(57)【要約】細胞膜の表面における分子のオリゴマー複合体の形成を検出するための方法が提供される。これらの方法は、タグ化プローブのペア、および切断プローブを利用し、それらの各々は、細胞表面分子に特異的に結合する。タグ化プローブは、切断可能な結合を介して第１の結合性化合物に結合される分子タグを含み、切断プローブは、第２の結合性物質、およびそれらに対して規定した近接の範囲内にある場合に結合を切断し得る切断誘導部分とを含む。オリゴマー複合体を形成するこの２つのプローブの細胞表面分子への結合は、結合性化合物から分子タグの放出を生じ、この複合体の形成の測定を提供する。
2005534030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜において膜結合分析物のダイマーを検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
ダイマーの第１の膜結合分析物に特異的な結合性化合物を提供する工程であって、該ダイマーが、該第１の膜結合分析物および第２の膜結合分析物を含み、そして該結合性化合物が、各々が切断可能な結合によってそれらに結合される１以上の分子タグを有し、該１以上の分子タグが、各々、分離特性を有する、工程；
該第２の膜結合分析物に特異的な切断プローブを提供する工程であって、該切断プローブが有効な近接を含む切断誘導部分を有する、工程；
該切断プローブ、該結合性化合物、および該細胞膜を混合する工程であって、その結果、該切断プローブが該第１の膜結合分析物に特異的に結合し、かつ該結合性化合物が該第２の膜結合分析物に特異的に結合し、そしてその結果、該結合性化合物の切断可能な結合が該切断誘導部分の有効な近接の範囲内にあり、その結果、分子タグが放出される、工程；ならびに
該放出された分子タグを分離かつ同定して、該細胞膜においてダイマーの存在または比存在、あるいは量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記第１の膜結合分析物および前記第２の膜結合分析物が、各々、前記細胞膜におけるレセプターであり、そして前記１以上の分子タグの前記分離特性が、電気泳動移動性である、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記分離工程および前記検出工程が、分離緩衝液中で前記放出された分子タグを電気泳動で分離する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、前記切断プローブの前記切断誘導部分が、光増感剤であり、ここで、該切断プローブおよび前記結合性化合物が、各々、抗体結合性組成物を含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記細胞表面レセプターが、上皮増殖因子レセプターおよびＧタンパク質共役レセプターからなる群より選択される、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記細胞表面レセプターが、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、およびＨｅｒ４からなる群より選択される、方法。
【請求項７】
細胞膜において第１の膜結合分析物と第２の膜結合分析物とのダイマーを検出する方法であって、該方法は、以下の工程：
該ダイマーの異なる抗原決定基に特異的な１以上の結合性化合物を提供する工程であって、各々の結合性化合物が、各々が切断可能な結合によってそれらに結合される１以上の分子タグを有し、そして異なる結合性化合物の該分子タグが、異なる分離特性を有する、工程；
該１以上の結合性化合物が特異的な該抗原決定基とは異なる、該ダイマーの抗原決定基に特異的な切断プローブを提供する工程であって、該切断プローブが、有効な近接を含む切断誘導部分を有する、工程；
該切断プローブ、該１以上の結合性化合物、および該細胞膜を混合する工程であって、その結果、該切断プローブおよび該１以上の結合性化合物が、それぞれの抗原決定基に特異的に結合し、かつ該１以上の結合性化合物の該切断可能な結合が、該切断誘導部分の該有効な近接の範囲内にあり、その結果、分子タグが放出される、工程；ならびに
該放出された分子タグを分離かつ同定して、該細胞膜においてダイマーの存在または比存在、あるいは量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、前記第１の膜結合分析物および前記第２の膜結合分析物が、各々、細胞表面レセプターであり、ここで、前記１以上の結合性化合物のうちの少なくとも１つが、前記ダイマーのリン酸化部位に特異的である、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記分離特性が電気泳動移動性であり、前記分離かつ同定する工程が、前記放出された分子タグを電気泳動で分離して、電気泳動図において明瞭なピークを形成する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項７、８、または９に記載の方法であって、前記第１の膜結合分析物および前記第２の膜結合分析物が、各々、上皮増殖因子レセプターおよびＧタンパク質共役レセプターからなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記第１の膜結合分析物および前記第２の膜結合分析物が、各々、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、およびＨｅｒ４からなる群より選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記ダイマーがヘテロダイマーであり、ここで、前記切断プローブおよび１以上の結合性化合物の各々が、抗体結合性組成物を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記ヘテロダイマーが、Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、前記ダイマーが、Ｈｅｒ１のホモダイマーであり、ここで、前記切断プローブおよび１以上の結合性化合物の各々が、抗体結合性組成物を含む、方法。
【請求項１５】
細胞膜において複数のレセプター型のオリゴマー形成を検出する方法であって、該方法は、以下の工程；
該複数のうちの第１のレセプター型に特異的な切断プローブを提供する工程であって、該切断プローブが、有効な近接を含む切断誘導部分を有する、工程；
各々が該複数のうちの異なる第２のレセプター型に特異的な１以上の結合性化合物を提供する工程であって、各々の結合性化合物が、各々が切断可能な結合によってそれらに結合される１以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物の該分子タグが、異なる分離特性を有する、工程；
該切断プローブ、該１以上の結合性化合物、および該細胞膜を混合する工程であって、その結果、該切断プローブおよび該１以上の結合性化合物が、それぞれのレセプターに特異的に結合し、かつ該１以上の結合性化合物の該切断可能な結合が、該切断誘導部分の有効な近接の範囲内にあり、その結果、分子タグが放出される、工程；ならびに
該放出された分子タグを分離かつ同定して、該細胞膜においてオリゴマー形成の存在または比存在、あるいは量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記分離特性が電気泳動移動性であり、前記分離かつ同定する工程が、前記放出された分子タグを電気泳動で分離して、電気泳動図において明瞭なピークを形成する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記切断プローブの前記切断誘導部分が、光増感剤である、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記第１のレセプター型および前記第２のレセプター型が、上皮増殖因子レセプターおよびＧタンパク質共役レセプターからなる群より選択される、方法。
【請求項１９】
生物学的サンプルにおいて第１のレセプター型および第２のレセプター型を含むダイマーを検出する方法であって、該方法は、以下の工程；
該ダイマーの異なる抗原決定基に特異的な１以上の結合性化合物を提供する工程であって、各々の結合性化合物が、各々が切断可能な結合によってそれらに結合される１以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物の分子タグが、異なる分離特性を有し、その結果、分離の際の分離プロフィールにおいて明瞭なピークが形成される、工程；
有効な近接を含む切断誘導部分を有する切断プローブを提供する工程であって、該切断プローブが、該１以上の結合性化合物についての抗原決定基と異なる該ダイマーの抗原決定基に特異的であり、但し、該抗原決定基のうちの少なくとも１つが、該第１のレセプター型における抗原決定基であり、かつ該抗原決定基のうちの少なくとも１つが、該第２のレセプター型における抗原決定基である、工程；
該切断プローブ、該１以上の結合性化合物、および該生物学的サンプルを含むアッセイ混合物を形成する工程であって、その結果、該切断プローブおよび該１以上の結合性化合物が、それぞれの抗原決定基に特異的に結合し、かつ該１以上の結合性化合物の該切断可能な結合が、該切断誘導部分の有効な近接の範囲内にあり、その結果、分子タグが放出される、工程；ならびに
該放出された分子タグを分離かつ同定して、該生物学的サンプルにおいてダイマーの存在または比存在、あるいは量を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記分離特性が電気泳動移動性であり、前記分離かつ同定する工程が、前記放出された分子タグを電気泳動で分離して、電気泳動図において明瞭なピークを形成する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記形成工程が、前記放出された分子タグの前記分離工程の前に、前記切断プローブ、前記１以上の結合性化合物、および前記生物学的サンプルを、結合緩衝液中でインキュベートし、そして該結合緩衝液を分離緩衝液と交換する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載の方法であって、前記切断誘導部分が、増感剤であり、ここで、前記形成工程が、該増感剤を誘導して、その前記有効な近接の範囲内で前記切断可能な結合を切断する活性種を生成する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記増感剤が光増感剤であり、ここで、前記活性種が、一重項酸素である、方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法であって、前記切断プローブおよび前記１以上の結合性化合物が、各々、抗体結合性組成物を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法であって、前記抗原決定基のうちの少なくとも１つが、前記第１のレセプター型または前記第２のレセプター型のリン酸化部位である、方法。
【請求項２６】
請求項１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５に記載の方法であって、前記第１のレセプター型および前記第２のレセプター型が、上皮増殖因子レセプターおよびＧタンパク質共役レセプターからなる群より選択される、方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、前記１以上の結合性化合物が、２〜１０個の範囲の複数の結合性化合物である、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記第１のレセプター型および前記第２のレセプター型が、各々、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、およびＨｅｒ４からなる群より選択される、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記ダイマーが、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、およびＨｅｒ４からなる群より選択されるレセプター型を含むヘテロダイマーまたはホモダイマーである、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記ダイマーが、Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ１ホモダイマー、Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ２ヘテロダイマー、Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ヘテロダイマー、またはＨｅｒ２−Ｈｅｒ３ヘテロダイマーである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００２年７月２５日に出願された米国仮特許出願番号第６０／３９８，７２４号（その全体が、本明細書中で参考として援用される）からの優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、細胞表面分子（特に、細胞表面膜レセプター）のオリゴマー形成（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
細胞表面膜成分の相互作用は、正常な生理状態および疾患状態において、細胞外シグナルを細胞に伝達するのに重要な役割を果たす。特に、細胞表面レセプターの多くの型は、細胞外事象または細胞外シグナル（例えば、リガンド−レセプター結合）の細胞応答（例えば、増殖、増加した遺伝子発現もしくは減少した遺伝子発現など）への導入に関連して、二量化またはオリゴマー形成が起こる（例えば、Ｇｅｏｒｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１：８０８−８２０（２００２）；Ｍｅｌｌａｄｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９：３９７−４２１（２００１）；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ、１０３：２１１−２２５（２０００）；Ｙａｒｄｅｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、３７：Ｓ３−Ｓ８（２００１））。疾患（例えば、ガン）におけるこのようなシグナル伝達事象の役割は、熱心な研究の主題であり、そしていくつかの新しい薬物および薬物候補の開発をもたらしてきた（例えば、ＨｅｒｂｓｔおよびＳｈｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ、９４：１５９３−１６１１（２００２）；ＹａｒｄｅｎおよびＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２：１２７−１３７（２００１））。
【０００４】
様々な技術が、細胞表面レセプターの二量化およびオリゴマー形成を研究するために使用されており、免疫沈降、化学的架橋、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などが挙げられる（例えば、Ｐｒｉｃｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２１８：２５５−２６７（２００３）；ＭｃＶｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１７：１４０９２−１４０９９（２００１）；Ｓａｌｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７：１５４８２−１５４８５（２００２）；Ａｎｇｅｒｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９７：３６８４−３６８９（２０００））。不運なことに、シグナル伝達プロセスにおけるレセプター二量化およびオリゴマー形成の重要性にもかかわらず、そのような相互作用を測定するための技術は、適用が困難であり、柔軟性に欠け、かつ感度に欠ける。細胞表面分子のオリゴマー形成を分析するための便利で感度の高い技術の欠如は、このような事象に基づく新しい治療方法または診断方法を開発する難しさを非常に増大してきた。
【０００５】
上記の点に鑑みて、細胞表面分析物の二量化またはオリゴマー形成を検出または測定するために、利便性があり、感度が高く、そして費用効率が高い技術が利用できれば、このような測定がますます重要になっている多くの分野（ライフサイエンス研究、医療研究および診断、薬物発見などを含む）における技術が前進する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、膜結合分子のオリゴマー、特に、細胞膜レセプターのダイマーおよびオリゴマーを検出および／または測定する方法を提供する。１つの局面において、本発明の方法は、ダイマーまたはオリゴマーの異なるメンバーに特異的な少なくとも２つの試薬を使用する：一方のメンバー（本明細書中で切断プローブという）は、そのごく近接の範囲内で感受性の結合を切断するように誘導され得る切断誘導部分を有する；そして他方のメンバー（本明細書で結合性化合物という）は、結合誘導部分によって切断可能な結合によって結合する、１以上の分子タグを有する。この方法に従って、このような異なるメンバーがダイマーまたはオリゴマーを形成する場合は常に、切断可能な結合が、切断誘導部分の有効な切断近接の範囲内に導かれ、その結果、分子タグが放出され得る。次いで、その分子タグは、反応混合物から分離され、そして二量化またはオリゴマー形成の測定を提供するために定量される。
【０００７】
別の局面において、本発明の方法は、以下の工程：複数のレセプター型のうちの第１のレセプター型に特異的な切断プローブを提供する工程であって、この切断プローブが、有効な近接を含む切断誘導部分を有する、工程；各々がその複数のうちの異なる第２のレセプター型に特異的な１以上の結合性化合物を提供する工程であって、各々の結合性化合物が、各々が切断可能な結合によってそれらに結合される１以上の分子タグを有し、異なる結合性化合物の分子タグが、異なる分離特性を有する、工程；切断プローブ、１以上の結合性化合物、および第１のレセプター型と第２のレセプター型とを含む細胞膜を混合する工程であって、その結果、切断プローブおよび１以上の結合性化合物が、それぞれのレセプターに特異的に結合し、かつ１以上の結合性化合物の切断可能な結合が、切断誘導部分の有効な近接の範囲内にあり、その結果、分子タグが放出される、工程；ならびに放出された分子タグを分離かつ同定して、細胞膜におけるレセプターのオリゴマー形成の存在または比存在、あるいは量を決定する工程、を包含する。
【０００８】
別の局面において、本発明は、細胞膜において膜結合分析物のダイマーを検出する方法を提供し、この方法は、以下の工程：ダイマーの第１の膜結合分析物に特異的な結合性化合物を提供する工程であって、このダイマーが、第１の膜結合分析物と第２の膜結合分析物とを含み、そしてこの結合性化合物が、各々が切断可能な結合によってそれらに結合される１以上の分子タグを有し、この１以上の分子タグが、各々、分離特性を有する、工程；第２の膜結合分析物に特異的な切断プローブを提供する工程であって、この切断プローブが、有効な近接を含む切断誘導部分を有する、工程；切断プローブ、結合性化合物、および細胞膜を混合する工程であって、その結果、切断プローブが第１の膜結合分析物に特異的に結合し、かつ結合性化合物が第２の膜結合分析物に特異的に結合し、その結果、結合性化合物の切断可能な結合が、切断誘導部分の有効な近接の範囲内にあり、その結果、分子タグが放出される、工程；ならびに放出された分子タグを分離かつ同定して、細胞膜におけるダイマーの存在または比存在、あるいは量を決定する工程を包含する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、細胞の表面上の複数のレセプター型の間で、ダイマーの頻度を概説する方法を提供する。
【００１０】
別の局面において、本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを含む。１つの実施形態において、本発明のキットは、１以上の結合性化合物および切断プローブを備える。別の実施形態において、このような１以上の結合性化合物および切断プローブは、各々、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、およびＨｅｒ４からなる群より選択されるレセプターを含むダイマーの異なる抗原決定基に特異的である。より具体的には、このような１以上の結合性化合物および切断プローブは、各々、Ｈｅｒ１のダイマー、Ｈｅｒ２のダイマー、Ｈｅｒ１とＨｅｒ２とを含むダイマー、Ｈｅｒ１とＨｅｒ３とを含むダイマー、およびＨｅｒ２とＨｅｒ３とを含むダイマーからなる群より選択されるダイマーの異なる抗原決定基に特異的である。
【００１１】
本発明は、現在の技術を越えるいくつかの利点を有する、膜結合分析物の二量化またはオリゴマー形成を検出または測定する方法を提供する。その利点としては、（１）アッセイ混合物から分離される分子タグの検出および／または測定が、非常に減少したバックグラウンドおよび感度における有意な増加を提供すること；ならびに（２）分離および検出の容易さのために特別に設計された分子タグの使用によって、利便性のある多重化能力を提供することが挙げられるが、これらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（定義）
「抗体」とは、別の分子の特定の空間的かつ極性的な構成体に特異的に結合し、それによって、これらに対して相補的であると定義される免疫グロブリンを意味する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、当該分野で周知の技術（例えば、宿主の免疫化および血清（ポリクローナル）の採取）により、または連続的なハイブリッド細胞系を調製し、分泌タンパク質（モノクローナル）を採取することにより、またはヌクレオチド配列もしくは天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列を少なくともコードするその変異形をクローニングおよび発現することにより、調製され得る。抗体は、完全免疫グロブリンまたはそのフラグメントを含み得、免疫グロブリンとしては、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭなどの種々のクラスおよびアイソタイプが挙げられる。それらのフラグメントとしては、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられ得る。さらに、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの凝集体、ポリマーおよび結合体は、特定のポリペプチドへの結合親和性が適切に維持される限り、使用され得る。
【００１３】
「抗体結合性組成物」とは、１つ以上の抗体を含む分子または分子の複合体を意味し、抗体からその結合特異性を誘導する。抗体結合性組成物としては、第１の抗体が標的分子に特異的に結合し、第２の抗体が、第１の抗体の定常領域に特異的に結合する抗体ペア；分子タグまたは光増感剤などの部分で誘導体化された標的分子およびストレプトアビジンに特異的に結合するビオチン化抗体；標的分子に特異的であり、そしてデキストランなどのポリマー（これが、次に分子タグまたは光増感剤などの部分で誘導体化される）に結合体化した抗体；標的分子に特異的であり、そしてビーズ、またはミクロビーズ、または他の固相支持体（これらが、次に分子タグまたは光増感剤、あるいは後者を含むポリマーなどの部分で誘導体化される）に結合体化した抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
「抗原決定基」、または「エピトープ」とは、単一の抗体分子が結合する膜結合分析物の表面上の部位を意味する；一般的には、膜結合分析物は、いくつかのまたは多数の異なる抗原決定基を有し、多くの様々な特性を有する抗体と反応する。膜結合分析物が、シグナル導入プロセスに関与する細胞表面レセプターである場合、好ましい抗原決定基は、レセプターのリン酸化部位である。
【００１５】
「結合部分」とは、膜結合分析物に特異的に結合可能な分子タグが、直接的または間接的に結合し得る任意の分子を意味する。結合部分としては、抗体、抗体結合性組成物、ペプチド、タンパク質（特に分泌タンパク質およびオーファン分泌タンパク質）、核酸、および１０００ダルトンまでの分子量を有し、かつ水素、炭素、酸素、窒素、硫黄およびリンからなる群より選択される原子からなる有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
分離カラムに関して「キャピラリーサイズ」とは、プレートまたは微量流体装置中のキャピラリーチューブまたはチャネルを意味し、ここで、分離カラムの直径または最も大きな寸法は、約２５〜５００ミクロンの間であり、分離媒体の全体にわたって効率的な熱散逸を可能にし、結果として媒体内に低熱対流を有する。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、「クロマトグラフィー」または「クロマトグラフィー分離」とは、化合物の混合物（例えば、分子タグ）を含む移動相（通常は液体）の流動が、移動相と固定相（通常は固体）との間の差示的分配によって、１つ以上の物理的性質または化学的性質に基づいてこのような化合物の分離を促進する分析法を意味するか、またはいう。分子タグのような分析物のクロマトグラフィー分離の基礎を形成する１つ以上の物理的特性としては、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性などが挙げられるが、これらに限定されない。１つの局面において、本明細書中で使用される場合、「高圧（または性能）液体クロマトグラフィー」（「ＨＰＬＣ」）とは、（ｉ）３００ｍｍまでの長さおよび５ｍｍまでの内径を有する剛性円筒形分離カラムを使用し、（ｉｉ）分離カラム内に詰められた５μｍまでの同一直径を有する剛性球形粒子（例えば、シリカ、アルミナなど）を含む固相を有し、（ｉｉｉ）３５℃〜８０℃までの範囲の温度、ならびに１５０バールまでのカラム圧で行われ、そして（ｉｖ）１μＬ／分〜４ｍＬ／分の範囲の流速を使用する、液相クロマトグラフィー分離をいう。好ましくは、ＨＰＬＣにおいて使用するための固相粒子は、（ｉ）平均粒径について狭いサイズ分布を有し、実質的に全ての粒径が平均の１０％以内であり、（ｉｉ）７０〜３００オングストロームの範囲の同じ孔隙サイズ有すること、（ｉｉｉ）５０〜２５０ｍ２／ｇの範囲の表面積を有すること、そして（ｉｖ）１ｎｍ２当たり１〜５の範囲の結合相密度（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ）（すなわち、１単位面積あたりの保持リガンド数）を有することにおいて、さらに特徴付けられる。分子タグを分離するための例示的な逆相クロマトグラフィーの媒体としては、それらの表面保持リガンド（例えば、Ｃ８〜Ｃ１８を含む群から選択されるフェニル基、シアノ基または脂肪族基）に結合している、粒子（例えば、シリカまたはアルミナ）が挙げられる。本発明に関するクロマトグラフィーは、「キャピラリー通電クロマトグラフィー」（「ＣＥＣ」）および関連技術を含む。ＣＥＣは、流体が、例えば、３０〜１００μｍの範囲の内径を有するキャピラリーサイズカラムを通して電気浸透流動により駆動される、液相クロマトグラフィー技術である。ＣＥＣは、Ｓｖｅｃ、Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：１−４７（２００２）；Ｖａｎｈｏｅｎａｃｋｅｒら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２２：４０６４−４１０３（２００１）などの引用文献に開示されている。ＣＥＣカラムは、従来の逆相ＨＰＬＣに使用されるものと同じ固相材料を使用してもよく、またさらに、いわゆる「モノリシック」の非特定のパッキングを使用してもよい。ＣＥＣのいくつかの形態において、圧力ならびに電気浸透は、カラムを通して分析物含有溶媒を駆動する。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「キット」とは、物質を送達するための任意の送達システムをいう。反応アッセイの文脈において、このような送達システムは、貯蔵、輸送、または反応試薬（例えば、適切な容器内のプローブ、酵素など）、および／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイを実施するための指示書など）の１つの位置から別の位置への送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含む１以上の封入物（例えば、ボックス）を備える。このような内容物は、意図されたレシピエントに一緒にまたは別々に送達し得る。例えば、第１の容器は、アッセイに使用する酵素を備え得、一方、第２の容器はプローブを備える。
