(57)【要約】本発明は、インターロイキン5 (IL5)および腫瘍壊死因子α(TNF、TNFα)の免疫原性異型のような、マルチマータンパク質の新規な免疫原性異型に関する。異型は、自己由来の宿主内で免疫原性であるほかにも、それらが由来するタンパク質の3D構造に非常に類似である。ある特定の異型は、マルチマーのモノマー模倣物であり、ここでペプチドリンカー(不活性またはTヘルパーエピトープ含有)が、正しい折り畳みを促進する、モノマー単位の空間的な構成を確実にする。異型の部分集合は、天然のタンパク質との高い構造類似性をもってマルチマーに集合する優れた能力を示すモノマーTNFα異型である。異型の処理および製造方法、ならびにDNA断片、ベクターおよび宿主細胞も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナログが、
d)   ペプチドリンカーによりペプチド結合を介して結合されている、ポリマータンパク質の少なくとも2つのモノマー単位の実質的なフラグメントを含み、
e)  ポリマータンパク質とは異種である、少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列を含み、そして
f)  アナログをエンコードする発現ベクターをもつ細胞からの単一の発現産物として産生され得る、
ペプチド結合により結合していない少なくとも2つのモノマー単位からなるポリマータンパク質の免疫原性アナログ。
【請求項２】
ポリマータンパク質がホモポリマータンパク質である、請求項1に記載の免疫原性アナログ。
【請求項３】
ポリマータンパク質がヘテロポリマータンパク質である、請求項1に記載の免疫原性アナログ。
【請求項４】
各々の実質的なフラグメントが、ポリマータンパク質の一部分である場合に、対応するモノマー中に見出されるB細胞エピトープの実質的なフラクションを表示する、先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項５】
各々の実質的なフラグメントが、ポリマータンパク質の一部分である場合に、対応するモノマー中に見出される本質的に全てのB細胞エピトープを表示する、請求項4に記載の免疫原性アナログ。
【請求項６】
モノマー単位に由来するアミノ酸配列が、マルチマータンパク質に比べてアナログの毒性を低減するように、および／またはMHCクラスII結合アミノ酸配列を導入するように、アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加により修飾される請求項4または5に記載の免疫原性アナログ。
【請求項７】
各々の実質的なフラクションが、各モノマー単位の実質的に完全なアミノ酸配列を、連続した配列または挿入を含む配列のいずれかとして含む、請求項1〜6のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項８】
ポリマータンパク質の全てのモノマー単位のアミノ酸配列が、アナログに表示される、先行する請求項のいずれかに記載の免疫原性アナログ。
【請求項９】
ポリマータンパク質を構成するモノマーの完全アミノ酸配列を、間断のない配列または挿入を含む配列のいずれかとして含む、先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項１０】
ペプチドリンカーが、アナログ中に、マルチマータンパク質とは異種である少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列を含むか、またはその存在に寄与する、先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項１１】
ペプチドリンカーが、マルチマータンパク質が由来する動物種において、MHCクラスII結合アミノ酸配列を含まず、かつその存在に寄与しない、請求項1〜9のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項１２】
MHCクラスII結合アミノ酸配列が、マルチマータンパク質が由来する動物種からのMHCクラスII分子の大多数に結合する、先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項１３】
少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列が、天然のT細胞エピトープおよび人工のMHC-II結合ペプチド配列から選択される、先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項１４】
天然のT細胞エピトープが、P2またはP30のような破傷風トキソイドエピトープ、ジフテリアトキソイドエピトープ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンエピトープ、およびピー・ファルシパルムCSエピトープから選択される、請求項12に記載の免疫原性アナログ。
【請求項１５】
完全なポリマータンパク質の三次元構造が本質的に保存される、先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項１６】
ポリマータンパク質が、インターロイキン5 (IL5)および腫瘍壊死因子α(TNFα)からなる群より選択される、先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項１７】
ポリマータンパク質がIL5であり、かつアナログが
−少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列を含む、ペプチドリンカーにより連結された2つの完全IL5モノマー、
−その少なくとも1つのモノマーが、異種のMHCクラスII結合アミノ酸配列を含む、不活性ペプチドリンカーにより結合された2つの完全IL5モノマー
からなる群より選択される、請求項16に記載の免疫原性アナログ。
【請求項１８】
線状の構造IL-Lm-ILまたはILm-Li-ILnまたはIL-Li-ILmまたはIL-Li-ILmまたはILm-Lm-ILn (ここで、"IL"は、モノマー成熟IL5の完全アミノ酸配列であり、"ILm"および"ILn"は同一または非同一で、異種のMHCクラスII結合アミノ酸配列を含むモノマー成熟IL5の実質的に完全なアミノ酸配列を表し、"Lm"は、アナログ中の少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列を含むか、またはそれに寄与するペプチドリンカーであり、"Li"は、アナログ中のいずれのMHCクラスII結合アミノ酸配列も含まないか、またはそれに寄与しない不活性ペプチドリンカーである)をもつ、請求項17に記載の免疫原性アナログ。
【請求項１９】
Lm、ILmおよびILnが、破傷風トキソイドのP2および／またはP30エピトープを含むか、またはPADREを含み、かつLiがジグリシンリンカーである、請求項18に記載の免疫原性アナログ。
【請求項２０】
SEQ ID NO: 9、11、13および15のいずれか1つに示す成熟アミノ酸配列を有する請求項19に記載の免疫原性アナログ。
【請求項２１】
ポリマータンパク質がTNFαであり、かつアナログが
−ペプチドリンカーにより末端と末端が連結されている、2または3の完全TNFαモノマー、ここで、少なくとも1つのペプチドリンカーは少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列含む、
−不活性ペプチドリンカーにより末端と末端が連結されている、2または3の完全TNFαモノマー、ここで、モノマーの少なくとも1つは、少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列を含むか、または少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列は、任意に不活性リンカーを介してN-もしくはC-末端モノマーに融合されている、
からなる群より選択される、請求項16に記載の免疫原性アナログ。
【請求項２２】
アナログが少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列を含み、さらに
−フレキシブルループ3に少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−TNFαモノマー三次元構造を安定化する、少なくとも1つのジスルフィドブリッジが導入されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−アミノ末端の1、2、3、4、5、6、7、8および9のいずれか1つのアミノ酸が欠失された、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−イントロン部位のループ1に少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、ヒトTNFαのN-末端の人工の柄領域の一部分として導入されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、トリマーの相互作用界面の疎水性を増加させることにより、モノマー構造を安定化するように導入されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−グリシン残基が側面に位置する少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、TNFαアミノ酸配列に挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、D-Eループに挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、ヒトTNFαの2つの相同な配列の間に挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−ヒトTNFα中の少なくとも1つの塩橋が、ジスルフィドブリッジで強化されているか、または置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−マウスTNFαの結晶構造を模倣した変異を導入することにより、溶解性および／またはタンパク質分解に対する安定性が増強されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、および／または
−少なくとも1つの点突然変異の導入により、潜在的な毒性が低減されているか、または撤廃されている、ヒトTNFαモノマーまたは請求項16に記載のアナログ、
である特徴を有する、ヒトTNFαの免疫原性アナログ。
【請求項２３】
アナログのアミノ酸配列が、SEQ ID NO: 18、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、49、51、53、55、57および59、ならびにその保存アミノ酸の変更のみを含むいずれかのアミノ酸配列から選択される、請求項25または26に記載の免疫原性アナログ。
【請求項２４】
細菌細胞から水溶性のタンパク質として発現され得る、先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ。
【請求項２５】
先行する請求項のいずれか1つに記載の免疫原性アナログをエンコードする核酸断片、またはそれに相補的な核酸断片。
【請求項２６】
DNA断片である、請求項25に記載の核酸断片。
【請求項２７】
SEQ ID NO: 17、48、50、52、54、56および58からなる群より選択される核酸配列、またはそれらに相補的な核酸配列を含む、請求項25に記載の核酸断片。
【請求項２８】
請求項1〜26のいずれか1つに記載の少なくとも1つの免疫原性アナログの免疫学的有効量の提示を、動物の免疫系にもたらすことを含む、自己由来の宿主中でポリマータンパク質をダウンレギュレーションする方法。
【請求項２９】
自己由来の宿主が、ヒトのような哺乳動物である請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
提示が、任意にアジュバントと混合して、自己由来の宿主に、請求項1〜26のいずれか1つに記載の免疫原性アナログを投与することによりもたらされる、請求項28または29に記載の方法。
【請求項３１】
アジュバントが、免疫標的化アジュバント；トキシン、サイトカインおよびマイコバクテリアの派生物のような免疫調節アジュバント；油処方成分；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合マトリックス(ISCOMマトリックス)；粒子；DDA；アルミニウムアジュバント；DNAアジュバント；γ−イヌリン；およびカプセル化アジュバントからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
アナログの免疫学的有効量が、皮内、皮下および筋肉内経路のような非経口経路；腹膜経路；経口経路；バッカル経路；舌下経路；硬膜外経路；脊髄経路；肛門経路；および頭蓋内経路から選択される経路を介して動物に投与される、請求項28〜31のいずれか1つに記載の方法。
【請求項３３】
有効量が、0.5μgから2000μgの間である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
1年当たり少なくとも2、少なくとも3、少なくとも6、および少なくとも12投与のような、1年当たり少なくとも1投与を含む、請求項32または33に記載の方法。
【請求項３５】
免疫系へのアナログの提示が、アナログをエンコードする核酸を動物の細胞内に導入し、それにより、導入された核酸の細胞によるインビボ発現を得ることによりもたらされる、請求項28に記載の方法。
【請求項３６】
導入された核酸が、裸のDNA、荷電または非荷電の脂質とともに処方されたDNA、リポソーム中に処方されたDNA、ウイルスベクターに包含されれたDNA、トランスフェクション促進タンパク質またはポリペプチドとともに処方されたDNA、標的化タンパク質またはポリペプチドとともに処方されたDNA、カルシウム沈殿剤とともに処方されたDNA、不活性担体分子と結合したDNA、キチンまたはキトサン中に被包されたDNA、および請求項30で定義されたアジュバントのようなアジュバントと処方されたDNAから選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
核酸が、動脈内、静脈内または請求項31で定義された経路により投与される、請求項35または36に記載の方法。
【請求項３８】
1年当たり少なくとも2、少なくとも3、少なくとも6、および少なくとも12投与のような、1年当たり少なくとも1の核酸の投与を含む、請求項35〜37のいずれか1つに記載の方法。
【請求項３９】
免疫系への提示が、アナログをエンコードし、発現する核酸断片をもつ非病原性微生物またはウイルスを投与することによりもたらされる、請求項28に記載の方法。
【請求項４０】
ウイルスが、ワクシニアウイルスのような非ビルレントポックスウイルスである、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
微生物が細菌である、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
非病原性の微生物またはウイルスが、動物に1回投与される、請求項39〜41のいずれか1つに記載の方法。
【請求項４３】
−請求項1〜26のいずれか1つに記載の免疫原性アナログ、ならびに
−医薬上および免疫学上許容される担体および／または賦形剤および／またはアジュバント
を含む、マルチマータンパク質に対する抗体の産生を誘導するための組成物。
【請求項４４】
−請求項27に記載の核酸断片、ならびに
−医薬上および免疫学上許容される担体および／または賦形剤および／またはアジュバント
を含む、マルチマータンパク質に対する抗体の産生を誘導するための組成物。
【請求項４５】
アナログが、請求項30または31のいずれか1つで定義されたように処方される、請求項43または43に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項27に記載の核酸断片の発現を促進する条件下で、請求項27に記載の核酸断片で形質転換した宿主細胞を培養し、続いて培養物からのタンパク質発現産物としてアナログを回収することを含む、請求項1〜26のいずれか1つに記載のアナログを製造する方法。
【請求項４７】
宿主細胞が細菌宿主細胞である、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
アナログが可溶性発現産物である、請求項47に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療的免疫療法の分野、特に自己由来(「自己の」)タンパク質およびその他の弱い免疫原性抗原のダウンレギュレーションを目的とする能動免疫療法の分野に関する。したがって、本発明は、マルチマータンパク質の新規な、改良された免疫原性異型、およびこのような異型を製造するための必要な手段を提供する。さらに本発明は、免疫治療の方法、およびそのような方法において有用な組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
疾患の治療または緩和の手段としての能動免疫療法(「ワクチン化」)の使用は、過去20年間にわたって注目が増えてきている。特に、病理上の(またはいずれにしろ望まれない)生理学的状態に何らかの関連がある自己由来タンパク質へのトレランスを破壊するための手段としての能動免疫療法の使用は、避妊ワクチンの最初の実験が報告された70年代後半から知られている。
【０００３】
自己由来の抗原に対するワクチンは、従来、関連する自己タンパク質の「免疫原化」、例えば大きい外来の免疫原性キャリアタンパク質への化学的連結(「結合」)によるか(US 4,161,519参照)、または自己由来タンパク質と外来キャリアタンパク質との間での融合構築物の調製により(WO 86/07383参照)産生されている。このような構築物においては、免疫原性分子のキャリア部分が、自己寛容の破壊を可能にするT-ヘルパーリンパ球にエピトープ(「THエピトープ」)を提供するからである。
【０００４】
その後の研究により、このような方策は自己由来タンパク質に対するトレランスの破壊を実際に提供しうるが、多くの問題に直面していることが立証されている。最も重要なことは、自己由来タンパク質に対する反応性はしばしば衰えるが、時間をかけて誘導される免疫応答が、免疫原のキャリア部分に対して向けられている抗体により左右されることであり、キャリアが以前に免疫原として貢献している場合に特に言明される効果−この現象は、キャリア抑制として知られている(例えばKaliyaperumalら、1995.、Eur. J. Immunol 25、3375〜3380参照)。しかしながら、治療的ワクチン化を用いる場合、通常、1年当たり数回、再免疫化をすること、および多くの年にわたってこの治療を持続することが必要であり、これが、キャリア部分に対する免疫応答が、自己由来分子に対する免疫応答の損失をますます左右する状況にする。
【０００５】
自己寛容を破壊するためにハプテン−キャリア技術を用いる場合に含まれるさらなる問題は、担体によりこのような構築物の自己由来タンパク質部分に及ぼされる、負の立体構造の結果である：天然の自己由来タンパク質にみられる立体構造パターンに似ている、いくつかの得やすいB細胞エピトープは、エピトープの単純な保護もしくはマスキングによるか、または免疫原の自己部分において誘導された立体構造の変化により、しばしば低減される。ついに、ハプテン−キャリア分子を充分に詳細に特徴づけることは、非常にしばしば困難である。
【０００６】
WO 95/05849は、上記のハプテン−キャリア方策を工夫したものを提供している。1つの単独の外来THエピトープほどわずかに内置換された(in-substituted)自己タンパク質が、自己由来タンパク質に対するトレランスを破壊し得ることが示された。外来TH要素の導入にもかかわらず、免疫原において自己由来B細胞エピトープの最大限の数が保存されることを確実にするために、自己由来タンパク質の三次構造の保存に焦点が当てられた。この方策は、誘導される抗体が広いスペクトルとともに高い親和性をもち、かつ免疫応答が、通常のキャリア構築物で免疫化する場合に見られるのよりも、より早い発現およびより高い力価を持つので、非常に好結果であることが、一般に証明されている。
【０００７】
WO 00/20027は、上記の原理の拡張を提供した。自己タンパク質のコーディング配列中への単一のTHエピトープの導入が、自己タンパク質を発現するタンパク質と特異的に反応する細胞毒性T-リンパ球(CTL)を誘導することができることが見出された。WO 00/20027の技術は、抗体およびCTLの両方が誘導される組み合わせ療法も提供した−これらの実施形態において、B細胞エピトープの実質的なフラクションを保存するのに、免疫原がまだ必要である。
