(57)【要約】本発明は、直列に遺伝子を連結することにより、インスリン分泌性ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体を生成する方法を開示する。さらに、このような方法により生成される組換えポリペプチドも開示する。本発明の方法を使用することで、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体の１から３２個までのコピーを、直列に発現させることができる。所望のポリペプチドは、融合タンパク質の切断、ならびに分離および精製のさらなる工程の後に得ることができる。本発明は、かなり低い生産費用で、大規模に、組換えＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体を生成することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドまたはＧＬＰ−１類似体をコードし得る遺伝子の二つの末端に、ハイブリッド部位を形成する能力のある二つの個別の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入し；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを用いた消化の後に、付着末端を連結してハイブリッド末端を形成し、そして、単独で連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子もしくはＧＬＰ−１類似体遺伝子、またはＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドもしくはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子を組み合わせて連結したもののコピーを、ｎ個（ｎは、１から３２までの整数である）ベクターにクローニングし；
（ｃ）連結した遺伝子を含むベクターを、宿主細胞に形質転換し；
（ｄ）宿主細胞に、ポリペプチドのコピーをｎ個（ｎは１から３２までの整数である）含む融合タンパク質を発現させ、該融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチド、ＧＬＰ−１類似体またはその組合わせを含むが、どのようなキャリアータンパク質も含まず；
（ｅ）融合タンパク質を切断し；
（ｆ）ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体を分離および精製すること：
から構成されることを特徴とする、インスリン分泌性ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体を生成する方法。
【請求項２】
ハイブリッド部位を形成する能力のある二つの制限エンドヌクレアーゼが、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ハイブリッド部位を形成する能力のある二つの制限エンドヌクレアーゼが、ＳａｌＩおよびＸｈｏｌＩであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ベクターが、連結した遺伝子のコピーをｎ個（ｎは１から３２までの整数である）含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターが、連結した遺伝子のコピーをｎ個（ｎは８から３２までの整数である）含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、連結した遺伝子のコピーをｎ個（ｎは１６である）含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターが、連結した遺伝子のコピーをｎ個（ｎは３２である）含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクターが、ＣＧＭＣＣ受託番号第０５９９号の寄託物に含まれるものであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、ポリペプチドのコピーをｎ個（ｎは１から３２までの整数である）含む融合タンパク質を発現することができることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、ポリペプチドのコピーをｎ個（ｎは８から３２までの整数である）含む融合タンパク質を発現することができることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、ポリペプチドのコピーをｎ個（ｎは１６である）含む融合タンパク質を発現することができることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、ポリペプチドのコピーをｎ個（ｎは３２である）含む融合タンパク質を発現することができることを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
前記宿主細胞が原核細胞であることを特徴とする、請求項９から１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、大腸菌ＪＭ１０３、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１またはＤＨ５αであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞がＣＧＭＣＣ寄託番号第０５９９号の細胞に含まれるものであることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
融合タンパク質を切断するために使用する前記プロテアーゼが、クロストリパインまたはトリプシンであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１の方法に従って生成された、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体。
【請求項１８】
アミノ酸配列が、式Ｉ：
【化１】
2005515167.tif 000011
で示されることを特徴とする、請求項１７に記載のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直列に遺伝子を連結することによって、グルカゴン様ペプチドＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドまたはグルカゴン様ペプチド−１類似体を生成する方法を開示する。さらに、本方法によって生成される組換えポリペプチドも開示する。ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体の外因性投与は、インスリンの分泌を刺激することができる。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド−１）は、ヒト腸細胞により分泌されるペプチドホルモンであり、それはＬ細胞が産生するプロテアーゼによりプログルカゴンがタンパク質分解性の切断をされることで発生するので、グルカゴン様ペプチド−１と命名される。多数の研究が、ＧＬＰ−１の外因性投与がインスリン分泌の効果を増強することを示している。例えば、血中グルコースが６ｍｍｏｌ／Ｌを越える場合、非常に低い濃度のＧＬＰ−１が、インスリン分泌を増大させる上で重要な役割を果たし得る。いったん血中グルコースが正常なレベルに戻ると、ＧＬＰ−１をさらに添加しても、もはやインスリン分泌に何ら効果を示さないであろう。
【０００３】
ＧＬＰ−１は、ヒトの体内で二種の形態で存在し、一方は、アミド化したＣ末端を有する３０個のアミノ酸残基から構成されるＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ2である。他方は、３１個のアミノ酸残基から構成されるＧＬＰ−１（７−３７）である。ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ2およびＧＬＰ−１（７−３７）の両方が、インスリン分泌に対し強力な増強効果を示し得る。ＧＬＰ−１（７−３６）−ＮＨ2の増強効果に関しては、ＧＬＰ−１（７−３６）−ＯＨペプチド（以降、ＧＬＰ−１（７−３６）とする）がインスリン分泌で類似の増強効果を示すことから、Ｃ末端でのアミド化が必ずしも要求されるものではないことが分かった。
【０００４】
先行の研究は、ＧＬＰ−１が、ＩＩ型糖尿病を治療する上でインスリンより多くの利点を有することを示している。というのも、ＧＬＰ−１は、１）プロインスリン遺伝子の転写および翻訳の調節を増大させ、２）インスリンおよびＣペプチドの分泌を増強し、３）細胞のインスリンレセプターの感受性を増強し、４）β細胞の数を増大させ得るからである。さらに、ＧＬＰ−１は、１）インスリンに対する耐性、２）グリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、フルクトサミン、グルカゴンおよび脂肪酸の量を、低下または減少させ得る（Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｊ．Ｈ．ら、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ｂｙ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５０巻、増補１：Ｓ２５−９頁、２００１年；Ｈｕｉ  Ｈ．ら、Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｌｅｔ  ｄｕｏｄｅｎａｌ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ−１−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５０（４）巻：７８５−９６頁、２００１年）。
【０００５】
さらに注目すべきことは、ＧＬＰ−１は、β細胞の分裂を増強して、β細胞の数を増大させる能力があることが観察されたが、それは、現在まで糖尿病治療のために使用される他のいかなる医薬品にも見られなかったことである。さらに、ＧＬＰ−１は、スルホニル尿素投与の治療に反応しなかった患者に有効である。さらに、ＧＬＰ−１の投与は、血中グルコースの濃度が正常レベルに戻ると、インスリン分泌を増強しない。したがって、低血糖症を生じさせない。全ての上述の理由のため、ＧＬＰ−１は、糖尿病を治療するための望ましい医薬品と考えられる。これは、実質的な臨床研究によっても立証される（Ｒａｃｈｍａｎ  Ｊ．ら、Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｂｙ  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １（７−３６）  ａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＮＩＤＤＭ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４５（１１）巻：１５２４−３０頁、１９９６年；Ｄｏｙｌｅ  Ｍ．Ｅ．ら、Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１、Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５６巻：３７７−９９頁、２００１年；Ｄａｎｉｅｌ  Ｊ．Ｄｒｕｃｋｅｒ、短期検討：Ｔｈｅ  Ｇｌｕｃａｇｏｎ−Ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４２（２）巻：５２１−５２７頁、２００１年）。
