(57)【要約】  高アフィニティー中和ｍＡｂから由来のキメラ、ヒト化および他のＲＡＮＫ−ＬｍＡｂ、それを含有する医薬組成物、治療および診断方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノクローナル抗体１４Ｆ３と同一の特徴を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体１４Ｆ３である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体１４Ｆ３の免疫グロブリン相補性決定領域を含む抗体。
【請求項４】
請求項３記載の抗体をコードしているポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体。
【請求項６】
配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体。
【請求項７】
配列番号５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在するとき、配列番号５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を産生できる、かかる抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現系、およびかかる発現ベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項１０】
抗体の産生に十分な条件下で宿主細胞を培養し、該培養培地から該抗体を回収する工程を特徴とする、配列番号５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の生産方法。
【請求項１１】
発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在するとき、配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を産生できる、かかる抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現系、およびかかる発現ベクターを含む組み換え宿主細胞。
【請求項１２】
抗体の産生に十分な条件下で宿主細胞を培養し、該培養培地から該抗体を回収する工程を特徴とする、配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体の生産方法。
【請求項１３】
慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患を、有効量の請求項１、２、３、５または６記載の抗体またはポリペプチドを必要な患者に投与することによって治療または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００１年５月１８日に出願された、その内容が出典明示により全体として本明細書の一部とされる、より初期の仮米国出願番号第６０／２９２，０３１号に対する利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、ＲＡＮＫリガンドにより媒介された病態の治療および診断において有用な抗体の分野、より詳細には、ｍＡｂ、Ｆａｂ、改変抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体に関する。
【０００３】
発明の背景
ヒトＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫ−Ｌ）は、免疫系、骨発達およびホメオスタシスの重要なレギュレーターであることが知られている蛋白質の腫瘍壊死因子スーパーファミリーの一員である（Andersonら、Nature, 390: 175-179, 1997）。該リガンドはまた、腫瘍壊死因子関連活性化−誘導性サイトカイン（Tumor Necrosis Factor Related Activation-Induced Cytokine：ＴＲＡＮＣＥ）（Wongら、J. Exp. Med. 186: 2075, 1997）、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）（Laceyら、Cell, 93: 165, 1998）および破骨細胞分化因子（ＯＤＦ）（Yasudaら、Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 3597, 1998）とも呼ばれる。腫瘍壊死ファミリーのメンバーは、種々の、およびときどき反対の生物学的応答、例えば、増殖、アポトーシス、細胞生存および分化の媒介となる。現在までのところ記載されたリガンドのＴＮＦファミリーの他のメンバーは、４−１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＦａｓＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴ−ａ、ＬＴ−ｂ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦａ、Ｔｒａｉｌ、ＲＡＮＫ−ＬおよびＴＷＥＡＫを包含する（Wongら、J. Leukocyte Biol.: 65 715, 1999およびKwonら、Curr Opin Immunol 11: 340, 1999において概説される）。これらの他のリガンドの中でも、ＲＡＮＫＬはＣＤ４０Ｌに対して最大のホモロジーを共有する（細胞外領域において約２８％同一性）。
【０００４】
ＴＮＦリガンドファミリーの他のメンバーと同様に、ＲＡＮＫ−Ｌは、短い細胞質尾部、およびＲＡＮＫ−Ｌ受容体、ＲＡＮＫの結合部位を含む細胞外ＴＮＦコアドメインを有するＩＩ型膜蛋白質として発現される。該受容体結合ドメインは、蛋白質分解により切断されて、離れて受容体機能を刺激することができる可溶性ＲＡＮＫＬを放出することができる。該切断はメタロプロテアーゼの阻害剤によって妨害され、精製したＴＮＦアルファ変換酵素（ＴＡＣＥ）が切断を誘導することができるので、該工程がＴＡＣＥまたは同様の酵素によって媒介されることが示唆される（Lumら、J. Biol. Chem. 274: 13613, 1999）。ＲＡＮＫ−Ｌは、活性化Ｔ細胞、活性化骨芽細胞、および免疫系生物学と骨生物学との間の関連を提供している骨髄ストロマ細胞上に発現される。生物化学的証拠は、ＲＡＮＫ−Ｌがグリコシル化されていることを示す。該細胞質尾部は、ＳＨ３ドメイン含有蛋白質のドッキング部位として作用することができ、したがって、その受容体への結合において逆のシグナル伝達の媒介となることのできるモチーフを有する。
【０００５】
ＲＡＮＫ−Ｌ受容体
ＲＡＮＫ−Ｌのための２つの受容体、ＲＡＮＫおよびＯＰＧが同定された。ＲＡＮＫは、ＣＤ４０に最も密接に関係したＴＮＦ受容体ファミリーメンバーである（Andersonら、Nature 390: 175, 1997）。ＲＡＮＫは、１８４アミノ酸細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および３８３アミノ酸よりなる大きな細胞質ドメインを有する６１６アミノ酸よりなるＩ型膜受容体である。ｍＲＮＡとして幅広く発現されるにもかかわらず、細胞表面におけるＲＡＮＫ蛋白質の発現は、脾臓、リンパ節ならびに骨髄由来の樹状細胞および破骨細胞前駆細胞に限られているようである（Wongら、J. Exp. Med., 186: 2075, 1997; Andersonら、Nature 390: 175, 1997; Laceyら、Cell 93: 165, 1998）。ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーの多くと同様に、ＲＡＮＫの細胞質ドメインは、ＴＮＦ−受容体関連因子（ＴＲＡＦ）として知られるアダプター分子との相互作用を介してシグナル変換の媒介となると考えられている。次いで、ＴＲＡＦは、いくつかの異なる経路、例えば、ＮＦ−ｋＢならびにｃ−ｊｕｎアミノ末端プロテインキナーゼ（ＪＮＫ）および細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）のようなマイトジェン誘導性プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）を活性化する。これらの異なるシグナル変換経路は、様々に、細胞生存シグナル、アポトーシス、分化、サイトカイン分泌、および／または細胞活性化の媒介となる。したがって、ＲＡＮＫ−ＬとＲＡＮＫとの相互作用は、免疫機能および骨ホメオスタシスの調節において重大な役割を果たしうる。生物化学的および遺伝学的遺伝子ノックアウト研究は、ＴＲＡＦ−６、また、ＴＲＡＦ−２およびＴＲＡＦ−５が、ＲＡＮＫの細胞質領域と結合する該ファミリーの主要メンバーであることを示す。
【０００６】
第２の同定されたＲＡＮＫ−Ｌ受容体はオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）であり、それは、膜貫通領域を欠き、ＲＡＮＫ−Ｌとその同種細胞表面受容体ＲＡＮＫとの間のシグナル伝達を遮断するように作用する可溶性デコイ受容体として機能するようである。ＯＰＧは、骨吸収の強力な阻害剤であることが知られており、ＲＡＮＫ−Ｌ媒介性破骨細胞形成をイン・ビトロおよびイン・ビボで阻害することができる（Laceyら、Cell 93: 165, 1998; Yasudaら、PNAS 95: 3597, 1998; Tomoyasuら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 382, 1998; TsudaおよびHigashino, Nippon Rinsho 56: 1435, 1998）。ＯＰＧはまた、ＴＮＦリガンドＴＲＡＩＬに結合する（Emeryら、J. Biol. Chem. 273: 14363, 1998）。
【０００７】
樹状細胞生物学におけるＲＡＮＫ−Ｌの役割
成熟した骨髄樹状細胞および脾臓樹状細胞は、その表面に高レベルのＲＡＮＫを発現し、それにより、樹状細胞生物学の調節におけるＲＡＮＫ−Ｌの主要な役割が示唆される（Wongら、J.Exp. Med., 186:2075, 1997）。ＲＡＮＫ−Ｌの１の主要な効果は、成熟した樹状細胞の生存を、おそらく、Ｂｃｌ−ｘＬ、よく記載されるアポトーシスサプレッサーのアップレギュレーションによって増加することである（Wongら、J.Exp. Med., 186:2075, 1997）。次いで、増加したＤＣ生存は、抗原／ＭＨＣ複合体ならびにＢ７−１およびＢ７−２などの共同刺激性分子の刺激性提示を延長することによって、増強されたＴ細胞増殖応答を導くことができる（Wongら、J.Exp. Med., 186:2075, 1997）。ＲＡＮＫ−Ｌによる樹状細胞の刺激は、また、いくつかのサイトカイン遺伝子、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１およびＩＬ−６の転写を誘導することも知られている（Wong
ら、J. Leukocyte Biol. 65:715, 1999）。これらのサイトカインは、免疫応答の強度および型を調節する。ＣＤ４０Ｌノックアウト背景において、残存するウイルス耐性は、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ経路によって媒介される（Bachmanら、J. Exp. Med. 189: 1017-1020）。また、ＲＡＮＫＬおよびＲＡＮＫノックアウトマウスは、リンパ節器官形成が不足しており、初期のＢおよびＴ細胞発達においていくつかの欠陥を示す（Kongら、Nature 397:315, 1999; Dougallら、Genes and Development 13:2412, 1999; Liら、Proc. Natl. Acad Sci. 97: 1566, 2000）。かくして、ＲＡＮＫ−Ｌは、免疫系の発達ならびに免疫応答の量および強度の調節において役割を果たすようである。
【０００８】
骨生物学におけるＲＡＮＫ−Ｌの役割