【０００８】
WO 95/05849およびWO 98/46642の両者は、TNFα(腫瘍壊死因子α)、すなわちI型糖尿病、リウマチ性関節炎および炎症性腸疾患のようないくつかの疾患の病理に関与するサイトカインの活性をダウンレギュレーションするために適切なワクチン技術を開示している。両者の開示は、分子が免疫系に立ち向かう場合における、モノマーTNFαの三次構造の保存を教示している。
【０００９】
WO 00/65058は、インターロイキン5 (IL5)、すなわち慢性喘息のようないくつかの気道の疾患の発病に重要な、好酸性顆粒球活性の活性化に関与する分子のダウンレギュレーションに関する。ダウンレギュレーションは、ポリペプチドワクチン化技術、生ワクチンおよび核酸ワクチン化の両方により達成され得ることが教示され、さらに、IL5に対する免疫応答を高める場合、B細胞エピトープの保存が重要であることが教示されている。
【００１０】
上記に参照した技術は、非常に有望な結果のために提供されているものであるが、疾患との戦いにおけるワクチンアプローチの実行可能性を評価する場合に役割を果たし得る、いくつかの因子がある。それらの因子のうちのひとつは、免疫原性タンパク質の発現レベルである。
【００１１】
例えば、核酸ワクチンが機能するためには、「免疫原化された」自己由来タンパク質をエンコードする構築物を用いてインビボでトランスフェクションされた細胞は、適切な免疫応答を誘導するような充分量の免疫原を発現することができなければならない。また、ポリペプチドベースのワクチンは、工業的培養プロセスにおいて、充分量の免疫原性タンパク質が産生されることを必要とする。しかしながら、既知のタンパク質のアミノ酸配列中のわずかな変化でさえも、回収され得るタンパク質の量に劇的な影響をもつことがしばしば観察されている。
【００１２】
さらに、遺伝子的に修飾されたタンパク質の配列の安定性は、最適よりも低くなり得る(保存期間の点、およびインビボでの安定性の点の両方において)。
【００１３】
最後に、ダウンレギュレーションすることが望まれる自己タンパク質がヘテロポリマーまたはホモポリマーである場合、このタンパク質のモノマー単位の異型が、ポリマータンパク質に対して天然である立体配座に充分に特異的な抗体を誘導可能であるために、これは必要ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
発明の目的
本発明の目的は、ポリマー自己由来タンパク質の改善された免疫原性アナログを提供するとともに、このようなポリマー自己由来タンパク質に対して体液性免疫を誘導する、改良された方法を提供することである。さらなる目的は、改善された安定性を有し、異種の宿主細胞内で発現された場合に改善された特性を示す、自己タンパク質の免疫原性アナログを提供することである。最後に、該改善された免疫原を製造または使用する場合に有用な手段および基準を提供することも、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要約
細菌宿主細胞において大規模量の組換えタンパク質を産生する場合、発現産物は細菌内部の封入体として入手可能となることがしばしば必要である。これに対する理由は、いろいろである：例えば、タンパク質が不溶性の封入体として発現される場合に、発現収率は通常かなり高くなり、所望の発現産物が細菌培養からの可溶性タンパク質から簡便に分離されるので、タンパク質の精製も促進される。
【００１６】
組換えタンパク質を不溶性の封入体として発現させる場合、発現産物を、それを生物学的に活性な形で得るために、種々のタンパク質のリフォールディングプロセスに付すことがしばしば必要であるが、このような工程が、正しく生物学的に活性な形に決して折りたたまれないという総組換えタンパク質のいくらかの損失を導くとしても、通常は許容される。
【００１７】
しかしながら、非免疫原性自己タンパク質の組換え免疫原性異型を産生する場合、THエピトープを導入し、それによりタンパク質産物の一次構造が、天然の自己タンパク質と比較した場合に、変更されることが必要である。本発明者らは、最もわずかな変化でさえも、封入体発現とそれに続くリフォールディングの通常のアプローチを実施不可能にすることを経験している：天然の自己タンパク質と比較して充分なB細胞エピトープのフラクションを保存した、リフォールディング後のタンパク質の収率はしばしば非常に低く、この論点は、問題のタンパク質の複雑さとともに増加する。
【００１８】
細菌から可溶性タンパク質として産生されるタンパク質構築物の発現を設計し、かつ発現させることが、他の可溶性タンパク質を除去しなければならないことから、後続の精製工程はより複雑になるが、自己タンパク質の免疫原性異型を産生するのに優れた方式であり、精製され、正確に折りたたまれた最終産物が、上記に概説した通常のアプローチに比べた場合にかなり高い収率で得られることをここに見出した。そして非常に重要なことには、このタイプの発現から得られた精製タンパク質は、それらが由来する天然の自己タンパク質のB細胞エピトープを保存する、従来に先例のない能力を示す。
【００１９】
簡単に、本発明によると、異型タンパク質の可溶性の発現は、ワクチン化の目的に適した自己タンパク質の免疫原性異型を初めに選択する場合に、優れた選択基準である。
このような免疫原化された自己タンパク質(および一次配列に変化を導入したその他のタンパク質)の可溶化タンパク質の発現の目標を得るために、いくつかのパラメータを変化させることができる−集合させるのが困難なマルチマータンパク質は、モノマーレベルでの両方のそれらの構造を安定化することによるだけでなく、マルチマーのモノマー模倣物を製造することによっても製造することができ、また単純なモノマータンパク質は、本明細書中に示す教示により、安定化することができる。
【００２０】
その他の重要な因子は、培養条件である−本発明者らの実験室における所見は、例えば高レベルの発現を得るために通常用いられるものより低い温度における細菌の培養が、異型タンパク質の可溶性の形の産生を大きく促進することを示している。
【００２１】
本発明者らは、「モノマー化した」形のIL5およびTNFαの産生が、高い安定性、優れた免疫原性および望ましい生産特性を有する免疫原性分子を提供しうることを見出している。特に、ペプチドリンカーにより連結された、hIL5の2つのモノマーにより構成され、外来Tヘルパー細胞エピトープを含む組換えポリペプチドを発現させる場合に、タンパク質の収率は、驚くほど高い。この所見が、その四次構造がそのモノマー版(version)の作製を許容するマルチマータンパク質に関して、一般に適用可能な所見を構成すると考えられる。
【００２２】
本発明の技術は、ペプチドリンカーの導入を、マルチマータンパク質の3D構造を同時に保存しながら、外来Tヘルパーエピトープの供給と好適に組み合わせることができるので(すなわち、モノマータンパク質において、新しい三次構造上に元来の四次構造をおくことによる、このようなタンパク質の三次および四次構造の両方からの要素の保存)、自己由来タンパク質に対する自己寛容を破壊するための免疫原を製造するのに特に適切であると考えられる。
【００２３】
したがって、ある広い観点において、本発明は、ポリマータンパク質の免疫原性アナログに関し、該ポリマータンパク質は、ペプチド結合により結合していない少なくとも2つのモノマー単位からなり(根本的に)、ここで該アナログは、
a)   ペプチドリンカーによりペプチド結合を介して結合されている、該ポリマータンパク質の少なくとも2つのモノマー単位の実質的なフラグメントを含み、
b)   ポリマータンパク質とは異種である、少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列を含み、そして
c)   アナログをエンコードする発現ベクターをもつ細胞からの単一の発現産物として産生され得る。
【００２４】
本発明者らは、モノマーTNFαのアミノ酸配列におけるいくつかの特定の操作が、免疫原性であり、かつ機能的な四次構造を達成し得るモノマー分子の供給をならしめることを見出し、このことは、これらの分子が、高度に保存された三次構造を有するので、機能的な、受容体結合性のダイマーおよびトリマーを自然発生的に形成することができ、かつこれらの分子が細菌において可溶性タンパク質として産生されることを意味する。
TNFαタンパク質において行われているこれらの操作のいくつかは、天然のタンパク質に比べて安定化された三次構造を製造するのが望まれるタンパク質に、一般に適用可能であると考えられる。
【００２５】
本発明の特定の観点は、少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列を導入しながら同時に、TNFαの正確な折りたたみを許容するように、充分に物理的状態を変えない(non-destructive)TNFαモノマー構造のいくつかの異型に関する。例えば、外来THエピトープの挿入は、タンパク質の発現特性、または機能的なTNFαダイマーもしくはトリマーを形成するモノマーの能力に負の影響をもつことなく、天然TNFαのある特定のループ構造内につくることができることが見出されている。したがって、本発明の重要な部分は、ヒトTNFαの免疫原性アナログに関し、ここで、該アナログは、少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列を含み、さらに
−フレキシブルループ3に少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−TNFαモノマー3D構造を安定化する、少なくとも1つのジスルフィドブリッジが導入されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−アミノ末端の1、2、3、4、5、6、7、8および9のいずれか1つのアミノ酸が欠失された、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
【００２６】
−イントロン部位のループ1に少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、ヒトTNFαのN-末端の人工の柄領域(stalk region)の一部分として導入されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、トリマーの相互作用界面の疎水性を増加させることにより、モノマー構造を安定化するように導入されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−グリシン残基が側面に位置する少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、TNFαアミノ酸配列に挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
【００２７】
−少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、D-Eループに挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列が、ヒトTNFαの2つの相同な配列の間に挿入されているか、または内置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−ヒトTNFα中の少なくとも1つの塩橋が、ジスルフィドブリッジで強化されているか、または置換されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−マウスTNFαの結晶構造を模倣した変異を導入することにより、溶解性および／またはタンパク質分解に対する安定性が増強されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ、および／または
−少なくとも1つの点突然変異の導入により、潜在的な毒性が低減されているか、または撤廃されている、ヒトTNFαモノマーまたは本発明のTNFαのモノマー化されたアナログ
である特徴を有する。
【００２８】
一般に、本発明の最適な免疫原性アナログの全ては、それらが産生される段階で既に可溶性であり、それらの組換え宿主細胞から可溶性の形で単離されるものである。
【００２９】
さらに、本発明は、このような免疫原性アナログをエンコードする核酸断片(DNA断片のような)、およびこのようなDNA断片を含むベクターも提供する。
本発明は、該アナログの製造に有用な形質転換細胞も提供する。
さらに、本発明は、本発明のアナログまたはベクターを含む免疫原性組成物を提供する。
【００３０】
マルチマータンパク質をダウンレギュレーションする治療方法、および特定のマルチマータンパク質に関する特定の疾患の治療方法も、本発明により提供される。
【００３１】
図の凡例
図1：p2ZOP2f昆虫細胞発現ベクター
ベクターの配列を、SEQ ID NO: 60に示す。該ベクターは、OpIE2プロモーターの下流およびOpIE2ポリAテール(OpIE2pA)の上流に、マルチクローニング部位(MCS)を含む。マーカーであるゼオシン耐性遺伝子(ZeoR)は、第二のOpIE2プロモーターの調節下にある。
【００３２】
発明の詳細な開示
定義
以下において、本明細書および請求項において用いるいくつかの語について、本発明の境界を明確にするために、定義して詳細に説明する。
【００３３】
「Tリンパ球」および「T細胞」の語を、各種の細胞媒介免疫応答とともに上腕骨の免疫応答におけるヘルパー活性の原因である、胸腺起源のリンパ球に対して同義的に用いるつもりである。同様に、「Bリンパ球」および「B細胞」の語を、抗体産生リンパ球に対して同義的に用いるつもりである。
【００３４】
本明細書において「ポリマータンパク質」は、ペプチド結合を介して末端と末端が結合されていない、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含むタンパク質として定義する(「マルチマータンパク質」の語は、これと同義的に用いる)。したがって、ポリマータンパク質は、ジスルフィド結合および／または非共有結合によりポリマー形態に一緒に保持されているいくつかのポリペプチドからなるポリマーであり得る。加工後に少なくとも2つの遊離のC末端および少なくとも2つの遊離のN末端を含む、加工されたプレタンパク質およびプロタンパク質も、この語に含む。最後に、独特な三次元構造を有する、不安定であるが、しかし生物学的に活性な分子性実体を形成し得る少なくとも2つのポリペプチド間の、一時的に存在する複合体も、この語に含む。
【００３５】
本明細書において、「免疫原性アナログ」(または「免疫原化された」アナログもしくは異型)は、完全なポリマータンパク質中に見出される配列情報の実質的な部分を含む、単一のポリペプチドを示すことを意味する。すなわち、ポリマータンパク質が少なくとも2つのポリペプチド鎖を含むのに対して、本発明のアナログタンパク質は1つのポリペプチド鎖を含む。アナログはポリマーのモノマーサブユニット構造の異型であり得るが、その場合、免疫原性アナログは天然ポリマーに類似したポリマータンパク質複合体を形成することが可能であることが記載される。
【００３６】
この関係において、ポリマータンパク質の「モノマー化された」アナログまたは異型は、ペプチド結合を介して共有的に結合された形態の、天然のポリマータンパク質において見出される少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む単一のポリペプチドであるが、これらの2つのポリペプチド鎖は、ペプチド結合を介して結合されていない。
【００３７】
マルチマータンパク質のモノマー単位の「実質的なフラグメント」は、マルチマータンパク質において見出され得るのと実質的に同じ3D構造に折りたたまれるドメインを形成するのに少なくとも充分なモノマーポリペプチドを構成する、モノマーポリペプチドの一部分を意味することを意図する。
【００３８】
本明細書において、「IL5ポリペプチド」は、ヒトまたは他の哺乳動物に由来するIL5タンパク質のアミノ酸配列をもつポリペプチドを意味することを意図する。原核系において製造されるIL5のグリコシル化されていない形態は、例えば酵母またはその他の非哺乳動物真核発現系の使用による、多様なグリコシル化パターンを有する形態と同様に、この語の境界内に含まれる。しかしながら、「IL5ポリペプチド」の語を用いる場合、問題のポリペプチドは、治療される動物に提示されるときに、通常、非免疫原性であることを意図することが記載される。言い換えると、IL5ポリペプチドは自己タンパク質であるか、または問題の動物のIL5に対する免疫応答を通常は起こさないような自己タンパク質の異種のアナログである。
【００３９】
本明細書中において「TNFαポリペプチド」は、ヒトおよびその他の哺乳動物に由来するTNFαタンパク質のアミノ酸配列をもつポリペプチドを意味することを意図する。原核系において製造されるTNFαのグリコシルされていない形態も、例えば酵母またはその他の非哺乳動物真核発現系の使用による、多様なグリコシル化パターンを有する形態と同様に、この語の境界内に含まれる。しかしながら、「TNFαポリペプチド」の語を用いる場合、問題のポリペプチドは、治療される動物に提示されるときに、通常、非免疫原性であることを意図することが記載される。言い換えると、TNFαポリペプチドは自己タンパク質であるか、または問題の動物のTNFαに対する免疫応答を通常は起こさないような自己タンパク質の異種のアナログである。
【００４０】
「IL5アナログ」は、その一次配列の変更に付されたか、および／または他の分子種からの要素と結合されたかのいずれかのIL5ポリペプチドである。このような変更は、例えばIL5ポリペプチドの適切な融合パートナーとの融合の形態(すなわち、もっぱらC-および／またはN-末端へのアミノ酸残基の付加を含む、一次構造の変化)にあるか、および／またはIL5ポリペプチドのアミノ酸配列における挿入および／または欠失および／または置換の形態にあることが可能である。派生のIL5分子もこの語に含まれるが、以下のIL5の修飾についての議論を参照。
【００４１】
「TNFαアナログ」は、その一次配列の変更に付されたか、および／または他の分子種からの要素と結合されたかのいずれかのTNFαポリペプチドである。このような変更は、例えばTNFαポリペプチドの適切な融合パートナーとの融合の形態(すなわち、もっぱらC-および／またはN-末端へのアミノ酸残基の付加を含む、一次構造の変化)にあるか、および／またはTNFαポリペプチドのアミノ酸配列における挿入および／または欠失および／または置換の形態にあることが可能である。派生のTNFα分子もこの語に含まれるが、以下のTNFαの修飾についての議論を参照。
【００４２】
IL5およびTNFαアナログも、完全なIL5およびTNFαマルチマータンパク質の実質的な部分を含むモノマー異型を含むことが理解される。
【００４３】
本明細書において「IL5」および「TNFα」の略語を用いる場合、それぞれ、成熟した、野生型のIL5およびTNFα(本明細書中において、「IL5m」および「IL5wt」、ならびに「TNFαm」および「TNFαwt」とも表す)のアミノ酸配列の表示を意図する。成熟ヒトIL5は、hIL5、hIL5mまたはhIL5wtと表され、マウス成熟IL5は、mIL5、mIL5mまたはmIL5wtと表され、同様の記号論をTNFαにも用いる。DNA構築物がリーダー配列またはその他の材料をエンコードする情報を含む場合、それは通常、前後関係から明確であろう。
【００４４】
「ポリペプチド」の語は、本明細書で、2〜10アミノ酸残基の短いペプチド、11〜100アミノ酸残基のオリゴペプチド、100を超えるアミノ酸残基のポリペプチドを共に意味することを意図する。さらに、この語はタンパク質、すなわち少なくとも1つのポリペプチドを含む機能性生体分子を含むことをも意図する；少なくとも2つのポリペプチドを含む場合、これらは複合体を形成するか、共有結合するか、または非共有結合することができる。タンパク質中のポリペプチドは、グリコシル化されるか、および／または脂質化されるか(lipidated)、および／または補欠分子団を含むことができる。
【００４５】
「サブシークエンス」の語は、天然に存在するIL5アミノ酸配列または核酸配列からそれぞれ直接由来する、少なくとも3つのアミノ酸、または適切な場合には、少なくとも3つのヌクレオチドのいずれかの連続的な範囲を意味する。
【００４６】
「動物」の語は、本明細書において一般に、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)、カニス・ドメスティカス(Canis domesticus)などのような動物種(好ましくは哺乳動物) で、単一の動物だけではないことを意味することを意図する。しかしながら、本発明の方法により免疫化された個体が全て、同じ免疫原で動物を免疫化することを許容する、実質的に同じIL5を有することが重要であるので、この語はこのような動物種の個体群をも意味する。例えば、TNFαのIL5の遺伝子的な異型が、異なるヒトの個体群に存在する場合、各個体群においてそれぞれIL5およびTNFαに対する自己寛容を破壊可能にするために、これらの異なる個体群において異なる免疫原を用いることが必要であろう。本明細書における動物が免疫系を有する生物であることは、当業者には明白であろう。該動物は、哺乳動物のような脊椎動物が好ましい。
