(57)【要約】プローブ組並びに癌の検出のためのプローブおよびプローブ組を用いる方法を記述する。患者から得られる生物学的サンプルに一組の染色体プローブをハイブリダイズさせること、および癌細胞がサンプルに存在するかどうかを同定することを含む癌を検出する方法。また、癌の検出のためのプローブの組み合わせを選択する方法も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２個のプローブの以下の組み合わせ：
（ａ）５ｐ染色体アームプローブ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ａｒｍ  ｐｒｏｂｅ）、並びに８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ（ｌｏｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ）、３ｑ染色体アームプローブ、２０ｑ染色体アームプローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、第１６染色体計数プローブ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）、第４染色体計数プローブ、第１２染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブおよび１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブよりなる群から選択されるプローブ；
（ｂ）８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、並びに第１７染色体計数プローブ、第１染色体計数プローブおよび第６染色体計数プローブよりなる群から選択されるプローブ；
（ｃ）７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、並びに３ｑ染色体アームプローブおよび第６染色体計数プローブよりなる群から選択されるプローブ；
（ｄ）３ｑ染色体アームプローブおよび第７染色体計数プローブ；または
（ｅ）第６染色体計数プローブおよび第７染色体計数プローブ、
のいずれかを含んでなる一組の染色体プローブ。
【請求項２】
検出部分が２個のプローブに連結されている請求項１の染色体プローブの組。
【請求項３】
検出部分が蛍光標識を含んでなる請求項２の染色体プローブの組。
【請求項４】
２個のプローブが異なる検出部分に連結されている請求項１の染色体プローブの組。
【請求項５】
検出部分が蛍光標識を含んでなる請求項４の染色体プローブの組。
【請求項６】
３個のプローブの以下の組み合わせ：
（ａ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、並びに９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブおよび１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブよりなる群から選択されるプローブ；
（ｂ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、第１２染色体計数プローブおよび９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ；
（ｃ）８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第１７染色体計数プローブおよび９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ；
（ｄ）８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブおよび９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ；または
（ｅ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、３ｑ染色体アームプローブおよび第１２染色体計数プローブ、
のいずれかを含んでなる一組の染色体プローブ。
【請求項７】
４個のプローブの以下の組み合わせ：
（ａ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブ、１７ｐ１３遺伝子座特異的プローブおよび第１７染色体計数プローブ；
（ｂ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ；
（ｃ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、３ｑ染色体アームプローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ；
（ｄ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、２０ｑ染色体アームプローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ；
（ｅ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブおよび１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブ；
（ｆ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ；
（ｇ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブおよび第１染色体計数プローブ；
（ｈ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブおよび第１２染色体計数プローブ；
（ｉ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブおよび第１２染色体計数プローブ；
（ｊ）第７染色体計数プローブ、第１染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブおよび第１２染色体計数プローブ；または
（ｋ）５ｐ染色体アームプローブ、第１染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブおよび第７染色体計数プローブ、
のいずれかを含んでなる一組の染色体プローブ。
【請求項８】
（ａ）被験体から生物学的サンプルを得ること；
（ｂ）請求項１の染色体プローブの組を得ること；
（ｃ）もしあれば、サンプル中の染色体への該組におけるプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で生物学的サンプルにプローブの組を接触させること；および
（ｄ）被験体が肺癌にかかっているかどうかを決定するために生物学的サンプルへの染色体プローブの組のハイブリダイゼーションパターンを検出すること、
を含んでなる被験体における肺癌をスクリーニングする方法。
【請求項９】
生物学的サンプルが気管支標本、肺生検もしくは喀痰サンプルを含んでなる請求項８の方法。
【請求項１０】
染色体プローブを蛍光的に標識する請求項８の方法。
【請求項１１】
サンプルの細胞学的分析を行うことをさらに含んでなる請求項８の方法。
【請求項１２】
（ａ）被験体から生物学的サンプルを得ること；
（ｂ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブおよび第９染色体計数プローブよりなる群から選択される染色体プローブを得ること；
（ｃ）もしあれば、サンプル中の染色体への該プローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で生物学的サンプルに染色体プローブを接触させること；および
（ｄ）被験体が肺癌にかかっているかどうかを決定するために生物学的サンプルへのプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出すること、
を含んでなる被験体における肺癌をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
生物学的サンプルが気管支標本、肺生検もしくは喀痰サンプルを含んでなる請求項１２の方法。
【請求項１４】
染色体プローブを蛍光的に標識する請求項１２の方法。
【請求項１５】
サンプルの細胞学的分析を行うことをさらに含んでなる請求項１２の方法。
【請求項１６】
（ａ）被験体から生物学的サンプルを得ること；
（ｂ）請求項６の染色体プローブの組を得ること；
（ｃ）もしあれば、サンプル中の染色体への該組におけるプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で生物学的サンプルにプローブの組を接触させること；および
（ｄ）被験体が肺癌にかかっているかどうかを決定するために生物学的サンプルへの染色体プローブの組のハイブリダイゼーションパターンを検出すること、
を含んでなる被験体における肺癌をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
（ａ）被験体から生物学的サンプルを得ること；
（ｂ）請求項７の染色体プローブの組を得ること；
（ｃ）もしあれば、サンプル中の染色体への該組におけるプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で生物学的サンプルにプローブの組を接触させること；および
（ｄ）被験体が肺癌にかかっているかどうかを決定するために生物学的サンプルへの染色体プローブの組のハイブリダイゼーションパターンを検出すること、
を含んでなる被験体における肺癌をスクリーニングする方法。
【請求項１８】
染色体プローブの組が５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブを含んでなる請求項１７の方法。
【請求項１９】
染色体プローブの組が５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブからなる請求項１７の方法。
【請求項２０】
第一の複数の染色体プローブを準備すること；
癌標本を正常標本から判別する第一の複数のプローブの各々の能力を決定すること；
正常標本と比較して癌標本を同定する第一の複数のプローブ内のプローブを選択して第二の複数のプローブを与えること、ここで、第二の複数のプローブ内の各プローブは、０．０１未満のｐ値もしくは０．５００未満のベクトル値で正常標本と比較して癌標本を同定する；
癌標本を正常標本から判別する第二の複数のプローブから選択されるプローブの組み合わせの能力を決定すること；および
０．４００未満のベクトル値で正常標本と比較して癌標本を同定するプローブの組み合わせを選択すること、
を含んでなる癌の検出のためのプローブの組み合わせを選択する方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願へのクロスリファレンス】
【０００１】
本願は、２００１年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６０／２７０，２７１号からの優先権を主張するものである。この出願は、その全部が引用することにより本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、癌の検出のための方法およびプローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
肺癌は、毎年約１５６，０００人の人々の命を奪う、米国における癌に起因する主な死亡原因である。９５％を超える原発性肺癌の原因となる４つの主要な気管支原性癌細胞タイプがある：腺癌；扁平上皮細胞癌；大細胞癌；および小細胞癌。これらの細胞タイプは単独でもしくは組み合わせて発生する。残りの５％の腫瘍は、いくつかのまれな腫瘍タイプから成る。
【０００４】
肺癌が発生すると、それは最初の癌部位からリンパ節に、そして次に、同時にもしくは順次、体の他の領域に広がる傾向がある。肺癌の広がり（転移）の最も一般的な部位は、脳、骨、肝臓、副腎、および高速の血流を有する任意の他の器官である。大部分の患者において死をもたらすのはこの転移のプロセスである。
【０００５】
癌が健康診断によりもしくは診断検査（例えばＸ線もしくはスパイラルＣＴのような高解像度画像）により最初に発見される場合、通常、それは少なくとも１ｃｍのサイズである。１ｃｍのサイズである癌は、少なくとも約１０億個の細胞を含有する。
【０００６】
染色体ＤＮＡにおける変化は、悪性細胞への正常細胞の転化に付随して起こることが示されている。このために、特定の染色体改変の検出は、肺癌を検出および診断する手段を提供する。
【発明の開示】
【発明の要約】
【０００７】
本発明は、高いレベルの感度で肺癌を検出するために特定のプローブおよびプローブ組を用いることができるという発見に基づく。本明細書に記述するプローブを用いることにより、常法と比較して高められた感度で肺癌を検出することができる。従って、本発明のプローブおよび方法は、肺癌の検出を容易にし、そして／もしくは初期段階での肺癌の検出を可能にする。本発明は、癌の検出のためのプローブ組、プローブおよびプローブ組を使用する方法、並びにプローブ組を選択する方法を含む。