ＲＡＮＫ−Ｌは、破骨細胞の発達および活性化のための重大な分化因子であり、例えば、骨ホメオスタシスおよびカルシウム代謝の維持において主要な役割を果たす。ＲＡＮＫ−Ｌは、骨髄前駆体から骨吸収性破骨細胞の分化を刺激することができる（Laceyら、Cell 93:165, 1998; Yasudaら、PNAS 95:3597, 1998）。かくして、ＲＡＮＫ−ＬおよびＲＡＮＫノックアウトマウスは、破骨細胞分化の完全な欠損により、重篤な大理石骨病によって特徴付けられた（Kongら、Nature 397: 315, 1999; Dougallら、Genes and Development 13: 2412, 1999; Liら、Proc. Natl Acad Sci. 97: 1566, 2000）。さらに、トランスジェニックマウスにおけるＲＡＮＫ−Ｌデコイ受容体ＯＰＧの全身性過剰発現は、可溶性ＲＡＮＫ外部ドメイン蛋白質の全身性投与（Fullerら、J.Exp.Med. 188:997, 1998）と同様に、大理石骨病を引き起こすことが見出された（Simonetら、Cell 89: 309, 1997）。ＲＡＮＫ−Ｌは、また、破骨細胞を刺激し、その結果、成熟破骨細胞の増加した運動性、分布および生存をもたらす。次いで、該刺激は、活性化した破骨細胞によって、より有効な骨吸収をもたらす。かくして、骨ホメオスタシスは、ＲＡＮＫ−ＬおよびＯＰＧの発現のバランスに少なくとも部分的に依存するようである。したがって、骨の疾患は、ＲＡＮＫ−Ｌの作用を増加または減少することによって治療されうる。例えば、活性化Ｔ細胞は、ＲＡＮＫＬの発現をアップレギュレートし（Josienら、J. Immunol 162:2562-2568, 1999; Kongら、Nature 402: 304-309, 1999）、ｃｔｌａ４ノックアウトマウス由来のポリクローナル活性化Ｔ細胞は、ＯＰＧの投与によって阻害されるｒａｇノックアウトマウス中への養子移入において骨喪失を誘導する（Kongら、Nature 402:304-309, 1999）。また、ラットにおけるアジュバント誘導性関節炎において、ＯＰＧ蛋白質の投与は、炎症性反応に影響することなく、骨および軟骨喪失を阻害する（Kongら、Nature 402: 304-309, 1999）。
【０００９】
まとめると、ＲＡＮＫとＲＡＮＫ−Ｌの結合は、骨髄または樹状細胞生存における破骨細胞分化および破骨細胞活性化ならびにリンパ器官におけるサイトカイン産生をもたらし、各々、増加した骨吸収および増強した免疫応答を導く。したがって、ＲＡＮＫ−Ｌは、免疫系障害および骨ホメオスタシスの疾患のための新規な治療の開発のための望ましい標的である。
【００１０】
中和ＲＡＮＫ−Ｌ抗体は、ヒトにおける病理学的骨喪失および関連する症状の緩和において有用でありうる。中和ＲＡＮＫ−Ｌ抗体は、また、ヒトにおける炎症および自己免疫疾患ならびに関連する症状の緩和に有用でありうる。したがって、ＲＡＮＫ−Ｌ媒介性破骨細胞分化および活性化を減少し、かくして、骨の疾患および関連する症状を減少するであろうヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する中和モノクローナル抗体に対する当該分野における要望もある。また、免疫応答のＲＡＮＫ−Ｌ媒介性強化を減少し、かくして、免疫系の疾患および関連する症状を減少するであろうヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する中和モノクローナル抗体などの高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌアンタゴニストに対する当該分野における要望もある。アンタゴニストＲＡＮＫＬモノクローナル抗体は、ＴＲＡＩＬなどの他のＴＮＦ関連リガンドと相互作用する可能性のあるＯＰＧ蛋白質よりも、その作用において選択的であると予測される。
【００１１】
発明の概要
第１の態様において、本発明は、詳細な記載において記載されるように、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに特異的で、約１０−１０Ｍ以下の解離定数によって特徴付けられる結合アフィニティーを有する中和モノクローナル抗体を提供する。かかるモノクローナル抗体の例は、マウスモノクローナル抗体１４Ｆ３である。本発明の別の態様は、ハイブリドーマ２４１３ １４Ｆ３（２）Ｂ１１である。関連する態様において、本発明は、本発明のげっ歯類中和モノクローナル抗体のＦｃ領域を削除することによって生産されるヒトＲＡＮＫ−Ｌに特異的なその中和ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを提供する。
【００１２】
また別の関連する態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する約１０−１０Ｍ以下の解離定数によって特徴付けられる非ヒト中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒトＲＡＮＫ−Ｌに特異的な改変抗体およびそれをコードする核酸分子を提供する。該改変抗体がヒト化抗体である場合、非ヒト免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列を第１の免疫グロブリンパートナー中に挿入し、ここに、第１の免疫グロブリンパートナーの少なくとも１つ、好ましくは全ての相補性決定領域（ＣＤＲ）が非ヒトモノクローナル抗体由来のＣＤＲによって置換されている。好ましくは、第１の免疫グロブリンパートナーは、免疫グロブリン定常鎖の全てまたは一部を含む第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結される。
【００１３】
関連する態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する約１０−１０Ｍ以下の解離定数によって特徴付けられる非ヒト中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来のＣＤＲ、およびかかるＣＤＲをコードしている核酸分子を提供する。
また別の態様において、ヒト重鎖および軽鎖定常領域ならびにヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する約１０−１０Ｍ以下の解離定数によって特徴付けられる非ヒト中和モノクローナル抗体由来の重鎖および軽鎖可変領域を含有するキメラ抗体が提供される。
【００１４】
また別の態様において、本発明は、１（またはそれ以上）の上記抗体および医薬上許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、過剰なＲＡＮＫ−Ｌに関連するヒトにおける病態、免疫系または骨の疾患、特に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患を、有効量の本発明の医薬組成物をヒトに投与することによって治療する方法を提供する。
【００１５】
また別の態様において、本発明は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する１０−１０Ｍ以下の解離定数によって特徴付けられる非ヒト中和モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の改変抗体（例えば、操作された抗体、ＣＤＲ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２フラグメント、またはその類似体）の組み換え生産のための方法、および該組み換え生産に有用な成分を提供する。これらの成分は、それをコードする単離核酸配列、選択された調節配列の制御下で該核酸配列を含有する組み換えプラスミド（該調節配列は、該組み換えプラスミドでトランスフェクトされた宿主細胞（好ましくは、哺乳動物細胞）中でその発現を指示することができる）を包含する。該生産方法は、抗体、好ましくはヒト化抗体が該細胞中で発現されるような条件下で本発明のトランスフェクト宿主細胞系を培養し、そこから発現生産物を単離することを含む。
【００１６】
本発明のまた別の態様において、ヒトにおける過剰なＴｈ１ Ｔ細胞活性または破骨細胞発達および活性化、特に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患に関連する病態を診断するための方法であって、患者から生物学的流体試料を得、ＲＡＮＫ−Ｌ／抗体（モノクローナルまたは改変）複合体が形成されるような条件下で、本発明の抗体および改変抗体をかかる試料と接触させ、該ＲＡＮＫ−Ｌ／抗体複合体の存在または不在を検出することを特徴とする方法が提供される。
本発明の他の態様および利益は、詳細な記載およびその好ましい具体例にさらに記載される。
【００１７】
発明の詳細な記載
表Ｉは、マウス抗体１４Ｆ３の長鎖可変領域のｃＤＮＡおよびその推定アミノ酸配列を示す（各々、配列番号１および２）。ボックスで囲んだ領域（表Ｉのボックス内）は、３つのＣＤＲ（配列番号５、６および７）および各ＣＤＲをコードしているポリヌクレオチド（配列番号１３、１４および１５）を示す。太字領域は、縮重プライマー配列（配列番号１１）を示す。
【００１８】
【表１−１】
2005515752.tif 000002
【表１−２】
2005515752.tif 000003
【００１９】
表ＩＩは、マウス抗体１４Ｆ３の重鎖可変領域のｃＤＮＡおよびその推定アミノ酸領域を示す（各々、配列番号３および４）。ボックスで囲んだ領域（表ＩＩのボックス内）は、３つのＣＤＲ（配列番号８、９および１０）および各ＣＤＲをコードしているポリヌクレオチド（配列番号１６、１７および１８）を示す。太字領域は、縮重プライマー配列を示す（配列番号１２）。
【００２０】
【表２】
2005515752.tif 000004
【００２１】
本発明は、種々の抗体、改変抗体およびそのフラグメントを提供し、それらは、マウスモノクローナル抗体１４Ｆ３（その可変軽鎖および重鎖領域は表ＩおよびＩＩに提供される）において例示されるようなヒトＲＡＮＫ−Ｌ結合特異性、中和活性、およびヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する高アフィニティーによって特徴付けられる。該モノクローナル抗体１４Ｆ３は、新規な中和抗体を作成するための慣例のハイブリドーマ技術によって調製された。本発明の抗体は、ＲＡＮＫ−Ｌ媒介性障害、例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患を治療するための治療的医薬組成物に有用である。該生産物は、また、ヒトにおける内在性ＲＡＮＫ−Ｌレベルまたは活性化細胞から体外に放出されたＲＡＮＫ−Ｌの測定（例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））によるＲＡＮＫ−Ｌ媒介性病態の診断において有用である。
【００２２】
１．定義
「抗体」なる語は、限定するものではないが、モノクローナル、改変、ヒト化、操作、およびキメラ抗体を包含する。
「モノクローナル抗体」なる語は、ポリクローナル抗体に対立するものとして、慣例のハイブリドーマ技術、ファージ・ディスプレイ・コンビナトリアル・ライブラリー、免疫グロブリン鎖シャッフリングおよびヒト化技術によって調製できる免疫グロブリンを示す。
【００２３】
「改変抗体」なる語は、選択された宿主細胞における発現によって得られうる改変された免疫グロブリンコーディング領域によってコードされる蛋白質を示す。かかる改変抗体は、操作された抗体（例えば、キメラまたはヒト化抗体）または免疫グロブリン定常領域の全てまたは一部を欠く抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２などである。
「改変された免疫グロブリンコーディング領域」なる語は、本発明の改変抗体をコードしている核酸配列を示す。改変抗体がＣＤＲ−融合またはヒト化抗体である場合、ヒト可変枠組配列を含む第１の免疫グロブリンパートナーは、非ヒト免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列によって置換されている。所望により、第１の免疫グロブリンパートナーは、第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結される。
【００２４】
「第１の免疫グロブリンパートナー」は、天然（または天然に生じる）ＣＤＲ−エンコーディング領域がドナー抗体のＣＤＲ−エンコーディング領域によって置換されているヒト枠組またはヒト免疫グロブリン可変領域をコードしている核酸配列を示す。該ヒト可変領域は、免疫グロブリン重鎖、軽鎖（または両鎖）、その類似体または機能的フラグメントであることができる。抗体（免疫グロブリン）の可変領域内に配置されるかかるＣＤＲ領域は、当該分野において既知の方法によって決定できる。例えば、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）は、ＣＤＲを配置する規則を開示する。さらに、ＣＤＲ領域／構造を同定するのに有用なコンピュータープログラムが知られている。
【００２５】
「中和」なる語は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌのその特異的受容体への結合を妨害することによって、またはＲＡＮＫ−Ｌのその結合が生じるべき受容体を介するシグナル伝達を阻害することによって、ＲＡＮＫ−Ｌ活性を阻害する抗体についていう。ｍＡｂは、ＲＡＮＫ−Ｌ中和アッセイにおいて測定したとき、ＲＡＮＫ−Ｌ活性の阻害において９０％有効、好ましくは９５％有効、もっとも好ましくは１００％有効である場合、中和している。
【００２６】
「高アフィニティー」なる語は、光学バイオセンサー分析によって決定されるとき、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する１０−１０Ｍ以下のＫｄによって特徴付けられる結合アフィニティーを有する抗体についていう。
「ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する結合特異性」なる語は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する、ネズミまたは他のＲＡＮＫ−Ｌよりも高いアフィニティーを意味する。
