(57)【要約】本発明は、ＰＡＭＧ−１抗体を検出することによって、膣内の少量の羊水を検出するための診断方法および装置に関する。装置は、図１に示されるように、標識されたＭ２７１抗体領域（１０）を含有するパッド（１２）と、検査領域（１４）と、制御領域（１６）と、を具備する。
2005535887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊婦の膣分泌液および当該方法に基づいたストリップ装置内の少量の羊水を検出する際に偽陽性および偽陰性の可能性を最小限にする方法であって、前記方法は、
（ｉ）膣分泌液中の胎盤アルファ−１−ミクログロブリン（ＰＡＭＧ−１）の最小バックグラウンド濃度を決定するためにモノクローナル抗体の高度に特異的な対を選択する工程、および
（ｉｉ）前記ストリップ検査装置の感度の所定の閾値を正確に設定するために、一つのストリップ検査装置内で前記対と組み合わせて使用されることが意図される他のモノクローナル抗ＰＡＭＧ−１抗体を選択する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体の（ｉ）前記対の高度に特異的なモノクローナル抗体は、前記ストリップ装置のパッド領域に位置する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記高度に特異的なモノクローナル抗体は、マーカーに結合される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記マーカーは、染料粒子である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記対の前記第２のモノクローナル抗体（ｉ）は、前記ストリップ装置の検査領域に位置する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
１つまたはそれ以上の他の追加抗ＰＡＭＧ−１モノクローナル抗体（ｉｉ）は、前記対の前記第２の抗体（ｉ）に対して所定の割合で前記ストリップ装置の検査領域に位置する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記対と組み合わせて使用される前記抗体（ｉｉ）を使用して、前記ストリップ装置の感度の所定の閾値を設定する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
所定の割合で組み合わせて使用される前記抗ＰＡＭＧ−１モノクローナル抗体（ｉ）および（ｉｉ）を使用して、１ミリリットル当たり０．０５〜０．２ナノグラムの範囲である膣分泌液中の前記ＰＡＭＧ−１のバックグラウンドレベルの値と、１ミリリットル当たり５〜１０ナノグラムの範囲である前記ストリップ装置の感度の前記閾値との間に最適なインターバルを設定し、妊婦の膣分泌液中の少量の羊水を検出する際に偽陽性および偽陰性の可能性を最小限にする、請求項１、６および７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
膣分泌液中に漏れている羊水を検出するための方法であって、膣分泌液中のＰＡＭＧ−１に特異的な一対の抗体の結合を検出する工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記一対の抗体は、バックグラウンドを超えるＰＡＭＧ−１のレベルに感度がある、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記一対の抗体の一方は、固体担体上に固定される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
前記固体担体は膜であり、それを通って液体は毛管作用によって移動することができる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記固体担体上に固定されたＰＡＭＧ−１に特異的な第２の抗体をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記固体担体上に固定された前記抗体の比率は、１ミリリットル当たり約５ナノグラムというＰＡＭＧ−１を検出する閾値レベルを提供する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
モノクローナル抗体は、ロシア国立工業微生物収集（ＶＫＰＭ）寄託機関に寄託されて受託番号ＶＫＰＭ−９３が割り当てられたハイブリドーマＮ２７１によって生産されるＭ２７１と、ＶＫＰＭに寄託されて受託番号ＶＫＰＭ−９２が割り当てられたハイブリドーマＮ５２によって生産されるＭ５２と、ＶＫＰＭに寄託されて受託番号ＶＫＰＭ−９４が割り当てられたハイブリドーマＮ４２によって生産されるＭ４２と、からなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
ＰＡＭＧ−１に特異的な固定された抗体と、ＰＡＭＧ−１に特異的な移動可能な抗体とを備える装置であって、それによって、流体試料による前記移動可能な抗体の移動は、前記移動可能な抗体が前記試料中の任意のＰＡＭＧ−１に結合するのを可能にし、且つ、それによって形成された移動可能な抗体ＰＡＭＧ−１複合体を前記固定された抗体に結合するのを可能にし、前記移動可能な抗体がマーカーを含む、装置。
【請求項１８】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
前記固定された抗体は、膜担体上に固定される、請求項１７記載の装置。
【請求項２０】
前記マーカーは、コロイド金である、請求項１７記載の装置。
【請求項２１】
固体担体上に固定されたＰＡＭＧ−１に特異的な第２の抗体をさらに含む、請求項１７記載の装置。
【請求項２２】
前記固体担体上に固定された前記抗体の比率は、１ミリリットル当たり約５ナノグラムというＰＡＭＧ−１を検出する閾値レベルを提供する、請求項１７記載の装置。
【請求項２３】
モノクローナル抗体は、ロシア国立工業微生物収集（ＶＫＰＭ）寄託所に寄託されて受託番号ＶＫＰＭ−９３が割り当てられたハイブリドーマＮ２７１によって生産されるＭ２７１と、ＶＫＰＭに寄託されて受託番号ＶＫＰＭ−９２が割り当てられたハイブリドーマＮ５２によって生産されるＭ５２と、ＶＫＰＭに寄託されて受託番号ＶＫＰＭ−９４が割り当てられたハイブリドーマＮ４２によって生産されるＭ４２と、からなる群から選択される、請求項１７記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権データ）
本願は、２００２年８月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／４０３，４０７号から優先権を主張し、これは、参照によってここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、膣内の少量の羊水を正確に検出するための診断方法に関する。特に、本発明は、胎盤α1ミクログロブリンに特異的に結合する特異的に選択されたモノクローナル抗体を使用することに関する。より具体的には、本発明は、妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の最小バックグラウンド濃度を検出するのに十分な感度を提供する一対の抗ＰＡＭＧ−１抗体（「基本対」）の選択に関する。さらに、本発明は、ＰＡＭＧ−１抗体を含む固相イムノアッセイシステムに関し、その中で２つまたはそれ以上の抗ＰＡＭＧ−１抗体の組み合わせが、装置の固相担体（solid phase support）に固定され、感度の所定の閾値レベルを正確に設定する。
【背景技術】
【０００３】
胎膜（羊膜嚢）の早期破裂は、妊婦の約１０％で発生し、直ちに処置を行わない場合には、全周産期死亡の約１０％の原因である。ＰＲＯＭ（胎膜の早期破裂（早期破水））という用語は、正期産または早期産の開始する２４時間またはそれ以上前に、膜が自発的に破裂することに関する。ＰＰＲＯＭは、膜の前期早期破裂（前期早期破水）を意味する。そのような早期破裂のおよそ約３０〜５０％は、妊娠３７週前に発生する。そのような場合には、ＰＲＯＭは、子宮内感染および胎児の肺システムの発育障害のリスクが有意に上昇することに関連があるため、破裂の最終的な診断は、非常に重要である。そのような感染の子宮内侵入は、母親および胎児の発病率および死亡率を約１０パーセント高める。一旦ＰＲＯＭが検出されると可能な限り早く出産を誘発しなければならないため、妊娠３８〜４０週で破裂を即座に診断することは重要である。破裂の診断は、羊膜内感染を予防し且つ胎児の肺の発育を刺激することができるため、妊娠３７週目前の破裂診断も重要である。
【０００４】
膜破裂の診断に利用可能な「判断基準」はない。ＰＲＯＭは、動的な存在であり、そのため、膜破裂と診断様式の実行との間のインターバル、「多量の」漏れの存在、間欠的な漏れ、人口に対するＰＲＯＭの発生率の変動、および検査結果に干渉する能力を有する材料について考慮することは、これらに対処されない場合には、不正確な報告を生じる要因である。これらの不正確さは、ＰＲＯＭを識別するための最良のツールを明らかにすることを目的とする研究の解釈における間違いを招くことがある。
【０００５】
ＰＲＯＭの診断は、伝統的に、患者が膣からの液体の漏出を報告することに依存している。理学的診察は、明白に診断することができるが、診察の結果が内的に矛盾しているかまたは いくつもの解釈ができるときがある。この状況は、確認的診断検査の必要性を命じる（ロックウッド、Ｃ．Ｊ．ら（Lockwood C. J.）、Am. J. Obstet. Gynecol.、１９９４年、第１７１巻、第１号、１４６〜１５０頁）。数種類の方法が、すべて不十分であるが、現在、膣内の羊水を検出するために使用されている（例えば、頸管粘液検査（Ｆｅｒｎ  ｔｅｓｔ）（Ｍ．Ｌ．フリードマン（M. L. Friedman）およびＴ．Ｗ．マクエリン（T. W. McElin）、「破裂した胎膜の診断（Diagnosis of Ruptured Fetal Membranes）」、American Journal of Obstetrics and Gynecology、１９６９年、第１００巻、５４４〜５５０頁））。この方法は、羊水がスライド上で乾燥するときにいわゆる樹枝状分岐の観察によって羊水を検出することに基づいている。しかし、この方法は、膣内の羊水の高揮発特性に基づいているため、十分正確ではない。症例の３０パーセントもの偽結果を産む可能性がある。
【０００６】
数種類の染料、すなわち、ナイルブルー、アクリジンオレンジ、ブロモチモールブルー、ニトラジン（nitrazine）等を使用することによって、胎膜の破裂を検出することも提案されている（上記Ｍ．Ｌ．フリードマンおよびＴ．Ｗ．マクエリン）。このアプローチは、不便であり、膣内の羊水の化学特性の揮発性およびこれへのいくつかの可能な混合物に関連する不都合を有する。例えば、膣感染症が、上記検査の結果に影響を与えることがある。現在一般的なニトラジンおよびシダ状結晶形成検査の初期の研究は、これらの検査が高い不正確率を有することを示した。これは、膜破裂から１時間以上経過すると次第に高くなり、２４時間後には結論が出なくなった。ＰＲＯＭが長引く場合には、これらの検査は単なる臨床的評価によって得られるものよりも良い診断情報を与えないと結論づけている（ゴロデスキー、Ｉ．Ｇ．（Gorodeski I. G）、ハイモビッツ、Ｌ．（Haimovitz L.）、バハリ、Ｃ．Ｍ．（Bahari C. M.）、Journal Perinat. Med、１９８２年、第１０巻、第６号、２８６〜２９２頁）。検査に関するより近年のデータ（トロボ、Ｓ．（Trovo S.）ら、Minerva Ginecol.、１９９８年、第５０巻、第１２号、５１９〜５１２頁）は、下記の通りである。
ニトラジン検査は、感度７０％、特異性９７％、正確度９０％を示す。
シダ状結晶形成検査は、感度７０％、正確度９３％を示す。
【０００７】
近年では、羊水中のタンパク質を免疫化学的に分析することに基づいて胎膜の破裂を検出することが提案されている。ドックされた免疫化学的分析（Docked immunochemical analysis）は、膜破裂を検出するために羊水の下記のタンパク質を使用する。すなわち、アルファ−フェトプロテイン、プロラクチン、フィブロネクチン、および、インスリン様成長因子結合タンパク質１である。Ｂ．Ｌ．ロチェルソン（B. L. Rochelson）ら、「迅速アッセイ−膜の早期破裂の診断における可能な適用（Rapid Assay--Possible Application in the Diagnosis of Premature Rupture of the Membranes）」、Obstetrics and Gynecology、１９８３年、第６２巻、４１４〜４１８頁；Ｐ．Ｒ．コニンクス（P. R. Koninckx）ら、「膣液中のプロラクチン濃度：破裂した膜を診断するための新規方法（Prolactin Concentration in Vaginal Fluid: a New Method for Diagnosing Ruptured Membranes）」、BritishJ.Obstetr. Gynecol.、１９８１年、第８８巻、６０７〜６１０頁；Ｐ．ヘルマン（P. Hellemans）ら、「羊膜の破裂の初期検出におけるＲＯＭチェックイムノアッセイを使用する予備段階の結果（Preliminary Results with the Use of the ROM Check Immunoassay in the Early Detection of Rupture of the Amniotic Membranes）」、Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.、１９９２年、第４３巻（３）、１７３〜１７９頁；ルタネン、Ｅ．Ｍ．（Rutanen, E. M）ら、「子宮頸部分泌液／膣分泌液中のインスリン様成長因子結合タンパク質１の測定：破裂した胎膜の診断におけるＲＯＭチェック膜イムノアッセイとの比較（Measurement of Insulin-like Growth-Factor binding Protein-1 in Cervical/Vaginal Secretions: Comparison with the ROM Check Membrane Immunoassay in the Diagnosis of Ruptured Fetal Membranes」、Clin.Chim. Acta.、１９９３年、第２１４巻、７３〜８１頁を参照のこと。ルタネン、Ｅ．Ｍ．らは、後に、逆さまに配置したクロマトグラフ膜を使用するクロマトグラフ検査を開発した（ＦＩ−８４８６３、米国特許第５，５５４，５０４号）。
