(57)【要約】本発明は、ＨＥＲ−２レセプターチロシンキナーゼポリペプチドおよび、ＨＥＲ−２レセプターチロシンキナーゼコードする核酸分子を提供する。特に、本発明は、ＨＥＲ−２のスプライス改変体（ＨＥＲ−２ｓｖ）に関する。本発明はまた、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、およびＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生する方法を提供する。本発明はさらに、薬学的組成物さらにＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに関連する疾患、障害ならびに状態の診断、処置、改善、および／または予防のための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む、
核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載のヌクレオチド配列領域であって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、もしくは抗原性である、ヌクレオチド配列領域；
（ｃ）配列番号２の残基２６１〜２６２を含む少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１に記載のヌクレオチド配列領域であって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号２に記載のポリペプチドの活性を有し、または抗原性である、ヌクレオチド配列領域；
（ｄ）配列番号４の残基３８３〜３８４を含む少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号３に記載のヌクレオチド配列領域であって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有し、または抗原性である、ヌクレオチド配列領域；
（ｅ）配列番号６の残基３８４〜４２２を含む少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号５に記載のヌクレオチド配列領域であって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号６に記載のポリペプチドの活性を有し、または抗原性である、ヌクレオチド配列領域；
（ｆ）配列番号１０の残基５８０〜６１３を含む少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号９に記載のヌクレオチド配列領域であって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号１０に記載のポリペプチドの活性を有し、または抗原性である、ヌクレオチド配列領域；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；または
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む、
核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドの活性を有し、さらに該ポリペプチドは、配列番号２の残基２６１〜２６２を含む、ヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは、配列番号４の残基３８３〜３８４を含む、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号６に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号６に記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは配列番号６の残基３８４〜４２２を含む、ヌクレオチド配列；
（ｅ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号１０に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号１０に記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは配列番号１０の残基５８０〜６１３を含む、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、Ｃ末端短縮またはＮ末端短縮である改変を少なくとも１つ有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは、配列番号２の残基２６１〜２６２、配列番号４の残基３８３〜３８４、配列番号６の残基３８４〜４２２、または配列番号１０の残基５８０〜６１３を含む、ヌクレオチド配列；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；または
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列
を含む、
核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生するプロセスであって、請求項５に記載の宿主細胞を該ポリペプチドを発現するのに適切な条件下で培養する工程；および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって産生された、ポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、前記核酸分子は、ネイティブＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドについてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含み、該プロモーターは、該ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている、プロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータプログラムを使用して決定される、核酸分子。
【請求項１２】
化合物が、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド産生を阻害するかを決定するためのプロセスであって、該プロセスは、請求項５、６または７のいずれかに記載の細胞を該化合物に曝露する工程、および該細胞でのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
【請求項１３】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸を含む、ポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかのオルソログのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の残基２６１〜２６２を含む少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号２に記載のポリペプチドの活性を有し、または抗原性である、フラグメント；
（ｄ）配列番号４の残基３８３〜３８４を含む少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号４に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有し、または抗原性である、フラグメント；
（ｅ）配列番号６の残基３８４〜４２２を含む少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号６に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号６に記載のポリペプチドの活性を有し、または抗原性である、フラグメント；あるいは、
（ｆ）配列番号１０の残基５８０〜６１３を含む少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号１０に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号１０に記載のポリペプチドの活性を有し、または抗原性である、フラグメント；
を含む、ポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは、配列番号２の残基２６１〜２６２を含む、アミノ酸配列；
（ｃ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号４に記載のアミノ酸配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは、配列番号４の残基３８３〜３８４を含む、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号６に記載のアミノ酸配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号６に記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは、配列番号６の残基３８４〜４２２を含むポリペプチドである、アミノ酸列；
（ｅ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号１０に記載のアミノ酸配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号１０に記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは、配列番号１０の残基５８０〜６１３を含む、アミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸置換、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮である改変を少なくとも１つ有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有し、そして該ポリペプチドは配列番号２の残基２６１〜２６２、配列番号４の残基３８３〜３８４、配列番号６の残基３８４〜４２２、または配列番号１０の残基５８０〜６１３を含む、アミノ酸配列；
を含む、ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１，２、または３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載の単離されたポリペプチドであって、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータプログラムを使用して決定される、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、１４、または１５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
請求項１８に記載の選択的結合因子または該選択的結合因子のフラグメントであって、該選択的結合因子または該選択的結合因子のフラグメントが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を包含するポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメントに特異的に結合する、選択的結合因子または選択的結合因子のフラグメント。
【請求項２０】
抗体もしくはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲグラフト化抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の可変領域フラグメント。
【請求項３０】
選択的結合因子または該選択的結合因子のフラグメントであって、該選択的結合因子または該選択的結合因子のフラグメントが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子または選択的結合因子のフラグメント。
【請求項３１】
検出可能な標識が結合されている、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの生物学的活性をアンタゴナイズする、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに関連する疾患、状態または障害を、処置、予防または改善するための方法であって、該方法が、請求項１８に記載の選択的結合因子の有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生された、選択的結合因子。
【請求項３５】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３６】
前記抗ＨＥＲ−２ｓｖ抗体または請求項１８に記載のフラグメントを使用してＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの量を検出または定量する、方法。
【請求項３７】
請求項１８に記載の選択的結合因子を含む生物学的サンプル中のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの量を検出または定量する、キット。
【請求項３８】
請求項１３，１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項３９】
請求項３８に記載の組成物であって、前記薬学的受容可能な処方剤は、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定化剤または抗酸化剤である、組成物。
【請求項４０】
請求項１３，１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項４１】
水溶性ポリマーで共有結合的に改変されている、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
請求項４１に記載のポリペプチドであって、前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、ポリペプチド。
【請求項４３】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項４４】
前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項４６】
異種アミノ酸配列に融合された請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
【請求項４７】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
医学的状態を、処置、予防または改善するための方法であって、該方法が、請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドあるいは請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを、患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４９】
被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）サンプル中の請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドあるいは請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現の存在または量を決定する工程；および
（ｂ）ポリペプチドの発現の存在または量に基いて、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程
を包含する、方法。
【請求項５０】
デバイスであって、該デバイスが、以下：
（ａ）移植に適切な膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、該細胞は、請求項１３、１４、または１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌する、細胞；
を含み、そして該膜は、該タンパク質に対して透過性でありかつ該細胞に有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
【請求項５１】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、該方法が、以下：
（ａ）請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドに化合物を接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該Ｈｅｒ２−ｓｖポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法であって、前記方法が、前記化合物に結合した際の前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５３】
動物におけるポリペプチドのレベルを調節する方法であって、該方法が、請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５４】
請求項１，２または３のいずれかに記載の核酸分子を含む、遺伝子組換え非ヒト哺乳動物。
【請求項５５】
化合物がＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの活性またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの産生を阻害するかを決定するプロセスであって、請求項５４に従う遺伝子組換え哺乳動物を該化合物に暴露する工程、および該哺乳動物内でのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性またはＨＥＲ−２ｓｖ産生を測定する工程、を包含する、プロセス。
【請求項５６】
固体支持体に付着する、請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５７】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を少なくとも１つは含む、核酸分子のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００２年４月１１日付けで出願された米国仮特許出願番号第６０／３７１，９１２号からの優先権の利益を主張する。これらの全開示は、本明細書中で参考として明示的に援用される。
【０００２】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、ＨＥＲ−２レセプターチロシンキナーゼポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。特に、本発明は、Ｈｅｒ−２のスプライシング改変体（ＨＥＲ−２ｓｖ）に関する。本発明はまた、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、およびＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生するための方法に関する。本発明はさらにＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが関与する疾患、障害ならびに状態の診断、処置、改善、および防御のための薬学的組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（２．発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作ならびにヒトゲノムの解読における技術的進歩は、新規の治療剤の発見を大きく加速した。現在では、高速の核酸配列決定技術により、前例のない速度で配列情報が作製され得、そしてコンピュータ分析と結合されて、ゲノムの一部および全体へと重複する配列をアセンブルすることが可能であり、そしてポリペプチドコード領域の同定が可能である。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の目印に対する相同性の程度を決定することを可能にし得る。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤として使用するために有利な特性を産物に付与し得る。
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における著しい技術的進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づいた新規の治療剤の開発に対する可能性は、未だ広範には実現されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療的分子に対して「標的」として機能し得る）は、依然として同定されていない。従って、診断的または治療的な利点を有する、新規なポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【０００５】
ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２、ｃ−ｎｅｕ、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕとしても公知）プロトオンコジーンは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーのメンバーである。ＥＧＦファミリーの他のメンバーとしては、上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲまたはＨＥＲ−１）、ＥｒｂＢ−３／ＨＥＲ−３、およびＥｒｂＢ−４／ＨＥＲ−４が挙げられる。ＨＥＲ−２は、チロシンキナーゼ活性を有する膜貫通レセプター（ｐ１８５）をコードし、これは、複数のシグナル伝達経路に関連する。異常なＨＥＲ−２発現は、多くの異なる型のヒト癌において検出されており、ヒト癌としては、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、および口腔癌が挙げられる。ＨＥＲ−２は、乳癌における重要な予後的かつ予測的な因子であり、ここで、乳癌におけるＨＥＲ−２過剰発現は、全体的に不良な生存率に関連し、悪性腫瘍を増大させることが示されている。この悪性腫瘍表現型は、ＨＥＲ−２抑制を介して抑制され得るので、ＨＥＲ−２は、抗癌剤の開発に対する重要な標的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、新規のＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【０００７】
本発明は、以下を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかにに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００８】
本発明はまた、以下を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドに対して、少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のコードされるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載のヌクレオチド配列の領域であって、ここでこのポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるヌクレオチド配列の領域；
（ｃ）配列番号２の残基２６１〜残基２６２を含む、少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１に記載のヌクレオチド配列の領域であって、このポリペプチドフラグメントは、配列番号２に記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるヌクレオチド配列の領域；
（ｄ）配列番号４の残基３８３〜残基３８４を含む、少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号３に記載のヌクレオチド配列の領域であって、このポリペプチドフラグメントは、配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）配列番号６の残基３８４〜残基４２２を含む、少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号５に記載のヌクレオチド配列の領域であって、このポリペプチドフラグメントは、配列番号６に記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるヌクレオチド配列の領域；
（ｆ）配列番号１０の残基５８０〜残基６１３を含む、少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号９に記載のヌクレオチド配列の領域であって、このポリペプチドフラグメントは、配列番号１０に記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるヌクレオチド配列の領域；
（ｇ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；または
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【０００９】
本発明はさらに、以下を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号２に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドの活性を有し、ここでポリペプチドは、配列番号２の残基２６１〜残基２６２を含む、ヌクレオチド配列；
（ｃ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号４に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有し、ここでポリペプチドは、配列番号４の残基３８３〜残基３８４を含む、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号６に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号６に記載のポリペプチドの活性を有有し、ここでポリペプチドは、配列番号６の残基３８４〜残基４２２を含む、ヌクレオチド配列；
（ｅ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号１０に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号１０に記載のポリペプチドの活性を有し、ここでポリペプチドは、配列番号１０の残基５８０〜残基６１３を含む、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、Ｃ末端およびＮ末端の短縮の少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有し、このポリペプチドは配列番号２の残基２６１〜残基２６２、配列番号４の残基３８３〜残基３８４、配列番号６の残基３８４〜残基４２２、または配列番号１０の残基５８０〜残基６１３を含む、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでコードされるポリペプチドは配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；または
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明はまた、以下を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）についてのアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の残基２６１〜残基２６２を含む、少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、このポリペプチドフラグメントは、配列番号２に記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるアミノ酸配列フラグメント；
（ｄ）配列番号４の残基３８３〜残基３８４を含む、少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号４に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、このポリペプチドフラグメントは、配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるアミノ酸配列フラグメント；
（ｅ）配列番号６の残基３８４〜残基４２２を含む、少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号６に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、このポリペプチドフラグメントは、配列番号６に記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるアミノ酸配列フラグメント；
（ｆ）配列番号１０の残基５８０〜残基６１３を含む、少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号１０に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、このポリペプチドフラグメントは、配列番号１０に記載のポリペプチドの活性を有するか、または抗原性であるアミノ酸配列フラグメント。
【００１２】
本発明はまた、以下を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ここでポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号２に記載のアミノ酸配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２に記載のポリペプチドの活性を有し、ここでポリペプチドは、配列番号２の残基２６１〜残基２６２を含む、アミノ酸配列；
（ｃ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号４に記載のアミノ酸配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号４に記載のポリペプチドの活性を有し、ここでポリペプチドは、配列番号４の残基３８３〜残基３８４を含む、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号６に記載のアミノ酸配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号６に記載のポリペプチドの活性を有有し、ここでポリペプチドは、配列番号６の残基３８４〜残基４２２を含む、アミノ酸配列；
（ｅ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号１０に記載のアミノ酸配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号１０に記載のポリペプチドの活性を有し、ここでポリペプチドは、配列番号１０の残基５８０〜残基６１３を含む、アミノ酸配列；または
（ｆ）アミノ酸置換、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮の少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列であって、ここでコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有し、このポリペプチドは配列番号２の残基２６１〜残基２６２、配列番号４の残基３８３〜残基３８４、配列番号６の残基３８４〜残基４２２、または配列番号１０の残基５８０〜残基６１３を含む、アミノ酸配列。
【００１３】
また、ＨＥＲ−２ｓｖアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドも提供される。
