(57)【要約】本発明は、異種移植片および生体プロテーゼデバイスに組み込むために組織を調製するための方法を提供する。本発明の方法は、感染性物質および化学薬剤を組織から除去するため、ならびに組織に化学薬剤（例えば、タンニング剤、架橋剤、および生物活性薬剤）を浸透させるために超臨界流体を利用する。本発明の１つの方法は、感染性因子を哺乳動物軟組織から除去する方法であって、該方法は、該軟組織を、超臨界流体を含む媒体を用いた抽出に供し、それにより、該感染性因子を除去する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性因子を哺乳動物軟組織から除去する方法であって、該方法は、該軟組織を、超臨界流体を含む媒体を用いた抽出に供し、それにより、該感染性因子を除去する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記感染性因子が、ウイルス、細菌、マイコバクテリア、真菌、マイコプラスマおよびプリオンからなる群より選択されるメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスが、肝炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスから選択されるメンバーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プリオンが、海綿状脳障害の原因因子である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記流体が、二酸化炭素である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組織が、組織１ｇあたり約１００ｇ〜約５００ｇの超臨界二酸化炭素を用いて処理される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組織が、組織１ｇあたり約１００ｇ〜約５００ｇの超臨界二酸化炭素を通過させるために、二酸化炭素の流速の関数として決定された期間にわたって二酸化炭素を用いて処理される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組織が、組織１ｇあたり約２００ｇ〜約４００ｇの超臨界二酸化炭素を通過させるために、二酸化炭素の流速の関数として決定された期間にわたって二酸化炭素を用いて処理される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記超臨界二酸化炭素が、約１×１０７Ｐａと約５×１０７Ｐａとの間の圧力で適用される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記超臨界二酸化炭素が、約２×１０７Ｐａと約４×１０７Ｐａとの間の圧力で適用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記超臨界二酸化炭素が、約４０℃と約５５℃との間の温度で適用される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記超臨界流体が、フルオロカーボンおよびアルカンからなる群のうちの１以上の化合物から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フルオロカーボンが、クロロジフルオロメタンおよびトリフロオロメタンからなる群のうちの１以上の化合物から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アルカンが、エチレン、プロパンおよびエタンからなる群のうちの１以上の化合物から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
臨界流体、超臨界流体または近臨界流体が、亜酸化窒素、窒素および二酸化炭素からなる群のうちの１以上の化合物から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
動物材料が、器官に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物軟組織が、神経組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物軟組織が、筋肉組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物軟組織が、脂肪組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物軟組織が、腺組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物軟組織が、上皮組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記哺乳動物軟組織が、内皮組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物軟組織が、心筋組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記哺乳動物軟組織が、脈管組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
動物材料が、リンパ組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
動物材料が、呼吸組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
動物材料が、消化組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
動物材料が、知覚組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
動物材料が、泌尿器組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
