230 (SYRSFSQQL); 配列番号231 (TYGRPIRFL); 配列番号232 (YYVFHMPRCL); 配列番号233 (MYMHDSDDVL); 配列番号234 (ETFPDLFCL); 配列番号235 (DLTETLERY); 配列番号236 (SPRTHYLML); 配列番号237 (FPDLFCLPL); 配列番号238 (SPRTHYLMLL); 配列番号239 (MPRCLFAGPL); 配列番号240 (TPMLLIFGHL); 配列番号241 (APYQRDNFIL); 配列番号242 (GRCQMLDRR); 配列番号243 (RRDHSLERL); 配列番号244 (SEALDPHAF); 配列番号245 (RENTTQCTY); 配列番号246 (DDVLFALDPY); 配列番号247 (HELLVLVKKAQL); 配列番号248 (LTVSEHVSYVVT); 配列番号249 (RQTEKHELLVLVKKAQLNRH); および配列番号250 (ALTVSEHVSYVVTNQYLIKG)。
【００７６】
より一層好ましくは、gHのエピトープは配列番号247 (HELLVLVKKAQL)または配列番号249 (RQTEKHELLVLVKKAQLNRH)に示すアミノ酸配列からなる。
【００７７】
本明細書中で用いる「IE-1」または「HCMV IE-1」または「IE-1抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号EDBEM5として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990)、好ましくは、前初期HCMVタンパク質の発現プロファイルを有するHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。当業者は、HCMVのIE-1ポリペプチドが「UL123」とも呼ばれていることを知っているだろう。
【００７８】
特に好ましいIE-1のエピトープは、本明細書において先に挙げたアミノ酸配列からなり、より好ましくは、以下の配列番号に示すアミノ酸配列からなる：配列番号97 (VLAELVKQI); 配列番号101 (VLEETSVML); 配列番号112 (ELRRKMMYM); 配列番号113 (QIKVRVDMV); 配列番号114 (ELKRKMMYM); 配列番号116 (AYAQKIFKIL); 配列番号117 (CSPDEIMAYAQKIFKILDEE); 配列番号118 (SEPVSEIEEVAPEEEEDGAE); および配列番号119 (VLCCYVLEETSVMLAKRPLI)。
【００７９】
本明細書中で用いる「IE-2」または「HCMV IE-2」または「IE-2抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号NC 001347として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; Bankierら, DNA Seq 2, 1-12, 1991)、好ましくは、前初期HCMVタンパク質の発現プロファイルを有するHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。当業者は、HCMVのIE-2ポリペプチドが「UL122」とも呼ばれていることを知っているだろう。
【００８０】
特に好ましいIE-2のエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：配列番号251 (FLMEHTMPV); 配列番号252 (LMQKFPKQV); 配列番号253 (NLALSTPFL); 配列番号254 (IIYTRNHEV); 配列番号255 (IIYTRNHEVK); 配列番号256 (LLGALNLCL); 配列番号257 (KPEPDFTIQY); 配列番号258 (IMKDKNTPF); 配列番号259 (PRKKKSKRI); 配列番号260 (FEQPTETPP); 配列番号261 (FEQPTETP); 配列番号262 (FEQPTETPPE); 配列番号263 (EQPTETPPE ); 配列番号264 (QFEQPTETPPE); 配列番号265 (SDYNMIIHA); 配列番号266 (YRNMIIHAAT); 配列番号267 (CLPLMQKFP); 配列番号268 (IDEVSRMFRNTNRS); 配列番号269 (TAAKAYAVGQFEQPTETPPE); 配列番号270 (FEQPTETPPEDLDTLSLAIE); 配列番号271 (MLPLIKQEDIKPEPDFTIQY); 配列番号272 (THQLCPRSSDYRNMIIHAAT); 配列番号273 (YRNMIIHAATPVDLLGALNL); 配列番号274 (TGPRKKKSKRISELDNEKVR); 配列番号275 (PVDLLGALNLCLPLMQKFPK); 配列番号276 (IQIIYTRNHEVKSEVDAVRC); 配列番号277 (VKSEVDAVRCRLGTMCNLAL); 配列番号278 (RVKIDEVSRMFRNTNRSLEY); 配列番号279 (SSSSSSCSSASDSESESEEM); 配列番号280 (ASSPSTGSGTPRBTSPTHPL); 配列番号281 (PRVTSPTHPLSQMNHPPLPD); 配列番号282 (PLGRPDEDSSSSSSSSCSSA); 配列番号283 (SDSESESEEMKCSSGGGASV); 配列番号284 (KCSSGGGASVTSSHHGRGGF); 配列番号285 (CTPNVQTRRGRVKIDEVSRM); 配列番号286 (FRNTNRSLEYKNLPFTIPSM); 配列番号287 (HQVLDEAIKACKTMQVNNKG); 配列番号288 (CKTMQVNNKGIQIIYTRNHE); 配列番号289 (KAAWSLKELHTHQLCPRSSD); および配列番号290 (CLPLMQKFPKQVMVRIFSTN)。
【００８１】
さらに一層好ましくは、IE-2のエピトープは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる：配列番号254 (IIYTRNHEV); 配列番号255 (IIYTRNHEVK); 配列番号260 (FEQPTETPP); 配列番号261 (FEQPTETP); 配列番号262 (FEQPTETPPE); 配列番号263 (EQPTETPPE); 配列番号264 (QFEQPTETPPE); 配列番号269 (TAAKAYAVGQFEQPTETPPE); 配列番号270 (FEQPTETPPEDLDTLSLAIE); および配列番号276 (IQIIYTRNHEVKSEVDAVRC)。
【００８２】
本明細書中で用いる「UL18」または「HCMV UL18」または「UL18抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号P08560として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; BeckおよびBarrell, Nature 331, 269-272, 1988)、好ましくは、少なくとも１つの膜貫通領域を有する糖タンパク質であるHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。
【００８３】
特に好ましいUL18のエピトープは、配列番号291 (GEINITFIHY); 配列番号292 (TENGSFVAGY); 配列番号293 (TMWCLTLFV); および配列番号308 (LELEIALGY)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００８４】
さらに一層好ましくは、UL18のエピトープは配列番号292 (TENGSFVAGY)に示すアミノ酸配列からなる。
【００８５】
本明細書中で用いる「US2」または「HCMV US2」または「US2抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号QQBEC5として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; WestonおよびBarrell, J. Mol. Biol. 192, 177-208, 1986)、好ましくは、少なくとも１つの膜貫通領域を有する糖タンパク質であるHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。
【００８６】
特に好ましいUS2のエピトープは、配列番号294 (LLVLFIVYV); 配列番号295 (SMMWMRFFV); 配列番号296 (TLLVLFIVYV); および配列番号297 (VYVTVDCNL)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００８７】
さらに一層好ましくは、US2のエピトープは配列番号295 (SMMWMRFFV)に示すアミノ酸配列からなる。
【００８８】
本明細書中で用いる「US3」または「HCMV US3」または「US3抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号QQBEC6またはP09712またはAAA45955として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; WestonおよびBarrell, J. Mol. Biol. 192, 177-208, 1986; ならびにWeston Virol. 162, 406-416, 1988)、好ましくは、感染期間中の初期に発現される糖タンパク質であるHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。
【００８９】
特に好ましいUS3のエピトープは、配列番号298 (YLFSLVVLV); 配列番号299 (TLLVYLFSL); 配列番号300 (LLFRTLLVYL); および配列番号301 (VYLFSLVVL)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００９０】
さらに一層好ましくは、US3のエピトープは配列番号298 (YLFSLVVLV)に示すアミノ酸配列からなる。
【００９１】
本明細書中で用いる「US6」または「HCMV US6」または「US6抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号QQBEC7として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有し(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; WestonおよびBarrell, J. Mol. Biol. 192, 177-208, 1986)、好ましくは、少なくとも１つの膜貫通領域を有する糖タンパク質であるHCMVのポリペプチド、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。
【００９２】
特に好ましいUS6のエピトープは配列番号303 (LYLCCGITL)に示すアミノ酸配列を有する。
【００９３】
本明細書中で用いる「US11」または「HCMV US11」または「US11抗原」、あるいは類似した用語は、NCBI登録番号NC 001347として登録された一般に入手可能なアミノ酸配列を有するHCMVのポリペプチド(Cheeら, Curr. Top. Microbiol. Immunol 154, 125-169, 1990; Bankierら, DNA Seq 2, 1-12, 1991)、または前記配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性を有するHCMVもしくは他のヒトβ-ヘルペスウイルスの関連ポリペプチドを意味するものと解釈される。
【００９４】
特に好ましいUS11のエピトープは、配列番号302 (YYVECEPRC); 配列番号304 (TLFDEPPPLV); 配列番号305 (TPRVYYQTL); 配列番号306 (APVAGSMPEL); および配列番号307 (SESLVAKRY)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【００９５】
当業者には知られているように、最小のCTLエピトープはHLAクラスI分子の特定のサブセットを発現するCD8+ T細胞に拘束される。好ましくは、本発明のCTLエピトープはHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A23、HLA A24、HLA A26、HLA A29、HLA A30、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B41、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。本発明のエピトープに関する特定のHLA拘束は本明細書中の表１、３および４に示されている。
【００９６】
特に好ましい実施形態において、本発明のpp28由来エピトープはHLA A1、HLA A2、HLA A3およびHLA B27からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【００９７】
特に好ましい実施形態において、本発明のpp50由来エピトープはHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA B27およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【００９８】
特に好ましい実施形態において、本発明のpp65由来エピトープはHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A24、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【００９９】
特に好ましい実施形態において、本発明のpp71由来エピトープはHLA A1、HLA A2、HLA A24およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【０１００】
特に好ましい実施形態において、本発明のpp150由来エピトープはHLA A1、HLA A2、HLA B7およびHLA B8からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【０１０１】
特に好ましい実施形態において、本発明のgB由来エピトープはHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A24、HLA A29、HLA B41、HLA DR7およびHLA DR*からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【０１０２】
特に好ましい実施形態において、本発明のgH由来エピトープはHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A24、HLA A26、HLA B7、HLA B27およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【０１０３】
特に好ましい実施形態において、本発明のIE-1由来エピトープは、HLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A23、HLA A24、HLA A30、HLA B7、HLA B8およびHLA B27からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【０１０４】
特に好ましい実施形態において、本発明のIE-2由来エピトープは、HLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA B8、HLA B35およびHLA B41からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【０１０５】
特に好ましい実施形態において、本発明のUL18由来エピトープは、HLA A2およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【０１０６】
特に好ましい実施形態において、本発明のUS2由来エピトープはHLA A2またはHLA A24に拘束される。
【０１０７】
特に好ましい実施形態において、本発明のUS3由来エピトープはHLA A2またはHLA A24に拘束される。
【０１０８】
特に好ましい実施形態において、本発明のUS6由来エピトープはHLA A24に拘束される。
【０１０９】
特に好ましい実施形態において、本発明のUS11由来エピトープは、HLA A2、HLA A24、HLA B7およびHLA B44からなる群より選択されるHLA対立遺伝子に拘束される。
【０１１０】
好ましくは、本発明の免疫学的に活性なペプチドはHLAスーパータイプ（超型）特異性を示す。明らかに、そのようなエピトープはワクチン製剤において好ましいものである。なんとなれば、それらは民族・人種にかかわりなく集団の大多数をカバーするのに必要なエピトープの総数を減らし、それによりワクチン処方上の困難性を最小限に抑えるからである。例えば、配列番号116または117に示すHCMV IE-1のHLA A23拘束エピトープに特異的なCTLは、HLA A23、HLA A24およびHLA A30を発現するペプチド感作標的細胞を認識する。さらに、配列番号109に示すHCMV IE-1由来のエピトープはHLA B7およびHLA B8の両方に拘束される。さらに、配列番号57または69に示すHCMV pp65由来のエピトープに特異的なCTLは、HLA A1およびHLA A24を発現するペプチド感作標的細胞を認識する。さらに、配列番号63、80または81に示すHCMV pp65由来のエピトープに特異的なCTLは、HLA B57およびHLA B58を発現するペプチド感作標的細胞を認識する。
【０１１１】
好ましくは、本発明の免疫学的に活性なペプチドは、HCMV感染ヒト被験者の抗原提示細胞(APC)の表面上のMHCクラスII分子の状況下でヘルパーＴ細胞機能を促進させるのに十分な１以上のCD4+決定基を含むものである。例えば、本発明者らは、連続したまたは重複するCTLエピトープおよびヘルパーＴ細胞エピトープ機能を含むいくつかの20-merペプチドを本明細書において提供するが、それらはCD4+細胞とCD8+細胞の両方と結合する能力を有することにより証明される。そのようなペプチドは、最小のCTLエピトープと比べて、ワクチン製剤中に外因性のヘルパーＴ細胞エピトープを必ずしも含める必要がないという利点がある。
【０１１２】
例えば、CTLエピトープとヘルパーＴ細胞エピトープの両方を含む、好ましいpp65のエピトープは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する：配列番号70 (PQYSEHPTFTSQYRIQGKLE); 配列番号76 (QYDPVAALFFFDIDLLLQRG); 配列番号77 (IIKPGKISHIMLDVAFTSHE); 配列番号80 (MNGQQIFLEVQAIRETVELR); 配列番号81 (QAIRETVELRQYDPVAALFF); 配列番号87 (YYTSAFVFPTKDVALRHVVC); 配列番号88 (VTTERKTPRVTGGGAMAGAS); 配列番号90 (SICPSQEPMSIYVYALPLKM); 配列番号92 (QQNQWKEPDVYYTSAFVFPT); および配列番号94 (TGGGAMAGASTSAGRKRKSA)。
【０１１３】
CTLエピトープとヘルパーＴ細胞エピトープの両方を含む、特に好ましいpp150のエピトープは、配列番号147 (WPRERAWALKNPHLAYNPFR)に示すアミノ酸配列を有する。
【０１１４】
CTLエピトープとヘルパーＴ細胞エピトープの両方を含む、特に好ましいgBのエピトープは、配列番号192 (RSYAYIYTTYLLGSNTEYVA)または配列番号195 (MQLIPDDYSNTHSTRYVTVK) に示すアミノ酸配列を有する。
【０１１５】
CTLエピトープとヘルパーＴ細胞エピトープの両方を含む、特に好ましいgHのエピトープは、配列番号249 (RQTEKHELLVLVKKAQLNRH)に示すアミノ酸配列を有する。
【０１１６】
CTLエピトープとヘルパーＴ細胞エピトープの両方を含む、特に好ましいIE-1のエピトープは、配列番号117 (CSPDEIMAYAQKIFKILDEE)に示すアミノ酸配列を有する。
【０１１７】
CTLエピトープとヘルパーＴ細胞エピトープの両方を含む、特に好ましいIE-2のエピトープは、配列番号269 (TAAKAYAVGQFEQPTETPPE); 配列番号270 (FEQPTETPPEDLDTLSLAIE); 配列番号279 (SSSSSSCSSASDSESESEEM); および配列番号283 (SDSESESEEMKCSSGGGASV)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
本明細書中に示されるエピトープの「機能的に同等の変異体」とは、該エピトープと実質的に同じアミノ酸配列を有し、該エピトープと同じ長さで、類似のHLA特異性を示すペプチドを意味する。本明細書に開示するペプチドまたは構造変異体はまた、本明細書に開示する免疫学的効果を奏する比較的長いペプチドエピトープの機能的部分であってもよい。ただし、その比較的長いペプチドは、それが誘導される基本ペプチドに対して異なるHLA特異性を有しておらず、また、以前に知られているエピトープではない。
【０１１９】
機能的に同等の配列変異体は、当業者が過度の実験を行なうことなく本明細書の開示に基づいて設計し、かつ／または構築することができる。例えば、個々のMHCクラスI分子は、1以上の不変「アンカー位置」（該アンカー位置はペプチドが高い親和性でMHCクラスI分子と結合することを可能にする）を含むアミノ酸配列を有するペプチドと優先的に結合することが確立されている (K. Falkら, Nature 351, 290-296, 1991)。さらに、アンカー位置のアミノ酸以外のアミノ酸もMHCクラスI分子へのペプチド結合の特異性に寄与している。例示したペプチドの好ましい変異体は基本ペプチドのそのような残基を保持しているものである。
【０１２０】
好ましくは、変異体ペプチド（基本ペプチドのアンカー位置をインタクトのまま保持するもの）はまた、以下の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるだろう：
(i)  MHCクラスI結合エピトープを決定するための予測アルゴリズム、例えば、ドイツ国チュービンゲン大学のSYFPEITHIアルゴリズム、または米国国立衛生研究所のバイオインフォマティクスおよび分子解析セクション(BIMAS)のHLAペプチド結合予測プログラムのアルゴリズムを用いて決定される、MHCクラスI対立遺伝子と有意なレベルで相互作用する配列；
(ii)  抗原提示細胞(APC)が実質的に単離された形態（例えば、ヒト被験者から得られたサンプルのPBMC画分またはバフィーコート画分中に存在）であるか、あるいはその天然の状態であるかにかかわりなく、APCの表面上のMHCクラスI分子と結合し、かつ／または、該分子を安定化する配列；
(iii)  Ｔ細胞が実質的に単離された形態（例えば、ヒト被験者から得られたサンプルのPBMC画分またはバフィーコート画分中に存在）であるか、あるいはその天然の状態であるかにかかわりなく、記憶CTL応答を誘発し、またはＴ細胞、例えば、CD8+Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞(CTL)、またはエフェクターＴ細胞によるIFN-γ発現を引き出す配列；
