(57)【要約】本発明は、配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５または配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７によりコードされる、それぞれＫｓｈＡタンパク質またはＫｓｈＢタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド配列、およびその機能的ホモログに関する。本発明のポリヌクレオチドは、あるステロイド産物を蓄積するステロイドの微生物性分解において有用である、３−ケトステロイド  ９α−ヒドロキシラーゼ活性を遮断された遺伝的に改変された微生物を構築するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５または配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７によりコードされるそれぞれＫｓｈＡタンパク質またはＫｓｈＢタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド配列、およびその機能的ホモログ。
【請求項２】
配列番号１の核酸配列、好ましくは、ヌクレオチド４９９−１６９５を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列番号１の核酸配列からなる、請求項１または２記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
配列番号２の核酸配列、好ましくは、配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項５】
配列番号２の核酸配列からなる、請求項１または４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項６】
配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５または配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７によりコードされるポリペプチド配列。
【請求項７】
遺伝的に改変された微生物、好ましくはアクチノマイセターレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）科の微生物であることを特徴とする、３−ケトステロイド  ９α−ヒドロキシラーゼ活性を遮断された微生物。
【請求項８】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属のものである、請求項７記載の微生物。
【請求項９】
ＫＳＨ活性をコードする遺伝子、好ましくは遺伝子ｋｓｈＡおよび／または遺伝子ｋｓｈＢの標的化遺伝子不活性化、好ましくは非標識遺伝子不活性化により得られ得る、請求項７または８のいずれか１項記載の微生物。
【請求項１０】
さらに、３−ケトステロイド  Δ１−デヒドロゲナーゼ活性をコードする少なくとも１つの遺伝子が、好ましくは非標識遺伝子欠失により不活性化されている、請求項７〜９のいずれか１項記載の微生物。
【請求項１１】
遺伝的に改変された微生物ＲＧ２、ＲＧ４およびＲＧ９から選ばれる、請求項７〜１０のいずれか１項記載の微生物。
【請求項１２】
ＫＳＨ活性をコードする遺伝子、好ましくは遺伝子ｋｓｈＡおよび／または遺伝子ｋｓｈＢを不活性化することを含んでなる、ステロイド核を分解する能力を欠くステロイド分解性微生物の遺伝的に改変された株を構築する方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の不活性化が標的化遺伝子欠失、好ましくは非標識遺伝子欠失により達成される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ステロイドΔ１−脱水素化における、好ましくは、１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンおよびプレドニソロンの製造における、遺伝的に改変された微生物の使用。
【請求項１５】
アクチノマイセターレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）科の微生物におけるＫＳＨ活性をコードする遺伝子、好ましくは遺伝子ｋｓｈＡおよび／または遺伝子ｋｓｈＢの標的化遺伝子不活性化、好ましくは非標識遺伝子欠失により前記微生物が得られている、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
前記微生物が、遺伝的に改変された株ＲＧ２、ＲＧ４およびＲＧ９から選ばれる、請求項１４または１５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ケトステロイド  ９α−ヒドロキシラーゼ成分をコードする単離されたポリヌクレオチド配列、３−ケトステロイド  ９α−ヒドロキシラーゼ活性を遮断された微生物、該微生物の製造方法、およびステロイドΔ１−脱水素化におけるそのような微生物の使用に関する。
【０００２】
現在のところ、微生物によるステロール／ステロイド分解において４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）および１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオン（ＡＤＤ）の９α−ヒドロキシル化を行う酵素である３−ケトステロイド  ９α−ヒドロキシラーゼ（ＫＳＨ）に関しては、非常に限られた知見しか得られていない。ＫＳＨ成分をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は報告されていない。さらに、酵素精製操作においては幾つかの問題に直面する（Ｃｈａｎｇ，Ｆ．Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９６４）３：１５５１−１５５７；Ｓｔｒｉｊｅｗｓｋｉ，Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８２）１２８：１２５−１３５）。ＫＳＨ活性を有する三成分モノオキシゲナーゼはノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）種Ｍ１１７から部分的に精製されており、フラボタンパク質レダクターゼと２つのフェレドキシンタンパク質とから構成される三成分酵素系を構成することが判明している（Ｓｔｒｉｊｅｗｓｋｉ，Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８２）１２８：１２５−１３５）。アルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）３１７においては、ステロイド多環式環構造の９α−ヒドロキシル化はプラスミドに担われるらしい（Ｄｕｔｔａ，Ｒ．Ｋ．ら  Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）３２：  ３１７−３２４）。しかし、該プラスミドのヌクレオチド配列分析は報告されていない。
