(57)【要約】本発明は、サイクリン依存性キナーゼインヒビターによって誘導される遺伝子のような、ウイルス感染、癌および加齢関連疾患に関与する遺伝子の誘導を阻害する化合物を同定するための方法および薬剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリン依存性キナーゼインヒビターによって誘導された、哺乳動物のウイルス遺伝子または細胞遺伝子からのプロモーターに動作可能に連結したレポーター遺伝子をコードしている組換え発現構築物。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼをコードしている、請求項１に記載の組換え発現構築物。
【請求項３】
前記プロモーターが、ＣＤＫインヒビターによって誘導される、ヒトのウイルス遺伝子または細胞遺伝子からのプロモーターである、請求項１に記載の組換え発現構築物。
【請求項４】
前記プロモーターが、表ＩＩまたは表Ｖにて同定される、ヒト遺伝子からのプロモーターである、請求項３に記載の組換え発現構築物。
【請求項５】
前記プロモーターが、血清アミロイドＡ（配列番号１）、補体Ｃ３（配列番号２）、結合組織増殖因子（配列番号３）、インテグリンβ−３（配列番号４）、アクチビンＡ（配列番号５）、ナチュラルキラー細胞タンパク質４（配列番号６）、プロサポシン（配列番号７）、Ｍａｃ２結合タンパク質（配列番号８）、ガレクチン−３（配列番号９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号１０）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ｐ６６ｓｈｃ（配列番号１２）、カテプシンＢ（配列番号１４）、β−アミロイド前駆体タンパク質（配列番号１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧａｓｅ、配列番号１６）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）に由来するプロモーター、１つまたは多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、ヒト免疫不全ウイルスプロモーター（配列番号８５）またはサイトメガロウイルス早期プロモーター（配列番号８２）である、請求項２に記載の組換え発現構築物。
【請求項６】
前記プロモーターが、ヒトナチュラルキラー細胞タンパク質４（配列番号６）、血清アミロイドＡ（配列番号１）、補体Ｃ３（配列番号２）、組織トランスグルタミナーゼ（配列番号１６）、β−アミロイド前駆体タンパク質（配列番号１５）、プロサポシン（配列番号７）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、ヒト免疫不全ウイルスプロモーター（配列番号８５）またはサイトメガロウイルス早期プロモーター（配列番号８２）である、請求項４に記載の組換え発現構築物。
【請求項７】
前記組換え発現構築物が、ｐＬｕＮＫ４である、請求項４に記載の組換え発現構築物。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５、６または７に記載の組換え発現構築物を含む、哺乳動物細胞。
【請求項９】
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受け入れ番号第ＰＴＡ３３８１号（ＨＴ１０８０  ＬｕＮＫ４ｐ２１）によって同定される、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記組換え発現構築物の発現が、ＮＦκＢによって調節される、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている第二組換え発現構築物をさらに含む、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記ＣＤＫインヒビターの発現が、哺乳動物細胞内で実験的に誘導される、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１３】
哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている前記組換え発現構築物が、誘導可能なプロモーターの転写制御下にあり、前記組換え発現構築物からのＣＤＫインヒビターの発現が、前記組換え細胞を、前記誘導可能プロモーターからの転写を誘導する誘導薬剤と接触させることによって、または、そのようなプロモーターからの転写を阻害する薬剤を除去することによって媒介される、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１４】
前記哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子が、ヒトｐ２１遺伝子またはそのＣＤＫ結合断片である、請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１５】
前記哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子が、ヒトｐ１６遺伝子またはそのＣＤＫ結合断片である、請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１６】
前記哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子が、マウスｐ２７またはヒトｐ２７遺伝子またはそのＣＤＫ結合断片である、請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１７】
細菌ラクトースリプレッサーをコードしている組換え発現構築物をさらに含み、その転写が、哺乳動物プロモーターによって制御され、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている前記組換え発現構築物が、ラクトースリプレッサー応答性プロモーター要素を含み、ＣＤＫインヒビター遺伝子の転写が、前記ラクトースリプレッサー応答性プロモーター要素によって制御され、そして、組換え発現構築物からのＣＤＫインヒビター遺伝子の発現が、前記組換え細胞を、ラクトースリプレッサー特異的誘導薬剤と接触させることによって媒介される、請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１８】
前記細胞がヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞である、請求項８に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１９】
前記細胞がヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２０】
前記細胞がヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞である、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２１】
前記第二発現構築物が、ＬＮｐ２１ＣＯ３である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２２】
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受け入れ番号第ＰＴＡ１６６４号（ＨＴ１０８０  ｐ２１−９）によって同定される、請求項２１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２３】
前記第二発現構築物が、ＬＮｐ１６ＲＯ２である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２４】
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受け入れ番号第ＰＴＡ−４０２０号（ＨＴ１０８０  ｐ１６−５）によって同定される、請求項２３に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２５】
前記第二発現構築物が、ＬＮｐ２７ＲＯ２である、請求項１１に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２６】
Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受け入れ番号第ＰＴＡ−４０２１号（ＨＴ１０８０  ｐ２７−２）によって同定される、請求項２５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２７】
前記ラクトースリプレッサー特異的誘導薬剤が、β−ガラクトシドである、請求項１７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２８】
哺乳動物細胞内で、ＣＤＫインヒビターによって誘導される、ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導を阻害する化合物を同定する方法であって、以下の
（ａ）化合物の存在下および不存在下で、哺乳動物細胞においてＣＤＫインヒビターによって誘導されるウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現を誘導する条件下で、請求項８に記載の組換え哺乳動物細胞を培養すること、
（ｂ）化合物の存在下での、前記細胞内でのレポーター遺伝子発現を、化合物の不存在下での、前記細胞内でのレポーター遺伝子発現と比較すること、および
（ｃ）化合物の存在下において、化合物の不存在下よりも、レポーター遺伝子発現が低い場合に、ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子の誘導を阻害する化合物を同定すること、
の段階を含む、方法。
【請求項２９】
前記細胞内でＣＤＫインヒビターの発現を誘導する条件下で、前記細胞を培養する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＤＫインヒビターが、ｐ２１、ｐ２７またはｐ１６、またはそれらのＣＤＫ結合断片である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている第二組換え発現構築物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記第二組換え発現構築物が、誘導可能プロモーターの転写制御下で、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子を含み、前記組換え発現構築物からのＣＤＫインヒビターの発現が、組換え細胞を、誘導可能プロモーターからの転写を誘導する誘導薬剤と接触させることによって、または、そのようなプロモーターからの転写を阻害する薬剤を除去することによって、媒介される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子が、ヒトｐ２１遺伝子またはそのＣＤＫ結合断片である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子が、ヒトｐ１６遺伝子またはそのＣＤＫ結合断片である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子が、ヒトｐ２７遺伝子またはそのＣＤＫ結合断片である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞がヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物細胞が、細菌ラクトースリプレッサーをコードしている組換え発現構築物をさらに含み、その転写が、哺乳動物プロモーターによって制御され、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている前記組換え発現構築物が、ラクトースリプレッサー応答性プロモーター要素を含み、ＣＤＫインヒビター遺伝子の転写が、前記ラクトース−リプレッサー応答性プロモーター要素によって制御され、そして、前記組換え発現構築物からのＣＤＫインヒビター遺伝子の発現が、前記組換え細胞をラクトースリプレッサー特異的誘導薬剤と接触させることによって媒介される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害する化合物を同定するための方法であって、以下の
（ａ）哺乳動物細胞内で、ＣＤＫインヒビターの発現を生成すること、
（ｂ）ＣＤＫインヒビターによって発現が媒介される細胞遺伝子の発現における変化に関して、化合物の存在下で、前記細胞をアッセイすること、
（ｃ）段階（ｂ）の細胞遺伝子の発現が、化合物の存在下で、より少ない程度まで変化する場合に、ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介調節のインヒビターとして、化合物を同定すること、
の段階を含む、方法。
【請求項３９】
前記ＣＤＫインヒビターが、ｐ１６、ｐ２７またはｐ２１である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物細胞が、誘導可能異種プロモーターの転写制御下で、哺乳動物ＣＤＫインヒビターをコードしている組換え発現構築物を含み、前記組換え発現構築物からのＣＤＫインヒビターの発現が、誘導可能プロモーターからの転写を誘導する誘導薬剤と、前記組換え細胞を接触させることによって、または、そのようなプロモーターからの転写を阻害する薬剤を除去することによって媒介される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＤＫインヒビターがｐ１６である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＤＫインヒビターがｐ２１である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＤＫインヒビターがｐ２７である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現が、ｐ２１によって誘導される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現が、ｐ１６によって誘導される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現が、ｐ２７によって誘導される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルス遺伝子または細胞遺伝子が、表ＩＩまたは表Ｖにおいて同定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルス遺伝子または細胞遺伝子が、表ＩＩまたは表Ｖにおいて同定される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現を、免疫学的薬剤を用いて検出する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現を、細胞遺伝子産物の活性に関するアッセイによって検出する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現を、相補的核酸に対するハイブリッド形成によって検出する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
哺乳動物細胞におけるウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害する化合物を同定するための方法であって、以下の
（ａ）化合物の存在下または不存在下で、前記哺乳動物細胞を薬剤で処理すること、または、老化を誘導する条件下にて、哺乳動物細胞を培養すること、
（ｂ）ＣＤＫインヒビター遺伝子発現によって誘導される、ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導に関して、前記哺乳動物細胞をアッセイすること、および
（ｃ）ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子が、化合物の不存在下よりも、化合物の存在下において、より少ない程度に誘導される場合に、ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導のインヒビターとして、化合物を同定すること、
の段階を含む、方法。
【請求項５３】
前記ＣＤＫインヒビターが、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記遺伝子が、表ＩＩまたは表Ｖにおいて同定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記遺伝子の発現を、免疫学的薬剤を使用して検出する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子の発現を、遺伝子産物の活性に関するアッセイによって検出する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記遺伝子の発現を、相補的核酸に対するハイブリッド形成によって検出する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳動物細胞におけるウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害する化合物を同定するための方法であって、以下の
（ａ）化合物の存在下または不存在下で、哺乳動物細胞を薬剤で処理すること、または、老化を誘導する条件下にて、哺乳動物細胞を培養すること；ここで、前記細胞は、その発現がＣＤＫインヒビターによって調節される、哺乳動物ウイルス遺伝子または細胞遺伝子に関するプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を含む、
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現における変化に関して、前記細胞をアッセイすること、および
（ｃ）前記レポーター遺伝子の発現が、化合物の不存在下よりも、化合物の存在下において、より少ない程度に変化する場合に、ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導のインヒビターとして、化合物を同定すること、
の段階を含む、方法。
【請求項５９】
前記ＣＤＫインヒビターが、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物遺伝子プロモーターが、表ＩＩまたは表Ｖにおいて同定される哺乳動物遺伝子プロモーターである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞遺伝子の発現を、免疫学的薬剤を使用して検出する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞遺伝子の発現を、細胞遺伝子産物の活性に関するアッセイによって検出する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞遺伝子の発現を、相補的核酸に対するハイブリッド形成によって検出する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害するための方法であって、請求項２８に記載の方法にしたがって生成した化合物と、前記細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項６５】
ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害するための方法であって、請求項３８に記載の方法にしたがって生成した化合物と、前記細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項６６】
ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害するための方法であって、請求項５２に記載の方法にしたがって生成した化合物と、前記細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項６７】
ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害するための方法であって、請求項５８に記載の方法にしたがって生成した化合物と、前記細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項６８】
ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害するための方法であって、有効量の、ＮＦκＢ活性を阻害する化合物と、前記細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項６９】
ＣＤＫインヒビター誘導遺伝子発現に伴う、動物における疾患を治療するための方法であって、有効量の、ＮＦκＢ活性を阻害する非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を、前記動物に投与する段階を含む方法。
【請求項７０】
前記疾患が、大腸癌以外の癌である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患が、腎不全である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記疾患が、アルツハイマー病であり、ＮＳＡＩＤがアスピリンまたはサリチル酸塩以外である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記疾患がアテローム性動脈硬化症であり、ＮＳＡＩＤがアスピリン以外である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記疾患が関節炎であり、ＮＳＡＩＤがアスピリン、スリンダクまたはサリチル酸塩以外である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
哺乳動物細胞において、老化の病因結果と関連した、ウイルス遺伝子または細胞遺伝子を阻害する化合物であって、以下の、
（ａ）前記化合物の存在下において、薬剤で前記哺乳動物細胞を処理すること、または、老化を誘導する条件下で、哺乳動物細胞を培養すること、
（ｂ）ＣＤＫインヒビター遺伝子発現によって誘導される、細胞遺伝子の誘導に関して、前記哺乳動物細胞をアッセイすること、および
（ｃ）ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子が、化合物の存在下において、より少ない程度に誘導される場合に、老化のインヒビターとして、化合物を同定すること、
の段階を含む方法によって生成される、化合物。
【請求項７６】
前記ＣＤＫインヒビターが、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である、請求項６９に記載の化合物。
【請求項７７】
哺乳動物細胞における、ＣＤＫインヒビターによって誘導される、ウイルス遺伝子産物または細胞遺伝子産物の生成を阻害する化合物であって、以下の
（ａ）化合物の存在下で、薬剤にて前記哺乳動物細胞を処理すること、または、ＣＤＫインヒビターの発現を誘導する条件下で、前記哺乳動物細胞を培養すること、
（ｂ）ＣＤＫインヒビター遺伝子発現によって誘導される、ウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導に関して、前記哺乳動物細胞をアッセイすること、および
（ｃ）ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子が、化合物の存在下において、より少ない程度に誘導される場合に、ＣＤＫインヒビター誘導のインヒビターとして、化合物を同定すること、
の段階を含む方法によって生成される、化合物。
【請求項７８】
前記ＣＤＫインヒビターが、ｐ２１、ｐ２７またはｐ１６である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
哺乳動物細胞における、抗アポトーシス因子またはマイトジェン因子の生成を阻害するための方法であって、細胞を、ＣＤＫインヒビターによる遺伝子発現の誘導を阻害する化合物と接触させる段階を含む、方法。
【請求項８０】
前記哺乳動物細胞が、間質繊維芽細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記化合物が、ＮＦκＢインヒビターまたはｐ３００／ＣＰＢインヒビターである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
ＣＤＫインヒビター誘導遺伝子発現に伴う疾患の効果を予防する、または改善するために、動物を処置するための方法であって、治療的に有効な用量の、請求項２８、３８、５２または５８に記載の方法にしたがって同定した化合物の薬剤の組成物を、それを必要とする動物に投与する段階を含む方法。
【請求項８３】
哺乳動物細胞において、ＣＤＫインヒビターによって誘導された遺伝子の発現を阻害または予防するための方法であって、前記哺乳動物細胞を、ＣＤＫインヒビターによって誘導された遺伝子の発現を阻害または予防するために効果的な、請求項２８、３８、５２または５８に記載の方法にしたがって同定した、ある一定量の化合物と接触させる段階を含む方法。
【請求項８４】
動物において、ＣＤＫインヒビターによって誘導された遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、ＮＦκＢインヒビターを、そのような処置を必要としている動物に投与することを含む方法。
【請求項８５】
前記ＮＦκＢインヒビターが、非ステロイド抗炎症化合物である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記動物がヒトである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
動物において、ＣＤＫインヒビターによって誘導されたウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に、請求項２８に記載の方法によって生成される化合物を投与することを含む方法。
【請求項８８】
前記動物がヒトである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
動物において、ＣＤＫインヒビターによって誘導されたウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に、請求項３８に記載の方法によって生成される化合物を投与することを含む方法。
【請求項９０】
前記動物がヒトである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
動物において、ＣＤＫインヒビターによって誘導されたウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に、請求項５２に記載の方法によって生成される化合物を投与することを含む方法。
【請求項９２】
前記動物がヒトである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
動物において、ＣＤＫインヒビターによって誘導されたウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に、請求項５８に記載の方法によって生成される化合物を投与することを含む方法。
