(57)【要約】本発明は、以下の一般式：(糖)-OCH2-CH(-NH-CO-R1)-CH(OH)-CH=CH-R2、ただし、（糖）は、糖残基を表わし、−ＣＯ−Ｒ１基は、アミドの形態で分子の残基に結合するアシル−脂肪酸を表わし、Ｒ１は、少なくとも１０炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル基を表わし、およびＲ２は、少なくとも１０炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル基または少なくとも１０炭素原子及び１、２若しくは３個の二重結合を有する直鎖のアルケニル基を表わす、のガングリオシドを含むまたは当該ガングリオシドから構成されるガングリオシド混合物に関するものである。当該混合物は、一般式Ｉのガングリオシドの少なくとも１０重量％は、アシル−脂肪酸％がＣ２０：０脂肪酸である−ＣＯ−Ｒ１基を有することを特徴とする。当該混合物は、改善された生物学的活性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉ：
【化１】
2005530824.tif 000003
ただし、（糖）は、糖残基を表わし、
−ＣＯ−Ｒ１基は、アミドの形態で分子の残基に結合するアシル脂肪酸を表わし、
Ｒ１は、少なくとも１０炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル基を表わし、および
Ｒ２は、少なくとも１０炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル基または少なくとも１０炭素原子及び１、２若しくは３個の二重結合を有する直鎖のアルケニル基を表わす、
のガングリオシドを含むまたは当該ガングリオシドから構成されるガングリオシド混合物であって、
該混合物に中に存在する式Ｉのガングリオシドにおいて、−ＣＯ−Ｒ１基、即ち、アシル−脂肪酸の少なくとも１０重量％がＣ２０：０脂肪酸であることを特徴とするガングリオシド混合物。
【請求項２】
Ｃ２０：０脂肪酸は、−ＣＯ−Ｒ１基、即ち、アシル−脂肪酸の１０〜１５重量％を占める、請求項１に記載のガングリオシド混合物。
【請求項３】
−ＣＯ−Ｒ１基は、Ｃ１８：０脂肪酸を表わし、この際、−ＣＯ−Ｒ１基のＣ２０：０脂肪酸に対するＣ１８：０脂肪酸の重量比が１．０〜３．０である、請求項１または２に記載のガングリオシド混合物。
【請求項４】
−ＣＯ−Ｒ１基はＣ２３：０脂肪酸を表わし、この際、Ｃ２３：０脂肪酸はガングリオシド分子の脂質部分においてアシル−脂肪酸の１０重量％以下を占める、請求項１〜３のいずれか１項に記載のガングリオシド混合物。
【請求項５】
ガングリオシド混合物は、一方では、動物および／または植物由来の天然源から得られる非修飾のガングリオシド、ならびに、他方では、動物および／または植物由来の天然源から同様にして得られるがその後修飾されるガングリオシドから構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のガングリオシド混合物。
【請求項６】
水性エマルジョンとして存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のガングリオシド混合物。
【請求項７】
脂肪ブレンドの成分を構成する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のガングリオシド混合物。
【請求項８】
インスタント食品、食品サプリメント(food supplement)または配合飼料(formulation food)中に添加される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のガングリオシド混合物。
【請求項９】
治療食(dietetic composition)、薬剤組成物(pharmaceutical composition)または食品組成物(food composition)を調製するための請求項１〜７のいずれか１項に記載のガングリオシド混合物の使用。
【請求項１０】
食品組成物は、インスタント食品、食品サプリメント(food supplement)または配合飼料(formulation food)である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のガングリオシド混合物を含む治療食、薬剤組成物及び食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガングリオシド混合物、治療食、薬剤組成物及び食品組成物を調製するための当該ガングリオシド混合物の使用、ならびに相当する組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ガングリオシドは、複雑な構造を有する糖脂質であり、細胞の原形質膜の外表面上に主に位置する。ガングリオシドは、糖及び糖誘導体ならびに場合によっては、Ｎ−アセチルノイラミン酸から構成される極性部分（ヘッド）、さらには脂肪酸及びそれらの誘導体から構成される幾つかの非極性脂肪族鎖を有する。
