(57)【要約】本発明は、仮説を用いない様式で、種の表現型に関連するゲノム全域での配列変化を決定するための方法を提供する。本発明の方法では、表現型を有する個体の部分集団のそれぞれについて１組の制限フラグメントが、１つ以上の異なる制限酵素を使用して個体由来の核酸を消化することによって作製される。個体について１組の制限配列タグが、その後、そのような１組の制限フラグメントから決定される。生物の部分集団についての制限配列タグが比較され、相同的な配列を含む制限配列タグをそれぞれの群が含む１つ以上の群にグループ分けされる。得られた１つ以上の制限配列タグ群により、表現型に関連する配列変化が同定される。本発明の方法は、例えば、微妙な遺伝的危険因子を同定するために、多くの患者サンプルにおいて非常に多数の配列変化体を分析するために使用することができる。
2005518811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の個々の生物の表現型に関連するゲノム全域での配列変化を決定するための方法であって、
Ｉ）下記のＡ）およびＢ）を含む方法によって、前記１つ以上の個々の生物のそれぞれの個々の生物について１組の制限配列タグを作製すること
Ａ）１組の制限フラグメントを生じさせるために１つ以上の第１の制限酵素を使用して、それぞれの前記個々の生物由来の核酸を消化すること；および
Ｂ）それぞれの前記個々の生物について１組の制限配列タグを決定すること、ここで、前記１組の制限配列タグは前記制限フラグメントのそれぞれについて１つ以上の制限配列タグを含み、それぞれの前記１つ以上の制限配列タグは、対応する制限フラグメントにおけるある配列を含む；および
ＩＩ）前記１つ以上の個々の生物に対する制限配列タグを、相同的である制限配列タグをそれぞれの群が含む１つ以上の制限配列タグ群にグループ分けすること
を含み、
前記１つ以上の制限配列タグ群により前記生物に関連する配列変化が同定される、方法。
【請求項２】
前記１組の制限配列タグを決定する前記工程が、
Ｂ１）前記１組の制限フラグメントにおける前記制限フラグメントを第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の環状核酸フラグメントを得ること、ここで、前記第１の操作された核酸は第２の制限酵素の１つ以上の認識部位を含む所定のヌクレオチド配列を含み、前記認識部位は前記第２の制限酵素が前記制限フラグメント内を切断するように配置され、かつ配向している；
Ｂ２）前記第１の環状核酸フラグメントを前記第２の制限酵素で消化すること；
Ｂ３）前記第２の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にすること；
Ｂ４）前記第２の制限酵素により生じた前記末端を連結して、１組の第２の環状核酸フラグメントを作製すること；および
Ｂ５）前記第２の環状核酸における前記制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、前記１組の制限配列タグを決定すること
を含む方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
それぞれの前記１つ以上の認識部位が前記第１の操作された核酸の末端の近くに配置される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の認識部位のそれぞれが前記第１の操作された核酸の末端から２５ヌクレオチド未満離れて配置される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の認識部位のそれぞれが前記第１の操作された核酸の末端から０〜５ヌクレオチド離れて配置される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の制限酵素がＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程Ｂ５）の前に、固体表面上で前記第２の環状核酸フラグメントに含まれる核酸フラグメントを固定および増幅する工程を更に含む、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
固定および増幅する前記工程が、前記固体表面上で前記第２の環状核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントのコロニーを生じさせることによって行われ、ここで、前記コロニーのそれぞれが、前記第２の環状核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントの１つを含む複数の固定化された一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）５’末端で固体表面に固定化された複数のコロニープライマーを含む固体表面を提供すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントを変性させて、一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｖ）前記一本鎖フラグメントを前記固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；および
ｖｉｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｖ）〜工程ｖｉｉ）を繰り返すこと
を含む方法によって生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）前記線状化されたフラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは、前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された線状化フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）前記固定化された線状化フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせて、アニーリングされた一本鎖フラグメントを得ること；
ｖｉ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；および
ｉｘ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｖ）〜工程ｖｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）前記線状化されたフラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含み、かつ、前記コロニープライマーの濃度は結合されている線状化されたフラグメントの増幅が生じ得るように調節されている；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された線状化フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが等温的に生じるように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含有する増幅溶液を前記固体表面に加えること；
を含む方法によって生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列決定が、
ｉ）配列決定用プライマーを前記コロニーにハイブリダイゼーションさせること；
ｉｉ）１つの標識されたヌクレオチドを用いてプライマー伸張を行うこと；
ｉｉｉ）それぞれの前記位置について、伸張されたプライマーに取り込まれている標識されたヌクレオチドの量を検出すること；および
ｉｖ）前記コロニーのそれぞれのヌクレオチド配列の一部分を決定するために、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって行われる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識されたヌクレオチドが蛍光標識ヌクレオチドであり、前記検出が前記標識されたヌクレオチドの蛍光強度を検出することを伴う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の制限酵素が、認識部位の一部でない配列の一部分を切断部位が含むような様式でその認識部位の両側を切断し、かつ、前記１組の制限配列タグを決定する前記工程が、
Ｂ１）前記第１の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にすること；
Ｂ２）前記１組の制限フラグメントにおける前記制限フラグメントを、所定のヌクレオチド配列を含む第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の環状核酸フラグメントを得ること；および
Ｂ３）前記第１の環状核酸における前記制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、前記１組の制限配列タグを決定すること
を含む方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程Ｂ３）の前に、固体表面上で前記第２の環状核酸フラグメントに含まれる核酸フラグメントを固定および増幅する工程を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
固定および増幅する前記工程が、前記固体表面上で前記第１の環状核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントのコロニーを生じさせることによって行われ、ここで、前記コロニーのそれぞれは前記第１の環状核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントの１つを有する複数の固定化された一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コロニーが、
ｉ）前記第１の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）５’末端で固体表面に固定化された複数のコロニープライマーを含む固体表面を提供すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントを変性させて、一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｖ）前記一本鎖フラグメントを前記固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖｉｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｖ）〜工程ｖｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コロニーが、
ｉ）前記第１の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）前記線状化されたフラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された線状化フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）前記固定化された線状化フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせて、アニーリングされた一本鎖フラグメントを得ること；
ｖｉ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；および
ｉｘ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｖ）〜工程ｖｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記コロニーが、
ｉ）前記第１の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）前記線状化されたフラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含み、かつ、前記コロニープライマーの濃度は結合されている線状化されたフラグメントの増幅が生じ得るように調節されている；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された線状化フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが等温的に生じるように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含有する増幅溶液を前記固体表面に加えること；
を含む方法によって生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記配列決定が、
ｉ）配列決定用プライマーを前記コロニーにハイブリダイゼーションさせること；
ｉｉ）１つの標識されたヌクレオチドを用いてプライマー伸張を行うこと；
ｉｉｉ）それぞれの前記位置について、伸張されたプライマーに取り込まれている標識されたヌクレオチドの量を検出すること；および
ｉｖ）前記コロニーのそれぞれの配列の一部分を決定するために、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって行われる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識されたヌクレオチドが蛍光標識ヌクレオチドであり、前記検出が前記標識されたヌクレオチドの蛍光強度を検出することを伴う、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１組の制限配列タグを決定する前記工程が、
Ｂ１）前記１組の制限フラグメントにおける前記制限フラグメントを第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の核酸フラグメントを得ること、ここで、前記第１の操作された核酸は第２の制限酵素の認識部位を含む所定のヌクレオチド配列を含み、前記認識部位は前記第２の制限酵素が前記制限フラグメント内を切断するように配置され、かつ配向している；
Ｂ２）前記第１の核酸フラグメントを前記第２の制限酵素で消化すること；
Ｂ３）前記第２の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にすること；
Ｂ４）前記第２の制限酵素により生じた前記末端を、所定のヌクレオチド配列を含む第２の操作された核酸と連結して、第２の核酸フラグメントを作製すること；および
Ｂ５）前記第２の核酸フラグメントにおける前記制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、前記１組の制限配列タグを決定すること
を含む方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の制限酵素の前記認識部位が前記第１の操作された核酸の末端の近くに配置される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記認識部位が前記第１の操作された核酸の前記末端から２５ヌクレオチド未満離れて配置される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記認識部位が前記第１の操作された核酸の前記末端から０〜５ヌクレオチド離れて配置される、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の制限酵素がＩＩｓ型エンドヌクレアーゼである、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記工程Ｂ５）の前に、固体表面上で前記第２の核酸フラグメントにおける核酸フラグメントを固定および増幅する工程を更に含む、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
固定および増幅する前記工程が、前記固体表面上で前記第２の核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントのコロニーを生じさせることによって行われ、ここで、前記コロニーのそれぞれは前記第２の核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントの１つを有する複数の固定化された一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記コロニーが、
ｉ）５’末端で固体表面に固定化された複数のコロニープライマーを含む固体表面を提供すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉ）前記第２の核酸フラグメントを変性させて、一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｉｉ）前記一本鎖フラグメントを前記固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｉｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｉｖ）〜工程ｖｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の核酸フラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉ）前記第２の核酸フラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された核酸フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｉｉ）前記固定化された核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｖ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせて、アニーリングされた一本鎖フラグメントを得ること；
ｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；および
ｖｉｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｉｖ）〜工程ｖｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の核酸フラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含み、かつ、前記コロニープライマーの濃度は結合されている第２の核酸フラグメントの増幅が生じ得るように調節されている；
ｉｉｉ）前記第２の核酸フラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された第２の核酸フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが等温的に生じるように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含有する増幅溶液を前記固体表面に加えること；
を含む方法によって生じる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記配列決定が、
ｉ）配列決定用プライマーを前記コロニーにハイブリダイゼーションさせること；
ｉｉ）１つの標識されたヌクレオチドを用いてプライマー伸張を行うこと；
ｉｉｉ）それぞれの前記位置について、伸張されたプライマーに取り込まれている標識されたヌクレオチドの量を検出すること；および
ｉｖ）前記コロニーのそれぞれの配列の一部分を決定するために、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって行われる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標識されたヌクレオチドが蛍光標識ヌクレオチドであり、前記検出が前記標識されたヌクレオチドの蛍光強度を検出することを伴う、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の制限酵素がレアカッターであり、かつ、前記１組の制限配列タグを決定する前記工程が、
Ｂ１）前記１組の制限フラグメントにおける前記制限フラグメントを、所定のヌクレオチド配列を含む第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の核酸フラグメントを得ること；
Ｂ２）前記第１の核酸フラグメントを１つ以上の第２の制限酵素で消化して、第２の制限フラグメントを得ること、ここで、前記第２の制限酵素は前記第１の制限酵素とは異なっており、前記第１の操作された核酸内を切断しない；
Ｂ３）前記第２の制限フラグメントの末端を、所定のヌクレオチド配列を含む第２の操作された核酸と連結して、１組の第２の核酸フラグメントを作製すること；および
Ｂ４）前記第２の核酸フラグメントにおける前記制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、前記１組の制限配列タグを決定すること
を含む方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記レアカッターが６塩基の認識配列を認識する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記レアカッターが８塩基の認識配列または８塩基を超える認識配列を認識する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記工程Ｂ４）の前に、固体表面上で前記第２の核酸フラグメントにおける核酸フラグメントを固定および増幅する工程を更に含む、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
固定および増幅する前記工程が、前記固体表面上で前記第２の核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントのコロニーを生じさせることによって行われ、ここで、前記コロニーのそれぞれは前記第２の核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントの１つを有する複数の固定化された一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記コロニーが、
ｉ）５’末端で固体表面に固定化された複数のコロニープライマーを含む固体表面を提供すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉ）前記第２の核酸フラグメントを変性させて、一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｉｉ）前記一本鎖フラグメントを前記固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｉｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｉｖ）〜工程ｖｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の核酸フラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉ）前記第２の核酸フラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された第２の核酸フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｉｉ）前記固定化された第２の核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｖ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせて、アニーリングされた一本鎖フラグメントを得ること；
ｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；および
ｖｉｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｉｖ）〜工程ｖｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の核酸フラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含み、かつ、前記コロニープライマーの濃度は結合されている第２の核酸フラグメントの増幅が生じ得るように調節されている；
ｉｉｉ）前記第２の核酸フラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された第２の核酸フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが等温的に生じるように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含有する増幅溶液を前記固体表面に加えること；
を含む方法によって生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記配列決定が、
ｉ）配列決定用プライマーを前記コロニーにハイブリダイゼーションさせること；
ｉｉ）１つの標識されたヌクレオチドを用いてプライマー伸張を行うこと；
ｉｉｉ）それぞれの前記位置について、伸張されたプライマーに取り込まれている標識されたヌクレオチドの量を検出すること；および
ｉｖ）前記コロニーのそれぞれの配列の一部分を決定するために、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって行われる、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記標識されたヌクレオチドが蛍光標識ヌクレオチドであり、前記検出が前記標識されたヌクレオチドの蛍光強度を検出することを伴う、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記１組の制限配列タグを決定する前記工程が、
Ｂ１）前記１組の制限フラグメントにおける前記制限フラグメントを、所定のヌクレオチド配列を含む第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の核酸フラグメントを得ること；
Ｂ２）前記第１の核酸フラグメントを第２の制限酵素で消化して、第２の制限フラグメントを得ること、ここで、前記第２の制限酵素は前記第１の制限酵素とは異なっており、前記第１の操作された核酸内を切断しない；
Ｂ３）前記第２の制限フラグメントの末端を、所定のヌクレオチド配列を含む第２の操作された核酸と連結して、１組の第２の核酸フラグメントを作製すること；および
Ｂ４）前記第２の核酸フラグメントにおける前記制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、前記１組の制限配列タグを決定すること
を含む方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
複数の異なる第２の制限酵素のそれぞれについて前記の工程Ｂ２）〜工程Ｂ４）を繰り返すことを更に含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記工程Ｂ４）の前に、固体表面上で前記第２の核酸フラグメントにおける核酸フラグメントを固定および増幅する工程を更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
固定および増幅する前記工程が、前記固体表面上で前記第２の核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントのコロニーを生じさせることによって行われ、ここで、前記コロニーのそれぞれは前記第２の核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントの１つを有する複数の固定化された一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記コロニーが、
ｉ）５’末端で固体表面に固定化された複数のコロニープライマーを含む固体表面を提供すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉ）前記第２の核酸フラグメントを変性させて、一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｉｉ）前記一本鎖フラグメントを前記固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｉｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｉｖ）〜工程ｖｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の核酸フラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉ）前記第２の核酸フラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された核酸フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｉｉ）前記固定化された核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｖ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせて、アニーリングされた一本鎖フラグメントを得ること；
ｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；および
ｖｉｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｉｖ）〜工程ｖｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の核酸フラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記第２の核酸フラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含み、かつ、前記コロニープライマーの濃度は結合されている第２の核酸フラグメントの増幅が生じ得るように調節されている；
ｉｉｉ）前記第２の核酸フラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された第２の核酸フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが等温的に生じるように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含有する増幅溶液を前記固体表面に加えること；
を含む方法によって生じる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記配列決定が、
ｉ）配列決定用プライマーを前記コロニーにハイブリダイゼーションさせること；
ｉｉ）１つの標識されたヌクレオチドを用いてプライマー伸張を行うこと；
ｉｉｉ）それぞれの前記位置について、伸張されたプライマーに取り込まれている標識されたヌクレオチドの量を検出すること；および
ｉｖ）前記コロニーのそれぞれの配列の一部分を決定するために、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって行われる、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記標識されたヌクレオチドが蛍光標識ヌクレオチドであり、前記検出が前記標識されたヌクレオチドの蛍光強度を検出することを伴う、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記１組の制限配列タグを決定する前記工程が、
Ｂ１）前記１組の制限フラグメントにおける前記制限フラグメントを第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の環状核酸フラグメントを得ること、ここで、前記第１の操作された核酸は、第２の制限酵素の認識部位と第３の制限酵素の２つの認識部位とを含む所定のヌクレオチド配列を含み、前記第２の制限酵素の前記認識部位は前記第３の制限酵素の前記２つの認識部位の間に配置され、前記第３の制限酵素の前記認識部位は前記第３の制限酵素が前記制限フラグメント内を切断するように配置され、かつ配向し、前記第２の制限酵素および前記第３の制限酵素は互いに異なる；
Ｂ２）前記第１の核酸フラグメントを前記第２の制限酵素で消化して、１組の第２の核酸フラグメントを得ること；
Ｂ３）前記第２の制限フラグメントの末端を連結して、１組の第２の環状核酸フラグメントを作製すること；および
Ｂ４）前記第３の環状核酸フラグメントにおける前記制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、前記１組の制限配列タグを決定すること
を含む方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
前記工程Ｂ３）の後に、
Ｂ５）前記第２の環状核酸フラグメントを前記第３の制限酵素で消化して、１組の第３の核酸フラグメントを作製する工程；
Ｂ６）前記第３の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にする工程；および
Ｂ７）前記第３の核酸フラグメントの末端を連結して、１組の第３の環状核酸フラグメントを作製する工程
を更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
複数の異なる第２の制限酵素のそれぞれについて前記の工程Ｂ１）〜工程Ｂ４）を繰り返すことを更に含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記認識部位のそれぞれが前記第１の操作された核酸の末端の近くに配置される、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記認識部位のそれぞれが前記第１の操作された核酸の末端から２５ヌクレオチド未満離れて配置される、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記認識部位のそれぞれが前記第１の操作された核酸の末端から０〜５ヌクレオチド離れて配置される、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第２の制限酵素がＩＩｓ型エンドヌクレアーゼである、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記工程Ｂ４）の前に、固体表面上で前記第２の環状核酸フラグメントにおける核酸フラグメントを固定および増幅する工程を更に含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
固定および増幅する前記工程が、前記固体表面上で前記第２の環状核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントのコロニーを生じさせることによって行われ、ここで、前記コロニーのそれぞれは前記第２の環状核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントの１つを有する複数の固定化された一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）５’末端で固体表面に固定化された複数のコロニープライマーを含む固体表面を提供すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントを変性させて、一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｖ）前記一本鎖フラグメントを前記固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖｉｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｖ）〜工程ｖｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）前記線状化されたフラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された線状化フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）前記固定化された線状化フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせて、アニーリングされた一本鎖フラグメントを得ること；
ｖｉ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；および
ｉｘ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｖ）〜工程ｖｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記コロニーが、
ｉ）前記第２の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）前記線状化されたフラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含み、かつ、前記コロニープライマーの濃度は結合されている線状化されたフラグメントの増幅が生じ得るように調節されている；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された線状化フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが等温的に生じるように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含有する増幅溶液を前記固体表面に加えること；
を含む方法によって生じる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記配列決定が、
ｉ）配列決定用プライマーを前記コロニーにハイブリダイゼーションさせること；
ｉｉ）１つの標識されたヌクレオチドを用いてプライマー伸張を行うこと；
ｉｉｉ）それぞれの前記位置について、伸張されたプライマーに取り込まれている標識されたヌクレオチドの量を検出すること；および
ｉｖ）前記コロニーのそれぞれのヌクレオチド配列の一部分を決定するために、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって行われる、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記標識されたヌクレオチドが蛍光標識ヌクレオチドであり、前記検出が前記標識されたヌクレオチドの蛍光強度を検出することを伴う、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記１組の制限配列タグを決定する前記工程が、
Ｂ１）前記１組の制限フラグメントにおける前記制限フラグメントを第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の核酸フラグメントを得ること、ここで、前記第１の操作された核酸は前記第１の制限酵素と異なる第２の制限酵素の認識部位を含む所定のヌクレオチド配列を含む；
Ｂ２）前記第１の核酸フラグメントを前記第２の制限酵素で消化して、１組の第２の核酸フラグメントを得ること；
Ｂ３）前記第２の制限フラグメントの末端を連結して、１組の第１の環状核酸フラグメントを作製すること；および
Ｂ４）前記第４の核酸フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定し、それにより前記１組の制限配列タグを決定すること
を含む方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６８】
前記工程Ｂ３）の後に、
Ｂ５）前記第１の環状核酸フラグメントを、前記の第１および第２の制限酵素と異なる第３の制限酵素で消化して、１組の第３の核酸フラグメントを作製する工程；
Ｂ６）前記第３の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にする工程；および
Ｂ７）前記第３の核酸フラグメントの末端を連結して、１組の第２の環状核酸フラグメントを作製する工程
を更に含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
複数の異なる第２の制限酵素のそれぞれについて前記の工程Ｂ１〜工程Ｂ４）を繰り返すことを更に含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記工程Ｂ４）の前に、固体表面上で前記第１の環状核酸フラグメントにおける核酸フラグメントを固定および増幅する工程を更に含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
固定および増幅する前記工程が、前記固体表面上で前記第１の環状核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントのコロニーを生じさせることによって行われ、ここで、前記コロニーのそれぞれは前記第１の環状核酸フラグメントにおける前記核酸フラグメントの１つを有する複数の固定化された一本鎖ＤＮＡ分子を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記コロニーが、
ｉ）前記第１の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）５’末端で固体表面に固定化された複数のコロニープライマーを含む固体表面を提供すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントを変性させて、一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｉｖ）前記一本鎖フラグメントを前記固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；
ｖｉｉｉ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｖ）〜工程ｖｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記コロニーが、
ｉ）前記第１の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）前記線状化されたフラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された線状化フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）前記固定化された線状化フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせて、アニーリングされた一本鎖フラグメントを得ること；
ｖｉ）前記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉ）前記固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせること；
ｖｉｉｉ）前記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせること；および
ｉｘ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが生じるように前記の工程ｖ）〜工程ｖｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって生じる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記コロニーが、
ｉ）前記第１の環状核酸フラグメントを線状化して、線状化されたフラグメントを生じさせること；
ｉｉ）前記線状化されたフラグメントをコロニープライマーと混合すること、ここで、それぞれの前記コロニープライマーは前記線状化されたフラグメントの３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含み、かつ、前記コロニープライマーの濃度は結合されている線状化されたフラグメントの増幅が生じ得るように調節されている；
ｉｉｉ）前記線状化されたフラグメントおよびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化された線状化フラグメントおよび固定化されたコロニープライマーを生じさせること；
ｉｖ）それぞれが前記固体表面での特定の位置に存在する前記コロニーが等温的に生じるように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含有する増幅溶液を前記固体表面に加えること；
を含む方法によって生じる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記配列決定が、
ｉ）配列決定用プライマーを前記コロニーにハイブリダイゼーションさせること；
ｉｉ）１つの標識されたヌクレオチドを用いてプライマー伸張を行うこと；
ｉｉｉ）それぞれの前記位置について、伸張されたプライマーに取り込まれている標識されたヌクレオチドの量を検出すること；および
ｉｖ）前記コロニーのそれぞれの配列の一部分を決定するために、工程ｉｉ）および工程ｉｉｉ）を繰り返すこと；
を含む方法によって行われる、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記標識されたヌクレオチドが蛍光標識ヌクレオチドであり、前記検出が前記標識されたヌクレオチドの蛍光強度を検出することを伴う、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記工程Ａ）において、前記１組の制限フラグメントを複数の異なる第１の制限酵素で消化することを更に含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
それぞれの前記群が、少なくとも６０％の相同性を有する制限配列タグからなる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
それぞれの前記群が、少なくとも７０％の相同性を有する制限配列タグからなる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
それぞれの前記群が、少なくとも８０％の相同性を有する制限配列タグからなる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
それぞれの前記群が、少なくとも９０％の相同性を有する制限配列タグからなる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
それぞれの前記群が、少なくとも９９％の相同性を有する制限配列タグからなる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
複数の異なる表現型の中でゲノム全域での配列変化を決定するための方法であって、
