(57)【要約】【課題】新規な信号発生アロステリックＤＮＡ酵素の選択方法を提供する。【解決手段】新規な信号発生アロステリックＤＮＡ酵素の選択方法を提供する。特に、蛍光信号発生アロステリックＤＮＡ酵素を記載する。選択系は、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドの開裂に基く。シス作用性およびトランス作用性の双方のアロステリックＤＮＡ酵素、並びにアプタマー／ＤＮＡ酵素共役体を確認した。
2005517409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
信号発生ＤＮＡ構造物であって、
ｉ．酵素性ＤＮＡ配列；および
ｉｉ．発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと、消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドであって、それらは互いに十分に接近しており、それにより触媒作用の不在下で、該発蛍光団からの蛍光が該消光物質により消光されるオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を有するＤＮＡ鎖
を含む、信号発生ＤＮＡ構造物。
【請求項２】
前記酵素性ＤＮＡ配列は、配列番号７または配列番号８に記載の配列を有するシス作用性酵素である、請求項１記載の信号発生酵素構造物。
【請求項３】
前記酵素性ＤＮＡ配列は、配列番号９に記載の配列を有するトランス作用性ＤＮＡ酵素である、請求項１記載の信号発生ＤＮＡ構造物。
【請求項４】
さらに、前記酵素性ＤＮＡ配列に共役したアプタマー配列を含む、請求項１記載の信号発生ＤＮＡ構造物。
【請求項５】
配列番号１０記載の配列を含む、請求項４記載の信号発生ＤＮＡ構造物。
【請求項６】
酵素性ＤＮＡ配列の選択方法であって、該方法は、ランダム配列を、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を有するＤＮＡ鎖中に挿入すること、および蛍光信号が生成されるか否かを決定することを含み、ここで該発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと該消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドは互いに十分に接近しており、それにより触媒作用の不在下で、該発蛍光団からの蛍光が該消光物質により消光される、方法。
【請求項７】
酵素性ＤＮＡ配列の検出方法であって、該方法は、
ｉ．スクリーニングするオリゴヌクレオチドのライブラリーを用意する工程と；
ｉｉ．該オリゴヌクレオチドを、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を含むアクセプター配列に結合する工程と；
ｉｉｉ．該リボヌクレオチド結合での開裂により、蛍光信号が生成されるか否かを決定する工程
を含む、方法。
【請求項８】
ＤＮＡ酵素の選択方法であって、該方法は、
ｉ．スクリーニングするオリゴヌクレオチドのライブラリを用意することと；
ｉｉ．該オリゴヌクレオチドを、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を含むアクセプター配列に結合することと；
ｉｉｉ．該リボヌクレオチド結合での開裂により、蛍光信号が生成されるか否かを決定することと；
ｉｖ．蛍光信号を生成する配列を増幅すること
を含む、方法。
【請求項９】
アプタマー配列の選択方法であって、該方法は、
ｉ．オリゴヌクレオチド配列のライブラリを請求項１記載の信号発生ＤＮＡ構造物に共役させて、共役分子を用意することと；
ｉｉ．該共役分子を所望の標的の存在下で培養することと；
ｉｉｉ．蛍光信号が生成されるか否かを決定することと；
ｉｖ．信号を生成する配列を増幅すること
を含む、方法。
【請求項１０】
酵素性ＤＮＡ配列の選択キットであって、該キットは、
ａ）試験ヌクレオチド配列の挿入部位と；
ｂ）発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドであって、それらは互いに十分に接近しており、それにより触媒作用の不在下で、該発蛍光団からの蛍光が該消光物質により消光され、かつ試験触媒作用性ヌクレオチド配列の存在下で蛍光信号が生成されるオリゴヌクレオチドよりフランキングされたリボヌクレオチド結合
を含む、キット。
【請求項１１】
コファクターの検出方法であって、該方法は、
ｉ．請求項１または４に記載の信号発生ＤＮＡ構造物を用意する工程と；
ｉｉ．試料を導入する工程と；
ｉｉｉ．信号が生成されるか否かを決定する工程
を含み、ここで要求コファクターの存在下で、開裂が前記リボヌクレオチド結合で生じ、そして蛍光信号が生成される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、所望の特徴を有する核酸酵素の検出方法および単離方法に関する。また、記載された方法に従って単離された酵素、およびその酵素の使用に基くアッセイに関する。特に、基質特異性および／または反応特異性を持つ蛍光信号発生レポーターの生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本出願を通して、様々な引用文献が挿入により引用されて、本発明が関連する最新技術をより完全に説明する。これらの引用文献の開示はここで引用により本願の開示に組み入れられ、そして便宜上、該引用文献は本願明細書に付属する引用文献のリストに列挙する。
【０００３】
過去１０年にわたり、生体認識要素としてのＤＮＡの使用に基く選択的バイオセンサーの開発に顕著な前進があった。大多数のＤＮＡをベースとするセンサーは相補的ＤＮＡを検出するために設計されるが、多くの最近の報告は、１本鎖ＤＮＡが同様に非ＤＮＡ標的（所謂、アプタマー）に選択的に結合することや1、2、または化学反応の触媒作用を行うこと3、4を可能にする複雑な３次構造を形成できることを示している。現在まで、多くの種類の化学転位を容易にする１００個以上のＤＮＡ配列が報告されている5。非常に限定された化学官能性を有するにも関わらず、驚くべき効率で触媒作用を行うデオキシリボザイム（deoxyribozyme）が、数々の研究で報告されている6。例えば、１０−２３として知られている小さなＤＮＡ酵素は、〜１０分-1の非常に印象的なｋcatで部位特異的ＲＮＡ開裂を行う7。ＲＮＡに対するＤＮＡ中の２’−ヒドロキシ基の欠如が触媒性能に損失を与えないことは明らかである。さらに、ＤＮＡの触媒能力は、金属イオン8および小分子コファクター9の使用により並びに触媒作用に有用な化学官能基での修飾10により増大できる。さらに、リボザイム（ribozyme）と比較したとき、デオキシリボザイムは生成が容易であり、また化学分解および酵素分解に対してより抵抗性であり、そして従って、適切に作製され、そして触媒的に有効なＤＮＡ酵素は、頑強なバイオセンサーの構成のために非常に望ましい要素である。
【０００４】
アロステリックなリボザイムおよびデオキシリボザイムは、診断分野、バイオセンシング分野および医薬スクリーニング分野での広範囲にわたる用途について、とても大きな可能性を有する。高速な触媒速度および大きな代謝回転数を持つデオキシリボザイムの使用は、迅速な酵素作用が必須である実用のための有効なアロステリックＤＮＡ酵素の作製を可能にする。検出関連用途のための触媒性ＤＮＡプローブを作製するために、酵素作用を蛍光信号発生能力と組み合わせることのできるＤＮＡ酵素の使用が非常に望ましく、それにより時間の掛かる分離工程の必要無しに即時の容易かつ高速な検出が行える。
【非特許文献１】Ellington, A. D.; Szostak, J. W. Nature 1990, 346, 818-822.
【非特許文献２】Tuerk, C.; Gold, L. Science 1990, 249, 505-510.
【非特許文献３】Famulok, M.; Mayer, G.; Blind, M. Acc. Chem. Res. 2001, 33, 591-599.
【非特許文献４】Wilson, D. S.; Szostak, J. W. Annu. Rev. Biochem. 1999; 68, 611-647.
【非特許文献５】Breaker, R. R. Nat. Biotechnol. 1997, 15, 427-431.
【非特許文献６】Breaker, R. R. Science 2000, 290, 2095-2096.
【非特許文献７】Sen D.; Geyer, C. R. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 680-687.
【非特許文献８】Li, Y.; Breaker, R. R. Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9, 315-323.
【非特許文献９】Jaschke, A. Curr. Opin. Struct. Biol. 2001, 11, 321-326.
【非特許文献１０】Emilsson, G. M.; Breaker, R. R. Cell Mol. Life Sci. 2002, 59, 596-607.
