(57)【要約】本発明は、ミルクおよび／または乳漿の水相において可溶性であるといえるタンパク質の豊富な液体溶液から、活性型で高度に濃縮されたTGF-βタンパク質画分を得る方法に関し、この方法は以下の工程;a)精製された可溶性タンパク質を5および30g/溶液1リットルの間の濃度に調節し;b)このように得た溶液の、55℃および68℃の間にわたる温度での4および5.5の間にわたるpHへの酸処理によって乳漿タンパク質の一部を沈殿させ;c)処理溶液のダイアフィルトレーションによる精密濾過を実施して、それぞれ精密濾過残留物および精密濾過液を得;d)TGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分を含有する精密濾過残留物を回収し;e)ダイアフィルトレーションに付された精密濾過残留物を乾燥させてTGF-βが高度に濃縮された粉末を得ることを含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミルク水相由来の可溶性タンパク質の豊富な溶液から活性型TGFβが濃縮されたタンパク質画分を得る方法であって、
a)精製した可溶性乳漿タンパク質を5および30g/溶液1リットルの間の濃度に調節し、
b)前記溶液の、4および5.5の間にわたるpHおよび55℃および68℃の間にわたる温度での酸処理によって前記乳漿タンパク質の一部を沈殿させ；
c)沈殿した懸濁液のダイアフィルトレーションを伴う精密濾過を実施して、それぞれ精密濾過残留物および精密濾過液を得て；
d)TGFβが高度に濃縮された前記タンパク質画分を含んでなる前記精密濾過残留物を回収し；さらに
e)ダイアフィルトレーションされた前記精密濾過残留物を乾燥させてTGFβが高度に濃縮された粉末を得る；
という工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記沈殿工程b)を4および5の間からなるpHで、好ましくは、4.6に近いpHで実施する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記沈殿工程b)を55℃および68℃の間からなる、好ましくは63℃に近い温度で実施する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記沈殿工程b)の期間が30秒および10分の間、好ましくは30秒および5分の間からなり、約2分が最も好ましい請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
工程b)の最後に前記液体溶液を迅速に冷却する請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記の工程c)の精密濾過を平均ポアサイズが0.8および1.6μmの間からなり、かつ、狭い範囲のポアサイズ分布を有する膜を用いて実施し、さらに、工程c)を均一な膜透過圧をもたらす装置で実施する請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記の工程b)のダイアフィルトレーションを浸透または鉱質除去濾過水を用いて実施する請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記のダイアフィルトレーションを伴う精密濾過を4および5.5の間からなるpH、好ましくは約4.6で実施する請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記の乳漿タンパク質の豊富な開始溶液を以下の工程：
a)スキムミルクのクロスフロー精密濾過を均一な膜透過圧を得ることができる装置において平均ポアサイズが0.1μmである精密濾過膜で実施し、次いで、精密濾過液を回収し；
b)ダイアフィルトレーションを伴う限外濾過によって工程a)で得られた残留物を濃縮し；さらに
c)ダイアフィルトレーションされた限外濾過残留物を回収すること；
を実施することによって得る請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法によって得ることが可能なTGFβが濃縮されたタンパク質画分であって、全乳漿タンパク質１グラム当たり5μgより高い活性型のTGFβ2含量を含んでなるタンパク質画分。
【請求項１１】
その他の乳漿タンパク質が主にα-ラクトアルブミンからなる請求項１０に記載のタンパク質画分。
【請求項１２】
前記画分の全重量に対して45〜80重量%の間のα-ラクトアルブミンを含んでなる請求項１１に記載のタンパク質画分。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質画分を、必要に応じて1種以上の生理学的に適合する賦形剤と組み合わせて含んでなる医薬組成物。
【請求項１４】
紅斑性狼瘡、乾癬およびクローン病のような自己免疫疾患の治療または予防のための医薬品調合のための請求項１０〜１２に記載のタンパク質画分の使用。
【請求項１５】
関節リウマチ、骨関節炎、筋無力症またはブドウ膜炎の治療または予防のための医薬品調合のための請求項１０〜１２に記載のタンパク質画分の使用。
【請求項１６】
治癒促進のための医薬品調合のための請求項１０〜１２に記載のタンパク質画分の使用。
【請求項１７】
骨粗鬆症の治療または予防のための医薬品調合のための請求項１０〜１２に記載のタンパク質画分の使用。
【請求項１８】
オンコスタチン様薬組成物の調合のための請求項１０〜１２に記載のタンパク質画分の使用。
【請求項１９】
移植片拒絶の予防または治療のための医薬品調合のための請求項１０〜１２に記載のタンパク質画分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、日常的な供給源からTGF-β因子を精製する分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ミルク、特にヒトおよび哺乳類のミルクは、いくつかの生理活性ポリペプチド、特に多数の成長因子を含んでいる。ミルクに含まれるこれらの成長因子の1つとして、TGF-β(トランスフォーミング成長因子β)がある。
【０００３】
TGF-βは、種々の成長因子のファミリーを示す。TGF-β1およびTGF-β2は2つの相同型のTGF-βである。これらは、各々が112個のアミノ酸を含み、ジスルフィド橋によって結合されている2つの類似ポリペプチド鎖からなるホモ二量体構成物である。その分子量は、25,000ダルトンである。TGF-β1およびTGF-β2は、72%の構造相同性を有し、類似の生物学的特性を示す。ウシおよびヒトにおけるTGF-β2は、そのアミノ酸配列に関する限りでは同一である。