【特許文献１】米国特許第５５４５６１８号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／９８３３１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ＧＬＰ−１の化学合成の費用は、非常に高い。試薬グレードのＧＬＰ−１の小売価格は４００ドル／ｍｇであり、それを医療施設で使用することは非常に制限される。数名の研究者が、遺伝子操作方法を用いて融合タンパク質または分泌タンパク質のいずれかとして組換えＧＬＰ−１を生成することを試みている。しかし、ＧＬＰ−１を生成するためのこのアプローチの収量と費用は、満足からは程遠く、したがって、現段階で低い費用でＧＬＰ−１を大規模生成することは不可能である。本発明は、直列に遺伝子を連結することによってＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体を生成する、新規な方法を開発することを目的とする。本発明の方法を用いることで、工程を簡素化し、生産費用を下げることができ、そしてそれにより、大規模でＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体を生成することを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（ａ）ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドまたはＧＬＰ−１類似体をコードし得る遺伝子の二つの末端に、ハイブリッド部位を形成する能力のある二つの個別の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入し；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを用いた消化の後に、付着末端を連結してハイブリッド部位を形成し、そして、単独で連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子もしくはＧＬＰ−１類似体遺伝子、またはＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドもしくはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子を組み合わせて連結したもののコピーをｎ個（ｎは１から３２までの整数である）ベクターにクローニングし；
（ｃ）連結した遺伝子を含むベクターを、宿主細胞に形質転換させ；
（ｄ）宿主細胞に、ポリペプチドのコピーをｎ個（ｎは１から３２までの整数である）含む融合タンパク質を発現させ、該融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチド、ＧＬＰ−１類似体またはその組合わせを含むが、どのようなキャリアータンパク質も含まず；
（ｅ）融合タンパク質を切断し；
（ｆ）ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体を分離および精製すること：
から構成される、インスリン分泌性ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体を生成する方法に関する。
【０００８】
ハイブリッドを形成する能力のある上述の二つの制限的エンドヌクレアーゼとしては、それに限定されないが、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩが挙げられる。
【０００９】
本発明による方法におけるベクターは、単独で連結した、または組み合わせて連結した、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子および／またはＧＬＰ−１類似体遺伝子をｎ個（ｎは１から３２までの整数である）含み得る。好ましくは、ｎは、８から３２までの整数である。さらに好ましくは、ｎは、１６または３２であるべきである。
【００１０】
本発明による方法で使用される宿主細胞は、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体のコピーをｎ個（ｎは１から３２までの整数である）含む融合タンパク質を発現することができる。融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドまたはＧＬＰ−１類似体のコピーをｎ個含み得る。さらに、それは、総コピー数がｎに等しい、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよびＧＬＰ−１類似体双方の複数のコピーを含み得る。好ましくは、ｎは、８から３２までの整数である。さらに好ましくは、ｎは、１６から３２までの整数である。好ましくは、ＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体を発現する本発明の宿主細胞は、原核細胞である。
【００１１】
本発明は、本発明の方法により生成されるＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体のポリペプチドにも関する。
【００１２】
本発明の方法により生成されるＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドは、式Ｉに示すアミノ酸配列を有する。
【００１３】
【化１】
2005515167.tif 000002
【００１４】
図面の簡単な説明
図１は、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドをコードする遺伝子のコピーを一個含む発現ベクターを構築する工程を表す。
図２は、断片（１）、（２）、（３）および（４）の連結後得られた、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す。
図３は、断片（１’）、（２’）、（３’）および（４’）の連結後得られた、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す。
図４は、直列にＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを２から３２個含むプラスミドを構築する工程を表す。
図５は、発酵工程の間の、遺伝子操作した細菌細胞の増殖曲線を示す。
図６は、組換えＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
図７は、組換えＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドのアミノ酸分析の結果を示す。
図８は、組換えＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドの質量スペクトル解析の結果を示す。
図９は、マウスにＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを注射した後の、マウス血中のインスリン濃度の変動を示す。
図１０は、マウスにＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを注射した後の、マウス血中のＣ−ペプチド濃度の変動を示す。
図１１は、マウスにＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを注射した後の、マウス血中のグルコース濃度の変動を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子の複数のコピーを直列に連結するハイブリッド部位を表す精巧な設計のＤＮＡ配列を提供する。得られる、単独で連結した、または組み合わせて連結したＤＮＡ断片の発現は、ＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体のコピーを複数含む融合タンパク質を生じさせることができる。融合タンパク質の切断とさらなる精製の後、多量のＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体を得ることができる。
【００１６】
本発明のＧＬＰ−１（７−３６）は、式Ｉで示すアミノ酸配列を有する。ここで用いる「ＧＬＰ−１類似体」は、式Ｉで示す配列中、または天然に生じるＧＬＰ−１（７−３７）−ＯＨポリペプチドのアミノ酸配列中の、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基の改変、置換または修飾により得ることができるポリペプチドに該当する。
【００１７】
先の研究は、多くのＧＬＰ−１類似体が、インスリンの分泌を増強する上で類似の特徴を有することを示している。典型的なＧＬＰ−１類似体としては、米国特許第５５４５６１８号明細書および国際公開第０１／９８３３１号パンフレットに記載されるものが挙げられる。これらの類似体は、８、１１、１２、１６、２２、２３、２４、２６、２７、３０、３３、３４または３５の位置で、天然に生じるＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨポリペプチド内の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が改変することによって得られる。典型的なＧＬＰ−１類似体としては、それに限定されないが、Ｇｌｙ8−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｖａｌ8−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｓｐ11−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｌａ16−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｕ22−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｈｉｓ23−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｕ24−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｔｒｐ26−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｌａ27−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｕ30−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｓｐ33−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｕ34−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｔｈｒ35−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｙ8−Ｇｌｕ24−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｌｅｕ8−Ａｌａ33−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｔｈｒ36−Ａｒｇ37−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｓｅｒ36−Ａｒｇ37−ＧＬＰ−１（７−３７）等が挙げられる。
【００１８】
好ましくは、本発明のＧＬＰ−１類似体は、同類置換したアミノ酸残基を含むことができる。さらに好ましくは、これらのＧＬＰ−１類似体は、高度な同類置換のアミノ酸残基を含むことができる。