(iv)  標準的な細胞傷害性アッセイでCTL活性を刺激する配列。
かかる基準の決定は、本明細書に提供される開示から容易に達成可能である。
【０１２１】
さらに一層好ましくは、機能的に同等の変異体は上記の項目(ii)から(iv)に挙げた3つの機能的基準の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも2つ、より好ましくは全部を満たす配列を含んでなる。より一層好ましくは、本明細書で定義するCTLエピトープは、上記の基準(i)をさらに満たす配列を含んでなる。
【０１２２】
好ましい変異体は、典型的には、基本ペプチドの配列に対して保存的アミノ酸置換（例えば、あるアミノ酸を、同様の疎水性、大きさ、電荷、抗原性などをもつ別の残基で置換することからなる）を含むものである。特に好ましい保存的アミノ酸置換は以下からなる群より選択される：
(i)  グリシン、アラニンおよびプロリンのうちいずれか2つが関係する置換；
(ii)  イソロイシン、ロイシンおよびバリンのうちいずれか2つが関係する置換；
(iii)  メチオニン、トレオニン、セリンおよびシステインのうちいずれか2つが関係する置換；
(iv)  アスパラギンおよびグルタミンが関係する置換；
(v)  アスパラギン酸およびグルタミン酸が関係する置換；
(vi)  リシンおよびアルギニンが関係する置換；および
(vii)  ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンのうちいずれか2つが関係する置換。
【０１２３】
また、当技術分野では、同類アミノ酸の置換は親水性に基づいて効果的に行なわれることが理解されており、置換により作製された生物学的機能的に同等のタンパク質またはペプチドが、本発明の場合のように、免疫学的実施形態での使用が意図される場合には特にそうである（例えば、米国特許第4,554,101号）。事実、タンパク質の最大局所的平均親水性（その隣接アミノ酸の親水性により支配される）はその免疫原性および抗原性と相関している。米国特許第4,554,101号に詳しく記載されるように、アミノ酸残基に対して以下の親水値が指定されている：アルギニン (+3.0); リシン (+3.0); アスパラギン酸 (+3.0 +/- 0.1); グルタミン酸 (+3.0 +/- 0.1); セリン (+0.3); アスパラギン (+0.2); グルタミン (+0.2); グリシン (0); トレオニン (-0.4); プロリン (-0.5 +/- 0.1); アラニン (-0.5); ヒスチジン (-0.5); システイン (-1.0); メチオニン (-1.3); バリン (-1.5); ロイシン (-1.8); イソロイシン (-1.8); チロシン (-2.3); フェニルアラニン (-2.5); トリプトファン (-3.4)。類似の親水値に基づいて改変する場合は、互いの親水値が約+/- 0.2以内、より好ましくは約+/- 0.1以内、より一層好ましくは約+/- 0.05以内にあるアミノ酸同士を置換することが好適である。
【０１２４】
本ペプチドの好ましい誘導体としてリポペプチドがあるが、これは脂質成分がアミノ酸配列にコンジュゲートされたもので、この脂質成分はアジュバントとして作用することが知られている (Jungら, Angew Chem, Int Ed Engl 10, 872, 1985; Martinonら, J Immunol 149, 3416, 1992; Toyokuniら, J Am Chem Soc 116, 395, 1994; Deprezら, J Med Chem 38, 459, 1995; Sauzetら, Vaccine 13, 1339, 1995; BenMohamedら, Eur. J. Immunol. 27, 1242, 1997; Wiesmullerら, Vaccine 7, 29, 1989; Nardinら, Vaccine 16, 590, 1998; Benmohamedら. Vaccine 18, 2843, 2000; およびObertら, Vaccine 16, 161, 1998)。適当なリポペプチドはアジュバント製剤に関連した有害な副作用を一切示さず、リポペプチドに対する抗体および細胞性応答の両方が観察されている。リポペプチド構築物で使用するために、いくつかの異なる脂質成分が知られている。代表的な脂質成分としては、限定するものではないが、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基およびデカノイル基が挙げられ、より一般的には、C2〜C30飽和、モノ不飽和、または高度不飽和脂肪アシル基が有用であると考えられる。
【０１２５】
リポアミノ酸のS-[2,3-ビス(パルミトイルオキシ)プロピル]システインは、Pam3Cys-OHとしても知られているもので(Wiesmullerら, Z. Physiol. Chem. 364 593, 1983)、グラム陰性菌の内膜と外膜に架かるBraunリポタンパク質のN-末端部分の合成物である。Metzgerらの米国特許第5,700,910号（1997年10月23日）は、合成アジュバント、Ｂリンパ球刺激剤、マクロファージ刺激剤、または合成ワクチンとして用いられるリポペプチドの製造用中間体として使用するための、いくつかのN-アシル-S-(2-ヒドロキシアルキル)システインを記載している。また、Metzgerらは、前記化合物を、Pam3Cys-OH (Wiesmullerら, Z. Physiol. Chem. 364 593, 1983)の合成、または該リポアミノ酸もしくはその類似体をN-末端に含むリポペプチドの合成における中間体として使用することを教示している。Metzgerらによれば、リポペプチドのペプチド部分は、リポアミノ酸中のC-末端保護基を除去し、次に得られた化合物を固相ペプチド合成のようなリポペプチド合成の基質として用いることによって、リポアミノ酸部分に結合される。Pam3Cysは、適当な合成CTLエピトープに結合させたとき、インフルエンザウイルス感染細胞に対するウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)応答を刺激することができ(Deresら, Nature 342, 561, 1989)、また、口蹄疫に対する防御抗体を惹起することが知られている(Wiesmullerら, Vaccine 7, 29, 1989; 米国特許第6,024,964号、Jungら、2000年2月15日)。このようなワクチンでPam3Cysを使用することの利点は、該化合物が膜アンカー化合物であるという点である（すなわち、それは細胞の原形質膜に浸透して、該リポアミノ酸にN-末端を介して結合された特異的CTLエピトープに応答する細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を高めることができる）。
【０１２６】
Pam2Cysは、マクロファージ活性化リポペプチド（すなわち、MALP-2）の脂質部分を構成する合成リポアミノ酸であり、最近合成されたものである(Metzgerら, J Pept. Sci 1, 184, 1995)。Pam2CysはPam3Cysよりも強力な脾細胞とマクロファージの刺激剤であると報告されている(Metzgerら, J Pept. Sci 1, 184, 1995; Muhlradtら, J Exp Med 185, 1951, 1997; およびMuhlradtら, Infect Immun 66, 4804, 1998)。
【０１２７】
これとは別に、または本発明のエピトープへの1以上の脂質成分のコンジュゲーションに加えて、前記エピトープは1以上の他のエピトープ、例えば、1以上のHCMV B細胞エピトープ、HCMVヘルパーＴ細胞エピトープ、または無差別／許容(promiscuous/permissive)ヘルパーＴ細胞エピトープの付加により修飾される。これに関連して、所与の抗原に対する抗体応答の生成には、強力なヘルパーＴ細胞応答の生成が必要とされる (Vitielloら, J. Clin. Invest. 95, 341-349, 1995; Livingstonら, J. Immunol. 159, 1383-1392, 1997)。したがって、この方法で本CTLエピトープを誘導体化することは特に有利である。あるいはまた、無差別または許容ヘルパーＴ細胞エピトープを含有するペプチドが抗原と共に投与される。無差別または許容ヘルパーＴ細胞エピトープの例は、破傷風トキソイドペプチド、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)pfg27、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびHlVgp120である(Contreasら, Infect. Immun, 66, 3579-3590, 1998; Gaudeboutら, J. A.I.D.S. Human Retrovirol 14, 91-101, 1997; Kaumayaら, J. Mol. Recog. 6, 81-94, 1993; ならびにFernおよびGood J. Immunol. 148, 907-913, 1992)。また、Ghoshら, Immunol 104, 58-66, 2001および国際特許出願番号PCT/AU00/00070 (WO 00/46390)もイヌジステンパーウイルスの融合タンパク質(CDV-F)からのヘルパーＴ細胞エピトープを記載している。ある種の無差別ヘルパーＴ細胞エピトープは所与の抗原に対して強力なB細胞応答を引き出し、いくつかのハプロタイプ拘束免疫応答を迂回することができる(Kaumayaら, J. Mol. Recog. 6, 81-94, 1993)。
【０１２８】
これとは別に、またはさらに、前記ペプチドは免疫感作の目的のために知られているアジュバント（例えば、ムラミルジペプチド、脂質またはリポ多糖）と共有結合させることで誘導体化される。
【０１２９】
本発明のペプチドは標準的な技法を用いて容易に合成することができ、かかる技法として、Merrifield合成法(Merrifield, J Am Chem Soc, 85,:2149-2154, 1963)およびこの合成法に対する無数の利用可能な改良法がある (例えば、Synthetic Peptides: A User's Guide, Grant編 (1992) W.H. Freeman & Co., New York, pp. 382; Jones (1994) The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford, pp. 230; Barany, G.およびMerrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E.およびMeienhofer, J.編), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York; Wunsch, E.編 (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Muler, E.編), vol. 15, 4版, Parts 1および2, Thieme, Stuttgart; Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg; Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474を参照されたい)。
【０１３０】
好ましくは、前記ペプチドは固相支持体上で合成されるが、かかる支持体として、例えば、ジビニルベンゼン（好ましくは、1% (w/w)ジビニルベンゼン）で架橋されたポリスチレンからなるポリスチレンゲルビーズ（ジクロロメタンやジメチルホルムアミド(DMF)のような親油性溶剤を用いてさらに膨潤させる）がある。ポリスチレンをクロロメタンまたはアミノメチル基の付加により官能化してもよい。あるいはまた、架橋および官能化したポリジメチル-アクリルアミドゲルを、DMFまたは双極性非プロトン性溶媒で膨潤および溶媒和させてから使用してもよい。当業者に公知のその他の固相支持体、例えば、不活性のポリスチレンビーズの表面にポリエチレングリコールをグラフトすることにより製造されるポリエチレングリコール誘導ビーズもペプチド合成に使用することができる。市販されている好適な固相支持体としては、PAL-PEG-PS、PAC-PEG-PS、KA、KRまたはTGR (Applied Biosystems, CA 94404, USA)が挙げられる。
【０１３１】
固相ペプチド合成の場合は、反復処理（成長しつつあるペプチド鎖のアミノブロッキング基の除去、および繰り返されるアミノ酸カップリングに必要である）に対して安定なブロッキング基を、合成中にアミノ酸側鎖を保護するため、また、α-アミノ、カルボキシルまたは側鎖官能基の望ましくない反応性をマスキングするために使用する。こうして、ブロッキング基（保護基またはマスキング基とも呼ばれる）は、カップリング反応に関与する活性化カルボキシル基を有するアミノ酸のアミノ基を保護したり、カップリング反応に関与するアシル化アミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基を保護する。
【０１３２】
合成の間、ペプチド結合を破壊することなく、また、ペプチドの別の部分に結合された保護基を除去することなく、カップリングがブロッキング基の除去後に起こる。さらに、ペプチドのC-末端を保護するペプチド-樹脂定着部は、樹脂からの開裂が必要となるまで、合成法の間ずっと保護される。したがって、直交的に保護されたα-アミノ酸を慎重に選択することによって、アミノ酸は成長しつつあるペプチドに所望の位置で付加されるが、その間ペプチドは樹脂に結合されたままである。
【０１３３】
好ましいアミノブロッキング基は、簡単に除去可能であるが、カップリング反応やその他の操作（例えば、側鎖基に対する修飾）の条件に耐えるに十分な安定性をもつものである。
【０１３４】
好適なアミノブロッキング基は以下からなる群より選択される：(i)ベンジルオキシカルボニル基（Zまたはカルボベンゾキシ）、この基は室温常圧で接触水素添加により、あるいは液体アンモニア中のナトリウムおよび酢酸中の臭化水素酸を用いて容易に除去される；(ii)ウレタン誘導体；(iii)t-ブトキシカルボニル基（Boc）、この基はt-ブトキシカルボニルアジドまたはジ-tert-ブチルジカーボネートを用いて導入され、トリフルオロ酢酸（ジクロロメタン中の50% TFA）や酢酸／ジオキサン／酢酸エチル中のHClのような穏やかな酸を用いて除去される；(iv)9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基(Fmoc)、この基は弱塩基性の非加水分解条件下で、例えば、一級または二級アミン（例えば、ジメチルホルムアミド中の20%ピペリジン）を用いて開裂される；(v)2-(4-ビフェニリル)プロピル(2)オキシカルボニル基(Bpoc)；(vi)2-ニトロ-フェニルスルフェニル基(Nps); および(vii)ジチア-スクシオニル基(Dts)。
【０１３５】
BocはFmoc化学においてN-末端を保護するために広く用いられており、また、FmocはBoc化学においてN-末端を保護するために広く用いられている。
【０１３６】
側鎖保護基は、合成すべきペプチドを形成するアミノ酸の機能性側鎖に応じて変化するだろう。一般的に、側鎖保護基はBzl基またはtBu基に基づくものである。側鎖中にアルコールまたはカルボン酸を有するアミノ酸は、Bzlエーテル、Bzlエステル、cHexエステル、tBuエーテル、またはtBuエステルとして保護される。Fmocアミノ酸の側鎖の保護には、理想的には塩基に安定で、弱酸(TFA)に不安定なブロッキング基が必要となる。例えば、リシンのε-アミノ基はMttで保護される（例えば、Fmoc-リシン(Mtt)-OH）。あるいは、酸安定性の向上が必要とされる場合は、ClZのようなハロゲン化ベンジル誘導体を用いてリシンを保護する。システインのチオール基、ヒスチジンのイミダゾール、またはアルギニンのグアニジノ基は一般に、特別な保護を必要とする。ペプチド合成用の多種多様の保護基がすでに記載されている(The Peptides, Grossら編, Vol. 3, Academic Press, New York, 1981を参照されたい)。例えば、4-メトキシ-2,3,6-トリメチルフェニルスルホニル(Nd- Mtr)基はアルギニンの側鎖保護に有用であるが、Arg(Mtr)の脱保護には長期のTFA処理が必要である。いくつかの弱酸(TFA、タリウム(III)トリフルオロアセテート/TFA)に不安定な基、またはTFAに安定でタリウム(III)トリフルオロアセテート/TFAに不安定な基、または弱酸に安定な基は、シスチンの保護に用いられる。
【０１３７】
最も広く採用されている2つの保護ストラテジーは、Boc/Bzl法とFmoc/tBu法である。Boc/Bzl法では、Bocをアミノ保護に使用し、Bzl系またはcHex系の保護基を用いて各種アミノ酸の側鎖を保護する。Bocは接触水素添加条件下に安定であり、多くの側鎖基の保護のためにZ基と共に直交的に使用される。Fmoc/tBu法では、Fmocをアミノ保護に使用し、側鎖をtBu系保護基で保護する。
【０１３８】
あるいはまた、本発明のペプチドは該ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸の組換え発現により生産される。前記核酸の適切なヌクレオチド配列は、本明細書に示すアミノ酸配列データから、遺伝子コードを生物（ペプチドを発現させる予定の生物）のコドン優先表と共に用いて、容易に誘導することができる。そのような方法は当技術分野で周知である。したがって、明らかに、本発明のさらなる実施形態は、配列番号22〜318のいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸に及ぶものである。
【０１３９】
ペプチドエピトープをコードする適切なヌクレオチド配列が決定されたら、本明細書に記載されるエピトープをコードする核酸を標準的なオリゴヌクレオチド合成法で製造する。好ましくは、オリゴヌクレオチドを合成するにあたり、その5’および3’末端にリンカーまたはアダプター配列を使用して、適当なベクター系への標準法による後続のクローニングを容易なものとする。組換え手段でペプチドを発現させる場合は、該ペプチドをコードする核酸を、無細胞株または細胞株での発現を調節することが可能なプロモーターまたはその他の調節配列と機能的に連結させた状態で配置する。
【０１４０】
核酸分子をプロモーター配列の調節制御下（すなわち、プロモーター配列と「機能的に連結させた状態」）で配置するとは、一般的に該ペプチドのコード配列の5’側（上流）にプロモーターを位置づけることによって、発現がプロモーター配列により制御されるように該核酸分子を配置することを意味する。
【０１４１】
大腸菌のような細菌においてインタクトなポリペプチドおよびペプチドを産生させるための必要条件は、効率的なリボソーム結合部位と共に強力なプロモーターを使用することである。大腸菌などの細菌細胞での発現に好適な典型的プロモーターとしては、限定するものではないが、laczプロモーター、温度感受性λLまたはλRプロモーター、T7プロモーター、またはIPTG誘導性tacプロモーターが挙げられる。大腸菌において本発明の核酸分子を発現させるための多くの他のベクター系が当技術分野で公知であり、例えば、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047150338, 1987)またはSambrookら(Molecular cloning, A laboratory manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)により記載されている。細菌での発現に適するプロモーター配列および効率的なリボソーム結合部位を含む多数のプラスミドがすでに記載されており、例えば、pKC30 (λL: ShimatakeおよびRosenberg, Nature 292, 128, 1981); pKK173-3 (tac: AmannおよびBrosius, Gene 40, 183, 1985)、pET-3 (T7: StudierおよびMoffat, J. Mol. Biol. 189, 113, 1986); アラビノース誘導性プロモーターを含むpBAD/TOPOまたはpBAD/Thio-TOPO系列のベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)、後者のベクターは発現タンパク質の溶解性を高めるためにチオレドキシンとの融合タンパク質を産生するようにも設計されている; pFLEX系列の発現ベクター (Pfizer Inc., CT, USA); またはpQE系列の発現ベクター (Qiagen, CA)が挙げられる。
【０１４２】
真核細胞のウイルスおよび真核細胞での発現に適する典型的プロモーターには、特に、SV40後期プロモーター、SV40初期プロモーター、およびサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、CMV IE (サイトメガロウイルス前初期)プロモーターが含まれる。哺乳動物細胞(例えば、293、COS、CHO、10T細胞、293T細胞)での発現に好適なベクターとしては、限定するものではないが、Invitrogenにより供給されるpcDNAベクターのセット、特にCMVプロモーターを含みかつC-末端の6xHis およびMYCタグをコードするpcDNA 3.1 myc-His-tag; およびレトロウイルスベクターpSRαtkneo (Mullerら, Mol. Cell. Biol., 11, 1785, 1991)が挙げられる。ベクターpcDNA 3.1 myc-His (Invitrogen)は、293T細胞において分泌型の本発明ペプチドまたはその誘導体を発現させるのに特に好適であり、この場合には、発現されたペプチドまたはタンパク質を、Hisタグを介して該タンパク質と結合するニッケルカラムを使用する標準的なアフィニティー技法により、非特異的タンパク質を取り除いて精製することができる。
【０１４３】
本発明のペプチドまたはその免疫学的誘導体を発現させるのに好ましい広範な追加の宿主／ベクター系が一般に入手可能であり、例えば、Sambrookら (Molecular cloning, A laboratory manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)に記載されている。
【０１４４】
ペプチドをコードする核酸またはそれを含む遺伝子構築物を発現用の細胞に導入する手段は当業者に周知である。所与の生物に用いられる技法は、成功を治めている公知技術に依存する。組換えDNAを動物細胞に導入する手段としては、マイクロインジェクション、DEAE-デキストランにより媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン(lipofectamine; Gibco, MD, USA)および／またはセルフェクチン(cellfectin; Gibco, MD, USA)などのリポソームにより媒介されるトランスフェクション、PEG媒介DNA取込み、エレクトロポレーション、およびDNAをコーティングしたタングステンまたは金粒子(Agracetus Inc., WI, USA)を使用するなどの微粒子衝撃法が挙げられる。
【０１４５】
2.  単離されたHCMVポリエピトープ
本発明の第2の態様は、上述した本発明の2以上の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)エピトープを含む、免疫学的活性のあるポリエピトープペプチドを提供する。
