(57)【要約】本発明は、副腎で主に発現される新規のレチノイン酸代謝性シトクロムP450であるP450RAI-3を提供する。この新規のポリヌクレオチド、ポリペプチド、断片、およびこの修飾因子に関する方法およびそれらの用途には癌の治療が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択される配列を含むポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子：
（a）配列番号：9（図1）もしくは配列番号：10（図2）のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号：11（図3）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（b）配列番号：9（図1）もしくは配列番号：10（図2）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号：11（図3）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（c）TがUの場合もある、（a）または（b）のポリヌクレオチド；
（d）（a）、（b）、または（c）に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド；
（e）遺伝暗号の縮重のために（a）から（c）の任意の核酸分子とはコドンが異なる核酸配列を有するポリヌクレオチド；
（f）変種、対立遺伝子変種であるポリヌクレオチド、または（a）から（c）または（e）の任意の一つのポリヌクレオチドの相同体をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（g）少なくとも15塩基であり、（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、または（f）と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリッドを形成する、（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、または（f）の核酸配列の断片を含むポリヌクレオチドであって、ストリンジェントな条件では、A残基のみ、またはT残基のみのヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリッドを形成しないポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号：9、10、または配列番号：11のアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号：9、10、または配列番号：11のアミノ酸配列をコードする核酸分子をからなる、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
ポリヌクレオチド断片が、配列番号：13、15、17、19、21、および23（図5の第1〜6エキソン）から選択される配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
ポリヌクレオチド断片が、配列番号：13、15、17、19、21、および23（図5の第1〜6エキソン）から選択される配列をコードする核酸配列を含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項2記載の単離された核酸分子、またはその生物学的に活性な断片を含む、シトクロムP450レチノイン酸代謝性タンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項6記載の核酸分子と90%相同である、単離された核酸分子。
【請求項８】
請求項1記載の核酸分子と75%相同である、単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項1記載の核酸分子と65%相同である、単離された核酸分子。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列が、C末端またはN末端のいずれか一方からの連続したヌクレオチド欠失を含む、請求項2記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列が、C末端またはN末端のいずれか一方からの連続したヌクレオチド欠失を含む、請求項4記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
請求項1記載の単離された核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１３】
宿主細胞を、請求項12記載の組換えベクターでトランスフェクトまたは形質転換する、請求項1記載の単離された核酸分子を含む組換え宿主細胞の作製法。
【請求項１４】
請求項13記載の方法で作製される組換え宿主細胞。
【請求項１５】
哺乳類細胞または昆虫細胞を含む、請求項14記載の宿主細胞。
【請求項１６】
Cos細胞、Sf9細胞、またはHela細胞を含む、請求項14記載の宿主細胞。
【請求項１７】
ベクター配列を含む、請求項14記載の組換え宿主細胞。
【請求項１８】
以下からなる群より選択される配列と少なくとも95%相同なアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド：
（a）配列番号：11（図3）のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（b）以下からなる群より選択される任意のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド；
（i）配列番号：13、15、17、19、または21（図5の第1〜6エキソン）のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ii）配列番号：9または10のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（iii）TがUの場合もある、配列番号：9または10のポリヌクレオチド；
（iv）変種、対立遺伝子変種であるポリヌクレオチド、または（i）から（iii）の任意の一つのポリヌクレオチドの相同体種をコードするポリヌクレオチド；
（c）成熟型、変種、対立遺伝子変種、または（a）もしくは（b）の任意のポリペプチドの相同体；
（d）（a）から（c）の任意のポリペプチドの断片。
【請求項１９】
配列番号：11、13、15、17、19、または21（図5の第1〜6エキソン）を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号：11（図3）のアミノ酸配列、またはその生物学的に活性な断片を含む、シトクロムP450レチノイン酸代謝性ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号：11（図3）のアミノ酸配列からなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号：11（図3）と少なくとも45%相同である、単離されたポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号：11（図3）と少なくとも55%相同である、単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
請求項18記載の単離されたポリペプチド、またはその免疫原性部分もしくは抗原性部分に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２５】
請求項18記載の単離されたポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項２６】
哺乳類細胞または昆虫細胞を含む、請求項25記載の宿主細胞。
【請求項２７】
Cos細胞、Sf9細胞、またはHela細胞を含む、請求項26記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項18記載の単離されたポリペプチドを含むミクロソーム。
【請求項２９】
以下の段階を含む、単離されたポリペプチドの作製法：
［a］請求項14または請求項17記載の組換え宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件で培養する段階；および
［b］対象ポリペプチドを回収する段階。
【請求項３０】
請求項29記載の方法で作製されるポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号：9（図1）または10（図2）のcDNA配列に対応する遺伝子。
【請求項３２】
請求項18記載の単離されたポリペプチド、および/または選択的にP450RAI-3活性の修飾因子を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
アジュバントをさらに含む、請求項32記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
治療的有効量の請求項18記載のポリペプチド、または請求項1記載のポリヌクレオチド、および/またはP450RAI-3の修飾因子を哺乳類の被験体に投与する段階を含む、P450RAI-3の発現に関連する医学的条件を予防するか、治療するか、または緩和する方法。
【請求項３５】
P450RAI-3の修飾因子が阻害物質であり、かつ阻害物質をP450RAI-3基質とともに投与する、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
基質がATRA、および/または9-シス-RAである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
以下の段階を含む、生物学的アッセイ法で活性を同定する方法：
［a］P450RAI-3を細胞で発現させる段階；
［b］生物学的画分を単離する段階；
［c］生物学的アッセイ法で活性を検出する段階；ならびに
［d］活性を有する上清中のタンパク質を同定する段階。
【請求項３８】
請求項37記載の方法で作製される産物。
【請求項３９】
P450RAI-3遺伝子の多型を検出する段階を含む、P450RAI-3関連条件、またはP450RAI-3関連条件の素因の診断法であって、多型の検出は、該条件またはその素因の存在を意味する診断法。
【請求項４０】
請求項1記載の核酸分子、および選択的に、多型に関してP450RAI-3遺伝子をヒトからスクリーニングする段階を含む方法に関する指示書を含む、P450RAI-3遺伝子の多型を同定するための診断用キットであって、多型の検出は、P450RAI-3関連条件または素因が存在することを意味するキット。
【請求項４１】
条件がビタミンAまたはレチノイン酸の代謝に関連する、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
請求項18記載の治療的に有効なポリペプチド、および／またはその作動物質の有効量を、治療を必要とする患者に投与する段階を含む、患者におけるビタミンAまたはレチノイン酸の代謝に関連した疾患または条件の治療法。
【請求項４３】
以下の段階を含む、P450RAI-3活性の修飾因子を生物学的アッセイ法で同定する方法：
［a］細胞中でP450RAI-3を発現させる段階、またはミクロソーム中のP450RAI-3を得る段階；
［b］基質を添加する段階；および
［c］修飾因子の存在下または非存在下で、該基質に対するP450RAI-3の活性を検出する段階。
【請求項４４】
基質がATRAおよび/または9-シス-RAである、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
基質が、放射標識されたATRAまたは9-シス-RAを含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
基質が[3H]-ATRAまたは[3H]-RAを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
細胞が哺乳類細胞または昆虫細胞を含む、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
細胞がCos細胞、Sf9細胞、またはHela細胞を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
以下の段階を含む、薬剤探索および/または製薬業を行う方法；
（a）P450RAI-3の活性もしくは発現、またはレチノイン酸代謝を調節する能力によって、薬剤を同定するための1つまたは複数のアッセイ系を提供する段階；
（b）段階（a）で同定された薬剤、またはそのさらなる類似体の、動物における有効性および毒性に関する治療プロファイルの作成を実施する段階；ならびに
（c）許容できる治療プロファイルを有する、段階（b）で同定された1つまたは複数の薬剤を含む、薬学的調製物を製剤化する段階。
【請求項５０】
薬学的調製物を販売目的で流通させる流通システムを確立する段階を含む、請求項43記載の方法。
【請求項５１】
薬学的調製物を市販するための販売グループを確率する段階を含む、請求項43記載の方法。
【請求項５２】
以下の段階を含む、標的探索事業を行う方法：
（a）薬剤を、P450RAI-3および/またはレチノイン酸代謝を調節する能力によって同定するための、1つまたは複数のアッセイ系を提供する段階；
（b）段階（a）で同定された薬剤の、動物における有効性および毒性に関する治療プロファイルの作成を（選択的に）実施する段階；ならびに
（c）段階（a）で同定された薬剤、またはその類似体の、さらなる薬剤開発および／または販売を行う権利を第三者に認可する段階。
【請求項５３】
薬学的物質を調製するための、請求項18記載の単離されたポリペプチド、および選択的に、P450RAI-3活性の修飾因子の用途。
【請求項５４】
P450RAI-3の発現が関連する医学的条件を予防するか、治療するか、または緩和するための、治療的有効量の請求項18記載のポリペプチド、または請求項1記載のポリヌクレオチド、および/またはP450RAI-3の修飾因子の用途。
【請求項５５】
患者における、ビタミンAまたはレチノイン酸代謝が関連した疾患または条件を治療するための、治療的に有効な請求項18記載のポリペプチド、および/またはその作動物質の用途。
【請求項５６】
P450RAI-3の発現に関連する医学的条件を予防するか、治療するか、または緩和するための、P450RAI-3阻害物質およびP450RAI-3基質の用途。
【請求項５７】
薬学的物質を調製するためのP450RAI-3阻害物質およびP450RAI-3基質の用途。
【請求項５８】
基質がATRAまたは9-シス-RAを含む、請求項56または請求項57のいずれか一項記載の用途。
【請求項５９】
以下の段階を含む、請求項18から23のいずれか一項記載のポリペプチドのATRAおよび/または9-シス-RA代謝活性を決定する方法：ポリペプチドを宿主細胞で発現させる段階、ATRAおよび/または9-シス-RAを細胞に添加する段階、ならびにATRAおよび/もしくは9-シス-RAの代謝量および/または代謝速度を決定する段階。
【請求項６０】
ATRAが放射標識されたATRAを含み、かつ9-シス-RAが放射標識された9-シス-RAを含む、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
放射標識されたATRAが[3H]-ATRAを含み、かつ放射標識された9-シス-RAが[3H]-9-シス-RAを含む、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
ATRAおよび9-シス-RAの代謝量ならびに/または代謝速度を、ヒドロキシ代謝物およびオキソ代謝物の産生量および/または産生速度を測定することにより決定する、請求項59記載の方法。
【請求項６３】
ATRAおよび/または9-シス-RA代謝量および代謝速度を決定するためにHPLCまたは質量分析を使用する、請求項59記載の方法。
【請求項６４】
ATRAおよび/または9-シス-RAを細胞に添加する段階に先立ち、ポリペプチドの候補活性化物質または候補阻害物質を細胞に添加する、請求項59記載の方法。
【請求項６５】
請求項64記載の方法により同定される活性化物質または阻害物質。
【請求項６６】
以下の段階を含む、請求項18から23のいずれか一項記載のポリペプチドの基質を決定する方法：ポリペプチドを宿主細胞で発現させる段階、候補基質を添加する段階、および基質が代謝されるか否かを判定する段階（ここで代謝は、候補基質がポリペプチドの基質であることを意味する）。
【請求項６７】
複数の候補基質を細胞に添加して、各基質の代謝量および代謝速度を決定する、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
候補基質を細胞に添加する段階に先立ち、ポリペプチドの候補活性化物質または候補阻害物質を細胞に添加する、請求項66記載の方法。
【請求項６９】
請求項68記載の方法により同定される活性化物質または阻害物質。
【請求項７０】
ポリペプチドを宿主細胞で発現させる段階、候補基質を添加する段階、ならびにKd値を決定する段階を含む、請求項18から23のいずれか一項記載のポリペプチドに対する基質の結合活性を決定する方法。
【請求項７１】
基質を細胞に添加する段階に先立ち、ポリペプチドの候補活性化物質または候補阻害物質を細胞に添加する、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
請求項71記載の方法により同定される活性化物質または阻害物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2001年5月23日に出願された米国仮特許出願第60/292,531号の利益および優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新しいレチノイン酸代謝性シトクロムP450、ならびにこの断片および変種に関する。本発明はさらに、同ペプチドをコードする核酸に関する。本発明のペプチドおよび核酸分子を用いて、誘導または同定される産物。以上のペプチド、核酸分子、および産物の方法および用途も本発明の範囲に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
シトクロムP450
シトクロムP450は、身体内の薬物および他の多数の化合物の酸化を触媒する500種類以上の異なるヘム-チオレートタンパク質をコードする、大規模な遺伝子スーパーファミリーを構成する（Nelsonら（1996）；Guengerich（1991））。少なくとも500種類の異なるシトクロムP450酵素が存在するので、これらのうちどの酵素が個々の化合物の代謝に最も重要な役割を果たすのかということを見極めることについて、薬学分野および他の分野において関心が寄せられている。シトクロムP450酵素に関して現在理解されている、有害な薬物-薬物相互作用および副作用には多くの例がある。
【０００４】
P450タンパク質は、生物に普遍的に存在し、細菌、酵母、植物、および動物で同定されている（Nelsonら（1996）；およびNelson、（1999a））。P450酵素は、さまざまな薬物、生体異物（xenobiotics）、発癌性物質、変異誘発物質、および殺虫剤の代謝を触媒し、またステロイド、プロスタグランジン、胆汁酸、および脂肪酸を含む数多くの内因性化合物の生理活性に関与する（Nelsonら（1996）；Guengerich（1991）；Nebertら（1989））。シトクロムP450により生体異物が代謝されると、排出可能状態への抱合により毒性化合物が解毒される場合があるほか、化合物が、毒性、変異原性、または発癌性のある代謝物に活性化される場合がある。多くのステロイドは、シトクロムP450が触媒する酸化によって非活性化される。
【０００５】
ミクロソームのシトクロムはERの膜上に存在し、その活性にはNADPHシトクロムP450還元酵素、およびフラビンタンパク質を必要とする。一方、ミトコンドリアのシトクロムはミトコンドリア内膜に存在し、その活性にはフェレドキシンおよびNADPHフェレドキシン還元酵素を必要とする（Beckman, M.およびDeLuca, H.（1997）Methods in Enzymol. 282, 200-223；Armbrecht, H.J.、Okuda, K.、Wongsurawat, N.、Nemani, R.、Chen, M.、およびBoltz, M.（1992）J.Steroid Biochem.Molec.Biol. 43、1073-1081）。
【０００６】
ビタミンAとレチノイン酸
ビタミンAの代謝によって、上皮組織の発生、再生、ならびに成長および分化における遺伝子発現の調節に関与する、複数の活性型のレチノイン酸（RA）が生じる（Maden、1992；Chambon、1995；Mangelsdorf、1995；Gudas、1994；Lotan、1995；Morriss-Kay、1996）。RAは、いくつかの細胞種におけるアポトーシス（プログラム細胞死）に、ならびに抗癌性および抗腫瘍性に関連づけられている（Lotan、1996）。
【０００７】
レチノール不足に関する初期の研究では、ビタミンAの枯渇と、癌および化学発癌の高い発症率、および化学発癌に対する感受性の高さが相関することが明らかにされた（Chytil、1984）。複数の動物モデルを用いて、皮膚、乳腺上皮、口腔、気管食道、肝臓、膀胱、および前立腺を含む、さまざまな組織における発癌を抑制するレチノイドの有効性が証明されている（Moon、1994）。これらの研究により、光線性角化症、および口腔白板症を含む前癌病変を治療するために、ならびに頭頚部の二次性腫瘍、および非小細胞肺癌、ならびに基底細胞癌の再発を予防するために、レチノイドが予防的に使用されつつある（Hong、1994；Lippman、1995）。RAそのものは、特に、急性前骨髄球性白血病（APL）、頭頚部腫瘍、および皮膚癌を含む癌の治療、ならびに光線性角化症、ざ瘡、乾癬、および魚鱗癬が関連する前癌状態などの皮膚疾患の治療に、治療的に有用であることがわかっている。抗腫瘍薬としてのRAの有効性が、少なくとも部分的には、細胞分化の誘導および/または増殖の阻害に起因することを示す証拠がある（Lotan、1996）。過去数年間の研究では、急性前骨髄球性白血病（APL）の多くの患者が、全トランス-RAによる短期間の治療後に完全寛解に至ることが報告されている。しかし残念ながら、再発が通常、短期間に高い率で生じる。再発後に患者は、RAを用いる後の治療に対して臨床的に耐性を示す（Warrell、1994；Warrellら、1994；Chomienne、1996；Muindi、1992）。このような耐性の機序は不明である。興味深いことに、RAに臨床耐性を示す患者の白血病細胞は、インビトロで成長させた場合に、RAのもつ分化作用に感受性をもつことが報告されている（Muindi、1992；Muindi、1994）。この結果は、薬物動態学的な機構で、RAに対する耐性獲得を説明できる可能性があることを示唆している。この可能性は、RAのピーク血漿濃度が、再発後に治療を受けた患者と比較して、初期投与後の患者ではかなり高いことを示す研究で支持されている。このようなピーク血漿RA濃度の低下は、尿中の4-オキソ-レチノイン酸濃度の10倍の上昇を伴っていた。また、シトクロムP450の機能の広域阻害物質であるケトコナゾールは、RAの薬物動態をインビボで調節することが報告されている（Muindi、1992；Muindi、1994）。したがってRAが、それ自体の代謝速度を上昇させ、次いで有効治療用量のRAを維持できなくなっている可能性は高い。RAの治療的投与は、さまざまな望ましくない副作用を生じる恐れがあるので、治療時のRAの最小必要用量を決定して維持することは重要である。例えば、妊娠中のRA治療は、胎児に重度の催奇形作用をもたらす恐れがある。RA治療による有害反応には、頭痛、悪心、口唇炎、顔面皮膚炎、結膜炎、および鼻粘膜の乾燥などがある。RAに長期間曝露すると、血清トリグリセリド濃度が大きく上昇する場合があり、肝腫大、肝硬変、および門脈圧亢進症を含む肝機能の重篤な異常を招く恐れがある。
【０００８】
RAの代謝は、RA治療に対するある種の腫瘍の反応の不在も説明できるかもしれない。例えば最近の研究では、RA代謝を阻害するシトクロムP450阻害物質が、RAの組織濃度の上昇を招き、前立腺癌治療の有用な治療薬となる可能性があることが報告されている（Wouters、1992；De Coster、1996）。したがって、RA代謝性シトクロムP450は、多種多様な癌の治療の有用な標的となりうる。
【０００９】
ビタミンAの代謝に関する従来の見解では、最も活性の高い代謝物である全トランス-RAは、2つの酸化段階を介する、レチノールからレチンアルデヒドを経てRAに至る変換に由来し、RAはさらに極性誘導体4-OH-RAおよび4-オキソ-RAに代謝されると考えられていた（Blaner、1994；Napoli、1995；Formelli、1996；Napoli、1996）。4-オキソ代謝物および4-OH代謝物が、単にRA異化経路の中間体であるのか否か、または全トランス-RAおよび9-シス-RAの活性とは異なる特異的な活性も有するのかどうかは不明である。Pijnappelら（Pijnappel、1993）はツメガエル（Xenopus）において、4-オキソ-RAが初期胚における位置的な特異化を効率よく調節可能であること、また全トランス-RAに勝る、Hoxb-9遺伝子およびHoxb-4遺伝子の発現を調節する強力な能力を示すことを報告している。4-オキソ-RAは、レチノイン酸受容体-β（RAR-β）に、全トランス-RAに匹敵する親和性で結合する（Pijnappel、1993）が、RAR-γとはほとんど結合しないこと（Reddy、1992）が報告されている。これらの結果は、同代謝物が、ある程度の受容体選択性を示すことを示唆している。4-オキソ-RAは、細胞のレチノイン酸結合タンパク質（CRABP）にも結合するが、その親和性は、全トランス-RAと比べてやや低い（Fiorella、1993）。Takatsukaら（Takatsuka、1996）は、RAのもつ成長阻害作用が、RAの代謝活性に相関することを報告しているが、RA代謝物の産生と成長阻害との間に因果関係があるか否かは不明である。これらの代謝物が、発生期の胚で非対称的に分布することは、これらが選択的に局在するか、または組織特異的なイソメラーゼによって作られることを示唆している（Creech Kraft、1994）。これらの代謝物の正常なバランスは、代謝前駆体、レチノール、およびレチンアルデヒドからの形成速度（Leo、1989）、および異化速度に依存する。この代謝スキーム（特にRAの異化）に関与する酵素については、現時点でほとんどわかっていない。
【００１０】
RAの異化は、RAのβ-イオノン環のC4位またはC18位のいずれかにおけるヒドロキシル化によって開始されると考えられている（Napoli、1996）。C4位のヒドロキシル化段階には、ケトコナゾールやリアラゾール（liarazole）などの広域のP450阻害物質のもつ、4-ヒドロキシル化を阻害する能力によって判断されるように、シトクロムP450活性が関与する（Williams、1987、Van Wauwe、1988；Van Wauwe、1990、Van Wauwe、1992、Wouters、1992）。精巣、皮膚、および肺を含む組織、ならびに骨髄単球性のNIH3T3繊維芽細胞、HL60骨髄単球性白血病細胞、F9およびP19マウス胚癌細胞系列、ならびにMCF7などの数多くの細胞系列では、RAの前処置によってRA代謝が誘導される場合がある（Frolik、1979、Roberts、1979aおよびb；Duell、1992；Wouters、1992）。F9細胞におけるRAR遺伝子群の標的破壊に関する研究では、RAR-αおよびRAR-γイソ型が、このような代謝上昇に関与する酵素の制御に役割を果たす可能性があることが示唆されている（Boylan、1995）。
【００１１】
