(57)【要約】本発明は、複合リノール酸を調製する方法に関する。特に、本発明は、穀物から有益な細菌を用いて、複合リノール酸、とりわけそのシス−９、トランス−１１異性体を調製する方法を開示する。本発明は、この方法により調製された産物も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合リノール酸を微生物により調製する方法であって、リノール酸を含む穀物脂肪を加水分解し、加水分解で放出されたリノール酸を複合リノール酸に微生物により異性化することを特徴とする方法。
【請求項２】
穀物がオートムギ、オオムギ、ライムギまたはコムギであることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
穀物がオートムギまたはオートムギフラクションであることを特徴とする、請求項２の方法。
【請求項４】
脂肪加水分解が穀物の酵素活性により生じることを特徴とする、請求項１−３のいずれかの方法。
【請求項５】
脂肪加水分解を外的酵素活性の添加により実施することを特徴とする、請求項１−３のいずれかの方法。
【請求項６】
異性化を有益な細菌により実施することを特徴とする、請求項１−５のいずれかの方法。 
【請求項７】
有益な細菌がプロピオン酸バクテリウムであることを特徴とする、請求項６の方法。
【請求項８】
プロピオン酸バクテリウムが種 Propionibacterium freudenreichii に属する株、好ましくは亜種 Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii または Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii に属する株であることを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項９】
プロピオン酸バクテリウムが Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS, DSM 7067 であることを特徴とする、請求項８の方法。
【請求項１０】
異性化を pH 約 6.5 から 9.5 で実施することを特徴とする、請求項１−９のいずれかの方法。
【請求項１１】
異性化を好ましくは pH 約 7.0 から 9.0、さらに好ましくは pH 約 8.0 から 8.5 で実施することを特徴とする、請求項１０の方法。
【請求項１２】
加水分解および異性化の工程を連続的に実施することを特徴とする、請求項１−１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
加水分解および異性化の工程を平行的に実施することを特徴とする、請求項１−１１のいずれかの方法。
【請求項１４】
複合リノール酸の調製を食品の調製と組み合わして行うことを特徴とする、請求項１−１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
複合リノール酸のシス-9,トランス-11 異性体が主に形成することを特徴とする、請求項１−１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
複合リノール酸を固体に、反応混合物の pH を約 3 から 9、好ましくは 7.0 以下に、最も好ましくは約 4 から 6 に調整することで固定することを特徴とする、請求項１−１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
複合リノール酸を反応物および場合により乾燥物より単離することを特徴とする、請求項１−１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
複合リノール酸、細菌細胞および好ましくはオートムギ材である出発材料として使用された穀物を濃縮し、場合により乾燥することを特徴とする、請求項１−１６のいずれかの方法。
【請求項１９】
リノール酸、細菌細胞および好ましくはオートムギ材である出発材料として使用された穀物を回収し、濃縮し、凍結乾燥することを特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項１−１６のいずれかの方法により得られる産物。
【請求項２１】
複合リノール酸の調製における使用のための穀物。
【請求項２２】
オートムギであることを特徴とする、請求項２１の穀物。
【請求項２３】
リノール酸から複合リノール酸を調製する方法において、穀物をリノール酸源として使用することを特徴とする方法。
【請求項２４】
穀物がオートムギであることを特徴とする、請求項２３の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、複合リノール酸を調製する方法に関する。特に、本発明は、穀物から有益な細菌を用いて、複合リノール酸、とりわけそのシス−９、トランス−１１異性体を調製する方法を開示する。
【０００２】
発明の背景
