(57)【要約】本発明は相互作用の程度に比例する検出パラメーターを提供することにより、インビトロシステムにおけるエストロゲン受容体と転写活性化蛋白質の直接相互作用を測定するための方法を提供する。この転写活性化蛋白質はｃ−Ｒｅｌである。本発明の１態様では、前記測定に用いる酵母２ハイブリッドアッセイを提供する。エストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させる化合物をシステムに加えることにより、システムにおけるエストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させるための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
相互作用の程度に比例する検出パラメーターを提供することにより、インビトロシステムにおけるエストロゲン受容体と転写活性化蛋白質の直接相互作用を測定するための方法であって、転写活性化蛋白質がｃ−Ｒｅｌであることを特徴とする前記方法。
【請求項２】
方法が、酵母２ハイブリッドアッセイであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法が、システム中の多数の化合物の各々を共存させて請求項１又は２に記載の方法を、場合により平行して、反復実施し、相互作用を強化する化合物を選択することにより、多数の化合物から骨粗鬆症の治療に有効な化合物を選択するために実施されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
方法が、骨粗鬆症の動物モデルにおける相互作用を強化する化合物を試験する段階を更に含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。。
【請求項５】
システムにおけるエストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させるための方法であって、エストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させる化合物をシステムに加えることを含む前記方法。
【請求項６】
インビトロシステムにおけるエストロゲン受容体と転写活性化蛋白質の直接相互作用を変化させるための方法であって、エストロゲン受容体と転写活性化蛋白質の直接相互作用を変化させる化合物をシステムに加えることを含み、転写活性化蛋白質がｃ−Ｒｅｌであることを特徴とする前記方法。
【請求項７】
化合物が、ＥＲ転写活性に及ぼす化合物の影響に比較して、相互作用を選択的に変化させることを特徴とする請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
相互作用を変化させるための治療処置に使用する医薬組成物の製造における請求項５から７のいずれか一項に記載の方法に適した化合物の使用。
【請求項９】
処置が、骨粗鬆症に使用されることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
エストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させる化合物を含有する請求項５又は６に記載の方法で使用するための医薬組成物。
【請求項１１】
ＥＲ転写活性に及ぼす化合物の影響に比較してエストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を選択的に変化させる化合物を含有する請求項５から７のいずれか一項に記載の方法で使用するための医薬組成物。
【請求項１２】
エストロゲン受容体が、ＥＲα又はＥＲβであることを特徴とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法又は使用又は組成物。
【請求項１３】
ＥＲ受容体が、ＥＲαであることを特徴とする請求項１２に記載の方法又は使用又は組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は相互作用の程度に比例する検出パラメーターを提供することにより、インビトロシステムにおけるエストロゲン受容体（ＥＲ）と転写活性化蛋白質の直接相互作用を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
数種の重要な医薬化合物は転写因子に作用することにより生物でその治療効果を有する。特に、この作用メカニズムは、ある種の避妊及び抗炎症化合物等の、ステロイドホルモン作用を模倣することにより作用する医薬により使用されている。転写因子は生物の細胞において遺伝ＤＮＡ材料の読取りを制御する蛋白質である。この制御メカニズムが生体細胞の多くの性質を決定する。細胞における遺伝子発現の制御は永久的な場合と一過性の場合がある。一過性変化は細胞の環境変化に応答する変化である。細胞の環境に他の細胞表面及び他の分子が存在すると、細胞へのシグナル源となり、その機能が変化する。転写因子は細胞に及ぼす外的影響のメディエーターとして主に機能する。この意味では、転写因子はシグナル伝達メカニズムに含まれる。
【０００３】
周知転写因子はエストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール等のステロイドホルモンの受容体等の核内受容体である。別の転写因子ファミリーは核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）転写因子ファミリーと呼ばれる。ＮＦ−κＢファミリーの転写因子はＲｅｌＡ（＝ｐ６５）、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、Ｐ５０及びＰ５２からなる群の２個のサブユニットから構成される二量体である。ＮＦ−κＢの動員によるシグナル伝達システムは阻害蛋白質ＩκＢを介して細胞の外部からのサイトカイン分子に応答することにより機能する。ＮＦ−κＢの阻害剤であるＩκＢはＮＦ−κＢと共に不活性化複合体を形成するが、サイトカインへの細胞暴露に応答してリン酸化によりこれらの複合体からＩκＢが酵素作用により除去される。ＩκＢ／ＮＦ−κＢ複合体からこの阻害因子が酵素作用により除去されると、ＮＦ−κＢはゲノムに作用できるようになる。別の転写因子ファミリーであるｃ／ＥＢＰ−βについては本明細書で後述する。
【０００４】
転写因子は多重サブユニットからなる複合体として作用する。これらの複合体はゲノム内の応答性エレメントと呼ばれるドメインに対して親和性をもつ。ＤＮＡ鎖の１個以上の応答性エレメントは転写因子と結合してゲノムのより大きな部分であるプロモーター領域と相互作用する位置を形成する。転写因子とＤＮＡの応答性エレメント及びプロモーター領域の複合体形成はＤＮＡ上でプロモーターの下流に連結した遺伝子の転写速度を決定する。多数の転写遺伝子が二量体としてＤＮＡに結合していることに注目すべきである。従って、核内ステロイドホルモン受容体は通常、２個の同一又は密接に関連するサブユニットから構成される。現代の生化学理論では、転写因子は相互作用をもたない別々の分類に属するという認識はもはや時代遅れであり、転写因子は転写因子分類間で相互作用するという認識に代わっている。例えば、グルココルチコイドステロイド受容体単量体（ＧＲ）とＲｅｌＡの選択的結合相互作用が立証されている（Ｈａｒｎｉｓｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４１：３４０３−３４１１，２０００）。アンドロゲン受容体（ＡＲ）とＲｅｌＡの高親和性結合も発見された（Ｐａｎｅｔ−Ｒａｙｍｏｎｄら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，１６７，ｐｐ  １３９−１５０，２０００）。エストロゲン受容体α単量体はｃ−Ｊｕｎと複合体を形成することが示されている（Ｔｅｙｓｓｉｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６  ｐｐ  ３６３６１−３６３６９，２００１）。このような複合体は転写因子として機能する複合体の構成ブロックであるか、あるいは、所定量の利用可能な転写因子を吸収することにより転写因子を不活性複合体に封入すると考えられている（Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７５２−７５６，１９９４；Ｋａｌｋｈｏｖｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６２１７−６２２４，１９９６）。
【０００５】
シグナル伝達メカニズムは転写因子サブユニット間の上記直接蛋白質−蛋白質相互作用により相互影響があるので、このような相互影響を表すものとしてクロストーク及び転写抑制なる用語が使用されている。転写抑制とはシグナル伝達経路間の負の影響を意味する。本発明はより詳細には、エストロゲン受容体ファミリーのメンバーとＮＦ−κＢ蛋白質の相互作用及び医薬の製造における前記相互作用の使用に関する。
【０００６】
ＥＲによるＮＦ−κＢシグナル伝達の効率的抑制は数件の研究に示されている（Ｑｕａｅｄａｃｋｅｒｓら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：１１５６−１１６６，２００１）。ＮＦ−κＢシグナル伝達に及ぼすＥＲの転写活性化及び転写抑制効果の基礎となるメカニズムは不明である。核内受容体とＮＦ−κＢが会合して大きな多量体複合体となるのではないかと考えられる。このような複合体は核内受容体、ＮＦ−κＢ及び数個の他の核内（コ）ファクターを含むが、依然としてＤＮＡと結合することができる。核内受容体とＮＦ−κＢシグナル伝達経路の相互作用の概念の１例を図１に示す。
【０００７】
【表１】
2005525108.tif 000002
【０００８】
（図１）ＥＲとＮＦ−κＢ蛋白質による相互転写抑制の概念図。ＧＲやＰＰＡＲγ等の他の核内受容体についても、ＮＦ−κＢとの同様の機能的相互作用が記載されている。ＮＦ−κＢと核内受容体から形成される複合体が単量体から構成されるのかあるいは二量体から構成されるのかは現時点ではまだ不明である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は相互作用の程度に比例する検出パラメーターを提供することにより、インビトロシステムにおけるエストロゲン受容体（ＥＲ）と転写活性化蛋白質の直接相互作用を測定するための方法であって、転写活性化蛋白質がｃ−Ｒｅｌであることを特徴とする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来は、ＥＲとある種のＮＦ−κＢとの弱い蛋白質−蛋白質相互作用しか報告されておらず（Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９７１−９，１９９５；Ｓｐｅｉｒ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７：１００６−１０１１，２０００）、この相互作用はＥＲリガンドの存在に非依存性であった。これに対して、本明細書に記載するエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用はエストロゲン受容体と結合することによってエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を誘導することができる化合物の存在に依存する。
【００１１】
ＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用は心臓血管系、骨及び中枢神経系（ＣＮＳ）に及ぼすエストロゲンの所定効果に関与しているので、エストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの相互作用を測定すると共にこの相互作用に及ぼす化合物の影響を測定することが有用である。これらの組織はエストロゲンが医療処置で有益な効果を示す三大組織である。更に、乳癌の進行におけるＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用の役割も示唆されており（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：１６１−１６７，１９９４；Ｎａｋｓｈａｔｒｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：３６２９−３６３９，１９９７）、ＮＦ−κＢ誘導遺伝子は悪性腫瘍や化学療法耐性に役割を果たすと考えられる。
【００１２】
ノックアウト表現型はＮＦ−κＢ型の一方のみに関連する明白な機能を示さない（Ａｔｔａｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ８：９３−１０１，１９９７）が、ｐ５０とｐ５２を欠失する二重ノックアウトマウスは骨粗鬆症となり、骨代謝におけるＮＦ−κＢの役割を裏付けている（Ｉｏｔｓｏｖａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１２８５−１２８９，１９９７）。
【００１３】
骨では、ＮＦ−κＢ蛋白質は炎症性遺伝子（例えばサイトカイン）や細胞接着分子の調節に重要な役割を果たす。どちらの型の調節分子も骨ホメオスタシスにおける重要な共同因子である。特に、Ｉｌ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦα等の特定サイトカインは破骨細胞前駆細胞と成熟破骨細胞を刺激して骨吸収を増進する（Ｍａｎｏｌａｇａｓ，Ｂｏｎｅ  １７：６３Ｓ−６７Ｓ，１９９５）。エストロゲンはこのようなサイトカインの産生を阻害することにより骨量の維持に大きな役割を果たす（Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７５２−７５６，１９９４；Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９７１−９，１９９５）。骨代謝におけるＮＦ−κＢの重要性は上記のようなノックアウト試験により実証されている（Ｉｏｔｓｏｖａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１２８５−１２８９，１９９７）。
【００１４】
ＣＮＳでは、数件の報告が種々のプロセスにおけるＮＦ−κＢの関与を示しているが、その厳密な役割はまだ不明である。シナプス可塑性、長期記憶及びアルツハイマー病に関連する因子がＮＦ−κＢの大脳特異的アクチベーターとして同定されている（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ａｎｄ  Ｋａｒｌｔｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２５２−２５８，１９９７；Ｇｒｉｌｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５００２−１５００７，１９９６）。更に、ＮＦ−κＢの阻害はニューロン細胞の生存に関連付けられている（Ｍａｇｇｉｒｗａｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７４：５２７−５３９，２０００，Ｉｒｖｉｎｇら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８８：４５−４８，２０００）。更に、ＮＲ／ＮＦ−κＢクロストークと鬱病治療の有効な潜在的候補であるセロトニン系の関連付けも行われている（Ｗｉｓｓｉｎｋら，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５（４）：５４３−５２，２００１）。ＣＶでは、エストロゲンはアテローム性動脈硬化症の発症を抑えると考えられる。アテローム性動脈硬化症の発症の最初期イベントの１つは単球細胞の血管壁浸潤である。重要な段階の１つは循環からの単球の動員である。この動員は数段階からなる。単球と内皮の初期相互作用は一過性であると思われ、血管壁に沿って単球のローリングが生じる。ローリングする単球は次に内皮により産生された局所分泌因子により活性化され、その結果、血管壁に固定し、強く接着する。最後に、単球は内皮を移動する。初期ローリング相互作用はセレクチン（例えばＥ−セレクチン）により媒介され、強い接着と漏出は単球表面のインテグリンと内皮細胞により発現される免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー（例えばＩＣＡＭ，ＶＣＡＭ）の相互作用により媒介されると思われる。Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭの発現はＮＦ−κＢシグナル伝達を介するサイトカインによる全３種の遺伝子の転写活性化の結果として強化される。従って、このＮＦ−κＢにより誘導される細胞接着分子の発現を妨害することにより、アテローム性動脈硬化症をもたらす単球浸潤を緩和することができる。血管壁におけるｃ−Ｒｅｌの発現はバルーニングに応答して明白に増加し（Ｌａｎｄｒｙら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１０８５−１０９５，１９９７）、血管形質転換におけるｃ−Ｒｅｌの役割を示唆している。
【００１５】
ｃ−Ｒｅｌの他の興味深い機能はプログラム細胞死の調節におけるその機能と、マクロファージ活性化におけるその役割である。ｃ−Ｒｅｌの過剰発現は骨髄細胞にアポトーシスを誘導するが、フィブロブラストでは細胞死に対して保護作用がある（Ａｂｂａｄｉｅら，Ｃｅｌｌ  ７５：８９９−９１２，１９９３）。ｃ−Ｒｅｌ欠損マウスに由来するマクロファージは炎症性サイトカインを正常レベルよりも高レベルで産生する（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：７０９９−７１０７，１９９６）。
【００１６】
文献に見られる情報に関する限り、ｃ−ＲｅｌがＲｅｌＡよりもＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制に重要であるらしいとする概念は新しい。従って、この概念はＥＲ／ｃ−Ｒｅｌ会合を選択的に誘導する化合物の選択に絶好の機会を与える。本発明はこのような化合物を同定するためのアッセイを提供する。本発明の１特定態様は酵母２ハイブリッドアッセイである。
【００１７】
本発明のこのような方法によると、システムに多数の化合物の各々を共存させて本発明の上記方法を、反復実施し、場合により平行し、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を強化する化合物を選択することにより、多数の化合物から骨粗鬆症の治療に有効な化合物を選択するための方法も提供される。
【００１８】
エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を強化する化合物の選択は動物モデル、好ましくは骨粗鬆症用動物モデルで更に改善することができる。
【００１９】
