(57)【要約】細胞サンプルを取得し、細胞（１）を溶液に懸濁する（１００）ことによって、悪性腫瘍、および／または癌を含む疾病に関連する分子標識分画化を伴う細胞を検出する。細胞を固定する（１０２）。分子標識を標識分子プローブで標示する（１０３）。細胞（１）を光の点源で照明し（１０４）、デジタル・アレイ検出器により異なる投射像を取得する（１０５）。投射像を照明のばらつきに対して補償し（１０６）、解析して、密度および位置特徴を有する標示分子標識を検出する（１０７）。分子標識の位置を解析し（１０８）、密度および位置特徴を用いて、分子標識の分画化を測定する（１０９）。悪性腫瘍、および／または分子標識分画化に関連する疾病を検出するための選別器を使用して、標示分子標識の分画化を解析する（１１０）。
2005525581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍および／または癌を含む疾病に関連する分子標識分画化を伴う細胞を検出するための方法であって、
ａ）複数の細胞（１）を有する細胞サンプルを取得し、複数の細胞を溶液に懸濁する工程（１００）と、
ｂ）必要な場合は、細胞サンプルの複数の細胞を固定する工程（１０２）と、
ｃ）複数の細胞における少なくとも１つの分子標識を標識分子プローブまたは染色剤で標示する工程（１０３）と、
ｄ）複数の細胞の少なくとも１つの細胞（１）を少なくとも１つの光の点源で照明する工程（１０４）と、
ｅ）デジタル・アレイ検出器により、少なくとも１つの細胞（１）全体の少なくとも２つの異なる投射像を取得する工程（１０５）と、
ｆ）少なくとも２つの投射像を照明のばらつきに対して補償する工程（１０６）と、
ｇ）少なくとも２つの投射像を解析して、密度および位置特徴を有する少なくとも１つの標示分子標識を検出する工程（１０７）と、
ｈ）少なくとも１つの細胞（１）内の少なくとも１つの分子標識の位置を解析する工程（１０８）と、
ｉ）密度および位置特徴を用いることによって、少なくとも１つの標示分子標識の分画化を測定する工程（１０９）と、
ｊ）悪性腫瘍および／または疾病関連分子標識分画化を検出するために、少なくとも１つの選別器により少なくとも１つの標示分子標識の分画化を解析する工程（１１０）とを含む方法。
【請求項２】
少なくとも２つの異なる投射像を取得する工程（１０５）は、光トモグラフィ・システムを動作して、少なくとも２つの異なる投射像を取得することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光トモグラフィ・システムは、流動光トモグラフィ・システムを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞サンプルは、痰、気管支胞洗浄液、頬切屑、尿、頸切屑および分泌物、乳頭吸引液、乳頭洗浄液、便、ならびに目標器官および血液からの微細針よりなる群から選択される少なくとも１つの単離検体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の細胞（１）から細胞質（１８）を分離する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
癌は、肺癌、膀胱癌、子宮頸癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、卵巣癌および血液細胞癌よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
分子プローブは、抗体、特異的結合タンパク質、レクチン、発色団で標識された核酸プローブ、蛍光体、発色団を生成できる酵素、および蛍光体を生成できる酵素よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの標示分子標識は、ｐＲｂ、ｐ５３／５３ＢＰ１、Ｅ２Ｆ、ＰＴＥＮ、ＳＡＭ６８、ＢＲＣＡ１、ｃ−ｍｙｃおよびメチルＣｐＧよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの標示分子標識は、癌を有する個人から採取した細胞（１）または細胞核（１９）と癌を有さない個人から採取した細胞（１）または細胞核（１９）との間で異なる分画化を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
画像解析を用いて、少なくとも１つの標示分子標識がその中で生じる少なくとも１つの細胞分画（１８、１９、３６）の境界面（１２、１３）を復元する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
分画化を測定する工程は、少なくとも２つの投射像内に位置する一致した境界面（１２、１３）内に位置する少なくとも１つの標示分子標識によって形成された密度特徴の構造を解析する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも２つの投射像内の境界面（１２、１３）を比較して、少なくとも２つの投射像の間の一組の一致した境界面（１２、１３）を確認する工程をさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
分画化を測定する工程（１０９）は、復元された三次元空間における少なくとも２つの標示標識の共存を確認する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
分画化を測定する工程（１０９）は、二次元空間における少なくとも２つの標示標識の共存を確認する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
分画化を測定する工程（１０９）は、互いに関係する少なくとも２つの標示標識の密度特徴の構造を解析する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
密度特徴の構造は、光学密度（ＯＤ）変動、ＯＤ歪み、ＯＤレンジ、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、光点の密度、高平均距離、中／高平均距離、相関性、均一性、エントロピ、フラクタル寸法、窪み、最近接解析、接続成分、最近接解析および空間密度周波数空間における高調波よりなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
分画化を測定する工程（１０９）は、メチルＣｐＧと、メチルＣｐＧ結合タンパク質および核酸プローブで標示される目標遺伝子のプロモータ領域に対して特異的なＤＮＡ配列とを共存させることによって、腫瘍抑圧遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化ＣｐＧアイランドを検出する工程をさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
分画化を測定する工程（１０９）は、メチルＣｐＧと、メチルＣｐＧ結合タンパク質および核酸プローブで標示される目標遺伝子のプロモータ領域に対して特異的なＤＮＡ配列とを共存させることによって、腫瘍抑圧遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化ＣｐＧアイランドを検出する工程をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
悪性腫瘍および癌を含む疾病に関連する分子標識分画化を伴う細胞を検出するための方法であって、
ａ）複数の細胞を有する細胞サンプルを取得し、複数の細胞を溶液に懸濁する工程（１００）と、
ｂ）必要な場合は、細胞サンプルの複数の細胞を固定する工程（１０２）と、
ｃ）複数の細胞における少なくとも１つの分子標識を標識分子プローブまたは染色剤で標示する工程（１０３）と、
ｄ）複数の細胞の少なくとも１つの細胞を少なくとも１つの光の点源で照明する工程（１０４）と、
ｅ）デジタル・アレイ検出器により少なくとも１つの細胞（１）全体の少なくとも１つの投射像を取得する工程（１０５）と、
ｆ）照明のばらつきに対して少なくとも１つの投射像を補償する工程（１０６）と、
ｇ）少なくとも１つの投射像を解析して、少なくとも１つの標示分子標識を検出する工程（１０７）と、
ｈ）少なくとも１つの細胞（１）内の二次元（２Ｄ）空間における少なくとも１つの分子標識の位置を解析する工程（１０８）と、
ｉ）密度および位置特徴を用いることによって、少なくとも１つの標示分子標識の分画化を測定する工程（１０９）と、
ｊ）悪性腫瘍および／または疾病関連分子標識分画化を検出するために、少なくとも１つの選別器により少なくとも１つの標示分子標識の分画化を解析する工程（１１０）とを含む方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの投射像を取得する工程（１０５）は、光トモグラフィ・システムを動作して、少なくとも２つの投射像を取得することをさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
光トモグラフィ・システムは、流動光トモグラフィ・システムを含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞サンプルは、痰、気管支胞洗浄液、頬切屑、尿、頸切屑および分泌物、乳頭吸引液、乳頭洗浄液、便、ならびに目標器官および血液からの微細針よりなる群から選択される少なくとも１つの単離検体を含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
複数の細胞（１）から細胞質（１８）を分離する工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
癌は、肺癌、膀胱癌、子宮頸癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、卵巣癌および血液細胞癌よりなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
分子プローブは、抗体、特異的結合タンパク質、レクチン、発色団で標識された核酸プローブ、蛍光体、発色団を生成できる酵素、および蛍光体を生成できる酵素よりなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの標示分子標識は、ｐＲｂ、ｐ５３／５３ＢＰ１、Ｅ２Ｆ、ＰＴＥＮ、ＳＡＭ６８、ＢＲＣＡ１、ｃ−ｍｙｃおよびメチルＣｐＧよりなる群から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの標示分子標識は、癌を有する個人から採取した細胞（１）または細胞核（１９）と癌を有さない個人から採取した細胞（１）または細胞核（１９）との間で異なる分画化を示す請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
画像解析を用いて、少なくとも１つの標示分子標識がその中で生じる少なくとも１つの細胞分画（１８、１９、３６）の境界面（１２、１３）を復元する工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