動物材料が、生殖組織を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、モディファイヤまたはエントレイナーを前記超臨界流体に添加する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記モディファイヤまたはエントレイナーが、界面活性剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記モディファイヤまたはエントレイナーが、水である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記モディファイヤまたはエントレイナーが、アルコールである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記アルコールが、エタノールである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アルコールが、ｎ−プロパノールである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記モディファイヤまたはエントレイナーが、ケトンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ケトンが、アセトンである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
哺乳動物軟組織を化学薬剤で処理する方法であって、該方法は、該組織を、超臨界流体中の該化学薬剤の溶液と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４０】
前記化学薬剤が、固定剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記固定剤が、アルデヒドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アルデヒドが、グルタルアルデヒドである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
化学薬剤で組織を処理した後に該組織から該化学薬剤を除去するための方法であって、該方法は、該化学薬剤を該組織から除去する条件下で該組織を超臨界流体と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４４】
前記感染性因子が、核酸、脂質、タンパク質および多糖からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
移植可能な異種移植片およびプロテーゼデバイスは、代表的に、意図されるレシピエントへの移植の前に滅菌される。滅菌は、そのデバイスが潜在的病原体または他の生物学的に有害な因子を意図されるレシピエントに導入しないことを確実にするために必要である。滅菌は、ヒトまたは他の哺乳動物ドナー由来の生体材料が移植片またはデバイスの構成要素である場合、特に適切である。例えば、Ｃｕｎｎａｎｅｎらに対する米国特許第６，２１４，０５４号（その全体が本明細書に援用される）は、このような生物学的組織についての十分に認識された滅菌技術の考察を含む。デバイスの構成要素は、デバイスを組み立てる前に個々に滅菌されるか、あるいはこれらは、「最終滅菌」のプロセスによって滅菌される。最終滅菌プロセスにおいて、このデバイスは、その構築の後（すなわち、全ての構成要素がデバイス中で互いに組み合わされた後）に滅菌される。両方のプロセスを組み合わせて用いて、移植片またはデバイスの完全な滅菌を確実にし得る。滅菌において使用するための種々の物理的方法または化学的方法が開発されており、例えば、化学物質もしくは熱に対する曝露、または電離放射線もしくは非電離放射線に対する曝露が挙げられる。しかし、これらの方法は、固有の問題を有する。さらに、これらの方法の大部分は、哺乳動物組織を組み込んだ生体プロテーゼデバイスには不適切である。
【０００２】
例示的滅菌方法としては、プロテーゼおよび移植片構成要素を化学的試薬で処理することが挙げられる。この化学的試薬自体またはこの試薬由来の反応副生成物は、このプロテーゼデバイスの意図されるレシピエントに対して有害であり得る。従って、このような化学物質は、このデバイスの移植の前に除去されなければならない。通常の化学的滅菌剤としては、エチレンオキシドおよびホルムアルデヒドが挙げられ、これらは両方とも、アルキル化剤であり、それゆえ、生物学的に活性な分子を改変して不活化し得る。しかし、これらの化学物質は両方とも、発癌物質および変異原であることが公知である（Ｄａｖｉｓら，（１９７３）「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版」，Ｈａｒｐｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｗ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。
【０００３】
デバイス構成要素を滅菌する他の方法としては、このデバイスまたはその構成要素をプラズマ（Ｍｏｕｌｔｏｎら，米国特許第５，０８４，２３９号）、熱、または電離放射線に曝露することが挙げられる、しかし、化学的処理と同様に、このデバイスが生物学的構成要素（例えば、タンパク質、細胞、組織）を含む場合、このデバイスを、上昇した温度、放射線またはプラズマに曝露することは望ましくない。なぜなら、タンパク質および他の生物学的物質が、変性し得、続いて、これらの形態のエネルギーへの曝露によって不活化または脆弱化され得るからである。電離放射線および非電離放射線に曝露することによる対象物の滅菌は、潜在的に毒性の化学物質を添加する必要性を除去するが、放射線エネルギーおよび／またはその副生成物（酸素フリーラジカルを含む）は、タンパク質のコンホメーションを改変する能力があり、それゆえ、タンパク質、細胞および組織を損傷または破壊し得る。さらに、いくつかの医学的に重要なポリマー（例えば、ポリウレタンまたはポリメチルメタクリレート）のγ線への曝露は、即座の物理的変化および長期の物理的変化をそのポリマーにもたらし得る。さらに、γ線またはベータ線での照射は、全ての病原体を確実に破壊するわけではない。実際、特定のウイルスは、放射線耐性である。従って、化学物質および放射線を用いて異種移植片およびプロテーゼデバイスの生物学的に誘導された構成要素を滅菌することに対する代替法が熱心に要求されている。