動物モデルとしては、インビボ骨粗鬆症モデルで骨量減少を予防するか又は骨形成を刺激する能力をモニターする方法が挙げられる。このモデルでは、．Ｅｄｅｒｖｅｅｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅｄｚ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１４（１１）：１９６３−７０，１９９９に記載されているように、３カ月齢卵巣切除ラットに試験化合物を４週間経口投与する。卵巣切除の直後に種々の用量の試験化合物の４週間経口投与を開始する。４週間投与後に大腿骨遠位骨幹端の小柱骨ミネラル密度（ＴＢＭＤ，ｍｇ／ｃｍ３で表す）をｐＱＣＴ（末梢型定量的コンピューター断層装置；ＸＣＴ  ９６０Ａ，Ｓｔｒａｔｅｃ，Ｂｉｒｋｅｎｆｅｌｄ，ドイツ）により測定する。解像度０．１４８ｘ０．１４８ｍｍで厚さ１ｍｍのスライスを含むスキャンを大腿骨の遠端から５ｍｍで行う。遠位大腿骨における小柱骨密度測定のアッセイ内及びアッセイ間変動は３％である。ＸＣＴ−９６０Ａはアクリルプラスチックに埋込んだヒドロキシアパタイトの標準で校正する。更に、皮質骨ミネラル密度を大腿骨の中間部位で測定することができる。
【００２０】
システムにおけるエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を誘導する化合物が提供されると、エストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させる化合物を加えることにより、システムにおける相互作用を変化させるための方法が提供される。本発明のこの側面のより特定的な態様では、化合物をシステムに加えることによりシステムにおける相互作用を変化させるための方法が、インビトロ培養培地をシステムとして選択することにより得られる。ＥＲ転写活性に及ぼす化合物の影響に比較して相互作用を選択的に変化させる化合物をシステムに加えることによりエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を変化させるためにこれらの方法を使用するのが最も好ましい。
【００２１】
前の段落で定義した方法に適切な化合物はエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を変化させるための治療処置に使用する医薬組成物の製造に使用することができる。このような治療処置は例えば骨粗鬆症の処置が好ましい。
【００２２】
本明細書では、用語は以下の意味をもつ。
【００２３】
２種の蛋白質間の直接相互作用とは蛋白質の天然環境に適合可能な状況下で化学親和性に基づく物理的接触を意味する。但し、これはこれらの蛋白質間の結合の増減だけを意味するのではなく、転写活性を阻止又は誘導するのに多少なりとも有効となるような結合複合体の二次構造の修飾も意味する。
【００２４】
転写活性化蛋白質とは遺伝子発現に転写活性化活性をもつ転写因子と呼ばれる蛋白質一般を意味する。転写活性化蛋白質はコファクター（コアクチベーター、コリプレッサー等）や転写機構に属する他の（転写）因子と相互作用し、これらと共に転写開始を調節する複合体を形成する。
【００２５】
エストロゲン受容体（ＥＲ）転写活性は、活性化ＥＲ二量体とゲノムの遺伝子調節部分である特定ＥＲ応答性調節エレメント（ＥＲＥ）との直接相互作用により得られる、エストロゲン受容体の転写活性化活性である。ＥＲ二量体の活性化の結果として、これはコアクチベーター及び他のコファクター、（転写）因子と相互作用し、転写機構と複合体を形成して転写開始を活性化する。「調節エレメント」又は「プロモーター」とは細胞においてＲＮＡポリメラーゼと直接又は間接的に結合して下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ配列を意味する。調節エレメントの活性化をシグナル伝達することが可能な異種レポーター遺伝子にプロモーターを連結してもよい。このような構築物では、プロモーターは異種遺伝子からの転写を変化させる。適切なレポーター遺伝子は例えばルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ及び分泌型胎盤性アルカリホスファターゼである。
【００２６】
エストロゲン受容体（ＥＲ）は、天然ホルモン１７β−エストラジオールに結合し、核内受容体ファミリー、より特定的にはステロイド受容体サブファミリーに属する蛋白質である。核内受容体の命名法は記載されている（Ｌａｕｄｅｔ  Ｖ．，Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｊ．−Ａ．＆  Ｗａｈｌｉ，Ｗ．（１９９９）  Ｃｅｌｌ  ９７  １６１−１６３）。現在、ＥＲαとＥＲβの２種の密接に関連するエストロゲン受容体が知られている。エストロゲン受容体は、１７β−エストラジオールと結合し、エストロゲン受容体の機能的等価物であり、ｃ−Ｒｅｌとのその相互作用において指定生物機能を維持する変異体及び修飾蛋白質でもよい。「機能的等価物」とは指定分子と同一生物機能を発揮することができ、共通の主要構造特徴をもち、当分野で一般に利用可能な技術に基づいて当業者が代替手段として利用可能な分子を意味する。多くの場合には、このような等価物は配列データにより定義される蛋白質と９０％、９５％、９８％又は９９％のアミノ酸一致度をもつ蛋白質として定義される。当然のことながら、ｃ−Ｒｅｌとの結合におけるエストロゲン受容体等価物の機能又は逆にエストロゲン受容体との結合におけるｃ−Ｒｅｌ等価物の機能をもつことを前提として、このような定義はより具体的な定義として本発明の定義に含まれる。本明細書では一致度百分率は以下のように定義される。
一致度（％）＝（２種の配列間の一致残基数）／（整列配列長−配列の最適アラインメント後の全ギャップ長）。
【００２７】
最適アラインメントはマッチ数を最大にし、ギャップ数を最少にするＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３−４５３（１９７０））を使用して実施することができる。
【００２８】
エストロゲン受容体に密接に関連する他の受容体はＥＲ関連受容体（ＥＲＲ）ＥＲＲα、ＥＲＲβ及びＥＲＲγであるが、これらはＥＲＲと結合するリガンドが実証されていないので、本発明で使用するエストロゲン受容体の定義には含まれない。
【００２９】
エストロゲン受容体−α（ＥＲα）はＥＲα遺伝子の翻訳産物であるα型エストロゲン受容体をコードする蛋白質である。これは本発明の方法で使用するのに好ましい蛋白質である。
【００３０】
ｃ−Ｒｅｌはｃ−Ｒｅｌ遺伝子に由来する蛋白質産物である。ｃ−Ｒｅｌは、相同のＲｅｌドメインを有し、遺伝子調節に関与するＮＦ−κＢファミリーのメンバーのつであり（Ｌｉｏｕ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：４７７−４８７，１９９３）、限定されないが、ＮＦ−κＢ１、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢがある。ｃ−Ｒｅｌには、エストロゲン受容体との指定相互作用における生物機能を維持し、ｃ−Ｒｅｌ遺伝子にコードされる蛋白質であり、ｃ−Ｒｅｌ遺伝子の転写と翻訳の産物であるｃ−Ｒｅｌの他の等価物も含まれる。
【００３１】
インビトロシステムは細胞を培養する培養培地であり、このシステムが使用する読取りシステムにおいて最適増殖及び／又は最適応答が得られるように最適化したものである。細胞培養用培地の典型例はＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ又はＤＦである。これらの培地には、必ずしも必要ないが、多くの場合には増殖因子、血清、ビタミン、アミノ酸及び抗生物質等の付加因子を添加する。記載するインビトロシステムでは、ＥＲ−ｃＲｅｌ相互作用に及ぼす試験化合物の効果を試験するために１７β−エストラジオール又は試験化合物を培地に加える。
【００３２】
検出パラメーターはエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を測定するために使用される方法である。これは調節エレメントの活性化をシグナル伝達することが可能な異種レポーター遺伝子に融合したＮＦ−κＢ又はＥＲ応答性調節エレメントを含むプロモーターレポーター構築物の使用を含む。更に、直接相互作用はＥＲ及びｃ−Ｒｅｌと（酵母２ハイブリッドについて記載するように）β−ｇａｌの転写活性化又はＤＮＡ結合部分とのキメラ蛋白質を使用して測定することができ、ｇａｌレポーター構築物の誘導としてＥＲとｃ−Ｒｅｌとの直接相互作用を測定することができる。更に、他のプロモーター由来エレメントをレポーター遺伝子と併用してもよく、レポーター遺伝子が活性化されると、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの所望相互作用が可視化される。これはｃ−Ｒｅｌ又はエストロゲン受容体又はこのような遺伝子の蛋白質産物（例えばＩｌ−６又は他のサイトカイン）により発現を調節される遺伝子でもよい。より詳細には、具体的に相互作用に関すると最初に明示している場合には、パラメーターはエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用のインビトロ生物効果を意味し得る。
【００３３】
化合物による相互作用の強化とは、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの親和性を増加することによる強化すること又はエストロゲン受容体がｃ−Ｒｅｌと結合している複合体の効果を強化することを意味する。本発明の定義では理論に拘束されないが、強化化合物はエストロゲン受容体の二次構造を変化させ、この二次構造の変化によりｃ−Ｒｅｌとの有効な複合体に適正なコンホメーションが導入されると考えられる。
【００３４】
ＥＲ転写活性に及ぼす化合物の影響に比較して相互作用を選択的に変化させるとは、相互作用を変化させる化合物が選択システムに応じてＥＲ転写活性が観察される用量レベル又は濃度の２分の１以下の用量レベル又は濃度で作用することを意味する。
【００３５】
酵母２ハイブリッドアッセイは２種の蛋白質間の相互作用の程度を定量するための細胞法である。これは２種の試験蛋白質（この場合にはＥＲとｃ−Ｒｅｌ）とＧａｌ４の転写活性化又はＤＮＡ結合部分の融合蛋白質をコードする構築物を作製することにより実施される。ｇａｌの転写活性化又はＤＮＡ結合部分は単独ではｇａｌ４応答性β−ガラクトシダーゼレポーター構築物のレポーター活性を誘導することができない。２種の蛋白質の相互作用により、Ｇａｌ４の転写活性化又はＤＮＡ結合部分は極近接し、その結果、ｇａｌ応答性レポーターの誘導が生じる。より詳細には、本発明のこの態様では、エストロゲン受容体をＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合させ、ｃ−ＲｅｌをＧａｌ４の活性化ドメイン（ＡＤ）に融合させる。ＥＲ／Ｇａｌ４−ＤＢＤ融合蛋白質は酵母株でレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼの上流のＧａｌ４応答性エレメントと結合する。ＥＲとｃ−Ｒｅｌの相互作用は化合物依存性であるので、インビトロシステムの化合物濃度が増加するにつれて相互作用するＥＲ及びｃＲｅｌ分子の数は増し、飽和レベルに到達するまでβ−ガラクトシダーゼレポーター活性の増加として測定することができる。従って、β−ガラクトシダーゼレポーター活性の量はエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用の程度の指標である。
【００３６】
相互作用の程度とは、相互作用するＥＲ及びｃＲｅｌ分子の数を意味する。酵母２ハイブリッドと同様に、トランスフェクション試験又は他のシステムにおいて、相互作用の程度は相互作用するエストロゲン受容体及びｃＲｅｌ分子の数に依存する特定検出パラメーターにより測定することができる。従って、相互作用するエストロゲン受容体及びｃＲｅｌ分子の数は使用する検出パラメーターに比例する。
【００３７】
治療効力のある化合物を多数の化合物から選択することは医薬用化合物を見いだすために医薬産業及び関連産業で一般に使用されている。化合物の大きなストックから活性化合物をスクリーニングし、最も有効な化合物の指向的合成により更に最適化が得られる。本発明により提供される方法はエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を強化する活性化合物の検索で多数の化合物をスクリーニングするのに適している。このようなスクリーニングプログラムでは、相互作用の測定方法は多くの場合には比較データを得るために多数の化合物で平行して反復実施され、比較データに基づいて医薬化合物として開発するために最も活性な化合物を選択する。
【００３８】
エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を変化させるための治療処置は動物又はヒトの体内の相互作用を増減するために相互作用を変化させることを目的とする処置である。現代医療では得ようとする治療効果よりも所期生化学効果に基づいて処置を決定するのが一般的であるので、このような処置は所期生化学効果を得ることを目的とする。治療効果は当然のことながら処置の所期必要結果でなければならない。エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を変化させる処置の１具体例は骨粗鬆症の良好な処置である。破骨細胞と骨芽細胞における生化学メカニズムを説明するならば、本発明の主題である相互作用を目的とする化合物は骨粗鬆症の治療に有効であり、他の所期以外の弱い効果もある。しかし、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を好ましくは選択的に変化させるための方法を提供することにより、本発明は骨粗鬆症の治療だけでなく広範囲の疾患の薬剤治療に利用できる。他の治療範囲の適応については本明細書の他の項に説明した。
【００３９】
「システム」なる用語は分子及び／又は生物学的に定義される環境を意味し、化合物を導入することができるインビトロシステムとインビボシステムを意味する。インビトロシステムは無傷細胞又は均質化生化学組成物中にＥＲ蛋白質とｃ−Ｒｅｌ蛋白質の両者を含む混合物であり、インビボシステムはＥＲ蛋白質とｃ−Ｒｅｌ蛋白質の両者を含む細胞であり、この細胞はヒト又は動物体内にある。
【００４０】
実施例にエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させる化合物が記載されている。
【００４１】
このような化合物は医薬組成物によりシステムに直接添加することができる。
【００４２】
薬剤を１種以上の医薬的に許容可能な助剤と混合することによる医薬組成物の製造方法は当分野で周知である（Ｇｅｎｎａｒｏら，Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ；２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００，特にＰａｒｔ  ５：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ参照）。適切な助剤は例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ａ．Ｗａｄｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４）に記載されている。薬剤と医薬的に許容可能な助剤の混合物を圧縮してピル、錠剤等の固体用量単位にしてもよいし、カプセルや座剤に加工してもよい。医薬的に適切な液体により、薬剤を溶液、懸濁液、エマルションの形態の注射製剤として投与してもよいし、スプレー（例えば鼻腔スプレー）として投与してもよい。例えば錠剤等の用量単位を製造するには、充填剤、着色剤、ポリマー結合剤等の慣用添加剤の使用が予想される。
【実施例１】
【００４３】
ＮＦ−κＢによる接着分子の調節とエストロゲンによるその抑制
本実施例はＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭ等の細胞接着分子のプロモーター、ＮＦ−κＢ蛋白質によるそれらの調節並びにその後のＥＲ−ｃＲｅｌ相互作用を誘導する化合物によるそれらの抑制に関する。ＥＲαによるＮＦ−κＢシグナル伝達の抑制を試験するために、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭの３種の接着分子をコードする遺伝子のプロモーターを合成３ｘＮＦ−κＢ応答性レポーターと平行使用した。全３種のプロモーターは数個のＮＦ−κＢ応答性エレメント（ＲＥ）を含み、核内受容体応答性エレメントは存在しない（別表１参照）。Ｅ−セレクチンプロモーターはｐ５０／ＲｅｌＡ、ＲｅｌＡ／ＲｅｌＡ及びＲｅｌＡ／ｃ−Ｒｅｌヘテロダイマーに最適なものからなる数個のＮＦ−κＢ応答性エレメントを含む（Ｐａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｍａｃｋｍａｎ，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０８２３−２０８２５；Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，１９９８ａ；Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６７−７３，１９９８ｂ，１９９４？？；Ｋｕｎｓｃｈら，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１２−４４２１）。３ｘＮＦ−κＢレポーターは保存ｐ５０／ＲｅｌＡ応答性エレメント３コピーを含む（Ｗｉｓｓｉｎｋら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１９８：５０−６４，１９９７；Ｗｉｓｓｉｎｋら，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５（４）：５４３−５２，２００１）。
【００４４】
３種のプロモーターのすべてがＩｌ−１β及びＴＮＦα等のサイトカインにより明白に誘導される。特に、Ｉｌ−１βによるＥ−セレクチンの誘導は極めて強力であり（未刺激プロモーター活性の１５倍）、最適化合成３ｘＮＦ−κＢ応答性レポーターの誘導と同様であった（データは示さず）。文献に報告されている研究はＮＦ−κＢの効果を試験する場合には主にＲｅｌＡとｐ５０を扱っている。炎症性刺激の結果として活性化ＲｅｌＡ−ｐ５０ヘテロダイマーが誘導され、例えばｃ−Ｒｅｌの発現と活性はＢ及びＴリンパ球等の炎症性細胞型で構成的に高レベルであるので、多くの場合にこの選択は論理的であると思われる（Ｇｒｕｍｏｎｔら；Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆ．４：７３１−７４３．１９９３；Ｄｏｂｒｚａｎｓｋｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４６０８−４６１６．１９９４）。しかし、エストロゲン剤に注目される応答型は急性炎症性応答ではなく、むしろアテローム性動脈硬化症の発症と骨ホメオスタシス中の骨芽細胞と破骨細胞の連続相互作用に関与する慢性的メカニズムである。
