(57)【要約】本発明は、ＰＲＲＳＶの細胞進入に関与するポリペプチドをコードする新規ポリヌクレンチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記ポリペプチドを発現し得る細胞、前記ポリペプチドの産生方法、細胞培養物、並びにＰＲＲＳウイルスの新規生成方法に関する。本発明は更に、前記ポリペプチドのＰＲＲＳＶ受容体機能に影響を及ぼす化合物の同定方法並びに薬剤の製造における前記ポリペプチド及び同定した化合物の使用に関する。本発明者らは、細胞へのウイルス進入において決定的な役割を果たすと考えられるタンパク質をＰＡＭ膜から単離することに成功した。前記タンパク質をコードする解明ヌクレオチド配列及び前記タンパク質のアミノ酸配列を配列データーベースに記憶されている配列と比較した。驚くことに、本発明が提供する推定ＰＲＲＳＶ受容体はシグレックファミリーに属する特定タンパク質とかなり相同であることが判明した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタポリペプチドまたは前記ポリペプチドの少なくとも５０アミノ酸を有する前記ポリペプチドの機能断片をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドは、細胞表面で発現させたときにその細胞をＰＲＲＳＶに対して受容性とし得、約２１０ｋＤの見かけ分子量を有し、且つＭＡｂ  ４１Ｄ３と反応性であるという特徴を有する、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２に記載されているアミノ酸配列と全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするかまたは少なくとも５０アミノ酸を有する前記ポリペプチドの機能断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２に記載されているアミノ酸配列と全長にわたって１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む請求の範囲第１項または第２項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチドが配列番号１に記載されている核酸配列と全長にわたって少なくとも９０％の同一性を有する請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが配列番号１に記載されている核酸配列と全長にわたって１００％の同一性を有する請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１に記載の核酸配列を含む請求の範囲第１項から第５項のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項８】
請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを発現調節配列に作動的に連結して含む請求の範囲第７項に記載の組換えベクター。
【請求項９】
請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組換えウイルス。
【請求項１０】
細胞が発現組換えポリペプチドをコードする請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、組換えポリペプチドを発現し得る細胞。
【請求項１１】
請求の範囲第１０項に記載の細胞または請求の範囲第９項に記載の組換えウイルスを感染させた細胞を培養するステップ、及び細胞培養物からポリペプチド含有材料を単離するステップを含む請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの産生方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１０項に記載の細胞を多数含む細胞培養物。
【請求項１３】
ＰＲＲＳウイルスを感染させた請求の範囲第１２項に記載の細胞培養物。
【請求項１４】
請求の範囲第１２項に記載の細胞培養物にＰＲＲＳＶを感染させるステップ、前記細胞を培養するステップ、細胞培養物からウイルスを収集するステップを含むＰＲＲＳＶの作成方法。
【請求項１５】
候補化合物のポリペプチドへの結合またはポリペプチドを有する細胞または膜への結合を測定することによりポリペプチドのＰＲＲＳＶ受容体機能に影響を及ぼす化合物の同定方法。
【請求項１６】
ポリペプチドのＰＲＲＳＶ受容体機能に影響を及ぼし得る化合物のブタのＰＲＲＳＶ感染の治療薬または予防薬の製造における使用。
【請求項１７】
請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるブタポリペプチドのブタのＰＲＲＳＶ感染の治療薬または予防薬の製造における使用。
【請求項１８】
ポリペプチドのＰＲＲＳＶ受容体機能に影響を及ぼし得る化合物のブタ免疫系を調節するための使用。
【請求項１９】
請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、好ましくは可溶化形態のポリペプチドのブタ免疫系を調節するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）の細胞進入に関与するポリペプチドをコードする新規ポリヌクレンチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記ポリペプチドを発現し得る細胞、前記ポリペプチドの産生方法、細胞培養物、並びにＰＲＲＳウイルスの新規生成方法に関する。本発明は更に、ポリペプチドのＰＲＲＳＶ受容体機能に影響を及ぼす化合物の同定方法並びに薬剤の製造における前記ポリペプチド及び同定した化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ繁殖呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は１９８７年に初めて米国で妊娠雌豚の生殖不全及び新生仔ブタの呼吸不全を引き起こすブタの新しい病気として認識された。この病気はその後ヨーロッパ及びカナダでも発見された。原因物質が同定されるまで、この病気はミステリーブタ病、ブタ不妊症／呼吸器症候群、青色耳ブタ病、流産ブロー(abortus blauw)等のいろいろな名前で呼ばれていた。
【０００３】
外被一本鎖ＲＮＡウイルスのＰＲＲＳウイルスが上記した病気の原因である。ＰＲＲＳＶはマウスのラクテートデヒドロゲナーゼ強化ウイルス（ＬＤＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）及びサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）を含めたアルテリウイルス科の１つである。
【０００４】
ＰＲＲＳＶにより感染される主要な細胞型はマクロファージである。このウイルスはまずブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）中で単離されたが、単球及びミクログリア細胞における複製も報告されている。ＰＲＲＳＶはインビトロでもインビボでも単球／マクロファージ細胞に対して限られた向性を有する。
【０００５】
現在、ＰＲＲＳＶは少数の樹立細胞株でしか複製されない。インビトロでのウイルス複製はサル腎臓細胞株ＭＡ−１０４やその許容クローンＭＡＲＣ−１４５のような樹立細胞株において示されている（Ｋｉｍら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｏｌ．，１３３：４７７−７８３（１９９３））。
【０００６】
ＭＡ−１０４由来クローン化細胞株の９００Ｂ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １１３０２と呼ばれる）でのＰＲＲＳＶの増殖方法は米国特許第５，５１０，２５８号明細書に記載されている。幾つかの他の細胞株におけるＰＲＲＳＶ複製の失敗も報告されている。
【０００７】
各種細胞株におけるＰＲＲＳＶ複製を制限するメカニズムが研究されている。ＰＲＲＳＶが試験した多くの細胞型に結合できなかったことが判明した。細胞にＰＲＲＳＶが結合しないことがＰＲＲＳＶ細胞向性を決定する因子の１つであると示唆された。特定細胞成分が存在しないことがウイルス進入にとって決定的であり、ウイルス進入は受容体媒介エンドサイトーシスにより生じたと仮定された（Ｋｒｅｕｔｚ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：１２１−１２８（１９９８））。
【０００８】
他の外被ウイルスについての受容体媒介エンドサイトーシスは公知である。幾つかのウイルスの受容体は公知である。例えば、トリ肉腫−白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）の各種サブグループの受容体が同定、クローン化されている（Ｂａｌｌｉｅｔら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７３（４）：３０５４−３０６１（１９９９））。マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）の細胞受容体も同定、クローン化されている。ＭＨＶ受容体のｃＤＮＡがサブクローン化されているベクターを通常ＭＨＶ感染に対して耐性の細胞においてＭＨＶ受容体を発現させるために使用した（ハムスター線維芽細胞のＢＨＫ系及びヒト横紋筋肉腫細胞のＲＤ系）。これは前記細胞にＭＨＶを感染させるのに十分であった（Ｄｖｅｋｓｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６５（１２）：６８８１−６８９１（１９９１））。
【０００９】