【０１４６】
当業者は、単一のポリエピトープペプチド内に含まれるCTLエピトープの数を容易に決定することができる。
【０１４７】
合成ペプチドの場合、単一のポリエピトープペプチドに包含されるCTLエピトープの最大数はペプチド合成の能力によって制約されるが、一般に、アミノ酸の長さとして、400以下、好ましくは350以下、より好ましくは300以下、さらにいっそう好ましくは250もしくは200もしくは150もしくは100もしくは50以下のアミノ酸からなるペプチドが容易に合成される。これは、本発明の約45もの異なるCTLエピトープが、１つの合成ポリエピトープペプチドに容易に含められることを意味する。当業者には明らかなように、ペプチド合成は、ペプチドが短いほど効率が高まる。本発明の特に好ましい実施形態において、合成ポリエピトープペプチドは約30〜35の本明細書に記載のCTLエピトープを含む。
【０１４８】
ポリエピトープペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクターによってあらかじめトランスフェクトされた分離細胞で発現される組換えポリエピトープペプチドに関しては、もっと多数の異なるCTLエピトープを単一のポリエピトープペプチドに含めることができる。当業者には明らかなように、最大で数キロベースのヌクレオチドからなる核酸を用いて、核酸操作を容易に行うことができる。組換えペプチドの生産法は上記、および2ページに引用した一般的な教科書に詳細に記述されており、これを参考として本明細書に含めるものとする。
【０１４９】
本発明のポリエピトープをコードする合成核酸については、長さが約50〜110ヌクレオチドまでの合成オリゴヌクレオチド（それぞれが約3〜4の隣接したCTLエピトープのコード容量を有する）を効率よく容易に作製して、こうしたオリゴヌクレオチドを直列に並べて適当なベクターにクローニングして、過度の実験なしに、必要な数の隣接したCTLエピトープを得ることができる。
【０１５０】
本発明のポリエピトープペプチドは、約5〜10のCTLエピトープを含むことが望ましいが、約10〜15のCTLエピトープがより望ましく、約15〜20のCTLエピトープがさらにいっそう望ましく、約20〜25のCTLエピトープがさらによりいっそう望ましく、さらに、約25〜30のCTLエピトープがなおいっそう望ましい。本明細書に例示される特に好ましい実施形態においては、本発明の26〜27の異なるCTLエピトープを含む単離されたポリエピトープペプチドが提供される。
【０１５１】
ポリエピトープ作製技術分野の当業者には明らかなように、ポリエピトープの個々のエピトープモノマーの間に、あるいはまた、ペプチド部分と、エピトープもしくはポリエピトープに導入された脂質部分との間に、何らかのスペーシングを導入する必要はない。
【０１５２】
本発明のポリエピトープは、単一のMHCクラスIハプロタイプに拘束されないことが望ましい。さらにいっそう望ましいのは、ポリエピトープが、人種起源や民族に関わりなく全集団の大部分をカバーするのに十分な数のMHCクラスI分子に拘束されることである。当業者は容易に、本明細書で与えられるHLA特異性データから、所与の集団をカバーするために必要とされる個々のHCMV CTLエピトープの数を決定することができるであろう。
【０１５３】
ポリエピトープペプチドは、HLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A11、HLA A23、HLA A24、HLA A26、HLA A29、HLA A30、HLA A68、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B41、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるMHCクラスI対立遺伝子に拘束されるアミノ酸配列を少なくとも含むことが望ましい。当業者は、本発明のエピトープおよび先行技術のエピトープについて本明細書で提供されるHLA拘束データに基づいて、このような広範な拘束性を容易に達成することができるであろう。ただし唯一の条件は、前記ポリエピトープの少なくとも１つのCTLエピトープが配列番号1〜21からなる群より選択されるエピトープ以外のものであることである。
【０１５４】
より好ましくは、ポリエピトープペプチドは、HLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A11、HLA A23、HLA A24、HLA A26、HLA A30、HLA A68、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B41、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるMHCクラスI対立遺伝子に拘束される。このような広範なHLA拘束性は、配列番号13 (YSEHPTFTSQY; HLA A1); 配列番号165 (VTEHDTLLY; HLA A1); 配列番号5 (NLVPMVATV; HLA A2); 配列番号101 (VLEETSVML;HLA A2); 配列番号7 (RIFAELEGV; HLA A2); 配列番号254 (IIYTRNHEV; HLA A2); 配列番号135 (IMREFNSYK; HLA A3); 配列番号21 (TTVYPPSSTAK; HLA A3); 配列番号1 (SVLGPISGHVLK; HLA A11); 配列番号116 (AYAQKIFKIL; HLA A23/A24/A30); 配列番号33 (QYDPVAALF; HLA A24); 配列番号2 (FTSQYRIQGKL; HLA A24); 配列番号37 (YVKYVYESF; HLA A26); 配列番号15 (DIYRIFAEL; HLA A26); 配列番号3 (FVFPTKDVALR; HLA A68); 配列番号134 (NVRRSWEEL; HLA B7); 配列番号132 (KARDHLAVL; HLA B7); 配列番号41 (QARLTVSGL; HLA B7); 配列番号8 (TPRVTGGGAM; HLA B7); 配列番号109 (KARAKKDEL; HLA B7/B8); 配列番号113 (QIKVRVDMV; HLA B8); 配列番号112 (ELRRKMMYM; HLA B8); 配列番号42 (RRRHRQDAL; HLA B8); 配列番号162 (ARVYEIKCR; HLA B27); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY; HLA B35); 配列番号4 (FPTKDVAL; HLA B35); 配列番号55 (IPSINVHHY; HLA B35); 配列番号260 (FEQPTETPP; HLA B41); 配列番号189 (YAYIYTTYL; HLA B41); 配列番号56 (QEFFWDANDIY; HLA B44); 配列番号170 (YEQHKITSY; HLA B44); 配列番号51 (QEPMSIYVY; HLA B44); 配列番号47 (SEHPTFTSQY; HLA B44); および 配列番号63 (QAIRETVEL; HLA B57/B58) からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCTLエピトープを用いて、容易に達成されるが、ただし、ポリエピトープペプチドに含まれる前記配列のうち少なくとも１つは、配列番号1 (SVLGPISGHVLK; HLA A11); 配列番号2 (FTSQYRIQGKL; HLA A24); 配列番号3 (FVFPTKDVALR; HLA A68); 配列番号4 (FPTKDVAL; HLA B35); 配列番号5 (NLVPMVATV; HLA A2); 配列番号7 (RIFAELEGV; HLA A2); 配列番号8 (TPRVTGGGAM; HLA B7); 配列番号13 (YSEHPTFTSQY; HLA A1); 配列番号15 (DIYRIFAEL; HLA A26); 配列番号21 (TTVYPPSSTAK; HLA A3);および配列番号55 (IPSINVHHY) からなる群より選択される配列以外のものであるという条件に従う。
【０１５５】
さらに、いっそう好ましくは、ポリエピトープはHLA A1、HLA A2、HLA A3、HLA A23、HLA A24、HLA A26、HLA A30、HLA B7、HLA B8、HLA B27、HLA B35、HLA B41、HLA B44、HLA B57およびHLA B58からなる群より選択されるMHCクラスI対立遺伝子に拘束される。このような広範なHLA拘束性は、配列番号165 (VTEHDTLLY; HLA A1); 配列番号101 (VLEETSVML;HLA A2); 配列番号254 (IIYTRNHEV; HLA A2); 配列番号135 (IMREFNSYK; HLA A3); 配列番号116 (AYAQKIFKIL; HLA A23/A24/A30); 配列番号33 (QYDPVAALF; HLA A24); 配列番号37 (YVKYVYESF; HLA A26); 配列番号134 (NVRRSWEEL; HLA B7); 配列番号132 (KARDHLAVL; HLA B7); 配列番号41 (QARLTVSGL; HLA B7); 配列番号109 (KARAKKDEL; HLA B7/B8); 配列番号113 (QIKVRVDMV; HLA B8); 配列番号112 (ELRRKMMYM; HLA B8); 配列番号42 (RRRHRQDAL; HLA B8); 配列番号162 (ARVYEIKCR; HLA B27); 配列番号66 (CPSQEPMSIYVY; HLA B35); 配列番号260 (FEQPTETPP; HLA B41); 配列番号189 (YAYIYTTYL; HLA B41); 配列番号56 (QEFFWDANDIY; HLA B44); 配列番号170 (YEQHKITSY; HLA B44); 配列番号51 (QEPMSIYVY; HLA B44); 配列番号47 (SEHPTFTSQY; HLA B44); および配列番号63 (QAIRETVEL; HLA B57/B58)からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCTLエピトープを用いて容易に達成される。
【０１５６】
単一エピトープと同様に、本発明のポリエピトープは、HLAスーパータイプ特異性を示し、かつ／または、HCMVに感染したヒト患者のヘルパーＴ細胞機能を促進するのに十分な、1以上のCD4+決定基を含むことが望ましい。ポリエピトープペプチドは、HLAスーパータイプ特異性を有する、少なくとも１つのエピトープを含むことが望ましいと思われるが、2または3または4または5のこうしたエピトープを含むことがさらに望ましい。好ましくは、HLAスーパータイプ特異性を示すポリエピトープペプチドは、配列番号116; 配列番号117; 配列番号109; 配列番号195; 配列番号57; 配列番号69; 配列番号63; 配列番号80; および配列番号81からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる。
【０１５７】
本発明の特に好ましい実施形態において、配列番号309; 配列番号310; 配列番号311; 配列番号312; 配列番号313; 配列番号314; 配列番号315; 配列番号316; 配列番号317; および配列番号318からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリエピトープペプチドが提供される。
【０１５８】
本発明のこのような態様は、明らかに、前記ポリエピトープペプチドの誘導体もしくは機能的に同等の変異体を包含する。
【０１５９】
本明細書で使用する「ポリエピトープペプチドの誘導体もしくは機能的に同等の変異体」という語は、該ポリエピトープペプチド内に含まれる1以上のCTLエピトープの誘導体もしくは機能的に同等の変異体、またはポリエピトープペプチドに適用された上記の誘導体もしくは変異体（すなわち、ポリエピトープペプチドの配列変異体もしくはリポペプチド、または、追加のB細胞エピトープもしくはヘルパーT細胞エピトープがコンジュゲートされたポリエピトープペプチド）を含むと解釈される。
【０１６０】
本発明は明らかに、スペーサー分子を含む本エピトープもしくはポリエピトープの誘導体を包含するものであり、こうしたスペーサー分子の例としては、炭素もしくはアミノ酸残基を含むスペーサーがある。セリン二量体、三量体、四量体などがこの目的に特に好ましい。好都合にも、コンフォメーションを安定化するα-アルキルアミノ酸（例えば、Aib）を1つ以上含むスペーサーを使用すると、α-へリックスの不安定化が防止される。X-(Ala-Aib-Ala-Aib-Ala)n -Y（ここで、nは2または4の整数であって、XおよびYは保護基、水素、ヒドロキシル、もしくはアミノ基である）のタイプのスペーサーが特に好ましい。こうしたスペーサーは、ペプチドへの付加に先だって脂質構造に付加されることが望ましく、また、末端の保護アミノ酸残基を含めることで修飾リポアミノ酸のポリペプチドへのその後の結合が容易になる。
【０１６１】
3.  ワクチン組成物
本発明の別の態様は、ヒト被験者においてHCMVに対する細胞性免疫応答を引き出す組成物を提供するが、この組成物は、有効量の、1以上の免疫学的に活性のある本発明のペプチド（すなわち、単一エピトープもしくはポリエピトープ）、またはその誘導体もしくは機能的に同等の変異体を、製薬上許容される担体、賦形剤、希釈剤および／またはアジュバントと組み合わせて含む。
【０１６２】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、HCMV特異的T細胞の活性化をもたらし、好ましくは被験者の細胞性免疫を引き出すのに十分な本ペプチドの量を意味する。
【０１６３】
本発明のワクチン組成物は、免疫学的活性のあるペプチド、もしくはそれから誘導されたリポペプチドを含むサブユニットワクチンとすることができる。
【０１６４】
サブユニットワクチンの場合は、本発明のペプチドエピトープもしくはポリエピトープ、またはそれらの誘導体もしくは変異体は、製薬上許容される賦形剤もしくは希釈剤、例えば水性溶媒、非水性溶媒、毒性のない賦形剤、例えば塩、防腐剤、バッファーを用いて都合よく製剤化される。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルがある。水性溶媒には、水、アルコール性／水性溶液、食塩水、非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム液、リンゲルのブドウ糖液が挙げられる。防腐剤には、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスが含まれる。ワクチン組成物のpH、および様々な成分の正確な濃度は、当技術分野のルーチンな技術にしたがって調節する。
【０１６５】
場合により、ワクチン製剤はキャリアーを含んでいてもよい。抗体産生を達成するのに厳密には必要でないが、分子量キャリアー分子は明らかに本発明の範囲に包含される。よく使用されるキャリアー分子はウシ血清アルブミン（BSA）、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、オボアルブミン、マウス血清アルブミン、ウサギ血清アルブミンなどである。合成キャリアーも使用され、容易に利用できる。ペプチドをキャリアータンパク質にコンジュゲートするための手段も当技術分野でよく知られており、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス-ジアゾ化ベンジジンを包含する。
【０１６６】
特定の状況において、ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体をアジュバントとともに製剤化して、CTLエピトープに対する免疫応答を増強することも望ましいと考えられる。これも厳密にいえば必須ではない。こうしたアジュバントは、例えばサイトカイン、毒素、もしくは合成組成物といった、すべての受容可能な免疫賦活性化合物を包含する。具体的なアジュバントとしては、スクアレンもしくは動物起源の他の油脂；ブロック共重合体；界面活性剤、例えばTween-80もしくは他の非イオン性界面活性剤；油脂、例えばDrakeolもしくはMarcol; 植物性油脂、例えばピーナッツ油；コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、例えば C. parvum、起源のアジュバント；プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、例えばP. acne、起源のアジュバント；マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、例えばM. Bovis、起源のアジュバント；ポックスウイルスタンパク質、例えばワクシニア(Vaccinia)に由来する；例えばコレラ毒素のようなウイルス成分；例えばIL-1、IL-2、またはIL-12のようなサイトカイン（モノカインもしくはインターロイキン）；腫瘍壊死因子（TNF）；例えばIFN-γといったインターフェロン（IFN）；BCG；水酸化アルミニウム；ムラミルジペプチドもしくはその誘導体のような合成グリコペプチドであって、これはN-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン (thur-MDP), N-アセチル-ノル-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン (CGP 11637、ノル-MDPと称する)、もしくはN-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン（CGP 1983A、MTP-PEと称する）を包含する；アブリジン(Avridine)；リピドAもしくはその誘導体、例えば、モノホスホリルリピドA；デキストラン硫酸；DEAE-デキストラン、リン酸アルミニウムとの組合せも選択可能；カルボキシポリメチレン、例えばCarbopol’EMA；アクリル共重合体エマルション、例えばNeocyl A640（米国特許第5,047,238号）；MPL；RIBI、これは細菌から抽出された3つの成分を含有する；トレハロースジマイコレート；細胞壁抽出物もしくは細胞壁骨格、例えば、2%スクアレン／Tween 80エマルション中のMPLとTDMとCWSの混合物；または、サポニンもしくはその画分を含むサポニンアジュバント組成物、例えば本明細書に記載の1以上のアジュバントもしくは他の既知アジュバントと組み合わせたQuilA、ISCOMATRIXもしくはISCOM、が挙げられる。
【０１６７】
特に好ましいアジュバントは、ISCOMおよび／またはISCOMATRIX（CSL Limited, Parkville, Australia）を含んでなり、本発明のエピトープもしくはポリエピトープによって得られる有効な免疫応答を増強するが、好ましくは、ヒト被験者において、細胞傷害性T細胞応答の誘導を増強する。ISCOMおよびISCOMATRIXは、本明細書に記載のペプチドに対する細胞性および体液性免疫応答を増強することができる。
【０１６８】
ISCOMATRIXは、抗原が組み込まれていないまたは結合されていないISCOM粒子である。ISCOMATRIXアジュバントは、例えば、コレステロールおよびリン脂質といった脂質と複合体化した、キラヤ（Quilaia saponaria molina）の樹皮から得られたサポニンを含む。一定の条件下で、上記の複合体は平均粒径40 nmの粒子を形成することができる。こうしたアジュバントの免疫賦活性は、細胞性免疫応答を必要とする適用例に理想的に適合する。したがって、ISCOMATRIX粒子はアジュバントおよび抗原送達性の両方をもたらす。
【０１６９】
抗原がISCOMATRIX粒子に組み込まれるか、もしくは予備形成ISCOMATRIX粒子と結合される場合、ISCOMが生成される。ISCOMはQuil A（サポニンの半精製調製物）もしくは精製サポニン画分を用いて調製することができる。好ましいサポニン調製物としては、例えば、精製サポニン画分の混合物を含むISCOPREP703(CSL Limited)が挙げられる。
【０１７０】
アジュバントに加えて、生物学的応答調節物質（BRM）をペプチドもしくは変異体もしくは誘導体とともに同時投与して、サプレッサーT細胞活性をダウンレギュレートすることが望ましいと考えられる。BRMの例としては、シメチジン（CIM;1200 mg/d）（Smith/Kline, PA, USA）；インドメタシン（IND; 150 mg/d）（Lederle, NJ, USA）；もしくは低用量のシクロホスファミド（CYP; 75, 150または300 mg/m.sup.2）（Johnson/Mead, NJ, USA）があるが、それに限定されない。
【０１７１】
ワクチン製剤の投与のための好ましいビヒクルには、リポソームがある。リポソームは、水性のコンパートメントを取り囲む1以上の脂質二重層からなる微細な小胞である。(Bakker-Woudenberg ら, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12(Suppl. 1), S61 (1993); およびKim, Drugs 46, 618 (1993))。リポソームは、組成が細胞膜と似ており、結果としてリポソームは概して安全に投与され、生分解性である。
【０１７２】
リポソームを調製する技法、および、ペプチドやオリゴヌクレオチドを含めた様々な分子をリポソームにより製剤化（例えば、カプセル化）するための技法は、当業者によく知られている。
【０１７３】
調製法に応じて、リポソームは単膜もしくは多重膜とすることができるが、直径が0.02μmから10μmを超えるまでの範囲で大きさを変化させることができる。様々な薬剤がリポソーム内に封入される。疎水性薬剤は二重層内に分配され、親水性薬剤は内部の水性スペース内に分配される(Machyら, LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY AND PHARMACOLOGY (John Libbey 1987)および Ostroら、American J. Hosp. Pharm. 46, 1576, 1989)。
【０１７４】
リポソームはほとんどあらゆるタイプの細胞に吸着した後、封入された薬剤を放出することができる。あるいはまた、リポソームは標的細胞に融合し、それによって、リポソームの内容物は空となり標的細胞に入る。あるいは、吸着されたリポソームを、食作用を有する細胞によってエンドサイトーシスにより取り込むことができる。エンドサイトーシスの後、リポソーム脂質のリソソーム内分解がおこり、封入された薬剤が放出される(Scherphof ら, Ann. N.Y. Acad. Sci. 446, 368 (1985))。この状況において、ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体をリポソームの表面上に局在化させて、リポソームの破壊もしくはエンドサイトーシスなしに、抗原提示を促進することができる。しかしながら、そうした機構もしくは送達にかかわりなく、結果は、関連ペプチドまたはその誘導体もしくは変異体の細胞内配置である。
【０１７５】
リポソームベクターは、アニオン性もしくはカチオン性とすることができる。アニオン性リポソームベクターには、エンドサイトーシスおよびエンドソームの酸性化の後に、エンドソーム膜を破壊するか、またはエンドソーム膜と融合するpH感受性リポソームが含まれる。カチオン性リポソームは、in vitroで哺乳動物細胞のトランスフェクションを仲介するために、または核酸の一般的な送達のために好んで用いられるが、ペプチドのような他の治療薬の送達にも使用される。
