(57)【要約】  ソロスペルミンは、細胞毒性ジヒドロフラノキサントンであり、これは、種々の腫瘍細胞系に対して著しい活性を示すことが発見された。残念なことに、ソロスペルミンは、もはや、その天然植物源からは容易に入手できない。本発明は、ソロスペルミン類似物を調製する方法に関する。ソロスペルミン類似物を使用して細胞増殖を阻害する方法もまた、開示されている。前記反応工程は、１５℃と３０℃の間の温度で行われ、キラル分離を実行する工程も包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物を調製する方法：
【化１】
2005512948.tif 000100
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ７は、ＣＨ２である；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；
該方法は、以下の工程を包含する：
次式の化合物を、ＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）またはＰｄ（ＯＣＯＣＦ３）２およびベンゾキノンと反応させる工程：
【化２】
2005512948.tif 000101
ここで、Ｒ１〜Ｒ６およびＲ８は、上で定義したとおりであり、そしてＲ７は、ＣＨ３である、
方法。
【請求項２】
前記反応工程が、１５℃と３０℃の間の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式（２）の化合物が、次式を有する、請求項１に記載の方法：
【化３】
2005512948.tif 000102
【請求項４】
次式のソロスペルミン類似物を調製する方法：
【化４】
2005512948.tif 000103
Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６の各々は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；
該方法は、次式の化合物をジヒドロキシル化することに続いてエポキシ化する工程を包含する：
【化５】
2005512948.tif 000104
ここで、Ｒ１〜Ｒ５およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ７は、ＣＨ３である、
方法。
【請求項５】
さらに、キラル分離を実行する工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記式（３）の化合物が、（±）（２’Ｒ＊，３’Ｒ＊）または（±）（２’Ｒ＊，３’Ｓ＊）の絶対立体配置を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
次式を有する（−）ソロスペルミン類似物を調製する方法：
【化６】
2005512948.tif 000105
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；
該方法は、次式の化合物の立体異性体の未分割混合物に対してキラル分離クロマトグラフィーを実行する工程を包含する：
【化７】
2005512948.tif 000106
ここで、Ｒ１〜Ｒ８は、上で定義したとおりである、
方法。
【請求項８】
次式を有するソロスペルミン類似物を調製する方法：
【化８】
2005512948.tif 000107
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；
該方法は、次式の化合物をジヒドロキシル化剤およびキラル配位子で処理して、ジヒドロキシル化生成物を得、続いて、該ジヒドロキシル化生成物をエポキシ化する工程を包含する：
【化９】
2005512948.tif 000108
ここで、Ｒ１〜Ｒ６およびＲ８は、上で定義したとおりであり、そしてＲ７は、ＣＨ２である、
方法。
【請求項９】
細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、細胞を、有効量の次式を有する化合物と接触させる工程を包含する：
【化１０】
2005512948.tif 000109
ここで、Ｒ１〜Ｒ８は、請求項１で定義したとおりである、
方法。
【請求項１０】
前記細胞が、癌細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞の増殖を阻害する方法であって、ここで、該癌細胞は、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、骨髄腫細胞、卵巣癌細胞または乳癌細胞であり、該方法は、該細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【化１１】
2005512948.tif 000110
ここで、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである、
方法。
【請求項１２】
前記癌細胞が、多剤耐性（ＭＤＲ）癌細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＤＲ癌細胞が、トポイソメラーゼＩＩインヒビターに耐性である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＭＤＲが、ＭＲＰ−１または糖タンパク質により媒介される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、哺乳動物にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡの配列特異的アルキル化を誘導する方法であって、該方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【化１２】
2005512948.tif 000111
ここで、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである、
方法。
【請求項１７】
トポイソメラーゼＩＩの活性を阻害する方法であって、該方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【化１３】
2005512948.tif 000112
ここで、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである、
方法。
【請求項１８】
発癌遺伝子を下方制御する方法であって、該方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【化１４】
2005512948.tif 000113
ここで、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである、
方法。
【請求項１９】
前記発癌遺伝子が、ＢＭＩ−１である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＢＭＩ−１に関連した癌に罹った患者を確認する方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：
ａ）患者から第一試料を得る工程；
ｂ）該第一試料中のＢＭＩ−１タンパク質または核酸の量を測定する工程；
ｃ）該第一試料中の該ＢＭＩ−１タンパク質または核酸の量を、非癌性被験体から得た第二試料と比較する工程；
ここで、該第二試料と比べた該第一試料中のＢＭＩ−１タンパク質または核酸の高い量は、ＢＭＩ−１に関連した癌を示す、
方法。
【請求項２１】
次式の化合物を含有する、製薬組成物：
【化１５】
2005512948.tif 000114
各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである、
組成物。
【請求項２２】
過剰増殖障害に罹った被験体を治療する方法であって、該方法は、該被験体に、次式の化合物を投与する工程を包含する：
【化１６】
2005512948.tif 000115
各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである、
方法。
【請求項２３】
さらに、前記被験体を、化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法または手術の１種またはそれ以上で治療する工程を包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
次式の化合物：
【化１７】
2005512948.tif 000116
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ７は、ＣＨ３である；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである、
化合物。
【請求項２５】
次式の化合物：
【化１８】
2005512948.tif 000117
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ７は、ＣＨ２である；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである、
化合物。
【請求項２６】
次式の化合物：
【化１９】
2005512948.tif 000118
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである、
化合物。
【請求項２７】
次式の化合物：
【化２０】
2005512948.tif 000119
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである、
化合物。
【請求項２８】
Ｒ６が、Ｈである、請求項２４〜２７のいずれかに記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６が、Ｈである、請求項２４〜２７のいずれかに記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ８が、メチルである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ５が、ＯＣＨ３であり、そしてＲ１が、Ｏ−アルキルまたはＯＨである、請求項３０に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本願は、２００１年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／２９２，１８９号から優先権を主張している。上で参照した開示の全内容は、棄権されることなく本明細書中で参考として援用されている。政府は、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙからの認可番号ＰＦ−９９−３４９−０１およびｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの認可番号ＣＡ４９７５１に従って、本発明の権利を保有する。
【技術分野】
【０００２】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、一般に、化学および細胞生物学の分野に関し、さらに具体的には、ソロスペルミンおよびソロスペルミンアナログおよびそれらの腫瘍インヒビターとしての使用に関する。
【０００３】
（ＩＩ．従来技術の簡単な説明）
過去２０年間にわたって、ＤＮＡを標的にした抗腫瘍剤の選択的な抗腫瘍活性に関与している分子機構の解明は、著しく進歩している。例えば、現在、アドリアマイシンは、トポイソメラーゼＩＩ毒であり、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）は、トポイソメラーゼＩ毒であり、そして、シス−Ｐｔは、ＤＮＡを架橋し、ＤＮＡ結合タンパク質を隔離またはハイジャックすることにより、その選択性を発現し得る。さらに最近では、アポトーシスを引き起こす情報伝達経路が明らかにされ、ｐ５３の重要性および他の多数の情報伝達分子の関与が推測された。下流エフェクターは、抗腫瘍活性の重要なモジュレーターとなっており、細胞静止剤、分化剤およびテロメラーゼインヒビターを使用して、さらに特異的な治療戦略が想定されている。これらのアプローチは、依然として、実験段階であるが、これまでより穏やかな形態の癌治療に希望がある。
【０００４】
抗アポトーシス因子が関与している下流エフェクター経路を下方制御することが示されている１つの有望な化合物には、ソロスペルミン（ｐｓｏｒｏｓｐｅｒｍｉｎ）がある。ソロスペルミンは、細胞傷害性ジヒドロフラノキサントンである。光学活性（−）ソロスペルミンは、アフリカの植物であるｐｓｏｒｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｆｅｂｒｉｆｕｇｕｍの根および茎樹皮から単離される。ソロスペルミンは、機構的には、抗腫瘍抗生物質のプルラマイシンファミリーと関連しており、インビトロで、種々の腫瘍細胞系に対して著しい活性を示すこと、また、インビボで、Ｐ３８８マウス白血病に対して著しい活性を示すことが分かっている（Ｃａｓｓａｄｙら、１９９０；Ｋｕｐｃｈａｎら、１９８０；Ｋｗｏｋら、１９９８）。
【０００５】
ソロスペルミンは、プルラマイシンのような類似の化合物と比較して、二重鎖ＤＮＡに対する反応性が低く配列選択性に乏しいが、インビトロ細胞傷害性は少なくとも同等であり、かつ、ＮＣＩ  ６０−パネルスクリーン（ＮＣＩ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｗｅｂ  Ｓｉｔｅ）では、非常に興味深いプロフィールであるので、抗癌剤として特に魅力的である。選択性トリガーは、インビトロに存在しているはずと考えられ、種々の提案がなされており、これには、ソロスペルミン誘発非塩基（ａｂａｓｉｃ）部位の結果としてのＤＮＡタンパク質架橋および潜在的架橋タンパク質としてのトポイソメラーゼＩまたはＩＩが挙げられる（Ｐｅｒｍａｎａら、１９９４）。
【０００６】
残念なことに、光学活性（−）ソロスペルミンは、もはや、アフリカでのその天然植物源からは容易に入手できない。さらに、使用可能な量でソロスペルミンを合成する公知方法も存在しない。従って、ソロスペルミンおよびソロスペルミンアナログを合成する方法が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明によれば、ソロスペルミンアナログを生成し得るフラノキサントン化合物を調製する方法が提供され、フラノキサントンは、次式を有する：
【０００８】
【化２１】
2005512948.tif 000002
【０００９】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；Ｒ７’は、ＣＨＲであり、ここで、Ｒは、アルキルまたはＨである；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。
【００１０】
この方法は、次式を有する第一化合物を得る工程、およびこの第一化合物を、ＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）またはＰｄ（ＯＣＯＣＦ３）２およびベンゾキノンと反応させる工程を包含する：
【００１１】
【化２２】
2005512948.tif 000003
【００１２】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；Ｒ７は、ＣＨ２Ｒであり、ここで、Ｒは、アルキルまたはＨである；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。好ましい１実施態様では、この反応は、１５℃と３０℃の間で起こる。１実施態様では、第一化合物は、次式を有する：
【００１３】
【化２３】
2005512948.tif 000004
【００１４】
そして得られたフラノキサントン化合物は、次式を有する：
【００１５】
【化２４】
2005512948.tif 000005
【００１６】
次式を有するソロスペルミンアナログを調製する方法も、提供されている：
【００１７】
【化２５】
2005512948.tif 000006
【００１８】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。この方法は、次式を有する第一化合物を得る工程、およびこの第一化合物を、ＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）およびベンゾキノンと、またはＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（ＯＣＯＣＦ３）２およびベンゾキノンと反応させる工程を包含する：
【００１９】
【化２６】
2005512948.tif 000007
【００２０】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；Ｒ７は、ＣＨ２Ｒであり、ここで、Ｒは、アルキルまたはＨである；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。この反応は、さらに、エポキシ化またはエポキシド形成反応を実行する工程を包含し得る。１実施態様では、これらのソロスペルミンアナログは、（±）（２’Ｒ＊，３’Ｒ＊）または（±）（２’Ｒ＊，３’Ｓ＊）の絶対立体配置を有し得る。
【００２１】
別の実施態様では、次式を有する（−）ソロスペルミンアナログを調製する方法も、提供されている：
【００２２】
【化２７】
2005512948.tif 000008
【００２３】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。この方法は、次式を有する第一化合物を得る工程、およびこの第一化合物を、ＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）およびベンゾキノンと、またはＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（ＯＣＯＣＦ３）２およびベンゾキノンと反応させて第二化合物を得る工程を包含する：
【００２４】
【化２８】
2005512948.tif 000009
【００２５】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；Ｒ７は、ＣＨ２Ｒであり、ここで、Ｒは、アルキルまたはＨである；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。この方法は、さらに、第二化合物の非対称ジヒドロキシル化を実行して、（＋）ジアステレオマーおよび（−）ジアステレオマーを含有する第三化合物を形成する工程、第三化合物の（−）ジアステレオマーを単離する工程、ならびにエポキシ化またはエポキシド形成反応を実行する工程を包含し得る。
【００２６】
１実施態様では、得られたソロスペルミンアナログは、（−）（２’Ｒ，３’Ｒ）または（−）（２’Ｒ，３’Ｓ）の絶対立体配置を有する。さらに、この非対称ジヒドロキシル化は、第一化合物を、（１）ｔＢｕ−ＯＨ、ＣＨ３ＣＮ、Ｈ２Ｏ、ＯｓＯ４およびキラル配位子、（２）キラル配位子、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、Ｋ２ＣＯ３およびＫ２ＯｓＯ４−２Ｈ２Ｏ、または（３）ｔＢｕ−ＯＨ、ＣＨＣｌ３、Ｈ２Ｏ、ＯｓＯ４およびキラル配位子と反応させる工程を包含し得る。第三化合物の（−）ジアステレオマーは、クロマトグラフィーで単離され得る。
【００２７】