【００１９】
用語「リガンド」はまた、リガンド−レセプター相互作用に介して所定のレセプターに結合する分泌タンパク質またはそのタンパク質をいうために、本明細書中で使用される。
【００２０】
「膜結合分析物」とは、膜（特に、哺乳動物細胞または哺乳動物組織の細胞表面膜のような生物学的膜）に直接的または間接的に結合している物質、化合物、分子または成分、あるいは上記のいずれかの部分を意味する。例えば、膜結合分析物が親油性部分を有するか、または膜において固定し得る親油性部分を有する別の分子に結合される場合、前記結合は直接的であり得る。例えば、膜結合分析物が細胞表面レセプターに結合し、そしてこれと安定な複合体を形成する溶解性リガンドである場合、前記結合はまた間接的であり得る。膜結合分析物は、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、有機分子、ハプテン、エピトープ、生物学的細胞の部分、タンパク質の翻訳後修飾、レセプター、レセプターのような膜成分に結合した複合糖、膜と安定な複合体を形成する溶解性化合物（例えば、ビタミン、ホルモン、サイトカインなど）、などであり得るが、これらに限定されない。単一の分子実体（例えば、同じタンパク質上の異なるリン酸化部位）と会合する１つより多い分析物が存在し得る。膜結合分析物としては、細胞膜レセプターのような細胞表面分子が挙げられる。本発明の１つの局面において、膜結合分析物は、表皮増殖因子レセプターおよびＧタンパク質共役レセプターからなる群より選択される細胞膜レセプターである。特に、表皮増殖レセプターとしては、Ｈｅｒ１レセプター、Ｈｅｒ２レセプター、Ｈｅｒ３レセプター、およびＨｅｒ４レセプターが挙げられる（例えば、Ｙａｒｄｅｎ（上記で引用）；ＹａｒｄｅｎおよびＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ（上記で引用））。膜結合分析物に関して「ダイマー」とは、安定な、通常は非共有結合性の、２つの膜結合分析物の会合体を意味する。膜結合分析物のダイマーは、リガンドとの相互作用（すなわち、リガンド誘導性二量化）の結果として形成され得る（例えば、Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅｌｌ、１１０：６６９−６７２（２００２））。膜結合分析物に関して「オリゴマー」とは、安定な、通常は非共有結合性の、少なくとも２つの膜結合分析物の会合体を意味する。
【００２１】
「ポリペプチド」とは、１つのアミノ酸のカルボキシ基と他のアミノ酸のアミノ基との間の水の脱離によるアミド結合により一緒に化学結合されたアミノ酸残基からなる化合物のクラスをいう。ポリペプチドは、多数のこのような残基を含み得る、アミノ酸残基のポリマーである。ペプチドは、一般にそれらがより少ないアミノ酸数からなることを除いて、ポリペプチドと類似している。ペプチドは、時にはオリゴペプチドと称される。ポリペプチドとペプチドとの間の明確な区別は存在しない。便宜上、本開示と特許請求の範囲とにおいて、用語「ポリペプチド」は、一般にペプチドおよびポリペプチドを称するために使用される。アミノ酸残基は、天然または合成であり得る。
【００２２】
「タンパク質」とは、規定された三次元構造に折りたたまれた、生物学的細胞により通常合成されるポリペプチドをいう。タンパク質は、一般に、約５，０００〜約５，０００，０００以上の分子量、より一般的には約５，０００〜約１，０００，０００の分子量であり、翻訳後の修飾（例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸エステル形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、およびユビキチン化）を含み得る（例えば、Ｗｏｌｄ，Ｆ．、「Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」、「Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３、ｐｐ．１−１２）。タンパク質としては、例示目的かつ限定なしに、サイトカインまたはインターロイキン、酵素（例えば、キナーゼ、プロテアーゼ、ガラクトシダーゼなど）、プロタミン、ヒストン、アルブミン、免疫グロブリン、硬タンパク質、リンタンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、Ｔ細胞レセプター、プロテオグリカン、非分類タンパク質（例えば、ソマトトロピン、プロラクチン、インスリン、ペプシン、ヒト血漿中に見られるタンパク質、血液凝固因子、血液型因子、タンパク質ホルモン、癌抗原、組織特異的抗原、ペプチドホルモン、栄養マーカ、組織特異的抗原、および合成ペプチドが挙げられる。
【００２３】
用語「サンプル」とは、検出または測定されるべき膜結合分析物を含むと思われる物質の量を意味する。本明細書中で使用される場合、この用語は、標本（例えば、生検標本または医学標本）または培養物（例えば、微生物学的培養物）を包含する。これはまた、生物学的サンプルおよび環境サンプルの両方を包含する。サンプルは、合成起源の標本を含み得る。生物学的サンプルは、ヒトを含む動物の、流体、固体（例えば、大便）または組織、ならびに液体食品および固形食品、飼料製品、および成分（例えば、乳製品、野菜、肉および肉副産物）、および廃棄物であり得る。生物学的サンプルとしては、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、痰、精液、針吸引液などを含む、患者から採取された材料が挙げられ得るが、これらに限定されない。生物学的サンプルは、種々の飼育動物科の全て、ならびに野生または自然の動物（例えば、有蹄動物、クマ、魚類、げっ歯類などが挙げられるが、これらに限定されない）から得ることができる。環境サンプルとしては、環境物質（例えば、表面物質、土壌、水および産業サンプル）、ならびに食品および乳製品加工用の器具、器械、装置、用具、使い捨て用品および非使い捨て用品から得られるサンプルが挙げられる。これらの例は、本発明に適用できるサンプル型を限定するものとして解釈すべきではない。特に、生物学的サンプルとしては、固定生物学的標本（例えば、固定液で処理された患者生検標本、パラフィン中に埋め込まれた生物学的標本、冷凍した生物学的標本、塗抹標本など）が挙げられる。
【００２４】
分子タグの分離に関する「分離プロフィール」とは、アッセイにおいて生じた各型の分子タグ数の読み出しまたは測定値を提供するシグナル強度データ対、保持時間、質量などのような分子タグに関連するパラメータのチャート、グラフ、曲線、棒グラフ、または他の表現を意味する。分離プロフィールは、電気泳動図、クロマトグラム、電気クロマトグラム、質量スペクトログラム、または使用される分離技術に依存するデータのグラフ表現であってもよい。分離プロフィールに関する「ピーク」または「バンド」または「ゾーン」とは、分離された化合物が集中される領域を意味する。例えば、異なる分子タグが、明確な発光スペクトルを有する異なる蛍光標識を有し、データが収集され、多重波長で記録される場合、単一アッセイに関して多重分離プロフィールが存在し得る。１つの局面において、放出分子タグは、電気泳動の移動差により分離され、異なる分子タグが電気泳動図上の明瞭なピークに相当する電気泳動図を形成する。電気泳動図における隣接したピークの明瞭さ、または重なりのなさの基準が、「電気泳動分解能」であり、これは、ピークの２つの標準偏差のうちの大きいものの４倍で割られた隣接ピーク最大値間の距離としてとることができる。好ましくは、隣接ピークは、少なくとも１．０、より好ましくは、少なくとも１．５、最も好ましくは、少なくとも２．０の分解能を有している。所与の分離および検出システムにおいて、望ましい分解能は、複数の分子タグを選択することにより得ることができ、このメンバーは少なくともピーク分解量が異なる電気泳動移動性を有し、このような量は、シグナル検出システム、蛍光部分の性質、タグの拡散係数、篩い分けマトリックスの存在または比存在、電気泳動装置の性質、例えば、チャネルの存在または比存在、分離チャネルの長さなど、当業者に周知のいくつかの因子に依存する。
【００２５】
標的分析物に関する化合物、またはプローブの結合のような１つの分子と他の分子との結合に関して「特異的」または「特異性」とは、プローブと標的間の認識、接触、および安定な複合体形成を意味し、プローブと他の分子との認識、接触または複合体形成が実質的により少ないことを伴う。１つの局面において、第１の分子と第２の分子との結合に関して「特異的」とは、反応またはサンプルにおいて第１の分子が別の分子を認識し、それと複合体を形成する程度に、第１の分子は第２の分子と最大数の複合体を形成することを意味する。１つの局面において、この最大数は、第１の分子によって形成されるこのような複合体全ての少なくとも５０パーセントである。一般に、特異的結合事象に関与する分子は、互いに結合する分子間に特異的認識を引き起こす表面領域または空洞領域を有している。特異的結合の例としては、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド間の二重または三重複合体形成、レセプター−リガンド相互作用などが挙げられる。特異性または特異的結合に関して本明細書中に用いられる「接触」とは、ファンデルワールス力、水素結合、イオン性および疎水性相互作用などの弱い非共有的化学相互作用が分子相互作用を支配するほど、２つの分子が十分に近接することを意味する。２つ以上の分子に関して本明細書中に用いられる「安定な複合体」とは、このような分子が、例えば、アッセイ条件下で、非凝集状態よりも熱力学的に都合のよい特異的結合により非共役的に結合された凝集体を形成することを意味する。
【００２６】
複数の蛍光標識に関して、本明細書中で使用される場合、用語「スペクトル分解可能（である）」とは、標識の蛍光発光バンドが十分に明瞭、すなわち、十分に重なりがなく、それぞれの標識が結合される分子タグが、米国特許第４，２３０，５５８号；米国特許第４，８１１，２１８号など、またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、「Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」、２１−７６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５）に記載されているシステムにより例示されるように、例えば、バンド・パス・フィルタおよび光電子増倍管システムなどを使用する標準的光検出システムにより、それぞれの標識により生成された蛍光シグナルに基づいて区別できることを意味する。
【００２７】
用語「分泌タンパク質」または「可溶性タンパク質」とは、（ｉ）細胞内発現し、（ｉｉ）細胞から、例えば、典型的に細胞膜を通して小胞体から発現タンパク質を指令するリーダー配列を必要とする細胞外媒体に分泌され、（ｉｉｉ）細胞増殖または細胞刺激、細胞表面事象、または細胞−細胞相互作用事象を含む細胞内事象であり得る何らかの細胞事象または活性をもたらす、または開始するために、レセプター、典型的には細胞表面レセプターに作用するタンパク質をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「タグ化プローブ」とは、細胞膜の表面上で標的分子に結合する、本発明において使用するためのプローブをいい、切断可能な結合を介してこのプローブの結合性物質に結合される１以上の分子タグを含む。本明細書中で使用される場合、「タグ化プローブ」は、「結合性化合物」と同義的に使用される。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
１つの局面において、本発明は、膜結合分析物および切断プローブと共に安定な複合体を形成する結合性化合物から分子タグを選択的に放出することによって、サンプル中の１以上の膜結合分析物のダイマーもしくはオリゴマーの存在および／または量を決定するための方法に関する。本発明のこの局面の重要な特徴は、この切断プローブのごく近接にあるこのような複合体中の結合性化合物からの、分子タグの制限的切断を含むが、実質的には、このような複合体を形成しない結合性化合物の分子タグの切断を含まない。すなわち、切断プローブは、そのすぐ近くにある特定の結合を切断するように誘導され得る切断誘導部分を含む。以下でより十分に開示されるように、このような局所的切断は、活性種（すなわち、分子タグの切断可能な結合と反応して、結合性化合物からのそれらの放出を引き起こし得る、拡散性で、短寿命で、反応性の化学実体）を生成するように誘導され得る「増感剤」と本明細書中で称される切断誘導部分を使用することによって、達成される。
【００３０】
本発明の１つの実施形態の説明は、図１Ａおよび図１Ｂにおいて図式的に示される。分子タグ「ｍＴ１」および「ｍＴ２」を有する結合性化合物（１００）、ならびに光増感剤「ＰＳ」を有する切断プローブ（１０２）が、生物学的細胞（１０４）と結合される。分子タグ「ｍＴ１」を有する結合性化合物は、細胞表面レセプターＲ１（１０６）に特異的であり、そして分子タグ「ｍＴ２」を有する結合性化合物は、細胞表面レセプターＲ２（１０８）に特異的である。細胞表面レセプターＲ１およびＲ２は、細胞表面膜（１１２）において、モノマー（例えば、（１０６）、（１０８））およびダイマー（１１０）として提示される。これらのアッセイの後、成分は、適切な結合緩衝液中でインキュベートされて、結合性化合物とそれぞれのレセプター標的との間で、および切断プローブとそのレセプター標的との間で、安定な複合体の形成（１１４）が可能になる。図示されるように、好ましい結合性化合物および切断プローブは、各々、抗体結合成分を含み、これは、分子タグおよび切断誘導部分が、膜組成物に特異的に標的化されるようにする。１つの局面において、このような抗体結合性組成物は、モノクローナル抗体である。このような実施形態において、結合緩衝液は、従来のＥＬＩＳＡ技術などにおいて使用される緩衝液を含み得る。安定な複合体（１１６）に対して化合物が結合し、そしてプローブが切断された後、このアッセイ混合物は照射されて（１１８）、光増感剤（１２０）を誘導し、一重項酸素を生成する。一重項酸素は、アッセイ混合物の成分と速やかに反応し、それによって、分子タグの切断可能な結合を切断するためのその有効な近接（１２２）は、空間的に限定され、それによって、たまたま有効な近接の範囲内にある分子タグのみが、放出される（１２４）。図示されるように、放出された分子タグのみが、Ｒ１−Ｒ２ダイマーおよび切断プローブと安定な複合体を形成する結合性化合物上にある分子タグである。放出された分子タグ（１２６）は、アッセイ混合物から除去され、そして分離特性に従って分離され（１２８）、それによって、分離プロフィール（１３２）に明瞭なピーク（１３０）が形成される。本発明に従って、このような除去および分離は、同じ工程であり得る。必要に応じて、照射に先立って、結合緩衝液が除去され得、そして分離により適切な緩衝液（すなわち、分離緩衝液）と交換され得る。例えば、結合緩衝液は、代表的に、分子タグを明瞭なピークへ分離するためのいくつかの分離技術（例えば、キャピラリー電気泳動）の性能を低下させ得る塩濃度を含む。１つの実施形態において、このような緩衝液の交換は、膜濾過によって実行され得る。
【００３１】
図２Ａ〜２Ｅは、多くのレセプター型の間での二量化を特徴付けるための、本発明の別の実施形態を示す。図２Ａは、このようなアッセイの基本工程の概要を説明する。細胞表面レセプターのダイマーに関して試験されるべき細胞膜（２００）は、結合性化合物（２０２）および（２０４）ならびに切断プローブ（２０６）のセットと組み合わせられる。膜画分（２００）は、３つの異なるヘテロダイマー（１−２、１−３、および２−３）を形成するように結合する、３つの異なる型のモノマーレセプター分子（「１」、「２」、および「３」）を、その細胞膜中に含む。３つの抗体試薬（２０２）および（２０４）は、膜画分（２００）と組み合わせられる。各々の抗体試薬は、３つのレセプター分子の１つに対する結合特異性を有し、ここで抗体（２０６）はレセプター分子１に特異的であり、抗体（２０４）はレセプター分子２に特異的であり、そして抗体（２０２）はレセプター分子３に特異的である。第１のレセプター分子に対する抗体は、光増感剤分子（標識されたＰＳ）に共有結合され、第２および第３のレセプター分子に対する抗体は、光増感剤部分によって生成された活性種によって、切断可能な結合を介して、２つの異なるタグ（標識されたＴ２およびＴ３）にそれぞれ結合される。
【００３２】
混合後、この抗体は膜表面上の分子に結合（２０８）することが可能になる。光増感剤は活性化され（２１０）、増感剤分子から作用可能な距離内にあるタグと抗体との間の結合を切断し、それによって、アッセイ媒体中にタグが放出される。次いで、この反応由来の物質が、例えば、図示されるようにキャピラリー電気泳動によって、分離される（２１２）。図２Ａの下に示されるように、放出され、そしてによって分離されたタグＴ２およびＴ３は、これらのタグに対応する２つのバンドを示す。タグが、公知の電気泳動移動性を有するように設計されているため、各々のバンドは、アッセイに使用されたタグの１つに対して一意的に割当てられ得る。
【００３３】
図２Ａに示すように、細胞膜上に提示され、３つの異なるヘテロダイマーのうちの２つのみが、光増感剤含有抗体およびタグ含有抗体の両者に結合し、従って、これら２種のみが、放出されたタグを生じるべきである。しかし、複数の実験は、異なるダイマーの相対量を測定することが必要とされる。図２Ｂは、５つの異なるアッセイの組み合わせを列挙する表を提供する。図２Ｃは、各々のアッセイ組成物についての例示的な結果である。アッセイＩは、図２Ａに記載するように、完全なアッセイからの結果を示す。アッセイＩＩにおいて、光増感剤に対して結合されるレセプター分子１について特異的な抗体が、除外される。このアッセイは、シグナルを全く生じず、このことは、アッセイＩにおいて得られたＴ２シグナルおよびＴ３シグナルが、光増感剤試薬を必要とすることを示す。同様に、アッセイＶは、タグシグナルが、膜の存在を必要とすることを示す。アッセイＩＩＩおよびＩＶは、各々のタグ化試薬が、切断されるために他の試薬の存在を必要としないことを示す。一緒に考慮した場合、これらの結果は、図２Ｃに示すように、膜に存在するレセプターヘテロダイマーの存在および組成に関する結論、すなわち、１−２ヘテロダイマーおよび１−３ヘテロダイマーの両方が存在することを導くことを可能にする。さらに、各々のタグからの相対シグナル強度は、各々のヘテロダイマーの相対存在量を推定することを可能にする。
【００３４】
しかし、２−３ヘテロダイマーの存在に関する結論は、このアッセイにおいて使用される試薬の組み合わせを用いてはなされ得ない。複合体が存在してもしなくても、この複合体を示すシグナルは得られない。なぜなら、複合体が、複合体に結合される光増感剤試薬を有さないからである。３つのモノマーについて可能なすべてのダイマーの組み合わせに関する結論を導くために、モノマー１、２、および／もしくは３を含む可能なすべてのオリゴマーに局在され得る第４の試薬が使用されなければならないか、あるいはこの実験で使用される３つの結合物質が、タグおよび増感剤分子に対して異なる組み合わせで結合されなければならないかのいずれかである。後者の戦略は、図２Ｄおよび２Ｅに示される。３つの抗体試薬の間での光増感剤とタグ分布との可能な３つの組み合わせは、図２Ｄの左側の表に列挙される。第１の組み合わせは、モノマー番号１に特異的な抗体に結合された光増感剤を含み、図２Ａ〜２Ｃの図で使用される組み合わせと同じであり、図２Ｃに示すような同一のダイマー集団を有する。第２の組み合わせは、モノマー番号２に特異的な抗体に結合された光増感剤を含み、その集団プロフィールは、ヘテロダイマー１−２について同一の数を生じ、加えて、ヘテロダイマー２〜３について同一の値を生じる。第３の組み合わせは、モノマー番号３に特異的な抗体に結合された光増感剤を含み、その集団プロフィールは、最初の２つの組み合わせから得られるようにヘテロダイマー１−２およびヘテロダイマー２−３について同一の数を生じる。これらの結果は、図２Ｅに与えられる全体的なヘテロダイマー集団プロフィールを生じるように組み合わされ得る。
【００３５】
上記のように、本発明の別の局面は、細胞膜において細胞表面分子の１以上のオリゴマー複合体の形成を決定することに関する。決定され得る複合体としては、単一の分子種のうちの２以上の分子を含むホモオリゴマー、および２以上の異なる分子種を含むヘテロオリゴマーが挙げられる。細胞表面分子の好ましいクラスとしては、レセプター（特に、Ｇ−タンパク質共役レセプターファミリーのメンバー、および上皮増殖因子レセプターファミリーのメンバー）が挙げられる。
【００３６】
本発明の方法は、少なくとも２つの細胞表面分子を２つの異なる結合物質と接触させる工程を包含し、第１の結合物質は切断可能な結合を介してタグ（ここで、このタグは検出基を含む）に結合され、第２の結合物質は、切断可能な結合が反応に有効な切断物質の近接の範囲内ある場合にその結合を切断し得る切断物質に結合される。この反応領域は、切断物質の「有効な近傍（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）」と称される。切断物質によるタグの放出は、切断プローブの有効な近傍の範囲内のタグ化プローブの局在化を示す。第１および第２の結合物質の好ましい組成は、抗体分子であり、より好ましくはモノクローナル抗体である。好ましい検出基は、フルオロフォアである。好ましい実施形態の切断物質は、活性な切断種を生成するために活性化され得る増感剤分子である。より好ましくは、切断物質は、オキシダントを生成するために光によって活性化される光増感剤を含み、この光増感剤は、オキシダントは、タグ化プローブの第１の結合物質に対してタグを結合している酸化不安定性の結合を切断する。
【００３７】
本発明の別の局面において、複数の細胞表面複合体の形成、または複数の異なる分子種を含む単一の細胞表面複合体の形成を決定することが望ましく、この方法は、各々が異なるタグに結合される複数の第１の結合物質を利用して、それによって、複数のタグ化プローブを形成する。複数のタグにおける各々のタグは、その複数における他のすべての放出可能なタグから各々の放出可能なタグを区別するための手段を提供する、検出基および移動性修飾物質を含む。放出されたタグを区別する１つの好ましい手段は、電気泳動による物理的な分離であり、ここで、移動性修飾物質は、電気泳動移動性に差を与える。電気泳動の好ましい様式としては、従来のキャピラリー電気泳動およびマイクロフルイディックスカード上での分離の両方を含む、キャピラリー電気泳動が挙げられる。他の好ましい区別する手段としては、タグの検出基の光学的特徴の差に基づくスペクトル分解、およびタグの質量の差に基づく質量分析による物理的分離が挙げられる。
【００３８】
本発明の別の局面は、細胞膜表面でのオリゴマー複合体形成における化合物の効果を決定することに関する。これらの方法は、細胞膜、タグ化プローブ、および切断プローブの２つの組み合わせを調製する工程を包含し、ここで、化合物が、２つの組み合わせのうちの一方に添加される。インキュベーションしてタグ化プローブの切断を可能にした後、各々の組み合わせにおいて放出されたタグの量が検出され、そして２つの混合物が比較される。本発明はさらに、複数の細胞表面複合体の形成における化合物の効果を決定するための方法を提供する。
【００３９】
別の局面において、本発明は、細胞膜において第１の細胞表面分子および第２の細胞表面分子を含むオリゴマー複合体の形成を決定するための方法を包含し、この方法は、以下の工程：（ａ）結合条件下で、以下：（ｉ）細胞膜、（ｉｉ）第１の細胞表面分子および検出基を含むタグのうちの少なくとも１つの分子に特異的に結合し得る第１の結合性物質を含むタグ化プローブであって、このタグが切断可能な結合を介して第１の結合性物質に結合されている、タグ化プローブ、および（ｉｉｉ）第２の細胞表面分子、および有効な近接の範囲内にある場合に切断可能な結合を切断し得る切断物質に特異的に結合し得る第２の結合性物質を含む切断プローブであって、ここで、オリゴマー複合体が細胞膜内で形成され、かつタグ化プローブおよび切断プローブの両方によって結合される場合、タグ化プローブのうちの少なくとも１つの切断可能な結合が、切断物質の有効な近接の範囲内にある、切断プローブ、を混合する工程；（ｂ）この混合物を、切断物質の有効な近接の範囲内にある切断可能な結合の切断を可能にする条件下で、インキュベートする工程であって、これによって、タグ化プローブからタグが放出される、工程；ならびに（ｃ）放出されたタグを検出する工程であって、これによって、オリゴマー複合体の形成を検出する、工程を包含する。
【００４０】
別の局面において、本発明は、１つまたはそれ以上のオリゴマー複合体の形成を決定するための方法を包含し、各々のオリゴマー複合体は、細胞膜において第１の細胞表面分子および第２の細胞表面分子を含み、この方法は、以下の工程：（ａ）結合条件下で、以下：（ｉ）細胞膜、（ｉｉ）複数のタグ化プローブであって、各々のタグ化プローブが、一連の細胞表面分子のうちの１つ、および一連のタグ由来のタグのうちの少なくとも１つの分子に特異的に結合し得る第１の結合性物質を含み、ここで、このタグが、一連のタグ由来の他のすべてのタグから各々のタグを区別するための手段を提供する検出基および移動性修飾物質（ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を含み、タグが切断可能な結合を介して第１の結合性物質に結合される、複数のタグ化プローブ、および（ｉｉｉ）第２の細胞表面分子に特異的に結合し得る第２の結合性物質、および有効な近接の範囲内にある場合に切断可能な結合を切断し得る切断物質を含む切断プローブを混合する工程であって、ここで、このオリゴマー複合体が、細胞膜中で形成され、かつタグ化プローブと切断プローブの両方によって結合される場合、タグ化プローブの切断可能な結合のうちの少なくとも１つが、切断物質の有効な近接の範囲内にある、工程；（ｂ）この混合物を、切断物質の有効な近接の範囲内にある切断可能な結合の切断を可能にする条件下でインキュベートして、タグ化プローブから放出されたタグを生成する工程；（ｃ）放出されたタグを、区別するための方法に従って分離する工程；ならびに（ｄ）分離されたタグを検出し、それによって、各々のオリゴマー複合体の形成を決定する工程、を包含する。
