(57)【要約】本発明は、マウスファルネソイドX受容体(FXR)のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにマウスFXRの発現のための発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。また、マウスFXRのモジュレーターをスクリーニングする方法、およびこれらのモジュレーターをFXR関連疾患の治療に使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 配列番号2のアミノ酸配列；
(b) 内因性胆汁酸により調節される、またはシトクロムP450 7a (Cyp7a)の発現との相互作用により胆汁酸ホメオスタシスを調節し、それによりコレステロール分解経路をモジュレートする、配列番号2の変異体；または、
(c) 内因性胆汁酸により調節される、またはシトクロムP450 7a (Cyp7a)の発現との相互作用により胆汁酸ホメオスタシスを調節し、それによりコレステロール分解経路をモジュレートする、(a)または(b)の断片；
を含んでなる、単離されたファルネソイドX受容体ポリペプチド。
【請求項２】
変異体(b)が配列番号2のアミノ酸配列に対して80％を上回る同一性を有する、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項1記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
cDNA配列である、請求項3記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
内因性胆汁酸により調節される、またはシトクロムP450 7a (Cyp7a)の発現との相互作用により胆汁酸ホメオスタシスを調節し、それによりコレステロール分解経路をモジュレートする、ファルネソイドX受容体をコードするポリヌクレオチドであって、
(a) 配列番号1もしくは配列番号3からなる核酸配列またはそれに相補的な配列；
(b) (a)で定義した核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
(c) (a)または(b)で定義した配列に遺伝子コードの結果として縮重しているが、依然として、内因性胆汁酸により調節される、またはシトクロムP450 7a (Cyp7a)の発現との相互作用により胆汁酸ホメオスタシスを調節し、それによりコレステロール分解経路をモジュレートするファルネソイドX受容体ポリペプチドをコードする配列；または、
(d) (a)、（b）または(c)で定義した配列に対して少なくとも80％の同一性を有する配列；
を含んでなる上記ポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが配列番号2に示すアミノ酸188-486をコードする、請求項3記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが配列番号2に示すアミノ酸123-187をコードする、請求項3記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが配列番号2に示すアミノ酸1-122をコードする、請求項3記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
(a) 請求項1記載のファルネソイドX受容体のDNA結合またはリガンド結合ドメイン；および、
(b) 非ファルネソイドX受容体由来のアミノ酸配列；
を含んでなる融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項9記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項3記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項11記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１３】
請求項5記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１４】
請求項13記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１５】
請求項10記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１６】
請求項15記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１７】
請求項1記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項１８】
請求項２記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項１９】
ファルネソイドX受容体の活性および/または発現のモジュレーターを同定する方法であって、
(a) 試験物質とマウスファルネソイドX受容体ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを接触させること；および
(b) 該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性および/または発現に及ぼす試験物質の効果を測定すること；
を含んでなる上記方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが細胞において発現される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
請求項19記載の方法により同定されたファルネソイドX受容体の活性または発現をモジュレートする物質。
【請求項２２】
有効量の請求項21記載の物質を患者に投与することを含んでなる、患者の胆汁酸合成およびコレステロールと脂質のホメオスタシスをモジュレートする方法。
【請求項２３】
有効量の請求項21記載の物質を患者に投与することを含んでなる、コレステロール代謝および異化の変化を起こしている患者の治療方法。
【請求項２４】
患者がアテローム性動脈硬化、胆石形成、または虚血性心疾患にかかっている、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
ファルネソイドX受容体ポリペプチドを発現させるのに適した条件下に宿主細胞を維持し、該ポリペプチドを単離することを含んでなる、請求項1記載のファルネソイドX受容体ポリペプチドの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウスファルネソイドX受容体(FXR)のヌクレオチドおよびポリペプチド配列ならびにそれらの比較薬理学における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核内ホルモン受容体は、ステロイド、レチノイド、および甲状腺ホルモンに対する応答を部分的に仲介する、リガンドにモジュレートされる転写因子の大きいスーパーファミリーを構成している（総論は、Beatoら、(1995) Cell 83: 851-857; Kastnerら、(1995) Cell 83:859-869; MangelsdorfおよびEvans, (1995) Cell 83: 841-850を参照されたい）。受容体、最も注目されるのはステロイドクラスの受容体の詳細な分析により、一般化された機能的特徴を示すファミリー内の複数の別個の機能的モジュールの存在が明らかになった（Tzukermanら、(1994) Mol. Endocrinol. 8: 21-30）。典型的には、強力な自律性の活性化機能(AF1)を有する、A/Bと称される可変アミノ末端ドメインが存在し、これは細胞および標的遺伝子特異性にとって極めて重要であることが示されている(Toraら、(1988) Nature 333: 677-684)。よりカルボキシ末端側の中心領域は、2つのC4型ジンクフィンガーを特徴とするDNA結合ドメイン(DBD)を含む。DBDは特異的ゲノム応答要素に結合し、それにより応答要素を含む選択した遺伝子の転写活性を調節する。