さらに別の実施態様では、次式を有する（−）ソロスペルミンアナログを調製する方法が提供される：
【００２８】
【化２９】
2005512948.tif 000010
【００２９】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。この方法は、次式を有する第一化合物を得る工程、ならびに第一化合物を、ＤＭＳＯ中にて、キラル配位子、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）およびベンゾキノンと、またはＤＭＳＯ中にて、キラル配位子、Ｐｄ（ＯＣＯＣＦ３）２およびベンゾキノンと反応させる工程を包含する：
【００３０】
【化３０】
2005512948.tif 000011
【００３１】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルである；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；Ｒ７は、ＣＨ２Ｒであり、ここで、Ｒは、アルキルまたはＨである；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。好ましい１実施態様では、このキラル配位子は、ｉｐ−ボキサックス、ビスオキサソリンビナフチルまたはスピロ−ビス（イソキサゾリン）を含有し得る。この方法はまた、エポキシ化またはエポキシド形成反応を実行する工程を包含し得る。得られたソロスペルミンアナログは、（−）（２’Ｒ，３’Ｒ）または（−）（２’Ｒ，３’Ｓ）の絶対立体配置を有し得る。
【００３２】
別の実施態様では、次式を有するソロスペルミンアナログを調製する方法が開示されている：
【００３３】
【化３１】
2005512948.tif 000012
【００３４】
ここで、Ｒは、水素、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、ベンジル、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。この方法は、次式を有する第一化合物を得る工程、第一化合物を、ＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）およびベンゾキノンと、またはＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（ＯＣＯＣＦ３）２およびベンゾキノンと反応させる工程、脱保護反応を実行する工程、その５’位置に位置している酸素にＲ基を導入する工程、およびエポキシ化またはエポキシド形成反応を実行する工程を包含する：
【００３５】
【化３２】
2005512948.tif 000013
【００３６】
ここで、Ｘは、保護基である。
【００３７】
Ｒ基を導入する工程は、アルキル化剤および塩基との化学反応を実行する工程を包含し得る。好ましい１実施態様では、Ｒ基を導入する工程は、ＣＨ３ＩおよびＫ２ＣＯ３、ＡｃＣｌおよびＫ２ＣＯ３、またはＢｎＢｒおよびＫ２ＣＯ３との化学反応を実行する工程を包含する。保護基であるＸは、第三級ブチルシランを含有し得る。
【００３８】
さらに別の実施態様では、次式を有するソロスペルミンアナログを調製する方法が提供される：
【００３９】
【化３３】
2005512948.tif 000014
【００４０】
ここで、Ｒは、水素、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、ベンジル、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。この方法は、次式の第一化合物を得る工程、その１位にある酸素からＣＨ３基を除去する反応を実行する工程、アルキル化剤および塩基との化学反応を実行する工程、およびエポキシ化またはエポキシド形成反応を実行する工程を包含する：
【００４１】
【化３４】
2005512948.tif 000015
【００４２】
１実施態様では、その１位にある酸素からＣＨ３基を除去する反応を実行する工程は、ＢＣｌ３との化学反応を実行する工程を包含し得る。アルキル化剤および塩基との化学反応を実行する工程は、ＥｔＩおよびＣｓ２ＣＯ３、イソプロピルブロマイド、ＫＩ、Ｃｓ２ＣＯ３、ＡｃＣｌおよびＫ２ＣＯ３、またはＢｎＢｒおよびＫ２ＣＯ３との化学反応を実行する工程を包含し得る。
【００４３】
細胞増殖を阻害する方法もまた、提供されている。この方法は、細胞を、有効量の次式を有する化合物と接触させる工程を包含する：
【００４４】
【化３５】
2005512948.tif 000016
【００４５】
ここで、Ｒ１およびＲ２は、別個に、水素、ベンジル、アルキル、アセチル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。細胞は、癌細胞、さらに特定すると、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、卵巣癌細胞または乳癌細胞であり得る。癌細胞はまた、多剤耐性（ＭＤＲ）癌細胞であり得る。ＭＤＲ癌細胞が、トポイソメラーゼＩＩインヒビターに耐性であり得、ＭＲＰ−１または糖タンパク質により媒介され得る。細胞はまた、哺乳動物にあり得る。
【００４６】
ＤＮＡの配列特異的アルキル化を誘導する方法もまた、提供されている。この方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【００４７】
【化３６】
2005512948.tif 000017
【００４８】
ここで、Ｒ１およびＲ２は、別個に、水素、ベンジル、アルキル、アセチル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。別の実施態様では、トポイソメラーゼＩＩの活性を阻害する方法が提供され、方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【００４９】
【化３７】
2005512948.tif 000018
【００５０】
ここで、Ｒ１およびＲ２は、別個に、水素、ベンジル、アルキル、アセチル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。
【００５１】
さらに別の実施態様では、発癌遺伝子を下方制御する方法が提供されている。方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【００５２】
【化３８】
2005512948.tif 000019
【００５３】
ここで、Ｒ１およびＲ２は、別個に、水素、ベンジル、アルキル、アセチル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。発癌遺伝子は、ＢＭＩ−１であり得る。
【００５４】
さらに他の実施態様では、ＢＭＩ−１に関連した癌に罹った患者を同定する方法が提供されている。方法は、患者から第一試料を得る工程、第一試料中のＢＭＩ−１タンパク質または核酸の量を測定する工程、第一試料中のＢＭＩ−１タンパク質または核酸の量を、非癌性被験体から得た第二試料と比較する工程を包含し、ここで、第二試料と比べた第一試料中のＢＭＩ−１タンパク質または核酸の高い量は、ＢＭＩ−１に関連した癌を示す。
【００５５】
さらに、本発明はまた、次式を有する化合物を含有する薬学的組成物に関する：
【００５６】
【化３９】
2005512948.tif 000020
【００５７】
ここで、Ｒ１およびＲ２は、別個に、水素、ベンジル、アルキル、アセチル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。
【００５８】
ソロスペルミンアナログもまた、開示されており、ソロスペルミンアナログは、次式を有する：
【００５９】
【化４０】
2005512948.tif 000021
【００６０】
ここで、Ｒ１およびＲ２は、別個に、水素、ベンジル、アルキル、アセチル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。
【００６１】
さらに、本発明はまた、次式を有する化合物に関する：
【００６２】
【化４１】
2005512948.tif 000022
【００６３】
ここで、Ｒ１〜Ｒ５およびＲ７〜Ｒ８は、別個に、水素、フェニル、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。
【００６４】
本発明はまた、次式の化合物を調製する方法を包含する：
【００６５】
【化４２】
2005512948.tif 000023
【００６６】
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ７は、ＣＨ２である；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；
方法は、以下の工程を包含する：
次式の化合物を、ＤＭＳＯ中にて、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）またはＰｄ（ＯＣＯＣＦ３）２およびベンゾキノンと反応させる工程：
【００６７】
【化４３】
2005512948.tif 000024
【００６８】
ここで、Ｒ１〜Ｒ６およびＲ８は、上で定義したとおりであり、そしてＲ７は、ＣＨ３である。
【００６９】
この方法は、１５℃と３０℃の間の温度の反応を包含し得る。
【００７０】
式（２）の化合物は、次式を有し得る：
【００７１】
【化４４】
2005512948.tif 000025
【００７２】
別の実施態様では、次式のソロスペルミンアナログを調製する方法が提供される：
【００７３】
【化４５】
2005512948.tif 000026
【００７４】
Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６の各々は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；
方法は、次式の化合物をジヒドロキシル化することに続いてエポキシ化する工程を包含する：
【００７５】
【化４６】
2005512948.tif 000027
【００７６】
ここで、Ｒ１〜Ｒ５およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ７は、ＣＨ３である。
【００７７】
この方法は、さらに、キラル分離を実行する工程を包含し得る。式（３）の化合物は、（±）（２’Ｒ＊，３’Ｒ＊）または（±）（２’Ｒ＊，３’Ｓ＊）の絶対立体配置を有し得る。
【００７８】
さらに別の実施態様では、次式を有する（−）ソロスペルミンアナログを調製する方法が提供される：
【００７９】
【化４７】
2005512948.tif 000028
【００８０】
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；
方法は、次式の化合物の立体異性体の未分割混合物に対してキラル分離クロマトグラフィーを実行する工程を包含する：
【００８１】
【化４８】
2005512948.tif 000029
【００８２】
ここで、Ｒ１〜Ｒ８は、上で定義したとおりである。
【００８３】
さらに別の実施態様では、次式を有するソロスペルミンアナログを調製する方法が提供される：
【００８４】
【化４９】
2005512948.tif 000030
【００８５】
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；
方法は、次式の化合物をジヒドロキシル化剤およびキラル配位子で処理して、ジヒドロキシル化生成物を得、続いて、ジヒドロキシル化生成物をエポキシ化する工程を包含する：
【００８６】
【化５０】
2005512948.tif 000031
【００８７】
ここで、Ｒ１〜Ｒ６およびＲ８は、上で定義したとおりであり、そしてＲ７’は、ＣＨ２である。
【００８８】
また、細胞増殖を阻害する方法が提供され、方法は、細胞を、有効量の次式を有する化合物と接触させる工程を包含する：
【００８９】
【化５１】
2005512948.tif 000032
【００９０】
ここで、Ｒ１〜Ｒ８は、請求項１で定義したとおりである。細胞が、癌細胞であり得る。
【００９１】
他の方法が提供され、これは、癌細胞の増殖を阻害し、ここで、癌細胞は、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、骨髄腫細胞、卵巣癌細胞または乳癌細胞であり、方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【００９２】
【化５２】
2005512948.tif 000033
【００９３】
ここで、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである。
【００９４】
癌細胞は、多剤耐性（ＭＤＲ）癌細胞であり得、そしてＭＤＲ癌細胞は、トポイソメラーゼＩＩインヒビターに耐性であり得る。ＭＤＲは、ＭＲＰ−１または糖タンパク質により媒介され得る。細胞は、哺乳動物にあり得る。
【００９５】
さらに他の実施態様では、ＤＮＡの配列特異的アルキル化を誘導する方法が提供され、方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【００９６】
【化５３】
2005512948.tif 000034
【００９７】
ここで、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである。
【００９８】
また、トポイソメラーゼＩＩの活性を阻害する方法が提供され、方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【００９９】
【化５４】
2005512948.tif 000035
【０１００】
ここで、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである。
【０１０１】
別に提供された発癌遺伝子を下方制御する方法は、細胞を、有効量の次式の化合物と接触させる工程を包含する：
【０１０２】
【化５５】
2005512948.tif 000036
【０１０３】
ここで、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は、請求項１で定義したとおりであり、そしてＲ５は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである。発癌遺伝子は、ＢＭＩ−１であり得る。
【０１０４】
さらに別の実施態様は、ＢＭＩ−１に関連した癌に罹った患者を同定する方法を提供し、方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から第一試料を得る工程；（ｂ）第一試料中のＢＭＩ−１タンパク質または核酸の量を測定する工程；（ｃ）第一試料中のＢＭＩ−１タンパク質または核酸の量を、非癌性被験体から得た第二試料と比較する工程；ここで、第二試料と比べた第一試料中のＢＭＩ−１タンパク質または核酸の高い量は、ＢＭＩ−１に関連した癌を示す。
【０１０５】
また、次式の化合物を含有する製薬組成物が提供される：
【０１０６】
【化５６】
2005512948.tif 000037
【０１０７】
各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである。
【０１０８】
別の提供された過剰増殖障害に罹った被験体を治療する方法は、被験体に、次式の化合物を投与する工程を包含する：
【０１０９】
【化５７】
2005512948.tif 000038
【０１１０】
各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである。
【０１１１】
この方法は、さらに、被験体を、化学療法、放射線療法、免疫療法、遺伝子療法または手術の１種またはそれ以上で治療する工程を包含する。
【０１１２】
別の提供された化合物は、次式を有する：
【０１１３】
【化５８】
2005512948.tif 000039
【０１１４】
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ７は、ＣＨ３である；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；または
【０１１５】
【化５９】
2005512948.tif 000040
【０１１６】
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；
Ｒ７’は、ＣＨ２である；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；または
【０１１７】
【化６０】
2005512948.tif 000041
【０１１８】
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである；または
【０１１９】
【化６１】
2005512948.tif 000042
【０１２０】
ここで、各Ｒ１〜Ｒ４およびＲ６は、別個に、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ハロゲンまたはアルキルである；
Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルである；そして
Ｒ８は、Ｈまたはアルキルである。
【０１２１】
これらの化合物では、Ｒ６がＨであり得る。これらの化合物では、Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６がＨであり得る。これらの化合物では、Ｒ８がメチルであり得る。これらの化合物では、Ｒ５がＯＣＨ３であり得、そしてＲ１がＯ−アルキルまたはＯＨであり得る。
【０１２２】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．本発明）
図１で示すソロスペルミンは、強力なＤＮＡアルキル化抗腫瘍剤である。ソロスペルミンの生物学的活性を担う正確な分子機構は、未知であるが、ソロスペルミンの抗腫瘍活性は、そのＤＮＡ−トポイソメラーゼＩＩ錯体との相互作用に関連していると考えられている。これは、他の細胞酵素機能を阻止し、最終的に、細胞死を引き起こす。
【０１２３】
本明細書中で開示したソロスペルミンアナログの一部はまた、抗−アポトーシス因子（例えば、ＢＭＩ−１）を含む下流エフェクター経路を下方制御するのに使用され得る。ソロスペルミンアナログは、現在利用できる臨床的に有効なトポイソメラーゼＩＩ毒（例えば、ドキソルビシンおよびミトキサントロン）またはアルキレーター（例えば、シクロホスファミドおよびＢＣＮＵ）（これらの化合物は、最も成功した抗腫瘍剤にはいるものの）よりも有意な利点を有すると予測されている。
【０１２４】
現在、使用可能な量でソロスペルミンアナログを合成する公知方法は、存在しない。本明細書中で使用する「ソロスペルミンアナログ」との用語は、ソロスペルミンそれ自体およびそのアナログの両方を含むと解釈される。さらに、ソロスペルミンは、もはや、アフリカでのその天然植物源からは入手できない。本発明は、市販の出発物質からソロスペルミンアナログの全量を生成する合成方法を提供する。これは、新規環化反応を使用して重要なベンゾフラン部分（これは、さらに反応して、ソロスペルミンアナログを生じ得る）を形成することにより、可能となる。さらに、この反応は、光学活性（−）ソロスペルミンアナログを生成するように改変できる。これは、光学活性（−）化合物が特に有効な抗腫瘍剤であると考えられているので、望ましい。
【０１２５】
（ＩＩ．トポイソメラーゼＩＩ）