【００４１】
別の局面において、本発明は、細胞膜において第１の細胞表面分子と第２の細胞表面分子とを含むオリゴマー複合体の形成における、化合物の効果を決定する方法を包含し、この方法は、以下の工程：（ａ）結合条件下で、以下：（ｉ）細胞膜、（ｉｉ）第１の細胞表面分子および検出基を含むタグのうちの少なくとも１つの分子に特異的に結合し得る第１の結合性物質を含むタグ化プローブであって、このタグが、切断可能な結合を介して第１の結合性物質に結合されている、タグ化プローブ、および（ｉｉｉ）第２の細胞表面分子および有効な近接の範囲内にある場合に切断可能な結合を切断し得る切断物質に特異的に結合し得る第２の結合性物質を含む切断プローブ、を含む２つの混合物を調製する工程であって、ここで、オリゴマー複合体が細胞膜中で形成され、かつタグ化プローブおよび切断プローブの両方によって結合される場合、タグ化プローブのうちの少なくとも１つの切断可能な結合が、切断プローブの有効な近接の範囲内にある、工程；（ｂ）化合物をこの２つの混合物のうちの一方に添加する工程；（ｃ）切断プローブの有効な近接の範囲内にある切断可能な結合の切断を可能にする条件下で、混合物をインキュベートし、それによって、タグ化プローブからタグを放出させる工程；（ｄ）工程（ｃ）における２つの組み合わせの各々において放出されたタグの量を検出し、かつ同定する工程；ならびに（ｅ）２つの混合物において放出されたタグの量を比較し、それによって、オリゴマー複合体の形成における化合物の効果を決定する工程、を包含する。
【００４２】
別の局面において、本発明は、任意のオリゴマー複合体またはすべてのオリゴマー複合体の形成における化合物の効果を決定するための方法を包含し、各々のオリゴマー複合体は、細胞膜において第１の細胞表面分子と第２の細胞表面分子とを含み、この方法は、以下の工程：（ａ）結合条件下で、以下：（ｉ）細胞膜、（ｉｉ）複数のタグ化プローブであって、各々のタグ化プローブが、複数のオリゴマー複合体の第１の細胞表面分子のうちの１つ、および一連のタグ由来のタグのうちの少なくとも１つの分子に特異的に結合し得る第１の結合性物質を含み、ここで、タグが、一連のタグ由来の他のすべてのタグから各々のタグを区別するための手段を提供する検出基および移動性修飾物質を含み、このタグが、切断可能な結合を介して第１の結合性物質に結合される、タグ化プローブ、ならびに（ｉｉｉ）複数のオリゴマー複合体の第２の細胞表面分子のうちの１つ、および有効な近接の範囲内にある場合に切断可能な結合を切断し得る切断物質に特異的に結合し得る第２の結合性物質を含む切断プローブ、を含む２つの混合物を調製する工程であって、ここで、オリゴマー複合体が、細胞膜中で形成され、かつタグ化プローブおよび切断プローブの両方によって結合される場合、タグ化プローブの切断可能な結合のうちの少なくとも１つが、切断プローブの有効な近接の範囲内にある、工程；（ｂ）化合物を２つの混合物のうちの一方に添加する工程；（ｃ）切断物質の有効な近接の範囲内にある切断可能な結合の切断を可能にする条件下で、混合物をインキュベートし、それによって、タグ化プローブからタグを放出する工程；（ｄ）放出されたタグを、区別するための手段に従って分離する工程；(ｅ）工程（ｃ）における２つの混合物の各々において放出された、分離したタグの各々の量を検出かつ同定する工程；ならびに（ｆ）２つの混合物において放出された各々のタグの量を比較し、それによって、オリゴマー複合体の形成における化合物の効果を決定する工程、を包含する。
【００４３】
標的膜結合分析物を含有するサンプルは、細胞培養物、動物組織もしくは植物組織、微生物、患者生検などを含む広範な種々の供給源に由来し得る。サンプルは、サンプルが採取される供給源に依存し得る従来の技術を使用して本発明のアッセイのために調製される。分析のための細胞膜を調製する指針は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９）；Ｉｎｎｉｓら編、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第１５２巻、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）；Ｏｈｌｅｎｄｉｅｃｋ、Ｋ．（１９９６）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、第５９巻、２９３−３０４；方法小冊子５、「Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ、２００２）；などの標準的学術論文に見出され得る。哺乳動物組織培養細胞などの供給源に関して、標的膜結合分析物のサンプルは、従来の細胞溶解技術（例えば、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．６）、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、ならびにプロテアーゼおよび／または必要な場合にホスファターゼ阻害剤）により調製され得る。生検および医学標本について：Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＪＤ  ＆  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ａ編、Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、１９７７）；Ｐｅａｒｓｅ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｅｄ．第４版（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ、１９８０）。
【００４４】
以下により十分に記載されるように、標的膜結合分析物は、放出された分子タグの分離および同定によって決定される。様々な分離技術が利用され得、これらの技術は、分離される分子間の１つ以上の物理的、化学的または光学的相違（電気泳動移動性、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、電荷／質量比、極性などが挙げられるが、これらに限定されない）に基づいて、分子を区別し得る。１つの局面において、複数の分子タグは、電気泳動移動性および光学的検出特性が異なり、電気泳動により分離される。別の局面において、複数の分子タグは、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性が異なり、順相または逆相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、ガス相クロマトグラフィーなどの技術によって分離される。
【００４５】
本発明の別の局面は、結合性化合物から放出された後に利用される分離技術により明瞭なバンドまたはピークに分離され得る一連の分子タグを提供する。セット内の分子タグは、化学的に多様であり得；しかし、便宜上、一連の分子タグは、通常は化学的に関連付けられる。例えば、これらはすべてペプチドであり得るか、またはこれらは、同じ基礎単位またはモノマーの異なる組み合わせからなり得るか、または以下により十分に記載されるように、異なる分離特性を付与する異なる置換基を有する同じ基本骨格を使用して合成され得る。複数の分子タグの数は、使用される分離様式、検出用の分子タグに用いられる標識、結合部分の感度、切断可能な結合が切断される効率などを含むいくつかの因子に依存して変わり得る。１つの局面において、複数の分子タグ数は、２から数十、例えば３０の範囲である。他の局面において、複数のサイズは、２から２０、２から１０、３から２０、３から１０、４から３０、４から１０、５から２０、または５から１０の範囲であり得る。
【００４６】
（分子タグおよび切断可能な連結）
１つの実施形態において、分子タグは、切断可能な連結と、切断誘導部分により生成された活性種（例えば、一重項酸素）との反応によって、結合化合物または標的化プローブから切断される（例えば、Ｓｉｎｇｈら，国際特許公報ＷＯ０１／８３５０２およびＷＯ０２／９５３５６）。
【００４７】
本発明の１つの局面は、複数の異なる結合化合物の混合物であって、各々の異なる結合化合物が、切断可能な連結を通して結合した１つ以上の分子タグを有する、混合物を提供することを包含する。結合化合物、切断可能な連結、および分子タグの性質は、様々に変更され得る。結合化合物は、抗体結合組成物、抗体、ペプチド、細胞表面レセプターに対するペプチドリガンドまたは非ペプチドリガンド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ペプチド核酸）、レクチン、または目的の膜結合分析物と特異的に結合し得るかまたは複合体を形成し得る任意の他の分子実態を含み得る。１つの局面において、以下の式：
Ｂ−（Ｌ−Ｅ）ｋ
により表され得る結合化合物は、分析物特異的結合部分に結合された１つ以上の分子タグを有する。式中、Ｂは結合部分であり；Ｌは切断可能な連結であり；そしてＥは分子タグである。好ましくは、非ポリヌクレオチド分析物の均一アッセイにおいて、切断可能な連連結Ｌは、酸化に不安定な連結であり、より好ましくは、一重項酸素により切断され得る連結である。部分「（Ｌ−Ｅ）ｋ」は、単一の結合化合物が、切断可能な連結を通じて結合した複数の分子タグを有し得ることを示している。１つの局面において、ｋは、１以上の整数であるが、他の実施形態においては、ｋは、数百より大きいか（例えば、１００〜５００）、またはｋは、数百より大きく数千であり得る（例えば、５００〜５０００）。本発明の組成物において、通常、各々の複数の異なる型の結合化合物は、異なる分子タグＥを有する。切断可能な連結（例えば、酸素に不安定な連結）および分子タグＥは、従来化学によりＢに結合される。
【００４８】
好ましくは、Ｂは、抗体結合組成物である。このような組成物は、膜結合分析物に特異的な、種々の市販の抗体（モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方）から容易に形成される。特に、表皮増殖因子レセプターに特異的な抗体は、本明細書中に参考として援用される以下の特許に開示されている：米国特許第５，６７７，１７１号；米国特許第５，７７２，９９７号；米国特許第５，９６８，５１１号；米国特許第５，４８０，９６８号；米国特許第５，８１１，０９８号。本明細書中に参考として援用している米国特許第６，４８８，３９０号は、Ｇタンパク質共役レセプターＣＣＲ４に特異的な抗体を開示している。本明細書中に参考として援用している米国特許第５，５９９，６８１号は、タンパク質のリン酸化部位に特異的な抗体を開示している。
【００４９】
Ｌが酸化に不安定である場合、Ｌは、好ましくは、チオエーテルもしくはそのセレニウムアナログであるか；または炭素−炭素二重結合を含み、二重結合のオキソ基への切断により、分子タグＥが放出されるオレフィンである。例示のチオエーテル結合は、本明細書中に参考として援用される、Ｗｉｌｌｎｅｒら，米国特許第５，６２２，９２９号に開示される。例示のオレフィンとしては、ビニルスルフィド、ビニルエーテル、エナミン、炭素原子がα−メチン（ＣＨ、少なくとも１つの水素原子を有する炭素原子）で置換されたイミンが挙げられ（ここで、ビニル基は環が存在し得るか、ヘテロ原子が環に存在し得るか、または、環状オレフィン炭素原子で置換されている）、かつ、オレフィン性炭素原子に結合した少なくとも１つおよび４つまでのヘテロ原子を有する。得られるジオキセタンは、周囲温度以上（通常は、約７５度より下）で加熱することによって、酸もしくは塩基と反応させることによって、または光感剤（ｐｈｏｔｏｓｅｎｔｉｚｅｒ）の非存在下もしくは存在下で光活性化することによって、自発的に分解し得る。このような反応は、以下の例示の参考文献に記載されている：ＡｄａｍおよびＬｉｕ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４，１２０６−１２０９，１９７２，Ａｎｄｏ，ら，Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１９７２，４７７−８，Ａｎｄｏ，ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２９，１５０７−１３，１９７３，Ａｎｄｏ，ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６，６７６６−８，１９７４，ＡｎｄｏおよびＭｉｇｉｔａ，同書，９７，５０２８−９，１９７５，ＷａｓｓｅｒｍａｎおよびＴｅｒａｏ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２１，１７３５−３８，１９７５，ＡｎｄｏおよびＷａｔａｎａｂｅ，同書．４７，４１２７−３０，１９７５，Ｚａｋｌｉｋａ，ら，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３０，３５−４４，１９７９，ならびにＡｄａｍ，ら，，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．３６，７８５３−４，１９９５。米国特許第５，７５６，７２６もまた参照のこと。
【００５０】
ジオキセタンの形成は、オレフィンの１つの炭素原子を分子タグで、他の炭素原子を結合部分で置換した活性化オレフィンと、一重項酸素との反応により得られる。例えば、米国特許第５，８０７，６７５号を参照のこと。これらの切断可能な連結は、以下の式：
−Ｗ−（Ｘ）ｎ−Ｃα＝Ｃβ（Ｙ）（Ｘ）−
により示され得る。式中：
Ｗは結合、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｍ（安定な共有結合を形成する金属を意図する））、または官能基（例えば、カルボニル、イミノ等）であり、かつＸまたはＣαに結合し得；少なくとも１つのＸは、脂肪族、芳香族、脂環式、またはヘテロ環式であり、かつヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、またはＳ）を通じてＣαに結合し得、他のＸは、同じであっても異なっていてもよく、さらに水素、脂肪族、芳香族、脂環式、またはヘテロ環式であり得、通常は、芳香族または芳香族ヘテロ環式であり（ここで、一般的に、水素以外が約１〜２０個（通常は、１〜１２個、さらに通常は、１〜８個）の炭素原子であり、１つのＸは０〜６個（通常は、０〜４個）のヘテロ原子を有し、他のＸは少なくとも１つかつ６個までのヘテロ原子（通常は、１〜４個のヘテロ原子）を有する場合、１つのＸがＹと一緒になって、それらが結合した炭素原子を有する環（通常は、ヘテロ環）を形成し得る）：
Ｙは、Ｘの定義の中に含まれ、通常、ヘテロ原子を通じてＣβに結合され、かつ示されるように、Ｘと一緒になってヘテロ環を形成し得：
Ｚは、通常は、上述のように、約４〜１２個、通常は４〜１０個の炭素原子および０〜４のヘテロ原子の芳香族（ヘテロ環式芳香族を含む）であり、上述のように、Ｃβに直接またはヘテロ原子を通じて結合され；
ｎは、分子タグがＣαに結合されるかＸに結合されるかに依存して、１または２であり；
ここで、ＹおよびＺのうちの１つは、結合部分に結合するための官能基を有するか、または、結合部分に結合している（例えば、結合部分Ｔとして作用することによるか、または結合部分Ｔへの連結基を含むことによって）。
【００５１】
好ましくは、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、切断時に分子タグＥが以下に記載されるサイズ制限内にあるように選択される。
【００５２】
例示の切断可能な連結としては、Ｓ（分子タグ）−３−チオアクリル酸、Ｎ（分子タグ）、Ｎ−メチル４−アミノ−４−ブテノイン酸、３−ヒドロキシアクロレイン、Ｎ−（４−カルボキシフェニル）−２−（分子タグ）−イミダゾール、オキサゾール、およびチアゾールが挙げられる。
【００５３】
また、以下の二価基：
−（ＣＯ）Ｘ１（Ａ）−
で９位を置換したＮ−アルキル誘導体が目的のものである。式中：
Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、Ｎ、およびＳｅからなる群より選択されるヘテロ原子であり（通常は、最初の３つのうちの１つであり）；かつ
Ａは、分子タグで置換された、少なくとも２つの炭素原子（通常は、６個未満の炭素原子）の鎖であり（ここで、好ましくは、Ａの他の原子価は、水素により満たされているが、この鎖は、他の基（例えば、アルキル、アリール、ヘテロ環式基など）で置換され得、Ａは、一般的に、１０個未満の炭素原子である）。
【００５４】
また、置換イミダゾール、チアゾール、オキサゾールなどにより例示されるような、ヘテロ環式化合物（例えば、ジヘテロシクロペンタジエン）が目的のものであり、ここで、この環は、通常、少なくとも１つの芳香族基で置換され、かついくつかの場合、分子タグを放出するのに加水分解が必要である。
【００５５】
テルル（Ｔｅ）誘導体もまた、目的のものであり、ここで、Ｔｅは、Ｔｅ原子への水素原子βを有するエチレン基に結合されており、ここで、エチレン基は、脂環式環またはヘテロ環式環の一部であり、該環は、好ましくは芳香族環へと縮合したオキソ基を有し得、Ｔｅの他の原子価が、分子タグに結合されている。この環は、クロマリン、ベンゾキサジン、テトラリン等であり得る。
【００５６】
いくつかの好ましい切断可能な連結およびそれらの切断産物は、図３Ａ〜Ｆに例示されている。図３Ａに示されるチアゾール切断可能な連結「−ＣＨ２−チアゾール−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−タンパク質」は、部分「−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＯ」を有する分子タグを生じる。好ましくは、ｎが１〜１２の範囲であり、より好ましくは、１〜６の範囲である。図３Ｂに示されるオキサゾール切断可能な連結「−ＣＨ２−オキサゾール−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−タンパク質」は、部分「−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨＯ」を有する分子タグを生じる。オレフィン切断可能な連結（図３Ｃ）は、上記のように、結合化合物の実施形態「Ｂ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」と組み合わせて示されており、Ｄは傾向色素である。オレフィン切断可能な連結は、他の実施形態においてもまた用いられ得る。示されるオレフィン連結の切断は、式「Ｒ−（Ｃ−Ｏ）−Ｍ−Ｄ」の分子タグを生じる。ここで、「Ｒ」は、先に提供された、分子タグＥの一般的な記載内の任意の置換基であり得る。好ましくは、Ｒは、電子供与基である（例えば、Ｕｌｌｍａｎら，米国特許第６，２５１，５８１号；ＳｍｉｔｈおよびＭａｒｃｈ，Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，第５版（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）等）。より好ましくは、Ｒは、１〜８個の炭素原子ならびにＯ、Ｓ、およびＮからなる群より選択される０〜４個のヘテロ原子を有する電子供与基である。より好ましくは、Ｒは、１〜８個の炭素原子ならびにＯ、Ｓ、およびＮからなる群より選択される０〜４個のヘテロ原子を有する電子供与基である。さらなる参照において、Ｒは、−Ｎ（Ｑ）２−、−ＯＱ、ｐ−［Ｃ６Ｈ４Ｎ（Ｑ）２］、フラニル、ｎ−アルキルピロロリル、２−インドリル等である（ここで、Ｑはアルキルまたはアリールである）。図３Ｃのオレフィン切断可能な連結のさらなる参照において、置換基「Ｘ」および「Ｒ」は、切断可能な連結Ｌを記載する上記式の置換基「Ｘ」および「Ｙ」と等価である。特に、図３ＣにおけるＸは、好ましくは、モルホリノ、−ＯＲ’、または−ＳＲ’’であり、ここで、Ｒ’およびＲ’’は、１〜８個の炭素原子ならびにＯ、Ｓ、およびＮからなる群より選択される０〜４個のヘテロ原子を有する脂肪族、芳香族、脂環式、またはヘテロ環式である。式「−（ＣＨ２）２−Ｓ−ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−」を有する好ましいチオエーテル切断可能な連結は、図３Ｄに示されている。ここで、ｎは２〜１２の範囲、より好ましくは２〜６の範囲である。図３Ｄに示される型のチオエーテル切断可能な連結は、図３Ｅおよび３Ｆに示される前駆体化合物によって、結合部分Ｔおよび分子タグＥに結合され得る。結合部分Ｔのアミノ基に結合するため、末端ヒドロキシルは、従来化学によりＮＨＳエステルに変換される。アミノ基との反応および結合の後、Ｆｍｏｃ保護基が除去されて遊離アミンが生成され、次いで、分子タグのＮＨＳエステルと反応される。
【００５７】
本発明における分子タグＥは、複数の分子タグの分離がガスクロマトグラフィーまたは質量分析法によって実施される場合、以下の参考文献に記載されるような電気泳動タグを含み得る：Ｚｈａｎｇら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１３：１００２−１０１２（２００２）；Ｇｉｅｓｅ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２：１６５−１６８（１９８３）；および米国特許第４，６５０，７５０号；同第５，３６０，８１９号；同第５，５１６，９３１号；同第５，６０２，２７３号等。
【００５８】
分子タグＥは、好ましくは、活性種（特に、一重項酸素）に対して安定であり、かつ検出基またはレポーター基を含む水溶性有機化合物である。そうでなければ、Ｅは、大きさおよび構造が広範に変化し得る。１つの局面において、Ｅは、約５０〜約２５００ダルトン、より好ましくは、約５０〜１５００ダルトンの範囲の分子量を有する。Ｅの好ましい構造は、以下により十分に記載されている。Ｅは、電気化学的シグナル、蛍光シグナル、または発色シグナルを生成するための検出基を含み得る。質量により検出を用いる実施形態においては、Ｅは、検出目的のための別個の部分を有さないかもしれない。好ましくは、検出基は、蛍光シグナルを生じる。
【００５９】
複数の分子タグは、各々が、同じ複数の他のメンバーに対して固有の分離特性および／または固有の光学特性を有するように選択される。１つの局面において、発色または電気泳動分離特性は、当該分野では従来的な標準分離条件のセット（例えば、電圧、カラム圧、カラム型、移動相、電気泳動分離媒体等）の下での保持時間である。別の局面において、光学的特性は、所定の波長または帯域での発光スペクトル、蛍光寿命、蛍光強度等のような蛍光特性である。好ましくは、蛍光特性は、蛍光強度である。例えば、複数の各々の分子タグは、同じ蛍光発光特性を有し得るが、各々は、固有の保持時間により互いに異なる。他方、複数の分子タグの２つ以上は、同一の保持時間を有し得るが、これらは、複数のメンバーの全てが、分子分離および蛍光測定の組み合わせにより識別可能なように、固有の蛍光特性（例えば、スペクトル分解可能な発光スペクトル）を有する。
【００６０】
好ましくは、放出された分子タグは、電気泳動分離および検出基の蛍光によって検出される。このような実施形態において、実質的に同一の蛍光特性を有する分子タグは、異なる電気泳動移動度を有し、その結果、電気泳動図における異なるピークが、分離条件下で形成される。好ましくは、本発明の複数の分子タグは、従来のふるいマトリクスの存在下または非存在下のいずれかで、従来のキャピラリー電気泳動装置によって分離される。例示のキャピラリー電気泳動装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル３１０、３１００、および３７００：Ｂｅｃｋｍａｎ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）モデルＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００または４０００；ＳｐｅｃｔｒｕＭｅｄｉｘ遺伝子分析システム等を含む装置である。電気泳動の移動度は、ｑ／Ｍ２／３に比例し、ここで、ｑは分子上の電荷であり、Ｍは分子の質量である。望ましくは、最も近い電気泳動標識間の決定の条件下での移動度の差は、少なくとも０．００１、通常は、０．００２、より通常は、少なくとも約０．０１であり、０．０２以上であり得る。好ましくは、このような従来の装置において、複数の分子タグの電気泳動移動度は、少なくとも１％、より好ましくは少なくとも１〜１０％の範囲で異なる。
【００６１】
１つの局面において、分子タグＥは、（Ｍ，Ｄ）である。ここで、Ｍは、移動度改変部分であり、Ｄは、検出部分である。記号「（Ｍ，Ｄ）」は、Ｍ部分およびＤ部分の順番が、いずれかの部分が切断可能な連結Ｌに隣接し得るようになっていることを示すように使用される。すなわち、「Ｂ−Ｌ−（Ｍ，Ｄ）」は、２つの式「Ｂ−Ｌ−Ｍ−Ｄ」または「Ｂ−Ｌ−Ｄ−Ｍ」のいずれかの結合化合物を示す。
【００６２】
検出部分Ｄは、蛍光標識または色素、発色標識または色素、電気化学的標識等であり得る。好ましくは、Ｄは蛍光色素である。本発明において使用するための例示の蛍光色素としては、以下の参考文献に開示される水溶性ローダミン色素、フルオレセイン、４，７−ジクロロフルオレセイン、ベンゾキサンテン色素、およびエネルギー移動色素が挙げられる：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，第８版，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２００２）；Ｌｅｅら，米国特許第６，１９１，２７８号；Ｌｅｅら，米国特許第６，３７２，９０７号；Ｍｅｎｃｈｅｎら，米国特許第６，０９６，７２３号；Ｌｅｅら，米国特許第５，９４５，５２６号；Ｌｅｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：２８１６−２８２２（１９９７）；Ｈｏｂｂ，Ｊｒ．，米国特許第４，９９７，９２８号；Ｋｈａｎｎａら，米国特許第４，３１８，８４６号；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，米国特許第３，９３２，４１５号；Ｅｃｋｅｒｔら，米国特許第２，１５３，０５９号；Ｅｃｋｅｒｔら，米国特許第２，２４２，５７２号；Ｔａｉｎｇら，国際特許公報ＷＯ  ０２／３０９４４等。さらなる特定の例示の蛍光色素としては、５−および６−カルボキシローダミン６Ｇ；５−および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−および６−カルボキシテトラメチルローダミン、５−および６−カルボキシフルオレセイン、５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、１’，２’，７’，８’−ジベンゾ−４’，５’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、２’，７’−ジクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセイン、および２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−５−および６−カルボキシ−４，７−ジクロロフルオレセインが挙げられる。最も好ましくは、Ｄはフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である。本発明と共に使用され得る例示の蛍光色素は、図４Ａ〜４Ｂに示されている。