Ａ）生物の集団のそれぞれについて、先行する請求項のいずれか一項に記載される方法によって１組の制限配列タグを決定すること、ここで、生物の前記集団は前記複数の異なる表現型のそれぞれについて、１つ以上の生物を含む；
Ｂ）異なる表現型に関連する１つ以上の配列変化を決定するように、様々な前記１組の制限配列タグを異なる表現型の生物の間で比較すること
を含む方法。
【請求項８４】
前記工程Ｂ）の後に、前記１つ以上の制限配列タグのゲノム位置を特定するように前記１つ以上の制限配列タグを前記生物のゲノム配列にマッピングする工程を更に含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記複数の異なる第２の制限酵素が少なくとも３つの異なる制限酵素から構成される、請求項４５〜５２、５５〜６６および６９〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
複数の異なる表現型の中でゲノム全域での配列変化を決定するための方法であって、
Ａ）生物の集団のそれぞれについて、請求項８５に記載される方法によって１組の制限配列タグを決定すること、ここで、生物の前記集団は前記複数の異なる表現型のそれぞれについて、１つ以上の生物を含む；
Ｂ）異なる表現型に関連する１つ以上の配列変化を決定するように、様々な前記１組の制限配列タグを異なる表現型の生物の間で比較すること
を含む方法。
【請求項８７】
前記工程Ｂ）の後に、前記１つ以上の制限配列タグのゲノム位置を特定するように前記１つ以上の制限配列タグを前記生物のゲノム配列にマッピングする工程を更に含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記複数の異なる第２の制限酵素が少なくとも１０個の異なる制限酵素から構成される、請求項４５〜５２、５５〜６６および６９〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
複数の異なる表現型の中でゲノム全域での配列変化を決定するための方法であって、
Ａ）生物の集団のそれぞれについて、請求項８８に記載される方法によって１組の制限配列タグを決定すること、ここで、生物の前記集団は前記複数の異なる表現型のそれぞれについて、１つ以上の生物を含む；
Ｂ）異なる表現型に関連する１つ以上の配列変化を決定するように、様々な前記１組の制限配列タグを異なる表現型の生物の間で比較すること
を含む方法。
【請求項９０】
前記工程Ｂ）の後に、前記１つ以上の制限配列タグのゲノム位置を特定するように前記１つ以上の制限配列タグを前記生物のゲノム配列にマッピングする工程を更に含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記１つ以上の個々の生物がヒトである、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
それぞれの前記１組の制限フラグメントが少なくとも１０個の異なる制限フラグメントを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
それぞれの前記１組の制限フラグメントが少なくとも１００個の異なる制限フラグメントを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
それぞれの前記１組の制限フラグメントが少なくとも１０００個の異なる制限フラグメントを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
それぞれの前記１組の制限フラグメントが少なくとも１０，０００個の異なる制限フラグメントを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
それぞれの前記１組の制限フラグメントが少なくとも１００，０００個の異なる制限フラグメントを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
それぞれの前記１組の制限フラグメントが少なくとも１０６個の異なる制限フラグメントを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
それぞれの前記１組の制限フラグメントが少なくとも１０７個の異なる制限フラグメントを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
それぞれの前記１組の制限フラグメントが少なくとも１０８個の異なる制限フラグメントを含む、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記工程Ｉ）が１つの個体について行われる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
制限配列タグをグループ分けする前記工程ＩＩ）が、前記制限配列タグを参照配列と比較することを更に含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記参照配列が当該生物のゲノム配列を含む、請求項１０１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、仮説を用いない様式で、表現型に関連するゲノム全域での配列変化を種の生物の集団において決定するための方法に関する。本発明はまた、生物についてゲノム全域での制限配列タグを作製するための方法にも関する。
【発明の背景】
【０００２】
遺伝子分析に対する分子的方法では、生物のゲノムにおいて天然かつランダムに生じるヌクレオチド配列変化が突き止められる。個体同士および集団間におけるＤＮＡ多型の知識は、遺伝子型変化と表現型変化との間における複雑な関連を理解する際に重要である。配列変化に関する完全なデータがない場合、当業者は、ある種の関連遺伝子座または原因となる配列変化の位置を推定することを可能にする「近くの」マーカーが同定できることに頼っている。そのようなマーカーが情報を与えるかどうかは、連鎖不平衡の大きさに依存する。様々なマーカーが、候補遺伝子を探すために連鎖研究において、また、個体間の変化に影響を及ぼす候補遺伝子の機能的な対立遺伝子変化を同定するために関連研究において使用され得る。
【０００３】
薬物治療に対する有害な応答および疾患に対する感受性を個体のゲノム構成に関連させるためには、個体同士のゲノムにおける違いをモニターすることが必要である。現在の方法には、大きな１組の遺伝子マーカー、例えば、ゲノム全体に一様に広がる数千の一塩基多型（ＳＮＰｓ）をモニターすることが含まれる。これらのＳＮＰｓは、コントロール集団に由来する個体において、および罹患集団における個体、あるいはより一般的には、所与の表現型を有する集団おける個体においてモニターされる。所与のＳＮＰｓに対するこれらの２つの集団の間における連鎖不平衡が、その場合、ＳＮＰｓと、薬物応答または疾患感受性に関与するゲノム領域との間におけるゲノム上での物理的近接度に対する目安として使用される。
【０００４】
ＳＮＰｓは遺伝子多型の最も一般的な形態である。このことは、機能的な変化体としてのそれらの潜在的可能性と一緒になり、薬理遺伝学的指標として、また、複雑な疾患について遺伝子をマッピングするためのマーカーとして、その両方でＳＮＰにおいて非常に多くの関心をもたらしている（Ｒｉｓｃｈら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：１５１６〜７；Ｋｒｕｇｌｙａｋ、１９９７、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２１〜４；Ｍａｓｏｏｄ、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ、３９８：５４５〜６）。非常に多数のＳＮＰｓが既に同定されており、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベースだけで２，５００，０００を超えるＳＮＰｓが登録されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）。多くの最近の研究は、一般的な疾患に関連する潜在的な候補遺伝子のコード配列に存在する多型を同定することに集中している（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９８、１９：２３３〜２４０；Ｃａｍｂｉｅｎら、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６５：１８３〜９１；Ｒｉｓｃｈら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：１５１６〜７；Ｋｒｕｇｌｙａｋ、１９９７、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２１〜４；Ｍａｓｏｏｄ、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ、３９８：５４５〜６；Ｃａｒｇｉｌｌら、１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：２３１〜２３８；Ｈａｌｕｓｈｋａら、１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２２：２３９〜２４７）。
【０００５】
当分野の現状では、１００名程度の十分に選ばれたコントロール集団に属する個体のゲノムの大部分を集中的に再び配列決定することによって、ＳＮＰｓをまず発見しなければならない。見出される最も一般的な違いが、ＳＮＰｓの候補である。この方法では、非常に時間および費用がかかり、その結果はコントロール集団の選択に依存している。
【０００６】
ＳＮＰが同定されると、個体における非常に多数のＳＮＰを迅速かつ費用効果的にスコア化することを可能にする方法を開発しなければならない。当分野の現状では、ＳＮＰをスコア化するために使用されているほとんどの方法は、ＳＮＰを取り囲む小さい領域のＰＣＲによる増幅（または代わりのＤＮＡ増幅方法）に頼っている。この増幅工程では、ＳＮＰを取り囲む領域の知識、および、それぞれのＳＮＰに対する特異的かつ特注の核酸プライマーの使用が要求される。非常に多数の異なるＤＮＡ配列を同時に増幅することは、精巧かつ高価なロボット工学および多量の高価な反応試薬を要求する冗長かつ費用のかかるプロセスである。
【０００７】
変化のこの豊富な供給源を迅速かつ正確に遺伝子型決定できることが、遺伝学の分野では更により重要な目標になりつつある（Ｂｏｎｎ，Ｄ．、１９９９、Ｌａｎｃｅｔ、３５３：１６８４）。様々な利用可能な技術が、ハイスループット遺伝子型決定を行う実験室に移転する可能性がある（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９９８、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：７６９〜７７６）。これらには、５’エキソヌクレアーゼアッセイ、例えば、ＴａｑＭａｎ（Ｌｙｖａｋら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、９：３４１〜３４２）、分子ビーコン（Ｔｙａｇｉら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：４９〜５３）、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）（Ｔｏｂｅら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４：３７３８〜３７３２）、色素標識されたオリゴヌクレオチドの連結（ＤＯＬ）（Ｃｈｅｎら、１９９８、Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｒｅｓ．、８：５４９〜５５６）、ミニ配列決定（Ｃｈｅｎら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．、２５：３４７〜３５３；Ｐａｓｔｉｎｅｎら、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７：６０６〜６１４）、マイクロアレイ技術（Ｈａｃｉａら、１９９８、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、８：１２４５〜１２５８；Ｗａｎｇら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：１０７７〜１０８２）、およびスコーピオンアッセイ（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：８０４〜８０７）などが含まれる。
【０００８】
これらの既存の方法には２つの大きな問題点がある。ひとつには、スコア化の前に、ＳＮＰｓを同定し、かつ任意に選択しなければならないということであり、もうひとつには、非常に多数の異なるＤＮＡ産物を特異的な増幅によって作製しなければならないということである。したがって、本発明者らは、これらの２つの問題点を特異的に回避する方法を設計している。
【０００９】
当分野の現状では、既存の方法は製薬業界の要求を満足させるものではない。製薬業界のほかに、多くの他の分野、例えば、医学研究、健康管理、獣医学、農業、食品、化粧品および多くの他の業界および分野が、種々の関連および／または種々の生物に基づく同じ方法を使用して注目されている。したがって、低コストで、非常に高い処理能および高い精度で生物の数多くの遺伝子変化に対する十分な利用を得るために、新しい方法が必要とされる。
【００１０】
したがって、より少数のマーカー、限られたサンプルサイズ、および／またはプールされたサンプルの使用による現在のゲノムスキャンでは検出されない微妙な遺伝的危険因子を同定するために、多くの患者サンプルにおいて非常に多数の配列変化体を分析するためのより効率的な方法が求められている。したがって、核酸変化のより効率的な検出方法を提供することは本発明の１つの目的である。より効率的な配列決定方法を提供することもまた、本発明の１つの目的である。
【００１１】
本明細書中での議論または参考文献の引用は、そのような参照が本発明に対する先行技術であることを認めるものとして解釈してはならない。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、種の表現型に関連するゲノム全域での配列変化を、好ましくは仮説を用いない様式で決定するための方法を提供する。１つの実施形態において、ゲノム全域での変化は、特定の表現型を有する個体の部分集団から決定される。本発明の方法において、表現型を有する個体の部分集団における各個体についての１組の制限フラグメントが、１つ以上の異なる制限酵素を使用して個体由来の核酸を消化することによって作製される。好ましくは、そのような１組の制限フラグメントは、その生物のゲノムにおける配列変化を同定することを可能にするために十分な数の異なる制限フラグメントを含む。より好ましくは、そのような１組の制限フラグメントは、少なくとも１０個、１００個、１０００個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個または１０８個の異なる制限フラグメントを含む。
【００１３】
１組の制限配列タグが、その後、個体のそのような１組の制限フラグメントから個体のそれぞれについて決定される。本発明の方法において、特定の表現型を有する部分集団における個体についての１組の制限配列タグが、好ましくは、個体の１組の制限フラグメント（例えば、個体のゲノムＤＮＡに由来する１組の制限フラグメント）を作製し、その後、（下記に記載される）ＤＮＡコロニーの作製を含む方法を使用して制限フラグメントのそれぞれの一部分を配列決定することによって決定される。
【００１４】
部分集団における異なる個体について得られた様々な１組の制限配列タグは、その後、好ましくは、比較され、相同的な配列を含む制限配列タグを群のそれぞれが含む１つ以上の群にグループ分けされる。比較により、好ましくは、制限配列タグの各群の数または頻度を決定することが可能になる。部分集団について相同的な制限タグ群のコレクションは、表現型に関連する配列変化を同定するために使用することができる。好ましい実施形態において、制限配列タグが、制限配列タグのゲノム位置を特定するために、生物のゲノム配列と比較される。別の好ましい実施形態において、認識部位の両側に隣接する制限配列タグもまた、生物のゲノム配列から同定される。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
本発明は、種の表現型に関連するゲノム全域での配列変化を決定するための方法を提供する（例えば、図１を参照のこと）。本発明は、少なくとも部分的には、表現型に関連する配列変化が、表現型を有する個体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡに由来する十分に多数の配列タグを取得し、比較することによって、仮説を用いることなく決定され得るという発見に基づいている。例えば、ゲノム全域での変化を、特定の表現型を有する個体（例えば、同じ表現型特徴を有する特定の種族、変種、種、属、科などに属する個体）の部分集団から決定することができる。ゲノム全域での変化はまた、例えば、健康な個体、特定の疾患を有する個体、または特定の疾患に罹りやすい個体、または特定の発達段階にある個体の部分集団から決定することができる。
【００１６】
本発明の方法において、表現型を有する個体の部分集団の各メンバーについて１組の制限フラグメントが、１つ以上の異なる制限酵素を使用して個体由来の核酸を消化することによって作製される。本明細書中で使用されているように、１組の制限フラグメントは１つ以上の制限フラグメントを含むことができる。個体についての１組の制限配列タグが、その後、そのような１組の制限フラグメントから決定される。生物の部分集団についての制限配列タグが比較され、相同的な配列を含む制限配列タグを群のそれぞれが含む１つ以上の群にグループ分けされる。１つの実施形態において、制限タグの１群は、相同性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９９％である制限タグからなる。別の実施形態では、制限タグの１群は、相同性が１００％である制限タグからなる。得られた１つ以上の制限配列タグ群は、表現型に関連する配列変化を同定するために使用することができる。好ましい実施形態において、調べられている表現型は配列変化の割合または組合せに関連する。本発明はまた、様々な異なる表現型の制限配列タグを比較することによって多数の表現型の間におけるゲノム全域での配列変化を決定するための方法を提供する。本発明の方法は任意の種の生物に対して適用することができる。本発明の方法は、複雑なゲノムを有する高等真核生物に対して、例えば、ヒトを含む高等動物、および植物などに対して特に有用であるが、これらに限定されない。特に、本発明の方法は、ヒトにおける疾患感受性または治療に対する応答に関連する配列変化を分析し、同定するために有用である。
【００１７】
本発明の方法を使用して、制限配列タグから種のゲノムにおける多型を同定することができる。本発明の方法は、既存の方法と比較した場合、下記のようないくつかの利点を提供する：ｉ）相関研究を開始する前に大きな１組の多型を発見する必要がない、ｉｉ）相関研究を開始する前に、限定された１組の多型を選択する必要がない、ｉｉｉ）任意の配列の事前の知識を使用する必要がない、ｉｖ）大きな１組の異なるオリゴヌクレオチドを合成する必要がない、ｖ）非常に多数の特異的な増幅工程を行う必要がない、ｖｉ）研究で使用される多型の数が、非常に多数の異なる制限酵素を使用することによって容易に増大させることができる、ｖｉｉ）全体の手順が、１つだけの物理的サンプルを操作することによって行われるのに対して、他の方法では、物理的サンプルの数が、分析される多型の数に比例する少なくとも１つの工程、すなわち、増幅工程が存在する、ｖｉｉｉ）各個体が分析され得るので、集団のサンプルをプールすることは必要でない；ｉｘ）集団において非常に低頻度で存在する配列変化を同定することができる；ｘ）分析費用が、現在の遺伝子型決定法よりも数桁も安い。
【００１８】
下記の説明および実施例において、多数の用語が本明細書中では使用されている。そのような用語に対して与えられる範囲を含めて、明細書および請求項の明瞭かつ一貫した理解を提供するために、下記の定義が提供される。
【００１９】
用語「ゲノム領域」は、本発明の方法を使用して個体の集団からのサンプルを比較することによって同定される１つまたは複数の配列変化を含有するゲノムの一部分を示す。
【００２０】
用語「核酸」は、共有結合的に連結されている少なくとも２つのヌクレオチドを示す。本発明の核酸はホスホジエステル結合を含有し得る。本発明の核酸はまた、例えば、ホスホルアミド結合（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９９３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４９、１９２５を参照のこと；これはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）、ホスホロチオアート結合（例えば、Ｍａｇら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９：１４３７；米国特許第５，６４４，０４８号を参照のこと；これらのそれぞれが、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）、ホスホロジチオアート結合（Ｂｒｉｕら（１９８９）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１：２３２１を参照のこと）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと）、ならびにペプチド核酸の骨格および結合（例えば、Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１４：１８９５；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６を参照のこと；これらはすべて、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）を含む骨格を有する核酸アナログであってもよい。他の核酸アナログには、正荷電の骨格を有する核酸アナログ（例えば、Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：６０９７を参照のこと；これはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）、非イオン性骨格を有する核酸アナログ（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；これらのそれぞれが、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）、および非リボース骨格を有する核酸アナログ（これには、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号（これらのそれぞれが、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載される核酸アナログが含まれる）が含まれる。１つ以上の炭素環状の糖を含有する核酸もまた、核酸の定義に含まれる（例えば、Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５）、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．、１６９頁〜１７６頁；これはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。いくつかの核酸アナログはまた、Ｒａｗｌｓ、Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ、１９９７年６月２日、３頁；これはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾は、標識などの更なる成分の付加を容易にするために、または、生理学的環境下でのそのような分子の安定性および半減期を増大させるために行うことができる。更に、天然に存在する核酸およびアナログの混合物を作製することができる。あるいは、異なる核酸アナログの混合物、ならびに、天然に存在する核酸およびアナログの混合物を作製することができる。当業者は、本発明の様々な実施形態において使用される適切なアナログを選択する方法を理解している。例えば、制限酵素で消化するときには、天然の核酸が好ましい。核酸は、規定されるように一本鎖または二本鎖であり得るか、あるいは、一本鎖配列または二本鎖配列の両方の一部分を含有することができる。核酸は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ、または、ハイブリッドであり得るが、ここで、核酸はデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せを含み、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組合せを含む。
