(57)【要約】本発明は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルスに関する。また本発明は、ワクシニアウイルス宿主遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体を含んでいる細胞、好ましくは鳥類細胞に関する。さらに本発明は、アビポックスウイルスによる細胞の感染後にその細胞から産生されるアビポックスウイルスの力価を増加させることを目的とする、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子またはその相同体の使用であって、前記宿主域遺伝子が前記細胞中で発現される、上記使用方法に関する。
2005534326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルス（ただし当該アビポックスウイルスが、ワクシニアウイルスＫ３Ｌ遺伝子と、ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｒｏ、ｇｐ１２０／ＴＭおよびＮｅｆ／Ｐｏｌポリエピトープストリングの各発現カセットとを、ウイルスゲノム中に含んでいる組換えカナリア痘ウイルスである場合は、上記宿主域遺伝子はＥ３Ｌ遺伝子ではないものとする）。
【請求項２】
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子がヒト細胞用の宿主域遺伝子である、請求項１記載のアビポックスウイルス。
【請求項３】
宿主域遺伝子がワクシニアウイルス遺伝子Ｅ３Ｌ、Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌから選ばれる、請求項１又は２記載のアビポックスイルス。
【請求項４】
鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルスより成る群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか１つに記載のアビポックスウイルス。
【請求項５】
ウイルスゲノム中に少なくとも１つの追加異種核酸配列を含んでいる、請求項１〜４のいずれか１つに記載のアビポックスウイルス。
【請求項６】
追加異種核酸配列が、少なくとも１つの抗原、抗原エピトープ及び(又は)治療化合物をコードする配列から選ばれる、請求項５記載のアビポックスウイルス。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のアビポックスウイルスと、薬学的に許容し得る担体、希釈剤及び(又は)添加剤を含む薬学的調合物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１つに記載のアビポックスウイルスを含むワクチン。
【請求項９】
ヒトを含む動物生体において免疫学的応答に影響を及ぼすための、好ましくは誘導するための薬物としての、請求項１〜６のいずれか１つに記載のウイルス、請求項７記載の調合物、または請求項８記載のワクチン。
【請求項１０】
医薬またはワクチンの製造を目的とする、請求項１〜６のいずれか１つに記載のウイルスの使用。
【請求項１１】
標的細胞中に相同及び(又は)異種核酸配列を導入する方法であって、標的細胞を請求項５または６記載のウイルスに感染させることを含む、上記方法。
【請求項１２】
ペプチド、タンパク質及び(又は)ウイルスを生産する方法であって、宿主細胞を請求項１〜６のいずれか１つに記載のウイルスに感染させる工程、感染した宿主細胞を適切な条件下で培養する工程、ならびにウイルスゲノムから発現したペプチド及び(又は)タンパク質及び(又は)該宿主細胞によって産生されたウイルスを単離及び(又は)濃縮する工程を含む、上記方法。
【請求項１３】
ヒを含む動物の生体における免疫応答に影響を及ぼす、好ましくは誘導する方法であって、処置すべき動物またはヒトに、請求項１〜６のいずれか１つに記載のウイルス、請求項７記載の調合物、または請求項８記載のワクチンを投与することを含む、上記方法。
【請求項１４】
動物が免疫不全状態である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか記載のウイルスを含んでいる細胞。
【請求項１６】
次の工程：
場合により請求項５又は６記載の異種核酸をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルスゲノム及び請求項１〜３のいずれか１つに記載の宿主域遺伝子を含んでいるＤＮＡ（このＤＮＡは当該アビポックスウイルスのゲノムＤＮＡと特異的な組換えを起こす能力を持っている）を、該ウイルスが増殖的に複製できる細胞中に導入する工程及び、
該宿主域遺伝子をウイルスゲノム中に含んでいるウイルス粒子を、これらの細胞から単離／濃縮する工程
を含む、請求項１〜６のいずれか１つに記載のアビポックスウイルスを得る方法。
【請求項１７】
次の工程：
請求項１〜４のいずれか１つに記載のアビポックスウイルスのゲノム、及び少なくとも１つの追加異種配列を含んでいるＤＮＡ（このＤＮＡは当該アビポックスウイルスのゲノムＤＮＡと特異的な組換えを起こす能力を持っている）を、該ウイルスが増殖的に複製できる細胞中に導入する工程及び、
少なくとも１つの該追加異種配列をウイルスゲノム中に含んでいるウイルス粒子を、これらの細胞から単離／濃縮する工程
を含む、請求項５又は６記載のアビポックスウイルスを得る方法。
【請求項１８】
アビポックスウイルスおよびワクシニアウイルスに感染した細胞（特に鳥類細胞）であって、当該ワクシニアウイルスが少なくとも１つのワクシニア宿主域遺伝子またはその相同体をウイルスゲノム中に含んでいる、上記細胞。
【請求項１９】
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体を含んでいる細胞（特に鳥類細胞）であって、該宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体がワクシニアウイルスゲノムの一部ではない、上記細胞。
【請求項２０】
宿主域遺伝子が請求項２又は３記載の宿主域遺伝子である、請求項１８又は１９記載の細胞。
【請求項２１】
宿主域遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれる、請求項１９又は２０記載の細胞。
【請求項２２】
宿主域遺伝子が非組込みＤＮＡの一部である、請求項１９又は２０記載の細胞。
【請求項２３】
アビポックスウイルスに感染した、請求項１９〜２２のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項２４】
アビポックスウイルスが組換えアビポックスウイルスである、請求項２３記載の細胞。
【請求項２５】
宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体がアビポックスウイルスのゲノムの一部ではない、請求項２３又は２４記載の細胞。
【請求項２６】
アビポックスウイルスの増殖的複製を可能にする細胞であって、請求項１５又は１８〜２５のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項２７】
アビポックスウイルスによる鳥類細胞の感染後にその細胞から産生されるアビポックスウイルスの力価を増加させることを目的とする、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子またはその相同体（特に請求項２又は３記載の宿主域遺伝子）の使用方法であって、当該宿主域遺伝子が該細胞内で発現される、上記使用方法。
【請求項２８】
請求項１９〜２２のいずれか１つに記載の細胞をアビポックスウイルスに感染させることによって、または請求項１５、１８又は２３〜２５のいずれか１つに記載の細胞を培養することによって、アビポックスウイルスの力価を増加させる方法であって、該細胞が、当該アビポックスウイルスの増殖的複製を可能にする細胞である、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルスに関する。また本発明は、ワクシニアウイルス宿主遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体を含んでいる細胞、好ましくは鳥類細胞に関する。さらに本発明は、アビポックスウイルスによる細胞の感染後にその細胞から産生されるアビポックスウイルスの力価を増加させることを目的とする、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子またはその相同体の使用であって、前記宿主域遺伝子が前記細胞中で発現される、上記使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポックスウイルス科は、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の細胞質で複製する複雑なＤＮＡウイルスからなる大きな科である。ポックスウイルス科はチョルドポックスウイルス亜科（脊椎動物ポックスウイルス）とエントモポックスウイルス亜科（昆虫ポックスウイルス）とに分類することができる。
【０００３】
チョルドポックスウイルス亜科には、誘導すべき免疫応答の対象となる抗原をコードする外因性ＤＮＡセグメントを発現させるためのベクターとして使用することができる数種のポックスウイルスが含まれている。生ワクチンとして使用できるポックスウイルスの例は、ワクシニアウイルスおよびアビポックスウイルス、例えばカナリア痘ウイルスおよび鶏痘ウイルスである。
【０００４】
組換え遺伝子発現用のウイルスベクターおよび組換え生ワクチンとしての使用が可能なウイルスベクターを作製するためのワクシニアウイルスの使用は、数多くの刊行物に開示されている（例えば非特許文献１を参照されたい）。組換えワクシニアウイルスを構築するには、外来抗原をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）をワクシニアウイルスのゲノム中に導入して、適当なポックスウイルスプロモーターの調節を受けるようにする。遺伝子が、ウイルスＤＮＡ中の、ウイルスの生活環にとって不可欠ではない部位に組み込まれる場合、その組換えワクシニアウイルスは感染性を失わない。感染後に、組換えウイルスは、組み込まれたＤＮＡ配列を発現させる（特許文献１及び２）。この方法で作製された組換えワクシニアウイルスは、感染性疾患予防用の生ワクチンとして使用することができ、また、真核細胞における異種タンパク質の製造に使用することもできる。
【０００５】