【００４５】
各種ＮＦ−κＢがＮＦ−κＢ応答性プロモーターの活性に及ぼす効果を試験するために、プロモーター−レポーターとＮＦ−κＢ蛋白質の組合せを試験するコトランスフェクション実験を設計した（表１）。Ｅ−セレクチンプロモーターの活性はｃ−ＲｅｌよりもＲｅｌＡにより強力に誘導されることが分かった。ＲｅｌＡとｃ−Ｒｅｌを同時発現させると、ＲｅｌＡとｃ−Ｒｅｌにより別々に誘導されるレベルの中間のプロモーター活性が誘導され、ＲｅｌＡ（ホモダイマー）はＲｅｌＡ／ｃ−Ｒｅｌヘテロダイマーよりも著しく強力なインデューサーであることが示唆された。３ｘＮＦ−κＢ応答性レポーターでは、ｃ−Ｒｅｌを含むヘテロダイマーはＲｅｌＡを含むホモ／ヘテロダイマーと同等に強力であった。両者レポーターに及ぼす効果から明らかなように、これらの場合、ｃ−Ｒｅｌ自体（ホモダイマーとして）は転写活性化活性がごく低い。これらのデータはｃ−Ｒｅｌがここで試験した遺伝子の転写活性化において他の型のＮＦ−κＢ蛋白質とのヘテロダイマーとして優先的に作用することを暗示している。
【００４６】
【表２】
2005525108.tif 000003
【００４７】
Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭのプロモーターを使用して、ＮＦ−κＢレポーターを介するＥＲとＮＦ−κＢシグナル伝達の機能的相互作用を試験した。全３種のプロモーター−レポーターはＩｌ−１βにより有効に誘導することができる（表２）。一過性トランスフェクション後に、Ｉｌ−１βにより誘導されたこれらのＮＦ−κＢ応答性プロモーターの活性はＥＲαとリガンドに依存して転写抑制することができる（表２）。これらの実験では完全な抑制は観察されず、Ｉｌ−１βにより誘導されたプロモーター活性は誘導された活性の６０％まで抑制される。これは平行して測定したこれらのプロモーターに及ぼすグルココルチコイドの転写抑制効果と同等である（データは示さず）。１７β−エストラジオールの用量応答は、１０−１１〜１０−１２Ｍの濃度で最大抑制の２分の１が生じることを示し、これはＵ−２  ＯＳ細胞でのＥＲＥ−転写活性化における１７β−エストラジオールのＥＣ５０値と同等である（データは示さず）。従って、１７β−エストラジオールは非選択的である。
【００４８】
次に、Ｕ−２  ＯＳ細胞で指定ＮＦ−κＢ蛋白質を過剰発現させることにより、ＥＲによる転写抑制がｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡ等の特定ＮＦ−κＢ型に限定されるか否かを調べた（表２）。これらの実験でもＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭ遺伝子のプロモーター−レポーター構築物を使用した。ｃＲｅｌの過剰発現によるこれらのレポーターの顕著な活性化が観察された。この活性化はＥＲαとＥＲβの両者により強力且つ再現可能に転写抑制された（表２）。他方、レポーターはＲｅｌＡにより強力に誘導されたが、ＥＲのよるこの活性の抑制は観察されなかった（表２）。
【００４９】
【表３】
2005525108.tif 000004
【実施例２】
【００５０】
ＮＦ−κＢによるＥＲ及びＧＲ依存性プロモーター活性の相互抑制
ＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用がＮＦ−κＢ蛋白質により誘導される経路と保存エストロゲン応答性エレメント（ＥＲＥ）を介して活性化ＥＲにより誘導される経路を調節することは文献（Ｂｏｄｉｎｅら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：２４３９−２４５１，１９９９）から公知である。前セクションではＥＲによるＮＦ−κＢシグナル伝達の抑制を示した。以下にはＮＦ−κＢ蛋白質によるＥＲシグナル伝達の抑制について記載する。これはＵ−２  ＯＳ骨芽細胞にＥＲ応答性プロモーターレポーターとＥＲα又はＥＲβ及びｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡを一過性トランスフェクションする試験により示した（表３）。これらの実験によると、特にＲｅｌＡはＥＲαにより誘導されるＥＲＥプロモーター活性の強力なリプレッサーである。ＥＲβでも同様の結果が得られた。
【００５１】
特筆すべき点として、ＥＲＥとＮＦ−κＢ応答性プロモーター活性化の抑制程度に相関があるとは思われない。ＥＲαとＥＲβは程度は異なるが、ｃ−Ｒｅｌにより誘導したＮＦ−κＢレポーターを抑制し、ＲｅｌＡにより誘導したレポーターには効果がなかった。他方、ｃ−ＲｅｌとＲｅｌＡはいずれもＥＲにより誘導したＥＲＥレポーターを抑制することができる。このことから、ＥＲ及びＮＦ−κＢ経路間に機能的クロストークが生じるが、これは各経路に異なる結果をもたらすらしい。
【００５２】
コンセンサスＧＲＥ−応答性レポーターシステムをＲｅｌＡ又はｃ−Ｒｅｌと併用すると、ＧＲとＲｅｌＡの同時発現の結果としてＧＲＥレポーターシステムに高い抑制活性が生じたが、ｃ−Ｒｅｌでは殆ど抑制は観察されなかった。これはＥＲとｃ−Ｒｅｌの相互作用の特異性を更に実証するものである。
【００５３】
【表４】
2005525108.tif 000005
【実施例３】
【００５４】
ＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制及び内因性遺伝子発現
インビボ及び薬剤治療におけるＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用の意義を実証するために、機能的ＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用を内因性遺伝子発現レベルで試験した。
【００５５】
Ｅ−セレクチンとＶＣＡＭは、いずれの遺伝子も内皮細胞型に選択的であるが、当時十分なＥＲα濃度の内皮細胞を入手できなかったので、内皮細胞における内因性Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭ発現に及ぼすエストロゲン効果を試験することはできなかった。従って、アテローム性動脈硬化症の機能的動物モデルでＥ−セレクチンとＶＣＡＭの内因性発現の調節を試験した（表４）。ウサギはヒトと同様に、高コレステロール飼料に応答してアテローム性動脈硬化症を発症する。ウサギにこのようなアテローム発生飼料を何週間も与えることにより、試験した大動脈の全領域（大動脈弓、腹部及び胸部大動脈）でＥ−セレクチンとＶＣＡＭの両者の発現の増加を認めることができた。重要な点として、Ｅ−セレクチンとＶＣＡＭのこれらの誘導レベルは１７β−エストラジオール投与により抑制されることが判明し（表４）、ＮＦ−κＢシグナル伝達がエストロゲンによりインビボ転写抑制されることが実証された。
【００５６】
【表５】
2005525108.tif 000006
【実施例４】
【００５７】
ＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用を測定するための酵母２ハイブリッド結合アッセイ
組織選択的バックグラウンドと無関係にＥＲとｃ−Ｒｅｌの相互作用を選択的に誘導する化合物をスクリーニングするためにはＨＴＳアッセイを使用することができる。この目的のために、スクリーニング目的に適切な酵母２ハイブリッドシステムを使用したＥＲ／ｃ−Ｒｅｌ蛋白質−蛋白質相互作用アッセイを例示する。
【００５８】
全長ＥＲαは強力な転写活性を示すので、Ｎ末端を切断した転写サイレントＥＲα変異体（δＡＢ）を使用してＥＲαとｃ−Ｒｅｌの相互作用を検出した。ＧＡＬ４−ＤＢＤに融合した全長ＥＲβは固有活性を示さないので、全長ＥＲβは相互作用試験に使用できなかった。
【００５９】
こうして、ＥＲαとｃ−Ｒｅｌの強力なエストロゲン依存性相互作用が検出された。ＥＲβとｃ−Ｒｅｌにも同様の相互作用が認められた（表５）。切断型ＥＲα構築物を使用すると、ＥＲαとｃ−Ｒｅｌの相互作用はＥＲαのＬＢＤに依存することが分かった（表５）。特筆すべき点として、ＲｅｌＡとＥＲαとやＲｅｌＡとＥＲβとの相互作用は認められなかった（表５）。これはエストロゲンがＲｅｌＡにより誘導したレポーター活性を抑制しなかったという知見（表２）に一致するが、ＲｅｌＡの過剰発現がＥＲαとＥＲβの両者により誘導したＥＲＥ転写活性化を強力に抑制したという知見（表３）とは明らかに反する。これは哺乳動物細胞の細胞質における（ＩκＢと会合した）種々の不活性ＮＦ−κＢ蛋白質のプールの存在により説明することができる。一方のＮＦ−κＢ型の過剰発現は活性型と不活性型のＮＦ−κＢ蛋白質間のバランスを調節すると予想されるので、ホモ及びヘテロ二量化を変化させると考えられる。
【００６０】
酵母２ハイブリッドシステムにおけるｃ−ＲｅｌとＥＲαの相互作用を高スループットアッセイに変換した。このアッセイはＥＲαとこのＮＦ−κＢの会合の強力なインデューサーである化合物の選択に使用することができる。
【００６１】
【表６】
2005525108.tif 000007
【実施例５】
【００６２】
内皮細胞に及ぼすＥＲの有益な効果の転写抑制アッセイ
高スループット相互作用アッセイにより選択される化合物を更に特性決定するためには、実施例１〜３に記載した結果に基づく機能的転写抑制アッセイが必要であった。Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭプロモーターを用いてＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制試験を開始した当初の目的は、エストロゲンのアテローム保護効果の予測値が高いアッセイを開発することであった。疫学試験によると、月経閉止前の女性はアテローム性動脈硬化症を発症する危険が低いことが示されている。エストロゲンが心臓血管疾患に対して保護作用があるという概念を裏付けるインビトロ及びインビボデータもある（Ｓｋａｆａｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．８２：３９１３−３９１８．１９９７）が、臨床試験は必ずしもこれらのデータを裏付けていない（Ｈｕｌｌｅｙら，ＪＡＭＡ  ２８０：６０５−６１３，１９９８）。
【００６３】
エストロゲンがアテローム保護作用をもつと考えられるメカニズムの１つはアテローム動脈硬化症の発症中の恐らくＮＦ−κＢシグナル伝達の妨害による炎症反応の阻害である。ＮＦ−κＢ蛋白質は炎症性遺伝子（例えばサイトカイン）や細胞接着分子の発現調節に重要な役割を果たす（実施例１）。細胞接着分子の発現はエストロゲンにより抑制することができ、サイトカインにより誘導したＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ及びＥ−セレクチンプロモーターの活性はエストロゲンにより阻害することができる（実施例１）。
【００６４】
本実施例はＴ２４／ＥＣＶ細胞株でＥ−セレクチン又はＶＣＡＭプロモーターをＥＲαと組合せたアッセイに関する。ＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制アッセイでは、安定なＥＲα発現クローンを生産するのに適した唯一の入手可能な内皮細胞株であると考えられたＥＣＶ３０４細胞株を使用したことに留意されたい。その後、ＡＴＣＣはＥＣＶ３０４細胞が内皮細胞ではなく、Ｔ２４膀胱癌細胞であると報告している。サイトカイン誘導とエストロゲンによる抑制量を増加するために、Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭプロモーターのＮＦ−κＢ応答性領域の多重コピーを使用して新規レポーターＥＬＡＭ１ａ、ＥＬＡＭ２、ＥＬＡＭ−ＨＭＧ、ＶＣＡＭ１−２、ＶＣＡＭ２、及びＶＣＡＭ３を構築した（レポーター詳細については別表１参照）。種々のＥ−セレクチン及びＶＣＡＭプロモーター由来レポーターの一過性トランスフェクションは、ＥＬＡＭ−ＨＭＧ及びＶＣＡＭ３で特に良好な結果を示した（サイトカインによる再現可能な高レベル誘導と５０％を上回るＥＲαによる抑制）［表６］。
【００６５】
【表７】
2005525108.tif 000008
【００６６】
これらのデータはＥＲαとＥＬＡＭ−ＨＭＧ又はＶＣＡＭ３レポーターを発現する安定にトランスフェクトしたクローンで確認された（表７）。残念ながら、クローンは長期細胞培養中に測定した転写抑制安定性が低いので非常に多数の化合物の試験には適していないことが分かった。この点は最近の報告（Ｑｕａｅｄａｃｋｅｒｓら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：１１５６−１１６６，２００１）に一致しており、安定にトランスフェクトした細胞では一過性トランスフェクトした細胞に比較してＥＲαによるＮＦ−κＢシグナル伝達の転写抑制が低下することを示している。従って、上記アプローチは高スループット転写抑制アッセイの設計の最適選択ではない。
【００６７】
【表８】
2005525108.tif 000009
【実施例６】
【００６８】
骨芽細胞に及ぼすＥＲの有益な効果の転写抑制アッセイ
エストロゲンは、破骨細胞活性を刺激して骨吸収を刺激する骨芽細胞によりサイトカイン産生を阻害して、骨吸収と骨形成のバランスを維持する。ＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制とＩＬ−６産生の関連性を更に詳細に分析した。骨芽細胞前駆細胞Ｕ−２  ＯＳをＩＬ−１β等のサイトカインで刺激すると、内因性ＩＬ−６蛋白質の産生が増加する。他方、Ｕ−２  ＯＳ細胞にＩＬ−１βとエストロゲンも投与すると、ＩＬ−６の産生増加は抑制される［表８］。
【００６９】
【表９】
2005525108.tif 000010
【００７０】
エストロゲンによるＩＬ−６産生の抑制における機能的ＥＲα／ｃ−Ｒｅｌ相互作用の役割を調べるために、ＩＬ−６遺伝子のプロモーターを含むレポーター構築物を使用してＥＲα及びＮＦ−κＢ蛋白質の種々の組合せがＩＬ−６産生に及ぼす効果を分析した。この分析もＮＦ−κＢ蛋白質に対するＥＲαの特異性を確認する。ｃ−Ｒｅｌによるレポーター誘導はエストロゲンにより刺激したＥＲにより強力に抑制することができたが、ＲｅｌＡにより誘導したレポーター活性には効果が認められなかった［表８］。文献［Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７５２−７５６，１９９４；Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９７１−９，１９９５］の記載通りに、エストロゲンはｃ／ＥＢＰβに転写抑制効果を示すことが分かった［表９］。特に、ｃ−Ｒｅｌとｃ／ＥＢＰβは相乗的にＩＬ−６プロモーター−レポーターを誘導し、これはエストロゲンにより強力に抑制することができる。ＲｅｌＡとｃ／ＥＢＰβの同様の相乗効果がエストロゲンにより抑制できなかったという知見もＮＩＦ−κＢにより誘導した遺伝子発現におけるｃ−Ｒｅｌ／ＥＲα相互作用の重要性を裏付けている。
【００７１】
【表１０】
2005525108.tif 000011
【実施例７】
【００７２】
ＥＲＥ由来転写活性よりもＥＲ／ｃＲｅｌ相互作用を誘導するための化合物の選択性
実施例４では、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用の強力なインデューサーである化合物の選択に使用する酵母２ハイブリッド法について記載した。表１０はこのアッセイフォーマットにおける４種の化合物の典型的な結果を示す。ＥＲの直接転写活性の誘導に対してＥＲ／ｃ−Ｒｅｌ相互作用におけるこれら化合物の選択性を試験するために、Ｔ２４／ＥＣＶ細胞でサイトカインにより誘導したＥＬＡＭ−ＨＭＧプロモーターレポーター活性の抑制についてこれら化合物を希釈系列で試験した（アッセイフォーマットの詳細については実施例５参照）。ＣＨＯ又はＵ−２  ＯＳ細胞におけるＥＲＥ転写活性化についてもこれら化合物の希釈系列を平行して試験した。
【００７３】
Ｕ−２  ＯＳにおけるＥＲＥ転写活性化を測定するために、細胞にＥＲα及びＥＲＥ由来プロモーターレポーター構築物ｐＲｏ−ｌｕｃを一過性トランスフェクトした。この構築物はラットオキシトシンプロモーターに存在する保存エストロゲン応答性エレメントによりＥＲ転写活性に相当するプロモーターの部分を含む（別表２参照）。使用したオキシトシンプロモーターの部分はＮＦ−κＢ応答性エレメントを含まない。ＣＨＯ細胞におけるＥＲＥ転写活性化には、ＥＲαとｐＲｏＬｕｃを安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞クローンを使用した。
【００７４】
上記アッセイで作成した用量−応答曲線に基づき、全３種の化合物と１７β−エストラジオールのＥＣ５０値を決定した。ＥＣ５０値は化合物の最大効果の２分の１が観察される濃度である。使用したアッセイでは、これは最大抑制の２分の１（ＥＬＡＭ−ＨＭＧレポーターの場合）でもよいし、最大誘導の２分の１（酵母２ハイブリッドにおけるＥＲαとｃ−Ｒｅｌの相互作用の場合又はＥＲＥ−レポーター活性の場合）でもよい。
【００７５】
表１０の結果によると、Ｏｒｇ３８６３３、Ｏｒｇ３８６３５及びＯｒｇ１０２１７は転写活性（ＣＨＯ細胞におけるＥＲＥ−レポーター）よりもＥＲα／ｃＲｅｌ転写抑制（Ｔ２４／ＥＣＶ細胞におけるＥＬＡＭ−ＨＭＧレポーター）に選択性を示す。ＥＲαの天然ホルモン（１７β−エストラジオール）はこの選択性を示さず、ＥＲ／ＥＲＥ転写活性化よりもＥＲ／ｃ−Ｒｅｌ転写抑制のほうが弱いとさえ思われる。
【００７６】
【表１１】
2005525108.tif 000012
【００７７】
５．材料と方法
細胞培養
ヒト骨肉腫Ｕ−２ＯＳ（ＨＴＢ−９６）、サル腎ＣＯＳ−１（ＣＲＬ−１６５０）及びヒトＥＣＶ３０４（ＣＲＬ−１９９８）細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。ＥＣＶ３０４細胞はＡＴＣＣからヒト内皮細胞として販売されたが、その後、ＡＴＣＣはこの細胞株が実際はヒト膀胱上皮癌細胞株Ｔ２４であると報告している。従って、これらの細胞を本発明ではＴ２４／ＥＣＶと呼ぶ。ＥＣＶ３０４／Ｔ２４（−ＥＲα）、Ｕ−２ＯＳ及びＣＯＳ−７細胞はフェノールレッド不含ダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（＝Ｍ５０５）の１：１混合物に１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えた中で増殖させた。実験はＭ５０５＋１０％ＦＣＴＳ（血清からステロイド活性を除去するためにデキストランを被覆した活性炭で処理したウシ胎仔血清）中で実施した。
【００７８】
使用した構築物