【請求項９４】
前記動物がヒトである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
動物において、ＣＤＫインヒビターによって誘導されたウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に、請求項７５に記載の方法によって生成される化合物を投与することを含む方法。
【請求項９６】
前記動物がヒトである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
動物において、ＣＤＫインヒビターによって誘導されたウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に、請求項２８、３８、５２または５８に記載の方法によって生成される化合物を投与することを含む方法。
【請求項９８】
前記動物がヒトである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
動物において、ＣＤＫインヒビターによって誘導されたウイルス遺伝子または細胞遺伝子の誘導を選択的に阻害するための方法であって、動物に、請求項７７に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項１００】
前記動物がヒトである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
動物における、ウイルス感染を処置するための方法であって、動物に、治療的に有効な量の、請求項７７に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項１０２】
前記動物がヒトである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
動物における、ウイルス感染を処置するための方法であって、動物に、治療的に有効な量の、請求項２８、３８、５２または５８に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項１０４】
前記動物がヒトである、請求項１００に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、２００１年８月２９日に出願された、米国仮出願番号第６０／３１５、７９１号を基礎とする優先権を主張する。
【０００２】
本願は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの補助金、第Ｒ０１  ＣＡ８９６３６号および第Ｒ０１  ＡＧ１７９２１号によってサポートされている。政府は本発明において一定の権利を持ちうる。
【０００３】
１．発明の技術分野
本発明は、細胞老化およびストレス応答、ならびに、老化およびストレス応答を伴う細胞遺伝子の発現の変化に関する。特に、本発明は、その発現が、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）インヒビターと呼ばれる一種の細胞遺伝子産物によって調整され、老化の開始において、および異なる形のストレスに応答して細胞中で誘導される、遺伝子の同定に関する。さらに具体的に言えば、本発明は、その発現がそのようなＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子である、細胞老化およびストレス応答のマーカーを提供する。本発明は、そのような化合物の存在下で、ＣＤＫインヒビターによるこれらのマーカー遺伝子の誘導の阻害を検出することによって、細胞老化およびストレス応答の病因結果を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。また、実験的に誘導可能なｐ２１、ｐ１６またはｐ２７のような、異なる細胞のＣＤＫインヒビターをコードする組換え発現構築物を含む組換え哺乳動物細胞、および、その発現が内因性または外因性の、実験的に誘導可能なＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子に対するプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を発現する組換え発現構築物を含む組換え哺乳動物細胞である、薬剤が提供される。
【０００４】
２．関連技術の要約
細胞周期進行は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫｓ）として知られている、一組のセリン／トレオニンキナーゼによって、大部分制御されている。ＣＤＫインヒビターとして知られる、特定のタンパク質群は、ＣＤＫと相互作用してＣＤＫを阻害し、したがって、種々の生理学的状況において細胞周期停止を引き起こす（Ｓｉｅｌｅｃｋｉら、２０００、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：１〜１８およびその参考文献を参照）。ＣＤＫインヒビターには２つのファミリーが存在する。Ｃｉｐ／Ｋｉｐとして知られる第一のものには、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１／Ｓｄｉ１、ｐ２７Ｋｉｐ１およびｐ５７Ｋｉｐ２が含まれる。第二のファミリー、Ｉｎｋ４には、ｐ１６Ｉｎｋ４Ａ、ｐ１５Ｉｎｋ４ｂ、ｐ１８Ｉｎｋ４ｃ、およびｐ１９Ｉｎｋ４ｄが含まれる。特定のＣＤＫインヒビターの発現は、異なる因子によって活性化される。たとえば、接触阻害は、ｐ２７およびｐ１６の発現を誘導し（Ｄｉｅｔｒｉｃｈら、１９９７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：２７４３〜２７４７）、ＴＧＦαのような細胞外抗マイトジェン因子はｐ１５の発現を誘導し（Ｒｅｙｎｉｓｄｏｔｔｉｒら、１９９５、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．９：１８３１〜１８４５）、血清飢餓はｐ２７の発現を誘導し（Ｐｏｌｙａｋら、１９９４、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８：９〜２２）、ＵＶ放射はｐ１６の発現を誘導する（Ｗａｎｇら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：２５１０〜２５１４）。さらに、上記の処置のすべて、ならびに異なる形のＤＮＡ損傷は、もっとも多面発現性の公知のＣＤＫインヒビターであるｐ２１の発現を誘導する（Ｄｏｔｔｏ、２０００、ＢＢＡ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １４７１：Ｍ４３−Ｍ５６）。
【０００５】
本発明の分野で特に重要なのは、２つのＣＤＫインヒビター、ｐ２１とｐ１６が、哺乳動物細胞における老化の過程に密接に関連していることである。複製老化の開始（Ａｌｃｏｒｔａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１３７４２〜１３７４７）および損傷により誘導される促進老化（Ｒｏｂｌｅｓ  ＆  Ａｄａｍｉ、１９９８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：１１１３〜１１２３）において、ｐ２１の誘導は結果として細胞増殖停止となる。ｐ２１の発現のこの急増は一過性であるが、しかし、ｐ１６の安定的な活性化が次に続き、これは、老化細胞における増殖停止の維持の原因となると考えられている。ｐ２１のノックアウト（Ｂｒｏｗｎら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：８３１〜８３４）またはｐ１６のノックアウト（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８５：２７〜３７）は、老化の開始を遅らせるか、または防止する。さらに、ｐ２１またはｐ１６いずれかの異所性過剰発現は、正常細胞および腫瘍細胞の両方における老化の表現型マーカーが伴う増殖停止を誘導する（Ｖｏｇｔら、１９９８、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９：１３９〜１４６；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：３５１〜３５４；Ｆａｎｇら、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２７８９〜２７９７）。
【０００６】
ｐ２１は、ＣＤＫに結合し、阻害するタンパク質として（Ｈａｒｐｅｒら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７５：８０５〜８１６）、野生型ｐ５３によってアップレギュレートされる遺伝子として（ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：２９１０〜２９１９）、および、老化繊維芽細胞において過剰発現した増殖阻害遺伝子として（Ｎｏｄａら、１９９４、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２１１：９０〜９８）、本技術分野で独立して同定されてきた。ｐ５３調節増殖停止におけるその重要な役割のために、ｐ２１は通常、腫瘍サプレッサーと考えられている。それにも関わらず、ヒト癌におけるｐ２１変異はまれであり（Ｈａｌｌ  ＆  Ｐｅｔｅｒｓ、１９９６、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：６７〜１０８）、ｐ２１ノックアウトマウスは正常に発育し、腫瘍化の速度の増加は示されていない（Ｄｅｎｇら、１９９５、Ｃｅｌｌ  ８２：６７５〜６８４）。
【０００７】
ｐ２１の細胞レベルは、ＤＮＡ損傷剤および分化剤を含む、種々の刺激に対する応答で増加する。これらの応答のいくつかは、ｐ５３によるｐ２１遺伝子の転写活性化を介して媒介されるが、しかしｐ２１はまた、種々のｐ５３非依存性因子によって調節される（Ｇａｒｔｅｌ  ＆  Ｔｙｎｅｒ、１９９９、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２２７：１７１〜１８１にて概説されている）。
【０００８】
ｐ２１の一過性誘導は、ＤＮＡ損傷または発癌性ＲＡＳ導入（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８８：５９３〜６０２）によって、正常な繊維芽細胞（ＤｉＬｅｏｎａｒｄｏら、１９９４、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．８：２５４０〜２５５１；Ｒｏｂｌｅｓ  ＆  Ａｄａｍｉ、１９９８、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：１１１３〜１１２３）および腫瘍細胞（Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：３７６１〜３７６７）で誘導される、細胞のＤＮＡ損傷の修復を可能にする一過性停止、ならびに永続的増殖停止（また「促進老化（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）」とも呼ばれる）を含む、異なる型の損傷誘導増殖停止を媒介する。ｐ２１発現の急増はまた、加齢繊維芽細胞の複製老化（Ｎｏｄａら、１９９４、上記；Ａｌｃｏｒｔａら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１３７４２〜１３７４７；Ｓｔｅｉｎら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：２１０９〜２１１７）および有糸分裂後細胞の末端分化（Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙら、１９９５、上記；Ｇａｒｔｅｌら、１９９６、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４６：２８０〜２８９）の間の末端増殖停止の開始と同時に起こる。
【０００９】
ｐ２１は転写因子それ自身でない一方で、その細胞の機能において役割を果たしうる細胞性遺伝子発現における間接的な効果を有する（Ｄｏｔｔｏ、２０００、ＢＢＡ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １４７１：Ｍ４３−Ｍ５６およびその参考文献）。ｐ２１によるＣＤＫ阻害の結果の一つは、Ｒｂの脱リン酸化であり、これはついで、ＤＮＡ複製および細胞周期進行に関与する多くの遺伝子を調節するＥ２Ｆ転写因子を阻害する（Ｎｅｖｉｎｓ、１９９８、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９：５８５〜５９３）。ｐ２１−発現細胞（ｐ２１＋／＋）およびｐ２１−非発現細胞（ｐ２１−／−）の比較により、細胞周期進行に関与するいくつかの遺伝子の放射線誘発阻害におけるｐ２１が示唆された（ｄｅ  Ｔｏｌｅｄｏら、１９９８、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９：８８７〜８９６）。ｐ２１の他の効果は、転写補助因子ヒストンアセチルトランスフェラーゼｐ３００の刺激であり、これは、ＮＦκＢを含む多くの誘導可能な転写因子を増強する（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：５２３〜５２７）。ｐ３００の活性化は、遺伝子発現において、多面発現性の効果を持ちうる（Ｓｎｏｗｄｅｎ  ＆  Ｐｅｒｋｉｎｓ、１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：１９４７〜１９５４）。ｐ２１はまた、ＪＮＫキナーゼ、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１、Ｍｙｃなどのような、ＣＤＫ以外の多くの転写調節因子および調節補助因子と相互作用することを介して、遺伝子発現に影響を与えうる（Ｄｏｔｔｏ、２０００、ＢＢＡ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １４７１：Ｍ４３−Ｍ５６）。これらの相互作用は、相当する経路によって調節される遺伝子の発現に影響を与えうる。
【００１０】
本発明に特に関連した他のＣＤＫインヒビターは、ｐ１６ＩＮＫ４Ａであり、ヒトタンパク質はＳｅｒｒａｎｏら（１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：７０４〜７０７）によって記述された。以上で言及したように、ｐ１６は、哺乳動物細胞における老化の重要な調節因子である。また、真の腫瘍サプレッサーであり、ヒトの癌において、もっとも一般的に変異される遺伝子の一つである（Ｈａｌｌ  ＆  Ｐｅｔｅｒｓ、１９９６、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６８：６７〜１０８）。ｐ１６は、直接ＣＤＫ４およびＣＤＫ６を阻害することが知られており、またＣＤＫ２を間接的に阻害しうる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、１９９９、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１９８１〜１９８９）。
【００１１】
本発明に特に関連したさらに別のＣＤＫインヒビターは、ｐ２７Ｋｉｐ１である。ｐ２７は最初に、接触阻害、ＴＧＦ−βまたはロバスタチンによって増殖停止された細胞における、ＣＤＫ２のインヒビターとして同定された（Ｈｅｎｇｓｔら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５２９１〜５２９５；Ｐｏｌｙａｋら、１９９４、Ｃｅｌｌ  ７８：５９〜６６）。ｐ２７はまた、分化、血清飢餓、懸濁液中での増殖、および他の因子に対する応答における細胞増殖停止を媒介する。正常の組織と比べて、ヒト癌においては、ｐ２７発現のレベルがしばしば変化する（減少および増加の両方）（Ｐｈｉｌｉｐｐ−Ｓｔａｈｅｌｉら、２００１、Ｅｓｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２６４：１４８〜１６１にて概説されている）。ｐ２７はまた、老化を導く経路の一つにおいて、腫瘍サプレッサーＰＴＥＮと共同で働くと提案されてきた（Ｂｒｉｎｇｏｌｄ  ａｎｄ  Ｓｅｒｒａｎｏ、２０００、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３５：３１７〜３２９）。
【００１２】
その発現が、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７のようなＣＤＫインヒビターの誘導によって調節される遺伝子を同定する必要性が、本技術分野で残っている。また、細胞老化、発癌、ウイルス疾患および加齢関連疾患における化合物の効果を評価するための標的を開発する必要性も、本技術分野で存在している。
【００１３】
本発明の概要
本発明は、その発現がＣＤＫインヒビター遺伝子発現の誘導によって調節される遺伝子を同定するための薬剤および方法を提供する。本発明はまた、発癌、ウイルス疾患および加齢関連疾患のような、細胞老化およびストレス応答の病因結果を予防するための合理的な薬物デザインの第一段階として、細胞の遺伝子発現においてｐ２１、ｐ２７およびｐ１６のようなＣＤＫインヒビターの効果を阻害する化合物を同定するための薬剤および方法を提供する。
【００１４】
第一の観点において、本発明は、誘導可能なＣＤＫインヒビター遺伝子を含む哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビター遺伝子は、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７をコードしている。好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、誘導可能なｐ２１遺伝子または誘導可能なｐ１６遺伝子、または誘導可能なｐ２７遺伝子をコードしている組換え発現構築物を含む、組換え哺乳動物細胞である。より好ましくは、構築物は、誘導可能なプロモーターの転写制御下で、ｐ２１、もっとも好ましくはヒトｐ２１をコードしているヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、前記構築物は、ＣＤＫ結合ドメインを含む、より好ましくはｐ２１アミノ酸配列のアミノ酸１〜７８を含む、ｐ２１のアミノ末端部分をコードしているヌクレオチド配列を含む。さらなる実施形態において、構築物は、誘導可能なプロモーターの転写制御下で、ｐ１６、もっとも好ましくはヒトｐ１６をコードしているヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、構築物は、誘導可能なプロモーターの転写制御下で、ｐ２７、好ましくはヒトｐ２７またはマウスｐ２７をコードしているヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態において、そのような各構築物における誘導可能なプロモーターは、前記細胞を、誘導薬剤、もっとも好ましくは、誘導可能なプロモーターからの転写を誘導する、生理学的に中性な誘導薬剤と接触させることによって、または、そのようなプロモーターからの転写を阻害する薬剤を除去することによって、誘導可能である。好ましい細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞が含まれる。とりわけ好ましい実施形態において、細胞は、繊維肉腫細胞、より好ましくはヒト繊維肉腫細胞、もっともこの好ましくは、ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株およびその誘導体である。
【００１５】
本発明の第一の観点の他の実施形態において、レポーター遺伝子が、その発現がＣＤＫインヒビター、もっとも好ましくはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７によって調節される、細胞遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下にある、組換え発現構築物を含む、組換え哺乳動物細胞が提供される。好ましい実施形態において、プロモーターは、その発現が、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７のようなＣＤＫインヒビターによって誘導される、細胞遺伝子に由来する。これらの実施形態において、プロモーターは、もっとも好ましくは、表ＩＩおよび表Ｖにて同定された遺伝子に由来するが、しかし、当業者は、その発現がＣＤＫインヒビター遺伝子発現によって誘導される任意の遺伝子に由来するプロモーターが、そのような構築物中で有利に使用されうることを認識するであろう。もっとも好ましくは、プロモーターは、血清アミロイドＡ（配列番号１）、補体Ｃ３（配列番号２）、結合組織増殖因子（配列番号３）、インテグリンβ−３（配列番号４）、アクチビンＡ（配列番号５）、ナチュラルキラー細胞タンパク質４（配列番号６）、プロサポシン（配列番号７）、Ｍａｃ２結合タンパク質（配列番号８）、ガレクチン−３（配列番号９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号１０）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ｐ６６Ｓｈｃ（配列番号１２）、カテプシンＢ（配列番号１４）、β−アミロイド前駆体タンパク質（配列番号１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧａｓｅ、配列番号１６）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８にて列記されている）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、またはＣＭＶ早期遺伝子プロモーター（配列番号８２）に由来する。本発明の組換え発現構築物を含む好ましいレポーター遺伝子には、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼが含まれる。
【００１６】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、その発現が、ＣＤＫインヒビター、もっとも好ましくはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７によって調整される、哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下でレポーター遺伝子をコードしている第一組換え発現構築物、および、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている第二組換え発現構築物を含む、哺乳動物細胞を提供し、ここで、ＣＤＫインヒビターの発現は、それによって哺乳動物細胞にて実験的に誘導される。好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビター遺伝子は、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている組換え発現構築物は、誘導可能な異種プロモーターの転写制御下にあり、ここで前記組換え発現構築物からの前記ＣＤＫインヒビターの発現は、前記組換え細胞を、誘導可能なプロモーターからの転写を誘導する誘導薬剤と接触させること、または、そのようなプロモーターからの転写を阻害する薬剤を除去することで媒介される。好ましくは、構築物は、ｐ２１、もっとも好ましくはヒトｐ２１をコードしているヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、構築物は、ＣＤＫ結合ドメインを含む、より好ましくはｐ２１アミノ酸配列のアミノ酸１〜７８を含む、ｐ２１のアミノ末端部分をコードしているヌクレオチド配列を含む。他の好ましい実施形態において、前記構築物は、ｐ１６、もっとも好ましくはヒトｐ１６をコードしているヌクレオチド配列を含む。他の好ましい実施形態において、前記構築物は、ｐ２７、好ましくはヒトｐ２７またはマウスｐ２７をコードしているヌクレオチド配列を含む。レポーター遺伝子をコードしている前記第二組換え発現構築物の好ましい実施形態において、プロモーターは、その発現がｐ２１、ｐ１６またはｐ２７のようなＣＤＫインヒビターによって誘導される、細胞遺伝子に由来する。これらの実施形態において、プロモーターは、もっとも好ましくは、表ＩＩまたは表Ｖにて同定された遺伝子、または、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（たとえば、５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８のように列記される）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、ＣＭＶ早期遺伝子プロモーター（配列番号８２）を含むプロモーターに由来する。本発明の前記第二組換え発現構築物を含む好ましいレポーター遺伝子には、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼが含まれる。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくはヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくはヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株およびその誘導体である。前記レポーター遺伝子またはＣＤＫインヒビターによって誘導される内因性遺伝子の産物は、好ましくは、免疫学的薬剤を用いて、遺伝子産物の活性をアッセイすることにより、または相補的核酸に対するハイブリッド形成によって、検出する。
【００１７】
第二の観点において、本発明は、哺乳動物内でのマイトジェンまたは抗アポトーシス因子の、ＣＤＫインヒビター誘導発現を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。好ましい実施形態において、前記方法には、化合物の存在下または不存在下で、細胞内において、ＣＤＫインヒビター、もっとも好ましくはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７の発現を誘導すること、および、ならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）中で、１つのマイトジェンまたは抗アポトーシス化合物または多数のそれらのものの発現を比較すること、の段階が含まれる。ＣＤＫインヒビター効果のインヒビターは、ならし培地中で、化合物の存在下において、化合物の不存在下においてより少ない量のマイトジェンまたは抗アポトーシス化合物または多数のそれらのものを有することにより、同定される。本発明のこの観点で提供される方法において、任意のＣＤＫインヒビター発現細胞が有用であり、もっとも好ましくは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７を発現している細胞が有用であり、そのような細胞でのｐ２１、ｐ１６またはｐ２７の発現は、内因性ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７を誘導することによって、または、本発明にしたがってｐ２１、ｐ１６またはｐ２７をコードしている誘導可能な発現構築物を含む細胞を使用することによって、実施可能である。好ましい細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞が含まれる。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくはヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくはヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株およびその誘導体である。マイトジェンまたは抗アポトーシス化合物発現は、免疫学的薬剤を用いて、遺伝子産物の活性をアッセイすることにより、または相補的核酸に対するハイブリッド形成によって検出する。