ＰＲＲＳＶ受容体を同定するための幾つかの努力も報告されている。ＰＲＲＳＶに対するマクロファージの感受性を決定し得るＰＡＭ受容体を同定する試みの中で、ＰＡＭのＰＲＲＳＶ感染を防御する２つのモノクローナル抗体（Ｍａｂ）４１Ｄ３及び４１Ｄ５を作成した（Ｄｕａｎら，「コロナウイルス及びアルテリウイルス(Coronaviruses and Arteriviruses)」，Ｅｎｊｕａｎｅｓら編，ｐ．８１−８７，ニューヨークに所在のＰｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）発行）。
【００１０】
ＰＡＭの表面にウイルスを付着させるために使用する分子を上記Ｍａｂを用いて同定しようと試みた。タンパク質ビオチニル化キットを用いて、すべての膜タンパク質を標識し、ビオチニル化細胞ライゼート由来のタンパク質をＭａｂを用いて免疫沈降させた。こうして、免疫沈降後約２１０ｋＤａの分子量を有するビオチン標識タンパク質が可視化され得た（Ｄｕａｎら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，４５２０−４５２３（１９９８））。
【００１１】
しかしながら、ＰＲＲＳＶの可能性ある受容体の特性決定は報告されておらず、細胞向性におけるその実際の役割は解明されていない。
【００１２】
上記したように、ＰＲＲＳＶは現在限定数の細胞株でしか培養され得ない。
【００１３】
ワクチンの目的で、ＰＲＲＳＶを培養するために現在利用されている少数の細胞株以外の他の細胞でウイルスを培養できれば好都合であろう。他の細胞株に対するＰＲＲＳＶワクチンの作成方法を変化させることによってのみ、ＰＲＲＳＶワクチンの品質、量及びコストを改善できる。よって、ウイルスのより効率的な培養方法が求められている。
【００１４】
実際ＰＲＲＳＶ受容体がウイルスのユニークな細胞特異性に関係するならば、通常ウイルスに対して非許容性の細胞において前記受容体を発現させるとより効率的なウイルスの培養方法が得られるであろう。
【００１５】
本発明者らは、ウイルスの細胞への進入において決定的な役割を果たすと思われるＰＡＭ膜からタンパク質を単離することに成功した。本発明者らは初めて分析するのに十分なくらい大量の純粋なタンパク質を同定、単離することに成功した。そのタンパク質を同定、単離する独自の方法により、本発明者らは該タンパク質の性質を測定し、該タンパク質のアミノ酸配列及び対応の遺伝子配列を解明した。該タンパク質をコードする解明したヌクレオチド配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を配列データーベースに記憶されている配列と比較した。
【００１６】
驚くことに、本発明が提供する推定ＰＲＲＳＶ受容体はシグレック（Ｓｉｇｌｅｃ）ファミリーに属する特定タンパク質と非常に相同であった。シグレックファミリーはシアル酸結合免疫グロブリン（Ｉｇ）様レクチンのファミリーである。
【００１７】
同定したポリペプチドは、Ｃｒｏｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３（１９），４４９０−４５０３（１９９４）に記載されている１８５ｋＤａマウスシアロアドヘシンタンパク質及びその対応遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託コード：Ｚ３６２９３，ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ注釈タンパク質レコード：Ｑ６２２３０）に対してそれぞれアミノ酸レベルで６９％の同一性、核酸レベルで７５％の同一性を示した。更に、前記ポリペプチドは、Ａ．Ｈａｒｔｎｅｌｌら，Ｂｌｏｏｄ，９７（１）：２８８−２９６（２００１）に記載されている２００ｋＤａヒトシアロアドヘシンタンパク質及びその遺伝子配列に対してそれぞれアミノ酸レベルで７８％の同一性、核酸レベルで８２％の同一性を示した
配列をＢＬＡＳＴプログラム（ＢＬＡＳＴＦ  ２．１．２［２０００年１０月１９日］）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒｓ及びＤａｖｉｓ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ，「ギャップ付ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新しいタイプのタンパク質データーベース検索プログラム(Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs)」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））を用いてデーターベース中の配列と比較した。このプログラムを用いて配列アラインメントを検索した。
【００１８】
マウス及びヒトシアロアドヘシンはアミノ酸レベルで約７２％、核酸レベルで約７７％の同一性を示し、両方の種で１７Ｉｇドメインを含む細胞外領域において最大の同一性を示した。ヒトシアロアドヘシン及びマウスシアロアドヘシンの発現パターンは類似している。単球及び他の末梢血リンパ球からは発現しないが、脾臓、リンパ節、骨髄、肝臓、結腸及び肺中の組織マクロファージにより強く発現する。
【００１９】
ヒトシアロアドヘシン（Ｓｎ）は、骨髄でのマクロファージ−造血細胞相互作用及び多分他の細胞−細胞相互作用に関与するであろうマクロファージ−制限細胞相互作用分子である。ヒトＳｎは細胞相互作用分子のシグレック（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）ファミリーのプロトタイプメンバーであり、シグレック−１と呼ばれていた。Ｓｎの他に、シグレックファミリーのメンバーにはＢ細胞上のＣＤ２２（シグレック−２）、未熟骨髄細胞及び単球上のＣＤ３３（シグレック−３）、シュワン細胞及び希突起グリア細胞上のミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）（シグレック−４Ａ）、並びに各種造血サブセット上で発現するシグレック−５、−６、−７、−８及び−９が含まれる。Ｓｎの生物学的機能の理解は不十分である。
【００２０】
上記したマウス−及びヒトシアロアドヘシンとの同一性％に基づいて、ブタ肺胞マクロファージ上のＰＲＲＳＶに対する受容体として働く同定ポリペプチドはブタシアロアドヘシン（Ｓｎ）であり得る。
【発明の開示】
【００２１】
１態様で、本発明はブタポリペプチドまたは前記ポリペプチドの機能断片をコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。前記ポリペプチドは以下の特徴：
細胞の表面で発現させたとき前記ポリペプチドはその細胞をＰＲＲＳＶに対して受容性とし得る；
前記ポリペプチドは約２１０ｋＤａの見かけ分子量を有する；及び
前記ポリペプチドはＭａｂ  ４１Ｄ３と反応性である；
を有する。
【００２２】
このＭａｂを産生するハイブリドーマ４１Ｄ３はフランス国パリに所在のパスツール研究所のＣＮＣＭに受託番号１−２７１９で寄託されている。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、ＰＲＲＳＶの細胞への進入において決定的な役割を果たすポリペプチドをコードする。ポリペプチドはウイルスの細胞への進入を媒介するので、このポリペプチドはブタ肺胞マクロファージ由来のＰＲＲＳＶ受容体であると推定される。よって、本発明によればＰＲＲＳＶの細胞への進入を促進する性質を有する免疫グロブリン様分子のスーパーファミリーの１員であるＳｎ様タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００２４】
Ｍａｂ  ４１Ｄ３は特異的に同定したポリペプチドを認識し、ＰＲＲＳＶの細胞への進入を阻止する。ブタ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ブタ腹腔マクロファージ（ＰＰＭ）、ＳＴ（ブタ精巣）、ＳＫ（ブタ腎臓）、ＰＫ−１５及びＭＡＲＣ−１４５細胞ではＭａｂ  ４１Ｄ３での膜免疫蛍光染色が観察されなかった。これらの細胞の中で、幾つかのＰＢＭＣ及びＰＰＭで弱い細胞内染色が観察された。
【００２５】
同定されたポリペプチドは約２１０ｋＤａの見かけ分子量を有する。分子量は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて測定した。「約」は、分子量が２００ｋＤ（ゲル中の最も近いマーカー）を越えており、２０５〜２２５ｋＤの範囲にあると解釈されるべきである。
【００２６】
本発明者らが解明したポリヌクレオチドの配列を配列番号１に示す。このポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの配列を配列番号２に示す。本明細書に記載されている配列情報は、ブタ集団におけるヌクレオチド配列の誤って同定された塩基または天然変異を排除しなければならないほど狭く解釈すべきではない。
【００２７】
ポリペプチドの機能断片をコードする核酸配列を有する断片も本発明の一部をなす。このポリペプチドの機能断片は、該ポリペプチドがＰＲＲＳＶの受容体として機能し得るには必須であり、例えば単独でまたは異種配列に融合したときにこの機能を満たし得るポリペプチドの一部を少なくとも構成する断片である。この機能断片をコードするポリヌクレオチドはそれ自体機能的であるポリペプチドをコードし得、または前記断片はキメラタンパク質を得るために他のポリペプチドに連結させたときに機能的であり得る。
【００２８】
例えば、ポリペプチドの機能断片をコードするポリヌクレオチドは膜貫通領域及び／またはシグナル配列をコードするポリヌクレオチドに融合させてもよい。前記したキメラタンパク質を作成することにより、機能部位はより豊富な細胞表面タンパク質に転移されてＰＲＲＳＶに対して高感受性を有する細胞が作成され得る。或いは、ＰＲＲＳＶに対する細胞の感受性を向上させるために、１つの分子上に複数の機能ドメインを作成してもよく、または貫膜領域と機能ＰＲＲＳＶ結合部位の間に最適長さを有するスペーサーを配置してもよい。
【００２９】