【００６３】
移動度改変部分Ｍの大きさおよび組成は、鎖中の１つの結合から約１００個の原子まで変化し得、通常は、約６０個未満の原子、より通常は約３０個未満の原子であり、ここで、原子は、炭素、酸素、窒素、リン、臭素、および硫黄である。一般的に、１つの結合以外である場合、移動度改変部分は、約０〜約４０個、より通常は約０〜約３０個のヘテロ原子を有し、上記ヘテロ原子に加えて、ハロゲンまたは他のヘテロ原子を含み得る。水素以外の原子の総数は、一般的に、約２００個よりも少ない原子であり、通常は、約１００個よりも少ない原子である。酸基が存在する場合、移動度改変部分が存在する媒体のｐＨに依存して、種々のカチオンが、酸基と会合され得る。この酸基は、有機酸または無機酸（カルボン酸、チオノカルボン酸、チオカルボン酸、ヒドロキサミン酸、リン酸、亜リン酸、ホスホン酸、ホスフィン酸、スルホン酸、スルフィン酸、ホウ素酸、硝酸、亜硝酸等を含む）であり得る。陽電荷については、置換基として、アミノ（アンモニウムを含む）、ホスホニウム、スルホニウム、オキソニウム等が挙げられ、ここで、置換基は、一般的に、約１〜６個の炭素原子の脂肪族であり、ヘテロ原子あたりの炭素原子の総数は、通常、約１２未満、通常、約９未満である。側鎖としては、アミン、アンモニウム塩、ヒドロキシル基（フェノール基を含む）、カルボキシル基、エステル、アミド、ホスホネート、ヘテロ環式が挙げられる。Ｍは、ホモオリゴマーまたは、同じもしくは異なる化学特性の異なるモノマーを有するヘテロオリゴマー（例えば、ヌクレオチドおよびアミノ酸）であり得る。
【００６４】
別の局面において、（Ｍ，Ｄ）部分は、コンビナトリアルライブラリーの生成に使用される化学的足場から構築される。例えば、以下の参考文献は、異なる移動改変部分を生成するのに有用な足場化合物を記載している：ペプトイド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９１／１９７３５，Ｄｅｃ．２６，１９９１）、コード化ペプチド（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９３／２０２４２，Ｏｃｔ．１４，１９９３）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０００９１，Ｊａｎ．９，１９９２）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ディバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチド）（Ｈｏｂｂｓ  ＤｅＷｉｔｔ，Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９−６９１３（１９９３）、ビニル性ポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、β−Ｄ−グルコース足場を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ，Ｒ．ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、低分子ライブラリのアナログ有機合成（Ｃｈｅｎ，Ｃ．ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ，Ｃ．Ｙ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））、ペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））；Ｃｈｅｎｇら，米国特許第６，２４５，９３７号；Ｈｅｉｚｍａｎｎら，「Ｘａｎｔｈｉｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ」，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．２：１７１−１７４（１９９７）；Ｐａｖｉａら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４：６５９−６６６（１９９６）；Ｏｓｔｒｅｓｈら，米国特許第５，８５６，１０７号；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｅ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５（１９９４）等。好ましくは、この局面において、Ｄは、足場上の置換基であり、Ｍは足場の残りの部分である。
【００６５】
Ｍはまた、公知のサブユニット合成法により調製されるポリマー鎖を含み得る。選択された長さのポリエチレン−オキシド含有鎖を形成する方法は、周知である（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎら、米国特許第５，７７７，０９６号）。規定された大きさの、複数のサブユニットポリマーユニットの別のユニットへの、直接または連結基を介する結合を含むこれらの方法が、広範なポリマー（例えば、ポリエーテル（ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシド）、ポリエステル（例えば、ポリグリコール酸、ポリ乳酸）、ポリペプチド、オリゴ糖、ポリウレタン、ポリアミド、ポリスルホンアミド、ポリスルホキシド、ポリホスホネート、およびこれらのブロックコポリマー（荷電した連結基または荷電していない連結基により結合される複数のサブユニットのユニットからなるポリマーを含む））に適用可能であることが、理解され得る。ホモポリマーに加えて、本発明に従って使用されるポリマー鎖は、選択された長さのコポリマー（例えば、ポリプロピレンユニットとポリエチレンオキシドユニットが交互に繰り返されるコポリマー）を含む。別の例として、ホモポリマーまたは混合されたポリマーとして、選択された長さのポリペプチドおよびアミノ酸組成物（すなわち、天然に存在するアミノ酸残基または人間の手で作られたアミノ酸残基を含む）がある。
【００６６】
別の局面において、放出後、分子タグ、Ｅが、以下の式により規定される：
Ａ−Ｍ−Ｄ
ここで：
Ａは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒであり、ここでＲは、１〜８個の炭素原子ならびにＯ、ＳおよびＮからなる群より選択される０〜４個のヘテロ原子を有する脂肪族、芳香族、脂環式、複素環式；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＯ；−ＳＯ２Ｈ；−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−ＣＨＯ；−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６Ｈ５）であり、ここでｎは、２〜１２の範囲である；
Ｄは、検出基、好ましくは、蛍光色素である；そして
Ｍは、Ａ−Ｍ−Ｄの総分子量が、約１００〜約２５００ダルトンの範囲内の分子量であるという条件下で、上記の通りである。
【００６７】
別の局面において、Ｄは、フルオレセインであり、Ａ−Ｍ−Ｄの総分子量は、約１００〜約１５００ダルトンの範囲内である。
【００６８】
別の局面において、Ｍは、通常直鎖における、分子の別の分子への連結を提供する官能基を有するより小さな分子から、合成され得る。このような官能基としては、カルボン酸、アミン、およびヒドロキシル基またはチオール基が挙げられる。本発明に従って、電荷伝達部分は、コア鎖にぶら下がっている１つ以上の側鎖基を有し得る。この側鎖基は、電荷伝達部分の標識または別の分子への結合を提供する機能を有する。使用される官能基の反応から生じる一般的な機能は、結合される分子の間に共有結合を形成することにより、例示される。このような官能基は、ジスルフィド、アミド、チオアミド、ジチオール、エーテル、尿素、チオ尿素、グアニジン、アゾ、チオエーテル、カルボキシレート、およびエステルおよび硫黄およびリンを含有するアミド（例えば、スルホネート、リン酸エステル、スルホンアミド、チオエステルなど）などである。
【００６９】
（結合部分への分子タグの結合）
結合化合物（例えば、抗体）へ分子タグを共有結合させることについての多数の手本が、文献中に見出され得る（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６）など）。本発明の１つの局面において、１つ以上の分子タグが、結合化合物上の一般的な反応基に、直接または間接的に、結合される。一般的な反応基としては、アミン、チオール、カルボキシレート、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトンなどが挙げられ、そして市販の架橋剤（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（上に引用された）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｏｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，２００２））により、分子タグに結合され得る。１つの実施形態において、分子タグのＮＨＳエステルが、結合化合物上の遊離アミンと反応される。
【００７０】
図１Ｃに例示される好ましい実施形態において、結合化合物は、結合部分として、ビオチン化抗体（１４０）を含む。分子タグ（１４４）が、アビジンまたはストレプトアビジン架橋（１４２）により、結合部分（１４０）に結合される。好ましくは、操作において、結合部分（１４０）が、膜結合検体と最初に反応し、その後、アビジンまたはストレプトアビジンが加えられて（１４６）、複合体（１４８）を形成する。複合体（１４８）に対して、ビオチン化分子タグが加えられ（１５０）、結合化合物（１５２）を形成する。
【００７１】
一旦各々の結合化合物が異なる分子タグにより別個に誘導体化されると、他の結合化合物と共にプールされて、複数の結合化合物を形成する。通常、各々の異なる種類の結合化合物が、同じ割合で組成物中に存在している；しかし、割合は、設計事項として変更されて、その結果特定の結合化合物の１つまたはサブセットが、特定の実施形態またはアッセイについての所望または必要物に依存して、より高い割合またはより低い割合で存在し得る。このような設計に影響し得る因子としては、特定の標的に対する抗体アフィニティーおよびアビジティー、標的の相対的普及度、分子タグの検出部分の特性などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
（開裂誘導部分生成活性種）
開裂誘導部分、または開裂剤は、開裂可能な結合を、好ましくは酸化により、開裂し得る活性種を生成する基である。好ましくは、活性種は、短い寿命の活性を示す化学種であり、その結果、その開裂誘導効果は、その生成部位の近位のみである。活性種が、本来短い寿命であり、その結果、その生成の近位より遠いために有意なバックグラウンドを生成しないか、または効率的に活性種を捕捉する捕捉剤が使用されて、その結果活性種が、その生成部位からある短い距離を超えて開裂可能な部位と反応するのに利用可能でないことかの、いずれかである。例示的な活性種としては、一重項酸素、過酸化水素、ＮＡＤＨ、およびヒドロキシキシラジカル、フェノキシラジカル、過酸化物などが挙げられる。酸化を引き起こす活性種に対するクエンチャーの例としては、ポリエン、カロテノイド、ビタミンＥ、ビタミンＣ、チロシンのアミノ酸−Ｎピロール結合体、ヒスチジン、およびグルタチオンなどが挙げられる。例えば、Ｂｅｕｔｎｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１９：２２６−２４１（２０００）。
【００７３】
開裂誘導部分および開裂可能な結合の重要な考慮は、これらが標的タンパク質と結合した場合、互いにあまり遠くに離れず、増感剤により生成される活性種が、その活性を拡散させ、失わせ、その後、この活性種は、開裂可能な結合と相互作用し得る。従って、開裂可能な結合は、好ましくは、結合した開裂誘導部分の１０００ｎｍ以内、好ましくは２０〜２００ｎｍ以内である。この開裂誘導部分の有効な範囲は、本明細書中で「有効な近接（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）」と呼ばれる。
【００７４】
有効な種のジェネレーターとしては、過酸化水素を生成するオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、キサンテンオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、ＮＡＤＨ−ＦＭＮオキシドレダクターゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グリセリルホスフェートオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼおよびアルコールオキシダーゼ）、ヒドロキシルラジカルを生成するセイヨウワサビペルオキシダーゼ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを生成する種々のデヒドロゲナーゼ、アンモニアを生成して高い局所的ｐＨを生成するウレアーゼが挙げられる。
【００７５】
増感剤は、誘導されて反応性中間体、または種、通常一重項酸素を生成し得る、化合物である。好ましくは、本発明に従って使用される増感剤は、光増感剤である。本発明の範囲内に含まれる他の増感剤は、熱、光、イオン化放射、または化学的活性化による励起において、一重項酸素分子を放出する、化合物である。このクラスの化合物の最も公知のメンバーは、エンドペルオキシド（例えば、１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシド、９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペルオキシドおよび５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン５，１２−エンドペルオキシド）を含む。これらの化合物を加熱することまたはこれらの化合物による直接の光の吸収は、一重項酸素を放出する。さらなる増感剤が、以下の参考文献に開示される：Ｄｉ  Ｍａｓｃｉｏら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３５５：２８７（１９９４）（ペルオキシダーゼおよびオキシゲナーゼ）；Ｋａｎｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：５９９１−５９９３（１９８３）（ラクトペルオキシダーゼ）；Ｐｉｅｒｌｏｔら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３１９：３−２０（２０００）（エンドペルオキシダーゼの熱溶解）；など。
【００７６】
結合剤の開裂誘導部分への結合は、直接または間接的な、共有結合または非共有結合であり得、そして文献中で一般的に利用可能な、周知の技術により達成され得る。例えば、‘‘Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，’’Ｉｃｈｉｒｏ  Ｃｈｉｂａｔａ，Ｈａｌｓｅｔｅｄ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７８）；Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５：３０５９（１９７０）を参照のこと。広範な官能基が、利用可能であり、または導入され得る。官能基としては、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などが挙げられる。広範な化合物に結合する様式は、周知であり、そして文献（上記を参照のこと）中に十分に示されている。結合剤への結合基の長さは、結合される化合物の性質、特異的な結合特性における距離の効果などに依存して、広範に変動し得る。
【００７７】
結合剤に結合される複数の開裂誘導部分を有し、例えば、生成される活性種の数を増大することが、所望され得る。このことは、多官能基材料（通常ポリマー性であり、結合のための部位としての、複数の官能基（例えば、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、カルボキシ、エチレン、アルデヒドなど）を有する）により達成され得る。あるいは、支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）が、使用され得る。この支持体は、多くの形状（例えば、ビーズを含む粒子、フィルム、膜、チューブ、ウェル、ストリップ、ロッドなど）のいずれかを有し得る。光増感剤がその中に導入される支持体について、支持体の表面は、好ましくは、親水性または親水性が与えられ、そして支持体の本体は、好ましくは、疎水性であり得る。この支持体は、その中で支持体が使用される媒体中で懸濁可能であり得る。例として、限定ではなく、懸濁可能な支持体の例としては、ポリマー性材料（例えば、ラテックス、脂質二重層、油滴、細胞およびヒドロゲル）である。他の支持体組成物としては、ガラス、金属、ポリマー（例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）など）；（これら自体で使用されるか、他の材料と組み合わされるかのいずれか）が挙げられる。結合剤の支持体への結合は、直接または間接の、共有結合または非共有結合であり得、そして上で議論されるような文献中で一般に利用可能な周知の技術により達成され得る。例えば、‘‘Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，’’Ｉｃｈｉｒｏ  Ｃｈｉｂａｔａ，前述を参照のこと。支持体の表面は、共有結合または非共有結合性特異的相互作用もしくは非共有結合性非特異的相互作用を介して、通常多官能性であるか、または多官能化され得るか、または標的結合部分と結合され得るかなどである。
【００７８】
開裂誘導部分は、支持体の表面に共有結合でまたは非共有結合で結合されることにより、または支持体の本体に導入されることにより、支持体と結合され得る。表面への結合が、上記のように達成され得る。開裂誘導部分が、支持体の調製の間またはその後のいずれかで、支持体の本体に導入され得る。一般に、開裂誘導部分が、活性種の必要量を達成するために必要な量で支持体と結合される。一般に、開裂誘導部分の量は、経験的に決定される。
【００７９】
（開裂誘導部分としての光増感剤）
上述のように、本発明に従う好ましい開裂誘導部分は、一重項酸素を生成する光増感剤である。本明際書中で使用されるように、「光増感剤」は、光により活性化された場合分子の酸素を一重項酸素に変換する、光吸収分子を言う。光増感剤は、クラス特異的試薬の結合剤に、直接的または間接的に、共有結合または非共有結合を介して結合され得る。このような組成物を構築するための（特に、結合剤としての抗体のための）指標が、例えば、光力学療法、免疫診断などの分野の文献中で利用可能である。以下が、例示的な参考文献である：Ｕｌｌｍａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，５４２６−５４３０（１９９４）；ｎＳｔｒｏｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４５：２９７−３２０（１９９４）；Ｙａｒｍｕｓｈら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，１０：１９７−２５２（１９９３）；Ｐｅａｓｅら，米国特許番号５，７０９，９９４号；Ｕｌｌｍａｎら，米国特許第５，３４０，７１６号；Ｕｌｌｍａｎら，米国特許第６，２５１，５８１号；ＭｃＣａｐｒａ，米国特許第５，５１６，６３６号など。
【００８０】
同様に、本発明の使用に適切な光増感剤の特性および選択に関する指標が、文献中に存在する。以下が、例示的な参考文献である：Ｗａｓｓｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｗ．Ｍｕｒｒａｙ．Ｓｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）；Ｂａｕｍｓｔａｒｋ、Ｓｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ、Ｖｏｌ．２（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ  １９８３）；およびＴａｒｒｏ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ、１９９１）。
【００８１】
光増感剤は、光での励起により一重項酸素の生成のための増感剤である。光増感剤は、色素および芳香族化合物を含み、そして通常複数の共役した二重結合または三重結合を有する、通常共有結合した原子からなる化合物である。これらの化合物は、代表的に、約２００〜約１，０００ｎｍ、通常、約３００〜約１，０００ｎｍ、好ましくは、約４５０ｎｍ〜約９５０の波長範囲で、励起波長にて、約５００Ｍ−１ｃｍ−１より大きい、好ましくは約５，０００Ｍ−１ｃｍ−１より大きい、より好ましくは、５０，０００Ｍ−１ｃｍ−１より大きい吸光度極大での吸光係数で、光を吸収する。酸素の非存在下で光の吸収に続いて生成した励起状態の寿命は、通常、少なくとも約１００ナノ秒、好ましくは、少なくとも約１ミリ秒である。一般に、寿命は、本発明に従う試薬の結合の開裂を可能にするほど十分長くなければならない。このような試薬は、通常、以下で議論されるとおりの濃度で存在する。光増感剤励起状態は、通常、その基底状態と異なるスピン量子数を有し、そして通常の場合そうであるように、基底状態がシングレット（Ｓ＝０）である場合、通常トリプレット（Ｓ＝１）である。好ましくは、光増感剤は、高いシステム間交差産生を有する。すなわち、光増感剤の光励起は、通常少なくとも約１０％の効率で、所望されるには少なくとも約４０％の効率で、好ましくは約８０％を超える効率で、トリプレット状態を産生する。
【００８２】
選択される光増感剤は、比較的光安定性であり、好ましくは、一重項酸素と効率的に反応しない。いくつかの構造的特徴が、ほとんどの有用な光増感剤において存在している。ほとんどの光増感剤が、少なくとも１つの、しばしば、剛性のしばしば芳香族構造に保持された３つ以上の共役した二重結合または三重結合を有する。これらの光増感剤は、しばしば、システム間交差反応を加速する少なくとも１つの基（例えば、カルボニル基もしくはイミン基または周期表の３列〜６列から選択される重原子（特にヨウ素または臭素））を含むか、または拡大された芳香族構造を有し得る。
【００８３】
多くの種々の光源が、光活性光増感剤に利用可能であり、一重項酸素を生成する。多色光源および単色光源の両方が、光源が十分強く、実際的な持続時間で十分な一重項酸素を生成する限り、使用され得る。照射の長さは、光増感剤の性質、開裂可能な結合の性質、照射の光源の力、およびそのサンプルからの距離などに依存している。一般に、照射の期間は、約ミリ秒未満から約１０分もの長さ、通常、約１ミリ秒〜約６０秒の範囲であり得る。照射の強度および長さは、少なくとも約０．１％の光増感剤分子、通常少なくとも約３０％の光増感剤分子、そして好ましくは、実質的に全ての光増感剤分子を励起するのに十分であるべきである。例示的な光源としては、例示として限定ではなく、レーザー（例えば、ヘリウム−ネオンレーザー、アルゴンレーザー、ＹＡＧレーザー、Ｈｅ／Ｃｄレーザー、およびルビーレーザー）；水銀ランプ、ナトリウムランプおよびキセノン蒸気ランプ；白熱ランプ（例えば、タングステンおよびタングステン／ハロゲン）；フラッシュランプ、などが挙げられる。
【００８４】
本発明において利用され得る光増感剤の例は、上記の特性を有するものであり、以下の参考文献に列挙される：Ｔｕｒｒｏ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（上に引用された）；Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｕｌｌｍａｎ，米国特許第５，５３６，８３４号；Ｌｉら，米国特許第５，７６３，６０２号；Ｕｌｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１，５４２６−５４３０（１９９４）；Ｓｔｒｏｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４５：２９７−３２０（１９９４）；Ｍａｒｔｉｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８６：６３５−６４５（１９９０）；Ｙａｒｍｕｓｈら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，１０：１９７−２５２（１９９３）；Ｐｅａｓｅら，米国特許第５，７０９，９９４号；Ｕｌｌｍａｎら，米国特許第５，３４０，７１６号；Ｕｌｌｍａｎら，米国特許第６，２５１，５８１号；ＭｃＣａｐｒａ，米国特許第５，５１６，６３６号；Ｗｏｈｒｌｅ，Ｃｈｉｍｉａ，４５：３０７−３１０（１９９１）：Ｔｈｅｔｆｏｒｄ，欧州特許公開番号０４８４０２７；Ｓｅｓｓｌｅｒら，ＳＰＩＥ，１４２６：３１８−３２９（１９９１）；Ｍａｄｉｓｏｎら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２２：９０−９８（１９９０）；Ｐｏｌｏら，Ｉｎｏｒｇａｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１９２：１−３（１９９２）；Ｄｅｍａｓら，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．，Ａ２５：１１８９−１２１４（１９８８）；など。例示的な光増感剤が、表１ａに列挙される。
【００８５】
【表１】
2005534030.tif 000003
【００８６】
特定の実施形態において、光増感剤部分は、開裂誘導部分に関して上で議論されたような支持体を含む。光増感剤は、支持体の表面に共有結合または非共有結合されることにより、または上で議論されるように支持体の本体に導入されることにより、支持体と結合され得る。一般に、光増感剤は、必要量の一重項酸素を達成するのに必要な量で支持体と結合される。一般に、光増感剤の量は、経験的に決定される。光増感剤として使用される光増感剤は、好ましくは、比較的非極性であり、光増感剤が例えばラテックス粒子中に導入されて光増感剤ビーズを形成する場合（例えば、Ｐｅａｓｅら、米国特許第５，７０９，９９４号により開示されるように）、親油性メンバー中の溶解を確実にする。例えば、光増感剤ローズベンガルは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９７：３７４１（１９７５）に記載されるようにラテックス上のクロロメチル基によって０．５ミクロンのラテックスビーズに共有結合され、エステル結合基を提供する。
