(57)【要約】非荷電小胞形成脂質からなり、所望により５モル％以下の荷電小胞形成脂質を含むリポソームを含んでなる非経口投与用医薬組成物であって、該リポソームが約４０〜２００ｎｍの範囲内で選択された平均粒径を有し、かつ、炎症性疾患の部位特異的治療のための水溶性コルチコステロイドを含有するものである、組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非荷電小胞形成脂質からなり、所望により５モル％以下の荷電小胞形成脂質を含むリポソームを含んでなる非経口投与用医薬組成物であって、
前記リポソームが、約４０〜２００ｎｍの範囲内で選択された平均粒径を有し、かつ、炎症性疾患の部位特異的治療のためのコルチコステロイドを含有するものであり、該コルチコステロイドが水溶性の形態で存在する、組成物。
【請求項２】
前記コルチコステロイドが、全身投与されるコルチコステロイドからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記全身投与されるコルチコステロイドが、プレドニゾロン、デキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロンからなる群から選択されるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記コルチコステロイドが、局所適用されるコルチコステロイドからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記局所適用されるコルチコステロイドが、ブデゾニド、フルニソリドおよびプロピオン酸フルチカゾンからなる群から選択されるものである、請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、非荷電小胞形成脂質からなり、所望により５モル％以下の荷電小胞形成脂質を含むリポソームを含んでなる、非経口投与および特に静脈内投与のための医薬組成物であって、該リポソームが約４０〜２００ｎｍの範囲内で選択された平均粒径を有し、かつ、炎症性疾患の部位特異的治療のためのコルチコステロイドを含有するものである、組成物に関する。
【０００２】
背景技術
リポソームはコロイド状担体粒子の群に属し、水性の空間を封じ込めた１以上の同心の脂質二重層からなる小胞である。大きさ、表面の電荷、脂質組成、二重層の流動性という点で構造上万能であるという理由から、また、ほとんど全ての薬剤を封入できるという理由から、薬剤送達系としてのリポソームの重要性は容易に理解される。しかし、リポソームの静脈注射では、これらは単核食細胞系（ＭＰＳ）によって外来粒子として認識され、循環系から肝臓、脾臓および骨髄などの食細胞の豊富な器官へと迅速に排除される。リポソームの粒径を小さくすることやリポソームの表面電荷を変化させることなど、この作用を低減する可能性がいくつか確認されている。粒子表面でタンパク質吸収を減少させる特異的親水性ポリマー成分をリポソーム表面へ導入することによる、リポソーム表面の修飾に関する開発もある。従って、このようなリポソームは、ＭＰＳの細胞による認識に対して保護され、全身循環中の滞留時間が長くなっている。リポソーム表面の修飾の周知の一例として、リポソーム組成物の調製の際に親水性ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の脂質誘導体を組み込むものがある。通常、このポリマーは、ホスファチジルエタノールアミン誘導体または長鎖脂肪酸の残基である疎水性部分で末端修飾されている。ポリエチレングリコールは、それ自体、どちらかといえば安定したポリマーであり、タンパク質付着を避ける物質であるため、生理条件下で酵素分解または加水分解を受けにくい。