RAのグルクロン酸抱合は、RAの不活性化の重要な代謝段階である（Blaner、1994；Formelli、1996）。RAが除去されるためには、4-オキソへ酸化されて、次いで抱合されて4-オキソ全トランス-RAグルクロニドが形成されることが必要である。これは、4-オキソ-RAグルクロニドが尿中に認められる唯一のレチノイド胞合体であることを示す、霊長類およびヒトの両方を対象とした研究で裏づけられている（Muindi、1992；Muindi、1994）。RA治療後に、血清中に4-オキソ-RAが存在しないか、またはほとんど検出されないという事実は、酸化がこの過程の律速段階である可能性を示唆している。
【００１２】
4-オキソレチノール（4-オキソ-ROL）の生物学的活性がレチノールより大きいことが最近報告された。4-オキソ-ROLは、F9およびP19マウス奇形癌腫細胞においてRAによって誘導される（Blumbergら、1995；Achkarら、1996）。
【００１３】
ゼブラフィッシュのひれは、初期脊椎動物の発生に関与する多くの遺伝子調節経路を利用するRA感受性過程を介して再生することが知られている（White、1994；Akimenko、1995aおよびb）。
【００１４】
シトクロムP450とレチノイン酸代謝
1979年にRobertsら（Roberts（1979a））は、レチノイン酸（RA）の異化にシトクロムP450酵素が関与することを初めて仮定した。その後、ヒト、ゼブラフィッシュ、およびマウスのP450タンパク質を含む、数種類のP450がRAを代謝することが報告されている。例えば、RAによって誘導されるヒトP450RAIは、RAを4-ヒドロキシレチノイン酸（4-OH-RA）、および4-オキソレチノイン酸（4-オキソ-RA）を含む、より極性の高い誘導体に代謝する（Whiteら（1996a））。RAは抗腫瘍薬として有用なので、RAの組織濃度を高く保つことが望ましい。したがって、RA代謝を阻害して、RAの組織濃度の上昇を招くシトクロムP450阻害物質は、前立腺癌などの癌の治療に有用となる可能性がある（Woutersら（1992）；およびDe Costerら（1996））。
【００１５】
1997年12月31日に公開された国際公開公報第97/49815号では、ヒト、ゼブラフィッシュ、およびマウスに由来するタンパク質を含むレチノイド代謝酵素CYP26Aのファミリー、およびそのコード配列について説明されている。この初期の出版物は、全体が参照として本明細書に組み入れられる。RAによって誘導されるシトクロムP450依存性酵素（P450RAI）をコードするcDNAはゼブラフィッシュからクローン化されており、また特性が明らかにされている。同タンパク質はRAを、4-ヒドロキシレチノイン酸（4-OH RA）、および4-オキソレチノイン酸（4-オキソ-RA）を含む、より極性の高い誘導体に代謝する（Whiteら、1996a）。P450RAI遺伝子の同定は、RAシグナル伝達を理解する上で重要な段階であるが、その存在は、Robertsら（1979a）が、RAの異化にP450酵素が介することを最初に仮定してから知られている（Frolikら、1979；Robertsら、1979a）。さらに最近になって、発現が魚類のシトクロムの場合と同様にRAによって高度に誘導される、ヒトおよびマウスの完全長のP450RAIオーソログをコードするcDNAが単離されている（Fujiiら、1997；Rayら、1997）。ヒトおよびマウスのゲノムP450RAI-1配列、ならびにP450RAI-1をコードするマウスのcDNA配列は同定されている。ヒトのP450RAI-1のcDNA配列およびアミノ酸配列は、本明細書では、それぞれ配列番号：1および配列番号：2として同定される（図6Aも参照）。相同体は、ヒト、マウス、ニワトリ、およびツメガエルからも単離されており、いずれも配列が高度に保存されている（Abu-Abedら、1998；Hollermannら、1998；Whiteら、1997）。ヒトと魚類のP450RAI遺伝子には広範囲の同一性が認められており、全体としてアミノ酸レベルで68%である（マウスとヒトでは90%以上）。
【００１６】
MCF7細胞は、RA誘導性のRA代謝を示すことが報告されている（ButlerおよびFontana、1992；Woutersら、1992）。この細胞におけるP450RAIの発現は、RAが持続的に存在することに依存する（Whiteら、1997）。この知見は、RAによるP450RAIの調節が、RAの局所濃度を制限するように機能する自己制御フィードバックループを形成して、RAの正常な生理的濃度が過剰となった場合に、P450RAIの誘導がRA濃度を正常化するように作用することを示唆している。P450RAIがマウス胚で誘導的に発現されることは、類似の自己制御機構が、発生中にRA感受性組織に対する曝露を制限している可能性があることも示唆している（Iulianellaら、1999）。
【００１７】
別のレチノイン酸代謝性シトクロムP450であるP450RAI-2も、ヒト、ラット、マウス、およびゼブラフィッシュで最近同定された。ヒトのcDNA配列およびアミノ酸配列は、本明細書では、それぞれ配列番号：3および配列番号：4として同定される。
【００１８】
レチノイン酸、シトクロムP450、および胚の発生
全トランス-RAは、胚発生期における遺伝子発現、および成体上皮組織の維持の極めて重要な調節因子である（Gudasら（1994）；Lotan, R.M.（1995）；Lotan, R.（1996）；Morriss-Kay, G.M.（1996））。全トランス-RAの作用には、RAの9-シス異性体によって調節される、レチノイン酸の核受容体（RAR）、およびレチノイド-X受容体の異種二量体が関与する。組織特異的に個別に発現されるが、胚発生期および成体の両方において本質的にすべての細胞種で集団的に見出される、各受容体に対して3種類の異なるサブタイプが存在する（RARα、β、およびγ；RXR RARα、β、およびγ）（Chambon, P.（1995））。これらの組織におけるRAの活性は、たいていの場合、レチンアルデヒド（ALDH-1およびRALDH-2）からの合成に関与する酵素、および4-OH産物、4-オキソ産物、および18-OH産物（P450RAI）への異化に関与する酵素によって制御される（White J.A.ら（1997）；Iulianella, A.ら（1999）；McCaffery P.ら（1999）、Niederreither, K.ら（1999）Swindell, E.ら（1999））。
【００１９】
ゼブラフィッシュ、マウス、ヒト、ニワトリ、およびツメガエルのP450RAI-1（CYP26A）が、活性全トランス-RAの、4-OH-RA、4-オキソ-RA、および18-OH-RAを含む不活性極性代謝物への代謝に関与することが報告されている（White, J.ら（1997）；Swindell, E.ら（1999）；White, J.およびPetkovich, M.（1996）；Abu-Abedら（1998）；Fujii, H.ら（1997）；Ray, W.ら（1997）；Hollermann, Tら（1998））。P450RAI-1の発現は、多くの組織および細胞種において、全トランス-RAの前処理によって誘導される場合があり、この発現は、全トランス-RAの異化の上昇を伴う。MCF7細胞では、フィードバックループ機構を示唆する、すべての全トランス-RAは、全トランス-RAの持続的な存在に依存することから、全トランス-RA濃度の調節にフィードバックループ機構があることが示唆される（White, J.ら（1997））。P450RAI-1の誘導発現は、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ツメガエル、およびマウスの胚でもインビボで観察されており、上述の自己制御フィードバックループが、特定の発生中組織における全トランス-RA濃度の平衡維持に重要な役割を果たしていることが示唆されている。
【００２０】
複数のグループによる研究で、ニワトリ胚の神経褶（Swindell E.ら（1999））、マウスの尾側神経上皮（Iulianella, Aら（1999）；Fujii, H.ら（1997））、および発生期の網膜（McCaffery, P.ら（1999））などの組織が、P450RAI-1を構成的に発現することで、全トランス-RA曝露に対する防護壁を形成していることが報告されている。これらのモデルにおけるRALDH-2とP450RAI-1の発現パターンの比較から、これらの酵素が協同で作用して、RAの合成および活性の領域（RALDH-2の発現領域）を形成することが示唆されている。RALDH-2を発現する組織は、レチノイド反応性レポーター遺伝子活性の測定と、組織抽出物のRA濃度の直接測定の両方により、レチノイド活性を含むことが報告されており、かつ類似の解析によって、P450RAI-1を発現する組織がレチノイド活性を含まないことが報告されている（Iulianella, A.ら（1999）；McCaffery, P.ら（1999））。また、ツメガエル胚におけるP450RAI-1の過剰発現は、外部から投与したRAの催奇形作用を抑制することが報告されており、これは同酵素が異化に果たす役割と矛盾しない（Hollermann, T.ら（1998））。
【００２１】
副腎
副腎には、交感神経系の調節も受ける血圧、心拍数、発汗、および他の活動に影響するアドレナリン（エピネフリン）などのホルモンを分泌する内部（髄質）がある。外部（皮質）は、血圧、ならびに体内の塩類およびカリウムの濃度を制御するコルチコステロイド、アンドロゲン、および鉱質コルチコイドを含む多種多様なホルモンを分泌する。
【００２２】
副腎は、相互作用性ホルモンを産生する複雑な系の一部である。視床下部は、下垂体による、（副腎によるコルチコステロイドの産生を調節する）コルチコトロピンの分泌を誘導するコルチコトロピン放出ホルモンを産生する。副腎は、下垂体または視床下部が十分な量の適切なホルモンを産生できない場合に機能を停止する場合がある。任意の副腎ホルモンの産生低下または過剰産生は、重篤な疾患を招く恐れがある。副腎に関連した疾患には、アジソン病、クッシング症候群、褐色細胞腫、腺腫、高アルドステロン症、高血圧症、虚弱、麻痺、皮膚の黒化、骨粗鬆症、および脂肪蓄積などがある。
【発明の開示】
【００２３】
発明の概要
本発明は、シトクロムP450のレチノイン酸代謝ファミリーの一部を成す新しいシトクロムP450に関する。別の局面では、本発明の新しいシトクロムP450は、副腎で選択的に発現される。別の態様では、本発明の新しいシトクロムは13-全トランスレチノイン酸を代謝する。さらに別の態様では、本発明の新しいシトクロムは9-シスレチノイン酸を代謝する。
【００２４】
発明者らは、ヒトのシトクロムP450RAI-3（本明細書では「P450RAI-3」または「CYP26C」と記載）の特性を最初に明らかにした。一つの態様では、P450RAI-3はミクロソームのシトクロムである。一つの態様では、P450RAI-3は副腎組織から単離される。これらの知見は、シトクロムP450およびレチノイン酸の経路、ならびに、癌、腺腫、高血圧症、筋肉虚弱、皮膚変色、骨粗鬆症、脂肪蓄積、褐色細胞腫、アジソン病、クッシング症候群などの上述したような、さまざまな疾患状態への応用に関する理解を高める上で重要な意味をもつ。
【００２５】
本発明のP450RAI-3、およびこれをコードする核酸配列は、任意の組織から単離して特性を解析することができるが、好ましくは副腎組織から単離して特性を解析する。
【００２６】
したがって本発明は、P450RAI-3、好ましくはヒトP450RAI-3、およびこの変種、相同体、類似体、ならびにこの断片をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドに相補的な（アンチセンスの）ポリヌクレオチド配列も本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
好ましい態様では、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：9（図1）または配列番号：10（図2）に示す核酸配列を含むように提供される。最も好ましくは、精製されたポリヌクレオチドおよび単離されたポリヌクレオチドは以下を含む：（a）配列番号：9（図1）または配列番号：10（図2）に示す核酸配列、または配列番号：3（図3）のアミノ酸配列コードする核酸配列（TはUの場合もある）；（b）（a）に相補的な核酸配列；（c）（a）もしくは（b）に相同な核酸配列；または（d）（a）〜（c）とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリッドを形成する（a）〜（c）の断片。好ましくは、このような断片は10塩基またはこれ以上であり、好ましくは少なくとも15塩基であり、最も好ましくは20〜30塩基である。別の態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号：13、15、17、19、21、または23（アミノ酸領域については図5参照）、または配列番号：12、14、16、18、20、または22（図5参照）に記載された、P450RAI-3の第1〜6エキソンの、任意の1つまたは複数をコードする配列を含む。さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載された単離されたポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
本発明は、P450RAI-3ポリペプチドも含む。一つの態様では、本発明は、配列番号：11（図3）に記載されたアミノ酸配列、およびこの変種、相同体、ならびに類似体、挿入、欠失、置換、および変異を有するポリペプチドを提供する。本発明は、配列番号：11のアミノ酸配列（図3）の断片を含むポリペプチド、または個々の変種、相同体、類似体、挿入、欠失、置換、および変異も含む。別の態様では、断片は、好ましくは14残基またはこれ以上のアミノ酸残基を含み、最も好ましくは抗原性または免疫原性を有する。別の態様では、本発明は、配列番号：10（図2）の配列を有するポリヌクレオチドにコードされたポリペプチド、またはこの変種、相同体、類似体、または断片を提供する。別の態様では、本発明のポリペプチドは、配列番号：13、15、17、19、21、または23（図5参照）に示す、P450RAI-3の第1〜6エキソンの任意の1個または複数のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
したがって一つの態様では、本発明は、ベクター、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、または本発明のポリペプチドを発現可能な宿主細胞に関する。本発明のポリペプチドに対する抗体も本発明の範囲に含まれる。本発明はさらに、P450RAI-3ポリペプチド、および本発明のポリヌクレオチドを作製するための組換え法を提供する。一つの態様では、本発明は、適切な発現ベクター中で発現制御配列に使用可能に連結される、本発明のポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、活性化されて、ポリヌクレオチドにコードされるペプチドを発現することが可能であり、かつ適切な宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに使用可能である。このような形質転換された細胞、またはトランスフェクトされた細胞も本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドを用いる、本発明のポリペプチドの調製法も提供する。一つの態様では、このようなポリペプチド、好ましくはP450RAI-3の調製法は以下の段階を含むように提供される：（a）本発明のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階；（b）非形質転換宿主細胞から形質転換宿主細胞を選択する段階；（c）選択された形質転換宿主細胞を、タンパク質の発現を可能とする条件で培養する段階；ならびに（d）対象タンパク質を単離する段階。
【００３１】
さらに別の態様では、本発明は、P450RAI-3の遺伝子発現およびポリペプチドに関連した障害を検出またはスクリーニングするための診断法、およびこのような障害の治療法も含む。
【００３２】
したがって本発明は、動物におけるP450RAI-3が関連する条件の検出法も含む。P450RAI-3が関連した条件には、ビタミンAまたはレチノイン酸の代謝が関連した疾患が含まれるがこれらに限定されない。この方法は、このような条件になりうる動物から採取された生検試料、または他の細胞試料もしくは組織試料などの試料に由来するP450RAI-3のアッセイ法を行う段階を含む。一つの態様では、この方法は、P450RAI-3に結合する本発明の抗体を試料に接触させる段階、および試料中のP450RAI-3結合抗体の量または非反応抗体の量を測定する段階を含む。別の態様では、この方法は、対象核酸分子とハイブリッドを形成するヌクレオチドプローブ（好ましくはmRNAまたはcDNA）を試料に接触させて、ハイブリダイゼーション産物の形成を可能とする条件でハイブリダイゼーション産物を形成させる段階、およびハイブリダイゼーション産物のアッセイ法を行う段階を含む、P450RAI-3をコードする配列を有する核酸分子の有無の判定に関する。
【００３３】
本発明はさらに、本発明の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を含む、P450RAI-3関連条件を試料から検出するためのキットを含む。好ましくは、この用途に関する指示書も提供される。本発明のキットは、試料中のP450RAI-3タンパク質と抗体の結合に必要な試薬類も含む。
【００３４】
本発明は、対象核酸分子とハイブリッドを形成するヌクレオチドプローブ、ヌクレオチドプローブと核酸分子のハイブリダイゼーションに必要な試薬類、および使用法の指示書を含む、本発明のポリペプチドに関連するか、または類似のポリペプチドをコードする配列を有する、ポリペプチドの存在を検出するためのキットも提供する。
【００３５】
本発明は、P450RAI-3の結合相手を同定するためのスクリーニング法も含む。また本発明は、P450RAI-3活性の作動物質や拮抗物質などの修飾因子（modulator）を同定するためのスクリーニング法に関する。一つの態様では、P450RAI-3の活性または発現の、このような修飾因子は、P450RAI-3に対する抗体、およびP450RAI-3遺伝子に対するアンチセンスポリヌクレオチド、またはこの断片を含みうる。
【００３６】
本発明はさらに、P450RAI-3の発現を活性化、シミュレート、または阻害する、有効量の薬剤を、状況に応じて、治療を必要とする動物に対して投与する段階を含む、P450RAI-3の発現が関連した疾患を治療または予防する方法を提供する。好ましい態様では、P450RAI-3、治療的に活性なその断片、またはP450RAI-3の発現を活性化またはシミュレートする薬剤を、治療を必要とする動物に投与して、過剰なレチノイン酸が関連した疾患または条件の治療を行う。別の態様では、このような疾患は、P450RAI-3の過剰発現、またはレチノイン酸の不足（すなわちレチノイン酸が十分でない状態、またはレチノイン酸濃度の維持に望ましい状態）に関連し、また同治療法は、P450RAI-3の拮抗物質、P450RAI-3に対する抗体、この変異、またはP450RAI-3遺伝子の全体または一部に対するアンチセンス核酸分子などの、P450RAI-3の発現を抑制する有効量の薬剤の投与を含む。
【００３７】
別の態様では、本発明は、P450RAI-3活性の修飾因子、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。別の態様では、本発明の薬学的組成物は、P450RAI-3（好ましくは可溶化状態）、または治療的に有効なこの断片、および薬学的に許容される担体を含む。別の態様では、本発明の薬学的組成物は、P450RAI-3活性の修飾因子とP450RAI-3（好ましくは可溶化状態）の両方、または治療的に有効なこの断片を含む。別の態様では、本発明の薬学的組成物は、P450RAI-3の修飾因子、および（a）レチノイン酸、（b）P450RAI-3のリガンド（P450RAI-3の基質）の任意の1つまたは複数をさらに含む場合がある。
【００３８】
本発明は、以下の段階を含む、P450RAI-3活性の修飾因子の同定法も含む：
［a］P450RAI-3、またはP450RAI-3を発現する細胞を、被験化合物と、P450RAI-3の発現または活性を促進する条件でインキュベートする段階；
［b］場合に応じて、このような被験化合物の存在下におけるP450RAI-3の活性または発現を検出する段階（活性または発現の低下は、対象被験化合物がP450RAI-3の発現または活性の阻害物質であることを意味し、また発現または活性の上昇は、対象被験化合物がP450RAI-3の作動物質であることを意味する）。
【００３９】
本発明の別の局面は、以下の段階を含む、P450RAI-3の基質の同定法に関する：
［a］P450RAI-3を、被験基質と、P450RAI-3/基質複合体の形成または相互作用を促進する条件でインキュベートする段階；
［b］P450RAI-3/基質複合体の形成または相互作用を判定する段階。
このインキュベーション段階は、P450RAI-3の既知の修飾因子を選択的にさらに含む。段階［b］は、被験基質の存在下または非存在下で、P450RAI-3に及ぼす作用を比較することで判定することができる。
【００４０】
本発明の別の局面は、以下の段階を含む、本発明のタンパク質と結合する物質の同定法である：
（a）本発明のタンパク質を、同タンパク質と潜在的に結合可能な少なくとも1つの物質と、同物質とタンパク質の結合を可能とする条件で反応させる段階；および
（b）対象物質と結合したタンパク質を除去または検出する段階（結合状態のタンパク質と基質が検出されれば、対象物質がタンパク質と結合していることがわかる）。
【００４１】
本発明の別の態様は、物質とタンパク質の複合体の形成を可能とする条件下で、タンパク質および被験化合物と結合する物質とともにタンパク質を提供する段階、ならびに複合体を除去および/または検出する段階を含む、本発明のタンパク質の生物学的活性を調節する能力に関して化合物を評価する方法に関する。
【００４２】
本発明は、以下の段階を含む、P450RAI-3タンパク質の相互作用の阻害物質の同定法にも関する：
（a）P450RAI-3関連タンパク質、および関連タンパク質に結合するか、または少なくともその一部が相互作用する物質を含む反応混合物を提供する段階；
（b）反応混合物に、1つまたは複数の被験化合物を接触させる段階；
（c）P450RAI-3関連タンパク質と物質の相互作用を阻害する化合物を同定する段階。
【００４３】
本発明は、以下の段階を含む、生物試料中に配列番号：40のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子の検出法も含む：
（a）請求項1記載の核酸分子と生物試料の核酸のハイブリッドを形成することで、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる段階；ならびに
（b）ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階（ハイブリダイゼーション複合体の存在は、生物試料に含まれるタンパク質をコードする核酸分子の存在と相関する）。
【００４４】
本発明は、生物試料の核酸を、ハイブリッド形成段階に先立ってポリメラーゼ連鎖反応で増幅させる、請求項50記載の方法も含む。
【００４５】
（a）本発明は、先行するいずれかの特許請求の範囲で主張される1つまたは複数の核酸分子もしくはタンパク質、または方法で同定される物質もしくは化合物、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む組成物も含む。本発明は、本発明のタンパク質、または本発明の核酸分子が関連する条件を治療するために薬学的組成物を調製する際における、本発明の核酸分子またはタンパク質、または本発明の方法で同定される物質もしくは化合物も含む。
【００４６】
本発明は、本発明の方法で同定される化合物を含む。
【００４７】
本発明の別の局面は、ワクチンを投与する対象となる被験者における、本発明のタンパク質に対する抗体の産生を刺激もしくは促進するためのワクチンを含む。本発明は、被験者における、タンパク質に対する抗体の産生を刺激または促進する方法も含む。本発明は、本発明のワクチンを、抗体産生を刺激または促進する有効な用量で被験者に投与する方法を含む。
【００４８】
本発明は、薬学的物質を調製するための、本発明の単離されたポリペプチドの用途、および選択的にP450RAI-3活性の修飾因子の用途も含む。本発明は、P450RAI-3の発現が関与する医学的条件を予防、治療、または緩和するための、治療的有効量の本発明のポリペプチド、または本発明のポリヌクレオチド、および/またはP450RAI-3の修飾因子の用途も含む。
【００４９】
本発明は、ビタミンAまたはレチノイン酸代謝に関与する疾患または条件の患者を治療するための、治療的に有効な本発明のポリペプチド、および/またはその作動物質の用途を含む。
【００５０】
本発明は、P450RAI-3の発現が関連する医学的条件を予防、治療、または緩和するための、または薬学的物質を調製するための、P450RAI-3阻害物質、およびP450RAI-3基質の用途も含む。
【００５１】
本発明の別の態様は、以下の段階を含む、本発明のポリペプチドによるATRAおよび/または9-シス-RAの代謝活性を決定する方法に関する：本発明のポリペプチドを宿主細胞で発現させる段階、ATRAおよび/または9-シス-RAを細胞に添加する段階、ならびにATRAおよび/または9-シス-RAの代謝量および/または代謝速度を決定する段階。
【００５２】
本発明の別の態様は、以下の段階を含む、本発明のポリペプチドの基質を決定する方法に関する：本発明のポリペプチドを宿主細胞で発現させる段階、候補基質を添加する段階、および対象基質が代謝されるか否かを判定する段階（代謝されることは、候補基質が本発明のポリペプチドの基質であることを示す）。
【００５３】
本発明は、本発明のポリペプチドを宿主細胞で発現させる段階、候補基質を添加する段階、およびKd値を決定する段階を含む、本発明のポリペプチドに対する基質の結合活性の判定法にも関する。
【００５４】
本発明の他の目的、特性、および利点は、以下の詳細な説明によって明らかになる。しかし、詳細な説明、および具体的な実施例は、本発明の好ましい態様を示しながらも、説明目的のみで挙げられていることを理解すべきである。本発明の精神および範囲に含まれる、さまざまな変更および修正は、詳細な説明によって当業者に明らかになる。
【００５５】
発明の詳細な説明
本発明では、当技術分野における従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術の知見を用いる。このような手法は文献で詳しく説明されている。例えばSambrook、Fritch、およびManiatis、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版（1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.）；DNA Cloning：A practical Approach、第I巻および第II巻（D.N. Glover編、1985）；Oligonucleotide Synthesis（M.J. Gait編、1984）；Nucleic Acid Hybridization、B.D. HamesおよびS.J. Higgens編（1985）；Transcription and Translation、B.D. HamesおよびS.J. Higgins編（1984）；Animal Cell Culture、R.I. Freshney編（1986）；Immobilized Cells and enzymes、IRL Press（1986）；ならびにB. Perbal、A practical Guide to Molecular Cloning（1984）を参照されたい。
【００５６】
以下の定義は、本出願で使用される用語の理解を促すために提供する。
【００５７】
アミノ酸残基の省略形は、当技術分野で用いられる、20種類の一般的なL型アミノ酸の1種を意味する標準的な3文字コードおよび/または1文字コードである。核酸に関する同様の省略形は、当技術分野で使用される標準コードである。
【００５８】
