(57)【要約】本発明はヒト５ＨＴ7受容体プロモーターを構成する単離された核酸分子を提供する。ＮｃｏＩ若しくはＢＡＲＢＩＥのようなエンハンサーおよび／若しくは応答配列を包含するそのフラグメント、ならびにその組換え的使用もまた開示される。従って、本発明のヌクレオチドがルシフェラーゼ遺伝子若しくはＣＡＴ遺伝子のような検出可能な産物に作動可能に連結されている組換えＤＮＡ分子を提供することが本発明のさらなる一局面である。ヒト５ＨＴ7受容体プロモーター若しくはその活性のフラグメントに作動可能に連結された遺伝子の発現のレベルを調節する化合物を同定するための細胞に基づくスクリーニングアッセイもまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１ないし３０８１、若しくは５ＨＴ7受容体プロモーター活性を表すそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）の相補鎖；および
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）で定義されるところのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能な核酸
よりなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項２】
（ａ）配列番号１中の位置−２７ないし−１１０（配列番号２）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体エンハンサー活性を表すそのフラグメント；
（ｂ）配列番号１中の位置−９２５ないし−９３９（配列番号３）として示されるヌクレオチド配列、若しくはバルビツレート誘導可能エレメント活性を表すそのフラグメント；
（ｃ）配列番号１中の位置−５０ないし−８０（配列番号４）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体プロモーター調節活性を表すそのフラグメント；
（ｄ）配列番号１中の位置−Ｘないし−Ｙ（配列番号６）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体プロモーター調節活性を表すそのフラグメント；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくは（ｄ）の相補鎖；および
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくは（ｄ）で定義されるところのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列
から選択される配列を含んでなる、請求項１に記載の５−ＨＴ7受容体プロモーター領域の単離された調節配列。
【請求項３】
請求項１若しくは２に記載の単離された核酸分子を含んでなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
単離された核酸分子が、８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメント（配列番号２）、ＢＡＲＢＩＥエレメント（配列番号３）若しくは２３３ｂｐのＧＣリッチモチーフ（配列番号６）である、請求項２に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
請求項１に記載の単離された核酸が、検出可能な産物をコードする核酸分子に作動可能に連結されている、請求項３若しくは４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
単離された核酸分子が、最小プロモーターを含有するレポータープラスミドに作動可能に連結されている、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
検出可能な産物をコードする核酸分子が、５ＨＴ7受容体ポリペプチド若しくはレポーター遺伝子をコードする核酸配列から選択されている、請求項５若しくは６に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質遺伝子よりなる群から選択されている、請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
レポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ遺伝子である、請求項５ないし８のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項３ないし８のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子を含んでなるベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
請求項１０若しくは１１に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記真核生物細胞が哺乳動物細胞、好ましくはＨＥＫ２９３、ＮＳ２０Ｙ若しくはＮ２Ａ細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
（ａ）請求項３ないし８のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞を試験化合物と接触させること；および
（ｂ）前記試験化合物が検出可能な産物の発現のレベルを調節するかどうか決定すること
を含んでなる、ヒト５ＨＴ7受容体プロモーター活性の調節物質である化合物の同定方法。
【請求項１７】
検出可能な産物が、５ＨＴ7受容体タンパク質、またはホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、若しくは緑色蛍光タンパク質遺伝子から選択されるレポーター遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）検出可能な産物に作動可能に連結された８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメント（配列番号２）を含んでなる組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした宿主細胞を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）前記試験化合物が検出可能な産物の発現のレベルを調節するかどうか決定すること
を含んでなる、５ＨＴ7受容体プロモーターエンハンサー活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項１９】
（ａ）検出可能な産物に作動可能に連結されたＢＡＲＢＩＥエレメント（配列番号３）を含んでなる組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした宿主細胞を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）前記試験化合物が検出可能な産物の発現のレベルを調節するかどうか決定すること
を含んでなる、５ＨＴ7受容体プロモーター領域内のバルビツレート誘導可能エレメントの活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２０】
（ａ）検出可能な産物に作動可能に連結されたＧＣリッチモチーフ（配列番号６）を含んでなる組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした宿主細胞を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）前記試験化合物が検出可能な産物の発現のレベルを調節するかどうか決定すること
を含んでなる、５ＨＴ7受容体プロモーター領域内のバルビツレート誘導可能エレメントの活性を調節する化合物の同定方法。
【請求項２１】
（ａ）８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメント（配列番号２）を含んでなる組換えＤＮＡ分子を、転写因子ＡＰ２の存在下で試験化合物と接触させること、および（ｂ）前記試験化合物が前記転写因子の８３ｂｐのエンハンサー領域（配列番号２）への結合に影響を及ぼすかどうか決定すること、を含んでなる、５ＨＴ7受容体プロモーターエンハンサー活性を調節することが可能な化合物の同定方法。
【請求項２２】
（ａ）ＧＣリッチモチーフ（配列番号６）を含んでなる組換えＤＮＡ分子を、転写因子Ｓｐ１若しくはＥｇｒ−１の存在下で試験化合物と接触させること、および（ｂ）前記試験化合物が、前記転写因子のＧＣリッチモチーフ（配列番号６）への結合に影響を及ぼすかどうか決定すること、を含んでなる、５ＨＴ7受容体プロモーターエンハンサー活性を調節することが可能な化合物の同定方法。
【請求項２３】
（ａ）配列番号３ないし８のいずれか１つに記載の組換えＤＮＡ分子で宿主細胞株をトランスフェクトする段階；
（ｂ）前記宿主細胞株に多様なヒトｃＤＮＡ配列をトランスフェクトする段階；
（ｃ）変えられたレベルの前記レポーター遺伝子の発現を有する細胞を同定かつ単離する段階；
（ｄ）段階（ｃ）で単離した細胞からｃＤＮＡを回収する段階；および
（ｅ）段階（ｄ）で回収したｃＤＮＡにより発現されるポリペプチドを同定する段階
を含んでなる、セロトニン媒介性の応答に関係する生物学的経路に関与するヌクレオチド配列に結合するポリペプチドの同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒト５−ＨＴ7受容体の単離されたプロモーター領域に関する。本発明はまた、ヒト５−ＨＴ7受容体の発現を調節しかつそれにより統合失調症、うつ、偏頭痛、情動障害ならびに睡眠および胃腸機能の調節不全（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）のようなセロトニン媒介性の応答に関係する医学的状態の処置に潜在的に有用である作用物質のスクリーニング方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）系は、おそらく、その細胞性の作用を媒介する受容体補足物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に関して脊椎動物のＣＮＳ中の最も多彩な神経伝達物質系であろう。今日まで、１４種のセロトニン（５−ＨＴ）受容体がクローン化されかつ７種の５−ＨＴ受容体サブタイプに分類されている。イオンチャネル内蔵型である５−ＨＴ3受容体を除き、５−ＨＴ受容体はＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）スーパーファミリーに属している。これらのなかで、５−ＨＴ7受容体は最も新しくクローン化されたとは言え、その存在はその独特の薬理学のため長い間推測されていた。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびリガンド結合のアプローチがＣＮＳ中でのその分布をマッピングしており、そして視床、視床下部および海馬で最も豊富であり、大脳皮質および扁桃核でより低レベルを示している（非特許文献１）。
【０００３】
５−ＨＴ7受容体の局在化へのこの洞察にもかかわらず、これらの受容体の生理学的役割に関する比較的少ない報告が存在した。非選択的リガンドに基づく研究は、サーカディアンリズムの調節における５−ＨＴ7受容体の役割（非特許文献２；非特許文献３）、ならびに睡眠障害およびうつとの関連を示唆している。慢性の抗うつ薬処置後の５−ＨＴ7様結合部位のダウンレギュレーションがこの役割をさらに裏付けている。ＲＴ／ＰＣＲ研究は、それらの予測された細胞内カルボキシル末端で構造的に相違している４種の哺乳動物５−ＨＴ７スプライスバリアントの同定を助けた（非特許文献１）。
【０００４】