【００１４】
本発明はまた、本明細書中に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に記載の組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびこの宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてそのようにして産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生する方法を提供する。発現したポリペプチドの単離を、必要に応じてとして記載したのは、ＨＥＲ−２ｓｖ活性のアンタゴニストの同定のためのスクリーニング方法を使用するために細胞表面または細胞膜上でポリペプチドを発現することが望ましい場合があり得るからである。
【００１５】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明によって包含される。ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現およびレベルの増加（これは、循環レベルの増加を含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子は、内因性のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を防ぐ様式で動物に導入される（すなわち、ＨＥＲ２−ｓｖポリペプチド遺伝子のノックアウトを有するトランスジェニック動物を作製する）。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、さらに好ましくは、ラットまたはマウスといったげっ歯類である。
【００１６】
また、本発明のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの誘導体が提供される。
【００１７】
さらに、本発明のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が提供される。
【００１８】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチドまたは選択的結合因子、および１以上の薬学的に受容可能な処方剤を含む薬学的組成物もまた、本発明によって包含される。この薬学的組成物は、治療的有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するように使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００１９】
本発明のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドおよび核酸分子は、本明細書中に列挙された疾患および障害を含む疾患および障害を処置、予防、改善、診断、および／または検出するために使用され得る。
【００２０】
本発明はまた、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに結合する試験分子を同定するために試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、ポリペプチドへの試験分子の結合程度を決定するために、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを試験分子と接触させる工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアンタゴニストであるか否かを決定する工程を包含する。本発明はさらに、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現に対する分子の影響、またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２１】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を調節する方法およびレベルを調整（すなわち、増加または減少）する方法もまた、本発明によって包含される。１つの方法は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を調節または調整するエレメントを含む核酸分子が投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるような、遺伝子治療、細胞療法、およびアンチセンス療法が挙げられる。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の見出しは、構成上の目的のためのみであり、そしてそこに記載される内容を限定するように解釈されるべきではない。本願において列挙される全ての参考文献が、明確に、本明細書中に参考として援用される。
【００２３】
（１．定義）
用語「ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子」もしくは「ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子」または「ＨＥＲ−２ｓｖポリヌクレオチド」は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸分子；配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および本明細書中で定義される核酸分子をいう。
【００２４】
用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド対立遺伝子改変体」は、生物体または生物体の集団の染色体上の所定の遺伝子座に存在する遺伝子のいくつかの可能な天然に存在する代替的形態の１つをいう。
【００２５】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総ＤＮＡが供給源細胞から単離される場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない、本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、任意の他の夾雑核酸分子、またはその天然の環境において見出される他の夾雑物（これらは、ポリペプチド産生におけるその用途、またはその治療的用途、診断的用途、予防的用途、または研究的用途を阻害する）を実質的に含まない。
【００２６】
「核酸配列」または「核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。この用語は、例えば、以下であるがこれらに限定されない、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含む：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−エチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００２７】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移入するために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
【００２８】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切であり、そして挿入された異種核酸配列の発現を、指向および／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書中で、隣接配列の配置をいうために使用され、ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成またはアセンブルされる。従って、コード配列に作動可能に連結された隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳を行うことを可能にし得る。例えば、コード配列は、このプロモーターがコード配列の転写を指示し得る場合に、プロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、これが正確に機能する限り、コード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なおこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００３０】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいうように使用される。この用語には、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【００３１】
用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド」は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸を含むポリペプチドポリペプチドおよび関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドには、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性の少なくとも１つを有するＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメント、ＨＥＲ−２ｓｖオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ），ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体、およびＨＥＲ−２ｓｖ誘導体が挙げられる。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、本明細書中で記載されるように、成熟ポリペプチドであり得て、それらが調整された方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３２】
用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメント」は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドのアミノ酸末端での短縮（リーダー配列を含むかまたは含まない）または／およびカルボキシ末端での短縮を含むポリペプチドをいう。用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメント」はまた、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドオルソログ、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド誘導体、またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体のアミノ末端での短縮および／またはカルボキシ末端での短縮、あるいはＨＥＲ−２ｓｖ対立遺伝子改変体によってコードされているポリペプチドのアミノ末端での短縮および／またはカルボキシ末端での短縮をいう。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメントは、インビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮化は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多くのアミノ酸を含む。このように生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸、または約２００より多くのアミノ酸を含む。このようなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに対する抗体を生成するために使用され得ることが理解される。
【００３３】
用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドオルソログ」は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドアミノ酸配列に対応する他の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスＨＥＲ−２ｓｖポリペプチとヒトＨＥＲ−２ｓｖポリペプチは、互いにオルソログであると考えられる。
【００３４】
用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体」は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドアミノ酸配列（リーダー配列を有するかまたは有さない）と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部の欠失および／またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメント）および／または付加（例えば、内部の付加および／またはＨＥＲ−２ｓｖ融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含むＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在し得る（例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド対立遺伝子改変体およびＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドオルソログ）か、または、人工的に構築され得る。このようなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載のＤＮＡ配列から変化するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００３５】
用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド誘導体」は、本明細書中で定義されたように、化学的に改変された配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０または配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載のポリペプチド、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメント、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドオルソログ）、またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体をいう。用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド誘導体」はまた、本明細書中で定義されたように、化学的に改変されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド対立遺伝子改変体によってコードされるポリペプチドをいう。
【００３６】
用語「成熟ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド」は、リーダー配列を欠いたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをいう。成熟ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、他の修飾（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシ末端のタンパク分解性のプロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合グリコシル化および／またはＯ結合グリコシル化など）もまた含み得る。
【００３７】
用語「ＨＥＲ−２ｓｖ融合ポリペプチド」は、本明細書中で、定義されたように、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチド、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメント、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドオルソログ）、またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体、またはＨＥＲ−２ｓｖ誘導体のアミノ末端またはカルボキシ末端での１つ以上のアミノ酸（例えば異種性のタンパク質またはペプチド）の融合をいう。用語「ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド融合ポリペプチド」はまた、本明細書中で定義されたように、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド対立遺伝子改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端での１つ以上のアミノ酸の融合をいう。
【００３８】
用語、「生物学的に活性なＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド」は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特徴的なの少なくとも１つの活性を有するＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをいう。さらに、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、免疫原として活性であり得る；すなわち、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、抗体を惹起し得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００３９】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリペプチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から単離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に連結しない（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）、本発明のポリペプチド、（３）天然には連結しないポリペプチドに作動可能に連結（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）する、本発明のポリペプチド、または（４）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、任意の他の混入ポリペプチドまたは天然の環境において見出される他の混入物（これは、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用に干渉する）を実質的に含まない。
【００４０】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の、配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、一列の２つ以上のヌクレオチド配列間または２つ以上のアミノ酸配列間の一致によって決定されるように、核酸分子またはポリペプチド配列間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によってアドレス指定されるギャップ整列（存在する場合）との間の一致の同一パーセントを評価する。
【００４１】
用語「類似性」は、概念に関するが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一的一致および保存的置換の一致の両方を含む類似性の測定値をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）である。したがって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド配列間のパーセント類似性は、これら２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【００４２】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない（非ネイティブ）」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質をいう。
【００４３】
用語「有効量」および「治療有効量」は、本明細書中に示されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用される、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子の量をいう
本明細書において使用される用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理的に受容可能なキャリア」とは、薬学的組成物としてのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド、核酸分子または選択結合因子の送達を達成または増強するために適切な、１つ以上の処方物材料をいう。
【００４４】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生し得る分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００４５】
用語「選択的結合因子」は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子の、ヒトＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに結合し、かつヒト非ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのオルソログ（すなわち、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの種間バージョン（例えば、マウスＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドおよびラットＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。
【００４６】
用語「形質導入」とは、通常はファージによる１つの細菌から別の細菌への遺伝子の伝達をいう。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得および伝達をいう。
【００４７】
用語「トランスフェクション」は、細胞による異種または外因性ＤＮＡの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合には「トランスフェクトされ」ている。多数のトランスフェクション技術は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；ａｎｄ  Ｃｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
【００４８】
用語「形質転換」とは、本明細書中で使用される場合、細胞の遺伝子特性の変化をいい、そしてこの細胞が新たなＤＮＡを含むように改変されている場合、この細胞は形質転換されている。例えば、細胞がそのネイティブの状態から遺伝子的に改変されている場合、この細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質転換の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体への物理的組込みによって、この細胞のＤＮＡと組換えられ得るか、または複製されることなく、エピトープソームエレメントとして一過的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。ＤＮＡが細胞分裂によって複製される場合、この細胞は安定に形質転換されたとみなされる。
【００４９】
（２．核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連の核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載されている核酸分子の対立遺伝子改変体、および上のヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列も含むと理解される。関連の核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載されているポリペプチドと比べて、１つ以上のアミノ酸残基の置換、修飾、付加および／または欠損を主に含むかまたはそれらからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。このような関連したＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、例えば、１つ以上のＮ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化位置の付加および／または欠損、もしくは１つ以上のシステイン残基の付加および／または欠損を含み得る。
【００５０】
関連の核酸分子はまた、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子のフラグメントを含み、このフラグメントは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載されているＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの少なくとも約２５個の連続しアミノ酸、または約５０個のアミノ酸、または約７５個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸、または約１５０個のアミノ酸、または約２００個のアミノ酸、または２００個より多くのアミノ酸のポリペプチドをコードする。
【００５１】
さらに、関連のＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子はまた、本明細書中に規定される中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載されているＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子；または配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかで示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子；あるいは本明細書中で定義される核酸フラグメント、または本明細書中で定義されるポリペプチドをコードする核酸フラグメントの、完全相補配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を含む。ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に提供されるＨＥＲ−２ｓｖ配列を用いて、関連配列に関してｃＤＮＡライブラリ、ゲノムライブラリまたは合成ＤＮＡライブラリースクリーニングして調製され得る。既知配列に対して顕著な同一性を示すＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列の領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブが設計され得る。
【００５２】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が非常に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ顕著に不一致のＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５３】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響される。他の薬剤は、非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、フィコール（ｆｉｃｏｌｌ）、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）およびデキストラン硫酸であるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨからほぼ独立する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５４】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって評価され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中での（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、１％の不一致毎に約１℃下げられる。
【００５５】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例示として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中での５０℃という「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を可能にする。
【００５６】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって認識される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長さのＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００５７】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ  ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な評価は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃  ＋  Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編，１９８１）を参照のこと。
【００５８】
オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェンシー洗浄条件は通常、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中でのそのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００５９】
別の実施形態において、関連する核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかで示されているヌクレオチド配列に少なくとも約７０％同一であるヌクレオチド配列を含むか、もしくはこれらからなる。好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかで示されているヌクレオチド配列に約７５％、もしくは約８０％、もしくは約８５％、もしくは約９０％、もしくは約９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。関連する核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする。
【００６０】
核酸配列における違いは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列に関して、アミノ酸配列の保存的または／および非保存的修飾を生じ得る。