本発明では「単離された」という表現は、元の環境（例えば天然の場合であれば自然環境）から除去された材料を意味するので、自然状態から「人の手によって」変化される。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、ベクターもしくは組成物の一部の場合があるほか、ベクター、組成物、または特定の細胞が、対象ポリヌクレオチドの元の環境ではないことから、細胞に含まれていながら「単離された」状態の場合がある。しかし、本発明において単離されたポリヌクレオチドは染色体を含まない。
【００５９】
本発明では「分泌された」タンパク質という表現は、シグナル配列の作用の結果としてER、分泌小胞、または細胞外空間に向かう能力をもつタンパク質、ならびにシグナル配列を必ずしも含むことなく細胞外空間に放出されるタンパク質を意味する。分泌型タンパク質が細胞外空間に放出されると、分泌型タンパク質は、細胞外プロセシングを受けて成熟タンパク質となる場合がある。細胞外空間への放出は、エキソサイトーシスやタンパク質分解による切断を含む多くの機構で起こる場合がある。
【００６０】
対象ポリペプチドの「作動物質」という表現は、ポリペプチド（例えばP450RAI-3）と直接的または間接的に相互作用し、ポリペプチドの活性を維持または増大させる化合物を意味する。作動物質は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、または他の任意の分子を含む場合がある。作動物質は、P450RAI-3に由来する分子、またはその基質もしくはリガンドも含む。特定のペプチドの構造的特徴を模倣するように設計された物理的構造をもつ合成分子であるペプチド模倣物質は、作動物質として機能する場合がある。刺激は直接的もしくは間接的の場合があるほか、競合的機構もしくは非競合的機構による場合がある。
【００６１】
本明細書で用いる、関心対象のポリペプチド（例えばP450RAI-3）の「拮抗物質」という表現は、対象ポリペプチドの活性を維持または阻害しない化合物を意味する。拮抗物質は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、または他の任意の分子を含む場合がある。拮抗物質は、P450RAI-3に由来する分子、またはこの基質もしくはリガンドも含む。特定のペプチドの構造的特徴を模倣するように設計された物理的構造をもつ合成分子であるペプチド模倣物質は、拮抗物質として機能する場合がある。阻害は直接的もしくは間接的の場合があるほか、競合的機構もしくは非競合的機構による場合がある。
【００６２】
「ペプチド模倣物質」は、分子間の相互作用においてペプチドの代用物として作用する構造体である（総説としてMorganら（1989）、Ann.Reports Med.Chem. 24：243-252を参照）。ペプチド模倣物質は、アミノ酸および/またはペプチド結合を含む場合も含まない場合もあるが、本発明のペプチド、または作動物質もしくは拮抗物質（促進物質もしくは阻害物質）の構造特性および機能特性を保持する合成構造体を含む。ペプチド模倣物質は、ペプトイド、オリゴペプトイド（Simonら（1972）、Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：9367）；および本発明のモチーフ、ペプチド、または作動物質もしくは拮抗物質（促進物質もしくは阻害物質）に対応する、可能なあらゆる配列のアミノ酸を示す、設計された長さのペプチドを含むペプチドライブラリーも含む。
【００６３】
「相互作用する」、「相互作用」、または「相互作用している」という表現は、タンパク質や、脂質、炭水化物、ヌクレオチドなどの他の分子と、他の細胞代謝物質との間の任意の物理的結合を意味する。相互作用の例には、タンパク質-タンパク質相互作用、タンパク質-脂質相互作用、および脂質-脂質相互作用などがある。この表現は好ましくは、例えば静電的結合、疎水結合、イオン結合、および/または水素結合の相互作用による、生理的条件における2分子間における安定な結合を意味する。ある種の相互作用性分子または結合状態の分子は、その1つまたは複数が刺激（例えばリン酸化）を受けた後にのみ相互作用する。タンパク質と他の細胞性分子間の相互作用は、直接的な場合もあれば間接的な場合もある。当技術分野で周知のさまざまな方法で、相互作用のレベルを測定することができる。例えば、共有結合の強度は、任意の数の結合を破壊するために必要なエネルギーを指標として測定することができる。
【００６４】
本明細書で用いる「P450RAI-3」または「CYP26C」はいずれも、本発明の、新しいシトクロムP450レチノイン酸誘導性タンパク質を意味する。
【００６５】
ii）P450RAI-3のポリヌクレオチドおよびポリペプチド
本発明は、新しいシトクロムP450のポリペプチドであるP450RAI-3、およびこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の新しいシトクロムのポリペプチドおよびポリヌクレオチドの断片および修飾（または変種）、ならびにこの明らかな化学的等価物も本発明の範囲に含まれる。
【００６６】
発明者らは、ヒトP450RAI-3、およびこれをコードするポリヌクレオチドを単離した。P450RAI-3の発現は副腎で認められた。ゲノムのヌクレオチド配列、またはP450RAI-3を図1（配列番号：9）に示す。cDNAのコード配列を図2（配列番号：10）に示す。これは長さが1569ヌクレオチドで、図3（配列番号：11）に示す配列である、522アミノ酸残基のポリペプチドをコードする読み枠を含む。P450RAI-3の特定のエキソン（第1エキソン、第4エキソン、第5エキソン、および第6エキソン）は、長さが160,532 bpのポリヌクレオチド配列であるゲノムクローンAL358613.4から最初に同定された。発明者らは、全cDNA配列を同定し、その機能を決定した。
【００６７】
P450RAI-3タンパク質の高い発現はヒトの副腎で認められた。この結果は、P450RAI-3が、副腎におけるレチノイン酸の代謝、および関連する条件に役割を果たす可能性があることを示唆している。
【００６８】
P450RAI-3は、レチノイン酸代謝に関連する条件などのさまざまな条件を含む、一般的な生理的過程に利用されている。P450RAI-3は、全トランスレチノイン酸（ATRA）を極性代謝物に代謝する。9-シス-RAはP450RAI-3活性と強く競合する（ID50 1μM）が、ケトコナゾールは弱い阻害物質である（ID50 70μM）。P450RAI-3は、ATRAならびに9-シス-RAを、ヒドロキシ代謝物およびオキソ代謝物に代謝する。レチノール（ビタミンA）およびレチナールは、CYP26-Cの基質ではない。
【００６９】
P450RAI-3は、アミノ酸レベルにおける同一性がP450RAI-1との間で約43%で、P450RAI-2との間で51%であることが報告されている。核酸レベルでは、P450RAI-3はP450RAI-1およびP450RAI-2とそれぞれ52%および61%の相同性をもつ。
【００７０】
シトクロムP450は、推定ファミリーの特徴
2005512511.tif 000002
（Xは任意の残基を意味し、保存されている残基を太字で示す（配列番号：1））を含むヘム結合タンパク質である（Nelson, D.R.、Methods in Molecular Biology、第107巻：Cytochrome P450 Protocols、Cytochrome P450 Nomenclature、pp.15-24、Phillips, I.R.およびShephard, E.A.編、Humana Press Inc.、Totowa、NJ（1998））。P450RAI-3のヘム結合の特徴は、図3のアミノ酸452〜461位に認められ、モチーフ
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を含む。
【００７１】
ミオグロビン、ヘモグロビン、およびシトクロムなどのヘム結合タンパク質は、呼吸や解毒作用などの複数の細胞過程に重要な役割を果たす。例えばミオグロビンまたはヘモグロビンのもつ酸素結合能力は、ヘム基の存在に依存する。ヘムは、有機性部分と鉄原子から構成される。ヘム中の鉄原子は、第一鉄（+2）と第二鉄（+3）のいずれかの状態をとるが、+2酸化状態の鉄原子を含むヘムのみが酸素に結合する（総説は例えばStryer、Biochemistry（第3版）、W.H. Freeman社、New York、pp.144、および404-405（1988）を参照）。
【００７２】
シトクロムP450は、フェノバルビタール、コデイン、およびモルヒネなどの毒性物質（生体異物）の酸化による解毒作用に重要な役割を果たす。これは、酸化酵素として機能することを可能とする、P450のもつ、ヘムおよび酸素に結合する能力である（総説は例えばDarnelleら、Molecular Cell Biology（第2版）、W.H. Freemand社、New York、pp.397および981-982（1990）を参照）。したがって、ヘム結合モチーフまたは酸素結合ドメイン、および関連する活性および機能を含むP450RAI-3のペプチドも本発明の対象となる。
【００７３】
図2に示すP450RAI-3のcDNA配列（配列番号：10）は、P450RAI-3のcDNA配列に含まれる核酸配列を検出するめの核酸ハイブリダイゼーション用プローブを設計する際に有用である。このようなプローブは、生物試料中の核酸分子ともハイブリッドを形成するので、本発明のさまざまな法医学的および診断的な方法が可能となる。同様に、図3（配列番号：11）に開示されているようなP450RAI-3のアミノ酸配列から同定されるポリペプチドは、P450RAI-3に特異的に結合する抗体の作製に使用することができる。
【００７４】
これにもかかわらず、配列決定反応で決定されたDNA配列は、配列決定時の誤りを含む場合がある。誤りは、決定されたDNA配列中で、誤同定されたヌクレオチド、または配列中におけるヌクレオチドの挿入もしくは欠失として存在する。誤って挿入されたり失われたりしたヌクレオチドは、推定アミノ酸配列の読み枠にフレームシフトを引き起こす。この場合、推定アミノ酸配列は、決定されたDNA配列が実際のDNA配列と99.9%以上同一であっても、実際のアミノ酸配列とは異なる。例えば、1000塩基を上回る読み枠中に1塩基の挿入または欠失がある。
【００７５】
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の精度を必要とする応用に関しては、本発明は、図2（配列番号：10）の決定されたP450RAI-3ヌクレオチド配列、および図3（配列番号：11）の推定翻訳アミノ酸配列を提供する。
【００７６】
本発明は、P450RAI-3遺伝子、および図1（ゲノムDNA（配列番号：9））、または図2（cDNA（配列番号：10））に対応する遺伝子にも関する。P450RAI-3遺伝子は、本明細書で開示された配列情報を用いて既知の方法で単離することができる。このような方法は、開示された配列からプローブまたはプライマーを調製する段階、およびゲノム材料の適切な供給源からP450RAI-3遺伝子を同定または増幅する段階を含む。
【００７７】
本発明には、ヒトP450RAI-3の相同体も含まれる。相同体種は、本明細書に提供された配列から適切なプローブまたはプライマーを作製し、また所望の相同体に対する適切な核酸供給源のスクリーニングを行うことで単離および同定することができる。
【００７８】
本明細書で用いられ、また本発明の範囲に含まれる、P450RAI-3の「核酸」もしくは「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」という表現は、図1（配列番号：9）の核酸配列、または図2（配列番号：10）の配列などの、そのコード領域を有する分子を意味する。例えば、P450RAI-3のポリヌクレオチドは、完全長のcDNA配列のヌクレオチド配列、ならびに同核酸の断片、エピトーム（epitomes）、ドメイン、および変種を含む場合がある。また、本明細書で用いるP450RAI-3の「ポリペプチド」という表現は、広く定義されたポリヌクレオチドから作製された翻訳アミノ酸配列を有する分子、および好ましくは図3の配列（配列番号：11）を有する分子を意味する。
【００７９】
P450RAI-3の「ポリヌクレオチド」という表現は、P450RAI-3のポリペプチド、およびこれに強く関連するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドも意味する。
【００８０】
P450RAI-3の「ポリヌクレオチド」という表現は、図3（配列番号：11）のアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド、または、生化学的に活性なその断片（明らかな化学的同等物を含む）も意味する。
【００８１】
P450RAI-3ポリヌクレオチドは、遺伝暗号の縮重のために本発明の任意のポリヌクレオチドとはコドン配列が異なるポリヌクレオチドも含む（このようなポリヌクレオチドは機能的に同等のポリペプチドをコードするが、配列は、遺伝暗号の縮重のために上記の配列とは異なる）。
【００８２】
P450RAI-3の「ポリヌクレオチド」は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、図1（配列番号：9）もしくは図2（配列番号：10）に記載されたポリヌクレオチド配列、またはこれらの相補物とハイブリッドを形成する能力をもつポリヌクレオチドも含む。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という表現は、50%ホルムアミド、5×SSC（750 mM NaCl、75 mM クエン酸ナトリウム）、50 mM リン酸ナトリウム（pH 7.6）、5×デンハルト液、10% 硫酸デキストラン、および20 μg/ml 変性せん断サケ精子DNAを含む溶液中における一晩のインキュベーション（42℃）と、これに続く0.1×SSC中におけるフィルターの洗浄（約65℃）を意味する。
【００８３】
ポリA+配列（cDNAの任意の3'末端のポリA+の連続など）、またはT残基（またはU）残基の相補的な鎖（stretch）とのみハイブリッドを形成するポリヌクレオチドが「ポリヌクレオチド」の定義に含まれないことは言うまでもない。というのは、このようなポリヌクレオチドは、ポリ(A)の連続、またはこの相補物を含む任意の核酸分子（例えば実際的には任意の2本鎖cDNAクローン）とハイブリッドを形成すると考えられるからである。
【００８４】
P450RAI-3のポリヌクレオチドは、非修飾のRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAもしくはDNAの場合がある、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを含む場合がある。したがって、本明細書で「T」と記載された配列は「U」でもありうる。例えば、P450RAI-3のポリヌクレオチドは、1本鎖DNAと2本鎖DNA、1本鎖DNAと2本鎖DNAの混合物であるDNA、1本鎖領域と2本鎖領域の混合物であるDNA、1本鎖RNAと2本鎖RNA、および1本鎖領域と2本鎖領域の混合物であるRNA、1本鎖、もしくはより典型的には2本鎖、または1本鎖領域と2本鎖領域の混合物の場合があるDNAおよびRNAを含むハイブリッド分子を含む場合がある。また、P450RAI-3のポリヌクレオチド、またはこのハイブリッドは、RNAもしくはDNA、またはRNAとDNAの両方を含む3本鎖領域を含む場合がある。
【００８５】
またP450RAI-3のポリヌクレオチドは、1個または複数の修飾塩基、または安定性もしくは他の理由のために修飾されたDNAもしくはRNAのバックボーンを含む場合がある。「修飾型」塩基は、例えばトリチウム化された塩基、またイノシンなどの通常とは異なる塩基を含む。さまざまな修飾をDNAやRNAに施すことができるので、「ポリヌクレオチド」という表現は、化学的に修飾された状態、酵素的に修飾された状態、または代謝的に修飾された状態を含む。修飾された状態は、修飾が本明細書に記載された配列の有用性を変化させない、本発明のポリヌクレオチド配列の類似体も含む。一つの態様では、修飾された配列または類似体では、非修飾配列に対して性質が改善されている。
【００８６】
本発明の範囲に含まれる類似体を調製するための修飾の一例は、図1または図2（配列番号：9または10）に記載された配列の天然の塩基（アデニン、グアニン、シトシン、またはチミジン）の一つを、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、6-メチル、2-プロピル、および他のアルキルアデニン、5-ハロウラシル、5-ハロシトシン、6-アザウラシル、6-アザシトシン、および6-アザチミン、プソイドウラシル、4-チオウラシル、8-ハロアデニン、8-アミノアデニン、8-チオールアデニン、8-チオールアルキルアデニン、8-ヒドロキシルアデニン、および他の8-置換アデニン、8-ハログアニン、8-アミノグアニン、8-チオールグアニン、8-チオールアルキルグアニン、8-ヒドロキシルグアニン、ならびに他の8-置換グアニン、他のアザウラシルおよびデアザウラシル、チミジン、シトシン、アデニン、またはグアニン、5-トリフルオロメチルウラシル、ならびに5-トリフルオロシトシンなどの修飾型塩基と置換することである。
【００８７】
修飾の別の例は、修飾型のリンまたは酸素のヘテロ原子を、図1または2（配列番号：9または10）に記載された、核酸分子内のリン酸バックボーン、短鎖アルキル、またはシクロアルキル糖鎖間結合、または短鎖ヘテロ原子、もしくは複素環の糖鎖間結合に含めることである。例えば、このような核酸配列は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、およびホスホロジチオエートを含む場合がある。
【００８８】
本発明の核酸分子の類似体の他の例は、DNA（もしくはRNA）中のデオキシリボース（もしくはリボース）リン酸バックボーンが、ペプチド中に認められるものと類似のポリアミドバックボーンと置換されたペプチド核酸（PNA）である（P.E. Nielsenら、Science 1991、254、1497）。PNA類似体は、酵素による分解に耐性をもつこと、またインビボおよびインビトロで長い寿命をもつことが報告されている。PNAは、PNA鎖とDNA鎖の間における電荷の反発を欠くために、相補的なDNA配列にも強く結合する。他の核酸類似体には、重合体バックボーン、環式バックボーン、または非環式バックボーンを含むヌクレオチドなどがある。例えば、このようなヌクレオチドは、モルホリノバックボーン構造をとる場合がある（米国特許第5,034,506号）。このような類似体は、核酸配列の薬物動態学的特性または薬力学的特性を改善するレポーター基などの官能基を含む場合もある。
【００８９】
本発明のP450RAI-3ポリペプチドは、ペプチド結合または修飾型ペプチド結合（ポリヌクレオチドアイソスター）で相互に連結されたアミノ酸を含む場合があり、また遺伝子にコードされている20種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含む場合がある。本発明のP450RAI-3ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然の過程で修飾される場合があるほか、当技術分野で周知の化学的修飾法で修飾することができる。このような修飾については、基本文献、研究用マニュアル、および研究文献で説明されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含む、P450RAI-3のどの位置でも生じる可能性がある。同じ型の修飾が、同じ程度か異なる程度で、任意のP450RAI-3ポリペプチドの複数の部位に存在する場合があることは言うまでもない。また、任意のP450RAI-3は、多くの型の修飾を含む場合がある。このような修飾は、翻訳後の天然の過程によって生じたり、合成法で作製されたりする場合がある。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、ジスルフィド結合の遊離システインへの還元、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（pegylation）、タンパク質分解性のプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移RNAによるアミノ酸のタンパク質への付加（アルギニル化など）、およびユビキチン化などがある（例えばProteins-Structure and Molecular Properties、第2版、T.E. Creighton、W.H. Freeman and Company、New York（1993）；Post-Translational Covalent Modification of Proteins、B.C. Johnson編、Academic Press、New York、p.1-12（1983）；Seifterら、Methods in Enzymology、182：626-646（1990）；Rattanら、Ann.NY Acad.Sci. 663：48-62（1992）を参照）。
【００９０】
用量依存性を示す場合もあれば示さない場合もある、任意の生物学的アッセイ法で測定される、成熟型を含むP450RAI-3のポリペプチドの活性に似ているが、必ずしも同一ではない活性を示すP450RAI-3も本発明の範囲に含まれる。用量依存性が存在する場合、これはP450RAI-3のポリペプチドに同一である必要はなく、むしろP450RAI-3ポリペプチドと比較した際に、所与の活性における用量依存性に実質的に類似していればよい。例えば、候補ポリペプチドは、P450RAI-3のポリペプチドに対して大きな活性、またはせいぜい約25倍未満の活性、また好ましくはせいぜい約10倍未満の活性、また最も好ましくはせいぜい約3倍未満の活性を示す。
【００９１】
このP450RAI-3ポリペプチドは、生物学的活性を保持する一次タンパク質のさまざまな構造状態を含む場合がある。例えば本発明のポリペプチドは、酸性または塩基性の塩の状態、または中性状態の場合がある。本発明のポリペプチドは、成熟型を含む、分泌型タンパク質の形状（融合タンパク質または可溶化状態の本発明のタンパク質を含む場合がある）をとりうるほか、融合タンパク質などの、より大きなタンパク質の一部の場合がある。分泌配列またはリーダー配列、プロ配列、精製を容易にする配列（複数のヒスチジン残基など）、または組換え体作製時の安定化に寄与する別の配列を含む、別のアミノ酸配列を含めることで有利となる場合がある。
【００９２】
P450RAI-3ポリペプチドは、好ましくは、単離された状態で提供され、また好ましくは実質的に精製された状態である。組換えによって作製されたバージョンのP450RAI-3ポリペプチド（分泌タンパク質になるように遺伝的に修飾される場合は分泌型ポリペプチドを含む）は、SmithおよびJohnson、Gene 67：31-40（1988）に記載される1段階の方法で実質的に精製することができる。P450RAI-3のポリペプチドは、天然の供給源または組換え体の供給源から、当技術分野で周知の方法において本発明のポリペプチドに対する本発明の抗体を用いて精製することもできる。
【００９３】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、当業者に周知の手段などの任意の適切な手段で調製することができる。このような方法には、天然のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離する方法、組換え的または合成的/化学的にポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを作製する方法、またはこれらの方法を組み合わせた方法がある。
【００９４】
DNAを含む本発明の単離された核酸分子は、図1または図2（配列番号：9または10）に示された核酸配列の全体または一部に基づく標識核酸プローブを調製することによって、かつ、このような標識核酸プローブを用いて適切なDNAライブラリー（例えばcDNAライブラリーやゲノムDNAライブラリー）のスクリーニングを行うことによって単離することができる。例えば、単離されたゲノムライブラリーを使用して、標識されたプローブでライブラリーのスクリーニングを標準的な手法で行うことで、本発明の新しいタンパク質をコードするDNAを単離することができる。cDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーのスクリーニングで単離された核酸の配列は標準的な手法で決定することができる。
【００９５】
本発明の単離された核酸分子（DNA）は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法で、cDNAまたはゲノムDNAを用いて、本発明の新しいタンパク質をコードする核酸を選択的に増幅することで単離することもできる。図1または図2（配列番号：9または10）に示した核酸配列から、PCRに用いるための合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計することが可能である。核酸は、上記オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なPCR増幅法でcDNAまたはゲノムDNAから増幅することができる。このような核酸を増幅して、適切なベクターにクローン化して、DNA配列解析で特徴を明らかにすることができる。cDNAが、全細胞mRNAをさまざまな手法、例えばChirgwinら、Biochemistry、18、5294-5299（1979）に記載されたチオシアン酸グアニジウム抽出法で単離することにより、mRNAから調製できることは言うまでもない。次にcDNAをmRNAから逆転写酵素（例えばGibco/BRL、Bethesda、MDから入手可能なMoloney MLV逆転写酵素、またはSeikagaku America, Inc.、St. Petersburg、FLから入手可能なAMV逆転写酵素）を用いて合成する。
【００９６】
本発明の単離された核酸分子（RNA）は、cDNAの転写を可能にすることで本発明のタンパク質をコードするRNA分子が得られる、本発明の新しいタンパク質をコードするcDNAを適切なベクターにクローニングすることで単離することができる。例えばcDNAは、ベクター中のバクテリオファージのプロモーター（例えばT7プロモーター）の下流にクローン化し、cDNAをT7ポリメラーゼによりインビトロで転写することが可能であり、結果として得られたRNAは標準的な手法で単離することができる。
【００９７】
本発明の核酸分子は、標準的な手法で化学的に合成することもできる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する、ペプチド合成のような固相合成法を含むさまざまな方法が知られており、市販のDNA合成装置で完全に自動化されている（例えばItakuraら、米国特許第4,598,049号；Caruthersら、米国特許第4,458,066号；およびItakura、米国特許第4,401,796号、および第4,373,071号を参照）。
【００９８】
特定の核酸分子が、本発明の新しいタンパク質をコードするか否かの判定は、cDNAを適切な宿主細胞内で標準的な手法で発現させ、対象タンパク質の活性を本明細書に記載された方法で検討することで達成することができる。このように単離された、本発明の新しいタンパク質の活性を有するcDNAの配列は、ジデオキシヌクレオチド鎖停止法、またはマキサムギルバート化学配列決定法などの標準的な手法によるか、または自動DNA配列決定法で決定することによって、核酸配列、およびコードされているタンパク質の推定アミノ酸配列を判定することができる。
【００９９】
本発明の核酸分子の開始コドン、および非翻訳配列は、専用のPC/Gene（IntelliGenetics Inc.、カリフォルニア州）などの現在利用可能なコンピュータソフトウェアで決定することができる。調節因子は、従来の手法で同定することができる。このような因子の機能は、因子に動作可能に連結されたレポーター遺伝子を、同エレメントによって発現させることで確認することができる。このような構築物は、培養細胞に標準的な手順で導入することができる。DNA中の調節因子を同定することに加えて、このような構築物を用いて、因子と相互作用するタンパク質を、当技術分野で周知の手法で同定することができる。