【００４７】
本明細書において「ダウンレギュレーション」の語により、生物におけるマルチマータンパク質の生物学的活性の減少(例えば、マルチマータンパク質とこの分子の生物学的に重要な結合パートナーとの間の相互作用の干渉による)を意味する。ダウンレギュレーションは、いくつかの機構により得ることができる：これらのうち、抗体の結合による、マルチマータンパク質の活性部位との単純な干渉が、最も単純である。しかしながら、清掃細胞（マクロファージや他の食細胞のような）によるマルチマータンパク質の除去とならしめる抗体の結合も、本発明の範囲内である。
【００４８】
「免疫系に・・・提示をもたらす」の表現は、動物の免疫系が、制御された方法で免疫原性攻撃に供されることを意味することを意図する。以下の開示から明らかなように、このような免疫系の攻撃は、いくつかの方法によりもたらすことができ、それらのうちで最も重要なものは、「ファーマクシン(pharmaccine)」（すなわち進行中の疾患を治療または改善するのに投与されるワクチン）を含むポリペプチドによるワクチン化、または核酸「ファーマクシン」ワクチン化である。達成する重要な結果は、動物における免疫適格細胞が免疫原的に効果的な方法で、抗原と対峙することであって、この結果を達成する精密なモードは、本発明の根底にある発明の概念にはほとんど重要ではない。
【００４９】
「免疫原的有効量」の語は、当該技術における通常の意味を有し、すなわち免疫原と免疫学的な特徴を共有する病原性の剤に著しく関与する免疫応答を誘導し得る免疫原の量である。
【００５０】
本明細書においてIL5、TNFαまたはその他の自己タンパク質が「修飾された」との表現を用いる場合、自己タンパク質の中軸を構成するポリペプチドの化学的修飾を意味する。このような修飾は、例えばアミノ酸配列中のあるアミノ酸残基の派生(例えばアルキル化、アシル化、エステル化など)であり得るが、以下の開示から認識されるように、好ましい修飾は、アミノ酸配列の一次構造の変化(またはそれへの付加)を含む。
【００５１】
「自己由来タンパク質に対する自己寛容」を論じる場合、適切なマルチマータンパク質はワクチン化される個体群において自己タンパク質であるので、個体群における正常な個体はそれに対して免疫応答しないことが理解される；しかし、動物個体群においてまばらに存在する個体が、例えば自己免疫異常の一部分として、天然のマルチマーに対して抗体を産生できるかもしれないことを除外することはできない。いずれの割合においても、動物種は、通常、それ自身のマルチマーに対してのみ自己寛容であるだろうが、他の動物種または異なる表現型を有する個体群に由来するアナログも該動物により寛容化されることを除外することはできない。
【００５２】
「外来T細胞エピトープ」（または「外来Tリンパ球エピトープ」）は、MHC分子に結合でき、動物種においてT細胞を刺激するペプチドである−そのための代わりの語である。本発明において好ましい外来T細胞エピトープは、「乱交雑(promiscuous)」(または「ユニバーサル」または「広範囲な」)エピトープ、すなわち、動物種または個体群において、特定のクラスのMHC分子の実質的なフラクションと結合するエピトープである。ごく限られた数のこのような乱交雑T細胞エピトープのみが知られており、それらを以下に詳述する。本発明に従って使用される免疫原を、できるだけ大きな動物個体群のフラクションで有効にするため、1) 同じアナログにいくつかの外来T細胞エピトープを挿入するか、または2)挿入された異なる乱交雑エピトープを各アナログが有する、いくつかのアナログを作ることが必要であろうことが記載される。また、外来T細胞エピトープの観念は、潜在性T細胞エピトープ、すなわち自己タンパク質に由来し、かつ問題の自己タンパク質の部分ではない単離の形態で存在する場合に、免疫原性の挙動を奏するのみであるエピトープの使用を包含することが記載される。
【００５３】
「外来Tヘルパーリンパ球エピトープ」（外来THエピトープ）は、MHCクラスII分子を結合し、MHCクラスII分子に結合した抗原提示細胞（APC）の表面に提示され得る外来T細胞エピトープである。
【００５４】
したがって「マルチマータンパク質に異種であるMHCクラスII結合アミノ酸配列」は、問題のマルチマータンパク質に存在しないMHCクラスII結合ペプチドである。このようなペプチドは、マルチマータンパク質をもつ動物種にとっても本当に外来である場合、外来THエピトープである。
【００５５】
(生体)分子の「機能性部分」は、本明細書において、分子によって奏せられる少なくとも1つの生化学的または生理学的な効果の原因となる分子の一部分を意味することを意図する。多くの酵素および他のエフェクター分子が、問題の分子によって奏される効果の原因となる活性部位を有することは、当該技術で周知である。分子の他の部分は、安定化または溶解性を増強する目的に役立つであろうし、従って、これらの目的が、本発明のある実施形態に関して適切でないならば除外することができる。しかしながら、本発明によると、本明細書に記載のモノマーを用いた場合に実際に増加した安定性が実証されているので、できるだけポリマー分子を用いることが好ましい。
【００５６】
「アジュバント」の語は、ワクチン技術の分野での一般的な意味を有し、すなわち、1)ワクチンの免疫原に対する特異的な免疫応答をそれ自体で有することができないが、2) にもかかわらず、免疫原に対する免疫応答を増強できる、物質または物質の組成物である。または、言い換えると、アジュバントのみでのワクチン化は、免疫原に対する免疫応答を提供せず、免疫原でのワクチン化は免疫原に対する免疫応答を発生させるか、または発生させないが、免疫原とアジュバントとを組み合わせたワクチン化は、免疫原単独で誘導されるより強い、免疫原に対する免疫応答を誘導する。
【００５７】
分子の「標的化」は、本明細書において、動物に導入される分子が、特定の組織で優先的に現れるか、または特定の細胞もしくは細胞のタイプと優先的に結合する状況を示すことを意図する。その効果は、標的化を促進する組成物中への分子の処方、または標的化を促進する分子の群に導入することを含むいくつかの方法で達成することができる。これらの問題を以下に詳細に述べる。
【００５８】
「免疫系の刺激」は、ある物質または物質の組成物が、一般の非特異的な免疫刺激効果を発揮することを意味する。いくつかのアジュバントと推定上のアジュバント（あるサイトカインのような）は、免疫系を刺激する能力を共有する。免疫刺激剤を用いる成果は、免疫原を用いて同時にまたは続いて起こる免疫化が、免疫原の単離された使用と比較して有意でより効果的な免疫応答を誘導することを意味する免疫系の増加された「機敏さ（alertness）」である。
【００５９】
本発明の免疫原性アナログの特徴
本発明で開示の方策が標的とするポリマータンパク質は、ホモポリマーおよびヘテロポリマーの両方であり得る。実施例から明らかになるように、本発明の第一の観点において最も重要な特徴は、問題のポリマータンパク質が、マルチマータンパク質の三次元構造に重大な変化を導入することなしに「モノマー化」され得ることである。よって、マルチマータンパク質の特定の機能は本発明の要点には重要ではなく、むしろそれは、本発明の第一の観点における本アプローチへの適切な候補であるか否かを決定する、タンパク質の構造的な特徴である。例えば、マルチマータンパク質中のあるモノマーのN末端が、マルチマー中の他のモノマーのC末端に空間的に近接している場合、ペプチドリンカーを介してのこれら2つの特定のモノマーの結合は、天然のマルチマータンパク質の構造に関して、重要な変化を課することなく達成され得る。一方、末端が遠く離れている場合、本発明の実行には、モノマーの少なくとも1つの大部分が本発明の免疫原的な目的には関係がないか、またはモノマーサブユニット間の結合が、タンパク質の抗原性の特徴に影響をもたない、長いリンカーペプチドを用いてなされ得ることが必要である。
【００６０】
本発明の第二の観点においては、自己タンパク質モノマーユニットの「免疫原化」は、得られる異型モノマーが、天然のポリマー自己タンパク質の四次構造を共有するポリマータンパク質の一部分をまだ形成し得るような様式で行われる。
【００６１】
本発明による免疫原性アナログが、実質的なフラグメントにおいて、ポリマータンパク質の一部分であるときに、対応するモノマーに見出されるB細胞エピトープの実質的なフラクションを表示する(display)場合は、有利である。本明細書において、B細胞エピトープの実質的なフラクションとは、その他のタンパク質に対して、マルチマータンパク質を抗原的に特徴付ける、B細胞エピトープのフラクションを意味することを意図する。実質的なフラグメントは、ポリマータンパク質の一部分であるときに、対応するモノマーに見出される本質的に全てのB細胞エピトープを表示することが好ましい−もちろん、モノマー配列中への重要でない変化の導入が必要であろう。例えば、モノマー単位に由来するアミノ酸配列は、リンカー中に位置するその配列を有することが望まれない場合に、マルチマータンパク質に比べてアナログの毒性を減少させるように、および／またはMHCクラスII結合アミノ酸配列を導入するように、アミノ酸の挿入、置換、欠失または付加により修飾されることが可能である。
【００６２】
特に好ましい実施形態は、本発明の免疫原性アナログを提供するが、ここで、実質的なフラクションの各々は、連続配列としてか、または挿入を含む配列のいずれかとして、各モノマー単位の完全アミノ酸配列を本質的に含む。つまり、モノマー単位の配列の重要でない部分のみがアナログから除外され、例えば、そのような配列がモノマー単位の三次構造またはマルチマータンパク質の四次構造に寄与しない場合である。しかしながら、マルチマータンパク質の3D構造が維持される限りは、この実施形態はモノマーの置換または挿入を許容する。よって、免疫原性アナログが、ポリマータンパク質の全てのモノマー単位のアミノ酸配列がアナログ中に表されるものである場合が格別有利であり、アナログが、間断のない配列または挿入を含む配列のいずれかとして、ポリマータンパク質を構成する（全ての）モノマーの完全アミノ酸配列を含む場合が特に有利である。
【００６３】
したがって、明らかになるように、完全なポリマータンパク質の三次元構造が、アナログにおいて本質的に保存されることが好ましい。
【００６４】
本明細書に記載のような修飾に付されるB細胞エピトープの実質的なフラクション、またはマルチマータンパク質の三次元構造までもが保持されることの証明は、いくつかの方法により達成される。その一つは、単に、マルチマーに対するポリクローナル抗血清(例えばウサギで作製された抗血清)を調整し、その後、この抗血清を、製造された修飾タンパク質に対する試験反応物として用いる(例えば競合的ELISAにおいて)ことである。マルチマーが反応するのと同程度に抗血清と反応する修飾されたバージョン(アナログ)は、マルチマーと同じ3D構造を有すると見なさなければならないが、このような抗血清との制限された(しかし、まだ重大で特異的な)反応性を示すアナログは、元来のB細胞エピトープの実質的なフラクションを保持していると見なされる。
【００６５】
代わりに、マルチマー上の独特なエピトープと反応性があるモノクローナル抗体の選択を製造すること、および試験パネルとして用いることが可能である。このアプローチは、1)マルチマーのエピトープマッピング、および2)作製されたアナログ中で保存されるエピトープのマッピングを許容するという利点を有する。
【００６６】
もちろん、第三のアプローチは、マルチマーの三次元構造(例えば上記)を決定し、これを作製したアナログの、決定した三次元構造と比較することである。三次元構造は、X線回折およびNMR分光法により決定できる。三次構造に関するさらなる情報は、与えられた分子の三次構造についての有用な情報を得るために、純粋な形態のポリペプチドが要求されるだけであることに利点を有する（X線回折はポリペプチドの結晶を用いることが要求され、NMRはポリペプチドの同位体異型の準備が要求されるのに対して）円偏光二色性分光分析の検討により、ある程度は得ることができる。しかしながら、円偏光二色性分析は二次構造の要素の情報を通じて、正しい三次元構造の間接的な証拠を提供することができるのみであるので、決定的なデータを得るには、結局、X線回折および／またはNMRが必要である。
【００６７】
本発明の免疫原性アナログは、アナログ中において、マルチマータンパク質に対して異種である少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列の存在を含むか、または該存在に寄与するペプチドリンカーを含むことができる。これは、マルチマータンパク質中のモノマー単位に相当するアミノ酸配列を変更することが望まれない場合に、特に有用である。代わりに、ペプチドリンカーは、マルチマータンパク質が由来する動物種において、MHCクラスII結合アミノ酸配列を有さず、かつ該存在に寄与しないことが可能である；これは、非常に短いリンカーを用いることが必要な場合、または例えば活性部位にMHCクラスII結合要素を導入することにより、潜在的に毒性のアナログを解毒化することが有利な場合に、簡便に行うことができる。これらの実施形態の両者は、必要であれば、分子を解毒化する点突然変異の導入と組み合わせることができる。
【００６８】
MHCクラスII結合アミノ酸配列は、マルチマータンパク質が由来する動物種からのMHCクラスII分子の大部分に結合すること、すなわちMHCクラスII結合アミノ酸配列がユニバーサルまたは乱交雑であることが好ましい。
【００６９】
もちろん、この配列が、免疫原がワクチン成分として役に立つことを意図するための種において、T細胞エピトープとしての目的にかなうことが重要である。動物種または動物個体群の多くの割合において活性である、天然に発生する「乱交雑」T細胞エピトープがいくつか存在し、これらはワクチンに導入されることが好適であり、それにより同じワクチンにおける非常に多数の異なるアナログの必要性が低減される。したがって、少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列は、天然のT細胞エピトープおよび人工のMHCII結合ペプチド配列から選択されることが好ましい。特に好ましい配列は、P2 (SEQ ID NO: 3)またはP30 (SEQ ID NO: 5)のような破傷風トキソイドエピトープ、ジフテリアトキソイドエピトープ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンエピトープおよびピー・ファルシパルム(P. falciparum) CSエピトープから選択される天然T細胞エピトープである。
【００７０】
長年にわたって、他の乱交雑T細胞エピトープがいくつか同定されている。特に、異なるHLA-DR対立遺伝子によりエンコードされるHLA-DR分子の多くの割合に結合することができるペプチドが同定され、これらは全て、本発明において用いるアナログに導入される可能性があるT細胞エピトープである。本明細書にその全てが参照として組み込まれる、次の参考文献において議論されるエピトープも参照：WO 98/23635 (Frazer IHら、The University of Queenslandに譲渡)；Southwood Sら、1998、J. Immunol. 160：3363〜3373；Sinigaglia Fら、1988、Nature 336：778〜780；Chicz RMら、1993、J. Exp. Med 178：27〜47；Hammer Jら、1993、Cell 74：197〜203；およびFalk Kら、1994、Immunogenetics 39：230〜242。後の参考文献もまたHLA-DQおよび-DPリガンドに関する。これらの5つの参考文献に列挙されるエピトープは全て、本発明において用いることとなる天然のエピトープの候補として適切である。なぜなら、これらと共通モチーフを共有するエピトープだからである。
【００７１】
代わりに、エピトープは、MHCクラスII分子の多くの割合に結合することができるいずれの人工T細胞エピトープでもあり得る。この関連において、WO 95/07707および対応する論文Alexander Jら、1994、Immunity 1：751〜761(どちらの開示も本明細書に参照として組み込まれる)に記載のpan DRエピトープペプチド("PADRE")は、本発明により用いられることとなるエピトープの候補として興味深い。これらの論文に開示の最も効果的なPADREペプチドは、投与されたときに安定性を向上するためにCおよびN末端にD-アミノ酸を有することが記載される。しかしながら、本発明は、続いてAPCのリソソーム区画内で酵素的に分解され、MHC-II分子に関する、続いて起こる提示を許容するアナログの一部分として適切なエピトープの組み込みをまず目的とし、よって本発明において用いるエピトープにD-アミノ酸を組み込むことは得策ではない。
【００７２】
特に好ましいPADREペプチドは、アミノ酸配列AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 7)またはその免疫学的に有効なサブシークエンスを有するものである。このエピトープおよび同じMHC制限の欠損を有するその他のエピトープは、本発明の方法に用いるアナログ中に存在するべき、好ましいT細胞エピトープである。このような超乱交雑(super-promiscuous)エピトープは、ただ1つの単独の修飾されたIL5がワクチン化された動物の免疫系に提示される、本発明の最も単純な実施形態を考慮に入れる。
【００７３】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも1つの外来免疫優性THエピトープの導入による修飾を含む。THエピトープの免疫優勢の論点は、問題の動物種に依存することが理解される。本明細書で用いられるように、「免疫優性」の語は、ワクチン化された個体において重大な免疫応答を起こすエピトープについて単に言及するが、ある個体において免疫優性であるTHエピトープが、必ずしも同じ種の他の個体において免疫優性ではないことは周知の事実であり、後者の個体においてそれがMHC-II分子に結合することが可能であってもである。
【００７４】
上述したように、外来T細胞エピトープの導入は、少なくとも1つのアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換により達成され得る。もちろん、通常の状況はアミノ酸配列中の1つ以上の変化の導入(例えば完全T細胞エピトープの挿入またはそれによる置換)であるが、達成する重要な目標は、抗原提示細胞(APC)により処理された(processed)場合に、アナログが、APCの表面においてMHCクラスII分子に関して提示されるようなT細胞エピトープを生じさせることである。よって、適切な位置でのモノマー単位のアミノ酸配列が外来THエピトープにおいても見出され得るいくつかのアミノ酸残基を含む場合に、外来THエピトープの導入は、外来エピトープの残りのアミノ酸をアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換により提供することにより達成され得る。言い換えると、挿入または置換により完全THエピトープを導入する必要はない。
【００７５】
本発明によると、アナログは、その存在がアナログの抗体への近づきやすさをかなりの程度で負に妨げない、少なくとも1つの機能的部分に結合しているより大きい分子の一部分を形成することもできる。このような部分(アナログに融合することができる)の性質は、抗原提示細胞(APC)またはBリンパ球に対して修飾された分子を標的にすること、免疫系を刺激すること、および免疫系へのアナログの提示を最適化することであり得る。
【００７６】
目標にする部分は、Bリンパ球またはAPC上にそれに対する受容体があるハプテンまたは糖類(carbohydrate)のようなBリンパ球特異的表面抗原またはAPC特異的表面抗原に対する、実質的な特異的結合パートナーからなる群より適切に選択される。免疫刺激部分は、サイトカイン、ホルモン及びヒートショックタンパク質からなる群より選択される。提示最適化部分は、パルミトイル基、ミリスチル基、ファルネシル基、ゲラニル−ゲラニル基、GPI−アンカー、およびN-アシルジグリセリド基のような脂質基からなる群より選択され得る。
【００７７】
適切なサイトカインは、インターフェロンγ(IFN-γ)、Flt3L、インターロイキン1 (IL-1)、インターロイキン2 (IL-2)、インターロイキン4 (IL-4)、インターロイキン6 (IL-6)、インターロイキン12 (IL-12)、インターロイキン13 (IL-13)、インターロイキン15 (IL-15)、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、またはいずれかの有効な一部分である。
好適なヒートショックタンパク質は、HSP70、HSP90、HSC70、GRP94、およびカルレティキュリン(CRT)、またはいずれかの有効な一部分である。