【００８７】
本発明の１つの局面において、クラス特異的試薬は、抗体である第１の結合剤および光増感剤である開裂誘導部分を含み、その結果、光増感剤は、例えば、Ｓｔｒｏｎｇら（上に引用される）；Ｙａｒｍｕｓｈら（上に引用される）；などに開示されるような周知の技術を使用して、抗体と共有結合される。あるいは、クラス特異的試薬は、固体相支持体（例えば、ビーズ）を含み、このビーズに、光増感剤が共有結合され、または非共有結合され、そして抗体が、好ましくは共有結合で、直接または官能化ポリマー（例えば、アミノデキストランなど）を経由してのいずれかで、結合される。
【００８８】
（例示的な細胞表面分子）
膜結合分析物としては、ダイマーまたはオリゴマーの複合体を形成する細胞表面分子が挙げられる。シグナル伝達に関与する細胞表面レセプターは、特に興味深く、これらとしては、酵素関連レセプターおよびＧタンパク共役レセプターが挙げられるがこれらに限定されない。ダイマーまたはオリゴマーは、別の細胞表面レセプター、すなわち、別の分子構造（例えば、別の一次アミノ酸配列）を有する細胞表面レセプターを含み得る。本明細書中で使用される場合、ダイマーまたはオリゴマーを参照する際の用語「レセプター型」は、ダイマーまたはオリゴマーの形成に関与する複数の異なる細胞表面分子のうちの１つを意味する。例えば、ヘテロダイマー（例えば、Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ３ヘテロダイマー）は、２つの異なるレセプター型（Ｈｅｒ２およびＨｅｒ３）から構成され、ホモダイマー（例えば、Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ１ホモダイマー）は、単一のレセプター型（Ｈｅｒ１）から構成される。
【００８９】
全ての酵素関連レセプターは、可能なオリゴマー細胞表面複合体内のサブユニットとして、本発明の範囲内であるとみなされる。目的の酵素関連レセプターとしては、内因性の酵素活性を有するいくつかの型（チロシンキナーゼ活性、チロシンホスファターゼ活性、グアニル酸シクラーゼ活性およびセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する酵素が挙げられる）が挙げられる。さらなる目的の酵素関連レセプターは、細胞内チロシンキナーゼとタンパク質−タンパク質複合体を形成する。チロシンキナーゼ関連レセプターの例としては、Ｈｅｒレセプターファミリー、インシュリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＰＤＧＦレセプター、ＦＧＦレセプター、ＶＥＧＦレセプター、ＨＧＦレセプターおよびＳＣレセプター、ノイトロフィンレセプターファミリー、ならびにＮＧＦレセプターが挙げられるがこれらに限定されない。チロシンホスファターゼ関連レセプターの例としては、例えば、ＣＤ４５タンパク質が挙げられる。グアニル酸シクラーゼ関連レセプターの例としては、例えば、ナトリウム利尿ペプチドレセプターが挙げられる。セリン／スレオニンキナーゼ関連レセプターの例としては、例えば、アクチビンレセプターおよびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）レセプターが挙げられる。
【００９０】
全てのＧＰＣＲは、可能なオリゴマー細胞表面複合体内のサブユニットとして、本発明の範囲内であるとみなされる。目的のＧタンパク共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、アデニル酸シクラーゼ活性を調節してセカンドメッセンジャーとしてｃＡＭＰを産生するもの（例えば、ホルモンレセプター、アドレナリン作動性レセプターおよび臭気物質レセプターが挙げられる）、２）ホスホリパーゼ−Ｃγ（ＰＬＣ−γ）を活性化するもの、および３）光受容体が挙げられる。本発明の方法を使用して研究され得るＧＰＣＲのファミリーとしては、例えば、クラスＡレセプター（ロドプシン様）（アセチルコリン、アンジオテンシン、オピオイド、ソマトスタチン、ドパミンおよびブラジキニンのレセプターを含む）、クラスＣレセプター（代謝調節型グルタミン酸レセプター、Ｃａ２＋感受性レセプターおよびＧＡＢＡｂレセプターを含む）、ｃＡＭＰ共役レセプターならびに多くの他のものが挙げられる。オリゴマーを形成することが知られているＧＰＣＲレセプターの例としては、例えば、ムスカリンｍ３レセプター、アンジオテンシンＡＴ１レセプター、ＧＡＢＡｂが挙げられる。
【００９１】
（膜および細胞）
本発明の実施において使用するための膜は、細胞から得られ得る（例えば、細胞膜、核膜、ミトコンドリア膜または他の細胞内膜）か、または、ミセルおよびリポソームにより例示されるように、人工的に作製され得る。本明細書中に記載される方法において使用される細胞は、任意の起源であり得、これらとしては、真核生物由来、原核生物由来、または原生生物（ａｒｃｈｅｏｎ）由来が挙げられるが、好ましくは、親油性の膜を含む。細胞は、生細胞であっても死細胞であってもよい。多細胞生物から得られる場合、細胞は、任意の細胞型由来であり得る。従って、細胞は、培養細胞株または初代単離体であり得、細胞は、哺乳動物、鳥類、爬虫類、植物、酵母、細菌、スピロヘータ、または原生動物のものであり得る。細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ニワトリ、ウズラ、ヤギまたはイヌのものであり得る。細胞は、正常細胞、変異細胞、遺伝子操作された細胞、腫瘍細胞、選択された抗体の分泌に対して陽性であるハイブリドーマなどであり得る。特に興味深いのは、疾患の原因遺伝子を差次的に発現する（過剰に発現するか、または、過小に発現する）細胞の型から得られた膜である。当業者に明らかであるように、種々の細胞株（例えば、ＣＨＯ）は、例えば、公的または私的な寄託機関から得られ得る。最も大きな寄託仲介者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）であり、かなりの数の生物および組織サンプルに由来する十分に特徴付けられた細胞株の多様なコレクションを提供する。
【００９２】
多細胞生物由来の例示的な細胞型としては、好酸球（ａｃｉｄｏｐｈｉｌ）、腺房細胞、松果体細胞、脂肪細胞、エナメル芽細胞、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、基底（幹）細胞、好塩基球、肝細胞、ニューロン、隆起表面細胞、Ｃ細胞、心筋細胞、中心腺房細胞、主細胞、軟骨細胞、クララ細胞、円柱上皮細胞、黄体細胞、脱落腸細胞、樹状細胞、内分泌（ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｅ）細胞、内皮細胞、腸内分泌細胞、好酸球（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ）、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）、糸球体外メサンギウム細胞、胎生線維芽細胞（ｆｅｔａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、胎生赤血球、線維芽細胞、濾胞細胞、ガングリオン細胞、巨大Ｂｅｔｚ細胞、杯細胞、毛細胞、内耳有毛細胞、Ｉ型有毛細胞、肝細胞、内皮細胞、ライディッヒ細胞、脂肪細胞（ｌｉｐｏｃｙｔｅ）、肝臓実質細胞、リンパ球、リゾチーム分泌細胞、マクロファージ、肥満細胞、巨核球、メラニン細胞、糸球体細胞、単球、筋上皮細胞、筋様細胞、頸筋細胞、神経細胞、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、稀突起膠細胞、卵母細胞、骨芽細胞、骨軟骨破骨細胞（ｃｌａｓｔ）、破骨細胞、骨細胞、柱細胞、溝細胞、副甲状腺細胞、壁細胞、ペプシノーゲン分泌細胞、周皮細胞、松果体細胞、下垂体細胞、血漿細胞、血小板、有足細胞、精母細胞、プルキンエ細胞、錐体細胞、赤血球、網状赤血球、シュワン細胞、セルトリ細胞、円柱細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ソマトスタチン細胞、腸内分泌細胞、精子細胞、精原細胞、精子、星状（ｓｔｅｌｌａｔｅ）細胞、支持Ｄｅｉｔｅｒ細胞、支持ハンセン細胞、表面細胞、表面内皮細胞、表面粘膜細胞、汗腺細胞、Ｔリンパ球、被膜ルテイン細胞、胸腺細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺細胞、移行性上皮細胞、Ｉ型肺細胞およびＨ型肺細胞。
【００９３】
細胞膜はまた、特定の疾患または特定の病期に関連する細胞型から得られ得る。特定の疾患または病期との関連は、１つ以上の生物学的プロセス（例えば、細胞周期調節、細胞分化、アポトーシス、化学走性、細胞運動性および細胞骨格再構成）における細胞の異常な挙動により確立され得る。疾患細胞はまた、関連する疾患の原因となる病原（例えば、ＡＩＤＳについてのＨＩＶおよびＢ型肝炎についてのＨＢＶ）の存在により確認され得る。特定の型の細胞の異常な機能に関する疾患の型としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されない：自己免疫疾患、癌、肥満、高血圧、糖尿病、神経変性疾患および／または筋肉変性疾患、心疾患、内分泌障害ならびにこれらの任意の組み合わせ。腫瘍細胞の例示的な型としては、腺腫、癌腫、腺癌腫、線維腫瘍、エナメル上皮腫、星状細胞腫、中皮腫、胆管癌、胆管線維症、胆管腫、軟骨腫、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、頭蓋咽頭腫、嚢胞腺癌、嚢胞腺腫、未分化胚細胞腫、上衣細胞腫、上皮腫、赤血球白血病、線維腺腫、線維腫、線維肉腫、ガングリオ神経節腫、神経節細胞腫、神経節芽細胞腫、神経膠腫、顆粒球白血病、血管腫、血管外皮細胞腫、血管肉腫、冬眠腫腺、組織球腫、角化棘細胞腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、黄体腫、リンパ管腫、リンパ管肉腫、リンパ球腫、髄芽細胞腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、骨髄腫、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫、ニューロミオブラストーマ（ｎｅｕｒｏｍｙｏｂｌａｓｔｏｍａ）、歯芽腫、乏突起膠腫、骨軟骨腫、骨腫、骨肉腫、乳頭腫、パラガングリオーマ、傍神経節腫褐色細胞腫、松果体症、下垂体細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、シュワン細胞腫、精上皮腫、奇形腫、テコーマおよび胸腺腫が挙げられる。
【００９４】
細胞株はまた、細胞表面分子をコードする遺伝子を用いてトランスフェクトされ得る。さらに、内因性に細胞表面分子を発現する細胞はまた、内因性表面分子と外来性表面分子との間の相互作用を研究するためにトランスフェクトされ得る。トランスフェクションに好ましい細胞は、よくトランスフェクトされ、トランスフェクトされた遺伝子産物の高いレベルの発現を生じる細胞である。内因性に発現される細胞表面レセプターを含むいくつかの好ましい細胞株（このうちの多くは、トランスフェクションに有用である）としては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＫ−２９３（ヒト胚性腎臓）細胞、Ｋ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病）細胞、ＭＤＡ  ＭＢ−２３１（ヒト乳癌）細胞、ＭＣＲ−７細胞、ＨｅＬａ（ヒト頸部癌）細胞およびＣＯＳ−７サル腎臓細胞が挙げられる。これらの細胞株の培養および維持の方法は、当該分野で周知である。
【００９５】
本発明の別の局面において、膜は、リポソームを含む。「リポソーム」は、１つ以上の脂質二重層を含む自己組立構造である。リポソームは通常、リン脂質二重層から構成されるが、他の分子（例えば、コレステロールまたは脂肪酸）がまた、二重層構築物中に含まれていてもよい。リポソームのリン脂質成分は、種々のグリセリルリン酸またはシリコーン誘導体の頭部構造に接続された疎水性脂質尾を含む。従って、通常脂肪族脂質から作製されるリポソームは、１つ以上の非極性（疎水性）アシル鎖に共有結合された極性（親水性）頭基領域を含む。疎水性アシル鎖と水性媒体との間のエネルギー的に不利な接触は一般に、脂質分子に再配置を誘導し、その結果、極性の頭基が、水性媒体に向かって方向付けられ、一方で、アシル鎖が、二重層の内側に向かって再配向されると考えられる。エネルギー的に適した構造は、アシル鎖が水性媒体と接触しないように効率的に保護されるように形成される。脂肪酸尾間の疎水性相互作用は、従って、水性溶液中でリポソームの二重層を作製する。より複雑なリポソームの構造において、１つ以上の脂質二重層が、水性コンパートメントを取り囲み得、２つの対抗する単層の両親媒性脂質分子を含む。従って、リポソームは、カプセル化された水性相を含有する完全に閉じた二重層膜である。従って、リポソームは、任意の種々の多重膜小胞（各々が水性層により分離された同心性膜二重層）または単膜小胞（単一の膜二重層を保有する）であり得る。
【００９６】
リポソームは、Ｂａｎｇｈａｍら（１９６５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２５２の方法に従って調製され得、この方法において、リン脂質は、有機溶媒に懸濁され、次いで、乾燥状態まで蒸発させて、反応容器上にリン脂質の蝋状の堆積物を残す。次いで、適切な量の水性相が添加され、混合物を膨張させ、多重膜小胞から構成される得られたリポソームが、機械的手段によって分散させられた。得られた膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）「尾」が二重層の中央に向かって配向し、一方で、親水性（極性）「頭」が水相に向かって配向するものである。この技術は、ＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９６７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３５：６２４−６３８により記載される小さな超音波処理された単膜小胞の開発の基礎を提供した。通常、水性溶液中のリン脂質の混合物は、自然に会合してリポソーム構造を形成するが、リポソームの大きさおよび形状を制御するための技術は、当該分野で公知である。
【００９７】
（方法）
方法ならびに特定の状態および材料の以下の一般的な議論は、例示の目的であって、限定するものではない。当業者は、本明細書中に記載される方法が、特に、異なる細胞型および細胞表面分子を使用して、他の適用に適合され得る方法を理解する。
【００９８】
本発明の方法を実施する際に、アッセイ成分の混合がなされ、これらとしては、試験される細胞、タグ化プローブおよび切断プローブが挙げられる。一般に、アッセイ成分は、任意の順序で混合され得る。しかし、特定の適用において、添加の順序が関連し得る。例えば、定量的アッセイにおいて、競合結合をモニタリングすることを所望し得る。または、組立られた複合体の安定性をモニタリングすることを所望し得る。このような適用において、反応は、段階的に組み立てられ得、そして、完全な混合物が組み立てられる前、または、切断反応が開始される前に、インキュベーションを必要とし得る。
【００９９】
各試薬の量は、通常、実験的に決定される。アッセイにおいて使用される細胞の数は、各細胞の表面における標的複合体の予想される数によって、そして、アッセイのシグナルをモニタリングするために使用される分離および検出の手段によって決定される。一般に、タグ化プローブおよび切断プローブの量は、サンプルの細胞における標的分子の予測される量に対してモル過剰に提供され、一般には、少なくとも１．５のモル過剰、より望ましくは約１０倍過剰、またはそれ以上で提供される。特定の適用において、使用される濃度は、結合剤の親和性および、単一細胞上に存在する標的分子の予測される数に依存して、これより高くてもこれより低くてもよい。オリゴマー細胞表面複合体の形成に対する化合物の効果を決定する場合に、モニタリングされる効果に依存して、化合物は、プローブの添加の前、同時またはその後に細胞に添加され得る。
【０１００】
アッセイ混合物は、プローブの細胞表面分子に対する結合を提供する条件下にて、通常は水性媒体中にて、一般に、生理的ｐＨ（細胞が培養されるｐＨと適合性である）において混合およびインキュベートされ、約１０〜２００ｍＭの範囲の濃度の緩衝液により維持される。従来の緩衝液ならびに、必要に応じて、他の従来の添加物（例えば、塩、増殖培地、安定化剤など）が使用され得る。生理学的かつ一定の温度が、通常使用される。インキュベーション温度は、通常、約４℃〜７０℃の範囲であり、普通は約１５℃〜約４５℃の範囲であり、より普通は、２５℃〜３７℃の範囲である。
【０１０１】
アッセイ混合物の組立およびプローブを細胞表面分子に結合させるためのインキュベーションの後、混合物を処理して切断剤を活性化し、切断剤の有効な近位内にあるタグ化プローブからタグを切断させ、細胞表面から対応するタグを溶液中に放出させる。この処理の性質は、切断剤の作用の機構に依存する。例えば、光感作物質が切断剤として使用される場合、切断の活性化は、使用される特定の感作物質に適した波長の光での混合物の照射を含む。
【０１０２】
切断の後、次いで、サンプルを分析して、放出されたタグの同一性を決定する。複数のタグ化プローブを使用するアッセイが採用される場合、放出されたタグの分離は、一般にその検出よりも前に来る。分離および検出の両方のための方法は、アッセイのためのタグを設計するプロセスにおいて決定される。分離の好ましい様式は、電気泳動を使用し、ここで、種々のタグが、その電気泳動の移動度における公知の差異に基づいて分離される。
【０１０３】
（放出される分子タグの分離）
上記のように、分子タグは、１つ以上の物理的、化学的および／または光学的特性（本明細書中で「分離特性」として称される）に基づいて分子タグを区別し得る分離技術による分離のために設計される。また、上記のように、本発明の種々の実施形態と共に使用され得る分離技術としては、正常相または逆相のＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、キャピラリー電気クロマトグラフィー、質量分析、気相クロマトグラフィーなどが挙げられる。好ましくは、選択される分離技術は、分子タグの存在または不在（および、それゆえ、対応する分析物）についての定量的な情報ならびに質的な情報を提供し得る。１つの局面において、液相分離技術は、分子タグの混合物を含有する溶液（例えば、緩衝溶液、反応溶媒など）が、プロセスされて分子タグの個々の種類の分離を行うように、使用される。通常、このような分離は、それぞれの分子タグの増加した濃度の領域に対応する、識別可能なピークまたはバンドを形成するまで、パスに沿って、このような最初の混合物からの分子タグの差次的な移動によって達成される。このようなパスは、流体の流れ、電場、磁場などによって規定され得る。特定の分離技術の選択は、その技術を使用する費用および簡便さ、分子タグの化学的性質を付与する技術の分解力、分離される分子タグの数、使用される検出様式の型などが挙げられる、いくつかの因子に依存する。好ましくは、分子タグは、電気泳動的に分離されて、エレクトロフェログラムを形成し、ここで、分離された分子タグは、別個のピークにより表される。
【０１０４】
（Ａ．電気泳動分離）
電気泳動のための方法は周知であり、当業者が特定多数の分子タグを形成および分離するための設計選択を行うための豊富なガイダンスが存在する。以下は、電気泳動に関する例示的な参考文献である：Ｋｒｙｌｏｖら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７２：１１１Ｒ−１２８Ｒ（２０００）；Ｐ．Ｄ．ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＪ．Ｃ．Ｃｏｌｂｕｒｎ，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９２）；米国特許第５，３７４，５２７号；同第５，６２４，８００号；同第５，５５２，０２８号；ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ，Ｒｅｖ．Ａ，１９９５年１月、第２章（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）など。１つの局面において、分子タグは、キャピラリー電気泳動により分離される。当業者の範囲内の設計選択としては、いくつかの市販のモデルからの機器の選択、操作条件（分離培地の型および濃度、ｐＨ、所望の分離時間、温度、電圧、キャピラリーの型および次元、検出様式、分離される分子タグの数などを含む）の選択が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０５】
本発明の１つの局面において、電気泳動分離の間または電気泳動分離の後に、分離された化合物の蛍光シグナルもしくは移動時間（もしくは移動距離）を記録することによってか、または、分子タグの相対蛍光のチャートおよび移動の順序を（例えば、エレクトロフェログラムとして）構築することによって、分子タグが検出または同定される。このような検出を行うために、分子タグは、標準的な手段（例えば、高密度水銀蒸気ランプ、レーザーなど）によって照射され得る。代表的には、分子タグは、Ｈｅ−Ｎｅ気体レーザーまたは固体ダイオードレーザーにより産生されたレーザー光により照射される。次いで蛍光シグナルが、光感作検出器（例えば、光電子倍増管、帯電連動型デバイス（ｃｈａｒｇｅｄ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ）など）によって検出され得る。例示的な電気泳動検出システムは、他のところ（例えば、米国特許第５，５４３，０２６号；同第５，２７４，２４０号；同第４，８７９，０１２号；同第５，０９１，６５２号；同第６，１４２，１６２号など）に記載される。別の局面において、分子タグは、例えば、米国特許第６，０４５，６７６号に記載されるように、電気化学的に検出され得る。
【０１０６】
電気泳動分離は、移動度の差に基づく、電場における分子の移動および分離に関する。種々の形態の電気泳動分離としては、例の目的として、そして限定する意味ではなく、フリーゾーン電気泳動、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、等速電気泳動、キャピラリー電気泳動およびミセル動電クロマトグラフィーが挙げられる。キャピラリー電気泳動は、好ましくは、動電学的な流れ（電気泳動的、二電気泳動的（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ）および／または電気浸透的な流れを含む）によって、約１〜約２００μｍの、通常は約１０〜約１００μｍの断面寸法のチューブまたはチャネル中で行われる、電気分離に関する。キャピラリーは、水中またはケイ素、石英、ガラスまたはプラスチックからなるフィルム中の、長い独立したキャピラリーチューブまたはチャネルであり得る。
【０１０７】
キャピラリー電気分離において、分子タグを含む反応混合物のアリコートが、このアリコートを、キャピラリーデバイスの一部であり得るか、またはキャピラリーデバイスに結合され得る電気分離チャネルに導入することによって電気分離に供される。このキャピラリーデバイスにおいて、増幅および他の反応が行われる。次いで、電位がチャネル内に含まれる導電性媒体に適用され、混合物内の成分の移動を達成する。一般に、適用される電位は、当該分野で周知の実施に従って所望の成分の電気分離を達成するのに十分である。当業者は、本発明において使用される所定のセットの試薬および／または切断される標識の性質、反応媒体の性質などに適した電位を決定し得る。電気分離のパラメータ（媒体および電位に関するパラメータを含む）は通常、所望の成分の最大分離を達成するように最適化される。このことは、経験的に達成され得、十分に当業者の範囲内である。
【０１０８】
検出は、米国特許第５，５６０，８１１号（１１欄１９〜３０行）；米国特許第４，６７５，３００号；米国特許第４，２７４，２４０号；および米国特許第５，３２４，４０１号（これらの関連開示が参考として本明細書中に援用される）に示された方法を含む、キャピラリー電気泳動カラムの分析に関連したいずれの公知の方法によってもよい。電気泳動の分野の当業者は、広範囲の電位または電場強度が使用され得ることを認識しており、例えば、１０から１０００Ｖ／ｃｍの電場が使用され、約２００から約６００Ｖ／ｃｍがより代表的である。市販システムの電圧上限は、約４０〜約６０ｃｍのキャピラリー長で、約３０ｋＶであり、約６００Ｖ／ｃｍの最大電場を与える。ＤＮＡのために、代表的に、キャピラリーはコーティングされて、電気浸透流を低減し、キャピラリーの注入端部は、負の電位に維持される。
【０１０９】
検出を容易にするために、全体の装置は、一般に約１８０〜約１５００ｎｍ、通常は約２２０〜約８００ｎｍ、より通常には約４５０〜約７００ｎｍの範囲の波長の光が、低い透過ロスを有することを可能にする光学的に透明であるプラスチック材料から組立てられ得る。好適な材料としては、溶融シリカ、プラスチック、石英、ガラスなどが挙げられる。
【０１１０】
本発明の一局面において、分子タグは、図１６Ａ〜１６Ｃに図式的に示されるとおり、微量流体工学デバイス内の電気泳動により分離される。微量流体工学デバイスは、多くの国内および外国の特許証および特許出願公開公報に記載されている。例えば、米国特許第５，７５０，０１５号；米国特許第５，９００，１３０号；米国特許第６，００７，６９０号；およびＷＯ第９８／４５６９３号；ＷＯ第９９／１９７１７号およびＷＯ第９９／１５８７６号を参照されたい。便宜上、一般に約５μｌ以下のアリコートを、統合システム内への直接の電気泳動注入または空気注入を介してか、またはシリンジ、キャピラリーなどによるかのいずれかにより、微量流体工学デバイスのサンプル貯蔵器に移す。分離が実施される条件は従来どおりであり、生成物の性質により変わる。
【０１１１】
図示を目的として、図８Ａ〜８Ｃは、上記の適用において、上記アッセイにおいて生じたプローブおよびタグのサンプルの充填およびサンプルの電気泳動分離について詳述された型の微量流体工学デバイス内のミクロチャネルネットワーク１００を示している。手短に言えば、前記ネットワークは、それぞれ上流および下流の貯蔵器１０４、１０６の境をなす主要分離チャネル１０２を含んでいる。主要チャネルは、貯蔵器１１０で境をなすサイドチャネル１０８、および貯蔵器１１４で境をなすサイドチャネル１１２によってオフセット軸位で交わっている。２つのサイドチャネル間のオフセットは、主要チャネル内のサンプル充填ゾーン１１６を形成している。
【０１１２】
操作において、アッセイ混合物を、図８Ａに示されたサンプル貯蔵器１１０に入れる。言及されたように、アッセイ混合物には、表面結合切断剤を有する１個以上の標的細胞、１つ以上のタンパク質プローブ、および必要に応じて分子タグ標準物質を含んでいる。標的細胞への最初のプローブ結合、次いでプローブ結合細胞におけるプローブリンカーの切断を伴うこのアッセイ反応は、サンプル貯蔵器１１０で実施され得るか、あるいはアッセイ反応は、別の反応容器内で、サンプル貯蔵器に反応したサンプル成分が添加されることにより実施され得る。
【０１１３】