【００１８】
他の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞における、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子のＣＤＫインヒビター誘導発現を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、ここで、細胞は、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７のようなＣＤＫインヒビターによって誘導される、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子をコードしている細胞遺伝子のプロモーターの転写調節下で、レポーター遺伝子をコードしている組換え発現構築物を含む。好ましい実施形態において、プロモーターには、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ、配列番号３）、アクチビンＡ（配列番号５）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ガレクチン−３（配列番号９）、プロサポシン（配列番号７）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、およびメタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）のプロモーター、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８にて列記されている）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、またはＣＭＶ早期遺伝子プロモーター（配列番号８２）が含まれる。好ましいレポーター遺伝子には、限定はしないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光タンパク質が含まれる。これらの実施形態において、レポーター遺伝子発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導の阻害は、ＣＤＫインヒビター発現細胞における、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子の誘導を阻害する化合物を同定するために使用される。
【００１９】
この観点において、本発明はまた、哺乳動物細胞内での、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子または化合物の生成を阻害するための方法も提供し、本方法は、前記細胞を、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子の生成を阻害する化合物と接触させる段階を含み、ここで前記化合物は、本発明のこの観点における前述の方法によって同定する。好ましい実施形態において、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子の生成が阻害される阻害化合物と接触させた前記哺乳動物細胞は、繊維芽細胞、もっとも好ましくは間質繊維芽細胞である。好ましい実施形態において、前記化合物は、核因子カッパ−Ｂ（ＮＦκＢ）活性または発現のインヒビターである。
【００２０】
第三の観点において、本発明は、細胞またはウイルス遺伝子発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。これらの方法には、哺乳動物細胞におけるＣＤＫインヒビター遺伝子の発現を誘導することまたは生ずること、その発現がＣＤＫインヒビターによって誘導される細胞遺伝子の発現における変化に関して、化合物の存在下で細胞をアッセイすること、および、細胞遺伝子の発現が、化合物の不存在下よりも化合物の存在下で、より低い程度に変化する場合に、細胞遺伝子発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導を阻害する化合物を同定すること、の段階が含まれる。好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、細胞遺伝子は、ＣＤＫインヒビターによって誘導され、細胞遺伝子発現のこの誘導を阻害する化合物は、ＣＤＫインヒビターが化合物の不存在下で発現する場合に検出されるものよりも低いレベルで、遺伝子発現を検出することによって、検出される。本発明の方法のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、遺伝子は、表ＩＩにて同定される。さらに他の実施形態において、方法は、その発現がＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を含む組換え哺乳動物細胞を使用することで、実施される。ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子に由来するプロモーターを含む構築物を使用する場合、前記レポーター遺伝子産物は、前記化合物がＣＤＫインヒビター媒介遺伝子発現調節を阻害するかまたは干渉する時に、その化合物の不存在下よりも存在する場合に、より低いレベルで生成される。本方法のこの観点の好ましい実施形態において、前記ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。これらの実施形態において、前記プロモーターは、もっとも好ましくは、表ＩＩおよび表Ｖにおいて同定された遺伝子に由来する。もっとも好ましくは、前記プロモーターは、血清アミロイドＡ（配列番号１）、補体Ｃ３（配列番号２）、結合組織増殖因子（配列番号３）、インテグリンβ−３（配列番号４）、アクチビンＡ（配列番号５）、ナチュラルキラー細胞タンパク質４（配列番号６）、プロサポシン（配列番号７）、Ｍａｃ２結合タンパク質（配列番号８）、ガレクチン−３（配列番号９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号１０）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ｐ６６Ｓｈｃ（配列番号１２）、カテプシンＢ（配列番号１４）、β−アミロイド前駆体タンパク質（配列番号１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧａｓｅ、配列番号１６）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８にて列記されている）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、またはＣＭＶ早期���伝子プロモーター（配列番号８２）に由来する。本発明の組換え発現構築物を含む好ましいレポーター遺伝子には、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼが含まれる。他の好ましい実施形態において、細胞は、その発現がＣＤＫインヒビターによって誘導される哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードしている第一組換え発現構築物、および、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている第二組換え発現構築物を含み、ここで、ＣＤＫインヒビターの発現は、それによって哺乳動物細胞内で実験的に誘導される。レポーター遺伝子またはＣＤＫインヒビターによって誘導される内因性遺伝子の産物は、免疫学的薬剤を使用して、遺伝子産物の活性をアッセイすることによって、または、相補的な核酸に対するハイブリッド形成によって、好ましくは検出される。
【００２１】
第四の観点において、本発明は、哺乳動物細胞における老化の病因結果を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、そこで、そのような病因結果が、ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子の発現によって少なくとも部分的に媒介される。これらの方法には、化合物の存在下において哺乳動物を薬剤で処理すること、または、ＣＤＫインヒビター遺伝子発現を誘導する条件下で、前記哺乳動物細胞を培養すること、ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子の誘導に関して、哺乳動物細胞をアッセイすること、および、ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子の発現が、前記化合物の不存在下より存在下で、より少ない程度まで誘導される場合に、老化または老化の病因結果のインヒビターとして、化合物を同定すること、の段階が含まれる。本発明の方法のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、遺伝子は、表ＩＩおよび表Ｖにて同定される。さらに他の実施形態において、前記方法は、その発現がＣＤＫインヒビターによって調整される遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子を含む組換え哺乳動物細胞を用いて、実施される。これらの実施形態において、ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子に由来するプロモーターを含む構築物を用いた、化合物の不存在下より存在下で、より少ないレベルでの、前記レポーター遺伝子の産物の生成は、化合物が細胞老化の病因結果のインヒビターである場合に、検出される。本発明方法のこの観点の好ましい実施形態において、前記ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。前記プロモーターは、好ましくは、表ＩＩおよび表Ｖにおいて同定された遺伝子に由来する。もっとも好ましくは、前記プロモーターは、血清アミロイドＡ（配列番号１）、補体Ｃ３（配列番号２）、結合組織増殖因子（配列番号３）、インテグリンβ−３（配列番号４）、アクチビンＡ（配列番号５）、ナチュラルキラー細胞タンパク質４（配列番号６）、プロサポシン（配列番号７）、Ｍａｃ２結合タンパク質（配列番号８）、ガレクチン−３（配列番号９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号１０）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ｐ６６Ｓｈｃ（配列番号１２）、カテプシンＢ（配列番号１４）、β−アミロイド前駆体タンパク質（配列番号１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧａｓｅ、配列番号１６）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８にて列記されている）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、またはＣＭＶ早期遺伝子プロモーター（配列番号８２）に由来する。他の好ましい実施形態において、細胞は、その発現がＣＤＫインヒビターによって誘導される哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードしている第一組換���発現構築物、および、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている第二組換え発現構築物を含み、ここで、ＣＤＫインヒビターの発現は、それによって哺乳動物細胞内で実験的に誘導される。本発明方法のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞であり、より好ましくはヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくはヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株およびその誘導体である。レポーター遺伝子またはＣＤＫインヒビターによって誘導される内因性遺伝子の産物は、免疫学的薬剤を使用して、遺伝子産物の活性をアッセイすることによって、または、相補的な核酸に対するハイブリッド形成によって、好ましくは検出される。
【００２２】
第五の観点において、本発明は、ＣＤＫインヒビターによるウイルス遺伝子発現誘導を阻害するため、または防止するための方法を提供する。好ましい実施形態において、本方法には、細胞、好ましくはウイルスに感染した細胞（急性または潜在性いずれか）、またはウイルス感染のリスクを持つ細胞を、ＣＤＫインヒビターによるウイルス遺伝子発現誘導を阻害または防止する化合物を同定するための本発明方法によって同定した化合物と、接触させる段階が含まれる。好ましい実施形態において、有効量の化合物は、医薬適合性の担体または他の薬剤を用いて薬剤の組成物内に処方され、動物、もっとも好ましくは、ＣＤＫインヒビター誘導遺伝子発現によって引き起こされるウイルス疾患を患っている動物に投与される。好ましい実施形態において、疾患は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）による感染である。
【００２３】
第六の観点において、本発明は、抗ウイルス化合物、およびウイルス遺伝子のｐ２１誘導発現を阻害する抗ウイルス化合物を同定するための方法を提供する。好ましい実施形態において、抗ウイルス化合物は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）を含むが，これらに限定されない、ウイルスに対して効果的である。
【００２４】
第七の観点において、本発明は、発癌または加齢関連疾患のような、細胞老化の病因結果を阻害するための方法を提供し、本方法は、本発明の先に言及した観点において提供された方法を用いて決定されたように、老化または老化の病因結果を阻害する化合物と、細胞とを接触させる段階を含む。
【００２５】
第八の観点において、本発明は、本明細書で開示したような本発明の任意の方法を用いて同定される化合物を提供する。
【００２６】
第九の観点において、本発明は、ＣＤＫインヒビターによる遺伝子発現誘導を阻害するため、または防止するための方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、ＣＤＫインヒビターによる遺伝子発現誘導を阻害または防止する化合物を同定するための本発明の方法によって同定された化合物と、細胞とを接触させる段階を含む。好ましい実施形態において、有効量の化合物は、医薬適合性の担体または他の薬剤を用いて、薬剤の組成物内に処方され、動物、もっとも好ましくは、ＣＤＫインヒビター誘導遺伝子発現によって引き起こされる疾患を患っている動物に投与される。好ましい実施形態において、疾患は、癌、アルツハイマー病、腎臓疾患、関節炎またはアテローム性動脈硬化症である。好ましい実施形態において、本発明は、ＮＦκＢインヒビターである化合物を使用する。
【００２７】
本発明の特に好ましい実施形態は、特定の好ましい実施形態の以下のより詳細な記述、および請求項より明らかになるであろう。
【００２８】
好ましい実施形態についての詳細な説明
本発明は、老化およびストレス応答のＣＤＫインヒビター誘導病因結果を媒介することに関与する遺伝子を同定するための薬剤および方法を提供し、哺乳動物細胞における老化およびストレス応答の病因結果を阻害可能な化合物を提供する。とりわけ、ＣＤＫインヒビターｐ２１、ｐ２７またはｐ１６によって誘導される遺伝子を同定するためのそのような薬剤および方法の実施形態が提供される。
【００２９】
本発明の目的に関して、語句「ＣＤＫインヒビター（ＣＤＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、サイクリン依存性キナーゼ阻害の生化学的活性を持つ、哺乳動物遺伝子のファミリーのメンバーを含むことが意図される。この定義に明らかに含まれるものは、ＣＤＫインヒビターｐ１５、ｐ１４、ｐ１８であり、とりわけｐ２１、ｐ１６またはｐ２７であり、後者３つは、本発明の薬剤および方法のとりわけ好ましい実施形態である。
【００３０】
本発明の目的に関して、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」または「細胞群（ｃｅｌｌｓ）」との記述は、同等であることが意図され、とりわけ、本技術分野で知られているように増殖および維持される哺乳動物細胞のインビトロ培養物が含まれる。
【００３１】
本発明の目的に関して、複数形での「細胞遺伝子（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｅｎｅｓ）」の表記は、単一の遺伝子ならびに２つまたはそれ以上の遺伝子を含むことが意図される。細胞遺伝子発現、または細胞遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下でのレポーター構築物の調節効果が、第一遺伝子内で検出可能であり、ついで、その効果が、第二または任意の数の追加的遺伝子またはレポーター遺伝子構築物を試験することによって反復されうることが、当業者によって理解されるであろう。あるいは、２つまたはそれ以上の遺伝子またはレポーター遺伝子構築物の発現が、本発明の範囲内で同時にアッセイ可能である。
【００３２】
本発明の目的のために、複数形での「ウイルス遺伝子（ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅｓ）」の表記は、単一の遺伝子ならびに２つまたはそれ以上の遺伝子を含むことが意図される。ウイルス遺伝子発現、またはウイルス遺伝子に由来するプロモーターの転写制御下でのレポーター構築物の調節効果が、第一遺伝子内で検出可能であり、ついで、その効果が、第二または任意の数の追加的遺伝子またはレポーター遺伝子構築物を試験することによって反復されうることが、当業者によって理解されるであろう。あるいは、２つまたはそれ以上の遺伝子またはレポーター遺伝子構築物の発現が、本発明の範囲内で同時にアッセイ可能である。
【００３３】
本明細書で使用するところの語句「ならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）」は、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子を含む、ＣＤＫインヒビター発現細胞の増殖によって条件付けられる、細胞培養培地を含むことが意図される。ならし培地は、ＣＤＫインヒビター発現細胞を、哺乳動物細胞培養培地中で培養することによって、好ましい実施形態で生成され、もっとも好ましくは、血清添加物を含まない合成培地である。任意のＣＤＫインヒビター発現細胞が、前記ならし培地の生成のために有用であり、そのような細胞内でのＣＤＫインヒビター発現は、（たとえば、ＤＮＡ損傷薬剤による処理、電離放射線または紫外線放射または接触阻害によって）内因性ＣＤＫインヒビターを誘導することで実施可能であり、または、本発明にしたがった誘導可能なＣＤＫインヒビター発現構築物を含む細胞を使用し、生理学的に中性な誘導薬剤中で細胞を培養することによって実施可能である。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞が含まれる。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくはヒト繊維肉腫細胞、および、もっとも好ましくはヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株およびその誘導体である。
【００３４】
本発明の目的に関して、語句「老化」は、正常細胞の増殖の寿命の最後で起こるか、または、細胞毒性薬剤、ＤＮＡ障害または他の細胞損傷に対する応答にて、正常細胞または腫瘍細胞で起こるような、ＤＮＡ複製の永久停止および増殖因子による非可逆的細胞増殖が含まれると理解されるであろう。
【００３５】
老化は、多くの方法で、哺乳動物細胞にて誘導可能である。第一は、インビボまたはインビトロいずれかでの、正常細胞増殖の通常の結果であり、正常細胞が老化になるまえに実行可能である、細胞分裂、継代または世代の数は限られている。正確な数字は、細胞の型およびもとの種によって変化する（Ｈａｙｆｌｉｃｋ  ＆  Ｍｏｏｒｈｅａｄ、１９６１、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５：５８５〜６２１）。任意の細胞型において老化を誘導するための他の方法は、ほとんどの抗癌剤、放射線および細胞分化剤のような、細胞毒性薬剤での処理である。Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：３７６１〜３７６７を参照のこと。老化はまた、細胞内へ、（ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６またはＲｂのような）腫瘍抑制遺伝子を形質導入すること、および、そこで遺伝子を発現させることにより、任意の哺乳動物細胞内に迅速に誘導可能である。Ｓｕｇｒｕｅら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：９６４８〜９６５３；  Ｕｈｒｂｏｍら、１９９７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：５０５〜５１４；Ｘｕら、１９９７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：２５８９〜２５９６；Ｖｏｇｔら、１９９８、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．９：１３９〜１４６を参照のこと。
【００３６】
本発明の目的に関して、語句「老化の病因結果（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）」は、癌、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、アミロイド沈着症、腎臓疾患および関節炎のような疾患を含むことが意図される。
【００３７】
本発明の目的に関して、「ウイルス疾患（ｖｉｒａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）」は、哺乳動物、もっとも好ましくはヒトの細胞中での、ウイルスの感染、複製、遺伝子発現または生成によって引き起こされるか、または関連する疾患である。とりわけ、本語句は、その発現が、ｐ２１に応答性であるか、またはｐ２１により誘導される、少なくとも１つの遺伝子をもつウイルスを含むことが意図される。とりわけ、本語句は、ＤＮＡウイルス、特に、二本鎖ＤＮＡウイルス、または、二本鎖ＤＮＡ型でその生存周期の一部分を持つウイルスを意味する（レトロウイルスおよびレンチウイルス、とりわけＨＩＶを含むが、これらに限定されない）。
【００３８】
本発明の薬剤には、ＣＤＫインヒビター、もっとも好ましくはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７の発現を誘導可能な、任意の哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウス細胞、およびもっとも好ましくはヒト細胞が含まれ、ここで、そのような遺伝子は、内因性遺伝子または遺伝子工学によって誘導された外因性遺伝子のいずれかである。実施例は、誘導可能なｐ２１、ｐ２７およびｐ１６遺伝子をコードしている組換え発現構築物を含む、組換え哺乳動物細胞を開示しているけれど、これらの実施形態が、単に実験的な設計の選択および利便性の問題であること、および本発明が、ｐ２１、ｐ２７およびｐ１６のような内因性ＣＤＫインヒビター遺伝子の誘導を完全に含むこと、が理解されるであろう。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明は、誘導可能な哺乳動物ｐ２１遺伝子をコードしている組換え発現構築物を含む、哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、ｐ２１遺伝子は、本明細書で参考文献にて組み込まれた、米国特許第５、４２４、４００号に列記されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を持つ、ヒトｐ２１である。他の実施形態において、ｐ２１遺伝子は、ヒトｐ２１遺伝子のアミノ末端部分であり、好ましくは（参考文献にて組み込まれた、米国特許第５、８０７、６９２号にて記述されているような）ネイティブヒトｐ２１タンパク質のアミノ酸残基１〜７８を含み、より好ましくは、ネイティブヒトｐ２１タンパク質のアミノ酸２１〜７１を含むＣＤＫ結合ドメインを含む（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、１９９５、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５５５〜５６３）。好ましい宿主細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、およびより好ましくはマウスまたはヒト細胞が含まれる。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくは、ヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくは、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびその誘導体である。もっとも好ましい細胞株は、受け入れ番号第ＰＴＡ１６６４号にて、２０００年４月６日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。
【００４０】
他の好ましい実施形態において、本発明は、誘導可能な哺乳動物ｐ１６遺伝子をコードしている組換え発現構築物を含む、哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、ｐ１６遺伝子は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００００７７およびＮＰ＿００００６８に列記されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を持つ、ヒトｐ１６である。好ましい宿主細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、および、より好ましくはマウスまたはヒト細胞が含まれる。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくは、ヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくは、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびその誘導体である。もっとも好ましい細胞株は、受け入れ番号第ＰＴＡ−４０２０号にて、２００２年１月３１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０  ｐ１６−５として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。