【００２７】
「第２の免疫グロブリンパートナー」なる語は、第１の免疫グロブリンパートナーが枠内で、または任意の慣例のリンカー配列（すなわち、作動可能に連結された）によって融合した蛋白質またはペプチドをコードしている別のヌクレオチド配列を示す。好ましくは、それは免疫グロブリン遺伝子である。第２の免疫グロブリンパートナーは、同じ（すなわち、同種−第１および第２の改変抗体は同じ供給源から由来する）または付加的な（すなわち、異種）抗体の全定常領域をコードしている核酸配列を含みうる。それは、免疫グロブリン重鎖または軽鎖（または単一ポリペプチドの一部として両鎖）であってもよい。第２の免疫グロブリンパートナーは、特定の免疫グロブリンクラスまたはイソ型に限定されない。さらに、第２の免疫グロブリンパートナーは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２においてみられるような免疫グロブリン定常領域の一部（すなわち、適当なヒト定常領域または枠組領域の分離した部分）を含んでいてもよい。かかる第２の免疫グロブリンパートナーは、また、例えばファージ・ディスプレイ・ライブラリーの一部として、宿主細胞の外表面に暴露された内在性膜蛋白質をコードしている配列、または分析的もしくは診断的検出のための蛋白質、例えば、西洋ワサビパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどをコードしている配列を含んでいてもよい。
【００２８】
Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２なる語は、それらの標準的な意味で使用される（例えば、Harlowら、Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)参照）。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「操作された抗体」なる語は、一種の改変抗体、すなわち、選択されたアクセプター抗体の軽鎖および／または重鎖可変ドメインの部分が選択されたエピトープに対して特異性を有する１以上のドナー抗体の類似部分によって置換されている全長合成抗体（例えば、抗体フラグメントの反対として、キメラまたはヒト化抗体）を示す。例えば、かかる分子は、修飾されていない軽鎖（またはキメラ軽鎖）と結合したヒト化重鎖（またはその反対）によって特徴付けられる抗体を包含しうる。操作された抗体は、また、ドナー抗体結合特異性を保持するために、アクセプター抗体軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組領域をコードしている核酸配列の改変によって特徴付けられてもよい。これらの抗体は、アクセプター抗体由来の１以上のＣＤＲ（好ましくは全て）の本明細書に記載のドナー抗体由来のＣＤＲでの置換を含むことができる。
【００３０】
「キメラ抗体」なる語は、アクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域と共に、ドナー抗体由来の天然可変領域（軽鎖および重鎖）を含有する一種の操作された抗体を示す。
「ヒト化抗体」なる語は、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のそのＣＤＲを有する一種の操作された抗体であって、該分子の残りの免疫グロブリン部分は、１（またはそれ以上）のヒト免疫グロブリン由来である抗体を示す。さらに、枠組支持残基は、結合アフィニティーを保持するために改変されていてもよい（例えば、Queenら、Proc. Natl. Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgsonら、Bio/Technology, 9:421 (1991)）。
【００３１】
「ドナー抗体」なる語は、改変された免疫グロブリンコーディング領域を提供するように、その可変領域、ＣＤＲまたは他の機能フラグメントまたはその類似体を第１の免疫グロブリンパートナーに与え、その結果、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性および中和活性を有する発現された改変抗体をもたらす抗体（モノクローナルまたは組み換え）を示す。本発明における作用に適当な１のドナー抗体は、１４Ｆ３と呼ばれる非ヒト中和モノクローナル抗体である。該抗体１４Ｆ３は、高アフィニティー、ヒト−ＲＡＮＫ−Ｌ特異的（すなわち、ネズミＲＡＮＫ−Ｌを認識しない）、イソ型ＩｇＧ２ａ／ｋａｐｐａの中和抗体として定義付けられる。該抗体は、各々、配列番号１および２の可変軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列；および各々、配列番号３および４の可変重鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列を適当なネズミＩｇＧ定常領域上に有する。
【００３２】
「アクセプター抗体」なる語は、ドナー抗体に対して異種の抗体（モノクローナルまたは組み換え）であって、その重鎖および／または軽鎖枠組領域および／またはその重鎖および／または軽鎖定常領域をコードしている核酸配列の全て（またはいずれかの部分、しかし好ましくは全て）を第１の免疫グロブリンパートナーに与える抗体を示す。好ましくは、ヒト抗体はアクセプター抗体である。
【００３３】
「ＣＤＲ」なる語は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義付けられる。例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)参照のこと。３つの重鎖および３つの軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が免疫グロブリンの可変部分に存在する。かくして、「ＣＤＲ」なる語は、本明細書で使用される場合、３つの重鎖ＣＤＲ全てまたは３つの軽鎖ＣＤＲ全て（または、もし適当ならば、全重鎖および全軽鎖ＣＤＲの両方）を示す。
ＣＤＲは、抗体の抗原またはエピトープへの結合のための多数の接触残基を提供する。本発明における目的のＣＤＲは、ドナー抗体可変重鎖および軽鎖配列由来であり、天然ＣＤＲの類似体（類似体は、また、それらが由来するドナー抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和力を有する、または維持する）を包含する。
【００３４】
抗原結合特異性または中和力を有することにより、例えば、ｍＡｂ １４Ｆ３がある特定のレベルの抗原アフィニティーによって特徴付けられても、適当な構造環境において１４Ｆ３の核酸配列によってコードされるＣＤＲは、より低いまたは高いアフィニティーを有しうることが意味される。にもかかわらず、かかる環境において１４Ｆ３のＣＤＲは、１４Ｆ３と同じエピトープを認識するであろうと予測される。１４Ｆ３の例示的軽鎖ＣＤＲは
配列番号５；
配列番号６；
配列番号７
を包含し、１４Ｆ３の例示的重鎖ＣＤＲは
配列番号８；
配列番号９；
および配列番号１０を包含する。
【００３５】
「機能的フラグメント」とは、該フラグメントが由来する抗体と同じ抗原結合特異性および／または中和力を保持する部分的重鎖または軽鎖可変配列（例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノまたはカルボキシ末端での少数の欠失）である。
「類似体」とは、少なくとも１つのアミノ酸によって修飾されたアミノ酸配列であり、ここに、該修飾は化学的であることができ、または少数（例えば、好ましくは１０以下）のアミノ酸の置換または再配列であることができ、その修飾は、該アミノ酸配列が非修飾配列の生物学的特徴、例えば、抗原特異性および高アフィニティーを保持することを可能にする。例えば、（サイレント）突然変異は、ある特定のエンドヌクレアーゼ制限部位をＣＤＲ−エンコーディング領域の内部または周囲に作成するとき、置換を介して構築することができる。
【００３６】
類似体はまた、対立遺伝子変異として生じてもよい。「対立遺伝子変異または修飾」とは、本発明のアミン酸またはペプチド配列をコードしている核酸配列における改変である。かかる変異または修飾は、遺伝コードの縮重に起因していてもよく、または所望の特徴を提供するように故意に操作されていてもよい。これらの変異または修飾は、いずれのコード化アミノ酸配列における改変を生じてもよく、または生じなくてもよい。
フラグメント、類似体および対立遺伝子変異の概念は、また、「同一性」によって表現することもできる。例えば、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５および１６、１７および１８からなる群から選択されるメンバーと少なくとも９０％、より好ましくは９５％同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。
【００３７】
「同一性」とは、当該分野で知られているように、配列比較により決定されるときの２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該分野において、「同一性」なる語は、また、場合により、かかる配列の鎖間の合致によって決定されるときのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列相関の度合いを意味する。「同一性」および「類似性」は、限定するものではないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., および Griffin, H.G.編, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; および Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. および Devereux, J.編, M Stockton Press, New York, 1991; およびCarillo, H.,および Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載の方法を包含する既知の方法によって容易に算出できる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列間の最大の合致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に入手可能なコンピュータープログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法は、限定するものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., ら、Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Atschul, S.F.ら、J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)）を包含する。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公に入手可能である（BLAST Manual, Altschul, S.ら、NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S.ら、J.Mol.Biol. 215: 403-410 (1990)）。よく知られたＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性の決定に用いてもよい。
【００３８】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメーターは、下記を包含する。
１）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：HentikoffおよびHentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919 (1992)由来のBLOSSUM62
ギャップ・ペナルティー：１２
ギャップ・レングス・ペナルティー：４
【００３９】
これらのパラメーターを用いて有用なプログラムは、Genetics Computer Group, Madison WI由来の「ギャップ」プログラムとして公に入手可能である。上記パラメーターは、ペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（エンドギャップのためのペナルティーなしを伴う）。
ポリヌクレオチド比較のための好ましいパラメーターは、下記を包含する。
１）アルゴリズム：NeedlemanおよびWunsch, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップ・ペナルティー：５０
ギャップ・レングス・ペナルティー：３
Genetics Computer Group, Madison WI.由来の「ギャップ」プログラムとして入手可能である。
