(57)【要約】本発明は、相補的核酸のような特異的核酸結合剤によって核酸をハイブリダイズするためのキットおよび方法に関する。先に、他者がそのような基質結合剤によって核酸をハイブリダイズしている。本明細書記載の改良方法は、その剤に加え、ポリカチオン化可能誘引化合物の基質への結合を含む。適当なポリカチオン化可能誘引化合物の例には、ヒスチジンのようなポリカチオン化の調節が可能なアミノ酸残基を有するポリペプチドなどがある。このハイブリダイゼーション速度向上技術を使用する組成物、キット、装置および方法を開示する。
2005520568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸と特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）をハイブリダイズする方法であって、
ｉ）核酸  および
ｉｉ）ハイブリダイゼーション領域を有する基質（ここに、ＳＮＡＢＡおよびポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）がそのハイブリダイゼーション領域で基質に結合し、そのＰＣＡＣは、ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化可能部分を有し結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含む）
を結合溶液中で接触させ、それによって核酸がＳＮＡＢＡとハイブリダイズする方法。
【請求項２】
基質が、ＳＮＡＢＡもＰＣＡＣも結合しないバックグラウンド領域を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ハイブリダイゼーション領域およびバックグラウンド領域が隣接している、請求項２記載の方法。
【請求項４】
基質が、ＳＮＡＢＡは結合しＰＣＡＣは結合しない第一調節領域を有する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
基質が、ＰＣＡＣは結合しＳＮＡＢＡは結合しない第二調節領域を有する、請求項２記載の方法。
【請求項６】
ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの両方がハイブリダイゼーション領域で基質に共有結合する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＰＣＡＣがその直線上の末端付近で基質と共有結合する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション領域と結合するＳＮＡＢＡのモル数が、ハイブリダイゼーション領域と結合するＰＣＡＣのモル数とおおよそ等しい、請求項６記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイゼーション領域と結合するＰＣＡＣのモル数が、ハイブリダイゼーション領域と結合するＳＮＡＢＡのモル数の約３倍以下である、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
ＰＣＡＣが、結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも５個の部分を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
ＰＣＡＣが、結合領域のｐＨで正に帯電する少なくとも１０個の部分を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＰＣＡＣが、結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも１５個の部分を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＰＣＡＣが、結合溶液のｐＨで負に帯電する部分を含まない、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ＰＣＡＣが、２５個より多くのアミノ酸残基を含まないポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ポリペプチドが、５から約２０個のアミノ酸残基を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ポリペプチドが、１０から２０個のアミノ酸残基を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドのカルボキシ末端がアミド化されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドが、少なくとも１個のヒスチジン残基を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが、少なくとも１個のリジン残基を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが、配列番号：１、２および９から２２のうちひとつのアミノ酸配列を有する領域を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
ポリペプチドが、配列番号：１、２および９から２２のうちひとつのアミノ酸配列を有する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドが、配列番号：１６から１８のうちひとつのアミノ酸配列を有する領域を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドが、配列番号：１６から１８のうちひとつのアミノ酸配列を有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
基質結合ＰＣＡＣが、化学構造：
Ｓｕ−Ｌｋ−Ｘ−（Ｌｙｓ−Ｈｉｓｎ）ｍ−Ｘ−Ｚ
［式中、
Ｓｕは基質、
Ｌｋはリンカー、
Ｘはそれぞれ独立して、０から２５個のアミノ酸残基、
ｎは１から５、
ｍは１から１０、および
Ｚは水素ラジカル、カルボキシレート・キャッピング部分およびＳＮＡＢＡのうちのひとつ］である、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
リンカーが、共有結合およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジル部分からなる群から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
Ｘがそれぞれ独立して、結合溶液のｐＨにおいて負に帯電しない側鎖を有する０から２５個のアミノ酸残基である、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
Ｘがそれぞれ独立して０から２５個のアミノ酸残基であり、これらの残基のあらゆる側鎖のカルボン酸部分がキャッピングされている、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
Ｚが水素ラジカルもしくはアミド部分のいずれかである、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
Ｚが、化学構造−ＮＲ１Ｒ２を有するアミド部分であり、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、水素ラジカルおよび１つまたはそれ以上のヒドロキシルまたはアミン部分で置換されていることもあるＣ１−Ｃ６直鎖アルキルラジカルからなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
Ｚが、化学構造−ＮＲ３Ｒ４を有する環状アミド部分であり、Ｒ３およびＲ４はともに１つまたはそれ以上のヒドロキシルまたはアミン部分で置換されていることもあるＣ５−Ｃ８ジアルキレン部分である、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
Ｚが−ＮＨ２である、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
基質結合化合物が、化学構造：
Ｓｕ−Ｌｋ−Ｘ−（Ｈｉｓｎ−Ｌｙｓ）ｍ−Ｘ−Ｚ
［式中、
Ｓｕは基質、Ｌｋはリンカー、
Ｘはそれぞれ独立して、０から２５個のアミノ酸残基、
ｎは１から５、
ｍは１から１０、および
Ｚは水素ラジカル、カルボキシレート・キャッピング部分およびＳＮＡＢＡのうちのひとつ］である、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
ＳＮＡＢＡがポリヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
ポリヌクレオチドが該核酸に相補的である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＳＮＡＢＡが、ポリヌクレオチドアナログ、配列特異的核酸結合タンパク質、構造特異的核酸結合タンパク質およびコンホメーション特異的核酸結合タンパク質からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３６】
ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣが結合している、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
ハイブリダイゼーション領域が、実質的に扁平な基質表面の一部である、請求項１記載の方法。
【請求項３８】
基質が結合溶液に対して実質的に不浸透性である、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
基質がガラス、シリコン基盤およびプラスチックからなる群から選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
基質が多孔質である、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
結合溶液で基質と接触した後に、第二の結合溶液でさらに基質と接触し、第二の結合溶液のｐＨが結合溶液のｐＨよりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
結合溶液が除去され、第二の結合溶液と交換される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
結合溶液にｐＨ調節剤を加えて第二の結合溶液を産生する、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
結合溶液存在下よりも第二の結合溶液存在下の方がＰＣＡＣの正味電荷がより小さい正電荷である、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
第二の結合溶液存在下のＰＣＡＣの正味正電荷が、結合容液存在下のＰＣＡＣの正味正電荷の半分以下である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