【０００４】
TGF-βは、遺伝子組換えによって精製型で得ることができる。しかしながら、TGF-β組換え体を含有する調製物はいくつかの細菌タンパク質を含みやすく、そのうちのいくつかはアレルゲン性である。さらに、その名のとおり、TGF-β組換え体の精製調製物は、TGFβの生物学的作用を完全に発揮させる、または、増加させることができる関連ミルクタンパク質を含んでいない。
【０００５】
牛乳は、TGF-β1またはTGFβ2の双方を含んでいる。TGF-β2は主要な成分であり、ミルク中に認められるTGF-βの90重量%に相当している。他方、TGF-β1はミルク中の総TGF-β含量の10重量%に相当している。
【０００６】
ミルクでは、90%より多くのTGF-β2が潜在型、すなわち非生物学的活性型である。
【０００７】
種々の科学的研究により、ミルク中のTGF-β含量は、初乳で12〜150μg/l、生ミルクおよびパスチャライズドミルクでは3.7〜3.8μg/l、スキムミルクでは4.3μg/l、乳漿では3.7μg/lであるということが示されている。
【０００８】
TGF-βの生物学的活性は多数あり、このことからこのポリペプチドは、広範な疾病や病状の予防および治療のため、治療上非常に注目されている。
【０００９】
TGF-βは、細胞外マトリックスにおいて、生物学的な活性を有している。これによって、マトリックスタンパク質の合成を促進し、また線維芽細胞ではコラーゲンおよびフィブロネクチンの合成を増加させる。また、コラゲナーゼおよびメタロプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素の合成に対する阻害作用も有する。TGF-βはプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターまたはメタロプロテアーゼインヒビターなどのプロテアーゼインヒビターの分泌を増加させる。
【００１０】
TGF-βは、また骨格においても生物学的活性を有している。TGF-βは、特に骨中において高濃度に存在している。軟骨形成に対する活性を有し、破骨細胞の再吸収および骨芽細胞の活性化を刺激する。骨の再吸収の天然のインヒビターとして作用し、骨形成刺激を示す。
【００１１】
TGF-βは、またリンパ球に対しても活性である。例として、Tリンパ球の増殖を阻害して、いわゆる「ナチュラルキラー」細胞の活性に寄与している。
【００１２】
さらにTGF-βは、強力な抗炎症剤でもある。炎症誘発性サイトカイン産生を減少させる。免疫抑制特性を有し、活性化Tリンパ球の増殖を阻害する。
【００１３】
さらにまた、TGF-βは抗増殖作用も有し、上皮細胞の強力なインヒビターである。TGF-βは、間葉細胞、胚性線維芽細胞、内皮細胞、Tリンパ球およびBリンパ球に対して強力な抗分裂促進活性を有している。これはまた、肝細胞の増殖に対する強力な阻害作用も有し、おそらくはその静止状態の維持において重要な役割を有していると考慮される。TGF-βは、また哺乳類の上皮における負の調節因子として作用もする。
【００１４】
TGF-βは、また抗癌作用も有している。発癌の際、癌細胞はTGF-βに応答する能力が低下する場合がある。それにもかかわらず、乳癌細胞のようないくつかの上皮細胞腫瘍はTGF-βの抗増殖作用に感受性がある。乳癌細胞の場合がそうである。
【００１５】
TGF-βは、また白血病細胞の増殖および分化に作用する。前骨髄球細胞の増殖を阻害し、また、レチノイン酸およびビタミンD3と相乗作用を有し得る。
【００１６】
特許文献１は、TGF-βを含有するミルク由来産物の製造プロセスが記載されている。このプロセスの際には、生のミルクを遠心分離によって脱脂し、PD-10(Pharmacia)クロマトグラフィーカラムで脱塩し、次いで、0.2μｍのポア直径の「Millipore」膜での濾過によって滅菌する。脱脂乳を滅菌し、pHを１NのHClで4.0に調節し、次いで、40,000gで60分間遠心分離して沈殿したカゼインを乳漿から分離する。分離した乳漿を１Nの水酸化ナトリウムで中和して透析する。しかしながら、このプロセスは最初の脱脂乳からカゼインを除去できるものであって、TGF-βを精製するプロセスではない。実際、最終産物は最初のミルク由来のすべての乳漿タンパク質を含むが、TGF-β、この特定のタンパク質の有意な濃縮はなされていない。
【００１７】
近年の技術においては、ミルクからTGF-βが濃縮されたタンパク質画分を得る多数のプロセスが記載されている。
【００１８】
特許文献２は、連続したクロマトグラフィー工程、特に陽イオン交換樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー(RP-HPLC)またはサイズ排除クロマトグラフィー支持体を用いてミルクに含まれる成長因子を精製するプロセスが記載されている。
【００１９】
特許文献３は、日常製品からTGF-βおよび同様にインスリン成長因子(IGF-1)を抽出するためのプロセスが記載されている。このプロセスは以下の工程：
a)陽イオン交換クロマトグラフィーによって日常製品の基礎画分を回収し；
b)工程a)で得られた画分をヒドロキシアパタイトカラムに通し；さらに
c)例えば実質的にIGF-1を含まないTGF-β画分が得られるよう選択した好適な溶出剤を用いてヒドロキシアパタイトカラムから溶出すること；
を含んでなるものである。
【特許文献１】
欧州特許出願EP0527283（ソシエテ・デ・プロデュイ・ネッスル・エス・エー(Societe des Produits NESTLE S.A.)）
【特許文献２】
欧州特許出願EP0313515（チバ・ガイギー(CIBA GEIGY)）
【特許文献３】
PCT国際出願WO0125276（カンピナ・メルクニー・ビー・ブイ(CAMPINA MELKUNIE B.V.)）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
前記のプロセスのすべてに技術的に不利な点がある。実際、連続したクロマトグラフィー工程を用いるTGF-β精製プロセスは長く、また単調なものである。所望の精製度を達成するのに必要なクロマトグラフィー工程の重要な数は、精製が実施されている間のTGF-βの連続的な分解、および各クロマトグラフィー工程での生物学的に活性なTGF-βの不可避な損失のために最終収率を大幅に低下させる。その後排除されなければならない、種々の塩類溶液および高度に汚染する再生溶液の使用と併せて、これらのプロセスは最終産物の細菌汚染の高いリスクを示す。
【００２１】