完全ポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１００アミノ酸または少なくとも２００アミノ酸長を有する断片をコードする。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドには、同定されたポリペプチドの変異体をコードするポリヌクレオチドも含まれる。同定されたポリペプチドの変異体とは、機能的特徴を依然として維持しながら、すなわちＰＲＲＳＶの細胞へのウイルス進入における役割を維持しながら、ＰＰＲＳＶ受容体活性を有し且つ同定されたアミノ酸配列の変異を含むポリペプチドを指す。よって、前記変異体は同定されたアミノ酸配列を有するポリペプチドと機能的に均等である。前記ポリペプチドは必ずしも本明細書に開示されている完全長アミノ酸配列を含んでいる必要はない。
【００３１】
アミノ酸配列で見られ得る変異は、全配列中のアミノ酸の違いにより、前記配列中のアミノ酸の欠失、置換、挿入、倒置または付加により示され得る。生物学的及び免疫学的活性を本質的に変化さないと予測されるアミノ酸置換は公知である。関連アミノ酸間の置換または進化の過程でしばしば起こっている置換は特にＳｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｍ．Ｄ．Ｄａｙｈｏｆ，「タンパク質配列及び構造のアトラス(Atlas of protein sequence and structure)」，第５巻，別冊３，ワシントン・ディー・シーに所在のＮａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．（１９７８年）発行参照）。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは迅速で感度の良いタンパク質比較方法を開発し（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１４３５−１４４１（１９８５））、相同ポリペプチド間の機能的類似性を決定する方法を開発した。前記変異体をコードするポリヌクレオチドも本発明の一部をなすことは自明である。
【００３２】
本発明で定義されるポリヌクレオチドには、同定された核酸配列とは異なる核酸配列を有したり多形部位を有するポリヌクレオチドも含まれる。“変異体”に関連して、ポリヌクレオチドは同定された核酸配列とは異なるが同定されたポリペプチドと同一のＰＲＲＳＶ受容体活性を有するポリペプチドをコードするものを意味する。
【００３３】
変異体は天然変異体でも非天然変異体でもよい。非天然変異体は突然変異により誘導され得る。天然変異体はアレリック変異体であってもよい。アレリック変異体は生物の染色体上の座を占める遺伝子の幾つかの別の形態の１つである。場合により、遺伝子はスプライシング変異体として特定組織中で発現され、５’または３’ｍＲＮＡが改変されたり１つ以上のエキソン配列が挿入または除去される。前記配列及びこの配列によりコードされるタンパク質はすべて同一または類似の機能を発揮すると予想され、本発明の一部をなす。
【００３４】
単離ｃＤＮＡ配列は対応ｍＲＮＡからの不完全転写のために完全でないこともあり、またクローンが完全ｃＤＮＡの断片を含んで得られることもある。ｃＤＮＡ配列を完成するための各種方法、例えばＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）が当業界で公知である。
【００３５】
同定された核酸配列の変異体である核酸配列を有するポリヌクレオチドは、ａ）当該ポリヌクレオチドを高度に発現するブタ細胞（好ましくは、ＰＡＭ）から単離される（ゲノム）ＤＮＡまたはｃＤＮＡである核酸に対してストリンジェントな条件で配列番号１に示す同定配列の全部または一部を含むＤＮＡをハイブリダイズするステップ及びｂ）核酸を当業界で公知の方法により単離するステップを含む方法により単離され得る。
【００３６】
ハイブリダイゼーション条件は好ましくは高ストリンジェントである。本発明によれば、“ストリンジェント”は６５℃の温度での１×ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳの洗浄条件を意味し、高ストリンジェント条件は０．３×ＳＳＣ、より好ましくは０．１×ＳＳＣへのＳＳＣの低下を指す。好ましくは、最初の２つの洗浄はそれぞれ１５〜３０分間ずつ続けて２回実施する。高ストリンジェント条件で洗浄する必要がある場合には、０．１×ＳＳＣでの追加洗浄を１５分間１回実施する。ハイブリダイゼーションは、例えば６５℃において０．５Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）／７％  ＳＤＳ中で一晩実施し得る。前記ハイブリダイゼーションは分子クローニングに関する一般書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: a laboratory manual)」，第３版，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年）発行に記載されている。
【００３７】
或いは、単離方法は本発明が提供する核酸配列から誘導されるプライマー及び／またはプローブを用いる核酸増幅方法を含む。前記プライマー及び／またはプローブは少なくとも１５ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、好ましくは約２５〜５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
同定した核酸配列の変異を表す核酸配列を有するポリヌクレオチドが同定した配列に機能的に関連するポリペプチドをコードするかを調べるためには実施例に例示されている方法が使用され得る。実施例６には、配列を細胞において発現させ得る方法及びその後トランスフェクトした細胞をＰＲＲＳＶ感染に対する感受性について調べる方法が開示されている。
【００３９】
更なる態様で、本発明は配列番号２に記載されているアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。配列番号２に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号２に対して少なくとも９７％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがより好ましい。少なくとも９８％または９９％の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが更に好ましい。配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。遺伝コードの縮重のために、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは別の特定コドンを用い得る。上記したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドすべてが本発明の一部と見做される。
【００４０】
本発明の特に好ましいポリヌクレオチドは配列番号１の全核酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する単離ポリヌクレオチドである。より好ましいポリヌクレオチドは配列番号１の全核酸配列に対して少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも９７％、特に好ましくは９８％または９９％の同一性を有する単離ポリヌクレオチドである。前記ポリヌクレオチドには、配列番号１に記載されている核酸配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。配列番号２に記載されている配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは配列番号１に記載されている核酸配列を含み得る。本発明の更に好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチドは配列番号１に記載されている核酸配列から構成される。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡでもＲＮＡでもよく、好ましくはＤＮＡである。本発明のＤＮＡはｃＤＮＡから得ることができる。或いは、コード配列はゲノムＤＮＡであっても、ＤＮＡ合成方法を用いて作成してもよい。ポリヌクレオチドがＤＮＡの場合、そのポリヌクレオチドは１本鎖でも２本鎖のいずれでもよい。１本鎖はコード鎖または非コード（アンチセンス）鎖でもよい。ポリヌクレオチドの定義には修飾ＲＮＡまたはＤＮＡが含まれる。核酸の塩基が修飾され得、イノシンのような塩基を挿入し得る。他の修飾の例には骨格の修飾が含まれ得る。
【００４２】
“単離される”とは、ポリヌクレオチドが天然状態から単離されること、すなわち天然環境から変化及び／または移動させたことを意味する。この分子は分離され、その分子が元々存在している丸ごとの生物とは区別される。
【００４３】
“同一性％”はアラインさせた配列の比較に基づく２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の関係を定義する。
【００４４】
同一性は公知の方法により計算され得る。本明細書に記載されている同一性％はＧＣＣ（ウィスコンシン州マジソンに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）が操作するＧＡＰプログラムを用いて計算され得る値である。
【００４５】
ポリペプチド配列比較のパラメーターには、アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０））が含まれる。アミノ酸アルゴリズムの比較マトリックスとして、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２））を下記パラメーターを用いて使用する：
ギャップペナルティー：８、
ギャップ長ペナルティー：２、
エンドキャツプに対するペナルティーなし。
【００４６】
使用したヌクレオチド比較のパラメーター：
アルゴリズム：上掲のＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｃｈ、