ｐＫＣＲＥ−ＥＲα、ｐＫＣＲＥ−ＥＲβ及びｐＮＧＶ１−ＧＲはヒト野生型エストロゲン受容体α（ＥＲα）、ＥＲβ又はＧＲを夫々ＳＶ４０プロモーターの制御下に含む。ｐＣＭＶ４−ｃ−Ｒｅｌ発現ベクターはｃ−Ｒｅｌのコーディング領域をｐＣＭＶ４ベクターにクローニングすることにより作製した（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，１９８９）。ｐＧＬ３−ＥＬＡＭ、ｐＧＬ３−ＶＣＡＭ及びｐＧＬ３−ＩＣＡＭは別表１に要約するような配列を使用してＰＣＲにより構築した。ルシフェラーゼレポータープラスミド３＊ＮＦ−κＢ−ＴＫは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターの手前にＩＣＡＭプロモーター（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｔｏｌｐｅら；Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：６１８５−６１９２．１９９４）に由来するＮＦ−κＢ結合部位の３個の反復配列を挿入することにより構築した。ＴＫプロモーターをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。オリゴヌクレオチドプライマー５’−ｃａｔａｃｇｇｔａａｇｃｔｔｇｇｇｇｔｃａｔｃｇｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｃｇａｔｔｇｃｔｔｔａｇｃｔｔｇｇａａａｔｔｃｃｇｇａ−３’及び５’−ｇｔａｔｇｃｃａａａｇｃｔｔｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔａａａ−３’をアニールした後にＰＲＣ増幅し、ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターにサブクローニングすることによりＮＦ−κＢ結合部位の三重反復配列を構築した。ＨｉｎｄＩＩＩを使用してインサートを切出し、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、ｐＧＬ３−ｔｋ−ｌｕｃのＳｍａＩ部位にライゲーションした。４ｘＥＲＥ−ＴＡＴＡ  Ｌｕｃ（プラスミド番号４６０）はエストロゲン応答性エレメントの４個の反復配列とその後にＴＡＴＡボックスとルシフェラーゼ遺伝子を含む。哺乳動物細胞のトランスフェクション効率をモニターするための陽性対照ベクターとしてｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（ｐＳＶβ）対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。ＳＶ４０初期プロモーター及びエンハンサーはβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードするＬａｃＺ遺伝子の転写を誘導する。酵母２ハイブリッド構築物ｐＧＡＤ４２４−ＥＲα、ｐＧＡＤ４２４−ＥＲαｄＡＢ及びｐＧＡＤ４２４−ＥＲβは夫々ヒトＥＲα、ＡＢドメインを欠失するＥＲα及びヒトＥＲβ  ＤＮＡをｐＧＡＤ４２４にクローニングすることにより構築した。ｐＧＡＤ４２４−ＥＲαＬＢＤはＰＣＲにより得られたＥＲαのＬＢＤをｐＧＡＤ４２４ベクターのＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位にクローニングすることにより構築した。ｐＧＢＴ９−ｃ−ＲｅｌはｐＣＭＶ４−ｃ−ＲｅｌでＰＣＲにより得られたｃ−ＲｅｌフラグメントをｐＧＢＴ９のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより構築した。ｐ６５／ＲｅｌＡｃＤＮＡはｐＣＭＶ４−ｐ６５でＰＣＲにより得られた。このフラグメントをｐＧＥＸ４Ｔ１にクローニングし、これを使用してｐ６５／ＲｅｌＡｃＤＮＡをｐＧＡＤ４２４の平滑化ＸｍａＩ部位にサブクローニングした。
【００７９】
６種のＮＦ−κＢ応答性レポーターｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ１ａ、ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ２、ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ  ＨＭＧ、ｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ１−２、ｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ２及びｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ３（夫々プラスミド番号１９２１〜１９２６）はアニールしたプライマーをｐＨＧＬ３−ＴＡＴＡのＫｐｎＩ及びＳａｃＩ部位にライゲーションすることにより構築した。プライマーはＥＬＡＭ及びＶＣＡＭプロモーターのＮＦ−κＢ−ＲＥ配列に基づいて設計した（別表１参照）。より高い絶対ルシフェラーゼシグナルが得られるようにＮＦ−κＢ−ＲＥの数個のコピーをクローニングした。ＥＬＡＭ  ＨＭＧ構築物は二重反復配列を含み、他の構築物は３個のＮＦ−κＢ−ＲＥを含む。プライマー及びレポーター配列については別表１を参照されたい。
【００８０】
トランスフェクション
一過性トランスフェクション
一過性トランスフェクションでは、細胞を６ウェルプレートに播種した（２．１０５細胞／ウェル）。２又は３日後に細胞にレポーター、発現ベクター及びβ−ガラクトシダーゼ対照ベクターをトランスフェクトした。２種の異なる実験設定を使用した。ＩＬ−１βにより誘導したプロモーター活性の転写抑制を試験するために、レポーター構築物１μｇ、（ＥＲα、ＥＲβ又はＧＲを含む）発現ベクター１μｇ、及びβ−ガラクトシダーゼ対照プラスミド０．２５μｇを細胞にトランスフェクトした。転写抑制とｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡ過剰発現の組合せを試験するために、レポーター構築物１μｇ、（ＥＲα、ＥＲβ又はＧＲを含む）発現ベクター１μｇ、ｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡを含む発現ベクター０．１又は１．０μｇ、及びβ−ガラクトシダーゼ対照プラスミド０．２５μｇを細胞にトランスフェクトした。インサートを欠失する適当な発現ベクターを加えることにより等価量のＤＮＡが得られた。一過性トランスフェクションはリポフェクチン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。リポフェクチンを使用した一過性トランスフェクションは製造業者の指示に多少の変更を加えて実施した。トランスフェクトするＤＮＡ１μｇにつきリポフェクチン５μｌを使用し、細胞をトランスフェクション混合物と共に５時間インキュベートした後、トランスフェクション混合物を吸引し、Ｍ５０５＋０．５μｇ／ｍｌインスリン＋５μｇ／ｍｌトランスフェリン＋試験化合物（例えばＩＬ−１βと１７β−エストラジオールの各種組合せ）に交換した。トランスフェクトした細胞を試験化合物と共に一晩インキュベートした後に細胞溶解させた。ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性の測定は夫々ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＧａｌａｃｔｏ−ｌｉｇｈｔ  ｐｌｕｓ（Ｔｒｏｐｉｘ）を製造業者のプロトコールに従って使用して実施し、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンター，Ｗａｌｌａｃで測定した。β−ガラクトシダーゼ活性の検出をトランスフェクション効率の対照として使用した。
【００８１】
安定なトランスフェクション
細胞を６０ｍｍ皿に密度１．１０６細胞／皿及び総容量１０ｍｌで播種した。２日間増殖後に、細胞に適当なプラスミドをトランスフェクトし、必要に応じてＰＡＧ６０等の選択プラスミド（１０：１比）を加えた。プラスミドはＯｐｔｉＭｅｍ２００μｌに加えた。リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）２５μｌにＯｐｔｉＭｅｍ１７５μｌを加えて３０分間室温でインキュベートした。ＤＮＡ／ＯｐｔｉＭｅｍ溶液をリポフェクチン溶液に加え、１５分間室温でインキュベートした。次に、ＯｐｔｉＭｅｍ３．６ｍｌを加えた。細胞をＭ５０５  ５ｍｌで２回洗浄し、トランスフェクション溶液を細胞に加えた。５時間トランスフェクション後に、培地をＭ５０５＋１０％ＦＣＳに交換した。細胞を２日間インキュベートし、トリプシン処理し、９６ウェルプレートでＭ５０５＋１０％ＦＣＳ＋抗生物質（ｐＫＣＲＥ−ＥＲ／ＰＡＧ６０コトランスフェクションにはネオマイシン又はｐＨＧＬ３−ＮＦ−κＢ−ＲＥレポータープラスミドにはハイグロマイシン）に分割した。培地を週２回交換した。抗生物質耐性コロニーを約２週間後にスコアした。ｐＫＣＲＥ−ＥＲをトランスフェクトしたＴ２４−ＥＣＶ細胞については、３＊ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−Ｌｕｃを一過性トランスフェクションし、１７β−エストラジオールと共にインキュベーションすることによりＥＲαの有無を調べた。ｐＨＧＬ３ＥＬＡＭ  ＨＭＧ又はｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ３をトランスフェクトしたＴ２４−ＥＣＶ及びＴ２４−ＥＣＶ−ＥＲα細胞については、ＩＬ−１β及びＩＬ−１β＋Ｅ２と共にインキュベーションすることによりＮＦ−κＢ−ＲＥレポータープラスミドの有無を調べ、転写抑制百分率が最高のクローンを記録した。
【００８２】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ
動物試験と細胞培養
ウサギの処理の実験プロトコールは従来記載されている（Ｓａｎｔｅｇｏｅｔｓら，１９９７）。要約すると、ニュージーランドシロウサギ（各実験群２羽）を卵巣切除した後に高コレステロール飼料を２、４、８又は１８週間与えた。動物屠殺の４又は１２時間前に、動物に１７β−エストラジオール（Ｏｒｇ  ２３１７）３μｇ／ｋｇを皮下注射するか又はプラセボ投与した。
【００８３】
ＲＮａｓｅ保護試験の細胞培養は１７５ｃｍ２フラスコで実施した。１０％ＦＣＴＳを添加したＭ５０５でＴ２４−ＥＣＶ、Ｔ２４−ＥＣＶ−ＥＲα−ＥＬＡＭ  ＨＭＧ  ２Ｂ８及びＴ２４−ＥＣＶ−ＥＲα−ＶＣＡＭ  ３  ３Ａ１０細胞を３日間増殖させた後、Ｍ５０５（０．１％ＢＳＡ添加）で希釈した１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ１β及び１．１０−８Ｍ１７β−エストラジオールの一方又は両方で細胞を６時間刺激した。
【００８４】
ＲＮＡ単離
組織試料又はＴ２４／ＥＣＶ−ＥＲα細胞からの全ＲＮＡの単離はＲＮＡｚｏｌ  Ｂ（Ｃａｍｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。化合物と共にインキュベーション後にＴ２４／ＥＣＶ−ＥＲα細胞をトリプシン処理し、Ｍ５０５＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、計数した。次に、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡｚｏｌＢを使用して細胞ペレットからＲＮＡを単離した。ＲＮＡをＡ２６０測定により定量し、Ａ２６０／Ａ２８０比の測定により純度を分析した。ＲＮＡは７０％エタノールと０．１Ｍ  ＮａＡｃ中で−２０℃にて保存した。
【００８５】
ＲＮａｓｅ保護プローブ
サイトカインの各種組合せの発現レベルの測定に使用したＲＮａｓｅ保護プローブはＲｉｂｏＱｕａｎｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の市販プローブセットｈＣＫ−３、４及び５とした。ウサギ大動脈でのＲＮａｓｅ保護には、ＲＴ−ＰＣＲによりＶＣＡＭ及びＥ−セレクチンのプローブを作製した。第１鎖ｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とランダムヘキサヌクレオチドを製造業者の指示に従って使用してウサギ大動脈弓全ＲＮＡ２．５μｇで実施した。ＰＣＲはｔａｑポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造業者の指示に従って使用した。使用したプライマーはＥ−セレクチンにはＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣとＧＣＴＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＣＣを使用し、ＶＣＡＭにはＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＣとＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣを使用した。適当な長さのフラグメントをＰＣＲ−２．１にサブクローニングし、配列をシーケンシングにより再確認した。プローブ鋳型はＴ７とインサート特異的プライマーの組合せを使用したＰＣＲにより作製し、ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎゲル抽出キットで精製した。使用したプライマーはＴ７ではＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧを使用し、Ｅ−セレクチンとＶＣＡＭには夫々上記プライマーを使用した。未保護／保護ＲＮａｓｅ保護プローブの長さは夫々Ｅ−セレクチン４９４／４２６ｂｐ、ＶＣＡＭ７１７／６４９ｂｐ、ＧＡＰＤＨ１８６／１１８ｂｐとした。
【００８６】
プローブ標識
上記のように作製した鋳型からインビトロ転写キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及び［α−３２Ｐ］ＵＴＰ取込みを使用してアンチセンスＲＮＡプローブを合成した。放射性ヌクレオチドはＮＥＮ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．から入手した。転写はＲＮａｓｉｎ２０Ｕ、ＧＴＰ、ＡＴＰ及びＣＴＰ各１３７．５μＭ、ＵＴＰ３．０５μＭ、［α−３２Ｐ］ＵＴＰ１．６７μＭ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＤＴＴ１０μＭ、５ｘ転写用緩衝液２μｌ、夫々Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＧＡＰＤＨの２本鎖ＤＮＡ鋳型１０、１５及び５ｎｇ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１０Ｕを含有する反応液１０μｌ中で３７℃にて１時間実施した。転写の終了はＤＮａｓｅ１Ｕを加えた後にフェノール−クロロホルム：イソアミルアルコール抽出とエタノール沈殿により行った。プローブ活性はＴＲＩ−ＣＡＲＢ液体シンチレーションアナライザー（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。
【００８７】
ＲＮａｓｅ保護分析
ＲＮａｓｅ保護分析はＲＰＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して実施した。全ＲＮＡ１０μｇを各プローブ約３ｘ１０５ｃｐｍと５６℃で１６時間ハイブリダイズさせた。次に試料を３０℃で４５分間ＲＮａｓｅで消化した。保護フラグメントはＧｅｎｏｍｙｘ  ＬＲ電気泳動システム（Ｇｅｎｏｍｙｘ）を使用して６％ポリアクリルアミドゲルで分析した。電気泳動は２５００Ｖ及び１２５Ｗで５０℃の一定温度にて２時間実施した。ＲＮａｓｅ保護結果はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０と付属のＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して定量した。定量後に、各保護バンドのシグナルをＧＡＰＤＨシグナルで割ることによりＲＮＡの厳密な使用量の補正を行った。
【００８８】
ＲＮＡ存在量とハイブリダイゼーションに使用したプローブの量の直線相関の対照として、ウサギ組織試料におけるｖｃａｍ及びＥ−セレクチン発現の測定、増加量の肝臓ＲＮＡを使用した場合にはハイブリダイゼーションシグナルの測定と平行して対照実験を行った。ＧＡＰＤＨ発現の上記補正後に、この結果として実際にＥ−セレクチンとＶＣＡＭをコードする等量のｍＲＮＡが得られた（結果は示さず）。
【００８９】
酵母２ハイブリッド
各種ＥＲ構築物を含むｐＧＡＤ４２４とｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡ構築物を含むｐＧＢＴ９による酵母株ＳＦＹ５２６の形質転換は酢酸リチウム法を使用して実施した。５個の固体クローンを選択し、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）レポーター遺伝子アッセイシステム（Ｔｒｏｐｉｘ，カタログ番号ＧＳＹ  １０００）を使用するβ−ガラクトシダーゼアッセイで１７β−エストラジオールの濃度系列により試験した。１７β−エストラジオール応答性に基づいて最良のクローンを選択した。
【００９０】
ＩＬ−６蛋白質の検出
ＥＲαを安定して過剰発現するＵ−２  ＯＳ細胞（Ｕ−２  ＯＳ−ＥＲα細胞）により分泌されるヒトＩＬ−６の抑制を試験するために、標準サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡキット＃ＤＹ２０６）。細胞を２４又は９６ウェルプレートでＭ５０５＋デキストランを被覆した活性炭で処理した血清（即ち１０％ＢＣＴＳ）にプレーティングし、９０％コンフルエントまで増殖させた。細胞を１７β−エストラジオール又は他のＥＲ調節化合物の不在下又は存在下にＩｌ−１β、ＴＮＦα及びＩＦＮγの各種組合せ等のサイトカインで一晩処理した。
【００９１】
ＥＬＩＳＡは以下に簡単に説明するように製造業者のプロトコールに従って実施した。細胞を適当な濃度の化合物と共に一晩インキュベーション後に、予め抗ＩＬ−６捕獲抗体で一晩被覆しておいた９６ウェルプレートに上清を移した。次に、捕獲されたＩＬ−６をビオチン化抗ＩＬ−６検出抗体とストレプトアビジン−ＡＰで検出した。次に、化学発光基質ＣＳＰＤ（Ｅｌｉｓａ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標），＃ＥＬ１００ＣＹ，Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してウェル当たりのＩｌ−６濃度を定量した後、Ｖｉｃｔｏｒマルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で発光量を測定した。
【００９２】
別表１
