(57)【要約】本発明は、マーカーとしてのAC133を同定するための定量RT-PCRの使用を含む。AC133は、血管新生において重要な細胞である内皮前駆細胞（EPC）の表面に主に存在する。したがって、本発明は、対象におけるEPCの量の確認、ならびに、例えば損傷組織および癌の発生と進行における、血管新生の診断およびモニタリングに適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）対象の細胞を含む試料を入手する工程；
（b）試料の細胞からRNA転写物を入手する工程；
（c）RNAに対して、AC133核酸セグメントを増幅するプライマーを用いて定量PCR（商標）を行う工程；および
（d）AC133増幅産物の量を非癌性細胞における増幅産物の量と比較する工程
を含む、ヒト対象における癌を診断するための方法であって、
非癌性細胞におけるAC133増幅産物の量と比較した、対象の細胞におけるAC133増幅産物の量の増加が、対象が癌を有することを示す、方法。
【請求項２】
癌が、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌、乳房癌、皮膚癌、肺癌、膵癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、白血病、肝癌、子宮内膜癌、前立腺癌および頭頸部癌である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
癌が、非上皮性腫瘍（non-epithelial cancer）である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
非上皮性腫瘍が骨肉腫、軟部組織肉腫または消化管間質腫瘍である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
細胞が単核細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
細胞が、以前に癌と診断されたヒト対象から単離される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
試料が、末梢循環系から採取した血液である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
フォワードプライマーが、DNA配列：5'-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3'（配列番号：1）から構成される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
リバースプライマーが、DNA配列：5'-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3'（配列番号：2）から構成される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
AC133増幅産物の増加により、腫瘍組織量（tumor burden）がさらに予測される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
AC133増幅産物の増加により、腫瘍再発がさらに予測される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
対象の細胞におけるAC133増幅産物の量の増加に基づいて治療上の決定を下す工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
対象を癌に関して治療する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
対象が、放射線療法、免疫療法、化学療法、ホルモン療法または遺伝子治療で治療される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
（a）対象の細胞を含む試料を入手する工程；
（b）試料の細胞からRNA転写物を入手する工程；および
（c）AC133核酸セグメントを増幅するプライマーを用いて定量PCRを行う工程
を含む、試料中の内皮前駆細胞を定量するための方法であって、
標準化曲線と比較した、試料の細胞におけるAC133増幅産物の量によって、試料中の内皮前駆細胞の総量が推定される、方法。
【請求項１６】
標準化曲線が、既知量の骨髄由来内皮前駆細胞の連続希釈から得られる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
精度が99％である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
検出限界が、細胞100万個当たり内皮前駆細胞1個である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
（a）対象の細胞を含む試料を入手する工程；
（b）試料の細胞からRNA転写物を入手する工程；
（c）AC133核酸セグメントを増幅するプライマーを用いて定量PCR（商標）を行う工程；および
（d）AC133増幅産物の量を評価する工程
を含む、対象の細胞における血管新生活性をモニタリングするための方法であって、
対象の細胞におけるAC133増幅産物の量が、対象の細胞における血管新生活性の指標となる、方法。
【請求項２０】
試料が、末梢循環系に由来する血液である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
循環性（circulating）内皮細胞の量を評価する工程をさらに含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
試料におけるVEGFレベルを評価する工程をさらに含む、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
対象の血管新生プロファイルを作成する工程をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
血管損傷、自己免疫疾患、心筋梗塞または敗血症の存在を検出するために用いられる、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
対象が抗血管新生療法を過去に投与されており、評価工程が、抗血管新生療法の有効性を評価する工程を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
フォワードプライマーが、DNA配列：5'-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3'（配列番号：1）から構成される、請求項19記載の方法。
【請求項２７】
リバースプライマーが、DNA配列：5'-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3'（配列番号：2）から構成される、請求項19記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、2002年8月28日に提出された同時係属中の出願である米国特許仮出願第60/406,535号、および、2003年6月11日に提出された米国特許出願第10/618,102号の優先権を主張する。上述した開示物の全文は、放棄されることなく、参照として本明細書に明確に組み入れられる。
【技術分野】
【０００２】
1. 発明の分野
本発明は癌生物学および核酸生化学の分野に関する。具体的には、本発明は、血管新生活性の指標となる特定の遺伝子産物の増幅および定量による、癌の診断および血管新生活性のモニタリングのための新たな方法を提供する。
【０００３】
2. 関連技術の説明
40種を上回る血管新生阻害性標的薬（target anti-angiogenic agent）が、癌および他の非癌性疾患における第I相、第II相および第III相臨床試験に導入されている。細胞毒性剤（cytotoxic agent）も血管新生阻害活性を有する。動物モデルでは目覚ましい成功を収めているにもかかわらず、多数の血管新生阻害性リード薬物による臨床結果は期待を裏切るものであった（Mundhenkeら、2001）。ごく最近になって、あるランダム化第III相試験で、転移性大腸癌患者における5-FU、ロイコボリン、イリノテカン（IFL）に対する抗VEGF抗体であるベバシズマブ（bevacezumab）の追加により、IFL単独と比較して腫瘍反応速度、腫瘍抑増殖停止期間および全生存期間が改善されることが初めて示された（Hurvitzら、2003）。このため、規定された代用指標（surrogate）を用いて血管新生阻害性標的反応のモニタリングおよびバリデーション（validating）は臨床的に極めて重要と考えられる（Mundhenkeら、2001；Folkmanら、2001）。現在用いられている多くの手法は、非実用的で、侵襲性で、非経済的である。
【０００４】
微小血管密度アッセイ（MVD）は、最も広く用いられている血管新生の代用指標であり、腫瘍内に分布したCD34+内皮細胞の密度を算出することによって定量化される（ByrneおよびBundred、2000）。しかし、MVDは腫瘍組織内の微小血管の直接的な評価を必要とするため、その臨床的使用には多くの実用上および理論上の限界がある。このため、MVDは侵襲性であり、連続測定には適していない。さらに、微小血管密度は、定着した腫瘍塊の中心部内よりも末梢内ではるかに高いため、腫瘍血管新生には著しい不均一性がある。加えて、MVDでは血管新生性サイトカインの全身的効果を見逃してしまい、さらに重要なことに内皮前駆細胞も見逃してしまう。
【０００５】
血管新生は、腫瘍血管吸収によってのみではなく、活発な血管新生部位への骨髄由来内皮前駆細胞（EPC）の動員および活性化によっても起こるが、これは、出生後血管新生の重要な特徴として徐々に認識されている上、MVDアッセイには評価できない特徴でもある（Asaharaら、1999）。したがって、EPCは実用性のある血管新生の代用指標であり、モノクローナル抗体を用いた蛍光活性化細胞分取法（FACS）によって定量化されうると考えられる。