【０００３】
ガングリオシドのオリゴサッカライド鎖の構造は、細胞−細胞の相互作用（細胞接着）、レセプターの適用範囲(coverage)（例えば、ＩＬ−２、セレクチン）、Robb, R.J., J. Immunol. 1986, 136, 971 - 976を参照、エンテロトキシンの関連（抗菌／抗ウィルス及び前生物的効果）、Rueda, R., Sabetel, J.L., Maldonaldo, J., Molinos-Font, J.A., Gil, A. J. Pediatr. 1998, 133, 90 - 94を参照、接着／抗体の関連、Welte, K., Miller, G., Chapman, P.B., Yuasa H., Natoli, E., Kunicka, J.E., Cordon-Cardo, C., Buhrer, C., Old, L.J., Houghton, A.N., J. Immunol. 1987, 139, 1763 - 1771を参照、ならびに細胞のシグナル伝達（Ｔ細胞の場合には、ＧＭ３）、Rippo, M.R., Malisan, F., Ravagnan, L., Tomassini, B., Condo, I., Constantini, P., Susin, S.A., Rufini, A., Todaro, M., Kroemer, G., Testi, R. FASEB J. 2000, 14, 2047 - 2057を参照を直接決定する。
【０００４】
しかしながら、脂肪酸の組成は、膜内の分子の空間的な配置に関与し（ミクロドメイン形成／クラスタ化）、代謝における糖脂質の基質に特異的な反応（酵素−基質の特異性）を同時に決定する因子(co-determinant)である。
【０００５】
文献で、ガングリオシドの前後で脂肪酸の組成が言及されているが、双方とも脂肪酸である、２つの非極性脂肪族鎖の間には相違がないことが非常に頻繁にある。しかしながら、これらの脂肪酸は、構造決定及び機能決定要素である、Ladisch, S., Hasegawa, A.; Li, R., Kiso, M. Biochemistry 1999, 34, 1197 - 1202を参照。ガングリオシドのＮ−アシルスフィンゴシン部分（セラミド）は、細胞内シグナル仲介分子として重要である。ガングリオシドの長鎖アシル基は、生体系で至る所に存在する脂肪酸であり、これらのガングリオシドに多様な機能で高い生物活性を付与する。
【０００６】
ガングリオシドは、酵素（リゾソーム酵素）により細胞内でセラミドに変換し、これはスフィンゴミエリン及びさらにスフィンゴシン、スフィンゴシン−１Ｐに変換する。また、セラミドは、スフィンゴミエリンへの変換により、ジアシルグリセロール及びホスホリルジアシルグリセロールの合成に影響を与える。これらの物質はすべて、非常に強力なシグナル仲介分子である。したがって、ガングリオシド及びセラミドに変換したガングリオシドは、様々な方法で代謝及び細胞機能を決定する。ガングリオシドの３−ケト結合脂肪酸は、構造上及び機能上セラミドのすべての代謝産物、例えば、スフィンゴシンを同時に決定する(co-determine)、即ち、この脂肪族鎖が代謝中変化せずに残るが、Ｎ−アシル化脂肪（アミド）酸は、セラミド自体及び相当するグリコシル誘導体の脂肪酸組成物として含まれるのみであり、二次メッセンジャーの代謝中に切断、除去される。
【０００７】
分子の特定のアシル化は、シグナル仲介分子としてのガングリオシド／セラミド及びその代謝物の可能性を決定する。基質に特異的な酵素（スフィンゴミエリナーゼ、セラミダーゼ、スフィンゴシンアシルトランスフェラーゼ(sphingosinacyl transferase)）によるガングリオシド誘導体の代謝及びシグナル分子としてのセラミド活性の酵素調節（セラミドヒドロゲナーゼ、セラミドキナーゼ）は、構造要素としてアシルパターンによって同時に決定される。加えて、炭素原子数が２４以下の炭素長を有する飽和脂肪酸は、迅速なガングリオシド代謝を引き起こす（de novo合成／変換）。分子の特異的なアシル化はまた、様々な細胞内調節酵素（ホスホキナーゼＣ、ホスホリパーゼＤ及び様々なプロテインホスファターゼ／キナーゼ）へのガングリオシドの影響に関連がある。
【０００８】
ガングリオシドの従来既知な生物学的な能としては、下記がある：
・新生児の胃腸管の発達；腸の免疫系の発達、Rueda, R., Maldonado, J., Narbona, E., Gil, A. Early human Development 1998, 53, p 135 - 147; Jensen, R. Lipids 1999, 34, 1243 - 1271を参照。