セロトニン受容体発現はしばしば高度に組織特異的であり、また、研究された場合においては、各セロトニン受容体ファミリーメンバーが脳内で局部的発現の特徴的パターンを有するようである。この制限された発現パターンは、おそらく、セロトニンに対する特異的生物学的応答を媒介するための臨界的な制御点であろう。５−ＨＴ7受容体が視交叉核（ＳＣＮ、サーカディアンリズムに関与している領域）中で発現されていることが示されたのはごく最近のことにすぎない。５−ＨＴ7受容体に対する高親和性をもつ５−ＨＴ1Aアゴニスト、８−ＯＨ−ＤＰＡＴを使用する研究もまた、ハムスターのサーカディアンリズムを移動させた（非特許文献４）。これらの結果は睡眠調節における５−ＨＴ7受容体の潜在的役割を示唆する。この制限された発現パターンを鑑み、５−ＨＴ7受容体はその遺伝子調節を研究するための興味深い候補となっている。
【０００５】
この点に関して、５−ＨＴ7受容体がステロイドによりｉｎ  ｖｉｖｏ（非特許文献５；非特許文献６）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ（非特許文献７）でダウンレギュレートされることが既に示されている。このダウンレギュレーションは情動障害である役割を演じているかもしれず、そして、従って、関与する調節配列要素を同定することが重要である。同様に、５−ＨＴ7受容体のダウンレギュレーションは慢性の抗うつ薬処置後に発生する（非特許文献８；非特許文献９）。これおよび他の予備的結果（非特許文献１０）は５−ＨＴ7受容体のシナプス前の役割を示唆し、そして、従って、この受容体はセロトニン放出を制御する負のフィードバックループにもまた関与しているかもしれない。この点に関して、現在利用可能である５−ＨＴ7受容体アンタゴニストの選択性を向上させることは有益であるとみられる。５−ＨＴ7プロモーター調節の解明は、５−ＨＴ7受容体形成を妨害することを可能にしかつ５−ＨＴ7受容体機能を妨害する薬物の新たなスクリーニング戦略につながるであろう。
【非特許文献１】Ｖａｎｈｏｅｎａｃｋｅｒら（２０００）。“５−ＨＴ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．”Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２１（２）：７０−７
【非特許文献２】Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇら（１９９３）。“Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（５−ＨＴ７）ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍｓ．”Ｎｅｕｒｏｎ  １１（３）：４４９−５８。
【非特許文献３】ＹｉｎｇとＲｕｓａｋ（１９９７）。“５−ＨＴ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｅｒｇｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｌｉｇｈｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｎｅｕｒｏｎｓ．”Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ７５５（２）：２４６−５４。
【非特許文献４】Ｅｈｌｅｎら（２００１）。“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｓｅｔｔｉｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｃｌｏｃｋ  ｂｙ  ５−ＨＴ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｐｒａｃｈｉａｓｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ．”Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２１（１４）：５３５１−７。
【非特許文献５】Ｌｅ  Ｃｏｒｒｅら（１９９７）。“Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ５−ＨＴ７（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ−７）ａｎｄ  ５−ＨＴ１Ａ（ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ−１Ａ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ａｆｔｅｒ  ａｄｒｅｎａｌｅｃｔｏｍｙ．”Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）１３０（４）：３６８−７４。
【非特許文献６】Ｙａｕら（１９９７）。“Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ａｄｒｅｎａｌｅｃｔｏｍｙ  ｏｆ  ５−ＨＴ６  ａｎｄ  ５−ＨＴ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．”Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ４５（１）：１８２−６。
【非特許文献７】Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９９７）。“Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｆｒｏｎｔｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ．”Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６８（６）：２６０４−９。
【非特許文献８】Ｓｌｅｉｇｈｔら（１９９５）。“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｒａｔ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ：ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｈｒｏｎｉｎｃ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．”Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４７（１）：９９−１０３。
【非特許文献９】Ｍｕｌｌｉｎｓら（１９９９）。“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｓ  ｏｎ  ５−ＨＴ７  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．”Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２１（３）：３５２−６７。
【非特許文献１０】Ｈａｒｓｉｎｇら、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃ  Ａｂｓｔｒ．３８０．１、２００１）
【発明の開示】
【０００６】
［発明の要約］
本発明は、図１（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する実質的に精製された５−ＨＴ7受容体遺伝子プロモーター領域を提供する。それはさらに、ヒト５−ＨＴ7受容体プロモーターの転写因子若しくは調節配列要素の同定、ならびに５−ＨＴ7受容体遺伝子発現を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法におけるそれらの使用に関する。
【０００７】
本発明はまた、５−ＨＴ7受容体プロモーター領域若しくはその調節配列要素に作動可能に連結された遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子も提供する。
【０００８】
本発明はさらに、５−ＨＴ7受容体プロモーター若しくはその調節配列要素に作動可能に連結された遺伝子の発現のレベルを調節する有効な作用物質を同定するための細胞に基づくスクリーニングアッセイにおける５−ＨＴ7受容体プロモーター若しくはその調節配列要素に作動可能に連結されたレポーター遺伝子のような遺伝子の使用方法を提供する。
【０００９】
こうした有効な作用物質は、５−ＨＴ7受容体のプロモーター若しくはその調節配列要素に作動可能に連結された遺伝子を含有する核酸分子を細胞に導入すること；該遺伝子を含有する細胞中での該遺伝子の対照発現レベルを測定すること；該遺伝子を含有する細胞を有効な作用物質であることが推測される作用物質と接触させること；および該作用物質と接触させた細胞中での該遺伝子の試験発現レベルを測定すること（ここで、対照発現レベルと比較した試験発現レベルの差異が該作用物質を有効な作用物質と同定する）による本発明の方法により同定可能である。
【００１０】
本発明の方法により同定される有効な作用物質は、例えば細胞中での５−ＨＴ7受容体遺伝子発現を低下若しくは阻害する薬物であり得、そして、従って、シナプス前の自己受容体レベルを制御する必要がある疾患、例えばうつの治療において有用である。
【００１１】
有効な作用物質はまた例えば５−ＨＴ7受容体遺伝子発現を増大させる薬物でもあり得、そして、従って、低下されたセロトニン応答を特徴とする疾患の治療において有用である。
［発明の詳細な説明］
本発明は、配列番号１のヌクレオチド１ないし３０８１よりなるヒト５−ＨＴ7受容体プロモーターを構成する核酸分子、および５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を有する前記プロモーターのフラグメントに関する。該遺伝子のこの以前に未知の領域中で、下で「調節配列」若しくは「調節配列要素」と称される調節機能と一致する、差示的に保存された領域が同定された。応答配列としてもまた知られる前記配列は、それらが連結された遺伝子の発現を調節しかつ転写因子の結合若しくは放出により活性化されることを部分的に特徴とする。調節配列および転写因子の多数の例が本明細書に開示されるか、そうでなければ当該技術分野で別の方法で既知である。
【００１２】
本明細書に開示される５−ＨＴ7受容体プロモーターは、例えば、下で８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメントと称される調節エンハンサーを含有する。５−ＨＴ7受容体プロモーター配列（図１）の位置−２７ないし−１１０（配列番号２）として示される配列は、該プロモーター配列の調節活性に対し正の効果を有する。さらなる一態様において、本発明は、図１の５−ＨＴ７プロモーター配列の位置−５０ないし−８０（配列番号４）のＡＰ２結合モチーフを提供する。
【００１３】
それはさらに、下でＢＡＲＢＩＥと称されるバルビツレート誘導可能エレメントを含有する。５−ＨＴ7受容体プロモーター配列の位置−９２５ないし−９３９（配列番号３）として示される本配列は、一過性トランスフェクションアッセイにおいて、フェノバルビタールおよびアモバルビタールのようなバルビツレートの存在下で５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を抑制することが示された。
【００１４】
それはさらにＧＣリッチモチーフを含有する。５−ＨＴ７プロモーターの位置−４０４ないし−６３７（配列番号６）として同定された本配列は、転写因子Ｅｇｒ−１およびＳｐ１の影響下で５−ＨＴ７プロモーター調節活性を有することが示された。
【００１５】
本記述中で言及されるところの「マイナスのヌクレオチド位置」は、翻訳のＡＴＧ開始コドン（Ａは位置１に等しくかつ先行するヌクレオチドは位置−１に等しい）の上流の５−ＨＴ7受容体プロモーター領域（図１）内に局在化されるヌクレオチド位置である。
