(57)【要約】天然の抗体の構造、安定性、および結合特性を模倣した代替抗体分子の産生プロセスを記載する。代替抗体の構造、代替抗体ライブラリーの組成物、代替抗体の調製方法、および代替抗体の適用を開示する。代替抗体の構造安定化方法およびヌクレアーゼ耐性も開示する。代替抗体は、特異性鎖および安定化鎖を含む。特異性鎖は、第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含む。安定化鎖は、第１の定常領域と相互作用する第１の安定化領域および第２の定常領域と相互作用する第２の安定化領域を含む。さらなる実施形態では、安定化鎖および特異性鎖は異なる分子を含む。他の実施形態では、代替抗体分子は、特異的リガンド結合特性を有するループを形成する少なくとも１つのヌクレオチド配列を有するポリオリゴヌクレオチドを含み得る。ランダム結合分子の巨大集団を含む代替抗体ライブラリーを予め構築し、必須の結合特性を有する分子を捕捉および増幅するプロセスで使用する。前記プロセスによって産生された増幅された代替抗体分子は、最初に構築したライブラリーから捕捉した親分子と同一の構造および結合特性を有する。代替抗体分子は、少なくとも２つの隣接および並列した鎖（一方の差は他方よりも多数のヌクレオチドを有する）のハイブリッド形成によって形成および安定化された結合ループを含む。ポリクローナル代替抗体試薬の調製を、捕捉／富化ならびに増幅、特異性の増大、および親和性の増大の段階によって進行させる。意図する適用に依存して、ポリクローナル代替抗体試薬を単一クローン性にプロセシングすることができる。これらの分子は、天然の免疫グロブリンの結合特性から発展し、その開発において動物、動物施設、細胞培養、または免疫応答の刺激を必要としない。これらを、天然の抗体分子の有効な代替物として使用することができるので、免疫アッセイなどの試験方法、治療薬、特異的結合、および研究目的で使用することができ、代替抗体の開発に適合する標的リガンドには、溶液中で代替抗体と複合体形成した場合に非複合体形成代替抗体と物理的または化学的に異なり得る特徴を達成する化合物、生物、および細胞が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異性鎖および安定化鎖を含む単離分子において、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む
ことを特徴とする単離分子。
【請求項２】
前記安定化鎖が、前記第１の安定化ドメインと前記第２の安定化ドメインとの間に第１のスペーサードメインをさらに含む、請求項１の単離分子。
【請求項３】
前記安定化鎖がアミノ酸配列を含む、請求項１の単離分子。
【請求項４】
前記核酸配列がデオキシリボ核酸配列またはリボ核酸配列を含む、請求項１の単離分子。
【請求項５】
前記分子が少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項１の単離分子。
【請求項６】
前記特異性領域がリガンドに結合する、請求項１の単離分子。
【請求項７】
前記安定化鎖が第２の核酸配列を含む、請求項１の単離分子。
【請求項８】
少なくとも１つの前記核酸配列または前記第２の核酸配列がデオキシリボ核酸配列またはリボ核酸配列を含む、請求項７の単離分子。
【請求項９】
前記安定化鎖を含む前記第２の核酸配列が少なくとも８個のヌクレオチドである、請求項７の単離分子。
【請求項１０】
前記特異性鎖が少なくとも１０個のヌクレオチドを含む、請求項７の単離分子。
【請求項１１】
前記分子がリガンドに結合する、請求項７の単離分子。
【請求項１２】
前記リガンドが、ポリペプチド、ヌクレオチド、化合物、ムコ多糖、細胞、生物、細菌、ウイルス、脂質、無機分子、有機分子、またはＰＣＢを含む、請求項１１の単離分子。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが受容体である、請求項１２の単離分子。
【請求項１４】
前記分子がリガンドとして作用する、請求項７の単離分子。
【請求項１５】
前記分子が少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項７の単離分子。
【請求項１６】
前記機能的部分がレポーター分子、親和性型分子、結合分子、または酵素を含む、請求項１５の単離分子。
【請求項１７】
前記機能的部分が有機分子または無機分子である、請求項１５の単離分子。
【請求項１８】
前記機能的部分が治療薬である、請求項１５の単離分子。
【請求項１９】
前記治療薬が抗微生物活性を有する抗微生物薬である、請求項１８の単離分子。
【請求項２０】
前記抗微生物活性が、抗細菌活性、抗ウイルス活性、または抗真菌活性を含む、請求項１９の単離分子。
【請求項２１】
前記機能的部分が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５の単離分子。
【請求項２２】
前記機能的部分が前記特異性領域に存在する、請求項１５の単離分子。
【請求項２３】
前記機能的部分により疎水性結合能力が前記特異性領域に導入される、請求項２２の単離分子。
【請求項２４】
前記機能的部分が、糖ヌクレオチドまたはリン酸分子の２’位で修飾された修飾ヌクレオチドを含む、請求項１５の単離分子。
【請求項２５】
前記機能的部分によりヌクレアーゼ分解耐性が増大する、請求項１５の単離分子。
【請求項２６】
前記機能的部分が前記安定化鎖中に存在する、請求項１５の単離分子。
【請求項２７】
前記機能的部分が、ＰＣＲ反応においてポリメラーゼ活性に対する耐性を増大させる増幅不可能な部分を含む、請求項２６の単離分子。
【請求項２８】
前記特異性鎖が第２の定常領域および第３の定常領域に隣接する第２の特異性領域をさらに含み、
前記安定化鎖が前記第３の定常領域と相互作用する第３の安定化ドメインをさらに含む、ことを特徴とする請求項１の単離分子。
【請求項２９】
前記安定化鎖が前記第１の安定化ドメインと前記第２の安定化ドメインとの間に第１のスペーサー領域をさらに含み、且つ前記第２の安定化ドメインと前記第３の安定化ドメインとの間に第２のスペーサー領域をさらに含む、請求項２８の単離分子。
【請求項３０】
前記安定化鎖が核酸配列を含む、請求項２８の単離分子。
【請求項３１】
前記安定化鎖がアミノ酸配列を含む、請求項２８の単離分子。
【請求項３２】
請求項１の分子集団を含む組成物。
【請求項３３】
特異性鎖および安定化鎖を含む分子集団を含む、単離分子のライブラリーであって、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
前記集団中の前記特異性鎖の第１の各定常領域が同一であり、前記集団中の前記特異性鎖の第２の各定常領域が同一であり、前記集団中の前記特異性鎖の各特異性領域がランダム化され、
前記集団中の各安定化鎖が同一である
ことを特徴とする単離分子のライブラリー。
【請求項３４】
前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む、請求項３３のライブラリー。
【請求項３５】
ａ）特異性鎖集団を準備するステップと、ここで、
ｉ）前記集団中の前記各特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
ｉｉ）前記集団中の前記特異性鎖の各第１の定常領域が同一であり、
ｉｉｉ）前記集団中の前記特異性鎖の各第２の定常領域が同一であり、
ｉｖ）前記集団中の前記特異性鎖の前記各特異性領域がランダム化されている、
ｂ）前記特異性鎖の集団を安定化鎖と接触させるステップと、
ここで、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
前記接触が、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で起こる
により生産される単離分子のライブラリー。
【請求項３６】
前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む、請求項３５のライブラリー。
【請求項３７】
代替抗体ライブラリーの作製方法であって、
ａ）特異性鎖集団を準備するステップと、ここで、
ｉ）前記集団中の前記各特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
ｉｉ）前記集団中の前記特異性鎖の各第１の定常領域が同一であり、
ｉｉｉ）前記集団中の前記特異性鎖の各第２の定常領域が同一であり、
ｉｖ）前記集団中の前記特異性鎖の前記各特異性領域がランダム化されている、
ｂ）前記特異性鎖の集団を安定化鎖と接触させるステップと、
ここで、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
前記接触が、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で起こる
を含む、方法。
【請求項３８】
前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
代替抗体分子の形成方法であって、
ａ）特異性鎖および安定化鎖を準備するステップと、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
ｂ）前記特異性鎖および前記安定化鎖を、第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で接触させるステップと、
ここで、前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含み
を含む、方法。
【請求項４０】
代替抗体分子の増幅方法であって、
ａ）特異性鎖および安定化鎖を準備するステップと、
ここで、前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
ｂ）前記特異性鎖を増幅するステップと、
ｃ）第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で、前記特異性鎖を前記安定化鎖に接触させるステップと、
ここで、前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含み、
を含む、方法。
【請求項４１】
代替抗体の捕捉方法であって、
ａ）リガンド結合代替抗体複合体集団を形成する条件下で、リガンドを代替抗体分子集団に接触させるステップと、ここで、前記代替抗体集団の各代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
ｂ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団から前記リガンドおよび前記代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団の特異性鎖を増幅するステップと
を含む、方法。
【請求項４２】
前記集団が代替抗体分子のライブラリーを含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む、請求項４１の方法。
【請求項４４】
前記集団が代替抗体の選択された集団を含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
前記方法が、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で、ステップ（ｃ）の特異性鎖の集団を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む、請求項４１の方法。
【請求項４６】
前記方法が、クローン化した特異性鎖を単離するステップをさらに含み、前記単離ステップがステップ（ｃ）の特異性鎖の増幅集団の少なくとも１つの特異性鎖をクローニングすることを含む、請求項４１の方法。
【請求項４７】
前記方法が、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で前記クローン化特異性鎖を前記安定化鎖に接触させるステップをさらに含む、請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記分配ステップが、保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中にリガンド結合代替抗体複合体が保持され、濾過物中に非結合代替抗体が濾過される多孔度を有する膜を通して、前記リガンド、前記代替抗体分子集団、および前記リガンド結合代替抗体複合体集団を濾過するステップを含む請求項４１の方法。
【請求項４９】
代替抗体の結合特異性を増大する方法であって、
ａ）非特異的部分結合代替抗体複合体集団が形成できる条件下で、代替抗体分子集団を非特異的部分と接触させるステップと、ここで、前記代替抗体分子集団が目的のリガンドに結合することができ、
前記代替抗体集団の各代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
ｂ）前記非結合代替抗体複合体集団から前記非特異的部分および前記非特異的部分結合代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）の前記非結合代替抗体複合体集団の少なくとも１つの特異性鎖を増幅するステップと
を含む、方法。
【請求項５０】
前記代替抗体集団が代替抗体のライブラリーを含む、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む、請求項４９の方法。
【請求項５２】
前記集団が選択された代替抗体集団である、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記方法が、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で、ステップ（ｃ）の特異性鎖を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む、請求項４９の方法。
【請求項５４】
代替抗体の結合親和性を増大する方法であって、
ａ）リガンド結合代替抗体複合体集団を形成できるストリンジェントな条件下で、リガンドを代替抗体分子集団に接触させるステップと、
ここで、前記代替抗体集団の代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
ｂ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団から前記リガンドおよび前記代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団の特異性鎖を増幅するステップと
を含む、方法。
【請求項５５】
前記方法が、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で、ステップ（ｃ）の特異性鎖を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む、請求項５４の方法。
【請求項５７】
前記集団が代替抗体分子のライブラリーを含む、請求項５４の方法。
【請求項５８】
前記集団が選択された代替抗体集団である、請求項５６の方法。
【請求項５９】
リガンドの検出方法であって、
ａ）リガンド結合代替抗体複合体集団を形成する条件下で、前記リガンドを代替抗体分子に接触させるステップと、ここで、前記代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する可変領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
ｂ）前記リガンドを検出するステップと
を含む、方法。
【請求項６０】
前記特異性鎖および前記安定化鎖が２つの異なる分子を含む、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記リガンドが、細胞、組織、器官、または器官系の表面上または内部に存在する、請求項６０の方法。
【請求項６２】
リガンドの活性を調整する方法であって、
リガンド結合代替抗体複合体集団を形成する条件下で、前記リガンドを代替抗体分子に接触させるステップを含み、ここで、前記代替抗体集団の各代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含むことを特徴とする、方法。
【請求項６３】
前記特異性鎖および前記安定化鎖が２つの異なる分子を含む、請求項６２の方法。
【請求項６４】
前記リガンドが、細胞、組織、器官、または器官系の表面上または内部に存在する、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記リガンドが、受容体、エフェクター、酵素、ホルモン、輸送タンパク質、無機分子、有機分子、ウイルス、細菌、原生生物、またはプリオンからなる群から選択される、請求項６４の方法。
【請求項６６】
薬剤の送達方法であって、リガンド結合代替抗体複合体集団を形成する条件下で、リガンドを代替抗体分子に接触させるステップを含み、ここで、前記代替抗体集団の代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
前記代替抗体が薬剤にさらに結合している、方法。
【請求項６７】
前記特異性鎖および前記安定化鎖が２つの異なる分子を含む、請求項６６の方法。
【請求項６８】
前記薬剤がリガンドまたはコンジュゲートしたリガンドの活性を調整する、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記リガンドが、細胞、組織、器官、または器官系の表面上または内部に存在する、請求項６７の方法。
【請求項７０】
前記薬剤が治療薬である、請求項６７の方法。
【請求項７１】
前記薬剤が抗菌活性を有する抗菌薬を含む、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記抗菌活性が、抗ウイルス活性、抗細菌活性、または抗真菌活性を含む、請求項７１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［政府援助研究または開発］
本出願は、助成金番号２−Ｒ４４−ＥＳ０１０５３４−０２で国立衛生研究所から政府援助を受けた。
［発明の分野］
【０００２】
本発明は、代替抗体ならびにその調製方法および使用に関する。代替抗体（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＳＡｂ）は、例えば、アッセイ方法、診断手順、細胞分取、標的分子画分のインヒビターとして、プローブとして、金属イオン封鎖剤（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）などとして結合反応を行うことができる任意の目的で有用である。代替抗体は、疾患の治療、診断、および予防、新規の癌マーカーの同定、抗体ベースの免疫アッセイにおける抗体の置換物として、および環境汚染物質の同定のために使用することができる。さらに、抗体は、触媒活性を有し得る。標的分子には、天然および合成のポリマー（タンパク質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、および細胞表面が含まれる）、薬物、代謝産物、補因子、遷移状態アナログ、毒素、および環境汚染物質などの小分子が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、免疫系の一部として体内で産生され、種々の疾患を治療するために使用される。抗体はまた、抗体によって選択的に結合される種々の化合物の存在を同定するための抗体ベースの免疫アッセイで使用される。抗体ベースの免疫アッセイは、適切な抗体の産生、同定、および特徴づけに長時間を要することで制限される。複数の標的について同時にスクリーニングするために非常に多数の抗体を発生させることが必要な高処理アッセイを準備することは困難である。
【０００４】
免疫原を使用して動物内に作製した抗体を使用して、種々のヒト疾患が治療されている。しかし、動物抗体は、ヒト免疫系には外来物であり、その有効性の排除および制限を促進する外因性抗抗体応答を刺激する。この制限は、しばしば、ヒト化抗体の調製によって克服することができるが、これは骨が折れ且つ時間のかかるプロセスである。一般に、モノクローナル抗体は選択性を付与し、ポリクローナル抗体はより高い感度を付与する。しかし、典型的には、これら２つの特性の両方を有する単一の抗体組成物を産生することは困難である。抗体は、その最大結合溝サイズ、進化および宿主ゲノムによって制限される結合特異性のレパートリーにさらに制限される。抗体分子が開発に長時間を要する免疫原性タンパク質であるという事実と併せて、種々の適用でその使用が制限される。
【０００５】
核酸は、溶液中で二次構造および三次構造を形成することが知られている。ＤＮＡの二本鎖形態には、いわゆるＢ二重らせん形態、Ｚ−ＤＮＡ、および超らせんが含まれる（Ｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：７９１−８４６）。一本鎖ＲＮＡ形態は、ヘアピンループおよびシュードノット構造などの二次構造領域に存在していた（Ｓｃｈｉｍｍｍｅｌ（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５８：９−１２）。しかし、ループ構造の安定性、形成および分解速度、熱力学に対する非対合ループヌクレオチドの効果に関してはほとんど知られておらず、核酸の三次構造および三次元形態や三次元折りたたみの速度および熱力学についてもほとんど知られていない（Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１３６４−１３６８）。代替抗体として機能するポリオリゴヌクレオチド構造については、以前の論文に記載されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
迅速に産生することができる特異的且つ非免疫原性の高親和性代替抗体を得ることは有利である。本発明は、このような代替抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
代替抗体、代替抗体のライブラリー、代替抗体の作製方法、および抗体およびそのライブラリーを使用したアッセイ方法を開示する。ヌクレアーゼに関する抗体の安定化方法も開示する。さらに、抗体のみ、他の治療薬との組み合わせ物、または治療薬とのコンジュゲートを使用した治療方法も開示する。結合分子あたり１つまたは複数の標識を有する代替抗体分子も開示する。
【０００８】
代替抗体は、１つまたは複数の特異性鎖および安定化鎖を含む。特異性鎖は、第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含む。安定化鎖は、第１の定常領域と相互作用する第１の安定化領域および第２の定常領域と相互作用する第２の安定化領域を含む。さらなる実施形態では、安定化鎖および特異性鎖は異なる分子を含む。
【０００９】
１つの実施形態では、代替抗体は、互いにハイブリッド形成してループ構造を安定化する少なくとも２つの鎖を含むハイブリッド形成構造内にランダムループ構造（特異性領域）を保有する分子である。リガンド結合条件下（ハイブリッド形成の長さおよび範囲をリガンド−代替抗体相互作用に必要な結合条件に調整することができる）で鎖が互いにハイブリッド形成する場合、鎖はループ構造とアニーリングされたハイブリッド形成鎖を形成する。
【００１０】
構築された代替抗体ライブラリー内の各代替抗体は固有の特異性領域配列を有し、標的分子に潜在的に結合することができる。予め形成された抗体のライブラリーを、所望の標的化合物または分子に特異的に結合する抗体を見出すためにスクリーニングすることができる。本発明は、安定化されたループ構造を形成するような様式で相互作用する核酸を形成することができるという所見に基づく。ループ構造は、従来の抗体に関する多様性またはさらなる多様性を有することができる。代替抗体は事実上任意の化合物（単量体または多量体）と特異的結合対を形成するのに十分な化学的汎用性を有する。任意のサイズの分子を標的として使用することができる。特定の実施形態（例えば、治療適用）では、許容可能な生理学的限度またはその付近の塩、温度、およびｐＨの水溶液で結合する。
【００１１】
標的（リガンド）を、標的に結合する代替抗体を同定するためにスクリーニングすることができる。アッセイ（例えば、高処理アッセイ）を使用して、標的分子または標的細胞の機能に対する代替抗体の結合効果を決定することができる。この方法を使用して、タンパク質（核酸結合タンパク質およびその生物学的機能の一部として核酸に結合することが知られていないタンパク質の両方が含まれる）に結合する代替抗体を単離および同定することができる。この方法を使用して、サンプル中の標的分子の有無を検出し、および／またはその量を測定することができる。あるいは、この方法を使用して、ある細胞／組織／器官の型に対する別の細胞／組織／器官の型に存在する標的分子を同定することができる。標的分子の存在を、標的分子に特異的な代替抗体へのその結合によって決定する。
【００１２】
リガンドに結合する代替抗体を、開始ライブラリーと標的リガンドと共にインキュベーションし、標的リガンドおよび標的リガンド−代替抗体複合体を除去するが、非結合代替抗体を濾過物中に通過させる多孔度を有する膜を通過させて濾過することによって開始ライブラリーから単離することができる。
【００１３】
本明細書中に記載の代替抗体を、従来の抗体ベースの診断と類似の様式により診断方法において使用することができる。代替抗体を使用して、薬剤を細胞、組織、器官、もしくは器官系の表面上もしくはそれらの中の特異的部位に特異的に送達させ、細胞、組織、器官、もしくは器官系の表面上もしくはそれらの中の標的リガンドを特異的に検出し、複数の治療薬を標的部位に特異的に送達し、および／または複数のレポーター分子の組み込みによって検出方法の感度を増大させることができる。小分子標的に結合する代替抗体を、診断アッセイの試薬としておよび金属イオン封鎖剤、薬物送達媒介物、およびホルモン作用の調整剤として治療で使用することができる。一旦結合した場合、抗体の結合親和性および触媒活性に基づいて、代替触媒抗体を選択することができる。触媒抗体の１つの選択方法は、酵素触媒反応の遷移状態アナログに結合する代替抗体を検索することである。
【００１４】
ＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）などの有毒有機化合物に特異的に結合するように代替抗体を調整することもできる。これらを使用して、土壌、水、または空気サンプル中の汚染プロフィールを得ることができる迅速且つ費用効果的な試験アレイを開発することができるか、これらを使用して環境修復において汚染物質を除去することができる。
【００１５】
異なる特異性領域および／または溝サイズおよび／または高次構造を有する代替抗体を、感度、特異性、および親和性の成熟ラウンドで使用することができる。１つの実施形態では、検出を容易にするために分子の異なる各集団に固有の５’および／または３’末端標識で標識する。このプロセスにより、ヌクレオチド配列によって得られた至適結合溝サイズおよび高次構造が同定される。
【００１６】
標的分子の機能を、代替抗体の結合によって改変または調整することができる。例えば、結合した場合、代替抗体は、受容体、エフェクター、酵素、ホルモン、および輸送タンパク質などの分子の機能を阻害または活性化することができる。
【００１７】
したがって、１つの態様では、本発明は、第１のオリゴヌクレオチド鎖および第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む代替抗体分子に関する。第１の鎖は、所定の条件下で第２の鎖にハイブリッド形成する２つの隣接する安定化領域を含む。第２の鎖は、第１の鎖とハイブリッド形成しない特異性領域を含む。特異性領域は、所定の条件下で第１の鎖の安定化領域とハイブリッド形成する安定化領域に隣接する。
【００１８】
本発明はまた、２以上の第１の鎖もしくは第２の鎖、またはそれぞれ２以上含むより複雑な代替抗体構造を含む態様を含む。
【００１９】
したがって、別の態様では、本発明は、少なくとも１つの第１のオリゴヌクレオチド鎖および少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む代替抗体分子に関する。第１の鎖は、所定の条件下で第２の鎖とハイブリッド形成する安定化領域を含む。第２の鎖は、第１の鎖とハイブリッド形成しない少なくとも１つの特異性領域を含む。少なくとも１つの特異性領域は、所定の条件下で第１の鎖の安定化領域とハイブリッド形成する安定化領域に隣接する。本発明の組成物および方法によれば、安定化領域のヌクレオチド配列を、有向（ｄｉｒｅｃｅｄ）ハイブリッド形成または相互作用させ、構築された分子の構造をカスタマイズするために変化させることができる。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、第１のオリゴヌクレオチド鎖および少なくとも１つの第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む代替抗体分子に関する。第１の鎖は、所定の条件下で第２の鎖とハイブリッド形成する安定化領域を含む。少なくとも１つの第２の鎖は、第１の鎖とハイブリッド形成しない少なくとも２つの特異性領域を含む。特異性領域は、所定の条件下で第１の鎖の安定化領域とハイブリッド形成する安定化領域に隣接する。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、第１のオリゴヌクレオチド鎖および少なくとも２つの第２のオリゴヌクレオチド鎖を含む代替抗体分子に関する。第１の鎖は、所定の条件下で第２の鎖とハイブリッド形成する安定化領域を含む。第２の鎖はそれぞれ第１の鎖とハイブリッド形成しない少なくとも１つの特異性領域を含む。特異性領域は、所定の条件下で第１の鎖の安定化領域とハイブリッド形成する安定化領域に隣接する。第１の鎖はまた、少なくとも１つの特異性領域を含み得る。
【００２２】
本発明の代替抗体分子は、結合ストレスを減少させるスペーサー領域を含み得る。スペーサー領域は、第２の鎖の特異性領域に隣接する第１の鎖上に存在し得る。スペーサー領域はまた、２つの隣接する第２の鎖とハイブリッド形成する隣接安定化領域の間の第１の鎖上に存在し得る。
【００２３】
各安定化領域は、約２個から約１００個までのヌクレオチド、約５個から約９０個までのヌクレオチド、または約１０個から約３０個までのヌクレオチドを含み得る。分子の安定化領域により、所定の条件下で鎖間に安定にハイブリッド形成され、所定の条件は、特異性領域への標的リガンドの結合に必要な条件である。安定化領域のハイブリッド形成により、異なるサイズの鎖のハイブリッド形成によって得られるストレスによって結合ループが形成される。特異性領域は、約２個から約１００個までのヌクレオチドを含み得る。特異性領域はまた、約１０個から約６０個のヌクレオチド、約１０個から約８０個までのヌクレオチド、または約１０個から約４０個までのヌクレオチドを含み得る。
【００２４】
第１の鎖は、ヌクレアーゼ保護および／または免疫寛容が得られる天然に存在する塩基修飾を含む天然に存在するオリゴヌクレオチド鎖であり得る。さらに、第２の鎖の安定化領域は、ヌクレアーゼ保護および／または免疫寛容が得られる天然に存在する修飾を含む天然に存在するオリゴヌクレオチド配列であり得る。
【００２５】
本発明の代替抗体の２つの鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＴＮＡ、アミノ酸、またはその任意の組み合わせ（すなわち、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＴＮＡ−ＲＮＡ、ＴＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−アミノ酸、ＴＮＡ−アミノ酸、またはＲＮＡ−アミノ酸など）であり得る。
【００２６】
代替抗体は、レポーター分子、結合分子、酵素、および治療薬からなる群から選択される少なくとも１つの部分を含み得る。少なくとも１つの部分を、安定化領域に固定することができる。
【００２７】
本発明はまた、親和性／感度および特異性を増大させるためのプロセスを含む代替抗体の産生プロセスを提供する。
【００２８】
したがって、１つの態様では、本発明は、第２の鎖よりも配列中のヌクレオチドが少ない第１の鎖を有する異なる長さの第２のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリッド形成する安定化領域を含む第１のオリゴヌクレオチド鎖の調製による代替抗体の産生プロセスに関する。ヌクレオチドの可変配列を含む少なくとも１つの特異性領域および第１のオリゴヌクレオチド鎖の安定化領域とハイブリッド形成する特異性領域に隣接する安定化領域を含む第２のオリゴヌクレオチド鎖のライブラリーを調製する。第２のオリゴヌクレオチド鎖の安定化領域が第１のオリゴヌクレオチド鎖の安定化領域と（配列アラインメントに基づいた所定の方法で）ハイブリッド形成して代替抗体を形成するように第１および第２のオリゴヌクレオチド鎖を組み合わせる。ハイブリッド形成鎖を標的リガンドと接触させ、標的リガンドおよび任意の結合代替抗体を非結合代替抗体から分離する。標的リガンドに結合した第２のオリゴヌクレオチド鎖を増幅する。増幅された第２のオリゴヌクレオチド鎖を精製し、第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリッド形成させて代替抗体を形成させる。
【００２９】
本発明はまた、代替抗体調製物を増幅および形成する最初のプロセス後に代替抗体の特異性を増大させる方法を提供する。
【００３０】
したがって、別の態様では、本発明のプロセスは、代替抗体を標的ハプテンに接触させるステップと、代替抗体およびハプテンをハプテン−タンパク質コンジュゲート体とインキュベートするステップと、ハプテン−タンパク質コンジュゲート体およびこれに結合した任意の代替抗体からハプテンに結合した代替抗体を分離するステップと、ハプテンに結合した任意の代替抗体の第２のオリゴヌクレオチド鎖を増幅するステップと、増幅された第２のオリゴヌクレオチド鎖を精製するステップと、増幅された第２のオリゴヌクレオチド鎖を第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリッド形成させて代替抗体を形成させるステップとをさらに含む。分離ステップは、タンパク質−ハプテンコンジュゲート体を保持しながら代替抗体、ハプテン、および代替抗体の任意の結合複合体、および非コンジュゲートハプテンを通過させて濾過物が得られるフィルターの使用を含み得る。調製物の特異性を、代替抗体調製物の標的リガンドと共に存在し得る潜在的に交差反応性を示すリガンド（非特異的部分）とのインキュベーションを含むステップを含めることによって増大させることもできる。これらの方法の各変形形態では、本明細書中に記載の分離および増幅方法を使用して特異性を増大させる。特異性が増大した代替抗体の調製に関与するステップの順番を変化させることができ、代替抗体の意図する用途に関する特定の要件にしたがって実施することができる。
【００３１】
本発明はまた、代替抗体調製物を増幅および形成させる最初のプロセス後の代替抗体調製物の結合親和性／感度の増大を提供する。
【００３２】
したがって、別の態様では、本発明のプロセスは、結合親和性を減少させる条件下で（例えば、疎水性、水素、静電気的、ファンデルワールス相互作用を和らげる作用因子）代替抗体を標的リガンドに接触させるステップと、非結合代替抗体から標的リガンドおよび任意の結合代替抗体を分離するステップと、標的リガンドに結合した第２のオリゴヌクレオチド鎖を増幅するステップと、増幅された第２のオリゴヌクレオチド鎖を精製するステップと、増幅された第２のオリゴヌクレオチド鎖を第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリッド形成させて代替抗体を形成するステップとをさらに含む。
【００３３】
感度を増大させるために、本発明のプロセスはまた、最初の増幅ステップの前に代替抗体への接触に使用した濃度よりも低濃度で代替抗体を標的リガンドに接触させるステップと、非結合代替抗体から標的リガンドおよび任意の結合代替抗体を分離するステップと、標的リガンドに結合した第２のオリゴヌクレオチド鎖を増幅するステップと、増幅された第２のオリゴヌクレオチド鎖を精製するステップと、増幅された第２のオリゴヌクレオチド鎖を第１のオリゴヌクレオチド鎖とハイブリッド形成させて代替抗体を形成するステップとをさらに含み得る。
【００３４】
本発明は、ポリクローナルまたはモノクローナル代替抗体調製物の産生を提供する。上記のプロセスにより、一般に、各特異性領域を有する多数の代替抗体が選択および増幅されるポリクローナル調製物が得られる。本発明は、さらに、モノクローナル代替抗体の産生を提供する。これらのステップは、上記のプロセスおよびその後の本明細書中に記載のクローンの選択および評価によって産生された第２のオリゴヌクレオチド鎖配列の増幅およびクローニングを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、添付の図面を参照して、以下により完全に記載され、この図面はいくつかの本発明の実施形態を示すが、本発明の実施形態全てをしめすものではない。実際、これらの発明を多数の異なる形態で実施することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきではなく、むしろ、この開示は適用可能な法的必要条件を満たすようにこれらの実施形態を記載している。図面を通して、数字は要素を示す。
【００３６】
本明細書中に記載の本発明の多数の修正形態および他の実施形態は、これらの発明の分野に属する当業者に理解され、上記説明および関連する図面に示す教示の利点を有する。したがって、本発明は開示された特定の実施形態に制限されず、修正形態および他の実施形態は添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることが意図されると理解すべきである。本明細書中で特定の用語が使用されているが、これらは一般的および説明としてのみ使用されており、限定することを目的としていない。
【００３７】