【０００９】
・抗発癌性効果（アポトーシスを誘発し、細胞の成長を止める）、Vesper, H., Schmelz, E.-M., Nikolova-Karakashian, M.N., Dillehay, D.L., Lynch, D.V., Merril, A.H.Jr. J. Nutr. 1999, 129, 1239 - 1250; Farooqui, A., Harrocks, L.A., Farooqui, T., Chemistry and Physics 2000, 106, 1 - 29を参照。
【００１０】
・Ｔ細胞の分化を誘導する（細胞の成熟の誘導）；Ｔ細胞応答の阻害、Yanagihava, K., Kato, E., Hitomi, S., Sunamoto, J., Wada, H. Glycoconjugate J. 1999, 16, 59 - 65を参照。
【００１１】
・プロスタグランジンの合成及びＣＯＸ遺伝子の発現を促進する、Wu, G., Lu, Z., Ledeen, R.W. Glycoconjugate J. 1996, 13, 235 - 239を参照。
【００１２】
文献に広く記載されるガングリオシドの生物学的な機能は、主にオリゴサッカライド鎖の組成と関連するものである。他方、ガングリオシドの生物活性は脂肪酸の組成によって同時に決定されることは知られているものの、機能上の重要性が脂質部分に関連つけられることはあまりない。
【００１３】
したがって、ほとんどの従来存在する特許は、主にオリゴサッカライド鎖を扱うものであり、脂肪酸を特定するものはない。平成４年特許願第１０５６１６号公報参照。他としては、不飽和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の割合を記載するものがあるのみである。特開平３−１０１６９１号公報参照。
【００１４】
米国特許第５，３６６，９６３  ２２／９４号には、Ｃ１８未満（＜Ｃ１８）及びＣ２０超（＞Ｃ２０）の脂肪酸部分及び鎖長とガングリオシド混合物の免疫抑制作用との関係が記載されているが、この際、Ｃ１８及びＣ２０は明らかに排除されている。
【発明の開示】
【００１５】
驚くべきことに、ガングリオシドの脂質成分が従来考えられていたより非常に重要性が高いことが見出された。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、生物学的活性が改善されるガングリオシド混合物を提供することである。
【００１７】
この目的は、特許請求の範囲の示唆によって達成される。
【００１８】
本明細書におけるガングリオシドは、下記一般式Ｉ：
【００１９】
【化１】
2005530824.tif 000002
【００２０】
を有するものである。
【００２１】
この一般式Ｉは、式により、本発明の混合物の基礎を表わすガングリオシドを記載するものである。我々は、これらのタイプのガングリオシドの提供に関心があるわけではない、すなわち、本発明の混合物は既知のガングリオシドから完全に構成されてもよい。むしろ、本発明は、上記式で示されるガングリオシド及び本明細書で規定されかつ上記一般式で示される残基のうち、−ＣＯ−Ｒ１基が、特定量の特定の脂肪酸から構成されるという事実に基づくものである。一般式Ｉは、本明細書で記載される材料及び量に関するデータが言及する計算上(computational)及び実質的な(material)参考ベースを提供するものである。例えば、単に既知のガングリオシドまたはガングリオシド混合物を再混合することによって、本発明の混合物を得ることが可能である。いうまでもなく、ガングリオシドの修飾等を行なってもよく、これに関しては以下でより詳細に説明する。
【００２２】
本発明における残基Ｒ２は、直鎖の飽和アルキル基または直鎖のアルケニル基を表わし、この際、双方の残基とも１０以上の炭素原子を有し、例えば、３０以下の炭素原子を有する。ゆえに、残基Ｒ２は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０炭素原子を有してもよい。好ましくは、炭素原子数は、例えば、１４、１６及び１８である。アルケニル基は、１、２または３個の二重結合を有していてもよい。
【００２３】
残基Ｒ１は、１０以上の炭素原子を有し、例えば、３０以下の炭素原子を有する直鎖の飽和アルキル基を表わす。ゆえに、残基Ｒ１は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９及び３０炭素原子を有してもよい。好ましくは、炭素原子数は、例えば、１８、２０、２２及び２４である。ケト基が結合した残基Ｒ１は、アミドの形態で分子の残基に結合する脂肪酸を表わす。この残基−ＣＯ−Ｒ１は、本明細書中ではアシル−脂肪酸と称する。
【００２４】