【００１６】
５−ＨＴ7受容体制御の調節は、統合失調症、うつ、情動障害、ならびに睡眠、偏頭痛、ＩＢＳおよび胃腸機能の調節不全において治療的価値を有すると期待される。
【００１７】
結果として、第一の局面において、本発明は：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１ないし３０８１、配列番号１中の位置−１１０ないし−１１２４（１０００ｌｕｃ構築物の境界）として示される、位置−２７ないし−１１２４（１０００ｌｕｃ＋構築物の境界）として示される、位置−１ないし−１１２４（Ｆ１０００ｌｕｃ構築物の境界）として示される、位置−１１０ないし−２１３７（２０００ｌｕｃ構築物の境界）として示される、位置−２７ないし−２１３７（２０００ｌｕｃ＋構築物の境界）として示される、位置として示される、位置−１ないし−２１３７（Ｆ２０００ｌｕｃ構築物の境界）として示される、位置−１１０ないし−３０８１（３０００ｌｕｃ構築物の境界）として示される、位置−２７ないし−３０８１（３０００ｌｕｃ＋構築物の境界）として示される、位置−２７ないし−３０８１（Ｆ３０００ｌｕｃ構築物の境界）として示される、若しくは位置−４０４ないし−６３７（２３３ｌｕｃ構築物の境界）として示されるヌクレオチド配列、または５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を表すそれらのフラグメント；
（ｂ）（ａ）の相補鎖；および
（ｃ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）若しくは（ｂ）で定義されるところのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列
から選択される配列を含んでなる単離されたヒト５−ＨＴ7受容体プロモーター領域を提供する。
【００１８】
「プロモーター領域」は１種若しくはそれ以上の遺伝子の転写を制御するよう機能しかつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位および遺伝子転写を調節するよう相互作用する同一分子上の他のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定されるＤＮＡの一領域を指す。
【００１９】
核酸に関しての「単離された」により、天然の供給源から単離されているか若しくは合成されるＲＮＡ若しくはＤＮＡを包含するポリヌクレオチドを意味する。本発明の単離された核酸は、それらが本来純粋なすなわち分離された状態で見出されないという意味において独特である。「単離された」という用語の使用は、天然に存在する配列がその通常の細胞の情況から取り出されていることを示す。従って、該配列は細胞を含まない溶液中にあってよいか、または、異なる細胞環境若しくは核酸の情況に置かれてよい。
【００２０】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件は、約４５℃で６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、次いで６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回若しくはそれ以上の洗浄である。
【００２１】
本発明の別の局面は、上で定義されるところのヒト５−ＨＴ7受容体プロモーター領域を含んでなる組換えＤＮＡ分子である。前記組換えＤＮＡ分子中で、ヒト５−ＨＴ7受容体プロモーター領域は、ヒト５−ＨＴ7受容体遺伝子のような検出可能な産物をコードする核酸分子、若しくはレポーター遺伝子に作動可能に連結し得る。本明細書で使用されるところの「作動可能に連結されている」という用語は、適正な読み枠である遺伝子とプロモーターを機能的に融合して該プロモーターの制御下に該遺伝子を発現させることを意味する。本明細書で使用されるところの「レポーター遺伝子」という用語は、単純な安価な方法若しくは試薬を使用して同定可能でありかつヒト５−ＨＴ7受容体プロモーター領域若しくはその活性の１フラグメントに作動可能に連結し得る遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。例えばホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ若しくは緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子を使用して、本発明のスクリーニングアッセイにて転写活性を測定し得る（例えばＧｏｅｄｄｅｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ｖｏｌ．１８５、サンディエゴ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照されたい；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記もまた参照されたい）。好ましい一態様において、レポーター遺伝子はホタルルシフェラーゼ遺伝子若しくは緑色蛍光タンパク質である。
【００２２】
本発明はまた、上で定義されるところの組換えＤＮＡ分子を含んでなるベクター、ならびにこうしたベクター若しくは一般には本発明の組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換された宿主細胞も提供する。「ベクター」という用語は、該宿主細胞による外因性ＤＮＡの複製および／若しくは適切な発現のために宿主細胞中に該ＤＮＡを移入させるために有用である外因性ＤＮＡのいかなる担体も指す。従って、特定の一態様において、前記ベクターはｐＧＬ３ｌｕｃ、ｐＢＬＣＡＴ５（ＬＭＢＰ  ２４５１）、ｐＧＭＣＳＦｌａｃＺ（ＬＭＢＰ  ２９７９）、ｐＥＧＦＰ若しくはｐＳＥＡＰｂａｓｉｃ（ＤＭＢ  ３１１５）のような発現ベクターであり、ここでＬＭＢＰおよびＤＭＢの数字はベルギー共同微生物収集物（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）のこれらの発現ベクターの受託番号を指す。
【００２３】
別の局面において、本発明は５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節する化合物の同定方法を提供し、前記方法は：（ｉ）候補の作用物質を上で定義されるところのヒト５−ＨＴ7受容体プロモーター領域と接触させる段階；および（ｉｉ）前記候補の作用物質が検出可能な産物の発現を調節するかどうか決定する段階（こうした調節は５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節することが可能な作用物質を暗示する）を含んでなる。検出可能な産物は、５−ＨＴ7受容体タンパク質、またはルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくは緑色蛍光タンパク質のようなレポーター遺伝子の産物のいずれかを指す。検出可能な産物の定量方法は当該技術分野で公知であり、そして、とりわけ、発現産物が酵素である場合は比色的基質の使用、ＲＩＡ若しくはＥＬＩＳＡアッセイにおける特異的抗体の使用、または該プロモーターに作動可能に連結された遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベルの測定（前記ｍＲＮＡは標準的手順を使用して直接若しくは間接的にのいずれかで測定し得る）を包含する。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「化合物」若しくは「作用物質」という用語は、単純な若しくは複雑な有機分子、ペプチド、タンパク質若しくはオリゴヌクレオチドのような生物学的若しくは化学的化合物を意味する。本明細書で使用されるところの「試験化合物」は、前記化合物が５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節するか若しくはその「調節配列」と相互作用するかを評価するために本発明の方法で使用される「化合物」若しくは「作用物質」を指す。
【００２５】
トランスフェクションアッセイは、５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）かつ／若しくは制御（ｒｅｇｕｌａｔｅ）する有効な作用物質を同定するためのとりわけ有用なスクリーニングアッセイとなり得る。一トランスフェクションアッセイにおいて、ヒト５−ＨＴ7受容体プロモーター若しくはその活性フラグメントに作動可能に連結された遺伝子、例えばレポーター遺伝子をコードする核酸を所望の細胞型にトランスフェクトする。試験レベルのレポーター遺伝子発現を候補の作用物質の存在下でアッセイしかつ対照発現レベルと比較する。有効な作用物質は、対照レベルのレポーター遺伝子発現（該作用物質の非存在下で測定される発現のレベルである）と異なる試験発現レベルをもたらす作用物質として同定する。
【００２６】
細胞のトランスフェクト方法および多様な便宜的レポーター遺伝子は当該技術分野で公知である（例えばＧｏｅｄｄｅｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ｖｏｌ．１８５、サンディエゴ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照されたい；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記もまた参照されたい）。結果として、前記方法は、例えば候補の作用物質の存在および非存在下でヒト５−ＨＴ7受容体プロモーターを含んでなる組換えＤＮＡ分子で一過性に若しくは安定に形質転換された宿主細胞中でのレポーター遺伝子発現をアッセイすることを含むことができ、ここで対照発現レベルに比較した試験発現レベルに対する影響が５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節することが可能な作用物質を暗示する。多様な５−ＨＴ7受容体プロモーターフラグメントがホタルルシフェラーゼに連結されている特定の一態様を実験手順で提供する。
【００２７】
５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節するポリペプチドの同定方法は、５−ＨＴ7受容体調節領域に結合するタンパク質を同定するための電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）（Ｄｉｇｎａｍ  Ｄ．ら（１９８３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１、１４７５−１４８９）；５−ＨＴ7受容体調節領域からの特定配列に結合するタンパク質を同定するための酵母１ハイブリッド系（ＬｉとＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２、１８７０−１８７４を参照されたい）；調節領域に結合するタンパク質の生化学的精製、「ファージライブラリー」に感染した細菌のプールをコードされるタンパク質を発現するように誘導しかつ５−ＨＴ7受容体調節領域からの放射活性ＤＮＡ配列でプロービングして結合タンパク質を同定する「サウスウェスタン」クローニング戦略（例えばＨａｉら（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：２０８３−２０９０を参照されたい）の使用のような当該技術分野で既知の多様な技術を包含し得る。
【００２８】
さらなる一局面において、本発明は：
（ａ）配列番号１中の位置−２７ないし−１１０（配列番号２）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体エンハンサー活性を表すそのフラグメント；