第二の結合溶液存在下のＰＣＡＣの正味正電荷が、結合溶液存在下のＰＣＡＣの正味正電荷の４分の１以下である、請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
第二の結合溶液のイオン強度が結合溶液のイオン強度よりも大きい、請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
基質が第二の結合溶液の流動によってリンスされる、請求項４３記載の方法。
【請求項４９】
第二の結合溶液で基質と接触した後に、第一リンス溶液でさらに基質と接触し、第一リンス溶液が第二結合容液と異なる温度である、請求項４３記載の方法。
【請求項５０】
第一リンス溶液の温度が第二の結合溶液の温度よりも高い、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ＰＣＡＣの分子量が約１５０００よりも大きい、請求項１記載の方法。
【請求項５２】
結合溶液存在下で核酸と特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）をハイブリダイズさせる装置であって、
ｉ）ＳＮＡＢＡおよび
ｉｉ）ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化部分を有し結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含む、ポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）
が結合するハイブリダイゼーション領域を有する基質を含む装置。
【請求項５３】
ＳＮＡＢＡとハイブリダイズした核酸を有する、請求項５２記載の装置。
【請求項５４】
核酸とＳＮＡＢＡをハイブリダイズさせるためのキットであって、請求項５２の装置およびその装置を使用して核酸とＳＮＡＢＡをハイブリダイズさせる方法を記載した説明書を含むキット。
【請求項５５】
ｉ）核酸と
ｉｉ）ハイブリダイゼーション領域とそこに結合した特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）を有する基質
を結合溶液存在下で接触させることにより、核酸とＳＮＡＢＡをハイブリダイズさせる方法の改良法であって、基質と核酸が接触するまでに、ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化部分を有し結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含むポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）をハイブリダイゼーション領域と結合させる方法であり、ＰＣＡＣにより核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーション速度が向上する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、2002年3月22日出願の米国出願番号10/104,307の利益を請求する。
【連邦政府関係の陳述】
【０００２】
［後援を受けた研究または進展］
非適用
【０００３】
［添付ミクロフィッシュの参照］
非適用
【背景技術】
【０００４】
マイクロアレイ技術を使用する生物学的アッセイの小型化はハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の発展に不可欠である。しかし、ＨＴＳが、薬理遺伝学（ファーマコフェネティクス）のような分野の発展に有用で、強力かつ費用効果的な研究手段として完全に認識されるまでには、重大な障害が依然として残っている。これらの障害のひとつは、マイクロアレイにおいて核酸が分子とハイブリダイズする速度である。
【０００５】
核酸のハイブリダイゼーション速度が向上すると、時間や必要な材料量の軽減および生産性の増大により、ＨＴＳの研究手段としての価値をより高めることが容易になる。最近の一般的なハイブリダイゼーション時間は数時間（例えば、単一のヌクレオチドの多型解析の場合）から一晩（12から18時間；例えば、遺伝子発現アレイの場合）の範囲である。このように、発現プロファイル マイクロアレイのハイブリダイゼーション時間は、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析およびナイロン膜ベースのマクロアレイに必要な時間とほぼ同等である。ＨＴＳ法の性能を高めるため、および他の目的のために、ハイブリダイゼーション時間を改善する必要がある。本発明は核酸ハイブリダイゼーション時間向上（ＨＲＥ）法を提供することにより、この必要性を満足させる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は核酸と特異的核酸結合剤をハイブリダイズする方法に関する。この方法は、結合容液の存在下で、
ｉ）核酸および
ｉｉ）ハイブリダイゼーション領域を有する基質（例えば、多孔質または非多孔質ガラス、シリコンまたはプラスチック基質）
を接触させる方法である。
ＳＮＡＢＡおよびポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）は基質のハイブリダイゼーション領域に（例えば共有結合的に）結合する。ＰＣＡＣは、ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化部分を有し結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含む。好ましくは、基質はさらに、ＳＮＡＢＡもＰＣＡＣも結合しない、１つまたはそれ以上のバックグラウンド領域、ＳＮＡＢＡが結合しＰＣＡＣが結合しない第一調節領域、およびＰＣＡＣが結合しＳＮＡＢＡが結合しない第二調節領域を有する。
【０００７】
一態様において、ハイブリダイゼーション領域に結合するＳＮＡＢＡのモル数は、ハイブリダイゼーション領域に結合するＰＣＡＣのモル数にほぼ等しいか、またはハイブリダイゼーション領域に結合するＰＣＡＣのモル数は、ハイブリダイゼーション領域に結合するＳＮＡＢＡのモル数の少なくとも約３倍以下である。
【０００８】
別の態様において、ＰＣＡＣは、結合溶液のｐＨにおいて正に帯電する部分を少なくとも５個、１０個または１５個含有する。ＰＣＡＣは好ましくは、結合溶液のｐＨにおいて負に帯電する部分を含まない。ＰＣＡＣは、２５個以下のアミノ酸残基（好ましくは５から約２０個または１０から２０個のアミノ酸残基）を含むようなポリペプチドであり得る。ＰＣＡＣがポリペプチドである場合、そのカルボキシ末端はキャッピングされていてもよい（例えば、アミド化される、またはＳＮＡＢＡと結合する）。ポリペプチドＰＣＡＣは好ましくは、少なくとも１つのヒスチジン残基、少なくとも１つのリジン残基、またはその両方を含む。ポリヌクレオチドＰＣＡＣの例には、配列番号：１、２および９から２２のうちの１つ（好ましくは配列番号：１６から１８のうちの１つ）のアミノ酸配列を有する領域を含むポリペプチド、および配列番号：１、２および９から２２のうちの１つ（好ましくは配列番号：１６から１８のうちの１つ）のアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。一態様において、ＰＣＡＣの分子量は約１５０００以下である。
【０００９】
基質結合ＰＣＡＣは化学構造：
Ｓｕ−Ｌｋ−Ｘ−（Ｌｙｓ−Ｈｉｓｎ）ｍ−Ｘ−Ｚ
［式中、
Ｓｕは基質、
Ｌｋはリンカー、
それぞれのＸはそれぞれ独立して、０から２５個のアミノ酸残基、
ｎは１から５、
ｍは１から１０、および
Ｚは水素ラジカル、カルボキシレート・キャッピング部分およびＳＮＡＢＡのうちのひとつ］を持ち得る。
リンカーは例えば、共有結合またはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル部分であり得る。Ｘ部分のアミノ酸残基は好ましくは、結合溶液のｐＨにおいて負に帯電しない側鎖を持つ残基である。さらに、Ｘ部分のアミノ酸残基のいずれかがカルボン酸部分側鎖を持つ場合、そのカルボン酸部分側鎖はキャッピングされていてもよい。Ｚがアミド部分である場合、適当な化学構造は−ＮＲ１Ｒ２［式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、水素ラジカルおよび、１つまたはそれ以上のヒドロキシまたはアミン部分で置換されていることもあるＣ１−Ｃ６直鎖アルキルラジカルからなる群から選択される］、および−ＮＲ３Ｒ４［式中、Ｒ３およびＲ４はともに１つまたはそれ以上のヒドロキシまたはアミン部分で置換されていることもあるＣ５−Ｃ８ジアルキレン部分］などである。一態様において、Ｚは−ＮＨ２である。
【００１０】
基質結合化合物は化学構造：
Ｓｕ−Ｌｋ−Ｘ−（Ｈｉｓｎ−Ｌｙｓ）ｍ−Ｘ−Ｚ
［式中、それぞれの部分は上記と同じ定義である］
を持ち得る。
【００１１】
重要な態様において、ＳＮＡＢＡは、核酸と相補的なポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドである。他のあり得るＳＮＡＢＡには、ポリヌクレオチドアナログ、配列特異的核酸結合タンパク質、構造特異的核酸結合タンパク質、およびコンホメーション特異的核酸結合タンパク質が含まれる。ＳＮＡＢＡはＰＣＡＣと（例えば共有結合的に）結合し得る。
【００１２】
基質と結合溶液を接触させた後、基質は、その結合溶液のｐＨよりも大きいｐＨを持つ第二の結合溶液と接触させることができる。一態様においては、結合溶液を除去し、第二の結合溶液と交換する。別の態様においては、ｐＨ調節剤を結合溶液に加えて、第二の結合溶液とする。好ましくは、結合溶液存在下よりも第二の結合溶液存在下の方が、ＰＣＡＣの正味電荷はより小さい正電荷である。例えば、第二の結合溶液存在下のＰＣＡＣの正味正電荷が結合溶液存在下のＰＣＡＣの正味正電荷の２分の１以下（または４分の１以下）となるように、第二の結合溶液を選択できる。もしくは、またはそれに加えて、第二の結合溶液のイオン強度が結合溶液のイオン強度より大きくともよい。
【００１３】
基質は、第二の結合溶液と接触した後に、第二の結合溶液とは異なる温度である第一リンス溶液と接触させることができる。
【００１４】
本発明はまた、結合溶液存在下で核酸と特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）をハイブリダイズする装置に関する。その装置はハイブリダイゼーション領域を有する基質を含む。ハイブリダイゼーション領域はそこで
ｉ）ＳＮＡＢＡおよび
ｉｉ）ポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）
と結合する。
ＰＣＡＣは、ｐＨ４から９．５の範囲にｐＫ値を持つ少なくとも１個のカチオン化部分を有し結合溶液のｐＨで正に帯電する少なくとも２個の部分を含む。本発明は核酸とＳＮＡＢＡをハイブリダイズするキットを含む。そのキットは、この装置と、核酸とＳＮＡＢＡをハイブリダイズする該装置の使用法を記載した説明書からなる。