【００２１】
本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」には、モノマー対モノマーの相互作用の通常的な様式によって、例えば、ワトソン・クリック型の塩基対形成、塩基スタッキング、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型または逆フーグスティーン型の塩基対形成などによって、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる、天然のまたは修飾されたモノマーまたは連鎖の線状オリゴマーが含まれる（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなどを含む）。好ましくは、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結され、サイズが数個のモノマーユニット（例えば、３個〜４個）から数十のモノマーユニット（例えば、４０〜６０）まで及ぶオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字列によって表されるときは、そのヌクレオチドは左から右に５’から３’の順であること、および、別途示されない限り、「Ａ」がアデノシンを示し、「Ｃ」がシチジンを示し、「Ｇ」がグアノシンを示し、「Ｔ」がチミジンを示し、「Ｕ」がウリジンを示すことが理解される。用語「ヌクレオチド」は「デオキシリボヌクレオチド」または「リボヌクレオチド」を示し、「ｄＡＴＰ」、「ｄＣＴＰ」、「ｄＧＴＰ」、「ｄＴＴＰ」および「ｄＵＴＰ」は、個々のヌクレオチドの三リン酸エステル誘導体を表す。通常、オリゴヌクレオチドは天然のヌクレオチドを含む。しかしながら、オリゴヌクレオチドはまた、非天然のヌクレオチドアナログを含むことができる。天然のヌクレオチドまたは非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを用いることができるが、例えば、酵素による処理が行われるときには、天然のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが好ましいことは当業者には明らかである。
【００２２】
用語「多型」は、集団において２つ以上の対立遺伝子が存在することを示す。用語「対立遺伝子」は、特異的な遺伝子座におけるいくつかの代わりの配列変化体の１つを示す。１カ所だけの染色体位置における多型は遺伝子マーカーを構成する。用語「ＳＮＰ」は一塩基多型を示す。好ましくは、遺伝子変化、例えば、ＳＮＰは、生物の集団において一般的であり、メンデル様式で遺伝する。そのような対立遺伝子は、関連した表現型を有してもよく、または関連した表現型を有しなくてもよい。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「ヘテロ接合体」は、相同的な染色体での対応する遺伝子座において異なる対立遺伝子を有する個体を示す。したがって、本明細書中で使用される用語「ヘテロ接合体」は、相同的な染色体での１つ以上の対になった遺伝子座において異なる対立遺伝子を有する個体または系統を表現する。
【００２４】
本明細書中で使用される用語「ホモ接合体」は、相同的な染色体での対応する遺伝子座において同じ対立遺伝子を有する個体を示す。したがって、本明細書中で使用される用語「ホモ接合体」は、相同的な染色体での１つ以上の対になった遺伝子座において同一の対立遺伝子を有する個体または系統を表現する。
【００２５】
用語「変異」は、生物のＤＮＡ配列における遺伝的な変化を意味する。
【００２６】
用語「遺伝子型」は、（ｉ）個体の遺伝的構成または（ｉｉ）個体における遺伝子座において見出される対立遺伝子のタイプを意味することが一般に知られている。
【００２７】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」または「制限酵素」は、二本鎖ＤＮＡ分子における特異的な塩基配列（標的部位または認識部位）を認識し、標的部位または認識部位において、あるいは標的部位または認識部位の近くで、例えば、標的部位または認識部位から特異的な距離の範囲内でそのＤＮＡ分子を切断する酵素を示す。
【００２８】
用語「制限部位」は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位および／または切断部位を含む核酸（好ましくは、二本鎖核酸）の内部における４ヌクレオチドおよび８ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチド以上の間の領域を通常は指すが、これらに限定されない。認識部位は、制限エンドヌクレアーゼまたは一群の制限エンドヌクレアーゼが結合する核酸内の配列に対応する。切断部位またはカット部位は、制限エンドヌクレアーゼによる切断が生じる特定の配列に対応する。制限エンドヌクレアーゼによっては、切断部位が認識部位内に存在する場合がある。しかしながら、一部の制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、認識部位の外側に存在する切断部位を有する。
【００２９】
用語「制限フラグメント」は、ＤＮＡ分子を制限エンドヌクレアーゼで消化することによって生じるＤＮＡ分子を示す。
【００３０】
用語「操作された核酸」または「アダプター」は、所定のヌクレオチド配列を有する短い二本鎖ＤＮＡ分子を示す。好ましくは、操作された核酸またはアダプターは長さが１０塩基対〜５００塩基対である。より好ましくは、操作された核酸またはアダプターは長さが１０塩基対〜１５０塩基対である。好ましくは、操作された核酸またはアダプターは、制限フラグメントの末端に連結され得るような方法で設計される。そのような核酸は、制限フラグメントの末端の配列が示されると、当業者によって設計され得る。好ましくは、操作された核酸は１つ以上の増幅プライマーの配列を含み、この場合、増幅プライマーはそれぞれが、好ましくは、操作された核酸の一方の末端の近くに存在し、かつ、分子の末端に向かう方向でのプライマー伸張を可能にするように配向している。増幅プライマーは同じでも異なってもよい。好ましくは、操作された核酸はまた、１つ以上の配列決定用プライマーの配列を含み、この場合、配列決定用プライマーはそれぞれが、好ましくは、操作された核酸の一方の末端の近くに存在し、かつ、分子の末端に向かう方向でのプライマー伸張を可能にするように配向している。配列決定用プライマーは同じでも異なってもよい。一部の実施形態では、増幅プライマーおよび配列決定用プライマーは同じでもよい。一部の実施形態では、操作された核酸はまた、１つ以上の制限部位を含むことができる。操作された核酸はまた、本開示ではＤＮＡコロニーベクターと呼ばれる。
【００３１】
用語「連結（ライゲーション）」は、２つの二本鎖ＤＮＡ分子が共有結合的につながれる、リガーゼにより触媒される酵素反応を示す。一方のＤＮＡ鎖または両方のＤＮＡ鎖が共有結合的につながれ得る。２つのＤＮＡ鎖の一方のみをつなぐことを可能にするために末端の一方を化学的および／または酵素的に修飾することによって２つの鎖の一方の連結を妨げることもまた可能である。
【００３２】
用語「固体支持体」は、核酸を結合させることができる任意の固体表面、例えば、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、およびシリコンウエハーなどがあるが、これらに限定されない。好ましくは、固体支持体はガラス表面である。
【００３３】
用語「核酸コロニー」または「コロニー」は、例えば、複数コピーの核酸鎖を含む固体表面上の分離された領域を示す。複数コピーのその相補鎖もまた、この同じコロニーに存在し得る。コロニーを構成する複数コピーの核酸鎖は、一般的には、固体支持体に固定化され、一本鎖または二本鎖の形態で存在する。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「コロニープライマー」は、相補的な配列にハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション）することができ、かつ、特異的なポリメラーゼ反応を開始させるオリゴヌクレオチド配列を含む核酸分子を示す。コロニープライマーを含む配列は、その相補的な配列との最大限のハイブリダイゼーション活性を有し、かつ、他の配列に対する非常に低い非特異的なハイブリダイゼーション活性を有するように選ばれる。コロニープライマーは長さが５塩基〜１００塩基であり得るが、好ましくは、長さが１５塩基〜２５塩基であり得る。天然に存在するヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドをプライマーに存在させることができる。１つまたは２つ以上の異なるコロニープライマーを使用して、本発明の方法における核酸コロニーを生じさせることができる。
【００３５】
５．１．特定の表現型を有する個体からのサンプルの収集および記録
特定の表現型を有する個体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを、そのような個体から集められたサンプルから得ることができる。好ましくは、その表現型を有する個体の部分集団、例えば、同じ表現型特徴を有する特定の種族、変種、種、属、科などに属する個体の部分集団、または、特定の状態（例えば、健康な状態）を有する個体の部分集団、特定の疾患を有する個体、もしくは特定の発達段階にある個体の部分集団が同定される。そのような部分集団の個体に由来するサンプルが、その部分集団に関連する表現型特徴の詳細な文書化とともに集められる。そのような慎重な文書化により、１つ以上の表現型に対する配列変化の帰属が容易になる。
【００３６】
５．２．制限消化による制限フラグメントを生じさせるための方法
本発明の方法は、生物に由来するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ（例えば、その生物に由来する細胞から抽出されたゲノムＤＮＡ、またはその生物に由来する細胞から抽出されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡ）から、１組の制限フラグメントを生じさせることを伴う。本発明では、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を、個体（例えば、種々の細胞、部分、組織または器官）から得ることができる。本発明の様々な実施形態では、１つ以上の異なる制限酵素が、そのような１組の制限フラグメントを、例えば、ゲノムＤＮＡから生じさせるために、同時または別々に用いられる。好ましくは、そのような１組の制限フラグメントは、生物のゲノムにおける配列変化を同定することを可能にするために十分に多数の異なる制限フラグメントを含む。より好ましくは、そのような１組の制限フラグメントは、少なくとも１０個、１００個、１０００個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個または１０８個の異なる制限フラグメントを含む。
【００３７】
分析される核酸分子（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、任意の供給源（例えば、組織ホモジネート、血液、羊水、絨毛サンプルおよび細菌培養）から得ることができる。核酸分子は、この分野で知られている標準的な方法を使用してこれらの供給源から得ることができる。好ましくは、ほんの微量の核酸が必要とされるだけであり、この場合、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る（ＲＮＡの場合、逆転写工程がＰＣＲ工程の前に要求される）。分子生物学的方法が、本発明の方法において使用される場合、標準的な方法を使用して行われる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１；Ｉｎｎｉｓ他、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）。
【００３８】
この分野で知られているいかなる制限酵素を本発明とともに使用することができる。本発明の一部の実施形態では、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼが１つ以上の工程で使用される。ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは一般に市販されており、この分野では広く知られている。ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは二本鎖ポリヌクレオチド配列内の特異的な配列の塩基対を認識する。そのような配列を認識したとき、このエンドヌクレアーゼはそのポリヌクレオチド配列を切断し、これにより、一般には、配列の一方の鎖の突出（オーバーハング）、すなわち、「突出末端（ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ）」が残る。ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、その特異的な認識部位が、ＩＩ型エンドヌクレアーゼの認識部位のように回文構造であること、すなわち、５’から３’の方向で読んだとき、塩基対配列が認識部位の両方の鎖について同じであることを要求しない。更に、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼはまた、一般にその認識部位の外側を切断する。切断が、認識部位から特定の塩基対離れた任意のポリヌクレオチド配列の位置において生じるので、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、本発明の一部の実施形態では切断部位までの介在配列の捕獲を可能にする。本発明において有用である特異的なＩＩｓ型エンドヌクレアーゼには、ＥａｒＩ、ＭｎｌＩ、ＰｌｅＩ、ＡｌｗＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｐＭＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＨｇａＩ、ＳａｐＩ、ＳｆａＮＩ、ＢｂｖＩ、ＢｓｍＦＩ、ＦｏｋＦＩ、ＢｓｅＲＩ、ＨｐｈＩ、ＭｍｅＩおよびＭｂｏＩＩが含まれるが、これらに限定されない。現在発見されている酵素は、その認識部位から最大で２０塩基〜２５塩基のところを切断する。その認識部位から更に離れて、例えば、その認識部位から５０塩基以上、１００塩基以上または２００塩基以上のところを切断する酵素は、本発明のために有用である。
【００３９】
本発明の一部の実施形態では、低頻度カッター（レアカッター）および高頻度カッター（フリークエントカッター）の組合せが、制限フラグメントを生じさせるために使用される。レアカッターは、４ヌクレオチドを超える配列（好ましくは、６ヌクレオチドまたは８ヌクレオチドの配列）からなる認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである。市販されているレアカッターの例には、ＰｓｔＩ、ＨｐａＩＩ、ＭｓｐＩ、ＣｌａＩ、ＨｈａＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＨｉｎＰＩ、ＭａｅＩＩ、ＢｂｖＩ、ＰｖｕＩＩ、ＸｍａＩ、ＳｍａＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖａＩ、ＨａｅＩＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩおよびＰｖｕＩＩがあり、その中でも、ＰｓｔＩ、ＨｐａＩＩ、ＭｓｐＩ、ＣｌａＩ、ＨｈａＩ、ＥｃｏＲＩＩ、ＢｓｔＢＩ、ＨｉｎＰＩおよびＭａｅＩＩが好ましい。高頻度カッターは、４塩基または４塩基未満のヌクレオチドの認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼである。適当な高頻度カッター酵素の例には、ＭｓｅＩおよびＴａｑＩが含まれる。
【００４０】
本発明の一部の実施形態では、制限フラグメントが消化部位において他の核酸または自身に連結される。典型的には、制限酵素は、平滑末端（この場合、両方の鎖の末端ヌクレオチドは塩基対形成している）または付着末端（この場合、２つの鎖の一方が突出して、短い一本鎖伸張部を与えている）のいずれかを生じさせる。本発明の一部の実施形態において、制限酵素がＩＩＳ型であるとき、ポリメラーゼを用いて突出末端を平滑末端に変換することによる末端の修飾を含む工程が好ましくは加えられる。
【００４１】
５．３．制限配列タグを決定するための方法
この分野で知られているいかなる方法も、５．２節の方法によって作製された制限フラグメントについて１組の制限配列タグを決定するために使用することができる。好ましくは、配列決定の前に制限フラグメントが増幅される。しかしながら、増幅を必要としない配列決定方法（例えば、単一分子配列決定など）も、更なる増幅工程を伴うことなく使用することができる。好ましくは、生じる制限配列タグの長さは少なくとも５ヌクレオチドである。より好ましくは、生じる制限配列タグは１０ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドの範囲にある。更により好ましくは、制限配列タグの長さは５０ヌクレオチドまでである。
【００４２】
好ましくは、ＤＮＡコロニーの作製および配列決定を伴う方法が、制限フラグメントの制限配列タグを決定するために使用される。この分野で知られている方法のいずれをも本発明において使用することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開公報第９８／４４１５１号、ＰＣＴ国際公開公報第９８／４４１５２号、ＰＣＴ国際公開公報第００／１８９５７号およびＰＣＴ国際公開公報第０２／４６４５６号を参照のこと；これらはすべて、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）。１つの核酸コロニーを、１つだけの固定化された核酸テンプレート（例えば、制限フラグメントに由来する核酸テンプレート）から生じさせることができる。本発明の方法により、異なる固定化された核酸をそれぞれが含有する多数のそのような核酸コロニーの同時産生が可能になる。
【００４３】
ＤＮＡコロニーを、固体表面に固定化されているプライマーを使用してＤＮＡフラグメント（例えば、制限フラグメント）を捕獲および増幅することを含む方法によって生じさせることができる（ＰＣＴ国際公開公報第９８／４４１５１号およびＰＣＴ国際公開公報第９８／４４１５２号を参照のこと）。ＤＮＡフラグメントが環状である本発明の実施形態では、制限酵素を使用して環状ＤＮＡフラグメントを線状化する工程が、好ましくは、コロニー作製の前に行われる。１つの実施形態において、ＤＮＡコロニーが、下記の工程を含む方法によって、ＤＮＡ分子のサンプル（例えば、制限フラグメントのプール）から生じさせられる：
ｉ）５’末端で固体表面に固定化された複数のコロニープライマーを含む固体表面を提供する工程、ここで、それぞれのコロニープライマーは、サンプル中のＤＮＡ分子の３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉ）ＤＮＡ分子を変性させて、一本鎖フラグメントを生じさせる工程；
ｉｉｉ）一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせる工程；
ｉｖ）アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせる工程；
ｖ）固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせる工程；
ｖｉ）固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせる工程；
ｖｉｉ）それぞれが固体表面での特定の位置に存在するコロニーが生じるように工程ｉｖ）〜工程ｖｉ）を繰り返す工程。
【００４４】
好ましい実施形態において、固定化されたコロニープライマーは、ＤＮＡ分子内の配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む。例えば、サンプル中のＤＮＡ分子は、所定の配列を有する核酸に連結された制限フラグメントであり得る。そのような場合、固定化されたプライマーは、その所定の配列における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を有することができる。本発明のいくつかの他の実施形態では、異なる配列を有するコロニープライマーを使用することができる。本発明において使用されるプライマーは、好ましくは、長さが少なくとも５塩基である。より好ましくは、プライマーは長さが１００塩基未満または５０塩基未満である。本発明では、固定化されたプライマーにテンプレートをアニーリングさせる工程、プライマー伸張工程、および伸張されたプライマーをテンプレートから分離する工程が反復されて使用される。これらの工程は、ＰＣＲ（または逆転写酵素＋ＰＣＲ）技術における試薬および条件を使用して行われ得ることが、当業者によって理解される。様々なＰＣＲ技術が、例えば、“ＰＣＲ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇにより１９９２年に発行；これはその全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されている。
【００４５】
ＤＮＡコロニーはまた、ＰＣＴ国際公開公報第００／１８９５７号に記載される方法によって生じさせることができる。増幅されるＤＮＡフラグメントが環状である本発明の実施形態では、制限酵素を使用して環状ＤＮＡフラグメントを線状化する工程が、好ましくは、コロニー作製の前に行われる。１つの実施形態において、ＤＮＡコロニーが、下記の工程を含む方法によって、ＤＮＡ分子のサンプル（例えば、制限フラグメントのプール）から生じさせられる：
ｉ）サンプル中のＤＮＡ分子をコロニープライマーと混合する工程、ここで、それぞれのコロニープライマーは、ＤＮＡ分子の３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含む；
ｉｉ）ＤＮＡ分子およびコロニープライマーをＤＮＡ分子およびコロニープライマーの両方の５’末端で固体表面に結合させて、固定化されたＤＮＡ分子および固定化されたコロニープライマーを生じさせる工程；
ｉｉｉ）上記固定化されたＤＮＡ分子を変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせる工程；
ｉｖ）上記固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせて、アニーリングされた一本鎖フラグメントを得る工程；