夫々Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＬ−６プロモーターのクローニング部分の配列。ＡＴＦ−２部位を点線の下線で示し、コンセンサスＮＦ−κｒＢ部位を一重下線で示し、ｃ／ＥＢＰβ部位を二重下線で示し、転写開始部位を太字で示す。番号は転写開始部位を基準とする。
【００９３】
【表１２】
2005525108.tif 000013
2005525108.tif 000014
【００９４】
ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ１α、ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ２、ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ  ＨＭＧ、ｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ１−２、ｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ２及びｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ３レポーターの構築に使用したプライマーの配列。
【００９５】
【表１３】
2005525108.tif 000015
2005525108.tif 000016
【００９６】
別表２
ＥＲＥコンセンサス：ＧＧＴＣＡ  ＮＮＮ  ＴＧＡＣＣ
エストロゲン受容体の転写活性を測定するために使用したラットオキシトシンプロモーターのクローニング部分の配列。公表ＥＲＥパリンドロームコンセンサス部位（ＧＧＴＣＡ  ＮＮＮ  ＴＧＡＣＣ）によると、プロモーターは２個の比較的十分に保存されたＥＲＥ（太字で示す）を含む。最上流ＥＲＥはミスマッチが２箇所あり、２番目は１箇所だけである。更に、２分の１の部位が数箇所ある（下線で示す）。
【００９７】
【表１４】
2005525108.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月26日(2004.10.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は相互作用の程度に比例する検出パラメーターを提供することにより、インビトロシステムにおけるエストロゲン受容体（ＥＲ）と転写活性化蛋白質の直接相互作用を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
数種の重要な医薬化合物は転写因子に作用することにより生物でその治療効果を有する。特に、この作用メカニズムは、ある種の避妊及び抗炎症化合物等の、ステロイドホルモン作用を模倣することにより作用する医薬により使用されている。転写因子は生物の細胞において遺伝ＤＮＡ材料の読取りを制御する蛋白質である。この制御メカニズムが生体細胞の多くの性質を決定する。細胞における遺伝子発現の制御は永久的な場合と一過性の場合がある。一過性変化は細胞の環境変化に応答する変化である。細胞の環境に他の細胞表面及び他の分子が存在すると、細胞へのシグナル源となり、その機能が変化する。転写因子は細胞に及ぼす外的影響のメディエーターとして主に機能する。この意味では、転写因子はシグナル伝達メカニズムに含まれる。
【０００３】
周知転写因子はエストラジオール、プロゲステロン、コルチゾール等のステロイドホルモンの受容体等の核内受容体である。別の転写因子ファミリーは核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）転写因子ファミリーと呼ばれる。ＮＦ−κＢファミリーの転写因子はＲｅｌＡ（＝ｐ６５）、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、Ｐ５０及びＰ５２からなる群の２個のサブユニットから構成される二量体である。ＮＦ−κＢの動員によるシグナル伝達システムは阻害蛋白質ＩκＢを介して細胞の外部からのサイトカイン分子に応答することにより機能する。ＮＦ−κＢの阻害剤であるＩκＢはＮＦ−κＢと共に不活性化複合体を形成するが、サイトカインへの細胞暴露に応答してリン酸化によりこれらの複合体からＩκＢが酵素作用により除去される。ＩκＢ／ＮＦ−κＢ複合体からこの阻害因子が酵素作用により除去されると、ＮＦ−κＢはゲノムに作用できるようになる。別の転写因子ファミリーであるｃ／ＥＢＰ−βについては本明細書で後述する。
【０００４】
転写因子は多重サブユニットからなる複合体として作用する。これらの複合体はゲノム内の応答性エレメントと呼ばれるドメインに対して親和性をもつ。ＤＮＡ鎖の１個以上の応答性エレメントは転写因子と結合してゲノムのより大きな部分であるプロモーター領域と相互作用する位置を形成する。転写因子とＤＮＡの応答性エレメント及びプロモーター領域の複合体形成はＤＮＡ上でプロモーターの下流に連結した遺伝子の転写速度を決定する。多数の転写遺伝子が二量体としてＤＮＡに結合していることに注目すべきである。従って、核内ステロイドホルモン受容体は通常、２個の同一又は密接に関連するサブユニットから構成される。現代の生化学理論では、転写因子は相互作用をもたない別々の分類に属するという認識はもはや時代遅れであり、転写因子は転写因子分類間で相互作用するという認識に代わっている。例えば、グルココルチコイドステロイド受容体単量体（ＧＲ）とＲｅｌＡの選択的結合相互作用が立証されている（Ｈａｒｎｉｓｈ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４１：３４０３−３４１１，２０００）。アンドロゲン受容体（ＡＲ）とＲｅｌＡの高親和性結合も発見された（Ｐａｎｅｔ−Ｒａｙｍｏｎｄら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，１６７，ｐｐ  １３９−１５０，２０００）。エストロゲン受容体α単量体はｃ−Ｊｕｎと複合体を形成することが示されている（Ｔｅｙｓｓｉｅｒら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６  ｐｐ  ３６３６１−３６３６９，２００１）。このような複合体は転写因子として機能する複合体の構成ブロックであるか、あるいは、所定量の利用可能な転写因子を吸収することにより転写因子を不活性複合体に封入すると考えられている（Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７５２−７５６，１９９４；Ｋａｌｋｈｏｖｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：６２１７−６２２４，１９９６）。
【０００５】
シグナル伝達メカニズムは転写因子サブユニット間の上記直接蛋白質−蛋白質相互作用により相互影響があるので、このような相互影響を表すものとしてクロストーク及び転写抑制なる用語が使用されている。転写抑制とはシグナル伝達経路間の負の影響を意味する。本発明はより詳細には、エストロゲン受容体ファミリーのメンバーとＮＦ−κＢ蛋白質の相互作用及び医薬の製造における前記相互作用の使用に関する。
【０００６】
ＥＲによるＮＦ−κＢシグナル伝達の効率的抑制は数件の研究に示されている（Ｑｕａｅｄａｃｋｅｒｓら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：１１５６−１１６６，２００１）。ＮＦ−κＢシグナル伝達に及ぼすＥＲの転写活性化及び転写抑制効果の基礎となるメカニズムは不明である。核内受容体とＮＦ−κＢが会合して大きな多量体複合体となるのではないかと考えられる。このような複合体は核内受容体、ＮＦ−κＢ及び数個の他の核内（コ）ファクターを含むが、依然としてＤＮＡと結合することができる。核内受容体とＮＦ−κＢシグナル伝達経路の相互作用の概念の１例を図１に示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は相互作用の程度に比例する検出パラメーターを提供することにより、インビトロシステムにおけるエストロゲン受容体（ＥＲ）と転写活性化蛋白質の直接相互作用を測定するための方法であって、転写活性化蛋白質がｃ−Ｒｅｌであることを特徴とする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従来は、ＥＲとある種のＮＦ−κＢとの弱い蛋白質−蛋白質相互作用しか報告されておらず（Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９７１−９，１９９５；Ｓｐｅｉｒ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８７：１００６−１０１１，２０００）、この相互作用はＥＲリガンドの存在に非依存性であった。これに対して、本明細書に記載するエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用はエストロゲン受容体と結合することによってエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を誘導することができる化合物の存在に依存する。
【０００９】
ＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用は心臓血管系、骨及び中枢神経系（ＣＮＳ）に及ぼすエストロゲンの所定効果に関与しているので、エストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの相互作用を測定すると共にこの相互作用に及ぼす化合物の影響を測定することが有用である。これらの組織はエストロゲンが医療処置で有益な効果を示す三大組織である。更に、乳癌の進行におけるＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用の役割も示唆されており（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３９：１６１−１６７，１９９４；Ｎａｋｓｈａｔｒｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：３６２９−３６３９，１９９７）、ＮＦ−κＢ誘導遺伝子は悪性腫瘍や化学療法耐性に役割を果たすと考えられる。
【００１０】
ノックアウト表現型はＮＦ−κＢ型の一方のみに関連する明白な機能を示さない（Ａｔｔａｒら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ８：９３−１０１，１９９７）が、ｐ５０とｐ５２を欠失する二重ノックアウトマウスは骨粗鬆症となり、骨代謝におけるＮＦ−κＢの役割を裏付けている（Ｉｏｔｓｏｖａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１２８５−１２８９，１９９７）。
【００１１】
骨では、ＮＦ−κＢ蛋白質は炎症性遺伝子（例えばサイトカイン）や細胞接着分子の調節に重要な役割を果たす。どちらの型の調節分子も骨ホメオスタシスにおける重要な共同因子である。特に、Ｉｌ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦα等の特定サイトカインは破骨細胞前駆細胞と成熟破骨細胞を刺激して骨吸収を増進する（Ｍａｎｏｌａｇａｓ，Ｂｏｎｅ  １７：６３Ｓ−６７Ｓ，１９９５）。エストロゲンはこのようなサイトカインの産生を阻害することにより骨量の維持に大きな役割を果たす（Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７５２−７５６，１９９４；Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９７１−９，１９９５）。骨代謝におけるＮＦ−κＢの重要性は上記のようなノックアウト試験により実証されている（Ｉｏｔｓｏｖａら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１２８５−１２８９，１９９７）。
【００１２】
ＣＮＳでは、数件の報告が種々のプロセスにおけるＮＦ−κＢの関与を示しているが、その厳密な役割はまだ不明である。シナプス可塑性、長期記憶及びアルツハイマー病に関連する因子がＮＦ−κＢの大脳特異的アクチベーターとして同定されている（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  ａｎｄ  Ｋａｒｌｔｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：２５２−２５８，１９９７；Ｇｒｉｌｌｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５００２−１５００７，１９９６）。更に、ＮＦ−κＢの阻害はニューロン細胞の生存に関連付けられている（Ｍａｇｇｉｒｗａｒら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７４：５２７−５３９，２０００，Ｉｒｖｉｎｇら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２８８：４５−４８，２０００）。更に、ＮＲ／ＮＦ−κＢクロストークと鬱病治療の有効な潜在的候補であるセロトニン系の関連付けも行われている（Ｗｉｓｓｉｎｋら，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５（４）：５４３−５２，２００１）。ＣＶでは、エストロゲンはアテローム性動脈硬化症の発症を抑えると考えられる。アテローム性動脈硬化症の発症の最初期イベントの１つは単球細胞の血管壁浸潤である。重要な段階の１つは循環からの単球の動員である。この動員は数段階からなる。単球と内皮の初期相互作用は一過性であると思われ、血管壁に沿って単球のローリングが生じる。ローリングする単球は次に内皮により産生された局所分泌因子により活性化され、その結果、血管壁に固定し、強く接着する。最後に、単球は内皮を移動する。初期ローリング相互作用はセレクチン（例えばＥ−セレクチン）により媒介され、強い接着と漏出は単球表面のインテグリンと内皮細胞により発現される免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーメンバー（例えばＩＣＡＭ，ＶＣＡＭ）の相互作用により媒介されると思われる。Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭの発現はＮＦ−κＢシグナル伝達を介するサイトカインによる全３種の遺伝子の転写活性化の結果として強化される。従って、このＮＦ−κＢにより誘導される細胞接着分子の発現を妨害することにより、アテローム性動脈硬化症をもたらす単球浸潤を緩和することができる。血管壁におけるｃ−Ｒｅｌの発現はバルーニングに応答して明白に増加し（Ｌａｎｄｒｙら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５１：１０８５−１０９５，１９９７）、血管形質転換におけるｃ−Ｒｅｌの役割を示唆している。
【００１３】
ｃ−Ｒｅｌの他の興味深い機能はプログラム細胞死の調節におけるその機能と、マクロファージ活性化におけるその役割である。ｃ−Ｒｅｌの過剰発現は骨髄細胞にアポトーシスを誘導するが、フィブロブラストでは細胞死に対して保護作用がある（Ａｂｂａｄｉｅら，Ｃｅｌｌ  ７５：８９９−９１２，１９９３）。ｃ−Ｒｅｌ欠損マウスに由来するマクロファージは炎症性サイトカインを正常レベルよりも高レベルで産生する（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：７０９９−７１０７，１９９６）。
【００１４】
文献に見られる情報に関する限り、ｃ−ＲｅｌがＲｅｌＡよりもＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制に重要であるらしいとする概念は新しい。従って、この概念はＥＲ／ｃ−Ｒｅｌ会合を選択的に誘導する化合物の選択に絶好の機会を与える。本発明はこのような化合物を同定するためのアッセイを提供する。本発明の１特定態様は酵母２ハイブリッドアッセイである。
【００１５】
本発明のこのような方法によると、システムに多数の化合物の各々を共存させて本発明の上記方法を、反復実施し、場合により平行し、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を強化する化合物を選択することにより、多数の化合物から骨粗鬆症の治療に有効な化合物を選択するための方法も提供される。
【００１６】
エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を強化する化合物の選択は動物モデル、好ましくは骨粗鬆症用動物モデルで更に改善することができる。
【００１７】
動物モデルとしては、インビボ骨粗鬆症モデルで骨量減少を予防するか又は骨形成を刺激する能力をモニターする方法が挙げられる。このモデルでは、．Ｅｄｅｒｖｅｅｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅｄｚ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１４（１１）：１９６３−７０，１９９９に記載されているように、３カ月齢卵巣切除ラットに試験化合物を４週間経口投与する。卵巣切除の直後に種々の用量の試験化合物の４週間経口投与を開始する。４週間投与後に大腿骨遠位骨幹端の小柱骨ミネラル密度（ＴＢＭＤ，ｍｇ／ｃｍ３で表す）をｐＱＣＴ（末梢型定量的コンピューター断層装置；ＸＣＴ  ９６０Ａ，Ｓｔｒａｔｅｃ，Ｂｉｒｋｅｎｆｅｌｄ，ドイツ）により測定する。解像度０．１４８ｘ０．１４８ｍｍで厚さ１ｍｍのスライスを含むスキャンを大腿骨の遠端から５ｍｍで行う。遠位大腿骨における小柱骨密度測定のアッセイ内及びアッセイ間変動は３％である。ＸＣＴ−９６０Ａはアクリルプラスチックに埋込んだヒドロキシアパタイトの標準で校正する。更に、皮質骨ミネラル密度を大腿骨の中間部位で測定することができる。
【００１８】
システムにおけるエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を誘導する化合物が提供されると、エストロゲン受容体（ＥＲ）とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させる化合物を加えることにより、システムにおける相互作用を変化させるための方法が提供される。本発明のこの側面のより特定的な態様では、化合物をシステムに加えることによりシステムにおける相互作用を変化させるための方法が、インビトロ培養培地をシステムとして選択することにより得られる。ＥＲ転写活性に及ぼす化合物の影響に比較して相互作用を選択的に変化させる化合物をシステムに加えることによりエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を変化させるためにこれらの方法を使用するのが最も好ましい。
【００１９】