【００７８】
アミノ酸の挿入、欠失、置換または付加の数は、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21および25の挿入、置換、付加または欠失のような、少なくとも2が好ましい。アミノ酸の挿入、置換、付加または欠失の数は、最大で100、最大で90、最大で80および最大で70のような、150を超えないのがさらにより好ましい。置換、挿入、欠失または付加の数が60を超えず、特にその数が50または40さえも超えないのが特に好ましい。最も好ましくは、その数が30以下である。アミノ酸付加に関しては、得られる構築物が融合ポリペプチドである場合、これらはしばしば150より相当に多いことが記載される。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも1つの外来免疫優性THエピトープ(= 「外来MHCクラスII結合アミノ酸配列」)の導入による修飾を含む。THエピトープの免疫優性の論点は、問題の動物種に依存することが理解される。本明細書で用いられるように、「免疫優性」の語は、ワクチン化された個体において重大な免疫応答を起こすエピトープについて単に言及するが、ある個体において免疫優性であるTHエピトープが、必ずしも同じ種の他の個体において免疫優性ではないことは周知の事実であり、後者の個体においてそれがMHC-II分子に結合することが可能であってもである。
【００８０】
その他の重要な点は、THエピトープのMHC制限の問題である。一般に、天然に発生するTHエピトープはMHC制限されており、すなわちTHエピトープを構成するあるペプチドは、MHCクラスII分子の部分集合に効果的に結合するのみである。これは、多くの場合、ある特異的なTHエピトープの使用が個体群のフラクションのみにおいて効果的なワクチン成分となる効果を交互に有し、そのフラクションのサイズに依存して、同じ分子内により多くのTHエピトープを含むか、または成分が導入されたTHエピトープの性質により他とは互いに区別される異型である、多成分ワクチン(multi-component vaccine)を製造することが必要となり得る。
【００８１】
用いるT細胞のMHC制限が全くわからない場合（例えばワクチン化された動物がほとんど明確でないMHC組成を有する状況において）、特定のワクチン組成物により包含される動物個体群のフラクションは、次の式：
【００８２】
【数１】
2005518194.tif 000002
【００８３】
(ここで、piは、ワクチン組成物に存在するi番目の外来T細胞エピトープに対する、応答者の個体群中の頻度であり、nはワクチン組成物中の外来T細胞エピトープの総数である）により決定される。よって、それぞれ0.8、0.7および0.6の個体群における応答頻度を有する、3つの外来T細胞エピトープを含むワクチン組成物は、
1 − 0.2 × 0.3 × 0.4 ＝ 0.976
を与えることになり、すなわち、個体群の97.6％が、ワクチンに対するMHC-II媒介応答を統計学的に有するであろう。
【００８４】
上記の式は、用いるペプチドの多少正確なMHC制限パターンがわかっている状況においては当てはまらない。もし、例えばあるペプチドがHLA-DR対立遺伝子であるDR1、DR3、DR5およびDR7によりエンコードされるヒトMHC-II分子にのみ結合するのであれば、このペプチドを、HLA-DR対立遺伝子によりエンコードされる残りのMHC-II分子に結合する他のペプチドとともに用いることが、問題の個体群における100％の適用範囲を達成する。同様に、もし第二のペプチドがDR3およびDR5にのみ結合するならば、このペプチドの付加は、適用範囲を全く増加させない。もしワクチン中のT細胞エピトープの純粋にMHC制限上への個体群の応答の計算に基礎をおく場合、特定のワクチン組成物により包含される個体群のフラクションは次の式：
【００８５】
【数２】
2005518194.tif 000003
【００８６】
（ここで、φjは、ワクチン中のT細胞エピトープのいずれか一つに結合し、かつ3つの周知のHLA遺伝子座(DP、DRおよびDQ)のj番目に属する、MHC分子をエンコードする対立遺伝子のハプロタイプの個体群中の頻度の合計である；実際問題として、まずどのMHC分子がワクチン中の各T細胞エピトープを認識するのかを決定し、その後これらのMHC分子はタイプ(DP、DRおよびDQ)により列挙され、次いで列挙された異なる対立遺伝子のハプロタイプのそれぞれの頻度を各タイプについて合計し、それによりφ1、φ2およびφ3を得る）により決定することができる。
【００８７】
式IIのpiの値が、対応する理論値πi：
【００８８】
【数３】
2005518194.tif 000004
【００８９】
（ここで、υjは、ワクチン中のi番目のT細胞エピトープに結合し、かつ3つの周知のHLA遺伝子座(DP、DRおよびDQ)のj番目に属する、MHC分子をエンコードする対立遺伝子のハプロタイプの個体群中の頻度の合計である）を超えることが起こり得る。これは、個体群の1 − πiでは、f残存-i = (pi − πi) / (1 − πi)の応答者の頻度があることを意味する。よって、式IIIは、式V：
【００９０】
【数４】
2005518194.tif 000005
【００９１】
（ここで、1 − f残存-iの表現は、負である場合、ゼロに設定される）を得るように調節することができる。式Vは、全てのエピトープがハプロタイプの同じ組に対してハプロタイプの位置づけをされていることが必要であることが記載される。
【００９２】
よって、本発明のアナログに導入されることとなるT細胞エピトープを選択する場合、エピトープについての入手可能である全ての知識を含むことが重要である：1) 個体群中の応答者の各エピトープに対する頻度、2) MHC制限データ、および3) 適切なハプロタイプの個体群中における頻度である。
【００９３】
本発明のアナログは、マルチマータンパク質の対応するモノマー単位と、または少なくとも10アミノ酸の長さのそれらのサブシークエンスと、少なくとも70%の配列相同性を有する範囲を含むポリペプチドとなる修飾を含むことが記載される。より高い配列相同性、例えば少なくとも75%、または少なくとも80%または85%でさえも好ましい。タンパク質および核酸の配列相同性は、(Nref − Ndif)・100/Nref (ここで、Ndifは、整列したときの、2つの配列中の非相同残基の総数であり、Nrefは、1つの配列中の残基数である。)のように算出できる。よって、DNA配列AGTCAGTCは、配列AATCAATCと75%の配列相同性を有する(Ndif=2およびNref=8)。
【００９４】
最後に、本発明のアナログが免疫原として実際に効果的であることを決定的に証明するために、必要な確認を得るための種々の試験を行うことができ、本明細書の実施例に示す具体例も参照されたい。この関係において、WO 00/65058での有用なIL5アナログの同定の議論にも言及する−この開示は、本発明の技術に付すアナログ(IL5由来またはそうでない)の有用性の証明のために用い得る。
本発明の技術に付され得る好ましいマルチマーは、IL5およびTNFαである。
【００９５】
IL5ベースの構築物
hIL5については、天然のhIL5ダイマー構築物を模倣し、同時に外来TH要素を含む構築物が、モノマー構造をベースとする構築物に比べて、例えばWO 00/65058に開示の構築物に対して、特に発現レベル、および該構築物に対して得られた抗血清の抗体反応性については、優れた結果を与えることが見出されている。
【００９６】
IL5ベースの好ましい構築物は、アナログが
−少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列を含む、ペプチドリンカーにより連結された2つの完全IL5モノマー、および
−少なくとも1つのIL5モノマーが、異種のMHCクラスII結合アミノ酸配列を含む不活性ペプチドリンカーにより結合された2つの完全IL5モノマー
からなる群より選択されるものである。
【００９７】
このようなアナログは、線状の構造IL-Lm-ILまたはILm-Li-ILnまたはIL-Li-ILmまたはIL-Li-ILmまたはILm-Lm-ILn (ここで、"IL"は、モノマー成熟IL5の完全アミノ酸配列であり、"ILm"および"ILn"は同一または非同一で、異種のMHCクラスII結合アミノ酸配列を含むモノマー成熟IL5の実質的に完全なアミノ酸配列を表し、"Lm"は、アナログ中の少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列を含むか、またはそれに寄与するペプチドリンカーであり、"Li"は、アナログ中のいずれのMHCクラスII結合アミノ酸配列も含まないか、または寄与しない不活性ペプチドリンカーである)を有する。Lm、ILmおよびILnが、破傷風トキソイドのP2および／またはP30エピトープを含むか、またはPADREを含み、かつLiがジグリシンリンカーであるのが特に好ましい。しかしながら、Liは、MHCクラスII結合配列を生じない、いずれの非免疫原性リンカーペプチドであり得る。
【００９８】
最も好ましい実施形態は、SEQ ID NO: 9、11、13および15のいずれか1つに示す、成熟アミノ酸配列を有するhIL5アナログである。
【００９９】
TNFαの背景
腫瘍壊死因子(TNF、TNFα、カケクチン、TNFSF2)は、炎症性および免疫性の機能の、潜在的なパラクリンおよびエンドクリンメディエーターである。TNFαは、特にγ-インターフェロンとの組み合わせで、多くの細胞にとって細胞毒性である。TNFαは、1975年に最初に同定され、腫瘍の壊死および退縮をおこすことが示された。抗癌効果は、後になって詳細に研究され、TNFαを用いた癌の試験はまだ続いているが、癌の療法としての治療は成功していない。TNFαは、後になって、悪液質の原因であることが見出され、TNFは受容体媒介プロセスによって、その機能を働かせることが見出された。TNFαの細胞毒性および炎症性の効果を媒介する、2つの異なるTNFα受容体(TNFR55およびTNFR75)が同定されている。TNFαは、リウマチ性関節炎(RA)のような慢性炎症性疾患における炎症性プロセスを誘導して永存させ、そしてアレルギーおよび乾癬において重大な役割を担っていると見られる。可溶性受容体、受容体特異的阻害剤、TNFα産生のダウンレギュレーションまたはモノクローナル抗TNFα抗体によるTNFαシグナルのブロックは、TNFαアップレギュレーションおよびシグナリングの生物学的効果に反する、魅力のある治療形態である。
【０１００】
可溶性TNFα受容体およびモノクローナル抗TNFα抗体での治療により得られる結果から、抗TNFα治療が、RAおよびクローン病のようないくつかの疾患において成功することが明らかである。抗TNFα治療は、安全で効果的の両方であると考えられる。
【０１０１】
現在までに、レミケード(Remicade) (インフリキシマブ(Infliximab)、セントコア/ジョンソンアンドジョンソン社)およびエンブレル(Enbrel) (エタネルセプト(Etanercept)、イミュネックス社)の2つのTNFαアンタゴニストが、臨床的な使用を認可されている。
【０１０２】
レミケードは、可溶性および細胞関連TNFαに対するマウス−ヒトキメラモノクローナルIgG1抗体である。レミケードは、TNFの、その内因性の細胞表面TNFα受容体との結合をブロックする。食品医薬品局(FDA)は、1998年10月に、従来の両方では難治性の中程度〜重症、またはフィステルを生じるクローン病における使用のためのレミケードを認可した。適応症は、メトトレキセートのみの療法では難治性のリウマチ性関節炎における、メトトレキセートをともに用いる補助的な使用、および2002年7月には、クローン病における維持療法を含むように拡張された。
【０１０３】
エンブレルは、ヒトIgG1のFc部分に融合したヒトTNFα受容体の細胞外部分からなる、組換えタンパク質である。エンブレルは、おとりのTNFα受容体として役割を果たすことにより、TNFα活性を阻害する。FDAは、1998年11月に、リウマチ性関節炎における使用のためのエンブレルを認可した。これらのTNFαアンタゴニストにより、350,000より多い患者が治療されている。これらの剤の臨床的効能及び安全性の情報の再検討は、継続的に行われており、感染およびその他の免疫に関する有害反応はTNFαアンタゴニストについての主要な懸念として残っているが、FDAおよび専売薬製品部会(CPMP)により行われた、市場取引後の経験についての最近の安全性の評価は、重度の感染症についての変更を含めたラベルの変更が必要ではあるが、抗TNFα療法が、好ましい危険性-利益のバランスを有していると述べている。
【０１０４】
確立された抗TNFα療法に比べて、今回提案するTNFα免疫療法は、マイクログラムの量のワクチン、およびより少ない頻度での注射で、大量のモノクローナル抗体の注入に比べて高い抗TNFαのインビボでの力価を維持する点において、利点を有する。肯定的な結果は、副作用へのより少ない危険性、およびより安価な治療である。天然のポリクローナル抗体の応答は、他の抗TNFα療法に比べて、TNFαのより効果的なダウンレギュレーターとして働くとも考えられている。
【０１０５】
TNFαは、233アミノ酸前駆体タンパク質として翻訳され、そしてトリマータイプII膜貫通タンパク質として分泌され、これが特定のメタロプロテアーゼにより開裂されてトリマー可溶性タンパク質になり、ここで各々の同一のモノマーサブユニットは、157アミノ酸からなる(このアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 17に示す)。ヒトTNFαは、グリコシル化されていないが、マウスのTNFαは、単独のN-グリコシル化部位をもつ。TNFαモノマーは、17 kDaの分子量をもち、架橋されたトリマーはSDS-PAGEにおいて43 kDaとして移動するが、トリマーは52 kDaの理論上のMWをもつ。TNFαは、分子内ジスルフィドブリッジを形成することにより、構造を安定化する2つのシステインを含む。TNFαのNおよびC-末端の両方は、活性に重要である。特に、C末端は、3、2および1つのアミノ酸の欠失でさえも、溶解性および生物活性を劇的に減少させるほど、敏感である。重要なアミノ酸は、Leu157であり、これはトリマー中の2つのモノマー間の安定化塩橋を形成する。一方、最初の8アミノ酸の欠失は、1.5〜5の係数で活性を増加させるが、最初の9アミノ酸の欠失は、全長の活性を回復させる。
【０１０６】
TNFαは、よく研究されたタンパク質であり、トリマー形成および受容体結合に導く多くの分子内および分子間相互作用が同定されている。
したがって、天然においては、ヒトTNFα(SEQ ID NO: 17)は、ダイマーおよびトリマーの両方として存在するが、両方の場合において、分子は本発明の標的の候補として非常に適している。
【０１０７】
TNFα構築物
好ましいTNFαアナログは、1) ペプチドリンカーにより末端と末端が連結されている、2または3の完全TNFαモノマー(ここで、少なくとも1つのペプチドリンカーは少なくとも1つのMHCクラスII結合アミノ酸配列含む)、および2) 不活性ペプチドリンカーにより末端と末端が連結されている、2または3の完全TNFαモノマー(ここで、モノマーの少なくとも1つは、少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列を含むか、または少なくとも1つの外来MHCクラスII結合アミノ酸配列は、任意に不活性リンカーを介してN-もしくはC-末端モノマーに融合されている)からなる群より選択される。
【０１０８】
本発明者らにより、モノマーTNFα構築物は比較的不安定であることが以前に見出されているので(しかし、以下の議論を参照)、特に興味深いものは高い安定性の免疫原性TNFα分子である。
よって、このタイプの構築物は、上記で論じたIL5構築物に非常に類似している。
【０１０９】
IL5について論じたのと同様の方法でエピトープおよび／または不活性ペプチドリンカーにより連結された3つのTNFαサブユニットをエンコードする遺伝子が作製されている。目標は、天然のTNFαトリマーにできる限り近い立体配座の異型TNFα分子をつくることである。異型は、wtTNFαに対する中和抗体を効率的に誘導するように設計される。最適なTNFα異型は、界面活性剤またはタンパク質の立体配座を妨害し得るその他の種類の添加剤の不在下において、可溶性で、かつ安定なタンパク質である。
【０１１０】
リンカーおよびTHエピトープを用いて1つの単独のポリペプチドとしてともに連結される3つのモノマーを発現することにより、以前の異型TNFα免疫原よりも安定なTNFα異型を作製することを意図する。これは、安定化する水素結合、塩橋またはジスルフィドブリッジの外側に必要なTHエピトープを導入することにより、TNFα構造の保存を許容する。
【０１１１】
TNFαのX線結晶構造により、N末端の最初の5残基が、可動性(flexible)でありすぎて構造決定が許容されないことがわかる。しかしながら、C末端は、モノマー界面の真ん中近くに位置し、可動性が低い。Arg-6およびLeu-157のCα原子間の距離は10Åであり、これは3〜4アミノ酸残基の距離である。したがって、モノマーサブユニットを直接一緒に連結し得るようにみえるが、C末端は繊細な位置に位置しているので、この結合には可動性リンカー、例えばグリシンリンカーを用いることが有利だろう。
【０１１２】
現在までに、「モノマー化されたトリマー」アプローチを用いて、5つの異型が設計されている。コントロールのTNF_T0 (TNFαトリマー番号0、SEQ ID NO: 22)は、2つの別のグリシンリンカー(GlyGlyGly)により一緒に直接連結された3つのモノマーからなる。TNF_T0は、野生型トリマータンパク質のように安定となるように設計されている。もちろん、タンパク質化学において周知の他の不活性で可動性リンカーを、上記のグリシンリンカーの代わりに用いることができ、重要な特徴は、可動性リンカーが、生理的に活性なwtTNFαの3D構造と類似の3D構造に折り畳まれるモノマータンパク質の能力に、負に干渉しないことである。
【０１１３】
TNF_T0構築物を、イー・コリ(E. coli)中で可溶性タンパク質として発現し、PADRE MHCクラスII結合ペプチド(SEQ ID NO: 7)が導入された異型である、具体例としての構築物、TNF_T4 (SEQ ID NO: 57)を作製するのに用いる。この構築物において、モノマー単位と外来エピトープとの間の比は、免疫原化されたモノマータンパク質に依存する従来技術の異型の場合のモノマー当たり1エピトープの代わりに、3モノマー当たり1エピトープであり、これは、SEQ ID NO: 55の場合もそうである。この事実は、トリマーの安定性への潜在的に肯定的な影響を与える。このアプローチから生じたものは、TNF_C2異型(SEQ ID NO: 28、以下を参照)であり、これは、TNF_T4と同じ位置にPADREエピトープを有するTNFαモノマーである。
【０１１４】
同様に、破傷風トキソイドP2およびP30エピトープ(それぞれSEQ ID NO: 3および5)は、各リンカー領域に1エピトープを有するTNF_T1およびTNF_T2異型(それぞれSEQ ID NO: 49および51)に用いられ、1つのC末端エピトープおよび第二のリンカー領域に1つを有するTNF_T3 (SEQ ID NO: 59)にも用いられている。タンパク質は、ほぼN末端からC末端の方に向かって折り畳まれる。TNF_T3の根底にあるアイデアは、最初の2つのN末端ドメインが折り畳まれるときに、エピトープにより囲まれている第三のドメイン(モノマー)への内部シャペロンとしてそれらが機能することである。
【０１１５】
上で詳細に記載した技術に加えて、ポリマータンパク質が「モノマー化」された場合、TNFα(およびおそらくその他の多くのマルチマータンパク質)は、1)少なくとも1つの安定化する変異を含み、および／または2) 少なくとも1つの非TNFα由来MHCクラスII結合アミノ酸配列を含むモノマーの産生を許容することが見出されており、ここで、これらのTNFαモノマー異型は、正しい四次構造をもつ(これらが受容体結合活性を持つことにより証明される)ダイマーおよびトリマーTNFαタンパク質の形成を続いて許容する三次構造に正しく折り畳まれることができる。したがって、これらの構築物においては、モノマー化されたトリマーとして必ずしも産生される必要がないモノマーTNFαの異型を製造することが可能である。なぜなら、モノマー配列に導入された変化は、ダイマーまたはトリマーが形成され得るように制限されたモノマーの三次構造の破壊を導入するからである。本発明の根底にあるアイデアによると、このような異型の全ては、細菌細胞から可溶化タンパク質として発現され得ることがさらに見出されている。
【０１１６】
したがって、組み合わせることができ、さらに、既に論じた本発明の「モノマー化アプローチ」と組み合わせることができる(なぜならこれらの特定の修飾は、本来、非破壊的であるからである)以下の方策に従って、免疫原性TNFα異型を作製することが可能である。