【００４１】
他の好ましい実施形態において、本発明は、誘導可能な哺乳動物ｐ２７遺伝子をコードしている組換え発現構築物を含む、哺乳動物細胞を提供する。好ましい実施形態において、ｐ２７遺伝子は、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００４０６４およびＮＰ＿００４０５５に列記されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を持つヒトｐ２７、または、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００９８７５およびＮＰ＿０３４００５に列記されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を持つマウスｐ１６である。好ましい宿主細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、および、より好ましくはマウスまたはヒト細胞が含まれる。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくは、ヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくは、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株およびその誘導体である。もっとも好ましい細胞株は、受け入れ番号第ＰＴＡ−４０２１号にて、２００２年１月３１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０  ｐ２７−２として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。
【００４２】
組換え発現構築物は、当業者によって理解されるように、適切な哺乳動物細胞内に導入可能である。前記構築物の好ましい実施形態は、本技術分野で知られているように、遺伝性ベクター、より好ましくはウイルスベクター、および、もっとも好ましくはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、およびワクシニアウイルスベクターである。一般的に、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、（Ｄａｖｉｓｏｎ  ＆  Ｅｌｌｉｏｔｔ、ｅｄ．）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３を参照のこと。
【００４３】
さらに好ましい実施形態において、本発明の組換え細胞には、誘導可能なＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている構築物が含まれ、ここで前記遺伝子は、誘導可能なプロモーターの転写制御下にある。より好ましい実施形態において、誘導可能なプロモーターは、その効果が、誘導薬剤によって調節されうる、トランス作用因子に応答性である。誘導薬剤は、温度、およびもっとも好ましくは誘導薬剤の存在または不存在を含む、実験的に操作可能である任意の因子でありうる。好ましくは、誘導薬剤は、化学化合物、もっとも好ましくは、トランス作用因子に特異的である生理学的に中性な化合物である。本明細書で開示したような、誘導可能なプロモーターを含む構築物の使用において、前記組換え発現構築物からのＣＤＫインヒビターの発現は、組換え細胞を、誘導可能なプロモーターからの転写を誘導する誘導薬剤と接触させること、または、そのようなプロモーターからの転写を阻害する薬剤を除去することによって、媒介される。本発明の方法のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ２７またはｐ１６である。種々の誘導可能なプロモーターおよび同起源のトランス作用因子が、本技術分野で公知であり、細胞培養の温度を上昇させることによって活性化可能であるヒートショックプロモーター、および、より好ましくは、たとえば、ｔｅｔプロモーター、およびその同起源のｔｅｔリプレッサーおよび哺乳動物転写因子とのその融合体（米国特許第５、６５４、１６８号、第５、８５１、７９６号、および第５、９６８、７７３号にて開示されたように）、ならびに、ラクトースオペロンの細菌ｌａｃプロモーターおよび同起源のｌａｃＩリプレッサータンパク質が含まれる。好ましい実施形態において、組換え細胞は、ｌａｃＩリプレッサータンパク質と、１つまたは多数のｌａｃ応答性要素を含むプロモーターの制御下で、ヒトｐ２１をコードしている組換え発現構築物とを発現しており、ここでｐ２１の発現は、細胞を、生理学的に中性な誘導薬剤、イソプロピルチオ−β−ガラクトシドと接触させることによって誘導可能である。この好ましい実施形態において、ｌａｃＩリプレッサーは、３’ＳＳとして同定された、組換え発現構築物によってコードされている（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）より市販されている）。他の好ましい実施形態において、組換え細胞は、ｌａｃＩリプレッサータンパク質と、１つまたは多数のｌａｃ応答性要素を含むプロモーターの制御下で、ヒトｐ１６をコードしている組換え発現構築物とを発現しており、ここでｐ１６の発現は、細胞を、生理学的に中性な誘導薬剤、イソプロピルチオ−β−ガラクトシドと接触させることによって誘導可能である。この好ましい実施形態において、ｌａｃＩリプレッサーは、３’ＳＳ組換え発現構築物（ストラタジーン）によってコードされている。他の好ましい実施形態において、組換え細胞は、ｌａｃＩリプレッサータンパク質と、１つまたは多数のｌａｃ応答性要素を含むプロモーターの制御下で、ヒトｐ２７またはマウスｐ２７をコードしている組換え発現構築物とを発現しており、ここでｐ２７の発現は、細胞を、生理学的に中性な誘導薬剤、イソ��ロピルチオ−β−ガラクトシドと接触させることによって誘導可能である。この好ましい実施形態において、ｌａｃＩリプレッサーは、３’ＳＳ組換え発現構築物（ストラタジーン）によってコードされている。
【００４４】
本発明はまた、レポーター遺伝子が、その発現がｐ２１、ｐ１６またはｐ２７のようなＣＤＫインヒビターによって調節される遺伝子のプロモーターの転写制御下にある、組換え発現構築物も提供する。これらには、その発現がＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子も含まれる。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、プロモーターは、その発現が、ＣＤＫインヒビター発現によって誘導される、または増加する遺伝子に由来し、表ＩＩまたは表Ｖにて同定されている。もっとも好ましくは、前記プロモーターは、血清アミロイドＡ（配列番号１）、補体Ｃ３（配列番号２）、結合組織増殖因子（配列番号３）、インテグリンβ−３（配列番号４）、アクチビンＡ（配列番号５）、ナチュラルキラー細胞タンパク質４（配列番号６）、プロサポシン（配列番号７）、Ｍａｃ２結合タンパク質（配列番号８）、ガレクチン−３（配列番号９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号１０）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ｐ６６Ｓｈｃ（配列番号１２）、カテプシンＢ（配列番号１４）、β−アミロイド前駆体タンパク質（配列番号１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧａｓｅ、配列番号１６）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８にて列記されている）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、またはＣＭＶ早期遺伝子プロモーター（配列番号８２）に由来する。これらのレポーター遺伝子は、そこで、ＣＤＫインヒビター遺伝子発現の効果の、感度がよく便利な指標として使用され、そして、哺乳動物細胞内でのＣＤＫインヒビターの発現の効果を阻害する化合物を、簡単に同定可能にする。これらの構築物に対する宿主細胞には、ＣＤＫインヒビター遺伝子発現が誘導されうる任意の細胞が含まれ、好ましくは、上述したような誘導可能なＣＤＫインヒビター遺伝子を含む、組換え発現構築物をもまた含む細胞が含まれる。本発明のこの観点の実施において有用なレポーター遺伝子には、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、またはアルカリホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくはヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくは、ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞およびその誘導体である。もっとも好ましい細胞株は、受け入れ番号第ＰＴＡ−３３８１号にて、２００１年５月１７日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０／ＬＵＮＫ４ｐ２１として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。
【００４５】
好ましい実施形態において、本発明のしたがった細胞は、その発現が、ＣＤＫインヒビターによって調節される、哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードしている、第一組換え発現構築物、および、哺乳動物ＣＤＫインヒビター遺伝子をコードしている第二組換え発現構築物の両方を含み、ここで、ＣＤＫインヒビター発現は、哺乳動物細胞内で、それによって実験的に誘導可能である。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。他の実施形態において、本発明は、その発現がＣＤＫインヒビターによって誘導される、哺乳動物遺伝子に対するプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードしている組換え発現構築物を含む哺乳動物細胞を提供し、ここで、前記プロモーターは、血清アミロイドＡ（配列番号１）、補体Ｃ３（配列番号２）、結合組織増殖因子（配列番号３）、インテグリンβ−３（配列番号４）、アクチビンＡ（配列番号５）、ナチュラルキラー細胞タンパク質４（配列番号６）、プロサポシン（配列番号７）、Ｍａｃ２結合タンパク質（配列番号８）、ガレクチン−３（配列番号９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号１０）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ｐ６６Ｓｈｃ（配列番号１２）、カテプシンＢ（配列番号１４）、β−アミロイド前駆体タンパク質（配列番号１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧａｓｅ、配列番号１６）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８にて列記されている）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、またはＣＭＶ早期遺伝子プロモーター（配列番号８２）をコードしている遺伝子からのものである。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。
【００４６】
本発明はまた、哺乳動物細胞における、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子のＣＤＫインヒビター誘導発現を阻害する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビター発現は、化合物の存在下または不存在下において、哺乳動物細胞培養にて誘導され、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子のＣＤＫインヒビター誘導発現のインヒビターとして同定される。化合物は、細胞内でＣＤＫインヒビターの発現を誘導することによって、および、前記化合物の存在下におけるマイトジェンまたは抗アポトーシス因子または多数のそれらのものの発現の程度を、前記化合物の不存在下においてと比較することによって、インヒビターとして同定され、また、インヒビターは、前記化合物の存在下でマイトジェンまたは抗アポトーシス因子または多数のそれらのものの発現量が削減されている化合物として同定される。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。任意のＣＤＫインヒビター発現細胞は、前記ならし培地の産生のために有用であり、そのような細胞内でのＣＤＫインヒビター発現は、（ＤＮＡ損傷薬剤および他の細胞毒性化合物での処理、および、電離放射線または紫外線放射、または接触阻害によってのような）内因性ＣＤＫインヒビターを誘導することによって、または、本発明にしたがって、誘導可能なＣＤＫインヒビター発現構築物を含む細胞を使用し、生理学的に中性な誘導薬剤中で前記細胞を培養することによって、達成可能である。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞が含まれる。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくはヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくは、ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞およびその誘導体である。本発明のとりわけ好ましい実施形態にしたがった例示的細胞株は、受け入れ番号第ＰＴＡ１６６４号にて、２０００年４月６日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。例示的細胞集団は、受け入れ番号第ＰＴＡ−２５８０号にて、２０００年１０月１０日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０／ＬＮｐ１６ＲＯ２として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。本発明のとりわけ好ましい実施形態にしたがった他の例示的細胞株は、受け入れ番号第ＰＴＡ−４０２０号にて、２００２年１月３１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０  ｐ１６−５として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。本発明のとりわけ好ましい実施形態にしたがった他の例示的細胞株は、受け入れ番号第ＰＴＡ−��０２１号にて、２００２年１月３１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０  ｐ２７−２として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。
【００４７】
他の実施形態において、本発明は、哺乳動物細胞内での、マイトジェンまたは抗アポトーシス因子のＣＤＫインヒビター誘導発現を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、ここで、細胞は、ＣＤＫインヒビターによって誘導される細胞遺伝子のプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードしている組換え発現構築物を含む。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましいプロモーターには、結合組織増殖因子（配列番号３）、アクチビンＡ（配列番号５）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ガレクチン−３（配列番号９）、プロサポシン（配列番号７）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）に関するプロモーター、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８にて列記されている）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、またはＣＭＶ早期遺伝子プロモーター（配列番号８２）が含まれる。好ましいレポーター遺伝子には、これらには限定されないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光タンパク質が含まれ、すべてが市販されている。これらの実施形態において、ＣＤＫインヒビター発現は、細胞内で誘導され、レポーター遺伝子の発現の程度が、化合物の存在下において、化合物の不存在下における発現と比較される。インヒビターは、化合物の不存在下よりも、化合物の存在下で、レポーター遺伝子の発現量の減少を起こす化合物として同定される。任意のＣＤＫインヒビター発現細胞が、本発明のこの観点で有用であり、そのような細胞内でのＣＤＫインヒビター発現は、（例えば、ＤＮＡ損傷薬剤および他の細胞毒性化合物での処理、電離放射線または紫外線放射、または接触阻害によってのような）内因性インヒビター遺伝子を誘導することによって、または、本発明にしたがって、誘導可能なＣＤＫインヒビター発現構築物を含む細胞を使用し、生理学的に中性な誘導薬剤中で前記細胞を培養することによって、達成可能である。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは齧歯類または霊長類細胞、より好ましくはマウスまたはヒト細胞が含まれる。とりわけ好ましい実施形態は、繊維肉腫細胞、より好ましくはヒト繊維肉腫細胞、もっとも好ましくは、ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞およびその誘導体である。もっとも好ましい細胞株は、受け入れ番号第ＰＴＡ−３３８１号にて、２００１年５月１７日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された、ＨＴ１０８０／ＬＵＮＫ４ｐ２１として同定された、ＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株誘導体である。
【００４８】
本発明は、細胞老化の病因結果を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、それによって、化合物の効果は、化合物が、その発現がＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子の誘導を阻害するかどうかを測定することによって、アッセイされる。本発明の本方法の実施において、そこでＣＤＫインヒビターが誘導されうる、培養哺乳動物細胞は、たとえば、電離放射線または放射線照射によって、または接触阻害処置または細胞毒性薬剤での処理によって、インヒビター遺伝子を誘導するために処理され、または、ＣＤＫインヒビターをコードしている遺伝性のベクターで形質導入される。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターは、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。より好ましくは、ｐ２１が細胞をＩＰＴＧと接触させることによって誘導可能である、ＨＴ１０８０ｐ２１−９細胞（受け入れ番号第ＰＴＡ  １６６４号にて、２０００年４月６日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された）が使用され、または、ＨＴ１０８０ｐ１６−５細胞（受け入れ番号第ＰＴＡ−４０２０号にて、２００２年１月３１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された）が、ｐ１６がＩＰＴＧにて誘導可能であるように、使用され、または、ＨＴ１０８０ｐ２７−２細胞（受け入れ番号第ＰＴＡ−４０２１号にて、２００２年１月３１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託された）が、ｐ２７がＩＰＴＧにて誘導可能であるように、使用される。典型的には、細胞を適切な培養培地で増殖させる（たとえば、ＨＴ１０８０誘導体に対して、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ）。ＨＴ１０８０ｐ２１−９、ＨＴ１０８０ｐ１６−５、またはＨＴ１０８０ｐ２７−２細胞において、ＣＤＫインヒビター遺伝子発現は、約５０μＭの濃度で、培養培地にＩＰＴＧを加えることによって誘導される。典型的には、ＣＤＫインヒビターは、化合物の存在下または不存在下において、これらの細胞内で誘導され、本発明の方法にしたがって試験される。ついでｍＲＮＡを、ＣＤＫインヒビターが誘導される細胞より単離し、ＣＤＫインヒビターによって制御された遺伝子の発現を解析する。発現を、化合物の存在下においてＣＤＫインヒビターが誘導される細胞内で、化合物の不存在下で誘導された発現と比較し、そして、差違を、本明細書に列記した方法にしたがって、細胞遺伝子発現に影響を与える化合物を同定するために使用する。一定の実施形態において、細胞遺伝子発現を、（たとえば、ゲノム  システムズ社（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）からのような）市販されているような、オリゴヌクレオチドまたは細胞ｃＤＮＡのマイクロアレイを用いて解析する。他の実施形態においては、ＣＤＫインヒビターによって誘導されることが知られている遺伝子をアッセイする。遺伝子発現は、１つまたは多数のＣＤＫインヒビター調節遺伝子に対して、細胞ｍ���ＮＡまたはタンパク質を解析することのいずれかによって、アッセイ可能である。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。もっとも好ましくは、これらのアッセイで使用する遺伝子は、表ＩＩおよび表Ｖにて同定される遺伝子である。
【００４９】
他の実施形態において、そのような化合物は、ＣＤＫインヒビター指向実験操作と独立して同定される。そのようなアッセイにおいては、細胞は、細胞毒性薬剤、放射線または細胞分化剤での処理、または腫瘍抑制遺伝子の導入を含むがこれらに限定されない、上記において開示された任意の方法で、老化を誘導するために処理される。ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子の発現は、試験化合物の存在下または不存在下で解析される。もっとも好ましくは、これらのアッセイで使用する遺伝子は、表ＩＩにて同定される遺伝子であり、遺伝子発現解析に関して、上記において議論したｍＲＮＡおよびタンパク質アッセイの型を使用する。
【００５０】
他の実施形態において、その中でＣＤＫインヒビターが誘導される細胞は、ＣＤＫインヒビターによって誘導される細胞遺伝子のプロモーターの転写制御下で、レポーター遺伝子をコードしている組換え発現構築物をさらに含む。本発明のこの観点の好ましい実施形態において、ＣＤＫインヒビターはｐ２１、ｐ１６またはｐ２７である。好ましい実施形態において、細胞遺伝子は、ＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子であり、プロモーターは表ＩＩおよび表Ｖにて同定された遺伝子に由来する。そのような遺伝子に関して知られているプロモーターの例には、血清アミロイドＡ（配列番号１）、補体Ｃ３（配列番号２）、結合組織増殖因子（配列番号３）、インテグリンβ−３（配列番号４）、アクチビンＡ（配列番号５）、ナチュラルキラー細胞タンパク質４（配列番号６）、プロサポシン（配列番号７）、Ｍａｃ２結合タンパク質（配列番号８）、ガレクチン−３（配列番号９）、スーパーオキシドジスムターゼ２（配列番号１０）、グラニュリン／エピセリン（配列番号１１）、ｐ６６Ｓｈｃ（配列番号１２）、カテプシンＢ（配列番号１４）、β−アミロイド前駆体タンパク質（配列番号１５）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧａｓｅ、配列番号１６）、クラステリン（配列番号１７）、プロスタサイクリン刺激因子（配列番号１８）、血管内皮増殖因子−Ｃ（配列番号１９）、メタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（配列番号２０）、１つ（配列番号７９）または多数のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーター（５倍のタンデムリピートＮＦκＢ認識配列を含むプロモーターは配列番号７８にて列記されている）、ＳＶ４０早期プロモーター（配列番号８１）、またはＣＭＶ早期遺伝子プロモーター（配列番号８２）が含まれる。好ましいレポーター遺伝子には、これらには限定されないが、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび緑色蛍光タンパク質が含まれ、すべてが市販されている。
【００５１】
本発明は、ウイルス感染、ウイルス遺伝子発現またはその病因結果を阻害する化合物を同定するための方法を提供し、それによって、化合物の効果は、化合物が、その発現がＣＤＫインヒビターによって誘導されるウイルス遺伝子の誘導を阻害するかどうかを決定することによって、アッセイされる。
【００５２】
本発明は、ウイルス感染の病因結果と関連したウイルス遺伝子の誘導を阻害する化合物を同定するための方法を提供する。そのような化合物は、遺伝子発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導におけるその効果によって、ウイルス疾患を予防、遅延または逆転させる能力を表すことが予想される。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明は、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７のようなＣＤＫインヒビターによって誘導される遺伝子発現を阻害するための方法を提供する。好ましい実施形態において、そのような阻害は、細胞を、ＤＮＡウイルス、もっとも好ましくは、ヒトに感染する二本鎖ＤＮＡウイルスからのプロモーターにおける遺伝子発現を阻害する、有効量の化合物と接触させることによって、実施される。さらなる好ましい実施形態において、化合物は、レンチウイルス遺伝子発現、もっとも好ましくはＨＩＶ遺伝子発現およびＨＩＶ感染性を阻害する。
【００５４】
本発明はしたがって、ウイルス遺伝子発現のＣＤＫインヒビター誘導を阻害することによって、細胞、もっとも好ましくはヒト細胞のウイルス感染を阻害するための方法を提供する。本発明の方法によって同定された化合物を使用して、治療または予防しうる疾患には、これらには限定されないが、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、１型および２型単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ＥＢウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、肝炎ウイルス、ヒトポリオーマウイルス、および任意のこれらのウイルスでの感染によって引き起こされる、または起こりやすい疾患が含まれる。とりわけ、本発明は、前記ウイルス、とりわけＨＩＶおよび帯状疱疹ウイルスによる潜在的感染細胞におけるウイルス遺伝子発現を阻害するための方法を提供する。
【００５５】