【００１９】
「同類置換」は、同じ正味電荷ならびにほぼ同じサイズおよび形状を示すアミノ酸を置換することである。
【００２０】
「高度な同類置換」は、アミノ酸を、側鎖に同じ官能基を有し、そしてほぼ同じサイズおよび形状を示す別のアミノ酸で置換することである。例えば、脂肪族または置換した脂肪族アミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、それらの側鎖における炭素およびヘテロ原子の総数の違いが二以下の場合、ほぼ同じサイズを有する。それらが側鎖に同じ数の分岐を有する場合、それらはほぼ同じ形状を示す。高度な同類置換の例としては、ロイシンの代わりのバリン、セリンの代わりのスレオニン、グルタミン酸の代わりのアスパラギン酸、およびフェニルアラニンの代わりのフェニルグリシンが挙げられる。高度ではない同類置換の例としては、バリンの代わりのアラニン、セリンの代わりのアラニン、およびセリンの代わりのアスパラギン酸が挙げられる。
【００２１】
したがって、本発明は、
（ａ）ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドまたはＧＬＰ−１類似体をコードし得る遺伝子の二つの末端に、ハイブリッド部位を形成する能力のある二つの個別の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入し；
（ｂ）制限エンドヌクレアーゼを用いた消化の後に、付着末端を連結してハイブリッド部位を形成し、そして、単独で連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子もしくはＧＬＰ−１類似体遺伝子、またはＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドもしくはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子を組み合わせて連結したもののコピーをｎ個（ｎは１から３２までの整数である）ベクターにクローニングし；
（ｃ）連結した遺伝子を含むベクターを、宿主細胞に形質転換させ；
（ｄ）宿主細胞に、ポリペプチドのコピーをｎ個（ｎは１から３２までの整数である）含む融合タンパク質を発現させ、該融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチド、ＧＬＰ−１類似体またはその組合わせを含むが、どのようなキャリアータンパク質も含まず；
（ｅ）融合タンパク質を切断し；
（ｆ）ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体を分離および精製すること
から構成される、インスリン分泌性ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよび／またはＧＬＰ−１類似体を生成する方法に関する。
【００２２】
「ハイブリッド部位」を形成するために使用することができる二つの制限エンドヌクレアーゼとしては、それに限定されないが、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩが挙げられる。例えば、ＢｇｌＩＩによって認識される塩基配列はＡ｜ＧＡ  ＴＣＴであり、一方ＢａｍＨＩにより認識されるものはＧ｜ＧＡ  ＴＣＣである。対応する制限酵素でその二つの配列を消化した後、得られた相補的な付着末端を連結して、ＢｇｌＩＩまたはＢａｍＨＩのいずれにも切断されないＡＧＡ  ＴＣＣまたはＧＧＡ  ＴＣＴの配列を形成することができる。このような配列は「ハイブリッド部位」と称され、特定の遺伝子の複数のコピーを直列に連結するために使用することができる。
【００２３】
本発明の融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体の複数のコピーから構成される。二つの連結したペプチド（二つのＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチド、二つのＧＬＰ−１類似体ポリペプチド、または一つのＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドと一つのＧＬＰ−１類似体ポリペプチド）の間に、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基がある。切断のためには、各所望のポリペプチド（ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体）のＮ末端と上述の残基との間に形成されるペプチド結合は、「特異的に切断可能なペプチド結合」でなければならない。
【００２４】
ここで用いる「特異的に切断可能なペプチド結合」は、特定の化学試薬またはプロテアーゼにより特異的に認識および切断され得るペプチド結合に該当する。切断の結果として、ペプチド鎖は破壊される。ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体のＮ末端と特異的に切断可能なペプチド結合を形成するためにここで用いるアミノ酸残基を、「結合形成アミノ酸（ＢＦＡＡ）」と称する。ＢＦＡＡとしては、それに限定されないが、臭化シアンにより認識され得るＭｅｔ、アルカリプロテアーゼにより認識され得るＡｒｇ、およびエンテロキナーゼにより認識され得るアミノ酸配列Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓが挙げられる。
【００２５】
適切な方法を使用することにより、融合タンパク質を、「特異的に切断可能なペプチド結合」で切断することができる。切断後、融合タンパク質を、ＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体ポリペプチドの複数のコピーに分解することができ、このとき各ポリペプチドは、そのＣ末端に付着したいくつかのアミノ酸を有する。上に記述した工程は、標的ペプチドのＮ末端切断と称する。
【００２６】
例として、ＧＬＰ−１（７−３６）の複数のコピーから構成される融合タンパク質について考慮すると、融合タンパク質のＮ末端切断は、ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘａａ…Ｘａａ（ここで、Ｘａａ…Ｘａａは、互いに接続した一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を表す）の複数のコピーを生じさせることができる。ＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端にあるアミノ酸残基がＡｒｇであるので、Ａｒｇのカルボキシル基に形成されるペプチド結合を特異的に認識することができる特定のプロテアーゼを使用してＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘａａ…Ｘａａを切断することで、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドの複数の分子が得られる。標的ペプチドのＣ末端で起こる工程は、Ｃ末端切断と称される。
【００２７】
Ｎ末端切断工程とＣ末端切断工程の順序は、入れ替えてもよい。
【００２８】
典型的には、Ａｒｇ残基をＧＬＰ−１（７−３６）のＮ末端に付加し、そしてＡｒｇのカルボキシル基に形成されるペプチド結合を特異的に認識する適切なプロテアーゼを、切断のために使用する。したがって、ＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端アミノ酸にあるアミノ酸残基がＡｒｇであるので、融合タンパク質を、他の付着残基のないＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドの複数の分子に切断することができる。ＭｅｔをＧＬＰ−１（７−３６）のＮ末端に加えることも可能である。ＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端アミノ酸がＡｒｇであるので、このＭｅｔで形成されるペプチド結合をまずＣＮＢｒによって切断し、そして次に、得られたペプチドを適切なプロテアーゼにより切断することで、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの複数の分子を得ることができる。Ｎ末端切断およびＣ末端切断の順序は、入れ替えてもよい。アミノ酸配列Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｌｙｓを、ＧＬＰ−１（７−３６）のＮ末端に加えることも可能であり、この配列を、プロテアーゼエンテロキナーゼにより特異的に切断することができる。エンテロキナーゼによるタンパク質分解性の切断によっても、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの複数の分子を得ることができる。
【００２９】
Ａｒｇ残基を、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドおよびＧＬＰ−１類似体のＮ末端に加えることが好ましい。
【００３０】
ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体のアミノ酸配列に基づいて、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子は、合成断片の５’末端で「ペプチド形成アミノ酸」をコードするコドンを付加することで合成することができる。連結配列、および制限酵素により認識される配列は、合成遺伝子の二つの末端にも含まれる。この修飾の後、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体をコードするコドンを含み、二つの末端に制限エンドヌクレアーゼにより認識される塩基対を含む、ＤＮＡ断片を形成することができる。この断片を用いてＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体の複数のコピーを直列に連結することができるので、「直列接続のための遺伝子」と称する。
【００３１】
天然に生じるＧＬＰ−１のＤＮＡ配列を修飾して、「直列接続のための遺伝子」を生じさせることも可能である。本発明における遺伝子を調製するための合成方法を用いるのが好ましい。
【００３２】
一つのアミノ酸を複数のコドンがコードすることができることがよく知られている。当業者は、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体をコードする種々のＤＮＡ配列および配列の組合せを推定し、合成することができる。本発明では、大腸菌で非常に頻度の高いコドンが好ましい。
【００３３】
ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体ペプチドをコードする遺伝子を、二つの方法により生じさせることができる。一方の方法は、付着末端または平滑末端によりいくつかの合成断片を連結して標的遺伝子を生じさせることによるものであり、他方の方法は、化学合成により完全な標的遺伝子を合成することである。いくつかの断片を合成し、その後連結することにより標的遺伝子を生じさせることが好ましい。
【００３４】
遺伝子の複数のコピーを直列に連結するために、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子の５’および３’末端にハイブリッド部位を形成することができる制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、注意深く選択し、優良に設計することを必要とする。クローニングのための制限エンドヌクレアーゼの認識部位の選択は、ベクターにおけるエンドヌクレアーゼ部位に基づくものであり、利用可能な認識部位の選択肢は比較的多い。