放出分子タグをサンプル充填ゾーンに充填するために、電場は、図８Ｂに示された方向で貯蔵器１１０、１１４にわたって適用され、負電荷の放出分子タグは、貯蔵器１１０から充填ゾーン１１６に引き寄せられ、一方、非荷電または正に荷電したサンプル成分はサンプル貯蔵器内に残る。ここで充填ゾーン内の放出タグは、図８Ｃに示された方向で貯蔵器１０４、１０６を横切る電場を適用して、従来のキャピラリー電気泳動により分離され得る。
【０１１４】
生じた電気泳動パターンから、分子タグおよび対応する分析物が確認され得る。代表的にこれは、分離チャネルの下流端付近に蛍光検出器を置くことにより、ならびに分離された分子タグの電気泳動図を作成することによりなされ、最初に上記のような分離特性（この場合、電気泳動移動度）を決定し、次に、シグナル強度（例えば、ピーク高、またはピーク面積）を各プローブと関連するタグの相対量の尺度として測定する。検出可能プローブを検出し、そのレベルを定量する方法は周知である。１つの好ましい方法において、分子タグは蛍光標識される。標準的蛍光発光源は、分離媒体の下流部分の検出ゾーンに向けられ、ゾーンの蛍光発光が標準的光検出器により測定される。記録されたシグナル高または面積は、サンプル中の生成物および基質濃度の測定を提供する。
【０１１５】
ここで上記検出情報により、プローブセット中の特定のプローブに対して検出された各々の分子タグを帰属し、その相対的基質変換またはリガンド結合の測定値として各検出可能プローブの相対的レベルを比較することが可能である。
【０１１６】
（Ｂ．クロマトグラフィー分離）
本発明の一局面において、複数の分子タグは、限定はしないが、分子量、形状、溶解度、ｐＫａ、疎水性、電荷、極性などを含む１つ以上の物理的特性に基づいて、クロマトグラフィーによる分離のために設計される。クロマトグラフィー分離法は、カラム型、固相、移動相などのパラメータに基づいて選択され、次いで、分離されて単回操作において明瞭なピークまたはバンドを形成し得る複数の分子タグを選択する。検出される分子タグ数（すなわち、複数のサイズ）、アッセイにおいて生成される各分子タグの推定量、多重アッセイに使用されるセットの候補物である分子タグの合成の利用可能性および容易さ、使用される検出様式、ならびにＨＰＬＣ器具、カラムおよび溶媒の利用可能性、堅固さ、コストおよび操作の容易さなどを含む幾つかの因子は、いずれのＨＰＬＣ法が、本発明での使用のために選択されるかを決定する。一般に、限定量のサンプルを分析するために好適で、最高の分解能分離を提供するカラムおよび方法が好ましい。このような選択をするためのガイダンスは以下の文献に見出され得る：例えば、Ｓｎｙｄｅｒら、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＨＰＬＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）；Ｍｉｌｌｎｅｒ、「Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）、Ｃｈｉ−Ｓａｎ  Ｗｕ、「Ｃｏｌｕｍｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９９）、およびＯｌｉｖｅｒ、「ＨＰＬＣ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８９）。特に、カラム型、固相などの条件を考慮して、クロマトグラフィー分離の系統的展開と最適化への手順が利用できる：例えば、Ｈａｂｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．、３８：ｐ．３８６−３９２（２０００）；Ｏｕｔｉｎｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、６：ｐ．１９７−２０５（１９９８）；Ｌｅｗｉｓら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、５９２：ｐ．１８３−１９５およびｐ．１９７−２０８（１９９２）；など。
【０１１７】
一局面において、分子タグ候補物の最初の選択は、選択されたカラムと固定相とにより代表的に分離される分子の物理化学的性質により左右される。次に、最初の選択は、上記参考文献に記載されている、従来の最適化手順に従うこと、ならびに特定の実施形態の分離目的のためにより好適な候補分子タグに代えることにより経験的に改善される。一局面において、本発明の分離目的としては、（ｉ）複数の分子タグの、６０分未満、より好ましくは、４０分未満、さらにより好ましくは、１０分から４０分の間の範囲の分離時間での、識別できるピークまたはバンドへの分離、（ｉｉ）任意のペアが、少なくとも１．０、より好ましくは、少なくとも１．２５、さらにより好ましくは、少なくとも１．５０の分解能を有するようなピークまたはバンドの形成、（ｉｉｉ）分離中１５０バール未満のカラム圧、（ｉｖ）２５℃〜９０℃の範囲、好ましくは、３５℃〜８０℃の範囲の分離温度、および（ｖ）複数の識別可能なピークが５本〜３０本の範囲内にあり、全てのピークが同じクロマトグラム内にあること、が挙げられる。２本のピークまたはバンドに関して、本明細書に用いられる「分解能」は、ピークの平均的ベース幅で割った２本のピークまたはバンドの中心間の距離である（例えば、Ｓｎｙｄｅｒら（上記参考文献））。
【０１１８】
クロマトグラフィー法は、そのクロマトグラフィーの特性に基づいて分子タグを分離するために用いられる。クロマトグラフィーの特性は、例えば、定められた条件下での特定のクロマトグラフィー媒体上の分子タグの保持時間、または分子タグが特定のクロマトグラフィー媒体から溶出される特定の条件であり得る。分子タグのクロマトグラフィーの特性はまた、定められた条件下で特定のクロマトグラフィー媒体を用いてクロマトグラフィーにより分離される一群のまたは一セットの分子タグに含まれている分子タグの、溶出順序または溶出パターンであり得る。分子タグのクロマトグラフィー特性は、分子タグの物理的特性ならびにクロマトグラフィーの媒体および移動相との相互作用によって決定される。クロマトグラフィーについての定められた条件としては、特定の移動相溶液、カラム直径および長さを含むカラムの構造、ｐＨ、流速、カラム操作の圧と温度、および分子タグの望ましい分離を得るために変え得る他のパラメータが挙げられる。分子タグ、または分子タグのクロマトグラフィーの特性は、種々のクロマトグラフィー法を用いて検出され得る。
【０１１９】
単回実験で検出される一セットの分子タグは一般に、異なる発蛍光団または同位元素標識、または他の特有の特性のような、質量、電荷、質量−電荷比、検出可能タグが異なる化学的関連分子の一群である。したがって、分子タグの化学的性質および一群の分子タグにおける分子タグ間の特定の相違の双方は、サンプル中の分子タグを分離するために好適なクロマトグラフィー媒体を選択する際に考慮され得る。
【０１２０】
液体クロマトグラフィーによる分子タグの分離は、分子タグの電荷、サイズおよび疎水性などの分子タグの物理的特性、または色素、レクチン、薬物、ペプチドおよびアフィニティマトリックス上の他のリガンドなどの分子に分子タグが結合する能力などの機能特性に基づき得る。広範な種類のクロマトグラフィーの媒体は、分子タグの電荷、サイズ、疎水性および他のクロマトグラフィーの特性に基づく分子タグの分離に好適である。特定のクロマトグラフィー媒体の選択は、使用される分子タグの特性に依存する。
【０１２１】
分離された分子タグは、吸光度、蛍光または電気化学的特性などの分子タグの固有の特性の検出、ならびに分子タグに結合された検出基または検出部分の検出を含む、種々の分析法を用いて検出され得る。必須ではないが、種々の検出基または検出部分は、クロマトグラフィー分離後、検出を促進するために分子タグに結合され得る。
【０１２２】
液体クロマトグラフィーの使用についての検出方法は、周知であり、市販されており、自動化高処理量サンプリングに適合可能である。分子タグの分析用に選択される検出方法は、分子タグが検出可能な基または部分を含むかどうか、使用される検出可能基の型、および使用される場合は分子タグおよび検出可能基の物理化学的特性に依存する。蛍光、導電率、屈折率、蒸発性光散乱に基づく検出方法は、種々の型の分子タグを検出するために使用され得る。
【０１２３】
種々の光学検出器は、液体クロマトグラフィーにより分離された分子タグを検出するために使用され得る。紫外（ＵＶ）／可視分光検出器を用いて、核酸、ポリペプチド、ペプチドならびに他の高分子および低分子を検出する方法は周知であり、ＵＶ／可視検出を、ＨＰＬＣ分析に最も広く用いられている検出方法にする。赤外分光分析器もまた、透明な極性液体である移動相とともに用いられる場合、高分子および低分子を検出するために使用され得る。
【０１２４】
可変波長検出器およびダイオードアレイの検出器は、２つの市販の型のＵＶ／可視分光検出器に相当する。幾つかの可変波長ＵＶ検出器の有用な特徴は、分光学的走査、およびピークがフローセルを通過する間の種々の波長での正確な吸光度の読み取りを実施する能力である。ダイオードアレイ法は、このような吸光度測定比の計算を可能にする２つ以上の波長で吸光度測定を可能にするさらなる利点を提供する。多重波長でのこのような吸光度の比率は、ピークが１つ以上の分子タグに相当するかどうかを決定するのに特に役立つ。
【０１２５】
蛍光検出器はまた、蛍光検出基を含む蛍光性分子タグおよび固有に蛍光がある蛍光性分子タグなどの蛍光性分子タグを検出するのに使用され得る。代表的に、蛍光感度は比較的高く、分子タグが発蛍光団を含む場合、他の分光学的検出方法よりも利点を提供する。分子タグは検出可能な固有の蛍光を有し得るが、分子タグが適切な蛍光検出基を含む場合、サンプル中の単独の分子タグを検出することが可能となり得る。
【０１２６】
電気化学的検出方法はまた、ＨＰＬＣにより分離された分子タグを検出するのに有用である。電気化学的検出は、適切な電極における分子タグの酸化または還元反応から生じる電流の測定に基づく。電流レベルは、分子タグ濃度に正比例することから、所望の場合、電気化学的検出は、定量的に用いられ得る。
【０１２７】
蒸発性光散乱検出は、多色ビーム光の進路を横切る際に、光子散乱を引き起こす粒子の能力に基づく。ＨＰＬＣからの液体流出液を最初に霧状にし、分子タグを含有する生じたエアゾールミストを光ビームにより検出する。サンプル中に存在する分子タグの量に比例するシグナルが生成され、発色団、発蛍光団または電気活性基などの検出可能基の存在または非存在に依存しない。したがって、分子タグ上の検出基または検出部分の存在は、蒸発性光散乱検出にとって必要ではない。
【０１２８】
質量分析法はまた、ＨＰＬＣにより分離された分子タグを検出するために使用され得る。質量分析計は、小さな質量相違によりイオンを分離し得、高度の精確さと感度とでイオンの質量を測定し得る。質量分析法は当該分野において周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７Ｒ−７１６Ｒ（１９９８）；ＫｉｎｔｅｒおよびＳｈｅｒｍａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと）。
【０１２９】
スペクトルデコンボルーションおよび定量分析などの任意の検出法を用いて得られたデータ解析は、手動またはコンピュータアシストであり得、自動化方法を用いて実施され得る。種々のコンピュータプログラムは、ピーク積算、ピーク面積、高さ、および保持時間を決定するために使用され得る。このようなコンピュータプログラムは、分子タグの存在を定性的または定量的に決定する利便性のために使用され得る。ＨＰＬＣでの使用のためのコンピュータプログラムおよび対応する検出器は、当業者に周知であり、一般に市販のＨＰＬＣおよび検出システムと共に提供される。
【０１３０】
種々の市販のシステムは、分子タグの高処理分析に十分に適している。当業者は、分子タグのＨＰＬＣ分析を自動化するために有用な自動化サンプル調製システムおよび自動注入システムなど適切な装置を決定し得る。自動化法は、例えば、大多数のサンプルを処理する場合、または標的分析物を検出するための本発明の方法の複合適用のために、分子タグの高処理量分析に使用され得る。本発明での使用に適切な代表的ＨＰＬＣ装置システムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）である。
【０１３１】
当業者は、特に分析が高処理フォーマットで実施される場合に、分子タグの信頼すべき分析を得るために有用な品質管理の基準を認識している。このような品質管理の基準としては、外部および内部の参照標準物質の使用、クロマトグラフィーのピーク形状の分析、装置性能の評価、例えば、線形性の範囲、サンプル回収、サンプルの溶液安定性、および測定精度を決定することによる実験法の検定が挙げられる。
【０１３２】
（Ｃ．質量分析法による分離）
質量分析法は、当該分野において周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７Ｒ−７１６Ｒ（１９９８）；ＫｉｎｔｅｒおよびＳｈｅｒｍａｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと）。質量分析法に関連する基本的過程は、サンプルから誘導されるガス相イオンの発生およびそれらの質量の測定である。
【０１３３】
ガス相イオンの移動は、質量分析計内で発生させた電磁場を用いて精密に制御され得る。これら電磁場におけるイオンの移動は、イオンのｍ／ｚに比例し、これは、ｍ／ｚを測定する基礎を形成し、したがってサンプルの質量を測定する基礎を形成する。これら電磁場におけるイオンの移動は、イオンを含有させ集中させ、これは、質量分析の高感度の原因となる。ｍ／ｚ測定の過程で、イオンは、これらイオンの到達を記録する粒子検出器に高効率で伝送される。各ｍ／ｚにおけるイオン量は、ｘ軸がｍ／ｚで、ｙ軸が相対量であるグラフ上のピークにより表示される。異なる質量分析計は、異なるレベルの分解能、すなわち、質量が近接した関係にあるイオン間のピークを分解する能力を有する。分解能は、Ｒ＝ｍ／Δｍとして定義され、式中、ｍは、イオン質量であり、Δｍは、質量スペクトル中の２本のピーク間の質量差である。例えば、１０００の分解能を有する質量分析計は、イオンからの１００．０のｍ／ｚを有するイオンを１００．１のｍ／ｚを有するイオンから分解できる。
【０１３４】
質量分析器の幾つかの型を入手し得るか、または種々の形状で製造し得る。一般に、質量分析計は、以下の主要な構成部分を有している：サンプル注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空システム、ならびに装置制御システムおよびデータシステム。サンプル注入口、イオン源および質量分析器の相違は、一般に装置の型とその能力を定める。例えば、注入口は、キャピラリー−カラム液体クロマトグラフィー源であっても、またはマトリックス−アシストレーザ脱離に用いられるような直接プローブまたはステージであってもよい。通常のイオン源は、例えば、ナノスプレーおよびミクロスプレーが挙げられるエレクトロスプレーまたはマトリックス−アシストレーザ脱離を含む。代表的質量分析器としては、四重極質量フィルタ、イオントラップ質量分析器および飛行時間型質量分析器が挙げられる。
【０１３５】
イオン形成過程は、質量スペクトル分析に関する出発点である。幾つかのイオン化法が利用でき、イオン化法の選択は、分析されるサンプルに依る。例えば、ポリペプチドの分析に関して、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）などの比較的温和なイオン化法が望ましくあり得る。ＥＳＩに関して、サンプル含有溶液は、強い電場を創る高電位で細針を通過し、質量分析計に向けられる高電荷小滴の細かいスプレーを生じる。他のイオン化法としては、例えば、高速原子衝撃（ＦＡＢ）が挙げられ、これは、脱離とイオン化を引き起こす固体サンプルに衝突させるために中性原子の高エネルギービームを用いる。マトリックスアシストレーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）は、ＵＶ吸収化合物マトリックス中で結晶化されたサンプルに衝突させるためにレーザパルスが用いられる方法である。当該分野に公知の他のイオン化法としては、例えば、プラズマおよびグロー放電、プラズマ脱離イオン化、共鳴イオン化、および二次的イオン化が挙げられる。タグレポータは、タグ化プローブからの切断前、切断中または切断後にイオン化され得る。
【０１３６】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、本明細書中に記載される発明に有用ないくつかの特性を有する。例えば、ＥＳＩは、生物学的分子（例えば、イオン化させるかまたは蒸発させるのが困難であるポリペチド）のために用いられ得る。さらに、ＥＳＩの効率は、非常に高くあり得、このことは、非常に感度が高い測定の基礎を提供する。さらに、ＥＳＩは、荷電した分子を溶液から生成し、このことは、溶液中に存在するタグレポーターを分析するために便利である。対照的に、ＭＡＬＤＩのようなイオン化手順は、イオン化の前にサンプルの結晶化を必要とする。
【０１３７】
ＥＳＩは、荷電した分子を溶液から直接的に生成し得るので、これは、液体クロマトグラフィー系からのサンプルと適合性である。例えば、質量分析計は、液体クロマトグラフィー系（例えば、ＨＰＬＣ）のための入口を有し得、その結果、画分は、クロマトグラフィーカラムから質量分析計中へと流れる。液体クロマトグラフィー系および質量分析計のこのインライン配置は、時々ＬＣ−ＭＳといわれる。ＬＣ−ＭＳ系を用いて、例えば、質量分析の前に切断されていないかまたは部分的に切断されたタグレポーターを、切断されたタグレポーターから分離し得る。さらに、クロマトグラフィーを用いて、質量分析の前にタグレポーターサンプルから塩または他の緩衝成分を除去し得る。例えば、逆相ＨＰＬＣカラム（インラインまたはオフライン）を使用したサンプルの脱塩を用いて、イオン化プロセスの効率を増大させ得、従って、質量分析法による検出感度を向上させ得る。
【０１３８】
異なるイオン源と対にされ得る種々の質量分析計が利用可能である。異なる質量分析計は、当業者に公知の、そして本明細書中に記載される通りの、異なる利点を有する。検出のために選択される質量分析計および方法は、特定のアッセイに依存し、例えば、少量のイオンが検出のために生成される場合、より高感度の質量分析計が用いられ得る。いくつかの型の質量分析計および質量分析法が以下に記載される。
【０１３９】
四重極質量分析法は、四重極質量フィルターまたは分析計を利用する。この型の質量分析計は、２本の電気的に接続されたロットの２セットとして配置された４本のロッドから構成される。ｒｆ電圧およびｄｃ電圧の組み合わせは、ロッドの各対に印加され、これは、電場を生じ、この電場は、質量フィルターの始めから終わりへと動くにつれてイオンの振動する動きを引き起こす。これらの電場の結果は、１対のロッドにおける高域質量フィルターおよび他方の対のロッドにおける低域フィルターの生成である。高域フィルターと低域フィルターとの間の重複は、両方のフィルターを通過して四重極の長さを横断し得る規定されたｍ／ｚを残す。このｍ／ｚが選択され、そして四重極質量フィルターにおいて安定なままであり、一方、他の全てのｍ／ｚは、不安定な軌道を有して、この質量フィルター中には残らない。質量スペクトルは、印加された電場に傾斜を付け、その結果、増加するｍ／ｚが選択されて質量フィルターを通過して検出器に到達することにより、生じる。さらに、四重極はまた、ｒｆのみの電場を印加することにより、全てのｍ／ｚのイオンを含んで伝達するように設定され得る。このことは、四重極が、質量をフィルタリングすることなく、イオン伝達が必要とされる質量分析器領域においてレンズまたは焦点系として機能することを可能にする。これは、以下にさらに記載される通り、タンデム質量分析法において有用である。
【０１４０】
四重極質量分析計、ならびに本明細書中に記載される他の質量分析計は、規定のｍ／ｚまたは質量範囲を分析するためにプログラミングされ得る。質量分析計のこの特性は、本明細書中に記載される発明に有用である。切断されたタグレポーターの質量範囲はアッセイ前に公知であるので、質量分析計は、より高いかまたはより低い質量範囲のイオンを排除しながら、投射された正しい質量範囲のイオンを伝達するためにプログラミングされ得る。質量範囲を選択する能力は、このアッセイにおいてバックグラウンドノイズを減少させ得、従ってシグナル対ノイズ比を増大させ得る。さらに、規定された質量範囲を用いて、完全に切断されたタグ化プローブ（タグレポーター）の質量よりも高い質量である、任意の未切断または部分的に切断されたタグ化プローブの分析を排除し得る。それゆえ、この質量分析計は、タグレポーターの、固有の分離工程、ならびに検出および同定を達成し得る。
【０１４１】
イオントラップ質量分析法は、イオントラップ質量分析計を利用する。これらの質量分析計では、全てのｍ／ｚのイオンが最初にトラップされて質量分析計において振動するように電場が印加される。イオンは、焦点デバイス（例えば、八重極レンズ系）を通ってイオン源からイオントラップに入る。イオントラップは、励起および電極を通る検出器への射出前にトラップ領域において生じる。質量分析は、増加するｍ／ｚのイオンをトラップから射出して検出器に入らせるような様式で振動の振幅を増加させる電圧を順次印加することにより達成される。四重極質量分析法とは対照的に、全てのイオンは、選択されたｍ／ｚを有するイオン以外は、質量分析計の電場において保持される。イオントラップに対する１つの利点は、１回にトラップされるイオンの数を制限することに注意する限り、これらが非常に高感度であることである。イオンの数の制御は、イオンがトラップに注入される時間を変化させることにより達成され得る。イオントラップの質量分解能は、四重極質量フィルターの質量分解能と類似するが、イオントラップは、低いｍ／ｚ限界を有する。
【０１４２】
飛行時間型質量分析法は、時間飛行型質量分析計を利用する。ｍ／ｚ分析のこの方法のために、イオンは、（高電圧により生成される）電磁場における加速により、固定された量の運動エネルギーが最初に与えられる。加速後、このイオンは、電場のない領域、または「ドリフト」領域に入り、この領域では、このイオンは、そのｍ／ｚに逆に比例する速度で移動する。それゆえ、低いｍ／ｚを有するイオンは、高いｍ／ｚを有するイオンよりも迅速に移動する。イオンが、電場のない領域の長さを移動するために必要とされる時間が測定され、そしてイオンのｍ／ｚを算出するために用いられる。
【０１４３】
この型の質量分析における１つの考慮事項は、研究されるべきイオンセットが、同時に分析計に導入されることである。例えば、この型の質量分析は、短い、充分に規定されたパルスのイオンを生成するＭＡＬＤＩのようなイオン化技術に充分に適している。別の考慮事項は、運動エネルギーの量にバリエーションを有するイオンによって生成される速度の広がりを制御することである。より長い飛行管、イオン反射器、またはより高い加速電圧の使用は、速度の広がりの効果を最小にするのを補助し得る。時間飛行型質量分析計は、高いレベルの感度、および四重極またはイオントラップ質量分析計よりもよりも広いｍ／ｚ範囲を有する。また、データは、この型の質量分析計を用いて迅速に獲得され得る。なぜなら、この質量分析計の走査が必要ないからである。
【０１４４】
（アッセイ試薬の合成）
本発明の方法において用いられる試薬は、当業者に周知の従来の化学を用いて合成される。以下の参考文献は、本発明の試薬を合成するための指針を提供する：国際特許公開ＷＯ  ００／６６６０７；同ＷＯ０１／８３５０２；同ＷＯ  ０２／９５３５６；同ＷＯ  ０３／０６９４７；および米国特許６，３２２，９８０および同６，５１４，７００。より特定には、図５Ａは、遊離アミノ基を用いた抗体または他の結合剤へのタグの結合体化、および遊離されるタグとしてスルフィン酸部分を生成する一重線酸素との、得られる結合体の反応についての方法論をまとめる。図５Ｂは、ＦＡＭ由来のタグ試薬の合成化学を概説する。図６Ａ〜図６Ｊは、いくつかのタグ試薬を示し、これらの大部分は、５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）を出発物質として利用する。これらのタグ分子の調製のための方法は以下の通りである。
【０１４５】
（１．Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ４、およびＰｒｏ６〜Ｐｒｏ１３の調製）
５工程手順は、カルボキシフルオレセイン由来タグ部分（すなわち、Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ４、Ｐｒｏ６、Ｐｒｏ７、Ｐｒｏ８、Ｐｒｏ９、Ｐｒｏ１０、Ｐｒｏ１１、Ｐｒｏ１２、およびＰｒｏ１３）の調製のために用いられる。第１工程は、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中の５−ＦＡＭまたは６−ＦＡＭと、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）との反応により、対応するエステルを得て、次いでこのエステルを、種々のジアミンで処理して、所望のアミドである化合物１を得ることを含む。Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテートでの化合物１の処理は、予想されたヨードアセトアミド誘導体を提供し、これを単離しなかったが、これをトリエチルアミンの存在下で３−メルカプトプロピオン酸とさらに反応させた。最後に、得られたチオ酸（化合物２）を上記の通りに変換してそのＮＨＳエステルにした。種々のタグ部分を、５−ＦＡＭまたは６−ＦＡＭおよび種々のジアミンのうちの１つから出発して合成した。ＦＡＭのレジオ異性体およびジアミン中の「Ｘ」という化学実体は、合成されたタグ部分の各々について、以下の表において示される。明らかに、ジアミンＸは、移動度改変物部分の考察において上記で記載した通り、広範囲のさらなる形態を有し得る。
【０１４６】
【表２】
2005534030.tif 000004
【０１４７】
（化合物１の合成）
乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）中の５−カルボキシフルオレセインまたは６−カルボキシフルオレセイン（０．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．１当量）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．１当量）を添加した。約１０分後、白色固体（ジシクロヘキシルウレア）が形成され始めた。反応混合物を室温にて一晩、窒素下で攪拌した。ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー；９：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ）は、出発物質の完全な消失を示した。
【０１４８】
上記混合物からの上清を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のジアミン（２〜５当量）の攪拌溶液に滴下した。ＴＬＣ（４０：９：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ）から明白な通り、この反応は瞬間的で完了した。溶媒を減圧下で除去した。Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓシリカでの得られた残渣のフラッシュクロマトグラフィーは、所望のアミン（化合物１）を５８％〜８９％の収率で提供した。化合物１の１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）は、帰属した構造と一致した。