従って、最先端の技術では、当技術分野で現在利用できるプロセスについて、前記のとおりの不利点がない日常製品から、TGF-βの精製を可能にする改良されたプロセスが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明の目的は、ミルクおよび／または乳漿の水相のいわゆる可溶性タンパク質の豊富な液体溶液から活性型TGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分を得る方法であって、この方法は以下の工程：
a)精製した可溶性タンパク質を5および30g/溶液1リットルの間の濃度に調節し；
b)このように得た溶液の55℃および68℃の間にわたる温度での4および5.5の間にわたるpHへの酸処理によって乳漿タンパク質の一部を沈殿させ；
c)処理した溶液のダイアフィルトレーションを伴う精密濾過を実施して、それぞれ精密濾過残留物および精密濾過液を得て；
d)TGFβが高度に濃縮されたタンパク質画分を含有する精密濾過残留物を回収し；さらに
e)ダイアフィルトレーションに付された精密濾過残留物を乾燥させてTGFβが高度に濃縮された粉末を得ること；
を含んでなる。
【００２３】
好ましくは、調節工程a)は乳漿タンパク質単離物（「WPI」とも示される）のような可溶性ミルクタンパク質を含有する溶液を希釈することで実施する。
【００２４】
好ましくは、沈殿工程ｂ）は60℃および68℃の間にわたる、より好ましくは、約63℃の温度で実施する。
【００２５】
沈殿工程b)の長さは30秒および10分の間にわたるのが有利であり、好ましくは、30秒および5分の間、より好ましくは約２分である。
【００２６】
好ましい実施形態では、工程c)の精密濾過は平均ポアサイズが0.8および1.6μｍの間からなり、かつ、ポアサイズ分布の狭い精密濾過膜を用いて実施する。
【００２７】
本発明のもう1つの目的は、前記のプロセスによって得ることが可能なTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分を提供することである。
【００２８】
前記で定義されるものなどのタンパク質画分を含んでなり、必要に応じて1種以上の生理学上適合する賦形剤を加えた医薬組成物にも関する。
【００２９】
本発明は、また前記で定義されるものなどのタンパク質画分の、種々の病状の予防または治療用の薬剤製造のための使用に関し、そのためにTGF-βは興味深い治療的化合物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本出願人は、乳漿タンパク質の豊富な液体溶液からTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分を得るための単純かつ迅速な方法を開発した。
【００３１】
TGF-βとは、少なくとも90重量%のTGF-β2および多くとも10重量%のTGF-β1を含んでなるTGF-βの関連物または混合物を意味する。
【００３２】
特に、本発明の方法は、少数の短い長さの工程を含んでなり、これにより精製プロセスの間に経時変化するタンパク質分解に関連する生物学的活性の相当な損失を避けることが可能となる。
【００３３】
さらに、本発明のプロセスは、いくつかの基質に対する注目するタンパク質の連続吸着、次いで、溶出による基質からのその脱離を必要とするであろう、TGF-βの相当な損失ひいてはプロセス最終収率に対する有害な結果を強制的に含む、いずれのクロマトグラフィー工程も含まない。
【００３４】
本発明は、タンパク質の豊富な液体溶液からTGF-βが濃縮されたタンパク質画分を得る方法に関し、この方法は：
a)精製した乳漿タンパク質を5および30g/溶液1リットルの間の濃度に調節し；
b)この液体溶液の4および5.5の間にわたるpHおよび55℃および68℃の間にわたる温度での酸処理によって乳漿タンパク質の一部を沈殿させ；
c)処理した溶液のダイアフィルトレーションを伴う精密濾過を実施して、それぞれ精密濾過残留物および精密濾過液を得て；
d)TGFβが高度に濃縮されたタンパク質画分を含有する精密濾過残留物を回収し；さらに
e)ダイアフィルトレーションされた精密濾過残留物を乾燥させてTGFβが高度に濃縮された粉末を得る；
という工程を含んでなる。
【００３５】
乳漿タンパク質の豊富な開始溶液は種々の種類のものであってよい。好ましくは、乳漿タンパク質単離物(WPI)であり、これは当業者において公知であるすべての方法で調製できる。
【００３６】
乳漿タンパク質の豊富な溶液は以下の組成：
総窒素性物質：10g/Kg
乾燥抽出物:10.4g/Kg
を有することが好ましい。
従って、タンパク質の96%が乾燥抽出物中にある。
本方法の工程a)
本方法の工程a)は、好ましくは溶液1キログラム当たり5〜30ｇタンパク質の濃度を得るためのタンパク質の浸透水での希釈工程からなる。
本プロセスの工程b)
工程b)は最初に乳漿タンパク質の豊富な液体、例えば、WPIに含まれていたTGF-βのほとんどすべてを含有するタンパク質画分の選択的沈殿を可能にする操作条件における乳漿タンパク質の分画沈殿工程からなる。
【００３７】
出願人はいくつかのpHおよび温度パラメーターを組み合わせることによって目標に到達した。
【００３８】
本発明によれば、これらパラメーターのうちのpH、または、温度のいずれか一方だけを適用しても所望のタンパク質沈殿度に到達できないということを見出した。
【００３９】
工程b)を55℃より低い温度で実施する場合には、TGF-βの豊富なタンパク質画分の沈殿は得られない。また、処理温度が68℃よりも高い場合には、温度の増加に対して、乳漿タンパク質のより多くの画分のTGF-βとの共沈が認められる。従って、70℃より高い温度については、最初の溶液に最初に含まれる乳漿タンパク質の全体に近いものが沈殿し、TGF-βの選択的濃縮はもはや得ることができない。
【００４０】
例として、4.6のpHでの温度の増加に対して認められた沈殿結果を以下の表１に示す。
【００４１】
以下の表１はpH4.6での熱処理強度に応じたTGF-βおよび乳漿タンパク質沈殿の発生を要約する(処理時間:２分)。
【００４２】
【表１】
2005506316.tif 000002
表１の結果は、pH4.6および温度50℃では乳漿タンパク質の豊富な溶液に最初に含まれていたTGF-βの43%しか沈殿しないということを示す。70℃の温度では最初のTGF-βの100%が沈殿するが、乳漿タンパク質の最初の溶液に最初に含まれていた全タンパク質の50%がTGF-βと共沈するので、この沈殿は選択性が低く、TGF-βの所望の濃縮度に到達できない。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法の工程b)は4および5.5の間からなるpHで、より有利な方法では、4および5の間のpHで実施する。最も好ましい実施形態では、本方法の工程b)は4.3および4.9の間からなるpHで、さらに良好には4.4および4.8の間で、好ましくは4.5および4.7の間で実施する。最適な処理pHは約4.6である。