【非特許文献１１】Breaker, R. R.; Joyce, G. F. Chem. Biol. 1994, 1, 223-229.
【非特許文献１２】Cuenoud, B.; Szostak, J. W. Nature 1995; 375, 611-614.
【非特許文献１３】Li, Y.; Sen, D. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 743-747.
【非特許文献１４】Carmi, N.; Schultz, L. A.; Breaker, R. R. Chem. Biol. 1996, 3, 1039-1046.
【非特許文献１５】Burmeister, J.; von Kiedrowski, G.; Ellington, A. D. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, 1321-1324.
【非特許文献１６】Travascio, P.; Li, Y.; Sen, D. Chem. Biol. 1998, 5, 505-517.
【非特許文献１７】Li, Y.; Breaker, R. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96, 2746-2751.
【非特許文献１８】Li, Y.; Liu, Y.; Breaker, R. R. Biochemistry 2000, 39, 3106-3114.
【非特許文献１９】Sheppard, T. L.; Ordoukhanian, P.; Joyce, G. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 7802-7807.
【非特許文献２０】Levy, M.; Ellington, A. D. Bioorg. Med. Chem. 2001, 9 2581-2587.
【非特許文献２１】Santoro, S. W.; Joyce, G. F. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4262-6.
【非特許文献２２】Li, J.; Zheng, W.; Kwon, A. H.; Lu, Y. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 481-448.
【非特許文献２３】Feldman, A. R.; Sen, D. J. Mol. Biol. 2001, 313, 283-294.
【非特許文献２４】Wang, W.; Billen, L. P.; Li, Y. Chem. Biol. 2002, 9, 507-517.
【非特許文献２５】Santoro, S. W.; Joyce, G. F. Biochemistry 1998, 37, 13330-13342.
【非特許文献２６】Roth, A.; Breaker, R. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1998; 95, 6027-6031.
【非特許文献２７】Santoro, S. W.; Joyce, G. F.; Sakthivel, K.; Gramatikova, S.; Barbas, C. F. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2433-2439.
【非特許文献２８】Perrin, D. M.; Garestier, T.; Helene, C. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1556-1563.
【非特許文献２９】Lermer, L.; Roupioz, Y.; Ting, R.; Perrin, D. M. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124 9960-9961.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の要約
本発明は、低いバックグラウンド蛍光を維持しながらＲＮＡ開裂により非常に大きな蛍光信号を生成でき、かつ非常に大きな触媒速度定数を示すデノボ（de novo）蛍光生成ＲＮＡ開裂ＤＮＡ酵素系を提供する。ＤＮＡ酵素の検出方法および単離方法が提供される。本発明のＲＮＡ開裂ＤＮＡ酵素は、化学触媒作用を即時の蛍光信号発生能力と独特に結び付ける。この系の２つの特別な例、自己触媒作用可能なシス作用性酵素、および特定のキメラ基質に作用するトランス作用性酵素が提供される。アプタマー標的結合により調節さ
れるアロステリックＤＮＡ酵素の開発もまた示される。好ましい態様において、既知のＡＴＰアプタマーがシス作用性酵素に共役する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の１つの観点において、信号発生ＤＮＡ酵素構造物が提供される。該構造物は、ａ）リボヌクレオチド部位で開裂できる酵素性ＤＮＡ配列（enzymatic DNA sequence）、およびｂ）発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドであって、互いに十分に接近しており、それにより触媒作用の不在下で、該発蛍光団からの蛍光が該消光物質により消光されるオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を有するＤＮＡ鎖を含む。
【０００７】
好ましい態様において、前記酵素性ＤＮＡ配列は、配列番号７または配列番号８に記載の配列を有するシス作用性酵素である。
【０００８】
他の好ましい態様において、前記酵素性ＤＮＡ配列は、配列番号９記載の配列を有するトランス作用性ＤＮＡ酵素である。
【０００９】
本発明のさらなる観点において、信号発生ＤＮＡ酵素構造物は、前記酵素性ＤＮＡ配列に共役したアプタマー配列を含む。
【００１０】
好ましい態様において、前記信号発生ＤＮＡ酵素／アプタマー構造物は、配列番号１０の配列を含む。
【００１１】
本発明の他の観点において、ＲＮＡ開裂触媒性ＤＮＡ分子の選択方法が提供される。該方法は以下の工程を含む：
ａ．一方側で発蛍光団で標識したヌクレオチドと他方側で消光物質で修飾したヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを有し、かつランダム配列挿入部位を有する１本鎖ＤＮＡを合成する工程；
ｂ．ランダムＤＮＡ配列を該挿入部位中に挿入して、候補ＤＮＡ分子を用意する工程；
ｃ．該候補ＤＮＡ分子をコファクターの存在下で定温放置する工程；および
ｄ．蛍光信号の存在または不在を検出する工程であって、該信号は開裂が該リボヌクレオチドで起こり、それにより該消光物質が該発蛍光団から分離したときに生成する工程。
【００１２】
本発明はまた、酵素性ＤＮＡ配列の他の選択方法を提供する。該方法は：
ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドのライブラリを用意する工程と；
該オリゴヌクレオチドを、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を含むアクセプター配列に結合する工程と；
該リボヌクレオチド結合の開裂により、蛍光信号が生成されるか否かを決定する工程と；該リボヌクレオチドで開裂した配列を増幅する工程
を含む。
【００１３】
本発明のさらなる観点において、ＤＮＡのランダム集合から自己触媒性ＤＮＡを選択する方法が提供され、該方法は：
ｉ．第１所定配列と、ランダム配列と、第２所定配列とを含む１本鎖ＤＮＡ分子の集合を用意する工程と；
ｉｉ．該１本鎖ＤＮＡ分子を、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドにより結合接点でフランキングされた少なくとも１つのリボヌクレオチド結合を含むアクセプターＤＮＡ配列に結合する工程と；