【０００４】
上記の生物学的に誘導されたプロテーゼデバイス構成要素を滅菌するための化学物質に基づく方法および放射線に基づく方法は、デバイスの生物学的構成要素に付随する感染性因子の不活化に依存する。この不活化される感染性因子は一般に、このデバイスの生物学的構成要素に付随したままである。生物学的に誘導された材料を非感染性にする有望な形態は、感染性因子を超臨界流体と接触させることによって、感染性因子を不活化することに依存する。しかし、哺乳動物軟組織から感染性物質を抽出するための超臨界流体の使用は、ほとんど注目されていない。
【０００５】
超臨界流体は、クロマトグラフィーの分野で主に用いられており、ここでは、これらの高密度材料が抽出溶媒および相互作用移動相として用いられる。例えば、Ｋｈｏｓａｈらに対する米国特許第４，８１６，１５９号および同第４，８８０，５４３号は、各々、特定の充填材料を利用する超臨界流体クロマトグラフィー法を開示する。これらの特許に開示される充填材料は、支持体材料上の反応性部位にリン含有有機分子が結合した金属酸化物／金属水酸化物支持体材料から選択される。歴史的には、超臨界流体クロマトグラフィーは、１９６０年代半ばにその起源を有し、一方、その抽出類似物は、近年にのみ、分析化学の分野において適用が見られる。
【０００６】
超臨界流体を利用する抽出方法もまた、多数の適用のために利用されている。超臨界流体を用いるクロマトグラフィーとは異なり、超臨界流体抽出は、高密度の気体様物質（例えば、超臨界二酸化炭素）を利用して有機化合物がサンプルマトリクスから抽出され得る技術である。二酸化炭素溶媒和力は、圧力および温度がそれらの臨界点（これらは、それぞれ、１０７０ｐｓｉおよび３１℃である）を超えて上昇するにつれて増大する。例えば、Ｚａｒｃｈｙに対する米国特許第４，５４７，２９２号；Ｍｏｓｅｓに対する同第４，７７０，７８０号；Ｂｅｔｈｕｅｌらに対する同第４，８２４，５７０号；Ｍｏｓｅｓに対する同第４，８７７，５３０号；および国際特許番号ＷＯ  ８５／０４８１６は各々、超臨界流体を利用した抽出を実施するために有用な種々のプロセスまたはシステムを開示する。超臨界流体抽出を考察する他の参考文献としては、Ｆａｖａｔｉら，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５３：１５３２−１５３６（１９８８）；Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７：３５５−３６４（１９８９）；およびＫｉｎｇら，Ｊ．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ＆  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：９５１−９５４（１９８９）が挙げられる。
【０００７】
多数の参考文献は、微生物およびウイルスを不活化するための超臨界流体の使用を開示する。例えば、超臨界状態の二酸化炭素ＣＯ２中の突然の減圧による微生物細胞の機械的破壊が記載されている（Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８（７）：１２９７−１３０１（１９９４））。Ｃａｓｔｏｒら（米国特許第５，８７７，００５号）は、生物学的物質を含む流体中のビリオンを不活化するための方法を開示する。骨移植片は、超臨界流体抽出を用いて脂質物質を移植片の固体骨格から抽出することによって調製されている。例えば、ＥＰ−Ａ−０．６０３．９２０は、超臨界状態の流体を用いて脂質性有機物質を抽出する、骨組織の処理のためのプロセスを記載する。超臨界流体抽出は、脂質性物質およびウイルスの両方を骨材料から除去するために用いられている。骨からのウイルスの除去を開示する代表的参考文献としては、Ｆａｇｅｓら，２１ｓｔ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，２３８頁（１９９５）；Ｆａｇｅｓら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １５：６５０−６５６（１９９４）；Ｆａｇｅｓ，米国特許第５，７２３，０１２号；および同第５，７２５，５７９号が挙げられる。
【０００８】
上記の参考文献は、超臨界流体を用いて骨および軟骨中の感染性因子を不活化するためのプロセスを開示する。これらの参考文献は、移植可能な組織を得るために、骨移植片材料は、超臨界流体抽出に加えて、多数の工程（残りのタンパク質を抽出するための（過酸化水素を用いる）化学的処理および／または酵素（プロテアーゼ）処理を含む）に供されなければならないことを開示する。次いで、この組織は、洗浄され、脱水され、そしてエタノール浴中で殺菌される（この最後の段階は、生体材料の感染に関する安全性を増す）。これらの参考文献はいずれも、感染性物質が、超臨界流体抽出によって軟組織から有効に除去され得ることを示唆しない。さらに、これらの参考文献はいずれも、超臨界流体のみでの任意の組織の処理が、感染性因子をこの組織から除去することを示唆しない。
【０００９】
増しつつある懸念は、異種移植片およびプロテーゼデバイスに用いられる、生物学的に誘導された材料における、感染性プリオンの存在である。プリオン関連疾患の広範な出現および種間伝染の可能性は、生物工学産業にとって深刻な意味を有する。生物工学産業は、その製品の多くを、哺乳動物組織から誘導する（Ｄｉ  Ｍａｒｔｉｎｏ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２１：６１−６６（１９９３））。哺乳動物組織製品の安全性に関する懸念は、プリオンの不活化についての研究を導く。これらの研究は、プリオンが、より一般的な病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）よりも不活化に対して耐性であることを示す。従って、プリオン含有生物学的材料を除染するためには、比較的過酷な条件が必要とされる。プリオン汚染生物学的調製物を殺菌するための、現在公知の唯一の方法は、１３０℃以上での長期オートクレーブおよび濃水酸化ナトリウム溶液での処理である。これらの方法は、プリオンの慣用的不活化のために推奨されている（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ８４：１６（１９８９））。