(57)【要約】本発明は、４５位に荷電アミノ酸あるいはＣのいずれでもないアミノ酸を含み、かつ、１０３位にＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｌ、およびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸および所望により１０８位にＱ、Ｌ、およびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸を含み、該位置がカバット番号付けにより決定される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸を含み、かつ、１０３位にＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｌ、およびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸、および所望により、１０８位にＱ、ＬおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸を含み、該位置はカバット番号付けに従って決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１３（ＲＧＱＧＴＱ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項３】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１４（ＲＧＫＧＴＱ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項４】
配列番号１５（ＶＸＸＸＸＸＸＧＬＸＷ）を含み、Ｘはアミノ酸であり、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項５】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１６（ＬＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項６】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１７（ＱＧＱＧＴＧＶＴＶＳＳ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項７】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１８（ＰＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項８】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１９（ＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項９】
配列番号１〜１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１０】
配列番号１、３、５、７または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１１】
配列番号２、４、６、８または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１２】
配列番号１、２、３、４または５のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１３】
配列番号６、７、８、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１４】
配列番号５、６、７、８または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１５】
配列番号１、３、７、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１６】
配列番号２、５、８、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１７】
配列番号３、４、５、６または７のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１８】
配列番号４、６、７、８または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１９】
配列番号２０〜７９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２０】
前記高分子がラクダ由来である、請求項１〜１９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２１】
前記高分子がヒト由来である、請求項１〜１９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２２】
前記高分子がマウス由来である、請求項１〜１９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２３】
前記高分子がラクダ、ヒトおよびマウス以外の脊椎動物由来である、請求項１〜１９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２４】
人工変異型である、請求項１〜２３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２５】
前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片のペプチド同族体である、請求項１〜２４のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片を含むポリペプチド。
【請求項２７】
１つまたはそれ以上のアミノ酸が誘導体化される、請求項１〜２６のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ，Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、かつ、所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、該位置はカバット番号付けにより決定される、重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片を機能化する方法。
【請求項２９】
１０３位のアミノ酸をＲで置換し、該位置はカバット番号付けにより決定される重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片を機能化する方法。
【請求項３０】
４５位のアミノ酸をＬで置換し、かつ、所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで置換し、かつ、１０３位のアミノ酸をＲで置換することを含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片をヒト化し、かつ、機能化する方法。
【請求項３１】
４５位のアミノ酸をＬで置換し、１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、かつ、所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで置換し、かつ、所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、該位置はカバット番号付けにより決定される、重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片をヒト化し、かつ、機能化する方法。
【請求項３２】
前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片はヒトまたはマウス由来である、請求項２８および２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片はヒトおよびマウス以外の脊椎動物種由来である、請求項２８および２９に記載の方法。
【請求項３４】
４５位のアミノ酸をＬで置換し、かつ、所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで置換することを含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ラクダ科動物ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片をヒト化する方法。
【請求項３５】
４５位のアミノ酸をＬ、ＶおよびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されたアミノ酸で置換し、かつ、３７位のアミノ酸をＦで置換し、４４位のアミノ酸をＧで置換し、４７位のアミノ酸をＷで、１０３位のアミノ酸をＲで置換し、そして、所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換することを含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片をラクダ化する方法。
【請求項３６】
請求項２８〜３３および３５に記載の方法によって得られうる機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項３７】
請求項２８〜３３および３５に記載の方法によって得られた機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法によって得られうる、機能的ヒト化ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ヒト化ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ヒト化ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片。
【請求項３９】
請求項３４に記載の方法によって得られた機能的ヒト化ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ヒト化ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ヒト化ＶＨドメインまたはそれらの機能的ヒト化断片。
【請求項４０】
人工変異型である、請求項３６〜３９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片。
【請求項４１】
前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片のペプチド同族体である、請求項３６〜４０のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片。
【請求項４２】
請求項３６〜４１のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片を含むポリペプチド。
【請求項４３】
１以上のアミノ酸が誘導体化されている、請求項３６〜４１のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項３６〜４３のいずれか１に記載の１以上の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片を含むライブラリー。
【請求項４５】
以下の工程を含む、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片を含むライブラリーの作成方法；
ＶＨ鎖のフレームワーク４領域のコード領域に制限酵素認識部位を導入し、該制限酵素認識部位の切断部位は、ＣＤＲ３領域中に位置し、
前記コード配列を含む核酸分子を前記制限酵素で切断し、
２本鎖プライマーをＶＨコード核酸分子に結合し、ＣＤＲ３を修復し、そして、１０３位にアミノ酸Ｒを導入し、該位置はカバット番号付けにより決定され、そして
結合した断片を増幅する。
【請求項４６】
前記制限酵素切断は、ＣＤＲ３コード領域の最後の２つのコドン内に位置する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記制限酵素は、１０１位アミノ酸をコードするコドンの第１ヌクレオチドの前で、かつ、相補鎖の１０１位アミノ酸をコードするコドンの第２ヌクレオチドの後を切断して、ＧＡ３´粘着末端を作成し、該位置はカバット番号付けにより決定される、請求項４５および４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記制限酵素切断は、ＣＤＲ３コード領域の最終コドン内に位置する、請求項４５〜４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記制限酵素は１０２位アミノ酸をコードするコドンの第２ヌクレオチドの前で、かつ、相補鎖の１０２位コドンの第３ヌクレオチドの後を切断して、ＣＡ３´粘着末端を作成し、該位置はカバット番号付けにより決定される、請求項４５〜４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記制限酵素は、ＢｐｍＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＢｓｇＩ、ＳｍｕＩ、ＦａｕＩ、ＢｓｅＲＩ、およびＢｆｉＩからなる群から選択される、請求項４５〜４９に記載の方法。
【請求項５１】
フォワードプライマーとしてフレームワーク１特異的プライマー、およびその３´末端の３つのヌクレオチドが１０３位のアミノ酸をコードする核酸鎖のコドンを超えた位置にあるように、前記核酸鎖にアニールするバックプライマーを使用して、該３´末端の３つのヌクレオチドの逆相補体がＲ１０３、Ｋ１０３、Ｑ１０３、Ｐ１０３、Ｇ１０３またはＳ１０３をコードし、該位置はカバット番号付けにより決定される、免疫または非免疫ＶＨＨ抗体のレパートリーをコードする核酸鎖を増幅する工程を含む、少なくとも１つの機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片を含むライブラリーの作成方法。
【請求項５２】
フォワードプライマーとしてフレームワーク１特異的プライマーを使用し、バックプライマーとして配列番号８０〜８８の１つまたはそれ以上を使用する、免疫または非免疫ＶＨＨ抗体またはそれらの断片のレパートリーをコードする核酸の増幅工程を含む、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片を含むライブラリーを作成する方法。
【請求項５３】
請求項４５〜５２のいずれか１に記載の方法によって得られうる、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片を含むライブラリー。
【請求項５４】
請求項４５〜５２のいずれか１に記載の方法によって得られた、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片を含むライブラリー。
【請求項５５】
前記方法がヒトまたはマウス由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する、請求項５３〜５４に記載のライブラリー。
【請求項５６】
前記方法がラクダ由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する、請求項５３〜５４に記載のライブラリー。
【請求項５７】
前記方法がラクダ、ヒトまたはマウス以外の脊椎動物由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する、請求項５３〜５４に記載のライブラリー。
【請求項５８】
請求項２８〜３５に記載の方法によって得られた免疫分析に使用するための重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片。
【請求項５９】
細胞中で前記抗体の転写および翻訳を調節する制御配列および該制御配列によって調節されたコード配列を含む構築物を含有する細胞中でポリペプチドの発現に有用な組換えＤＮＡ構築物であって、前記コード配列は、ＤＮＡ配列が請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または請求項２６および４２に記載のポリペプチドをコードするように、読取り枠中に少なくとも２１ｂｐのＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構築物。
【請求項６０】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片および請求項２６および４２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸。
【請求項６１】
請求項６０で規定される配列と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項６２】
請求項６０および６１のいずれかに記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項６３】
請求項６０および６１に記載の核酸分子の組込みまたはエピソームのコピーまたは請求項６２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６４】
前記宿主細胞は酵母、細菌、昆虫、真菌、植物または哺乳動物細胞である、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
（ａ）ポリペプチドの発現を可能とする条件下に、請求項６０および６１のいずれか１に記載の核酸を含む宿主細胞を培養し、そして、
（ｂ）培養物から産生されたポリペプチドを回収することを含む、
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチドを産生する方法。
【請求項６６】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチド、または請求項６０および６１のいずれか１に記載の核酸の薬物調製のための使用。
【請求項６７】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチド、または請求項６０および６１のいずれか１に記載の核酸の、喘息、鼻結膜炎、アレルギー性障害、急性同種移植拒絶反応、クローン病および潰瘍性大腸炎に関する疾患の治療用薬物調製のための使用。
【請求項６８】
所望により好適な賦形剤と組み合わせた、請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチド、または請求項６０および６１に記載の核酸を含む薬剤組成物。
【請求項６９】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチド、または請求項６０および６１に記載の核酸の喘息、鼻結膜炎、アレルギー性障害、急性同種移植拒絶反応、クローン病および潰瘍性大腸炎に関する疾患の診断への使用。
【請求項７０】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチドのタンパク精製のための使用。
【請求項７１】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチドのタンパク精製のための使用。
【請求項７２】
請求項６０および６１に記載の核酸、請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または請求項２６および４２に記載のポリペプチドを含む、被検者の病理学的状態または病理学的状態に対する感受性の診断のためのキット。
【請求項７３】
（ａ）生体試料中の前記核酸のゲノムおよび制御配列の変異を含む、請求項６０および６１のいずれかに記載の核酸中の変異の存否を決定し、そして
（ｂ）該変異の存否に基づく病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程を含む、
被検者の病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法。
【請求項７４】
（ａ）生体試料中の請求項６０および６１に記載の核酸の存在または量、または請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または請求項２６および４２に記載のポリペプチドの発現を測定し、そして
（ｂ）前記核酸の存在または量、または機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、それらの機能的断片またはポリペプチドの発現に基づく病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程を含む、
被検者の病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法。
【請求項７５】
（ａ）請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、または機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチドを、前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、その機能的断片またはポリペプチドと試験化合物との相互作用を可能とする条件下に、試験化合物と組み合わせて、複合体を生成し、そして、