【０００８】
アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）およびプロラクチン（ＰＲＬ）の検出に基づく方法は、信頼できないが、それは、ＡＦＰおよびＰＲＬタンパク質の血液／羊水比率は、有意な変動を受けやすいからである。ＡＦＰおよびＰＲＬは、妊娠の第２の３ヶ月の間のみに高濃度で羊水に存在する。両方のタンパク質についての羊膜／血清タンパク質濃度比率は、正期産時に約３〜４にすぎない。
【０００９】
膣分泌液における胎児フィブロネクチンの検出に基づいた別の方法もまた、満足のいくものではないことがわかった。例えば、胎児フィブロネクチンの存在は、胎膜破裂がない場合でさえ発生することがあり（Ｐ．ヘルマンら）、「羊膜の破裂の初期検出におけるＲＯＭチェックイムノアッセイを使用する予備結果」、Eur. J. Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol.、１９９２年、第４３巻（３）、１７３〜１７９頁；Ｃ．ロックウッド（C. Lockwood）ら、「早期産の予測としての子宮頸部分泌液および膣分泌液中の胎児フィブロネクチン（Fetal Fibronectin in Cervical and Vaginal Secretions as a Predictor of Preterm Delivery）」、New England Journal of Medicine、１９９１年、第３２５巻、６６９〜６７４頁）、それによって偽陽性結果を産出する。
【００１０】
アルファ−フェトプロテイン、プロラクチンおよびフィブロネクチンの検出に基づいて胎膜破裂を検出するこれらの方法のすべては、羊水中のこれらのタンパク質の濃度、および、血清中のこれらのタンパク質の濃度に対する羊水中のこれらのタンパク質の濃度の相対濃度の制御における可変因子のため、不正確である。
【００１１】
最新のＩＧＦＢＰ−１検査に関しては、その特異性および正確性に関する矛盾するデータがある。ラピッドストリップ検査（フィンランドのＯＹメディックスバイオケミカ（OY Medix Biochemica）によるＰＲＯＭ検査、アムニチェック（ドイツ、ＭＡＳＴダイアグノスティカ（MAST Diagnostica））とも称される）が、膣分泌液中でＩＧＦＢＰ−１の存在を検出するために開発されている（ルタネン  ＥＭ、カールカイネン  ＴＨ（Karkkainen TH）、ルトビルタ  Ｊ．（Lehtovirta J.）、ウオティラ  ＪＴ（Uotila JT）、ヒンクラ  ＭＫ（Hinkula MK）、ハーティカイネン  ＡＬ（Hartikainen AL）、「破裂した胎膜の診断におけるインスリン様成長因子結合タンパク質１用ラピッドストリップ検査の評価（Evaluation of a rapid strip test for insulin-like growth factor binding protein-1 in the diagnosis of ruptured fetal membranes）」、Clin Chim Acta、１９９６年、９月３０日、第２５３巻（１−２）、９１〜１０１頁）。Ｅ．ルタネンは、膣分泌液中の４００ｎｇ／ｍｌ未満のＩＧＦＢＰ−１濃度（妊婦の血清ＩＧＦＢＰ−１レベルの９５パーセンタイル未満）がネガティブのままであるように、検査の検出限界が設定されたと報告した。しかし、出血の場合には、胎盤床から直接の血液は子宮頸部血管からの血液よりも高い量のＩＧＦＢＰ−１を含有することがあるため、検査結果は慎重に解釈されなければならない。
【００１２】
臨床的に確認されたＰＲＯＭの女性の全試料（ｎ＝５５）は、陽性結果を示し、無症候の女性から取られた７５試料の７１が、検査にしたがって陰性であった。試料のこのセットの中で、検査は、感度１００％および特異性９４．７％であった。この事実は、検査の最初のステップで使用されたモノクローナル抗体の不十分な特異性（交差反応）によって説明することができる。
【００１３】
疑わしいと評価されたが当初診察でははっきりしないＰＲＯＭであった１８１の患者の中で、検査は、６４例で陽性、１１７例で陰性であった。６４人の陽性患者のうちの５０例（７８．１％）が、妊娠３７週以前に出産し、４２例（６５．６％）は、試料採取後２週間以内に出産した。陰性検査結果の１１７症例のうちの５例が、ＰＲＯＭとは関係のない理由で選択的帝王切開術を受けた。他の１１２人の患者のうち、１０２人（９１．１％）が正期産であり、１０人（８．９％）が３７週以前に出産し、このうちの７人（６．３％）が試料採取後２週間以内に出産した（Ｅ．ルタネンら、１９９６年）。残念ながら、ＰＲＯＭと明確に診断された女性のＰＲＯＭ検査の感度および特異性に関するデータはない。
【００１４】
Ｗ．ウォルトマン（W. Woltmann）による研究において、アムニチェックを使用して、臨床的に未確認のＰＲＯＭの女性から１５０羊水標本および５０膣分泌液試料内のＩＧＦＢＰ−１を検出した。検査は、感度９７％および特異性１００％であった（ウォルトマン、Ｗ．ら、Z. Gebursh. Neonatal、１９９５年、第１９９巻、２４３〜２４４頁）。
【００１５】
Ｖ．ラゴシュ（V. Ragosh）は、７５膣分泌液試料でアムニチェック検査の診断正確度を評価した。検査は、感度１００％および特異性８３％を示した。調査者は、偽陽性率は、分娩活動に大いに依存すると報告した。子宮収縮のある女性では、検査は、特異性５９％であった（ラゴシュ、Ｖ．ら、Geburtsh. U. Frauenheililk.、１９９６年、第５６巻、２９１〜２９６頁）。
【００１６】
Ｅ．ダルジ（E.Darj）およびＳ．リレナス（S. Lyrenas）の研究において（Acta Obstet. Gynecol.Scand.、１９９８年、第７７巻、２９５〜２９７頁）、ＰＲＯＭ検査は、臨床的に確認された診断の患者（膜が明らかに破裂した女性、または、膜に傷がない女性）の中で、感度９５．７％および特異性９３．１％であった。しかし、ＰＲＯＭ検査の感度および特異性は、それぞれＰＲＯＭが疑わしい患者の７０．８％および８８．２％のみであった。この不一致は、検査のカットオフ限界（４００ｎｇ／ｍｌ）によって説明することができ、これは、両義に取れる診断（例えば、小破裂の場合）をされた患者の膣分泌液中で少量の羊水を検出することを不可能にする。
【００１７】
このようにして、膜に傷がない女性の膣ＩＧＦＢＰ−１の有意なバックグラウンドレベルおよび検査の高いカットオフ閾値が、感度および特異性に害することもあり、したがって、両義に取れる診断をされた患者の検査正確度に影響を与える。血清および／または炎症性滲出液の混合物もまた、検査正確度に影響を与えることがある（上記Ｅ．ダルジおよびＳ．リレナスのデータ参照のこと）。この検査の著者は、この問題を研究しなかった。
【００１８】
上述の欠点のいくつかを回避しようと試みて、胎盤α1ミクログロブリンの未結合画分を検出するために、インスリン様成長因子用の２つの結合部位に対して、２つのモノクローナル抗体が使用された（米国特許第５，９６８，７５８号、第５，５９７，７００号、第５，８９１，７２２号、第５，８７７，０２９号）。
【００１９】
これらの特許において、２つのタンパク質、未結合ＰＡＭＧ−１およびＩＧＦＢＰ−１の同一性（identity）は、根拠が無く想定されている。事実、そのような想定は、これらのタンパク質の一次構造および遺伝子の比較のみに基づいている。
【００２０】
上述の特許において、できるだけ最高の正確度（９９％またはそれ以上）を達成するように、そのような検査の感度の閾値を設定することは不可能であった。そのような検査の共通の問題は、バックグラウンドレベル、および、検出された物質のバックグラウンド濃度の可変性である。例えば、妊婦の膣分泌液中の別のタンパク質、すなわち、ＩＧＦＢＰ−１のバックグラウンドレベルは、０．５から９０ｎｇ／ｍｌの広い範囲で変動する（ルタネンの研究を参照のこと）。第２の重要な点は、膣分泌液中の検出された物質を含有する炎症滲出液または血清の混合の可能性である。これは、偽陽性結果を引き起こす可能性がある。
【００２１】
タンパク質ＰＡＭＧ−１は、最初、Ｄ．ペトルニン（D. Petrunin）によって説明された（Ｄ．ペトルニンら、Akusherstvo i Ginekologia、１９７７年、第１号、６４頁、ロシア語；および、ＰＭＩＤ：６５９２４（ＭＥＤＬＩＮＥ用に索引を付けられたＰｕｂＭｅｄ（PubMed-indexed for MEDL1NE）：「器官特異的なヒト胎盤アルファグロブリンの免疫学的識別および羊水中のその内容物（Immunochemical identification of organ specific human placental alpha-globulin and its concentration in amniotic fluid）、Akusherstvo i Ginekologia、（モスクワ）、１９７７年、第１巻、６４頁）も参照のこと）。抗体が、精製され単離されたタンパク質に対して得られ、免疫化学的な方法により、妊娠の異なる段階における羊水（膣から取られた羊水も含む）内のタンパク質の内容物を測定し得た。胎児および成人の血液および異なる器官内のタンパク質の濃度も、測定された。
【００２２】
このリサーチグループは、その後の年月の間、１９９０年まで、タンパク質に関する新しい結果を公表し続けた（ペトルニン、Ｄ．ら、「妊娠中の４つの胎盤タンパク質の比較研究（Comparative Study of Four Placental Protein During Gestation）」、Akusherstvo i Ginekologia、１９８８年、第１号、５０〜５２頁；ザライスキー、Ｅ．（Zaraisky, E.）ら、Voprosy Med. Khemii、１９８９年、第５号、１３１〜１３２頁；タタリノフ、Ｙ．（Tatarinov, Y. ）ら、Uspekhi Sovr. Biologii、１９９０年、第１０９巻、３６９〜３７３頁；ボルトフスカヤ、Ｍ．（Boltovskaya, M.）ら、Bulletin of Experimental Biology and Medicine、１９９１年、第７号、３９７〜４００頁；ナシモワ、Ｓ．Ｖ．（Nasimova, S. V.）ら、Bulletin of Experimental Biology and Medicine、１９９３年９月、第１１６巻、第９号、３０２〜３０４頁（これらの論文はすべてロシア語であり、英語の要約がついている））。Ｄ．ペトルニンは、ＰＡＭＧ−１の単離の方法に関する発明証を得た（＃ＳＵ−１６１４１８４Ａ１、優先権年１９８８年）。
【００２３】
１９８８〜８９年には、羊水、胎盤、およびヒトヘパトーマから得られた類似のタンパク質であるインスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）の部分配列および完全配列を詳述するいくつかの論文が公表された（ベル、Ｓ．（Bell S.）ら、１９８８年；ルートマン、Ｈ．（Luthman H.）ら、１９８９年；ユルケネン（Julkunen）ら、１９８８年；リー、Ｙ．（Lee, Y.）ら、１９８８年）。遺伝子は、第７番ヒト染色体の７ｐ１４〜７ｐ１２片に位置していた。１９９１年以前には研究者らは、このタンパク質に異なる名前：α1−ＰＥＧ、ＰＰ−１２、ＩＧＦＢＰ、ＢＰ−２５等を使用した。
【００２４】
１９８０〜８２年には、ボーン（Bohn）が、胎盤からタンパク質を単離し、これをＰＰ−１２と名付けた。ボーンは、その論文で、ＰＰ−１２を、先に発見されたＰＡＭＧ−１タンパク質と比較し、両者の間の類似性および相違点を検討した。
【００２５】
他の研究発表とは対照的であるのがベルらの論文（１９８８年）であり、ベルらは、α1−ＰＥＧタンパク質のＮ末端ペプチドに、すなわち、１１番目および１２番目の位置に、多型を発見し、実際は１つではなく２つの異なるタンパク質があるという結論に達した。
【００２６】
Ｓ．ベルは、再度、羊水中の２つの異なるタンパク質α1−ＰＥＧに関する自分の論文を参照する。この論文は、１９９０年の命名委員会（Nomenclature Committee）の決定を受け入れたが（ＩＧＦ結合タンパク質の命名に関する報告（Report on the Nomenclature of the IGF Binding Proteins）、Journ. Clin. Endocr. And Metabol.、１９９０年、第７０巻、第３号、８１７頁）、これは、タンパク質ＡＦＢＰ、ＰＰ−１２、α1ＰＥＧ、ＧＨタンパク質、結合タンパク質２８、２６、２５、ＪＢ−１は同一であると判断し、それらすべてに一般名ｈＩＧＦＢＰ−１を与えた。