６Ｍ尿素での処理と組み合わせた１００ｋＤカットオフの限外濾過がプリオン含有調製物の除染をもたらすこともまた報告されている（Ｐｏｃｃｈｉａｒｉら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．９８：１３１−１３５（１９８８））。プリオン活性を低下させ得る他の方法としては、有機溶媒、界面活性剤、タンパク質変性剤、カオトロピック塩（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ  ｓａｌｔ）およびフェノールでの処理が挙げられる（Ｍｉｌｌｓｏｎら，ＰｒｕｓｉｎｅｒおよびＨａｄｌｏｗ編，ＳＬＯＷ  ＴＲＡＮＳＭＩＳＳＩＢＬＥ  ＤＩＳＥＡＳＥＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＮＥＲＶＯＵＳ  ＳＹＳＴＥＭ，第ＩＩ巻，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ４０９−４２４（１９７９）；Ｐｒｕｓｉｎｅｒら，ＰＮＡＳ  ７８：４６０６−４６１０（１９８１）；Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．５９：３９０−３９２（１９８３）；Ｗａｌｋｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ７３：６６１−６６５（１９８３）；Ｂｒｏｗｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５３：１１４５−１１４８（１９８６））。
【００１０】
生体材料中の感染性、特にプリオンの感染性を除去するために必要とされる極端な条件は、代表的に、これらの材料の有用な活性および構造を保つことを意図した方法と適合性ではない。先行法の過酷な条件は、哺乳動物軟組織に対して特に有害であり、この組織の機能的構成要素および構造的構成要素の変性をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、これらの所望の生体材料の完全性を損なうことなく、哺乳動物軟組織から感染性物質を除去するための方法についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
哺乳動物軟組織由来の生体材料の超臨界流体抽出が、感染性物質（プリオンを含む）を除去し、この生体材料を、異種移植片としての使用および生体プロテーゼデバイスの構成要素としての使用に安全かつ有効にすることが現在見出されている。超臨界流体はまた、異種移植片およびプロテーゼデバイスにおいて使用される組織に化学薬剤を送達するために優れたビヒクルであることが見出されている。さらに、より一般的な化学的処理の後に、残った化学薬剤をこの組織から除去するために超臨界流体抽出が用いられ得ることが見出されている。本発明の方法は、低温で、そして感染性因子を組織から除去するための当該分野で認識されている方法よりも顕著に温和な条件下で有効である。
【００１３】
超臨界状態の流体は、有機物質（特に脂質性物質）を骨組織から抽出することが示されている。しかし、生体プロテーゼデバイスにおいて使用するために哺乳動物軟組織を調製する際の超臨界流体の使用に対しては、ほとんど注目が払われていない。軟組織を調製する際の超臨界流体の使用の中でも、組織から感染性因子および化学薬剤を除去することである。超臨界流体はまた、化学薬剤（例えば、タンニング（ｔａｎｎｉｎｇ）剤、架橋剤、生物活性薬剤など）を送達および除去するための溶媒として有用である。これらの化学薬剤は、軟組織異種移植片および生体プロテーゼデバイスの構成要素を処理するために用いられる。
【００１４】
従って、第１の局面では、本発明は、感染性因子を哺乳動物軟組織から除去するかまたは感染性因子を不活化する方法を提供する。この方法は、この軟組織を、超臨界流体を含む媒体を用いた抽出に供し、それによってこの感染性因子を除去または不活化する工程を包含する。同様に、本発明は、望ましくない化合物（例えば、心膜心臓弁組織の石灰化を加速するかまたは生じる化合物）をこの組織から抽出するために調整され得る。
【００１５】
本発明のプロセスはまた、異種移植片または生体プロテーゼデバイスの構成要素としてのその使用前に、多孔質組織マトリクスに化学薬剤（例えば、この組織を安定化するための架橋剤）を深く染込ませるために用いられ得る。超臨界流体の比類ない浸透性質に起因して、これらの流体およびこれに溶解している溶質は、組織構造中に、化学薬剤の単純溶液よりも迅速に、深く、そして完全に浸透する。従って、本発明の方法を用いて、化学薬剤の非超臨界溶液を用いて可能であるよりも温和な条件下で、より短い期間で、組織に化学薬剤をより徹底的に浸透させることが可能である。
【００１６】
従って、第２の局面では、本発明は、哺乳動物組織を化学薬剤で処理する方法を提供する。この発明は、この組織を、超臨界流体に溶解した化学薬剤と接触させる工程を包含する。
【００１７】
さらに、本発明は、１以上の化学薬剤で組織を処理した後に、過剰な化学薬剤（例えば、固定剤、架橋剤、保存剤など）をこの組織から除去するための方法を提供する。
【００１８】
従って、第３の局面では、本発明は、化学薬剤で組織を処理した後にこの化学薬剤をこの組織から除去するための方法を提供する。この方法は、この化学薬剤をこの組織から除去する条件下でこの組織を超臨界流体と接触させる工程を包含する。
【００１９】
本発明の方法の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。
【００２０】