（ｂ）前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはその機能的断片と相互作用する試験化合物の能力が、複合体中の試験化合物の存在によって示される複合体の生成を検出することを含む、
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチドと相互作用する試験化合物をスクリーニングするための医薬スクリーニング分析法。
【請求項７６】
請求項７５に記載の分析法によって同定され得る生産物または化合物。
【請求項７７】
配列番号８０の配列を含む核酸。
【請求項７８】
配列番号８１の配列を含む核酸。
【請求項７９】
配列番号８２の配列を含む核酸。
【請求項８０】
配列番号８３の配列を含む核酸。
【請求項８１】
配列番号８４の配列を含む核酸。
【請求項８２】
配列番号８５の配列を含む核酸。
【請求項８３】
配列番号８６の配列を含む核酸。
【請求項８４】
配列番号８７の配列を含む核酸。
【請求項８５】
配列番号８８の配列を含む核酸。
【請求項８６】
請求項７７〜８５に規定される配列と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項８７】
１以上の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片を産生するための方法における請求項７７〜８６に記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は機能的重鎖抗体、その断片およびそのライブラリーに関する。また、機能的重鎖抗体、その断片およびそのライブラリーを産生する方法に関する。さらに、機能的重鎖抗体、その断片およびそのライブラリーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧイソタイプは血清中に見出される最も豊富な免疫グロブリンである。全ての哺乳動物では、これは２つの同一重（Ｈ）鎖と２つの同一軽（Ｌ）鎖から構成される。したがって、この構造を有する免疫グロブリンは４本鎖免疫グロブリンと命名される。４本鎖免疫グロブリンのＨ鎖は、４つのドメインおよび第２と第３ドメインの間にヒンジ領域を含む。Ｌ鎖は２つのドメインを有する。Ｌ鎖およびＨ鎖の両方のＮ末端ドメインは残りのドメインよりも可変性であり、Ｖドメイン（それぞれ、ＶＬとＶＨ）として知られている。ＶＨ中の３つのループおよび対になるＶＨ−ＶＬドメイン内のＶＬ並列内の３つのループは、抗原結合部位を構成する。これらのループは順に超可変性であり、相補性決定領域、即ちＣＤＲと命名される。４本鎖免疫グロブリンの一般的構造の説明は、ロイット（Roitt）Iら編集、「免疫学」、MEDSI/McGRAWHILL（非特許文献１）に記載される。
【０００３】
多くの抗原結合多様性および実質的に全ての可能性ある外来物質に対して堅固な抗原結合体を生成する抗体反応は、数千分の１の可能性あるＶＨと数千分の１の可能性あるＶＬとのランダムな対形成から生じる。より保存された配列を有し、ＣＬと表示されるＬ鎖の第２ドメインは、やはり保存された配列を有するＨ鎖の第２ドメイン（ＣＨ１）と会合する。
【０００４】
重鎖病として知られているヒトの病理学的異常は、Ｌ鎖を含まない抗体が血清中に存在することに特徴付けられる。さらに、これらの抗体はそのＶＨならびにＣＨ１の重要な部分を欠いているが、欠けているＶＨおよびＣＨ１領域は異なったＨＣＡｂ（重鎖抗体）中では広く変化している。Ｈ鎖中の欠失はＶＨおよびＣＨ１ドメインの再構築されたＨ鎖関与部分の欠失による。これらの抗体はＶＬが存在せず、かつ、ＶＨの大部分も存在しないから、もはや抗原を認識しない。ＣＨ１に会合するシャペロンタンパク（ＢＩＰなど）は、ＢＩＰがＬ鎖によって置換されるまで、小胞体中のＨ鎖を保持するから、ＨＣＡｂはＢ細胞から分泌され得る。ＣＨ１ポリペプチドドメインを欠く場合、ＢＩＰは小胞体中に切断されたＨ鎖をもはや保持せず、かつ、Ｌ鎖は結合することができず、Ｈ鎖が直ちにホモ二量体として分泌されるという結果になる。
【０００５】
同様な非機能性ＨＣＡｂもまた、マウスモノクローナルセルラインに出現すると報告されている。
【０００６】
ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ）の血清中に、我々は４本鎖免疫グロブリン、さらに、多量の機能的ＨＣＡｂの存在を見出した。これらの機能的ＨＣＡｂはヨーロッパ特許出願第０６５６９４６号（特許文献１）およびハマーズ・キャスターマン(Hamers-Casterman)ら、（１９９３）（非特許文献２）、ヴュ(Vu)ら、（１９９７）（非特許文献３）およびミュイルダーマンズ(Muyldermans)ら、（２００１）（非特許文献４）を含む種々の刊行物に記載されている。これらは病理学的状態の結果として存在するヒト／マウスＨＣＡｂとは、いくつかの点で相違する。まず、これらは抗原結合において機能的である。この点では、ラクダ科動物で見出されたＨＣＡｂは機能的正常免疫グロブリンである。第２に、ラクダ科動物では全ＣＨ１ドメインは失われ、Ｖドメインは原型を保っているが、ＨＣＡｂは正常ＶＨ配列からいくつかの部位で逸脱している配列を有する。この機能的ＨＣＡｂはホモ二量体分子として生じる。
【０００７】
しかしながら、ＣＨ１はヒトコブラクダ（およびラマ）の全γ−遺伝子の生殖系列中にコードされ、ヒンジエクソンの５´末端でＶエクソンの３´末端をスプライシングすることによって、機能的ＨＣＡｂをコードするｍＲＮＡから除かれている。すなわち、ＣＨ１はイントロンの部分であり、かつ、コンセンサススプライシングシグナル配列の単一点突然変異ゆえにエクソンとしてもはや認識されない。ラマおよびヒトコブラクダは、前部(former)ＣＨ１エクソンに同じ点突然変異を保有し、この発見はこれらのγ遺伝子が互いに分岐進化したラマおよびラクダ以前に出現したことを示す。全てのｍＲＮＡがこのスキームによってスプライシングされるから、ｍＲＮＡの異なったスプライシング活性は代替スプライシングとはならない。それゆえ、これらのγ遺伝子は、除去されたＣＨ１を有するＨ鎖に常に生じるであろう。他のγ遺伝子はＣＨ１ドメインを有する共通したＨ鎖を産生するために使用される。
【０００８】
機能的ＨＣＡｂのＨ鎖のＶドメイン（正常な、すなわち免疫学的に活性なＨＣＡｂのＨ鎖の可変ドメイン、ＶＨＨと呼ぶ）は、ＶＬ（またはＣＨ１）ドメインにもはや接触していない領域中で、かつ、抗原結合性（すなわち、抗原結合部位）に関与する領域中で、ＶＨ（すなわち、従来の４本鎖抗体のＨ鎖のＶドメイン）に対する適応性を得ると予測される。
【０００９】
例えば、チョシア(Chothia)ら、（１９８５）（非特許文献５）は上記文献中で、保存されたＶａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５およびＴｒｐ４７が、従来の４本鎖ＩｇＧ中の空間に密集し、ＶＬとの重要な疎水性接触となることを結晶学的データから明らかにしている。彼らは、ＶＨアミノ酸、Ｇｌｎ３９、Ｔｙｒ９１、Ｔｒｐ１０３およびＧｌｕ１０５がＶＬ会合において重要であると認識されることも補足していた。さらに、デスマイター(Desmyter)ら、（１９９６）（非特許文献６）はラクダ科動物に存在し、ＶＬと相互作用する従来のＩｇＧのＶＨサイドに対応するＶＨＨドメインの表面は、ラクダ科動物ＶＨＨ中で有意に新形態となることを観察している。本発明では、アミノ酸残基の番号付けは、http://www.bioing.org.uk/sbsで入手可能なカバットデータベースにおいて使用されるカバット番号付け（カバット(Kabat)Ｅ、１９９１）（非特許文献７）を参考にして行う。
【００１０】
ＶＬと相互作用することが知られている１２のＶＨ位置にもっとも頻繁に生じるアミノ酸残基は、３３２の脊椎動物のＶＨセグメントにおいて測定されている。本発明の目的において、可変性重ポリペプチド鎖のタンパクドメインは「ＶＨ」と呼ばれ、対応するＤＮＡがＶＨ生殖系列、多様性Ｄミニ遺伝子およびＪミニ遺伝子から構築されるから、ＶＨ−Ｄ−Ｊと命名される。実際には、ＣＤＲ３およびＦＲ４はＶＨでコードされていないが、それらはＶＨまたは（ＶＨＨ）生殖系列で組換えられているＤおよびＪミニ遺伝子でもってもたらされる。
【００１１】
比較のために、アミノ酸コンセンサスは対応する位置の４２のヒトコブラクダ生殖系列ＶＨＨ配列において推定されている。４つの位置（３９、４３、６０および９１、カバット番号付け）の好ましいアミノ酸残基は、ＶＨおよびＶＨＨ中で不変である。対照的に、４つの他の部位（３３、３５、５０および５８）でＶＨまたはＶＨＨ配列のいずれも顕著なアミノ酸優先度を示していない。後者ＶＨ部位でのＶＬとの可能性ある接触は、ＶＨおよびＶＬドメイン間の実際の角度に依存し、これは観察されたアミノ酸の縮重を説明する。この領域のＶＨおよびＶＨＨタンパク間の唯一の重大な相違点は、３７、４４、４５および４７の位置に関する。これらはＶＨ表現型の中の高度に保存されたアミノ酸残基（すなわち、Ｖａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５およびＴｒｐ４７）であるが、ＶＨＨ中では、本発明者らはもっとも頻繁にＰｈｅ３７（またはＴｙｒ）、Ｇｌｕ４４、Ａｒｇ４５（またはＣｙｓ）およびＧｌｙ４７（またはＬｅｕ）を観察した。これらの比較は、Ｌ鎖欠如に応答して生じるラクダＶＨＨ特異的「特徴」残基のこれまでの同定を実証する。
【００１２】
グエン(Nguyen)ら、（２０００）（非特許文献８）によって発表された結果から、ＶＨＨおよびＶＨ遺伝子はヒトコブラクダゲノム中にインプリントされることが明らかになっている。ＶＨおよびＶＨＨ遺伝子はおそらく同じ座位に存在している。ＶＨおよびＶＨＨ生殖系列遺伝子は、従来の４本鎖抗体のＨ鎖を有する同じＤおよびＪ遺伝子を使用することが注目されていた。ＰＣＲによって、約５０ＶＨおよび約４０ＶＨＨ生殖系列遺伝子がヒトコブラクダ中で確認された。各ＰＣＲ断片はリーダーシグナルエクソンおよびＣＤＲ３が開始すべき箇所で終わるＶエクソンを含む。ＣＤＲ３およびＦＲ４は組換えＤ−Ｊセグメントによってもたらされる。ＶＨ生殖系列セグメントはＶａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５およびＴｒｐ４７のコドンを有し、ＶＨＨ生殖系列ミニ遺伝子はＰｈｅ３７（１１ｘ）Ｔｙｒ３７（３０ｘ）、あるいは１つのシングルケースでは、Ｖａｌ３７；Ｇｌｕ４４またはＧｌｎ４４（８ｘ）；Ａｒｇ４５（３７ｘ）またはＣｙｓ４５（５ｘ）およびＧｌｙ４７（６ｘ）またはＬｅｕ４７（２４ｘ）またはＴｒｐ４７（８ｘ）またはＰｈｅ４７（３ｘ）を所有する。さらに、これらのＶＨＨ生殖系列遺伝子は、常に（１を除いて）４５位またはＣＤＲ１領域（コドン３０、３２または３３）にＣｙｓコドンを含む。ＣＤＲ２（大きさが１６または１７個のアミノ酸）の長さおよび特別なＣｙｓの位置に基づいて、ＶＨＨ生殖系列セグメントはサブファミリーにグループ化された。いくつかのサブファミリーは様々なメンバーを有していたが、他のサブファミリーはゲノム中により多く欠乏している。しかしながら、発現したＨＣＡｂ中のこれらのＶＨＨ生殖系列遺伝子の出現頻度は、まったくゲノム中のその出現頻度に関連していないことに注目すべきである。４５位またはＣＤＲ１のまわりのＣｙｓは再配列されたＶＨＨ−Ｄ−Ｊセグメント中に正常に保持され、かつ、これらの再配列産物はＣＤＲ３中にも特別なＣｙｓを得ている。同様に、そのＣＤＲ３中に特別なＣｙｓを生成することができないＶＨＨ−Ｄ−Ｊ再配列は、明らかに体性過剰変異によって、またはＢ細胞受容体編集によって、おそらくＣｙｓ４５またはＣＤＲ１中のＣｙｓをノックアウトするであろう。Ｂ細胞受容体編集とは、ほとんど機能的でなく、あるいは自己抗原を認識しない既存のＶ−Ｄ−Ｊ組換え産物中に、上流未再配列Ｖセグメントが組換えられるメカニズムである。
【００１３】
ヒトコブラクダにおいて、ＶＨＨドメインはＶＨドメインの長さよりも長いＣＤＲ３をも保有する（平均長１７〜１８対９）。より長いＣＤＲ３を生成する３つの可能性が予見され得る。前記ＶＨＨは２以上のＤミニ遺伝子を使用してもよい。しかしながら、これは異なった組換えシグナル配列（１２〜２３スペーサールール）でもって、２つのミニ遺伝子を組換える必要性を考えるとありえない。また、Ｄ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ組換え中でより活性なターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは、数種の非鋳型コードヌクレオチドを加えるであろう。最後に、長さの違いは、長いＣＤＲ３を有するＶＨＨドメインまたは短いＣＤＲ３を有するＶＨドメインの画分が機能的となり、抗原と相互作用する傾向が強い選択のみによることは考慮されるべきである。後者の２つの説明の組み合わせも関連しているようである。
【００１４】
３７、４４、４５または４７位のＶＨＨ特徴の存在またはＶＨＨ特徴中へのＶＨの置換が、可溶性１本鎖ドメイン抗体断片の形成となり得ると繰り返し提案されている。これらのうち、４５位のアミノ酸は単離されたドメインをより可溶性とするＡｒｇ４５によるヒトＶＨドメインのＬｅｕ４５の置換として重要であると考えられていた。このラクダ化ヒトＶＨは、適当に折りたたまれた免疫グロブリン構造を有する（リーチマン(Riechman)、１９９６、「ラクダ化された単一ドメインＶＨ抗体の解構造(solution  structure)中における前部ＶＬ界面の再配列」）（非特許文献９）。
【００１５】
しかしながら、チョシア(Chothia)ら、（１９８５）（非特許文献５）の研究は、ＶＨ遺伝子セグメントがコードする３５、３７、３９、４４、４５、４７、９１、９３位、ＣＤＲ３の部分である９５、１００、１０１位およびＪ遺伝子セグメントがコードする１０３、１０５位のＶＨアミノ酸がＶＬ相互作用における重要な関与物質であることを明らかにした。これらのうち、アミノ酸３７、４５、４７はＶＨとＶＨＨの間で大きく異なる。１０３位はＶＨ−ＶＬ複合体中に十分に隠されている保存Ｔｒｐで占められ、Ｌｅｕ４５およびＴｒｐ４７の後でＶＬとの最も大きな接触表面をもたらす（チョシア(Chothia)ら（非特許文献５）、図２）。このＴｒｐ１０３はＪ遺伝子によってコードされ、かつ、Ｊ遺伝子がＶＨ−Ｄ−ＪおよびＶＨＨ−Ｄ−Ｊ組換えで共通して使用されるから、ＶＨＨの１０３位Ｔｒｐも同様に推定することは道理にかなっている。ＶＨ−ＶＬ会合も疎水性相互作用によって仲介されるから、荷電親水性Ａｒｇによる大きな芳香族でかつ疎水性のＴｒｐ１０３残基の置換は、ＶＬとの会合、および代わりの軽鎖の会合も同様に阻止するであろうことは明らかである。ＷＯ９２／０１７８７は、３７、３９、４５、４７、９１、９３または１０３位の１つ以上のアミノ酸残基を変化させた合成可変免疫グロブリン重鎖ドメインである単鎖可変ドメインを特許請求する。これによって、１０３位のトリプトファンはグルタミン酸、チロシンまたはスレオニンに変更される。しかしながら、アルギニン、グリシン、リジン、プロリンまたはセリンによる１０３位トリプトファンのみの置換は、機能的重鎖抗体を得るには十分である特徴は存在しない。この変異は４５位の荷電アミノ酸またはシステインの欠如を代償せず、また、この変異は単一ドメイン重鎖抗体断片の大きな溶解性を生じないであろう。
【００１６】
例えば、細菌過剰発現技術、ファージディスプレイライブラリーによる抗体の産生は、抗体またはその断片が低く発現され、不溶性であり、かつ、誤って折りたたまれることから技術的に困難であることは当該分野で公知である。抗体ライブラリーのスクリーニングが可溶性であるものに制限され、それゆえ、潜在的に活性な抗原結合領域を有する抗体の大きな画分を排除することも公知である。すなわち、治療に有用である結合体は、スクリーニングから除外されるであろう。
【特許文献１】ヨーロッパ特許出願第０６５６９４６号
【特許文献２】ＷＯ９２／０１７８７
【非特許文献１】Roitt Iら編集、「免疫学」、MEDSI/McGRAWHILL
【非特許文献２】Hamers-Casterman C" Atarhouch, T., Muyidermans, S., Robinson,G.,Hamers,C.;Songa E.B., Bendaham, N. and Hamers, R. (1993).Nature,363:446-448.
【非特許文献３】Vu, K.B., Ghahroudi, M.A., Wyns, L. and Muyidermans,S.(1997).MolImmunol, 34, 1121-1131.
【非特許文献４】Muyidermans, S., Cambillau, C. and Wyns, L. (2001). TrendsBiochemSci,26:230-235.
【非特許文献５】Chothia, Novotny, Bruccoleri Karplus, (1985), J.Mol.Biol. 186, 651-663.
【非特許文献６】Desmyter et al , (1996), Nature structural biology, v3: 803-811.
【非特許文献７】Kabat, E.; Wu,T.,T.; Pefry,H.,M.; Gottesman,K.,S.;Foeller.C.1991,USPublic Health Services, NIH, Bethesda, Md.
【非特許文献８】Nguyen, V.K., Hamers, R., Wyns, L. and Muyidermans, S. (2000).EMBOJ,19:921-930.
【非特許文献９】Riechman (1996), J.Mol.Biol. 259: 957-969.
【非特許文献１０】Harmsen, M.M., Ruuls, R.C., Nijman, I.J., Niewold,T.A.,Frenken,LG.J.and de Geus, B. (2000). Mol Immunol, 37: 579-590.
【非特許文献１１】Anker, R., Zavala, Fand Pollok, B.A. (1990). EurJ lmmunol20:2757-2761.
【非特許文献１２】Chukwuocha, R" Hsiao, E.T., Shaw, P., Witztum, J.L.andChen,P.P.(1999). J Immunol 163: 4604-4611.
【非特許文献１３】Nuttall, S.D., lrving, R.A. and Hudson, P.J.(2000).CurrPharmBiotechnol,  1: 253-263.
【非特許文献１４】Pessi, A., Bianchi, E., Crameri, A., Venturi, S.,Tramonatno,A.andSolazzo, M. (1993). Nature, 362:367-369.
【非特許文献１５】Quiocho, F.A. (1993). Nature, 362: 293-294.
【非特許文献１６】Dimasi, N., Martin, F., Volpari, C., Brunetti, M.,Biasiol,G.,Altamura,S., Cortese, R., De Francesco, R., Steinkuhler, C. andSollazzo,M.(1997). JVirol, 71: 7461-7469.
【非特許文献１７】Bodtger, U., Poulsend, L.K., Jacobi, H.H. andMalling,H.J.(2002).Allergy 57: 297-305.
【非特許文献１８】Babu, K.S., Arshad, S.H. and Holgate, S.T. (2001).ExpertOpinBiol1:1049-1058.
【非特許文献１９】Sollinger, H., Kaplan, B., Pescovitz, M.D., Philosophe,B.,Roza,A.,Brayman, K. and Somberg, K. (2001). Transplantation 72: 1915-1919.
【非特許文献２０】Hommes, D.W., van de Heisteeg, B.H., van der Spek,M.,Bartelsman,J.F.and van Deventer, S.J. (2002). Inflamm Bowel Dis 8: 81-86.
【非特許文献２１】Gordon,  F.H"  Hamilton,  M.I.,  Donoghue,  S.,  Greenlees,  C.,  Palmer,  T.,  Rowley-Jones,D.,Dhillon,A.P.,Amiot, P.L. and Pounder, R.E. (2002). Aliment Pharmacol Ther16:699-705.
【非特許文献２２】Hoogenboom H.R., Griffiths A.D., Johnson K.S., Chiswell D.J.,HudsonP.,andWinter, G. (1991). NucleicAcid Res 19:4133-4137.
【非特許文献２３】Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987) Anal Biochem 162: 156-159.
【非特許文献２４】Ghahroudi,  M.A.  Desmyter, A., Wyns,  L,  Hamers,  R.  and Muyidermans,  S.(1997).FEBSLetters414: 521-526.