（ｂ）配列番号１中の位置−９２５ないし−９３９（配列番号３）として示されるヌクレオチド配列、若しくはバルビツレート誘導可能エレメントの活性を表すそのフラグメント；
（ｃ）配列番号１中の位置−５０ないし−８０（配列番号４）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体プロモーター調節活性を表すそのフラグメント；
（ｄ）配列番号１中の位置−４０４ないし−６３７（配列番号６）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体プロモーター調節活性を表すそのフラグメント；
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくは（ｄ）の相補鎖；および
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）若しくは（ｄ）で定義されるところのヌクレオチド配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列
から選択される配列を含んでなる５−ＨＴ7受容体プロモーター領域の単離された調節配列を提供する。
【００２９】
５−ＨＴ7受容体プロモーター領域について上述されたとおり、本発明はさらに、検出可能な産物をコードする核酸分子に作動可能に連結された前述の調節配列の１つを含んでなる組換えＤＮＡ分子を提供する。前記検出可能な産物は、５−ＨＴ7受容体ポリペプチド、またはホタルルシフェラーゼ遺伝子、アルカリホスファターゼ、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子若しくはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のようなレポーター遺伝子のいずれかであり得る。最小プロモーター要素を欠きかつそれ自体連結されている遺伝子の発現を調節し得ない調節配列を、最小インターロイキン６（ＩＬ６）プロモーター（ｐｈｕ．ＩＬ６Ｐ−５０ｌｕｃ＋−Ｐｌａｉｓａｎｃｅら（１９９７）ＭＣＢ  １７、３７３３−３７４３）、最小Ｅ１Ｂプロモーター（ｐＭＣＳＬｕｃ−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）若しくはルシフェラーゼのＴＫプロモーター（ｐＴＫＬｕｃ−Ｐｒｏｍｅｇａ）のような最小プロモーターを含有するレポータープラスミドに作動可能に連結し得る。好ましい一態様において、該組換え分子は、８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメント（配列番号２）、ＢＡＲＢＩＥエレメント（配列番号３）若しくは２３３ｂｐのＧＣリッチモチーフ（配列番号６）よりなる群から選択される１個の単離された核酸分子を含んでなる。
【００３０】
さらに、本発明は、５−ＨＴ7受容体プロモーター調節配列活性を調節若しくはそれと相互作用する化合物の同定方法を提供し、前記方法は：（ｉ）試験化合物を、上で定義されるところのヒト５−ＨＴ7受容体プロモーター調節配列と接触させる段階；および（ｉｉ）前記候補の作用物質が５−ＨＴ7受容体遺伝子の発現を調節するかどうか（こうした調節は５−ＨＴ7受容体プロモーター調節配列活性を調節若しくはそれと相互作用することが可能な作用物質を暗示する）を決定する段階を含んでなる。
【００３１】
従って、本発明は：
（ａ）配列番号１中の位置−２７ないし−１１０（配列番号２）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体エンハンサー活性を表すそのフラグメント；
（ｂ）配列番号１中の位置−４０４ないし−６３７（配列番号６）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体エンハンサー活性を表すそのフラグメント；
（ｃ）（ａ）若しくは（ｂ）の相補鎖；および
（ｄ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で（ａ）、（ｂ）若しくは（ｃ）で定義されるところのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列
から選択される配列を含んでなる単離されたヒト５−ＨＴ7受容体エンハンサー領域を提供する。
【００３２】
「エンハンサー領域」は、１種若しくはそれ以上の遺伝子の転写を制御するよう機能するＤＮＡの一領域を指す。
【００３３】
５−ＨＴ7受容体プロモーター領域について上述されたとおり、本発明はさらに、ヒト５−ＨＴ7受容体エンハンサー領域を含んでなる組換えＤＮＡ分子、前記組換えＤＮＡ分子を含んでなるベクター、ならびに前記ベクター若しくは前記組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換された宿主細胞を提供する。
【００３４】
さらに、本発明は５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節する化合物の同定方法を提供し、前記方法は：（ｉ）試験化合物を、上で定義されるところのヒト５−ＨＴ7受容体エンハンサー領域と接触させる段階；および（ｉｉ）前記試験化合物が５−ＨＴ7受容体遺伝子の発現を調節するかどうか（こうした調節は５−ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節することが可能な作用物質を暗示する）を決定する段階を含んでなる。こうした方法を実施するために既知の段階が利用可能であることが当業者により理解されるであろう。例えば、調節装置の単一塩基若しくは下位セグメントの特定の一変化とある応答を結びつけるために、多様な突然変異および欠失を包含する一「団」の構築物を使用し得る。単純な一団は：エンハンサーおよびプロモーター、プロモーターのみ、エンハンサーおよび別個の遺伝子からの「最小」プロモーターを包含してよい。
【００３５】
上で挙げられたとおり、適する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換された宿主細胞を使用するトランスフェクションアッセイは、有効な作用物質を同定するためのとりわけ有用なスクリーニングアッセイとなり得る。
【００３６】
本発明のさらなる一局面は本発明の核酸分子を含んでなるベクターである。前記ベクターは、例えば、本発明のＤＮＡ分子を運搬しかつその発現を媒介することが可能である複製可能な発現ベクターであり得る。本情況において、「複製可能な」という用語は、該ベクターが、それが導入されている所定の型の宿主細胞中で複製することが可能であることを意味する。
【００３７】
ベクターの例は、バクテリオファージのようなウイルス、コスミド、プラスミドおよび他の組換えベクターである。核酸分子は当該技術分野で公知の方法によりベクターのゲノム中に挿入する。
【００３８】
本発明のベクターをもつ培養宿主細胞もまた本発明に包含される。こうした宿主細胞は、原核生物細胞、単細胞真核生物細胞若しくは多細胞生物体由来の細胞であり得る。宿主細胞は従って例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような細菌細胞；ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）若しくはピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母細胞、またはＨＥＫ２９３細胞のような哺乳動物細胞であり得る。宿主細胞へのベクターの導入を遂げるために使用される方法は、組換えＤＮＡの方法の当業者に公知の標準的方法である。下で例示されるところの好ましい細胞はＨＥＫ２９３細胞、ＮＳ２０Ｙ細胞若しくはＮ２Ａ細胞よりなる。
【００３９】
従って、５ＨＴ7受容体プロモーター活性を調節することが可能な化合物の同定方法を提供することが本発明の一目的であり、前記方法は：（ａ）本発明の組換えＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞を試験化合物と接触させること；および（ｂ）前記試験化合物が検出可能な産物の発現のレベルを調節するかどうかを決定することを含んでなる。前述の方法での組換えＤＮＡ分子は、好ましくは；
（ａ）配列番号１中の位置−２７ないし−１１０（配列番号２）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体エンハンサー活性を表すそのフラグメント；
（ｂ）配列番号１中の位置−９２５ないし−９３９（配列番号３）として示されるヌクレオチド配列、若しくはバルビツレート誘導可能エレメント活性を表すそのフラグメント；または
（ｃ）配列番号１中の位置−４０４ないし−６３７（配列番号６）として示されるヌクレオチド配列、若しくは５−ＨＴ7受容体プロモーター調節活性を表すそのフラグメント
から選択される単離された核酸分子を含んでなる。
【００４０】
従って、本発明は；
（ａ）検出可能な産物に作動可能に連結された８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメント（配列番号２）を含んでなる組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした宿主細胞を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）前記試験化合物が検出可能な産物の発現のレベルを調節するかどうかを決定すること
を含んでなる、５ＨＴ7受容体プロモーターエンハンサー活性を調節する化合物の同定方法。
【００４１】
（ａ）検出可能な産物に作動可能に連結されたＢＡＲＢＩＥエレメント（配列番号３）を含んでなる組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした宿主細胞を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）前記試験化合物が検出可能な産物の発現のレベルを調節するかどうかを決定すること
を含んでなる、５ＨＴ7受容体プロモーター領域内のバルビツレート誘導可能エレメントの活性を調節する化合物の同定方法。
【００４２】
（ａ）検出可能な産物に作動可能に連結されたＧＣリッチモチーフ（配列番号６）を含んでなる組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトした宿主細胞を試験化合物と接触させること、および
（ｂ）前記試験化合物が検出可能な産物の発現のレベルを調節するかどうかを決定すること
を含んでなる、５ＨＴ7受容体プロモーター領域内のバルビツレート誘導可能エレメントの活性を調節する化合物の同定方法
を提供する。
【００４３】
代替の一態様において、前述のアッセイは、５ＨＴ７受容体プロモーターの調節配列の特異的リガンドとして転写因子を使用する結合アッセイよりなる。従って、５ＨＴ7受容体プロモーターエンハンサー活性を調節することが可能な化合物の同定方法を提供することが本発明の一目的であり、前記方法は；（ａ）本発明の５−ＨＴ７受容体プロモーターの調節配列を含んでなる組換えＤＮＡ分子を転写因子の存在下で試験化合物と接触させること、および（ｂ）前記試験化合物が該調節配列への前記転写因子の結合に影響を及ぼすかどうかを決定することを含んでなる。
【００４４】
とりわけ、本発明は、５ＨＴ7受容体プロモーターエンハンサー活性を調節することが可能な化合物の同定方法を提供し、前記方法は；（ａ）８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメント（配列番号２）を含んでなる組換えＤＮＡ分子を転写因子ＡＰ２の存在下で試験化合物と接触させること、および（ｂ）前記試験化合物が８３ｂｐのエンハンサー領域（配列番号２）への前記転写因子の結合に影響を及ぼすかどうかを決定することを含んでなる。
【００４５】