（本発明および好ましい実施形態の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「接触させる」とは、曝露することおよび一緒にすることを意味する。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「化学薬剤」とは、異種移植片および生体プロテーゼデバイスへの組み込みのために組織を調製するために用いられる薬剤をいう。例示的化学薬剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：タンニング剤、固定剤、架橋剤、アルキル化剤、およびアシル化剤。有用な生物活性化学薬剤の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗血栓剤、抗炎症剤、コルチコステロイド、微小管の重合、構造および機能に影響を与える薬剤、血小板の活性化および凝集および崩壊に影響を与える薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗腫瘍剤、抗酸化剤、反応性酸素に影響を与える薬剤、カルシウムチャネルブロッカー、変換酵素インヒビター、サイトカインインヒビター、増殖因子、増殖因子インヒビター、増殖因子隔離剤、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）、抗微生物剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、免疫抑制因子（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、組織因子インヒビター、平滑筋インヒビター、有機セレン化合物、レチノイン酸、レチノイド化合物、硫酸化プロテオグリカン、ポリアニオン、免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ）、スーパーオキシドジスムターゼ模倣物、ＮＯ、ＮＯ前駆体ならびにこれらの組み合わせ。
【００２２】
上記のクラスに入る生物学的に活性な特定の化学薬剤は、現在好ましい。例えば、この生物活性薬剤のうちの１以上が抗血栓剤である場合、これは好ましくは、ヘパリン、ヒルジンまたはこれらの組み合わせから選択される。この生物活性薬剤のうちの１以上がコルチコステロイドである場合、これは好ましくは、デキサメタゾン、デキサメタゾン誘導体またはこれらの組み合わせから選択される。この生物活性薬剤のうちの１以上が抗微小管剤である場合、これは好ましくは、タキサン、タキサンの誘導体またはこれらの組み合わせから選択される。この生物活性薬剤のうちの１以上が抗血小板剤である場合、この薬剤は好ましくは、コラーゲン合成のインヒビター（例えば、ハロフジノル（ｈａｌｏｆｕｇｉｎｏｒｅ））、ハロフジノルの誘導体、タンパク質（例えば、ＧｐＩＩｂＩＩＩａ、ＲｅｏＰｒｏＴＭ）またはこれらの組み合わせである。
【００２３】
生物学的に活性な化学薬剤の約学的に受容可能な塩もまた、本発明において有用である。例示的な塩としては、例えば、無毒性の無機酸または有機酸から形成されたような、本発明の化合物の従来の無毒性塩が挙げられる。例えば、このような従来の無毒性塩としては、以下が挙げられる：無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）に由来する塩；ならびに有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモイック酸（ｐａｍｏｉｃ）、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、トリフルオロ酢酸など）から調製される塩。
【００２４】
本発明に関連して有用である他の薬剤は、当業者に容易に明らかである。
【００２５】
用語「滅菌」とは、本明細書中で使用される場合、異種移植片または生体プロテーゼデバイスに関連した実質的に全ての生存可能な生物体（特に、微生物、ウイルスおよび他の病原体）を除去または不活化するための、物理的手段または化学的手段のいずれかを用いた作用またはプロセスをいう。本明細書中で使用される場合、「滅菌された」とは、ＦＤＡ（Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ；米国医薬品局）標準によって決定した場合に、１０−６の滅菌保証レベルを達成するデバイスを包含する。
【００２６】
用語「最終滅菌」とは、本明細書中で使用される場合、デバイスがその組立て後に滅菌されるデバイスの製造における最後の工程をいう。
【００２７】
用語「電離放射線」とは、本明細書中で使用される場合、物質（例えば、本明細書中で意図される治療用デバイス）を通しての通過の際に電離を直接的に生じるに充分なエネルギーを有する、粒子または光子をいう。
【００２８】
臨界（ｃｒｉｔｉｃａｌ）流体、超臨界（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ）流体および近臨界（ｎｅａｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ）流体が用いられる（特に、溶媒特性が適用される）産業環境では、用語「臨界」は、超臨界流体、臨界流体および近臨界流体をいうのに用いるのが通常である。本発明は、超臨界流体、臨界流体および近臨界流体を示すために、用語「超臨界」を用いる。
【００２９】
超臨界流体とは、特定の温度および圧力で溶媒密度に関連する溶媒力を示す。超臨界流体の溶媒和特性は、共溶媒およびエントレイナー（ｅｎｔｒａｉｎｅｒ）によって影響される。用語「共溶媒」および「エントレイナー」は、超臨界流体に可溶性であって、添加した超臨界流体に所望の溶解性特性を付与する組成物を示唆するために、交換可能に用いられる。
【００３０】
（緒言）
本発明は、異種移植片および生物体プロテーゼデバイスに組み込むための哺乳動物組織の調製における超臨界流体の使用に関する。超臨界流体は、温和な条件（組織タンパク質を顕著には分解も変性もさせない条件）下で、組織からの感染性因子を除去または不活性化するために用いられる。超臨界流体はまた、組織へ化学薬剤を送達するため、および組織から過剰の化学試薬を除去するためにも使用される。
【００３１】
臨界状態の流体は、その特性が気体の特性と液体の特性との中間であるような温度および圧力の条件下にある物質である。これらはまた、「濃密（ｄｅｎｓｅ）な気体」または「膨張した（ｅｘｐａｎｄｅｄ）液体」とも呼ばれる。所定の化学物質について、温度−圧力ダイアグラム上における、液体および蒸気の二相が１つのみの相を形成する正確な点は、臨界点と呼ばれる。この臨界温度（Ｔｃ）および臨界圧力（Ｐｃ）を超えると、流体は、いわゆる「超臨界」状態にある。
【００３２】
（超臨界流体）