【０１７６】
カチオン性リポソーム製品は、従来の方法によって作製される(Feignerら, Proc. Nat'l Acad. Sci USA 84, 7413 (1987); Schreier, Liposome Res. 2, 145 (1992))。市販の製品、例えばリポフェクチン（Lipofectin、Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Md. USA)は容易に入手できる。投与すべきリポソームの量は、用量反応曲線に基づいて最適化される。Feignerら、前掲。
【０１７７】
本発明の方法に使用する他の適当なリポソームとしては、多重膜リポソーム（MLV）、オリゴラメラリポソーム（OLV）、単膜リポソーム（UV）、小さな単膜リポソーム（SUV）、中程度の単膜リポソーム（MUV）、大きな単膜リポソーム（LUV）、巨大単膜リポソーム（GUV）、多小胞リポソーム（MVV）、逆相蒸発法によって作製された単膜もしくはオリゴラメラリポソーム（REV）、逆相蒸発法によって作製された多重膜リポソーム（MLV-REV）、安定な多重膜（プルリラメラ）リポソーム（SPLV）、凍結融解MLV（FATMLV）、押出法によって調製されたリポソーム（VET）、フレンチプレスによって調製されたリポソーム（FPV）、融合によって調製されたリポソーム（FUV）、脱水-再水和リポソーム（DRV）、およびバブルソーム（BSV）がある。当業者は、上記のリポソームを調製するための技法が当技術分野で周知であることを認識するであろう（COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, 第66巻, J. Kreuter編, Marcel Dekker, Inc. 1994を参照されたい）。
【０１７８】
他の形態の送達粒子、例えばミクロスフェアなども、ペプチドエピトープもしくはポリエピトープの送達のために考慮される。
【０１７９】
適当な製剤を調製する指針および製薬上有効なビヒクルは、例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第83-92章, 第1519-1714頁 (Mack Publishing Company 1990) (Remington's)に見いだされるが、これを参考として本明細書に含めるものとする。
【０１８０】
あるいはまた、免疫学的に活性なペプチドエピトープもしくはポリエピトープをコードし、適当なベクター（例えば、ワクシニア、カナリア痘、アデノウイルス、もしくは他の真核生物ウイルスベクター）中にクローニングされた、例えばDNAまたはRNAといった核酸を含有する核酸ベースのワクチンも調製される。
【０１８１】
あるいは、ペプチドは、表面上にそのペプチドを提示するようにin vitroで処理された自己もしくは同種異系APCまたは樹状細胞の投与によって、細胞性ワクチンの形で投与される。
【０１８２】
4. HCMV特異的免疫を増強する方法
本発明のもう一つの態様は、ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法を提供するが、これは、少なくとも１つの免疫学的に活性のある、本発明のエピトープペプチドもしくはポリエピトープペプチド、または前記ペプチドの誘導体もしくは機能的に同等の変異体、あるいは前記ペプチドもしくは変異体もしくは誘導体を含むワクチン組成物を、前記患者のCTLおよび／またはCTL前駆細胞を活性化するのに十分な条件下で、かつ十分な期間にわたり投与することを含んでなる。
【０１８３】
「CTL前駆細胞」とは、ナイーブT細胞（すなわち、1以上のT細胞受容体をその表面上に発現し、記憶T細胞もしくはエフェクターT細胞へと増殖し分化する能力を有するT細胞）である。
【０１８４】
ペプチドもしくはワクチンは、HCMVの潜伏感染もしくは活動性感染を有する、または免疫抑制状態もしくは免疫無防備状態である被験者、例えば、移植レシピエント、あるいはHCMV感染に起因する合併症の危険がある被験者、例えば生殖能力を有する女性患者もしくは妊娠した女性、に投与されることが望ましい。好ましくは、移植レシピエントは骨髄移植（BMT）レシピエントである。
【０１８５】
本明細書において、「活性化する」という用語は、一時的に、あるいは持続的に、HCMVを有する細胞を認識して溶解するT細胞の能力を増強すること、またはHCMVの抗原のT細胞エピトープを認識するT細胞の能力を強めることを意味する。また、「活性化する」という用語は、当然、HCMV潜伏感染の活性化後の、またはHCMV再感染後の、または、すでに感染した患者を本発明のペプチドもしくは組成物で免疫化した後の、T細胞集団の再活性化を包含すると解釈されるべきであろう。
【０１８６】
当業者は、最適なT細胞活性化には、T細胞受容体（TcR）による抗原／MHCのコグネイト認識、およびT細胞上の様々な細胞表面分子と抗原提示細胞（APC）上の表面分子との結合を伴う副刺激(co-stimulation)が必要であることを認識している。CD28/B7、CD40L/CD40およびOX40/OX40Lの副刺激相互作用が好ましいが、T細胞活性化に必須というわけではない。他の副刺激経路も機能すると考えられる。
【０１８７】
CTL活性化が被験者に生じているかどうかは、例えば、細胞傷害性アッセイ、ELISPOT、もしくは、被験者のPBMCにおけるIFN-γ産生を測定する、といった基本的に本明細書に記載の標準的な方法を用いて判定する。
【０１８８】
ペプチドもしくは誘導体もしくは変異体またはワクチン組成物は、CD8+T細胞の増殖を誘導し、もしくは高めるのに十分な条件下で、かつ十分な期間にわたり投与することが望ましい。
【０１８９】
CD4+ヘルパーT細胞は、体液性免疫を支持することに加えて、CMIにおいてサイトカイン産生細胞として機能するが、この細胞は遅延型過敏に介在してCTLを支持し、したがって細胞内病原体へのCMI応答の重要な成分である。例えば、主要組織適合性複合体（MHC）拘束性CTL応答は、Th1細胞によって支持される。ある場合には、CD4+ヘルパーT細胞はまた、例えばIL-2のような、十分なサイトカインを分泌することによってCD8+T細胞の増殖を促進するために、またはAPCと相互作用することによってAPCのCD8+T細胞を活性化する能力を高めるためにも必要とされるかもしれない。こうした状況において、CD4+およびCD8+エピトープの両方を含む20-merペプチドを使用すること、もしくは代わりに、本発明のCD8+エピトープを既知の許容CD4+エピトープと組み合わせて使用することが好ましい。
【０１９０】
さらにいっそう好ましくは、ペプチドもしくは誘導体もしくは変異体またはワクチン組成物は、患者においてHCMV特異的な細胞性免疫（CMI）を高めるのに十分な条件下で、かつ十分な期間にわたり投与される。
【０１９１】
「HCMV特異的CMI」とは、活性化されてクローン増殖したCTLがMHC拘束性であり、さらに本発明のCTLエピトープに特異的であることを意味する。CTLは抗原特異性およびMHC拘束性に基づいて分類される（すなわち、非特異的CTLおよび抗原特異的、MHC拘束性CTL）。非特異的CTLは、NK細胞および抗体依存性細胞傷害性を含めた様々な細胞タイプからなり、抗原特異的応答がまだ確立されつつある間に、免疫応答のごく初期に作用して病原体量を減らすことができる。これに対して、MHC拘束性CTLは、非特異的CTLより遅く、通常は抗体産生の前に、至適活性を達成する。抗原特異的CTLは、HCMVの伝播を阻止もしくは減少させるが、好ましくは、感染を終結させる。
【０１９２】
CTL活性化、クローン増殖、もしくはCMIは、全身的に誘導されても、またはコンパートメントに局在してもよい。コンパートメントに局限された効果の場合には、そのコンパートメントへの投与に合わせて製剤化されたワクチン組成物を用いることが好ましい。他方、患者において全身的にCTL活性化、クローン増殖、もしくはCMIを誘導するためにはこうした厳しい要件はない。
【０１９３】
単独でも、ワクチン組成物としても、CTL活性化、クローン増殖、もしくはCMIを誘導するために投与されるべきペプチドの有効量は、免疫原性エピトープの性質、投与経路、免疫処置を受ける患者の体重、年齢、性別、または全身健康状態、および調べるCTL応答の性質によって異なる。このような変動要因はすべて、業界で認知された方法によって経験的に決定される。
【０１９４】
ペプチドは、場合によっては、あらゆる好適なもしくは望ましい担体、アジュバント、BRM、または製薬上許容される賦形剤と共に製剤化されるが、こうしたペプチドは注射可能な組成物の形で適切に投与される。注射は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、もしくは他の既知の経路とすることができる。静脈内注射の場合は、1以上の液体および栄養補給剤を包含することが望ましい。
【０１９５】
投与されるべき最適用量および好ましい投与経路は、動物モデルを用いて、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、またはブタに、ペプチドを含む製剤を注射し、その後、そのエピトープに対するCTL免疫応答を、実施例に記載の従来のアッセイを用いてモニターすることによって、確立される。
【０１９６】
ヒトHLA A*0201対立遺伝子のα1およびα2ドメイン、およびマウスH-2KbクラスI分子のα3ドメインを含むキメラヒト-マウスクラスI主要組織適合性複合体（MHC）遺伝子座を有するHLA A2/Kbトランスジェニックマウス（Vitielloら、J. Exp. Med. 173, 1007, 1991）の使用は、HLA A2拘束性ペプチドエピトープもしくはポリエピトープを含む本発明のワクチン組成物に対するCTL応答をin vivoで試験するために特に好ましい。
【０１９７】
関連する実施形態において、本発明は、ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法を提供する。この方法は、ex vivoで、ヒト被験者から得られたT細胞に、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性のあるペプチド、その誘導体もしくは変異体、またはワクチン組成物（前記ペプチドもしくは誘導体もしくは変異体を含む）を、HCMV活性を前記T細胞に賦与するのに十分な条件下で、かつ十分な期間にわたり接触させることを含んでなる。
【０１９８】
好ましい実施形態において、本発明はヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強する方法を提供するが、この方法は下記を含んでなる：
(i)  ex vivoで、ヒト被験者から得られたT細胞に、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性のあるペプチド、その誘導体もしくは変異体、またはワクチン組成物（前記ペプチドまたは誘導体もしくは変異体を含む）を、HCMV活性を前記T細胞に賦与するのに十分な条件下で、かつ十分な期間にわたり接触させること；および
(ii)  活性化されたT細胞を自己由来として該被験者に、または同種異系として別のヒト被験者に導入すること。
【０１９９】
T細胞はCTLもしくはCTL前駆細胞とすることができる。
【０２００】
T細胞を採取されるヒト被験者は、治療を受けるべき被験者と同じであっても、異なる被験者であってもよい。治療を受ける被験者は、HCMVの潜伏感染もしくは活動性の感染を有するか、またはHCMV感染の危険もしくはHCMV感染の再活性化の危険にさらされている（例えば、生殖能のある女性もしくは妊娠女性、または骨髄移植患者をはじめとする移植患者）か、またはHCMVのワクチン接種を必要とするか、もしくはHCMVのワクチン接種を受けることを希望する人とすることができる。
【０２０１】
こうした養子移入を実施して、基本的にEinsele ら、Blood 99, 3916-3922, 2002に記載のように、HCMV反応性をアッセイすることが望ましく、この手順は参考として本明細書に含めるものとする。
【０２０２】
「HCMV活性」とは、T細胞を上記のように活性化されうるようにすることを意味する（すなわち、T細胞は、一時的にも、持続的にも、HCMVを保有する細胞を認識して溶解するか、またはHCMVの抗原のT細胞エピトープを認識することができる）。したがって、T細胞は、一時的にも、持続的にも、本発明の方法によってHCMVを保有する細胞を認識して溶解しうるようにされるか、またはHCMVの抗原のT細胞エピトープを認識しうるようにされるCTL前駆細胞とすることが特に好ましい。
【０２０３】
このようなex vivoでの適用のために、T細胞は、ヒト被験者から得られた生物学的サンプル中に含まれることが望ましく、例えば、一次もしくは中枢リンパ器官（例えば、骨髄もしくは胸腺）または二次もしくは末梢リンパ器官（例えば、血液、PBMC、またはそれらに由来するバフィーコート画分）を含む生検検体に含まれる。
【０２０４】
好ましくは、T細胞、もしくはT細胞を含む検体を前もってヒト被験者から、例えば、顧問の医師が採取し、その医師は検体を分析のために病理検査室に付託しておく。
【０２０５】
好ましくは、本方法は被験者のT細胞を含むサンプルの採取をさらに含んでなり、前記被験者から前記サンプルを採取することがさらに好ましい。
【０２０６】
本発明の別の態様は、感染していないヒト被験者においてHCMVに対する免疫を賦与し、または増強する方法を提供し、この方法は、前記被験者に、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性のあるペプチド、その誘導体もしくは変異体、またはワクチン組成物（前記ペプチドまたは誘導体もしくは変異体を含む）を、HCMVによる将来の感染にそなえる免疫記憶を与えるのに十分な条件下で、かつ十分な期間にわたり投与することを含んでなる。
【０２０７】
関連する実施形態において、本発明は、感染していないヒト被験者においてHCMVに対する免疫を増強または賦与する方法を提供し、この方法は、前記被験者から採取されたT細胞に、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性のあるペプチド、その誘導体もしくは変異体、またはワクチン組成物（前記ペプチドまたは誘導体もしくは変異体を含む）を、HCMV反応性を前記T細胞に賦与するのに十分な条件下で、かつ十分な期間にわたりex vivoで接触させること含んでなる。
【０２０８】
したがって、本発明の上記の態様は、予防用のワクチンを被験者に投与することを含んでなり、ここで前記ワクチンの活性置換分（すなわち、本発明のエピトープもしくはポリエピトープ）は、感染していない個体において、記憶T細胞による免疫記憶を誘導する。本明細書に記載される、ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫を増強することを目的とするワクチン接種プロトコルの好ましい実施形態は、必要な変更を加えて、ヒト被験者のHCMVに対する免疫記憶の誘導に適用される。
【０２０９】
5.  診断への応用
本発明の別の態様は、ある被験者が以前にHCMVに感染したことがあるか否かを判定する方法を提供するが、この方法は、その被験者から採取したT細胞を、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性なペプチド、その誘導体もしくは変異体、またはワクチン組成物（前記ペプチドまたは誘導体もしくは変異体を含む）で抗原刺激を受けた抗原提示細胞（APC）と、ex vivoで接触させること、およびCTLもしくはCTL前駆細胞の活性化を判定することを含んでなる。ここにおいて、前記のCTLもしくはCTL前駆細胞の活性化は、この被験者が以前にHCMVに感染したことがあることを示す。
【０２１０】
本方法のプロセスは、HCMV感染を受けた、またはHCMV潜伏感染を有する個体の免疫の程度をモニターするためにも有用である。したがって、本方法は、HCMV特異的T細胞免疫の定量分析（すなわち免疫の程度）および定性分析（すなわち、感染に対する未感染）のいずれにも有用である。
【０２１１】
関連する実施形態において、本発明は、ヒト被験者のHCMV特異的細胞性免疫のレベルを測定する方法を提供するが、この方法は、その被験者から採取したT細胞を、HCMV抗原のCTLエピトープを含む免疫学的に活性なペプチド、その誘導体もしくは変異体、またはワクチン組成物（前記ペプチドまたは誘導体もしくは変異体を含む）で初回刺激を受けた抗原提示細胞（APC）と、ex vivoで接触させること、およびCTLもしくはCTL前駆細胞の活性化レベルを測定することを含んでなる。ここにおいて、CTLもしくはCTL前駆細胞の活性化レベルは被験者のHCMV特異的細胞性免疫のレベルに相関している。
【０２１２】
ヒト被験者からT細胞を採取するが、その被験者は、診断されるべき被験者と同一の被験者であってもよいし、異なる被験者であってもよい。診断を受ける被験者は、HCMVの潜伏感染もしくは活動性の感染を有するか、またはHCMV感染の危険もしくはHCMV感染の再活性化の危険にさらされているヒト被験者（例えば、生殖能力を有する女性、もしくは妊娠した女性、または骨髄移植患者を含めた移植患者）、またはHCMV状態の測定を行う必要のあるもしくはHCMV状態の測定を受けることを希望するヒトとすることができる。
【０２１３】
こうしたex vivoでの適用のために、T細胞は、ヒト患者から得られる、例えば、一次もしくは中枢リンパ器官（例えば、骨髄もしくは胸腺）または二次もしくは末梢リンパ器官（例えば、血液、PBMC、またはそれらに由来するバフィーコート画分）を含む生検検体のような、生物学的サンプル中に含まれることが望ましい。
【０２１４】
好ましくは、T細胞もしくはT細胞を含む検体を、前もってヒト被験者から、例えば、顧問の医師が採取し、その医師は検体を分析のために病理検査室に付託しておく。
【０２１５】
本方法は、被験者のT細胞を含むサンプルの採取をさらに含んでなることが望ましく、前記被験者からの前記サンプルの採取を含んでなることがいっそう望ましい。
【０２１６】
ヒト被験者において、CTLもしくはCTL前駆細胞の活性化、またはHCMV特異的細胞性免疫のレベルを測定することを目的として、HCMVに特異的である検体中のT細胞の数をアッセイするための、または検体中のT細胞がHCMV特異的に活性化される能力を測定するための、標準的な方法を使用することができる。好ましいアッセイ法は、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生アッセイ、例えば、標準的なクロム放出アッセイ、または本明細書に記載のELISPOTアッセイを包含する。
【０２１７】
特にCD8+T細胞のHCMVエピトープ特異的定量化のためには、MHCクラスI四量体アッセイを利用することもできる（Altman ら、Science 274, 94-96, 1996; Ogg ら、Curr Opin Immunol. 10, 393-396, 1998）。四量体を作製するために、MHC分子のカルボキシル末端、例えばHLA A2重鎖を特異的ペプチドエピトープもしくはポリエピトープに結合し、それに適当なレポーター分子、好ましくは蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコエリトリン、フィコシアニンもしくはアロフィコシアニン、を結合した四量体複合体を形成するように処理する。四量体の形成は、例えば、MHC-ペプチド融合タンパク質をビオチン化分子として作製すること、およびその後、このビオチン化MHC-ペプチドを、蛍光色素で標識された脱グリコシル化アビジンと、モル比4:1で混合することによって達成される。作製された四量体を、被験者に由来する（例えば全血中もしくはPBMCサンプル中の）CD8+T細胞サブセット上のCD8+T細胞受容体（TcR）の個別の集団に結合するが、前記ペプチドはこれに対してHLA拘束をうける。in vitro でのT細胞活性化もしくは増殖のために要求されるものはない。結合後、さらに結合していない、もしくは非特異的に結合した四量体を除去するためにT細胞を洗浄した後、HLA-ペプチド四量体に特異的に結合しているCD8+細胞の数は、標準的なフローサイトメトリー法によって、例えば、FACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて、容易に定量される。この四量体を常磁性粒子もしくは磁気ビーズに付着させて、非特異的に結合したレポーターの除去およびセルソーティングを促進することができる。こうした粒子は市販の供給元から簡単に入手できる（例えば、Beckman Coulter, Inc., San Diego, CA, USA）。四量体染色は標識された細胞を殺すことはない；したがって、細胞の完全性はこれ以降の分析についても維持される。MHC四量体によって、たとえ、CD8+T細胞の1%未満に生じるような、極めてまれな事象についても、特異的細胞性免疫応答の正確な定量分析が可能となる（Bodinier ら、Nature Med. 6, 707-710, 2000; Ogg ら、Curr Opin Immunol. 10, 393-396, 1998）。
【０２１８】
また、例えば、サンプルを、四量体を測定するために使用したのとは異なるレポーター分子と結合したCD8に対するモノクローナル抗体とともにインキュベートすることによって、サンプル中のCD8+細胞の総数を容易に測定することができる。こうした抗体は容易に入手できる（例えば、Becton Dickinson）。2つのレポーター分子からのシグナルの相対強度は、CD8+細胞の総数および四量体-結合T細胞の両方の定量化を可能とし、四量体と結合した全T細胞の割合の決定を可能にする。
【０２１９】
サイトカインアッセイを使用して、ヒト被験者において、CTLもしくはCTL前駆細胞の活性化、またはHCMV特異的細胞性免疫のレベルを測定することもできる。このようなアッセイでは、サイトカイン、例えばIL-2が検出され、またはサイトカインの産生がHCMV抗原-反応性T細胞のレベルの指標として測定される。上記で説明したように、CD4+ヘルパーT細胞はCMIにおいて、例えばIL-2のようなサイトカインの産生細胞として機能して、CD8+T細胞の増殖を促進し、またはAPCと相互作用して、それがいっそうCD8+T細胞の活性化能力を有するようにする。したがって、サイトカインの産生は、T細胞活性化の間接的な尺度となる。
【０２２０】
好ましくは、サイトカインもしくはサイトカイン産生レベルを測定するために使用されるサイトカインアッセイ法は、基本的にPetrovsky および Harrison, J. Immunol. Methods 186, 37-46, 1995に記載の通りとし、このアッセイの参考文献を本明細書に含めるものとする。
【０２２１】
サイトカインアッセイは全血もしくはPBMCもしくはバフィーコートについて行われることが望ましい。
【０２２２】
6.  治療／診断への応用のためのHCMV特異的T細胞の作製
本発明の別の態様は、T細胞を、本発明の単離されたペプチドと、または本発明の単離されたペプチドで抗原刺激を受けたAPCと、接触させること、そのT細胞を培養すること、および増殖するT細胞を選択することを含んでなる、HCMV特異的CTLを作製する方法に関する。
【０２２３】
「HCMV特異的CTL」とは、HCMVのCTLエピトープもしくは前記エピトープを含むポリエピトープを認識する能力を有するか、またはHCMVに感染したヒト細胞を溶解する能力を有するT細胞もしくはT前駆細胞を意味する。
【０２２４】