【発明の詳しい説明】
【００１５】
従来の核酸ハイブリダイゼーションは受動的であり、ｉ）液体に懸濁した核酸標的分子（標的）およびｉｉ）液体に懸濁するかまたはその液体が接触する表面に固定することができる第二分子（プローブ）の拡散および会合速度の遅さに依存する。受動的ハイブリダイゼーション速度は、液体中の標的濃度に大きく依拠するが、他の要因（例えば、プローブ濃度、標的とプローブの構造、温度および液体のイオン強度）にも依拠する。
【００１６】
本発明は、受動的ハイブリダイゼーション法に対して、ハイブリダイゼーション速度を有意に促進することができるハイブリダイゼーション技術に関する。本明細書に記載する方法は、一般にハイブリダイゼーション速度促進（ＨＲＥ）法として言及され、特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ；例えば、核酸プローブ、核酸結合タンパク質または別の核酸結合物質）が結合する基質の帯電を誘導し、標的をその基質に誘引する方法である。帯電した基質を、標的ポリヌクレオチドを一般にその基質の全表面域に誘引するために用いていたこれまでの方法とは異なり、本明細書記載のＨＲＥ法では、ＳＮＡＢＡが結合する基質の１つまたはそれ以上の領域（場合によりＳＮＡＢＡがない時に電荷が誘導される１つまたはそれ以上の「調節」領域を含む）にのみ電荷を誘導する。本明細書記載のＨＲＥ法を用いることにより、核酸ハイブリダイゼーション時間を有意に短縮できる。
【００１７】
従来技術のハイブリダイゼーション法が時間または日数というハイブリダイゼーション期間を必要とするのに対し、本明細書記載のＨＲＥ法を含むハイブリダイゼーション法は、わずか約１、２、３、５、１０、１５、２０、３０または４５分の間に十分な量のハイブリダイゼーションができる。必要とされるハイブリダイゼーション量によって（例えば、簡単に検出できる核酸を用いた時など）、さらにより短いハイブリダイゼーション時間（例えば、１、２、３、５、１０、１５、２０、３０または４５秒）を用いることができる。これらのハイブリダイゼーション期間の短縮は、先の従来のハイブリダイゼーション法を劇的に改善したことを現している。ＨＲＥ法を用いたハイブリダイゼーション検定により、リアルタイムのハイブリダイゼーション結果を得ることが出来る。
【００１８】
他の特許（例えば米国特許番号6,331,274）において、ハイブリダイゼーション速度を短縮するための装置が構築されてきた。これらの装置には、対象とする核酸ハイブリダイゼーション部位またはその周辺に電極を配置する小型化電子回路が含まれている。そのような装置は、込み入っていて費用のかかる製造法、複雑な回路設計と配置が必要であり、ひとつの装置に配置できる分析可能なハイブリダイゼーションスポットの数に比較的限りがある。さらにこれらの装置を操作して分析するためには、電流を調節し配分する機構などの、高価で非常に特殊な設備が必要である。本明細書記載の装置や方法にはこれらの欠点がない。
【００１９】
本明細書記載の核酸ＨＲＥ法は、結合溶液存在下で核酸と、ＳＮＡＢＡが結合した基質を接触させる方法を含む。ＳＮＡＢＡに加え、基質にはポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）も結合している。好ましくは、ＰＣＡＣとＳＮＡＢＡは基質の同じ領域に、好ましくは間隔を置いて結合する。つまり、基質のハイブリダイゼーション領域には、規則的な配置または不規則な配置のいずれかでＰＣＡＣとＳＮＡＢＡの両方が結合する。ＰＣＡＣは結合溶液のｐＨにおいて正に帯電する少なくとも２個の部分（例えば、アミノ酸側鎖）を有する。
【００２０】
結合溶液存在下において、ＰＣＡＣは基質のハイブリダイゼーション領域で正電荷を持ち、核酸はそのハイブリダイゼーション領域に誘引される。特定の操作理論にとらわれるものでないが、核酸がハイブリダイゼーション領域へ誘引されることにより、ハイブリダイゼーション領域における核酸の有効局所濃度が増加することは疑いない。ＳＮＡＢＡもまたハイブリダイゼーション領域に存在するので、核酸の有効局所濃度が増加すると、核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーション速度は増大し、それによってこの方法のハイブリダイゼーション速度は速くなり、ハイブリダイゼーションを達成するのに必要な時間は減少する。
【００２１】
該方法の一例において、第一の核酸は、ハイブリダイゼーション領域にＰＣＡＣおよび第二の核酸（この例においてはＳＮＡＢＡ）が結合した基質と接触し得る。もし第一および第二の核酸が相補的な配列を持つならば、それらはハイブリダイズ可能である。ＰＣＡＣがハイブリダイゼーション領域に結合していない基質を用いる方法で第一および第二の核酸がハイブリダイズする速度に比べ、基質のハイブリダイゼーション領域にＰＣＡＣが存在すると、第一および第二の核酸が相補的にハイブリダイズする速度は増大する。
【００２２】
本明細書記載のＨＲＥ法のさらなる利点は、先の従来ハイブリダイゼーション法に実際に用いられているよりかなり低濃度でサンプル内に存在する核酸を検出するハイブリダイゼーション法を容易にすることである。おそらくハイブリダイゼーション領域にあるＰＣＡＣの核酸濃縮効果によって、先の従来ハイブリダイゼーション法では実行不可能なほどに遅かったハイブリダイゼーション反応を、妥当な時間（秒、分、時間または日）で完了するほどに加速できる。
【００２３】
ＰＣＡＣは結合溶液と接触する基質の全表面に存在し得るが、好ましくは、ＳＮＡＢＡが存在する１つまたはそれ以上の領域にのみ存在する。もちろん、ＰＣＡＣとＳＮＡＢＡの両方が存在するハイブリダイゼーション領域と比較できる調節領域を供給する手段として、ＰＣＡＣがＳＮＡＢＡの存在しない基質の部分に存在する可能性はあり、その結果（ＰＣＡＣと比較して）ＳＮＡＢＡに対する核酸の特異性が分析できる。もしくは、ＰＣＡＣは、ＳＮＡＢＡが存在するいくつかの基質領域にのみ存在し得るか、またはＳＮＡＢＡが存在しない基質領域に存在するＰＣＡＣよりも高濃度でＳＮＡＢＡを有する領域に存在し得る。
【００２４】
定義
【００２５】
本明細書で用いられる次のそれぞれの用語はこの章の用語に付随する意味である。
【００２６】
もし核酸が結合剤と非共有結合で結合するならば、核酸がその結合剤の結合能を特徴づける配列、構造またはコンホメーションを持つ場合に限り、核酸はその結合剤と「ハイブリダイズ」する。例として、第一の核酸は有意な配列相同性がある領域を持つ核酸と特異的に結合すると特徴づけられる。
【００２７】
「ポリカチオン化可能誘引化合物」（「ＰＣＡＣ」）は、ｐＫ値４から８のカチオン化可能部分を少なくとも１個有し本明細書記載の方法に用いられる結合溶液のｐＨで正に帯電する部分を少なくとも２個持つ化合物である。一態様において、ＰＣＡＣの分子量は少なくとも約２００でありかつ１５０００以下である。例として、約２個から１００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド（およびそのアナログ）はＰＣＡＣとして用いることができ、ただしそれらは、ｐＫ値が４から８の部分を有し結合溶液のｐＨで正に帯電する側鎖を持つアミノ酸残基を少なくとも２個含む。ストレプトアビジンはＰＣＡＣとして使用するのに適するポリペプチドの一例である。
【００２８】
「特異的核酸結合剤」（「ＳＮＡＢＡ」）は、核酸が規定の配列、構造またはコンホメーションを有する部分を含む場合に、その核酸に特異的に結合する化合物である。ＳＮＡＢＡの例は、核酸（すなわち、相補的配列を有する核酸に特異的に結合する）、配列特異的核酸結合タンパク質（例えば、ラクトース オペレーター領域の配列を持つＤＮＡと特異的に結合する、大腸菌ラクトース オペロンのラクトース リプレッサー タンパク質）、および構造またはコンホメーション特異的核酸結合タンパク質（例えば、ミスマッチＤＮＡに結合する、E. coli MutSタンパク質および哺乳類のそのホモログ）などである。
【００２９】
「単位複製配列標的」は、テンプレートＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ）またはｃＤＮＡ（例えば、ＲＮＡサンプルから逆転写されたもの）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって産生されたＤＮＡ標的分子である。
【００３０】
「プローブ スポット」は、ＳＮＡＢＡ、ＰＣＡＣまたはその両方が現れるアレイ表面上の個々の位置（または所在）。
【００３１】
「バックグラウンド」領域は、核酸プローブが結合しない基質の区域である。例えば、バックグラウンド領域は、基質のハイブリダイゼーション領域の個々のプローブ−スポット間のスペースによって定義される基質区域であり得る。
【００３２】
「調節」領域は、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣのうち多くて１つが結合する基質の区域であり、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣのうちひとつまたは両方に起因する結合と、ＳＮＡＢＡの存在またはＰＣＡＣの存在に依存しない結合を比較するのに有用である。
【００３３】
「共プリント比」は、基質のプローブ スポットにアプライされる懸濁液中のＳＮＡＢＡとＰＣＡＣの割合を意味し、共プリント比が１：２のプローブ スポットは、懸濁液中に１分子のＳＮＡＢＡごとに２ＰＣＡＣ分子を含む溶液をアプライすることによって得られる。
【００３４】
「共結合比」は、基質上のプローブ スポットに現れるＳＮＡＢＡとＰＣＡＣの割合を意味する。例えば、共結合比が１：２のプローブスポットには、プローブスポットに結合したＳＮＡＢＡ１分子ごとにプローブスポットに結合した２ＰＣＡＣ分子がある。本明細書記載の通り、ある共プリント比でＳＮＡＢＡとＰＣＡＣを含む懸濁液をアプライしても、必ずしもそのプローブ スポットが同じ共結合比になるとは限らない（例えば、基質上の潜在的な結合部位に対するＳＮＡＢＡとＰＣＡＣの反応性の潜在的な差異に依る）。
【００３５】
ある化学化合物または部位が、あるｐＨで正電荷を示し、より高いｐＨでは帯電しないならば、その化合物または部位は「カチオン化可能」である。
【００３６】
ある化学化合物または部位が、あるｐＨで少なくとも＋２の正電荷を示し、より高いｐＨではより小さい正電荷を示すならば、その化合物または部位は「ポリカチオン化可能」である。
【００３７】
「相補的」なる語は、２個の核酸間、例えば２個のＤＮＡ分子間で相補的なサブユニット配列という大まかな概念を意味する。両分子のヌクレオチド部分が、お互いに正常に塩基対を形成できるヌクレオチドで占められている時、核酸はその部分においてお互いに相補的であると見なされる。つまり、相当数（少なくとも５０％、７０％、９０％または１００％）の両分子それぞれの対応部分が、塩基対をお互いに正常に形成する（例えば、Ａ：ＴおよびＧ：Ｃヌクレオチド対）ヌクレオチドによって占められている時、その２個の核酸はお互いに相補的である。
【００３８】
