(57)【要約】本開示は、ダイズ細胞又は組織のアグロバクテリウム介在形質転換のための方法並びに形質転換させた細胞又は組織の、形質転換される植物中での再生のための方法を供する。この方法は、多くのダイズ品種を形質転換させるために使用されて良い。
2005535312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズ細胞又は組織を形質転換せしめるための方法であって当該方法は：
（a）外植片をダイズ種子から：
（ｉ）当該ダイズ種子から胚軸を取り除き；
（ii）１つの子葉をそれに隣接する腋芽に沿って取り除き、そして残りの１つの子葉に対して結合している初生葉を残し；そして
（iii）当該残りの子葉から初生葉の一部分を取り除き、それによって初生葉基部を生じさせること；
によって調製し；そして
（b）当該外植片を、１又は複数のダイズ細胞のゲノム中へと組み込まれるべき注目の１以上の核酸を含んで成るアグロバクテリウム（Agrobacterium）と共培養すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
１以上の形成された芽（shoot）を、選択剤を含有する培地で培養することを更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１以上の注目の核酸が選択的マーカー遺伝子を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記選択的マーカー遺伝子がフォスフォマンノースイソメラーゼ遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記選択剤がマンノースである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記アグロバクテリウムとの共培養をマンノースの存在下で行っている、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記初生葉基部からの芽形成を誘導することを更に含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記芽形成を、芽誘導ホルモンを含んで成る培地で前記初生葉基部を培養することによって誘導している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記芽誘導ホルモンが、オーキシン、サイトカイニン、及びジベレリン酸のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オーキシンが、IAA、NAA、及びIBAからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記サイトカイニンが、ベンジルアミノプリン（BAP）、チジアズロン、カイネチン、及びイソペンテニルアデニンからなる群から選択されている、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
芽形成の誘導が、１又は複数の一次分裂組織、二次分裂組織、及び子葉に対して結合している腋分裂組織を除去することを含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
形質転換した芽を選択することを更に含んで成る、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
選定の形質転換した芽をダイズ植物へと入れ再生せしめることを更に含んで成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ダイズ種子が成熟した種子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ダイズ種子が未熟な種子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ダイズ種子が発芽種子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
安定に形成されたダイズ植物を生産するための方法であって当該方法は：
（a）外植片をダイズ種子から：
（ｉ）当該ダイズ種子から胚軸を取り除き；
（ii）１つの子葉をそれに隣接する腋芽に沿って取り除き、残りの１つの子葉に対して結合している初生葉を残し；そして
（iii）当該残りの子葉から各初生葉の一部分を取り除き、それによって初生葉基部のペアを生じさせること；
によって調製し；そして
（b）当該外植片を、ダイズ細胞のゲノム中へと組み込まれるべき注目の核酸を含んで成るアグロバクテリウムと共培養し；
（c）各初生葉基部からの芽形成を誘導し；
（d）形成された１以上の芽を、選択剤を含有する培地中で培養し；
（e）形質転換した芽を選択し；そして、
（f）選定の形質転換した芽をダイズ植物へと入れ再生せしめること、
を含んで成る方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法により形質転換させたダイズ細胞又は組織から再生させたトランスジェニックダイズ植物。
【請求項２０】
請求項１９に記載のトランスジェニック植物によって生産されたトランスジェニック種子。
【請求項２１】
請求項１８の方法により形質転換させたダイズ細胞又は組織から再生させたトランスジェニックダイズ植物。
【請求項２２】
請求項２１に記載のトランスジェニック植物によって生産されたトランスジェニック種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許
本願は、その全体が本明細書中参照によって組み込まれている、２００２年７月２２日に提出された米国特許仮出願第60/390,562の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、植物を形質転換させるための方法、そして一層詳細には、ダイズ細胞又は組織を形質転換させるための方法に関連する。本発明は、トランスジェニックダイズ植物を形質転換したダイズ細胞又は組織から再生するための方法に関連する。本発明は、かかる方法によって獲得されたトランスジェニックダイズ植物及び種子にも関連する。
【背景技術】
【０００３】
ダイズは、他の双子葉作物とは異なり世界中、より広いエーカーで栽培されている主要な食品及び食料源である。それは、５０００万Ha超で栽培されていると報じられている。不幸にも、米国では、ほんの僅かな植物の導入により主要品種が成長し、結果として、この限られた遺伝資源基盤はダイズ育種能力を制限する。この国内のダイズの品種における遺伝子基盤の制限は、改良又は価値が付加された形質を伴う品種を成長させるための伝統的な育種方法の力を制限してきた。
【０００４】
従って、ダイズを改変するために遺伝子工学技術を使用することは、例えば、除草剤耐性、疾患耐性（例えば、ウィルス耐性など）などの形質を伴う新たな品種の開発、及び伝統的な育種技術又は組織培養誘導変異によっては達成不可能であった態様での種子品質の改良を促すことができる。
【０００５】
効率的形質転換系の開発は、植物における遺伝子発現を分析するために欠かすことができない。かかる系のために必要なものとしては、効率的に植物を再生せしめる適切な標的植物組織、外来DNAを標的植物細胞中へと効率的にデリバリーする遺伝子デリバリービヒクル、及び形質転換した細胞を選択するための効率的な方法が挙げられる。双子葉種の遺伝子形質転換において、細菌のアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を利用する形質転換系が遺伝子デリバリーのためのビヒクルとして頻繁に使用されている。アグロバクテリウム介在形質転換のための好適な標的組織としては、子葉、葉組織、及び胚軸が挙げられる。高速微粒子銃は、遺伝子を双子葉植物中へとデリバリーするための代わりの方法を提案する。
【０００６】
ダイズにおけるアグロバクテリウム介在遺伝子デリバリーは、ありきたりではない。報告では、公に、分裂組織及び子葉組織が頻繁に、アグロバクテリウム介在遺伝子デリバリーにおいて使用するための標的として述べられてきた。しかし、これら２つの外移植片源からの信頼でき且つ効率的な形質転換及び再生は往々にして遂行されていない。
【０００７】
Cheeらの米国特許第5,169,770号及び5,376,543号は、ダイズを形質転換させトランスジェニック細胞を生産する非組織培養法を論じており、この方法では、種子を発芽させ、そして分裂組織又は中間胚（mesocotyl）細胞組織に細菌細胞、詳細には、アグロバクテリウム系統を、インフェクション、DNAを外移植片中へと移すことを介して植える。この方法は、予め形成される芽（shoot）の成長に依存する。
【０００８】
ParrottW.Aら（1989）、”Recovery of primary transfotmants of soybean”、Plant Cell Reports vol.7：pp.615〜617は、未成熟な子葉組織からの、アグロバクテリウムと共培養した後に、ダイズ形質転換体を回収することを報じている。しかし、再生された植物はキメラであり、そしてトランス遺伝子は子孫に受け継がれることはなかった。