本発明の必須の形態は、本発明のガングリオシド混合物において、Ｃ２０：０脂肪酸がアシル−脂肪酸（ゆえに、基−ＣＯ−Ｒ１、上記参照）の少なくとも１０重量％を占める点にある。したがって、上記情報は、ガングリオシドの非極性脂肪族鎖の一にのみ関係する。これは、他の非極性脂肪族鎖及び糖単位に関しては情報がないことを意味する。この他の脂肪族鎖は、既知のおよび／または所望の性質を有するものであってもよい。
【００２５】
Ｃ２０：０は、一般的な命名法に従うと、二重結合を持たない（：０）２０炭素原子（ＣＯ−基の炭素原子をカウントする）を有するアシル基を意味する。
【００２６】
好ましい実施態様によると、Ｃ２０：０脂肪酸の量は、１０〜１５重量％である。すべての中間値、すべてのより狭い範囲、及び特にすべての整数の中間値、例えば、１１、１２、１３及び１４重量％は、この範囲の記載に包含、開示される。
【００２７】
好ましい実施態様によると、−ＣＯ−Ｒ１基におけるＣ２０：０のアシル−脂肪酸に対する−ＣＯ−Ｒ１基におけるＣ１８：０基のアシル−脂肪酸の重量比は、１．０〜３．０である。また、この範囲の記載は、すべての中間値、すべてのより狭い範囲、及び特に１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８及び２．９などの単一値を包含する。
【００２８】
本発明のガングリオシド混合物は、動物由来の脂質抽出物であっても（本明細書で使用される「動物」ということばはヒトまたはヒト由来の源を示すものではない）および／または真菌や単細胞生物からのみ得られる植物由来の脂質抽出物であってもおよび／または合成により製造されるガングリオシドであってもよい。アシル−脂肪酸の本発明による組成を達成するために、上記脂質抽出物由来のガングリオシドは修飾されてもよい。加えて、ガングリオシドの単離物を加えて、このような脂質抽出物への脂肪酸の含有量を増やしてもよい。また、このような脂質抽出物に化学的に合成したガングリオシドを添加することも可能である。さらに、本混合物を構成するガングリオシドは、完全に合成によって調製されてもよい。また、様々なタイプの修飾法および／または調製法を組み合わせることも可能である。しかしながら、天然のガングリオシドを使用すること好ましいと考えられる。次に、これらは修飾されてもよい。したがって、本発明の混合物は、予め天然のガングリオシドから得られたガングリオシドと混合された天然の非修飾型のガングリオシドから構成され、後に修飾されることが好ましい。幾つかの可能性のある修飾法としては、下記がある：
・Ｎ−アシル残基を酵素により切断、除去すること（スフィンゴ脂質／セラミド  Ｎ−デアシラーゼ  ＥＣ３５１−）および酸／アルカリにより触媒される化学的なエステル化による新しい特定の脂肪酸のエステル化または遊離脂肪酸によるAnand, J.K., Sadozai, K.K., Hakomori, S., Lipids 1996, 31, 995 - 998に従った特定の脂肪酸の誘導化(derivatization)による天然の／単離されたガングリオシド／セラミドのアシル鎖の組成(specification)。
【００２９】
・最適なｐＨ値及び温度での特定の遊離脂肪酸、メチルエステル、エチルエステルまたはトリアシルグリセリドを用いたセラミド  Ｎ−デアシラーゼ  ＥＣ３５１によるガングリオシドのエステル交換。
【００３０】
・Gasa, S., Kamio, K., Makita, A.J., Lipid Res. 1992, 33, 1079 - 1084に従ったリゾガングリオシド(lysogangliosides)への脱アシル化、次に遊離脂肪酸、メチルエステル、エチルエステルまたはトリアシルグリセリドによる特定の脂肪酸の酸／アルカリにより触媒される化学的なエステル化による天然の、単離されたガングリオシド／セラミドのアシル鎖の組成(specification)。
【００３１】
これらの可能性のある修飾法を、下記実施例においてより詳細に説明する。
【００３２】
本発明においてアシル−脂肪酸を修飾することによって、ガングリオシドの生物学的活性は促進される。この生物学的な活性の促進は、ほとんどの多様なガングリオシド機能に適用される。ガングリオシドが、例えば、糖単位を変えずに、脂質部分を変更または修飾することによって、例えば、特定の生物学的活性を有する場合には、相当する既存の生物学的活性は促進するであろう。これは、ガングリオシドの脂質部分の本発明による修飾によって、膜内の分子の運動性の改善が達成されるという事実に基づくものである。本発明による脂肪酸組成によって誘導される膜内のガングリオシドの高い運動性及び空間的な配置（クラスタ化、コレステロール／糖脂質のマイクロ−ドメイン）により、レセプターが介在するシグナルが促進し（細胞表面レセプターに影響を与え）、イオンチャンネル（例えば、Ｎａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅ）の活性が促進し、さらに膜固有の酵素（例えば、ホスホキナーゼＣ）の活性が促進する。Zeller, C.B., Marchase, R.B., Am. J. Physiol. 1992, 262, C1341 - C1355参照。