【００６１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列への保存的な修飾（およびコードヌクレオチドへの対応する修飾）は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに類似した機能および化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。対照的に、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特長における実質的な修飾は、（ａ）置換領域内での分子の骨格構造（例えば、シート高次構造またはらせん状の高次構造）（ｂ）標的部位における分子の電荷はまた疎水性、もしくは（ｃ）側鎖のバルク、の維持における効果が有意に異なる、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することにより達成し得る。
【００６２】
例えば、「保存的なアミノ酸置換」は、結果として、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷においてほとんど、もしくは全く影響がない、非天然残基での天然のアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチドにおける任意の天然の残基はまた、以前に「アラニン走査突然変異」として記載されているように、アラニンで置換され得る。
【００６３】
保存的なアミノ酸置換はまた、代表的には、生物学的系での合成よりも化学ペプチド合成によって組み入れられている天然に存在しないアミノ酸残基を包含する。これらには、ペプチド擬態および他のアミノ酸部分の逆転形態または反転形態が挙げられる。
【００６４】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、複数のクラスに分割され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００６５】
例えば、非保存的な置換には、他のクラス由来のメンバーに対するこれらクラスの１つのメンバーの交換が挙げられ得る。このような置換残基は、非ヒトＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと相同なヒトＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド領域へ、もしくはその分子の非相同性領域へと導入され得る。
【００６６】
このような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てられている。ヒドロパシー指数は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００６７】
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を確認する際の、ヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定のアミノ酸が類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を起こす際に、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００６８】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）こともまた、当該分野において理解されている。近接するアミノ酸の親水性により支配されるように、タンパク質の最も大きな局所的な平均親水性は、免疫原性および抗原性（すなわち、タンパク質の生物学的特徴に）に関する。
【００６９】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づいて変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。一次アミノ酸配列から、エピトープをまた、親水性に基づいて同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と呼ばれる。
【００７０】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、このような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換が表Iで記載されている。
【００７１】
（表I）
（アミノ酸置換）
【００７２】
【表１】
2005535297.tif 000002
当業者は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して決定し得る。生物学的活性を破壊することなく変化され得る適切な分子領域の同定のために、当業者は、活性のために重要であるとは考えられていない領域を標的とし得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には、当業者は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていない、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの領域における変化が、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えるようではないことが理解される。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、化学的に類似のアミノ酸を、活性を維持しながら天然に存在する残基と置換し得ることが公知である（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に不利に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００７３】
さらに、当業者は、活性または構造に重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較の観点において、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似のアミノ酸置換を、選択し得る。
【００７４】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造に関して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の観点において、当業者は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が破壊を生じるか、所望でなく減少するか、または所望でない活性であることを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００７５】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕら、１９７４  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３（２）：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８  Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、２次構造を推定するのを補助するために、コンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を推定する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％より大きな配列同一性または４０％より大きな類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長は、二次構造（ポリペプチドまたはタンパク質の構造における可能な折り畳みの数を含む）の増強された推定性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質において制限された数の折り畳みが存在すること、および一旦、決定的な数の構造が解析されると、構造推定は劇的により正確となることが、示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）。
【００７６】
二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）、および「ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ」（Ｈｏｌｍら（前出）、およびＢｒｅｎｎｅｒら（前出）を参照のこと）を包含する。
【００７７】
好ましいＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して変化しているグリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列に比べてより多いかまたはより少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ糖鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合糖鎖を除去する。１つ以上のＮ結合グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ結合部位が作製される、Ｎ結合糖鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＨＥＲ−２ｓｖ改変体としては、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して、１つ以上のシステイン残基が、欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されているシステイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性な立体配置に再折り畳みされなければならない場合に有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には同数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００７８】
別の実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体は、少なくとも１つのアミノ酸の挿入を伴う配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸であって、そのポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列または、少なくとも１つのアミノ酸の欠失を伴う配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸であって、そのポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列を含む。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸を含み、そのポリペプチドが、カルボキシ末端の短縮および／またはアミノ末端の短縮を有し、さらにポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列を含む。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体はさらに、少なくとも１つの改変（すなわち、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシ末端の短縮、またはアミノ末端の短縮）を伴う配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸であって、ここで、ポリペプチドが配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７９】
さらなる実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％または約９９％、同一のアミノ酸配列を含む。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有する。
【００８０】
さらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のいずれかのアミノ酸配列または他のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを含むポリペプチドは、ホモ二量体を形成するために相同的なポリペプチドに融合、またはヘテロ二量体を形成するために異種的なポリペプチドに融合し得る。異種性のペプチドおよびポリペプチドとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＥＲ−２ｓｖ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはそれらの一部（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；リガンドまたは膜貫通レセプタータンパク質に結合するリガンドの一部；酵素または触媒的に活性な酵素の一部；オリゴマー形成を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を高めるポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；および配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとは異なる治療的活性を有するポリペプチド。
【００８１】
融合は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端、または他のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドで作製され得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いない直接的であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約２０〜約５０アミノ酸残基である。リンカーまたはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を用いて設計されて、融合した部分の分離を可能にし得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【００８２】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、もしくは配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに相補的活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメインの２つの機能的に独立した部分を含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはこのような機能（Ｆｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体結合、およびおそらく、胎盤移入さえも）を組み込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８３】
【表２】
2005535297.tif 000003
（表ＩＩ  治療的タンパク質とのＦｃ融合）
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、当業者に公知の方法を使用して、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに融合され得る。別の例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域が、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメントのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれか（例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの予想された細胞外部分）に融合され得る。
【００８４】
得られるＨＥＲ−２ｓｖ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療品質、循環時間、もしくは減少した凝集のような特定の品質を改善するよう変更され得る。
【００８５】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算される。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ，編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ  １，Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，およびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，およびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の一致を与えるために、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含む）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００８７】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、特許請求の範囲のポリペプチドの少なくとも５０の連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００８８】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定される２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、ギャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もまた、このアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３、１９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較行列）を参照のこと）。
【００８９】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ  ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１２
Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：４
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｏｆ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：０
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【００９０】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，前出；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ｍａｔｃｈｅｓ＝＋１０，ｍｉｓｍａｔｃｈ＝０
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：５０
Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：３
このＧＡＰプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９１】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む、他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較行列、および類似性の閾値が使用され得る。なされるべき特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ）；ならびにさらに、その比較が所定の対の配列間（この場合には、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）であるか、１つの配列と大きなデータベースの配列との間（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるかに依存する。
【００９２】
（３．核酸分子）
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の様式（化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリのスクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない）で容易に得られ得る。
【００９３】
本明細書中において使用される組換えＤＮＡ法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に記載されている。本発明は、本明細書中に記載されるような核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９４】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が、１つの種から同定された場合、その遺伝子の全てもしくは一部が、同じ種からのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）または関連した遺伝子を同定するためのプローブとして使用され得る。プローブまたはプライマーは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを発現すると考えられている種々の組織源からのｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用され得る。さらに、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、または配列番号９のいずれかに記載の配列を有する一部または全ての核酸分子を使用して、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離するためのゲノムライブラリをスクリーニングし得る。代表的に、中程度または高いストリンジェンシーの条件が、スクリーニングに使用されて、このスクリーニングから得られる偽陽性の数を最小にする。
【００９５】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子もまた、発現されたタンパク質の特性に基づいて陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、同定され得る。代表的に、核酸ライブラリは、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面に発現され、そして提示されるクローンタンパク質に結合させることによって、スクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【００９６】
以下に記載される説明に従って実施される組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現し得る。例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが、多量に生成され得る。
【００９７】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに付加され、そしてこのポリメラーゼが、このｃＤＮＡのこれら２つのプライマー間の領域を増幅する。
【００９８】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマー支持される合成である。代表的に、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されるか否かに依存して、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【００９９】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先性のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン度数表を組み込むコンピュータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン度数表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１００】
いくつかの場合において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望であり得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマーが所望の点変異を有する、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して生成し得る（変異誘発技術の記載に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０１】
（４．ベクターおよび宿主細胞）
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）を参照のこと。
【０１０２】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１０３】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列を含み得る。この「タグ」コード配列は、すなわち、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子であって、このオリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス））または市販の抗体が存在するｍｙｃをコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対して抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドから除去され得る。
【０１０４】
隣接配列は、同種隣接配列（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または同じ系統由来）であり得るか、異種隣接配列（すなわち、宿主細胞種または系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド隣接配列（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成隣接配列であり得るか、あるいは隣接配列は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１０５】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成または核酸クローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１０６】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドならびに／または同じもしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子すらを含み得る大きな片のＤＮＡから単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１０７】
複製起点は、代表的に、購入された市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数までのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶまたはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含むためだけに、しばしば、使用される）。
【０１０８】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として市販で購入すらされる一方、これはまた、本明細書中に記載されるような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１０９】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか；細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは複合培地から入手不能な重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１０】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により大きく要求される遺伝子が、組換え細胞の連続的に生成される染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように独特に適合される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１１】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核性物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのプロモーターの３’側およびコード配列の５’側に配置される。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）。多くのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して、原核生物ベクターを使用して容易に合成され得る。
【０１１２】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子のコード領域に位置するか、または直接ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコード領域の５’側に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性であるシグナル配列のいずれかが、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子に対して同種（天然に存在する）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。大部分において、シグナルペプチドの存在を介した宿主細胞からのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの分泌は、分泌されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子の一部であり得る。
【０１１３】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が、本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドシグナル配列を認識せず、処理しない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼリーダー、ペニシリナーゼリーダー、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が申し分ないが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１１４】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましい、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のシグナルペプチド（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（これもまた、グリコシル化に影響し得る）を加え得る。最後のタンパク質産物は、−１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、このアミノ酸は、完全に除去されていなくともよい。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、所望のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの僅かに短縮した形態を生じ得る。