組換え生ワクチンを開発するためのベクターとしてのワクシニアウイルスの使用は、安全性の懸念および規制の影響を受けてきた。文献に記載されている組換えワクシニアウイルスの大半は、ワクシニアウイルスのウェスタン・リザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ）株に基づいている。この株は高い神経毒性を持つので、ヒトおよび動物での使用にはあまり適していないことが知られている（非特許文献２）。これに対して、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）は例外的に安全であることが知られている。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で長期間にわたって連続継代することによって作製された（概要については非特許文献３、特許文献３を参照されたい）。ＭＶＡは、その弱毒化が著しいこと、すなわち良好な免疫原性を保ちながらも、毒力または感染力が低下していることを特徴とする。ワクチンとして有用な組換えＭＶＡは既に構築され、臨床試験で使用されている。特許文献４には、デングウイルス抗原をコードする１つ以上のＤＮＡ配列を含有し、それを発現させる能力を持つ組換えＭＶＡが開示されている。外来ＤＮＡ配列は、ＭＶＡゲノムの自然欠失部位を使って、ウイルスＤＮＡに組み込まれた。
【０００６】
安全で有効なポックスウイルスワクチンの作製を目指すもう１つのアプローチでは、アビポックスウイルス（例えばカナリア痘ウイルスおよび鶏痘ウイルス）を利用して抗原を発現させることにより、免疫応答を誘導する（特許文献５）。アビポックスウイルスはもともと宿主が限定されていて、鳥類種および鳥類細胞でしか増殖的には複製しない（非特許文献４）。ヒト細胞をアビポックスウイルスに感染されると、異種遺伝子がウイルスゲノムから発現させる。しかしアビポックスウイルスはヒト細胞中では複製せず、したがってヒトが増殖的ウイルス複製による危害を被る危険はない。レンチウイルス遺伝子産物（特許文献６）、サイトカイン及び(又は)腫瘍関連抗原（特許文献７）または狂犬病糖タンパク質Ｇ（非特許文献５）などを発現させる種々の組換えアビポックスウイルスが構築されている。４つのＨＩＶ遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｅｆを発現させる組換えカナリア痘ウイルスは、既に臨床試験で使用されている（非特許文献６）。
【０００７】
アビポックスウイルスは鳥類細胞でしか増殖的に複製しないので、ウイルスの複製および組換えウイルスの作製には、これらの細胞を使用する必要がある。残念なことに、鳥類細胞を使って得られるアビポックスウイルスの力価は、他のポックスウイルスと比較すると相対的に低く、そのため工業的規模で（組換え）アビポックスウイルスを大量に生産することは、他のポックスウイルスよりも困難である。
【特許文献１】欧州特許第８３２８６号明細書
【特許文献２】欧州特許第１１０３８５号明細書
【特許文献３】スイス特許第５６８３９２号明細書
【特許文献４】国際特許出願（ＷＯ）第９８／１３５００号明細書
【特許文献５】米国特許第６，３４０，４６２号明細書
【特許文献６】米国特許第５，７６６，５９８号明細書
【特許文献７】米国特許第５，８３３，９７５号明細書
【非特許文献１】Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．およびＭｏｓｓ，Ｂ．［１９８２］Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ７９，７４１５−７４１９、Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．，Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＭｏｓｓ，Ｂ．［１９８４］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２，３８３−４０７
【非特許文献２】Ｍｏｒｉｔａら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ５，６５−７０［１９８７］
【非特許文献３】Ｍａｙｒ，Ａ．，Ｈｏｃｈｓｔｅｉｎ−Ｍｉｎｔｚｅｌ，Ｖ．およびＳｔｉｃｋｌ，Ｈ．［１９７５］Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４
【非特許文献４】Ｔａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９５，１３：５３９−５４９
【非特許文献５】Ｔａｙｌｏｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９５，１３：５３９−５４９
【非特許文献６】Ｐｅｔｅｒｓ，Ｂ．Ｓ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００２，２０：６８８−７０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
力価が高いアビポックスウイルス、特に組換えアビポックスウイルスの生産を可能にする手段を提供して、ウイルスの大量生産、特に工業的規模での生産が可能になるようすることが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、アビポックスウイルスに増殖性感染した細胞で、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子を発現させる。これらワクシニアウイルス遺伝子の発現は、感染細胞から産生されるアビポックスウイルス力価の増加をもたらす。本発明の具体的一態様に関して実施例の項で詳述するように、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子（特にワクシニアウイルス遺伝子Ｃ７Ｌ）を発現させる組換えアビポックスウイルス（特にカナリア痘ウイルス）では、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子を持っていないアビポックスウイルスと比較して、鳥類細胞、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）でのウイルス力価が１０倍増加する。本組換えアビポックスウイルスからは宿主域遺伝子が発現されるが、ヒト細胞株での増殖は影響を受けない。すなわち、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子を発現させるアビポックスウイルスは、宿主域遺伝子を発現させないアビポックスウイルスと同じぐらい弱毒化されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
好ましい一態様によれば、本発明は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルスに関する。
【００１１】
「アビポックスウイルス」という用語は、任意のアビポックスウイルス、例えば鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、ジュンコ痘ウイルス（Ｕｎｃｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、マイナ痘ウイルス、鳩痘ウイルス、オウム痘ウイルス、ウズラ痘ウイルス、クジャク痘ウイルス、ペンギン痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルスおよび七面鳥痘ウイルスなどを指す。好ましいアビポックスウイルスはカナリア痘ウイルスおよび鶏痘ウイルスである。
【００１２】
カナリア痘ウイルスの一例はレンチュラー（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ）株である。ＡＬＶＡＣと呼ばれるプラーク精製されたカナリア痘ウイルス（米国特許第５，７６６，５９８号）は、ブダペスト条約の規定に基づいて、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に受託番号ＶＲ−２５４７として寄託されている。もう１つのカナリア痘ウイルス株は、ＬＦ２  ＣＥＰ  ５２４  ２４  １０  ７５と呼ばれる市販のカナリア痘ワクチン株であり、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手することができる。
【００１３】
鶏痘ウイルスの例にはＦＰ−１、ＦＰ−５およびＴＲＯＶＡＣ株がある（米国特許第５，７６６，５９８号）。ＦＰ−１は１日齢雛においてワクチンとして使用されるように改変されたＤｕｖｅｔｔｅ株である。該株は１９８０年１０月にＯ  ＤＣＥＰ  ２５／ＣＥＰ６７／２３０９と命名された市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手することができる。ＦＰ−５はニワトリ胚起源の市販の鶏痘ウイルスワクチン株であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｌｉｃｅｎｓｅ  Ｎｏ．１６５、ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．３０３２１）から入手することができる。
【００１４】
アビポックスウイルスのウイルスゲノムに含まれるワクシニアウイルス宿主域遺伝子はどの宿主域遺伝子でもよい。「ワクシニアウイルス宿主域遺伝子」という用語は、機能的な宿主遺伝子が存在しなければ複製することのできない種の細胞でワクシニアウイルスが複製する能力を持つためにワクシニアウイルスが必要とする遺伝子産物をコードしている遺伝子を指す。個々の宿主域遺伝子が欠失すると、ウイルス複製は、１動物種だけに由来する細胞に制限されうる。例えばワクシニアウイルス遺伝子Ｋ１Ｌ、Ｃ７ＬおよびＥ３Ｌが挙げられる。Ｋ１ＬまたはＣ７Ｌの発現はヒトＭＲＣ−５細胞におけるワクシニアウイルス複製を可能にすることが示されており、Ｅ３Ｌ遺伝子はサルＶｅｒｏ細胞およびヒトＨｅＬａ細胞におけるワクシニアウイルス複製に必要とされることが示されている（Ｗｙａｔｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９８，２５１：３３４−３４２）。
【００１５】
「ヒト細胞用のワクシニアウイルス宿主域遺伝子」という用語は、ヒト細胞におけるワクシニアウイルスの複製に必要とされる遺伝子を指す。
【００１６】
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子の例は、Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９３，１９６：３８１−４０１で使用されている命名法でいうところの遺伝子Ｃ１８Ｌ、Ｃ１７Ｌ、Ｃ７Ｌ、Ｋ１Ｌ、Ｅ３Ｌ、Ｂ４Ｒ、Ｂ２３ＲおよびＢ２４Ｒ、ならびにＷｙａｔｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９８，２５１：３３４−３４２に詳述されている遺伝子（ＣＨＯ）ｈｒおよびＳＰＩ−１である。好ましい宿主域遺伝子はヒト細胞用の宿主域遺伝子、例えばＥ３Ｌ、Ｋ１ＬおよびＣ７Ｌである。最も好ましいのはＣ７Ｌである。ＭＶＡのＣ７Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列を調節配列と共に図４に示し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として記載する。対応するアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載する。