代替抗体、代替抗体のライブラリー、代替抗体の作製方法、ならびに抗体およびそのライブラリーをしたアッセイ方法を開示する。ヌクレアーゼに対する抗体の安定化方法も開示する。さらに、抗体のみまたは治療薬との組み合わせを使用した治療方法も開示する。
【００３８】
［組成物］
Ｉ．代替抗体
代替抗体分子を含む組成物および代替抗体分子を含むライブラリーを提供する。そのリガンドに結合した代替抗体をさらに提供する。本明細書中で使用される、「代替抗体」は、標的分子に選択的に結合することができる個別の核酸構造またはモチーフを含む分子クラスをいう。より詳細には、代替抗体は、ランダムループ構造（すなわち、特異性領域）およびループ構造を安定化させる適切な構造エレメントを有する。
【００３９】
特に進化の歴史で決して試験されていない配列および修飾ヌクレオチドを有する代替抗体の結合ループ（すなわち、特異性領域）に可能な非常に多数の配列および形状により、おそらく、従来のオリゴヌクレオチドが４つのヌクレオチドのみから構成され、且つ非常に荷電している骨格を有する場合でさえも、所望の機能および結合親和性が得られる。すなわち、代替抗体はほとんどの標的への強固且つ特異的な結合に十分な物理的および化学的多様性を得るためにループ形成特異性領域に適切な多様性を有することができる。代替抗体の適切に形成されたライブラリーは、脊椎動物免疫系の結合分子で認められる結合多様性と集合的に同一であるこれを超える分子からなると考えられる。体液性免疫応答によって産生された抗体分子が多数のリガンドに結合することができる一方で、代替抗体の結合はサイズに制限されず、且つ産生がゲノム組成および生物中での発現に制限されないので、本発明の代替抗体ライブラリーは同等またはより優れた機会を得ることができる。ライブラリーは、天然に存在する抗体が有し得るどのような本来の利点も代替抗体を選択することができる可能な「プール」の巨大さおよび産生することができる結合部位の多様性によって相殺されるこのような非常に多数の異なる構造を含み得る。
【００４０】
本発明の代替抗体の多様な構造を、多様な範囲の結合特異性、結合親和性、およびこのような組成物の産生方法と共に以下にさらに詳述する。
【００４１】
１つの実施形態では、代替抗体は、本明細書中で「特異性鎖」といわれる第１の鎖および本明細書中で「安定化鎖」といわれる第２の鎖を含む。この実施形態では、特異性鎖は、第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含む。安定化鎖は、第１の定常領域と相互作用する第１の安定化領域および第２の定常領域と相互作用する第２の安定化領域を含む。
【００４２】
本発明は、単離または実質的に単離された代替抗体組成物を含む。「単離」代替抗体分子は、実質的に他の細胞物質、培養培地、化学的前駆体、または化学合成されている場合は他の化合物を含まない。実質的に細胞物質を含まない代替抗体には、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の夾雑タンパク質または核酸を有する代替抗体の調製物が含まれる。さらに、代替抗体分子が天然の配列に相同な核酸配列を含む場合、「単離」代替抗体分子は、代替抗体が相同性を有する生物のゲノムＤＮＡ中に核酸に天然に隣接し得る配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に存在する配列）を含まない。
【００４３】
本明細書中で使用される、「核酸」は、ＴＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その一本鎖または二本鎖、およびその任意の化学的修飾物を意味する。代替抗体は、１つまたは複数のループ構造（すなわち、特異性ドメイン）を安定化させる相互作用領域が存在する二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖組み合わせ、ハイブリッドＴＮＡ−ＤＮＡ、ハイブリッドＴＮＡ−ＲＮＡ、ハイブリッドアミノ酸／ＲＮＡ、アミノ酸／ＤＮＡ、アミノ酸／ＴＮＡ、または得られたその任意の組み合わせから構成され得る。これらの種々の抗体構造のさらに詳細な説明を以下に記載する。特異的抗体を、本明細書中に記載の方法を使用して捕捉および同定し、一旦同定されると大量に増幅することができる。核酸配列が天然に存在するヌクレオチドおよび合成された修飾ヌクレオチドを含むことがさらに認識される。
【００４４】
Ａ．特異性鎖
本明細書中で使用される、代替抗体の特異性鎖は、２つの定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸分子を含む。本明細書中で使用される、「に隣接する」は、定常領域が特異的領域に直接隣接するか、定常領域が特異性領域の５’および３’で見出されるがスペーサー配列で分離されていることを意図する。特異性領域はリガンド結合溝として機能し、定常ドメインは安定化鎖上で見出される安定化ドメインと相互作用し、それにより特異性ドメインはリガンド結合溝を形成する。
【００４５】
特異性鎖は、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、（３’，２’）−α−Ｌ−トレオース核酸（ＴＮＡ）、修飾ＴＮＡ、またはその任意の組み合わせから構成される核酸配列を含む。修飾には、ヌクレオチド配列の任意の機能的部分または分子の結合（所望の条件下で安定な任意の相互作用手段（すなわち、共有結合、イオン結合など））が含まれる。例えば、Ｃｈａｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：８５６−８５７（本明細書中に参照することにより組み込まれる）を参照のこと。修飾は、鎖中のどこかの各ヌクレオチド残基に付加するか、ピリミジンまたはプリン残基の全てまたは一部に結合するか、ヌクレオチド残基の所与の型の全てまたは一部に結合させた配列の５’末端および／または３’末端に存在し得る。ＤＮＡおよびＲＮＡ残基への種々の修飾が当分野で公知であり、本発明の代替抗体に対する目的の修飾のいくつかの例は、以下でさらに詳細に考察している。
【００４６】
特異性鎖およびその反応性ドメイン（すなわち、定常ドメインおよび特異性ドメイン、ならびにいくつかの実施形態ではスペーサー領域）は、鎖が本明細書中に記載の代替抗体を形成することができる限り任意の長さであり得る。例えば、特異性鎖は、１０、５０、１００、２００、４００、５００、８００、１０００、２０００、４０００、８０００またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。あるいは、特異性鎖は、約１５〜８０、８０〜１５０、１５０〜６００、６００〜１２００、１２００〜１８００、１８００〜３０００、３０００〜５０００、またはそれ以上であり得る。定常ドメインおよび特異性ドメインは、約２ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、約２０ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約８０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約６０ヌクレオチド長との間、または約１０ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長との間であり得る。
【００４７】
代替抗体分子は特異性領域中にスペーサー領域を必要としないが、この領域が存在する場合、任意の長さであり得る。例えば、スペーサー領域が特異性鎖中に存在する場合、この領域は、約２ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、約２０ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約６０ヌクレオチド長との間、または約１０ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長との間であり得る。さらに他の実施形態では、スペーサー領域は核酸残基を含む必要はないが、所望の空間を空けて代替抗体分子を形成する鎖に組み込まれたリン酸分子などの任意の分子であり得る。
【００４８】
いくつかの実施形態では、特異性鎖またはその成分（定常領域または特異性領域）は、天然に存在する核酸配列と有意に類似する。他の実施形態では、核酸配列は、天然の配列とほとんどまたは全く同一ではない配列を共有することができる。さらに他の実施形態では、核酸残基を本明細書中に記載のように修飾することができる。
【００４９】
Ｂ．安定化鎖
代替抗体は、安定化鎖をさらに含む。安定化鎖は、特異性鎖の定常ドメインに相互作用して特異性ドメインのリガンド結合溝を安定化することができる任意の分子を含む。したがって、安定化鎖は、例えば、アミノ酸配列、核酸配列、または種々のポリマー（任意のカチオン性ポリマー、シクロデキストリンポリマー、または臭化リチウムもしくは臭化エチジウムなどの適切に荷電した薬剤を有するポリマーが含まれる）を含み得る。
【００５０】
代替抗体中の安定化領域は同一であり得るか（すなわち、同一のヌクレオチド配列またはペプチド配列）、各安定化領域が特異性鎖中のその対応する定常領域と相互作用する限り、領域は非同一であり得ることが認識される。さらに、定常領域と安定化領域との間の相互作用は直接または間接的であり得る。相互作用は、さらに、所望のリガンド結合条件下を含む種々の条件下などで相互作用が起こる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、代替抗体の成分（すなわち、安定化鎖およびその各ドメイン）は、天然に存在しない。他の実施形態では、これらは、天然に存在する核酸配列またはアミノ酸配列と有意に類似し得るか、実際に天然に存在する配列であり得る。当業者は、安定化ドメインの長さは特異性鎖の定常ドメインに必要な相互作用の型に依存して変化することを認識する。このような相互作用を、本明細書中でさらに詳細に考察する。
【００５２】
アミノ酸配列を含む安定化鎖は、特異性鎖の定常ドメインの核酸配列と相互作用することができる任意のポリペプチドを含み得る。例えば、ＤＮＡ結合活性を有するアミノ酸配列（すなわち、ジンクフィンガー結合ドメイン（Ｂａｌｇｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：７１５８−７１６３；Ｆｒｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１９６３１−９；Ｄｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９４６６−７９；Ｓｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：７０７４−８１（その全てが参照することにより本明細書中に組み込まれる）、ヘリックス−ターンドメイン、ロイシンジッパーモチーフ（Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１６９３−９）、またはレクチン活性を有するポリペプチドを１つまたは複数の安定化ドメインに使用することができる。したがって、種々のポリペプチド（転写因子、制限酵素、テロメラーゼ、ＲＮＡもしくはＤＮＡポリメラーゼ、インデューサー／リプレッサー、または核酸結合活性を保持するそのフラグメントおよび変異型が含まれる）を使用することができる。例えば、Ｇａｄｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４９：６０７−２４を参照のこと。他の実施形態では、安定化鎖には、ポリアミドなどの小分子に結合する配列特異的ＤＮＡ（Ｄｅｒｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：６８８−９３およびＷｉｎｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ６：６７０−８１）；アミノグリコシド（Ｙｏｓｈｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：６２６３−７０）、キノキサリン抗生物質（Ｂａｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ３７：６８７４−６８８３）などの抗生物質；ＡＴ特異的結合分子（Ｗａｇｎａｒｏｃｏｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５８７：３００−８）；ロジウム複合体（Ｔｅｒｂｒｕｅｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３３０：８１−７）が含まれ得る。当業者は、例えば、安定化鎖中でジンクフィンガー結合ドメインを使用する場合、対応する核酸結合部位は特異性鎖の所望の定常領域に存在することを認識する。同様に、安定化鎖中でレクチン活性を有するポリペプチドを使用する場合、特異性鎖の対応する定常ドメインは所望の相互作用に必要な修飾を有する。安定化ドメインがアミノ酸配列を含む場合、任意のアミノ酸残基を機能的部分を含むように修飾することができる。このような修飾を、本明細書中でさらに詳細に考察する。
【００５３】
安定化鎖が核酸分子を含む場合、第１の鎖および第２の鎖から代替抗体が形成される。上記の第１の鎖（特異性鎖）は、ａ）第２の鎖（安定化鎖）上の２つの安定化領域に相補的な２つの安定化領域（本明細書中で定常領域という）およびｂ）定常領域の間に存在するリガンド結合溝として機能する特異性領域を含む。第２の鎖（安定化鎖）は、第１の鎖（特異性鎖）上の２つの安定化領域（または定常領域）に相補的な２つの安定化領域を含む。１つの実施形態では、第１および第２の鎖が互いにハイブリッド形成した場合（特異性領域が特異性鎖のいかなる部分ともハイブリッド形成しないリガンド結合溝を形成する）、代替抗体が形成される。この実施形態では、特異性鎖は安定化鎖よりも長い。他の実施形態では、代替抗体のリガンド結合溝は、１つまたは複数のヘアピンループ、非対称に突出したヘアピンループ、対称的なヘアピンループ、およびシュードノットを含み得る。
【００５４】
安定化鎖は、任意のヌクレオチド塩基（例えば、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、またはその任意の組み合わせが含まれる）を含み得る。
【００５５】
Ｃ．代替抗体の形成
安定化鎖および特異性鎖を使用した代替抗体の形成方法をさらに提供する。代替抗体の形成方法は、特異性鎖および安定化鎖を準備するステップと、第１の安定化ドメインが第１の定常領域と相互作用し、且つ第２の安定化ドメインが第２の定常領域と相互作用する条件下で特異性鎖を安定化鎖に接触させるステップとを含む。安定化ドメインと定常ドメインとが安定に相互作用する任意の条件下で、特異性鎖を安定化鎖に接触させることができる。この代替抗体の形成方法を使用して、代替抗体集団を作製することができる。
【００５６】
以下で考察するように、代替抗体分子の形成条件は、目的のリガンドおよび意図する適用に依存して変化する。当業者は、所望の適用のための適切な条件を経験的に決定することができる。例えば、意図する適用が生理学的条件下で起こることである場合、ｐＨ７．４での生理学的塩濃度（すなわち、２８０〜３００ミリオスモル）で抗体を形成させることができる。
【００５７】
安定化鎖が核酸配列を含む場合、定常領域および安定化領域のヌクレオチド配列は所望の条件下で（すなわち、リガンド結合条件下で）相互作用する（すなわち、ハイブリッド形成する）。さらに、好ましくは第１の定常ドメインが第１の安定化ドメインと相互作用し、好ましくは第２の安定化ドメインが第２の定常ドメインと相互作用するように各安定化ドメインおよび各定常ドメインのデザインを構築することができる。この方法では、特異性鎖と安定化鎖との相互作用時に、代替抗体の配列直接的自己構築が起こり得る。
【００５８】
１つの実施形態では、各安定化／定常ドメイン相互作用のＴｍが意図する適用温度（すなわち、所望のリガンド結合条件）より約１５℃〜約２５℃高くなるように代替抗体分子をデザインする。したがって、意図する適用が治療への適用または生理学的に条件下で行われる任意の適用である場合、Ｔｍは、約３７℃＋約１５℃〜約３７℃＋２５℃（すなわち、４９℃、５０℃、５２℃、５４℃、５５℃、５６℃、５８℃、６０℃、６２℃、６４℃、またはそれ以上）であり得る。意図する適用が室温で行われる診断アッセイである場合、Ｔｍは、２５℃＋約１５℃〜約２５℃＋２５℃（すなわち、３８℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５３℃またはそれ以上）であり得る。Ｔｍの測定式は、当分野で公知である。Ｔｍの好ましい計算プログラムは、ＩＤＴＢｉｏＴｏｏｌｓ（著作権）２０００のＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．０を含む。本発明の方法に任意の温度を使用することができると認識される。したがって、リガンド結合条件の温度は、約５℃、１０℃、１５℃、１６℃、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、２６℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３８℃、４０℃、４２℃、４４℃、４６℃、４８℃、５０℃、５２℃、５４℃、５６℃、５８℃、６０℃、またはそれ以上であり得る。
【００５９】
あるいは、約４０％〜約９９％、約４０％〜約５０％、または約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれ以上の代替抗体集団が意図するリガンド結合条件下でアニーリングを保持するように、安定化ドメインおよび各定常ドメインをデザインする。ゲル電気泳動を含む種々の方法を使用して、代替抗体の形成率を決定することができる。実施例を参照のこと。さらに、この決定型の計算は、例えば、Ｍａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２６：１６０１−１６２０およびＰｅｔｅｒｓｔｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：２５６−２６３（その両方が参照することにより本明細書中に組み込まれる）に見出すことができる。
【００６０】
比が代替抗体の形成に好ましい限り、特異性鎖および安定化鎖の相対濃度を変化させることができる。このような条件には、過剰な安定化鎖の獲得が含まれる。
【００６１】
定常領域および安定化領域は、任意の所望のＧ／Ｃ含量（例えば、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％のＧ／Ｃが含まれる。）を有し得る。
【００６２】
安定化鎖およびこれに含まれるドメイン（安定化ドメイン、いくつかの実施形態では、スペーサードメイン）は、鎖が本明細書中に記載の代替抗体を形成することができる限り、任意の長さであり得る。例えば、安定化鎖は、約８、１０、５０、１００、２００、４００、５００、８００、１０００、２０００、４０００、８０００、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。あるいは、安定化鎖は、約１５〜８０、８０〜１５０、１５０〜６００、６００〜１２００、１２００〜１８００、１８００〜３０００、３０００〜５０００、またはそれ以上であり得る。
【００６３】
安定化ドメインは、約２ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、約２０ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約６０ヌクレオチド長との間、または約１０ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長との間であり得る。スペーサー領域が安定化鎖中に存在する場合、この領域は、約１ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間、約５ヌクレオチド長と約５０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間、約１０ヌクレオチド長と約６０ヌクレオチド長との間、または約１０ヌクレオチド長と約４０ヌクレオチド長との間であり得る。あるいは、本明細書中で考察されるように、スペーサーは、１つまたは複数の分子（例えば、リン酸部分が含まれる）を含み得る。定常ドメインと安定化ドメインとの間の相互作用が抗体構造の安定化および安定化結合ループ（特異性領域）の産生に十分である限り、各ドメインの長さおよびＧ／Ｃ含量を変化させることができる。さらに、安定化鎖は、線状、環状、または球状であり、複数（２、３、４、５、６、またはそれ以上）の特異性鎖が相互作用する安定化ドメインをさらに含むことができる。
【００６４】
ヘパリンループ、対称性および非対称性突起、シュードノット、およびその組み合わせなどの非ワトソン−クリック型相互作用に関与する公知のオリゴヌクレオチド構造またはモチーフは、当分野でたった３０個のヌクレオチドの核酸配列から形成されることが示唆される。しかし、今回、本明細書中に記載の代替抗体中でより大きなループ構造を安定化することができることが見出された。特異性領域は、約１０と約９０との間のヌクレオチド、約１０と約８０との間のヌクレオチド、約１０と約６０との間のヌクレオチド、または約１０と約４０との間のヌクレオチドを含み得る。これらの安定化された結合溝により、疎水性結合部位が得られ、これは天然の抗体結合で意図される主要な力を模倣する様式で結合親和性の増大に寄与する。したがって、代替抗体のリガンド結合溝は１つまたは複数のヘパリンループ、非対称に突起したヘアピンループ、対称性ヘアピンループ、およびシュードノットを含み得る。
【００６５】
当業者は、安定化ドメインおよび定常ドメインを所望の条件下で相互作用の安定性を最大にするようにデザインし、それにより代替抗体の構造を維持することができると認識する。例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：８５５−８６１およびＮａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：１９３５−１９４０を参照のこと。代替抗体分子の安定性または構造を測定する方法は公知である。例えば、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ）を使用して、代替抗体分子形成の速度値を決定することができる（ＢＩＡＣＯＲＥ  ＡＢ）。他の使用技術には、ＮＭＲ分光法および電気泳動移動度シフトアッセイが含まれる。Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：１９３５−１９４０を参照のこと。相補性ハイブリッド形成安定化領域および定常領域は互いに１００％相同である必要はないと認識される。これらは配向性様式で互いに結合し、リガンド結合条件に曝露された場合に安定な構造を形成することが必要である。一般に、これは、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、およびそれ以上の配列が相同な安定化ドメインおよび定常ドメインが必要である。さらに、相互作用には、安定化ドメインおよび対応する定常ドメイン中に少なくとも５個の連続する相補性ヌクレオチド残基が必要であり得る。
【００６６】
「配列同一性または相同性」は、定常ドメインのヌクレオチド配列の特定された連続セグメントが整列され、安定化ドメインのヌクレオチド配列と比較した場合、定常領域および安定化ドメイン内に同一のヌクレオチド（または相補塩基を有するヌクレオチド）が見出されることを意図する。配列アラインメントおよび配列間の同一性の決定方法は、当分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １９（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；およびＡＬＩＧＮプログラム（Ｄａｙｈｏｆｆ（１９７８）ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．））を参照のこと。２つのヌクレオチド配列の至適アラインメントに関して、定常／安定化ドメインの連続セグメントは、対応する定常／安定化ヌクレオチド配列に関してさらなるヌクレオチドまたは欠失ヌクレオチドを有し得る。基準ヌクレオチド配列との比較で使用した連続セグメントは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５個の連続ヌクレオチドを含み、３０、４０、５０、１００、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列中のギャップの封入に関する配列同一性の増大を、ギャップペナルティの割り当てによって補正することができる。
【００６７】
２配列間の同一率を、数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。ギャップオープンペナルティ２５およびギャップ伸長ペナルティ５を使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同検索アルゴリズムを使用して、ヌクレオチド配列の同一率を決定する。例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃのＤｅＣｙｐｈｅｒ  Ｈａｒｄｗａｒｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを使用して、このような配列同一性を決定することができる。
【００６８】
代替抗体の特異性鎖および安定化鎖が核酸配列を含む場合、第１および第２の鎖を溶液に入れること、溶液を加熱すること、および冷却時に第１および第２の鎖がアニーリングして抗体を形成するような条件下で溶液を冷却することによって代替抗体を形成することができる。２つの第１の鎖または２つの第２の鎖で起こり得る任意のハイブリッド形成は、各特異性領域および対応する定常ドメインにデザインした多ヌクレオチド相補結合と比較して親和性係数が有意に低いので、安定しない。
【００６９】
Ｄ．代替抗体の多様な構造
代替抗体は、標的／リガンドが核酸組成物であり、且つワトソン／クリック塩基対合による結合または３つのヘリックス結合が望ましい場合以外は、リガンドとの高次構造相補性、共同の疎水性、静電気力、ファンデルワールス力、および／または水素結合による親和性によって特異的リガンド結合が得られる安定な結合溝を形成するように準備された核酸配列を有する分子クラスである。例えば、Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：４４２−４４３を参照のこと。したがって、多数の種々の代替抗体構造を形成することができる。
【００７０】
１つの実施形態では、本明細書中に記載の代替抗体には、各特異性ドメインが定常ドメインに隣接した１つまたは１つを超える特異性ドメイン（ループ構造）を有する１つまたは複数の特異性鎖が含まれ得る。したがって、本発明の代替抗体は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の特異性ドメインを有し得る。複数の特異性ドメインを有する少なくとも１つの特異性鎖から構成される代替抗体は適切に代替抗体を形成させる対応する安定化ドメインを有する安定化鎖が必要であると認識される。さらに、各特異性領域は、異なる鎖、（個別の）鎖、または同一の鎖上に存在し、特異性鎖は線状または環状であり得る。さらに、複数のスペーサー領域を、特異性鎖または安定化鎖のいずれかで見出すこともできる。
【００７１】
さらなる実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドを使用して抗体を形成することができ、それにより二量体および／または三量体を使用して、最終代替抗体構造を形成することができる。例えば、図２および３を参照のこと。したがって、２つまたはそれ以上の分子内および／または鎖内ループは分子中に存在し得る。したがって、別の実施形態では、代替抗体分子は、アニーリングして複数の結合ループ／溝を有する多量体を形成する安定化領域および定常領域を含む１つを超えるオリゴヌクレオチド鎖を含む。
【００７２】
代替抗体分子には、種々のサイズのリガンドへの代替抗体結合を至適化するための共通のサイズおよびヌクレオチド配列または異なるサイズおよびヌクレオチド配列を有する複数の特異性領域が含まれ得る。分子は、さらに、共通のサイズおよびヌクレオチド配列を有する多数のスペーサー領域（Ｓ）または異なるサイズおよびヌクレオチド配列のスペーサー領域を含み得る。特異性領域は、異なるオリゴヌクレオチド鎖上に存在することができ、代替抗体分子には、アニーリングして複数の結合溝を有する多量体を形成する特異性領域を含む複数のオリゴヌクレオチド鎖が含まれ得る。
【００７３】
したがって、１つの実施形態では、代替抗体は、第１および第２の特異性鎖および安定化鎖を含み、第１の特異性鎖は第１の定常領域および第２の定常領域に隣接した第１の特異性領域を有する核酸配列を含み、第２の特異性鎖は第３および第４の定常領域に隣接した第２の特異性領域を含む核酸配列を含む。安定化鎖は第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、安定化鎖は、第３の定常領域と相互作用する第３の安定化ドメインおよび第４の定常領域と相互作用する第４の安定化ドメインをさらに含む。この実施形態では、安定化鎖（第１および／または第２の特異性鎖）は、同一または異なる分子を含み得る。さらに他の実施形態では、第１および第２の特異性鎖は、同一または非同一であり得る。
【００７４】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、隣接鎖と結合する２〜１００個の相補ヌクレオチドの並列オリゴヌクレオチド鎖に安定化領域を含む。
【００７５】
別の態様では、本発明は、ハイブリッド形成時に１つまたは複数のリガンド結合ループ／溝（すなわち、特異性領域）が作製される相補ヌクレオチドから構成される安定化領域を含む、異なる長さの隣接して並列されたオリゴヌクレオチドを含むポリオリゴヌクレオチド代替抗体分子に関する。
【００７６】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、反対側の鎖上のヌクレオチドの結合ループ／溝配列と反対側に隣接したオリゴヌクレオチド鎖上に存在する１つまたは複数のヌクレオチドを有するスペーサー領域を含む。
【００７７】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、分子中のストレスを最小にするか排除し、反対側のオリゴヌクレオチド鎖上の結合ループ／溝のサイズおよび／または高次構造を改変するスペーサー領域のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、隣接した並列のオリゴヌクレオチド鎖上のヌクレオチドに相補的な２〜１００個のヌクレオチドから構成される安定化領域を含む。
【００７９】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、３〜１００個のヌクレオチドを含む特異性領域を含む。
【００８０】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、０〜１００個のヌクレオチドを含むスペーサー領域を含むか、あるいはスペーサーはリン酸部分などの分子を含み得る。
【００８１】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、共通のヌクレオチド配列および配列長または異なるヌクレオチド配列および配列長を有する複数の安定化領域を含む。
【００８２】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、共通のヌクレオチド数およびヌクレオチド配列または異なるヌクレオチド数およびヌクレオチド配列を有する複数の特異性領域を含む。
【００８３】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体リガンド結合代替抗体分子）は、天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、または天然ヌクレオチドと修飾ヌクレオチドとの組み合わせを含む。
【００８４】
１つの実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、同一または異なり得る１つまたは複数の結合リガンドを含む。
【００８５】
したがって、代替抗体は、「多価」であり得るので、１つまたは複数の特異性鎖上に含まれる複数の特異性ドメインを含む。したがって、多価の代替抗体（すなわち、抗体ループ）の特異性ドメインは、同一のヌクレオチド配列および同一のサイズであり得る。他の実施形態では、特異性ドメイン（すなわち、ループ）が異なり得るので、「多特異的」代替抗体を形成することができる。多特異的抗体は、異なるリガンドまたは同一リガンドの異なる領域／エピトープに結合する。したがって、各特異性ドメインを、同一の標的／リガンドまたは異なる標的／リガンドに結合するようにデザインすることができる。この方法では、代替抗体は、１つの細胞上の２つの共通の決定基に同時に結合するか、異なる決定基に結合するか、２つの異なる方向で化合物に結合することができる。例えば、抗体は、好ましい結合部位およびアロステリックな位置で特定の受容体に結合することができる。あるいは、代替抗体は、所与の細胞表面上の受容体の特定の対に結合して共同結合相互作用によって親和性を増大するか、分子または細胞間に架橋を形成することができる。
【００８６】
別の態様では、本発明は、サイズ、電荷、疎水性、電気泳動移動度（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｌｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ）、固有の標識などに基づいてフィルターによって保持されるか分画されるのに十分なサイズの任意のリガンドに対して産生されたポリオリゴヌクレオチド、代替抗体、リガンド結合分子に関する。
【００８７】
代替抗体は、個別のループ構造の間にヒンジ領域（またはスペーサー領域）をさらに含むことができる。代替抗体は、従来の抗体中でヒンジ単位として類似の様式で機能する「ヒンジ単位」またはスペーサーを含み得る。隣接標的（例えば、隣接細胞または１つの細胞上の複数の結合部位）への結合を立体的に至適化するために、スペーサーおよび／またはハイブリッド形成配列は、特異性鎖上の構造の間および／または安定化鎖の安定化ドメインの間に存在し得る。この方法では、スペーサー領域を使用して、分子中の結合ストレスを排除するか、結合溝のサイズおよび形状に多様性を持たせるか、特異性ループの配向を変化させるか、凝集もしくは綿状沈殿を至適化するか、エネルギー（フルーア）移動反応を至適化することができる。したがって、代替抗体分子は、同数のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列または異なる数のヌクレオチドおよびヌクレオチド配列を有する複数のスペーサー領域を含み得る。
【００８８】
この分子型の代表を図１に示す。図２は、複数の特性領域を含む代替抗体分子の２つの実施形態を示す。１つの実施形態では、代替抗体分子は、集合的に多次元リガンド結合が得られる複数の特異性領域（ＳＰ）、安定化領域（ＳＴ）、およびスペーサー領域（Ｓ）を含む。これらの分子型を、例えば、図３ａ〜３ｄに示す。上で考察するように、１つの実施形態では、代替抗体分子は、鎖の接着ならびに代替抗体分子および結合溝の安定性および形状を集合的に確実にする共同相互作用を使用して相補性ヌクレオチドの反対の鎖から構成される安定化領域および定常領域を含み得る。代替抗体分子は、２ヌクレオチドとい１０ヌクレオチドの間の配列を含む鎖から構成される安定化領域（ＳＴ）、３と１００との間のヌクレオチドを含む特異性領域（ＳＰ）、および０と１００との間のヌクレオチドを含むスペーサー領域（Ｓ）を含み得る。代替抗体分子は、共通のサイズおよびヌクレオチド配列または異なるサイズおよびヌクレオチド配列の複数の安定化領域（ＳＴ）を含み得る。
【００８９】
安定化鎖および特異性鎖がヌクレオチド配列を含む場合、同一または個別の（すなわち、異なる）核酸分子上に鎖を含むことができることがさらに認識される。したがって、別の実施形態では、１つのヌクレオチド鎖からａ）第１の定常領域、ランダムなヌクレオチド配列ループ形成特異性領域、第２の定常領域、第１のスペーサー領域、第２の定常領域とハイブリッド形成することができる第２の安定化領域、第２のスペーサー領域、および第１の定常領域とハイブリッド形成することができる第１の安定化領域を含む代替抗体を形成する。１つの実施形態では、各領域は、約１個から約２０個のヌクレオチドを含む。安定化領域および定常領域が非ハイブリッド形成特異性領域と共にハイブリッド形成してループ構造を形成する限り、ヌクレオチドの鎖は線状または環状であり得る。
【００９０】
あるいは、特異性鎖および安定化鎖は、共有性相互作用によって結合する必要はない。その代わり、特異性鎖および安定化鎖は、非共有相互作用を介して（直接または間接的に）相互作用する異なる分子を含み得る。この様式では、特異性鎖および安定化鎖が核酸配列を含む場合、各「異なる」鎖は３’末端および５’末端を有する核酸配列を含む。したがって、本発明は、２つまたはそれ以上の一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖、２つまたはそれ以上の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖、２つまたはそれ以上のＴＮＡオリゴヌクレオチド鎖、または２つまたはそれ以上の一本鎖ＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖、もしくはＴＮＡ鎖の組み合わせの構築物を含むリガンド結合代替抗体分子に関する。
【００９１】
他の実施形態では、代替抗体分子は、２つの並列する一本鎖ＤＮＡ分子、複数のオリゴヌクレオチドがそれぞれ結合溝を形成して同時且つ複数のリガンド結合を行うことができる分子が得られるより長い相補性オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成した複数のオリゴヌクレオチド、または１つまたは複数のリガンド結合部位を有する安定な分子を産生するオリゴヌクレオチドの並列した鎖から構成される二本鎖ＤＮＡを含む。