【０１１５】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが天然で遺伝子内に（大部分のｃＤＮＡについて）存在しない場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子に関してイントロンの位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないゆえに、一般的に重要である。従って、ＨＥＲ−２ｓｖ  ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側で、ｐｏｌｙ−Ａ転写終止配列の５’側である。好ましくは、イントロンは、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの１つの側面または他の側面（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロン（但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である）を使用して、本発明を実行し得る。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１１６】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐの範囲内）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、従来、２つのクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）の１つに分類される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、制御下で、ＤＮＡからの転写のレベルの上昇を開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対する制御がほとんど存在しないかまたは全く存在しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＨＥＲ−２ｓｖプロモーター配列は、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子の増幅および／または発現に指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して多量の転写および発現タンパク質のより高い収率を可能にし、そして使用のために選択されている宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１１７】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼプロモーター系；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、それにより、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡにそれらの配列を連結し得る。
【０１１８】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターもまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとの使用に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモータ）が挙げられる。
【０１１９】
ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子発現を制御する際に関心があり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長い終末反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，ら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２  ：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域もまた興味深い：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ球、および肥満細胞において活性なマウス哺乳動物腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリンベースのタンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；ならび��視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１２０】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは、相対的な方向および位置に依存しない。これらは、転写ユニットに対して５’側および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化について例示的に増強するエレメントである。エンハンサーは、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子に対して５’位または３’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’位側に配置される。
【０１２１】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望の隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書中に記載される隣接配列の１つ以上がすでにベクター内にない場合、これらは、個々に得られ得、ベクター内に連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２２】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１２３】
さらなる適切なベクターとしては、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはバキュロウイルス発現系のようなウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
ベクターが構築され、そしてＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに対する発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む周知の技術によって達成され得る。選択される方法は、一部、使用される宿主細胞の種類の機能である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出に記載される。
【０１２５】
宿主細胞は、原核宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、脊椎動物細胞）であり得る。適切な条件下で培養された場合、宿主細胞は、後に培養培地から（宿主細胞が培地中にＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを分泌する場合）、もしくはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生する宿主細胞から直接（分泌されない場合）収集され得るＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを合成する。適切な宿主細胞の選択は、種々の因子（例えば、所望する発現レベル、活性のために所望されるかまたは必要なポリペプチドの改変（例えば、グリコシル化またはリン酸化）および生物学的に活性な分子への折り畳みの容易さ）に依存する。
【０１２６】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．Ａ．９７：４２１６−２０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞または２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルのＣＯＳ−１細胞株およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株およびゲッ歯類動物細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型として欠損し得るか、または優先的に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓから誘導された３Ｔ３株、Ｂａｌｂ−ｃマウス細胞株またはＮＩＨマウス細胞株、ＢＨＫまたはＨａｋハムスター細胞株が挙げられる（これらは、ＡＴＣＣから入手可能である）が、これらに限定されない。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現の当業者によって公知であり入手可能である。
【０１２７】
同様に、細菌細胞が、本発明に適切な宿主細胞として有用である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）の種々の菌株は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．，他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの種々の菌株がまた、本方法において使用され得る。
【０１２８】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のため宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１２９】
さらに、所望される場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３０】
グリコシル化ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを発現するために、トランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳中に得られ得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、しかし、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において産生されるものとは異なり、ヒトの治療的使用に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１３１】
（５．ポリペプチド産生）
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）、最小培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫細胞についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／または胎仔ウシ血清を補充したグレース培地である。
【０１３２】
代表的に、トランスフェクトされた細胞または形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって検出される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養倍地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１３３】
宿主細胞によって産生されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲル移動アッセイのような活性アッセイが挙げられる。
【０１３４】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１３５】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するかまたは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌についての封入体を含む）は、当業者に公知の任意の標準的な技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、均質化、および／または超音波処理、続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の含有物を放出するように溶解され得る。
【０１３６】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、内部および／または外部細胞膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後にペレット材料において見出される。次いで、ペレット材料は、ｐＨ極限値で処理され得るか、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下アルカリ性のｐＨで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下酸性のｐＨで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、分断させ、そして溶解させ得る。次いで、可溶化されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１３７】
いくつかの場合、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、単離の際、生物学的に活性でなくても良い。「再折り畳みする」、つまり、ポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド連結を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、可溶化されたポリペプチドをあるｐＨ（通常７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体可溶化に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２，２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が使用され得るか、または再折り畳みの効率を増加するのに必要であり得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１３８】
封入体がＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１３９】
溶液からのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。そのポリペプチドがそのカルボキシル末端もしくはアミノ末端のいずれかに、ヘキサヒスチジンのようなタグを含む（ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）かまたはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）もしくはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような他の小さいペプチドを含むように合成されている場合、そのポリペプチドは、カラムマトリックスがそのタグにまたはそのポリペプチドに直接高い親和性を有するアフィニティーカラムにその溶液を通すことによって、１工程のプロセスで精製され得る。
【０１４０】
例えば、ポリヒスチジンはニッケルに大きな親和性および特異性で結合し、従ってニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）が、ＨＥＲ−２ＳＶポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０．１１．８節（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９３）を参照のこと。
【０１４１】
さらに、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを特異的に認識し得そして結合し得るモノクローナル抗体の使用を介して、精製され得る。
【０１４２】
精製のための他の適した方法には、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）と続くゲル溶出、ならびに調製的等電収束法（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシーン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が挙げられるがこれら限定されない。いくつかの場合、２つ以上の精製技術が、純度の増加を達成するために組み合わされ得る。
【０１４３】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、当該分野で公知の技術を使用して化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）により調製され得、その公知技術は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９、１９６３）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２、１９８５）、ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、１９８４）に示される技術である。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを含んで合成され得るし、または含まずに合成され得る。化学合成されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、これらの参考文献に示される方法を使用して、ジスルフィド架橋を形成するように酸化され得る。化学合成されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、組換え産生されるかもしくは天然の供給源から精製された対応するＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると予測され、従って、組換えＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドもしくは天然のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと互換可能に使用され得る。
【０１４４】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを得る別の手段は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【０１４５】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ  ３：２６８−７３もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、それぞれが、５’無作為化配列、中心予備選択配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的活性を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１４６】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成される。次いで、この宿主細胞は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１４７】
ペプチドまたはポリペプチドの産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願されたＷＯ９９／１５６５０に記載されている。「Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られている、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同性組換えまたは異常な組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、放射線に供せられ、そして遺伝子プロモーターに挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方に最終的に配置され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を生じる。
【０１４８】
これらの方法は、包括的なＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド発現ライブラリを作製するためにも使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アセイおよび全生物アッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ると理解される。
【０１４９】
（６．合成）
本明細書中で記載された核酸およびポリペプチド分子は、組換え方法および他の方法によって産生され得ると当業者によって理解される。
【０１５０】
（７．選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」は、１以上のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに対して特異性を有する分子を言及する。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なＨＥＲ−２ＳＶポリペプチド選択的結合因子は、ＨＥＲ−２ＳＶポリペプチドの特定の部分に結合し得、これにより、ポリペプチドのＨＥＲ−２ｓｖレセプターへの結合を阻害する。
【０１５１】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと結合する抗体および抗体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異的なポリクローナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組換え；キメラ；ヒト化（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化）；ヒト；単鎖；および／または二特異的；ならびにフラグメント；改変体；またはそれらの誘導体であり得る。抗体フラグメントとしては、ＨＥＲ−２ＳＶポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のこれらの一部を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって産生されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【０１５２】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、一般に、ＨＥＲ−２ＳＶポリペプチドおよびアジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＨＥＲ−２ＳＶポリペプチドをキャリアタンパク質に結合させることは、有用であり得、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのように、免疫化される種において免疫原性である。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、この動物は採血され、そして血清を、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド抗体力価についてアッセイする。
【０１５３】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、培地中の連続的細胞株によって抗体分子を産生するために提供される、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために適切な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７））が挙げられる。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと反応する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がまた、本発明によって提供される。
【０１５４】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る。１実施形態は、「キメラ」抗体であり、この重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）の一部が、特定の種から誘導されるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスの属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である一方で、この鎖の残りは、別の種から誘導されるか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である。抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、これらの抗体のフラグメントも含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５を参照のこと。
【０１５５】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化した抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載される方法（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６）を使用して、げっ歯類の相補性決定領域の少なくとも一部をヒトの抗体の対応する領域と置換することによって、実施される。
【０１５６】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと結合するヒト抗体がまた、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリンの産物の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個の連続アミノ酸を有する）を用いて免疫化することによって産生され、必要に応じて、キャリアに結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、本明細書中の重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（この動物は、改変体の完全相補体未満を有する）は、所望の免疫系の改変体の全てを有する動物を得るためにクロスブレッドされる。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物が、ヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、これらの抗原に対して免疫特異性である改変領域を含む）を有する抗体を産生する。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１および同第５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１５７】
代替の実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらのプロセスは、糸状のバクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイを介した免疫選択を模倣し、選択した抗原への結合によってファージを続いて選択する。１つのこのような技術は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを使用して、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−レセプターについて、高い親和性および機能的なアゴニスト抗体の単離が記載される。
【０１５８】
キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、およびヒト化抗体は、代表的に組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書中に記載される物質および手順を使用して発現される。好ましい実施形態において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で処理される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書中に記載されるように、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１５９】
本発明の抗−ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド抗体は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの検出および定量のために、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ）において使用され得る（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））。この抗体は、使用されるアッセイ方法に対して、適切である親和性でＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと結合する。
【０１６０】
診断適用のために、特定の実施形態において、抗−ＨＥＲ−２ｓｖ抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａ）；蛍光化合物または化学的蛍光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくはホースラディシュペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）。
【０１６１】
競合結合アッセイは、標識した標準（例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド、またはその免疫学的に活性な部分）の、限定された量の抗−ＨＥＲ−２ｓｖ抗体との結合に関して、試験サンプル検体（ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド）と競合する能力に依存する。試験サンプル中のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの量は、抗体と結合する標準の量と反比例する。結合する標準の量を決定するのを容易にするために、この抗体は、競合前または後に、代表的に不溶化され、この抗体と結合する標準および検体は、結合しないままの標準および検体から好都合に分離され得る。
【０１６２】
サンドイッチアッセイは、２つの抗体の使用に代表的に関連し、各々は、決定および／または定量されるべきタンパク質の異なる免疫部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル検体は、固体支持体上に固定される第１抗体によって代表的に結合され、その後、第２抗体が、この検体に結合され、不溶性の３部の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０を参照のこと。第２抗体自体は、検出可能な部分で標識されるか（直接的なサンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識される抗−免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）（この場合、検出可能な部分は、酵素である）である。