ＣＬＡは、複合リノール酸の種々の異性体についての包括的用語である。その２つの異性体（シス−９、トランス−１１異性体、すなわちボビン酸、およびトランス−１０、シス−１２異性体）にのみ生物学的活性が認められている。合成的に製造された市販のＣＬＡは、すべての異なるＣＬＡ異性体を一般的に含有し、ｃ９,ｔ１１異性体は４０％に過ぎない。また、肉や乳などの動物性産物がＣＬＡ源として使用し得る。この利点は、それに含有されるＣＬＡがｃ９,ｔ１１異性体を含有し、例えば、乳ＣＬＡがｃ９,ｔ１１−１８：２異性体を８０％含有することである。
【０００３】
いくつかの研究報告によると、動物脂肪は、試験動物において癌を阻止し、成長因子に影響を与え、生体内での脂肪組織の量を調節し得る脂肪酸を含有する。ハンバーガー肉を調べて、Michael Pariza は、複合リノール酸（ＣＬＡ）と検定された脂肪酸が含有されていることを発見した。動物試験でＣＬＡ含有食を摂取した群で、対照群に比して乳癌、胃癌、大腸癌の発生が減少した（Pariza, M.W., Loretz, L.J., Storkson, J.M., Holland, N.C., Mutagens and modulator of mutagenesis in fried ground beef, Cancer Res. (Suppl.), 1983, 43: 2444s-2446s; Pariza, M.W., Hargraves, W.A., A beef-derived mutagenesis modulator inhibits initiation of mouse epidermal tumors by 7, 12-dimethylbenzanthracene, Carcinogenesis, 1985, 1985, 6: 591-593)。ヒト細胞の組織培養においても、ＣＬＡは癌細胞の発育を阻害し得る。ＣＬＡがどのように作用し得るかはまだ不明であるが、ＣＬＡが腫瘍形成の種々の段階、多くの成長因子、肝での癌原性物質の代謝に対して作用を有することが知られている。ＣＬＡが抗酸化物質として作用することも示唆されており（Ip, C., Chin, S.F., Scimeca, J.A., Pariza, M.W., Mammary cancer prevention by congugated dienoic derivatives of linoleic acid, Cancer Res., 1991, 51: 6118-6124)、この場合この化合物が遊離基の有害作用から細胞膜を保護するのであろう。この化合物のコレステロール低下作用も調べられ、この物がコレステロール低下剤のように良性の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の量を下げないことが分かっている（Lee, K.N., Kritchevsky, D., Pariza, M.W., Conjugated linoleic acid and atherosclerosis in rabbits, Atherosclerosis, 1994, 108: 19-25)。ＣＬＡは、脂肪組織を分割することがわかっているので、減量剤にも好適であり得る（Park et al., Changes in Body Composition in Mice during Feeding and Withdrawal of Conjugated Linoleic acid, Lipids, 1999, 34: 243-248)。
【０００４】
他方、非複合リノール酸は、有害作用、例えば、乳癌に対する促進作用を有することが報告されている。非複合リノール酸の抗微生物作用も一般に知られている。
【０００５】
ＣＬＡを化学的または酵素的異性化によりつくることができる。天然のＣＬＡは、例えば反芻動物の第一胃においてポリ不飽和脂肪酸から細菌 Butyrivibrio fibrisolvens の生物活性の結果として形成され、それから乳汁および肉に分泌される。乳汁および肉はＣＬＡの最上の供給源である。
【０００６】
食物から摂取されるＣＬＡの量が過去十年間でかなり減少していることがわかっている。食物分析からの計算によると１９７０年代で平均的食事は１日につき約０.４５ｇのＣＬＡを含有していた。ミルクおよび乳製品の使用の減少により、平均のＣＬＡ１日摂取量が現在では０.２５ｇとなった。食物中の天然ＣＬＡを増加せしめることが健康上の観点から非常に重要である。研究者によると、ＣＬＡ摂取を倍にすると癌の危険性を減じることができよう。
【０００７】
ＣＬＡ源としての食物、特に、ミルクの重要性について、いくつかの研究が発表されている。例えば、フインランドの疫学的調査（Knekt et al.、口頭発表）によると、ミルクの使用が乳癌の危険性を減少した。現在、乳脂肪中のＣＬＡ濃度は餌の質にかなり依存して季節的に変動する（２.４〜２８.１ｍｇ／ｇ脂肪)。
【０００８】
腸管中の有益な微生物がＣＬＡをつくることがわかっている。特に第一胃において生じる細菌 Butyrivibrio fibrisolvens およびそのイソメラーゼ酵素について研究されている。しかし、この細菌は嫌気性であるので、工業的規模でＣＬＡをつくり得ない。この株が必要とする完全な嫌気性状態を得るのは困難であり、経済的でないからである（米国特許５,８５６,１４９、Pariza et al.)。