【００４４】
好ましくは、pHは濃酸で調節して溶液のさらなる容量の添加を受ける希釈現象を最大限に減少させる。好ましくは、濃HCl溶液を用い、また、その他の濃酸によりもその操作がより容易で、かつ、危険性が少ないことから、6NのHCl溶液を特に用いることが、最も好ましい方法である。
【００４５】
工程b)の処理温度は、有利には55℃および68℃の間、好ましくは61℃および65℃の間、好ましい方法では62℃および64℃の間、最も好ましい実施形態では約63℃からなる。
【００４６】
いずれかの特定の理論に拘束されようとは思わないが、本出願人は、TGF-βは乳漿タンパク質の開始溶液中では主に潜在型で認められるが、本方法の工程b)の間に活性型(生物学的に活性)に変換すると考える。
【００４７】
前記の温度およびpHパラメーターを組み合わせることにより短期間の沈殿工程を実施することが可能となり、従って、TGF-β分解を避けることができる。従って、沈殿工程b)の期間は30秒および10分の間、好ましくは、30秒および5分の間、さらに良好には1分および3分の間、最も好ましい実施形態では約2分からなる。
【００４８】
本方法の工程b)をpH7.0、80℃にて15分間実施する場合には、TGF-β分解が認められ、この分解は15分を超える沈殿工程の長さとともに増加する。
【００４９】
熱処理はいずれの種類のものであってもよい。フレッシュチーズのような粘稠溶液または懸濁液の熱処理には当業者に公知の管状または滑面熱交換器で実施するのが好ましい。
【００５０】
本プロセスの工程b)の特定の実施形態では、TGF-βの沈殿溶液を迅速に冷却する。
【００５１】
本出願人は、沈殿後の迅速な冷却には、得られた沈殿の質感に対して明白な影響があり、結果としてその後の方法工程の処理、特に、精密濾過工程を支援するということを確認したが、これは沈殿が膜に詰まるのを避けるために細かすぎてはならないからである。
【００５２】
好ましくは、冷却は管状または板状熱交換器で、室温の、好ましくは20℃および30℃の間の、有利には約25℃の水を用いて実施する。
【００５３】
冷却工程の長さは好ましくは1および20分の間、最も好ましい方法では2および10分の間からなる。
【００５４】
従って、工程b)の最終産物は沈殿していない乳漿タンパク質溶液中にTGF-βを含む沈殿したタンパク質の懸濁液を含有する液体である。
本プロセスの工程c)
工程b)で得られた沈殿していない乳漿タンパク質の溶液中にTGF-βを含有するタンパク質懸濁液をダイアフィルトレーションを伴って精密濾過する。
【００５５】
沈殿をダイアフィルトレーションを伴う精密濾過工程に付して、主にTGF-βを含有する注目するタンパク質画分を濃縮しながら、残存する乳漿可溶性タンパク質のほとんどを除去する。
【００５６】
TGF-βの相当な損失を避け、一方で所望でない可溶性乳漿タンパク質のほとんどを除去するために、精密濾過工程はポアサイズガウス分布の狭い膜を用いて実施する。
【００５７】
精密濾過は平均ポアサイズが0.8および1.6μmの間からなり、かつ、ポアサイズガウス分布の狭い精密濾過膜で実施するのが好ましい。
【００５８】
最も好ましい方法では、ダイアフィルトレーションを伴う精密濾過を膜透過圧が、全濾過膜表面にわたって均一に維持されるような条件で実施する。
【００５９】
透過物の同時循環が、本発明のプロセスの精密濾過工程を達成する第1の実施形態に相当し、これは全濾過膜表面にわたって実質的に均一な膜透過圧を提供する。
【００６０】
従って、濾過膜支持体の外表面での透過物の同時循環により各フィルターコンパートメントで同一の、かつ、全濾過面にわたって濾過膜の各点で同一の圧力低下(濾過膜の両側で循環する流体の入り口圧力と出口圧力の相異)を発生させることができる。透過物の同時循環についての技術は、例えば、スウェーデン国特許SW7416257(Sandblom)に記載されている。
【００６１】
透過物の同時循環を適用し、かつ、均一な膜透過圧を所望する場合には、ソシエテ・デ・セラミク・テクニーク(Societe des Ceramiques Techniques、フランス国)によってMembraloxの商標で、または、ソシエテ・オレリス(Societe Orelis、フランス国)によってKERASEPの商標で、市販されているαアルミナ製のもの、または、さらにSTERILOXの商標の膜などの鉱物またはセラミック膜を用いるとよりよい結果が得られる。
【００６２】
もう1つの態様では、濾過膜を縦方向に透過率勾配を有するマクロ孔支持体上に設置する。この支持体は多孔度勾配が濾過膜の一方の端からもう一方に向けて減少するような構造を有する。
【００６３】
このフィルター支持体のために、濾過膜の一方の端からもう一方に向けて水圧抵抗が低下し、これにより膜経路のすべてで均一な膜透過圧が生じる。
【００６４】
仏国特許出願FR9704359に記載される支持フィルターなどのセラミック製のような種類のフィルターが有利である。
【００６５】
もう1つの態様では、例えば、有機膜を用いることによる、仏国特許FR9306321(公開2692441)に記載されるものなどのダイナミック膜濾過も達成できる。
【００６６】
本発明の方法を実施する形態に従って、濾過膜およびその支持体を回転軸に設置するが、その装置は精密濾過膜から短い距離に位置する回転ディスクを備えている。
【００６７】
精密濾過膜から短い距離(約4mm)に位置するディスクを回転させることで従来のクロスフロー濾過よりも50〜100倍強力な剪断応力が生じ、この剪断応力が三次元(放射状、接線方向、軸方向)に作用する。係る装置では、内容物への剪断応力の発生は膜透過圧から切り離されている。ダイナミック膜濾過のかかるプロセスも米国特許第5,037,532号、同3,997,447号および同4,956,102号に記載されている。
【００６８】
好ましい実施形態では、精密濾過膜の平均ポアサイズは１および1.6μmの間からなり、最も好ましい実施形態では、EXEKIA社によって「STERILOX 1.4μm classic」の参照のもとで、または「STERILOX 1.4μm GP」の参照のもとで市販されているものなどの約1.4μmからなり、これは均一な膜透過圧を得るために、精密濾過装置において精密濾過液の同時循環処理を必要とする。
【００６９】
好ましくは、ダイアフィルトレーションは濾過滅菌された浸透水または鉱質除去水を用いて実施する。