血漿半減期を伸ばすことおよび食細胞の豊富な器官への集積を減少させることに関し、ＰＥＧを表面にグラフト化したリポソームについて、種々の動物種および人間への静脈内投与後に望ましい結果が得られている(Storm G., Belliot S. O., Daemen T. and Lasic D. D.: Surface modification of nanoparticles to oppose uptake by the mononuclear phagocyte system in Adv. Drug Delivery Rev. 17, 31-48, (1995); Moghimi S. M., Hunter A. C. and Murray J. C.: Long-circuling and target-specific nanoparticles; theory to practice in Pharmacol. Rev. 53, 283-318, (2001); Boerman O. C., Dams E. T., Oyen W. J. G., Corstens F. H. M. and Storm G.: Radiopharmaceuticals for scintigraphic imaging of infection and inflammation in Inflamm. Res. 50, 55-64, (2001))。ドキソルビシンを含むこのようなリポソーム製剤の販売が認可されている。
【０００３】
その一方で、長期循環する小型リポソームにおいてポリマーポリエチレングリコールを使用することの不利な点がいくつか出てきた。マクロファージおよび皮膚でのＰＥＧグラフト化リポソームの集積には、非生分解性であるがためのいくらかの懸念がある。ＰＥＧ−リポソームを注射すると、２回目で長期循環する特性を失う（クリアランスが速い）ことが見出されている(Dams E. T., Laverman P., Oijen W. J., Storm G., Scherphof G. L., Van der Meer J. W., Corstens F. H. and Boerman O. C.: Accelerated blood clearance and altered biodistribution of repeated injections of sterically stabilized liposomes in J. Pharmacol. Exp. Ther. 292, 1071-1079, (2000))。患者にＰＥＧ−リポソームを用いた最近の研究から、ＰＥＧ−リポソームが急な副作用（顔面紅潮、胸苦しさ、息切れ、血圧の変化）を誘発し得ることが示され、これはＰＥＧ−リポソーム製剤の投与（注入）を停止すると直ちに回復した。最近のデータによれば、副作用の誘発の際に補体を活性化させる役割があることが指摘されている(Szebeni J., Baranyi L., Savay S., Lutz H., Jelezarova E., Bunger R. and Alving C. R.: The role of complement activation in hypersensitivity to Pegylated liposomal doxorubicin (Doxil) in J. Liposome Res. 10, 46-481, (2000))。これまで、ＰＥＧ−リポソームを基にした市販の製剤は水性懸濁液製剤である。一般的なリポソームの水性懸濁液製剤の保存期間はかなり限られており、また、ＰＥＧ−リポソームの場合も同様であることは周知である。このような製剤のビヒクルまたは連続相を除去する技術はいくつか知られており、吹き付け乾燥法、透析濾過法（diafiltration）、回転蒸発法などがあるが、凍結乾燥法が好ましい。近年、テクネチウム−キレート剤ヒドラジノニコチンアミドを含むＰＥＧ−リポソームの保存期間を長期に改善した凍結乾燥法が提唱されているが(Laverman P., van Boerman O. C., Oyen W. J. G., Corstens F. H. M. and Storm G.: Lyophilisation of Tc-99m-HYNIC labeled PEG-liposomes in J. Liposome Res. 10(2 & 3), page 117-129 (2000))、その効果およびこの技術のリポソーム製剤への適用のためには、さらなる研究が必要である。
【０００４】