【００３３】
脂質部分の（またはより正確には、アシル−脂肪酸の）修飾によって、ガングリオシドの既存の生物学的活性が促進される。
【００３４】
本発明のガングリオシド混合物は、純粋な形態で、さらにはエマルジョンの形態で、特に水性エマルジョンの形態で使用されてもよい。また、ガングリオシド混合物は、他の脂質と一緒に使用されてもよく、この際、追加の脂質はガングリオシド混合物のまたはこの混合物を構成するガングリオシドの生物学的活性に影響を及ぼさないと考えられる。これは、ガングリオシドの生物学的活性はガングリオシド脂質成分中に存在する脂肪酸によってのみ影響を受け、追加で使用される脂肪酸によっては影響を受けないことを意味する。
【００３５】
本発明のガングリオシド混合物は、一般的な食品、さらには、適切な場合には、薬剤に添加されてもよい。換言すると、本発明の対象は、本発明のガングリオシド混合物を含む食品組成物(food composition)、治療食(dietetic composition)及び薬剤組成物(pharmaceutical composition)を包含するものである。
【００３６】
これらの組成物としては、特に、インスタント食品、食品サプリメント(food supplement)及び配合飼料(formulation food)が挙げられる。本明細書において、配合飼料(formula food)は、動物（ヒトは除く）及び植物から出発する材料または製品を基礎として配合された食品を意味するものと解される。本発明のガングリオシド混合物は、例えば、以下に制限されないが、ミルク及び乳製品、特殊調製粉乳及びベビーフード、チョコレートバー、ヨーグルト飲料、元気を回復させる食品、宇宙食(probe food)、妊婦用の輸液(infusion)及び製品などの、製品への混合剤または添加剤として添加されてもよい。
【００３７】
本発明のガングリオシド混合物はまた、単独でまたは一若しくは幾つかのさらなる活性剤と一緒に薬剤組成物(pharmaceutical composition)の形態で投与されてもよい。これらは、例えば、錠剤／カプセルとして配合されてもよい。このような医薬品の配合では、一般的なアジュバント、担体、補助剤、希釈剤、湿潤化剤、増粘剤、着香剤、甘味料などが使用されてもよい。
【００３８】
薬剤組成物は、患者（即ち、ヒト及び動物）に一般的な方法で（例えば、非経口であるいは経腸で）投与されてもよい。しかしながら、簡便であるためには、薬剤組成物は、経口または舌を介した投与に適した組成物であり、投与形態に適するように配合されるであろう。
【００３９】
ガングリオシドを含む混合物または本明細書に記載される種類のガングリオシドを含む組成物が本発明のガングリオシド混合物を含むか否かを見出すためには、一般式Ｉに含まれるガングリオシドの量を決定し、さらにアシル基−ＣＯ−Ｒ１に関して本明細書で記載された組成を満たすか否かを分析することが必要であるだけである。
【００４０】
十分可能性がありそうなことではあるが、一般式Ｉに含まれない化合物またはガングリオシドが存在する場合には、これらは計算の考慮に入れない。
【００４１】
本発明のガングリオシド混合物を含む食品、治療用組成物及び薬剤組成物は、特に、胃腸管、腸の免疫系及び神経系の発達を改善するために、ならびに腸管、腸の免疫系及び神経系の有害な変化を処置するために、使用されてもよい。新生児から年配の人々までの、すべての年齢層のグループが、本発明のガングリオシド混合物の標的グループとして記載されうる。
【００４２】
本発明を、実施例によって以下により詳細に説明するが、この際、実施例１〜４は本発明のガングリオシドまたはガングリオシド混合物を製造または修飾する方法を記載するものであり、実施例５〜８は本発明の組成物に関する適用例または配合例を説明するものである。本発明のガングリオシド混合物のガングリオシドは、既知の化合物であってもまたは既知の方法に従って製造されるものであってもよい。
【００４３】
実施例１
原料から出発した抽出及び分離