リガンド結合ドメイン(LBD)は、遠位のカルボキシ末端に存在し、ホルモン依存性転写トランス活性化に重要な、高度に保存された第２転写トランス活性化機能(AF2)を含む(LanzおよびRusconi, (1994) Endocrinology 135: 2183-2195)。核局在化、受容体二量体化、および熱ショックタンパク質との相互作用(GronemeyerおよびLaudet, (1995) CCQ: 1173-1308)において機能する配列もまた核内受容体下位構造内に存在する。これらの別個の機能ドメインの協調した作用によって、リガンドによる核内受容体の活性化は、標的遺伝子発現のモジュレーション(TsaiおよびO=Malley, (1994) Ann. Rev. Biochem.63:451-486)、およびある場合には、他の細胞シグナル伝達経路、たとえばNF-kB (SteinおよびYang, (1995) Mol. Cell. Biol. 15:4971-4979)およびAP-1(Paechら、(1998) Science 277: 1508-1510) とのクロストークを引き起こす。最終的には、リガンドは、受容体が関与するさまざまなタンパク質-タンパク質相互作用を変更することにより、核内受容体の機能を変更する(総論として、Freedman, (1999) Cell 97: 5-8を参照されたい)。核内受容体により仲介される多くの細胞作用の基礎となる分子的な詳細は、熱心な研究活動の課題となっている。
【０００３】
治療の標的としての進歩しつつある核内受容体に対する重要なステップは、非ヒト動物モデルにおいて該受容体の有用性を確実にすることである。これらの研究には、関連する非ヒトオーソログの単離が必要であり、その後該オーソログは比較薬理実験をおこなうために用いることができる。
【０００４】
核内受容体ファルネソイドX受容体(FXR; 合同命名委員会名称 NR1H4)は、ケノデオキシコール酸のような内因性胆汁酸により調節されることが示された(Parksら、(1999) Science 284, 1365-1367; Makishimaら、(1999) Science 284, 1362-1364; Wangら、(1999) Mol. Cell 3, 543-553)。げっ歯類において、FXRは、シトクロムP450 7a (Cyp7a)の発現を調節することにより、コレステロールおよび胆汁酸のホメオスタシスにおいて不可欠の役割を果たしていることが分かっている。CYP7Aはコレステロール分解経路における最初の律速酵素であるので、この遺伝子によりコードされる酵素はコレステロール低下治療の重要な標的となる(Russell, D.W. (1999) Cell 97, 539-542; およびRepaら、(1999) Curr. Opinion Biotech. 10, 557-563に総論が記載されている)。さらに最近では、FXRは、それがCyp7aプロモーターに及ぼす効果を、核内受容体SHP-1およびLRH-1を巻き込んだ調節カスケードを介して仲介することが示された(Goodwinら、(2000) Mol. Cell 6, 517-526)。FXRの生物学について識見を与えたほとんどの予備研究はげっ歯類を用いておこなわれている。
【０００５】
しかしながら、マウスのようなげっ歯類モデルにおける標的確認研究用のFXR化合物の評価には、全長マウスFXRの正しい配列を用いたリガンドの特性決定が必要である。全長マウスFXRアッセイを用いる化合物の特性決定は、FXRの有用性を胆汁酸およびコレステロールのホメオスタシス以外に拡げるためにも必要であろう。このように、全長マウスFXRの正確な配列を用いた比較薬理学は、この受容体を疾病における有用な標的として確実なものにするうえで重要な目標である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
全長マウスFXR配列が提供される。また、大腸菌(E. coli)における該配列の安定性を促進するように改変されたマウスFXR配列も提供される。本発明のマウスFXR配列は、FXRに選択的な化合物の同定および開発のためのスクリーニング標的として有用である。これらの物質はFXRの比較薬理学に特に有用である。
【０００７】
したがって、本発明の1つの態様は、内因性胆汁酸により調節される、またはシトクロムP450 7a (Cyp7a)の発現との相互作用により胆汁酸ホメオスタシスを調節し、それによりコレステロール分解経路をモジュレートする、配列番号2のアミノ酸配列、または配列番号2の変異体、またはその断片からなる単離されたマウスFXRポリペプチドに関する。
【０００８】
本発明の別の態様は、本発明のマウスFXRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関し、上記のポリヌクレオチドは、
(a)  配列番号1または3の核酸配列およびそれに相補的な配列；
(b)  (a)で定義した配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
(c)  (a)または(b)で定義した配列に遺伝コードの結果として縮重した配列；または、
(d)  (a)、(b)または(c)で定義した配列に少なくとも60％、より好ましくは80％の同一性を有する配列；
を含んでなる。
【０００９】
本発明の他の関連する態様には、本発明のポリヌクレオチドを含みかつ本発明のポリペプチドを発現することができる発現ベクター；本発明の発現ベクターを含む宿主細胞；本発明のポリペプチドを発現させるのに適した条件下で本発明の宿主細胞を維持し、該ポリペプチドを単離することを含んでなる本発明のポリペプチドの生産方法；本発明のポリペプチドに特異的な抗体；およびマウスFXRまたはその変異体を発現する非ヒトトランスジェニック動物；が含まれる。
【００１０】
本発明はまた、FXRの活性および/または発現をモジュレートする物質を同定する方法に関する。1つの実施形態において、上記方法は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞または非ヒトトランスジェニック動物を試験物質と接触させ、ポリペプチドの活性および/または発現に対する試験化合物の効果を測定して、試験物質がFXR活性および/または発現をモジュレートするかどうかを判定することを含んでなる。
【００１１】
さらに、本発明は、FXRの発現または活性をモジュレートする、上述の方法により同定可能な化合物に関する。
【００１２】
発明の詳細な説明
本明細書および添付する特許請求の範囲を通じて、「〜を含んでなる」および「〜を含む」という用語は包括的に解釈されるべきである。すなわち、これらの用語は、文脈が許す場合、特に列挙されていない他の要素または整数を含む可能性があることを意図するものである。
【００１３】
本発明はマウスファルネソイドX受容体（本明細書においてはFXRという）およびその変異体に関する。マウスFXRに関する配列の情報は、配列番号１（ヌクレオチドおよびアミノ酸）および配列番号２（アミノ酸のみ）により提供される。大腸菌(E. coli)内で安定であるように改変されているが、依然としてFXRをコードするマウスFXR配列は配列番号3で表される。このように、本発明のポリペプチドは、本質的に配列番号2のアミノ酸配列、またはその配列の変異体、またはそのいずれかの断片からなる。
【００１４】
配列番号1で表される全長FXR核酸配列は、以前に報告されたいずれの全長マウスFXR cDNA配列とも異なる。この配列はマウスゲノムデータ（登録番号AA270183からの配列）に由来し、新規の5’領域を含む。新規の全長の連続的な配列の存在は、マウス肝臓cDNAライブラリーからの配列のPCR増幅により確認された。
【００１５】
しかし、この配列を大腸菌(E.coli)ベクターにクローン化すると、5’配列は不安定で大腸菌により該配列から欠失された。そこで、本明細書において配列番号3として開示されるものは、同じアミノ酸配列をコードするが3'ヌクレオチドコドン位置が異なっている、改変された全長マウスFXR配列である。配列番号3の改変マウスFXR配列は大腸菌内で安定であって、全長FXRを含むプラスミドの増殖および単離を可能にする。
【００１６】
本発明のマウスFXR配列と以前に報告されたマウスFXR配列(GenBank登録番号U09416)の相違は、FXRのアミノ末端ドメインをコードするcDNAの5’領域に含まれる。典型的には、この領域は生物学的活性に一般的に必要とされる領域であるAF-1ドメインを含む。