物理化学の分野において、用語「臨界流体」とは、臨界温度以上の温度および臨界圧力以上の圧力にある気体をいう。用語「超臨界流体」とは、臨界温度より高い温度および臨界圧力より高い圧力の気体をいう。超臨界流体は、本願では、時々略語「ＳＣＦ」によって示される。用語「近臨界」は、臨界に近いまたはほぼ臨界という意味で用いられる。臨界圧力および臨界温度またはそれらの付近の超臨界流体は、次の式：
Ｔｒ＝Ｔｏ／Ｔｃ
に従い、ここで、Ｔｒは、絶対換算温度であり；Ｔｏは、絶対作用温度であり；そしてＴｃは、絶対臨界温度である。Ｔｒの好ましい範囲は、０．１〜２．０である。
【００３３】
臨界圧力および臨界温度またはそれらの付近の超臨界流体は、次の式：
Ｐｒ＝Ｐｏ／Ｐｃ
に従い、ここで、Ｐｒは換算圧力であり；Ｐｏは作動圧力であり；そしてＰｃは臨界圧力である。好ましいＰｒは、０．２〜２０．０であって、最も好ましくは０．５〜１０．０である。本明細書中で使用される場合、用語「近臨界」は、０．２〜１．０の換算圧力Ｐｒおよび／または１０．０〜１．０の換算温度Ｔｒを有することを意味する。
【００３４】
近臨界流体の限定しない一例は、臨界温度未満の温度および臨界圧力以上の圧力を有する気体である。このような気体は、特に、溶媒和特性における超臨界または臨界流体の特性に近似し得る特性を有する。
【００３５】
本発明のプロセスの実施に有用な超臨界流体としては、実質的に純粋であるか、または添加剤（例えば、共溶媒）を含むかどちらかの任意の超臨界流体（例えば、エタノール、メタノール、アセトン、およびエチレングリコール）が挙げられる。共溶媒は、特に臨界流体の極性に影響を与え、それによって、その臨界流体がある物質を抽出または送達する能力を増強するために導入され得る。他の有効な添加剤は、感染性因子および化学薬剤のような種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を共沸または溶媒和する役割を果たし、それによって、組織からのこれらの因子の除去を促進する添加剤（例えば、界面活性剤、洗剤、シクロデキストリンなど）である。
【００３６】
本発明に有用な他の超臨界流体は、固定剤、タンニング（ｔａｎｎｉｎｇ）剤、保存剤、生物活性化学薬剤のような化学薬剤が可溶である超臨界流体である。特定の用途について所望の特性を有する任意の超臨界流体が、本発明を実践するのに用いられ得るとはいえ、特定の超臨界流体が、現在好ましい。
【００３７】
好ましい流体は、周囲条件での気体であり、かつ０℃と１００℃との間の臨界温度、最も好ましくは０℃と６０℃との間の臨界温度を有する、流体である。軟組織に用いる場合、軟組織の構造完全性および生物学的活性をより保護するために、６０℃未満の臨界温度を有する流体が好ましい。実際的な問題として、サンプルが凍結するのを回避するため、水系では０℃を超える温度が望ましい。
【００３８】
好ましい超臨界流体は、少なくとも２つの因子に基づいて選択される。この選択された流体は、組織に浸透し得、そして所望の因子を組織から抽出し得るかまたは組織に送達し得る。第２に、この流体は、処理される物質への影響を最小化するように選択されるべきである。現在好ましい超臨界流体としては、例えば、フルオロカーボン、アルカンおよびそれらの混合物からなる群の１つ以上の化合物が挙げられる。好ましいフルオロカーボンとしては、クロロジオルオロメタンおよびトリフルオロメタンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアルカンとしては、エチレン、プロパンおよびエタンからなる群の１つ以上の化合物が挙げられる。まださらに好ましい超臨界流体としては、亜酸化窒素、窒素および二酸化炭素が挙げられる。
【００３９】
以下の考察において、本発明は、哺乳動物軟組織を処理するために超臨界状態の二酸化炭素を用いた例によって例示される。超臨界二酸化炭素の使用に関する焦点は、例示を明確にするためであって、本発明の範囲を規定または制限すると解釈されるべきではない。
【００４０】
（超臨界流体を用いた感染性因子の抽出）
第１局面において、本発明は、哺乳動物軟組織から感染性因子を除去する方法を提供する。この方法は、超臨界流体を含む溶媒を用いた抽出に軟組織を供し、それによってこの組織からこの感染性因子を除去する工程を包含する。
【００４１】
本発明のプロセスを用いて組織から除去される例示的な感染性因子としては、ウイルス、細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、真菌、プリオンおよびそれらの構成成分が挙げられる。本発明は、トガウイルス科（特にアルファウイルス属）のウイルス（例えばＣ型肝炎ウイルス）に対抗するためにおよび組織移植の間のそれらの伝染を防ぐために；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｖｉｒｉｄａｅ）（特にエンテロウイルス属）のウイルス（さらにとりわけＰｏｌｉｏ  Ｓａｂｉｎウイルス）に対抗するためにおよび組織移植の間のそれらの伝染を防ぐために；ヘルペスウイルス科のウイルスに対抗するためにおよび組織移植時のそれらの感染を防ぐために；レトロウイルス科（特にレンチウイルス属、さらにとりわけヒトＨＩＶ免疫不全ウイルス）のウイルスに対抗するためにおよび組織移植時のそれらの感染を防ぐために、適用可能である。特に興味深いのは、組織に関してプリオンの除去のために本発明の方法を使用することである。
【００４２】
本方法を実施する組織としては、生物学的成分を有するプロテーゼデバイスの調製に有効な実質的に任意の哺乳動物軟組織が挙げられる。例えば、１つの実施形態において、この組織は器官に由来する。別の実施形態において、軟組織は、神経組織、腺組織（例えば、リンパ組織）、呼吸器組織、消化器組織、尿路組織、感覚器組織（例えば、角膜、水晶体、など）、および生殖組織から選択される。
【００４３】
現在の好ましい実施形態において、組織は、筋肉組織、脂肪組織、上皮組織および内皮組織から選択される。特に好ましい実施形態において、組織は、心筋組織および脈管組織から選択される。
【００４４】