本発明はまた、細胞老化および老化の病因結果に関連した、または、ＣＤＫインヒビター誘導細胞老化の効果を媒介する、遺伝子を同定するための方法も提供する。ＣＤＫインヒビターの誘導は、老化に関連した細胞増殖停止、末端分化および細胞障害への応答の、不可欠な部分であることがわかった。以下の実施例で記述しているように、ｃＤＮＡアレイハイブリッド形成は、これらの効果が、遺伝子発現におけるｐ２１誘導変化によるものであることを示していた。ｐ２１は、細胞老化および加齢に関連した、または、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、アミロイド沈着症、腎臓疾患および関節炎を含む、加齢に関連した疾患に関与している、遺伝子を選択的に誘導する。これらの発見は、生物におけるｐ２１誘導の累積効果が、癌および加齢関連疾患の病因に関与する可能性があることを示唆した。さらに、多くのｐ２１活性化遺伝子が、細胞増殖およびアポトーシスにおける潜在的なパラクリン効果を持つ、分泌タンパク質をコードしている。本発見と一致して、ｐ２１−誘導細胞からのならし培地が、マイトジェンおよび抗アポトーシス活性を示した。
【００５６】
さらに、以下の実施例に提示された結果により、ｐ１６またはｐ２７の発現の誘導が、ｐ２１遺伝子発現の効果を模倣すること、および、その発現がｐ２１遺伝子発現によって調節された同一の遺伝子もまた、ｐ１６またはｐ２７遺伝子発現によって調節されたことが実証された（図６を参照のこと）。したがって、本発明の方法は、内因性ｐ１６またはｐ２７の遺伝子の誘導によって、あるいは、ｐ１６またはｐ２７をコードしている誘導可能な発現構築物を含む組換え細胞内でのいずれかで、ｐ１６またはｐ２７遺伝子発現が誘導される細胞を含むように、拡張された。
【００５７】
遺伝子発現における、ＣＤＫインヒビター誘導、とりわけｐ２１、ｐ１６およびｐ２７誘導の観察された結果は、細胞老化および生物加齢に関連した変化との多くの関連性を示している。これらの関連性のいくつかは、ＣＤＫインヒビターによって阻害される遺伝子の解析より生ずる。したがって、老化した繊維芽細胞は、ｐ２１誘導において観察されたように、より低レベルのＲｂを発現すると報告された（Ｓｔｅｉｎら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：２１０９〜２１１７）。ＣＤＫインヒビターによって阻害される３つの遺伝子、ＣＨＬ１、ＣＤＣ２１およびＲＡＤ５４が、ヘリカーゼファミリーのメンバーをコードしていることも興味深い。ヘリカーゼ群の他のタンパク質の欠損が、ワーナー症候群、すなわち早期老化に関連した臨床状態の原因として、および、細胞レベルで、培地中にある細胞の促進老化の原因として同定された（Ｇｒａｙら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１７：１００〜１０３）。
【００５８】
しかしながら、老化表現型とのもっとも強力な関連性は、ＣＤＫインヒビター誘導遺伝子の同定より発生しており、その多くは、複製老化または生物加齢の間に、そのレベルが増加することが知られている。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質の過剰発現は、複製老化の知られた特質であり、この群の２つのＣＤＫインヒビター誘導遺伝子、フィブロネクチン１およびプラスミノーゲン活性化インヒビター１（ＰＡＩ−１）は、しばしば細胞老化と関連してきた（Ｃｒｉｓｏｆａｌｏ  ＆  Ｐｉｇｎｏｌｏ、１９９６、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３１：１１１〜１２３にて概説されている）。老化した繊維芽細胞にて過剰発現しているとも報告された、他のＣＤＫインヒビター誘導遺伝子には、組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ；Ｗｅｓｔら、１９９６、Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．３１：１７５〜１９３）、カテプシンＢ（ｄｉＰａｏｌｏら、１９９２、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１：５００〜５０５）、インテグリンβ３（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４０：８８〜９２）およびＡＰＰ（Ａｄｌｅｒら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１６〜２０）が含まれる。ｔ−ＰＡおよびＰＡＩ−１（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、１９８７、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．４６：６２５〜６３３）、カテプシンＢ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、１９９０、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．２４：４３〜５４９）、アクチビンＡ（Ｌｏｒｉａら、１９９８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：４８７〜４９２）、プロサポシン（Ｍａｔｈｕｒら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．３４：１０６３〜１０７１）、ＡＰＰ（Ｏｇｏｍｏｒｉら、１９８８、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４３：Ｂ１５７−Ｂ１６２）、ＳＡＡ（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ  ＆  Ｆｒａｎｋｌｉｎ、１９７５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５：７４６〜７５３）およびｔ−ＴＧａｓｅ（Ｓｉｎｇｈａｌら、１９９７、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｍｅｄ．４５：５６７〜５７５）を含む、いくつかのＣＤＫインヒビター誘導タンパク質の発現が、生物老化に関連することが示された。
【００５９】
もっとも一般的に使用される、細胞老化のマーカーは、ＳＡ−β−ｇａｌ活性である（Ｄｉｍｒｉら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９３６３〜９３６７）。この遺伝子は、ＩＰＴＧ−処理ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞内で強く上昇する（Ｃｈａｎｇら、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：４８０８〜４８１８）。ＳＡ−β−ｇａｌは、リソソームのβ−ガラクトシダーゼの活性の増加および局在の変化を示すと示唆され（Ｄｉｍｒｉら、１９９５、上記）、他の研究により、老化細胞でのリソソーム活性の増加が記述された（Ｃｒｉｓｔｏｆａｌｏ  ＆  Ｋａｂａｋｉｊａｎ、１９７５、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖ．４：１９〜２８）。Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）、カテプシンＢ、酸性α−グルコシダーゼ、酸リパーゼＡおよびリソソームペプスタチン不感受性プロテアーゼを含む、５つのリソソーム酵素が表ＩＩにて見られる。ｐ２１はまた、ミトコンドリアタンパク質ＳＯＤ２、メタジンおよび２、４−ジエノイル−ＣｏＡリダクターゼに関する遺伝子をアップレギュレートし、これは、老化細胞内で過剰発現する異なるミトコンドリア遺伝子のレポートと関連する（Ｄｏｇｇｅｔｔら、１９９２、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖ．６５：２３９〜２５５、Ｋｏｄａｍａら、１９９５、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２１９：８２〜８６、Ｋｕｍａｚａｋｉら、１９９８、Ｍｅｃｈ．Ａｇｉｎｇ  Ｄｅｖ．１０１：９１〜９９）。
【００６０】
ひときわ、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７によって誘導されることを本発明者らが発見した多くの遺伝子の産物は、アルツハイマー病、アミロイド沈着症、アテローム性動脈硬化症および関節炎を含む、加齢関連疾患に関連してきた。したがって、ＡＰＰは、アルツハイマー病のアミロイドプラークの主要な成分である、β−アミロイドペプチドを生じさせる。補体Ｃ３（Ｖｅｅｒｈｕｉｓら、１９９５、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ．４２６：６０３〜６１０）およびＡＭＰデアミナーゼ（Ｓｉｍｓら、１９９８、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  １９：３８５〜３９１）もまた、アルツハイマー病で役割を果たすと示唆された。ｐ２１によってもっとも早く誘導され、細胞分化、発癌、アポトーシスおよび老化の多面的なメディエーターとして記述されてきた（Ｐａｒｋら、１９９９、Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．５４：Ｂ７８〜Ｂ８３）、ｔ−ＴＧａｓｅが、アルツハイマー病およびアミロイド沈着症の両方に関連したプラークの形成に関与することは、特に興味深い（Ｄｕｄｅｋ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９４、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６５１：１２９〜１３３）。後者の疾患は、他のＣＤＫインヒビター誘導遺伝子産物、ＳＡＡの沈着によるものであり、これはまた、アテローム性動脈硬化症、変形性関節炎および慢性関節リウマチに関連してきた（Ｊｅｎｓｅｎ  ＆  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：４８９〜５０３）。分泌タンパク質をアップレギュレートする２つの他のＣＤＫインヒビター、ＣＴＧＦおよびガレクチン３は、アテローム性動脈硬化症に関連する（Ｏｅｍａｒら、１９９７、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９５：８３１〜８３９、Ｎａｃｈｔｉｇａｌら、１９９８、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：１１９９〜１２０８）。さらに、カテプシンＢ（Ｈｏｗｉｅら、１９８５、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４５：３０７〜３１４）、ＰＡＩ−１（Ｃｅｒｉｎｉｃら、１９９８、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６３：４４１〜４５３）、フィブロネクチン（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ、１９９３、Ｓｅｍｉｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２２：３０７〜３１８）、ＧＡＬＮＳおよびＭａｃ−２結合タンパク質（Ｓｅｋｉら、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４１：１３５６〜１３６４）が、変形性関節炎および／または慢性関節リウマチに関連してきた。さらに、ＰＡＩ−１発現の増加のような、ＥＣＭタンパク質における老化関連変化が、皮膚および他の組織の構造における年齢特異的変質という結果となることが、提案された（Ｃａｍｐｉｓｉ、１９９８、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．３：１〜５）。加齢細胞によるフィブロネクチン生成の増加はまた、ＥＣＭにおけるフィブロネクチンネットワークの密度の増加を示唆し、これは、加齢個体における傷治癒が遅くなることに寄与する可能性がある（Ａｌｂｉｎｉら、１９８８、Ｃｏｌｌ．Ｒｅｌａｔ．Ｒｅｓ．８：２３〜３７）。
【００６１】
ｐ２１およびｐ２１誘導遺伝子はまた、糖尿病性腎症および慢性腎不全に関与してきた。Ｋｕａｎら（１９９８、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９：９８６〜９９３）は、ｐ２１が、糖尿病性腎症のインビトロモデルである、グルコース誘導メサンギウム細胞肥大の条件下で誘導されることを発見した。Ｍｅｇｙｅｓｉら（１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１：Ｆ１２１１〜１２１６）は、ｐ２１が、急性腎不全のいくつかの動物モデルにおいて、インビボで誘導され、このｐ２１誘導がｐ５３に依存しないことを示した。これらの発病過程におけるｐ２１の機能的役割については、Ａｌ−Ｄｏｕａｈｊｉら（１９９９、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５６：１６９１〜１６９９）によって、ｐ２１（−／−）マウスでは実験的糖尿病の条件下で、糸球体肥大が生じないことを発見した、ということが実証され、および、Ｍｅｇｙｅｓｉら（１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９６：１０８３０〜１０８３５）によって、ｐ２１（−／−）マウスにおいて、部分的腎臓切除の後に、慢性腎不全が生じないことを示した、ということが実証されてきている。注目すべきことに、Ｋｕａｎら（１９９８、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９：９８６−９９３）によって使用されたのと同様のインビトロモデルで研究をしている、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５８３０〜５８３４）は、メサンギウム細胞肥大が、ｐ２１によって誘導可能であると本明細書で示されているいくつかの遺伝子のアップレギュレーションに関与することを報告した。これらには、ＣＴＧＦ、フィブロネクチンおよびプラスミノーゲン活性化インヒビター１が含まれる。後者の研究はまた、ＣＴＧＦが、このモデル系で、メサンギウムマトリックス蓄積において、機能的役割を果たしていることを示した（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５８３０〜５８３４）。これらの結果は、腎不全の病因における、ｐ２１および遺伝子発現のｐ２１媒介誘導を示唆している。
【００６２】
特に興味深いものとして、ｐ２１は、ストレス耐性の増加および寿命のかなりの延長を示しているｐ６６（−／−）マウスで、酸化的障害を増強すると最近わかった（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：３０９〜３１３）遺伝子である、ｐ６６Ｓｈｃの発現を誘導する。これらの観察は、ｐ２１の遺伝子発現における効果が、多数の疾患の病因および哺乳動物の寿命の総合的な制限に関与する可能性を示唆している。
【００６３】
臨床試験中の主な新規種類の抗癌薬は、血管新生阻害物である。これらの薬剤は、腫瘍細胞を標的とはせず、間質毛細血管の増殖を標的とし、腫瘍分泌血管新生因子によって刺激される（最近の概説に関して、Ｋｅｒｂｅｌ、２０００、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２１：５０５〜５１５を参照のこと）。しかしながら、脈管構造は、腫瘍増殖に必要な唯一の間質要素ではない。多数の研究で、間質繊維芽細胞がまた、インビトロおよびインビボにて腫瘍細胞の増殖を支えること、および、正常および不死化繊維芽細胞が、腫瘍形成性を促進し癌腫細胞の死を阻害する、パラクリン因子を分泌することが示された（Ｇｒｅｇｏｉｒｅ  ａｎｄ  Ｌｉｅｕｂｅａｕ、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１４：３３９〜３５０；Ｃａｍｐｓら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：７５〜７９；Ｎｏｅｌら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６：２６７〜２７３；Ｏｌｕｍｉら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４５２５〜４５３０）。そのような因子は、繊維芽細胞ならし培地（Ｃｈｕｎｇ、１９９１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１０：２６３〜７４）および共生培養研究にて同定された。とりわけ、Ｏｌｕｍｉら（１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４５２５〜４５３０）は、正常の前立腺繊維芽細胞との、前立腺癌腫細胞の共生培養が、癌腫細胞死を非常に減少させ、異種移植腫瘍形成を促進する。繊維芽細胞のパラクリン効果はまた、初期前立腺上皮細胞に関して示されたように、発癌における腫瘍促進活性をも持つ（Ｏｌｕｍｉら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：５００２〜５０１１）。これらの結果にもかかわらず、腫瘍関連繊維芽細胞の、このパラクリン発癌活性および腫瘍刺激活性は、薬理学的介在の標的としてはまだ利用されてはこなかった。本発明は、そのような間質繊維芽細胞からのマイトジェン生成を阻害することが可能な化合物を検出し、同定するための方法を提供し、したがって、腫瘍細胞増殖を阻害する方法を提供する。
【００６４】
このパラクリン腫瘍促進活性は、最近、ｐ２１およびｐ１６の誘導を含む工程である、正常のヒト繊維芽細胞の複製老化の間に選択的に増加することが示された（Ｋｒｔｏｌｉｃａら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．４１、Ａｂｓ．４４８）。間質組織の腫瘍促進効果はまた、間質繊維芽細胞における高いｐ２１レベルを生成する処理（Ｍｅｙｅｒら、１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：５７９５〜５８０５）である、電離放射線によって誘導されるべき、マウス乳癌発癌モデルにおいても示された（Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ−Ｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｒａｖａｎｉ、２０００、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：１２５４〜６０）。これらの結果より、ｐ２１過剰発現細胞のならし培地において、本明細書で開示したパラクリン抗アポトーシス活性およびマイトジェン活性が、同一の生物学的現象を示す可能性があることが示唆された。
【００６５】
本明細書で開示した結果は、ＣＤＫインヒビター誘導が、癌または加齢関連疾患の発現の可能性を増加させうる方法にて、細胞遺伝子発現に影響を与えることを示唆している。ＣＤＫインヒビター発現の急上昇は、正常複製老化においてのみではなく、細胞損傷への応答においてもおこり、両方の場合で、ＣＤＫインヒビター誘導の望まない効果が、年齢依存的様式で蓄積すると予想される。
【００６６】
本明細書で開示した結果は、ＣＤＫインヒビター誘導がまた、異なるウイルス遺伝子のプロモーター機能を増加させることを示唆しており、したがって、ＣＤＫインヒビターの転写効果がまた、異なる型のウイルス感染およびその病因結果を促進することを示唆している。
【００６７】
したがって、本発明は、細胞老化の病因結果と関連した遺伝子、とりわけ老化の間に誘導される遺伝子、および、とりわけＣＤＫインヒビター発現によって誘導される遺伝子の誘導を阻害することが可能である化合物を同定するための方法を提供する。そのような化合物は、遺伝子発現のＣＤＫインヒビター媒介誘導におけるその効果によって、加齢関連疾患を予防、遅延または逆行させる能力を示すことが、予想される。そのような化合物はまた、ウイルス疾患を予防、処置、遅延または治療することが、予想される。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明は、ｐ２１、ｐ１６またはｐ２７のようなＣＤＫインヒビターによって誘導された遺伝子発現を阻害するための方法を提供する。好ましい実施形態において、そのような阻害は、細胞を、核因子カッパ−Ｂ（ＮＦκＢ）の活性、発現または核転座を阻害する、有効量の化合物と、接触させることによって達成される。ＮＦκＢ活性は少なくとも以下の３つの方法にて、細胞内で阻害されうることが、当業者によって理解されるであろう。第一に、ＮＦκＢヘテロダイマーを作り上げる遺伝子いずれかの、転写、プロセシングおよび／または翻訳のダウンレギュレーションまたは阻害；第二に、細胞内でのＩκＢ発現および／または活性の不活性化を阻害することに依存しうる、細胞質から核へのＮＦκＢの転座の阻害；第三に、ＮＦκＢそれ自身の活性の阻害。本発明は、これらの方法のいずれかまたはすべてにより、ＮＦκＢ活性を阻害し、そしてそれによってＣＤＫインヒビターによる遺伝子の誘導を阻害するための方法を含む。本技術分野で知られているＮＦκＢインヒビターの例には、Ｎ−複素環カルボキシイミド誘導体（たとえば、国際出願公開番号第ＷＯ０１／０２３５９号にて開示されたような）、アニリド化合物（たとえば、国際出願公開番号第ＷＯ００／１５６０３号にて開示されたような）、４−ピリミジノアミノインダン誘導体（たとえば、国際出願公開番号第ＷＯ００／０５２３４号にて開示されたような）、４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン誘導体（たとえば、日本国出願番号第ＪＰ１１１９３２３１号にて開示されたような）、キサンチン誘導体（たとえば、日本国出願番号第ＪＰ９２２７５６１号にて開示されたような）、カルボキシアルケニルベンゾキノンおよびカルボキシアルケニルナフトール誘導体（たとえば、日本国出願番号第ＪＰ７２９１８６０号にて開示されたような）、ジスルフィドおよびその誘導体（たとえば、国際出願公開番号第ＷＯ９９／４０９０７号にて開示されたような）、プロテアーゼインヒビター（たとえば、欧州出願公開番号第ＥＰ６５２２９０号にて開示されたような）、フルルビプロフェン、サリドマイド、デキサメタゾン、ピロリジンジチオカルバメート、ジメチルフマレート、メサリジン、ピモベンダン、スルファサラジン、メチルクロロゲナート、クロロメチルケトン、コハク酸アルファ−トコフェロール、テポキサリン、ならびに、アスピリン、サリチル酸ナトリウムおよびスリンダクを含む、特定の非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）が含まれる。
【００６９】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態をさらに例示するためであり、事実上は制限しているのではない。
【００７０】
実施例１  誘導可能なｐ２１遺伝子を含む哺乳動物細胞の生成
ヒト繊維肉腫細胞株ＨＴ１０８０  ｐ２１−９の組換え誘導体を、Ｃｈａｎｇら（１９９９、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：４８０８〜４８１８、本明細書で参考文献にて組み込まれている）に基本的にしたがって、生成した。この細胞株は、イソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって制御されたプロモーターの転写制御下で、ｐ２１コード配列を含んだ。ｐ２１の発現は、十分な量のＩＰＴＧの存在下でこれらの細胞を培養し、それによって、内因性ｐ２１遺伝子の誘導が誘発されうる任意のさらなる効果がない状態で、ｐ２１発現の結果（ｓｅｑｕｅｌｌａｅ）を研究可能にすることで、誘導可能である。この細胞株は、２０００年４月６日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｕ．Ｓ．Ａ．に委託され、受け入れ番号ＰＴＡ１６６４を付与された。
【００７１】
簡単に記すと、マウスのエコトロピックレトロウイルスレセプターを発現しているＨＴ１０８０のサブライン、および、プラスミド３’ＳＳ（ストラタジーン）（Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｒｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６、Ｇｅｎｅ  ３３：７０３〜７０９に記述された、参考文献にて組み込まれている）によってコードされた改変細菌ｌａｃＩリプレッサーを、組換えレトロウイルスＬＮｐ２１ＣＯ３を含むレトロウイルス粒子に感染させた。その構造は図１に示している。このレトロウイルスベクターは、レトロウイルス長末端繰り返しプロモーターの転写制御下で、細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含む。ｐ２１コード配列を、改変ヒトサイトメガロウイルスプロモーターの制御下、ｎｅｏ遺伝子の転写方向と逆方向でクローン化する。とりわけ、ＣＭＶプロモーターは、プロモーターからの発現を、細胞内で発現したｌａｃＩリプレッサーに対して感受性にする、細菌ｌａｃオペレーター配列の三倍繰り返しを含む。ＬＮｐ２１ＣＯ３は、親ベクター、ＬＮＸＣＯ３（Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｒｏｎｉｎｓｏｎ、上記にて開示された）のＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩ部位内に、ｐ２１コード配列を含む４９２ｂｐのＤＮＡ断片をクローン化することにより、構築された。
【００７２】
感染の後、ＬＮｐ２１ＣＯ３Ｘベクターに感染させた細胞は、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＢＲＬ−ＧＩＢＣＯ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤより得た）の存在下で細胞を培養することにより、選別された。クローン株ＨＴ１０８０  ｐ２１−９は、形質導入されたＬＮｐ２１ＣＯ３、Ｇ４１８耐性細胞株から、クローン細胞株が得られるまで終点希釈することにより、誘導された。
【００７３】
実施例２  細胞増殖アッセイ
実施例１にて記述したようにして生成したＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞を、細胞増殖アッセイにて使用し、ｐ２１が細胞内で発現したときに、細胞増殖にどのような変化が起こるか、を決定した。
【００７４】
ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞中のＬＮｐ２１ＣＯ３ベクターからのｐ２１発現は、前記細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）およびＩＰＴＧを含むＤＭＥＭ培地中で培養することによって、誘導された。これらのアッセイの結果を図２Ａおよび２Ｂに示している。図２Ａは、５０μＭ  ＩＰＴＧの存在下で培養した細胞内での、ｐ２１タンパク質生成の時間経過を示している。ｐ２１遺伝子発現は、増殖培地内にＩＰＴＧを導入した後６〜１２時間の間で増加し、その発現は、誘導後約２４時間の時点でピークとなった。ＩＰＴＧ含有培地から細胞を除去すると、ｐ２１発現が、上昇したのとほぼ同様に急速に減少し、ＩＰＴＧ除去後約２４時間の時点で、誘導前のレベルにまで戻った（図２Ｂ）。