【００９２】
代替抗体を調製するために使用したヌクレオチド（すなわち、特異性鎖およびいくつかの実施形態では安定化鎖）は、天然に存在するか修飾することができる。このような修飾には、「機能的部分」が結合する特異性鎖または安定化鎖の成分の変化が含まれる。以下でさらに詳細に考察されるように、この部分を共有性または非共有性相互作用を介して結合させることができる。代替抗体分子中のこれらの修飾の例には、アミン、ジオール、チオール、ホスホロチオエート、グリコール、フッ素、ヒドロキシル、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、アビジン、ビオチン、芳香族化合物、アルカン、およびハロゲンで修飾されたヌクレオチドが含まれる。このような修飾には、さらに、シトシン環外アミン、５−ブロモ−ウラシルの置換（Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８１：１６７−１７８）、骨格修飾、メチル化、通常の塩基対合組み合わせなどでの修飾が含まれ得るが、これらに限定されない。概説として、Ｊａｙａｓｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１６２８−１６５０を参照のこと。
【００９３】
当業者は、エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対してより高い耐性を付与する隣接ヌクレオチド間のヌクレオチドおよびリン酸結合の修飾を多数認識している（Ｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．９０：５４３−９８およびＡｇｒａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１４７−９およびＵｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  １０６：１９９７−１２０２）。このような機能的部分には、例えば、糖の２’位での修飾が含まれる（Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−４５およびＰｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４−７）。例えば、修飾ヌクレオチドを、２’位でアミノおよびフルオロ官能基で置換することができる。さらに、目的のさらなる機能的部分には、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドおよびホスホロチオエート修飾ヌクレオチド（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：６８３−６９５；Ｖｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１３６８２−１３６８３；Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７：２８５５５−２８５６１；およびＳｅｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７７：６７−７０）が含まれる。したがって、別の実施形態では、代替抗体分子は、血清ヌクレアーゼの存在下で分子を安定化させる修飾ヌクレオチドを含む機能的部分を含む。
【００９４】
目的の他の機能的部分には、修飾ヌクレオチドが特異性ドメインに疎水性結合能力を導入する、特異性鎖の特異性ドメイン中の１つまたは複数のヌクレオチドに対する化学修飾が含まれる。一定の実施形態では、この化学修飾は、ヌクレオチドの糖、窒素含有塩基、またはリン酸分子の２’位で起こる。このような修飾は当分野で公知であり、例えば、６−メチルプリンおよび２，４−ジフルオロトルエンなどの非極性の非水素結合形状の模倣物が含まれる（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：１８６３−７２およびＧｕｃｋｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：９５０−９（その両方が本明細書中に参照することによって組み込まれる））。さらなる修飾には、イミダゾール、フェニル、プロリン、およびイソロイシルが含まれる。
【００９５】
他の実施形態では、代替抗体分子の特異性鎖が優先的に増幅されることが望ましい。「優先的に増幅される」は、代替抗体分子の特異性鎖が、対応する安定化鎖の増幅レベルと比較して高い頻度で増幅ステップ中に増幅されることを意図する。したがって、目的のさらなる機能的部分は、代替抗体分子の特異性鎖を優先的に増幅する修飾を含む。代替抗体の増幅方法は、本明細書中でさらに詳細に考察するが、この増幅型を可能にする修飾型は当分野で公知であり、例えば、ＰＣＲ反応においてポリメラーゼ活性耐性を増大させる安定化鎖に対する少なくとも１つのヌクレオチドの修飾が含まれる。このような修飾には、例えば、ビオチンを含む増幅を妨害する任意の機能的部分が含まれる。
【００９６】
目的のさらなる機能的部分には、例えば、レポーター分子が含まれる。本明細書中で使用される、「レポーター分子」は、結合した代替抗体を検出する分子をいう。したがって、別の実施形態では、機能的部分としての「レポーター」分子の組み込みまたは結合により、代替抗体および複合体形成された標的リガンドが検出される。このようなレポーター分子には、例えば、ポリペプチド；ラジオヌクレオチド（例えば、32Ｐ）；蛍光分子（Ｊｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２：２４６９−２４７３）、発光分子、発色団（ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ＴＲＩＴＣ、メチルウンベリフェロン、ルミノール、ルシフェリン、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄなど（Ｓｕｍｅｄｈａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１６２８−１６４９，Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：８６−９１、および（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３４５−３４９））、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼなど）、ランタニド系列（例えば、ユーロピウム、テルビウム、イットリウム）、およびミクロスフェア（例えば、サブミクロンポリスチレン（染色または非染色））が含まれる。このようなレポーター分子は、直接的な定性または定量検出またはエネルギー転移反応が可能である。
【００９７】
１つの実施形態では、レポーター分子を含む機能的部分はジゴキシゲニンである。いくつかの異なる蛍光色素または酵素に直接結合した抗ジゴキシゲニン抗体とのインキュベーションまたは直接免疫蛍光によってこの機能的部分を検出する。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．およびＣｅｌｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：９８−１０２（両方が参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。レポーターとして作用することができるさらなる分子には、ビオチンおよびポリＡテールが含まれる。
【００９８】
別の実施形態では、複数のレポーター分子を有する代替抗体分子を、試験方法の感度を増幅させるために試験方法で使用することができる。
【００９９】
別の実施形態では、機能的部分は、固体支持体または溶液中の他の分子に代替抗体を結合させるために使用することができる親和性タグ（すなわち、「結合分子」）である。したがって、リガンド結合代替抗体複合体の単離を、代替抗体に結合した親和性タグの使用によって容易にすることができる。本明細書中で使用される、「親和性タグ」は、代替抗体分子に結合することができ、且つ化合物または複合体を分離するために使用することができ、そして／または代替抗体に化合物を結合させるために使用することができる任意の化合物である。好ましくは、親和性タグは、リガンド結合分子または抗体などの別の化合物と結合するか相互作用するリガンドまたはハプテンなどの化合物である。親和性タグと捕捉成分とのこのような相互作用（ハプテンと抗体との間またはリガンドとリガンド結合分子との間など）は特異的相互作用であることも好ましい。例えば、代替抗体分子がカラム、マイクロタイターウェル、または固定化ストレプトアビジンを含むチューブに結合した場合、ビオチン化プライマーを使用して調製した代替抗体分子により固相に結合したストレプトアビジンに結合する。この様式で使用される他の親和性タグには、ポリＡ配列、プロテインＡ、受容体、抗体分子、キレート剤、アンチセンス配列によって認識されるヌクレオチド配列、シクロデキストリン、およびレクチンが含まれ得る。核酸プローブの文脈で記載されているさらなる親和性タグは、Ｓｙｖａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５０３７に記載されている。好ましい親和性タグには、核酸配列に組み込むことができ、且つストレプトアビジンまたはビオチン特異的抗体を使用して捕捉することができるビオチン（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３）が含まれる。親和性タグ用の好ましいハプテンは、ジゴキシゲニンである（Ｋｅｒｋｈｏｆ（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：３５９−３６４）。特異性抗体が公知であるか特異性抗体を作製することができる多数の化合物を、親和性タグとして使用することができる。このような親和性タグを、化合物を認識する抗体によって捕捉することができる。親和性タグとして有用な抗体は市販されているか、十分に確立された方法を使用して産生することができる。例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）３０−８５は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生に有用な一般的方法を記載している。
【０１００】
他の親和性タグは、抗抗体抗体である。このような抗抗体抗体およびその使用は周知である。例えば、一般に、一定のクラスまたはイソトープもしくはサブクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ）または一定の種の抗体（例えば、抗ウサギ抗体）に特異的な抗抗体抗体を使用して、他の抗体群を検出または結合させる。したがって、これらは、親和性タグに対する抗体を有することができ、この抗体：親和性タグ：代替抗体複合体を複合体の抗体部分への抗体の結合によって精製することができる。
【０１０１】
別の親和性タグは、他の最適な分子と選択的に切断可能な共有結合を形成することができるものである。例えば、この型の親和性タグは、硫黄原子を含むものである。この親和性タグと結合する核酸分子を、チオプロピルセファロースカラムへの保持によって精製することができる。カラムの強力な洗浄により望ましくない分子を除去し、例えば、β−メルカプトエタノールでの還元により、精製後に比較的穏やかな条件下で所望の分子を回収可能である。
【０１０２】
さらに他の実施形態では、遺伝コードを拡大するために機能的部分を特異性鎖に組み込む。このような部分には、例えば、ＩｓｏＧ／ＩｓｏＣ対および２，６−ジアミノピリミド／キサンチン塩基対（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４３：５３７−９およびＴｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１−７）；ｍｅｔｉｒｉｓｏ  Ｃおよび（６−アミノヘキシル）イソＧ塩基対（Ｌａｔｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：２８１７−２２）、ベンジル基（Ｄｅｗｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：８４７４−５およびＥａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：１０−６）、およびアミノ酸側鎖が含まれる。
【０１０３】
目的の他の機能的部分には、架橋分子（すなわち、光架橋または化学的架橋のいずれかのためのヨウ素または臭素；化学的架橋のための−ＳＨ）；治療薬（すなわち、癌、関節炎、敗血症、心筋の不整脈および梗塞、ウイルスおよび細菌感染、自己免疫疾患、およびプリオン疾患の治療で使用される化合物）；生体分布、薬物動態学、および組織浸透、またはその任意の組み合わせを変化させる化学修飾物が含まれる。このような修飾は、ピリミジン残基のＣ−５位に存在し得る。
【０１０４】
代替抗体に組み込まれた機能的部分（安定化鎖もしくは特異性鎖またはその両方のいずれか）は、多機能であり得る（すなわち、この部分により標識および親和性送達、ヌクレアーゼ安定化が可能であり、そして／または所望の複数の治療効果もしくは毒性が得られる）。これらの種々の「機能的部分」修飾は、例えば、蛍光標示式細胞分取（Ｃｈａｒｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：３０１８−３０２６およびＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：７０２−７０３）、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（Ｄｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：１０２１−１０２５）、および他の診断アッセイ（そのいくつかが本明細書中で考察される）などに適用するための検出の補助で適用される。さらに、テクネチウム−９９ｍキレート化ケージ（ｃｈｅｌａｔｉｎ  ｃａｇｅ）とのコンジュゲートによりインビボで画像化することができる。例えば、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３９：５６−６４を参照のこと。
【０１０５】
さらに、例えば、セルロース（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：５４６２−５４６７）またはＳｅｐｈａｄｅｘ（Ｓｒｉｓａｗａｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９）に結合することが公知のアプタマーが同定されている。これらのアプタマーを、代替抗体に結合し、代替抗体分子の単離または検出手段として使用することができる。目的のさらなる機能的部分には、インビボで血漿クリアランスを減少させるためのポリエチレングリセロールの添加（Ｔｕｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７３２：２０３−２１２）またはジアシルグリセロール脂質基の添加（Ｗｉｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９：５７３−５８２）が含まれる。さらに、抗菌活性（すなわち、抗細菌、抗ウイルス、または抗真菌）特性を有する機能的部分を、病原性生物およびウイルスの修飾可能性を抑制するための抗バイオテロ薬として代替抗体と共に使用することができる。本明細書中でさらに詳細に考察するように、機能的部分の結合は、種々の方法で適用される。
【０１０６】
代替抗体構造への機能的部分の種々の結合方法は、当分野で公知である。例えば、代替抗体にポリペプチドまたは目的の他の化合物がコンジュゲートされる生体コンジュゲート反応を、例えば、Ａｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｌｉｎｋ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ｗｗｗ．ｓｏｌｕｌｉｎｋ．ｃｏｍ）で見出すことができる。
【０１０７】
機能的部分を、特異性鎖もしくは安定化鎖の任意の領域またはその任意の組み合わせに結合することができる。１つの実施形態では、機能的部分を、１つまたは複数の定常ドメインおよび／または安定化ドメインに結合させる。他の実施形態では、機能的部分を、特異性ドメインに結合させる。当業者は、機能的部分の結合部位は所望の機能的部分に依存することを認識する。
【０１０８】
さらなる機能的部分には、標的リガンドの位置に指示されることが望まれる種々の薬剤が含まれる。送達用薬剤は、任意の目的の分子（治療薬または薬物送達媒介物が含まれる）であり得る。このような薬剤およびその送達方法は、本明細書中に開示されている。
【０１０９】
代替抗体構造に組み込むために選択した機能的部分を、代替抗体がそのリガンドまたは潜在的リガンドに接触する環境条件に依存して選択することができる。例えば、イオン化可能な基を有する分子を含む代替抗体ライブラリーの作製により、塩に感受性を示す代替抗体を得ることができ、金属キレート化基の存在により、特異的な金属イオンに感受性を示す代替抗体を得ることができる。例えば、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５２２９−３４およびＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１０４４−８を参照のこと。
【０１１０】
本明細書中に記載の任意の種々の方法および組成物では、種々の機能的部分を、抗体を形成する１つまたは複数の鎖上（鎖上の１つまたは複数の位置）でコンジュゲートすることができる。鎖を、１つまたは複数または３つまたはそれ以上の異なる型の部分に共有結合することができる。
【０１１１】
特異性鎖または安定化鎖への補助分子の結合のための複数の部位が得られる並列オリゴヌクレオチド鎖を含むように代替抗体を構成することができる。例えば、特異性鎖および安定化鎖が核酸配列を含む場合、補助分子を３’末端および／または５’末端に結合することができる。
【０１１２】
別の実施形態では、ポリオリゴヌクレオチド（代替抗体分子）は、代替抗体分子の各成分オリゴヌクレオチドに特異的である修飾プライマーを使用して固定した１つまたは複数のリガンドを含む。
【０１１３】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の成分オリゴヌクレオチド鎖に固有のオリゴヌクレオチド配列をターゲティングする修飾プライマーを使用して代替抗体分子のオリゴヌクレオチドに配向様式で１つまたは複数のリガンドに結合する方法に関する。
【０１１４】
天然の抗体を超える核酸ベースの代替抗体の１つの利点は、ＰＣＲ増幅＋特異性領域を含まないオリゴヌクレオチドのアニーリングによる構築を使用してインビトロで容易に構築する能力である。別の利点は、動物または動物施設を必要とせずに抗体分子を産生する能力である。これらはまた、選択プロセスで生きた組織培養物を維持する必要性を排除し、サンプルマトリクス中で代替分子が直接捕捉および増幅される。これにより、サンプルマトリクスの適合性に関する問題が最小になり、適合し且つ有効な試薬の生成時間が短縮される。代替抗体分子により、免疫応答の刺激および成熟の必要性が排除される。別の利点は、修飾プライマー分子または修飾ヌクレオチドを使用した代替抗体分子の標識の容易さである。別の利点は、移動度が増大した小さな低免疫原性一次構造である。
【０１１５】
ＩＩ．代替抗体ライブラリー
本発明の組成物は、代替抗体集団をさらに含む。「集団」は、２つまたはそれ以上（すなわち、１０、１００、１，０００、１０，０００、１×１０6、１×１０7、１×１０8、またはそれ以上）の代替抗体を含む群または集団を意図する。代替抗体の種々の「集団」（例えば、以下に詳細に考察するように、ランダム化特異性領域を有する代替抗体集団を含む代替抗体のライブラリーが含まれる）を提供する。代替抗体の種々の集団を、混合物または基質／アレイ中で見出すことができる。
【０１１６】
本明細書中に提供するように、代替抗体のライブラリーは、所望の代替抗体が同定／捕捉される選択技術のインビトロでの反復によって進行する。各選択ラウンドにより、ライブラリーと比較して所望のリガンドに対する特異性および／または結合親和性が増大した代替抗体分子集団が選択される。このような選択された代替抗体集団を、以下にさらに詳細に考察する。
【０１１７】
１つの実施形態では、代替抗体集団はライブラリーを含む。代替抗体分子のライブラリーは、所望のリガンドに結合することができる抗体分子が捕捉される安定且つ予め形成された異なる配列の代替抗体分子の混合物である。本明細書中で使用される、「代替抗体分子のライブラリー」は、特異性鎖および安定化鎖を含む分子の集団を含む。特異性鎖は、第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、安定化鎖は、第１の定常領域に相互作用する第１の安定化ドメインおよび第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む。さらに、集団中の特異性鎖の第１の定常領域はそれぞれ同一である；集団中の特異性鎖の第２の定常領域はそれぞれ同一である；集団中の特異性鎖の特異性領域はそれぞれランダム化されている；集団中の安定化鎖はそれぞれ同一である。本明細書中に記載の任意の種々の構造を有する代替抗体分子のライブラリーを構築することができると認識される。
【０１１８】
天然の抗体分子で認められるリガンド結合機構に類似の様式で、疎水性相互作用、水素相互作用、静電気的相互作用、およびファンデルワールス結合相互作用によって標的リガンドに結合する結合溝を有する１つまたは複数のメンバーを含む代替抗体分子のライブラリーを調製することができる。ライブラリーは、相補ヌクレオチド残基（共有または非共有（例えば、ワトソン−クリック対合）相互作用によって結合した各残基対）の並列鎖からその構造安定性が得られ、その結果並列鎖の結合力の蓄積によって分離が防止される分子を含み得る。ライブラリーは、一方の核酸鎖が他方よりも多数のヌクレオチド残基を含み、且つ安定なループ構造を形成するように核酸（例えば、ＤＮＡ）の対合鎖から構成される代替抗体分子を含み得る。
【０１１９】
したがって、特異性領域のいずれかの側面上の定常領域は、安定化鎖の安定化領域との結合により安定化するだけでなく、代替抗体の増幅およびレポーター分子および治療薬を含むことができる複数の分子の結合を容易にするために使用することもできる。代替抗体のライブラリーには、複数の異なるループ構造を含む複数の代替抗体が含まれる。ライブラリー中の複数のループ構造により、特定の抗原に結合する抗体として機能する複数のループ構造から適切なループ構造を有する代替抗体を捕捉および同定可能である。
【０１２０】
本明細書中で使用される、「ライブラリー」は、典型的には、約２および１×１０14との間の代替抗体を有する集団が含まれる。あるいは、選択で使用される代替抗体ライブラリーには、各結合溝（すなわち、特異性ドメイン）中に少なくとも１０ヌクレオチド長の連続ランダム化配列を有する約２と１０18との間、１０9と１０14との間、約１０9と１０19との間、約１０9と１０24との間、約２と１０27との間、またはそれ以上の代替抗体の混合物が含まれ得る。さらに他の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも３、１０、１００、１０００、１００００、１×１０5、１×１０6、１×１０7、１×１０10、１×１０14、１×１０18、１×１０22、１×１０25、１×１０27、またはそれ以上のランダム化または半ランダム特異性ドメインを有する代替抗体分子を含む。ライブラリー中に含まれる分子を、混合物中またはアレイ中で見出すことができる。
【０１２１】
ライブラリーには、天然に存在する核酸もしくはそのフラグメント、化学合成された核酸、酵素合成された核酸、またはその組み合わせによって作製された核酸から形成された代替抗体が含まれ得る。このようなヌクレオチド修飾を、本明細書中でより詳細に考察した。
【０１２２】
本明細書中の用途についての一定の他の例では、用語「集団」を、１つまたは複数の選択された特徴を有する本発明のポリクローナルまたはモノクローナル代替抗体調製物を言うために使用することができる。
【０１２３】
ポリクローナル代替抗体ライブラリーまたは「ポリクローナル抗体集団」は、標的リガンドへの結合が増大したポリクローナル抗体を産生するために構築した代替抗体の各クローン集団を含む。一旦代替抗体または複数の個別の代替抗体クローンが標的能力の基準を満たすことが見出されると、これらをポリクローナル試薬に構築して、標的リガンドの検出において複数のエピトープ認識およびより高い感受性／アビディティを得ることができる。ポリクローナル代替抗体集団は所望のリガンドに対する捕捉および増幅ステップ後に得られる分子のプールに相当し得ると認識される。あるいは、ポリクローナル代替抗体集団を、所望のリガンド結合特性を有する少なくとも２つの各モノクローナル代替抗体クローンの混合によって形成することができる。
【０１２４】
全ての脊椎動物中の全ての物質ではないが、脊椎動物に移入した事実上任意の物質は、抗体応答を誘発し得る。ヒトにおける抗体レパートリーは、約２．５〜３．５×１０8個の異なる結合特異性を示す１０11個の異なる抗体分子からなる。ヒトゲノムは、抗体結合部位の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の転写を担うＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの複数のコピーを含む。重鎖および軽鎖上の異なる組み合わせ中のこれらの遺伝子は、分子の結合多様性の原因である。カッパ（κ）軽鎖は、約４０個のＶκ遺伝子セグメント、５個のＪκセグメントを含み、潜在的に２００種の並べ替えと見なされる。ラムダ（λ）軽鎖は、約３０個のＶλおよび４個のＪκ（すなわち、１２０種の並べ替えが可能である）を含む。重鎖は、約６５個のＶｈ遺伝子セグメント、２７個のＤｈセグメント、および６個のＪｈセグメントを含み、約１１，０００の並べ替えと見なされる。結合溝を形成するための２つの鎖の対合により、３２０×１１，０００または３．５×１０6の組み合わせ（すなわち、結合特異性）が得られる。実際には、全てのＶ領域のセグメントが同一の頻度で発現せず、全抗体中でいくつかは共通であり、その他は稀にしか見出されないので、結合多様性の範囲はこの理論計算値よりも小さい。いくつかのＶｈおよびＶｌ配列対は、ほとんど互いに対合しない。これらの制限を補正して、Ｖ、Ｊ、およびＤ領域の遺伝子セグメントの不正確な連結および変異免疫グロブリン遺伝子産物が高い比率で得られる再配列された重鎖および軽鎖遺伝子に点変異が導入される体細胞超変異によってさらに多様化する。
【０１２５】
代替抗体分子の結合多様性は、ゲノム内の遺伝子セグメントの多様性に制限されない。結合溝／ループのサイズおよびエピトープの範囲は、進化によって制限されない。代替抗体の結合レパートリーは、分子の特異性領域で使用される制限された高次構造の機能、異なるヌクレオチド塩基の数、機能的部分、ヌクレオチド残基の数である。４０個の天然のヌクレオチドから構成される特異性領域を有するライブラリーは、潜在的に１．２×１０24種の特異性を有する。天然の塩基と組み合わせた修飾塩基の選択的使用により、再び抗体レパートリーの多様性が増大する。
【０１２６】
Ａ．特異性領域のランダム化集団の形成
ランダム化特異性ドメインを有する特異性鎖集団の産生または形成方法は、当分野で公知である。例えば、多数の方法（例えば、ランダム化核酸配列の合成および無作為に切断された細胞核酸からの選択が含まれる）で特異性領域を調製することができる。あるいは、核酸（またはその一部）の直接化学合成または適切な酵素の使用によって核酸（またはその一部）を調製することができるテンプレートの合成によって完全または部分的な配列のランダム化を容易に行うことができる。例えば、Ｂｒｅａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８；Ｊａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙ  １８３：２８１−３０６；Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍｋ６４：７６３−７９７；Ｐｅｒｓｐｅｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（１９９８）、およびＢｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．３．３．１−３．２０（その全てが参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。あるいは、オリゴヌクレオチドを天然の供給源（ゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡ調製物）から切断し、定常領域の間にライゲーションすることができる。
【０１２７】
「ランダム化」は、原則的に所与の長さを超える天然または修飾塩基を含む任意の可能なヌクレオチド配列を有する核酸のセグメントを説明するために使用される用語である。上で考察されるように、特異性領域は種々の長さであり得る。したがって、代替抗体ライブラリー中のランダム化配列はまた、約１０から約９０までまたはそれ以上のヌクレオチドの範囲の所望する種々の長さであり得る。ランダム配列セグメントが作製される化学反応または酵素反応では、存在し得る未知の偏りまたはヌクレオチドの優先度に数学的にランダムな配列を得ることができない。本明細書中で使用される、用語「ランダム化」または「ランダム」は、非理想性からのこのような逸脱の可能性を反映する。現在公知の技術（例えば、連続的化学合成）では、大きな逸脱が起こることは知られていない。２０個またはそれ以下のヌクレオチドの短いセグメントについては、存在し得る任意の小さな偏りは、無視できる結果である。１回の合成手順が長いほど任意の偏りの影響が大きくなる。
【０１２８】
さらに、例えば、合成反応の前駆体ヌクレオチド（またはデオキシヌクレオシド）三リン酸のモル比の変化によって、ランダム化配列に偏りを意図的に導入することができる。意図的な偏りは、例えば、所与の生物における各塩基の比率に近づけるか二次構造に影響を与えるのに望ましい。Ｈｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  ８４：１４３−１５１およびＢａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７：５２９−５３６（参照することによりその両方が本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。規定のステムループ構造を含む偏りを有するランダム化集団を作製したＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１１６１６−１１６２１も参照のこと。したがって、本明細書中で使用されるように、ドメインの一次配列および／または二次構造中に所望の偏りが含まれるように特異性ドメインのランダム化集団を作製することができる。
【０１２９】
ライブラリーが全ての可能な変異配列を含む必要はない（ランダム化長セグメントからは可能）。最大数の潜在的な結合配列を確実に同定するために、ライブラリーは、実際的に選択されるできるだけ多数の配列変異型を含み得る。例えば、特異性領域中のランダム化配列が３０個のヌクレオチドを含む場合、４つの天然に存在する塩基を使用して約１０18（すなわち、４30）種の配列並べ替えを含む。
【０１３０】
実際的検討材料には、ＤＮＡ合成カラム上のテンプレート数ならびに溶液中の代替抗体および標的の溶解度が含まれる。代替抗体ライブラリー中の配列数に理論的制限は存在しないが、過剰な塩基数を含むランダム化セグメントを含むライブラリーは、産生に不都合であり得る。適切な代替抗体を選択するために全ての可能な配列をライブラリーに含める必要はない。
【０１３１】
ライブラリー中の各メンバーのループ構造（特異性領域）のサイズは、実質的に同一であっても異なっていてもよい。ループ構造のサイズが各ライブラリーで変化するかループサイズが混合したライブラリーを形成するために組み合わせる場合、特定の標的リガンドについての至適ループサイズを同定する目的のために、反復ライブラリーを使用することができる。
【０１３２】
上記で考察されるように、特異性鎖は、種々の機能的部分を含み得る。特異性鎖のランダム化集団の形成方法は、鎖に含まれる機能的部分に依存して変化する。例えば、１つの実施形態では、機能的部分は、修飾アデノシン残基を含む。これに関して、特異性ドメイン中のみにアデノシン残基を含むように特異性鎖をデザインすることができる。増幅時に使用したヌクレオチド混合物は、所望の機能的部分（すなわち、疎水性結合特性を増大させる部分）を有するアデノシンを含む。他の例では、合成反応後に機能的部分を代替抗体に結合することができる。
【０１３３】
Ｂ．代替抗体ライブラリーの作製
一旦ランダム化した種々の特異性領域を有する特異性鎖集団が形成されると、（本明細書中で考察されるように）所望の条件下での特異性鎖の適切な安定化鎖との接触によって代替抗体を形成することができる。
【０１３４】
代替抗体分子のライブラリーの作製方法を提供する。この方法は、ａ）ｉ）特異性鎖集団が核酸分子集団として特徴付けられ、ｉｉ）前記集団中の各特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接した特異性領域を有する核酸配列を含み、ｉｉｉ）前記集団中の特異性鎖の各第１の定常領域が同一であり、ｉｖ）前記集団中の特異性鎖の各第２の定常領域が同一であり、およびｖ）前記集団中の特異性鎖の各特異性領域がランダム化されている、特異性鎖集団を準備するステップを含む。特異性鎖集団を安定化鎖に接触し、安定化鎖は第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、第１の安定化ドメインが第１の定常領域と相互作用し、且つ第２の安定化ドメインが第２の定常領域と相互作用する条件下で接触させる。この方法によって産生された代替抗体ライブラリーも提供する。他の実施形態では、ライブラリーを構成する代替抗体は、異なる鎖上に含まれる特異性鎖および安定化鎖を有する。
【０１３５】
１つの実施形態では、核酸配列を含む特異性鎖および安定化鎖を含む代替抗体ライブラリーを、５’末端相補ヌクレオチド配列、ランダムヌクレオチド介在配列、および３’末端相補配列を含む長いオリゴヌクレオチド鎖の５’末端および３’末端で２つの相補配列を含む短いオリゴヌクレオチド鎖とのハイブリッド形成によって調製することができる。
【０１３６】
長さの異なるランダム化特異性ドメインを有する代替抗体集団を産生することが有利であり得ることがさらに認識される。この様式では、ラブラリーを、任意の所与の標的に使用するための至適代替抗体の溝サイズを定義する代替抗体開発の「多適合」プロセスで使用することができる。このプロセスにより、パラトープ（結合部位）がサイズに無関係に全てのリガンドに有限な天然の抗体分子の結合特異性について代替抗体結合を改良することが可能である。「多適合」プロセスは、代替抗体−リガンド複合体の適合、特異性、および親和性を増大させる空間的特徴を有する溝サイズを同定する。「多適合」プロセスは、理想的な結合ループ／溝（進化および遺伝学の教えによってサイズまたは次元が制限されないもの）として同定することができる。したがって、代替抗体分子は、天然の抗体分子の性質について科学および研究に依存して形成されたエピトープまたは決定基のサイズに関する従来のパラダイムに挑む。種々のサイズおよび高次構造の溝を含む異種代替抗体集団を使用して、予備的「多適合」リガンド捕捉ラウンドを実施する。代替ライブラリー調製物についての至適溝サイズを、制限された数の捕捉および増幅サイクル後の最も高いリガンド結合度を示す溝サイズを有する下位集団によって示す。
【０１３７】
ＩＩＩ．キット
開示の代替抗体分子およびこのような分子の種々の集団（すなわち、モノクローナル代替抗体、ポリクローナル代替抗体、抗体分子の選択集団、およびライブラリー）を、キット中の試薬として使用することもできる。例えば、所望のリガンドの同定のためのキットを提供する。キットは、代替抗体集団および所望のリガンドの検出に適切な緩衝液を含む。１つの例では、代替抗体および緩衝液は、溶液、懸濁液、または固体（粉末または凍結乾燥物など）の形態で存在し得る。試薬は、共に存在するか、互いに分離されているか、適切な支持体上に存在し得る。開示のキットを、診断薬としてか未知の遺伝子の機能の同定のために使用することもできる。
【０１３８】
ＩＶ．代替抗体ライブラリーのスクリーニング方法
上で考察するように、本発明は、代替抗体および代替抗体を含むライブラリーの形成のための方法および組成物を提供する。所望のリガンド結合特異性を有する代替抗体または代替抗体集団を同定または「捕捉する」ための代替抗体ライブラリーまたは代替抗体の選択された集団のスクリーニング方法も提供する。この様式では、その後のクローニングのために、ランダム配列リガンド結合溝（特異性領域）および溶液中の分子の構造を安定化する安定化領域を含む予め合成した複数鎖の分子のライブラリーから代替抗体分子を選択する。
【０１３９】
一般に、特定の標的／リガンドに結合する代替抗体を、１つまたは複数のリガンドのライブラリーへの接触、標的／リガンドへの１つまたは複数の代替抗体の結合、非結合代替抗体からの代替抗体結合リガンドの分離、および結合標的および／または結合代替抗体の同定によって出発代替抗体ライブラリーから捕捉する。
【０１４０】
例えば、１つの実施形態では、本発明は、
ａ）少なくとも１つのリガンドを代替抗体分子のライブラリーに接触させるステップと、ここで、前記ライブラリーが特異性鎖および安定化鎖を含む代替抗体分子集団を含み、ここで、
ｉ）前記特異性鎖が、第１の定常領域および第２の定常領域に隣接した特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含み、