さらなる特定の一態様において、本発明は、５ＨＴ7受容体プロモーターエンハンサー活性を調節することが可能な化合物の同定方法を提供し、前記方法は；（ａ）ＧＣリッチモチーフ（配列番号６）を含んでなる組換えＤＮＡ分子を転写因子Ｓｐ１若しくはＥｇｒ−１の存在下で試験化合物と接触させること、および（ｂ）前記試験化合物がＧＣリッチモチーフ（配列番号６）への前記転写因子の結合に影響を及ぼすかどうかを決定することを含んでなる。
【００４６】
転写因子のその認識部位への結合の測定方法は当該技術分野で既知であり、そして例えば下の実験の部に概説されるところのゲル移動度シフトアッセイを含んでなる。
【００４７】
なお別の局面において、本発明は、上で定義されるところの核酸分子の発現を調節することが可能な作用物質の同定方法を包含し、前記方法は（ｉ）候補の作用物質を前記核酸分子と接触させる段階；および（ｉｉ）前記候補の作用物質が前記核酸分子の発現を調節するかどうかを決定する段階を含んでなる。
【００４８】
５−ＨＴ7受容体遺伝子の制御配列に特異的に結合することが可能なアンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡ（好ましくは１０ないし２５塩基対のオリゴヌクレオチド）を、例えばウイルスベクター若しくはリポソームのようなコロイド分散系により細胞に導入する。アンチセンス核酸若しくはｓｉＲＮＡは細胞中の標的ヌクレオチド配列に結合しそして前記標的配列の転写および／若しくは翻訳を予防する。ホスホロチオエートおよびメチルホスホネートアンチセンスオリゴヌクレオチドが本発明による治療的使用にとりわけ企図される。転写若しくは翻訳いずれかのレベルでの５−ＨＴ7受容体遺伝子の発現の抑制は、セロトニン媒介性の応答に関係する疾患／状態の細胞若しくは動物モデルを生成させるのに有用である。
【００４９】
なお別の局面において、本発明は：
（ａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（総説については、例えばＧａｌｂｒａｉｔｈら（１９９９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５８：３１５−３４１を参照されたい）をコードする遺伝子のようなレポーター遺伝子に連結したヒト５−ＨＴ7受容体プロモーターヌクレオチド配列で宿主細胞株をトランスフェクトする段階；
（ｂ）前記宿主細胞株を多様なヒトｃＤＮＡ配列、例えばｃＤＮＡライブラリーに包含される配列でトランスフェクトする段階；
（ｃ）添加されたｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドがセロトニン媒介性の応答に関係する生物学的経路に関与する最低１種の遺伝子をアップ若しくはダウンレギュレートすることを暗示する、前記レポーター遺伝子の変えられた発現レベルを有する細胞を例えばＦＡＣＳ細胞分取により同定かつ単離する段階；
（ｄ）段階（ｃ）で単離した細胞から標準的手順、例えばＰＣＲ若しくはＣＲＥ−ＬＯＸ媒介性の手順（例えばＳａｕｅｒ（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４：３８１−３９２を参照されたい）によりｃＤＮＡを回収する段階；および
（ｅ）例えばｃＤＮＡをシークェンシングしかつ得られた配列を配列データベースと比較することにより、段階（ｄ）で回収したｃＤＮＡにより発現されるポリペプチドを同定する段階
を含んでなる、セロトニン媒介性の応答に関係する生物学的経路に関与するヌクレオチド配列に結合するポリペプチドの同定方法を提供する。
【００５０】
本記述を通じて、「標準的方法」、「標準的プロトコル」および「標準的手順」という用語は、分子生物学の技術の情況で使用される場合に：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９４、若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．とＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー  １９８９のような通常の実験室手引き書に見出されるプロトコルおよび手順と理解されるべきである。
【００５１】
本発明は後に続く実験の詳細への参照によりより良好に理解されるであろうが、しかし、当業者は、これらはその後に続く請求の範囲でより完全に記述されるところの本発明の具体的説明にすぎないことを容易に認識するであろう。加えて、本出願を通じ多様な刊行物を引用する。これらの刊行物の開示は、これにより、本発明が関する従来技術をより完全に記述するために本出願に引用することにより組み込まれる。
【実施例】
【００５２】
実験手順
ヒト５−ＨＴ7受容体ゲノムクローンの同定
ヒト５−ＨＴ7セロトニン受容体の既知のｃＤＮＡ配列（ＧＩ：１７８６４１３１）を使用してＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を検索した。われわれはＢＡＣクローン（ＧＩ：１４５４７２６２）すなわち５−ＨＴ7受容体の完全なコーディング配列を含有する完全な配列、第１０染色体上のＲＰ１１−１０３Ａ２からのヒトＤＮＡ配列を同定した。ＢＡＣ配列情報に基づきプライマーを設計して、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅから得たＢＡＣクローン中の５−ＨＴ7エキソンの存在を確認した。プライマーの配列を表Ｉに示す。
【００５３】
最初の変性段階（９４℃５分間）後に、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＰＣＲを２５周期（９４℃１分間の変性段階、５９℃１分間のアニーリング段階、および６８℃１０分間の伸長段階）実施した。
【００５４】
ＥＢＶに基づくベクターへの再クローン化はＣｒｅ−ＬｏｘＰ技術を使用してＲｉｃｈａｒｄ  Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓにより実施した。
プロモーター構築物およびプラスミド
ＢＡＣ配列に基づいてプライマーを設計して３種の異なる長さの５’隣接領域を生成させた（表ＩＩ）。
【００５５】
全部のフラグメントは、Ｐｆｕポリメラーゼを使用し、以下のプロトコルに従って生成させた。３０周期のＰＣＲを９４℃１分間、４８℃１分間および７２℃４分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  ＢｌｕｎｔクローニングベクターｐＣＲ  ２．１  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そして配列分析により数クローンを検証した。
【００５６】
サブクローニングのため、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化した１０１４ｂｐのフラグメント、若しくはＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化した２０２７および３０１１ｂｐのフラグメントを、同様に消化したｐＧＬ３−ｂａｓｉｃルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。結果として生じるプラスミドをそれぞれ１０００  ｌｕｃ、２０００  ｌｕｃおよび３０００  ｌｕｃと命名した（図３）。このクローン化戦略により、全構築物は翻訳開始点のすぐ上流の１１０ｂｐを欠く。８３ｂｐの新たなフラグメントを全３種のレポーター構築物に成功裏にサブクローニングしてプラスミド１０００  ｌｕｃ＋、２０００  ｌｕｃ＋および３０００  ｌｕｃ＋をもたらした。挿入された８３ｂｐの向きをシークェンシングにより検証した。
【００５７】
プロモーターおよびエンハンサー領域を欠くｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ、ならびにルシフェラーゼが強力なＣＭＶプロモーターの制御下にあるＣＭＶ  ｌｕｃをそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。ｐＮｅｏｇａｌを使用してトランスフェクション効率の変動について補正した。プラスミド１０００  ｌｕｃ＋、２０００  ｌｕｃ＋および３０００  ｌｕｃ＋中で欠けている２７ｂｐと同一の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）のリンカー配列を全３種のプラスミドに正しい位置および向きで挿入して、構築物Ｆ１０００  ｌｕｃ、Ｆ２０００  ｌｕｃおよびＦ３０００  ｌｕｃを生成させた。Ｆ１０００  ｌｕｃ構築物からＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩで２３３ｂｐを切断することにより、２３３ｂｐのｌｕｃフラグメント（下で２３３ｌｕｃ構築物と称される）を生成させた。クレノウ処理後に、得られた２３３ｂｐを、ＮｃｏＩで開環しかつ平滑化したｐＧＬ３  ｌｕｃベクターにクローン化し、そして配列および向きを配列分析により確認した。
細胞培養および一過性発現アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ新生児血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地中で維持した。これらの細胞は５％ＣＯ2の加湿雰囲気中３７℃で維持した。
【００５８】
標準的リン酸カルシウム共沈殿法を使用して１５０ｎｇのプロモータープラスミドおよび５０ｎｇのｎｅｏｇａｌ（内部対照として供される）で２４ウェル皿中の１０5細胞／ｃｍ2をトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に細胞をＰＢＳＡで１回洗浄し、そして１５０μｌの１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で溶解した。サンプルを以前に記述された（Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅら、１９９８）とおりルシフェラーゼ活性について分析した。β−ガラクトシダーゼ活性は基質としてＧａｌａｃｔｏ  Ｓｔａｒ（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用して測定した。バルビツレート実験のため、多様なバルビツレートでの処理を細胞のトランスフェクションの２４時間後に開始した。
【００５９】
ＣＭＶ−ＡＰ２過剰トランスフェクション（ｏｖｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）実験のため、リン酸カルシウム法を使用して３×１０6個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２μｇのＣＭＶ−ＡＰ２プラスミド（贈品  Ｒ．Ｔｊｉａｎ）でトランスフェクトした。Ｎ２ＡおよびＮＳ２０Ｙ細胞は１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地中で維持した。これらの細胞は５％ＣＯ2の加湿雰囲気中３７℃で維持した。ＪｅｔＰＥＩ陽イオン性ポリマートランスフェクション試薬（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）を使用して、６ウェル皿中の４×１０5細胞を５００〜１０００ｎｇのプロモーター構築物および３００ｎｇのｎｅｏｇａｌ（内部対照として供される）でトランスフェクトした。
【００６０】
Ｅｇｒ−１、Ｚｎ−Ｅｇｒ−１、Ｓｐ１およびＢＤ−Ｓｐ１でのコトランスフェクション実験において、４×１０5個のＮＳ２０Ｙ若しくはＮ２Ａ細胞をＪｅｔＰＥＩおよび図に示されたところのＤＮＡ量でトランスフェクトした（ＤＮＡの総量は常にｐｃＤＮＡ３を用いて各ウェル中で等レベルに補正する）。
【００６１】
細胞を多様な濃度のミトラマイシンＡで２４時間処理した。
ゲル移動度シフトアッセイ