ＩＩ型トポイソメラーゼは、必須核酵素であり、これは、ＤＮＡの位相的状況を制御する（Ｗａｎｇ，１９９６）。トポイソメラーゼＩＩ触媒サイクルは、いくつかの別個の工程から成る。最初に、トポイソメラーゼＩＩは、二重鎖ＤＮＡとの非共有結合錯体を形成する。Ｍｇ２＋の存在下にて、次いで、プレストランド通過段階にて、二本鎖ＤＮＡ開裂および再連結平衡が確立され、トポイソメラーゼＩＩチロシン残基は、切断したＤＮＡの５’−リン酸に結合する。次に、ＡＴＰの結合後、インタクトなＤＮＡ二重鎖は、一過性二本鎖切断部位（または「ゲート部位」）を通る。次いで、ＤＮＡの切断および再連結に関与しているポストストランド通過平衡が確立される。最後に、この再連結後、ＡＴＰは、加水分解されて、酵素の代謝回転および引き続くサイクルの開始を促進する（Ｗａｔｔら、１９９４；Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、１９９１）。
【０１２６】
（ＩＩＩ．トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としてのソロスペルミン）
ソロスペルミンとトポイソメラーゼＩＩ−ＤＮＡ錯体との相互作用により、ＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩ部位特異的アルキル化が生じ、これは、トポイソメラーゼＩＩ−ＤＮＡ共有結合錯体の形成前の工程で起こることが立証されている（Ｈａｎｓｅｎら、１９９６；Ｋｗｏｋら、１９９８；ＫｗｏｋおよびＨｕｒｌｅｙ，１９９８）。アルキル化に加えて、抗腫瘍活性の他の原因には、以下があり得る：（１）トポイソメラーゼＩＩ毒−このアルキル化は、共有結合したＤＮＡ／トポイソメラーゼＩＩ錯体を捕獲し得、これは、その切断／再結合反応を妨害する；（２）可逆的トポイソメラーゼＩＩ開裂であり、その結果、脱プリン化非塩基部位が生じる；および（３）トポイソメラーゼ開裂の触媒阻害剤。
【０１２７】
（Ａ．ソロスペルミン−（Ｎ７−グアニン）−ＤＮＡ付加物の構造）
図２で示すように、ＤＮＡ内のグアニンのＮ７との共有結合の機構を規定するために、およびこの共有結合反応に対するＤＮＡ配列選択性を決定するために、ゲル電気泳動および強磁界ＮＭＲが、以前には使用された（Ｈａｎｓｅｎら、１９９６）。ソロスペルミンは、１０１と１０２の間にあり、プルラマイシンよりも反応性が低い。また、プロラマイシンとは異なり、アルキル化グアニンの３’部位に対する塩基対の選択性はないが、５’側の塩基対に対する異なる選択性がある。
【０１２８】
反応性が高い部位および反応性が中程度の部位の両方には、ソロスペルミンは、その５’側に位置しているグアニンに対して、最も高い優先度を示し、その５’位置にあるアデニンに対して、２番目の優先度を示し、同じ部位にあるピリミジンを有するグアニンとの反応性のみが低い。プロラマイシンと同様に、ソロスペルミンは、ＤＮＡにインターカレートし、反応性エポキシドを、そのインターカレート部位の３’側に位置しているグアニンの近傍に位置付ける。ＮＭＲの結果から、グアニンのＮ７と、ソロスペルミン配位子上のエポキシドのＣＤ４’との間には、共有結合が生じることが明らかである。図３を参照。しかしながら、これらの類似性にもかかわらず、ＤＮＡ結合の提案されたプレ共有結合（ｐｒｅｃｏｖａｌｅｎｔ）モードは、プロラマイシンよりもアクリジン類の試薬に類似している（Ｈａｎｓｅｎら、１９９６）。アクリジンと同様に、ソロスペルミンは、プロラマイシンの直交配向特性とは反対に、隣接塩基対に平行な配向で、その芳香族発色団を積み重ねる（ＨａｎｓｅｎおよびＨｕｒｌｅｙ，１９９５；Ｓｕｎら、１９９５；Ｈａｎｓｅｎ，Ｙｕｎ，およびＨｕｒｌｅｙ，１９９５）。
【０１２９】
この点では、ソロスペルミン−ＤＮＡ相互作用は、キナクリンナイトロジェンマスタードのものに似ている（Ｂａｇｕｌｅｙ，１９９１；Ｇｏｐａｌａｋｒｉｓｈｎａｎら、１９９２）。この塩基対の垂直配向ではなく平行配向は、著しい溝相互作用なしで共有結合アルキル化前に錯体を安定化するために塩基スタッキング相互作用を最大にすることが重要であることを説明しているので、重要である。さらに、これらの向上した塩基対スタッキング相互作用を使っても、ソロスペルミンは、アルキル化性能に乏しいか中程度であるにすぎない。このことは、そのアルキル化配列選択性がトポイソメラーゼＩＩによる部位特異的アルキル化により決定されるので、重要であり、最大の選択性を達成するためには、トポイソメラーゼＩＩなしでの共有結合反応性が最小であることが好ましい。
【０１３０】
（Ｂ．トポイソメラーゼＩＩは、ソロスペルミンによるＤＮＡの部位特異的アルキル化を指向する）
トポイソメラーゼＩＩは、ソロスペルミンによるＤＮＡの配列特異的アルキル化を指向する。比較すると、プロラマイシンのアルキル化は、トポイソメラーゼＩＩの濃度を高くすると、阻害される。ソロスペルミンは、無細胞系では、配列選択性およびＤＮＡとの反応性に乏しいのに対して、インビトロ系では、トポイソメラーゼＩＩにより指向されるずっと高い反応性および配列選択性を示す。その立体化学的要件から、プロラマイシンが影響を受けないのに、ソロスペルミンのトポイソメラーゼＩＩ増強が何故起こるのかが分かる。
【０１３１】
ソロスペルミンなしでは、トポイソメラーゼＩＩ媒介ＤＮＡ開裂の強度は、部位Ａよりも部位Ｂの方がずっと小さい。ソロスペルミンの濃度が高まるにつれて、部位ＡでのトポイソメラーゼＩＩ媒介ＤＮＡ開裂は、少なくなったのに対して、部位Ｂでの開裂は、高まった。トポイソメラーゼＩＩによるソロスペルミン誘導性ＤＮＡの開裂は、１０μＭの薬剤濃度で、最大で３倍に達する（図４）。この結果は、部位Ｂでのソロスペルミンアナログのアルキル化がこの部位でのトポイソメラーゼＩＩ−ＤＮＡ錯体を捕獲することを示唆している。他方、部位Ａでの開裂した錯体の形成は、ソロスペルミンの存在下では、部位Ａでのソロスペルミンアルキル化の３倍向上にもかかわらず、低下した。
【０１３２】
部位ＡおよびＢは、互いに離れた３個の塩基対であり、ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａトポイソメラーゼＩＩは、ＤＮａｓｅＩフットプリント実験の結果に基づいて、約２３個の塩基対の領域を結合する（Ｌｅｅら、１９８９）。従って、部位ＡおよびＢは、トポイソメラーゼＩＩの結合に対して、互いに競合しており、部位Ｂでのソロスペルミンアルキル化の２５倍向上は、この競合を支配していると思われる。図５は、ソロスペルミンによるＤＮＡの部位特異的アルキル化の３つの可能な生化学結果を要約している。ソロスペルミンは、７−アルキル付加物であるので、脱プリンは、室温で、数日間にわたって、ゆっくりと起こる。
【０１３３】
臨床的に重要な多数の抗癌剤は、トポイソメラーゼＩＩを標的にすることにより、腫瘍細胞を殺すことが明らかとなっている（Ｏｓｈｅｒｏｆｆら、１９９７；Ｌｉｕ，１９８９）。表１で示すように、トポイソメラーゼＩＩ毒のＤＮＡ結合の多数の様式がある。（Ｃａｐｒａｎｉｃｏ  ａｎｄ  Ｂｉｎａｓｃｈｉ，１９９８）。
【０１３４】
（表１．真核生物ＤＮＡトポイソメラーゼ毒のＤＮＡ結合の様式）
【０１３５】
【表１】
2005512948.tif 000043
【０１３６】
これらの３つの形式、すなわち、純粋インターカレーター、溝結合剤および混合した溝結合剤／インターカレーターのうち、混合した溝結合剤／インターカレーター様式の化合物は、トポイソメラーゼＩＩ毒として、最も有効である。この群に属するものとして、臨床的に有効なアントラサイクリン、ｍＡＭＳＡおよびキノロンがある。ソロスペルミンは、これらの確立された群のいずれにも合わない。その代わりに、それは、第四群に属し、この群は、共有結合インターカレーター型と呼ばれ得る。ソロスペルミンは、機構上／構造上の基準で、これらの他の薬剤とは離れている。
【０１３７】
その部位選択性（例えば、インターカレーションまたは溝結合部位の周りの配列選択性）は、一群のトポイソメラーゼＩＩ毒と他の群（例えば、Ａ−１、ドキソルビシンに対するＡ＋１およびＣ／Ｔ−１、ミトキサトロンに対するＧ＋１）とは異なり、一般に、細胞毒性と二本鎖切断の生成との間で相関がある１群に入る（Ｐｏｍｍｉｅｒら、１９８９；Ｃｏｖｅｙら、１９８８；Ｚｗｅｌｌｉｎｇら、１９８１）。しかしながら、異なる部位で開裂する異なる薬剤群の間では、細胞毒性と二本鎖切断との間には相関がなく、このことは、そのゲノム内の異なる部位での開裂が異なる生物学的結果を引き起こし得ることを示唆している（Ｐｏｍｍｉｅｒら、１９８９；Ｃｏｖｅｙら、１９８８；Ｚｗｅｌｌｉｎｇら、１９８１）。
【０１３８】
エトポシドおよびｍＡＭＳＡについては、インビボでのトポイソメラーゼＩＩ誘導性開裂の部位は、異なる（Ｐｏｍｍｉｅｒら、１９９２）。ｃ−ｍｙｃプロトオンコジーンでは、そのＰ２部位では、ｍＡＭＳＡだけが開裂する（Ｐｏｍｍｉｅｒら、１９９２）。ある場合、トポイソメラーゼＩＩの部位選択性に対するドキソルビシンの異なるアナログの効果が決定され、異なることが分かった（Ｃａｐｒａｎｉｃｏら、１９９５）。それは、薬剤特異的トポイソメラーゼＩＩ開裂が、薬剤の種類（例えば、アントラサイクリン対キノリン）だけでなく、その薬剤分子の独特の立体特性および電子特性にも依存していることを暗示し得る。従って、ソロスペルミンの異なるアナログは、トポイソメラーゼＩＩαおよびトポイソメラーゼＩＩβにより異なるグアニン部位をアルキル化するために部位特異的であるはずである。
【０１３９】
既存のトポイソメラーゼＩＩ毒よりもソロスペルミンが有利な点の要約は、表２で示す。
【０１４０】
（表２）
【０１４１】
【表２】
2005512948.tif 000044
【０１４２】
（Ｃ．ソロスペルミンによるトポイソメラーゼＩＩ誘導性ＤＮＡ開裂は可逆的である）
トポイソメラーゼＩＩゲート内のアルキル化部位、およびトポイソメラーゼＩＩ開裂およびリシーリングサイクルでアルキル化が起こるタイミングは、以前に決定された（ＫｗｏｋおよびＨｕｒｌｅｙ，１９９８）。ソロスペルミンによるＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩ誘導性アルキル化は、Ｍｇ２＋なしで起こるので、トポイソメラーゼＩＩ媒介鎖開裂事象に先行した時点で起こる。ソロスペルミンによるＤＮＡのアルキル化は、７−デアザグアニンによる標的グアニンの置換がアルキル化を妨げるので、トポイソメラーゼＩＩの存在下にて、グアニンのＮ７で起こる。
【０１４３】
ソロスペルミンによるトポイソメラーゼＩＩ誘導性ＤＮＡ開裂の刺激は、過剰な塩の付加により、ゆっくりと逆行できるので、これは、ソロスペルミンによるＤＮＡのアルキル化が可逆性トポイソメラーゼＩＩ−ＤＮＡ錯体を捕獲することを示している。トポイソメラーゼＩＩ媒介開裂の刺激を担っているのは、脱プリンから生じる無塩基部位ではなく、ソロスペルミン−ＤＮＡ付加物であると考えられている。トポイソメラーゼＩＩ開裂部位内でのソロスペルミンの正確な位置は、ＤＮＡ共有結合の化学的作用およびソロスペルミン−ＤＮＡ付加物の立体配座と共に、知られているので、この構造上の洞察により、新たなさらに有効なトポイソメラーゼＩＩ毒の設計および合成の指針が得られる。
【０１４４】
ソロスペルミンは、既存のトポイソメラーゼＩＩ毒または配列特異的アルカレートよりも明らかに有利な多数の固有の特徴を有する。第一に、ソロスペルミンは、共有結合トポイソメラーゼＩＩ毒であり、従って、ドキソルビシンまたはミトキサントロンと比較して、トポイソメラーゼＩＩゲートにおいて、無限の「滞留時間」を有する。第二に、トポイソメラーゼＩＩ部位特異的アルキル化のために、ソロスペルミンは、同程度のアルキル化剤よりもずっと高い配列選択性を有する。第三に、次に記述するように、ソロスペルミンおよびソロスペルミンアナログで治療した癌細胞では、過剰発現したオンコジーンの下方制御の証拠がある。
【０１４５】
（ＩＶ．ソロスペルミンによるオンコジーンの下方制御）
（Ａ．過剰発現オンコジーンの部位特異的アルキル化に対するトポイソメラーゼＩＩの使用）
トポイソメラーゼＩＩαおよびトポイソメラーゼＩＩβは、異なるオンコジーンの薬剤アルキル化を部位に指向され得、これは、ソロスペルミンアナログの正確な立体特性および電子特性に依存していると考えられている。トポイソメラーゼＩＩは、転写的に活性な領域でのアルキル化を部位に指向する重要な役割があるので、転写でのトポイソメラーゼＩＩの役割を確認することが重要である。原理的には、その転写性錯体は、ＤＮＡの周りで回転でき、それにより、トポイソメラーゼがＲＮＡポリメラーゼの前で高次コイルを蓄積することを妨げる必要性をなくす。しかし、トポイソメラーゼの欠失が転写を示し（Ｂｒｉｌｌら、１９８７ａ，ｂ；Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９９２）、トポイソメラーゼがないと、一時的な高次コイル化が起こる（ＬｉｕおよびＷａｎｇ，１９８７）ことは、明らかである。
【０１４６】
これらの観察は、トポイソメラーゼＩＩが転写活性領域でのソロスペルミンのアルキル化を指向できるという考えを裏付ける。この考えは、トポイソメラーゼＩＩ毒の立体的特徴および電子的特徴が部位特異的アルキル化に対する正確な配列に影響を与えることができるという前提と共に、ソロスペルミンアナログのライブラリから、転写活性遺伝子（例えば、癌細胞で活発に過剰発現されるオンコジーン（ＢＭＩ−１，ＢＣＬ−２，ｃ−ｊｕｎ，ｃ−ｍｙｃ））を標的にする化合物を選択することが重要であることを示唆している。トポイソメラーゼＩＩ毒性であるだけでなく抗アポトーシスである下流オンコジーンを下方制御するソロスペルミンアナログを選択すると、薬剤耐性腫瘍で活性な臨床的に有効な化合物として選択された化合物の潜在的な価値を著しく高める。
【０１４７】
特に、ソロスペルミンアナログは、ＢＭＩ−１を下方制御するのに使用され得ると考えられている。ＢＭＩ−１は、Ｐｏｌｙｃｏｍｂ群ファミリーに属する推定オンコジーンであり、白血病、リンパ腫、およびある種の固形腫瘍で発見されている。このＢＭＩ遺伝子は、染色体１０ｐ１３に位置しており、これは、小児白血病での染色体転座および悪性Ｔ細胞リンパ腫の再配列に関与している領域である（Ｂｅａら、２００１）。ＢＭＩ−１を下方制御する薬剤は、ｃ−ｍｙｃ誘導性アポトーシスの増加を生じると考えられている。
【０１４８】
どのソロスペルミンアナログがオンコジーンを標的にするかを決定するには、２段階アプローチが行われ得る。第一に、キサントンの周辺部での種々の部位における立体的かつ電子的相互作用の効果が決定され得る。これらの部位は、限られているが、周辺機能化が可能な場所を明らかにする。第二に、異なるインターカレート種および周辺置換基が試験できる。後者の種は、第一段階の結果に基づいて、選択され得る。
【０１４９】
（Ｂ．種々のオンコジーンのプロモーターアッセイ）
選択したオンコジーンは、別々のプロモーターアッセイで試験され得る。多数のオンコジーンをスキャンするために、ＤＮＡチップアレイ技術もまた、使用され得る。種々のオンコジーンは、選択したソロスペルミンアナログに対してアッセイされ、そのアナログがオンコジーンを調節する性能を決定できる。トポイソメラーゼＩＩであるだけでなく抗アポトーシスのオンコジーンを下方制御するソロスペルミンアナログを選択すると、これらの化合物が臨床的に有効な抗腫瘍剤である可能性が高まる。
【０１５０】
オンコジーンレポーターアッセイに対する種々のクローニング戦略は、当業者に明らかである。１方法には、市販のｐＧＬ２ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用することがある。そのフラグメントおよびベクターＤＮＡは、クローニングに対して適合性の末端を発生する制限酵素で消化され得る。大ていの場合、このＤＮＡフラグメントの末端は、合成リンカーを使用することによってか、適切な制限酵素に対する部位を含むプライマーを使うＰＣＲ反応によってか、またはその制限部位オーバーハングを満たすことによってかの、いずれかにより、改変を必要とし得る。５’リン酸基を除去するためには、ベクターＤＮＡを子ウシ腸ホスファターゼで処理することが有利であり、それにより、インサートなしで、このベクターのそれ自体への再閉鎖を防止する。
【０１５１】
消化工程、連結工程および形質転換工程に対する制御反応を実行するためには、十分なＤＮＡが調製され得る。正しいインサートＤＮＡの捕獲を保証するために、所望の制限フラグメントは、アクリルアミドまたはアガロースゲル上での電気泳動により精製され得、次いで、いくつかの方法（例えば、ＷｉｚａｒｄＴＭＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用する方法）の１つにより、そのゲルから回収され得る。あるいは、分画されていない制限フラグメントは、その標的プラスミドにクローン化され、次いで、プラスミドＤＮＡのゲル電気泳動により、所望の組換えが確認できる。
【０１５２】
真核細胞へのＤＮＡの形質移入は、カチオン性リポソーム（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）  Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＳｃｈｅｎｂｏｒｎおよびＧｏｉｆｆｏｎ，１９９１）、リン酸カルシウム（Ｃｕｌｌｅｎ，１９８７；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｃｕｌｌｅｎ，１９８７；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，１９８７）または電気穿孔（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８８）により、媒介され得る。ホタルルシフェラーゼは、ルシフェラーゼおよびＡＴＰを加えたときの光の発生を測定することにより、アッセイされ得る。一般に、これらのアッセイは、非常に急速かつ感受性である（ｄｅ  Ｗｅｔら、１９８７；Ｗｏｏｄ，１９９０）。目的の遺伝子からのプロモーターフラグメントは、ゲノムＤＮＡ配列から誘導したプライマーを使うＰＣＲにより、作製できる。ＰＣＲ反応は、２５回の増幅サイクルに対して、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で実行され得る。それらの生成物は、次いで、適切な制限酵素で切断でき、次いで、ｐＧＬ−２−Ｂａｓｉｃベクターにサブクローン化できる（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１５３】
例えば、リンパ腫細胞にあるＢＭＩ−１の特定の下方制御が立証されている。他の目的のオンコジーンは、ＢＣＬ−２である。ヒトＢＣＬ−２は、複雑な遺伝子構造を示し、同様に、複雑な発現戦略を示す。ｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）転座中に保持される２つの別々のプロモーター領域があり、この転座は、卵胞非ホジキンリンパ腫の８０％を超えるもので起こる（Ｙｕｎｉｓら、１９８２；Ｌｅｖｉｎｅら、１９８５）。この転座の結果は、ＢＣＬ−２−Ｉｇ対立遺伝子の調節解除であるのに対して、正常なＢＣＬ−２遺伝子は、転写的にサイレントである。ＢＣＬ−２−Ｉｇ融合遺伝子にあるＰ２プロモーターは、エキソンＩＩにあるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のすぐ５’にあり、古典的なＴＡＴＡ＋ＣＡＡＴボックスであり、予想どおり、２個の異なる開始部位が見られる。第二プロモーター（Ｐ１）は、エキソンＩに対して５’に存在している。このプロモーターは、７個のＳｐｌ結合部位を含むが、ＴＡＴＡボックスを含まない。臨床試験での使用が非常に成功したＢＣＬ−２アンチセンス（Ｗｅｂｂ，１９９７）は、ＢＣＬ−２  ｍＲＮＡのＯＲＦを標的にし、下方制御およびアポトーシスを引き起こす。隣接Ｐ２プロモーターは、ソロスペルミンアナログによるトポイソメラーゼＩＩ特異的アルキル化の標的として、使用され得る。