【０１４９】
（化合物２の合成）
このアミン（化合物１）（０．３ｍｍｏｌ）に、乾燥ＤＭＦ（１０ｍＬ）およびＮ−スクシンイミジルヨードアセテート（１．１当量）を順次添加した。得られた混合物を、透明な溶液が得られるまで、室温で攪拌した。ＴＬＣ（４０：９：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ）は、反応の完了を示した。
【０１５０】
次いで、上記の反応溶液を、トリエチルアミン（１．２当量）および３−メルカプトプロピオン酸（３．２当量）で処理した。この混合物を室温で一晩攪拌した。減圧下での溶媒除去、続いてフラッシュクロマトグラフィーにより、チオ酸（化合物２）が６２％〜９１％の収率で得られた。化合物２の構造を、その１ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）に基づいて帰属させた。
【０１５１】
（Ｐｒｏ２、Ｐｒｏ４、およびＰｒｏ６〜Ｐｒｏ１３の合成）
乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のβ−チオ酸（化合物２）（０．０５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．５当量）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．５当量）を添加した。この混合物を、室温にて窒素下で２４時間〜４８時間（出発物質の全てが反応するまで）攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、次いでフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標的分子を４１％〜９２％の収率で得た。
【０１５２】
（２．Ｐｒｏ１の調製）
乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中の５−ヨードアセトアミドフルオレセイン（化合物４）（２４ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、トリエチルアミン（８μＬ、０．０５７ｍｍｏｌ）および３−メルカプトプロピオン酸（５μＬ、０．０５７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を室温で１．５時間攪拌した。ＴＬＣ（４０：９：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ）は、反応の完了を示した。その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１８ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温にて窒素下で１９時間攪拌し、この時点で、ＴＬＣは、出発物質の完全な消失を示した。減圧下での溶媒除去およびその後の２５：１および１５：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを溶離液として用いたフラッシュクロマトグラフィーにより、Ｐｒｏ１（２３ｍｇ、８３％）を得た。
【０１５３】
（３．Ｐｒｏ３の調製）
乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中の６−ヨードアセトアミドフルオレセイン（化合物５）（２６ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、トリエチルアミン（８μＬ、０．０５７ｍｍｏｌ）および３−メルカプトプロピオン酸（５μＬ、０．０５７ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を、室温にて１．５時間攪拌した。ＴＬＣ（４０：９：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ）は、反応の完了を示した。その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１８ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温にて窒素下にて１９時間攪拌し、この時点で、ＴＬＣは、出発物質の完全な消失を示した。減圧下での溶媒除去およびその後の３０：１および２０：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを溶離液として用いたフラッシュクロマトグラフィーにより、Ｐｒｏ３（１８ｍｇ、６１％）を得た。
【０１５４】
（４．Ｐｒｏ５の調製）
乾燥ＤＭＦ（５ｍＬ）中の５−（ブロモメチル）フルオレセイン（化合物６）（４０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、トリエチルアミン（１５μＬ、０．１０８ｍｍｏｌ）および３−メルカプトプロピオン酸（１０μＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を室温にて２日間攪拌した。ＴＬＣ（４０：９：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ）は、反応の完了を示した。反応溶液を、減圧下でエバポレートした。最後に、３０：１および２５：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを溶離液として用いたフラッシュクロマトグラフィーにより、β−チオ酸（化合物７）（２８ｍｇ、６６％）を得た。
【０１５５】
乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のこの酸（化合物７）（２７ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２０ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温にて窒素下にて２日間攪拌し、その時点で、ＴＬＣ（９：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ）は、出発物質の完全な消失を示した。減圧下での溶媒除去およびその後の３０：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを用いたフラッシュクロマトグラフィーにより、Ｐｒｏ５（２４ｍｇ、７３％）を得た。
【０１５６】
（５．Ｐｒｏ１４の調製）
５−アミノアセトアミドフルオレセイン（化合物８）（４９ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）およびＮ−スクシンイミジルヨードアセテート（５２ｍｇ、０．１８４）を順次添加した。透明溶液が得られ、そしてＴＬＣ（４０：９：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ）は、出発物質の完全な消失を示した。
【０１５７】
次いで、上記反応溶液を、トリエチルアミン（３０μＬ、０．２１５ｍｍｏｌ）および３−メルカプトプロピオン酸（３０μｌ、０．３４４ｍｍｏｌ）で処理した。得られた混合物を２時間攪拌した。減圧下での溶媒除去、続いて２０：１および１５：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを溶離液として用いたフラッシュクロマトグラフィーにより、β−チオ酸（化合物９）（４１ｍｇ、６２％）を得た。構造帰属を、１ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）に基づいて行った。
【０１５８】
乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物９（２２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）および１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１６ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を、室温にて窒素下で約２４時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、そして残渣を、３０：１および２０：１のＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨを溶離液として用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、Ｐｒｏ１４（１８ｍｇ、７０％）を得た。
【０１５９】
（６．Ｐｒｏ１５、Ｐｒｏ２０、Ｐｒｏ２２、およびＰｒｏ２８の合成）
タグＰｒｏ１５、Ｐｒｏ２０、Ｐｒｏ２２、およびＰｒｏ２８のＮＨＳエステルを精製するための合成スキームを、それぞれ、図７Ａ〜図７Ｄに示す。試薬および反応条件の全ては、当該分野で慣用的であり、上記に記載された反応と同様に進行する。
【０１６０】
（抗体へのタグ分子の結合体化）
結合体化についての２つの異なるアプローチが一般的に用いられる。第１のものは、抗体へのタグ分子の直接的な結合を含み、そして第２のアプローチは、デキストランへのタグ分子の結合、次いで抗体へのデキストランの結合を含む。この第２のアプローチは、複数のタグ分子（これは全て、単一の感作分子によって遊離され得る）を含むタグ化抗体試薬を生成する、シグナル増幅のための手段を提供する。
【０１６１】
（１．抗体へのＰｒｏ１タグ分子の直接的結合体化）
タグ分子を、抗体の１級アミンと反応して安定なアミド結合を形成して抗体の表面でのタグ分子のランダム結合をもたらすＮＨＳエステル末端を用いて合成する。予め結合体化されたタグ−抗体は、抗体分子１個あたり６〜１２個までのＮＨＳエステル含有分子を用いた改変が、抗体結合活性における減少を代表的にもたらさないことを実証した。より高い比率のＮＨＳエステル対抗体でさえ、ごくわずかな活性喪失が可能である。
【０１６２】
（プロトコル）
１．精製したマウスモノクローナル抗体９Ｅ１０（これは、Ｃ−ＰｌｙＣについて特異的なアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを認識する、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮから）を、１×ＰＢＳ（０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中に２ｍｇ／ｍＬまで希釈する。
【０１６３】
２．ＮＨＳエステル含有Ｐｒｏ１分子を、１０〜２０ｎｍｏｌ／μＬ  ＤＭＦの最終濃度になるようにＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中に溶解する。
【０１６４】
３．５００μＬの希釈した９Ｅ１０抗体（６．５ｎｍｏｌ）を、１μＬ、５μＬ、２５μＬまたは５０μＬのいずれかのＰｒｏ１タグ試薬（それぞれ、１４ｎｍｏｌ、６８ｎｍｏｌ、３４０ｎｍｏｌ、および６８０ｎｍｏｌ）と混合する（図６Ａを参照のこと）。
【０１６５】
４．この溶液を、暗所にて氷中で２時間反応させる。
【０１６６】
５．Ｐｒｏ１結合体化マウス抗ｃ−ｍｙｃを、０．１×ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に対して４℃にて２０時間透析することにより精製する。
【０１６７】
（２．Ｐｒｏ１−デキストランの抗体への結合体化）
この第二の方法において、タグ分子は、最初に、本質的に上に記載されるように、アミド結合を介してアミン含有デキストランに付着される。ポリクローナル抗体およびいくつかのモノクローナル抗体は、この抗体のＦｃ部分に、炭水化物を含む。これらの多糖類は、過ヨウ素酸で酸化されて、反応性のアルデヒド残基を形成し得る。次いで、アミノデキストラン含有タグは、シッフ塩基の形成を介して、この酸化された抗体のアルデヒド残基に結合体化される。この連結は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムでの第二級アミン結合への還元によって、さらに安定化される。
【０１６８】
タグ分子への結合体化のための５０〜５００の平均アミノ基を有する、極めて大きいサイズのアミノデキストラン（５００，０００の分子量）は、抗体に結合されるタグの数の有意な増加を可能にし、シグナル増幅を提供する。デキストランは、抗体のＦｃ部分の炭水化物を介して結合されるので、これは、抗原結合部位から十分に除去され、その結果、結合活性を構成しない。
【０１６９】
Ｐｒｏ１タグ分子の、アミノデキストランへの結合体化のプロトコル
１．アミノ−デキストラン（デキストラン１モルあたり５００アミンを有する、５００，０００ｍｗ）を、９０％  ＤＭＦに、２ｍｇ／ｍＬ（２ｎｍｏｌアミン／μＬ）の最終濃度で溶解する。
２．ＮＨＳエステル含有タグ分子を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）に、１０〜２０ｎｍｏｌ／μＬ  ＤＭＦの間の最終濃度で溶解する。
３．５００μＬのアミノ−デキストラン（１０００ｎｍｏｌのアミン）を、５００ｎｍｏｌ、１０００ｎｍｏｌ、または２０００ｎｍｏｌのいずれかのＰｒｏ１タグ試薬と混合する。
４．この溶液を、氷上で暗所で２時間反応させる。
５．タグと結合体化したアミノデキストランを、０，１×ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して４℃で２０時間透析することによって、精製する。
６．沈殿物を、１４，０００×ｇで５分間の遠心分離によって除去する。
【０１７０】
抗体の、過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化のためのプロトコル
１．５００μＬ（２．８ｍｍｏｌ）の精製マウスモノクローナル抗体９Ｅ１０（これは、アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを認識し、ｃ−ｍｙｃに特異的であり、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ製）を、１０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で酸化する。
２．この溶液を、室温で暗所で３０分間反応させる。
３．エチレングリコールを、１００ｍＭの最終濃度で添加し、そして室温で１０分間インキュベートする。
４．次いで、酸化された抗体を、０．１×ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して、４℃で２時間透析することによって、精製する。
【０１７１】
過ヨウ素酸で酸化された抗体の、Ｐｒｏ１結合体化アミノデキストランへの結合体化のためのプロトコル。
１．５４μＬ（３００ｐｍｏｌ）の酸化マウスモノクローナル抗体９Ｅ１０を、３００ｐｍｏｌのＰｒｏ１結合体化アミノデキストランと、２００ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）の存在下で混合する。
２．この溶液を、室温で暗所で２時間反応させる。
３．シアノホウ素化水素ナトリウム（１Ｎ  ＮａＯＨ中で新たに作製する）を、５０ｍＭの最終濃度で添加し、そして室温で３０分間反応させる。
４．未反応のアルデヒドを、５０ｍＭのエタノールアミン（ｐＨ９．６）の添加によってブロックし、そして室温で３０分間反応させる。
５．次いで、Ｐｒｏ１結合体化マウス抗ｃ−ｍｙｃを、０．１×ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２））に対して４℃で２０時間透析することによって、精製する。
【０１７２】
（結合剤への光増感剤分子の結合体化）
増感剤分子は、種々の方法および構成によって、抗体に結合体化され得る。例えば、活性化された増感剤（例えば、ＮＨＳエステル、アルデヒド、または塩化スルホニルで活性化された、例えば、メチレンブルーまたはフタロシアニン）が、抗体におけるアミノ基と反応され得る。次いで、これらの結合体は、種々のアッセイにおいて直接使用され得る。また、複数の活性化された増感剤分子が、例えば、２０〜２００の増感剤および２００〜５００のアミノ基を含有するアミノデキストラン−増感剤結合体（過ヨウ素酸で酸化された抗体分子に結合される）を使用することによって、抗体と結合され得、抗体−デキストラン−増感剤結合体を生成する。これらの試薬を生成するためのプロトコルは、タグ−抗体試薬について上に記載されるとおりである。
【０１７３】
この例について、増感剤結合体は、ＮＨＳエステルで活性化されたメチレンブルーと結合体化された精製マウスモノクローナル抗体１２ＣＡ５（これは、アミノ酸配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡを認識し、赤血球凝集素に特異的であり、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ製）を使用して、メチレンブルー結合体化マウス抗ＨＡを生成することによって、生成される。
【０１７４】
（実施例において使用される材料の源）
抗体：
【０１７５】
【表３】
2005534030.tif 000005
【０１７６】
細胞株：すべての細胞株を、ＡＴＣＣから購入した。
【０１７７】
ヒト組織：スナップ凍結された（ｓｎａｐ−ｆｌｏｚｅｎ）全てのヒト組織サンプルを、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）またはＢｉｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）のいずれかから購入し、そして供給者において、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって認可された。
【実施例】
【０１７８】
（実施例１）
（ＧＡＢＡＢＲ１／ＧＡＢＡＢＲ２ヘテロオリゴマー化をモニタリングするためのアッセイ  ）
Ｇ−タンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）である、γ−アミノ酪酸Ｂ（ＧＡＢＡ）Ｂレセプターは、脳膜における高親和性ＧＴＰａｓｅ活性の刺激をＧＡＢＡによって媒介し、カリウムチャンネルおよびカルシウムチャンネルを調節する。このレセプターの活性形態（細胞表面に局在する）は、２つのレセプター（ＧＡＢＡＢＲ１およびＧＡＢＡＢＲ２であり、これらの両方は、クラスＩＩＩ  ＧＰＣＲであり、そして３５％の配列同一性を共有する）を含むヘテロオリゴマーであることが示されている（Ｊｏｎｅｓら、１９９８、Ｋａｕｐｍａｎｎら、１９９８、Ｗｈｉｔｅら、１９９８、Ｍｉｌｌｉｇａｎ，２００１）。
【０１７９】
ＧＡＢＡＢレセプターヘテロオリゴマー化は、本発明の方法を使用してモニタリングされ得る。最初に、エピトープタグ化ＧＡＢＡＢＲ１レセプターおよびＧＡＢＡＢＲ２レセプターが生成され、そしてＷｈｉｔｅら（１９９８）によって記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされる。
【０１８０】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＧＡＢＡＢＲ１コード配列およびＧＡＢＡＢＲ２コード配列でトランスフェクトするためのプロトコル
１．ＭｙｃエピトープをコードするｃＤＮＡ（モノクローナル９Ｅ１０と共に使用される）を、ＧＡＢＡＢＲ１をコードするｃＤＮＡの５’末端にインフレームで融合させ、そしてネイティブシグナル配列を除去し、そしてＣＤ３３のシグナル配列で置き換える。
２．ＨＡエピトープをコードするｃＤＮＡ（モノクローナル抗体１２ＣＡ５と共に使用される）を、ＧＡＢＡＢＲ２をコードするｃＤＮＡの５’末端にインフレームで融合させ、そしてネイティブシグナル配列を除去し、そしてＴ８のシグナル配列で置き換える。
【０１８１】
３．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭ培地中に維持する。これらの細胞を、６０ｍｍディッシュ内で６０から８０％のコンフルエンシーまで増殖させ、そして１．５μｇの各ＧＡＢＡＢ  ｃＤＮＡキメラで、１０μＬのリポフェクタミン試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してトランスフェクトする。細胞を、トランスフェクションの４８〜７２時間後に収集する。
【０１８２】
（オリゴマー化をモニタリングするためのプロトコル）
１．５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中のＧＡＢＡＢＲ１およびＧＡＢＡＢＲ２でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１０５細胞）を、Ｐｒｏ１結合体化マウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体およびメチレンブルー結合体化マウス抗ＨＡ抗体の各々５〜２０ｎＭと、暗所で合わせる。３つのコントロールサンプルを作製し、これらは、細胞、抗ｃ−ｍｙｃ抗体、または抗ＨＡ抗体のうちの１つを省略する。
２．この混合物を、３７℃で暗所で３０分間インキュベートし、結合させる。
３．未結合抗体を、このサンプルの遠心分離および上清の除去によって除去し、続いて、ペレット中の細胞を、交換緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および緩衝液中１：２０００に希釈したＲＯＸ  Ｔ１８標準（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を含有する）で再懸濁する。
４．次いで、サンプルを、発光ダイオードを使用して、６８０ｎｍで５分間照射し、切断のための増感剤を活性化する。
５．サンプルを再度遠心分離し、そして上清を収集し、この上清は、このアッセイの間に放出された任意のタグ分子を含有する。
６．放出されたタグを、キャピラリー電気泳動によって、ＡＢＩ３１００キャピラリー電気泳動装置またはＡＣＬＡＲＡプラスチックＬａｂＣａｒｄＴＭデバイス（ＡＣＬＡＲＡ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）のいずれかで分離する。ＡＢＩ３１００での放出されたタグの分離条件は、以下のとおりである：５０μｍキャピラリー、４７ｃｍの長さおよび３６ｃｍの端部から検出器；分離緩衝液ＰＯＰ−４；注入３．０ｋＶにて８０秒；分離電圧１５ｋＶ。
【０１８３】
（実施例２）
（Ｈｅｒ−２ヘテロダイマー化およびレセプターリン酸化のための細胞溶解物の分析）
この実施例において、Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ２ヘテロダイマーおよびＨｅｒ２−Ｈｅｒ３ヘテロダイマー、ならびにリン酸化状態を、いくつかの細胞株由来の細胞溶解物において、種々の濃度の上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびヘレグリン（ＨＲＧ）での処理後に、測定する。測定を、以下に記載されるように、３つの結合化合物および切断プローブを使用して行う。
【０１８４】
（サンプル調製）
１．血清飢餓させた乳癌細胞株を、使用の前に一晩培養する。
２．細胞株を、ＥＧＦおよび／またはＨＲＧで、培養倍地中３７℃で１０分間刺激する。ＥＧＦ／ＨＲＧの例示的な用量は、ＢＴ２０（これについては、最大用量は、５００ｎＭまで増加する。なぜなら、１００ｎＭ  ＥＧＦでは飽和に達しないからである）を除く全ての細胞株（例えば、ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＳＫＢＲ−３）について、０ｎＭ、０．０３２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭである。
３．培養培地を吸引し、氷上に移し、そして溶解緩衝液を添加して、細胞をインサイチュで溶解する。
４．溶解物を掻き取り、そして微小遠心分離管に移す。氷上で３０分間インキュベートする。１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間微小遠心分離する（遠心分離は、任意である）。
５．上清を溶解物として収集し、そして使用までの−８０℃での貯蔵のために、アリコートに分ける。
【０１８５】
（アッセイ）
アッセイ設計：図９Ａに図式的に示されるように、Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ３ヘテロダイマー（９００）を、切断プローブ（９０２）の結合ならびに結合化合物（９０４）、（９０６）、および（９０８）の結合に基づいて、比率測定的に（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）定量する。「ＰＳ」によって示される光増感剤を、アビジン−ビオチン結合を介して切断プローブ（９０２）に付着させ、そして結合化合物（９０４）、（９０６）、および（９０８）を、分子タグＰｒｏ１４、Ｐｒｏ１０、およびＰｒｏ１１でそれぞれ標識する。結合化合物（９０４）は、Ｈｅｒ３におけるリン酸化部位に特異的である。
【０１８６】
全アッセイ体積は、４０μｌである。溶解液体積を、溶解緩衝液で３０μｌに調整する。抗体を、１０μｌまで溶解緩衝液中で希釈する。代表的に、１回の反応あたり約５０００〜１５０００細胞当量の溶解液を使用する。検出限界は、約１０００細胞当量の溶解液である。
【０１８７】
手順；反応における、混合前の結合化合物（すなわち、分子タグ−抗体結合体またはビオチン−抗体結合体）の最終濃度：
Ｐｒｏ４＿抗Ｈｅｒ−２：０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ１０＿Ａｂ１１抗Ｈｅｒ−１：０．０５〜０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ１１＿抗Ｈｅｒ−３：０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ２＿ＰＴ１００抗ホスホ−Ｔｙｒ：０．１μｇ／ｍｌ
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−２：１〜２μｇ／ｍｌ。
１．９６ウェルをアッセイするために、１０μｌの抗体混合物を、３０μｌの溶解液に添加し、そして室温で１時間インキュベートする。
２．２μｌのストレプトアビジン誘導体化切断プローブ（最終２μｇ／ウェル）をアッセイウェルに添加し、そして４５分間インキュベートする。
３．１％のＢＳＡを含有する１５０μｌのＰＢＳを、９６ウェルフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＧＶＮ２２５０）に添加し、そしてブロッキングのために、室温で１時間インキュベートする。
４．減圧吸引によってフィルタプレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタプレートに移し、そして減圧を適用して空にする。
５．２００μｌの洗浄緩衝液を添加し、そして減圧を適用して空にする。１回繰り返す。
６．２００μｌの照射緩衝液を添加し、そして減圧を適用して空にする。１回繰り返す。