【００１７】
「宿主域遺伝子の相同体」という用語は、ヌクレオチド配列のコード部分に、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を持つ遺伝子を指し、「宿主域遺伝子の相同体」は宿主域遺伝子の生物学的機能を持つ。宿主域遺伝子の生物学的機能および定義は上述のとおりである。ある遺伝子が宿主域遺伝子の生物学的機能を持つかどうかを決定するための個別試験は、当業者には知られている。特に、Ｗｙａｔｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９８，２５１：３３４−３４２、Ｐｅｒｋｕｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９０，１７９：２７６−２８６およびＧｉｌｌａｒｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９８５，５３：３１６−３１８が挙げられる。
【００１８】
本発明によれば、アビポックスウイルスのウイルスゲノムに含まれるワクシニアウイルス宿主域遺伝子は、機能的遺伝子である。本願で使用する「機能的遺伝子」という用語は、アビポックスウイルスに増殖性感染した細胞中で機能的であると共にそのアビポックスウイルス感染細胞における宿主域遺伝子の機能的な遺伝子産物の生成を可能にする調節要素を、宿主域遺伝子が含んでいるという意味に解釈すべきである。したがって、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子は細胞内で発現される。
【００１９】
「アビポックスウイルスに増殖性感染した細胞」という用語は、アビポックスウイルスの増殖及び(又は)組換えアビポックスウイルスの生成を可能にする細胞を指す。これらの細胞は好ましくは鳥類細胞であり、最も好ましくはＣＥＦ細胞である。その他、好ましい細胞は、ウズラ線維芽細胞株ＱＴ−３５（Ｃｏｗｅｎ，Ｂ．Ｓ．およびＢｒａｕｎｅ，Ｍ．Ｏ．，Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．１９８８；３２：２８２−２９７、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｉｎ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．１９８８；１０：６５−７６）またはカナリア胚細胞（第１３回国際ポックスウイルス・イリドウイルスシンポジウム（２０００年９月２〜６日フランス・モンペリエ）におけるＷｕｒｔｚ，Ｓ．，Ｂｏｎｎｅｔ−Ｐｉｒｏ，Ｅ．およびＢａｒｂａｎ，Ｖ．のポスターＰ４５、ならびにＷｕｒｔｚ，Ｓ．およびＢａｒｂａｎ，Ｖ．のポスターＰ９３）である。さらに、他の市販の鳥類細胞株がアビポックスウイルスの増殖に適しているかどうかを試すことは、当業者にとっては自明である。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手することができるそのような細胞株の例は、ウズラ線維芽細胞株ＱＴ６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１７０８）、ＱＭ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６２）、ＱＮＲ／Ｄ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３２）、ウズラ細胞株ＱＮＲ／Ｋ２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３３）、アヒル線維芽細胞株アヒル胚（Ｄｕｃｋ  ｅｍｂｒｙｏ）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１４１）、七面鳥リンパ芽球細胞株ＭＤＴＣ−ＰＲ１９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８１３５）、ニワトリ線維芽細胞株ＳＬ−２９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９０）およびＵＭＮＳＡＨ／ＤＦ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２２０３）、ならびにニワトリリンパ芽球細胞株ＤＴ４０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１１１）およびＤＴ９５（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１１２）である。
【００２０】
調節要素には、なかんずく、アビポックスウイルス感染鳥類細胞で活性であることが当業者に知られている適当なプロモーター／エンハンサーおよび終結シグナルが含まれる。そのようなプロモーター／エンハンサー要素の例は、ワクシニアウイルスプロモーターＰ７．５、ＰＨ５、Ｐ１１、合成強力プロモーターＰｓｙｎ（Ｒｉｎｇ，Ｃ．Ｊ．Ａ．およびＢｌａｉｒ，Ｅ．Ｄ．（編）「Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ（遺伝子改変ウイルス）」（Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｄｔ．，２００１、英国オックスフォード、ＩＳＢＮ  １  ８５９９６  １０３  ７）の１１０頁から始まる「Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ（ワクシニアウイルスプロモーター）」という章、Ａｍａｎｏ，Ｈ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９，２５６：２８０−２９０を参照されたい）、およびワクシニアウイルス宿主域遺伝子の自己プロモーターである。
【００２１】
Ｆａｎｇ，Ｚ．−Ｙ．ら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００１，２９１：２７２−２８４）には、ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｒｏ、ｇｐ１２０／ＴＭおよびＮｅｆ／Ｐｏｌポリエピトープストリングのための３つの発現カセットとＥ３Ｌ遺伝子の発現カセットとをウイルスゲノム中に含んでいる組換えカナリア痘ウイルスが開示されている。この組換え体のウイルスゲノムはワクシニアウイルスＫ３Ｌ遺伝子も含んでいる。ワクシニアウイルスのＥ３Ｌ遺伝子およびＫ３Ｌ遺伝子が存在しているので、感染ＨｅＬａ細胞でのアポトーシスは著しく減少し、感染細胞における抗原産生量が増加した。Ｆａｎｇらは、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子が組換えアビポックスウイルスの力価の増加に関係することを開示していない。したがって、本発明のアビポックスウイルスは、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルスである（ただし、当該アビポックスウイルスが（Ｉ）ＨＩＶ  ｇａｇ−ｐｒｏ、（ＩＩ）ｇｐ１２０／ＴＭおよび（ＩＩＩ）Ｎｅｆ／Ｐｏｌポリエピトープストリングのための発現カセットと、（ＩＶ）ワクシニアウイルスＫ３Ｌ遺伝子の発現カセットとをウイルスゲノム中に含んでいる組換えカナリア痘ウイルスである場合、前記宿主域遺伝子はＥ３Ｌ遺伝子ではないものとする）。さらにもう１つの態様として、本発明は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルス（ただし、当該アビポックスウイルスがワクシニアウイルスＫ３Ｌ遺伝子をウイルスゲノム中に含んでいる組換えカナリア痘ウイルスである場合、前記宿主域遺伝子はＥ３Ｌ遺伝子ではないものとする）に関する。
【００２２】
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域、ウイルスゲノムの遺伝子間領域、またはウイルスゲノムの欠失部位に挿入される。「非必須領域」は、鳥類細胞におけるウイルスゲノムの複製には必要でなく、感染性ウイルスの産生にも必要でない領域である。非必須領域は当業者には知られており、なかんずく米国特許第５，７６６，５９８号に開示されている。カナリア痘ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子への異種遺伝子の挿入はＡｍａｎｏ，Ｈ．らによって開示されている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９，２５６：２８０−２９０）。
【００２３】
ウイルス領域中の「遺伝子間領域」は、コード配列を含有せず、好ましくは調節要素も含有しない領域である。遺伝子間領域の位置は当業者には知られている（例えばＡｌｆｏｎｓｏ  Ｃ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ２０００，７４：３８１５−３８３１を参照されたい）。遺伝子間領域への挿入の一例を図３および実施例の項に示す。したがって、Ｔｋ遺伝子とそれに隣り合うＸ遺伝子との間の遺伝子間領域に宿主域遺伝子を挿入することは、特にカナリア痘ウイルスにとっては、好ましい態様である。
【００２４】
欠失部位とは、改変アビポックスウイルスのゲノムのうち、親アビポックスウイルスと比較して欠失している部分をいう。欠失部位は、野生型アビポックスウイルスゲノムから出発して、当業者に知られている方法を使って、生成させることができる。
【００２５】
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子を含んでいるアビポックスウイルスは、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子を唯一の異種遺伝子として含んでいる野生型ウイルスであってもよいし、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子を唯一の異種遺伝子として含んでいる弱毒化ウイルスであってもよいし、組換えアビポックスウイルス、すなわちワクシニアウイルス宿主域遺伝子の他にも異種遺伝子を含んでいる野生型または弱毒化ウイルスであってもよい。
【００２６】
「弱毒化ウイルス」は、病原性ウイルスから派生したウイルスであるが、宿主生物が感染した時の死亡率及び(又は)罹病率が、非弱毒化親ウイルスよりも低くなるウイルスである。弱毒化ポックスウイルスの例は当業者には知られている。弱毒化アビポックスウイルス株の例は、なかんずく、ＦＰ−１、ＡＬＶＡＣまたはＴＲＯＶＡＣである。
【００２７】