本発明のこの局面の実施に有用な超臨界流体としては、純粋な超臨界流体および超臨界流体と希釈剤、界面活性剤、洗剤、有機溶媒（例えば、アルコール、ケトン、エステル、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、炭化水素、など）、エントレイナー（例えば、シクロデキストリン、荷電多糖類、ならびに感染性因子または感染性因子を認識して相互作用する組織上の部位に特異的に結合する分子）との混合物が挙げられる。例えば、組織上の感染性因子にとっての結合部位に関して感染性因子と競合する分子を超臨界流体中に含むことは、本発明の範囲内である。
【００４５】
現在の好ましい実施形態において、超臨界流体としては、エタノール、ｎ−プロパノールおよびこれらの組み合わせから選択されるアルコールが挙げられる。他の好ましい実施形態において、超臨界流体は、アセトン、水酸化ナトリウム、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドまたは他のＰＥＧ関連化合物もしくはＰＥＯ関連化合物を含む。
【００４６】
超臨界流体の正確な量、ならびに特定の適用に必要な任意の共溶媒またはエントレイナーの正体および量の決定は、充分に当業者の能力範囲内である。例えば、組織は、超臨界流体で１回以上抽出され、そしてその抽出物質は回収される。抽出によって除去された感染性物質または化学薬剤の量が、決定される。超臨界流体が、組織から感染性因子および／または化学薬剤を除去するのが終わると終点に到達し、これは組織から特定の薬剤を除去するのに必要な超臨界流体の量の指標となる。
【００４７】
例示的な実施形態において、本発明の方法は、超臨界二酸化炭素を使用する。組織は、実質的に任意の量の超臨界二酸化炭素で処理され、このことは、求められた結果を提供する。二酸化炭素の臨界温度である３１℃は低い。従って、二酸化炭素は、約３１℃の温度および約７．３８ＭＰａの圧力で作動しても超臨界状態であり得る。適用された圧力に関連して、約３１℃と約６０℃との間の温度（組織構成成分の変性が最小限である温度）で作業するのが便利である。さらに、二酸化炭素の溶媒能は優秀である。例えば、多くの脂肪酸およびトリグリセリドは、超臨界状態の二酸化炭素に１０％までの溶解度を有することが知られている。
【００４８】
二酸化炭素を利用する好ましい実施形態において、組織は、組織１ｇ当たり約１００ｇ〜約５００ｇの超臨界二酸化炭素で処理される。抽出は、単一の工程として実施される。あるいは、抽出は、連続した工程の一連として実施される。連続した工程の各々の終了時に、抽出された薬剤を含む二酸化炭素は、二酸化炭素の新しいフラクションとを組織を接触させる前に組織から除去されることが好ましい。
【００４９】
別の好ましい実施形態において、組織は、超臨界流体の流動で処理される。この実施形態において、この組織は、好ましくは、組織１ｇ当たり約１００ｇ〜約５００ｇの超臨界二酸化炭素の通過を可能にするために、二酸化炭素の流速の関数として決定される期間にわたって、二酸化炭素で処理される。より好ましくは、組織は、超臨界流体の流動で処理される。この実施形態において、この組織は、好ましくは、組織１ｇ当たり約２００ｇ〜約４００ｇの超臨界二酸化炭素の通過を可能にするために、二酸化炭素の流速の関数として決定される期間にわたって、二酸化炭素で処理される。
【００５０】
本発明の方法は、任意の実行可能な圧力で超臨界流体を用いて実施される。抽出圧力は、流体が超臨界状態で維持されるように選択される。超臨界二酸化炭素を用いた現在好ましい実施形態において、二酸化炭素は、約１×１０７Ｐａと約５×１０７Ｐａとの間の圧力で組織に適用される。別の実施形態において、超臨界二酸化炭素は、約２×１０７Ｐａと約４×１０７Ｐａとの間の圧力で適用される。
【００５１】
超臨界流体の温度は、好ましくは、超臨界流体が組織から汚染因子を効果的に抽出するのを可能にする一方で、組織に対する熱損傷を最小にするために十分に低く維持される。超臨界二酸化炭素を用いた好ましい実施形態において、超臨界流体は、約３０℃と約６０℃の間の温度で適用され、さらに好ましくは、約４０℃〜約５０℃で適用される。
【００５２】
抽出または送達プロセスの完了時に、組織は、好ましくは、無菌的条件下で臨界流体から分離される。好ましい実施形態において、分離を達成するために、混合物は減圧され、それによって、結果として組織から流体が相分離される。その後、組織は無菌条件下で単離される。
【００５３】
（組織添加剤を送達する超臨界流体）
第２の局面において、本発明は化学薬剤で組織を処理する方法を提供する。この方法は、超臨界流体に溶解した化学薬剤に組織を接触させる工程を包含する。前項で議論された超臨界流体の代表的特性および好ましい特性は、本発明の当局面に同様に適用される。
【００５４】
超臨界状態の流体（すなわち、低い動粘性率（気体の動粘性率に近い）、高い拡散係数、非常に低い界面張力および高密度（液体の密度に近い）を有する流体）は、いかなる吸収性の問題もなく組織を通過して容易に拡散する。さらに、このような流体の溶媒力は高く（液体の溶媒力に近く、時には気体の溶媒力の１０８倍まで）、そして圧力の変化によって改変され得る。その結果、このような超臨界の流体は、化学薬剤状態（ｓｔａｔｅ）を容易に溶解し、さらに化学薬剤を組織に効果的に送達するまで完全に組織に浸透する。
【００５５】
超臨界流体は、組織特性を変化させる化学薬剤にとって、高度に貫通性の送達ビヒクルである。超臨界流体中の化学薬剤の送達によって改変される例示的な組織特性としては、免疫原性、強度、含水量、耐久性ならびに感染、血栓形成、インビボおよびインビトロにおける拒絶および分解に対する耐性が挙げられる。超臨界流体によって送達される化学薬剤はまた、組織の表面特性（例えば、疎水性、親水性、電荷、極性、など）の改変にも有効である。送達薬剤として超臨界流体を用いて組織に送達される例示的な化学薬剤としては、組織固定剤、架橋剤、保存剤、薬物（例えば、抗菌、抗ウイルス、抗真菌剤、免疫抑制剤、など）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