【０００８】
一つの態様として、本発明は２個のプローブの以下の組み合わせ：（ａ）５ｐ染色体アームプローブ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ａｒｍ  ｐｒｏｂｅ）並びに８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ（ｌｏｃｕｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ）、３ｑ染色体アームプローブ、２０ｑ染色体アームプローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、第１６染色体計数プローブ（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅ）、第４染色体計数プローブ、第１２染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブおよび１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブよりなる群から選択されるプローブ；（ｂ）８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、並びに第１７染色体計数プローブ、第１染色体計数プローブおよび第６染色体計数プローブよりなる群から選択されるプローブ；（ｃ）７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、並びに３ｑ染色体アームプローブおよび第６染色体計数プローブよりなる群から選択されるプローブ；（ｄ）３ｑ染色体アームプローブおよび第７染色体計数プローブ；または（ｅ）第６染色体計数プローブおよび第７染色体計数プローブのいずれかを含む一組の染色体プローブを特徴とする。
【０００９】
これらの２個のプローブに検出部分を連結することができる。検出部分は、蛍光標識を含有することができる。場合により、２個のプローブを異なる検出部分に連結することができる。例えば、検出部分は蛍光標識を含有することができる。
【００１０】
別の態様として、本発明は３個のプローブの以下の組み合わせ：（ａ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、並びに９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブおよび１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブよりなる群から選択されるプローブ；（ｂ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、第１２染色体計数プローブおよび９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ；（ｃ）８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第１７染色体計数プローブおよび９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ；（ｄ）８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブおよび９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ；または（ｅ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、３ｑ染色体アームプローブおよび第１２染色体計数プローブのいずれかを含む一組の染色体プローブを特徴とする。
【００１１】
別の態様として、本発明は４個のプローブの以下の組み合わせ：（ａ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブ、１７ｐ１３遺伝子座特異的プローブおよび第１７染色体計数プローブ；（ｂ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ；（ｃ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、３ｑ染色体アームプローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ；（ｄ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、２０ｑ染色体アームプローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ；（ｅ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブおよび１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブ；（ｆ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブおよび７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ；（ｇ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブおよび第１染色体計数プローブ；（ｈ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、第６染色体計数プローブおよび第１２染色体計数プローブ；（ｉ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブおよび第１２染色体計数プローブ；（ｊ）第７染色体計数プローブ、第１染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブおよび第１２染色体計数プローブ；または（ｋ）５ｐ染色体アームプローブ、第１染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブおよび第７染色体計数プローブのいずれかを含む一組の染色体プローブを特徴とする。
【００１２】
本明細書に記述するプローブ組、例えば、少なくとも２、３もしくは４個のプローブを含有する組のある態様として、５ｐ染色体アームプローブを５ｐ１５遺伝子座特異的プローブの代わりに用いることができる。本明細書に記述するプローブ組の別の態様として、７ｐ染色体アームプローブを７ｐ１２遺伝子座特異的プローブの代わりに用いることができる。
【００１３】
別の態様として、本発明は、（ａ）被験体から生物学的サンプルを得ること；（ｂ）本明細書に記述する組から、一組の少なくとも２個の異なる染色体プローブ、例えば少なくとも２、３もしくは４個のプローブを得ること；（ｃ）もしあれば、サンプル中の染色体への該組におけるプローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で生物学的サンプルにプローブの組を接触させること；および（ｄ）被験体が肺癌にかかっているかどうかを決定するために生物学的サンプルへの染色体プローブの組のハイブリダイゼーションパターンを検出することの工程を含む、被験体における肺癌をスクリーニングする方法を特徴とする。
【００１４】
本明細書に記述する方法において用いるプローブは、第１染色体計数プローブ、第３染色体計数プローブ、第４染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブ、第７染色体計数プローブ、第８染色体計数プローブ、第９染色体計数プローブ、第１０染色体計数プローブ、第１１染色体計数プローブ、第１２染色体計数プローブ、第１６染色体計数プローブ、第１７染色体計数プローブ、第１８染色体計数プローブ、３ｐ１４遺伝子座特異的プローブ、３ｑ２６遺伝子座特異的プローブ、５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、５ｑ３１遺伝子座特異的プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ、１０ｑ２３遺伝子座特異的プローブ、１３ｑ１４遺伝子座特異的プローブ、１７ｐ１３遺伝子座特異的プローブ、１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブ、２０ｑ１３遺伝子座特異的プローブ、２１ｑ２２遺伝子座特異的プローブ、３ｑ染色体アームプローブ、５ｐ染色体アームプローブ、７ｐ染色体アームプローブ、３ｐ染色体アームプローブおよび２０ｑ染色体アームプローブよりなる群から選択することができる。
【００１５】
本明細書に記述する方法において用いる生物学的サンプルは、気管支標本、肺生検もしくは喀痰サンプルを含むことができる。本明細書に記述する方法において用いる染色体プローブは、場合により、蛍光的に標識することができる。本明細書に記述する方法は、サンプルの細胞学的分析を行うことをさらに含むことができる。
【００１６】
別の態様として、本発明は、（ａ）被験体から生物学的サンプルを得ること；（ｂ）５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、第１染色体計数プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブおよび第９染色体計数プローブよりなる群から選択される染色体プローブを得ること；（ｃ）もしあれば、サンプル中の染色体への該プローブのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な条件下で生物学的サンプルに染色体プローブを接触させること；および（ｄ）被験体が肺癌にかかっているかどうかを決定するために生物学的サンプルへのプローブのハイブリダイゼーションパターンを検出することの工程を含む、被験体における肺癌をスクリーニングする方法を特徴とする。
【００１７】
別の態様として、本発明は、（ａ）第一の複数の染色体プローブを準備すること；（ｂ）癌標本を正常標本から判別する第一の複数のプローブの各々の能力を決定すること；（ｃ）正常標本と比較して癌標本を特定する第一の複数のプローブ内のプローブを選択して第二の複数のプローブを与えること、ここで、第二の複数のプローブは、各々、０．０１未満のｐ値もしくは０．５００未満のベクトル値で正常標本と比較して癌標本を同定する；（ｄ）癌標本を正常標本から判別する第二の複数のプローブから選択されるプローブの組み合わせの能力を決定すること；および（ｅ）０．４００未満のベクトル値で正常標本と比較して癌標本を同定するプローブの組み合わせを選択することの工程を含む、癌の検出のためのプローブの組み合わせを選択する方法を特徴とする。
【００１８】
一つの態様として、癌標本は肺癌標本である。例えば、標本は、肺癌にかかっていると診断される患者から得ることができる。正常標本は、肺癌にかかっていると診断されない患者から得られる肺組織標本であることができる。
【００１９】
一つの態様として、方法の工程（ｃ）は、正常標本と比較して癌標本を同定する第一の複数のプローブ内のプローブを選択して第二の複数のプローブを与えることを含み、ここで、第二の複数のプローブは、各々、０．００５もしくは０．００１未満のｐ値および／または０．４００、０．３００、０．２００もしくは０．１００未満のベクトル値で正常標本と比較して癌標本を同定する。
【００２０】
別の態様として、方法の工程（ｃ）は、０．３００、０．２００もしくは０．１００未満のベクトル値で正常標本と比較して癌標本を同定するプローブの組み合わせを選択することを含む。
【００２１】
別の態様として、本発明は、少なくとも２個の異なるプローブを含む一組の染色体プローブを特徴とし、ここで、プローブの該組は、例えば、少なくとも３５人の肺癌患者を含有する集団に対して試験する場合に、少なくとも約６０％の感度で肺癌を検出することができる。
【００２２】
一例として、該組は少なくとも３個の異なるプローブを含有する。別の例として、該組は少なくとも４個の異なるプローブを含有する。
【００２３】
一例として、該組は、約１０％のカットオフ値で少なくとも約６０％の感度で肺癌を検出することができる。別の例として、該組は、気管支標本を含む生物学的サンプルに対して検出を行う場合に少なくとも約７０％の感度で肺癌を検出することができる。別の例として、該組は、約２０％のカットオフ値で少なくとも約８０％の感度で肺癌を検出することができる。
【００２４】
本明細書に記述する組、例えば、少なくとも２、３もしくは４個の異なるプローブの組に含まれる染色体プローブは、第１染色体計数プローブ、第３染色体計数プローブ、第４染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブ、第７染色体計数プローブ、第８染色体計数プローブ、第９染色体計数プローブ、第１０染色体計数プローブ、第１１染色体計数プローブ、第１２染色体計数プローブ、第１６染色体計数プローブ、第１７染色体計数プローブ、第１８染色体計数プローブ、３ｐ１４遺伝子座特異的プローブ、３ｑ２６遺伝子座特異的プローブ、５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、５ｑ３１遺伝子座特異的プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ、１０ｑ２３遺伝子座特異的プローブ、１３ｑ１４遺伝子座特異的プローブ、１７ｐ１３遺伝子座特異的プローブ、１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブ、２０ｑ１３遺伝子座特異的プローブ、２１ｑ２２遺伝子座特異的プローブ、３ｑ染色体アームプローブ、５ｐ染色体アームプローブ、７ｐ染色体アームプローブ、３ｐ染色体アームプローブおよび２０ｑ染色体アームプローブよりなる群から選択することができる。