【００７５】
ＩＰＴＧの存在下での細胞増殖を、３つの方法でアッセイした：３Ｈ−チミジン取り込み（「標識指標」と表記）、培地中の有糸分裂細胞数の顕微鏡による観察（「有糸分裂指標」と表記）、および、細胞周期の異なる部分での、培養細胞の分布の決定（「細胞周期分布」と表記）。
【００７６】
３Ｈ−チミジン取り込みアッセイを、実質上、Ｄｉｍｒｉら（１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：９３６３〜９３６７）によって記述されたように実施した。細胞を、３時間、３Ｈ−チミジンの存在下で培養し、ついで、オートラジオグラフィーによって解析した。ＤＮＡ複製は、培養培地へのＩＰＴＧの添加後９時間までで完全に停止される、オートラジオグラフィーによって決定された。有糸分裂指標は、顕微鏡で細胞を観察し、５μｇ／ｍｌの４、６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いた染色後、有糸分裂の細胞数を計算することにより決定され、そして、イメージは、ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭＩＲＢ蛍光顕微鏡およびＶａｙｔｅｋ（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、Ｉｏｗａ）イメージングシステムを用いて回収された。顕微鏡で検出可能な有糸分裂細胞は、ＩＰＴＧ処理の１４時間までに、これらの培養物から消失した。
【００７７】
細胞周期分布を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｏｒｔを用いて、Ｊｏｒｄａｎら（１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５６：８１６〜８２５）によって記述されたように、ヨウ化プロピジウムで染色した後に、ＤＮＡ含量のＦＡＣＳ解析を用いて、決定した。細胞周期分布は、ＩＰＴＧ処理の２４時間後に安定した。このときまでに、４２〜４３％のＩＰＴＧ処理細胞が、それぞれＧ１およびＧ２で停止し、約１５％の細胞が、Ｓ期ＤＮＡ含量にて停止した。ＩＰＴＧ処理ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞もまた、形態学的老化マーカー（形態の拡大および平坦化、ならびに粒度の増加）を発達させ、同様に、ＳＡ−β−ｇａｌ活性を発達させた（Ｃｈａｎｇら、１９９９、上記）。これらの結果は、ｐ２１の誘導発現が、細胞周期停止、および、細胞老化に特徴的な、他の種々の変化の両方を生じることを示唆している。
【００７８】
実施例３  ｐ２１遺伝子発現によって媒介される遺伝子発現の解析
実施例２にて開示された結果は、ｐ２１誘導の形態学的および細胞周期結果は、遺伝子発現における多数の変化を反映している可能性があることを示唆していた。細胞遺伝子発現におけるｐ２１誘導の効果を以下のように試験した。
【００７９】
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、未処理ＨＴ１０８０ｐ２１−９細胞、および、５０μＭ  ＩＰＴＧで３日間処理した細胞から単離した。ｃＤＮＡをポリ（Ａ）＋ＲＮＡより調製し、４、０００以上の配列が実証された既知のヒト遺伝子および３、０００ＥＳＴｓを含む、Ｈｕｍａｎ  ＵｎｉＧＥＭ  Ｖ  ｃＤＮＡマイクロアレイ（ゲノム  システムズ社（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）での特異的なハイブリッド形成のためのプローブとして使用した。２、５００を超える遺伝子およびＥＳＴｓが、未処理およびＩＰＴＧ−処理ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞の両方からのプローブによって、測定可能なハイブリッド形成シグナルを示した。平衡ディファレンシャル発現（ｂａｌａｎｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）≧２．５にてダウンレギュレートされたか、または、平衡ディファレンシャル発現≧２．０にてアップレギュレートされた遺伝子は、それぞれ表ＩおよびＩＩに列記されている。
【００８０】
６９のこれらの遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンハイブリダイゼイションによって個々に試験した。ＲＴ−ＰＣＲ解析を、基本的にＮｏｏｎａｎら（１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７１６０〜７１６４）によって記述されたように実施した。ノーザンハイブリダイゼイションに対するプローブは、マイクロアレイ中に存在するｃＤＮＡクローンの挿入物に由来し、これらのｃＤＮＡは、ゲノムシステムズ社より得た。さらに、いくつかのｐ２１−調節遺伝子産物の発現における変化を、免疫ブロッティングによって解析した。以下の第一抗体を、免疫ブロッティングのために使用した：Ｃｄｃ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、サイクリンＡ（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ）、Ｐｌｋ１（Ｚｙｍｅｄ）およびＲｂ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に対するマウスモノクローナル抗体；ＭＡＤ２（ＢａｄＣｏ）、ｐ１０７（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＣＴＧＦ（Ｆｉｓｐ−１２；Ｄｒ．Ｌ．Ｌａｕより頂いた）、Ｐｒｃ１（Ｄｒ．Ｗ．ＪｉａｎｇおよびＤｒ．Ｔ．Ｈｕｎｔｅｒより頂いた）、およびトポイソメラーゼＩＩα（Ａｂ０２８４、Ｄｒ．Ｗ．Ｔ．Ｂｅｃｋより頂いた）に対するウサギポリクローナル抗体、および、ＳＯＤ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に対するヒツジポリクローナル抗体。使用したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−共役第二抗体は、ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）およびウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ＫＰＬ）であった。すべての試料中のタンパク質濃度を、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキットで測定した後に、均一にした。免疫ブロッティングを、標準の手順にて実施し、シグナルを、ＬｕｍｉＧｌｏ（ＫＰＬ）を用いて化学ルミネッセンスにより検出した。
【００８１】
これらの結果は、図３Ａから図３Ｃにて示している。上記のマイクロアレイアッセイによって予想された遺伝子発現の変化が、３８／３９ダウンレギュレート遺伝子および２７／３０アップレギュレート遺伝子に関して確認された。試験した遺伝子のほとんどに関する、ノーザンハイブリダイゼイションまたはＲＴ−ＰＣＲにおける、観察されたシグナルの差違（図３Ａ〜３Ｃ）は、ｃＤＮＡアレイ（表ＩおよびＩＩ）から決定された平衡ディファレンシャル発現の値よりも、より高いことが明らかになり、このことは、ｃＤＮＡアレイハイブリッド形成が、遺伝子発現におけるｐ２１効果の程度を過小評価する傾向にあることを示唆している。６つのダウンレギュレートされた遺伝子および４つのアップレギュレートされた遺伝子の発現における変化はまた、免疫ブロッティング（図３Ｂ）またはザイモグラフィー（示していない）によってタンパク質レベルで試験され、試験したすべての場合で確認された。
【００８２】
遺伝子発現におけるｐ２１−媒介変化が、ｐ２１誘導細胞増殖停止の次にくる、短期効果および長期効果からなることが認識された。この目的のために、ＩＰＴＧの添加および除去後のｐ２１−阻害遺伝子（図３Ｂ）およびｐ２１−誘導遺伝子（図３Ｃ）のサブセットのＲＮＡレベルにおける変化の時間経過を決定した。免疫ブロッティングを、（電気泳動移動度によって示されたような）Ｒｂリン酸化における、および、ｃＤＮＡアレイにしたがってｐ２１によって阻害されるＲｂおよびいくつかのタンパク質の細胞レベルにおける、ｐ２１誘導変化の時間経過を解析するために使用した。これらの結果を図３Ｂに示している。Ｒｂは、ＩＰＴＧ添加後、６時間ほどで脱リン酸化されるようになることがわかった。さらに、Ｒｂタンパク質レベルは、１２〜２４時間の間で急激に減少し（図３Ｂにて示されている）、しかし、ＲＢ  ｍＲＮＡレベルにおいては何の変化も検出されなかった（データは示していない）。同様の減少が、Ｒｂ関連タンパク質ｐ１０７に関して観察された（図３Ａにて示されている）。
【００８３】
１．ｐ２１によって阻害される遺伝子発現
すべての試験したｐ２１阻害遺伝子は、ｐ２１誘導および放出に対して迅速な応答を示した。これらの遺伝子のうち５つ（トポイソメラーゼＩＩα、ＯＲＣ１、ＰＬＫ１、ＰＲＣ１およびＸＲＣＣ９）は、ＩＰＴＧ添加後、４〜８時間の間で、ＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で、有意な阻害を示した（図３Ｂ）。このパターンは、「即時型応答（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」と表現されてきており、細胞増殖停止の速度論と、Ｒｂ脱リン酸化の速度論に並行する。他のｐ２１阻害遺伝子（ＣＤＣ２またはＤＨＦＲのような）は、ＤＮＡ複製および有糸分裂の停止にわずかに遅れる、「早期応答（ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」パターンを示し、ＩＰＴＧ添加後わずか１２時間のみで検出することができる、ｍＲＮＡレベルが大きく減少した。しかしながら、すべてのｐ２１阻害遺伝子は、細胞がいまだに増殖停止していた場合に、および、ＤＮＡ複製および有糸分裂の再開の前に、ＩＰＴＧの除去後１２〜１６時間、その発現が再開した（図３Ｂ）。この解析により、ｐ２１阻害遺伝子の発現における変化が、ｐ２１誘導および放出の短期効果であって、細胞増殖停止および回復の結果ではなかったことを示唆している。
【００８４】
要約すると、６９個の遺伝子および３個のＥＳＴｓが、ｐ２１誘導細胞内でダウンレギュレートされたとして、２．５〜１２．６の平衡ディファレンシャル発現で、ｃＤＮＡマイクロアレイによって同定された（表ＩＡ）；細胞周期進行に関連し、ＩＰＴＧ処理細胞においてダウンレギュレートされたとして、本発明者らの分離アッセイによって同定された、５つのさらなる遺伝子を表ＩＢに列記している。ｃＤＮＡアレイによって同定されたダウンレギュレートされた遺伝子（６９のうち４３）の著しく高い画分が、有糸分裂、ＤＮＡ複製、分離および修復およびクロマチンアセンブリに関連し、このことは、遺伝子発現のｐ２１媒介阻害の、非常に選択的な特性を示唆している。
【００８５】
ｐ２１−ダウンレギュレート遺伝子のもっとも大きな群は、有糸分裂のシグナル伝達、実行および制御に関与しているものである。多くのｐ２１阻害遺伝子は、ＤＮＡ複製および分離、クロマチンアセンブリおよびＤＮＡ修復に関連している。これらの遺伝子のいくつかが、ヌクレオチド生合成に関連する酵素をコードしており、他のタンパク質はＤＮＡ複製に関連している。いくつかのｐ２１−阻害遺伝子は、ＤＮＡ修復に関連している。これらの結果は、治療的介在のための標的であり得る、ｐ２１誘導増殖停止の細胞プログラムの成分を発見するための機会を示唆している。
【００８６】
２．ｐ２１によって誘導される遺伝子発現
ｐ２１発現によって抑制される遺伝子に加えて、上記アッセイは、ｐ２１によって誘導される遺伝子を検出した。ｐ２１誘導遺伝子の遺伝子発現のパターンを図３Ｃに示している。ｐ２１阻害遺伝子に対して、ｐ２１アップレギュレート遺伝子は、その発現を、ＩＰＴＧ添加後、すなわちすべての細胞における増殖停止の開始後、わずか４８時間のみで増加させた。試験した遺伝子のただ一つ、組織トランスグルタミナーゼ（ｔ−ＴＧａｓｅ）が、ＩＰＴＧの添加後１２時間で検出可能な増加を示したが、その発現は、わずか４８時間までには最大に達した（図３Ｃにて示されている）。さらに、すべての試験した遺伝子（ｔ−ＴＧａｓｅ以外）の発現の上昇が、ＩＰＴＧからの放出後少なくとも３日間、細胞周期の回復のかなり後において、持続した（示していない）。この「遅延応答（ｌａｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」速度論は、そのような遺伝子のｐ２１誘導が、ｐ２１媒介増殖停止に関連した、遅延効果であることを示唆した。
【００８７】
４８の既知の遺伝子および６つのＥＳＴｓまたは未知の機能を持つ遺伝子が、２．０〜７．８の平衡ディファレンシャル発現で、ｐ２１誘導細胞内でアップレギュレートされたとして、同定された（表ＩＩ）。この群中の、非常に高い画分（２０／４８）の同定可能な遺伝子は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（たとえばフィブロネクチン１、ラミニンα２、Ｍａｃ−２結合タンパク質）、他の分泌タンパク質（たとえばアクチビンＡ、結合組織増殖因子、血清アミロイドＡ）、またはＥＣＭレセプター（インテグリンβ３のような）をコードしている。これらの分泌タンパク質のいくつか、ならびに大きな群のｐ２１誘導細胞内タンパク質（表ＩＩ）が、異なる形態のストレス応答にて誘導されること、または、ストレス関連シグナル伝達において役割を果たすことが、知られている。注目すべきことに、ｐ２１によって誘導されることがわかった多くの遺伝子がまた、細胞老化、生物加齢、または、異なる加齢関連疾患においてアップレギュレートされ、このことは、ｐ２１媒介遺伝子誘導の抑制が、そのような疾患の発生を予防するための方法を提供しうることを示唆している。以下の実施例５にて開示されるように、いくつかのｐ２１誘導遺伝子は、パラクリン抗アポトーシス活性およびマイトジェン活性を持つ分泌因子をコードしており、ｐ２１誘導細胞からのならし培地が、ｐ２１アップレギュレート遺伝子の特性から予測される２つの生物学的効果、すなわち、細胞増殖の刺激およびアポトーシスの抑制を示している。この発見は、ｐ２１の「パラクリン」効果が、近接細胞における腫瘍促進効果を介して、発癌に関与する可能性があることを示唆している。このことは、ｐ２１媒介遺伝子誘導の抑制がまた、抗発癌効果を達成するための方法を提供する可能性を上昇させる。
【００８８】
実施例４  ＩＰＴＧ処理および血清飢餓ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞と比較することによる、ｐ２１誘導の特異性の同定
細胞増殖停止の結果である可能性のある、細胞遺伝子発現におけるｐ２１誘導変化の同定を、以下のように決定した。
【００８９】
増殖停止（休止）は、細胞を、血清フリー培地中で４日間培養することにより生成した血清飢餓によって、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞中で誘導された。血清飢餓細胞内では、ＩＰＴＧ処理ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞とは違い、細胞は、老化形態を発達させず、ただ非常に弱いＳＡ−β−ｇａｌ発現を示した。血清飢餓細胞内でのｐ２１レベルは、ＩＰＴＧ処理細胞内で見られる１５〜２０倍の増加に対して、ただ約２倍増加した。図３Ｄは、血清フリー培地中で４日後、または５０μＭ  ＩＰＴＧの存在下３日後に増殖停止した、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞中のｐ２１−阻害遺伝子およびｐ２１−誘導遺伝子の群の発現の、上述したように実施したＲＴ−ＰＣＲ解析を示している。培養培地が５０μＭ  ＩＰＴＧを含んだ場合に、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞内で完全に阻害された遺伝子はまた、血清飢餓細胞においても阻害されたが、しかし、これらの遺伝子のほとんどは、ＩＰＴＧ処理細胞内においてよりも、より低い程度に阻害された。
【００９０】
その発現がｐ２１によって誘導される遺伝子は、３つの異なるパターンを示した。第一の群は、その発現が、老化細胞においてと同様に強く、停止細胞において誘導される、遺伝子である。これらには、ガレクチン−３、スーパーオキシドジスムターゼ２、補体Ｃ３およびプロサポシンが含まれ、このことは、その誘導が、細胞増殖停止の結果であること、または、そのような遺伝子は、わずかに上昇したｐ２１レベルに非常に感受性であったことを示唆している。第二の群は、停止細胞においてアップレギュレートされたが、しかし、老化細胞内においてと同様の強さではない遺伝子である。これらの遺伝子には、フィブロネクチン−１、Ｍａｃ２結合タンパク質およびアルツハイマー前駆タンパク質血清アミロイドＡが含まれる。第三の群は、停止細胞では検出可能なほど誘導されないが、老化細胞で強く誘導されている、遺伝子である。これらの遺伝子には、ＣＴＧＦ、プラスミノーゲン活性剤インヒビター１、組織トランスグルタミナーゼまたはナチュラルキラー細胞マーカータンパク質ＮＫ４、インテグリンβ３およびアクチビンＡが含まれる。
【００９１】
ｐ２１のＩＰＴＧ誘導過剰発現を介した、血清飢餓および細胞老化による、停止の誘導に対する特定の遺伝子の応答の間の差違が、これらの遺伝子を、老化の診断マーカーとして同定した。さらに、新規の老化マーカーが、ｐ２１発現細胞および停止細胞間でのその発現を比較することによって、同定可能である。
【００９２】
実施例５  マイトジェン因子を含む、ならし培地の生成とマイトジェン活性アッセイ
いくつかのｐ２１アップレギュレート遺伝子（表ＩＩ）は、ＣＴＧＦ（Ｂｒａｄｈａｍら、１９９１、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１４：１２８５〜１２９４）、アクチビンＡ（Ｓａｋｕｒａｉら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４１１８〜１４１２２）、エピセリン／グラニュリン（Ｓｈｏｙａｂら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７９１２〜７９１６）およびガレクチン−３（Ｉｎｏｈａｒａら、１９９８、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４５：２９４〜３０２）を含む、増殖因子として作用する分泌タンパク質をコードしている。さらに、ガレクチン−３（Ａｋａｈａｎｉら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：５２７２〜５２７６）およびプロサポシン（Ｈｉｒａｉｗａら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４７７８〜４７８１）が、抗アポトーシス活性を持つことが示された。パラクリン抗アポトーシス活性またはマイトジェン活性はまた、ｃＤＮＡマイクロアレイハイブリッド形成における、その平衡ディファレンシャル発現値が１．８〜１．９であるので、表ＩＩで列記されていないいくつかのｐ２１誘導可能遺伝子産物に関しても報告されてきた。これは、本発明者が、この表の中に含めるために、またはＲＴ−ＰＣＲによって確認するために使用した、任意に選択した最小値２．０より低い。これらのタンパク質は、クラステリン（Ｋｏｃｈ−Ｂｒａｎｄｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎｓ、１９９６、Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｓｕｂｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１３０〜１４９）、プロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）（Ｙａｍａｕｃｈｉら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０３：５９１〜５９８）、血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）（Ｊｏｕｋｏｖら、１９９６、ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：２９０〜２９８）、ゲルソリン（Ｏｈｔｓｕら、１９９６、ＥＭＢＯ  Ｊ  １６：４６５０〜４６５６）およびメタロプロテイナーゼ−１の組織インヒビター（ＴＩＭＰ−１）（Ｌｉら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：６２６７〜６２７５）である。
【００９３】
ｐ２１による分泌マイトジェン因子および抗アポトーシス因子の誘導を確認するために、ＩＰＴＧ処理ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞からのならし培地を、細胞増殖およびアポトーシスにおいて効果を有するかどうかを調査するために試験した。これらの実施形態において、ならし培地を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳの存在下で、１５ｃｍプレートあたり１０６ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞をプレーティングすることにより、調製した。次の日、ＩＰＴＧを５０μＭの最終濃度で加え、この培地を３日後に、０．５％ＦＣＳおよび５０μＭ  ＩＰＴＧを添加したＤＭＥＭで置換した。２日後（ＩＰＴＧ処理の３〜５日目）に、このならし培地を回収し、使用前１５日まで、４℃にて保存した。コントロール培地を、ＩＰＴＧ処理細胞と同様の密度まで増殖した未処理細胞に、ＩＰＴＧフリーＤＭＥＭ／０．５％ＦＣＳを加えることにより、および、その２日後に培地を回収することにより、調製した。
【００９４】
遅増殖ヒト繊維肉腫細胞株ＨＳ１５．Ｔを使用して、これらのならし培地中でのマイトジェン活性を検出した。マイトジェン活性アッセイに関して、両方の型のならし培地、ならびに、新鮮な培地、ならびに、ならし培地および新鮮な培地の１：１混合物を使用して、マイトジェン活性を試験した。これらの実験において、ならし培地に、１％または２％ＦＣＳを加えた。簡単に記すと、ＨＳ１５．Ｔ細胞を、1ウェルあたり１５、０００細胞にて、１２ウェルプレートにまいた。２日後、これらの細胞を異なる型の培地中で培養した。細胞を、６０時間ならし培地で培養し、３．１３μＣｉ／ｍｌの濃度での３Ｈ−チミジンを加え、２４時間インキュベートした。ついで細胞を回収し、その３Ｈ−チミジン取り込みを、Ｍｏｓｃａら（１９９２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４３７５〜４３８３）によって記述されたように測定した。
【００９５】
新鮮な培地へのＩＰＴＧの添加は、このアッセイでは何の効果もなかった。未処理ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞からの、新鮮な培地およびならし培地における細胞増殖間で、有意な差はなかった。対照的に、ＩＰＴＧ処理細胞からのならし培地は、３倍まで３Ｈ−チミジン取り込みが増加した。ＩＰＴＧ処理細胞からのならし培地によるＨＳ１５．Ｔの増殖刺激もまた、メチレンブルー染色によって検出可能であった。
【００９６】
アポトーシスにおけるこのならし培地の効果もまた測定した。これらの実験では、マウス胎児繊維芽細胞株Ｃ８を用い、Ｅ１Ａによって不死化した。この細胞株は、血清飢餓（Ｌｏｗｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０２６〜２０３０）を含む、異なる刺激によって誘導されたアポトーシスに対して非常に感受性である（Ｌｏｗｅら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：８０７〜８１０；Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、１９９６、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３：１７０９〜１７１９）。アポトーシスは、６ｃｍプレートあたり３×１０５Ｃ８細胞をまき、そして、次の日に、０．４％血清を添加した新鮮な培地で、または、ならし培地（新鮮な血清は加えない）で、前記培地を置換することにより、解析された。ＤＮＡ含量解析およびＤＡＰＩ染色を、２４時間後および４８時間後に実施し、関連する細胞の数を、低血清培地中で、４８時間後に、メチレンブルー染色（Ｐｅｒｒｙら、１９９２、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２７６：１８９〜１９７）によって測定した。
【００９７】
低血清の新鮮な培地、または、ＩＰＴＧ処理または未処理細胞からのならし培地の添加は、ＤＡＰＩ染色後に大部分の細胞にて検出可能な、細胞分離およびアポトーシス形態によって証明されたように（示していない）、Ｃ８細胞においてアポトーシスを急速に誘導した。しかしながら、ＩＰＴＧ処理細胞からのならし培地は、４８時間後に結合したままであった細胞のメチレンブルー染色によって測定されたように、新鮮な培地および未処理細胞からのならし培地と比較して、細胞生存を強く増加させた。ｐ２１誘導細胞からのならし培地の効果は、培地交換の２４時間後および４８時間後、結合および浮遊Ｃ８細胞を併せて実施した、細胞ＤＮＡ含量のＦＡＣＳ解析によって、いっそうより明らかであった。多くの他の細胞株と違って、Ｃ８細胞のアポトーシスは、少ない（ｓｕｂ−Ｇ１）量のＤＮＡを持つ少しの細胞のみを生成し、Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ含量を持つ細胞の選択的な消失によって特徴づけられる（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、１９９６、上記）。ＩＰＴＧ処理細胞からのならし培地における血清飢餓細胞は、Ｇ２／Ｍ画分を保持し、血清リッチな培地中で増殖しているコントロール細胞に似ている、細胞周期プロファイルを示した。それ自身によるＩＰＴＧの添加は、Ｃ８細胞におけるアポトーシスにおいて何の効果もなかった。したがって、ＨＴ１０８０細胞中のｐ２１誘導は、ｐ２１−非調節遺伝子の性質によって予想されるように、結果として、マイトジェン因子および抗アポトーシス因子の分泌となる。
【００９８】
実施例６  誘導可能なｐ１６Ｉｎｋ４Ａまたはｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子を含む哺乳動物細胞の生成