【０００９】
Propionibacterium acnes もＣＬＡをつくることが知られている。しかし、この病原性株は、つくられたＣＬＡをさらに他の脂肪酸に還元するレダクターゼ酵素をも産生する（Verhulst et al., System. Appln. Microbiol., 9: 12-15 (1987))。
【００１０】
いくつかのプロピオン酸バクテリウムがリノール酸をその複合シス−９、トランス−１１の形態に転換し得ることも一般に知られている。さらに、遊離リノール酸のＣＬＡへの転換はトリグリセリド脂肪酸の転換よりも効率的であることが一般に知られている。しかし、遊離のリノール酸はプロピオン酸バクテリウムの成長に対する阻害作用を比較的低濃度で有し、この作用が複合リノール酸、特にそのシス−９、トランス−１１形態の大規模な産生を妨げる。
【００１１】
米国特許５,８５６,１４９（Pariza および Yang) は、非複合で不飽和（９および１２位での二重結合）脂肪酸の Lactobacillus reuterii 株、特に L. reuterii PYR8 株による転換によりシス−９、トランス−１１脂肪酸をつくる方法を開示している。この開示では、ＣＬＡ産生株の単離について記載され、４５の単離株のうち僅か４株が所望のリノール酸イソメラーゼ活性を有し、リノール酸からＣＬＡをつくり得る。この開示は、リノール酸の細菌成長に対する阻害作用について言及しておらず、また、この問題を解消する解決法を提起していない。
【００１２】
文献（J., Jiang, L. Bjoerck, R. Fonden: Production of conjugated linoleic acid by dairy starter cultures, J. Appl. Nicrobiol., 85 (1998), pp. 95-102) によると、プロピオン酸バクテリウムはリノール酸をＣＬＡに転換できる。生育培地に加えられたリノール酸をＣＬＡに転換する１９種の異なる出発物細菌の能力が調べられ、成熟チーズが他の乳製品よりも高いレベルのＣＬＡを含有することが認められた。lactobacillus ７株、lactococcus ４株、streptococcus ２株、プロピオン酸バクテリウム６株についてリノール酸からＣＬＡをＭＲＳ、ミルク、乳酸ナトリウム培地においてつくる能力が調べられた。さらに、異なるリノール酸濃度についてリノール酸をＭＲＳ肉汁に Tween 80 界面活性剤水溶液中で加えて調べられた。試験された細菌のうち、いくつかのプロピオン酸バクテリウムのみが生物的転換活性を有した。６株種のうち３種、すなわち Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii PFF および PFF6、 P. freudenreichii ssp. shermanii PFS が活性を示した。元のリノール酸濃度７５０μｇ／ｍｌから高収率２６５μｇ／ｍｌのＣＬＡが PFF6 株で得られた。つくられたＣＬＡのうち、７０ないし９０％が生物学的に活性のｃ９,ｔ１１異性体であった。lactobacillus、lactococcus、streptococcus はいずれもＣＬＡを産生しなかった。
【００１３】
このように、Jiang et al. に記載の方法では、最良のプロピオン酸バクテリウム、PFF6 株が、加えられたリノール酸のわずか３５％をＣＬＡに転換できる。この研究者によると、プロピオン酸バクテリウムのＣＬＡ産生はその遊離リノール酸に対する耐性に正相関する。従って、この研究は、リノール酸が細菌の成長を阻害する抗微生物作用を有するとの一般的に知られる事実を確認した。この開示は、抗微生物性脂肪酸の作用は洗剤などの界面活性剤、例えば Tween 80 やタンパク質を用いることにより低下することがあると述べている。しかし、この面での研究はなされておらず、この開示は可能性ある有用な技法について述べていない。
【００１４】
ＷＯ９９／２９８８６（J. Jiang, L. Bjoerck, R. Fonden) は、上記の文献の研究結果に部分的に基づいている。その適用は、インビトロでＣＬＡをつくるために食材で有用な具体的な細菌を利用することに関している。Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii および P. freudenreichii ssp. shermanii に加えて、適当な細菌として Bafidobacterium breve が記載されている。この開示によると、発酵を乳化剤の存在で実施できる。例として Tween 80 およびレシチンがある。しかし、乳化剤の使用はこの開示の実施例に記載されていない。得られる最良の結果は上記開示と同じであると報告されている。すなわち、２４６.４μｇ／ｍｌの生物活性ｃ９,ｔ１１異性体が元のリノール酸濃度７５０μｇ／ｍｌから、株 PFF6 を用いて得られた。収率は３３％以下であった。
【００１５】