比較マトリックスマッチ：マッチ＝＋１０，ミスマッチ＝０、
ギャップペナルティー：５０、
ギャップ長ペナルティー：３。
【００４７】
本発明のＤＮＡは十分量の実質的に純粋な形態のコード化ポリペプチドをインビボ及びインビトロで発現するために非常に有用である。本発明のポリヌクレオチドをコード化ポリペプチドを発現するために使用するとき、ポリヌクレオチドはポリペプチドまたはその機能断片のためのコード配列に加えて他のコード配列、例えばリーダー配列または融合部分（例えば、マーカー配列等）を含み得る。
【００４８】
広範囲の宿主細胞及びクローニングベクターの組合せが本発明の核酸配列をクローニングするときに使用され得る。本発明のポリヌクレオチドは適当な発現系、例えば細菌発現系（例えば、大腸菌ＤＨ５α）、ウイルス発現系（例えば、バキュロウイルス）、酵母系（例えば、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ））または真核細胞（例えば、Ｃｏｓ、ＢＨＫ，ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＨｅＬａ、ＰＫ１５細胞）にクローン化され得る。すべての系でポリヌクレオチドはまず好適な構成的または誘導性プロモーターのコントロール下で適当なベクターにクローン化される。
【００４９】
別の態様で、本発明は本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。好適なベクターは、例えばコスミド、細菌または酵母プラスミド、野生宿主プラスミド、並びにプラスミド及びファージまたは各種ＤＮＡの組合せに由来するベクターである。染色体ＤＮＡ由来のベクターも含まれる。更に、複製起源及び／または優性選択マーカーも本発明のベクター中に存在し得る。本発明のベクターは宿主細胞を形質転換させるために適している。好適なクローニングベクターの例はプラスミドベクター、例えばｐＢＲ３２２、各種ｐＵＣ、ｐＥＭＢＬ及びブルースクリプトプラスミドである。
【００５０】
ポリペプチドまたはその機能断片を発現させる際に使用するとき、本発明の組換えベクターは更にタンパク質をコードする核酸配列に作動的に連結して発現調節配列を含んでいてもよい。作動的に連結とは、ポリヌクレオチドを発現させるときに通常通り実施するように調節配列が配置されている状態を指す。前記した発現調節配列は通常、転写及び翻訳を調節及び／または発現レベルを向上させるプロモーター配列を１つ以上含む。所望のポリヌクレオチドが転写及び翻訳され得る限り必ずしも調節配列を組換えベクター中に存在させる必要はない。勿論、発現調節配列及び他の配列は選択した宿主細胞に応じて変更させ得、または誘導可能とされ得る。発現調節配列は当業界で公知であり、遺伝子を転写し得る真核、原核またはウイルスプロモーターまたはポリＡ信号でもあり得る。有用なプロモーターの例はＳＶ−４０プロモーター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：５２４−５２７（１９８３））、メタロチオネインプロモーター（Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９−４２（１９８２））、熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，８２：４９４９−４９５３（１９８５））、ＰＲＶ  ｇＸプロモーター（Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ及びＲａｕｈ，Ｊ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３０：５５−６６（１９９０））、ヒトＣＭＶ  ＩＥプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号明細書）、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら，ＰＮＡＳ，７９：６７７７−６７８１（１９８２））またはヒト延長因子１αまたはユビキチンプロモーター等である。
【００５１】
ポリヌクレオチドを適当なベクターにクローン化した後、構築物を細胞、細菌または酵母に適当な方法（例えば、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２トランスフェクションまたはリポフェクチン）を用いて転移させ得る。バキュロウイルス系を使用するとき、ポリヌクレオチドを含有する転移ベクターは完全バキュロゲノムと共にトランスフェクトされ得る。
【００５２】
本発明のポリヌクレオチドを含む組換えウイルスも本発明の一部をなす。
【００５３】
上記した技術はすべて当業界で公知であり、分子生物物質の製造業者（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ及び／またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が提供しているプロトコル及び一般書または参考文献（例えば、Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｄｔ編，「ベクター：分子クローニングベクター及びその使用の研究(Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses)」，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ（１９８８年）発行；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｂｅｌ編，「分子生物学における現在のプロトコル(Current protocols in Molecular Biology)」，ニューヨーク州のＷｉｌｅｙ（１９９５年）発行；Ｓａｍｂｒｏｏｋら編，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: a laboratory manual)」，第３版，ＣＳＨＬ  ｐｒｅｓｓ（２００１年）発行；及びＧｌｏｖｅｒ及びＨａｍｅｓ編，「ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)」，第１〜４巻，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）発行）に詳しく記載されている。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換させた細胞も本発明の一部をなす。すなわち、１つの態様で、本発明は、発現させた組換えポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換えポリペプチドを発現し得る細胞を提供する。本明細書中、“組換え体”は元々細胞において発現されないポリペプチドを指す。宿主細胞がブタ起源の場合、ポリヌクレオチド配列は細胞のゲノム材料中に存在し得るが、特定型のブタ細胞において発現しない。よって、本発明のＤＮＡまたは発現ベクターを含む宿主細胞も本発明の範囲内である。工学処理した宿主細胞は一般的な栄養培地において培養され得るが、前記培地を例えば適切な選択、増幅または転写の誘導のために改変してもよい。温度、ｐＨ、栄養素等の培養条件は当業者に公知である。
【００５５】
本発明のベクターを用いて形質転換される細胞はブタまたは非ブタ起源のものであり得る。ブタ起源の細胞はＰＫ  １５細胞、ＳＫ細胞またはＳＴ細胞であり得る。本発明のポリペプチドを発現するために形質転換され得る非ブタ起源の細胞の例は、ＭＤＣＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＢＫ細胞、昆虫細胞、ＨｅＬａ細胞またはＣＯＳ細胞である。
【００５６】
本発明の形質転換細胞は、ゲノム材料に安定的に組み込まれた形態でまたは自律複製ベクターの一部として本発明のポリヌクレオチドを含み得る。
【００５７】
本発明の細胞を多数含む細胞培養物も本発明の一部をなす。好ましい実施態様では、細胞培養物にＰＲＲＳＶを感染させる。ＰＲＲＳＶは野生型ウイルスまたは弱毒化ウイルスであってもよい。後者はワクチンを調製するために特に適している。ポリペプチドを発現させるため本発明の細胞が使用され得、ポリペプチドは細胞培養物から単離され得る。
【００５８】
別の態様で、本発明は、細胞の表面で発現させたとき細胞をＰＰＲＳＶに対して受容性とし得、約２１０ｋＤａの見かけ分子量を有し、ＭＡＢ  ４１Ｄ３と反応性であるポリペプチドの産生方法を提供し、その方法は本発明の細胞を培養するステップ及び細胞培養物からポリペプチド含有物質を単離するステップを含む。
【００５９】
本発明の好ましい細胞はその表面上にポリペプチドが存在する細胞である。ポリペプチドは細胞におけるＰＲＲＳＶの進入において役割を果たすので、その表面上で本発明のポリペプチドを発現し得る細胞はＰＲＲＳウイルスに接近し得るようになる。よって、本発明により、通常ＰＲＲＳＶに対して非受容性である細胞にＰＲＲＳＶを感染させることができる。このようにして、ＰＲＲＳＶの培養に関する新規ルートが提供される。
【００６０】
従って、本発明は、本発明の細胞を含む細胞培養物にＰＲＲＳＶを感染させ、培養し、その後ウイルスを前記細胞培養物から収集し得るＰＲＲＳＶの作成方法を提供する。一方、細胞向性が限られているのでウイルスは非常に特定の細胞でしか培養できなかったが、本発明によれば新規なウイルス培養ルートが利用可能となる。本発明では、動物化合物を含まない培地で培養することができる細胞においてＰＰＲＳＶを培養することができ、培養ウイルスを多く含む産物（例えば、ワクチン）の性質を向性させる特徴を得ることができる。懸濁状態で増殖し得る細胞はＰＲＴＳＶに対してより感受性となり得、発酵装置における産生方法がより最適となり得る。細胞はウイルスに対してより受容性となり得、より高いＰＲＲＳＶ産生力価のために選択され得る。ウイルスが高力価に増殖したら、所期用途に従って当業界で公知の手段を用いて処理され得る。例えば、ウイルス流体はワクチンに使用するために例えばホルマリン、ＢＰＬ、ＢＥＡまたはγ線照射を用いて不活化され得る。或いは、感染に使用されるウイルス株は生弱毒化ワクチンの調製の際に使用するためには弱毒化株であってもよい。ワクチンは当業界で公知の手段により調製され得る。通常、この方法にはアジュバント及び／または適当な担体の添加が含まれ得る。