【００１７】
本発明の全長マウスクローンを含む発現ベクターを用いた研究により、以前に報告されたマウスFXRの全長配列(GenBank登録番号U09416)と異なる機能的な特徴も明らかになった。たとえば、CV-1細胞における一過性のトランスフェクションアッセイにおいて、本発明の全長配列は、以前に報告された全長マウスFXR (GenBank登録番号U09416)を含む類似の発現プラスミドと比較して、ケノデオキシコール酸による完全な活性化に関して、外因的に加えられたSRC-1発現プラスミドに対する依存性がより低かった。
【００１８】
したがって、1つの実施形態において、本発明は実質的に単離されたまたは精製された形のマウスFXRポリペプチドに関する。「実質的に単離された」とは、ポリペプチドが、ポリペプチドの意図した目的を妨害しない担体または希釈剤と混合されていてもよいが、依然として実質的に単離されているとみなされるものと理解される。本発明のポリペプチドは実質的に精製された形であってもよく、この場合、それは一般的に調製物中にポリペプチドを含み、調製物の重量で50%以上、たとえば80%、90%、95%または99%以上のポリペプチドが本発明のポリペプチドである。通常の方法を用いて本発明のタンパク質を精製および/または合成することができる。このような方法は当業者に公知であり、Sambrookら、「分子クローニング：実験室マニュアル」(Molecular Cloning: a Laboratory Manual) 第2版、CSH Laboratory Press, 1989（この開示を全体として参照により本明細書に組み入れる）に開示されるような技術が含まれる。
【００１９】
本発明のポリペプチドは、本質的に配列番号2のアミノ酸配列、その配列の変異体、またはそれらのいずれかの断片からなる。
【００２０】
「変異体」という用語は、配列番号２のマウスFXRと類似した本質的な特徴または基本的な生物学的機能性を有するポリペプチドを包含するものである。たとえば、マウスFXRの本質的特徴には、ケノデオキシコール酸のような内因性胆汁酸によるその調節、ならびに、シトクロムP450 7a (Cyp7a)発現を調節することによりコレステロール分解経路をモジュレートすることを介したコレステロールと胆汁酸のホメオスタシスにおけるその不可欠な役割が含まれる。マウスFXRは、それがCyp7aプロモーターに及ぼす効果を、核内受容体SHP-1およびLRH-1を巻き込んだ調節カスケードを介して仲介する(Goodwinら、(2000) Mol. Cell 6, 517-526)。好ましくは、変異体ポリペプチドはFXRと同じリガンドに結合するものである。したがって、本発明の１つの実施形態においては、本発明のマウスFXRと同様に、FXRポリペプチド変異体の発現および/または活性が内因性胆汁酸によって調節されると同時に、FXRポリペプチド変異体がシトクロムP450 7a (Cyp7a)の発現および/または活性を調節する。マウスFXRと同じ本質的特徴を有する変異体ポリペプチドは、Cyp7aの発現および/または活性を調節する能力、SHP-1および/またはLRH-1と相互作用する能力、またはケノデオキシコール酸のような内因性胆汁酸により調節されるポリペプチドの能力のような、FXRの1以上の機能をモニターすることにより同定される。全長の変異体ポリペプチドは、好ましくはFXRリガンド結合ドメイン全体を含むものである。
【００２１】
本明細書において用いる「変異体」はまた、FXRと同じ活性を示さず、むしろFXRの基本的な機能または活性を阻害するFXRポリペプチドをも含むことを意味する。たとえば、本発明の変異体は、たとえば、FXRまたはそのリガンドと結合してFXRへのリガンドの結合により仲介される活性を妨害することで、FXRがSHP-1および/またはLRH-1と相互作用する能力およびCyp7aの発現および/または活性を調節する能力を阻害するポリペプチドを含んでいてもよい。
【００２２】
典型的には、配列番号2のアミノ酸配列と約65％以上の同一性、好ましくは80％以上、85％以上または90％以上、より好ましくは95％以上、97％以上、または99％以上の同一性を有するポリペプチドがそのタンパク質の変異体であるとみなされる。同一性は、BLAST配列アライメントプログラムのようなプログラムを用いて決定することができる。このような変異体には、そのペプチドがFXRの基本的な生物学的機能性を維持または阻害する限り、対立遺伝子変異体およびタンパク質配列内の単一のアミノ酸またはアミノ酸類の欠失、改変または付加が含まれる。アミノ酸置換は、たとえば、1、2または3から10、15、20または30の置換がなされてよい。改変されたポリペプチドは一般的にFXRとしての活性を保持している。たとえば、下記の表1に従って保存的置換をおこなうことができる。第2列の同じブロックで、好ましくは第3列の同じ行にあるアミノ酸は互いに置換することができる。
【表１】
2005520487.tif 000002
【００２３】
置換の例を表2に示す。
【表２】
2005520487.tif 000003
2005520487.tif 000004
【００２４】
本明細書において断片とも呼ばれる、より短いポリペプチド配列もまた本発明の範囲に含まれる。たとえば、15、20または30個以上のアミノ酸または50、60、70、80、100、150または200個までのアミノ酸の長さの断片は、それがFXRの基本的な生物学的機能性を示すか、またはFXRの基本的機能性を阻害するかのいずれかであれば、本発明の範囲に含まれるとみなされる。具体的には、しかし排他的ではないが、本発明のこの態様は、タンパク質が完全なタンパク質配列の断片であり、とりわけ、A/Bドメイン（たとえば、配列番号2のマウスFXRのおよそアミノ酸1-122）、DBD（たとえば、配列番号2のマウスFXRのおよそアミノ酸123-187）、またはLBD（たとえば、配列番号2のマウスFXRのおよそアミノ酸188-468）を、単独でまたは組合せで表すような状況を包含する。このような断片は、好ましくは別の核内受容体との、より好ましくはFXR核内受容体のファミリーの別のメンバーとのキメラ受容体を構築するために、または、全長配列の生産における中間体として、用いることができる。このようなFXRまたはその変異体の断片はまた、抗FXR抗体を作るために用いることができる。この実施形態において、断片はFXRポリペプチドのエピトープを含み、そうでなければ、FXRのリガンド結合または他の特性を示さないだろう。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、たとえば翻訳後修飾のように化学的に修飾されてもよい。たとえば、これらはグリコシル化されてもよいし、修飾されたアミノ酸残基を含んでいてもよい。これらはまた、精製を容易にするためのヒスチジン残基の付加、または細胞膜中への挿入を促進するためのシグナル配列の付加により修飾されてもよい。このような修飾されたポリペプチドは、本発明の「ポリペプチド」という用語の範囲内に含まれる。
【００２６】
本発明のポリペプチドはまた、FXRまたはその一部、好ましくはFXRのDNA結合ドメインまたはリガンド結合ドメインが非FXR由来アミノ酸配列と連結している、融合タンパク質を含む。たとえば、全長FXRを、ウイルスVP16自律トランス活性化ドメインにアミノ末端で連結すると、構成的に活性な受容体が得られる。融合タンパク質は、融合タンパク質の発現ベクターを含む宿主細胞を用いて公知の方法に従って組換えにより発現させることができる。あるいは、これらの融合タンパク質は、標準的な技術を用いて合成により調製することもできる。
【００２７】
本発明はまた、FXRまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列ならびにそれに相補的なヌクレオチド配列を含む。「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド」とは、RNAまたはDNA、たとえば、ゲノムDNA、合成DNAまたはcDNAを含むことを意味する。好ましくは、ヌクレオチド配列はDNA配列であり、最も好ましくはcDNA配列である。ヌクレオチド配列の情報は配列番号1および配列番号3に提供される。このようなヌクレオチドは、マウス細胞から単離するか、たとえばSambrookら、1989に記載されるような当業者に公知の方法により合成することができる。