【０００６】
しかし、FACS法には多くの限界がある。例えば、EPCの濃度が低いことが見出されており、かつ単離による収率も低いため、FACSアッセイ法にはアッセイ1回につき最大50mL〜100mLの血液が必要である。もし連続測定が必要ならば、この工程は大きな負担になると考えられる。FACSは非常に変動性が大きく、EPCの収率および生存率が低く、さらに、EPCが単離工程中にしばしばアポトーシスを起こすと考えられるため、回収率はさらに低下する。加えて、FACS法は面倒であり、高価なFACSソーター、および装置を動作させるための熟練した技術者が必要である。
【０００７】
したがって、臨床的使用のための以下の仕様を満たす、血管新生阻害の代用マーカーが必要である：（1）非侵襲性であり、利用しやすく（accessible）、再現性があるべきである；（2）連続測定に適しており、経済的であるべきである；および（3）最も重要なこととして、背景にある腫瘍血管新生活性を反映するべきである（ByrneおよびBundred, 2000）。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、血管新生を活性化する癌または炎症状態に起因する、背景にある血管新生活性を検出するための方法を提供する。特定の態様において、本発明は、（a）対象の細胞を含む試料を入手する工程；（b）試料の細胞からRNA転写物を入手する工程；（c）RNAに対して、AC133核酸セグメントを増幅するプライマーを用いて定量PCRを行う工程；および（d）癌対象由来の細胞におけるAC133増幅産物の量を非癌性対象由来の細胞における増幅産物の量と比較する工程を含む、対象における癌を診断するための方法であって、非癌性対象における細胞からのAC133増幅産物の量と比較された、癌対象の細胞におけるAC133増幅産物の量の増加によって、その対象が癌を有することが示される方法を提供する。定量PCRは半定量的でも完全に定量的でもよい。本方法は、背景にある、癌に由来する血管新生活性を示すために用いられうる。
【０００９】
特定の態様において、本方法は、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌、乳房癌、皮膚癌、肺癌、膵癌、胃癌、食道癌、脳腫瘍、白血病、肝癌、子宮内膜癌、前立腺癌および頭頸部癌を非制限的に含む癌を診断するために用いることができる。別の特定の態様において、癌は非上皮性腫瘍（non-epithelial cancer）である。さらに特定の態様において、非上皮性腫瘍は骨肉腫、軟部組織肉腫または消化管間質腫瘍である。
【００１０】
本発明の1つの態様において、細胞は単核性である。別の特定の態様において、細胞は、以前に癌と診断されたヒト対象から単離される。別の態様において、試料は末梢循環系から採取した血液である。
【００１１】
本発明の別の特定の局面において、フォワードプライマーは、DNA配列 5'-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3'（配列番号：1）から構成される。本発明のもう1つの特定の局面において、リバースプライマーは、DNA配列 5'-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3'（配列番号：2）から構成される。
【００１２】
本発明の別の態様において、AC133増幅産物の増加はさらに腫瘍組織量（tumor burden）を予測する。本発明のもう1つの態様において、AC133増幅産物の増加はさらに腫瘍再発を予測する。本発明のもう1つの態様において、本発明はさらに、対象の細胞におけるAC133増幅産物の量の増加に基づいて治療上の決定を下す工程を含む。
【００１３】
本発明のある種の規定された態様において、本方法はさらに、対象を癌に関して治療する工程を含む。より具体的には、本発明のもう1つの特定の態様とは、対象を放射線療法、免疫療法、化学療法、ホルモン療法または遺伝子治療で治療することである。本方法はまた、放射線療法、免疫療法、化学療法、ホルモン療法または遺伝子治療を含む癌治療の血管新生効果をモニタリングする工程も含みうる。
【００１４】
もう1つの態様において、本発明は、（a）対象の細胞を含む試料を入手する工程；（b）試料の細胞からRNA転写物を入手する工程；および（c）AC133核酸セグメントを増幅するプライマーを用いて定量PCRを行うことを含む、試料中の内皮前駆細胞を定量するための方法であって、標準化曲線と比較して、試料の細胞におけるAC133増幅産物の量により、試料中の内皮前駆細胞の総量が推定される方法を提供する。1つの特定の態様において、標準化曲線は既知量の前記骨髄由来内皮前駆細胞の連続希釈によって得られる。本発明の特定の局面において、測定精度は99％である。本発明のもう1つの局面において、検出限界は細胞100万個当たり内皮前駆細胞1個である。
【００１５】
（a）対象の細胞を含む試料を入手する工程；（b）試料の細胞からRNA転写物を入手する工程；（c）AC133核酸セグメントを増幅するプライマーを用いて定量PCR（商標）を行う工程；および（d）AC133増幅産物の量を評価することを含む、対象の細胞における血管新生活性をモニタリングするための方法であって、対象の細胞におけるAC133増幅産物の量が対象の細胞における血管新生活性の指標となる方法も、本明細書で提供される。本発明の特定の態様において、試料は、末梢循環系から採取した血液である。もう1つの態様において、本発明はさらに、循環性（circulating）内皮細胞の量を評価する工程を含む。1つの特定の態様において、本発明はさらに、試料におけるVEGFレベルを評価する工程を含む。もう1つの態様において、本発明は、対象の血管新生プロファイルを作成する工程を含む。
【００１６】
本発明の特定の態様において、本発明は、血管損傷、自己免疫疾患、心筋梗塞または敗血症の存在を検出するために用いられる。本発明のもう1つの局面において、対象は抗血管新生療法を過去に投与されており、評価は抗血管新生療法の有効性を評価する工程を含む。
【００１７】
特許請求の範囲を含む、本文書の文脈において、「1つの（a）」および「1つの（an）」という単語は、接続詞「を含む（comprising）」とともに用いられた場合には「1つまたは複数の」を表す。
【００１８】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになると考えられる。しかし、本発明の精神および範囲に含まれるさまざまな変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになると考えられるため、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい態様を示しているものの、例示のみを目的として提示していることが理解される必要がある。
【００１９】
発明の詳細な説明
高度に研究されるヒト疾患の最前線に癌が躍り出たのに伴い、癌の検出および/または診断のため、ならびに抗血管新生療法の有効性のモニタリングのための、実用的で非侵襲性で経済的な手段に対する早急な必要性が生じている。抗血管新生療法の効用は転移性大腸癌の患者で示されている。多数回かつ頻回な測定を行う必要があればいかなる特定の方法であっても費用および侵襲性が倍加することを考慮すれば、抗血管新生療法の連続測定の必要性はさらに高まっている。血管新生活性のモニタリングに利用されうる、微小血管密度アッセイ（MVD）などの方法は、腫瘍組織内の微小血管の直接的な評価を必要とするため、その臨床的使用には多くの実用上および理論上の限界がある。
【００２０】
血管新生は、腫瘍血管の吸収によってのみではなく、活発な血管新生部位への骨髄由来内皮前駆細胞（EPC）の動員（mobilization）および活性化によっても起こるが、これは、MVDアッセイが評価を行うことのできない特徴である。したがって、EPCは実行可能な代理の血管新生であり、AC133に対するモノクローナル抗体を用いた蛍光活性化細胞分取法（FACS）で定量化されうる。しかし、FACS法には多くの限界がある。例えば、EPCは低濃度で認められ、単離の際の収率も低いため、FACSアッセイには、アッセイ1回につき最大50mL〜100mLの血液が必要である。連続測定が必要ならば、この工程は大きな負担になると考えられる。EPCが単離工程中にしばしばアポトーシスを来すと考えられるため、FACSは非常に変動性が大きく、EPCの収率および生存率の低さを免れないので、回収率はさらに低下する。加えて、FACS分取法は非常に面倒であり、費用もかかる。
【００２１】
このように、血管新生活性をモニタリングするための方法は存在するものの、これらの方法にはそれぞれ大きな限界がある。
【００２２】
A. 本発明
本発明は、ヒト末梢血中のEPCの検出および定量のための、一段階式で、高感度でありながらも特異的かつ定量的な方法を提供する。AC133はEPCに極めて特異的であって機能は不明確な糖タンパク質であり、対象の末梢血試料に0.1％〜0.5％の比率で存在する。AC133はEPCに極めて特異的であるため、細胞試料中のAC133遺伝子産物を特異的に増幅するRT-PCRを用いて試料中のEPCの数を推定することができる。EPCのこの推定量は、既知量のEPCのシグナル強度を測定することによって作成した標準化曲線を用いて得ることができる。
【００２３】
前述の通り、血管新生部位へのEPCの動員は血管新生活性の特徴である。このため、EPCを定量するこの方法は血管新生活性のモニタリングも行う。さらに、動員されたEPCの癌血管新生部位での関与を想定すると、本発明はまた、血管新生活性の検出、および、この動員が起こる癌、例えば、これらに限定されるわけではないが、大腸癌、膀胱癌、卵巣癌、精巣癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、脳癌、白血病、肝癌、子宮内膜癌、前立腺癌および頭頸部癌の診断も容易にする。
【００２４】
本方法は再現性が高く、実用的で、非侵襲性である上に、各アッセイが5mL〜10mLの血液しか必要としないため連続測定に適している。アッセイの感度は、AC133+ EPCのU-937細胞系中への連続希釈、または濃縮された末梢動員化幹細胞/前駆細胞へのヒト単核末梢血中への連続希釈によって評価される。この手法の検出限界はPMNC 100万個当たりEPC 1個である。