「組換えウイルス」という用語は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子に加えて、本来はウイルスゲノムの一部でない別の異種核酸も含んでいる任意のウイルスを指す。異種遺伝子には、例えば、治療遺伝子、免疫応答を誘導するために少なくとも１つのエピトープを含んでいるペプチドをコードする遺伝子、アンチセンス発現カセット、またはリボザイム遺伝子がありうる。
【００２８】
したがって、好ましい一態様によれば、本発明は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子をコードする配列に加えて、少なくとも１つの異種核酸配列をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルスに関し、その追加異種核酸配列は、好ましくは、少なくとも１つの抗原、抗原エピトープ及び(又は)治療化合物をコードする配列から選ばれる。
【００２９】
好ましい一態様として、本発明は、ワクチンとしての本発明のアビポックスウイルスに関する。「ワクチン」とは化合物、すなわち特異的免疫応答を誘導するベクターまたはウイルスである。
【００３０】
上記異種核酸は、好ましくは、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子に関して上で説明したウイルスゲノムの好ましい挿入部位に挿入される。したがって、異種核酸配列の好ましい挿入部位は、なかんずく、ウイルスゲノムの遺伝子間領域、欠失部位および非必須領域である。
【００３１】
アビポックスウイルスが非組換えウイルス、すなわちワクシニアウイルス宿主域遺伝子以外の異種遺伝子をウイルスゲノム中に持っていないアビポックスウイルスである場合は、そのアビポックスウイルスを使って、鳥類ポックスウイルス感染に対する予防接種を行うことができる。これは、獣医学分野では、例えば家禽の予防接種などに非常に重要である。この場合は、弱毒化アビポックスウイルスを使用することが好ましい。アビポックスウイルスが組換えウイルス、すなわちワクシニアウイルス宿主域遺伝子以外の異種遺伝子をウイルスゲノム中に持っているアビポックスウイルスである場合は、そのアビポックスウイルスを使って、鳥類ポックスウイルス感染に対する予防接種及び(又は)当該追加異種核酸がコードしているペプチド／タンパク質に対する免疫応答の誘導を行うことができる。この態様は、組換えアビポックスウイルスが哺乳動物（特にヒト）の予防接種に使用される場合には、とりわけ重要である。この場合、追加異種配列は、誘導しようとしている免疫応答の対象となる抗原を発現させることができる。そのような抗原の例は、なかんずく、腫瘍抗原、感染因子（ウイルス、細菌、真菌など）に由来する抗原、合成ポリエピトープストリングなどである。
【００３２】
予防接種は、本発明のアビポックスウイルスを、ヒを含む動物に投与することによって行われる。当業者は既知の方法で、投与様式、投与量および投与回数を最適化することができる。ポックスウイルスベクターの場合、最も好ましいのは、皮下投与または筋肉内投与である。
【００３３】
ワクチンを製造するには、本発明のウイルスを生理学的に許容できる形態に変換する。これは、天然痘の予防接種に用いられるポックスウイルスワクチンの製造における経験（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら［１９７４］Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２に記載されているもの）に基づいて行うことができる。例えば、精製ウイルスは、５×１０８  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、約１０ｍＭトリスおよび１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に製剤化して、−８０℃で保存される。ワクチン注射剤を製造するには、例えば２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のウイルス粒子１０２〜１０８個を、アンプル（好ましくはガラスアンプル）内で凍結乾燥する。あるいは、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスを段階的に凍結乾燥するによって製造することもできる。この製剤は、さらに、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンなどの添加剤、または、生体内投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくは組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の助剤も含むことができる。次に、ガラスアンプルを封止すると、４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。ただし、必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。予防接種を行うには、上記凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解することができ、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、筋肉内投与または当業者に知られる他の任意の投与経路によって投与する。
【００３４】
関連する一態様として、本発明は、ヒを含む動物の生体において、免疫応答に影響を及ぼす方法、好ましくは免疫応答を誘導する方法であって、処置すべき動物またはヒトに、本発明のアビポックスウイルス、本発明の薬学的調合物及び(又は)ワクチンを投与することを含む、上記方法に関する。好ましい一態様として、前記動物は免疫不全状態でありうる。免疫不全状態の動物には、その動物が増殖的ウイルス複製によって壊滅されることがないように、著しく弱毒化したウイルス株を使用することが好ましい。その動物が本ウイルスの自然宿主である場合（家禽はこれに当てはまる）は、特にそうであると言える。アビポックスウイルスはヒトでは複製しないので、本発明のアビポックスウイルスは、たとえ使用するウイルス株がその自然宿主に関して弱毒化された株でなかったとしても、ヒトではとりわけ安全である。
【００３５】
本発明のさらにもう１つの態様によれば、本発明は、本発明のアビポックスウイルスと、薬学的に許容し得る担体、希釈剤及び(又は)添加剤を含む薬学的調合物に関する。本薬学的調合物が、誘導すべき免疫応答の対象である抗原をコードする異種核酸をウイルスゲノム中に含有するアビポックスウイルスを含んでいる場合、その調合物は、実際にワクチンである。しかし異種核酸はこのタイプの配列に限定されるわけではなく、異種核酸は、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子などの自殺遺伝子、アンチセンスＲＮＡ遺伝子もしくはリボザイム遺伝子などの治療遺伝子、または治療上有益な他の任意の遺伝子でもありうる。後者の選択肢では、本発明のアビポックスウイルスは、疾患に対する予防接種を主たる目的とするのではなく疾患を処置することを目的としている薬学的調合物の一部でありうる。異種遺伝子が自殺遺伝子である場合は、本薬学的調合物を腫瘍に局所投与して、腫瘍細胞を組換えアビポックスウイルスに感染させることができる。次に、自殺遺伝子を腫瘍細胞内で発現させると、自殺遺伝子の各遺伝子産物に対応するプロドラッグ（例えば単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の場合はガンシクロビル）を投与することによって、腫瘍細胞を選択的に殺すことが可能になる。
【００３６】
一般に、本薬学的調合物及び(又は)本ワクチンは、許容できるかつ／または承認された医薬用の担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤及び(又は)安定剤を、１つ以上含みうる。そのような補助物質としては、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを挙げることができる。好適な担体は通例、巨大で緩徐に代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質集合体などである。
【００３７】
好ましい一態様によれば、本発明は、標的細胞中に相同及び(又は)異種核酸配列を導入する方法であって、標的細胞を本発明のアビポックスウイルスに感染させることを含む、上記方法に関する。この態様に関して、「異種」核酸および「相同」核酸とは、細胞ゲノムに対してそれぞれ異種および相同である核酸を指す。したがってこの態様では、「相同核酸」とは、コード領域に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチド配列相同性を持っている、細胞ゲノムに相同な配列、例えば細胞遺伝子またはその誘導体である。この態様では、「異種核酸」という用語は、細胞ゲノム中に相同体を持たない核酸を指す。そのような異種核酸の例は、ウイルス遺伝子、細菌遺伝子および真菌遺伝子である。標的細胞は、本発明のウイルスに感染させることができる細胞であればどの細胞でもよい。したがって、標的細胞は、ＣＥＦ細胞などの鳥類細胞であってもよいし、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞であってもよい。細胞は初代細胞であってもよいし、細胞株であってもよい。標的細胞は、生体外で培養される細胞（すなわち培養フラスコで培養される細胞）でもよく、生体の一部である細胞でもよい。細胞を感染させる方法は当業者には知られている。
【００３８】
さらに本発明は、ペプチド及び(又は)タンパク質を生産する方法であって、宿主細胞を本発明のアビポックスウイルスに感染させること、感染した宿主細胞を適切な条件下で培養すること、ウイルスゲノムから発現したペプチド及び(又は)タンパク質を単離及び(又は)濃縮することを含む、上記方法に関する。上記ペプチド／タンパク質はアビポックスウイルスタンパク質／ペプチドでありうる。アビポックスウイルスがウイルスゲノムに対して異種である核酸を発現させるのであれば、上記ペプチド／タンパク質は、その異種核酸から発現されるペプチド／タンパク質でもありうる。宿主細胞のタイプは、その細胞を本ウイルスに感染させることができ、単離すべきタンパク質／ペプチドがその細胞中でウイルスベクターから発現される限り、決定的な問題ではない。細胞は、本ウイルスが増殖的に複製する細胞であってもよいし、増殖的複製を促進しない細胞（例えばヒト細胞）であってもよい。
【００３９】
さらに本発明は、本発明のアビポックスウイルスを生産する方法、特に本発明のアビポックスウイルスを増幅させる方法であって、宿主細胞を本発明のアビポックスウイルスに感染させること、感染した宿主細胞を適切な条件下で培養すること、前記宿主細胞が産生するウイルスを単離及び(又は)濃縮することを含む、上記方法に関する。アビポックスウイルスを増幅させるには、そのウイルスの増殖的複製を可能にする細胞を感染させる必要がある。そのような細胞は当業者には知られており、例えば鳥類細胞、なかんずくＣＥＦ細胞が挙げられる。他の好適な細胞および細胞株は上に記載した。