フィンランド特許８８８５６は、生きている微生物を含有し、オートムギ殻を主に基としている発酵食品を調製する方法を記載している。オートムギ殻をそのまま、または熱処理後に、発酵させるもので、微生物として、乳酸菌、特に Lactobacillus acidophilus を用いる。この公表の発明の目的は、新種の食品におけるオートムギ繊維の高濃度を利用することである。例として、ヨーグルト型おつまみがある。この公表は、リノール酸およびそれからつくられる複合リノール酸についてなにも記載していない。
【００１６】
したがって、改善された収率でもって複合リノール酸を産生する方法が提供されることは、明らかに必要性がある。遊離リノール酸の最大可能量をＣＬＡの出発物質として利用しようとするときに、基本的なことは、遊離リノール酸の抗微生物作用に関連する問題をいかにして小さくまたは無くし得るかである。新しい粗材料をＣＬＡ生産に使用し得る方法も非常に歓迎されるところである。
【００１７】
本発明の要旨
本発明は、リノール酸源として穀物の利用に基づく。様々な穀物種のうち、オートムギがリノール酸の好ましい源とみられる。
【００１８】
本発明は、リノール酸から複合リノール酸（ＣＬＡ）を調製する方法、リノール酸源としてリノール酸を含有する穀物を用いる方法に関する。
【００１９】
本発明は、好ましくは２工程を含む。穀物油脂を加水分解して、それからリノール酸を放出せしめる工程と、放出されたリノール酸を複合リノール酸に微生物によって異性化する工程である。
【００２０】
本発明は、複合リノール酸の調製における穀物の使用にも関する。
【００２１】
本発明は、さらに本発明方法により調製される産物、およびそのままの使用または機能性物質の調製における使用に関する。
【００２２】
発明の詳細な記述
複合リノール酸を微生物の手段によって調製するための本発明方法は、リノール酸を含有する穀物油脂を加水分解して、加水分解により放出されたリノール酸を複合リノール酸に微生物によって異性化することを特徴とする。
【００２３】
本発明は、リノール酸源としての穀物の使用に基づく。本発明に従って、リノール酸が穀物から脂肪の加水分解反応により放出される。本発明において驚くべきことに、穀物材料をリノール酸源として本明細書で記載のように用いるとき、リノール酸は異性化反応を阻害しない。穀物、特にオートムギを出発物質として使用するとき、確実に、リノール酸は、異性化の全期間中微生物に対して、その機能を阻害することなく、使用できる。
【００２４】
材料源として使用される穀物は、リノール酸を含有するいかなる穀物でもあり得、食品の出発材料として使用に適する。オートムギ、オオムギ、ライムギ、コムギおよびそれらからつくられる麦芽を例として挙げ得る。適当な粗材料には、未処理および処理済みの穀粒およびそれからつくられるフラクションがある。
【００２５】
本発明において、オートムギが最も好ましい出発材料である。オートムギのリノール酸含量は乾燥固体の約２〜４％であり、リノール酸の大部分はジグリセリドおよびトリグリセリドに結合している。オートムギはジグリセリドおよびトリグリセリドを遊離の脂肪酸塩に分解するリパーゼ酵素も含有する。本発明の目的からして、オートムギが、その高リノール酸含量および天然のリパーゼ活性からして有利な粗材料である。
【００２６】
穀類、特にオートムギの天然リパーゼ活性を脂肪の加水分解反応において利用できる。反応において必要とされる酵素活性は外部から加えることもできる。ＣＬＡ収量を、オートムギの場合および特に他の穀類の場合に、必要に応じてリパーゼ酵素を反応に加えることで改善できる。
【００２７】
オートムギ脂肪または他の穀類脂肪の酵素的加水分解を前処理でも容易にできる。ひとつの好都合の前処理方法は、麦芽生成であって、穀類中にリパーゼ活性をつくるのに使用できる。他の適当な前処理に、圧搾、粉砕、粉末化、適当な溶媒中、特に水などの液体媒体中での溶解がある。
【００２８】
オートムギの脂肪分解は、例えば、オートムギ粒を圧搾し、圧搾されたオートムギに水を加えると始まる。脂肪分解中に形成した遊離のリノール酸がオートムギの他の成分と部分的に結合しており、この成分は異性化反応に利用されるリノール酸の量を減少せしめることになるので、避けるべきである。
【００２９】
適当な反応条件の選択により問題を少なく、さらには無くすることもできる。条件の選択において、オートムギ材料の特徴的なｐＨ低下を、リノール酸異性化工程中ｐＨを十分高レベルに保って、防止することが最も肝要である。例えば、適当なｐＨは６．５〜９である。好ましくは、ｐＨを約７．０〜約９．０のレベル、さらに好ましくは約８．０〜約８．５に調整する。このｐＨ調整は、リノール酸がオートムギ材料に結合するのを防ぎ、異性化反応に好都合な作用をもたらす。重要なのは、異性化混合物におけるｐＨ低下が起きるのはオートムギ材料自体により、発酵によるものでないことである。すなわち、異性化反応は通常の発酵、すなわち酸性化を要しないで、バイオ転換を含む。異性化反応において形成されるＣＬＡの大部分はシス−９，トランス−１１異性体である。
【００３０】