【０００３】
遺伝的データの欠如が、所望の特性（すなわち、ステロイドの９α−ヒドロキシル化の遮断）を有する分子的に明示された突然変異株を、遺伝子工学により構築することを妨げている。突然変異体は古典的な突然変異誘発により単離されているが、これらの株は、主として遺伝的不安定性および／または低い生物変換効率のため、通常は工業的方法においては不適当である。分子的に明示された突然変異体は、古典的な突然変異誘発により作製された突然変異体と比較して幾つかの利点を有する。該構築変異体は遺伝的に安定であり、導入されている突然変異は、十分に特徴づけられた遺伝的改変である。遺伝的に操作された株の構築は、９α−ヒドロキシル化（例えば、α，α−ジピリジル、ｏ−フェナントロリン）を遮断するための化学物質の広範な使用を不用にする。ＫＳＨ活性を遮断するために使用する化学物質は反応特異的ではなく、他の重要な酵素反応（例えば、ステロール側鎖分解におけるステロール  ２６−ヒドロキシル化）を阻害し、これはステロールの生物転換効率に負の影響を及ぼしうる。遺伝子工学による明示された突然変異体の使用はこれらの問題を克服する。
【０００４】
３−ケトステロイド  ９α−ヒドロキシラーゼ（ＫＳＨ）は、微生物によるステロイド環Ｂ開環経路における主要な酵素である。ＫＳＨはＡＤから９α−ヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン（９ＯＨＡＤ）への変換およびＡＤＤから化学的に不安定な化合物［９ＯＨＡＤＤ］への変換を触媒する。ＫＳＨ活性は多数の細菌属（Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｋ．Ａ．、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９７７）２２：２９−５８；Ｋｉｅｓｌｉｃｈ，Ｋ．、Ｊ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：４６１−４７４；Ｍａｈａｔｏ，Ｓ．Ｂ．ら．、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ（１９９７）６２：３３２−３４５）、例えばロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）（Ｄａｔｃｈｅｖａ，Ｖ．Ｋ．ら、Ｓｔｅｒｏｉｄｓ（１９８９）５４：２７１−２８６；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００１）２０５：１９７−２０２）、ノカルジア（Ｓｔｒｉｊｅｗｓｋｉ，Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８２）１２８：１２５−１３５）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）（Ｄｕｔｔａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９２）３２：３１７−３２４）およびマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（Ｗｏｖｃｈａ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９７８）５３１：３０８−３２１）において見出されている。ＫＳＨ活性を欠く細菌株はステロール／ステロイド生物転換において重要だとみなされている。ＫＳＨ活性を遮断された突然変異体はＫＳＴＤ（３−ケトステロイド  Δ１−デヒドロゲナーゼ）反応のみ行ない得、ステロイド化合物の選択的Δ１−脱水素化をさせるであろう。具体例としては、コルチゾールからプレドニソロンへの生物転換およびＡＤからＡＤＤへの生物転換が挙げられる。ステロイド  ９α−ヒドロキシル化の段階で遮断された突然変異体によるステロールの生物変換もステロール側鎖の選択的分解をもたらして、生物活性ステロイドホルモンの合成のための優れた前駆体であるＡＤおよび／またはＡＤＤを蓄積しうる。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の１つの局面においては、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）のｋｓｈＡおよびｋｓｈＢと称される２つの遺伝子の単離されたポリヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１および配列番号２）を提供する。ＫｓｈＡタンパク質は配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５によりコードされ、ＫｓｈＢタンパク質は配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７によりコードされる。したがって、特に好ましいのは、それぞれ配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５の及び配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７の完全コードＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチドである。
【０００６】
さらに、コドン可変性を適合化させるために、本発明はまた、ＫｓｈＡタンパク質およびＫｓｈＢタンパク質の同じアミノ酸配列をコードする配列を含む。発現されるタンパク質の個々のドメインをコードするコード配列の部分、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体も本発明の一部である。場合によっては、遺伝子は、追加的なエキソン配列の含有またはエキソンの除去をもたらすスプライシング変異体として発現される。また、部分的なエキソン配列が含有または除去されうる。遺伝子は、遺伝子内の異なる部位に位置する代替的プロモーターからも転写されて、異なる５’末端を有する転写産物を与えうる。また、転写は異なる部位において終結して、異なる３’末端の転写産物を与えうる。これらの配列およびこれらの配列によりコードされるタンパク質はすべて、同一または類似の機能を行なうと予想され、それらも本発明の一部を構成する。本発明で提供する配列情報は、誤って同定された塩基を含めなければならないほど狭く解釈されるべきではない。本明細書に開示する特定の配列は、完全な遺伝子を単離するために容易に使用することが可能であり、そして該遺伝子を更なる配列分析に容易に供することが可能であり、それにより配列決定の誤りを同定することができる。
【０００７】
本発明は更に、若干の変異を有する又は多型部位を有するポリヌクレオチドに関する。若干の変異を有するポリヌクレオチドは、天然の成熟タンパク質と同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドをコードする。