【００２８】
典型的には本発明のポリヌクレオチドは、選択的な条件下で配列番号1または配列番号3の少なくとも一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチドの連続的な配列を含む。
【００２９】
ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖または三本鎖の形であってよい。さらに、本明細書において用いられるポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAまたは両方からなる三本鎖領域を指すことがある。そのような領域の鎖は同じ分子に由来するものでも、異なる分子に由来するものでもよい。本明細書において、ポリヌクレオチドの用語はまた、1以上の修飾された（たとえば、トリチル化された）または普通でない（たとえば、イノシン）塩基を含む核酸をも含む。かくして、安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するDNAまたはRNAもまた、本明細書におけるポリヌクレオチドの用語に含まれる。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドは、バックグラウンドよりも有意に高いレベルで配列番号1または配列番号3にハイブリダイズすることができる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、たとえば、cDNAライブラリー中に存在する他のcDNAのために起こる。本発明のポリヌクレオチドと配列番号1または配列番号3の間の相互作用により発生するシグナルレベルは、他のポリヌクレオチドと配列番号1または配列番号3の間の相互作用と比較して、典型的には10倍以上、好ましくは100倍以上の強度を有する。相互作用の強度は、たとえば、プローブを、たとえば32Pにより、放射性標識することにより測定される。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には中程度から高いストリンジェンシーの条件を用いて達成できる。しかしながら、このようなハイブリダイゼーションは当業者に公知のいかなる適当な条件下で実施してもよい（Sambrookら、1989参照）。たとえば、高いストリンジェンシーが要求される場合には、適当な条件には、60℃〜65℃で0.1〜0.2×SSCが含まれる。より低いストリンジェンシーが要求される場合には、適当な条件には、60℃で2×SSCが含まれる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドはまた、改変された配列を包含する。たとえば、配列番号1または配列番号3は、1、2または3から10、15、25、50または100までのヌクレオチド置換により改変することができる。配列番号1または配列番号3のポリヌクレオチドは、1以上の挿入および/または欠失により、および/または、片方または両方の末端における延長により二者択一的にまたは付加的に改変されてよい。本発明のポリヌクレオチドはまた、FXRのゲノムDNAからのイントロンのような1以上のイントロンを含んでもよい。また、ポリペプチドの細胞膜への挿入を助けるシグナル配列のような付加的配列を含んでもよい。改変されたポリヌクレオチドは一般的にFXR活性を有するポリペプチドをコードする。あるいは、ポリヌクレオチドはポリペプチドのリガンド結合部分、またはFXR活性を阻害するポリペプチドをコードする。縮重したアミノ酸置換および/または保存的アミノ酸置換の両方を導入して、たとえば上記の表に示されるような改変された配列を得ることができる。
【００３２】
配列番号1または配列番号3のDNAの相補体に選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は、一般的に、20以上、好ましくは30以上、たとえば40以上、60以上、より好ましくは100以上の連続したヌクレオチドの領域にわたって、または最も好ましくは配列番号1または配列番号3の全長にわたって、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上または99％以上の配列番号1に対する配列同一性を有する。
【００３３】
同一性および/または相同性を計算するためのさまざまなコンピュータープログラムが利用可能である。たとえば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために用いることができるBESTFITプログラム（たとえば、そのデフォルトセッティングで用いる）を提供する（Devereuxら、(1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395）。PILEUPおよびBLASTアルゴリズムは、たとえばAltschul (1993) J.Mol. Evol. 36:290-300; Altschulら、(1990) J.Mol. Biol. 215: 403-410に記載されるように、（典型的にはこれらのデフォルトセッティングで）相同性またはラインアップ配列(line up sequence)を計算するために用いることができる。
【００３４】
BLAST分析をおこなうためのソフトウェアは米国バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通じて公開されており、利用可能である。このアルゴリズムでは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントをおこなったときに、ある正の値の閾値スコアTと一致するか、その閾値Tを満たすかいずれかであるクエリー配列における長さWの短いワードを同定することにより、高いスコアを与える配列対(HSP)を同定する。Tは近隣ワードのスコア閾値と呼ばれる(Altschulら、1990)。これらの初期の近隣ワードヒットは、それらを含むHSPを見つけ出す検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。ワードヒットのそれぞれの方向への延長は、累積アライメントスコアが、その最大達成値から量Xだけ下がったとき；1以上の負のスコアを与える残基アライメントの蓄積のために累積スコアがゼロ以下になったとき；またはいずれかの配列の末端に到達したときに停止される。BLASTアルゴリズムパラメーターのW、TおよびXはアライメントの感度およびスピードを決定する。BLASTプログラムはデフォルトとして11のワード長さ(W)、BLOSUM62スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919参照）、50のアライメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=4、および両鎖の比較を用いる。
【００３５】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計的分析をおこなう。たとえば、KarlinおよびAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムにより提供される1つの類似性の尺度は、最小合計確率(P (N))であり、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致（マッチ）が偶然に起こる確率の指標を与える。たとえば、第1配列と第2配列との比較において最小合計確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合に、ある配列は別の配列に類似しているとみなされる。
【００３６】
よりストリンジェントな組合せ（すなわち、より長い鎖長にわたるより高い配列同一性）が好ましいが、本発明のポリヌクレオチドを定義するために、上記程度の配列同一性および最小サイズの任意の組合せを用いることができる。したがって、たとえば、25、好ましくは30ヌクレオチドにわたって90％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドは、40ヌクレオチドにわたって95％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドと同様に、本発明の1つの態様を構成する。