ｉｉ）前記集団中の特異性鎖の各第１の定常領域が同一であり、集団中の特異性鎖の各第２の定常領域が同一であり、前記集団中の特異性鎖の各特異性ドメインがランダム化されており、前記集団中の各安定化鎖が同一であることを特徴とし、
ｂ）リガンド結合代替抗体複合体集団からリガンドおよび代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団の特異性鎖を増幅するステップと
を含む、代替抗体ライブラリーのスクリーニング方法を提供する。
【０１４１】
さらに他の実施形態では、代替抗体ライブラリーのスクリーニング方法は、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下でステップ（ｃ）の前記特異性鎖集団を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む。
【０１４２】
他の実施形態では、代替抗体分子の安定化鎖および特異性鎖は異なる。
【０１４３】
前に考察するように、この方法により、目的の所望のリガンドと相互作用する代替抗体分子が選択または捕捉される。それにより、この方法は、代替抗体分子のライブラリーからの選択およびその後の目的のリガンドについての所望の結合親和性および／または選択性を有する代替抗体分子を同定するための選択および増幅の段階的反復を使用する。本明細書中で使用される、「代替抗体分子の選択された集団」は、少なくとも１ラウンドのリガンド結合を受けた分子集団を意図する。
【０１４４】
したがって、別の実施形態では、代替抗体の捕捉方法は、代替抗体の選択された集団を目的のリガンドに接触させるステップを含む。この実施形態では、ランダム化特異性ドメインを含む分子のライブラリーを使用する必要はないが、むしろ例えば、第２、第３、第４、第５、第６、第７、またはそれ以上のラウンドの選択／増幅後に作製された代替抗体分子の選択された集団を、所望のリガンドに接触させることができる。この実施形態では、代替抗体の捕捉方法は、
ａ）リガンド結合代替抗体複合体集団を形成する条件下でリガンドを代替抗体分子集団に接触させるステップと、ここで、前記代替抗体集団の代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、ここで、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含むことを特徴とし、
ｂ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団から前記リガンドおよび前記代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団の特異性鎖を増幅するステップと
を含む。
【０１４５】
他の実施形態では、代替抗体分子の捕捉方法は、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下でステップ（ｃ）の特異性鎖集団を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む。さらに他の実施形態では、安定化鎖および特異性鎖が異なる。
【０１４６】
したがって、別の実施形態では、プロセスは、少なくとも２つの代替分子あるいは１０9〜１０14個の代替抗体分子（０．１７ナノモル〜１．７フェムトモル）の予め構築したライブラリーからリガンド結合代替抗体分子を調製するステップを含む。
【０１４７】
別の実施形態では、プロセスは、１０と９０との間のヌクレオチド、１０と６０との間のヌクレオチド、または１０と４０との間のヌクレオチドから構成される少なくとも１つの特異性領域を有する予め構築された代替抗体分子のライブラリーからの代替抗体の補足によってリガンド結合代替抗体試薬を調製するステップを含む。
【０１４８】
別の実施形態では、プロセスは、リガンド結合および／または安定性を増大させる種々の数および配列のヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドから構成される特異性領域を有する代替ライブラリー分子の予め構築したライブラリーからリガンド結合代替抗体試薬を調製するステップを含む。
【０１４９】
別の実施形態では、プロセスは、代替抗体と複合体形成した場合にフィルターを貫通することができない任意の分子に対するリガンド結合代替抗体試薬を調製するステップを含む。
【０１５０】
別の実施形態では、プロセスは、同一の溶液中の非複合体形成代替抗体からの溶液中の代替抗体−リガンド複合体の分離を含むリガンド結合代替抗体分子を調製するステップを含む。
【０１５１】
別の実施形態では、プロセスは、非複合体形成代替抗体分子を保持しないが標的リガンドと複合体形成した代替抗体分子を保持するフィルターを使用したリガンド結合代替抗体試薬を調製するステップを含む。
【０１５２】
別の実施形態では、プロセスは、サイズ排除クロマトグラフィ、サイズ排除／分子篩濾過、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ＦＡＣＳ、または電気泳動を使用した上記のリガンド結合代替抗体試薬を調製するステップを含む。
【０１５３】
別の実施形態では、プロセスは、標的リガンドに対する結合親和性および特異性を増大させるために異次元構造を有する結合ループ／溝（特異性ドメイン）を有する分子の代替抗体ライブラリーから代替抗体分子を捕捉するステップを含む。
【０１５４】
別の実施形態では、プロセスは、あるとすれば使用されるヌクレオチドおよびヌクレオチド修飾物の数によって決定されるサイズおよび高次構造を有する結合ループ／溝（特異性ドメイン）を有する代替抗体を産生するステップを含む。
【０１５５】
別の実施形態では、プロセスは、サイズが制限されていない結合ループ／溝（特異性ドメイン）を有する代替抗体を産生するステップを含む。
【０１５６】
別の実施形態では、プロセスは、異なる結合特異性を有するリガンド結合代替抗体分子の同時調製を含む。
【０１５７】
別の実施形態では、プロセスは、ランダム結合代替抗体分子の単一ライブラリーと代替抗体に結合した場合にフィルターによって保持することができる標的リガンドとのインキュベーションによるリガンド結合代替抗体分子の同時調製を含む。
【０１５８】
別の実施形態では、代替抗体を、以下により詳述している高処理アッセイで使用することができるライブラリーに構築することができる。
【０１５９】
別の態様では、本発明は、無作為に結合する代替抗体分子の予め構築したライブラリー中に存在するリガンド結合代替分子を捕捉するリガンド結合代替抗体試薬の調製プロセスに関する。
【０１６０】
Ａ．接触方法
「接触」は、目的の所望のリガンドを代替抗体分子またはその集団と相互作用させる任意の方法を意図する。当業者は、種々の条件をこの相互作用に使用することができることを認識する。例えば、種々の標的リガンドに結合する代替抗体を選択するために使用した実験条件を、標的がインビボで見出されるかインビトロでの適用が予想される環境を模倣するために選択することができる。この結合環境をより正確に反映するように変化させることができる調整可能な条件には、総イオン強度（浸透圧）、ｐＨ、酵素組成物（例えば、ヌクレアーゼ）、金属タンパク質（例えば、ヘモグロビン、セルロプラスミン）、温度、および無関係の化合物の存在が含まれるが、これらに限定されない。インビトロ環境での試験方法のために代替抗体を開発する場合に変化させることができる条件には、上記因子および条件ならびに溶媒、界面活性剤、放射性核種、土壌で存在し得る通常の成分、水、エアサンプル、揮発性および半揮発性化合物、無機および有機化合物を含み得る。例えば、Ｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２６４：２６８−２７８；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５８８３−７；Ｂｒｉｄｏｎｎｅｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ９：１−１１；Ｈｉｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．９８：２６８８−９２；およびＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７１：４４６−８（その全てが参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。
【０１６１】
目的のリガンドと代替抗体との適切な接触条件を、反応化学に基づいて経験的に決定することができる。一般に、適切な条件は、１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜４０％、４０％〜６０％、６０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％の抗体分子集団をリガンドと相互作用させるのに十分である。
【０１６２】
Ｂ．分配方法
「分配」は、リガンド結合代替抗体複合体と呼ばれる標的リガンドに結合した代替抗体を標的分子に結合していない代替抗体から分離する任意のプロセスを意図する。当分野で公知の種々の方法によって分配することができる。例えば、標的／リガンドに結合した代替抗体を固定することができるか、フィルターまたは分子篩を通過することができず、非結合代替抗体はそうではない。リガンド結合代替抗体を特異的に保持するカラムを分配に使用することができる。濾過ゲルリターデイションおよび密度勾配遠心分離と同様に液体−液体分配を使用することもできる。分配方法の選択は、標的／リガンドの性質およびリガンド結合代替抗体に依存し、当業者に公知の原理および性質にしたがって作製することができる。
【０１６３】
１つの実施形態では、分配は、保持物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）中のリガンド結合代替抗体複合体を保持し、且つ非結合代替抗体を濾液中に通過させることを特徴とする濾過システムによって、リガンド、代替抗体分子集団、およびリガンド結合代替抗体複合体集団を含む混合物を濾過するステップを含む。このような濾過システムは、当分野で公知である。例えば、種々の濾過膜を使用することができる。用語「濾過膜」には、サイズ（例えば、Ａｍｉｃｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）、Ｐａｌｌ  Ｎａｎｏｓｅｐ（登録商標））、電荷、疎水性、キレート化、および包接に基づいて分離するデバイスが含まれる。
【０１６４】
濾過プロセスで使用される孔サイズを、標的リガンドのサイズおよび代替抗体の初期の集団で使用した代替抗体分子のサイズに対合させることができる。例えば、直径７〜１０ミクロンの細胞リガンドは、７ミクロンを排除する膜によって保持される。複合体形成しない場合に１２０ヌクレオチドの二オリゴヌクレオチド構造を有する代替抗体分子が、膜を通過するので容易に排除される。保持物中のリガンドに結合した代替抗体が捕捉され、その後の集団の構築に使用される。代替抗体とＢＳＡ−ハプテンコンジュゲート体との調製物には、代替抗体−コンジュゲート複合体を排除する孔を使用しなければならない。５０，０００または１００，０００ダルトンを排除する膜により、コンジュゲート体に結合したこの代替抗体が遊離の代替抗体から有効に分画される。小タンパク質（酵素西洋ワサビペルオキシダーゼなど）に対して調製された代替抗体は、約５０，０００ダルトンまたはそれ以上の分子を排除し、非複合体形成代替抗体がフィルターを通過する膜が必要である。サイズおよび膜排除特性を増大させるために、標的リガンドは巨大なキャリア分子と化学的にコンジュゲートするか重合することができる。
【０１６５】
非結合代替抗体から標的リガンドに結合した代替抗体を分離するために使用される別のプロトコールは、当分野に利用可能である。例えば、溶液中に存在するリガンド結合代替抗体分子および遊離代替抗体分子を、サイズ排除カラムクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、サイズ排除／分子篩濾過、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィ、溶解性の調整（例えば、硫酸アンモニウム沈殿またはメタノール沈殿）、免疫沈降、タンパク質変性、ＦＡＣＳ密度勾配遠心分離を使用して分離することができる。リガンド結合および非結合代替抗体分子を、ＨＰＬＣおよび蛍光標示式細胞分取器などの分析方法を使用して分離することができる。
【０１６６】
固相への選択的固定を使用したアフィニティクロマトグラフィ手順を使用して、非結合代替抗体分子から標的リガンドに結合した代替抗体を分離することができる。このような方法には、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ガラス、ナイロン、セルロースアセテート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、またはシリコンチップから構成される吸着剤（ａｄｓｏｒｂｅｎｔ）への標的リガンドの固定を含み得る。
【０１６７】
代替抗体の特異性鎖の増幅方法が以下に記載されているが、標的リガンドに結合した代替抗体をＰＣＲ増幅で使用して、親和性マトリクスから分離されているか分離されていない複合的な特異性領域を有するオリゴヌクレオチド鎖を産生することができると認識される。
【０１６８】
溶液と固相分離との組み合わせには、代替抗体結合によって得られた生理化学的効果に基づいて単離することができるリガンドコンジュゲートミクロスフェアへの代替抗体の結合が含まれ得る。個別のミクロスフェア集団を、異なる標的リガンドまたは異なる方向の同一のリガンドとコンジュゲートした発色団、フルオロフォア、マグネタイトで個別に標識することができる。各ミクロスフェア集団に結合した代替抗体分子を、ミクロスフェアレポーター分子の特徴に基づいて分離し、異なるリガンドに対する複数の代替集団を同時に産生することができる。
【０１６９】
したがって、別の実施形態では、代替抗体分子は、任意のリガンド（免疫学的ハプテン、有機環境汚染物質（例えば、ポリ塩化ビフェニル）、治療薬、乱用された物質、ホルモン、ペプチド、プリオン、核酸、およびフィルターを通過することができるがコンジュゲートしてフィルターに保持することができる他の分子が含まれる）に結合することができる。
【０１７０】
一旦結合すると抗体の結合親和性および触媒活性に基づいて、代替触媒抗体を選択することができる。触媒抗体の１つの選択方法は、酵素触媒反応の遷移状態アナログに結合する代替抗体を検索することである。
【０１７１】
別の実施形態では、代替抗体分子は、フィルターによって保持することができる分子に結合することができる。
【０１７２】
化学的に複数の（化学的に異なる）リガンドに結合する代替抗体分子を同時に産生するための方法を使用することができる。したがって、この方法を使用して、膜を通過することができない標的リガンドコンジュゲート体の混合集団について代替抗体を選択することができる。非コンジュゲート濾過可能リガンドとの代替抗体集団の連続的インキュベーションにより、濾過物中の非特異的代替抗体集団を分離することが可能である。濾過可能な標的リガンドの予備インキュベーションにより、その後の増幅のための保持物中のＳＡｂ集団を迅速に分画することが可能である。
【０１７３】
Ｃ．増幅方法
代替抗体分子の特異性鎖の増幅方法、代替抗体集団の特異性鎖の増幅方法、および／またはリガンド結合代替抗体複合体の特異性鎖の増幅方法も提供する。増幅は、分子または分子クラスのコピーの量または数を増大させる任意のプロセスまたはプロセスの組み合わせを意味する。以下の一連の３つの反応：選択したＲＮＡのｃＤＮＡコピーの作製、各ｃＤＮＡのコピー数を増加させるためのポリメラーゼ連鎖反応の使用、および選択ＲＮＡと同一の配列を有するＲＮＡ分子を得るためのｃＤＮＡコピーの転写によってＲＮＡ分子を増幅することができる。当業者に認識されるように、当分野で公知の任意の反応または反応の組み合わせ（直接ＤＮＡ増幅および直接ＲＮＡ増幅などが含まれる）を必要に応じて使用することができる。増幅方法により、増幅混合物の比率は最初の混合物中の異なる成分配列の比率を本質的に代表するはずである。
【０１７４】
この様式では、特異性鎖集団が作製される。したがって、増幅された特異性鎖を適切な安定化鎖に接触させた場合、所望のリガンド結合親和性および／または特異性を有する代替抗体集団を形成することができる。リガンド相互作用の特異性を選択的に増大する方法および集団の結合親和性の増大方法を以下に提供する。
【０１７５】
一旦所望の代替抗体または代替抗体組が同定されると、１つまたは複数のモノクローナル代替抗体クローンのヌクレオチド配列を同定し、大量のモノクローナルまたは構築したポリクローナル代替抗体試薬のいずれかを作製することがしばしば望ましい。別の実施形態では、モノクローナル代替抗体を作製する（すなわち、捕捉する）ことができる。この実施形態では、代替抗体の捕捉方法は、増幅された特異性鎖集団から少なくとも１つの特異性鎖をクローン化するステップをさらに含む。クローン化した特異性鎖を、日常的な方法を使用して増幅し、その後第１の安定化ドメインが第１の定常領域と相互作用し、且つ第２の安定化ドメインが第２の定常領域と相互作用する条件下で適切な安定化鎖と接触させることにより、モノクローナル代替抗体集団を産生することができる。
【０１７６】
核酸配列（特異性鎖の核酸配列など）の増幅方法は公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、例示的な核酸増幅方法である。ＰＣＲ法は、例えば、Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３５０−１３５４；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３−１６６；Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：１０７６−１０７８；Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：９４３６−９４４０；ならびに米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号（参照することによりそれぞれの内容全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【０１７７】
ＰＣＲ増幅は、ｓｓＤＮＡの３’末端および５’末端に相補的な特異的オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼを使用したプライマー伸長、およびＤＮＡ変性を使用した所望の一本鎖ＤＮＡ（またはＲＮＡのｃＤＮＡコピー）の反復複製サイクルを含む。伸長によって１つのプライマーから作製された産物は、他のプライマー由来の伸長のテンプレートとして作用する。ＰＣＴ公開出願ＷＯ８９／０１０５０号に記載の関連する増幅方法には、二本鎖中間体を得るために増幅されるべき配列の上流にプロモーター配列の存在または移入が必要である。次いで、ＲＮＡポリメラーゼを使用して、中間体を含む二本鎖プロモーターの多ＲＮＡコピーを産生する。得られたＲＮＡコピーを、逆転写酵素で処理して中間体を含むさらなる二本鎖プロモーターを産生し、これらをＲＮＡポリメラーゼを使用した別の増幅ラウンドに供することができる。別の増幅方法は、特に、適切なベクターで選択されたＤＮＡまたは選択されたＲＮＡのｃＤＮＡコピーをクローン化するステップと、宿主生物にベクターを移入し、ベクターおよびクローン化ＤＮＡが複製および増幅されるステップとを含む（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：１８７４）。一般に、選択された核酸配列を忠実且つ有効に増幅する任意の手段を使用することができる。増幅後の配列の比率が増幅前の混合物中の配列の相対的比率を少なくともおおよそ反映することのみが必要である。Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：４１１０（参照することにより本明細書中に組み込まれる）も参照のこと。
【０１７８】
この方法は、任意選択的に、適切な核酸精製ステップを含み得る。
【０１７９】
一般に、特異性領域のヌクレオチドを含む代替抗体鎖を増幅することができる。一般に、この鎖中で使用される任意の保存領域もまた増幅を妨害する分子を含まない。しかし、本発明は、例えば、選択化学を介して特異性領域またはＰＣＲなどの方法による増幅に妨害し得る他の領域へのこの部分の移入を含み得る。このような代替抗体を、本発明の方法にしたがって、任意の必要な生物学的および／または化学的ステップによって産生することができる。
【０１８０】
他の実施形態では、安定化鎖および特異性鎖は、安定化鎖の増幅を防止するために適切なプライマーと組み合わせて使用することができる非相同領域を含む。この実施形態の非限定的な例を図７および実施例の実施例４に示す。簡単に述べれば、この非限定的な例では、安定化鎖および特異性鎖は、特異性ドメインに対して５’に位置する約２、３、４、５、６、８、またはそれ以上のヌクレオチドが相同性を欠く。図７の斜線のボックスを参照のこと。特異性鎖の正の鎖の増幅に使用したプライマーは、特異性鎖の配列に相補的である。しかし、ミスマッチデザインによって、このプライマーは、安定化鎖の配列に対して３’末端で相同性を欠く。この相同性の欠如により、負の全長安定化鎖の増幅が防止される。したがって、この方法により、特異性鎖が優先的に増幅される。
【０１８１】
代替抗体は核酸配列を含む安定化鎖および特異性鎖を含む場合、安定化配列、定常領域、特異性配列、および／またはスペーサー配列の線状アレイを含む各鎖（すなわち、並列代替抗体鎖）がＤＮＡ合成機によって最初に調製される。１つの実施形態では、特異的な高親和性の代替抗体試薬の捕捉および増幅のための選択プロセスにより、ＰＣＲによって特異性領域配列を含む鎖のみが優先的に増幅される。上でより詳細に概説しているように、定常ドメインと安定化ドメインとの相互作用時に適切なアラインメントが確保される適切な安定化鎖とのこれらの鎖の混合によって代替分子を構築する。一旦並列鎖が混合されると、溶液を加熱し、温度低下と共に鎖がハイブリッド形成する。他の実施形態では、代替抗体を加熱せずに形成することができる。
【０１８２】
したがって、本発明は、特異性鎖および安定化鎖を準備するステップと、ここで、前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含むことを特徴とし、前記特異性鎖を増幅するステップと、第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で前記特異性鎖を前記安定化鎖に接触させるステップとを含む、代替抗体分子の増幅方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記安定化鎖および前記特異性鎖が異なる分子を含む。
【０１８３】
Ｄ．ステージング
選択された標的分子に高親和性で特異的に結合する代替抗体エレメントの反復選択プロセスを、本明細書中で「ステージング」と命名する。ステージングは、高分子であるか免疫学的ハプテンサイズであり得る標的分子／リガンドに結合する代替抗体分子の「捕捉および増幅」を意味する用語である。所望の代替抗体のこの同定が可能な種々の方法でステージングプロセスを修正することができる。例えば、「特異性の増大」により捕捉された集団から無関係または望ましくない代替抗体分子の数を排除または減少させるステップを使用することができる。さらに、「親和性を増大」させ、それにより標的リガンドに対して高親和性の代替抗体分子を選択することが可能である。ステージングプロセスは、標的分子／リガンドに対して高い親和性および特異性を有する代替抗体の迅速な単離および増幅に特に有用である。例えば、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：４４１０を参照のこと。
【０１８４】
Ｖ．代替抗体またはその集団の結合特異性の増大方法
特異的結合は、場合によって定義される用語である。所与の代替抗体分子と所与の標的との間の所与の相互作用の文脈で、代替抗体の標的との優先的結合相互作用が代替抗体と無関係および／または望ましくない標的との間に認められる相互作用よりも高い場合に結合特異性が増大した。本明細書中に記載の代替抗体分子を、特異的分子を捕捉、単離、および増幅するための「ステージング」プロセスを使用して必要に応じて特異的に選択することができる。
【０１８５】
したがって、本発明は、ａ）非特異的部分結合代替抗体複合体集団を形成する条件下で目的のリガンドに結合することができる代替抗体分子集団を非特異的部分に接触させるステップと、ここで、前記代替抗体集団の代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
ここで、前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含むことを特徴とし、
ｂ）前記非結合代替抗体分子集団から前記非特異的部分および前記非特異的部分結合代替抗体複合体集団を分配するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）の前記非結合代替抗体複合体集団の少なくとも１つの特異性鎖を増幅するステップと
を含む、代替抗体の結合特異性を増大する方法をさらに提供する。
【０１８６】
さらなる実施形態では、結合親和性の増大方法は、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下でステップ（ｃ）の特異性鎖集団を安定化鎖と接触させるステップをさらに含む。
【０１８７】
さらなる実施形態では、代替抗体集団は、代替抗体のライブラリーおよび／または選択された抗体集団を含む。他の実施形態では、安定化鎖および特異性鎖は、異なる分子を含む。
【０１８８】
この実施形態では、非特異的部分結合代替抗体複合体集団を形成する条件下での代替抗体集団の非特異性部分との接触によって代替抗体集団の結合特異性を増大する。この様式では、標的リガンドおよび種々の非特異的部分の両方と相互作用する代替抗体を、所望のリガンドに対してより高い特異性レベルを有する代替抗体集団から分配することができる。
【０１８９】
「非特異的部分」は、所望の標的リガンドではない任意の分子、細胞、生物、ウイルス、化合物、ヌクレオチド、またはポリペプチドを意図する。産生される所望の代替抗体集団に依存して、当業者は、使用すべき最も適切な非特異的部分を認識する。例えば、所望の標的がプロテインＹと９５％の配列が同一のプロテインＸである場合、プロテインＸに対する代替抗体集団の結合特異性を、非特異的部分としてプロテインＹを使用して増大させることができる。この方法では、プロテインＸに対する相互作用が増大した代替抗体集団を産生することができる。例えば、Ｇｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：５５０９−５５１６およびＪｅｌｌｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１２２７−１１２３１を参照のこと。
【０１９０】
ＶＩ．代替抗体またはその集団の結合親和性を増大する方法
結合親和性は、代替抗体とリガンドとの間の結合相互作用の強度を説明する用語である。結合親和性の増大により、標的リガンドと代替抗体との間の結合相互作用が増大する。代替抗体と標的リガンドとの間の相互作用の結合親和性は、代替抗体が達成することができる検出感度に直接相関する。実際の適用において結合親和性を評価するために、結合反応条件は意図する用途の条件に匹敵しなければならない。最も正確な比較のために、溶液中およびその意図する適用の条件下での代替抗体と標的リガンドとの間の相互作用を反映する測定を行う。
【０１９１】
したがって、本発明は、ａ）リガンド結合代替抗体複合体集団を形成するストリンジェントな条件下でリガンドを代替抗体分子集団に接触させるステップと、ここで、
前記代替抗体集団の代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が前記第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび前記第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含むことを特徴とし、
ｂ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団から前記リガンドおよび前記代替抗体分子集団を分配するステップと、
ｃ）前記リガンド結合代替抗体複合体集団の特異性鎖を増幅するステップと
を含む、代替抗体の結合親和性を増大する方法を提供する。
【０１９２】
さらなる実施形態では、結合親和性を増大する方法は、前記第１の安定化ドメインが前記第１の定常領域と相互作用し、且つ前記第２の安定化ドメインが前記第２の定常領域と相互作用する条件下で上記のステップ（ｃ）の特異性鎖集団を安定化鎖に接触させるステップをさらに含む。
【０１９３】
さらなる実施形態では、代替抗体集団は、代替抗体のライブラリーおよび／または選択された代替抗体集団を含む。他の実施形態では、安定化鎖および特異性鎖は異なる分子を含む。
【０１９４】
この実施形態では、リガンド結合代替抗体複合体集団を形成するストリンジェントな条件下での所望のリガンドと代替抗体分子集団との接触により、所望のリガンドに対する結合親和性が増大した代替抗体を選択可能である。「ストリンジェントな条件」は、所望のリガンドと代替抗体集団との相互作用にストレスを与える任意の条件を意図する。このような条件は、目的のリガンドおよび代替抗体とリガンドが相互作用する好ましい条件に依存して変化する。選択されたストリンジェントな条件は代替抗体構造の形成に寄与すると認識される。このようなストリンジェントな条件の例には、浸透圧、ｐＨ、溶媒（有機または無機）、温度、界面活性剤、またはその任意の組み合わせの変化が含まれる。ストリンジェントな条件を得ることができるさらなる成分には、疎水性結合、水素結合、静電気、およびファンデルワールス相互作用を和らげる（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）成分が含まれる。例えば、１０％メタノールまたはエタノールは疎水性結合を和らげ、水溶性である。
【０１９５】
条件のストリンジェンシーを、代替抗体：リガンド比によって操作することもできる。代替抗体の増加または標的リガンドの減少によってこれを増大させることができる。例えば、Ｉｒｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２２：７３９−７６１を参照のこと。結合条件のストリンジェンシーを増大させるためのさらなる変化には、塩濃度、結合平衡時間、結合緩衝液の希釈、ならびに洗浄の量および組成の変化が含まれる。条件のストリンジェンシーは、総集団の１％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９９％の抗体の減少に十分である。
【０１９６】
さらに他の実施形態では、所望のリガンド結合特異性を有するモノクローナル代替抗体の同定および単離後、当業者は、特異性領域の変異誘発およびより強固な結合変異体のスクリーニングによって所望する目的のために分子の親和性をさらに増大させることができる。例えば、Ｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９７：１３７２０−１３７２５を参照のこと。
【０１９７】
［使用方法］
上で考察されるように、本明細書中に記載の代替抗体および代替抗体の種々の集団（すなわち、ライブラリー、選択された集団、ポリクローナル集団、およびモノクローナル代替抗体集団）は所望のリガンドと相互作用する。したがって、リガンド結合代替抗体を使用して、試験への適用、薬学的適用、および研究への適用において従来の抗体と置換することができる。そのループサイズ、結合ループ数、高次構造、安定化鎖、およびヌクレオチドの化学的性質に導入することができる修飾により、従来の抗体より多数結合する。したがって、本発明の代替抗体を、リガンド活性の調整方法を含む種々の方法で使用することができる。リガンドと相互作用するタンパク質または他の分子の単離方法も提供する。
【０１９８】
本明細書中で使用される、「リガンド」は、沈降アッセイ、綿状沈殿、凝集、または免疫アッセイの標的抗原などの他の分子と複合体を形成する任意の分子であることが意図される。したがって、リガンドには、イオン、分子、またはより大きな複合体を形成するために別の化合物と結合する分子群が含まれる。上記の種々の方法では、１つを超える標的リガンドを使用して開始ライブラリーまたは集団から複数の代替抗体を同時に捕捉するか、抗体集団の結合特異性を増大させることができることが認識される。リガンドは、その代替抗体結合親和性において互いに異なり、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、またはアロステリックモジュレーターとして作用することができる。
【０１９９】
したがって、リガンドは、代替抗体と相互作用する任意の所望の分子を含む。標的分子またはリガンドは、細胞および／またはその成分であり得る。種々の表現型および病理学的条件（癌表現型など）を有する目的の任意の発生段階での目的の任意の細胞型を使用することができる。目的の細胞には、原核細胞または真核細胞（上皮細胞、筋細胞、分泌細胞、悪性細胞、赤血球、および白血球など）がさらに含まれる。目的の他のリガンドには、有毒環境化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、天然および合成ポリマー、炭水化物、多糖類、ムコ多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、エフェクター、酵素、抗原、抗体、細菌およびその成分（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｍｅｄｉａｓｉａｔｉｃａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｎｏｖｉｃｉｄａ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓが含まれる）、ウイルス、原生動物、プリオン、基質、代謝産物、小分子、薬物、麻薬、毒素、遷移状態のアナログ、補因子、インヒビター、色素、栄養素、成長因子、固有の細胞表面決定基、または細胞内マーカーなどが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに制限されない。リガンドには、さらに、免疫ハプテン、ポリ塩化ビフェニルなどの有毒環境化合物、乱用物質、治療薬、およびチロキシンが含まれ得る。さらなる目的のリガンドには、腫瘍中でそのレベルが変化する分子（すなわち、成長因子受容体、細胞周期レギュレーター、脈管形成因子、およびシグナル伝達因子）が含まれる。したがって、本発明の代替抗体分子を、任意の目的のリガンドの検出のために産生することができる。
【０２００】
例えば、代替抗体分子を使用して、タンパク質（核酸結合タンパク質およびその生物学的機能の一部として核酸に結合することが知られていないタンパク質が含まれる）を結合することができる。核酸結合タンパク質には、特に、ポリメラーゼおよび逆転写酵素が含まれる。代替抗体分子を使用して、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド補因子、および構造的に関連する分子を結合することもできる。
【０２０１】
「エピトープ」または「決定基」は、天然の抗体分子が結合するリガンド上の部位である。抗体結合溝の次元によってエピトープサイズは制限され、約４アミノ酸または６グルコース分子までのサイズの分子が適合し得る。天然抗体の結合部位の次元により、比較的小さいサイズの固有の特徴（エピトープ）が認識される。これらは、この結合部位の制限外に存在し得る特徴を同定することは不可能である（図４を参照のこと）。
【０２０２】
さらに、代替抗体を使用して、複数の化合物または生物を同時に検出することができ、多パラメータ検出および定量のためのアレイのプロファイリングで使用することができる。これらを使用して、関連化合物（例えば、ＰＣＢ同族体）または環境もしくは健康に悪影響を与える異なる化合物（例えば、ＰＣＢ、ダイオキシン、多環芳香族炭化水素）を検出するための環境試験アレイを調製することができる。原核細胞（例えば、細菌）、ウイルス、真核細胞（例えば、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、感覚細胞、分泌細胞、悪性細胞、赤血球、リンパ球、幹細胞、原生動物、真菌）の表面上または内部で見出される正常、異常、または固有の成分に結合するように代替抗体を開発することができる。これらを使用して、腫瘍結合抗原、癌細胞、または特異的疾患細胞に結合する固有の構造もしくは化合物を同定および検出することができる。
【０２０３】
サイズ、複雑性、宿主に対する外来性、または宿主中の遺伝子の制限によって免疫応答を刺激しないリガンドに対する代替抗体分子を産生することができる。抗体産生生物または細胞培養物に有毒な化合物に対する代替抗体分子を産生することができる。
【０２０４】
任意の分子または分子の集団を使用して、分子と相互作用する代替抗体を開発することができる。実際、代替抗体分子の産生基準は、標的リガンド−代替抗体複合体が非複合体形成代替抗体分子と異なる物理化学的特徴を前提とするという点である。その例は、非複合体形成代替抗体分子のサイズと比較した代替抗体リガンド複合体のサイズの増大および遊離物から結合物を分離するためのサイズ排除濾過の使用である。この例では、代替抗体分子に結合した場合に濾過膜の多孔度によって保持されるが、非複合体形成代替抗体分子は濾過物となるリガンドに対する代替抗体分子を産生する。
【０２０５】
Ｉ．リガンドの検出方法
リガンドの検出方法を提供する。１つの実施形態では、リガンドの検出方法は、
ａ）リガンド結合代替抗体複合体を形成する条件下でリガンドを代替抗体分子に接触させるステップと、ここで、前記代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、