本発明に従って（オートムギから）放出されたリノール酸をＣＬＡ生産に使用する。異性化反応を、例えば、化学的に、酵素的に、または微生物学的に実施できる。リノール酸のＣＬＡへの転換は微生物学的に実施するのが好ましい。バイオ転換において、リノール酸をＣＬＡに転換し得る能力を持ついかなる細菌も使用でき、例えば、背景技術で記載した細菌である。しかし、適用する材料に適した有益な細菌、特にプロピオン酸バクテリウムの手段で実施するのが好ましい。例えば、種 Propionibacterium freudenreichii に属する株ならびに特に亜種 P.freudenreichii ssp. freudenreichii および P. freudenreichii ssp. shermanii に属する株が適当である。
【００３１】
異性化は、それ自体既知の方法で実施する。異性化の成分および条件を、最適のＣＬＡ収量が得られるように、使用する株の必要条件に従って選択する。本発明の公開後は、適切な反応パラメーターの選択が当業者のノウハウの部分となろう。
【００３２】
脂肪加水分解と異性化の工程は、別個の容器または同じ容器で並行的すなわち同時に、または連続的に実施できる。１つの容器における工程の同時的実施が、方法の容易さからして好都合とみられる。
【００３３】
特に好ましい実施態様において、有益な細菌、好ましくはプロピオン酸バクテリウムを粉砕されたオートムギに加えると、脂肪分解において放出されたリノール酸が有益な細菌と直接反応し、この細菌がリノール酸を複合リノール酸に異性化する。脂肪分解および異性化反応に適したプロセス条件を調節することにより、混合物中にかなりの量のＣＬＡを得ることができる。水などの適当な媒質、特に液体媒質を用いて、混合を容易にできる。本発明において、例えば、媒質として水を用いると、オートムギ混合物の乾燥固体含量は５％である。その場合、オートムギ乾燥固体の約１％およびオートムギ脂肪の約１０％のＣＬＡ形成を得ることができる。
【００３４】
穀物の性質と触媒として異性化し得る細菌の使用とを異性化反応において組み合わせて、ＣＬＡ産生に関連する２つの大きい問題を回避できる。すなわち、リノール酸の毒性とその低い水溶性の問題である。ＣＬＡ生産株の能力を、好ましくは、リノール酸およびリパーゼを含有し、ＣＬＡ生産のために他の添加なしに粉砕された形態でリノール酸を提供する材料と組み合わす。穀物中でそのような材料はオートムギである。コムギなどのリパーゼ活性のない材料を用いるときは、外部からのリパーゼ活性を加えるか、または麦芽形成時に形成せしめる。本発明によると、外的リノール酸または他の有害な添加物を「溶解する」のに必要な洗剤の使用を回避できる。
【００３５】
本発明により調製されたＣＬＡ含有 (オートムギ) 細菌混合物をそのままで使用できる。これを食品および類似の機能性産物の調製に加えて使用できる。そして、それから種々のＣＬＡ含有フラクションを単離できる。ＣＬＡ形成は食品の調製と同時的にも生じ得る。 異なる産物をつくるときに、ＣＬＡ、有益な細菌および／またはオートムギなどの穀粒を所望の方法で産物に利用できる。
【００３６】
異性化混合物から複合リノール酸を単離する実施態様が好ましい実施態様である。複合リノール酸と細菌の両方の機能的効果を利用しようとするとき、これらを一緒に回収し、濃縮し、そして場合により乾燥または凍結乾燥できる。水を媒質として使用するとき、ＣＬＡを (オートムギ) 細菌性固体に、ｐＨの低下により結合できる。本発明において、複合リノール酸を固体に、反応混合物のｐＨを約３〜９、好ましくは７．０以下、最も好ましくは約４〜６に調整することで、結合できる。
【００３７】
本明細書において、用語、食品は広い意味で使用しており、固体、ゲル状または液体の形態にあり得るすべての飲食できる産物を含み、また、インスタント産物および本発明の産物が消費に際して添加物としてまたは産物の構成成分として加えられる産物を含む。例えば、食品は、酪農業、肉処理業、食物処理業、飲料業、製パン業、製菓業および飼料業の産物であり得る。この産物には、ミルクおよび乳製品、例えば、ヨーグルト、凝固乳、凝乳チーズ、サワー乳、バターミルクなどの発酵乳飲料、未成熟チーズ、成熟チーズ、おつまみの具など、飲料、例えば、ホエー飲料、果汁飲料、ビール、スープなどがある。食品業の産物は他の重要な群を形成する。
【００３８】
好ましい適用には、ＣＬＡおよびオートムギ含有のプロピオン酸バクテリウムカプセルおよび粉末などの凍結乾燥産物ならびにプロピオン酸バクテリウムの活性によってＣＬＡ含量が増加している産物がある。ＣＬＡとオートムギ成分、例えばβ−グルカンの両方を含む産物、すなわち両成分の機能的効果を発現する産物が特に好ましい。本発明の重要な別の利点は、複合リノール酸がオートムギ産物中に形成され、オートムギの栄養価が増加され得ることである。
【００３９】
本発明は、さらに詳細に下記の実施例を用いて説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、いかなる場合も本発明の範囲を制限するものではない。
【００４０】
参考実施例１
発酵オートムギふすまに基づく産物のＣＬＡ濃度