【００６１】
別の作用効果は、（診断）検査の際に本発明の細胞を使用することである。従来技術ではＰＡＭが必要であるのに対して、ウイルスに対してより感受性となった細胞株をウイルス検出検査で使用することができる。ＰＭＡはブタから収集しなければならない主な非成長細胞である。よって、前記細胞系でＰＭＡを収集する厄介なプロセスを省くことができ、高い感度を得ることができる。
【００６２】
ブタ細胞を使用するとき、前記細胞も他の細胞タイプと同様にポリペプチドに関する遺伝子情報を含むベクターを用いて形質転換される。しかしながら、ブタ細胞はそのゲノム材料中に本発明の核酸に対応するゲノムＤＮＡ配列を既に持っている。しかしながら、遺伝子はブタ肺胞マクロファージのようにすべてのブタ細胞で発現しない。本発明によれば、単離形態の遺伝子及びその配列が解明された。本発明で提供される上記情報のみならず、ブタ細胞において遺伝子を発現するための（細胞を遺伝子を含むベクターを用いる形質転換以外の）他のルートも利用可能となる。ブタ細胞における遺伝子の発現はブタ細胞中に既に存在する遺伝子の発現を“スイッチングオン”することによっても達成され得る。本発明により遺伝子配列が提供され、特定のプロモーターを相同組換えによりスタートコドンの前に挿入し得、その後受容体遺伝子を発現する細胞が選択され得る。このプロモーターは構成的哺乳動物プロモーター（例えば、ＨＣＭＶ、ＳＶ４０  ＬＴＲ）または誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−系）であり得る。
【００６３】
表面でポリペプチドを発現する細胞は、該ポリペプチドに特異的に結合する化合物について化合物ライブラリーからスクリーニングするために使用されるスクリーニングアッセイにおいても使用され得る。前記ポリペプチドはＰＲＲＳＶの細胞への進入において役割を果たすので、前記化合物はＰＲＲＳＶ感染を治療または予防する際に使用され得る。よって、更なる態様で、本発明はポリペプチドの機能に影響を及ぼす化合物のスクリーニング方法を提供する。前記化合物はポリペプチドの機能を刺激または阻害し得る。
【００６４】
本発明のスクリーニング方法で同定され得る化合物は、化合物ライブラリーや（天然）化合物の混合物を含めた各種ソースから誘導され得る。
【００６５】
前記スクリーニング方法は、候補化合物のポリペプチド、前記ポリペプチドを有する細胞または膜、或いは完全長ポリペプチドの結合ドメインのみを有する融合タンパク質への結合を測定することを含み得る。結合の測定は直接でも間接的でもよい。結合は、例えば化合物に対する標識を用いて直接測定され得る。結合を間接的に測定してもよい。例えば、候補化合物の結合の間接的測定には（標識）競合剤との競合が含まれ得る。候補化合物の結合は、例えば候補化合物がＰＲＲＳウイルスの細胞進入を阻止し得るかを調べることができる細胞ベースアッセイで測定され得る。この場合、化合物の存在下でも細胞がＰＥＥＳＶで感染され得るかを調べることができる。
【００６６】
更なる態様で、本発明は、ＰＰＲＳＶウイルスの結合を阻害することによりブタにおけるＰＲＲＳＶ感染を治療または予防する方法を提供する。これは、ウイルスの細胞への進入を阻止するポリペプチド阻害剤を投与することにより達成され得る。前記阻害剤は化合物であり得、本発明のスクリーニング方法で同定された化合物（またはその誘導体）であってもよい。前記阻害剤はポリペプチドに結合し得る別の分子、例えば抗体または抗体断片でもあり得る。
【００６７】
ウイルス摂取を阻害する別の方法は、ウイルスを可溶性受容体により被覆することである。こうすると、付着及びその後のウイルスの細胞への進入が阻止される。よって、ブタにおいてＰＲＲＳＶ感染の治療薬または予防薬の製造におけるポリペプチドの使用も本発明の一部をなす。
【００６８】
本発明は更に、ポリペプチドのＰＲＲＳＶ受容体機能に影響を及ぼし得る化合物のブタ免疫系を調節するための使用に関する。ポリペプチド、好ましくは可溶化形態のポリペプチドを免疫系を調節するための使用も本発明に含まれる。
【００６９】
阻害剤を投与するために使用される組成物は選択した投与ルートに適した医薬的に許容され得る担体を用いて調製されるべきである。
【実施例１】
【００７０】
ＰＲＲＳＶ受容体の同定
１）モノクローナル抗体の作成
ＰＲＲＳＶのマクロファージ向性を決定し得る受容体を同定するために、モノクローナル抗体（４１Ｄ３）を作成した。このＭａｂはＰＡＭのＰＲＲＳＶ感染を完全に阻止した（Ｄｕａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：４５２０−４５２３（１９９８）；Ｄｕａｎら，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，４４０：８１−８８（１９９８））。Ｍａｂ  ４１Ｄ３はＰＰＲＳＶのＰＡＭへの付着を低下させ、ＰＡＭから２１０ｋＤａタンパク質を沈降させた。このタンパク質はフロサイトメトリー及び蛍光顕微鏡によりＰＡＭの細胞膜上で検出された。蛍光染色は、ＰＢＭＣ、ブタ腹腔マクロファージ、ＳＴ、ＳＫ及びＰＫ１５細胞を含めたＰＲＲＳＶ非許容細胞の膜では見られなかった。ＰＲＲＳＶ非許容細胞株由来の細胞のＭＡＲＣ−１４５もＭａｂ  ４１Ｄ３で染色されなかった。
【実施例２】
【００７１】
ｐ２１０の精製
（材料及び方法）
１）ＰＡＭ膜精製
ＰＡＭを、ＰＲＲＳＶネガティブ群の４〜６週令ベルギー在来種ブタからＷｅｎｓｖｏｏｒｔｅら（Ｖｅｔ．Ｑ．，１３：１２１−１３０（１９９１））に既報されている方法に従って得た。ＰＡＭを、１０％  ウシ胎仔血清、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン及び１％  カナマイシンを補充したＲＰＭＩ培地に維持した。５０×１０６細胞／１７５ｃｍ２の密度で平板培養してから２４時間後、５０Ｕ／ｍｌの組換えブタインターフェロンα（ｒＰｏ  ＩＦＮ−α１；Ｌｅｆｅｖｒｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：１０５７−１０６３（１９９０））を補充した新鮮培地を添加し、この培地でＰＡＭを更に４８〜７２時間維持した。低速で遠心することにより非付着ＰＡＭを培地中に回収し、付着ＰＡＭは手で撹拌することによりＰＢＳ中に排出させた。細胞をプールし、ＰＢＳで３回洗浄し、遠心（７分間，７００ｇ，４℃）して集めた。細胞ペレットを緩衝液Ａ（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ））中に再懸濁し、ＤｏｕｎｃｅｒホモジナイザーＢ１を用いて溶解した。細胞核を遠心（１０分間，８００ｇ，４℃）してペレット化し、上清を更に遠心（１時間，１００，０００ｇ，４℃）して膜フラクションをペレット化した。次いで、このフラクションを緩衝液Ａ中７０％  サッカロース中に再懸濁し、６０％−３０％−０％  サッカロース段階勾配にかけた（１時間，１００，０００ｇ，４℃）。６０−３０％界面を集め、緩衝液Ａで３回希釈し、遠心（１時間，１００，０００ｇ，４℃）してペレット化した。３×１７５ｃｍ２のＰＡＭに相当する精製膜フラクションを緩衝液Ａ（１ｍｌ）中に再懸濁し、−７０℃で凍結させた。
【００７２】
２）ｐ２１０の免疫沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製
タンパク質−Ｇセファロース（１００μｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を家兎抗−マウスポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ）（２０μｌ）と２０℃において１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、更にＭＡｂ  ４１Ｄ３（２０μｌ）と２０℃において１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、可溶化膜フラクション（４００μｌ）を添加し、４℃において１６時間インキュベートした。可溶化膜フラクションは、ＰＡＭの精製膜フラクションを２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で０．１％  トリトンＸ−１００を用いて３７℃において１時間処理し、遠心（３０分間，１３，０００ｇ，４℃）して、非溶解産物をペレット化した。免疫複合体をＰＢＳ−０．１％  ツイーン２０を用いて４回、水を用いて１回洗浄した。ｐ２１０を効率良く回収し、その後濃縮してＳＤＳ−ＰＡＧＥに相容する最終容量を与えるために、免疫複合体に改変Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１５．５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１％  ＳＤＳ，１．２５％  ２−メルカプトエタノール）を添加してから３分間煮沸した。１３，０００ｇで１分間遠心後、上清を真空遠心（Ｊｏｕａｎ  ＲＣ  １０．１０）を用いて８回濃縮し、１０％  グリセロールを添加し、タンパク質を７％  アクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより還元条件下で精製した。２１０ｋＤａバンドはｐ２１０に相当した。（１匹のブタから抽出したＰＡＭの量にほぼ匹敵する）８×１７５ｃｍ２のＰＡＭから精製したｐ２１０の３つの調製物をプールし、質量分析法により分析した。
【００７３】
（結果）