【００２７】
いわゆる遊離ＰＡＭＧ−１を使用して、胎膜破裂が検出された。しかし、上述のように、高正確度（＞９９％）の検査は創出されなかった。この目標は、後に、本願に記載される我々の新しい方法および装置で達成された。本発明は、膣分泌液中の非常に低濃度のＰＡＭＧ−１の検出のために十分な感度を提供する一対のモノクローナル抗体を選択する方法を使用し、また、他のいくつかの抗ＰＡＭＧ−１抗体の選択を包含し、これは、上述の２つの抗体と組み合わせて、ストリップ装置用の感度の所定の閾値を正確に設定することを可能にした。これは、次に、検査の偽陽性結果の頻度を最小限にすることを可能にした。
【００２８】
本発明は、Ｄ．ペトルニンの先駆的研究から開始し、ペトルニンは、胎盤アルファミクログロブリンを分離し説明し、免疫化学的な方法を使用して羊水、血液およびいくつかの組織におけるその濃度の徹底的な測定を実施した。この発表は、全ての研究者が考慮に入れるべきパブリックドメインである。ＰＡＭＧ−１を分離する方法は、以前のＵＳＳＲにおける特許の等価物である発明者証（＃ＳＵ−１６１４１８４Ａ１、優先権年１９８８年）。によって保護されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、妊娠中に膣分泌液中の少量の羊水を検出するための方法に関する。
【００３０】
本発明は、妊婦の膣分泌液中の羊膜タンパク質ＰＡＭＧ−１の最小バックグラウンド濃度を超えるＰＡＭＧ−１を検出するための方法に関し、それは、羊水の存在を示すものである。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
特定の実施形態において、ＰＡＭＧ−１タンパク質を検出するための方法は、膣分泌液中の最小バックグラウンド濃度のＰＡＭＧ−１タンパク質を検出するために特別に選択された一対のモノクローナル抗体を使用する。検査の感度の所与の閾値を正確に設定するために、この抗体の対は、少なくとも１つの追加抗ＰＡＭＧ−１モノクローナル抗体と組み合わせて使用されている。
【００３２】
本発明は、膣分泌液中の羊膜タンパク質ＰＡＭＧ−１を検出するための方法における感度の閾値をより正確に設定するのを可能にするために、１つのストリップ装置にＰＡＭＧ−１捕捉抗体を組み合わせて使用することを、さらに企図する。このアプローチは、抗体の選択された対を単独で使用するよりも、感度および動的な範囲のより大きな制御を提供する。
【００３３】
方法のもっとも適切な感度閾値レベルは、５ｎｇ／ｍｌに近いことがわかったが、それは、炎症によって発生する可能性のある膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の上限が、３ｎｇ／ｍｌを超えず、他方、健常な妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の通常のバックグラウンドレベルはおよそ０．２ｎｇ／ｍｌであるためである。バックグラウンドレベルと検出された物質の閾値濃度との間の有意なギャップは、偽陰性および偽陽性の結果を最小限にする。１つの実施形態において、羊膜ＰＡＭＧ−１を認識する第１のステップは、ストリップ装置のパッド部分で起こり、そこに、特別に選択され標識された抗体が位置する。反応の第２のステップは、ディップスティック装置の検査領域で起こり、そこで、選択された対の第２の抗体、および、好ましくは、少なくとも１つの追加抗ＰＡＭＧ−１抗体が、固定される。
【００３４】
要約すると、妊婦の膣内の少量の羊水を検出するための方法および装置が説明される。方法は、好ましくは、胎盤α1ミクログロブリン（ＰＡＭＧ−１）に対する一対のモノクローナル抗体の選択に基づいている。選択の目標は、第１に、膣分泌液中の最小バックグラウンド濃度のＰＡＭＧ−１を測定することである。この情報を有して、閾値を超えるＰＡＭＧ−１を検出することができる任意の分析技術を使用して、膣分泌液中の羊水を検出することができる。この情報に基づいて、装置の感度の閾値を下げ且つ正確に設定し、それによって偽陰性および偽陽性の結果の可能性を最小限にするように、同じ対の抗体および追加の抗体の使用に基づいて、装置を作り出すことができる。
【００３５】
捕捉抗体およびそのフラグメントの様々な組み合わせ、または、ここに特定されるのと同一の特性を備えた任意の他の分子の組み合わせが、可能である。
【００３６】
本発明の１つの実施形態において、方法は、ＰＡＭＧ−１タンパク質を含有する試料とモノクローナル抗体との接触を含み、選択された対の最初のものは、ＰＡＭＧ−１を選択的に検出する。これは、抗体ＰＡＭＧ−１複合体を形成する抗体と、対の他方の標識されたモノクローナル抗体によって抗体−ＰＡＭＧ−１複合体を検出するステップと、をさらに含む。これは、最後に、羊膜が破裂していない妊婦の膣分泌液におけるＰＡＭＧ−１の低最小バックグラウンドを定量的に測定することを含む。この方法は、ＥＬＩＳＡ分類検査に使用されることが多い。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態において、装置は、ＰＡＭＧ−１タンパク質を含有する試料と標識されたモノクローナル抗体との接触を実行し、選択された対の最初のものは、ＰＡＭＧ−１を選択的に検出する。これはさらに、抗体ＰＡＭＧ−１複合体を形成する抗体と、この複合体の側方向流れと、ＰＡＭＧ−１を認識する他方のモノクローナル抗体によって抗体−ＰＡＭＧ−１複合体を検出するステップとを備え、それによって、モノクローナル抗体を認識するＰＡＭＧ−１の対を使用して達成することができる正確度よりも高い正確度で、追加抗体を使用して、装置の感度閾値を５〜７ｎｇ／ｍｌの範囲に設定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は、膣分泌液中の非常に低濃度の胎盤α1ミクログロブリンを検出することによって、膣分泌液中の羊水を正確に検出することの上述の問題に対処する。このアプローチは、ＰＡＭＧ−１濃度の低バックグラウンドレベル（妊婦の膣分泌液のおよそ０．２ｎｇ／ｍｌ）のため、有利であることがわかった。本発明の重大な点は、低濃度でタンパク質を検出するモノクローナル抗体の選択であったが、これは、これらの値の定量化を可能にし、次に、ＰＡＭＧ−１のレベルを検出するためにあらゆる分析技術を使用することを可能にする。血液中のタンパク質用の毛細管壁の透過性は、翻訳後のタンパク質修飾および他の分子との相互作用に依存するため、膣分泌液中に低濃度でＰＡＭＧ−１が存在することは、予想可能であった（マリナロー、Ｊ．Ａ．（Marinaro J. A.）ら、「Ｏ−グリコシル化は、循環からヒトＩＧＦ−結合タンパク質−６のクリアランスを遅延する（O-glycosylation delays the clearance of human IGF-binding protein-6 from the circulation）」、Eur J Endocrinol、２０００年５月、１４２（５）：５１２；シュネーベルガー、Ｅ．Ｅ．（Schneeberger E. E.）、「血管内皮層内のタンパク質および小胞輸送（Proteins and vesicular transport in capillary endothelium）」、Fed Proc、１９８３年５月、１５；４２（８）：２４１９−２４；ミンシャル、ＲＤ（Minshall RD）ら、「内皮細胞内の小胞形成およびトラフィッキング、および、内皮障壁機能の調整（Vesicle formation and trafficking in endothelial cells and regulation of endothelial barrier function）」、Histochem Cell Biol、２００２年２月、１１７（２）：１０５−１２；デルベッキオ、ＰＪ（Del Vecchio PJ）ら、「巨大分子への内皮単層の透過性（Endothelial monolayer permeability to macromolecules）」、Fed Proc、１９８７年６月、４６（８）：２５１１−５；シフリンガー−バーンボイム、Ａ（Siflinger-Birnboim A）ら、「内皮単層の選択性：透過性増大に関する効果（Selectivity of the endothelial monolayer: effects on increase permeability）」、Microvasc Res、１９９８年１１月、３６（３）：２１６−２７；ギネア、Ｎ（Ghinea N）、ミルグロム、ＥＡ（Milgrom EA）、「ＬＨ／ＣＧレセプター用の新規機能：標的器官の内皮障壁にわたるホルモンのトランスサイトーシス（new function for the LH/CG receptor:transcytosis of hormone across the endothelial barrier in target organs）」、Semin Reproduct Med、２００１年、１９（１）：９７−１０１）。翻訳後修飾を受けたか、または、別の分子と非共有結合を確立したＰＡＭＧ−１分子の中に、膣分泌液中への浸透が最小であるものがある。膣分泌液中のそのような分子の濃度は、羊膜嚢に裂け目がない限り、低くなければならない。ＰＡＭＧ−１分子の異種性もまた、オルタナティブスプライシングの結果であり得る。ベルらは、羊水中の２つの近いが異なるタンパク質α1−ＰＥＧに関するデータを呈した。アルファ1−ＰＥＧは、ＰＡＭＧ−１に近い。膣分泌液中への異なる分子の低い浸透または高い浸透は、毛細管壁の選択的な透過性および選択的分泌過程のために発生する。成功するイムノアッセイには、膣分泌液中の低バックグラウンド濃度のＰＡＭＧ−１分子を検出することが必要であった。
【００３９】
そのような検出が可能である一対のモノクローナル抗体が、首尾よく選択された。検出されたＰＡＭＧ−１分子の正確な特性は、本発明の目的には重要ではないように見えるが、１つの例外があり、膣分泌液中で低濃度であることが確実でなければならない。このパラメータは、検査の閾値と膣分泌液中のＰＡＭＧ−１濃度のバックグラウンドレベルとの間に有意なギャップを維持して、感度閾値を低レベルに設定するのに十分である。最適閾値をこのように選択することによって、検査の可能性のある偽陰性結果および偽陽性結果の両方を除外することが可能である。
【００４０】
特に、胎盤アルファ−１−ミクログロブリンへのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、本発明の別のＭＡｂのシステムＭＡｂ−ＰＡＭＧ−１−接合体におけるその反応に基づいて研究された（実施例４、表６）。特異的にＭ２７１−Ｍ５２の対を使用して、最高力価が見いだされた。しかし、対ＭＡｂ２７１−ＭＡｂ５２および慣用的ＥＬＩＳＡ技術を使用して、出願人は、膣分泌液中にいかなる濃度のＰＡＭＧ−１も検出することができなかった。高感度ＥＬＩＳＡ技術は、対ＭＡｂ２７１−ＭＡｂ５２（実施例５、表７）用に開発されたものであり、これを使用して、膣試料内の低（ピコグラム範囲）濃度のＰＡＭＧ−１（実施例６、表８）を測定し、次いで、妊婦の子宮頸部分泌液および膣分泌液中の両方で測定した（実施例７、表９）。ＥＬＩＳＡでは、第１の層は、高感度ＭＡｂ Ｍ２７１から形成された。西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体は、ＭＡｂ Ｍ５２を含有し、いかなる抑制剤をも含有しない緩衝液で稀釈された。
【００４１】
実施例７、表９から、妊娠の合併症のない妊婦の子宮頸部分泌液および膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の濃度は、０．０５から０．２２ｎｇ／ｍｌの範囲であったことを見ることができる。このデータから、
−ＰＡＭＧ−１の正常濃度（８例）は、いくつかの安定レベル付近に位置する。膣および子宮頸部の両方のＰＡＭＧ−１の相対的安定性は、方法のパラメータの安定性を示し且つ収集試料の標準化された方法を示す役割を果たしてもよい。
−子宮頸部分泌液中のＰＡＭＧ−１の正常濃度の平均レベルは、およそ１５１ｐｇ／ｍｌであり、膣分泌液ではおよそ１１０ｐｇ／ｍｌである。
−血管障害に関連しない妊娠性疾病の場合（貧血、胎児の発育の遅れ）にはまた、正常に近いレベルのＰＡＭＧ−１が観察された。
−血液混合物は、子宮頸部のＰＡＭＧ−１の濃度の上昇を伴い、これは、１５１ｐｇ／ｍｌの正常濃度とは対照的に、レベル２９０ｐｇ／ｍｌで観察された。
−早期産および妊娠中毒症からの症候が存在する場合にＰＡＭＧ−１レベルが上昇し、これは、タンパク質に対する胎膜の透過性の増加に順応することもある。
−羊水の漏れがある場合には、ＰＡＭＧ−１レベルは急激に上昇する（１０〜５０倍）。
ということが理解され得る。
【００４２】
下記の実施例に示されるように、一対のモノクローナル抗体Ｍ２７１およびＭ５２が、方法、装置および検査キットのさらなる開発のために選択された。
【００４３】
このように、本発明は、特に、ＰＡＭＧ−１に対する結合親和性を有する選択された対のモノクローナル抗体、ＰＡＭＧ−１に対する結合親和性を有する抗体を含む生物学的組成物、本発明の抗体を使用してＰＡＭＧ−１を検出するためのキット、および、本発明の抗体を生産するための細胞株に関する。本発明はまた、ＰＡＭＧ−１を検出するための装置および方法、さらに、膣分泌液中にＰＡＭＧ−１が存在することによって示されるような、膣内の羊水の存在に基づいた、胎膜の破裂にも関する。
【００４４】