長期循環する小型リポソームは、ＰＥＧ−リポソームのように、電荷を持たないかまたは僅かに負の電荷を持つ小胞形成脂質を含み、静脈内投与の後は全身循環ほど多くない量で何時間も循環することができる。従って、前記小型リポソームは、理論的には、炎症域に共通する血管への透過性の高まった部位において、溢血によって比較的大量の抗炎症薬を送達することができる。このようなリポソームは、炎症性疾患、例えば関節の炎症および進行性の軟骨破壊を起こす慢性の自己免疫疾患である慢性関節リウマチの治療において特に注目される。何種類かの抗リウマチ薬が使用できるが、重篤な持続性滑膜炎および急性増悪の治療には、高用量のグルココルチコイドを含む数回の静脈注射を必要とする場合がある。全身に投与されたコルチコステロイドは疾病の症状を抑制できるが、副作用のためにその使用は限られる。さらに、グルココルチコイドは好ましくない薬物動態学的挙動を示す。すなわち、血漿半減期が短く、分布容積が大きいため、所望の作用部位で治療上有効な薬剤濃度に達するためには高用量での投与および反復投与が必要とされる。グルココルチコイドの（局所での）有効性を高めるため、また、全身の副作用を減少させるために、患部関節へのステロイドの関節内注射がしばしば用いられるが、この投与方法は患者にとってあまり快適なものではなく、複数の小さな関節が罹患している場合には適していない。また、無痛性の関節破壊の発生の多くの場合は、グルココルチコイドの関節内への反復注射に関連している可能性がある。欧州特許第０６６２８２０号公報によれば、ＰＥＧを含有するリポソーム中での捕捉に好ましい化合物は、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、パラメタゾン、１１−フルドコルチゾル、トリアムシノロン、ベタメタゾンおよびデキサメタゾンなどのステロイド性の抗炎症化合物とされている。列挙されたステロイド類は全身に投与されるステロイドの群に属する。しかし、これらのグルココルチコイドを含む、長期循環するリポソームの実施例は記載されていない。グルココルチコイドを含有するＰＥＧ−リポソームの唯一の実施例、すなわち実施例１２は、二プロピオン酸ベクロメタゾンを含有するＰＥＧ−リポソーム製剤に関するものである。欧州特許第０６６２８２０号公報中の開示に従ってデキサメタゾンを含有するＰＥＧ−リポソームを調製し、in vivo実験用関節炎モデルでそれを静脈投与する際、本発明者らは、欧州特許第０６６２８２０号公報中で教示される有益な効果が全く見られなかったことに注目した。
【０００５】
グルココルチコイドは炎症性疾患の治療で最も有効な薬剤であることが多いため、非経口投与した後に、また、反復投与後にも、局所作用の増強および延長のために、炎症領域または炎症組織へ有効量のグルココルチコイドをより効率的に送達できるリポソーム組成物の実現が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、非荷電小胞形成脂質からなり、所望により５モル％以下の荷電小胞形成脂質を含むリポソームを含んでなる非経口投与用医薬組成物であって、該リポソームが約４０〜２００ｎｍの範囲内で選択された平均粒径を有し、かつ、炎症性疾患の部位特異的治療のための水溶性コルチコステロイドを含有するものである、組成物を提供することにある。
【発明の具体的説明】
【０００７】
今般、非荷電小胞形成脂質からなり、所望により５モル％以下の荷電小胞形成脂質を含み、かつ約４０〜２００ｎｍの範囲内で選択された平均粒径を有する長期循環リポソームに、水溶性の形態のコルチコステロイドを組み込むことにより、該リポソームを含んでなる医薬組成物の一回の静脈内注射後における炎症組織でのコルチコステロイドの局在性の向上および滞留性の改善を達成することができ、また、その結果として、ラットアジュバント関節炎モデルにおいて足の炎症を顕著に回復できることが見出された。
【０００８】
本発明による長期循環リポソームの循環半減期は少なくとも６時間である。この循環半減期は、対数的なリポソームのクリアランスプロフィールの２度目の直線相が初期濃度（ｔ＝０での外挿血漿濃度）の５０％に達する時点と定義される。
【０００９】
リポソームの粒径は直径５０〜１１０ｎｍの間が好ましい。
【００１０】
本発明による水溶性コルチコステロイドは、水、または生理的な値、例えば１５〜２５℃の温度でｐＨ＞６．０、で緩衝化された水において評価した場合に、１０分の１（ｗ／ｖ）以上（1 in <10 (w/v)）で溶解する化合物である。
【００１１】
