(57)【要約】非Aβポリペプチドに連結されたAβポリペプチドを含んでいる組成物、ならびにそのような組成物を用いる方法について述べている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβ(Aβ)ポリペプチドおよび非Aβポリペプチドを含んでなる組成物であって、該Aβポリペプチドおよび該非Aβポリペプチドが連結されている、組成物。
【請求項２】
該組成物がさらに製薬上許容される担体または添加剤を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該非Aβポリペプチドが抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
該抗体がFabフラグメントを含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
該抗体が単鎖Fv抗体フラグメントを含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
該抗体がF(ab)2フラグメントを含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
該抗体がアミロイドに対して特異的結合アフィニティーを有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
該抗体が放射性同位体または造影剤で標識されたものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
該抗体が造影剤で標識されたものである、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
該非Aβポリペプチドが酵素またはサイトカインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
該酵素が抗酸化酵素である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
該抗酸化酵素がカタラーゼまたはスーパーオキシドジスムターゼである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
該非Aβポリペプチドがレプチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
該サイトカインがインターフェロンまたはインターロイキンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
該サイトカインが神経栄養因子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１６】
該Aβポリペプチドおよび該非Aβポリペプチドが共有結合で連結されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
該Aβポリペプチドが配列番号１の残基1-40、1-42、または1-43を含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
アルツハイマー病と診断された患者を治療する方法であって、該方法が該患者にアルツハイマー病を治療するために有効な組成物の量を投与することを含んでなり、該組成物はAβポリペプチドおよび該Aβポリペプチドに対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体を含んでなる、方法。
【請求項１９】
該抗体がFabフラグメントを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該抗体が単鎖Fv抗体フラグメントを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
該抗体がF(ab)2フラグメントを含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
アルツハイマー病と診断された患者を治療する方法であって、該方法が該患者にアルツハイマー病を治療するために有効な抗体の量を投与することを含んでなり、該抗体はポリアミンで修飾されておりAβポリペプチドに対して特異的な結合アフィニティーを有するものである、方法。
【請求項２３】
患者がアルツハイマー病であるか診断する方法であって、該方法がa)該患者に組成物を投与すること、ここで該組成物はAβポリペプチドおよびアミロイドに特異的な結合アフィニティーを有する抗体を含んでなり、該抗体は標識されたものであり、ならびにb)該患者の脳内でアミロイドに結合した該抗体の存在または不在を検出すること、ここで該患者は該患者の脳内での標識されたアミロイドの存在に基づいてアルツハイマー病と診断される、方法。
【請求項２４】
該検出ステップが診断的造影法を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該診断的造影法が、陽電子放射断層法、γ-シンチグラフィー、単光子放出コンピューター断層撮影、核磁気共鳴映像法、機能的核磁気共鳴映像法、または脳磁図を含んでなるものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該診断的造影法が核磁気共鳴映像法を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
該アミロイドがβ-アミロイド斑を含んでなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
該抗体が造影剤で標識されたものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