【０００９】
米国特許第5,416,011号（Hincheeらの）は子葉外植片を利用することを論じており、それは胚軸の除去、子葉を保存及び分離し、そして所望の遺伝子を含むアグロバクテリウム・チュメファシエンスベクターを植えることによってキメラ遺伝子を挿入することが必要となる。
【００１０】
Yan Bら（2000）の”Agrobacterium tumefacience−mediated transformation of soybean using immature zygotic cotyledon explants”、Plant Cell Reports vol.19：pp.1090〜1097は、ダイズの、未成熟な子葉によるアグロバクテリウム介在形質転換における全体形質転換頻度は０.０３％であることを報じている。
【００１１】
Martinellらの米国特許第6,384,301号は、単離したダイズ胚軸の分裂組織における細胞中へのアグロバクテリウムが介在した遺伝子導入を記載している。彼らの方法は、カルス段階の組織培養を伴わない。
【００１２】
上記の研究から、信頼できるダイズ形質転換系を確立する目的は、分裂組織及び子葉組織をアグロバクテリウムが介在した遺伝子デリバリーのための移植片源として使用する場合を伴う研究者によって達成されることがめったにないことが明らかである。従って、一層効率の良いダイズ形質転換系を開発するために、新たなる移植片源を含め、新たなる方法を開発し続ける必要がある。
【００１３】
ダイズ組織培養において、植物再生は、上胚軸組織及び初生胚組織から達成されうることが証明されている。しかし、現在まで、これらの２つの外植片源を遺伝子デリバリーのための標的として使用するダイズにおける首尾良い形質転換は報じられていない。
【００１４】
Wright M.S.ら（1987）”Initiation and propagation of Glycine max L. Merr.：Plants from tissue-cultured epicotyls”、Plant Cell Reports vol.8：pp.83〜90はダイズの上胚軸組織からの発芽（shoot）の首尾良い開始及び増殖を記載する。外植された上軸胚は、２０μMのカイネチンを含有するSchenkとHildebrandt培地で５週に渡り芽形成を導かれている。芽増殖は、２.１nMのピクロラム及び０.１μMのベンジルアデニンを含むN6倍地上で維持されていた。
【００１５】
Wright M.S.ら（1987）”Regeneration of soybean（Glycine max L.Merr）from cultured primary leaf tissue”、 Plant Cell Reports vol.6：pp.83〜89は、２７品種のダイズの初生葉組織から植物を再生させるための再現可能な方法を記載する。彼らは、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸が再生のために必須であるべきと証明された一方で、ベンジアデニン（BA）の添加は再生を増強することを確認した。
【００１６】
Rajasekaren Kら（1997）”Somatic embryogenesis from cultured epicotyls and primary leaves of soybean（Glycine max L.merr）”In Vitro Cellular ＆ Developmental Biology vol.33（No.2）：pp.88〜91は、温室で成長した植物に由来する未成熟な種子の培養した上肺軸及び初生葉組織からの不定胚形成よる、数品種のダイズの再生を記載している。彼らは、不完全な接合体胚軸を有する上軸胚を４６．２μMの2,4-Dを補ったMurashige-Skoog（MS）培地上で培養した場合、不定胚形成が、上肺軸及び初生葉から誘導されることを発見した。子葉を伴い培養されていない場合、単離した軸、上胚軸又は初生胚からの胚形成は確認されていなかった。発芽中の不定胚からの芽の先端の迅速な操作は１１．３μMのベンジルアデニンを含むChengの基本培地により達成された。
【発明の開示】
【００１７】
概要
本発明は、ダイズ細胞を形質転換せしめるための方法及び形質転換した細胞を形質転換される植物中に入れ再生させるための方法に関連する。本法は、多くのダイズ品種を形質転換せしめるために使用されて良い。
【００１８】
本発明は、ダイズ細胞中への高効率でのアグロバクテリウム・チュメファシエンス介在遺伝子デリバリーを可能にする新規ダイズ外植片を提供する。
【００１９】
更に詳細に、本発明は、ダイズ細胞又は組織を形質転換せしめるための方法を提供し、当該方法は：
（a）ダイズ種子から外植片を：
（ｉ）当該種子から胚軸の全部又は一部を取り除き；
（ii）当該種子から１つの子葉をそれに隣接する腋芽に沿って取り除き、そして１つの子葉をそれに対して結合している上軸胚及び初生葉を伴い残し；
（iii）残りの子葉から初生葉の一部分を取り除き、それによって初生葉基部を生じさせること；
によって調製し；そして
（b）当該外植片を、ダイズ細胞のゲノム中へと組み込まれるべき注目の核酸を含んで成るアグロバクテリウム・チュメファシエンスと共培養すること、
を含んで成る。
【００２０】
更なる実施態様において、本法は更に、１又は複数の以下の：初生葉基部及び隣接する上軸胚からの芽形成を誘導し；当該芽を、選択剤を含有する培地中で培養し；形質転換した芽を選択し；そして当該形質転換した芽から形質転換された植物を再生すること、を含んで成る。
【００２１】
更なる実施態様において、本発明は、安定に形質転換したダイズ植物を生産するための方法を供し、当該方法は：
（a）ダイズ種子から外植片を：
（ｉ）当該種子から胚軸の全部又は一部を取り除き；
（ii）当該種子から１つの子葉をそれに隣接する腋芽に沿って取り除き、そして１つの子葉をそれに対して結合している上軸胚及び初生葉を伴い残し；
（iii）当該上軸胚から初生葉の一部分を取り除き、それによって１以上の初生葉基部を生じさせること；
によって調製し；そして
（b）当該外植片を、ダイズ細胞のゲノム中へと組み込まれるべき注目の核酸を含んで成るアグロバクテリウム・チュメファシエンスと共培養し；
（c）当該初生葉基部領域からの芽の形成を誘導し；
（d）形成された芽を、選択剤を含有する培地中で培養し；
（e）形質転換した芽を選択し；そして、
（f）選定の形質転換した芽をダイズ植物へと入れて再生すること、
を含んで成る。
【００２２】
他の実施態様において、（a)(ii）において生成された外植片の各々の初生葉の一部分が取り除かれ、それによって初生葉基部のペアを生じさせる。
【００２３】
本発明の方法は、任意の所望の核酸をダイズ細胞中へと導入するために用いて良い。本発明の１つの実施態様において、核酸はダイズにおいて所望の作物学的形質を発現するだろう遺伝子を含んで成る。
【００２４】
本発明の他の実施態様において、核酸は、選択的マーカー遺伝子として使用されるホスホマンノースイソメラーゼ遺伝子を含んで成る。
【００２５】
本発明の更なる実施態様において、マンノースの存在下での外植片とアグロバクテリウムの共培養が行われている。
【００２６】
成熟及び未成熟種子のどちらも本発明において使用される外植片を生成するために使用されて良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
詳細な説明
本発明は、本明細書中以降、添付の図を参照することにより更に詳細に記載されており、ここには本発明の様々な実施態様が記載されている。しかしながら、本発明は、様々な形態で具体化されて良く、そして本明細書中に開示された実施態様に限定されるべきではないと解される。むしろ、これらの実施態様は、本発明の範囲を完全且つ十分に当業者に対して投げかけられ且つ運ばれるように供されている。本明細書中、本発明の記載において使用される語彙は、特定の実施態様のみを記載する目的のためであり、そして本発明を限定する目的ではない。本発明の記載及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形態「a」、「an」及び「the」は、背景により特に断りがない限り、複数形態もまた含むことを意図する。
【００２８】
特に断りがない限り、本明細書中で使用された全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の通常の知識を有するものによって共通して理解されるような意味を有する。
【００２９】