【非特許文献２５】Ameloot, P., Declercq, W., Fiers, W., Vandenabeele, P.andBrouckaert,P.(2001), J Biol Chem 276: 27098-27103.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
新規な治療剤の発見に関与する研究者には、機能的抗体およびその断片を産生する方法が必要である。新規な治療剤の発見に関与する研究者には、機能的抗体を含む抗体ライブラリーが必要である。新規な治療剤の発見に関与する研究者には、抗体を機能化する方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の１つの実施態様は、４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸を含み、１０３位にＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｌ、およびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸を含み、かつ、所望により、１０８位にＱ、ＬおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸を有し、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。  
【００１９】
本発明の他の実施態様は、４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１３（ＲＧＱＧＴＱ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２０】
本発明の他の実施態様は、４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１４（ＲＧＫＧＴＱ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２１】
本発明の他の実施態様は、配列番号１５（ＶＸＸＸＸＸＸＧＬＸＷ）を含み、Ｘはアミノ酸であり、該位置はカバット番号付けにより決定される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２２】
本発明の他の実施態様は、４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１６（ＬＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２３】
本発明の他の実施態様は、４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１７（ＱＧＱＧＴＧＶＴＶＳＳ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２４】
本発明の他の実施態様は、４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１８（ＰＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２５】
本発明の他の実施態様は、４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１９（ＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、該位置はカバット番号付けにより決定される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２６】
本発明の他の実施態様は、配列番号１〜１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２７】
本発明の他の実施態様は、配列番号１、３、５、７または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２８】
本発明の他の実施態様は、配列番号２、４、６、８または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００２９】
本発明の他の実施態様は、配列番号１、２、３、４または５のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３０】
本発明の他の実施態様は、配列番号６、７、８、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３１】
本発明の他の実施態様は、配列番号５、６、７、８または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３２】
本発明の他の実施態様は、配列番号１、３、７、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３３】
本発明の他の実施態様は、配列番号２、５、８、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３４】
本発明の他の実施態様は、配列番号３、４、５、６または７のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３５】
本発明の他の実施態様は、配列番号４、６、７、８または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３６】
本発明の他の実施態様は、配列番号２０〜７９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３７】
本発明の他の実施態様は、配列番号１を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３８】
本発明の他の実施態様は、配列番号２を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００３９】
本発明の他の実施態様は、配列番号３を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４０】
本発明の他の実施態様は、配列番号４を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４１】
本発明の他の実施態様は、配列番号５を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４２】
本発明の他の実施態様は、配列番号６を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４３】
本発明の他の実施態様は、配列番号７を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。  
【００４４】
本発明の他の実施態様は、配列番号８を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４５】
本発明の他の実施態様は、配列番号９を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４６】
本発明の他の実施態様は、配列番号１０を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４７】
本発明の他の実施態様は、配列番号２０を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４８】
本発明の他の実施態様は、配列番号２１を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００４９】
本発明の他の実施態様は、配列番号２２を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５０】
本発明の他の実施態様は、配列番号２３を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５１】
本発明の他の実施態様は、配列番号２４を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５２】
本発明の他の実施態様は、配列番号２５を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５３】
本発明の他の実施態様は、配列番号２６を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５４】
本発明の他の実施態様は、配列番号２７を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５５】
本発明の他の実施態様は、配列番号２８を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５６】
本発明の他の実施態様は、配列番号２９を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５７】
本発明の他の実施態様は、配列番号３０を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５８】
本発明の他の実施態様は、配列番号３１を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００５９】
本発明の他の実施態様は、配列番号３２を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６０】
本発明の他の実施態様は、配列番号３３を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６１】
本発明の他の実施態様は、配列番号３４を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６２】
本発明の他の実施態様は、配列番号３５を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６３】
本発明の他の実施態様は、配列番号３６を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６４】
本発明の他の実施態様は、配列番号３７を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６５】
本発明の他の実施態様は、配列番号３８を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６６】
本発明の他の実施態様は、配列番号３９を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６７】
本発明の他の実施態様は、配列番号４０を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６８】
本発明の他の実施態様は、配列番号４１を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００６９】
本発明の他の実施態様は、配列番号４２を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７０】
本発明の他の実施態様は、配列番号４３を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７１】
本発明の他の実施態様は、配列番号４４を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７２】
本発明の他の実施態様は、配列番号４５を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７３】
本発明の他の実施態様は、配列番号４６を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７４】
本発明の他の実施態様は、配列番号４７を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７５】
本発明の他の実施態様は、配列番号４８を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７６】
本発明の他の実施態様は、配列番号４９を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７７】
本発明の他の実施態様は、配列番号５０を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７８】
本発明の他の実施態様は、配列番号５１を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００７９】
本発明の他の実施態様は、配列番号５２を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８０】
本発明の他の実施態様は、配列番号５３を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８１】
本発明の他の実施態様は、配列番号５４を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８２】
本発明の他の実施態様は、配列番号５５を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８３】
本発明の他の実施態様は、配列番号５６を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８４】
本発明の他の実施態様は、配列番号５７を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８５】
本発明の他の実施態様は、配列番号５８を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８６】
本発明の他の実施態様は、配列番号５９を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８７】
本発明の他の実施態様は、配列番号６０を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８８】
本発明の他の実施態様は、配列番号６１を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００８９】
本発明の他の実施態様は、配列番号６２を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９０】
本発明の他の実施態様は、配列番号６３を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９１】
本発明の他の実施態様は、配列番号６４を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９２】
本発明の他の実施態様は、配列番号６５を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９３】
本発明の他の実施態様は、配列番号６６を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９４】
本発明の他の実施態様は、配列番号６７を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９５】
本発明の他の実施態様は、配列番号６８を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９６】
本発明の他の実施態様は、配列番号６９を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９７】
本発明の他の実施態様は、配列番号７０を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９８】
本発明の他の実施態様は、配列番号７１を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【００９９】
本発明の他の実施態様は、配列番号７２を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１００】
本発明の他の実施態様は、配列番号７３を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１０１】
本発明の他の実施態様は、配列番号７４を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１０２】
本発明の他の実施態様は、配列番号７５を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１０３】
本発明の他の実施態様は、配列番号７６を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１０４】
本発明の他の実施態様は、配列番号７７を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１０５】
本発明の他の実施態様は、配列番号７８を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１０６】
本発明の他の実施態様は、配列番号７９を含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１０７】
本発明の他の実施態様は、前記高分子がラクダ由来である、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１０８】
本発明の他の実施態様は、前記高分子がヒト由来である、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１０９】
本発明の他の実施態様は、前記高分子がマウス由来である、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１１０】
本発明の他の実施態様は、前記高分子がウサギ由来である、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１１１】
本発明の他の実施態様は、前記高分子がヤギ由来である、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１１２】
本発明の他の実施態様は、前記高分子がカンガルー由来である、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１１３】
本発明の他の実施態様は、前記高分子がヒツジ由来である、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１１４】
本発明の他の実施態様は、前記高分子がラクダ、ヒトおよびマウス以外の脊椎動物由来である、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１１５】
本発明の他の実施態様は、人工変異型として上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１１６】
本発明の他の実施態様は、前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片のペプチド同族体として、上記高分子のいずれか１による機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１１７】
ここで、「同族体」とは、本発明のアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％同一であるアミノ酸配列を意味する。ポリペプチドのアミノ酸配列が参考配列に比べて５％までのアミノ酸の欠失または置換を有することを除くか、または参考配列のアミノ酸全数の５％までのアミノ酸の挿入を有することを除き、本発明の参考アミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一性」を有するアミノ酸配列をもつポリペプチドとは、ポリペプチドのアミノ酸配列が参考配列と同一であることを意図する。実際問題として、特定ペプチドが、本発明のアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％同一である否かは、公知アルゴリズムを使用して決定され得る。
【０１１８】
本発明の他の実施態様は、上記した機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片を含むポリペプチドである。
【０１１９】
本発明の他の実施態様は、１つ以上のアミノ酸が誘導体化された上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１２０】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が二量体である上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１２１】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が三量体である上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１２２】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が多量体である上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１２３】
本発明の他の実施態様は、１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、かつ、所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されたアミノ酸で置換し、これらの位置はカバット番号付けにより決定される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片を機能化する方法である。