該造影剤がガドリニウム、ジスプロシウム、および鉄からなる群から選択されたものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該造影剤がガドリニウムである、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルツハイマー病(AD)などの中枢神経系(CNS)障害を治療するための組成物、より特定して述べれば、β-アミロイドでない(非Aβ)ポリペプチドに連結されたβ-アミロイド(Aβ)ポリペプチドを含んでいる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Aβペプチド、またはそれらのAβペプチドに特異的なモノクローナル抗体が関与する受動免疫および能動免疫はADの治療および予防に用いるか評価されてきた。能動免疫によってAβの蓄積を低減させるとマウスの認知行動を改善する。例えば、Chenら, Nature, 408:075-979(2000); Janusら, Nature, 408:979-982(2000); およびMorganら, Nature, 408:982-985(2000)を参照せよ。宿主が産生するAβに対する抗体が脳の老人斑を除去する機作については全く判明していない。能動免疫の実験にはフロイントの完全アジュバントを用いるが、これはそれ自体が、注射後2〜3週後にIgGを含む血清タンパク質の脳血管関門(BBB)を通過する漏出を誘発し、ヒトにおけるアジュバントとして用いることはできない。受動免疫の研究は脳血管関門が強固なためうまくいかず、この関門では免疫グロブリンの通過が制限されている。IgGの透過係数 x 表面積(PS)の積はラットで調べられ、非常に低い値(0.03〜0.1 x 10-6 mg/g/sec)であることが見出され、それは受動拡散または液相エンドサイトーシスの輸送機作であるとの考え方に整合していた。
【発明の開示】
【０００３】
本発明はAβ-免疫複合体が抗体単独の場合よりも速い速度で、受容体がメディエートするプロセスを介してBBBを横切って輸送されるという発見に基づいている。従って、Aβに対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体のBBBを横切る輸送、またはBBBでの透過性の低いその他のポリペプチドの輸送は、それらをAβポリペプチドと連結させて増大させることができる。その結果、ADおよびその他のCNS障害について受動免疫および治療の成功の可能性が高まる。Aβに対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体をポリアミンで修飾したものもまた、BBBでの透過性が増大し、ADの受動免疫および治療に用いることができる。
【０００４】
1態様においては、本発明はAβポリペプチドと非Aβポリペプチドを含んでいる組成物を特色とし、その組成物では、Aβポリペプチドと非Aβポリペプチドは連結されている(例えば、共有結合で)。その組成物にはさらに、製薬上許容される担体または添加剤を含むことができる。該非Aβポリペプチドは抗体またはそのフラグメントとすることができる(例えば、Fabフラグメント、単鎖Fv抗体フラグメント、またはF(ab)2フラグメント)。その抗体は放射性同位体または造影剤で標識することができる。その抗体はアミロイドに対して特異的な結合アフィニティーを有するものとすることができる。該非Aβポリペプチドはまた、抗酸化酵素(例えば、カタラーゼもしくはスーパーオキシドジスムターゼ)などの酵素、インターフェロン、インターロイキン、もしくは神経栄養因子などのサイトカイン、またはレプチンとすることもできる。該Aβポリペプチドは配列番号１の1-40、1-42、または1-43の残基のものを含むようにすることができる。
【０００５】
本発明はまた、ADと診断された患者の治療方法をも特徴としている。その方法には、ADを治療するために有効な組成物の量を該患者に投与することを含んでおり、その組成物はAβポリペプチドおよびそのAβポリペプチドに対して特異的な結合アフィニティーを有している抗体を含んでいる。その抗体はFabフラグメント、単鎖Fv抗体フラグメント、またはF(ab)2フラグメントとすることができる。
【０００６】
別の1態様においては、本発明はADと診断された患者の治療方法を特徴とする。該方法にはADを治療するために有効な量の抗体を患者に投与することを含んでおり、その方法では、該抗体はポリアミンで修飾されたものであり、Aβポリペプチドに対して特異的な結合アフィニティーを有している。
【０００７】
また別の1態様においては、本発明は患者がADであるか診断する方法を特徴とする。その方法は組成物を患者に対して投与することを含んでおり、その組成物はAβポリペプチドおよびアミロイドに対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体を含んでおり、その抗体は標識されており、患者の脳内のアミロイドに結合した抗体の存在または不在をその標識で検出し、標識されたアミロイドの存在に基づいてその患者がADであるか診断される(例えば、標識されたアミロイドはβ-アミロイド斑などに沈着する)。検出ステップには診断的造影(例えば、陽電子放射断層法、γ-シンチグラフィー、単光子放出コンピューター断層撮影、核磁気共鳴映像法、機能的核磁気共鳴映像法、脳磁図など)を含むことができる。核磁気共鳴映像法が特に有用である。抗体は造影剤(例えば、ガドリニウム、ジスプロシウム、または鉄)で標識することができる。ガドリニウムが特に有用である。
【０００８】
特に定義しない限りは、本明細書中に用いている技術的および科学的用語は全て、本発明が属する業界の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載したものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施に用いることができるが、適切な方法および材料については下記に述べる。本明細書中で言及した公表物、特許出願、特許、およびその他の参照文献は全てその全体を本明細書中に参照により組み入れる。対立点があるような場合には、定義の部分を含め本明細書が優先する。
【０００９】
本発明の他の特徴および利点については下記の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかなものとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、非AβポリペプチドのBBBを横切る輸送を増大させるために用いることのできるAβポリペプチドを含んでいる組成物を特徴とする。本明細書に記載のとおり、モノクローナル抗体に結合したAβを含んでいる組成物のBBB透過性は、そのモノクローナル抗体単独の透過性よりも有意に大きい。特定の作用機作に束縛されることはないが、Aβそれ自体が、抗体のBBBを横切る輸送を可能とする原因となっているのであろう。このように、Aβは他のポリペプチドのBBBでの透過性を増大させるために用いることができ、その結果として本発明の組成物は、AD、パーキンソン病、前頭側頭部痴呆(例えばピック病)、アミロイド多発ニューロパシー、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、Gerstmann- Straussler-Scheinker症候群、および致死性家族性不眠症などの伝播性海綿状脳症(すなわち、プリオン病)、多発性硬化症などの脱髄性疾患、ならびに筋萎縮性側索硬化症などの神経変性性障害の診断、治療、および/または予防に用いることができる
Aβ組成物