多様な細胞株の全抽出物を以前に記述されたところの溶解緩衝液を用いて調製した。８３ｂｐのプローブをＴＯＰＯ  ２１３８構築物からＮｃｏＩ消化により単離した。３０ｂｐの配列は、以下のスキームすなわち９４℃１０分間、７０℃１０分間、５０℃１０分間、３０℃２０分間および４℃１０分間に従って５’−ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＣＣＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＡＧ−３’および５’−ＣＣＧＧＴＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＣＡ−３’をアニーリングすることにより生成させた。
【００６２】
ＤＮＡフラグメントはクレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して［α−32Ｐ］ｄＣＴＰで末端標識した。結合反応は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ2、１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび１５％  Ｆｉｃｏｌｌを含有する２０μｌの総容量中で実施した。細胞抽出物を反応緩衝液中氷上で１０分間前インキュベートし、その後標識ＤＮＡプローブを添加し、そしてインキュベーションを室温で別の１５分間継続した。
【００６３】
競合実験においては、標識した８３ｂｐのプローブの添加前に過剰の未標識の３０ｂｐのプローブを添加した。電気泳動は６％ポリアクリルアミドゲルを使用し０．５×ＴＢＥ中２時間実施した。Ｂｉｏｒａｄモレキュラーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ）を使用して結果を解析した。
ヒト５−ＨＴ7受容体遺伝子の転写開始部位の同定
製造元のプロトコル（Ａｍｂｉｏｎ）に従ってＲＬＭ−ＲＡＣＥ技術を使用して５’ＲＡＣＥを実施した。１０μｇの全ヒト胎児脳ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）（Ａｍｂｉｏｎ）で処理して、リボソームＲＮＡ、断片化ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよび汚染するゲノムＤＮＡのような分子から遊離の５’リン酸を除去した。フェノール：クロロホルム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出後にＲＮＡを沈殿させ、そして１１μｌのヌクレアーゼを含まない水に溶解した。５μｌを、合計２０μｌ中で２μｌのタバコ酸ピロホスファターゼ（ＴＡＰ）（Ａｍｂｉｏｎ）で３７℃で１時間処理した。ＴＡＰは完全長ｍＲＮＡからｃａｐ構造を除去して５’一リン酸を残す。次に、２０μｌの総容量中で５μｌのＣＩＰ／ＴＡＰ処理ＲＮＡ、１μｌの５’ＲＡＣＥアダプターおよび２μｌのＴ４  ＲＮＡリガーゼ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、４５塩基のＲＮＡアダプターオリゴヌクレオチド（５’−ＧＣＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＧＡＡＵＧＡＡＣＡＣＵＧＣＧＵＵＵＧＣＵＧＧＣＵＵＵＧＡＵＧＡＡＡ−３’）をＲＮＡ集団に３７℃で１時間連結した。その後、連結したＲＮＡは、ランダムプライマー（Ａｍｂｉｏｎ）およびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ａｍｂｉｏｎ）を用いる４２℃で１時間の逆転写酵素反応で使用した。１μｌのこのｃＤＮＡを使用して、３回の連続したネステッドＰＣＲ反応を実施した。最初のＰＣＲ反応は、アダプター特異的外側（ｏｕｔｅｒ）プライマー（５’−ＧＣＴＧＡＴＧＧＣＧＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧ−３’）および遺伝子特異的プライマーＢ１（５’−ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＴＡＡＡ−３’）を用いて実施した。ＰＣＲ反応は、以下の条件すなわち９４℃３０秒間、６０℃３０秒間および７２℃１分間（３５周期）下に５０μｌの総容量で実施した。その後、上と同一の条件下でアダプター特異的外側プライマー（上を参照されたい）および遺伝子特異的外側プライマー（５’−ＡＴＧＡＣＧＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＧＡＡ−３’）を使用する第二のネステッドＰＣＲ反応で、このＰＣＲ混合物の１／１０をさらに増幅した。
【００６４】
最後に、再度同一のＰＣＲ条件を適用してアダプター特異的内側（ｉｎｎｅｒ）プライマー
（５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＣＴＧＣＧＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧ−３’）および遺伝子特異的内側プライマー（５’−ＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴ−３’）を使用する第三のネステッドＰＣＲで、このＰＣＲ増幅混合物の１／１０を使用した。５μｌの最終ＰＣＲ反応をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクターｐＣＲ  ２．１  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そして配列決定により陽性クローンを検証した。
内因性５−ＨＴ７  ｍＲＮＡレベルのＲＴ−ＰＣＲ分析
１３２−１Ｎ１ヒト星状細胞腫細胞を５８ｃｍ2プレートに接種し；接種１２時間後に、培地単独（−）または１０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ若しくは５μＭのミトラマイシンＡ（Ｓｅｒｖａ）を含有する培地のいずれかを用いて細胞を培養した。ＲＮｅａｓｙ（全ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して全ＲＮＡを単離した。ＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡを合成した。その後、１０ｐｍｏｌの各プライマー、２００μＭ  ｄＮＴＰ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、２．５単位のＴａｑおよび５μｌのｃＤＮＡを含有する３０μｌの総容量中でＰＣＲにより該ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ条件は９４℃、３０秒；５６℃、１分；７２℃、２分；３５周期であった。ＰＣＲ産物は６％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動により分析した。
５−ＨＴ7フォワードプライマーＦ１：ＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＡＡＣＴＡＣＧＧＣＡＧＡＧＴ
５−ＨＴ7リバースプライマーＢ１：ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＴＡＡＡ
Ｆ１およびＢ１の使用は７８０ｂｐのＰＣＲ産物をもたらす。
ＧＡＰＤＨフォワードプライマー：ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ
ＧＡＰＤＨリバースプライマー：ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ
ＧＡＰＤＨプライマーの使用は４５２ｂｐのＰＣＲ産物をもたらす。
結果
ゲノムクローンの同定
５−ＨＴ7受容体の公表されたｃＤＮＡ配列（ＧＩ：１７８６４１３１）を使用して、ＮＣＢＩ  ｂｌａｓｔウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で完全なヒトゲノムのｂｌａｓｔ検索を実施した。これは、ヒト５−ＨＴ7受容体の完全なゲノム配列を含有するＢＡＣクローン（ＧＩ：１４５４７２６２）の同定をもたらした。このＢＡＣクローンをＳａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）から注文し、そしてプライマーの組Ｐｒｉ  ３−Ｐｒｉ  ４（６６４３ｂｐ）、Ｐｒｉ  ５−Ｐｒｉ  ６（８５９７ｂｐ）およびＰｒｉ  ７−Ｐｒｉ  ８（６０１５ｂｐ）を使用して、ＰＣＲにより多様なエキソンおよびイントロン配列の存在を同定した。ヒトゲノムＤＮＡのものとｃＤＮＡ配列を比較することにより、ヒト５−ＨＴ7受容体のエキソン−イントロンの構成が示された。コーディング配列およびイントロンは別にして、このＢＡＣクローンはまたそれぞれ１４．０２５ｂｐおよび２８．４２１ｂｐの上流および下流配列も含有した。図２はヒト５−ＨＴ7受容体の構造を示す。
【００６５】
完全なゲノム挿入物を含有するＢＡＣクローンは、ＬｏｘＰ−Ｃｒｅ組換え技術（Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ、１９９９；Ｗａｄｅ−Ｍａｒｔｉｎｓ、２０００）を使用してＥＢＶベクターに追加挿入（ｒｅｔｒｏｆｉｔ）した。再度、ＢＡＣクローンの検証についてと同一のプライマーの組を使用するＰＣＲにより、ＥＢＶベクター中のゲノム挿入物の存在を確認した。このＥＢＶベクターはわれわれが完全なゲノム５−ＨＴ7受容体配列を真核生物細胞に移入することを可能にし、そして、従って、選択的スプライシングを制御する配列の同定ならびに該遺伝子のプロモーター調節を研究するために有用であろう。
プロモーター領域の同定
ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）を使用する５’隣接ＤＮＡの配列分析は複数の転写因子のコンセンサス結合部位を示す。５’隣接領域（図１）はＧＣが豊富でありかつ転写開始部位近くのＴＡＴＡボックス若しくはＣＡＡＴボックスを含有しない（さらに参照されたい）。興味深いことに、５−ＨＴ7受容体遺伝子のニューロン制限に重要であるとみられる、数種のニューロン制限的なサイレンサ要素／リプレッサー要素１（ＮＲＳＥ／ＲＥ１）モチーフが同定された。
【００６６】
５−ＨＴ7遺伝子の調節で重要であるとみられる数種の他のモチーフはＳｐ１、ＡＰ２、ＯＬＦ１、ＢＡＲＢＩＥ、ＰＰＡＲ／ＲＸＲ、ＮＧＦＩＣ、Ｅｇｒなどである。
【００６７】
われわれがＰｒｏｓｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｐｒｏｓｃａｎ）およびＰｒｏｍｏｔｅｒＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）を使用して５’隣接領域中の潜在的プロモーターを同定した場合に、双方のプログラムはＡＴＧコドンの−６６３と−６８上流の間の推定のプロモーター領域を示した。
【００６８】
これは、多様な長さの５ＨＴ７プロモーター領域を使用するＨＥＫ２９３ＴおよびＮＳ２０Ｙ細胞の一過性トランスフェクションで確認された（図７）。プロモーター活性が最も増大した領域（２７１ｂｐ〜３６５ｂｐ）はＧＣリッチな領域ならびにＳｐ１／ＭＡＺおよびＥｇｒ−１の推定の結合場所を有する（図８）。この２３３ｂｐの領域（配列番号６）をＢａｍＨ１およびＢｇｌ１での制限消化によりＦ１０００構築物から切断し、そしてｐＧＬ３ｌｕｃにクローン化して構築物２３３ｌｕｃを生じさせた。
プロモーター領域の分析
５−ＨＴ7受容体遺伝子の潜在的プロモーター活性を検討するために、特異的プライマーの組および高忠実度Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して多様な長さのフラグメントを単離した（表ＩＩ）。ＰＣＲフラグメントをＺｅｒｏ−ＢｌｕｎｔベクターｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そしてそこからプロモーターフラグメントをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローニングした。