【００２５】
B. AC133、EPCおよび血管新生
AC133は構造的に新しい5回膜貫通型糖タンパク質であり、その機能は不明である（Yinら、1997）。これは、骨髄由来内皮前駆細胞（「EPC」）の表面に選択的に発現される（Reyesら、2002；Schmeisserら、2000；Hariharanら、1999）。AC133のDNA配列はGeneBank ID AF027208（配列番号：3）に見出されうる。
【００２６】
EPCは出生後の血管新生に役割を果たすと考えられている（Gillら、2001）。最近の証拠から、血管新生における重要な事象（event）の1つは血管新生部位へのEPCの動員および活性化であることが示唆されている（Reyesら、2001；Gillら、2001）。例えば、熱傷により、または外科手術時などの機械的損傷により誘発される血管外傷は、損傷した血管組織部位へのEPCの補充を含む事象のカスケードをもたらし、これにより血管治癒が加速される（Gillら、2001）。EPCはまた、癌血管新生においても役割を果たす。したがって、EPCの補充および増殖を評価することにより、これらの種々の損傷および疾患の診断における重要な情報が与えられる。癌の血管新生活性を単に同定することに加えて、本発明を、癌の予後判定、早期癌または転移性癌の血管新生能力またはバックグラウンドの同定、腫瘍組織量の評価、腫瘍再発の予測、化学療法の奏功性の評価および寛解の測定のために用いることもできる。
【００２７】
C. 細胞試料の入手
本発明は、ヒト対象から細胞試料を入手する段階を部分的に含む方法を開示する。本発明の特定の態様は、ヒト対象からの末梢血の試料の収集を含む。これは、静脈血の採取によって、または任意の外肢（exterior limb）静脈もしくは末梢循環系の一部を含むその他の静脈からの他の利用可能な手段を介して行うことができる。
【００２８】
細胞試料を収集したならば、細胞を単離するために試料を処理する必要がある。本発明の1つの局面は、単核細胞の単離を開示する。血液から単核細胞を単離する1つの方法は、Ficoll-Paque（Pharmacia Biotech）法である。Ficoll-Paqueは、末梢血から細胞を高い収率で単離するために用いられる無菌培地である。末梢血から細胞を単離する他の方法には、超遠心分離法および濾過が含まれる。軟膜（buffy coat）単層細胞の収集を用いてもよい。
【００２９】
D. 細胞試料からのRNA転写物の単離および定量
細胞を含む細胞を入手したならば、RNAを細胞から抽出する。全細胞RNAを単離するための多くの方法が当業者に周知である。例えば、ChomczynskiおよびSacchi（1987）を参照されたい。この作業を行うためのある特定の方法は、Trizol試薬（Gibco Life Technologies）を用いて全細胞RNAを抽出することである。Trizol法は、細胞を破砕器でホモジネート化した後に、フェノールをに基づくTrizol試薬で抽出する工程を含む。続いてRNAをイソプロピルアルコールで沈殿させ、エタノールで洗浄した後にRNase非含有水または0.5％SDS中に再溶解する工程を含む。
【００３０】
E. 逆転写
逆転写とは、mRNAのDNAへの変換に関する工程である。簡潔に述べると、ポリ-dTプライマーをメッセンジャーRNAのポリ-A尾部とアニーリングさせる。これにより、逆転写酵素（RT）による伸長のための遊離3'末端が得られる。この酵素は、mRNAを鋳型として用いて5'→3'合成を行う。中間産物であるRNA-DNAハイブリッド分子が生成される。この反応の終了時に、酵素は、完全なDNA、すなわちmRNAを置き換えた相補的DNAの合成のための鋳型として逆転写物の最後の少数の塩基を用いることにより、自らに対して「ループバック（loop back）」する。これによって「ヘアピン」構造が生じる。続いて、元のmRNAをアルカリ処理によって分解し、それにより一本鎖DNAを生成することができる。ヘアピンは、次の段階（一本鎖DNAから二本鎖DNAであるcDNAに変換するためのDNAポリメラーゼIの使用）のための天然のプライマーとなる。ヘアピンをS1ヌクレアーゼによって除去する。
【００３１】
RNAをcDNAに逆転写する方法は周知であり、Sambrookら（1989）に記載されている。逆転写の代替法は、熱安定性のRNA依存性DNAポリメラーゼを利用するが、これらは当業者に周知である。
【００３２】
F. 増幅方法
1. プライマー
一般に、核酸増幅法は増幅工程を容易にするプライマーの使用に依拠している。プライマーという用語は、本明細書における定義では、鋳型依存的な工程において新生核酸の合成のプライミングを行いうる任意の核酸を含むことを意味する。一般的には、プライマーは長さが10〜25塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を用いることもできる。プライマーは二本鎖型または一本鎖型で提供されうるが、一本鎖型の方が好ましい。本発明の具体的な態様は、増幅反応に用いるためのプライマーを開示している。
【００３３】
GeneBank ID：AF027208のAC133遺伝子産物に対する相補性に基づいて多数のプライマーを作製した。本発明で開示した特異的プライマーは、多数のプライマーを結果の最適性に関してスクリーニングすることによって選択された。しかし、本発明は種々の適切なプライマーを用いて行われうる。オリゴヌクレオチド合成は標準的な方法に従って行うことができる。例えば、ItakuraおよびRiggs（1980）を参照されたい。さらに、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号（これらのそれぞれは参照として本明細書に組み入れられる）は、オリゴヌクレオチドを調製する方法を記載している。また、プライマーは手頃な値段で市販されている。
【００３４】
13〜100ヌクレオチド長、好ましくは17〜100ヌクレオチド長、または本発明のいくつかの局面においては最長で1〜2キロベースもしくはそれ以上の長さである、プローブまたはプライマーを用いることにより、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成が可能となる。得られるハイブリッド分子の安定性および/または選択性を高めるためには、20塩基長を上回る連続鎖にわたって相補配列を有する分子が一般に好ましい。20〜30ヌクレオチド長または必要ならばさらに長い1つまたは複数の相補配列を有する、ハイブリダイゼーション用の核酸分子を設計することが、一般的に好ましいと考えられる。このような断片は、例えば、化学的手段によって断片を直接合成することにより、または選択した配列を組換え体産生のために組換えベクターに導入することにより、容易に調製されうる。
【００３５】
2. ハイブリダイゼーション
したがって、本発明のヌクレオチド配列（プライマーなど）は、相補的なDNA鎖および/もしくはRNA鎖と二重鎖分子を選択的に形成する能力、または、DNAもしくはRNAを試料から増幅するためのプライマーを提供する能力のために、用いられうる。想定される用途によっては、標的配列に対するプローブまたはプライマーの選択性の程度の変更を実現するための、種々のハイブリダイゼーション条件を用いることが望ましいと考えられる。
【００３６】
高い選択性を必要とする用途のためには、一般的に、ハイブリッドを形成させるために比較的高いストリンジェンシー条件を用いることが望ましい。例えば、約50℃〜約70℃の温度で約0.02M〜約0.10M NaClにより得られるような、比較的低い塩濃度および/または高温の条件である。このような高ストリンジェンシー条件は、プローブまたはプライマーと鋳型または標的鎖との間のミスマッチを（あったにしても）ほとんど許容せず、かつ、特定の遺伝子を単離するため、または特定のmRNA転写物を検出するために特に適していると考えられる。添加するホルムアミドの量を増やすことにより、条件をよりストリンジェントにできることは、一般に認められている。
【００３７】
中程度のストリンジェンシー条件は、約37℃〜約55℃の温度で約0.1M〜0.25M NaClによって得られ、一方、、低ストリンジェンシー条件は約20℃〜約55℃の範囲の温度で約0.15M〜約0.9Mの塩によって得られうる。ハイブリダイゼーション条件は、所望の結果に応じて容易に操作することができる。別の態様において、ハイブリダイゼーションを、例えば、約20℃〜約37℃の間の温度で50mM Tris-HCl（pH 8.3）、75mM KCl、3mM MgCl２、1.0mMジチオトレイトールの条件下で行うこともできる。用いられうる他のハイブリダイゼーション条件には、約40℃〜約72℃の範囲の温度で、約10mMのTris-HCl（pH 8.3）、50mM KCl、1.5mM MgCl２が含まれうる。
【００３８】
3. 標識
ある種の態様においては、規定された配列の本発明の核酸を、ハイブリダイゼーションを決定するための適切な手段（例えば、標識）と組み合わせて用いることが有利であると考えられる。多岐にわたる適切な指標手段が当技術分野で知られており、これには、検出が可能な、蛍光性リガンド、放射性リガンド、酵素性リガンドまたは他のリガンド（例えば、アビジン/ビオチン）が含まれる。好ましい態様においては、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識または酵素タグ（例えば、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ）を用いることが望ましい。酵素タグの場合には、相補的核酸を含む試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定するための、目視可能なまたは分光光学的に検出可能な検出手段を得るために用いられうる比色指標基質が知られている。
【００３９】
4. PCR（商標）