ＭＡｂ  ４１Ｄ３を用いるＦＡＣＳ分析により測定したところ、ＰＡＭをブタインターフェロンで７２時間処理するとｐ２１０の表面発現が約４倍増加したことが判明した。還元条件下でのウェスタンブロットではｐ２１０が認識されないので、ＭＡｂ  ４１Ｄ３はコンフォメーション依存性であることが分かった。洗剤可溶化後ＭＡｂ  ４１Ｄ３により抗原認識する際に多くの問題が見られた。その結果、ｐ２１０を効率的に回収し得る可溶化及び免疫沈降条件を実験的に決定した。洗剤の種類（イオン性、非イオン性）、その濃度、インキュベーション時間、可溶化緩衝液がＭＡｂ  ４１Ｄ３によるｐ２１０の認識に影響を及ぼす決定的なパラメーターであった。他の重要な問題は、ｐ２１０のちょうど下への、効率的な分離を妨げる非還元条件下でのゲル中の抗体の移動であった。ｐ２１０を標識し（以下参照）、ＭＡｂ  ４１Ｄ３で免疫沈降させた後、還元した糖タンパク質の見かけ分子量を測定し、還元した抗体分子から分離するための還元条件を使用することができた。ここに記載の条件を用いると、内部配列決定を実施するのに必要な２〜４ピコモルのｐ２１０を精製できた。
【実施例３】
【００７４】
タンパク質配列分析
切除２１０ｋＤａタンパク質バンドの２Ｍ  尿素、０．１Ｍ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）の存在下でのゲルトリプシン消化を１晩実施した。生じたペプチドを抽出し、作成して０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ  水／アセトニトリルを移動相として短逆相カラム（内径１ｍｍ×１００ｍｍ−Ｃ１８）にかけた。溶離したペプチドを５０μｌずつの１８フラクションとして自動的に収集した。各フラクション０．５μｌのアリコートを採取し、マトリックス溶液（シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸／２，５−ジメチル安息香酸，重量比１／４）（０．５μｌ）と混合し、反射モードにより分析した。フラクション１６及び１７中にのみペプチドが検出され得た。Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ質量分析法により、フラクション１６中には９５６．１Ｄａ、１６７６．３４Ｄａ、１８５３．５１Ｄａ、１８７０．５７Ｄａのモノ等方性分子量を有する１６個のペプチド、フラクション１７中には１７９０．４７Ｄａのペプチドが検出された。フラクション７〜１４及びフラクション１５、１７及び１８をプールした。プールしたフラクション及びフラクション１６を凍結乾燥した。０．０５％（ｖ／ｖ）ギ酸  水／アセトニトリルを移動相として約３μｌ／分でＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８逆相カラム（内径０．３ｍｍ×２５０ｍｍ）で毛細管クロマトグラフィーを実施した。溶離したペプチドを２〜５μｌずつのフラクションとして手で収集した。関連ピークのアリコートを金被覆針に充填し、ナノスプレーＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳにかけた。最も強力なイオンを断片化のために選択した。
【００７５】
（結果）
７ペプチドのアミノ酸配列を決定した（表１）。これらのペプチドのアミノ酸配列でタンパク質データーベース（ＢＬＡＳＴ  ２．０．９．，Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を検索後、ペプチド１〜５がマウスシアロアドヘシン（Ｃｒｏｃｋｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：４４９０−４５０３（１９９４））に対して７５〜９１％の配列同一性を有することが判明した。ペプチド６及び７はいずれのタンパク質とも有意な相同性を有していないことが判明した。明らかに、ｐ２１０はマウスシアロアドヘシンのブタオルソログである。
【００７６】
【表１】
2005506835.tif 000002
【実施例４】
【００７７】
ｐ２１０の生化学的性質決定
（材料及び方法）
ｐ２１０の性質を決定するために、７×１０６ＰＡＭ細胞の表面タンパク質を推奨プロトコル（プロトコルＤ２，ＥＣＬタンパク質ビオチニル化モジュール，ＲＰＮ２２０２，Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてビオチニル化により標識した。細胞ペレットを１００μｌの２５ｍＭ  トリス（ｐＨ７．４）、０．１％  トリトン−Ｘ−１００及びＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤混合物中で３７℃において１時間溶解させた。遠心（３０分間，１３，０００ｇ，４℃）した後、上清（３０μｌ）を予めＭａｂ  ４１Ｄ３（２μｌ）とインキュベートしたタンパク質Ｇ−セファロース（２０μｌ）に添加し、２０℃において２時間インキュベートした。免疫複合体をＰＢＳ−０．１％  ツイーン２０で４回、水で１回洗浄した。エンドグリコシダーゼＨ及びＦ、ノイラミニダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）及びヘパリナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）で順次処理した。エンドＦ脱グリコシル化キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，カタログ番号１８３６５５２）及び２．５〜４ＵのエンドＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，カタログ番号１３６５１６９）を用いて変性後或いは前変性せずにエンドＦ処理（３７℃で１６時間）をＰＢＳ中で実施した。エンドＨ処理（３７℃で１６時間）は５０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）、０．０２％  ＳＤＳ、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール及び１００ｍＵ  エンドＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，カタログ番号１０８８７２６）中で実施した。５０ｍＭ  ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）、４ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２ｍＵ  ノイラミニダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，カタログ番号１０８１７２５）中でノイラミニダーゼ処理（３７℃で１６時間）した後、ＰＢＳ中２ｍＵ  Ｏ−グリコシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，カタログ番号１３４７１０１）と３７℃で１６時間インキュベートした。ＰＢＳ中でエンドＦ（２．５Ｕ）、ノイラミニダーゼ（２ｍＵ）及びＯ−グリコシダーゼ（２ｍＵ）を用いる組合せエンドグリコシダーゼ消化を３７℃において１６時間実施した。ヘパリナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｈ２５１９）消化を、Ｋｅｉｌら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７０：３０３２−３０３８（１９９６）と同様に５Ｕ  酵素を用いてＰＢＳ中３７℃において１６時間実施した。ＤＡＢ（Ｓｉｇｍａ）試薬を用いて実施した検出ステップを除いて推奨（Ａｍｅｒｓｈａｍ）するようにウェスタンブロッティングを実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: a laboratory manual)」，第２版，ニューヨーク州コールドスプリングハーバーに所在のＣｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）発行）。
【００７８】
（結果）
ＭＡｂ  ４１Ｄ３は還元条件下でのウェスタンブロットでｐ２１０に結合できなかった。そこで、ｐ２１０をビオチンで標識し、ＭＡｂ  ４１Ｄ３と免疫沈降させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンを用いてウェスタンブロット実験を実施した。免疫沈降させたビオチン標識ｐ２１０に対して異なる処理を実施した。
【００７９】
１）還元及び非還元条件下での移動
２−メルカプトエタノールの存在下で、ビオチニル化ｐ２１０は２２０ｋＤＡの１つのバンドとして移動した。非還元条件下では１８０ｋＤａタンパク質として移動する主要拡散バンドが非常に高い見かけ分子量を有する小さなバンドと一緒に観察された。他のタンパク質は検出できなかったので、ｐ２１０は、還元後１つのバンドとなるマルチマー（小バンド、多分ダイマー）とモノマー（主要バンド）が分子内ジスルフィド架橋により結合した状態で存在していたことが示唆された。更に、本発明者らのデーターからも、還元タンパク質が非還元モノマーよりも非常にゆっくりとしか移動しなかったので分子内ジスルフィド架橋の存在が示唆された。
【００８０】
２）エンドグリコシダーゼＨ、Ｆ及びヘパリナーゼＩによる処理
ｐ２１０のグリコシル化を分析するために、免疫沈降させたタンパク質をエンドグリコシダーゼＨ（エンドＨ）またはＦ（エンドＦ）で処理した。エンドＨに対する感受性がないことから、ｐ２１０はハイブリッドまたは高マンノースグリカンを含まなかったこと及びｐ２１０上に存在するｎ−グリカンが複合体タイプであることが示唆された。約３０ｋＤａの大きな移動がエンドＦの存在で見られ、還元条件下で１８０ｋＦＡのタンパク質が生じた。非還元条件下では、ダイマー及びモノマーの分子量が変化し、高移動性を有する２つのバンドが生ずることが見られた。これらの結果から、ｐ２１０がＮ−結合グリカンで大きく修飾されていたことが示され、ダイマーがｐ２１０の複合体であるということが分かった。
【００８１】
ＭＡＲＣ細胞をヘパリナーゼＩで処理したときには前記細胞へのＰＲＲＳＶの結合が抑制されたことが分かったので、ｐ２１０のヘパリナーゼＩ感受性を調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの変化は見られなかったことから、ｐ２１０上にはヘパリナーゼＩに対して感受性のヘパラン様部分は存在しないことが示された。