分画化を測定する工程（１０９）は、二次元空間における少なくとも２つの標示標識の共存を確認する工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
分画化を測定する工程（１０９）は、互いに関係する少なくとも２つの標示標識の密度特徴の構造を解析する工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
構造解析の構造は、光学密度（ＯＤ）変動、ＯＤ歪み、ＯＤレンジ、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、光点の密度、高平均距離、中／高平均距離、相関性、均一性、エントロピ、フラクタル寸法、窪み、最近接解析、接続成分、最近接解析および空間密度周波数空間における高調波を含むが、それらに限定されない請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
分画化を測定する工程（１０９）は、メチルＣｐＧと、メチルＣｐＧ結合タンパク質および核酸プローブで標示される目標遺伝子のプロモータ領域に対して特異的なＤＮＡ配列とを共存させることによって、腫瘍抑圧遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化ＣｐＧアイランドを検出する工程をさらに含む請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、投射撮像システム全体および細胞分類に関し、より詳細には悪性腫瘍および疾病に関連する核または細胞質分子標識分画化の高度定量に基づいて高リスクの個人における癌を検出するための流動光トモグラフィ（ＦＯＴ）の如き投射撮像を用いた高スループット自動システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれている、２００３年２月１８日に発行された米国特許第６，５２２，７７５号（Ａｌａｎ  Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ）の一部継続である。
【０００３】
患者の癌を診断する最も一般的な方法は、疑わしい組織のサンプルを入手し、明らかに悪性腫瘍の細胞の存在についてそれを顕微鏡で検査することによるものである。この方法は、疑わしい組織の解剖学的位置が知られているときは比較的容易で、完全にサンプリングできるが（例えば子宮頸部）、容易に識別可能な腫瘍または病変が存在せず、サンプリング対象領域が非常に大きいときはさほど容易ではない。例えば、肺癌の検出については、肺の全気道を交換することは不可能である。肺の気道から剥がれた細胞を含むために、痰などのサンプルを使用しなければならない。これは、初期の肺癌は、肺の全内面に比べて非常に小さく、その結果、腫瘍から剥がれた細胞の数も正常細胞に比べて非常に少ないため、希薄化の問題を生じる。実際には痰サンプルの小さな部分しか検査されないため、この問題は複雑である。したがって、従来の痰細胞診断による肺癌の検出では、１つまたは複数の比較的希薄な癌細胞が、検査するサンプルの当該部分に存在することが必要である。したがって、サンプルが肺の状態を知覚的かつ正確に反映しなければ、肺癌をかかえる患者を適正に診断することができない。
【０００４】
顕微鏡を使用したシステム、診断細胞、および悪性腫瘍に伴う変化を有する細胞を検出するための方法の一例が、米国特許第６，０２６，１７４号（Ｐａｌｃｉｃ他）に開示されている。Ｐａｌｃｉｃ他のシステムは、従来の顕微鏡、カメラ、画像デジタイザ、これらの構成要素を制御し、それと対話するためのコンピュータ・システム、初期細胞分類のための一次選別器、および次の細胞分類のための二次選別器を有する自動選別器を含む。この方法は、自動選別器を利用して、診断細胞、および悪性腫瘍に伴う変化を有する細胞を自動的に検出する。この方法は、癌細胞より一般的である、悪性腫瘍に伴う変化を示す細胞を検出することにより、従来の細胞診断に改良を加えたものである。しかし、診断結果の質は、染色密度の正確な測定が不可能である従来の顕微鏡を使用することによって制限されている。また、Ｐａｌｃｉｃ他の方法は、特定の分子プローブの使用や分子標識の分画化に対処しない。
【０００５】
抗体および拡散プローブの如き特定の分子プローブが実現すれば、これらの分子プローブを標識し、次いで生体細胞および組織内におけるそれらの位置および濃度を測定することによって、新しい疾病関連問題に対処することが可能になる。標識された特定の分子プローブは、癌などの疾病過程の情報を提供しうるｐＲｂ、ｐ５３／ｐ５３結合タンパク質１（５３ＢＰ１）、Ｓａｍ６８、ＰＴＥＮ、Ｅ２Ｆおよび５−メチルシトシン−グアニン（メチルＣｐＧ）の如き分子標識の間接的定量および分画化を可能にする。（例えば、Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｄ．、「Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ＴＢＰ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７０：２８１−２８７、１９９８、Ｒａｐｐｏｌｄ  Ｉ、「Ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐ５３  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（５３ＢＰ１）Ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５３（３）：６１３−６２０．２００１、Ｃｈｅｎ，Ｔ．、「Ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＳＧ  Ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  Ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ  Ｓａｍ６８  ｔｏ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １０：３０１５−３０３３、１９９９、Ｐｅｒｒｅｎ，Ａ．、「Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｍｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＴＥＮ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌｓ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５７（４）：１０９７−１１０３、２０００、Ｇｉｌ，Ｒ．、「Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ２Ｆ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ  Ｓｔａｔｅ  ｉｎ  Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｍｕｓｃｌｅ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４８（６）：１１８７−１２０１、２０００、およびＲｏｕｎｔｒｅｅ，Ｍ．、「ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０：３１５６−３１６５、２００１を参照のこと）。これらのプローブをより正確に配置、定量化する必要性が生じるにつれて、二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）のサブミクロンの解像度でプローブ密度を測定する改善された技術が同時に必要とされている。ガラス・スライドに置かれた細胞を利用する従来の光学顕微鏡法は、焦点面深さの制限、サンプリング角度、および典型的には細胞を画像の平面内で重複させる細胞調製に伴う問題により、２Ｄ密度��定値しか概算することができない。光学顕微鏡法の他の欠点は、狭い焦点面内の領域しか正確な解析用データを提供しない、対物レンズを介して観察するという固有の制限である。
【０００６】
流動細胞診断法は、一般には、細胞を流体の流れにおいて１つずつ流すことによって細胞重複の問題を克服する。残念なことに、流動細胞診断システムは、従来の光学顕微鏡と同じ品質の細胞の画像を生成せず、いずれの場合も、画像は三次元にならない。背景については、当業者は、Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３ｒｄ  ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５．を指針とする。
【０００７】
共焦点顕微鏡法は、サンプルの連続的な薄層を撮像して、三次元で観察できる、二次元画像の階層を作成することによって、サンプルの三次元撮像を提供する。ガラス・スライド上のサンプルに沿って光の狭いスポットをスキャンすることによって撮像を行う。焦点外の光が検出器に当たるのを防ぐピンホールを介して蛍光または反射光を検出器に集める。したがって、ピンホールの大きさが、垂直方向の解像度を決定づけ、スポットの大きさが、水平方向の解像度を決定づける。残念なことに、共焦点顕微鏡は、光の小さいスポットをサンプルに沿ってラスタでスキャンすることによって画像を形成し、サンプルを再度スキャンして各追加的な切片を生成しなければならないため、非常に遅い方法である。他の欠点は、スライドに付着させた細胞を平坦化するため、細胞構造を変形させる。
【０００８】
コンピュータ支援トモグラフィの分野において、１９９５年３月２８日に発行された「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ」という名称の米国特許第５，４０２，４６０号（Ｊｏｈｎｓｏｎ他）には、Ｘ線発生器と、検体を通じてＸ線ビームの減衰を測定するＸ線検出器とを使用して、検体の高解像度三次元画像を生成するためのマイクロトモグラフィック・システムが開示されている。それぞれ異なるエネルギーのＸ線ビームを用いた検体の各画像の２つの投射像がＪｏｈｎｓｏｎ他のマイクロトモグラフィック・システムによって作成される。検体の１つの画像の２つの投射像を作成した後に、検体を検体ホルダ上で回転させ、他の組の投射像を作成する。検体の各画像の投射像を一緒に解析して、検体を含む物質の相率を定量的に示す。異なる画像の投射像を組み合わせて、検体の三次元画像を提供する。米国特許第５，４０２，４６０号は参照により本明細書に組み込まれている。米国特許第５，４０２，４６０号に教示されているＸ線技術はいくつかの用途に対して有用であるが、生体細胞内の分子密度の三次元分布を測定することが可能である、流動細胞診断に有用な光学的ソルーションを提供するものではない。
【０００９】
上述の制限および当該システムに見られる他の制限を克服するために、流動細胞診断個別細胞表示と多点源投射像からの演算光トモグラフィとを組み合わせて、複数の投射像から細胞内の密度情報を復元することが、本発明の目的である。復元された密度情報は、特異的に標示された標識の正確な定量化および当該標識の分画化を可能にする。
【００１０】