【００３７】
本発明のヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの生産に利用され、これはin vitro、in vivoまたはex vivoで実施することができる。本発明のヌクレオチドは組換えタンパク質合成に関与することもできるし、または実際にそれら自体の能力により治療薬として遺伝子治療技術に利用することもできる。FXRをコードするヌクレオチドに相補的なヌクレオチド、またはアンチセンス配列もまた、遺伝子治療に用いることができる。
【００３８】
本発明のポリヌクレオチドはプライマー、たとえば、PCRプライマーまたは別の増幅反応のプライマーとして、またはプローブ、たとえば、放射性もしくは非放射性標識を用いて通常の手段により検出可能に標識されたポリヌクレオチドとして、用いることができる。さらに、本発明のポリヌクレオチドはベクターにクローン化することができる。
【００３９】
上記のようなプライマー、プローブおよび他の断片は、好ましくは10以上、好ましくは15以上または20以上、たとえば25以上、30以上または40以上のヌクレオチドの長さを有する。これらは典型的には40、50、60、70、100または150までのヌクレオチドの長さを有する。プローブおよび断片は150ヌクレオチド以上の長さであってもよく、たとえば、200、300、400、500、600または700ヌクレオチドまでの長さ、または配列番号1または配列番号3から数ヌクレオチド（たとえば5から10ヌクレオチド）短いものであってもよい。
【００４０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、FXR成分を有するキメラ受容体または融合タンパク質の製造に有用である。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、非FXR由来の配列と融合したマウスFXRの少なくともDNA結合ドメインまたはリガンド結合ドメインを含んでなる。非FXR由来の配列は、キメラ受容体が果たすべき目的に適するように選択することができる。このような配列の例としては、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、酵母転写因子GAL4のDNA結合ドメインおよび他のDNA結合ドメイン、たとえば、エストロゲンまたは糖質コルチコイド受容体のDNA結合ドメイン、およびウイルスVP16転写活性化ドメインが含まれるが、これらに限定されない。本発明のキメラ受容体は放射性または蛍光標識のような検出可能な標識をさらに含んでいてもよい。キメラ受容体はまた、ガラスまたはプラスチックの粒子もしくはプレートまたはフィルターのような固相支持体に結合していてもよい。
【００４１】
本発明はまた、本発明のポリペプチドまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野においてルーチンに構築されており、たとえば、プラスミドDNAおよび適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー、および他のエレメント、たとえばポリアデニル化シグナル（これはタンパク質発現を可能にするために必要なことがあり、正しい配向で位置づけられる）の使用を含む。その他の適当なベクターは当業者には明白であり、Sambrookら、1989のような一般的な参照文献に教示されている。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドは、アンチセンスRNAを生産するために、アンチセンス配向で上記のベクター中に挿入することができる。アンチセンスRNAまたは他のアンチセンスポリヌクレオチドはまた、合成的な手段により製造してもよい。このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、FXRの発現を阻害する本発明のアッセイにおいて試験化合物として用いることができる。このようなアンチセンス薬はFXR遺伝子の発現を阻害するために治療上有用である。
【００４３】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ベクター中で用いられる場合、宿主細胞によるコード配列の発現を生じさせることができる制御配列と機能的に連結される。すなわち、ベクターは発現ベクターである。「機能的に連結される」という用語は、記載された構成成分がそれらの意図された方法で機能することができる関係にあるような並置状態をさす。コード配列に機能的に連結される調節配列（たとえばプロモーター）は、コード配列の発現が調節配列に適合しうる条件下で達成されるように位置づけられる。
【００４４】
ベクターは、たとえば、複製起点、必要に応じてポリヌクレオチド発現のためのプロモーター、および必要に応じてプロモーターの調節因子を与えられたプラスミド、ウイルスまたはファージベクターでありうる。ベクターは1つ以上の選択可能なマーカー遺伝子、たとえば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、または真菌ベクターの場合には耐性遺伝子を含んでもよい。ベクターは、in vitroで、たとえばDNAまたはRNAの生産のために用いてもよいし、宿主細胞、たとえば哺乳類宿主細胞にトランスフェクトまたは形質転換するために用いてもよい。ベクターはまた、in vivoで、たとえば遺伝子治療の方法に、または非ヒトトランスジェニック動物の作製に用いるように適合させることもできる。当業者に公知の他のベクター構成成分は本発明のベクターへの使用に適しており、たとえば、ポリアデニル化シグナルのようなプロセシング部位、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、および転写終結配列が含まれる。
【００４５】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現用の宿主細胞に適合するように選択される。たとえば、酵母プロモーターとしては、S. cerevisiaeのGAL4およびADHプロモーター、S. pombeのnmt1およびadhプロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターもまた用いることができる。例としては、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復配列(MMLV LTR)、ラウス肉腫ウイルス(RSV) LTRプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス(CMV) IEプロモーター、アデノウイルス、HSVプロモーター（たとえば、HSV IEプロモーター）、およびHPVプロモーター、特にHPV上流調節領域(URR)が含まれるが、これらに限定されない。哺乳類プロモーターには、カドミウムのような重金属に応答して誘導されるメタロチオネインプロモーター、およびβ-アクチンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。組織特異的プロモーターが特に好ましい。これらのプロモーターはすべて当業界で容易に利用可能である。
【００４６】
ベクターはさらに、真核生物ゲノム配列、好ましくは哺乳類ゲノム配列、またはウイルスゲノム配列に相同な配列を含むポリヌクレオチドを生じさせる、該ポリヌクレオチドに隣接する配列を含んでいてもよい。これにより、本発明のポリヌクレオチドを相同的組換えにより真核細胞またはウイルスのゲノム中に導入することが可能になる。特に、ウイルス配列により挟まれた発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に送達するのに適したウイルスベクターを調製するために用いることができる。適当なウイルスベクターの例には、単純ヘルペスウイルスベクターおよびレトロウイルス、たとえばレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびHPVウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。これらのウイルスを用いる遺伝子導入法は当業者に公知である。たとえば、レトロウイルスベクターを用いて、宿主ゲノム中にポリヌクレオチドを安定に組み込むことができる。対照的に、複製欠損アデノウイルスベクターはエピソームのままであり、したがって一過性の発現を可能にする。