【０１２４】
本発明の他の実施態様は、１０３位のアミノ酸をＲで置換し、該位置はカバット番号付けにより決定される重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片を機能化する方法である。
【０１２５】
本発明の他の実施態様は、重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片をヒト化し、かつ、機能化する方法であって、４５位のアミノ酸をＬで、所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで、そして１０３位のアミノ酸をＲで置換し、該位置はカバット番号付けにより決定される方法である。
【０１２６】
本発明の他の実施態様は、重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片をヒト化し、かつ、機能化する方法であって、４５位のアミノ酸をＬで置換し、１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、かつ、所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで置換し、そして所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、該位置はカバット番号付けにより決定される方法である。
【０１２７】
本発明の他の実施態様は、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片がヒトまたはマウス由来である上記方法である。
【０１２８】
本発明の他の実施態様は、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片がヒト由来である上記方法である。
【０１２９】
本発明の他の実施態様は、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片はマウス由来である上記方法である。
【０１３０】
本発明の他の実施態様は、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片がウサギ由来である上記方法である。
【０１３１】
本発明の他の実施態様は、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片がヤギ由来である上記方法である。
【０１３２】
本発明の他の実施態様は、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片がヒツジ由来である上記方法である。
【０１３３】
本発明の他の実施態様は、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片がラット由来である上記方法である。
【０１３４】
本発明の他の実施態様は、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片がヒトおよびマウス以外の脊椎動物由来である上記方法である。
【０１３５】
本発明の他の実施態様は、機能的ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、またはこれらの機能的断片をヒト化する方法であって、４５位のアミノ酸をＬで置換し、そして所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで置換し、該位置はカバット番号付けにより決定される方法である。
【０１３６】
本発明の他の実施態様は、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片をラクダ化する方法であって、４５位のアミノ酸をＬ、ＶおよびＰからなる群から独立して選択されたアミノ酸で置換し、１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されたアミノ酸で置換し、３７位のアミノ酸をＦで、４４位のアミノ酸をＧで、４７位のアミノ酸をＷで、１０３位のアミノ酸をＲで置換し、そして所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、該位置はカバット番号付けにより決定される方法である。
【０１３７】
本発明の他の実施態様は、上記方法によって得られうる機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１３８】
本発明の他の実施態様は、上記方法によって得られた機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１３９】
本発明の他の実施態様は、上記方法によって得られうるヒト化ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ヒト化ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ヒト化ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片である。
【０１４０】
本発明の他の実施態様は、上記方法によって得られたヒト化ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ヒト化ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ヒト化ＶＨドメインまたはこれらの機能的ヒト化断片である。
【０１４１】
本発明の他の実施態様は、人工変異型として上記４つの章に記載される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１４２】
本発明の他の実施態様は、前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片のペプチド同族体として、上記５つの章に記載される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片である。
【０１４３】
本発明の他の実施態様は、上記６つの章に記載される機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片を含むポリペプチドである。
【０１４４】
本発明の他の実施態様は、前記高分子を記載する上記７つの章の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片、または、１以上のアミノ酸が誘導体化されている上記章に記載されるポリペプチドである。
【０１４５】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が二量体である上記方法によって得られた機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１４６】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が二量体である上記方法によって得られうる機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１４７】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が三量体である上記方法によって得られた機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１４８】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が三量体である上記方法によって得られうる機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１４９】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が多量体である上記方法によって得られた機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１５０】
本発明の他の実施態様は、前記高分子が多量体である上記方法によって得られうる機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片である。
【０１５１】
本発明の他の実施態様は、１以上の上記した機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片を含むライブラリーである
。
【０１５２】
本発明の他の実施態様は、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片を含むライブラリーを作成する方法であって、下記工程を含む：
ＶＨ鎖のフレームワーク４領域のコード領域中に制限酵素認識部位を導入し、該制限酵素認識部位の切断部位は、ＣＤＲ３領域に位置し；
前記制限酵素で前記コード配列を含む核酸分子を切断し；
ＶＨコード核酸分子に２本鎖プライマーを結合し、ＣＤＲ３を修復し、そして、１０３位にアミノ酸Ｒを導入し、該位置はカバット番号付けにより決定され；そして
結合した断片を増幅する。
【０１５３】
本発明の他の実施態様は、前記制限酵素切断部位がＣＤＲ３コード領域の最後の２つのコドン内に位置する上記方法である。
【０１５４】
本発明の他の実施態様は、前記制限酵素がアミノ酸１０１位をコードするコドンの第１ヌクレオチド前で、かつ、相補鎖のアミノ酸１０１位をコードするコドンの第２ヌクレオチドの後で切断することによって、ＧＡ３´粘着末端を作成し、該位置はカバット番号付けによって決定される上記方法である。
【０１５５】
本発明の他の実施態様は、前記制限酵素切断がＣＤＲ３コード領域の最後のコドン内に位置する上記方法である。
【０１５６】
本発明の他の実施態様は、前記制限酵素が１０２位アミノ酸をコードするコドンの第２ヌクレオチド前で、かつ、相補鎖のコドン１０２位の第３ヌクレオチド後で切断することによって、ＣＡ−３´粘着末端を作成し、該位置はカバット番号付けによって決定される上記方法である。
【０１５７】
本発明の他の実施態様は、前記制限酵素がＢｐｍＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＢｓｇＩ、ＳｍｕＩ、ＦａｕＩ、ＢｓｅＲＩおよびＢｆｉＩからなる群から選択される上記方法である。
【０１５８】
本発明の他の実施態様は、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片を含むライブラリーを作成する方法であって、フォワードプライマーとしてフレームワーク１特異的プライマー、および３´末端の３つのヌクレオチドが１０３位アミノ酸をコードする核酸鎖のコドンを越えた位置にあるように前記核酸鎖にアニールするバックプライマーを使用して、免疫または非免疫ＶＨＨ抗体のレパートリーをコードする核酸鎖を増幅する工程を含み、３´末端の３つのヌクレオチドの逆相補体はＲ１０３、Ｋ１０３、Ｑ１０３、Ｆ１０３、Ｐ１０３、Ｇ１０３またはＳ１０３をコードし、該位置はカバット番号付けによって決定される方法である。
【０１５９】
本発明の他の実施態様は、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片を含むライブラリーを作成する方法であって、フォワードプライマーとしてフレームワーク１特異的プライマーを使用し、バックプライマーとして配列番号８０〜８８のうちの１以上を使用する、免疫または非免疫ＶＨＨ抗体またはこれらの断片のレパートリーをコードする核酸の増幅工程を含む方法である。
【０１６０】
本発明の他の実施態様は、上記請求項のいずれか１に記載の方法によって得られうる、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片を含むライブラリーである。
【０１６１】
本発明の他の実施態様は、上記方法によって得られうる、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片を含むライブラリーである。
【０１６２】
本発明の他の実施態様は、前記方法がヒトまたはマウス由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する上記ライブラリーである。
【０１６３】
本発明の他の実施態様は、前記方法がラクダ由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する上記ライブラリーである。
【０１６４】
本発明の他の実施態様は、前記方法がヒツジ由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する上記ライブラリーである。
【０１６５】
本発明の他の実施態様は、前記方法がヒト由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する上記ライブラリーである。
【０１６６】
本発明の他の実施態様は、前記方法がマウス由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する上記ライブラリーである。
【０１６７】
本発明の他の実施態様は、前記方法がラット由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する上記ライブラリーである。
【０１６８】
本発明の他の実施態様は、前記方法がヤギ由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する上記ライブラリーである。
【０１６９】
本発明の他の実施態様は、前記方法がラクダ、ヒトまたはマウス以外の脊椎動物由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する上記ライブラリーである。
【０１７０】
本発明の他の実施態様は、上記方法によって得られた、免疫学的検定に使用するための重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはその機能的断片である。
【０１７１】
本発明の他の実施態様は、構築物を含む細胞中でポリペプチドを発現するために有用である組換えＤＮＡ構築物であり、該構築物は細胞中で前記抗体の転写および翻訳を制御する制御配列および該制御配列で制御されるコード配列を含み、該コード配列は読み取り枠中に少なくとも２１ｂｐのＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または上記ポリペプチドをコードする構築物である。
【０１７２】
本発明の他の実施態様は、構築物を含む細胞中でポリペプチドを発現するために有用である組換えＤＮＡ構築物であり、該構築物は細胞中で前記抗体の転写および翻訳を制御する制御配列および該制御配列で制御されるコード配列を含み、該コード配列は読み取り枠中に少なくとも４２ｂｐのＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または上記ポリペプチドをコードする構築物である。
【０１７３】
本発明の他の実施態様は、構築物を含む細胞中でポリペプチドを発現するために有用である組換えＤＮＡ構築物であり、該構築物は細胞中で前記抗体の転写および翻訳を制御する制御配列および該制御配列で制御されるコード配列を含み、該コード配列は読み取り枠中に少なくとも６３ｂｐのＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または上記ポリペプチドをコードする構築物である。
【０１７４】
本発明の他の実施態様は、構築物を含む細胞中でポリペプチドを発現するために有用である組換えＤＮＡ構築物であり、該構築物は細胞中で前記抗体の転写および翻訳を制御する制御配列および該制御配列で制御されるコード配列を含み、該コード配列は読み取り枠中に少なくとも８３ｂｐのＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または上記ポリペプチドをコードする構築物である。
【０１７５】
本発明の他の実施態様は、構築物を含む細胞中でポリペプチドを発現するために有用である組換えＤＮＡ構築物であり、該構築物は細胞中で前記抗体の転写および翻訳を制御する制御配列および該制御配列で制御されるコード配列を含み、該コード配列は読み取り枠中に少なくとも１５０ｂｐのＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または上記ポリペプチドをコードする構築物である。
【０１７６】
本発明の他の実施態様は、構築物を含む細胞中でポリペプチドを発現するために有用である組換えＤＮＡ構築物であり、該構築物は細胞中で前記抗体の転写および翻訳を制御する制御配列および該制御配列で制御されるコード配列を含み、該コード配列は読み取り枠中に少なくとも２４０ｂｐのＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または上記ポリペプチドをコードする構築物である。
【０１７７】
本発明の他の実施態様は、構築物を含む細胞中でポリペプチドを発現するために有用である組換えＤＮＡ構築物であり、該構築物は細胞中で前記抗体の転写および翻訳を制御する制御配列および該制御配列で制御されるコード配列を含み、該コード配列は読み取り枠中に少なくとも３００ｂｐのＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列は上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または上記ポリペプチドをコードする構築物である。
【０１７８】
本発明の他の実施態様は、上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸である。
【０１７９】
本発明の他の実施態様は、上記配列と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸である。
【０１８０】
本発明の他の実施態様は、上記核酸配列を含むベクターである。
【０１８１】
本発明の他の実施態様は、上記核酸分子の組込み(integrated)またはエピソームのコピーを含む宿主細胞である。
【０１８２】
本発明の他の実施態様は、上記宿主細胞であって、該宿主細胞は酵母、細菌、昆虫、真菌、植物または哺乳動物細胞である。
【０１８３】
本発明の他の実施態様は、上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）ポリペプチドの発現を可能とする条件下に、上記核酸を含む宿主細胞を培養し、そして、
（ｂ）培養物から産生したポリペプチドを回収することを含む。
【０１８４】
本発明の他の実施態様は、薬剤の調製のための上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチド、または上記核酸である。
【０１８５】
本発明の他の実施態様は、喘息、鼻結膜炎、アレルギー性障害、急性同種移植拒絶反応、クローン病および潰瘍性大腸炎に関する疾患の治療用薬物調製のための上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチド、または上記核酸である。
【０１８６】
本発明の他の実施態様は、上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチド、または上記核酸を含み、所望により適当な賦形剤と組み合わせた薬剤組成物である。
【０１８７】
本発明の他の実施態様は、喘息、鼻結膜炎、アレルギー性障害、急性同種移植拒絶反応、クローン病および潰瘍性大腸炎に関する疾患の診断における上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチド、または上記核酸の使用である。
【０１８８】
本発明の他の実施態様は、タンパク精製のための上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片または上記ポリペプチドの使用である。
【０１８９】
本発明の他の実施態様は、タンパク精製のための上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片または上記ポリペプチドの使用である。
【０１９０】
本発明の他の実施態様は、上記核酸、上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片または上記ポリペプチドを含む、被検者の病理学的状態または病理学的状態の感受性の診断のためのキットである。
【０１９１】
本発明の他の実施態様は、被検者の病理学的状態または病理学的状態の感受性の診断用組成物であって、下記工程：
（ａ）生体試料中の前記核酸のゲノムおよび制御配列中の変異を含む、上記核酸中の変異の存否を決定し、そして
（ｂ）該変異の存否に基づいて病理学的状態または病理学的状態の感受性を診断する
ことを含む方法である。
【０１９２】
本発明の他の実施態様は、被検者の病理学的状態または病理学的状態の感受性の診断用組成物であって、下記工程：
（ａ）生体試料中の上記核酸の存在または量、または上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または上記ポリペプチドの発現を測定し、そして
（ｂ）前記核酸の存在または量、または前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、これらの機能的断片またはポリペプチドの発現に基づいて、病理学的状態または病理学的状態の感受性を診断する
ことを含む方法である。
【０１９３】
本発明の他の実施態様は、上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチドと相互作用する試験化合物をスクリーニングするための薬剤スクリーニング分析法であって、
（ａ）上記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチドを前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または上記ポリペプチドと試験化合物との相互作用を可能とする条件下に試験化合物と混合して複合体を生成し、そして
（ｂ）前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片と相互作用する試験化合物の能力が、複合体中の試験化合物の存在によって示される、複合体の生成を検出する