ｉｉｉ．結合した１本鎖オリゴヌクレオチドを単離する工程と；
ｉｖ．該結合したオリゴヌクレオチドをコファクターの存在下で定温放置する工程と；
ｖ．ＲＮＡ開裂活性をＰＡＧＥにより測定する工程と；
ｖｉ．リボヌクレオチドで開裂されたＤＮＡ分子を単離する工程
を含む。
【００１４】
好ましい態様において、上記方法により選択されたＤＮＡにさらなる選択ラウンドを受けさせる。これは、
ｖｉｉ．結合接点を包含する前記結合したＤＮＡの領域に相補的な第１プライマーと、前記第２所定領域に相補的な第２プライマーを使用する第１ＰＣＲ増幅；
ｖｉｉｉ．該結合接点でリボヌクレオチドを有する２本鎖ＤＮＡ生成物を与えるための、リボ末端第３プライマーを使用する第２ＰＣＲ増幅；
ｉｘ．該リボヌクレオチドでの該２本鎖ＤＮＡ生成物の開裂；
ｘ．工程１記載の１本鎖ＤＮＡ分子の単離；および
ｘｉ．十分な程度の選択が達成されるまでの工程ｉｉ）ないしｘ）の反復
の工程を含む。
【００１５】
本発明はまた、所望の標的に特異的なアプタマー配列の選択方法を提供する。該方法は、ランダム配列を信号発生自己触媒性ＤＮＡ酵素に共役させることと、該共役した配列を所望の標的の存在下で定温放置することと、該溶液の蛍光強度を決定することを含む。好ましい態様において、重要な生物学的標的の検出アッセイが提供される。
【００１６】
本発明はまた、酵素性ＤＮＡ配列の選択キットを提供する。１つの好ましい態様において、該キットは、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を持つＤＮＡクレームと、ランダムオリゴヌクレオチドの挿入に適合した配列を含むＤＮＡ構造物を含む。他の態様において、キットは、ランダムまたは既知の配列の挿入に適合したライブラリーＤＮＡと、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを含むアクセプターＤＮＡと、ＲＮＡ開裂配列のＰＣＲ増幅のためのプライマーを含む。
【００１７】
さらなる他の観点において、要求ファクターの検出方法が提供される。該方法は、信号発生ＤＮＡ構造物を用意することと、試料を導入することと、信号が生成されるか否かを決定することを含む。好ましい態様において、金属イオンまたは小分子の検出方法が提供される。
【００１８】
図面の簡単な説明
本発明の好ましい態様は図面を参照して下記され、ここで：
図１は、リボヌクレオチド結合でのＤＮＡ鎖の開裂により生成する信号の模式図であり、図２は、信号発生配列の選択を図示し、
図３Ａは、ＲＮＡ開裂ＤＮＡ酵素の選択方法の模式図であり、
図３Ｂは、図３Ａに図示した方法に従いＤＮＡ酵素を選択するために使用する例示的な配列を図示し、
図３Ｃは、様々な選択条件下での酵素活性をグラフにより図示し、
図４Ａは、シス作用性ＤＮＡ酵素の配列を図示し、
図４Ｂは、図４Ａに図示した酵素の信号発生特性を図示し、
図５は、信号発生活性についての３’側切除の効果を図示し、
図６Ａは、シス作用性ＤＮＡ酵素、ＤＥＣ２２−１８Ａの２次構造を図示し、
図６Ｂは、トランス作用性ＤＮＡ酵素、ＤＥＴ２２−１８の提案される２次構造を図示し、
図６Ｃは、ＤＥＴ２２−１８の速度論的分析のグラフ図であり、
図７Ａは、酵素が過剰であるときの、ＤＥＴ２２−１８の即時信号発生能力を示し、
図７Ｂは、基質が過剰であるときの、ＤＥＴ２２−１８の即時信号発生能力を示し、
図８Ａは、アプタマー配列が信号発生ＤＮＡ酵素に結合したアロステリックＤＮＡＳ酵素を図示し、
図８Ｂは、アプタマー標的の導入に基く活性アッセイをグラフにより図示し、そして
図８Ｃは、信号発生構造物の標的特異性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は、基質を規定した開裂部位で開裂する酵素に関する。特に、酵素レポーターとして機能できるＤＮＡ含有分子およびその単離方法が提供される。
【００２０】
本明細書を通して、用語：酵素性ＤＮＡ分子、触媒性ＤＮＡ、ＤＮＡ酵素、ＤＮＡザイムおよびデオキシリボザイムは交換可能に使用される。酵素的に活性な部分もまた該用語に包含される。本発明の酵素性ＤＮＡ分子は、変異、欠失および／または付加により変性され得、そしてそれらはヌクレオチド類似物を含み得る。本発明の酵素性ＤＮＡ分子はオリゴヌクレオチド基質を開裂する。シス作用性およびトランス作用性の双方の酵素が包含される。
【００２１】
触媒性ＤＮＡ分子はホスホジエステル結合を開裂し、そしてそれ故、医薬的／医療的用途および毎日の生活の双方において多くの用途を有する。
【００２２】
本発明は、ＲＮＡを開裂できる触媒性ＤＮＡ分子の検出のための、迅速な蛍光に基く系を提供する。リボヌクレオチドを含む信号発生オリゴヌクレオチドが合成される。発蛍光団で修飾したヌクレオチドは該リボヌクレオチドの一方側（例えば、上流側）に位置し、そして消光物質で修飾したヌクレオチドは他方側（例えば、下流側）に位置する。反対の配向（即ち、該発蛍光団で修飾したヌクレオチドが該リボヌクレオチドの下流に位置し、そして該消光物質で修飾したヌクレオチドが上流に位置する）も機能性であることは明白である。該消光物質で修飾したヌクレオチドは、低い蛍光バックグラウンドを与えるために、該発蛍光団で修飾したヌクレオチドに十分近くなければならない。該信号発生オリゴヌクレオチドはランダム配列に結合されれる。該ランダム配列が該信号発生オリゴペプチドを該リボヌクレオチドで開裂できるＤＮＡ酵素を含む場合、該発蛍光団および該消光物質は分離されることとなり、そして該蛍光信号の顕著な増加が検出できる。
本発明は、蛍光信号の生成に基くＤＮＡ酵素の選択および単離を可能にする。本発明の１つの観点において、ＲＮＡ開裂に基く信号発生ＤＮＡ酵素リポーター系が提供される。一般的な概念を図１に図示する。埋め込まれたＲＮＡ結合１４を有するＤＮＡ鎖１２を含むリポーター１０を用意する。発蛍光団１６は鎖１２に該ＲＮＡ結合の一方側で結合し、そして消光物質１８は該鎖に該ＲＮＡ結合の他方側で結合する。該発蛍光団と該消光物質は互いに十分近く、該消光物質が該発蛍光団からの蛍光を効率良く消光する。これはまた偽陽性を最小限にする。該ＲＮＡ結合が開裂したとき、該発蛍光団と該消光物質は分離し、そして蛍光信号が生成する。この系は、ＲＮＡを開裂する何れの成分の存在をも検出するために使用できる。この系はまた、ＲＮＡ開裂酵素により要求されるコファクターの存在を検出するために使用できる。
【００２３】
最適な信号発生ＤＮＡリポーターは、良好な信号対ノイズ比を有する。あらゆる酵素活性の不在下では低いバックグラウンドであり、そして開裂が生じると、強い信号が生成する。これらの特性についての前記発蛍光団と前記消光物質との間の距離の効果は、図２に示したものと同様な構造物を使用して評価でき、そして実施例２でさらに議論する。該発蛍光団と消光物質が異なる距離で隔て離れた一連の構造物を用意する。ＲＮＡは塩基で断片化できることは良く知られており、またＮａＯＨはＲＮＡを破壊するがＤＮＡを破壊し
ないことが知られている。それ故、ＮａＯＨが該構造物に添加でき、そして蛍光の倍数変化を決定できる。この方法において、特定部位での開裂に基く信号発生レポーターが生成できる。一般に、該発蛍光団と消光物質は、開裂の不在下では低いバックグランドを与え、そして良好な信号対ノイズ比を与えるために十分に近くなければならない。
【００２４】
他の観点において、本発明は、蛍光信号を発生しＲＮＡを開裂する自己触媒作用性ＤＮＡ分子の選択方法および単離方法を提供する。基本的に、発蛍光団で修飾したオリゴヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを含むＤＮＡ構造物を用意する。該構造物はまた、ランダムヌクレオチド配列の挿入部位を含む。挿入した配列がＲＮＡ開裂活性を有する場合、該リボヌクレオチド結合は開裂し、そして該発蛍光団は該消光物質から分離し、そして蛍光信号が生成する。
【００２５】