スフィンゴ糖脂質を、クロロホルム−メタノールを用いてLadisch及びGillard(Ladisch S., Gillard, B., A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification, 1984, Analytical Biochemistry 146, 220 - 231)に従って天然の基質（卵、大豆、動物のミルク、初乳、バターミルク、動物の組織など）から抽出し、ジイソプロピルエーテル−１−ブタノールＮａＣｌ水溶液で分配することによって精製する。異なる糖組成を有する個々のガングリオシド種の分離は、Gazzotti (Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R., Normal phase high performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures, 1985, J. Chromatogr. 348, 371-78)に従って順相ＨＰＬＣを用いて行なってもよい。アシル鎖の特性に関するガングリオシドの分離及び分別は、以下のようにしてＲＰ−ＨＰＬＣによって行なう：水に溶かしたガングリオシドを、アセトニトリルと５ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０との溶剤系を用いてＲＰ−８カラムによって分別する。クロマトグラムを、Wagener(Wagener, R., Kobbe, B., Stoffel, W., Quantification of gangliosides by microbore high performance liquid chromatography, 1996, J. Lipid Res. 37, 1823 - 1829)に従ってＵＶ／ＶＩＳ検出（波長：１９５ｎｍ）によってまたはCaboni(Caboni, M.F., Menotta, S., Lercker, G., Separation of phospholipids in different foods with light-scattering detector, 1996, JAOCS 73, 1561 - 1566)に従って光散乱検出によって記録する。得られた画分を、クロマトグラムの５点較正(five-point calibration)によって定量する。個々のアシル鎖の特性は、自動分画コレクターによって溜め、アシル鎖の組成(acyl chain specification)の混合比に従って再構成されてもよい。
【００４４】
実施例２
酵素によるエステル交換
スフィンゴ糖脂質について、天然の基質（卵、大豆、動物ミルク、初乳、バターミルク、動物の組織など）に直接含まれるまたはLadisch及びGillard(Ladisch S., Gillard, B., A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification, 1984, Analytical Biochemistry 146, 220 - 231)に従って抽出した後の特定の遊離脂肪酸とのエステル交換を行なった。基質のエステル交換は、０．１％トリトンＸ１００中で最適なｐＨ（ｐＨ５．０〜６．０でのＮ−アシル鎖の加水分解；ｐＨ７．０でのリゾスフィンゴ脂質(lysosphingolipid)の遊離脂肪酸との縮合）で特定の遊離脂肪酸を用いて基質に特異的なセラミド−Ｎ−デアシラーゼ  Ｅ．Ｃ．３．５．１．(Sigma-Aldrich, Inc., USA)によって行なう(Ito, M., Kurita, T., Kita, K., A novel enzyme that cleaves the N-acyl linkage of ceramides in various glycosphingolipids as well as sphingomyelines to produce their lysoforms, 1995, J. Biol. Chem. 270, 24370 - 24374; Kita, K., Okino, N., Ito, M., Reverse hydrolysis reaction of a recombinant alkaline ceramidase of Pseudomonas aeruginosa, 2000, Biochim. Biophys. Acta 1485 (2-3), 111 - 120)。この修飾されたスフィンゴ糖脂質は、アシル鎖の組成の混合比で直接使用しても、またはアシル鎖の組成の混合比に従って他の成分と再構成されてもよい。
【００４５】
実施例３
脂肪酸の化学的修飾