ことを含む分析法である。
【０１９４】
本発明の他の実施態様は、上記分析法によって確認され得る産物または化合物である。
【０１９５】
本発明の他の実施態様は、配列番号８０を含む核酸である。
【０１９６】
本発明の他の実施態様は、配列番号８１を含む核酸である。
【０１９７】
本発明の他の実施態様は、配列番号８２を含む核酸である。
【０１９８】
本発明の他の実施態様は、配列番号８３を含む核酸である。
【０１９９】
本発明の他の実施態様は、配列番号８４を含む核酸である。
【０２００】
本発明の他の実施態様は、配列番号８５を含む核酸である。
【０２０１】
本発明の他の実施態様は、配列番号８６を含む核酸である。
【０２０２】
本発明の他の実施態様は、配列番号８７を含む核酸である。
【０２０３】
本発明の他の実施態様は、配列番号８８を含む核酸である。
【０２０４】
本発明の他の実施態様は、上記配列と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸である。
【０２０５】
本発明の他の実施態様は、１以上の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片を産生する方法において、上記核酸を使用することである。
【０２０６】
上記実施態様の抗体は機能的であり、それ自体で特徴的態様を欠く抗体よりも改良された性質、例えば、発現レベル、安定性、親和性および溶解性を示す。例えば、ライブラリーをスクリーニングするためにファージディスプレイライブラリー中で細菌過剰発現技術により抗体を産生することは、抗体またはその断片の性質からみて困難であることが当該技術分野で公知である。
【０２０７】
驚くべきことに、本発明者らは可能なら１０８位の変異と組み合わせて１０３位に変異を有する重鎖は、たとえ３７、４４、４５および４７位にＶＨＨ特徴アミノ酸を有していなくても、機能的重鎖抗体（ＨＣＡｂ）として挙動することを見出した。特に、本発明者らは１０３位（カバット番号付け）に対応するアミノ酸残基がアルギニン、グリシン、プロリン、セリン、ロイシン、グルタミンまたはリジンから選択されたアミノ酸に変異した変異は、４５位の臨界的特徴アミノ酸の損失を補うことができることを見出した。その際、４５位の荷電アミノ酸またはシステインは他のアミノ酸に変化し、好ましくは、ロイシンに変化していてもよい。本発明の態様より前には、４５位および１０３位の前記アミノ酸を有する重鎖は、古典的４本鎖抗体複合体の一部（ハームセン(Harmsen)ら、２０００）（非特許文献１０）であり、機能的重鎖抗体でないと当業者には考えられていた。さらに、本発明の一態様を特徴とする残基を有するいくつかの抗体では、軽鎖の存在はこれらの抗体が機能的重鎖抗体でないことを明らかに証明していると記述されている（アンカー(Anker)ら、１９９０（非特許文献１１）；チュクウオチャ(Chukwuocha)ら、１９９９（非特許文献１２））。
【０２０８】
驚くべきことに、本発明者らはアルギニン、グリシン、プロリン、セリンまたはリジンから選択された１０３位のアミノ酸は、重鎖の溶解性を増加させ、一方、それは軽鎖と相互作用する可能性を壊すであろうことを示すことができた。したがって、このような重鎖分子は４５位に機能的ＨＣＡｂにおける特徴アミノ酸を有していなくても、機能的重鎖抗体のように挙動する。
【０２０９】
本発明は、カバット番号付けによる４５位に、荷電アミノ酸またはシステインのいずれでもないアミノ酸を含み、かつ、可能なら１０８位のグルタミン（Ｑ）と組み合わせた１０３位のアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択されたアミノ酸を含む機能的ＨＣＡｂに関する。本発明の一実施態様では、４５位のアミノ酸はＬである。他の実施態様では、１０３位のアミノ酸はＲである。他の実施態様では、１０３位のアミノ酸はＲであり、かつ、１０８位のアミノ酸はＱである。
【０２１０】
本発明の一実施態様では、本発明の機能的ＨＣＡｂまたはその断片は人工変異型である。ここで使用する人工変異型とは、変異が意図的に導入され、かつ、天然の状況下に見出された配列と異なることを意味する。前記人工変異型は、可能なら１０８位（カバット番号付け）に対応するアミノ酸残基がＱに変異している変異と組み合わせて、１０３位（カバット番号付け）に対応するアミノ酸残基がＲ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＰからなる群から選択されたアミノ酸に変異している免疫グロブリンの重ポリペプチド鎖の可変ドメイン（ＶＨで示される）から誘導してもよい。他の実施態様では、前記人工変異型は１０３位（カバット番号付け）に対応するアミノ酸残基がアルギニンに変異している免疫グロブリンの重ポリペプチド鎖の可変ドメイン（ＶＨで示される）から誘導される。他の実施態様では、前記人工変異型は１０３位（カバット番号付け）に対応するアミノ酸残基がアルギニンに変異し、かつ、１０８位（カバット番号付け）に対応するアミノ酸残基がグルタミンに変異している免疫グロブリンの重ポリペプチド鎖の可変ドメイン（ＶＨで示される）から誘導される。
【０２１１】
また、前記人工変異型は、可能なら３７、４４および４７位の他の特徴アミノ酸のうち、１以上のＶａｌ３７、Ｇｌｙ４４およびＴｒｐ４７への変異と組み合わせて、４５位の特徴アミノ酸残基をロイシンに変異した重鎖抗体の重ポリペプチド鎖の可変領域（ＶＨＨで示される）から誘導してもよい。１つの実施態様は、３７、４４、４５および４７位の全ての特徴アミノ酸がＶａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５およびＴｒｐ４７に変異している人工変異型である。
【０２１２】
本発明の人工変異型は、ＶＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＲＧＱＧＴＱ（配列番号１３）または、配列ＲＧＫＧＴＱ（配列番号１４）を包含する。
【０２１３】
本発明の他の人工変異型は、ＶＨＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＶＸＸＸＸＸＸＧＬＸＷ（配列番号１５）を包含し、ここでＸはいかなるアミノ酸であってもよい。
【０２１４】
本発明の他の人工変異型は、ＶＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＲＧＱＧＴＱ（配列番号１３）を包含し、該配列のＲはカバット番号付けによる１０３位に存在する。本発明の他の人工変異型は、ＶＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＲＧＫＧＴＱ（配列番号１４）を包含し、該配列のＲはカバット番号付けによる１０３位に存在する。
【０２１５】
本発明の他の人工変異型は、ＶＨＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＶＸＸＸＸＸＸＧＬＸＷ（配列番号１５）を包含し、該配列のＶはカバット番号付けによる３７位に存在し、Ｘはいかなるアミノ酸であってもよい。
【０２１６】
本発明の他の人工変異型は、ＶＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＬＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１６）を包含し、該配列のＬはカバット番号付けによる１０３位に存在する。
【０２１７】
本発明の他の人工変異型は、ＶＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＱＧＱＧＴＧＶＴＶＳＳ（配列番号１７）を包含し、該配列のＬはカバット番号付けによる１０３位に存在する。
【０２１８】
本発明の他の人工変異型は、ＶＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＰＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１８）を包含し、該配列のＬはカバット番号付けによる１０３位に存在する。
【０２１９】
本発明の他の人工変異型は、ＶＨドメインから誘導されたポリペプチド配列を含み、該ポリペプチド配列内にＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ（配列番号１９）を包含し、該配列のＬはカバット番号付けによる１０３位に存在する。
前記配列番号１３〜１９は図９に記載されるものである。
【０２２０】
本発明の人工変異型はＶＨドメインまたはＶＨＨドメインから誘導される。本発明の人工変異型は本発明では前記変異を導入することによって前記ドメインから単離され得るか、または化学的に合成されることを含めて合成されうるか、あるいは宿主細胞中で組換え技術によって特に発現されることを意味し、前記ＶＨドメインまたはＶＨＨドメインのポリペプチド配列および導入されるべき変異の位置の知識をもとに始める。より一般的には、本発明の人工変異型はポリペプチド鎖調製のために利用できる方法によって調製され得る。
【０２２１】
ＶＨ遺伝子から誘導され、かつ、ここに記載した態様を有するポリペプチド鎖は、従来のＶＨ−Ｄ−Ｊ遺伝子、特にライブラリーから得られたものをもとに始めて、部位特異的突然変異誘発に関する方法またはＰＣＲ（前記変異を有するプライマーを使用する）によって得られるであろう。関連する方法は、ヘムスレー(Hemsley)ら、（１９８９）に記載されたものである。すなわち、本発明はＶＨ−Ｄ−Ｊ遺伝子から始まる可溶性変異型単一ドメイン抗体断片を生成する可能性を提供する。しかしながら、ヘムスレー(Hemsley)の方法は、少なくとも変異が導入されなければならない領域で、変異されるべき遺伝子配列が公知であることを必要とする。変異されるべき位置、残基１０３は可変領域に近接しているから、ヘムスレー(Hemsley)ら、（１９８９）の方法は、未知可変領域を有するＶＨに変異を導入するためには適当でなく、この場合、ある適応した方法を使用しなければならない。
【０２２２】
また、ＶＨＨから誘導され、かつ、ここに記載した態様を有するポリペプチド鎖は、ＨＣＡｂ  ＶＨＨ、特にライブラリーから得られたものをもとに始めて、部位特異的突然変異誘発に関する方法またはＰＣＲ（前記変異を有するプライマーを使用する）によって得られるであろう。これらの変異は保存フレームワーク領域内に位置することから、ヘムスレー(Hemsley)ら、（１９８９）の方法が適用され得る。この場合、本発明はＶＨＨ−Ｄ−Ｊ遺伝子から始まる単一ドメイン抗体断片をヒト化する可能性を提供する。ヒト化は、３７、４４、４５および４７位のＶＨＨ特徴アミノ酸のうちの１以上を保存されたヒト残基Ｖａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５およびＴｒｐ４７へ置換することを含むであろう。しかしながら、１０３位に補償変異(compensate  mutation)を導入するために、隣接可変領域の配列は、上記したように知られているべきである。
【０２２３】
さらに、本発明は従来の４本鎖免疫グロブリンから誘導された単一ドメイン重鎖断片を可溶化する方法に関する。実際に、本発明者らは親水性アミノ酸残基、特にアルギニン、グリシン、プロリン、セリンまたはリジンから選択された残基の１０３位での存在が、１０３位にトリプトファン残基を有する同じポリペプチドに比べて、ＶＨから誘導されたポリペプチドをより可溶性とすることを示している。この効果はグルタミンによる１０８位のアミノ酸の置換によって、なおも増大されるであろう。
【０２２４】
本発明の他の態様は、ラクダ科動物重鎖抗体を「ヒト化する」方法であり、該方法は可能なら３７、４４および４７位の他の特徴アミノ酸の１以上の置換と組み合わせて、少なくとも４５位のラクダ科動物特徴アミノ酸の置換を含む。ここで使用されるヒト化とは、ＨＣＡｂ中のラクダ科動物特徴アミノ酸の１つまたはそれ以上をヒトコンセンサス配列中に見られるヒト対応部分によって置換することであるが、前記重鎖抗体はその典型的な特徴を失っていないことを意味する。すなわち、ヒト化は得られたＨＣＡｂまたはその断片の抗原結合能力に有意な影響を与えない。
【０２２５】
本発明の他の態様は、本発明の方法によって得られうる機能的単一ドメイン重鎖抗体断片である。本発明のさらに他の態様は本発明の方法によって得られた機能的単一ドメイン重鎖抗体断片である。また、本発明の他の態様は、本発明の方法によって得られうる機能的ヒト化単一ドメイン重鎖抗体断片である。本発明のさらに他の態様は、本発明の方法によって得られた機能的ヒト化単一ドメイン重鎖抗体断片である。
【０２２６】
本発明の他の態様は、１以上の本発明の機能的単一ドメイン重鎖抗体断片を含むライブラリーである。本発明の一実施態様では、前記ライブラリーは少なくとも１００、または少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００、または少なくとも１００，０００、または少なくとも１，０００，０００の機能的単一ドメイン重鎖抗体断片を含む。このようなライブラリーは、不溶性かつ非機能的である古典的ＶＨ分子の可能性あるライブラリー（ヌタール(Nutall)ら、２０００）（非特許文献１９）とは違って、可溶性分子から構成される利点を有する。
【０２２７】
１つの単一ＶＨでは、この問題は変性、次いで再折り曲げおよび再可溶化によって解決されるであろうが、この過程は複合ライブラリー作成の場合には可能性が少なく、特に、前記作成が抗原結合特異性を変化させたドメイン選択の後に続く場合には、その可能性がない。実際に、選択過程中での不溶性、かつ、「粘着性」である骨格タンパク質の生成は、ディスプレイされたドメインの疎水性パッチによって、抗原への非特異的結合による誤った陽性につながることになる。いくつかの試みが、この凝集問題を克服するために行われている（ペッシ(Pessi)ら、１９９３（非特許文献１４）；キオチョ（Quiocho）、１９９３（非特許文献１５）；ディマシ（Dimasi）ら、１９９７（非特許文献１６））が、許容され得る溶解特性を有する単一ドメインＶＨライブラリーを産生する試みはいまだ成功していない。それゆえ、本発明の可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片は、初めて、機能的単一鎖抗体断片を含むライブラリーの有効な構築を可能とする。
【０２２８】
本発明の機能的単一ドメイン重鎖抗体は通常、天然には生じないから、このようなライブラリーはメッセンジャーＲＮＡの直接増幅によって作成できないが、変異原性プライマーを使用して作成しなければならない。原則的には、ＶＨＨバックボーン(backbone)を出発材料として使用してもよいが、ラクダ科動物特徴アミノ酸が変異されなければならないのみならず、１０３位の補正変異も導入されなければならないから、これはいくつかの欠点を有する。この理由から、ヒトＶＨｍＲＮＡライブラリーから出発したライブラリーを構築することが好ましい。このようなライブラリーから、潜在的抗原結合体が検出されるであろう。ＶＨＨ状況に反してＶＨバックボーンから出発すると、１０３位の変異のみが導入されなければならない。
【０２２９】
このようなライブラリーを作成する問題は、ＲＴ−ＰＣＲでＶＨを増幅するために使用する３´末端プライマーはコドン１０３において変異原性であることが必要であり、プライマーは鋳型に完全にアニールするために、その３´末端に向かう少なくとも４〜５個のヌクレオチドにおいて伸長すべきである。しかしながら、この領域はＣＤＲ３の一部であるから、このようなプライマーは多くの縮重を含み、ＤＮＡ増幅は行われないであろう。その結果、本発明の機能的単一ドメイン重鎖ライブラリーは到底、自明ではない。
【０２３０】
したがって、本発明の他の態様は、本発明の少なくとも１種の機能的単一鎖ライブラリーを含むライブラリーの作成方法であって、
ＶＨまたはＶＨＨ鎖のフレームワーク４領域のコード領域中に制限酵素認識部位を導入し、その際、前記制限酵素認識部位の切断部位はＣＤＲ３領域中に位置し、
前記制限酵素で前記コード配列を含む核酸分子を切断し、
二本鎖プライマーを残余のＶをコードする核酸分子に結合し、ＣＤＲ３とフレームワーク４コドンを修復し、そしてフレームワーク４中に１０３位変異を導入し、
結合した断片を増幅する
ことを含む方法である。
【０２３１】
１つの実施態様は、ｍＲＮＡプールなどのコード配列のプール、ならびに１つの単離されたコード配列にて実施する前記方法を含む。他の実施態様は、１つの単離されたコード配列で実施し、合成ライブラリーを、１以上のＣＤＲループの１以上のコドンをランダム化することよって生成する前記方法を含む。また、ライブラリーは１０３Ｒ変異を含む変異フレームワークにラクダ科動物ＣＤＲループを移植して生成してもよい。
【０２３２】
他の実施態様では、制限酵素切断は最後のコドン内またはＣＤＲ３コード領域の最後の２つのコドン内に位置する。１つの実施態様は前記酵素がＣＤＲ３−フレームワーク４接合部で平滑末端を作り出す前記方法を含む。他の実施態様は、前記酵素がコドン１０２の第２ヌクレオチドの前で、かつ、コドン１０２の第２ヌクレオチドの後を切断してＣＡ３´粘着末端を作り出す前記方法を含む（カバット番号付けによる）。実際に、ほとんどのＶＨおよびＶＨＨでは１０２位に保存されたチロシン（Ｙ）が存在する。このアミノ酸は、大抵はＴＡＣでコードされる。他の実施態様は前記酵素がコドン１０１の第１ヌクレオチド前で、かつ、コドン１０１の第２ヌクレオチド後で切断してＧＡ３´粘着末端を作り出す方法を含む（カバット番号付けによる）。実際に、ほとんどのヒトＶＨでは１０１位に保存されたアスパラギン酸（Ｄ）、ＣＤＲ３ループ構造において重要である荷電アミノ酸が存在する。このアミノ酸はＧＡＣまたはＧＡＴのいずれかでコードされる。ＧＡ３´粘着末端を作り出すことによって、２本鎖プライマーに結合することにより、保存コドンは修復されるであろう。この場合、コドン１０２はプライマーの結合によってランダム化または固定化されてもよい。１つの実施態様は前記制限酵素部位がＢｐｍＩである前記方法を含む。他の実施態様は前記制限酵素部位がＥｃｏ５７Ｉである前記方法を含む。他の実施態様は前記制限酵素部位がＢｓｇＩである前記方法を含む。一実施態様は前記制限酵素部位がＦａｕＩである前記方法を含む。他の実施態様は、前記制限酵素部位がＳｍｕＩである前記方法を含む。他の実施態様は前記制限酵素部位がＢｓｅＲＩである前記方法を含む。
【０２３３】
他の実施態様は、酵素が上部鎖中のＣＤＲ３接合部で切断し、および下部鎖のフレームワーク４に隣接したＣＤＲ３の第１ヌクレオチドと第２ヌクレオチドの間で切断するように導入された、制限酵素部位がＢｆｉＩである前記方法を含む。後者の場合、ＣＤＲ３とフレームワーク４領域は、上部鎖のフレームワーク４コード領域およびＴＧ３´オーバーハング、またはＴＧ３´オーバーハングとＴｒｐ１０３コドン前のＧＴＧまたはＴＡＣなどのエキストラコドンのいずれかを有する、その相補鎖からなる２本鎖プライマーを用い結合して修復してもよい。
【０２３４】
本発明のなおも他の態様は、１以上の機能的単一ドメイン重鎖抗体断片を含む、本発明で得られうるライブラリーである。本発明のなおも他の態様は、１以上の機能的単一ドメイン重鎖抗体断片を含む、本発明で得られたライブラリーである。
【０２３５】
１つの実施態様では、前記ライブラリーは少なくとも１００、他の実施態様では少なくとも１０００、他の実施態様では少なくとも１０，０００、他の実施態様では少なくとも１００，０００、他の実施態様では少なくとも１０００，０００の機能的単一ドメイン重鎖抗体断片を含む。
【０２３６】
驚くべきことに、我々は当業者が考えるものに反して、ラクダ科動物抗体の有意な画分が本発明の機能的重鎖抗体を含むことを見出した。この有意な画分は新規な機能的重鎖抗体のクラスを意味する。したがって、機能的重鎖抗体および／または機能的可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片がラクダ科動物からのｍＲＮＡ調製物から直接に単離され、そして、この物質が本発明の機能的可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片ライブラリーの調製において出発材料として使用され得ることは、当業者には自明でないであろう。その結果、本発明の他の態様は本発明において記載された新規なクラスの機能的重鎖抗体の特異的増幅およびクローニングによって得られたライブラリーである。また、該ライブラリーはＦＲ２の親水性残基を有するＶＨＨのクラスよりもヒト抗体に対してより多くの相同性を有する。免疫または非免疫抗体のレパートリーからこの新規なＶＨＨのクラスを得るために、残基１０３としてアルギニン、リジン、グルタミン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、トリプトファンまたはセリンを有するＶＨＨをコードする遺伝子に優先的にアニールする特異的増幅プライマーを設計した。特異的アニールを達成するために、プライマーの３´部位は、新規なＶＨＨのクラス中でＶＨＨ断片を含む、トリプトファン１０３と異なる残基１０３をコードするコドンの第１ヌクレオチドで正確に終了する。
【０２３７】
以下のプライマーが設計された：
【０２３８】
【表１】
2005520494.tif 000002
【０２３９】
特異的増幅は、本発明の機能的可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片の増幅のためのフォワードプライマーとして、ＳｆｉＩ部位に結合した５´であるフレームワーク１特異的プライマー、およびバックプライマーとしてプライマー１〜１０のプールを使用して実施した。得られた物質をＳｆｉＩおよびＮｏｔＩまたはＢｓｔＥＩＩで切断し、得られた断片をｐＨｅｎ４中にクローン化した。
【０２４０】
本発明のさらに他の態様は、本発明の機能的重鎖抗体または本発明の機能的可溶性単一ドメイン重鎖抗体の薬剤調製への使用である。本発明のさらに他の態様は、所望により適当な賦形剤と組み合わせた本発明の機能的重鎖抗体を含むか、または本発明の機能的可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片を含む薬剤組成物である。実際に、抗体は喘息および鼻結膜炎（ボツガー(Botger)ら、２００２）（非特許文献１７）、アレルギー性障害（バブ（Babu）ら、２００１）（非特許文献１８）、急性同種移植拒絶反応（ソリンガー(Sollinger)ら、２００１）、クローン病（ホムズ(Hommes)ら、２００２）（非特許文献１９）（非特許文献２０）、および潰瘍性大腸炎（ゴードン(Gordon)ら、２００２）（非特許文献２１）などのいくつかの疾患の治療に使用されるであろうが、これらの例に限定されない。機能的可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片はその小さなサイズおよびその溶解性ゆえに有意な利点を有するであろう。