断りがある場合を除いて、標準的な方法が、本発明に従い、クローン化された遺伝子、発現カセット、ベクター（プラスミドなど）、タンパク質及びタンパク質断片、形質転換細胞及び植物を生産するために使用されて良い。断りがある場合を除いて、標準的な方法が、本発明に従い、クローン化された遺伝子、発現カセット、ベクター（プラスミドなど）、タンパク質及びタンパク質断片、形質転換した細胞及び植物を生産するために使用されて良い。かかる技術は当業者に公知であり、例えば、J. Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Editioin (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989)、及びF.M. Ausubelら、Current Protocols In Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. and Wiley-Interscience, New York, 1991); J. Draperら、eds., Plant Genetic Transformation And Gene Expression: A Laboratory Manual, (Blackwell Scientific Publications, 1988); 及びS.B. Gelvin & R.A. Schilperoort, eds., Introduction, Expression, And Analysis Of Gene Production In Plants. を参照のこと。
【００３０】
本発明は、ダイズの、注目の核酸配列による安定な形質転換及びトランスジェニック植物の再生のための方法及び組成物を記載する。
【００３１】
本発明の方法は、ダイズ植物において注目の任意核酸を発現させるために使用されて良い。注目の遺伝子としては、例えば、除草剤耐性、疾患耐性、又は昆虫/害虫耐性のための遺伝子が挙げられ、又はそれは選択的もしくはスコラブル（scorable）マーカーであり、そして植物操作可能プロモーター、コーディング領域、及び３´ターミネーター領域を含んで成る。除草剤耐性遺伝子としては、イミダゾリノン又はスルフォニルウレア除草剤に対する耐性のためのAHAS遺伝子、ビアラフォスもしくはグルフォシネートに対する耐性のためのpatもしくはbar遺伝子、グリフォセートに対する耐性のためのEPSPシンターゼ遺伝子が挙げられる。疾患耐性遺伝子としては、抗細菌合成酵素のための、例えば、ピロルニトリン合成酵素のための遺伝子、植物が誘導した耐性遺伝子などが挙げられる。昆虫耐性遺伝子としてはバチルス・チュリンゲンス（Bacillus thuringiensis）に由来する殺昆虫タンパク質のための遺伝子が挙げられる。注目の遺伝子は、生化学的経路に関わる酵素をもコードし、その発現は、食品、食料、栄養及び/又は医薬製品において重要な形質をも変える。注目の遺伝子はプラスミド中に配置されて良い。本発明において使用するために適したプラスミドは、注目の遺伝子を１種以上含んで成って良くそして/又はアグロバクテリウムは様々な注目の遺伝子を有する様々なプラスミドを含んで成って良い。
【００３２】
本発明は、ダイズ品種例えば、Glycine maxを形質転換させるための方法を供する。この方法は、所望の遺伝子をアグロバクテリウムが介在したデリバリーでダイズ細胞中に入れ、しかる後に形質転換した１又は複数の細胞を形質転換されるダイズ植物へと入れ再生することに基づく。本発明の方法は、品種に無関係である。
【００３３】
本発明の１つの実施態様において、外植片は、温室で成長したダイズ植物から回収した成熟種子又は未成熟種子をある時間に渡り種子発芽培地中で発芽せしめ、当該成熟種子又は未成熟種子から種子外皮を除去し、そしてその後、子葉を除去することによって調製されている。本発明の好適な実施態様において、次いで、露出した初生葉の一部分が除去され、それによって初生葉基部で切断点が生じる（図４）。アグロバクテリウムが介在した遺伝子デリバリーは、細胞を初生葉基部へと入れること又は初生葉切断点の領域でなし遂げられる。異常な位置に生じた芽は上軸胚の初生葉から誘導される。この誘導は、既存の分裂組織（即ち、一次、二次、及び腋窩）を除去し、そして外植片を、適切な成長調節因子を含有する芽誘導培地に委ねることによって達成される。この芽誘導方法は、標的初生葉基部細胞からの、形質転換した芽の成長又は再生を促す。
【００３４】
形質転換したダイズ細胞は、選択剤の存在下で培養される。好適に、この細胞は、フォスフォマンノースイソメラーゼ（PMI）遺伝子で形質転換され、そして形質転換した細胞はマンノースの存在下で培養される。マンノースを選択剤として含む培地において、PMI遺伝子により形質転換した細胞は、そのような形質転換されていない細胞を超える成長上の利点を有する。
【００３５】
本発明の方法を使用することで、形質転換したダイズ植物を再生せしめるために要する時間は、刊行物中で報じられている他の、アグロバクテリウム介在した形質転換プロトコールに比較して有意に減っている。安定に形質転換したダイズ芽は、形質転換実験の開始から８〜１２週で生産されうる。ダイズゲノム中に挿入されるべき外来遺伝子、又はトランス遺伝子は、in vitroで、通常の組み換えDNA操作技術によって生産される。構築体は、任意の相同的な核酸からなりうる。遺伝子構築体は、ダイズ細胞中へとデリバリーされるためのアグロバクテリウム系統中へと形質転換される。アグロバクテリウムは発ガン性ではなく、そしてここでかかる系統のいくつかは広く入手可能である。アグロバクテリウムは、好適にA.チュメファシエンス（A. tumefacience）及びA.リゾゲネス（A.rhizogenes）から選択される。
【００３６】
外来遺伝子構築体は、好適に選択的マーカー遺伝子を含んで成る。好適な選択的マーカー遺伝子は、フォスフォマンノースイソメーラーゼ遺伝子である。他の適切な選択的マーカー遺伝子としては：ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼII（Fraleyら、CRC Critical Reviews in Plant Science vol.4、p.1 (1986)）；シアナミドヒドラターゼ（Maier-Greinerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.88、p.4250 (1991)）；アスパラギン酸塩キナーゼ；ジヒドロジピコリネートシンターゼ（Perlら、BioTechnology vol.11、p.715 (1993)）；bar遺伝子（Tokiら、Plant Physiol. vol.100、p.1503 (1992); Meagherら、Crop Sci. vol.36、p.1367 (1996)）；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijnら、Plant Mol. Biol. vol.22、p.907 (1993)）；ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（NEO; Southernら、J. Mol. Appl. Gen. vol.1、p.327 (1982)）；ヒグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（HPT or HYG; Shimizuら、Mol. Cell. Biol. vol.6、p.1074 (1986)）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）；フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（DeBlockら、EMBO J. vol.6、p.2513 (1987)）；２，２−ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼ（Buchanan-Wollatronら、J. Cell. Biochem. 13D、p.330 (1989)）；アセトヒドロキシ酸シンターゼ（米国特許第4,761,373号Andersonら；Haughnら、Mol. Gen. Genet. vol.221、266 (1988)）；５−エノルピルビル−シキミ酸塩−リン酸塩シンターゼ（aroA; Comaiら、Nature vol.317、p.741 (1985)）；ハロアリールニトリラーゼ（WO 87/04181 Stalkerら）；アセチル−コエンザイムＡカルボキシラーゼ（Parkerら、Plant Physiol. vol.92、p.1220 (1990)）；ジヒドロプテロエートシンターゼ（sul1; Gucrincauら、Plant Mol. Biol. vol.15、p.127 (1990)）；及び３２kDa光化学系IIポリペプチド（psbA; Hirschbergら、Science vol.222、p.1346 (1983)）. をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定はされない。
【００３７】