【００７０】
TGF-β以外の可溶性乳漿タンパク質を最大に除去するには、ダイアフィルトレーションは１および6の間のダイアボリューム、好ましくは約4のダイアボリュームを用いて達成するのが好ましい。
【００７１】
ダイアフィルトレーションを伴う精密濾過は、TGF-βを沈殿型で維持することが可能な、4および5.5の間、好ましくは、4.3および5の間からなるpHで、最も好ましい方法では約4.6のpHで実施するのが好ましい。
【００７２】
pH調節は濃酸、好ましくは濃HCl、有利には6Nの濃度で達成する。
【００７３】
ダイアフィルトレーションによる精密濾過工程の最終産物は、それぞれ：
一方では、TGF-βが高度に濃縮された残留物；および
他方では、可溶性乳漿タンパク質を含有する精密濾過液
である。
【００７４】
例えば、精密濾過液は乾燥物質含量約8.8g/lにつき8.0g/lのかかる可溶性タンパク質を含む。それらの沈殿していない乳漿タンパク質は有利なことに当業者に公知のいずれかの技術、例えば限外濾過膜を用いてさらに濃縮してもよく、ひと度濃縮されると、ほとんどのWPIの従来の適用に用いられる。
・精密濾過残留物の回収
ダイアフィルトレーションを伴う精密濾過工程後、精密濾過残留物を回収し、これはTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分となる。
【００７５】
通常、この精密濾過残留物は1gの全タンパク質当たり6.5〜17μg/lのTGF-βを含む。
【００７６】
精密濾過残留物は回収後、当業者に公知のいずれかの技術(凍結乾燥、噴霧乾燥等)によって乾燥させて粉末型でTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分を得るのが有利である。
【００７７】
残留物粉末は、開始溶液中の最初の乳漿タンパク質の約15%を含んでいる。本発明におけるすべてのプロセス工程を組み合わせることによって、最初の溶液に最初から含まれていた乳漿タンパク質の85%を排除することが可能となる。この粉末では、TGF-β含量は通常6.5および17μg/1g間の粉末からなり、これは、開始乳漿タンパク質溶液中に最初に含まれていたTGF-βの70%の回収率にほぼ相当する。TGF-β2の濃度は粉末重と比較して、粉末に含まれる全タンパク質1g当たり6〜15μgというTGF-β2の濃度に相当する。
【００７８】
このTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分はそれ自体で、および必要に応じて、1種以上の生理学上適合する賦形剤と関連して用いればよい。
【００７９】
また、このTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分を、さらなる精製工程(精密濾過、遠心分離、酸性化、クロマトグラフィー等)に付してTGF-β濃度がより高い最終産物を得てもよい。
【００８０】
これらのさらなる精製工程により、主にα-ラクトアルブミンおよび免疫グロブリンによって構成される不溶性乳漿タンパク質の排除が可能となる。
・乳漿タンパク質の豊富な開始溶液を調製するための好ましい実施形態
本発明の有利な実施形態では、乳漿タンパク質の豊富な開始溶液は以下の工程：
i)均一な膜透過圧を可能にする装置において平均ポアサイズが0.1μmの膜でスキムミルクをクロスフロー精密濾過して精密濾過液を回収し；
ii)工程i)で得られた精密濾過液を、乳漿からタンパク質濃縮物を調製するために当業者によって頻繁に用いられるものなどの、5000ダルトンおよび20000ダルトンの間からなるカットオフを有する膜でダイアフィルトレーションを伴う限外濾過で濃縮し;さらに
iii)ダイアフィルトレーションされた限外濾過残留物を回収すること
によって得る。
【００８１】
所望により、ダイアフィルトレーションされた限外濾過残留物に含まれるタンパク質の希釈を実施して、本発明に記載されるような出発乳漿タンパク質溶液を得てもよい。
【００８２】
クロスフロー精密濾過は、精密濾過装置において精密濾過液の同時循環(いわゆる均一な膜透過圧という水圧の考え方)での処理を必要とする、Membraloxタイプの膜(アルミナ単独またはアルミン-ジルコン混合物製である)0.1μm classicまたはEXEKIA社によって市販されているもの等のGP参照のMembralox 0.1μm膜で実施するのが好ましい。
【００８３】
クロスフロー精密濾過の工程i)後に得られる残留物は主にミセル型のミルクカゼインを含む。
【００８４】
工程i)の最後に得られる精密濾過液は本質的に可溶性ミルクタンパク質、ラクトース、非タンパク質型窒素および可溶性無機塩類を含む。
【００８５】
工程i)の精密濾過液は乳漿タンパク質の濃縮のためにダイアフィルトレーションによる限外濾過工程に付す。限外濾過は1および20kDの間からなる、より好ましくは、5kDに近いカットオフを有する膜で実施するのが好ましい。
【００８６】
ダイアフィルトレーションは浸透水を用いて実施するのが好ましく、ダイアフィルトレーション容量は2および6ダイアボリュームの間、好ましくは4に近いダイアボリュームからなる。
【００８７】
限外濾過液は、ミルク由来の可溶性窒素(非タンパク質性窒素)、ラクトースおよび無機塩類を含む。
【００８８】
例えば、工程iii)後に得られる限外濾過残留物は、残留物1リットル当たり約200gの全タンパク質を含む。
【００８９】
残留物を回収した後、後者に含まれるタンパク質を希釈して開始乳漿タンパク質溶液を得る。希釈は浸透水で実施するのが好ましい。
【００９０】
必要に応じて、200g/lの濃度でタンパク質を含有する工程iii)で回収された限外濾過残留物を、本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分を得る方法において開始材料として用いる前に粉末型に乾燥させてもよい。
・TGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分
本発明のもう1つの目的は、5μg/全タンパク質1gより高い活性型TGF-β2の濃度を含んでなることを特徴とする、TGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分からなることである。
【００９１】
前記のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分は全タンパク質1g当たり6μgおよび15μgの間の活性型のTGF-β2からなるTGF-β2の濃度を有することが好ましい。
【００９２】