本明細書に示される密度情報は、狭焦点面の外側の非集中構造体による固有の望ましくないぼやけた人為要素を伴うレンズおよび焦点面の使用を必要としない投射撮像システムに独自のものである。投射撮像システムはレンズおよび焦点面を必要とせず、同時にすべての構造体の焦点が明確になる射影を生成するため、密度特徴の測定は、従来の顕微鏡システムより定量的で正確である。さらに、投射像からの三次元復元は、任意の二次元画像において重複しうる特徴の分離を可能にする。これらの密度特徴は、細胞を染色するのに使用される分子プローブの位置および量に直接関連する。
【特許文献１】米国特許第６，０２６，１７４号
【非特許文献１】Ｐａｓｑｕａｌｅ，Ｄ．、「Ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ＴＢＰ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７０：２８１−２８７、１９９８
【非特許文献２】Ｒａｐｐｏｌｄ  Ｉ、「Ｔｕｍｏｒ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐ５３  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １（５３ＢＰ１）Ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１５３（３）：６１３−６２０．２００１
【非特許文献３】Ｃｈｅｎ，Ｔ．、「Ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＳＧ  Ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  Ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ  Ｓａｍ６８  ｔｏ  Ｎｏｖｅｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １０：３０１５−３０３３、１９９９
【非特許文献４】Ｐｅｒｒｅｎ，Ａ．、「Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｒｅｖｅａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｍｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＴＥＮ  ｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌｓ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１５７（４）：１０９７−１１０３、２０００
【非特許文献５】Ｇｉｌ，Ｒ．、「Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ２Ｆ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒｓ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ  Ｓｔａｔｅ  ｉｎ  Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｍｕｓｃｌｅ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１４８（６）：１１８７−１２０１、２０００
【非特許文献６】Ｒｏｕｎｔｒｅｅ，Ｍ．、「ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０：３１５６−３１６５、２００１
【非特許文献７】Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３ｒｄ  ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５
【特許文献２】米国特許第５，４０２，４６０号
【非特許文献８】Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐ．、「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｂｊｅｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：１０５−１７、１９７２
【非特許文献９】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｂ．Ｅ．、「Ｍｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ３  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＮＳ−２１：７２−７、１９７４
【非特許文献１０】Ｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｒ、Ｇｒｕｎｂａｕｍ、Ｆ．Ａ．、Ｋｏｈｎ，Ｐ．、ａｎｄ  Ｚｕｂｅｌｌｉ，Ｊ．Ｐ．、「Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｏｆ  Ｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８（４９５８）；９９０−３、１９９０
【非特許文献１１】Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙａｇｅ，Ｒ．、「Ｒａｐｉｄ  ３−Ｄ  Ｃｏｎｅ−ｂｅａｍ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＡＲＴ）Ｕｓｉｎｇ  ２−Ｄ  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｈａｒｄｗａｒｅ」、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  １９（１２）：１２２７−３７，２００１
【非特許文献１２】Ｂｅｌｌｍａｎ，Ｓ．Ｈ．、Ｂｅｎｄｅｒ，Ｒ．、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．、ａｎｄ  Ｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．、「ＡＲＴ  ｉｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｂｅｉｎｇ  Ａ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  ｏｆ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３２：２０５−１６、１９７１
【非特許文献１３】Ｇｉｌｂｅｒｔ，ｉｄ．＃１４９３
【非特許文献１４】Ｍａｎｇｌｏｓ，Ｓ．Ｈ．、Ｊａｓｚｃａｋ，Ｒ．Ｊ．、ａｎｄ  Ｆｌｏｙｄ，Ｃ．Ｅ．、「Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｅ  Ｂｅａｍ  ＳＰＥＣＴ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｔｅｓｔｓ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４（１２）：１９４７−５７、１９８９、＃１３８２
【非特許文献１５】Ｍａｎｇｌｏｓ，Ｓ．Ｈ．、Ｇａｇｎｅ，Ｇ．Ｍ．、Ｋｒｏｌ  Ａ，Ｔｈｏｍａｓ，Ｆ．Ｄ．、ａｎｄ  Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ，Ｒ．、「Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｓｕｂｓｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｅ  Ｂｅａｍ  ＣＴ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０（７）：１２２５−４１、１９９５、＃４３８９
【非特許文献１６】Ｂｌａｓｓ，Ｍ．、ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃｓ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｖｏｌ．ＩＶ、ＭｃｇｒａｗＨｉｌｌ、２００１
【非特許文献１７】Ｋａｋ，Ａ．Ｃ，ａｎｄ  Ｓｌａｎｅｙ，Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ、ＩＥＥＥ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８
【非特許文献１８】Ｈｅｒｍａｎ，Ｇ．、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０
【非特許文献１９】Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｋ．Ｄ．ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ，Ｈ．、「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｆｉｎｉｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２２（６９１−７０１）１９９５
【非特許文献２０】Ｈａｍｐｅｌ，Ｕ．ａｎｄ  Ｆｒｅｙｅｒ，Ｒ．、「Ｆａｓｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉａｌｌｙ  Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２５（１）：９２−１０１、１９９８
【非特許文献２１】Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｋ．Ｄ．ａｎｄ  Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ｕ．Ｌ．、「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ  Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｈｏｔｏ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ  Ｐｈａｎｔｏｍｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２５（２）：１８３−９３、１９９８
【特許文献３】米国特許第６，５１９，３３５号
【特許文献４】米国同時係属出願第１０／１４７，１５４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、これまで、それらの測定を行う効率的な方法が存在しなかったため、分子標識の細胞成分または副核分画化の測定が診断に使用されなかった従来の技術の欠点を克服する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一実施形態において、本発明は、細胞サンプルにおける悪性腫瘍に関連する細胞を検出する方法であって、