これらは、核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００４０】
例示として、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号１の参照配列と同一であってもよく、すなわち、１００％同一であり、またはそれは、該参照配列と比べて、ある整数個までのヌクレオチド改変を含んでいてもよい。かかる改変は、少なくとも１個のヌクレオチド欠失、置換（トランジションおよびトランスバージョンを包含する）または挿入からなる群から選択され、ここに、該改変は、参照配列中のヌクレオチド中で個別にまたは参照配列内の１以上の連続した群において散在して、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置またはその末端位置間のいずれで起こってもよい。ヌクレオチド改変の数は、配列番号１中のヌクレオチドの総数に各パーセント同一性のパーセント値（１００で割る）を掛け、該配列番号１中のヌクレオチドの総数からその積を引くことによって、または：
ｎｎ＜ｘｎ−（ｘｎ・ｙ）
［式中、ｎｎはヌクレオチド改変の数であり、ｘｎは配列番号１中のヌクレオチドの総数であり、ｙは、例えば、７０％の場合０．７０、８０％の場合０．８０、８５％の場合０．８５、９０％の場合０．９０、９５％の場合０．９５などであり、ここに、ｘｎとｙのいずれかの非整数積は、端数を切り捨てて最も近似の整数にした後、それをｘｎから引く］
によって決定される。配列番号２のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の改変は、該コーディング配列にナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を作成することができ、それにより、かかる改変の後のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを改変する。
【００４１】
同様に、本発明のポリペプチド配列は、配列番号２の参照配列と同一であってもよく、すなわち１００％同一であり、またはそれは、該参照配列と比べて、％同一性が１００％未満になるように、ある整数個までのアミノ酸改変を含んでいてもよい。かかる改変は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換（保存的および非保存的置換を包含する）または挿入からなる群から選択され、ここに、該改変は、参照配列中のアミノ酸中で個別にまたは参照配列内の１以上の連続した群において散在して、参照ポリペプチド配列のアミノまたはカルボキシ末端位置またはその末端位置間のいずれで起こってもよい。所定の％同一性に関するアミノ酸改変の数は、配列番号２中のアミノ酸の総数に各パーセント同一性のパーセント値（１００で割る）を掛け、次いで、該配列番号２中のアミノ酸の総数からその積を引くことによって、または：
ｎａ＜ｘａ−（ｘａ・ｙ）
［式中、ｎａはアミノ酸改変の数であり、ｘａは配列番号２中のアミノ酸の総数であり、ｙは、例えば、７０％の場合０．７０、８０％の場合０．８０、８５％の場合０．８５、９０％の場合０．９０、９５％の場合０．９５などであり、ここに、ｘａとｙのいずれかの非整数積は、端数を切り捨てて最も近似の整数にした後、それをｘａから引く］
によって決定される。
【００４２】
「エフェクター剤」なる語は、改変抗体、および／またはドナー抗体の天然または合成軽鎖または重鎖あるいはドナー抗体の他のフラグメントが常法により結合しうる非蛋白質担体分子を示す。かかる非蛋白質担体は、診断分野で使用される慣例の担体、例えば、ポリスチレンまたは他のプラスチックビーズ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Pharmacia）系において使用されるようなポリサッカライド、または医学分野で有用でヒトおよび動物への投与に安全な他の非蛋白質物質を包含することができる。他のエフェクター剤は、重金属原子をキレートするための大環式物質、または放射性同位体元素を包含しうる。かかるエフェクター剤、例えば、ポリエチレングリコールは、また、改変抗体の半減期を増加するのにも有用である。
【００４３】
ＩＩ．高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌモノクローナル抗体
本発明の抗体、改変抗体およびフラグメントの構築に使用する場合、非ヒト種（例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、げっ歯類（例えば、ネズミおよびラット）など）を、天然ヒトＲＡＮＫ−Ｌまたはそのペプチドエピトープの提示において、所望の免疫グロブリンを作成するために用いてもよい。慣例のハイブリドーマ技術を用いて、非ヒトｍＡｂ ＲＡＮＫ−Ｌを分泌するハイブリドーマ細胞系統を提供する。次いで、実施例のセクションに記載されるように、かかるハイブリドーマを９６−ウェルプレートに被覆したＲＡＮＫ−Ｌを用いる、またはストレプトアビジン被覆プレートに結合したビオチン化ＲＡＮＫ−Ｌを用いる結合についてスクリーンする。
【００４４】
本発明の一例の高アフィニティー中和ｍＡｂは、マウス抗体ｍＡｂ１４Ｆ３（その重鎖および軽鎖可変領域が表ＩおよびＩＩに示される）であり、それは、下記の実施例により詳細に記載されるように、キメラまたはヒト化抗体の開発に使用することができる。１４Ｆ３ｍＡｂは、約Ｋｄ１０−１０ＭのヒトＩＬ−１ＲＡＮＫ−Ｌに対する抗原結合特異性によって特徴付けられる。該ｍＡｂは、イソ型ＩｇＧ２ａ／ｋａｐｐａであることによって特徴付けられる。
【００４５】
本発明は、１４Ｆ３またはその超可変（すなわち、ＣＤＲ）配列の使用に限定されない。そのために、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対する約１０−１０Ｍ以下の解離定数によって特徴付けられるいずれか他の適当な高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌ抗体および対応する抗ＲＡＮＫ−Ｌ ＣＤＲを代わりに用いてもよい。下記の記載のいずれでも、ドナー抗体は１４Ｆ３とされているが、これは単に記載の説明および単純さのために明示されているに過ぎない。
【００４６】
ＩＩＩ．抗体フラグメント
本発明は、また、ヒトＲＡＮＫ−Ｌに対して向けられたｍＡｂ由来のＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの使用を包含する。これらのフラグメントは、ＲＡＮＫ−ＬおよびＴｈ１ Ｔ細胞媒介性病態に対してイン・ビボで保護する薬剤として、またはＲＡＮＫ−Ｌ診断の一部としてイン・ビトロで、特に、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患において有用である。Ｆａｂフラグメントは全軽鎖および重鎖のアミノ末端部分を含有し；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、ジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂフラグメントによって形成されるフラグメントである。ｍＡｂ １４Ｆ３および他の類似の高アフィニティーＲＡＮＫ−Ｌ結合性抗体は、常法、例えば、適当な蛋白質溶解酵素、パパインおよび／またはペプシンでのｍＡｂの切断または組み換え法によって得ることのできるＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントの供給源を提供する。これらのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、それ自体、治療剤、予防剤または診断剤として、および本明細書に記載のような組み換えまたはヒト化抗体の形成に有用な可変領域およびＣＤＲ配列を包含する配列のドナーとして有用である。
【００４７】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、コンビナトリアル・ファージ・ライブラリー（例えば、Winterら、Ann.Rev.Immunol., 12: 433-455 (1994)参照）または免疫グロブリン鎖シャッフリング（例えば、Marksら、Bio/Technology, 10:779-783 (1992)参照）（これらは、出典明示により本明細書の一部とされる）によって構築でき、ここに、選択された抗体（例えば、１４Ｆ３）由来のＦｄまたはｖＨ免疫グロブリンは軽鎖免疫グロブリンのレパートリー、ＶＬ（またはＶＫ）と結合して、新規なＦａｂを形成することが可能である。逆に言えば、選択された抗体由来の軽鎖免疫グロブリンは、重鎖免疫グロブリンのレパートリー、ＶＨ（またはＦｄ）と結合して新規なＦａｂを形成することが可能である。
【００４８】
ＩＶ．目的の抗ＲＡＮＫ−Ｌアミノ酸およびヌクレオチド配列
上記ｍＡｂ１４Ｆ３または他の抗体は、可変重鎖および／または軽鎖ペプチド配列、枠組配列、ＣＤＲ配列、機能的フラグメントおよびその類似体、およびそれをコードしている核酸配列などの、ドナー抗体の抗原結合特異性によって特徴付けられる種々の改変抗体を設計し、得るのに有用な配列を提供しうる。
一例として、本発明は、ＲＡＮＫ−Ｌ ｍＡｂ１４Ｆ３由来の可変軽鎖および可変重鎖配列ならびにそれ由来の配列を提供する。
【００４９】
可変軽鎖および重鎖ペプチド配列をコードしている本発明の核酸配列、またはそのフラグメントは、また、ＣＤＲまたは枠組領域をコードしている核酸配列内での特定の変化の突然変異誘発性導入、および得られる修飾または融合核酸配列の発現用プラスミドへの組み込みにも有用である。
遺伝コードの縮重を考慮して、本発明の可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列、およびＣＤＲ配列ならびにドナー抗体の抗原特異性を有する機能的フラグメントおよびその類似体をコードする種々のコーディング配列を構築してもよい。可変鎖ペプチド配列またはＣＤＲをコードしている本発明の単離核酸配列、またはそのフラグメントは、第２の免疫グロブリンパートナーと作動可能に結合した場合に、改変抗体、例えば、本発明のキメラまたはヒト化抗体、または他の操作された抗体を生産するために使用できる。
【００５０】
１の具体例において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択されるメンバーと少なくとも９０％、より好ましくは９５％同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。別の具体例において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関する。また別の具体例において、本発明は、配列番号２、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対し少なくとも９０％、より好ましくは９５％同一のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。
【００５１】
本発明は、また、配列番号５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらに、本発明は、また、配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。また、本発明の範囲内には、配列番号５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドが包含される。さらに、配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドが包含される。
また、発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在する場合に抗体を産生することのできる、配列番号５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現系、およびかかる発現ベクターを含む組み換え宿主細胞が包含される。また、抗体の産生に十分な条件下で宿主細胞を培養し、培養倍地から該抗体を回収する工程を特徴とする、配列番号５、６、７、８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を生産する方法も包含される。
【００５２】
また、発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在する場合に抗体を産生することのできる、配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現系、およびかかる発現ベクターを含む組み換え宿主細胞が包含される。また、抗体の産生に十分な条件下で該宿主細胞を培養し、培養培地から該抗体を回収する工程を特徴とする、配列番号２および４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を生産する方法も包含される。