好ましくは、TGF-βが高度に濃縮された画分は、全タンパク質1gあたり7μgおよび13μgの間、有利には8μgおよび12μgの間、9μgおよび11μgの間のTGF-β2からなる活性型TGF-β2の濃度を含んでなることを最も好ましい実施形態とする。
【００９３】
本発明に従って濃縮されたタンパク質画分のTGF-β2の濃度は、当業者ならば、例えば、Societe R&D SYSTEMS(Barton Lane, Oxon, OX14345,英国)によってQUANTIKINE(登録商標)の商標で市販されているもののような、TGF-β2の特異的抗体を用いる免疫学的試験の使用によって容易に測定することができる。
【００９４】
本出願人は、TGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分に含まれる乳漿タンパク質は、主にα-ラクトアルブミンおよび免疫グロブリンからなるということを示した。
【００９５】
従って、本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分は、画分の全重量に対して約45〜80重量%のα-ラクトアルブミンおよび10および25%の間の免疫グロブリンを含む。
【００９６】
さらに、このTGF-βが濃縮されたタンパク質画分は、ほぼ通常はβ-ラクトグロブリン、そのアレルゲン性のためによく知られているタンパク質を含まない(11%未満)。
【００９７】
本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分では、β-ラクトグロブリンがこのように低濃度であるために、ヒトまたは動物への使用が可能となる。
【００９８】
さらに、いずれかの特定の理論に拘束されようとは思わないが、本出願人は本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分において、α-ラクトアルブミンが高濃度であることがTGF-βの治療特性を有意に高め得ると考える。
【００９９】
実際、α-ラクトアルブミンはトリプトファンが豊富であるが、これはタンパク質分子当たり4個のこのアミノ酸の残基を含むためである。α-ラクトアルブミンはこのアミノ酸含量が最も高いミルクタンパク質である。トリプトファンはセロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン)およびメラトニンの前駆体である。セロトニンは鎮静および抗ストレス特性を有する。セロトニンは不安を減少させ眠りにつくのに役立つ。ストレスが乾癬の進行に重要な役割を果たすということは実際に認められている。実際、乾癬を患う患者は連続的なストレスを受けている。TGF-βとα-ラクトアルブミンの組み合わせによって、本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分が、乾癬に対する薬剤の開発に特に適するものとなっている。
【０１００】
さらに、α-ラクトアルブミンはまた、モルヒネ様特性を有する、50位のアミノ酸からはじまり53位のアミノ酸で終わるペプチドを含む。α-ラクトアルブミン由来のこのオピオイドペプチドは「α-ラクトルフィン」と呼ばれている(Ciba H. and Yoshikawa M., Biological Functional Peptides from Food Proteins: New Opioides Peptides from Milk Proteins. Prot. Tail for Food and Med. Uses, Ed. M. Dekka, N.Y. 1986,p123-153参照)。
【０１０１】
さらに、α-ラクトアルブミンは殺菌特性を有する。腸管でのトリプシンおよびキモトリプシンによるその加水分解により殺菌ペプチドの産生が誘導される(Pellegrini A. et al., Isolation and Identification of Fluid Bactericidal Domains in the Bovine Alpha-Lactalbumin Molecule, Biochim. Biophys. Acta, 1999, 1426: 439-448参照)。α-ラクトアルブミンの殺菌特性は乾癬の患者にとって有益であり得る。実際、連鎖球菌およびブドウ球菌などの病因は、血液Tリンパ球の活性化および過剰増殖を引き起こす細菌毒であるスーパー抗原を産生し、これが皮膚レベルでの活性化Tリンパ球の急激な変動をもたらす。この急激な変動がケラチノサイトの活性化および増殖をもたらし、これが乾癬の基礎を形成する細胞増殖である。
【０１０２】
いずれかの理論に拘束されようとは思わないが、本出願人は、α-ラクトアルブミンの殺菌活性は細菌感染後のケラチノサイトの増殖を制限し、次いで、乾癬に対するTGF-βの作用を増強するために使用できると考える。
【０１０３】
さらに、TGF-βと関連するα-ラクトアルブミンの存在は、タンパク質画分中の、または本発明の組成物中のTGF-βの安定性を高める。特に、例えば、画分または組成物を患者に投与する場合に、TGF-βをタンパク質分解酵素による多様な分解から保護すると思われる。
・本発明の医薬組成物
本発明のもう1つの目的は、前記のとおりのTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分を、必要に応じて1種以上の生理学上適合する賦形剤と組み合わせて含んでなる医薬組成物からなる。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、さらに治療上有効量のTGF-βを含むことを特徴とする。
【０１０５】
もう1つの特徴によれば、本発明の医薬組成物は、TGF-βとαラクトアルブミン間の治療上有効量の組み合わせを含む。
【０１０６】
局所投与に用いる場合には、本発明の医薬組成物は、好ましくは用量当たり1ナノグラムおよび1mgの間のTGF-β2、より好ましくは用量当たり10ナノグラムおよび100μgの間のTGF-β2、最も好ましい実施形態では用量当たり50ナノグラムおよび20μgの間のTGF-β2を含んでなる。
【０１０７】
全身投与に用いる場合には、本発明の医薬組成物は、患者の体重1kg当たり1ナノグラムおよび500μgの間のTGF-β2、好ましくは患者の体重1kg当たり80ナノグラムおよび100μgの間のTGF-β2、最も好ましい実施形態では患者の体重1kg当たり1μgおよび20μgの間のTGF-β2を毎日の投与に適応させる。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、錠剤、トローチ剤、ハードゼラチンカプセル剤、薬包、注射製剤用溶液、ローション、ポマード、皮膚用クリーム、軟膏、包帯、エマルション、鼻腔内または気管支エアゾール、インプラント、練り歯磨きまたはうがい薬の形態であってもよい。