【００４７】
本発明はまた、マウスFXRポリペプチドまたはその変異体もしくは断片を発現するように改変された細胞を含む。このような細胞には、一過性の、または好ましくは安定した高等真核細胞系、たとえば哺乳類細胞または昆虫細胞（たとえばバキュロウイルス発現系を用いる）、酵母のような下等真核細胞、または細菌細胞のような原核細胞が含まれる。本発明のポリペプチドをコードするベクターの挿入により改変される細胞の具体的な例には、哺乳類HEK293T、CHO、HeLaおよびCOS細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドはまた、非ヒトトランスジェニック動物の細胞においても発現させることができる。したがって、本発明のFXRポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物もまた本発明の範囲に含まれる。たとえば、本発明のFXRおよびその内在性FXR遺伝子を発現するマウス以外の非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる。また、その内在性FXR遺伝子をノックアウトした後に本発明の変異型FXRポリヌクレオチドに置き換えたマウスも作ることができる。FXRのイソ型および本発明のFXRの突然変異対立遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物もまた作ることができる。これらの方法により開発されたトランスジェニック動物は、薬物相互作用および毒性について化合物をスクリーニングするため、およびin vivoでのFXRの調節を研究するために用いることができる。
【００４８】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに特異的な抗体に関する。このような抗体は、免疫沈降技術を必要とする精製、単離またはスクリーニング法を含むがこれらに限定されないさまざまな方法に有用であり、または実際、それら自体の性質による治療薬として有用である。
【００４９】
抗体は本発明のポリペプチドの特異的エピトープに対して誘導することができる。このような抗体は受容体へのリガンドの結合を遮断するために用いられる。抗体または他の化合物は、それが特異的であるタンパク質に優先的にまたは高い親和性でもって結合するが、他のタンパク質とは実質的に結合しないかまたは低い親和性でしか結合しない場合には、そのタンパク質と特異的に結合する。抗体の特異的結合能を測定するための競合結合アッセイまたは免疫放射線検定法のさまざまなプロトコールが当業者に公知である（たとえば、Maddoxら、（1993） J. Exp. Med. 158: 1211-1226を参照されたい）。このようなイムノアッセイは、典型的には特異的タンパク質とその抗体との複合体の形成および複合体形成の測定を必要とする。
【００５０】
本発明の抗体はマウスポリペプチドまたはその断片に対する抗体でありうる。本発明においては、抗体という用語は、特に断らない限り、本発明のポリペプチドと結合するフラグメントを含む。このようなフラグメントには、Fv、F(ab')およびF(ab')2フラグメント、ならびに一本鎖抗体が含まれる。さらに、抗体およびそのフラグメントは、キメラ抗体、CDRグラフト抗体またはヒト化抗体であってよい。
【００５１】
抗体は、生物学的サンプル中の本発明のポリペプチドを検出する方法に使用することができる。これらの方法では、本発明のポリペプチドを含むと予想される生物学的サンプルを、抗体とポリペプチドの抗体-抗原複合体の形成を可能にする条件下で、抗体と共にインキュベートする。次いで、抗体-抗原複合体の形成を周知の方法により測定する。
【００５２】
本発明の目的のために、「生物学的サンプル」とは、組織抽出物、血液、血清、唾液、尿、脳脊髄液および胆汁を含むことを意味するが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明の抗体は、固相支持体に結合させることができ、かつ/または適当な試薬、対照品、使用説明書等と共に適当な容器にキットとして包装されていてもよい。抗体は顕示用標識と結合させることもでき、こうしてin vivo FXRイメージングの方法で使用するのに適したものとなる。
【００５４】
本発明の抗体は、どのような適した方法により生成されてもよい。抗体を調製して特性決定する手段は当業者に公知であり、たとえば、HarlowおよびLane (1988) 「抗体：実験室マニュアル」(Antibodies: A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい。たとえば、抗体は、宿主動物において、全ポリペプチドまたはその断片、たとえば、その抗原エピトープ（以後、免疫原という）に対して抗体を生起させることにより生産することができる。
【００５５】
ポリクローナル抗体を生産する方法は、適当な宿主動物、たとえば実験動物を、免疫原で免疫感作し、動物の血清から免疫グロブリンを単離することを含んでなる。この方法では、動物に免疫原を接種する。その後、動物から血液を採取し、IgG画分を精製する。
【００５６】
モノクローナル抗体を生産する方法は、所望の抗体を生産する細胞を不死化することを含んでなる。ハイブリドーマ細胞は、接種した実験動物由来の脾細胞を腫瘍細胞と融合させることにより作製される(KohlerおよびMilstein (1975) Nature 256:495-497)。所望の抗体を生産する不死化細胞は通常の方法で選択する。次に、ハイブリドーマを培養下で増殖させるか、または腹水を生成させるために腹腔内に、あるいは同種異系宿主もしくは免疫無防備状態にある宿主の血流中に注射する。
【００５７】
モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を生産するためには、実験動物はヤギ、ウサギまたはラットが適している。必要ならば、免疫原がたとえばアミノ酸残基の1つの側鎖により適当なキャリアーに結合しているコンジュゲートとして、免疫原を投与してもよい。キャリアー分子は典型的には生理的に許容されるキャリアーである。得られた抗体は単離して、必要ならば精製する。
【００５８】
本発明のひとつの重要な態様は、本発明のポリペプチドをスクリーニング法に使用することである。スクリーニング法は、FXRと結合する物質、特にリガンドを同定するために用いられる。スクリーニング法はまた、FXR活性をモジュレートするアゴニストまたはアンタゴニスト、FXR活性の阻害剤または活性化剤、および/またはFXR発現をアップレギュレートもしくはダウンレギュレートする薬剤を同定するためにも用いられる。
【００５９】
「モジュレートする」という用語は、FXRの発現レベルのアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーション、および/またはFXR活性の増加もしくは減少を意味する。
【００６０】
アッセイのためにどのような適当なフォーマットを用いてもよい。一般的には、このようなスクリーニング法は、本発明のポリペプチドを試験物質と接触させ、試験物質のポリペプチドへの結合をモニターするか、または受容体活性を測定することを含む。本発明のポリペプチドを試験物質と共にインキュベートする。FXR活性および/または発現のモジュレーションは、FXRとケノデオキシコール酸のような内因性胆汁酸との相互作用の変化、またはCyp7aのレベルの変化をモニターすることにより測定される。好ましい態様において、アッセイは細胞ベースのアッセイである。好ましくは、アッセイはマイクロタイタープレートの1つのウェルでおこなわれる。最も好ましいのは、ハイスループットスクリーニングを可能にするアッセイフォーマットである。
【００６１】
モジュレーターの活性は、本発明のポリペプチドを発現する細胞を、実験中の物質（本明細書では試験物質または試験化合物ともいう）と接触させ、試験化合物により仲介される効果をモニターすることにより測定することができる。本発明のポリペプチドを発現する細胞は、in vitroで存在してもin vivoで存在してもよい。本発明のポリペプチドは天然でまたは組換えにより発現させることができる。好ましくは、アッセイは、組換えポリペプチドを発現する細胞を用いてin vitroでおこなわれる。また、観察された応答がポリペプチドの活性化の結果であるかどうかを確証するために、本発明のポリペプチドを発現しない細胞で対照実験をおこなうことが好ましい。