【００２５】
別の態様として、本発明は、少なくとも２個の異なるプローブを含む一組の染色体プローブを特徴とし、ここで、該組は、例えば、少なくとも３５人の肺癌患者および２０人の正常人を含有する集団に対して試験する場合に、０．５００未満のベクトル値で肺癌を検出することができる。
【００２６】
一例として、該組は約１０％のカットオフ値で０．５００未満のベクトル値で肺癌を検出することができる。別の例として、該組は０．４００未満のベクトル値で肺癌を検出することができる。別の例として、該組は約１５％のカットオフ値で０．４００未満のベクトル値で肺癌を検出することができる。別の例として、該組は０．３００未満のベクトル値で肺癌を検出することができる。別の例として、該組は約１５％のカットオフ値で０．３００未満のベクトル値で肺癌を検出することができる。別の例として、該組は０．２００未満のベクトル値で肺癌を検出することができる。別の例として、該組は約２０％のカットオフ値で０．２００未満のベクトル値で肺癌を検出することができる。
【００２７】
該組の少なくとも２個の異なるプローブは、第１染色体計数プローブ、第３染色体計数プローブ、第４染色体計数プローブ、第６染色体計数プローブ、第７染色体計数プローブ、第８染色体計数プローブ、第９染色体計数プローブ、第１０染色体計数プローブ、第１１染色体計数プローブ、第１２染色体計数プローブ、第１６染色体計数プローブ、第１７染色体計数プローブ、第１８染色体計数プローブ、３ｐ１４遺伝子座特異的プローブ、３ｑ２６遺伝子座特異的プローブ、５ｐ１５遺伝子座特異的プローブ、５ｑ３１遺伝子座特異的プローブ、７ｐ１２遺伝子座特異的プローブ、８ｑ２４遺伝子座特異的プローブ、９ｐ２１遺伝子座特異的プローブ、１０ｑ２３遺伝子座特異的プローブ、１３ｑ１４遺伝子座特異的プローブ、１７ｐ１３遺伝子座特異的プローブ、１７ｑ２１遺伝子座特異的プローブ、２０ｑ１３遺伝子座特異的プローブ、２１ｑ２２遺伝子座特異的プローブ、３ｑ染色体アームプローブ、５ｐ染色体アームプローブ、７ｐ染色体アームプローブ、３ｐ染色体アームプローブおよび２０ｑ染色体アームプローブよりなる群から選択することができる。
【００２８】
本発明の利点は、細胞診のような常法と比較して、改善された感度で肺癌の検出を可能にすることである。従って、これらのプローブおよび方法は、例えば浸潤前段階で、肺癌の早期発見を可能にすることができる。
【００２９】
本発明の別の利点は、細胞構造における肉眼で見える形態学的変化よりむしろ、遺伝子改変に基づく癌細胞の検出を可能にすることである。遺伝子改変は、初期段階で、例えば細胞構造の視覚的に検出可能な変化の発生の前に、検出することができる。
【００３０】
他に特定しない限り、本明細書において用いる全ての技術および科学用語は、本発明が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記述するものと同様もしくは同等の方法および材料を本発明の実践もしくは試験に用いることができるが、適当な方法および材料を以下に記述する。本明細書に記載する全ての公開、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全部が引用することにより組み込まれる。専門用語における不一致の場合、本明細書が規制する。さらに、記述する材料および方法は実例となるだけであり、限定するものではない。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および請求項から明らかである。
【発明の詳細な記述】
【００３２】
本発明は、肺癌の検出のためのプローブ組並びにプローブおよびプローブ組を用いる方法を含む。本明細書に記述するプローブおよび方法は、気管支標本、肺生検もしくは喀痰サンプルのような生物学的サンプルにおける肺癌の迅速で且つ高感度の検出を可能にする。さらに、本発明は、癌の検出のためのプローブ組を選択する方法を含む。
染色体プローブ
本発明によるインサイチューハイブリダイゼーションに適当なプローブは、３種の幅広い群：染色体領域にハイブリダイズしそして染色体の有無を示す染色体計数プローブ；染色体領域にハイブリダイズしそして染色体の腕の有無を示す染色体アームプローブ；および染色体上の特定の遺伝子座にハイブリダイズしそして特定の遺伝子座の有無を検出する遺伝子座特異的プローブに分類される。染色体プローブおよびその組み合わせは、肺癌の検出のための方法に用いる場合、感度および／もしくは特異性に関して選択される。プローブ組は、任意の数のプローブ、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０個のプローブを含むことができる。
【００３３】
染色体計数プローブは、動原体の近くもしくはそれから離れて位置する反復配列にハイブリダイズすることができ、または染色体上の任意の位置に位置するユニーク配列にハイブリダイズすることができる。例えば、染色体計数プローブは、染色体の動原体と関連する反復ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。霊長類染色体の動原体は、アルファ−サテライトＤＮＡと呼ばれる、約１７１塩基対のモノマー反復長から成る、複雑な一群のＤＮＡの長い縦列反復を含有する。染色体計数プローブの限定されない例には、第１、第３、第４、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１６、第１７および第１８染色体に対するプローブが包含される。いくつかの特定の染色体計数プローブおよびそれらのそれぞれの標的領域の例を実施例１の表１に記述する。
【００３４】
染色体アームプローブは、既定の染色体の短腕もしくは長腕のいずれかの腕上に位置する反復もしくはユニーク配列にハイブリダイズすることができる。染色体アームプローブがハイブリダイズする配列の獲得もしくは喪失は、腕の獲得もしくは喪失を示すために用いることができる。染色体アームプローブの限定されない例には、染色体腕３ｑ、５ｐ、７ｐ、３ｐおよび２０ｑに対するプローブが包含される。特定の染色体アームプローブおよびそれらのそれぞれの標的領域の例を表１に記述する。
【００３５】
遺伝子座特異的プローブは、染色体上の特定の非反復遺伝子座にハイブリダイズする。遺伝子座特異的プローブの限定されない例には、以下の遺伝子座：３ｐ１４；３ｑ２６；５ｐ１５；５ｑ３１；７ｐ１２；８ｑ２４；９ｐ２１；１０ｑ２３；１３ｑ１４；１７ｐ１３；１７ｑ２１；２０ｑ１３；および２１ｑ２２に対するプローブが包含される。これらの遺伝子座のいくつかは、癌のある形態において改変される遺伝子、例えば癌遺伝子および癌抑制遺伝子を含んでなる。従って、遺伝子のエキソン、イントロンもしくは調節配列のいずれかのこれらの遺伝子を標的とするプローブは、本明細書に記述する検出方法において用いることができる。標的遺伝子の例には：ＦＨＩＴ（３ｐ１４）；ＥＧＲ１（５ｑ３１）；ＥＧＦＲ１（７ｐ１２）；ｃ−ＭＹＣ（８ｑ２４）；ＰＴＥＮ（１０ｑ２３）；ＲＢ（１３ｑ１４）；Ｐ５３（１７ｐ１３）；およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ（１７ｑ２１）が包含される。
【００３６】
染色体プローブは、任意のサイズであることができるが、典型的には、約５０〜約５ｘ１０５ヌクレオチドの長さである。染色体プローブは反復配列、例えば約１００〜約５００ヌクレオチドの長さのフラグメントを含んでなることができる。動原体ＤＮＡおよび特定の染色体遺伝子座とハイブリダイズするプローブは、例えば、Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から、もしくはＣｙｔｏｃｅｌｌ（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から市販されている。あるいはまた、プローブは、標準的な技術によって染色体もしくはゲノムＤＮＡから非商業的に製造することができる。例えば、用いることができるＤＮＡ源には、ゲノムＤＮＡ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）のようなクローン化されたＤＮＡ配列、宿主の正常な染色体相補体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）と一緒に１本もしくは１本の一部のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッド、およびフローサイトメトリーもしくは顕微解剖により精製された染色体が包含される。当該領域、例えば表１に示す標的領域は、クローニングによって、もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による部位特異的増幅によって単離することができる。例えば、Ｎａｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．，１９９８，７３（１）：６−２２；Ｗｈｅｅｌｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９９４，１７：３１９−３２６；および米国特許第５，４９１，２２４号を参照。
【００３７】
染色体プローブは、染色体にハイブリダイズした場合にプローブの検出を容易にする検出部分を含有することができる。検出部分の例には、下記のような、直接および間接標識の両方が包含される。
【００３８】
染色体プローブは、検出可能な標識で直接標識することができる。検出可能な標識の例には、発蛍光団、より低い波長／より高いエネルギーの光を吸収した後に蛍光を発する有機分子、並びに放射性同位体、例えば３２Ｐおよび３Ｈが包含される。発蛍光団は、二次検出分子なしにプローブを視覚化させることができる。例えば、発蛍光団をヌクレオチドに共有結合的に連結した後、該ヌクレオチドをニックトランスレーション、ランダムプライミングおよびＰＣＲラベリングのような標準的技術でプローブに直接導入することができる。あるいはまた、プローブ内のデオキシシチジンヌクレオチドをリンカーでアミノ基転移することができる。次に、アミノ基転移したデオキシシチジンヌクレオチドに発蛍光団を共有結合的に連結する。例えば、米国特許第５，４９１，２２４号を参照。
【００３９】
本明細書に記述する方法において用いることができる発蛍光団の例は以下のとおりである：７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、テキサスレッドＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ｌｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ、５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン；フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート；５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン；７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸；６−［フルオレセイン５−（および−６）カルボキサミド］ヘキサン酸；Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸；エオシン−５−イソチオシアネート；エリトロシン−５−イソチオシアネート；およびカスケーｄＴＭブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
【００４０】
複数のプローブを用いる方法において、該組の各染色体プローブを区別して視覚化できるように異なる色の発蛍光団を選択することができる。あるいはまた、該組の２個もしくはそれ以上のプローブを同じもしくは同様の発蛍光団で標識することができる。プローブは、蛍光顕微鏡および各発蛍光団に適切なフィルターで、もしくは複数の発蛍光団を観察するために二重もしくは三重帯域通過フィルター組を用いることにより調べることができる。例えば、米国特許第５，７７６，６８８号を参照。あるいはまた、フローサイトメトリーのような技術を染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを調べるために用いることができる。
【００４１】