ｖ）上記アニーリングされた一本鎖フラグメントをテンプレートとして使用してプライマー伸張反応を行って、固定化された二本鎖核酸フラグメントを生じさせる工程；
ｖｉ）固定化された二本鎖核酸フラグメントを変性させて、固定化された一本鎖フラグメントを生じさせる工程；
ｖｉｉ）固定化された一本鎖フラグメントを固定化されたコロニープライマーにアニーリングさせる工程、および
ｖｉｉｉ）それぞれが固体表面での特定の位置に存在するコロニーが生じるように工程ｉｖ）〜工程ｖｉｉ）を繰り返す工程。
【００４６】
好ましくは、混合物中のコロニープライマーの割合はコロニーテンプレートの割合よりも高い。好ましくは、コロニープライマーのコロニーテンプレートに対する比率は、コロニープライマーおよび核酸テンプレートが固体支持体に固定化されているとき、コロニープライマーの「芝生」が形成されるようにされる。この場合、コロニープライマーの芝生は、固体支持体の全領域または規定された領域にわたってほぼ一様な密度で存在する複数のコロニープライマーを、コロニープライマーの芝生内に様々な間隔で個々に固定化されている１つ以上のコロニーテンプレートとともに含む。本発明において使用されるプライマーは、好ましくは、長さが少なくとも５塩基である。より好ましくは、プライマーは長さが１００塩基未満または５０塩基未満である。本発明では、固定化されたプライマーにテンプレートをアニーリングさせる工程、プライマー伸張工程、および伸張されたプライマーをテンプレートから分離する工程が繰り返されて使用される。これらの工程は、ＰＣＲ（または逆転写酵素＋ＰＣＲ）技術における試薬および条件を使用して行われ得ることが、当業者によって理解される。様々なＰＣＲ技術が、例えば、“ＰＣＲ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇにより１９９２年に発行）に開示されている。
【００４７】
固体支持体上での核酸の等温増幅もまた、ＤＮＡコロニーを生じさせるために使用することができる（例えば、ＰＣＴ国際公開公報第０２／４６４５６号を参照のこと）。増幅されるＤＮＡフラグメントが環状である本発明の実施形態では、制限酵素を使用して環状ＤＮＡフラグメントを線状化する工程が、好ましくは、コロニー作製の前に行われる。１つの実施形態において、ＤＮＡコロニーが、下記の工程を含む方法によって、ＤＮＡ分子のサンプル（例えば、制限フラグメントのプール）から生じさせられる：
ｉ）サンプル中のＤＮＡ分子をコロニープライマーと混合する工程、ここで、それぞれのコロニープライマーはＤＮＡ分子の３’末端における配列に対してハイブリダイゼーション可能である配列を含み、コロニープライマーの濃度は結合されているＤＮＡ分子の増幅が生じ得るように調節されている；
ｉｉ）ＤＮＡ分子およびコロニープライマーを５’末端で固体表面に結合させて、固定化されたＤＮＡ分子および固定化されたコロニープライマーを生じさせる工程；
ｉｉｉ）固体表面における特定の位置にそれぞれが存在するコロニーが等温的に生じするように、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを含有する増幅溶液を固体表面に加える工程。
【００４８】
工程ｉｉ）における固定化された核酸の量により、作製され得る表面ユニットあたりのＤＮＡコロニーの平均的な数が決定される。固定化されるＤＮＡ分子の好ましい濃度の範囲は、好ましくは、コロニーテンプレートについては１ｎＭ〜０．０１ｎＭの間であり、コロニープライマーについては５０ｎＭ〜１０００ｎＭの間である。好ましい実施形態において、反応温度は、ポリメラーゼ活性について最適な温度であるように選ばれる。好ましい実施形態において、サンプル中のＤＮＡ分子は、サイズが約５０〜５０００塩基対の範囲にある。
【００４９】
本節に記載された方法において、様々なコロニーが表面上の分離された位置で生じる。表面上のコロニーの密度は、例えば、表面に固定化されるプライマーの密度を調節することによって制御することができる。好ましい実施形態において、コロニー密度は１０４〜６コロニー／ｃｍ２であり、より好ましくは１０７〜８コロニー／ｃｍ２以上である。コロニーのサイズもまた、実験条件を調節することによって制御することができる。好ましくは、コロニーは、その最大の長さが１０ｎｍ〜１００μｍであり、より好ましくは、その最大の長さが１００ｎｍ〜１０μｍである。
【００５０】
ＤＮＡコロニーは、その配列の少なくとも一部分を決定するために配列決定することができる。１つの実施形態において、配列決定は、適切なプライマー（これは本明細書中では「配列決定用プライマー」として示されることがある）をＤＮＡコロニー内の核酸分子とハイブリダイゼーションさせること、プライマーを伸張させること、およびプライマーを伸張させるために使用されたヌクレオチドを決定することによって行われる。好ましくは、それぞれのコロニーにおいてプライマーを伸張させるために使用されたヌクレオチドは、次のヌクレオチドが成長中の核酸鎖に付加される前に検出され、したがって、これにより、１塩基ずつその場での核酸配列決定を行うことができる。
【００５１】
取り込まれたヌクレオチドの検出は、１つ以上の標識されたヌクレオチドをプライマー伸張反応物に含めることによって容易になる。任意の適切な検出可能な標識を使用することができ、例えば、発蛍光団、放射能標識などを使用することができる。好ましくは、蛍光標識が使用される。この分野で知られている任意の蛍光標識を使用することができる。同じ標識または異なる標識をそれぞれの異なるタイプのヌクレオチドについて使用することができる。標識が発蛍光団であり、同じ標識がそれぞれの異なるタイプのヌクレオチドについて使用される場合、それぞれのヌクレオチドの取り込みにより、特定の波長で検出されるシグナルの累積的な増大がもたらされる。異なる標識が使用される場合、これらのシグナルを異なる適切な波長で検出することができる。好ましい実施形態において、同じタイプの標識ヌクレオチドおよび非標識ヌクレオチドの混合物がそれぞれのプライマー伸張工程のために使用される。
【００５２】
適切な配列決定用プライマーを配列決定される核酸テンプレートに対してハイブリダイゼーション可能とするために、核酸テンプレートは、通常、一本鎖の形態でなければならない。核酸コロニーを構成する核酸テンプレートが二本鎖の形態で存在する場合、核酸テンプレートは、この分野で広く知られている方法を使用して、例えば、変性、切断など（これらに限定されない）によって、一本鎖の核酸テンプレートを得るために処理することができる。
【００５３】
核酸テンプレートにハイブリダイゼーションし、かつプライマー伸張のために使用される配列決定用プライマーは、好ましくは、例えば、長さが１５ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドである短いオリゴヌクレオチドである。プライマーの配列は、配列決定される核酸テンプレートの一部分に、好ましくはストリンジェントな条件のもとでハイブリダイゼーションするように設計することができる。配列決定のために使用されるプライマーの配列は、核酸コロニーを生じさせるために使用されたコロニープライマーの配列と同じ配列または類似する配列を有してもよい。
【００５４】
核酸テンプレートおよび配列決定用プライマーを適切な条件（これは、この分野で広く知られている方法により決定される）に供することによって、配列決定用プライマーが配列決定される核酸テンプレートにアニーリングさせられると、プライマー伸張が、例えば、核酸ポリメラーゼおよびヌクレオチド（その少なくとも一部が、標識された形態で提供される）の供給、ならびに、適当なヌクレオチドが提供された場合にプライマー伸張させるために適当な条件を使用して行われる。使用され得るＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドは当業者には広く知られている。
【００５５】
好ましくは、それぞれのプライマー伸張工程の後には、その後の工程を妨害し得る、取り込まれなかったヌクレオチドを除くために、洗浄工程が含められる。プライマー伸張工程が行われた後、標識されたヌクレオチドが伸張されたプライマーに取り込まれているかどうかを決定するために、ＤＮＡコロニーを検出することができる。その後、プライマー伸張工程を、伸張されたプライマーに取り込まれた次のヌクレオチドおよび引き続くヌクレオチドを決定するために繰り返すことができる。
【００５６】
伸張されたプライマーに取り込まれている適切な標識（例えば、蛍光または放射能）の存在または非存在および好ましくはその量を検出することを可能にする任意の装置を、配列決定のために使用することができる。標識が蛍光標識である実施形態では、拡大装置（顕微鏡など）に取り付けられたＣＣＤカメラを使用することができる。
【００５７】
プライマー伸張の各工程の後でそれぞれのコロニーにおいて取り込まれているヌクレオチドの数および正体を決定するために、検出システムは、好ましくは分析システムと組み合わせて使用される。この分析は、それぞれのプライマー伸張工程の直後に、または記録されたデータを使用して後ほど行うことができるが、この分析により、所与のコロニー内の核酸テンプレートの配列を決定することが可能になる。
【００５８】
本発明の更なる実施形態においては、２つ以上の核酸の完全な配列または部分配列を、２つ以上の核酸コロニーに存在する核酸テンプレートの完全な配列または部分配列を決定することによって決定することができる。好ましくは、複数の配列が同時に決定され、核酸コロニーに加えられるヌクレオチドは、通常、分析を通して繰り返される選ばれた順序で加えられる（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）。
【００５９】
したがって、特定の核酸コロニーを構成する核酸テンプレートの完全な配列または部分配列が決定され得ることが理解され得る。
【００６０】
本発明の方法で使用されるプライマーおよびオリゴヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡであり、標準的な技術を使用して合成することができ、そして適するときには、標準的な方法を使用して検出可能に標識することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ、上掲）。本発明の方法において使用され得る検出可能な標識には、蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびローダミン）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法で使用される標識は、標準的な方法を使用して検出される。
【００６１】
本発明の方法はまた、アッセイを行うために必要とされる試薬を含有するキットの使用によって容易になり得る。キットは、（例えば、診断方法において使用される）単一制限フラグメントタグまたは（例えば、ゲノムマッピングにおいて使用される）複数の制限フラグメントタグの分析を行うための試薬を含有することができる。複数のサンプルが分析されるとき、複数組の適切なプライマーおよびオリゴヌクレオチドがキットで提供される。様々な方法を行うために要求されるプライマーおよびオリゴヌクレオチドに加えて、キットは、その方法で使用される酵素、および標識を検出するための試薬などを含有することができる。キットはまた、本発明の方法を行う際に使用される固体基板を含有することができる。例えば、キットは、ガラスプレートまたはシリコンもしくはガラスのマイクロチップなどの固体基板を含有することができる。
【００６２】
５．４．表現型に関連する制限配列タグを同定するための方法
各個体について得られる制限配列タグは、その後、所与の表現型の部分集団の中で比較され、すべての相同的なタグを同定し、かつ、相同的な制限配列タグの数を決定する。好ましい実施形態において、ＤＮＡコロニー内で得られた２つの制限配列タグにより、１組の制限フラグメントにおける対応する制限フラグメントの末端が表される。これらの２つのタグは、ゲノム上の互いに物理的に接近した位置に由来している。それぞれのタグはまた、より長い配列を得るためのゲノムＤＮＡの消化のために使用された制限酵素の制限部位の配列と組み合わせることができる。相同的なタグがグループ分けされる。１つの実施形態において、制限タグの１群は、相同性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９９％である制限タグからなる。別の実施形態では、特有な制限タグの１群は、相同性が１００％である制限タグからなる。部分集団について制限タグ群のコレクションは、表現型に関連する配列変化を同定するために使用することができる。１つの好ましい実施形態において、調べられている表現型は、集団における配列変化の割合に関連するか、または配列変化の組合せに関連する。１つの実施形態において、集団における１つ以上の特定の配列の割合、例えば、それぞれが２つの異なる集団の間で１０％以上、２０％以上、５０％以上、７０％以上または９０％以上異なる制限配列タグのそれぞれの１つ以上の特定の群における制限タグの相対的な数によって表されるような、集団における１つ以上の特定の配列の割合は、２つの集団の間で表現型差に関連しているとして同定される。別の好ましい実施形態では、表現型は、集団に由来する個体において見出される配列変化の特定の組合せに関連する。１つの実施形態において、集団における複数の特定の配列の割合の組合せ、例えば、複数の特定の制限配列タグ群における制限タグの数の組合せ（すなわち、複数の群における制限タグの総数）によって表されるような、集団における複数の特定の配列の割合の組合せは、割合のそのような組合せが２つの異なる集団の間で１０％以上、２０％以上、５０％以上、７０％以上または９０％以上異なるならば、２つの集団の間で表現型差に関連しているとして同定される。別の実施形態では、複数のそのような組合せが使用されて、表現型差を同定する。複数の組合せが使用される実施形態では、複数の組合せにおけるそれぞれの組合せは、複数の組合せにおける異なる組合せにもまた含まれる１つ以上の特定の配列を含むことができる。これらの実施形態は実施例６．３（下記）に例示される。
【００６３】
１つの実施形態において、制限配列タグは、制限配列タグのゲノム位置を特定するために、生物のゲノム配列と比較することができる。別の実施形態では、認識部位の両側でゲノムに隣接する制限配列タグが、生物のゲノム配列から同定される。
【００６４】
５．５．制限配列タグを得るための具体的な好ましい実施形態
制限配列タグを得るためのいくつかの好ましい実施形態が本節には記載される。これらの方法は、表現型に関連する配列変化を同定するために５．１節〜５．４節に記載された任意の方法とともに使用することができる。本節に記載される具体的な実施形態の１つ以上の任意の繰り返しおよび／または組合せもまた使用され得ることは、当業者には明らかである。
【００６５】
（Ｉ）第１の具体的な実施形態
好ましい実施形態において、本発明は、生物学的サンプルの制限配列タグを生じさせるための方法を提供する（図２Ａおよび図２Ｂ）。この方法では、１つ以上の第１の制限酵素が、生物学的サンプルから抽出された核酸を消化して、１組の制限フラグメントを生じさせるために使用される。１組の制限配列タグが、その後、下記の工程を含む方法によって１組の制限フラグメントから決定される：
１）１組の制限フラグメントにおける制限フラグメントを、第２の制限酵素の１つ以上の認識部位を含む所定の配列を含む第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の環状核酸フラグメントを得る工程、ここで、認識部位は第２の制限酵素が制限フラグメント内を切断するように配置され、かつ配向している；
２）第１の環状核酸フラグメントを第２の制限酵素で消化する工程；
３）第２の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にする工程；
４）第２の制限酵素により生じた末端を連結して、１組の第２の環状核酸フラグメントを作製する工程；および
５）第２の環状核酸における上記制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、１組の制限配列タグを決定する工程。
【００６６】
好ましくは、第１の操作された核酸における第２の制限酵素の認識部位のそれぞれは、第１の操作された核酸の末端の近くに存在する。１つの好ましい実施形態において、第１の操作された核酸における第２の制限酵素の認識部位のそれぞれは、第１の操作された核酸の末端から２０ヌクレオチド未満のところに存在する。より好ましくは、第１の操作された核酸における第２の制限酵素の認識部位のそれぞれは、第１の操作された核酸の末端から０〜５ヌクレオチドのところに存在する。好ましくは、第２の制限酵素はＩＩｓ型エンドヌクレアーゼである。好ましい実施形態において、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼは、その認識部位から５塩基以上、１０塩基以上、２０塩基以上、５０塩基以上、１００塩基以上または２００塩基以上のところを切断する。別の実施形態において、第２の環状核酸フラグメントは、例えば、１組の第３の制限フラグメントを得るために、第１および第２の制限酵素とは異なる第３の制限酵素を使用することによって線状化することができる。好ましい実施形態において、この方法は更に、第１の操作された核酸に見出されるプライマーを使用して第３の制限フラグメントを増幅する工程を含む。別の好ましい実施形態において、第３の制限酵素で消化し続いて増幅する工程は、第２の環状核酸フラグメントを増幅する工程によって置き換えることができる。
【００６７】
好ましい実施形態において、第２の環状核酸フラグメントを固定および増幅する工程が工程５）の前に行われる。より好ましい実施形態では、固定および増幅は、５．３節に記載されたＤＮＡコロニー法のいずれか１つによって行われる。更により好ましい実施形態では、配列決定が、５．３節に記載された１塩基ずつのプライマー伸張法のいずれかによって行われる。
【００６８】
本発明の更に他の好ましい実施形態において、上記第２の制限フラグメントの上記末端を修飾する工程は、末端が連結されるために平滑であるように、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記第２の制限フラグメントの末端を充填するか、または上記第２の制限フラグメントの突き出たヌクレオチドを除くことによって行われる。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、各工程の後で、精製工程および／またはＤＮＡ単離工程を含む。
【００７０】
更に他の好ましい実施形態において、１組の制限フラグメントにおける小さいゲノムＤＮＡ配列がある程度連結され、プラスミドに挿入され、バクテリアにクローン化され、そして、バクテリアはアガロースプレートに蒔かれ、それぞれの個々のバクテリアコロニーのプラスミドが単離され、そして、自動化されたキャピラリー配列決定装置を用いたサンガー配列決定を使用して配列決定される。バクテリアクローニング工程を使用しない他の方法もまた、当業者には知られている。例えば、第１の操作された核酸は、第３の核酸フラグメントがビーズ上での分子クローニングのために使用され、かつ１塩基ずつ配列決定され得るように、コンビナトリアル配列タグを含むことができる。
【００７１】
（ＩＩ）第２の具体的な実施形態
別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルの制限配列タグを生じさせるための方法を提供する（図３Ａおよび図３Ｂ）。この方法では、第１の制限酵素が、生物学的サンプルから抽出された核酸を消化して、１組の制限フラグメントを生じさせるために使用される。第１の制限酵素は、切断部位が認識部位の一部でない配列の一部を含むような様式で、その認識部位の両側で切断する。この目的のために使用され得る制限酵素には、ＢａｅＩ、ＢｃｇＩ、ＢｓａXＩが含まれるが、これらに限定されない。１組の制限配列タグが、その後、下記の工程を含む方法によって１組の制限フラグメントから決定される：
１）第１の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にする工程；
２）１組の制限フラグメントにおける制限フラグメントを、所定のヌクレオチド配列を含む第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の環状核酸フラグメントを得る工程；および
３）第１の環状核酸における制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、１組の制限配列タグを決定する工程。
【００７２】
好ましい実施形態において、第１の環状核酸フラグメントを固定および増幅する工程が工程３）の前に行われる。より好ましい実施形態では、固定および増幅は、５．３節に記載されたＤＮＡコロニー法のいずれか１つによって行われる。更により好ましい実施形態では、配列決定が、５．３節に記載された１塩基ずつのプライマー伸張法によって行われる。
【００７３】
本発明の更に他の好ましい実施形態において、上記第２の制限フラグメントの上記末端を修飾する工程は、末端が連結されるために平滑であるように、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記第２の制限フラグメントの末端を充填するか、または上記第２の制限フラグメントの突き出たヌクレオチドを除くことによって行われる。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、各工程の後で、精製工程および／またはＤＮＡ単離工程を含む。
【００７５】
（ＩＩＩ）第３の具体的な実施形態
更に別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプルの制限配列タグを生じさせるための方法を提供する（図４Ａおよび図４Ｂ）。この方法では、１つ以上の第１の制限酵素が、生物学的サンプルから抽出された核酸を消化して、１組の制限フラグメントを生じさせるために使用される。１組の制限配列タグが、その後、下記の工程を含む方法によって１組の制限フラグメントから決定される：
１）１組の制限フラグメントにおける上記制限フラグメントを第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の核酸フラグメントを得る工程、ここで、第１の操作された核酸は第２の制限酵素の認識部位を含む所定のヌクレオチド配列を含み、認識部位は第２の制限酵素が制限フラグメント内を切断するように配置され、かつ配向している；
２）第１の核酸フラグメントを第２の制限酵素で消化する工程；
３）第２の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にする工程；
４）第２の制限酵素により生じた末端を、所定のヌクレオチド配列を含む第２の操作された核酸と連結して、第２の核酸フラグメントを作製する工程；および
５）第２の核酸フラグメントにおける制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、１組の制限配列タグを決定する工程。
【００７６】
好ましくは、第１の操作された核酸における第２の制限酵素の認識部位は、第１の操作された核酸の末端の近くに存在する。１つの好ましい実施形態において、第１の操作された核酸における第２の制限酵素の認識部位は、第１の操作された核酸の末端から２０ヌクレオチド未満のところに存在する。より好ましい実施形態では、第１の操作された核酸における第２の制限酵素の認識部位は、第１の操作された核酸の末端から０〜５ヌクレオチドのところに存在する。好ましくは、第２の制限酵素はＩＩｓ型エンドヌクレアーゼである。好ましい実施形態において、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼは、その認識部位から５塩基以上、１０塩基以上、２０塩基以上、５０塩基以上、１００塩基以上または２００塩基以上のところを切断する。
【００７７】