【０１１７】
可動性ループの方策
本発明者らにより、位置Gly108-Ala109のループ3へのPADREエピトープ(SEQ ID NO: 7)の挿入が、天然のTNFα分子に非常に類似の構造をもつTNFα異型を作製するのに見込みのあるアプローチであることが見出されている。この位置に直接挿入されたTHエピトープは、相互作用するのに極めて近接したいずれの近隣のアミノ酸残基も有さないことが、TNFαの結晶構造から推断されている。このアプローチにより作製された最初のPADRE構築物であるTNF34 (SEQ ID NO: 18)の研究により、細菌宿主細胞が37℃で培養された場合に、発現されたタンパク質TNF34の約5%がイー・コリにおいて可溶性であり、TNF34の95%が封入体として発現されたが、培養温度が25℃である培養プロセスへの調節後、培養からの可溶性タンパク質の収率は、100%に近くなることが示されている。したがって、生育条件の最適化は、可溶性タンパク質の収率を増加させる。
【０１１８】
他の構築物のいくつかが作製され(TNF35-TNF39、SEQ ID NO: 23、24、25、26および27)、ここでこれらの全ては、単に、可動性ループ3へのSEQ ID NO: 7の導入を頼りにしている。
【０１１９】
安定性を増大する変異
可動性ループ3へのTHエピトープの導入は、TNFα異型の構造を不安定化する可能性がある。しかしながら、この潜在的な不安定化は、ジスルフィドブリッジを形成するシステインの導入を介する構造の安定化により、阻止することができる。2つの異なる位置でのシステインの対は、現在までに、異型TNF34-AおよびTNF34-B (SEQ ID NO: 29および30)に導入されている。また、受容体相互作用の強度を低減することが知られている、可動性N末端(最初の8アミノ酸)は同時に欠失され、すなわち異型TNF34-C (SEQ ID NO: 31)である。ジスルフィドブリッジは、天然に発生するジスルフィドブリッジ(Cys-67 Cys-101)と一緒にエピトープ挿入部位を安定化するために、モノマーに導入される。この方策は、TNFαモノマーそのまま、およびモノマー化されたダイマーまたはトリマーの両者を安定化する。
【０１２０】
その他の構築物
いくつかの異なる方策が、可溶性発現産物となる異型の設計において用いられている。TNFX1.1-2 (SEQ ID NO: 32および33)は、TNFαの第1のループ中でのSEQ ID NO: 7の挿入をベースとしており、ここで、挿入部位は、イントロンの位置に位置する。TNFX2.1 (SEQ ID NO: 34)においては、人工の「柄」領域が、SEQ ID NO: 7の挿入を含んで創られている。
【０１２１】
TNFαの変異は、トリマーの界面の方を向いている大きな疎水性のアミノ酸の置換が、トリマーの構造を安定化することを明らかにする。TNFX3.1およびTNFX3.2 (SEQ ID NO: 35および36)は、存在するTNF34異型を安定化する計画である。TNFX4.1 (SEQ ID NO: 37)は、ジグリシンリンカーを用いて、TNF34の構造の全体にわたって、PADREペプチドからの構造の束縛を減少している。TNFX5.1 (SEQ ID NO: 38)は、挿入点として、TNFファミリーの構成要素であるBlySにおいてみられるループ構造を用いている。TNFX6.1-2、TNF7.1-2およびTNFX8.1 (SEQ ID NO: 39、40、41、42および43)は、さらなる異型である。TNFX9.1およびTNFX9.2 (SEQ ID NO: 44および45)は、プレ(pre)およびポスト(post)エピトープの両方である同一のオーバーラップする4〜6アミノ酸のTNFα配列を用いたTNF34異型である。最後に、2つの異型(SEQ ID NO: 46および47)は、TNF34におけるPADREペプチドについてと同じ位置でのP2/P30二重異型である。
【０１２２】
さらに、TNFαの結晶構造から、Lys-98およびGlu-116残基の間で、TNFαモノマー中に1つの安定化する塩橋が存在することが観察される。塩橋の定義は、AspまたはGlu中の側鎖の酸素と、Arg、LysまたはHis中の正に帯電した原子である側鎖の窒素との間の静電的相互作用であり、かつ原子間距離は7.0Å未満である。Glu 116のAspでの置換と組み合わせた、この位置でのLys-98のArgまたはHisでの特定部位置換変異により、この塩橋の安定性の向上、およびそれによるトリマー分子の安定性の向上が達成され得る。上述した方法で、これらの塩橋をジスルフィドブリッジで交換することも可能である。
【０１２３】
マウスTNFαは、溶解性およびタンパク質分解に関して、ヒトTNFαよりもかなり安定であることが観察されている。TNFα異型の改良は、マウスTNFα結晶構造を模倣してタンパク質分解においてより安定なTNFα産物を得るように、部位特異的変異体を作製することを含む。
【０１２４】
ヒトおよびマウスTNFαのX線構造から、トリマーの中心(3つのTNFαモノマーの中央)は、疎水力によりまとまっているが、トリマーの上部と下部は、天然に起こる塩橋により結合していることがわかる。したがって、より強い結合のためにこれらの塩橋をスクリーニングすることにより、TNFαトリマーの安定性も向上される。
【０１２５】
最後に、本発明のTNFα異型を用いて得られる予備的な結果は、驚くべきことに、異型が、少なくともそれらがTNF受容体に結合するという意味において、生理的に活性であることを示している。しかしながら、TNFαは毒性のタンパク質であるので、本発明によるワクチンで免疫化された対象において重度の副作用を引き起こさない、安全な異型を作製することが望まれる。したがって、適切な毒性モデルでの試験においてそれらがワクチン化する個体に対して危険である可能性があると示された場合に、構築物中に解毒化変異を含むことが本発明の重要な実施形態でもある。
【０１２６】
当該技術において、いくつかの点突然変異がTNFαを解毒化するか、または少なくとも毒性を大幅に低減することが知られている。これらの点突然変異は、必要であれば、本発明の異型に導入される。特に好ましい変異は、成熟TNFαに対応するTyr-87のSerでの置換、Asp-143のAsnでの置換、およびAla-145のArgでの置換である。さらに、Loetscher, H.、Stueber, D.、Banner, D.、Mackay, F.およびLesslauer, W. 1993 JBC 268 (35) 26350〜7に記載の全ての有効な変異は、本発明の解毒化の実施形態において興味深い実施形態である。
【０１２７】
まとめると、次の具体的なTNFα異型が本発明により作製されている：
【０１２８】
【表１】
2005518194.tif 000006
【０１２９】
用いた数字は、SEQ ID NO: 17のN末端のVから (つまり、SEQ ID NO: 17のアミノ酸no. 2から)である。いくつかの配列においては、翻訳開始に用いられるメチオニンが、N末端のバリンに先行している。
【０１３０】
したがって、本発明の最も好ましいタンパク質構築物は、SEQ ID NO: 18、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、49、51、53、55、57および59のいずれか1つにより表されるもの、ならびに保存アミノ酸の変化、またはそれらの解毒化するアミノ酸変化のみを含む、これらに由来するアミノ酸配列のいずれかである。
【０１３１】
いずれにしても、上記で論じたこれらのTNFα異型の全てが、イー・コリのような細菌細胞から可溶性タンパク質として発現可能であるのが、重要な実施形態である。
好ましいベクターは、イー・コリからの発現が目標である場合にはpET28b+であり、p2Zop2F (SEQ ID NO: 60)は昆虫細胞での発現のために用いられるベクターであり、pHP1 (またはその市場で入手可能な「ツイン」pCI)は、哺乳動物細胞での発現のために用いられるベクターである。
【０１３２】
本発明により提供される一般的な療法
本発明は、それにより、非常に有利な方法で、特定のポリマータンパク質をダウンレギュレーションすることが可能になる方法を提供する。
一般に、自己由来の宿主中でのポリマータンパク質をダウンレギュレーションする方法が提供され、該方法は、本発明の少なくとも1つの免疫原性アナログの免疫学的有効量の提示を、動物の免疫系にもたらすことを含む。自己由来の宿主は、哺乳動物であることが好ましく、最も好ましくはヒトである。
【０１３３】
該方法はいくつかの様式で実行することができ、その中で、タンパク質ワクチンの投与は1つの選択肢であるが、核酸ワクチン化方策または生ワクチン化方策も非常に興味深い。
【０１３４】
タンパク質/ポリペプチドワクチン化および処方
動物へのその投与によりアナログの提示を動物の免疫系にもたらす場合、ポリペプチドの処方は、当該技術において一般に認められている原則に従う。
有効成分としてペプチド配列を含むワクチンの製造は、全てが本明細書中に参照として組み込まれる米国特許4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792;および4,578,770号に例示のように、当該技術においてよく理解されている。典型的には、このようなワクチンは、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能物として製造される；注射に先立って液体中の溶液、または懸濁液に適切な固体形態も製造可能である。製剤は、乳化することも可能である。活性な免疫原性成分は、医薬上許容され、かつ有効成分に悪影響を及ぼさない医薬品添加物と、しばしば混合される。適切な医薬品添加物は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびこれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、またはワクチンの有効性を増大させるアジュバントのような添加剤の少量を含有することができる；以下のアジュバントの詳細な議論を参照。
【０１３５】
ワクチンは、非経口で、例えば皮下(subcutaneously)、皮内(intracutaneously)、皮内(intradermally)、皮下(subdermally)または筋肉内のいずれかの注射により、通常、投与される。投与のその他の形態に適した付加的な製剤は、坐剤や、ある場合においては、経口、バッカル、舌下、腹腔内、膣内、肛門、硬膜外、脊髄、および頭蓋内の製剤を含む。坐剤については、伝統的な結合剤および担体は、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができる；このような坐剤は、有効成分を0.5%〜10%、好ましくは1〜2%の範囲で含む混合物からつくられる。経口製剤は、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられる医薬添加物を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性製剤または粉剤の形態をとり、10〜95%、好ましくは25〜70%の有効成分を含む。経口製剤について、コレラトキシンは、興味深い製剤パートナーである（および抱合パートナーとしても可能性がある）。
【０１３６】
ポリペプチドは、中和または塩の形態でワクチンに処方することができる。医薬上許容される塩は、酸付加塩(ペプチドの遊離のアミノ基とともに形成される)、および例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成されるものを含む。遊離のカルボキシ基と形成される塩は、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノ  エタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来するものであり得る。
【０１３７】
ワクチンは、投与量製剤に影響を及ぼさない方法で、治療上有効であり、かつ免疫原性である量で投与される。投与される量は、例えば免疫応答をする個体の免疫系の受容力、および所望の防御の程度を含み、治療される対象に依存する。適切な投与量範囲は、ワクチン接種あたり数百μgのオーダーの有効成分であり、好ましい範囲が、約0.5μg〜1,000μgの範囲のような約0.1μg〜2,000μg (1〜10 mgの範囲のより高い量でさえ予期されるが)、好ましくは1μg〜500μgの範囲、特に約10μg〜100μgの範囲である。
初期の投与およびブースター注射の好適なレジメン(regimens)も変動するが、初期の投与に続く接種または他の投与を行うことにより代表される。
【０１３８】
使用の様式は広く変動する。ワクチンの投与の通常の方法のいずれも使用可能である。これらは、固体の生理学的に許容されるベース上の、または生理学的に許容される分散液中の経口使用、注射による非経口などを含む。ワクチンの投与量は、投与経路に依存し、ワクチン化されるヒトの年齢および抗原の製剤により変動する。
【０１３９】
ワクチンのアナログのいくつかは、ワクチン中において充分に免疫原性であるが、他のいくつかについては、ワクチンがさらにアジュバント物質を含む場合、免疫応答が増強される。
【０１４０】
ワクチンについてアジュバント効果を達成する種々の方法が知られている。一般的な原理および方法は、“The Theory and Practical Application of Adjuvants"、1995、Duncan E.S. Stewart-Tull(編)、John Wiley & Sons Ltd、ISBN 0-471-95170-6、および“Vaccines: New Generationn Immunological Adjuvants"、1995、Gregoriadis Gら(編)、Plenum Press、New York、ISBN 0-306-45283-9に詳述され、両者とも本明細書に参照として組み込まれる。
【０１４１】
自己抗原への自己寛容の破壊の促進を示し得るアジュバントを用いることが、特に好ましい；実際、非修飾IL5を自己ワクチン中の有効成分として用いる場合に、これは必須である。適切なアジュバントの限定しない例は、免疫標的化アジュバント；トキシン、サイトカインおよびマイコバクテリア派生物のような免疫変調アジュバント；油処方成分；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合マトリクス(immunostimulating complex matrix) (ISCOMマトリックス)；粒子；DDA；アルミニウムアジュバント；DNAアジュバント；γ−イヌリン；および被包されたアジュバントからなる群より選択される。一般的に、アナログ中の第一、第二および第三成分として有用な化合物および剤に関する上記の開示は、必要な変更を加えて、本発明のワクチンのアジュバントにおけるそれらの使用に当てはまることが記載される。
【０１４２】
アジュバントの使用は、緩衝食塩水中の0.05〜0.1%溶液として通常用いられる水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン）のような剤、0.25%溶液として用いられる糖の合成ポリマー(例えばCarbopol（登録商標）)との混合物の使用を含み、70〜101℃の範囲の温度においてそれぞれ30秒〜2分間の熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集、および架橋剤による凝集も可能である。アルブミンへのペプシン処理抗体(Fabフラグメント)を用いた再活性化による凝集、シー・パルバム(C. parvum)のような細菌細胞もしくはエンドトキシンもしくはグラム陰性細菌のリポ多糖類成分との混合物、マンニドモノ−オレエート (Aracel A)のような生理学的に許容される油賦形剤中の乳化物、またはブロック代替物として用いられるペルフルオロカーボン(Fluosol-DA)の20%溶液との乳化物も用いることができる。スクアレンのような油およびIFAとの混合物も好ましい。
【０１４３】
本発明によると、DDA(ジメチルジオクタデシルアンモニウム  ブロミド)は、DNAおよびγ−イヌリンと同様にアジュバントとして興味深い候補であるだけでなく、フロイントの完全アジュバントおよび不完全アジュバント、ならびにQuilAおよびQS21のようなキラヤサポニンもRIBIと同様に興味深い。更なる可能性は、モノホスホリルリピドA (MPL)、上記のC3およびC3d、ならびにムラミルジペプチド(MDP)である。
【０１４４】
リポソーム製剤も、アジュバント効果を与えることが知られており、よって本発明によると、リポソームアジュバントは好ましい。
【０１４５】
また、免疫刺激複合体マトリックスタイプ (ISCOM（登録商標）マトリックス)アジュバントも、特に、このタイプのアジュバントがAPCによるMHCクラスII発現をアップレギュレーションすることができることが示されているので、本発明による好ましい選択である。ISCOM（登録商標）マトリックスは、キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)からの(任意に分別された)サポニン(トリテルペノイド)、コレステロール、およびリン脂質からなる。免疫原性タンパク質と混合した場合、得られる微粒子製剤は、サポニンが60〜70% w/w、コレステロールおよびリン脂質が10〜15% w/w、ならびにタンパク質が10〜15% w/wを構成する、ISCOM粒子として知られるものである。組成物および免疫刺激複合体の使用に関する詳細は、例えばアジュバントに関する上記の教科書に見出されるが、Morein Bら、1995、Clin. Immunother. 3：461〜475、ならびにBarr IGおよびMitchell GF、1996、Immunol. and Cell Biol. 74：8〜25(両者とも本明細書に参照として組み込まれる)も、完全免疫刺激複合体の製造についての有用な教示を与える。
【０１４６】
アジュバント効果を達成する、その他の非常に興味深い（よって、好ましい）可能性は、Gosselinら、1992(本明細書に参照として組みこまれる)に記載の技術を用いることである。簡単に、本発明の抗原のような適切な抗原の提示は、抗原を単核/マクロファージ上のFcγ受容体に対する抗体(または抗原結合抗体フラグメント)に結合させることにより増大される。特に、抗原と抗−FcγRIとの間の抱合は、ワクチン化の目的のための免疫原性を増大させることが示されている。
【０１４７】
他の可能性は、タンパク質構築物への部分として請求の範囲に記載した標的化および免疫調節物質（とりわけサイトカイン）の使用を含む。この関連において、ポリI:Cのようなサイトカインの合成インデューサーも可能性がある。
【０１４８】
好適なマイコバクテリア派生物は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、RIBI、ならびにTDMおよびTDEのようなトレハロースのジエステルからなる群より選択される。
【０１４９】
好適な免疫標的化アジュバントは、CD40リガンドおよびCD40抗体またはそれらの特異的結合フラグメント(上記の議論参照)、マンノース、Fabフラグメント、ならびにCTLA-4からなる群より選択される。
【０１５０】
好適なポリマーアジュバントは、デキストラン、PEG、スターチ、マンナンおよびマンノースのような炭水化物；プラスチックポリマー；ならびにラテックスビーズのようなラテックスからなる群より選択される。
【０１５１】
興味深いその他の免疫応答の調節の手段は、「バーチャルリンパ節」(VLN) (ImmunoTherapy, Inc.、360 Lexington Avenue、New York、NY 10017-6501により開発された専売医用装置)中に、免疫原(任意にアジュバントおよび医薬上許容される担体および賦形剤とともに)を含むことである。VLN(薄い管状の装置)は、リンパ節の構造および機能を模倣している。皮膚の下へのVLNの挿入は、サイトカインおよびケモカインの急な高まりを伴う無菌の炎症の部位を創生する。T細胞およびB細胞とともにAPCは危険信号に迅速に応答し、炎症を起こした部位に戻り、VLNの多孔性マトリックスの内側に蓄積する。抗原に免疫応答を装備するのに要求される必要な抗原投与量は、VLNを用いる場合に減少されることと、VLNを用いたワクチン化により与えられた免疫防御は、アジュバントとしてRibiを用いた通常の免疫化に勝ることとが示されている。この技術は、とりわけGelber Cら、1998、"Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node"："From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts、October 12th〜15th 1998, Seascape Resort、Aptos、California"に簡単に記載されている。
【０１５２】