プローブはまた、標識されたプローブを視覚化するために二次検出分子、もしくはさらなる処理を必要とするが、例えばビオチンもしくはジゴキシゲニンで、間接的に標識することもできる。例えば、ビオチンで標識したプローブは、検出可能なマーカー、例えば発蛍光団に結合したアビジンにより検出することができる。さらに、アビジンはアルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素マーカーに結合することができる。酵素マーカーは、酵素の基質を用いて標準的な比色反応において検出することができる。アルカリホスファターゼの基質には、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸およびニトロブルーテトラゾリウムが包含される。西洋ワサビペルオキシダーゼの基質としてジアミノベンゾエートを用いることができる。
インサイチューハイブリダイゼーション
染色体異常を有する細胞の有無は、インサイチューハイブリダイゼーションにより決定する。染色体異常を有する細胞は、例えば、異常な数の染色体を有し、そして／または表１に示すような遺伝子座もしくは染色体腕のような、特定の染色体領域の獲得もしくは喪失（例えばヘミ接合性もしくはホモ接合性喪失）のような染色体構造の改変を有する。例えば、一つもしくはそれ以上の染色体の獲得、例えば３コピーもしくはそれ以上の任意の既定の染色体を有する細胞は、本明細書に記述する方法において検査で陽性反応を示すと考えることができる。単染色体性および零染色体性を示す細胞もまた、ある特定の状況下で検査で陽性反応を示すと考えることができる。一般に、インサイチューハイブリダイゼーションは、生物学的サンプルを固定すること、固定した生物学的サンプル内に含まれる標的ＤＮＡに染色体プローブをハイブリダイズさせること、非特異的結合を除くために洗浄すること、およびハイブリダイズしたプローブを検出することの工程を含む。
【００４２】
「生物学的サンプル」は、細胞もしくは細胞材料、例えば、肺実質、細気管支、気管支（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ）、気管支（ｂｒｏｎｃｈｉ）および気管が包含されるがこれらに限定されるものではない、肺構造から得られる細胞もしくは細胞材料を含有するサンプルである。肺癌の検出に有用な生物学的サンプルの限定されない例には、気管支標本、肺生検および喀痰サンプルが包含される。気管支標本の例には、気管支分泌物、洗浄液、洗浄、吸引および擦過が包含される。肺生検は、外科手術、気管支鏡検査および経胸郭針生検が包含される方法により得ることができる。一例として、肺生検からタッチプレパレーション（ｔｏｕｃｈ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）を作ることができる。
【００４３】
さらに、生物学的サンプルは滲出液、例えば、胸水、心外膜液もしくは腹水を包含することができる。さらに、生物学的サンプルは、肺癌が一般に転移する組織から得られる細胞もしくは細胞材料を包含することができる。これらの組織には、例えば、リンパ節、血液、脳、骨、肝臓および副腎が包含される。従って、本明細書に記述するプローブおよびプローブ組は、肺癌および肺癌転移を検出するために用いることができる。
【００４４】
典型的には、当業者に周知である技術を用いて細胞を生物学的サンプルから採取し、そして調製する。例えば、細胞は、気管支洗浄液のような生物学的サンプルを遠心分離しそしてペレットにした細胞を再懸濁することにより採取することができる。典型的には、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁する。細胞ペレットを得るために細胞懸濁液を遠心分離した後、細胞を例えば酸アルコール溶液、酸アセトン溶液、もしくはホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドのようなアルデヒドにおいて固定することができる。例えば、メタノールおよび氷酢酸をそれぞれ３：１の比率で含有する固定剤を固定剤として用いることができる。中性緩衝ホルマリン溶液もまた用いることができ、そしてリン酸ナトリウムの水溶液中約１％〜１０％の３７−４０％ホルムアルデヒドを含む。固定剤の大部分を取り除き、ごく一部の溶液に懸濁した濃縮細胞を残すことにより細胞を含有するスライドを調製することができる。細胞がスライド上で重なり合わないように細胞懸濁液をスライドに加える。細胞密度は、光学もしくは位相差顕微鏡により測定することができる。
【００４５】
インサイチューハイブリダイゼーションの前に、染色体プローブおよび細胞内に含まれる染色体ＤＮＡを各々変性させる。染色体プローブが一本鎖核酸として調製される場合、プローブの変性は必要とされない。変性は、典型的には、高いｐＨ、熱（例えば約７０℃〜約９５℃の温度）、ホルムアミドおよびテトラアルキルアンモニウムハロゲン化物のような有機溶媒、もしくはその組み合わせの存在下でインキュベーションすることにより行う。例えば、７０℃より上の温度（例えば約７３℃）と７０％のホルムアミドおよび２ＸＳＳＣ（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）を含有する変性バッファーとの組み合わせにより染色体ＤＮＡを変性させることができる。変性条件は、典型的に、細胞形態が保たれるように定める。例えば、染色体プローブは、熱により、例えばプローブを約７３℃に約５分間加熱することにより変性させることができる。
【００４６】
変性する化学物質もしくは条件を取り除いた後、ハイブリダイズする条件下でプローブを染色体ＤＮＡにアニーリングさせる。「ハイブリダイズする条件」は、プローブと標的染色体ＤＮＡ間のアニーリングを促進する条件である。ハイブリダイゼーション条件は、プローブの濃度、塩基組成、複雑さおよび長さ、並びにインキュベーションの塩濃度、温度および長さにより異なる。例えば、インサイチューハイブリダイゼーションは、典型的に、１−２ＸＳＳＣ、５０−５５％ホルムアミド、ハイブリダイゼーション促進剤（例えば１０％硫酸デキストラン）、および非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するためのブロッキングＤＮＡを含有するハイブリダイゼーションバッファーにおいて行う。一般に、上記のようなハイブリダイゼーション条件は、約２５℃〜約５５℃の温度、および約０．５時間〜約９６時間のインキュベーションの長さを含む。より特に、ハイブリダイゼーションは、約３２℃〜約４５℃で約２〜約１６時間行うことができる。
【００４７】
標的領域の他のＤＮＡへの染色体プローブの非特異的結合は、一連の洗浄により除くことができる。各洗浄における温度および塩濃度は、所望のストリンジェンシーにより決まる。例えば、高いストリンジェンシー条件では、０．２Ｘ〜約２ＸＳＳＣ、および約０．１％〜約１％のＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ４０）のような非イオン性界面活性剤を用いて、約６５℃〜約８０℃で洗浄を行うことができる。ストリンジェンシーは、洗浄の温度を下げることによりもしくは洗浄の塩濃度を上げることにより低くすることができる。
染色体異常の検出
細胞における染色体プローブもしくは染色体プローブの組のハイブリダイゼーションパターン（例えば各プローブのシグナルの数）を調べ、そしてシグナルの数を記録することにより、細胞内の染色体もしくは染色体領域の獲得もしくは喪失を評価する。典型的なアッセイでは、ハイブリダイゼーションパターンを複数の細胞、例えば約２５−５，０００個の細胞において評価する。
【００４８】
１個もしくはそれ以上、例えば少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０個の細胞が「検査で陽性反応を示す」複数の細胞、例えば少なくとも約１００個を含有するサンプルは、癌陽性と考えられる。「検査で陽性反応を示す」は、本明細書に記述するような染色体、染色体腕もしくは遺伝子座の獲得もしくは喪失を有することを意味する。「検査で陽性反応を示す」規準は、１、２、３、４個もしくはそれ以上のプローブで検査で陽性反応を示すことを含むことができる。さらに、「検査で陽性反応を示す」は、複数のプローブ、例えば４個のプローブでハイブリダイゼーション分析を行いそして一部のプローブ、例えば少なくとも２もしくは３個のプローブで異常なハイブリダイゼーションパターンを検出することを含むことができる。
【００４９】
細胞、例えばスライドのような平面上に置かれた細胞を含有するサンプルは、様々な方法によりそして様々な規準を用いて評価することができる。本明細書に記述するプローブおよび方法は、特定のスクリーニング方法論での使用に限定されない。例えば、「走査法」として既知であるものにおいて、観察者は何百〜何千もの細胞を細胞学的異常に関して走査する（ＤＡＰＩフィルターで調べて）。評価する細胞の数は、患者によって異なる標本の細胞充実性により決まる。必ずではないが一般に新生細胞と関連する細胞学的異常には、核の拡大（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ）、核の不規則（ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｉｔｙ）、および異常なＤＡＰＩ染色（しばしばまだらでそしていっそう薄い）が包含される。走査法において、観察者は、（ＦＩＳＨにより示されるような）染色体異常に関する細胞の評価を細胞学的異常もまた示す細胞に集中する。さらに、染色体異常は細胞学的異常がなくても起こるので、明らかな細胞学的異常がない細胞の一部を評価することができる。走査法は、米国特許第６，１７４，６８１号にさらに詳細に記述されており、その内容は引用することにより組み込まれる。
肺癌に関する患者のスクリーニング、モニタリングおよび診断
本明細書に記述する方法は、肺癌に関して個体をスクリーニングするためにもしくは肺癌と診断される患者をモニターするために用いることができる。例えば、スクリーニング形態において、喫煙するかもしくは煙に慢性的にさらされている個体、またはアスベストに慢性的にさらされる個体のような肺癌の危険にさらされている個体を肺癌のいっそう早期の発見という目的でスクリーニングする。さらに、本明細書に記述するプローブおよび方法は、症状のある患者の診断に用いることができる。本明細書に記述する方法は、単独でもしくは他の試験とともに用いることができる。例えば、画像分析、例えばＣＴ、スパイラルＣＴ、およびＸ線解析、並びに／もしくは細胞診のような他の標準試験と一緒に本明細書に記述するようなインサイチューハイブリダイゼーションを行うことにより肺癌の増大した危険を有する患者を肺癌に関してスクリーニングすることができる。あるいはまた、最初に標準方法を患者に対して行うことができ、そして標準試験が疑わしいもしくは陰性の結果を与える場合に、本明細書に記述する方法を行うことができる。
【００５０】
本明細書に記述する方法はまた、肺癌にかかっていると診断される患者に対して治療を選択するために用いることもできる。従って、該方法は、肺癌を診断し、同時に、癌の可能な処置に関する有用な情報を提供することができる。本明細書に記述するプローブのいくつかは、癌遺伝子および癌抑制遺伝子に向けられる。患者が癌にかかっているという決定の過程でこれらの遺伝子の１個もしくはそれ以上が改変されていることが見出される場合、この情報を治療、例えばこれらの遺伝子および／もしくはそれらのタンパク質産物の存在もしくは活性を調節する（増加するもしくは減少する）治療を選択するために用いることができる。例えば、１７ｑ２１遺伝子座の改変が見出される場合、この情報をＨｅｒ−２に基づく治療を設計するために用いることができる（例えば、Ｃｒａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１１：５４１−５４７を参照）。特定の癌遺伝子および癌抑制遺伝子を含有する遺伝子座を表１に示す。
プローブ選択法
個々のプローブおよびプローブ組の選択は、実施例に記述する原理を用いて行うことができる。これらの選択法は、高感度での肺癌の検出に有用なプローブおよびプローブ組を選択するために判別および／もしくは組み合わせ分析を利用する。
【００５１】
本明細書に記述する方法は、好ましくは、特に肺癌の早期発見のための、常法のものより優れている組み合わせた感度および特異性を有する。実施例に記述するように、２６個の染色体プローブを２７個の異なる肺腫瘍標本および１２個の正常隣接組織標本にハイブリダイズさせ、そして各標的の獲得および喪失の程度を測定した。このデータを分析しそして最も有用なプローブ組を選択するために、組み合わせて考慮した場合に、高い感度および特異性を有するプローブ組をもたらすいくつかの基準を開発した。各基準は厳格ではないが、最適に遂行するプローブ組に到達するために他の基準に対して重視する一般的な優先を提示する。
【００５２】
（１）プローブ組に選択される各プローブは、独力で腫瘍と正常な組織を判別する能力を有するべきである。高い判別能力を有するプローブが好ましい。判別分析は２つの異なる方法を利用する：（ａ）プローブ標的の各々の標的獲得および喪失を有する細胞のパーセンテージの平均および標準偏差を腫瘍標本組および正常隣接腫瘍標本間で比較すること、並びに（ｂ）獲得および喪失した標的の細胞パーセンテージの様々なカットオフ値に対して、腫瘍および正常隣接腫瘍標本を特定する各プローブの感度および特異性を個々に計算すること。方法（ａ）を評価するためにいくつかの異なる測定基準を作製することができ、これらにはＤ．Ｖ．（判別値）、Ｓ．Ｄ．Ｍ．（「中間点」での標準偏差）およびｐ値の計算が包まれた。Ｄ．Ｖ．およびｐ値は、評価のために一般に認められている方法である。Ｓ．Ｄ．Ｍ．の妥当性は、それが腫瘍および正常平均からの標準偏差の倍数として、平均および標準偏差が２つの集団の真の値に実際に等しい場合に感度が特異性と等しいカットオフ値であることである。例えば、中間点が腫瘍標本の平均から腫瘍標本の１標準偏差および正常隣接標本の平均から正常隣接標本の１標準偏差である場合、感度および特異性は各々８４％に等しい（これはまた、正常隣接組織分布では０へのそれらの近似のために真実である可能性が低い、各集団の正規誤差分布も仮定する）。Ｓ．Ｄ．Ｍ．が大きいほどそのプローブの感度および特異性は大きい。