幾つかの選択ラウンドが、触媒作用性配列を濃縮するために好ましくなされる。好ましい態様において、図３Ａに示しまた実施例５で議論するものに類似した選択計画が、ＲＮＡ開裂ＤＮＡ酵素を濃縮および選択するために使用される。
【００２６】
本発明の選択計画は、所定の５’側配列と所定の３’側配列によりフランキングされたランダム配列を含む１本鎖ＤＮＡ分子の集合を生成することを含む。これらのＤＮＡ分子は“ライブラリー”ＤＮＡと呼ばれる。本願明細書で“アクセプター”オリゴヌクレオチドと呼ぶオリゴヌクレオチドは、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと、消光物質で修飾したヌクレオチドと、該発蛍光団と該消光物質との間に位置するリボヌクレオチド結合を含む。“テンプレートＤＮＡ”と命名する他のオリゴヌクレオチドも用意する。テンプレートＤＮＡは、該アクセプターオリゴヌクレオチドの配列に少なくとも部分的に相補的である第１配列と、該ライブラリーＤＮＡの所定の５’側配列に少なくとも部分的に相補的である第２配列とを含む。該配列の相補性により、該テンプレートＤＮＡは該アクセプターオリゴヌクレオチドおよび該ライブラリーＤＮＡと２重構造を形成し、そしてそれらを接近させる。リガーゼを導入すると、該ライブラリーＤＮＡは該アクセプターオリゴヌクレオチドに結合して結合分子を形成する。該２重構造は解離し、そして該結合分子はテンプレートＤＮＡからＰＡＧＥにより分離できる。
【００２７】
本発明の特別な特徴は、蛍光信号発生に基き酵素の選択および単離を可能にすることである。本発明の選択計画が図３に示す特定の配列に限定されないことは明白である。一般的な計画は、異なる特徴を有する様々なＤＮＡ酵素を選択するために使用できる。
【００２８】
小分子、ペプチド、金属イオン、代謝産物、糖、核酸等のようなコファクターの存在を必要とする酵素性ＤＮＡ分子は、前記結合分子をそのファクターの存在下で定温放置することにより選択される。該結合分子がそのファクターに応答性のＤＮＡ酵素を含む場合、開裂が該リボヌクレオチド結合で生じる。これは、前記発蛍光団と消光物質が分離されることとなるので、蛍光信号の発生を生じる。この一例は、金属イオンを導入する場合、図３の工程ＩＩＩに示される。
【００２９】
前記自己触媒作用性分子はその後、一連のポリメラーゼ連鎖反応を通して濃縮できる。該自己触媒作用性ＤＮＡは、前記ライブラリーＤＮＡの所定の３’側配列を有するので、その配列に相補的なプライマーが使用できる。このプライマーをＰ１と命名する。第２プライマー、Ｐ２は、前記アクセプターオリゴヌクレオチドに相補的な配列と、前記集合ＤＮＡの保存された５’側配列を含む。これらのプライマーでのＰＣＲは、リボヌクレオチドを除き前記結合ＤＮＡの配列を有するＤＮＡ分子を生成する。リボヌクレオチドはその後、リボ末端化した第３プライマー、Ｐ３を使用して導入する。増幅後、該ＤＮＡをＮａＯＨのようなＲＮＡ開裂成分で処理する。開裂したＤＮＡにＰＡＧＥ精製およびＤＮＡリン酸化を受けさせる。該５’側リン酸化ＤＮＡは、さらなる選択ラウンドを開始するため
に使用する。この戦略を使用して、非常に選択的なレポーターでさえその場で再生できる。
【００３０】
前記方法は一般的に適用可能で、そして図３に示す特定のヌクレオチド配列に限定されないことは、当業者に明白である。
【００３１】
前記ＤＮＡ酵素は始めに選択し、そして数々の選択ラウンドを通過することにより濃縮できる。加えて、自己開裂反応に許される時間は、図３Ｃに示しまた実施例５でさらに議論するように、最も有効なＤＮＡ酵素を選択するために徐々に減少できる。好ましい態様において、該技術は、数回の選択ラウンド後、単一種のＤＮＡ酵素を含むクローンを生じる。
【００３２】
ＲＮＡ開裂ＤＮＡ酵素を上記の方法論を使用して単離し、そしてＤＥＣ２２−１８と命名した。該命名は、ＤＮＡ酵素（DNA enzyme）、シス作用性（cis-acting）、２２選択ラウンド（22 rounds of selection）、クローン１８（clone 18）に基く。ＤＥＣ２２−１８は、１０９個のヌクレオチドからなる大きなＤＮＡ分子である。この酵素の配列を図４Ａおよび配列番号７に示す。この分子の触媒作用活性は、図４Ｂに図示しまた実施例７でさらに記載するように確認した。
【００３３】
本発明の１つの観点において、触媒作用活性に必要とされる最小の配列が、一連のヌクレオチド切除をし、そして切除した分子の酵素活性を測定することにより決定された。本発明の例示的な態様において、ＤＥＣ２２−１８に一連の３’側切除を受けさせた。該切除実験は、図５に図示しまた実施例８でより完全に記載する。最後の２６個のヌクレオチドの切除は、より高度に有効な酵素であるＤＥＣ１８−２２Ａと命名する酵素を生じた。一度、主要なオリゴヌクレオチド構造が既知となると、２次構造は様々なアルゴリズムを使用して予測できる。ＤＥＣ２２−１８Ａの２次構造を、Ｍ−フォールドプログラム（hhtp://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna）を使用して予測し、そして図６Ａに示す。
【００３４】
ＤＥＣ２２−１８Ａはシス作用性酵素である。ＤＥＣ２２−１８Ａの２次構造に基いて、トランス作用性ＤＮＡ酵素系を設計することが可能である。トランス作用性ＤＮＡ酵素、ＤＥＴ２２−１８もまた提供される。ＤＥＴ２２−１８の構造およびその信号発生特性の説明を図６および７に図示し、また実施例９および１０でより完全に記載する。
【００３５】
本発明のＲＮＡ開裂ＤＮＡ酵素はまた、信号発生アロステリックデオキシリボザイムを設計するために使用できる。アプタマー配列は、ステム−ループ２次構造を有するＤＮＡ酵素に共役する。例示的な信号発生アロステリックデオキシリボザイムを表８に図示し、また実施例１１でさらに議論する。好ましい態様において、弱いステムを該アプタマー配列を該酵素配列に共役させるために使用する。該アプタマー標的の不在下では、該ステムは弱く、そして触媒作用活性も弱い。該標的の存在下では、ステムの形成が促進され、そして２次構造の形成により付随して触媒作用活性が増加する。該ＤＮＡ酵素成分は、発蛍光団と消光物質によりフランキングされたリボヌクレオチドを含むために、上記したように変性される。アプタマー標的の不在下では、該ステム形成は弱く、そして該リボヌクレオチドでの開裂は殆どまたは全くない。それ故、標的の不在下では、該発蛍光団と消光物質は近く接近したままであり、そして蛍光は消光される。アプタマー標的の存在下では、該ＤＮＡ酵素はその２次構造を呈し、そして開裂が該リボヌクレオチドで生じて、蛍光信号が生成することとなる。それ故、信号を発生するアロステリックＤＮＡ酵素または“アプタザイム（aptazyme）”は、標的分子の存在を検出するために使用できる。
【００３６】
本発明の信号発生ＤＮＡ酵素が様々な技術を使用して様々なアプタマー配列に共役できることは明白である。開裂が蛍光信号により検出できる容易性に基いて、本発明の信号発
生酵素は、アプタマー配列を確認するために使用できる。ランダム配列をデオキシリボザイムドメインに共役させ、そして様々な標的に結合するその能力について試験できる。
【００３７】
好ましい態様において、アプタマー配列に共役したＤＥ２２−１８Ａを含む信号発生アロステリックＤＮＡ酵素が提供される。好ましい態様において、ＡＴＰ結合アプタマーに共役したＤＥ２２−１８Ａを含む信号発生アロステリックＤＮＡ酵素が提供される。この共役ＤＮＡ分子の２次構造を図８Ａに示し、また配列を配列番号１０に記載する。この分子の標的報告能力を図８Ｂおよび８Ｃにし、また実施例１１でさらに議論する。ＡＴＰアプタマー／ＤＥＣ２２−１８アプタザイムがＡＴＰの存在を検出し、そして信号が標的特異的に生成されることは明白である。他のアプタマー配列を組み入れた信号発生アロステリックＤＮＡ酵素は、本発明内に包含される。
【００３８】
本発明の信号発生ＤＮＡ酵素は様々な方法で有用である。本発明の信号発生ＤＮＡ酵素系は、特定の分析物を検出する溶液をベースとしたアッセイに良く適している。そのようなアッセイは使用が容易であり、また、分離工程を有する必要または蛍光発色剤を添加する必要がないので、該検出は極めて迅速である。本発明はまた、選択が所定の位置にある発蛍光団と消光物質でなされるので、後の標識化反応により触媒作用性ＤＮＡの活性を変化させる危険が排除される利点を有する。