【０００８】
本発明のＤＮＡは、配列番号１または配列番号２に由来する適当なプローブを使用してｃＤＮＡから得ることができる。あるいは、該コード配列はゲノムＤＮＡであることが可能であり、あるいはＤＮＡ合成技術を用いて製造することが可能である。該ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態でもありうる。該ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合には、それは一本鎖または二本鎖の形態でありうる。該一本鎖はコード鎖または非コード鎖でありうる。
【０００９】
本発明は更に、配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５の及び配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７の全ＤＮＡ配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％、非常に好ましくは９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。そのようなポリヌクレオチドは、天然の成熟タンパク質と同じ生物学的機能または活性を保有するポリペプチドをコードする。あるいは、基質に尚も結合しうる該タンパク質のドメインをコードする前記ポリヌクレオチドの断片も本発明に含まれる。
【００１０】
２つの配列間の同一性（％）は、デフォルト設定で使用されるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ１．７（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９４）２２：４６７３−４６８０：“ＣＬＵＳＴＡＬＷ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ．”）のようなプログラムを使用して測定することができる。同一性（％）は、一般には、既知配列の残基の総数で割り算された２つの配列間の同一残基数として定義される。
【００１１】
類似性は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ１．７において定められる以下のグループによるアライメントにおける同一性とすべての半保存アミノ酸残基との組合せとして定義される：
‘＊’＝同一性＝単一の完全に保存された残基を有する位置を示す：
‘：’＝半保存＝以下の「強い」グループの１つが完全に保存されていることを示す：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ；
‘．’＝半保存＝以下の「より弱い」グループの１つが完全に保存されていることを示す：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ、ＨＦＹ。これらはすべて、Ｇｏｎｎｅｔ  Ｐａｍ２５０マトリックスにおいて見出される正得点化（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ  ｓｃｏｒｉｎｇ）グループである。
【００１２】
例えばアクチノマイセターレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）科（例えば、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））における新規遺伝子の機能的ホモログも本発明の範囲内である。
【００１３】
類似作用を有するそのような遺伝子を他の微生物において同定するために、そのような目的のための当技術分野で公知の（ポリ）ヌクレオチドの検出のための任意の方法が本発明に含まれる。例えば、ヌクレオチド伸長方法／増幅方法が意図されうるが、また、そのような方法は、ＫｓｈＡまたはＫｓｈＢのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに特異的なプローブを、該プローブが該ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするのに有効な条件下でサンプルにハイブリダイズさせる工程、および該サンプル中のポリヌクレオチドへの該プローブのハイブリダイゼーションを判定する工程を含みうる。この場合の「特異的」なる語は、ハイブリダイゼーションの大部分が本発明のポリヌクレオチドと生じることを意味する。好ましくは、該プローブは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチドの少なくとも２５個を含む。より好ましくは、該プローブは５０個、特に好ましくは１００個を超える、配列番号１または配列番号２のヌクレオチドを含む。最も好ましくは、該プローブは、それぞれ配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５および配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７から選ばれるヌクレオチドのポリヌクレオチドからなる。ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシーの条件、例えば約４５℃、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）およびそれに続く５０℃、２．０×ＳＳＣでの洗浄が当業者に公知であり、あるいはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に記載されている。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃、約２．０×ＳＳＣの低いストリンジェンシーから５０℃、約０．２×ＳＳＣの高いストリンジェンシーまでの範囲から選ばれうる。また、洗浄工程における温度は、室温、例えば２２℃の低いストリンジェンシー条件から約６５℃の高いストリンジェンシーまで増加させることが可能である。
【００１４】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、例えば他の種における遺伝子破壊を目的として、特定の遺伝子を標的化するために使用することも可能である（例えば、ＷＯ  ０１／３１０５０およびそれに引用されている参考文献を参照されたい）。
【００１５】
本発明の新たに同定されたポリヌクレオチドの配列（配列番号１および配列番号２）は、適当な宿主細胞内でのコード化タンパク質の発現のためのベクター分子の製造において使用することも可能である。タンパク質ＫｓｈＡもしくはＫｓｈＢまたはそれらの一部をコードする核酸配列のクローニングにおいては、多種多様な宿主細胞とクローニングビヒクルとの組合せを有用に用いることが可能である。例えば、有用なクローニングビヒクルは、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列、例えば種々の公知の細菌プラスミドおよびより広い宿主域のプラスミド、ならびにプラスミドおよびファージまたはウイルスＤＮＡの組合せに由来するベクターを含みうる。機能的ドメインを含む本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を発現するのに使用するビヒクルは更に、該タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された制御配列を含む。そのような制御配列は、一般にプロモーター配列、ならびに発現レベルを調節および／または増強する配列を含む。もちろん、制御配列および他の配列は、選択される宿主細胞に応じて様々なものとなりうる。