【０１００】
本発明の核酸分子の配列を、転写の通常表示に対して反転させることでアンチセンス核酸分子が得られる。「アンチセンス」核酸分子という表現は、その標的に相補的なヌクレオチド配列を意味する。好ましくはアンチセンス配列は、先行する領域を反転させるか、または開始コドンまたは非保存領域を標的にすることにより構築される。別の態様では、このようなアンチセンス配列は、P450RAI-3をコードするmRNAまたはcDNAの全体または一部を標的とする。特に、本発明の核酸分子、またはこの断片、好ましくは図1または図2（配列番号：9または10）に記載された核酸配列に含まれる核酸配列は、転写の通常表示に対して反転させることでアンチセンス核酸分子が得られる。一つの態様では、このようなアンチセンス分子を用いて、P450RAI-3の発現、および/またはレチノイン酸の代謝を抑制することができる。
【０１０１】
本発明のアンチセンス核酸分子、またはその断片は、天然のヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を高めるように、またはmRNAもしくは天然の遺伝子と形成される2本鎖の物理的安定性を高めるように設計された、さまざまに修飾されたヌクレオチド（例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を用いて化学的に合成することができる。本発明のアンチセンス配列は、効率の高い調節領域の制御下でアンチセンス配列が作られる、組換えプラスミド、ファージミド、または減弱化ウイルスの形態で細胞に導入される、発現ベクターを用いて生物学的に作製することができ、その活性を、ベクターを導入する細胞種によって決定することができる。
【０１０２】
本発明は、本発明の新しいタンパク質、および選択されたタンパク質、または選択マーカータンパク質（後述）を含む融合タンパク質をコードする核酸も提供する。
【０１０３】
本発明のタンパク質（修飾、変異、切り詰め、挿入、類似体、融合タンパク質などを含む）は、組換えDNA技術で調製することができる。これらのタンパク質は、当技術分野で周知の手法で、さまざまな程度に精製または単離することができる。したがって、本発明のタンパク質をコードする配列を有する本発明の核酸分子は、当技術分野で周知の手順で、タンパク質の良好な発現を確実にする適切な発現ベクターに導入することができる。可能な発現ベクターは、使用される宿主細胞とベクターが互換性をもつ限りにおいて、コスミド、プラスミド、または修飾型ウイルス（例えば、複製欠損型のレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）を含むがこれらに限定されない。「宿主細胞の形質転換に適したベクター」の発現という表現は、発現ベクターが、本発明の核酸分子、および、発現に使用される宿主細胞を元に選択され、核酸分子に動作可能に連結される、調節配列を含むことを意味する。「動作可能に連結される」という表現は、対象核酸が、核酸の発現を可能とするように調節配列に連結されることを意味する。
【０１０４】
したがって本発明は、本発明の核酸分子、またはこの断片、および挿入タンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要な調節配列を含む、本発明の組換え発現ベクターを対象とする。適切な調節配列は、細菌、真菌、またはウイルスの遺伝子群を含む、さまざまな供給源に由来する場合がある（例えばGoeddel、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、CA（1990）に記載された調節配列を参照）。適切な調節配列の選択は、選択される宿主細胞に依存し、当業者であれば容易に達成することができる。このような調節配列の例には、転写のプロモーターおよびエンハンサー、またはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列（翻訳開始シグナルを含む）などの配列がある。また、選択される宿主細胞、および使用するベクターに応じて、複製起点、追加的なDNA制限酵素切断部位、エンハンサー、および転写を誘導する配列などの他の配列を、発現ベクターに組み入れることができる。必要な調節配列が、天然のタンパク質、および/またはその隣接領域から提供される場合があることは言うまでもない。
【０１０５】
本発明はさらに、発現ベクターにアンチセンス方向にクローン化された本発明のDNA核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわちこのようなDNA分子は、DNA分子の転写により、図1または図2（配列番号：9または10）に示されたヌクレオチド、またはこの断片を含むヌクレオチド配列に対してアンチセンスであるRNA分子の発現を可能とするように、調節配列に動作可能に連結される。アンチセンス核酸に動作可能に連結される調節配列は、アンチセンスRNA分子の連続的な発現を誘導するように選択することができる。
【０１０６】
本発明の組換え発現ベクターには、本発明の組換え分子で形質転換された宿主細胞、またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含めることもできる。選択マーカー遺伝子の例には、G418やハイグロマイシンなどの特定の薬剤に対する耐性もたらすタンパク質をコードする遺伝子がある。使用可能な他のマーカーの例には、緑色蛍光タンパク質（GFP）、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルのルシフェラーゼなどがある。選択マーカー遺伝子の転写は、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルのルシフェラーゼなどの選択マーカータンパク質の濃度変化によって追跡することができる。選択マーカー遺伝子が、ネオマイシン耐性などの抗生物質耐性をもたらすタンパク質をコードする場合、形質転換細胞はG418で選択可能である。選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する。このため、本発明の組換え発現ベクターの発現を可視化すること、およびアッセイ法を行うこと、また特に変異が発現および表現型に及ぼす作用を決定することが可能となる。選択可能なマーカーを、関心対象の核酸に由来する別のベクター上に導入できることは言うまでもない。
【０１０７】
組換え発現ベクターには、組換えタンパク質の発現の上昇や、組換えタンパク質の溶解性の上昇をもたらし、ならびにアフィニティ精製時のリガンドとして作用することで標的組換えタンパク質の精製を容易にする融合部分をコードする遺伝子群を含めることもできる。例えば、タンパク質分解によって切断される部位を標的組換えタンパク質に追加することで、融合タンパク質の精製後に、組換えタンパク質と融合部分の分離が可能となる。
【０１０８】
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入することで、形質転換された宿主細胞を作製することができる。「形質転換された宿主細胞」という表現は、本発明の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、原核細胞および真核細胞を含むことを意味する。「〜で形質転換された」、「〜でトランスフェクトされた」、「形質転換」、および「トランスフェクション」という表現は、核酸（例えばベクター）を、当技術分野で周知の多くの可能な手法の一つにより細胞に導入することを含むことを意図する。原核細胞は、例えばエレクトロポレーション法、または塩化カルシウムを用いる形質転換法によって核酸で形質転換することができる。核酸は、哺乳類細胞に、カルシウムリン酸法、または塩化カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストランによるトランスフェクション法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、またはマイクロインジェクション法などの従来の手法で導入することができる。宿主細胞を形質転換およびトランスフェクトする適切な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory press（1989））、およびその他のこのような実験室教科書に見出される。
【０１０９】
適切な宿主細胞は、さまざまな原核宿主細胞および真核宿主細胞を含む。例えば本発明のタンパク質は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用）、酵母細胞、または哺乳類細胞で発現させることができる。他の適切な宿主細胞は、Goeddel、Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego CA（1991）で説明されている。
【０１１０】
本発明のタンパク質は、固相合成法（Merrifield、1964、J.Am.Chem. Assoc. 85：2149-2154）、または均一溶液中における合成（Houbenweyl、1987、Methods of Organic Chemistry、E.Wansch編、第15巻、IおよびII、Thieme、Stuttgart）などのタンパク質化学領域で周知の手法を用いた化学合成法により調製することもできる。
【０１１１】
iii）ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの変種
「変種」という表現は、P450RAI-3のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特徴を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。変種は通常、P450RAI-3のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと全体が極めて似ており、多くの領域で同一である。本発明は、本発明のポリペプチドの相同体、類似体、およびイソ型、ならびに（適用可能な場合は）ポリヌクレオチドを含む。挿入、欠失、変異、および置換も、本発明の範囲に含まれる。
【０１１２】
本発明が、図1または図2の配列（配列番号：9または10）と実質的な配列相同性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むことは言うまでもない。「実質的な配列相同性を有する配列」という表現は、このような配列との、わずかな配列変化、または重要でない配列変化を有する核酸配列（すなわち、このような配列は実質的に同じように機能して、機能的に等価のタンパク質を産生する）を意味する。このような変化は、局所的な変異または構造的修飾に起因しうる。好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、図1または図2の配列（配列番号：9または10）と少なくとも85%、好ましくは90%、および最も好ましくは95%の同一性を有する。しかし本発明が、これらに限定されず、図1または2の配列（配列番号：9または10）と少なくとも50%、60%、および70%の相同性を有するポリヌクレオチド配列を含むことに留意すべきである。
【０１１３】
本発明の標準ヌクレオチド配列と少なくとも例えば90%が「同一な」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が、P450RAI-3ポリペプチドをコードする標準ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり最大10個の点突然変異を含む点を除いて、ポリペプチドのヌクレオチド配列が標準配列と同一であることを意味する。したがって、標準ヌクレオチド配列と少なくとも90%が同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、標準配列のヌクレオチドの最大10%が欠失するか、もしくは別のヌクレオチドで置換されるか、または標準配列の全ヌクレオチドの最大10%のヌクレオチド数が標準配列に挿入されうる。問合わせ配列は、本明細書に記載されたP450RAI-3のヌクレオチド配列の全体、または任意の断片の場合がある。
【０１１４】
特定の核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%相同であるか否かは、既知のコンピュータプログラムを用いた従来の手法で判定することができる。問合わせ配列（本発明の配列）と対象配列との最高の全体的な適合を判定する好ましい方法（グローバルアラインメントとも呼ばれる）は、Brutlagら、Comp.App.Biosci. 6：237-245（1990）のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムで決定することができる。配列アラインメントの場合、問合わせ配列および対象配列はいずれもDNA配列である。RNA配列は、チミン（T）をウラシル（U）と交換することで比較することができる。グローバル配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで表される。同一性パーセントを計算するための、FASTDBによるDNA配列のアラインメントで使用される好ましいパラメータは以下の通りである：Matrix-Unitary、k-tuple＝4、Mismatch Penalty＝1、Joining Penalty＝30、Randomization Group Length＝09、Cutoff Score＝1、Gap Penalty＝5、Gap Size Penalty＝0.05、Window Size＝500または対象ヌクレオチド配列長のいずれか短い方。
【０１１５】
対象配列が、内部欠失ではなく5'または3'の欠失のために問合わせ配列より短い場合は、結果を得るために手計算による修正を行う必要がある。これは、FASTDBプログラムが、同一性パーセントを計算する際に、対象配列の5'および3'の切り詰めを考慮しないためである。問合わせ配列に対して5'端または3'端が欠けた対象配列の場合、同一性パーセントは、適合/アラインメントしない対象配列の5'および3'側である問合わせ配列の塩基数を、問合わせ配列の全塩基のパーセントとして計算することにより修正される。ヌクレオチドが、適合/アラインメントするか否かは、FASTDB配列アラインメントの結果で判定される。次に、このパーセンテージを、上述のFASTDBプログラムで特定のパラメータを用いて計算された同一性パーセントから差し引くことで、最終的な同一性パーセントスコアが得られる。この修正後のスコアを、本発明の目的で使用する。問合わせ配列と適合/アラインメントしない、FASTDBアラインメントで示される、対象配列の5'側および3'側の塩基の外側の塩基のみを、同一性パーセントスコアを手計算で調整する目的で計算する。
【０１１６】
例えば、90塩基の対象配列を100塩基の問合わせ配列に対してアラインメントすることで同一性パーセントを得るとする。対象配列の5'端に欠失があると、FASTDBアラインメントでは、5'端の先頭10塩基について適合/アラインメントを示さない。対を形成していない10残基の塩基は、配列の10%に対応する（5'端および3'端における適合しない塩基数/問合わせ配列の全塩基数）ので、FASTDBプログラムで計算された同一性パーセントスコアから10%を差し引く。仮に残りの90塩基が完全に適合する場合、最終的な同一性パーセントは90%となる。別の例として、90塩基の対象配列を、100塩基の問合わせ配列と比較することを考える。この場合は、欠失が内部欠失である場合があるので、対象配列の5'端または3'端に、問合わせ配列と適合/アラインメントしない塩基は存在しない。このような場合、FASTDBで計算される同一性パーセントは手計算で修正されない。問合わせ配列と適合/アラインメントしない、対象配列の5'端および3'端の塩基だけを手計算で修正する。
【０１１７】
P450RAI-3（配列番号：11）などの、本発明の問合わせアミノ酸配列と少なくとも例えば90%が「同一」な、または相同なアミノ酸を有するポリペプチドでは、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、対象ポリペプチド配列が、問合わせアミノ酸配列の各100残基のアミノ酸あたり最大10残基のアミノ酸の変化を含む場合がある点を除いて問合わせ配列と同一である。したがって、問合わせアミノ酸配列と少なくとも90%が同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列のアミノ酸残基の最大10%が挿入されているか、欠失しているか、または他のアミノ酸と置換されている可能性がある。標準配列の変化は、標準アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端の位置で、または末端間のどこかで標準配列の残基中に個別に分散されるか、または標準配列内の1つもしくは複数の隣接した群として分散されて生じる可能性がある。
【０１１８】
任意の特定のポリペプチドが、クローンRP11-30F3にコードされたアミノ酸配列と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、または99%相同であるか否かは、既知のコンピュータプログラムを用いて従来の手順で判定することができる。問合わせ配列（本発明の配列）と対象配列間における最高の全体的な適合を判定する好ましい方法（グローバル配列アラインメントとも呼ばれる）は、Brutlagら、Comp.App.Biosci. 6：237-245（1990）のアルゴリズムに基づくFASTDBコンピュータプログラムで決定することができる。配列アラインメントでは、問合わせ配列および対象配列は、両方がヌクレオチド配列か、または両方がアミノ酸配列のいずれかである。グローバル配列アラインメントの結果は、同一性パーセントで表される。FASTDBアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメータは以下の通りである：Matrix＝PAM 0、Mismatch Penalty＝1、Joining Penalty＝20、Randomization Group Length＝0、Cutoff Score＝1、Window Size＝配列長、Gap Penalty＝5、Gap Size Penalty＝0.05、Window Size＝500または対象アミノ酸配列長のいずれか短い方。
【０１１９】
対象配列が、内部欠失ではなくN末端またはC末端の欠失のために問合わせ配列より短い場合は、結果を得るために手計算による修正が必要である。これは、FASTDBプログラムが、グローバル同一性パーセントを計算する際に対象配列のN末端およびC末端の切り詰めを考慮しないためである。問合わせ配列に対してN末端およびC末端が欠けた対象配列の場合、対応する対象残基と適合/アラインメントしない、対象配列のN末端およびC末端にある問合わせ配列の残基数を、全塩基に対する問合わせ配列のパーセントとして計算することで同一性パーセントを修正する。残基が適合/アラインメントするか否かは、FASTDB配列アラインメントの結果で決定される。次に、このパーセンテージを、特定のパラメータを用いる上述のFASTDBプログラムで計算された同一性パーセントから差し引くことで、最終的な同一性パーセントスコアが得られる。問合わせ配列と適合/アラインメントしない、対象配列のN末端およびC末端に対する残基のみが、同一性パーセントスコアを手計算で調整する目的に関して考慮される。
【０１２０】
例えば、90アミノ酸残基の対象配列を、100残基の問合わせ配列にアラインメントさせて同一性パーセントを決定するとする。欠失は対象配列のN末端で生じるので、FASTDBアラインメントは、N末端の先頭10残基と適合/アラインメントを示さない。対を形成していない10残基は、配列の10%を占める（適合していないN末端およびC末端における残基数/問合わせ配列内の全残基数）ので、FASTDBプログラムで計算された同一性パーセントスコアから10%を差し引く。仮に残りの90残基が完全に適合する場合、最終的な同一性パーセントは90%となる。別の例では、90残基の対象配列を100残基の問合わせ配列と比較する。この場合、欠失を内部欠失とすると、問合わせ配列と適合/アラインメントしない対象配列のN末端またはC末端に残基は存在しない。この場合、FASTDBで計算された同一性パーセントは手計算で修正されない。問合わせ配列と適合/アラインメントしない、FASTDBアラインメントで表される、対象配列のN末端およびC末端の外側の位置の残基のみを手計算で修正する。
【０１２１】
P450RAI-3の変種は、コード領域、非コード領域、またはこの両方に変化を含む場合がある。特に好ましいのは、サイレント置換、付加、または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの性質もしくは活性は変化しない変化を含むポリヌクレオチド変種である。遺伝暗号の縮重によるサイレント置換によって生じるヌクレオチド変種が好ましい。また5〜10残基、1〜5残基、または1〜2残基のアミノ酸が、置換されるか、欠失するか、または任意の組み合わせで付加されたりすることも好ましい。P450RAI-3のポリヌクレオチド変種は、特定の宿主におけるコドンの発現を最適化することを含む、さまざまな理由で作製することができる。
【０１２２】
天然のP450RAI-3変種は「対立遺伝子変種」と呼ばれ、生物体の染色体上の任意の座位を占有する複数の択一性の遺伝子の1つを意味する。このような対立遺伝子変種は、ポリヌクレオチドレベル、および/またはポリペプチドレベルのいずれかにおいて変化する場合がある。あるいは非天然の変種を、変異導入法によって、または直接合成法によって作製することができる。本発明のcDNAに対応するmRNAの選択的スプライシングによって生じる、本発明のポリヌクレオチドの変種型が本発明に含まれることは言うまでもない。
【０１２３】
タンパク質工学および組換えDNA技術の既知の方法で変種を作製して、P450RAI-3ポリペプチドの特性を改善したり変化させたりすることができる。例えば1個または複数のアミノ酸を、生物学的機能を実質的に失うことなく、タンパク質のN末端またはC末端から欠失させることができる（例えばRonら、J.Biol.Chem. 268：2984-2988（1993）；Dobeliら、J.Biotechnology 7；199-216（1988）；およびGayleら、J.Biol.Chem. 268：22105-22111を参照）。
【０１２４】
ポリペプチドのN末端またはC末端から失われた1個または複数のアミノ酸が、1つまたは複数の生物学的機能の修飾または喪失につながる場合、他の生物学的活性はそのまま維持される場合がある。例えば、欠失変種のもつ、分泌型を認識する抗体の誘導能力および/または結合能力は、分泌型の残基の大部分未満がN末端またはC末端から除去されても保持される可能性が高い。タンパク質のN末端またはC末端残基を欠く特定のポリペプチドが、上記のような免疫学的活性を保持しているか否かは、本明細書に記載されるか、または当技術分野で周知の常用の方法で容易に判定することができる。
【０１２５】
本発明はさらに、実質的な生物学的活性を示すP450RAI-3ポリペプチドの変種を含む。このような変種は、当技術分野で周知の一般的な規則にしたがって選択される、欠失、挿入、逆位、反復、および置換を含む（例えばBowie, J.U.ら、Science 247：1306-1310（1990）を参照）。
【０１２６】
一つの方法では、進化の過程の自然選択によるアミノ酸置換の寛容性を利用する。さまざまな種におけるアミノ酸配列を比較することで、保存されたアミノ酸を同定することができる。このような保存されたアミノ酸は、タンパク質の機能に重要な役割を果たす可能性がある。これとは対照的に、自然選択によって置換が寛容されたアミノ酸の場合、このような位置は、タンパク質の機能に重要ではないことを意味する。したがって、アミノ酸置換を寛容する位置は、タンパク質の生物学的活性を維持しながら修飾することができる。
【０１２７】
別の方法では遺伝子工学を利用して、クローン化された遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入することで、タンパク質の機能に重要な領域を同定する。例えば、部位特異的変異導入法、またはアラニンスキャニング変異導入法を利用することができる（例えばCunninghamおよびWells、Science 244；1081-1085（1989）を参照）。結果として得られるポリペプチドを対象に、生物学的活性を調べることができる。
【０１２８】
保存的アミノ酸置換に加えて、本発明は、［1］置換されたアミノ酸残基が、遺伝暗号でコードされていてもいなくてもよい1個または複数の非保存的アミノ酸残基との置換、または［2］置換基を有する1個または複数のアミノ酸残基との置換、または［3］成熟ポリペプチドと、ポリペプチドの安定性および/または溶解性を高める化合物などの別の化合物との融合、または［4］ポリペプチドと、IgGFcの融合領域ペプチド、または精製を促す配列などの別のアミノ酸の融合、を含むP450RAI-3の変種を対象とする。このような変種は、本明細書に記載された当技術分野の範囲内にあるとみなされる。
【０１２９】
例えば、荷電性アミノ酸が、別の荷電性または中性のアミノ酸と置換されたアミノ酸置換物を含むP450RAI-3ポリペプチドの変種は、性質が改善されたポリペプチドとなる可能性がある（例えばPinckardら、Clin.Exp.Immunol. 2：331-340（1967）；Robbinsら、Diabetes 36：838-845（1987）；およびClevlandら、Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier System 10：307-377、1993）を参照）。
【０１３０】
iv）ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの断片
本発明では「ポリヌクレオチド断片」という表現は、図1または図2の核酸配列の一部を有する短いポリヌクレオチドを意味する。このような短いヌクレオチド断片は、好ましくは少なくとも長さが約15ヌクレオチド（nt）であり、またより好ましくは少なくとも約20 ntであり、さらにより好ましくは少なくとも約30 ntであり、またさらに好ましくは少なくとも約40 ntである。例えば「長さが少なくとも20 nt」の断片は、図1もしくは図2（配列番号：1もしくは2）のcDNA配列、または図3のペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号：11）に由来する、20個またはこれ以上の隣接する塩基を含むことを意味する。このようなヌクレオチド断片は、診断用のプローブおよびプライマーとして有用な場合がある。また、より長い断片も診断用プローブとして有用である（例えば50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、150ヌクレオチド、200ヌクレオチド、250ヌクレオチド、300ヌクレオチド、350ヌクレオチド、400ヌクレオチド、450ヌクレオチド、500ヌクレオチド、550ヌクレオチド、600ヌクレオチド、650ヌクレオチド、700ヌクレオチド、750ヌクレオチド、800ヌクレオチド、850ヌクレオチド、900ヌクレオチド、950ヌクレオチド、1000ヌクレオチド、1050ヌクレオチド、1100ヌクレオチド、1150ヌクレオチド、1200ヌクレオチド、1250ヌクレオチド、1300ヌクレオチド、1350ヌクレオチド、1400ヌクレオチド、1450ヌクレオチド、1500ヌクレオチド、1550ヌクレオチド...など）。さらに、図5に示したエキソンをコードする任意のヌクレオチド配列も、本発明に含まれることを意味する。
【０１３１】