本発明に従って有利に用いることのできる水溶性のコルチコステロイドは、遊離ヒドロキシル基、ならびに（Ｃ２−Ｃ１２）脂肪族飽和および不飽和ジカルボン酸などの有機酸、ならびにリン酸および硫酸などの無機酸を有する、コルチコステロイドから調製したアルカリ金属塩およびアンモニウム塩である。コルチコステロイドの酸付加塩もまた、長期循環するリポソーム中に有利に封入することができる。コルチコステロイド分子中の１を超える基が塩の形成に利用可能ならば、一塩および二塩が有用となろう。アルカリ金属塩としては、カリウム塩およびナトリウム塩が好ましい。その他の正または負の電荷を持つコルチコステロイドの誘導体を用いてもよい。水溶性コルチコステロイドの具体例としては、リン酸ベタメタゾンナトリウム、リン酸デソニドナトリウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸コルチゾンナトリウム、コハク酸コルチゾンナトリウム、リン酸メチルプレドニゾロン二ナトリウム（methylprednisolone disodium phosphate）、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、リン酸メチルプレドニゾン二ナトリウム（methylprednisone disodium phosphate）、コハク酸メチルプレドニゾンナトリウム、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、リン酸プレドニゾンナトリウム、コハク酸プレドニゾンナトリウム、塩酸プレドニゾロン（prednisolamate hydrochloride）、リン酸トリアムシノロンアセトニド二ナトリウム（triamcinolone acetonide disodium phosphate）およびリン酸トリアムシノロンアセトニド二カリウム（triamcinolone acetonide dipotassium phosphate）がある。
【００１２】
上述のコルチコステロイド類は、通常、抗炎症疾患および疾病の全身治療に使用される。特殊な小さい平均粒径の長期循環リポソーム中において水溶性の形態のコルチコステロイドを使用することにより、全身投与による関節炎部位への薬剤の有効なターゲティングが生じることはすでに分かっているため、本発明は、種々の理由から通常局所用途に用いられるコルチコステロイドへ有利に適用することができる。このようなコルチコステロイドとしては、例えば、二プロピオン酸アルクロメタゾン、アムシノニド、モノプロピオン酸ベクロメタゾン、１７−吉草酸ベタメタゾン、シクロメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾン、プロピオン酸デプロドン、デソニド、デソキシメタゾン、酢酸デキサメタゾン、吉草酸ジフルコルトロン、ジフロラゾンジアセテート、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、酢酸フルオシノロンアセトニド、フルオシオニド、ピバル酸フルオコルトロン、酢酸フルオロメトロン、酢酸フルプレドニデン、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、メドリゾン、酢酸メチルプレドニゾロン、フランカルボン酸モメタゾン、酢酸パラメタゾン、プレドニカルベート、酢酸プレドニゾロン、プレドニリデン、リメキソロン、ピバリン酸チクソコルトールおよびトリアムシノロンヘキサアセトニドが挙げられる。特に注目される局所用コルチコステロイドとしては、例えば、ブデソニド、フルニソリドおよびプロピオン酸フルチカゾンがあり、これらは、これらの薬剤が全身循環中で有効になるや否や、迅速で有効なクリアランスを起こす。これらのステロイドを水溶性の形態に調製し、本発明に従って長期循環リポソーム中へ封入することによって、部位特異的薬剤の送達を目的としたこのようなコルチコステロイドの全身投与が可能となり、その結果、全身治療に関連する副作用を避け、速いクリアランスなどのコルチコステロイドに固有の問題を克服することが、今般可能となった。この点でリン酸ブデゾニド二ナトリウムが大いに注目される塩であるものと思われる。
【００１３】