本発明は、また、配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらに、本発明は、また、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。また、本発明の範囲内には、配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドが包含される。さらに、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドが包含される。
【００５３】
また、発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在する場合に抗体を産生することのできる、配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびかかる発現ベクターを含む組み換え宿主細胞も包含される。また、抗体の産生に十分な条件下で該宿主細胞を培養し、培養培地から該抗体を回収する工程を特徴とする、配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を生産する方法も包含される。
また、発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在する場合に抗体を産生することのできる、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現系、およびかかる発現ベクターを含む組み換え宿主細胞が包含される。また、抗体の産生に十分な条件下で該宿主細胞を培養し、培養培地から該抗体を回収する工程を特徴とする、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を生産する方法も包含される。
【００５４】
本発明は、また、配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。さらに、本発明は、また、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体に関する。また、本発明の範囲内には、配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドが包含される。さらに、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドが包含される。
また、発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在する場合に抗体を産生することのできる、配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現系、およびかかる発現ベクターを含む組み換え宿主細胞が包含される。また、抗体の産生に十分な条件下で該宿主細胞を培養し、培養培地から該抗体を回収する工程を特徴とする、配列番号８、９および１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を生産する方法も包含される。
【００５５】
また、発現ベクターが適合性宿主細胞中に存在する場合に抗体を産生することのできる、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現系、およびかかる発現ベクターを含む組み換え宿主細胞が包含される。また、抗体の産生に十分な条件下で該宿主細胞を培養し、培養培地から該抗体を回収する工程を特徴とする、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体を生産する方法が包含される。
【００５６】
本明細書に記載の改変抗体の一部をコードしている単離核酸配列のほかに、他のかかる核酸配列、例えば、天然ＣＤＲ−エンコーディング配列に相補的な配列またはＣＤＲ−エンコーディング領域の周囲の修飾ヒト枠組領域に相補的な配列が本発明に包含されることに注意すべきである。有用なＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列へのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（T. Maniatisら、Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), p387-389参照）で、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのいずれかにハイブリダイズする配列を包含する。１のかかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４Ｘ ＳＳＣ、６５℃でのハイブリダイゼーション、次いで、０．１Ｘ ＳＳＣ、６５℃で１時間の洗浄である。別法では、例示的ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、４Ｘ ＳＳＣ中、４２℃である。好ましくは、これらのハイブリダイズしているＤＮＡ配列は、少なくとも約１８ヌクレオチド長であり、すなわち、およそＣＤＲの大きさである。
【００５７】
Ｖ．改変された免疫グロブリン分子および改変抗体
改変された免疫グロブリン分子は、キメラ抗体およびヒト化抗体のような操作された抗体を包含する改変抗体をコードすることができる。所望の改変された免疫グロブリンコーディング領域は、第１の免疫グロブリンパートナー（ヒト枠組またはヒト免疫グロブリン可変領域）中に挿入されたＲＡＮＫ−Ｌ抗体、好ましくは、本発明によって提供されるような高アフィニティー抗体の抗原特異性を有するペプチドをコードするＣＤＲ−エンコーディング領域を含有する。
好ましくは、第１の免疫グロブリンパートナーは、第２の免疫グロブリンパートナーに作動可能に連結される。第２の免疫グロブリンパートナーは上記のとおりであり、目的の第２抗体領域、例えば、Ｆｃ領域をコードしている配列を包含しうる。第２の免疫グロブリンパートナーは、また、軽鎖または重鎖定常領域が枠内で、またはリンカー配列によって融合した別の免疫グロブリンをコードしている配列を包含しうる。ＲＡＮＫ−Ｌの機能的フラグメントまたはその類似体に対して向けられた操作された抗体は、同じ抗体での増強された結合を顕在化するように設計されてもよい。
【００５８】
第２の免疫グロブリンパートナーは、また、非蛋白質担体分子を包含する、第２の免疫グロブリンパートナーが常法により作動可能に連結しうる上記で定義されたようなエフェクター剤と結合していてもよい。
第２の免疫グロブリンパートナー、例えば、抗体配列とエフェクター剤との間の融合または連結は、いずれかの適当な手法により、例えば、通常の共有結合またはイオン結合、蛋白質融合、またはヘテロ−二官能性架橋、例えば、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによるものであってもよい。かかる技術は当該分野で知られており、通常の化学および生物化学教本に容易に記載されている。
【００５９】
さらに、単に、第２の免疫グロブリンパートナーとエフェクター剤との間に所望の量のスペースを提供するだけの慣例のリンカー配列もまた、改変免疫グロブリンコーディング領域中に構築されてもよい。かかるリンカーの設計は、当業者によく知られている。
さらに、本発明の分子のためのシグナル配列は、発現を増強するために修飾されてもよい。
【００６０】
例示的改変抗体は、ｍＡｂ １４Ｆ３の抗原特異性を有する可変重鎖および／または軽鎖ペプチドまたは蛋白質配列、例えば、ＶＨおよびＶＬ鎖を含有する。本発明のまた別の所望の改変抗体は、マウス抗体分子１４Ｆ３の重鎖および／または軽鎖の可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、好ましくは全てを含有し、残りの配列はヒト供給源由来であるアミノ酸配列によって特徴付けられる抗体、あるいはその機能的フラグメントまたは類似体である。
またさらなる具体例において、本発明の操作された抗体は、それに付加的な作用物質を結合していてもよい。例えば、組み換えＤＮＡ工学の手法を用いて、完全抗体分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ２ ＣＨ３ドメインが酵素または他の検出可能な分子（すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子）で置換されている、本発明の操作された抗体を作成してもよい。
【００６１】
第２の免疫グロブリンパートナーは、また、例えば、マウス１４Ｆ３の抗原特異性を有するＣＤＲ−含有配列に対して異種の非免疫グロブリンペプチド、蛋白質またはそのフラグメントに作動可能に連結されていてもよい。得られる蛋白質は、抗−ＲＡＮＫ−Ｌ抗原特異性および非免疫グロブリンの特徴の両方を発現時に示しうる。その融合パートナーの特徴は、例えば、別の結合またはレポータードメインなどの機能的特徴、または融合パートナー自体が治療的蛋白質である場合、治療上の特徴、または付加的な抗原性特徴であってもよい。
本発明の別の所望の蛋白質は、全長重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、またはそのいずれかの別個のフラグメント、例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント、重鎖ダイマー、またはそのいずれかの最小組み換えフラグメント、例えば、ＦＶ、または１本鎖抗体（ＳＣＡ）または選択されたドナーｍＡｂ、例えば、ｍＡｂ１４Ｆ３と同じ特異性を有するいずれかの他の分子を含みうる。かかる蛋白質は、改変抗体の形態で使用し、またはその非融合形態で使用してもよい。
【００６２】
第２の免疫グロブリンパートナーがドナー抗体と異なる抗体、例えば、免疫グロブリン枠組または定常領域のいずれかのイソ型またはクラス由来であれば、操作された抗体が生じる。操作された抗体は、１の供給源、例えば、アクセプター抗体由来の免疫グロブリン（Ｉｇ）定常領域および可変枠組領域、およびドナー抗体、例えば、本明細書に記載の抗−ＲＡＮＫ−Ｌ抗体由来の１以上（好ましくは全て）のＣＤＲを含むことができる。さらに、核酸またはアミノ酸レベルでのアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組領域、またはドナーＣＤＲ領域の改変、例えば、欠失、置換、または付加が、ドナー抗体抗原結合特異性を保持するように作成されてもよい。
かかる操作された抗体は、ＲＡＮＫ−Ｌ ｍＡｂの可変重鎖および／または軽鎖の１つ（または両方）（記載のように修飾されていてもよい）あるいは１以上の下記に同定される重鎖または軽鎖ＣＤＲを用いるように設計される。該操作された抗体は、中和することが予測され、すなわち、それらは望ましくは、ＲＡＮＫ−Ｌ蛋白質の受容体への結合を阻害し、またそれらは、ＲＡＮＫ−Ｌ依存性細胞の増殖を阻止または妨害する。
【００６３】
かかる操作された抗体は、選択されたヒト免疫グロブリンまたはサブタイプの枠組領域を含有するヒト化抗体、またはＲＡＮＫ−Ｌ抗体機能的フラグメントに融合したヒト重鎖および軽鎖定常領域を含有するキメラ抗体を包含しうる。適当なヒト（または他の動物）アクセプター抗体は、慣例のデータベース、例えば、ＫＡＢＡＴＲ（登録商標）データベース、Ｌｏｓ ＡｌａｍｏｓデータベースおよびＳｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対するホモロジーによって選択されたものであってもよい。ドナー抗体の枠組領域に対するホモロジー（アミノ酸ベースで）によって特徴付けられるヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変枠組領域を提供するのに適当でありうる。軽鎖定常または可変枠組領域を与えることのできる適当なアクセプター抗体は同様に選択されうる。アクセプター抗体重鎖および軽鎖が同じアクセプター抗体から生じる必要のないことに注目すべきである。
【００６４】
望ましくは、異種の枠組および定常領域は、ヒト免疫グロブリンクラスおよびイソ型、例えば、ＩｇＧ（サブタイプ１〜４）、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥから選択される。しかしながら、該アクセプター抗体はヒト免疫グロブリン蛋白質配列を含む必要がない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の一部をコードしているＤＮＡ配列がポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子などの非免疫グロブリンアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列に融合している遺伝子を構築してもよい。
特に所望のヒト化抗体の一例は、選択されたヒト抗体配列の枠組領域上に挿入されたＣＤＲ１４Ｆ３を含有するであろう。中和ヒト化抗体の場合、ＲＡＮＫ−Ｌ抗体重鎖および／または軽鎖可変領域由来の１、２または好ましくは３個のＣＤＲを選択されたヒト抗体配列の枠組領域中に挿入し、後者抗体の天然ＣＤＲを置換する。
【００６５】