スエーデン特許８８８５６に記載の発酵産物の脂肪酸含量ならびにオレイン酸、リノール酸およびＣＬＡの濃度を下記のように測定した。Bioferme Oy, Finland による製造の市販品、Yosa ワイルドベリーおよび Yosa プラムからサンプルを取り、それから脂肪を直接的サポニン化およびジエチルエーテルヘキセン抽出で単離した。脂肪酸のメチルエステルを硫酸による触媒方法で調製した。表Ａは、サンプルの脂肪酸含量を脂肪酸の全量について％で示す。表Ｂは、オレイン酸、リノール酸およびＣＬＡ (c-9,t-11) の濃度をサンプルの mg/g として示す。Yosa プラムおよび Yosa ワイルドベリーはＣＬＡをほとんど含有していなかった。非常に少量のＣＬＡが分析法によっては得られることがある。これは、ガスクロマトグラフィーの際にＣＬＡの近くに溶出するリノール酸異性体(Cl8:3) かもしれない。
【００４１】
【表１】
2005520549.tif 000002
【００４２】
【表２】
2005520549.tif 000003
【００４３】
実施例１
プロピオン酸バクテリウムによるオートムギ／水混合物におけるＣＬＡの産生
本発明方法の効果を検定するために、オートムギ／水混合物に異性化触媒としてプロピオン酸バクテリウム細胞を加えて、試験した。未処理のオートムギ(variety Lisbeth) を挽き、０.５ｍｍのスクリーンを通してオートムギ食をつくった。５％水混合物 (w/v) をオートムギ食からつくり、この混合物を Ultra Turrax 機で２分間ホモゲナイズした。
【００４４】
２種のプロピオン酸バクテリウム株を試験で使用した。すなわち、Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii JS (PJS) および Propionibacte-rium freudenreichii subsp. freudenreichii 131 (P131)。
【００４５】
試験用のＰＳＪ細胞の培養を Rainio, A.,Vahvaselka, M., Suomalainen, T. ja Laakso, S., Reduction of linoleic acid inhibition in production of conjugated linoleic acid by Propionibac-terium freudenreichii ssp. shermanii, Can. J.Microbiol. 47 (2001), 735-740 に記載のように実施した。Ｐ１３１株をＭＲＳ液 (LabM) 中で培養した。細胞を遠心分離し (6000 rpm, 20 分間)、単離し、少量のペプトン塩溶液で溶出した。この溶液は 0.1% 微生物的ペプトン (LabM) および 0.85% の NaCl を含有する。細胞懸濁液をオートムギ／水混合物 (約 100 ml) に加え、細胞濃度約 1 x1010 cfu/ml を得た。混合物の pH を 7.0 に 1 M NaOH 溶液で調整し、加水分解および異性化反応を25 ℃で生じせしめた。最初の 17 時間、オートムギ／水混合物を pH 調整なしに加水分解せしめると、pH が約 4.8 に低下する。その後、混合物の pH を 8.0 に NaOH 液で上げ、この調整を約 1.5 から 2 時間ごとに約８時間繰り返した。混合物の pH を約 7.5 から 8.0 に保持した。その後、異性化を pH 調整なしに、全時間が約 40 時間になるまで続けた。
【００４６】
比較のために、オートムギ／水混合物に PJS または P131 細胞懸濁液の代わりに相当量のペプトン塩溶液を加えて、試験した。最初の 17 時間で混合物の pH が約 5.4 に低下した。その後、pH を上記の試験のように調整した。
【００４７】
試験において、オートムギの天然リパーゼ酵素の活性の結果としてのリノール酸の放出およびこの遊離リノール酸の微生物細胞によるＣＬＡへの異性化は下記の通りである。サンプル 0.5 ml をオートムギ／水混合物から取り、脂肪酸分析の前に冷乾燥した。異なる脂肪酸の量をサンプルからガスクロマトグラフィーで測定した。脂肪酸の分析は、Suutari M., Liukkonen, K. and Laakso, S., Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty acids, J. Gen. Microbiol. 136 (1990), 1469-1474 に記載のように実施した。サンプル中に含まれる脂肪酸は、その停留時間を既知の脂肪酸標準の停留時間と比較することで同定した。複合リノール酸は、Sigma の製剤を用いて同定した。この製剤は cis およびトランス-9,11 ならびにシスおよびトランス-10,12 ＣＬＡ異性体の混合物である。C17:0 脂肪酸のメチルエステル (ヘプタデカン酸メチルエステル、Sigma) を脂肪酸の定量における内部標準として用いた。
【００４８】
冷乾燥したサンプル 1.5 ml をオートムギ／水混合物から脂肪酸の脂質類の分析のために取得した。脂質類の分析は、Liukkonen, K. H.,Montfoort, A. and Laakso, S., Water-induced lipid changes in oat processing, J. Agric. Food Chem. 40 (1992) 126-130 に記載のように実施した。