ここで、前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、
前記安定化鎖が第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含むことを特徴とし、
ｂ）前記リガンドを検出するステップと
を含む。
【０２０６】
リガンド結合代替抗体を形成する接触方法および条件を、本明細書中で考察している。当業者は、特異的反応条件が反応の化学的性質および実験デザインに依存して変化することを認識する。
【０２０７】
「検出」は、リガンド結合代替抗体複合体の同定を意図する。検出方法は制限されず、定性的または定量的であり得る。上で詳細に考察される用に、リガンド結合代替抗体複合体の検出を補助する種々の機能的部分（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素、または放射性標識、フルオロフォア、化学発光物質などが含まれる）を代替抗体に直接結合することができる。例えば、ＲＮＡ／タンパク質相互作用の検出が記載されているＭａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：４９６１−４９６５を参照のこと。
【０２０８】
あるいは、２部位結合アッセイを使用してリガンドを検出することができる。この実施形態では、リガンド−代替抗体複合体を第２の「検出」分子に結合する。このようなサンドイッチアッセイ型は、当分野で公知である。例えば、アルカリホスファターゼにコンジュゲートしたＦａｂフラグメントを使用して核酸分子の５’末端に結合したフルオレセインを検出したＤｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１０２１−５を参照のこと。Ｊｅｎｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  ８：２６５−７９およびＢｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−６も参照のこと。
【０２０９】
リガンド結合代替抗体複合体の形成前に、代替抗体（例えば、非選択ライブラリーまたは種々の他の集団型）を、代替抗体分子の迅速な捕捉および増幅の促進または結合したリガンドの同定（例えば、高処理薬の発見）のための固体マトリクス（プラスチックまたはガラスプレート、チューブ、膜、またはセンサーチップなど）上の複数の位置に固定することができる。Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０：１０８４−６を参照のこと。リガンドを含む溶液をこれに添加する。
【０２１０】
あるいは、代替抗体およびリガンドを溶液中で混合し、リガンド結合代替抗体複合体を形成することができる。検出前に、リガンド結合代替抗体複合体を、他の夾雑物から分離することができる。例えば、遠心分離およびアフィニティクロマトグラフィを使用することができる。分離は必ず必要というわけではない。アプタマー（ａｐａｔｍｅｒ）−色素コンジュゲート体が事前の固定および洗浄を必要とせずに溶液中のリガンドの存在を直接示すことができることを証明したＪｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉ．１２２：２４６９も参照のこと。例えば、結合溝中のフルオロフォア修飾ヌクレオチドをリガンド結合時に消光することができる。この技術を使用して、リガンド結合に関与する特異性領域の重大な残渣を同定することもできる。
【０２１１】
代替抗体分子を、標的リガンドまたは標的リガンドのコンジュゲート形態に結合した代替抗体をリガンドまたは標的リガンドのコンジュゲート形態に結合していない代替抗体から分離するために使用した１つまたは複数の洗浄ステップを含む異種結合アッセイを使用したリガンドの検出、同定、および／または定量に使用する結合アッセイで使用することができる。例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：３３８−４６およびＴｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：４９−５３を参照のこと。
【０２１２】
代替抗体分子を、標的リガンドまたは標的リガンドの縫合形態への代替抗体分子結合の結果として産生されたシグナルの調整を含む同種の結合アッセイを使用したリガンドの検出、同定、および／または定量に使用する結合アッセイで使用することができる。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４４：８６−９１；Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ２７２：６４５−６４；Ｈｓｉｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ３：１０４６−５０；Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０３−８およびＴｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：４９−５３およびＦａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３：５７５２−７を参照のこと。
【０２１３】
したがって、代替抗体分子は、高処理アッセイの開発、癌および他のマーカー（すなわち、種々の病態に関連するマーカー）の同定、ならびに免疫抗原およびハプテンの検出を容易にすることができる。代替抗体を、従来の抗体ベースの免疫アッセイにおける抗体として同一または類似の様式で使用することができる。
【０２１４】
代替抗体を使用して、疾患（例えば、癌）の新規の診断マーカーを同定することができ、癌細胞上または癌細胞内の固有の因子に対する代替抗体分子（すなわち、モノクローナル抗体集団または代替抗体もしくはポリクローナル抗体の選択された集団）が作製される。このような代替抗体分子を、レポーター分子（例えば、ＦＩＴＣ）で標識し、異なる個体の癌細胞上の検出された因子の罹患率を同定することができる。このようなマーカーの検出率をデータベースに記録することができる。投与方法を、本明細書中で考察する。
【０２１５】
特定の実施形態では、細胞、組織、器官、または器官系内でリガンドを検出する。
【０２１６】
リガンドをインビボまたはインビトロのいずれかで検出することができると認識される。例えば、その内部または表面上に目的のリガンドを含む組織、細胞、または器官系を、適切な代替抗体とインビトロで接触させることができる。次いで、リガンド結合代替抗体複合体を検出することができる。したがって、１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の代替抗体または代替抗体集団を含む薬学的組成物に関する。
【０２１７】
別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の代替抗体または代替抗体集団を含む薬学的組成物に関する。１つの方法では、このような組成物を、例えば、リガンドレベルの増加または減少によって特徴付けられる病態のインビボ検出に使用することができる。この方法では、特定の病態で濃度が増減されるリガンドに対する結合特異性を有する有効量の代替抗体を被験体に投与する。リガンド結合代替抗体の形成を検出する。
【０２１８】
用語「病態」は、この用語が当分野で一般的に使用されるように、異常または疾患をいう。このような病態の非限定的リストは、癌、関節炎、敗血症、心筋の不整脈および梗塞、ウイルスおよび細菌感染、自己免疫疾患、およびプリオン疾患を含む。
【０２１９】
ＩＩ．活性の調整方法
リガンド活性を調整する方法をさらに提供する。「調整」は、特定の特徴、質、活性、物質、または応答の増減を意図する。
【０２２０】
１つの実施形態では、リガンドの活性を調整する方法は、リガンド結合代替抗体複合体を形成する条件下でリガンドを代替抗体分子に接触させるステップと、ここで、前記代替抗体の代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含み、ここで、ａ）前記特異性鎖が第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含み、ｂ）前記安定化鎖が第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含むことを特徴とする。リガンドと代替抗体分子との相互作用によりリガンドの活性が調整されるか、リガンドにコンジュゲートした分子の活性が調整される。この実施形態では、有効濃度の代替抗体を使用して、リガンド活性を望ましく調整することが可能である。別の実施形態では、特異性鎖および安定化鎖は異なる分子を含む。
【０２２１】
インビボまたはインビトロのいずれかで調整することができると認識される。さらに、細胞、組織、器官、または器官系にリガンドを含めることができる。代替抗体分子がリガンド活性を調整する能力のアッセイ方法は、当分野で公知である（すなわち、フルオロフォア偏光アッセイ、干渉および相補性アッセイ、酵素または基質活性の干渉、または光屈折性の変化）。さらに、相互作用をインビトロでモニターし、リガンド活性をアッセイすることができる。あるいは、リガンド活性の調整を、インビボでアッセイすることができる。
【０２２２】
本方法によって種々のリガンド（例えば、受容体、エフェクター、酵素、ホルモン、輸送タンパク質、無機分子、有機分子、ウイルス、細菌、原生生物、またはプリオンが含まれる）の活性を調整することができる。リガンド活性の調整についてのアッセイ方法は、リガンドに依存して変化する。当業者は、アッセイによりリガンド活性を直接測定することができるか、あるいは細胞、組織、または器官の表現型を変化させることができることをさらに認識する。したがって、リガンドは、細胞、組織、器官、または器官系の表面上またはこれらの内部に存在する。
【０２２３】
したがって、１つの実施形態では、代替抗体試薬を使用して、標的分子の機能を調整することができる。１つの実施形態では、特定の受容体に結合した代替抗体分子は、アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト、部分的アゴニスト、またはアロステリックモジュレーターとして機能する。さらに、代替抗体は、ミノタイプ（ｍｉｍｏｔｙｐｅ）として作用することができる（米国特許第５，８７４，５６３号を参照のこと）。標的分子が酵素である場合、代替抗体分子を使用して、酵素活性を阻害または増大させることができる。
【０２２４】
１つの実施形態では、目的のリガンドとの直接的相互作用または目的のリガンドとの相互作用後に起こる免疫応答の間接的調整のいずれかによって免疫応答を調整する。
【０２２５】
別の実施形態では、エピトープの結合およびアポトーシスの促進または創薬のための固有のエピトープの同定のために、代替抗体を使用して疾患細胞を「パニングする（ｐａｎ）」。さらに、アポトーシス性エピトープを、インビトロでの迅速な創薬でも使用する。したがって、代替抗体は、アポトーシス性エピトープの活性の調整およびそれによる細胞死の調整（すなわち、増大または遅延）で適用される。
【０２２６】
ＩＩＩ．薬剤の送達方法
本発明の代替抗体分子は、単、二重、または多機能性分子であり得る。１つの実施形態では、代替抗体は、輸送および送達媒介物として機能する。したがって、さらに、目的の薬剤の送達方法を提供する。「薬剤」は任意の補助分子を意図するので、上記の種々の機能的部分（例えば、結合アッセイで使用した場合に代替抗体の検出能力を増幅することができる「レポーター」分子、特定の部位に送達される「治療」分子、または広範なリガンドの結合を促進する「結合分子」が含まれる）を含む。例えば、化学修飾プライマーを使用するか、直接化学的方法によるか、安定化鎖または特異性鎖中に組み込まれた「結合分子」（親和性タグ）との複合体形成によって「レポーター」分子を添加することができる。
【０２２７】
したがって、本発明は、リガンド結合代替抗体複合体集団を形成する条件下でリガンドを代替抗体分子に接触させるステップと、前記代替抗体集団の代替抗体分子が特異性鎖および安定化鎖を含むこととを含む、薬剤の送達方法を提供する。代替抗体は、第１の定常領域および第２の定常領域に隣接する特異性領域を有する核酸配列を含む特異性鎖を含み、安定化鎖は第１の定常領域と相互作用する第１の安定化ドメインおよび第２の定常領域と相互作用する第２の安定化ドメインを含む。代替抗体は、さらに、目的の薬剤に結合しているかこれを含んでいる。
【０２２８】
治療薬には、例えば、癌、関節炎、敗血症、心筋の不整脈および梗塞、ウイルスおよび細菌感染、自己免疫疾患、およびプリオン疾患の治療用に開発した薬学的化合物が含まれる。この様式では、同一または異なる薬剤であり得る１つまたは複数の治療薬と複合体形成した場合、代替抗体を治療ターゲティング薬として使用することができる。
【０２２９】
特定の障害の治療のために目的の薬剤が送達された場合、特定の障害のために治療薬を選択することができる。例えば、代替抗体が特定の腫瘍部位での腫瘍細胞上に見出される固有の腫瘍抗原にターゲティングされる場合、その部位への特異的送達および正常な組織に対する付随的病変を最小化または排除するために、抗腫瘍薬に代替抗体をコンジュゲートすることができる。薬剤を、代替分子によって認識され、且つ腫瘍部位で特異的に見出される特異的標的リガンドに送達することができる。
【０２３０】
治療薬は、代替抗体に結合することができる事実上任意の型の抗腫瘍または抗脈管形成化合物（すなわち、腫瘍への血管の供給を破壊する薬剤）（例として、細胞毒素、インターロイキン、化学走性因子、放射性ヌクレオチド、メトトレキセート、シスプラチン、アナストロゾール／Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）、およびタモキシフェンなどの合成または天然の化合物が含まれ得る）であり得る。さらなる薬剤には、リシンもしくはジフテリア毒素、真菌由来のカリケアミシン、メイタンシノイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、およびリボソーム相互作用タンパク質などの生物毒素が含まれる。例えば、Ｂｕｓｃｈｓｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５：Ｇｒａｓｓｂａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ７９：５７６−８３；Ｂａｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：２２００−５；Ｐｅｎｉｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８：９１−１０１；Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：３３３６−３３４２；Ｔｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｔｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８：５７９−５８４；およびＴａｚｚａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：４２２２−４２２９を参照のこと。
【０２３１】
あるいは、治療薬はプロドラッグを含み得る。特異的標的へのその局在化後、薬物をプロドラッグにした非毒性分子を注射する。例えば、Ｓｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ２２：３４１−９を参照のこと。
【０２３２】
１つの実施形態では、現在治療薬を送達するために使用されている天然の抗体分子または抗体フラグメントのタンパク質組成物と対照的に、核酸組成物を有する代替抗体分子は、有意に免疫原性が低く、免疫応答の誘発によって患者から排除されないようである。安定化ドメインのペプチドから構成される安定化鎖を有する代替抗体もまた、配列のヒト化および／または安定化ドメインの形成に必要なペプチドサイズの減少によって免疫原性が低くなり得るとさらに認識される。
【０２３３】
したがって、本発明の１つの実施形態は、代替抗体分子とその標的リガンドとの相互作用による所望の位置への薬剤の方向付けを提供する。１つの実施形態では、薬剤の送達方法は、リガンド結合代替抗体複合体を形成する条件下でリガンドを代替抗体分子に接触させ、それにより結合した治療薬を所望の標的部位（すなわち、病変部位）に送達させるステップを含む。このような代替抗体分子を、修飾しないかヌクレアーゼ妨害塩基で修飾するか、本明細書中で考察されている任意の種々の構造によって使用することができる。
【０２３４】
１つの実施形態では、代替抗体に結合した薬剤は、抗菌活性を有する分子を含む。「抗菌活性」は、任意の微生物の成長を阻害または減少させる能力および／または微生物集団中の微生物数を減少させる能力を意図する。「微生物」は、細菌、ウイルス、真菌、または寄生虫を意図し、したがって、抗菌活性を有する薬剤は、抗細菌活性、抗真菌活性、および／または抗ウイルス活性を有する。
【０２３５】
「抗細菌活性」は、任意の細菌の成長を阻害または減少させる能力および／または細菌集団中の生存細菌数を減少させる能力を意図する。薬剤は、グラム陽性抗細菌薬、グラム陰性抗細菌薬、または雄性特異的抗細菌薬であり得る。「抗ウイルス活性」は、任意のウイルスまたはウイルス感染細胞の成長を阻害または減少させる能力および／または集団中の生存ウイルス粒子またはウイルス感染細胞集団を減少させる能力を意図する。用語「抗真菌活性」は、真菌の成長を阻害または減少させる能力を意図する。抗菌薬は当分野で公知であり、種々のケモカイン、サイトカイン、抗菌ポリペプチド（すなわち、抗細菌、抗ウイルス、および抗真菌ポリペプチド）、抗生物質、ＬＰＳ、補体アクチベーター、ＣｐＧ配列、および抗菌活性を有する種々の他の薬剤が含まれる。抗菌薬の例を、以下でさらに詳細に考察する。
【０２３６】
したがって、１つの実施形態では、本発明は、抗菌薬に共有結合した代替抗体を提供する。本明細書中に記載の種々の方法を使用して、特定の標的リガンド（すなわち、標的微生物のエピトープ）に結合するように抗体をデザインすることができる。次いで、代替抗体／抗菌複合体を、抗菌薬を微生物に送達するための手段として使用することができる。組成物は、組織培養物を含む種々のサンプルで抗菌力価を減少させる方法としてインビトロで適用される。したがって、代替抗体分子を、組織培養での微生物の過剰成長を予防するためのインビトロ細胞培養物用の添加物として使用することができる。さらに、組成物は、必要な被験体に投与した場合に被験体中に含まれる微生物の成長を阻害または減少させ、そして／または被験体中の微生物集団を減少させる治療薬として適用される。
【０２３７】
ケモカインは、本発明の方法および組成物で使用することができる抗菌薬の１つのクラスを含む。ＣＣケモカイン（すなわち、ＭＣＰ−１（ＳｗｉｓｓＰｒｏアクセッション番号Ｐ１３５００および米国特許第６，１３２，９８７号））およびＣＸＣケモカイン（すなわち、ＩＬ８（ＳｗｉｓｓＰｒｏアクセッション番号Ｐ１０１４５））、ＩＰ−１０（ＳｗｉｓｓＰｒｏアクセッション番号Ｐ０２７７８）を含む複数のクラスが存在する。さらに、目的の別のケモカイン中のグラヌリシン（ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ）。このポリペプチドは細胞傷害性Ｔリンパ球およびナチュラルキラー細胞によって産生され、グラム陽性およびグラム陰性細菌、寄生虫、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む広範な微生物に活性である。グラヌリシンの活性変異型およびフラグメントが公知である。例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｒｕｇｓ  １０：３２１−９およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２５：３５５−６５、米国特許第４，９９４，３６９号、同第６，４８５，９２８号、およびＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏｓ．Ｘ０５０４４、Ｘ０５０４４、およびＸ５４１１０１（その全てが参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。
【０２３８】
サイトカインは、本発明の方法および組成物で使用することができる別の抗菌ポリペプチドクラスを含む。抗菌活性を有する複数のサイトカインは当分野で公知であり、ＴＮＦ−α、リンホトキシン（ＬＴおよびＴＮＦ−β）、ＩＦＮ−γ、インターロイキン１２などが含まれる。
【０２３９】
抗生物質は、本発明の方法および組成物で使用することができるさらに別の抗菌ポリペプチドクラスを含む。目的の抗生物質には、ペニシリン（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリンなど）；セファロスポリン（例えば、セファクロール、セファゾリン、セフロキシム、モキサラクタムなど）；カルバペネム；モノバクタム；アミノグリコシド；テトラサイクリン；マクロライド；リンコマイシン；ポリミキシン；スルホンアミド；キノロン；クロラムフェニコール；メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン；ゲンタマイシン；およびシプロフロキサシンＨＣＬなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
さらなる抗菌薬には、グラム陽性抗細菌薬（例えば、ガリデルミン（ｇａｌｌｉｄｅｒｍｉｎ）タンパク質ファミリーのメンバーが含まれる）が含まれる（ＩｎｔｅｒＰｒｏアクセッション番号ＩＰＲ００６０７８）。このようなポリペプチドには、グラム陽性細菌由来の非常に修飾されたバクテリオシン様ペプチドであるランチバイオティック（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）が含まれる。ランチバイオティックＡ型には、ニシン（ＩｎｔｅｒＰｒｏアクセッション番号ＩＰＲ０００４４６、Ｐ１３０６８、Ｐ１０９４６、およびＫｕｉｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４３４０−２４３４６）、サブチリン、エピデルミン、ガリデルミン（ＩＰＲアクセッション番号００６０７８およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｏ６８５８６、Ｐ０８１３６、およびＰ２１８３８）およびＰｅｐ５が含まれる。これらのペプチドは、強いカチオン性且つ殺菌性を示す。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｏ６８５８６、Ｐ０８１３６、Ｐ２１８３８、およびＢｕｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１６２６０−１６２６６、およびＦｒｅｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３１：８０３−８１１を参照のこと。これらの各引例は、参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【０２４１】
多数の他の抗菌ペプチドファミリーが公知である。例えば、アタシンポリペプチドファミリーは、ＰＦＡＭアクセッション番号ＰＦ０３７６９およびＰＦ０３７６８に記載の保存シグニチャー配列（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有し、アタシンおよびサルコトシキンなどのポリペプチドが含まれる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１５１２ＡＲＴＴＢ＿ＨＹＡＣＥ、Ｐ０１５１３ＡＴＴＥ＿ＨＹＡＣＥ、Ｐ１０８３６ＤＩＰＡ＿ＰＲＯＴＥ、Ｐ１４６６７ＳＲ２＿ＳＡＲＰＥ、およびＨｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：４−１０を参照のこと。ジプテリシンは、別のクラスの抗菌タンパク質である。これらのポリペプチドは、アタシンファミリーといくらか類似している。ジプテリシン型ポリペプチドは、Ｐ．ｔｅｒｒａｎｏｖａｅおよびＳ．ｐｅｒｅｇｉｎａ（Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８７：５７３−５７８）およびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離されている。活性変異型と共に保存領域も公知である。例えば、Ｏｔｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ  ６：４９７−５１１を参照のこと。
【０２４２】
セクロピンは、さらに別の強力な抗菌タンパク質クラスである。例えば、Ｂｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｅｒｏｂｉｏｌ．４１：１０３−１２６、Ｂｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６５：２０５−２０７、Ｂｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１：２３−３１、Ｂｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１：２３−３１、およびＳｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：２４６−２４８を参照のこと。セクロピンは、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の両方に活性な約３５アミノ酸残基の小タンパク質である。セクロピア以外の昆虫から単離したセクロピンは、バクテリシジン、レピドプテラン、サルコトキシンなどを含む種々の名称が与えられている。これら全てのペプチドは構造的に関連し、セクロピンファミリーシグニチャーを含む（ＰＦＡＭアクセッション番号ＰＦ００２７２を参照のこと）。ファミリーのメンバーには、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９４５５７  ＣＥＣ１ＤＲＯＶ１、Ｈｙｐａｎｔｒｉａ  ｃｕｎｅａ由来のＰ５０７２０  ＣＥ３Ｄ＿ＨＹＰＣＵ、Ｂｏｍｂｙｚ  ｍｏｒｉ由来のＱ２７２３９  ＣＥＣＡ＿ＢＯＭＭＯ、ブタ由来のＰ１４６６７  ＣＥＣ１＿ＰＩＧ、およびＳａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ由来のＰ０８３７７  ＳＲ１Ｃ＿ＳＡＲＰＥが含まれる。これらの各引例は、参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【０２４３】
デフェンシンは、主にグラム陽性細菌に活性なシステインリッチで抗菌性のペプチドファミリーである。これらのペプチドの多数は、アミノ酸長の範囲が３８から５１までであり、全て鎖内ジスルフィド結合に関与する６つの保存システインを含む。例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２６２−２６６、Ｋｅｐｐｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２６２−２６６、Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１３３３−１１３３７、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９１：２７５−２７９、Ｂｕｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２４５２０−２４５２５、Ｂｕｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０９：９７７−９８４（１９９２）、Ｈａｎｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２６９：４１３−４２０、Ｃｏｃｉａｎｃｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９４：１７−２２、Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５６：９４−１０３、Ｃｏｃｉａｎｃｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３００：５６７−５７５、Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １３：４１１−４１５、Ｄｉｍａｒｃｑ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２１：２０１−２０９、およびＬｏｗｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：８６７−８７３を参照のこと。節足動物デフェンシンの例には、ミツバチのローヤルゼリー由来のＰ１７７２２  ＤＥＦＩ＿ＡＰＩＭＥ（ロイヤリシン）、ニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）由来のＰ３１５２９  ＳＡＰＢ＿ＳＡＲＰＥサペシンＢ、ニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）由来のＰ１８３１３  ＳＡＰＥ＿ＳＡＲＰＥサペシン、Ｌｅｉｕｒｕｓ  ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｎｔｕｓ  ｈｅｂｒａｅｕｓ由来のＰ４１９６５  ＤＥＦ４＿ＬＥＩＱＨ４Ｋｄデフェンシン、Ａｅｓｃｈｎａ  ｃｙａｎｅａの幼虫由来のＰ８０１５４  ＤＥＦＩ＿ＡＥＳＣＹデフェンシン、クロバエ（Ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｉｍｉａ  ｔｅｒｒａｅｎｏｖａｅ）由来のＰ１０８９１  ＤＥＦＩ＿ＰＲＯＴＥホルミシンＡおよびＢ、Ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｓ  ａｐｔｅｒｕｓ由来のＰ３７３６４  ＤＥＦＩ＿ＰＹＲＡＰ：デフェンシン、ニクバエ（Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ  ｐｅｒｅｇｒｉｎａ）由来のＰ３１５３０  ＳＡＰＣ＿ＳＡＲＰＥサペシンＣ、ならびにＺｏｐｈｏｂａｓ  ａｔｒａｔｕｓ由来のＰ８００３３  ＤＥＦＡ＿ＺＯＰＡＴ抗細菌ペプチドＢおよびＣが含まれるが、これらに限定されない。これらの各引例は、参照することにより本明細書中に組み込まれる。いくつかの哺乳動物の定義も公知である。例えば、Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：２３９６−２４０１を参照のこと。
【０２４４】
ドロソシン（ｄｒｏｓｏｃｉｎ）は、別の抗菌ポリペプチドファミリーである。このファミリーのメンバーは同定されており、Ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｓ  ａｐｔｅｒｕｓ由来のピロコリシン（ｐｙｒｒｈｏｃｏｒｉｃｉｎ）（Ｃｏｃｌａｎｃｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３００：５６７−５７５）、ミツバチ由来のアピダセイン（ａｐｉｄａｃｅｉｎ）（Ｃａｓｔｅｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：２３８７−２３９１）（以下で考察）、Ｍｙｒｍｅｃｉａ  ｇｕｌｏｓａ由来のフォルマエシン（ｆｏｒｍａｅｃｉｎ）（Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７６９−７７４）が含まれる。他のメンバーには、アバエシン（ａｂａｅｃｉｎ）（Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３１０：６５１−６５６）およびレボシン（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３８：７９６−７７４）が含まれる。このファミリーの保存ドメインおよび機能的変異型が公知である。例えば、Ｏｔｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ  ６：４９７−５１１、Ｏｔｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５９：１１３８−５０、およびＧｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  ８：７６３−７８を参照のこと。アピダエシンは、ミツバチで見出された抗細菌タンパク質の別のファミリーであり、ＰＦＡＭアクセッション番号００８８０７のシグニチャー配列を有する。これらのポリペプチドは、いくつかのヒト病原体に対して抗細菌活性を有する（Ｃａｓｔｅｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ  ８：２３８７−２３９１）。このファミリーのメンバーには、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ３５５８１  ＡＰ２２＿ＡＰＩＭＥが含まれる。
【０２４５】
カセリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）は、抗菌ポリペプチドファミリーであり、ＰＦＡＭアクセッション番号０００６６６のシグニチャー配列を有する。ファミリーの多数のメンバーは、活性化時の好中球によって分泌される。例えば、Ｚａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ  ３７４：１−５を参照のこと。このファミリーのメンバーには、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２６２０２（ウサギｐ１５）、Ｐ８００５４（ブタ抗細菌ペプチドＰＲ−３９）、Ｐ５４２２８（ウシ脊髄抗細菌ペプチドＢＭＡＰ−２７、Ｐ３３０４６ウシインドリシジン（ｉｎｄｏｌｉｃｉｄｉｎ）、トリプトファンリッチ強力抗生物質、Ｐ４９９１３（ヒトＦＡＬＬ−３９（またはＬＬ−３７）抗細菌ＬＰＳ結合ペプチド）、Ｐ１９６６０（ウシバクテネシン５（Ｂａｃ５）プロリンおよびアルギニンリッチ抗生物質）、Ｐ５１４３７（マウスＣＲＡＭＰ（ＣＰＬ））、Ｐ３２１９４ブタプロテグリン１〜５）、Ｐ４９９３０（ブタ脊髄抗細菌ペプチドＰＭＡＰ−２３）、Ｐ２５２３０（ウサギＣＡＰ１８、ＬＰＳに結合するタンパク質）、Ｐ１５１７５（ブタカセリン（ｃａｔｈｅｌｉｎ））、Ｐ４９９２８（ヒツジ脊髄抗細菌ペプチドＳＭＡＰ−２９）、およびＰ５４２３０（ヒツジ環状ドデカペプチド、抗生物質）が含まれる。
【０２４６】
目的のさらなる抗菌ペプチドには、マゲイニンが含まれる。このポリペプチドの活性変異型およびフラグメントが公知である。Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４３：７８２−７８８を参照のこと。例えば、ペキシガナンは、抗菌活性を持ちつづけ且つ足の糖尿病性壊疽の局所治療用の現在抗菌治療薬として使用されている複数の置換および欠失を有するマゲイニンの変異型を含む（Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｎｄ  ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３７ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。別の抗菌ポリペプチドには、ビメチンが含まれる。例えば、Ｎｉｒｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５９−６３を参照のこと。これらの各引例は、参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【０２４７】
抗菌薬は抗菌ペプチドを含み、このペプチドは、任意の動物種（昆虫、げっ歯類、トリ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒトが含まれるが、これらに限定されない）に由来し得ると認識される。いくつかの実施形態では、投与される抗菌ペプチドは治療を受ける被験体と同種由来である。
【０２４８】
抗菌ポリペプチドの生物活性変異型および抗菌薬の生物活性誘導体もまた、本発明の方法に含まれる。このような変異型および誘導体は、抗菌薬の生物活性（すなわち、抗菌活性、抗細菌活性、抗ウイルス活性、および／抗真菌活性）を保持するはずである。このような系列の活性変異型は活性のアッセイ方法として当分野で公知である。好ましくは、変異型は、少なくとも天然分子と同一の活性を有する。
【０２４９】
抗菌ポリペプチドの適切な生物活性変異型は、抗菌ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体であり得る。「フラグメント」は、インタクトな抗菌ポリペプチド配列の一部のみからなるタンパク質を意図する。フラグメントは、調節ポリペプチドのＣ末端欠失物またはＮ末端欠失物であり得る。抗菌ポリペプチドの「変異型」は、１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する天然の配列および構造を含む抗菌活性、抗ウイルス活性、抗細菌活性、および／または抗真菌活性を有する全長ポリペプチドまたはそのフラグメントのアナログを意図する。１つまたは複数のペプトイド（ペプチド模倣物）を有するペプチドはまた、用語「アナログ」に含まれる（すなわち、国際公開番号ＷＯ９１／０４２２８２を参照のこと）。
【０２５０】
抗菌薬の「誘導体」は、活性が保持される限り、天然の抗菌ポリペプチドもしくはそのフラグメントの任意の適切な修飾物、天然の抗菌薬の各変異型もしくは任意の適切な修飾物（グリコシル化、リン酸化、または外来部分の他の付加など）を意図する。