好ましくは、ヒト化抗体において、ヒト重鎖および軽鎖の両方における可変ドメインが１以上のＣＤＲ置換によって操作されている。全６個のＣＤＲ、または６未満のＣＤＲの種々の組み合わせを用いることが可能である。好ましくは、全６個のＣＤＲを置換する。軽鎖としてヒトアクセプター抗体由来の非修飾軽鎖を用いて、ヒト重鎖におけるＣＤＲのみを置換することが可能である。また別法では、慣例の抗体データベースにより別のヒト抗体から、適合性軽鎖を選択してもよい。該操作された抗体の残りは、いずれかの適当なアクセプターヒト免疫グロブリン由来であってもよい。
かくして、好ましくは、操作されたヒト化抗体は、天然ヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、効果的な治療的使用、例えば、ヒトにおけるＲＡＮＫ−Ｌ媒介性炎症性疾患の治療、または診断的使用に必要な特性の組み合わせを有する。
【００６６】
操作された抗体が、必ずしもドナー抗体の特異性および高アフィニティーに影響を及ぼすことなく、可変ドメインアミノ酸における変化によってさらに修飾されうること（すなわち、類似体）は、当業者に理解されるであろう。重鎖および軽鎖アミノ酸が、可変ドメイン枠組またはＣＤＲまたはその両方のいずれかにおいて、他のアミノ酸によって置換されうることが予測される。
さらに、定常領域は、本発明の分子の選択的特性を増強または減少するために改変してもよい。例えば、二量体化、Ｆｃ受容体への結合、または補体結合および活性化能（例えば、Angalら、Mol. Immunol, 30: 105-108 (1993), Xuら、J.Biol.Chem. 269: 3469-3474 (1994), Winterら、EP307,434-B参照）。
【００６７】
キメラ抗体である改変抗体は、両鎖のヒト免疫グロブリン定常領域と共に、枠組領域を包含する全非ヒトドナー抗体重鎖および軽鎖可変領域を提供することにより、上記のヒト化抗体と異なる。本発明のヒト化抗体に関して付加的な非ヒト配列を保持するキメラ抗体が、有意な免疫応答をヒトにおいて顕在化しうることが予測される。
かくして、１の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択されるメンバーに対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である１以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。別の具体例において、本発明の改変抗体は、配列番号２、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である１以上のポリヌクレオチドを含む。
かかる抗体は、下記のように、ＲＡＮＫ−Ｌ媒介性障害の予防および治療に有用であろう。
【００６８】
ＶＩ．改変抗体および操作された抗体の生産
好ましくは、ｍＡｂ１４Ｆ３または他の適当なドナーｍＡｂの可変軽鎖および／または重鎖配列およびＣＤＲ、およびそれらのエンコーディング核酸配列は、本発明の改変抗体、好ましくはヒト化抗体の構築において下記の工程により、使用される。同じまたは類似の技術もまた、本発明の他の具体例を生じるために使用されうる。
【００６９】
選択されたドナーｍＡｂ、例えば、マウス抗体１４Ｆ３を生産するハイブリドーマを常法によりクローン化し、その重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡを、当業者に既知の技術、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring harbor Laboratory(1989)に記載の技術によって得る。少なくともＣＤＲ−エンコーディング領域を含有する１４Ｆ３の可変重鎖および軽鎖領域およびドナーｍＡｂ結合特異性を保持するために必要なアクセプターｍＡｂ軽鎖および／または重鎖可変ドメイン枠組領域の部分、ならびにヒト免疫グロブリンから由来する該抗体鎖の残りの免疫グロブリン部分は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得ることができる。ＣＤＲ−エンコーディング領域は、既知のデータベースを用い、他の抗体との比較により、同定される。
次いで、マウス／ヒトキメラ抗体を調製し、結合能についてアッセイしてもよい。かかるキメラ抗体は、全非ヒトドナー抗体ＶＨおよびＶＬ領域を両鎖のヒトＩｇ定常領域と共に含有する。
【００７０】
ヒト化抗体は、キメラ抗体由来であってもよく、または好ましくは、重鎖および軽鎖由来のドナーｍＡｂ ＣＤＲ−エンコーディング領域を選択された重鎖および軽鎖枠組内に適当に挿入することによって合成により作成されてもよい。別法では、本発明のヒト化抗体は、標準的な突然変異誘発技術を用いて調製されうる。かくして、得られるヒト化抗体は、ヒト枠組領域およびドナーｍＡｂ ＣＤＲ−エンコーディング領域を含有する。枠組残基のその後の操作が存在していてもよい。得られるヒト化抗体は、組み換え宿主細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯまたはミエローマ細胞中に発現させる。他のヒト化抗体は、他の適当なＲＡＮＫ−Ｌ特異的中和高アフィニティー非ヒト抗体に該技術を用いて調製されうる。
通常の発現ベクターまたは組み換えプラスミドは、改変抗体のためのこれらのコーディング配列を、宿主細胞における複製および発現および／または宿主細胞からの分泌を制御することのできる通常の調節制御配列と作動可能に連結して配置することによって生産できる。調節配列は、他の既知抗体由来であることのできるプロモーター配列、例えば、ＣＭＶプロモーター、およびシグナル配列を包含する。同様に、相補的抗体軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡ配列を有する第２の発現ベクターを生産することができる。好ましくは、可能な限り、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることが保障されるように、該第２の発現ベクターは、コーディング配列および選択マーカーに関するかぎり、第１と同一である。別法では、改変抗体のための重鎖および軽鎖コーディング配列は、単一ベクター上に存在していてもよい。
【００７１】
選択された宿主細胞を、第１および第２ベクターの両方を用いて、通常の技術によって同時トランスフェクト（または単一ベクターによって単純にトランスフェクト）して、組み換えまたは合成軽鎖および重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクト宿主細胞を作成する。次いで、該トランスフェクト細胞を通常の技術により培養して、本発明の操作された抗体を生産する。組み換え重鎖および／または軽鎖の両方の結合を含む該ヒト化抗体は、適当なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって培養物からスクリーンされる。同様な通常の技術を用いて、本発明の他の改変抗体および分子を構築してもよい。
本発明の方法および本発明の組成物の構築に用いられるクローニングおよびサブクローニング工程に適当なベクターは、当業者によって選択されうる。例えば、クローニングベクターの慣用的なｐＵＣシリーズを用いてもよい。使用される１のベクターはｐＵＣ１９であり、それはAmersham (Buckinghamshire, United Kingdom)またはPharmacia (Uppsala, Sweden）のような供給会社から商業的に入手可能である。さらに、容易に複製可能ないずれかのベクターは、豊富なクローニング部位および選択可能遺伝子（例えば、抗生物質耐性）を有し、容易に操作され、クローニングに使用可能である。かくして、該クローニングベクターの選択は本発明の限定的因子ではない。
【００７２】
同様に、本発明の操作された抗体の発現のために用いられるベクターは、いずれかの慣用的なベクターから当業者により選択されうる。該ベクターは、また、選択された宿主細胞中で異種ＤＮＡ配列の複製および発現を指示する選択された調節配列（例えば、ＣＭＶプロモーター）を含有する。これらのベクターは、操作された抗体または改変された免疫グロブリンコーディング領域をコードする上記のＤＮＡ配列を含有する。さらに、該ベクターは、すぐに操作できるように所望の制限部位の挿入によって修飾された選択された免疫グロブリン配列を組み込んでいてもよい。
該発現ベクターは、また、異種ＤＮＡ配列の発現を増幅するのに適当な遺伝子、例えば、哺乳動物ジヒドロフォレート還元酵素遺伝子（ＤＨＦＲ）によって特徴付けられうる。他の好ましいベクター配列は、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）由来のポリＡシグナル配列およびベータグロブリンプロモーター配列（Betaglopro）を含む。本明細書において有用な発現ベクターは、当業者によく知られた技術によって合成されうる。
【００７３】
かかるベクターの成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などは、商業的または天然供給源から得てもよく、または選択された宿主における組み換えＤＮＡの生産物の発現および／または分泌を指示するのに有用な既知の手法によって合成されてもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母および真菌の発現のための多くの種類が当該分野で知られている他の適当な発現ベクターもまた、この目的のために選択されうる。
本発明は、また、操作された抗体またはその改変された免疫グロブリン分子のコーディング配列を含有する組み換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞系統を包含する。これらのクローニングベクターのクローニングおよび他の操作に有用な宿主細胞もまた、慣用的である。しかしながら、最も望ましくは、イー・コリ（E.coli）の種々の株由来の細胞をクローニングベクターの複製および本発明の改変抗体の構築における他の工程に用いる。
【００７４】
本発明の操作された抗体または改変抗体の発現に適当な宿主細胞または宿主細胞系統は、好ましくは、ＣＨＯ、ＣＯＳ、繊維芽細胞（例えば、３Ｔ３）および骨髄細胞などの哺乳動物細胞であり、より好ましくは、ＣＨＯまたは骨髄細胞である。ヒト細胞を用いてもよく、かくして、分子をヒトグリコシル化パターンで修飾することが可能である。別法では、他の真核細胞系統を用いてもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニングならびに生産物生産および精製の方法は、当該分野で既知である。例えば、上記のSambrookらを参照のこと。
細菌細胞は、本発明の組み換えＦａｂの発現に適当な宿主細胞として有用であることを証明しうる（例えば、Plueckthun, A., Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992））。しかしながら、細菌細胞中に発現される蛋白質が折りたたまれていない、または不適当に折りたたまれた形態にあるか、あるいは非グリコシル化形態にある傾向のため、細菌細胞中に産生されるいずれの組み換えＦａｂも、抗原結合能力の保持についてスクリーンされなければならないであろう。細菌細胞によって発現される分子が適当に折りたたまれた形態において生産された場合、その細菌細胞は所望の宿主である。例えば、発現に使用されるイー・コリの種々の株は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・ズブチリス（B.subtilis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、他のバチルス（bacillus）などの種々の株もまた、該方法において使用してもよい。
【００７５】
所望により、当業者に既知の酵母細胞の株もまた、宿主細胞として利用可能であり、また、昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ（Drosophila）およびレピドプテラ（Lepidoptera）ならびにウイルス発現系も利用可能である。例えば、Millerら、Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986)およびその引用文献を参照のこと。
本発明のベクターを構築しうる一般的方法、本発明の宿主細胞の生産に必要なトランスフェクション法、およびかかる宿主細胞から本発明の改変抗体を生産するのに必要な培養法は、全て、慣用的な技術である。同様に、本発明の改変抗体は、いったん生産されると、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを包含する当該分野の標準的手法に従って、細胞培養物内容物から精製することができる。かかる技術は、当該分野の技術内であり、本発明を制限するものではない。
【００７６】
ヒト化抗体の発現のまた別の方法は、米国特許第４，８７３，３１６号に記載のようなトランスジェニック動物中での発現を利用しうる。これは、哺乳動物中にトランスジェニックとして組み込まれた場合に、雌が所望の組み換え蛋白質をそのミルク中に生産することを可能にする動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関する。