【００８２】
３）Ｏ−グリコシダーゼ及びノイラミニダーゼによる処理
シアル酸残基の存在を検出するために免疫沈降させたｐ２１０をノイラミニダーゼで処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで変化は認められなかった。このことから、ｐ２１０には実質量のシアル酸残基が存在しないことが分かる。また、その後Ｏ−グリコシダーゼで処理しても見かけ分子量が変化しなかった。このことから、ｐ２１０上にはＯ−グリコシダーゼによる開裂に対して感受性のＯ−グリカンがないことが分かる。
【実施例５】
【００８３】
ｐ２１０  ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定
Ｉｎｎｉｓら（ＰＣＲプロトコル  方法及び応用へのガイド(PCR protocols. A guide to methods and applications)，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９０年）発行）に記載されているようにブタ全血からＤＮＡを作成し、ペプチド３及び４に基づく非縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ実験のための第１標的として使用した。プライマー中の縮重ヌクレオチドコードをマウス（受託番号ＥＭＢＬ  Ｚ３６２９３）またはヒト（受託番号ＥＭＢＬ  ＡＬ１０９８０４）中のｐ２１０ペプチドに対応するヌクレオチド配列と同様に選択した。マウス（前進５’−ＴＣＣＴＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴ−３’及び逆５’−ＡＧＴＧＡＧＧＣＡＧＣＣＧＴＴＣＣＣＴＣ−３’）から誘導した２つのプライマーはマウスシアロアドヘシン遺伝子のエキソン１４、イントロン及びエキソン１５の末端に対応する３４０ｎｔ断片を増幅させた。
【００８４】
この第１配列から特異的ブタオリゴヌクレオチドを誘導し、ブタＢＡＣライブラリー（Ｒｏｇｅｌ−Ｇａｉｌｌａｒｄら，Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．８５：２０５−２１１（１９９９））をＰＣＲによりスクリーニングするために使用した。１つのクローン（ＢＡＣ６３４Ｃ１０）を選択することができ、更にブタｐ２１０遺伝子を配列分析するために使用した。一般的な方法を用いてｐ２１０遺伝子のエキソン４〜１８から配列情報を得た。
【００８５】
エキソン１〜４及びエキソン１８〜２１の配列を決定するために、５’及び３’ＲＡＣＥを製造業者の指示（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＧＣリッチｃＤＮＡに関するＲＡＣＥプロトコル）に従って全ブタ肺胞マクロファージＲＮＡを用いて実施した。
【００８６】
５’ＲＡＣＥについて、第１鎖ｃＤＮＡをエキソン４（５’−ＴＣＴＧＧＴＣＴＴＴＧＡＧＣＴＴＣＧＴＣ−３’）由来の逆プライマー及びｄＣＴＰを末端につけたＴｄＴを用いて合成した。第２鎖合成は５’ＲＡＣＥ  Ａｂｒｉｄｇｅｄ  Ａｎｃｈｏｒプライマー及びエキソン４（５’−ＡＣＣＴＧＡＧＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＴ−３’）由来のネステッドプライマーを用いて実施した。半ネステッドＰＣＲはＡｂｒｉｄｇｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ増幅プライマー（ＡＵＡＰ）及びエキソン（５’−ｃａｃｃｔｇｇｃａｇｃｔｇａｇｇｇｔｇａｃｃａｇａｔｃ−３’）由来のネステッドプライマーを用いて実施した。
【００８７】
３’ＲＡＣＥについて、第１鎖ｃＤＮＡを作成するための供給Ａｄａｐｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒを用い、半ネステッドＰＣＲのためにエキソン１８（５’−ＧＡＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＧ−３’）由来の前進プライマー及び供給プライマーＡＵＡＰを使用した。ｐ２１０コード配列に対応するエキソンの完全ＤＮＡ配列をＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ及び３’ＲＡＣＥのデータから作成した（図３及び配列番号１，２）。
【００８８】
ｐ２１０  ｃＤＮＡの配列決定及びその真核発現ベクターでのクローニングのために、全ＲＮＡをまずマクロファージから単離した。全ＲＮＡを単離し、最適量のｐ２１０コード化ＲＮＡを得るために、５×１０７マクロファージを直接培養容器において溶解し、ＲＮＡをＲｎｅａｓｙキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。第１鎖をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）及び２．５μＭのランダムノナマー（Ｓｉｇｍａ）を製造業者（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）の指示に従って用いて作成した。ＰＣＲのために、０．４μＭの前進プライマー５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣ−３’及び０．４μＭの逆プライマー５’−ＣＴＴＧＧＧＧＴＴＴＧＡＡＧＣＴＡＧＧＴＣＡＴＡＡ−３’を２００μＭの各ｄＮＴＰ、１ＵのＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ反応緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。熱サイクリングを次のように実施した：９５℃×３分間、その後９５℃×２０秒間、６５℃×３０秒間及び７４℃×５．３分間を１サイクルとして３０サイクル、最後に７４℃×１０分間。これらのパラメーターを用いて、全部で５．２ｋｂのｐ２１０  ｃＤＮＡが増幅された。増幅したＤＮＡをアガロースゲル（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）を用いて精製し、ＴＯＰＯを製造業者の指示に従って真核発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）においてクローン化した。形質転換（大腸菌ＴＯＰ１０株，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）後、クローン化遺伝子の予想される配向での存在に関して９コロニーを選択した。このベクターにおいてコード配列をＣＭＶプロモーターからの非融合タンパク質として発現させる。最後に、機能性ｐ２１０遺伝子にするクローンを配列決定し、ｐ２１０遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定した（図４）。
【実施例６】
【００８９】
ＰＫ−１５細胞のトランスフェクション、ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体の発現の検出及びＰＲＲＳＶの培養
集密度５０％でＰＫ−１５細胞にｐ２１０  ｃＤＮＡを含む精製ｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯプラスミドをカルシウムホスフェート法（ＣｅｌｌＰｈｅｃｔトランスフェクションキット，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトから７２時間後、トランスフェクトした細胞をトリプシン処理し、１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）の存在下で培養した。ジェネティシン添加してから１０日後、ジェネティシン耐性細胞のコロニーをトリプシンに浸した滅菌３ｍｍ濾紙を用いて単離した。これらのコロニーをジェネティシンの存在下で更に２週間培養した後、組換えｐ２１０の発現をチェックした。
【００９０】
ｐ２１０の発現をチェックするために、細胞を４℃においてメタノールで１０分間固定し、ＰＢＳ中に再度水和し、３７℃においてＭＡｂ  ｐ２１０（１０％  補体除去ヤギ血清を補充したＰＢＳで１／３００希釈した腹水）と１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を３７℃において１０％  補体除去ヤギ血清を補充したＰＢＳで１／１００希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ血清抗−マウスＩｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と１時間インキュベートした。ＰＢＳ及び水で洗浄後、細胞を乾燥し、蛍光顕微鏡下で観察した。
【００９１】
９個の特定プラスミドのうち３個のプラスミドを用いて作成したトランスフェクション由来の単層において細胞のポジティブ染色が検出された。
【００９２】
ｐ２１０の表面発現を調べるために、細胞を固定しなかった以外は上記と同じ染色プロトコルを用い、ＰＢＳを培地（添加剤非含有のＭＥＭ）で置換し、０．１％  アジ化ナトリウムを抗体に添加し、抗体エンドサイトーシスを阻止するためにインキュベーションステップを４℃において実施した。使用した９個のプラスミドから１個のプラスミドのみが細胞においてｐ２１０の表面発現を示した。
【００９３】