【００１６】
適当な発現ベクターとしては、例えば、細菌または酵母プラスミド、広宿主域プラスミド、ならびにプラスミドおよびファージまたはウイルスＤＮＡの組合せに由来するベクターが挙げられる。染色体ＤＮＡに由来するベクターも含まれる。さらに、本発明のベクター中には、複製起点および／または優性選択マーカーが存在しうる。本発明のベクターは宿主細胞の形質転換に適している。組込みベクターも、適当な発現ベクターとみなされうる。
【００１７】
本発明のＤＮＡを含む組換え発現ベクター、および該ＤＮＡまたは該発現ベクターで形質転換された細胞も、本発明の一部を構成する。
【００１８】
本発明の適当な宿主細胞としては、細菌宿主細胞、酵母および他の真菌、昆虫、植物または動物宿主細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞またはサル細胞またはヒト細胞系が挙げられる。したがって、本発明のＤＮＡまたは発現ベクターを含む宿主細胞も本発明の範囲内である。これらの操作された宿主細胞は、例えば適当な選択、増幅または転写誘導のために改変されうる通常の栄養培地内で培養することができる。温度、ｐＨ、栄養素などのような培養条件は当業者に周知である。
【００１９】
本発明のＤＮＡまたはベクターの製造および該ＤＮＡまたはベクターでの宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションのための技術は、当技術分野においては標準的なものであり、周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照されたい。
【００２０】
本発明のもう１つの局面においては、前記ＤＮＡ分子のいずれかによりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質を提供する。好ましくは、本発明のタンパク質は、それぞれ配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５または配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７によりコードされるアミノ酸配列を含む。本発明のポリヌクレオチドによりコードされる、翻訳後プロセシングにより生じたタンパク質も、本発明の一部である。
【００２１】
配列の変異を有するが機能的特性を尚も維持する、ＫｓｈＡおよびＫｓｈＢまたはそれらの一部のアミノ酸配列と相同なタンパク質である機能的等価体も、本発明に含まれる。
【００２２】
配列内に生じうる変異は、配列全体におけるアミノ酸の相違により、又は該配列内のアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位もしくは付加により示されうる。生物学的活性を本質的に変化させないと予想されるアミノ酸置換が記載されている。関連アミノ酸間のアミノ酸置換、または進化において頻繁に生じた置換としては、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌ（Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９７８，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３）が挙げられる。この情報に基づき、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎは、迅速かつ高感度なタンパク質比較（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７，１４３５−１４４１）および、相同ポリペプチド間の機能的類似性を測定する方法を開発した。そのような変異体をコードするポリヌクレオチドも本発明の一部であることが明らかであろう。
【００２３】
本発明のポリペプチドはまた、それぞれ配列番号１のヌクレオチド４９９−１６９５または配列番号２のヌクレオチド３８７−１４２７によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そして更には、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より一層好ましくは９５％の類似性を有するポリペプチドを含む。生物学的効果を尚も与え得るそのようなポリペプチドの一部も含まれる。
【００２４】
本発明のもう１つの局面は、遺伝的に改変された微生物である。９α−ヒドロキシル化を引き起こし得ない突然変異株の構築には、ＫＳＨ活性をコードする遺伝子を同定しなければならず、それらのヌクレオチド配列が既知でなければならない。ｋｓｈＡおよびｋｓｈＢと称される本発明の２つの遺伝子は、ＫＳＨをコードするロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＱ１中で確認されている。これらの遺伝子は、共にＡＤ（Ｄ）の９α−ヒドロキシル化が損なわれている株ＲＧ１−ＵＶ２６およびＲＧ１−ＵＶ３９と称される２つのＵＶ突然変異体の機能的相補性によりクローニングされた。それらは、株ＳＱ１のｋｓｔＤ（３−ケトステロイドΔ１−デヒドロゲナーゼ＝ＫＳＴＤ１）遺伝子欠失突然変異体であるロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）株ＲＧ１（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｉｚｅ，Ｒ．ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００１年投稿）のＵＶ照射細胞の広範なスクリーニングにより単離された。株ＲＧ１−ＵＶ２６およびＲＧ１−ＵＶ３９はＡＤおよびＡＤＤ上では増殖し得なかったが、９ＯＨＡＤ上では正常に増殖した。これはＫＳＨ活性の欠損を示している。
【００２５】