本発明の組成物には、精製非Aβポリペプチドに連結された精製Aβポリペプチドが含まれる。本明細書中では、「精製された」という用語は、ポリペプチドであって、そのポリペプチドに天然の状態では会合している細胞性成分(例えば、そのもの以外のポリペプチド、脂質、炭水化物、および核酸など)から分離されたポリペプチドを意味している。精製ポリペプチドはその天然状態での環境から取り出されたなんらかのポリペプチドであって、少なくとも75%の純度のもの(例えば、少なくとも約80、85、90、95、または99%の純度のもの)である。典型的には精製ポリペプチドは、非還元のポリアクリルアミドゲル上で単一の主要バンドを示すこととなるものである。
【００１１】
本明細書で用いている「Aβポリペプチド」とは、1) 天然のヒトAβポリペプチド(DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IAT、配列番号１)、2) 天然のヒトAβポリペプチドのアミノ酸配列に1箇所以上の置換または挿入を有するものであってBBBを横切る能力を保持しているもの、ならびに3) 1)および2)のフラグメントであってBBBを横切る能力を保持しているものを意味する。AβポリペプチドのBBBにおける透過性は、実施例１の方法に従って評価することができる。また。Podusloら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:2218-2222 (1992)、およびPodusloら, Neurobiol. Disease 8:555-567 (2001)をも参照せよ。天然のヒトAβポリペプチドはその長さがアミノ酸39個から43個の範囲であり(配列番号１の残基1から39、1から40、1から41、1から42、または1から43)、アミロイド前駆タンパク質(APP)のタンパク分解産物である。ヒトAβ中に導入しうるアミノ酸の置換の例としては、限定されるものではないが、配列番号１のアミノ酸残基の5、10、13、19、および20の位置での置換、またはそれらの組み合わせが含まれる。特に、5の位置のアルギニンをグリシンで置換することができ、10の位置のチロジンをフェニルアラニンで置換することができ、13の位置のヒスチジンをアルギンで置換することができる。このような置換はヒトAβポリペプチドの性質を変化させない。Fraserら, Biochemistry 31:10716-10723 (1992)、およびHilbichら, Eur. J. Biochem. 201:61-69 (1992)を参照せよ。19および20の位置のフェニルアラニン残基を、イソロイシン、ロイシン、トレオニン、セリン、アラニン、バリン、またはグリシンで置換することができる。
【００１２】
Aβポリペプチドの適切な断片とは、その長さが約6から38個のアミノ酸残基であり(例えば、その長さが10から36、10から34、10から30、12から28、14から26、16から24、または18から22個のアミノ酸残基のもの)、BBBを横切る能力を維持しているものである。例えば、Aβポリペプチドは配列番号１の1から10、1から15、1から20、5から15、5から20、5から25、10から20、10から25、10から30、15から25、15から30、 または15から35の残基を含んだものとすることができる。あるいはまた、Aβポリペプチドは配列番号１の残基の20から30、20から35、20から40、25から35、25から40、30から40、25から42、または30から42の残基を含んだものとすることができる。
【００１３】
Aβポリペプチドは共有結合を介して非Aβポリペプチドと連結させることができる。共有結合で架橋させる技法は当業界では既知である。例えば、「タンパク質のコンジュゲーションと架橋の化学」"Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking", Shan S. Wong, CRC Press, Ann Arbor, 1991を参照せよ。適切な架橋剤はAβポリペプチドのそれと同種の受容体への結合を妨害しないものであって、反応性、特異性、スペーサーアーム長、膜透過性、切断の容易性、および溶解性の適切なものが選択される。同様にして、適切な架橋剤は非Aβポリペプチドのそれの結合相手(例えば、巨大分子上の同種の受容体、またはエピトープ)との結合を妨害しないものである。架橋剤はPierce Chemical Co., Rockford, ILを含む多数の供給者から市販されている。
【００１４】
Aβポリペプチドと非Aβポリペプチドは、例えばホモ二価性架橋剤であるグルタルアルデヒド、またはヘテロ二価性架橋剤を用いて共有結合で架橋させることができる。グルタルアルデヒドはそのアミノ部分を介してポリペプチドを架橋させる。ホモ二価性架橋剤(例えば、ホモ二価性イミドエステル、ホモ二価性N-ヒドロキシスクシニミジル(NHS)エステル、またはホモ二価性スルフヒドリル反応性架橋剤など)は2個以上の同一の反応性部分を含んでおり、それは1段階で行う反応法で用いることができ、その反応法では該架橋剤は連結されるポリペプチドの混合物を含有している溶液中に添加される。ホモ二価性NHSエステルおよびイミドエステルはアミン含有のポリペプチドを架橋する。穏和なアルカリ性のpH条件では、イミドエステルは第１アミンのみと反応してイミドアミドを形成し、架橋されたポリペプチドの全体としての電荷は影響を受けない。ホモ二価性スルフヒドリル反応性架橋剤としては、ビス-マレイミドヘキサン(BMH)、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(DFDNB)、および1,4-ジ-(3',2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミドブタン(DPDPB)が含まれる。
【００１５】
ヘテロ二価性架橋剤は2つ以上の異なる反応部分(例えば、アミン反応性部分およびスルフヒドリル反応性部分)を有し、ポリペプチドのうちの一方とアミン反応性部分またはスルフヒドリル反応性部分を介して架橋し、次いで前記の反応で用いなかった方の反応部分を介してもう一方のポリペプチドと反応する。多数のヘテロ二価性ハロアセチル架橋剤が利用でき、例えばピリジルジスルフィド架橋剤がある。カルボジイミドはヘテロ二価性架橋剤の古典的な例であり、カルボキシルをアミンと結合させてアミド結合をもたらす。
【００１６】
あるいはまた、Aβポリペプチドは抗体などの非Aβポリペプチドと、その抗体のAβポリペプチドへの特異的結合アフィニティーを介して連結させることができる。精製Aβポリペプチドおよび抗体を適切なバッファー (例えばリン酸塩緩衝食塩液) 中で37℃で共にインキュベートして免疫複合体を形成させることができる。そのような免疫複合体は本発明の1組成物をなす。