「説明書」は、本明細書記載のキットまたは方法の使用の仕方を伝達するのに利用できる出版物、記録、図解またはあらゆる他の表現媒体である。本発明のキットの説明書は、例えば、本発明のキットが入った箱に添付するか、またはキットの入った箱と一緒に出荷できる。もしくは、受取人が説明書とキットを合わせて使用することを意図すれば、キットを箱と別々に出荷してもよい。
【００３９】
説明
【００４０】
本発明は、核酸が剤と特異的に結合（ハイブリダイズ）する速度を上昇させる組成物、キットおよび方法に関する。本明細書ではその剤を、核酸との結合が、単に２分子の非特異的な吸着ではなく、むしろその核酸の配列、構造またはコンホメーションに依存した相互作用であることを強調するために、特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡs）と名付けた。従来技術の方法のように、ＳＮＡＢＡと核酸のハイブリダイゼーションを促進するためには、ＳＮＡＢＡを基質と結合させ、その基質を結合溶液存在下で核酸を含むサンプルと接触させる。しかしながら、本明細書記載の強力になった組成物、キットおよび方法においては、第二の化合物をまた基質と結合させる。ポリカチオン化可能誘引化合物と名付けたこの化合物は、結合溶液のｐＨにおいて正に多価帯電する部分を持つ。ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣは基質の同じ領域に結合し、核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーション速度は、ＰＣＡＣが基質に結合しない時よりも、ＰＣＡＣが基質に結合する時の方が速い。つまり、ハイブリダイゼーション速度の促進は、ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣの両方が結合する基質を用いて達成できる。
【００４１】
結合溶液存在下で核酸と基質が接触した後に、結合溶液のｐＨを上げることができる（または結合溶液はより高いｐＨの第二の結合溶液に交換できる）。ＰＣＡＣは４から８の範囲のｐＫ値を持つカチオン化可能残基（例えば、ヒスチジン残基側鎖のｐＫ値は６．０である）を含むので、ｐＨが上昇する（例えば、ｐＨ６未満から６より大きいｐＨへ。例として４から８または５から７へのｐＨ変化など）と、ＰＣＡＣの正電荷は減少する。ｐＨが上昇すると、核酸と基質の結合に対するＰＣＡＣの影響は弱まり、核酸と基質の結合特異性は、ＳＮＡＢＡと核酸のハイブリダイゼーション特異性に収斂されていく。その代わりに、またはそれに加えて、核酸と基質の非特異的な結合を最小にするために、第二の結合溶液はより高いイオン強度、より高い温度、またはその両方にすることができる。結合溶液は基質から吸引またはデカントでき、基質は、この時点またはこの時点と結合核酸を検出する前の両時点に、非特異的結合核酸を除去するための液体でリンスできる。
【００４２】
ハイブリダイゼーション反応をどのように遂行できるかの特別な例として、ＰＣＡＣおよびＳＮＡＢＡが結合した基質は、基本的に２ミリモーラー緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）からなるｐＨ４．５の選択した体積の結合溶液存在下で、核酸と接触させる。数秒または数分後、ほぼ当量の標準生理食塩水クエン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を結合溶液に混合し、ｐＨを約７．５に上げる。
【００４３】
特定の操作理論にとらわれるものでないが、ＰＣＡＣの正電荷が減少するので、核酸と基質の会合が核酸とＰＣＡＣ間の非特異的な耐電による誘引に依存する程度は減少する。ＰＣＡＣの電荷が中性に近づくので、ＰＣＡＣが核酸と特異的に結合しない限り、ＰＣＡＣが核酸−基質会合に及ぼす影響はごく小さくなるかまたはゼロになるはずである。理論的には、ＰＣＡＣが帯電していない場合、核酸と基質の結合特異性は完全にＳＮＡＢＡに依存するはずである。つまり、ＰＣＡＣの存在により核酸は基質周辺（およびＳＮＡＢＡ周辺）に濃縮されるが、ＰＣＡＣの存在は核酸−ＳＮＡＢＡハイブリダイゼーションの特異性には影響しないはずである。結果として、ハイブリダイゼーション反応はその特異性を改変せずとも迅速化する。
【００４４】
本明細書記載の組成物、キットおよび方法は、結合剤と核酸のハイブリダイゼーションに基づくアッセイの遂行速度の向上に用いることができる。ハイスループットスクリーニング処理のように、大量のアッセイをごく短時間で行う必要がある場合、速度が重要な問題となり得る。本明細書記載の題材を、核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーションを検査するハイスループットスクリーニングアッセイで使用する際のその役割は重要である。というのは、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣは、本明細書使用の同じ分析材料および装置に同時にまたは連続して組み込まれ得るからである。例として、多数のハイブリダイゼーション領域（ここに、個々のハイブリダイゼーション領域には一個のＳＮＡＢＡ（例えば、核酸プローブアレイ）が結合している）を持つ基質を含むマイクロアレイが、ハイスループットスクリーニングアッセイに一般に使用されている。本発明は、ハイブリダイゼーション領域の少なくともいくつか（および好ましくは全部）にＰＣＡＣが結合している改良マイクロアレイを含む。核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーションを行うために、改良マイクロアレイが核酸を含むサンプルと接触するのに必要な時間は、ＰＣＡＣを含まないマイクロアレイの対応する時間よりも有意に短い。
【００４５】
特異的核酸結合剤（ＳＮＡＢＡ）
【００４６】
ＳＮＡＢＡが何であるかは重要ではない。ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、配列特異的核酸結合タンパク質、構造特異的核酸結合タンパク質、およびコンホメーション特異的核酸結合タンパク質を含む多数のＳＮＡＢＡが当業者に既知である。ポリヌクレオチドアナログは、天然に存在する型の核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）がハイブリダイズ可能な物質を含む。ポリヌクレオチドアナログの例としては、天然に存在しないヌクレオシド間結合、例えばホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートまたはスルホン結合、およびそのような結合の組合せを含む、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたは両方のポリマーがある。ポリヌクレオチドアナログはまた、たった５つの天然に存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）から構成される必要はなく、代替または追加して他の塩基（例えば、イノシン）を含み得る。天然に存在する塩基に代えて天然に存在しない塩基への置換、および相当する結合特異性への影響は当業者に既知である。
【００４７】
好ましい態様では、ＳＮＡＢＡは相補的配列依存的にて核酸と結合するポリヌクレオチドである。一例として、このポリヌクレオチドは、核酸とおよそ同じ長さを有し、かつその全長の核酸配列と少なくとも実質的に相補的な配列を有し得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、核酸におけるある部分または全部と実質的に相補的な配列を有する第一部分、およびそうではない第二部分を有しうる。
【００４８】
１つの具体例にて、基質は、それと結合したポリヌクレオチド（すなわち、ＳＮＡＢＡ）およびＰＣＡＣを有する。このポリヌクレオチドは、選択した遺伝子と相補的なｃＤＮＡが特定のプライマーを用いて増幅される場合、標識したｃＤＮＡの一部または生成したＰＣＲ産物の一部と相補的である。前記基質は、細胞由来のｃＤＮＡ調製液を作製すること、特定のプライマーを用いて生成したｃＤＮＡを増幅すること、および基質と増幅した産物（すなわち、核酸）とを接触させることによって、細胞が遺伝子を発現するかどうかを判断するために用いられ得る。基質と増幅した産物のハイブリダイゼーションは、遺伝子が細胞にて発現することを示す。この分析形式は、組織または細胞型、単一細胞型における遺伝子発現の特異性、遺伝子発現のオントロジー（存在論）、罹患しているまたは罹患していない組織間の遺伝子発現における相違を判断するため、および他の目的のために用いられる。
【００４９】
核酸とＳＮＡＢＡとのハイブリダイゼーションは、既知であった。しかし、そのようなハイブリダイゼーションを行うための先行技術の従来方法の反応速度は遅く、数時間、数日以上のハイブリダイゼーション時間が必要である。本明細書に記載の方法は、ハイブリダイゼーション反応の起こる速度を顕著に増加させる。結果として、ハイブリダイゼーション反応をより迅速に行うことが可能となり、ハイブリダイゼーション時間を顕著に短縮することが可能である（秒、分、時間または日）。一例として、非常に低濃度の核酸試料を用いた従来型のハイブリダイゼーション方法は、とても長いハイブリダイゼーション時間が必要であったため実践的ではなかった。本明細書に記載したハイブリダイゼーション速度の増大した技術により、前記のハイブリダイゼーションをさらに迅速に行うことができる。
【００５０】
ポリカチオン化可能誘引化合物（ＰＣＡＣ）
【００５１】
ＰＣＡＣが何であるかは重要ではない。しかし、ＰＣＡＣは、基質と結合し結合溶液にさらされる場合、より多くの正に帯電した部分を有しうる（例えば、３〜２５、すなわち３、４、５、７、１０、１５および２０）が、少なくとも２つの正に帯電した部分を有する分子でなくてはならない。少なくともそのうち１つの正電荷部分が、ｐＫ値４〜９．５の範囲でカチオン化可能部分でなくてはならない（好ましくはｐＨ４〜８の範囲内、より好ましくは約６である）。ｐＫ値以下のｐＨ値にて、カチオン化可能部分は正に帯電する傾向にあり、ｐＫ値以上のｐＨ値にて、この部分は帯電しない（すなわち中性である）傾向にある。カチオン化可能部分は「可変」であり、例えばＰＣＡＣにおける正味の電荷は、ＰＣＡＣと接触する溶液のｐＨを調節することによって制御され得る。ＰＣＡＣは好ましくは、多数のカチオン化可能部分を含み、よって広範囲の正味の電荷状態が、溶液のｐＨを調節することにより発生されうる。
【００５２】
基質結合ＰＣＡＣの正電荷の可変性は、比較的低いｐＨ値（すなわち、ＰＣＡＣが大きな正電荷を示す時のｐＨ）での核酸（通常、負電荷である）の基質への誘引を促進する。ＰＣＡＣの正味の電荷は可変であるため、ＰＣＡＣの正電荷のいくつかまたは全ては、基質に誘引された核酸および基質に結合したＳＮＡＢＡとのハイブリダイゼーションに対するＰＣＡＣによる支障を減少するために中性化することができる（例えば、基質と接触する溶液のｐＨを上昇させる）。
【００５３】