【０１６３】
抗ＨＥＲ−２ｓｖ抗体を含む選択的結合因子はまた、インビボでの画像化に有用である。検出可能な部分で標識された抗体は、動物、好ましくは血流に投与され得、そして宿主中の標識された抗体の存在および位置は、アッセイされる。抗体は、核磁気共鳴、放射線医学、または当該分野において公知の他の検出手段によって、動物中において検出可能な部分のいずれかで標識され得る。
【０１６４】
抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。好ましい実施形態において、選択的結合因子は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに特異的に結合可能であり、その結果としてインビボまたはインビトロにおいてＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの機能活性を阻害または排除するアンタゴニスト抗体である。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、および好ましくは、少なくとも約８０％によって、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得る抗−ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド抗体であり、これにより、インビトロまたはインビボにおいてＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性を阻害または排除する。アンタゴニスト抗ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１６５】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＨＥＲ−２ｓｖ選択可能な結合因子（例えば、抗体）およびＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのレベルを検出するために有用な他の試薬を含むキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブコントロールサンプルおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬を含み得る。
【０１６６】
（８．マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術が、本発明に従って利用され得ることは明らかである。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された、核酸の微小の高密度アレイである。このアレイ内の各セルまたはエレメントは、単一種の核酸の多くのコピーを有し、この核酸は、相補的な核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションのための標的として作用する。ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用する発現プロファイリングにおいて、最初に、ｍＲＮＡが、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変換される。この材料を、マイクロアレイにハイブリダイズさせ、そして未結合ｃＤＮＡを洗浄により除去する。次いで、アレイ上に提示される別々の遺伝子の発現を、各標的核酸分子に特異的に結合された標識ｃＤＮＡの量を定量することによって可視化する。このようにして、数千の遺伝子の発現を、生物学的材料の単一のサンプルから、高スループットの並行様式で定量し得る。
【０１６７】
この高スループット発現プロファイリングは、本発明のＨＥＲ−２ｓｖ分子に関する広範な適用を有する。これらの適用としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：治療用標的としてのＨＥＲ−２ｓｖ疾患関連遺伝子の同定および確証；関連ＨＥＲ−２ｓｖ分子およびそのインヒビターの分子毒性研究；集団の層別化および臨床試験用の代理マーカーの作製；ならびに高スループットスクリーニングにおける選択的な化合物の同定を補助することによるＨＥＲ−２ｓｖ関連低分子薬物発見の増大。
【０１６８】
（９．化学的誘導体）
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、この開示が、本明細書中に記載された場合、当業者によって調製され得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然で結合した分子の型または位置のいずれかで、異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然で結合した化学的な基の除去によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列または他のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、結合するタンパク質は、水環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、目的産物の調製の治療学的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１６９】
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、上記の分子量より多い、いくらか少ない重量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７０】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコキシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導するために使用されるＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤ）のデキストラン）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリジン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。共有結合したＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【０１７１】
一般に、化学的誘導体化は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させるために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、または配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは他のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが、１以上のポリマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とポリペプチドを反応させる工程、ならびに（ｂ）反応生成物を得る工程。最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子のタンパク質に対する比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も大きくなる。１実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド誘導体は、アミノ末端の単一ポリマー分子部分を有する。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７２】
ポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のペグ化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応のためには、選択されるポリマーは、単一の反応性エステル基を有する。還元的アルキル化のためには、選択されるポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有する。例えば、反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水溶性である）、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７３】
別の実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、ビオチンに化学的に連結され得る。次いで、このビオチン／ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド分子は、アビジンに結合され得、その結果、４価のアビジン／ビオチン／ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド分子が得られる。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた結合体は、抗−ＤＮＰまたは抗−ＴＮＰ−ＩｇＭと共に沈殿し、１０価の十量体の結合体を形成する。
【０１７４】
一般に、本発明のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド誘導体の投与によって、緩和または調節され得る条件は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドについて本明細書中に記載されたものを含む。しかし、本明細書中に開示されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増強または減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加または減少した半減期）を有し得る。
【０１７５】
（１０．遺伝子操作された非ヒト動物）
非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、もしくは他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、またはヒツジ、あるいは、他の家畜動物）は、本明細書の範囲にさらに含まれる。これらの動物において、ネイティブなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする遺伝子は、破壊されている（「ノックアウトされている」）ので、これらの遺伝子の発現レベルは、顕著に減少しているかまたは完全に除外されている。このような動物は、例えば、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
【０１７６】
本発明はさらに、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、もしくは他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、またはヒツジ、あるいは、他の家畜動物）を含み、これらの動物において、これらの動物に対してネイティブな形態のＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子または異種性ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子は、これらの動物によって過剰発現され、これにより、「トランスジェニック」動物が作製される。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／２８１２２に記載されるような周知の方法を使用して調製され得る。
【０１７７】
本発明はさらに、非ヒト動物を含み、これらの動物において、本発明の１つ以上のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドについてのプロモーターは、活性化されるかまたは不活性化されるかのいずれか（例えば、相同組換え法を使用することによって）であり、１つ以上のネイティブなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現レベルを変更する。
【０１７８】
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングに用いられ得る。このようなスクリーニングにおいて、動物における薬物候補の影響は、測定され得る。例えば、薬物候補は、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の発現を減少または増加し得る。特定の実施形態において、産生されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの量は、動物をその薬物候補に暴露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病理学的状態を生じ得るかあるいは疾患または病理学的状態に関し得る。このような場合において、この遺伝子の発現を減少するための薬物候補の能力、あるいは病理学的状態を予防または阻害するための能力を試験し得る。他の実施例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、あるいは疾患または病理学的状態に関連し得る。このような場合において、薬物候補がこのような代謝産物の産生を減少させる能力、またはその病理学的状態を予防もしくは阻害する能力が、試験され得る。
【０１７９】
（１１．ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性の他の調節因子についてのアッセイ）
いくつかの状況において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの活性の調節因子（例えば、アンタゴニスト）である分子を同定することが所望され得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、本明細書中に記載されるもののような１つ以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式でか、または注射によるインビボ様式でか、あるいは経口投与、移植デバイスなどによってのいずれかで投与され得る。
【０１８０】
「試験分子」は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）する能力についての評価下である分子をいう。最も一般的には、試験分子は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性を例えば、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子発現に影響を与えることによってかまたはＨＥＲ−２ｓｖ結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、間接的に調節し得ることもまた意図される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、もっとも好ましくは約１０−９Ｍ、そしてさらにもっとも好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数でＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに結合する。
【０１８１】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、試験分子のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、試験分子とインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定され得る。試験分子は、実質的に精製された形態または粗製混合物においてスクリーニングされ得る。
【０１８２】
特定の実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖアンタゴニストは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの活性を調節するようＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと相互作用するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量分子であり得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を調節する分子には、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする核酸と相補的な核酸、またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を指示もしくは制御する核酸配列と相補的な核酸、ならびに発現のアンチセンス調節因子として働く核酸が挙げられる。
【０１８３】
一旦、試験分子がＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと相互作用するとして同定されると、この分子はさらに、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性を増加または減少するその能力について評価され得る。試験分子のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの型（細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、溶液相アッセイおよび免疫アッセイを含む）において実施され得る。一般には、試験分子は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドと特定の時間にわたってインキュベートされ、そして、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性は、生物学的活性を測定するための１つ以上のアッセイによって決定される。
【０１８４】
試験分子のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるエピトープタグを含有するＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの改変形態は、溶液中および免疫アッセイにおいて使用され得る。
【０１８５】
結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介してＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが生物学的活性を示す場合、種々のインビトロアッセイは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのその対応する結合パートナー（例えば、選択的な結合因子、もしくはレセプターまたはリガンド）との結合を測定するために使用され得る。このようなアッセイは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのその結合パートナーとの結合の割合および／または程度を増加または減少するこれらの能力について試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにおいて、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェルにおいて固定化される。次いで、放射標識されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨード化されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナー）、および試験分子は、ウェルに一度に一方（どちらの順番でも）または同時にかのいずれかで添加され得る。インキュベート後ウェルを、洗浄し、そして、結合した結合パートナーがＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに程度を決定するためにシンチレーションカウンターを使用して放射能について計数し得る。代表的には、これらの分子は、濃度の範囲にわたって試験され、そして、試験アッセイの１つ以上の要素を欠く一連のコントロールウェルは、これらの結果の評価における正確さについて使用され得る。本方法の代替は、タンパク質の「位置」を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレートにＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナーを固定化する工程）、試験分子を放射標識されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとインキュベートする工程、ならびにＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合の程度を決定する工程を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１８章、（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９５）を参照のこと。
【０１８６】
放射標識の代替として、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、次いで、ビオチン化タンパク質の存在は、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に連結されたストレプトアビジンを使用して検出され得、これは、比色定量により（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化により、検出され得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはＨＥＲ−２ｓｖ結合パートナーに対する、ビオチンに結合体化された抗体はまた、ＡＰまたはＨＲＰと連結された酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベート後に検出の目的で使用され得る。
【０１８７】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはＨＥＲ−２ｓｖ結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズまたはこのような不活性な固相基質の他の型への接着によって固定化され得る。基質−タンパク質複合体は、相補的タンパク質および試験化合物を含む溶液に入れられ得る。インキュベート後、ビーズは、遠心分離によって沈殿され得、そしてＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量は、本明細書中に記載される方法によって評価され得る。あるいは、基質−タンパク質複合体は、カラムに固定化され得、そして試験分子および相補的タンパク質は、このカラムを通過される。次いで、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとその結合パートナーとの複合体の形成は、本明細書中に記載の技術のいずれか（例えば、放射性標識、または抗体結合）を使用して評価され得る。
【０１８８】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合タンパク質とＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナーとの複合体の形成を増加または減少する試験分子を同定するために有用な、別のインビトロアッセイは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のような表面プラズモン共鳴検出器システムである。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって特定されるように利用され得る。このアッセイは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはＨＥＲ−２ｓｖ結合パートナーのいずれかの、検出器に位置するデキストランコートされたセンサーチップとの共有結合を必ず含む。次いで、試験化合物および他の相補的タンパク質は、センサーチップを含むチャンバーへと同時または順次いずれかで注入され得る。結合する相補的タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコートされた側に物理的に結合する分子量における変化に基づいて評価され得、そして分子量における変化は、検出器システムによって測定され得る。
【０１８９】
いくつかの場合において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する能力について、２つ以上の試験化合物を一緒に評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載されるアッセイは、このようなさらなる試験化合物の添加（第一の試験化合物と同時に、または第一の試験化合物に引き続いてかのいずれか）によって容易に改変され得る。このアッセイにおけるこの工程の残りは、本明細書中に記載されるとおりである。
【０１９０】
本明細書中に記載されるもののようなインビトロアッセイは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナーとの間の複合体形成に対する影響について、多数の化合物をスクリーニングするために有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイライブラリ、合成ペプチドライブラリー、および化学合成ライブラリにおいて作製される化合物をスクリーニングするために自動化され得る。
【０１９１】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドとＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する化合物はまた、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用する細胞培養においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物より取得され得るが、好ましくは、ヒトもしくは他の霊長類、イヌ、またはげっ歯類の供給源由来である。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの、表面でＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への結合は、試験分子の存在下または非存在下において評価され、そして結合の程度は、例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって測定され得る。細胞培養アッセイはさらに、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいてポジティブにスコアリングされる化合物を評価するために有利に使用され得る。
【０１９２】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の発現を減少または増加し得る。特定の実施形態において、産生されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物を薬物候補に暴露した後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。このような場合において、この遺伝子の発現を増加または減少する薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害する薬物候補の能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患または病理学的状態を生じ得るか、あるいは疾患または病理学的状態に関し得る。このような場合において、細胞培養物におけるこのような代謝産物の産生を減少する薬物候補の能力を試験し得る。
【０１９３】
（１２．内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）は、細胞にタンパク質を内部移行するために使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１：６６４−６８（１９９４）を参照のこと。例えば、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ：配列番号１２）（「タンパク質伝達ドメイン」、またはＴＡＴ  ＰＤＴと呼ばれる）は、細胞の細胞膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２（１９９９）；およびＮａｇａｈａｒａら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２（１９９８）を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ−構築物（ＦＩＴＣ標識化Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１３）（これらの構築物は、腹腔内投与後に組織を貫く）は、調製され、そしてこのような構築物の、細胞への結合は、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって観察される。ｔａｔ−βｇａｌ融合タンパク質で処理された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現は、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓、および脳組織を含む）は、において検出され得る。これらの構築は、細胞への侵入のためにある程度のアンフォールディングを受け；細胞への侵入後にリフォールディングが必要とされ得ると考えられる。
【０１９４】
従って、ｔａｔタンパク質配列が所望のポリペプチドを細胞内へ内部移行するために使用され得ることは明白である。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＨＥＲ−２ｓｖアンタゴニスト（例えば、抗ＨＥＲ−２ｓｖ選択的な結合因子、小分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、細胞内へ投与されてＨＥＲ−２ｓｖ分子の活性を阻害し得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＨＥＲ−２ｓｖ分子」は、本明細書中で規定されるようなＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子およびＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの両方をいう。所望の場合、ＨＥＲ−２ｓｖタンパク質自身はまた、これらの手順を使用して細胞内部に投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ，１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１４６６−６７をまた参照のこと。
【０１９５】
（１３．ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを使用する細胞供給源同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに結合する特定の細胞型の供給源を決定し得ることは有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する補助として疾患または病理学的状態の起源を決定することは、有用であり得る。特定の実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用され得て、このようなプローブでの細胞の核酸のスクリーニングによって本明細書中で記載される細胞を同定するためのプローブである。別の実施形態において、細胞中でのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの存在について試験をするよう抗ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド抗体が使用され得る。従って、このような細胞が、本明細書中で記載された型であるか否かが決定され得る。