ワクチンは、1年に少なくとも1、2、3、4、5、6および12回のように、年に少なくとも1回投与されるべきであることが予期される。より具体的には、それを必要とする個体に、年に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、または12回のように、年に1〜12回が予期される。本発明による好ましい自己ワクチンの使用により誘導される記憶免疫性は永続せず、したがって免疫系はアナログで定期的に攻撃されることが必要であることがすでに示されている。
【０１５３】
遺伝的多様性のために、異なる個体が同じポリペプチドに対して変動した強度の免疫応答で反応することができる。したがって、本発明のワクチンは、免疫応答を増加させるためにいくつかの異なるポリペプチドを含んでいてもよく、これは外来T細胞エピトープ導入の選択に関する、上記の議論を参照。ワクチンは2以上のポリペプチドを含むことができ、全てのポリペプチドは、上記で定義したとおりである。
この結果、ワクチンは、3〜10のアナログのような3〜20の異なるアナログを含むことができる。しかしながら、通常は、アナログの数は1または2のアナログのような最小限を維持するようにされる。
【０１５４】
核酸ワクチン化
ペプチドベースワクチンの伝統的な投与の非常に重要な代替物として、核酸ワクチン化(「核酸免疫化」、「遺伝的免疫化」および「遺伝子免疫化」としても知られる)の技術は、多くの魅力的な特徴を提供する。
【０１５５】
第一に、伝統的なワクチンのアプローチに比較して、核酸ワクチン化は、免疫原性剤の大規模な製造（例えばタンパク質産生微生物の工業的規模の培養の形態で）を消費する資源を必要としない。さらに、免疫原の精製およびリフォールディングの計画を工夫する必要がない。最後に、核酸ワクチン化は、導入された核酸の発現産物を製造するために、ワクチン化された個体の生化学的器官に頼っているので、発現産物の最適な翻訳後プロセシングが起こることが予期される；これは、上述したように、ポリマーの本来のB細胞エピトープのかなりのフラクションが修飾された分子中に保存されるべきであり、B細胞エピトープは、いずれの(生体)分子(例えば炭水化物、脂質、タンパク質など)の部分からも原則として構成することができるので、自己ワクチン化の場合に特に重要である。したがって、免疫原の本来のグリコシル化およびリピド化パターンは、全体としての免疫原性に非常に重要であり、これは免疫原を産生する宿主を有することにより最も確実にされることが予期される。
【０１５６】
今回開示されたアナログを用いて観察される増大された発現レベルは、インビボ発現レベルがDNAワクチンの免疫原性効率において決定する因子の一つであるので、DNAワクチン化の効率に非常に重要である。
【０１５７】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、アナログをエンコードする核酸を動物細胞に導入し、それにより導入された核酸の細胞によるインビボ発現を得ることにより、本発明のアナログの免疫系への提示をもたらすことを含む。
【０１５８】
本実施形態においては、導入された核酸は、裸のDNA、荷電または非荷電の脂質とともに処方されたDNA、リポソーム中に処方されたDNA、ウイルスベクターに包含されたDNA、トランスフェクション促進タンパク質またはポリペプチドとともに処方されたDNA、標的化タンパク質またはポリペプチドとともに処方されたDNA、カルシウム沈殿剤とともに処方されたDNA、不活性担体分子に結合したDNA、ポリマー、例えばPLGA (WO 98/31398に記載のマイクロカプセル化技術を参照)中またはキチンもしくはキトサン中に被包されたDNA、およびアジュバントとともに処方されたDNAの形態にあり得るDNAが好ましい。この関係において、伝統的なワクチン処方でのアジュバントの使用に適する実用上全ての考慮すべき事柄が、DNAワクチンの処方に当てはまることが記載される。よって、ポリペプチドベースのワクチンの関係におけるアジュバントの使用に関する、本明細書における全ての開示は、必要な変更を加えて、核酸ワクチン化技術におけるその使用に当てはまる。
【０１５９】
上記で説明したポリペプチドベースのワクチンの投与経路および投与スキームに関し、これらは本発明の核酸ワクチンにも適用可能であり、ポリペプチドについての投与経路および投与スキームに関する上記の全ての議論は、必要な変更を加えて、核酸にも当てはまる。核酸ワクチンは、静脈内および動脈内に適切に投与され得ることをこれに追加するべきである。さらに、核酸ワクチンは、いわゆる遺伝子銃により投与され得ることは当該技術において周知であり、よってこのことおよびこれと同等の投与形態は、本発明の一部分であるとみなされる。最後に、核酸の投与におけるVLNの使用は、良好な結果を生じることが報告されており、よってこの特定の投与形態は特に好ましい。
【０１６０】
さらに、免疫化剤として用いられる核酸は、例えば有用なアジュバントとして論じたサイトカインのような、上記の免疫調節物質の形態にある、請求の範囲に記載した部分をエンコードする領域を含むことができる。この実施形態の好ましいバージョンは、異なるリーディングフレームでまたは少なくとも異なるプロモーターの制御下で、アナログのコーディング領域および免疫調節剤のコーディング領域を有することを包含する。これにより、アナログまたはエピトープが免疫調節剤の融合パートナーとして産生されるのを回避する。代わりに、2つの別個なヌクレオチド断片を用いることができるが、これは、同じ分子中に含まれた両方のコーディング領域を有する場合、共発現が確実になる利点があるので、あまり好適ではない。
【０１６１】
したがって、本発明は
−本発明の核酸断片またはベクター(以下のベクターの議論を参照)、ならびに
−上記の医薬上および免疫学上許容される賦形剤および／または担体および／またはアジュバント
を含む、IL5に対する抗体産生を誘導する組成物に関する。
【０１６２】
通常の環境において、核酸は、発現がウイルスプロモーターの調節下にあるベクターの形態で導入される。本発明によるベクターおよびDNA断片のより詳細な議論については、以下の議論を参照。また、核酸ワクチンの処方および使用に関する詳細な開示は入手可能であり、Donnelly JJら、1997、Annu. Rev. Immunol. 15：617〜648およびDonnelly JJら、1997、Life Sciences 60：163〜172を参照。これらの両者の参考文献は、本明細書に参照として組み込まれる。
【０１６３】
生ワクチン
免疫系に対して本発明のアナログを提示する第三の代案は、生ワクチン技術の使用である。生ワクチン化では、免疫系への提示は、本発明のアナログをエンコードする核酸断片またはこのような核酸断片を組み込んだベクターで形質転換した非病原性微生物を、動物に投与することによりもたらされる。非病原性微生物は、いずれの適切な弱毒化細菌株(継代培養によるか、または組換えDNA技術による病原性発現産物の除去により弱毒化)、たとえばマイコバクテリウム・ボビス  ビーシージー(Mycobacterium bovis BCG.)、非病原性のストレプトコッカス種(Streptococcus spp.)、イー・コリ、サルモネラ種(Salmonella spp.)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholerae)、シゲラ(Shigella)などであり得る。最新の生ワクチンの製造に関する概説は、例えばSaliou P、1995、Rev. Prat. 45：1492〜1496およびWalker PD、1992、Vaccine 10：977〜990に見出され、両者は本明細書中に参照として組み込まれる。このような生ワクチンで用いられる核酸断片およびベクターについての詳細は、以下の議論を参照。
【０１６４】
細菌の生ワクチンの代替物として、ワクシニア株またはいずれの他の適切なポックスウイルスのような非ビルレントウイルスワクチンベクターに、以下で論じられる本発明の核酸断片を組み込むことができる。
【０１６５】
通常、非病原性微生物またはウイルスは、動物に一度のみ投与されるが、寿命の間に1回以上微生物を投与して、防御免疫を維持することが必要な場合がある。ポリペプチドワクチン化について上記で詳述したような免疫化スキームが、生またはウイルスワクチンを用いる場合に、有用であろうことが考えられる。
【０１６６】
代わりに、生またはウイルスワクチン化を、その前またはその後のポリペプチドおよび／または核酸ワクチン化と組み合わせる。例えば、生またはウイルスワクチンによる一次免疫化をもたらし、続いてポリペプチドまたは核酸アプローチを用いてブースター免疫化を行うことが可能である。
【０１６７】
微生物またはウイルスは、例えば有用なアジュバントとして論じたサイトカインのような、上記の免疫調節物質の形態にある上述の部分をエンコードする領域を含む核酸で形質転換することができる。この実施形態の好ましいバージョンは、アナログのコーディング領域および免疫調節剤のコーディング領域を、異なるリーディングフレームで、または少なくとも異なるプロモーターの制御下で有することを包含する。これにより、アナログまたはエピトープが免疫調節剤の融合パートナーとして産生されるのを回避する。代わりに、2つの別個なヌクレオチド断片を形質転換の剤として用いることができる。もちろん、アジュバント部分を同じリーディングフレームに有することは、発現産物として本発明のアナログを提供することができ、このような実施形態は、本発明において特に好ましい。
【０１６８】
組み合わせ治療
本発明を実施する特に好ましい形態の一つは、第一(一次)免疫化としての核酸ワクチン化の使用、続いて、上述したようなポリペプチドベースのワクチンまたは生ワクチンでの第二(ブースター)免疫化を含む。
【０１６９】
疾患の治療における本発明の方法の使用
治療のレジメンの精密な選択は、標的とするマルチマータンパク質の選択に依存する。例えば、IL5を標的とする場合、WO 00/65058に記載の全ての条件が適切であり、標的がTNFαである場合、関係する疾患/条件は、リウマチ性関節炎、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、多発筋炎、皮膚筋炎、脈管炎、乾癬(斑)および乾癬性関節症、Mb.クローン、慢性閉塞性肺疾患、脊髄形成異常症候群、リウマチ性関節炎におけるブドウ膜炎、急性肺機能不全、喘息、ヴェグナー肉芽腫症、過敏性腸疾患、側頭下顎骨の障害(有痛性顎関節)、口内炎骨粗しょう症(stomatitisosteoporosis)、および癌悪液質、ならびに一般にTNFαの有害反応に関連があると当該技術でみなされている、その他の炎症性疾患およびその他の症状である。したがって、マルチマータンパク質の活性をダウンレギュレーションする本発明の方法を用いることにより、これらの疾患のいずれかに関連する症状の治療または改善が可能である。
【０１７０】
本発明の組成物
本発明は、本発明の方法の行使において有用な組成物にも関する。したがって、本発明は、上記で定義したアナログを免疫原的有効量含む免疫原性組成物に関し、該組成物は、さらに、医薬上および免疫学上許容される希釈剤および／または賦形剤および／または担体および／または医薬添加物、ならびに任意にアジュバントを含む。言いかえると、本発明のこの部分は、上述したように、本質的に、アナログの処方に関する。アジュバント、担体および賦形剤の選択は、ペプチドワクチン化のためのアナログの処方について言及するときに上記で論じたことに従う。
【０１７１】
アナログは、当該技術において周知の方法により製造される。より長いポリペプチドは、アナログをエンコードする核酸配列の適切なベクターへの導入、該ベクターによる適切な宿主細胞の形質転換、(宿主細胞を適切な条件下で培養することによる)核酸配列の発現、宿主細胞またはその培養上清からの発現産物の回収、ならびにその後の精製および任意の更なる修飾、例えばリフォールディングまたは派生(derivatization)を含む組換え遺伝子技術の手段により、通常、製造される。必要な道具に関する詳細は、以下の「本発明の核酸断片およびベクター」の標題の下だけでなく、実施例においても見出される。
【０１７２】
より短いペプチドは、固相または液相ペプチド合成の周知の技術により製造するのが好ましい。しかしながら、この技術における最近の進歩は、これらの手段による全長ポリペプチドおよびタンパク質の製造を可能にし、したがって合成手段により長い構築物を製造することも本発明の範囲内である。
【０１７３】
本発明の核酸断片およびベクター
修飾ポリペプチドが、組換え遺伝子技術だけでなく化学合成または半合成により製造できることが、上記の開示から認められるであろう；後者の2つの選択は、修飾がタンパク質担体（KLH、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、およびBSAのような）と、炭水化物ポリマーのような非タンパク性分子との結合からなるか、またはそれを含む場合、ならびに修飾がポリマー由来ペプチド鎖への側鎖もしくは側方の基の付加を含む場合にももちろん、特に関係する。これらの実施形態は、上記から理解されるように、好ましいものではない。
【０１７４】
組換え遺伝子技術の目的のために、およびもちろん核酸免疫化の目的のために、アナログをエンコードする核酸断片（それらの相補的配列も同様）は重要な化学産物である。よって、本発明の重要な部分は、本明細書に記載のアナログ、すなわち上記で詳述したような、ポリマー由来人工ポリマーポリペプチドをエンコードする核酸断片に関する。本発明の核酸断片は、DNAまたはRNA断片のいずれかである。
【０１７５】
本発明の最も好ましいDNA断片は、SEQ ID NO: 8、10、12、14、17、48、50、52、54、56および58からなる群より選択される核酸配列、またはこれらのいずれに相補的な核酸配列を含む。
【０１７６】
本発明の核酸断片は、通常、適切なベクターに挿入され、本発明の核酸断片を有するクローニングまたは発現ベクターを形成する；このような新規なベクターもまた本発明の一部分である。本発明のこれらのベクターの構築に関する詳細は、形質転換細胞および微生物の関係において以下で論じる。ベクターは、使用の目的およびタイプに応じて、プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体またはウイルスの形態にあり得るだけでなく、特定の細胞において一過的に発現するだけの裸のDNAも重要なベクターである(そしてDNAワクチン化において有用である）。本発明の好ましいクローニングおよび発現ベクターは自律複製が可能であり、それにより、後に続くクローニングのための高レベル発現または高レベル複製を目的とする高いコピー数を可能にする。
【０１７７】
本発明のベクターの全体的な概要は、5'→3'方向に実施可能な連鎖で次の特徴を含む：本発明の核酸断片の発現を推進するプロモーター、ポリペプチドフラグメントの(細胞外の相へ、もしくは適用可能である場合にはペリプラズマへの)分泌または膜への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエンコードする任意の核酸配列、本発明の核酸断片、および任意のターミネーターをエンコードする核酸配列である。生産株または細胞ラインにおいて発現ベクターとともに機能する場合、形質転換細胞の遺伝的安定性を目的として、宿主細胞に導入されたときのベクターが、宿主細胞ゲノムに組み込まれることが好ましい。これに対して、動物においてインビボ発現をもたらすために用いるベクターとともに作用する場合(すなわち、DNAワクチン化においてベクターを用いる場合)、ベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれることができないことが、安全性の理由から好ましい；典型的に、裸のDNAまたは非組み込みウイルスベクターが用いられ、その選択は当業者に周知である。
【０１７８】
本発明のベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、本発明の修飾IL5ポリペプチドを産生する。本発明の一部分でもあるこのような形質転換細胞は、本発明の核酸断片またはベクターを増殖させるのに用いるか、または本発明の修飾IL5ポリペプチドの組換え産生に用いる培養細胞または細胞ラインであり得る。代わりに、形質転換細胞は、修飾IL5の分泌、または細菌の膜もしくは細胞壁への組み込みをもたらすように核酸断片(単一または多コピー)が挿入された、適切な生ワクチン株であり得る。
【０１７９】
本発明の好ましい形質転換細胞は、細菌(エシェリヒア[たとえばイー・コリ]、バチルス(Bacillus) [例えばバチルス・サチリス(Bacillus subtilis)]、サルモネラ、またはマイコバクテリウム[好ましくは非病原性の、例えばエム・ボビス  ビーシージー]種のような)、酵母(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のような)、ならびに原虫のような微生物である。代わりに、形質転換細胞は真菌、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞のような多細胞生物に由来する。最も好ましくは、ヒト由来の細胞であるが、これは以下の細胞ラインおよびベクターの議論を参照。最近の結果は、市場で入手可能なドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)細胞ライン(Invitrogenから入手可能なスナイダー2 (S2)細胞ラインおよびベクター系)の、本発明のIL5アナログの組換え産生のための使用に大きな見込みを示し、したがってこの発現系は特に好ましく、よってこのタイプの系も、一般に、本発明の好ましい実施形態である。
【０１８０】
クローニングおよび／または最適化された発現の目的のために、形質転換細胞が本発明の核酸断片を複製することができることが好ましい。核酸断片を発現する細胞は、本発明の好ましい有用な実施形態である；これらは、アナログの小規模または大規模の製造のために、または非病原性細菌の場合には、生ワクチン中のワクチン構成成分として用いることができる。
【０１８１】
形質転換細胞により本発明のアナログを製造する場合に、少しも必須ではないが、発現産物が培地中に運び出されるか、または形質転換細胞の表面上にあるかのいずれかが便利である。なぜなら、これらのオプションの両方は、その後の発現産物の精製を促進するからである。
【０１８２】
効果的な産生細胞が同定された場合、それを基礎として、本発明のベクターを有し、修飾IL5をエンコードする核酸断片を発現する安定な細胞ラインを樹立することが好ましい。好ましくは、この安定な細胞ラインは、本発明のIL5アナログを分泌するか、有し、それによりその精製を促進する。
【０１８３】
一般に、宿主細胞に影響を与えない種に由来するレプリコンおよび調節配列を含むプラスミドベクターは、宿主と関連して用いる。ベクターは、通常、複製部位とともに、形質転換細胞において表現型の選択を提供し得るマーキング配列を有する。例えば、イー・コリは、イー・コリ種に由来するプラスミド、pBR322を用いて典型的に形質転換される(例えばBolivarら、1977参照)。pBR322プラスミドは、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、したがって形質転換細胞を同定するのに簡単な手段を提供する。pBRプラスミド、またはその他の微生物のプラスミドもしくはファージは、発現のために原核細胞微生物により使用され得るプロモーターも含まなければならないか、含むように修飾されなければならない。
【０１８４】
これらのプロモーターは、B-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)およびラクトースプロモーター系(Changら、1978；Itakuraら、1977；Goeddelら、1979)およびトリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddelら、1979；EP-A-0 036 776)を含む原核生物の組換えDNA構築において、最も一般的に用いられる。これらは最も一般的に用いられるが、その他の微生物のプロモーターが発見されて使用され、これらの核酸配列に関する詳細が発表され、当業者がそれらをプラスミドベクターと機能的に連結することを可能にしている(Siebwenlistら、1980)。原核生物からのある遺伝子は、人為的な手段による他のプロモーターの付加を必要とすることなく、それ自身のプロモーター配列からイー・コリにおいて効率的に発現することができる。
【０１８５】
原核生物に加えて、酵母培養のような真核微生物も用いることができ、ここでプロモーターは発現を推進することが可能であるべきである。サッカロミセス・セレビシエ、または通常のパン酵母は、いくつかのその他の株も通常入手可能であるが、真核微生物中で最も一般的に用いられる。サッカロミセス中での発現には、たとえばプラスミドYRp7が一般的に用いられる(Stinchcombら、1979；Kingsmanら、1979；Tschemperら、1980)。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力が欠失した酵母の変異株、例えばATCC No. 44076またはPEP4-1 (Jones、1977)に対して選択マーカーを提供するtrpl遺伝子を予め含む。よって、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrpl障害の存在は、トリプトファンの不在下での成長により形質転換を検出する、効果的な環境を提供する。