クロラムフェニコール（Herrera-Estrellaら、EMBO J. vol.2、p.987 (1983)）；メトトレキセート（Herrera-Estrellaら、Nature vol.303、p.209 (1983); Meijerら、Plant Mol. Biol. vol.16、p.807 (1991)）；ヒグロマイシン（Waldronら、Plant Mol. Biol. vol.5、p.103 (1985); Zhijianら、Plant Science vol.108、p.219 (1995); Meijerら、Plant Mol. Bio. vol.16、p.807 (1991)）；ストレプトマイシン（Jonesら、Mol. Gen, Genet. vol.210、p.86 (1987)）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnardら、Transgenic Res. vol.5、p.131 (1996)）；ブレオマイシン（Hilleら、Plant Mol. Biol. vol.7、p.171 (1986)）；スルホンアミド（Guerineauら、Plant Mol. Bio. vol.15、p.127 (1990)）；ブロモキシニル（Stalkerら、Science vol.242、p.419 (1988)）；２，４−Ｄ（Streberら、Bio/Technology vol.7、p.811 (1989)）；フォスファノトリシン（DeBlockら、EMBO J. vol.6、p.2513 (1987)）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnard及びChupeau, Transgenic Research vol.5、p.131 (1996)）. に対する耐性をコードする遺伝子も挙げられる。
【００３８】
１つの実施態様において、形質転換法のための出発物質は、ダイズ成熟種子である。他の実施態様において、出発物質は、成長中のダイズ植物に由来するダイズ未熟種子でありうる。種子は発芽培地上に置かれ、そして６〜２４時間、好適には約６〜１４時間、そして一層好適には、約８〜１２時間に渡り発芽せしめられる。種子は、もし所望されれば、より長い時間、例えば、２〜５日に渡り発芽せしめられて良い。
【００３９】
発芽中の種子の種子外皮及び胚軸は取り除かれる。１つの子葉は、それの隣接する腋芽も取り除かれている。後ほど、初生葉は実質上除去され、それにより初生葉基部、初生葉基部が結合している上軸胚、及び上軸胚が結合している子葉を含んで成る外植片が形成される。実質上除去されたとは、初生葉組織の主要部分の除去を意味する。
【００４０】
アグロバクテリウム介在遺伝子輸送、植物組織の損傷は、遺伝子輸送を促すことが知られている。従って、損傷を葉の基部領域で作ることが、必須ではないが、好適である。
【００４１】
次いで、上記のようにして調製された外植片は、数分〜数時間、典型的には、約０.５〜３時間、そして好適には１〜２時間に渡りアグロバクテリウム懸濁中に浸される。過剰なアグロバクテリウム懸濁が取り除かれ、そして残りのアグロバクテリウムは、共培養培地上で外植片と共に、数日、典型的には、２〜５日、そして好適には３〜４日に渡り、１６時間の明期/８時間の暗期条件下、約２２±２℃の温度で共培養される。
【００４２】
共培養後、外植片は、芽成長誘導性且つ形質転換した細胞選択性の培地（又は一組の培地）に、８〜１２週に渡り移される。かかる培地（又は媒質）は一般に芽誘導性ホルモン並びに選択剤を含む。この例で使用される下の再生培質の例は、選択剤としてマンノース、並びに芽誘導剤ホルモンとして、ベンジルアミノプリン（BAP）を含む。用語ホルモンとは、芽形成を誘導する細胞増殖調節化合物をも含み、オーキシン（例えば、IAA、NAA、及びインドール酪酸（IBA）など）、サイトカイン（例えば、チジアズロン、カイネチン、及びイソペンテニルアデニンなど）、及び/又はジベレリン酸（GA3）が挙げられるがそれらに限定はされない。
【００４３】
芽が約２cmに至り、そして完全三つ葉形成を伴う場合、芽は外植片から分離され、そして根の形成を誘導するために発根培地上に置かれる。好適に、発根培地は、更に、潜在的に形質転換した芽の同定を促すために、選択剤をも含む。根形成には、約１〜２週を要し、その後、植物が土壌に移されて完全成熟体へと成長させられる。
【００４４】
相同核酸を含んで成るトランスジェニック植物（即ち、本明細書中記載された方法に従い形成された細胞又は組織を含んで成る）、並びに当該トランスジェニック植物によって生産された種子及び子孫は、本発明の更なる観点でである。細胞を有用な品種へと形質転換せしめるための手順は、当業者に周知である。技術は、植物組織のin vitro培養において公知であり、そして多くの場合、全体植物へと再生するために公知である。本発明の更なる観点は、トランスジェニック植物組織、トランスジェニック植物、又は上記の核酸を含有する種子である。好適な実施態様において、本明細書中で記載された方法を使用することで生産された形質転換された植物はキメラではない、又は形質転換された植物の僅かな部分のみがキメラである。これは好適に、高カイネチン処理の期間を延ばすことによってもしくはマンノース選択のストリンジェンシーを高めることによって、もしくはその両方によって達成される。
【００４５】
従って、本発明の形質転換された細胞は、本明細書中で供されるように、選択又はスクリーニングによって同定され、再生を支持する適切な条件にて培養され、次いで植物中に入れられて成熟可能にされて良い。植物は好適に、成長チャンバー又は温室のいずれかにて成熟させられる。植物は、形質転換体が、初期組織に依存し同定された約２〜６週後に再生される。再生の間、細胞は、組織培養容器中の固体培地上で成長させられうる。かかる容器の代表的な例は、ペトリ皿及びPlant Con（登録商標）の容器である。再生後、植物は芽及び根の成長段階に到達し、それらは更なる成長及び試験のために温室に移されて良い。上に供されるように、再生された植物の種子及び子孫植物は本発明の観点である。従って、用語「種子」とは、形質転換した植物の種子、並びに形質転換した植物の子孫から生産された種子を意味する。本発明の植物は、形質転換した植物及び再生した植物のみならず、本明細書中に記載の方法によって生産された、形質転換されて再生された植物の子孫をも含む。
【００４６】
記載された方法によって生産された植物は、上記の標準的な方法による首尾良い形質転換のためにスクリーニングされて良い。本発明の再生された植物の種子及び子孫植物は、本発明の他の観点である改良された植物及び種子系統を開発するために、トランスジェニック及び完全核酸配列の連続した存在の関して連続的にスクリーニング及び選択されて良い。従って所望のトランスジェニック核酸配列は他の遺伝系統、例えば、所定の選定のもしくは商業的に有用な系統もしくは品種中へと移動（即ち、遺伝子移入又は同系交配）させられて良い。所望の核酸配列を遺伝的植物系統中へと遺伝子移入する方法は、当業者に公知の様々な方法によって、例えば、古典的な育種、プロトプラスト融合、核移植及び染色体移植によって行われて良い。育種方法及び技術は、当業者に公知であり、そして、例えば、J.R. Welsh, Fundamentals of Plant Genetics and Breeding (John Wiley and Sons, New York, (1981)); Crop Breeding (D.R. Wood, ed., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin, (1983)); O. Mayo, The Theory of Plant Breeding, Second Edition (Clarendon Press, Oxford, England (1987)); 並びにWricke及びWeber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding (Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986)) に開示されている。これら及び当業界における他の技術を使用することで、本発明に従い獲得されたトランスジェニック植物及び同系交配系統は、本発明の他の観点でもある、商業上価値があるハイブリッド植物及び作物を生産するために使用されて良い。
【００４７】
上記は本発明の実施態様の様々な形態の説明であり、そして本発明を限定する様に構築されてはいない。
【００４８】
本発明は更に、以下の例によって記載され、それはいかなる態様においても本発明の範囲を限定する目的ではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１
形質転換ベクター
プラスミドpNOV2105（図１）は、WO97/04112中で記載及び開示されているpVictorの変更型であり、即ち、35SプロモーターがSMASプロモーターに置換されており、35SターミネーターがNosターミネーターに置換されており、そして更なるSMASプロモーターが、Nosターミネーターに３´末端で隣接するGUSイントロンGUS配列の上流に挿入されている。本明細書中で使用されているpNOV2105は、pVictor中で見られるマルチクローニングサイトを含まない。しかし、もし所望されれば、かかるクローニングサイトを加えることは当業者に周知である。
【００５０】
pNOV2105（図１）は、アグロバクテリウムが介在した植物形質転換のためのベクターであり、そしてフォスフォマンノースイソメラーゼ（PMI）及びβグルコニダーゼ遺伝子（GUS）に隣接する、ノパリン型pTiT37プラスミド（Yadavら、1982 Proc Natl. Acad.Sci.vol.79：pp.6322〜6326）に由来するTi右及び左境界配列を含む。
【００５１】