【００３５】
本発明の好ましい態様では、発明者らは、四つの遺伝子断片を合成するために、大腸菌で非常に頻度の高いコドンを選択する。連結の後、得られた組換えＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子は、二つの末端にそれぞれ、直列に遺伝子を連結するために必要なＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩのクローニング部位は、ベクターへの挿入のために必要である。ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩの認識部位の位置は、入れ替えてもよい。
【００３６】
本発明の別の好ましい態様では、発明者らは、四つの遺伝子断片を合成するために、大腸菌で非常に頻度の高いコドンを選択する。連結の後、得られたＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子は、直列に遺伝子を連結するために必要なＳａｌＩとＸｈｏｌＩの制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩのクローニング部位は、ベクターへの挿入のために必要である。
【００３７】
上述のエンドヌクレアーゼ部位を使用することによって、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子の複数のコピーを直列に連結し、そして次に、ベクターにクローニングすることができる。直列に連結したこれらの遺伝子を、組み合わせて連結したものとすることもできる。用語「組み合わせて連結したもの」は、任意の順序で直列に共に連結した、ＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体をコードする任意の数の混合ＤＮＡ断片に該当する。この目的のために適切であるベクターは、染色体由来の、非染色体由来の、または合成したＤＮＡベクターであり得る。これらのベクターとしては、それに限定されないが、ミクロファージＤＮＡ、バチルスウイルス、細菌プラスミド、酵母プラスミド、ならびにファージ、プラスミドおよびウイルスＤＮＡの組合わせから誘導されるベクターが挙げられる。ウイルスＤＮＡとしては、それに限定されないが、ウシおよび家禽の天然痘ウイルス、アデノウイルスおよび仮性狂犬病ウイルスが挙げられる。適切なベクターの多くは、当業者によく知られている。宿主細胞内で安定して存在し複製する全てのプラスミドまたはベクターを、本発明に使用することができる。
【００３８】
発現ベクターの、典型的ではあるが制限されない例としては、市販で入手可能なプラスミドｐＫＫ２３３−２、ｐＫＫ２２３−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９およびｐＴ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のような、細菌系で使用されるものが挙げられる。
【００３９】
標的遺伝子を、発現ベクター上の適切なプロモーターに連結する。プロモーターは、遺伝子転写を調節および制御することができる配列である。プロモーターの典型的な例としては、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ；ファージのＴ７；λファージのＰL、および遺伝子発現を制御するために原核細胞、真核細胞およびウイルスに存在する、他の公知のプロモーターが挙げられる。細菌中のそれらのプロモーターが、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、プロテインＡシグナルペプチド、ｇｐｔ、λＰR、ＰLおよびｔｒｐを含むことを特に明らかすることは価値がある。適切なプロモーターの選択は、当業者にとって明らかである。
【００４０】
さらに、好ましい発現ベクターは、宿主細胞をスクリーニング可能にするために、一つまたはそれ以上の選択マーカー遺伝子を有することができる。典型的なものとしては、大腸菌でのテトラサイクリンおよびペニシリン耐性遺伝子、真核細胞の発現系でのジヒドロ葉酸還元酵素およびネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる
【００４１】
本発明に存在する発現ベクターは、直列に連結した遺伝子のコピーをｎ個（ｎは１と３２の間の整数である）含み得る。好ましくは、ｎは、８と３２の間の整数であるべきである。さらに好ましくは、ｎは、１６または３２のいずれかであるべきである。
【００４２】
本発明の一つの好ましい態様では、発現ベクターは、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１個含む。
【００４３】
本発明の別の好ましい態様では、発現ベクターは、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを２個含む。
【００４４】
本発明で提示する実施例の別の好ましい態様では、発現ベクターは、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを４個含む。
【００４５】
本発明の別の好ましい態様では、発現ベクターは、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを８個含む。
【００４６】
本発明の別の好ましい態様では、発現ベクターは、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１２個含む。
【００４７】
本発明の別の好ましい態様では、発現ベクターは、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１６個含む。
【００４８】
本発明で提示される実施例の別の好ましい態様では、発現ベクターは、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを３２個含む。
【００４９】
発明者らは、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを３２個含む組換え発現ベクターｐＫＫ２２３−３を担持する細菌株を寄託した。その株の寄託番号は、ＣＧＭＣＣ第０５９９号である。
【００５０】
遺伝子の複数のコピーおよび適切なプロモーターまたは他の遺伝子発現調節要素を担持する、本発明で提示するベクターを、適切な宿主細胞に形質転換して、宿主細胞中で融合タンパク質を発現させることができる。
【００５１】
したがって、本発明は、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体ポリペプチドを発現する能力のある宿主細胞にも関する。形質転換、トランスフェクション、または感染のような遺伝子操作法、例えば、塩化カルシウムを用いた形質転換、キャリアーとしてのＤＥＡＥデキストランの存在下でのトランスフェクション、または電気穿孔によって、発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。これらの方法は、遺伝子の複数のコピーを含むベクターを、宿主細胞に効果的に移行させることができる。ここで言及するベクターは、プラスミド、ウイスル粒子または細菌ファージであり得る。
【００５２】
適切な宿主細胞としては、それに限定されないが、大腸菌、ストレプトコッカスおよびサルモネラのような細菌細胞、ならびに酵母等のような真核細胞が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、当業者にとって明らかである。
【００５３】
生産費用を下げるためには、原核細胞が、好ましい宿主細胞である。典型的な例としては、ＪＭ１０３、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１およびＤＨ５αのような大腸菌の多くの株が挙げられる。
【００５４】
本発明の宿主細胞は、ＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子のコピーをｎ個（ｎは１と３２の間の整数である）含む発現ベクターを担持する。対応して、宿主細胞は、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体のペプチドのコピーをｎ個含む融合タンパク質を発現し、ここで、ｎは１と３２の間の整数であり、好ましくは、ｎは８と３２の間の整数であるべきであり、そしてさらに好ましくは、ｎは１６と３２の間の整数であるべきである。融合タンパク質は、どのような他のキャリアータンパク質も含まない。
【００５５】
本発明の一つの好ましい態様では、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１個含む発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０３細胞に形質転換する。遺伝子操作したＪＭ１０３細胞は、一つのＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子を保持する。
【００５６】
本発明の別の好ましい態様では、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを２個含む発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０３細胞に形質転換する。遺伝子操作したＪＭ１０３細胞は、２個のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができる。
【００５７】
本発明の別の好ましい態様では、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを４個含む発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０３細胞に形質転換する。遺伝子操作したＪＭ１０３細胞は、４個のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができる。
【００５８】
本発明の別の好ましい態様では、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを８個含む発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０３細胞に形質転換する。遺伝子操作したＪＭ１０３細胞は、８個のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができる。
【００５９】
本発明の別の好ましい態様では、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１２個含む発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０３細胞に形質転換する。遺伝子操作したＪＭ１０３細胞は、１２個のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができる。
【００６０】
本発明のさらに別の好ましい態様では、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１６個含む発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０３細胞に形質転換する。遺伝子操作したＪＭ１０３細胞は、１６個のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができる。