好ましい実施形態において、第２の核酸フラグメントを固定および増幅する工程が工程５）の前に行われる。より好ましい実施形態では、固定および増幅は、５．３節に記載されたＤＮＡコロニー法のいずれか１つによって行われる。更により好ましい実施形態では、配列決定が、５．３節に記載された１塩基ずつのプライマー伸張法によって行われる。
【００７８】
本発明の更に他の好ましい実施形態において、上記第２の制限フラグメントの上記末端を修飾する工程は、末端が連結されるために平滑であるように、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、上記第２の制限フラグメントの末端を充填するか、または上記第２の制限フラグメントの突き出たヌクレオチドを除くことによって行われる。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、各工程の後で、精製工程および／またはＤＮＡ単離工程を含む。
【００８０】
（ＩＶ）第４の具体的な実施形態
更に別の好ましい実施形態において、本発明は、生物学的サンプルの制限配列タグを生じさせるための方法を提供する（図５Ａおよび図５Ｂ）。この方法では、１つ以上のレアカッターが、生物学的サンプルから抽出された核酸を消化して、１組の制限フラグメントを生じさせるために使用される。好ましくは、６塩基、８塩基または８塩基超の認識配列を認識するレアカッターが使用される。１組の制限配列タグが、その後、下記の工程を含む方法によって１組の制限フラグメントから決定される：
１）１組の制限フラグメントにおける制限フラグメントを、所定のヌクレオチド配列を含む第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の核酸フラグメントを得る工程；
２）第１の核酸フラグメントを１つ以上の第２の制限酵素で消化して、第２の制限フラグメントを得る工程、ここで、第２の制限酵素は第１の制限酵素とは異なっており、第１の操作された核酸内を切断しない；
３）第２の制限フラグメントの末端を、所定のヌクレオチド配列を含む第２の操作された核酸と連結して、１組の第２の核酸フラグメントを作製する工程；および
４）第２の核酸フラグメントにおける制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、１組の制限配列タグを決定する工程。
【００８１】
好ましい実施形態において、第１および第２の制限酵素による消化は、第１および第２の操作されたフラグメントとの連結の前に同時に行われる。
【００８２】
好ましい実施形態において、第２の核酸フラグメントを固定および増幅する工程が工程４）の前に行われる。より好ましい実施形態では、固定および増幅は、５．３節に記載されたＤＮＡコロニー法のいずれか１つによって行われる。更により好ましい実施形態では、配列決定が、５．３節に記載された１塩基ずつのプライマー伸張法によって行われる。
【００８３】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、各工程の後で、精製工程および／またはＤＮＡ単離工程を含む。
【００８４】
（Ｖ）他の具体的な実施形態
本発明はまた、生物学的サンプルの制限配列タグを生じさせるための方法を提供する。そのような方法では、１つ以上の第１の制限酵素が、生物学的サンプルから抽出された核酸を消化して、１組の制限フラグメントを生じさせるために使用される。複数の異なる第２の制限酵素が、その後、制限フラグメントを更に消化するために使用される。そのような方法により、第１の制限酵素の認識部位の近くに存在する制限配列タグの数を更に増大させることが可能になる。
【００８５】
１つの好ましい実施形態（図６Ａおよび図６Ｂ）において、第１の制限酵素による消化の後、１組の制限配列タグが、下記の工程を含む方法によって１組の制限フラグメントから決定される：
１）１組の制限フラグメントにおける上記制限フラグメントを、所定のヌクレオチド配列を含む第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の核酸フラグメントを得る工程；
２）第１の核酸フラグメントを第２の制限酵素で消化して、第２の制限フラグメントを得る工程、ここで、第２の制限酵素は第１の制限酵素とは異なっており、第１の操作された核酸内を切断しない；
３）第２の制限フラグメントの末端を、所定のヌクレオチド配列を含む第２の操作された核酸と連結して、１組の第２の核酸フラグメントを作製する工程；および
４）第２の核酸フラグメントにおける制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、１組の制限配列タグを決定する工程。
【００８６】
別の好ましい実施形態（図７Ａおよび図７Ｂ）において、第１の制限酵素による消化の後、１組の制限配列タグが、下記の工程を含む方法によって１組の制限フラグメントから決定される：
１）１組の制限フラグメントにおける制限フラグメントを第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の環状核酸フラグメントを得る工程、ここで、第１の操作された核酸は、第２の制限酵素の認識部位と第３の制限酵素の２つの認識部位とを含む所定のヌクレオチド配列を含み、第２の制限酵素の認識部位は第３の制限酵素の認識部位の間に存在し、第３の制限酵素の認識部位は第３の制限酵素が制限フラグメント内を切断するように配置され、かつ配向し、第２の制限酵素および第３の制限酵素は互いに異なる；
２）第１の核酸フラグメントを第２の制限酵素で消化して、１組の第２の制限フラグメントを得る工程；
３）第２の制限フラグメントの末端を連結して、１組の第２の環状核酸フラグメントを作製する工程；および
４）第３の環状核酸フラグメントにおける制限フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定して、１組の制限配列タグを決定する工程。
【００８７】
好ましくは、この方法は更に、工程３）の後に、３ｉ）第２の環状核酸フラグメントを第３の制限酵素で消化して、１組の第３の核酸フラグメントを作製する工程；３ｉｉ）第３の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にする工程；および、３ｉｉｉ）第３の核酸フラグメントを連結して、１組の第３の環状核酸フラグメントを作製する工程を含む。好ましくは、第１の操作された核酸における第３の制限酵素の認識部位は、第１の操作された核酸の末端の近くに存在する。１つの好ましい実施形態において、第１の操作された核酸における第３の制限酵素の認識部位のそれぞれは、第１の操作された核酸の末端から２０ヌクレオチド未満のところに存在する。より好ましい実施形態では、第１の操作された核酸における第３の制限酵素の認識部位のそれぞれは、第１の操作された核酸の末端から０〜５ヌクレオチドのところに存在する。好ましくは、第３の制限酵素はＩＩｓ型エンドヌクレアーゼである。好ましい実施形態において、ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼは、その認識部位から５塩基以上、１０塩基以上、２０塩基以上、５０塩基以上、１００塩基以上または２００塩基以上のところを切断する。
【００８８】
更に別の好ましい実施形態（図８Ａおよび図８Ｂ）において、第１の制限酵素による消化の後、１組の制限配列タグが、下記の工程を含む方法によって１組の制限フラグメントから決定される：
１）１組の制限フラグメントにおける制限フラグメントを第１の操作された核酸と連結して、１組の第１の核酸フラグメントを得る工程、ここで、第１の操作された核酸は、第１の制限酵素とは異なる第２の制限酵素の認識部位を含む所定のヌクレオチド配列を含む；
２）第１の核酸フラグメントを第２の制限酵素で消化して、１組の第２の制限フラグメントを得る工程；
３）第２の制限フラグメントの末端を連結して、１組の第１の環状核酸フラグメントを作製する工程；および
４）第４の核酸フラグメントのそれぞれの少なくとも一部分を配列決定し、それにより１組の制限配列タグを決定する工程。
【００８９】
好ましくは、この方法は更に、工程３）の後に、３ｉ）第１の環状核酸フラグメントを第３の制限酵素で消化して、１組の第３の核酸フラグメントを作製する工程、ここで、第３の制限酵素は第１および第２の制限酵素とは異なる；３ｉｉ）上記第３の制限酵素により生じた末端を修飾して、連結を可能にする工程；および、３ｉｉｉ）第３の核酸フラグメントを連結して、１組の第２の環状核酸フラグメントを作製する工程を含む。
【００９０】
そのような実施形態の場合、第１の制限酵素により生じた１組の制限フラグメントは、複数の異なる第２の制限酵素のそれぞれで別々に更に消化されることが好ましい。より好ましくは、複数の異なる第２の制限酵素は、少なくとも３個、５個、１０個または２０個の異なる制限酵素を含む。
【００９１】
好ましい実施形態において、第１の環状核酸フラグメントを固定および増幅する工程が配列決定工程の前に行われる。より好ましい実施形態では、固定および増幅は、５．３節に記載されたＤＮＡコロニー法のいずれか１つによって行われる。更により好ましい実施形態では、配列決定が、５．３節に記載された１塩基ずつのプライマー伸張法によって行われる。
【００９２】
本発明の更に別の好ましい実施形態において、第２の制限フラグメントの末端を修飾する工程は、末端が連結されるために平滑であるように、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、第２の制限フラグメントの末端を充填するか、または第２の制限フラグメントの突き出たヌクレオチドを除くことによって行われる。
【００９３】
別の好ましい実施形態において、本発明の方法は、各工程の後で、精製工程および／またはＤＮＡ単離工程を含む。
【００９４】
そのような実施形態により、第１の制限タグが第１の制限酵素認識部位の隣に存在し、第２の制限タグが第２の制限酵素認識部位の隣に存在するそれぞれの第１の制限フラグメント部分に含まれる２つの制限配列タグを同定すること、そして、第１および第２の制限配列タグが、同じ第１の制限フラグメントに由来する対になった制限配列タグであるという情報を保存することが可能になる。
【００９５】
制限配列タグは、配列相同性によって、そして、可能であるならば、同じ第１の制限配列タグを含有する対になった制限配列タグを更にグループ分けすること、および、グループ分けされた対になった制限配列タグからの第２の制限タグが、所与の第１の制限酵素認識部位の近く、所与の第１の制限酵素認識部位の同じ側に、物理的に存在するという情報を保存することによってグループ分けすることができる。本発明の好ましい実施形態において、ゲノム配列が利用できる場合、第１の制限酵素の認識部位の両側にゲノム上に存在する隣接制限配列タグを同定するためにマッピングすることによって制限配列タグをクラスター化する更なる工程が提供される。
【実施例】
【００９６】
下記の実施例は、本発明の例示として示され、したがって、本発明を限定することは決して意図されない。
【００９７】
６．１．実施例１  ＤＮＡコロニーテンプレートの調製：二重制限配列タグ
本実施例では、ＤＮＡタグのインビトロ作製のためにベクターを操作することが例示される。ゲノムＤＮＡに由来する制限配列タグを生じさせる実施形態が図９Ａに示される。本実施例では、２つのＢｓｍＦＩ部位の間に位置するＤＮＡクローニング部位を有するプラスミドベクターが利用された。このベクターは、そのサイズが小さいために選ばれたｐＵＣ１９プラスミドに基づいている。
【００９８】
１）クローニングベクターの第１の作製
最初に作製されたクローニングベクターは、単一の制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡとともに使用するために設計された。本実施例では、バクテリオファージλのゲノムＤＮＡが、制限配列タグの作製を実際に示すために使用された。
【００９９】
ベクターの２つの変異体が、合成リンカーをｐＵＣ１９にクローン化することによって作製された。第１の変異体において、ベクターは下記のインサートを含む：
ＢｓｍＦＩ  ＢａｍＨＩ    ＢｓｍＦＩ
ＧＧＧＡＣ  ＧＧＡＴＣＣ  ＧＴＣＣＣ  （配列番号１）
ＣＣＣＴＧ  ＣＣＴＡＧＧ  ＣＡＧＧＧ  （配列番号２）
【０１００】
これは、Ｓａｕ３ＡＩで消化されたλＤＮＡの、２つのＢｓｍＦＩ部位が隣接するＢａｍＨＩ制限部位へのクローニングを可能にする。ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位はベクターから事前に除去された。
【０１０１】
第２の変異体において、ベクターは、２つの隣接したＢｓｍＦＩ部位によって形成されるＡａｔＩＩ制限部位（下線）を有するインサートを含む：
ＢｓｍＦＩ  ＢｓｍＦＩ
ＧＧＧＡＣ  ＧＴＣＣＣ（配列番号３）
ＣＣＣＴＧ  ＣＡＧＧＧ（配列番号４）
ＡａｔＩＩ
【０１０２】
これは、ＴａｉＩで消化されたλＤＮＡのベクターへのクローニングを可能にする。ｐＵＣ１９のＡａｔＩＩ部位はベクターから事前に除去された。
【０１０３】
最初に作製されたベクターはともに、空ベクターの自己連結（セルフライゲーション）を防ぐために、使用前に脱リン酸化された。λＤＮＡフラグメントを連結した後、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびリガーゼを使用して両方のＤＮＡ鎖の完全性を修復した。
【０１０４】
下記には、使用された工程（これらはまた、更に作製されるベクターについても共通している）が要約される：
ｉ）１回目の連結
ｉｉ）加熱によるＴ４ＤＮＡリガーゼの不活性化
ｉｉｉ）ＢｓｍＦＩによる消化
ｉｖ）クレノウ酵素およびｄＮＴＰｓによるＤＮＡ末端の充填
ｖ）加熱によるＢｓｍＦＩの不活性化
ｖｉ）２回目の連結反応
【０１０５】
インビトロでの制限配列タグ作製の下記のプロトコルが本実施例では使用された：
１回目の連結
０．１μｇの、適切な酵素により切断されたバクテリオファージλのゲノムＤＮＡ
０．０５μｇの線状ベクター（アガロースゲルにより精製）
１ｍＭのＡＴＰ
１×緩衝液ＮＥＢ４
１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs、４００ｕ／μｌ）
総体積１０μｌ、室温で２時間インキュベーションする。
６５℃で２０分間加熱することによって、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを不活性化する。
【０１０６】
ＢｓｍＦＩ消化
下記を含有する５μｌの溶液を添加する：
１×緩衝液ＮＥＢ４
０．５μｌのＢｓｍＦＩ（New England Biolabs、２ｕ／μｌ）。
６５℃で２時間インキュベーションする。
【０１０７】
クレノウ処理
下記を含有する５μｌの溶液を添加する：
１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ用緩衝液（New England Biolabs）
１００μＭのｄＮＴＰｓ
０．５μｌのクレノウフラグメント（New England Biolabs、５ｕ／μｌ）。
室温で５分間インキュベーションする。
８０℃で２０分間加熱することによって、酵素を不活性化する。
【０１０８】
２回目の連結
下記を含有する等量の溶液を添加する：
１×ＭＳＬ緩衝液
２ｍＭのＡＴＰ
２０％のＰＥＧ６０００
１０％（ｖ／ｖ）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs、４００ｕ／μｌ）
１６℃で一晩インキュベーションする。
【０１０９】
上記プロトコルでは、分子内連結が低塩中ではより効率的であるので、最少塩類連結（ＭＳＬ）緩衝液が使用された。ＭＳＬ緩衝液の組成を下記に示す：
【０１１０】
【表１】
2005518811.tif 000003
【０１１１】
インビトロ連結生成物の分析がＰＣＲによって行われた。正しいサイズの２つのλＤＮＡの制限配列タグがベクター中に存在するならば、１３４ｂｐの増幅産物が形成される。これよりも小さなサイズの増幅産物が、例えば、ベクターに１つだけタグが挿入されること、タグを全く含まない空ベクター、または、空ベクターのＢｓｍＦＩ消化の後での自己連結によって形成され得る。
【０１１２】
ＰＣＲ産物の長さ分析が、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ５００チップまたはＤＮＡ１０００チップを使用して行われた。コンピテントな大腸菌細胞にインビトロ連結生成物を形質転換するためのインビトロ連結生成物を調べる別の方法には、個々のコロニーから単離されたプラスミドの分析が続いた。ベクターへのλＤＮＡの１回目の連結の生成物が分析されたとき、種々の長さのＤＮＡフラグメントがベクターに挿入された結果として複数のピークが観察された（図９Ｂ）。
【０１１３】
２回目の連結の生成物が分析されたとき、予想されたサイズのフラグメントが、より小さなフラグメントとともに存在した（図９Ｃ）。
【０１１４】
最初に作製されたベクターは、予想されたサイズを有する２つの制限配列タグへのλゲノムＤＮＡのサイズ標準化を可能にするが、望ましくない生成物がいくつか検出された。その原因は、おそらくは、１回目の連結反応のときのベクターの自己連結であると考えられる。これは、不完全な脱リン酸化の結果として起こり得るか、または、脱リン酸化された塩基をベクターの末端から除去することができるＤＮＡポリメラーゼＩ処理によって誘導され得る。この問題は、単一制限配列タグを用いた実施例において例示されるように、ゲノムＤＮＡフラグメントの部分的充填によって克服することができる。例えば、ＢａｍＨＩ部位をｄＧＴＰで部分的に充填することができる。
【０１１５】
あるいは、ベクターは、ＢａｍＨＩ部位をＢｇｌＩＩ部位で置き換えることによって設計することができる。ＢａｍＨＩゲノムフラグメントをＢｇｌＩＩ制限酵素の存在下でＢｇｌＩＩ消化ベクターに連結することにより、ベクターの自己連結が防止される。ベクター−インサートの予想される連結生成物のみがＢｇｌＩＩ部位を抑制し、従って、消化に抵抗する。
【０１１６】
ＢｓｍＦＩ酵素が単純な構築物において評価された。最初に作製されたベクターのＢａｍＨＩ部位に２０００ｂｐのＤＮＡインサートを含有する環状プラスミドが、ＢｓｍＦＩ（インサート内に存在しない部位）を使用して消化され、結合したＤＮＡタグを含有するベクターの３０００ｂｐのバンドがアガロースゲルから単離された。このＤＮＡは、平滑末端を生じさせるためにクレノウ酵素およびｄＮＴＰｓにより処理され、そして２回目の連結のためにＴ４リガーゼで処理された。図９Ｄに示される結果は、１３３ｂｐの予想されるサイズよりも小さいフラグメントのバンドが存在しないことを示している。より大きなサイズのフラグメントの余分のバンドは、その後の実験では観察されなかったので、ＰＣＲの人工産物であると考えられる。
【０１１７】
この実験は、ＢｓｍＦＩ酵素がその誤りのない距離で正確に切断し、タグの作製が首尾良く行われ得ることを示している。２つの制限配列タグの連結を可能にするために平滑末端を生じさせる代替法は、２つの制限配列タグの間にリンカーを挿入することである。
【０１１８】
別の選択肢は、ベクター−インサート−リンカー系を逆にすることである。１回目の連結により、ゲノムＤＮＡフラグメントが、リンカー（これは、ＤＮＡコロニーの線状化のために有用であり、かつ、それぞれのＤＮＡコロニーにおいて増幅されるＤＮＡの両方の鎖の配列決定を可能にする、唯一の切断部位を含有する）と連結される。ＩＩＳ型酵素による消化の後、「ベクター」アームが、ＩＩＳ型酵素によって切断された末端に連結される。
【０１１９】
２）第２の作製ベクター
第２の作製ベクターは、２つの異なる酵素をクローニングのために使用して、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメントの平均サイズの更なる削減を可能にし、かつ、空ベクターの自己連結を回避するために設計された。アガロースゲル上で、完全に切断されたプラスミドを部分消化プラスミドから分離することを容易にするために、１０００ｂｐのＤＮＡフラグメント（これはＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔプラスミドｐＢＳＫに由来する）が未処理ベクターの制限部位の間に含められた。脱リン酸化およびＤＮＡポリメラーゼＩ処理は第２の作製ベクターには必要とされない。
【０１２０】
未処理ベクターは図１０Ａに示されるようなインサートを含有するが、そのインサートはクローニングのためにＳｐｈＩ制限部位およびＡｃｃＩ制限部位の使用を可能にする。ｐＵＣ１９プラスミドのそれ自身のＳｐｈＩ部位およびＡｃｃＩ部位は除去された。３’突出末端がＳｐｈＩ消化によって形成されるため、空のベクターは、突出部がクレノウ酵素によって完全に除去されない限り、自己連結することができない。２つの異なる酵素によって消化されたＤＮＡを第２の作製ベクターに挿入することができる。図１０Ａには、クローニングのいくつかの可能性が示される。
【０１２１】
ＳｐｈＩ−ＡｃｃＩで開環されたベクターへの、ＭｓｐＩおよびＳｐｈＩにより消化されたλＤＮＡのインビトロ連結が行われた。２回目の連結の生成物の分析は、図１０Ｂに示されるように、正しいサイズの単一のバンドだけが存在することを示した。２回目の連結の生成物が大腸菌細胞に形質転換された。３０個のコロニーを液体培養液に播種した。最も高い密度を有する細菌培養物に由来する１２個のプラスミドが分析された。空ベクターに対応するプラスミドは観察されなかった。インサートサイズの変動が２塩基を超えるプラスミドは観察されなかった。
【０１２２】
同様の実験を、ＨｉｎｃＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたベクターに挿入された、ＡｌｕＩおよびＳｐｈＩで消化されたλＤＮＡを用いて行った（ＡｌｕＩおよびＨｉｎｃＩＩは平滑末端を生じさせる）。図１０Ｃには、１回目の連結の生成物の分析結果が示される。λＤＮＡに由来する種々のサイズのフラグメントが、予想されたように、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップを使用した分析によって観察された。非常に大きいピークはサイズマーカーである。図１０Ｄには、２回目の連結の生成物の分析結果が示される。予想されたサイズである単一のフラグメントのみが、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップを使用した分析によって観察された。
【０１２３】
６．２．実施例２  ＤＮＡコロニーテンプレートの調製：単一制限配列タグ
本実施例では、図４Ａに示されるように、遺伝子型決定されるＤＮＡサンプルに由来する単一制限配列タグをそれぞれが含有するＤＮＡコロニーテンプレートの調製が例示される。可変性のフラグメント（すなわち、制限配列タグ）はＤＮＡコロニーテンプレートのサイズの６％未満を表わすので、このプロトコルのサイズ標準化工程により、すべてのＤＮＡコロニーの効率的かつ同程度の増幅が確実になる。ＤＮＡコロニーベクターへの挿入は、ＤＮＡコロニーテンプレートを生じさせるための汎用配列を付加することを可能にする。
【０１２４】
本実施例で使用されたインビトロクローニングの一般的な戦略が図１１Ａ〜図１１Ｂに示される。簡単に記載すると、短い二本鎖アダプター（これは「短いアーム」と呼ぶ）は、増幅プライマーＰｘと、それに続く、ＩＩｓ型制限酵素ＭｍｅＩの認識部位を形成するヘキサヌクレオチドＴＣＣＧＡＣとからなる。オリゴヌクレオチドの５’末端には、切断可能なジスルフィド結合を介して結合したビオチン部分が含まれる。相補鎖は５’がリン酸化されており、そして、最初の制限酵素によって消化されたＤＮＡの粘着末端と適合し得る伸長したヌクレオチドを含有する。短いアームは、対応するエンドヌクレアーゼで切断されたＤＮＡと連結され、ＩＩＳ型酵素のＭｍｅＩで更に処理される。これにより、２０ｂｐのＤＮＡフラグメントが短いアームに結合されたままになる。結合体は、その後、ストレプトアビジンビーズを使用して他のＤＮＡフラグメントから精製され、別の増幅プライマーＰｙを含有する「長いアーム」に連結される。
【０１２５】
このクローニング方針が、６ｂｐの配列を認識するエンドヌクレアーゼ（ＨｉｎｄＩＩＩ）によるＤＮＡ切断に基づくときでさえ、ＤＮＡを第２の高頻度切断酵素（４ｂｐの認識部位、ＲｓａＩ）で消化することは、ＤＮＡフラグメントの平均サイズを減少させるために好ましい。