【０２４１】
本発明の他の態様は、本発明の機能的重鎖抗体または本発明の機能的可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片を診断へ使用することである。当業者に公知である抗体を使用する診断方法としてはＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ法が挙げられるが、これらの例に限定されない。本発明の抗体はその安定性、および活性を有意に損失することなく固体支持体上に固定化され得る事実から、前記分析法においていくつかのさらなる利点を有する。後者特徴はマイクロアレーに使用することを含めて、数種の免疫学的検出技術において望ましいように、本発明の抗体を表面被覆において特に好適なものとする。
【０２４２】
本発明のなおも他の態様は、本発明の機能的重鎖抗体または本発明の機能的可溶性単一ドメイン重鎖抗体断片をタンパクおよび他の分子の精製へ使用することである。免疫クロマトグラフィーなどの精製方法は当業者には公知であるが、これに限定されない。本発明の抗体は精製担体の長期寿命を保証する安定性、および活性を有意に損失することなく固体支持体上に固定化され得る事実から、このような精製方法においていくつかのさらなる利点を有する。
【０２４３】
定義
次の定義は、ここで本発明を記述するために使用された種々の用語の意味と範囲を説明および規定するために開示される。
ポリペプチド高分子に関して、ここで使用された「誘導体化」とは、誘導体化されたアミノ酸を含むことを意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは本発明の目的で誘導体化されたアミノ酸であるとみなされる。誘導体化されたアミノ酸はまた、プロリンおよびヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基を含む。さらに、逆鏡像異性体である同じアミノ酸で置換された本発明の変異型タンパクの１成分を示すアミノ酸は、誘導体化されたとみなされる。すなわち、Ｌ体で天然に生じるアミノ酸（化学的実体構造に基づいて、ＲまたはＳとも呼ばれる）は、一般にはＤ−アミノ酸と呼ばれる同じ構造型を有するが逆鏡面異性体を有するアミノ酸、一般的にはその組成物および化学的配置に基づいてＲ−またはＳ−とさらに呼ばれ得るアミノ酸で置換されていてもよい。このような誘導体は大きく増大した安定性を有し、したがって、経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、局所的、直腸、眼内または他の経路から投与する場合、より長いインビボ半減期を有する化合物の処方において有利である。
【０２４４】
好ましい実施態様では、誘導体化アミノ酸は（Ｓ）またはＬ体または（Ｓ）またはＤ体である。誘導体化アミノ酸は例えば、インビボでの分解を阻止または遅延させるために使用してもよい。天然に存在しないアミノ酸を含むタンパクは合成されるか、またはある場合には組換え技術により作成されるであろう；ファンヘスト(vanHest)ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ４２８：（１−２）６８−７０、１９９８年５月２２日およびタン(Tan)ら、Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ．Ｓ２１８：Ｕ１３８−Ｕ１３８  Ｐａｒｔ２，１９９９年８月２２日参照。両者は本明細書中に参考として導入される。
【０２４５】
芳香族アミノ酸はＤ−またはＬ−ナフィルアラニン、Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン、Ｄ−またはＬ−２−チエネイルアラニン、Ｄ−またはＬ−１−，２−，３−または４−ピレネイルアラニン、Ｄ−またはＬ−３−チエネイルアラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−メトキシビフェニルフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニン、およびアルキルが置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソペンチル、Ｃ１〜Ｃ２０の非酸性アミノ酸であるＤ−またはＬ−アルキルアラニンで置換されていてもよい。
【０２４６】
酸性アミノ酸はそれらが非カルボン酸で置換された場合、即ち（ホスホノ）アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、またはセリン；または硫酸化（例えば、−ＳＯ３Ｈ）スレオニン、セリンまたはチロシンなどの陰性電荷を維持するアミノ酸、およびその誘導体または類似体は誘導体化されているとみなされるが、これらに限定されない。
【０２４７】
他の置換としては、非天然ヒドロキシ化アミノ酸が挙げられる。他の誘導体は、「アルキル」を天然アミノ酸と組み合わせて作成してもよい。ここで使用する「アルキル」との用語は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラシシルなどの炭素原子１〜２４個の分岐または未分岐飽和炭化水素基を呼ぶ。アルキルは窒素、酸素または硫黄の原子を有するヘテロアルキルを含む。ここで、好ましいアルキル基は１〜１２個の炭素原子を含む。塩基性アミノ酸は天然に存在するアミノ酸、リジン、アルギニン、オルニチン、シトルリン、または（グアニジノ）酢酸、または他の（グアニジノ）アルキル酢酸のいかなる位置においてアルキル基で置換されていてもよく、「アルキル」とは上記したものである。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨに代えて、ＣＮ基を含む）はまた、アスパラギンまたはグルタミンに代えて置換されてもよく、メチオニンスルフォキシドはメチオニンに代えて置換されてもよい。このようなペプチド誘導体調製方法は当業者には周知である。
【０２４８】
さらに、変異型ポリペプチドのいずれのアミド結合もケトメチレン基で置換され得る。このような誘導体は酵素による分解に対して大きな安定性を有することが期待され、それ故、経口、静脈内、筋肉内、腹膜内、局所、直腸、眼内、または他の経路から投与された場合、増加したインビボ半減期を有する化合物の処方における利点を有する。
【０２４９】
本発明の変異型ポリペプチドのアミノ酸の別なアミノ酸修飾としては、次のものが挙げられる：システニル残基は２−クロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体となる。システニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルファイド、メチル２−ピリジルジスルフィド、Ｐ−クロロマーキュリーベンゾエート、２−クロロマ−キュリー−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールなどの化合物と反応して誘導体化してもよい。
【０２５０】
ヒスチジル残基は、例えば、ｐＨ５．５〜７でジエチルプロカーボネートなどの化合物と反応して誘導体化してもよく、この試薬は比較的ヒスチジル側鎖に対して特異的であり、また、例えば、ｐ−ブロモフェナシルブロミドも使用され、この反応は、好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中で行われる。
【０２５１】
リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物などの化合物と反応してもよい。これらの試薬による誘導体化は、リジニル残基の荷電を逆転する効果を有すると予期される。
【０２５２】
α−アミノ含有残基を誘導体化する他の好適な試薬としては、メチルピコリニミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルフォン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応物などの化合物が挙げられる。アルギニル残基は公知方法の工程において、従来の１種または数種の試薬、とりわけ、フェニルグルオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾してもよい。アルギニン残基の誘導体化は、反応がグアニジン官能基の高いｐＫａゆえにアルカリ条件下で行うことが必要である。さらに、これらの試薬はリジンならびにアルギニンエプシロン−アミノ基と反応してもよい。チロシル残基に特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基中に分光標識を導入するなど、それ自体、周知である。
【０２５３】
Ｎ−アセチルイミドジゾルおよびテトラニトロメタンは、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を生成するために使用してもよい。カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は１−シクロヘキシル−３−（２−モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ´−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ´）との反応によって選択的に修飾してもよい。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基へ変換してもよい。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、しばしば、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へ脱アミドしてもよい。また、これらの残基は温和な酸性条件下に脱アミドしてもよい。これらの残基のいずれかの形態も本発明の範囲内にある。
【０２５４】
重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメインまたはそれらの断片に関して、「機能的」とは、インビボでのその結合性に比べて、そのエピトープに対して有意な結合性（ミクロモル範囲の解離定数）を保持すること、および凝集を示さないか、あるいは限定された凝集（１ｍｇ／ｍｌ以上の可溶性および非凝集性）を示し、結合体としての抗体の使用を可能とする。
【０２５５】
重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体またはそれらの断片に関して、「機能化」とは、前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体またはそれらの断片を機能的にすることを意味する。
【０２５６】
ここで使用する「それらの断片」とは、配列の９５％以上、配列の９０％以上、配列の８５％以上、配列の８０％以上、配列の７５％以上、配列の７０％以上、配列の６５％以上、配列の６０％以上、配列の５５％以上または配列の５０％以上に対応する部分を意味する。
【０２５７】
「コード配列」とは適当な制御配列の制御下におかれたとき、ｍＲＮＡ中に転写され、および／またはポリペプチドへ翻訳されるヌクレオチド配列である。完全なコード配列の境界は、５´末端の翻訳開始コドンおよび３´末端の翻訳終始コドンによって決定される。しかしながら、ここで使用するコード配列は、完全なコード配列に限定されず、それらの断片を含む。このような断片はまた、コード領域として示される。コード配列としては、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列またはゲノムＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。一方、イントロンはある状況下には同様に存在していてもよい。
【０２５８】
非ヒト抗体のヒト化に関して、ここで使用する「ヒト特徴アミノ酸」とはＶａｌ３７、Ｇｌｙ４４、Ｌｅｕ４５、Ｔｒｐ４７であり、位置はカバット番号付けにより決定される。
【０２５９】
ここで使用する「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」、「核酸分子」または「核酸」とは、いかなる長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかの重合体を意味する。この用語は一次構造の分子のみを意味する。すなわち、この用語は２本鎖および単一鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。これは公知タイプの修飾、例えば、メチル化、類似体による天然に存在する１以上のヌクレオチドの「キャップ」置換も含む。
【０２６０】
ＤＮＡ配列の「上部鎖」とは、ｍＲＮＡ中に生じるコドンのＤＮＡ翻訳を含む鎖であり、「下部鎖」とはｍＲＮＡを合成する鋳型として使用されるアンチコドンを有する鎖である。
ここで使用する「ＶＨドメイン」とは、従来の４本鎖抗体のＨ鎖可変ドメインを意味する。
ここで使用する「ＶＨＨドメイン」とは、従来の（すなわち、免疫学的に機能的な）ＨＣＡｂのＨ鎖の可変ドメインを意味する。
【実施例】
【０２６１】
実施例１：単離ＶＨ１のラクダ化
古典的には、組換えＶＨドメインはｓｃＦｖライブラリーから単離される。このようなＶＨドメインは、例えば、ＶＨ−ＶＬに代わるＶＨのクローニングによるクローニング人為産物が通常、生じるか、あるいはＶＬ遺伝子断片の欠失となる、例えば、リンカー配列の不安定性によるクローン内の遺伝子組み換えから生じるであろう。これらの分子は、例えば細菌および他の発現系での低発現量およびそれらの低溶解性ゆえに、通常、共に作用することが難しい。本発明者らは１０３位のＴｒｐをＡｒｇに変化させる変異を導入することによって、これらのＶＨ分子がよりよく発現し、かつ、より高い溶解性を示すことを明らかにした。これは、デイビス(Davis)およびリーチマン(Riechman)（１９９４）がもともと実施したようなＶａｌ３７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ４４Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５ＡｒｇおよびＴｒｐ４７Ｇｌｙまたはその一部よりも、より容易であり、かつ、より明瞭な変異である。これは全てのＶＨ配列、即ちヒト起源のもののみならず、Ｉｇフォールド(fold)を有する抗体をもつ全ての他の種でも達成され得たことは、さらなる利点である。
【０２６２】
実施例２：ｓｃＦｖ抗原結合断片からの可溶性単一ドメインの生成
抗原結合断片の最小サイズが認識される場合、既存のｓｃＦｖから単一ドメインを設計することが有利であろう。ＶＨドメインは、このドメインが原則的には特異性をもたらし、親和性へ最も大きく寄与することから、特別な関心がもたれている。単一ドメインはそのより小さなサイズゆえに、さらに利点を有する。ＶＨドメインは抗原と相互作用するには十分な活性を保持することが繰り返し示されているが、ＶＨドメインは粘着性であり、かつ不溶性であることが公知である。本発明はこれらの問題をＴｒｐ１０３Ａｒｇ置換によって改善することができる。
【０２６３】
実施例３：ＶＨＨの溶解性および抗原結合性におけるＡｒｇ１０３Ｔｒｐ変異の効果
３．１  野生型および変異型ＶＨＨの産生および精製
抗β−ラクタマーゼＶＨＨ  ＴＥＭ０４をコードする遺伝子断片は、ＦＲ４特異的プライマーＡ４ショート−ＴＥＭ０４（５´−ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ−３´）を使用したＰＣＲによって変異誘発し、それによって、１０３位の野生型残基ＡｒｇをＴｒｐ１０３に変更した。同様な方法を使用して、抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）ＶＨＨ  ＣＥＡ７１をプライマーＡ４ショートＣＥＡＶＨ（５´−ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＧＣ−３´）を使用して変異誘発した。
【０２６４】
大腸菌産生ベクターｐＨＥＮ６を野生型および変異ＶＨＨ断片の発現に使用した。ｐＨＥＮ６はｐＨＥＮ１（フーゲンブーム(Hoogenboom)ら、１９９１）（非特許文献２２）から誘導し、ｐＨＥＮ６はＶＨＨ精製のためのヘキサヒスチジンタグ配列をコードし、ファージＭ１３遺伝子３を欠く。ＰＣＲ産物およびベクターはＮｃｏＩ−ＢｓｔＥＩＩで消化し、１％アガロースゲル上に載置した。断片およびベクターはジェットソーブ(Jetsorb)を使用してゲルから精製し、結合し、ＷＫ６コンピテントセル中に形質転換し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含むＬＢ寒天プレート上に置いた。１０３位のＲからＷへの変異は配列決定により確認した（図１）。
【０２６５】
各構築物において、前培養は１００μｇ／ｍｌアンピリシンおよび２％グルコースを含むＬＢ培地１０ｍｌ中にて３通りにて開始した。培養物３３０ｍｌ（１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ培地中）は前培養物３ｍｌを植菌し、３７℃で成長させた。培養物を１ｍＭ  ＩＰＴＧとともに、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４で誘導し、２８℃で終夜、成長させた。野生型と変異型の間の誘導後の細胞密度に有意な差異が観察されず（ＶＨＨ  ＴＥＭ０４：ＯＤ６００（野生型）＝１．０５±０．２５；ＯＤ６００（変異型）＝１．２５±０．０５；ＶＨＨ  ＣＥＡ７１：ＯＤ６００（野生型）＝１．４８±０．２８；ＯＤ６００（変異型）＝１．３０±０．２０）、毒性産物が発現されなかったことを示唆した。
【０２６６】
試料緩衝液を減らして細胞を沸騰させ、１５％ＰＡＧＥ上に載置し、細胞数を正規化した（ＯＤ６００ｎｍ＝０．１）。タンパクをニトロセルロース上にブロットし、１％カゼインを含むＰＢＳ中で終夜、ブロックした。ヘキサヒスチジンタグ化ＶＨＨは、マウス抗−ヒスチジンモノクローナル抗体（セロテック(Serotec)、ＰＢＳ中で１：１０００に希釈された）を使用して検出し、ＰＢＳ−０．５％Tween−２０で４回、洗浄後、発色性物質としてＮＢＴおよびＢＣＩＰを使用して、抗マウスアルカリホスファターゼ共役体（シグマ(Sigma)、１：１０００に希釈された）とともにインキュベートした。ＶＨＨ  ＴＥＭ０４変異型は野生型誘導体よりもより低い濃度に発現するが、ＶＨＨ  ＣＥＡ７１では相違が観察されなかった（図２）。
【０２６７】
ペリプラズム抽出物は４ｍｌＴＥＳ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍショ糖；ｐＨ８．０）中に細胞を再懸濁させて、全培養物から作成した。前記懸濁液を氷上で３０分間、インキュベートした。続いて、０．２５×ＴＥＳ６ｍｌを添加し、氷上でインキュベーションを２０分間続けた。ペリプラズムはＳＳ３４−ロータ（ソルバル(Sorval)）中で１０，０００ｒｐｍおよび４℃で２０分間、遠心分離して除去した。ＶＨＨはＮｉ−ＮＴＡ（キアゲン(Qiagen)）を使用して、ＩＭＡＣによって精製した。収量は計算されたモル吸光係数（ＶＨＨ  ＴＥＭ０４Ｅ（Ｒ１０３）＝２．１６８およびＥ（Ｗ１０３）＝２．５８２；ＶＨＨ  ＣＥＡ７１Ｅ（Ｒ１０３）＝１．４４４およびＥ（Ｗ１０３）＝１．８６５）を使用して、ＯＤ２８０ｎｍにて測定して決定した（表２）。ウエスタンブロット分析にて観察されたように、ＶＨＨ  ＴＥＭ０４の変異型抗体の収量は、その野生型のものよりも低かったが、ＶＨＨ  ＣＥＡ７１では差異が見出されなかった。精製ＶＨＨはクマシー染色ＰＡＧＥにて分析された（図５）。このことから、β−ラクタマーゼが野生型および変異型の両方で、ＶＨＨ  ＴＥＭ０４の複合体として共精製されたことが明らかとなった。
【０２６８】
培養物１リットル当たり発現した野生型（１０３位にＲ）および変異型（Ｗ）ＶＨＨの産生収量
【表２】
2005520494.tif 000003
【０２６９】
３．２  ＶＨＨ  ＣＥＡ７１変異型の抗原結合特性
野生型と変異型ＶＨＨ  ＣＥＡ７１の抗原結合特性を比較するために、ＥＬＩＳＡを実施した。マイクロタータープレート（マキシソープ(Maxisorp)、NUNC）を濃度１μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ中）のＣＥＡ（スクリップス(Scrips)）とともに４℃で終夜、被覆し、ＰＢＳ中、１％カゼイン３００μｌでもって、室温（ＲＴ）で２時間、ブロックした。プレートはＰＢＳ−Tweenで３回、洗浄した。全精製試料の希釈シリーズ（１０μｇ／ｍｌ〜４．５７ｎｇ／ｍｌ、希釈因子３）を室温にて２時間、３通りにインキュベートした（１００μｌ／ウェル）。プレートをＰＢＳ−Tweenで６回洗浄し、その後、ＶＨＨの結合性は室温で１時間、マウス抗ヒスチジンｍＡＢ（セロテック(Serotec)；１：１０００希釈；１００μｌ／ウェル）、次いで室温で１時間、抗マウスアルカリホスファターゼ共役体（シグマ(Sigma)、１：２０００希釈）とともにインキュベートして検出した。染色は基質ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、１Ｍジエタノールアミン中、２ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭ  Ｍｇ２ＳＯ４、ｐＨ９．８）を使用して行い、シグナルを３０分後、４０５ｎｍで測定した。ＣＥＡ野生型ＶＨＨは、変異型よりも約１０倍低い濃度で結合する（図６）。これは変異型タンパクの９０％が正確に折りたたまれていない（すなわち不活性）か、あるいは変異したＶＨＨの親和性が１０倍低いことのいずれかを意味する。
【０２７０】