本明細書中により詳細に説明されるように、本発明は、部分的には、妊婦の膣分泌液中で最小バックグラウンド濃度のＰＡＭＧ−１を検出するのを可能にする一対のモノクローナル抗体での研究から生じる。膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の最小バックグラウンド濃度および羊水のその高濃度は、まず第１に、装置の感度の閾値を低レベルに設定するのを可能にし、それによって、膣分泌液中の非常に少量の羊水の検出を可能にし、第２に、最適なやり方で装置の感度の閾値を、特に、胎膜の破裂のない妊婦の膣分泌液におけるＰＡＭＧ−１の低い最小バックグラウンド濃度の典型的なレベルと、羊水中のＰＡＭＧ−１の高い典型的なレベルと、の間に置くことができる。ＰＡＭＧ−１に対する単数または複数の追加のモノクローナル抗体は、装置の感度の閾値を、所定のレベルに、例えば半定量分析のために、より正確に設定することを可能にする。さらに、膣分泌液中に羊水が存在することが胎膜の破裂を示すため、膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の検出は、胎膜の破裂を検出するために使用することもできる。この組み合わせはすべて、ＰＲＯＭおよびＰＰＲＯＭを検出する検査の偽結果を最小限にすることができる。
【００４５】
本発明によると、ＰＡＭＧ−１に特異的なモノクローナル抗体を、ＰＡＭＧ−１の検出、およびそれによって膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の存在に基づいた胎膜破裂の発生の検出に使用される組成物、キット、装置および方法に組み込むことができる。
【００４６】
タンパク質ＰＡＭＧ−１
ＰＡＭＧ−１は、妊婦の血清、羊水、および膣分泌液、ならびにすべてのヒトの血清内に存在するタンパク質である。ＰＡＭＧ−１は、非妊婦の血清（０〜６０ｎｇ／ｍｌ）および妊婦（５〜１２０ｎｇ／ｍｌ）に存在し、測定された濃度は、その検出のために使用された一対のモノクローナル抗体に依存する（実施例１、表１、２）。同一のタンパク質に対して異なる対の抗体を使用すると、そのタンパク質の異なる測定濃度を生じることが知られている。このようにして、ディアマンディＡ．（Diamandi A.）らの類似研究において（ディアマンディＡ．ら、「インスリン様成長因子結合タンパク質−３のイムノアッセイ（Immunoassay of the Insulin-Like Growth Factor-Binding Protein-3）」、Journal of Clinical Endoofinology and Metabolism、２０００年６月、第８５巻、第６号、２３２７〜２３３３頁参照のこと）、ＥＬＩＳＡの３種類の変形例が、ＩＧＦＢＰ−３の３種類の異なる濃度を示した。これを、ディアマンディＡ．らは、そのタンパク質分子の特定の翻訳後修飾を選定する各抗体対の能力に起因するとした。ＰＡＭＧ−１は、血清よりも有意に高い濃度の羊水に見られる（２０００〜７５０００ｎｇ／ｍｌ）。
【００４７】
ＰＡＭＧ−１は、１９７７年に、Ｄ．ペトルニン（D. Petrunin）によって羊水から単離された。これは、もともとは、胎盤の特異的なアルファ−１グロブリンと称された（Ｄ．ペトルニンら、「ヒト胎盤の器官特異的なアルファ−１グロブリンの免疫学的識別および羊水中のその内容物（Immunological Identification of Organ Specific alpha-1 Globulin of Human Placenta and Its Content in the Amniotic Fluid）」、Akusherstvo i Ginelologiya、１９７７年、Ｎ１、６４〜６５頁、ソビエト連邦、モスクワ、（実施例２参照のこと））。
【００４８】
ＰＰ１２（胎盤タンパク質１２）として識別された類似ではあるが同一ではないタンパク質が、後に、ボーン（Bohn）らによって、胎盤膜および胎膜から、単離され精製された（「Isolierung und Characterisierung eines Neuen Placentaspezifischen Proteins (PP12)」Arch. Gynecol.、９８０、第２２９巻、２７９〜２９１頁）。Ｓ．ベルらは、子宮内膜ＰＥＧ−１タンパク質の分離を報告したが、これは、１５アミノ酸のＮ末端ペプチドにおける２つのアミノ酸置換基（アミノ酸Ｎ１１、１２）がＰＰ１２とは異なっていた（Ｓ．ベルら、American Journal of Reproductive Immunology、１９８９年、第２０巻、８７〜９６頁）。
【００４９】
羊水から識別されたタンパク質をさらに特徴づけるために、ＰＡＭＧ−１の分子量を決定するために一連の測定が行われた。ＰＡＭＧ−１の分子量を決定するためにイムノブロット法が使用され、これは、３２ｋＤ（キロダルトン、ｋＤは原子質量単位）であることがわかった（ボルトブスカヤＭ．Ｎ．（Boltovskaya, M. N.）ら、「モノクローナル抗体を使用する胎盤アルファミクログロブリン（ＰＡＭＧ−１）の組織化学的臨床診断研究（Histochemical and Clinico-Diagnostic Study of the Placental Alpha-Microglobulin [PAMG-1] Using Monoclonal Antibodies）」、Bulletin of Experimental. Biology and Medicine、１９９１年、第１０号、３９７〜４００頁）。出願人は、後に、ＰＡＭＧ−１はＩＧＦＢＰタンパク質のファミリーに関連すると想定した（米国特許第５，９６８，７５８号参照のこと）。
【００５０】
ＰＡＭＧ−１は、異なるイソフォームで存在することができ、すなわち、異なる翻訳後修飾を受けている。抗体は、イソフォームごとに異なる特異性を有してもよく、これは、本発明のアッセイにおいて有利に使用することができる。
【００５１】
ＰＡＭＧ−１への抗体
元々は、ＰＡＭＧ−１への単一特異的な抗体が使用された（例えば、タタリノフ、Ｙ．ら、Uspekhi Sovr. Biologii、１９９０年、第１０９巻、３６９〜３７３頁参照のこと）。後に、ＩＧＦ−１および−２がないＰＡＭＧ−１分子のみを認識することができる抗体が得られた（米国特許第５，８９１，７２２号参照のこと）
【００５２】
ここで、「抗体」という用語は、タンパク質を得るために使用される方法とは無関係に、本願で特定されたような結合親和力を有するあらゆるタンパク質を意味する。例えば、タンパク質は、モノクローナル抗体であってもよく、または、そのフラグメントであってもよく、または、本願で特定されたような結合特異性を有する任意の分子であってもよい。
【００５３】
本発明によると、組み替えによってまたは化学合成によって生産された体液から分離されたＰＡＭＧ−１ポリペプチド、およびそのフラグメント、または融合タンパク質を含む他の誘導体またはアナログは、ＰＡＭＧ−１ポリペプチドを認識する抗体を生成するイムノゲンとして使用されてもよい。そのような抗体は、ポリクローナル、単一特異性、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリを含むが、それらに限定されない。本発明の抗ＰＡＭＧ−１抗体は、交差反応性であってもよく、例えば、異なる種からＰＡＭＧ−１を認識してもよい。ポリクローナル抗体は、交差反応の可能性がより高い。あるいは、本発明の抗体は、ＰＡＭＧ−１の単一フォームに特異的であってもよい。そのような抗体は、ヒトＰＡＭＧ−１に特異的であることが好ましい。
【００５４】
ＰＡＭＧ−１ポリペプチドまたはその誘導体またはアナログへのポリクローナル抗体の生産に、当該分野で公知の様々な手順を使用してもよい。抗体を生産するために、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等を含むが、それらに限定されない様々な宿主動物に、ＰＡＭＧ−１ポリペプチドまたはその誘導体（例えば、フラグメントまたは融合タンパク質）を注入することによって、免疫することができる。１つの実施形態において、ＰＡＭＧ−１ポリペプチドまたはそのフラグメントは、免疫原性キャリヤ（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ））に、結合させることができる。免疫反応を高めるために、宿主種に依存して、様々なアジュバントを使用してもよく、これらには、フロイント（完全および不完全）、ミネラルジェル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性物質（例えば、リゾレシチン）、プルロニックポリオール（pluronic polyol）、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、および、有用な可能性のあるヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（bacille Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウムパルヴム（Corynebacterium parvum））が含まれるが、それらに限定されない。
【００５５】
ＰＡＭＧ−１ポリペプチド、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体に対するモノクローナル抗体を調製するために、培養液中の連続継代細胞系によって抗体分子の生産を提供する任意の技術を使用してもよい。これらには、もともとはコーラー（Kohler）およびミルスタイン（Milstein）によって開発されたハイブリドーマ技術（Nature、１９７５年、２５６：４９５〜４９７）、ならびにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（コズボル（Kozbor）ら、Immunology Today、１９８３年、４：７２；コート（Cote）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１９８３年、８０：２０２６〜２０３０）、およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（コール（Cole）ら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、アランＲ．リス社（Alan R. Liss,Inc.）７７〜９６頁、１９８５年）が含まれるが、それらに限定されない。本発明のさらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、無菌動物で生産することができる（国際特許出願公開第８９／１２６９０号、１９８９年１２月２８日公開）。事実、この発明によると、ＰＡＭＧ−１ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にスプライスすることによって、「キメラ抗体」の生産用に開発された技術（モリソン（Morrison）ら、J. Bacteriol、１９８４年、１５９：８７０；ニューベルガー（Neuberger）ら、Nature、１９８４年、３１２：６０４〜６０８；タケダ（Takeda）ら、１９８５年、Nature、３１４：４５２〜４５４）を使用することができる。そのような抗体は、本発明の範囲内である。そのようなヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾病または障害の治療に使用するのに好適であるが（後述）、それは、ヒトまたはヒト化抗体が、それ自体、免疫反応、特にアレルギー反応を誘発することが、外因性抗体よりもかなりありそうもないからである。
【００５６】
本発明によると、単鎖抗体の生産のために記載された技術（ヒューストン（Huston）に付与された米国特許第５，４７６，７８６号および第５，１３２，４０５号、米国特許第４，９４６，７７８号）を採用して、ＰＡＭＧ−１ポリペプチド特異性単鎖抗体を生産することができる。実際、これらの遺伝子は、生体内で（in vivo）発現するように送出されることができる。本発明のさらなる実施形態は、Ｆａｂ発現ライブラリの構築のために記載された技術（ヒューズ（Huse）ら、Science、１９８９年、２４６：１２７５〜１２８１）を使用して、ＰＡＭＧ−１ポリペプチドまたはその誘導体またはアナログに所望の特異性を備えたモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ簡便な同定を可能にする。
【００５７】
イディオタイプの抗体分子を含有する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成することができる。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生産することができるＦ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂフラグメント、および、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成することができるＦａｂフラグメントを含むが、それらに限定されない。
【００５８】