【００６９】
クローン化戦略により、全構築物が当初は８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメント（配列番号２）を欠いていた。その後、このフラグメントを全プロモーター構築物に挿入して「＋」構築物を生じさせた。全構築物はなお、翻訳開始部位に先行する２７ｂｐを欠く。図４は全フラグメントがＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でかなりの転写活性を表すことを示す。最高の活性は１０００ｂｐのフラグメントに比較して潜在的なエンハンサー要素の存在を示す２０００ｂｐのフラグメントを使用して得られた。他方、なおより長いプロモーターフラグメントの使用は発現レベルの下落をもたらし、位置−２０００から−３０００までの潜在的リプレッサー要素の存在を指摘する。しかしながら、全構築物について、われわれは、８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメントが存在しなかった場合にプロモーター活性の明瞭な低下を見出した。これらの結果は、この８３ｂｐの配列内の重要な基礎的プロモーター若しくはエンハンサー要素の存在を明確に示す。
【００７０】
多様な長さの５−ＨＴ７の推定されるプロモーター領域の一過性トランスフェクションは、２７１ｂｐと６５３ｂｐとの間の領域のプロモーター活性の有意の増大に至った（図７）。この領域の解析はいくつかの潜在的Ｅｇｒ−１結合部位および最低１個の推定のＳｐ１結合部位を示した（図８）。
【００７１】
ＳｍａｒＴｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）を使用して、われわれは位置２８４０から２５９０までの範囲にわたる推定のＳ／ＭＡＲ配列の存在もまた同定し得た。Ｓ／ＭＡＲはプロモーター活性の主制御因子であると考えられており、その結果それらは近隣の配列の影響を遮断し得る。これが、全５−ＨＴ7プロモーター活性が３０００ｂｐのフラグメント内に存することを意味するかどうかは、より長いプロモーターフラグメントを使用することにより検討されるであろう。
【００７２】
要約すれば、これらの結果は、５−ＨＴ7受容体の５’非翻訳領域から単離されたフラグメントがプロモーター活性を明確に表したことを示す。
ヒト５−ＨＴ7遺伝子中の転写開始部位の同定
ヒト胎児脳ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から開始して、ヒト５−ＨＴ7受容体の既知配列由来の遺伝子特異的アンチセンスプライマーを使用して５’ＲＡＣＥを実施した。アダプター特異的外側プライマーおよびプライマーＢ１を用いる第１回の後に８００ｂｐのフラグメントを検出し得た。第二のアダプター特異的外側プライマーおよび遺伝子特異的外側プライマーを使用してこのフラグメントをさらに増幅して、６００ｂｐのフラグメントをもたらした。最後に、第三回のＰＣＲでアダプター特異的内側プライマーおよび遺伝子特異的内側プライマーを使用して４００ｂｐのフラグメントを生成させた。この４００ｂｐのフラグメントをＴＯＰＯ−ＴＡベクターにクローン化し、そして、配列分析は、翻訳開始部位ＡＴＧの３０７ｂｐ上流の転写開始の開始部位の存在を示した。この転写部位はＢａｒｄ（ＧＩ：１０８８０１３２、ＧＩ：１０８８０１３０、ＧＩ：１０８８０１２８）およびＨｅｉｄｍａｎｎ（ＧＩ：１８５７１４４、ＧＩ：１８５７１４２）により同定された、公表されたものと異なる。
８３ｂｐのフラグメント上の興味深い潜在的転写因子の同定
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのわれわれの解析は、５−ＨＴ7プロモーター活性に対する８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメントの重要性を示した。これをさらに検討するため、われわれはゲルシフト実験でこの８３ｂｐのフラグメント（配列番号２）および内的な３０ｂｐのオリゴヌクレオチド（配列番号４）を使用した。双方のプローブを放射活性標識し、そしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの抽出物およびＣＭＶ−ＡＰ２で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞とともにインキュベートした（ＷｉｌｌｉａｍｓとＴｊｉａｎ、１９９１）。８３ｂｐのフラグメントでの結果は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの数種のタンパク質がこのプロモーターフラグメントと相互作用したことを示した。配列分析はこの８３ｂｐ内のＡＰ２モチーフの存在を示したため、われわれはＡＰ２でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの抽出物を使用してその役割を検討した。ゲルシフト実験は、ＡＰ２が実際に８３ｂｐのフラグメントと相互作用することを示し、また、これらの結果はＡＰ２部位を包含するより短い３０ｂｐのオリゴヌクレオチドを使用することにより確認された。相互作用の特異性は、競合実験で非放射性の３０ｂｐを使用することにより示された。競合体としてのこの３０ｂｐのオリゴヌクレオチドの使用は、しかしながら未知のプロテインＢおよびＣのより強い結合をもたらした。これは、これらのタンパク質がオーバーラップする結合モチーフを有することおよびＡＰ２の結合がこの部位について競合することを示すかもしれない。潜在的な候補のタンパク質はＳＲＥＢ、ＮＲＳＦ、Ｍｙｆ５若しくはｃ−ＥＴＳである（図５）。
５−ＨＴ7プロモーター活性におけるバルビツレートの役割
ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒによれば、推定のＢＡＲＢＩＥ（バルビツレート誘導可能エレメント（Ｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ））が５−ＨＴ7受容体のプロモーター領域に存在する。５−ＨＴ7プロモーター活性に対するバルビツレートの可能な影響を検討するため、われわれはＨＥＫ２９３Ｔ細胞を多様なプロモーター構築物で一過性にトランスフェクトし、そしてトランスフェクトした細胞をバルビツレートで２４時間処理した（図６ａ）。該結果は、２４時間のバルビツレート処理（１、５ｍＭ）が一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてプロモーター活性を抑制したことを示す。該低下は、使用したプロモーター構築物およびバルビツレートの型に依存して３０から５０％変動した。アモバルビタールはいくぶんより強力であるように思われ、そして該影響は２０００プロモーターフラグメントにおいてより顕著であった。バルビツレートはＣＭＶプロモーター活性に影響しなかったため、これらの結果は、観察された影響が５−ＨＴ7プロモーター特異的であることを示す。
【００７３】
われわれは次に時間経過実験を実施し（図６ｂ）、これは、抑制効果が６時間後に既に存在しておりかつ１６時間後に最大に達したことを示した。５２時間後にプロモーター活性が再度増大した。
５−ＨＴ7プロモーター調節に対するＥｇｒ−１およびＳｐ１の役割
ＮＳ２０Ｙ細胞における５−ＨＴ７プロモーター構築物と一緒のＣＭＶ−Ｓｐ１若しくはＣＭＶ−Ｅｇｒ１の一過性トランスフェクションは、５−ＨＴ７プロモーター活性に対する双方の転写因子（Ｅｇｒ１およびＳｐ１）の正の効果を示した（それぞれ図９Ａおよび９Ｂ）。加えて、双方の転写因子のドミナントネガティブな構築物（ＣＭＶ−Ｓｐ１−ＢＤおよびＺｎ−Ｅｇｒ１）は５−ＨＴ７プロモーター活性に対する負の効果を示す。５−ＨＴ７遺伝子の調節における双方の転写因子の役割を示唆する。
【００７４】
Ｎ２Ａ細胞における５−ＨＴ７プロモーター構築物と一緒のＣＭＶ−Ｓｐ１およびＣＭＶ−Ｅｇｒ１のコトランスフェクション実験で、双方の転写因子の相互の役割が示唆された。該転写因子の一方を同一レベル（５００ｎｇ）に保ちかつ他方の転写レベルを増大させた場合に、５−ＨＴ７プロモーター活性に対する負の効果をみることができた（それぞれ図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【００７５】
転写活性についての５−ＨＴ７プロモーターへのＳｐ１による結合の意義を、ミトラマイシンＡ（ＤＮＡ中のＧＣボックスへのＳｐ１結合を妨害する化合物）を用いる実験で確認した。第一の実験において、５−ＨＴ７プロモーターのＦ１０００構築物で一過性にトランスフェクトしかつ増大する濃度のミトラマイシンＡで処理したＮＳ２０Ｙ細胞はプロモーター活性の用量依存性の喪失を示した（図１１Ａ）。類似の現象が１３２１−Ｎ１細胞で観察された。５−ＨＴ７受容体を内因性に発現するこのヒト細胞株を多様な濃度のミトラマイシンＡで２４時間処理することは５−ＨＴ７  ｍＲＮＡレベルの有意の減少をもたらした一方、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのレベルが影響されなかった（図１１Ｂ）。これらの結果は、Ｓｐ１が５−ＨＴ７プロモーター活性の「ｉｎ  ｖｉｖｏ」調節で重要な役割を演じていることを示唆する。
考察
われわれは、５’および３’隣接領域を包含するヒト５−ＨＴ7受容体の完全なゲノム構造を初めて報告した。１０７ｋＢの第一イントロンを包含する完全なゲノム配列をＥＢＶに基づくベクターにクローン化し、それはわれわれが真核生物細胞中で５−ＨＴ7受容体遺伝子を研究することを可能にすることができる。
【００７６】
５’ＲＡＣＥ実験により、われわれは、翻訳の開始点の３０７ｂｐ上流に位置する主転写開始部位を同定することが可能であった。この部位は以前に同定された部位と異なる。これは、ＣＡＡＴ要素の現実のＴＡＴＡボックスがこれまでプロモーター領域中で同定され得なかったという事実と相互に関連づけられ得る。
【００７７】
多様なソフトウェアプログラムを使用する５’隣接領域の配列分析は転写因子のいくつかのモチーフを示しかつ同定した。それらのなかで、５’隣接領域のＧＣリッチな特徴と相関するいくつかの推定のＳｐ１およびＡＰ２部位が存在する。
【００７８】
われわれは多様な長さのプロモーターフラグメントを単離しかつＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でそれらの転写活性を試験した。全フラグメントがプロモーター活性を明瞭に表し、また、われわれの結果はエンハンサーおよびリプレッサー双方のドメインの存在を示した。８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメントを構築物中に包含した場合に転写の明瞭な増強が観察された。その後、この８３ｂｐのフラグメントをゲルシフト実験で使用し、それは数種の相互作用するタンパク質の存在を示した。これまでのところ、われわれはＡＰ２をエンハンサー領域結合因子であると同定した。
【００７９】
ＡＰ２は、ヒトｍ３ムスカリン様アセチルコリン受容体（ＢｉｌｌｉｎｇｔｏｎとＰｅｎｎ、２００２）、α７ニューロンニコチン様アセチルコリン受容体（Ｇａｕｌｔら、１９９８）およびＤ（１Ａ）ドーパミン受容体（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９９）を包含する数種の他の神経伝達物質受容体遺伝子のプロモーター調節においてある役割を演じていることが報告されている。
【００８０】
ＡＰ２部位を包含する３０ｂｐのフラグメントを使用する競合実験は、他の転写因子がオーバーラップ配列について競合し得ることを示した。これらの因子、例えばＳＲＥＢＰ、ＮＲＳＦ、Ｍｙｆ５、ｃ−ＥＴＳは、５−ＨＴ7受容体のプロモーター中の３０ｂｐの配列中にそれらの認識配列を有する。
【００８１】