ＰＣＡＣの大きさおよび電荷密度は、重要でない。１つの具体例にて、ＰＣＡＣの分子量は、好ましくは約２００以上であり、かつ１５０００以下である。２００より小さい分子量を有する化合物は、ＳＮＡＢＡ、基質または両方により実質的に覆い隠されている。１５０００より大きい分子量を有する化合物は、核酸とＳＮＡＢＡ間の結合を妨げることがあり得るため、より小さな化合物が望まれうる。ポリペプチド（すなわち、２またはそれ以上のアミノ酸残基またはそのアナログを有するアミノ酸ポリマー）は、本明細書に記載のカチオン化可能部分を含む場合、ＰＣＡＣとして用いられることができる。そのようなポリペプチドの１つの例としては、ストレプトアビジンがある。他の好適なポリペプチドが、本明細書に記載される。
【００５４】
核酸ハイブリダイゼーション分析は、様々な理由でｐＨ値が４〜９．５の範囲である溶液にて行われることが多い。ＰＣＡＣは好ましくは、前記範囲内のｐＫ値、好ましくはその範囲の中心に近いｐＫ値を有するカチオン化可能部分を有する。ポリペプチドのヒスチジン残基は、約６．０のｐＫ値を有するイミダゾール側鎖部分に相応するｐＫ値を有する。よって、１つまたはそれ以上のヒスチジン部分（または、他の型のイミダゾール部分）を含む化合物は、多くの分析条件にてＰＣＡＣとして有用である。
【００５５】
ＰＣＡＣの好ましい群は、ポリペプチドアナログおよびペプチド模倣物質（peptidomimetics）を含むポリペプチドである。ＰＣＡＣがポリペプチドである場合、ＰＣＡＣは、好ましくは４または５アミノ酸残基以上の長さであり、かつ約１００アミノ酸残基以下の長さである。より長いポリペプチドは、二次または三次構造を取ることができ、正電荷の残基を覆い隠すことができる。ｐＨが４〜９．５の範囲にて、リシンおよびヒスチジン残基の側鎖は共に、正に帯電しうる。リシン側鎖は実質的にこのｐＨ範囲全体で正電荷である。ｐＨ６．０にて、ヒスチジン側鎖の約半数が正に帯電し、そして残り半数が帯電しない。より低いｐＨ値にて、より多くのヒスチジン側鎖が正に帯電し、そしてより高いｐＨ値にて、より少ないヒスチジン側鎖が正に帯電する。よってヒスチジン残基は、ポリペプチドに電荷の「可変性」を供し、ヒスチジン残基を含むポリペプチドであるＰＣＡＣが好まれる。いくつかの具体例にて、ポリペプチドは、ｐＨ４〜８の範囲で正に帯電する側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、リシン残基）を含む。
【００５６】
正電荷のアミノ酸残基を有するＰＣＡＣは、ＰＣＡＣに多くの利点を供し得る。正電荷の残基はＰＣＡＣの溶解性を増し、よって標的核酸と相互作用する能力を向上する可能性がある。正電荷の残基は、基質の表面から他の標的を除き、それにより標的核酸とＳＮＡＢＡとの結合を阻害しうる、基質上に存在する負電荷部分を中性化、マスクまたは克服する。同様に、ＰＣＡＣの正電荷部分は、ＳＮＡＢＡの負電荷部分および負電荷の標的核酸の反発効果を減少し、よって標的核酸とＳＮＡＢＡとの反発を減じ、前記２つの結合を増強することができる。
【００５７】
ＰＣＡＣがポリペプチドである場合、そのポリペプチドの一端、すなわちポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のどちらかにて基質と結合することが好ましい。ポリペプチドがそのアミノ末端にて結合する場合、カルボキシル末端はその内生的な陰イオン化能を中性化または消去するためにキャップされていなければならない。ポリペプチドであるＰＣＡＣ（または、相当する他のＰＣＡＣ）をキャップする１つの好ましい方法は、ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣの一端とを結合することである。例として、ＰＣＡＣがポリペプチドであり、ＳＮＡＢＡがポリヌクレオチドである場合、ＳＮＡＢＡはポリペプチドのカルボキシル末端と結合することが可能であり、そしてポリペプチドのアミノ末端は基質との結合が可能である。
【００５８】
１つの具体例にて、ＰＣＡＣは以下の式Ｉまたは式ＩＩのどちらかの化学構造をとる。
Ｓｕ−Ｌｋ−Ｘ−（Ｌｙｓ−Ｈｉｓｎ）ｍ−Ｘ−Ｚ（Ｉ）
Ｓｕ−Ｌｋ−Ｘ−（Ｌｙｓｎ−Ｈｉｓ）ｍ−Ｘ−Ｚ（ＩＩ）
式Ｉおよび式ＩＩのいずれにおいても：
Ｓｕは基質であり；
Ｌｋはリンカーであり；
それぞれＸは、独立して０〜２５アミノ酸残基であり；
ｎは１〜５（またはより大きい、例えば７、１０、１５、２０、２５）であり；
ｍは１〜１０（またはより大きい、例えば１５、２０、５０、１００）であり；そして、
Ｚは水素ラジカル、カルボキシレート・キャッピング部分またはＳＮＡＢＡである。
【００５９】
式ＩおよびＩＩにて、カルボキシレート・キャッピング部分は、実質的に比較的小さな群（一般に３００以下の分子量の群）であってよく、それらは負電荷とならないカルボキシル末端カルボキシル部分を供し、またはカルボキシル末端陰イオン化可能部分のｐＫ値を結合溶液のｐＨより約２ユニット高いｐＨに少なくとも上昇する（すなわち、キャッピング部分はカルボキシル末端が負電荷となるのを防ぐ）。適したカルボキシルキャッピング部分は、アミド基またはメチル基である。Ｚがアミド基である場合、Ｚの１つの適した構造は−ＮＲ１Ｒ２（ここにＲ１およびＲ２はそれぞれ、独立して水素ラジカル、および１つまたはそれ以上のヒドロキシルあるいはアミン部分で置換されていることあるＣ１−Ｃ６直鎖アルキルラジカルからなる群から選択される）である。Ｚの他の適した構造は−ＮＲ３Ｒ４であり、ここにＲ３およびＲ４は共に、１つまたはそれ以上のヒドロキシルあるいはアミン部分で置換されていることあるＣ５−Ｃ８ジアルキレン部分である。上述のように、ＺはＳＮＡＢＡであって、ＰＣＡＣと結合することができる。
【００６０】
式Ｉおよび式ＩＩにて、それぞれのＸは、０〜２５アミノ酸残基を含むスペーサー・ポリペプチド部位を示す。スペーサー・ポリペプチド部位における残基はそれぞれ、アミノ酸残基であってよいが、結合溶液のｐＨにて負に帯電しない残基が望ましい。前記残基は、非電荷または正電荷でありうる。１つの具体例にて、１つまたはそれ以上の残基が、ｐＨ４〜９．５の範囲（好ましくはｐＨ４〜８の範囲）におけるｐＫ値を有する陽イオン化可能部分を持つ。例えば、ポリペプチドであるＰＣＡＣは好ましくは、グルタミン酸およびアスパラギン酸残基を含まず、もしそのような残基を含む場合、前記残基のベータおよびガンマ・カルボキシル部分は、側鎖が結合溶液のｐＨにて負電荷となるのを防ぐためにキャップされる。
【００６１】
配列番号：１、２および９〜２２（好ましくは配列番号：１６〜１８）のうちどれか１つを含む配列、あるいは配列番号：１、２および９〜２２（好ましくは配列番号：１６〜１８）の１つと同じ配列を有する、ＰＣＡＣとして有用なポリペプチドの例を本明細書に開示する。
【００６２】
基質
【００６３】
基質の同定は、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣが（直接または間接的に）結合することができる物質を含まなければならないことを除いて、重要ではない。基質は好ましくは、核酸と顕著な結合を示さず、すなわちハイブリダイゼーション領域における核酸の結合が、その部位におけるＳＮＡＢＡの存在に依存する。好適な基質の例としては、生体分子マイクロアレイ装置の製造に用いられるガラス、プラスチック、シリコン基質および他の物質を含む。
【００６４】
基質は多孔質でありうるが、実質的に結合溶液に不透性であることが好ましく、よってＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣは実質的に、結合溶液に接触する基質の表面にてのみ実質的に結合する。多孔質表面の例としては、ポリアクリルアミド・ゲルおよび他のヒドロゲルが含まれる。多孔質基質が用いられる場合、基質の穴の大きさは好ましくはＳＮＡＢＡとハイブリダイズする核酸の大きさ（例えば、流体力学的直径）と比較して大きく、よって物質輸送限界は核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーションを妨げない。
【００６５】
ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣが基質のハイブリダイゼーション領域と結合する方法は難しくなく、ＳＮＡＢＡまたはＰＣＡＣの特性に依存しうる。例として、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル・エステル部分を有する基質（例えば、ＡＦＦＩＧＥＬＴＭ産物、Bio-Rad Laboratories、Richmond、CA）がポリヌクレオチド、および遊離の第一アミノ部分を有するポリペプチドと結合しうることが知られている。同様に、ヨードアセトアミド部分を有する基質（例えば、SULFOLINKTM産物、Pierce Chemical Company、Rockford、IL）が遊離のスルフヒドリル部分（例えば、システイン側鎖）を有する物質と結合しうることが知られている。ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ポリペプチドおよびポリペプチドアナログと多様な基質とを結合する方法、および多数の他の組成物が知られている。ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣと基質とを結合するために適するカップリング物質の選択は、当分野技術の通常レベル範囲内で行われる。  
【００６６】
ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣは、それぞれ基質と共有結合していることが望ましいが、それらと結合する手段として非共有結合（例えば、抗体の使用、ビオチン−アビジン結合または疎水結合）が用いられてもよい。１つの具体例にて、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣが結合し、一方または両方が基質と結合する。ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣが結合したポリマーもまた、基質と結合しうる。ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣが結合した好適な立体構造は以下：
基質−ＰＣＡＣ−ＳＮＡＢＡ；
基質−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ；
基質−ＰＣＡＣ−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ；
基質−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ−ＳＮＡＢＡ；そして、
基質−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ−ＳＮＡＢＡ−ＰＣＡＣ
で示される例を含む。
【００６７】