抗体の生産において、所望の抗体のためのスクリーニングは、当該分野で公知の技術によって達成することができ、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、インシチュ（in situ）イムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素またはラジオアイソトープ標識を使用する）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集反応アッセイ（例えば、ゲル凝集反応アッセイ、赤血球凝集反応アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光測定アッセイ、タンパク質Ａアッセイ、免疫電気泳動アッセイ等である。１つの実施形態において、抗体結合は、一次抗体の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、一次抗体は、二次抗体または試薬が一次抗体に結合するのを検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体は標識をつけられる。イムノアッセイにおいて結合を検出するための多くの手段が当該分野で公知であり、本発明の範囲内である。例えば、ＰＡＭＧ−１ポリペプチドの特異的なエピトープを認識する抗体を選択するために、そのようなエピトープを含有するＰＡＭＧ−１ポリペプチドフラグメントに結合する生成物に対して生成されたハイブリドーマをアッセイしてもよい。ＰＡＭＧ−１ポリペプチドに特異的な抗体を特定な種の動物から選択するために、その種の動物の細胞によって発現されるかまたはそれから単離されるＰＡＭＧ−１ポリペプチドとの陽性結合に基づいて、選択することができる。
【００５９】
本発明による特異的な抗体
本発明によるハイブリドーマ細胞系は、下記の手順によって生産される。第１に、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞を有するマウスを、ＰＡＭＧ−１で免疫する。次いで、ハイブリドーマが生産されて、Ｂ細胞を不死化する。Ｂ細胞は、脾臓および／またはリンパ節Ｂ細胞であってもよい。これらのハイブリドーマは、ＰＡＭＧ−１に結合親和力を有するモノクローナル抗体を生産するものであり、ＥＬＩＳＡ（第１の層：ＰＡＭＧ−１；第２の層：ハイブリドーマ上清；および第３の層：西洋ワサビペルオキシダーゼによって標識されたウサギ抗マウス抗体のコンジュゲート）において同定される。これらの同定されたハイブリドーマは、次いで、生体外で（in vitro）または腹水で培養され、それらが産生するモノクローナル抗体が単離される。特定の実施形態において、抗体は、ハイブリドーマＮ５２、Ｎ２７１およびＮ４２由来のものであり、これらはロシア国立工業微生物寄託機関に寄託され、それぞれ、受託番号ＶＫＰＭ Ｈ−９２、ＶＫＰＭ Ｈ−９３およびＶＫＰＭ Ｈ−９４が付されている。
【００６０】
本発明の組成物
本発明は、本発明による２つまたはそれ以上の抗体を含む一連の組成物にも関連する。１つの実施形態において、組成物は、一対の抗体と、その一対の抗体の一方に結合された検出可能なマーカーと、を含む。様々な検出可能なマーカーを使用してもよく、これらには、例えば、着色した粒子、酵素、蛍光色素および放射性同位元素を含まれるが、それらに限定されない。検出可能なマーカーの１つの特定の例は、２０〜３０ｎｍの範囲の平均寸法を有する金着色粒子である。検出可能なマーカーの別の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼである。例えば、検出可能なマーカーを抗体に結合するための方法は、ハーロー、Ｅ．（Harlow, E.）およびレーン、Ｄ．（Lane, D.）による、Methods In Enzymology、１９８１年、第７３巻、３〜４６頁；「抗体ａラボラトリーマニュアル（Antibodies a Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory、１９８８年、３２２、３２３および３４３頁；および、 Pierce Catalog、Ｔ９〜Ｔ１７頁（１９９６年）、に記載されている。適切な酵素として、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられるが、それらに限定されない。本発明に使用される他のマーカーまたは標識として、コロイド金、着色ラテックスビーズ、磁気ビーズ、蛍光標識（例えば、２、３のフルオロフォアの例を挙げると、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ローダミン、フリーまたはキレートのランタニド系列塩、特にＥｕ３＋）、化学発光分子、ラジオアイソトープ（１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、キレートＴｃ等）、または、磁気共鳴画像法標識が挙げられる。他のマーカーとして、蛍光消光、および、蛍光移動マーカー、例えば、均質アッセイおよび固相アッセイに使用されるものが挙げられる。さらに、本発明にしたがって、マーカーは、エピトープ、結合パートナー、または、別の分子と相互作用するための「ハンドル」、例えば、ビオチン−ストレプトアビジン；グルタチオン−ＧＳＴ；ヘキサヒスチジン−ニッケル等であってもよい。本発明はまた、二次抗体を使用することも企図しており、これは、それ自体が、マーカーとして、検出可能に標識される（例えば、抗ＰＡＭＧ−１抗体対が、２つの異なる動物種からのＦｃ部分を備えた抗体を使用する状況である）。
【００６１】
別の実施形態において、組成物は、本発明のストリップ装置の検査領域に位置する２つまたはそれ以上のモノクローナル抗体をさらに含んでもよい。
【００６２】
本発明によるキット
本発明は、ＰＡＭＧ−１を検出するためのキットにも関する。１つの実施形態において、キットは、本発明による一対の抗体を含み、その一方は、ＰＡＭＧ−１に高度に特異的である。キットの１つの変形例において、一方または他方の抗体が、抗体に結合された検出可能なマーカーを含む。別の変形例において、選択された対の一方または他方の抗体は、固体担体に結合される。この変形例において、選択された対の移動可能な抗体は、検出可能なマーカーを含む。別の実施形態において、組成物は、３つまたはそれ以上のモノクローナル抗体を含み、そのうちの１つは、移動可能であり且つ検出可能であり、この組み合わせは、イムノクロマトグラフアッセイの感度の閾値を調節するのを可能にする。
【００６３】
特定の実施形態において、最高結合親和力の抗ＰＡＭＧ−１抗体は、移動可能であり、当初試料接触のために装置のパッド領域に置かれる。別の抗体は、装置の検査領域に置かれる。あるいは、最高結合親和力ほど高くないが、ＰＡＭＧ−１に高い結合親和力を有する他のモノクローナル抗体を異なる組み合わせで調製し、装置の検査領域内で固定して、本発明の装置用の感度の所定の閾値を設定するかまたは調整することができる。これは、実施例１１に示されるように、慣用的な実験によって行うことができる。抗体の異なる組成物は、所定のレベルで本発明の装置用の信号検出の閾値を確立する。
【００６４】
ＰＡＭＧ−１を検出するための方法および装置
本発明は、ＰＡＭＧ−１、特に、通常の膣液よりもはるかに多い量の羊水に存在するＰＡＭＧ−１が、結果として羊水が膣内に漏れることになる胎膜の破裂を検出するための有用な検体であることを確立する。言い換えると、これによって、膜すなわち羊膜嚢の早期破裂を診断することが可能になる。本発明はさらに、正常条件下でのＰＡＭＧ−１の検出、膣炎の様々な症候および真の膜破裂の検出のためのカットオフを確立する。検体、および、膜の破裂を示す相対的レベルを識別すると、当業者は、早期膜破裂の状態が患者に発生しているか否かを決定するためにタンパク質を検出するのに公知の任意の分析技術を、完全に有利に、使用することができる。
【００６５】
イムノアッセイ、特に、イムノクロマトグラフアッセイは、本発明にしたがって好適な技術を構成し、イムノアッセイは下記に詳細に述べられる。これらのアッセイは、特異性、正確度、速度および経済性という利点を有する。
【００６６】
本発明は、ＰＡＭＧ−１を検出し定量するための他の方法を使用することもできるが、これらの方法は、高価な機器を必要とし、アッセイを実験室設定に限定することもある。１つのそのような技術は、例えば、ディレイドエクストラクションおよび飛行時間型チャンバのリフレクトロンを備えたマトリックス支援レーザ脱離（ＭＡＬＤＩ）飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析（ＭＳ）を使用する質量分析である。好ましくは、ＭＡＬＤＩアッセイは、シリコンアレイ上で実行される。ＭＡＬＤＩ用のアレイの例は、酸化シリコン上で、３５０μｍセンターで、２００μｍ円形ゲルパッドである。ゲルパッドの間の疎水性表面（撥水表面）は、ＭＡＬＤＩ用に、より焦点を合わせたマトリックス／タンパク質スポットをさらに提供し、それによって、定量用の信号を改良する。例えば、パッカードバイオサイエンス（Packard Bioscience）システムを使用して作成されたスポットは、直径が２００μｍ未満であり得る。ピエゾシステムは、約３００ｐＬのＭＡＬＤＩマトリックス（例えば、ＤＨＢ、シナピン酸）を、親和力捕捉剤（affinity capture agent）−ペプチドスポットの正確な位置へ送出して、均質なペプチド／マトリックス結晶を形成することができる。ＭＡＬＤＩーＭＳ（例えば、パーセプティブボイジャー（Perseptive Voyager））におけるこの結晶からの脱離／イオン化（カラス（Karas）ら、Ion Processes、１９８７年、第７８巻、５３〜６８頁、または、ゼノビ（Zenobi）ら、Mass Spectrom. Rev.、１９９８年、第１７巻、３３７〜３６６頁）は、ペプチドピークの高さがそのペプチドを含有するタンパク質の量に比例する質量スペクトルを産する。
【００６７】
本発明に使用される代替技術は、キャピラリー電気泳動クロマトグラフィであり、これは、少量の試料に存在する検体の定量を可能にする。
【００６８】
さらに、定量的な生化学的技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高性能液体クロマトグラフィ等を、単独でまたは組み合わせて使用して、試料中のＰＡＭＧ−１を検出し、その量を定量してもよい。
【００６９】
ＰＡＭＧ−１を検出するための免疫学的方法および装置
抗原に対する抗体の免疫特異的な結合を検出するための当該分野で公知の様々な手段を使用して、本発明にしたがって結合を検出することができる。複合体の分析に関与する抗原と抗体との間の相互作用を検出する初期の方法は、ゲルの沈降によるものである。検体−検出抗体結合対を検出するためのさらなる方法は、放射性ヨウ化検出抗体または放射性ヨウ化タンパク質を使用することを含み、これは、ＩｇＧ例えばタンパク質Ａと反応する。これらの初期の方法は、Methods in Enzymology、１９８０年、第７０巻、１６６〜１９８頁に検討されているように、当業者によく知られている。抗体および本明細書中に開示されたＰＲＯＭ用の閾値を超える陽性結果を生じる条件を選択することによって、この技術を本発明の実施において使用し得る。
【００７０】
１つの抗体のみを使用して試料中の検体の存在を決定するための後の方法は、競合結合アッセイが含まれていた。この技術において、抗体は、固体担体に固定されることが非常に多く、公知の量の標識された検体と一緒に、検体を含有すると疑われる試料に露出される。２つの検体、すなわち、標識された検体と試料中の検体とは、抗体の結合部位を競合する。遊離標識検体または結合標識検体のいずれかが決定され、この測定から、試料中の競合する検体が知られる。この方法のより完全な説明は、「抗原−抗体反応の基本原理（Basic Principles of Antigen-Antibody Reaction）、エルビンＡ．ラバト（Elvin A. Labat）（Methods in Enzymology、７０、３〜７０、１９８０年）に開示されている。この例において、標識された検体は、ラジオアイソトープまたは酵素標識のいずれかで標識されることができる。
【００７１】
より近年のイムノアッセイは、検体の存在を検出するために二重抗体法を使用する。これらの技術も、Methods in Enzymologyの上記参照した巻に検討されている。したがって、本発明の１つの実施形態にしたがって、個別マーカーの存在は、検出されるべきマーカーの各々用の一対の抗体を使用して決定される。上記対の抗体の一方は、ここでは「検出抗体」と称され、上記対の抗体の他方は、ここでは「捕捉抗体」と称される。本発明の１つの実施形態は、このようにして、膣液の試料内のＰＡＭＧ−１を検出するために二重抗体サンドイッチ方法を使用する。この方法において、検体は、検出抗体と捕捉抗体との間に挟まれ、捕捉抗体は、固体担体に不可逆的に固定されている。検出抗体は、抗体−検体サンドイッチの存在、すなわち検体の存在を識別するために、検出可能な標識を含有する。
【００７２】
固体担体の一般的な初期の形態は、ポリスチレン製のプレート、チューブまたはビーズを含み、これらはすべて、ラジオイムノアッセイおよび酵素イムノアッセイの分野では周知である。より近年には、多数の多孔性材料、例えば、ナイロン、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ガラス繊維および他の多孔性ポリマーが、固体担体として使用されている。
【００７３】
このようにして、特定の実施形態において、本発明の装置は、イムノクロマトグラフアッセイを行うための手段を具備する（「イムノクロマトグラフアッセイ装置」）。そのような装置は、液体を伝えるための固相手段を具備する。本明細書中において使用される場合、「液体を伝えるための固相手段」は、液体がそれを通って、例えば毛管作用によって、移動することを可能にする固体担体を意味する。この性質を有する典型的な製品は、ニトロセルロース膜であり、これは、当業者に周知の方法で調製されてもよい。