例示的な実施形態において、超臨界流体は、化学的な「タンニング剤」を送達する。異種移植材料は、レシピエントへの移植に先立って免疫原性を低下するために、代表的に化学的に「タンニングされる」または「架橋される」。例えば、グルタルアルデヒドは、Ｌａｕｒｅｎ（米国特許第４，７５５，５９３号）に詳細に記載されているように、抗原性を低下させるために、異種移植組織を架橋または「タンニング」するために用いられる。種々の化学的なタンニング手順または「固定化」手順は、膠原性の組織移植片を保護およびその崩壊を阻止するのに利用されている。一般に、このような「固定化」手順は、コラーゲン架橋化試薬中に膠原性の移植片組織を液浸および浸漬させる工程を包含する。化学的架橋化コラーゲンまたは移植片材料の調製についての方法例は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（米国特許第２，９００，６４４号）、Ｓａｗｙｅｒ（米国特許第３，９２７，４２２号）、Ｈａｎｃｏｃｋら（米国特許第３，９６６，４０１号）、Ｄａｒｄｉｋら（米国特許第３，９７４，５２６号）、Ｈｏｌｍｕｎら（米国特許第４，２３９，４９２号）およびＤｅｗａｎｊｅｅ（米国特許第４，５５３，９７４号）に見出される。これらの物質のうちで、生物学的物質の固定化に最も広く用いられている物質は、アルデヒドである。特に、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリオキサールおよび他のアルデヒドが用いられる。これらの化合物は、組織を安定化する結合のネットワークを作製し得る。特に、グルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒドは、その安定化効果について知られている。
【００５７】
脂肪族ジアミン化合物および芳香族ジアミン化合物のような他の薬剤は、組織ポリペプチドのアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基の側鎖カルボキシル基の至るところにさらなる架橋を提供する。グルタルアルデヒドタンニングおよびジアミンタンニングはまた、組織の安定性をも増大させる。ジアミンタンニングは、例えば、アルデヒドによる固定前、固定とともに、または固定後に実施され得る。脂肪族ジアミンおよび芳香族ジアミンの両方が使用され得る。構造的に異なるジアミンおよびアルデヒドの混合物は、結合形成の可能性を高める鎖長の範囲を提供するのに有用である。
【００５８】
組織のタンニングおよび固定化のさらなる薬剤および方法、ならびに特定の用途のために組織に送達される特定の薬剤の同一性および量は、その選択が当業者の能力範囲内であるパラメータである。組織を調製する方法が、組織に化学薬剤を送達するのに超臨界流体を利用する範囲まで、この方法は本発明の範囲内である。
【００５９】
例示的な実施形態において、組織は、超臨界流体（好ましくは二酸化炭素）中に溶解されたグルタルアルデヒドで処理される。組織に取り込まれるグルタルアルデヒドの量は、当業者に認知された方法（例えば、超臨界送達ビヒクル中のグルタルアルデヒド量の減少を決定する方法）によって測定され得る。アルデヒドの存在および濃度を決定する方法ならびにアルデヒドを他の有機化合物から区別する方法は、当業者に周知である。例示的な実施形態において、組織固定は、予定された量のグルタルアルデヒドが組織に取り込まれたとき、または組織がグルタルアルデヒドの取り込みを停止するときに終結される。
【００６０】
（過剰の化学薬剤を抽出するための超臨界流体）
第３の局面において、本発明は、超臨界流体を用いて組織を抽出することによって、組織から過剰の化学薬剤を除去する方法を提供する。本発明に従って、超臨界状態の流体は、その処理のある段階（化学薬剤が組織中に存在する段階）で組織に浸透する。化学薬剤は、超臨界状態の流体中に可溶化され、それによって組織から抽出される。上項で考察された超臨界流体の一般的な特性および好ましい特性は、本発明の本局面にも同様に適用可能である。
【００６１】
化学薬剤（例えば、アルデヒド）を用いた組織の処理は、例えば細胞傷害性、石灰化の誘導、炎症性反応の発生などのような多様な影響を引き起こし得る。事実、多くの著者が、組織石灰化の主要な原因の１つとして、アルデヒド残留物の存在を述べている（例えば、生物学的心臓弁プロテーゼにおいて、このプロテーゼに起因する多くの合併症を引き起こす）。さらに、最初に組織中に存在する脂質は、この石灰化の一因となり得ることが見出されている。
【００６２】
化学薬剤と超臨界抽出溶媒の組み合わせは、当業者の能力範囲内である。例示的な実施形態において、超臨界流体中の薬剤の溶解度は、まず組織の非存在下で決定される。この薬剤が可溶性である超臨界流体が特定されると、組織は、この超臨界流体で抽出される。あるいは、超臨界流体の混合物は、選択されたクラスの化合物の抽出を向上させるために調整され得る。抽出の有効性または終点は、例えば、予定量の超臨界抽出溶出物を収集することによって、決定され、その後、この溶出物は、組織から除去された化学薬剤の含有量について分析される。あるいは、別の例示的な実施形態において、組織中に予定量の化学薬剤（例えば、薬物または他の生物活性薬剤）をそのままにすることが望ましい。この実施形態において、組織は薬剤を充填され、予定量の過剰の薬剤は、超臨界流体抽出によって組織から除去される。
【００６３】
組織から感染性物質が除去されるかまたは組織に化学薬剤が送達される本発明の局面と同様に、組織からの化学薬剤の抽出を促進するために、超臨界流体中に共溶媒およびエントレイナーを含むことは、本発明の範囲内である。
【００６４】
本明細書中に記載された実施例および実施形態は、例示目的としてのみ記述されること、そしてこれらを考慮して、種々の改変または変更（これらは本願の意図および範囲に包含され、そして添付された特許請求の範囲内とみなされる）が当業者に提案されることが理解される。本明細書中に引用された全ての出版物、特許、および特許出願は、これらの全体において全ての目的のために参考として本明細書に援用される。
【国際公開パンフレット】
2005506173.tif 000002
2005506173.tif 000003
2005506173.tif 000004
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2005506173.tif 000024
2005506173.tif 000025
2005506173.tif 000026
2005506173.tif 000027
【国際調査報告】
2005506173.tif 000028
2005506173.tif 000029
2005506173.tif 000030