細胞サンプルを取得し、細胞を溶液に懸濁する工程と、
必要であれば、細胞サンプルの細胞を懸濁液に固定する工程と、
細胞を染色し、かつ／または標示して、サンプルの各細胞内の特定の分子標識または他の構造体に関連する光学密度を生成する工程と、
単一細胞の流れを生成する工程と、
流れのなかの各細胞を光の「点」源で照明し、デジタル検出器によって細胞全体の１つまたは複数の投射像（例えば射影）を取得する工程と、
背景照明の変動に対して投射像を補償する工程と、
投射像を解析して、特異的に標示された分子標識の検出および分画化を行う工程と、
細胞サンプルにおける悪性腫瘍に関連する細胞の識別および特徴付けを行う少なくとも１つの選別器に、標識分画化および他の解析データを提供する工程とを含む方法を提供する。
【００１３】
他の態様において、本発明は、分子標識の自動検出、および細胞内の標識の分画化または配置を行うためのシステムを提供する。好ましいシステムは、コンピュータ・システムによって制御され、コンピュータ・システムと対話する流動光トモグラフィ（ＦＯＴ）装置を含む。ＦＯＴによって取り込まれた投射像をコンピュータ・システムによって保存、操作して、標示された分子標識の存在を検出する。多数の投射像をコンピュータによって復元して、三次元（３Ｄ）画像を生成して、細胞または核内の標示標識を分画化するとともに、当該標識を定量化することができる。
【００１４】
分子標識分画を判断するために、細胞サンプルを取得し、懸濁液で染色し、次いでＦＯＴにより撮像する。染色または標識プローブは、対象となる分子標識に特有のもので、ｐＲｂ、ｐ５３／５３ＢＰ１、Ｅ２Ｆ、ＰＴＥＮ、ＳＡＭ６８およびメチルＣｐＧ等を含むが、それらに限定されない。発色基、蛍光色素、または発色基または蛍光色素を生成できる酵素で分子プローブを標識することができる。次いで、コンピュータ・システムは、投射像を直接解析し、かつ／または解析される三次元復元を演算する。画像を不均一照明、および画像取得システムの他の欠陥に対して補正する。すべての画像を補正した後に、対象となるオブジェクトの縁、表面、体積および密度、すなわちどのピクセルまたはボクセルが対象となるオブジェクトまたは構造体に属し、どのピクセルまたはボクセルが背景に属するかを決定づける境界を計算する。対象となるこれらのオブジェクトは、標識プローブおよび染色細胞構造体の凝集体を含む。
【００１５】
次いで、コンピュータ・システムは、オブジェクトまたは構造体毎に一組の一次元、二次元および三次元の特徴値を計算する。いくつかの特徴計算については、縁（または表面）を１つまたは複数のピクセル（またはボクセル）分拡大または縮小することによって、最高の傾き値に沿う境界を補正する。これは、各特徴が、オブジェクトのクラスのより高度な区別能力を達成するように行われるため、オブジェクトに特有なものである。次いで、これらの特徴値を、オブジェクトが人為要素であるか、あるいは特異的に染色または標示された細胞または核内の対象となるオブジェクトまたは構造体であるかを判断するための特徴値を使用する選別器によって解析する。オブジェクトが対象となるオブジェクトまたは構造体である場合は、選別器によって特徴値をさらに解析して、オブジェクトがそのタイプのもので、疾病を示す細胞または核分画にあるかどうかを判断する。対象となるオブジェクトまたは構造体が識別されると、関連する分子プローブ密度がその特定のオブジェクトに割り当てられ、プローブの分画化が達成される。標識分画化において大きな疾病関連変化を有すると思われる、サンプル内に見いだされる細胞の数に基づいて、細胞サンプルが取得された患者が健康であるか、悪性腫瘍の成長を抱えているかについての統計的判断を行うことができる。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、細胞サンプルにおける上皮細胞を検出するための方法、および上皮細胞のうちで疾病に関連する分子分画を有する細胞を検出するための方法を提供する。他の実施形態において、患者に癌が発生するかどうかを予測するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ここでは、生体細胞に関する具体的な例について本発明を説明するが、これらの例は本発明の原理を例示することを目的とし、本発明はそれに限定されないことが理解されるであろう。一例において、点密度および照射強度の三次元分布を微視的な体積内に構成することにより、細胞成分体積内の任意の位置における密度および蛍光の測定が可能になり、標識分子プローブで標示された構造体または分子標識の位置が決定づけられる。標識分子プローブを使用することによって、巨視的なオブジェクトにおける特定の構造体または分子標識に結合するプローブの量を測定し、構造体に関連する標識の分画化の測定値を与えることができる。例示を目的として、生体細胞の如きオブジェクトを抗体、特定の結合タンパク質、レクチンまたは拡散プローブ等の少なくとも１つの標識分子プローブで標示することができ、これらのプローブの測定された分画化は、肺癌、乳ガン、前立腺癌、子宮頸癌、膀胱癌および卵巣癌の如き様々な癌を含むが、それらに限定されない細胞の疾病状態に関する重要な情報をもたらすことができる。分子プローブは、ｐＲｂ、ｐ５３、５３ＢＰ１、Ｓａｍ６８、ＰＴＥＮ、Ｅ２ＦまたはメチルＣｐＧに対する抗体でありうる。
【００１８】
懸濁液に調製し、特定の疾病診断に向けて染色、または標識分子プローブで標示した生体細胞に、投射像を収集し、細胞の運動ベクトルにほぼ垂直な光投射光線路からの二次元または三次元密度情報の復元を可能にするデバイスを流動または移動させる。軸に沿う細胞運動の速度を制御することによって、垂直な二次元の復元面を細胞の軸に沿って正しく配置（または積層）して、細胞全体の三次元画像を作成することができ、または細胞の三次元画像を二次元の光伝達または放射線投射から直接演算することができる。
【００１９】
流動細胞診断は、以下の特徴により画像復元に極めて好適である。
・細胞は、単一ファイルで毛管を流れるため、細胞重複および不明瞭化が最小限に抑えられる。
・毛管を流れる細胞の速度は直接測定することが可能であり、一定である。
・細胞は、毛管の中心軸に沿う傾向がある。
・懸濁液中の細胞の分析は、構造的変形を最小限にする。
【００２０】
本発明は、点源投射撮像およびトモグラフィック画像復元のためのシステムを提供するために、上述の特徴を利用するが、これらの特徴に限定されない。
【００２１】
次に図１を参照すると、本発明の実施形態が意図する流動細胞診断システムの例が模式的に示されている。このシステムは、ｘ、ｙおよびｚ方向に座標を有する座標系１１を基準に配向されている。処理に際して、既知の注入デバイス４を使用して、細胞１を注入管３に注入する。毛管は、注入端５にいくに従って広くなっており、圧力キャップ６を含む。被覆液７を管８から導入して、毛管２内に層流を形成する。点線９によって示されているように、溶液に調製して懸濁した細胞１を、流れの軸に沿ってわずかに伸長し、毛管２の中心軸のほぼ下を移動するように、毛管２を移動させることができる。円筒形の毛管の中心軸に沿う単一ファイル内で細胞を軸対称に、一定速度１０で有利に流動させることができる。
【００２２】
次に図２を参照すると、本発明の実施形態が意図する単一細胞に対する流動過程の例が模式的に示されている。細胞１は、毛管２の速度ベクトル１０によって示される一定速度（Ｖ）で移動する。細胞１は、細胞質膜１２および核膜１３を含む。毛管２を流れる過程を通じて、細胞１は、それぞれ第１、第２および第３の復元面１４ａ、１４ｂおよび１４ｃとして例示を目的として示された複数の復元面を通過する。細胞質を通る第１の平面状切片１５ａは復元面１４ａ内に位置する。同様に、細胞質および核を通る第２の平面状切片１５ｂは、第２の復元面１４ｂ内に位置し、第３の平面状切片１５ｃは復元面１４ｃ内に位置する。本発明の中心的な特徴は、選択可能な波長のいくつかの光点源を毛管のまわりにそれと同心に配置することである。光点源は、光スペクトルの選択可能な部分に敏感な対向する光センサ・アレイとともに動作するため、細胞を透過する光の投射像を取得することが可能になる。トモグラフィック画像復元を用いて、取得した投射像を直接解析または加工して、細胞内の密度および／または放射線強度の分布の空間マップまたは画像を提供することができる。実際は、システムに対して表示されているオブジェクトの必要な画像解像度に応じて、復元面の数が数個から数百個以上まで変動しうることが理解されるであろう。復元された平行な平面状切片画像の群をソフトウェアで組み合わせ、または積層して、細胞内の密度および放射線強度の三次元（３Ｄ）画像を生成することができる。加えて、線形（１Ｄ）ではなく平面状（２Ｄ）の光センサ・アレイを採用することにより、また扇形の照明パターンではなく円錐形を採用することにより、流動細胞を通る複数の隣接平面状切片の投射像を同時に取得できる。その結果、円錐ビーム復元アルゴリズムを使用して、細胞体積内の密度および放射線強度の分布の三次元（３Ｄ）画像を二次元（２Ｄ）投射像から直接演算することができる。あるいは、無限のフィールド深さを有する二次元の点源投射像を直接解析することができる。
【００２３】
生体細胞の場合は、復元面の間の距離は数ミクロンまたはそれ以下であってもよい。細胞１内の点は、以下の関係式によって表すことができる時間間隔（ｔ）で、各復元面と符合することになる。
ｔ＝ｄ÷Ｖ（式１）
【００２４】
次に図３Ａと図３Ｂを併せて参照すると、本発明の実施形態が意図する復元の断面１６の例が模式的に示されている。細胞を通る光投射像からの細胞内の点密度の復元は、流動細胞の軸対称性および球心性を利用している。また、投射像により抽出されている空間を３つの主要分画から構成されるものとしてモデル化することができる。
１．細胞１７の外の流体（すなわち、被覆液または細胞懸濁媒体）、
２．細胞質１８、および
３．細胞核１９。
【００２５】
これら３つの分画における光学密度または分子プローブの分布を定量的に把握することで、細胞生物学および疾病診断における多くの重要な問題に十分に対処できる。また、細胞質膜１２および核膜１３を含む２つの境界面に特定の分子プローブが優先的に結合する場合は、これらの境界面の演算を行うことが有用でありうる。さもなければ、これらの膜を３つの異なる分画間の遷移面として特徴づけるだけで十分でありうる。
【００２６】
他の場合において、それぞれゴルジ体および核の如き細胞質および核内の分画を復元するとともに規定し、これらの分画に対して特定の分子標識を配置することが有利でありうる。
【００２７】
細胞の復元切片を組み合わせる、または螺旋立体的に復元することによって、三次元形態および体積情報を生成することができるが、（相対ではなく）絶対体積は、細胞位置の正確な情報に依存する。細胞位置は、流速の関数である。しかし、いくつかの場合において、染色または分子プローブの相対濃度または密度は、ある細胞成分または副核分画には他の分画と比べてどのくらいのプローブが存在するかという診断上の問題に対処するのに十分である。様々な分画における特定のプローブの相対光学密度で測定されるいくつかの分子標識の不適切な分画化でも疾病状態の診断に十分でありうる。サブミクロンの空間分解能によって、標識プローブと、細胞質または核内の特定の細胞成分分画、構造体または細胞器官との関連付けが容易になる。