前の段落で定義した方法に適切な化合物はエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を変化させるための治療処置に使用する医薬組成物の製造に使用することができる。このような治療処置は例えば骨粗鬆症の処置が好ましい。
【００２０】
本明細書では、用語は以下の意味をもつ。
【００２１】
２種の蛋白質間の直接相互作用とは蛋白質の天然環境に適合可能な状況下で化学親和性に基づく物理的接触を意味する。但し、これはこれらの蛋白質間の結合の増減だけを意味するのではなく、転写活性を阻止又は誘導するのに多少なりとも有効となるような結合複合体の二次構造の修飾も意味する。
【００２２】
転写活性化蛋白質とは遺伝子発現に転写活性化活性をもつ転写因子と呼ばれる蛋白質一般を意味する。転写活性化蛋白質はコファクター（コアクチベーター、コリプレッサー等）や転写機構に属する他の（転写）因子と相互作用し、これらと共に転写開始を調節する複合体を形成する。
【００２３】
エストロゲン受容体（ＥＲ）転写活性は、活性化ＥＲ二量体とゲノムの遺伝子調節部分である特定ＥＲ応答性調節エレメント（ＥＲＥ）との直接相互作用により得られる、エストロゲン受容体の転写活性化活性である。ＥＲ二量体の活性化の結果として、これはコアクチベーター及び他のコファクター、（転写）因子と相互作用し、転写機構と複合体を形成して転写開始を活性化する。「調節エレメント」又は「プロモーター」とは細胞においてＲＮＡポリメラーゼと直接又は間接的に結合して下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始することが可能なＤＮＡ配列を意味する。調節エレメントの活性化をシグナル伝達することが可能な異種レポーター遺伝子にプロモーターを連結してもよい。このような構築物では、プロモーターは異種遺伝子からの転写を変化させる。適切なレポーター遺伝子は例えばルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ及び分泌型胎盤性アルカリホスファターゼである。
【００２４】
エストロゲン受容体（ＥＲ）は、天然ホルモン１７β−エストラジオールに結合し、核内受容体ファミリー、より特定的にはステロイド受容体サブファミリーに属する蛋白質である。核内受容体の命名法は記載されている（Ｌａｕｄｅｔ  Ｖ．，Ａｕｗｅｒｘ  Ｊ．，Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｊ．−Ａ．＆  Ｗａｈｌｉ，Ｗ．（１９９９）  Ｃｅｌｌ  ９７  １６１−１６３）。現在、ＥＲαとＥＲβの２種の密接に関連するエストロゲン受容体が知られている。エストロゲン受容体は、１７β−エストラジオールと結合し、エストロゲン受容体の機能的等価物であり、ｃ−Ｒｅｌとのその相互作用において指定生物機能を維持する変異体及び修飾蛋白質でもよい。「機能的等価物」とは指定分子と同一生物機能を発揮することができ、共通の主要構造特徴をもち、当分野で一般に利用可能な技術に基づいて当業者が代替手段として利用可能な分子を意味する。多くの場合には、このような等価物は配列データにより定義される蛋白質と９０％、９５％、９８％又は９９％のアミノ酸一致度をもつ蛋白質として定義される。当然のことながら、ｃ−Ｒｅｌとの結合におけるエストロゲン受容体等価物の機能又は逆にエストロゲン受容体との結合におけるｃ−Ｒｅｌ等価物の機能をもつことを前提として、このような定義はより具体的な定義として本発明の定義に含まれる。本明細書では一致度百分率は以下のように定義される。
一致度（％）＝（２種の配列間の一致残基数）／（整列配列長−配列の最適アラインメント後の全ギャップ長）。
【００２５】
最適アラインメントはマッチ数を最大にし、ギャップ数を最少にするＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３−４５３（１９７０））を使用して実施することができる。
【００２６】
エストロゲン受容体に密接に関連する他の受容体はＥＲ関連受容体（ＥＲＲ）ＥＲＲα、ＥＲＲβ及びＥＲＲγであるが、これらはＥＲＲと結合するリガンドが実証されていないので、本発明で使用するエストロゲン受容体の定義には含まれない。
【００２７】
エストロゲン受容体−α（ＥＲα）はＥＲα遺伝子の翻訳産物であるα型エストロゲン受容体をコードする蛋白質である。これは本発明の方法で使用するのに好ましい蛋白質である。
【００２８】
ｃ−Ｒｅｌはｃ−Ｒｅｌ遺伝子に由来する蛋白質産物である。ｃ−Ｒｅｌは、相同のＲｅｌドメインを有し、遺伝子調節に関与するＮＦ−κＢファミリーのメンバーのつであり（Ｌｉｏｕ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：４７７−４８７，１９９３）、限定されないが、ＮＦ−κＢ１、Ｌｙｔ−１０、ｃＲｅｌ、ＲｅｌＡ及びＲｅｌＢがある。ｃ−Ｒｅｌには、エストロゲン受容体との指定相互作用における生物機能を維持し、ｃ−Ｒｅｌ遺伝子にコードされる蛋白質であり、ｃ−Ｒｅｌ遺伝子の転写と翻訳の産物であるｃ−Ｒｅｌの他の等価物も含まれる。
【００２９】
インビトロシステムは細胞を培養する培養培地であり、このシステムが使用する読取りシステムにおいて最適増殖及び／又は最適応答が得られるように最適化したものである。細胞培養用培地の典型例はＤＭＥＭ、α−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ又はＤＦである。これらの培地には、必ずしも必要ないが、多くの場合には増殖因子、血清、ビタミン、アミノ酸及び抗生物質等の付加因子を添加する。記載するインビトロシステムでは、ＥＲ−ｃＲｅｌ相互作用に及ぼす試験化合物の効果を試験するために１７β−エストラジオール又は試験化合物を培地に加える。
【００３０】
検出パラメーターはエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を測定するために使用される方法である。これは調節エレメントの活性化をシグナル伝達することが可能な異種レポーター遺伝子に融合したＮＦ−κＢ又はＥＲ応答性調節エレメントを含むプロモーターレポーター構築物の使用を含む。更に、直接相互作用はＥＲ及びｃ−Ｒｅｌと（酵母２ハイブリッドについて記載するように）β−ｇａｌの転写活性化又はＤＮＡ結合部分とのキメラ蛋白質を使用して測定することができ、ｇａｌレポーター構築物の誘導としてＥＲとｃ−Ｒｅｌとの直接相互作用を測定することができる。更に、他のプロモーター由来エレメントをレポーター遺伝子と併用してもよく、レポーター遺伝子が活性化されると、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの所望相互作用が可視化される。これはｃ−Ｒｅｌ又はエストロゲン受容体又はこのような遺伝子の蛋白質産物（例えばＩｌ−６又は他のサイトカイン）により発現を調節される遺伝子でもよい。より詳細には、具体的に相互作用に関すると最初に明示している場合には、パラメーターはエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用のインビトロ生物効果を意味し得る。
【００３１】
化合物による相互作用の強化とは、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの親和性を増加することによる強化すること又はエストロゲン受容体がｃ−Ｒｅｌと結合している複合体の効果を強化することを意味する。本発明の定義では理論に拘束されないが、強化化合物はエストロゲン受容体の二次構造を変化させ、この二次構造の変化によりｃ−Ｒｅｌとの有効な複合体に適正なコンホメーションが導入されると考えられる。
【００３２】
ＥＲ転写活性に及ぼす化合物の影響に比較して相互作用を選択的に変化させるとは、相互作用を変化させる化合物が選択システムに応じてＥＲ転写活性が観察される用量レベル又は濃度の２分の１以下の用量レベル又は濃度で作用することを意味する。
【００３３】
酵母２ハイブリッドアッセイは２種の蛋白質間の相互作用の程度を定量するための細胞法である。これは２種の試験蛋白質（この場合にはＥＲとｃ−Ｒｅｌ）とＧａｌ４の転写活性化又はＤＮＡ結合部分の融合蛋白質をコードする構築物を作製することにより実施される。ｇａｌの転写活性化又はＤＮＡ結合部分は単独ではｇａｌ４応答性β−ガラクトシダーゼレポーター構築物のレポーター活性を誘導することができない。２種の蛋白質の相互作用により、Ｇａｌ４の転写活性化又はＤＮＡ結合部分は極近接し、その結果、ｇａｌ応答性レポーターの誘導が生じる。より詳細には、本発明のこの態様では、エストロゲン受容体をＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合させ、ｃ−ＲｅｌをＧａｌ４の活性化ドメイン（ＡＤ）に融合させる。ＥＲ／Ｇａｌ４−ＤＢＤ融合蛋白質は酵母株でレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼの上流のＧａｌ４応答性エレメントと結合する。ＥＲとｃ−Ｒｅｌの相互作用は化合物依存性であるので、インビトロシステムの化合物濃度が増加するにつれて相互作用するＥＲ及びｃＲｅｌ分子の数は増し、飽和レベルに到達するまでβ−ガラクトシダーゼレポーター活性の増加として測定することができる。従って、β−ガラクトシダーゼレポーター活性の量はエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用の程度の指標である。
【００３４】
相互作用の程度とは、相互作用するＥＲ及びｃＲｅｌ分子の数を意味する。酵母２ハイブリッドと同様に、トランスフェクション試験又は他のシステムにおいて、相互作用の程度は相互作用するエストロゲン受容体及びｃＲｅｌ分子の数に依存する特定検出パラメーターにより測定することができる。従って、相互作用するエストロゲン受容体及びｃＲｅｌ分子の数は使用する検出パラメーターに比例する。
【００３５】
治療効力のある化合物を多数の化合物から選択することは医薬用化合物を見いだすために医薬産業及び関連産業で一般に使用されている。化合物の大きなストックから活性化合物をスクリーニングし、最も有効な化合物の指向的合成により更に最適化が得られる。本発明により提供される方法はエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を強化する活性化合物の検索で多数の化合物をスクリーニングするのに適している。このようなスクリーニングプログラムでは、相互作用の測定方法は多くの場合には比較データを得るために多数の化合物で平行して反復実施され、比較データに基づいて医薬化合物として開発するために最も活性な化合物を選択する。
【００３６】
エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を変化させるための治療処置は動物又はヒトの体内の相互作用を増減するために相互作用を変化させることを目的とする処置である。現代医療では得ようとする治療効果よりも所期生化学効果に基づいて処置を決定するのが一般的であるので、このような処置は所期生化学効果を得ることを目的とする。治療効果は当然のことながら処置の所期必要結果でなければならない。エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を変化させる処置の１具体例は骨粗鬆症の良好な処置である。破骨細胞と骨芽細胞における生化学メカニズムを説明するならば、本発明の主題である相互作用を目的とする化合物は骨粗鬆症の治療に有効であり、他の所期以外の弱い効果もある。しかし、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用を好ましくは選択的に変化させるための方法を提供することにより、本発明は骨粗鬆症の治療だけでなく広範囲の疾患の薬剤治療に利用できる。他の治療範囲の適応については本明細書の他の項に説明した。
【００３７】
「システム」なる用語は分子及び／又は生物学的に定義される環境を意味し、化合物を導入することができるインビトロシステムとインビボシステムを意味する。インビトロシステムは無傷細胞又は均質化生化学組成物中にＥＲ蛋白質とｃ−Ｒｅｌ蛋白質の両者を含む混合物であり、インビボシステムはＥＲ蛋白質とｃ−Ｒｅｌ蛋白質の両者を含む細胞であり、この細胞はヒト又は動物体内にある。
【００３８】
実施例にエストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの直接相互作用を変化させる化合物が記載されている。
【００３９】
このような化合物は医薬組成物によりシステムに直接添加することができる。
【００４０】
薬剤を１種以上の医薬的に許容可能な助剤と混合することによる医薬組成物の製造方法は当分野で周知である（Ｇｅｎｎａｒｏら，Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ；２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２０００，特にＰａｒｔ  ５：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ参照）。適切な助剤は例えばＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ａ．Ｗａｄｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４）に記載されている。薬剤と医薬的に許容可能な助剤の混合物を圧縮してピル、錠剤等の固体用量単位にしてもよいし、カプセルや座剤に加工してもよい。医薬的に適切な液体により、薬剤を溶液、懸濁液、エマルションの形態の注射製剤として投与してもよいし、スプレー（例えば鼻腔スプレー）として投与してもよい。例えば錠剤等の用量単位を製造するには、充填剤、着色剤、ポリマー結合剤等の慣用添加剤の使用が予想される。
【実施例１】
【００４１】
ＮＦ−κＢによる接着分子の調節とエストロゲンによるその抑制
本実施例はＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭ等の細胞接着分子のプロモーター、ＮＦ−κＢ蛋白質によるそれらの調節並びにその後のＥＲ−ｃＲｅｌ相互作用を誘導する化合物によるそれらの抑制に関する。ＥＲαによるＮＦ−κＢシグナル伝達の抑制を試験するために、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭの３種の接着分子をコードする遺伝子のプロモーターを合成３ｘＮＦ−κＢ応答性レポーターと平行使用した。全３種のプロモーターは数個のＮＦ−κＢ応答性エレメント（ＲＥ）を含み、核内受容体応答性エレメントは存在しない（別表１参照）。Ｅ−セレクチンプロモーターはｐ５０／ＲｅｌＡ、ＲｅｌＡ／ＲｅｌＡ及びＲｅｌＡ／ｃ−Ｒｅｌヘテロダイマーに最適なものからなる数個のＮＦ−κＢ応答性エレメントを含む（Ｐａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｍａｃｋｍａｎ，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２０８２３−２０８２５；Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，１９９８ａ；Ｃｈｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６７−７３，１９９８ｂ，１９９４？？；Ｋｕｎｓｃｈら，１９９２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１２−４４２１）。３ｘＮＦ−κＢレポーターは保存ｐ５０／ＲｅｌＡ応答性エレメント３コピーを含む（Ｗｉｓｓｉｎｋら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１９８：５０−６４，１９９７；Ｗｉｓｓｉｎｋら，Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５（４）：５４３−５２，２００１）。
【００４２】
３種のプロモーターのすべてがＩｌ−１β及びＴＮＦα等のサイトカインにより明白に誘導される。特に、Ｉｌ−１βによるＥ−セレクチンの誘導は極めて強力であり（未刺激プロモーター活性の１５倍）、最適化合成３ｘＮＦ−κＢ応答性レポーターの誘導と同様であった（データは示さず）。文献に報告されている研究はＮＦ−κＢの効果を試験する場合には主にＲｅｌＡとｐ５０を扱っている。炎症性刺激の結果として活性化ＲｅｌＡ−ｐ５０ヘテロダイマーが誘導され、例えばｃ−Ｒｅｌの発現と活性はＢ及びＴリンパ球等の炎症性細胞型で構成的に高レベルであるので、多くの場合にこの選択は論理的であると思われる（Ｇｒｕｍｏｎｔら；Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆ．４：７３１−７４３．１９９３；Ｄｏｂｒｚａｎｓｋｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４６０８−４６１６．１９９４）。しかし、エストロゲン剤に注目される応答型は急性炎症性応答ではなく、むしろアテローム性動脈硬化症の発症と骨ホメオスタシス中の骨芽細胞と破骨細胞の連続相互作用に関与する慢性的メカニズムである。
【００４３】
各種ＮＦ−κＢがＮＦ−κＢ応答性プロモーターの活性に及ぼす効果を試験するために、プロモーター−レポーターとＮＦ−κＢ蛋白質の組合せを試験するコトランスフェクション実験を設計した（表１）。Ｅ−セレクチンプロモーターの活性はｃ−ＲｅｌよりもＲｅｌＡにより強力に誘導されることが分かった。ＲｅｌＡとｃ−Ｒｅｌを同時発現させると、ＲｅｌＡとｃ−Ｒｅｌにより別々に誘導されるレベルの中間のプロモーター活性が誘導され、ＲｅｌＡ（ホモダイマー）はＲｅｌＡ／ｃ−Ｒｅｌヘテロダイマーよりも著しく強力なインデューサーであることが示唆された。３ｘＮＦ−κＢ応答性レポーターでは、ｃ−Ｒｅｌを含むヘテロダイマーはＲｅｌＡを含むホモ／ヘテロダイマーと同等に強力であった。両者レポーターに及ぼす効果から明らかなように、これらの場合、ｃ−Ｒｅｌ自体（ホモダイマーとして）は転写活性化活性がごく低い。これらのデータはｃ−Ｒｅｌがここで試験した遺伝子の転写活性化において他の型のＮＦ−κＢ蛋白質とのヘテロダイマーとして優先的に作用することを暗示している。
【００４４】
【表１】
2005525108.tif 000018
【００４５】
Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭのプロモーターを使用して、ＮＦ−κＢレポーターを介するＥＲとＮＦ−κＢシグナル伝達の機能的相互作用を試験した。全３種のプロモーター−レポーターはＩｌ−１βにより有効に誘導することができる（表２）。一過性トランスフェクション後に、Ｉｌ−１βにより誘導されたこれらのＮＦ−κＢ応答性プロモーターの活性はＥＲαとリガンドに依存して転写抑制することができる（表２）。これらの実験では完全な抑制は観察されず、Ｉｌ−１βにより誘導されたプロモーター活性は誘導された活性の６０％まで抑制される。これは平行して測定したこれらのプロモーターに及ぼすグルココルチコイドの転写抑制効果と同等である（データは示さず）。１７β−エストラジオールの用量応答は、１０−１１〜１０−１２Ｍの濃度で最大抑制の２分の１が生じることを示し、これはＵ−２  ＯＳ細胞でのＥＲＥ−転写活性化における１７β−エストラジオールのＥＣ５０値と同等である（データは示さず）。従って、１７β−エストラジオールは非選択的である。