ＶＨＨ  ＴＥＭ０４について、ＥＬＩＳＡを実施しなかったが、クマシー染色ゲル（図５）から、共精製されたβ−ラクタマーゼがＶＨＨと同様な強度を有するようであり、Ｒ１０３Ｗ変異型が活性型で完全に産生されることが示唆される。したがって、１０３位にトリプトファンを導入することは親和性を減少させると推定され得る。
【０２７１】
３．３  ＶＨＨ  ＣＥＡ７１野生型およびＲ１０３Ｗ変異型の溶解性
溶解特性は、ＶＨＨが沈殿し始めるときの硫酸アンモニウム濃度を測定することによって試験した。したがって、ある有限量の水に過剰量の塩を溶解して硫酸アンモニウムの飽和ストック溶液を調製した。室温で２時間、平衡化した後、固体粒子を４３００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して除去し、上清（１００％硫酸アンモニウム溶液）を０〜８０％に希釈して使用した。試料６０μｌを硫酸アンモニウム溶液３００μｌへ添加して、４℃で１８時間、混合した。この混合物をエッペンドルフ遠心管で１３０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離した。上清中の可溶性ＶＨＨの量は、抗原結合性の程度から推論されるＥＬＩＳＡで（図７）、および一方、ＯＤ２８０のタンパク濃度を測定して（図８）決定された。
【０２７２】
両測定法から、野生型抗ＣＥＡ  ＶＨＨ  ＣＥＡ７１は硫酸アンモニウム濃度６５％で沈殿し始めたが、変異型は５８％で沈殿の徴候を示すと結論つけられる。この実験は明らかに１０３位にアルギニンを有するＶＨＨ  ＣＥＡ７１の野生型配列の中で、１０３位にトリプトファンを導入することは、その溶解度を減少させることを証明する。
【０２７３】
実施例４：機能的単一ドメイン重鎖抗体断片のクローニング、選択および産生
ヒトコブラクダおよびラマに、完全フロインド(Freund)アジュバント（第１注射）およびフロインド(Freund)不完全アジュバント（続いての注射）を使用して、抗原の反応混液を筋肉注射で免疫した。ヒトコブラクダは、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、卵アルブミン（ＯＶＡ）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、変異型表面グリコプロテイントリパノソーム（ＶＳＧ）、β−ラクタマーゼ、炭酸脱水素酵素、クチナーゼ、ポティウイルス(Potyvirus)およびリゾチームでもって免疫した。ラマは、ポリＡ結合タンパク２型（ＰＡＢＰ２）、リノール酸ＢＳＡ−共役体、ＣＤ４０へのヒト化マウスｍＡｂ（Ｈｕ−抗ＣＤ４０）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、サルモネラチフィムリウム（Salmonella  typhimurium）、ロタウイルスでもって免疫した。１週間間隔で６回、注射した後、血液試料１００ｍｌを採取した。ＰＢＬ細胞をフィコール−パケプラス（Ficoll-Paque  Plus）勾配（アマシャムバイオサイエンシズ(Amersham  Biosciences)）上で分離した。全ＲＮＡは酸性グアニジンチオシアネート抽出法を使用して、これらの細胞から単離し（チョムジンスキー(Chomczynski)およびサッチ(Sacchi)、１９８７）（非特許文献２３）、ｃＤＮＡをＭ−ＭＬＶ  ＲＴ（ギブコ(Gibco  BRL)およびランダムオリゴヌクレオチドプライマー（アマシャムバイオサイエンシズ）を使用して調製した。全てのラクダ科動物免疫グロブリンのリーダー配列およびＣＨ２エクソンにそれぞれアニールするプライマーＣａｌｌ００１（５´−ＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧ−３´）およびＣａｌｌ００２（５´−ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ−３´）を使用して、可変ドメインをコードする遺伝子断片をＰＣＲで増幅した。ＮｃｏＩ制限酵素部位を導入するために、上流プライマーＳＭ０１７（５´−ＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３´）およびＳＭ０１８（５´−ＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧ−３´）の等モル混合物を使用して、Ｃａｌｌ００２と組み合わせてネスティド（nested）ＰＣＲで遺伝子断片を再増幅した。最終増幅で、Ａ４ショートプライマー（５´−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣ−３´）を一方ではＳｆｉＩ部位を導入するために使用し、他方、前記プライマーを使用して、１０３位に主要残基およびＮｏｔＩ部位を導入するために使用した：プライマー１（Ｒ１０３）、プライマー２（Ｒ１０３）、プライマー３（Ｋ１０３）、プライマー４（Ｑ１０３）、プライマー５（Ｌ１０３）、プライマー６（Ｆ１０３）、プライマー７（Ｇ１０３）、プライマー８（Ｓ１０３）、プライマー９（Ｐ１０３）、プライマー１０（Ｙ１０３）。ＰＣＲ産物をファージミドベクターｐＨＥＮ４（重鎖抗体断片のクローニング部位の下流にＨＡ−タグを有するｐＨＥＮ１（フーゲンブーム(Hoogenboom)ら、１９９１）（非特許文献１３）の誘導体）中に、ＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ制限酵素を使用してクローン化した。レパートリーはＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージに感染した後、ファージ上に発現させた。特異的結合体をファージディスプレイおよびパニングの原理（ガールーディ(Ghahroudi)ら、１９９７）（非特許文献２４）を使用して選択した。
【０２７４】
ＣＥＡ（ＣＥＡ１およびＣＥＡ７２）、ＰＳＡ（Ｎ３−Ａ、Ｎ８−Ｂ、Ｃ９−Ｂ、Ｃ１１−Ｂ、Ｃ１２−Ａ、Ｃ１−Ｂ、Ｃ２４−Ａ、Ｎ１３−Ａ、Ｎ１５−Ｂ）、ＨＳＡ（ＡＬＢ１、ＡＬＢ２、ＡＬＢ３、ＡＬＢ４、ＡＬＢ５）、Ｈｕ抗ＣＤ４０（ＣＤ４０−１、ＣＤ４０−２、ＣＤ４０−３、ＣＤ４０−４、ＣＤ４０−５、ＣＤ４０−６、ＣＤ４０−７）、ＯＶＡ（Ｂ１３、１ＤＢＯＶＡ１１、１ＤＢＯＶＡ２３、１ＤＢＯＶＡ４３、Ａ２−１９、Ａ４−１７、Ｂ３６８、Ｒ２４）、ＶＳＧ（ｃＡｂＡｎ０４）、β−ラクタマーゼ（ｃＡｂＢＬＡ０１、ｃＡｂＴＥＭ０４）、炭酸脱水素酵素（１Ｄ２ＣＡ３０）、ＰＡＢＰ２（Ｃ４  ＰＡＢＰ２、Ｅ３  ＰＡＢＰ２、Ｆ６  ＰＡＢＰ２）、サルモネラチフィムリウム(Salmonella  typhimurium)（ＭＰＯＤ６サケ）、ロタウイルス（１−Ｆ６  ＲＴＶ）、リノール酸（ＬＡ−１）、クチナーゼ（ＣｕｔＩＩＩ１９，Ａ４ｃｕｔ９、ＣＡＣＵ１３、ＣＡＢＣＵＴ４、ＣＵ１６）、ポティウイルス(Potyvirus)（４８ｄｐｖｙ、３４８ＤＰＶＹ、１６４８ＤＰＶＹ、１０４８ＤＰＶＹ２３、ＰＶＹＩＡ１５、ＰＶＹＩＡ２、ＰＶＹＩＡ１、ＰＶＹ１７）およびリゾチーム（１Ｄ２Ｌ２８）に対して特異的な単一ドメイン重鎖抗体を単離し、発現、ＥＬＩＳＡでの結合性および親和性について評価した。配列は以下の通りであり、カバット番号付けにより決定された１０３位アミノ酸は太線で示す。
【０２７５】
【表３】
2005520494.tif 000004
【０２７６】
各構築物について、１０ｍｌの前培養を１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含むＴＢ中にて開始した。各前培養物において、４×３３０ｍｌ培養を終夜培養物３ｍｌとともに、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＴＢ中にて３７℃で開始した。培養物をＯＤ６００ｎｍ＝０．４にて、１ｍＭ  ＩＰＴＧを使用して誘導し、２８℃で終夜、成長させた。
【０２７７】
全ての終夜培養物からペリプラズム抽出物を調製した。終夜培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清を除き、ペレットをＴＥＳ（０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５Ｍショ糖）１６ｍｌ中に再懸濁した。この混合物を氷上で３０分間、インキュベートした。０．２５×ＴＥＳ２４ｍｌを添加し、２０分間、氷上でインキュベートし、１０，０００ｒｐｍで２０分間、遠心分離した。上清をＮｉ−ＮＴＡ（キアゲン(QIAGEN)）で精製し、ＰＢＳに対して終夜、透析した。ＯＤ２８０を測定し、培養物１リッター当たりの精製物質の収量（ｍｇ）を測定した。Ｋｄをビアコア(BIAcore)で測定した結果を下記の表に示す。
【０２７８】
【表４】
2005520494.tif 000005
【０２７９】
ＣＥＡ１結合体およびヒトＶＨ３生殖系列（ＤＰ−４７）の整列から、以下に示すように、高度のホモロジー（位置１および５におけるＦＲ１中での２つのアミノ酸変化および位置７４、８３、８４および９４におけるＦＲ３中での４つの変化）が明らかになった。
【０２８０】
【表５】
2005520494.tif 000006
【０２８１】
したがって、ヒト生殖系列遺伝子ＤＰ−４７に対して高いホモロジーを有するＣＥＡ腫瘍抗原の特異的結合体は、さらにヒト化し、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅで結合親和性における変異誘発の影響を評価する理想的な候補であった。
【０２８２】
ＦＲ１中の残基の変異誘発は、特異性、結合親和性および発現濃度に有意な影響をもっていなかった。ＦＲ３残基のほとんどの変異誘発は、特異性、親和性および発現濃度の損失に到らなかった。ほとんどのヒト化した最良機能ＣＥＡ１変異型を免疫原性研究において選択した。ヒヒを１週間毎、用量１ｍｇ／ｋｇ体重を静脈内、筋肉内、および皮下から免疫した。血液試料を採取し、体液反応をＥＬＩＳＡで評価した。有意な抗体反応はＣＥＡ１変異型に対して生じなかった。
【０２８３】
実施例５：ヒトおよびマウスＶＨ由来機能的単一ドメイン重鎖抗体断片ライブラリーの構築
ｃＤＮＡ鋳型を非免疫ヒトドナー２０名（またはＩｇフォールドを有する抗原結合分子を含む他の種から得たもの）から得た血液試料から開始して作成した。末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）をフィコール−パケ(Ficoll-Paque)勾配（アマシャムバイオサイエンシズ）上で単離した。全ＲＮＡを実施例４で記載したようにＰＢＬの２０個の試料から個々に調製した。第１鎖ｃＤＮＡもまた、プライマーとしてランダムヘキサマー（実施例４のように）を使用して全ＲＮＡから個々に合成した。変異誘発はバックプライマーとして、ＳｆｉＩ部位に５´連結したフレームワーク１特異的プライマー、およびフォワードプライマーとして、変異誘発プライマー：
【０２８４】
【表６】
2005520494.tif 000007
【０２８５】
または、
【０２８６】
【表７】
2005520494.tif 000008
【０２８７】
を使用して実施した。得られたＤＮＡはＢｓｅＲＩを使用して切断し、２本鎖プライマー：
第１変異誘発プライマーを使用して得たＰＣＲ産物には、
【０２８８】
【表８】
2005520494.tif 000009
【０２８９】
または、第２変異誘発プライマーを使用して得たＰＣＲ産物には、
【０２９０】
【表９】
2005520494.tif 000010
【０２９１】
に結合した。
【０２９２】
このプライマーはＣＤＲ３およびフレームワーク４コード領域を再構築する。得られたＤＮＡを上記した同じフォワードプライマーを使用し、バックプライマーとして
【０２９３】
【表１０】
2005520494.tif 000011
【０２９４】
を使用して増幅した。このプライマーはＶＨコード配列の末端にＮｏｔＩ部位を作成した。得られた物質をＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで切断し、得られた断片をｐＨＥＮ４中にクローン化して、ファージディスプレイライブラリーを得た。
【０２９５】
ライブラリーをヒト血清アルブミンおよびヒトＩｇＧ１などの抗原のパネルを用いて選択し、それによって、多数の抗原特異的抗体断片を得た。配列分析から、１０３位の導入残基を明らかにした。産生したＨｉｓ６−タグ化ＶＨＨ断片は、良好な溶解特性、良好な特異性（無関係な抗原に対しては非反応性）および高い親和性（２〜５０ｎＭの範囲）を示した。
【０２９６】
マウスを１セットの抗原（ＣＥＡおよびＰＳＡ）で免疫し、４週間後に脾臓を取り除き、ポリトロン(Polytron)破砕機でグアニジニンチソシアネート緩衝液中に均質化し、低速遠心分離によって細片を除去し、下記方法を使用して全ＲＮＡを抽出した。上記したように、マウスＶＨコード遺伝子断片を増幅し、それによって、１０３位に変異型残基を導入した。高親和性を選択するとき、ＶＨ断片を溶解性に関する良好な特性をもとに選択した。
【０２９７】
実施例６：ヒトＴＮＦ特異的断片の単離、配列決定および産生
ファージライブラリーから腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）に対する結合体を選択することは、実施例４に記載したようにして実施した。ライブラリーをパニングした後、４８個のクローンを選択し、固定化ＴＮＦおよびＢＳＡ上でファージＥＬＩＳＡにて試験した。ＴＮＦ上のシグナルがＢＳＡ上で得られたものより優れているクローンをさらなる特性化のために選択した。選択されたクローンを配列決定して、我々は同一クローンを取り除き、Ｗ１０３が選択断片中にもはやコードされていないことを実証することができた。
【０２９８】
選択された抗体断片をコードする遺伝子断片を実施例３に記載したようにして、ｐＨＥＮ６発現ベクター中に再クローン化した。このことにより、我々が可溶性ペリプラズムタンパクとして組換え抗体断片を産生することが可能となった。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース上でＩＭＡＣ、続いてスーパーデックス(Superdex)７５のゲル濾過クロマトフラフィーによって、ペリプラズム画分から組換え抗体断片を均質に精製した。その純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにて測定した。
【０２９９】
６．１  抗ＴＮＦ抗体断片の用途
【０３００】
６．１．１  治療用途
アメルート(Ameloot)ら、（２００１）（非特許文献２５）が記載するプロトコールに従って、Ｌ９２９マウス線維肉腫細胞中で抗ＴＮＦ特異的断片を試験した。９６ウェルマイクロタイタープレート中にウェル当たり細胞３０，０００個にてＬ９２９細胞を播種した。翌日、精製組換え抗体断片をいくつかのウェルに添加し、その際、ＰＢＳのみをコントロールウェルへ添加した。この実験では、抗体断片の最終濃度は１マイクロモルであった。
【０３０１】
続いて、致死量のＴＮＦを抗体が添加されたウェルおよびコントロールウェルの一部へも添加した。１８時間後、生存細胞の濃度を比色法によって測定した。この方法で我々はこれらの抗体断片がＴＮＦの細胞毒性効果を中和する能力を有し、治療上の潜在性を有することを実証した。
【０３０２】
６．１．２  ＥＬＩＳＡにおける抗ＴＮＦ  ＶＨＨの診断用途
我々はマイクロタイタープレートの個々のウェルへＰＢＳ中、濃度５μｇ／ｍｌの抗体断片１００μｌを添加した。４℃で終夜、インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中、１％ＢＳＡでブロックした。機能的固定化抗体断片の存在を１μｇ／ｍｌでビオチン化ＴＮＦの結合性によって実証した。結合したビオチン化ＴＮＦの存在は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役体およびそれに続くｐ−ニトロフェニルホスフェートとの反応によって実証した。
【０３０３】
６．１．３  抗ＴＮＦ  ＶＨＨの抗体アレーへの用途
２つの異なったフォーマット、すなわちニトロセルロースフィルターおよびガラススライドの抗体アレーを試験した。フィルター法では、ＰＢＳ中、濃度１ｍｇ／ｍｌの精製抗体断片２μｌをニトロセルロースシート上にマイクロピペットで滴下した。乾燥後、シートをＰＢＳ中、１％ＢＳＡでブロックした。ニロトセルロースシート上の機能的固定化抗体断片の存在は、ビオチン化ＴＮＦで実証した。結合したＴＮＦの存在は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役体およびＮＢＴ−ＢＣＩＰ試薬でもって実証した。ＴＮＦ特異的断片が適用されたこれらの位置のダークスポットの出現は、これらの抗体断片が受動的に固体支持体を被覆したとき、機能性を保持していることを証明した。この方法は抗原特異的断片のランダムスクリーニングおよび選択において使用し得る。
【０３０４】
ガラススライドタイプの抗体アレーでは、抗ＴＮＦ抗体断片を共有結合により固定化した。２０％グリセロールを含むＰＢＳ中、濃度２００μｇ／ｍｌにまで精製抗体断片を希釈した。試料を３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルへ移送した。続いて、自動化コンタクトプリンターを使用して、抗体溶液５ナノリットルを市販ガラススライド（テレケム−スーパーアルデヒド(Telechem-Superaldehyde)）へ移した。
【０３０５】
試料を塗布してから、ガラススライドを湿潤チャンバーで１時間、インキュベートして、ガラススライド上に存在する反応性アルデヒドと抗体断片表面上に存在するリジン基との間の反応を進行させた。
【０３０６】
続いて、スライドを１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロックし、次いで１μｇ／ｍｌのＣｙ３−修飾ＴＮＦ（蛍光標識Ｃｙ３−アマシャムバイオサイエンシズ）とともにインキュベートし、最後にＰＢＳで洗浄して、未結合標識ＴＮＦを除去した。スライドの表面に存在する蛍光強度をスキャニングした後、我々はＴＮＦ特異的抗体断片を塗布したそれらの位置に大きなシグナルを観察した。
【０３０７】
この結果は、これらの抗体断片が結合能力を保持して共役結合により固定化されたことを実証した。
【０３０８】
６．１．４  親和性クロマトグラフィー
濃度が少なくとも１ｍｇ／ｍｌである精製抗体断片を０．１Ｍ重炭酸ナトリウムに対して透析し、続いて製造者（アマーシャムバイオサイセンシズ）が記載するプロトコールに従い、１ｍｌゲル懸濁液（ＣＮＢｒ活性化セファロース）と混合した。
【０３０９】
３時間、インキュベートした後、１ＭトリスｐＨ８溶液１００μｌを添加した。未結合タンパクを除去するために、十分に洗浄した後、親和性樹脂を１ｍｌＰＢＳ中に再懸濁した。
【０３１０】
固定化抗ＴＮＦ抗体樹脂の機能性を以下のように試験した。ヒト血漿１ｍｌへ精製ＴＮＦ１０μｇを添加した。次いで、我々は親和性樹脂１００μｌを添加した。この懸濁液を終夜、インキュベートした後、該樹脂をＰＢＳで十分に洗浄した。続いて、ペレット化ビーズを１％ＳＤＳ溶液を含む溶液１００μｌ中へ再懸濁し、１０分間、沸騰させた。遠心分離後、上清２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に載置した。期待される分子量バンドが分析試料中で豊富に見られた。
【図面の簡単な説明】
【０３１１】
【図１】野生型抗β−ラクタマーゼＶＨＨ  ＴＥＭ０４のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列。
【図２】抗癌胎児性抗原ＶＨＨ  ＣＥＡ７１のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列。
【図３】抗β−ラクタマーゼＶＨＨ  ＴＥＭ０４のＲ１０３Ｗおよび野生型ＶＨＨのウェスタンブロット分析。各クローンから３つの培養物を誘導し、分析に使用した。ポジティブコントロールとして抗リゾチームＶＨＨ  ｃＡｂｌｙｓ３を使用した。
【図４】抗癌胎児性抗原ＶＨＨ  ＣＥＡ７１のＲ１０３Ｗおよび野生型ＶＨＨのウェスタンブロット分析。各クローンから３つの培養物を誘導し、分析に使用した。ポジティブコントロールとして抗リゾチームＶＨＨ  ｃＡｂｌｙｓ３を使用した。
【図５】ＩＭＡＣ精製Ｒ１０３Ｗ変異型および野生型ＶＨＨのクーマシー染色された１５％ＳＤＳ  ＰＡＧＥ。左側の２つのレーン中のより遅い移動産物は、ＶＨＨに複合体化されたβ−ラクタマーゼである。
【図６】ＶＨＨ  ＣＥＡ７１野生型（ＷＴ）およびＲ１０３Ｗ変異型のＥＬＩＳＡにより測定された抗原結合性。
【図７】断片が沈殿し始めたときの硫酸アンモニウムの濃度を測定することによるＶＨＨ  ＣＥＡ７２（野生型）およびＲ１０３Ｗ（変異型）の溶解性能の試験。上清中のＶＨＨ量は、ＯＤ２８０のタンパク含量にて測定した。
【図８】断片が沈殿し始めたときの硫酸アンモニウムの濃度を測定することによるＶＨＨ  ＣＥＡ７２（野生型）およびＲ１０３Ｗ（変異型）の溶解性能の試験。上清中のＶＨＨ量は、ＥＬＩＳＡの抗原結合性にて測定した。
【図９】配列番号１〜１０および２０〜７９：重鎖抗体、単一ドメイン抗体、ＶＨドメイン、またはこれらの断片の配列。示された位置のアミノ酸は、示されたアミノ酸で置換され、該位置はカバット番号付けにより決定される。
【図１】
2005520494.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2005520494.tif 000019
【図９】
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【配列表】
2005520494000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月17日(2005.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸を含み、かつ、１０３位にＲ、Ｇ、Ｋ、Ｓ、Ｑ、Ｌ、およびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸、および所望により、１０８位にＱ、ＬおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸を含み、これらの位置はカバット番号付けに従って決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１３（ＲＧＱＧＴＱ）を含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項３】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１４（ＲＧＫＧＴＱ）を含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項４】