ＫＳＨ欠損突然変異株ＲＧ１−ＵＶ２６およびＲＧ１−ＵＶ３９の機能的相補性ならびにｋｓｈＡおよびｋｓｈＢ遺伝子のクローニングのために、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＲＥＳＱを使用して、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ１のゲノムライブラリーを構築した（図１）。Ｓａｕ３Ａで消化された、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ１の染色体ＤＮＡをショ糖勾配により６〜１０ｋｂにサイズ化し、ＢｇｌＩＩにより消化されたｐＲＥＳＱ内に連結した。この連結混合物での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）の形質転換は、該構築物の約９０％が挿入物を含有する約１５，０００個の形質転換体の遺伝子ライブラリーを与えた。平均の挿入物サイズは６ｋｂと推定された。安定性または再配置の問題は全く見られなかった。該遺伝子ライブラリーは、約６Ｍｂのゲノムサイズが推定される完全なゲノム（ｐ＞０．９９）を示す。
【００２６】
ＲＧ１−ＵＶ３９およびＲＧ１−ＵＶ２６内への該ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ１ゲノムライブラリーの導入、ならびにそれに続くＫＳＨ欠損の相補性に関するスクリーニングは、それぞれｋｓｈＡ遺伝子およびｋｓｈＢ遺伝子を含有する２つの独立したＤＮＡ断片のクローニングをもたらした（図２）。
【００２７】
これらの遺伝子の分析は、ｋｓｈＡが３９８アミノ酸のタンパク質（ＫｓｈＡ）をコードしていることを示した。ＫｓｈＡは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）における遺伝子Ｒｖ３５２６（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＢ０５０５１）によりコードされる仮説的タンパク質に対して高い類似性（５８％の同一性；８４％の類似性）を示した（Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９３：５３７−５４４）。したがって、Ｒｖ３５２６はマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）におけるｋｓｈＡのホモログであると予想される。得られたｋｓｈＡのヌクレオチド配列をデータベースと比較したところ、ｋｓｈＡは、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）株ＴＡ４２１においてＭａｅｄａ，Ｍ．ら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）６１：５４９−５５５）により見出された、ｂｐｈＣ１の上流の仮説的遺伝子（ＯＲＦ１２）（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８８０１３）（図３）と同一（９７％）であることが示された。株ＴＡ４２１で見出される分子構成の類推により、この株においてＯＲＦ１２の下流で同定された仮説的ＯＲＦ１１が株ＳＱ１におけるｋｓｈＡの下流においても同定された。したがって、株ＳＱ１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列と株ＴＡ４２１のＤＮＡ断片のヌクレオチド配列とを合体させ、得られた仮説的ヌクレオチド配列を使用して、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）株ＳＱ１および株ＲＧ８における非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）インフレームｋｓｈＡ遺伝子欠失の導入（それぞれ、株ＲＧ２および株ＲＧ９を与える）に使用されるプラスミドｐＫＳＨ１２６を構築するのに成功した（図３）。
【００２８】
ｋｓｈＢ遺伝子は３４６アミノ酸のタンパク質（ＫｓｈＢ）をコードしている。データベースの類似性検索は、ＫｓｈＢが多成分オキシゲナーゼのフェレドキシンレダクターゼ成分に対して高い類似性を示すことを明らかにした。マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＲｖ３５７１（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ａ７０６０６）で最高の類似性（５６％の同一性、８５％の類似性）が見出された。
【００２９】
非標識（ｕｎｍａｒｋｅｄ）遺伝子欠失によるｋｓｈＡまたはｋｓｈＢの不活性化は、ＫＳＨ活性が存在しないために更なる代謝を受けないＡＤＤを産生するＡＤの選択的Δ１−脱水素化を行いうる、分子的に明示される遺伝的に安定な突然変異株を与える（ＷＯ  ０１／３１０５０を参照されたい）。ｓａｃＢ対抗選択系（ＷＯ  ０１／３１０５０に記載されている）を用いて、３つの非標識遺伝子欠失突然変異株を構築した。すなわち、ｐＫＳＨ１２６（図３）を使用してｋｓｈＡ突然変異体ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ２を、ｐＫＳＨ２１２（図４）を使用してｋｓｈＢ突然変異体ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ４を、そしてｋｓｔＤ  ｋｓｔＤ２  ｋｓｈＡ突然変異体ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ９を構築した。株ＲＧ２およびＲＧ４はロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＱ１から誘導される。株ＲＧ９は、ｐＫＳＨ１２６（図３）を使用してｋｓｔＤ  ｋｓｔＤ２突然変異体ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ８から誘導される。株ＲＧ８は両方の３−ケトステロイド  Δ１−デヒドロゲナーゼイソ酵素（ＫＳＴＤ１およびＫＳＴＤ２；ＷＯ  ０１／３１０５０に記載されている）を欠いている。
【００３０】
したがって、本発明のもう１つの局面は、遺伝的に改変された微生物、特にアクチノマイセターレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）科の微生物、好ましくはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の微生物、最も好ましくはロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）であることを特徴とする、３−ケトステロイド  ９α−ヒドロキシラーゼ活性を遮断された微生物である。３−ケトステロイド  Δ１−デヒドロゲナーゼ活性をコードする少なくとも１つの遺伝子が不活性化された株、好ましくは非標識遺伝子欠失により不活性化された株も好ましい。特に好ましいのは、株ＲＧ２、ＲＧ４およびＲＧ９である。
【００３１】
また、本発明の局面は、ＫＳＨ活性をコードする遺伝子、好ましくは遺伝子ｋｓｈＡおよび／または遺伝子ｋｓｈＢを不活性化することを含んでなる、ステロイド核を分解する能力を欠くステロイド分解性微生物の遺伝的に改変された株を構築するための方法である。好ましくは、該遺伝子の不活性化は標的化（好ましくは非標識）遺伝子欠失により達成される。
【００３２】