【００４６】
次に、Ｕ−２  ＯＳ細胞で指定ＮＦ−κＢ蛋白質を過剰発現させることにより、ＥＲによる転写抑制がｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡ等の特定ＮＦ−κＢ型に限定されるか否かを調べた（表２）。これらの実験でもＥ−セレクチン、ＩＣＡＭ及びＶＣＡＭ遺伝子のプロモーター−レポーター構築物を使用した。ｃＲｅｌの過剰発現によるこれらのレポーターの顕著な活性化が観察された。この活性化はＥＲαとＥＲβの両者により強力且つ再現可能に転写抑制された（表２）。他方、レポーターはＲｅｌＡにより強力に誘導されたが、ＥＲのよるこの活性の抑制は観察されなかった（表２）。
【００４７】
【表２】
2005525108.tif 000019
【実施例２】
【００４８】
ＮＦ−κＢによるＥＲ及びＧＲ依存性プロモーター活性の相互抑制
ＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用がＮＦ−κＢ蛋白質により誘導される経路と保存エストロゲン応答性エレメント（ＥＲＥ）を介して活性化ＥＲにより誘導される経路を調節することは文献（Ｂｏｄｉｎｅら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０：２４３９−２４５１，１９９９）から公知である。前セクションではＥＲによるＮＦ−κＢシグナル伝達の抑制を示した。以下にはＮＦ−κＢ蛋白質によるＥＲシグナル伝達の抑制について記載する。これはＵ−２  ＯＳ骨芽細胞にＥＲ応答性プロモーターレポーターとＥＲα又はＥＲβ及びｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡを一過性トランスフェクションする試験により示した（表３）。これらの実験によると、特にＲｅｌＡはＥＲαにより誘導されるＥＲＥプロモーター活性の強力なリプレッサーである。ＥＲβでも同様の結果が得られた。
【００４９】
特筆すべき点として、ＥＲＥとＮＦ−κＢ応答性プロモーター活性化の抑制程度に相関があるとは思われない。ＥＲαとＥＲβは程度は異なるが、ｃ−Ｒｅｌにより誘導したＮＦ−κＢレポーターを抑制し、ＲｅｌＡにより誘導したレポーターには効果がなかった。他方、ｃ−ＲｅｌとＲｅｌＡはいずれもＥＲにより誘導したＥＲＥレポーターを抑制することができる。このことから、ＥＲ及びＮＦ−κＢ経路間に機能的クロストークが生じるが、これは各経路に異なる結果をもたらすらしい。
【００５０】
コンセンサスＧＲＥ−応答性レポーターシステムをＲｅｌＡ又はｃ−Ｒｅｌと併用すると、ＧＲとＲｅｌＡの同時発現の結果としてＧＲＥレポーターシステムに高い抑制活性が生じたが、ｃ−Ｒｅｌでは殆ど抑制は観察されなかった。これはＥＲとｃ−Ｒｅｌの相互作用の特異性を更に実証するものである。
【００５１】
【表３】
2005525108.tif 000020
【実施例３】
【００５２】
ＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制及び内因性遺伝子発現
インビボ及び薬剤治療におけるＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用の意義を実証するために、機能的ＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用を内因性遺伝子発現レベルで試験した。
【００５３】
Ｅ−セレクチンとＶＣＡＭは、いずれの遺伝子も内皮細胞型に選択的であるが、当時十分なＥＲα濃度の内皮細胞を入手できなかったので、内皮細胞における内因性Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭ発現に及ぼすエストロゲン効果を試験することはできなかった。従って、アテローム性動脈硬化症の機能的動物モデルでＥ−セレクチンとＶＣＡＭの内因性発現の調節を試験した（表４）。ウサギはヒトと同様に、高コレステロール飼料に応答してアテローム性動脈硬化症を発症する。ウサギにこのようなアテローム発生飼料を何週間も与えることにより、試験した大動脈の全領域（大動脈弓、腹部及び胸部大動脈）でＥ−セレクチンとＶＣＡＭの両者の発現の増加を認めることができた。重要な点として、Ｅ−セレクチンとＶＣＡＭのこれらの誘導レベルは１７β−エストラジオール投与により抑制されることが判明し（表４）、ＮＦ−κＢシグナル伝達がエストロゲンによりインビボ転写抑制されることが実証された。
【００５４】
【表４】
2005525108.tif 000021
【実施例４】
【００５５】
ＥＲ／ＮＦ−κＢ相互作用を測定するための酵母２ハイブリッド結合アッセイ
組織選択的バックグラウンドと無関係にＥＲとｃ−Ｒｅｌの相互作用を選択的に誘導する化合物をスクリーニングするためにはＨＴＳアッセイを使用することができる。この目的のために、スクリーニング目的に適切な酵母２ハイブリッドシステムを使用したＥＲ／ｃ−Ｒｅｌ蛋白質−蛋白質相互作用アッセイを例示する。
【００５６】
全長ＥＲαは強力な転写活性を示すので、Ｎ末端を切断した転写サイレントＥＲα変異体（δＡＢ）を使用してＥＲαとｃ−Ｒｅｌの相互作用を検出した。ＧＡＬ４−ＤＢＤに融合した全長ＥＲβは固有活性を示さないので、全長ＥＲβは相互作用試験に使用できなかった。
【００５７】
こうして、ＥＲαとｃ−Ｒｅｌの強力なエストロゲン依存性相互作用が検出された。ＥＲβとｃ−Ｒｅｌにも同様の相互作用が認められた（表５）。切断型ＥＲα構築物を使用すると、ＥＲαとｃ−Ｒｅｌの相互作用はＥＲαのＬＢＤに依存することが分かった（表５）。特筆すべき点として、ＲｅｌＡとＥＲαとやＲｅｌＡとＥＲβとの相互作用は認められなかった（表５）。これはエストロゲンがＲｅｌＡにより誘導したレポーター活性を抑制しなかったという知見（表２）に一致するが、ＲｅｌＡの過剰発現がＥＲαとＥＲβの両者により誘導したＥＲＥ転写活性化を強力に抑制したという知見（表３）とは明らかに反する。これは哺乳動物細胞の細胞質における（ＩκＢと会合した）種々の不活性ＮＦ−κＢ蛋白質のプールの存在により説明することができる。一方のＮＦ−κＢ型の過剰発現は活性型と不活性型のＮＦ−κＢ蛋白質間のバランスを調節すると予想されるので、ホモ及びヘテロ二量化を変化させると考えられる。
【００５８】
酵母２ハイブリッドシステムにおけるｃ−ＲｅｌとＥＲαの相互作用を高スループットアッセイに変換した。このアッセイはＥＲαとこのＮＦ−κＢの会合の強力なインデューサーである化合物の選択に使用することができる。
【００５９】
【表５】
2005525108.tif 000022
【実施例５】
【００６０】
内皮細胞に及ぼすＥＲの有益な効果の転写抑制アッセイ
高スループット相互作用アッセイにより選択される化合物を更に特性決定するためには、実施例１〜３に記載した結果に基づく機能的転写抑制アッセイが必要であった。Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＣＡＭプロモーターを用いてＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制試験を開始した当初の目的は、エストロゲンのアテローム保護効果の予測値が高いアッセイを開発することであった。疫学試験によると、月経閉止前の女性はアテローム性動脈硬化症を発症する危険が低いことが示されている。エストロゲンが心臓血管疾患に対して保護作用があるという概念を裏付けるインビトロ及びインビボデータもある（Ｓｋａｆａｒら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｍｅｔａｂ．８２：３９１３−３９１８．１９９７）が、臨床試験は必ずしもこれらのデータを裏付けていない（Ｈｕｌｌｅｙら，ＪＡＭＡ  ２８０：６０５−６１３，１９９８）。
【００６１】
エストロゲンがアテローム保護作用をもつと考えられるメカニズムの１つはアテローム動脈硬化症の発症中の恐らくＮＦ−κＢシグナル伝達の妨害による炎症反応の阻害である。ＮＦ−κＢ蛋白質は炎症性遺伝子（例えばサイトカイン）や細胞接着分子の発現調節に重要な役割を果たす（実施例１）。細胞接着分子の発現はエストロゲンにより抑制することができ、サイトカインにより誘導したＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ及びＥ−セレクチンプロモーターの活性はエストロゲンにより阻害することができる（実施例１）。
【００６２】
本実施例はＴ２４／ＥＣＶ細胞株でＥ−セレクチン又はＶＣＡＭプロモーターをＥＲαと組合せたアッセイに関する。ＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制アッセイでは、安定なＥＲα発現クローンを生産するのに適した唯一の入手可能な内皮細胞株であると考えられたＥＣＶ３０４細胞株を使用したことに留意されたい。その後、ＡＴＣＣはＥＣＶ３０４細胞が内皮細胞ではなく、Ｔ２４膀胱癌細胞であると報告している。サイトカイン誘導とエストロゲンによる抑制量を増加するために、Ｅ−セレクチン及びＶＣＡＭプロモーターのＮＦ−κＢ応答性領域の多重コピーを使用して新規レポーターＥＬＡＭ１ａ、ＥＬＡＭ２、ＥＬＡＭ−ＨＭＧ、ＶＣＡＭ１−２、ＶＣＡＭ２、及びＶＣＡＭ３を構築した（レポーター詳細については別表１参照）。種々のＥ−セレクチン及びＶＣＡＭプロモーター由来レポーターの一過性トランスフェクションは、ＥＬＡＭ−ＨＭＧ及びＶＣＡＭ３で特に良好な結果を示した（サイトカインによる再現可能な高レベル誘導と５０％を上回るＥＲαによる抑制）［表６］。
【００６３】
【表６】
2005525108.tif 000023
【００６４】
これらのデータはＥＲαとＥＬＡＭ−ＨＭＧ又はＶＣＡＭ３レポーターを発現する安定にトランスフェクトしたクローンで確認された（表７）。残念ながら、クローンは長期細胞培養中に測定した転写抑制安定性が低いので非常に多数の化合物の試験には適していないことが分かった。この点は最近の報告（Ｑｕａｅｄａｃｋｅｒｓら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４２：１１５６−１１６６，２００１）に一致しており、安定にトランスフェクトした細胞では一過性トランスフェクトした細胞に比較してＥＲαによるＮＦ−κＢシグナル伝達の転写抑制が低下することを示している。従って、上記アプローチは高スループット転写抑制アッセイの設計の最適選択ではない。
【００６５】
【表７】
2005525108.tif 000024
【実施例６】
【００６６】
骨芽細胞に及ぼすＥＲの有益な効果の転写抑制アッセイ
エストロゲンは、破骨細胞活性を刺激して骨吸収を刺激する骨芽細胞によりサイトカイン産生を阻害して、骨吸収と骨形成のバランスを維持する。ＥＲ／ＮＦ−κＢ転写抑制とＩＬ−６産生の関連性を更に詳細に分析した。骨芽細胞前駆細胞Ｕ−２  ＯＳをＩＬ−１β等のサイトカインで刺激すると、内因性ＩＬ−６蛋白質の産生が増加する。他方、Ｕ−２  ＯＳ細胞にＩＬ−１βとエストロゲンも投与すると、ＩＬ−６の産生増加は抑制される［表８］。
【００６７】
【表８】
2005525108.tif 000025
【００６８】
エストロゲンによるＩＬ−６産生の抑制における機能的ＥＲα／ｃ−Ｒｅｌ相互作用の役割を調べるために、ＩＬ−６遺伝子のプロモーターを含むレポーター構築物を使用してＥＲα及びＮＦ−κＢ蛋白質の種々の組合せがＩＬ−６産生に及ぼす効果を分析した。この分析もＮＦ−κＢ蛋白質に対するＥＲαの特異性を確認する。ｃ−Ｒｅｌによるレポーター誘導はエストロゲンにより刺激したＥＲにより強力に抑制することができたが、ＲｅｌＡにより誘導したレポーター活性には効果が認められなかった［表８］。文献［Ｒａｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｆｏｎｔａｉｎｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：７５２−７５６，１９９４；Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：４９７１−９，１９９５］の記載通りに、エストロゲンはｃ／ＥＢＰβに転写抑制効果を示すことが分かった［表９］。特に、ｃ−Ｒｅｌとｃ／ＥＢＰβは相乗的にＩＬ−６プロモーター−レポーターを誘導し、これはエストロゲンにより強力に抑制することができる。ＲｅｌＡとｃ／ＥＢＰβの同様の相乗効果がエストロゲンにより抑制できなかったという知見もＮＩＦ−κＢにより誘導した遺伝子発現におけるｃ−Ｒｅｌ／ＥＲα相互作用の重要性を裏付けている。
【００６９】
【表９】
2005525108.tif 000026
【実施例７】
【００７０】
ＥＲＥ由来転写活性よりもＥＲ／ｃＲｅｌ相互作用を誘導するための化合物の選択性
実施例４では、エストロゲン受容体とｃ−Ｒｅｌの相互作用の強力なインデューサーである化合物の選択に使用する酵母２ハイブリッド法について記載した。表１０はこのアッセイフォーマットにおける４種の化合物の典型的な結果を示す。ＥＲの直接転写活性の誘導に対してＥＲ／ｃ−Ｒｅｌ相互作用におけるこれら化合物の選択性を試験するために、Ｔ２４／ＥＣＶ細胞でサイトカインにより誘導したＥＬＡＭ−ＨＭＧプロモーターレポーター活性の抑制についてこれら化合物を希釈系列で試験した（アッセイフォーマットの詳細については実施例５参照）。ＣＨＯ又はＵ−２  ＯＳ細胞におけるＥＲＥ転写活性化についてもこれら化合物の希釈系列を平行して試験した。
【００７１】
Ｕ−２  ＯＳにおけるＥＲＥ転写活性化を測定するために、細胞にＥＲα及びＥＲＥ由来プロモーターレポーター構築物ｐＲｏ−ｌｕｃを一過性トランスフェクトした。この構築物はラットオキシトシンプロモーターに存在する保存エストロゲン応答性エレメントによりＥＲ転写活性に相当するプロモーターの部分を含む（別表２参照）。使用したオキシトシンプロモーターの部分はＮＦ−κＢ応答性エレメントを含まない。ＣＨＯ細胞におけるＥＲＥ転写活性化には、ＥＲαとｐＲｏＬｕｃを安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞クローンを使用した。
【００７２】
上記アッセイで作成した用量−応答曲線に基づき、全３種の化合物と１７β−エストラジオールのＥＣ５０値を決定した。ＥＣ５０値は化合物の最大効果の２分の１が観察される濃度である。使用したアッセイでは、これは最大抑制の２分の１（ＥＬＡＭ−ＨＭＧレポーターの場合）でもよいし、最大誘導の２分の１（酵母２ハイブリッドにおけるＥＲαとｃ−Ｒｅｌの相互作用の場合又はＥＲＥ−レポーター活性の場合）でもよい。
【００７３】
表１０の結果によると、Ｏｒｇ３８６３３、Ｏｒｇ３８６３５及びＯｒｇ１０２１７は転写活性（ＣＨＯ細胞におけるＥＲＥ−レポーター）よりもＥＲα／ｃＲｅｌ転写抑制（Ｔ２４／ＥＣＶ細胞におけるＥＬＡＭ−ＨＭＧレポーター）に選択性を示す。ＥＲαの天然ホルモン（１７β−エストラジオール）はこの選択性を示さず、ＥＲ／ＥＲＥ転写活性化よりもＥＲ／ｃ−Ｒｅｌ転写抑制のほうが弱いとさえ思われる。
【００７４】
【表１０】
2005525108.tif 000027
【００７５】
５．材料と方法
細胞培養
ヒト骨肉腫Ｕ−２ＯＳ（ＨＴＢ−９６）、サル腎ＣＯＳ−１（ＣＲＬ−１６５０）及びヒトＥＣＶ３０４（ＣＲＬ−１９９８）細胞はＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。ＥＣＶ３０４細胞はＡＴＣＣからヒト内皮細胞として販売されたが、その後、ＡＴＣＣはこの細胞株が実際はヒト膀胱上皮癌細胞株Ｔ２４であると報告している。従って、これらの細胞を本発明ではＴ２４／ＥＣＶと呼ぶ。ＥＣＶ３０４／Ｔ２４（−ＥＲα）、Ｕ−２ＯＳ及びＣＯＳ−７細胞はフェノールレッド不含ダルベッコ変法培地（ＤＭＥＭ）とＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（＝Ｍ５０５）の１：１混合物に１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えた中で増殖させた。実験はＭ５０５＋１０％ＦＣＴＳ（血清からステロイド活性を除去するためにデキストランを被覆した活性炭で処理したウシ胎仔血清）中で実施した。
【００７６】
使用した構築物
ｐＫＣＲＥ−ＥＲα、ｐＫＣＲＥ−ＥＲβ及びｐＮＧＶ１−ＧＲはヒト野生型エストロゲン受容体α（ＥＲα）、ＥＲβ又はＧＲを夫々ＳＶ４０プロモーターの制御下に含む。ｐＣＭＶ４−ｃ−Ｒｅｌ発現ベクターはｃ−Ｒｅｌのコーディング領域をｐＣＭＶ４ベクターにクローニングすることにより作製した（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，１９８９）。ｐＧＬ３−ＥＬＡＭ、ｐＧＬ３−ＶＣＡＭ及びｐＧＬ３−ＩＣＡＭは別表１に要約するような配列を使用してＰＣＲにより構築した。ルシフェラーゼレポータープラスミド３＊ＮＦ−κＢ−ＴＫは単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーターの手前にＩＣＡＭプロモーター（ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｔｏｌｐｅら；Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：６１８５−６１９２．１９９４）に由来するＮＦ−κＢ結合部位の３個の反復配列を挿入することにより構築した。ＴＫプロモーターをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。オリゴヌクレオチドプライマー５’−ｃａｔａｃｇｇｔａａｇｃｔｔｇｇｇｇｔｃａｔｃｇｃｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃｃｇｃｃｃｇａｔｔｇｃｔｔｔａｇｃｔｔｇｇａａａｔｔｃｃｇｇａ−３’及び５’−ｇｔａｔｇｃｃａａａｇｃｔｔｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔｃｃｇｇａａｔｔｔｃｃａａｇｃｔａａａ−３’をアニールした後にＰＲＣ増幅し、ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターにサブクローニングすることによりＮＦ−κＢ結合部位の三重反復配列を構築した。ＨｉｎｄＩＩＩを使用してインサートを切出し、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にし、ｐＧＬ３−ｔｋ−ｌｕｃのＳｍａＩ部位にライゲーションした。４ｘＥＲＥ−ＴＡＴＡ  Ｌｕｃ（プラスミド番号４６０）はエストロゲン応答性エレメントの４個の反復配列とその後にＴＡＴＡボックスとルシフェラーゼ遺伝子を含む。哺乳動物細胞のトランスフェクション効率をモニターするための陽性対照ベクターとしてｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ（ｐＳＶβ）対照ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用した。ＳＶ４０初期プロモーター及びエンハンサーはβ−ガラクトシダーゼ酵素をコードするＬａｃＺ遺伝子の転写を誘導する。酵母２ハイブリッド構築物ｐＧＡＤ４２４−ＥＲα、ｐＧＡＤ４２４−ＥＲαｄＡＢ及びｐＧＡＤ４２４−ＥＲβは夫々ヒトＥＲα、ＡＢドメインを欠失するＥＲα及びヒトＥＲβ  ＤＮＡをｐＧＡＤ４２４にクローニングすることにより構築した。ｐＧＡＤ４２４−ＥＲαＬＢＤはＰＣＲにより得られたＥＲαのＬＢＤをｐＧＡＤ４２４ベクターのＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ部位にクローニングすることにより構築した。ｐＧＢＴ９−ｃ−ＲｅｌはｐＣＭＶ４−ｃ−ＲｅｌでＰＣＲにより得られたｃ−ＲｅｌフラグメントをｐＧＢＴ９のＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより構築した。ｐ６５／ＲｅｌＡｃＤＮＡはｐＣＭＶ４−ｐ６５でＰＣＲにより得られた。このフラグメントをｐＧＥＸ４Ｔ１にクローニングし、これを使用してｐ６５／ＲｅｌＡｃＤＮＡをｐＧＡＤ４２４の平滑化ＸｍａＩ部位にサブクローニングした。