配列番号１５（ＶＸＸＸＸＸＸＧＬＸＷ）を含み、Ｘはアミノ酸であり、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項５】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１６（ＬＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項６】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１７（ＱＧＱＧＴＧＶＴＶＳＳ）を含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項７】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１８（ＰＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項８】
４５位に荷電アミノ酸またはＣのいずれでもないアミノ酸および配列番号１９（ＳＳＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）を含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項９】
配列番号１〜１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１０】
配列番号１、３、５、７または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１１】
配列番号２、４、６、８または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１２】
配列番号１、２、３、４または５のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１３】
配列番号６、７、８、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１４】
配列番号５、６、７、８または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１５】
配列番号１、３、７、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１６】
配列番号２、５、８、９または１０のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１７】
配列番号３、４、５、６または７のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１８】
配列番号４、６、７、８または９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項１９】
配列番号２０〜７９のいずれか１つを含む機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２０】
前記高分子がラクダ由来である、請求項１〜１９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２１】
前記高分子がヒト由来である、請求項１〜１９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２２】
前記高分子がマウス由来である、請求項１〜１９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２３】
前記高分子がラクダ、ヒトおよびマウス以外の脊椎動物由来である、請求項１〜１９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２４】
人工変異型である、請求項１〜２３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２５】
前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片のペプチド同族体である、請求項１〜２４のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片を含むポリペプチド。
【請求項２７】
１つまたは複数のアミノ酸が誘導体化される、請求項１〜２６のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ，Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、かつ、所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片を機能化する方法。
【請求項２９】
１０３位のアミノ酸をＲで置換し、これらの位置はカバット番号付けにより決定される重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片を機能化する方法。
【請求項３０】
４５位のアミノ酸をＬで置換し、かつ、所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで置換し、かつ、１０３位のアミノ酸をＲで置換することを含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片をヒト化し、かつ、機能化する方法。
【請求項３１】
４５位のアミノ酸をＬで置換し、１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、かつ、所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで置換し、かつ、所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片をヒト化し、かつ、機能化する方法。
【請求項３２】
前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片はヒトまたはマウス由来である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記重鎖抗体、単一ドメイン重鎖抗体、ＶＨドメイン、またはそれらの断片はヒトおよびマウス以外の脊椎動物種由来である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３４】
４５位のアミノ酸をＬで置換し、かつ、所望により３７位のアミノ酸をＶで、および／または４４位のアミノ酸をＧで、および／または４７位のアミノ酸をＷで置換することを含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ラクダ科動物ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片をヒト化する方法。
【請求項３５】
４５位のアミノ酸をＬ、ＶおよびＰからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換し、１０３位のアミノ酸をＲ、Ｇ、Ｋ、ＳおよびＰからなる群から独立して選択されたアミノ酸で置換し、かつ、３７位のアミノ酸をＦで置換し、４４位のアミノ酸をＧで置換し、４７位のアミノ酸をＷで、１０３位のアミノ酸をＲで置換し、そして、所望により１０８位のアミノ酸をＬ、ＱおよびＲからなる群から独立して選択されるアミノ酸で置換することを含み、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片をラクダ化する方法。
【請求項３６】
請求項２８〜３３および３５のいずれか１に記載の方法によって得られうる機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項３７】
請求項２８〜３３および３５のいずれか１に記載の方法によって得られた機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片。
【請求項３８】
請求項３４に記載の方法によって得られうる、機能的ヒト化ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ヒト化ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ヒト化ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片。
【請求項３９】
請求項３４に記載の方法によって得られた機能的ヒト化ラクダ科動物重鎖抗体、機能的ヒト化ラクダ科動物単一ドメイン重鎖抗体、機能的ヒト化ＶＨドメインまたはそれらの機能的ヒト化断片。
【請求項４０】
人工変異型である、請求項３６〜３９のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片。
【請求項４１】
前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片のペプチド同族体である、請求項３６〜４０のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片。
【請求項４２】
請求項３６〜４１のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片を含むポリペプチド。
【請求項４３】
１つまたは複数のアミノ酸が誘導体化されている、請求項３６〜４１のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項３６〜４３のいずれか１に記載の１つまたは複数の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片を含むライブラリー。
【請求項４５】
以下の工程を含む、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片を含むライブラリーの作成方法；
ＶＨ鎖のフレームワーク４領域のコード領域に制限酵素認識部位を導入し、該制限酵素認識部位の切断部位は、ＣＤＲ３領域中に位置し、
前記コード配列を含む核酸分子を前記制限酵素で切断し、
２本鎖プライマーをＶＨコード核酸分子に結合し、ＣＤＲ３を修復し、そして、１０３位にアミノ酸Ｒを導入し、これらの位置はカバット番号付けにより決定され、そして
結合した断片を増幅する。
【請求項４６】
前記制限酵素切断は、ＣＤＲ３コード領域の最後の２つのコドン内に位置する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記制限酵素は、１０１位アミノ酸をコードするコドンの第１ヌクレオチドの前で、かつ、相補鎖の１０１位アミノ酸をコードするコドンの第２ヌクレオチドの後を切断して、ＧＡ３´粘着末端を作成し、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記制限酵素切断は、ＣＤＲ３コード領域の最終コドン内に位置する、請求項４５〜４７のいずれか１に記載の方法。
【請求項４９】
前記制限酵素は１０２位アミノ酸をコードするコドンの第２ヌクレオチドの前で、かつ、相補鎖の１０２位コドンの第３ヌクレオチドの後を切断して、ＣＡ３´粘着末端を作成し、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、請求項４５〜４８のいずれか１に記載の方法。
【請求項５０】
前記制限酵素は、ＢｐｍＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、ＢｓｇＩ、ＳｍｕＩ、ＦａｕＩ、ＢｓｅＲＩ、およびＢｆｉＩからなる群から選択される、請求項４５〜４９のいずれか１に記載の方法。
【請求項５１】
フォワードプライマーとしてフレームワーク１特異的プライマー、およびその３´末端の３つのヌクレオチドが１０３位のアミノ酸をコードする核酸鎖のコドンを超えた位置にあるように、前記核酸鎖にアニールするバックプライマーを使用して、該３´末端の３つのヌクレオチドの逆相補体がＲ１０３、Ｋ１０３、Ｑ１０３、Ｐ１０３、Ｇ１０３またはＳ１０３をコードし、これらの位置はカバット番号付けにより決定される、免疫または非免疫ＶＨＨ抗体のレパートリーをコードする核酸鎖を増幅する工程を含む、少なくとも１つの機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片を含むライブラリーの作成方法。
【請求項５２】
フォワードプライマーとしてフレームワーク１特異的プライマーを使用し、バックプライマーとして配列番号８０〜８８の１つまたは複数を使用する、免疫または非免疫ＶＨＨ抗体またはそれらの断片のレパートリーをコードする核酸の増幅工程を含む、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片を含むライブラリーを作成する方法。
【請求項５３】
請求項４５〜５２のいずれか１に記載の方法によって得られうる、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片を含むライブラリー。
【請求項５４】
請求項４５〜５２のいずれか１に記載の方法によって得られた、少なくとも１の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片を含むライブラリー。
【請求項５５】
前記方法がヒトまたはマウス由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する、請求項５３または５４に記載のライブラリー。
【請求項５６】
前記方法がラクダ由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する、請求項５３または５４に記載のライブラリー。
【請求項５７】
前記方法がラクダ、ヒトまたはマウス以外の脊椎動物由来の単一ドメイン重鎖ライブラリーを使用する、請求項５３または５４に記載のライブラリー。
【請求項５８】
請求項２８〜３５のいずれか１に記載の方法によって得られた免疫分析に使用するための重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片。
【請求項５９】
細胞中で前記抗体の転写および翻訳を調節する制御配列および該制御配列によって調節されたコード配列を含む構築物を含有する細胞中でポリペプチドの発現に有用な組換えＤＮＡ構築物であって、前記コード配列は、ＤＮＡ配列が請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチドをコードするように、読取り枠中に少なくとも２１ｂｐのＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ構築物。
【請求項６０】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片および請求項２６および４２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む核酸。
【請求項６１】
請求項６０で規定される配列と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項６２】
請求項６０または６１に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項６３】
請求項６０もしくは６１に記載の核酸分子の組込みまたはエピソームのコピー、または請求項６２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６４】
前記宿主細胞は酵母、細菌、昆虫、真菌、植物または哺乳動物細胞である、請求項６３に記載の宿主細胞。
【請求項６５】
（ａ）ポリペプチドの発現を可能とする条件下に、請求項６０または６１に記載の核酸を含む宿主細胞を培養し、そして、
（ｂ）培養物から産生されたポリペプチドを回収することを含む、
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチドを産生する方法。
【請求項６６】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチド、または請求項６０もしくは６１に記載の核酸を含む医薬。
【請求項６７】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチド、または請求項６０もしくは６１に記載の核酸を含む、喘息、鼻結膜炎、アレルギー性障害、急性同種移植拒絶反応、クローン病および潰瘍性大腸炎に関する疾患の治療剤。
【請求項６８】
所望により好適な賦形剤と組み合わせた、請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチド、または請求項６０もしくは６１に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項６９】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片または請求項２６および４２に記載のポリペプチド、または請求項６０もしくは６１に記載の核酸を含む、喘息、鼻結膜炎、アレルギー性障害、急性同種移植拒絶反応、クローン病および潰瘍性大腸炎に関する疾患の診断用剤。
【請求項７０】
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはそれらの機能的断片または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチドを使用する、タンパクの精製方法。
【請求項７１】
請求項６０および６１に記載の核酸、請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片、または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチドを含む、被検者の病理学的状態または病理学的状態に対する感受性の診断のためのキット。
【請求項７２】
（ａ）生体試料中の前記核酸のゲノムおよび制御配列の変異を含む、請求項６０または６１に記載の核酸中の変異の存否を決定し、そして
（ｂ）該変異の存否に基づく病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程を含む、
被検者の病理学的状態または病理学的状態に対する感受性の診断用剤。
【請求項７３】
（ａ）生体試料中の請求項６０もしくは６１に記載の核酸の存在または量、または請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはこれらの機能的断片、または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチドの発現を測定し、そして
（ｂ）前記核酸の存在または量、または機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、それらの機能的断片またはポリペプチドの発現に基づく病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程を含む、
被検者の病理学的状態または病理学的状態に対する感受性の診断用剤。
【請求項７４】
（ａ）請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、または機能的断片または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチドを、前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、その機能的断片またはポリペプチドと試験化合物との相互作用を可能とする条件下に、試験化合物と組み合わせて、複合体を生成し、そして、
（ｂ）前記機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメインまたはその機能的断片と相互作用する試験化合物の能力が、複合体中の試験化合物の存在によって示される複合体の生成を検出することを含む、
請求項１〜２５、２７、３６〜４１、４３のいずれか１に記載の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはこれらの機能的断片または請求項２６もしくは４２に記載のポリペプチドと相互作用する試験化合物をスクリーニングする医薬スクリーニング分析法。
【請求項７５】
請求項７４に記載の分析法によって同定され得る生産物または化合物。
【請求項７６】
配列番号８０の配列を含む核酸。
【請求項７７】
配列番号８１の配列を含む核酸。
【請求項７８】
配列番号８２の配列を含む核酸。
【請求項７９】
配列番号８３の配列を含む核酸。
【請求項８０】
配列番号８４の配列を含む核酸。
【請求項８１】
配列番号８５の配列を含む核酸。
【請求項８２】
配列番号８６の配列を含む核酸。
【請求項８３】
配列番号８７の配列を含む核酸。
【請求項８４】
配列番号８８の配列を含む核酸。
【請求項８５】
請求項７６〜８４に規定される配列と少なくとも６５％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸。
【請求項８６】
請求項７６〜８５のいずれか１に記載の核酸を使用する、１つまたは複数の機能的重鎖抗体、機能的単一ドメイン重鎖抗体、機能的ＶＨドメイン、またはそれらの機能的断片を産生する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
2005520494.tif 000021
2005520494.tif 000022
2005520494.tif 000023
2005520494.tif 000024
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2005520494.tif 000026