【００１７】
Aβポリペプチドはどのような非Aβポリペプチドとも連結させることができ、とりわけ、CNSの障害を診断または治療するために有用ないかなるポリペプチドとも連結させることができる。非Aβポリペプチドはその長さが少なくともアミノ酸残基6個のものである。例えば、Aβポリペプチドは例えば抗酸化酵素などの酵素と連結させることができ、その抗酸化酵素は細胞を活性酸素種から防護するものである。抗酸化酵素の例としては、限定はされないが、カタラーゼ(E.C. 1.11.1.6)、スーパーオキシドジスムターゼ(E.C.1.15.1.1)、グルタチオンペルオキシダーゼ(E.C.1.6.4.2)、およびグルタチオンレダクターゼ(E.C.1.11.1.9)が挙げられる。
【００１８】
Aβポリペプチドはまた、インターフェロン(例えば、インターフェロンα、β、またはγ)、インターロイキン(IL)(例えば、IL-1aもしくはb、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、またはIL-12)、ニューロトロフィン(例えば神経成長因子または脳由来神経栄養因子)などの神経栄養因子、コリン作動性分化因子、毛様体神経栄養因子、オンコスタチンM、細胞増殖促進因子、および汗腺因子などの神経新生因子、グリア細胞系神経栄養因子などの増殖因子ペプチドなどのサイトカイン、またはレプチンなどのホルモンと連結させることができる。
【００１９】
さらに、Aβポリペプチドは抗体と連結させることができる。例えば、AβポリペプチドはAβのアミロイド沈着、またはプリオンタンパク質(PrP)の沈着に対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体と連結させることができる。Aβに特異的な結合アフィニティーを有する抗体の例については、米国特許第5,231,000号および米国特許第5,262,332号を参照せよ。PrPのプロテアーゼ抵抗性の形態に対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体の例については、Zanussoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:8812-8816(1998)を参照せよ。本明細書で用いている「抗体」という用語には、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、および単鎖Fv抗体フラグメント、Fabフラグメント、およびF(ab)2フラグメントなどの抗体フラグメントが含まれる。モノクローナル抗体は特に有用である。キメラ抗体は異なる部分が異なる動物種由来のものである分子であり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域を有する分子などである。キメラ抗体は標準的な技法によって作成することができる。
【００２０】
抗体フラグメントは既知の技法で作成することができる。例えば、F(ab')2フラグメントは抗体分子のペプシン消化によって作成することができ、FabフラグメントはF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作成することができる。あるいはまた、Fab発現ライブラリーを構築することができる。例えば、Huseら, Science, 246:1275(1989)を参照せよ。単鎖Fv抗体フラグメントはFv領域の重鎖および軽鎖のフラグメントをアミノ酸架橋(例えば、15から18個のアミノ酸)を介して連結させて単鎖のポリペプチドとすることによって作成することができる。例えば、米国特許第4,946,778号を参照せよ。
【００２１】
いくつかの実施形態においては、該Aβポリペプチドおよび/または非AβポリペプチドはCNS障害の診断を容易にするために標識される。そのために有用な典型的な標識としては、ヒトでの造影法に用いられる放射性同位元素および造影剤が含まれる。そのような標識としては、限定はされないが、123I(ヨウ素)、18F(フッ素)、99mTc(テクネシウム)、111In(インジウム)、および67Ga(ガリウム)などの放射性同位元素、ならびにガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム(disprosium)、および鉄などの造影剤が含まれる。放射性のGdの同位体(153Gd)も利用でき、ヒト以外の哺乳類の造影法には適している。ポリペプチドは標準的な技法で標識することができる。例えば、ポリペプチドはクロラミン-Tまたは1,3,4,6-テトラクロロ-3α,6α-ジフェニルグリクリル(diphenylglycouril)を用いてヨウ素化することができる。フッ素化には、ポリペプチドを合成し、その合成の間にフッ素イオン置換反応によって、フッ素を添加する。放射性同位元素を伴うタンパク質の合成についての総説は、Muller-Gartner, H., TIB Tech., 16:122-130 (1998)およびSaji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 16(2):209-244 (1999)を参照せよ。
【００２２】
ポリペプチドはまた、標準的な技法を用いて造影剤で標識することもできる。例えば、ポリペプチドは、Gdジエチレントリアミン五酢酸(GdDTPA)またはGdテトラアザシクロドデカン四酢酸(GdDOTA)などの低分子量のGdキレートを該ポリペプチドに結合させることによってGdで標識することができる。Caravanら, Chem. Rev. 99:2293-2352(1999)、およびLaufferら, J. Magn. Reson. Imaging 3:11-16(1985)を参照せよ。抗体は、例えばポリリジン-Gdキレートを抗体に結合させることによってGdで標識することができる。例えば、 Curtetら, Invest. Radiol. 33(10):752-761(1998)を参照せよ。あるいはまた、抗体は、Gdキレーター脂質を含んでいる常磁性の重合リポソームをアビジンおよびビオチニル化した抗体とインキュベートすることによってGdで標識することができる。例えば、Sipkinsら, Nature Med., 4 623-626(1998)を参照せよ。
【００２３】
Aβおよび非Aβポリペプチドをコードする核酸