【００３９】
本発明のＤＮＡ分子はまた、水晶、ガラス、シリカ、様々な金属および何れかのポリマーを含む様々な表面上に固定化できる。該ＤＮＡは、光ファイバー、平面導波管または顕微鏡スライド上に固定化できる。該ＤＮＡは単層または多層として適用できるか、またはポリマー溶液中に捕捉できる。
【００４０】
本説明を通して、前記発蛍光団としてフルオレセインおよび前記消光物質としてＤＡＢＣＹＬの使用を記載してきた。同様に有効であるかまたは増大した光安定性を有し、またより良好な散乱阻止を有する他のプローブ系が使用できることは明白である。例えば、Ｅｕ（ＩＩＩ）およびＴｂ（ＩＩＩ）をベースとする長寿命プローブ、Ｒｕ（ＩＩ）プローブおよびテキサスレッドのような長波長プローブも使用できる。加えて、ＦＲＥＴ受容体およびＦＲＥＴ供与体は、測定可能な蛍光信号を生成するために使用できる。本発明の系はまた、波長をシフトする蛍光レポーターの構成に良く適している。
【００４１】
本発明はまた、酵素性ＤＮＡ配列の選択キットを提供する。１つの好ましい態様において、該キットは、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチド結合を持つＤＮＡクレームと、ランダムオリゴヌクレオチドの挿入に適応した配列を含むＤＮＡ構成物を含む。他の態様において、キットは、ランダムまたは既知の配列の挿入に適応したライブラリーＤＮＡと、発蛍光団で修飾したヌクレオチドと消光物質で修飾したオリゴヌクレオチドによりフランキングされたリボヌクレオチドを含むアクセプターＤＮＡと、ＲＮＡ開裂配列のＰＣＲ増幅のためのプライマーを含む。
【００４２】
本発明は、信号発生アロステリックＤＮＡ酵素、およびその検出方法、選択方法および増幅方法を提供する。独特に同時に起こる化学触媒作用／即時信号発生能力を有するシス作用性ＲＮＡ開裂ＤＮＡ酵素、ＤＥＣ２２−１８、および関連するトランス作用性ＤＮＡ酵素、ＤＥＴ２２−１８の双方が提供される。ＤＥＣ２２−１８は、該酵素および基質が同じ分子内に存在する独特な構造的特徴を有し、適した２価金属イオンで大きな蛍光信号を生成できる自己触媒作用性系を導く。そのような系の利点は、触媒作用成分および信号発生成分の双方が単一分子中に存在するので、光ファイバーのもののような適した表面上への該ＤＮＡザイムの固定化に基いて、“無試薬”センサーを開発できることである。この場合において、信号を生成するために、適した標的の存在のみが必要とされる。大きな
ｋobs値、およびこの系からの蛍光強度の非常に顕著な増加を達成する能力があれば、標的分子の迅速かつ敏感な検出は、そのようなリポーターで達成できる。
【００４３】
トランス作用性ＤＮＡザイム、ＤＥＴ２２−１８は、現在まで報告されている最速のＤＮＡ酵素の１つである〜７分-1のｋcatを持つ真の酵素である。５８−ｎｔのＤＮＡ酵素は、キメラＲＮＡ／ＤＮＡ基質を、近接した間隔にある発蛍光団−消光物質対により囲まれた孤立ＲＮＡ結合で開裂する。この独特な構造は、化学開裂と蛍光信号発生が同時に起こることを可能にする。ＦとＱとの間の非常に短い距離は、開始基質における最大蛍光消光を起こし（シスおよびトランスの双方の反応について）、そして化学触媒作用による非常に大きな蛍光増大を生じる。同時に、同じ基質内でのＦおよびＱの共有結合による一体化は、発蛍光団および消光物質の互いから離れる望ましくない広範囲の移動を抑止して、化学触媒作用を起源としない偽信号発生の可能性を最小にする。本発明の信号発生ＤＮＡ酵素は、高速な化学作用の能力、同時に起こる触媒作用−信号発生能力、優れた蛍光信号特性（低いバックグラウンド蛍光、大きな信号増大、および偽信号発生の最小の可能性）、および単純なステム−ループ構造を有する。これは、それらを、例外的な即時検出感度および正確性を持つ有用なアロステリックデオキシリボザイムバイオセンサーを作製するために理想的なＤＮＡ酵素とする。異なる発蛍光団および消光物質を伴う多数の同様なＤＮＡ酵素が、ＤＥＣ２２−１８およびＤＥＴ２２−１８の生成に使用したのと同様な戦略で非常に容易に生成できる。そのようなＤＮＡ酵素は、重要な生物学的標的の検出のための様々な形態の多重アッセイを組み立てることに有用である。
【００４４】
上記の開示は本発明の一般的な説明である。より完全な理解は以下の特定の実施例の参照により得ることができる。これらの実施例は説明の目的のみのために記載されており、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。形態の変化および等価物の置換は、状況が都合が良いことを示唆するか都合を良くするときに考慮される。特別な用語が本明細書において使用されているけれども、そのような用語は記述上の観念を意図し、そして限定目的を意図しない。
【００４５】
実施例
例は説明の目的のために記載され、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００４６】
本開示で言及されるが明記されていない合成化学、タンパク質およびペプチド化学および分子生物学の方法は、化学文献において報告され、また当業者に良く知られている。
【実施例１】
【００４７】
実施例１．オリゴヌクレオチド
標準オリゴヌクレオチドを、シアノエチルホスファアミダイト化学（ケック・バイオテクノロジー・リソース・ラボラトリー、イェール・ユニヴァーシティー；セントラル・ファシリティ、マクマスター・ユニヴァーシティー）を使用する自動化ＤＮＡ合成により生成した。ランダム配列ＤＮＡライブラリーを４つの標準ホスファアミダイトの等モル混合物を使用して合成した。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを１０％予備変性（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製し、そしてその濃度を分光光度計により決定し、そしてバイオポリマー・カリキュレーター・プログラム（ HYPERLINK http://paris.chem.yale.edu http://paris.chem.yale.eduで入手可能）を使用して計算した。
【００４８】
フルオレセインおよび４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）標識を、自動化ＤＮＡ合成の間に、フルオレセイン−ｄＴアミダイトおよびＤＡＢＣＹＬ−ｄＴアミダイト（グレン・リサーチ社、スターリング、バージニア）を使用して組み入れた。アデニンリボヌクレオチド結合をまた、固相合成の間に、Ａ−ＴＯＭ−ＣＥホスファアミダイト（グレン・リサーチ社製）を使用して組み入れた。フルオレセインおよ
びＤＡＢＣＹＬで修飾したオリゴヌクレオチドを、１６８・ダイオード・アレイ検出器を持つベックマン−カルター・ＨＰＬＣ・システム・ゴールドで行う逆相液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により精製した。使用したＨＰＬＣカラムは、４．６ｍｍ×２５０ｍｍの寸法および５μｍのビーズ径を持つアジレント・ゾーバックス・ＯＤＳ・Ｃ１８カラムだった。溶離を０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ、ｐＨ６．５）である緩衝液Ａおよび純粋なアセトニトリルである緩衝液Ｂでの２緩衝液系を使用して達成した。最良の分離結果は非線形溶離勾配（５分間０％Ｂ、９５分にわたり１０％Ｂから３０％Ｂ）を使用し０．５ｍＬ／分の流速で達成された。主ピークは２６０ｎｍおよび４９１ｎｍの双方で非常に強い吸収を有することが見出された。
【００４９】