一つの態様では、本発明のポリヌクレオチド断片は、好ましくは、本発明の核酸分子（図1または図2など）とハイブリダイゼーション条件下において、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてハイブリッドを形成する。DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は当技術分野で周知であるか、または「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons、N.Y.（1989）、6.3.1-6.3.6で説明されている。例えば以下の条件を用いることができる：6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）（約45℃）に続いて、2.0×SSCによる洗浄（50℃）。ストリンジェンシーは、洗浄段階で用いられる条件を元に選択することができる。例えば、洗浄段階の塩濃度は、約0.2×SSC（50℃）の高ストリンジェンシーから選択することができる。また、洗浄段階の温度は、約65℃における条件などの高ストリンジェンシー条件とすることができる。
【０１３２】
代表的なポリヌクレオチド断片の例は、図2に含まれる1〜50、51〜100、101〜150、151〜200、201〜250、251〜300、301〜350、351〜400、401〜450、451〜500、501〜550、551〜600、601〜650、651〜700、701〜750、751〜800、801〜850、851〜900、901〜950、951〜1000、1001〜1050、1051〜1100、1151〜1200、1201〜1250、1251〜1300、1301〜1350、1351〜1400、1401〜1450、1451〜1500、1501〜1550、1551など〜cDNAの末端までであるか、または図5の第1〜6エキソンの任意の1つまたは複数をコードするヌクレオチド配列である。好ましい態様では、このようなポリヌクレオチド断片は、配列番号：8をコードする全体または少なくとも約15ヌクレオチドの部分を含む。この文脈における「約」という表現は、いずれかの末端、または両端において数ヌクレオチドだけ長いか短い特定の範囲を含む。好ましくは、これらの断片は、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする。より好ましくは、このようなポリヌクレオチドは、本明細書に記載されたプローブまたはプライマーとして使用することができる。
【０１３３】
本発明において、「ポリペプチド断片」という表現は、図3の短いアミノ酸配列（配列番号：11）、または図2のcDNA（配列番号：10）にコードされたアミノ酸配列を意味する。タンパク質断片は「自立している（free-standing）」か、または断片が、一部もしくは領域、最も好ましくは1つの連続領域を形成する、より長いポリペプチドに含まれる。例えばタンパク質断片は、コード領域の末端に向かって、アミノ酸番号約1〜20、21〜40、41〜60などからの断片を含む場合がある。このようなポリペプチド断片の長さは、約20アミノ酸、30アミノ酸、40アミノ酸、50アミノ酸、60アミノ酸、70アミノ酸、80アミノ酸、90アミノ酸などの場合がある。「約」という表現は、本明細書に記載された範囲、および各末端または両末端において数アミノ酸だけ長いか短い範囲を含む。このようなタンパク質断片は、図5の第1〜6エキソン（配列番号：13、15、17、19、21、または23）の任意の1つまたは複数を含む場合もある。
【０１３４】
好ましいタンパク質断片は、P450RAI-3の新生型および成熟型を含む。またアミノ末端およびカルボキシ末端における欠失の任意の組み合わせが好ましい。例えば、短縮化されたP450RAI-3変異体がもつ、完全長すなわち成熟型のポリペプチドを認識する抗体を誘導する能力、および/またはこれに結合する能力は一般に、完全長すなわち成熟型のポリペプチドの残基の大部分未満がN末端から除去されるときに保持される。完全長のポリペプチドのN末端の残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、当技術分野で周知の方法で容易に判定することができる。N末端のアミノ酸残基を多く欠失したP450RAI-3変異体が、ある程度の生物学的活性または免疫原性活性を保持する可能性は低くない。わずか5個のアミノ酸残基を含むペプチドが免疫応答を惹起する場合が実際にありうる。
【０１３５】
したがって本発明はさらに、P450RAI-3のアミノ末端から1個または複数の残基が欠けたポリペプチドを提供する。例えば、短縮化したP450RAI-3変異体のもつ、完全長すなわち成熟型のポリペプチドを認識する抗体を誘導する能力、および/またはこれに結合する能力は一般に、完全長すなわち成熟型のポリペプチドの残基の大部分未満がC末端から除去される場合は保持される。完全長のポリペプチドのC末端残基を欠く特定のポリペプチドが、このような免疫学的活性を保持するか否かは、当技術分野における常用の方法で容易に判定することができる。C末端のアミノ酸残基を数多く欠くP450RAI-3変異体が、ある程度の生物学的活性または免疫学的活性を保持する場合がある可能性は低くない。
【０１３６】
本発明は、P450RAI-3ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方で1個または複数のアミノ酸を欠くポリペプチドも対象とする。
【０１３７】
EST配列などの多くのポリヌクレオチド配列は公開されており、配列データベースから閲覧できる。このような配列の一部はP450RAI-3の配列に関連している場合があり、本発明が着想される前に公開されている場合がある。好ましくは、このような関連ポリヌクレオチドは、本発明の範囲から選択的に除外される。
【０１３８】
好ましい断片は、ある程度の生物学的活性または生化学的活性を示すを示す断片である。このような断片は、P450RAI-3のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと似ているが、必ずしも同一である必要はない活性を示す断片である。このような活性は、改善された所望の活性、または低下した非所望の活性を含む場合がある。このような断片は、P450RAI-3の調節もしくはシミュレーション、またはP450RAI-3の発現、またはこのような薬剤の同定もしくは生産に利益がある、任意のポリペプチド断片またはポリヌクレオチド断片を含む場合もあるが、これらに必ずしも制限されない。
【０１３９】
v）エピトープと抗体
本発明では「エピトープ」という表現は、P450RAI-3、または動物で抗原性または免疫原性活性を有するこの断片を意味する。本発明の好ましい態様は、エピトープを含むP450RAI-3断片、ならびに断片をコードするポリヌクレオチドに関する。抗体が結合可能なタンパク質分子の領域は「抗原性エピトープ」と定義される。これとは対照的に「免疫原性エピトープ」という表現は、抗体反応を生じるタンパク質の一部と定義される（例えばGeysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002（1983）を参照）。
【０１４０】
エピトープとして機能する断片は任意の従来の手段で作製することができる（例えばHoughten, R.A.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135（1985）を参照）。
【０１４１】
本発明では、抗原性エピトープは好ましくは7アミノ酸もしくはそれ以上、より好ましくは少なくとも9アミノ酸、および最も好ましくは約15〜約30アミノ酸の配列を含む。抗原性エピトープは、エピトープの結合を特定するモノクローナル抗体を含む抗体の作製に有用である（例えばWilsonら、Cell 37：767-778（1984）；およびSutcliffe, J.G.ら、science 218：660-666を参照）。
【０１４２】
同様に、免疫原性エピトープを使用して、当技術分野で周知の方法でT細胞を誘導することができる（例えばChow, M.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：910-914；およびBittle, F.J.ら、J.Gen.Virol. 66：2347-2354（1985）を参照）。免疫原性エピトープは、アルブミンなどの担体タンパク質とともに、動物系（ウサギやマウスなど）に対して呈示される場合があるほか、十分長い場合（少なくとも約25アミノ酸）は、担体を含まない。しかし、わずか8〜10アミノ酸しか含まない免疫原性エピトープでも、ウェスタンブロッティングなどの変性したポリペプチドの状態で、直線状エピトープにわずかながらではあるが結合可能な抗体を十分産生することが報告されている。
【０１４３】
本明細書で用いる「抗体」（Ab）、または「モノクローナル抗体」（mAb）という表現は、タンパク質に特異的に結合可能な完全な分子、ならびに抗体断片（例えばFab断片およびF(ab')2断片）を意味する。このような断片は、完全な抗体のFc断片を欠き、典型的には、パパイン（Fab断片が得られる）、またはペプシン（F(ab')断片が得られる）などの酵素を用いてタンパク質分解による切断によって作られる。Fab断片およびF(ab')2断片は血管系から速やかに除かれ、完全抗体と比較して非特異的な組織結合性をそれほど示さない場合がある（例えばWahlら、J.Nucl.Med. 24：316-325（1983）を参照）。したがって、これらの断片は、Fabの産物または他の免疫グロブリンの発現ライブラリーであることから好ましい。本発明は、キメラ抗体、1本鎖抗体、およびヒト化抗体を含む。また、標的タンパク質結合断片は、組換えDNA技術を応用することで、または合成化学法で作製することができる。
【０１４４】
以上の方法は当技術分野で周知である。参考文献としてCurrent Protocols in Immunology、John Wiley & Sons、New York；Kennett, R.ら編、Monoclonal Antibodies, Hybridoma：A New Dimension in Biological Analysis、Plenum Press、New York（1980）、およびCampbell, A.、Monoclonal Antibody Technology、Burden, R.ら編、Laboratory Techniques in Biochemistry、および「Molecular Biology」、第13巻、Elsevier、Amsterdam（1984）などを参照されたい。
【０１４５】
標的エピトープに対する抗体は、エピトープまたはポリペプチドを動物に直接注入することで、またはポリペプチドを動物（好ましくはヒト以外の動物）に投与することで得られる。このような抗体は次に、ポリペプチドそのものに結合する。この方法によって、ポリペプチドの断片のみをコードする配列を用いて、天然のポリペプチドすべてに結合する抗体を作製することができる。このような抗体を用いて、ポリペプチドをコードするポリペプチドを、本明細書に記載された方法で発現ライブラリーから単離することができる。
【０１４６】
モノクローナル抗体の調製に関しては、連続的な細胞系列培養で作製される抗体を提供する任意の手法を使用することができる。例には、ハイブリドーマ技術（KohlerおよびMilstein、Nature 256：495-497 （1975））、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら、Immunol.Today 4：72（1983））、およびヒトモノクローナル抗体を作製するEBVハイブリドーマ技術（Coleら、Monoclonal Antibody and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、p.77-96（1985））などがある。
【０１４７】
1本鎖抗体の作製に関して記載された手法（米国特許第4,946,778号）を適合させて、対象となる免疫原性ポリペプチド産物に対する1本鎖抗体を作製することができる。
【０１４８】
本発明に有用な抗体は、当技術分野で周知の任意のさまざまな方法で調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体を含む血清の導入を誘導するために、標的タンパク質、またはその抗原性断片を発現する細胞を動物に導入することができる。別の方法では、標的タンパク質の調製を行い、精製し、天然の混入物質を実質的に含まない状態とする。比活性の高いポリクローナル抗血清を産生させるために、このような調製物を次に動物に導入する。
【０１４９】
好ましい方法では、本発明に使用される抗体はモノクローナル抗体（または標的タンパク質に結合するその断片）である。このようなモノクローナル抗体は、当技術分野で周知のハイブリドーマ法で調製することができる。一般に、このような手順では、標的タンパク質抗原で、または好ましくは標的タンパク質発現細胞で動物（好ましくはマウス）を免疫化する。適切な細胞は、細胞がもつ抗標的タンパク質抗体との結合能力によって認識される場合がある。このような細胞は、任意の適切な組織培養用培地で培養することができる。免疫化されたマウスの脾細胞を抽出し、適切なミエローマ細胞系列と融合させる。本発明では、任意の適切なミエローマ細胞系列を使用することができる。好ましくは、American Type Culture Collection（Mannassas、VA）から入手可能なSP20ミエローマ細胞系列を使用する。融合後に結果として得られるハイブリドーマ細胞を、HAT培地で選択的に維持した後に、当技術分野の文献に記載された手順（例えばWandsら、Gastroenterology 80：225-232（1981）を参照）で段階希釈してクローン化する。次に、このような選択法で得られたハイブリドーマ細胞を対象にアッセイ法を行い、標的タンパク質抗原と結合可能な抗体を分泌するクローンを同定する。
【０１５０】
あるいは、標的タンパク質抗原に結合可能な別の抗体を、抗イディオタイプ抗体を用いて2段階の手順で作製することができる。このような方法は、抗体そのものが抗原として作用すること、したがって二次抗体に結合する抗体を得ることができるという事実を利用している。この方法では、標的タンパク質に特異的な抗体を用いて動物（好ましくはマウス）を免疫化する。次に、このような動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を作製し、このハイブリドーマ細胞を対象にスクリーニングを行って、標的タンパク質-特異的抗体に結合する能力が標的抗原で達成されうる抗体を産生するクローンを同定する。このような抗体は、標的タンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、これを用いて動物を免疫化して、別の標的タンパク質特異的抗体の生成を誘導することができる。
【０１５１】
本発明の、標的タンパク質に特異的な抗体の適切な標識について以下に説明する。適切な酵素標識の例には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ-グリセロールリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼなどがある。
【０１５２】
適切な放射標識の例には、3H、111In、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、57To、58Co、59Fe、75Se、152Eu、90Y、67Cu、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pdなどがある。適切な非放射性同位体標識の例には、157Gd、55Mn、162Dy、52Tr、および56Feなどがある。
【０１５３】
適切な蛍光標識の例には、152Eu標識、フルオレセイン標識、イソチオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、o-フタルデヒド（phthaldehyde）標識、およびフルオレスカミン標識などがある。
【０１５４】
化学発光標識の例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香性アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびエクオリン標識などがある。
【０１５５】
核磁気共鳴造影剤の例には、Gd、Mn、および鉄などの重金属核がある。
【０１５６】
上述の標識を抗体に結合させる典型的な手法は、Kennedyら、Cin.Chem.Acta. 70；1-31（1976）、およびSchursら、Clin.Chem.Acta 82：1-40（1970）で説明されている。後者で言及されているカップリング法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジマレイミド法、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシ-スクシニイミドエステル法であり、いずれの方法も参照として本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
ヒトでの抗体のインビボ使用に関しては、「ヒト化」されたキメラのモノクローナル抗体の使用が好ましい場合がある。このような抗体は、本明細書に記載されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝的構築物を用いて作製することができる。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で周知である（例えばMorrison、Science 229：1202（1985）；Oiら、Bio Techniques 4：214、91986）；Cabillyら、米国特許第4,816,567号；Taniguchiら、欧州特許第171496号；Morrisonら、欧州特許第173494号；Neubergerら、国際公開公報第8601533号；Robinsonら、国際公開公報第8702671号；Boulianneら、Nature 312：643（1984）；Neubergerら、Nature 314：268（1985））。
【０１５８】
vi）疾患状態の診断と予後
ある条件によって、哺乳類において、対応する「標準的な」哺乳類（何らかの疾患条件のみられない同じ種の哺乳類）と比較して、有意に変化したレベルのP450RAI-3のタンパク質、およびP450RAI-3タンパク質をコードするmRNAレベルの発現が誘導される場合があることが知られている。シトクロムP450は、いくつかの経路に関連づけられており、いくつかの医学的条件に関連づけられている。一般に、シトクロムP450に関連する可能性のある条件に加えて、P450RAI-3の発現は副腎で高い。これが、他のレチノイン酸代謝性シトクロムP450（P450RAI-1およびP450RAI-2）との相同性の程度と関連していることは、発癌性細胞系列、腫瘍細胞系列、および胚細胞系列の細胞分化に役割を果たすことを示唆している。したがって本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド、またはこれらの修飾因子は、癌や発生異常などの、細胞分化が関連する条件を診断および治療する際に有用な場合がある。これは、例として乾癬、高血圧症、ステロールやホルモンの異常が関連する条件、および本明細書で記載された、副腎の他の条件などを治療する際に有用な場合もある。
【０１５９】
さらに、P450RAI-3、または本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および/またはP450RAI-3活性の修飾因子は、本明細書に記載されているような、ビタミンAまたはレチノイン酸の代謝経路が関与する障害または条件の治療に有用な場合がある。
【０１６０】
診断が従来の方法で既に下されている場合には、本発明は予後因子として有用であり、P450RAI-3遺伝子の発現に変化を示す患者は、同遺伝子を正常レベルで発現する患者に対して、より悪化した、またはより改善した臨床転帰を示す。
【０１６１】
「P450RAI-3のポリペプチドをコードする遺伝子の発現をアッセイする」という表現は、第1の生物試料を対象に、定性的および定量的にP450RAI-3タンパク質のレベル、またはP450RAI-3タンパク質をコードするmRNAのレベルを直接的に（例えば絶対的なタンパク質のレベルまたはmRNAのレベルを決定または評価することで）、または相対的に（例えば第2の生物試料のP450RAI-3タンパク質のレベルまたはmRNAのレベルを比較することで）測定したり評価したりすることを意味する。
【０１６２】
好ましくは、第1の生物試料のP450RAI-3タンパク質のレベル、またはmRNAのレベルを測定または評価し、また標準となるP450RAI-3タンパク質のレベルまたはRNAのレベルと比較する（この標準は、症状を示さない個体から得られた第2の生物試料から採取される）。当技術分野では周知なように、標準となるP450RAI-3タンパク質のレベル、またはmRNAのレベルが既知であれば、比較用の標準として繰り返し使用することができる。
【０１６３】
「生物試料」という表現は、個体、細胞系列、組織培養物、またはCYP26CまたはmRNAを含む他の供給源から得られる任意の生物試料を意味する。組織生検試料および体液を哺乳類から得る方法は当技術分野で周知である。生物試料がmRNAを含むようにする場合は、組織生検試料が好ましい供給源である。
【０１６４】
好ましい哺乳類には、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ネズミ、およびヒトなどがある。特に好ましい哺乳類はヒトである。
【０１６５】
全細胞RNAは当技術分野で周知の方法で単離することができる（例えばChmczynskiおよびZSacchi、Anal.Biochem. 162：156-159（1987）を参照）。次にP450RAI-3タンパク質をコードするmRNAのレベルのアッセイ法を適切な方法で行う。このような方法には、ノーザンブロット解析（Haradaら、Cell 63：303-312（1990））、S1ヌクレアーゼマッピング法（Fujitaら、Cell 49：357-367（1987））、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写法（RT-PCR）（Marikoら、Technique 2：295-301（1990））、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写法（RT-LCR）などがある。
【０１６６】
生物試料のP450RAI-3タンパク質のレベルのアッセイ法は、抗体ベースの方法で実施することができる。例えば、組織におけるP450RAI-3タンパク質の発現は、当技術分野で周知の従来の免疫組織学的手法で調べることができる（例えばJalkanen, M.ら、J.Cell Biol. 105：3087-3096（1987））。
【０１６７】
P450RAI-3タンパク質の遺伝子発現の検出に使用される他の抗体ベースの方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）や放射免疫アッセイ法（RIA）などの免疫アッセイ法などがある。
【０１６８】
適切な標識は当技術分野で周知であり、酵素標識（グルコースオキシダーゼなど）、および放射性同位元素（ヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）、およびテクネチウム（99mTc）など）、ならびに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミン、およびビオチンなど）などがある。
【０１６９】
タンパク質のインビボ画像法の抗体の標識またはマーカーには、X線撮影、NMR、またはESRで検出可能なものがある。X線撮影の場合、適切な標識には、被験者に過度に害を及ぼさない検出可能な放射線を放出するバリウムやセシウムなどの放射性同位元素などがある。NMRやESRに適したマーカーには、対象ハイブリドーマの栄養素を標識することで抗体に導入することができる、重水素などの検出可能な特徴的なスピンを利用するマーカーがある。
【０１７０】
放射性同位元素（例えば131I、112In、99mTc）、放射線不透過性物質、または核磁気共鳴法で検出可能な材料などの、適切な検出可能な結像部分（imaging moiety）が標識された、タンパク質に特異的な抗体、または抗体断片を哺乳類に（例えば非経口的に、皮下に、または腹腔内に）導入する。当技術分野では、対象個体の大きさ、および使用する画像化システムが、診断用の画像を得るために必要な結像部分の質を決定すると理解される。インビボにおける腫瘍画像法については、S.W. Burchielら、「Immunopharmackinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragment」で説明されている（Tumour Imaging：The Radiochemical Detection of Cancerの第13章、S.W. BurchielおよびB.A. Rhodes編、Masson Publishing Inc.（1982）も参照）。
【０１７１】
vii）融合タンパク質
任意のP450RAI-3ポリペプチド（本発明の任意のポリペプチド−ハイブリッド、異型、断片など）を用いて融合タンパク質を作製することができる。例えば、P450RAI-3ポリペプチドを第2のポリペプチドに融合することで、抗原タグとして使用することができる。P450RAI-3ポリペプチドに対する抗体を用いて、P450RAI-3ポリペプチドに結合することにより、第2のタンパク質を間接的に検出することができる。P450RAI-3に融合可能なドメインの例には、非相同的な機能性領域などがある。融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を間に挟んでもよい。
【０１７２】
ある好ましい態様では、P450RAI-3融合ポリペプチドは、別のN末端および/またはC末端のアミノ酸残基を含むように構築することができる。特に、本明細書に開示された、任意のN末端またはC末端が欠けたP450RAI-3ポリペプチドは、別のアミノ酸残基をN末端に含めることで変化させて、P450RAI-3融合ポリペプチドを作製することができる。また、上述したようにN末端およびC末端における欠失の任意の組み合わせを含む、P450RAI-3ポリペプチドに融合させた、別のN末端および/またはC末端のアミノ酸残基を含むP450RAI-3融合ポリペプチドが対象となる。
【０１７３】
また、融合タンパク質は、P450RAI-3ポリペプチドの性質を改善するように作製することができる。例えば、別のアミノ酸（特に荷電性アミノ酸）の領域を、P450RAI-3ポリペプチドのN末端に追加することで、宿主細胞からの精製時、または続く処理および保存時における安定性、および持続性を改善することができる。また、ペプチド部分をP450RAI-3ポリペプチドに付加することで精製の効率を挙げることができる。このような領域は、P450RAI-3ポリペプチドの最終的な調製を行う前に除去することができる。ポリペプチドの処理効率を高めるためのペプチド部分の付加は、当技術分野でよく知られており、常用の手法である。
【０１７４】
断片（特に特異的エピトープ）を含むP450RAI-3ポリペプチドに、免疫グロブリン（IgG）の定常ドメイン部分を結合することでキメラポリペプチドが得られる。このようなタンパク質は精製が容易であり、インビボにおける半減期が長くなることが知られている。報告されている一例は、ヒトCD4-ポリペプチドの先頭の2つのドメインと、哺乳類の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域のさまざまなドメインを含むキメラタンパク質である（欧州特許出願第394,827号；Trauneckerら、Nature 331：84-86（1988））。ジスルフィド結合で結合された二量体構造（IgGによる）を有する融合タンパク質も、単量体の分泌型タンパク質、またはタンパク質断片のみの場合と比較して、他の分子との結合効率、および他の分子の中和効率が高い（例えばFountoulakisら、J.Biochem. 270：3958-3964（1995）を参照）。
【０１７５】