【０１９６】
（１４．ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内にある。このようなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの薬学的組成物は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたはＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子の治療有効量を、投与の様式に適合するように選択された薬学的または生理的に受容可能な処方因子と混合して含み得る。薬学的組成物は、１つ以上のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド選択的結合因子の治療有効量を、投与の様式に適合するように選択された薬学的または生理的に受容可能な処方因子と混合して含み得る。
【０１９７】
受容可能な処方材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。
【０１９８】
薬学的組成物には、例えば、その組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、明澄度、色調、等張性、匂い、滅菌性、安定性、溶解速度または放出速度、吸収または浸透を改変、維持または保存のための、処方物材料を含み得る。適切な処方物材料には、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝薬（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、充填剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）、単糖、二糖、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、またはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、香料添加剤、および希釈剤（ｄｉｌｕｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール）、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物−好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム−またはマンニトールソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、および／または薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）を参照のこと。
【０１９９】
最適な薬学的組成物は、例えば、投与の意図された経路、送達形式、および所望する投与量に依存して当業者によって決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出を参照のこと。このような組成物は、ＨＥＲ−２ｓｖ分子の物理的な状態、安定性、インビボでの放出速度、およびインビボでの排除の速度に影響し得る。
【０２００】
薬学的組成物中の主なビヒクルまたはキャリアはその性質が水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注射のために適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理的食塩水溶液または人工の脳脊髄液であり得、これらには、非経口投与のための組成物中に一般的な他の材料が補充されていてもよい。中性緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤、または約ｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含む。これは、ソルビトールまたは適切なその代替物をさらに含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、任意の処方剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）で所望の程度の純度を有する選択された組成物と混合することによって、保存用に調製され得る。さらに、ＨＥＲ−２ｓｖのポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を用いた凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０１】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド薬学的組成物は、非経口的送達のために選択され得る。あるいは、その組成物は、吸入もしくは消化管を通じての送達（例えば、経口的）のために選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当業者の技術の範囲内にある。
【０２０２】
この処方物成分は、投与部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、生理的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ（代表的には約５と約８との間のｐＨ範囲内）でその組成物を維持するために使用され得る。
【０２０３】
非経口投与が検討される場合、本発明における使用のための治療的組成物は、発熱物質を含まない、非経口的に受容可能な水溶液（薬学的に受容可能なビヒクル中に所望のＨＥＲ−２ｓｖ分子をふ組む）の形態であり得る。非経口注射に特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水である。この中に、所望するＨＥＲ−２ｓｖ分子は、滅菌等張性溶液として、処方され、適切に保存される。さらに別の調製物は、その産物の制御されたまたは維持された放出を提供し、次いでデポー注射として送達され得る薬剤（例えば、注射可能なミクロスフェア、生体分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸もしくはポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソーム）を用いた所望の分子の処方物を包含し得る。ヒアルロン酸もまた使用され得、これは、循環中でも持続時間を促進する効果を有し得る。所望される分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを包含する。ヒアルロン酸もまた、使用され得て、そしてこれは、血液循環の間維持される促進効果を有し得る。所望する分子導入のための他の適した方法は、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０２０４】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアゾール送達のためのプロペラントを用いて、液化されたプロペラントを用いて処方され得る。さらに別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与は、国際公開ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２０５】
特定の処方物は、経口投与され得ることもまた企図される。本発明の一つに実施形態において、この様式で投与されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、錠剤およびカプセルのような固体投薬形態の処方において慣例的に使用されるそれらのキャリアとともにまたはそれを含まずに処方され得る。例えば、カプセルは、胃腸管において、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして全身前分解が最小化される時点で処方物の活性部分が放出されるように設計され得る。さらなる薬剤が、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの吸収を容易にするように含まれ得る。希釈剤、矯味矯臭剤、低融点ろう、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合因子もまた使用され得る。
【０２０６】
別の薬学的組成物は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの有効量を、錠剤の製造のために適切な非毒性賦形剤と混合して含み得る。滅菌水または他の適切なビヒクル中にその錠剤を溶解することによって、溶液が単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；あるいは結合因子（例えば、デンプン、ゼラチン、アラビアゴム）；あるいは滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２０７】
さらなるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド薬学的組成物は、当業者に明らかであり、これには、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを、徐放送達処方物または制御された送達処方物中のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを含む組成物が包含される。種々の他の徐放手段または制御された送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー（ｄｅｐｏｔ）注射）を処方するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、以下を参照のこと：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９。これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御された放出を記載する。
【０２０８】
徐放調製物のさらなる例としては、成型された物品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスを包含する。徐放マトリクスとしては以下が挙げられ得る：ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）。徐放組成物はまた、リポソームを含み得る。このリポソームは、当該分野において公知のいくつかの方法のいずれかにより調製され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−９２；欧州特許第０３６６７６号；欧州特許第０８８０４６号；欧州特許第１４３９４９号。
【０２０９】
インビボ投与のために使用されるＨＥＲ−２ｓｖ薬学的組成物は、代表的に無菌でなくてはならない。これは、滅菌ろ過膜を通してのろ過によって達成され得る。その組成物が凍結乾燥されている場合、この方法を用いた滅菌は、凍結乾燥および再構築の前またはその後のいずれかで行われ得る。非経口的投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口的組成物は、一般的に、滅菌アクセス口を有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアル）に配置される。
【０２１０】
一旦薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として保存され得る。そのような処方物は、直ぐ使用可能な形態または投与前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存され得る。
【０２１１】
特定の実施形態において、本発明は、単回用量投与単位を産生するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を備え得る。本発明の範囲内に含まれるのはまた、単回および複数のチャンバーつきの予備充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシジンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を備えるキットである。
【０２１２】
治療に使用される、有効量のＨＥＲ−２ｓｖ薬学的組成物は、例えば、治療背景および治療対象に依存する。当業者は、治療のための適切な投与量のレベルは、このように、送達される分子、どのＨＥＲ−２ｓｖ分子が使用されるかの指示、投与の経路および大きさ（体重、体表面、または器官の大きさ）ならびに患者の状態（年齢および一般的な健康状態）に部分的に依存して変化すると理解する。従って、臨床医は、投薬量を力価測定し、そして最適な治療効果を得るために投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲、またはそれを超える範囲であり得る。別の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得るか；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るか；あるいは５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
【０２１３】
投与の頻度は、使用される処方物における、ＨＥＲ−２ｓｖ分子の薬物動態的パラメータに依存する。代表的には、臨床医は、投薬量が所望の効果を達成するに達するまで、その組成物を投与する。従って、その組成物は、単回用量として、または経時的な２もしくはそれを超える用量（これは、所望の分子の同じ量を含んでいても含んでいなくてもよい）として、あるいは移植可能なデバイスまたはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。適切な投与量のさらなる精妙は、当業者により慣用的に作製され、当業者による慣用的に実施されている仕事の範囲である。適切な投与量は、適切な投与量−応答データの使用を通して確認され得る。
【０２１４】
薬学的組成物の投与経路は、公知の方法に従って行われる（例えば、経口（静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または創傷内経路への注射による）；徐放系システムによる；または移植デバイスによる）。所望の場合、その組成物は、ボーラス注射により、または注入により連続的に、または移植デバイスにより投与され得る。
【０２１５】
あるいはまたは加えて、その組成物は、所望の分子が吸収またはカプセル化された膜、スポンジまたは他の適切な材料の罹患領域への移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用されるとき、そのデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時間放出ボーラスによって、または連続投与によってであり得る。
【０２１６】
いくつかの症例では、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド薬学的組成物をエキソビボ様式で使用することも好ましくあり得る。そのような場合、患者から取り出された細胞、組織または器官は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド薬学的組成物に暴露され、その後、その細胞、組織および／または器官は、続いてその患者に移植して戻される。
【０２１７】
他の症例において、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、本明細書において記載されるもののような方法を用いて遺伝子操作された特定の細胞を移植してＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを発現および分泌させることによって送達され得る。そのような細胞は、動物またはヒトの細胞であり得、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。必要に応じて、その細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、その細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。カプセル化された材料は、代表的に、生体適合性で、半透過性のポリマー封入物または膜であり、これは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲組織からの他の悪性因子による細胞の破壊を予防することを可能にする。
【０２１８】
本明細書中で考察したように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど）を１種以上のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドで処置することが所望され得る。これは、ポリペプチドが、細胞膜に対して透過性の形態である場合、単離された細胞を、ポリペプチドに直接暴露することにより達成され得る。
【０２１９】
本発明のさらなる実施形態は、治療的ポリペプチドのインビトロ産生と遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。通常は転写的にサイレントなＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子または下方に発現する遺伝子を含む細胞を改変するよう、相同組換えまたは他の組換え方法が使用され得る。その結果、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの治療有効量を発現する細胞を産生し得る。
【０２２０】
相同組み換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または矯正するために遺伝子を標的化するためにもともと開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１。基本的な技術は、哺乳動物ゲノムの特定の領域に特定の変異を導入するための方法として開発された（Ｔｈｏｍａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４４：４１９−２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８５８３−８７）か、または欠損遺伝子内の特定の変異を矯正するための方法として開発された（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８）。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１（欧州特許第９１９３０５１号，欧州特許第５０５５００号；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開ＷＯ９１／０９９５５）に記載されている。
【０２２１】
相同組換えにより、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、目的の遺伝子を標的化ＤＮＡに付着させることによって目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。標的化ＤＮＡの小片であって、ゲノムの特定の領域に相補的であるものは、ＤＮＡ複製プロセスの間に親の鎖と接触するようにおかれる。これは、ハイブリダイズしてそれゆえ共通の相同領域を通じて内因性ＤＮＡの他の片と組換わるように細胞中に挿入されたＤＮＡの一般的特性である。この相補的鎖が、変異あるいは異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合、この相補的鎖もまた、組み換えの結果として、新たに合成される鎖へと組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレートとして機能することが可能となる。従って、移入されたＤＮＡがゲノムに組み込まれる。
【０２２２】
標的化ＤＮＡのこれらの片に付着されるのは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現と相互作用し得るかまたは制御し得るＤＮＡの領域である（例えば、隣接配列）。例えば、プロモーター／エンハンサーのエレメント、サプレッサー、または外因性の転写調節エレメントは、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響するに十分近位および方向において挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現は、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子自身をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の転写のために認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと組み合わされた標的化ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同性の領域を含む）の使用によって達成され得る。
【０２２３】
例示方法において、細胞における所望される標的化遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、少なくとも制御配列、エキソンおよびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの、導入によって予備選択された部位において細胞ゲノム中への相同組換えを介して変更される。これらの成分は、染色体（ゲノム）ＤＮＡに、実際これが新たな転写単位の生産を生じるような様式で導入される（ここで、そのＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結されている）。これらの成分の染色体ＤＮＡへの成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
【０２２４】
本明細書において記載される変更された遺伝子発現は、得られた細胞において通常サイレント（発現されていない）な遺伝子を活性化すること（または発現されるように生じさせること）、ならびに得られる細胞において生理学的に有意なレベルで発現されない遺伝子の発現を増強することを包含する。この実施形態は、さらに、得られる細胞において生じる調節または導入のパターンとは異なるような調節または導入のパターンを変化させること、ならびに得られる細胞において発現される遺伝子の発現を減少させる（消去することを含む）ことを包含する。
【０２２５】
相同組み換えを使用して、細胞の内因性ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子から、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド生産を増強または生じさせ得る１つの方法は、第一に、相同組み換えを用いて部位特異的組換え系からの組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ，ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−５２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）を、細胞の内因性ゲノムＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコード領域の上流（すなわち５’側）に配置することを包含する。ゲノムＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位と相同な組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素とともに改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼは、細胞株においてゲノムＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置される組換え部位に、プラスミドの組換え部位を介して、プラスミドが組み込まれるようにさせる（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５）。転写を増強することが知られる任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミドに適切に配置されるとき、細胞の内因性ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子から、デノボでまたは増強されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で組み込まれる。
【０２２６】
部位特異的組換え配列が細胞の内因性ゲノムＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコード領域の直ぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株ゲノムにおいてその他の場所で第二の組換え部位に導入するように相同組み換えを用いることである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素は、２つの組換え部位の細胞株へと導入され、組換え事象が生じ（欠失、反転、トランスロケーション）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−５２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これは、細胞の内因性のＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子からデノボのまたは増強されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を生じる。
【０２２７】
細胞の内因性のＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子からのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を増強させるためまたは生じるためのさらなるアプローチは、細胞の内因性ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子からデノボまたは増強されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド産生を生じるような様式で、遺伝子（単数または複数）（例えば、転写因子）の発現を増強または生じさせることおよび／または遺伝子（単数または複数）（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させることを包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞に導入し、その結果、細胞の内因性のＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子からデノボまたは増強されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの産生が、生じることを包含する。
【０２２８】
本発明は、標的遺伝子の発現を変更する方法において有用なＤＮＡ構築物にさらに関する。特定の実施形態において、例示のＤＮＡ構築物は、（ａ）１つ以上の標的化配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エキソン；および（ｄ）対でないスプライスドナー部位を含む。ＤＮＡ構築物における標的化配列は、エレメント（ａ）−（ｄ）を細胞内の標的遺伝子に組み込み、その結果、エレメント（ｂ）−（ｄ）が内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結されるようになることを指向する。別の実施形態において、このＤＮＡ構築物は、（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライス−ドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位を含む。ここで、標的配列は、エレメント（ａ）−（ｆ）を組み込んで、その結果、（ｂ）−（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されるようになる。標的化配列は、相同組換え生じる細胞の染色体ＤＮＡにおいて予備選択される部位と相同である。この構築物において、そのエキソンは、概して調節配列の３’側にあり、そしてスプライスドナー部位は、エキソンの３’側にある。
【０２２９】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書において提示されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの核酸配列）が知られている場合、その遺伝子の選択された領域に相補的なＤＮＡの片を合成または他の方法で入手し得る（例えば、目的の領域と境界を接する特定の認識部位で、ネイティブＤＮＡの適切な制限による）。この片は、その細胞への挿入の際に標的化配列として作用し、そしてそのゲノム内のその相同領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの片およびそれに付随する任意の他のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖中に取り込まれる。従って本発明は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的化配列として使用され得る。
【０２３０】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド細胞治療（例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた、企図される。この実施形態は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの生物学的に活性な形態を合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。そのようなＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド産生細胞は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの天然のプロデューサーである細胞であり得るか、あるいはそれがＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生する能力が、所望のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする遺伝子またはＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を増強する遺伝子で形質転換されることによって増強された、組換え細胞であり得る。このような改変は、その遺伝子の送達のために、ならびにその遺伝子の発現および分泌を促進するために適切なベクターの手段により達成され得る。外来種のポリペプチドの投与とともに生じ得るような、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドが投与される患者において可能な免疫学的反応を最小化するために、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生する天然の細胞がヒト起源のものであって、そしてヒトＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを産生する組換え細胞は、ヒトＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３１】