【０１５４】
（Ｃ．選択ソロスペルミンアナログの細胞毒性評価）
オンコジーンでの遺伝子発現およびトポイソメラーゼＩＩ特異的アルキル化の位置の決定に対する選択されたソロスペルミンアナログの効果を検査するために、インビトロでさらに評価する前に、適切な整合対の細胞系にて、インビトロ細胞毒性アッセイを行うことが望まれ得る。例えば、ＢＣＬ−２を下方制御するアナログが同定されるなら、異なる薬剤感受性を捜すために、整合対のリンパ腫系が使用され得、一方は、正常であり、そして、第二のものは、過剰発現したＢＣＬ−２である。薬剤治療、培養および細胞毒性効力決定の方法は、本明細書中でさらに述べる。
【０１５５】
（Ｄ．異なる遺伝子発現パターンおよびトポイソメラーゼＩＩ部位特異的アルキル化の位置に対する選択化合物の効果の決定）
規定オンコジーンを下方制御する選択化合物の同定に続いて、これらの化合物は、観察された効果を引き起こすプロモーターに対する損傷の主要な役割を確認する遺伝子発現パターンを捜すために、その遺伝子チップアレイを使用して、試験され得る。例えば、ｃ−ｍｙｃのＰ１プロモーターと相互作用してこの遺伝子を下方制御する化合物は、以前に同定されている。ＤＮＡチップアレイ分析により、ｃ−ｍｙｃで制御される他の遺伝子（例えば、ｈ−ＴＥＲＴ、ＯＤＣおよびＣＤＣ  ２５Ａ）もまた、ｃ−ｍｙｃ下方制御に続いて下方制御されることが示された。
【０１５６】
もし、選択したオンコジーンを下方制御する化合物を同定するのにプロモーターアッセイを使用するのがうまくいかないなら、主要なスクリーンとして、遺伝子チップアレイが使用され得る。細胞系の選択対におけるインビトロ細胞毒性に基づいて有望な活性を有する化合物が選択され得る（例えば、特定のオンコジーンを過剰発現することが知られている細胞系での感受性）。
【０１５７】
一旦、このプロモーターおよびＤＮＡマイクロアレイ分析によって、そのソロスペルミンアナログの投与後に、標的細胞にて、重要なオンコジーン発現が下方制御されていると決定されると、アルキル化のための正確な配列部位を決定するために、ＬＭ−ＰＣＲが使用され得る。このアッセイでは、ＨｅＬａ細胞において、一過性形質移入が実行され、続いて、ソロスペルミンアナログの処理が実行される。標的プロモーター（例えば、ＢＣＬ−２）を含むプラスミドＤＮＡの単離後、基質ＤＮＡを変性することに続いてプライマー伸長により、そのＤＮＡがアルキル化塩基の位置で切断するか、または制限酵素部位が平滑末端に転化される。非対称リンカーの平滑連結に続いて、入れ子ＰＣＲおよび標的プライマー伸長により、配列決定ゲルにおいて、既知の長さのバンドが得られる。
【０１５８】
このアッセイは、理想的には、組織培養物に形質移入されたプラスミドでのＤＮＡ損傷を評価するのに適している。これらの実験には、ＢＣＬ−２プロモーターおよび適切な制限酵素部位（これは、これらのプロモーター配列のすぐ上流で導入される）が使用され得る。消化およびピペリジン開裂の後、トポイソメラーゼＩＩ部位特異的ＤＮＡアルキル化の相対量を決定するために、ＬＭ−ＰＣＲが使用され得る。
【０１５９】
Ｖ．無細胞系およびインビトロ系でのソロスペルミン類似物の評価
Ａ．標的癌
当業者は、本発明のソロスペルミン類似物が種々の癌を治療するのに使用され得ることを理解する。特に重要な２種の癌であるリンパ腫および白血病を、ここで述べる。
【０１６０】
（ｉ）低級非ホジキンリンパ腫。非ホジキンリンパ腫の耐性に関する最も一般的な機構は、ＢＣＬ−２遺伝子の過剰発現であり、その結果、プログラム化した細胞死（アポトーシス）に対する耐性が得られ、これは、化学耐性を引き起こす（ＭｉｙａｓｈｉｔａおよびＲｅｅｄ，１９９２）。事実、低級卵胞非ホジキンリンパ腫の予後マーカーは、ＢＣＬ−２の過剰発現である（Ｈｅｒｍｉｎｅら、１９９６；Ｈｉｌｌら、１９９６）。中心的な研究（Ｗｅｂｂら、１９９７）では、ＢＣＬ−２  ｍＲＮＡのオープンリーディングフレームで標的されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＣＬ−２発現の特異的下方制御を生じ、これは、患者において、腫瘍の退行を引き起こした。
【０１６１】
例えば、ＢＣＬ−２陽性リンパ腫に罹った再発患者での段階Ｉ試験における非ホジキンリンパ腫の治療では、４３％の患者において、疾患の安定化が見られ、また、１４％では、改善が見られた。細胞毒性と組み合わせた段階ＩＩ試験は、再発性小細胞肺癌、乳癌、結腸直腸癌、ホルモン耐性で転移性の結腸直腸癌および再発性急性白血病に罹った患者に関する他の研究と平行して、現在、進行中である（Ｗａｔｅｒｓら、２０００）。それゆえ、ＢＣＬ−２に向けた治療は、潜在的な腫瘍標的として、リンパ腫を遙かに超えている。
【０１６２】
トポイソメラーゼＩＩは、ソロスペルミンのアルキル化を指示し、また、ＢＣＬ−２  ｍＲＮＡの発現は、非ホジキンリンパ腫細胞で活性化されるので、トポイソメラーゼＩＩ毒性効果を生じることに加えて、オンコジーンをアルキル化するソロスペルミン類似物を同定することが望ましい。このようにして、このトポイソメラーゼＩＩ毒性効果は、過剰発現オンコジーンの抗アポトーシス効果なしで、標的細胞でのアポトーシスを誘発する可能性が高い。選択性を高めるさらなる手段として、これらのソロスペルミン類似物は、トポイソメラーゼＩ毒として、ＣＰＴ−１１と組み合わされ得、これは、トポイソメラーゼＩＩのレベルを高める。
【０１６３】
（ｉｉ）白血病。薬剤難治白血病の重要な誘因の１つには、トポイソメラーゼＩＩ毒に対する耐性がある。トポイソメラーゼＩＩ標的薬剤の耐性は、多因子性であり、薬剤膜輸送体、下流事象、細胞周期調節、およびトポイソメラーゼＩＩ発現の下方制御を含む（Ｄｉｎｇｅｍａｎｓら、１９９８）。それに加えて、標的トポイソメラーゼＩＩは、この耐性に寄与し得、その結果、トポイソメラーゼＩＩゲート部位での相互作用が無効となる。これは、その三元錯体の可逆性から生じ得、これは、インターカレーター（例えば、ドキソルビシンおよびミキサントン）の場合、その毒性効果がアポトーシスの誘発を引き起こす前に、遊離の薬剤および無傷のＤＮＡを生じる。
【０１６４】
ソロスペルミンは、これらの非共有結合性トポイソメラーゼＩＩ阻害剤よりも有利な点がいくつかある。第一に、その三元錯体からのトポイソメラーゼＩＩの逆転により、依然として、アルキル化グアニンが残る。第二に、ソロスペルミンの滞留時間は、事実上、その共有結合付加物のために、この三元錯体内では、無限である。第三に、ソロスペルミンのインターカレーション部位は、臨床的に使用されているトポイソメラーゼＩＩ毒（これは、−１と＋１の間であり、従って、変異トポイソメラーゼＩＩ酵素である）とは対照的に、トポイソメラーゼＩＩゲートの＋１と＋２の間である。これらの変異酵素は、三元錯体の形成に抵抗するか、容易に逆転し、依然として、ソロスペルミンに感受性であるはずである。これらの原理の１つ以上は、ソロスペルミンに対する薬剤耐性白血病の実証された感受性を説明し得る。
【０１６５】
上記原理に加えて、白血病におけるＢＣＬ−２およびｃ−ｊｕｎの過剰発現により、ＢＣＬ−２過剰発現リンパ腫について記述したものと類似の追加戦略が得られる。これはまた、薬剤難治白血病にてソロスペルミン類似物活性を得る有用な戦略であり得る。
【０１６６】
白血病細胞系は、ＣＰＴ−１１およびソロスペルミンの併用によりソロスペルミンに対する癌細胞の感受性が高まるかどうかを試験するのに、使用され得る。Ｌ１２１０白血病に罹ったマウスでは、トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩ毒のカンプトセシンおよびテニポシドの異なるスケジューリングにより、拮抗作用または相乗作用のいずれかが生じ得る（Ｅｃｋａｒｄら、１９９３；Ｈａｍｍｏｎｄら、１９９８）。同時投与により、拮抗作用が生じるのに対して、トポイソメラーゼＩ毒に次いでトポイソメラーゼＩＩ毒の逐次投与により、相乗作用が生じる。明らかな説明としては、トポイソメラーゼＩ毒で治療した細胞は、トポイソメラーゼＩＩレベルを上方制御することにより、補償することがある。トポイソメラーゼＩＩのレベルを高くした細胞は、トポイソメラーゼＩＩ毒に対して過敏になる。
【０１６７】
ＶＩ．ソロスペルミンおよびソロスペルミン類似物の調製
本発明は、次式を有するソロスペルミン類似物（光学活性類似物を含めて）を合成するいくつかの方法を開示する：
【０１６８】
【化６２】
2005512948.tif 000045
【０１６９】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルであり；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルであり；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルであり；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。これらのソロスペルミン類似物は、新しいＷａｃｋｅｒ型環化反応を使用する反応図式により、合成され得る。この環化反応は、図式１で図示されている。
【０１７０】
図式１
【０１７１】
【化６３】
2005512948.tif 000046
【０１７２】
ソロスペルミン類似物（１）は、エポキシ化またはエポキシド形成反応を実行することにより、（３）から形成され得る。
【０１７３】
Ａ．ラセミソロスペルミン類似物の合成
（±）−（２’Ｒ，３’Ｒ）ソロスペルミン（４）の合成のアプローチは、２つの異なるグループの化学者により、研究されている。（４）の絶対空間配置を決定するために、Ｃａｓｓａｄｙおよび共同研究者らは、ジアステレオマーＯ５−メチル−（±）−（２’Ｒ，３’Ｓ）ソロスペルミンの全合成を完成した（Ｃａｓｓａｄｙら、１９８７ａ）。後に、彼らは、非対称エポキシ化およびジップ型配列（これは、その重要な段階として、Ｎｉｃｏｌａｏｕにより開発された）を使用して、（４）のジヒドロベンゾフラン部分を作成した（Ｃａｓｓａｄｙら、１９８７ｂ）。
【０１７４】
これらの研究は、非常に洞察に満ちたものであるものの、それらは、感受性エポキシド基を導入するのに使用する方法のために、その合成の後期では、類似物を合成できない。ＫｕｐｃｈａｎおよびＳｔｒｅｅｌｍａｎ（１９７７）は、オレフィン性中間体に基づいて、Ｏ５−メチル−（±）−（２’Ｒ，３’Ｒ）ソロスペルミンを合成し得た；しかしながら、それらの合成は、（４）の光学活性を検討しておらず、その全体的な収率は、その重要な工程の収率が低いために、乏しかった。本発明の方法は、所望のオレフィン置換による非対称Ｗａｃｋｅｒ型環化（これは、新しいベンゾフラン中間体（５）を形成することが分かっている）を利用する（Ｈａｙａｓｈｉら、１９９９）。これらのキラルオレフィン性生成物は、次いで、不安定エポキシドを導入する前に、多くの所望の類似物に操作され得る。
【０１７５】
本発明の１実施態様による（４）のレトロ合成分析は、図式２で示す。
【０１７６】
【化６４】
2005512948.tif 000047
【０１７７】
ソロスペルミン類似物は、オレフィン（５）の非対称ジヒドロキシル化を経由して、このエポキシドの導入により、得られ得る。重要な中間体（５）は、新しいＷａｃｋｅｒ型環化により、アルキルフェノール（６）から合成され得る。環化前駆体（６）は、クライゼン再配列および短い一連の保護基操縦の後、そのキサントン（７）から製造され得る。
【０１７８】
当業者は、この方法が種々のソロスペルミン類似物を製造するのに使用され得ることを理解する。１つのこのような類似物には、Ｏ５−メチル−（±）−（２’Ｒ，３’Ｒ）ソロスペルミン（１６）がある（ＨｕｒｌｅｙおよびＦｅｌｌｏｗｓ，２０００）。アリルフェノール（１３）を合成し、これに対して、Ｗａｃｋｅｒ環化を試験し得た。１つの合成方法は、図式３で示す。
【０１７９】
【化６５】
2005512948.tif 000048
【０１８０】
ジメトキシ安息香酸（８）とフロログルシノール（９）とを縮合すると、キサントン（１０）が得られた（Ｇｒｏｖｅｒら、１９５５；１９５６）。ケトンにキレート化されていないフェノールを臭化ベンジルで選択的にアルキル化することに続いて、ＭｅＩでアルキル化すると、（１１）が得られた（Ｃａｓｓａｄｙら、１９８７ａ）。ＦｅＣｌ３で脱ベンジル化することに続いて、塩化プロパルギルでアルキル化すると、アルキン（１２）が得られた。そのオレフィンをＬｉｎｄｌａｒ触媒で還元することに続いて、クライゼン再配列すると、Ｗａｃｋｅｒ環化用の基質（１３）が得られた（Ｔａｙｌｏｒら、１９６９，１９７１；Ｈｌｕｂｕｃｅｋら、１９６９）。
【０１８１】
図式４で示すように、ＤＭＳＯ中での（１３）のＷａｃｋｅｒ環化により、６９％の収率で、フラン（１４）が得られた。
【０１８２】
【化６６】
2005512948.tif 000049
【０１８３】
本明細書中で示した反応で示すもの以外の試薬もまた使用され得ることは、当業者に容易に明らかとなる。例えば、Ｗａｃｋｅｒ環化工程では、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）に代えて、Ｐｄ（ＯＣＯＣＦ３）が使用され得る。
【０１８４】
合成したメチルソロスペルミンと、メチル化天然生成物から得たものとの旋光性を比較すると、非対称誘導がなかったことが明らかとなった（ＫｕｐｃｈａｎおよびＳｔｒｅｅｌｍａｎ，１９７７）。この反応は、キラル配位子なしで行い、優れた収率で、ラセミ体（１４）を生じることが分かった。標準的な条件下でのオレフィン（１４）のジヒドロキシル化により、ジアステレオマージオール（１５）が得られ、これは、クロマトグラフィーにより分離し得た。（１５）のメシル化に続いて、アセトン中で粗メシレートをＫ２ＣＯ３および１８−クラウン−６で処理すると、最終エポキシドであるＯ５−メチル−（±）−（２’Ｒ，３’Ｒ）ソロスペルミン（１６）が得られた。
【０１８５】
本発明による（±）ソロスペルミンメチルエーテルの１合成経路は、図式５で示す。
【０１８６】
【化６７】
2005512948.tif 000050
【０１８７】
種々の他のソロスペルミン類似物は、単に、出発物質を変えることにより、この反応図式を使用して合成され得、ソロスペルミン類似物上の種々の位置で所望の配位子基を有するソロスペルミン生成物が得られる。例えば、（８）および（９）について異なる化合物の置換を使用して、そのキサントン化合物上の種々の位置で配位子を有するキサントン出発物質が得られ得る。異なる出発物質を使用することにより、本発明の方法は、次式を有する中間体を生成するのに使用できる：
【０１８８】
【化６８】
2005512948.tif 000051
【０１８９】
ここで、Ｒ１〜Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は、別個に、水素、フェニル、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。同様に、次式を有するソロスペルミン類似物：
【０１９０】
【化６９】
2005512948.tif 000052
【０１９１】
ここで、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルであり；Ｒ２〜Ｒ４は、Ｈ、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＯＣＨ３、ハロゲンまたはアルキルであり；Ｒ５は、Ｈ、Ｏ−アルキルまたはアルキルであり；そしてＲ８は、Ｈまたはアルキルである。本発明は、多くの市販の出発物質から種々のソロスペルミン類似物が合成できるので、特に有利である。
【０１９２】
フェノール基保護戦略を使用するこの方法の変形は、以下のソロスペルミン類似物を合成するのに使用され得る：
【０１９３】
【化７０】
2005512948.tif 000053
【０１９４】
ここで、Ｒは、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、ベンジル、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。化合物（１７）は、次式を有する化合物から合成され得る：
【０１９５】
【化７１】
2005512948.tif 000054
【０１９６】
ここで、Ｘは、保護基である。好ましい保護基には、第三級ブチルシランがあるが、他の適当な保護基もまた、使用され得る。
【０１９７】
化合物（１９）は、先に記述したＷａｃｋｅｒ環化反応を使用して、製造され得る。その保護基がＴＢＳである化合物（１９）を合成する好ましい方法は、図式６で図示されている。
【０１９８】
【化７２】
2005512948.tif 000055
【０１９９】
酸性条件下でのメチルエーテル（１０）の開裂に続いて臭化ベンジルでの選択的アルキル化により、（１１）が得られる。シリルエーテル保護に続いて、メチル化することにより、（２０）が得られる。次に、ベンジルエーテル（２０）は、図式３でモデル基質で使用したものと同じ反応工程により、Ｗａｃｋｅｒ環化用の基質に転化され得る。同様に、環化により、オレフィン性キサントフラン（２１）が得られるはずであり、これは、さらに、操作されて、種々のソロスペルミン類似物を得ることができる。
【０２００】
化合物（１７）は、化合物（１９）に対して脱保護反応を実行して保護基
を除去することにより、化合物の５’位置に位置している酸素に所望の配位子基を置くことにより、そしてエポキシ化またはエポキシド形成反応を実行することにより、合成され得る。化合物（１７）の種々の類似物を生成する好ましい合成方法は、図式７で示す。
【０２０１】
【化７３】
2005512948.tif 000056
【０２０２】
当業者は、図式６で示したもの以外のＲ基含有ソロスペルミン類似物が図式７の工程２での試薬を変えることにより合成され得ることを理解する。
【０２０３】
本明細書中で開示したＷａｃｋｅｒ環化反応はまた、以下の式を有するソロスペルミン類似物を製造するのに使用され得る：
【０２０４】
【化７４】
2005512948.tif 000057
【０２０５】
ここで、Ｒは、水素、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、ベンジル、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。これらの類似物は、化合物（５）の１’位置からＣＨ３基を除去することにより、得られた反応物をアルキル化剤および塩基と反応させることにより、次いで、エポキシ化またはエポキシ形成反応を実行することにより、合成され得る。化合物（２２）のいくつかの類似物を形成する１方法は、図式８で示す。
【０２０６】
【化７５】
2005512948.tif 000058
【０２０７】
Ｂ．光学活性ソロスペルミン類似物の合成
先に開示された方法の変形もまた、光学活性ソロスペルミン類似物を形成するのに使用され得る。具体的には、（＋）および（−）ジアステレオマーを有する第三化合物を生じるために、中間体（３）の非対称ジヒドロキシル化が実行され得る。これらの（−）ジアステレオマーは、次いで、好ましくは、クロマトグラフィーにより、単離され得る。次いで、エポキシ化またはエポキシド形成反応が行われ得、（−）ソロスペルミン類似物生成物が得られる。この非対称ジヒドロキシル化反応を実行するのに、種々の試薬が使用され得、好ましい薬剤としては、以下が挙げられる：１）ｔＢｕ−ＯＨ、ＣＨ３ＣＮ、Ｈ２Ｏ、ＯｓＯ４およびキラル配位子、２）キラル配位子、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、Ｋ２ＣＯ３およびＫ２ＯｓＯ４・２Ｈ２Ｏ、３）ｔＢｕ−ＯＨ、ＣＨＣｌ３、Ｈ２Ｏ、ＯｓＯ４およびキラル配位子または４）キラル配位子、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、Ｋ２ＣＯ３およびＫ２ＯｓＯ４・２Ｈ２Ｏ。