【００２８】
次に図４を参照すると、本発明の実施形態が意図する、流動細胞１を含む流管２を囲む復元シリンダの例が模式的に示されている。復元シリンダ２０は、例えば、ピッチ角θの所定の螺旋ピッチで配置された点源２１の螺旋２４を含む。各点源２１は、光子２２のビームを生成し、光子２２のビームは典型的には円錐形または扇形である。図４の例に示される点源の配置形態は螺旋状であるが、点源のアレイは、一部に電子の速度、細胞速度、およびセンサ（検出器）において非重複投射信号を達成する構造に応じて、広範囲な幾何学的パターンをとることができる。感知素子２３は、点源からの光を受光するように配置される。
【００２９】
固定光点源２１は、管の周囲に取りつけられた対向検出器２３とともに、細胞１全体を通じて、それが点源を通過するときに多数の投射角をサンプリングすることができる。光源、および減衰透過および／または散乱および／または放射光の放射または読取りまたはその両方のタイミングによって、各検出信号が、流動細胞のｚ方向の軸に沿う特定の既知の位置に符合する。このようにして、放射される、または同期的に検出される光源に垂直な既知の軸に沿う既知の速度で流動する細胞１は、ｘ−ｙ平面の二次元の切片を形成するために復元されうる細胞を通じた投射像によって光学的に区分けすることが可能である。連続的な切片を積層するか、または数学的に組み合わせることによって、細胞の三次元画像が生成されることになる。細胞運動と流れ軸の周囲の光源（または複数の光源）の配置とを組み合わせて、例えば螺旋状に復元されて細胞の三次元画像を作成することができるデータを生成することも可能である。扇形ビーム復元アルゴリズムを用いて線形（１Ｄ）投射像から復元された近隣の平面画像を積層することによって、または円錐形ビーム復元アルゴリズムを用いて平面（２Ｄ）投射像から直接復元を行うことが可能である。細胞の三次元画像は、細胞成分構造体の定量測定値、ならびに診断情報を提供する標識分子プローブの分画化または位置および量を導くことができる。
【００３０】
述べたように、細胞切片または体積における二次元または三次元密度構造を復元するのに細胞切片全体の２つ以上の投射像が必要とされる。従来の切片毎の医学的ｘ線演算トモグラフィでは、患者を固定することによって多数の投射像を作成しながら、Ｘ線源および対向する検出器が円周に沿って移動して、患者を通じて多数の投射角を生成する。同様に、本発明の流動光トモグラフィ・システムは、細胞を毛管の円周に沿って異なる角度で配置された多数の点源を通って所定の速度（Ｖ）で移動させて、細胞が点源を通るときに細胞を通じて多数の投射像を生成する。これらの点源は、細胞を通り、点源に対向するセンサのアレイによって検出される光子を放射する。点源を螺旋２４に沿って有利に配置することができ、あるいは他の適切な幾何学的パターンにおいて、細胞が点源のアレイを通るときに、多数の角度から細胞内の各点をサンプリングするように、毛管の円周上に配置することができる。良好なサンプリング構造としては、これらの点源が、円周の少なくとも１８０度を覆うことができる。より小さい角度被覆率（すなわちサンプリング下の角度）もある場合において実現可能でありうるが、さらなる半径方向被覆によって、精度、および演算された復元の信号対雑音比が向上することになる。構造に応じて、円錐形ビームまたは扇形ビーム画像復元に対して従来の解析的、反復的または統計的アルゴリズムを適用するのが有益でありうる。（例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐ．、「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｂｊｅｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：１０５−１７、１９７２、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｂ．Ｅ．、「Ｍｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ３  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＮＳ−２１：７２−７、１９７４、Ｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｒ、Ｇｒｕｎｂａｕｍ、Ｆ．Ａ．、Ｋｏｈｎ，Ｐ．、ａｎｄ  Ｚｕｂｅｌｌｉ，Ｊ．Ｐ．、「Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｏｆ  Ｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８（４９５８）；９９０−３、１９９０、Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙａｇｅ，Ｒ．、「Ｒａｐｉｄ  ３−Ｄ  Ｃｏｎｅ−ｂｅａｍ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＡＲＴ）Ｕｓｉｎｇ  ２−Ｄ  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｈａｒｄｗａｒｅ」、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  １９（１２）：１２２７−３７，２００１．を参照のこと）。関連方法としては、ＡＲＴ（Ｂｅｌｌｍａｎ，Ｓ．Ｈ．、Ｂｅｎｄｅｒ，Ｒ．、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．、ａｎｄ  Ｒｏｗｅ，Ｊ．Ｅ．、「ＡＲＴ  ｉｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｂｅｉｎｇ  Ａ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  ｏｆ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔ��ｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３２：２０５−１６、１９７１に記載されている代数的復元法）、ＳＩＲＴ（例えばＧｉｌｂｅｒｔ，ｉｄ．＃１４９３に記載されている同時反復復元法）、ＭＬ―ＥＭ（例えばＭａｎｇｌｏｓ，Ｓ．Ｈ．、Ｊａｓｚｃａｋ，Ｒ．Ｊ．、ａｎｄ  Ｆｌｏｙｄ，Ｃ．Ｅ．、「Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｅ  Ｂｅａｍ  ＳＰＥＣＴ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｔｅｓｔｓ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４（１２）：１９４７−５７、１９８９、＃１３８２に記載されている最尤推定極大化）およびＯＳＥＭ（例えばＭａｎｇｌｏｓ，Ｓ．Ｈ．、Ｇａｇｎｅ，Ｇ．Ｍ．、Ｋｒｏｌ  Ａ，Ｔｈｏｍａｓ，Ｆ．Ｄ．、ａｎｄ  Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ，Ｒ．、「Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｓｕｂｓｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｅ  Ｂｅａｍ  ＣＴ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０（７）：１２２５−４１、１９９５、＃４３８９に記載されている順序付け部分集合推定極大化）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３１】
方法
流動細胞計
次に図５を参照すると、本発明の実施形態が意図する流動光トモグラフィ・システム（ＦＯＴ）の例が模式的に示されている。流動光トモグラフィ・システムは、復元シリンダ２０が毛管２のまわりに配置された流動細胞計を含む。光子２５の光源および光子センサ２６がパルス高アナライザ２７と協働して、トリガリング・デバイスとして動作する。パルス高アナライザ２７は、既知の原理に従って動作して、細胞の始端に対する第１のトリガ点２８と、細胞の終端に対する第２のトリガ点２９とを提供する。パルス高アナライザ２７は、各細胞の始端および終端に対応するトリガ信号３０を出力し、トリガ信号は復元シリンダ２０によって受信される。
【００３２】
コンピュータ４０を接続して、信号線４１〜４３により、データ、制御信号およびタイミング信号を点源２１、感知素子２３およびパルス高アナライザ２７に送信する。コンピュータは、既知のコンピュータまたは複数のコンピュータ、ならびに画像取得および画像復元処理に適したアレイ・プロセッサを含むことができる。
【００３３】
市販の流動細胞計は、３つの基本的な流れ構成がある。すなわち、円筒形流管、矩形流管および空気流動システム（Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｈ．Ｍ．、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３ｒｄ  ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５を参照のこと）。流れ機構による半径方向依存性を最小にするために復元アルゴリズムに対する最適な円筒形構造を維持することが重要であるため、好ましい構成は円筒形流管である（図１を参照のこと）。さらに、円筒形流管は、毛管の断面積に対して均一に薄い壁を有することができる。
【００３４】
また、トリガリング・デバイスを復元モジュールの上流に配置して、細胞が復元シリンダに最適に進入し、次いで出るときにデータ収集を開始し、次いで終了させるタイミング信号を提供することができる。トリガリング・デバイスは、有利には、レーザ・ダイオード、ＣＣＤ、ＰＭＴ、光検知器結合体、固体光検知器および前記要素の組合せを含むことができる。トリガリング・デバイスは、流動細胞の存在を感知する閾値設定を有し、したがって、既知の細胞速度とともに用いることで、下流の復元シリンダが対象となるその特定細胞に対するデータ収集を開始できるときを計算することができるトリガ信号を生成する。さらに、復元シリンダに対する細胞の入口および出口に対応する第１のトリガ点と第２のトリガ点との時間間隔を、その間に光源２１を検出し、センサ・アレイ２３を読み出すことによって追加的な投射データを取得できる均等または不均等の間隔に分割することができる。
【００３５】
流速を制御し、正確に測定する必要がある。この機能は、１メートル／秒から１０メートル／秒の範囲の速度を利用する高度な市販のシステムに提供される。最適な細胞速度は、データ収集速度、および後に述べる信号対雑音比の条件によって決定づけられることになる。
【００３６】
復元モジュール