【００５３】
（２）組み合わせた感度および特異性の主な測定基準は、理想的な（感度＝特異性＝１）および測定された感度および特異性を示す特異性に対する感度のプロット上の点の間で引いたベクトルの大きさである「ベクトル」と呼ばれる量である。従って、ベクトル値は、理想的な場合の０から最も悪い場合で１．４１４である。
【００５４】
（３）プローブ組に選択される各プローブは、他の選択されたプローブを補足すべきであり、すなわち、それは、他のプローブ（１個もしくは複数）が特定できなかった追加の腫瘍標本を特定すべきである。プローブの最も良い補足する組を特定する一つの方法は、最も低いベクトル値を有するプローブを選び、それが特定する腫瘍標本の群を腫瘍標本の完全な組から取り除き、そして次に残りの腫瘍標本に対して最も低いベクトル値を有するプローブを決定することである。プローブ組を完成するために必要に応じてこの方法を続けることができる。全ての可能なプローブの組み合わせを作製しそして各々の感度および特異性を計算する本明細書において選択する方法は、全ての可能なプローブ組の性能を予測し、そして最も高い性能特性を有する最小限のプローブ組の選択を可能にする。また、同様に高い性能特性を有する様々な組み合わせも得られる。試験する標本の限定された数のために起こりうる誤差を考慮して、高位のプローブの組み合わせのいくつかを疾患の予後診断との関連性もしくはプローブを製造することにおける困難のような他の実用的特徴に基づいて比較することができる。
【００５５】
（４）相互に補足し合うプローブの能力は、以下の（５）に示す場合を除いて、個々のプローブの判別能力より重要である。
【００５６】
（５）他のプローブを補足する測定された能力にかかわらず、各プローブは、腫瘍標本組と正常隣接組織標本組間で統計的に異なるパーセンテージの検査で陽性反応を示す細胞を特定しなければならない。この条件が満たされない場合、プローブは見かけの相補性に基づいて誤って選択されるかもしれない。
【００５７】
（６）２個のプローブの組み合わせのデータは、３個のプローブの組み合わせのデータより信頼性があり、そして３個のプローブの組み合わせのデータは、４個のプローブの組み合わせのデータより信頼性がある。これは、より多数のプローブおよび試験する限定された数の標本間の相関関係をもたらす能力の低下に起因する。
【００５８】
（７）カットオフ値の関数としてのプローブおよびプローブの組み合わせの性能の依存性を考慮しなければならない。「カットオフ値」は、陽性とみなされるサンプルで獲得もしくは喪失を有するはずである集団における細胞のパーセンテージをさす。従って、サンプルにおける細胞のパーセンテージがカットオフ値より上であるかもしくはカットオフ値と等しいかもしくはそれ未満であるかによりサンプルを陽性もしくは陰性と称する。
【００５９】
一般に、プローブの組み合わせた特異性および感度は、低いカットオフ値でいっそう優れている。しかしながら、癌細胞が、気管支分泌物もしくは喀痰のような、多数の正常細胞を含有するマトリックス内に分散している場合、高いカットオフで最も良く遂行するプローブが、検出される可能性が高い。これは、高いカットオフでの優れた性能が、異常性を含有する細胞のいっそう高い普及率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）を示すからである。計算に用いることができるカットオフ値の例には、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％および６０％が包含される。
【００６０】
（８）標的獲得の測定は、標的喪失の測定より好ましい。重複する標的もしくはある細胞への弱いハイブリダイゼーションは、単染色体性を誤って示唆する可能性がある。欠失プローブは、最小に欠失した領域を越えて広がってはならないので、欠失を検出するために設計する遺伝子座特異的もしくは染色体アームプローブは、一般に、獲得を検出するために設計する遺伝子座特異的もしくは染色体アームプローブより小さい。「欠失プローブ」のあまりに多くが欠失配列を越えて広がる場合、誤って計数されるのに十分なシグナルが残り得る。通常、「欠失プローブ」は小さくしておくので、それらのシグナルは典型的に獲得される標的のシグナルほど強くない。これは言い換えると、欠失をモニターする標的からの実際のシグナルを誤算し得る可能性を高くする。同様に、本発明に用いるいくつかの染色体計数プローブのような反復配列プローブは、通常、遺伝子座特異的プローブより鮮明なシグナルを与えそして速くハイブイダイズするので、単一の遺伝子座プローブより好ましい。一方、反復配列プローブは、多型に対して遺伝子座特異的プローブより感度が高い。
【００６１】
（９）プローブもしくはプローブの組み合わせは、好ましくは、細胞診のような常法より優れた改善を示す。プローブもしくはプローブの組み合わせは、好ましくは、少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％さえの感度で肺癌を検出する。プローブもしくはプローブの組み合わせは、好ましくは、約０．５００、０．４５０、０．４００、０．３５０、０．３００、０．２５０、０．２００、０．１５０もしくは０．１００未満のベクトル値で肺癌を検出する。
【００６２】
本発明を以下の実施例においてさらに記述し、これらは請求項に記述する本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００６３】
実施例１：プローブ選択
インサイチューハイブリダイゼーションにより肺癌における染色体異常を検出するための候補として２６個のプローブの収集物を集めた。これらのプローブを肺癌タッチプレパレーションの収集物にハイブリダイズさせ、そして各プローブ標的の細胞当たりのコピー数の分布を決定した。腫瘍標本を保全するために、多色ハイブリダイゼーションを利用して標本当たりのハイブリダイゼーション領域の数を８に限定した。これを成し遂げるために、２６個のプローブをいくつかの異なる発蛍光団で標識した。標識したプローブから各々３もしくは４個のプローブの混合物を調製して８プローブ組を生成せしめた。可能である場合、全染色体異数性と染色体内の領域の獲得および喪失を判別するために同じ染色体を標的とする染色体計数プローブおよび遺伝子座特異的プローブを同じ組に組み合わせた。
【００６４】
肺タッチプレパレーションへのハイブリダイゼーションに選択した２６個のプローブを表１に記述する。これらのプローブには、１３個の染色体計数プローブ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．からのＣＥＰＴＭプローブ；反復動原体配列を標的とする）および１３個の遺伝子座特異的プローブ（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．からのＬＳＩＴＭもしくはＢＡＣ調製物；増幅もしくは欠失した染色体領域と関連するユニーク配列を標的とする）が含まれた。表１の第３縦列は、２６個のプローブの各々の標的位置を記述する。これらのプローブのいくつかには、関連遺伝子座に位置する癌遺伝子もしくは癌抑制遺伝子もまた記載する。
【００６５】
ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａＴＭ、ＡｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎＴＭおよびＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅＴＭで標識した３個のプローブ、もしくはＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａＴＭ、ＡｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎＴＭ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄＴＭおよびＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄＴＭで標識した４個のプローブの混合物を調製して８プローブ組を生成せしめた。各プローブに用いた蛍光標識および各プローブを含有するプローブ組を表１のそれぞれ第４および第５縦列に記述する。
【００６６】
各種の肺癌にかかっている２７人の患者から取り除いた肺癌から調製した腫瘍タッチプレパレーションを２６個のプローブを試験するのに用いた。さらに、１２人の該患者からの腫瘍から一般に少し離れた正常な肺組織より調製した標本（ＮＡＬ＝正常隣接肺組織）もまた、各プローブの獲得および喪失標的のバックグラウンドレベルを調べるために試験した。肺腫瘍および正常標本の特徴を表２に記載する。タッチプレパレーションは、一片の肺腫瘍もしくは正常隣接組織を顕微鏡スライドガラスに押し付けそしてエタノールにおいて短時間固定することにより調製した。次にこれらの標本は、使用の準備ができるまで−２０℃で保存した。
【００６７】
インサイチューハイブリダイゼーションの前に、タッチプレパレーションを以下のプロトコルによりインサイチューハイブリダイゼーション性能を向上するために処理した。
【００６８】
（１）標本スライドを新しいＣａｒｎｏｙ溶液（３：１メタノール：酢酸）において室温で２０分間固定する。スライドを風乾させる。
【００６９】
（２）スライドを４５℃のホットプレート上に１５分間置く。
【００７０】
（３）スライドを２ｘＳＳＣにおいて３７℃で１０分間インキュベーションする。
【００７１】
（４）スライドをペプシン溶液（０．０５ｍｇペプシン／ｍｌ  １０ｍＭ  ＨＣｌ）に３７℃で１３分間置く。ペプシン溶液は、２５μＬのペプシンストック溶液（１００ｍｇペプシン／ｍＬ水；２，５００−３，０００Ｕ／ｍｇペプシンを用いる）を５０ｍＬの１０ｍＭ  ＨＣｌに希釈することにより毎日新しく調製する。
【００７２】
（５）スライドを１ｘＰＢＳに室温で５分間置く。
【００７３】
（６）スライドを１％ホルムアルデヒドにおいて室温で５分間固定する。ホルムアルデヒド溶液は、１．３５ｍＬの３７％ホルムアルデヒドを４８．１５ｍＬの１ｘＰＢＳおよび０．５ｍＬの２Ｍ  ＭｇＣｌ２と混合することにより調製する。毎日の使用後に廃棄する。
【００７４】
（７）スライドを１ｘＰＢＳに室温で５分間置く。
【００７５】
（８）スライドを一連のエタノール溶液（７０％、８５％、１００％）に溶液当たり１−５分置くことにより標本を脱水する。変性させる前に標本を風乾させる。
【００７６】
上記の処理を行った後、以下のように蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを全ての標本に対して行った。
【００７７】
（１）スライドを７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣの溶液に７３℃で５分間置くことにより標本のＤＮＡを変性させる。
【００７８】
（２）スライドを一連のエタノール溶液（７０％、８５％、１００％）に溶液当たり１−５分置くことにより標本を脱水する。変性したプローブを加える前に標本を風乾させる。
【００７９】
（３）プローブを含有するチューブを７３℃の水浴に５分間置くことによりプローブ溶液を変性させる。
【００８０】
（４）変性したプローブ溶液を変性したスライドに加え、溶液上にカバースリップを置き、そして縁に沿ってゴムセメントを付けることによりカバースリップを密封する。プローブを給湿チャンバーにおいて３７℃で一晩ハイブリダイズさせる。
【００８１】
（５）スライドをコプリン（Ｃｏｐｌｉｎ）ジャーにおいて０．４ｘＳＳＣ／０．３％  ＮＰ−４０中７０℃で３分間（もしくは７３℃で１分）洗浄する。コプリンジャー当たり４枚のスライドを同時に洗浄する。
【００８２】
（６）スライドを２ｘＳＳＣ／０．１％  ＮＰ−４０に数秒〜数分間浸す。
【００８３】
（７）退色防止／対比染色溶液を加え、そしてカバースリップで覆う。分析するまでスライドを−２０℃で保存する。
【００８４】
ハイブリダイズした標本スライドを４種の蛍光標識およびＤＡＰＩ対比染色の各々に特異的な単一帯域通過フィルター組を用いて蛍光顕微鏡上で調べた。１００個の連続した非炎症細胞における各蛍光色の点の数を計数することにより各タッチプレパレーションを分析し、そして各プローブ標的のコピー数を記録した。標本のいくつかは、２６個全てのプローブと十分にハイブリダイズするとは限らず、従って、試験する標本の数は各プローブで異なる。さらに、プローブ組８を全ての標本に対して試験したとは限らなかった。
実施例２：インサイチューハイブリダイゼーションデータの分析