リポソームを形成するのに使用される脂質成分は、リン脂質、スフィンゴ脂質、およびステロールなどの種々の小胞形成脂質から選択してよい。「リン脂質」とは、リポソームを形成することのできる任意の一つのリン脂質またはリン脂質の組み合わせをいう。天然源から得たもの、または部分的または全体的に合成されたもの、あるいは様々な脂質鎖長および不飽和のものをはじめとするホスファチジルコリン（ＰＣ）は、本発明での使用に好適である。好ましいリン脂質は、比較的高い遷移温度を有する二重層を生じるＤＳＰＣ、ＨＳＰＣおよびＤＰＰＣなどの飽和アルキル鎖を含むものである。コレステロールは二重層成分として好ましく、二重層構成要素の最大５０モル％を形成することができる。
【００１４】
これらの基本成分の、例えばスフィンゴミエリンおよびエルゴステロールによる、（完全または部分的な）置換が可能であるものと思われる。リポソーム中に水溶性コルチコステロイドを効果的に封入し、それによりリポソームからの薬剤の漏出を避ける。
【００１５】
本発明によるリポソームは、従来のリポソームの調製に用いられる方法に従って調製することができる。コルチコステロイドを水相へ溶解することにより有効成分をリポソームへ受動的に充填することによって、十分な量の薬剤を封入することができる。しかし、能動的または遠隔での充填が好ましく、この方法でも同様に高い封入効率が実現できる。遠隔充填では、温度感受性のあるコルチコステロイドエステルにより、時間がかかるうえに有害であるおそれのある押出しプロセスを避けることができる。コルチコステロイドの遠隔充填は、ｐＨ勾配を用いて実現することができ、リポソーム内部の錯化剤として酢酸カルシウムの封入を伴う。
【００１６】
ＰＥＧ−リポソームに対する本発明によるリポソームの利点は、高い封入効率およびコルチコステロイドの封入時の優れた薬剤対脂質比である。さらに重要なことには、リポソーム製剤を静脈から注射した場合、本発明によるリポソームでは、補体に関連する急性の副作用が少ないと思われる。
【００１７】
水溶性コルチコステロイドを含有する本発明による長期循環リポソームを一回注射した後に見られる有益な効果は、封入されていない様々な濃度の水溶性コルチコステロイドを反復注射した後に得られる結果と比較して、極めて好ましい。本発明によるリポソームは、ＰＥＧ−リポソームと比較して、薬物動態プロフィールの改善を示した。リン酸デキサメタゾン血漿濃度−時間曲線におけるＡＵＣが増加する一方で、リポソーム化リン酸デキサメタゾンを注射した後の最初の１時間において循環中に見出される遊離デキサメタゾンの量は減少する。
【００１８】
本発明による組成物は、慢性関節リウマチ、変形性関節症、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸症候群、大腸炎、クローン病などの炎症性疾患の、これらに罹患したヒトにおける治療のための薬剤の製造に有利に用いることができる。癌への適用も有用である。
【００１９】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００２０】
参照例
リン酸デキサメタゾンを含有するＰＥＧリポソームの調製
６９４ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）(Lipoid Ludwigshafen)、１９３ｍｇのコレステロール(Sigma Aldrich)および２０６ｍｇのＰＥＧ−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）(Avanti Polar Lipids)を計量し、１００ｍｌ丸底フラスコ中で混合した。脂質を約３０ｍｌのエタノールに溶解した。その後、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ中、減圧下にて４０℃で１時間蒸発乾固させ、その後、窒素ガスで１時間フラッシュした。
【００２１】
１０００ｍｇのリン酸デキサメタゾン二ナトリウム(OPG Nieuwegein)を計量し、１０ｍｌの滅菌水に溶解した。この溶液を乾燥脂質フィルムへ加え、脂質フィルムを完全に水和できるようにガラスビーズの存在下で５分間振盪した。
【００２２】
このリポソーム懸濁液を押出成形機（Avestin，最大容積１５ｍｌ）へ移し、窒素ガスを用い、室温で圧力をかけて、１枚の上部へもう１枚を載せた、孔径がそれぞれ２００および１００ｎｍ、それぞれ１００および５０ｎｍ、ならびにそれぞれ５０および５０ｎｍの２枚のポアフィルターから６回押出した。その後、透析カセット(Slide-A-Lyzer, 10.000MWCO)中、１リットルの滅菌ＰＢＳに対して、２４時間の間に２回リポソーム懸濁液を透析した。