誘導可能なＣＤＫインヒビターｐ１６Ｉｎｋ４Ａ（ＣＤＫ４／６を選択的に阻害する；Ｓｅｒｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  １６、７０４〜７０７、１９９３）、またはｐ２７Ｋｉｐ１（ＣＤＫ２を選択的に阻害する；Ｂｌａｉｎら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５８６３〜２５８７２）を含む哺乳動物細胞株を、誘導可能なｐ２１含有細胞株の生成のために実施例１で記述しように、一般的に生成した。細菌ｌａｃＩ遺伝子をコードし、および、マウスのエコトロピックレトロウイルスレセプターを発現している、組換え発現構築物を含むヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株の組換え誘導体（ＨＴ１０８０  ３’ＳＳ６；Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｒｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６、Ｇｅｎｅ  １８３：１３７〜１４２）を使用して、誘導可能株を作製した。ｐ１６の誘導可能発現に関して、ヒトｐ１６の４７１ｂｐコード配列を含んでいるＤＮＡ断片を（参考文献にて組み込まれている、米国特許第５、８８９、１６９号にて記述されているような）、ＩＰＴＧ調節レトロウイルスベクターＬＮＸＲＯ２（Ｃｈａｎｇ  ＆  Ｒｏｎｉｎｓｏｎ、１９９６、Ｇｅｎｅ  １８３：１３７〜１４２）内にクローン化した。このレトロウイルスベクターは、レトロウイルス長末端繰り返しプロモーターの転写制御下で、細菌ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含み、Ｇ４１８（ＢＲＬ−ＧＩＢＣＯ）を用いて選別可能である。結果として得られたＬＮｐ１６ＲＯ２と称する構築物を、図４にて概略的に描いた。ｐ２７の誘導可能発現に関しては、同様のＬＮＸＲＯ２ベクター中にマウスｐ２７  ｃＤＮＡ（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿００９８７５）を持つ、ベクターＬＮｐ２７ＲＯ２が、Ｋｏｋｏｎｔｉｓら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２：９４１〜９５３によって開発および記述され、Ｄｒ．Ｎ．Ｈａｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｃｈｉｃａｇｏ）によって本発明者らに提供された。
【００９９】
ＬＮｐ１６ＲＯ２およびＬＮｐ２７ＲＯ２構築物を、従来のレトロウイルス感染方法を用いて、個々に、ＨＴ１０８０  ３’ＳＳ細胞内に導入した。感染細胞を、４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＢＲＬ−ＧＩＢＣＯより入手）の存在下で細胞を培養することによって、選別した。ＬＮｐ１６ＲＯ２形質導入細胞のＧ４１８選別集団を、ＨＴ１０８０／ＬＮｐ１６ＲＯ２と命名した。この細胞集団を、２０００年１０月１０日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに委託し、受け入れ番号ＰＴＡ−２５８０を得た。
【０１００】
この細胞集団をサブクローン化し、２０個のクローン細胞株を単離し、ＩＰＴＧ誘導増殖阻害に関して試験した。もっとも強い増殖阻害を示している細胞株をＨＴ１０８０  ｐ１６−５と命名した。この細胞株を、２００２年１月３１日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに委託し、受け入れ番号ＰＴＡ−４０２０を得た。図５Ａは、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加におけるＨＴ１０８０  ｐ１６−５細胞の細胞周期分布の変化を示している。異なる細胞周期の位相の細胞画分を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｏｒｔを用いて、Ｊｏｒｄａｎら（１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：８１６〜８２５）によって記述されたように、ヨウ化プロピジウムによる染色の後、ＤＮＡ含量のＦＡＣＳ解析を用いて測定した。細胞周期分布は、ＩＰＴＧ処理の２４時間後に安定化し、その時間までに、９３％のＩＰＴＧ処理細胞がＧ１で停止した。そのようなＧ１停止は、ｐ１６によるＣＤＫ４／６の阻害から予想される。
【０１０１】
同様に、ＬＮｐ２７ＲＯ２形質導入細胞のＧ４１８選別集団をサブクローン化し、３８個のクローン細胞株を単離し、ＩＰＴＧ誘導増殖阻害に関して試験した。もっとも強い増殖阻害を示している細胞株をＨＴ１０８０  ｐ２７−２と命名した。この細胞株を、２００２年１月３１日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに委託し、受け入れ番号ＰＴＡ−４０２１を得た。図５Ｂは、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加におけるＨＴ１０８０  ｐ２７−２細胞の細胞周期分布の変化を示している。細胞周期分布は、ＩＰＴＧ処理の２４時間後に安定化し、その時間までに、８９％のＩＰＴＧ処理細胞がＧ１で停止した。そのようなＧ１停止は、ｐ１６によるＣＤＫ４／６の阻害から予想される。
【０１０２】
実施例７  ｐ２１誘導可能遺伝子の発現におけるｐ１６およびｐ２７の効果
実施例６で記述したようにＩＰＴＧにて誘導可能なｐ１６またはｐ２７遺伝子をもつ、ＨＴ１０８０誘導体、ＨＴ１０８０  ｐ１６−５およびＨＴ１０８０  ｐ２７−２を、以下のように、遺伝子発現アッセイにて使用した。
【０１０３】
ＲＮＡをこれらの細胞株より得、３日間、５０μＭ  ＩＰＴＧの存在下または不存在下で培養した。ついでこれらのＲＮＡ試料を、β２−ミクログロブリンのかわりにβ−アクチンを正規化のために使用したことをのぞいて、基本的に実施例３にて上述したように実施されるＲＴ−ＰＣＲにて使用した。ｐ２１によって誘導されると上記に示された１８個の遺伝子を、これらの細胞のＩＰＴＧ処理によって誘導されたｐ１６またはｐ２７遺伝子発現の効果に関して、解析した。試験した遺伝子には、誘導ｐ２１発現に関して上述したように、アルツハイマー病、アミロイド沈着症、関節炎、アテローム性動脈硬化症およびパラクリンアポトーシスおよびマイトジェン効果に関連した遺伝子が含まれた。ｐ１６に関する結果を図６Ａに、ｐ２７に関する結果を図６Ｂに示している。すべての試験したｐ２１誘導遺伝子はまた、ＩＰＴＧ誘導ｐ１６発現によって誘導され、試験した遺伝子のほとんどすべて（ｔ−ＰＡおよびＣＴＧＦを除く）もまたｐ２７によって誘導された。図６にて示した結果もまた、ｐ１６またはｐ２７発現が、ｐ２１発現における効果を検出しなかったことを示している。
【０１０４】
実施例８  ｐ２１応答性プロモーターによって発現したレポーター遺伝子を含む組換え発現構築物の生成
プロモーターレポーター構築物を、以下のように、ＮＫ４、ＳＡＡ、補体Ｃ３（ＣＣ３）、プロサポシン、βＡＰＰおよびｔ−ＴＧａｓｅを含む、いくつかのｐ２１誘導可能ヒト遺伝子のプロモーターより調製した。ＣＣ３遺伝子のプロモーター領域を、ＣＣ３  ｃＤＮＡ（Ｖｉｋら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１０８０〜１０８５）の５’末端に隣接したものとして、ヒトゲノム配列内で同定した（ＮＣＢＩ受け入れ番号Ｍ６３４２３．１号）。ＮＫ４遺伝子のプロモーター領域を、ＮＫ４  ｃＤＮＡ（受け入れ番号Ｍ５９８０７号）の５’末端に隣接したものとして、ヒトゲノム配列内で同定した（受け入れ番号第ＡＪ００３１４７号）。先に記述されたＳＡＡ遺伝子のプロモーター（Ｅｄｂｒｏｏｋｅら、１９８９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９：１９０８〜１９１６）を、ヒトゲノム配列内で同定した（受け入れ番号第Ｍ２６６９８号）。βＡＰＰ遺伝子のプロモーター領域を、βＡＰＰ  ｃＤＮＡ（受け入れ番号第ＸＭ００９７１０号）の５’末端に隣接したものとして、ヒトゲノム配列中に同定した（受け入れ番号第Ｘ１２７５１号）。ｔ−ＴＧａｓｅ遺伝子のプロモーター領域を、ｔ−ＴＧａｓｅ  ｃＤＮＡ（受け入れ番号第Ｍ５５１５３号）の５’末端に隣接したものとして、ヒトゲノム配列内で同定した（受け入れ番号第Ｚ４６９０５号）。プロモーター特異的ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を、鋳型としてＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞からのゲノムＤＮＡを用いて、実施した。ＰＣＲを、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）および表ＩＩＩａにて列記したプライマーセットを用いて実施した。各プライマーセットに対するＰＣＲ条件を表ＩＩＩｂにて記述している。本実施例に開示されたように使用した遺伝子プロモーターを含む、ＣＤＫインヒビターによって誘導されたいくつかの遺伝子からのプロモーター配列の増幅のための、プライマーセットを表ＩＩＩｃにて列記している。
【０１０５】
ＰＣＲ生成物を得、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター、ｐＣＲ２．１／ＴＯＰＯ（ＳＡＡ、ＣＣ３、βＡＰＰおよびｔ−ＴＧａｓｅに対して）またはｐＣＲＩＩ／ＴＯＰＯ（ＮＫ４に対して）内にクローン化した。これらの構築物を、配列決定によって確認し、ついで、正しい方向でプロモーターを含んでいるＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ断片を、標準の組換え遺伝子技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記）を用いて、ホタルルシフェラーゼ−レポーターベクターｐＧＬ２−ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内のＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ部位内に挿入した。ホタルルシフェラーゼ発現を駆動している、４８０ｂｐのプロサポシンプロモーターの配列を含むクローンは、Ｓｕｎら（１９９９、Ｇｅｎｅ  ２１８、３７〜４７）にて記述され、Ｄｒ．Ｇｒａｂｏｗｓｋｉ（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）より提供された。
【０１０６】
それぞれのプロモーター構築物に関するプラスミドクローンを、一過性トランスフェクションアッセイによって、ｐ２１調節に関して試験した。ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞の一過性トランスフェクションを、基本的にＢｉｏ−Ｒａｄプロトコールにおいて記述されたように、エレクトロポレーションによって実施した。各エレクトロポレーションに関して、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞を、１０％  ＦＣ２血清が添加され、またペニシリン、ストレプトマイシンおよびグルタミンを含むＤＭＥＭを用いて、１５ｃｍプレートにおいて、９５％コンフレントまで増殖させた。ついで細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中に再懸濁させ、ＩＥＣ  ＨＮ−ＳＩＩ遠心分離機にて１０分間、１、０００ｒｐｍにてスピンダウンした。遠心分離に続いて、培地を吸引し、細胞を、１８００万〜２０００万細胞／ｍｌの濃度にて、再びＯｐｔｉ−ＭＥＭ中に再懸濁した。４００μｌの再懸濁液（およそ７００万〜８００万細胞）を、４ｃｍギャップのエレクトロポレーションのキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。１０〜２０μｇのプロモータールシフェラーゼ構築物を細胞に加えた。いくつかの実験で、ＣＭＶプロモーターからの細菌β−ガラクトシダーゼを発現しているコントロールプラスミドｐＣＭＶｂｇａｌを、正規化のために、１：１０の比で混合液に加えた。他の実験では、正規化は、ＣＭＶプロモーターからのウミシイタケルシフェラーゼを発現しているベクターｐＲＬ−ＣＭＶを、１：２０のモル比で加えることにより実施し、ホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、同一の試料で測定した。エレクトロポレーションを、０．２２ボルトにて、９６０μＦＤに設定した電気容量増強器を備える、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒを用いて実施し、２７〜３０のτ値を得た。予備実験にて、エレクトロポレーション後の細胞生存および接着が、およそ３３％であると測定された。細胞を、１２ウェルプレートに、およそ５０、０００接着細胞／ウェルの開始濃度にて、三組で（ｉｎ  ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）まいた。細胞を３〜６時間沈降させた後、培地を吸引し、５０μＭ  ＩＰＴＧを含む、または含まない新鮮な培地で置換した。２〜４日後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水にて２回洗浄し、３００μｌの１×Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  ＢｕｆｆｅｒまたはＲｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に回収した。溶解物を短時間、１０、０００ｇにて遠心し、残余物を沈殿させ、５０μｌ分液を、Ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にて使用するために、新しいチューブに移した。ルシフェラーゼ活性を、Ｔｕｒｎｅｒ  ２０／２０ルミノメーターを用いて、５秒遅延期間（ｄｅｌａｙ  ｐｅｒｉｏｄ）および１０〜１５秒統合時間（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）にて、５２．１％感度で測定した。
【０１０７】
図７は、代表的な実験の結果を示している。形質導入細胞におけるｐ２１−誘導の２〜４日後、ｐ２１誘導遺伝子のプロモーター構築物からの発現は、ＮＫ４に関して約７．０倍、ＳＡＡに関して３．７倍、ＣＣ３に関して１２．５倍、プロサポシンに関して３．０倍、βＡＰＰに関して２．６倍、およびｔ−ＴＧａｓｅに関して２．３倍増加した。これらの結果は、そのプロモーターを調節することによって、ｐ２１がこれらの遺伝子の発現をアップレギュレートすること、および、そのような遺伝子のプロモーター構築物は、遺伝子発現のｐ２１媒介調節に関してアッセイするために使用可能であること、を示唆している。そのようなアッセイは、実施例９にて以下で記述したように、ｐ２１媒介遺伝子活性化を阻害する化合物を同定するために使用可能である。
【表ＩＩＩａ】
2005518222.tif 000002
【表ＩＩＩｂ】
2005518222.tif 000003
【表ＩＩＩｃ】
2005518222.tif 000004
実施例９  ｐ２１誘導可能レポーター構築物で安定に形質導入した細胞の生成
ｐ２１調節ルシフェラーゼ発現にて安定に形質導入した細胞株を開発するために、実施例８にて記述され、ｐＬｕＮＫ４と称される、ＮＫ４プロモータールシフェラーゼ構築物を、選別可能マーカーとして、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼをもつｐＢａｂｅＰｕｒｏとのコトランスフェクションによって、ＩＰＴＧ誘導ｐ２１をもつ、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞に導入した。形質導入は、１０：１比のｐＬｕＮＫ４およびｐＢａｂｅＰｕｒｏを用いて、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））を使用して実施した。安定なトランスフェクタントを、５日間、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて、選別した。５４個のピューロマイシン耐性細胞株を単離し、５０μＭ  ＩＰＴＧの存在下または不存在下、（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａを用いて）ルシフェラーゼ活性に関して試験した。
【０１０８】
本アッセイは以下のように実施した。細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む１ｍｌの培地中で、１２ウェルプレートにて、４０、０００細胞／ウェルの密度でまいた。接着後、細胞を、異なる時間、５０μＭ  ＩＰＴＧにて処理するか、または処理せずに静置した。ついでルシフェラーゼ活性を、上記実施例８にて記述したように測定した。追加分液を細胞溶解物より除去し、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキット（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。各試料に関するルシフェラーゼ活性を、タンパク質含量に対して正規化し、ルシフェラーゼ活性／μｇタンパク質として表した。すべてのアッセイは三組で行い、平均および標準偏差として表示した。
【０１０９】
５４のうち２１の試験細胞株が、測定可能なルシフェラーゼ活性を示したが、ただ１つの細胞株、ＨＴ１０８０  ＬｕＮＫ４ｐ２１と命名されたもののみが、ＩＰＴＧ不存在下においてよりも存在下において、より高いルシフェラーゼ発現を示した。ｐ２１ＬｕＮＫ４細胞株で実施したアッセイの結果を、図８Ａおよび８Ｂで示している。図８Ａは、ＩＰＴＧ処理の２４時間後の、ルシフェラーゼ発現のＩＰＴＧ用量依存性を示しており、図８Ｂは、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加における、ルシフェラーゼ発現の時間経過を示している。この解析によって、ほとんどの誘導は、５μＭほどのＩＰＴＧを使用して、１７時間ほどの短い処理時間で実施可能であることが示されている。
【０１１０】
これらの結果は、ｐＬｕＮＫ４レポーター構築物が、レポーター遺伝子転写のｐ２１誘導に対して応答性である、安定に形質導入した細胞株を生成するために使用可能であることを、示している。そのような構築物および細胞は、ｐ２１媒介遺伝子活性化を阻害する化合物を同定するためのスクリーニングアッセイに対して基礎を提供する。ルシフェラーゼ誘導で必要である比較的短い時間（約１７時間）、ならびに、ＩＰＴＧ処理細胞内での言明された（およそ３倍）ルシフェラーゼレベルの増加により、ＬｕＮＫ４ｐ２１細胞株が、ｐ２１の誘導効果を阻害しうる化合物のハイスループットスクリーニングに好適となる。同様の（そして潜在的によりよい）誘導性を持つ他の細胞株もまた、ＬｕＮＫ４ｐ２１を誘導するために使用される、本明細書で開示した方法を介して開発しうる。実施例８にて記述された結果は、同型のスクリーニングがまた、安定に形質導入した細胞株よりむしろ、ｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーター構築物での一過性トランスフェクションアッセイを用いて実施可能であることを示している。ルシフェラーゼ発現に基づくハイスループットスクリーニングに関する方法は、本技術分野でよく知られている（一過性トランスフェクションに基づくアッセイの最近の例に関しては、Ｓｔｏｒｚら、１９９９、Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７６：９７〜１０４を、および、安定に形質導入した細胞株に基づくスクリーニングの例に関しては、Ｒｏｏｓら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７３：３０７〜３１５を参照のこと）。これらの細胞およびアッセイを使用して同定した化合物は、加齢関連遺伝子のｐ２１媒介誘導を阻害するか、または予防することが可能である治療的薬剤を開発するために有用である。
【０１１１】
実施例１０  一過性トランスフェクションアッセイにおいて、ｐ２１媒介誘導を阻害するための、ＮＦκＢおよびｐ３００／ＣＢＰインヒビターの使用
ｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーター配列の実験により、ＮＫ４を含む、これらのプロモーターの多くが、既知のまたは潜在的なＮＦκＢ結合部位を含むことが示された。スーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）（Ｊｏｎｅｓら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：６９７０〜６９８１）、ｔ−ＴＧａｓｅ（Ｍｉｒｚａら、１９９７、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２：Ｇ２８１〜Ｇ２８８）、アルツハイマーβ−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（Ｇｒｉｌｌｉら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５００２〜１５００７）および炎症性タンパク質血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）（Ｊｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３３４：４８９〜５０３）を含む、いくつかのｐ２１誘導遺伝子が、ＮＦκＢによって正に制御されることが知られている。ｐ２１は、一過性コトランスフェクション実験によって、ヒト免疫不全ウイルスにおいて、ＮＦκＢ依存性転写を活性化することがすでに示されてきており（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：５２３〜５２７）、このことは、ウイルスの長末端繰り返し（配列番号８５）に存在するＨＩＶプロモーターが、ＮＦκＢに応答性であり、ＮＦκＢにより調節されていることを示唆している。ｐ２１のこの効果は、転写補助因子ｐ３００およびＣＢＰの刺激によるものと示されており（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：５２３〜５２７）、ｐ３００／ＣＢＰまたは関連する転写補助因子の活性化が、いくつかのアップレギュレートされた遺伝子におけるｐ２１の効果の原因である可能性がある。したがって、ＮＦκＢまたはｐ３００／ＣＢＰのインヒビターは、潜在的にｐ２１による転写の誘導を予防する。
【０１１２】
ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞におけるＩＰＴＧ誘導可能ｐ２１発現が、ＮＦκＢの転写活性を刺激するかどうかを決定するために、本発明者らは、一過性トランスフェクションアッセイを使用して、ストラタジーンより市販されているプラスミドｐＮＦκＢ−Ｌｕｃからのルシフェラーゼ発現における、ｐ２１誘導の効果を調べてきた。このプラスミドは、５回タンデムリピートＮＦκＢコンセンサス配列を含む人工プロモーターからのホタルルシフェラーゼを発現する。本発明者らはまた、配列番号８０および８３として同定されたプライマーを用いて、ただ１つのＮＦκＢコンセンサス配列のみを含む同一のプロモーターのバージョンを、ＰＣＲにより作製した。これらの２つのプロモーターの配列は、配列番号７８および７９として同定される。
【０１１３】
これらのプロモーターを誘導するｐ２１の能力を、異なるレベルまでｐ２１を誘導する、異なる濃度のＩＰＴＧを使用して、実施例８にて記述したように、一過性トランスフェクションアッセイによって、試験した。図９Ａおよび図９Ｂにて示したように、両方のプロモーターが、ＩＰＴＧによる用量依存的誘導を示したが、ＩＰＴＧによる活性の基底レベルおよび誘導倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）の両方は、５つのＮＦκＢ部位を含むプロモーターにおいてさらに高かった。これらの結果は、ｐ２１が、本発明者らのシステムにおいて、ＮＦκＢ依存性転写を誘導すること、および、１つまたはそれ以上のＮＦκＢ部位を含むプロモーターが、ｐ２１誘導可能細胞遺伝子のプロモーターの代替物として使用しうることを示唆している。
【０１１４】
ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃからのルシフェラーゼ発現における、ＮＦκＢの遺伝的インヒビターの効果を評価するために、２０μｇの後者のプラスミドを、ＮＦκＢを選択的に阻害するＩκＢキナーゼαのドミナント変異体を発現しているプラスミドＭＡＤ３（ａ．ｋ．ａ．ｐＲＣ／βアクチン−ＨＡ−ＩＫＫα）と、（モル比１：２で）混合した（ＤｉＤｏｎａｔｏら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１２９５〜１３０４）（Ｄｒ．Ｍ．Ｋａｒｉｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏより提供された）。このプラスミドを以下、ＩＫＫと呼ぶ。ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃからのルシフェラーゼ発現におけるｐ３００／ＣＢＰ阻害の効果を決定するために、後者のプラスミドを、Ｃ−末端欠損｛△ＣＲ２（１２０−１４０）｝のあるアデノウイルスＥ１Ａタンパク質に関する切断遺伝子を発現しているベクターとともに、別のアッセイにて同様に混合した。Ｃ−切断Ｅ１Ａ（Ｅ１Ａ△ＣＲ２と呼ぶ）は、ｐ３００／ＣＢＰおよび関連因子（例えば、ＰＣＡＦ）を阻害することが知られているが、Ｅ１ＡのＣ−末端ドメインの標的である、Ｒｂは阻害しない（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、１９９９、Ｃｅｌｌ  ９６：３９３〜４０３）。陰性コントロールとして、ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃを、Ｃ−末端およびＮ−末端｛△Ｎ（２−３６）｝両方に欠損のあるＥ１Ａの機能的に不活性な型であって、Ｅ１Ａ△Ｎ／△ＣＲ２と称されるものと混合した。Ｅ１Ａ△ＣＲ２およびＥ１Ａ△Ｎ／△ＣＲ２構築物は、Ｄｒ．Ｖ．Ｏｇｒｙｚｋｏ（ＮＩＣＨＨＤ、ＮＩＨ）によって提供された。ＩＫＫ、Ｅ１Ａ△ＣＲ２またはＥ１Ａ△Ｎ／△ＣＲ２とのｐＮＦκＢ−Ｌｕｃの混合物を、実施例８で記述したように（ｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドを正規化のためにさらに加えて）、エレクトロポレーションによってＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞内に形質導入した。エレクトロポレーション後、同数の形質導入した細胞を、３日間、５０μＭ  ＩＰＴＧで処理するか、または処理しなかった（三組で）。各形質導入試料にて、ホタルルシフェラーゼ活性を測定し、測定したウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化した（ＩＰＴＧ不存在下で）。
【０１１５】
本解析の結果を図９Ｃにて示している。陰性コントロール（Ｅ１Ａ△Ｎ／△ＣＲ２）と混合したｐＮＦκＢ−Ｌｕｃは、ＩＰＴＧの存在下で１５倍までの誘導を示し、このことは、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞におけるＮＦκＢ転写活性の増加を示している。ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃを、ＩＫＫインヒビターと混合することにより、ＩＰＴＧ処理または未処理細胞におけるルシフェラーゼ発現が、ほとんど完全になくなり、このことは、このインヒビターの効能を示している。Ｅ１Ａ△ＣＲ２は、ＩＫＫと同様であるが、より弱い効果を有し、このことは、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞におけるＮＦκＢ活性に関して、ｐ３００／ＣＢＰが必要であることを意味している（図９Ｃ）。
【０１１６】