前記プラスミドは、大腸菌（E.coli）中での複製と維持のために、大腸菌プラスミドpUC19に由来する複製の開始点（pUC19ori）（Yanish-Perronら、1985 Gene vol.33：pp.103〜119）を、そして当該プラスミドは更に、アグロバクテリウム・チュメファシエンス中での複製及び維持のためにシュードモナスプラスミドpVS1に由来する複製の開始点（pVSori）（Itohら、1984、Plasmid vol.11：pp.206〜220；Itoh及びHaas1985 Gene vol.36：27〜36）を含む。大腸菌及びアグロバクテリウム・チュメファシエンス中での選択のために、当該プラスミドは、酵素３”（９）−O−ヌクレオチジルトランスフェラーゼをコードするトランスポゾンTn7に由来するスペクチノマイシン/ストレプトマイシン耐性遺伝子（spec/strep）（Flingら、1985、Nucleic Acid Res.vol.19：pp.7095〜7106）を含む。このspec/strep耐性遺伝子は、細菌中での効率的発現のためにtacプロモーター（Amannら1983、Gene vol.25（No.203）：pp.167〜78）に対して融合されている。
【００５２】
右及び左境界の間のT−DNAセグメントは、以下の遺伝子を係留し、それらはアグロバクテリウム・チュメファシエンスが介在した形質転換を介してのみダイズ植物へと移される遺伝子である。
【００５３】
GUSイントロンGUS
β−グルクロニダーゼ（GUS）：右境界に隣接するこのセグメントは、SMASプロモーター及びNosターミネーターに対して融合したアグロバクテリウムによる翻訳を避けるために、コーディング領域におけるイントロンを伴う大腸菌由来のβ−グルクロニダーゼ遺伝子（GUS）を含む。このGUSイントロンGUS遺伝子は、プラスミドpBISN1から単離されている（Narasimhuluら、1986、Early transcription of Agrobacterium DNA in tabacco and maze、Plant Cell vol.8：pp.873〜866）。
【００５４】
フォスフォマンノースイソメラーゼ（PMI）：左境界配列に隣接するこのセグメントは、SMASプロモーター（Ni M、CuiD、Einstein J、Narasimhulu S、Vergara CE、 Gelvin SB（1995））及びNosターミネーターに対して融合した大腸菌由来のマンノース−６−フォスフェートイソメラーゼ遺伝子である。フォスフォマンノースイソメラーゼ遺伝子は、Dマンノースを炭素源として含有する培質上でトランスジェニック芽を選択するための選択マーカーとして使用されている。
【００５５】
pNOV2145（図２）の要素及び配列は、配列番号：１に開示されている。pNOV2147（図３）の要素及び配列は、配列番号：２に開示されている。
【００５６】
実施例２
形質転換及び再生
成熟乾燥ダイズ種子（Var.S42H1）を、デシケーター内に塩素ガスを放出することによって表層滅菌した。種子をペトリ皿に維持し、そして１００mlのClorox（登録商標）をビーカーに注ぎ８mlの濃HClを徐々に加えることによって塩素ガスを発生させた。種子を２回以上、各８〜１８時間に渡るガス放出処理によって滅菌した。
【００５７】
次いで、滅菌した種子（およそ１５〜２０個の種子／皿）を０.６%アガー固体化MS基本培地（Murashige及びSkoog（1962）、タバコカルス培養による急速成長及びバイオアッセイのための改変培地。Physiol Plant vol.15：pp.473〜479）及び２%スクロースを含有する発芽培地に置いた。このpHを5.8に維持した。ペトリ皿を室温３７℃に、種子の一晩成長のため又は吸収のために置いた。種子外皮を取り除き、しかる後に、約０.５cmの胚軸を維持し、胚軸の部分を除去した。１つの子葉をそれに隣接する腋芽に沿って除去して捨てた。残りの子葉上で、外科用メスを使用して初生葉を破壊分離し、上軸胚上の初生葉基部を残す（図４）。
【００５８】
プラスミドpNOV2145（図１に記載のように、ZsGreen1及びPMIを）を含むアグロバクテリウム系統（LBA4404）を凍結グリセロールストックから、適当な抗生物質（１００mg/Lのスペクチノマイシン）を含むYEPプレート（イーストエクストラクト１０g/L、ペプトン５g/L、NaCl５g/L、バクトアガー１５g/L）上に漏出させた。次いで、アグロバクテリウムを２７℃で１〜２日に渡りインキュベートした。プレートからすくい取ったアグロバクテリウムを、シェーカー中、抗生物質（１００mg/Lのスペクチノマイシン）を含有する１００mlのYEP液体培地上、２７℃で、１晩に渡り増殖させた。細菌懸濁を約１５００gで１５分に渡り遠心し、そして共培養液体培地（B5塩０．０５×（Sigma）、ビタミンB5（０．０５×）（ビタミンB5組成物（１×）：イノシトール１００mg/L、ニコチン酸１mg/L、ピリドキシンHCl１mg/L、チアミンHCl１０mg/L）、アセトシリンゴン４０mg/L、スクロース２０g/L、BAP２mg/L、GA3０．２５mg/L、MES（モルホリノエタンスルホン酸）３．９g/L、及びpH５．４）中、OD660＝０．２又は０．６５の密度で再懸濁せしめた。
【００５９】
標的組織を含有する外植片をアグロバクテリウム懸濁中に浸しそして１〜２時間に渡りインキュベートした。アグロバクテリウム懸濁を注ぎ、そして処理した外植片を共培養プレート内のろ紙上に置いた。外植片の向軸面をろ紙と接触するようにした。共培養固体培地は、B5塩（Sigma、０．０５×）、ビタミンB5（０．０５×）、アセトシリンゴン４０mg/L、スクロース２０g/L、BAP２mg/L、GA3０．２５mg/L、MES３．９g/L、及びpH５．４からなる。培地を０．５％精製アガー（Sigma）で固体化させた。
【００６０】
外植片をアグロバクテリウムと２０〜２３℃で２〜５日に渡り、１６時間の明期/８時間の暗期条件下で共培養した。共培養後、外植片を２５０mg/Lのセフォタキサムを含む滅菌水で洗浄し、一次及び二次分裂組織を除去し、そして外植片を再生培地（即ち、REG-1培地）に移した。再生過程の間、子葉に隣接する全ての腋芽も、初生葉基部領域からの成長を確実にするために取り除いた。
【００６１】
REG-1培地は、MS塩（１×）、B5塩（１×）、KNO3１g/L、BAP１mg/L、チカルシリン３００mg/L、セフォタキサミン１００mg/L、グルタミン２５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、マンノース１５〜３０g/L、スクロース０、０.２５、及び１g/L、pH５．６、並びに精製アガー１０g/Lを含む。５つの外植片を各ペトリ皿に上向きで配置し、従って、外植片の上軸胚末端を培地に挿入した。この皿をプラスチック容器の内部で維持し、そして、１８〜２０時間の明期/４〜６時間の暗期サイクル下、６０〜１００μEm-2S-1で２２〜２５℃で培養室に置いた。REG-1培地上で２週間後、外植片をREG-2培地に移した。その培地は、MS塩（１×）及びビタミンB5（１×）、KNO3１g/L、BAP０．５mg/L、チカルシリン３００mg/L、セフォタキサミン１００mg/L、グルタミン２５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、マンノース１５g/L、及びスクロース１g/Lを含んだ。培質のpHを５．６に維持し、そして当該培質を精製アガー１０g/Lで固体化させた。
【００６２】
４〜６週で、ダイズ培養物を、選択及び芽成長を続けるためにREG-3培地に移した。REG-3培地は、MS塩（１×）、ビタミンB5塩（１×）、KNO3１g/L、BAP０．２mg/L、GA3０．５mg/L、IBA０．１mg/L、チカルシリン３００mg/L、セフォタキサミン１００mg/L、グルタミン２５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、マンノース１５g/L、及びスクロース１g/Lを含んだ。培地のpHは５．６であり、そして培地を精製アガー１０g/Lで固体化した。死んだ組織を取り除いて再生する芽を伴う移植片を新鮮REG-3培地中で２週ごとに継代培養した。伸長した芽をそれらが約２〜４cmの長さに到達した場合に、培養物から連続的に収穫した。同時に、芽を発根培地へと移した。その培地は、MS塩（０．５×）、ビタミンB5（０．５×）、グルタミン２５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、KNO3１g/L、セフォタキサミン１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、スクロース１５g/L、IBA０．５mg/L、pH５．６及び精製アガー１０g/Lを含んだ。
【００６３】