正常および腫瘍標本の各々の標的コピー数データを、腫瘍標本と正常標本を判別する各プローブの能力（判別分析）および腫瘍標本と正常標本を判別するプローブ組み合わせの能力（組み合わせ分析）に関して分析した。これらの分析は、肺癌細胞を最もよく特定するためにどのプローブを個々にもしくは合わせて用いるべきかを決定することにおいて考慮するデータの一部として用いた。
判別分析
正常標本群と腫瘍標本群を判別する個々のプローブの能力は、各群において見出される異常細胞のパーセンテージの平均および標準偏差を比較することによってまず評価した。これらのデータを表３（正常標本群）および４（腫瘍標本群）に記載する。各表の最初の２６列は、試験する２６個のプローブの各々の細胞当たりの絶対標的計数から得られたデータを記載する。これらの計算では、２コピーより多く存在する個々の標的はコピー数の異常な獲得とみなし、そして２コピーより少なく存在する標的はコピー数の異常な喪失と見なした。表３および４の最後の８列は、ＬＳＩ／ＣＥＰ標的数の比、もしくは第５染色体の場合にはＬＳＩ  ５ｐ１５／ＬＳＩ  ５ｑ３１標的数の比から得られるデータを示す。比は、両方のプローブが同じプローブ組に含まれる場合にのみ計算した。これらの比は、細胞ごとに計算した。これらの計算の上で、比が１より大きい場合には細胞が標的獲得を、そして比が１未満である場合には標的喪失を有すると見なした。
【００８５】
表３および４において、「・・・細胞の％の平均」の見出しのある縦列は、見出しに示すように、標的コピー数獲得もしくは標的コピー数喪失のいずれかを有する各標本において見出される細胞のパーセンテージの平均である。「・・・細胞の％のＳ．Ｄ．」は、各特定のプローブの判断可能なハイブリダイゼーションが得られた標本の数（「標本の数」の縦列）の平均細胞パーセンテージの標準偏差である。
【００８６】
表４には、腫瘍標本群と正常標本群を判別する各プローブの能力の異なる基準を含む３つの縦列が含まれる。判別値、Ｄ．Ｖ．は、式：１：
ＤＶ＝（ＭＴ−ＭＮ）２／（ＳＤＴ２＋ＳＤＮ２）      （１）
に従って計算され、値は、正常標本の平均、ＭＮおよび腫瘍標本の平均、ＭＴ間の大きい分離に対して、そして正常、Ｓ．Ｄ．Ｎおよび腫瘍、Ｓ．Ｄ．Ｔ標本の小さい標準偏差に対して大きい。
【００８７】
「中間点でのＳＤ」、Ｓ．Ｄ．Ｍ．は式２：
Ｓ．Ｄ．Ｍ．＝（ＭＴ−ＭＮ）／（ＳＤＴ＋ＳＤＮ）      （２）
により計算され、そして平均の分離に等しい腫瘍および正常群平均からの標準偏差の数である。平均および標準偏差が腫瘍および正常集団の真の値である場合、Ｓ．Ｄ．Ｍ．は感度および特異性が相互に等しい点である。Ｓ．Ｄ．Ｍ．が大きいほど、感度および特異性の値は大きい。
【００８８】
表４に記載する第三の判別基準は、測定された平均が同じ集団からである確率、ｐである。ｐの値は、スチューデントｔ検定から決定する。実際、ｐ値が小さいほど、腫瘍集団は正常集団といっそう大きく統計的に異なる。ｐ＜０．０５は、典型的に、２群間の統計的に有意な差を表すと考えられる。
【００８９】
表４のｐ値は、２６個のプローブの全てが、絶対標的数を用いる場合に、正常群に対する腫瘍標本群の統計的に有意な（ｐ＜０．０５）獲得を検出したことを示す。ＬＳＩと対応するＣＥＰもしくはＬＳＩ標的数間の比として調べると、８個の比のうち５個が有意な差を示した（表４の最後の８列）。それに反して、２６個のプローブのうち２個のみが絶対標的数の統計的に有意な喪失を検出し（ＬＳＩ  ８ｐ２４およびＣＥＰ１７）、一方、８個の比のうち５個が有意な差を示した。
【００９０】
表４の列は、標的の獲得の最も高いＤ．Ｖ．から最も低いＤ．Ｖ．に分類される。絶対標的計数から得られたデータは、比率データと別個に分類される。標的獲得のＤ．Ｖ．、Ｓ．Ｄ．Ｍ．およびｐ値の試験は、これら３つの判別パラメーター間の比較的よい対応を示す。３つ全てのパラメーターにより選択されるトップ５個の判別プローブは同じもの、降順にＬＳＩ  ５ｐ１５、ＬＳＩ  ７ｐ１２、ＣＥＰ１、ＣＥＰ６およびＬＳＩ  ８ｑ２４である（全て腫瘍標本における標的の獲得を示す）。
【００９１】
どのプローブが正常標本と腫瘍標本の最もよい判別を与えるかを決定する総合選択法内の別の方法は、各プローブによって正しく特定される標本の数を調べることである。これは、獲得もしくは喪失を有する細胞のパーセンテージのカットオフ数を選択することを必要とする。次に、サンプルにおける細胞のパーセンテージが、それぞれ、カットオフ値より上であるかもしくはカットオフ値に等しいかもしくはそれ未満であるかにより、サンプルを癌に陽性もしくは陰性と称する。次に、最もよいプローブを選択するために陽性サンプル（感度）および陰性サンプル（特異性）を特定する精度を用いる。
【００９２】
表５は、２６個全てのプローブ標的並びに表３および４に記載するのと同じＣＥＰ／ＬＳＩおよび５ｑ／ｐ比の獲得および喪失の特異性および感度を記載する。この表には、６つの異なるカットオフ値（５％、１０％、２０％、３０％、４０％および５０％）での特異性および感度値が含まれる。腫瘍標本と正常標本を判別する総合能力は特異性および感度の両方により決まるので、この表にはまた、組み合わせた特異性および感度の２つの基準も含まれる。第一の組み合わせた特質は、特異性および感度の積である。積は、特異性および感度の両方が高い場合に最も大きく、そしていずれかもしくは両方が低い場合に減少する。「ベクトル」と称する、もう一つの組み合わせた特質は、式３：
ベクトル＝［（１−特異性）２＋（１−感度）２］０．５      （３）
に従って計算される。この特質は、特異性および感度＝１の場合に０の値を有し、そして両方が０に近づくにつれて１．４１４まで増加する。
【００９３】
表５の列は、各カットオフ値の増加するベクトル値により分類される。絶対標的計数から得られたデータは、比率データと別個に分類される。標的獲得は表のトップを占め、そして同じプローブは、それらの相対的順位はカットオフ値とともに変わるが、最も低いベクトル値を示す傾向がある。ベクトル値および絶対標的計数に基づく一貫して高い判別能力を示すプローブには、ＬＳＩ  ８ｑ２４、ＬＳＩ  ５ｐ１５、ＬＳＩ  ７ｐ１２、ＬＳＩ  ３ｑ２６、ＬＳＩ  ２０ｑ１３、ＬＳＩ  ５ｑ３１、ＬＳＩ  ３ｐ１４、ＬＳＩ  １７ｑ２１、ＣＥＰ１、ＣＥＰ４、ＣＥＰ６、ＣＥＰ７、ＣＥＰ９およびＣＥＰ１６が包含される。これらのプローブの各々は、少なくとも二つのカットオフ値のトップ１０列に見出される。標的比は、一般に、それらの絶対標的計数に基づく最もよいプローブのいくつかと匹敵するベクトル値を有する染色体５ｐ１５／５ｑ３１比を除いて、より低いベクトル値を示した。
組み合わせ分析
合わせて用いる複数のプローブのアッセイ感度を上げる（相補性）能力を組み合わせ分析を用いて調べた。一群のプローブの全ての可能な組み合わせを作製することにより分析を開始した。次に、各組み合わせにおけるプローブのいずれかが細胞の閾値数を越えてそれらの標的の獲得もしくは喪失を特定するかどうかを決定するために各標本からの計数データを調べた。組み合わせにおけるプローブのいずれかが陽性である場合、標本をその組み合わせで癌に陽性と見なした。
【００９４】
組み合わせは最大４個のプローブに保った。獲得および喪失に関して各々を調べる２６個のプローブおよびそれらの関連比に対して作製される多数の可能な組み合わせにより（１、２、３および４個のプローブの８６６，８４７の可能な組み合わせ）、全ての組み合わせを作製するために２６個のプローブの完全な一揃いは用いなかった。その代わりに、プローブおよび比の組は、ｐ＜０．０１で獲得を同定したプローブおよび喪失を同定したプローブ（表４）のみを含むように限定した。これは、個々のプローブの無作為に高い標的計数の結果としてプローブの組み合わせが過大に評価されないいくらかの保証を与えた。複雑さをさらに減らすために、プローブの２つの異なる群を別個に調べた。群１は、絶対計数がｐ＜０．０１で標的獲得もしくは喪失を特定したプローブの全てを含んだ。群２は、比がｐ＜０．０１で標的獲得もしくは喪失を同定した場合に、群１のメンバーをそれらの対応するＬＳＩ／ＣＥＰもしくはＬＳＩ／ＬＳＩ比で置き換えた。従って、群１は、表４の最初の２５列に記載する獲得のプローブの全てからなり（その高い有意性のために、ＬＳＩ  ５ｐ１５／ＬＳＩ  ５ｑ３１もまたこの群に含まれた）、そして喪失のプローブのいずれからもならなかった。群２：獲得にはＬＳＩ  ７ｐ１２およびＬＳＩ  ８ｑ２４をそれぞれＬＳＩ  ７ｐ１２／ＣＥＰ７およびＬＳＩ  ８ｑ２４／ＣＥＰ８で置き換え；ｐ＞０．０１で対応するＬＳＩ／ＣＥＰ比を有した他のＬＳＩプローブを削除し；そして喪失にはＬＳＩ  ９ｐ２１／ＣＥＰ９およびＬＳＩ  １７ｐ１３／ＣＥＰ１７を加えた。
【００９５】
表６〜９は、それぞれ、１０％（表６）、２０％（表７）、３０％（表８）および４０％（表９）のカットオフ値の、組み合わせた最も高い感度および特異性を有する２、３および４個のプローブの組み合わせを記載する。組み合わせを順序付けるために用いる組み合わせた感度および特異性の基準は、ベクトル値であった。組み合わせにおける一部のプローブが、等しいかもしくはより低いベクトル値を与える場合には、特定の組み合わせを表から除いた。カットオフ値を上げるにつれて最もよい組み合わせに寄与するプローブは変わった。単一のプローブに対して表５において以前に認められたように、最もよいベクトル値もまたカットオフ値を上げるにつれて増加した。組み合わせにおけるプローブの数を決定する際に、比は、比におけるプローブの一方が組み合わせ中にもある場合を除いて、２個のプローブとして計数した。一般に、比は、ＬＳＩ  ５ｐ１５／ＬＳＩ  ５ｑ３１比を除いて、よりよい評点の組み合わせにおいて見出されなかった。また、標的喪失は、トップの遂行するプローブ組み合わせにめったに位置付けられなかった。結果として、さらなる説明において、特に喪失と示さない限り、標的の獲得を意味する。
【００９６】
１０％のパーセント細胞カットオフ値で（表６）、ＬＳＩ  ８ｑ２４およびＬＳＩ  ５ｐ１５は、２個のプローブのトップの遂行する組み合わせに一般に見出され、そしてその上お互いを補足し合った。ＬＳＩ  ８ｑ２４はまた、ＬＳＩ  １７ｑ２１、ＬＳＩ  ５ｑ３１、ＬＳＩ  ９ｐ２１、ＣＥＰ１、ＣＥＰ６、ＣＥＰ７、ＣＥＰ９、ＣＥＰ１１およびＣＥＰ１７によってもよく補足された。ＬＳＩ  ５ｐ１５はまた、ＬＳＩ  １７ｑ２１、ＬＳＩ  ５ｑ３１、ＬＳＩ  ９ｐ２１、ＬＳＩ  １３ｑ１４、ＣＥＰ８、ＣＥＰ１２およびＣＥＰ１７によってもよく補足された。
【００９７】
さらに、ＬＳＩ  ７ｐ１２およびＣＥＰ１はお互いによく補足し合った。同じプローブはまた、３個および４個のプローブの優れた組み合わせにおいても見出された。
【００９８】
カットオフを２０％に上げた場合（表７）、ＬＳＩ  ５ｐ１５は２個のトップの組み合わせにとどまり、そしてＬＳＩ  ３ｑ２６、ＣＥＰ１６、ＬＳＩ  ２０ｑ１３、ＬＳＩ  １７ｑ２１およびＣＥＰ４によって最もよく補足された。ＬＳＩ  ８ｑ２４、ＬＳＩ  ３ｐ１４、ＬＳＩ  ５ｑ３１、ＬＳＩ  ７ｐ１２、ＣＥＰ３、ＣＥＰ６およびＣＥＰ９もまたＬＳＩ  ５ｐ１５に対する優れた相補性を与えた。ＬＳＩ  ８ｑ２４は、依然として優れた遂行者であるが、表の下位へ落ち、ＬＳＩ  ７ｐ１２およびＣＥＰ６によって補足された。３個および４個のプローブの優れた組み合わせもまた、これらのプローブ並びに１０のカットオフでの優れた組み合わせに上記で同定された他のプローブを含んだ。
【００９９】
カットオフを３０％に上げた場合（表８）、ＬＳＩ  ５ｐ１５は優れた組み合わせに存続し、そしてＬＳＩ  ８ｑ２４は高位を占める組み合わせになかった。ＬＳＩ  ５ｐ１５の相補性は、ＣＥＰ６、ＣＥＰ１６、ＬＳＩ  ２０ｑ１３、ＬＳＩ  ３ｑ２６、ＬＳＩ  １７ｑ２１、ＬＳＩ  ７ｐ１２およびＬＳＩ  ３ｐ１４によって与えられた。また、ＬＳＩ  ７ｐ１２はＣＥＰ６によって補足され、そしてＣＥＰ６およびＣＥＰ７はお互いを補足し合った。標的喪失の検出は、４個のプローブの組み合わせにおいてのみ重要であると見出された（ＣＥＰ７に対するＬＳＩ  １７ｐ１３の喪失）。
【０１００】
カットオフ値を４０％に増やすことは（表９）、２個のプローブの組み合わせにおけるＬＳＩ  ５ｐ１５の重要性を下げ、そしてＬＳＩ  ７ｐ１２を表のトップに置き、これはＬＳＩ  ３ｑ２６およびＣＥＰ６によって、そしてまたＣＥＰ１８、ＣＥＰ４、ＣＥＰ１６、ＬＳＩ２０ｑ１３およびＬＳＩ  ５ｐ１５によっても最もよく補足された。ＣＥＰ６は、ＣＥＰ１もしくはＣＥＰ７のいずれかによって補足される場合に高位を占めた。他の高位を占めるプローブ対には、ＬＳＩ  ５ｐ１５、ＣＥＰ１もしくはＣＥＰ７のいずれかとＬＳＩ  ３ｑ２６が含まれた。３個のプローブの組み合わせにおいて、ＣＥＰ１１とＬＳＩ  ７ｐ１２およびＣＥＰ６の組み合わせは、同様にＣＥＰ１１によって補足される、ＣＥＰ１もしくはＣＥＰ７のいずれかとＣＥＰ６の組み合わせのすぐ前の、表のトップであった。３個の優れた遂行する組み合わせに含まれる他のプローブは、１７ｑ２１、ＬＳＩ  ３ｑ２６、ＣＥＰ４、ＣＥＰ１６、ＣＥＰ１８およびＬＳＩ  ２０ｑであった。４個のプローブの組み合わせにおいて、ＣＥＰ１もしくはＣＥＰ７のいずれかと組み合わせたＣＥＰ６は、１７ｐ１３／ＣＥＰ１６喪失によって補足される場合に表のトップであった。別の喪失、９ｐ２１／ＣＥＰ９は、ＣＥＰ７およびＬＳＩ３ｑと組み合わせた場合に次であった。４個の他の高位を占める組み合わせには、ＬＳＩ  ７ｐ１２、ＬＳＩ  １０ｑ２３、ＣＥＰ１０、ＣＥＰ１１、ＬＳＩ  ５ｐ１５、ＬＳＩ  ５ｑ３１、ＬＳＩ  ５ｐ／ＬＳＩ  ５ｑ、ＣＥＰ６、ＣＥＰ７およびＣＥＰ９が含まれた。