同一の解析を、６つのｐ２１誘導可能遺伝子に関して、プロモータールシフェラーゼ構築物を使用して実施した。ＳＡＡに関する結果を図９Ｄに、プロサポシンに関しては図９Ｅに、βＡＰＰに関しては図９Ｆに、ｔ−ＴＧａｓｅに関しては図９Ｇに、補体Ｃ３に関しては図９Ｈに、そしてＮＫ４に関しては図９Ｉに示している。ＩＫＫおよびＥ１Ａ△ＣＲ２の両方が、ＩＰＴＧの存在下で、試験したプロモーターすべての誘導を阻害し、このことは、ｐ２１によるこれらのプロモーターの調節が、ｐ３００／ＣＢＰおよびＮＦκＢを介して部分的に媒介されていることを示唆している。しかし、定量的には、これらのインヒビターの効果は、プロモーター間で変化する。ＳＡＡ（図９Ｄ）およびＮＫ４（図９Ｉ）の試験したプロモーターのほとんどの、基底発現およびＩＰＴＧ刺激発現の両方が、ＮＦκＢのものとほぼ同じ強さで、ＩＫＫおよびＥ１Ａ△ＣＲ２によって阻害される。一方で、これらのインヒビターは、プロサポシン（図９Ｅ）、βＡＰＰ（図９Ｆ）、ｔ−ＴＧａｓｅ（図９Ｇ）または補体Ｃ３（図９Ｈ）のプロモーターからの基底発現においては、ほとんどまたは全く効果を持たないが、しかし、ＩＰＴＧの存在下で、これらのプロモーターの誘導を妨害した。しかしながら、ＩＰＴＧによるプロサポシンプロモーター（図９Ｅ）の誘導におけるＩＫＫの効果は、実質上、他のプロモーターのものよりも弱かった。
【０１１７】
これらの結果は、これらの因子の、ｐ２１の効果への相対的寄与が、プロモーターによって変化する可能性があるけれども、ｐ３００／ＣＢＰおよびＮＦκＢが、ｐ２１によるすべての試験したプロモーターの誘導に関与することを、示唆している。
【０１１８】
実施例１１  ｐ２１媒介遺伝子誘導を阻害するための非ステロイド抗炎症剤の使用
臨床使用においてよく研究されたＮＦκＢインヒビターは、アスピリン、サリチル酸ナトリウムおよびスリンダクなどの一定の非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）である（Ｋｏｐｐ  ａｎｄ  Ｇｈｏｓｈ、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：９５６〜９５９；Ｙｉｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：７７〜８０；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７４：２７３０７〜２７３１４）。上述の実施例９で説明したＬｕＮＫ４ｐ２１細胞株を用いて、この細胞株において、ＮＦκＢ阻害活性をもつＮＳＡＩＤによって、ｐ２１によるルシフェラーゼ発現の誘導が阻害されるかどうか、測定した。
【０１１９】
実質上実施例９で説明したように、ルシフェラーゼ分析を行なった。５０μＭのＩＰＴＧ存在下または不存在下で１６時間インキュベーションした後、ルシフェラーゼ活性を測定し、続いて、２０ｍＭのサリチル酸ナトリウム、１ｍＭのスリンダク、または１０ｍＭのアスピリンの存在下または不存在下でさらに２０時間処理した。さらに、ＮＦκＢを阻害しない２種のＮＳＡＩＤ、インドメタシンおよびイブプロフェン（それぞれ２５μＭ）について試験した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９９、上記）。ＮＳＡＩＤ濃度は、抗炎症性を示すのに必要な、患者の血清中でのそれらの薬剤の薬理学的濃度に基づいて決定した（Ｙｉｎら、１９９８、上記）。
【０１２０】
これらの分析結果を図１０に示す。ＮＳＡＩＤの存在下で、ＩＰＴＧによりルシフェラーゼ発現がおよそ３〜４倍増加したが、この誘導は、サリチル酸塩、スリンダク、またはアスピリンの存在下では、完全にまたはほぼ完全に消失した。対照的に、インドメタシンおよびイブプロフェンではＩＰＴＧによるルシフェラーゼ誘導に対する有意な違いは見られなかった。
【０１２１】
ＮＦκＢ阻害ＮＳＡＩＤが、ＮＫ４プロモーターからの転写の誘導だけでなく、内因性ｐ２１誘導可能遺伝子のＲＮＡ発現をも阻害することを測定するために、ＬｕＮＫ４ｐ２１細胞は６ウェルプレートに1ウェルあたり１２５、０００細胞をプレーティングし、スリンダク２５０μＭ、５００μＭまたは１ｍＭの存在下または不存在下で、４８時間（ｐ２１誘導可能遺伝子の最大刺激に必要な時間；Ｃｈａｎｇら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：４２９１〜４２９６）、５０μＭのＩＰＴＧで処理し、または、処理しなかった。インキュベーションした後、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて細胞からＲＮＡを抽出し、いくつかのｐ２１誘導可能遺伝子の相対ＲＮＡ濃度を、ｃＤＮＡ正規化のためにβ２−ミクログロブリンではなくβ−アクチンを用いたことを除いて、本質的にＮｏｏｎａｎら（１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７１６０〜７１６４）に記載の方法で、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定した。試験した遺伝子それぞれのＰＣＲプライマー配列を、表ＩＶａに示す。ＰＣＲサイクルは次のとおりであった：第一サイクルは、３分間変性、２分間アニーリング、および２分間伸長、そして残りのサイクルは、３０秒間変性；３０秒間アニーリング；１分間伸長。ＰＣＲサイクルの温度条件およびＰＣＲ産物の大きさは表ＩＶｂに示す。
【０１２２】
ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を図１１に示す。ＮＫ４（そのプロモーターが、ＬｕＮＫ４ｐ２１細胞においてルシフェラーゼ発現をさせるのに用いられた）では、スリンダクの添加は、ＩＰＴＧ不存在下における遺伝子発現にほとんど影響を及ぼさなかったが、ＩＰＴＧ存在下においては、すべてのスリンダク濃度で、用量に依存したＮＫ４  ＲＮＡ濃度の減少がみられた。ｔ−ＴＧａｓｅ  ＲＮＡでも非常に似た結果が得られた。その他のすべての試験遺伝子では、ＩＰＴＧ不存在下において、スリンダクによる、用量に依存した遺伝子発現の増加がみられた。この作用の結果、スリンダクの最高試験濃度（１ｍＭ）では、ＩＰＴＧ存在下において遺伝子発現が減少しなかったが、それより低いスリンダク濃度ではＩＰＴＧ作用の顕著な減少がみられた。特に、ＡＰＰ遺伝子に対しては、２５０μＭおよび５００μＭのスリンダクによりＩＰＴＧ作用が減少したが、ｐ６６Ｓｈｃ、ＣＴＧＦおよびＭａｃ２結合タンパク質（Ｍａｃ２−ＢＰ）遺伝子に対しては、２５０μＭスリンダクによってのみ減少した。プロサポシンまたはスーパーオキシドジスムターゼ２（ＳＯＤ２）のＩＰＴＧ誘導ＲＮＡ濃度においては、試験されたどのスリンダク濃度でも、有意な減少はみられなかった。プロサポシンに対してスリンダクによる影響がないことは、プロサポシンプロモーターに対するＩＫＫインヒビターの中程度の効果に一致する（上記実施例１０を参照のこと）。よって、適度な用量（２５０μＭ）のスリンダクにより、試験遺伝子のほとんどにおいてｐ２１の転写誘導能が阻害される。
【表ＩＶａ】
2005518222.tif 000005
【表ＩＶｂ】
2005518222.tif 000006
これらの結果により、ｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーター由来のレポーター発現のｐ２１媒介誘導の妨害に関する分析により、発癌性および加齢関連疾患に関連した遺伝子のｐ２１媒介誘導を阻害する薬剤を同定することが可能であることが、実証された。特に、ＬｕＮＫ４ｐ２１細胞株を用いた、プロモーターに基づいた分析において効果的なインヒビターであるとして最初に同定された薬剤（スリンダク）は、ｐ２１によるいくつかの加齢に関連する遺伝子の誘導を阻害することが分かった。これらの結果により、ＮＦκＢインヒビターとして活性をもつＮＳＡＩＤによって、ＣＤＫインヒビターによる加齢に関連する遺伝子の誘導を阻害できることも、さらに実証された。
【０１２３】
ＣＤＫインヒビターによる転写の誘導を阻害する薬剤は、アルツハイマー病、アミロイド沈着症および関節炎などの加齢関連疾患の化学防御、または進行を減速させるために、臨床的に有効でありうる。さらに、それらの化合物は、分泌された増殖因子（ＣＴＧＦなど）の発現における効果により、癌の治療または予防において有用でありうる。事実、ＮＦκＢ阻害活性をもつＮＳＡＩＤの、利用できる臨床データは、これらの利用範囲を裏付けている。したがって、スリンダク、アスピリンおよびサリチル酸塩を含む、いくつかのＮＳＡＩＤは、結腸直腸癌および他の様々な種類の癌に対し化学防御的な有用性を持ち、結腸ポリープの消失を促進することが、明らかになっている（Ｌｅｅら、１９９７、「アスピリンおよびその他の非ステロイド抗炎症剤の利用と癌進展の危険性（Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｓｐｉｒｉｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．）」：ＤｅＶｉｔａら編、ＣＡＮＣＥＲ．ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ＆ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ｐｐ．５９９〜６０７に掲載）。アスピリンおよびその他のＮＳＡＩＤの利用により、アルツハイマー病の危険性が減少することも明らかになっている（Ｓｔｅｗａｒｔら、１９９７、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４８：６２６〜６３２）。さらに、長期間のアスピリン治療によりアテローム性動脈硬化症の発生率が減少することも、さらに報告されている（Ｓｌｏｏｐ、１９９８、Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ  ４９：８２７〜８３２）。最後に、スリンダクは、関節炎の治療において臨床的な効果が立証されている、最も一般的に使用されている薬剤の一つである（Ｂｒｏｇｄｅｎら、１９７８、Ｄｒｕｇｓ  １６：９７〜１１４）。ＮＳＡＩＤのこれらの有益な効果のいくらかは、シクロオキシゲナーゼ２インヒビターとしての活性にあるとされているが（Ｐｅｎｎｉｓｉ、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１１９１〜１１９２）、本明細書に開示した結果から、これらの臨床的活性はまた、おそらくそれらの化合物のＮＦκＢ阻害活性による、ｐ２１誘導遺伝子発現の阻害に起因していることが示唆される。本発明の提供する分析およびスクリーニングシステムにより、当業者は、この活性を向上させるために様々なＮＳＡＩＤ誘導体について試験することが可能になる。さらに、これらの結果から、癌および加齢関連疾患の化学防御または治療に利用する薬剤として、ＮＦκＢおよびｐ３００／ＣＢＰインヒビターといった一般的な種類を利用するための基礎が提供される。
【０１２４】
実施例１２  ｐ１６およびｐ２７によるｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーターの刺激
実施例７で実証したように、ｐ２１誘導可能遺伝子の発現もまた、その他のＣＤＫインヒビター、ｐ１６Ｉｎｋ４Ａおよびｐ２７Ｋｉｐ１によりアップレギュレートされる。ｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーターが後者のＣＤＫインヒビターにより刺激されるかどうかを決定するために、ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃおよび実施例８に記載のプロモータールシフェラーゼ構築物のいくつか（ＳＡＡ、ＮＫ４、補体Ｃおよびプロサポシン）を、実施例６に記載の、ｐ１６をＩＰＴＧ誘導可能に発現しているＨＴ１０８０誘導体（ＨＴ１０８０  ｐ１６−５）またはｐ２７をＩＰＴＧ誘導可能に発現しているＨＴ１０８０誘導体（ＨＴ１０８０  ｐ２７−２）中に、形質導入した。対照として、ｐ２１をＩＰＴＧ誘導可能に発現しているＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞において、同一の分析を行なった。ついで、実施例８でｐ２１誘導系について記載したように、これらのプロモーターの発現におけるＩＰＴＧの影響を分析した。ＮＦκＢについて観察された誘導の特異性を、ＩＫＫインヒビターを用いたコトランスフェクションにより決定した。図１２に示すように、すべての試験プロモーターは、ｐ２１によってだけでなく、ｐ１６およびｐ２７によっても誘導された。ＮＦκＢインヒビターＩＫＫは、プロサポシンを除くすべての試験プロモーターにおいて、３つのＣＤＫインヒビターすべてに対し強い阻害作用を示したが、プロサポシンでは、ＩＫＫは3つのＣＤＫインヒビターすべてに対し弱い効果しか見られなかった（図１２Ｅ）。
【０１２５】
これらの結果から、ｐ２１誘導可能プロモーターは、ｐ２１によってだけではなく、ｐ１６およびｐ２７などのその他のＣＤＫインヒビターによっても活性化され、ＣＤＫインヒビターの影響はかなりの程度でＮＫκＢに媒介されていることが、示唆される。
【０１２６】
実施例１３  ウイルス遺伝子プロモーターのｐ２１誘導
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のプロモーターは、ｐ３００／ＣＢＰ依存性の様式でｐ２１により誘導可能であることが、以前に示されている（Ｐｅｒｋｉｎｓら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：５２３）。ｐ２１誘導性が異なるウイルスプロモーターにおいて一般的な性質であるかどうかを決定するために、霊長類のウイルス由来の、他の２つの完全プロモーターについて、ｐ２１誘導性、およびそのような誘導性のｐ３００／ＣＢＰに対する依存の可能性を試験した。これらのプロモーターは、哺乳動物の発現ベクターにおいて一般に利用されているが、ＣＭＶ（エンハンサーおよび早期プロモーター）およびＳＶ４０（早期エンハンサー／プロモーター）から得た。これらのプロモーターは、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｃ．）から入手し、レポーター遺伝子としてウミシイタケルシフェラーゼを発現している、ｐＲＬ−ＣＭＶおよびｐＲＬ−ＳＶ４０構築物中で試験した。
【０１２７】
ｐＲＬ−ＣＭＶおよびｐＲＬ−ＳＶ４０について、上記実施例１および２において説明したように、イソプロピル−β−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）誘導可能ｐ２１発現をもつＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受け入れ番号ＰＴＡ−１６６４）中に、一過性に形質導入することにより試験した。ｐ３００／ＣＢＰの役割を調べるために、ｐ３００／ＣＢＰおよびＲｂの両方を阻害する、アデノウイルスタンパク質Ｅ１Ａを発現しているベクターを用いた。レポーター構築物をモル比１：２で、野生型Ｅ１Ａ、Ｒｂ阻害に必要なＣＲ２ドメイン欠失Ｅ１Ａ変異体（Ｅ１ＡΔＣＲ２）、または、Ｎ−末端（ｐ３００／ＣＢＰ阻害の原因であるＥ１Ａタンパク質の一部）およびΔＣＲ２欠失のＥ１Ａの非機能的切断型（Ｅ１ＡΔＮ／ΔＣＲ２）を発現している、ｐｃＤＮＡ３ベクターと混合した（上記実施例１０で開示したように）。
【０１２８】
形質導入後（上記実施例３で説明したように、エレクトロポレーションにより）、細胞を３日間、５０μＭのＩＰＴＧで処理し、または処理しなかった（三組で）。Ｐｒｏｍｅｇａウミシイタケルシフェラーゼ分析キットを用いて、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。この分析結果を以下の表に示す。
【表Ｖ】
2005518222.tif 000007
上記の分析の結果により、ＣＭＶおよびＳＶ４０プロモーターの両方が、非機能的コントロール（Ｅ１ＡΔＮ／ΔＣＲ２）との混合物中でｐ２１により誘導されることが、実証された。ｐ３００／ＣＢＰを阻害する、野生型Ｅ１ＡおよびＥ１ＡΔＣＲ２の両方もまた、ｐ２１によるＣＭＶプロモーターの誘導を阻害したが、しかし、ｐ２１が誘導されない場合に、このプロモーターの活性に対して大きな影響を与えなかった。野生型Ｅ１ＡおよびＥ１ＡΔＣＲ２もまた、ｐ２１誘導がある場合でも、ない場合でも、ＳＶ４０プロモーターを強く阻害する。これらの結果から、ＣＭＶおよびＳＶ４０プロモーターの両方のｐ２１誘導は、他のＥ１Ａ結合タンパク質の役割を排除できないけれども、ｐ３００／ＣＢＰを必要とするであろう、ということが示唆される。ＣＭＶではなくＳＶ４０プロモーターはまた、その基底発現のために、ｐ３００／ＣＢＰまたはいくつかの他のＥ１Ａ結合タンパク質を必要とする。
【０１２９】
したがって、異なる霊長類ウイルスの試験した３つのプロモーターのすべて（ＣＭＶ、ＳＶ４０および、Ｐｅｒｋｉｎｓらにより１９９７年に試験されたＨＩＶ）が、ｐ２１による誘導を示した。興味深いことに、ｐ２１誘導は、ヒト細胞における最も一般的なストレス応答の一つであるが、ウイルス感染の結果しばしば起こるものでもある。例えば、Ｃ型肝炎ウイルスはｐ５３非依存性の様式でｐ２１発現を誘導し（Ｍａｊｕｍｄｅｒら、２００１、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１４０１〜７に開示）、Ｂ型肝炎ウイルス−Ｘタンパク質によりｐ２１発現がアップレギュレートされる（Ｐａｒｋら、２０００、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９：３３８４）。ｐ２１の過剰発現もまた、ヒトＴ細胞リンパ親和性ウイルス１型−感染細胞において観察された（ｄｅ  Ｌａ  Ｆｕｅｎｔｅら、２０００、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７２７０）。ＣＭＶ感染により、ｐ２１発現の一過性の増加が起こり、続いて感染の後期においてｐ２１のダウンレギュレーションが起こる（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３６１３）。Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｇｒｉｍｍｉｎｇｅｒら（１９９８、Ａｍ、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２：１０１５）は、種々のパピローマウイルスに感染したヒト組織においてｐ２１発現を観察し、ｐ２１誘導はウイルスＤＮＡの複製を阻害する宿主応答である、と提案した。ウイルス遺伝子発現を増加させるためにこの宿主応答を利用することは、種々のウイルスにとって、合理的で一般的な進化の戦略であると思われる。
【０１３０】
これらの考察に基づいて、遺伝子発現のｐ２１媒介誘導を妨害する化合物は、種々のウイルス性疾患の治療または予防において治療的に有益であると思われる。
【０１３１】
以上の開示は、本発明のある特定の実施例を強調しており、それに対して同等の改変または代替はすべて、添付の特許請求の範囲に記述の本発明の意図および範囲内であると理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞株変異体ＨＴ１０８０  ｐ２１−９を生成するために使用した、ＩＰＴＧ調節レトロウイルスベクターＬＮｐ２１ＣＯ３の概略図である。
【図２】図２Ａは、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加後のｐ２１誘導の時間経過のグラフであり、ｐ２１レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定した。図２Ｂは、ＩＰＴＧ除去後の、ｐ２１減少の時間経過のグラフである。
【図３】図３Ａは、ＲＴ−ＰＣＲ実験のゲル電気泳動パターン（左）、細胞ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット解析（中央）、および、表示した遺伝子の発現におけるＩＰＴＧ誘導変化に関する免疫ブロッティングアッセイ（右）の写真である。Ｃ：コントロール未処理ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞、Ｉ：５０μＭ  ＩＰＴＧにて３日間処理した細胞。β２−ミクログロブリン（β２−Ｍ）を、ＲＴ−ＰＣＲに関する正規化のコントロールとして使用し、Ｓ１４リボソームタンパク質遺伝子を、ノーザンハイブリダイゼイションに関して使用した。図３Ｂは、ＩＰＴＧ添加および放出における、表示したｐ２１阻害遺伝子の発現における変化の時間経過を示している、ＲＴ−ＰＣＲ実験のゲル電気泳動（左）および免疫ブロッティング解析（右）の写真である。図３Ｃは、ＩＰＴＧ添加における、表示したｐ２１−誘導遺伝子の発現における変化の時間経過の、ＲＴ−ＰＣＲ実験のゲル電気泳動パターン（左）およびノーザンハイブリダイゼイション解析（右）の写真である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、未処理コントロールＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞（Ｃ）、血清飢餓停止細胞（Ｑ）およびＩＰＴＧ処理老化細胞（Ｉ）における遺伝子発現の比較である。
【図４】図４は、ヒトＨＴ１０８０繊維肉腫細胞株変異体ＨＴ１０８０／ＬＮｐ１６ＲＯ２を生成するために使用した、ＩＰＴＧ調節レトロウイルスベクターＬＮｐ１６ＲＯ２の概略図である。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、５０μＭ  ＩＰＴＧの添加における、ＨＴ１０８０  ｐ１６−５（図５Ａ）またはＨＴ１０８０  ｐ２７−２（図５Ｂ）細胞の、細胞周期分布における変化の図である。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ＨＴ１０８０  ｐ１６−５細胞におけるｐ１６（図６Ａ）またはＨＴ１０８０  ｐ２７−２細胞におけるｐ２７（図６Ｂ）のＩＰＴＧ誘導発現において、表示した遺伝子の発現における、ＩＰＴＧ誘導変化を検出するための、ＲＴ−ＰＣＲ実験のゲル電気泳動パターンの写真である。−：コントロール未処理細胞；＋：５０μＭ  ＩＰＴＧにて３日間処理した細胞。β−アクチンを、ＲＴ−ＰＣＲについての正規化のコントロールとして使用した。
【図７】図７は、表示したｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーターによって駆動される、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現における、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞におけるｐ２１誘導の効果を図示している。アッセイは、一過性形質導入に続き、５０μＭ  ＩＰＴＧの存在下または不存在下で、培養の２日後（プロサポシンプロモーターに関して）、培養の３日後に（他のすべてのプロモーターに関して）、実施した。アッセイは、三組（プロサポシンに関して）、四組で（ｉｎ  ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）（他のすべてのプロモーターに関して）実施した。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ＩＰＴＧ処理の２４時間後、ＬｕＮＫ４ｐ２１におけるルシフェラーゼ発現のＩＰＴＧ用量依存（図８Ａ）、および５０μＭ  ＩＰＴＧの添加におけるルシフェラーゼ発現の時間経過（図８Ｂ）を示しているグラフである。
【図９】図９Ａ〜９Ｉは、ＮＦκＢ依存性プロモーターによって（図９Ａ〜９Ｃ）、または表示したｐ−２１誘導可能遺伝子のプロモーターによって（図９Ｄ〜図９Ｉ）駆動される、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現におけるＨＴ１０８０  ｐ２１−９でのｐ２１誘導の効果を例示している。図９Ｃ〜９Ｉでの実験において、プロモーターレポーター構築物を、ＮＦκＢのドミナントインヒビター（ＩＫＫ）、ｐ３００／ＣＢＰを阻害するＣ切断Ｅ１Ａ変異体（Ｅ１Ａ△ＣＲ２）、または、Ｅ１Ａの非機能的Ｎ−およびＣ−切断型（Ｅ１Ａ△Ｎ／△ＣＲ２）を発現しているベクターと、モル比１：２で混合した。ルシフェラーゼレベルを、図９Ａおよび９Ｂにおいては表示した濃度で、他のすべての図では５０μＭにて使用した、ＩＰＴＧの存在下または不存在下で、３日後に測定し、そして、ＩＰＴＧの不存在下においてコトランスフェクトｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドから発現したウミシイタケルシフェラーゼのレベルによって、または、（図９Ｅにおいて）細胞タンパク質レベルによってのいずれかにより、正規化した。実験は三組で行った。
【図１０】図１０は、ＩＰＴＧの存在下または不存在下において、および、異なる量のＮＳＡＩＤとインキュベートした、ＬｕＮＫ４ｐ２１細胞におけるルシフェラーゼ活性の棒グラフである。
【図１１】図１１は、異なる量のスリンダクによる表示した遺伝子の発現における、ＩＰＴＧ誘導変化の阻害を検出するための、ＬｕＮＫ４ｐ２１を用いた、ＲＴ−ＰＣＲ実験のゲル電気泳動パターンの写真である。β−アクチンを、ＲＴ−ＰＣＲについての正規化のコントロールとして使用した。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｅは、ＮＦκＢ依存性プロモーターによって（図１２Ａ）、または、表示したｐ２１誘導可能遺伝子のプロモーターによって（図１２Ｂ〜１２Ｅ）駆動される、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現における、ＨＴ１０８０  ｐ１６−５細胞でのｐ１６誘導、ＨＴ１０８０  ｐ２１−９細胞でのｐ２１誘導、ＨＴ１０８０  ｐ２７−２細胞でのｐ２７誘導の効果、および、そのような誘導におけるＮＦκＢのドミナントインヒビター（ＩＫＫ）の効果を図示している。ＩＰＴＧまたはコトランスフェクトしたＩＫＫが存在するか、またはしないかを、各実験に関して示している。ルシフェラーゼレベルを、ＩＰＴＧの存在下または不存在下で、３日後に測定し、そして、コトランスフェクトしたｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドから発現したウミシイタケルシフェラーゼのレベルによって、正規化した。
【表Ｉ】
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2005518222.tif 000009
【表ＩＩ】
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【配列表】
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2005518222.tif 000045
【図１】
2005518222.tif 000046
【図２】
2005518222.tif 000047
【図３】
2005518222.tif 000048
【図３Ｄ】
2005518222.tif 000049
【図４】
2005518222.tif 000050
【図５】
2005518222.tif 000051
【図６】
2005518222.tif 000052
【図７】
2005518222.tif 000053
【図８】
2005518222.tif 000054
【図９Ａ．Ｂ】
2005518222.tif 000055
【図９Ｃ．Ｄ】
2005518222.tif 000056
【図９Ｅ．Ｆ】
2005518222.tif 000057
【図９Ｇ．Ｈ】
2005518222.tif 000058
【図９Ｉ】
2005518222.tif 000059
【図１０】
2005518222.tif 000060
【図１１】
2005518222.tif 000061
【図１２Ａ．Ｂ】
2005518222.tif 000062
【図１２Ｃ．Ｄ】
2005518222.tif 000063
【図１２Ｅ】
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