一般に、本明細書に記載のプローブまたはプライマーは、固相を用いる態様においてと同様、溶液ハイブリダイゼーションにおける、例えばPCR（商標）における試薬として有用であることが想定される。固相を含む態様では、被験DNA（またはRNA）を、選択されたマトリックスまたは表面に対して吸着させる、またはさもなくば固定する。この固定された一本鎖核酸を、続いて、所望の条件下で、選択されたプローブとのハイブリダイゼーションに供する。選択される条件は、個々の環境に依存すると考えられる（例えば、G＋C含量、標的核酸の種類、核酸の供給源、ハイブリダイゼーションプローブの長さなどに依存する）。関心対象の個々の用途に対するハイブリダイゼーション条件の最適化は当業者に周知である。ハイブリダイズした分子を洗浄して、非特異的に結合したプローブ分子を除去した後に、結合した標識の量を決定することにより、ハイブリダイゼーションを検出し、および/または定量化する。代表的な固相ハイブリダイゼーション法は、米国特許第5,843,663号、第5,900,481号および第5,919,626号に開示されている。本発明の実施に用いられうるその他のハイブリダイゼーション法は、米国特許第5,849,481号、第5,849,486号および第5,851,772号に開示されている。本明細書の本章で特定された、これらおよび他の参考文献の関連部分は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００４０】
さまざまな鋳型依存的工程を、所定の細胞試料中のAC133遺伝子産物を増幅するために利用することができる。最もよく知られた増幅方法の1つはポリメラーゼ連鎖反応（PCR（商標）と呼ばれる）であり、これは米国特許第4,683,202号および第4,800,159号ならびにInnisら、1990に詳細に記載されている。簡潔に述べると、PCRでは、マーカー配列の対向する相補鎖上の領域に対して相補的な2つのプライマー配列を調製する。過剰量のデオキシヌクレオシド三リン酸を、DNAポリメラーゼ（例えば、Taqポリメラーゼ）とともに反応混合物に添加する。もしマーカー配列が試料中に存在するならば、プライマーはマーカーと結合し、ポリメラーゼはヌクレオチドを付加することによってプライマーをマーカー配列に沿って伸長させる。反応混合液の温度を上昇および低下させることにより、伸長したプライマーはマーカーから解離して反応生成物を形成し、過剰なプライマーがマーカーおよび反応生成物と結合して、この工程が繰り返される。
【００４１】
逆転写酵素（RT）PCR増幅法は、mRNA鋳型の増幅を可能にする、PCRの変法である。このため、AC133遺伝子産物を増幅する好ましい方法は、RT-PCRキット（Invitrogene）を製造元の指示に従って利用する。この技法では、ゲル電気泳動による精製や分離を行うことなく、蛍光発生ハイブリダイゼーションプローブまたはdsDNA特異的蛍光色素を用いて増幅時にPCR産物を検出する（リアルタイム検出）。この方法のプローブの感度が高いために、重要な反応物が制約的になる前に、増幅の対数期の間にPCR産物を測定することが可能になる。この方法はPCR産物の分離を必要としない。
【００４２】
5. 定量PCR
（i）定量PCRの種類
本発明は、試料中のAC133+細胞の数を算出するための定量PCR（より具体的には定量RT-PCR）に依拠している。本方法は半定量的でも完全に定量的でもよい。
【００４３】
競合的定量PCR（商標）およびリアルタイム定量PCR（商標）という2通りのアプローチはいずれも、標準DNAの連続希釈物の増幅から構築された標準曲線との比較により、試料中の標的遺伝子の濃度を推定する。しかし、これらの標準曲線の作成方法においてこれらは実質的に異なる。競合的QPCRでは、連続希釈した標準試料および未知の（環境）試料の両方に対して、内部競合（internal competitor）DNAを既知の濃度で添加する。同時増幅の後に、内部競合物および標的のPCR（商標）産物を標準希釈物および未知の試料の両方に関して算定し、競合物-標的のPCR（商標）産物の比を標準希釈物の初期標的DNA濃度に対してプロットした標準曲線を作成する。競合物および標的DNAの増幅効率が等しいと仮定すれば、環境試料における後者の濃度をこの標準曲線から外挿することができる。
【００４４】
リアルタイムQPCRでは、標的DNAの標準的希釈物、および未知の量の標的DNAを含む試料の両方で増幅産物の蓄積を連続的に測定する。標準試料における初期鋳型濃度を、産物の特定の閾値濃度を生じるのに必要なPCR（商標）サイクル数（Ct）と相関付けることにより、標準曲線を作成する。被験試料における標的PCR（商標）産物の蓄積を同じCtの後に測定することにより、標準曲線から標的DNAの濃度を内挿することが可能になる。リアルタイムQPCRは日常的な分析における標的DNAのより迅速かつ容易な測定を可能にするが、競合的QPCRも依然として、環境試料における標的の定量化のための重要な選択肢である。既知量の競合物DNAと標的DNAとの同時増幅は、標準希釈物に存在しないことが明らかである阻害基質および大量のバックグラウンドDNAの存在に起因する増幅効率の試料間のばらつきを補正するための、分かりやすい手法である。
【００４５】
もう一種類のQPCRは、PCR（商標）に定量的に適用される。この方法はしばしば「相対定量PCR」と呼ばれており、特定の核酸の相対濃度を決定する。本発明の文脈において、RT-PCRは患者から単離されたmRNA種に対して行われる。特定のmRNA種の濃度が多様であること判定することにより、特定のmRNA種をコードする遺伝子が差次的に発現されることが示される。
【００４６】
（ii）理論的考察
PCR（商標）では、増幅される標的DNA分子の数は、何らかの試薬が制約的になるまで、反応のサイクル毎に2に近い倍数で増加する。その後、増幅速度は次第に低下し、最終的には増幅される標的の増加がサイクル間で起こらなくなる。X軸をサイクル数にし、Y軸を増幅される標的DNAの濃度の対数値にしてグラフをプロットすると、プロットした点をつなぐことによって特徴的な形の曲線が形成される。1回目のサイクルを開始した時点では、この線の傾きは正でありかつ一定である。これは、この曲線の直線部分といわれる。試薬が制約的になった後、この線の傾きは減少しはじめ、最終的にはゼロになる。この時点で、増幅された標的DNAの濃度は、ある固定値に漸近する。これが、この曲線のプラトー部分といわれる。
【００４７】
PCR（商標）増幅の直線部分における標的DNAの濃度は、反応を開始する前の標的の開始濃度に正比例する。同じサイクル数を完了しかつ直線的範囲にある、PCR（商標）反応における標的DNAの増幅産物の濃度を決定することにより、元のDNA混合物中の特定の標的配列の相対的な濃度を決定することが可能である。DNA混合物が、異なる組織または細胞から単離されたRNAから合成されたcDNAである場合には、標的配列が由来する特定のmRNAの相対的存在量を、それぞれの組織または細胞について決定することができる。PCR（商標）産物の濃度とmRNAの相対的存在量との間のこの正比例関係は、PCR（商標）反応の直線的範囲においてのみ成り立つ。
【００４８】
曲線のプラトー部分における標的DNAの最終濃度は反応混合物中の試薬の利用可能性によって決定され、標的DNAの元の濃度には依存しない。このため、RNA集団の収集物に関して、mRNA種の相対的存在量をRT-PCRによって決定する前に満たさなければならない第1の条件とは、PCR（商標）反応がそれらの曲線の直線部分にある時に、増幅されたPCR産物の濃度がサンプリングされなければならないというということである。
【００４９】
特定のmRNA種の相対的存在量を首尾よく決定するための定量RT-PCR実験に関して満たさなければならない第2の条件とは、増幅可能なcDNAの相対濃度を、何らかの独立した標準に対して標準化しなければならないということである。RT-PCR実験の目標は、試料中の全mRNA種の平均存在量に対する、特定のmRNA種の存在量を決定することである。以下に記載した実験では、β-アクチン、アスパラギン合成酵素およびリポコルチンIIのmRNAを外部標準および内部標準として使用して、他のmRNAの相対的存在量と比較した。
【００５０】
競合的PCR（商標）に関するほとんどのプロトコールは、標的とほぼ同じ量で存在する内部PCR（商標）標準を利用する。これらのストラテジーは、PCRの線形期にPCR増幅産物をサンプリングする場合に有効である。反応がプラトー期に近づいている時に産物をサンプリングする場合には、少ない量の産物が相対的に過剰に示される。差次的発現に関してRNA試料を試験する場合のように、多くの異なるRNA試料に対して行われる相対的存在量の比較は、RNAの相対的存在量の差が実際にそうであるよりも少なく現われるような形で曲解される。これは、内部標準が標的よりもはるかに豊富に存在する場合には重要な問題ではない。内部標準が標的よりも豊富に存在する場合には、直線の直接比較をRNA試料同士で行うことができる。
【００５１】
上記の考察では、臨床由来の材料に対するRT-PCRアッセイに関する理論的考察事項を述べている。臨床試料に固有の問題とは、量が変動すること（標準化に問題を生じる）、および、質が変動すること（信頼性のある内部標準（標的よりも大きいサイズであることが好ましい）の同時増幅を必要とする）である。RT-PCRが内部対照を用いる相対定量RT-PCRとして行われ、ここで、内部標準が、標的cDNA断片よりも大きな増幅可能cDNA断片であって、内部標準をコードするmRNAの存在量が標的をコードするmRNAよりもほぼ5倍〜100倍多い場合には、これらの問題はいずれも克服される。このアッセイは、それぞれのmRNA種の絶対的存在量ではなく、相対的存在量を測定する。
【００５２】
その他の試験を、外部標準プロトコルを用いるより一般的な相対定量RT-PCRアッセイ法を用いて行うこともできる。これらのアッセイ法は、増幅曲線の直線部分においてPCR（商標）産物をサンプリングする。サンプリングに最適なPCR（商標）サイクル数は、それぞれの標的cDNA断片に対して経験的に決定しなければならない。さらに、種々の組織試料から単離された各RNA集団の逆転写酵素産物は、等濃度の増幅可能なcDNAに対して慎重に標準化される必要がある。アッセイではmRNAの絶対的存在量が測定されるため、この事項は非常に重要である。mRNAの絶対的存在量は、標準化された試料のみにおいて、遺伝子の差次的発現の基準として用いられうる。直線的範囲の増幅曲線の経験的な決定、およびcDNA調製物の標準化は、単調で時間のかかる工程であるが、この結果得られるRT-PCRアッセイは、内部標準を用いる相対定量RT-PCRアッセイに由来するよりも優れている可能性がある。