【０２５１】
好ましくは、抗菌ポリペプチドの天然または非天然の変異型は、基準分子（例えば、グラヌリシンなどの抗菌ペプチド）または抗菌ポリペプチドのより短い基準部分に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％のアミノ酸配列が同一であるアミノ酸配列を有する。より好ましくは、分子は、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。ギャップオープンペナルティ１２およびギャップ伸長ペナルティ２を使用したアフィンギャップ検索（６２のＢＬＯＳＵＭ行列）を使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同検索アルゴリズムを使用して配列同一率を決定する。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同検索アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９で教示されている。変異型は、例えば、１〜１０個ほどのアミノ酸残基（６〜１０など）、５個ほど、４、３、２、または１ほどのアミノ酸残基が異なり得る。
【０２５２】
２つのアミノ酸配列の至適アラインメントに関して、変異アミノ酸配列の連続セグメントは、基準アミノ酸配列に関してさらなるアミノ酸残基を含むか、アミノ酸残基が欠失され得る。基準アミノ酸配列との比較のために使用した連続セグメントは、少なくとも２０個の連続アミノ酸残基を含み、３０個、４０個、５０個、またはそれ以上のアミノ酸残基であり得る。保存残基置換またはギャップに関する配列同一性を修正することができる（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同検索アルゴリズムを参照のこと）。
【０２５３】
当業者は、このような変異型の調製および使用に関する実質的なガイダンスを提供している。抗菌ポリペプチドのフラグメントは、一般に、全長分子の少なくとも約１０個の連続アミノ酸残基、好ましくは全長分子の約１５〜２５個の連続アミノ酸残基、最も好ましくは全長抗菌ポリペプチドの約２０〜５０個またはそれ以上の連続アミノ酸残基を含む。
【０２５４】
本発明の代替抗体に結合した抗菌薬は、任意の目的の微生物に活性であり得る。目的の微生物には、グラム陽性好気性菌およびグラム陰性好気性菌を含む好気性菌が含まれるが、これらに限定されない。グラム陽性好気性菌には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、他の凝固酵素陰性ブドウ球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｓ、他の連鎖球菌、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉａｄｉａ属（例えば、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｃ．ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）が含まれる。グラム陰性好気性菌には、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｎａｎｉｉ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｄｉｖｅｒｓｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属（例えば、大腸菌）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｅｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｒｏｐｈｉｌａが含まれる。
【０２５５】
さらなる目的の微生物には、嫌気性菌が含まれる。グラム陽性嫌気性菌には、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｉｎｎｏｃｕｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｍｏｓｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｉｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｅｖｏｔｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓが含まれる。グラム陰性嫌気性菌には、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｅｒｏｎ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｂｉｖｉａ、およびＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｏｇｅｎｉｃａが含まれる。
【０２５６】
さらなる目的の細菌には、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属、Ｐｒｏｔｅｕｓ属、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属（例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌｓ属、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属（例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属（例えば、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ属（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属（例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ属、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属（例えば、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などが含まれる。他の細菌には、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ属（例えば、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ属（例えば、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ属（例えば、Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）、Ｂｏｒｒｅｌｉａ属（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｅ属、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ属（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｒ．ｔｙｐｈｉ）、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属（例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ属（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））などが含まれる。
【０２５７】
目的の非細菌微生物には、真菌および原生動物病原体（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ属（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ属（例えば、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）、ｓｈｉｓｔｏｓｏｍｅｓ、Ｅｎｔａｅｍｏｅｂａ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ））などが含まれる。
【０２５８】
目的のウイルスには、呼吸器ウイルス病原体（例えば、アデノウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コサッキーウイルス、コロナウイルス、インフルエンザＡ型およびＢ型ウイルス、パラインフルエンザウイルス１〜４、呼吸器合胞体ウイルスが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。消化器ウイルス病原体には、例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスが含まれる。全身性ウイルス病原体には、例えば、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、水疱瘡ウイルス、関連単純ヘルペスウイルス１、および単純ヘルペスウイルス２が含まれる。全身性ウイルス病原体には、例えば、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２が含まれる。アルボウイルス病原体には、例えば、デングウイルス１〜４、黄熱病ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、および局所性出血熱ウイルスが含まれる。さらなるウイルス病原体には、例えば、乳頭腫ウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルスが含まれる。癌に関連するウイルス病原体には、例えば、ヒト乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、およびカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）が含まれる。
【０２５９】
さらなる目的の微生物には、ダニ感染微生物が含まれる。これらには、例えば、オルトミクソウイルス、ライム病スピロヘータ（すなわち、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂ．ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、ダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）ウイルスが含まれる。ダニは、さらに、原生動物Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｂ．ｂｏｖｉｓ、およびＢ．ｂｉｇｅｍｉｎａ（全てウシの病原体として公知）を感染する（Ｄｅｓｐｏｍｍｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐａｒａｓｉｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。さらなる感染微生物には、リケッチアＥｈｒｌｉｃｈｉａ属が含まれる。さらに、北西合衆国におけるバベシア症様病は、これまでＷＡ１と命名されている同定されていないバベシア属様生物に寄与している。Ｑｕｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１９：２８４−２９０（１９９３）。
【０２６０】
他の目的の微生物には、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｍｅｄｉａｓｉａｔｉｃａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｎｏｖｉｃｉｄａ、およびＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓが含まれるＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓが含まれる。
【０２６１】
本発明の方法は、微生物に結合する抗菌薬を有する代替抗体を微生物に接触させるステップを含む。用語「接触」は、結合した抗菌薬が微生物を有効に阻害または死滅させることができる代替抗体への微生物の曝露をいう。接触はインビトロであり得る（例えば、代替抗体複合体に対する微生物の感受性を試験するための細菌培養物への代替抗体の添加または汚染微生物を阻害または死滅させるための細胞培養物への代替抗体の添加による）。あるいは、接触はインビボであり得る（例えば、微生物感染した被験体へのペプチドの投与）。抗菌効果を得るための代替抗体の有効濃度は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の微生物集団の減少に十分な濃度である。あるいは、有効量は、１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、またはそれ以上の微生物集団の減少に十分であり得る。
【０２６２】
結合した抗菌薬を有する代替抗体を、治療有効濃度で微生物感染した宿主に投与することができる。投与は、特定の微生物に依存して局所または全身であり得る。本発明の代替抗体の投与方法は、以下でより詳細に考察する。一般に、治療有効用量は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上の微生物集団の減少に十分である。あるいは、用量は、１ｌｏｇ、２ｌｏｇ、３ｌｏｇ、またはそれ以上の細胞集団の減少に十分であり得る。
【０２６３】
結合した抗菌薬を有する代替抗体に対する特定の微生物の感受性を決定するアッセイを、インビトロ試験によって決定することができる。一般に、微生物の培養物を、結合した抗菌薬を有する代替抗体と種々の濃度で薬剤が作用するのに十分な時間組み合わせる。生存微生物（ウイルス、細菌、および／または真菌）を計数し、死滅レベルを決定する。当業者は、目的の各生物の特定の成長要件に培養条件を適合すべきであると認識する。
【０２６４】
アッセイの例には、細菌および真菌のＣＦＵ決定が含まれる。Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２３９６−２４０１に以前に記載のように、細菌および真菌についてのＣＦＵアッセイを行った。簡単に述べれば、微生物と結合した抗菌薬を有する代替抗体とを混合し、最終体積５０μｌの１０ｍＭ  ＰＯ4（ｐＨ７．４）を含む０．０３％トリプチカーゼダイズブロス（ＴＳＢ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）（細菌）または０．０３％Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロースブロス（ＳＡＢ、Ｄｉｆｃｏ）（真菌）の存在下にて３７℃で３時間同時インキュベーションする。インキュベーション後、サンプルを、氷冷１０ｍＭ  ＰＯ4で１００倍希釈し、エリアあたり一定体積送達させて微生物コロニーを正確に計数可能なスパイラルプレーター（Ｓｐｉｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）を使用してトリプチカーゼダイズ寒天プレートまたはＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天プレート（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｅｚ，Ｃａｌｉｆ）に広げる。
【０２６５】
他のアッセイには、放射拡散（ｒａｄｉａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）が含まれる。寒天放射拡散アッセイは、Ｌｅｈｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３７：１６７−７３（参照することにより本明細書中に組み込まれる）に以前に記載されている。０．０３％ＴＳＢを含む１０ｍｌの３％アガロース溶液への４×１０6ＣＦＵ／ｍｌの添加によって細菌−寒天層を調製する。下層に３ｍｍの穴をあけ、５μｌの代替抗体／抗菌薬希釈物を３７℃で３時間寒天に拡散させ、１０ｍｌの６％ＴＳＢ３％アガロースで覆い、プレートを一晩インキュベートする。細菌カーペット中の透明帯の直径を測定する。例えば、米国特許第６，４６５，４２９号および同第６，４６９，１３７号（参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。
【０２６６】
活性ウイルス粒子レベルの減少を、プラーク形成単位（ＰＦＵ）の計数による測定によってアッセイすることができる。例えば、Ｂｅｃｈｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｍａｔ  Ａｒｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｔ  Ｏｒｇ  １６：１２３−１２８（参照することにより本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。あるいは、活性ウイルス粒子の減少は、ＴＣＩＤ50値によって決定されるウイルス力価の減少を含む。ＴＣＩＤ50は、本明細書中で、５０％の細胞が死滅する組織培養物感染用量と定義する。
【０２６７】
抗菌活性についてのインビボアッセイも当分野で公知である。例えば、試験被験体を、目的の微生物で攻撃誘発することができる。治療有効濃度の代替抗体を投与し、微生物集団の遅延もしくは阻害および／または微生物集団の減少を決定する。したがって、微生物集団の成長または集団の減少の決定によって治療有効用量をアッセイすることができるか、治療を受けた被験体の臨床症状の改善によって治療有効用量をアッセイすることができる。
【０２６８】
抗菌薬の組み合わせ処方物を使用することができる。１つの実施形態では、代替抗体は、これに結合した１つまたは複数の同一および／または異なる抗菌化合物を有し得る。他の実施形態では、異なる抗菌化合物を有する複数の代替抗体を、微生物集団に接触させることができる。あるいは、抗菌薬にコンジュゲートした代替抗体を、さらなる抗菌薬と組み合わせて微生物集団に投与することができる。
【０２６９】
したがって、本発明の方法および組成物は、微生物感染の治療または予防に適用される。この実施形態では、「治療または予防」は、被験体中の微生物集団の成長の任意の減少および／または微生物集団中に含まれる微生物数の減少を意図する。この抗菌活性を決定するアッセイは、本明細書中に記載されている。
【０２７０】
ＩＶ．薬学的組成物および送達方法
本発明の代替抗体分子は、無機もしくは有機で固体もしくは液体の薬学的に許容可能なキャリアをさらに含み得る。キャリアはまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、可溶化剤、安定化剤、緩衝液、溶媒、および塩を含み得る。組成物を滅菌し、固体、粒子、または粉末、溶液、懸濁液、または乳濁液として存在することができる。
【０２７１】
薬学的に許容可能なキャリア媒介物との混合などによって薬学的に有用な組成物を調製するために公知の方法に従って代替抗体を処方することができる。適切な媒介物およびその処方は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１６ｔｈ  ｅｄ．，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ．），Ｍａｃｋ，ＥａｓｔｏｎＰＡ（１９８０））に記載されている。有効な投与に適切な薬学的に許容可能な組成物を形成するために、このような組成物は、単独または適切な量のキャリア媒介物と共に有効量の代替抗体分子を含む。
【０２７２】
薬学的に許容可能なキャリアは、投与方法および意図する使用方法に依存して変化する。使用される薬学的キャリアは、例えば、固体、液体、または徐放物であり得る。代表的な固体キャリアは、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、微結晶性セルロース、およびポリマーヒドロゲルなどである。典型的な液体キャリアには、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、シクロデキストリン、および乳濁液などが含まれる。当業者は、それぞれの一般的に使用される投与方法に適切なキャリアを周知である。さらに、代替抗体の総投与量は投与される薬学的組成物（すなわち、使用されるキャリア）、投与様式、結合活性、および所望の効果（すなわち、治療薬の検出方法、調整方法、送達方法）に依存すると認識する。
【０２７３】
一旦薬学的組成物が処方されると、これを溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中で保存することができる。このような処方物を、すぐに使用できる形態または投与直前に再構成が必要な形態で保存することができる。
【０２７４】
代替抗体を、カテーテルまたはシリンジの使用によって適切な細胞、組織、または器官系に局所的に送達させることもできる。このような代替抗体オリゴマーの細胞への他の局所的送達手段には、移植片周辺領域への治療用代替抗体の徐放に影響を与え得る輸液ポンプ（例えば、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の使用または高分子移植片への代替抗体の組み込み（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｅｎｇｌａｎｄ：Ｅｌｌｉｓ  Ｈｏｒｗｏｏｄ  Ｌｔｄ．）を参照のこと）が含まれる。
【０２７５】
種々の方法が、被験体（すなわち、動物（哺乳動物）、組織、器官、または細胞）への代替抗体の送達に利用可能である。全身送達のための代替抗体の投与様式は、皮下、ＩＤ、筋肉内、静脈内、または鼻腔内であり得る。さらに、吸入ミスト、経口活性処方物、経皮イオン導入、または坐剤も想定される。１つのキャリアは生理学的食塩水であるが、他の薬学的に許容可能なキャリアも使用することができることが意図される。１つの実施形態では、キャリアおよび代替抗体分子は生理学的に適合可能な徐放処方物を構成することが想定される。このようなキャリア中の主な溶媒は、本質的に水性または非水性のいずれかであり得る。さらに、キャリアは、処方物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、無菌、安定性、溶解速度、または臭気の修正または維持のための他の薬理学的に許容可能な賦形剤を含み得る。同様に、キャリアは、代替抗体の安定性、溶解速度、放出、または吸収の修正または維持のためのさらに他の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。このような賦形剤は、単位用量または複数回用量形態のいずれかでの非経口投与のための投薬量を処方するために通常および習慣的に使用される物質である。
【０２７６】
例えば、一般に、開示の代替抗体を、微粒子またはリポソーム内またはその表面上に組み込むことができる。開示の代替抗体を含む微粒子またはリポソームを、例えば、開示の代替抗体の標的細胞への送達に有効な量の静脈内または腹腔内投与によって全身に投与することができる。適切な微粒子と組み合わせて使用した場合、他の可能な経路には、経皮または経口投与が含まれる。一般に、個体に投与されるリポソーム結合代替抗体の総量は、同一の望ましいか意図する効果のために投与されなければならない非結合代替抗体の量未満である。
【０２７７】
「有効量」は、所望の効果（すなわち、リガンドの検出、リガンド活性の調整、または所望の効果を誘発するための一定量の治療薬の送達）を誘発するのに十分な代替抗体の濃度を意味する。
【０２７８】
したがって、本発明の投与単位中の代替抗体の濃度は、所望の効果を得るのに有効である。有効量は、多数の要因（例えば、使用した特定の代替抗体、所望の効果、被験体の反応性、被験体の体重、他の被験体内の変動性、投与方法、使用した処方物）に依存する。有効性、投薬量、Ｋａ、および投与経路を決定する方法は、当業者に公知である。
【０２７９】
本発明の実施形態は、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ，４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、１５．０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇの用量の代替抗体の投与を提供する。あるいは、代替抗体を、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．２ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ〜２．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ〜３．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、または１５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
【０２８０】
単位用量として特定の組織に投与される代替抗体の総量は、投与される薬学的組成物の型（組成物が、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、または徐放性処方物のいずれかの形態）に依存すると認識される。例えば、治療有効量の代替抗体を含む薬学的組成物が徐放性処方物である場合、代替抗体をより高い濃度で投与する。
【０２８１】
本発明のこの実施形態における代替抗体の治療有効用量および投与頻度に関する変形形態が許容可能であることが当業者に明らかなはずである。代替抗体の単回用量を数分、数時間、数日、または数週間にわたって投与することができると認識される。代替抗体の単回用量で十分であり得る。あるいは、反復用量を、数時間、数日、または数週間にわたり患者に投与することができる。さらに、所望ならば、本明細書中に記載のように代替抗体の組み合わせを投与することができる。
【０２８２】
さらに、代替抗体の治療有効量または用量および投与頻度は、複数の要因（例えば、治療理由が含まれる）に依存する。最も有効な用量および投与頻度を決定するためにいくらかの小規模の実験が必要であり、これは、一旦本発明が開示されると当業者の能力の範囲内である。本発明の方法を任意の哺乳動物で使用することができる。哺乳動物の例には、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、およびより好ましくはヒトが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８３】
したがって、本発明はまた、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリアおよび任意選択的に任意の他の治療成分と共に代替抗体を含む脊椎動物およびヒトの医療用の薬学的処方物または組成物を提供する。キャリアは、処方物の他の成分と適合することができるがそのレシピエントに過度の悪影響を与えないという意味で薬学的に許容可能でなければならない。
【０２８４】
組成物には、経口、直腸、局所、鼻腔内、眼内、または非経口（腹腔内、静脈内、皮下、または筋肉内注射が含まれる）投与に適切なものが含まれる。組成物は、単位投与形態で都合よく存在することができ、薬学分野で周知の任意の方法によって調製することができる。全ての方法は、１つまたは複数の副成分を構成するキャリアと組み合わせた有効成分を送達するステップを含む。一般に、有効成分を液体キャリア、微粉化固体キャリア、またはその両方と均一且つ十分に組み合わせ、その後必要に応じて生成物を所望の処方物に成形することによって組成物を調製する。
【０２８５】
経口投与に適切な本発明の組成物は、カプセル、カシェ、錠剤、およびロゼンジなどの個別の単位として存在することができ、それぞれ粉末もしくは顆粒、シロップ、エリキシル、乳濁液、および吸気などの水性または非水性の液体中の懸濁液として所定量の有効成分を含む。
【０２８６】
任意の副成分も添加することができる糖（例えば、スクロース）の濃縮水溶液への活性化合物の添加によってシロップを作製することができる。このような副成分には、香料、適切な防腐剤、糖の結晶化を遅延させる薬剤、多価アルコール（例えば、グリセロールまたはソルビトール）などの任意の他の成分の可溶性を増大させる薬剤が含まれ得る。
【０２８７】
非経口投与に適切な処方物は、レシピエントの血液と等張であり得る活性化合物の滅菌水性調製物を都合よく含む。
【０２８８】
鼻腔スプレー処方物は、防腐剤および等張化剤と共に有効成分の精製水溶液を含む。このような処方物を、鼻粘膜に適合するｐＨおよび等張状態に調節することが好ましい。
【０２８９】
直腸投与用の処方物は、ココアバター、硬化脂肪、または硬化脂肪カルボン酸などの適切なキャリアを含む坐剤として存在することができる。
【０２９０】
ｐＨおよび等張因子を好ましくは眼のそれに適合するように調整すること以外は鼻腔内スプレーに類似の方法によって眼内処方物を調製する。
【０２９１】
局所処方物は、鉱物油、石油、多価アルコール、または局所処方物に使用される他の基剤などの１つまたは複数の媒体中に溶解または懸濁された活性化合物を含む。上記の他の副成分の添加が望ましい。
【０２９２】
さらに、本発明は、代替抗体のリポソーム処方物を提供する。リポソーム懸濁液の形成テクノロジーは当分野で周知である。代替抗体が水溶性塩である場合、従来のリポソームテクノロジーを使用して、これを脂質小胞に組み込むことができる。このような例では、化合物の水溶性のために、化合物を実質的に親水性中心またはリポソームのコアに混入させる。使用した脂質層は、任意の従来の組成物に由来し、コレステロールを含み得るか、無コレステロールであり得る。目的の化合物または塩が水に不溶性である場合、従来のリポソーム形成テクノロジーを使用して、塩を親水性脂質二重層内に実質的に混入してリポソーム構造を形成することができる。いずれかの例では、標準的な超音波処理および均一化技術を使用して生成されたリポソームのサイズを減少させることができる。プロゲステロン代謝産物またはその塩を含むリポソーム処方物を凍結乾燥させて、水などの薬学的に許容可能なキャリアで再構成させてリポソーム懸濁液を再度作製することができる凍結乾燥物を生成することができる。
【０２９３】
エアゾールとして吸入投与に適切な薬学的処方物も提供する。これらの処方物は、所望の代替抗体の溶液もしくは懸濁液または化合物もしくは塩の複数の固体粒子を含む。所望の処方物を小チャンバーに入れて噴霧することができる。化合物または塩を含む複数の液滴または固体粒子を形成する圧縮空気または超音波エネルギーによって噴霧することができる。
【０２９４】
上記の成分に加えて、本発明の組成物は、希釈剤、緩衝液、香料、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、および防腐剤（抗酸化剤が含まれる）などからなる群から選択される１つまたは複数の副成分をさらに含み得る。
【０２９５】
本発明は、以下の非限定的な例を参照してより深く理解される。
〔実施例１〕
【０２９６】
リガンド結合代替抗体試薬の作製プロセス
市販の（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）予め定義された配列の２つのオリゴヌクレオチド鎖のハイブリッド形成によって「代替抗体」（Ｓａｂ）分子の最初のライブラリーを構築した。２μｌ（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ）の「（５’）ＧＴＡ−ＡＡＡ−ＣＧＡ−ＣＧＧ−ＣＣＡ−ＧＴ−ランダム４０ｎｔ−ＴＣＣ−ＴＧＴ−ＧＴＧ−ＡＡＡ−ＴＴＧ−ＴＴＡ−ＴＣＣ（３’）」（配列番号５）の配列を有する７８ｎｔのオリゴヌクレオチド鎖および２μｌ（１００ｐｍｏｌｅ／μｌ）の「（５’）ビオチン−ＧＧＴ−ＴＡＡ−ＣＡＡ−ＴＴＴ−ＣＡＣ−ＡＣＡ−ＧＧＡ−ＧＧＡ−ＣＴＧ−ＧＣＣ−ＧＴＣ−ＧＴＴＴＴＡ−Ｃ（３’）」（配列番号６）の配列を有する４０ｎｔのオリゴヌクレオチド鎖をＭｇＳＯ4を含む修正Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中で混合した。サーマルサイクラーを使用して溶液を９６℃に加熱し、溶液が室温に冷却されるにつれてハイブリッド形成した。配列番号５は、特異性鎖を含む。第１の定常領域に下線を引き、第２の定常領域の下に二重線を引く。配列番号６は、安定化領域の鎖を示す。第１の安定化ドメインの下に一本の点線を引く。第２の安定化ドメインの下に二重線を引く。
【０２９７】
１０％メタノールを含む修正Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中に懸濁した２０μｌ（１μｇ／μｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）コンジュゲート体に１．２×１０14個の代替抗体分子のライブラリーを添加した。溶液をＲＴ／２５℃でインキュベートし、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）−ＰＣＲ濾過デバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。この濾過デバイスは、ＢＳＡ−ＰＣＢコンジュゲート体に結合したＳＡｂ分子を保持し、且つ非結合ＳＡｂ分子を保持しないことが予め判断されていた。コンジュゲート物に結合したＳＡｂを、インキュベーション溶液の１０００ｇ／１０’／ＲＴでの遠心分離によって非結合分子から分離した。保持物中のＢＳＡ−ＰＣＢ結合ＳＡｂを２００μｌアリコートの修正Ｔｒｉｓ緩衝液で３回洗浄した。
【０２９８】
洗浄保持物中のＳＡｂを、フィルターから吸引し（約４０μｌ）、ＰＣＲエッペンドルフチューブに移した。事前にコンジュゲート体から分離することなく、回収されたＳＡｂ−ＢＳＡ−ＰＣＢ複合体を使用して、７８ｎｔの鎖を増幅させた。ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、緩衝液、および正の開始鎖に特異的であり且つ配列（５’）ビオチン−ＧＧＡ−ＴＡＡ−ＣＡＡ−ＴＴＴ−ＣＡＣ−ＡＣＡ−ＧＧＡ（３’）（配列番号７）を有するＭ１３Ｒ４８プライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用して、７８ｎｔの負の鎖（すなわち、特異性鎖）の増幅集団を最初に産生した。９６℃、４８℃、および７２℃で３０〜３００秒で４０サイクルの増幅を行うようにサーマルサイクラーをプログラミングした。
【０２９９】
次に、非対称ＰＣＲを使用して、増幅した７８ｎｔの負の鎖材料から正の７８ｎｔの鎖の増幅集団を産生した。約５％の増幅した７８ｎｔの負の鎖を、４０μｌのＤＩ  Ｈ2Ｏを含むエッペンドルフＰＣＲチューブに添加した。ポリメラーゼ、ＮＴＰ、緩衝液、および負の鎖に特異的であり、且つ（５’）ビオチン−ＧＴＡ−ＡＡＡ−ＣＧＡ−ＣＧＧ−ＣＣＡ−ＧＴ（３’）（配列番号８）の配列を有するＭ１３−２０プライマーを添加し、ＰＣＲ増幅に使用した。以前に引用した温度サイクルを再度使用した。４％未満の増幅集団が、７８ｎｔの負の鎖または４０ｎｔの正の鎖のいずれかを含んでいることが見出された。市販品（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット）を使用して、ポリメラーゼ、ＮＴＰ、プライマー、および４０ｎｔオリゴマーを除去するために精製を行った。
【０３００】
捕捉し、増幅し、精製した７８ｎｔの鎖（すなわち、特異性鎖）の４０ｎｔの開始オリゴヌクレオチド（すなわち、安定化鎖）とのハイブリッド形成によって１２０ｎｔの二本鎖ＳＡｂの再構築を行った。この再構築プロセスにより、リガンド結合ＳＡｂ分子の富化ライブラリーが産生される。その後の各選択ラウンドの開始前に富化ＳＡｂライブラリーを構築する。これらのその後のサイクルは、標的リガンドに対するＳＡｂ集団の平均特異性および親和性を増大させる正の選択プロセスを使用する。
【０３０１】
約８０％（４０μｌ）の精製した７８ｎｔの材料を、修正Ｔｒｉｓ緩衝液および５μｌ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ）の４０ｎｔ鎖を含む２００μｌエッペンドルフチューブに添加した。脱イオン水（３５μｌ）を添加し、混合物を９６℃／５’、６５℃／５’、６０℃／５’、および５６℃／５’に加熱した。次いで、溶液を、室温に達するまで１℃／分の速度で３０分間冷却した。溶液を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）濾過デバイス（５’／１０００ｇ／ＲＴ）で濾過し、濾過物をその後の選択サイクルで使用するために回収した。
【０３０２】
いくつかの捕捉および増幅選択サイクル（すなわち、２〜６回）（それぞれ、７８ｎｔオリゴヌクレオチド鎖の増幅、精製、およびＳＡｂ構築前）を使用して、ＢＳＡ−ＰＣＢ結合ＳＡｂ分子の富化ライブラリーを産生した。捕捉および増幅サイクルの完了後、富化ＳＡｂライブラリーを、標的リガンドに特異的なＳＡｂ分子を捕捉および増幅するために処理した。
【０３０３】
特異性選択サイクルを使用して、キャリアタンパク質、誘導化合物、架橋化合物に結合する集団中のＳＡｂ分子を排除する。これにより、標的リガンドに特異的に結合する分子の富化ＳＡｂ集団が得られる。新生物組織上の固有の決定基に特異的に結合することができるＳＡｂ集団を産生する場合、特異性選択により正常な細胞構成要素に結合するＳＡｂ分子が排除される。
【０３０４】