常用される基質の形状の１つは平らな表面であって、生体分子のマイクロアレイは平らな表面上の別のハイブリダイゼーション領域にて常時合成され、プリントされ、あるいは別の方法に用いられ、よって試料は表面に用いられ、同時にそれぞれ別のハイブリダイゼーション領域に接触することができる。そのような表面を作製する多数の方法が既知であり、前記方法には生体分子をリソグラフィー技術、光電析技術（例えば、マスクレス・アレイ合成）を用いて表面上にて合成する方法、生体分子を接している観測機（例えば、ピンおよびキャピラリー系）または接していない観測機（例えば、インクジェットまたは圧電性プリント／析出系）を用いて表面上にプリントする方法が含まれる。平らな表面は、これらの製造方法すべてを容易にすることができる。
【００６８】
基質は、個々のＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの両方が結合する１つまたはそれ以上のハイブリダイゼーション領域を有する単一の物質断片でありうる。前記基質は単一であってよく、それと（ＰＣＡＣと共に）個別に結合する異なるＳＮＡＢＡを有するハイブリダイゼーション領域を多数有していてよい。前記基質は、それと（ＰＣＡＣと共に）結合するたった一つのＳＮＡＢＡを有しない、粒子形状をとることができる。そのような多数または多様な粒子は、個々の粒子を試料の核酸とハイブリダイズするための一つの試料と同時に用いることができる。
【００６９】
基質は、ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣが共に結合するハイブリダイゼーション領域を少なくとも１つ有する。基質は好ましくは、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣのどちらも結合しないバックグラウンド領域を有し、このバックグラウンド領域は好ましくはハイブリダイゼーション領域付近（隣接）であり、よってハイブリダイゼーション領域にて結合する核酸とバックグラウンド領域との対照は、簡単に観察することができる。基質はＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣのうち１つが結合する（すなわち、両方ともが同じ調節領域に結合することがない）、１つまたはそれ以上の調節領域を有し得る。これらの調節領域は、存在しないＳＮＡＢＡまたはＰＣＡＣに起因しない、基質に結合する核酸を判断するのに用いることができる。
【００７０】
個々のハイブリダイゼーション領域内にて、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣが個々の部位に結合する相対量は、変化しうる。部位内でのＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣ量の最適比は、最適比が核酸およびＳＮＡＢＡの特性、ＰＣＡＣの大きさ、結合溶液のｐＨでのＰＣＡＣの電荷、分析系の幾何学、ハイブリダイゼーションを行う温度、試料内の所望の核酸濃度および試料内の非所望（非ＳＮＡＢＡ結合性）の核酸濃度を含む多数の因子によって変化しうるため、実験的に決定されるのが良い。ハイブリダイゼーション領域におけるＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの適した比率の決定は、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣ量の様々な率を有するいくつかのハイブリダイゼーション領域を調整し、模擬（または実際）分析状態下にてハイブリダイゼーションを行い、かつそれぞれの実験部位にて結合する特定の核酸の程度を評価することにより簡単に行うことができる。原則として、ハイブリダイゼーション分析に用いられるべきＳＮＡＢＡ／ＰＣＡＣの分子量比は、結合溶液のｐＨにてＰＣＡＣ上に存在する帯電部分の数が増加するにつれて減少する。例として、ハイブリダイゼーションが、約１５ヌクレオチド残基長の核酸とおおよそ同じ長さのポリヌクレオチド（ＳＮＡＢＡ）で行われる場合、結合溶液のｐＨにて１５の正電荷部分を有するＰＣＡＣとのハイブリダイゼーション領域が望まれ、所望のＳＮＡＢＡ／ＰＣＡＣの分子量比はおおよそ０．５〜２の範囲にありうることが決定されている。しかし、所望の共結合比の範囲は、用いた実験状態に依存して変化しうる（例えば、結合溶液の組成に依存して変化する）。さらに、その共結合比を成すために必要な共プリント比は、物質の性質、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣと物質を結合する化学的性質、ＳＮＡＢＡとＰＣＡＣ間の相互作用、用いたプリントおよびスポット方法の電位効果およびその他の因子に依存する。しかし、適した共結合および共プリント比の実験的選択は、本明細書にて提供される基準を考えて当業者が理解しうる範囲内である。
【００７１】
ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣが結合するハイブリダイゼーション領域の大きさは、重要でない。しかし、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣがハイブリダイゼーション領域内で非常に近接して結合し、非特異的な電荷力によってＰＣＡＣに誘引された核酸が、基質上のＳＮＡＢＡ結合部位近くに効率的に集中していることが重要である。よって、ハイブリダイゼーション領域上のＳＮＡＢＡ結合部位とＰＣＡＣ結合部位間の平均距離は、一般に約５０〜１００オングストローム（すなわち、静電効果が比較的低イオン強度溶液にて影響する最大距離）以下でなくてはならず、好ましくは２０オングストローム以下でなくてはならない。好ましいＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣは基質と同時に結合し（例えば、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣを両方含む同じ反応溶液を用いて結合する）、よってＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣ分子はハイブリダイゼーション領域内に無作為に分配される。しかし、ＳＮＡＢＡ分子およびＰＣＡＣ分子は、所望であれば多様な幾何学構造で（例えば、ＰＣＡＣ環で囲まれたＳＮＡＢＡ部位、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの交互縞など）、基質と別々に結合することができる。ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの共局在に起因するハイブリダイゼーション速度増大効果がＰＣＡＣによる核酸濃縮効果に起因すると考えられるため、ＳＮＡＢＡ分子がＰＣＡＣ分子に物理的に十分近い位置に局在し、濃縮効果がＰＣＡＣ分子から離れた核酸分子の拡散によって実質的に減少しないことが重要である。
【００７２】
ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣ分子がハイブリダイゼーション領域に同時に結合しうる方法の例として、引用が米国特許番号６３３１４４１に記載され、ここに分析した基質に試料をスポットするための方法および装置が開示されている。前記特許または他の同様の引用文献における方法は、再現可能または指定可能な状態にて基質上にＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣを共に含む懸濁液をスポットするために用いられ得る。
【００７３】
核酸
【００７４】
ＳＮＡＢＡとハイブリダイズする核酸が何であるかは、重要ではない。前記用いられうる核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、増幅ポリヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド；リボザイム；ウイルス性ポリヌクレオチド；キメラポリヌクレオチド；ｍＲＮＡ；プラスミド；コスミド；ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；遺伝子断片；および一本鎖、二本鎖、スーパーコイル、三重らせん、ならびにミスマッチ・ポリヌクレオチドを含む多様な構造型のポリヌクレオチドを包含する。核酸は、従来的な手法によって分離または調製することができる。
【００７５】
結合溶液
【００７６】
核酸および基質の接触が起こる結合溶液が何であるかは、重要でない。核酸がＳＮＡＢＡとハイブリダイズすることのできる実質的な液体が用いられ得る。結合溶液の一般例としては、標準的な生理食塩水であるクエン酸緩衝液およびその希釈液、ＰＣＲ産物溶液、ならびに粗または脱タンパク質化細胞抽出液を含む。
【００７７】
結合溶液は、ＰＣＡＣが２以上（好ましくは、平均して少なくとも２、５、１０または１５）の帯電部分を持つようなｐＨを有する。この点にて、結合溶液のｐＨとＰＣＡＣの陽イオン化特性が互いに関係し、前記２つはｐＨ／電荷の関係を維持する実質的な組み合わせにて選択され得る。例として、ＰＣＡＣが結合溶液のｐＨにて完全に正電荷である１つの部分を含み（すなわち、前記部分のｐＫが結合溶液のｐＨより少なくとも約２ユニット上のｐＨである）、そしてＰＣＡＣが結合溶液のｐＨにほぼ等しいｐＫ値を有する陽イオン化部分を含む場合（すなわち、該部分の５０％が結合溶液のｐＨにて正電荷である）、ＰＣＡＣは少なくとも２つの陽イオン化部分を含んでいなければならず、よってＰＣＡＣは結合溶液のｐＨにて約＋２またはより高い平均電荷を有している。
【００７８】
結合溶液の成分は、核酸とＰＣＡＣとの結合を妨げる得るため、ハイブリダイゼーション速度の増大を減少することができる。これらの成分は、結合溶液のイオン強度を増加させる物質、結合溶液の粘度を増加させる物質、核酸変性物質および帯電分子を含む。よって、結合溶液中のこれらの成分の濃度は、実用的にまたは可能な限り低く維持されなければならない。
【００７９】
逆に帯電した分子間（例えば、ＰＣＡＣと核酸）の相互作用は、溶液中での距離間の逆の帯電との引力に依存する。溶液のイオン強度の増加が、溶液における逆の帯電分子間の引力を阻害することが知られている。よって、結合溶液は、核酸とＰＣＡＣとの結合によって影響をうけるハイブリダイゼーション速度の増大が最低限に阻害される、低イオン強度でありを有することが好ましい。
【００８０】
ＰＣＡＣから離れた溶液中の位置からＰＣＡＣにより近い位置へ核酸を置換するには、溶液を介して核酸を移動させる必要がある（すなわち、核酸の周りの溶液の流れに相当する）。液体の粘性は、液体の流動性に対する抵抗性、すなわち液体を介する分子の抵抗性で表される。溶液の粘性の増大は、溶液を介する核酸の移動を阻害し、同程度の移動に必要な時間を増加させる。よって、結合溶液の粘性の増加は、基質上のＰＣＡＣの存在に影響されるハイブリダイゼーション速度の増大を減少するだろう。これにより、結合溶液の粘性は、実用的にまたは可能な限り低くなければならない。
【００８１】
核酸を変性する化合物（例えば、ＤＭＳＯおよびホルムアルデヒド）は、核酸に構造上の変化をもたらし、溶液中での核酸の大きさ（および相当する流体物直径）を増大する。その結果、溶液を介した核酸の移動は一般に、そのような変性剤のある状態では、ない状態よりもゆっくりであり、そのような移動は、少なくともある濃度範囲以上に変性剤の濃度が増加するにつれて阻害される。溶液を介する核酸の移動の阻害は、本明細書に記載の方法でハイブリダイゼーション速度の増大が減少するため、結合溶液は核酸変性剤をできるだけ低い濃度で含むことが望ましい。