実施例３：プローブ組の選択
表１３は、判別および組み合わせ分析からのデータを分析しそして本明細書に記述するプローブ選択規準を適用することにより選択されるプローブおよびプローブ組を記載する。表１３のプローブ組は、サイズが単一のプローブから４個のプローブまでである。追加のプローブ、例えば４個より多く、および追加の蛍光標識を用いるアッセイを行うことができる。
【０１０１】
表１３に記載する単一のプローブは、細胞診より優れた改善を個々に示したプローブである。これらには、ＬＳＩ  ５ｐ１５、ＬＳＩ  ７ｐ１２、ＬＳＩ  ８ｑ２４、ＣＥＰ１、ＣＥＰ６およびＣＥＰ９が包含される。これらのプローブの各々で、ベクトル値は、試験するカットオフ値の二つで０．４００未満であった。本明細書に記述する他のプローブもまた、単一のカットオフで０．４００未満のベクトル値を与えた。しかしながら、２つのカットオフ値での優れた性能は、プローブがいっそう強力であることを意味する。
【０１０２】
次に、表１３は２個のプローブの組み合わせを記載する。この群に置かれるプローブ対は、０．４００未満のベクトル値を有しそして少なくとも一つのカットオフ値でトップ約３０のプローブ対（最も低いベクトル値）を占めることが必要とされた。プローブ対がトップ３０に位置付けられた各カットオフ値の各プローブ対のベクトル値を表に記載する。特に注目すべきであるのは、３つの異なるカットオフ値で０．４００未満のベクトル値を有する、ＬＳＩ  ５ｐ１５＋ＬＳＩ  ８ｑ２４、ＬＳＩ  ５ｐ１５＋ＣＥＰ１２、およびＬＳＩ  ５ｐ１５＋ＬＳＩ  １７ｑ２１のプローブ対である。
【０１０３】
次に、表１３は３個のプローブの組み合わせを記載する。３個のプローブのほんのわずかな組み合わせのみが、任意の特定のカットオフ値で２個のプローブの組み合わせより改善された数組であるので、これらをこの見出しの下に記載する。
【０１０４】
次に、表１３は４個のプローブの組み合わせを記載する。４個のプローブの１つの組み合わせのみが、任意の特定のカットオフ値で２および３個のプローブの組み合わせより改善された唯一の組み合わせであったので、これをこの見出しの下に記載する。
【０１０５】
３および４個のＦＩＳＨプローブを一緒に用いることの実用的能力を利用するために、重複の戦略を導入することができる。この戦略下で、第三のプローブは、それが一対の相補的プローブの一方もまた補足する場合にこれら２個のプローブに加えることができる。あるいはまた、それはいずれのプローブも十分に補足しないかもしれないが、その代わりにそれは次に最も高い遂行する単一プローブであるかもしれない。同様に、４個のプローブ対は、相補的プローブの対を組み合わせることにより作製することができる。表１３に記載する２個のプローブ対の重複を用いて作製するいくつかの３および４個のプローブ組を同じ表の下の部分に記載する。代わりの方法は、２個のプローブ対を選択し、そして一方が最初の対の一方のメンバーを補足しそしてもう一方が最初の対のもう一方のメンバーを補足する追加の２個のプローブを加えることである。重複プローブの一つの利点は、標本を異常と称するために標的の２つが獲得されることを必要とすることによりアッセイの特異性が改善されるかもしれないことである。重複はまた、１つのプローブハイブリダイゼーションがアッセイにおいて失敗する場合に重複するプローブがなお標的獲得を検出するかもしれないので、感度を向上することもできる。他の実用的問題をプローブ選択において考えることができる。例えば、ＬＳＩ  ５ｐ１５＋ＬＳＩ  ８ｑ２４＋ＬＳＩ  ７ｐ１２＋ＬＳＩ  １７ｑ２１の４個のプローブ組は、表１３に記載する２個のプローブのトップの遂行する組み合わせの３つにおけるプローブから構築することができる。このプローブ組の意義は、それが治療的に重要な２つの遺伝子座、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子を含有する１７ｑ２１および上皮成長因子受容体遺伝子（ＥＧＦＲ）を含有する７ｐ１２を検出することである。これらの遺伝子座での異常の同定は、適切な処置処方計画を選択するために用いることができる。
実施例４：肺癌検出
一連の気管支分泌物標本に対する予備試験のために２つの３色プローブ組を選択した。この研究の結果は、通常の細胞診と同等のもしくはそれより優れた特異性および感度を多色ＦＩＳＨパネルで得ることができることを示した。
【０１０６】
２１個の気管支分泌物塗抹標本の各々に対する３色プローブ組のハイブリダイゼーションの結果を標本特定数、臨床診断、細胞診結果、および気管支鏡生検結果（追加の生検を行う場合には２つの結果）と一緒に表１２に記載する。各標本を２つの異なる３色プローブ組とハイブリダイズさせた。第一の３色プローブ組は、ＬＳＩ  ８ｑ２４、ＬＳＩ  ５ｐ１５およびＣＥＰ１を含有し、そして第二の組は、ＬＳＩ  ８ｑ２４、ＬＳＩ  ５ｐ１５およびＣＥＰ６を含有した。５ｐ１５標的の獲得は、１３個のＦＩＳＨ陽性標本のうち１３個において見出された。８ｑ２４、ＣＥＰ１およびＣＥＰ６標的の獲得は、それぞれ、１３個のＦＩＳＨ陽性標的の１１、７および５個で見出された。標本スライドの一つは、劣悪な形態のためにＦＩＳＨにより評価することができず、そして残りの７個の標本においてＦＩＳＨ異常は見出されなかった。表１１および１２において通常の細胞診およびＦＩＳＨの性能をそれぞれ臨床診断と比較する。臨床診断は、臨床医に利用可能な組み合わせた情報に基づき、そしてＦＩＳＨ結果を含まなかった。
【０１０７】
上記の方法において、気管支分泌物の塗抹標本は、標本を２枚の顕微鏡スライド間に置きそしてわずかな圧力をかけながらスライドを相互から離して滑らせることにより調製した。次に、スライドをエタノールで短時間固定し、そして使用の準備ができるまで−２０℃で保存した。
【０１０８】
以下のプロトコルにより気管支分泌物の塗抹標本をインサイチューハイブリダイゼーションのために調製した。
【０１０９】
（１）スライドを２ｘＳＳＣにおいて３７℃で１０分間インキュベーションする。
【０１１０】
（２）スライドをペプシン溶液（０．０５ｍｇペプシン／ｍＬ  １０ｍＭ  ＨＣｌ）に３７℃で１３分間置く。
【０１１１】
（３）スライドを１ｘＰＢＳに室温で５分間置く。
【０１１２】
（４）スライドを１％ホルムアルデヒドに室温で５分間置くことにより標本を固定する。
【０１１３】
（５）スライドを１ｘＰＢＳに室温で５分間置く。
【０１１４】
以下のようにインサイチューハイブリダイゼーションを標本に対して行った。
【０１１５】
（１）スライドを７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣの溶液に７３℃で５分間置くことにより標本ＤＮＡを変性させる。
【０１１６】
（２）スライドを一連のエタノール溶液（７０％、８５％、１００％）に溶液当たり１−５分置くことにより標本を脱水する。変性したプローブを加える前に標本を風乾させる。
【０１１７】
（３）プローブを含有するチューブを７３℃の水浴に５分間置くことによりプローブ溶液を変性させる。
【０１１８】
（４）変性したプローブ溶液を変性したスライドに加え、溶液上にカバースリップを置き、そして縁に沿ってゴムセメントを付けることによりカバースリップを密封する。
【０１１９】
（５）プローブを給湿チャンバーにおいて３７℃で一晩ハイブリダイズさせる。
【０１２０】
（６）スライドをコプリンジャーおいて０．４ｘＳＳＣ／０．３％  ＮＰ−４０中７０℃で３分間（もしくは７３℃で１分）洗浄する。コプリンジャー当たり４枚のスライドを同時に洗浄する。
【０１２１】
（７）スライドを２ｘＳＳＣ／０．１％  ＮＰ−４０に数秒〜数分間浸す。
【０１２２】
（８）退色防止／対比染色溶液を加え、そしてカバースリップで覆う。分析するまでスライドを−２０℃で保存する。
【０１２３】
全標本を走査することにより気管支分泌物塗抹標本を分析した。標的獲得を有する細胞を探索する４つの単一帯域通過フィルター組（ＤＡＰＩに加えて３種のプローブ標識）で各顕微鏡視野を順次調べた。３個のプローブの各々の標的の数を３個の標的の一つもしくはそれ以上における獲得を示すあらゆる細胞に対して記録した。
【０１２４】
【表１】
2005505241.tif 000002
【０１２５】
【表２】
2005505241.tif 000003
【０１２６】
【表３】
2005505241.tif 000004
【０１２７】
【表４】
2005505241.tif 000005
【０１２８】
【表５】
2005505241.tif 000006
【０１２９】
【表６】
2005505241.tif 000007
【０１３０】
【表７】
2005505241.tif 000008
【０１３１】
【表８】
2005505241.tif 000009
【０１３２】
【表９】
2005505241.tif 000010
【０１３３】
【表１０】
2005505241.tif 000011
【０１３４】
【表１１】
2005505241.tif 000012
【０１３５】
【表１２】
2005505241.tif 000013
【０１３６】
【表１３】
2005505241.tif 000014
【０１３７】
【表１４】
2005505241.tif 000015
【０１３８】
【表１５】
2005505241.tif 000016
【０１３９】
【表１６】
2005505241.tif 000017
【０１４０】
【表１７】
2005505241.tif 000018
【０１４１】
【表１８】
2005505241.tif 000019
【０１４２】
【表１９】
2005505241.tif 000020
【０１４３】
【表２０】
2005505241.tif 000021
【０１４４】
【表２１】
2005505241.tif 000022
【表２２】
2005505241.tif 000023
【０１４５】
実施例５：気管支洗浄物標本における肺癌の検出
本研究は、細胞学的分析によって以前に特性化されている７４個の気管支洗浄物標本における肺癌を検出するために間期ＦＩＳＨアッセイ（４個のプローブの多色ＦＩＳＨパネルを用いる）を用いた。４８個の標本は、癌に陽性の臨床診断を有する患者からであり、そして２６個の標本は、癌に陰性の臨床診断を有する患者からであった。
【０１４６】
気管支洗浄物標本は、スイス、バーゼルのＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙの細胞病理学アーカイブから選択した。これらの細胞診標本は、ＰＡＰ染色液で前染色され、そしてカバースリップ下で永久的に標本にされた。標本は、数ヶ月〜２年におよぶ期間にわたって保管された。
【０１４７】
ＦＩＳＨアッセイに用いる４個のプローブには、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａＴＭ、ＡｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎＴＭ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｏｌｄＴＭおよびＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄＴＭでそれぞれ標識した、第１染色体に対してセントロメリックな（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １）反復配列プローブ（ＣＥＰ１）、並びに遺伝子座５ｐ１５、８ｑ２４（ｃ−ｍｙｃ遺伝子を含有する）および７ｐ１２（ＥＧＦＲ遺伝子を含有する）に対する３個のユニーク配列プローブが含まれた。これらのプローブを一緒に混合し、そして各気管支洗浄物標本に同時にハイブリダイズさせた。
【０１４８】
保管されたスライドをカバースリップが落ちるまでキシレンに浸し（約４−５日）、そして次に新しいキシレンにおいて２回、洗浄当たり５分洗浄した。次に、スライドを９５％エタノール、８５％エタノールおよび７０％エタノールに順次置き（溶液当たり５分）、続いてスライドを２ｘＳＳＣバッファーに１分間浸した。次に、スライドを１０ｍＭ  ＨＣｌ中０．５ｍｇ／ｍｌのペプシン溶液において３７℃で１０分間インキュベーションし、その後にＰＢＳ洗浄を５分間続けた。スライドを１％中性緩衝ホルマリンの新しく調製した溶液において４℃で５分間固定し、続いてＰＢＳに５分間浸した。次に、スライドを７０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣにおいて７３℃で１０分間変性させ、７０％、８５％および１００％エタノールのエタノールシリーズにおいて脱水し（溶液当たり５分）、そしてスライド保温器上に３７−４５℃で１分間置いて乾燥させた。ハイブリダイゼーション混合物中のプローブは、混合物を含有するチューブを７３℃の水浴に５分間置くことにより変性させた。変性したプローブハイブリダイゼーション混合物を標本に加え、カバースリップで覆い、そしてゴムセメントで密封した。スライドを３７℃で一晩インキュベーションし、その後でスライドを２ｘＳＳＣ／０．３％  ＮＰ−４０において７３℃で２−５分間洗浄した。次に、スライドを２ｘＳＳＣ／０．１％  ＮＰ−４０に数秒〜数分間置いた。ＤＡＰＩ  ＩＩを標的領域に加え、そして単一帯域通過フィルター組を用いて蛍光顕微鏡下でスライドを分析した。