移植された細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するためにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物の細胞は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの放出を可能にするが患者の免疫系または周囲組織からの他の悪性因子による細胞の破壊を予防する生体適合性の半透過性ポリマー封入物または膜中で、患者に移植され得る。あるいは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞は、そのようなカプセルなしで患者に直接移植され得る。
【０２３２】
生存細胞のカプセル化のための技術は、当該分野において公知であり、そして患者におけるカプセル化された細胞の調製およびそれらの移植は、慣用的に行われ得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（国際公開ＷＯ９５／０５４５２；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の有効な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。カプセルは、生体適合性であり、そして容易に取り出し可能である。カプセルは、組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。この分子は、哺乳動物宿主中に移植される際にインビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された、生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む。このデバイスは、レシピエント内の特定の部位に生存する細胞からの分子の送達を提供する。さらに、以下を参照のこと：米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，０１１，４７２号および同第５，１０６，６２７号。生存する細胞をカプセル化するための系は、以下に記載される：国際公開ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）。以下もまた参照のこと：国際公開ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら）、Ｗｉｎｎら，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１３：３２２−２９（１９９１）、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５（１９９１）；およびＴｒｅｓｃｏら，ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３（１９９２）。
【０２３３】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた、企図される。遺伝子治療技術の一つの例は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用することである。この遺伝子は、構成的または誘導性のプロモーターと作動可能に連結されて、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成し得る。このプロモーターは、構築物が挿入される細胞または組織の型においてそれが活性である限り、内因性ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子に対して同種であってもよく、異種であってもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのために有用な内因性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親の細胞よりも選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化について）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによって発現を増強する転写因子、ならびにベクター製造を可能にする因子が挙げられる。
【０２３４】
遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して、細胞（エキソビボまたはインビボのいずれかで）に導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための一つの手段は、本明細書において記載されるウイルスベクターの手段による。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、細胞の染色体ＤＮＡに対してこの遺伝子治療ＤＮＡ構築物を送達し、そしてその遺伝子は、染色体ＤＮＡ中に組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残存する。
【０２３５】
さらに他の実施形態において、調節エレメントは、標的細胞中にＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の制御された発現のために包含され得る。そのようなエレメントは、適切なエフェクターに対する応答においてスイッチオンされる。このようにして、治療ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの慣用される制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）をダイマー化するための低分子ダイマー化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）（国際公開ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９７／３１８９８、およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）の使用を包含する。そのタンパク質のダイマー化を使用して、導入遺伝子の転写を開始し得る。
【０２３６】
代替調節技術は、凝集物またはクラスターとして細胞内に目的の遺伝子から発現されるタンパク質を格納する方法を使用する。目的の遺伝子は、従来の凝集ドメインを含む誘導タンパク質として発現され、これは、小胞体内での凝集タンパク質の保持を生じる。格納されたタンパク質は、細胞内で安定かつ不活性である。しかし、そのタンパク質は、条件つき凝集ドメインを除き、それにより凝集物またはクラスターから離れて特異的に破壊する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与し、その結果そのタンパク質がその細胞から分泌され得ることによって放出され得る。以下を参照のこと：Ａｒｉｄｏｒら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８１６−８１７、およびＲｉｖｅｒａら，２０００，８２６−８３０。
【０２３７】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中に記載される系が挙げられるがそれらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合が、２つの転写因子のダイマーを形成し、次いでこれが核に入りＤＮＡに結合することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメインは、天然のリガンドへそのレセプターが結合する能力を除去するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系は、さらに米国特許第５，３６４，７９１号、国際公開ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７で記載される。
【０２３８】
さらに別の制御系は、エクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。これは、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、活性化する。次いで、このレセプターは、核に移行し、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答遺伝子からのプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するためのトランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、さらに、米国特許第５，５１４，５７８号、国際公開ＷＯ９７／３８１１７、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２で記載される。
【０２３９】
別の制御手段は、陽性のテトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーターを使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された、変異されたｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（変異されたｔｅｔ  Ｒ−４アミノ酸変異を含み、これは、反転テトラサイクリン制御されたトランスアクチベータータンパク質を生じる。すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。そのような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号および同第５，６５４，１６８号で記載されている。
【０２４０】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃに対する米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号で記載されている。
【０２４１】
インビボ遺伝子治療は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする遺伝子を、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子の局所注入または他の適切なウイルスもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞中に導入することによって行われ得る。Ｈｅｆｔｉ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５。例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする核酸分子は、標的化された細胞に送達するためにアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）中に含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，国際公開ＷＯ９５／３４６７０、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照）。組換えＡＡＶゲノムは代表的に、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結された、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ反転末端反復を含む。
【０２４２】
代替の適切なウイルスベクターは、以下が挙げられるがそれらに限定されない：レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスおよびパピローマウイルスのベクター。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、インビトロで治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントが挿入されるように処理されたヒト細胞の送達によって治療タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療の実施のためのさらなる方法および材料は、以下に記載されている：米国特許第５，６３１，２３６号（これは、アデノウイルスベクターを含む）；米国特許第５，６７２，５１０号（これは、レトロウイルスを含む）；および米国特許第５，６３５，３９９号（これは、サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）。
【０２４３】
非ウイルス送達方法としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：リポソーム媒介性移入、裸のＤＮＡ送達（直接注射）、レセプター媒介性移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）。遺伝子治療材料および方法はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親の細胞よりも選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全手段）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増強するための転写因子ならびにベクター製造の方法をも包含し得る。遺伝子治療技術の実施のためのそのようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，９７０，１５４号（これは、エレクトロポレーション技術を含む）、米国特許第５，６７９，５５９号（これは、遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）、米国特許第５，６７６，９５４号（これは、リポソームキャリアを含む）、米国特許第５，５９３，８７５号（これは、リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を含む）、米国特許第４，９４５，０５０号（ここでは、生物学的に活性な粒子は、その粒子が細胞の表面に浸透し、そしてその細胞の内部へと取り込まれるようになる速度で細胞に噴霧される）、ならびに国際公開ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）で記載される。
【０２４４】
ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子治療または細胞治療は、さらに同じ細胞もしくは異なる細胞における１種以上のさらなるポリペプチドの送達を含むことが、企図される。そのような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはその細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上述のカプセル化膜）中に含まれ得るか、またはその細胞はウイルスベクター手段によって別個に改変され得る。
【０２４５】
遺伝子治療を介した、細胞における内因性ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド発現を増強するための手段は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドプロモーター中に１つ以上のエンハンサーエレメントを挿入することである。ここで、このエンハンサーエレメントは、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の転写活性を増強するように働き得る。このエンハンサーエレメントは、その遺伝子を活性化することが所望される組織に基づいて選択される。その組織中でのプロモーター活性化を付与することが知られるエンハンサーエレメントが選択される。例えば、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「スイッチオン」されるべき場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、加えられるべき転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を用いてＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡフラグメント中に挿入され得る（そして、必要に応じて、ベクターならびに／または５’および／もしくは３’隣接配列など中に挿入される）。次いで、「相同組換え構築物」として知られるこの構築物は、エキソビボまたはインビボでのいずれかで所望の細胞中に導入され得る。
【０２４６】
遺伝子治療は、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド発現を減少するために使用され得る。そのような改変は、代表的に、相同組換え法を介して行われる。例えば、不活化することについて選択されたＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子のプロモーターのすべてまたは一部を含むＤＮＡ分子は、操作されて、転写を調節するプロモーターの片を除去および／または置き換えることができる。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモーターの転写アクチベーターの結合部位は、標準的な分子生物学的技術を用いて欠失され得る。そのような欠失は、プロモーター活性を阻害し、それにより対応するＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の転写を抑制することができる。プロモーターにおけるＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドプロモーター（制御されるべきＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子と同じまたは関連する種からの）のすべてまたは関連する部分を含むＤＮＡ構築物を作製することによって達成され得る。ここでは、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位のヌクレオチドの１つ以上が、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入によって変異されている。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、活性が減少しているか、または完全に不活化されている。この構築物はまた、代表的に、改変されたプロモーターセグメントに隣接するネイティブの（内因性の）５’および３’のＤＮＡ配列に対応するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含み、この構築物は、直接または本明細書に記載されるウイルスベクターを介してのいずれかで、適切な細胞中に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。代表的に、その構築物のその細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みは、相同組み換えを介する。ここで、プロモーター構築物における５’および３’のＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを介して改変されたプロモーター領域への組み込みを補助するように働き得る。
【０２４７】
（１５．治療的使用）
ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子、ポリペプチド、それらのアンタゴニストは、本明細書中で記載されたものを含む、多数の疾患、障害または状態の処置、診断、改善または予防するために使用され得る。
【０２４８】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドアンタゴニストは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの成熟形態の少なくとも１つの活性を減少させることにより、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド活性を調節する分子を含む。アンタゴニストは、Ｈｅｒ−２ｓｖペプチドと相互作用し、その結果、Ｈｅｒ−２ｓｖポリペプチドの活性を調節するコファクター（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量分子）であり得る。潜在的なポリペプチドアンタゴニストは、所定のタンパク質の一部または全ての細胞外ドメインを含むＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの可溶性形態または膜結合形態のいずれかと反応する抗体を含む。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を調節する分子は、代表的には、発現のアンチセンスレギュレーターとして働き得るＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２４９】
異常なＨＥＲ−２発現が、多数のヒトの癌（乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌および口腔癌を含む）において検出されたことから、ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子、ポリペプチド、およびそれらのアンタゴニストは、疾患（乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌および口腔癌を含む）の診断または処置において有用であり得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを含む他のヒト癌腫は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５０】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド機能のアンタゴニストは、処置される状態に適合させて、１種以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤、または化学療法薬との組み合わせで使用され得る（同時にまたは順次に）。
【０２５１】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの望ましくないレベルに起因するまたは媒介される他の疾患または障害は、本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、望ましくないレベルは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの過剰なレベルを含む。
【０２５２】
（１６．ＨＥＲ−２ｓｖ核酸およびポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それら自身は、生物学的に活性なポリペプチドをコードしないものを含む）は、染色体上のＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子および関連遺伝子の位置をマッピングするために使用され得る。マッピングは、当該分野において公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）によって行われ得る。
【０２５３】
ＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子（それら自身は、生物学的に活性なポリペプチドをコードしないものを含む）は、哺乳動物の組織または体液のサンプル中でのＨＥＲ−２ｓｖ核酸分子の存在を、定性的にもしくは定量的に、試験するための診断アッセイにおいてハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２５４】
１種以上のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの活性を阻害することが、所望される場合、他の方法もまた、使用され得る。そのような阻害は、発現制御配列（３重らせん構造）もしくはＨＥＲ−２ｓｖ  ｍＲＮＡに対し相補的であり、ハイブリダイズする核酸分子によって、影響され得る。例えば、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の少なくとも１部と相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡ分子またはアンチセンスＲＮＡ分子は、細胞へ導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中で開示されているＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子の配列を使用した利用可能な技術によって設計され得る。代表的に、そのようなアンチセンス分子各々は、選択されたＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子各々の出発部位（５’末端）に対して相補的である。次いで、アンチセンス分子が、対応するＨＥＲ−２ｓｖ  ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、妨げられるもしくは減少させられる。アンチセンスインヒビターは、細胞または器官におけるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの減少または欠損に関する情報を提供する。
【０２５５】
あるいは、遺伝子治療は、１種以上のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドのドミナントネガティブなインヒビターを作製するために使用され得る。この場合、選択されたＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの各々の変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡは、調製され、本明細書中で記載されるように、ウイルス方法または非ウイルス方法のいずれかを使用して、患者の細胞へと導入され得る。そのような変異体の各々は、代表的に生物学的役割において、内因性のポリペプチドと競合するように設計される。
【０２５６】
さらに、生物学的に活性か活性でないかに関わらず、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドは、免疫原（少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドであり、このエピトープに対して抗体は惹起させられ得る）として使用され得る。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに結合する選択的結合因子（本明細書中で記載するように）は、インビボおよびインビトロでの診断目的に使用され得る。これには、体液サンプルまたは細胞サンプル中のＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの存在を検出するための標識化された形態での使用が挙げられるが、これに限定されない。本明細書中で列挙したものを含む、多くの疾患および障害を予防、処置または診断するために抗体もまた使用され得る。抗体は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの少なくとも１つの活性の特徴を減少または妨げるために、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに結合し得る。もしくは、抗体は、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの少なくとも１つの活性の特徴を増加させるために（ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの薬物動態を上昇させることが含まれる）、ポリペプチドに結合し得る。
【０２５７】
本発明のヒトＨＥＲ−２ｓｖ核酸はまた、対応する染色体ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド遺伝子を単離するために有用な道具である。ヒトＨＥＲ−２ｓｖゲノムＤＮＡは、遺伝性の組織変性疾患を同定するために、使用され得る。
【０２５８】
以下の実施例は、説明目的のみを意図するのであって、本発明の範囲を制限するとしていかなるようにも解釈されるべきでない。
【０２５９】
（実施例１：ＨＥＲ−２スプライス改変体のクローニング）
一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出において記載されるような材料および方法を、ラットＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードする遺伝子のクローニングおよび分析に使用した。
【０２６０】
ＨＥＲ−２スプライス改変体ｃＤＮＡ配列を単離するために、アンプリマー２７７１−３１（５’−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−３’；配列番号１４）およびアンプリマー２７７１−３３（５’−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−３’；配列番号１５）を使用したＰＣＲによって所有のヒト組織ｃＤＮＡライブラリアレイをスクリーニングした。ＰＣＲ増幅は、５０μｌの最終容量中で１００ｎｇのヒト組織ｃＤＮＡテンプレート、１０ｎｇのＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＭａｒａｔｈｏｎヒトｃＤＮＡテンプレート、または１０ｎｇのＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｍａｒａｔｈｏｎヒト異種移植片ｃＤＮＡテンプレートのいずれか；１０ｐｍｏｌのアンプリマー；Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；および２μｌのＧＣ−Ｍｅｌｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して調製された。反応は、９４℃で２分間を１サイクル；９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間および７２℃で３分間を４０サイクル、次いで７２℃で７分間を１サイクルで実行した。
【０２６１】
この第１のＰＣＲにより産生される生成物を第１のＰＣＲからの生成物を１ｍｌおよびアンプリマー２７７１−３２（５’−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号１６）ならびにアンプリマー２７７１−３４（５’−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ−３’；配列番号１７）、そして最初のＰＣＲにおいて使用された同じ条件を使用したネスト化されたＰＣＲ増幅において再び増幅した。ネスト化されたＰＣＲ増幅において産生されたＰＣＲ生成物をゲル電気泳動により分析した。以下のｃＤＮＡライブラリにおいて種々の大きさの産物が検出された：胎児胃、胎児膵臓、胎児腎臓、胎児肺、胎児心臓、子宮、精巣、胎盤、胎児頭皮、胎児頭蓋冠、脊柱、気管、肺腫瘍、Ｔ１５４３乳腫瘍、卵巣腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍、胎児の小腸、および、単核循環リンパ球。これら、生成物を、ベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹに結合し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するために使用した。プラスミドＤＮＡを各々の形質転換から単離された６個の個々のコロニーから単離し、その挿入物の配列を決定した。
【０２６２】
ＰＣＲスクリーニングにおいて、ＨＥＲ−２レセプターチロシンキナーゼ遺伝子の細胞外ドメインの５種のスプライス改変体が、同定された。図６Ａ〜６Ｃは、ヒトＨＥＲ−２（配列番号１１）の細胞外部分のアミノ酸配列アラインメントおよび５種のスプライス改変体によってコードされているポリペプチドを描写する。これら、スプライス改変体は、ＨＥＲ−２ｓｖ形態９７（配列番号４）、ＨＥＲ−２ｓｖ１８４（配列番号１０）、ＨＥＲ−２ｓｖ１１９（配列番号６）、ＨＥＲ−２ｓｖ６８（配列番号２）、およびＨＥＲ−２ｓｖ１５６（配列番号８）を含んでいた。