【００７４】
多くのイムノクロマトグラフアッセイ手段およびフォーマットは、当該分野で公知であり、本発明の実施のために使用することができる。ディップスティックまたは流入装置に固体担体として膜を使用するイムノクロマトグラフアッセイは、臨床の研究室において使用するために、および代替の、すなわち非実験室系の現場検査での使用のために、よく確立されている。イムノクロマトグラフアッセイ装置用の通常の形態は、プラスチックホルダ内に装備された膜（セルロースまたは非セルロース）である。プラスチックホルダは、装置全体が正確に機能するのを確実にするために、膜を適切な構成に保つ。アッセイ装置の基本構造には、多くの変形例がある。例えば、リトマン（Litman）ら（米国特許第５，１５６，９５２号および第５，０３０，５５８号）には、試料中の検体の最小量の存在を検出するためのアッセイ方法および装置が記載されている。ウルマン（Ullman）ら（米国特許第５，１３７，８０８号および第４，８５７，４５３号）には、試料が流れるのを補助するために内蔵式の液体試薬を含むアッセイ膜を収容するための装置が記載されている。ダフォーン（Dafforn）ら（米国特許第４，９８１，７６８号）には、試料および特別な液体を加えるためのポートを備えた装置が記載されている。コルチ（Corti）ら（欧州特許出願公開第８９１１８３７８．２号）、グリーンキスト（Greenquist）ら（米国特許第４，８０６，３１２号）、および、バーガー（Berger）ら（米国特許第５，１１４，６３７号）にも、アッセイ装置が記載されている。
【００７５】
好ましくは、イムノクロマトグラフアッセイ手段は、アッセイが正しく進行していることを示すコントロールを含む。コントロールは、固相担体上の試料添加点から、検体の存在下にまたは非存在下で標識された試薬に結合する検出ゾーンよりも離れたスポットにある特異的な結合反応物であり得、したがって、動員可能なレセプターが液体試料とともに十分な距離を移動して、意味のある結果を与えていることを示す。
【００７６】
イムノクロマトグラフアッセイに使用されるのに適切な標識として、酵素、フルオロフォア、クロモフォア、ラジオアイソトープ、染料、コロイド金、コロイド状炭素、ラテックス粒子、および、化学発光剤が挙げられる。コントロールマーカーが使用される場合には、レセプターおよびコントロールマーカーに同一の標識または異なる標識を使用してもよい。
【００７７】
本発明の１つの実施形態は、流入型のイムノアッセイ装置を使用する。バルカーズ（Valkirs）ら（米国特許第４，６３２，９０１号）には、抗原検体に特異的であり、液体試料が加えられる多孔性膜またはフィルタに結合された抗体を含む装置が開示されている。液体が膜を通って流れるにつれて、標的検体が抗体に結合する。試料の追加後に、標識された抗体が追加される。標識された抗体を目で見て検出することによって、試料内に標的検体が存在することが示される。
【００７８】
流入装置の別の例は、クローマー（Kromer）ら（欧州特許出願公開第０２２９３５９号）に開示されており、これには、マトリックスの下に配置された反応マトリックスに送達するように試薬の溶出速度を制御するために、水溶性ポリマーに分散された試薬またはその成分で飽和されたマトリックスを備える試薬送達システムが記載されている。
【００７９】
移動型のアッセイでは、固相担体（例えば、膜）に、アッセイを実行するのに必要な試薬が含浸される。標識された検体が結合され、アッセイの結果が読み取られる検体検出ゾーンが設けられる。例えば、トム（Tom）ら（米国特許第４，３６６，２４１号）およびズク（Zuk）（欧州特許出願公開第０１４３５７４号）を参照のこと。移動度アッセイ装置は、通常、その中に、着色された標識（例えば、コロイド金またはコロイド状炭素）に結合されている試薬を組み込み、それによりさらなる物質を加えることなく、アッセイ結果を目で見て検出するのを可能にする。例えば、バーンスタイン（Bernstein）（米国特許第４，７７０，８５３号）、メイ（May）ら（国際特許出願公開第８８／０８５３４号）およびチン（Ching）ら（欧州特許出願公開第０２９９４２８号）を参照のこと。これらの公知のタイプの流入装置のすべては、本発明にしたがって使用することができる。
【００８０】
直接標識は、本発明によるイムノクロマトグラフアッセイに使用することができる標識の１つの例である。直接標識は、自然の状態で、裸眼により、または光学フィルタおよび／または蛍光を促進するために加えられる刺激（例えば、紫外線）のいずれかの補助を用いることにより、容易に見ることができるエンティティーとして規定されている。本発明にしたがって使用することができる着色標識の例としては、金属ゾル粒子（例えば、ルーベリン（Leuvering）（米国特許第４，３１３，７３４号）に記載されたもののような金ゾル粒子）；グリブノー（Gribnau）ら（米国特許第４，３７３，９３２号）およびメイ（May）ら（国際特許出願公開第８８／０８５３４号）に記載されたもののような染料ゾル粒子；上記メイ、およびスナイダー（Snyder）（欧州特許出願公開第０２８０５５９号および第０２８１３２７号）に記載されたもののような染色されたラテックス；または、キャンベル（Campbell）ら（米国特許第４，７０３，０１７号）に記載されたようなリポソームに封入された染料が挙げられる。他の直接標識として、放射性核種、蛍光性部分または発光性部分が挙げられる。これらの直接標識づけ装置に加えて、酵素を含む間接標識も、本発明にしたがって使用することができる。様々な種類の酵素結合免疫アッセイが当該分野では周知であり、例えば、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼであり、これらおよび他のものは、エバ・エングバル（Eva Engvall）によって、エンザイムイムノアッセイＥＬＩＳＡおよびＥＭＩＴ（Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT）、Methods in Enzymology、７０、４１９〜４３９、１９８０年および米国特許第４，８５７，４５３号に詳細に検討されている。
【００８１】
特定の実施形態において、本発明の診断装置は、試料を導入する点の近位に検出セクションと、その点から下流に捕捉セクションとを有する膜アセンブリを具備する。検出セクションは、抗体（検出抗体）を含有し、これは試料中に存在する本発明の任意の検体と反応する。検出抗体は、膜に可逆的に固定され、使用時には、試料と一緒に移動する。検出抗体は、例えば、放射性核種、酵素、蛍光性部分、発光性部分、または、先行技術に記載されたものおよび上記に検討されたもののような着色され標識で標識されることが、必須ではないが好適である。具体的には、反応の早い標識を使用することができ、そのため、例えば、抗体は、抗原の捕捉前に金に見え、捕捉時に紫に変わる。
【００８２】
捕捉セクションは、述べたように、検出セクションから下流にあり、捕捉抗体を含み、これは、固体担体に不可逆的に固定され、各抗体は、捕捉セクションの異なる位置で固定される。抗体および必要な試薬は、先に検討した流入型のイムノアッセイ装置で検討した当該分野で認められた標準的な技術を使用して、固体担体に固定される。一般に、抗体は、非極性タンパク質基礎構造と非極性担体マトリックス材料との間の疎水的相互作用の結果として、固体担体に吸収される。
【００８３】
本発明のイムノクロマトグラフアッセイ技術の特定の利点は、これらのアッセイが定量的データを提供することができないことを克服することである。このようにして、捕捉セクションは、試料中のＰＡＭＧ−１の量が所望の検出閾値を超えたときのみに、信号が生成されるように、ＰＡＭＧ−１に特異的な固定された抗体の混合物を含有することができる。
【００８４】
加えて、本発明は、均質イムノアッセイフォーマットを使用することを企図する。そのような競合均質方法の１つの例は、ルーベンスタイン（Rubenstein）およびウルマン（Ullman）による米国特許第３，８１７，８３７号に見られ、これには、リガンドおよび酵素結合リガンドが抗体結合部位に対して競合する技術が記載されている。酵素結合リガンドに対する抗体の結合は、酵素活性を変えるため、存在するリガンドの濃度は、そのような混合物が基質を生成物に転換する速度を測定することによって概算することができる。このようにして、均質方法では、標識の検出可能な特性は、結合しているか否かに依存して本質的に異なる。結合状態では、標識は、より大きいかまたはより小さい信号強度を有する。通常、標識されたリガンドに対する抗体の結合は、例えば、標識が酵素であるときには、信号強度を減少させる。このカテゴリーの典型的な生成物として、シバ社（Syva Company）からのエンザイムイムノアッセイのＥＭＩＴ系、および、アボットダイアグノスティクス（Abbott Diagnostics）からの蛍光分極イムノアッセイのＴＤＸ系が挙げられる。特定の均質アッセイは、検体の全てをビーズに沈着させることで調製することができ、その場合、試料が導入され、その後、ビーズは遠心沈降され、検出される。
【００８５】
本発明にしたがって使用することができる生物学的診断装置の他の例として、米国特許第４，９０６，４３９号および第４，９１８，０２５号に、Ｐ．Ｂ．ダイアグノスティクスシステムズ社（P. B. Diagnostics Systems,Inc.）のＧ．グレナー（G. Grenner）が記載している装置が挙げられる。グレナーの’４３９号の特許装置は、診断検査要素と、流体送達要素を備える試料添加ユニットとを具備し、これは試料を検査要素へ送出するために複数の溝を備えた層を有することを特徴とする。グレナーの’０２５号特許は、試料導入手段（例えば、膜）を含む装置に関し、その試料導入手段に隣接して、固定試薬および廃液リザーバーを含有する毛細管が配置される。試料が沈殿された後、毛細管から固定試薬を放出することによって反応を完了し、過剰な液体は廃液リザーバーに保持される。そのため、装置は自己充足式である。
【００８６】
膜で測定することが好適であるが、他の技術および対応するセンサ装置も同様に、上記に類似したやり方で使用されてもよいことが理解されるべきである。現在、数種類の自動化アッセイ機器が利用可能であり、これらは、多数の試料のアッセイを同時に行うことができる。これらの自動化アッセイ機器は、連続式／ランダムアクセスアッセイ機器を含む。そのようなシステムの例として、Ｐ．Ｂ．ダイアグノスティクシステムズ社（PB Diagnostic System, Inc.）のＯＰＵＳ（登録商標）、および、１９８８年にイリノイ州ノースシカゴ（North Chicago, Ill）のアボットラボラトリーズ（Abbott Laboratories）が導入したＩＭＸ（登録商標）アナライザが挙げられる。一般に、検査流体の試料は、典型的に、試料カップに提供され、試料をアッセイ検査要素内にピペット注入することと、インキュベーションと、得られた信号を読み取ることと、を含むすべてのプロセスステップは、自動的に行われる。自動化アッセイシステムは、一般に、一連のワークステーションを含み、その各々は、検査手順でステップの１つを実行する。アッセイ要素は、様々な手段（例えば、カルーセルまたは可動ラック）によって１つのワークステーションから次のワークステーションへ運ばれて、検査ステップを順に達成することを可能にしてもよい。アッセイ要素はまた、試薬、混合流体、稀釈試料等を保存するためのリザーバーを含んでもよい。アッセイ要素はまた、所定の量の試料流体を投与するのを可能にする開口を含み、必要に応じて、多孔性部材への他の任意の必要な試薬を含む。試料要素もまた、処理ステップの得られた信号（典型的には、多孔性部材に存在する試薬の蛍光変化または比色分析変化）を、例えば、アッセイシステム内に含まれるスペクトロスコピーまたはフルオリメータのような手段によって、読み取ることができるように、窓を含んでもよい。Ｐ．Ｂ．ダイアグノスティクシステムズ社の自動化アッセイ器具は、米国特許第５，０５１，２３７号、第５，１３８，８６８号、第５，１４１，８７１号および第５，１４７，６０９号に記載されている。
【００８７】
イムノケミカルアナライザシステムのさらなるクラスは、本発明を実行するのに使用することができるが、バイオセンサまたは光学式イムノセンサシステムである。一般に、光学式バイオセンサは、光学的原理を定量的に使用して、興味のある化学的または生化学的な濃度または活性を電気信号に変換する装置である。これらの装置は、４つの主なカテゴリーにグループ分けされる。すなわち、反射技術、表面プラズモン共鳴、光ファイバ技術および集積光学デバイスである。反射技術は、偏光解析法、マルチプルインターナル反射スペクトロスコピー（multiple integral reflection spectroscopy）、および、蛍光キャピラリーフィル装置（fluorescent capillary fill devices）を含む。光ファイバ技術は、エバネッセント場蛍光、光ファイバキャピラリチューブ、および、光ファイバ蛍光センサを含む。集積光学デバイスは、プラナーエバネッセント場蛍光、インプットグレーディングカプラーイムノセンサ、マッハツェンダ干渉計、ハートマン干渉計、および、差干渉計センサを含む。結合反応のホログラフ検出は、結合対の一方の反応物が結合対の固定された第２の反応物に結合するときに所定の画像場所で生成されるホログラフ画像の存在を検出して、達成される（リヒテンワルター（Lichtenwalter）らに付与された１９９４年１０月４日に発行された米国特許第５，３５２，５８２号参照のこと）。光学式イムノセンサの例は、一般に、Ｇ．Ａ．ロビンズ（G. A. Robins）（バイオセンサの進歩Advances in Biosensors）、第１巻、２２９〜２５６頁、１９９１年の概説記事に記載されている。これらの装置のより具体的な記載は、例えば、米国特許第４，８１０，６５８号、第４，９７８，５０３号および第５，１８６，８９７号、Ｒ．Ａ．ブラディ（R. A. Brady）ら（Phil. Trans. R. Soc. Land.Ｂ３１６、１４３〜１６０、１９８７年）、および、Ｇ．Ａ．ロビンズら（Sensors and Actuators、エルゼビア、１９９２年）に見られる。