本発明のAβおよび非Aβポリペプチドをコードする核酸分子の単離されたものは標準的な技法で作成することができる。本明細書中では「単離された」とは、Aβまたは非Aβポリペプチドをコードする遺伝子の一部または全部に対応する配列であって、哺乳類のゲノム中でそれらの野生型の遺伝子の片側または両側に通常は隣接している配列を含まないものを意味する。単離された核酸は、例えば組換えDNA分子とすることができるが、天然のゲノム中で通常はそのDNA分子に直接的に隣接していることが認められる核酸配列の一方または双方を除去した、または欠いているものであるという条件が付く。従って、単離された核酸としては、限定はされないが、他の配列からは独立の別の分子(例えば、cＤＮＡまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって作成されたゲノムDNA断片)、ならびに、ベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス)中に組み込まれた、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれた組換えDNAが含まれる。さらに、単離された核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸の一部分である組換えDNA分子が含まれる。数百から数百万の他の核酸、例えばcDNAもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムDNA制限酵素消化産物を含んでいるゲル切片などの中に存在する単一の核酸は単離された核酸とは見なさない。
【００２４】
単離された核酸分子はその長さが少なくとも約18個のヌクレオチド数のものである。例えば、該核酸分子はその長さがヌクレオチド数が約18から20、20〜50 、50〜100、または150個を超えるものとすることができる。核酸分子はDNAもしくはRNA、直鎖状もしくは環状、およびセンス方向もしくはアンチセンス方向のものとすることができる。
【００２５】
天然のヒトAβポリペプチドをコードする核酸配列中に特定の点変化を、例えば、オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法によって導入することができ、次いでそれを野生型核酸とハイブリダイズすることができる。該オリゴヌクレオチドはDNAポリメラーゼによって伸長され、点変化を導入した場所でのミスマッチを含んだヘテロ二本鎖が作られ、5'末端には一本鎖のニックがあり、それはDNAリガーゼによって封じられる。そのミスマッチは大腸菌(E.coli)またはその他の適切な生物体の形質転換時に修復され、改変したビタミン-K依存性ポリペプチドをコードする遺伝子は大腸菌(E.coli)もしくはその他の適切な生物体から再び単離することができる。部位指定突然変異を導入するためのキットは市販されているものを購入することができる。例えば、Mutagen(登録商標)in vitro突然変異誘発キットはBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA)から購入することができる。
【００２６】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技法も突然変異を導入するために用いることができる。例えば、Valletteら, Nucleic Acids Res., 17(2):723-733(1989)を参照せよ。PCRとは標的の核酸を増幅する方法または技法を意味する。対象とする領域の末端またはその先から得た配列情報は典型的には、増幅しようとする鋳型に対向する鎖と配列が同一であるようなオリゴヌクレオチドプライマーをデザインするために用いられ、一方突然変異の導入には、所望の変化を組み入れたオリゴヌクレオチドが、対象の核酸配列の増幅に用いられる。PCRはDNAならびにRNAから特定の配列を増幅するために用いられ、そのような配列としては総ゲノムDNAまたは総細胞RNAからの配列が含まれる。プライマーは典型的にはその長さがヌクレオチド14個から40個であるが、ヌクレオチド10個から数百個の範囲のものとすることができる。一般的なPCR技法については、例えば、「PCRプライマー：実験室マニュアル」"PCR Primer: A Laboratory Manual", Dieffenbach, C. およびDveksler, G.編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995中に述べられている。
【００２７】
Aβおよび非Aβポリペプチドをコードする核酸はまた、化学合成によって単一の核酸分子または一連のオリゴヌクレオチドのシリーズとして作成することができる。例えば、所望の配列を含んでいる長いオリゴヌクレオチド(例えば、>100ヌクレオチド)の1組以上のペアを合成することができ、その各ペアには相補的な短いセグメント(例えば、約15個のヌクレオチド)を含んでおりそのオリゴヌクレオチドペアがアニールされると二本鎖が形成される。DNAポリメラーゼはそのオリゴヌクレオチドを伸長させるために用いられ、その結果オリゴヌクレオチドのペアあたり1個の二本鎖の核酸分子がもたらされ、次いでそれがベクター中に連結される。
【００２８】
精製ポリペプチドの作成
本発明のAβおよび非Aβポリペプチドの精製されたものは、商業的ソースから得ることができ、あるいはまた天然のソース(例えば、肝臓の組織)からの抽出、化学合成、または宿主細胞内での組換えによる産生で得ることができる。一般的には組換えポリペプチドは、対象とするポリペプチドとそのポリペプチドの発現に必要な調節エレメントとを機能しうる形で連結されたものをコードする核酸を含んでいる発現ベクターを、細菌または真核生物の宿主細胞(例えば、昆虫細胞、酵母、または哺乳類細胞)中に導入することによって産生される。調節エレメントは典型的には遺伝子産物をコードするものではないが、その代わりに該核酸配列の発現に影響を及ぼす。細菌の系では、BL-21などの大腸菌株が用いられる。適切な大腸菌ベクターとしてはグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質を産生させるpGEXシリーズのベクターが含まれる。形質転換された大腸菌は典型的には対数的に増殖し、次いで採取前にイソプロピルチオガラクトピラノシド(IPTG)で刺激する。そのような融合タンパク質は典型的には可溶性であり、融解させた細胞からグルタチオン-アガロースビーズに吸着させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出させることによって容易に精製することができる。pGEXベクターはトロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むようにデザインされており、それによってクローン化された標的遺伝子産物がGST部分から放出されうる。
【００２９】