【０２６３】
図７は、ＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９、１８４、９７、６８、１５６の細胞外ドメインの公知の形態の構造の概略図を示す。ＨＥＲ−２ｓｖ細胞外ドメインの公知の形態は、１７のエキソンからなる。構造的に、２つのＬレセプタードメイン、フリン様ドメイン、および膜貫通ドメインを有する。レセプターＬドメインはリガンド結合ドメインである。そのようなドメインの各々は、１本鎖右手βヘリックスからなる。フリン様ドメインは、シグナル伝達に関わる種々のタンパク質において見出されるシステインリッチ領域である。
【０２６４】
ＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９において、ＨＥＲ−２ｓｖ細胞外ドメインの公知の形態のエキソン９とエキソン１０との間のさらなるエキソンは、さらなる３９アミノ酸をコードする。このさらなる配列は、ＨＥＲ−２の第２のＬ−ドメインを妨害する。形態１１９の配列は、頭皮ｃＤＮＡライブラリにおいて検出された。
【０２６５】
ＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４において、ＨＥＲ−２ｓｖ細胞外ドメインの公知の形態のエキソン１４とエキソン１５との間のさらなるエキソンは、さらなる３４アミノ酸をコードする。このさらなる配列は、ＨＥＲ−２のＬ−ドメインまたはフリン様ドメインを妨害しない。形態１８４の配列は、気管ｃＤＮＡライブラリにおいて検出された。
【０２６６】
ＨＥＲ−２ｓｖ形態９７は、ＨＥＲ−２ｓｖ細胞外ドメインの公知の形態のエキソン１６を欠いている。エキソン１６の欠損は、ＨＥＲ−２のＬ−ドメインまたはフリン様ドメインを妨害しない。形態９７の配列は、頭蓋冠ｃＤＮＡと気管ｃＤＮＡライブラリとの両方で検出された。
【０２６７】
ＨＥＲ−２ｓｖ形態６８は、ＨＥＲ−２ｓｖ細胞外ドメインの公知の形態のエキソン７およびエキソン１２内に異常なスプライシング部位を有し、１８７アミノ酸の欠損を生じる。ＨＥＲ−２のこの部分の欠損は、フリン様ドメインのほとんど、および第２のレセプターＬドメインのほとんどを除去する。形態６８の配列は、胎児腎臓のｃＤＮＡライブラリ、精巣のｃＤＮＡライブラリ、結腸腫瘍のｃＤＮＡライブラリ、およびＴ１５４３乳癌のｃＤＮＡライブラリにおいて検出された。
【０２６８】
ＨＥＲ−２ｓｖ形態１５６は、ＨＥＲ−２細胞外ドメインの公知の形態のエキソン４およびエキソン１５内に異常なスプライシング部位を有し、１８７アミノ酸の欠損を生じる。エキソン４における異常なスプライシング部位は、フレームシフトおよび成熟前終止コドンをもたらす。このスプライス改変体は、フリン様ドメインと第２のレセプターＬドメインとの両方を欠く。形態１５６の配列は、Ｔ１５４３乳癌のｃＤＮＡライブラリにおいて検出された。
【０２６９】
（実施例２：ＨＥＲ−２ｓｖ  ｍＲＮＡ発現）
ＨＥＲ−２ｓｖ  ｍＲＮＡの発現は、ノーザンブロット分析によって検査された。多数のヒト組織ノーザンブロット（Ｃｏｌｏｎｔｅｃｈ）をヒトＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドｃＤＮＡクローンから単離された適切な制限フラグメントで調べる。プローブを標準的な技術を使用して３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識する。
【０２７０】
ノーザンブロットを、４２℃で２時間、ハイブリダイゼーション溶液中（５Ｘ  ＳＳＣ，５０％脱イオン化ホルムアミド、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）でプレハイブリダイズし、水で、４２℃で一晩、１ｎｇ／ｍｌの標識されたプローブを含む新しいハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、フィルターを室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中で２回洗浄し、次いで、６５℃で３０分間０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中で２回洗浄した。そして、ブロットを、オートラジオグラフィーに暴露する。
【０２７１】
ＨＥＲ−２ｓｖ  ｍＲＮＡの発現は、インサイチュハイブリダイゼーションによって局在化される。正常な胚組織およびマウスの成体組織のパネルを、４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、５μｍで切り出す。切り出された組織は、０．２Ｍ  ＨＣｌ中で透過化処理され、プロテイナーゼＫで切断し、トリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化する。切片を６０℃で１時間、ハイブリダイゼーション溶液中（３００ｍＭ  ＨＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．２％  ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙＡ、２５μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙＣおよび５０％ホルムアミド）でプレハイブリダイズする。次いで、６０℃で一晩、１０％デキストランおよび２×１０４ｃｐｍ／μｌのヒトＨＥＲ−２ｓｖ遺伝子に対して相補的な３２Ｐ−標識化アンチセンスリボプローブを含む同じ溶液中でハイブリダイズする。リボプローブは、標準的な技術を使用した、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ  ｃＤＮＡ配列を含むクローンのインビトロでの転写によって得る。
【０２７２】
ハイブリダイゼーションの後、切片をハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、ハイブリダイズしなかったプロ−ズを背一断するためにＲＮａｓｅＡで処理し、次いで、５５℃で３０分間、０．１Ｘ  ＳＳＣ中で洗浄する。そして、切片を、ＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中に浸し、４℃で３週間、露光し、現像し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳（１つの矢状切片２つの冠状切片）、消化管（食道、胃、十二指腸、回腸、近位結腸および遠位結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、オスおよびメスの生殖器官（メスにおける卵巣、卵管および子宮；ならびにオスにおける精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、および輸精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、表皮）、骨（大腿骨）、皮膚、乳、および骨格筋に対するダークフィールド（ｄａｒｋｆｉｅｌｄ）および標準的なイルミネーション（ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）によって同時に分析する。
【０２７３】
（実施例３：ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの産生）
（Ａ．細菌におけるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）のような代表的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向性クローニングのために、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いて消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供して挿入物の存在を確認する。
【０２７４】
形質転換した宿主細胞を、誘導前に、３０ｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中、３０℃でインキュベートする。Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンの最終濃度の３０ｎｇ／ｍＬまでの添加、それに続く３０℃かまたは３７℃での６時間のインキュベーションによって、遺伝子発現を誘導する。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現を、細菌ペレットの培養物、再懸濁物および溶解物の遠心分離、ならびに、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【０２７５】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを含有する封入体を、以下の通り精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレットにし、そして水に再懸濁する。この細胞懸濁液を超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇでの５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。上清を廃棄し、そしてペレットを洗浄してホモジナイザーに移す。このペレットを、均一に懸濁されるまで、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中でホモジナイズし、次いで希釈して２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収してプールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２７６】
Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに相当する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５（１９８７）に記載のように決定する。
【０２７７】
（Ｂ．哺乳動物細胞におけるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。５’および３’末端に対応するプライマー配列は上述される。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス複製起点を含む代表的な発現ベクターであるｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス核抗原）細胞におけるＨＥＲ−２ｓｖの発現のために用い得る。増幅およびゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクチンによって２９３−ＥＢＮＡ細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００ｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルエンスになるまで増殖する。次いで、この細胞を無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を取り出し、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０２７８】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド発現は、銀染色によって検出し得る。あるいは、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを、タグペプチドに対する抗体を用いるウエスタンブロット分析によって検出可能である、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）を有する融合タンパク質として生成する。
【０２７９】
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得る、またはＨＥＲ−２ｓｖ融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして本明細書に記載のようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０２８０】
（Ｃ．哺乳動物細胞におけるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現および精製）
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド発現構築物は、リポフェクションプロトコルまたはリン酸カルシウムプロコルのいずれかを用いて２９３  ＥＢＮＡまたはＣＨＯ細胞に導入される。
【０２８１】
産生されるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドでの機能的研究を実施するために、ハイグロマイシンで選択された２９３ＥＢＮＡクローンのプールから大量の調製された条件培地が産生される。培地を収集する１週間前に血清を含まない培地へと変える以前に、細胞を５００ｃｍ  Ｎｕｎｃ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆｌａｓｋ中で８０％のコンフルーエンスになるまで培養する。条件培地は、収集され、精製まで−２０℃で凍結される。
【０２８２】
以下に記載するように、条件培地を親和性クロマトグラフィーによって精製する。培地を解凍し、次いで０．２μｍフィルターに通す。タンパク質Ｇカラムを、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で平衡化し、次いでろ過した培地で充填する。カラムをＡ２８０での吸収がベースラインに到達するまでＰＢＳで洗浄する。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．７）でカラムから溶出し、そして直ぐに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中性化する。ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドを含む画分を、プールし、ＰＢＳ中で透析し、さらに−７０℃で保存する。
【０２８３】
ヒトＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断のために、アフィニティークロマトグラフィーで精製されたタンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２（ｐＨ８．０）中で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を透析されたタンパク質に１／１００（重量／重量）で加え、室温で一晩、サンプルを消化する。
【０２８４】
（実施例４：抗ＨＥＲ２−ｓｖポリペプチド抗体の産生）
Ｈｅｒ−２ｓｖポリペプチドに対する抗体は、精製されたタンパク質または生物学的合成もしくは化学的合成により産生されたＨＥＲ−２ｓｖタンパク質で免疫することによって得られ得る。抗体を産生するための適切な手順には、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ，Ｐａｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）で記載されているものが挙げられる。
【０２８５】
抗体産生の１つの手順では、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）をＨｅｒ−２ｓｖ抗原（例えば、Ｈｅｒ−２ｓｖポリペプチド）で注射し、そしてＥＬＩＳＡによって決定されるように十分は血清力価レベルを有する動物をハイブリドーマ産生のために選択する。免疫された動物の脾臓を収集し、単一細胞懸濁液として調製する。単一細胞懸濁液から、脾細胞を回収する。脾細胞を、マウスの骨髄細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）へと融合し、まず２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミンを含むＤＭＥＭ中でインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）中でインキュベートする。選択の後、各融合ウェルから組織培養懸濁液から取り出し、抗ＨＥＲ−２ｓｖ抗体産生のためにＥＬＩＳＡによって試験をする。
【０２８６】
抗ＨＥＲ−２ｓｖ抗体を得るための代替的な手順もまた使用され得る。例えば、ヒト抗体産生のためのヒトＩｇ遺伝子座を有する遺伝子組換えマウスの免疫、および合成抗体ライブラリのスクリーニング（例えば、抗体可変ドメインの突然変異により産生されたもの）。
【０２８７】
（実施例５：遺伝子組換えマウスでのＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの発現）
ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの生物学的活性を評価するために、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下にあるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質を含む構築物が調製される。この構築物の送達は、Ｈｅｒ−２ｓｖポリペプチドの機能にとって有益な情報となる病理学的変化を生じると期待される。同様に、βアクチンプロモータの制御下にあるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド全長を含む構築物が調製される。この構築物の送達により、普遍的発現が生じるものと考えられる。
【０２８８】
これらの構築物を産生するために、ＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅するようＰＣＲを使用する。このＰＣＲには、所望する配列の５’末端および３’末端に対応し、増幅された生成物を発現ベクターへと挿入することを可能にするよう制限酵素部位を組み入れたプライマーを使用する。増幅の後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクターに結合した。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２−７４およびＲａｙら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２２６５−７３で記載されているように、増幅されたＨＥＲ２−ｓｖポリペプチド配列は、ヒトβアクチンプロモータの制御下でクローニングされ得る。
【０２８９】
結合の後、反応混合物をエレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換のために使用し、形質転換体を薬物抵抗性に対して選択する。選択されたコロニー由来のプラスミドベクターを単離し、適切な挿入断片の存在および変異が無いことを確認するためにＤＮＡ配列決定に供する。ＨＥＲ−２ｓｖ発現ベクターを２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心を介して精製し、適切な制限酵素で切断し、そしてＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド導入遺伝子を含む直線的なフラグメントをゲル電気泳動によって精製する。精製されたフラグメントを５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ  に濃度２ｍｇ／ｍＬで最懸濁する。
【０２９０】
ＢＤＦ１ｘＢＤＦ１支給マウス由来の単細胞胚を記載されているように（国際公開ＷＯ９７／２３６１４）注射する。ＣＯ２培養器において一晩、胚を培養し、１５〜２０個の２細胞胚を偽妊娠のＣＤ１メスマウスの卵管へと移す。微量注入された胚の移植から得られた子孫を、以下に示すようにゲノムＤＮＡサンプル中の組み込まれた導入遺伝子のＰＣＲ増幅によってスクリーニングする。耳の一部が、５５℃で一晩、２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、および５００ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ）中で消化する。次いで、サンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、２ｍＬの耳のサンプルを適切なプライマーを用いたＰＣＲ反応に使用する。
【０２９１】
８週齢で、遺伝子組換え創始動物およびコントロール動物を、犬歯および病理学の分析のために屠殺する。脾臓の一部を除去し、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて脾臓から総細胞ＲＮＡを単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲにより導入遺伝子の発現を決定する。以下に示すように、脾臓から回収されたＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換する。発現ベクターの配列内およびＨＥＲ−２ｓｖポリペプチド導入遺伝子の３’に位置する適切なプライマーを、導入遺伝子の転写物からｃＤＮＡ合成を開始するために使用する。７０℃で１０分間、遺伝子組換え創始物およびコントロール由来の総脾臓ＲＮＡの１０ｍｇを１ｍＭのプライマーと共にインキュベートする。次いで、反応に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．３）、５０  ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を補う。４２℃で５０分間インキュベートした後、７２℃で１５分間、加熱することで反応を止め、さらに３７℃で２０分間、２ＵのＲＮＡａｓｅ  Ｈで消化する。次いで、サンプルをＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドに対する特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅する。
【０２９２】
（実施例６：組換えマウスにおけるＨＥＲ−２ｓｖポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、組換え動物の重さを量り、イソフルランにより麻酔をし、そして心臓穿刺により採血する。サンプルを血液学分析および血清化学分析に供する。全採血終了の後、Ｘ線撮影を行う。総解剖において、主な内臓器官は、重量分析に供される。
【０２９３】
総解剖の後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、全体的な消化管、腎臓、生殖器、皮膚および乳房、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ球および骨格筋）を除去し、組織学的な分析のために１０％緩衝化Ｚｎホルマリンで固定する。
【０２９４】
組換えマウスとコントロールマウスとの両方の脾臓、リンパ球、およびバイエル板を、以下のように、Ｂ細胞およびＴ細胞特異的な抗体と共に免疫組織学の分析に供する。ホルマリン固定されたパラフィン包埋切片を、脱パラフィン化し、脱イオン水中で水分補給する。切片を３％過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、さらにラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合をビオチン標識したラビットの抗ラット免疫グロブリンおよび色素であるＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を伴うペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）により検出する。切片をヘマトキシリンで対比染色する。
【０２９５】
検死の後、ＭＬＮ、および組換え動物ならびにコントロールの同原仔の脾臓の切片ならびに胸腺の切片を除去する。単一細胞懸濁液を、１００ｍｍナイロン細胞ろ過器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ）に対して、シリンジの平らな端で組織を優しく粉砕することにより調製する。細胞を２回洗浄し、数え、次いで各組織由来の約１ｘ１０６細胞を１０分間、２０μＬの容積中０．５μｇ  ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックと共にインキュベートする。次いで、２〜８℃で３０分間、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４またはＣＤ（（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に対する０．５μｇのＦＩＴＣもしくはＰＥ結合モノクローナル抗体の抗体を含む１００μＬ容積のＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を欠く）、０．１％ウシ血清アルブミン、および０．０１％アジ化ナトリウム中でサンプルを染色する。抗体結合の後、細胞を洗浄し、次いで、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーにより分析する。
【０２９６】
本発明は好ましい実施形態の面から説明されたが、当業者により変更および改良が加えられることが理解される。従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の範囲内で生じる全てのこのような等価な改良を網羅することを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０２９７】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｃは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態６８遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態６８ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｃは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態６８遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態６８ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｃは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態６８遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態６８ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２Ａ】図２Ａ−２Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ−２Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ−２Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ｄ】図２Ａ−２Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図４】図４は、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１５６遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１５６ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１８４ポリペプチドの推測されるアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖの細胞外部分のアミノ酸配列整列（配列番号１１）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７（配列番号４）、１８４（配列番号１０）、１１９（配列番号６）、６８（配列番号２）、および１５６（配列番号８）の細胞外部分のアミノ酸配列整列を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖの細胞外部分のアミノ酸配列整列（配列番号１１）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７（配列番号４）、１８４（配列番号１０）、１１９（配列番号６）、６８（配列番号２）、および１５６（配列番号８）の細胞外部分のアミノ酸配列整列を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、ヒトＨＥＲ−２ｓｖの細胞外部分のアミノ酸配列整列（配列番号１１）およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態９７（配列番号４）、１８４（配列番号１０）、１１９（配列番号６）、６８（配列番号２）、および１５６（配列番号８）の細胞外部分のアミノ酸配列整列を示す。
【図７】図７は、ＨＥＲ−２遺伝子およびヒトＨＥＲ−２ｓｖ形態１１９、１８４、９７、６８および１５６の細胞外ドメインの既知の形態構造の概略図である。ＨＥＲ−２遺伝子の細胞外ドメイン中の機能的ドメイン（２つのＬ−ドメインおよび１つのフリン様ドメイン）を示す。
【配列表】
2005535297.tif 000004
2005535297.tif 000005
2005535297.tif 000006
2005535297.tif 000007
2005535297.tif 000008
2005535297.tif 000009
2005535297.tif 000010
2005535297.tif 000011
2005535297.tif 000012
2005535297.tif 000013
2005535297.tif 000014
2005535297.tif 000015
2005535297.tif 000016
2005535297.tif 000017
2005535297.tif 000018
2005535297.tif 000019
2005535297.tif 000020
2005535297.tif 000021
2005535297.tif 000022
2005535297.tif 000023
2005535297.tif 000024
2005535297.tif 000025
2005535297.tif 000026
2005535297.tif 000027
2005535297.tif 000028
2005535297.tif 000029
【図１Ａ】
2005535297.tif 000030
【図１Ｂ】
2005535297.tif 000031
【図１Ｃ】
2005535297.tif 000032
【図２Ａ】
2005535297.tif 000033
【図２Ｂ】
2005535297.tif 000034
【図２Ｃ】
2005535297.tif 000035
【図２Ｄ】
2005535297.tif 000036
【図３Ａ】
2005535297.tif 000037
【図３Ｂ】
2005535297.tif 000038
【図３Ｃ】
2005535297.tif 000039
【図３Ｄ】
2005535297.tif 000040
【図４】
2005535297.tif 000041
【図５Ａ】
2005535297.tif 000042
【図５Ｂ】
2005535297.tif 000043
【図５Ｃ】
2005535297.tif 000044
【図５Ｄ】
2005535297.tif 000045
【図６Ａ】
2005535297.tif 000046
【図６Ｂ】
2005535297.tif 000047
【図６Ｃ】
2005535297.tif 000048
【図７】
2005535297.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月24日(2005.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005535297000001.app