前に説明するように、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）濾過デバイスを使用した非結合ＳＡｂからの結合ＳＡｂの分離プロセスを使用した。捕捉および増幅時に産生された富化ＳＡｂライブラリーを、非コンジュゲートウシ血清アルブミン（２０μｇ／ｍｌ）溶液と６０’／ＲＴでインキュベートした。次いで、溶液を、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）濾過デバイスによって濾過した（５’／１００ｇ／ＴＲ）。フィルターにはＢＳＡに結合したＳＡｂが保持される。濾過物中のＳＡｂを回収し、これを使用して７８ｎｔ鎖を増幅し、新規のＳＡｂライブラリーを構築および精製した。ＳＡｂを、非ターゲティングＰＣＢ同族体（例えば、ＢＺ５４、ＢＺ１８など）、ダイオキシン、多環式芳香族炭化水素（例えば、ナフタレン、フェナントレン）、および他の無関係のハプテンを含む溶液とインキュベートし、その後標的ＰＣＢ（ＢＺ−１０１）−ＢＳＡコンジュゲート体とインキュベートした。ＳＡｂ、無関係のリガンド、および標的コンジュゲート体を含むインキュベートした溶液を、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）濾過デバイスで濾過する。溶液中の架橋リガンドに結合した非特異的ＳＡｂ分子は、フィルターの多孔度によって排除されずに通過して濾過物となり、これを破棄する。潜在的な架橋化合物への曝露後、ＰＣＢ−ＢＳＡコンジュゲート体に結合した分子は、膜に保持され、新規のＳＡｂ集団に処理される。これらの分子を使用して、７８ｎｔ鎖を増幅し、ＳＡｂ分子の特異的集団を構築し、その後、最も結合親和性の高い分子を捕捉するための感受性選択サイクルで使用する。
【０３０５】
感受性選択サイクルを使用して、特異的且つ高親和性のポリクローナルＳＡｂライブラリーの調製のために特異性結合分子のライブラリーから最も親和性の高いＳＡｂ分子を捕捉する。このプロセスは、特異性選択サイクル後に産生されたＳＡｂライブラリーを低濃度の標的リガンドおよび薬剤および疎水性、静電気、水素、ファンデルワールス結合相互作用を和らげる条件に曝露する。このような薬剤および条件には、単独または組み合わせて使用することができる溶媒（例えば、メタノール）、ｐＨ調整、アオトロピック剤（例えば、塩酸グアニジン）、高塩濃度、界面活性剤（例えば、ｔｗｅｅｎ、ｔｏｒｉｔｏｎ）が含まれる。プロセスによりリガンド結合が和らげられ、結合親和性の最も高い分子が選択される。一旦選択されると、これらの分子を、７８ｎｔ鎖を増幅して富化ポリクローナル集団を構築するためのテンプレートとして使用する。
【０３０６】
「捕捉および増幅」および「特異性選択」の完了後に得られた富化ＳＡｂ集団を使用して感受性選択を行う。そのリガンドへの結合に基づいたＳＡｂの捕捉または排除の溶液相プロセスおよび分子篩濾過デバイスを使用した捕捉を再度使用した。ＳＡｂを非コンジュゲートＰＣＢ分子とインキュベートし、その後６０’／ＲＴでＢＳＡ−ＰＣＢ（ＢＺ１０１）コンジュゲート体を添加した。インキュベーション液を、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）濾過デバイスに導入し、１０００ｇ／１０’／ＲＴで遠心分離した。非コンジュゲートＰＣＢ分子に結合したＳＡｂを濾過し、濾過物を回収し、これを使用して７８ｎｔ鎖を増幅し、非結合リガンドに結合する富化分子集団を構築した。富化集団を低濃度（０．４μｇ／ｍｌ）のＰＣＢ−ＢＳＡコンジュゲート体とインキュベートし、コンジュゲート体に結合したＳＡｂをＭＩＣＲＯＣＯＮ（登録商標）デバイス（１０００ｇ／１０’／ＲＴ）を使用した濾過および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む修正Ｔｒｉｓ緩衝液を使用した３回の洗浄後に回収する。保持物中の回収したＳＡｂを増幅して７８ｎｔ鎖を産生し、ＳＡｂ分子に構築した。メタノール（１０％ｖ／ｖ）およびＴｗｅｅｎ２０（０．０５％）の存在下でのＳＡｂライブラリーのＰＣＢ−ＢＳＡ（０．４％）コンジュゲート体とのインキュベーションによってこのプロセスを繰り返した。保持物中のコンジュゲート体に結合したＳＡｂを回収し、７８ｎｔ鎖の増幅に使用した。ポリクローナルＳＡｂ集団を上記のように構築した。以下の手順を使用して、ポリクローナルＳＡｂ集団を各モノクローナルＳＡｂ試薬に分画することができる。
〔実施例２〕
【０３０７】
モノクローナルＳＡｂの調製
特異的プライマーを使用してＰＣＲによってポリクローナルＳＡｂ集団を増幅して、二本鎖７８ｎｔおよび二本鎖４０ｎｔ分子を先生する。信頼性の高いポリメラーゼおよび少数のＰＣＲサイクル（２５サイクル）の使用によって増幅物およびＰＣＲエラーを最小にする。ＰＣＲ産物を、３1/2高分解能アガロースゲルで電気泳動し、７８ヌクレオチドフラグメントを回収し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ抽出キットによって精製する。精製７８ｎｔ二本鎖ＤＮＡを、ＰＣＲクローニングベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙなど）にクローン化して、各二本鎖７８ｎｔフラグメントコピーを含むプラスミドを産生する。大腸菌細菌（例えば、ＪＭ１０９株、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、エレクトロポレーションによってプラスミドで形質転換する。
【０３０８】
形質転換細菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ／寒天プレートで培養する。７８ｎｔフラグメントを含む細菌は白色のコロニーを形成し、７８ｎｔフラグメントを含まない細菌は１３ｇａｌを発現し、青色のコロニーを形成する。各白色コロニーを、液体増殖培地を含むマイクロウェル（例えば、ＳＯＣ培地、Ｐｒｏｍｅｇａ）に移し、３７℃で一晩インキュベートする。
【０３０９】
各ウェルからＰＣＲマイクロプレートにアリコートを移した後、ウェルの内容物を増幅する。適切なプライマーおよびＰＣＲ条件の使用によって、ＰＣＲ産物を精製する必要性を回避する。前に記載のプロセスである４０ｎｔフラグメントの添加および定義の加熱および冷却サイクルを使用したサーマルサイクラーでのハイブリッド形成を使用して、マイクロプレート中でＳＡｂ分子を構築する。
〔実施例３〕
【０３１０】
分析およびデータベースの構築
モノクローナルＳＡｂクローンの反応性パネルプロファイリングを使用して、市販のアプリケーションのために選択試薬で使用した結合特性を比較する。分析した特徴は、以下を含み得る。
１）標的リガンドの認識；
２）相対力価および親和性；
３）感受性；
４）特異性；
５）マトリクス効果；
６）温度効果；
７）安定性；および
８）商業的意義（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）の他の変化（例えば、溶解、エフェクター機能）。
【０３１１】
標準的な試験プロトコールを使用し、各クローンから収集したデータを、リレーショナルデータ−ベースに入力する。
【０３１２】
特徴づけアッセイは、構築したモノクローナルＳＡｂ試薬のアリコートを分析用の特定の特徴づけプレートに移す。親和性および滴定アッセイは、各試薬の相対親和性（Ｋａ）および濃度を比較する。感受性アッセイは、低濃度の標的リガンドを検出して最小検出用量を評価する能力を比較する。特異性アッセイは、無関係／望ましくないリガンドのＳＡｂ認識を比較する。マトリクス干渉研究は、ＳＡｂ結合に対する予想されるマトリクス成分の効果を評価する。温度効果は、結合との関係を評価する。安定性は、最も安定なクローンおよびさらなる評価に必要な問題を同定する。予想される適用に関連する他の特徴を、公知の手段を使用して評価することもできる。
【０３１３】
ＳＡｂ結合のための標的リガンドには、原核細胞（例えば、細菌）、ウイルス、真核細胞（例えば、上皮細胞、筋細胞、神経細胞、感覚細胞、分泌細胞、悪性細胞、赤血球、白血球、幹細胞、原生動物、真菌）、タンパク質、プリオン、核酸、およびコンジュゲート濾過可能化合物が含まれる。ＳＡｂ結合のための標的リガンドは、濾過膜／分子篩によって保持することができる十分なサイズの任意のリガンドであり得る。
〔実施例４〕
【０３１４】
増幅不可能な安定化鎖を使用したＰＣＢ同族体ＢＺ１０１に対する代替抗体８７／４８の調製
隣接する定常ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔのランダム特異性ドメイン配列を有する二量体分子を形成させるために自己構築オリゴヌクレオチド鎖（８７ｎｔ＋４８ｎｔ）を使用して代替抗体（ＳＡｂ）分子を産生した。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合／遊離の分離、および構築／再アニーリングのサイクルを使用して、ＳＡｂ集団にＢＳＡ−アジポイル−ＢＺ１０１コンジュゲート体および非コンジュゲートＢＺ１０１（２，２’、５，５’−ペンタクロロビフェニル）ハプテンに結合する分子を富化させた。
方法
【０３１５】
Ａ．代替抗体ライブラリーの形成：
ランダム４０ｎｔ配列、ＦＩＴＣ（Ｆ）、およびビオチン化（Ｂ）プライマーを含む８７ｎｔ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリーを、ＩＤＴから購入した。可変領域に隣接する定常配列領域中のヌクレオチド数を反映させるために、８７ｎｔ  ｓｓＤＮＡを＃２２−４０−２５（８７ｇ２）と命名した。これらは、代替抗体分子の特異性鎖であり、８７量体の配列を以下に示し（上の鎖；配列番号９）、４８ｎｔオリゴヌクレオチド（安定化鎖）を以下に示す（下の鎖；配列番号１０）。
【化１】
2005517422.tif 000002
可変配列のいずれかの端の２つの定常領域ヌクレオチド配列は、並列した４８ｎｔの安定化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的である。安定化鎖は、ＦＩＴＣ標識５’であり、オリゴヌクレオチド（＃Ｆ２１−１０−１７）（太字の塩基は８７ｎｔ特異性鎖上の塩基と非相補性である）として参照される。
【０３１６】
ＤＩ水中でオリゴを０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）に再構成し、ストック溶液として２ｍｌネジ蓋バイアルにて−２０℃で保存した。（再構成安定性についての製造者の主張は６ヶ月超である）。各２０μｌの作業アリコートをＰＣＲ反応チューブに分注し、−２０℃で保存した。
【０３１７】
Ｂ．選択；サイクル１
４μｌの０．１ｍＭ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドＡ２２−４０−２５（すなわち、「＋８７」）ライブラリー（２．４×１０14分子）を、５’末端がＦＩＴＣ標識された４μｌの０．１ｍＭ  Ｆ２１−１０−１７（すなわち、「−４０」）および２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５（すなわち、５ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含むＴＮＫ緩衝液）緩衝液と混合した。ＴＮＫ緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．０）である。５×ストックは２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、６９０ｍＭ  ＮａＣｌ、１３．５ｍＭ  ＫＣｌを含み、ワーキング緩衝液（１×）は５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．７ｍＭ  ＫＣｌを含む。ＴＮＫ５Ｍｇは５ｍＭ  ＭｇＳＯ4（１Ｍ  ＭｇＳＯ4ストックの２００倍希釈物）を含む上記のＴＮＫであり、５×ＴＮＫ５Ｍｇは２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４（１Ｍ  ＭｇＳＯ4の４０倍希釈物）を含む５×ＴＮＫである。
【０３１８】
ＨＹＢＡＩＤ  ＰＣＲ  ＥＸＰＲＥＳＳサーマルサイクラーを使用して、ＳＡｂ分子をアニーリングした。オリゴ混合物を、９６℃で５分間加熱し、温度を２℃／秒の速度で６５℃に低下させ、この温度で２０分間維持した。次いで、温度を２℃／秒の速度で６３℃に低下させ、この温度で３分間維持した。次いで、温度を２℃／秒の速度で６０℃に低下させ、この温度で３分間維持した。次いで、温度を２℃／秒の速度で３℃ずつ低下させ、温度が２０℃に達するまで各温度で３分間保持した。６０℃から２０℃までの総時間は４０分である。総アニーリング時間は、１．５時間である。
【０３１９】
代替抗体の形成についてアッセイするために、電気泳動を使用した。各分離ゲル上で、ＦＡＭ−８７およびＦ−４８をロードして、対応するバンドおよびＳＡｂの位置を決定した。並行ゲル（または分離ゲルの他の半分）上に、各アニーリングＳＡｂのアリコート（０．５μｌ）の隣に１０ｂｐラダー、４８ｓｓ、８７ｓｓ、および保持ＰＣＲ産物。上記由来の１０μｌの反応混合物を、７μｌの６０％ｗ／ｖスクロースと混合した。混合物を、２０％アクリルアミドゲル上にロードした。４８ｎｔ（Ｆ２１−１０−１７）およびｄｓＳＡｂは、緑色蛍光バンドとして出現した。４８バンドは、約５０塩基対に泳動し、ｄｓＳＡｂは約３０４に泳動された。Ｓａｂの抽出後、ゲルをＥｔＢｒ（１０ｍｇ／ｍｌを１０ｍｌ緩衝液に溶解したうちの１μｌ）で染色する。標準的な分子量関数を使用して、約１５７ｂｐに８７バンドが出現する。
【０３２０】
ＳＡＢ８７／４８バンドを含むゲルフラグメントを切り出し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。滅菌ピペットチップを使用してゲル画分を浸漬させ、０．０５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０を含む４００μｌ  ＴＮＫＭｇ５緩衝液を添加し、サンプルを２時間／ＲＴの低速での回転プラットフォームで震盪する。ゲルスラリーを吸引し、Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｅｒ３００Ｋに添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１７Ｒ中にて１〜５０００×ｇ（７０００ｒｐｍ）で３分間スピンする。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む４０μｌのＴＮＫＭｇ５緩衝液を４４０μｌまで添加し、３分間遠心分離した。
【０３２１】
濾過物の体積を測定する。１０μｌアリコートの濾過物および９０μｌ緩衝液、ならびにＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ２、ｍｄｌ  １４２０（プログラム名「フルオレセイン（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ，１）」）を使用して、形成されたＳａｂのＲＦＵ（相対蛍光単位）を測定した。緩衝液のみのブランクも測定した。バックグラウンドを差し引き、適切な希釈計数および体積を掛けることにより総蛍光を計算した。
【０３２２】
２０μｌのＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１コンジュゲート体（１０％ＭｅＯＨｖ／ｖを含むＴＮＫＭｇ５  Ｔｗ０．０５中の１μｇ／μｌのコンジュゲート体濃縮物）と共に１／１０の体積（４０μｌ）のＭｅＯＨを濾過物に添加した。実施例５に概説するように、ＢＳＡ−ＡＡ−ＢＺ１０１コンジュゲート体を合成し、特徴付けた。サンプルを、１時間／ＲＴでインキュベートした。
【０３２３】
反応混合物を吸引し、新規のＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ遠心分離デバイスに添加し、１０００ｇ／３’で遠心分離した。（Ｎａｎｏｓｅｐ  １００Ｋおよび３００Ｋ遠心分離デバイスをＰＡＬＬ−Ｇｅｌｍａｎ（カタログ番号ＯＤ１００Ｃ３３）から購入し、ポリエチレン基質上にＯｍｅｇａ低タンパク質およびＤＮＡ結合修飾ポリエーテルスルホンを備えた遠心分離フィルターである。）フィルターを使用して、非結合ＳａｂからＢＳＡ−ＡＤ−ＢＺ１０１に結合したＳＡｂを分画した。保持物中のコンジュゲート体に結合したＳＡｂを回収し、非結合ＳＡｂは濾過物に保持された。濾過物を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加した。１００μｌの混合物を除去し、Ｗａｌｌａｃ  ＶｉｃｔｏｒＩＩを使用してマイクロウェルプレート中でＲＦＵを定量した。サイクル１について保持物を４００μｌアリコートのＴＮＫＭｇ５緩衝液（ＴｗｅｅｎおよびＭｅＯＨを含まない）を使用した１０００ｇ／３〜８’で１回だけ洗浄した（サイクル２については２回、サイクル３〜６については３回）。スピン時間は、フィルターごとに異なる（一般に、３〜８分間）。保持物はＳＡｂを確保し、濾過物およびプールを保持し、保持物ＲＦＵと一致させるために蛍光×体積を測定した。濾過物を破棄した。
【０３２４】
１００μｌアリコートのＤＩ  Ｈ2Ｏの添加、撹拌、および吸引によって保持物中のＳＡｂ（ＳＡｂがコンジュゲート体と結合する場合、ＭＷ＞１００ＫＤ）を回収した。回収した物質について総ＲＦＵを計算した。コンジュゲート物とインキュベートした開始量のＳＡｂ中の総量に対する総回収量の計算によって回収率を計算した。
【０３２５】
Ｂ．ＰＣＲ増幅
４０サイクルのＰＣＲ増幅プログラムおよび２μＭのプライマーＦ２２−５および２μＭのプライマーＢｉｏ２１−４を使用して保持物から回収したＤＮＡを増幅した。Ｂｉｏ２１−４は、−８７オリゴヌクレオチドの５’末端にビオチンを添加する。
【０３２６】
ＰＣＲプライマー。８７鎖（特異性鎖）のみを増幅し、且つ−４８鎖（安定化鎖）を増幅しないように、プライマーをデザインした。８７鎖に相補するが４８鎖に相補しない３’末端上に４〜５塩基を有することによってこれを行った。図７を参照のこと。非相補性の
４〜５塩基は、伸長の阻害に十分であった。
【０３２７】
ＰＣＲ増幅のために使用したプライマー配列を以下に示した。プライマーＦ２２−５は−８７鎖から増幅させて新規の＋８７鎖を作製し、配列：５’ＦＡＭ−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＴＣＴ  Ｃ３’（配列番号１１）を含む。プライマーＢｉｏ−２１−４は＋８７から増幅させてビオチン標識−８７を作製し、いくつかの実施形態では、これを使用して−４８にアニーリングしない−８７鎖を抽出することができる。Ｂｉｏ−２１−４の配列は、ｂｉｏ−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＡＴＣ  Ｔ３’（配列番号１２）である。
【０３２８】
プライマーを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ＥＢ）中で０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）に再構成し、ストック溶液として−２０℃で２ｍｌのネジ蓋付きバイアルに保存した（再構成物の安定性は６ヶ月超である）。２０μｌのワーキングアリコートを、ＰＣＲ反応チューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。
【０３２９】
ＰＣＲ反応：１０μｌの保持物を、２ｍｌ  ＰＣＲチューブに添加した。１０ｍＭの４つの各ヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）、１２μＬの５Ｍベタイン（Ｓｉｇｍａ  Ｂ−０３００）および１０μｌの１０ｐｍｏｌｅ／μｌの各プライマーの混合物を含む５μｌのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ  １０×緩衝液、１μｌＮＴＰストック溶液（ＰＣＲ  ｄＮＴＰ、ヌクレオチド三リン酸１０ｍＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １８４２７．０１３）を添加した。ＱＳを、ＤＩ  Ｈ2Ｏで４９．５μｌにした。以下のパラメーターでプログラムを実行した。３分、９４℃−６５℃−７２℃で３０秒をそれぞれ３５回、１０℃で保持。ＰＣＲ装置が９６℃で５μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（（ＮＥＢｉｏｌａｂｓカタログ番号ＭＯ２６７Ｓ）５Ｕ／μＬ）を添加し、反応物を混合し、ＰＣＲ装置にセットした。
【０３３０】
ＰＣＲ反応後、５μＬのＰＣＲ産物を、増幅およびバンドサイズを検証するための１０ｂｐラダーコントロールおよびｓｓオリゴと共に３％アガロース１０００ゲルまたは４％Ｅ−ゲルで泳動した。残存する増幅ＤＮＡを、１００％エタノールを使用した塩沈殿によって精製する。特に、１／３体積（１００μｌ）の８Ｍ酢酸アンモニウムを、２００μｌの増幅ＤＮＡに添加する。２．６倍の組み合わせ（ＤＮＡ＋酢酸アンモニウム）体積（約７８０〜８００μｌ）の冷無水エタノール（−２０℃）をチューブに添加する。チューブを撹拌し、氷上で１時間保存する。サンプルを、冷却遠心分離機で１５’／１４，０００ｇ／４℃で遠心分離する。ペレットに触れたり破壊することなく上清液を除去する。０．５ｍｌの７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを添加する。サンプルを穏やかに混合し、５’／１４，０００ｇで遠心分離する。ペレットを乱すことなく上清を除去し、室温での空気への曝露によって蒸発乾燥させる。
【０３３１】
保持物から選択したＤＮＡを増幅する場合、以下のコントロールも泳動する。ＤＮＡなし、８７のみ、および４８のみ。これにより、保持物由来のバンドが正しいサイズであり、プライマー二量体に起因しないことが確認される。ＳＡｂチューブ中で４８鎖が増幅されないこともまた示す。単独で、−４８は増幅し、−４８コントロールチューブで検出することができる。これにより、増幅した場合に、ＳＡｂチューブ中でｄｓ４８の位置が同定される。
【０３３２】
再アニーリング：４μｌの滅菌ＤＩ  Ｈ2Ｏ＋４μｌの０．１ｍＭ−４８ｎｔオリゴヌクレオチド（Ｆ２１−１０−１７）を含む８μｌの溶液の添加によって、ペレットを再構成した。サンプルを、０．２ｍｌＰＣＲチューブに移し、２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５緩衝液を添加した。（注意：過剰なＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔ）プライマーの添加により、所望の＋８７／−４８ＳＡｂ分子の形成が駆動される）。
【０３３３】
Ｂ．サイクル２〜６：ＳＡｂのアニーリング
アニーリングのために前に特定した温度プログラムを使用した０．２ｍｌＰＣＲチューブでの再構成物質の加熱によってｄｓＳＡｂをアニーリングした。第１のサイクル後、複数のバンドが出現する。したがって、切断されたバンドが実際に新規のＳＡｂであることを確認するために、並行ＳＡｂアリコートをその対応するＰＣＲ開始鎖と共に泳動した。ＳＡｂバンドがｄｓ８７／４８であることを確認するために、アリコートを除去し、変性ゲル（１６％、２×尿素サンプル緩衝液中でボイル）で泳動し、分離ゲル由来のバンドが８７鎖および４８鎖の両方を含むことを確認した。
【０３３４】
１２０ｖで４０分間電気泳動を行った。７μｌの６０％ｗ／ｖスクロースを、１０μｌのＤＮＡと混合し、サンプルをロードした。５’末端にＦＩＴＣを有する任意のＤＮＡ成分（すなわち、ＳＡｂ  ８７／４８、ｄｓ４８およびｓｓ４８）が、長波長下で緑色蛍光バンドとしてゲル上に出現する。サイズマーカーとして利用可能なレーン中に５ｐＭｏｌのＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔプライマー）を泳動した。ＳＡｂは、２０％アクリルアミド未変性ゲルにおいて２５０〜３００ｎｔのｄｓＤＮＡと同時に移動することが認められた。ＳＡｂ−ゲル部分を切り出し、２５０μｌのＴＮＫＭｇ５Ｔｗ０．０５緩衝液中に浸漬させた。サンプルを、低速の回転プラットフォームで撹拌しながら２時間／ＲＴでインキュベートした。
【０３３５】
ゲル上清をＰａｌｌ  ３００Ｋ遠心分離デバイスに移し、１〜５０００ｇ／３’で遠心分離してポリアクリルアミドを除去した。保持物を、５０μｌアリコートの緩衝液の添加によって洗浄し、１０００ｇ／３’で遠心分離した。その後の選択サイクルで使用するために、濾過物からＳＡｂを回収する。
【０３３６】
１００μｌアリコートの濾過物を使用してＳＡｂおよび緩衝液ブランクのＲＦＵをＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２によって上記のように測定した。
【０３３７】
Ｃ．選択サイクル２〜７
サイクル１で１／１０体積のＭｅＯＨおよび２０μｌのＢＺ１０１−ａａ−ＢＳＡ（１μｇ／μｌ）を添加する。サンプルを１時間インキュベートし、Ｐａｌｌ  １００Ｋフィルターを使用して選択する。サイクル２については２回およびサイクル３〜６については３回洗浄後、保持物のＲＦＵを測定した。バックグラウンドＲＦＵを差し引くことにより、回収率を決定する。
【０３３８】
ネガティブセレクション。この実施例では、サイクル番号１〜６でＢＳＡを使用したネガティブセレクションを行わなかった。
【０３３９】
ネガティブセレクションを所望する場合、２５０μｌのＳＡｂ  ８７／４８濾過物（ＦＩＴＣによって２〜２０ｐＭｏｌ）を、２０μｌの１μｇ／μｌ（２０μｇ）ＢＳＡ溶液と混合した。サンプルを、３０’／ＲＴでインキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ  ＩＩプログラムを使用して１００μｌアリコート中のＲＦＵを測定した。
【０３４０】
２５０μｌの上記反応混合物（１６％非変性ＰＡＧＥおよび８Ｍ尿素を使用した８％変性ＰＱＧＥのために２０μｌを確保する）を、Ｎａｎｏｓｅｐ１００Ｋ遠心分離濃縮器に添加した。フィルターを、１０００ｇ／１５’／ＲＴで遠心分離した。濾過物中の総体積は、約２４０μｌであった。濾過物を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。１００μｌアリコートのＲＦＵをチェックした。
【０３４１】
２００μｌ  ＴＮＫＭｇ５緩衝液の添加によってフィルターを洗浄し、遠心分離し（１０００ｇ／１０’／ＲＴ）、遠心分離後にさらに２００μｌの同一の緩衝液を添加し、再度遠心分離し、１００μｌの同一の緩衝液を添加し、再度遠心分離した。１００μｌのＤＩ  Ｈ2Ｏを添加し、濾過し、撹拌し、保持物を吸引した。保持物の吸引によってＢＳＡに結合したＳＡｂのＲＦＵをＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ  ＩＩによって決定し、回収率を決定した。
【０３４２】
２００μｌのネガティブセレクションを行った濾過物を、ＴＮＫＭｇ５緩衝液中に懸濁した２０μｌ（１μｇ／μｌ）のＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０コンジュゲート体を混合した。総体積約２２０μｌの混合物を１時間／ＲＴでインキュベートした。反応溶液を新規のＮａｎｏｓｅｐ１００Ｋ遠心分離デバイスに添加し、１０００ｇ／３’で遠心分離した。ＴＮＫＭｇ５緩衝液を使用して３回洗浄した。非結合（遊離）ＳＡｂの比率を決定するために、１００μｌアリコートの濾過物のＲＦＵを測定した。
【０３４３】
１００μｌのＤＩ  Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、撹拌し、保持物を吸引した。全サンプルをマイクロタイタープレートのウェルに入れた。サンプルのＲＦＵおよびバックグラウンドを測定し、回収率を計算した。
【０３４４】
さらなるステップ。１００μｌアリコート中に回収した１〜２０％の結合ＳＡｂを、プライマーを使用したＰＣＲ増幅に使用した。前に記載のように、これにより、それぞれ５０μｌ含まれる４つのチューブ中にｄｓＤＮＡを再度作製する。ＳＡｂ集団において回収率がさらに増大しなくなるまで負および正の選択サイクルを繰り返した。
【０３４５】
コンジュゲート体添加前のポリクローナルＳＡｂライブラリーとの遊離ハプテンの予備インキュベーションおよびその後の増幅のための濾過物の回収によってさらなるサイクルを実施することができる。高ＭｅＯＨ、界面活性剤、低ｐＨ、および／または塩の増加におけるＳＡｂおよびコンジュゲート体のインキュベーションによって親和性富化のサイクルを実施することができる。コンジュゲート体に結合した高親和性の残存ＳＡｂを増幅する。１．結合、２．特異性富化、３．親和性の増大およびその後のモノクローナルＳＡｂクローンの産生によってポリクローナルＳＡｂ産生プロセスを進行させる。
【０３４６】
計算。コンジュゲート体とインキュベートした場合に存在するＲＦＵの総量に対する回収されたコンジュゲート体結合アリコート中の総ＲＦＵ量を決定した。ネガティブセレクションのために、ＢＳＡとインキュベートした場合に総ＲＦＵ量に対する回収したＢＳＡ結合アリコート中のＲＦＵ量を決定した。濾過物から定量したＲＦＵから非結合ＳＡｂおよび濾過デバイスでのロスを示すデータおよび補助的情報が得られる。
【０３４７】
注釈：サイクル番号２〜５におけるＤＮＡ／コンジュゲート体比およびＤＮＡ／ＢＳＡ比は、１０〜１００ｎＭ  ＤＮＡ／２，０００ｎＭタンパク質（すなわち、２０〜２００分子のコンジュゲート体またはＢＳＡに対して１分子のＳＡｂ）であった。この計算により、コンジュゲート体が１モルのタンパク質あたり報告された２０モルのＢＺ１０１を有すると推測される。（ＳＡｂ  ８７／４８−−ＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１）複合体の分子量＝（Ａ２２−４０−２５＝２１７．４Ｋｄ）＋（ＦＭ２１−１０−１７＝１５．４Ｋｄ）＋（ＢＳＡ＝６７Ｋｄ）＋（２０ＢＺ１０１＝７Ｋｄ）。総量＝約１１６．８Ｋｄ；２ＳＡｂ１：１コンジュゲート体＝約１５９．６Ｋｄ。
〔実施例５〕
【０３４８】
ＰＣＢ同族体ＢＺ１０１に対する代替抗体７８／４８の調製
隣接定常ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔランダム配列結合ループを有する二量体代替抗体分子を形成するための自己構築オリゴヌクレオチド鎖（７８ｎｔ＋４８ｎｔ）を使用して代替抗体（ＳＡｂ）分子を産生した。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合／遊離の分離、および構築／再アニーリングサイクルを使用して、ＢＳＡ−アジポイル−ＢＺ１０１コンジュゲート体および非結合ＢＺ１０１（２，２’、４，５，５’ペンタクロロビフェニル）ハプテンに結合する分子を有するＳＡｂ集団を富化した。
【０３４９】
Ａ．バックグラウンド
ＰＣＢは、２０９種の異なる分子構成（同族体）で存在し得る塩素化芳香族化合物である。より高度に塩素化された種は、高温での酸化に比較的安定であり、１９２９年から１９７７年まで冷媒として使用されていた。この期間中、その１２個の炭素ビフェニル核および塩素の平均比率を反映させて命名された混合同族体Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）生成物（例えば、Ａｒｏｃｌｏｒ  １２４２、１２４８、１２５４など）として１４億ポンドが製造販売された。今日、これらの化合物は遍在する環境汚染物質であり、変換器、産業用機械、および家庭用電化製品、コンプレッサ、塗料、断熱材、接着剤、および化学処理装置で使用されている。１９７６年制定の有害物質規制法（ＴＳＣＡ）でその廃絶についての法的枠組みが確立されたが、以前の汚染、新規の流出、および汚染物質の継続的廃棄が続いている。ＰＣＢは、難分解性有機汚染物質（ＰＯＰ）として分類されており、その廃絶を調整する国際協定の起草が試みられている。
【０３５０】
ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）は、内分泌かく乱物質として分類されている。これらは、エストロゲン（外因性エストロゲン）を模倣し、内分泌性ホルモンバランスを崩す。雄の性的発達はアンドロゲンに依存し、ＰＣＢに起因するアンドロゲン／エストロゲン比の不均衡が生殖器成長を阻害すると考えられている。ＰＣＢは子宮の神経発達の欠損に関連し、ＰＣＢ汚染魚を消費した母親の胎児の健康が懸念されている。母乳中にもＰＣＢが見出されており、新生児の曝露源である。研究により、ＰＣＢの出生前曝露により精神および身体が異常をきたすことが示された。他の影響は、出産体重の低さ、甲状腺および免疫機能の変化、ならびに神経への悪影響である。他の研究により、新生児へのＰＣＢの継続的曝露により成人男性の男性ホルモン機能が低下することが示唆される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｅｌｌ  ３３：１６９−７７）。
【０３５１】
健康への影響についての特定の懸念は、甲状腺依存性脳発達の臨界期におけるＰＣＢによる甲状腺機能の変化に起因する神経毒性である。この期間は、分娩前から分娩後２年までである。甲状腺機能は、神経成長に必要な細胞骨格系の構築および安定性ならびに大脳皮質および海馬のコリン作動系およびドーパミン作動系の発達を制御する。ＰＣＢへの曝露により、甲状腺が肥大し、それに付随して循環チロキシン（Ｔ４）レベルが減少する。可能性のある原因は、選択された同族体と甲状腺ホルモンとの間の構造類似性および高親和性のトランスサイレチンなどの輸送タンパク質に結合するＰＣＢの能力である。ＰＣＢは、甲状腺受容体と結合した場合にアゴニストおよびアンタゴニストとして作用することが示された。甲状腺障害に起因する神経への影響およびＰＣＢおよびダイオキシン曝露後に報告された影響は、非常に類似しており、共通の機構が示唆される。
【０３５２】
ＥＰＡ参照方法に記載の３つの同族体（ＢＺ１３８、１５３、１８０）は、２つの核受容体への結合に対する天然のリガンドとの競合によって性ホルモン制御を妨害する。これらの同族体はまた、エストロゲンおよびアンドロゲン受容体に対して異なる親和性を有し、細胞増殖（ｎＭ）および阻害（μＭ）の両方を有することができる。ＰＣＢは、子宮内膜症の発症が疑われる作用因子であり、免疫抑制性が示されており、発癌性を示し得る。発癌は、ダイオキシンについてＰｏｌａｎｄ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒｓと同一の経路を介したＡｈ受容体（アリール炭化水素）への結合によって媒介されると考えられる。
【０３５３】
ＰＣＢアレイのために開発された本発明の代替分子は、アプタマーと天然の抗体との特性を組み合わせている。これらの分子は、核酸組成に由来し、定常領域および疎水性結合溝を有する安定な二次構造を保持する。任意の組み合わせの結合溝配列を有する分子の予め形成されて連続的に富化されたライブラリーを、標的に結合するライブラリーを増幅するように分画する。モノクローナル抗体手順により、特徴づけ、同定、配列決定、および合成のための均一な分子が産生される。調製プロセスにより、開発時間の有意な減少が予想される。複数の標識と簡単に結合するように分子をデザインした。動物は使用せず、動物応答の誘導は必要ない。ＰＣＲまたは直接的合成によって産生する。代替抗体分子は、環境からのＰＣＢの排除を促進し、持続的な公衆衛生病原体を除去する。
【０３５４】
Ｂ．材料と方法
Ｉ．選択；サイクル１
代替抗体の形成。以下の実験で使用する代替抗体のライブラリーを、以下のように形成した。ランダム４０ｎｔ配列ならびにＦＩＴＣ（Ｆ）およびビオチン化（Ｂ）プライマーを含む７８ｎｔ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーを、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。７８ｎｔ  ｓｓＤＮＡを、可変領域に隣接する定常配列領域中のヌクレオチド数を反映させて＃１７−４０−２１と命名した。４８ｎｔオリゴヌクレオチド（すなわち、安定化鎖；配列番号１４）と共に７８量体配列（すなわち、親和性鎖；配列番号１３）を以下に示す。
（７８ｎｔオリゴヌクレオチド（上の鎖として示す））
【化２】
2005517422.tif 000003
（４８ｎｔオリゴヌクレオチド（下の鎖として示す））
可変配列のいずれかの端の２つの定常領域のヌクレオチド配列は、並列４８ｎｔ安定化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列に相補的である。ＦＩＴＣ標識５’−オリゴヌクレオチド（＃Ｆ２１−１０−１７）の太字の塩基は、７８ｎｔ鎖上の塩基に非相補的である。ＤＩ水中で０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）のオリゴを再構成し、ストック溶液として２ｍｌのネジ蓋付きバイアルにて−２０℃で保存した。
【０３５５】
４μｌの０．１ｍＭ  ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドＡ１７−４０−２１（すなわち、「＋７８」）ライブラリー（２．４×１０14個の分子）（すなわち、特異性鎖）を、５’末端でＦＩＴＣ標識した４μｌの０．１ｍＭ  Ｆ２１−１０−１７（すなわち、「−４０」）（すなわち、安定化鎖）および２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５（すなわち、５ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含むＴＮＫ緩衝液）緩衝液と混合した。ＴＮＫ緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ８．０）である（１×ストックは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、および２．７ｍＭＫＣｌを含む）。ＴＮＫＭｇ５緩衝液は、ＴＮＫ緩衝液＋５ｍＭ  ＭｇＳＯ4を含む。
【０３５６】
ＨＹＢＡＩＤ  ＰＣＲ  ＥＸＰＲＥＳＳサーマルサイクラー（プログラム名：「Ｐｒｉｍｅｒ」）を使用してＳＡｂ分子をアニーリングした。オリゴ混合物を９６℃で５分間加熱し、この温度を２℃／秒の速度で６５℃に低下させ、この温度を２０分間維持する。次いで、温度を２℃／秒で６３℃に低下させ、この温度を３分間維持する。ついで、温度を２℃／秒で６０℃に低下させ、この温度を３分間維持する。ついで、温度を２℃／秒で３℃ずつ低下させ、温度が２０℃に達するまで各温度で３分間保持した。６０℃から２０℃までの総時間は４０分である。
【０３５７】
１０μｌの上記由来の反応混合物を、７μｌの６０％ｗ／ｖスクロースと混合し、１ｍｍの１６％アクリルアミドゲル（１９：１のアクリルアミド：メチレンジサリチルアミド）にロードした。長波ＵＶ−３６６ｎｍブラックレイランプモデルＵＶＬ−５６を使用してゲルを試験した。緑色蛍光バンドとして４０ｎｔ（Ｆ２１−１０−１７）およびｄｓＳＡｂが出現する。