ＲＮＡ結合の２’−ヒドロキシ基についてのＴＯＭ保護基を、ＴＨＦ中で１５０ｍＬの１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）と共に６０℃で振盪しながらの６時間の定温放置、続く２５０ｍＬの１００ｍＭトリス（ｐＨ８．３）の添加、およびさらなる振盪しながらの３０分間、３７℃での定温放置により除去した。該ＤＮＡをエタノール沈殿を使用して回収し、０．０１％ＳＤＳを含有する水中に溶解し、そしてテトラブチルアンモニウム塩を、スピンカラム（ナノセップ・３Ｋ・オメガ、ポール・コーポレイション、アン・アンバー、ミシガン）を使用する遠心分離により除去した。
【００５０】
ヌクレオチド５’−トリホスフェート、［ｇ−32Ｐ］ＡＴＰおよび［ａ−32Ｐ］ｄＧＴＰはアマーシャム・ファルマシア社より購入した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）はＭＢＩ・ファールメンタス社より購入した。全ての他の化学試薬はシグマ社より購入した。
【実施例２】
【００５１】
実施例２．最適な蛍光消光のためのオリゴヌクレオチドの設計
何れかの与えられた条件下でもその不活性状態では低いバックグラウンド蛍光を有するが、ＤＮＡ鎖中に埋め込まれそして共有結合した発蛍光団および消光物質の対によりフランキングされた１つのＲＮＡ結合の開裂により大きな蛍光信号を生成できるＲＮＡ開裂に基く信号発生ＤＮＡ酵素レポーターを生成した。この配置は、該発蛍光団と該消光物質との間の短い距離のために、非常に有効な蛍光消光を生じるだけでなく、該ＲＮＡ結合が開裂するまで該消光物質が該発蛍光団から分離できないので、偽陽性を最小にする。該発蛍光団と該消光物質との間の最適な距離を決定するために、図２Ａに示すような変化を持つ一連のＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ｆ：フルオレセイン−ｄＴ；Ｑ：ＤＡＢＣＹＬ−ｄＴ；Ａｒ：アデニンリボヌクレオチド）を合成した。これらのＤＮＡ分子の開裂に依存した信号発生挙動を０．２５ＭのＮａＯＨでの処理により評価し、そしてデータを図２Ｂに示すが、ここでＦ0およびＦは、０．２５ＭのＮａＯＨの添加直後（ＲＮＡ開裂はまだ起こっていない）および２０時間の定温放置後（完全なＲＮＡ開裂19）に測定した関連するＤＮＡの蛍光強度を表す。この例において、Ｆ１ＱＤＮＡは最も顕著な蛍光変化（〜７０倍の強度の増加を持つ）を有し、続いてＦ２ＱＤＮＡ（〜３０倍）であった。Ｆ３ＤＮＡは約４倍の蛍光増大を生じた。距離に伴う蛍光増大の減少は、より効果的でない消光により距離が増大するにつれてＦ0の高い値が高くなる結果から生じた。全てのＦｘＱＤＮＡ系（ｘ＝１〜３）は、ＦＤＮＡと同様な最終強度値に到達した。
【実施例３】
【００５２】
実施例３．蛍光測定
全ての測定は、４００μｌ溶液でキャリー・エクリプス・フルオレセンス・スペクトロフォトメーター（バリアン社製）でなした。励起は４９０で設定し、そして発光は５２０ｎｍで設定した。
【実施例４】
【００５３】
実施例４．速度論的分析
典型的な反応は以下の工程を伴った：（１）水中で３０秒間９０℃でのＤＮＡの熱変性、（２）室温で反応緩衝液中、指定した時間のＲＮＡ開裂のための定温放置、（３）該反応を停止するための３０ｍＭまでのＥＤＴＡの添加、（４）変性１０％ＰＡＧＥによる開裂生成物の分離、および（５）ホスフォイメージャーおよびイメージクアントソフトウェアを使用する定量。ＲＮＡ開裂反応溶液の一定分量を、全て完了１０％以下の異なる反応時点で収集し、そして該反応についての速度定数を、未反応のままであるＤＮＡ画分の自然対数を反応時間に対してプロットすることにより決定した。該データへの最小二乗合わせにより生成した直線の負の勾配を速度定数とした。
【実施例５】
【００５４】
実施例５．ＤＮＡ酵素の単離のための選択計画
Ｆ１ＱＤＮＡが最大の蛍光強度増加を有したので、発蛍光団を含有するヌクレオチドと消光物質で変性されたヌクレオチドにより直ちにフランキングされたＲＮＡ結合を、ＤＮＡ酵素の生成に使用するための開始ランダム配列集合に組み入れた。信号を発生する自己触媒作用性ＤＮＡ分子を単離するための選択計画を図３に示す。一般的な計画を図３Ａに示し、そして好ましい態様の特定の配列を図３Ｂに示す。工程Ｉにおいて、４３個のランダム配列ヌクレオチドを含有する１本鎖で８６−ｎｔのＤＮＡの集合を生成した。これをライブラリーＬ１と命名する。図３Ｂに示す配列において、Ｎ43は、４３個のヌクレオチドのランダム配列を示す。３００ｐｍｏｌの５’側をリン酸化しゲル精製した８６−ｎｔのランダム配列ＤＮＡＬ１を、等モル比で、テンプレートＴ１およびアクセプターＡ１（全ての配列を図３Ｂに示す）と混合し、９０℃まで３０秒間加熱し、室温まで冷却し、そして修飾したＤＮＡドメインを導入するＤＮＡ結合のために、１０×リガーゼ緩衝液およびＴ４ＤＮＡリガーゼと組み合わせた（工程Ｉ、図３Ａ）。結合混合物（５０ｍＬ）は、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２３℃でｐＨ７．８）、４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．５ｍＭのＡＴＰ、および０．１Ｕ（ヴァイス）ｍＬ-1のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有した。該溶液を２３℃で１時間定温放置し、そして結合した１０９−ｎｔのＤＮＡを１０％変性ＰＡＧＥにより精製した（工程ＩＩ）。
【００５５】
上記のように構成した１０９−ｎｔのＤＮＡ集団を初期集合（世代０またはＧ０と記載）として使用し、９０℃まで３０秒間加熱し、室温まで冷却し、そしてその後、２’選択緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２３℃でｐＨ６．８、８００ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＭｎＣｌ2、２．５ｍＭのＣｄＣｌ2、２ｍＭのＣｏＣｌ2、０．５ｍＭのＮｉＣｌ2）と、０．０５ｍＭの最終ＤＮＡ濃度まで組み合わせた（工程ＩＩＩ）。該混合物を自己開裂のために２３℃で５時間定温放置した。
【００５６】
該開裂反応を３０ｍＭの最終濃度までのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の添加により停止した。開裂したＤＮＡを１０％変性ＰＡＧＥにより単離した。ＤＮＡ回収の収率を増加させるためおよび９４−ｎｔの開裂生成物の状態を追跡するために、１０９−ｎｔの構造物のアルカリ消化により作製した強放射線活性で９４−ｎｔのＤＮＡマーカー０．２５ｐｍｏｌを、“キャリアＤＮＡ”として使用した。該単離した開裂生成物を、５×１００ｍＬ反応体積においてプライマーＰ１およびＰ２（図３Ｂ）を使用するＰＣＲにより増幅した（工程ＩＶ）。該ＰＣＲ反応をＳＹＢＲグリーン（モレキュラー・プローブ社製）を使用して即時観察した。２％の増幅したＤＮＡ生成物を、１０×１００ｍＬの反応体積においてプライマーＰ１およびリボ末端プライマーＰ３を使用する新たなＰＣＲ反応のためのＤＮＡテンプレートとして使用した（工程Ｖ）。反応混合物はまたＤＮＡ標識のための３０ｍＣｉの［ａ−32Ｐ］ｄＧＴＰを含んだ。
【００５７】
前記第２のＰＣＲにおけるＤＮＡ生成物をエタノール沈殿により回収し、０．２５ＭのＮａＯＨ９０ｍＬに再懸濁し、そして９０℃で１０分間定温放置して１つの埋め込んだＲ
ＮＡ結合を開裂した（工程ＶＩ）。該開裂溶液を、３ＭのＮａＯＡｃ（２３℃でｐＨ５．２）１０ｍＬを添加することにより変性し、そして〜８６−ｎｔの１本鎖ＤＮＡ断片を、１０％変性ＰＡＧＥにより単離した。該回収したＤＮＡ分子を、１０単位のＰＮＫと共に３７℃で１時間、ＤＮＡリン酸化のために、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（２３℃でｐＨ７．８）、４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．５ｍＭのＡＴＰを含有する１００ｍＬの反応混合物中で定温放置した。該反応を３０ｍＭの最終濃度までのＥＤＴＡの添加により停止した。５1−リン酸化ＤＮＡを、最初の選択ラウンドについて記載したのと同じ手順を使用する第２の選択ラウンドに使用した。