【０２０８】
この方法の一例は、図式９で図示している。
【０２０９】
【化７６】
2005512948.tif 000059
【０２１０】
光学活性（−）ソロスペルミン類似物もまた、図式４で示した方法と類似の方法を使用して、調製され得る。次式を有する化合物を得た後、先に記述したものと類似のＷａｃｋｅｒ環化反応が実行されるが、キラル配位子もまた、使用される：
【０２１１】
【化７７】
2005512948.tif 000060
【０２１２】
Ｒ１〜Ｒ５およびＲ７〜Ｒ８は、別個に、水素、フェニル、アルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン、アミン、アルキルアミン、チオールまたはアルキルチオールである。好ましい１実施態様は、ＤＭＳＯ中にて、化合物（２）と、Ｐｄ（（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２）またはＰｄ（ＯＣＯＣＦ３）２、キラル配位子およびベンゾキノンを反応させる工程を包含する。次いで、図式４の残りの工程が実行され得、（−）ソロスペルミン類似物が得られる。
【０２１３】
この反応で使用するのに好ましいキラル配位子としては、ｉｐ−ボキサックス、ビスオキサソリンビナフチルまたはスピロ−ビス（イソキサゾリン）が挙げられる。他の適切な配位子は、当業者に明らかである。
【０２１４】
Ｃ．ソロスペルミン類似物を生成するための溶液相での平行合成の開発
（−）−ロテノンは、市販されており、比較的に安価であり（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．）、最も重要なことには、ソロスペルミンと同じ（２Ｒ）−ベンゾジヒドロフランを含有する。これらの特徴があるために、（−）−ロテノンは、ソロスペルミン類似物（２６）を合成する出発物質として選択された。初期合成は、図式１０Ａで示すように実行した。
【０２１５】
【化７８】
2005512948.tif 000061
【０２１６】
所望のキサントン（２５）を投与する代わりに、テューバ酸（ｔｕｂａｉｃ  ａｃｉｄ）（２４）をフロログルシノールでＧｒｏｖｅｒ、ＳｈａｈおよびＳｈａｈ縮合して、化合物（２７）を得た（ＡｈｌｕｗａｌｉａおよびＴｅｈｉｍ，１９８４；Ｌｏｃｋｓｌｅｙら、１９７１）が、ここで、二重結合が移動した。さらに、異なる条件下にて、この縮合反応を達成する種々の試みは、そのアリル型エーテル部分がルイス酸を有する試薬に感受性であることが原因で、挫折した。
【０２１７】
この問題を克服するために、二重結合を予め機能化する戦略が採用され得る。２つの理由から、図式１１で示した目的を達成するために、架橋等価物として、中間体である１，２−ジオール（２９）が選択される。
【０２１８】
【化７９】
2005512948.tif 000062
【０２１９】
第一に、それは、エナンチオ純度を有するオレフィン（２８）から容易に製造され得、第二に、それは、直接的に、エポキシド（３０）に立体特異的に転化され得る。結果的に、図式１２では、新しい合成計画が概説される。
【０２２０】
【化８０】
2005512948.tif 000063
【０２２１】
（−）−ロテノンをＳｈａｒｐｌｅｓｓ非対称ジヒドロキシル化すると、キラルジオール（３１）が得られる（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓら、１９９２；Ｋｏｌｂら、１９９４）。ジオール（３１）を２，２−ジメトキシプロパンで保護すると、１，２−アセトニド（３２）が得られる（Ｋｉｔａｍｕｒａら、１９８４）。化合物（３２）の酸化的分解によって、ｏ−ヒドロキシ安息香酸が得られる（Ｃｏｏｋｅｒｉｌｌら、１９９５）。ｏ−ヒドロキシ安息香酸（３３）をフロログルシノールでＺｎＣｌ２媒介縮合すると、所望のキサントン（３４）が生成すると予想される（ＡｈｌｕｗａｌｉａおよびＴｅｈｉｍ，１９８４；Ｌｏｃｋｓｌｅｙら、１９７１；Ｄｅａｎ，１９７３）。キサントン（３４）をＤｏｗｅｘ  ５０Ｗ−Ｘ８で脱保護すること（Ｐａｒｋら、１９９４）に続いて、ＮａＨおよび１−（ｐ−トルエンスルホニル）イミダゾール（ＩｒｅｌａｎｄおよびＳｍｉｔｈ，１９８８）またはトルエン中のポリマー−Ｐ（ＯＥｔ）２Ｐｈ２（Ｋｅｌｌｙら、１９８５）でシクロ脱水すると、ソロスペルミン類似物（２６）の合成が完結する。
【０２２２】
この合成経路は、図式１２および表３で化合物（３３）からソロスペルミン類似物（２６）を調製する際に説明されているように、ソロスペルミン類似物（２６）を調製するちょうど６つの簡潔な工程をとるだけでなく、成分Ａを３段階で成分Ｂとカップリングすることにより、ソロスペルミン類似物を合成する収束性アプローチの道を開く。
【０２２３】
表３、ライブラリでのソロスペルミン類似物の構造
【０２２４】
【表３】
2005512948.tif 000064
【０２２５】
このアプローチは、分子的に多様なソロスペルミン類似物を合成する興味深い機会を提供する。３つの反応のうちの２つは、図式１２で示すように、重合体支持試薬を使用できるので、並行溶液合成において、集中したソロスペルミンライブラリが作成され得る。このライブラリに入力される成分ＡおよびＢの代表的な構造は、表３で示す。これらのソロスペルミン類似物は、反復様式で、合成され、スクリーンされ、そして分析され得る。各サイクルの最後でのＳＡＲの結果により、追加ソロスペルミン類似物を設計し合成する直接的な情報が得られ、それにより、不要なソロスペルミン類似物の合成が避けられ、価格および時間を減らす。この戦略により、資材をできるだけ少なくして、合成するソロスペルミン類似物の代表的な多様性を最も豊富にできるようになる。さらに、これらの化合物の評価により、潜在的な薬剤候補が確認できる。さらに、式１からのジアステレオマーの各々はまた、キラルクロマトグラフィーにより、さらに分離を行うことができ、光学的に純粋な鏡像異性体が得られる。順相クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーのいずれかでは、典型的には、キラル固定相（例えば、Ｐｉｒｋｌｅキラル固定相、Ｄａｖａｎｋｏｖキラル固定相またはシクロデキストリン結合相）が使用される。この方法の１実施態様は、図式１０Ｂのように、ヘキサン、１，２−ジクロロエタンおよびイソプロパノールの移動相を使って、シリカゲルに結合した３，５−ジニトロアニリン誘導体化（ｓ）−第三級ロイシンの固定相を使用して、そのソロスペルミンメチルエーテルのいずれかのジアステレオマーを光学的に純粋な鏡像異性体に分離する。
【０２２６】
【化８１】
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【０２２７】
ＶＩＩ．薬学的に有効なソロスペルミン類似物の選択
薬学的に有効な新規ソロスペルミン類似物の設計は、２つの知見により、案内される。第一には、ＤＮＡのアルキル化に対するソロスペルミンの選択性は、トポイソメラーゼＩＩの存在に依存している。トポイソメラーゼＩＩの非存在下での二本鎖ＤＮＡのバックグラウンドアルキル化は、うまくいかず、配列選択性を殆ど示さない（たとえあったとしても）（Ｈａｎｓｅｎら、１９９６）。それゆえ、その標的細胞でのアルキル化頻度を決定するのは、トポイソメラーゼＩＩのレベルである。従って、このトポイソメラーゼＩＩ依存的な反応性を失うソロスペルミン類似物を設計し合成することは、望ましくない。従って、二本鎖ＤＮＡとの過剰に安定化する相互作用を有しかつネイキッドＤＮＡとの固有の高い反応性を生じるソロスペルミンの類似物は、生物学的な使用には望ましくない。
【０２２８】
第二に、ＮＭＲおよび分子モデル化に基づいて、ソロスペルミン−ＤＮＡ二本鎖付加物の構造が得られたものの、その細胞内の本当のレセプターは、トポイソメラーゼＩＩ−ＤＮＡ錯体である。このＤＮＡ上のソロスペルミン結合ポケットは、二元（薬剤−ＤＮＡ）錯体および三元（薬剤−トポイソメラーゼ−ＤＮＡ）錯体の両方について、類似している可能性があるが、この三元錯体の構造がないと、ソロスペルミンとトポイソメラーゼＩＩとの間において、何が重要な相互作用であるかは、未知である。これらは、その薬剤がトポイソメラーゼＩＩ−ＤＮＡを捕獲するので起こる可能性が非常に高い。これらは、ある配列では、その薬剤がトポイソメラーゼＩＩ−ＤＮＡ付加物を捕獲するので起こる可能性が非常に高い。しかしながら、これは、図５で示すように、４つの可能な結果のうちの１つにすぎない。
【０２２９】
生物学的に有効なソロスペルミン類似物のライブラリの編集は、最初に、芳香環上の適度な置換（これは、二本鎖ＤＮＡ反応性に悪影響を与えないが、このトポイソメラーゼＩＩ−ＤＮＡ錯体との相互作用を生じ得る）を行うことにより達成できる。これらは、図５で示した結果（例えば、触媒の阻害、トポイソメラーゼＩＩ中毒、ＤＮＡの部位特異的アルキル化および非塩基部位形成）を変調させ得ると推測されている。これらの結果の変調または減衰は、異なる標的細胞での薬剤の全体的な効能に影響を及ぼす可能性があるので、重要である。例えば、ある癌細胞系は、それより高いトポイソメラーゼＩＩを有する異なる細胞系よりも、転写的に活性な領域または複製フォークの近くでのトポイソメラーゼＩＩ部位特異的アルキル化を受けやすい場合があり、従って、トポイソメラーゼＩＩ中毒効果を受けやすい。
【０２３０】
このソロスペルミン−ＤＮＡ付加物および種々のソロスペルミン類似物をモデル化しても、トポイソメラーゼＩＩとの相互作用の重要な洞察が得られないのに対して、それにより、ＤＮＡ相互作用に関するある程度の洞察が得られる。例えば、表４で示した類似物のベンゾフラン部分およびエポキシド部分は、他に対して最小化した構造とそれほど変動しないが、そのモデル化は、側方塩基対との相互作用を予測する際に、有用である。それゆえ、Ｃ６およびＣ８をフェノールで置換することにより、潜在的なＨ結合相互作用が得られる。
【０２３１】
ＤＮＡでのソロスペルミンおよびその類似物の分子モデル化、エネルギー最小化立体配座の重ね合わせ、およびリガンド分子のドッキングを、ＳＹＢＹＬを使用して実行し、ＭＩＤＡＳで調整した。主に、そのＤＮＡに対するソロスペルミン類似物の位置を見るために、その分子間水素結合を決定するために、また、その複合体の潜在的エネルギーを測定するために、ソロスペルミン類似物の分子モデル化を実行した。これらの結果を、新しいソロスペルミン類似物を設計する原理を支持するために、ソロスペルミンモデル化データと比較した。これらの類似物の全ては、ｄ（ＡＣＧＴ）２と共に安定な相互作用体を形成し、隣接塩基対と平行な向きで、芳香族発色団を積み重ね、それらはまた、その反応性エポキシドを、ソロスペルミンに類似のグアニンのＮ７の近傍に位置付ける。このエネルギー最小化類似物をソロスペルミンに重ね合わせることにより明らかにされるように、表４で示した全てのソロスペルミン類似物は、ソロスペルミンと類似の立体配座および立体化学を保持している。
【０２３２】
例えば、Ｒ１位および／またはＲ３位置をＯＨおよびＯＣＨ３で置換した次式を有するソロスペルミン類似物は、表４で示されているが、これらの置換基を小溝部の近傍に位置付ける：
【０２３３】
【化８２】
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【０２３４】
多数の既存のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤もまた、ＤＮＡをインターカレートしかつ小溝部に結合する置換基を含有することが知られている（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９６）。一連のイントプリシン類似物の構造活性研究により、トポイソメラーゼ阻害に対するインターカレーターの水酸基の重要性が明らかとなっている（Ｎａｂｉｅｖら、１９９４）。重要な位置に追加水酸基を含有する化合物により高めたトポイソメラーゼＩＩ阻害は、ミトキサントロン類似物で認められている（Ｄｅら、１９９３）。
（表４、提案されたソロスペルミン類似物の構造）
【０２３５】
【表４】
2005512948.tif 000067
【０２３６】
（ＶＩＩＩ．治療法）
（Ａ．癌）
本発明のソロスペルミン類似物は、種々の癌を治療するのに使用され得る。これらには、例えば、膵臓癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、卵巣癌および乳癌が挙げられる。これらのソロスペルミン類似物はまた、多剤耐性（ＭＤＲ）癌細胞を治療するのに使用され得、これには、トポイソメラーゼＩＩに耐性のあるＭＤＲ癌細胞およびＭＲＰ−１または糖タンパク質で媒介されるＭＤＲ癌細胞が挙げられる。
【０２３７】
（Ｂ．医薬品）
本発明の製薬組成物は、有効量の１種以上のソロスペルミン類似物または追加薬剤（これは、薬学的に受容可能な担体に溶解または分散されている）を含有する。「薬学的または薬理学的に受容可能な」との語句は、適切な場合、動物（例えば、ヒト）に投与したとき、有害な反応、アレルギー反応または他の厄介な反応を生じない分子要素および組成物を意味する。少なくとも１種のソロスペルミン類似物または追加活性成分を含有する製薬組成物の製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で例示されているように、本開示に照らして、当業者に公知である。さらに動物（例えば、ヒト）への投与には、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓで要求されているように、無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の標準を満たすべきであることが分かる。
【０２３８】
本明細書中で使用する「薬学的に受容可能な担体」には、当業者に公知であるように、任意の全ての溶媒、分散媒体、被覆、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬剤、薬剤安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香料、色素、このような類似の物質およびそれらの組合せが含まれる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９〜１３２９（その内容は、本明細書中で参考として援用されている））。任意の通常の担体が活性成分に非相溶性である範囲以外、それを治療組成物または製薬組成物で使用することが企図される。
【０２３９】
これらのソロスペルミン類似物は、固形状、液状またはエアロゾル形状で投与できるかどうか、また、注射のような投与経路のために滅菌する必要があるかどうかに依存して、異なる種類の担体を含有し得る。本発明は、当業者に公知であるように（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）を参照）、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、外傷内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸腔内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘤内、筋肉内、腹膜内、皮下、結膜下、水疱内（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｕｌａｒｌｌｙ）、粘膜内、心膜内、臍内、眼内、経口、局在（ｌｏｃａｌｌｙ）、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流、カテーテルを経由、洗浄液を経由、クリーム、脂質組成物（例えば、リポソーム）、または他の方法もしくは前述のいずれかの組合せにより、投与できる。
【０２４０】
動物の患者に投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、身体的要因および生理学的要因（例えば、体重、病気の重症度、治療する疾患の種類、予備または同時の治療処置、患者の突発性または投与経路）により、決定できる。投与を担当する医師は、いずれにしても、個々の被験体に対して、活性成分の濃度および組成物および適切な用量を決定する。
【０２４１】
ある実施態様では、製薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含有し得る。他の実施態様では、この活性化合物は、その単位の重量の約２％と約７５％の間、または約２５％と約６０％の間、およびそこから誘導できる任意の範囲を含有し得る。他の非限定的な例では、用量はまた、１回の投与あたり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重以上まで、およびそこから誘導できる任意の範囲を含有し得る。本明細書中で列挙した数から誘導できる範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲は、上記数値に基づいて、投与できる。
【０２４２】
いずれの場合でも、この組成物は、１種以上の成分の酸化を遅らせる種々の酸化防止剤を含有し得る。さらに、微生物の作用の防止は、防腐剤（例えば、種々の抗細菌剤および抗真菌剤）によりもたらされ得、これには、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
これらのソロスペルミン類似物は、遊離塩基、中性形状または塩形状で、組成物に処方され得る。薬学的に受容可能な塩には、酸付加塩（例えば、タンパク様組成物の遊離アミノ基と形成されたもの）、あるいは、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸またはマンデル酸のような有機酸と形成される塩が、挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄）；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインのような有機塩基から誘導できる。
【０２４４】
その組成物が液状である実施態様では、担体は、溶媒または分散媒体であり得、これは、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組合せを包含するが、これらに限定されない。その適切な流動性は、例えば、被覆（例えば、レシチン）を使用することによるか、担体（例えば、液状ポリオールまたは脂質）に分散することによって必要な粒径を維持することによるか、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）を使用することによるか、またはこのような方法を組み合わせることにより、維持できる。多くの場合、等張剤（例えば、ショ糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組合せ）を含有させることが好ましい。
【０２４５】
他の実施態様では、本発明では、点眼液、鼻内溶液またはスプレー式点鼻薬、エアロゾルまたは吸入剤を使用し得る。このような組成物は、一般に、標的組織型と適合性であるように設計される。非限定的な例では、鼻内溶液は、通常、小滴または噴霧で鼻孔に投与されるように設計された水溶液である。鼻内溶液は、鼻内分泌液と多くの点で類似しているように調製され、その結果、通常の毛様体作用が維持される。それゆえ、好ましい実施態様では、これらの鼻内水溶液は、通常、約５．５〜約６．５のｐＨを維持するために、等張性であるか、僅かに緩衝化される。それに加えて、眼内製剤、薬剤または適切な薬剤安定化剤で使用されるものと類似の抗細菌防腐剤は、もし必要なら、その処方に含有され得る。例えば、種々の市販の鼻内製剤は、公知であり、これらには、抗生物質または抗ヒスタミン剤のような薬剤が挙げられる。