５−ＨＴ7受容体がｉｎ  ｖｉｖｏ（Ｌｅ  Ｃｏｒｒｅら、１９９７；Ｙａｕら、１９９７）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９７）でステロイドによりダウンレギュレートされることが既に示されており、そしてその結果これは情動障害である役割を演じているかもしれない。５’隣接領域中に存在する調節配列要素ＧＲＥＦ／ＰＲＥおよびＰＰＡＲ／ＲＸＲの同定は、プロモーター活性に対するステロイド例えばデキサメサゾン若しくは他の核受容体リガンドの影響を試験しかつ活性のこの差異が該モチーフの１種により引き起こされるとみられるかどうかを確認するためのツールを提供する。加えて、完全長のゲノムクローンとともに、デキサメサゾンのようなステロイドが５−ＨＴ7受容体のスプライシングパターンにどう影響し得るかを研究することが今や可能である。
【００８２】
抗うつ薬について、一般に、高用量でそれらが神経および筋双方の活動を抑制しかつ組織中での酸素消費を阻害することが既知であった。低用量でバルビツレートは鎮静剤として作用する。すなわちそれらは鎮静効果を有し；増大された用量は催眠若しくは睡眠誘導効果を有する。中枢神経系における該作用機序は未知である。５−ＨＴ7受容体プロモーターの配列分析は、驚くべきことにバルビツレート誘導可能エレメント（ＢＡＲＢＩＥ）の存在を示した。１．５ｍＭのバルビツレートを使用したわれわれの結果は、バルビツレートが５−ＨＴ7プロモーター活性に対する負の効果を有することを明瞭に示す。これは、睡眠調節における５−ＨＴ7受容体の潜在的役割を示唆し、また、５−ＨＴ7受容体に対する高親和性をもつ５−ＨＴ1Aアゴニスト、８−ＯＨ−ＤＰＡＴで処理したハムスターのサーカディアンリズムの移動を示したＥｈｌｅｎら、２００１による早期の知見を裏付ける。ＢＡＲＢＩＥエレメントの同定は今や、５−ＨＴ7受容体調節に対するバルビツレートの影響を検討するためのツール、ならびにバルビツレート誘導可能エレメントの活性に特異的に影響を及ぼす作用物質を同定するための手段を提供する。
【００８３】
ＳｍａｒＴｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）を使用して、われわれは３０００ｂｐのフラグメント内のＳ／ＭＡＲを同定した。ＭＡＲ（マトリックス結合領域（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎｓ））は、転写を可能にするための１要件である核マトリックスすなわち足場構造へのゲノムＤＮＡの結合の原因であると考えられている（Ｂｏｄｅら、１９９５）。ＭＡＲのいくつかの機能的特徴は、１）プロモーターおよびエンハンサーのような調節配列の核マトリックスへの固定、２）独立したクロマチンドメイン（遺伝子の協調発現に必要とされる全部のｃｉｓ調節配列を包含する）の境界の規定、３）プロモーターおよびエンハンサーの長期活性を確実にすること、４）機能的ドメインを位置の影響に対し非感受性とする遮蔽を包含する。従って、完全な５−ＨＴ7プロモーター調節がこの３０００ｂｐのフラグメント内に存することが期待されるはずである。
【００８４】
５−ＨＴ７プロモーター中のＧＣリッチな領域の同定は、不変のＴＡＴＡおよびＣＡＡＴボックスを欠く遺伝子が、ＴＡＴＡボックスの代わりに作用しうるＧＣリッチな領域を有するという早期の知見を確認する。これらの遺伝子のいくつかはＳｐ１により活性化されることが示されている。例はＥＧＦ受容体［Ｋａｇｅｙａｍａ、１９９８＃３８］およびエストロゲン受容体α［ｄｅＧｒａｆｆｅｎｒｉｅｄ、２００２＃３９］を包含する。Ｅｇｒ−１は認識されており、そしてそれらのＧ＋Ｃリッチな要素での遺伝子プロモーターの転写を阻害かつ刺激の双方をすると報告されている。Ｓｐ１は通常、活性化因子であるが、しかしＥｇｒ−１の存在下の場合は複雑な応答を生じる。Ｓｐ１とＥｇｒ−１との間の競合は、ＡＤＡ遺伝子プロモーターの結合および活性化についてＡｃｋｅｒｍａｎ［Ａｃｋｅｒｍａｎ、１９９３＃４０］により最初に報告された。それ以降、Ｅｇｒ−１とＳｐ１との間に複雑な関係が存在することをいくつかの報告が示している。Ｈｕａｎｇは、Ｅｇｒ−１発現がオーバーラップしていないＳｐ１＋Ｅｇｒ−１部位のＳｐ１活性化を増強するがしかし該部位がオーバーラップする場合には該結合部位についてＳｐ１と競合することによりＳｐ１活性を阻害することを示した［Ｈｕａｎｇ、１９９７＃４１］。
【００８５】
われわれの結果は５−ＨＴ7受容体遺伝子の調節における双方の転写因子の役割を明瞭に示す。従って、これらの転写因子の活性に影響するための戦略は、５−ＨＴ7受容体レベルを制御するためのツールを提供するかもしれない。
【００８６】
さらに、これを用い、われわれは、ＤＮＡ中のＧＣボックスへのＳｐ１結合を妨害する化合物、ミトラマイシンＡが５−ＨＴ7プロモーター活性を阻害することを見出した。
【００８７】
これまでのところ、ＳＢ２５８７１９、ＤＲ４００４およびＳＢ２６９９７０（Ｔｈｏｍａｓら、１９９８；Ｋｉｋｕｃｈｉら、１９９９；Ｈａｇａｎら、２０００）のようなわずか数種の選択的５−ＨＴ7受容体アンタゴニストが記述されているが、しかし選択的アゴニストは未だ利用可能でない。５−ＨＴ7プロモーター調節の解明は、われわれが新たな様式で５−ＨＴ7受容体形成を妨害することを可能にするであろうし、また、５−ＨＴ7受容体機能を妨害する薬物に対する新たなスクリーニング戦略につながるかもしれない。また、利用可能な完全なゲノムクローンをわれわれが有しているという事実は、われわれが５−ＨＴ7受容体の選択的スプライシングの原因である機構（１種若しくは複数）を同定することを可能にするであろう。これまでのところ、スプライスバリアント間の差違は報告されていないとは言え、根底にある機構を妨害する可能性は、今後の治療的介入にとって価値があるものとみられる。
【００８８】
【表１】
2005535300.tif 000002
【００８９】
【表２】
2005535300.tif 000003
【００９０】
【表３】
2005535300.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】ヒト５−ＨＴ7受容体（配列番号１）の予測される「最小プロモーター」領域を具体的に説明する。下線を付けた配列はありそうな転写因子結合部位を示す。太字の配列は転写開始部位（Ｉ）に隣接するＧＣリッチな領域を示す。
【図２】ヒト５−ＨＴ7受容体遺伝子の構造を示す地図である。エキソンは灰色の四角により、また、イントロンは実線により示す。短い水平の矢印はヒト５−ＨＴ7受容体のイントロ−エキソンの構成の部分を確認するのに使用した表（Ｉ）のプライマーを示す。短い垂直の矢印は翻訳開始コドンＡＴＧの下流のイントロン−エキソンの境界の位置を示す。
【図３】ＰＣＲ産物を生成させるのに使用した表（ＩＩ）のプロモーター配列プライマー対。ＰＣＲ産物はＺｅｒｏ  ＢｌｕｎｔクローニングベクターｐＣＲ  ２．１  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し；その後、クローン化したフラグメントは、それぞれ１０１４ｂｐのフラグメントについてＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化により、また、２０２７および３０１１ｂｐのフラグメントについてＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ消化により大きさを決め（ｓｉｚｅｄ）、そして最後に、同様に消化したｐＧＬ３−ｂａｓｉｃルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に再クローン化した。結果として生じるプラスミドをそれぞれ１０００ｌｕｃ、２０００ｌｕｃおよび３０００ｌｕｃと命名した。
【図４】１５０ｎｇの多様なプロモーター構築物での一過性トランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞中での相対的ルシフェラーゼ値を示すグラフである。ｌｕｃ＋構築物は８３ｂｐのエンハンサーフラグメント（配列番号２）を含有する。
【図５】翻訳開始コドンＡＴＧのすぐ上流のヒト５−ＨＴ7受容体プロモーター配列（配列番号５）のフラグメントである。下線を付けた配列は８３ｂｐのＮｃｏＩフラグメント（配列番号２）である。囲んだ配列は、水平の矢印により示されるところのＡＰ２結合モチーフを含んでなる３０ｂｐのオリゴヌクレオチド配列（配列番号４）である。転写因子ＮＲＳＦ、ＳＲＥＢ、Ｍｙｆ５およびｃ−ＥＴＳの潜在的結合モチーフもまた示す。
【図６Ａ】１５０ｎｇの２０００ｌｕｃ＋および１０００ｌｕｃ＋プロモーター構築物での一過性トランスフェクション後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞中での相対的ルシフェラーゼ値に対する１．５ｍＭのアモバルビタール若しくはフェノバルビタールの影響を示すグラフである。ＣＭＶｌｕｃを対照ベクターとして使用した。ルシフェラーゼ活性は、２４時間のトランスフェクション２４時間後に前記バルビツレートで処理した細胞中で測定した。
【図６Ｂ】１５０ｎｇベクターの２０００ｌｕｃ＋および１０００ｌｕｃ＋で一過性にトランスフェクトしかつ１．５時間から５２時間までの範囲にわたる誘導時間の間１．５ｍＭのフェノバルビタールで処理したＨＥＫ２９３Ｔ細胞での時間経過実験を示すグラフである。
【図７】多様な長さをもつ１５０ｎｇの５−ＨＴ７プロモーター構築物での一過性トランスフェクション後のＨＥＫ２９３ＴおよびＮＳ２０Ｙ細胞中での相対的ルシフェラーゼ値を示すグラフである。
【図８】プロモーター活性が最も増大したヒトおよびマウス５’ＵＴＲ領域（２７１ｂｐ〜６５３ｂｐ）のアライメントである。四角および楕円形の囲みはそれぞれＥｇｒ−１およびＳｐ１／ＭＡＺの推定の結合場所を示す。
【図９Ａ】ＧＣリッチな領域２３３ｌｕｃおよび多様な濃度の転写因子ＣＭＶ−Ｓｐ１でトランスフェクトしたＮＳ２０Ｙ細胞中での相対的ルシフェラーゼ値を示すグラフである（灰色の棒）。Ｓｐ１結合ドメイン（Ｓｐ１−ＢＤ）よりなる多様な濃度のドミナントネガティブな構築物は５−ＨＴ７プロモーター活性に対し負の効果を示す（黒色の棒）。
【図９Ｂ】ＧＣリッチな領域２３３ｌｕｃおよび多様な濃度の転写因子ＣＭＶ−Ｅｇｒ−１でトランスフェクトしたＮＳ２０Ｙ細胞中での相対的ルシフェラーゼ値を示すグラフである（灰色の棒）。Ｚｎ−Ｅｇｒ−１（Ｚｎ−Ｅｇｒ−１はＥｇｒ１のＺｎフィンガードメインよりなる）よりなる多様な濃度のドミナントネガティブな構築物は５−ＨＴ７プロモーター活性に対し負の効果を示す（黒色の棒）。
【図１０Ａ】Ｆ１０００  ｌｕｃ構築物ならびに多様な濃度の転写因子Ｓｐ１および／若しくはＥｇｒ−１でトランスフェクトしたＮＳ２０Ｙ細胞中での相対的ルシフェラーゼ値を示すグラフである。Ｓｐ１を５００ｎｇで一定に保つ場合、増大する濃度のＥｇｒ−１はプロモーター活性に対し負の効果を有する（白色の棒）。
【図１０Ｂ】Ｆ１０００  ｌｕｃ構築物ならびに多様な濃度の転写因子Ｓｐ１および／若しくはＥｇｒ−１でトランスフェクトしたＮＳ２０Ｙ細胞中での相対的ルシフェラーゼ値を示すグラフである。Ｅｇｒ−１を５００ｎｇで一定に保つ場合、増大する濃度のＳｐ１はプロモーター活性に対し負の効果を有する（白色の棒）。
【図１１Ａ】Ｆ１０００  ｌｕｃ構築物でトランスフェクトしかつ多様な濃度のミトラマイシンＡで２４時間処理したＮＳ２０Ｙ細胞中での相対的ルシフェラーゼ値を示すグラフである。
【図１１Ｂ】ヒト星状細胞腫細胞株１３２１−Ｎ１の内因性の５−ＨＴ７  ｍＲＮＡレベルに対するミトラマイシンＡ（レーン（１）−、レーン（２）１０ｎＭ、レーン（３）１００ｎＭ、レーン（４）５００ｎＭ、レーン（５）１μＭ、レーン（６）２μＭ、レーン（７）５μＭ）の影響を示す。
【配列表】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【国際調査報告】
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