【００５８】
この例において、Ｍｇ2+並びにＭｎ2+、Ｃｏ2+、Ｎｉ2+およびＣｄ2+を含む幾つかの２価遷移金属イオンが前記選択緩衝液中に含まれていた。２価金属イオンの総濃度は１５ｍＭとなるように選択し、個々の濃度は以下のように設定した：７．５ｍＭのＭｇ2+、５ｍＭのＭｎ2+、１．２５ｍＭのＣｄ2+、１ｍＭのＣｏ2+、０．２５ｍＭのＮｉ2+。他の組み合わせおよび濃度も有効であり得ることは明白である。
【００５９】
反復した選択ラウンドは高効率のデオキシリボザイムの選択を導く。選択の進行を図３Ｃに要約する。開裂活性が無いか低い開裂活性が、世代Ｇ０〜Ｇ８において単離したＤＮＡ配列に観察された。しかしながら、顕著な開裂がＧ９およびＧ１０において見られた。Ｇ１１では、ＤＮＡ構造物の３０％以上が５時間の定温放置後に開裂した。非常に有効なＤＮＡ酵素を得るため、反応時間をその後暫時減少した。自己開裂反応を、Ｇ１２において１０分間またＧ１３において１分間のみ進行させ、そして該反応時間をさらにＧ１４およびＧ１５において３０秒まで、Ｇ１６およびＧ１７において５秒まで、そして最後にはＧ１８〜Ｇ２１において１秒まで減少させた。Ｇ２２におけるＤＮＡ分子は、１分間反応させ、そして開裂されたＤＮＡはクローン化した。
【実施例６】
【００６０】
実施例６．選択したデオキシリボザイムのクローン化および配列決定
２２番目の選択ラウンドからのＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅し、そしてＴＡクローン化法によりベクター中へクローン化した。個々の触媒を含有するプラスミドを、キアゲン・ミニプレップ・キットを使用して生成した。ＤＮＡ配列決定を、製造者により推奨された手順に従いＬＣＱ２０００キャピラリーＤＮＡシークエンサー（ベックマン−カルター社製）で行った。
【実施例７】
【００６１】
実施例７．自己触媒作用性ＤＮＡ分子の単離および活性
単一種のデオキシリボザイムを、２０個以上のクローンを配列決定した後に、Ｇ２２集合中に見出した。この自己触媒作用性ＤＮＡ分子、名称ＤＥＣ２２−１８の配列を図４Ａに与える。その触媒作用活性の確認および金属イオン要求の分析を図４Ｂに示す。該ＤＮＡ酵素を、２３番目と２４番目とを結合するホスホジエステル結合で32Ｐで標識した。未開裂で１０９−ｎｔのＤＥＣ２２−１８は従って弱蛍光性（Ｑ成分が未だ存在しているから）であり、そして高放射線活性であった。図４Ｂに示すように、自己開裂により、ＤＥＣ２２−１８は２つの開裂生成物を生じさせ、５’側開裂断片（１５−ｎｔ；Ｐ１）は強蛍光性であるが放射線活性でなく、そして３’側断片（９４−ｎｔ；Ｐ２）は放射線活性のみであった。該２つの開裂生成物はＮａＯＨでの該デオキシリボザイムの部分消化により得、そして対照（第１列）として使用した。該デオキシリボザイムを水（第２列）、１価金属イオン（第３列）、Ｃｄ2+（第５列）またはＭｇ2+（第８列）で処理したとき、開裂生成物は生成せず、該ＤＮＡ酵素をＣｏ2+（第４列）、Ｎｉ2+（第６列）またはＭｎ2+（第７列）で処理したとき、それは合致する信号発生特性を持つ２つの予期されたＤＮＡ断片に自己開裂した。各場合において、未開裂のＤＥＣ２２−１８のものに対するＰ１の蛍光強度の比率は、これらの種の放射線活性の比率より大きく、結合した触媒作用−信号
発生機構と合致した蛍光増大を意味する。該データは、ＤＥＣ２２−１８が２価金属コファクターとしてＣｏ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）またはＭｎ（ＩＩ）を使用できるメタロＤＮＡ酵素であることを示す。さらなる実験は、Ｃｏ（ＩＩ）がＤＥＣ２２−１８のための好ましい金属コファクターであることを示唆した。
【実施例８】
【００６２】
実施例８．最適配列の決定
活性についての最適な配列を、ヌクレオチド切除実験を使用して決定した。切除戦略を図５に示す。ＤＥＣ２２−１８は、選択緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２３℃でｐＨ６．８、４００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＫＣｌ、７．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＭｎＣｌ2、１ｍＭのＣｏＣｌ2、０．２５ｍＭのＮｉＣｌ2、１．２５ｍＭのＣｄＣｌ2）条件下で、１．０分-1のｋobsを示す。ＤＥＣ２２−１８は１０９個のヌクレオチドからなる大きなＤＮＡ分子である。ＤＮＡ酵素配列が最小化できるか否かを決定するために、３’−末端からの様々な切除して一連のＤＮＡ分子を合成した。これらの切除した変異体を触媒作用活性について調査し、そして結果を図５に要約する（相対的活性は野生種ＤＥＣ２２−１８のものを１００として示す）。１つの態様において、該結果は、ＤＥＣ２２−１８の最後の２９個のヌクレオチドを、触媒作用活性を顕著に低減することなく除去できることを示す。他の態様において、幾つかの切除変異体は、野生種分子より有効である。好ましい態様において、最後の２６個のヌクレオチドの切除は、ＤＥＣ２２−１８Ａと記載する８３−ｎｔの酵素を生じ、それは該選択緩衝液条件下で２．１分-1のｋobsを持つ顕著に改良された触媒作用活性を有する。ＤＥＣ２２−１８Ａはさらに、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２３℃でｐＨ６．８）、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１０ｍＭのＣｏＣｌ2を含有し、１価金属イオンを伴わない溶液中に存在するとき、より有効な触媒である。この場合、自己開裂反応は、慣用の手動停止方法を使用して速度定数の正確な測定を可能にするには速過ぎた（データは示さない）。ｋobs値は、ＤＥＣ２２−１８Ａの約５０％が３秒で開裂した観察に基いて、１０分-1であると見積もることができる。
【実施例９】
【００６３】
実施例９．トランス作用性ＤＮＡ酵素の設計
トランス作用性ＤＮＡ酵素を与える。Ｍ−フォールドプログラム（http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna）により予測したＤＥＣ２２−１８Ａについての２次構造を図６Ａに示す。この構造を、ＤＥＣ２２−１８Ａ中に存在するステム−１およびそのループを８つの塩基対からなるステムと交換することにより、トランス作用性ＤＮＡ酵素系、ＤＥＴ２２−１８を首尾良く設計するために使用した。この構造を図６Ｂに示す。ＤＥＴ２２−１８は、メカエリス−メンテン速度論に従って基質Ｓ１を開裂する真のＤＮＡ酵素かつ多重代謝回転ＤＮＡ酵素である。図６Ｃは、ＤＥＴ２２−１８を５ｎＭで使用し、一方、Ｓ１の濃度が１００〜２０００ｎＭの間で変化する速度論的実験からのデータを示す。７．２±０．７分-1のｋcatおよび０．９４±０．１９ｍＭのＫMをグラフィットソフトウェアを使用して得た。これらのデータは、５８−ｎｔのＤＥＴ２２−１８が非常に有効なＤＮＡ酵素であることを示す。
【実施例１０】
【００６４】
実施例１０．ＤＥＴ２２−１８の信号発生特性
ＤＥＴ２２−１８／Ｓ１基質系の信号発生挙動を蛍光分光計を介して即時測定し、そして結果を図７に示す。最適なＣｏ（ＩＩ）濃度未満（１０ｍＭよりむしろ１ｍＭ）を、蛍光強度変化が慣用の分光法を使用して観察できるように開裂反応を鈍化するため、並びにこの金属イオンにより引き起こされる何れかの蛍光消光を最小化するために使用した。信号発生反応を２つの異なる酵素：基質比の下で調査した：（１）Ｓ１に対し１０倍過剰のＤＥＴ２２−１８（Ｅ）（図７Ａ）および（２）ＤＥＴ２２−１８に対し１０倍過剰のＳ１（図７Ｂ）。双方の場合において、該系は、Ｓ１を金属イオン単独とＤＥＴ２２−１８