同様に、欧州特許出願第469 533号（カナダでは第2045869号が対応する）では、免疫グロブリン分子の定常領域のさまざまな部分を、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに含む融合タンパク質について開示されている。多くの場合、融合タンパク質のFc部分は治療および診断に有用なので、例えば薬物動態学的性質の改善につながる場合がある（欧州特許出願第0232 262号）。あるいは、融合タンパク質の発現後、検出後、および精製後にFc部分を切除することが望ましい場合がある。例えばFc部分は、融合タンパク質を免疫化の抗原として使用する場合に、治療および診断の妨げとなる恐れがある。また薬剤探索の場合では、hIL-5などのヒトタンパク質が、hIL-5の拮抗物質を同定するための高スループットのスクリーニングアッセイ法の目的でFc部分と融合されている（例えばBennet, D.ら、J.Molecular Recognition 8：52-58（1995）；K. Johansonら、J.Biol.Chem. 270：9459-9471（1995）を参照）。
【０１７６】
また、本発明のP450RAI-3ポリペプチドは、例えばNADPHシトクロムP450還元酵素、NADPHフェレドキシン還元酵素、他のフラビンタンパク質もしくはフェレドキシン、またはシトクロムP450RAI-3還元酵素として機能したり、このような活性を高めて多タンパク質融合複合体を作製したりする他のタンパク質もしくは補因子などの他のタンパク質と融合させることができる。このような多タンパク質融合複合体は、酵素的に活性な、共有結合で連結されたP450RAI-3還元酵素複合体として機能する場合がある。多タンパク質複合体は、化学的架橋法で合成可能なほか、例えば複合体を安定化させる特異的抗体を用いる新しい分子内相互作用を介して集合させることができる。
【０１７７】
P450RAI-3ポリペプチドは、ポリエチレングリコール、および修飾オリゴ糖や多糖を含むがこれらに限定されない親水性分子に融合させることで、疎水性部分を用いて、P450RAI-3と他のタンパク質、天然の膜、または人工の膜との相互作用を安定化させるか、または、他のタンパク質、天然の膜、または人工の膜との新しい相互作用を作ることができる。P450RAI-3ポリペプチドと親水性分子の融合は、溶解性を変化させるために利用することもできる。
【０１７８】
結果として得られる修飾型P450RAI-3タンパク質の精製、安定化、または同定に利用されるか、または酵素活性、もしくは他のタンパク質、膜、固相支持体、またはクロマトグラフィー用の樹脂との相互作用といった他の性質に影響を及ぼす、非標準アミノ酸、または付加的な化学修飾を含むP450RAI-3ポリペプチドの変種が対象となる。これは、ビオチン化された誘導体、またはP450RAI-3ポリペプチドの融合体を含むがこれらに限定されない。
【０１７９】
また、P450RAI-3ポリヌクレオチド配列の修飾では、P450RAI-3の遺伝子もしくはポリペプチドの関連領域を別の遺伝子配列に挿入して、所望の活性（酵素活性など）をもつキメラタンパク質を作る。このようなキメラタンパク質は例えば、他のシトクロムP450の遺伝子またはポリペプチドの領域を、P450RAI-3の関連領域と置換することで得られ、それによってこのような修飾が、結果として得られるキメラタンパク質に、新しい特異性、酵素学的動態の変化、還元酵素もしくは他の関連分子、もしくは膜との新しい相互作用、もしくは相互作用の変化、溶解性の変化、および安定性の変化を含むがこれらに限定されない新しい機能特性を付与する。
【０１８０】
またP450RAI-3ポリペプチドを、P450RAI-3の精製効率を高めるペプチドなどのマーカー配列に使用することができる。好ましい態様では、マーカーとなるアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド（His-tag）であり、例えばpQEベクター（QIAGEN、9259 Eton Avenue、Chatsworth、CA、91311）中に提供され、多くは市販されている（例えばGentzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824（1989）を参照）。例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を可能とする。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザのヘマグルトニンタンパク質に由来するエピトープに対応する「HA」タグがある（例えばWilsonら、Cell 37：767（1984）を参照）。
【０１８１】
これらの任意の融合体は、本発明のP450RAI-3のポリヌクレオチド、またはP450RAI-3のポリペプチドを用いて作製することができる。
【０１８２】
viii）ベクター、宿主細胞、およびタンパク質の作製
本発明は、本発明のポリヌクレオチド（好ましくはP450RAI-3をコードするポリヌクレオチド）を含むベクター、宿主細胞に関し、また本発明のポリペプチド（好ましくはP450RAI-3ポリペプチド）の組換え法による作製にも関する。例えば、このようなベクターは、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスのベクターの場合がある。レトロウイルスベクターには複製可能型または複製欠損型がある。後者の場合、ウイルスは通常、複製を相補する宿主細胞でのみ増殖する。
【０１８３】
宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAE-デキストランによるトランスフェクション法、陽イオン脂質によるトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、トランスダクション法、感染法、または他の方法で可能となる。このような方法は、Davisら、Basic Methods in Molecular Biology（1986）などの多くの標準的な実験マニュアルで説明されている。
【０１８４】
P450RAI-3は、組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウム沈殿法もしくはエタノール沈殿法、酸抽出法、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー法、ホスホセルロースクロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、およびレクチンクロマトグラフィー法を含む当技術分野で周知の方法で回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（HPLC）法を精製に用いることができる。
【０１８５】
本発明は、本明細書に記載されたベクター構築物を含む宿主細胞を含むことに加えて、本発明のP450RAI-3ポリヌクレオチドに動作可能に結合され、かつ内因性のP450RAI-3ポリヌクレオチドを活性化し、改変し、かつ/または増幅する内因性遺伝的材料を欠くように、または置換するように作製された、および/または遺伝的材料（例えば非相同的ポリヌクレオチド配列）を含むように作製された、脊椎動物（特に哺乳類）由来の一次宿主細胞、二次宿主細胞、および不死化された宿主細胞も含む。例えば当技術分野で周知の手法で、非相同的な制御領域（例えばプロモーターおよび/またはエンハンサー）と内因性P450RAI-3ポリヌクレオチド配列を実施可能となるように相同組換えで関連づけることができる（例えばKollerら、Proc.Natl.Acad.Sci. 86：8932-8935（1989）；およびZijilstraら、Nature 342：435-438（1989）を参照）。
【０１８６】
ix）P450RAI-3ポリヌクレオチドの用途
本明細書で言及されたP450RAI-3ポリヌクレオチドは、薬剤として数多くの方法に使用することができる。当技術分野で周知の手法を用いるいくつかの例を以下に挙げる。
【０１８７】
実際の配列データ（反復性の多型）に基づく染色体マーキング試薬は現在ほとんどないことから、新しい染色体マーカーの同定が必要とされている。
【０１８８】
簡単に説明すると、配列は、図1または図2に示す配列に由来するPCRプライマー（好ましくは5〜25 bp）を用いて染色体にマップすることができる。プライマーは、ゲノムDNAの1つの推定エキソンより大きくならないようにコンピュータ解析で選択することができる。このようなプライマーは次に、個々のヒト染色体を含む体細胞雑種を対象とするPCRによるスクリーニングに使用することができる。任意の配列（好ましくは図2の配列）に対応するヒトP450RAI-3遺伝子を含むこのような雑種でのみで増幅断片が得られる。
【０１８９】
同様に、体細胞雑種は、特定の染色体に対するポリヌクレオチドを対象とする迅速なPCRマッピング法を提供する。1回の熱サイクルで、1日あたり3個またはこれ以上のクローンを割り当てることができる。また、P450RAI-3ポリヌクレオチドの下位局在化は、特定の染色体断片のパネルで達成することができる。使用可能な他の遺伝子マッピング法には、インサイチューハイブリダイゼーション法、フローサイトメトリーによる標識染色体とのプレスクリーニング、およびハイブリダイゼーションによる事前選択法による染色体特異的なcDNAライブラリーの構築などがある。
【０１９０】
P450RAI-3ポリヌクレオチドの染色体上の正確な位置は、分裂中期の拡散状態の染色体を対象とした蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）で決定することもできる。この手法では、最短500〜600塩基のポリヌクレオチドを使用するが、2,000〜4,000 bpのポリヌクレオチドが好ましい（例えばVermaら、「Human Chromosomes：a Manual of Basic Techniques」、Pergamon Press、New York（1988）を参照）。
【０１９１】
染色体マッピングの場合、P450RAI-3ポリヌクレオチドを個別に使用する（1本の染色体、または染色体上の1か所をマークするため）か、またはパネルを使用する（複数の部位および/または複数の染色体をマークするため）。cDNAの非コード領域に対応する好ましいポリヌクレオチドでは、コード配列が遺伝子ファミリー内に保存されている可能性が高いので、染色体マッピング中の交差ハイブリダイゼーションの発生率が高くなる。
【０１９２】
ポリヌクレオチドが正確な染色体位置にマップされたら、ポリペプチドの物理的位置を連鎖解析に用いることができる。連鎖解析を行うことで、染色体上の位置と特定疾患の発症と間の連鎖（coinheritance）を判定することができる。1メガ塩基のマッピング解像度、また20 kbあたりに1つの遺伝子が存在すると仮定すると、対象疾患に関与する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50〜500個の潜在的原因遺伝子の1つとなる。
【０１９３】
したがって、連鎖（coinheritance）の存在が明らかになれば、罹患者と非罹患者間におけるP450RAI-3ポリヌクレオチドと対応遺伝子の差を検討することができる。最初に、肉眼で観察可能な染色体構造変化（欠失または転座など）を染色体拡散時に、またはPCR法で調べる。構造変化が認められない場合は、点突然変異の有無を調べる。正常者では認められず、罹患者の一部またはすべてで認められた変異は、その変異が疾患の原因である可能性を意味する。しかし、多型による変異を区別するためには、複数の正常者に由来するP450RAI-3ポリヌクレオチド、および対応遺伝子の全配列決定が必要となる。新しい多型が同定されたら、このような多型を示すポリペプチドは、その後の連鎖解析に使用することができる。多型の存在は、疾患の存在または疾患の素因を意味する場合もある。したがって、P450RAI-3関連条件、またはP450RAI-3関連条件に対する素因を対象とした、P450RAI-3遺伝子の多型の同定による診断法も本発明の対象となる。また、ヒトを対象としたP450RAI-3遺伝子の多型スクリーニングによる、P450RAI-3遺伝子の多型を同定するための診断用キットも本発明の態様の一つである。
【０１９４】
また、非罹患者に対する罹患者における対象遺伝子の発現の増加または減少をP450RAI-3ポリヌクレオチドを用いて評価することができる。何らかの変化（発現の変化、染色体再編成、または変異）を、診断マーカーまたは予後マーカーとして使用することができる。
【０１９５】
また、P450RAI-3ポリヌクレオチドは、3重鎖形成、またはアンチセンスDNAもしくはRNAによる、遺伝子発現の制御に使用することができる。いずれの方法でも、DNAまたはRNAに対する同ポリペプチドの結合を利用する。これらの方法に関しては、好ましいポリヌクレオチドは通常20〜40塩基の長さであり、転写に関与する遺伝子の領域、またはmRNAそのもののいずれかに相補的である（例えばDervanら、Science 251：1360（1991）；Okano、J.Neurochem. 56；560（1991）を参照）。3重鎖の形成は好ましくは、DNAからRNAへの転写を停止させる。一方、アンチセンスRNAハイブリダイゼーションは、mRNA分子からポリペプチドへの翻訳をブロックする。いずれの手法もモデル系で有効であり、また本明細書に記載された情報を用いて、疾患の治療を目的としたアンチセンスまたは3重鎖のポリヌクレオチドを設計することができる。
【０１９６】
P450RAI-3ポリヌクレオチドは、遺伝子治療にも有用である。遺伝子治療の目的の一つは、遺伝子欠損を修復するために、欠損型遺伝子を有する生物体に正常な遺伝子を挿入することである。P450RAI-3は、このような遺伝子欠損を極めて正確に標的とする手段となる。したがって例えば、患者から採取した細胞に、P450RAI-3ポリペプチドをコードするP450RAI-3ポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）をもつようにエクスビボで処理し、作製した細胞を、このポリペプチドによる治療を受ける患者に注射して戻すことができる。このような方法は当技術分野で周知である。例えば細胞は、P450RAI-3をコードするRNAを含むレトロウイルス粒子を用いて当技術分野で周知の手順で作製することができる。
【０１９７】
遺伝子治療のもう一つの目的は、宿主ゲノムには存在しない新しい遺伝子を挿入することで、宿主細胞に新しい形質を加えることである。
【０１９８】
P450RAI-3ポリヌクレオチドは、微量の生物試料を元に個人を同定する際にも有用である。例えば米国軍は、制限酵素切断断片長の多型（RFLP）を個人の同定に使用することを検討中である。この方法では、個人のゲノムDNAを1種類または複数の制限酵素で切断し、プローブを用いてサザンブロットを行って、個人を同定するための固有のバンドを得る。P450RAI-3ポリヌクレオチドは、RFLPの新たなDNAマーカーとして使用することができる。
【０１９９】
P450RAI-3ポリヌクレオチドは、個人のゲノムの選択された部分の実際の個々の塩基のDNA配列を決定することで、RFLPに代わる方法にも使用できる。これらの配列を用いて、このような選択されたDNAを増幅して単離するためのPCRプライマーを調製し、後に配列決定に使用することができる。個人は固有のセットのDNA配列をもつので、上記の方法で個人を同定することができる。
【０２００】
法医生物学（forensic biology）も、本明細書に記載されたDNAベースの同定法の恩恵を受ける。組織（例えば毛髪もしくは皮膚）、または血液もしくは唾液などの体液などの極めて微量の生物試料から採取したDNA配列をPCR法で増幅することができる（例えばErlich, H.、PCR Technology、Freeman and Co.（1992）を参照）。同様に、P450RAI-3ポリヌクレオチドは、法医学的な目的で多型マーカーとして使用することができる。
【０２０１】
本発明は、以下の段階を含む、疾患の診断法を提供する：［1］個体の組織試料または細胞試料などの、個人から採取された生物試料に含まれるP450RAI-3遺伝子の発現レベルをアッセイする段階；［2］P450RAI-3遺伝子の発現レベルを、標準的なP450RAI-3遺伝子の発現レベルと比較する段階（アッセイしたP450RAI-3遺伝子の発現レベルが、標準発現レベルと比較して上昇または低下することが疾患の有無を意味する）。
【０２０２】
少なくともP450RAI-3ポリヌクレオチドは、サザンゲル上における分子量マーカーとして、細胞種に特異的なmRNAの存在の診断用プローブとして、「遺伝子チップ」もしくは他の支持体に結合させたり、もしくはDNA免疫化法で抗DNA抗体を作製したりするためのオリゴマーを選択および作製するために新しいポリペプチドを見出す過程で、既知の配列を「差し引く（subtract-out）」ためのプローブとして、または免疫応答を惹起するための抗原として、使用することができる。
【０２０３】
x）P450RAI-3ポリペプチドの用途
P450RAI-3ポリペプチドは、以下の例を含むいくつかの方法に使用することができる。
【０２０４】
P450RAI-3ポリペプチドは、抗体ベースの方法で生物試料中のタンパク質レベルを調べるために使用することができる。例えば、組織中のタンパク質の発現は、従来の免疫組織学的手法で調べることができる（例えばJalkanen, M.ら、J.Cell Biol. 105：3087-3096（1987）を参照）。タンパク質をコードする遺伝子の発現検出に使用される他の抗体ベースの方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、および放射免疫アッセイ法（RIA）などの免疫アッセイ法がある。適切な抗体アッセイ法の標識は当技術分野で周知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識、ヨウ素（125I、121I）、炭素（14C）、硫黄（35S）、トリチウム（3H）、インジウム（112In）、およびテクネチウム（99mTc）などの放射性同位元素、ならびにフルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンなどがある。
【０２０５】
また本発明のP450RAI-3ポリペプチドは、疾患の治療に使用することができる。例えば、P450RAI-3ポリペプチドの喪失またはレベルの低下を置換したり、さまざまなポリペプチドまたは分子の喪失またはレベル低下を補ったり、ポリペプチドの活性を阻害したり、ポリペプチドの活性を活性化したり、膜に結合した受容体の活性を、受容体と遊離リガンドを競合させることで低下させたり、または所望の反応を惹起したりする目的で、P450RAI-3ポリペプチドを患者に投与することができる。
【０２０６】
P450RAI-3ポリペプチドに対する抗体は、疾患の治療に使用することができる。本明細書の「エピトープおよび抗体」のセクションで詳細に説明されているように、本発明のポリペプチドは、組換え細胞に由来するP450RAI-3タンパク質の発現を検出するアッセイ法に有用なポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製のため、宿主細胞の形質転換を評価する手段として、またはP450RAI-3タンパク質の機能を抑制可能な拮抗物質として、使用することができる。同様に、抗体を投与することで、膜に結合した状態のポリペプチド（受容体）に結合することなどによってポリペプチドを活性化することができる。また、このようなポリペプチドを酵母のツーハイブリッド系に使用することで、候補作動物質であり拮抗物質でもあるP450RAI-3タンパク質結合タンパク質を本発明の手順にしたがって「捕捉」することができる。酵母ツーハイブリッド系については、FieldsおよびSong、Nature 340：245-246（1989）で説明されている。
【０２０７】
特異的な基質である低分子量分子（ATRAや9-シス-RAなど）、またはP450RAI-3タンパク質の代謝物も、P450RAI-3が関与する疾患状態の診断または解析に、または治療の進行のモニタリングに使用することができる。
【０２０８】
P450RAI-3、もしくはこの誘導体、P450RAI-3融合体、複合体、およびキメラタンパク質も、改善または変化した低分子量分子のスクリーニングを含むがこれらに限定されない、個々の化学物質または化学物質の複合体混合物の解析に使用することができる。これらの分子は、P450RAI-3関連条件に対する新しい治療薬または新しい診断法の開発に使用することができる。
【０２０９】
単離された状態、または複合体混合物の一部としての、P450RAI-3、またはこの誘導体、P450RAI-3融合体、複合体、およびキメラタンパク質は、低分子量分子の合成または修飾にも使用することができる。これらの分子は治療薬または診断薬として使用することができる。また、これらの分子は、治療用または診断用の新たな分子の開発に使用することができる。
【０２１０】
P450RAI-3またはその誘導体、P450RAI-3相同体、キメラ、およびタンパク質融合体は、天然の宿主細胞もしくは生物体か、または実験的に作製した細胞もしくは生物体において、治療上および診断上重要な低分子量分子を作製し、解析し、または修飾する目的で発現させることができる。
【０２１１】
P450RAI-3またはこの誘導体、およびP450RAI-3融合体を細胞または生物体で発現させることで、正常な機能または病的な機能、およびこのような宿主の状態を修飾することができる。特にこれは、ヒトまたは動物の遺伝子治療のためのP450RAI-3ポリペプチドおよび誘導体の用途を含むがこれらに限定されない。P450RAI-3ポリペプチドを実験動物に使用して、ヒトの疾患、健康、または発生の研究および解析に有用な生理的状態を再現することもできる。
【０２１２】
P450RAI-3ポリペプチドまたは誘導体、およびP450RAI-3融合体は、天然の宿主細胞もしくは生物体か、または実験的に作製した細胞もしくは生物体において発現させ、かつ天然または人工の環境における低分子量分子の抽出、変換、局在、またはバイオレメディエーションに使用することができる。この用途は、水中または土壌中におけるトランスジェニック（遺伝子改変）植物もしくは微生物の育成による、またはこのような生物体を宿主とするいわゆるバイオリアクターの構築による、環境汚染物質もしくは産業汚染物質の除去または中和を含むがこれらに限定されない。
【０２１３】
少なくともP450RAI-3ポリペプチドは、当技術分野で周知の方法を用いるSDS-PAGEゲル上、または分子ふるいゲル濾過カラム上の分子量マーカーとして使用することができる。
【０２１４】
xi）ヘム結合、酸素結合、および解毒作用
すべてのシトクロムP450は、推定ファミリーの配列が
2005512511.tif 000004
であるヘム結合タンパク質である（Xは任意の残基を意味し、保存されている残基を太字で示す）。
【０２１５】
シトクロムP450を始めとするヘム結合タンパク質は、毒性物質または生体異物の解毒に重要な役割を果たす。例えば毒性物質は、酸化によって解毒される場合がある。シトクロムP450は、フェノバルビタール、コデイン、およびモルヒネなどの毒性物質を解毒する酸化酵素として機能することができる。シトクロムP450がもつ酸素結合能力は、ヘム基の存在、および酸素結合ドメインに依存する。したがってP450が、ヘムおよび分子状酸素に対する結合能力をもつことで、酸化による毒性物質の解毒が可能となる。
【０２１６】
したがって、P450RAI-3ポリペプチドは、フェノバルビタール、コデイン、およびモルヒネなどの毒性物質または生体異物を解毒する酸化酵素としても有用である。
【０２１７】
xii）拮抗物質、作動物質、およびアンチセンス法
本発明はさらに、本発明のP450RAI-3ポリペプチドに対する作動物質および拮抗物質を同定するための、化合物のスクリーニング法を提供する。
【０２１８】
潜在的なP450RAI-3作動物質の例には、P450RAI-3そのもの、またはその生物学的に活性な断片、P450RAI-3の変種、またはその生物学的に活性な断片、任意のペプチド作動物質をコードする核酸構築物、またはP450RAI-3の発現または活性を高める核酸、薬剤、もしくは低分子量分子を含めることができる。
【０２１９】
潜在的なP450RAI-3拮抗物質の例には、抗体、薬剤、低分子量分子、または場合によっては同ポリペプチドに結合するオリゴヌクレオチドなどがある。
【０２２０】
アンチセンス法で作製されたアンチセンス構築物も潜在的な拮抗物質である。したがって本発明はさらに、アンチセンス法によるP450RAI-3のインビボにおける抑制に関する。アンチセンス法では、3重鎖の形成、またはアンチセンスのDNAもしくはRNA（いずれの方法もポリヌクレオチドとDNAまたはRNAの結合に基づく）によって遺伝子発現を制御することができる。例えば、本発明の（成熟型）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の5'コード部分を用いて、約10〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計することができる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドは、mRNAとインビボでハイブリッドを形成し、mRNA分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする（例えば、Okano, J.、Neurochem. 56：560（1991）；Oligodeoxynucleotide as Antisense Inhibitors of Gene Expression」、CPR Press、Boca Raton、FL（1988））。DNAオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子の領域に相補的になるように設計する（3重鎖に関してはLeeら、Nucl.Acids Res. 6：3073（1979）；Cooneyら、Science 241：456（1988）；およびDervanら、Science 251：1360（1991）を参照）ことで、P450RAI-3ポリペプチドの転写および産生が妨げられる。
【０２２１】
別の潜在的なP450RAI-3拮抗物質は、生物学的機能を失ったもののP450RAI-3基質（群）を認識するポリペプチドの、天然または合成的に修飾された類似体である、同ポリペプチドのペプチド誘導体である。ペプチド誘導体の例には、低分子量ペプチド、またはペプチド様分子などがあるがこれらに限定されない。
【０２２２】
このような拮抗物質は、P450RAI-3が誘導、促進、または調節する障害の治療、例えばビタミンAまたはレチノイン酸の代謝障害に使用することができる。
【０２２３】
P450RAI-3活性を核酸レベルで抑制する代わりに、適切な低分子量分子や薬物などの薬剤に対する結合によってP450RAI-3活性を直接抑制することができる。したがって本発明は、P450RAI-3ポリペプチドの活性に（修飾因子（例えば作動物質もしくは拮抗物質）、好ましくは阻害物質として）及ぼす作用に関する薬物のスクリーニング法を含む。特に、薬物もしくはペプチド、または他の化学的な化合物もしくは分子などの、P450RAI-3活性の修飾因子を、P450RAI-3を細胞で発現させ、基質（例えば9-シス-RAまたはATRA）を添加し、基質に対するP450RAI-3ポリペプチドの活性を潜在的な修飾因子の存在下、ならびに選択的に対照として潜在的な修飾因子の非存在下で検出することによって、生物学的アッセイ法で同定することができる。このようなアッセイ法は、P450RAI-3を含むミクロソーム中、またはP450RAI-3に加えて、その活性に必要な可能性がある補因子（一つの態様ではNADPHシトクロムP450還元酵素、および/またはフラビンタンパク質、および/またはNADPH）が存在する他の環境中で実施することもできる。したがってP450RAI-3タンパク質を、予想される阻害物質、または調節作用をもつ薬物に接触させて、タンパク質の活性に及ぼす作用を決定することができる。予想される薬剤は、阻害されないことが望ましい他のP450シトクロムの活性の阻害について検討を行うことができる。このようにして、他のP450ではなくP450RAI-3を選択的に抑制する薬物を同定することができる。本発明のアッセイ法で同定されたP450RAI-3の修飾因子の用途も本発明の範囲に含まれる。