T細胞は、例えばエフェクターT細胞または記憶T細胞またはCTL前駆細胞といった、ヒトもしくはヒト以外の細胞とすることができる。T細胞は、(a)ペプチドエピトープもしくはポリエピトープを認識することができるMHCクラスI分子を有する細胞、および(b)細胞(a)の能力を有するCTLに変換されうる細胞、を包含する。
【０２２５】
CTLはin vivoとex vivoのいずれでも生産される。in vivoでのCTL生産のために、ペプチド、もしくは同ペプチドを含む組成物を、HCMV特異的CTLが生産されるために十分な条件下で、かつ十分な期間にわたり動物に投与する。ex vivo での生産のために、動物体から取り出された細胞を、ペプチドと、もしくはペプチドを提示するAPCと、もしくは自己の感作LCLと接触させる。
【０２２６】
好ましくは、単クローン性または多クローン性HCMV特異的CTLは、健康な血清反応陽性ドナーから得られたPBMCを、本発明の、単離されたエピトープペプチドもしくはポリエピトープペプチド、または前記エピトープペプチドもしくはポリエピトープペプチドを含む本発明のワクチン組成物を用いて以前に抗原刺激または感作されたことのある自己LCLで、刺激することによって作製される。特に好ましい実施形態において、HCMV抗原またはエピトープペプチドもしくはポリエピトープペプチドを発現する組換えウイルス、例えば、組換えワクシニアウイルスを用いて、LCLを抗原刺激する。LCLを感作するための方法は、当業者に広く知られている。
【０２２７】
本明細書において、「感作する」とは、例えば、前記ペプチドをコードする核酸（例えば、適当な発現ベクターにクローン化されたウイルスゲノム断片または合成核酸、ワクチンベクター等の形をしている）によるLCLのトランスフェクションまたは形質転換、ならびにLCLと単離されたペプチドまたは抗原もしくはウイルスタンパク質との接触を包含する。
【０２２８】
特に好ましい実施形態において、個別のドナーに由来するT細胞クローンは、基本的に実施例9に記載の方法によって生産される。
【０２２９】
ヒト以外の動物細胞は診断用途で用いるのに適しており、例えば、特異的ペプチドエピトープもしくはペプチドポリエピトープに結合させて前記ペプチドのHLA特異性もしくは結合効率を判定するのに適している。当業者には明らかなように、こうしたCTLクローンは、本明細書に開示したエピトープの変異型配列を含めて、新たに合成されたCTLエピトープを、例えば、MHCクラスI四量体アッセイ、細胞傷害性アッセイ、IFN-γ産生アッセイ（例えば、クロム放出アッセイ）、サイトカインアッセイ、ELISPOT、などによってアッセイするために有用である。
【０２３０】
ヒト細胞の場合には、上記のように生産されたCTLは、次に、治療計画の一環として、または診断への応用のために、ヒトへの養子移入（例えば、CTLを同一のもしくは異なる被験者に導入する）に使用される。
【０２３１】
場合によっては、T細胞を、例えばIL-2のようなサイトカインの存在下で、ペプチドと接触させることも可能である。
【０２３２】
本発明の範囲は、明らかに、本明細書に記載の新規の免疫学的に活性なペプチドを用いて生産されたT細胞クローンにまで及び、さらにヒト被験者におけるHCMV感染、HCMV感染の潜在性、HCMV感染の可能性を、例えば、臓器移植（例えば、BMT）の前、途中、もしくは後に、または妊娠中に、モニターすることを目的として、あらゆる診断、予防もしくは治療法において、こうしたT細胞クローンを利用することにまで及ぶ。
【０２３３】
本発明の本質をいっそう明確にするため、好ましい形態について、下記の限定的でない実施例を参照して、ここに説明するものとする。
【実施例１】
【０２３４】
材料および方法
1.  細胞株の樹立および維持
Epstein Barrウイルスで形質転換したリンパ芽球様細胞株（LCL）を、HCMV血清反応陽性のドナーから、B95.8（Klein ら、Intervirology 3, 232-244, 1974）およびQIMR-WIL（Pope ら、Int J Cancer 4, 255-260, 1969）ウイルス分離株を用いた末梢B細胞の外来ウイルス形質転換によって樹立した。さらに、ペプチドトランスポーター（TAP）陰性B×Tハイブリッド細胞株174×CEM.T2(T2と称する)（Salter ら、EMBO J. 5, 943, 1986）をMHC安定化アッセイのために使用した。すべての細胞株は2 mM L-グルタミン、100 IU/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシン＋10%ウシ胎仔血清（FCS）を添加したRPMI 1640中にルーチンに維持された。
【０２３５】
フィトヘマグルチニン（PHA）芽球を生成するために、末梢血液単核細胞（PBMC）をPHA（Commonwealth Serum Laboratories, Melbourne, Australia）で刺激し、培養3日後に、MLA 144上清および高純度の組換えヒトIL-2(rIL-2)を含有する増殖培地を添加した（Khannaら、 J. Exp Med 176, 169, 1992）。6週間までの期間、週2回rIL-2およびMLA 144上清を交換する（これ以上のPHAの添加はない）ことによって、PHA芽球を増殖させた。
【０２３６】
個々のHLAクラスI抗原でトランスフェクトされたT2細胞をMHC安定化アッセイ（下記参照）に使用した。HLA B35、HLA B7およびHLA B27を発現するT2細胞は、他の文献で報告されている（Takiguchi ら、Int. Immunol. 6, 1345, 1994; Smith and Lutz, J. Immunol. 156, 3755, 1996; および Zweerink ら、J. Immunol. 150, 1763, 1993）。HLA A3, HLA A24 および HLA B8を発現するT2細胞は、個々のクラスI対立遺伝子をコードする発現ベクターを以前の記述にしたがってトランスフェクトすることによって樹立された（Khanna ら、Eur. J. Immunol. 29, 1587, 1999）。手短に述べると、これらのHLAクラスI対立遺伝子のcDNAを、配列特異的なプライマーを用いて増幅し、EGFP-N1発現ベクター（Clontech）にクローニングした。T2細胞をこれらの組換え発現ベクターでトランスフェクトし、G418(800μg/ml)を添加した増殖培地中で3週間培養した。緑色蛍光タンパク質（GFP）陽性細胞をFACS(蛍光標識セルソーター)の優れた機能によって選別し、純化された細胞は、G418(800μg/ml)を添加した増殖培地中で維持した。こうしたトランスフェクタントでのHLAクラスI発現は、HLA対立遺伝子特異的抗体を使用することによって確認された。
【０２３７】
2.  エピトープ予測およびペプチド合成
予測アルゴリズムを用いて、HCMV抗原pp28、pp50、pp65、pp150、pp71、gH、gB、IE-1、IE-2、US2、US3、US6、US11およびUL18のアミノ酸配列の中から推定HLAクラスI拘束性CTLエピトープを予測した。使用したアルゴリズムは次の通りであった：(i) チュービンゲン大学（ドイツ）の、MHCクラスI分子と結合するMHCリガンドおよびペプチドモチーフに関するSYFPEITHIデータベースにおけるエピトープ予測アルゴリズム(Rammensee ら、Immunogenetics 50, 213, 1999)；および(ii)米国国立衛生研究所のBioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS)のHLAペプチド結合予測アルゴリズム(Parker ら、J. Immunol 152, 163, 1994)。こうしたアルゴリズムを利用して、HLA A1、A2、A3、A24、A26、B7、B8、B27、B35およびB44対立遺伝子に対する、可能性のあるエピトープを同定した。それぞれのペプチドは、MHC分子と当該ペプチドとの間の相互作用の強さに基づいてスコアを割り当てられた。SYFPEITHIプログラム予測で24より上位にあるペプチド、およびBIMASプログラム予測から100を超えるスコアを与えたペプチドを、Merrifieldの固相法によって合成するか(Valerioら、Anal. Biochem 197, 168, 1991)、もしくはChiron Mimotopes (メルボルン、オーストラリア)から購入した。さらに、重複したペプチドのセット（完全長のpp65、gB、gH、pp150、IE-1およびIE-2抗原に由来する20-merペプチド、ここで、各セットのそれぞれのメンバーは、同一セットの別のメンバーと10アミノ酸残基だけ重複している）も合成した。MHC分子と結合して、ドナーPBMCおよびT細胞クローンにおいてIFN-γの産生(ELISPOT)およびCTL活性の両者を誘導する能力を調べるアッセイで用いるために、すべてのペプチドを10% (v/v) ジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解し、無血清RPMI 1640培地で希釈した。
【０２３８】
3.  MHC安定化アッセイ
T2細胞株の表面上のMHC分子を安定化する合成ペプチドの能力を、間接蛍光抗体法(Burrowsら、J. Virol 70, 4829, 1966)によって測定した。加湿雰囲気で37℃および5% CO2 にて1時間、5μMのペプチドの存在下で、T2細胞(2×105)を無血清AIM-V培地(GibcoBRL, InvitrogenTM, メルボルン、オーストラリア)中でインキュベートした。次にこれらをさらに14〜16時間26℃でインキュベートした後、細胞を2時間37℃に戻してから免疫蛍光染色を行った。一次抗体を添加する前に、細胞を増殖培地で洗浄して、結合していないペプチドを除去した。抗HLA対立遺伝子特異的モノクローナル抗体をT2細胞に添加して4℃にて30分間インキュベートした。この研究で使用したHLA特異的抗体はMA2.1 (HLA A2特異的, ATCC受託番号HB54)、SFR8-B6 (HLA Bw6特異的, ATCC受託番号HB152)、TU109 (HLA Bw4特異的; Mullerら、Hum Immunol 14, 333-349, 1989)であった。増殖培地で洗浄後、上記の細胞をFITC-もしくはPE-標識抗マウスIg特異的抗体(Silenus, AMRAD, オーストラリア)とともに4℃にて30分間インキュベートした。最後に、細胞を洗浄して、1% FCSを添加した500μlの冷PBSに再懸濁した。T2細胞の1サンプルを、AIM-V培地のみとともに26℃で14〜16時間インキュベートして、陰性対照とした。第2の陰性対照は、ペプチド無しで37℃にて増殖培地で培養したT2細胞のサンプルを含んでいた。次に、FACScanもしくはFACSclaibur (BD Biosciences, San Jose, CA)を用いて蛍光強度を測定した。各ペプチドに関するMHC安定化効率（MSE）は、陰性対照サンプルについて測定された蛍光と比較した平均蛍光の増加パーセントとして算出した。
【０２３９】
4.  ELISPOTアッセイ
血清反応陽性ドナー集団から得られたPBMCをHCMVペプチドで刺激することによってT細胞でのIFN-γ発現が誘導されるかどうかを、ELISPOTアッセイを用いて評価した。簡単に述べると、96ウェルニトロセルロースプレート(Multiscreen, Millipore)を、4℃にて一晩、マウスモノクローナル抗体である抗IFN-γIgG1(10μg/ml; Mabtech Nacka, スウェーデン)でコーティングした。次にそのプレートを6回リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、5% FCSを添加したPBSで37℃にて1時間ブロックした。ブロッキング溶液を除去して、健康なHCMV血清反応陽性ドナーから得られたPBMCを、増殖培地中にウェル当たり2.5×105の細胞密度となるように添加した。この細胞を、HCMV抗原由来の合成ペプチドの存在下で（10μg/ml）、5% CO2の雰囲気で37℃にて18時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを3回、0.05% Tweenを添加したPBSで洗浄し、次にPBCだけで3回洗浄した。ビオチン化抗IFN-γ（Mabtech Nacka, スウェーデン）検出抗体を、PBS中の最終濃度1μg/mlとなるように各ウェルに添加した。プレートを暗所で室温にて4時間、インキュベートした後、上記のように洗浄した。ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ（Sigma）をPBS中の最終濃度1μg/mlとなるように各ウェルに添加して、室温にて暗所で2時間インキュベートした。PBSで最後に洗浄した後、基質リン酸 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルおよびニトロブルーテトラゾリウムを各ウェルに添加し、そのプレートを30分間室温にてインキュベートした。ペプチドの存在に応答してIFN-γを産生した細胞を、各ウェルのニトロセルロース膜上で紫色のスポットとして検出した。このスポットを、閉回路カメラ（CCD）およびImagePro画像分析ソフトウェアもしくは自動化ELISPOTリーダー（AID, ドイツ）によって自動的に計数した。各ペプチドに対するT前駆細胞の頻度は、3ウェルを平均して、ウェル中のPBMCの総数およびウェル当たりのペプチド特異的スポット数に基づくものとした。また、ペプチド特異的スポットの数は、ペプチド無しのPBMCからなる陰性対照の値（
3ウェルの平均）を試験ウェルから差し引くことによっても算出された。
【０２４０】
5.  ELISPOTアッセイのためのCD4+/CD8+T細胞の濃縮
特定の20-merペプチドがCD4+-もしくはCD8+-拘束性エピトープのいずれか一方、または両方を含有するかどうかを判定するために、健康なウイルス保持者から得られたPBMCについてCD4+/CD8+細胞枯渇ELISPOTアッセイを行った。いずれの実験においても、3つの細胞集団を使用した：a) CD8+枯渇PBMC、b) CD4+枯渇PBMC、およびc)非枯渇PBMC。これらの細胞集団を、上記のような通常のELISPOTアッセイで同一ペプチドを用いて同時に試験した。CD4+もしくはCD8+細胞に特異的に結合するDYNABEADS M-450(Dynal, オスロ、ノルウェー)を使用して、基本的にメーカーの説明書にしたがって、枯渇を実施した。ビーズを2% FCSを添加した冷PBS中で磁気分離によって2回洗浄した。必要数の細胞を2% FCSを添加した冷PBS中に再懸濁してビーズに加えた後、4℃にて暗所で30分間（CD8+ビーズ）または60分間（CD4+ビーズ）インキュベートした。細胞集団から磁気分離を用いてCD4+もしくはCD8+細胞を枯渇させた。枯渇後、結合しなかった細胞を取り出し、増殖培地で1回洗浄して、通常のELISPOTアッセイに使用した。枯渇細胞はウェル当たり1.7×105細胞数で使用し、非枯渇集団はウェル当たり標準2.5×105細胞数で用いた。枯渇ステップ後、それぞれの細胞集団を、3色フローサイトメトリーによってCD4+およびCD8+T細胞の純度について評価した。枯渇細胞集団のサンプルを、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）と直接コンジュゲートした抗CD3抗体、フィコエリトリン（PE）蛍光色素とコンジュゲートした抗CD4抗体、およびTricolor蛍光色素（下記）とコンジュゲートした抗CD8抗体によって染色した。CD8+枯渇集団に存在するCD3+/CD4+細胞のパーセントおよびCD4+枯渇集団に存在するCD3+/CD8+のパーセントをFACSCaliburサイトメーター（Becton Dickinson）で算定した。各集団の純度は90%より高く、ELISPOTアッセイから得られた結果は、IFN-γの産生によって各ペプチドに対して応答した枯渇集団内のCD4+もしくはCD8+細胞のパーセントとして表される。
【０２４１】
6.  細胞内サイトカイン染色
PBMCを、10μg/mlのペプチドを含むまたは含まないRPMI＋10% FCS中で37℃にて6時間インキュベートした。インキュベーション1時間後から2時間までのあいだに、GolgiPlugTM (Pharmingen, San Diego, CA, USA)をメーカーの使用説明書にしたがってサンプルに添加し、25 ng/mlのホルボール12-ミリスチデート 13-アセテート（PMA; Sigma-Aldrich Co, St. Louis MO）および1μg/mlのイオノマイシン(Sigma)で活性化した細胞を陽性対照とした。インキュベーション後、1×106細胞／サンプルを、GolgiPlugTM、3% FCSおよびアジ化ナトリウムを含有するPBSからなる染色バッファーで洗浄して再懸濁した。次に、細胞を、FITCコンジュゲート抗CD3-FITC (UCHT1, Immunotech, Marseille, France)、およびTricolor(TRI)コンジュゲート抗CD4(S3.5, Caltag, Burlingame, CA)もしくは抗CD8(3B5, Caltag)のいずれかで、4℃にて暗所で30分間染色した。Cytofix/CytopermTM (BD Biosciences)を用いて4℃で20分間、細胞を固定し、Perm/WashTM 透過処理バッファー(BD Biosciences)に使用説明書にしたがって再懸濁した。固定された細胞を、フィコエリトリン（PE）コンジュゲート抗ヒトIFN-γ(B27, Pharmingen)を用いて、暗所で4℃にて30分間染色した。陰性対照として、細胞を、適当なアイソタイプの適合した対照抗体によって染色した。透過処理バッファーで細胞を2回洗浄し、染色バッファーに再懸濁した後、FACSCaliburサイトメーター(BD Biosciences)にて3色フローサイトメトリーによって分析した。すべてのデータ解析はFlowJoソフトウェア (Tree Star, Inc. San Carlos, CA)を用いて実施された。
【０２４２】
7.  多クローン性およびクローン性HCMV特異的CTLの生成
多クローン性CTLを生成するために、HCMV血清反応陽性の健康なドナーから得られた2x106個のPBMCを、合成ペプチド（20μg/ml）で感作された1×106個の自己PBMCと7日間共培養した。7日目にこれらのリンパ球をペプチド感作自己LCLで再刺激した。rIL-2（20 U/ml）および30% TCGFを添加した増殖培地中で10日間培養後、ペプチド感作自己PHA芽球もしくはLCLに対する標準的な51Cr放出アッセイにおいて、その細胞を多クローン性エフェクターとして使用した(Burrowsら、Eur. J. Immunol 22, 191, 1992)。
【０２４３】
HCMV特異的CTLクローンを生成するために、2 ml培養ウェル（Linbro）中で増殖培地にて、PBMC(106/ml)をペプチド感作自己PBMC（レスポンダー対刺激剤の比が2:1）とともに3日間培養した。CTLクローンは、0.35%アガロースへの接種によって生じ、rIL2を含有する増殖培地中で樹立および維持されるが(Burrowsら、Eur. J. Immunol. 22, 191, 1992)、γ線照射したペプチド感作自己LCLによって毎週1回、再刺激を受けた。このCTLクローンを標的細胞のパネルによって選別したが、ここでこの標的細胞は合成ペプチドで感作されているか、または個別のHCMV抗原をコードする組換えワクシニアウイルスに感染しているかのいずれかである（下記参照）。
【０２４４】
8.  ワクシニアウイルス組換え体
HCMV抗原をコードする組換えワクシニア構築物、およびpSC11ベクターのみを挿入することによって作製されたチミジンキナーゼ陰性の対照ワクシニアウイルス構築物が、一般に入手可能である(Riddellら、Rev. Infect. Dis. 13 Suppl. 11, S966-S973, 1991; Browneら、Nature 347, 770, 1990; および Brittら、J. Virol 64, 1079, 1990)。Khannaら、J. Exp. Med. 176, 169, 1992 およびKhannaら、Immunol 74, 504, 1991に記載のように、標的細胞に組換えワクシニアウイルスを感染多重度（MOI）10:1で1時間37℃にて感染させた。一晩感染させた後、細胞を増殖培地で洗浄し、CTLアッセイを目的として処理した(Khannaら、J. Immunol. Meth. 164, 41, 1993)。
【０２４５】
9.  細胞傷害性アッセイ
標的細胞に組換えワクシニアウイルスを感染させるか、または標的細胞を合成ペプチドエピトープであらかじめ感作するか、のいずれかを行った後、この細胞を51Crとともに90分間インキュベートした。インキュベーション後、この細胞を増殖培地で洗浄し、標準的な4〜6時間51Cr放出アッセイで標的として使用した(Burrowsら、Eur. J. Immunol 22, 191, 1992)。
【実施例２】
【０２４６】
HCMV抗原に由来するHLAクラスIエピトープ予測およびHLA結合ペプチド
HLAクラスI拘束性CTLエピトープは、実施例1に記載の2つのコンピュータ利用アルゴリズムによって同定された。これらのアルゴリズムは、MHCクラスI分子(HLA A1、A2、A3、A24、A26、B7、B8、B27、B35およびB44)にうまく結合する可能性の高い8、9もしくは10-merアミノ酸配列を、相互作用の半減期解離に基づいて予測する。SYFPEITHIプログラムで24より上にランクされたペプチドおよび／またはBIMASプログラムで100をこえるスコアを与えたペプチドを表１に一覧表として示す。
【０２４７】
表１に記載のペプチドを用いて、健康な血清反応陽性ドナーを選別した。また、HLAクラスI対立遺伝子と結合することが予測されるすべてのペプチドは、HLAクラスI MHC分子と結合し、かつ個々のHLA対立遺伝子でトランスフェクトされたT2細胞の表面上でのそれらの発現を安定化する能力についても分析した。HLA A2安定化に関する代表的なデータを図1a〜1iに示す。MHC安定化データのまとめも表1に示す。陰性対照と比較して相対蛍光強度の有意な増加（すなわち、平均値＋3 S.E.Mより大きい）を引き起こす、各HLAクラス1対立遺伝子に対するHCMVペプチドは、陽性であると見なされた。HLA B44およびA26に対する予測ペプチドは上記アッセイで試験されなかったが、これらの対立遺伝子に関するT2トランスフェクタントが本研究では得られなかったためである。
【０２４８】
データは、バイオインフォマティクスのアプローチによって予測された多数のペプチドがやはり強いHLAクラスI結合を示したことを示す。
【実施例３】
【０２４９】
HLA A2予測ペプチドに関するELISPOTアッセイ
予測的なHCMV見込みエピトープに対する記憶CTL応答が健康な血清反応陽性のウイルス保持者で検出されるかどうかを判定するために、ELISPOTアッセイを使用したが、これは長期にわたるin vitro培養をすることなしにCTLエピトープの迅速な同定を可能にする。HLA A2陽性の健康なウイルス保持者のグループから分離されたPBMC（表2）を、HLA結合アッセイ（実施例2）で陽性の結果を与えたペプチドにより刺激して、IFN-γを産生する細胞を検出した。
【０２５０】
HLA A2結合ペプチドのELISPOTアッセイでの代表的なデータは、HCMV pp65、IE-1、pp150、pp28、US2、US3、pp50、gB、gHおよびIE-2に由来するペプチドについて図2a〜2cに示される。
【０２５１】
全体的には、ELISPOTアッセイにおけるHLA A2拘束性エピトープに対するT細胞の応答は、HCMVの様々な抗原の間で興味深い階層(hierarchy)を示した。Gyulai ら、J. Infect. Dis. 181, 1537-1546, 2000によって報告されているように、pp65は明らかに、健康なウイルス保持者すべてによって認識される、もっとも強い免疫優性抗原であった（図2a）。ドナーの大部分はpp65抗原内の2以上のエピトープを認識した。pp65エピトープに関する前駆体CTL頻度の範囲は、様々なドナーの間で明白であって、29 SFC/106 PBMC から3752 SFC/106 PBMCまでの範囲であった。