ｐ２１０の発現が細胞をＰＲＲＳ許容性とするかどうかをチェックするために、細胞に最小培養容量で各種ＰＲＲＳＶ株を０．１ＴＣＩＤ５０／細胞の多重感染度で感染させた。１時間インキュベート後、培地を添加し、細胞を３７℃において更に２０時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をメタノールで固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＲＲＳＶ（１０％補体除去したヤギ血清を補充したハイブリドーマ）に対して特異的なＭＡｂ  Ａ２７と３７℃において１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を１０％補体除去したヤギ血清を補充したＦＩＴＣ標識ヤギ血清抗−マウスＩｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と３７℃において１時間インキュベートした。ＰＢＳ及び水で洗浄した後、細胞を乾燥し、蛍光顕微鏡（ＦＩＴＣフィルター）下で観察した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中でビオチニル化Ｍａｂ  ４１Ｄ３と３７℃において１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＰＢＳで希釈したＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と３７℃において１時間インキュベートした。ＰＢＳ及び水で洗浄した後、細胞を乾燥し、蛍光顕微鏡（ＦＩＴＣフィルター）下で観察した。
【００９４】
ｐ２１０をトランスフェクトした細胞（ｐ２１０が細胞表面上にある）でのみポジティブな感染細胞が観察された。更に、この細胞でインキュベートしたウイルス株（ＬＶ株、ＶＲ２３３２、及び２つのベルギー野生型ＰＲＲＳＶ株）はいずれもｐ２１０−発現細胞を感染できた。
【実施例７】
【００９５】
ヒト細胞株ＨＥＫ２９３Ｔのトランスフェクション、ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体の発現の検出及びＰＲＲＳＶの培養
集密度２５％でＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐ２１０  ｃＤＮＡを含有するＱｉａｇｅｎｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドをカルシウムホスフェート法（Ｃｅｌｌｐｈｅｃｔトランスフェクションキット，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトから１６時間後、細胞にアメリカ型ＰＲＲＳＶ  ＶＲ−２３３２（Ｍａｒｃ−１４５細胞で増殖）、ヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ  Ｌｅｌｙｓｔａｄウイルス（ブタ肺胞マクロファージで増殖）及びベルギー単離物９４Ｖ３６０（Ｍａｒｃ−１４５細胞で増殖）を接種した。感染から８時間後、細胞を４℃においてメタノールで１０分間固定し、ＰＢＳ中に再水和し、感染細胞及びｐ２１０発現細胞の両方を二重免疫蛍光染色法により同定した。ＰＲＲＳＶ感染を検出するために、細胞を３７℃においてＰＲＲＳＶヌクレオキャプシドタンパク質を認識するＭａｂ  Ａ２７（ＰＢＳで１／１００希釈した培養上清）と１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳで１／１００希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗−マウス血清とインキュベートした。ｐ２１０タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃においてｐ２１０タンパク質に対するビオチニル化Ｍａｂ  ４１Ｄ３（ＰＢＳで１／２００希釈した腹水）と１時間インキュベートすることにより検出した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を更に３７℃においてＰＢＳで１／５０希釈したストレプトアビジンＴｅｘａｓ  Ｒｅｄと１時間インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５％  ＤＡＢＣＯ（Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｃｈｉｍｉｃａ）を含有する緩衝グリセリン溶液に入れた。ＰＲＲＳＶ感染細胞（緑）及びｐ２１０発現細胞（赤）が蛍光顕微鏡で可視化された。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞はアメリカ型及び２つのヨーロッパ型のＰＲＲＳＶで感染できた。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ｐ２１０  ｃＤＮＡ（クローン８０．２）を含むプラスミドｐｃＤＮＡ３．１Ｄ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯを安定的にトランスフェクトした組換えＰＫ−１５細胞におけるｐ２１０の発現。メタノール固定（Ａ）または非固定（Ｂ）細胞をＭＡｂ  ４１Ｄ３（ｐ２１０に対する）及びＦＩＴＣ標識ヤギ血清抗−マウスＩｇを用いて間接免疫蛍光染色した。メタノールで固定したブタ肺胞マクロファージを同一プロトコルを用いて染色し、ポジティブコントロール（Ｃ）として含めた。
【図２】ｐ２１０を発現し、Ｌｅｌｙｓｔａｄウイルスを感染させた組換えＰＫ−１５細胞におけるＰＲＲＳＶヌクレオチド及びｐ２１０の共局在化。メタノール固定細胞をＭＡｂ  Ａ２７（ＰＲＲＳＶヌクレオキャプシドに対する）及びＦＩＴＣ標識ヤギ血清抗−マウスＩｇを用いて二重間接免疫蛍光染色した後、ビオチニル化ＭＡｂ  ４１Ｄ３（ｐ２１０に対する）及びＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識ストレプトアビジンを用いて染色した。イメージ（Ａ）はＦＩＴＣシグナルを示し、イメージ（Ｂ）はＴｅｘａｓＲｅｄシグナルを示し、（Ａ）及び（Ｂ）を併合することにより得たイメージ（３）は（Ａ）及び（Ｂ）が共局在化したときには黄色シグナルを与える。
【図３−１】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−２】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−３】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−４】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−５】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−６】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−７】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−８】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−９】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−１０】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−１１】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−１２】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図３−１３】ｐ２１０遺伝子の同定ゲノム核酸配列（エキソン）及びコード化アミノ酸配列。
【図４−１】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−２】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−３】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−４】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−５】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−６】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−７】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−８】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−９】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−１０】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−１１】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−１２】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図４−１３】機能的ｐ２１０  ＰＲＲＳＶ受容体を発現するクローンの同定ｃＤＮＡ核酸配列及びコード化アミノ酸配列。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図３−９】
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【図３−１０】
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【図３−１１】
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【図３−１２】
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【図３−１３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506835.tif 000106
【国際調査報告】
2005506835.tif 000107
2005506835.tif 000108
2005506835.tif 000109
2005506835.tif 000110