所望の方法によりいったん発現されると、次いで、操作された抗体を適当なアッセイを用いることにより、イン・ビトロ活性について試験する。目下、慣用的なＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて、操作された抗体のＲＡＮＫ−Ｌへの定性的および定量的結合が評価される。さらに、他のイン・ビトロアッセイを用いて中和力を立証した後、通常のクリアランスメカニズムにもかかわらず、操作された抗体の体内での維持を評価するために臨床的研究を行ってもよい。
【００７７】
ヒト化抗体を調製するために記載された一般的手法にしたがって、当業者は、本明細書に記載の他のドナーＲＡＮＫ−Ｌ抗体、可変領域配列およびＣＤＲペプチドからヒト化抗体を構築することもできる。操作された抗体は、操作された抗体のレシピエントによって「自身」として認識される可能性のある可変領域枠組を用いて生産することができる。レシピエントに対して相当に増加した免疫原性を伴うことなく、抗原結合における大きな増加をもたらすように、該可変領域枠組に対する少数の修飾を施すことができる。かかる操作された抗体は、ＲＡＮＫ−Ｌ媒介性病態についてヒトを効果的に治療しうる。かかる抗体は、また、かかる病態の診断にも有用でありうる。
【００７８】
ＶＩＩ．治療的／予防的使用
本発明は、また、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、または乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患を患っているヒトを治療する方法であって、本明細書に記載の１以上の操作された抗体または改変抗体を包含する抗体、またはそのフラグメントの有効量を投与することを特徴とする方法にも関する。
【００７９】
本発明の分子の使用によって誘導される治療的応答は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌへの結合、およびそれに続く、破骨細胞および樹状細胞発達および機能の阻害によって生じる。かくして、本発明の分子は、治療的使用に適当な調製物および処方にある場合、骨ホメオスタシスの障害、例えば、限定するものではないが、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、または乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患を患っている患者に非常に望ましい。本発明の分子は、治療的使用に適当な調製物および処方にある場合、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、または乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患を患っている患者にも非常に望ましい。
【００８０】
本発明の抗体およびそのフラグメントは、また、サイトカイン阻害剤、例えば、サイトカイン抑制抗炎症薬（Cytokine Suppressive Anti-Inflammatory Drugs (ＣＳＡＩＤＳＴＭ（登録商標）)）または他の抗体、特に、本発明の抗体が向けられている病態の原因となる他のマーカー（エピトープ）と反応するヒトｍＡｂと共に使用してもよい。
本発明の治療剤は、約２日〜６ヶ月または必要なだけの骨減少性疾患または自己免疫疾患の治療に望ましいと考えられる。例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、または乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患を治療する場合、より長期の治療が望ましい。投与量および治療期間は、ヒト循環中における本発明の分子の相対的持続時間に関係し、治療すべき疾患および患者の一般的な健康状態に依存して当業者によって調整されることができる。
【００８１】
本発明の治療剤の投与様式は、宿主に薬剤を送達するいずれの適当な経路であってもよい。本発明の抗体およびそのフラグメントならびに医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋内、静脈内または鼻腔内投与に特に有用である。
本発明の治療剤は、医薬上許容される担体中に有効量の本発明の抗体（例えば、ヒト化型）を活性成分として含有する医薬組成物として調製されうる。本発明の予防剤において、好ましくは生理学的ｐHで緩衝化された、注射用の形態における抗体を含有する水性懸濁または溶液が好ましい。非経口投与用組成物は、一般に、医薬上許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解した本発明の抗体またはそのカクテルの溶液を含むであろう。種々の水性担体、例えば、０．４％セーライン、０．３％グリシンなどを用いてもよい。これらの溶液は滅菌しており、一般に、粒状物質不含である。これらの溶液は、慣用的なよく知られた滅菌技術（例えば、ろ過）により滅菌していてもよい。該組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされるような医薬上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤などを含有していてもよい。本発明の抗体のかかる医薬処方中濃度は、幅広く変化することができ、すなわち、約０．５重量％、通常、少なくとも約１重量％未満から１５または２０重量％程度の大きさまで変化することができ、主として、流体容積、粘度などに基づいて、選択された特定の投与様式にしたがって選択されるであろう。
【００８２】
かくして、筋内注射用の本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水、および約１ｎｇ〜約１００ｍｇ、例えば、約５０ｎｇ〜約３０ｍｇ、またはより好ましくは約５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体を含有するように調製できる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約２５０ｍｌまでの滅菌リンガー溶液、および約３０ｍｇ、好ましくは５ｍｇ〜約２５ｍｇの本発明の抗体を含有するように調製できる。非経口投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者によく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにおいてより詳細に記載されている。
医薬調製物における場合、本発明の治療剤が単位投与形態にあることが好ましい。適当な治療上有効な投与量は、当業者によって容易に決定できる。ヒトまたは他の動物における炎症障害を有効に治療するために、７０ｋｇ体重あたり約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの本発明の蛋白質または抗体の１投与量を非経口投与、好ましくは、静脈内または筋内投与すべきである。かかる投与は、必要ならば、病気の間、内科医によって適宜選択される適当な時間間隔で繰り返してもよい。
【００８３】
本発明の抗体は、また、例えば、ＲＡＮＫ−Ｌ媒介性障害の決定またはかかる障害の進行の追跡のための診断計画において使用してもよい。診断剤として、これらの抗体を、血清、血漿または他の適当な組織中のＲＡＮＫ−Ｌレベル、または培養中のヒト細胞によるその放出の測定のためのＥＬＩＳＡおよび他の慣用的なアッセイフォーマットにおける使用のために、慣用的に標識してもよい。抗体が使用されるアッセイの性質は従来のものであり、該開示を制限するものではない。
かくして、本発明の１の具体例は、骨ホメオスタシスの障害または自己免疫疾患および過剰または不足した破骨細胞またはＴ細胞活性に関連する他の病態（例えば、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、骨粗鬆症（ＯＰ）、転移性および原発性骨癌、磨耗破片により誘導される骨溶解または骨関節症（ＯＡ）を包含する骨減少性疾患、および乾癬、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する免疫疾患）の患者における診断を補助する方法であって、該患者から得られた試料（血漿または組織）中のヒトＲＡＮＫ−Ｌの量を決定し、正常集団内のヒトＲＡＮＫ−Ｌの平均量と該決定された量を比較する工程を含み、それにより、患者試料中のＲＡＮＫ−Ｌの有意に上昇した量の存在が骨または自己免疫疾患および過剰な破骨細胞またはＴ細胞数または活性に関連する他の障害を示すことを特徴とする方法に関する。同様に、患者試料中のＲＡＮＫ−Ｌの有意に減少した量の存在は、不足した破骨細胞数または活性に関連する骨疾患を示す。
【００８４】
本明細書に記載の抗体またはそのフラグメントは、保管のために凍結乾燥でき、使用前に適当な担体中で復元できる。該技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当該分野で既知の凍結乾燥および復元技術を用いることができる。
かくして、本発明は、（ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌに結合するモノクローナル抗体；（ｂ）モノクローナル抗体１４Ｆ３と同一の特徴を有するモノクローナル抗体；および（ｃ）モノクローナル抗体１４Ｆ３に関する。
【００８５】
本発明は、また、（ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌに結合する抗体の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離ポリペプチド；（ｂ）モノクローナル抗体１４Ｆ３の抗体としての特徴の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離ポリペプチド；（ｃ）モノクローナル抗体１４Ｆ３の免疫グロブリン相補性決定領域を含む単離ポリペプチドに関する。本発明は、また、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。
本発明のポリペプチドは、なかでも、配列番号５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるポリペプチドを含む免疫グロブリン相補性決定領域に関する。本発明のポリヌクレオチドは、なかでも、配列番号５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドに関する。本発明は、（ａ）免疫グロブリン相補性決定領域が配列番号５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるポリペプチドを含むヒトＲＡＮＫ−Ｌに結合するモノクローナル抗体；（ｂ）配列番号２に示されるような重鎖可変領域ポリペプチド、および／または配列番号４に示されるような軽鎖可変領域ポリペプチドを含むモノクローナル抗体に関する。
【００８６】
本発明のポリヌクレオチドは、また、配列番号２および配列番号４からなる群から選択されるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドに関する。
本発明は、モノクローナル抗体１４Ｆ３と同一の特徴を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に関する。また、（ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌに結合するモノクローナル抗体；（ｂ）モノクローナル抗体１４Ｆ３と同一の特徴を有するモノクローナル抗体；および（ｃ）モノクローナル抗体１４Ｆ３を含む医薬組成物が包含される。
【００８７】
本発明は、
ａ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌに結合する抗体に試料を曝露し；次いで
ｂ）ヒトＲＡＮＫ−Ｌに結合した抗体を検出する
ことを特徴とする、試料中のヒトＲＡＮＫ−Ｌの存在を検出する方法に関する。なかでも、好ましい方法は、ヒトＲＡＮＫ−Ｌ蛋白質が抗体による結合に利用しやすいように、抗体への曝露前に試料を処理する。ヒトＲＡＮＫ−Ｌに結合する好ましい抗体は、モノクローナル抗体１４Ｆ３と同一の特徴を有し、より好ましくは、モノクローナル抗体１４Ｆ３である。
【００８８】
下記の実施例は、本発明の種々の態様を説明するものであり、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。全てのアミノ酸は、慣例の３文字または１文字コードによって示される。全ての必要な制限酵素、プラスミドならびに他の試料および材料は、別記しないかぎり、商業的供給元から入手された。全ての一般的なクローニングおよび他の組み換えＤＮＡ法は、T.Maniatisら（上記）または同じ出版元（Sambrookら）によるその第二版（1989）Sambrookら編において行われたとおりであった。
【実施例】
【００８９】
生物学的方法／実施例
実施例１−ＲＡＮＫ−Ｌに対するＭＡｂの生産
Ａ．モノクローナル抗体作成