真核生物の宿主細胞では、対象のポリペプチドを産生させるために多数のウイルスベースの発現系を用いることができる。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、例えば、pBlueBac(Invitrogen, San Diego, CA)などのバキュロウイルスベクター中にクローン化することができ、次いでそれをAutographa californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)から得た野生型DNAと共にSpodoptera frugiperda(Sf9)細胞などの昆虫細胞を同時トランスフェクトするために用いる。本発明のポリペプチドを産生する組換えウイルスは標準的な方法で同定することができる。あるいはまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸をSV40、レトロウイルスベクター、またはワクシニアをベースとしたウイルスベクター中に導入し、適切な宿主細胞を感染させるために用いることができる。
【００３０】
対象のポリペプチドを安定に発現する哺乳類の細胞系統は、選択マーカーを含んでいる発現ベクターと標準的な技法を用いて産生させることができる。例えば、真核生物の発現ベクターpCR3.1(Invitrogen, San Diego, CA)を、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS-1細胞、ヒト胚性腎293細胞、NIH3T3細胞、BHK21細胞、MDCK細胞、およびヒト血管内皮細胞(HUVEC)中で対象のポリペプチドを発現させるために用いることができる。発現ベクターを電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン、またはその他の適切なトランスフェクション法で導入した後、安定な細胞系統を、たとえば、G418、カナマイシン、またはハイグロマイシンに対する抗生物質耐性によって選択する。あるいはまた、対象のポリペプチドをコードする核酸は、pcDNA3(Invitrogen, San Diego, CA)などの哺乳類の発現ベクター中に連結し、次いでコムギ胚芽抽出物またはウサギ赤血球融解物を用いてin vitroで転写および翻訳を行うことができる。
【００３１】
対象のポリペプチドは、DEAEイオン交換、ゲルろ過、およびヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーを含む既知のクロマトグラフィー法で精製することができる。ポリペプチドはアフィニティーマトリックス上にそのポリペプチドが捕捉されるようにするためのアミノ酸配列を含むように「加工」することができる。例えば、c-myc、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、またはFlagTMタグ(Kodak)などのタグをポリペプチド精製の助けとして用いることができる。そのようなタグはそのポリペプチド内のカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかを含むどの位置にも挿入することができる。有用なものとなりうるその他の融合体としては、そのポリペプチドの検出の助けとなるアルカリホスファターゼなどの酵素が含まれる。イムノアフィニティークロマトグラフィーも、対象のポリペプチドの精製に用いることができる。
【００３２】
ポリアミンで修飾された抗体
本明細書に記載のとおり、Aβに対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体のポリアミンによる修飾はその修飾された抗体のBBBでの透過性を増大させる。特に、Aβに対するポリアミン修飾モノクローナル抗体は皮質においてそのPSの積が修飾されていない抗体と比較すると36倍高く、このものがADに対する受動免疫法により良いアプローチを提供する可能性がある。Aβに対して特異的な結合アフィニティーを有する抗体を天然または合成のいずれかのポリアミンで修飾することができる。例えば、米国特許第5,670,477号を参照せよ。有用な天然のポリアミンとしては、プトレッシン、スペルミジン、スペルミンｋ、1,3-ジアミノプロパン、ノルスペルミジン、シン-ホモスペルミジン、テルミン、サーモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、およびカナバルミンが含まれる。プトレッシン、スペルミジン、およびスペルミンは特に有用である。合成ポリアミンはCxHyNzの経験式からなるもので、環状または非環状、分枝したものまたはしないもの、3〜12個の炭素原子を有するヒドロカルビル鎖でさらに1〜6個のNRまたはN(R)2部分を含み、そのRがH、(C1-C4)アルキル、フェニル、もしくはベンジルであるものとすることができる。ポリアミンは上述の架橋技法を用いて抗体と連結させることができる。
【００３３】
CNS障害の診断または治療
本発明の組成物は製薬上許容される担体を用いて製剤化して哺乳類に投与することができる。例えば、本発明の組成物はヒト以外の動物(例えば、アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデル)へ、またはヒトへ、アルツハイマー病などのCNS障害の診断を助けるために、またはCNS障害と診断されたヒトの患者を治療するために、投与することができる。本明細書で用いている「治療」または「治療する」という用語は、本発明の組成物を患者に、その患者がその治療に応答するか否かにかかわらず、その同じ組成物をある患者集団に投与すると、その集団内の統計学的に有意な数の患者が、その障害の1種以上の臨床的特徴の臨床的に認めうる改善または安定化を示すという条件で投与することを意味する。
【００３４】
一般的には、本発明の組成物は静脈内(i.v.)投与されるが、その他の非経口投与経路、それには皮下、筋肉内、動脈内、鼻腔内、頸動脈内、および鞘内が含まれるが、そのような投与経路も用いることができる。非経口投与用の製剤には、滅菌した水または食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物油、水素化ナフタレン、および類似のものなどの製薬上許容される担体を含有することができる。
【００３５】
該組成物の投与量は担当医によって薬剤の作用を修飾することが知られている種々の要素を考慮に入れて決定することができる。それらの要素としては、患者の健康状態、体重、性別、食事、投与の時間と経路、他の併用薬剤、およびその他の関連する臨床的要素が含まれる。典型的には、投与量は約1-3000μg/kg体重(例えば、約10-1000μg/kg体重または50-500μg/kg体重)である。治療上有効な投与量はin vitroまたはin vivoの方法のいずれかで定めることができよう。