【００８２】
逆に帯電した分子は、静電的相互作用によってもう一方の分子と結合することができ、効果的にもう一方の帯電のすべてまたは一部を中和する。本明細書に記載のハイブリダイゼーション速度を増大する方法は、少なくとも一部にてＰＣＡＣと核酸分子との静電的引力に依存すると考えられるため、結合溶液に含まれる、ＰＣＡＣまたは核酸のどちらかに結合しその電荷を中性化しうる分子は可能な限り低い濃度または実用的でなければならない。
【００８３】
１つまたはそれ以上の上記の物質を含むハイブリダイゼーション反応のために調製される核酸の懸濁液は多くの場合、本明細書に記載のハイブリダイゼーション速度の増大を妨げうる。そのような例にて、本明細書に記載のハイブリダイゼーション反応を行う前にそれらの物質を取り除く、または濃度を減少するように核酸含有懸濁液を処置することが望ましい。物質の同定応じた多くのそのような方法が、当業者に既知である。
【００８４】
本明細書に記載の方法を用いて行われるハイブリダイゼーション速度の増大は、少なくとも一部にてＰＣＡＣと標的核酸との静電的結合に起因する標的核酸濃縮効果を基にしていると考えられる。標的核酸がいったんＳＮＡＢＡの近傍にて濃縮すると、ＰＣＡＣの役割は果たされたと見なされる。ＰＣＡＣと標的核酸との過剰な相互作用は、標的核酸とＳＮＡＢＡとの結合を妨げうる。さらに、標的核酸とＰＣＡＣとの相互作用を増大する溶液の状態（例えば、低いｐＨ）が、標的核酸とＳＮＡＢＡとの結合を不十分にし得る。よって、標的核酸が基質上にてＰＣＡＣと結合した後、結合溶液を変更または置換することが効果的でありうる。結合溶液の変更とは、例えば結合溶液のｐＨを変化する物質の付加（例えば、ＨＣｌ、ＮａＯＨまたは緩衝溶液）、結合溶液のイオン強度を増加する物質の付加、または両方を含みうる。結合溶液は、例えば結合溶液をデカント、吸引または蒸散し（すなわち、基質上のＰＣＡＣと塩の形状にて結合している標的核酸を取り除く）、そしてそこへ置換溶液を用いることにより置換することができる。例として、ＳＮＡＢＡが特定の核酸配列と特異的に結合するタンパク質であり、ＰＣＡＣが多数のヒスチジン残基を含むポリペプチドである場合、結合溶液のｐＨの低下（例えば、ｐＨ４または５への低下）は、試料内でのＰＣＡＣと核酸との引力を強めることができる。しかし、タンパク質のコンホメーションは、タンパク質と核酸との特異的な結合が阻害される範囲に低下したｐＨにて変化し得る。この例にて、ハイブリダイゼーション速度は、ＰＣＡＣを有する物質と核酸との接触によって増大することができ、タンパク質は低いｐＨである結合溶液下にてその部位上に結合し、次にタンパク質と核酸との特異的な結合がほとんど阻害されない値にｐＨを合わせた結合溶液に物質を付加する。
【００８５】
１つの態様にて、本発明は第一の核酸（例えば、核酸標的分子）とＳＮＡＢＡをハイブリダイズするための装置に関する。前記装置は、ＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣを結合した基質、本明細書に記載の特性を有するＰＣＡＣを含む。上述のように、ハイブリダイゼーション反応が起こる速度は、本明細書に記載のような装置を用いることによって速くなりうる（また、相当するハイブリダイゼーション時間は減少しうる）。
【００８６】
本発明のもう一つの態様は、核酸ハイブリダイゼーション反応にて用いるための装置一式に関する。前記装置一式は、本明細書に記載の装置およびその装置で核酸およびＳＮＡＢＡをハイブリダイズするための装置の使用法を記載した取扱説明書を含む。前記装置一式はさらに、１つまたはそれ以上の洗浄あるいはリンス溶液、結合溶液、色素または他の核酸標識、およびハイブリダイゼーション反応を行うためまたはハイブリダイゼーションを検出するために有用な他の試薬あるいは装置を含む。
【００８７】
本発明はさらに、以下の実験例の引用文献に記載されている。これらの実施例は、例証のみを目的として提供され、本発明はその実施例に開示した特定の具体例に限定されない。むしろ本発明は、本明細書に供した技術の結果である多様な事実をすべて包含する。
【００８８】
（実施例）
実施例は、ＰＣＡＣの大きさおよび陽イオン化能、基質のハイブリダイゼーション領域におけるＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣの相対濃度（実施例にて共プリント比を示す）、および核酸ハイブリダイゼーション速度に影響する核酸とＳＮＡＢＡ両方に含まれる長さおよび配列などの因子について検討する。他に示されなければ、実施例に用いた方法は、Zhang et al.(2001, Nucleoside, Nucleotides ＆ Nucleic Acid 20 (4-7):1251-1254)に記載の方法と同様である。
【００８９】
実施例１
【００９０】
ペプチド・ライブラリー構築および特性化
【００９１】
いくつかのヒスチジン含有ペプチドを検討し、そしてこれらのペプチド配列を標準的な一文字アミノ酸コードを用いて表１に一覧とした。これらのペプチドは、大きさおよび配列が異なり、かつ「ＣＯＮＨ２」で示されるペプチドは、カルボキシル末端のヒドロキシル基をアミン部分で置換することによってアミド化されている。
【表１】
2005520568.tif 000003
【００９２】
実施例２
【００９３】
ヒスチジン含有ペプチドと１５塩基のポリヌクレオチドとの結合
【００９４】
ペプチドＰ０〜Ｐ１４を、活性化したＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）ポリアクリルアミドの小さなフィルム基質上に配置し、（ZhangらのＥＤＡＣカップリング技術を用いることなく）標準的なＮＨＳエステル付着力を用いて共有結合する。それぞれのペプチドは、BIOCHIP ARRAYER（登録商標）スポット装置（Packard Bio Sciences）を用いて１５０ミリモル・二炭酸ナトリウム緩衝液中に２００マイクロモル・ペプチド懸濁液（ｐＨ約９．３の懸濁液）の５ナノリットル試料として用い、それぞれのペプチドを５つ同じようにスポットした。蛍光標識した１５塩基のポリヌクレオチドは、ｐＨ４．５の２ミリモル・酢酸ナトリウムを含む結合溶液の存在下にて１５分間小さなフィルム基質と１０ナノモル濃度で接触した。その後基質を、ｐＨ４．５の酢酸ナトリウム２ミリモルを含む洗浄溶液にさらすことにより、１０分間洗浄した。ペプチド分析をSCAN ARRAY（登録商標）MODEL 4000XLイメージ装置（Packard Bio Sciences）を用いて蛍光状態下にて画像処理し、その画像を図１Ａに示す。ペプチド配列を示すマップを図１Ｂに示す。
【００９５】
Ｐ８およびＰ７、Ｐ１１およびＰ１０、そしてＰ１３およびＰ１２のプライマー対の比較は、相当する非アミノ化したポリペプチドと比較して、カルボキシル末端アミノ部分がペプチドへのポリヌクレオチドの結合を増強することを明らかにする。さらに、ペプチドにおける正電荷残基の増加が、ペプチドへのポリヌクレオチドの結合を増加した（Ｐ７、Ｐ１０およびＰ１２、またはＰ８、Ｐ１１、Ｐ１３およびＰ１４の組を比較）。
【００９６】
蛍光標識したＤＮＡ標的分子の結合率を明示する本実施例にて提供されるデータは、リジン含有量、ヒスチジン含有量およびアミドカップリングなどの操作パラメータによって変化しうる。
【００９７】
実施例３
【００９８】
ヒドロゲル表面上におけるリジンおよびヒスチジン含有ペプチドの評価
【００９９】
ペプチドＰ０〜Ｐ１５、Ｐ１７、Ｐ１８およびＰ２０〜Ｐ２４を配列し、図２Ａに示した形状におけるポリアクリルアミドの小さなフィルム基質に共有結合した。それぞれのペプチドは、BIOCHIP ARRAYER（登録商標）スポット装置（Packard Bio Sciences）を用いて１５０ミリモル・炭酸水素ナトリウム溶液中における５０マイクロモル・ペプチド懸濁液（ｐＨ約９．３）の３ナノリットル試料として用い、それぞれのペプチドを４つ同じようにスポットした。
【０１００】
蛍光標識した１５３塩基対の二本鎖増幅産物（amplicon）を熱変性し、次に１０ナノモル濃度でｐＨ４．５の２ミリモル・酢酸ナトリウムを含む結合溶液の存在下にて１５分間基質と接触した。その後基質を、ｐＨ４．５の２ミリモル・酢酸ナトリウムを含む洗浄溶液にさらすことにより、１０分間洗浄した。
【０１０１】
ペプチド配列を蛍光状態下で画像処理し、そして画像を図２Ｂに示す。最も大きく、正に帯電したペプチドであるＰ１７、Ｐ１８およびＰ２０を、より大きな二本鎖核酸に対する最大引力として用いた。
【０１０２】
実施例４
【０１０３】
オリゴヌクレオチド／ペプチド共プリントを用いたハイブリダイゼーション実験
【０１０４】
ＳＮＡＢＡ標的モデル系
【０１０５】
ペプチドを介したハイブリダイゼーション速度増強法の評価のために用いるモデル系は、ラット神経線維腫症遺伝子（ｒＮｅｕ）由来であり、２０１２位のヌクレオチド残基における変異（Ｔ→Ａ）が乳ガン表現系に関係している。１１〜３０ヌクレオチドの長さにて変化する一組のオリゴヌクレオチドプローブを、この変異の位置範囲で合成した。プローブは、野生型の配列または変異型配列のどちらかを含むよう設計された。１０％〜２０％のミスマッチ・ヌクレオチド残基を含む２０塩基および３０塩基の多様なプローブを、プローブの結合が特異的であることを検討するために合成した。さらに、合成した末端Ｃｙ３蛍光修飾基を含む標的ポリヌクレオチドを構築した。
【０１０６】
ＰＣＲプライマーを、プラスミドＤＮＡ由来の１５３残基の増幅産物を増幅することによって合成した。前記増幅産物は、増幅した配列の中間にプローブ結合部位を含む。ＰＣＲプライマーはまた、調査される鎖上に末端Ｃｙ３タグを含み、ストレプタビジン・コートしたマグネシウムビーズを用いて一本鎖分離を可能とする調査しない鎖上の末端ビオチン部分を含むように設計した。
【０１０７】
本モデル系のヌクレオチド配列情報は、表２および３に示した。表２に一覧したそれぞれのプローブは、５’アミン修飾を有し、表３に一覧したそれぞれのプローブは、５’Ｃｙ３修飾を有する。
【表２】
2005520568.tif 000004
【表３】
2005520568.tif 000005
【０１０８】
オリゴヌクレオチドおよびペプチド共プリント比の評価
【０１０９】
ポリヌクレオチドであるＳＮＡＢＡおよびポリヌクレオチドであるＰＣＡＣとポリアクリルアミド基質とを結合するために同じカップリング反応（Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル−塩基）が用いられるため、ポリペプチドの共プリントによるポリヌクレオチドプローブの置換能を検討した。これを行うために、プローブ・スポットのセット（それぞれ９つの複製物を含むセット）を、ポリアクリルアミドの小さなフィルム基質にプリントした。基質にプリントされた液体は、２５マイクロモル濃度にて蛍光標識したポリヌクレオチドプローブを含む。プローブ・スポットの１セットに、液体はポリヌクレオチドプローブのみが含まれる。プローブ・スポットの他のセットに、液体は、ポリヌクレオチドプローブの濃度と比較して選択した比に相当する濃度におけるポリペプチドも含む。比は、１：１（２５マイクロモル・ポリヌクレオチド＋２５マイクロモル・ポリペプチド）〜１：１６（２５マイクロモル・ポリヌクレオチドプローブ＋４００マイクロモル・ポリペプチド）の範囲である。