【００４９】
形成したリノール酸およびＣＬＡの量を固体サンプルごとの反応時間の関数として計算した。この試験は、オートムギ／水混合物においてプロピオン酸バクテリウム (PAB) の存在および不存在の両方で行った。結果を表１に示す。
【００５０】
【表３】
2005520549.tif 000004
【００５１】
ＣＬＡの形成は、オートムギ／水混合物における異性化触媒としてのプロピオン酸バクテリウムの機能を必要とする。PJS 株を用いたとき、かなりの量のＣＬＡが形成し、7.6 mg/g 乾燥固体であった。この量はオートムギに含まれる脂肪の 7.3% であった。
【００５２】
表２は、オートムギ／水混合物を PJS 細菌ともにインキュベートしたとき、リノール酸およびＣＬＡについての種々の脂質類への分布を示す。PL = 極性脂質、TG = トリグリセリド、DG = ジグリセリド、FFA = 遊離脂肪酸。
【００５３】
【表４】
2005520549.tif 000005
【００５４】
結果では、試験の開始時にリノール酸の大部分がトリグリセリドと結合し、その僅か 4% が遊離の脂肪酸の形態にあった。しかし、17 時間の加水分解後には、トリグリセリドからほぼ 40% のリノール酸が放出されていた。形成されるＣＬＡは大部分 (約 90%) が遊離脂肪酸の形態にあった。形成されたＣＬＡの少なくとも 80% がシス-9,トランス-11 異性体であった。
【００５５】
生きているプロピオン酸バクテリウム細胞の測定に、0.5% トリプトン (LabM)、1% 酵母抽出物質 (LabM)、16.8ml/l の 50% 乳酸ナトリウム (Merck)、1% グリセロリン酸ジナトリウム (Merck) および 1.5% 寒天 (LabM) を含有する緩衝乳酸ナトリウム寒天を用いた。プレートを嫌気的に 30 ℃で 6 日間インキュベートした。試験の開始時に PJS 濃度は 9.0 x109 cfu/ml であり、20 時間後で 7.5 x109 cfu/ml であった。この結果に基づくと、プロピオン酸バクテリウム細胞はオートムギ／水混合物において反応中増殖しなかった。
【００５６】
オートムギ／水混合物の pH は、混合物にプロピオン酸バクテリウムを加えようが、加えなかろうが、低下する傾向にある。pH 低下の原因はオートムギの酸成分の水中への溶解である。この方法は細胞がオートムギを発酵せしめ得ることを要しないで、形成された有機酸が pH を低下せしめるのであろう。
【００５７】
実施例２
プロピオン酸バクテリウムによる他の穀物種からのＣＬＡの産生
オートムギの代わりにオオムギおよびライムギを用いて、実施例１を繰り返した。プロピオン酸バクテリウムとして Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii JS (PJS) を用いた。結果に基づくと、オオムギまたはライムギの水混合物におけるＣＬＡ産生はオートムギ/水混合物の場合よりもかなり低かった; pH を 8.0 に 17 から 25 時間の間で調整した 41 時間のインキュベーションで、ＣＬＡ/g 乾燥固体がオオムギの場合 0.91 mg、ライムギの場合 0.83 mg であった。この低い結果は、これらの穀物材のリノール酸濃度がオートムギの場合よりも低い事実から部分的に説明できる。さらに、これらのものは発芽なしにリパーゼ活性を含まないことが知られている。しかし、結果に基づくと、本発明のプロセスが他の穀物材にも機能することは明らかである。遊離リノール酸の形成を、外部からのリパーゼ活性を反応混合物に加えることで、高め得る。その場合、プロセス収量を上記に値よりも有意に改善し得る。
【００５８】
実施例３
ＣＬＡ形成に対するｐＨの効果
オートムギ/水混合物の pH のＣＬＡ形成に対する効果を下記の試験で解析した：
- pH をまったく調整しない
- pH を 8.0 に 0 から 8 時間の間、調整する (このように、試験は単離の脂肪加水分解工程を含まない) 
- pH を 7.0 に 17 から 25 時間の間、調整する
- pH を 8.0 に 17 から 25 時間の間、調整する
- pH を 8.5 に 17 から 25 時間の間、調整する
- pH を 9.0 に 17 から 25 時間の間、調整する。
【００５９】
すべての上記の試験において、PJS 細菌株を、実施例１に記載のようなオートムギ/水混合物に加えた。他の試験の調節も同じである。
【００６０】
さらに、試験は、オートムギ/水混合物の pH を 8.5 に全異性化工程中 (17 から 41 時間)保持している発酵機中で NaOH 液の自動添加により行った。それに先立つ 17 時間の脂肪分解において、pH が 4.7 に低下した。オートムギ/水混合物の量は 1.5 リットル、温度は 25 ℃、混合速度は 100 rpm であった。生 PJS 細胞の濃度は、試験開始時で 1.1 x 1010 cfu/ml 、試験終了時で 8.4 x 109 cfu/ml であった。
【００６１】