【００３６】
CNS障害の治療効果は、その障害の臨床的特徴(例えば、その患者の認知機能、記憶、行動、言語能力、運動能力、または硬直性)の1種以上がその患者で改善または安定化を示すかどうかを定めることによって評価することができる。
【００３７】
CNS障害の診断には、患者に投与される組成物は、上述のように標識された少なくとも1種のポリペプチドを含有している。その標識ポリペプチド(例えば、標識抗体または標識Aβポリペプチド)の存在または不在は、例えば陽電子放射断層法(PET)、γ-シンチグラフィー、核磁気共鳴映像法(MRI)、機能的核磁気共鳴映像法(FMRI)、脳磁図(MEG)、単光子放出コンピューター断層撮影(SPECT)などの造影技法を用いてin vivo(例えば、患者の脳内)のCNS中で検出される。MRIは、MRI(30ミクロン)で提供される空間的な分解能と信号-雑音比がアミロイドの沈着、そのサイズは200ミクロンにまで達しうるものであるが、そのような沈着を検出するために適しているので有用である。CNS障害は、例えば、標識されたアミロイドの存在(例えば標識されたアミロイドの沈着)に基づいて診断することができる。
【００３８】
本発明は下記の実施例によってさらに説明されるが、下記の説明は特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１
材料と方法：Aβタンパク質：ヒトAβ1-42はMayo Protein Core Facility内でPerkin-Elmerペプチド合成機でf-moc反応を用いて合成した。ヒトAβのアミノ酸配列は配列番号１に示している。得られたペプチドの純度はペプチドの配列分析およびレーザー脱離マススペクトロメトリーで調べた。
【００４０】
モノクローナル抗体の作成：B細胞ハイブリドーマはSt. GrothsとScheideggerの方法(J. Immunol. Methods 35:1(1980))に従ってMayo Monoclonal Core Facility内で作成した。37℃で24時間インキュベートして凝集させ、フィブリル化させたヒトAβ1-42を抗原として使用した。陽性を示したサブクローンをアイソタイプに分け冷凍保存し、さらにELISAおよびADトランスジェニックマウスの脳の切片のADの免疫組織化学的標識で特徴を調べた。非特異的なモノクローナル抗体は、ATCC HB96 L227(抗ヒトIa)から得た。
【００４１】
BBBでの放射性ヨウ素標識モノクローナルIgG(MoIgG)のPS/Vp 測定：タンパク質(MoIgGまたはAβ)のアリコートを、Podusloら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9:5705-5709(1994)に報告されているクロラミンT法を用いて125Iまたは131Iで標識した。PS/Vp測定はPodusloら, Neurobiol. Disease 8:555-567 (2001)、およびPodusloら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:2218-2222 (1992)で報告されているとおり行った。タンパク質のBBB透過性を定量するための方法は、ラットでの方法をマウス用に改変したもので、その方法には、ラットでは気管支動静脈で行っていたカテーテル挿入の代わりにマウスでは大腿動静脈でカテーテルを挿入することを含めた。マウスでは血液量がラットより少ないので、大腿動脈から20μLの血液の連続的サンプリングを行い、直接的にTCAで沈殿させてインタクトなタンパク質についての全血ウオッシュアウト曲線を作成した。簡潔に記せば、125I-MoIgG(100μC)を含有するリン酸塩緩衝食塩液(PBS)の静脈内ボーラス注射をペントバルビタールで麻酔したマウスの大腿静脈内へ急速に注射した。その後の30〜120分間にわたって大腿動脈から連続的に血液サンプルを採取した。実験終了の30〜60秒前に、放射性標識したタンパク質の第2の同位体(131I-MoIgG)(100μC)をVpのインディケーターとするために静脈内に投与した。
【００４２】
最後の血液サンプルを採取した後、マウスを屠殺し、脳と髄膜を摘出し、脳を皮質、尾状核-被殻(新線条体)、海馬、視床、脳幹、および小脳に分けた。組織を凍結乾燥し、乾燥重量を微量天秤で測定し、それをあらかじめ定めた湿重量/乾燥重量比を用いて、それぞれ湿重量に変換した。組織と血漿サンプルは、125Iと131Iの放射活性について、2チャンネルガンマカウンター(Packard COBRA II)を用いて、131Iの放射活性の125Iチャンネルへのクロスオーバーとバックグラウンドを補正してアッセイした。データはｘ±SEMの値で表し、有意水準をP<0.05レベルとしてANOVAを用いて統計学的評価を付した。VpとPSの測定はPodusloら, Neurobiol. Disease 8:555-567 (2001)およびPodusloら, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:2218-2222 (1992)で報告されているとおり計算した。全ての操作は、National Institute of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って、Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committeeで承認された人道的倫理的プロトコールを用いて行った。害を受ける動物および用いる動物の双方とも最小限となるようにあらゆる努力を行った。
【００４３】
免疫複合体の調製：ヒトAβ42をそれの放射性ヨウ素化モノクローナル抗体(PC2)、または放射性ヨウ素化した非特異的モノクローナル抗体(L227)とPBS中でモル比を10:1、100:1、または1000:1として37℃で1時間インキュベートした。次いでアリコートを大腿静脈中にI.V.ボーラスで注射した。
【００４４】
モノクローナルIgGのポリアミンでの修飾：モノクローナル抗体(PC2)の修飾はPodusloとCurran, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:2218-2222 (1992)およびPodusloとCurran, J. Neurochem. 66:1599-1609(1996)で報告されているとおり行った。カルボジイミドを用いてプトレッシン(PUT)をカルボン酸に共有結合で付着させた。カルボン酸基のイオン化はpHで調節し、それが引き続いてポリアミンによる修飾の程度を調節する。