【０２４６】
ある実施態様では、これらのソロスペルミン類似物は、経口摂取のような経路により投与するように、調製される。これらの実施態様では、その固形組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル（例えば、硬質または軟質殻のゼラチンカプセル）、徐放処方物、舌下組成物、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハ、またはそれらの組合せを含有し得る。経口組成物は、直接的に、常食の食物と混合され得る。経口投与に好ましい担体は、不活性希釈剤、吸収可能な食用担体またはそれらの組合せを包含する。本発明の他の局面では、この経口組成物は、シロップまたはエリキシル剤として、調製され得る。シロップまたはエリキシル剤は、例えば、少なくとも１種の活性剤、甘味料、防腐剤、香料、染料、防腐剤またはそれらの組合せを含有し得る。
【０２４７】
ある好ましい実施態様では、経口組成物は、１種以上の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香料、およびそれらの組合せを含有し得る。ある実施態様では、組成物は、１種以上の以下のものを含有し得る：結合剤（例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンまたはそれらの組合せ）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組合せ）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸またはそれらの組合せ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；甘味料（例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組合せ）；香料（例えば、ペパーミント、冬緑油、サクランボ香料、オレンジ香料など）；または前述のものの組合せ。その投薬単位形状は、カプセルである場合、上記の型の物質に加えて、担体（例えば、液状担体）を含有し得る。種々の他の物質は、被覆として存在し得るか、そうでなければ、その投薬単位の物理的形状を変え得る。例えば、錠剤、丸薬またはカプセルは、セラック、ショ糖またはそれらの両方で被覆され得る。
【０２４８】
他の投与様式に適切なさらなる処方物には、座剤が挙げられる。座剤は、種々の重量および形状の固形投薬形状であり、通常、直腸、膣または尿道に挿入するように、添加される。挿入後、座剤は、その腔の流体中で、軟化、融解または溶解する。一般に、座剤には、伝統的な担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組合せが挙げられ得る。ある実施態様では、座剤は、例えば、約０．５％〜約１０％、好ましくは、約１％〜約２％の範囲で活性成分を含有する混合物から、形成され得る。
【０２４９】
無菌注射可能溶液は、これらの活性化合物を、必要に応じて、必要な量で、上で枚挙した種々の他の成分と共に、適切な溶媒に混合し、続いて濾過滅菌することにより、調製される。一般に、分散剤は、種々の無菌活性成分を無菌ビヒクル（これは、その塩基性の分散媒体および／または他の成分を含有する）に混合することにより、調製される。滅菌注射可能溶液、懸濁液または乳濁液の調製用の無菌粉末の場合、その好ましい調製方法は、真空乾燥技術または凍結乾燥技術であり、これにより、予め無菌濾過したその液状媒体から、その活性成分の粉末＋任意の追加の所望成分が得られる。この液状媒体は、適切には、もし必要なら、緩衝化されるべきであり、その液状希釈剤は、まず、十分な生理食塩水またはグルコースと共に注入する前に、等張性にされる。直接注射用の高濃度組成物の製剤もまた考慮され、この場合、極端に急速な浸透を生じるために、溶媒として、ＤＭＳＯの使用が想定されて、これらの活性成分の高い濃度が小領域に送達される。
【０２５０】
この組成物は、製造条件下および保存条件下にて安定でなければならず、また、微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。内毒素汚染は、安全なレベル（例えば、タンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満）で、最小に保たれなければならないことが理解される。
【０２５１】
特定の実施態様では、注射可能組成物の長期間にわたる吸収は、その組成物中で吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組合せ）を使用することにより、もたらされ得る。
【０２５２】
（Ｃ．組合せ療法）
ソロスペルミン類似物の有効性を高めるために、本発明の組成物および方法を、過剰増殖疾患の治療に有効な薬剤（例えば、抗癌剤）と組み合わせることが望まれ得る。「抗癌」剤は、例えば、１個以上の癌細胞を殺すことにより、１個以上の癌細胞でのアポトーシスを誘発することにより、１個以上の癌細胞の成長速度を遅くすることにより、転移の発生率または数を少なくすることにより、腫瘍の増殖を阻害することにより、腫瘍または１個以上の癌細胞への血液の供給を減らすことにより、１個以上の癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進することにより、癌の進行を防止または阻害することにより、あるいは癌に罹った被験体の寿命を延ばすことにより、被験体において癌にネガティブな影響を及ぼすことができる。抗癌剤には、例えば、化学療法剤（化学療法）、放射線療法剤（放射線療法）、外科的処置（手術）、免疫療法剤（免疫療法）、遺伝子療法剤（遺伝子療法）、ホルモン療法、他の生物剤（生物療法）および／または代替療法が挙げられる。
【０２５３】
さらに一般的には、このような薬剤は、癌細胞を殺すかその増殖を阻止するのに有効な１種以上のソロスペルミン類似物との組合せ量で、供給される。このプロセスは、その細胞を、同時にまたは一定期間内で、薬剤およびソロスペルミン類似物と接触させる工程を包含し得、ここで、このソロスペルミン類似物および薬剤を、細胞、組織または生物体に別々投与すると、所望される治療利益を生じる。これは、この細胞、組織または生物体を、単一組成物または薬理学的処方物（これは、ソロスペルミン類似物および１種以上の薬剤の両方を含有する）と接触させることにより、またはその細胞を、２種以上の別個の組成物または処方物と接触させることにより、達成され得、ここで、一方の組成物は、ソロスペルミン類似物を含有し、そして他方は、１種以上の薬剤を含有する。
【０２５４】
「接触される」および「曝露される」との用語は、細胞、組織または生物体に適用するとき、ソロスペルミン類似物および／または他の薬剤（例えば、化学療法剤または放射線療法剤）の治療構成物が、標的の細胞、組織もしくは生物体に送達されるか、または標的細胞、組織もしくは生物体と直接並置して置かれるプロセスを記述するために、本明細書中で使用される。細胞を殺すか静止させるために、このソロスペルミン類似物および／または追加薬剤は、その細胞を殺すかそれらが分裂するのを阻止するのに有効な組合せ量で、１種以上の細胞に送達される。
【０２５５】
このソロスペルミン類似物は、例えば、数分間〜数週間の範囲の間隔で、他の薬剤に先行して投与されるか、それと同時に投与されるか、および／またはそれに続いて投与され得る。そのソロスペルミン類似物および他の薬剤が、細胞、組織または生物体に別々に適用される実施態様では、一般に、そのソロスペルミン類似物および薬剤が、依然として、細胞、組織または生物体に対して有利な組合せ効果を発揮できるように、各送達時点の間にて、あまり長い時間が経過しないことを保証する。例えば、このような場合には、その細胞、組織または生物体は、このソロスペルミン類似物として、実質的に同時に（例えば、約１分未満内で）、２個、３個または４個以上の様相と接触され得ると考えられる。他の局面では、１種以上の薬剤は、実質的に同時から、これらのソロスペルミン類似物の投与前および／または投与後、約１分間、約５分間、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４５分間、約６０分間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約３７時間、約３８時間、約３９時間、約４０時間、約４１時間、約４２時間、約４３時間、約４４時間、約４５時間、約４６時間、約４７時間、約４８時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、約２１日間、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間以上、およびここで誘導可能な任意の範囲内で、投与され得る。
【０２５６】
これらのソロスペルミン類似物と１種以上の薬剤との種々の組合せレジメンが使用され得る。このような組合せの非限定的な例は、以下で示すが、ここで、その組成では、このソロスペルミン類似物は、「Ａ」であり、そして薬剤は、「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
これらのソロスペルミン類似物の組成物の、細胞、組織または生物体への投与は、その毒性（もしあれば）を考慮して、化学療法剤の投与用の一般プロトコルに従い得る。その治療サイクルは、必要に応じて、繰り返されると予想される。特定の実施態様では、種々の追加薬剤は、本発明との任意の組み合わせで適用され得ると企図される。
【０２５７】
（１．化学療法）
癌の治療には、また、化学ベースの処置および放射線ベースの処置の両方との種々の組合せ療法が挙げられる。組合せ化学療法には、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲンシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質転移酵素阻害剤、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、または前述のもののいずれかの類似物または誘導体が挙げられる。
【０２５８】
（２．放射線療法）
ＤＮＡの損傷を引き起こし、そして広範に使用されている他の因子には、γ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞に向けた放射性同位元素の送達として一般に知られているものが挙げられる。他の形状のＤＮＡ損傷因子（例えば、マイクロ波およびＵＶ照射）もまた、企図される。これらの因子の全ては、ＤＮＡ、ＤＮＡ前駆体、その複製、ＤＮＡの修復、および染色体の組立や維持に対して、広範囲の損傷を引き起こす可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたって５０〜２００レントゲンの毎日の線量から、２０００〜６０００レントゲンの１回線量までの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は、広く変わり、その同位元素の半減期、照射する放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存している。
【０２５９】
（３．免疫療法）
免疫療法は、一般に、癌細胞を標的化して破壊する免疫エフェクター細胞および分子の使用に頼っている。この免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面にある一部のマーカーに特異的な抗体であり得る。この抗体は、単独で、治療のエフェクターとして働き得るか、または他の細胞を補充して、細胞を実際に殺し得る。この抗体はまた、薬剤または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合体化され得、そして単に標的化剤として働き得る。あるいは、このエフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的のいずれかで相互作用する表面分子を保持するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞には、細胞毒性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０２６０】
それゆえ、免疫療法は、Ａｄ−ｍｄａ７遺伝子療法と併用して、組合せ療法の一部として使用できる。組合せ療法の一般的なアプローチは、以下で述べる。一般に、腫瘍細胞は、標的化を受け易い（例えば、大部分の他の細胞には存在しない）いくつかのマーカーを持っているはずである。多くの腫瘍マーカーが存在しており、これらのいずれかは、本発明の状況で標的化するのに適切である。一般的な腫瘍マーカーには、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、尿路腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢおよびｐｌ５５が挙げられる。
【０２６１】
（４．遺伝子）
さらに他の実施態様では、二次処置は、遺伝子療法であり、ここで、そのソロスペルミン類似物の前、後またはそれと同時に、治療ポリヌクレオチドが投与される。種々のタンパク質が包含され得、その一部は、以下で記述する。
【０２６２】
（ａ．細胞増殖の誘発剤）
細胞増殖を誘発するタンパク質は、さらに、機能に依存して、種々の範疇に入る。これらのタンパク質の全ての共通点には、それらが細胞増殖を調節する能力である。例えば、ＰＤＧＦ、すなわち、ｓｉｓオンコジーンの１形態は、分泌性成長因子である。オンコジーンは、遺伝子がコードする成長因子からめったに生じず、現在、ｓｉｓは、唯一の公知の天然に存在するオンコジーン成長因子である。本発明の１実施態様では、細胞増殖の誘発剤の発現を防止するために、細胞増殖の特定の誘発剤に向けたアンチセンスｍＲＮＡを使用することが企図される。
【０２６３】
タンパク質であるＦＭＳ、ＥｒｂＡ、ＥｒｂＢおよびｎｅｕは、成長因子受容体である。これらの受容体への突然変異により、調節可能機能の喪失が起こる。例えば、Ｎｅｕ受容体タンパク質の膜貫通ドメインに影響を与える点突然変異は、ｎｅｕオンコジーンを生じる。ｅｒｂＡオンコジーンは、甲状腺ホルモンの細胞内受容体から誘導される。改変された発癌性ＥｒｂＡ受容体は、内因性の甲状腺ホルモン受容体と競合すると考えられ、制御されない成長を引き起こす。
【０２６４】
最も大きい種類のオンコジーンには、情報伝達タンパク質（例えば、Ｓｒｃ、ＡｂｌおよびＲａｓ）が挙げられる。タンパク質Ｓｒｃは、細胞質内タンパク質チロシンキナーゼであり、プロト−オンコジーンからオンコジーンへのその形質転換は、いくつかの場合において、チロシン残基５２７での突然変異により起こる。対照的に、ＧＴＰａｓｅタンパク質ｒａｓのプロトオンコジーンからオンコジーンへの形質転換は、一例では、その配列中のアミノ酸１２でのバリンのグリシンへの変異から生じ、ｒａｓのＧＴＰａｓｅの活性を低下させる。
【０２６５】
タンパク質Ｊｕｎ、ＦｏｓおよびＭｙｃは、転写因子として、核内機能に対するそれらの効果を直接発揮するタンパク質である。
【０２６６】
（ｂ．細胞増殖の阻害剤）
これらの腫瘍サプレッサオンコジーンは、過度の細胞増殖を阻止するように機能する。これらの遺伝子を不活性化すると、それらの阻害活性が破壊されて、調節されない増殖が起こる。腫瘍サプレッサｐ５３、ｐ１６およびＣ−ＣＡＭは、以下で記述する。
【０２６７】
発癌剤、紫外線照射およびいくつかのウイルスにより形質変換された多くの細胞では、高いレベルの変異体ｐ５３が発見されている。このｐ５３遺伝子は、広範囲のヒト腫瘍における変異性不活性化の頻繁な標的であり、既に、一般的なヒトの癌において、最も頻繁に変異される遺伝子であることが実証されている。それは、５０％を超えるヒトＮＳＣＬＣおよび広い範囲の他の腫瘍において、突然変異される。
【０２６８】
このｐ５３遺伝子は、３９３アミノ酸のホスホプロテインをコードし、これは、宿主タンパク質（例えば、ラージＴ抗原およびＥ１Ｂ）と複合体を形成できる。このタンパク質は、正常な組織および細胞で見い出されるが、形質転換した細胞または腫瘍組織と比較して僅かな濃度である。
【０２６９】
野生型ｐ５３は、多くの細胞型において、重要な成長調節剤として認識されている。ミスセンス突然変異は、このｐ５３遺伝子に共通であり、そのオンコジーンの形質転換能力に必須である。点突然変異により促される単一遺伝子変化により、発癌性ｐ５３が生じ得る。しかしながら、他のオンコジーンとは異なり、ｐ５３点突然変異は、少なくとも３０個の異なるコドンで起こることが知られており、これは、しばしば、優性対立遺伝子を作り、それらの対立遺伝子は、ホモ接合性の低下なしに、細胞表現型のシフトを生じる。さらに、これらの優性ネガティブ対立遺伝子の多くは、生物体中で寛容であるようであり、生殖系に伝えられる。種々の突然変異対立遺伝子は、微小な機能障害から強力な浸透性の優性ネガティブ対立遺伝子にわたるようである。
【０２７０】
細胞増殖の他のインヒビターには、ｐ１６がある。真核生物の細胞周期の主な遷移は、サイクリン依存性キナーゼ、すなわち、ＣＤＫにより、誘発される。あるＣＤＫ、すなわち、サイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）は、Ｇ１による進行を調節する。この酵素の活性は、後期Ｇ１において、Ｒｂをホスホリル化することであり得る。ＣＤＫ４の活性は、サブユニットであるＤ型サイクリンを活性化することにより、および阻害性サブユニットにより、制御され、そのｐ１６ＩＮＫ４は、ＣＤＫ４に特異的に結合してそれを阻害し、そしてＲｂホスホリル化を調節し得るタンパク質として、生化学的には特徴付けられている。このｐ１６ＩＮＫ４タンパク質は、ＣＤＫ４インヒビターであるので、この遺伝子が欠乏すると、ＣＤＫ４の活性が高まり得、その結果、Ｒｂタンパク質の過剰ホスホリル化が起こる。ｐ１６はまた、ＣＤＫ６の機能を調節することが知られている。
【０２７１】
ｐ１６ＩＮＫ４は、新たに記述したクラスのＣＤＫ−阻害タンパク質に属し、これには、また、ｐ１６Ｂ、ｐ１９、ｐ２１ＷＡＦ１およびｐ２７ＫＩＰ１が挙げられる。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子は、９ｐ２１、すなわち、多くの腫瘍型ではしばしば欠損している染色体領域にマップ化する。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子のホモ接合性欠損および突然変異は、ヒト腫瘍細胞系では、頻繁に起こる。この証拠は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であることを示唆する。しかしながら、この解釈は、ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子変化の頻度が、培養した細胞系よりも一次非培養腫瘍において、ずっと大きいという知見により、疑問がもたれている。野生型ｐ１６ＩＮＫ４の回復は、ある種のヒト癌細胞系によるプラスミド発現ベクター低減コロニーの形成を使う形質移入により、機能する。
【０２７２】
使用され得る他の遺伝子には、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃｌ、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐｌ６融合体、ｐ２１／ｐ２７融合体、抗血栓遺伝子（例えば、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ）、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、ＥｌＡ、ｐ３００、脈管形成に関与している遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦまたはそれらのレセプター）およびＭＣＣが挙げられる。