【００６２】
本発明において、本明細書中で用いる「効果」とは、試験化合物が存在しない場合のFXRの結合能、活性および/または発現と比較して、試験化合物の存在がFXRの結合能、活性および/または発現レベルを増大または減少させることを意味する。
【００６３】
試験物質の本発明のポリペプチドへの結合は直接測定することができる。たとえば、放射性標識した試験物質を本発明のポリペプチドと共にインキュベートし、試験物質のポリペプチドへの結合をモニターすることができる。典型的には、放射性標識した試験物質を、ポリペプチドを含む細胞膜と共に平衡に達するまでインキュベートする。次に、膜を未結合の試験物質から分離し、シンチレーション液に溶解して、放射性成分をシンチレーション計数により測定する。飽和濃度の非放射性リガンドの存在下で実験を繰り返すことにより、試験物質の非特異的結合も測定する。
【００６４】
アッセイはFXRを発現する細胞を用いて、この細胞を試験物質と共に、必要に応じてFXRリガンドの存在下でインキュベートすることにより実施することができる。あるいは、FXR活性を仲介するために、FXRと複合体を形成することができる抗体を用いることもできる。次に、試験物質を加えて上記活性に対する効果を評価する。FXR機能のアッセイに使用するために、FXRを構成的に発現する細胞を用いる。このような構成的に発現されたFXRは、リガンド結合なしでFXR活性を示すことができる。どのアッセイにおいても、リガンド結合の阻害剤またはFXR仲介活性の阻害剤を探すために、追加の試験物質を導入することができる。
【００６５】
FXR発現を変更する物質、つまり、より具体的にはFXR発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする物質を同定するためにアッセイをおこなうこともできる。このようなアッセイは、たとえば、FXR発現のレベルをモニターするためにFXRの抗体または他の特異的リガンドを用いておこなわれる。FXR発現に対する試験物質の効果をモニターするために用いることができる他のアッセイには、プロモーター配列としてのFXR調節配列により駆動されるリポーター遺伝子構築物を用いて、リポーターポリペプチドの発現をモニターすることが含まれる。
【００６６】
本発明のポリペプチドに特異的なリガンドを同定するために、他のFXRの公知のリガンドを用いてアッセイをおこなうこともできる。公知のFXRアゴニストまたはFXRアンタゴニストを試験化合物と比較するアッセイもおこなうことができる。
【００６７】
そこで、本発明はまた、本発明のFXRポリペプチドと相互作用する能力について試験化合物をスクリーニングする方法に関する。好ましくは、上記方法はFXR LBDを含むポリペプチドを用意し、それと相互作用する試験化合物の能力を測定することからなる。このような方法は、FXRの天然のリガンドを同定するため、また、試験化合物がその受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとしての使用に適しているかを判定するために用いることができる。
【００６８】
本発明のスクリーニングアッセイは、一般的に、まず受容体（たとえば、受容体のLBD）に結合する試験化合物の能力を測定することを含む。次に、結合する化合物を、受容体の活性に影響を及ぼす能力について試験する。例として、本発明のFXR LBD含有ポリペプチドを、公知のカップリング試薬を用いて固相支持体、たとえばプラスチックビーズまたはプレートに結合させることができる。次に、試験化合物（検出可能な標識をもっていてもよい）を固定したポリペプチドに接触させ、試験化合物とポリペプチドの間の相互作用をモニターする。
【００６９】
好ましい実施形態において、スクリーニングアッセイはFRET（蛍光共鳴発光転移アッセイ）（Nicholsら、(1998) Anal. Biochem. 257:112-119）の形をとる。この方法は、第1の位置に置かれた供与体および第2の位置に置かれた受容体を含むサンプル部分を、供与体に第1の電子遷移を誘導することができる第1波長の光に曝露するステップを含んでなる。ここにおいて、供与体はランタニドキレートおよび該キレートに結合可能なランタニドの複合体からなり、また、供与体発光および受容体吸収のスペクトルの重なりが、受容体ルミネセンスの検出可能な増加として測定される供与体から受容体へのエネルギー転移を可能にするのに十分である。この方法の改良点はSRC-1(LCD2, 677-696)ランタニドキレートを使用することである。具体的には、ランタニド元素はユウロピウムであってよく、シグナルキレートはFXRに結合したユウロピウムでありうる。この方法は、FXRに結合したユウロピウムおよびSRC-1に結合したアロフィコシアニン(APC)からなるシグナル対を利用することができる（たとえば、Parksら、(1999) Science 284:1365-1368を参照されたい）。
【００７０】
全長マウスFXRタンパク質またはマウスFXRの完全なアミノ末端を用いる他の相互作用アッセイは、本明細書に記載される技術に基づいて当業者がルーチンに開発することが可能であり、たとえば、哺乳類ツーハイブリッドアッセイおよびマウスFXRのアミノ末端と反応するファージディスプレイペプチドの同定を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
上記のアッセイでスクリーニングするのに適した試験物質には、コンビナトリアルライブラリーから誘導されるもの、規定された化学物質および化合物、ペプチドおよびペプチドミメチック、オリゴヌクレオチドおよび天然産物ライブラリー、たとえばディスプレイ（例：ファージディスプレイライブラリー）、および抗体産物が含まれる。好ましい実施形態において、試験物質には、有機分子、好ましくは50〜2500ダルトンの分子量を有する小さい有機分子が含まれる。候補の試験物質として、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造類似体または組合せを含む生体分子が挙げられる。これらの試験物質は合成または天然の化合物のライブラリーを含むさまざまな供給源から得られる。さらに、既知の薬理活性物質に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、方向づけられたまたはランダムな化学修飾をおこなって、スクリーニングのための構造類似体を製造してもよい。
【００７２】
試験物質は、最初のスクリーニングにおいて、たとえば反応当たり10物質が使用される。次に、阻害または活性化を示した試験物質を個々に試験する。試験物質は、1nM〜1000μM、好ましくは1μM〜100μM、より好ましくは1μM〜10μMの濃度で使用される。好ましい実施形態において、試験物質の活性は、既知の活性化剤または阻害剤が示す活性と比較される。阻害剤として作用する試験物質は、受容体の活性の50％阻害をもたらし得る。あるいはまた、活性化剤として作用する試験物質は、既知の活性化剤を用いて得られた最大活性の50％をもたらし得る。
【００７３】
比較薬理学では、化合物のヒトにおける効果を予想するため、または化合物のヒトにおける効果との対照的な相違を明らかにするために、非ヒト動物モデルが使用される。したがって、上記のような本発明のマウスFXRを用いたアッセイの結果は、対象の化合物が類似のヒト受容体と対比して同様に（または異なって）受容体をモジュレートするかどうかに関して、重要な情報を提供する。
【００７４】
そこで、本発明の別の態様は、上記のマウスFXRによるスクリーニング技術により同定された試験化合物を、ヒトにおけるFXR活性/発現の調節に応答する症状の処置に使用することである。その処置は治療的であっても予防的であってもよい。こうして、そのような症状を有する患者の状態を改善することができる。具体的には、上記のような物質は、胆汁酸合成ならびにコレステロールおよび脂質のホメオスタシスのモジュレーションに用いられる。したがって、処置される症状は、コレステロール代謝または異化の改変と関連するものであり、たとえば、アテローム性動脈硬化、胆石形成、および虚血性心疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