次に図６を参照すると、本発明の実施形態が意図する復元シリンダ２０内の扇形ビーム投射光線の例が模式的に示されている。復元シリンダの目的は、複数の固定された点源２１ａ〜２１ｃから小さな円周に沿って円筒形毛管に光を投射する手段を提供することである。点源から発せられた光子は、扇形または円錐形のような既知の投射構造を有し、毛管を通って、場合によっては対応する点源に対向するより大きな円周に沿って配置された感知素子２３ａ、２３ｂまたは２３Ｃのアレイによって検出される。例示を目的として扇形ビーム徹照に適した曲線形（１Ｄ）センサ・アレイが描かれているが、円錐形ビーム照明に適した直線形（１Ｄ）センサ・アレイまたは平面（２Ｄ）センサ・アレイも同様に採用できることを理解すべきである。このようにして、一組の投射光線を生成することができ、その投射光線を、点源と個々の感知素子を接続する直線として示すことができる。光線３１の如き特定の投射光線に沿って点源から出る光子の数と、特定の感知素子で受光される光子の数との差は、細胞および関連標識分子プローブとの相互作用、ならびに投射光線路に沿う流路の他の内容物により損失または減衰した光子の数に関連づけられる。
【００３７】
しかし、光の散乱、光子エネルギーのシフト、不完全な構造およびコリメーション不良により複雑化し、多数の点源が同時に活性化されるときに、異なる光源からの光子が特定の感知素子に到達する場合もある。例えば、本明細書に記載されている点源およびそれらの対向検出器のパターンに対する構造の適切な選択、ならびに多数の点源の活性化およびセンサ・アレイの読取りの適正なタイミングまたは多重化により復元シリンダを慎重に構成することによって、これらの問題による光子汚染を最小にすることができるが、払拭することはできない。
【００３８】
光子汚染は、例えば細胞が存在しないシステムの較正によって対処できる。すなわち、順番に各光源を照明し、各々のセンサに対するその影響を測定するできることにより、システムの正規化に用いるオフセット・データが提供される。追加的な較正工程は、例えば、その光学密度が把握されており、細胞撮像に対する対象となる密度範囲にあるラテックス・ポリマー・ビーズまたは他の微小球あるいは偏球を撮像することを含むことができる。後に記載するように、検出器においてスペクトル帯域フィルタを使用することによって、蛍光プローブから発せられる光子を点源に由来する光子と区別することができる。
【００３９】
光源
各光源は、好ましくは、以下の同一一般特性を有することができる。
・小さな点源と類似したものとすることができる。
・既知のスペクトル容量で点灯することができる。
・光源から発せられる光子は、円錐形ビームまたは扇形ビームの如き既知の構造を有することができる。
【００４０】
各光源は、１つの投射角に対するデータを作成する。その軸が流管の中心軸である螺旋に沿って配置された複数の光源は、細胞がモジュールを通過するときに、各連続面（または復元切片）にわたる多数の投射角からデータを作成する。センサ構造に応じて、センサにおいて投射が重複しないように、いくつかの点源を同じ円周上に共直線的に配置することが可能である。ある場合にはより小さい角度被覆率が許容されうるが、１８０度の螺旋に沿って等距離に光源を配置することによって良好なサンプリング構造を達成することができ、３６０度を採用して、信号対雑音比を向上することができる。光源の所望の数は、各平面復元（ｘ−ｙ平面）または立体復元内における必要な分解能の関数である。例示のために光源の螺旋配置を用いているが、様々な幾何学的パターンを点源アレイに採用できることを理解すべきである。さらに、光源の波長は、様々なダイオードまたは他のレーザの使用、あるいは白色または他の広帯域光源、例えば水銀またはキセノン・アーク・ランプの帯域フィルタリングによって選択可能である。
【００４１】
次に図７を参照すると、本発明の実施形態が意図する、図６に示される復元シリンダの上面図の例が模式的に示されている。すべての投射像が、時間的に遅れて取得されるが、重複するものとして描かれ、細胞全体が含まれる復元のサークル３２を二次元において構成する光源軌道の投射像において、核１９がページに対して垂直に流れる細胞とともに、第１の点源２１ａおよび第１のセンサ・アレイ２３ａが示されている。第２の点源２１ｂおよび第２のセンサ・アレイ２３ｂは、螺旋のまわりに約３０度で配置されている。第３の点源２１ｃおよび第３のセンサ・アレイ２３ｃは、螺旋のまわりに約９０度で配置されている。
【００４２】
データ収集は、細胞の「濃厚」平面形軸断面内の細胞速度と同期してゲートされる。所望の平面厚さは、ｚ方向における必要な分解能の関数である。典型的には、軸方向（ｚ方向）における分解能は、平面トランス軸方向における分解能より小さくなる。また、その頂部に点源を有し、その底部に感知アレイの幅を有する扇形投射像の重複交差点によって、最良の復元サークルを定めることもできる。復元シリンダの構造は、流動細胞断面が復元サークル内に完全に含まれることを保証することが望ましい。
【００４３】
光学的点源を形成するのに採用できるいくつかの選択肢を以下に記載する。
・レーザまたは他の高強度光子源の前方のピンホール。
・断面が小さい光ファイバ。
・光子源の前方の短焦点長レンズ。
・（ＣＲＴの形態の）蛍光面上の点を照射する電子ビーム。
・上記の様々な組合せ。
【００４４】
その構造は、点源が対象となるオブジェクト（細胞）に近づくほど、より点源に近いオブジェクトによって範囲が定められる幾何学的角度が広くなるため針率が高くなるというものである。逆に、必要な分解能がシステム設計において予め把握されていれば、その特定の分解能に対して構造を最適化できる。背景については、当業者は、Ｂｌａｓｓ，Ｍ．、ｅｄｉｔｏｒ−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃｓ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｖｏｌ．ＩＶ、ＭｃｇｒａｗＨｉｌｌ、２００１を指針とする。
【００４５】
次に図８を参照すると、図８は、本発明の実施形態が意図する細胞復元に使用される直線アレイ２３の例を示す図である。例えば、細胞断面１２および核１９が直径３０ミクロンの復元サークル内に含まれ、所望の分解能が０．５ミクロンであるとすると、ナイキスト・サンプリング（すなわち二倍の過剰サンプリング）では、点源２１毎に少なくとも１２０の感知素子３３が必要とされる。頂部の点源２１および基部の線形アレイ長３４は、例えば、直径３０ミクロンの細胞が、点源２１にできるだけ近くなるように三角形３５内に嵌るように、三角形３５を形成する。本例において、（例えばＣＣＤ）アレイの各要素が２０ミクロン幅で、アレイ長が２４００ミクロンであれば、点源と線形アレイの距離が８ミリメートルであるときに、細胞の中心が、点源から約１００ミクロン（毛管の直径の半分）のところに位置して、８０倍の倍率を与えることができる。
【００４６】
第２の例として、直径３０ミクロンの復元サークル、およびピクセル要素のサイズが４ミクロンである相補的な金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）感知アレイを考えてみる。この場合、アレイは、４８０ミクロンの幅に対して１２０の要素を含み、点源と細胞の距離が１００ミクロンのときに点源から１．６ｍｍのところに配置して、１６倍の倍率を与えることができる。
【００４７】
感知素子
各点源は、復元サークルを通じて伝達される光子光線を受光する、点源に対向する直線または曲線の幾何学的配置のＣＣＤの如き対応する感知要素のアレイを有するものとする。典型的には、線形アレイは、点源と中心流れ軸の間の線を中心とした感知素子のアレイを有することができ、流れ軸に対して垂直に整列することができる。二次元アレイ内の各ラインの素子の部分集合のみが復元入力に対して読み取られる二次元アレイを使用することが可能である。二次元アレイにおいて、連続する各々の素子の部分集合を適切な数の素子によってジグザグ配置させて、点源の螺旋配置に沿って各々の異なる点源と適正に整列させることができる。
【００４８】
扇形１つ当たり１２０の感知素子を有する３０ミクロンの復元サークルの例を用いて、０．５ミクロンの分解能を得る切片毎の扇形ビーム復元では、１半径度の間隔で配置された１３６の点源を感知し、連続画像間の平均オフセットが３００ミクロンで、それが１５の感知素子に相当する場合は、２０００×２０００の２０ミクロン素子を有する二次元アレイで十分である。（アレイの中心では、オフセットは１４０ミクロン、または７素子であるのに対して、アレイの先端では、画像間の１半径度の広がりは極めて大きなオフセットを伴う）。１５列のセンサ・アレイのグループを平均化して、１つの切片に対して投射データを提供したとすると、細胞画像内のｚ分解能は３．７５ミクロンになるのに対して、各投射像毎に２列を平均化したとすると、オブジェクト空間の軸分解能は０．５ミクロンで、トランス軸分解能に相当することになる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、復元シリンダと同軸であってもよい円筒の円周に沿って二次元アレイを湾曲させるため、光線路の長さがすべて等しくなる。３０ミクロンの復元サークルの場合については、点源の螺旋部位に対向することが必要とされる素子のみを有した曲線の二次元アレイを、上記の例の１３６の素子の高さ（長さ）にある倍数を乗じた螺旋帯の１２０の素子幅とすることができる。
【００５０】
上記例示を目的として平面または「濃厚」扇形照明について説明したが、円錐形ビームアルゴリズムを用いた三次元復元を考慮して、真の非コリメーション円錐形ビーム照明を二次元平面検出器と併用して採用できることを理解すべきである。二次元投射像を直接解析して、例えば、疾病状態または細胞の転移状態についての情報を得ることができる。直接的な立体円錐形ビーム復元では、点源および検出器の幾何学的配置が与えられた場合に、異なる点源からの円錐形の照明がセンサ・アレイ上で重複しないように、複数の点源による照明を多重化する。
【００５１】
さらに、細胞が１メートル／秒（または１００００００ミクロン／秒）の速度で流動し、二次元アレイにおける各素子が２０ミクロン幅であるとすると、２０マイクロ秒毎に読み出されるラインは、０．２５ミクロンの切片の細胞内のデータを容易に取り込むことができる。１５のセンサ列を平均化して、３．７５ミクロンの切片に対するデータを提供する場合については、３００マイクロ秒毎に読出しが行われることになる。より大きい二次元アレイを使用すると、復元画像の質が著しく向上する。
【００５２】
いくつかの透過または放射波長帯域のマルチスペクトル撮像に特に適した本発明の一実施形態は、有利には、直列配置された２つ以上の復元モジュールを含むことができる。当該多重復元シリンダを毛管の介在部で隔てることができ、各モジュールは、そこを流れるオブジェクトの完全な復元画像を生成するのに適した投射データを提供する。いくつかの復元モジュールの各々に対する点源および／またはセンサ・アレイを特定のスペクトル帯域に対して最適化することができる。例えば、第１の復元モジュールは、オブジェクトの光学密度、吸収または散乱係数のマップを復元するための完全投射データ群を提供するために高輝度の白色光照明および非濾過検出を採用することができ、第２の復元モジュールは、後に記載するように、放射復元アルゴリズムを用いることにより、標示タンパク質の濃度分布をマッピングするのに十分な第２の完全投射データ群を提供するために、５２０ｎｍの放射線に敏感な濾過センサ・アレイと併用して免疫蛍光試験用蛍光プローブ標示タンパク質を励起する、４９５ｎｍ付近に集中する狭スペクトル帯域のアルゴン−イオン・レーザ（４８８ｎｍ）の如き照明を採用することができる。また、第３の復元モジュールは、化学量論的にＤＮＡに結合するヨウ化プロピジウムを励起する、５３５および／または３４２ｎｍ付近に集中する狭帯域照明、および倍数性の試験のための赤色（６１７ｎｍ）放射線を最適に検出するための濾過センサ・アレイを使用することができる。前述の例は例示を目的としたものであること、また該方法は照明および感知のためのあらゆる波長の組合せに広く適用されることが理解されるであろう。