【０２５２】
配列NLVPMVATV (配列番号5)を有するpp65由来の既知のペプチドエピトープは、本研究で試験したすべてのドナーによって認識される唯一のエピトープであった。もう一つの、共通して認識されるpp65由来の既知エピトープは、配列RIFAELEGV (配列番号7)を有するが、これは試験した8人のドナーのうち5人によって認識された。pp65エピトープに関しては、平均の前駆体頻度はNLVPMVATV (配列番号5)が最も高く、LMNGQQIFL (配列番号53)、RIFAELEGV (配列番号7)およびMLNIPSINV (配列番号6)がそれぞれ続く。これらのうち、配列番号53に記載の配列を有するエピトープはこれまで報告されていない。pp65に含まれる他のエピトープ、例えばRLLQTGIHV (配列番号10)およびILARNLVPM (配列番号54)に対する副次的な応答も、2人の異なるドナーによって検出された。
【０２５３】
IE-1はpp65の次に強い免疫優性抗原であると見なされ、その後にpp150、gB、gH、IE-2、US2、pp28、US3およびpp50が続く。8人のHLA A2陽性ドナーのうち6人が、IE-1に含まれる少なくとも1つのCTLエピトープに対してCTL反応性を示した（図2b）。興味深いことに、あらゆるエピトープに対するもっとも強い優性CTL応答の１つがIE-1の中に確認された(VLEETSVML; 配列番号101)。このエピトープは、ドナーSBにおいて3752 SFC/106 PBMCの前駆体頻度を示した。このエピトープは、配列YILEETSVM (配列番号18; Retiere ら、 J. Virol 74, 3948-3952, 2000)を有する類似の以前に記載されたエピトープよりも効率よく3人のドナーによって認識された。IE-1から同定された他の新規エピトープは、同様に低い頻度を示す配列VLAELVKQI (配列番号97)、SLLSEFCRV (配列番号96)およびCLQNALDIL (配列番号102)を有していた。gBおよびgHに含まれるCTLエピトープは、pp150、pp28、US2、US3、US11およびpp50と比較してより高頻度に、健康なウイルス保持者によって認識されたが、全般的にgB、gH、pp28、pp50、US2、US3、US11、IE-2およびpp150に含まれるエピトープに対するCTL頻度は極めて低い。さらに、IE-2、US2、US3およびUS11抗原は、はじめて、T細胞応答に対する標的として同定された。わずかに4人のHLA A2陽性の健康なウイルス保持者が、上記4抗原に含まれるエピトープに対する可能性のあるレスポンダーとして確認されたが、他のHLAクラスI対立遺伝子によって拘束される追加のエピトープをさらにスクリーニングすることによって、数多くの他のエピトープがこれらの抗原の中から同定された（下記参照）。
【０２５４】
健康なウイルス保持者のグループの間で、すべての試験された抗原に対する全体的なT細胞反応性を比較することによって、CTL応答は通常、単一のHCMV抗原に拘束されるのではないことが明らかになった。本研究で調べたHLA A2陽性ドナーのほとんどは、複数の抗原に対して広範なCTL応答を示した。ドナーSBおよびCPは、もっとも広範なCTL応答を示して、本研究で調べられた10抗原のうち7つを認識した。その上、これらのドナーは2人とも、本研究で試験されたあらゆる他のドナーよりも多数のエピトープ（11/30）を認識した（図2a〜2c）。平均すると、本研究の健康なHLA A2陽性ウイルス保持者パネルからのCTL応答は、6〜7の異なるエピトープに向けられていた。こうした結果は、複数のエピトープに対する広範なCTL応答が、効率的なHCMV複製の制御に必要とされることを強く示唆する。広範なT細胞反応性によって、単一抗原もしくは少数のエピトープに対して焦点を絞ったCTL応答より効率よく個体がHCMVを取り除くことが可能となる。こうした知見は、1回の投与計画で予防をもたらすことができるあらゆる抗原を組み合わせたHCMVワクチンをデザインすることの重要性を強調するものである。
【実施例４】
【０２５５】
他のHLAクラスI予測HCMVペプチドに対するT細胞応答
ELISPOTアッセイでHLA A1、A3、A24、A26、B7、B8、B27、B35およびB44拘束性を示したエピトープを試験して、記憶T細胞応答が健康なHLA適合ウイルス保持者で検出されるかどうかを判定した。健康なウイルス保持者のグループから得られたPBMC（表2）を個々のペプチドで刺激して、IFN-γ産生細胞を検出した。HLA A1、A3、A24、A26、B7、B8もしくはB27のいずれかによって拘束されるCTLエピトープが同定された。
【０２５６】
上記対立遺伝子のそれぞれについてELISPOT応答を示す代表的なデータを、図3a〜3cに示す。HLA A2拘束性CTL応答の場合のように、pp65およびIE-1はいずれも、明らかに、もっとも強い免疫優性抗原であった（図3a）。驚くべきことには、一部の個体におけるIE-1エピトープに対するCTL応答は、全CD8+T細胞集団の5〜10%に相当した（データは示さず）。pp150、gH、pp28、pp50、IE-2およびUL18のような他の抗原も、クラスI拘束性CTL応答の標的となりうるものとして同定された（図3b, 3c）。pp28およびpp50はCTL応答の標的となりうるものとして同定されたが、本明細書がHLA A1、A2およびB27によって拘束される複数のCTLエピトープをマッピングする最初の報告である。
【０２５７】
特に興味深いのは、配列VTEHDTTLY (配列番号165)を有するpp50由来のHLA A1拘束性CTLエピトープがすべての（すなわち6/6）HLA A1陽性の健康なウイルス保持者において、もっとも強い応答の１つとして一貫して認識されたことである。さらに、この応答の頻度および強度は、HLA A2陽性ドナーにおいてNLVPMVATV (配列番号5)に対して測定されたCTL応答に匹敵した。新規エピトープがIE-2およびUL18抗原内にもマッピングされた。
【０２５８】
ELISPOTアッセイによって同定された全エピトープの総覧を表3に示してある。
【実施例５】
【０２５９】
HCMV特異的CTL応答の細胞傷害性アッセイによる分析
ELISPOTアッセイによって同定されたCTLエピトープをさらに確認するために、これらのエピトープに特異的な多クローン性およびクローン性CTL株を作製した。健康な血清反応陽性ドナーから得られたPBMCを合成ペプチドエピトープで刺激し、樹立されたCTLクローンもしくは多クローン株を51Cr放出アッセイで試験した。
【０２６０】
ドナーSB、PP、CS、SEおよびSCから樹立された多クローン性CTL株から得られた代表的なデータを図4aおよび4bに示す。ドナーSB(図4a)に関しては、IE-2、pp150、pp65、IE-1およびgB抗原由来の7つの代表的なHLAクラスI拘束性エピトープを評価した。これら7つのうちの6エピトープは強いCTL応答を呼び起こし、配列GQTEPIAFV (配列番号 122)を有するポリエピトープに対して樹立された多クローン性CTL株ではより低いCTL活性が観察された。
【０２６１】
同様に、他のドナー(PP、CS、SEおよびSC)から樹立されたCTL株も、ペプチド感作された自己PHA芽球に対して強い細胞溶解活性を示した。
【０２６２】
上記のアッセイで観察された全体的なCTL活性の強さは、通常、検出されたIFN-γ産生細胞の数と相互に関連していた。例えば、HCMV IE-1抗原由来のVLEETSVML (配列番号101)エピトープはELISPOTアッセイにおいて、ドナーSBに対してもっとも有力なエピトープであったが（表3）、細胞傷害性アッセイでも強いCTL活性を示した（図4a）。
【０２６３】
一連のCTLクローンを樹立して、上記エピトープをさらに特徴づけた。4つの異なるエピトープから得られたデータを図5a〜5dに示す。
【０２６４】
特に興味深いのは、HCMV IE-1抗原に由来するVLEETSVML (配列番号101)エピトープに特異的なCTLクローンであった。Retiereら、J. Virol 74, 3948-3952, 2000は、このエピトープと同一ではないが類似した配列を有する、別のHCMV IE-1 HLA拘束性エピトープ(YILEETSVM; 配列番号18)を同定している。これらのエピトープに対するCTL応答が類似しているかどうかを判定するために、これらのペプチドの力価を測定して標準的な51Cr放出アッセイで細胞傷害性を比較した。図5aに示すデータは、これらのエピトープ間の有意な交差認識の欠如を明らかにする。こうした知見は、他のHLA A2陽性ドナーから樹立された多クローン性CTL株によっても確認されている（データは示さず）。したがって、VLEETSVML (配列番号101)およびYILEETSVM (配列番号18)は明確に区別されるCTLエピトープに相当する。
【０２６５】
本研究で調べられた他のCTLクローンは、HLA A2拘束性pp65エピトープNLVPMVATV (配列番号5；図5b)、HLA A2拘束性IE-2エピトープIIYTRNHEV (配列番号254; 図5c)もしくはHLA B8拘束性IE-1エピトープQIKVRVDMV (配列番号113; 図5d)に特異的であった。IIYTRNHEV (配列番号254)に特異的なクローンの全体的なCTL反応性の比較によって、このエピトープは限界濃度では概ね認識が不十分であることが明らかになった（図5c）。IIYTRNHEV (配列番号254)エピトープについて、最大溶解の半値のために必要とされるペプチド濃度は、NLVPMVATV (配列番号5) および VLEETSVML (配列番号101)エピトープよりそれぞれ、ほとんど100〜500倍高かった。また、同一のペプチド力価測定パターンが、IIYTRNHEV (配列番号254)エピトープに特異的な、他の異なる5個のCTLクローンを用いて、観察された（データ示さず）。
【実施例６】
【０２６６】
組換えワクシニアコード化HCMV抗原のCTL認識
本明細書に提示されるデータは、コンピュータを用いたアルゴリズムによって予測され、その後ELISPOTアッセイで試験されたエピトープが、実際に強力なT細胞応答を呼び起こすことができたことを明白に示す。これらのCTLエフェクターが完全長HCMV抗原を発現する標的細胞を認識することも可能であることを示すために、14人の健康なHCMV免疫ドナーのグループから、上記の刺激プロトコールによって、100を超えるクローン性もしくは多クローン性T細胞株を分離した。ペプチド感作標的に対して強い反応性を示すCTL株は、HCMV抗原pp28、pp65、pp150、gH、gBもしくはIE-1を発現する組換えワクシニアベクターに感染した自己LCLに対して試験された。ドナーSBから得られた2つの異なるCTLクローン、およびドナーSCから得られた多クローン性CTL株の反応性を、図6に示す。こうしたクローンのうちの1つはpp65をコードする組換えワクシニアに感染した標的細胞を認識した（Vacc.pp65と称する; 表6の上段パネル）。残る2つのCTL株はVacc.IE-1に感染した標的細胞を認識した（図6の中段および下段）。同様に、強いペプチド特異的反応性を示す他のCTLエピトープに特異的なCTLクローン／株は、組換えワクシニアに感染した標的を効率よく認識した（データ示さず）。こうした結果は、上記ストラテジーによってマッピングされたCTLエピトープが、HCMVに対するCTL応答の全体的なレパートリーに相当し、これらのエピトープがウイルス感染細胞によって内因的に効率よくプロセッシングされることを示す。
【実施例７】
【０２６７】
HCMV抗原に由来する重複ペプチドを用いたELISPOTおよびCTLアッセイ
本発明者らの研究室および他グループの両方から得られた以前の研究は、コンピュータを利用したアルゴリズムを有効に使用して、大量の新規エピトープをマッピングすることができるが、こうした方法は個々のHLA対立遺伝子に特異的なモチーフの利用可能性によって制限される、ことを示している。さらに、エピトープの長さ、および可能性のあるMHC結合アンカー残基に関してコンピュータによるアルゴリズムによって適切に配置される制約に従わないクラスI拘束性エピトープは、こうした予測法では選択されないことが多い。このような制限が生じる可能性を克服するために、もっとも有力なHCMV抗原のうち6個(gB、gH、IE-1、IE-2、pp150およびpp65)を選択し、各抗原の全長をカバーする重複ペプチドの完全なセット（20アミノ酸の長さで、それぞれのペプチドは10アミノ酸だけ同じセットの別のペプチドと重なり合っている）を合成した。したがって、合計450ペプチドが合成された。ELISPOTアッセイを用いて、14人の健康なウイルス保持者のグループにおいてex vivoでの記憶T細胞応答が検出可能かどうかを判定した（表2）。PBMCを個別のペプチドで刺激して、IFN-γを産生する細胞を検出した。5人の健康なウイルス保持者の部分集団から得られた代表的データを図7a〜7fに示す。異なるHCMV抗原に由来する複数のペプチドに対する強力なELISPOT応答が検出された。本発明者らの以前の分析と一致して、pp65由来のペプチドが、ELISPOTアッセイでもっとも高頻度に認識されたエピトープであった。また、20-merペプチドを用いた分析は、IE-2抗原がIE-1、gB、gHおよびpp150と比較してより高頻度に認識されることを示した。
【０２６８】
HCMVに対するT細胞応答の全体的なレパートリーは、単一の抗原に拘束されなかった。応答するすべてのドナーにおいて、2以上の抗原が常にCTL防御の標的として認識された。このような応答の多様性にもかかわらず、1または2のエピトープに対する優性の応答が、応答するドナーにおいて常に明らかであった。
【０２６９】
ELISPOTによるエピトープの同定に加えて、T細胞をペプチドで特異的に刺激して多クローン性およびクローン性CTL株を生じさせることによって、それらの妥当性をさらに確認した。6人の別々のドナー(RK、JW、MB、CS、SBおよびSE)に基づいて、こうした分析から得られたデータを図8に示す。
【０２７０】
次に、生成したエフェクターの抗原特異性を、51Cr放出アッセイで、個別のHCMV抗原を発現する組換えワクシニアウイルスに感染した自己LCL標的を用いて確認した。図9に示すデータは、ドナーPK(パネルA)およびドナーMB(パネルB)から得られたCTLクローンがそれぞれVacc.gB (OB6.13, OB12.3) および Vacc.pp65 (1C9.28, ID9.7)を認識し、一方ドナーSB(パネルC)から得られた多クローン性株はVacc.pp65 (IC7 CTL)を認識したことを示す。
【０２７１】
重複する20-merペプチドの分析は、HCMVタンパク質から、従来のアルゴリズムによっては同定されなかった多数の新規配列を同定した。このことは、2つの方法を併用して、ウイルスにコードされた抗原の中でCTLエピトープを包括的にマッピングする必要性を際立たせるものである。
【０２７２】
20-merペプチドを用いてELISPOTによってエピトープをマッピングする場合、一部の応答はMHCクラスII拘束性であって、必ずしもHLAクラスI対立遺伝子によって拘束されるわけではないと考えられる。本研究を通じて、ELISPOTによって同定された一部のエピトープが細胞傷害性分析によっては確認され得ないことは明白であった。この場合、本発明者らは、細胞内IFN-γ染色法およびIFN-γELISPOTの両方を用いて20-mer配列内のクラスII拘束性エピトープの存在を詳しく調べた。PBMCを、様々な20-merペプチドで刺激後、CD4、CD8、CD3およびIFN-γで染色し、ペプチドに応答するCD4+および CD8+集団の割合をフローサイトメトリーによって分析した（図10a〜10b）。
【０２７３】
IFN-γELISPOTアッセイのために、CD4+ T細胞枯渇およびCD8+ T細胞枯渇PBMCの両方の集団を調製し、20-merペプチドで刺激して、IFN-γ産生によってペプチドに応答するCD4+もしくはCD8+ T細胞を評価した。これらの技法は2つとも、HCMV抗原由来のMHCクラスII拘束性エピトープの存在を特徴づける際に有用であることが判明した。
【０２７４】
その上、MHCクラスII拘束性エピトープはMHCクラスI拘束性エピトープのみを含有すると考えられる20-mer配列から同定された。例えば、HCMV pp65ペプチドSICPSQEPMSIYVYALPLKM (配列番号90) (図10aおよび10bにおいてSICと称する)は、ドナーJWから得られた106個のPBMC当たり3178個の細胞でIFN-γ産生を刺激した（表4を参照されたい）。しかしながら、かなりのIFN-γ産生が、細胞内IFN-γ分析後、同一ドナーから得られたPBMCのCD3+/CD4+集団でも検出された。さらに、当該20-mer配列に応答したCD3+/CD4+細胞のパーセンテージ（1.18%）は、応答したCD3+/CD8+細胞集団のパーセンテージ（1.36%）に匹敵した。このことは、この配列がクラスI拘束性CTLエピトープを含有するのみならず、MHCクラスII拘束性エピトープも含有することを示した。もう一つの20-merペプチドは、CD8+ CTLエピトープとして特徴づけるのは困難であると判明したが、やはりクラスII拘束性エピトープを含有していることが明らかになった。配列RQTEKHELLVLVKKAQLNRH (配列番号249)を有するgHペプチドに特異的な多クローン性およびクローン性細胞傷害性T細胞株の両者の作製を何回も試みたが不成功であった。細胞内IFN-γ産生のフローサイトメトリー分析から得られた結果は、CD3+/CD4+ T 細胞の1.52%が、上記ペプチドに応答してIFN-γを産生するのに対して、CD3+/CD8+集団はわずか0.57%が産生するのみであることを示した（図10aおよび10b）。したがって、配列番号249に示すペプチドはCD8+ T細胞よりもCD4+ T細胞からより多くの応答を誘導した。
【０２７５】
20-merペプチドに応答する細胞の前駆体頻度は低すぎてフローサイトメトリーでは検出されなかったが、IFN-γELISPOTアッセイはPBMCのCD4+ T細胞枯渇集団およびCD8+ T細胞枯渇集団を用いて実施された。この方法は、所定のペプチドに応答してIFN-γを産生する細胞の可視化および計数をいずれも可能にした。20-merペプチドのCD4+/CD8+分析から得られた結果を表4に示す。上記方法を2つとも使用することによって、従来のHMCV標的抗原gBおよびgH (Plotkin ら、Pediatr. Infect. Dis. J. 18, 313, 1999; および Britt ら、 Intervirol. 39, 401, 1996)のみならず、他のHCMV抗原でも同様にMHCクラスII拘束性エピトープの存在がはっきり示された。この知見は、HCMVから防御するために細胞傷害性およびヘルパー免疫応答の両者を呼び起こす将来のワクチン候補のデザインに重要な意味を持つと考えられる。
【０２７６】
ELISPOTアッセイによってマッピングされた20-merペプチドの中で最小配列を同定するために、重複する12-merおよび／または9-merペプチドを合成し、ELISPOTおよび／またはCTLアッセイで試験した。ある代表的な研究から得られたデータを図11aおよび11bに示す。表4に示すように、20-merペプチドに関するELISPOTアッセイは、ドナーPKによる、重複するペプチドTAAKAYAVGQFEQPTETPPE (配列番号269)およびFEQPTETPPEDLDTLSLAIE (配列番号270)に対する強力な応答を示したが、この応答はin vitro細胞傷害性アッセイによってその後確認された（表4）。2つのアッセイはいずれも、配列FEQPTETPP (配列番号260)がドナーPK由来のT細胞による強力な溶解活性を誘導するために必要とされる最小の配列であることを示した（図11aおよび11b）。この分析の概要を表4に示す。
【０２７７】
CTLエピトープのHLAクラスI拘束性は、1以上の対立遺伝子を共有するペプチド感作された自己PHA芽球もしくはLCL、およびペプチド感作された同種異系PHA芽球もしくはLCLの溶解を比較することによって判定される。例えば、IE-2およびIE-1抗原内のエピトープに特異的なCTL株に関するHLA拘束性分析を図12aおよび12bに示す。ドナーPKから得られたIE-2特異的CTL株はHLA B41陽性標的細胞を認識したが、これは、このエピトープがHLA B41対立遺伝子によって拘束されることを示す（図12a）。興味深いのはドナーCSから得られたIE-1特異的CTL株の反応性であり、この株は合成ペプチドエピトープで感作されたHLA A23、A24およびA30陽性標的細胞をいずれも認識した（図12b）。これらのデータは、このIE-1エピトープが効率よく複数のHLA A24スーパータイプ対立遺伝子と結合できることを示唆する(Sette および Sidney, Immunogenetics 50, 201, 1999)。
20-mer配列についてのHLA拘束性分析の全体的な概要を表4に示す。
【実施例８】
【０２７８】
ポリエピトープペプチド
本明細書に記載の方法にしたがって、同一の、または異なるHLAクラスI拘束エレメントに特異的な、複数のHCMVエピトープを含むペプチドをデザインした。これらのエピトープは、それを用いたワクチン接種によって達成される集団のカバー範囲を最大にするようにデザインされた。したがって、このようなポリエピトープワクチンに含めるためには、高頻度に発現されるHLA対立遺伝子によって拘束されるCTLエピトープ（表1、3および4）が好ましいが、免疫優性のpp65 IE-1、およびpp150タンパク質の両方から得られたエピトープ、ならびに亜優性の抗原から得られたエピトープも含めた。10の代表的なポリエピトープペプチドのアミノ酸配列を配列番号309〜319に示す。
【実施例９】
【０２７９】
CTLの作製
1.  多クローン性CTL株の作製
健康な血清反応陽性ドナーから得られたPBMCを、0日目および7日目に、HCMVで形質転換された自己リンパ芽球様細胞株(LCL)で刺激することによって、多クローン性CTLエフェクターを作製した。
【０２８０】
2.  T細胞の寒天クローニング
個々のドナーからT細胞クローンを次のように作製した。PBMCを分離し、24ウェルプレート内で2×106個の細胞濃度で培地中に懸濁した(Costar, Cambridge, Mass.)。同じドナーから得られたペプチド感作されたPBMCを前記ウェルのそれぞれに、いずれも106細胞／ウェルずつ添加する。3日後、細胞を分散させて、RPMI 1640、20% 2x RPMI 1640、20% FCS、16% MLA上清および50 U/ml 組換えIL-2 (rIL-2)を含有する0.35%(W/V)アガロースを入れた直径3.5 cmの培養皿(Seaplaque, FMC Corp., Rockland, Me.)に撒く。5日後、寒天中にコロニーが出現する。それを倒立顕微鏡（25×倍率）下で分散した細胞のクラスターもしくは連鎖として同定した。これらのコロニーをGilsonピペット内への吸引によって、層流キャビネット内にて顕微鏡下で集める。集められたコロニーをT細胞増殖培地(RPMI 1640、20% FCS、30% MLA上清および20 U/ml rIL-2)に分散させて、同一ドナーから得られたペプチド感作γ線照射LCLを入れた96ウェルマイクロタイタートレイに移す(103 細胞/ウェル)。これらのコロニーは増殖を続け、液体窒素中で保存する（約5×106細胞/アンプル）。
【実施例１０】
【０２８１】
CTLクローンを用いた診断法
1.  HCMVワクシニアウイルス組換え体に対する反応性についてのCTLクローンの選別