【０１８６】
酵母ベクター中の適切なプロモーター配列は、3−ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzmanら、1980)、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのようなその他の糖分解酵素(Hessら、1968；Hollandら、1978)のプロモーターを含む。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子に関連する終結配列は、発現ベクター中で発現が所望される配列の3'に連結され、mRNAのポリアデニル化および停止を提供する。
【０１８７】
成長条件により制御される転写の付加的な利点を有するその他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソシトクロムC、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関する分解酵素、および上記のグリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用の原因である酵素のプロモーター領域である。酵母に影響を与えないプロモーター、複製起点および終結配列を含むいずれのプラスミドベクターも適切である。
【０１８８】
微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞の培養も宿主として用いることができる。原則として、そのような細胞培養は、脊椎動物または無脊椎動物培養のいずれからであっても機能し得る。しかしながら、脊椎動物細胞における興味は最大になっており、培養(組織培養)での脊椎動物の増殖は、近年、ルーチンの手順となっている(Tissue Culture、1973)。このような有用な宿主細胞ラインの例は、VEROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO)細胞ラインおよびW138、BHK、COS-7 293、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda) (SF)細胞(とりわけProtein Sciences、1000 Research Parkway、Meriden、CT 06450、U.S.A.およびInvitrogenからの完全発現系として市場で入手可能)、ならびにMDCK細胞ラインである。本発明においては、Invitrogen、PO Box 2312、9704 CH Groningen、The Netherlands から入手可能な昆虫細胞ラインであるS2が特に好ましい細胞ラインである。
【０１８９】
このような細胞の発現ベクターは、(必要であれば)複製起点、いずれかの必要なリボソーム結合部位とともに、発現される遺伝子の上流に位置するプロモーター、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を通常含む。
【０１９０】
哺乳動物細胞における使用には、発現ベクター上の制御機能がウイルス材料からしばしば提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、最も頻繁にはシミアンウイルス40 (SV40)またはサイトメガロウイルス(CMV)に由来する。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点も含む断片としてウイルスから簡単にどちらも得られるので、特に有用である(Fiersら、1978)。ウイルスの複製起点内に位置するHindIII部位からBglI部位に広がる約250 bpの配列を含むのであれば、より小さいまたはより大きいSV40断片を用いることもできる。さらに、所望する遺伝子配列と通常関連するプロモーターまたは調節配列を用いることが、このような調節配列が宿主細胞系に影響を及ぼさないのであれば、可能であり、しばしば所望される。
【０１９１】
複製起点は、SV40またはその他のウイルス(例えばポリオーマ、アデノ、VSV、BPV)に由来するような外来の起点を含むベクターの構築により提供されるか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供されるかのいずれかであり得る。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれる場合、後者がしばしば充分である。
【０１９２】
実施例1
4つの新しい2エピトープ(P2+P30)モノマーIL5構築物の設計
IL5は、モノマーのC末端およびN末端が分子中で近くに位置する逆平行のホモダイマーである。これは、2つのモノマーを結合して、野生型ダイマーの四次構造に極めて類似の単一のモノマーにする可能性を開く。
我々は、p2/P30エピトープをリンカーとして用いるか、またはLiら、1997、PNAS USA 94(13): 6694〜9に以前に記載されたようにしてジグリシンリンカーを挿入するかのいずれかを用いてこれにアプローチした。
【０１９３】
全ての研究に用いた天然のhIL5をエンコードするDNA分子は、R&Dシステムズ(BBG16)から購入した。このDNA配列は、hIL5リーダー配列を含んでいなかった；よって、天然のhIL5リーダーペプチドをエンコードする合成DNA配列を付加した。P2およびP30 T細胞エピトープをエンコードする配列は、破傷風トキソイドに由来する。これらの配列は、遺伝子の天然の配列に挿入され、よってIL5の免疫原性変異体を与える。挿入は、IL5遺伝子内の読み枠を保存して行う。
【０１９４】
異型をつくるためのクローニング方策は、配列オーバーラップを用いるプライマーまたはDNA断片の伸長に基づく。まず、挿入をつくる相補的5'末端をもつプライマーの2組を、テンプレートとしてのwt IL5 DNA分子およびフランキングベクタープライマーを用いる2つの別々のPCR反応で伸長する。その後、このようにして相補的5'末端ももつこれらの2つの2本鎖断片をアニールして伸長し、第2のPCRで完全挿入を含むようにする。最後に、断片を、フランキングプライマーを用いて増幅する。これらの挿入を、ベクターも同様に、適切なエンドヌクレアーゼで消化し、ベクターと挿入とを一緒に連結する。この手順は、Hortonら、1989により記載され、Ausabel らによるCurrent protocols in molecular biology (pp. 8.5.7〜9) "Introduction of a point mutation by sequential PCR steps"に概説される「オーバーラップ伸長によるスプライス(splice by overlap extension)」手順の変法である。
【０１９５】
標準的な分子生物学的技術、ならびに制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動およびイー・コリ細胞の成育および保存のようなDNA操作は、Sambrook, J.、Fritsch, E.F. & Maniatis, T. 1989に記載された標準の分子生物学的技術を用い、そしてM&E標準プロトコールを用いて行った。
【０１９６】
実施例2
hIL5.34およびhIL5.35
分子の内部にT細胞エピトープを有するために、2つのIL5モノマーの間にリンカーとして、頭から末尾にP2およびP30を挿入し、hIL5-P30-P2-hIL5 (hIL5.34、SEQ ID NO: 5および6中の成熟ペプチド)、およびhIL5-P2-P30-hIL5 (hIL5.35、SEQ ID NO: 7および8中の成熟ペプチド)の2つの構築物を得る−両方のDNA構築物は、天然のIL5リーダー配列をエンコードし、266アミノ酸の成熟発現産物となる。これらの設計により得られる翻訳産物は、「モノマーIL5ダイマー」、すなわちダイマーIL5の完全な三次元構造に非常に類似の三次構造をもつモノマー分子に折り畳まれることを意図している。
【０１９７】
実施例3
hIL5.36およびhIL5.37
J. Liらによる、ジグリシンリンカーの挿入による生物学的に活性なモノマー「IL5ダイマー模倣物」の以前に成功した作製に基づいて、T細胞エピトープを付加した、類似であるが免疫原性である構築物を設計した。よって、異型hIL5.36は、SEQ ID NO: 9および10中の成熟ペプチドの構造をもち、異型hIL5.37は、SEQ ID NO: 11および12中の成熟ペプチドの構造をもつ。これらの両者の構築物は、天然のIL5リーダー配列の後に、IL5の最初の4アミノ酸をエンコードし、その後に続いて第一の挿入エピトープが続く−他方のエピトープは、C末端に位置する。
【０１９８】
これらの2つの構築物において、hIL5の配列の保存を目的とする代わりに、N末端エピトープが完全IL5配列にN末端的に位置しない2つの主要な理由がある。hIL5のN末端とともに天然のhIL5リーダーペプチドを用いることにより、リーダーペプチドが正しく開裂されることを確かにする。また、IL5のN末端が可動性領域を構成するので、得られる構築物の三次元構造の保存のためにそれは重要ではない。
これらの設計から得られる翻訳産物は、実施例2に記載のように、「モノマーIL5ダイマー」に折り畳まれるようである。
【０１９９】
実施例4
発現レベル
上記に記載のヒトIL5アナログは、当該技術における標準の方法を用いて、マルチプルベクターに挿入され、構築、DNAワクチン化、および昆虫、哺乳動物またはイー・コリ細胞での組換え発現に用いられる。
特に、COS細胞(一時的な発現)、およびS2細胞における標準の発現系およびプロトコールを用いて、IL5野生型タンパク質をエンコードする構築物で得られるものよりも、発現レベルがよいこと、および発現レベルはWO 00/65058に開示のhIL5異型を発現する際に得られるものも超えることが見出された。
【０２００】
実施例5
交差反応可能な抗IL5抗体の誘導
マウスの標準の免疫化プロトコールに用いる、今回開示のヒトIL5のアナログ。簡単に、マウスを、実施例2および3からの上記の異型で免疫化した。マウス抗hIL5抗体を、イムノアフィニティクロマトグラフィーにより単離し、それらの抗hIL5活性を、野生型hIL5に対して得られたマウス抗体のものと比較した。結果は、該抗体は、WO 00/65058で教示のアナログに対する抗体よりも、より高い力価およびより高い親和性であることを示した。
予備的な結果は、本発明によるマルチマー模倣物が、少なくともある程度のIL5特異的活性を維持していることも示す。
【０２０１】
実施例6
TNFα異型の作製
野生型ヒトTNFαモノマーポリペプチド(SEQ ID NO: 17)をエンコードする合成DNA配列"SMTNFWT3" (SEQ ID NO: 16)は、Entelechon GmbHからライゲーション産物として届けられた。ヒトhTNFαのDNA配列は、コドンユーセージデータベース(Codon Usage Database)に従って、イー・コリ中での頻度が10％未満の全てのコドンを除くことにより、イー・コリ中での発現に最適化された。さらに、配列は、その後のクローニング工程のために、5' NcoI制限部位を含むように設計された。
【０２０２】
SMTNFWT3ライゲーション産物をpCR 4 TOPOブラントベクターに挿入し、イー・コリDH10B細胞を形質転換した。得られたSMTNFWT3TOPOクローンの10クローンからのプラスミドDNAを精製し、予想される断片(制限酵素(RE)消化により分析された場合)を含む5クローンを選択した。
5つの正しい可能性があるSMTNFWT3TOPOクローンからのNcoI/EcoRI DNA断片を単離して、pET28b(+)ベクターに移して、配列を決定した。挿入、欠失または置換が4クローンにおいて同定され、1クローンが正しいようであった。正しい構築物である、SMTNFWT3pET28を、その後、全ての単一TNFα異型の作製のための鋳型として用いた。
【０２０３】
実施例7
TNF34構築
PanDRエピトープアミノ酸配列(SEQ ID NO: 7および20)を、イー・コリ中での発現に最適なDNA配列(SEQ ID NO: 19)に手動で「逆翻訳」して(以下を参照)、SOE PCRによりTNFαのループ3に挿入した。
得られた構築物(SEQ ID NO: 18をエンコードするDNA配列)を、pET28b+ベクターに位置させ、TNF34-pET28b+を得た。
【０２０４】
実施例8
モノマー化されたトリマー構築物
モノマー化されたトリマー構築物は、トリグリシンリンカーおよび／またはエピトープエンコード領域のいずれかにより分離された3つのTNFαエンコード領域をベースとする。
TNFα遺伝子は、3つの別々の単位として合成された。3つの断片はSOE PCRにより組み立てられ、組み立てられた遺伝子(SEQ ID NO: 21)を、pCR2.1-TOPO中にクローニングした。配列の確認後、正しいクローンを単離した。hTNFT_0遺伝子(TNFα-GlyGlyGly-TNFα-GlyGlyGly-TNFαをエンコードするSEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、すなわち2つのトリグリシンリンカーにより分離されたSEQ ID NO: 17の3コピー)を、pET28b+に移してhTNFT_0-pET28b+を得た。正しいクローンを単離し、配列を確認し、BL21-STAR、BL21-GOLDおよびHMS174のイー・コリライン中に形質転換した。
【０２０５】
hTNFT_0-pET28b+を鋳型として用いて、次の4つのモノマー化されたトリマー異型をSOE PCRにより作製した：hTNFT_1、hTNFT_2、hTNFT_3およびhTNFT_4 (SEQ ID NO: 49、51、57および59)。更なる異型(SEQ ID NO: 53)は、同様の方法で作製することができる。
hTNFT_1、hTNFT_2およびhTNFT_3は、SOE PCRの2循環により組み立てられる必要がある破傷風トキソイドエピトープP2およびP30 (それぞれSEQ ID NO: 3および5)を含む異型である。hTNFT_4は、PADRE (SEQ ID NO: 7)挿入をもつ異型であり、SOE PCRの1循環により組み立て可能である。更なる異型(SEQ ID NO: 55)は、同様の方法により作製可能である。
【０２０６】
hTNFT_4は、上記の方法により構築され、hTNFT_4-pET28b+の正しいクローンは、TOP 10細胞に見出され、構築物をBL21-STARおよびHMS174細胞に移した。
hTNFT_1、hTNFT_2およびhTNFT_3を構築するために、SOE PCRによりエピトープをトリマーの非常に小さいフラグメントに挿入し、これをRE切断およびライゲーションによりhTNFT_0-pET28b+に挿入した。
【０２０７】
実施例9
TNF34変異体の安定化
上記のTNF34-pET28b+異型をさらに安定化するために、過剰のジスルフィドブリッジの導入を含む異型とともに欠失変異体を構築した。3つの異なる異型を構築した：
TNF34-A-pET28b+ は、Q67CおよびA111Cの置換を含み、TNF34-B-pET28b+はA96CおよびI118Cを含み、そしてTNF34-C-pET28b+は、最大で8のN末端アミノ酸の欠失を含む−発現産物のアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 20、30および31に示す。
3つ全ての構築物をSOE PCRを用いて作製し、BL21-STAR、BL21-GOLDおよびHMS174にクローニングし、続いて配列の確認を行った。
【０２０８】
実施例10
可動性ループの異型
TNF34-pET28b+異型に比べて向上された特性を示すであろう異型を見出すために、PADRE挿入(SEQ ID NO: 7)をTNFα分子の可動性ループ3の周辺に移動した構築物を作製した。
これらの全て：TNF35-pET28b+、TNF36-pET28b+、TNF37-pET28b+、TNF38-pET28b+、TNF39-pET28b+、およびPADREが分子のC末端に位置する異型；TNFC2-pET28b+を、SOE PCR技術により作製し、BL21-STAR、BL21-GOLDおよびHMS174にクローニングし、その後、配列確認をした。発現産物のアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 23、24、24、26、27および28に示す。
【０２０９】
発現系として昆虫細胞を用いることの可能性を評価するためにも、TNFWT、TNF34、TNF35、TNF36、TNF37、TNF38、TNF39およびTNFC2を、p2Zop2f ベクター(図1参照)に移し、S2昆虫細胞中で発現させた。
【０２１０】
実施例11
その他の構築物
多数のさらなるTNFα異型を作製し、全てをTNFXと名付けた。上記を参照。これらの異型をエンコードするDNAは、SOE PCRにより作製され、pET28b+に直接クローニングされる。
正しいTNFXクローンを、BL21-STARおよびHMS174に形質転換し、その後、配列を確認する。
【０２１１】
実施例12
ペリプラズム発現
LTBリーダー配列を、TNF34-pET28b+中のSEQ ID NO: 16のすぐ上流に付加し、ペリプラズム間隙への発現をねらいとする。
【０２１２】
実施例13
哺乳動物発現
哺乳動物細胞での発現を試験するために、SEQ ID NO: 16およびTNF34をエンコードするDNAを、市場で入手可能なpCIベクター(プロメガコーポレーション)の異型であるpHP1ベクターに移す。pHP1は、pCIのAmpR遺伝子の代わりに、マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含む。
【０２１３】
実施例14
GroELおよびGroESの共発現
イー・コリシャペロン複合体であるGroEL/ESの発現は、可溶性TNFα異型の発現を増加させることが以前に報告されている(Jeong, Wら、1997、Biotechnology letters、19巻、第6号、pp579〜582)。GroEL/ESの共発現が本明細書に記載のようにTNFα異型の発現を向上させることができるかを試験するために、その天然のプロモーターの調節下にある、イー・コリからのGroEL/ESオペロンを含むプラスミドを用いる。このプラスミドは、wtTNFα、TNF34またはTNF37をエンコードするDNAのいずれかとともに、HMS174に共形質転換される。二重の形質転換体を、2つの関連する選択マーカーであるカナマイシンおよびカルベニシリンを含む平板上で平板培養することにより選択した。二重の形質転換体は、次いでRE分析により同定され、同じクロ−ン内での両方のプラスミドの存在を試験した。
【０２１４】
予備的な実験において、細胞を37℃にてOD600= 0.6〜1まで培養し、その後、42℃で30分間ヒートショックを行った。細胞のコントロールのフラクションはヒートショックを行わず、全ての細胞を1 mM IPTGを含むLB培地中に5倍希釈し、25℃で一晩(ON)培養した。
細胞を回収し、上清および溶菌液の両方をTNFα発現について分析した。クマシー染色を行ってGroEL/ES発現を評価した。
【０２１５】
この実験において、シャペロンの添加による改善は見られなかった。これは、主に、我々がこの実験において、シャペロンの非存在下においてさえもほぼ100％の可溶性物質を得たからであろう。しかしながら、我々は、それらが可溶性がより低い異型であるか、本発明のその他の異型での改善を調べる。
【０２１６】
実施例15
イー・コリ発現
3つの異なるイー・コリ株における可溶性TNFα異型の発現を、実験室の発酵槽、および振とうフラスコにおいて試験する。用いた発酵装置は、1Lの運転容量のInfors発酵槽システムであった。試験した3つのイー・コリ株は：HMS174、BL21 STARおよびBL21 GOLDであった。培養に用いた培地は、唯一の炭素源としてグルコースを含む合成最小培地であった。
【０２１７】
主な目的の1つは、可溶性TNFα異型の発現のために最適化するような最適培養プロセスパラメータ(特に温度およびIPTG濃度)を決定することであった。
プロセスパラメータ：
【０２１８】
【表２】
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【０２１９】