【００６１】
本発明のさらに別の好ましい態様では、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを３２個含む発現プラスミドを、大腸菌ＪＭ１０３細胞に形質転換する。遺伝子操作したＪＭ１０３細胞は、３２個のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができる。
【００６２】
「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」にしたがって、３２個のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを含む融合タンパク質を発現することができるこのような遺伝子操作した細菌株を、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ）に寄託した。寄託日は、２００１年７月１１日であり、寄託番号は、ＣＧＭＣＣ第０５９９号である。寄託株は、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子を単独で連結したコピーを３２個含むプラスミドを担持する。寄託は、当業者の便宜のためのものである。寄託微生物の増殖、使用または販売はどれも、本発明者の特別な許可を必要とする。このような許可は、ここでは与えられていない。
【００６３】
本発明で提示する遺伝子操作した細菌株を、適切な条件下で培養して、連結ポリペプチドのｎ個のコピーから構成される融合タンパク質を産生し、蓄積することができる。培養培地、温度、湿度およびｐＨ値のような培養条件は、当業者にとって明らかである。
【００６４】
宿主細胞が適切な密度まで成長した後、通常、それらを遠心分離により採取することができる。物理的または化学的方法により、細胞を破砕する。上記操作で得られる産物を回収し、そしてさらに精製する。
【００６５】
どのような従来の手段によっても、組換えタンパク質を発現する微生物細胞を破砕することができるが、当該手段としては、限定されるものではないが、凍結と解凍のサイクル、超音波処理または機械的処理または細胞溶解剤が挙げられる。宿主細胞を破砕する適切な手順の選択は、当業者にとって明らかである。
【００６６】
本発明で提示する融合タンパク質は、複数のポリペプチドから構成される。ポリペプチドは、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体またはこれらの二つの混合物であり得る。二つの隣接するペプチドの間には、いくつかのアミノ酸残基がある。これらの二つのペプチドは、二個のＧＬＰ−１（７−３６）ペプチド、二個のＧＬＰ−１類似体ペプチド、または一個のＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドと一個のＧＬＰ−１類似体であり得る。ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体それぞれのＮ末端に連結したアミノ酸は、上述したように「ペプチド形成アミノ酸」であり、それは、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドまたはＧＬＰ−１類似体ペプチドそれぞれのＮ末端アミノ酸残基と、「特異的に切断可能なペプチド結合」を形成する。適切な切断条件下で、そして適切な物質を用いて、融合タンパク質を、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体ペプチドそれぞれのＮ末端で切断し、Ｃ末端に複数の連結アミノ酸を有する、複数のＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体ペプチドを生成することができる。例えば、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドのｎ個のコピーから構成される融合タンパク質を切断して、ＧＬＰ−１（７−３６）−Ｘａａ・・・Ｘａａ（Ｘａａ・・・Ｘａａは、直列の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を表す）を得る。さらに、ＧＬＰ−１（７−３６）のＣ末端がＡｒｇ残基であるので、ＡｒｇとＸａａ・・・Ｘａａの間に形成されるペプチド結合を、適切なプロテアーゼにより特異的に切断して、ＧＬＰ−１（７−３６）を得ることができる。
【００６７】
切断工程を簡素化する解決策として、Ａｒｇを「ペプチド形成アミノ酸」として選択する。プロテアーゼを用いて、Ａｒｇのカルボキシル基を介して形成されるペプチド結合を特異的に切断する。この方法では、融合タンパク質を、ただ一段階の切断により、ポリペプチドの複数の分子に加水分解することができる。
【００６８】
本発明の一つの好ましい態様では、Ｍｅｔを、ペプチド形成アミノ酸として選択する。ＣＮＢｒを用いて、Ｍｅｔのカルボキシル基の関与により形成されるペプチド結合を破壊し、続いて、Ａｒｇのカルボキシル基の関与により形成されるペプチド結合を特異的に認識するプロテアーゼ（例えばクロストリパイン）を用いた。この工程で、Ｃ末端でのアミド化の修飾のない、複数のＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドが生じる。上述の二段階の切断順序は、入れ替えることができる。本発明の別の好ましい態様では、Ａｒｇを、「ペプチド形成アミノ酸」として選択する。膵臓のプロテアーゼであるトリプシンは、ＬｙｓまたはＡｒｇのカルボキシル基の関与により形成されるペプチド結合を特異的に切断することができる。ある種の無水物を、Ｌｙｓを保護するためにこの工程で使用する。結果として、トリプシンを用いて、Ａｒｇのカルボキシル基の関与により形成されるペプチド結合を特異的に切断することができる。したがって、一段階の切断で、Ｃ末端でのアミド化の修飾のない、複数のＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドを生じさせることができる。
【００６９】
融合タンパク質切断の後、クロマトグラフィー法のような一連の分離および精製段階を介して、非常に純粋なポリペプチドを得ることができる。クロマトグラフィー法としては、それに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーが挙げられる。これらのクロマトグラフィーで使用する媒体は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｗｈａｔｍａｎ、Ｍｅｒｋ  ＫＧａＡおよびＧｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃなどのような商業的な供給メーカーから購入できる。単一のクロマトグラフィーまたは複数のクロマトグラフィー段階の組合わせを、精製工程で使用することができる。一般に、ＨＰＬＣを、精製の手段として使用する。典型的には、移動相としてＴＦＡ−ＣＨ3ＣＮ系を用いて、Ｃ１８逆相クロマトグラフィーを利用する。これらのクロマトグラフィー法は、当業者によく知られている。
【００７０】
注意すべきことは、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを生成する方法を、本発明を説明するために以降に記述したが、このような方法が、ＧＬＰ−１類似体のＮおよびＣ末端にあるアミノ酸残基が近隣のアミノ酸残基と「特異的に切断可能なペプチド結合」を形成することができる限り、ＧＬＰ−１類似体を生成するためにも使用することができる一方で、切断はポリペプチド内部では起こらないということが、当業者にとって明らかであるに違いないということである。したがって、遺伝子を直列に連結することによりＧＬＰ−１類似体を生成する方法は、本発明で主張するものの範囲内にある。
【００７１】
一般に、ＧＬＰ−１類似体は、そのＣ末端にＡｒｇを含むが、類似体のアミノ酸配列の他のいかなる位置にもＡｒｇを含まない。これらのＧＬＰ−１類似体としては、それに限定されないが、Ｇｌｙ8−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｖａｌ8−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｓｐ11−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｌａ16−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｕ22−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｈｉｓ23−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｕ24−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｔｒｐ26−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｌａ27−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｕ30−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ａｓｐ33−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｕ34−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｔｈｒ35−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｇｌｙ8−Ｇｌｕ24−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｌｅｕ8−Ａｌａ33−ＧＬＰ−１（７−３６）、Ｔｈｒ36−Ａｒｇ37−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｓｅｒ36−Ａｒｇ37−ＧＬＰ−１（７−３７）等が挙げられる。
【００７２】
ＧＬＰ−１（７−３６）およびＧＬＰ−１類似体を生成する他の方法と比べて、本発明の方法は、明らかな利点を示す。ＧＬＰ−１の化学的合成は、技術的に難しく、費用が高い。遺伝子操作アプローチにより組換えＧＬＰ−１を生成する方法は、ほとんど成功しなかった。それらは概ね、以下のように説明される：
（１）宿主細胞中に発現する２０から６０個のアミノ酸残基から構成されるポリペプチドは、容易に分解する。したがって、このようなポリペプチドの直接発現を行うことはできない。このようなポリペプチドとキャリアータンパク質を融合して、不溶性の封入体を形成すると、ほとんど分解を生じない。ほとんどの状況下で、ポリペプチドは、生成量の点で、融合タンパク質の十パーセントを数えるのみである。融合タンパク質の発現の後、封入体の分離および精製を行う。続いて行う融合タンパク質の切断は、通常、７０％ギ酸溶液中の臭化シアンを用いて行う。通常、切断を融合タンパク質で行う場合、キャリアータンパク質も複数のポリペプチド断片に切断する。これらの断片により、続けて行うタンパク質の分離および精製工程で、余分な加工段階や費用が増える。ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2が望ましい最終産物である場合、アミド化は、組換えペプチドのＣ末端で実施しなければならない。要約すると、説明した方法を使用しての組換えポリペプチドの生成量は低く、費用は高く、そして生成工程はいっそう多くの環境汚染を引き起こし得る。