【００２３】
リポソームの平均粒径を光走査法(MalvernZeta-sizer)によって測定すると９３．１±１．２ｎｍであり、多分散性指数は０．０９５±０．０２４であった。リン酸デキサメタゾンの封入効率をＨＰＬＣ法によって測定すると４．８％であった。リン脂質含量を、過塩素酸を用いる脂質破壊によって測定し、続いてリン酸測定を行うと、４０．０μｍｏｌ／ｍｌであった。薬剤の脂質に対する比は０．１２であった。リポソームの懸濁液を窒素雰囲気下で４℃で保存し、約２ヶ月間は安定していることがわかった。
【００２４】
実施例１
リン酸デキサメタゾンを含有するリポソームの調製
７５０ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）(Lipoid Ludwigshafen)および１９３ｍｇのコレステロール(Sigma Aldrich)を計量し、１００ｍｌ丸底フラスコ中で混合した。脂質を約３０ｍｌのエタノールに溶解した。その後、Ｒｏｔａｖａｐｏｒ中、減圧下にて４０℃で１時間蒸発乾固させ、その後、窒素ガスで１時間フラッシュした。
【００２５】
１０００ｍｇのリン酸デキサメタゾン二ナトリウム(OPG Nieuwegein)を計量し、１０ｍｌの滅菌水に溶解した。この溶液を乾燥脂質フィルムへ加え、脂質フィルムを完全に水和できるようにガラスビーズの存在下で５分間振盪した。
【００２６】
このリポソーム懸濁液を押出成形機（Avestin，最大容積１５ｍｌ）へ移し、参照例に記載したように室温で押出した。
【００２７】
このリポソームの平均粒径を参照例に記載したように測定すると、１０２．０±４．３ｎｍであり、多分散性指数は０．１２±０．０５であった。リン酸デキサメタゾンの封入効率は８．４％であった。リン脂質濃度は２６．６μｍｏｌ／ｍｌであった。薬剤の脂質に対する比は０．３２であった。このリポソームの懸濁液を窒素雰囲気下で４℃で保存した。
【００２８】
実施例２
リン酸デキサメタゾンを含有するリポソームの調製
ＤＰＰＣの代わりにジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を主な脂質成分として用いたこと以外は、実施例１を繰り返した。前の実施例に記載したように水和を行ったが、水和プロセス中に懸濁液を繰り返して加熱し、上記に記載の５分間のところを１５分間所要した。水和後、リポソーム分散液を実施例１に記載のように押出したが、この押出しプロセスは６５℃で行った。このリポソームの平均粒径を参照例に記載のように測定すると、１０２．９±０．５ｎｍであり、多分散性指数は０．２６±０．０１５であった。リン酸デキサメタゾンの封入効率は１７．５％であった。リン脂質濃度は５７．５μｍｏｌ／ｍｌであった。薬剤の脂質に対する比は０．３０であった。リポソームの懸濁液を窒素雰囲気下で４℃で保存した。
【００２９】
実施例３
リン酸デキサメタゾンを含有するリポソームの調製
実施例２を繰り返した。１００ｍｇ／ｍｌリン酸デキサメタゾンの代わりに、１０ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌリン酸デキサメタゾン溶液を脂質フィルムの水和に使用した。水和後、リポソーム分散液を実施例２に記載のように６５℃で押出した。孔径５０ｎｍの２枚のフィルターを通して押出した後、このリポソーム分散液を、それぞれ５０および３０ｎｍの孔径の２枚のフィルター、および双方とも３０ｎｍの孔径の２枚のフィルターから６回押出した。このリポソームの平均粒径を参照例に記載のように測定すると、６３．１±０．７ｎｍであり、多分散性指数は０．２０±０．０２１であった。リン酸デキサメタゾンの封入効率は１４．４％であった。リン脂質濃度は６３．２μｍｏｌ／ｍｌであった。薬剤の脂質に対する比は０．１１であった。リポソームの懸濁液を窒素雰囲気下で４℃で保存した。
【００３０】
実施例４
リン酸デキサメタゾンを含有するリポソームの調製
実施例２を繰り返した。７５０ｍｇの代わりに、６９４ｍｇのＤＳＰＣを用いた。さらに、１１２ｍｇの負の電荷を持つジパルミトイルホスファチジルグリセロールを脂質二重層成分として加えた。水和および押出しを実施例２に記載のように行った。リポソームの平均粒径は９５．１±０．９ｎｍであり、多分散性指数は０．１２±０．０１８であった。リン酸デキサメタゾンの封入効率は３．０％であった。リン脂質濃度は３９．０μｍｏｌ／ｍｌであった。薬剤の脂質に対する比は０．０８であった。リポソームの懸濁液を窒素雰囲気下で４℃で保存した。