【０１１０】
プローブ−スポットをプリント、洗浄した後、１００％基底値をポリヌクレオチドプローブのみをプリントすることで確立した。基底値と比較して、シグナルの減少がそれぞれのプローブ：ポリペプチド共プリント比において測定された。この分析結果を図３に示す。プローブ：ポリペプチド率約１：３より上では、ポリペプチドはポリアクリルアミド基質上の結合部位のプローブを圧倒し始めており、その結果として基質に結合するポリペプチドが基質に付着するプローブの量をハイブリダイゼーションシグナルに有意に不利に影響する程に減少させている。プローブ：ポリペプチド率約１：１より下では、おそらくそのＰＣＡＣ量の標的核酸を基質に誘引する効果ではハイブリダイゼーションシグナルが有意に増加していないほど結合ＰＣＡＣがあまりにも少ないために、ポリペプチドＰＣＡＣの誘引機能が減少している可能性がある。これらの理由から、１：２（つまり、基質の修飾に使用する溶液におけるＰＣＡＣの分子がＳＮＡＢＡ分子の約２倍）など、１：１から１：３の範囲のプローブ：ポリペプチド率が好ましい。共プリント比に対する共結合比は決定しなかったが、標準の技術を使用して決定できると思われる。
【０１１１】
共プリントしたオリゴヌクレオチド／ペプチドアレイにおける合成標的のハイブリダイゼーション
【０１１２】
低ｐＨ（４．５）および低カチオン状態（２ミリモーラーＮａ＋）下の共プリントしたプローブとペプチドのハイブリダイゼーション能を検定するために、プローブの長さおよびミスマッチ成分の影響を調べるアレイを設計した。基本マイクロアレイ地図（図中、４個の複製物上の記号は図２のプローブ記号を意味する）を図４に示す。プローブ：ペプチド（ＳＮＡＢＡ：ＰＣＡＣ）率の影響を検定するために、１：０（２５マイクロモーラープローブ＋ペプチドなし）から１：２（２５マイクロモーラープローブ＋５０マイクロモーラーペプチド）の範囲から選択された共プリント比でアレイをプリントした。
【０１１３】
蛍光（Ｃｙ３）でラベルした１５ｍｅｒ標的オリゴヌクレオチドを用いて、１：０、１：１、１：１．５および１：２プローブ：ペプチド率で共プリントしたペプチドＰ１８の影響を評価した実験の結果を図５に示す。これらの結果は、合成Ｃｙ３ラベル１５ｍｅｒ標的オリゴヌクレオチドを用いた誘引および特異的二本鎖形成の例である。この例において、２ミリモーラー酢酸ナトリウム溶液中に１０ナノモーラー標的オリゴヌクレオチドを含むｐＨ４．５の結合溶液に基質を１５分間接触させ、その後基質を０．５×ＳＳＣを含むｐＨ７．５の洗浄溶液に１５分間接触させて洗浄した。プローブ：Ｐ１８共プリント比が１：０から１：２に増加すると、ハイブリダイゼーションシグナルとマッチ：ミスマッチ識別率の両方が劇的に増加する。これらの結果は、ＳＮＡＢＡが存在するハイブリダイゼーション領域にＰＣＡＣを加えることにより、核酸とＳＮＡＢＡのハイブリダイゼーションの速度、程度および特異性が増加することを示している。
【０１１４】
図４に示した共プリントプローブアレイとペプチドＰ１７、Ｐ１８、およびＰ２０を用いて、選択したプローブ：ペプチド率で同様の実験を行った。そのプローブアレイと、２ミリモーラー酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を含む溶液存在下の蛍光ラベル１５３塩基対核酸（つまり、二本鎖ｒＮｅｕ単位複製配列標的）１０ナノモーラー懸濁液を１５分間接触させ、その後基質を２ミリモーラー酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を含む第二の結合溶液と１５分間接触させてリンスした。図６に示したこれらの結果（図６ＡはＰ１７に対応；図６ＢはＰ１８に対応；図６ＣはＰ２０に対応）は、単位複製配列サイズの二本鎖ＤＮＡ標的にとって、Ｐ１８がもっとも良好な総合的誘引特性を持つことを示している。
【０１１５】
単位複製配列標的ＤＮＡの誘引は、より短く合成した核酸におけるテストで観察された誘引と比べ、大きく減少している。特定の操作理論にとらわれるものでないが、単位複製配列標的の誘引減少は、その単位複製配列標的が二本鎖であり、二本のＤＮＡ鎖のうちの一本のみがラベルされるために起こると考える。誘引シグナルの減少は、ペプチド電荷に基づく誘引における非ラベルＤＮＡとの競合が原因のようである。非ラベルＤＮＡは調べたい標的鎖に対して非常に近い位置にあり、かつ完全に相補的であるので、プリントプローブへのハイブリダイゼーションも妨害する可能性がある。低塩誘導溶液を高塩結合溶液に交換する時、二本鎖の単位複製配列の再アニーリングはあり得ることで、標的鎖とプローブのハイブリダイゼーションよりも起こりやすいと考えられる。これらのデータは、少なくともＳＮＡＢＡがオリゴヌクレオチドである場合（もしくはオリゴヌクレオチドのアレイを使用する場合）は、可能であれば、（二本鎖よりもむしろ）一本鎖の核酸をＰＣＡＣの存在下でＳＮＡＢＡとハイブリダイズさせるのが好ましいかもしれないことを示唆している。
【０１１６】
二本鎖核酸を作成する際、サンプルをＳＮＡＢＡおよびＰＣＡＣ結合ハイブリダイゼーション基質と接触させる前に、サンプルから標識した片方の鎖を回収または摘出できるように、二本鎖のうちの一本に選択的に標識を付けることがしばしば可能である。例えば、単位複製配列標的の１鎖をビオチン分子で標識し、ストレプトアビジンで被覆した電磁ビーズで、非ビオチン標識鎖からビオチン標識鎖を分離することが可能である。そうしてどちらか一方の鎖がハイブリダイゼーション基質と接触する。この効果を実証するためにある実験を行った。一本鎖単位複製配列標的核酸の１０ナノモーラー懸濁液と、共プリントしたｒＮｅｕプローブ：本明細書記載の通り調製したＰ１８を接触させた。単位複製配列核酸とアレイを、２ミリモーラー酢酸ナトリウム溶液中ｐＨ４．５で１５分間接触させ、その後、基質と、２ミリモーラー酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を含む第二の結合溶液を１５分間接触させてリンスした。図６Ｂおよび７を比較すると、蛍光ラベルした一本鎖核酸の場合は、ラベルした二本鎖核酸の場合よりも、より強い誘引が見られる。
【０１１７】
図８は、ＨＲＥ法を利用した実験の代表例を示している。この実験において、Ｐ１８とともに共プリントされたプローブアレイを、１０ナノモーラーのラベルされた一本鎖単位認識配列ポリヌクレオチドおよびｐＨ４．５の５０ミリモーラー酢酸ナトリウムを含む結合溶液に１５分間接触させる。次に、そのアレイを、０．５×ＳＳＣを含むｐＨ７．５の第二の結合溶液と１５分間接触させる。共プリント比が１：０から１：２に増加すると、結果として生じるハイブリダイゼーションシグナルは増加した。２０−ｍｅｒおよび３０−ｍｅｒの完全にマッチしたプローブ（プローブ２０および３０）をそれらの対応する２０％ミスマッチプローブ（それぞれ、２０ｍ４および３０ｍ６）と比較すると、マッチ：ミスマッチ識別率は約２：１である。これらの結果は、本明細書記載のＨＲＥ法は、ＰＣＡＣ存在下で基質に結合したＳＮＡＢＡとサンプル中の核酸のハイブリダイゼーションの速度、程度および特異性を向上させるのに用いることができることを示している。
【０１１８】
本明細書に記載した全ての特許、特許出願および公報の開示は本明細書には含まれないので、そのものを参照のこと。
【０１１９】
当業者であれば、本発明の広い発明思想から逸脱することなく、上記態様に対して変化を施すことができると理解するであろう。それゆえ、この発明は開示された特定の態様に限定されず、添付の特許請求の範囲によって定義した本発明の精神と範囲内での改変をも保護することを意図したものであると、理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
上記の概要ならびに下記の本発明における好ましい態様の詳細な説明は、添付の図と併せて読むとより理解しやすいであろう。本発明を説明するために、目下好ましい態様を図に示した。しかしながら、本発明は図示したちょうどその配列および手段に限定されないと理解されたい。
【０１２１】
【図１】図１は図１Ａおよび図１Ｂからなる。図１Ａは、実施例２に記載された蛍光環境下でのペプチドアレイ像である。図１Ｂは、図１Ａのアレイ上にスポットされたペプチドの配列を示すマップである。
【０１２２】
【図２】図２は図２Ａおよび図２Ｂからなる。図２Ａは、図２Ｂのアレイ上にスポットされたペプチドの配列を示すマップである。図２Ｂは、実施例３に記載した蛍光環境下でのペプチドアレイ像である。
【０１２３】
【図３】図３は、ペプチドがない場合におけるヒドロゲル基質に結合したポリヌクレオチド成分の量に対する、ヒドロゲル表面に結合したポリヌクレオチド成分のパーセンテージとポリヌクレオチド／ペプチド共プリント比関数との関係を示している。
【０１２４】
【図４】図４は、実施例４で用い、図５、６、７および８に示している、オリゴヌクレオチドプローブアレイのマップである。マップ中、４個の（円で表した）複製物上の記号は、その位置にスポットされたプローブを表す。プローブ記号は表２に列記した。そのプローブ記号において、数字はヌクレオチド残基中のプローブの長さを示し、「ｍ」は１ミスマッチ発生を意味し、「ｍ２」および「ｍ３」は１０％のミスマッチ残基の発生、「ｍ４」および「ｍ６」は２０％のミスマッチ残基の発生を意味する。
【０１２５】
【図５】図５は、記載した共プリント比でペプチドＰ１８と共プリントし、１５ｍｅｒ合成標的と結合したＣｙ３とハイブリダイズしたプローブアレイ像である。
【０１２６】
【図６】図６は、図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃからなる。図６Ａは、ペプチドＰ１７と共プリントし、二本鎖単位複製配列標的を用いて誘引特性を評価したプローブアレイ像である。図６Ｂは、Ｐ１８と共プリントし、二本鎖単位複製配列標的を用いて誘引特性を評価したプローブアレイ像である。図６Ｃは、ペプチドＰ２０と共プリントし、二本鎖単位複製配列標的を用いて誘引特性を評価したプローブアレイ像である。
【０１２７】
【図７】図７は、ペプチドＰ１８と共プリントし、一本鎖単位複製配列標的を用いて誘引特性を評価したプローブアレイ像である。
【０１２８】
【図８】図８は、ペプチドＰ１８と共プリントし、一本鎖単位複製配列標的を用いてハイブリダイゼーション特性を評価したプローブアレイ像である。
【図１Ａ】
2005520568.tif 000006
【図１Ｂ】
2005520568.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月22日(2004.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005520568000001.app
【国際調査報告】
2005520568.tif 000016
2005520568.tif 000017