ある適切なスキームは、次であることが見出されている：IPTG濃度は0.5 mMであり、誘導における温度は25℃よりも低い。全培養時間は、増殖、誘導およびタンパク質産生を含めて14〜18時間の間である。全培養時間は、培養の生育に依存する。発酵槽での開始のOD600は、接種培養でのODから計算されるように、一般的に0.1〜0.3 (前培養において2〜6)である。培養の誘導は、OD600 = 20 ± 1〜2または接種後、9〜11時間で行う。次いで、タンパク質産生は、3〜5時間で起こる。
【０２２０】
代わりに：TNFα異型の発現は、低温培養の利点を享受して異型タンパク質の封入体への細胞内沈殿を避けることにより達成される。所望のODまでの培養の生育は、最適生育温度(37℃)から、より低い誘導温度(25℃)まで温度を変化させることによる細胞への「ショック」を避けるために、実際の誘導と同じ温度で行われる。この方法を用いることにより、細胞に課す圧力のみがIPTGによる実際の誘導であることと考えられている−いずれにしても、この方法は、可溶性発現産物のかなり向上された収率を、最近提供している。小さい一晩培養を作製し、1日前に、大きい1L LB培地を調製することにより、大きいLB培養での物質の産生は、約9時間で仕上げることができ、一方、実際の誘導期間は一晩(16〜20時間で)で行われる。したがって、好ましい方法は、次のように記載される：TNFα異型の発現は、1L LB培地を含む2×2Lの邪魔板付き振とうフラスコ中で行い、上記の方法にそれぞれ、細胞(BL21 STAR)を25℃においてOD436が0.7になるまで培養し、その後、細胞を1mM IPTGで誘導し、そして20時間(まだ25℃において)タンパク質を産生するのを許容する修飾のみを行う。
【０２２１】
実施例16
選択アッセイ
ポリクローナルELISAとともに直接受容体ELISA、ならびにKD-4およびWehi細胞を用いる細胞毒性アッセイを、スクリーニングの最初のラインアッセイとして用い、続いて精製を行う。TNFα異型に対して産生された抗体は、受容体および細胞毒性アッセイの両方においてwtTNFαの結合を阻害するのに用い、抗体の質を測定する。
【０２２２】
実施例17
精製手順
この実施例においては、TNFα異型の一つ(TNF37)の組換え産生およびそれに続く精製を詳細に記載する。しかしながら、精製手順は本発明による好ましいものであり、本発明のその他のTNFα異型についても(各異型について適切なわずかな調整とともに)用いることができる。
LB-カナマイシン平板(1.5 %アガーを含む60 mgカナマイシン/L LB培地)からのイー・コリ株BL21 STAR/TNF37コロニーを、LB培地(60 mgカナマイシン/L LB) 5 mlに再懸濁し、ニュー・ブラウンシュヴァイク(New Braunswick)振とう器で220 RPMで振とうしながら37℃において一晩(16時間)培養する。
【０２２３】
この培養の2×2 mlを、2Lの邪魔板付き振とうフラスコ中の2×1 L LB (60 mgカナマイシン/L)に移し、細胞を、220 RPMにてニュー・ブラウンシュヴァイク振とう器において、OD436= 0.6〜0.8まで生育するのを許容する。この工程を、37℃および25℃の例証的な温度で行うが、温度は各培養について最適化することができる。
【０２２４】
1 M IPTG 1 mlを各フラスコに添加し、細胞の生育を16〜20時間許容する。誘導前に、それが既に培養温度でない場合に、温度を25℃に調整する。
細胞を、Sorvall遠心分離機内のSLA-3000ヘッドを用いて、5000 RPM、15分間の遠心分離により、遠心管(500 ml)中に回収する。
【０２２５】
細胞を、500 mlの予め秤量した遠心管に、0.9 % NaClを用いて移し、前と同じように遠心分離により細胞を回収する。
上清を捨て、遠心管を秤量して細胞重量(7〜11グラムであるはずである)を測定する。
50 mM Na2HPO4、pH = 7.0 200 mlを添加する(細胞を再懸濁する場合、それらは直接用いるべきであり、そうでなければ凍結可能である)。
【０２２６】
細胞破砕、遠心分離およびろ過
細胞の機械的破砕は、酵素的破砕に比べて、効率、確実性および精製の次の工程において必要ないずれの緩衝液をも選択できることの点で、いくつかの利点をもたらす。APV-1000を、使用前にサンプルチャンバーに氷水を添加することにより、操作の間じゅう冷却に保ち、サンプルの2の通過の間に機械に氷水を通す。遠心分離およびろ過は、タンパク質のクロマトグラフィーによる分離に先立って、溶液からいずれの粒子または凝集物の除去を供給する。細胞破砕およびHA-クロマトグラフィーは、クロマトグラフィー工程におけるこれらからの分離の結果として、これが見かけのプロテアーゼ活性を最少にするので、同日に行うべきである。破砕、遠心分離、およびろ過の手順は、次の通りである：
【０２２７】
注意して再懸濁した細胞材料を、細胞破砕器(APV-1000)に移す。細胞懸濁物を、700バールの背圧を用いて、破砕器に注意して2回 (各通過後に氷上で冷却し、通過の間にAPV-1000に氷水を通過させる)通過させる(溶液は、この時点で澄んでいるはずである)。
破砕された細胞を500 mlの遠心管に移し、細胞を、SLA-3000ヘッドを用いてSorvall遠心分離機で45分間、10000 RPMで回転させる。
抽出物(約225 ml)を、0.22μmフィルターに通す。
【０２２８】
ヒドロキシアパタイト(HA)クロマトグラフィー
ヒドロキシアパタイトBio-Gel HTPゲル(BIO-RAD；カタログ# 130-0420)は、さもなければ他の方法により分離できない、モノクローナル抗体のようなタンパク質およびその他のタンパク質の分離における独特の道具としてそれ自身が立証されている、リン酸カルシウムの結晶の形態である。しかしながら、我々の経験においては、材料の流動特性は、2 ml/分を超える流れは、圧力を許容できない高いレベルに上昇させる意味において、多少重大である。また、材料は、製造業者により推奨されるように水酸化ナトリウムで再生する試みを行った場合に、数回崩壊していた。
【０２２９】
緩衝液およびカラム
緩衝液A + Bのストック：1 M Na2HPO4 × 2H2O、pH = 7.0 (pHを7にHClで調整)。ストックの希釈から作った緩衝液A+B。
緩衝液A：50 mM Na2HPO4 × 2H2O、pH = 7.0
緩衝液B：0.3 M Na2HPO4 × 2H2O、pH = 7.0
【０２３０】
ヒドロキシアパタイトBio-Gel HTPゲル(BIO-RAD；カタログ# 130-0420)の緩衝液A中の懸濁液、およびXK 26/40 (Amersham Biosciences)カラムを用いて、約50〜60 mlにパックしたカラム。
【０２３１】
クロマトグラフィープログラム
パージシステム  30 ml/分の流れで20 ml。
平衡化：2 ml/分の流れで緩衝液Aを4 CV。
2 ml/分の流れでポンプ(BioCadの入口F)を通してサンプルをロード(管内のサンプルが必要な場合、約225+5-10 ml)。
2 ml/分の流れで緩衝液A 1.5 CVでカラムを洗浄。
溶出：2 ml/分の流れで0%から100%までの緩衝液B 4 CVの勾配でタンパク質を溶出。
2 ml/分の流れで緩衝液B 2 CVでカラムを洗浄。
2 ml/分の流れで緩衝液A 4 CVでカラムを再平衡化。
フラクションを選択し、プールし、15×容量の20 mM Tris-HCl、0.075 M NaCl、pH 8.0に対して4℃にて一晩透析。
【０２３２】
HAクロマトグラフィー後のTNF37含有フラクションの選択
HAクロマトグラフィー溶出フラクションプロフィールは、基本的に「通り抜け(run through)」フラクションおよびいくつかのピークに分離できる1つの溶出ピークからなる。TNF37含有フラクションは、TNF37を含有するピークを直接同定することはできないので、全てのピークのクマシー染色ゲルをもとに選択されなければならない。しかしながら、その後の精製工程の結果として、この時点でのフラクションの選択は、ほとんど重大ではなく、あとの手順で夾雑物を除去することが可能である。つまり、フラクションのあまり控えめでない選択が、異型の最大限の収率を確実にする。
【０２３３】
最初に、いずれかのTNF37について、「ドットブロット」で「通り抜け」を調べた。これは、異型のかなりの部分がカラムに結合しなかったことを理論的に示すであろう、陽性の結果を与えた。しかしながら、「通り抜け」を非常に効果的なSP-セファロースカチオン交換クロマトグラフィー(次工程参照)に付し、フラクションをクマシー染色ゲルで分析すると、それらはいずれの検出可能なTNF37異型をも含んでおらず、「ドットブロット」における間違った陽性反応、またはSP-セファロースに全く違って結合する異型のフラクションを示す。
【０２３４】
SP-セファロースカチオン交換クロマトグラフィー
SP-セファロースは、7.8のwtTNFαのpIに比べてより高い、9.4の異型の計算されたpIの結果として選択された塩基性カチオン交換工程である。このpIの増加は、PADREエピトープを介して導入された2つのリシンの結果である。このクロマトグラフィーは、TNF37異型について非常に効率的で速く、そしてTNFαのその他のループ異型の多くに有用であることが期待される。
【０２３５】
アプライされたサンプルは、8 mS/cm未満の導電率をもつべきであり、pHは、SP-セファロースクロマトグラフィーを続ける前に、少なくとも7.7であるべきである。なぜなら、我々の経験では、これにおける変動はタンパク質の結合特性をその時々で変化させるからである。
【０２３６】
緩衝液およびカラム
緩衝液A+Bのストック：1 M Tris-HCl。pH = 8.0。
緩衝液A：20 mM Tris-HCl、0.075 M NaCl、pH = 8.0。
緩衝液B：20 mM Tris-HCl、1 M NaCl、pH = 8.0。
SP-セファロースFF (アマシャムバイオサイエンス：カタログ# 17-0729-01)の緩衝液A 中の懸濁液と、XK 26/40 (アマシャムバイオサイエンス)カラムを用いて、約60 mlにパックされたカラム。
【０２３７】
クロマトグラフィープログラム
パージシステム  30 ml/分の流れで20 ml。
平衡化：4 ml/分の流れで緩衝液Aを4 CV。
4 ml/分の流れでポンプ(BioCadの入口F)を通してサンプルをロード(管内のサンプルが必要な場合、サンプル+10 ml)。
4 ml/分の流れで緩衝液A 1.5 CVでカラムを洗浄。
溶出：4 ml/分の流れで0%から100%までの緩衝液B 4 CVの勾配でタンパク質を溶出。
4 ml/分の流れで緩衝液B 2 CVでカラムを洗浄。
4 ml/分の流れで緩衝液A 4 CVでカラムを再平衡化。
フラクションを選択し、プールし、15×容量の20 mM Tris-HCl、0.075 M NaCl、pH 8.0に対して4℃にて一晩透析。
【０２３８】
SPセファロースクロマトグラフィー後の、TNF37含有フラクションの選択
プロフィールは、基本的に、「通り抜け」フラクションと、いくつかのタンパク質含有ピークとからなる。しかしながら、2つのピークが、ある夾雑物とともに異型を含む。この時点において、ピーク2の右側にある多くのフラクションを含まないことが重要である。なぜなら、我々の経験では、これが、その後のクロマトグラフィー工程では容易に除去されない多くの夾雑物を含有するからである。
【０２３９】
Q-セファロースアニオン交換クロマトグラフィー
Q-セファロースは、HA-クロマトグラフィーおよびSP-セファロースを含むTNF37の精製に続く、高い再現性を持つ、主要な夾雑タンパク質の除去のために選択された、塩基性アニオン交換工程である。TNF37異型自体はカラムに結合しないが、主要な未知の夾雑物は結合する。しかしながら、夾雑物を避ける方法で、SP-セファロース工程ですでに控えめな様式でフラクションを選択することが可能である。しかしながら、これは、手順においてQ-セファロースを用いる場合に比べてTNF37異型の収率が劣っており、そして他の少量の夾雑物もこの工程で除去されるので、全体の手順においてこれを含むことが好ましい。結果として、異型37の精製において、Q-セファロース工程は重要であり、よりよい最終産物を、高い収率で与える。
【０２４０】
緩衝液およびカラム
緩衝液A+Bのストック：1 M Tris-HCl。pH = 8.0。
緩衝液A：20 mM Tris-HCl、0.075 M NaCl、pH = 8.0。
緩衝液B：20 mM Tris-HCl、1 M NaCl、pH = 8.0。
Q-セファロースFF (アマシャムバイオサイエンス：カタログ# 17-0510-01)の緩衝液A 中の懸濁液と、XK 26/40 (アマシャムバイオサイエンス)カラムを用いて、約50〜60 mlにパックされたカラム。
【０２４１】
クロマトグラフィープログラム
パージシステム  30 ml/分の流れで20 ml。
平衡化：4 ml/分の流れで緩衝液Aを4 CV。
2 ml/分の流れでポンプ(BioCadの入口F)を通してサンプルをロード(管内のサンプルが必要な場合、サンプル+10 ml)。
4 ml/分の流れで緩衝液A 3 CVでカラムを洗浄。
溶出：4 ml/分の流れで100%の緩衝液B 2 CVで、残存のタンパク質を溶出。
4 ml/分の流れで緩衝液A 4 CVでカラムを再平衡化。
フラクションを選択し、プールし、直接SP-セファロースカラムにアプライ。
【０２４２】
溶出プロフィールは、基本的に「通り抜け」フラクション、およびいくつかのタンパク含有ピークからなる。「通り抜け」フラクションは、時として、全てTNF37異型を含む、いくつかのきれいに分割されたピークに分配され得るので全てプールされる。TNF37のこの不均質性は、見かけのタンパク質分解性の分解の問題が解決された場合に、おそらく解決されるであろう。
【０２４３】
実施例18
免疫化研究
材料：
食塩水(滅菌水中に0.9% NaCl、Fresenius Kabi Norge AS、Norway)
完全フロイントアジュバント(シグマ、F-5881、39H8926)
不完全フロイントアジュバント(シグマ、F-5506、60K8937)
アルヒドロゲル(Alhydrogel) 2% [10 mg Al/ml](Brenntag Biosector、Batch 96 (3176))
アジュフォス(Adjuphos) [5 mg Al/ml] (Brenntag Biosector、Batch 2 (8937))
野生型ヒトTNF (インビトロジェン、カタログno:10062-024)
KYM-1D4：A. Meager (A. Meager、J. Immunol. Methods 1991、144:141〜143)より提供
WEHI 164 クローン13: T. Espevik (T. EspevikおよびJ. Nissen-Myer、J. Immunol. Methods 1986、95:99〜105)より提供
テトラゾリウム塩(MTS、CellTiter 96 Aqueous one solution; プロメガ、G3581)
回転バー(Rotating bar) (Rotamix、Heto、Denmark)
ボルテックス(OLE DICH instrumentmakers ApS、Denmark)
【０２４４】
処方／アジュバントの選択
精製されたTNFα異型タンパク質(20 mM Tris-HCl、0.075 M NaCl、pH 8.0中)を、食塩水(0.9% NaCl)で0.5 mg/mlに希釈し、一回分にまとめ(375μl/バイアル)、免疫化に用いるまで−20℃に保存する。
【０２４５】
各TNFα異型について、免疫化を2つのアジュバントを用いて行う：1)完全フロイントアジュバント(CFA、第一の免疫化のため)、および不完全フロイントアジュバント(IFA、ブースト免疫化のため)、ならびに2)アルヒドロゲルまたはアジュフォス（それぞれ、最新式の水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムアジュバント）−これらを、第一の注射およびブースト注射の両方に用いる。
【０２４６】
第一の免疫化の前に、TNF異型のアジュバントとしてのアルヒドロゲルまたはアジュフォスのいずれかの選択の決定を行う。TNF異型を吸着する能力が最もよいアジュバントを、免疫化実験においてさらに用いるために選択する。TNFα異型の2つのアリコートを、2つのバイアル中で、同じ容量のアルヒドロゲルおよびアジュフォスと混合する。バイアルを、回転バー上で室温にて30分間、静かに攪拌する。次いで、バイアルを13000 gで15分間遠心分離し、上清を勾配(4〜12%) SDSゲル上で、可溶性TNF異型の含量について試験する。よって、最も少ない遊離の異型(すなわち、より多くの異型はアルミニウム粒子に結合している)を含むアジュバント/異型のアリコートが、最もよいアジュバントとして選択される。
【０２４７】
抗原／アジュバントエマルゲート(emulgate)の作製：
次の手順を通して、CFA/IFAエマルゲートを作製する：
TNFα異型[0.5 mg/ml]の入ったバイアルを融かし、10 mlの滅菌バイアルに移し、等容量のCFAまたはIFAと混合する。次いで、バイアルをさらにボルテックスで3300 rpmで、20℃において30分間混合する。
【０２４８】
次の手順を通して、アルヒドロゲル/アジュフォスエマルゲートを作製する：
アルヒドロゲル/アジュフォスを、食塩水で1.4 mg Al/mlに希釈する。TNFα異型[0.5 mg/ml]の入ったバイアルを融かし、10 mlの滅菌バイアルに移し、等容量のアルヒドロゲル[1.4 mg Al/ml]またはアジュフォス[1.4 mg Al/ml]と混合する。次いで、バイアルをさらに回転バーで20℃において30分間混合する。
【０２４９】
動物モデルの選択
6〜8週齢のBalb/Ca雌マウスを、TNFα異型で繰返し免疫化する。異なった間隔において血液サンプルを採取し、単離した血清を、抗wtTNFα抗体力価について調べる。マウスはTaconic Farms, Inc. Acquires M&B A/S、Denmarkから注文する。マウスは、実験の開始1週間前から、ファーメクサの動物施設に収容する。
【０２５０】
免疫化スキームおよび投与量
10+10のマウスの組を、それぞれCFA/IFAおよびアルヒドロゲル/アジュフォス中の各TNFα異型で免疫化する。20+20マウスを、野生型TNFαでの免疫化に用いる。
第一の免疫化において、アジュバント中のタンパク質50μgを皮下注射する。全てのマウスは、第一の免疫化後2、6および10週に、アジュバント中のタンパク質25μgでの付加的なブースター免疫を皮下に受ける。
第一の免疫化の直前、および各ブースター免疫化の1週間後に、血液サンプルを採取する。
【０２５１】
行うアッセイ
WEHI 164 クローン13-またはKYM-1D4-細胞を用いる細胞毒性バイオアッセイ：このアッセイは、本発明のTNFα異型の毒性を測定するものである。細胞を、TNFα異型の滴定された量の存在下で48時間培養し、そして細胞死を、生細胞により着色したフォルマザン産物に生還元される(bioreduced)テトラゾリウム塩(MTS)の添加により測定する。TNFα異型の細胞毒性を、ヒト野生型TNFαのものと比較する。
【０２５２】
WEHI 164クローン13-またはKYM-1D4-細胞を用いる細胞毒性−阻害バイオアッセイ：このアッセイは、TNFαで免疫化されたマウスで産生された抗血清の、野生型TNFαの細胞毒性効果を中和する能力を調べるのに用いられる。抗血清の滴定された量、および抗血清の欠乏時に細胞の50％で細胞死を誘導するのに充分な野生型ヒトTNFαの一定濃度の存在下で、細胞を48時間培養する。細胞死は、上述したようにMTSにより決定される。TNFα異型で免疫化されたマウスからの血清の中和能力を、ヒト野生型TNFαで免疫化されたマウスから得られる血清と比較する。
【０２５３】
インビトロの研究
WEHI 164 クローン13-またはKYM-1D4-細胞を用いる細胞毒性バイオアッセイ：WEHI 164クローン13-またはKYM-1D4-細胞を用いる細胞毒性−阻害バイオアッセイ。
【０２５４】
最良の免疫原性構築物の選択の基準
TNFα異型は、最小限の細胞毒性を表示すべきである。TNFα異型でのマウスの免疫化は、WEHI-またはKYM-1D4細胞においてヒト野生型TNFαで媒介される細胞毒性を中和する能力が、ヒト野生型TNFαで免疫化されたマウスから得られる血清よりも良いか、または等しい抗血清を産生するべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】図1は、p2ZOP2f昆虫細胞発現ベクターを示す。
【図１】
2005518194.tif 000008
【配列表】
2005518194000001.app
【国際調査報告】
2005518194.tif 000009
2005518194.tif 000010
2005518194.tif 000011
2005518194.tif 000012
2005518194.tif 000013
2005518194.tif 000014
2005518194.tif 000015
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