蛍光タンパク質遺伝子（ZsGreen1）を発現する安定したトランスジェニック芽を、湿化Fafard germinating mix（Conrad Fafard Inc. MA、USA）を含む２”ポットに移しておよそ２週間に渡り水分を維持するためにプラスチックキャップでカバーした。植物を、２７〜２９℃の日中温度、２１℃の夜温度、及び１６時間の明期（２０〜４０μEm-2S-1光強度）で順化させた。新たな葉が出現し始めたときに、植物を、コンポスト化パイン樹皮５０〜５５％、泥炭４０〜４５％、真珠岩５〜１０％からなる土壌混合物（Sungrow Horticultural Supply、Pine Bluff、Arkansas）を含む１ガロンポットに移した。順化させたダイズ植物を温室中、２７〜２９℃の日中温度、２１℃の夜温度、４００〜６００μEm-2S-1光強度、７０〜９５％の相対湿度、１６時間の明期で成長させた。植物を成長期間中、オスモコート（Scotts-Sierra Horticultural Products Company、Ohio；17-6-12）で滅菌した。形質転換を、温室で成長した植物の葉における蛍光タンパク質遺伝子並びにPMI遺伝子の存在に関してTaquman分析によって確認した。形質転換したダイズ組織における蛍光タンパク質遺伝子の発現も蛍光顕微鏡を使用して発現を視覚化することによって確認した。
【００６４】
遺伝子構築体pNOV2145を使用することで成長させた６つのトランスジェニック植物をサザンブロット解析で確認した。PMI遺伝子又はZsGreen1遺伝子のいずれかに関する１つの事象の子孫解析により、形質転換されたダイズ、及び子孫のゲノムに入るT-DNAの１つの完全部位が、T1世代において３：１の比で分離されたことが明らかになった。
【００６５】
【表１】
2005535312.tif 000003
【００６６】
実施例３
ダイズ種子（Var.S42 H1）を表層滅菌して外植片を実施例２のようにして調製した。
【００６７】
プラスミドpNOV2147を担持するアグロバクテリウム系統（LBA4404）を実施例１のようにして調製した。最終細菌濃度をOD660＝０．６０に共培養液体培地で調節した。外植片調製、アグロバクテリウム摂取、及び共培養のための条件は、実施例２に記載されているものと同じであった。
【００６８】
固体共培養培中での共培養の３日後、過剰のアグロバクテリウムを洗浄して、一次及び二次分裂組織を除去し、そして外植片をREG-1培地に移した。それらを、２８〜３０℃で１６時間の明期及び８時間の暗期条件で培養した。REG-1培地上で２週間後、培養物をREG-2培地に移した。この再生過程の間、初生葉の基部から生じた芽のみを維持した。およそ第４週目に、芽培養物をREG-3培地に移した。次いで、それらを１０〜１４日ごとに新鮮REG-3培地に移した。REG-1及びREG-2培地中におけるように、初生葉の基部から生じる芽のみを維持して、その一方で残りの芽は除去した。伸長した芽が約２〜４cmの長さに到達した時に、それらを残りの芽培養物から分離して発根培地へと移した。
【００６９】
３５サンプルのうち５つのトランスジェニック芽をシアノ蛍光タンパク質遺伝子を発現するとして同定した（表２）。
【００７０】
【表２】
2005535312.tif 000004
【００７１】
実施例４
共培養の間のマンノース処理
この実験で使用した遺伝子構築体はpNOV2145（これは、例１に記載のように、ZsGreen1及びPMI遺伝子を含んで成る）であった。外植片調製、アグロバクテリア懸濁、細菌懸濁の外植片への植えつけのための手順は、実施例２に記載されているものと同じである。最終細菌濃度をOD660＝０．５５又は０．８５に調節した。
【００７２】
摂取段階に続いて、外植片を、２０g/Lスクロース又は１５g/Lマンノースのいずれかを含有する共培養培地に移し、そして２０〜２３℃、１６時間の明期及び８時間の暗期条件下で維持した。
【００７３】
共培養の３〜５日の後、蛍光タンパク質遺伝子の発現を、蛍光顕微鏡を使用することで視覚化した。マンノース含有共培養培地中でアグロバクテリウムを植えつけた外植片は、スクロース含有共培養培地中で共培養したものに比べて２倍以上の蛍光スポットを示した。次の、芽再生及び選択段階は例２で示したもののように続く。
【００７４】
形質転換した芽の生産の有意な増加が、マンノースが共培養培地に含まれていた実験で確認された（表３）。マンノースを含んだ共培養培地に由来する５つの形質転換した芽を発根させて、そして土壌に移した。その後の、Taqman並びにサザンブロットによる解析によって、遺伝子導入が完全であることが確認された。T1子孫における導入遺伝子発現により導入遺伝子の生殖細胞系列伝達が確認された。
【００７５】
【表３】
2005535312.tif 000005
【００７６】
実施例５
この例では、プラスミドpNOV2105（例１に記載のように、SMAS-PMI SMAS-GUS）を含んで成るアグロバクテリウムEHA101をダイズ形質転換において使用した。外植片の調製、アグロバクテリア懸濁、及びアグロバクテリアの外植片への植えつけは、実施例２に記載されているものと同じである。最終細菌濃度をOD660＝０．４５又は０．６に調節した。
【００７７】
外植片を、アグロバクテリウム摂取に続いて、２０g/Lスクロース又は１５g/Lマンノースのいずれかを含有する共培養培地へと移した。共培養を２０〜２３℃で、１６時間の明期/８時間の暗期条件下で行った。共培養の３〜５日後、GUS発現を、組織化学的GUSアッセイを使用することで視覚化した。マンノース含有共培養培地において共培養した外植片は、スクロースを含有する共培養培地において培養したものと比べて２倍以上のGUSスポットを示した。芽再生及び選択を例２で記載したように行った。形質転換した芽の生産の有意な増加は、マンノースを共培養培地に加えた実験において確認された（表４）。
【００７８】
【表４】
2005535312.tif 000006
【００７９】
実施例６
この例では、プラスミドpBSC11234（図５）を含んで成るアグロバクテリウムEHA101をダイズ形質転換において使用した。pBSC11234の要素と配列を配列番号３に開示している。pBSC11234はCMP-PMI：βコングリシン−ガラクトシダーゼ遺伝子構築体を含んで成る。外植片の調製、アグロバクテリア懸濁、及び外植片へのアグロバクテリアの植えつけは、実施例２に記載されているものと同じである。最終細菌濃度をOD660＝０．６に調節した。共培養液体培地は、B5塩（０．１×）、ビタミンB5（１×）、アセトシリンゴン８０mg/L、スクロース２０g/L、BAP２mg/L、GA3０．２５mg/L、MES３．９g/L、及びpH５．４を含んだ。この固体共培養培地は、精製アガー５g/Lを前記液体共培養培地に対して組み込むことによって調製した。
【００８０】
外植片を、アグロバクテリウムの植えつけに続いて、固体共培養培地へと移して共培養を２０〜２４℃で、１６時間の明期及び８時間の暗期条件下で行った。共培養の３〜５日後、一次及び二次芽分裂組織を除去して捨て、そして生じる外植片をREG-4培地に移した。その培地は、B5塩（１×）、ビタミンB5塩（１×）、BAP１mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、セフォタキサミン１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、マンノース１５〜２０g/L、スクロース０、０．２５又は１g/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。５〜７日の期間後、子葉に近接する腋分裂組織から成長した全ての芽を除去し、そして外植片をREG-5培地へと移した。その培地は、B5塩（１×）、ビタミンB5塩（１×）、BAP０．５mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、セフォタキサミン１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、マンノース１５g/L、スクロース１g/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。４週後、外植片をREG-6培地へと芽伸長のために移した。REG-6培地は、MS塩（１×）、MSビタミン（１×）（MSビタミン組成：イノシトール１００mg/L、ニコチン酸０．５mg/L、ピリドキシンHCl０．５mg/L、チアミンHCl０．１mg/L、グリシン２mg/L）、ミオイノシトール２００mg/L、BAP０．２mg/L、ゼアチンリボシド０．５mg/L、IBA０．１mg/L、GA3１mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、チカルシリン３００mg/L、マンノース１５g/L、スクロース５g/L、硝酸銀０．８mg/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。外植片を新鮮REG-6培地へと２週ごとに移した。伸長した芽（２〜４cmの長さ）を除去して発根培地中で根を張らせ、そして土壌に移した。この発根培地は、MS塩（１×）、ビタミンB5（１×）、グルタミン１００mg/L、アスパラギン１００mg/L、IBA０．７mg/L、チメンチン１００mg/L、及びスクロース１５g/Lを含んだ。Taquman解析により、２つの事象に由来する葉試料における導入遺伝子（αガラクトシダーゼ遺伝子及びフォスフォマンノースイソメラーゼ遺伝子）の存在が確認された。
【００８１】