【００３１】
実施例５
リン酸デキサメタゾンを含有するリポソームの調製
実施例３を繰り返した。７５０ｍｇの代わりに、６９４ｍｇのＤＳＰＣを用いた。さらに、１１２ｍｇの負の電荷を持つジパルミトイルホスファチジルグリセロールを脂質二重層成分として加えた。水和および押出しを実施例３に記載のように行った。リポソームの平均粒径は６５．３±０．５ｎｍであり、多分散性指数は０．１７±０．０２１であった。リン酸デキサメタゾンの封入効率は３．０％であった。リン脂質濃度は５３．８μｍｏｌ／ｍｌであった。薬剤の脂質に対する比は０．０６であった。リポソームの懸濁液を窒素雰囲気下で４℃で保存した。
【００３２】
実施例６
ラットへの一回の静脈内注射後の循環における、リポソームリン酸デキサメタゾンおよび遊離デキサメタゾンの比較動態
雄ラット（Ｌｅｗｉｓ（非近交系、ＳＰＦラット）(Maastricht University, The Netherlands)）に標準のペレット状の実験動物用飼料(Altromin, code VRF1, Lage, Germany)および水道水を自由に摂取させた。１回につき１０ｍｇ／ｋｇのリン酸デキサメタゾンを含むリポソーム製剤の、単一回の静脈内注射を尾静脈から行った。血液サンプルを各ラットの尾静脈から次の時点：投与後１、４、２４および４８時間後、４日後および１週間後に採取した。採取したサンプルの量は１回のサンプリングあたり約５００μｌとした。
【００３３】
サンプル血液をＥＤＴＡを含有する試験管に移し、遠心分離して血漿画分を−８０℃で保存した。リン酸を添加して血漿画分のｐＨを下げた後、２００μｌの血漿サンプルから２ｍｌ酢酸エチルを用いてリン酸デキサメタゾンおよびデキサメタゾン双方の抽出を行った。酢酸エチル画分を窒素下で蒸発させ、抽出物を１５０μｌのエタノール／水（５０／５０）の混合物中で再構成した。これらの溶液を、ｐＨ＝２のアセトニトリル／水（２５／７５）混合物を移動相として用いる、Ｃ１８カラムを備えた逆相ＨＰＬＣ系に移した。検出は、ＵＶ検出器を用いて、２５４ｎｍで行った。
【００３４】
結果を図１および２に示す。
【００３５】
【表１】
2005534663.tif 000002
【００３６】
実施例７
治療有効性の評価
Ｌｅｗｉｓラットを、フロイント不完全アジュバント中の熱失活した結核菌（Mycobacterium tuberculosis）で尾底部の皮下より感作した。感作後９〜１２日で足の炎症が起こり、約２０日後に重篤度が最大に達し、その後徐々に回復した。
【００３７】
疾病の評価は、足の炎症の重篤度を視覚的にスコアリングし（１本の足につき最大４点）、疾病により誘発される体重減少を測定することによって行った。参照例、実施例２および実施例３に従って調製した、１０ｍｇ／ｋｇのリポソームリン酸デキサメタゾンの治療有効性を、対照処理としてのＰＢＳに対して評価した。平均スコアが６を超えたときにラットを処理した（疾病誘発後１４日または１５日）。
【００３８】
炎症プロセスの完全な寛解は、１０ｍｇ／ｋｇのリポソームリン酸デキサメタゾンを単一回投与した後３日以内に認められた。３種類の製剤のいずれもが、疾患モデルにおいて同じ治療効率をもたらした（結果は図３に表示）。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】種々の粒径の非ポリマーコーティングＤＳＰＣ−コレステロールリポソームと対比したＰＥＧ−リポソームに関する、時間に対する血漿サンプル中の注射量の算出パーセンテージの平均値を表した図である。
【図２】３種類の異なるリン酸デキサメタゾンリポソーム製剤１０ｍｇ／ｋｇ注射後の遊離デキサメタゾンの血漿レベルを表した図である。
【図３】生理食塩水およびリン酸デキサメタゾンを含有するリポソームの単一回の静脈内注射の前および後における、時間に対する足の炎症スコアを表した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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