（２）米国特許第５５１２４５９号明細書、第５６５５４５６号明細書、第５７０７８２６号明細書、第６０３７１４３号明細書、第６４０３３６１号明細書に記載される、ＧＬＰ−１を生成する方法は、最初に解決されるべきいくつかの主要な問題を有する：当該問題とは、効果的な精製の前の融合タンパク質の選択的切断、ペプチド転移反応でジペプチドおよびトリペプチド基質が要求されること、そして、ＧＬＰ−１（７−３４）−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＡｌａにおけるＬｙｓ34のみがペプチド転移反応に関与してＬｙｓ26は関与しないということを保証することである。したがって、この手順は複雑であり、そして制御するのが困難である。
（３）ＧＬＰ−１にシグナルペプチドを付着させて、それを分泌タンパク質として産生する。本方法は、通常、生じる組換えＧＬＰ−１は少ない。
【００７３】
本発明で、発明者は、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体をコードする遺伝子の二つの末端にハイブリッド部位を巧妙に導入して、このような遺伝子の１から３２個のコピーを直列に連結する。発現した融合タンパク質は、特異的に切断可能であるＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１類似体ポリペプチドのモノマーを複数含む。この生成法で、生産費用をおおいに削減し、下流工程を簡素化し、そして生成量の多い組換えＧＬＰ−１（７−３６）および／またはＧＬＰ−１類似体ポリペプチドを生成することができる。本発明は、医療施設に多量のＧＬＰ−１（７−３６）を提供することを可能にし、そしてＩＩ型糖尿病患者にとって費用効率の高い医薬品である。
【００７４】
以下の実施例は例示であり、いずれかの手段により本発明の範囲が制限されるということを意図するものではない。
【実施例１】
【００７５】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１個含む遺伝子操作した細菌株の構築
大腸菌で頻繁に使用されるコドンを選択した後に、ＧＬＰ−１（７−３６）のアミノ酸配列にしたがって、四つのＤＮＡ断片を設計する。ＡｒｇのコドンをＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子の５’末端に付加して、得られた融合タンパク質の切断部位を作る。５’および３’末端に、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩについての切断部位をそれぞれ導入し、したがって、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩの制限的な消化により相補的付着末端が生じ、そしてそれにより、ＤＮＡ断片の直列の連結が促進される。ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを一個含む発現プラスミドを作る構築工程を、図１に示す。
【００７６】
１．ＤＮＡ断片の合成
ＡＢＩ３９００（登録商標）ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、四つの断片を合成する。その断片の配列は、それぞれ以下のように示される：
【００７７】
【化２】
2005515167.tif 000003
【００７８】
【化３】
2005515167.tif 000004
【００７９】
【化４】
2005515167.tif 000005
【００８０】
【化５】
2005515167.tif 000006
【００８１】
断片（１）は５’末端に、ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩにより認識され得る部位を有し、ＡｒｇをコードするコドンＣＧＴを含む。断片（２）は、断片（１）の配列と相補的な配列を有する。断片（４）は５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩによって認識され得る部位を含む。断片（３）は、断片（４）の配列と相補的な配列を有する。断片（Ｉ）中の、ＢｇｌＩＩにより認識される部位ＡＧＡ  ＴＣＴは、断片（４）中の、ＢａｍＨＩにより認識されるＣＧＡ  ＴＣＣと置き換えることができる。
【００８２】
２．ＤＮＡ断片を連結して、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１個形成する。
連結は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｓａｍ  Ｂｒｏｏｋらによる第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓにより出版）に記載されるとおりに行う。以下は、簡便な説明である：四つのＤＮＡ断片（各量：Ａ260nm＝５）を、四つの微量遠心管中に入れた５０μｌの二回蒸留水中にそれぞれ溶解し、四つの管に、対応して、１番（Ａ）、２番（Ｂ）、３番（Ｃ）および４番（Ｄ）と印を付した。１番および２番の管の溶液１μｌを、それぞれ１．５ｍｌ微量遠心管に移して、混合した。同様に、３番および４番の溶液１μｌを、それぞれピペットで取り、別の微量遠心管中で混合した。１μｌの１０×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液、１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰおよび１μｌのポリヌクレオチドキナーゼを、それぞれ、二つの管に添加した。管を、３７℃で一時間インキュベートし、続いて９０℃で５分間インキュベートして、キナーゼを不活化した。その後、管を室温（ＲＴ）まで徐々に冷却した。これら二つの管内の内容物を、１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌの１０×Ｔ4ＤＮＡリガーゼ緩衝液および１μｌのＴ4ＤＮＡリガーゼを添加して混合した。混合液を、１６℃で一晩インキュベートした。連結の完了を、１％アガロースゲルで、エチジウムブロマイド（ＥＢ）で染色して断片のサイズを調べることによって、確認した。
【００８３】
３．ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子の発現ベクターへのクローニング
最初に、適切な条件下で、ｐＫＫ２２３−３プラスミド（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化した。その後、フェノール−クロロホルムを添加し、水相をクロロホルムで二回洗浄した。遠心分離の前に、ＲＴで一時間、消化したプラスミドＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させた。沈殿物中の有機溶媒を、蒸発させて除去した。
【００８４】
連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子を、二重消化したプラスミド溶液と混合し、１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌの１０×Ｔ4ＤＮＡリガーゼ緩衝液および１μｌのＴ4ＤＮＡリガーゼを添加した。混合液を、１８℃で一晩インキュベートした。
【００８５】
４．形質転換
ＪＭ１０３の単独コロニーを選択し、細菌培養物の６００ｎｍでのスペクトル吸収（Ａ600nm）が０．６に達するまで、５０ｍｌのＬＢ液体培地で３７℃で培養した。液体細菌培養物を遠心分離した後、細菌塊を採取し、１０ｍｌの氷冷ＣａＣｌ2溶液（ＣａＣｌ2  ６０ｍＭ、グリセロール１５％、１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ７．０）中に懸濁させた。懸濁液を３０００ｒｐｍで遠心分離し、細菌塊を２ｍｌの氷冷ＣａＣｌ2溶液中に再懸濁させ、そして後に使用するために氷浴に保持した。５０μｌのコンピテント細胞を、５μｌのクローニングしたプラスミドと混合した。混合液を、４２℃で２分間加熱し、その後冷却した。１００μｌのＬＢ培地を添加した後、この混合液を、３７℃で一時間インキュベートした。次に、混合液を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢアガロースプレート上に広げた。そのプレートを、３７℃で一晩インキュベートした。プレート上に現れる単独コロニーをかき取り、プラスミド抽出のために培養した。得られたプラスミドｐＧ1を、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化し、そしてクローニングした遺伝子を、１％アガロースゲル上での電気泳動により試験した。
【００８６】
５．ＤＮＡシークエンシング検証
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、組換えプラスミドにより担持されるＧＬＰ１−１（７−３６）遺伝子のＤＮＡ配列を解析した。解析結果は、図２に示したものと一致する。
【実施例２】
【００８７】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを一個含む、遺伝子操作した細菌株の構築
実施例１の断片（１）中のＢｇｌＩＩ部位をＳａｌＩ部位で置換した後、断片（１’）を合成した。同様に、実施例１の断片（４）中のＢａｍＨＩ部位をＸｈｏＩ部位で置換した後、断片（４’）を合成した。断片（２’）の配列は、断片（１’）の配列と相補的であり、断片（３’）の配列は、断片（４’）の配列と相補的である。断片（１’）および（４’）の配列は、以下のとおりである：
【００８８】
【化６】
2005515167.tif 000007
【００８９】
【化７】
2005515167.tif 000008
【００９０】
実施例１に記載した手順にしたがって、四つの断片の連結、ベクターの消化、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子の挿入、発現ベクターの（大腸菌ＪＭ１０９への）形質転換、およびＤＮＡ配列の解析を行った。解析結果は、図３に示したものと一致する。
【実施例３】
【００９１】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを一個含む、遺伝子操作した細菌株の構築
実施例１の断片（１）中のＡｒｇコドンをＭｅｔコドンで置換して、断片（１’’）を合成する。断片（２’’）の配列は、断片（１’’）の配列と相補的である。断片（３）および断片（４）の配列は引き続き同じものとする。断片（１’’）および（２’’）を以下に示す：
【００９２】
【化８】
2005515167.tif 000009
【００９３】
【化９】
2005515167.tif 000010
【００９４】
ベクターの消化、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子の挿入、発現ベクターの（大腸菌ＪＭ１０３への）形質転換、およびＤＮＡ配列の解析を、実施例１に記述されるとおりに行った。
【実施例４】
【００９５】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを二個保持する、遺伝子操作した細菌株の構築
方法１：
図４に示したとおり、実施例１で得られた５μｌのプラスミドを、０．５ｍｌの微量遠心管に加え、その後、１μｌの１０×ＢｇｌＩＩ、１μｌのＢｇｌＩＩおよび１μｌのＨｉｎｄＩＩＩを、それぞれ管に加えた。混合液を、３７℃で一時間インキュベートした。切り離されたＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子断片を、１％アガロースゲル上での電気泳動により回収した。
【００９６】