【００５３】
この利点の一つの根拠とは、内部標準/競合物を用いることなく、試薬のすべてが増幅曲線の直線範囲内で単一のPCR（商標）産物へと変換され、これによりアッセイ法の感度が高まるということである。もう1つの根拠とは、一種類のみのPCR産物を用いることで、電気泳動ゲルまたは別の提示方法による産物の提示の複雑性が低下し、バックグラウンドが減少し、かつ解釈が容易になることである。
【００５４】
6. その他の増幅手法
その他のいくつかの鋳型依存的工程を、所与の鋳型試料に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するために利用することができる。最もよく知られた増幅方法の1つはポリメラーゼ連鎖反応（PCR（商標）と呼ばれる）であり、これは米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号ならびにInnisら、1988（これらのそれぞれはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）に詳細に記載されている。
【００５５】
もう1つの増幅方法は、欧州特許出願第320 308号（これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）に開示されているリガーゼ連鎖反応（「LCR」）である。米国特許第4,883,750号は、プローブ対を標的配列に結合させるためのLCRに類似した方法を記載している。米国特許第5,912,148号に開示されたPCR（商標）およびオリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ（OLA）に基づく方法を用いることもできる。
【００５６】
本発明の実施に用いられうる、標的核酸配列の増幅のための代替的な方法は、米国特許第5,843,650号、第5,846,709号、第5,846,783号、第5,849,546号、第5,849,497号、第5,849,547号、第5,858,652号、第5,866,366号、第5,916,776号、第5,922,574号、第5,928,905号、第5,928,906号、第5,932,451号、第5,935,825号、第5,939,291号および第5,942,391号、英国特許出願第2202 328号、ならびにPCT出願番号PCT/US89/01025号に開示されており、これらのそれぞれはその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００５７】
PCT出願番号PCT/US87/00880号に記載されたQβレプリカーゼを、本発明の増幅方法として用いることもできる。この方法では、標的配列に対して相補的な領域を有するRNAの複製配列をRNAポリメラーゼの存在下で試料に添加する。ポリメラーゼは複製配列をコピーすると考えられ、その後この複製配列が検出されうる。
【００５８】
制限部位の一方の鎖にヌクレオチド5'-[α-チオ]-三リン酸を含む標的分子の増幅を行うために制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼが用いられる等温増幅法も、本発明における核酸の増幅に有用でありうる（Walkerら、1992）。米国特許第5,916,779号に開示された鎖置換増幅法（Strand Displacement Amplification）（SDA）は、核酸の等温増幅を行うもう1つの方法であり、これは複数回の鎖置換および合成、すなわちニックトランスレーションを含む。
【００５９】
他の核酸増幅手順としては、転写に基づく増幅系（TAS）が含まれ、これには核酸配列に基づく増幅（NASBA）および3SRが含まれる（Kwohら、1989；Gingerasら、国際公開公報第88/10315号、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。欧州特許出願第329 822号は、一本鎖RNA（「ssRNA」）、ssDNAおよび二本鎖DNA（dsDNA）の周期的合成を伴う核酸増幅工程を開示しており、これは本発明に従って用いられうる。
【００６０】
国際公開公報第89/06700号（これはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）は、プロモーター領域/プライマー配列と標的一本鎖DNA（「ssDNA」）とのハイブリダイゼーションを行い、その後に配列のRNAコピーの多くの転写を行うことに基づく、核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームは周期的ではない、すなわち、結果的に生じるRNA転写産物から、新たな鋳型は生成されない。他の増幅方法には、「race」および「片側PCR（商標）」が含まれる（Frohman、1994；Oharaら、1989）。
【００６１】
G. 分離方法
増幅産物を、鋳型もしくは過剰なプライマーなどの試薬から、または他の増幅産物から、いずれかの段階で分離することが通常は望ましい。例えば、増幅産物を、標準的な方法を用いるアガロース電気泳動、アガロースアクリルアミド電気泳動、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離することができる。Sambrookら（1989）を参照のこと。核酸を扱う作業をする場合には、変性PAGEが好ましい。
【００６２】
または、効果的な分離のためにクロマトグラフィー技術を用いることもできる。本発明に用いられうる、多くの種類のクロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび分子篩クロマトグラフィー、ならびにカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーを含む、それらを用いるための多くの専門的な技術）が存在する（Freifelder、1982）。
【００６３】
分離された増幅産物を、さらなる操作のために切断してゲルから溶出させることもできる。低融点アガロースゲルを用いて、分離されたバンドをゲルの加熱によって取り出し、その後に核酸を抽出することもできる。
【００６４】
これらの分離技術を、臨床的状況において機能するように適合させることができ、それにより多数の試料の処理が可能になる。しかし、PCR（商標）産物の分離および検出のための新たなツールにより、臨床家が数百または数千もの試料を一度に観察することが可能になっている。これらの技術には、FMAT（蛍光定量微量アッセイ法）、化学発光法、配列検出システム（Applied Biosystems）および質量分析法が含まれる。
【００６５】
以下は、核酸に対して容易に適用されうる分離技術のいくつかの例である。
【００６６】
1. ゲル電気泳動
1つの態様においては、増幅産物を、標準的な方法を用いるアガロース電気泳動、アガロースアクリルアミド電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する（Sambrookら、1989）。
【００６７】
2. クロマトグラフィー技術
または、効果的な分離のためにクロマトグラフィー技術を用いることができる。本発明に用いられうる、多くの種類のクロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび分子篩クロマトグラフィー、ならびにカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィーを含む、それらを用いるための多くの専門的な技術）が存在する（Freifelder、1982）。さらにもう1つの選択肢として、ビオチン標識されたまたは抗原標識されたなど、標識されたcDNA産物を、それぞれアビジンまたは抗体を有するビーズで捕捉することができる。
【００６８】
3. マイクロ流体技術
マイクロ流体技術には、ACLARA BioSciences Inc.によって設計されたマイクロキャピラリーまたはCaliper Technologies Inc.によって製造されたLabChip（商標）「液体集積回路」などのプラットフォーム上での分離が含まれる。これらのマイクロ流体プラットフォームはナノリットルの容積の試料しか必要とせず、これは他の分離技術がマイクロリットルの容積を必要とすることとは対照的である。マイクロ流体デバイスを用いて、遺伝子分析にかかわる工程のいくつかの縮小が達成された。例えば、NorthrupおよびWhiteの国際公開公報第94/05414号（これは参照として本明細書に組み入れられる）は、標本由来の核酸の収集および増幅のための集積型micro-PCR（商標）装置を報告している。Wildingらの米国特許第5,304,487号およびKrickaらの米国特許第5,296,375号は、細胞を含む試料の収集および分析のためのデバイスについて考察しており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。米国特許第5,856,174号は、核酸分析にかかわる種々の処理作業および分析作業を統合した装置を記載しており、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【００６９】
4. キャピラリー電気泳動
いくつかの態様においては、増幅された遺伝子を分析するための追加的または代替的な手段を提供することが望ましい。これらの態様においては、マイクロキャピラリーアレイを分析のために用いることが考えられる。
【００７０】
マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は一般に、特定の分離媒体で充填されてもされなくてもよい、薄いキャピラリーまたはチャンネルの使用を含む。キャピラリーを通した試料の電気泳動により、サイズに基づく試料の分離プロファイルが得られる。核酸のサイズ分離におけるマイクロキャピラリー電気泳動の使用は、例えば、WoolleyおよびMathies（1994）に報告されている。マイクロキャピラリーアレイ電気泳動は一般に、サイズに基づくシークエンシング、PCR（商標）産物の分析および制限断片の分級（sizing）のための迅速な方法を提供する。これらのキャピラリーは表面積対容積比が高いため、キャピラリー全体に実質的な熱較差を生じさせずに、より強力な電場をキャピラリー全体に適用することができ、その結果、より迅速な分離を可能にする。さらに、共焦点画像化法と組み合わせると、これらの方法によってアットモル範囲の感度が得られ、これは放射性シークエンシング法の感度に匹敵する。マイクロキャピラリー電気泳動デバイスを含むマイクロ流体デバイスの微細製造は、例えば、Jacobsenら（1994）；Harrisonら（1993）；Manzら（1992）；および米国特許第5,904,824号において詳細に考察されている。一般的には、これらの方法は、シリカ、シリコンまたは他の結晶性の基質またはチップ上へのミクロンスケールのチャンネルの光リソグラフィーエッチング（photolithographic etching）を含み、本発明における使用に容易に適合されうる。いくつかの態様においては、キャピラリーアレイを、本明細書に記載の射出成形技術を用いて、デバイス本体の製造に関して記載されたものと同じポリマー材料から製造することができる。
【００７１】
Tsudaら（1990）は、円筒形のキャピラリーガラス管に代わるものとして、矩形キャピラリーを記載している。これらのシステムのいくつかの利点とは、高さ対幅比が大きくかつそのため表面積対容積比が大きいことに起因する、効率的な熱放散、および光学的オンカラム検出モードでの検出感度の高さである。これらの平面的な分離チャンネルは、分離チャンネルに適用されるある作用力、および、多チャンネルアレイ検出器を用いることによって検出される試料区域によって、二次元分離を行う能力を有する。
【００７２】
多くのキャピラリー電気泳動法において、例えば溶融シリカキャピラリーなどのキャピラリー、または、平面基質へとエッチングされた、機械加工された、もしくは型成形されたチャンネルは、適切な分離/篩分けマトリックスで充填される。一般的には、当技術分野で知られた種々の篩分けマトリックスがマイクロキャピラリーアレイに用いられうる。このようなマトリックスの例には、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースなどが含まれる。一般に、特定のゲルマトリックス、泳動用緩衝液および泳動条件は、例えば、核酸断片の大きさ、必要な分解能、および天然または非変性の核酸分子の存在といった、個々の用途の分離特性を最大化するように選択される。例えば、試料中の核酸を変性させるために、泳動用緩衝液に、変性剤、カオトロピック試薬（尿素など）を含めることができる。
【００７３】
H. 核酸の検出
本発明に従って、核酸増幅産物の検出および定量が行われる。ある種の用途において、検出は可視的な手段によって行われる。一般的な可視化の方法には、臭化エチジウムによるゲルの染色、およびUV光の下でのバンドの可視化が含まれる。または、もし増幅産物が放射性または蛍光性の標識ヌクレオチドで一体的に標識されている場合には、分離された増幅産物は、組み込まれた放射性標識の放射性シンチグラフィー、もしくは蛍光検出に供されるか、または電気インパルスシグナルおよび/もしくは熱衝撃シグナルの使用に供される（Affymax technology；Bellus, 1994）。
【００７４】
1つの態様においては、増幅産物の分離後に、標識された核酸プローブを、増幅されたマーカー配列と接触させる。プローブは発色団と接合していることが好ましいが、放射性標識がなされていてもよい。もう1つの態様において、プローブは結合パートナー（例えば、抗体またはビオチン）、または検出可能な部分を有する別の結合パートナーと接合している。
【００７５】
従来の方法では、検出は、サザンブロット法および標識されたプローブを用いたハイブリダイゼーションによる。サザンブロット法に伴う技術は当業者に周知である（Sambrookら、1989を参照のこと）。前述したものの一例は、自動電気泳動および核酸の移行のための装置および方法を開示した、米国特許第5,279,721号（参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。この装置は、外部からゲルの操作を行わずに電気泳動およびブロット法を行うことができ、本発明による方法を行うには理想的に適している。
【００７６】
本発明の実施に用いられうる、その他の核酸検出法は、米国特許第5,840,873号、第5,843,640号、第5,843,651号、第5,846,708号、第5,846,717号、第5,846,726号、第5,846,729号、第5,849,487号、第5,853,990号、第5,853,992号、第5,853,993号、第5,856,092号、第5,861,244号、第5,863,732号、第5,863,753号、第5,866,331号、第5,905,024号、第5,910,407号、第5,912,124号、第5,912,145号、第5,919,630号、第5,925,517号、第5,928,862号、第5,928,869号、第5,929,227号、第5,932,413号および第5,935,791号に開示されており、これらのそれぞれは参照として本明細書に組み入れられる。
【００７７】
1. 質量分析法
核酸検出における最近の革新的手法に質量分析法がある。質量分析法とは、真空中で分子をイオン化し、揮発によってそれらを「飛行」させることにより、個々の分子を「秤量する」手段である。電場および磁場の組み合わせの影響下で、イオンは自身の質量（m）および電荷（z）に依存した軌道を描く。低分子に関しては、質量分析法は、親分子イオンの質量の決定による有機分子の分析および特性決定において、日常的な有機物理学手法の一部である。さらに、この親分子イオンと他の粒子（例えば、アルゴン原子）との衝突を行わせることにより、分子イオンは、いわゆる衝突誘起解離（CID）によって断片化され二次イオンを形成する。断片化のパターン/経路により、大半の場合、詳細な構造情報を導くことができる。当技術分野で知られている質量分析法のその他の用途は、McCloskey（1990）における方法の項に概説されているのが見出されうる。
【００７８】
高い検出感度、質量測定の正確さ、CIDとMS/MS型構成との併用による詳細な構造情報、および速度の高さ、ならびにコンピュータへのオンラインのデータ転送が得られるという質量分析法の明らかな分析上の利点のために、核酸の構造解析に質量分析法を用いることに高い関心が寄せられている。この分野をまとめた総説にはSchram（1990）；およびCrain（1990）が含まれる。質量分析法を核酸に適用する上で最大の障害とは、これらの極めて極性の高い生体高分子を揮発させることの困難さである。このため、親分子イオンの質量を決定し、これによって既知の配列を確認することにより、または、高速原子衝撃法（FAB質量分析法）もしくはプラズマ脱離法（PD質量分析法）を特にイオン化および揮発に利用するMS/MS型構成におけるCIDを介した二次イオン（断片イオン）の産生によって既知の配列を確認することによる「シークエンシング」は、低分子量の合成オリゴヌクレオチドに限定されていた。一例として、オリゴデオキシヌクレオチドの化学合成のための、保護された二量体ブロックの分析に対するFABの適用が記載されている（Kosterら、1987）。
【００７９】
エレクトロスプレー/イオンスプレー法（ES）およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化法（MALDI）という2種類のイオン化/脱離法がある。ES質量分析法はFennら（1989）；国際公開公報第90/14148号によって導入され、その適用は総説論文にまとめられている（Smithら、1990；Ardrey、1992）。質量分析装置としては四重極型が最も高頻度に用いられている。そのすべてを質量の算出に用いることができる多数のイオンピークが存在するため、フェントモル量の試料の分子量決定は極めて正確である。
【００８０】
これに対して、MALDI質量分析器として、質量分析装置に飛行時間（TOF）型構成が用いられる場合に特に魅力がある。MALDI-TOF質量分析法はHillenkampら（1990）によって導入された。ほとんどの場合には、この技法では多数の分子イオンピークは産生されないので、質量スペクトルは、原則的には、ES質量分析法よりも単純に見える。分子量が最大410,000ダルトンのDNA分子を脱離させて揮発させることができる（Williamsら、1989）。さらに最近では、この技術に赤外レーザー（IR）を用いることにより（UVレーザーではなく）、大きさが最大2180ヌクレオチドの合成DNA、プラスミドDNAの制限酵素断片およびRNA転写物などの、より大型の核酸の質量スペクトルが得られることが示されている（Berkenkampら、1998）。Berkenkampら（1998）は、MALDI-TOF IRを用いて、限定的な試料精製により、DNA試料およびRNA試料を分析する方法に関しても記載している。
【００８１】
日本国特許第59-131909号には、電気泳動、液体クロマトグラフィーまたは高速ゲル濾過のいずれかによって分離された核酸断片を検出する装置が記載されている。質量分析による検出は、DNA中に通常は存在しないS、Br、IまたはAg、Au、Pt、Os、Hgなどの原子を核酸に組み入れることによって行われる。
【００８２】
2. エネルギー移動