【０１０９】
本発明の医薬組成物は、局所的な様式によって適用してもよい。かかる組成物はまた局所的に、または全身経路によって投与してもよい。
【０１１０】
好ましいことに、前記で定義されるものなどの医薬組成物は、経口、経腸、非経口、皮内、皮下または静脈内経路によって投与してもよい。
【０１１１】
本発明の医薬組成物は、治療上有効量のTGF-β2またはTGF-β2とα-ラクトアルブミンの組み合わせに加え、賦形剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバントまたは生理学的に適合するビヒクルも含んでなる。かかる組成物は液体であっても固体であってもよい。それらは凍結製剤または乾燥粉末製剤の形態であってもよい。
【０１１２】
係る医薬組成物は、有利なことに表面、界面活性剤(例えば、Tween20(登録商標)、Tween80(登録商標)、プルロニックS68(登録商標))、胆汁酸塩、可溶化剤(例えば、ベンジルアルコール)、荷電剤または弾力性を改変する化合物(例えば、ラクトース、マンニトール)への吸着を防ぐために緩衝希釈剤(例えば、トリス-HCl、アセテート、ホスフェート)、アルブミンまたはゼラチンなどの添加剤を含む。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は、またポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルピロリドンなどの高分子化合物の粒子を基剤とする製剤、またはリポソーム、マイクロエマルション、ミセルまたは単層もしくは多層ベシクルの形態で存在してもよい。
【０１１４】
所望により、本発明の医薬組成物はその他の成分：アスコルビン酸のような抗酸化剤などの添加剤、ポリアルギニンなどの低分子量のポリペプチド(10個未満のアミノ酸)を含んでなってもよい。またグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンなどのアミノ酸を含んでなってもよい。また、EDTAなどのキレート剤を含んでもよい。また、マンニトールまたはソルビトールなどのヒドロキシル化糖を含んでなってもよい。
【０１１５】
徐放性または遅延放出性医薬組成物には、脂肪酸、ワックスまたはオイルを添加する。粒子の形態の医薬組成物はTGF-βが濃縮されたタンパク質画分がポロキサマーまたはポロキサミンなどのポリマーによって包含されているが同様に本発明の一部である。
【０１１６】
局所製剤用組成物としては、炭水化物ポリマーまたはその生分解性マトリックスを含むゲル、クリーム、溶液、エマルション挙げられる。本発明の医薬組成物の実現化のためには、TGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分をワックス、フィルムまたはチューイングガムを含んでなる固体ビヒクル中に封入してもよい。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、また、唾液によるその希釈を妨げるためにメチルプロピルセルロースなどの薬剤により固定化されていてもよい。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、いくつかのその他の臨床適用を有し、限定されるものではないが、その中のいくつかを以下に記載する。
【０１１９】
TGF-βは注目すべき治癒特性を有する。本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分は、有利なことに内傷もしくは外傷、必要に応じて、術後の治療に、または乾燥痂皮の治療に、または骨折後の骨強化のために適用してもよい。
【０１２０】
本発明のタンパク質画分は、またTGF-βの破骨細胞および骨芽細胞に対する軟骨および骨の形成の誘導を引き起こす作用のために骨粗鬆症の治療に適用してもよい。
【０１２１】
有利なことに、本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分は、TGF-βの上皮細胞増殖に対する阻害作用のために黒色腫、骨髄腫またはリンパ腫の治療に適用してもよい。
【０１２２】
本発明のタンパク質画分は、また有利なことに、ある種の白血病の治療にビタミンD3およびレチノイドと関連して用いてもよい。有利なことに、ある種の癌、特に、乳癌に対する治療に適用してもよい。
【０１２３】
さらに、本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分は、また、いくつかの自己免疫疾患の予防または治療に向けた薬剤の製造に用いてもよい。
【０１２４】
また有利なことに、赤色斑または歯石に覆われたプラークの存在、角質増殖、真皮におけるTリンパ球の浸潤および活性化と関連し、自己抗体の産生をもたらす炎症プロセスを特徴とする皮膚病である紅斑性狼瘡の予防または治療に適用してもよい。紅斑性狼瘡は自己免疫疾患の原型である。本発明の医薬組成物の紅斑性狼瘡の患者への経口経路による投与により、その全身症状を有意に改善することが可能である。
【０１２５】
有利なことに、本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分は、また、乾癬の予防または治療用薬剤の製造に用いてもよい。乾癬は慢性的に発生する皮膚炎であり、その成熟異常と関連したケラチノサイトの過剰増殖を特徴とする。乾癬性ケラチノサイトの増殖は有糸分裂数の増加および細胞周期の短期化によって示される。さらに、乾癬性表皮が活性化Tリンパ球の急激な変動と関連した炎症性侵入物および炎症誘発性サイトカイン遊離の中心である。本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分は、経口経路によって投与される場合には、その細胞分裂停止、抗炎症および免疫抑制特性のために乾癬の基本的治療をなす。
【０１２６】
また関節リウマチ、骨関節炎、重症筋無力症、ブドウ膜炎などのその他の病気の治療ともなる。移植片拒絶を避ける、または少なくとも減少させるための器官移植のための使用も考慮され得る。
【０１２７】
本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分は、またクローン病の予防または治療に向けた薬剤の製造に用いてもよい。この疾病は腸の炎症、クラスII主要組織適合複合体(MHC)の抗原調節の悪化を特徴とする。腸の炎症は腸の上皮におけるクラスIIMHC抗原の増加と関連している。この炎症は腸の自己免疫反応の、または免疫調節の障害の結果である。