実施例１で得られた１μｌのプラスミドを、１μｌの１０×ＢａｍＨＩ緩衝液、１μｌのＢａｍＨＩおよび１μｌのＨｉｎｄＩＩＩと混合した。混合液を、３７℃で一時間インキュベートした。その後、フェノール−クロロホルムを添加し、水相をクロロホルムで二回洗浄した。消化したプラスミドＤＮＡを、遠心分離の前に、ＲＴで一時間、６０％イソプロパノールにより沈殿させた。沈殿物中の有機溶媒を、蒸発させて除去した。ペレットを、１０μｌの水に溶解した。
【００９７】
ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子断片を、ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで二重消化したプラスミドと混合した。その後、１μｌの１ｍＭ  ＡＴＰ、１μｌの１０×Ｔ4ＤＮＡリガーゼ緩衝液および２μｌのＴ4ＤＮＡリガーゼを添加した。混合液を、１８℃で一晩インキュベートした。
【００９８】
実施例１で記載したとおり、コンピテントＪＭ１０３大腸菌細胞を形質転換した。その後、細菌懸濁液を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢアガロースプレート上に広げた。プレートを、３７℃で一晩放置した。プレート上に現れる単独コロニーをかき取り、プラスミド抽出のために培養した。得られたプラスミドを、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで二重消化した。１％アガロースゲル上での電気泳動により、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを二個有するものを選択する。所望のプラスミドを保持する細菌株を保存した。
【００９９】
方法２：
実施例１の代わりに実施例２で得られたプラスミドを用い、そして、方法１に記載した制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩを、それぞれＳａｌＩおよびＸｈｏＩに替えた。他の手順は、方法１に記載したとおり行い、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを二個保持する遺伝子操作した細菌株を構築した。
【０１００】
方法３：
実施例３で得られたプラスミドを使用して、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを二個保持する、遺伝子操作した細菌株を構築した。他の手順は、方法１に記載したとおり行った。
【実施例５】
【０１０１】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを４個含む、遺伝子操作した細菌株の構築
実施例４に記載した手順に従って、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子を直列に連結した。適切な細菌細胞系を、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを４個担持するプラスミドで形質転換し、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを４個担持する発現プラスミドを保持する細菌株を選択する。
【実施例６】
【０１０２】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを８個含む、遺伝子操作した細菌株の構築
実施例４に記載した手順に従って、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子を直列に連結した。適切な細菌細胞系を、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを８個担持するプラスミドで形質転換し、直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを８個担持する発現プラスミドを保持する細菌株を選択する。
【実施例７】
【０１０３】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１２個含む、遺伝子操作した細菌株の構築
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを４個担持するプラスミド、およびＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを８個担持するプラスミドを使用した。これら二種類のプラスミドの二重消化をそれぞれ行った。実施例４に記載した手順に従って直列に連結し、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１２個担持するプラスミドを得た。適切な細菌細胞系をプラスミドで形質転換し、そして直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１２個担持する発現プラスミドを保持する細菌株を選択する。
【実施例８】
【０１０４】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１６個含む、遺伝子操作した細菌株の構築
実施例４に記載した手順に従って、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子の直列の連結を繰り返した。適切な細菌細胞系を、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１６個担持するプラスミドで形質転換し、そして直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを１６個担持する発現プラスミドを保持する細菌株を選択した。
【実施例９】
【０１０５】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを３２個含む、遺伝子操作した細菌株の構築
実施例４に記載した手順に従って、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子の直列の連結を繰返した。適切な細菌細胞系を、ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを３２個担持するプラスミドで形質転換し、そして直列に連結したＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを３２個担持する発現プラスミドを保持する細菌株を選択する。
【実施例１０】
【０１０６】
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子を保持する遺伝子操作した細菌株の発酵
ＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子を保持する遺伝子操作した細菌株の発酵を、「ａ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｆｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅ．Ｃｏｌｉ」（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２巻増補、５３−５７頁、１９９６年）にＡｉｚｈｅｎ  Ｗｕらにより記載された方法に従って行った。
【０１０７】
１．播種する細菌の培養
播種する細菌の培養培地は、１０ｇ／Ｌのペプトン、（Ｄｉｆｅｎ、ＳｉｇｍａまたはＯｘｏｉｄから得た）５ｇ／Ｌの酵母抽出物、ｐＨ７．０の、２０ｍｌの０．２Ｍリン酸緩衝液ならびにＣａＣｌ2、Ｎｉ（ＮＯ4）3、ＣｏＣｌ3、ＭｇＳＯ4、およびＦｅＣｌ3（各塩：１ｍｇ／Ｌ）を含む。培地を、１２０℃で２０分間オートクレーブにかけた。３７℃に冷却した後、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌ、２０ｍｌの消泡剤、２０ｍｌの播種細菌および５ｍｌの２０％グルコースを添加した。２Ｍ  ＮａＯＨおよび２Ｍ  ＨＣｌを用いて、ｐＨ値を６．８〜７．２に調整した。その後、発酵を行った。
【０１０８】
２．発酵
５Ｌまたは１５Ｌまたは１５０Ｌのバイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ）中で、発酵を行った。発酵のための条件は、以下のとおりであった：温度３７℃、ＰL３０→４２℃、５００ｒｐｍの攪拌速度、６．８〜７．２のｐＨ、それぞれ、５Ｌ／分または１５Ｌ／分または１５０Ｌ／分の通気、およびＣＯ2５０％。
【０１０９】
３．発酵の間の細菌濃度の測定
１ｍｌの発酵培養物を取り出して、一時間毎に細菌濃度を測定した。培養物を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清を除去し、そして細菌塊の湿潤質量を秤量した。別の方法として、ＯＤ600nmで密度を検出することによって濃度を測定することができる。
【０１１０】
図５に示したように、１２〜１６時間の発酵の後、発酵槽中の細菌の密度は、１５０ｇ／Ｌ（湿潤質量）であった。静止期に達して、発酵が完了した。
【実施例１１】
【０１１１】
封入体の抽出
発酵の後、培養培地を４０００ｒｐｍで遠心分離した。細菌塊を回収し、ホモジナイザー中で５０ＭＰａの圧力で二回ホモジナイズして、破壊した。細胞残屑の懸濁液を６０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた上清を除去した。１０，０００ｒｐｍでのさらなる遠心分離の段階で、封入体を回収し、その後１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１％ＮａＣｌを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で二回洗浄した。封入体を８Ｍ尿素溶液に溶解した後、未溶解不純物を遠心分離により除去した。限外濾過を使用して上清中の尿素を除去し、その後、封入体を遠心分離で回収した。
【実施例１２】
【０１１２】
封入体の切断
一段階のタンパク質分解
実施例４における方法１または２で構築した、遺伝子操作した細菌株の発酵から得られた封入体を、以下の手順により切断することができる。
【０１１３】
Ｉ．クロストリパインプロテアーゼの使用
クロストリパインは、Ａｒｇ残基のカルボキシル基の関与により形成されるペプチド結合を特異的に切断することができる。
【０１１４】
実施例１１から得られる封入体を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁させた。クロストリパインプロテアーゼを、１０００：１（タンパク質乾燥重量：クロストリパインの量）の比で添加した。混合物を３７℃でインキュベートし、継続的にサンプル採取し、そして全ての封入体が完全に切断されるまで、ＨＰＬＣによりモニターした。大型分子の不純物を、限外濾過（１０，０００のＭＷＣＯ）で除去した。ＧＬＰ−１（７−３６）を、調製レベルのＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥して、９９％以上の純度を示す所望のペプチドを得た。
【０１１５】
ＩＩ．トリプシンプロテアーゼの使用
膵臓のプロテアーゼであるトリプシンは、Ｌｙｓ残基またはＡｒｇ残基のカルボキシル基の関与により形成されるペプチド結合を切断することができる。Ｌｙｓ残基が無水物により保護される場合、Ａｒｇのカルボキシル基の関与により形成されるペプチド結合は、トリプシンにより特異的に切断され得る。
【０１１６】