本発明のもう１つの局面は、ステロイドΔ１−脱水素化における、特に、１，４−アンドロスタジエン−３，１７−ジオンおよびプレドニソロンの製造における、遺伝的に改変された微生物の使用である。好ましくは、そのような使用のための微生物は、アクチノマイセターレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）科の微生物におけるＫＳＨ活性をコードする遺伝子、好ましくは遺伝子ｋｓｈＡおよび／または遺伝子ｋｓｈＢの標的化遺伝子の不活性化、好ましくは非標識遺伝子欠失により得られる。この使用のための好ましい微生物は、遺伝的に改変された株ＲＧ２、ＲＧ４およびＲＧ９から選ばれる。
【００３３】
微生物株ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ２、ＲＧ４およびＲＧ９は、それぞれ受託番号ＤＳＭ  １４５４４、ＤＳＭ  １４５４５およびＤＳＭ  １４５４６としてＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ），Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １Ｂ，Ｄ−３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに寄託されている。これらの寄託はブダペスト条約の条項に従い行われた。
【００３４】
該突然変異誘発法において使用するビヒクルを構築するための方法はよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，最新版）。さらに、部位特異的突然変異誘発、追加的な配列の連結、ＰＣＲ、ＤＮＡの配列決定および適当な発現系の構築のための技術もすべて、現在までに当技術分野で周知である。所望のタンパク質をコードするＤＮＡの一部または全部は、標準的な固相技術を用いて合成的に構築することが可能であり、好ましくは、それにより、連結を容易にする制限部位を含有させる。
【００３５】
破壊された遺伝子突然変異の導入、標的化遺伝子の不活性化、特に非標識遺伝子の欠失、ならびに形質転換および接合のための方法の改変および変更は、本発明の詳細な説明から当業者に明らかであろう。そのような改変および変更は本出願の範囲内に含まれると意図される。ＫＳＨ活性を欠く微生物を構築するための、本明細書に記載および言及されている方法および材料の使用方法は、当業者により理解されるであろう。
【００３６】
以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではないと解釈されるべきである。
【００３７】
実施例
概略
ｐＲＥＳＱシャトルベクターの構築
ＢａｍＨＩ部位がＢｇｌＩＩ部位により置換されたｐＺＥｒＯ−２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）誘導体を構築した。ｌａｃＺ−ｃｃｄＢ遺伝子を含有する、ｐＺＥｒＯ−２．１のＳａｃＩ−ＳｔｕＩ断片を、所望のＢｇｌＩＩ制限部位（下記の下線部後半の６ヌクレオチド）およびＳａｃＩ制限部位（下記の下線部前半の６ヌクレオチド）を含有する突然変異誘発性フォワードプライマー（５’ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣ  ３’、配列番号３）、ならびにＳｔｕＩ制限部位（下記の下線で示されている）を含有するリバースプライマー（５’ＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＣＣＣＣ  ３’、配列番号４）を使用するＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｃＩおよびＳｔｕＩで消化し、ＳａｃＩ−ＳｔｕＩで消化されたｐＺＥｒＯ−２．１内に連結した（ｐＲＥＳ１４）。ｐＷＪ５（Ｊａｇｅｒ，Ｗ．Ａ．ら（１９９２）．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７４：５４６２−５４６５）からのａｐｈＩＩ遺伝子を平滑末端化ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片（クレノウ酵素で埋めたもの）として、ＥｃｏＲＶで消化されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＩＩ）ＫＳ内にクローニングして、ｐＢｓＫｍ１を構築した。ｐＢｓＫｍ１内のユニークＢｇｌＩＩ部位を、ＢｇｌＩＩ消化で破壊し、次いでクレノウ酵素で埋めた（ｐＲＥＳ４）。ｐＲＥＳ４内に存在するアンピシリンカセットを、ＢｓｐＨＩ消化後の自己連結により除去した（ｐＲＥＳ９）。ついで、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種における自律的複製のための領域を含有する、ｐＭＶＳ３０１（Ｖｏｇｔ−Ｓｉｎｇｅｒ，Ｍ．Ｆ．ら，（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：６３８−６４５）の２．５ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片を、ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩで消化されたｐＲＥＳ９内に連結して、ｐＲＥＳ１１を構築した。ＢｓｐＨＩ−ＮｃｏＩで消化されたｐＲＥＳ１４内にｐＲＥＳ１１の４．１５ｋｂのＢｓｐＨＩ／ＮｃｏＩ断片を連結することにより、ｐＲＥＳＱ（６．５５ｋｂ）の構築を完了した。
【実施例１】
【００３８】
ＵＶ突然変異誘発によるステロイド  ９α−ヒドロキシラーゼ活性の不活性化
１０ｍＭ  グルコース無機培地内で増殖させた後期指数的成長相のロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ１（＝ｋｓｔＤ突然変異体）細胞（２・１０８ＣＦＵ・ｍｌ−１）を短時間にわたり超音波処理して単一の細胞を得た。希釈（１０４）サンプルをグルコース無機寒天培地上に塗抹し、平均２７ｃｍの距離からＵＶランプ（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＴＡＷ  １５Ｗ）で１５〜２０秒間照射して細胞の９５％を殺した。４日間のインキュベーションの後、出現したコロニーをＡＤ（０．５ｇ・ｌ−１でＤＭＳＯ（５０ｍｇ・ｍｌ−１）中に可溶化）無機寒天培地上でレプリカプレーティングした。９ＯＨＡＤ無機培地上で増殖しうるロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ１のＡＤ（Ｄ）増殖欠損突然変異体に関するスクリーニングは、ＫＳＨ反応が明らかに損なわれた２個の突然変異体を与えた。株ＲＧ１−ＵＶ２６および株ＲＧ１−ＵＶ３９と称されるこれらの突然変異体は、ＡＤまたはＡＤＤを唯一の炭素およびエネルギー源として使用した場合には３〜４日後に増殖を全く示さなかったが、９ＯＨＡＤ無機寒天培地上での増殖は正常であった。
【実施例２】
【００３９】
ｋｓｈＡおよびｋｓｈＢのクローニングおよび分子的特徴づけ
該ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）株ＲＧ１遺伝子ライブラリーを株ＲＧ１−ＵＶ３９内に電気的形質転換により導入して、その突然変異表現型を相補化させた（図２）。ＡＤ無機寒天培地上の株ＲＧ１−ＵＶ３９の増殖を回復させうる６ｋｂの挿入物を含有するクローン（ｐＫＳＨ１０１）を単離した。制限酵素マッピング分析、ｐＲＥＳＱにおけるサブクローニングおよびそれに続く相補性実験は、株ＲＧ１−ＵＶ３９を尚も相補化しうる１．８ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓａｕ３Ａ  ＤＮＡ断片（ｐＫＳＨ１０６）の同定をもたらした（図２）。この１．８ｋｂの挿入物をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＩＩ）ＫＳ内にクローニングし、そのヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列分析は、３９８アミノ酸の推定タンパク質（ＫｓｈＡ）をコードする単一の１，１９７ヌクレオチドのＯＲＦ（ｋｓｈＡ、配列番号１の４９９−１６９５）を示した。
【００４０】
該株ＲＧ１遺伝子ライブラリーでのロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ１−ＵＶ２６の相補化は、ＡＤ無機寒天培地上の株ＲＧ１−ＵＶ２６の増殖を回復しうるクローンｐＫＳＨ２００の単離をもたらした（図２）。後続のｐＫＳＨ２００の制限マッピング分析、サブクローニングおよび相補性実験により、本発明者らは、株ＲＧ１−ＵＶ２６の突然変異表現型を尚も回復させうる２．８ｋｂのＢｇｌＩＩ−Ｓａｕ３Ａの断片（ｐＫＳＨ２０２）を同定した（図２）。この断片をｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＩＩ）ＫＳ内にサブクローニングし、そのヌクレオチド配列を決定した。ＲＧ１−ＵＶ２６突然変異表現型の相補性に関与するＯＲＦを後続の相補性実験から同定した。２．８ｋｂの断片上にマッピングされたＡｓｐ７１８制限部位を使用してｐＫＳＨ２０５を構築しが、これは、もはや、該突然変異表現型を相補化することができなかった（図２）。したがって、相補性に関与するＯＲＦ内にＡｓｐ７１８制限酵素が位置する。同定された１，０４１ヌクレオチドのＯＲＦを、ｋｓｈＢ（配列番号２の３８７−１４２７；ＧＣ含量  ６２．３％）と命名した。これは、３７．１ｋＤａの計算分子量を有する３４６アミノ酸の推定タンパク質（ＫｓｈＢ）をコードする。
【実施例３】
【００４１】
ロドコッカス・エリスロポリスＳＱ１におけるｋｓｈＡの非標識遺伝子欠失
ｋｓｈＡの非標識インフレーム遺伝子欠失（ΔｋｓｈＡ）のために、ｐＫＳＨ１２６を構築した。ｋｓｈＡの上流の配列にアニールするプライマー（図３  プライマー１）（５’ＣＧＣＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＡＧＡＧＣＡＣＧＴＴ  ３’、配列番号５）と、ＳｍａＩ部位（下線部）を含有する、ＫｓｈＡ遺伝子の５’末端にアニールするプライマー（図３  プライマー２）（５’ＧＣＧＣＣＣＧＧＧＴＣＣＧＡＧＴＧＣＣＡＴＧＴＣＴＴＣ  ３’、配列番号６）とを使用して、ｐＫＳＨ１０１から１．３ｋｂの断片（ＰＣＲ産物１）を得た。ＰＣＲ産物２用のプライマーは、株ＳＱ１と株ＴＡ４２１（ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ８８０１３）との合体配列のヌクレオチド配列を使用して作製した。ＳｍａＩ制限部位（下線部）を含む、ｋｓｈＡ遺伝子の３’末端にアニールするフォワードプライマー（図３  プライマー３）（５’ＧＣＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＡＴＴＣＧＣＡＧＴＣ  ３’、配列番号７）と、ＸｂａＩ制限部位（下線部）を含む、ＯＲＦ１１にアニールするリバースプライマー（図３  プライマー４）（５’ＧＣＧＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡＴＴＣＣＣＴＣＧＣＡ  ３’、配列番号８）とを使用して、ＳＱ１染色体ＤＮＡからＰＣＲ産物２（８４０ｂｐ）を得た。ＰＣＲ産物１からの５’切断型ｋｓｈＡ遺伝子の後方のこのＰＣＲ断片の連結後に、ｋｓｈＡのインフレーム欠失を得るために、ＳｍａＩ制限部位を導入した。最後に、ｐＫＳＨ１２５からの２．０５ｋｂのＳａｌＩ−ＸｂａＩ断片をｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢベクター内に連結した（ｐＫＳＨ１２６）。
【００４２】
株ＳＱ１における突然変異誘発性ベクターｐＫＳＨ１２６の導入、およびそれに続くｓａｃＢ対抗選択（ＷＯ  ０１／３１０５０）により、ｋｓｈＡ遺伝子の非標識インフレーム欠失を得た。野生型ｋｓｈＡ遺伝子は、僅か９個のアミノ酸（ＭＡＬＧＰＧＴＴＳ）をコードする３０ヌクレオチドのＯＲＦ（ΔｋｓｈＡ）に短縮された。ｋｓｈＡの遺伝子欠失は、ｐＫＳＨ１２６の２ｋｂの挿入物をプローブとして使用する、ＢａｍＨＩで消化された染色体ＤＮＡのサザン分析により確認した。該遺伝子欠失突然変異株においては、２．０５ｋｂの野生型ＢａｍＨＩ  ＤＮＡ断片は０．８８ｋｂに短縮された。得られた株はロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ２と称される。
【実施例４】
【００４３】
ロドコッカス・エリスロポリスＳＱ１におけるｋｓｈＢの非標識遺伝子欠失
ｋｓｈＢの非標識インフレーム遺伝子欠失のために、構築物ｐＫＳＨ２１２を作製した（図４）。この目的のために、鋳型としてのｐＫＳＨ２０２から得たＰＣＲ産物（１，２７５ｂｐ）にｐＫＳＨ２０１を融合した。フォワードプライマー５’ＧＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＴＣＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＧＡＧＴ  ３’（配列番号９）とリバースプライマー５’ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧ  ３’（配列番号１０）とを使用してＰＣＲ産物を得、これを、ＥｃｏＲＶで消化されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（ＩＩ）ＫＳ内に（平滑）連結した（ｐＫＳＨ２１０）。ｐＫＳＨ２０１のＡｓｐ７１８制限部位との連結の後にｋｓｈＢの適切なインフレーム欠失が保証されるよう、このＰＣＲ産物の５’末端において、ｋｓｈＢの終結コドンに先行するＡｓｐ７１８制限部位（フォワードプライマーを参照されたい）を導入した。３’末端においては、クローニングのために、ｐＫＳＨ２０１のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に適合しうるＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（リバースプライマーを参照されたい）を付加した。ＰＣＲ産物をＡｓｐ７１８−ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりｐＫＳＨ２１０から単離し（１，２６３ｂｐ）、Ａｓｐ７１８−ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＫＳＨ２０１内に連結し（図２）（ｐＫＳＨ２１１）、それにより所望のｋｓｈＢインフレーム欠失を導入した（図４）。最後に、ｋｓｈＢ欠失を含有するＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡ断片（２．２ｋｂ）を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（ＷＯ  ０１／３１０５０を参照されたい）内に連結した（ｐＫＳＨ２１２）。