【０１４９】
ＦＩＳＨシグナルおよびバックグラウンド染色の技術的質を最初に評価するために標本スライドを蛍光顕微鏡下で評価した。質が許容しうる場合、スライドを計数した。総合的なサンプルの外見は、４０ｘの倍率でＤＡＰＩ単一帯域通過フィルター組で評価した。以下のサンプル特徴は、注意することが重要であった：１）まばらなもしくは密な粘液性繊維の存在；２）細胞が粘液性繊維内に捕捉された程度；３）核の多型性の存在；および４）破壊された細胞（明瞭な核境界がない、不定形の形状）の存在。細胞もしくは細胞群がはっきりと特定される核境界を有しそして好ましくは粘液性繊維のない領域にある場合にのみそれらをシグナル計数のために選択した。
【０１５０】
計数は、ＤＡＰＩ単一帯域通過フィルター組および３つのプローブに特異的な単一帯域通過フィルター組（Ｖｙｓｉｓ  ａｑｕａ、ｇｒｅｅｎ、ｇｏｌｄおよびｒｅｄ）を用いて以下の規則に従って実施した。全ての標本評価は、標本の正体が分からない検査者で行った。
【０１５１】
（１）ＤＡＰＩ単一帯域通過フィルター組を用いて細胞を有する適切な領域を選択する。
【０１５２】
（２）金色もしくは緑色単一帯域通過フィルター組に変え、そして視野を観察する。シグナルコピー獲得を有する細胞が存在する場合、他の３つのプローブ特異的単一帯域通過フィルター組に順次変えて（順序は重要でない）、４個全てのプローブのこれらの細胞におけるコピー数パターンを記録する。細胞が金色もしくは緑色フィルター組で二染色体に見える場合、他の３つのプローブ特異的フィルター組の一つに変え、そして視野を観察する。シグナルコピー獲得を有する細胞が存在する場合、４個全てのプローブのそれらのシグナルパターンを記録する。視野を４つ全てのプローブ特異的フィルター組で走査するまでこれを行う。任意の一つの細胞のパターンを１回記録するのみである。
【０１５３】
（３）新しい領域に動かし、そして評価を繰り返す。
【０１５４】
（４）少なくとも２５個の細胞を評点するかもしくはスライドの端に達すると計数を止める。
【０１５５】
各プローブのシグナルコピー数の計数結果をＪＭＰ３．２バージョン統計ソフトウェアを用いて分析した。
【０１５６】
本研究に用いるサンプルは、癌の臨床診断を有する４８個の標本の約半分が細胞診によっても陽性と診断され、そして約半分が細胞診によって陰性と診断されるように選択した。癌陽性標本の大部分は、腺癌にかかっている患者（２３標本）、続いて扁平上皮細胞癌にかかっている患者（１１標本）からであった。残りの標本は、大細胞癌（６標本）、小細胞癌（６標本）、類癌腫（１標本）および平滑筋肉腫（１標本）にかかっている患者からであった。癌に臨床的に陰性である２６個全ての標本は、陰性の細胞診結果を有した。陰性の臨床診断および陽性の細胞診結果を有する標本は選択しなかった（本研究における細胞診特異性は故意に１００％であった）。
【０１５７】
表１４は、本研究に用いた患者のコホートにおける細胞診結果の分布を示す。細胞診結果は２２人の患者で陽性であり、４８人の患者で陰性であり、そして４人の患者で疑わしかった。臨床診断により癌に陽性である４８個のサンプルの群の細胞診の感度は４５．８％であった。１３個の標本は、組織の過度の喪失のためにＦＩＳＨ評価から退けた（癌陽性患者からの９個の標本および癌陰性患者からの４個の標本）。ＦＩＳＨにより評価されなかったスライドを除いて、残りの３９人の癌陽性患者の細胞診感度は５０％であった。細胞診で疑わしいサンプルを陽性として計数する場合、細胞診感度は５３．９％に上がった。
【０１５８】
【表２３】
2005505241.tif 000024
【０１５９】
気管支洗浄物標本を、キシレンに浸すことによりカバースリップを取り除いた後に多色ＦＩＳＨプローブ混合物とハイブリダイズさせた。各サンプルの総合的な外見を評価した。標本が過度に無細胞であるように見えるか、もしくは細胞の形態が乱れているか、もしくはハイブリダイゼーションシグナルが弱すぎる場合、ＦＩＳＨ計数に対してサンプルを退けた。
【０１６０】
ＦＩＳＨ結果を評価するためには、癌確信規準を作成する必要があった。これは、個々の細胞を悪性腫瘍に関して疑わしい（異常）もしくは疑わしくない（正常）と分類する基準を作成することおよび標本を癌に陽性と分類するために必要な異常細胞の最小数のカットオフ値を定めることを含んだ。
【０１６１】
細胞が、プローブ混合物に含まれる少なくとも２個のプローブに対してコピー数獲得を示す場合（これを「複数ＤＮＡ遺伝子座獲得」と称した）、それを異常と分類した。いったんこの基準が定められると、標本データの全てを評価し、そして標本の各々における「異常」細胞の数を表にした。何が「癌確信規準」（癌陰性症例と癌陽性症例を判別するための定量的基準）であるべきかを決定するために、データ分析に受信動作特性（ＲＯＣ）曲線法を適用した。この方法を用いて、一連の仮のカットオフ点を設定し、そして各点で感度および特異性を計算する。本明細書に提示するデータでは、標本当たり１〜１０個の細胞のカットオフ値を用いた。各カットオフ値で、癌陽性患者のコホートに対して感度を決定し、そして癌陰性患者のコホートに対して特異性を決定した。次に、ＲＯＣ曲線を［１−特異性］（ｘ軸）の関数としての感度（ｙ軸）に対してプロットした（図１）。
【０１６２】
図１に示すように、特異性がほぼ同じ状態のままで感度が有意に増加する曲線上の部分がある。カットオフ点は、曲線が方向を変える部分において選択されることが多い。このアッセイにおける方向を変える点は、癌確信の規準を満たす５−６個の細胞を見出すカットオフ値に相当した。その結果、本研究に用いる標本を陽性と分類する基準は以下のとおりであった：サンプルが「複数遺伝子座獲得」を有する６個もしくはそれ以上の異常細胞を含有する場合、それを「癌陽性」と分類した。サンプルが６個未満の異常な細胞を有する場合、それを「癌陰性」と分類した。
【０１６３】
表１５は、「癌陽性」患者の群の細胞診とＦＩＳＨ結果間の相関関係を示す。細胞診は４８人の「癌陽性」患者のうち２２人において陽性であり、４５．８％の感度を与えた。別の４標本では、細胞診が細胞病理学者によって再評価され、そしてこれらの標本は「疑わしい」と分類された。「疑わしい」結果を「癌陽性」と判断する場合、細胞診の感度は５３．８％になった。数個のサンプルは、低い細胞充実性および他の理由のためにＦＩＳＨ評価から退けられ、その結果、ＦＩＳＨにより評価する症例の数は、細胞診により評価する症例の数と異なった。ＦＩＳＨによっても評価した症例の細胞診結果を再計算すると、細胞診の感度は４６．２％になり（１８／３９症例）、「疑わしい」結果を陽性結果と計数する場合、感度は５３．８％である。従って、ＦＩＳＨで退けられたサンプルを計算に含むにせよ除くにせよ感度結果に有意な差はなかった。同じ群の患者のＦＩＳＨ結果は、３９人の「癌陽性」患者の中で３２の陽性結果を示し、８２．０％の感度を与えた。
【０１６４】
【表２４】
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【０１６５】
ＦＩＳＨは、細胞診で疑わしい標本の２つ（さらにもう１つの標本はＦＩＳＨ評価には退けられた）を「癌陽性」標本の範疇に置くことによりそれらを分類することができた。これらの標本の各々における異常細胞の数は、小細胞癌標本では８個、そして大細胞癌標本では１０個であった。なおさらに重要であるのは、１８の細胞診陰性／癌陽性症例の群で得られた結果である。表１５は、細胞診によって見逃されたこれらの癌患者に対して、ＦＩＳＨは１５／１８症例において陽性であり、従って８３．８％の症例において診断を改善したことを示す。
【０１６６】
ＦＩＳＨおよび細胞診結果を腫瘍のタイプに関しても分析した。データは、ＦＩＳＨが、扁平上皮細胞癌と診断された標本に対してその最も低い感度を有することを示した（５／９標本、５５．５％）。このタイプの肺腫瘍に対して、細胞診は５４．５％の感度を示した。腺癌、大細胞癌および小細胞癌は、それぞれ、８６．４％（１９／２２症例）、１００％（５／５症例）および１００％（３／３症例）のＦＩＳＨによる感度を示した。これらの腫瘍の細胞診感度は以下のとおりであった：腺癌では６０．９％；大細胞癌では５０％；そして小細胞癌では１００％。
【０１６７】
「癌陰性」患者の群は２６人の患者からなった。細胞診結果は、１００％の特異性を設定するこの選択した群における患者の全てに対して陰性であった。４個の標本は、低い細胞充実性のためにＦＩＳＨ評価から退けられ、従って、２２個の標本のみを評価した。これらの２２個の標本の中で、ＦＩＳＨは１８人の患者において明らかに陰性であり、８１．８％の特異性を与えた（表１６）。４個の標本は、陽性のＦＩＳＨ結果を有した。これら４個の標本は、２５個の評価した疑わしい細胞当たり１９、１５、１１および８個もの数の「異常」細胞を含有した。標本のうち２個では、コピー数獲得の大きさが一方の症例では細胞当たり７−８コピーそしてもう一方の症例では細胞当たり１１−１２コピーほどと高かったことに注意することもまた重要である。これらの標本の一方は、標本を調製する約１年前に進行した結腸直腸癌にかかっていると診断された患者から得られた（患者は本研究時までに死亡した）。もう一方の患者は大量の喫煙の既往歴があり、そして鉱夫という職業上の危険を有した。従って、これらのＦＩＳＨ陽性であるが「細胞診陰性」の標本は、肺癌を発症する危険にさらされた患者から得られたと考えられる。
【０１６８】
【表２５】
2005505241.tif 000026
【０１６９】
表１７は、７４人の患者の全集団の細胞診およびＦＩＳＨの感度および特異性に関する比較データを示す。
【０１７０】
【表２６】
2005505241.tif 000027
【０１７１】
実施例６：気管支鏡標本における肺癌の検出
本研究は、外科病理学分析によって以前に特性化されている１９１個の気管支標本における肺癌を検出するために間期ＦＩＳＨアッセイ（４個のプローブの多色ＦＩＳＨパネルを用いる）を用いた。本研究に用いる標本の外科病理学結果を表１８に要約する。１０４の標本（５５％）は、肺癌に陽性の臨床診断を有する患者からであった。８４個の標本（４４％）は、肺癌に陰性の臨床診断を有する患者からであった。
【０１７２】
【表２７】
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【０１７３】
４個のプローブの以下の３つの組の一つを各ＦＩＳＨアッセイに用いた：
（１）第１染色体に対する動原体の反復配列プローブ（ＣＥＰ１）、並びに遺伝子座５ｐ１５、８ｑ２４および７ｐ１２に対する３個のユニーク配列プローブ；（２）第１６染色体（ＣＥＰ１６）および第１７染色体（ＣＥＰ１７）に対する動原体の反復配列プローブ、並びに遺伝子座３ｑ２６および２０ｑ１３に対する２個のユニーク配列プローブ；もしくは（３）第６染色体に対する動原体の反復配列プローブ（ＣＥＰ６）、並びに遺伝子座５ｐ１５、８ｑ２４および７ｐ１２に対する３個のユニーク配列プローブ。これらのプローブを一緒に混合し、そして各気管支標本に同時にハイブリダイズさせた。
【０１７４】
１０４個の癌陽性標本のＦＩＳＨおよび細胞診分析の各々により検出される感度を表１９（３８個の気管支擦過サンプル）および表２０（６６個の気管支分泌物サンプル）に示す。表１９に示すように、ＦＩＳＨは、気管支擦過サンプルの細胞診（５１％）と比較して有意に高められた感度（７２％）を示した。気管支分泌物サンプルではＦＩＳＨと細胞診間で有意な差は認められなかった（表２０）。
【０１７５】
【表２８】
2005505241.tif 000029
【０１７６】
【表２９】
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【０１７７】
肺癌に陰性である（外科病理学分析により決定する場合）８４個の標本のＦＩＳＨおよび細胞診分析により検出される特異性を表２１（４９個の気管支擦過サンプル）および表２２（３５個の気管支分泌物サンプル）に示す。外科病理学分析により陰性であるがＦＩＳＨ分析により陽性であった表２１および２２に記述するサンプルの中には、外科病理学方法により同定されなかった癌性および／もしくは前癌性細胞を含有するいくつかの標本があり得ると考えられる。そのような場合、ＦＩＳＨは肺癌の早期発見を可能にすることができる。
【０１７８】
【表３０】
2005505241.tif 000031
【０１７９】
【表３１】
2005505241.tif 000032
【０１８０】
他の態様
本発明は、その詳細な記述とともに記述されているが、先の記述は本発明の範囲を例示するものでありそして限定するものではないと理解されるべきである。本発明の他の態様、利点および改変は、以下に記述する請求項の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】癌陽性および癌陰性患者からの標本のＦＩＳＨ分析から得られる受信動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。感度（ｙ軸）および特異性（ｘ軸；１−特異性）は、標本当たり１〜１０個の細胞であるカットオフ値に対して示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005505241.tif 000102
2005505241.tif 000103
2005505241.tif 000104
2005505241.tif 000105