を伴わずに定温放置したとき、一定の蛍光強度を有した（反応の最初の１０分）。該ＤＮＡ酵素を導入したとき、双方の溶液の蛍光強度は鋭く増加した。図７Ａ（Ｅ：Ｓ＝１０：１）において、蛍光増大（Ｆ／Ｆ０；Ｆ０は初期強度を表し、そしてＦは何れかの与えられた時間での強度を表す）は、１分以内に、７．４倍の増大が観察されるような急激な速度で増加した（挿入したグラフ参照）。図７Ｂにおいて、蛍光増大は、ＤＮＡ酵素の濃度が基質のものの１０倍低いので、予期したような低減した比率で増加した。１分の定温放置においいて３．３倍の増大があり（挿入したグラフ参照）、２．１／分の初期代謝回転率を表した（反応が完了したとき、１６倍の増大が観察された観察に基く）。これらのデータは、信号発生ＤＮＡ酵素が、広範囲の基質濃度下での信号発生のために使用できることを示す。
【実施例１１】
【００６５】
実施例１１．信号発生アロステリックＤＮＡ酵素の生成
ＤＥＣ２２−１８Ａの構造におけるステム−ループ特徴は、アロステリックデオキシリボザイムの設計のために理想的である。ＤＥＣ２２−１８ＡがアロステリックＤＮＡ酵素へと容易に設計できるか否かを決定するために、ＡＴＰアプタマーを該ＤＮＡ酵素に弱めたステム−１を通して共役させた。この構造を図８Ａに示す。ＡＴＰの不在下では、弱いステム−１は強く対合せず、そして結果としてこの構造物の触媒作用活性は相当に弱い。しかしながら、ＡＴＰが導入されると、該アプタマードメインはＡＴＰと安定な複合体を形成して、ステム−１の形成を促進し、そしてそれにより、開裂活性が顕著に増加する。
【００６６】
共役したＤＮＡ分子または“アプタザイム”を、始めに以下の反応条件下で信号発生特性について評価した：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（２３℃でｐＨ６．８）、１４ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＣｏＣｌ2、２３℃。結果を図８Ａに示す。蛍光強度は、ＡＴＰが存在しないとき（最初の５分の定温放置）、〜０．０４蛍光単位／分（ｆ．ｕ．／分）の比率で増加した。ＡＴＰの導入により（定温放置６分目でのデータ記録の前）、信号比率は〜０．１６ｆ．ｕ．／分、即ち、触媒速度の４倍の増大まで増加した。該系はＡＴＰの添加後３分のうちに、その最大信号発生能力の８０％に到達した。ＲＮＡ開裂依存性蛍光信号発生の性質を、32Ｐ−標識したＤＮＡ構造物を使用する開裂生成物のＰＡＧＥ分析により確認した。ＡＴＰによるＲＮＡ開裂の同様の４倍の活性化をＰＡＧＥ実験において観察した。
【００６７】
図８Ｂに示すデータは、アプタマー−デオキシリボザイム構造物のＲＮＡ開裂活性がＡＴＰの不在下で高いことを示唆する。これは、酵素性ドメイン単独が有効な触媒作用を与えるために十分安定かつ活性な構造を形成できることを示唆する。“自己折畳み”のこの能力がより高い温度および低減したＣｏ2+濃度で弱まるか否かを決定するために、高温および低減したＣｏ2+濃度で一連の実験を行った。図８Ｃは、３７℃および０．２５ｍＭのＣｏ2+で１ｍＭのＡＴＰ（三角）または１ｍＭのＧＴＰ（四角）の存在下で行った１組の実験からの結果を図示する。各反応混合物をＡＴＰまたはＧＴＰの不在下で最初に１０分間定温放置し、そしてＡＴＰまたはＧＴＰを反応の１１分目でのデータ記録の前に導入した。ＡＴＰの不在下およびＧＴＰを伴うか伴わない場合、反応は、９．５×１０-4ｆ．ｕ．／分の同じ信号発生比率（初期比率）で進行した。ＡＴＰの存在下では、信号発生比率は１．８×１０-2ｆ．ｕ．／分まで増加し、ＡＴＰによる約２０倍の活性化を表す。図８Ｃでのデータはまた標的報告がＡＴＰ特異的であり、ＧＴＰは顕著な信号増大を全く生じないことをも示す。より応答性のアロステリック活性とより小さな触媒速度の減少とを伴う信号発生ＤＮＡ酵素は、部分的にランダム化したＤＥＣ２２−１８配列を使用するインビトロ選択を通して入手できる。
【００６８】
当業者は、本明細書において開示された特定の態様の変法および等価法は、通常の実験のみを使用して達成できることを容易に認識するであろう。そのような変法および等価法は本願の請求の範囲に包含されることが意図される。
【００６９】
引用文献
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、リボヌクレオチド結合でのＤＮＡ鎖の開裂により生成する信号の模式図である。
【図２】図２は、信号発生配列の選択を図示する。
【図３Ａ】図３Ａは、ＲＮＡ開裂ＤＮＡ酵素の選択方法の模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに図示した方法に従いＤＮＡ酵素を選択するために使用する例示的な配列を図示する。
【図３Ｃ】図３Ｃは、様々な選択条件下での酵素活性をグラフにより図示する。
【図４Ａ】図４Ａは、シス作用性ＤＮＡ酵素の配列を図示する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａに図示した酵素の信号発生特性を図示する。
【図５】図５は、信号発生活性についての３’側切除の効果を図示する。
【図６Ａ】図６Ａは、シス作用性ＤＮＡ酵素、ＤＥＣ２２−１８Ａの２次構造を図示する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、トランス作用性ＤＮＡ酵素、ＤＥＴ２２−１８の提案される２次構造を図示する。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＤＥＴ２２−１８の速度論的分析のグラフ図である。
【図７Ａ】図７Ａは、酵素が過剰であるときの、ＤＥＴ２２−１８の即時信号発生能力を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、基質が過剰であるときの、ＤＥＴ２２−１８の即時信号発生能力を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、アプタマー配列が信号発生ＤＮＡ酵素に結合したアロステリックＤＮＡＳ酵素を図示する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、アプタマー標的の導入に基く活性アッセイをグラフにより図示する。
【図８Ｃ】図８Ｃは、信号発生構造物の標的特異性を示す。
【配列表】
2005517409.tif 000003
2005517409.tif 000004
2005517409.tif 000005
2005517409.tif 000006
2005517409.tif 000007
2005517409.tif 000008
【図１】
2005517409.tif 000009
【図２】
2005517409.tif 000010
2005517409.tif 000011
【図３Ａ】
2005517409.tif 000012
【図３Ｂ】
2005517409.tif 000013
【図３Ｃ】
2005517409.tif 000014
【図４】
2005517409.tif 000015
【図４Ｂ】
2005517409.tif 000016
【図５】
2005517409.tif 000017
【図６Ａ】
2005517409.tif 000018
【図６Ｂ】
2005517409.tif 000019
【図６Ｃ】
2005517409.tif 000020
【図７Ａ】
2005517409.tif 000021
【図７Ｂ】
2005517409.tif 000022
【図８Ａ】
2005517409.tif 000023
【図８Ｂ】
2005517409.tif 000024
【図８Ｃ】
2005517409.tif 000025
【国際調査報告】
2005517409.tif 000026
2005517409.tif 000027
2005517409.tif 000028
2005517409.tif 000029
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