LCLに組換えワクシニアウイルスを10:1の感染多重度で37℃にて1時間感染させる。14〜16時間後、細胞を基本培地で洗浄し、51Crとともに90分間インキュベートして3回洗浄し、下記のような標準的な4〜6時間のクロム放出アッセイで標的として使用する。
【０２８２】
2.  ペプチドのスクリーニング
標準的な4〜6時間のクロム放出アッセイを多クローン性T細胞エフェクターもしくはT細胞クローンのそれぞれについて実施して、ペプチドエピトープに対する特異性を評価する。簡単に述べると、洗浄された51Cr（Amersham International, England）標識（60分、37℃）標的細胞（自己PHA芽球）を、U底ウェルの96ウェルプレート（Nunc, Denmark）中の10μlのペプチド（最終濃度 10μM)に添加する（104細胞/ウェル、40μl中）。37℃にて30分間のインキュベーション後、104から50×104までのエフェクターT細胞（クローン化CTLもしくはバルクCTL）を3回反復で、150μlとしてウェルごとにさらに添加して、最終的なエフェクター対標的比を10:1もしくは5:1とする。2つの対照を加える；(i)培地および標的（バックグラウンド放出）、ならびに(ii)標的（全放出）、SDSの添加のため、好ましくは100μlの0.5% SDS。次に、このプレートを500rpmで5分間遠心し、5時間37℃でインキュベートする。インキュベーション後、ガンマ計数のため20μl上清を取り出す。結果は下記のように計算された特異的溶解％として表される：
平均カウント数（実験ウェル）−平均カウント数（対照ウェル）
SDS可溶化の全カウント数−平均カウント数（対照ウェル）
【表１】
2005504733.tif 000002
2005504733.tif 000003
2005504733.tif 000004
2005504733.tif 000005
2005504733.tif 000006
【表２】
2005504733.tif 000007
【表３】
2005504733.tif 000008
2005504733.tif 000009
2005504733.tif 000010
【表４】
2005504733.tif 000011
2005504733.tif 000012
2005504733.tif 000013
2005504733.tif 000014
2005504733.tif 000015
2005504733.tif 000016
2005504733.tif 000017
2005504733.tif 000018
2005504733.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０２８３】
【図１ａ】HCMV抗原pp65に由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、上から下に向かって、それぞれ配列番号6、53、10、12、52、11、54、7および5）を有していた。最初に、T2細胞を100mlの各ペプチド(100mg/ml)と共に26℃で14〜16時間インキュベートし、続いて37℃で2〜3時間インキュベートした。BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。蛍光強度は、ペプチドの非存在下において26℃でインキュベートしたT2細胞上のHLA A2の蛍光強度に対するパーセントとして示してある。点線は、ペプチドの非存在下において26℃でインキュベートしたT2細胞上のHLA A2についての蛍光強度の平均 + 3 S.E.M.を示す。
【図１ｂ】HCMV抗原pp71に由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、上から下に向かって、それぞれ配列番号177、176、175および174）を有していた。図1aに関して上述したように、T2細胞をペプチドとインキュベートし、BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。示される蛍光強度は、図1aで説明したとおりである。
【図１ｃ】HCMV抗原pp150に由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、上から下に向かって、それぞれ配列番号140、141、122、138、139、142、145、144および143）を有していた。図1aに関して上述したように、T2細胞をペプチドとインキュベートし、BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。示される蛍光強度は、図1aで説明したとおりである。
【図１ｄ】HCMV抗原IE-1に由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、上から下へ、それぞれ配列番号98、102、96、101、100、103、97および99）を有していた。図1aに関して上述したように、T2細胞をペプチドとインキュベートし、BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。示される蛍光強度は図1aで説明したとおりである。
【図１ｅ】HCMV抗原gBに由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、上から下へ、それぞれ配列番号183、188、181、187、186、182、185および184）を有していた。図1aに関して上述したように、T2細胞をペプチドとインキュベートし、BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。示される蛍光強度は図1aで説明したとおりである。
【図１ｆ】HCMV抗原pp50およびpp28に由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、pp50由来のペプチドについては、上から下へ、それぞれ配列番号164および163；pp28由来のペプチドについては、上から下へ、それぞれ配列番号155、154、153、152、151および150）を有していた。図1aに関して上述したように、T2細胞をペプチドとインキュベートし、BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。示される蛍光強度は図1aで説明したとおりである。
【図１ｇ】HCMV抗原gHに由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、上から下へ、それぞれ配列番号216、206、205、201、200、204、203、198、202、197、199および196）を有していた。図1aに関して上述したように、T2細胞をペプチドとインキュベートし、BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。示される蛍光強度は図1aで説明したとおりである。
【図１ｈ】HCMV抗原IE-2に由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、上から下へ、それぞれ配列番号256、254、253、252および251）を有していた。図1aに関して上述したように、T2細胞をペプチドとインキュベートし、BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。示される蛍光強度は図1aで説明したとおりである。
【図１ｉ】HCMV抗原US3、US2およびUL18に由来する種々のHLA A2結合ペプチドについてのT2細胞上でのMHC安定化を示すグラフである。試験したペプチドはグラフの左側に示したアミノ酸配列（すなわち、US3由来のペプチドについては、上から下へ、それぞれ配列番号300、298および299；US2由来のペプチドについては、上から下へ、それぞれ配列番号296、294および295；UL18由来のペプチドについては、グラフの最下位の配列番号293）を有していた。図1aに関して上述したように、T2細胞をペプチドとインキュベートし、BB7.2抗体を用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞上でのHLA A2発現を分析した。示される蛍光強度は図1aで説明したとおりである。
【図２ａ】8人のHLA A2陽性の健康な血清反応陽性個体のグループにおけるHCMV pp65由来ペプチドまたはHCMV IE-1由来ペプチドに対するHCMV特異的CTL応答のex vivo機能分析を示すグラフである。HCMV pp65 (パネルA)またはHCMV IE-1 (パネルB)由来のCTLエピトープペプチドをELISPOTアッセイにより試験した。HCMV pp65ペプチドはパネルAのx軸上に示したアミノ酸配列（図面の左から右へ、それぞれ配列番号10、54、5、53、6および7）を有していた。HCMV IE-1ペプチドはパネルBのx軸上に示したアミノ酸配列（図面の左から右へ、それぞれ配列番号97、96、102、101および18）を有していた。健康な血清反応陽性個体から得られた末梢血単核細胞(PBMC)を、これらの抗原からの個々の合成ペプチド(10mg/ml)で刺激し、「材料および方法」の項に記載したELISPOTアッセイでIFN-γ産生を測定した。その結果は、縦座標上に106個のPBMCあたりのスポット形成細胞(SFC)として表してある。
【図２ｂ】8人のHLA A2陽性の健康な血清反応陽性個体のグループにおけるHCMV pp150由来ペプチド(パネルC)、pp28由来ペプチド(パネルD)、US2由来ペプチド(パネルE)、US3由来ペプチド(パネルF)、またはpp50由来ペプチド(パネルG)に対するHCMV特異的CTL応答のex vivo機能分析を示すグラフである。CTLエピトープペプチドは図2aに関して上述したようにELISPOTアッセイを用いて試験した。データは図2aに関して上述したように示してある。HCMV pp150ペプチドはパネルCのx軸上に示したアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号122、141、143、144および140）を有していた。HCMV pp28ペプチドはパネルDのx軸上に示したアミノ酸配列（すなわち、配列番号150）を有していた。HCMV US2ペプチドはパネルEのx軸上に示したアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号294、296および295）を有していた。HCMV US3ペプチドはパネルFのx軸上に示したアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号298および300）を有していた。HCMV pp50ペプチドはパネルGのx軸上に示したアミノ酸配列（すなわち、配列番号163）を有していた。
【図２ｃ】8人のHLA A2陽性の健康な血清反応陽性個体のグループにおけるHCMV gB由来ペプチド(パネルH)、gH由来ペプチド(パネルI)、またはIE-2由来ペプチド(パネルJ)に対するHCMV特異的CTL応答のex vivo機能分析を示すグラフである。CTLエピトープペプチドは図2aに関して上述したようにELISPOT法を用いて試験した。データは図2aに関して上述したように示してある。HCMV gBペプチドはパネルHのx軸上に示したアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号181および187）を有していた。HCMV gHペプチドはパネルIのx軸上に示したアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号206、216および202）を有していた。HCMV IE-2ペプチドはパネルJのx軸上に示したアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号254および251）を有していた。
【図３ａ】HCMV pp65抗原 (左のパネル)またはHCMV IE-1抗原 (右のパネル)に由来するHLA B8拘束性CTLエピトープに対するHCMV特異的Ｔ細胞応答のex vivo機能分析を示すグラフである。ペプチドエピトープはELISPOT法により試験した。健康な血清反応陽性個体から得られたPBMCを、これらの抗原からの個々の合成ペプチドで刺激し、本明細書に記載するELISPOT法でIFN-γ産生を測定した。ペプチドおよびそれらのHLA拘束性をx軸上に示してある。試験したHCMV pp65ペプチドは示されるアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号43、14および44）を有していた。試験したHCMV IE-1ペプチドは示されるアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号109、110、111、112および114）を有していた。Ｔ細胞応答は、縦座標上に106個のPBMCあたりのスポット形成細胞(SFC)として表してある。
【図３ｂ】HCMV pp65 (左のパネル)、IE-1 (中央のパネル)、またはHCMV pp150 (右のパネル)抗原に由来するHLA B7拘束性CTLエピトープに対するHCMV特異的Ｔ細胞応答のex vivo機能分析を示すグラフである。ペプチドエピトープはELISPOT法により試験した。健康な血清反応陽性個体から得られたPBMCを、これらの抗原からの個々の合成ペプチドで刺激し、本明細書に記載するELISPOT法でIFN-γ産生を測定した。ペプチドおよびそれらのHLA拘束をx軸上に示してある。試験したHCMV pp65ペプチドは示されるアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号40および41）を有していた。試験したHCMV IE-1ペプチドは示されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号109）を有していた。試験したHCMV pp150ペプチドは示されるアミノ酸配列（すなわち、図面の左から右へ、それぞれ配列番号134、132、131および130）を有していた。Ｔ細胞応答は、縦座標上に106個のPBMCあたりのスポット形成細胞(SFC)として表してある。
【図３ｃ】HLA A24、HLA B27、HLA A3、HLA B44またはHLA A1拘束を有するCTLエピトープに対するHCMV特異的Ｔ細胞応答のex vivo機能分析を示すグラフである。前記CTLエピトープはHCMV gH (左のパネル)、pp28 (中央のパネル)、またはHCMV pp50 (右のパネル)抗原に由来するものであった。ペプチドエピトープはELISPOT法により試験した。健康な血清反応陽性個体から得られたPBMCを、これらの抗原からの個々の合成ペプチドで刺激し、本明細書に記載するELISPOT法でIFN-γ産生を測定した。ペプチドおよびそれらのHLA拘束をx軸上に示してある。試験したHCMV gHペプチドは示されるアミノ酸配列（すなわち、図面の左から、それぞれ配列番号227、243、217および220）を有していた。試験したHCMV pp28ペプチドはHLA B27拘束性であり、示されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号162）を有していた。試験したHCMV pp50ペプチドは示されるアミノ酸配列（すなわち、図面の左から、それぞれ配列番号170および165）を有していた。Ｔ細胞応答は、縦座標上に106個のPBMCあたりのスポット形成細胞(SFC)として表してある。
【図４ａ】SBと称される健康な血清反応陽性ドナー由来のCTLによるHLA A2拘束性HCMV CTLエピトープの認識を示すグラフである。前記ドナーから得られたPBMCを、ペプチド(20mg/ml)で感作した自己PBMCと共に2：1の比で7日間共培養した。7日目に、ペプチドエピトープで感作した自己γ線照射EBV形質転換LCLで前記培養物を再刺激した。10日目に、これらのＴ細胞株を、ペプチドで感作した自己フィトヘマグルチニン(PHA)芽球に対する標準的な51Cr放出アッセイにおいて多クローン性エフェクターとして使用した。これらのアッセイではエフェクター：標的比を10：1とした。特異的溶解パーセントをx軸上に示してある。完全なCTLエピトープ配列（すなわち、図面の上から下へ、それぞれ配列番号187、18、101、97、5、122および254）、ペプチドの起源抗原（すなわち、図面の上から下へ、それぞれgB、IE-1、IE-1、IE-1、pp65、pp150およびIE-2）、および各エピトープのHLA拘束(HLA A2)をY軸上に示してある。また、応答するドナーも示してある(SB)。
【図４ｂ】CS、SE、SCおよびPPと称される健康な血清反応陽性ドナー由来のCTLによるHCMV CTLエピトープの認識を示すグラフである。図4aに関して上述したように、各ドナーから得られたPBMCを、ペプチド(20mg/ml)で感作した自己PBMCと共培養し、ペプチドエピトープで感作した自己γ線照射EBV形質転換LCLで再刺激し、さらに51Cr放出アッセイを行なった。特異的溶解パーセントをx軸上に示してある。完全なCTLエピトープ配列（すなわち、図面の上から下へ、それぞれ配列番号292、295、113、114、112、303および165）、ペプチドの起源抗原（すなわち、図面の上から下へ、それぞれUL18、pp50、US2、IE-1、IE-1、IE-1、US6およびpp50）、および各エピトープのHLA拘束（すなわち、図面の上から下へ、それぞれHLA B44、HLA B44、HLA A2、HLA B8、HLA B8、HLA B8、HLA A24およびHLA A1）をY軸上に示してある。また、各ペプチドについて応答するドナーも示してある(すなわち、CS、SE、SCおよびPP)。
【図５ａ】健康なウイルス保持者から得られたウイルス特異的CTLクローンを用いた、HCMV CTLエピトープのさまざまな濃度での特異的溶解パーセントを示すグラフである。本明細書に記載するようにして健康なウイルス保持者からCTLクローンを単離し、配列VLEETSVML (配列番号101; ◆)または配列YILEETSVM (配列番号18; ■)からなるHLA A2拘束性のHCMV IE-1由来ペプチドエピトープと共にインキュベートした。各ペプチドエピトープに特異的なCTLクローンを、さまざまな濃度の合成ペプチドで予め感作した自己PHA芽球に対して試験した（x軸）。
【図５ｂ】健康なウイルス保持者から得られたウイルス特異的CTLクローンを用いた、アミノ酸配列NLVPMATV (配列番号5)を有するHLA A2拘束性のHCMV pp65由来CTLエピトープのさまざまな濃度での特異的溶解パーセントを示すグラフである。本明細書に記載するようにして健康なウイルス保持者からCTLクローンを単離し、このペプチドと共にインキュベートした。前記ペプチドエピトープに特異的なCTLクローンを、さまざまな濃度の合成ペプチドで予め感作した自己PHA芽球に対して試験した（x軸）。その結果を特異的溶解パーセントとして示してある。
【図５ｃ】健康なウイルス保持者から得られたウイルス特異的CTLクローンを用いた、アミノ酸配列IIYTRNHEV (配列番号254)を有するHLA A2拘束性のHCMV IE-2由来CTLエピトープのさまざまな濃度での特異的溶解パーセントを示すグラフである。本明細書に記載するようにして健康なウイルス保持者からCTLクローンを単離し、このペプチドと共にインキュベートした。前記ペプチドエピトープに特異的なCTLクローンを、さまざまな濃度の合成ペプチドで予め感作した自己PHA芽球に対して試験した（x軸）。その結果を特異的溶解パーセントとして示してある。
【図５ｄ】健康なウイルス保持者から得られたウイルス特異的CTLクローンを用いた、アミノ酸配列QIKVRVDMV (配列番号113)を有するHLA B8拘束性のHCMV IE-1由来CTLエピトープのさまざまな濃度での特異的溶解パーセントを示すグラフである。本明細書に記載するようにして健康なウイルス保持者からCTLクローンを単離し、このペプチドと共にインキュベートした。前記ペプチドエピトープに特異的なCTLクローンを、さまざまな濃度の合成ペプチドで予め感作した自己PHA芽球に対して試験した（x軸）。その結果を特異的溶解パーセントとして示してある。
【図６】HCMV抗原pp65 (Vacc.pp65)、IE-1 (Vacc.IE-1)、gB (Vacc.gB)、gH (Vacc.gH)、pp150 (Vacc.pp150)またはpp28 (Vacc.pp28)を発現する組換えワクシニアウイルスに感染した自己LCLの、SB（SB CTL 62.3と記した上段のパネルおよびSB CTL 75.20と記した中段のパネル）またはSC（SC CTL ELRRと記した下段のパネル）と称する健康なHCMV血清反応陽性ドナーから得られたHCMV特異的CTLによる特異的溶解を示すグラフである。LCLにワクシニア構築物を10：1の感染多重度(MOI)で12〜14時間感染させ、標準51Cr放出アッセイのために処理した。その結果は、標準的な4時間クロム放出アッセイで観測された特異的溶解パーセントとして表してある。このアッセイを通して5：1のエフェクター：標的比を用いた。
【図７ａ】HCMV抗原gB由来の重複するペプチドのセットに対するex vivo HCMV特異的Ｔ細胞応答を示すグラフである。RK (黒塗り)、SB (右上がり斜線)、MB (点描)、SE (網目)およびMW (右下がり斜線)と称する5人の無関係で健康なHCMV保持者のグループにおいて92の重複するペプチドのセットをELISPOT法により試験した。これらのドナーから得られたPBMCを個々の合成ペプチドで刺激し、本明細書に記載するようにしてIFN-γ産生をELISPOT法で測定した。その結果は、106個のPBMCあたりのスポット形成細胞(SFC)として縦座標上に表してある。ペプチドの番号はx軸上およびそれぞれの棒グラフの上に示してある。
【図７ｂ】HCMV抗原pp65由来の重複するペプチドのセットに対するex vivo HCMV特異的Ｔ細胞応答を示すグラフである。56の重複するペプチドのセットを、図7aに関して上述したように試験した。
【図７ｃ】HCMV抗原IE-1由来の重複するペプチドのセットに対するex vivo HCMV特異的Ｔ細胞応答を示すグラフである。49の重複するペプチドのセットを、図7aに関して上述したように試験した。
【図７ｄ】HCMV抗原IE-2由来の重複するペプチドのセットに対するex vivo HCMV特異的Ｔ細胞応答を示すグラフである。41の重複するペプチドのセットを、図7aに関して上述したように試験した。
【図７ｅ】HCMV抗原gH由来の重複するペプチドのセットに対するex vivo HCMV特異的Ｔ細胞応答を示すグラフである。74の重複するペプチドのセットを、図7aに関して上述したように試験した。
【図７ｆ】HCMV抗原pp150由来の重複するペプチドのセットに対するex vivo HCMV特異的Ｔ細胞応答を示すグラフである。104の重複するペプチドのセットを、図7aに関して上述したように試験した。
【図８】健康な血清反応陽性ドナーからの多クローン性エフェクターによるHCMV抗原由来の20-merペプチドのCTL認識を示すグラフである。RK、JW、MB、CSおよびSEと称する健康なHCMV血清反応陽性ドナーから得られたPBMCを、それぞれの特定のペプチドエピトープ(20mg/ml)を2：1の比で用いて感作した自己PBMCと共に7日間培養した。試験したペプチドは縦座標に示したアミノ酸配列（すなわち、図面の上から下へ、それぞれ配列番号75、193、117、72、92、77、90、269、70、249および192）を有していた。7日目に、これらの培養物をペプチドエピトープで感作した自己γ線照射EBV形質転換LCLにより再刺激した。10日目に、これらのＴ細胞株を、ペプチドで感作した自己PHA芽球に対する標準的な51Cr放出アッセイにおいて多クローン性エフェクターとして使用した。これらのアッセイではエフェクター：標的比を10：1とした。結果は特異的溶解パーセントとしてx軸上に示してある。