【００８８】
本発明の方法および対応するキットは、様々な光学式測定システム内に組み込み実行することができる。具体的には、本発明のキットおよび材料は、イムノアッセイフォーマットで実行してもよく、そのようなフォーマット自体を、様々なオプトエレクトロニクス検出システムに具現することができる。より詳細には、本発明を実行する際に容易にされ実施されてもよい様々な光学式イムノセンサ技術は、既に公知である。このようにして、例えば、反射技術、表面プラズモン共鳴、光ファイバ導波管技術および集積光学デバイス等の装置および技術は全て、本発明の方法にしたがって患者の生体試料を検出しその試験の結果を表示するように採用され、具体的に構成されてもよい。特定の反射技術（例えば、反射率測定法および偏光解析法）、および光ファイバ、光導波管、蛍光キャピラリーフィル装置および集積光学バイオセンサの特定の用途が、ほんの数例の、使用されてもよい変形例の技術および機器を提示する。これらの装置の一般的な概説は、ロビンソン、Ｇ．Ａ．の光学式イムノセンサ：概要（OpticalImmunosensors : An Overview）、バイオセンサの進歩（Advances in Biosensors）、第１巻、２２９〜２５６頁（１９９１年）に見出され得る。
【００８９】
より具体的には、偏光解析法は、偏光ビームの方向に依存し、第１に参照表面（標準）に対して、その後試料表面に対して、それに続いて、結果として得られる反射の性質および程度の比較を行うことができる。特に、レセプター分子に対する検体の結合は、鎖として参照表面に対する表面の厚さを測定される。
【００９０】
マルチプルインターナル反射スペクトロスコピー（multiple internal reflection spectroscopy）の場合には、例えば、リガンドおよびそのレセプターが、平坦な溶融石英導波管の光学面に共有結合的に固定されてもよく、その後、光ビームが導波管内で内的に反射し、導波管に隣接する溶液中に浸透し、その結果、屈折の差を、標準と試料との間で測定することができる。この特定のフォーマットにおいて、蛍光標識が連結されていてもよく、蛍光が測定されて、結果として、現在の結合の程度が決定さる。
【００９１】
追加技術は、蛍光キャピラリーフィル装置として知られる技術を使用する。この特定の技術において、キャピラリー寸法のギャップによって離れて保持される２枚のガラスプレートが使用される。レセプター分子は、基部プレート上で固定されてもよく、これは光導波管としても作用する。ＦＩＴＣ標識づけを使用する競合アッセイまたはサンドイッチアッセイが実行されてもよく、誘起された蛍光が、非結合の供給源とは対照的に結合された供給源からの信号で導波管内に連結される。そのような信号は、導波管を出るときにその角度発散によって識別される。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置も準備されており、これは、薄金属フィルムに入射する光の、金属フィルム内の集合的電子振動に関連した表面モードとの連結に応答して作用する。共鳴状態は、金属フィルムの光学的特徴、その厚さ、そのフィルムのいずれかの側の誘電体の屈折率、および、光の入射の角度に依存する。レセプター分子は、金属フィルムの頂部に結合され、光は、例えばプリズム基材を通ってフィルムの底部に方向づけられる。標的検体は、これらのレセプターに結合するときには、局所屈折率に発生する変化のため、共鳴状態にシフトを生じる。共鳴は、金属フィルム表面に光ビームが入射する角度が変化する際に、反射した光強度をモニタすることによって観察される。共鳴角度の変化が、結合された検体の量に直接相関する。
【００９２】
光ファイバシステムに関与する技術には、エバネッセント場蛍光が含まれる。この場合、クラッドが、光ファイバの端から除去され、このようにして、周囲の媒体とエバネッセント的に相互作用するセンサ要素を生成する。レセプター分子は、露出されたファイバ表面に結合される。直接アッセイは、レセプターおよび接合体タンパク質の自然な蛍光を使用して実行されてもよい。競合アッセイまたはサンドイッチアッセイは、より大きな感度を達成するためにＦＩＴＣ標識づけを使用して実行されてもよい。操作において、光波がファイバ内に連結され、エバネッセント的に生成された蛍光の一部が、ファイバへ連結し戻され、検出器へ伝播され戻される。
【００９３】
光ファイバ技術を使用するさらなる技術は、光ファイバキャピラリチューブに関与し、裸の光ファイバが円筒形フィルチャンバ内に取り囲まれ、ファイバの周囲を直に被っているフィル容量の一部とエバネッセント的に相互作用するセンサ要素を生成する。レセプター分子は、露出されたファイバ表面に結合されてもよく、サンドイッチアッセイまたは競合置換アッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ）が行われ得る。光波がファイバに連結されて、エバネッセント的に誘起された蛍光の一部がファイバ内に連結されて戻り、そして検出器へ伝播され戻される。バックグラウンド源に対する標的検体からの信号は、ファイバから出るときにその角度発散によって識別される。他の光ファイバ技術（例えば、光ファイバ蛍光）が、上記に明記した特定の同じ原理を使用して、本発明に適合されてもよい。
【００９４】
さらなる光子技術（例えば、干渉分光法）は、例えば２本の経路を有する薄フィルム導波管の配置を含み、その第１の経路にレセプター分子が固定されてもよく、一方、第２の経路はシールドされて、参照チャネルを提供する。例えば、レーザ光が導波管内に連結され、２本の経路に分かれてもよく、その結果、覆う層の屈折率および厚さの変化は、ビームの位相シフトの結果として検出され得、それが今度は、結合された検体の量と相関する。このアプローチの変形例は、単一経路マルチモード薄フィルムプラナー導波管が準備されるハートマン干渉計で確認される。レセプター分子はこの経路に固定されてもよく、２つのモードが経路を伝播するようにレーザからの光が導波管内に連結されてもよい。マルチモード形状の光学では、より高い次元のモードが大きなエバネッセント場を有し、信号機構を提供し、より低い次元のモードは実際にはエバネッセント場を有さず、参照機構を提供する。標的検体と結合することは、経路上を覆う層の屈折率および厚さに関連変化を発生させ、これは、より高い次元のモードのエバネッセント場によって検出され、そのモードに位相シフトを発生させる。より低い次元のモードまたは参照モードではそのような変化は見えないため、位相シフトは経験されず、信号と参照ビームとの間の測定された差は、結合された検体の量を決定するために相関することができる。
【００９５】
前述の検討は、一般的に且つ幾分は詳細に提供されているが、光学センサ技術において利用可能な様々な技術が本発明の実施に適合させ得る。上記の列記は、決して網羅的なものでも限定的なものでもなく、様々な現存の技術を採用してもよく、それは、首尾よく結合における差を測定し、結果として、本願におけるそれぞれの目的のマーカーまたは検体の存在および量を測定することを理解すべきである。当然ながら、上記に強調されたように、どの技術が使用されるのであれ、本発明の実施は、少なくとも３つの検体の同時検出および測定を含む。
【００９６】
ＰＡＭＧ−１を検出するためのイムノクロマトグラフ法
本発明にしたがってＰＡＭＧ−１を検出する方法の実施形態が、下記に記載される。
【００９７】
上記方法の１つの実施形態において、ＰＡＭＧ−１は、ＰＡＭＧ−１を含有する試料を、本発明のイムノアッセイシステムに接触させ、抗体−ＰＡＭＧ−１複合体を形成させることによって、試料内で検出される。次いで、抗体−ＰＡＭＧ−１複合体が検出される。この実施形態の１つの変形例において、抗体は、検出可能なマーカーを含み、抗体−ＰＡＭＧ−１複合体を検出するステップは、検出可能なマーカーを含む。
【００９８】
上記方法の別の実施形態において、ＰＡＭＧ−１は、試料を、ＰＡＭＧ−１に高度に特異的な結合親和力を有する抗体（下記に例証されるＭ２７１のようなもの）に接触させることによって、試料内で検出され、このようにして、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体を形成する。この複合体は、次いで、固定された第２の抗体（例えば、Ｍ５２のようなもの）に接触するようになる。第２の抗体は、免疫学的に第１の抗体とは異なり、交差反応せず、そのため、そのような抗体は、ＰＡＭＧ−１分子に同時に結合することができる。固定された抗体は、可動抗体ＰＡＭＧ−１複合体に結合して、固定された抗体ＰＡＭＧ−１抗体複合体を形成する。ＰＡＭＧ−１は、このヘテロトリマー複合体を検出することによって、検出される。上記のように、ＰＡＭＧ−１に高い特異性を有する抗体が、ＰＡＭＧ−１の初期認識のために使用されることが好ましい。
【００９９】
上述の方法が、検出可能なマーカーで標識された選択された対の一方の抗体の使用を含む場合には、方法の変形例は、試料が第２の固定された抗体に接触する前に、試料を、第１の標識された抗体に接触させることを含む。この変形例において、標識された抗体は、試料中のＰＡＭＧ−１に結合するように作用する。方法のさらに別の実施形態は、下記のステップを含む。すなわち、ＰＡＭＧ−１を含有する流体試料を、抗体およびタンパク質がそれを通って移動することを可能にする多孔性材料の移動可能な標識された抗体領域に加えるステップであって、抗体領域は、ＰＡＭＧ−１に高い特異性を有する移動可能な抗体を含み、結果として、抗体をＰＡＭＧ−１に結合させ、抗体ＰＡＭＧ−１複合体を形成するステップと、複合体を、固定された第２の抗体をその中に含有する検査領域へ移動するステップであって、この第２の抗体はＰＡＭＧ−１に結合親和力を有し、結果として、第２の抗体は、標識された抗体ＰＡＭＧ−１複合体に結合して、固定された複合体を形成するステップと、固定された複合体を検査領域で検出するステップと、である。
【０１００】
方法のさらに別の実施形態は、標準サンドイッチアッセイであり、標識されていない抗体は、あらゆる表面に固定される。ＰＡＭＧ−１を含有する流体試料を追加すると、結果として、固定された抗体によるＰＡＭＧ−１の結合になり、抗体ＰＡＭＧ−１複合体を形成する。標識された抗体を加えると、結果として、固定された抗体ＰＡＭＧ−１−標識された抗体から構成される固定された複合体を形成し、そしてこの複合体を検出する。
【０１０１】
上述の方法にしたがって、抗体は、検出可能なマーカーまたは標識を含んでもよく、抗体−ＰＡＭＧ−１またはＰＡＭＧ−１−抗体複合体を検出するステップは、検出可能なマーカーまたは標識の検出を含む。使用することができる検出可能なマーカーの例として、着色した粒子、酵素、染料および放射性同位元素が挙げられる。特定の実施形態において、検出可能なマーカーは、金の着色粒子であり、例えば、約２０ｎｍ〜３０ｎｍの間の平均寸法を有する。さらに別の実施形態において、検出可能なマーカーは、西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【０１０２】
ＰＡＭＧ−１を検出するための模範的な装置
試料内のタンパク質ＰＡＭＧ−１を検出するために、様々な装置が企図されている。ＰＡＭＧ−１を検出するための本発明の装置の特定な実施形態は、図１〜２に示されている。本発明による装置は、ＰＡＭＧ−１の濃度が約５ｎｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの間である試料内のＰＡＭＧ−１を検出することができることが好ましい。装置は、約５〜７ｎｇ／ｍｌの検出閾値を有することも好適である。ＰＡＭＧ−１のバックグラウンド濃度と検出装置の感度の閾値との間のギャップが広くなればなるほど、偽陽性の結果が得られる可能性は低くなる。このセクションでは、本発明による装置の可能な異なる実施形態が、図１、２に例示された装置内で具現される。この装置は、単に、膣分泌液の試料内のＰＡＭＧ−１の存在を検出するために設計され得ることに注意されたい。
【０１０３】
本明細書中で使用される「約」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての容認可能な誤差範囲内を意味し、これは、ある程度は、値がどのように測定されるかまたは決定されるか、すなわち、測定システムの限界に依存する。例えば、「約」は、当該分野の慣行により、１または１を超える標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の、２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、および、さらにより好ましくは１％まで、の範囲を意味することができる。あるいは、特に、生物学的システムまたはプロセスに関しては、この用語は、ある値の、１桁の大きさ内であること、好ましくは５倍内、より好ましくは２倍内であることを意味し得る。特定の値が明細書および特許請求の範囲に記載される場合には、別途記載のない限り、「約」という用語は、特定の値についての容認可能な誤差範囲内を意味することを想定するべきである。