【０２７３】
ｃ．プログラム化細胞死の調節剤
アポトーシスまたはプログラム化細胞死は、正常な胚の発達に必須のプロセスであり、これは、成人組織での恒常性を維持し、そして発癌を抑制する。Ｂｃｌ−２族のタンパク質およびＩＣＥ様プロテアーゼは、他のシステムでのアポトーシスの重要な調節剤およびエフェクターであることが立証されている。Ｂｃｌ−２タンパク質は、卵胞リンパ腫と関連した発見されたが、アポトーシスを抑制し多様なアポトーシス刺激に応答して細胞の生存を高める際に、重要な役割を果たす。進化的に保存されたＢｃｌ−２タンパク質は、現在、関連したタンパク質の系統の構成要素であることが認められており、これらは、デスアゴニストまたはデスアンタゴニストとして分類され得る。
【０２７４】
その発見に引き続いて、Ｂｃｌ−２は、種々の刺激により誘発される細胞死を抑制するように作用することが明らかとなった。また、現在、共通の構造および配列相同性を共有する系統のＢｃｌ−２細胞死制御タンパク質が存在することが明らかである。これらの異なる系統のメンバーは、Ｂｃｌ−２と類似の機能を有する（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａｌ、Ｂｆｌ−１）か、またはＢｃｌ−２機能を相殺して細胞死を促進する（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）ことが明らかとなっている。
【０２７５】
５．手術
癌に罹った人の約６０％は、ある種の手術を受け、これには、予防的、診断的またはステージングな治療的および対症的手術が挙げられる。対症的な手術には、他の療法（例えば、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法）と併用され得る癌の治療がある。
【０２７６】
治療的手術には、切除が挙げられ、ここで、癌性組織の全部または一部は、物理的に除去、切除および／または破壊される。腫瘍の切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することをいう。腫瘍の切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、冷凍手術、電気手術および顕微鏡で制御した手術（モース手術）が挙げられる。さらに、本発明は、表在性の癌、前癌または付随した量の正常組織の除去と併用され得ると考えられる。
【０２７７】
癌細胞、組織または腫瘍の全部または一部を切除術の際、体内には、空洞が形成され得る。治療は、その領域を追加抗癌療法で灌流、直接注入または局所適用することにより、達成され得る。このような治療は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日ごとに、または１週間、２週間、３週間、４週間および５週間ごとに、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１２ヶ月ごとに、繰り返され得る。これらの治療は、同様に、投薬量が変えられ得る。
【０２７８】
６．他の薬剤
処置の治療的有効性を向上させるために、本発明には、他の薬剤が併用され得ると考えられている。これらの追加薬剤には、免疫調節剤、細胞表面レセプターおよびＧＡＰ接合部の上方制御に影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞付着のインヒビター、またはアポトーシス誘発剤に対する過剰増殖細胞の感受性を高める薬剤が挙げられる。免疫調節剤には、腫瘍壊死因子；インターフェロン−α、βおよびγ；ＩＬ−２および他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカイン類似物；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−ｌβ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、および他のケモカインが挙げられる。さらに、細胞表面レセプターまたはそれらの配位子（例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓ配位子、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ）の上方制御は、過剰増殖細胞に対する自己分泌効果またはパラ分泌効果を確立することにより、本発明のアポトーシス誘発性能を増強すると考えられている。
【０２７９】
ＧＡＰ接合部の数を多くすることにより、細胞内シグナル伝達を高めると、隣接する過剰増殖細胞の集団に対する抗過剰増殖効果が高くなる。他の実施態様では、それらの処置の抗過剰増殖有効性を向上させるために、細胞増殖抑制剤または分化剤が本発明と併用され得る。細胞付着のインヒビターは、本発明の有効性を高めるために、考慮される。細胞付着インヒビターの例には、焦点付着キナーゼ（ＦＡＫｓ）インヒビターおよびロバスタンがある。さらに、その処置の有効性を向上させるために、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を高める他の薬剤（例えば、抗体ｃ２２５）が本発明と併用され得ると考えられている。
【０２８０】
ホルモン療法もまた、本発明または前記の他のいずれかの癌療法と併用され得る。ホルモンの使用は、特定の癌（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌または子宮癌）の処置において、特定のホルモン（例えば、テストステロンまたはエストロゲン）の効果を阻止するかそのレベルを低くするのに使用され得る。この処置は、しばしば、治療選択肢として、少なくとも１種の他の癌療法と併用されるか、転移のリスクを減少するのに使用される。
【０２８１】
ＩＸ．生物学的結果
Ａ．選択細胞系でのソロスペルミン（ｐｓｏｒｏｓｐｅｒｍｉｎ）およびその初期制限群の類似物の比較細胞毒性
ソロスペルミンおよびその類似物がインビボで抗腫瘍活性の向上を示す可能性を評価する初期手段として、ヒト癌細胞系の対応対の選択が選択され得、これにより、規定の特性（例えば、突然変異トポイソメラーゼＩＩが存在しているための薬物耐性を避ける性能または過剰発現オンコジーンを下方制御する性能）により性能が向上し得る類似物が同定可能である。これらの対応細胞系を使用して、細胞毒性効力について、一組の化合物が評価できる。
【０２８２】
（ｉ）ヒト腫瘍細胞系。微小細胞障害性アッセイで使用する主な形態のヒトの癌に代表的なヒト腫瘍細胞系には、ＭＣＦ７（乳癌）、ＳＷ４８０（結腸癌）、ＨＬ−６０（前骨髄球性白血病）、ＭｉａＰａＣａ−２（膵臓癌）、Ｕ９３７（組織球性リンパ腫）および８２２６（骨髄腫）が挙げられる（表５を参照）。８２２６の１つの薬物耐性改変体もまた、含まれていた：８２２６／ＤＯＸ４０、すなわち、ｍｄｒ−１媒介薬物耐性細胞系。他の対応対もまた、加えられ得る。全ての系は、公知の核型を有し、これらは、少なくとも毎年１回、品質管理について検査される。
【０２８３】
５％ウシ胎児血清、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン（１００単位／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｇ／ｍｌ）および１％（ｖ／ｖ）Ｌ−グルタミン（全て、ＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）製）で補足したＲＰＭＩ１６４０培地にて、懸濁液中で、３７℃で、５％ＣＯ２、９５％空気の雰囲気にて、細胞を成長し、６日ごとに１回、継代した。さらに、これらの系は、インビボ確認研究のために、ＳＣＩＤマウスにて、インビボ増殖され得る。初期実験では、一連の細胞系にて、（±）−ソロスペルミンメチルエーテルの２つのジアステレオマー対を評価した。それらの結果は、表５で示すが、これにより、多分、予想されるように、（±）−（２’Ｒ，３’Ｒ）（２’Ｓ，３’Ｓ）ソロスペルミンメチルエーテル（「化合物Ａ」）からなるジアステレオマー対（これは、天然鏡像異性ソロスペルミンを含む）は、「天然」（±）−（２’Ｒ，３’Ｓ）（２’Ｓ，３’Ｒ）ソロスペルミンメチルエーテル（「化合物Ｂ」）よりも強力であることが明らかである。
【０２８４】
表５．ソロスペルミンメチルエーテルのジアステレオマー対のインビトロ細胞毒性効力
【０２８５】
【表５】
2005512948.tif 000068
【０２８６】
白血病、リンパ腫、および種々の固形腫瘍における（＋）−（２’Ｒ，３’Ｒ）（２’Ｓ，３’Ｓ）ソロスペルミンメチルエーテルのＩＣ５０値を、表６に示す。さらなるソロスペルミン類似物に対するＩＣ５０値を、図６に示す。
【０２８７】
【表６】
2005512948.tif 000069
【０２８８】
ドキソルビシンおよびソロスペルミンメチルエーテルに対する対応細胞系の感受性の比較を、図７に示し、種々の細胞系に対するソロスペルミンメチルエーテルの細胞毒性の例を、図８に示す。
【０２８９】
表７  腫瘍細胞での光学的に純粋な鏡像異性体ソロスペルミン類似物の効果
【０２９０】
【表７】
2005512948.tif 000070
【０２９１】
腫瘍細胞における光学的に純粋な（２Ｓ，３Ｒ）−ソロスペルミンメチルエーテル（１１６）および（２Ｒ，３Ｓ）−ソロスペルミンメチルエーテル（１１７）の効果を、表７に示す。
【０２９２】
（ｉｉ）微小細胞障害性アッセイ。（細胞倍加時間に依存して）１ウェルあたり４，０００〜１０，０００個の細胞で、１薬物用量あたり６個の複製ウェルで、各細胞系をマイクロタイタープレートにプレーティングことにより、標準９６ウェル微小細胞障害性アッセイを実行する。全てのプレートを、３７℃で、湿潤組織培養インキュベータ（これは、空気中にて、５％ＣＯ２を含有する）にて、４日間インキュベートする。その終点の決定は、スルホルホダミンブルー（ＳＲＢ）を使用し、各ウェルのタンパク質含量の分光光度的決定は、ＳＲＢ染色で反映される。ＩＣ５０値は、線形回帰分析により、計算した。
【０２９３】
（ｉｉｉ）結論。両方の化合物は、試験した全ての腫瘍細胞系に対して、強力な効果を有する。化合物Ａは、平均して、化合物Ｂよりも２倍有効であった。ＨＬ−６０（急性前骨髄球性白血病であって、これは、ｃ−ｍｙｃおよびＢＣＬ−２に陽性である）は、化合物Ｂに非常に感受性である。８２２６および８２２６／ＤＯＸ（骨髄腫細胞系であって、ここで、ｍｄｒ−１は、上方制御される（ＤＯＸ）か、ＢＣＬ−２は、上方制御される（両方））は、ｍｄｒ−１耐性を示さない。化合物Ａは、膵臓細胞系ＭｉａＰａＣａ（これは、処置が非常に困難である）に著しい活性を示す。ＭｉａＰａＣａにおける活性は、ゲミシタビン（これは、膵臓癌の処置用の唯一の認可された薬物である）と同程度またはそれにより良好である。
【０２９４】
Ｂ．ＤＮＡチップアレイ技術を使用する差別的オンコジーン発現
（ｉ）背景。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析は、どの遺伝子または経路が特定の薬剤（ソロスペルミンまたは類似物）または薬剤の組合せ（ソロスペルミンおよびＣＴＰ−１１）を使う処置で影響されるかを決定するために使用され得る。５７００個のヒト遺伝子チップのうちの数百を製作するのに成功した。この遺伝子チップは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（９７００１．Ｖ）から譲渡された第一ヒト遺伝子セットから構成され、５１８４個の配列を確認したＩＭＡＧＥコンソーシアムクローンからなる。ＵｎｉＧｅｎｅで決定されるように、約３０００個は、公知の遺伝子であり、残りは、「発現された配列タグ」（ＥＳＴ’ｓ）である。各クローンに関する関連情報（例えば、受託番号およびＵｎｉｇｅｎｅクラスター）は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓのウェブサイト（ｗｗｗ．ｒｅｓｇｅｎ．ｃｏｍ）から得ることができる。各スライドはまた、感度、蛍光標識効率および非特異的ハイブリダイゼーションをモニターするために、「ハウスキーピング」遺伝子および非ヒト配列の集合を含む。
【０２９５】
（ｉｉ）データ分析。ｃＤＮＡマイクロアレイ分析により得た結果は、標準ＲＮＡ分析技術（例えば、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，ＲＴ  ＰＣＲ）を使用して、実験的に確認され得る。この実験的な確認に加えて、これらのハイブリダイゼーションからの結果の再現性を評価する統計的なアプローチが使用され得る。第一の試験は、大部分の遺伝子が発現の差を示さないという予測に基づいている。別個の軸において、各遺伝子に対する蛍光強度をグラフにすることにより、発現に差がない遺伝子は、全て、１の勾配で、一直線上にのる。
【０２９６】
このデータの質をさらに評価するために、全部で３回の実験で測定した発現割合の一貫性が計算され得る。ＧｅｎｅＰｉｘ分析ソフトウェアは、このマイクロアレイの各要素に対して、中央強度値を生じる。別個のハイブリダイゼーションから得た強度および局所背景データは、正規化され得、各チャンネルにある各遺伝子について、平均および標準偏差を計算するのに使用され得る（Ｃｙ３およびＣｙ５）。遺伝子発現の著しい差は、２つのチャンネルにおける平均強度間の差を、２つのチャンネルの標準偏差の大きい方の１．９倍と比較することにより、９０％の信頼性レベルで、決定され得る。これらのアレイ結果に対する「真の」背景（局所背景は、非特異的ハイブリダイゼーションを考慮しない）を決定するために、Ｉｃｅ  Ｐｌａｎｔ（Ｍｅｓｅｍｂｒｙａｎｔｈｅｍｕｍ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｕｍ）から誘導した８個の遺伝子について、背景を差し引いたシグナル強度を平均し、それぞれ、マイクロアレイ上に１６倍で印刷して、その標準偏差を決定した。これらの統計を使用して、９５％の信頼度で真のシグナルを表わすデータが選択される（例えば、平均Ｉｃｅ  Ｐｌａｎｔシグナル＋１．９６（ＳＤ  Ｉｃｅ  Ｐｌａｎｔシグナル）＝低シグナルカットオフ）。次いで、両方のチャンネルにおいて発現および「真の」背景上シグナルに有意な差がある遺伝子について、発現比が計算される。
【０２９７】
Ｘ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を立証するために、含めている。以下の実施例で開示した技術は、本発明者が本発明を実施する際にうまく機能することを発見した技術を表わし、それゆえ、その実施に好ましい様式を構成すると考えられることは、当業者に理解できるはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施態様に変更をなすことができ、依然として、同じまたは類似の結果を得られることを理解できるはずである。
【０２９８】
Ａ．ソロスペルミンメチルエーテルの合成
ソロスペルミンメチルエーテルの合成を、図式１３に示す。
【０２９９】
【化８３】
2005512948.tif 000071
【０３００】
以下の一般手順に従った。特に明記しない限り、全ての出発物質は、業者から得、さらに精製することなく、使用した。Ｐｄ（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ４）２を、Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得た。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、Ａｌｄｒｉｃｈから、９９．８％無水で購入した。ベンゼンは、ＣａＨ２から蒸留した。全ての反応は、特に明記しない限り、アルゴン雰囲気下にて実行した。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、特に明記しない限り、指定した領域にて、ＣＤＣｌ３の溶液として、測定した；化学シフトは、その溶媒を参照して、ｐｐｍ（δ単位）で表わす。分割パターンは、ｓ（一重項）；ｄ（二重項）；ｔ（三重項）；ａｐｐ  ｔ（見かけ三重項）；ｑ（四重項）；ｍ（多重項）；ｃｏｍｐ（錯体多重項）；ｂｒ（ブロード）として、表わす。
【０３０１】
１，３−ジヒドロキシ−５−メトキシキサントン（１０１）。Ｃａｓｓａｄｙら（１９８７ａ）の文献手順に従って、調製する。全ての分析データは、良好である。
【０３０２】
３−ベンジルオキシ−１−ヒドロキシ−５−メトキシキサントン（１０２）。０℃で、ＤＭＦ（８０ｍＬ）中にて、フェノール（１０１）（４．０ｇ、１５ｍｍｏｌ）およびＢｎＢｒ（１．７ｍｌ、１４ｍｍｏｌ）に、Ｃｓ２ＣＯ３（１０．１ｇ、３１ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。この反応物を室温まで温めた。５時間後、フェノールが残ったので、さらに多くのＢｎＢｒ（０．１ｍＬ）を加え、その反応物を３６時間攪拌した（ＴＬＣ：４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）。この反応物をデカントし、そしてＣＨ２Ｃｌ２で三角フラスコ（ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）中で洗浄し、これを、氷冷浴に入れた。攪拌しつつ、ｐＨ紙で酸性になるまで、２Ｍ  ＨＣｌをゆっくりと加えた。室温まで温めた後、この反応物をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈した。層分離し、その水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×３００ｍＬ）で再抽出した。有機層を合わせ、ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下にて濃縮して、ピンク色固形物として、（３．９ｇ、７２％）の２を得た。（ＬＨ−５８−３６）
【０３０３】
【化８４】
2005512948.tif 000072
【０３０４】
３−ベンジルオキシ−１，５−ジメトキシキサントン（１０３）。室温で、ＤＭＦ（４００ｍＬ）中にて、フェノール（１０２）（１４．５ｇ、４２ｍｍｏｌ）およびＭｅＩ（８．０ｍｌ、１２５ｍｍｏｌ）に、Ｃｓ２ＣＯ３（２７．０ｇ、８３ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。５０℃で３時間後、その反応物をデカントし、そして三角フラスコ中でＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、これを、氷冷浴に入れた。攪拌しつつ、ｐＨ紙で酸性になるまで、２Ｍ  ＨＣｌをゆっくりと加えた。室温まで温めた後、この反応物をＣＨ２Ｃｌ２（８００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（４００ｍＬ）で希釈した。層分離し、その水層をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で再抽出した。有機層を合わせ、ブライン（４００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下にて濃縮して、赤色スラッジを得、これは、ＥｔＯＨで倍散して（ｔｒｉｔｒａｔｅ）濾過し得、ピンク色固形物として、（９．３ｇ、６６％）の（１０３）を得た。この時点で、５０％ＥｔＯＨ／ヘキサンを使うカラムクロマトグラフィーにより、分析的に純粋な物質を得ることができる。
【０３０５】