【００４４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｓ１７−１を使用する接合により、プラスミドｐＫＳＨ２１２をロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＱ１内に導入した。ｓａｃＢ対抗選択系（ＷＯ  ０１／３１０５０）を使用して、非標識ｋｓｈＢ遺伝子欠失を得た。ＡＤ無機寒天プレート上でのレプリカプレーティングにより、潜在的ｋｓｈＢ突然変異体をスクリーニングし、これにより、ＡＤの存在下では増殖し得ないｋｓｈＢ突然変異体を単離することができた。野生型および３つのＡＤ増殖欠損突然変異体の、Ａｓｐ７１８で消化された染色体ＤＮＡ上で、サザン分析を行った。完全なｋｓｈＢ遺伝子とのハイブリダイゼーションは、該推定ｋｓｈＢ突然変異体のゲノム内にはｋｓｈＢが存在しないことを示した。明らかなハイブリダイゼーションシグナル（４．３ｋｂの断片）は専ら野生型染色体ＤＮＡで見出された。さらに、ｋｓｈＢの両方のフランキング領域を含むｐＫＳＨ２１２の２．２ｋｂの挿入物である別のプローブでの追加的なサザン分析は、ｋｓｈＢ遺伝子欠失を確認した。ｋｓｈＢ遺伝子を含有する４．３ｋｂのＡｓｐ７１８野生型ＤＮＡ断片はｋｓｈＢ突然変異体においては３．３ｋｂに短縮され、これは、１，０４１ｂｐのｋｓｈＢ遺伝子が、（ＭＴＴＶＥＶＰＩＡをコードする）３０ヌクレオチドのｋｓｈＢインフレーム残部で置換されたことを示している。得られた株はロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ４と称される。
【実施例５】
【００４５】
遺伝的に改変された株ＲＧ１−ＵＶ２６、ＲＧ１−ＵＶ３９、ＲＧ２、ＲＧ４およびＲＧ９の、ステロイドΔ１−脱水素化における使用
株ＲＧ２およびＲＧ４を、唯一の炭素およびエネルギー源としてＡＤ、ＡＤＤまたは９ＯＨＡＤを含有する無機寒天培地上にプレーティングした。両方の株はＡＤ（Ｄ）存在下では増殖を全く示さなかったが、９ＯＨＡＤの存在下の増殖は株ＳＱ１に匹敵するものであった。これらの表現型は、ＵＶ突然変異株ＲＧ１−ＵＶ２６およびＲＧ１−ＵＶ３９で見出されるものと一致している。株ＳＱ１でのＡＤ（１ｇ・ｌ−１）の生物変換はＡＤの利用をもたらすが、ＡＤＤ又は他の代謝産物の蓄積をもたらさない。株ＲＧ２または株ＲＧ４によるＡＤ（１ｇ・ｌ−１）の生物変換は、比較しうるＡＤＤの蓄積レベル（１６８時間後に０．３〜０．５ｇ・ｌ−１の様々な値となった）を与えた。したがって、ＡＤ（Ｄ）９α−ヒドロキシル化はｋｓｈＡまたはｋｓｈＢの不活性化により遮断され、これは、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＱ１のＫＳＨ活性におけるＫｓｈＡおよびＫｓｈＢの両方の必須の役割を示している。株ＲＧ９でのＡＤ生物変換実験では、初期ＡＤ濃度の減少も９ＯＨＡＤ形成も観察されなかった。したがって、突然変異株ＲＧ９は、ｋｓｈＡがＡＤ  ９α−ヒドロキシラーゼ活性をコードしていること、およびＫＳＴＤイソ酵素とは対照的に、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＱ１中には更なるＫＳＨイソ酵素が存在しないことを確認する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＲＧ１のゲノムライブラリーを構築するために使用する、ｐＺＥｒＯ−２．１（細い曲線）に基づくロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＲＥＳＱ。ｒｅｐ：ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種における自律的複製をコードするｐＭＶＳ３０１の２．５ｋｂの領域（太い曲線）。ｌａｃＺ−ｃｃｄＢ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における陽性選択のためのマーカー。ａｐｈＩＩ：ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのカナマイシン耐性マーカー。
【図２】いくつかのｐＲＥＳＱ由来構築物を使用する、ＵＶ突然変異株ＲＧ１−ＵＶ３９（Ａ）およびＲＧ１−ＵＶ２６（Ｂ）の機能的相補性による、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＱ１中でＫＳＨ活性をコードするそれぞれｋｓｈＡ遺伝子およびｋｓｈＢ遺伝子の別々のクローニングおよび同定のための戦略。
【図３】（Ａ）ｋｓｈＡをコードするロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＱ１の２．６ｋｂ  ＤＮＡ断片、およびロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＴＡ４２１におけるその４．１ｋｂ対応物の概要。ＯＲＦ１２の灰色の棒線は、黒い矢印（Ｍａｅｄａら（１９９５）で提案されているＯＲＦ１２のサイズ）と共に、ｋｓｈＡと同一（９７％）であるロドコッカス・エリスロポリス（Ｒ．ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＴＡ４２１におけるＯＲＦ１２の実際のサイズを表す。「Ｘ」はそれらの２つの配列の合体点を示す。（Ｂ）株ＳＱ１および株ＴＡ４２１のＤＮＡ断片の理論的に合体したヌクレオチド配列、ならびに株ＳＱ１および株ＲＧ８における非標識インフレームｋｓｈＡ遺伝子欠失のためのプラスミドｐＫＳＨ１２６の構築におけるその使用のスキーム。１〜４の番号は、親株ＳＱ１およびｋｓｔＤ  ｋｓｔＤ２突然変異株ＲＧ８におけるｋｓｈＡ非標識遺伝子欠失に使用するプラスミドｐＫＳＨ１２６の構築のためのＰＣＲ産物１および２を得るために使用するプライマーを示す。
【図４】親株ＳＱ１からのｋｓｈＢ非標識遺伝子欠失突然変異株ＲＧ４の構築に使用するプラスミドｐＫＳＨ２１２の構築のためのクローニングスキーム。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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