結果を表３に示す。結果によると、ＣＬＡ形成は、リパーゼ酵素がリノール酸を放出した後にオートムギ/水混合物の pH を 8.0 〜 8.5 に調整すると、効果的である。これは異性化反応の pH よりも低い pH で最上に進行した。最も速いかつ大きいＣＬＡ形成を、オートムギ/水混合物の pH を 8.5 に全異性化工程中継続的に調整すると、達成した。このことは、異性化に適した pH レベルでもプロセスについての重要性を反映する。
【００６２】
【表５】
2005520549.tif 000006
【００６３】
実施例４
ｐＨ低下によりオートムギ乾燥固体中に産生されたＣＬＡの濃度
オートムギ/水混合物におけるＣＬＡ産生を、実施例１に従い PJS 細胞を用いて行った。その後、オートムギ/水混合物の pH を 8.0 に NaOH 液で、または 4.5 に HCl 液で調整した。混合物を遠心分離し、ＣＬＡ濃度を上澄み液およびオートムギ細菌マスから測定した。ＣＬＡ分布は下記の通りであった。pH 8.0 でＣＬＡの 85% が固体中に、15% が液体中に、pH 4.5 でＣＬＡの 100% が固体中にあった。この結果は、pH 低下を利用して、ＣＬＡをオートムギおよび細菌細胞により形成された固体中に集中的につくることができ、ＣＬＡを媒質とともに除去しない方法を提供する。
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月1日(2004.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複合リノール酸を微生物により調製する方法であって、オートムギ脂肪を加水分解し、加水分解で放出されたリノール酸を複合リノール酸に微生物により異性化することを特徴とする方法。
【請求項２】
穀物が非処置オートムギ、前処置オートムギまたはオートムギフラクションであることを特徴とする、請求項１の方法。
【請求項３】
脂肪加水分解がオートムギの酵素活性により生じることを特徴とする、請求項１または２の方法。
【請求項４】
脂肪加水分解を外的酵素活性の添加により実施することを特徴とする、請求項１または２の方法。
【請求項５】
異性化を有益な細菌により実施することを特徴とする、請求項１−４のいずれかの方法。 
【請求項６】
有益な細菌がプロピオン酸バクテリウムであることを特徴とする、請求項５の方法。
【請求項７】
プロピオン酸バクテリウムが種 Propionibacterium freudenreichii に属する株、好ましくは亜種 Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii または Propionibacterium freudenreichii ssp.shermanii に属する株であることを特徴とする、請求項６の方法。
【請求項８】
プロピオン酸バクテリウムが Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS, DSM 7067 であることを特徴とする、請求項７の方法。
【請求項９】
異性化を pH 約 6.5 から 9.5 で実施することを特徴とする、請求項１−８のいずれかの方法。
【請求項１０】
異性化を好ましくは pH 約 7.0 から 9.0、さらに好ましくは pH 約 8.0 から 8.5 で実施することを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１１】
加水分解および異性化の工程を連続的に実施することを特徴とする、請求項１−１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
加水分解および異性化の工程を平行的に実施することを特徴とする、請求項１−１０のいずれかの方法。
【請求項１３】
複合リノール酸の調製を食品の調製と組み合わして行うことを特徴とする、請求項１−１２のいずれかの方法。
【請求項１４】
複合リノール酸のシス-9,トランス-11 異性体が主に形成することを特徴とする、請求項１−１３のいずれかの方法。
【請求項１５】
複合リノール酸を固体に、反応混合物の pH を約 3 から 9 に、好ましくは 7.0 以下に、最も好ましくは約 4 から 6 に調整することで固定することを特徴とする、請求項１−１４のいずれかの方法。
【請求項１６】
複合リノール酸を反応物および場合により乾燥物より単離することを特徴とする、請求項１−１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
複合リノール酸、細菌細胞および出発材料として使用されたオートムギを濃縮し、場合により乾燥することを特徴とする、請求項１−１５のいずれかの方法。
【請求項１８】
リノール酸、細菌細胞および出発材料として使用されたオートムギを回収し、濃縮し、凍結乾燥することを特徴とする、請求項１７の方法。
【請求項１９】
複合リノール酸の調製における使用のためのオートムギ。
【請求項２０】
リノール酸から複合リノール酸を調製する方法において、オートムギをリノール酸源として使用することを特徴とする方法。
【国際調査報告】
2005520549.tif 000007
2005520549.tif 000008
2005520549.tif 000009