核酸検出のためのもう1つの新しい方法はエネルギー移動を含む。ハイブリダイゼーション用のオリゴヌクレオチドプローブを蛍光標識で標識することは当技術分野で周知の技法であり、プローブのハイブリダイゼーションの検出を容易にするための高感度で非放射性の方法である。さらに最近になって開発された検出方法では、プローブのハイブリダイゼーションの検出のために、蛍光強度の直接検出ではなく蛍光エネルギー移動（FET）の工程を利用する。FETは、ドナーのフルオロフォアとアクセプターの色素（これはフルオロフォアでもそうでなくてもよい）との間で、一方（アクセプター）の吸収スペクトルがもう一方（ドナー）の発光スペクトルと部分的に重なり、2つの色素が接近した場合に起こる。これらの特性を有する色素は、ドナー/アクセプター色素の対またはエネルギー移動色素の対と呼ばれる。ドナーフルオロフォアの励起状態エネルギーは、共鳴双極子誘発性の双極子相互作用によって近傍のアクセプターに移動する。これにより、ドナーの蛍光は消失する。アクセプターもフルオロフォアであるような場合には、その蛍光強度は増大されうる。エネルギー移動の効率はドナーとアクセプターとの距離に大きく依存し、これらの関係を予測する等式が開発されている（Forster, 1948）。エネルギー移動効率50％におけるドナーとアクセプター色素との距離は、Forster距離（RＯ）と呼ばれる。他の蛍光消失機構も知られており、これには例えば、電荷移動および衝突消光が含まれる。
【００８３】
消光を生じる近接した2つの色素の相互作用に依拠するエネルギー移動および他の機構は、ヌクレオチド配列を検出または同定するのに魅力的な手段であるが、これはこの種のアッセイが均一（homogeneous）形式で行われうるからである。不均一アッセイは一般的に、ハイブリダイズした標識を遊離性標識から分離するための補足的な段階を必要とするので、均一アッセイ形式は、単一のフルオロフォア標識の蛍光の検出に依拠する従来のプローブハイブリダイゼーションアッセイよりも単純である。FETハイブリダイゼーションアッセイに関するいくつかの形式に関してはNonisotopic DNA Probe Techniques（1992）に概説されている。
【００８４】
核酸増幅の検出のために、エネルギー移動または蛍光消失の他の機構を用いる均一法も、記載されている。Higuchiは、臭化エチジウムが二本鎖DNAと結合する時のその蛍光の増加をモニタリングすることにより、DNA増幅をリアルタイムに検出するための方法を開示している。臭化エチジウムの結合は標的特異的でなく、バックグラウンド増幅産物も検出されるため、この方法の感度は低い。Leeら（1993）は、PCR（商標）の際に、二重標識された検出プローブが標的増幅特異的な様式で切断される、リアルタイム検出方法を開示している。Taqポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性によって検出プローブが消化されるように、検出プローブが増幅プライマーの下流にハイブリダイズし、それによって、エネルギー移動対を形成する2つの蛍光色素が分離する。蛍光強度はプローブが切断されるのに伴って上昇する。国際公開公報第96/21144号は、酵素を介した核酸の切断によって蛍光の増加が引き起こされる、連続蛍光アッセイ法を開示している。本方法における蛍光エネルギー移動の使用が提案されているが、これは標的へのハイブリダイゼーションによって消光する単一の蛍光標識を用いる方法の文脈においてのみである。
【００８５】
増幅プライマーのハイブリダイゼーション部位の下流にある標的配列とハイブリダイズするシグナルプライマーまたは検出プローブが、核酸増幅の検出に用いるために記載されている（米国特許第5,547,861号）。シグナルプライマーは、増幅プライマーの伸長と類似した様式でポリメラーゼによって伸長される。増幅プライマーの伸長により、シグナルプライマーの伸長産物は標的増幅依存的な様式で移動し、標的増幅の指標として検出されうる二本鎖の二次増幅産物を生成する。シグナルプライマーから生じた二次増幅産物は、種々の標識およびレポーター基、切断されて特徴的な大きさの断片を生じるシグナルプライマー中の制限部位、捕捉基、ならびに三重らせんなどの構造的特徴、ならびに二本鎖DNA結合タンパク質の認識部位によって検出することができる。
【００８６】
多くのドナー/アクセプター色素の対が当技術分野で知られており、本発明に用いることができる。これらには、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）/テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）、FITC/Texas Red（商標）（Molecular Probes）、FITC/N-ヒドロキシスクシンイミジル1-ピレンブチレート（PYB）、FITC/エオシンイソチオシアネート（EITC）、N-ヒドロキシスクシンイミジル1-ピレンスルホネート（PYS）/FITC、FITC/ローダミンX、FITC/テトラメチルローダミン（TAMRA）などが含まれる。特にドナー/アクセプターフルオロフォアの対を選択するかは重要ではない。エネルギー移動消光機構に関して必要なことは、ドナーフルオロフォアの発光波長がアクセプターの励起波長と重複することのみである、すなわち、効率的なエネルギー移動、電荷移動または蛍光消失を可能にするには2つの色素間に十分なスペクトルの重なりがなければならない。 P-(ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸（DABCYL）は、隣接したフルオロフォア、例えばフルオレセインまたは5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン（EDANS）からの蛍光を効果的に消失させる非蛍光性アクセプター色素である。本発明の検出用核酸において蛍光消失を生じる任意の色素が、消光が起こる機構にかかわらず、本発明の方法における使用に適している。末端標識および内部標識の方法はいずれも当技術分野で知られており、検出用核酸中のそれぞれの部位においてドナー色素とアクセプター色素を結合させるために日常的に用いられうる。
【００８７】
I. キット
本発明は、本明細書に記載の任意の方法を行うためのキットも含みうる。非制限的な一例において、プライマー、逆転写のための酵素、増幅のための酵素および補足的な物質をキットに含めることができる。したがって、キットは、これらの試薬の1つまたは複数を適切な容器手段内に含むと考えられる。キットは、RNAの単離、増幅産物の精製、標識などのための物質も含みうる。
【００８８】
キットの構成要素は、水性媒体中でまたは凍結乾燥形態で包装されうる。キットの適切な容器手段には一般に、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の容器手段が含まれ、その中に構成要素が入れられ、好ましくは適切に分注される。キットに複数の構成要素が存在する場合には、キットはまた一般に、追加構成要素を別々に収納できる、第2、第3または他の追加用の容器も含むと考えられる。しかし、構成要素のさまざまな組み合わせが1つのバイアル内に含まれてもよい。本発明のキットはまた一般に、販売のために密に閉じ込められた状態で試薬容器を含めるための手段も含む。このような容器には、所望のバイアルが保持される射出成形または中空成形されたプラスチック容器が含まれうる。
【００８９】
J. 実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含められる。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが発明者らによって見いだされた技術を代表し、そのため、その実施のための好ましい様式を構成するとみなしうることが、当業者には理解されよう。しかし、当業者には、本発明の開示に鑑みて、開示された特定の態様にさまざまな変化を加えることができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を入手しうることも理解されよう。
【００９０】
実施例1
材料および方法
AC133の定量PCR（商標）
mRNAを1×10６個のヒト末梢単核細胞から調製し、オリゴdTを用いて抽出した。発表されているAC133のcDNAに関する遺伝子バンク配列クエリーに基づき、AC133に対する沢山の特異的な3'および5'プライマーを設計した（Yinら、1997）。スクリーニングにより、高度に特異的な3'および5'プライマーを選択した。AC133に関するPCR（商標）はすべて、30サイクルの増幅を伴い、β-アクチンを内部対照として用いる標準的なプロトコールによって行った。アッセイの感度は、U-937細胞系におけるヒト臍帯内皮細胞の連続希釈、またはヒト単核末梢血における精製CD34+細胞の連続希釈によって評価した。この手法の検出限界はPMNC 1×106個当たりEPC 1個であり、特異性は90％を上回った。
【００９１】
CECおよびEPCの測定
末梢血中の細胞の計数は、CD45（造血細胞を除外するため）、AC133およびCD34と反応する1パネル（panel）のモノクローナル抗体を用いる、三色フローサイトメトリーによって行われる。EPCを計数するために適切な分析ゲートを用いた（Boyerら、2000）。細胞の絶対数を算出するために参照蛍光ビーズを用いた。末梢血試料1つ当たり少なくとも100,000個の細胞を獲得した後に、CEC計数ゲートにおいて十分な数の事象（＞100件、通常は3件〜400件）を収集することにより、情報価値のある分析が得られる。この手法の感度および特異性は、ヒトサイトカイン動員性CD34+に富むMNC調製物のU-937細胞系における連続希釈によって評価しうる。この手法の検出限界は細胞0.1個/μLであり、特異性は90％を上回る（Boyerら、2000）。
【００９２】
実施例2
結果
AC133発現を分析するために、CRC患者3例のほかに健康志願者2例においてRT-PCRを行った。対照は、骨髄移植のために調製され、MNC 1×10６におけるCD34+を有する濃縮された末梢単核前駆細胞/幹細胞から得た。興味深いことに、患者1および2はいずれも転移性疾患を有していたが、一方で患者3は原発性腫瘍が約4週間前に切除されて、血漿VEGFレベルと同じくAC133レベルも低いことが示されたことに留意されたい（図1）。このデータは、腫瘍組織量の減少（外科手術）が末梢血EPCの低下と関連することを示している。
【００９３】
血清VEGFおよびその他の血管新生サイトカイン
VEGFおよびその他のサイトカイン用の市販のELISAキット（R&D, Minneapolis, MN）を他で記載された通りに用いることにより（Shiら、2001；Shiら、2000）、ヒト対象の血漿中のサイトカインおよびVEGFを測定した。
【００９４】