スフィンゴ糖脂質を、Ladisch及びGillard(Ladisch S., Gillard, B., A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification, 1984, Analytical Biochemistry 146, 220 - 231)に従って天然の基質（卵、大豆、動物のミルク、初乳、バターミルク、動物の組織など）から抽出し、精製する（上記参照）。単離されたガングリオシドのアシル鎖の組成を変えるために、抽出物を、スフィンゴシンのＮ−トリフルオロアセチル化、さらにはＮ−アセチル化及び次の相当するジデアシル化ガングリオシド（保護基）への緩やかなけん化によって、Gasa, S.(Gasa, S., Kamio, K., Makita, A., Improved preparation method for Isogangliosides, 1992, J. Lipid Res. 33, 1079 - 1084)に従って変換する。これらは、リゾガングリオシドに化学的に脱アシル化される。天然のガングリオシド由来のアシル鎖の切断はまた、Gaver及びSweeley(Gaver, R.C., Sweeley, C.C., Methods for methanolysis of sphingolipids and direct determination of long chain bases by gas chromatography, 1995, J. Lipid Res. 24, 1389 - 1397)に従った直接化学的加水分解によってまたは７５℃で２時間、アセトニトリル（またはメタノール）における０．５Ｍ  ＨＣｌ及び４Ｍ  Ｈ２Ｏと共に基質をインキュベートすることによるAndu(Kadowaki, H., Bremer, E.G., Evans, J.E., Jungalwala, F.B., McCluer, RH, Acetonitrile-hydrochloric acid hydrolysis of gangliosides for high performance liquid chromatographic analysis of their long chain bases, J. Lipid Res. 1983, 24, 1389 - 1397)に従った酸による加水分解によって行なわれてもよい。このようにして得られたリゾガングリオシドを、アミノプロピル相によるアニオン交換クロマトグラフィーによって遊離脂肪酸、塩及び低分子量の混入物から分離する。特定の遊離脂肪酸、メチルエステルまたはエチルエステルを有するリゾガングリオシドの新たなアシル鎖の特性が、酸／アルカリで触媒する化学的なエステル化によって得られる。Anand(Anand, J.K., Sadozai K.K., Hakomori, S., A simple method for the synthesis of ceramides and radiolabeled analogues, 1996, Lipids 31, 995 - 998)に従って、特定の脂肪酸で、得られたスフィンゴ糖脂質を化学的に特異的にアシル化することが可能であると考えられる。ジエチルホスホリルシアニド(diethyl phosphoryl cyanid)をトリエチルアミンと組み合わせて使用することによって、スフィンゴ脂質のアミンが特定の脂肪酸と結合する。このようにして、特定のＮ−脂肪酸スフィンゴ脂質、セレブロシド及びガングリオシドを得ることが可能である。反応は、ラセミ化合物を含まない。所望の産物は、８５〜９０％の収率で得られる。この方法の利点としては、特異的にエステル化されたガングリオシドが非常に純粋な形態で存在することがある。修飾されたスフィンゴ糖脂質は、アシル鎖の組成の混合比に従って他の成分と再構成されてもよい。
【００４６】
実施例４
化学合成
スフィンゴ糖脂質を、Duclos(Duclos, R.I., The total synthesis of ganglioside GM3, 2000, Carbohydr. Res. 328, 489 - 507)に従って全化学合成を介して特定の脂肪酸を用いて化学的にまたは化学酵素的に(chemo-enzymatically)合成する。所定の脂肪酸特性を有する純粋な形態で合成により製造されたスフィンゴ糖脂質は、アシル鎖の組成の混合比に従って他の化合物と再構成されてもよい。
【００４７】
実施例５
粉ミルク(baby formulation)／特殊調製粉乳の調製
粉ミルクの調製用のスフィンゴ糖脂質を提供することを目的として、乾燥バターミルク材料を使用する。Ｎ−アシル−脂肪酸の全量を基準としてＣ１８：０（１０〜２０重量％）及びＣ２０：０（０．０１〜０．５重量％）のＮ−アシル−脂肪酸の脂肪分布を有するバターミルクのガングリオシド抽出物の脂肪酸分布を、その脂肪酸分布になるように修飾されかつＣ１８：０（６〜９重量％）及びＣ２０：０（６０〜９０重量％）のＮ−アシル−脂肪酸から１〜３重量％のＣ１８：０及び１０〜１５重量％のＣ２０：０の新たなＮ−アシル−脂肪酸分布までの脂肪分布を有する材料（下記参照）と、１：６の比で混合することによって調整する。