【００４０】
さらに本発明は、本発明のアビポックスウイルスに感染した細胞に関する。これらの細胞は、アビポックスウイルスの増殖的複製を可能にする細胞、例えば鳥類細胞、特にＣＥＦ細胞であってもよいし、アビポックスウイルスに感染させることはできるが、ウイルスの複製を促進しない細胞、例えば初代ヒト細胞またはヒト細胞株などであってもよい。
【００４１】
本発明のアビポックスウイルスを取得する方法は、当業者には知られている（例えば米国特許第５，７６６，５９８号、第５，８３３，９７５号、第６，３４０，４６２号を参照されたい）。好ましい一態様として、そのような方法には、以下の工程が含まれうる。すなわち、第１工程では、アビポックスウイルスゲノムと、上に定義した宿主域遺伝子を含むＤＮＡ断片とを、そのウイルスが増殖的に複製できる細胞中に導入する。アビポックスウイルスゲノムは、上に定義した異種核酸を既に含んでいてもよい。アビポックスウイルスゲノムは、細胞を対応するアビポックスウイルスに感染させることにより、都合良く細胞中に導入される。上記ＤＮＡは、好ましくは、当業者に知られているトランスフェクション技術によって細胞に導入される。そのような技術には、リポフェクションや、リン酸カルシウム沈殿法などがある。細胞中に導入されるＤＮＡは、アビポックスウイルスのゲノムＤＮＡと特異的な組換えを起こす能力を持つことが好ましい。そこで、ウイルスゲノム中に挿入されるべき核酸には、ウイルスゲノムへの核酸の特異的組換えを指示するウイルス配列を隣接させる。隣接ウイルス配列のタイプに応じて、ウイルスゲノムのどの部分にでも、核酸を挿入することができる。挿入は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域、遺伝子間領域、または欠失部位に行う。
【００４２】
ウイルスゲノムと宿主域遺伝子を含むＤＮＡとを細胞に導入した後、第２工程では、宿主域遺伝子をウイルスゲノム中に含んでいるウイルス粒子を、これらの細胞から単離／濃縮する。ウイルス粒子を単離／濃縮する方法は当業者には知られている。これらの技術には、例えば、ウイルスゲノム中に導入される核酸配列内にマーカー遺伝子を使用することなどが含まれる。マーカー遺伝子が選択マーカー（例えば耐性遺伝子）である場合、選択圧下（例えば抗生物質の存在下）では、そのマーカーを含有する組換えウイルスだけが感染細胞中で複製する。これに代えて、またはこれに加えて、染色マーカー（例えば緑色蛍光タンパク質）も使用できよう。選択マーカーを使用すべきでない場合には、限界希釈及び(又は)プラーク精製を行った後、単離されたウイルスを異種核酸の存在に関してスクリーニングすることによって、組換えウイルスを単離し精製することができる。もちろんこれらの方法を組み合わせてもよい。
【００４３】
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子と少なくとも１つの追加異種核酸とを含んでいるアビポックスウイルスを取得する方法は、当業者には知られており、基本的には、上述した本発明のアビポックスウイルスを取得する方法と対応している。基本的には好ましい選択肢が３つある。すなわち、第１の選択肢では、少なくとも１つの追加異種配列を含んでいるＤＮＡと、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子をウイルスゲノム中に既に含んでいるアビポックスウイルスゲノムとを、前記ウイルスが増殖的に複製できる細胞に導入する。上述したように、ＤＮＡは、アビポックスウイルスのゲノムＤＮＡと特異的な組換えを起こす能力を持つＤＮＡであることが好ましい。次に、少なくとも１つの追加異種配列をウイルスゲノム中に含んでいるウイルス粒子を、これらの細胞から単離／濃縮する。第２の選択肢では、上に定義した宿主域遺伝子を含んでいるＤＮＡと、少なくとも１つの追加異種ヌクレオチド配列を既に保持しているアビポックスウイルスゲノムとを、前記ウイルスが増殖的に複製できる細胞に導入する。前記ＤＮＡは、アビポックスウイルスのゲノムＤＮＡと特異的な組換えを起こす能力を持っている。この場合も、次に、宿主域遺伝子をウイルスゲノム中に含んでいるウイルス粒子を、これらの細胞から単離／濃縮する。第３の選択肢では、アビポックスウイルスゲノムと、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子および追加異種核酸配列を含んでいるＤＮＡとを、細胞に導入する。ワクシニアウイルス宿主域遺伝子と追加異種核酸配列とは、１つのＤＮＡ分子中に含まれていてもよいし、または宿主域遺伝子と異種核酸分子は異なるＤＮＡ分子中に含まれていてもよい。これ以降の組換えウイルス作製工程は、上述のとおりである。
【００４４】
上述のように、本発明者らは、アビポックスウイルスに増殖性感染した細胞におけるワクシニアウイルス宿主域遺伝子の発現が、感染細胞から産生されるアビポックスウイルス力価の増加をもたらすことを示した。上記の態様では、アビポックスウイルスのウイルスゲノムに機能的なワクシニアウイルス宿主域遺伝子を組み込むことによって、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子の発現を達成した。この場合、宿主域遺伝子は、天然プロモーター配列、他の任意の適切なワクシニアウイルスプロモーター、またはアビポックスウイルス感染細胞中で機能する他の任意のプロモーターの調節を受ける。
【００４５】
しかし、機能的宿主域遺伝子が、アビポックスウイルスの増殖的複製を可能にする細胞によって供給される場合にも、同じ結果を得ることができる。ワクシニアウイルス宿主域遺伝子は、上に定義したどの宿主域遺伝子でもよい。好ましい宿主域遺伝子は、ワクシニアウイルス遺伝子Ｃ７Ｌ、Ｋ１ＬおよびＥ３Ｌを含む、ヒト細胞用のワクシニアウイルス宿主域遺伝子である。最も好ましいのはＣ７Ｌである。別段の表示がなければ、上記の定義は、ウイルス、プロモーター、遺伝子、用語の定義を含めて全て、以下の態様にも当てはまる。好ましい態様から最も好ましい態様の順序も、別段の表示がなければ、以下の項にも当てはまる。
【００４６】
したがって、この態様の第１の選択肢として、本発明は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体を含んでいる細胞であって、前記宿主域遺伝子がワクシニアウイルスゲノムの一部ではない細胞に関する。さらに本発明は、アビポックスウイルスに感染したこれらの細胞に関する。すなわち本発明は、さらに、アビポックスウイルスゲノムを含んでいる細胞に関する。細胞を感染させるために使用するアビポックスウイルス、または細胞に含まれるアビポックスウイルスのゲノムは、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子またはその相同体をウイルスゲノム中に含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。好ましくは、アビポックスウイルスゲノムを含んでいる細胞はワクシニアウイルス宿主域遺伝子またはその相同体を含み、しかも当該宿主域遺伝子またはその相同体は、ワクシニアウイルスゲノムの一部ではなく、アビポックスウイルスゲノムの一部でもない。
【００４７】
宿主域遺伝子は、好ましくは、上に定義した宿主域遺伝子またはその相同体、すなわち、好ましくはヒト細胞用の宿主域遺伝子、より好ましくはＥ３Ｌ、Ｃ７ＬおよびＫ１Ｌから選ばれる宿主域遺伝子である。
【００４８】
宿主域遺伝子は細胞ゲノムに組み込まれてもよい。細胞ゲノム中に外来遺伝子を含有する細胞株を作製する方法は、当業者に知られている。この態様では、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子を安定的に組み込ませる細胞として最も好ましいのは、鳥類細胞株（上記参照）、特にＱＴ３５細胞である。本発明によれば、細胞ゲノムに含まれるワクシニアウイルス宿主域遺伝子は、上に定義した機能的遺伝子である。
【００４９】
あるいは、宿主域遺伝子は、非組込みＤＮＡの一部であってもよい。非組込みＤＮＡは、細胞をアビポックスウイルスに感染させる前に、または細胞をアビポックスウイルスに感染させた後に、従来の技術によって細胞中に導入されたプラスミドＤＮＡでありうる。さらに、非組込みＤＮＡは、細胞ゲノムに組み込まれずに細胞内に留まる任意のＤＮＡであってもよい。そのような持続性非組込みＤＮＡの例は組換えウイルスゲノム、例えばヘルペスウイルスゲノムや、ヘルペスウイルスゲノム由来のベクターである。この態様では、細胞は、アビポックスウイルスの増殖的複製を可能にする任意の細胞（ＣＥＦ細胞などの初代細胞を含む）でありうる。
【００５０】
アビポックスウイルスは、組換えアビポックスウイルスを含めて、上に定義した任意のアビポックスウイルスでありうる。
【００５１】
この態様の第２の選択肢として、本発明は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体と、アビポックスウイルスゲノムとを含んでいる細胞に関する。この場合、前記宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体は、アビポックスウイルスゲノムの一部であってもよいし、アビポックスウイルスゲノムの一部でなくてもよい。別段の表示がなければ、定義、好ましい態様および好ましい態様から最も好ましい態様の順序は、上に示すこの態様の第１の選択肢のものと一致する。特に、宿主域遺伝子は、細胞ゲノムに挿入されていてもよいし、非組込みＤＮＡの一部であってもよい。しかし、この態様の第１の選択肢に加えて、第２の選択肢には、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子またはその相同体がワクシニアウイルスゲノムの一部であるという可能性も含まれる。したがって、本発明は、アビポックスウイルスゲノムとワクシニアウイルスゲノムとを含んでいる細胞であって、前記ワクシニアウイルスゲノムが少なくとも１つのワクシニアウイルス宿主域遺伝子、特に上に定義した好ましい宿主域遺伝子の少なくとも１つを含んでいる細胞にも関する。ワクシニアウイルス宿主域遺伝子が発現されて、アビポックスウイルスの複製に対してプラスの効果を発揮することにより、ワクシニアウイルスゲノムを含んでいない細胞と比較して、前記細胞から産生されるアビポックスウイルスの量が増加する。
【００５２】
ワクシニアウイルスゲノムとアビポックスウイルスゲノムとを含んでいる細胞は、適切な細胞をワクシニアウイルスとアビポックスウイルスの両方に感染させることによって、容易に得ることができる。感染細胞がワクシニアウイルスの増殖的複製もアビポックスウイルスの増殖的複製も共に可能にする場合は、同時感染の結果として、両ウイルスの混合物が得られる。ほとんどの用途には、ワクシニアウイルスが混入していないアビポックスウイルス調製物を得ることが望ましい。そのようなワクシニアウイルス非含有調製物を得るには、細胞に感染するがその細胞内では増殖的に複製しない特殊なワクシニアウイルス株を使用するか、またはアビポックスウイルスの増殖的複製は可能にするがワクシニアウイルスの増殖的複製は可能にしない特殊な細胞または細胞株を使用することができる。