【０１２６】
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＲｓａＩで消化されたλファージＤＮＡからのテンプレートの調製プロトコル、ならびに種々の生じた工程が下記に要約される：
ｉ）λゲノムＤＮＡの消化
ｉｉ）短いＰｘアームへの連結
ｉｉｉ）ＭｍｅＩによる消化
ｉｖ）Ｐｘアーム−タグ結合体の精製
ｖ）Ｐｙアームの結合
ｖｉ）最終のＤＮＡコロニーテンプレートの精製
【０１２７】
本実施例で使用されたそれぞれの個々の工程に対するプロトコルを以下に詳しく記載する。
【０１２８】
ｉ）バクテリオファージλのゲノムＤＮＡの消化
【０１２９】
λゲノムＤＮＡがＨｉｎｄＩＩＩおよびＲｓａＩの両方で消化される。
【０１３０】
１０μｌのλバクテリオファージＤＮＡ（New England Biolabs、０．５μｇ／μｌ）を、５μｌの緩衝液Ｙ＋／Ｔａｎｇｏ（Fermentas）；３２．５μｌの水；１．２５μｌのＨｉｎｄＩＩＩ（New England Biolabs）；１．２５μｌのＲｓａＩ（New England Biolabs）と混合する。
【０１３１】
３７℃で２時間〜１６時間にわたってインキュベーションする。
【０１３２】
これにより、４２ｆｍｏｌ／μｌのＨｉｎｄＩＩＩ末端を含有するλファージＤＮＡの１００ｎｇ／μｌの溶液が得られる。
【０１３３】
ｄＡＴＰを用いたＨｉｎｄＩＩＩ突出部の部分的充填
【０１３４】
種々のプロトコルを使用して、λゲノムフラグメントの自己連結および短いアームの自己連結を防止しながら、λゲノムＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ末端と短いアームベクターとの連結を最大にすることができる。
【０１３５】
ＨｉｎｄＩＩＩ末端の自己連結を防止するための最適な方法は、ｄＡＴＰで一塩基充填する工程であることが発見された。短いアームのフラグメントはまた、ゲノムＤＮＡフラグメントの部分的に充填されたＨｉｎｄＩＩＩ末端と適合し得るように設計されなければならない。
【０１３６】
ＨｉｎｄＩＩＩ末端の充填：
２０μｌのＨｉｎｄＩＩＩ−ＲｓａＩ消化されたλゲノムＤＮＡを、２μｌの１０ｍＭ  ｄＡＴＰ；１μｌのクレノウ酵素（New England Biolabs、５ｕ／μｌ）と混合する。
【０１３７】
２５℃で３０分間、次いで７０℃で２０分間インキュベーションする。
【０１３８】
ｉｉ）短いアーム部分への連結
この連結反応中は、短いアームの二量体の形成を防止するために（または溶液からそれらを排除するために）注意しなければならない。そのような二量体は、ＭｍｅＩによる部分消化の後に形成され、短いアームのクローン化されたフラグメントを含有する正しいサイズのテンプレートを生じさせることができる。
【０１３９】
上記のように、部分的に充填されたＤＮＡ末端に対して相補的な非回文構造の突出部を含有する短いアームの使用は、好ましい方法である。あるいは、ジデオキシ塩基をその３’末端に含有する短いアームを使用することができる。ＭｍｅＩは、ニックが認識部位の直後に存在する場合、ＤＮＡを切断することができる。リン酸化されていない短いアームの使用は別の選択肢である。
【０１４０】
このクローニング工程は、ｄＡＴＰで充填されたＨｉｎｄＩＩＩ末端よりも１０倍モル過剰の短いアームを使用することによって行われる。
【０１４１】
短いアームの調製：
１０μＭのビオチン化オリゴＳｈｏｒｔ−Ａ  ５’−ＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＧＡＣ−３’（配列番号９）の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液１０μｌを、１０μＭのオリゴＳｈｏｒｔ−Ｂ  ５’−ＧＣＴＧＴＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号１０）の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液１０μｌと混合する。オリゴＳｈｏｒｔ−Ａは、ビオチンとその５’末端との間に切断可能なジスルフィド架橋を含有する。
【０１４２】
８０℃まで加温し、３０分間かけて室温までゆっくり冷却する。
【０１４３】
連結：
ゲノムＤＮＡ混合物の部分的に充填されたＨｉｎｄＩＩＩ末端に、３μｌの１０ｍＭのリボＡＴＰ；４μｌの５μＭの短いアーム；１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs、４００ｕ／μＬ）を加えて、１６℃で１時間インキュベーションする。
【０１４４】
Qiagen MiniElute Reaction Clean Upのプロトコルに従ってＤＮＡ精製を進める。１２μｌの緩衝液ＥＢで溶出し、また、５μｌの新しく調製された緩衝液ＥＢを使用して、チューブを変えることなく溶出を繰り返す。
【０１４５】
これらの連結条件のもとでは、ＲｓａＩにより生じた平滑末端の連結によるゲノムＤＮＡフラグメントの顕著な多量体化は認められない。
【０１４６】
Ｔ４リガーゼを熱不活性化することの代わりにQiagen Mini Eluteカラムを使用するサンプルの精製は、非連結アームの大部分を除去するために好ましい。二度の溶出は反応生成物の回収を増大させることができる。
【０１４７】
ｉｉｉ）ＭｍｅＩ消化
ＭｍｅＩによる効果的な消化は、テンプレートの収率を決定する重要な工程である。この酵素は、１μｇのＤＮＡあたり１ユニット〜２ユニットを超えない比率で使用しなければならない。New England Biolabsによれば、過剰の酵素はエンドヌクレアーゼの切断を妨害する。
【０１４８】
サンプル混合物に、２μｌの緩衝液Ｙ＋／Ｔａｎｇｏ（Fermentas）；２μｌの１ｍＭのＳＡＭ；１μｌ（２ｕ）のＭｍｅＩ（New England Biolabs）を加える。
【０１４９】
３７℃で１時間インキュベーションする。
【０１５０】
ｉｖ）ストレプトアビジンビーズへの結合／遊離
製造者の情報では、ＤＮＡをビーズに結合させるためには３０分の時間が十分であることが示されているが、一晩のインキュベーションにより、生成物の収率が強く増大する。２００ｍＭのＤＴＴによるジスルフィド結合の切断およびＤＮＡの遊離は３０分で完了する。この工程の後、所望される生成物（５０ｂｐ）の収率およびＭｍｅＩ消化の効率を分析することは有用である。未消化生成物は大きなＤＮＡフラグメントとして観察される。
【０１５１】
ＳＡビーズへの結合／遊離：
２０μｌの２×Ｂ＆Ｗ緩衝液（これはＤｙｎａｌのプロトコルに従って調製）に１０μｌの洗浄したＳＡ２８０ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を加えて再懸濁した。
【０１５２】
撹拌しながら室温で一晩インキュベーションする。ビーズを４０μｌの１×Ｂ＆Ｗ緩衝液で２回洗浄する。ビーズを４０μｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２回洗浄する。ビーズに、２００ｍＭのＤＴＴを含む８０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）の１１μｌを加える。
【０１５３】
撹拌しながら室温で３０分間インキュベーションする。
【０１５４】
ビーズから上清を分離し、ビーズを廃棄する。必要な場合には、１μｌの上清をＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップで分析する。
【０１５５】
ｖ）長いアーム部分の連結
この連結は、ＭｍｅＩ連結によってノムＤＮＡ中に生じた３’突出部に存在するランダムな２塩基を認識することに基づいている。これらの２塩基が変性されているとき、そのような連結は遅い反応であり、増大した濃度の酵素を必要とする（New England Biolabs、ＭｍｅＩに関する情報ノート）。
【０１５６】
長いアームの調製：
直ちに使用可能なＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むチューブに、１９μｌの水；１μｌの１ｎｇ／μｌのｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ（５７１〜８７０の領域が増幅される）；２．５μｌの１０μＭのオリゴＬｏｎｇ−Ａ  ５’−ＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴＧＣＧＮＮＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号１１）；２．５μｌの１０μＭのオリゴＬｏｎｇ−Ｂ  ５’−ＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧ−３’（配列番号１２）を加える。増幅を、ＰＴＣ−２００サーマルサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）におけるプログラム（９４℃で２分３０秒；（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒）の２５サイクル；その後、７２℃で１０分）を使用して行う。
【０１５７】
増幅産物の予想される長さは３２３ｂｐである。反応産物はＱｉａｇｅｎカラムにより精製され、その純度および濃度はＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップでの分析によって見積もらなければならない。
【０１５８】
ＰＣＲ産物は、その後、ＢｔｓＩで消化されなければならない。酵素量およびインキュベーション時間はＰＣＲ産物の量に依存する。消化効率はＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップでの分析によって見積もらなければならない。３２３ｂｐから３０１ｂｐへのサイズの変化が予測される。消化が完全であるならば、Ｑｉａｇｅｎカラムによる精製（ＰＣＲ産物精製プロトコル）が、反応液から小さい２２ｂｐの生成物を除去するために十分である。そうでない場合には、３０１ｂｐのフラグメントを２％アガロースゲルにより精製しなければならない。
【０１５９】
長いアーム部分の連結：
ビーズから除かれた上清に、２μｌの１００ｍＭのＭｇＣｌ２；２μｌの１０ｍＭのｒＡＴＰ；５μｌの長いアーム；１μｌの濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs、２０００ｕ／μｌ）を加える。
【０１６０】
１６℃で一晩インキュベーションする。
【０１６１】
必要な場合には、１μｌの反応液をＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップで分析する。
【０１６２】
ｖｉ）最終のテンプレート精製
最終精製工程の場合、所望される連結されたテンプレートが、遊離状態の長いアームおよび結果として生じ得る長いアームの二量体または未反応の５０ｂｐの産物から分離される。変性条件でのテンプレートの加熱は、テンプレート鎖の解離を最小限に抑えるために避けなければならない。
【０１６３】
テンプレートの最終精製：
サンプル全量を２％アガロースゲルに負荷する。遊離状態の長いアーム（３０１ｂｐ）、テンプレート（３５０ｂｐ）および長いアームの二量体（６００ｂｐ）の間の良好な分離が達成されるほど長く電気泳動する。アガロースからバンドを切り出す。
【０１６４】
Clontech Montage AgaroseキットまたはQiagen MiniElute Agarose ExtractionキットによってＤＮＡを精製する。Ｑｉａｇｅｎキットが使用される場合、推奨されるように５０℃でチューブを加温してはならず、室温で１５分間溶解させられる。必要な場合には、最終生成物をＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップで分析することができる。
【０１６５】
その後、サイズ標準化が確認された。同じ実験が、３３Ｐ−ｄＡＴＰで標識されたバクテリオファージλのゲノムＤＮＡまたはヒトのゲノムＤＮＡから開始して並行して行われた。
【０１６６】
図１１Ｃには、プロセスの様々な工程の後で回収され、オートラジオグラフィーによって分析されたアリコートが示される。レーン１：完全なＤＮＡコロニーベクターサイズのＰＣＲ産物（３５０ｂｐ）；レーン２〜６：λゲノムＤＮＡ、およびレーン７〜１０：ヒトゲノムＤＮＡ；レーン３および７、短いアームへの連結の後；レーン４および８、ＭｍｅＩによる消化の後、サイズ標準化が観察される；レーン５、６、９および１０：長いアームとの連結の後、従って、予想されたサイズを有するＤＮＡコロニーベクターが生じている。
【０１６７】
ＤＮＡコロニーは、その後、以下のように作製された：ＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＭｍｅＩでサイズ標準化されたλまたはヒトのゲノムＤＮＡフラグメントを含有し、本実施例に示されたように構築されたＤＮＡコロニーベクターが、国際公開公報第００／１８９５７号の方法を使用してＤＮＡコロニーを生じさせるために使用された。図１１Ｄには、λＤＮＡのＤＮＡコロニーが示される。図１１Ｅには、λＤＮＡのＤＮＡコロニー（左段）またはヒトＤＮＡのＤＮＡコロニー（右欄の最初の３つの画像）が示される。これらのＤＮＡコロニーは、その後、制限配列タグを同定するために、国際公開公報第９８／４４１５２号の方法を使用してその場で配列決定されている。
【０１６８】
ＤＮＡコロニーベクターのサイズはまた、ＰＣＲ増幅によって確認された。ＰＣＲ産物は、その後、ｐＵＣ１９プラスミドにクローン化され、大腸菌のコンピテント細胞（ＸＬ−２Ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換された。個々のクローンからのミニプレップが配列決定された。制限配列タグが２０ｂｐの予想されたサイズであることが確認された。しかしながら、一部のクローンについて長さが２１塩基であるタグが回収された。２０塩基未満のタグは見出されなかった。
【０１６９】
フィンガープリント実験では、予想された１４個のＨｉｎｄＩＩＩ消化λのすべてがＤＮＡコロニーベクターに存在することが明らかにされた。ＭｍｅＩ処理および長いアームの連結の後、フラグメントがアガロースゲルから精製され、プライマー伸長が３つのｄＸＴＰおよび１つのジデオキシヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄｄＧＴＰ）の存在下で行われた。生成物は、その後、それぞれの予想されるフラグメントの同定を可能にするアクリルアミドゲルで分析された。
【０１７０】
４塩基の突出部を生じさせる６塩基カッターがクローニングのために使用される場合、２１個の連続した塩基に関する情報を、調製されたテンプレートから得ることができる。２１塩基のうち、６塩基はエンドヌクレアーゼの認識部位を形成する既知の塩基であり、１５塩基は遺伝子変化を検出するために使用することができる。一部の酵素の場合、短いアームの「突出」末端がＭｍｅＩ部位と重なるならば、この数を増大させることができる。例えば、ＮｃｏＩ末端のＣＡＴＧＧに連結されたＴＣＣＧＡはＭｍｅＩ部位を形成する。
【０１７１】
上記に記載された標準的なプロトコルの２つの変法もまた、クローニングの能力を増大させるために使用された。１つの変法では、平滑末端を生じさせる酵素が使用された。ＤＮＡ切断のために使用される酵素が６塩基の認識配列を有し、かつ平滑末端をもたらす場合、２３個の連続した塩基に関する情報（６塩基が既知であり、１７塩基がＳＮＰ検出のためである）を得ることができる。平滑末端連結の効率はより低いので、長い連結時間が必要とされる。それにもかかわらず、連結が一晩行われたとき、十分な連結効率が達成された。ＭｓｃＩで消化されたλＤＮＡを使用して得られたテンプレートの収率は、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたλＤＮＡを用いた収率と類似していた。
【０１７２】
増幅されたテンプレートをｐＵＣ１９プラスミドに挿入することによって得られたプラスミドの分析により、以下のことが明らかなった：（１）短いアームの二量体を含む「テンプレート」は存在しないこと；（２）所望されない生成物の量が低いこと（１８クローンのうち、わずかに１個〜２個のクローンのみ）；（３）種々のλゲノムＤＮＡフラグメントがテンプレートにおいて良好に提示されること（合計で１５個のテンプレート中、３個のフラグメントが２度検出されただけであった）。
【０１７３】
別の変法では、平滑末端の人為的な作製が用いられた。最初のＤＮＡ消化の後に残存する４塩基の突出部が除去されている場合、クローニング情報は２５塩基に増大する（６塩基が既知であり、１９塩基がＳＮＰ検出のためである）。予備実験において、突出部を除去することができる２つの酵素が調べられた。リョクトウヌクレアーゼ（New England Biolabs）は平滑末端を効率的に生じさせることができなかった。クレノウ酵素による３’突出部の除去は、満足すべき結果をもたらした。更に、必要なデオキシヌクレオチドが存在する場合、後者の酵素はまた、高頻度カッターによって生じる末端が連結に関係することを効率的に妨げることができる。例えば、ＤＮＡがＰｓｔＩおよびＭｓｐＩによって消化される場合、ｄＣＴＰの存在下で、クレノウ酵素はＰｓｔＩ末端を削り、ＭｓｐＩ末端を不活性な一塩基の５’突出に変換する（図１２）。
【０１７４】
６．３．実施例３  ゲノム全域での配列変化の検出
本実施例では、再現性のある様式で、複雑なゲノムから非常に多数の制限配列タグを生じさせるために使用される本発明の実施形態が例示される。これらの制限配列タグは、ゲノム間の遺伝子変化体を、これらの変化体の事前の知識を用いることなく同定するために、また、包括的な様式で、かつ、個体の集団に特異的な表現型に関連する変化体の事前の知識に基づいた仮説を用いることなく同定するために、また、そのような変化体を、得られた高密度の制限配列タグにより、最小サイズのゲノム領域に対応させるために有用である。
【０１７５】
本実施例に開示される方法は、異なるゲノムＤＮＡサンプルから同一の制限フラグメントを生じさせるために同じ制限エンドヌクレアーゼを使用することに基づいている。増幅の後、これらの制限フラグメントの末端が配列決定され、その配列が処理されて、ゲノムＤＮＡの消化のために使用される制限酵素の認識部位のすぐ横に隣接するヌクレオチドの短い配列である制限配列タグを同定する。
【０１７６】
臨床研究の患者によって本明細書中に例示される研究中の集団の各個体について、この方法が以下の工程に従って行われる：
１）ゲノムＤＮＡの抽出
ゲノムＤＮＡが、種々の個体に由来する生物学的サンプルから抽出される。これらの生物学的サンプルは口腔粘膜または血液サンプルのいずれかである。ゲノムＤＮＡは、標準的なプロトコルを使用して抽出される。典型的には、０．５マイクログラム〜３マイクログラムのゲノムＤＮＡが口腔粘膜サンプルから抽出され、４マイクログラムのゲノムＤＮＡが１００マイクロリットルの全血サンプルから抽出される。１つの二倍体ヒトゲノムは約６ピコグラムのＤＮＡを有するので、これは二倍体ゲノムの少なくとも８０コピーから６００コピー以上に相当し、本発明者らの目的には十分である。
【０１７７】
２）制限消化
使用される制限エンドヌクレアーゼは、２つの制限酵素認識部位の間の平均距離（これは、得られるゲノム制限フラグメントの平均的な長さに等しい）に直接的に依存する、得られるゲノムでの制限配列タグの密度に従って選ばれる。したがって、５０００塩基毎に平均して少なくとも１回の切断を得ることが目的であるので、平均サイズが４０９６塩基であるフラグメントを生じさせることが予想されるように、６塩基の認識部位を有する制限酵素が使用される。したがって、約６０億塩基を含有するそれぞれの二倍体ヒトゲノムについて１，４００，０００個を超えるゲノム制限フラグメントが作製される。それぞれのゲノム制限フラグメントについて、２つの制限配列タグが作製されるので、推定される総数で２８０万を超える異なる制限配列タグが二倍体ヒトゲノムについて作製される。以下に議論されるように、これらの実施例で生じる制限配列タグは長さが１５塩基であり、その多型がヒトゲノムにおいて５００塩基毎に見出され、２８０万個のタグにより、患者あたり８０，０００を超える多型、またはヒトゲノム配列の３５，０００塩基毎に１つの多型が生じることが見積もられる。
【０１７８】
個体あたりの得られる制限配列タグの数は、異なる制限酵素または酵素の組合わせを使用することによって調節することができる。例えば、制限配列タグの数を増大させるために、複数の制限酵素を組み合わせて使用することができるし、あるいは、この方法を異なる酵素を用いて連続して繰り返すことができる。あるいは、制限配列タグの数を減少させるために、認識部位がより長い酵素を単独または組合せで使用することができる。
【０１７９】
この方法が同じサンプルまたは異なるサンプルに対して繰り返されるとき、サンプル間のゲノム配列における変化による変動を除いて、同一の制限フラグメントを生じさせ、その結果、同等の制限配列タグを得ることが不可欠である。理論的には、認識部位が同一である異なる制限酵素（例えば、アイソシゾマー）を使用することができる。しかしながら、これらの実施例では、同じ生物および同じ供給者に起源を有する同一の酵素が使用される。
【０１８０】
制限消化は、患者あたり二倍体ゲノムの少なくとも１０コピー〜２０コピーを使用して行われる。すなわち、重複性が、それぞれの制限配列タグが提示されることを確実にするために導入される。
【０１８１】
３）増幅用および配列決定用のベクターへのゲノム制限フラグメントの挿入
本実施例では、ＤＮＡコロニーがゲノム制限フラグメントの増幅および配列決定のために使用される。
【０１８２】
ゲノム制限フラグメントは、環状分子をもたらす連結反応を行うことによってＤＮＡコロニーベクター（すなわち、所定の配列を有する操作された核酸）に連結される。ＤＮＡコロニーベクターは以下の特徴を有する：消化されたゲノムＤＮＡフラグメントの末端との適合性を有し、好ましくは粘着性である２つの末端（ここで、そのような末端は、ベクターの自己連結を防止するために脱リン酸化されている）；ＩＩＳ型制限酵素（例えば、ＢｓｍＦＩ、ＢｃｅＡ１、Ｅｃｏ５７ＩまたはＭｍｅＩなど）に対する２つの認識部位（ここで、それらはそれぞれが、末端のすぐ近くに配置され、ベクターに連結されるゲノム制限フラグメント内での切断を行わせるように配向している）；２つの配列決定用プライマーに対する認識部位（ここで、それらのそれぞれもまた、ベクターの末端の近くにあり、ベクターと連結されるゲノム制限フラグメントの方向にプライマー伸長を可能にするように配向している）；ベクターおよび挿入されたフラグメントの一部分の増幅を可能にするように配向した２つの増幅プライマー（ここで、これらは配列決定用プライマーの配列と重なり得る）；そして、場合により、増幅プライマー配列を使用して増幅される領域の外側に配置されている低頻度で切断する制限酵素の認識部位。ＤＮＡコロニーベクターの更なる特徴には、例えば、ＤＮＡコロニーの線状化のための、増幅された領域の内部に存在する更なる制限部位、またはスペーサー配列が含まれる。
【０１８３】
ゲノム制限フラグメントの鎖状体化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を防止するために、ＤＮＡコロニーベクター分子は、ゲノム制限フラグメントと比較してモル過剰で使用される。
【０１８４】
４）インサートサイズの標準化
ゲノム制限フラグメントに連結されたＤＮＡコロニーベクターを含有する環状ＤＮＡ分子は、その後、ＩＩｓ型制限酵素で消化される。例えば、ＢｃｅＡＩが使用される場合、ＢｃｅＡＩは挿入ゲノムフラグメント内の１４塩基を切断する。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを用いた充填反応の後、得られた平滑末端が連結され、これにより、連結されたゲノム制限フラグメントの２８塩基部分（すなわち、ゲノム制限フラグメントの各末端に由来する１４塩基の部分）を含有する環状分子が得られる。
【０１８５】