配合食品の固形分含量１００ｇに対して、スフィンゴ糖脂質のその脂肪酸分布になるように修飾された材料は、以下のようにして調製する：スフィンゴ糖脂質、主に１０〜１５％の脂肪画分を有するバターミルク(Uelzena, Germany)由来のＧＭ１、ＧＭ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂを、Ladisch及びGillard (Ladisch S., Gillard, B., A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification, 1984, Analytical Biochemistry 146, 220 - 231)に従って抽出、精製する。１０ｇの乾燥バターミルク材料（約１リットルのミルクに相当する）を、５０ｍｌのメタノール及び５０ｍｌのクロロホルムと混合し、１５分間抽出し、さらに４℃でペレット化する。上清を、ロータリーエバポレーションまたは凍結乾燥によって元の容積の約１／４になるまで蒸発させる。次に、溶液のタンパク質部分を、−２０℃で沈殿させ、ペレット化する。上清を乾固するまで蒸発させる。分別を目的として、抽出物を、ジイソプロピルエーテル／１−ブタノール  ６０：４０（ｖ／ｖ）６０ｍｌで再懸濁した後、３０ｍｌの水に加える。相分離を行なう。水相は、材料のスフィンゴ糖脂質部分（約１ｇ／ｌ）を含む。脂肪酸の修飾は、以下のようにして行なう：１ｇのスフィンゴ糖脂質抽出物（ＭＧ１２００で約０．８３ｍｍｏｌ）を、０．１％のトリトンＸ１００を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム溶液１０ｍｌ中に懸濁し、１００Ｕのセラミド−Ｎ−デアシラーゼを添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。Ｎ−アシル−脂肪酸の加水分解を、ｐＨ５〜６で行なう。次に、この溶液を、リン酸ナトリウムを添加することによって、最終濃度が２５ｍＭリン酸ナトリウムになるように調節する。特定の遊離脂肪酸を、使用されるスフィンゴ糖脂質（８．３ｍｍｏｌ  Ｃ２０：０）に対して１：１０のモル比になるように添加する。エステル交換を、３７℃、ｐＨ７〜８で１〜２時間にわたって行なう。修飾されたスフィンゴ糖脂質を、分取液体クロマトグラフィー（ＲＰＣ１８）により精製し、相の調整を、クロロホルム／メタノール／０．１Ｍ  ＫＣｌ溶液  ３：９８：７４（ｖ／ｖ／ｖ）で行なう。反応溶液をカラムにのせる。このカラムをクロロホルム／メタノール／０．１Ｍ  ＫＣｌ溶液  ３：９８：７４（ｖ／ｖ／ｖ）、水及びメタノール／水  １：１（ｖ／ｖ）で洗浄する。エタノール及びクロロホルム／メタノール  ２：１（ｖ／ｖ）で、スフィンゴ糖脂質を溶出する。得られた溶出液を乾固するまで蒸発させる。この工程によって、Ｎ−アシル−脂肪酸の全量を基準としてＣ１８：０（６〜９重量％）及びＣ２０：０（６０〜９０重量％）���Ｎ−アシル−脂肪酸の脂肪分布を有するバターミルク１リットル当たり、約０．８ｇのスフィンゴ糖脂質が得られる。
【００４８】
１１．８ｇのタンパク質、５６．９ｇの炭水化物、２４．９ｇの脂肪、２．５ｇのミネラル及びビタミンならびに４５ｍｇのタウリンを含むタンパク質適応特殊調製粉乳(protein-adapted infant milk formula)(AptamilＲ、Milupa製)をビーズ製品の形態で一般的な方法で調製する。ａ）で記載されるガングリオシド混合物を、配合食品の固形分含量を基準として０．２〜５００ｍｇ／１００ｍｇの量で添加する。
【００４９】
実施例６
食品サプリメント(food supplement)
ウシの初乳、卵のレシチンまたはバターミルクのガングリオシド抽出物を、Ｎ−アシル−脂肪酸分布を修飾することによって、または、材料を、その脂肪酸分布になるように修飾されかつＮ−アシル−脂肪酸の全量を基準として１〜３重量％のＣ１８：０及び１０〜１５重量％のＣ２０：０の脂肪酸分布が得られるようなＮ−アシル−脂肪酸の脂肪分布を有する材料と混合することによって調節した。
【００５０】
記載されるガングリオシド混合物を、１０〜５０ｍｇ／カプセルで軟質ゲルカプセルに配合する。
【００５１】
実施例７
妊婦用の製品
発泡錠（最終重量  ４．１５ｇ）(NeovinＲ、Milupa製)を、１０〜５０ｍｇの記載されたガングリオシド混合物を混合することによって、それ自体既知の方法で調製する。１日当たり１錠を、１５０ｍｌの水に溶解して、飲ませる。
【００５２】
実施例８
年配の衰弱した人用の製品
２２．５ｇのタンパク質、７．７ｇの脂肪、６０．８ｇの炭水化物、５．４ｇのミネラル及びビタミンを含むバランスのとれた粉状の元気を回復させる食品(balanced pulverized restorative food)(DilsanaＲ、Milupa製)を、配合食品の固形分含量１００ｍｇに対して０．２〜５００ｍｇの記載されるガングリオシド混合物を添加することによって、それ自体既知の方法で調製する。１日当たり３×５０ｇ以下の食品を、１５０ｍｌの水に溶解して、投与する。
【国際調査報告】
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