【０２２４】
xiii）本発明の他の方法
本発明の方法は、以下の段階を含む、薬物探索および製薬業を行う方法も含む：
（a）P450RAI-3の活性もしくは発現、またはレチノイン酸代謝を調節する能力を用いて、薬剤を同定するための1つまたは複数のアッセイ系を提供する段階；
（b）段階（a）で同定された薬剤、またはこの類似体の、動物における有効性および毒性に関する治療プロファイルを作成する段階；ならびに
（c）許容される治療プロファイルを示すことが段階（b）で同定された1つまたは複数の薬剤を含む薬学的調製物を製剤化する段階。
【０２２５】
本発明の方法はさらに、薬学的調製物を販売目的で流通させる流通システムを確立する段階をさらに含みうる。この方法はさらに、薬学的調製物の営業目的の販売グループを確率する段階を含む場合がある。
【０２２６】
本発明は、以下の段階を含む、標的探索事業を行う方法も提供する：
（a）P450RAI-3またはレチノイン酸の代謝の調節能力によって薬剤を同定する、1つまたは複数のアッセイ系を提供する段階；
（b）段階（a）で同定された薬剤の、動物における有効性および毒性に関する治療プロファイル作成を（選択的に）実施する段階；ならびに
（c）段階（a）で同定された薬剤、またはその類似体の、さらなる薬物開発および/または販売の権利を第三者に認可する段階。
【０２２７】
xiv）薬学的組成物
P450RAI-3は、いくつかの疾患または医学的条件に役割を果たす場合がある。本明細書で用いる「P450RAI-3関連条件」という表現は、P450RAI-3の発現または活性（過剰な発現もしくは活性、過小な発現もしくは活性、または修飾された発現もしくは活性に関する）が、障害および/または条件の特性を示す条件である（P450RAI-3の発現または活性を修飾することは、条件の治療の一助となる場合がある）。
【０２２８】
このような障害は、P450RAI-3の発現がレチノイン酸の酸化を導く、レチノイン酸の発現または活性に関連する障害を含む場合があるがこれらに限定されない。したがってP450RAI-3の発現は、レチノイン酸濃度を低下させる場合があり、このような低下は望ましい場合もあれば望ましくない場合もある。P450RAI-3は、副腎の活性に役割を果たす場合がある。したがってP450RAI-3の発現または活性を調節することは、副腎の条件の治療に有効な場合がある。このような副腎の条件の例については「発明の背景」で説明した。
【０２２９】
しかしP450RAI-3は、このような条件だけに関連するだけではない。特にP450RAI-3は、癌などの細胞分化障害に、より一般的な役割を果たす可能性がある。
【０２３０】
本発明は、P450RAI-3の活性もしくはP450RAI-3の発現を調節またはシミュレートする方法、好ましくは、P450RAI-3が関連する条件を治療または予防する方法を含む。本発明はさらに、P450RAI-3の発現もしくは活性が関連する条件の治療用もしくは予防用の医薬品の調製を目的として、本明細書に開示された薬剤を調節するか（任意の変化、またはP450RAI-3の活性または発現に対する制御作用。P450RAI-3そのものの投与を含む）、またはシミュレートする用途を含む。別の態様では、本発明は、P450RAI-3関連条件を治療または予防する目的で、薬剤を調節またはシミュレートする用途を提供する。
【０２３１】
したがって本発明は、P450RAI-3の発現もしくは活性を調節またはシミュレートする薬剤を、治療を必要とする動物に投与する段階を含む、P450RAI-3の発現または活性に関連した疾患を治療または予防する方法を提供する。
【０２３２】
一つの態様では、このような薬剤は、P450RAI-3の活性を促進またはシミュレートする。P450RAI-3の活性を活性化またはシミュレートする薬剤の例には、P450RAI-3、適切なプロモーター（好ましくは組織特異的なプロモーターなど）を備えたP450RAI-3をコードする遺伝子、および本発明の核酸およびアミノ酸の配列の治療的に（または機能的に）有効な断片などがあるがこれらに限定されない。また、このような薬剤は、このような作用をもつことが同定された低分子量分子または薬剤などの、P450RAI-3の作動物質を含みうる。
【０２３３】
別の態様では、好ましくはP450RAI-3を、投与する場合に可溶化する。別の態様では、本発明のP450RAI-3ポリペプチドを好ましくは、補因子（適切なNADPHシトクロムP450還元酵素、および好ましくはフラビンタンパク質など）とともに投与することができる。別の態様ではNADPHを投与することもできる。別の態様では、本発明のP450RAI-3ポリペプチドを、基質、レチノイン酸（例えばATRA、9-シス-RA）と同時に投与することができる（例えば、レチノイン酸の代謝物レベルが上昇することが望ましい）。このような基質および補因子はいずれも、P450RAI-3ポリペプチドとともに投与することができるほか、単独で、または併用時に潜在的に有効な場合がある。
【０２３４】
また、レチノイン酸の濃度または活性が維持されるか、または上昇する状況などにおいて、P450RAI-3の阻害が必要とされる場合がある疾患または条件が存在する場合がある。したがって本発明は、P450RAI-3の発現または活性を阻害または抑制する薬剤を、治療を必要とする患者に投与することで、P450RAI-3の発現または活性（任意の発現または活性、または発現もしくは活性の上昇のいずれか）に関連した疾患または条件を、治療または予防する方法を提供する。
【０２３５】
P450RAI-3を抑制する薬剤の例には、本明細書に記載された、P450RAI-3に対するアンチセンス核酸分子、またはこの断片、抗体、拮抗物質、およびトランス優性阻害物質などがある。
【０２３６】
P450RAI-3の発現または活性を（単独で、または上述したようにレチノイン酸などの別の薬剤とともに）調節する薬剤は、インビボにおける投与に適切な、生物学的に適合する形態で被験者に投与する目的で、薬学的組成物中に製剤化することができる。好ましくはP450RAI-3の修飾因子は、P450RAI-3の阻害物質であり、単独で、またはATRAや9-シス-RAなどのP450RAI-3基質とともに投与される。このような治療法は、望ましいならば、上述したように患者がRA治療に耐性を生じる恐れのある癌の治療などにおけるレチノイン酸濃度の維持を支持することができる。本明細書で用いる「インビボにおける投与に適切な、生物学的に適合する形態」という表現は、治療効果があらゆる毒性作用を上回る、投与物質の形態を意味する。このような物質を、治療を必要とする動物に投与することができる。本明細書で用いる「動物」は、P450RAI-3が関連する条件に感受性を示す任意の動物（好ましくはイヌ、ネコ、マウス、ウマ、およびヒト）を意味する。
【０２３７】
本発明の薬学的組成物は、個々の患者の臨床状態（および潜在的な副作用）、投与部位、投与法、投与計画、および術者に周知の他の要因を考慮して、良好な医療に合致して製剤化されて投与される。本発明の薬学的組成物の「有効量」の投与は、所望の結果を達成するのに必要な用法および期間における薬学的組成物の量と定義される。例えば、治療的に有効量の物質は、レシピエントの疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびにレシピエントにおける所望の反応を誘発する物質の能力などの要素にしたがって変化する。投与計画は、最適な治療反応をもたらすように調整することができる。例えば、複数回に分けた用量が連日投与される場合があるほか、治療状況の緊急性を考慮して比例的に減じながら投与される場合がある。治療指針にしたがって、好ましくは、活性化合物の投与量（P450RAI-3の発現または活性の修飾因子を単独投与、またはレチノイン酸基質などの他の化合物と併用投与）は、約1μg/kg体重/日〜10 mg/kg体重/日の範囲にあり、好ましくは少なくとも0.01 mg/kg/日であり、また最も好ましくはヒトに対して約0.01〜1 mg/kg/日である。
【０２３８】
活性物質は、注射（皮下、静脈内、局所、腫瘍内など）、経口投与、吸入投与、塗布、または経腸投与などにより簡便に投与することができる。所望の輸送部位に達するまでに化合物を不活性化する恐れがある酵素、酸、および他の自然条件の作用を化合物が受けることを防ぐために、投与経路に応じて活性物質を材料でコーティングする場合がある。徐放性の組成物中に製剤化することもできる。
【０２３９】
本明細書に記載された組成物は、被験者に投与可能な薬学的に許容される組成物を調製するための既知の方法で、有効量の活性物質が混合物内で薬学的に許容される担体と混合されるように調製することができる。適切な担体については例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、USA 1985）で説明されている。これを元に、本発明の組成物は、絶対というわけではないが、1つまたは複数の薬学的に許容される溶媒または希釈剤と関連し、適切なpHで生理的溶液と等浸透圧の緩衝液に含まれる、物質の溶液を含む。
【０２４０】
センス配列、アンチセンス配列、またはこれらのオリゴヌクレオチド断片を含む組換え核酸分子は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびDNAウイルスベクターなどの、当技術分野で周知の輸送用溶媒を用いて、細胞または組織にインビボで直接導入することができる。これらは、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法などの当技術分野で周知の物理的な手法で、または共沈殿法やリポソームにDNAを取り込ませる方法などの化学的な方法で細胞にインビボで導入することもできる。組換え分子は、エアゾルまたは洗浄液の状態で輸送することもできる。
【０２４１】
本発明の物質、抗体、センスおよびアンチセンス核酸分子、ならびに組成物の有用性は、動物実験モデル系で確認することができる。活性の判定に使用可能な適切な動物モデル系には、レチノイン酸またはP450RAI-3のノックアウトトランスジェニック動物などがあるがこれらに限定されない。
【０２４２】
xv）トランスジェニック動物およびノックアウト動物、ならびにこれらの作製法
P450RAI-3をコードする核酸分子、またはP450RAI-3に類似の生物学的活性を有するタンパク質をコードする核酸分子を用いて、トランスジェニック動物または「ノックアウト」動物のいずれかを作製することができる。これらの動物は、治療的に有用な試薬の開発およびスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えばマウス）は、個体または出生前の時点（例えば胚形成期）の動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子は、トランスジェニック動物の元となる細胞のゲノムに組み込まれるDNA分子である。
【０２４３】
一つの態様では、ヌクレオチド配列（配列番号：9または10）、またはこの適切な変種、断片、もしくは下位配列を含むヒトP450RAI-3のcDNAを用いて、ヒトのP450RAI-3を発現する細胞を含むトランスジェニック動物を作製することができる。ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、およびブタ、また特にマウスなどのトランスジェニック動物を作製する方法は当技術分野で慣例になってきた（例えば米国特許第4,736,866号、および第4,870,009号を参照）。
【０２４４】
好ましい態様では、本発明の組換え分子を含むプラスミドをマウス胚に微量注入する。特に本発明のプラスミドを、受精後の1細胞期のマウス胚の雌の前核に微量注入し、2〜4細胞期に注入胚を偽妊娠状態の仮親に移し、仮親の胚を満期まで発生させる（Hoganら、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour、N.Y. Cold Spring Harbour（1986）を参照）。
【０２４５】
あるいは、胚幹細胞系列を、P450RAI-3活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトし、このポリヌクレオチドを含む細胞を用いて、適切なレシピエントマウス系列に由来する胚を用いて凝集キメラを形成することができる。このキメラ胚を、適切な系列の適切な偽妊娠状態の雌マウスに移植して、胚を満期にさせることができる。生殖細胞に導入されたDNAをもつ子孫を用いて、トランスジェニックマウスを均一に育種することができる。
【０２４６】
胚形成期までに動物の生殖系列に導入されたP450RAI-3導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物を用いて、さまざまな組織におけるP450RAI-3の発現上昇の影響を調べることもできる。
【０２４７】
これとは対照的に、P450RAI-3遺伝子が欠損したか変化した「ノックアウト」動物を作製することができる（例えばLemoineおよびCooper、Gene Therapy、Human Molecular Genetics Series、BIOS Scientific Publishers、Oxford、U.K.（1996）を参照）。機能性のP450RAI-3ポリペプチドを発現できないノックアウト動物を作製することができる。例えば、P450RAIのDNAの一部（例えばエキソン）を欠失させたり、組込みの追跡に使用可能な選択マーカーをコードする遺伝子などの別の遺伝子と置換したりすることができる。次に、変化させたP450RAI-3のDNAを胚幹細胞系列に導入することができる。この後に一部の細胞内で、内因性のP450RAI-3遺伝子と相同的に組換えが生じる。改変遺伝子を含むクローンを選択することができる。改変遺伝子を含む細胞を、動物（マウスなど）の胚盤胞に注入することで凝集キメラを形成させ、トランスジェニック動物に関して述べた上記手順でキメラ胚を移植する。結果として得られる動物の生殖系列への改変遺伝子の伝達は、標準的な手法で確認することが可能であり、この動物を用いて、すべての細胞に改変型のP450RAI-3遺伝子を有する動物を育種することができる。このようなノックアウト動物を用いて、例えば、P450RAI-3タンパク質の非存在時における薬剤の有効性を検討することができる（P450RAI-3の発現がない場合でも致死性とならない）。ノックアウト動物を用いて、P450RAI-3の発現または活性の変化に関連した任意の条件の変化を追跡することもできる。
【０２４８】
以下の非制限的な実施例は本発明を説明するためのものである。
【０２４９】
実施例
実施例1−P450RAI-3をコードするcDNA配列の決定
インターネット（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）で利用可能な、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information；NCBI）の未完高処理ゲノム配列（Unfinished High Throughput Genomic Sequences）（htgs）データベースを対象に、ヒトP450RAI-1（配列番号：2、または図6Aを参照）およびヒトP450RAI-2（配列番号：4、または図6Aを参照）のアミノ酸配列を用いて検索を行った。Translated BLASTプログラムのTBLASTNアルゴリズムを用いて、2つのタンパク質の問合わせ配列に対するHTG配列全体の6つの可能な読み枠の検索を行った。すべての検索のパラメータは、ギャップ存在対価（gap existence cost）として11、残基あたり対価（per residue cost）として1、およびλ比として0.85を用いるBlosum 62のデフォルト値とした。配列番号：2または4（図6Aも参照）に類似性を示したヌクレオチド配列、および対応するアミノ酸配列をGenBankからダウンロードした。
【０２５０】
GenBank（AL358613）から得た対象配列の一つ（本明細書では配列番号：6）の、ヒト第10染色体に由来する160,532 bpのクローン（クローン名RP11-348J12、ライブラリーRPCI-11.2、配列決定はSanger Genome Centerで進行中；施設プロジェクト名：bA348J12、http：//www.sanger.ac.uk）は、配列番号：2および4（図6Aを参照）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチドと類似性を示した。後述するように、発明者らは、このクローンが、本発明の新しいシトクロムP450（P450RAI-3）の配列をコードするポリヌクレオチドを含むことを決定した。
【０２５１】
配列番号：6（不規則に並んだ43の断片）の6つの可能な読み枠の翻訳結果にアラインメントされたヒトP450RAI-1（配列番号：2、図6Aも参照）、およびヒトP450RAI-2（配列番号：4、図6Aも参照）のアミノ酸配列を用いて、N末端の第1エキソン、ならびに第4エキソン、および第5エキソン、ならびに第6エキソンのC末端の一部を推定した。第6エキソンは、すべてのP450に特徴的なヘム-チオレートのベンチマーク配列（
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を含んでいた。
【０２５２】
BACクローン（AL358613）の細菌の穿刺培養物をSanger Genome Centerから得た。コロニーのスクリーニングを2組のプライマーを用いてPCRで行い、P450RAI-3の既知断片を含む陽性コロニーを同定した。一組は、推定第1エキソン
2005512511.tif 000007
（配列番号：10のヌクレオチド1〜19 bp）と
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（配列番号：10のヌクレオチド204〜181 bpに相補的）に特異的なものとした。もう一組は、推定第4エキソン
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（配列番号：10のヌクレオチド715〜741 bp）と
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（配列番号：10のヌクレオチド826〜801 bpに相補的）の内部に対応するものとした。BACクローンのDNAを調製し、Hospital for Sick Children（Toronto、Ontario）のCentre for Applied Genomicsに送付し、配列の決定を行い、P450RAI-3を含む同定された領域の周囲の全ゲノム配列を完了した。
【０２５３】
AL358613のコンティグ配列情報、およびCentre for Applied Genomicsから得られた配列を用いて、ゲノムDNAの22,179 bpの断片（配列番号：9）を推定した。nrデータベース（GenBank+EMBL+DDBJ+PDBの配列のすべて）を対象に、BLASTNおよびBLASTXのアルゴリズムによって配列番号：9を用いて検索を行い、かつhtgsデータベースを対象にBLASTNおよびTBLASTXによる検索を行った。このヌクレオチド（配列番号：10、図2も参照）、および結果として得られるP450RAI-3の翻訳されたタンパク質配列（配列番号：11、図3も参照）も同定した。イントロンとエキソンの境界は、P450RAI-1、P450RAI-2、およびゲノム配列の関連領域間におけるアミノ酸の類似性の不在を元に推定した。新しいP450（P450RAI-3）の6つのエキソン、およびイントロン/エキソン境界を図5に示す。個々のエキソン内にコードされるアミノ酸を図の上部に示し、ヒトゲノム配列に関連するヌクレオチドの位置（配列番号：9、図1も参照）を図の下に示す。しかし、図5に記載されたエキソンの位置が、おおよその位置であり、実際の境界とは必ずしも一致しないことは言うまでもない。
【０２５４】
この配列を、P450RAI-1（CYP26A1）およびP450RAI-2（CYP26B1）との配列相同性を元にP450RAI-3と命名した。ヒトP450RAI-3とヒトP450RAI-1とP450RAI-2のアミノ酸配列の比較を図6Aに示す。P450RAI-1とP450RAI-3は全体的に、推定読み枠の領域に関してアミノ酸レベルで43%、ヌクレオチドレベルで52%の同一性を示す。これら2つの推定読み枠の全体的な類似性は、保存的に置換されるアミノ酸を考慮するとやや高い。P450RAI-2とP450RAI-3は全体的に、推定読み枠の領域に関してアミノ酸レベルで51%、ヌクレオチドレベルで61%の同一性を示す。また、2つの推定読み枠の全体的な類似性は、保存的に置換されるアミノ酸を考慮すると、やや高い。
【０２５５】
実施例2−P450RAI-3の組織発現
P450RAI-3の発現組織を明らかにするために、76種類のさまざまなヒト組織（Clontech、CA）を含む複数の組織のポリA+ RNAのドットブロットを対象にプローブを用いて調べた。末梢血液の白血球のcDNA（Origene、MD）に由来する200 bpのPCR断片（配列番号：24）を、推定第1エキソン（配列番号：25および26）に対するプライマーセットを用いて増幅した。ランダムプライムα-[32P]dATP-標識プローブを、製造業者によって記載された条件でブロットとハイブリッドを形成させた。図7Aに結果を示す。P450RAI-3の明瞭なシグナルが副腎で検出された。図7Bに76の組織試料の組織マップを示す。
【０２５６】
さまざまなヒト組織（筋肉、胃、精巣、胎盤、下垂体、甲状腺、副腎、および膵臓）に提示する複数の組織RACE cDNAパネル（Origene、MD）を、推定P450RAI-3遺伝子（配列番号：25および26）の推定第1エキソンに特異的なプライマーのセットを用いてPCR法で増幅した。したがって、P450RAI-3に由来するいくつかの増幅産物は、第1エキソンの大きさ（約200 bp）を示すはずである。PCR産物を1%アガロースゲルで分画し、UV照射下で調べた。この結果を図8に示す。この図から、200 bpの増幅断片についても主に副腎で発現しており、また程度は低いものの精巣で検出されたことがわかる。
【０２５７】
副腎におけるP450RAI-3の発現は、図9に示す結果によって確認した。副腎のmRNA（Ambion、TX）をRT-PCRで、P450RAI-3の推定第4エキソン（配列番号：27）に特異的なプライマー、および第6エキソン内部に特異的なプライマー
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（配列番号：10のヌクレオチド1248〜1224 bpに相補的）とともに用いた。増幅は、製造業者の推奨にしたがって実施した（Clontech、CA）。増幅産物を1%アガロースゲルで分画し、DNAマーカーを並置して紫外光下で可視化した（図9、パネルA）。次に、このゲルをHybond ECLニトロセルロース膜（Amersham Pharmacia Biotech、UK）上にブロットし、真空下で80℃で2時間ベーキングして膜に固定した。プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションの工程は、ExpressHyb（Clontech、CA）を用いて製造業者の指示書にしたがって実施した。このブロットを対象に、末端標識した（T4ポリヌクレオチドキナーゼの使用によるg-[32P]ATP）、第4エキソン内部に特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号：29）をプローブとして探査した。このブロットを、2×SSC/0.1% SDS中で室温で15分間、2回洗浄した後に、0.1% SSC/0.1% SDS中で15分間洗浄（60℃）し、Kodak X-OMAT ARフィルム（Eastman Kodak Company、NY）を70℃で一晩感光させた（図9、パネルB）。P450RAI-3に由来する推定PCR増幅産物に対応する0.5 kbpの断片が、図9のパネルBに認められる。
【０２５８】
実施例3−全トランス-レチノイン酸（ATRA）の代謝活性：
哺乳類細胞のトランスフェクション：酵素活性
哺乳類のCos-1細胞に、pcDNA-P450RAI-3ベクターまたはpcDNA-controlベクターのいずれかを、Fugene（商標）（Roche Diagnostic）を用いて、製造業者による指示書にしたがってトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞をPBSで洗浄し、ATRA代謝活性を文献に記載される手順で評価した。簡単に説明すると、トランスフェクト細胞を、放射標識した[3H]-ATRA（18000 cpm、2 nM）とともに3時間インキュベートした。有機性代謝物および水溶性代謝物をBligh-Dyer法で抽出し、放射能をカウントした（図10）。
【０２５９】
有機性代謝物のHPLC解析：Bligh-Dyer法による有機性のボタン層（button-layer）の水分を除去し、残存物をHPLC溶媒に懸濁した後に、文献（Whiteら、PNAS、vol 97、pg.6403-6408）に記載された手順でHPLC解析を行った（図11）。
【０２６０】
その結果、P450RAI-3がATRAを極性代謝物に効率的に代謝することがわかった。
【０２６１】
実施例4−細胞アッセイ法における基質の競合：レチノイド異性体と代謝物の競合
この実験の目的は、P450RAI-3の特異的な基質を決定することである。非標識のATRA、9-シス-RA、13-シス-RA、4-OH-RA、4-オキソ-RA、18-OH-RA、レチノール、レチナール、およびケトコナゾールを以下のように[3H]-RA代謝阻害アッセイ法に用いた。P450-RAIを安定にトランスフェクトしたHela細胞を、10% FBSおよび100 μg/mlハイグロマイシンBを含むMEM培地中で維持した。細胞を培養用のディッシュで培養し、指数関数的に増殖する細胞（70〜80%コンフルエント）を回収し、PBSで洗浄した後に、48ウェルプレートに5×105細胞/ウェルになるように、10% FBSを含む0.150 mlのMEM培地にプレーティングした。非標識ATRA、RA前駆体（レチノール、レチナール）、RA異性体（13-シス型および9-シス型）、またはRA代謝物（4-OH-RA、4-オキソ-RA、および18-OH-RA）のいずれかを濃度を上昇させながらDMSOに溶解して細胞に添加した。50 μlの[3H]-RA溶液（20000 cpm、最終濃度＝2 nM）を添加してRA代謝反応を開始させた。細胞を加湿CO2インキュベーター内で37℃で3時間インキュベートした。5 μlの10%酢酸を添加して反応を停止させた。有機性および水溶性の放射標識代謝物をBligh-Dyer法で抽出した。
【０２６２】
得られた結果を図12に示す。
【０２６３】
ATRAが最良の競合基質であり（ID50 0.3μM）、RA代謝物（4-OH-RA、および4-オキソ-RA）がこれに続いた。意外なことに、低濃度の9-シス-RAでも、P450RAI-3（ID50 1μM）と競合することがわかった。またケトコナゾールは弱い阻害物質であった（ID50 70μM）。しかし、過去のデータで得られたCYP26-AおよびCYP26-Bから判定されるように、レチノール（ビタミンA）およびレチナールはCYP26-Cの基質ではなかった。
【０２６４】
基質の競合：P450RAI-3とCYP26-Bの比較
9-シス-RAはP450RAI-3と競合することがわかったので、発明者らは、一過的に発現させたCos-P450RAI-3とCos-CYP26-B-2の細胞ベースのアッセイ法で、[3H]-RA代謝の阻害を非標識のATRA、9-シス-RA、13-シス-RA、およびケトコナゾールの濃度を上昇させながら比較した。
【０２６５】
この結果を図13と表1に示す。
【０２６６】
低濃度では、非標識ATRAはP450RAI-3とBの両方と競合した。しかし、9-シス-RA異性体はP450RAI-3のみと競合した。13-シス-RA異性体は、いずれの基質でもなかった。ケトコナゾールはCYP26-Bを阻害したが、P450RAI-3（CYP26C）の弱い阻害物質でしかなかった。
【０２６７】
（表１）細胞アッセイ法で得られたID50値の概要
2005512511.tif 000012
【０２６８】