【００５３】
上に定義した細胞は、本発明のどちらの選択肢によるものでも、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体を含んでいる細胞をアビポックスウイルスに感染させることを特徴とするアビポックスウイルスの増幅方法に使用することができる。細胞を培養し、その細胞によって産生されたウイルス粒子を単離／濃縮する。あるいは、細胞にアビポックスウイルスを導入してから、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子を導入するか、またはアビポックスウイルスとワクシニアウイルス宿主域遺伝子とを同時に導入することもできる。アビポックスウイルスは上に定義したどのポックスウイルスでもよく、より具体的には、ウイルスゲノム中にワクシニアウイルス宿主域遺伝子を持っていない野生型アビポックスウイルス、弱毒化アビポックスウイルスもしくは組換えアビポックスウイルス、またはウイルスゲノム中にワクシニアウイルス宿主域遺伝子を持っている野生型アビポックスウイルス、弱毒化アビポックスウイルスもしくは組換えアビポックスウイルスのどれでもよい。
【００５４】
さらに、本発明は、アビポックスウイルスによる鳥類細胞の感染後にその細胞から産生されるアビポックスウイルスの力価を増加させることを目的とする、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子またはその相同体の使用であって、前記宿主域遺伝子が前記細胞内で発現される、上記使用方法に関する。
【００５５】
さらに本発明は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体を含んでいる細胞をアビポックスウイルスに感染させることにより、鳥類細胞から産生されるアビポックスウイルスの力価を増加させる方法に関する。
【００５６】
図面の簡単な説明
図１：組込みベクターｐＢＮＣａＰＶＸ０６のプラスミド地図。
【００５７】
このプラスミドは、カナリア痘ウイルスゲノムに対して相同な領域を２つ持っている（Ｆｌａｎｋ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に相当）とＦｌａｎｋ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に相当））。これらの配列により、Ｆｌａｎｋ１とＦｌａｎｋ２との間に位置する配列は、ウイルスゲノムの対応する位置への相同組換えを起こすように指示される。カナリア痘ウイルスゲノムへの組込み部位は、ＴＫ遺伝子（チミジンキナーゼ遺伝子）とＣａ．Ｘと呼ばれる機能未知の遺伝子との間に位置する（図３参照）。ＮＰＴＩＩ＝ネオマイシン耐性遺伝子（ワクシニアウイルス強力合成プロモーターであるＰＳプロモーターから発現）、ＩＲＥＳ＝内部リボソーム結合部位、ＥＧＦＰ＝強化緑色蛍光タンパク質、ＢｓａＩ＝ＢｓａＩの制限酵素認識部位、ｐｒＴ３＝プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）由来のＴ３プロモーター配列、ｐｒＴ７＝プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ｐＢＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）由来のＴ７プロモーター配列。本明細書では、ｐＢＮＣａＰＶＸ０６という名称とｐＢＮＸＣａＰＶ０６という名称とは互換的に使用され、同じプラスミドを表す。
【００５８】
図２：組込みベクターｐＢＮＣａＰＶ０８プラスミド地図。
【００５９】
このプラスミドは基本的には図１の説明文で説明したｐＢＮＣａＰＶＸ０６と対応している。ｐＢＮＣａＰＶ０８には、天然のＣ７Ｌプロモーターから発現されるＭＶＡ（改変ワクシニアアンカラ）由来のＣ７Ｌ遺伝子が追加されている（図４参照）。ＭＶＡ由来のＣ７Ｌ遺伝子はワクシニアウイルス中のＣ７Ｌ遺伝子と同じヌクレオチド配列を示す。
【００６０】
図３：ワクシニアウイルス宿主域遺伝子の挿入に使用したカナリア痘ウイルスゲノムの遺伝子間領域の概要図。
【００６１】
Ｃａ．６、Ｃａ．５、Ｃａ．Ｘ、Ｃａ．３：それぞれカナリア痘ウイルス遺伝子６、５、Ｘおよび３。Ｃａ．ＴＫ：カナリア痘ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子。Ｆｌａｎｋ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）は、Ｃａ．６遺伝子の一部、Ｃａ．５遺伝子全体およびＣａ．ＴＫ遺伝子全体を含んでいるＤＮＡ断片である。Ｆｌａｎｋ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は、Ｃａ．Ｘ遺伝子全体とＣａ．３遺伝子の一部とを含んでいるＤＮＡ断片である。
【００６２】
図４：ＭＶＡ（改変ワクシニアアンカラ）のＣ７Ｌ領域の配列。
【００６３】
この配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相当する。
【００６４】
図５：組換えカナリア痘ウイルスｃａｎＢＮＸ０１およびｃａｎＢＮ０１のＰＣＲ産物。
【００６５】
図５Ａ：０．８％アガロースゲルに現れたｃａｎＢＮＸ０１のＰＣＲ産物。レーン１：１００ｂｐマーカー、レーン２：１ｋｂマーカー、レーン３〜５：種々のｃａｎＢＮＸ０１分離株、レーン６：ＣａＰＶ野生型、レーン７：ｐＢＮＣａＰＶＸ０６、レーン８：水対照。
【００６６】
図５Ｂ：０．８％アガロースゲルに現れたｃａｎＢＮ０１のＰＣＲ産物。レーン１：１００ｂｐマーカー、レーン２〜４：種々のｃａｎＢＮ０１分離株、レーン５：水対照、レーン６：ｐＢＮＣａＰＶ０８、レーン７：ＣａＰＶ野生型。
【００６７】
図６：さまざまな細胞株での組換えＣａＰＶの多段階増殖曲線。
【００６８】
細胞株ＢＨＫ−２１、Ｖｅｒｏ、１４３Ｂ、ＨａＣａＴ、ＨｅｌａおよびＭＲＣ−５ならびにＣＥＦ細胞におけるｃａｎＢＮＸ０１（マーカー遺伝子カセッを含むが、ワクシニアウイルスＣ７Ｌ遺伝子を含んでいない組換えＣａＰＶ）とｃａｎＢＮ０１（Ｃ７Ｌ遺伝子とマーカー遺伝子とを発現させる組換えＣａＰＶ）の増殖。ウイルス増幅（６穴プレートでの投入レベルに対するウイルス収量の増加倍率）は、９６時間後のウイルス収量を投入量５×１０４（ｍｏｉ  ０．０５）で割ることによって決定した。１．０という比は産生量＝投入量であることを意味する。これらの比は３つの実験の平均値を表す。標準誤差をバーで示す。
【００６９】
図７：Ｆｌａｎｋ１（Ａ部分、上側）およびＦｌａｎｋ２（Ｂ部分、下側）のヌクレオチド配列。
【実施例】
【００７０】
例１：  組換えカナリア痘ウイルスｃａｎＢＮＸ０１（ｐＳ  ＮＰＴＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ）およびｃａｎＢＮＯ１（ｐＳ  ＮＰＴＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ  Ｃ７Ｌ−ＭＶＡ）の構築
（概要）
この実施例では、ＮＰＴＩＩ（ネオマイシン耐性遺伝子）およびＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）選択を使った組換えカナリア痘ウイルスの作製について説明する。ワクシニアウイルス宿主域遺伝子Ｃ７Ｌを、カナリア痘ウイルスの遺伝子間領域に相同組換えによってクローニングした。２回のプラーク精製（ＰＰ）後に、検出可能な野生型ウイルスは存在せず、組換えウイルスだけが存在した。組込み領域の配列決定により、組込みが正しく起こっていて、突然変異も存在しないことがわかった。ＲＴ−ＰＣＲにより、組み込まれた遺伝子、すなわち改変ワクシニアアンカラ由来のＣ７Ｌ遺伝子およびマーカー遺伝子カセットがうまく発現していることが示された。この組換えウイルスはＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）の選択圧がなくても、継代第２０代までは安定であることが示された。
（序論）
この実施例の目的は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子Ｃ７Ｌとマーカーカセットとを発現させる組換えカナリア痘ウイルス（ｃａｎＢＮ０１）およびマーカーカセットだけを発現させる組換えカナリア痘ウイルス（ｃａｎＢＮＸ０１）を構築することだった。そこで、組込みベクターｐＢＮＣａＰＶＸ０６（図１参照）およびｐＢＮＸＣａＰＶ０８（図２参照）をクローニングした。これらの組込みベクターはどちらも、カナリア痘ウイルスゲノムに相同な２つの隣接配列、マーカーカセット（ＮＰＴＩＩ＝ネオマイシン耐性、ＩＲＥＳ＝内部リボソーム結合部位、ＥＧＦＰ＝強化緑色蛍光タンパク質）を持ち、ｐＢＮＣａＰＶ０８はさらに、天然のＣ７Ｌプロモーターによって発現されるＭＶＡ（改変ワクシニアアンカラ）由来のＣ７Ｌも持っている（図４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１参照）。ＭＶＡ由来のＣ７Ｌはワクシニアウイルス中のＣ７Ｌと同じヌクレオチド配列を示す。マーカーカセットはＰＳプロモーター（ワクシニア強力合成プロモーター）によって発現される。カナリア痘ウイルスへの組込み部位は、ＴＫ遺伝子（チミジンキナーゼ）と機能未知のＣａ．Ｘと呼ばれる遺伝子との間に位置する（図３参照）。
（材料）
【００７１】
【表１】
2005534326.tif 000003
【００７２】
（方法および結果）
１．相同組換え（ＨＲ）
制限酵素ＢｓａＩによるプラスミドｐＢＮＣａＰＶ０９およびｐＢＮＣａＰＶＸ０６（図１および図２参照）の線状化を５０℃で一晩行った（プラスミド主鎖の切断）。消化物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、５０μｌのＨ２Ｏで溶出させた。
【００７３】
ＲＰＭＩ  １０％ＦＣＳを使ってＣＥＦ細胞を６穴プレートに播種した。翌日、６０〜８０％コンフルエントの細胞を、ＣａＰＶ粗製ストックに、それぞれ０．１および０．０１のｍｏｉで感染させた。３７℃で１時間放置して感染させた後、ウイルス懸濁液を除去し、細胞をＲＰＭＩで洗浄し、１．６ｍｌのＲＰＭＩ  ２％ＦＣＳを加えた。
【００７４】
トランスフェクションには、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、その取扱説明書に従って行った。すなわち、線状化したプラスミド（５０μｌ）を８０μｌの緩衝液ＥＣと混合し、８μｌのエンハンサーを加えた。その溶液を混合し、室温にて５分間放置した。次に、２５μｌのＥｆｆｅｃｔｅｎｅを加えて混合し、室温にて１０分間放置した。最後に６００μｌのＲＰＭＩ  ２％ＦＣＳを加えて、細胞上に移した。トランスフェクションは蛍光が検出可能になるまで３７℃で４日間放置して行った。ｍｏｉ  ０．１での感染の方が、より明瞭な蛍光を検出できるので有効であるようだった。プレートを３回凍結／融解し、最後に−２０℃で凍結させた。