【化８５】
2005512948.tif 000073
2005512948.tif 000074
【０３０６】
１，５−ジメトキシ−３−（３’，３’−ジメチルプロピノキシ）キサントン（１０４）。ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）中にて、（１０３）（５．０ｇ、１７ｍｍｏｌ）に、ＦｅＣｌ３（９．０ｇ、６９ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。４０分間攪拌した後、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）を加え、その反応物を、激しく攪拌／渦流化した。この反応物を非常に大きいブフナー漏斗で濾過し、その褐色のｐｐｔをＨ２Ｏ（３００ｍＬ）およびエーテル（２００ｍＬ）で洗浄し、そして漏斗上で一晩乾燥した。
【０３０７】
ＤＭＦ（６０ｍＬ）の粗ジメチルエーテルキサントン（３．２７ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）に、３−クロロ−３−メチル−１−ブチン（１１．８ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）、ＫＩ（１．０ｇ、６．０１ｍｍｏｌ）およびＣｓ２ＣＯ３（１１．８ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）を加えた。その反応物を、５０℃で、１９時間加熱し、室温まで冷却し、次いで、氷浴に入れた。その反応がクエンチされるまで、２Ｍ  ＨＣｌを加えたところ、それ以上の発泡は観察されなかった。次いで、この混合物をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で希釈し、層分離した。その有機層を飽和ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下にて濃縮した。その粗生成物をカラムクロマトグラフィー（６０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、黄色固形物（３．５０ｇ（７５％））を得た。
【０３０８】
【化８６】
2005512948.tif 000075
【０３０９】
１，５−ジメトキシ−３−（３’，３’−ジメチルプロペノキシ）キサントン（１０５）。（１０４）（２．１７ｇ、６．４２ｍｍｏｌ）およびキノリン（３．５ｍＬ）のベンゼン（２００ｍＬ）溶液に、鉛で毒性にした５％Ｐｄ／ＣａＣＯ３（Ｌｉｎｄｌａｒ触媒）（１．３７ｇ、０．６４２ｍｍｏｌ）を加えた。その反応フラスコを脱気し、次いで、バルーンからのＨ２を充填し直した。その反応物を、Ｈ２下にて、２時間攪拌した。（この反応は、セリットで濾過し濃縮した小アリコートの１Ｈ  ＮＭＲでモニターでき、これは、そのアルキンプロトンの消失またはオレフィンプロトンの消失を観察する）。２時間後、さらに多くのＰｄ触媒（０．５ｇ）を加え、その反応物を、Ｈ２下にて、１．５時間攪拌した。この反応物をセリットのパッドで濾過し、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）で洗浄し、そして減圧下にて濃縮した。その残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＨＣｌ（４×２００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下にて濃縮して、黄色固形物１．６５ｇ（７６％）を得た。（ＬＨ−６３−１７）
【０３１０】
【化８７】
2005512948.tif 000076
【０３１１】
１，５−ジメトキシ−４−（１，１−ジメチルプロペン）キサントン（１０６）。（１０５）（０．２３ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）のジエチルアニリン（５５ｍＬ）懸濁液を、３時間にわたって、２００℃まで加熱し、そして室温まで冷却した。その反応物を濾過し、そのｐｐｔをＭｅＯＨで洗浄して、ベージュ色固形物として、２．３ｇ（６０％）の（１０６）を得た。（ＬＨ−６３−１９）
【０３１２】
【化８８】
2005512948.tif 000077
【０３１３】
（１０６）（１．２１ｇ、３．５６ｍｍｏｌ）、（±）１，５−ジメトキシ−２’−イソプロペニルジヒドロフロアノキサントン（１０７）。Ｐｄ［（ＣＨ３ＣＮ）４（ＢＦ）２］（０．７９ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）およびベンゾキノン（これは、ＥｔＯＨから再結晶した；３．８４ｇ、３５．６ｍｍｏｌ）の混合物に、ＤＭＳＯ（１１８ｍＬ）を加えた。その溶液を３６時間攪拌し、次いで、分液漏斗（これは、ＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍＬ）を含有する）に注ぎ、そしてＨ２Ｏ（２×３００ｍＬ）で洗浄した。層分離し、そのＨ２Ｏ層をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を合わせ、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下にて濃縮した。その粗生成物をカラムクロマトグラフィー（５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、その生成物を、最小量のＣＨ２Ｃｌ２で、そのカラムに装填して、０．１５ｇ（１２％）のクロメンを得、次いで、白色固形物として、０．９７ｇ（８１％）のベンゾフラン（１０７）を得た。（ＬＨ−６４−５０）。
【０３１４】
【化８９】
2005512948.tif 000078
2005512948.tif 000079
【０３１５】
（２Ｒ＊’，３Ｒ＊’）−１，５−ジメトキシ−３’，４’−ジヒドロキシジヒドロフラノキサントン（１０８）。（１０７）（０．２５ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（２．５ｍＬ）溶液を、１：１のＨ２Ｏ／アセトン（２ｍＬ）中のＮ−メチルモルホリンオキシド（ＮＭＯ）（０．１０ｇ、０．８９ｍｍｏｌ）およびＯｓＯ４に加えた。その反応物を、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）により出発物質の残留がなくなるまで、２時間攪拌した。ＴＬＣにより、２種のジアステレオマーが明らかとなり、その低い方のＲｆは、所望のジアステレオマー（１０８Ａ）であった。この反応物を濾過し、そのｐｐｔをＨ２Ｏ（５ｍＬ）およびアセトン（２ｍＬ）で洗浄し、そして集めて、（±）（１０８）のジアステレオマー混合物（０．２４ｇ、９６％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ分析により、ジアステレオマーの２：１混合物（Ｂ：Ａ）が明らかである。（ＬＨ−６４−３７）。
【０３１６】
【化９０】
2005512948.tif 000080
【０３１７】
ジアステレオマー比は、芳香族一重項プロトンの１Ｈ  ＮＭＲにより決定し得る：８Ａ＝６．５４ｐｐｍに対して、８Ｂ＝６．５７ｐｐｍ。
【０３１８】
（２Ｒ＊’，３Ｒ＊’）−４−ｔ−ブチルシリルオキシ−１，５−ジメトキシ−３’−ヒドロキシジヒドロフラノキサントン（１０９）。（１０８）（０．２３ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）、ＴＢＳＣｌ（０．１４ｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、イミダゾール（０．１３ｇ、１．９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３８ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）の溶液を、ヒートガンで約８５℃まで加熱し、そして一晩攪拌した。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）により、ジオールは、依然として残留していることが明らかとなり、そこで、過剰のＴＢＳＣｌ（０．１４ｇ）、イミダゾール（０．１３ｇ）およびＤＭＡＰ（４０ｍｇ）を加えた。その反応物を、同様の様式で、ヒートガンで加熱し、そして２時間攪拌した。この反応物を、再度、ヒートガンで加熱し、さらに２時間攪拌した。この反応物を、減圧下にて濃縮した。その粗生成物を２個の連続カラム（１０％ＥｔＯＡｃ／ＣＨ２Ｃｌ２）で精製して、（１０９Ｂ）１２７ｍｇ（４２％）、（１０９ＡおよびＢ）の５４ｍｇ（１８％）の混合画分および５４ｍｇ（１８％）の純粋（１０９Ａ）を得た。（ＬＨ−６５−４１）。
【０３１９】
【化９１】
2005512948.tif 000081
【０３２０】
（２Ｒ＊’，３Ｒ＊’）−ソロスペルミンメチルエーテル（１１０）。ＴＨＦ（１．５ｍＬ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）（０．０６ｍＬ、０．０６２ｍｍｏｌ）および（１０９Ａ）（０．０２ｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を１０分間攪拌し、次いで、減圧下にて濃縮した。その粗生成物をピリジン（０．５ｍＬ）に溶解し、０℃まで冷却し、そして塩化メシル（１００μｌ）を滴下した。その反応物を３０分間攪拌し、そしてＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）でモニターした。さらに多くのＭｓＣｌ（２０μｌ）を加え、その反応物を１５分間攪拌した。Ｈ２Ｏ（２ｍＬ）を加え、その混合物をＣＨＣｌ３で抽出した。その曇った有機層を６Ｍ  ＨＣｌ（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下にて濃縮した。その粗メシレートに、アセトン（２ｍＬ）、１８−クラウン−６（８２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（４３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を加えた。ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）によりメシレートが残留していないことが明らかとなるまで（１〜３時間）、その白色懸濁液を激しく攪拌した。この反応物を、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を含有する分液漏斗にデカントした。そのフラスコおよび残留しているＫ２ＣＯ３を、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で洗浄し、これを、この分液漏斗に加えた。その有機層を飽和ＮａＣｌ（１０ｍｌ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下にて濃縮した。その粗生成物をカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）で精製し、その生成物を、ＣＨ２Ｃｌ２中にて、そのカラムに装填して、（±）ソロスペルミンメチルエーテル７ｍｇ（５０％）を得た。その１Ｈ  ＮＭＲおよび高分解能質量スペクトルデータは、予想したものに一致しているだけでなく、以前に報告されたもの（Ｓｔｒｅｅｌｍａｎ，ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎａ，１９７７）に一致している。（ＬＨ−６５−９，１０）。
【０３２１】
【化９２】
2005512948.tif 000082
【０３２２】
ソロスペルミンメチルエーテルの（２Ｒ＊，３Ｒ＊）ジアステレオマー（１１０）（８ｍｇ）を、最小量のジクロロメタンに溶解し、得られた溶液の１００マイクロリットル注入液を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ２５ｃｍ×１０ｍｍ  ＨＰＬＣカラム（これは、シリカゲルに結合した３，５−ジニトロ尿素連結第三級ロイシンの固定相を使う）に適用した。そのカラムを、３０℃で、６０％ヘキサン、２０％１，２−ジクロロエタンおよび２０％イソプロパノールで溶出し、繰り返し注入して、（＋）（２Ｓ，３Ｓ）−ソロスペルミンメチルエーテル（１１４）（３ｍｇ）を得た。
【０３２３】
【化９３】
2005512948.tif 000083
2005512948.tif 000084
【０３２４】
同様に、ソロスペルミンメチルエーテルの（２Ｒ＊，３Ｓ＊）ジアステレオマー（９０ｍｇ）を分離して、（２Ｓ，３Ｒ）−ソロスペルミンメチルエーテル（１１６）（３１ｍｇ）を得た。
【０３２５】
【化９４】
2005512948.tif 000085
【０３２６】
Ｂ．他のソロスペルミン類似物の合成
図式１４で示した反応に従って、さらなるソロスペルミン類似物を合成した。
【０３２７】
【化９５】
2005512948.tif 000086
【０３２８】
（±）−１−ヒドロキシ−２’−イソプロペニル−５−メトキシジヒドロフラノキサントン（１１１）。ＣＨＣｌ３中にて、０℃で、メチルエーテル（１０７）（０．１０ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）に、５秒間隔で、ＢＣｌ３（ＣＨ２Ｃｌ２中で１．０Ｍ、０．３０ｍｌ、０．３０ｍｍｏｌ）を滴下した。その反応物を１５分間攪拌し、次いで、室温まで温めた。ＴＬＣ（４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により、（１０７）が依然として残留していることが明らかとなった。室温で、さらに多くのＢＣｌ３（０．１０ｍｌ）を滴下した。１５分後、ＴＬＣにより、（１０７）が依然として残留していることが明らかとなり、そこで、室温で、ＢＣｌ３（０．１５ｍｌに続いて５０μｌ）を滴下した。その反応物を、Ｈ２Ｏ（２０ｍｌ）を含有する分液漏斗に注ぎ、そしてＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、飽和ＮａＣｌで洗浄し、そして乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。その粗生成物をカラムクロマトグラフィー（これは、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出する）により精製して、黄色固形物として、８４ｍｇ（８８％）の（１１１）を得た。（ＬＨ−６６−３８）。
【０３２９】
【化９６】
2005512948.tif 000087
【０３３０】
（±）−１−アルキルエーテル−２’−イソプロペニル−５−メトキシジヒドロフラノキサントン（１１２）に対する一般手順。室温で、ＤＭＦ（３ｍＬ）中のフェノール（１１１）（４０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＥｔＩ（１５μＬ、０．１９ｍｍｏｌ）に、Ｃｓ２ＣＯ３（８０．０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。５０℃で３時間後、さらに多くのＥｔＩ（１０μＬ）を加え、その反応物を、さらに１時間攪拌した。その反応混合物がｐＨ紙により酸性となるまで、２Ｍ  ＨＣｌをゆっくりと加えた。室温まで温めた後、その反応物をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈した。その有機層をブライン（４００ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして減圧下にて濃縮して、黄色固形物を得た。４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出するカラムクロマトグラフィーにより、白色固形物として、（３４ｍｇ、７９％）の１２を得た。（ＬＨ−６６−４１）。
【０３３１】
イソプロピル類似物（１１２）：
【０３３２】
【化９７】
2005512948.tif 000088
【０３３３】
エチル類似物（１１２）：
【０３３４】
【化９８】
2005512948.tif 000089
2005512948.tif 000090
【０３３５】
（２Ｒ＊’，３Ｒ＊’）−１−エトキシ−ソロスペルミンメチルエーテル（１１３）。手順は、化合物（１０８）、（１０９）および（１１０）を製造するのに使用した手順と同じである。
【０３３６】
【化９９】
2005512948.tif 000091
【０３３７】
（２Ｒ＊’，３Ｒ＊’）−１−イソプロポキシ−ソロスペルミンメチルエーテル（１１３）。手順は、化合物（１０８）、（１０９）および（１１０）を製造するのに使用した手順と同じである。
【０３３８】
【化１００】
2005512948.tif 000092
【０３３９】
（参考文献）
以下の参考文献の内容は、本明細書中で述べた例示的な手順またはそれを補足する他の詳細を提供する範囲まで、本明細書中で参考として具体的に援用されている。
【０３４０】
【表８】
2005512948.tif 000093
【０３４１】
【表９】
2005512948.tif 000094
【０３４２】
【表１０】
2005512948.tif 000095
【０３４３】
【表１１】
2005512948.tif 000096
【０３４４】
【表１２】
2005512948.tif 000097
【０３４５】
【表１３】
2005512948.tif 000098
【０３４６】
【表１４】
2005512948.tif 000099
【０３４７】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、本発明の特定の局面をさらに説明するために含まれている。本発明は、本明細書中で提示した特定の実施態様の詳細な説明と組み合わせ、これらの図面の１枚以上を参照して、さらによく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０３４８】
【図１】図１は、ソロスペルミンの構造を示す。
【図２】図２は、ＤＮＡ中でのソロスペルミンとＮ７グアニンとの反応を示す。
【図３】図３は、ソロスペルミンと主溝との間のＮＯＥＳＹ結合性の概略的な要約を示す；その分子間結合性は、インターカレート発色団の長軸が隣接塩基対とほぼ平行配向にあることを示している。
【図４】図４は、部位Ａおよび部位Ｂとして示されるトポイソメラーゼＩＩ開裂生成物を示す。
【図５】図５は、ソロスペルミンによるＤＮＡの部位特異的アルキル化の可能な生化学的結果を示す。
【図６】図６は、種々のソロスペルミンアナログのＩＣ５０値を示す。
【図７】図７は、ドキソルビシンおよびソロスペルミンメチルエーテルに対する一致した細胞系の感度の比較を示す。
【図８】図８は、一致した白血病細胞系およびリンパ腫細胞系、正常および新生物性乳細胞（ＭＣＦ−７）および膵臓細胞（ＭｉａＰａＣａ）に対するソロスペルミンメチルエーテルの細胞毒性の例を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005512948.tif 000125
【図７】
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【図８】
2005512948.tif 000127
【国際調査報告】
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2005512948.tif 000129
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