【００４５】
実施例２
ポリアミンで修飾した抗体および免疫複合体のBBBにおける透過性の増大：非特異的モノクローナル抗体(抗ヒトIa；L227；IgG1κ)、ヒトAβ1-42に対するモノクローナル抗体(PC2；IgG1κ)、および免疫複合体[(ヒトAβ42)-L227または(ヒトAβ42)-PC2]を種々のモル比でのBBB透過性を正常なマウスの成獣(B6SJL)で測定したが、その方法は実施例１に記したとおり、透過係数 x 表面積(PS)の積を、各タンパク質について、I.V.ボーラス注射後に脳の種々の領域中での血管内のそのタンパク質によって占められている残存血漿容積(Vp)についての補正を行った後、求めることによって行った。これらの実験でVp値は同じタンパク質をヨウ素の異なる同位体(125I対131I)を実験終了の30〜60秒前に加えて放射性ヨウ素化したタンパク質の第2のアリコートを用いて測定した。同一の供試物質を用いることで正確なVpの測定が可能となり、その供試タンパク質に特徴的な、毛細管壁への非特異的付着が補正される。同様にして、2種類の同位体を用いるアプローチによって動物の各個体での血管スペースの測定が可能となる。従って、種々の放射性ヨウ素化したタンパク質についてのBBBでのPSの積は、同じタンパク質の第2のトレーサーでのVpの値で補正される。
【００４６】
非特異的モノクローナル抗体(L227)のPSの積は、脳の異なる6箇所の領域で0.5-1.1 x 10-6 mL/g/secの範囲であった(表１)。ヒトAβ1-42に対するモノクローナル抗体(PC2)でのPSの積は同じ脳の領域で0.6-1.4 x 10-6 mL/g/secの範囲であり、有意差はなかった。L227でのVp値は12.8-28.4 μL/gの範囲であり、PC2では11.8-28.0 μL/gでこれらの間には有意差はなかった(表１)。2種のモノクローナル抗体でのPS値は低く、双方ともアルブミンでの値よりも低かった。IgGとアルブミンは双方ともBBBで受動拡散または液相エンドサイトージスによって輸送されるものと考えられている。これに対して、インスリンはマウスで非常に高いPS値を有し(27.7-43.0 x 10-6 mL/g/sec)、BBBで受容体がメディエートする輸送によって輸送される。インスリンはBBBでのPSの積が、ヒトAβ42に対するモノクローナル抗体(PC2)の値に比べ約28.3-49.9倍大きい値である。これに対して、インスリンのVp値およびヒトAβ42に対するモノクローナル抗体(PC2)の値は類似している。
【表１】
2005504779.tif 000002
【００４７】
ヒトAβ42とそれの放射性ヨウ素化したモノクローナル抗体とを種々のモル比で免疫複合体としたものの透過性を上述の方法で調べた。10:1のモル比[(ヒトAβ42)-PC2]では、PC2単独で観察されたPS値と比較すると、脳の6箇所の領域中4箇所でBBBでのPSの値の有意な増加が認められた(表１)。モル比を100:1に増加させると、脳の全ての領域で高度に有意なPS値(2.3-4.3 x 10-6 mL/g/sec)が得られた。このことは、PSの値で3.1倍から4.0倍の増加を意味する。これに対して、ヒトAβ42を非特異的モノクローナル抗体(L227)と同じモル比(100:1)でインキュベートすると、得られるPS値は、抗原のない状態でのPS値と有意差がない(表１)。ヒトAβ42をPC2とモル比1000:1でインキュベートすると、大部分の脳領域でPS値の低下は有意でなく、このことはBBBでのヒトAβ42に対する受容体が飽和され始めたことを示している(表１)。これに対して、Vp値はモノクローナル抗体に比較すると種々のモル比の免疫複合体では増加の傾向がわずかに見られたが、それが有意差となったのはごく少数例にすぎなかった。これらの研究は、(ヒトAβ42)-PC2の免疫複合体のBBB透過性が、モノクローナル抗体単独または非特異的モノクローナル抗体よりも大きいことを示している。このことは、この抗体がBBBを横切ることの機作におそらくBBBにおけるヒトAβの受容体が関与していることを示唆している。
【００４８】
実施例３
ポリアミンで修飾した抗体のBBBにおける透過性：下記の一連の実験において、6箇所の異なる脳の領域で21.5-33.0 x 10-6 mL/g/secの範囲のPS値が(表２)、ポリアミンで修飾された、ヒトAβに対するモノクローナル抗体(PC2)で観察された。PUT-PC2に対するこれらのPS値は高度に有意であり(P<0.0001)、抗体(PC2)単独の場合よりも22.8-37.9倍の範囲でより高値であった。モノクローナル抗体のポリアミンでの修飾によって、BBBを横切る送達がより良いものとなろう。このアプローチは循環血液中のAβレベルに依存せず、受動免疫後のアルツハイマー脳でのアミロイド負荷をより劇的に低減させうるものである。
【表２】
2005504779.tif 000003
【００４９】
その他の実施形態
本発明はそれの詳細な説明と関連づけて記載されてはいるが、上の記述は説明することを意図したものであって、本発明の範囲、それは付属の特許請求の範囲で定義されるものであるが、その範囲を限定しようとするものではないことは理解されよう。その他の態様、利点、および改変は下記の特許請求の範囲の範囲内のものである。
【国際公開パンフレット】
2005504779.tif 000004
2005504779.tif 000005
2005504779.tif 000006
2005504779.tif 000007
2005504779.tif 000008
2005504779.tif 000009
2005504779.tif 000010
2005504779.tif 000011
2005504779.tif 000012
2005504779.tif 000013
2005504779.tif 000014
2005504779.tif 000015
2005504779.tif 000016
2005504779.tif 000017
2005504779.tif 000018
2005504779.tif 000019
2005504779.tif 000020
2005504779.tif 000021
2005504779.tif 000022
2005504779.tif 000023
2005504779.tif 000024
2005504779.tif 000025
2005504779.tif 000026
2005504779.tif 000027
2005504779.tif 000028
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504779.tif 000029
【国際調査報告】
2005504779.tif 000030