【００７５】
２．継代およびプラーク精製：
上述したように、組換えカナリア痘ウイルスの作製に使用されるプラスミドは、ネオマイシン耐性遺伝子を持っている。したがって、細胞培養培地にＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）を２００μｇ／ｍｌの濃度で添加することによって組換えウイルスを選択することができる。
（粗製ウイルスストックｃａｎＢＮＸ０１の調製）
トランスフェクション／感染（上記参照）後に、得られたウイルス含有懸濁液を、６穴プレート中で選択圧を受けている新鮮ＣＥＦ細胞に加えた。蛍光プラークが得られた細胞の上清を使って、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）の選択圧下で限界希釈を行うと共に、緑色蛍光タンパク質を発現する細胞／プラークのスクリーニングを行うことにより、組換えウイルスを精製した。組換えウイルスの生成をＰＣＲスクリーニングによって確認した。またこれにより、残存している野生型の混入も検出することできた。野生型の混入がＰＣＲによって検出できなくなるまで、プラーク精製工程を繰り返した。野生型が混入していないｃａｎＢＮＣａＰＶＸ０１の陽性クローンが検出された３つのウェルの上清１００μｌを使って、ほぼコンフルエントなＣＥＦ細胞のＴ２５フラスコを感染させた。培地にはＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）を加えておいた。３７℃で３日間のインキュベーション後に、陽性の蛍光とＣＰＥを検出することができた。フラスコを３回凍結／融解し、粗製ストックを採取した（Ｐ７＝継代第７代）。そのうち２００μｌをＰＣＲ分析用に採取した。残りの材料は−２０℃で凍結した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）による選択圧の存在下および不在下で、以下の３回の継代をＣＥＦ細胞のＴ２５フラスコで行った。作業用粗製ストック（Ｐ１１）をＣＥＦ細胞のＴ１７５フラスコ（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）有りおよび無し）で調製した。これらの継代後に、組換えウイルスは、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）を加えずに継代を行った場合でさえ、野生型が混入せず安定であることが示された。
（粗製ウイルスストックｃａｎＢＮ０１の調製）
ｃａｎＢＮＣａＰＶ０１の陽性クローンが検出された３つのウェルの上清１００μｌを使って、ほぼコンフルエントなＣＥＦ細胞のＴ２５フラスコを感染させた。さらなる精製は上述と同じ方法で行った。
【００７６】
３．組換えウイルスおよび野生型のＰＣＲ分析
ＤＮＡ：５．０μｌ
Ｈ２Ｏ：２．９５μｌ
１０倍緩衝液：１．０μｌ
ｄＮＴＰ：０．２μｌ
プライマー＃４８７：０．４μｌ
プライマー＃４８８：０．４μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ：０．０５μｌ
（ＰＣＲ条件）：
９４℃、５分；９４℃、３０秒；５３℃、３０秒；６８°、３分；３５サイクル；６８℃、７分；４℃で維持。
（対照）：
ｐＢＮＣａＰＶＸ０６およびｐＢＮＣａＰＶ０８（組込みに使用したプラスミド）
カナリア痘ウイルス（ＣａＰＶ）由来のＤＮＡ（野生型の対照）
水対照
（予想されるＰＣＲ産物のサイズ）
ｐＢＮＣａＰＶＸ０６および組換えウイルス（ｃａｎＢＮＸ０１）：２７３４ｂｐ
ｐＢＮＣａＰＶ０８および組換えウイルス（ｃａｎＢＮＸ０１）：３４６１ｂｐ
ＣａＰＶ：４３６ｂｐ
ＰＣＲ分析（図５Ａおよび図５Ｂ）により、組換えウイルスが産生されることと、精製ウイルスが投入した野生型ウイルスを含まないことが明確に実証された。
【００７７】
４．挿入された遺伝子の配列決定
配列決定は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ配列決定装置で、製造者の指示に従って行った。配列決定には、プライマー＃４８７、＃４８８およびＥｘｐａｎｄポリメラーゼで生成したＰＣＲ産物を使用した。このＰＣＲ産物は、組込み隣接配列（Ｆ１、Ｆ１）の一部と、ＮＰＴＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ領域およびＣ７Ｌ領域の全体とを含んでいる。予想どおりの配列を確認することができた。
【００７８】
５．粗製ストックｃａｎＢＮＸ０１およびｃａｎＢＮ０１Ｐ１１の力価測定
ウイルス力価を二重の力価測定で決定し、平均力価を計算したところ、次のとおりだった：
ｃａｎＢＮＸ０１＋Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）：４．９×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ
ｃａｎＢＮＸ０１［Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）なし］：３．７×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ
ｃａｎＢＮ０１＋Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）：１．３×１０７  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ
ｃａｎＢＮ０１［Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）なし］：２．２×１０６  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ。
【００７９】
６．発現試験としてのＲＴ−ＰＣＲ
６．１  ＲＮＡ調製
ＣＥＦ細胞を６穴プレートに播種し（１ウェルあたり５×１０５細胞、ＤＭＥＭ  １０％ＦＣＳ）、翌日、１００μｌのｃａｎＢＮＸ０１およびｃａｎＢＮ０１に、それぞれ感染させた。感染は、蛍光が検出可能になるまで２日間放置することによって行った。ＲＮＡ抽出は、Ｒｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、製造者の指示に従って行った。ＲＮＡ濃度をＯＤによって測定した。
【００８０】
６．２  ＲＴ−ＰＣＲのためのＤＮアーゼ消化
ＲＮＡ：２５μｌ
ＤＮアーゼ（ＲＮアーゼフリー）：３μｌ
１０×緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ）：５μｌ
Ｈ２Ｏ（ＲＮアーゼフリー）：５０μｌまで
３７℃で９０分。
【００８１】
ＲＮＡ浄化のためのＲｎｅａｓｙミニプロトコール（Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ）を使って消化物を浄化し、ＲＮＡ濃度をＯＤで測定した。
【００８２】
６．３  逆転写酵素
ＲＮＡとプライマー＃５０４（ｃａｎＢＮＸ０８用）または＃４９８（ｃａｎＢＮ０１用）とを、ＲＮＡ  ２μｇ対プライマー１μｇの比率で混合した。水（ＲＮアーゼフリー）を総液量が１０μｌになるまで加えた。その混合物を７０℃で５分間放置した後、氷上でインキュベートした。
【００８３】
以下の試薬類を加えた：
５×緩衝液：５μｌ
ｄＮＴＰ：５μｌ
Ｒｎａｓｉｎ：０．５μｌ
Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ：２μｌ
Ｈ２Ｏ（ＲＮアーゼフリー）：２．５μｌ
４２℃で６０分。
【００８４】
ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってＲＴを浄化した。
【００８５】
６．４  ＰＣＲ（Ｔａｑ  Ｒｏｃｈｅ）
ＤＮＡ：５μｌ
１０×緩衝液：５μｌ
ｄＮＴＰ：１μｌ
プライマー１：２μｌ
プライマー２：２μｌ
Ｔａｑ（Ｒｏｃｈｅ）：１μｌ。
（ＰＣＲ条件）：
９４℃、５分；９４℃、３０秒；５８℃、３０秒；６８℃、２分３０秒；３０サイクル；６８℃、７分；４℃を維持。
【００８６】
試料：ＲＴ−ＰＣＲ前のＲＮＡ（混入したＤＮＡを検出するため）
ＲＴ−ＰＣＲおよび浄化後のＲＮＡ
対照：ｐＢＮＣａＰＶＸ０６およびｐＢＮＣａＰＶ０８（陽性対照）
プライマー：ｃａｎＢＮＸ０１には＃５０５、＃５０６
ｃａｎＢＮ０１には＃４９６、＃４９７
予想されるＰＣＲ産物のサイズ：
ｐＢＮＣａＰＶＸ０６および組換えウイルス（ｃａｎＢＮＸ０１）：２１８８ｂｐ
ｐＢＮＣａＰＶ０８および組換えウイルス（ｃａｎＢＮ０１）：４２８ｂｐ。
【００８７】
挿入された遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲで陽性として確認することができた。
（結論）
上述した方法を使って、ワクシニアウイルスＣ７Ｌ遺伝子を含んでいる組換えカナリア痘ウイルスを構築することができた。このＣ７Ｌ遺伝子はＭＶＡ（改変ワクシニアアンカラ）に由来し、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株中のＣ７Ｌ遺伝子と同じヌクレオチド配列を示す。２回のプラーク精製後に検出可能な野生型ウイルスは存在しなかったので、上記の選択方法は極めて有効であることが示された。挿入された遺伝子と両脇の隣接配列の一部とを配列決定したが、機能に影響を及ぼす突然変異は示さなかった。ＲＴ−ＰＣＲにより、天然プロモーターの調節を受けるワクシニア宿主域遺伝子Ｃ７Ｌの発現が示された。
【００８８】
例２
組換えカナリア痘ウイルスｃａｎＢＮＸ０１（ｐＳ  ＮＰＴＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ）およびｃａｎＢＮ０１（ｐＳ  ＮＰＴＩＩ  ＩＲＥＳ  ＥＧＦＰ  Ｃ７Ｌ−ＭＶＡ）の多段階増殖曲線解析
（概要）
この実施例の目的は、天然プロモーターの調節を受けるヒト（組織培養）宿主域遺伝子Ｃ７Ｌを発現させる組換えカナリア痘ウイルスの複製を、いくつかの細胞株での多段階増殖曲線で調べることだった。多段階増殖曲線とは、感染を低いｍｏｉ（感染の多重度）で行うことを意味し、これによりウイルスの伝播と複製を調べることが可能になる。その結果から、組換えカナリア痘ウイルスはＣＥＦ細胞での増殖性が向上していて、マーカーカセットだけを発現させる対照ウイルスの力価よりも１ｌｏｇ高い力価をもたらすことがわかる。いくつかの哺乳類細胞株（ヒト、サルおよびウサギ細胞株）での複製特性は依然として影響を受けていない。これは組換えウイルスが対照ウイルスと同程度に弱毒化されているらしいことを意味する。
（序論）