【０１２８】
かかる医薬組成物は経口投与した場合に、クローン病に対する基礎的な治療をなす。
【０１２９】
本発明は同様に前記のものなどのTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分の紅斑性狼瘡、乾癬、クローン病、関節リウマチ、骨関節炎、重症筋無力症、ブドウ膜炎などの疾病の予防または治療用薬剤の製造のための使用を目的とする。
【０１３０】
また、移植片拒絶の予防または治療用薬剤の製造のためのTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分の使用にも関する。
【０１３１】
本発明は、また本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分の創傷治癒の促進に向けた薬剤の製造のための使用にも関する。
【０１３２】
また、骨粗鬆症の予防または治療に向けた薬剤の製造のためのTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分の使用にも関する。
【０１３３】
もう1つの態様によれば、本発明はオンコスタチン様薬の製造のためのTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分の使用に関する。
【０１３４】
さらに、本発明を実施例によって例示するが、以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【０１３５】
実施例１  本発明のプロセスのための開始産物としての乳漿タンパク質の豊富な溶液(WPI)の調製：
50℃にて、乾物で92.9g/Kgの含有物およびN×6.38で35.4g/Kgの含有物を含む10,000Kgのスキムミルクを4.6m2および0.1μmのMembralox(登録商標)膜(アルミン-ジルコン)を含んでなり、0.6〜0.7バールの均一な膜透過圧などを得るための精密濾過液の同時循環機能を有する精密濾過装置に注入した。
【０１３６】
残留物コンパートメントのスキャニング速度は7m/sで固定した。
【０１３７】
精密濾過液抽出流束は345l/hで固定した。残留物抽出流束は172.5l/hで固定した。
【０１３８】
得られた、乾物で57.8g/Kgの含有物およびN×6.38で6.4g/Kgの含有物を含む6670lの精密濾過液を10℃で冷却し、らせんの概念を含み、5Kdのカットオフを有する9.6m2のKoch(登録商標)膜を含んでなる限外濾過装置に注入した。出口圧は3.4バールで固定した。
【０１３９】
限外濾過の抽出流束は250l/hで固定し、残留物のそれは12.5l/hで固定した。1336lの浸透水に334l/hの残留物を、加えたこの容積の水が限外濾過液形態に排出されるまで連続的に加えた。
【０１４０】
このように得たダイアフィルトレーションされた最終残留物は101.0g/Kgのタンパク質含量(N×6.38)および乾物で106.3g/Kgの含有物を有していた。TGF-βが濃縮された画分の調製にすぐに用いるか-30℃にて凍結するのいずれかとした。
実施例２  乳漿タンパク質の豊富な溶液から出発するTGF-βが高度に濃縮された画分の調製：
攪拌羽根装置を備えたタンクにおいて、20℃の温度にて200kgの実施例I、に従って得たダイアフィルトレーションされた残留物を浸透水で2000lに希釈した。
【０１４１】
10分攪拌した後、pH値が7.25から4.6に低下するまで1800mlの6NHClを徐々に加えた。10〜15分間攪拌を継続した。この溶液をActijoule(登録商標)装置において1000lのアリコートで、63℃で2分間熱処理して25℃に冷却した。次いで、35℃に加熱した、得られた懸濁液の2000lを平均ポア直径が1.4μmの4.6m2のSTERILOX(登録商標)膜を備え、0.4および0.8バールの間の均一な膜透過圧が得られるように精密濾過液を同時循環する装置において4.5時間連続で精密濾過した。
【０１４２】
精密濾過液の抽出流束は400l/hで固定した。残留物の抽出は実施しなかった。
【０１４３】
残留物容積が精密濾過装置のデッドボリュームに近い場合には、320lの浸透水を連続的に加え、精密濾過液形態に抽出した。
【０１４４】
得られた53Kgのダイアフィルトレーションされた残留物は、乾物で39.96g/Kgの含有物および39.14g/Kgのタンパク質含量(N×6.38)および430.5μg/KgのTGF-β含量(従って、11μg/タンパク質1g)を含んでいた。それらは-30℃で凍結し、10kgのアリコートで凍結乾燥した。
実施例３  本発明のTGF-βが高度に濃縮されたタンパク質画分の定量および定性分析：
実施例２で得た1mgの凍結乾燥粉末を1mlのミリQ水に溶解し、次いで、バッファーAで5倍希釈した。用いた分析装置は「source RPC3ml」カラム(Pharmacia(登録商標))を用いるWaters600E HPLCクロマトグラフであった。
【０１４５】
用いた2種のバッファーは以下のものであった。
【０１４６】
バッファーA:トリフルオロ酢酸(TFA)0.1%、および
バッファーB:アセトニトリル90%中のTFA0.09%。
【０１４７】
50μlの産物を注入し、2ml/分の流束で30分間(室温にて)30〜100%のバッファーBのグラジエントによる溶出を実施した。検出は214nmで実施した。クロマトグラフィー面積の処理はNelson(登録商標)ソフトウェアを用いて実施し、これにより、全タンパク質と比較した場合の含量の推定が可能であった:53%のα-ラクトアルブミン、0.03%の血清アルブミン、10.9%のβ-ラクトグロブリンおよび18.3%の免疫グロブリン。
【０１４８】
濃縮された画分のTGF-β2含量はTGF-β2の特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫アッセイ法(アール・アンド・ディー・システムズ(R&D Systems),Barton Lane, Oxon, 0X14 3Y5,U.K.によって市販されているQuantikineキット)によって測定した。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】TGF-βが濃縮されたタンパク質画分を得るための本発明の方法のスキームを例示した図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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