【０３５８】
「ＳＡｂ  ７８／４８」バンドをゲルから切り出し、ゲル画分を、０．０５ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０を含む４００μｌのＴＮＫＭｇ５緩衝液中に浸漬した。ゲルスライスを、低速のボルテックスにて２時間／室温で震盪した。
【０３５９】
ゲルスラリーを吸引し、ゲル懸濁液をＡｍｉｃｏｎ（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）遠心分離デバイスに添加し、１０００ｇ／１０’でスピンした。０．０５％Ｔｗｅｅｎを含む４０μｌのＴＮＫＭｇ５緩衝液を添加し、サンプルを１０００ｇ／１０’で遠心分離した。総体積は、４４０μｌ以下である。
【０３６０】
４０μｌのＭｅＯＨを濾過物に添加した。抗体量を定量するために、１００μｌアリコートの濾過物およびＷａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ２、ｍｄｌ  １４２０（プログラム名「Ｆｌｕｏｒｏｃｅｉｎ（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ，１）」）を使用してＲＦＵ（相対蛍光単位）を測定した。
【０３６１】
全ＳＡｂ濾過物を、Ｎａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ遠心分離デバイス（Ｐａｌｌ−Ｇｅｌｍａｎ）に添加し、１０００ｇ／５’で遠心分離した。１００μｌアリコートの上記濾過物を使用して、ＲＦＵを定量した。
【０３６２】
ＩＩ．代替抗体の選択
上記由来の濾過物を、２０μｌのＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１コンジュゲート体（１μｇ／μｌのコンジュゲート体濃度）を含むＴＮＫＭｇ５  Ｔｗ０．０５（１０％ＭｅＯＨｖ／ｖを含む）を含む０．２ｍｌのＰＣＲチューブに添加した。ＢＳＡ−ＡＡ−ＢＺ１０１コンジュゲート体を、下記のように合成した。最終濃度１０％ｖ／ｖのメタノールを添加した。最終濃度０．０５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を添加した。サンプルを、１時間／ＲＴでインキュベートした。
【０３６３】
反応混合物を吸引し、新規のＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ遠心分離デバイスに添加し、１０００ｇ／１０’で遠心分離した。使用したＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ遠心分離デバイス（カタログ番号ＯＤ１００Ｃ３３  ＰＡＬＬ−Ｇｅｌｍａｎ、ポリエチレン基質上にポリエチレンスルホンを修飾したＯｍｅｇａ低タンパク質およびＤＮＡ結合の遠心分離フィルター）は、非結合ＳＡｂからのＢＳＡ−ＡＤ−ＢＺ１０１に結合したＳＡｂを分画することができた。コンジュゲート体に結合したＳＡｂが保持物中に回収され、非結合ＳＡｂは通過して濾過物となった。濾過物を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに添加した。１００μｌを取り出し、Ｗａｌｌａｃ  ＶｉｃｔｏｒＩＩを使用してマイクロウェルプレート中でＲＦＵを定量した。２００μｌアリコートのＴＮＫＭｇ５緩衝液（ｔｗｅｅｎおよびＭｅＯＨなし）を使用して保持物を１０００ｇ／１０’で３回洗浄した。濾過物を破棄した。
【０３６４】
保持物中のＳＡｂ（ＳＡｂがコンジュゲート物に結合した場合、ＭＷは１００ＫＤ超）を、１００μｌアリコートのＤＩＨ2Ｏの添加、撹拌、および吸引によって回収した。回収物質についての総ＲＦＵを計算した。コンジュゲート物とインキュベートしたＳＡｂの総開始量に対する総回収量の計算によって回収率を決定した。
【０３６５】
ＩＩＩ．ＰＣＲ増幅
４０サイクルのＰＣＲ増幅プログラムならびに２μＭのプライマーＦＭ１３−２０および２μＭのプライマーＢｉｏＭ１３Ｒ４８を使用して、保持物から回収したＤＮＡを増幅させた。ＢｉｏＭ１３Ｒ４８は、＋７８オリゴヌクレオチドの５’末端にビオチンを付加する。ＰＣＲ反応により、＋７８、−４８ｎｔ、−７８ｎｔ、および＋４８ｎｔ鎖が増幅され、それによってＳＡｂの理論的収量が減少する。
【０３６６】
ＰＣＲ増幅に使用したプライマー配列を以下に示す。プライマー＃ＦＭ１３−２０（配列番号１５）は配列５’ＦＩＴＣ−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴ３’を有し（ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオシアネートである）、プライマー＃ＢｉｏＭ１３Ｒ４８（配列番号１６）は配列５’Ｂｉｏ−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧＡ３’（Ｂｉｏはビオチンである）を有する。ＤＩ中で０．１ｍＭ（１００ｐｍ／μｌ）のプライマーを再構成し、ストック溶液として２ｍｌのネジ蓋付きバイアル中にて−２０℃で保存した。
【０３６７】
１００μｌの保持物を、０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブに添加した。２０μｌのＴｈｅｒｍｏｐｏｌ  １０×緩衝液、４μｌ  ＮＴＰストック溶液、および４μｌの１００ｐｍｏｌｅ／μｌの各プライマーを添加した。ＤＩ  Ｈ2Ｏで最終体積を２００μｌにした。サンプルを混合し、ＰＣＲ装置に入れた。温度が９６℃に到達したとき、プログラムを中止し、１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液と共に２μｌのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（エクソヌクレアーゼ陰性）ＤＮＡポリメラーゼストック溶液（２単位／μｌ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓカタログ番号Ｍ０２５９Ｓ）を添加した。１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液は、１０ｍＭ  ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８、２℃）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む。装置中で９６℃に予め加熱した空の５０μｌＰＣＲチューブに反応混合物を等分した。総増幅時間は、約２．５〜３時間であった。
【０３６８】
等量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール溶液（２５：２４：１ｖ／ｖ）での抽出によって増幅ＤＮＡを精製した。２００μｌの増幅ＤＮＡを、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。２００μｌの抽出溶液をチューブに添加した。チューブを撹拌し、５’／１２，０００ｇで遠心分離した。上清（緩衝液層）を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。
【０３６９】
吸引したＤＮＡ溶液を、１００％エタノールを使用した塩沈殿に供する。１００μｌの８Ｍ酢酸アンモニウムを、約２００μｌの吸引ＤＮＡに添加した。２．６倍の組み合わせ（ＤＮＡ＋酢酸アンモニウム）体積（約７８０〜８００μｌ）の冷無水エタノール（−２０℃）をチューブに添加した。チューブを混合し、氷水中で３０分間保存した。サンプルを、１５’／１２，０００ｇで遠心分離した。上清を、吸引し、破棄した。０．５ｍｌの７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを添加し、サンプルを５’／１２，０００ｇで遠心分離した。ペレットを崩壊させないように上清を除去し、室温での空気への曝露によって蒸発乾燥させた。４μｌの滅菌ＤＩ  Ｈ2Ｏ＋４μｌの０．１ｍＭプライマー（Ｆ２１−１０−１７）を含む８μｌの溶液の添加によって、ペレットを再構成した。サンプルを、０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブに移し、２μｌの５×ＴＮＫＭｇ５緩衝液を添加する。所望の＋７８／−４８ＳＡｂ分子の形成を優先する過剰なＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔ）プライマーの添加によって代替抗体を再形成させた。
【０３７０】
ＩＶ．ＳＡｂのアニーリング
アニーリングのために前に特定した温度プログラムを使用した０．２ｍｌ  ＰＣＲチューブ中での再構成物質の加熱によって、ｄｓＳＡをアニーリングした。１０μｌのＤＮＡを含む７μｌの６０％ｗ／ｖのスクロースおよびロードサンプルを、１６％アクリルアミドゲルにロードした。長波長（ＵＶ−３６６ｎｍ  ＢＬＡＫ−ＲＡＹ  ＬＡＭＰモデルＵＶＬ−５６）下で緑色蛍光バンドとして５’末端にＦＩＴＣを有する任意のＤＮＡ成分（すなわち、ＳＡｂ７８／４８、ｄｓ４８、およびｓｓ４８）がゲル上に出現する。サイズマーカーとして５ｐＭｏｌのＦ２１−１０−１７（−４８ｎｔプライマー）もゲルに泳動した。ＳＡｂ  ７８／４８の５００〜６００ｎｔのｄｓＤＮＡとの同時移動が認められる。ＳＡｂ−ゲル片を切り出し、浸漬し、２５０μｌのＴＮＫＭｇ５  Ｔｗ０．０５緩衝液をサンプルに添加した。次いで、サンプルを、低速のボルテックスで撹拌しながら２時間／ＲＴでインキュベートした。
【０３７１】
ゲル懸濁液をＡｍｉｃｏｎＰＣＲ遠心分離デバイスに移し、１０００ｇ／１０’で遠心分離してポリアクリルアミドを除去した。５０μｌアリコートの緩衝液の添加によって保持物を洗浄し、１０００ｇ／１０’で遠心分離した。濾過物から回収したＳＡｂを、次の選択サイクルで使用する。１００μｌアリコートの濾過物を使用したＦＵによってＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２にてＳａｂを定量した。
【０３７２】
Ｖ．選択サイクル２〜７
サイクル番号１でＢＳＡを使用したネガティブセレクションを行わなかった。ネガティブセレクション混合物は、２０μｌの１μｇ／μｌ（２０μｇ）のＢＳＡ溶液と共に２５０μｌのＳＡｂ  ７８／４８濾過物（ＦＩＴＣによって２〜２０ｐＭｏｌ）を含む。サンプルを３０’／ｒｔでインキュベートし、Ｗａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ  ＩＩを使用して１００μｌアリコートのＲＦＵを測定した。
【０３７３】
２５０μｌの上記反応混合物（１６％未変性ＰＡＧＥおよび８Ｍ尿素を含む８％変性ＰＡＧＥのために２０μｌを確保する）をＮａｎｏｓｅｐ１００Ｋ遠心分離機に添加する。濾過物を、１０００ｇ／１５’／ＲＴで遠心分離した。濾過物中の総体積は、約２４０μｌであった。濾過物を吸引し、新規の１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。１００μｌアリコートのＲＦＵを決定した。
【０３７４】
２００μｌ  ＴＮＫＭｇ５緩衝液の添加によって濾過物を洗浄し、遠心分離し（１０００ｇ／１０’／ＲＴ）、遠心分離後にさらに２００μｌの同一緩衝液を添加した。サンプルを再構成し、１００μｌの同一緩衝液を添加した。サンプルを再度遠心分離した。１００μｌ  のＤＩ  Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、撹拌し、保持物を吸引する。保持物の吸引および回収率の決定によって、Ｗａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ  ＩＩにてＢＳＡに結合したＳＡｂのＲＦＵを決定した。
【０３７５】
２００μｌの負に選択された濾過物を、２０μｌ（１μｇ／μｌ）のＴＮＫＭｇ５緩衝液中に懸濁されたＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０コンジュゲート体と混合した。サンプルを、１時間／ＲＴでインキュベートした。反応物の総体積は２２０μｌである。
【０３７６】
新規のＮａｎｏｓｅｐ  １００Ｋ遠心分離デバイスに反応溶液を添加し、１０００ｇ／１５’で遠心分離した。ＴＮＫＭｇ５緩衝液を使用してフィルターを３回洗浄した。非結合（遊離）ＳＡｂの比率と共に１００μｌアリコートの濾過物のＲＦＵを決定した。
【０３７７】
１００μｌのＤＩ  Ｈ2Ｏをフィルターに添加し、撹拌し、保持物を吸引した。全サンプルをマイクロタイタープレートのウェルに入れ、ＲＦＵおよび回収率を測定した。
【０３７８】
ＰＣＲ増幅のために、プライマー＃ＢｉｏＭ１３Ｒ４８（１００ｐＭｏｌ）およびＦＭ１３−２０（１００ｐＭｏｌ）と共に１００μｌアリコート中で回収した１〜２０％の結合ＳＡｂを使用した。これにより、それぞれ５０μｌの上記を含む４つのチューブ中でｄｓＤＮＡが再度作製される。ＳＡｂ集団中で回収率がさらに増大しなくなるまで負および正の選択サイクルを繰り返す。
【０３７９】
遊離ハプテンのポリクローナルＳＡｂライブラリーとの予備インキュベーション、その後のコンジュゲート体の添加、およびその後の増幅のための濾過物の回収によってさらなるサイクルを行うことができる。高ＭｅＯＨ、界面活性剤、低ｐＨ、および／または高濃度の塩の存在下でのＳＡｂおよびコンジュゲート体のインキュベーションによって親和性増加サイクルを行うことができる。コンジュゲート体に結合した残存高親和性ＳＡｂを増幅した。ポリクローナルＳＡｂの産生プロセスは、１）結合、２）特異性の増大、および３）モノクローナルＳＡｂクローン産生前の親和性の増大によって進行する。
【０３８０】
ＶＩ．計算
コンジュゲート体とインキュベートした場合に存在する総ＲＦＵ量に対する回収されたコンジュゲート体結合アリコート中の総ＲＦＵ量は、代替抗体の結合率を示す。
【０３８１】
ネガティブセレクションのために、ＢＳＡとインキュベートした場合に存在する総ＲＦＵ量に対する回収されたＢＳＡ結合アリコート中のＲＦＵ量を決定する。
【０３８２】
さらなる計算は、非結合ＳＡｂおよび濾過デバイスでのロスを示すデータおよび情報が得られる濾過物から定量したＲＦＵを含む。
【０３８３】
サイクル番号２〜５におけるＤＮＡ／コンジュゲート体比およびＤＮＡ／ＢＳＡ比は、１０〜１００ｎＭ  ＤＮＡ／２，０００ｎＭタンパク質（すなわち、２０〜２００分子のコンジュゲート体またはＢＳＡに対して１分子のＳＡｂ  ７８／４８）であることにさらに留意のこと。この計算により、コンジュゲート体が１モルのタンパク質あたり報告された２０モルのＢＺ１０１を有すると推測される。さらに、（ＳＡｂ  ８７／４８−−ＢＳＡ−ａａ−ＢＺ１０１）複合体の分子量は、約１１３．４Ｋｄである（（Ａ１７−４０−２１＝２４Ｋｄ）＋（ＦＭ２１−１０−１７＝１５．４Ｋｄ）＋（ＢＳＡ＝６７Ｋｄ）＋（２０ＢＺ１０１＝７Ｋｄ）。２ＳＡｂ：１コンジュゲート体の分子量は、約１５２．８Ｋｄであり、１ＳＡｂ：２コンジュゲート体の分子量は、約１８９．４Ｋｄである。
【０３８４】
Ｃ．結果
図１に示す代替抗体の産生を開始させて、ステム−ループ構造を有するアプタマーよりも万能なコア分子が得られた。デザインには、結合特異性ドメインをまとめた定常領域ドメインが組み込まれている。多オリゴヌクレオチド構造により、複数の標識（例えば、ＦＩＴＣ、ビオチン）（同一であっても同一でなくてもよい）を簡単に結合させることが可能である。複数の自己指示且つ自己形成結合溝を容易に組み込むことができる。結合鎖から離れた安定化鎖により、必要に応じて化学修飾のための都合のよい部位が付与される。
【０３８５】
標的とのインキュベーション前の「安定化鎖」への「特異性鎖」のアニーリングによって代替抗体が形成される。結合する分子を、「特異性鎖」を優先的に富化する非対称ＰＣＲを使用して増幅する。定常配列（「安定化鎖」）を付加し、別の選択サイクルのために代替分子をアニーリングする。
【０３８６】
結合ループ中のヌクレオチド数を変化させる「結合鎖」を使用して、代替抗体を構築することができる。これらの各分子は、異なる結合溝および固有の結合配置を有する。図８は、「特異性」および「安定化」プライマーの異なる組み合わせを使用して構築した代替抗体の電気泳動の移動度を示す。フルオレセイン標識した「安定化鎖」（略語「Ｆ」）おおび非標識「特異性鎖」（略語「Ａ」）を、これらの分子の産生で使用した。この組み合わせは、フルオレセイン標識した「安定化」鎖およびアニーリング分子の電気泳動移動度の有意な変化を示す。
【０３８７】
分子の二本鎖の性質および約１：１の比「特異性」鎖および「安定化」鎖を検証するために、未変性アクリルアミドゲル電気泳動を使用して特徴付けた代替抗体を、変性ゲル（８％アクリルアミド、８Ｍ尿素）を使用して再度特徴付けた。
【０３８８】
図１０は、８、９、および１０サイクルでのＢＳＡ−ＰＣＴ（ＢＺ１０１同族体）に対する代替抗体の選択および富化を示す。シグナル／負のコントロールは、標的が存在しない（負のコントロール）場合に回収された代替抗体の量に対する標的に結合した代替抗体の量の比率として示す。
【０３８９】
Ｄ．所見および結論
非極性ＢＺ１０１同族体に対する代替抗体の結合親和性は、分子および疎水性相互作用にデザインされた結合ループ／溝の結果であると考えられる。βシクロデキストリンによるＰＣＢ同族体の高親和性結合を示した他の実験と類似の所見である。感受性が予想よりも高いことにより、疎水性結合、水素結合、静電気結合、およびファンデルワールス結合の相乗効果も示唆することができる。ＢＺ１０１−ＢＳＡコンジュゲート体の結合、比較的低濃度の遊離ＢＺ１０１によって誘導された結合の有効な阻害は、特に興味深かった。データにより、選択時に使用されたコンジュゲートリガンドの制限された優先的結合および同一結合の化学的性質を最後の免疫アッセイのレポーター分子で使用することができるが示唆される。これは、典型的には、ハプテン特異的免疫アッセイ（優先的に抗体が結合する場合）の開発時に利用可能なオプションではなく、レポーター分子および免疫原が同一の架橋の化学的性質を共有する場合にアッセイの感度が低くなる。所見は、選択方法の汎用性およびＳＡｂライブラリーからの架橋およびキャリア結合分子の排除能力を示す。データは、通常の処理限界未満の濃度でＥＰＡ特異的ＰＣＢ同族体に優先的に結合することができる新規の結合試薬の迅速な生産を示す。
〔実施例７〕
【０３９０】
アレイでの代替抗体の使用
表１に示した同族体に対する５つのモノクローナル代替抗体試薬を、Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）免疫アッセイアレイのために調製する。オイルまたは溶媒を含む複合ＰＣＢサンプルを試験するアンプルを作製する。
【０３９１】
【表１】
2005517422.tif 000004
【０３９２】
５つの免疫アッセイ（それぞれ方法８０８２特定同族体の１つをターゲティングする）を開発する。５つの試験によって得られた固有の応答プロフィールを使用して、Ａｒｏｃｌｏｒの存在を同定する。作製された複合物のシグナルを使用して、Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）濃度を定量する。産生された５つのモノクローナル代替抗体由来のポリクローナル試薬を使用して単一ウェルの「総ＰＣＢ」アッセイを構築する。
【０３９３】
試験の特徴の提案：Ｆｒａｍｅ（Ｆｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４６８Ａ−４７５Ａ）によって公開されたＡｒｏｃｌｏｒ（登録商標）複合物データおよびＥＰＡ領域Ｖ（Ｆｒａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  １９：６５７−６８８）を使用して、固有に予想および検出可能な応答プロフィールが集合的に得られる標的同族体を選択した。表２は、５つの各ＥＰＡ特定Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）中の同族体の重量組成比を示す。
【０３９４】
【表２】
2005517422.tif 000005
【０３９５】
表３は、サンプル中の総Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）濃度が１０ｐｐｍである場合の各同族体のモル濃度を示す（固形廃棄物のＥＰＡ−ＯＳＷＥＲ調節作用レベル）。
【０３９６】
【表３】
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【０３９７】
この濃度により各免疫アッセイのＫａを概算し、代替抗体はその各用量反応曲線の中間（Ｂ50）で同族体を検出する必要がある。試験のために引用したいくつかの適用には、２ｐｐｍ（２〜４倍の親和性に必要な濃度）の実際の定量限度が必要である。ＢＺ１０１免疫アッセイデータおよびアプタマーの親和性で引用した文献に基づいて、代替抗体を使用して開発した免疫アッセイにより、さらなる分析前濃縮ステップを使用しないで必要な実際的検出限度が達成されなければならない。表４は、各Ａｒｃｌｏｒ（登録商標）の選択された同族体の相対分布を示し、図１１は、選択されたＡｒｏｃｌｏｒ（登録商標）のためにアレイが得た固有の同族体応答プロフィールを示す。
【０３９８】
【表４】
2005517422.tif 000007
【０３９９】
代替抗体の開発：
代替抗体開発のための図１０で同定した５つの同族体を以下に基づいて選択した。
１．予想される代替抗体結合定数に適合可能な濃度（注釈；開発されたサンプル処理化学によりＰＣＢを濃縮し、それにより結合Ｋａと必要なアッセイ検出範囲との間の相違が克服される）。
２．固有のＡｒｏｃｌｏｒ（登録商標）分布プロフィール（注釈；ガスクロマトグラフィ参照方法で使用した方法でのＡｒｏｃｌｏｒ（登録商標）に対する免疫アッセイの固有の応答プロフィールを使用する）
３．ＥＰＡ参照方法８０８２におけるその引用
４．Ａｒｏｃｌｏｒ１２４８ａおよび１２４８ｇならびに１２５４ａおよび１２５４ｇとほぼ同濃度の同族体（注釈；第１の作製された産物はこれらの下位集団を区別しない）。
【０４００】
選択サイクル前に代替抗体分子をビオチン−プライマーを使用して非標識または標識することができる一方の鎖および５’末端をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識された他方の鎖を有する二本鎖オリゴヌクレオチドに構築する（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＮＡＲ  ２８：１９６３−１９６８）。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２多標識リーダーを使用して、ＦＩＴＣ標識鎖の濃度を定量し、ＳＡｂを構築する。未変性アクリルアミドゲル（１６％）を使用して、アニーリングしたＦＩＴＣ標識鎖に対する比アニーリング鎖の移動度の変化によってＳＡｂの構築を確認する。８％アクリルアミドゲルおよび８Ｍ尿素を使用した電気泳動を使用して、アニーリングした二本鎖分子の同一性を確認する。成分の総蛍光に対する切り出したＳＡｂゲル画分中のＳＡｂ関連蛍光の決定によって構築されたＳＡｂの収量および回収率を定量する。
【０４０１】
最初の非選択集団を同族体−ＢＳＡコンジュゲート体とインキュベートして、結合集団を増幅する。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）を使用した「サイズ排除」濾過法を使用して、コンジュゲート体に結合したＳＡｂを結合していないものから分離する。非結合分子は通過して濾過物となる。体積および蛍光を定量し、この画分を破棄する。体積および蛍光について保持物中の分子を同様に定量し、ＰＣＲ増幅に使用する。総開始蛍光に対する保持物中の相対蛍光量を、回収率（結合量／総量の比率）として計算する。
【０４０２】
一方をＦＩＴＣで標識した２つのプライマーを使用してＰＣＲを行う。ＦＩＴＣプライマーを使用して、正の同族体結合鎖を産生する。４０サイクルの増幅、Ｄｅｅｐ−Ｖｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ（無エクソヌクレアーゼ）、およびＮＴＰを使用して標準的なＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物を、フェノール／クロロホルム抽出を使用して精製し、ＮａＡｃ：ＥｔＯＨ沈殿によるタンパク質（例えば、ポリメラーゼ）を除去し、産物を濃縮する。「安定化」プライマー（ビオチンを含む／含まない）を４〜１０倍モル過剰の濃度で精製ＰＣＲペレットの「結合鎖」に添加する。９５℃／５’、６５℃／２０’、６０℃／５’、５５℃／５’でサーマルサイクラーを使用して混合物をアニーリングし、１℃／１’の速度で室温に冷却する。６５℃のアニーリング温度を使用して、８０℃の範囲のＴｍを有する二本鎖ＳＡｂの形成を優先させる。電気泳動前の密度を増大させるためにスクロース緩衝液（７μｌ、６０％）をＳＡｂに添加する。未変性電気泳動（１６％アクリルアミド、１００Ｖ、ＲＴ）を使用して、他の成分由来のＳＡｂを分画する。蛍光スキャニングおよび移動度（Ｒｆ）によってゲル上にＦＩＴＣ標識ＳＡｂを位置付け、選択のために切り出す。緩衝液の添加、２時間のインキュベーション、およびＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）濾過後に浸漬ゲルからＳＡｂを抽出する。
【０４０３】
同族体−ＢＳＡコンジュゲート体を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）カラムによって最初に濾過する。濾過物中に認められたコンジュゲート体を破棄し、保持物中のコンジュゲート体を選択用に回収する。処理したコンジュゲート体（１０〜２０μｌ）を、精製ＳＡｂとインキュベートし、ＲＴ／６０’でインキュベートする。インキュベートした溶液を濾過し、保持物中のＳＡｂを回収し、ＦＩＴＣについて定量し、増幅する。結合／総ＳＡｂの比率を再度計算する。エクソヌクレアーゼＩとのインキュベーションを使用して、二本鎖構造の形成および使用を証明する（注釈；ＳＡｂ分子はこの酵素による分解に耐性を示すはずである）。Ｂ／Ｔ率がさらに富化されなくなるまで選択サイクルを持続する。
【０４０４】
特異性の富化により、誘導化ＢＳＡキャリアを認識する代替抗体が除去される。富化した結合集団を、非コンジュゲートＢＳＡとのインキュベーションサイクルおよびその後のＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）濾過に供する。保持物中の非特異的オリゴヌクレオチドを破棄し、濾過物中のこれらをベースラインタンパク質結合が得られるまで再処理する。負の土壌サンプルのメタノール抽出物の添加およびその後の標的コンジュゲート体の添加によって類似のサイクリングを実施する。増幅のためにコンジュゲート体に結合した代替抗体を回収する。非コンジュゲート標的同族体最終サイクルのインキュベーション、濾過、および濾過物中のＳＡｂの増幅により、誘導認識のないポリクローナル試薬が得られる。選択緩衝液中の１０％ＭｅＯＨの一貫した使用により親和性が増大し、最後の免疫アッセイにおいてより高いＰＣＢ濃度が得られる。ＭｅＯＨの使用についての公開データは水に対する二重らせんの制限された脱安定性を示し（Ａｌｂｅｒｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０：１４１３−８）、疎水性結合は二本鎖安定性の主な構成要素ではないことが示唆される（Ｈｉｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ９：２０８６−９４）。
【０４０５】
富化ポリクローナル試薬からモノクローナル代替抗体を産生する。ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ  Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、３’末端に１つのデオキシアデノシン（Ａ）を有する分子をライゲーションする。１つの配列インサートを各ベクターにライゲートし、１つの配列を有する各細菌コロニーを産生する。ベクター配列中のα−ペプチドの存在により、表示プレート上で組換えクローンの直接色素スクリーニングを行う。ＰＣＲフラグメントを含むクローンは、白色または青色コロニーを産生する。前に使用したＰＣＲ増幅およびアニーリングプロトコールを使用して、モノクローナル代替抗体を含む各ウェルを産生する。次に、各ウェルを特徴付ける。
【０４０６】
特徴づけおよび方法の開発：
蛍光検出に適切な黒色マイクロプレートを、選択のために使用したコンジュゲート体−ＢＳＡコンジュゲート体で受動的にコートする。ＳＡｂの優先的コンジュゲート体結合が認められた場合、塩素原子の位置または数を変化させるようにコンジュゲート体を修飾する。標準的な検証プロトコールを使用して、親和性、同族体架橋性、存在し得る関連化合物またはその他に対する架橋性、およびマトリクス干渉に基づいて分子を選択する。ＳＡｂのパフォーマンスを比較してアレイのために１つまたは複数を選択するためのデータベースを準備する。試験のための複数のモノクローナル試薬とポリクローナル試薬との組み合わせによっていくらかでも得られるパフォーマンスの利点を概説および考察する。選択した代替抗体分子を配列決定し、合成して必要なアレイ開発材料を得る。
【０４０７】
特徴づけ方法は、一本鎖または二本鎖のＦＩＴＣ標識代替抗体分子の検出に依存する。免疫アッセイプロトコールでは、溶液中で標準、サンプル、コントロールと共に代替抗体分子をインキュベートする。標的コンジュゲート体でコートしたマイクロタイタープレートのウェルに反応混合物を添加し、２％ＢＳＡでブロックする。１５〜３０分後、内容物を取り出し、ウェルをＴｗｅｅｎ（登録商標）２０を含む緩衝液で洗浄する。Ｗａｌｌａｃ  ＶｉｃｔｏｒＩＩ多標識リーダーを使用してシグナルを定量する。１０％ＭｅＯＨ−Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液中の２倍希釈物の試験によって代替抗体の力価を定量する。代替抗体の希釈および５０％結合阻害（Ｂ50／ＥＤ50）を示す１０ｐｐｍの同族体から構成されるアッセイを使用して、用量−応答特性を計算する。５つの同族体標準を使用して、用量応答曲線を作成する。ｙ＝ｍｘ＋ｂにデータを外挿するデータのロジットｌｏｇ変換を使用して曲線を線形化する。競合結合アッセイの定量範囲は、典型的にはＢ80（すなわち、８０％コンジュゲート体結合）からＢ20（２０％結合）までである。濃度範囲は、代替抗体のＫａに依存して１から２ｌｏｇの範囲である。ロジットｌｏｇライン（ｌｏｇ  ｌｉｎｅ）の相関係数（ｒ2）から評価する検量線の線形性を評価する。相関係数（０．９５以上）および２つの標準のエラー率（１５％以下）の検量線を、検証パラメータ（例えば、感度、架橋率）のために使用する。
【０４０８】
予備架橋率は、標的同族対への代替抗体結合を５０％阻害するのに必要な非標識同族体の濃度を定義する。この比を架橋反応率として示す。アレイを開発するために、１０％未満の架橋度の抗体を選択する。可能な架橋反応物として「明細書（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｈｅｅｔ）」に列挙した化合物を使用して、類似の研究を行う。種々のサンプル行列を使用したスパイク回収（ｓｐｉｋｅ−ｒｅｃｏｖｅｒｙ）研究により、相対マトリクス効果を評価する。最小検出用量（ＬＤＤ）、最小検出限界（ＭＤＬ）、部分的定量限界（ＰＱＬ）として示した感度を、複数の負のサンプルの同時試験から得た複数（例えば、ＬＤＤ＝２σ）のシグナル標準偏差に等しい外挿同族体濃度としてとして計算する。予想応答プロフィールを使用して検出能力および一貫性を検証するために１０ｐｐｍ以下の濃度でＡｒｏｃｌｏｒ（登録商標）を試験する（図１１）。
【０４０９】
各同族体の検出のための代替抗体試薬を合わせ、隣接するウェルに固定した５つのコンジュゲート体を有するマイクロタイタープレートと共に使用する。ウェルを分離するために非コンジュゲートＢＳＡを固定し、コントロールとして使用する。アッセイを使用して、Ａｒｏｃｌｏｒ（登録商標）標準およびスパイクされたマトリクスを試験する。プロフィールアレイデータを収集し、Ａｒｏｃｌｏｒに対するピーク高さの研究を行い、収集する。Ａｒｏｃｌｏｒ同定アッセイ形式と対照的に、各マイクロタイターウェルへの５つの同族体コンジュゲート体混合物の固定によって総ＰＣＢを評価する。サンプルを混合抗体試薬とインキュベートし、混合コンジュゲート体ウェルおよびＢＳＡコントロールウェルに添加する。予備的感度、架橋製、マトリクス干渉、回収率の特徴を評価するために、標準ＦＤＡおよびＥＰＡ検証プロトコールを行う。
〔実施例８〕
【０４１０】
ＩｇＧを認識するリガンド結合代替抗体試薬の作製方法
実施例５に概説するように、隣接する定常ヌクレオチド配列を有する４０ｎｔのランダム特異性ドメイン配列を有するニ量体分子を形成するための自己構築オリゴヌクレオチド鎖（８７ｎｔ＋４８ｎｔ）を使用して、代替抗体（ＳＡｂ）分子を産生した。リガンド結合、ＰＣＲ増幅、結合／遊離の分離、および構築／再アニーリングのサイクルを使用して、ＳＡｂ集団にＩｇＧポリペプチドに結合する分子を富化させた。選択方法は、実施例１で詳細に考察している。
【０４１１】
図１２は、ＩｇＧに対する代替抗体の選択および富化を示す。シグナル／負のコントロールは、標的が存在しない（負のコントロール）場合に回収された代替抗体の量に対する標的に結合した代替抗体の量の比率として示す。
【０４１２】
以下の引例は、全ての目的のために参照することによりその全体が本明細書中に組み込まれる。
Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（２２）４５８１−４５８８
Ｐｅｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ，３７７（１）：６７−７０
Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．７０２（１−２）：６９−７６
Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １（４）：２３５−４２
Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ６：５１９−２３
Ｊａｙａｓｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４５；９：１６２８−１６５０
Ｄｏｕｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２７（３）：２８９−９７
Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．
【０４１３】
明細書中に記載の全ての刊行物および特許出願は、本発明に属する当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が参照することによりあたかも具体的且つ個別に組み込まれる用に示されるような範囲において、参照することにより本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０４１４】
【図１】リガンド結合溝を形成するヌクレオチド配列から構成された１つまたは複数の特異性領域（ＳＰ）を境にする並列したオリゴヌクレオチド鎖（Ａ、Ａ’、Ｄ、およびＤ’）から構成された１つまたは複数の安定化領域（ＳＴ）を含む代替抗体（ＳＡｂ）分子を示す図である。この実施形態では、上の鎖（特異性鎖）は２つの定常領域（ＡおよびＤ）に隣接する特異性領域（ＳＰ）を含む。下の鎖（安定化鎖）は、各定常領域（ＡおよびＤ）と相互作用する２つの安定化領域（Ａ’およびＤ’）に隣接するスペーサー領域を含む。
【図２】複数の特異性領域（ＳＰ領域ループ）、安定化領域（ＳＴ）、およびスペーサー領域（Ｓ）を含む代替抗体分子の２つの実施形態を示す図である。
【図３】複数の特異性領域（ＳＰ領域ループ）、安定化領域（ＳＴ）、およびスペーサー領域（Ｓ）を含み、且つ集合的に多次元リガンド結合が得られる代替抗体分子の４つの実施形態を示す図である。
【図４】サイズの異なるＳＰ領域ループを含む代替抗体分子への標的リガンドの結合を示す略図である。
【図５】天然の抗体と比較して結合親和性および特異性を増大させるための代替抗体の能力を示す略図である。
【図６】代替抗体の１つの調製方法の略図である。
【図７】代替抗体の非限定的な増幅方法を提供する。この実施形態では、「Ｆ４８」は安定化鎖（配列番号１）を含み、「Ｆ２２−４０−２５（８７）」は特異性鎖（配列番号２）を含む。安定化鎖は、特異性鎖に対して５つのヌクレオチドミスマッチ（斜線ボックス）を含む。適切なプライマー（Ｂ２１−４０、配列番号３およびＦ１７−５０、配列番号４）と組み合わせたこのミスマッチにより、ＰＣＲ増幅時の安定化鎖の増幅が抑制される。この方法についてのさらなる詳細は、実施例４で見出される。
【図８】特異性および安定性プライマーの異なる組み合わせを使用して構築した代替抗体の電気泳動の移動度を示す図である。
【図９】分子の二本鎖の性質を評価するための変性ゲルを使用した代替抗体の特徴づけを示す図である。
【図１０】８、９、および１０サイクルでのＢＳＡ−ＰＣＴ（ＢＺ１０１同族体）コンジュゲート体に対する代替抗体の選択および富化を示す図である。シグナル／負のコントロールは、標的が存在しない場合（負のコントロール）に回収される代替抗体の量に対する標的に結合した代替抗体の量を百分率として示す。
【図１１】アレイが選択されたＡｒｏｃｌｏｒｓ（登録商標）を産生する固有の同族体応答プロフィールを示す図である。
【図１２】ＩｇＧに対する代替抗体の選択および富化を示す図である。シグナル／負のコントロールは、標的が存在しない場合（負のコントロール）に回収される代替抗体の量に対する標的に結合した代替抗体の量を百分率として示す。
【配列表】
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2005517422.tif 000012
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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