実施例5−昆虫細胞およびミクロソーム調製物におけるP450RAI-3の発現
P450RAI-3またはCYP26B（Bac-P450RAI-3もしくはBac-CYP26B、またはCYP26B）のいずれかを発現する組換えバキュロウイルスを調製し、終点希釈、および96ウェルフォーマットでSf9細胞に感染させて力価を滴定した。ベクターを発現するバキュロウイルスをSf9昆虫細胞に同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に、RA代謝の細胞ベースのアッセイ法で感染細胞のRA代謝を以下のように評価した：自動リピートピペットを用いて50 μlの[3H]-RA溶液（20000 cpm、終濃度＝2 nM）を添加してRA代謝反応を開始した。細胞を3時間インキュベートした。5 μlの10%酢酸を添加して反応を停止させた。有機性および水溶性の放射標識代謝物をBligh-Dyer法で抽出した。
【０２６９】
P450RAI-3ならびにCYP26-Bを感染させたSf9細胞はATRAを代謝し、これを水溶性代謝物に変換した（図14）。
【０２７０】
P450RAI-3感染Sf9細胞およびCYP26B感染Sf9細胞に由来するミクロソームを以下の手順で調製した：指数関数的に成長する細胞を回収し、氷冷したPBSで洗浄し、カウントし、プロテアーゼ阻害物質カクテルを含む溶解緩衝液（5 mlの溶解緩衝液中に108個の細胞）中でホモジナイズして超音波処理を行った。P450RAI-3はミクロソームのシトクロムなので、これは好ましくは、NADPHシトクロムP450還元酵素、およびフラビンタンパク質を活性のために用いる。分画遠心法でミクロソームを単離し（800×gで10分に続き、10,000×gで10分）、最後に後ミトコンドリア（post mitochondrial）上清を超遠心機（Beckman）で遠心した（100,000×gで60分間）。ミクロソームのペレットを単離し、プロテアーゼ阻害物質カクテルを含む保存緩衝液中で穏やかにホモジナイズした。ミクロソーム調製物のタンパク質濃度を、ブラッドフォード反応アッセイ法のキットを用いて、BSA（Pierce）を標準として決定した。標準（1、0.5、0.25、0.125、および0.0625 mg/mlのBSA）の562 nmにおける吸光度、ならびに3段階に希釈した（1/5、1/10、および1/20）ミクロソーム試料を、自動マイクロプレートリーダー（μQuant、BioTek instruments Inc.）を用いて決定した。タンパク質濃度は、ソフトウェア（KCJunior）で直接計算した。ミクロソームは、保存緩衝液中に1 mg/mlとなるようにアリコートをとり、酵素活性を調べた後に、使用時まで液体窒素中で保存した。すべての手順は4℃で実施した。ミクロソームのP450量は、一酸化炭素アッセイ法で評価し、P450の全量を3 nmol/mlで決定した。
【０２７１】
RA代謝活性をRA代謝ミクロソームベースのアッセイ法で評価し、以下の手順でBligh Dyer法で抽出した：自動リピートピペットを用いて穏やかに解凍し、ホモジナイズされたミクロソームを48ウェルのプレートに、最終量が150 μlの保存緩衝液（0.5 mg/ml BSAを含む）になるようにプレーティングした。所定の濃度の2 μlの化合物溶液をアッセイ系に添加し、2μlのDMSOをMS対照（4回）および非MS対照に添加した。50 μlの[3H]-RA溶液（30,000 cpm、終濃度＝2 nM）を添加した。この化合物および[3H]-ATRAを有するミクロソームアッセイ系を最初に37℃で10分間インキュベートした後に、20μlのNADPH溶液（または最終濃度＝1 mM）を添加して反応を開始した。1時間のインキュベーション後に、5μlの10%酢酸を添加して反応を停止した。有機性および水溶性の放射標識代謝物をBligh-Dyer法で抽出した。5μgのミクロソームにおいて、NADPHの存在下で飽和活性を明らかにした（図14）。
【０２７２】
実施例6−ミクロソームアッセイ法における基質競合：P450RAI-3とCYP26-Bの比較
ATRA、9-シス-RA、および13-シス-RAを使用したSf9昆虫ミクロソームアッセイ法、ならびにSf9-Bac-P450RAI-3昆虫ミクロソームを使用した競合アッセイ法：（P450RAI-3対CYP26-B）。
【０２７３】
9-シス-RAはP450-RAI-3-RA代謝と競合するので、[3H]-RA代謝阻害の比較を、Sf9-Bac-P450RAI-3、およびSf9-Bac-CYP26-Bの昆虫ミクロソームにおいて、非標識のATRA、9-シス-RA、13-シス-RA、またはケトコナゾールのいずれかの濃度を上昇させながら行った。
【０２７４】
結果を図15に示し、ID50値を表2に示す。
【０２７５】
非標識ATRAは、P450RAI-3とCYP26-Bの両方と競合した（ID50値はそれぞれ20 nMと30 nM）。しかし9-シス-RAはP450RAI-3としか競合せず（ID50 80 nM）、CYP26-Bについては、かなり高濃度の異性体で、極めて弱い9-シス-RA競合が認められた（P450RAI-3に関しては高親和性基質である）。
【０２７６】
（表２）ID50値の概要
2005512511.tif 000013
【０２７７】
哺乳類のミクロソームにおける基質競合：P450RAI-3対CYP26-B
安定なHela-CYP26-B細胞、または一過的にP450RAI-3を感染させたCOS細胞のいずれかから調製したミクロソームを用いた。非標識ATRA、13-シス-RA、および9-シス-RA異性体の濃度を上昇させながら、実施例5に記載された手順で[3H]-RA代謝阻害アッセイ法を実施した。
【０２７８】
結果を表3と図16に示す。
【０２７９】
哺乳類のミクロソームについては、バキュロウイルスSf9感染昆虫細胞から調製されたミクロソームについて既に得られた結果と同様の結果が得られた。簡単に説明すると、ATRAが、CYP26-BおよびP450RAI-3に対する最高の親和性基質であった（ID50 20 nM）。しかし9-シス-RAはP450RAI-3と競合したが（ID50 80 nM）、CYP26Bとは競合しなかった。予測されるように13-シス-RAは、低濃度ではCYP26AまたはCYP26Bのいずれとも競合しなかった。ケトコナゾールはP450RAI-3の弱い阻害物質であった（ID50 70μM、CYP26Bに関するID50は0.7μM）。
【０２８０】
（表３）哺乳類ミクロソームのID50値の概要
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【０２８１】
実施例7−ATRAおよび9-シス-RA結合アッセイ法
P450RAI-3に対するATRAの結合実験は、Sf9-Bac-P450RAI-3昆虫ミクロソームを用いて2回行った。結果を図17に示し、ID50値を表4に示す。
【０２８２】
実験はCYP26-Bとともに実施し、P450RAI-3およびCYP26-Bに関してそれぞれKd値として48 nM、および114 nMを得た。2回目は、P450RAI-3のみのアッセイ法を実施し、Kd値として42 nMを得た。ケトコナゾールによるP450RAI-3に対するATRA結合の競合についても2回実施した。1回目は、最大10μMの濃度のケトコナゾール濃度を用いたが、最高濃度では15%の阻害しか認められなかった。2回目のアッセイ法は、CYP26-Bとともに、ケトコナゾール濃度を最大100μMとして行った。P450RAI-2とP450RAI-3のそれぞれについて、Kd値として1.5μM、および70.5μMを得た。
【０２８３】
CYP26-A、B、およびCに対する9-シス-RAの結合も、0.05 nM〜1000 nMの基質濃度で実施した（図18）。
【０２８４】
極めて良好な結合は、P450RAI-3ミクロソームでしか認められなかった。しかし、CYP26-AおよびCYP26-Bに対する9-シス-RAの弱い結合も認められた。P450RAI-3についてはKd値は69 nMであったが、CYP26-AとCYP26-BについてKd値を決定することはできなかった。これは、両タンパク質に対する9-シス-RAの結合が、最大1000 nMの基質濃度に対して直線的であったためである。得られたKd値を表4にまとめた。
【０２８５】
酵素競合アッセイ法の結果からわかるように、この結合アッセイ法で、P450RAI-3に対するATRAならびに9-シス-RAの親和性が高いことが確認された。
【０２８６】
（表４）Kd値の概要
2005512511.tif 000015
【０２８７】
実施例8−P450RAI-3による9-シス-RAの代謝
9-シス-RAはP450RAI-3と競合し、結合することがわかったので、発明者らは、P450RAI-3を一過的にトランスフェクトしたCos細胞における9-シス-RAの代謝を調べた。哺乳類Cos-1細胞に、pcDNA-P450RAI-3ベクターまたはpcDNA-controlベクターのいずれかを、製造業者による指示書にしたがってFugene（Roche）を用いて導入した。トランスフェクションの48時後に細胞をPBSで洗浄し、9-シス-RA代謝の活性の評価を文献記載の手順でBligh-Dyer法で行った。簡単に説明すると、形質転換細胞を放射標識した[3H]-9-シス-RA（38000 cpm、2 nM）と3時間インキュベートした。有機性および水溶性の代謝物をBligh-Dyer法で抽出し、放射能をカウントした（図19）。
【０２８８】
9-シス-RA代謝のHPLCによる解析：ボタン有機相から水分を除き、残存物をHPLC溶媒に懸濁し、文献記載の手順（Whiteら、PNAS、vol 97、pg.6403）でHPLCで解析した（図20）。
【０２８９】
結果：P450RAI-3をトランスフェクトしたCos細胞は、9-シス-RAをヒドロキシ代謝物およびオキソ代謝物に、ならびに極性の高い水溶性代謝物に変換した。
【０２９０】
実施例9−P450RAI-3：ATRAおよび9-シス-RA代謝経路のLC/MS解析
Hela-P450RAI-3安定細胞を用いて、ATRAおよび9-シス-RAの代謝経路を決定した。Hela-P450RAI-3細胞を、1μMのATRAまたは9-シス-RAのいずれかと、10% FBSを含む10 mlのMEM培地中でインキュベートした。37℃で5時間インキュベートした後に、酢酸を添加して細胞を酸性化し、全レチノイドを酢酸エチル法で抽出した。有機性の上層をプールし、急速真空下で水分を除き、乾燥後の残存物をHPLC移動溶媒に溶解してLC/MSで解析した。
【０２９１】
HPLCシステムは、Waters Alliance 2690分離モジュールで構成した。クロマトグラフィーは、Eclipse X DB-C18逆相カラム（5μm、2.1×150 mm、HP）で得た。勾配溶出プログラムではアセトニトリル、水、および10%酢酸を用いた。流速は0.2 ml/分とした。UV吸光度を351 nmに設定し、レチノイド標準物質（ATRA、9-シス-RA、13-シス-RA、4-OH-RA、18-OH-RA、4-オキソ-RA）のモニタリングに使用した。
【０２９２】
この実験に用いた質量分析の条件は、Micro-mass Quatro Ultima Tandem triple quadruple 質量分析計（エレクトロスプレーインターフェース（ESI）を装備）からなり、ネガティブモードで運転した。MSモードMSおよびMS/MSの2つの方法、1）完全スキャンモード（m/z 200〜500）を使用し、かつ2）前駆体イオンスキャンモードを用いるMS/MSモードを用いて、RAのヒドロキシ代謝物およびオキソ代謝物のピークのスクリーニングおよび同定を行った。
【０２９３】
結果を図21に示す。
【０２９４】
P450RAI-3は、ATRAならびに9-シス-RAを、ヒドロキシ代謝物およびオキソ代謝物に代謝した。
【０２９５】
実施例10−P450RAI-3を発現する安定哺乳類細胞
細胞のトランスフェクションおよびクローニング
P450RAI-3遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を含むpcDNAベクターまたはpcEBVベクターのいずれかをHela細胞にトランスフェクトした。次に10% FBSおよびハイグロマイシン（200μg/ml）を含むMEM培地で形質転換細胞を選択した。生存した選択細胞をRA活性に関して試験し、クローン化を行った。2つの高活性クローン（pcEBVクローン1とpcDNAクローン22）を選択し、増殖して、ATRAおよび9-シス-RAの代謝の評価を行った（図22）。
【０２９６】
ミクロソームをHela-P450RAI-3クローン1から調製し、RA代謝活性を評価した後に液体窒素中で保存した（図23）。
【０２９７】
CYP26Cを安定に発現する哺乳類細胞が作製されており、ATRAおよび9-シス-RAの代謝活性をもつことが報告されている。
【０２９８】
本発明は、現在好ましい実施例であると考慮されている事項に関して記載されているが、本発明は、開示された実施例に制限されないと理解される。むしろ本発明は、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲に含まれる、さまざまな改変および同等の配置（arrangements）を対象とする。
【０２９９】
すべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に、その全体が参照として本明細書に組み入れられることが示されているのと同程度に、全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０３００】
参考文献
上記で引用された参考文献の詳細を以下に示す。記載された全ての参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０３０１】
2005512511.tif 000016
2005512511.tif 000017
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2005512511.tif 000027
【図面の簡単な説明】
【０３０２】
【図１】AL358613のコンティグ情報、およびCentre for Applied Genomicsから得た配列に基づく、P450RAI-3（配列番号：9）の22,179 bpのゲノムDNA配列である。対応するアミノ酸配列（ヌクレオチド配列の3つの異なる読み枠に由来する配列）も示す。
【図２】1569 bpのP450RAI-3のcDNA配列（配列番号：10）である。
【図３】P450RAI-3の522アミノ酸配列（配列番号：11）である。
【図４】P450RAI-3のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のアラインメントである。
【図５】ヒトゲノムクローン（配列番号：9）上のヒトシトクロムP450RAI-3の6個のエキソンを示す略図である。図の上の数字は、図3（配列番号：11）と関するエキソンのアミノ酸領域を示す。図の下の数字は、ヒトゲノムクローン配列（配列番号：9、または図1）上のヌクレオチドの位置を示す。
【図６】Aは、P450RAI-1、P450RAI-2、およびP450RAI-3のアミノ酸配列のアラインメントを示す。Bは、3種のシトクロムP450RAIのアミノ酸レベルにおけるアラインメントスコアを示す。Cは、3種のシトクロムP450RAIの核酸レベルにおけるアラインメントスコアを示す。
【図７】Aは、さまざまなヒト組織におけるP450RAI-3の発現を示すドットブロットである。Bは、図6Aのドットブロットの凡例である。
【図８】さまざまなヒト組織におけるP450RAI-3の発現を示す1%アガロースゲルである。
【図９】ヒト副腎におけるP450RAI-3の発現を示すサザンブロットである。
【図１０】AおよびBは、pcDNA-P450RAI-3ベクターまたはpcDNA-controlベクターのいずれかをトランスフェクトした哺乳類Cos-1細胞の水性画分（A）および有機性画分（B）の全トランスレチノイン酸の活性（放射能カウント）を示す棒グラフである。COS細胞単独の場合、およびNCCの場合の結果をあわせて示す。
【図１１】P450RAI-3（Cos-pcDNA-CYP26C）（B）がATRAを極性代謝物に代謝することを示す、ATRA代謝アッセイ法に由来する有機性代謝物のHPLC解析を示す（対照（Cos-pcDNA）（A）ではこのような代謝活性は認められない）。
【図１２】AおよびBは、実施例4の基質アッセイ法の結果を示す線グラフを示す。候補化合物であるATRA、RA前駆体（レチノール、レチナール）、RA異性体（13-シス型および9-シス型）、またはRA代謝物（4-OH-RA、4-オキソ-RA、および18-OH-RA）を対象としたP450RAI-3基質の決定。
【図１３】AおよびBは、一過的に導入したCos-P450RAI-3（A）細胞と、Cos-CYP26-B（B）細胞をベースとしたアッセイ法における、非標識ATRA、9-シス-RA、13-シス-RA、およびケトコナゾールの濃度を上昇させたときの[3H]-RA代謝阻害の比較を示す線グラフ。
【図１４】Aは、P450RAI-3（CYP26C）、およびCYP26-Bを感染させたSf9細胞を対象としたRA代謝の評価を示す棒グラフである。Bは、NADPHの存在下および非存在下におけるP450RAI-3の活性。この結果は、P450RAI-3がミクロソームのシトクロムP450であることと矛盾しない。
【図１５】AおよびBは、Sf9-Bac-P450RAI-3（A）、およびSf9-Bac-CYP26-B（B）昆虫ミクロソームを対象に、非標識ATRA、9-シス-RA、13-シス-RA、またはケトコナゾールのいずれかの濃度を上昇させたときの[3H]-RA代謝阻害の比較を示す線グラフである。
【図１６】AおよびBは、P450RAI-3（A）、およびCYP26-B（B）哺乳類ミクロソームを対象に、非標識ATRA、13-シス-RA、および9-シス-RA異性体の濃度を上昇させながら実施した[3H]-RA代謝阻害アッセイ法の結果を示す線グラフである。
【図１７】A（線グラフ）およびB（ラインウィーバー・バークプロット）は、Sf9-Bac-P450RAI-3、およびSf9-Bac-CYP26B昆虫ミクロソームを用いた、実施例7のATRA/P450RAI-3およびCYP26Bの結合アッセイ法の結果を示すグラフである。
【図１８】A（線グラフ）およびB（ラインウィーバー・バークプロット）は、実施例7に記載された9-シス-RA/CYP26C（P450RAI-3）の結合アッセイ法の結果を示すグラフである。CYP26-A、B、およびCに対する9-シス-RAの結合の決定は、0.05 nM 〜1000 nMの基質濃度で実施したが、CYP26AおよびCYP26BのKd値を決定することはできなかった（実施例7参照）。
【図１９】AおよびBは、実施例8に記載された手順による、P450RAI-3を一過的にトランスフェクトしたCOS細胞における9-シス-RA代謝に由来する水溶性代謝物（A）および有機性代謝物（B）の解析を示す棒グラフである。
【図２０】AおよびBは、対照COS細胞（A）、およびP450RAI-3を一過的にトランスフェクトしたCOS細胞（B）を対象とした、9-シス-RA代謝のHPLC解析を示す。
【図２１】AおよびBは、実施例9に記載された手順による、Hela-P450RAI-3安定細胞によるATRA（B）、および9-シス-RA（A）の代謝の質量分析を示す。
【図２２】AおよびBは、Hela細胞クローン（pcEBVクローン1、pcDNAクローン22）における、ATRA（A）、および9-シス-RA（B）の代謝の評価を示すグラフである。
【図２３】実施例10に記載された手順でHela-P450RAI-3クローン1から回収したミクロソームのRA代謝活性を示すグラフである。
【配列表】
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2005512511.tif 000080
【図１−１】
2005512511.tif 000081
【図１−２】
2005512511.tif 000082
【図１−３】
2005512511.tif 000083
【図１−４】
2005512511.tif 000084
【図１−５】
2005512511.tif 000085
【図１−６】
2005512511.tif 000086
【図１−７】
2005512511.tif 000087
【図１−８】
2005512511.tif 000088
【図１−９】
2005512511.tif 000089
【図１−１０】
2005512511.tif 000090
【図１−１１】
2005512511.tif 000091
【図１−１２】
2005512511.tif 000092
【図１−１３】
2005512511.tif 000093
【図１−１４】
2005512511.tif 000094
【図１−１５】
2005512511.tif 000095
【図１−１６】
2005512511.tif 000096
【図１−１７】
2005512511.tif 000097
【図１−１８】
2005512511.tif 000098
【図１−１９】
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【図１−２０】
2005512511.tif 000100
【図１−２１】
2005512511.tif 000101
【図１−２２】
2005512511.tif 000102
【図１−２３】
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【図１−２４】
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【図１−２５】
2005512511.tif 000105
【図２】
2005512511.tif 000106
【図３】
2005512511.tif 000107
【図４−１】
2005512511.tif 000108
【図４−２】
2005512511.tif 000109
【図５】
2005512511.tif 000110
【図６Ａ−１】
2005512511.tif 000111
【図６Ａ−２】
2005512511.tif 000112
【図６Ａ−３】
2005512511.tif 000113
【図６Ａ−４】
2005512511.tif 000114
【図６Ａ−５】
2005512511.tif 000115
【図６Ｂ】
2005512511.tif 000116
【図６Ｃ】
2005512511.tif 000117
【図７−１】
2005512511.tif 000118
【図７−２】
2005512511.tif 000119
【図８】
2005512511.tif 000120
【図９】
2005512511.tif 000121
【図１０】
2005512511.tif 000122
【図１１】
2005512511.tif 000123
【図１２】
2005512511.tif 000124
【図１３】
2005512511.tif 000125
【図１４】
2005512511.tif 000126
【図１５】
2005512511.tif 000127
【図１６】
2005512511.tif 000128
【図１７】
2005512511.tif 000129
【図１８】
2005512511.tif 000130
【図１９】
2005512511.tif 000131
【図２０】
2005512511.tif 000132
【図２１】
2005512511.tif 000133
【図２２】
2005512511.tif 000134
【図２３】
2005512511.tif 000135
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月29日(2004.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明は、以下の段階を含む、生物試料中に配列番号：40のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子の検出法も含む：
（a）本発明の核酸分子と生物試料の核酸のハイブリッドを形成することで、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる段階；ならびに
（b）ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階（ハイブリダイゼーション複合体の存在は、生物試料に含まれるタンパク質をコードする核酸分子の存在と相関する）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
本発明は、生物試料の核酸を、ハイブリッド形成段階に先立ってポリメラーゼ連鎖反応で増幅させる方法も含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明は、本発明の1つまたは複数の核酸分子もしくはタンパク質、または方法で同定される物質もしくは化合物、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む組成物も含む。本発明は、本発明のタンパク質、または本発明の核酸分子が関連する条件を治療するために薬学的組成物を調製する際における、本発明の核酸分子またはタンパク質、または本発明の方法で同定される物質もしくは化合物も含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１−２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１−２５】
2005512511.tif 000136
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2005512511.tif 000137
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2005512511.tif 000138
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７−１】
2005512511.tif 000139
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７−２】
2005512511.tif 000140
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月28日(2004.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本発明は、生物試料中における、例えば配列番号：11のアミノ酸配列を含む、P450RAI-3タンパク質をコードする核酸分子の検出法であって、以下の段階を含む方法も含む：
（a）本発明の核酸分子と生物試料の核酸のハイブリッドを形成することで、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる段階；ならびに
（b）ハイブリダイゼーション複合体を検出する段階（ハイブリダイゼーション複合体の存在は、生物試料に含まれるタンパク質をコードする核酸分子の存在と相関する）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
シトクロムP450は、推定ファミリーの特徴
2005512511.tif 000141
（Xは任意の残基を意味し、保存されている残基を太字で示す（配列番号：7））を含むヘム結合タンパク質である（Nelson, D.R.、Methods in Molecular Biology、第107巻：Cytochrome P450 Protocols、Cytochrome P450 Nomenclature、pp.15-24、Phillips, I.R.およびShephard, E.A.編、Humana Press Inc.、Totowa、NJ（1998））。P450RAI-3のヘム結合の特徴は、図3のアミノ酸452〜461位に認められ、モチーフ
2005512511.tif 000142
を含む。
【国際調査報告】
2005512511.tif 000143
2005512511.tif 000144
2005512511.tif 000145
2005512511.tif 000146
2005512511.tif 000147
2005512511.tif 000148