3例のCRC患者および2例の健常志願者から得た血漿試料におけるVEGFおよび塩基性FGFに関してELISAアッセイを行った。データ（図2）により、血漿VEGFおよびFGFが正常志願者のものよりも有意に高いことが示されている。3例の患者すべてにおいて、VEGFレベルはAC133シグナルと正に相関するようである（図1）。さらに、患者1および2は転移性疾患を有するCRC患者であり、デュークCの結腸癌が切除された患者3よりも高レベルのAC133および血漿VEGFを示すようである。以前に記載された方法を用いた代替的な仮説に関して、血漿中のその他の血管新生サイトカイン、例えば一酸化窒素を探索することも考えられる（Shiら、2001；Shiら、2000）。
【００９５】
実施例3
AC133のRT-PCRおよび定量PCR（商標）（Q-RT-PCR）分析
試験集団
58例のCRC患者をこの試験に組み入れた。活動性の創傷、炎症、感染症、外科手術から4週間以内、最近の心発作もしくは脳卒中、または肢虚血を潜在的に有する患者は対象外とした。末梢血30ccを採取する前に、全患者から署名によるインフォームドコンセントを得た。
【００９６】
CEP陽性対照細胞
この実験には、健康志願者由来のサイトカイン動員性CD34+PBMNCを用いた。凍結した、CD34+に富む末梢血単核細胞調製物を、37℃水浴中で解凍した。赤血球をRBC溶解液により溶解させた。続いてPBMNC細胞を、フィコエリトリン（PE；赤色の蛍光）で標識した抗CD34抗体（Becton Dickinson, San Jose、CA）に対するFITC標識高親和性非中和性MoAb 1.5μLとともに20分間インキュベートし、細胞をPBSで洗浄した。陽性細胞の数を免疫グロブリンGアイソタイプ対照（FITC；Immunotech, Marceille, France）と比較し、Coulter Eliteフローサイトメーター（COULTER, Hialeah, FL）を用いて決定した。非生存細胞はヨウ化プロピジウム染色とともに7AAD（生存性マーカー）によって同定した。合計で少なくとも10,000件の事象を獲得した。CD34+細胞はPBMNC全体のうち0.56％を占めた。CD34+、7AAD（-）集団は96.1％であった。
【００９７】
RT-PCR
患者におけるRT-PCRを、β-アクチンを対照として用いて行った。670bpの増幅産物の配列が確認され、AC133は患者にしか存在せず正常対照には存在しないことが明らかになった。図3は、いくつかの患者試料で上昇したAC133のレベルを示している。これらの結果は他の患者試料を用いた別の試験でも確認された。
【００９８】
PCR（商標）は、1×TaqMan緩衝液、5.5nMのMgCl２、200μMのdATP、dCTP、dGTP、および400μMのdUTP、300nMの各プライマー、100nMのプローブ、0.5単位のAmpErase Uracril Nグリコシラーゼ（UNG）、1.25単位のAmpliTaq Goldならびに10μlのcDNAを含む全容積50μl中で行った。β-アクチンおよびAC133の増幅はいずれも各試料に関して2回ずつ行った。熱サイクル条件には、50℃ 2および95℃ 10分間を、ならびにその後、95℃ 15および60℃ 1分間を40サイクル行うことを、含めた。RT-PCRTのために用いた試薬はすべて、Applied Biosystems社（Foster City, CA）から購入した。用いたプライマーは以下の通りである。
2005537012.tif 000002
【００９９】
データの解釈
内因性参照（GAPDH）に対して標準化され、陽性対照に対して相対化された標的の量が、Ct法によって定義される。式は以下のように適用される：
標的量＝2−ΔΔＣt
式中、ΔΔCt＝{[Ct（AC133試料）- Ct（GAPDH試料）] - [Ct（AC133較正物質）- Ct（GAPDH較正物質）]}である。
【０１００】
AC133（CD133）のリアルタイムQRT-PCR
CEPを定量するためのAC133プライマーを用いて、リアルタイム定量RT-PCRを行った。本アッセイは、ABI PRISM 7700配列検出システム（Applied Biosystems）を用いて、TaqMan法に基づいて行った。蛍光発光を介して、この技法により、PCR（商標）産物が検出可能になった時点のサイクリング点を見いだすことが可能になる（Ct値は標的mRNAの出発量と相関する）。用いたプライマーは以下の通りである。
2005537012.tif 000003
【０１０１】
インフォームドコンセントを得た後に末梢血試料を採取し、その結果を分析時まで盲検下においた。外科手術から4週間未満の患者、活動性の関節炎、外傷および/または炎症のある患者はこの試験から除外した。本アッセイは、GAPDHを内部対照として用いた点以外は、Marchettiら（2002）によって記載された方法に基づく。試料はすべて2回ずつ試験し、サイトカイン動員性末梢幹細胞由来のAC133+細胞を陽性対照として用いた。CD133 mRNAは活動性CRC患者の末梢血のみで検出され、健康志願者の末梢血中で検出されなかった（n＝10）。
【０１０２】
AC133のリアルタイムQ-RT-PCRを、活動性CRCを有するまたは有さない患者において行った（n＝44）。AC133マーカーの推定中央値は、臨床疾患を有する患者（4.2；範囲：0.017〜106.9）の方が臨床疾患を有さない患者（0.0017、範囲、0.0〜9.51）よりも有意に高かった（p値＜0.001（Mann-Whitney検定））。AC133に関する3つの中央値（0.01、0.05、0.1）を、X線評価による（radiographic）活動性病状と非活動性病状とを識別するオッズ比（OR）および95％信頼区間（CI）と推定するためのカットオフ点として用いたところ、3つの点はいずれも統計学的に有意であり、ORは8.2〜14.6の範囲であった（表1）。
【０１０３】
興味深いことに、CEA値は上昇しているがCRCの所見はない3例の患者でAC133が上昇したことに留意されたい。CEAの上昇に反映される状態である、CRCが再発した患者でもまたCEPは上昇した。1例の患者では、甲状腺癌のためにCEAが高かった。肝転移の切除を受けた病歴のある2例のハイリスク患者ではAC133が最大9まで上昇していた。活動性病状と非活動性病状を識別するAC133カットオフ点の推定値は0.017のようであり、そのAUCは81％であった（図6）。本研究により、AC133のリアルタイムQ RT-PCRが、潜在的腫瘍血管新生の結果としての腫瘍状態と相関し、腫瘍血管新生の代用マーカーとして用いられうることが示された。
【０１０４】
【表１】
2005537012.tif 000004
【０１０５】
本明細書に開示され、主張されているすべての組成物および方法は、本発明の開示に鑑みて、不要な実験を行うことなく作製され、実施されうる。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物および方法ならびに方法の工程または一連の工程に対して変更を加えうることは当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的に関連する特定の物質は、同じまたは同様の結果が得られると思われる限り、本明細書に記載されている物質と置き換えることができることは明らかである。当業者に明らかなこのような同様の置換および改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内にあると考えられる。
【０１０６】
K. 参照文献
以下の参照文献は、本明細書に記載したものを補足する、例示的な手法の詳細または他の詳細を提供する程度において、参照として本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
以下の図面は本明細書の一部をなしており、これらは本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。これらの図面の1つまたは複数を、本明細書中に提示された具体的な態様の詳細な説明とともに参照することにより、本発明はさらに良く理解されよう。
【図１】AC133のPCR（商標）。Ficoll-Paque（Pharmacia Biotech）法により、単核細胞を末梢血から単離した。RNAをTrizol試薬（Gibco Life Technologies）を用いて抽出し、その濃度を測定した。AC133遺伝子転写物の増幅は、RT-PCRキット（Invitrogene, San Diego, CA）を製造元の指示に従って用いて行った。スクリーニングの全体を通じて、実験に用いたPCR（商標）プライマー配列はフォワードプライマー 5'-tgtacgaattcgacagctacttggctcagac-3'（配列番号：1）およびリバースプライマー 5'-tctagctcgagcatgatctttatgataacc-3'（配列番号：2）であった。予想されたPCR（商標）産物は670bpであり、この配列は確認されている。プライマーは、GeneBank ID：AF027208のAC133遺伝子配列に基づいて設計された。β-アクチンに対する定量PCR（商標）を追加の対照として行った。患者1および2は転移性疾患を有していた；患者3は3週間前にデュークC（Duke C）の癌の切除を受けていた。
【図２】癌患者におけるVEGFおよびbFGFのレベルは、正常対照に比して有意に高い。
【図３】AC133（CD133）マーカーを発現するCD34+細胞の生存度。
【図４】RT-PCRは、患者試料におけるAC133レベルが高いことを示す。内因性参照（GAPDPH）に対して標準化され、較正物質に対して相対化された標的の量がΔΔCt法によって定義される。
【図５】定量PCR（Q-RT-PCR）の感度および特異性。CRC患者試料において活動性病状と非活動性病状を識別するCD133閾値の推定値は0.017であると思われ、ここで曲線下面積（AUC）は81％である。試料サイズ（n＝50）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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