７．３０μｌの照射緩衝液を添加し、そして２０分間照射する。
８．分析のために、２２ｃｍのキャピラリーを備えるＡＢＩ３１００  ＣＥ器具を使用して、各反応物１０μｌをＣＥアッセイプレートに移す（注入条件：５ｋＶ、７５秒、３０℃；泳動条件：６００秒、３０℃）。
【０１８８】
アッセイ緩衝液は、以下のとおりである：
溶解緩衝液（新たに作製し、そして氷上で保存する）
【０１８９】
【表４】
2005534030.tif 000006
【０１９０】
洗浄緩衝液（４℃で保存する）
【０１９１】
【表５】
2005534030.tif 000007
【０１９２】
照射緩衝液：
【０１９３】
【表６】
2005534030.tif 000008
【０１９４】
（データ分析）
１．各分子タグの相対蛍光単位（ＲＦＵ）シグナルを、ＣＥ参照標準Ａ３１５に対して標準化する。
【０１９５】
２．対応する分子タグシグナルから「溶解物なし」のバックグラウンドコントロールのＲＦＵを引く。
【０１９６】
３．Ｈｅｒ−１またはＨｅｒ−３に対するヘテロダイマー化を、ビオチン−抗−Ｈｅｒ−２を使用するウェルのアッセイから得たＰｒｏ４＿抗Ｈｅｒ−２のＲＦＵに比例した対応するＲＦＵとして、記録する。
【０１９７】
４．Ｈｅｒ−１、２、３に対するレセプターリン酸化を、ビオチン−抗Ｈｅｒ−２を使用するウェルのアッセイから得たＰｒｏ４＿抗Ｈｅｒ−２のＲＦＵに比例したＰｒｏ２＿ＰＴ１００抗ホスホ−ＴｙｒのＲＦＵとして、記録する。
【０１９８】
アッセイの結果を、図９Ｂ〜図９Ｈに図解する。図９Ｂは、ＥＧＦの濃度の増加に伴ってＭＣＦ−７細胞のＨｅｒ１−Ｈｅｒ２ヘテロダイマーの量が増加するのに対して、ＨＲＧの濃度の増加に伴って、同じダイマーの量は、本質的に変化しないことを示す。図９Ｃは、Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ３ヘテロダイマーに対する逆の結果を示す。つまり、ＭＣＦ−７細胞のＨｅｒ２−Ｈｅｒ３ヘテロダイマーの量は、ＨＲＧの濃度の増加に伴って増加するのに対して、同じダイマーの量は、ＥＧＦの濃度の増加に伴って、本質的に変化しないことを示す。図９Ｄおよび図９Ｅは、ＳＫＰＲ−３細胞およびＢＴ−２０細胞でのＨｅｒ１−Ｈｅｒ２ヘテロダイマーの量が、ＥＧＦの濃度の増加に伴ってそれぞれ増加することを示す。
【０１９９】
（実施例３  Ｈｅｒ２のヘテロダイマー化およびレセプターのリン酸化に対する組織溶解物の分析）
この実施例では、Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ２ヘテロダイマーおよびＨｅｒ２−Ｈｅｒ３ヘテロダイマーならびリン酸化状態を、ヒト乳癌標本由来の組織溶解物中で測定した。
【０２００】
（サンプル調製）
１．スナップ凍結した（ｓｎａｐ  ｆｒｏｚｅｎ）組織を、凍結状態で、切断により機械的にばらばらにする。
【０２０１】
２．組織を微小遠心管に移し、３×組織体積の溶解緩衝液（別表Ｉ）を添加し、その後ボルテックスすることにより、組織を緩衝液中に分散する。
【０２０２】
３．断続的にボルテックスして混合しながら、氷上で３０分間インキュベートする。
【０２０３】
４．４℃にて、１４，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。
【０２０４】
５．溶解物として上清を回収し、少量のアリコートを使用して、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により、総タンパク質濃度を決定する。
【０２０５】
６．残余分を、使用まで−８０℃で貯蔵するためにアリコートに分ける。
【０２０６】
（アッセイ設計）
１．総アッセイ体積は、４０μｌである。
【０２０７】
２．溶解物を、４０、２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１μｇ総当量の連続滴定シリーズで試験し、その体積を溶解緩衝液で３０μｌに調整する。滴定シリーズからのデータにより、ダイマー化シグナルまたはリン酸化シグナルの特異性を確認する。
【０２０８】
３．溶解緩衝液中に希釈した全てのｅＴａｇ抗体を含む全抗体混合物を、以下の濃度で使用する。
【０２０９】
４．各レセプターに対する個々のビオチン抗体を、反応物に別々に添加する。
【０２１０】
５．測定すべき特異的レセプターダイマー化に対応する異なったビオチン抗体をそれぞれ使用して、３つのｅＴａｇアッセイを、各組織溶解物を用いて実施する。
【０２１１】
６．レセプターに特異的なビオチン抗体を含む種々のアッセイから各レセプターの発現レベルを決定する。
【０２１２】
７．ビオチン抗Ｈｅｒ−２を含むアッセイのみにおいて、ダイマー化シグナルおよびリン酸化シグナルを比率測定的に（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）決定する。
【０２１３】
（アッセイコントロール）
ＭＣＦ−１０Ａ細胞株およびＭＣＦ−７細胞株を、それぞれ定量のネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用する。細胞株を、１００ｎＭ  ＥＧＦまたは１００ｎＭ  ＨＲＧで刺激しないか、または刺激する。組織サンプルを交換する場合、溶解緩衝液をバックグラウンドコントロールとして含める。
【０２１４】
反応におけるプレミックス抗体の最終濃度：
全抗体混合物：
Ｐｒｏ４＿抗Ｈｅｒ−２：０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ１０＿抗Ｈｅｒ−１：０．０５μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ１１＿抗Ｈｅｒ−３：０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ２＿抗ホスホ−Ｔｙｒ：０．０１μｇ／ｍｌ
個々のビオチン抗体：
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−１：２μｇ／ｍｌ
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−２：２μｇ／ｍｌ
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−３：２μｇ／ｍｌ
（手順）
１．ビオチン抗体を全抗体混合物に添加することによって、抗体反応混合物を調製する。
【０２１５】
２．９６ウェルをアッセイするために、１０μｌの全反応混合物を３０μｌの溶解物に添加し、室温で１時間インキュベートする。
【０２１６】
３．２μｌのストレプトアビジン由来切断プローブ（最終２μｇ／ウェル）をアッセイウェルに添加し、４５分間インキュベートする。
【０２１７】
４．１％  ＢＳＡを含む１５０μｌのＰＢＳを、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＧＶＮ２２５０）に添加し、ブロッキングのために、室温で１時間インキュベートする。
【０２１８】
５．減圧吸引によりフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、減圧を適用して空にする。
【０２１９】
６．２００μｌの洗浄緩衝液を添加し、減圧を適用して空にする。１回繰り返す。
【０２２０】
７．２００μｌの照射緩衝液を添加し、減圧を適用して空にする。１回繰り返す。
【０２２１】
８．３０μｌの照射緩衝液を添加し、２０分間照射する。
【０２２２】
９．分析のために、２２ｃｍのキャピラリーを備えるＡＢＩ３１００キャピラリー電気泳動装置を使用して、１０μｌの各反応物をＣＥアッセイプレートに移す（注入条件：５ｋＶ、７５秒、３０℃；泳動条件：６００秒、３０℃）。
【０２２３】
（データ分析）
１．各分子タグのＲＦＵシグナルを、ＣＥ参照標準Ａ３１５に対して標準化する。
【０２２４】
２．シグナルが低すぎて信頼性がないので、割合が計算できないＲＦＵ（ダイマー化またはリン酸化のそれぞれについて）以下のカットオフ値を決定する。カットオフ値以下の場合、ＲＦＵシグナルは、一連の試験した溶解物希釈では、滴定可能ではない。その値を、ダイマー化シグナルおよびリン酸化シグナルが、存在しないかまたは最も低いと考えられる正常組織の多数の集合を用いて決定し得る。これらの値はまた、腫瘍組織が比較される正常組織のダイマー化またはリン酸化の基礎レベルを表す。
【０２２５】
３．少数の正常組織については、カットオフ値より高いＲＦＵ値を有する組織が存在する場合、個々のＲＦＵレベルを決定し、Ｈｅｒ−１またはＨｅｒ−３のヘテロダイマー化またはリン酸化の検出されたピークの比率測定値を決定する。これらのサンプルは、記録する間に、対応する腫瘍組織サンプルに対する対応ドナーコントロールとして使用される異常値を示す。
【０２２６】
４．滴定可能なＲＦＵシグナルを示す全ての腫瘍サンプルに関して、バックグラウンドとしての組織溶解物滴定シリーズからのＨｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３のそれぞれの最も低いシグナル、または、ぞれぞれのリン酸化の最も低いシグナルを使用する。特異的ＲＦＵシグナルを得るために、高用量溶解物（例えば、４０μｇ）の分子タグシグナルからこのバックグラウンドを引く。滴定シリーズにおいて、シグナル用量反応がない場合、全てのシグナル（通常は、非常に低い）は、バックグラウンドと考えられ、非特異的シグナルは、比率測定分析に使用され得る。
【０２２７】
５．Ｐｒｏ４＿抗Ｈｅｒ−２からの特異的ＲＦＵに比率が比例した、対応する特異的ＲＦＵとして、Ｈｅｒ−１またはＨｅｒ−３に対するヘテロダイマー化を記録する。特異的ＲＦＵが得られない場合、ダイマー化はネガティブである。
【０２２８】
６．Ｐｒｏ４＿抗Ｈｅｒ−２からの特異的ＲＦＵに比率が比例したＰｒｏ２＿抗ホスホ−Ｔｙｒからの特異的ＲＦＵとして、Ｈｅｒ−１、２、３に対するレセプターリン酸化を記録する。特異的ＲＦＵが得られない場合、リン酸化はネガティブである。
【０２２９】
図１０Ａ〜図１０Ｃでは、示したデータは、本発明のアッセイで試験した複数の患者の胸部組織サンプルの代表である。１０の腫瘍サンプルのうち９の免疫組織化学（ＤＡＫＯ  Ｈｅｒｃｅｐｔｅｓｔ）からの臨床Ｈｅｒ−２状態は、ネガティブで、このことは、Ｈｅｒ−２染色が検出できないか、または腫瘍細胞の１０％未満の染色であるか、またはかすかであって、１０％腫瘍細胞より多い細胞膜の部分の染色をほとんど識別できないことを示している。本発明のアッセイは、正常組織および腫瘍組織の両方で、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２およびＨｅｒ−３の発現を検出した。Ｈｅｒ−１とＨｅｒ−２のヘテロダイマー化およびＨｅｒ−２とＨｅｒ−３のヘテロダイマー化を、腫瘍組織のみで検出したが、正常組織では全く検出しなかった。
【０２３０】
（実施例４  Ｈｅｒ１またはＨｅｒ２のホモダイマー化およびレセプターのリン酸化に対する細胞溶解物の分析）
サンプル調製は本質的に、実施例２に記載したように行った。細胞株をＥＧＦまたはＴＧＦαで処理することによって、Ｈｅｒ１ホモダイマー化を誘導した。リガンドを有さないＨｅｒ２のホモダイマー化については、未刺激の、Ｈｅｒ２を過剰発現するＳＫＢＲ−３細胞またはＭＤＡ−ＭＤ−４５３細胞を、未刺激の、低レベルのＨｅｒ２を発現するＭＣＦ−７細胞と比較する。
【０２３１】
（アッセイ設計）
切断プローブおよび結合化合物が、この実施例の同一のエピトープに競合して結合するように、レセプターに特異的なモノクローナル抗体を、分子タグまたはビオチン（次いで、アビジン架橋によって光感作物質に結合させる）のどちらかに別々に結合させる。比率測定シグナルがホモダイマー化の指標として生成し得るように、レセプター上の重複するエピトープを認識する二次抗体からなる別の結合化合物を使用する。二次抗体に由来するシグナルはまた、サンプル中のレセプターの総量の指標を提供する。レセプターの総量は、別のアッセイウェルにおいて決定される。レセプターのリン酸化は、ホモダイマー化または総レセプター量のいずれかと一緒に、定量化され得る。
【０２３２】
（手順）
アッセイ体積は、４０μｌであって、一般的手順は、実施例２の手順と類似する。ホモダイマー化およびレセプターの総量を別々に定量するために、２つのアッセイウェルＡおよびＢを、各サンプルに対して準備する。
【０２３３】
Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ１ホモダイマーの定量化について：
アッセイウェルＡ中の抗体混合物の最終濃度：
Ｐｒｏ１２＿抗Ｈｅｒ−１：０．０５〜０．１μｇ／ｍｌ
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−１：１〜２μｇ／ｍｌ
アッセイウェルＢ中の抗体混合物の最終濃度：
Ｐｒｏ１０＿抗Ｈｅｒ−１：０．０５〜０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ２＿抗ホスホ−Ｔｙｒ：０．１μｇ／ｍｌ
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−１：１〜２μｇ／ｍｌ
Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ２ホモダイマーの定量化について：
アッセイウェルＡ中の抗体混合物の最終濃度：
Ｐｒｏ４＿抗Ｈｅｒ−１：０．０５〜０．１μｇ／ｍｌ
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−１：１〜２μｇ／ｍｌ
アッセイウェルＢ中の抗体混合物の最終濃度：
Ｐｒｏ４＿抗Ｈｅｒ−１：０．０５〜０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ２＿抗ホスホ−Ｔｙｒ：０．１μｇ／ｍｌ
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−１：１〜２μｇ／ｍｌ
（データ分析）
１．各分子タグのＲＦＵシグナルを、ＣＥ参照標準Ａ３１５に対して標準化する。
【０２３４】
２．「溶解物なし」のバックグラウンドコントロールのＲＦＵを、対応する分子タグシグナルから引く。
【０２３５】
３．Ｈｅｒ−１またはＨｅｒ−２に対するホモダイマー化を、対応するアッセイウェルＢから総レセプター量を標準化したＲＦＵに比率が比例するアッセイウェルＡから標準化した、対応するＲＦＵとして、記録する。
【０２３６】
４．Ｈｅｒ−１ホモダイマーまたはＨｅｒ−２ホモダイマーに対するレセプターリン酸化を、同一のアッセイウェルＢの総レセプター量から標準化したＲＦＵに比率が比例するアッセイウェルＢのＰｒｏ２＿ＰＴ１００抗ホスホ−Ｔｙｒから標準化したＲＦＵとして記録する。
【０２３７】
アッセイの結果を図１１Ａ〜図１１Ｂおよび図１２に図解する。図１１Ａは、ＢＴ−２０細胞上のＨｅｒ１−Ｈｅｒ１ホモダイマーの量が、ＥＧＦの濃度の増加に伴って増加することを示す。図１１Ｂは、ＢＴ−２０細胞のＨｅｒ１リン酸化の量が、ＥＧＦの濃度の増加に伴って増加することを示す。Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ２ホモダイマーの検出を、Ｈｅｒ２を発現するＳＫＢＲ−３細胞からのシグナルを、細胞表面上での低減したレベルのＨｅｒ２を発現するＭＣＦ−７細胞からのシグナルと比較することによって示した。図１２のグラフに示されるように、特異的な滴定可能Ｈｅｒ２−Ｈｅｒ２ホモダイマーシグナルを、ＭＣＦ−７細胞では検出しなかったが、ＳＫＢＲ−３細胞からのＨｅｒ２−Ｈｅｒ２ホモダイマーシグナルは、ＭＣＦ−７細胞からのシグナルを明らかに上回っていた。
【０２３８】
（実施例５  Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３のヘテロダイマー化およびレセプターのリン酸化に対する細胞溶解物の分析）
サンプルは、以下のように調製する：
１．血清飢餓させた乳癌細胞株を、使用前に一晩培養する。
【０２３９】
２．細胞株を、３７℃にて１０分間、培養培地中で、ＨＲＧで刺激する。例示的なＨＲＧの用量は、Ｔ４７Ｄについて、０ｎＭ、０．０３２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭである。
【０２４０】
３．培養培地を吸引し、氷上に移し、インサイチュで細胞を溶解するために、溶解緩衝液を添加する。
【０２４１】
４．溶解物をすくい取り、微小遠心管に移す。氷上で３０分間インキュベートする。４℃にて、１４，０００ｒｐｍで、１０分間微量遠心する（遠心分離は、任意である）。
【０２４２】
５．上清を溶解物として回収し、そして、使用するまで−８０℃での貯蔵のためにアリコートに分ける。
【０２４３】
（アッセイ設計）
総アッセイ体積は、４０μｌである。溶解物の体積を、溶解緩衝液で３０μｌに調整する。抗体を溶解緩衝液中に５μｌまで希釈する。代表的に、約５，０００〜５０，０００細胞当量の溶解物を、反応当たり使用する。反応における予め混合した抗体の最終濃度は、以下のとおりである：
Ｐｒｏ１０＿Ａｂ１１  抗Ｈｅｒ−１：０．０５〜０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ１１＿抗Ｈｅｒ−３：０．１μｇ／ｍｌ
Ｐｒｏ２＿ＰＴ１００抗ホスホ−Ｔｙｒ：０．１μｇ／ｍｌ
ビオチン＿抗Ｈｅｒ−３：１〜２μｇ／ｍｌ
１．９６ウェルをアッセイするために、５μｌの抗体混合物を３０μｌの溶解物に添加し、室温で１時間インキュベートする。
【０２４４】
２．５μｌのストレプトアビジン由来分子はさみ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｓｓｏｒ）（最終４μｇ／ウェル）をアッセイウェルに添加し、４５分間インキュベートする。
【０２４５】
３．１％  ＢＳＡを含む１５０μｌのＰＢＳを、９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＧＶＮ２２５０）に添加し、ブロッキングのために、室温で１時間インキュベートする。
【０２４６】
４．減圧吸引によりフィルタープレートを空にする。アッセイ反応物をフィルタープレートに移し、減圧を適用して空にする。
【０２４７】
５．２００μｌの洗浄緩衝液を添加し、減圧を適用して空にする。１回繰り返す。
【０２４８】
６．２００μｌの照射緩衝液を添加し、減圧を適用して空にする。１回繰り返す。
【０２４９】
７．３０μｌの照射緩衝液を添加し、２０分間照射する。
【０２５０】
８．分析のために、２２ｃｍのキャピラリーを備えるＡＢＩ３１００キャピラリー電気泳動装置を使用して、１０μｌの各反応物をＣＥアッセイプレートに移す（注入条件：５ｋＶ、４２５秒、３０℃；泳動条件：６００秒、３０℃）。
【０２５１】
（データ分析）
１．各ｅＴａｇレポーターのＲＦＵシグナルを、ＣＥ参照標準Ａ３１５に対して標準化する。
【０２５２】
２．「溶解物なし」のバックグラウンドコントロールのＲＦＵを、対応するｅＴａｇレポーターシグナルから引く。
【０２５３】
３．抗Ｈｅｒ−３由来のＰｒｏ１１  ＲＦＵに比率が比例するＨｅｒ−１由来Ｐｒｏ１０ＲＦＵとしてヘテロダイマー化を記録する。
【０２５４】
４．Ｈｅｒ−１／３に対するレセプターリン酸化を、ビオチン−抗Ｈｅｒ−３を使用するアッセイウェルのＰｒｏ１１＿抗Ｈｅｒ−３由来のＲＦＵに比率が比例する、Ｐｒｏ２＿ＰＴ１００抗ホスホ−Ｔｙｒ由来のＲＦＵとして記録する。
【０２５５】
アッセイの結果を、図１３Ａおよび図１３Ｂに図解する。データは、Ｈｅｒ１−Ｈｅｒ３ヘテロダイマー化およびダイマーリン酸化の両方が、ＨＲＧの濃度の増加に伴って増加することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２５６】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、生物学的細胞の表面におけるレセプターダイマーの存在を測定するための、本発明の方法の実施形態を図式的に示す。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、生物学的細胞の表面におけるレセプターダイマーの存在を測定するための、本発明の方法の実施形態を図式的に示す。
【図１Ｃ】記載なし。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｅは、複数のレセプター型のダイマーの頻度を概説するための、本発明の方法の実施形態を図式的に示す。
【図２−２】図２Ａ〜図２Ｅは、複数のレセプター型のダイマーの頻度を概説するための、本発明の方法の実施形態を図式的に示す。
【図２−３】図２Ａ〜図２Ｅは、複数のレセプター型のダイマーの頻度を概説するための、本発明の方法の実施形態を図式的に示す。
【図３−１】図３Ａ〜図３Ｆは、酸化不安定結合および一重項酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図３−２】図３Ａ〜図３Ｆは、酸化不安定結合および一重項酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図３−３】図３Ａ〜図３Ｆは、酸化不安定結合および一重項酸素によって媒介されるそれぞれの切断反応を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｂは、本発明の分子タグを構成するのに使用され得る蛍光誘導体を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｂは、本発明の分子タグを構成するのに使用され得る蛍光誘導体を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、抗体に対してタグを結合して、タグ化プローブを形成するための一般的な方法論、および放出されるタグとしてスルフィン酸部分を生成するための、一重項酸素を用いる、得られるタグ化プローブの反応を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、蛍光標識した分子タグの合成化学の概要を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｇ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｈ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｉ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図６Ｊ】図６Ａ〜図６Ｊは、設計し、合成されたタグの構造を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜図７Ｄは、図６に示したタグ部分の合成化学を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｄは、図６に示したタグ部分の合成化学を示す。
【図７Ｃ−１】図７Ａ〜図７Ｄは、図６に示したタグ部分の合成化学を示す。
【図７Ｃ−２】図７Ａ〜図７Ｄは、図６に示したタグ部分の合成化学を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜図８Ｃは、分子タグを電気泳動で分離する工程を実行するための微量流体装置を図式的に示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｃは、分子タグを電気泳動で分離する工程を実行するための微量流体装置を図式的に示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜図８Ｃは、分子タグを電気泳動で分離する工程を実行するための微量流体装置を図式的に示す。
【図９−１】図９Ａ〜図９Ｅは、本発明の方法を使用する、レセプターヘテロダイマーについての細胞溶解物におけるアッセイからのデータを示す。
【図９−２】図９Ａ〜図９Ｅは、本発明の方法を使用する、レセプターヘテロダイマーについての細胞溶解物におけるアッセイからのデータを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、本発明の方法を使用する、レセプターヘテロダイマーについての組織サンプルにおけるアッセイからのデータを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、本発明の方法を使用する、レセプターヘテロダイマーについての組織サンプルにおけるアッセイからのデータを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜図１０Ｃは、本発明の方法を使用する、レセプターヘテロダイマーについての組織サンプルにおけるアッセイからのデータを示す。
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、Ｈｅｒ１のホモダイマーおよびリン酸化を検出するための本発明のアッセイからのデータを示す。
【図１２】図１２は、２つの異なる細胞株におけるＨｅｒ２ダイマー集団を示す本発明のアッセイからのデータを示す。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、細胞におけるＨｅｒ１とＨｅｒ３とのヘテロダイマーを検出する本発明のアッセイからのデータを示す。
【図１Ａ】
2005534030.tif 000009
【図１Ｂ】
2005534030.tif 000010
【図１Ｃ】
2005534030.tif 000011
【図２−１】
2005534030.tif 000012
【図２−２】
2005534030.tif 000013
【図２−３】
2005534030.tif 000014
【図３−１】
2005534030.tif 000015
【図３−２】
2005534030.tif 000016
【図３−３】
2005534030.tif 000017
2005534030.tif 000018
2005534030.tif 000019
【図５Ａ】
2005534030.tif 000020
2005534030.tif 000021
2005534030.tif 000022
2005534030.tif 000023
2005534030.tif 000024
2005534030.tif 000025
【図６Ｆ】
2005534030.tif 000026
【図６Ｇ】
2005534030.tif 000027
【図６Ｈ】
2005534030.tif 000028
【図６Ｉ】
2005534030.tif 000029
【図６Ｊ】
2005534030.tif 000030
【図７Ａ】
2005534030.tif 000031
2005534030.tif 000032
【図９−１】
2005534030.tif 000033
【図９−２】
2005534030.tif 000034
【図１０Ａ】
2005534030.tif 000035
【図１０Ｂ】
2005534030.tif 000036
【図１０Ｃ】
2005534030.tif 000037
【図１１】
2005534030.tif 000038
【図１２】
2005534030.tif 000039
【図１３】
2005534030.tif 000040
【図５Ｂ】
2005534030.tif 000041
【図７Ｂ】
2005534030.tif 000042
【図７Ｃ−１】
2005534030.tif 000043
【図７Ｃ−２】
2005534030.tif 000044
【国際調査報告】
2005534030.tif 000045