より長いインサートが、その認識配列の２０塩基外側で切断するＭｍｅＩなどの酵素を使用して作製される。しかしながら、２塩基の３’突出部が生じるという事実により、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼを用いた反応により、２塩基が除かれる。この場合、得られる連結されたゲノム制限フラグメントは長さが３６塩基である。
【０１８６】
５）ＤＮＡコロニーテンプレートの作製
ＤＮＡコロニーテンプレートは、増幅プライマーの存在下での１サイクル以上のＰＣＲ増幅を使用して作製される。ＤＮＡテンプレート分子の配列は５’末端から３’末端に以下の配列を含む：順方向での第１の増幅プライマーの配列；順方向での第１の配列決定用プライマーの配列（これは第１の増幅プライマーの配列と重なり得る）；ＩＩＳ型制限酵素の第１の認識部位；サイズ標準化工程から得られる２８塩基または３６塩基の連結されたゲノム制限フラグメント（これは、ゲノムＤＮＡを消化するために使用された制限酵素の認識部位の半分を含む）；ＩＩＳ型制限酵素の第２の認識部位；逆方向での第２の配列決定用プライマーの配列（これは第２の増幅プライマー配列の配列と重なり得る）；および逆方向での第２の増幅プライマーの配列。
【０１８７】
あるいは、ＤＮＡコロニーテンプレートは、増幅プライマーによって増幅される領域の外側でＤＮＡコロニーベクターを切断する低頻度切断酵素を使用して、前の工程で得られる環状分子を単に制限消化することによって生じさせることができる。
【０１８８】
６）ＤＮＡコロニーの作製
ＤＮＡコロニーを生じさせるための第１の工程は、固体表面にＤＮＡコロニーテンプレート分子および増幅プライマーを結合させることであり、固体表面は例えば、官能基化されたガラスまたはプラスチック（例えば、ＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋチューブ（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）などの表面などである。ＤＮＡコロニーテンプレートおよび増幅プライマー分子の濃度は、結合後、結合した増幅プライマーを使用したＤＮＡコロニー内へのＤＮＡコロニーテンプレート分子の局在化した増幅を可能にするために、また、異なるＤＮＡコロニーの間において所望される間隔を達成するために、表面が高密度の増幅プライマー分子および比較的低密度のＤＮＡコロニーテンプレート分子で覆われるように選ばれる。増幅後のＤＮＡコロニーの総数は、適切な重複性を確保にするために、ゲノムＤＮＡから得られた異なる制限フラグメントの数の少なくとも１０倍〜２０倍でなければならない。１４０万個のゲノム制限フラグメントが作製されるこの実施例では、約３０００万個のＤＮＡコロニーが３平方センチメートルの表面に作製される。
【０１８９】
増幅は、５．３節およびＰＣＴ国際公開公報第０２／４６４５６号に記載されているように、等温手法を使用して行われる。
【０１９０】
７）ＤＮＡコロニーの配列決定
増幅後、ＤＮＡコロニーは、制限消化、その後の変性によって一本鎖にされる。第１の配列決定用プライマーが、その後、ＤＮＡコロニーベクターに対してハイブリダイゼーションさせられる。その後、表面は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼおよび４つの可能なヌクレオチドのうちの１つのみの混合物とインキュベーションされる。混合物は、取り込まれるヌクレオチドの１０個のうちのほぼ１個が蛍光標識されているように、同じ種類の蛍光標識されたヌクレオチドおよび標識されていないヌクレオチドの両方を含有する。これらの標識されたヌクレオチドは、それらがＤＮＡコロニー内の分子の配列に対して相補的である場合、プライマーの３’末端に取り込まれる。プライマー伸長工程の後、画像を蛍光顕微鏡（ＯＲＣＡ−ＥＲ  ＣＣＤカメラ（浜松、日本）を備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ２００（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ））によって撮影し、それぞれのＤＮＡコロニーの蛍光の位置および強度を測定する。この手法は、４つの異なる種類のヌクレオチドのすべてを１つずつ繰り返して反復することによる段階的な様式で繰り返される。それぞれの工程において、所定の塩基が取り込みのために使用され、得られたシグナルが表面上の各ＤＮＡコロニーについて測定される。この工程において１つ以上の塩基を取り込んでいるＤＮＡコロニーの蛍光強度は、それに比例してより強くなり、これに対して、塩基を取り込んでいないコロニーの蛍光強度は変化しないままである。取り込み工程の後での蛍光強度を組み込み工程の前での強度と比較することによって、ＤＮＡコロニーに取り込まれた塩基の量が決定される。各ＤＮＡコロニーについて蛍光強度の連続的な変化を追跡し、その強度を、伸長工程のために使用された塩基の正体と相関させることにより、各ＤＮＡコロニーに含有されるＤＮＡの配列が決定される。
【０１９１】
配列決定工程は、ゲノムフラグメントに由来する２８塩基または３６塩基が読み取られるまで繰り返される。配列決定される塩基の数は、ゲノムＤＮＡの消化のために使用される制限酵素の認識部位の半分まで伸長する配列決定用プライマーを使用することによって減少させることができる。
【０１９２】
必要な場合には、伸長した第１の配列決定用プライマーを変性および洗浄によって除去することができ、相補鎖の配列決定を、第２の配列決定用プライマーを使用して行うことができる。
【０１９３】
８）制限配列タグ
ＤＮＡコロニーを配列決定することから得られる配列は、それぞれの最初のゲノム制限フラグメントに由来する２つの制限配列タグを同定するために処理される。例えば、酵素ＭｍｅＩが連結された制限フラグメントのサイズを標準化するために使用されたとき、制限配列タグは、１８塩基の長さから、ゲノムＤＮＡの消化のために使用される制限部位の半分に由来する３塩基を引いた長さである。ＢｃｅＡＩの場合、制限配列タグは１１塩基の長さである。
【０１９４】
これらの２つの制限配列タグにより、最初のゲノム制限フラグメントの末端が表される。それぞれのＤＮＡコロニーについて得られた２つのタグは、ゲノム上で物理的に近接しており（例えば、平均して４０９６塩基離れており）、更なる使用のために保存される。ゲノム上のタグの位置は、１５塩基または１１塩基からなる配列に、ゲノムＤＮＡの消化のために使用される制限酵素の制限部位の６塩基を加えた配列（すなわち、２１塩基または１７塩基の配列）を使用して決定される。
【０１９５】
９）制限配列タグの整理および表現型に関連する配列変化の同定
その後、異なるタグを同定し、各個体についてそれぞれの制限配列タグの数を決定するために、コンピュータープログラムを使用して制限配列タグが比較される。これらのタグは、その後、相同的なタグの群および集団における特定の表現型に関連する配列変化を同定するために、個体間で比較される。この比較は、この分野で知られている統計学的分析（例えば、隠れマルコフ連鎖またはクラスタリング法など）によって行うことができる。タグはまた、以前に得られたタグと、またはデータベース由来の配列と比較することができる。
【０１９６】
２つの集団間の制限配列タグの比較は異なる結果をもたらし得る。所定の配列変化について、集団１における２つのタイプの遺伝子変化の割合が集団２における割合と異なることがある。
【０１９７】
他の例では、配列変化の様々なタイプの割合が２つの集団で類似または同一であることがある。しかし、各集団に由来する個体における異なる遺伝子変化体の特定の組合わせを分析することにより、変異体のいくつかの組合わせが２つの集団において異なる割合で表されることを明らかにすることができる。
【０１９８】
本発明の方法によって得ることができたタグ群の例：
個体１では、下記の配列が決定される：
Ｔ１ａ＝acgtgtcgatggctgatgggtaggtagt（配列番号１３）、２３回見出される。
Ｔ１ｂ＝ggtggtgggaatgggattggaaatgttt（配列番号１４）、１１回見出される。
Ｔ１ｃ＝ggtggtgggaatcggattggaaatgttt（配列番号１５）、８回見出される。
Ｔ１ｅ＝ccaaggtgatcggatgtaatggtattgt（配列番号１６）、１３回見出される。
Ｔ１ｆ＝ccaaggtgatcggaagtaatggtattgt（配列番号１７）、５回見出される。
【０１９９】
個体２では、下記の配列が決定される：
Ｔ２ａ＝acgtgtcgatggctgatgggtaggtagt（配列番号１３）、１８回見出される。
Ｔ２ｂ＝ggtggtgggaatgggattggaaatgttt（配列番号１４）、２２回見出される。
Ｔ２ｃ＝ccaaggtgatcggatgtaatggtattgt（配列番号１６）、１５回見出される。
【０２００】
個体３では、下記の配列が決定される：
Ｔ３ａ＝acgtgtcgatggctgatgggtaggtagt（配列番号１３）、２０回見出される。
Ｔ３ｂ＝ggtggtgggaatcggattggaaatgttt（配列番号１５）、２４回見出される。
Ｔ３ｃ＝ccaaggtgatcggaagtaatggtattgt（配列番号１７）、１７回見出される。
【０２０１】
以下のことを決定することができる：
タグＴ１ａ、タグＴ２ａおよびタグＴ３ａは同一であり、群−配列Ｓｇ１＝Ｔ１ａの群ｇ１を形成する。
タグＴ１ｂおよびタグＴ２ｂは同一であり、群−配列Ｓｇ２＝Ｔ２ｂの群ｇ２を形成する。
タグＴ１ｃおよびタグＴ３ｂは同一であり、群−配列Ｓｇ３＝Ｔ１ｃの群ｇ３を形成する。
タグＴ１ｅおよびタグＴ２ｃは同一であり、群−配列Ｓｇ４＝Ｔ１ｅの群ｇ４を形成する。
タグＴ１ｆおよびタグＴ３ｃは同一であり、群−配列Ｓｇ５＝Ｔ１ｆの群ｇ５を形成する。
【０２０２】
以下のことを認めることができる：
Ｓｇ２＝ggtggtgggaat  g  ggattggaaatgttt（配列番号１４）
Ｓｇ３＝ggtggtgggaat  c  ggattggaaatgttt（配列番号１５）
は一塩基までで同一であるが、それらはそれぞれが、Ｓｇ１、Ｓｇ４およびＳｇ５とは非常に異なっていること、および、
Ｓｇ４＝ccaaggtgatcgga  t  gtaatggtattgt（配列番号１６）
Ｓｇ５＝ccaaggtgatcgga  a  gtaatggtattgt（配列番号１７）
は一塩基までで同一であり、しかし、それらはそれぞれが、Ｓｇ１、Ｓｇ２およびＳｇ３とは非常に異なっていること。
【０２０３】
Ｓｇ２およびＳｇ３により形成される群Ｇ１、Ｓｇ４およびＳｇ５により形成される群Ｇ２、ならびに、グループＳｇ１により形成される群Ｇ３が、その後、作製され得る。
【０２０４】
各個体は染色体の２つの異なるセットを保有するので、
（１）個体１は、２コピーのＳｇ１、１コピーのＳｇ２、１コピーのＳｇ３、１コピーのＳｇ４および１コピーのＳｇ５を保有すること、
（２）個体２は、２コピーのＳｇ１、２コピーのＳｇ２および２コピーのＳｇ４を保有すること、
（３）個体３は、２コピーのＳｇ１、２コピーのＳｇ３および２コピーのＳｇ５を保有すること
を理解することができる。
【０２０５】
典型的な結果１
集団１では、
１０００コピーの配列タグＳｇ１
３２７コピーの配列タグＳｇ２
６７３コピーの配列タグＳｇ３
５２１コピーの配列タグＳｇ４
４７９コピーの配列タグＳｇ５
が見出される。
集団２では、
１０００コピーの配列タグＳｇ１
３４５コピーの配列タグＳｇ２
６６５コピーの配列タグＳｇ３
５０２コピーの配列タグＳｇ４
４９８コピーの配列タグＳｇ５
が見出される。
【０２０６】
集団１と集団２との間での群Ｇ１、群Ｇ２および群Ｇ３のそれぞれの組成の間には有意な差がないので、これらの群は集団間における表現型差に関連していないと結論付けることができる。
【０２０７】
典型的な結果２
集団１では、
１０００コピーの配列タグＳｇ１
９９３コピーの配列タグＳｇ２
７コピーの配列タグＳｇ３
５２１コピーの配列タグＳｇ４
４７９コピーの配列タグＳｇ５
が見出される。
集団２では、
１０００コピーの配列タグＳｇ１
９４６コピーの配列タグＳｇ２
５４コピーの配列タグＳｇ３
５０２コピーの配列タグＳｇ４
４９８コピーの配列タグＳｇ５
が見出される。
【０２０８】
集団１と集団２との間での群Ｇ１および群Ｇ３のそれぞれの組成の間には有意な差がないので、これらの群は集団間における表現型差に関連していないと結論付けることができる。集団１と集団２との間での群Ｇ２の組成には有意な差が存在するので、この群は集団間において表現型差に関連していると結論付けることができる。更に、集団２に属する確率は、配列Ｓｇ３を保有する個体の方が、配列Ｓｇ２を保有する個体よりも高いと結論付けることができる。
【０２０９】
典型的な結果３
集団１では、
１０００コピーの配列タグＳｇ１
３１４コピーの配列タグＳｇ２
６８６コピーの配列タグＳｇ３
４８６コピーの配列タグＳｇ４
５１４コピーの配列タグＳｇ５
が見出される。
集団２では、
１０００コピーの配列タグＳｇ１
２８９コピーの配列タグＳｇ２
７１１コピーの配列タグＳｇ３
５１１コピーの配列タグＳｇ４
４８９コピーの配列タグＳｇ５
が見出される。
【０２１０】
集団１と集団２との間での群Ｇ１、群Ｇ２および群Ｇ３のそれぞれの組成の間には有意な差がない。しかしながら、データの更なる分析を、何名の個体が配列タグの下記の組合わせを保有するかを計数することによって行うことができる。
【０２１１】
【表２】
2005518811.tif 000004
【０２１２】
この分析は、集団１と集団２との間での配列タグの組合わせの分布における有意差を示している。したがって、配列タグのこれらの組合わせは集団間における表現型差に関連していると結論付けることができる。
【０２１３】
７．引用参考文献
本明細書中に引用されている参考文献はすべて、それぞれの個々の刊行物または特許または特許出願が、その全体がすべての目的のために参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのように、それと同じ程度でその全体がすべての目的のために参照により本明細書中に組み込まれる。
【０２１４】
本発明の多くの改変および変化が、当業者には明らかであるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書中に記載された特定の実施形態は、例として提供されているにすぎず、したがって、本発明は、添付された特許請求の範囲の用語、ならびに、そのような特許請求の範囲の権利範囲が及ぶ均等物の範囲全体によってのみ限定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】表現型に関連する制限配列タグを同定するための方法を示す。
【図２Ａ】制限配列タグを決定するための本発明の１つの実施形態を示す。
【図２Ｂ】制限配列タグを決定するための本発明の１つの実施形態を示す。
【図３Ａ】その認識部位の両側で切断する制限酵素を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための１つの実施形態を示す。
【図３Ｂ】その認識部位の両側で切断する制限酵素を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための１つの実施形態を示す。
【図４Ａ】ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼを使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための１つの実施形態を示す。
【図４Ｂ】ＩＩｓ型エンドヌクレアーゼを使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための１つの実施形態を示す。
【図５Ａ】二重消化（すなわち、レアカッター、その後の高頻度カッター）を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための１つの実施形態を示す。
【図５Ｂ】二重消化（すなわち、レアカッター、その後の高頻度カッター）を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための１つの実施形態を示す。
【図６Ａ】二重消化（すなわち、第１の制限酵素および多数の第２の制限酵素）を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための別の実施形態を示す。
【図６Ｂ】二重消化（すなわち、第１の制限酵素および多数の第２の制限酵素）を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための別の実施形態を示す。
【図７Ａ】二重消化（すなわち、第１の制限酵素および多数の第２の制限酵素）を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための別の実施形態を示す。
【図７Ｂ】二重消化（すなわち、第１の制限酵素および多数の第２の制限酵素）を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための別の実施形態を示す。
【図８Ａ】二重消化（すなわち、第１の制限酵素および多数の第２の制限酵素）を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための別の実施形態を示す。
【図８Ｂ】二重消化（すなわち、第１の制限酵素および多数の第２の制限酵素）を使用して生物のゲノム由来の制限フラグメントを生じさせることによって制限配列タグを決定するための別の実施形態を示す。
【図９Ａ】クローン化されたＤＮＡフラグメント由来の短いＤＮＡタグの作製を示す。長いＤＮＡフラグメントが環状ベクターの２つのＢｓｍＦＩ部位の間にクローン化される。ＢｓｍＦＩ消化により、短いＤＮＡタグのみがベクターに結合したままにされる。自己連結の後、環状ベクターは、本来のＤＮＡフラグメントインサートの長さにかかわりなく、１対のタグによって形成されるインサートを含有する。
【図９Ｂ】１回目の連結の後での生成物の分析結果を示す。Ｓａｕ３ＡＩで消化されたλファージＤＮＡが、ＢａｍＨＩ消化／脱リン酸化された第１の作製ベクターと連結された。分析のために、生成物が、挿入部位に隣接するプライマーを使用してＰＣＲによって増幅された。
【図９Ｃ】第２の連結の後での生成物の分析結果を示す。図９Ｂにおけるものと同じサンプルが、ＢｓｍＦＩ消化および自己連結によってそのサイズを正規化するために更に処理されて、環状ベクターを生じさせる。分析のために、この生成物がＰＣＲによって増幅された。１３２ｂｐの予想されたピークが観測される。
【図９Ｄ】単純化された反応で得られた第２の連結生成物の分析結果を示す。１つだけのインサートを含有するプラスミドがＢｓｍＦＩで処理され、平滑末端を生じさせるためクレノウ酵素処理の後で自己連結された。分析のために、生成物がＰＣＲによって増幅された。正しいサイズよりも小さいサイズのフラグメントに対応するバンドは観測されなかった。
【図１０Ａ】２つの異なる酵素を使用する消化によって生じたＤＮＡを第２の作製ベクターにクローン化することのいくつかの可能性を示す。
【図１０Ｂ】第２の作製ベクターへのインビトクローニングの分析結果を示す。ＭｓｐＩおよびＳｐｈＩで消化されたλＤＮＡが、ＳｐｈＩおよびＡｃｃＩで消化されたベクターに挿入された。ＢｓｍＦＩによる消化の後、第２の連結により、正規化されたサイズのインサート、すなわち、制限配列タグが生じた。最後の連結反応物を増幅することにより得られたＰＣＲ産物が分析された。正しいサイズのバンドのみが観測された。
【図１０Ｃ】ＡｌｕＩおよびＳｐｈＩで消化されたλＤＮＡが、ＨｉｎｃＩＩおよびＳｐｈＩで消化されたベクターに挿入されたときの第１の連結反応物の分析結果を示す。分析のためのＰＣＲ増幅の後、予想されたように、種々のサイズのフラグメントが、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップを分析のために使用して観測された。最も強いピークはサイズマーカーである。
【図１０Ｄ】第２の連結の後の、図１０Ｃにおけるものと同じサンプルの分析結果を示す。分析のためのＰＣＲ増幅の後、予想されたサイズの１つだけのフラグメントが、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザーＤＮＡ１０００チップを使用して観測されただけであった。サイズマーカーに対応するピークが図中に示されている。
【図１１Ａ】図４Ａに図示された単一制限配列タグ方法を使用する、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＲｓａＩで消化されたＤＮＡのテンプレート調製を示す。
【図１１Ｂ】図４Ａに図示された単一制限配列タグ方法を使用する、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＲｓａＩで消化されたＤＮＡのテンプレート調製を示す。
【図１１Ｃ】様々な工程の後で回収され、オートラジオグラフィーによって分析されたアリコートを示す。レーン１：完全なＤＮＡコロニーベクターサイズ（３５０ｂｐ）のＰＣＲ産物；レーン２〜６：λゲノムＤＮＡ；レーン７〜１０：ヒトゲノムＤＮＡ；レーン３および７：短いアーム（short arm）への連結後、多数のフラグメントまたはスメアが観測される；レーン４および８：ＭｍｅＩによる消化後、サイズ標準化が観測されている；レーン５、６、９および１０：長いアーム（long arm）との連結後、従って、予想されたサイズを有するＤＮＡコロニーベクターを生じる。
【図１１Ｄ】λＤＮＡのＤＮＡコロニーを示す。
【図１１Ｅ】λＤＮＡのＤＮＡコロニー（左欄）またはヒトＤＮＡのＤＮＡコロニー（右欄の最初の３つの像）を示す。これらのＤＮＡコロニーは、その後、制限配列タグを同定するために、国際公開公報第９８／４４１５２号の方法を使用してインサイチューで配列決定されている。
【図１２】ｄＣＴＰの存在下でのクレノウポリメラーゼによる、（ＰｓｔＩ消化物について例示される）３’突出部からの平滑末端の作製および（ＭｓｐＩ消化物について例示される）５’突出部の部分的充填を示す。
【図１】
2005518811.tif 000005
【図２Ａ】
2005518811.tif 000006
【図２Ｂ】
2005518811.tif 000007
【図３Ａ】
2005518811.tif 000008
【図３Ｂ】
2005518811.tif 000009
【図４Ａ】
2005518811.tif 000010
【図４Ｂ】
2005518811.tif 000011
【図５Ａ】
2005518811.tif 000012
【図５Ｂ】
2005518811.tif 000013
【図６Ａ】
2005518811.tif 000014
【図６Ｂ】
2005518811.tif 000015
【図７Ａ】
2005518811.tif 000016
【図７Ｂ】
2005518811.tif 000017
【図８Ａ】
2005518811.tif 000018
【図８Ｂ】
2005518811.tif 000019
【図９Ａ】
2005518811.tif 000020
【図９Ｂ】
2005518811.tif 000021
【図９Ｃ】
2005518811.tif 000022
【図９Ｄ】
2005518811.tif 000023
【図１０Ａ】
2005518811.tif 000024
【図１０Ｂ】
2005518811.tif 000025
【図１０Ｃ】
2005518811.tif 000026
【図１０Ｄ】
2005518811.tif 000027
【図１１Ａ】
2005518811.tif 000028
【図１１Ｂ】
2005518811.tif 000029
【図１１Ｃ】
2005518811.tif 000030
【図１１Ｄ】
2005518811.tif 000031
【図１１Ｅ】
2005518811.tif 000032
【図１２】
2005518811.tif 000033
【配列表】
2005518811000001.app
【国際調査報告】
2005518811.tif 000034
2005518811.tif 000035
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