モノクローナル抗体は、ＣＢ６ ｆ１マウスを可溶性ヒトＲＡＮＫＬ蛋白質の複数投与で免疫することによって作成された。免疫化したマウスから抗血清を取り、抗−ＲＡＮＫＬ抗体について力価を決定した。試験出血（test bleed）イムノアッセイに基づいて、最も応答するマウスを膵臓切除の３日および１日前に追加免疫した。膵臓を取り出し、ポリエチレングリコール法を用いて、膵臓細胞をＸ６３ ＡＧ８ ６５３ミエローマ細胞と融合した。次いで、融合細胞を２０ｘ９６ウェル組織培養プレート中で培養した。融合の１４日後、ハイブリドーマをＲＡＮＫＬ蛋白質に結合する抗体についてアッセイした。ＲＡＮＫＬに結合する抗体を有するハイブリドーマを、ハイブリドーマの成長速度にしたがって、徐々に大きくなる組織培養プレートに展開した。ハイブリドーマ由来の上清をイムノアッセイに用いて、抗体特異性およびＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ結合の中和におけるその生物学的活性を確認した。確認したならば、ハイブリドーマ細胞系統を低温保存し、血清不含培地中で抗体産生について評価した。
【００９０】
ＲＡＮＫＬ蛋白質に対する抗体の作成における大きな問題は、ハイブリドーマ培養物のアポトーシスであった。これは通常、ハイブリドーマ拡大の初期段階において起こり、完全な細胞系統の死または抗体合成をスウィッチオフした非生産者ハイブリドーマ細胞系統の生成のいずれかをもたらした。１００を超える他の抗原を用いる発明者らの観察に関して、該問題はむしろ、ＲＡＮＫＬ抗原に特有であった。該影響は、おそらく、ネズミＲＡＮＫＬに対するＲＡＮＫＬ抗体の弱い交差反応性に由来する。ＲＡＮＫＬがハイブリドーマ細胞上に存在する場合、該ハイブリドーマ培養培地中の比較的高濃度のＲＡＮＫＬ抗体がアポトーシスのＲＡＮＫＬ誘導への結びつきを導きうる。成長を刺激し、アポトーシス効果を相殺するためのハイブリドーマ成長因子を付加してみたが、該ハイブリドーマ細胞系統のほとんどで効果的ではないことが証明された。該問題の結論は、細胞系統死または制止されたＩｇＧ合成のいずれかであり、ハイブリドーマの９０％以上が該融合から失われていた。いくつかの融合において、全てのハイブリドーマがこのように失われた。
該影響に抵抗するために、複数のマウスを免疫し、その脾臓を逐次用いて、生物学的アッセイにおける評価のための抗−ＲＡＮＫＬ抗体を分泌している安定なハイブリドーマのパネルを作成した。
【００９１】
Ｂ．１４Ｆ３Ｍａｂの精製および配列決定
各々、製造者の指示書を用いて、１４Ｆ３ＭａｂをＰｒｏｓｅｐＡ（Bio Processing, Consett, UK）クロマトグラフィーにより精製した。該Ｍａｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより＞９５％純度であった。Ｎ−末端配列分析のために、重鎖および軽鎖ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）膜に移し、直接配列決定した（P. Matsudaira J.Biol.Chem., 262: 10035-10038, 1987）。
【００９２】
Ｃ．Ｍａｂのイソ型分類
ネズミＲＡＮＫＬ ｍＡｂ １４Ｆ３を市販のキット（Zymed, Amersham）によりイソ型分類し、ＩｇＧ２ａ／ｋａｐｐａであることがわかった。
【００９３】
実施例２−アッセイ
Ａ．プラスチック上に被覆したヒトＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋白質および溶液中での検出のためのビオチン化可溶性ヒトＲＡＮＫＬ蛋白質を用いて、競合ＥＬＩＳＡを確立した。ＲＡＮＫ−ＦｃおよびＲＡＮＫＬ蛋白質は、各々、ＣＨＯ細胞およびピチア・パストリス（Pichia pastoris）において生産され、＞９０％均質性に精製された。ｓｈＲＡＮＫＬ（可溶性、ヒトＲＡＮＫＬ）蛋白質は、製造者の説明書にしたがって、蛋白質に対するＮＨＳ−ビオチンの２０：１モル比でビオチン化した（Pierce, Rockford, IL）。９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩、ｐＨ９．６炭酸塩−重炭酸塩バッファー中における５０ｎｇ／ウェル（０．５３ナノモル）ＲＡＮＫ−Ｆｃで被覆した。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するｐＨ７．４Ｔｒｉｓ−セーラインバッファーで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中室温で２時間ブロックした。競合蛋白質（ＲＡＮＫ−Ｆｃ；デスレセプター５（ＤＲ５）−Ｆｃ；ＯＰＧ−Ｆｃ；ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ １４Ｆ３）を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中で希釈し、ウェルに加えた後、ビオチン化したｓｈＲＡＮＫＬ（０．４３ｎＭ）を添加し、合わせた試料を室温で２時間インキュベートした。アルカリホスファターゼ結合型ストレプトアビジンを用いて、被覆したＲＡＮＫ−Ｆｃ（＋／−競合物質）に結合したビオチン化ｓｈＲＡＮＫＬの量を測定した。シグナル検出のための基質は、１０５ＰＮＰＰ（Pierce Inc., Rockford, IL）であり、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ３４０プレートリーダーを用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ＤＲ５−Ｆｃ蛋白質は、それがＲＡＮＫＬと相互作用しなかったことを示す種々の他の研究からの予測どおり、阻害を示さなかった。いくつかの異なる並行アッセイにおいて、ＯＰＧ−Ｆｃは、ＲＡＮＫＬ−Ｆｃより強力な阻害剤であり、各々約０．５および６ｎＭのＩＣ５０を有した。１４Ｆ３ｍＡｂは、ＯＰＧ−Ｆｃにより類似した強度を示し、約２ｎＭのＩＣ５０を有した。
【００９４】
Ｂ．培養中におけるヒト単球由来の樹状細胞の成熟の阻害
勾配単離によって精製された新鮮なヒト単球を培養中６日間、組み換えヒトＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理して、抗原捕獲表現型を有する樹状細胞（未熟ＤＣ）を作成した。６日目に培地を、ＴＮＦαアンタゴニストＴＮＦＲＩＩ−Ｆｃ（３０μｇ／ｍｌ）またはＲＡＮＫＬ ｍＡｂ １４Ｆ３（３０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下での組み換えヒトＴＮＦα（３０ｎｇ／ｍｌ）または可溶性ＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかの添加で交換した。単独のＴＮＦαまたはＲＡＮＫＬは、表現型、形態学的、および機能的特性によって測定したとき、成熟ＤＣの形成を誘導した。かくして、該細胞は、細胞表面ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８０およびＭＨＣＩＩのアップレギュレーション、およびＣＤ１ａのダウンモジュレーションを示した。未熟細胞が大飲作用を示すＦＩＴＣ−デキストランの著しい取り込みを示したのに対し、成熟細胞は該能力を事実上失っていた。ＴＮＦαは、成熟誘導においてＲＡＮＫＬよりも効果的であり、成熟ＤＣの本質的に均質の集団をもたらした。対照的に、ＲＡＮＫＬでの処理は、類似の表現型を有する細胞の集団を生じたが、該細胞のほんのわずかだけ（種々のドナーから得られた単核細胞を用いる種々の実験において３０−８０％）が、ＲＡＮＫＬで処理した細胞において該表現型を示した。ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ １４Ｆ３は、ｓＲＡＮＫＬで処理した細胞の成熟を阻害したが、ＴＮＦαで処理した細胞に対し影響を及ぼさなかった。同様に、ＴＮＦＲＩ−Ｆｃは、ＴＮＦαで処理した細胞の成熟を阻害したが、ｓＲＡＮＫＬで処理した細胞に対し影響を及ぼさなかった。したがって、ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ １４Ｆ３は、ＤＣ成熟のＲＡＮＫＬ誘導の機能的活性を特異的に阻害する。
【００９５】
Ｃ．細胞培養中、ヒトｓＲＡＮＫＬに刺激された骨髄ネズミ破骨細胞形成の阻害
６週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウス大腿から骨髄細胞を収集し、３回洗浄し、カウントし、次いで、培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび２５ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ−１、５０ｎｇ／ｍｌ可溶性ＲＡＮＫＬ）中に再懸濁した。これらの細胞をＮｕｎｃ２４−ウェルマルチウェルプレート中に５ｘ１０５／ウェルで播種し（４連）、７−１０日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。試験物質（例えば、抗体、ＯＰＧ−Ｆｃ）を培養開始時に加えた。培地および試験物質を３−４日ごとに取り替えた。培養期間の終わりに、細胞を固定し、Ｓｉｇｍａキット３８６−１を用い、製造者の指示書にしたがって、滴定−耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）について染色した。各ウェル中の破骨細胞の数（＞３核を有するＴＲＡＰ陽性細胞として定義される）を顕微鏡で数えた。ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ １４Ｆ３およびＯＰＧ−Ｆｃの両方は、ウェルあたりの発育している破骨細胞の数によって測定したとき、１μｇ／ｍｌ濃度にて破骨細胞形成を完全に阻害し、その両方が、約２００ｎｇ／ｍｌの該アッセイ中のＩＣ５０を示した。対照的に、ＲＡＮＫ−Ｆｃ融合蛋白質は、１０μｇ／ｍｌで完全に阻害したが、２μｇ／ｍｌでは影響を及ぼさなかった。
【００９６】
Ｄ．ＲＡＮＫＬによって媒介されるヒト単球破骨細胞形成の阻害
ヒト単球を、上記セクションＢにおける樹状細胞成熟について記載のように調製した。５０ｎｇ／ｍｌヒト可溶性ＲＡＮＫＬ＋２５ｎｇ／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦの存在下におけるこれらの細胞の６−８日間の培養は、骨吸収活性を有する破骨細胞の形成を導いた。阻害研究のために、ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ １４Ｆ３またはＲＡＮＫ−Ｆｃ蛋白質を培養開始時に加え、破骨細胞の形成を多核細胞の形成によってモニターした。１のアッセイにおいて、ネズミ破骨細胞形成アッセイにおける観察とは対照的に（上記Ｃ部分）、１４Ｆ３ ｍＡｂは約４μｇ／ｍｌのＩＣ５０を与えたのに対し、ＲＡＮＫ−Ｆｃ蛋白質は約５００ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０を有し、より活性であった。
【００９７】
まとめると、これらの結果は、ＲＡＮＫＬ ｍＡｂ １４Ｆ３が、ヒトＲＡＮＫＬとその受容体ＲＡＮＫとの間の相互作用の強力な阻害剤であることを示す。該阻害は、ＲＡＮＫＬに媒介されるＤＣ成熟ならびに破骨細胞発達および機能の拮抗を導く。
【００９８】
実施例３−ＣＤＲ配列
遺伝子クローニングおよび配列分析：
下記に簡単に記載する標準的な分子生物学的方法を用いて、可変重鎖および軽鎖遺伝子をハイブリドーマ細胞からクローン化した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Life Technologies Cat. #15596-026）を用い、製造者のプロトコールにしたがって、全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞から単離した。該ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲキットで製造者の指示により（Boehringer Mannheim Cat. No. 1483-188）、ポリ−ｄＴオリゴヌクレオチドをプライミングのために用いて逆転写した。第１鎖ｃＤＮＡ合成の後、３’定常領域特異的プライマーおよび縮重５’プライマーを用いて、重鎖および軽鎖Ｖ領域をＰＣＲ増幅した。縮重５’プライマー配列は、可変重鎖または軽鎖領域の予め決定されたＮ末端アミノ酸配列をコードするように設計された。マルチプルクローン由来の全長配列を各ＰＣＲ増幅物から得、コンセンサスを提供するように整列させた。したがって、重鎖および軽鎖の両方についてＤＮＡ配列の最初の１７塩基は作成されたＰＣＲプライマーであるが、その翻訳蛋白質配列は天然であった。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年1月8日(2004.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005515752000001.app
【国際調査報告】
2005515752.tif 000011
2005515752.tif 000012