【図９】20-merペプチドを用いたin vitro刺激により生成された、RK (すなわち、パネルA; クローンRK CTL OB6.13およびRK CTL 1C9.28)、MB (すなわち、パネルB; クローンMB CTL OB12.3およびMB CTL 1D9.7)、ならびにSB (すなわち、パネルC; クローンSB CTL 1C7)と称する健康なHCMV血清反応陽性ドナーから得られたHCMV特異的CTLクローンの機能を示すグラフである。個々のHCMV抗原をコードする組換えワクシニアウイルス（各パネルの上から下へ、それぞれVacc.pp28、Vacc.pp150、Vacc.gH、Vacc.gB、Vacc.IE-1およびVacc.pp65）に感染させた自己LCL上でクローンを試験した。LCLにワクシニア構築物を10：1のMOIで12〜14時間感染させ、標準51Cr放出アッセイのために処理した。その結果は、標準的な4時間クロム放出アッセイで観測された特異的溶解パーセントとしてx軸上に示してある。このアッセイを通して5：1のエフェクター：標的比を用いた。
【図１０ａ】ペプチドの非存在下（「ペプチドなし」と記したパネル）またはHCMV pp65もしくはHCMV gH抗原に由来する20-merペプチドの存在下（「＋ペプチド」と記したパネル）でのCD4+Ｔ細胞集団によるIFN-γ分泌を示した図である。20-merペプチドは、配列SICPSQEPMSIYVYALPLKM (配列番号90; 図面ではSICと称される; 左のパネル)を有するpp65由来の20-merペプチド、および配列RQTEKHELLVLVKKAQLNRH (配列番号249; 図面ではRQTと称される; 右のパネル)を有するgH由来の20-merペプチドであった。細胞をリンパ球について、さらにＴ細胞のCD3＋について前方および側方散乱光により前進的にゲーティングした。ゲーティングされた集団をCD4染色（水平軸）対IFN-γ染色（垂直軸）として確率等高線プロットでプロットする。抗原特異的CD4+およびIFN-γ陽性細胞の頻度（全CD4+Ｔ細胞内）をそれぞれのボックスの上に示してある。
【図１０ｂ】ペプチドの非存在下（「ペプチドなし」と記したパネル）またはHCMV pp65もしくはHCMV gH抗原に由来する20-merペプチドの存在下（「＋ペプチド」と記したパネル）でのCD8+Ｔ細胞集団によるIFN-γ分泌を示した図である。20-merペプチドは、配列SICPSQEPMSIYVYALPLKM (配列番号90; 図面ではSICと称される; 左のパネル)を有するpp65由来の20-merペプチド、および配列RQTEKHELLVLVKKAQLNRH (配列番号249; 図面ではRQTと称される; 右のパネル)を有するgH由来の20-merペプチドであった。細胞をリンパ球について、さらにＴ細胞のCD3＋について前方および側方散乱光により前進的にゲーティングした。ゲーティングされた集団を、CD8染色（水平軸）対IFN-γ染色（垂直軸）として確率等高線プロットでプロットする。抗原特異的CD8+およびIFN-γ陽性細胞の頻度（全CD8+Ｔ細胞内）をそれぞれのボックスの上に示してある。
【図１１ａ】ELISPOT法を用いた最小エピトープ配列のマッピングを示すグラフである。RKと称する健康な血清反応陽性ドナーから得られたPBMCを、HCMV IE-2抗原由来の重複するペプチドで刺激し、本明細書に記載されるELISPOT法でIFN-γ産生を測定した。試験したペプチドはアミノ酸配列FEQPTETP (配列番号261)、FEQPTETPP (配列番号260)、EQPTETPPE (配列番号263)、FEQPTETPPE (配列番号262)、QFEQPTETPPE (配列番号264)またはTAAKAYAVGQFEQPTETPPE (配列番号269)を有していた。データは106個のPBMCあたりのスポット形成細胞(SFC)として表してある。
【図１１ｂ】CTLアッセイを用いた最小エピトープ配列のマッピングを示すグラフである。アミノ酸配列TAAKAYAVGQFEQPTETPPE (配列番号269)を有するHCMV IE-2由来ペプチドに特異的なCTLクローンを、アミノ酸配列FEQPTETPPE (配列番号262; ◆)、FEQPTETPP (配列番号260; ■)またはFEQPTETP (配列番号261; 黒三角)を有する重複合成ペプチドを様々な濃度で用いて予め感作した自己PHA芽球に対して試験した。ペプチドの濃度をx軸上に示してある。特異的溶解パーセントは縦座標に示してある。
【図１２ａ】RKと称する健康な血清反応陽性ドナーから得られたHLA B41拘束性CTL株に対するHCMV IE-2抗原由来のHCMV CTLエピトープのHLAクラスI拘束分析を示すグラフである。ドナーRKから得られたCTLクローンを、標準的な51Cr放出アッセイにおいて、ドナーRKからのペプチド感作自己LCL(自己RK LCL)に、またはWS(すなわち、WS LCL)、MB(すなわち、MB LCL)、CS(すなわち、CS LCL)、BM21(すなわち、BM21 LCL)もしくはSB(すなわち、SB LCL)と称する健康な血清反応陽性ドナーからの同種異系LCLに曝した。個々のLCLがドナーRK（このドナーからCTL株が樹立された）と共有するHLAクラスI対立遺伝子をY軸に示してある。データはx軸上に特異的溶解パーセントとして示してある。
【図１２ｂ】HLA A23、HLA A24およびHLA A30を発現するペプチドコーティング標的細胞を認識するCSと称する健康な血清反応陽性ドナーから得られたCTL株に対するHCMV IE-1抗原由来のHCMV CTLエピトープのHLAクラスI拘束分析を示すグラフである。ドナーCSから得
られたCTLクローンを、標準的な51Cr放出アッセイにおいて、ペプチド感作自己LCL(自己CS LCL)に、またはJW(すなわち、JW LCL)、PP(すなわち、PP LCL)、CSt(すなわち、CSt LCL)、DUCAF(すなわち、DUCAF LCL)またはWS(すなわち、WS LCL)と称する健康な血清反応陽性ドナーからの同種異系LCLに曝した。個々のLCLがドナーRK（このドナーからCTL株が樹立された）と共有するHLAクラスI対立遺伝子をY軸に示してある。データはx軸上に特異的溶解パーセントとして示してある。
【図１ａ】
2005504733.tif 000020
【図１ｂ】
2005504733.tif 000021
【図１ｃ】
2005504733.tif 000022
【図１ｄ】
2005504733.tif 000023
【図１ｅ】
2005504733.tif 000024
【図１ｆ】
2005504733.tif 000025
【図１ｇ】
2005504733.tif 000026
【図１ｈ】
2005504733.tif 000027
【図１ｉ】
2005504733.tif 000028
【図２ａ】
2005504733.tif 000029
【図２ｂ】
2005504733.tif 000030
【図２ｃ】
2005504733.tif 000031
【図３ａ】
2005504733.tif 000032
【図３ｂ】
2005504733.tif 000033
【図３ｃ】
2005504733.tif 000034
【図４ａ】
2005504733.tif 000035
【図４ｂ】
2005504733.tif 000036
【図５ａ】
2005504733.tif 000037
【図５ｂ】
2005504733.tif 000038
【図５ｃ】
2005504733.tif 000039
【図５ｄ】
2005504733.tif 000040
【図６】
2005504733.tif 000041
【図７ａ】
2005504733.tif 000042
【図７ｂ】
2005504733.tif 000043
【図７ｃ】
2005504733.tif 000044
【図７ｄ】
2005504733.tif 000045
【図７ｅ】
2005504733.tif 000046
【図７ｆ】
2005504733.tif 000047
【図８】
2005504733.tif 000048
【図９】
2005504733.tif 000049
【図１０ａ】
2005504733.tif 000050
【図１０ｂ】
2005504733.tif 000051
【図１１ａ】
2005504733.tif 000052
【図１１ｂ】
2005504733.tif 000053
【図１２ａ】
2005504733.tif 000054
【図１２ｂ】
2005504733.tif 000055
【国際公開パンフレット】
2005504733.tif 000056
2005504733.tif 000057
2005504733.tif 000058
2005504733.tif 000059
2005504733.tif 000060
2005504733.tif 000061
2005504733.tif 000062
2005504733.tif 000063
2005504733.tif 000064
2005504733.tif 000065
2005504733.tif 000066
2005504733.tif 000067
2005504733.tif 000068
2005504733.tif 000069
2005504733.tif 000070
2005504733.tif 000071
2005504733.tif 000072
2005504733.tif 000073
2005504733.tif 000074
2005504733.tif 000075
2005504733.tif 000076
2005504733.tif 000077
2005504733.tif 000078
2005504733.tif 000079
2005504733.tif 000080
2005504733.tif 000081
2005504733.tif 000082
2005504733.tif 000083
2005504733.tif 000084
2005504733.tif 000085
2005504733.tif 000086
2005504733.tif 000087
2005504733.tif 000088
2005504733.tif 000089
2005504733.tif 000090
2005504733.tif 000091
2005504733.tif 000092
2005504733.tif 000093
2005504733.tif 000094
2005504733.tif 000095
2005504733.tif 000096
2005504733.tif 000097
2005504733.tif 000098
2005504733.tif 000099
2005504733.tif 000100
2005504733.tif 000101
2005504733.tif 000102
2005504733.tif 000103
2005504733.tif 000104
2005504733.tif 000105
2005504733.tif 000106
2005504733.tif 000107
2005504733.tif 000108
2005504733.tif 000109
2005504733.tif 000110
2005504733.tif 000111
2005504733.tif 000112
2005504733.tif 000113
2005504733.tif 000114
2005504733.tif 000115
2005504733.tif 000116
2005504733.tif 000117
2005504733.tif 000118
2005504733.tif 000119
2005504733.tif 000120
2005504733.tif 000121
2005504733.tif 000122
2005504733.tif 000123
2005504733.tif 000124
2005504733.tif 000125
2005504733.tif 000126
2005504733.tif 000127
2005504733.tif 000128
2005504733.tif 000129
2005504733.tif 000130
2005504733.tif 000131
2005504733.tif 000132
2005504733.tif 000133
2005504733.tif 000134
2005504733.tif 000135
2005504733.tif 000136
2005504733.tif 000137
2005504733.tif 000138
2005504733.tif 000139
2005504733.tif 000140
2005504733.tif 000141
2005504733.tif 000142
2005504733.tif 000143
2005504733.tif 000144
2005504733.tif 000145
2005504733.tif 000146
2005504733.tif 000147
2005504733.tif 000148
2005504733.tif 000149
2005504733.tif 000150
2005504733.tif 000151
2005504733.tif 000152
2005504733.tif 000153
2005504733.tif 000154
2005504733.tif 000155
2005504733.tif 000156
2005504733.tif 000157
2005504733.tif 000158
2005504733.tif 000159
2005504733.tif 000160
2005504733.tif 000161
2005504733.tif 000162
2005504733.tif 000163
2005504733.tif 000164
2005504733.tif 000165
2005504733.tif 000166
2005504733.tif 000167
2005504733.tif 000168
2005504733.tif 000169
2005504733.tif 000170
2005504733.tif 000171
2005504733.tif 000172
2005504733.tif 000173
2005504733.tif 000174
2005504733.tif 000175
2005504733.tif 000176
2005504733.tif 000177
2005504733.tif 000178
2005504733.tif 000179
2005504733.tif 000180
2005504733.tif 000181
2005504733.tif 000182
2005504733.tif 000183
2005504733.tif 000184
2005504733.tif 000185
2005504733.tif 000186
2005504733.tif 000187
2005504733.tif 000188
2005504733.tif 000189
2005504733.tif 000190
2005504733.tif 000191
2005504733.tif 000192
2005504733.tif 000193
2005504733.tif 000194
2005504733.tif 000195
2005504733.tif 000196
2005504733.tif 000197
2005504733.tif 000198
2005504733.tif 000199
2005504733.tif 000200
2005504733.tif 000201
2005504733.tif 000202
2005504733.tif 000203
2005504733.tif 000204
2005504733.tif 000205
2005504733.tif 000206
2005504733.tif 000207
2005504733.tif 000208
2005504733.tif 000209
2005504733.tif 000210
2005504733.tif 000211
2005504733.tif 000212
2005504733.tif 000213
2005504733.tif 000214
2005504733.tif 000215
2005504733.tif 000216
2005504733.tif 000217
2005504733.tif 000218
2005504733.tif 000219
2005504733.tif 000220
2005504733.tif 000221
2005504733.tif 000222
2005504733.tif 000223
2005504733.tif 000224
2005504733.tif 000225
2005504733.tif 000226
2005504733.tif 000227
2005504733.tif 000228
2005504733.tif 000229
2005504733.tif 000230
2005504733.tif 000231
2005504733.tif 000232
2005504733.tif 000233
2005504733.tif 000234
2005504733.tif 000235
2005504733.tif 000236
2005504733.tif 000237
2005504733.tif 000238
2005504733.tif 000239
2005504733.tif 000240
2005504733.tif 000241
2005504733.tif 000242
2005504733.tif 000243
2005504733.tif 000244
2005504733.tif 000245
2005504733.tif 000246
2005504733.tif 000247
2005504733.tif 000248
2005504733.tif 000249
2005504733.tif 000250
2005504733.tif 000251
2005504733.tif 000252
2005504733.tif 000253
2005504733.tif 000254
2005504733.tif 000255
2005504733.tif 000256
2005504733.tif 000257
2005504733.tif 000258
2005504733.tif 000259
2005504733.tif 000260
2005504733.tif 000261
2005504733.tif 000262
2005504733.tif 000263
2005504733.tif 000264
2005504733.tif 000265
2005504733.tif 000266
2005504733.tif 000267
2005504733.tif 000268
2005504733.tif 000269
2005504733.tif 000270
2005504733.tif 000271
2005504733.tif 000272
2005504733.tif 000273
2005504733.tif 000274
2005504733.tif 000275
2005504733.tif 000276
2005504733.tif 000277
2005504733.tif 000278
2005504733.tif 000279
2005504733.tif 000280
2005504733.tif 000281
2005504733.tif 000282
2005504733.tif 000283
2005504733.tif 000284
2005504733.tif 000285
2005504733.tif 000286
2005504733.tif 000287
2005504733.tif 000288
2005504733.tif 000289
2005504733.tif 000290
2005504733.tif 000291
2005504733.tif 000292
2005504733.tif 000293
2005504733.tif 000294
2005504733.tif 000295
2005504733.tif 000296
2005504733.tif 000297
2005504733.tif 000298
2005504733.tif 000299
2005504733.tif 000300
2005504733.tif 000301
2005504733.tif 000302
2005504733.tif 000303
2005504733.tif 000304
2005504733.tif 000305
2005504733.tif 000306
2005504733.tif 000307
2005504733.tif 000308
2005504733.tif 000309
2005504733.tif 000310
2005504733.tif 000311
2005504733.tif 000312
2005504733.tif 000313
2005504733.tif 000314
2005504733.tif 000315
2005504733.tif 000316
2005504733.tif 000317
2005504733.tif 000318
2005504733.tif 000319
2005504733.tif 000320
2005504733.tif 000321
2005504733.tif 000322
2005504733.tif 000323
2005504733.tif 000324
2005504733.tif 000325
2005504733.tif 000326
2005504733.tif 000327
2005504733.tif 000328
2005504733.tif 000329
2005504733.tif 000330
2005504733.tif 000331
2005504733.tif 000332
2005504733.tif 000333
2005504733.tif 000334
2005504733.tif 000335
2005504733.tif 000336
2005504733.tif 000337
2005504733.tif 000338
2005504733.tif 000339
2005504733.tif 000340
2005504733.tif 000341
2005504733.tif 000342
2005504733.tif 000343
2005504733.tif 000344
2005504733.tif 000345
2005504733.tif 000346
2005504733.tif 000347
2005504733.tif 000348
2005504733.tif 000349
2005504733.tif 000350
2005504733.tif 000351
2005504733.tif 000352
2005504733.tif 000353
2005504733.tif 000354
2005504733.tif 000355
2005504733.tif 000356
2005504733.tif 000357
2005504733.tif 000358
2005504733.tif 000359
【国際調査報告】
2005504733.tif 000360
2005504733.tif 000361
2005504733.tif 000362
2005504733.tif 000363