上に記載したスクリーニング法によりFXR発現または活性のモジュレーターとして同定された物質は、薬学分野で通常おこなわれるように、標準的な製薬上許容される担体および/または添加物を加えて製剤化することができる。たとえば、注入用には適当なモジュレーターを生理食塩水または水に溶解する。製剤の正確な性質は、投与される個々の物質および望まれる投与経路を含むいくつかの要因に依存する。適当な製剤のタイプは、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Eastern Pennsylvania, 第17版、1985（この文献の開示を全体として参照により本明細書に組み入れる）のような標準的な参考文献に詳細に記載されている。
【００７６】
FXRモジュレーターは、経口、バッカル、肛門、肺、静脈内、動脈内、筋内、腹腔内、局所または他の適当な投与経路のような腸管内または非腸管内経路により投与することができる。
【００７７】
治療上有効な量のモジュレーターが患者に投与される。モジュレーターの用量はさまざまなパラメーターに従って、特に、使用される物質、本明細書に記載したスクリーニングアッセイにより決定された物質の活性、治療すべき患者の年齢、体重および状態、投与経路、および必要な投与計画に従って決定される。医師は、個々の患者に対して必要な投与経路および投与量を決定することができる。典型的な1日量は、特定のモジュレーターの活性、治療すべき被験者の年齢、体重および状態、退化のタイプおよび重症度、ならびに投与の頻度および経路に応じて、体重kgあたり約0.1〜50mgである。好ましくは、1日の投与量レベルは5mg〜2gである。
【００７８】
FXR活性をモジュレートするマウスFXRまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドもまた、治療に用いることができる。マウスFXRまたはその変異体が患者の体内で発現されるように、RNAまたはDNAのようなポリヌクレオチド、より好ましくはDNAをベクターの形で提供し、患者に投与することができる。
【００７９】
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはどのような利用可能な技法で投与してもよい。たとえば、ポリヌクレオチドは、針を用いた注入により、好ましくは皮内、皮下または筋内に導入する。あるいは、ポリヌクレオチドは、粒子が介在する遺伝子送達のような核酸送達装置を用いて皮膚から直接送達される。また、ポリヌクレオチドは、たとえば、鼻内、経口、膣内または直腸内投与により、皮膚に局所的に、または粘膜表面に投与されてもよい。
【００８０】
いくつかの公知のトランスフェクション技術（たとえば、トランスフェクション試薬の使用を含むもの）により、核酸構築物の取り込みを増大させることができる。これらの試薬の例としては、カチオン性試薬、たとえば、リン酸カルシウムおよびDEAE-デキストラン、ならびにリポフェクタント(lipofectants)、たとえば、リポフェクタムおよびトランスフェクタムが含まれる。核酸の投与量は変えることができる。典型的には、核酸は、粒子介在遺伝子送達では1pg〜1mg、好ましくは1pg〜10μgの範囲で、他の経路では10μg〜1mgの範囲で投与される。
【００８１】
本発明の別の態様は、本発明のマウスFXRポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ヒト遺伝子にも生じる可能性があって、ヒト疾患に関与している可能性があるFXR遺伝子の突然変異を同定するために使用することに関する。このような突然変異の同定は、突然変異遺伝子を発現するトランスジェニック動物の開発に有用である。これらのトランスジェニック動物はヒト疾患の有用なモデルとして用いることができる。このような突然変異の同定はまた、上記疾患への罹病性の診断を助けたり、上記疾患の生理学を評価するのに用いられる。ポリヌクレオチドはまた、FXR発現のアップ-またはダウンレギュレーションをモニターするためにハイブリダイゼーション研究で用いることができる。配列番号1または配列番号3のようなポリヌクレオチドまたはその断片を用いて、対立遺伝子変異体、ゲノムDNAおよび種変異体を同定することができる。
【００８２】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【実施例】
【００８３】
実施例１：  配列の特性決定
全長マウスFXRのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が決定された。これらは配列番号1および2に示されている。全長マウスFXR配列は、in silico配列比較ツール(BlastおよびHMMR)を用いたマウスゲノムデータベースのバイオインフォマティック分析により同定された。5=タンパク質のコード領域は文献に発表された配列と異なることが見出された。この新規配列は、マウスゲノムの関連部分を再配列決定した後、全長マウスFXRの発現構築物を作ることにより明らかにされた。文献に発表されたマウスFXR配列は不安定であるので、複数のサイレント突然変異を生じさせて配列番号1および3の安定な配列を作製した。
【００８４】
実施例２：  細胞ベースのアッセイによるFXRモジュレーターの同定
本発明の全長マウスFXR配列を用いて、一時的なまたは安定したフォーマットでの細胞ベースのアッセイを開発した。これらのアッセイのために、全長マウスFXRを発現する受容体発現構築物、および最小のプロモーターおよびリポーター遺伝子に連結された１以上のFXR応答要素を含むリポーター構築物を細胞系の中に導入する。次に、この細胞系に試験化合物をさまざまな濃度で加えて、リポーター遺伝子の発現に及ぼす試験化合物の効果を測定する。試験化合物に曝していない細胞におけるリポーター遺伝子の発現と比較して、試験化合物の存在下でのリポーター遺伝子の発現が変化している場合は、試験化合物がマウスFXRのモジュレーターであることを示している。
【配列表】
2005520487.tif 000005
2005520487.tif 000006
2005520487.tif 000007
2005520487.tif 000008
2005520487.tif 000009
2005520487.tif 000010
2005520487.tif 000011
2005520487.tif 000012
2005520487.tif 000013
2005520487.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月31日(2005.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む単離されたファルネソイドX受容体ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
cDNA配列である、請求項２記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ファルネソイドX受容体をコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
(a) 配列番号１；
(b) 配列番号３；
(c) (a)または(b)に相補的な配列；および、
(d) 遺伝子コードの縮重の結果、(a)または（b）と異なる配列；
より選択される配列を含んでなる上記ポリヌクレオチド。
【請求項５】
(a) 請求項１記載のファルネソイドX受容体；および、
(b) 非ファルネソイドX受容体のアミノ酸配列；
を含んでなる融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項２記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項９】
請求項４記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１１】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【国際調査報告】
2005520487.tif 000015
2005520487.tif 000016