この実施例では、Ｃ７Ｌを発現させる組換えカナリア痘ウイルス（ｃａｎＢＮ０１；クローニングの詳細については実施例１を参照されたい）およびＣ７Ｌ遺伝子を発現させない対照ウイルス（ｃａｎＢＮ０１；実施例１参照）の様々な細胞株または初代細胞における増殖能を評価する。使用する細胞株／細胞は、カナリア痘ウイルスに対して許容性である細胞、例えばＣＥＦ細胞と、カナリア痘ウイルスに対して非許容性である細胞株、例えばＢＨＫ−２１、Ｖｅｒｏ、１４３Ｂ、ＨａＣａＴ、Ｈｅｌａ、ＭＲＣ−５およびＲＫ−１３細胞である。カナリア痘ウイルスは、初代ＣＥＦ細胞をはじめとする鳥類細胞でしか増殖しないという厳密な制約を持つことが知られている（Ｅｓｐｏｓｉｔｏら、１９９１；Ｐｌｏｔｋｉｎら、１９９５；Ｔａｙｌｏｒら、１９９５）。残念なことに、そのウイルス力価は、他のポックスウイルス（例えばＭＶＡなど）と比較すると相対的に低い。そこで、ヒトワクシニアウイルス宿主域遺伝子Ｃ７Ｌ（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９０；Ｏｇｕｉｕｒａら、１９９３）を発現させる組換えカナリア痘ウイルスの増殖特性を、ＣＥＦ細胞で評価し、組換えウイルスが依然として哺乳類細胞株では複製することができないかどうかを調べた。
（材料）
細胞株：
ＣＥＦ：ニワトリ胚線維芽細胞、初代細胞
ＢＨＫ−２１：ベビーハムスター腎細胞、線維芽細胞株
Ｖｅｒｏ：アフリカミドリザル腎細胞、線維芽細胞株
１４３Ｂ：ヒト骨肉腫細胞株、ＴＫ−
ＨａＣａＴ：ヒト角化細胞株
Ｈｅｌａ：ヒト子宮頚部癌細胞株、上皮
ＭＲＣ−５：ヒト肺細胞株、線維芽細胞
ＲＫ−１３：ウサギ腎細胞株、上皮
細胞はすべてＤＭＥＭ  １０％ＦＣＳで培養する。
【００８９】
ウイルス：
ｃａｎＢＮＸ０１、マーカーカセット（ＮＰＴＩＩ、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰ；ｐＳ強力合成プロモーターによって調節される）だけを発現させる組換えカナリア痘ウイルス
ｃａｎＢＮ０１、マーカーカセット（ＮＰＴＩＩ、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰ；ｐＳ強力合成プロモーターによって調節される）と天然プロモーターによって調節されるＭＶＡ由来のＣ７Ｌとを発現させる組換えカナリア痘ウイルス。
【００９０】
細胞培養培地：ＤＭＥＭ＋２％ＦＣＳ
ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）
ＦＣＳ（ＰＡＡ）
他の試薬：ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）、抗生物質−抗真菌物質（Ｇｉｂｃｏ）、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、トリプシンＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ）、固定液：アセトン／メタノール１：１、インキュベーション溶液：ＰＢＳ＋３％ＦＣＳ、抗ＣａＰＶ血清（モルモット＃４３３／１）、抗モルモットＩｇＧ−ＰＯＤ（Ｓｉｇｍａ）、染色液：ＰＢＳ＋ＴＭＢ（Ｓｅｒａｍｕｎ）１：１。
【００９１】
（方法：６穴プレートにおける種々の細胞株の感染）
各細胞株を、両ウイルスのそれぞれについて３枚の６穴組織培養皿で、ほぼコンフルエントまで成長させた。その細胞単層を、各ウェルにつき５００μｌのＤＭＥＭ中、合計５×１０４  ＴＣＩＤ５０／ｍｌを使って、約０．０５のｍｏｉ（感染の多重度）で感染させた。３７℃で１時間放置して感染させた後、未吸着ウイルスを除去するために細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、１０００μｌのＤＭＥＭ  ２％ＦＣＳにて３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートした。感染後に細胞を培地中に掻き落とし、細胞＋培地を３回凍結融解して、細胞からウイルスを遊離させた。これらのウイルス抽出物の力価をＣＥＦ細胞で測定した。
（ＣａＰＶの力価測定（カナリア痘ウイルス特異的抗血清による免疫染色））
力価測定をＣＥＦ細胞で行った。簡単に述べると、試験細胞（ＣＥＦ）を、ＲＰＭＩ  １％抗生物質／抗真菌物質７％ＦＣＳ中、１×１０４細胞／ウェルの濃度で、９６穴プレートに播種し、３７℃にて５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。試験試料は既に３回凍結／融解されており、ＲＰＭＩ培地を使って、１０−１〜１０−１２の希釈液を調製した。ウイルス希釈液を試験細胞に分配し、３７℃にて５％ＣＯ２で５日間インキュベートして、ＣＰＥを発生させた。試験細胞を１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、インキュベーション緩衝液で１：１０００希釈したカナリア痘ウイルス特異的ポリクローナル抗血清と共に、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、インキュベーション緩衝液で１：１０００希釈したＨＰＲ結合抗モルモット抗体を、室温で１時間加えた。細胞を再びＰＢＳで２回洗浄し、青色のスポットが見えるようになるまで（１５分）、染色液と共にインキュベートした。染色液を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。褐色のスポットを呈する各ウェルはＣＰＥに関して陽性であるとして印を付け、Ｋａｅｂｅｒの式を使って力価を計算した（ＴＣＩＤ５０に基づくアッセイ）（Ｋａｅｒｂｅｒ，Ｇ．１９３１．Ａｒｃｈ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ．１６２，４８０）。
（結果）
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子Ｃ７Ｌを発現させる組換えカナリア痘ウイルスを使って、三つ組にしたＣＥＦ、ＢＨＬ−２１、Ｖｅｒｏ、１４３Ｂ、ＨａＣａＴ、Ｈｅｌａ、ＭＲＣ−５およびＲＫ−１３細胞を、低い感染多重度（ｍｏｉ  ０．０５）で感染させた。感染後にウイルス接種物を除去し、未吸着の遊離ウイルス粒子を除去するために細胞を２回洗浄した。次に、４日間放置して感染させ、ウイルス抽出物を調製し、ＣＥＦ細胞で力価を測定した。図６は、それらの６穴プレートについて産生量／投入量の比をプロットしたものである（産生量とは４日後の総ウイルス産生量を意味し、投入量とは最初の感染に使用したウイルスの量を意味する）。これらの比はさまざまな細胞タイプにおけるウイルス増幅度の明確な指標になる。
【００９２】
はっきりわかるように、Ｃ７Ｌを発現させる組換えカナリア痘ウイルス（ｃａｎＢＮ０１）は、ＣＥＦ細胞で、対照ウイルス（ｃａｎＢＮＸ０１）よりも約１０倍高い力価を示す。これは力価が約１ｌｏｇ増加したことを意味する。
【００９３】
試験した全ての哺乳類細胞株で起こった増幅のレベル（投入量に対して１００〜１０００分の１に減少）と比較すると、ｃａｎＢＮ０１は試験した細胞株ではその増殖が厳しく制限されているようである。ワクシニアウイルスヒト宿主域遺伝子の発現は、哺乳類細胞株でのカナリア痘ウイルスの複製に影響を及ぼさないようである。試験した細胞株ではｃａｎＢＮ０１の細胞間伝播による増幅を検出できないということを、図６は明瞭に示している。
（結論）
ワクシニアウイルスヒト宿主域遺伝子Ｃ７Ｌ（ＭＶＡ（改変ワクシニアアンカラ）由来）がその天然プロモーターの調節を受けて発現するようにするカナリア痘ウイルスの遺伝子工学は、ＣＥＦ細胞でのウイルス力価を増加させるのに有用である。カナリア痘ウイルスは、増殖しても力価は比較的低く、他のポックスウイルス（例えばＭＶＡ）と比べると増殖速度も遅いことが知られている。したがって、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子は、一連の哺乳類細胞に対する弱毒化された複製特性に影響を及ぼさずにカナリア痘ウイルスの産生量を増加させるための、優れた道具である。
【００９４】
例２の参考文献）
Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｊ．Ｊ．ら：Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．（１９９１）２，７９−１０２．
Ｏｇｕｉｒｕａ，Ｎ．ら：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）７４，１４０９−１４１３．
Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．ら：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９，２７６−２８６．
Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．ら：Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ．Ｂａｓｅｌ，Ｋａｒｇｅｒ（１９９５）Ｖｏｌ．８４，１６５−１７０．
Ｔａｙｌｏｒ，Ｊ．ら：Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．６，４３９−５４９．
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、組込みベクターｐＢＮＣａＰＶＸ０６のプラスミド地図を示す。
【図２】図２は、組込みベクターｐＢＮＣａＰＶ０８プラスミド地図を示す。
【図３】図３は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子の挿入に使用したカナリア痘ウイルスゲノムの遺伝子間領域の概要図を示す。
【図４】図４は、ＭＶＡ（改変ワクシニアアンカラ）のＣ７Ｌ領域の配列を示す。
【図５Ａ】図５は、０．８％アガロースゲルに現れたｃａｎＢＮＸ０１のＰＣＲ産物を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは０．８％アガロースゲルに現れたｃａｎＢＮ０１のＰＣＲ産物を示す。
【図６】図６は、さまざまな細胞株での組換えＣａＰＶの多段階増殖曲線を示す。
【図７】図７は、Ｆｌａｎｋ１（Ａ部分、上側）およびＦｌａｎｋ２（Ｂ部分、下側）のヌクレオチド配列を示す。
【配列表】
2005534326.tif 000004
2005534326.tif 000005
2005534326.tif 000006
2005534326.tif 000007
【図１】
2005534326.tif 000008
【図２】
2005534326.tif 000009
【図３】
2005534326.tif 000010
【図４】
2005534326.tif 000011
2005534326.tif 000012
【図６】
2005534326.tif 000013
2005534326.tif 000014
【国際調査報告】
2005534326.tif 000015
2005534326.tif 000016
2005534326.tif 000017
2005534326.tif 000018
2005534326.tif 000019