この例では、プラスミドpBSC11369（図６）を含んで成るアグロバクテリウムEHA101をダイズ形質転換において使用した。pBSC11369の要素と配列を配列番号：４に示している。pBSC11369はCMP-HPT：CMP-ZsGgreen1遺伝子構築体を含んで成る。外植片の調製、アグロバクテリア懸濁、及び外植片へのアグロバクテリアの植えつけは、実施例２に記載されているものと同じであった。最終細菌濃度をOD660＝０．６に調節した。共培養液体培地は、B5塩（０．１×）、ビタミンB5（１×）、アセトシリンゴン８０mg/L、スクロース２０g/L、BAP２mg/L、GA3０．２５mg/L、MES３．９g/L、及びpH５．４を含んだ。この固体共培養培地は、精製アガー５g/Lを前記液体共培養培地に対して組み込むことによって調製した。
【００８２】
外植片を、アグロバクテリウムの植えつけに続いて、固体共培養培地へと移して共培養を２０〜２４℃で、１６時間の明期及び８時間の暗期条件下で行った。共培養の３〜５日後、初生葉基部領域からの芽成長を確実にするために当該外植片から一次及び二次分裂組織を除去した後に、外植片をREG-7培地に移した。REG-7培地は、B5塩（１×）、ビタミンB5塩（１×）、BAP１mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、セフォタキサミン１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、スクロース３０g/L、ヒグロマイシン２〜５mg/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。外植片を、当該外移植片の上胚軸末端が培地中に挿入されるように逆さに配置した。７〜１０日の期間後、子葉に近接する腋分裂組織から成長した全ての芽を除去した。そして外植片をREG-8培地へと移した。その培地は、B5塩（１×）、ビタミンB5塩（１×）、BAP０．５mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、セフォタキサミン１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、スクロース３０g/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。更に２週後、外植片をREG-9培地へと移し、そしてこの後２週ごとに継代培養した。REG-9培地は、MS塩（１×）、MSビタミン（１×）、ミオイノシトール２００mg/L、BAP０．２mg/L、ゼアチンリボシド０．５mg/L、IBA０．１mg/L、GA3１mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、硝酸銀０．８mg/L、チカルシリン３００mg/L、スクロース３０g/L、ヒグロマイシン０．１〜０．２mg/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含む。伸長した芽（２〜４cmの長さ）を除去し、そして発根培地中で根を張らせ、そして土壌に移した。この発根培地は、MS塩（１×）、ビタミンB5（１×）、グルタミン１００mg/L、アスパラギン１００mg/L、IBA０．７mg/L、チメンチン１００mg/L、及びスクロース１５g/Lを含んだ。Taquman解析により、５つの事象から獲得した葉試料において導入遺伝子（HPT並びにZsGreen1）の存在が確認された。ZsGreen1遺伝子の植物部分における発現を、蛍光顕微鏡の下で、視覚化により確認した。
【００８３】
本明細書中で引用された全ての刊行物、特許、及び特許出願は参照によって組み込まれている。上記明細書において、本発明は所定の好適な実施態様との関係において記載され、そして多くの詳細は例示の目的のために開示されてきたが、本発明は更なる実施態様に影響を受けやすく且つ本明細書中で記載された所定の詳細は、本発明の基本的な精神から逸脱することなく非常によく変わりうることは当業者に明らかだろう。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】プラスミドpNOV2105の地図を示す。
【図２】プラスミドpNOV2145の地図を示す。
【図３】プラスミドpNOV2147の地図を示す。
【図４】ダイズ外植片を調製するための例示となる方法を示す。パネルAは胚軸の一部を除去したダイズ種子を描く。パネルBは、１つの子葉を隣接する腋芽に沿って除去した、パネルAに由来するダイズ外植片を描く。パネルCは、２つの初生葉を除去した後、各初生葉の基部で切断点が生じるパネルBに由来するダイズ外植片を描く。
【図５】プラスミドpBSC11234の地図を示す。
【図６】プラスミドpBSC11369の地図を示す。
【図１】
2005535312.tif 000007
【図２】
2005535312.tif 000008
【図３】
2005535312.tif 000009
【図４】
2005535312.tif 000010
【図５】
2005535312.tif 000011
【図６】
2005535312.tif 000012
【配列表】
2005535312000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月16日(2005.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
前記サイトカイニンが、ベンジルアミノプリン（BAP）、チジアズロン、カイネチン、及びイソペンテニルアデニンからなる群から選択されている、請求項９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１８】
安定に形質転換されたダイズ植物を生産するための方法であって当該方法は：
（a）外植片をダイズ種子から：
（ｉ）当該ダイズ種子から胚軸を取り除き；
（ii）１つの子葉をそれに隣接する腋芽に沿って取り除き、残りの１つの子葉に対して結合している初生葉を残し；そして
（iii）当該残りの子葉から各初生葉の一部分を取り除き、それによって初生葉基部のペアを生じさせること；によって調製し；そして
（b）当該外植片を、ダイズ細胞のゲノム中へと組み込まれるべき注目の核酸を含んで成るアグロバクテリウムと共培養し；
（c）各初生葉基部からの芽形成を誘導し；
（d）形成された１以上の芽を、選択剤を含有する培地中で培養し；
（e）形質転換した芽を選択し；そして、
（f）選定の形質転換した芽をダイズ植物へと入れ再生せしめること、
を含んで成る方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
外植片をアグロバクテリウムと２０〜２３℃で２〜５日に渡り、１６時間の明期/８時間の暗期条件下で共培養した。共培養後、外植片を２５０mg/Lのセフォタキシムを含む滅菌水で洗浄し、一次及び二次分裂組織を除去し、そして外植片を再生培地（即ち、REG-1培地）に移した。再生過程の間、子葉に隣接する全ての腋芽も、初生葉基部領域からの成長を確実にするために取り除いた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
REG-1培地は、MS塩（１×）、ビタミンB5（１×）、KNO3１g/L、BAP１mg/L、チカルシリン３００mg/L、セフォタキシム１００mg/L、グルタミン２５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、マンノース１５〜３０g/L、スクロース０、０.２５、及び１g/L、pH５．６、並びに精製アガー１０g/Lを含む。５つの外植片を各ペトリ皿に上向きで配置し、従って、外植片の上軸胚末端を培地に挿入した。この皿をプラスチック容器の内部で維持し、そして、１８〜２０時間の明期/４〜６時間の暗期サイクル下、６０〜１００μEm-2S-1で２２〜２５℃で培養室に置いた。REG-1培地上で２週間後、外植片をREG-2培地に移した。その培地は、MS塩（１×）及びビタミンB5（１×）、KNO3１g/L、BAP０．５mg/L、チカルシリン３００mg/L、セフォタキシム１００mg/L、グルタミン２５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、マンノース１５g/L、及びスクロース１g/Lを含んだ。培質のpHを５．６に維持し、そして当該培質を精製アガー１０g/Lで固体化させた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
４〜６週で、ダイズ培養物を、選択及び芽成長を続けるためにREG-3培地に移した。REG-3培地は、MS塩（１×）、ビタミンB5（１×）、KNO3１g/L、BAP０．２mg/L、GA3０．５mg/L、IBA０．１mg/L、チカルシリン３００mg/L、セフォタキシム１００mg/L、グルタミン２５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、マンノース１５g/L、及びスクロース１g/Lを含んだ。培地のpHは５．６であり、そして培地を精製アガー１０g/Lで固体化した。死んだ組織を取り除いて再生する芽を伴う移植片を新鮮REG-3培地中で２週ごとに継代培養した。伸長した芽をそれらが約２〜４cmの長さに到達した場合に、培養物から連続的に収穫した。同時に、芽を発根培地へと移した。その培地は、MS塩（０．５×）、ビタミンB5（０．５×）、グルタミン２５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、KNO3１g/L、セフォタキシム１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、スクロース１５g/L、IBA０．５mg/L、pH５．６及び精製アガー１０g/Lを含んだ。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