【００５３】
画像復元
濾過逆投射法として知られる最も一般的で、容易に具現化される復元アルゴリズムは、円錐形ビームおよび扇形ビーム構造を使用するコンピュータ化されたＸ線トモグラフィ（ＣＴ）における同様のパラダイムから導かれる。（以下の参考文献、例えば、Ｋａｋ，Ａ．Ｃ，ａｎｄ  Ｓｌａｎｅｙ，Ｍ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ、ＩＥＥＥ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８、およびＨｅｒｍａｎ，Ｇ．、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０を参照のこと）。これらの方法は、光源／検出器構成および照射ビームにおける光線路の特定の構造を反映する改造を伴うラドン変換の定理に基づくものである。しかし、臨床Ｘ線ＣＴの場合は、切片毎の取得については、ヒト対象を通常固定しながら、Ｘ線源および検出器アレイを患者の周囲のアークに沿って移動させて、所定の切片内の多数の投射角からのデータを収集することができる。次いで、ヒト対象をｚ軸に沿って再配置し、他のデータの収集等を行う。あるいは、より近代的な臨床螺旋ＣＴでは、患者をｚ軸に連続的に並行移動させながら、光源−検出器組立品を連続的に回転させて、螺旋投射データを提供し、次いでそれを補間して、患者のｚ軸に直交する投射像を提供する。流動光トモグラフィでは、固定した光源および検出器アレイと相対的に一定速度で対象（細胞）を移動させ、複数の光源／検出システムは、所定の切片または体積内に多数の投射角データを生成するように、細胞速度ベクトルに沿う特定のゲート時点と同期してデータを取得する。切片毎のスキャニングについては、復元アルゴリズムは、運動の軸に垂直な平面の二次元画像を演算し、多数の切片の連続的な積層により、対象の三次元画像を生成し、コントラストは、それぞれＣＴまたは流動光トモグラフィに対する対象内のＸ線減衰係数または光学密度の変動の関数になる。立体的な円錐形ビームスキャニングについては、復元アルゴリズムは、細胞または他のオブジェクト内の体積の三次元画像を、平面透過または放射光投射像から直接演算し、コントラストは、撮像オブジェクト内のそれぞれ光学密度および／または蛍光標識プローブ密度分布の関数になる。
【００５４】
透過データが細胞密度復元を生成するか、または放射データが蛍光標識プローブ分布を復元する、あるいは両者が濾過逆放射以外の画像復元アルゴリズムを採用するのが望ましいといえる。反復的復元アルゴリズムとして知られる一般的なクラスは、特に放射トモグラフィに対して、またはオブジェクトの軸対称性および三分画性が把握されている現行の発明の場合のように、優先情報を復元アルゴリズムに組み込んで、復元の質を向上させることが可能なときに、いくつかの場合においてより効果的である（例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐ．、「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｂｊｅｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：１０５−１７、１９７２、および上記の他の参考文献を参照のこと）。
【００５５】
同様に、１つの方法は、有利には、有限要素モデリング（ＦＥＭ）ベースの統計的復元アルゴリズムを用いることができる。ＦＥＭアルゴリズムは、要素のすべての境界において光子拡散／移動方程式を解いて、撮像オブジェクトの吸収、散乱、屈折率および異方性因子特性の組合せの二次元または三次元マップを生成する線形輸送理論から導かれる。当該方法の例は、Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｋ．Ｄ．ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ，Ｈ．、「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｆｉｎｉｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２２（６９１−７０１）１９９５、Ｈａｍｐｅｌ，Ｕ．ａｎｄ  Ｆｒｅｙｅｒ，Ｒ．、「Ｆａｓｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉａｌｌｙ  Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２５（１）：９２−１０１、１９９８、およびＪｉａｎｇ，Ｈ．，Ｐａｕｌｓｅｎ，Ｋ．Ｄ．ａｎｄ  Ｏｓｔｅｒｂｅｒｇ，Ｕ．Ｌ．、「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ  Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｈｏｔｏ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ  Ｐｈａｎｔｏｍｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２５（２）：１８３−９３、１９９８に教示されている。
【００５６】
色分離
多色点源（例えば白色光）を使用する場合は、異なる色の染色剤（例えば発色団）を利用して、所定の細胞内のいくつかの分子プローブと構造特徴とを区別することができる。ここでは、光源または感知アレイ（または両方）における直列帯域フィルタは、波長データを分離し、個別に染色された分子の復元および空間配置を可能にする。多数のプローブを撮像するためのより確実な方法は、高輝度の白色光源、およびセンサ・アレイにおける多数の濾過帯域幅の同時収集を用いて、画像復元アルゴリズムが、発色団毎に空間画像切片を演算することを可能にする。これらは、カラー画像として表示されうる。
【００５７】
蛍光、燐光、化学発光およびナノ粒子放射
光トモグラフィ・システムの特殊な場合として、光子の一次光源で刺激されると異なる（より長い）波長の光を発する「レポータ」で特定の分子プローブを標識することができる。レポータからの二次放射線を標準的な光学フィルタで濾過して、二次放射光子から一次光源光子を分離することができる。しかし、二次光子は、点源からの直接的な光線経路で生じるとは限らないため、二次放射光子画像復元アルゴリズムがさらに複雑になる。二次光子が均一な球状パターンで二次点源から放射すると仮定すると、任意の感知素子に到達する二次光子の強度は、感知素子までの距離の単純な関数になる。さらに改良すると、点源と相対的で、復元切片内の二次光子の空間分布のモデルを提供することによって、二次光源からの光子の非球状分布に対処できる。いずれの方法も、復元切片または体積における二次光源の位置を計算する手段を提供することになる。撮像オブジェクトと検出器アレイの間のコリメーションによって画像復元が改善されることになる。
【００５８】
一次光子強度および二次光子強度を光学的濾過によって同時に測定する場合は、局所的なプローブ集合に沿う画像形態を単一の復元画像で得られるように、一次光子強度からの高分解能密度復元を二次光源復元に重畳または融合させることができる。強度、信号対雑音比、ならびに光源および／またはセンサにおいて狭帯域幅の光子を濾過または生成する能力に応じて、それぞれ異なる標識分子プローブに対応する多数の二次光源を利用するのが有利であるといえる。
【００５９】
上述したように、本発明は、患者から得た細胞の光放射およびトモグラフィック復元から、分子プローブで特異的に染色または標示した分子標識を自動的に検出、分画化するためのシステムである。不適切な分子標識発現および／または分画化の存否により、患者が悪性腫瘍癌を有するかどうかを判断できる。
【００６０】
次に図９を参照すると、本発明の実施形態が意図する細胞復元データによる分類方法の例が模式的に示されている。そのシステムは、特定の細胞サンプルが対象となる細胞を含むかどうか、ならびにこれらの細胞が疾病に関連する不適切な分子標識発現および／または分画化を示すかどうかを判断するために協働できるいくつかの選別器を含むことができる。選別器は、特定の特徴値９１に基づいてオブジェクトを解析するコンピュータ・プログラムである。本発明の自動選別器システムは、例えば、基本的な選別機能を果たし、対象となるオブジェクトを選択する一次選別器９０を含むことができる。二次選別器９２は、細胞オブジェクトを形態学的に異常または形態学的に正常、ならびに疾病に関連する不適切な分子標識発現および／または分画化を有するもの、または正常で、疾病に関連する不適切な分子標識発現および／または分画化を示さないものに分類する。選別器のいずれか１つまたはすべての分類結果を詳細に示すレポート９３を提供することができる。用途に応じて、多くの、かつ様々な選別器を採用できることが理解されるであろう。
【００６１】
上述したように、本発明の自動システムは、一次および二次選別器を含むことができるが、単一の選別器を使用して、本発明によって達成される分類を連続的に得ることができる。統計的手法に基づく分類機能を生成するのに使用されるソフトウェア・パッケージが広く市販されている。
【００６２】
本発明の自動選別器は、その分類機能を果たす上で、分子標識特徴に基づくファジイ・バイナリ決定またはベイズの統計的決定を利用する選別器を含むのが好ましい。該選別器は、例えば分子標識分画化特徴、形態的特徴、分光特徴、個別構造特徴、マルコフ構造特徴、非マルコフ構造特徴、フラクタル構造特徴および連長構造特徴を含む数多くの特徴値を含むように構成されうる。
【００６３】
一次選別器は、典型的には、対象となるオブジェクトを３つのクラス、すなわち（１）疾病に関連する分子標識およびそれらの分画化を含む診断情報を含む細胞、（２）炎症細胞、ならびに（３）人為要素に分類するように機能することができる。一次選別器は、特徴値の選択を取り入れたバイナリ決定木による細胞毎の分類に影響することができる。
【００６４】
上記のように、細胞および細胞核を人為要素から区別し、疾病に関連する分子標識分画化を有する細胞を他の正常細胞から区別する本発明のシステムの能力は、演算した特徴の値に基づいて区別を行う選別器の能力に依存する。例えば、正常細胞を異常細胞（すなわち診断細胞）から区別するために、本発明は、それぞれが、特定のタイプのオブジェクト、ならびに分子標識発現および／または分画化の特定の変化を識別するようになされたいくつかの異なる判別機能を適用することができる。
【００６５】