【００７７】
６種のＮＦ−κＢ応答性レポーターｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ１ａ、ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ２、ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ  ＨＭＧ、ｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ１−２、ｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ２及びｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ３（夫々プラスミド番号１９２１〜１９２６）はアニールしたプライマーをｐＨＧＬ３−ＴＡＴＡのＫｐｎＩ及びＳａｃＩ部位にライゲーションすることにより構築した。プライマーはＥＬＡＭ及びＶＣＡＭプロモーターのＮＦ−κＢ−ＲＥ配列に基づいて設計した（別表１参照）。より高い絶対ルシフェラーゼシグナルが得られるようにＮＦ−κＢ−ＲＥの数個のコピーをクローニングした。ＥＬＡＭ  ＨＭＧ構築物は二重反復配列を含み、他の構築物は３個のＮＦ−κＢ−ＲＥを含む。プライマー及びレポーター配列については別表１を参照されたい。
【００７８】
トランスフェクション
一過性トランスフェクション
一過性トランスフェクションでは、細胞を６ウェルプレートに播種した（２．１０５細胞／ウェル）。２又は３日後に細胞にレポーター、発現ベクター及びβ−ガラクトシダーゼ対照ベクターをトランスフェクトした。２種の異なる実験設定を使用した。ＩＬ−１βにより誘導したプロモーター活性の転写抑制を試験するために、レポーター構築物１μｇ、（ＥＲα、ＥＲβ又はＧＲを含む）発現ベクター１μｇ、及びβ−ガラクトシダーゼ対照プラスミド０．２５μｇを細胞にトランスフェクトした。転写抑制とｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡ過剰発現の組合せを試験するために、レポーター構築物１μｇ、（ＥＲα、ＥＲβ又はＧＲを含む）発現ベクター１μｇ、ｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡを含む発現ベクター０．１又は１．０μｇ、及びβ−ガラクトシダーゼ対照プラスミド０．２５μｇを細胞にトランスフェクトした。インサートを欠失する適当な発現ベクターを加えることにより等価量のＤＮＡが得られた。一過性トランスフェクションはリポフェクチン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。リポフェクチンを使用した一過性トランスフェクションは製造業者の指示に多少の変更を加えて実施した。トランスフェクトするＤＮＡ１μｇにつきリポフェクチン５μｌを使用し、細胞をトランスフェクション混合物と共に５時間インキュベートした後、トランスフェクション混合物を吸引し、Ｍ５０５＋０．５μｇ／ｍｌインスリン＋５μｇ／ｍｌトランスフェリン＋試験化合物（例えばＩＬ−１βと１７β−エストラジオールの各種組合せ）に交換した。トランスフェクトした細胞を試験化合物と共に一晩インキュベートした後に細胞溶解させた。ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性の測定は夫々ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＧａｌａｃｔｏ−ｌｉｇｈｔ  ｐｌｕｓ（Ｔｒｏｐｉｘ）を製造業者のプロトコールに従って使用して実施し、Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０マルチラベルカウンター，Ｗａｌｌａｃで測定した。β−ガラクトシダーゼ活性の検出をトランスフェクション効率の対照として使用した。
【００７９】
安定なトランスフェクション
細胞を６０ｍｍ皿に密度１．１０６細胞／皿及び総容量１０ｍｌで播種した。２日間増殖後に、細胞に適当なプラスミドをトランスフェクトし、必要に応じてＰＡＧ６０等の選択プラスミド（１０：１比）を加えた。プラスミドはＯｐｔｉＭｅｍ２００μｌに加えた。リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）２５μｌにＯｐｔｉＭｅｍ１７５μｌを加えて３０分間室温でインキュベートした。ＤＮＡ／ＯｐｔｉＭｅｍ溶液をリポフェクチン溶液に加え、１５分間室温でインキュベートした。次に、ＯｐｔｉＭｅｍ３．６ｍｌを加えた。細胞をＭ５０５  ５ｍｌで２回洗浄し、トランスフェクション溶液を細胞に加えた。５時間トランスフェクション後に、培地をＭ５０５＋１０％ＦＣＳに交換した。細胞を２日間インキュベートし、トリプシン処理し、９６ウェルプレートでＭ５０５＋１０％ＦＣＳ＋抗生物質（ｐＫＣＲＥ−ＥＲ／ＰＡＧ６０コトランスフェクションにはネオマイシン又はｐＨＧＬ３−ＮＦ−κＢ−ＲＥレポータープラスミドにはハイグロマイシン）に分割した。培地を週２回交換した。抗生物質耐性コロニーを約２週間後にスコアした。ｐＫＣＲＥ−ＥＲをトランスフェクトしたＴ２４−ＥＣＶ細胞については、３＊ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−Ｌｕｃを一過性トランスフェクションし、１７β−エストラジオールと共にインキュベーションすることによりＥＲαの有無を調べた。ｐＨＧＬ３ＥＬＡＭ  ＨＭＧ又はｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ３をトランスフェクトしたＴ２４−ＥＣＶ及びＴ２４−ＥＣＶ−ＥＲα細胞については、ＩＬ−１β及びＩＬ−１β＋Ｅ２と共にインキュベーションすることによりＮＦ−κＢ−ＲＥレポータープラスミドの有無を調べ、転写抑制百分率が最高のクローンを記録した。
【００８０】
ＲＮａｓｅ保護アッセイ
動物試験と細胞培養
ウサギの処理の実験プロトコールは従来記載されている（Ｓａｎｔｅｇｏｅｔｓら，１９９７）。要約すると、ニュージーランドシロウサギ（各実験群２羽）を卵巣切除した後に高コレステロール飼料を２、４、８又は１８週間与えた。動物屠殺の４又は１２時間前に、動物に１７β−エストラジオール（Ｏｒｇ  ２３１７）３μｇ／ｋｇを皮下注射するか又はプラセボ投与した。
【００８１】
ＲＮａｓｅ保護試験の細胞培養は１７５ｃｍ２フラスコで実施した。１０％ＦＣＴＳを添加したＭ５０５でＴ２４−ＥＣＶ、Ｔ２４−ＥＣＶ−ＥＲα−ＥＬＡＭ  ＨＭＧ  ２Ｂ８及びＴ２４−ＥＣＶ−ＥＲα−ＶＣＡＭ  ３  ３Ａ１０細胞を３日間増殖させた後、Ｍ５０５（０．１％ＢＳＡ添加）で希釈した１００Ｕ／ｍｌ  ＩＬ１β及び１．１０−８Ｍ１７β−エストラジオールの一方又は両方で細胞を６時間刺激した。
【００８２】
ＲＮＡ単離
組織試料又はＴ２４／ＥＣＶ−ＥＲα細胞からの全ＲＮＡの単離はＲＮＡｚｏｌ  Ｂ（Ｃａｍｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の指示に従って使用して実施した。化合物と共にインキュベーション後にＴ２４／ＥＣＶ−ＥＲα細胞をトリプシン処理し、Ｍ５０５＋１０％ＦＣＳに再懸濁し、計数した。次に、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡｚｏｌＢを使用して細胞ペレットからＲＮＡを単離した。ＲＮＡをＡ２６０測定により定量し、Ａ２６０／Ａ２８０比の測定により純度を分析した。ＲＮＡは７０％エタノールと０．１Ｍ  ＮａＡｃ中で−２０℃にて保存した。
【００８３】
ＲＮａｓｅ保護プローブ
サイトカインの各種組合せの発現レベルの測定に使用したＲＮａｓｅ保護プローブはＲｉｂｏＱｕａｎｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の市販プローブセットｈＣＫ−３、４及び５とした。ウサギ大動脈でのＲＮａｓｅ保護には、ＲＴ−ＰＣＲによりＶＣＡＭ及びＥ−セレクチンのプローブを作製した。第１鎖ｃＤＮＡ合成はＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とランダムヘキサヌクレオチドを製造業者の指示に従って使用してウサギ大動脈弓全ＲＮＡ２．５μｇで実施した。ＰＣＲはｔａｑポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を製造業者の指示に従って使用した。使用したプライマーはＥ−セレクチンにはＧＡＴＧＡＧＧＣＣＡＧＴＧＣＴＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣとＧＣＴＣＡＣＡＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＧＣＣを使用し、ＶＣＡＭにはＣＴＣＴＴＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＣとＣＡＧＴＡＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＣＴＴＧＡＡＣを使用した。適当な長さのフラグメントをＰＣＲ−２．１にサブクローニングし、配列をシーケンシングにより再確認した。プローブ鋳型はＴ７とインサート特異的プライマーの組合せを使用したＰＣＲにより作製し、ＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎゲル抽出キットで精製した。使用したプライマーはＴ７ではＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧを使用し、Ｅ−セレクチンとＶＣＡＭには夫々上記プライマーを使用した。未保護／保護ＲＮａｓｅ保護プローブの長さは夫々Ｅ−セレクチン４９４／４２６ｂｐ、ＶＣＡＭ７１７／６４９ｂｐ、ＧＡＰＤＨ１８６／１１８ｂｐとした。
【００８４】
プローブ標識
上記のように作製した鋳型からインビトロ転写キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ及び［α−３２Ｐ］ＵＴＰ取込みを使用してアンチセンスＲＮＡプローブを合成した。放射性ヌクレオチドはＮＥＮ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．から入手した。転写はＲＮａｓｉｎ２０Ｕ、ＧＴＰ、ＡＴＰ及びＣＴＰ各１３７．５μＭ、ＵＴＰ３．０５μＭ、［α−３２Ｐ］ＵＴＰ１．６７μＭ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ＤＴＴ１０μＭ、５ｘ転写用緩衝液２μｌ、夫々Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＧＡＰＤＨの２本鎖ＤＮＡ鋳型１０、１５及び５ｎｇ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１０Ｕを含有する反応液１０μｌ中で３７℃にて１時間実施した。転写の終了はＤＮａｓｅ１Ｕを加えた後にフェノール−クロロホルム：イソアミルアルコール抽出とエタノール沈殿により行った。プローブ活性はＴＲＩ−ＣＡＲＢ液体シンチレーションアナライザー（Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。
【００８５】
ＲＮａｓｅ保護分析
ＲＮａｓｅ保護分析はＲＰＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して実施した。全ＲＮＡ１０μｇを各プローブ約３ｘ１０５ｃｐｍと５６℃で１６時間ハイブリダイズさせた。次に試料を３０℃で４５分間ＲＮａｓｅで消化した。保護フラグメントはＧｅｎｏｍｙｘ  ＬＲ電気泳動システム（Ｇｅｎｏｍｙｘ）を使用して６％ポリアクリルアミドゲルで分析した。電気泳動は２５００Ｖ及び１２５Ｗで５０℃の一定温度にて２時間実施した。ＲＮａｓｅ保護結果はＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ  Ｓｔｏｒｍ  ８４０と付属のＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して定量した。定量後に、各保護バンドのシグナルをＧＡＰＤＨシグナルで割ることによりＲＮＡの厳密な使用量の補正を行った。
【００８６】
ＲＮＡ存在量とハイブリダイゼーションに使用したプローブの量の直線相関の対照として、ウサギ組織試料におけるｖｃａｍ及びＥ−セレクチン発現の測定、増加量の肝臓ＲＮＡを使用した場合にはハイブリダイゼーションシグナルの測定と平行して対照実験を行った。ＧＡＰＤＨ発現の上記補正後に、この結果として実際にＥ−セレクチンとＶＣＡＭをコードする等量のｍＲＮＡが得られた（結果は示さず）。
【００８７】
酵母２ハイブリッド
各種ＥＲ構築物を含むｐＧＡＤ４２４とｃ−Ｒｅｌ又はＲｅｌＡ構築物を含むｐＧＢＴ９による酵母株ＳＦＹ５２６の形質転換は酢酸リチウム法を使用して実施した。５個の固体クローンを選択し、Ｇａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）レポーター遺伝子アッセイシステム（Ｔｒｏｐｉｘ，カタログ番号ＧＳＹ  １０００）を使用するβ−ガラクトシダーゼアッセイで１７β−エストラジオールの濃度系列により試験した。１７β−エストラジオール応答性に基づいて最良のクローンを選択した。
【００８８】
ＩＬ−６蛋白質の検出
ＥＲαを安定して過剰発現するＵ−２  ＯＳ細胞（Ｕ−２  ＯＳ−ＥＲα細胞）により分泌されるヒトＩＬ−６の抑制を試験するために、標準サンドイッチＥＬＩＳＡを使用した（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡキット＃ＤＹ２０６）。細胞を２４又は９６ウェルプレートでＭ５０５＋デキストランを被覆した活性炭で処理した血清（即ち１０％ＢＣＴＳ）にプレーティングし、９０％コンフルエントまで増殖させた。細胞を１７β−エストラジオール又は他のＥＲ調節化合物の不在下又は存在下にＩｌ−１β、ＴＮＦα及びＩＦＮγの各種組合せ等のサイトカインで一晩処理した。
【００８９】
ＥＬＩＳＡは以下に簡単に説明するように製造業者のプロトコールに従って実施した。細胞を適当な濃度の化合物と共に一晩インキュベーション後に、予め抗ＩＬ−６捕獲抗体で一晩被覆しておいた９６ウェルプレートに上清を移した。次に、捕獲されたＩＬ−６をビオチン化抗ＩＬ−６検出抗体とストレプトアビジン−ＡＰで検出した。次に、化学発光基質ＣＳＰＤ（Ｅｌｉｓａ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標），＃ＥＬ１００ＣＹ，Ｔｒｏｐｉｘ）を使用してウェル当たりのＩｌ−６濃度を定量した後、Ｖｉｃｔｏｒマルチラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で発光量を測定した。
【００９０】
別表１
夫々Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ及びＩＬ−６プロモーターのクローニング部分の配列。ＡＴＦ−２部位を点線の下線で示し、コンセンサスＮＦ−κｒＢ部位を一重下線で示し、ｃ／ＥＢＰβ部位を二重下線で示し、転写開始部位を太字で示す。番号は転写開始部位を基準とする。
【００９１】
【表１１】
2005525108.tif 000028
2005525108.tif 000029
【００９２】
ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ１α、ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ２、ｐＨＧＬ３−ＥＬＡＭ  ＨＭＧ、ｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ１−２、ｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ２及びｐＨＧＬ３−ＶＣＡＭ３レポーターの構築に使用したプライマーの配列。
【００９３】
【表１２】
2005525108.tif 000030
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【００９４】
別表２
ＥＲＥコンセンサス：ＧＧＴＣＡ  ＮＮＮ  ＴＧＡＣＣ
エストロゲン受容体の転写活性を測定するために使用したラットオキシトシンプロモーターのクローニング部分の配列。公表ＥＲＥパリンドロームコンセンサス部位（ＧＧＴＣＡ  ＮＮＮ  ＴＧＡＣＣ）によると、プロモーターは２個の比較的十分に保存されたＥＲＥ（太字で示す）を含む。最上流ＥＲＥはミスマッチが２箇所あり、２番目は１箇所だけである。更に、２分の１の部位が数箇所ある（下線で示す）。
【００９５】
【表１３】
2005525108.tif 000032
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】ＥＲとＮＦ−κＢ蛋白質による相互転写抑制の概念図である。  ＧＲやＰＰＡＲγ等の他の核内受容体についても、ＮＦ−κＢとの同様の機能的相互作用が記載されている。ＮＦ−κＢと核内受容体から形成される複合体が単量体から構成されるのかあるいは二量体から構成されるのかは現時点ではまだ不明である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１】
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【国際調査報告】
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