蛍光タンパク質遺伝子（ZsGreen1）を発現する根を張ったトランスジェニック芽を、湿化Fafard germinating mix（Conrad Fafard Inc. MA、USA）を含む２”ポットに移しておよそ２週間に渡り水分を維持するためにプラスチックキャップでカバーした。植物を、２７〜２９℃の日中温度、２１℃の夜温度、及び１６時間の明期（２０〜４０μEm-2S-1光強度）で順化させた。新たな葉が出現し始めたときに、植物を、コンポスト化パイン樹皮５０〜５５％、泥炭４０〜４５％、真珠岩５〜１０％からなる土壌混合物（Sungrow Horticultural Supply、Pine Bluff、Arkansas）を含む１ガロンポットに移した。順化させたダイズ植物を温室中、２７〜２９℃の日中温度、２１℃の夜温度、４００〜６００μEm-2S-1光強度、７０〜９５％の相対湿度、１６時間の明期で成長させた。植物を成長期間中、オスモコート（Scotts-Sierra Horticultural Products Company、Ohio；17-6-12）で滅菌した。形質転換を、温室で成長した植物の葉における蛍光タンパク質遺伝子並びにPMI遺伝子の存在に関してTaquman分析によって確認した。形質転換したダイズ組織における蛍光タンパク質遺伝子の発現も蛍光顕微鏡を使用して発現を視覚化することによって確認した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【表１】
2005535312.tif 000013
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
形質転換した芽の生産の有意な増加が、マンノースが共培養培地に含まれていた実験で確認された（表３）。マンノースを含んだ共培養培地に由来する５つの形質転換した芽を根を張らせて、そして土壌に移した。その後の、Taqman並びにサザンブロットによる解析によって、遺伝子導入が完全であることが確認された。T1子孫における導入遺伝子発現により導入遺伝子の生殖細胞系列伝達が確認された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
外植片を、アグロバクテリウム摂取に続いて、２０g/Lスクロース又は１５g/Lマンノースのいずれかを含有する共培養培地へと移した。共培養を２０〜２３℃で、１６時間の明期/８時間の暗期条件下で行った。共培養の３〜５日後、GUS遺伝子発現を、組織化学的GUSアッセイを使用することで視覚化した。マンノース含有共培養培地において共培養した外植片は、スクロースを含有する共培養培地において培養したものと比べて２倍以上のGUSスポットを示した。芽再生及び選択を例２で記載したように行った。形質転換した芽の生産の有意な増加は、マンノースを共培養培地に加えた実験において確認された（表４）。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
外植片を、アグロバクテリウムの植えつけに続いて、固体共培養培地へと移して共培養を２０〜２４℃で、１６時間の明期及び８時間の暗期条件下で行った。共培養の３〜５日後、一次及び二次芽分裂組織を除去して捨て、そして生じる外植片をREG-4培地に移した。その培地は、B5塩（１×）、ビタミンB5（１×）、BAP１mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、セフォタキシム１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、マンノース１５〜２０g/L、スクロース０、０．２５又は１g/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。５〜７日の期間後、子葉に近接する腋分裂組織から成長した全ての芽を除去し、そして外植片をREG-5培地へと移した。その培地は、B5塩（１×）、ビタミンB5（１×）、BAP０．５mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、セフォタキシム１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、マンノース１５g/L、スクロース１g/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。４週後、外植片をREG-6培地へと芽伸長のために移した。REG-6培地は、MS塩（１×）、MSビタミン（１×）（MSビタミン組成：イノシトール１００mg/L、ニコチン酸０．５mg/L、ピリドキシンHCl０．５mg/L、チアミンHCl０．１mg/L、グリシン２mg/L）、ミオイノシトール２００mg/L、BAP０．２mg/L、ゼアチンリボシド０．５mg/L、IBA０．１mg/L、GA3１mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、チカルシリン３００mg/L、マンノース１５g/L、スクロース５g/L、硝酸銀０．８mg/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。外植片を新鮮REG-6培地へと２週ごとに移した。伸長した芽（２〜４cmの長さ）を除去して発根培地中で根を張らせ、そして土壌に移した。この発根培地は、MS塩（１×）、ビタミンB5（１×）、グルタミン１００mg/L、アスパラギン１００mg/L、IBA０．７mg/L、チメンチン１００mg/L、及びスクロース１５g/Lを含んだ。Taquman解析により、２つの事象に由来する葉試料における導入遺伝子（αガラクトシダーゼ遺伝子及びフォスフォマンノースイソメラーゼ遺伝子）の存在が確認された。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
外植片を、アグロバクテリウムの植えつけに続いて、固体共培養培地へと移して共培養を２０〜２４℃で、１６時間の明期及び８時間の暗期条件下で行った。共培養の３〜５日後、初生葉基部領域からの芽成長を確実にするために当該外植片から一次及び二次分裂組織を除去した後に、外植片をREG-7培地に移した。REG-7培地は、B5塩（１×）、ビタミンB5（１×）、BAP１mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、セフォタキシム１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、スクロース３０g/L、ヒグロマイシン２〜５mg/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。外植片を、当該外移植片の上胚軸末端が培地中に挿入されるように逆さに配置した。７〜１０日の期間後、子葉に近接する腋分裂組織から成長した全ての芽を除去した。そして外植片をREG-8培地へと移した。その培地は、B5塩（１×）、ビタミンB5（１×）、BAP０．５mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、セフォタキシム１００mg/L、チカルシリン３００mg/L、スクロース３０g/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含んだ。更に２週後、外植片をREG-9培地へと移し、そしてこの後２週ごとに継代培養した。REG-9培地は、MS塩（１×）、MSビタミン（１×）、ミオイノシトール２００mg/L、BAP０．２mg/L、ゼアチンリボシド０．５mg/L、IBA０．１mg/L、GA3１mg/L、グルタミン５０mg/L、アスパラギン５０mg/L、硝酸銀０．８mg/L、チカルシリン３００mg/L、スクロース３０g/L、ヒグロマイシン０．１〜０．２mg/L、精製アガー１０g/L、及びpH５．６を含む。伸長した芽（２〜４cmの長さ）を除去し、そして発根培地中で根を張らせ、そして土壌に移した。この発根培地は、MS塩（１×）、ビタミンB5（１×）、グルタミン１００mg/L、アスパラギン１００mg/L、IBA０．７mg/L、チメンチン１００mg/L、及びスクロース１５g/Lを含んだ。Taquman解析により、５つの事象から獲得した葉試料において導入遺伝子（HPT並びにZsGreen1）の存在が確認された。ZsGreen1遺伝子の植物部分における発現を、蛍光顕微鏡の下で、視覚化により確認した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2005535312.tif 000014
【国際調査報告】
2005535312.tif 000015