実施例１１から得られる２００グラム（湿潤重量）の封入体を、１グラムのシトラコン酸無水物を含む５リットルの２０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3溶液に溶解して、８．０のｐＨで２時間、アシル化反応を行う。小分子を、限外濾過（１０，０００のＭＷＣＯ）で除去する。トリプシンを、１０００／１（プロテアーゼに対する、タンパク質の乾燥重量）の比で添加した。タンパク質分解反応を３７℃で行い、封入体の切断が完了するまでＨＰＬＣでモニターした。ＧＬＰ−１（７−３６）を調製レベルのＨＰＬＣでさらに精製し、凍結乾燥して、９９％以上の純度を示す所望のペプチドを得た。
【０１１７】
二段階の切断
実施例４の方法３で構築した、遺伝子操作した細菌株の発酵から得られた封入体を、以下の手段により切断することができる。
【０１１８】
封入体／融合タンパク質を、７０％ギ酸または８Ｍ尿素溶液に溶解して、約２〜１００ｍｇ／ｍＬ（乾燥重量）の濃度範囲にした。臭化シアン（ＣＮＢｒ）を１：１００（融合タンパク質対臭化シアン）のモル比で添加した。混合液を８〜２４時間、暗所で攪拌した。これらの条件下で、ＣＮＢｒは、Ｍｅｔのカルボキシル基によって形成されるペプチド結合を特異的に切断する。これは、二段階の切断工程の第一段階である。
【０１１９】
第一の切断で得られた溶液を１０００のＭＷＣＯの膜で濾過して、小分子を除去した。その後、実施例１１の手順に従って、Ａｒｇのカルボキシル基により形成されるペプチド結合の、プロテアーゼを用いた第二の切断を行って、ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドを得た。ＧＬＰ−１（７−３６）を、調製レベルのＨＰＬＣでさらに精製し、凍結乾燥して、９９％以上の純度を示す所望のペプチドを得た。
【実施例１３】
【０１２０】
ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドの化学的分析
１．純度分析
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣ、および内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＺｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ１８クロマトグラフィーカラムを使用した。移動相Ａは、０．１％ＴＦＡであり、そして移動相Ｂは、０．１％ＴＦＡ／８０％ＣＨ3ＣＮとした。１０〜８０％の勾配のＢを、２０分以内に形成した。流速は、１ｍｌ／分であった。
【０１２１】
１ｍｌの０．１％ＴＦＡ中に、１ｍｇの凍結乾燥したＧＬＰ−１（７−３６）の粉末（９９％以上の純度）を溶解した。カラムに、１０μｌのサンプルをロードした。結果を図６に示した。
【０１２２】
２．アミノ酸組成分析
０．５ｍｌの５．７Ｎの二回蒸留したＨＣｌに、１００μｇのＧＬＰ−１（７−３６）を溶解した。得られた溶液を容器内に密閉して封入し、１１０℃で２０時間インキュベートした。真空蒸発によりＨＣｌを除去した。二回蒸留水で、蒸発工程を二回繰返した。体積を測定し、その後サンプルを取り出し、Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）ｃＬＣプロテインシーケンスシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてアミノ酸組成分析を行った。図７に示したように、実測値は理論値と一致した。
【０１２３】
３．質量スペクトル分析
ＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドの少量のサンプルを用いて、ＡＰＩ２０００ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行った。結果を図８に示した。本発明における手順で生じるＧＬＰ−１（７−３６）ペプチドは、３２９７．１２の分子量を有する。計算したＭＷである３２９８．６８と測定値との間の差は、許容範囲であった。
【０１２４】
４．ペプチド配列分析
上記組成分析で記載した方法で、サンプルを作成した。その生成したＧＬＰ−１（７−３６）のＮ末端ペプチド配列を、Ｐｒｏｃｉｓｅ（登録商標）ｃＬＣ自動プロテインシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により決定した。結果は、その生成したＧＬＰ−１（７−３６）の最初の１５個のアミノ酸の配列が、正しかったということを示す（この分析は、北京大学、生命科学部によって行った）。
【実施例１４】
【０１２５】
インスリン分泌の増強におけるＧＬＰ−１（７−３６）の効果
健全なＣ57／ＢＬ／６Ｊマウスを、中国科学院の上海実験動物センターから購入した。マウスを、各群６匹の三群に分けた。プラセボ群のマウスには、腹腔内に２００μｌの生理食塩水を注射し、一方、試験群には１０μｇのＧＬＰ−１（７−３６）を注射し、そして陽性対照群には、１０μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（Ｓｉｇｍａ）を注射した。動物に注射をした瞬間を時間ゼロと設定した。ヘパリンですすぎ、乾燥した目盛り付き毛細管を用いて、眼角の静脈から、５０μｌの血液を抜き取った。その後、血液サンプルを、５分目、１５分目、３０分目および６０分目に抜き取った。血液サンプルは、即座に、微量遠心管中の５０μｌの生理食塩水と混合した。混合物を３０００ｒｍｐで遠心分離して、赤血球を除去した。血清を使用して、インスリン濃度を測定した。
【０１２６】
インスリンについてのラジオイムノアッセイキット（中国衛生部、上海生物製品研究所）を使用して、インスリン分泌におけるＧＬＰ−１（７−３６）の効果を測定した。図９に示したように、プラセボ群ではインスリン濃度に顕著な変化はなく、そしてＧＬＰ−１（７−３６）およびＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2をそれぞれ与えた二つの群は、血清インスリン濃度で顕著な増加を示す。この実測結果は、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2のいずれかの投与が、マウスにおけるインスリンの分泌を増強することを示す。したがって、この結果は、ＧＬＰ−１（７−３６）が、マウスにおけるインスリンの分泌を増強する点で、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2と類似の特徴を示すことを裏付ける。
【実施例１５】
【０１２７】
Ｃペプチド分泌の増強におけるＧＬＰ−１（７−３６）の効果
実施例１４に記載したように、Ｃ５７／ＢＬ／６Ｊマウスを、腹腔内に２００μｌの生理食塩水を注射したプラセボ群と、１０μｇのＧＬＰ−１（７−３６）を注射した試験群の、二つの群に分けた。Ｃペプチドについてのラジオイムノアッセイキット（中国衛生部、上海生物製品研究所）を使用して、Ｃペプチド分泌におけるＧＬＰ−１（７−３６）の効果を測定した。
【０１２８】
図１０に示したように、プラセボ群ではＣペプチド濃度に顕著な変化はなく、そしてＧＬＰ−１（７−３６）を与えた群は、血清Ｃペプチド濃度で顕著な増加を示した。この実測結果は、ＧＬＰ−１（７−３６）の投与が、マウスにおけるＣペプチドの分泌を増強することを示す。
【実施例１６】
【０１２９】
血中グルコースレベルの減少におけるＧＬＰ−１（７−３６）の効果
健全なＣ57／ＢＬ／６Ｊマウスを、中国科学院の上海実験動物センターから購入した。マウスを、各群６匹の四つの群に分けた。一晩絶食させたマウスに、腹腔内注射をした。プラセボ群には、２００μｌの４０％グルコース溶液を注射し、試験群には、１０μｇのＧＬＰ−１（７−３６）を加えた２００μｌの４０％グルコース溶液を注射し、陽性対照群（Ｉ）には、１０μｇのＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（Ｓｉｇｍａ）を加えた２００μｌの４０％グルコース溶液を注射し、そして陽性対照群（ＩＩ）には、１０μｇのＧＬＰ−１（７−３７）（Ｓｉｇｍａ）を加えた２００μｌの４０％グルコース溶液を注射した。動物に注射をした瞬間を時間ゼロと設定した。注射の後、２０μｌの血液サンプルを、ヘパリン処理した毛細管を用いて、各マウスの眼窩から即時に抜き取った。血液サンプルを、即座に、微量遠心管中の３００μｌの生理食塩水と混合した。混合液を３０００ｒｍｐで遠心分離して、赤血球を除去した。血清を使用して、血清グルコース濃度を測定した。この手順を、３０分目、６０分目、１２０分目に繰返した。
【０１３０】
市販のキット（中国科学院の上海実験動物センター）により、血清グルコース濃度を測定した。図１１に示したように、（グルコースのみを注射した）プラセボ群の血中グルコース濃度の顕著な増加、そして正常なレベルまでの漸次的な低下が見られた。他の三つの群のマウスについては、血清グルコース濃度は、測定工程の間、正常なレベルからの明らかな上昇を示さなかった。この実測結果は、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2またはＧＬＰ−１（７−３７）のいずれかの投与が、マウスにおけるインスリンの分泌を増強して、血中グルコース濃度の大きな変動を防止し得ることを示す。したがって、この結果は、ＧＬＰ−１（７−３６）が、血中グルコースを低下させる点で、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2またはＧＬＰ−１（７−３７）と同様の特徴を示すことを裏付ける。
【０１３１】
本発明の好ましい態様および図面は、先の段落で記述されているが、本発明の修正および代替版が可能であることは、当業者に明らかであるに違いなく、そして実質的に同じ方法および物質が、本発明の範囲内にあり、そしてそれは、以下の請求項に規定される。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドをコードする遺伝子のコピーを一個含む発現ベクターを構築する工程を表す。
【図２】断片（１）、（２）、（３）および（４）の連結後得られた、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す。
【図３】断片（１’）、（２’）、（３’）および（４’）の連結後得られた、ＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を示す。
【図４】直列にＧＬＰ−１（７−３６）遺伝子のコピーを２から３２個含むプラスミドを構築する工程を表す。
【図５】発酵工程の間の、遺伝子操作した細菌細胞の増殖曲線を示す。
【図６】組換えＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドのＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図７】組換えＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドのアミノ酸分析の結果を示す。
【図８】組換えＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドの質量スペクトル解析結果を示す。
【図９】マウスにＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを注射した後の、マウス血中のインスリン濃度の変動を示す。
【図１０】マウスにＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを注射した後の、マウス血中のＣ−ペプチド濃度の変動を示す。
【図１１】マウスにＧＬＰ−１（７−３６）ポリペプチドを注射した後の、マウス血中のグルコース濃度の変動を示す。
【図１】
2005515167.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2005515167.tif 000024
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