二次選別器は、一次選別器によって選択された細胞サンプル中の細胞を分類するとともに、分類機能を果たす上で、バイナリ決定木および特徴値を使用する。サンプル毎に選別器と見なすことができる二次選別器は、一次選別器によって分類された細胞を解析し、サンプルを癌に関連する特徴を有するもの、または癌に関連する特徴を有さないものとして分類する。一次選別器と同様に、二次選別器は、一連の好ましい分子標識分画化に基づいて細胞を区別するように構成される。
【００６６】
選別器は、少なくとも１つの判別機能を含むことができ、該判別機能は、分子標識発現および分画化、ならびに面積、平均半径、光学密度（ＯＤ）変動、ＯＤ歪み、ＯＤレンジ、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、光点の密度、高平均距離、中／高平均距離、相関性、均一性、エントロピ、フラクタル寸法、構造、窪み、接続成分、最近接解析、および空間密度周波数空間における様々な高調波よりなる群から選択される特徴を含むが、それらに限定されない射影からの特徴を用いて、サンプル中の対象細胞を分類する。
【００６７】
次に図１０を参照すると、分子プローブの分画化を決定するための例示的な方法が模式的に示されている。第１の工程９４において、特徴を投射像または三次元復元画像から抽出する。工程９５では、例えば、既知の縁確認技術を用いて、対象となるオブジェクト内の縁、境界、辺縁、領域、表面および体積を識別する。特徴を投射像または三次元復元画像から抽出した後に、上記図９で説明した分類システムの下で達成できるように、工程９６において特徴を用いて、対象となるオブジェクトを確認する。工程９７において、対象となるオブジェクトを決定すると、工程９８において、対象となるオブジェクトに関連する分子プローブ密度をそのプローブ分画化の尺度として対応するオブジェクトに対してマッピングする。例えば、対象となるオブジェクトＸに関連するプローブＡの濃度は、そのオブジェクトに関連する目標分子の濃度の尺度になるため、細胞内の目標の分画化となる。
【００６８】
次に図１１を参照すると、対象となりうる分画の例が模式的に示されている。最も単純な場合では、細胞１を２つの分画、すなわち細胞質分画１８と核分画１９とに分割することができる。細胞の細胞質または核分画内で分子標識を分画することができる。他の例では、細胞質分画をミトコンドリア、小胞体およびリソソームの如き他の分画にさらに分割することができる。さらに他の例では、核小体の如き細胞器官を核分画内の分画と定義することができる。さらに他の例では、濃縮染色体３６の如き過渡的な構造体を分画と定義することができる。細胞内空間に位置することができる任意の分子構造体を分画と定義できることを当業者なら認識するであろう。
【００６９】
次に図１２を参照すると、悪性腫瘍および／または癌を含む疾病に関連する分子標識分画化を伴う細胞を検出するための方法の構成図が模式的に示されている。
【００７０】
該方法は、
工程１００において、複数の細胞を有する細胞サンプルを取得し、複数の細胞を溶液に懸濁すること、
必要な場合は、工程１０２において、細胞サンプルの複数の細胞を固定すること、
工程１０３において、複数の細胞における少なくとも１つの分子標識を標識分子プローブまたは染色剤で標示すること、
工程１０４において、複数の細胞の少なくとも１つの細胞を少なくとも１つの光の点源で照明すること、
工程１０５において、デジタル・アレイ検出器により、少なくとも１つの細胞全体の少なくとも２つの異なる投射像を取得すること、
工程１０６において、少なくとも２つの投射像を照明のばらつきに対して補償すること、
工程１０７において、少なくとも２つの投射像を解析して、密度および位置特徴を有する少なくとも１つの標示分子標識を検出すること、
工程１０８において、少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの分子標識の位置を解析すること、
工程１０９において、密度および位置特徴を用いることによって、少なくとも１つの標示分子標識の分画化を測定すること、および
工程１１０において、悪性腫瘍および／または疾病関連分子標識分画化を検出するために、少なくとも１つの選別器により少なくとも１つの標示分子標識の分画化を解析することを含む。
【００７１】
一実施形態において、従来の光および画像処理技術を用いて、少なくとも２つの投射像を照明のばらつきに対して補償する工程１０６を遂行することができる。工程１０７において、少なくとも２つの投射像を解析して、密度および位置特徴を有する少なくとも１つの標示分子標識を検出することは、その教示内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００３年２月１１日に発行され、「ＯＰＴＩＣＡＬ  ＰＲＯＪＥＣＴＩＯＮ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＡＵＴＯＭＡＴＩＣＡＬＬＹ  ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ  ＣＥＬＬＳ  ＨＡＶＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＡＲ  ＡＮＤ  ＣＹＴＯＰＬＡＳＭＩＣ  ＤＥＮＳＩＴＯＭＥＴＲＩＣ  ＦＥＡＴＵＲＥＳ  ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＷＩＴＨ  ＤＩＳＥＡＳＥ」という名称の米国特許第６，５１９，３３５号（Ａｌａｎ  Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ）に記載されている技術を用いて実施されうる。
【００７２】
工程１０８において、少なくとも１つの細胞内の少なくとも１つの分子標識の位置を解析することは、その教示内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００２年５月１３日に出願され、「ＭＥＴＨＯＤ  ＡＮＤ  ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  ＦＯＲ  ＥＭＩＳＳＩＯＮ  ＣＯＭＰＵＴＥＤ  ＴＯＭＯＧＲＡＰＨＹ  ＵＳＩＮＧ  ＴＥＭＰＯＲＡＬ  ＳＩＧＮＡＴＵＲＥＳ」という名称の米国同時係属出願第１０／１４７，１５４号（Ａｌａｎ  Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎ）に記載されている技術を用いて実施されうる。
【００７３】
工程１０９において、分画化を測定することは、有利には、少なくとも２つの投射像内に位置する一致した境界面内に位置する少なくとも１つの標示分子標識によって形成された密度特徴の構造を解析することを含むことができる。さらに、分画化を測定する工程は、有利には、少なくとも２つの投射像内の境界面を比較して、少なくとも２つの画像の間の一致した境界面の組を決定することを含むことができる。さらに、分画化を測定する工程は、有利には、復元三次元空間における少なくとも２つの標示標識の共存を判断することを含むことができる。さらに、分画化を測定する工程は、有利には、二次元空間における２つの標示標識の共存を判断することを含むことができる。さらに、分画化を測定する工程は、有利には、例えば前述の米国出願第１０／１４７，１５４号（Ｎｅｌｓｏｎ）の技術を用いて、互いに関係する少なくとも２つの標示標識の密度特徴の構造を解析することを含むことができる。
【００７４】
好ましい実施形態において、分画は、ＦＯＴによって区別される細胞内の境界を有する任意の三次元空間であってもよい。細胞サンプルはヒトの肺の検体、ヒトの頸部の検体または血液検体であってもよく、あるいは微量細胞を含んでいてもよい。一例において、分子標識分画化を識別するためのサンプルの染色は、細胞と抗ｐＲｂ抗体とを反応させることを含む。他の例において、メチルＣｐＧに特有の結合タンパク質を使用して、メチル化ＤＮＡを染色することができる。
【００７５】
本発明のシステムは、様々な種類の生体細胞を解析するのに有用である。一例において、対象となる細胞を癌の特徴を示す細胞に選択することができ、かつ／または対象となる細胞を有利には前侵襲癌細胞とすることができる。対象となる細胞は侵襲癌細胞を含むことができ、対象となる細胞は癌に対して患者の選別検査を行うのに利用する。対象となる細胞は、患者に癌が発生するかどうかを判断するのにも利用されうる。癌細胞は上皮癌から派生しうる。あるいは、またはそれに加えて、前侵襲癌細胞は上皮由来の細胞でありうる。有利には、肺および喉頭癌、子宮頸癌および卵巣癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、皮膚癌ならびに胃腸管の癌よりなる群から上皮癌を選択できる。
【００７６】
他の実施形態において、肺癌の個人から採取した多数の痰サンプルにおけるｐＲｂ、ｐ５３／５３ＢＰ１、ＳＡＭ６８、ＰＴＥＮ、Ｅ２Ｆおよびｃ−ｍｙｃを含むが、それらに限定されない標識の分画化を測定し、正常な個人におけるこれらの分子標識の分画化を比較して、どの分子標識がこれら２つのグループ間で区別可能な分画化を有するかを判断することによって、疾病関連分子標識区画化を決定する。同じ方法で他の分子標識を疾病関連区画化に対して選別することもできる。
【００７７】
ここでは、特許法を遵守するとともに、本発明の新規の原理を応用し、必要とされる例示的かつ特殊な構成要素を構成し使用するために必要な情報を当業者に提供するために、本発明を極めて詳細に説明した。しかし、本発明を具体的に異なる設備、デバイスおよび復元アルゴリズムによって実施できること、ならびに本発明の真の主旨および範囲を逸脱することなく設備詳細および動作手順の両方に関する様々な改造を行うことができることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の実施形態が意図する流動細胞診断システムの例を模式的に示す図である。
【図２】本発明の実施形態が意図する単一細胞に対する流動過程の例を模式的に示す図である。
【図３】本発明の実施形態が意図する復元の細胞および断面の例を模式的に示す図である。
【図４】本発明の実施形態が意図する復元シリンダの例を模式的に示す図である。
【図５】本発明の実施形態が意図する流動光トモグラフィ（ＦＯＴ）システムの例を模式的に示す図である。
【図６】本発明の実施形態が意図する復元シリンダ内の投射光線の例を模式的に示す図である。
【図７】本発明の実施形態が意図する復元シリンダの上面図の例を模式的に示す図である。
【図８】本発明の実施形態が意図する細胞復元に使用される光源／線形アレイ構成の構造の例を模式的に示す図である。
【図９】本発明の実施形態が意図する投射像およびトモグラフィック復元からの標識定量および分画化の解析に用いられる分類方法の例を模式的に示す図である。
【図１０】本発明の実施形態が意図する分子プローブの分画化の過程の例を模式的に示す図である。
【図１１】細胞内の分画の例を模式的に示す図である。
【図１２】悪性腫瘍および／または癌を含む疾病に関連する分子標識分画化による細胞の検出方法の構成図を模式的に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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