【０１０４】
本発明の装置の説明
例証の目的で、この説明は、下記に例証されるモノクローナル抗体を参照する。しかし、必ずしもこれらの特定のモノクローナルが使用される必要はない。図１および２に示されるように、装置は、数個の順次に相互連結される要素から構成されるストリップ状本体を具備する。より具体的には、装置の部分１２はパッドを具備し、これはＭ２７１抗体領域１０を含有し、その中で、Ｍ２７１抗体は、例えば、着色した粒子ＳＰ（図示せず）によって標識される。パッド１２は、ガラス繊維組織または他の任意の材料から作られてもよく、これは、多孔性であり、試料の様々な粒子および物質が移動するのを可能にする。着色した粒子は、２０〜３０ｎｍの範囲内平均寸法を有する金粒子を具備してもよい。Ｍ２７１抗体領域は、同一の着色粒子によって標識されたマウスＩｇＧ免疫グロブリンを含有する。標識されたＭ２７１抗体およびマウスＩｇＧ免疫グロブリンは、パッド１２を標識されたＭ２７１抗体および標識されたマウスＩｇＧの溶液で含浸することによって、パット１２のバンド部分１０内に導入される。Ｍ２７１抗体およびマウスＩｇＧ免疫グロブリンの溶液は、製図用ペンまたはマイクロドロップ形成装置を使用して、ニトロセルロース膜２２に導入されてもよい。パッド１２の一方の端に、その長手方向に、ニトロセルロース膜２２が接続され、これは、検査領域１４および制御領域１６を含む。検査領域１４および制御領域１６の両方は、その幅全体にわたって装置を横切って配列される。検査領域１４は、ニトロセルロース膜２２のバンド部分である。検査領域１４は、ニトロセルロース膜２２に結合されたＭ５２抗体を含有する。制御領域１６は、ニトロセルロース膜２２に結合された抗マウス抗免疫グロブリン抗体を含有する。制御領域１６は、ストリップ２２の幅全体を横断する。フィルタペーパー膜２４がニトロセルロース膜２２の端に接続され、これは、パッド１２に接続されたニトロセルロース膜２２の端に向かい合っている。フィルタペーパー膜２４は、ニトロセルロースストリップ２２の端に長手方向に接続される。装置の表面は、特別な保護フィルム２８および３０（例えば、ストリップ装置用に特別に設計された薄い接着テープ）でコーティングされている。矢印１８は、パッド１２の試料添加端を示すために、フィルム２８の表面に引かれる。パッド１２、ニトロセルロース膜２２およびフィルタペーパーストリップ２４は、接着剛性プラスチック基部２６に結合される。
図１、２の説明
１０  Ｍ２７１抗体領域
１２  パッド
１４  検査領域
１６  制御領域
１８  矢印
２２  ニトロセルロース膜
２４  フィルタペーパー膜
２６  接着剛性プラスチック基部
２８  矢印を備えた部分的に透明な保護フィルム
３０  非透明保護フィルム
【０１０５】
本発明の装置の好適な実施の形態
このセクションに記載される実施形態において、装置は、抗体およびタンパク質がそれを通って移動するのを可能にする多孔性試料添加マトリックスから形成されたＭ２７１抗体パッド領域１０を含む。Ｍ２７１抗体領域１０は、Ｍ２７１抗体を含み、これは、ＰＡＭＧ−１に高度に特異的に結合することができる。ＰＡＭＧ−１を含有する流体試料をＭ２７１抗体領域内に導入することは、結果として、Ｍ２７１抗体がＰＡＭＧ−１に結合することになり、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体を形成する。装置はまた、抗体およびタンパク質がそれを通って移動するのを可能にする多孔性材料から形成されたＭ２７１抗体領域１０に流体接続する検査領域１４も含む。検査領域１４は、検査領域１４に固定されたＭ５２抗体を含み、これもＰＡＭＧ−１に結合することができる。Ｍ５２抗体は、Ｍ２７１抗体およびＭ５２抗体が同時にＰＡＭＧ−１に結合することができるように、Ｍ２７１抗体とは免疫学的に異なる。流体試料をＭ２７１抗体領域１０へ導入することは、結果として、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体を検査領域１４内に移動させることになり、そこで、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体はＭ５２抗体に結合し、Ｍ５２抗体によって検査領域に固定される。装置は、検査領域１４に固定されたＭ５２抗体の存在に基づいて、試料内のＰＡＭＧ−１を検出する。この実施形態によると、両方の抗体は、本発明に従う抗体である。上述の抗体の対を選択する手順は、当業者によって再現されることが可能である。結果として、ＰＡＭＧ−１のみが、検査領域１４に固定される抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１−Ｍ５２抗体複合体を形成する。このようにして、検査領域１４に固定されたＭ５２抗体の存在が、試料内にＰＡＭＧ−１が存在することを示す。
【０１０６】
装置のこの実施形態において、Ｍ２７１抗体は、検査領域１４に固定されたＰＡＭＧ−１を検出するのに使用される検出可能なマーカーに結合される。使用されてもよい検出可能なマーカーの例として、着色した粒子、酵素、染料、蛍光染料および放射性同位元素が挙げられるが、それらに限定されない。１つの実施形態において、検出可能なマーカーは、約２０〜３０ｎｍの間の平均寸法を有する金粒子である。１つの実施形態において、Ｍ２７１抗体は、フリーズドライ状態の標識された抗体である。
【０１０７】
Ｍ２７１抗体パッド領域のＭ２７１抗体が検出可能なマーカーで標識される実施形態の変形例において、装置は、検査領域をさらに含み、これは、Ｍ５２抗体を含有する。パッド領域および検査領域は、流体接続している。
【０１０８】
装置のさらに別の実施形態において、図１〜２に例示された装置内に具現されたように、装置は、近位端および遠位端を備えたストリップ状本体を有する。ストリップ状本体のＭ２７１抗体領域１０は、抗体およびタンパク質がそれを通って移動するのを可能にする材料から作られる。ストリップ状本体のＭ２７１抗体領域１０は、ＰＡＭＧ−１に高度に特異的な結合親和力を有するＭ２７１抗体を含み、ＰＡＭＧ−１を含有する流体試料のＭ２７１抗体パッド領域へ導入することは、結果として、Ｍ２７１抗体がＰＡＭＧ−１に結合することになり、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体を形成する。
【０１０９】
ストリップ状本体はまた検査領域１４も含み、これは、Ｍ２７１抗体領域１０に対して近位であり、Ｍ２７１抗体領域１０に流体接続する。検査領域１４は、抗体およびタンパク質がそれを通って移動するのを可能にする材料から形成される。検査領域１４は、検査領域１４に固定されたＭ５２抗体を含み、これは、ＰＡＭＧ−１に結合親和力を有し、流体試料をＭ２７１抗体領域１０へ導入することは、結果として、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体が検査領域１４に移動することになり、そこで、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体はＭ５２抗体に結合し、Ｍ５２抗体によって検査領域１４に固定される。検査領域１４は、検査領域１４に固定されたＭ４２抗体およびＭ５２抗体も含む。標識されていないＭ５２およびＭ４２抗体を組み合わせて、本発明のストリップ装置の感度閾値を微調整することを可能にする（実施例１１）。装置は、標識された抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１の複合体が検査領域１４で固定されるのに基づいて、試料内のＰＡＭＧ−１を検出する。
【０１１０】
制御領域。本発明の装置は、１つの標準制御領域１６を含む（図１〜２）。この制御領域は、装置の適切な操作を確認するように作用する。しかし、本発明の装置では、任意の代替的な制御領域設計を使用してもよいことに注意すべきである。
【０１１１】
１つの制御領域を備えた装置は、抗体およびタンパク質がそれを通って移動するのを可能にする材料から形成されたＭ２７１抗体領域１０を含み、Ｍ２７１抗体領域１０は、中に固定されていない標識されたＭ２７１抗体を含み、ＰＡＭＧ−１に高い特異性を有し、ＰＡＭＧ−１を含有する流体試料をＭ２７１抗体パッド領域１０へ導入することは、結果として、Ｍ２７１抗体がＰＡＭＧ−１に結合することになり、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体を形成する。装置はまた、抗体およびタンパク質がそれを通って移動するのを可能にする材料から形成されるＭ２７１抗体領域１０に流体接続する検査領域１４も含む。検査領域１４はまた、検査領域１４に固定されたＭ５２抗体を含み、これは、ＰＡＭＧ−１に結合親和力を有する。Ｍ５２抗体は、Ｍ２７１抗体およびＭ５２抗体が同時にＰＡＭＧ−１に結合することができるように、Ｍ２７１抗体とは免疫学的に異なる。流体試料をＭ２７１抗体領域１０へ導入することは、結果として、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体を検査領域１４内に移動させることになり、そこで、抗体Ｍ２７１−ＰＡＭＧ−１複合体はＭ５２抗体に結合し、Ｍ５２抗体によって検査領域に固定される。装置は、標識されたＭ２７１抗体が検査領域１４に固定されることに基づいて、試料内のＰＡＭＧ−１を検出する。低濃度のＰＡＭＧ−１が試料内に存在するときには、少なくともいくらかの標識されたＭ２７１抗体がＭ２７１抗体領域１０から検査領域１４を通って制御領域１６へ移動する。抗マウス抗免疫グロブリン抗体は、制御領域１６に固定される。抗免疫グロブリン抗体は、制御領域を着色する標識されたＭ２７１抗体に結合する。高濃度のＰＡＭＧ−１が試料内に存在するときには、低量の標識されたＭ２７１抗体のみが制御領域１６に近づくことができ、制御領域の着色は弱すぎるためヒトの裸眼では見ることができないこともある。そのような可能性を防止するために、標識されたマウスＩｇＧ免疫グロブリンが、Ｍ２７１抗体領域１０内に加えられた。この免疫グロブリンは、ＰＡＭＧ−１に結合せず、Ｍ５２抗体検査領域１４を通って自由に制御領域１６へ移動し、そこで、抗マウス抗グロブリン抗体によって結合され、制御領域１６を着色する。制御領域は、試料内のＰＡＭＧ−１の濃度にかかわらず、装置が適切に機能するのを確認する。
【０１１２】
本発明の装置のさらに別の構成要素は、検査領域の材料に密接に多孔性接続する多孔性材料である。本発明の装置のこの部分は、液体、タンパク質および抗体がそれを通って動くのを補助するポンプとして働く。マウス抗体およびＩｇＧ免疫グロブリンを標識するために使用されてもよい検出可能なマーカーの例として、着色した粒子、酵素、染料および放射性同位元素が挙げられるが、それらに限定されない。１つの実施形態において、検出可能なマーカーは、蛍光染料である。さらに別の実施形態において、検出可能なマーカーは、着色した粒子である。１つの実施形態において、Ｍ２７１抗体は、標識された抗体であり標識されたマウス免疫グロブリンＩｇＧであるが、フリーズドライ状態である。
【０１１３】
上述の装置の様々な領域に使用される材料は、抗体およびタンパク質がそれを通って移動するのを可能にする材料の任意の組み合わせであってもよい。適切な材料の例として、ガラス繊維、多孔性プラスチック、ニトロセルロースおよびフィルタペーパーが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１４】
装置の部分は、本発明の装置の任意の実施形態において妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の最小バックグラウンド濃度を検出する選択された一対の抗体があるならば、任意の機能的な組み合わせに配置され得る。
【０１１５】
本特許の装置は、装置の少なくとも一部を覆う保護フィルムを必要に応じて含んでいてもよい。これは、透明であってもなくてもよく、また、その表面に、必要な商標、情報マーク／サインまたは矢印を有することができる。
【０１１６】
胎膜破裂の検出
ＰＡＭＧ−１は、妊婦の血清よりも少なくとも１００倍大きい濃度で、胎膜破裂がない場合の妊婦の膣分泌液よりも少なくとも３０００倍大きい濃度で、羊水中に存在する。結果として、少量の羊水が膣分泌液試料に溶解されるときでさえ（膣分泌液の１ｍｌにつき１滴の約１／１００）、十分な量のＰＡＭＧ−１がこの膣分泌液試料内に存在し、胎膜破裂が起こっていることを示す。さらに、血清中のＰＡＭＧ−１の濃度は低いため、試料へのわずかな量の血清の混合（１０〜１５％）は、本発明の装置および方法によって産出される結果に影響を与えない。
【０１１７】
膣分泌液中に羊水が存在することは胎膜破裂を示すため、膣分泌液中でＰＡＭＧ−１を検出することもまた、胎膜破裂を検出するために使用することができる。
【０１１８】
羊水中のＰＡＭＧ−１を検出するための本発明による方法は、高感度である。例えば、０．０５ｎｇ／ｍｌ濃度のＰＡＭＧ−１を検出することができる（実施例６、７）。羊水中の最小濃度が約１６８０ｎｇ／ｍｌであるのに比較して、血清内のＰＡＭＧ−１の最大濃度は約２５ｎｇ／ｍｌであるため、且つ、膣分泌液中のＰＡＭＧ−１のバックグラウンド濃度は非常に低く約０．２ｎｇ／ｍｌであるため、膣内の羊水の発生を検出するための本発明の方法において、ＰＡＭＧ−１のより低い閾値レベルを使用することができる。本発明の場合には、より低い検出閾値を使用することによって、大半の偽結果が回避される。
【０１１９】
本発明の装置および方法は、感度が高くＰＡＭＧ−１に特異的な一対の抗体を使用することによって、偽結果を産出するのを回避するように設計される。それに加えて、本発明の装置の感度の閾値は、５〜７ｎｇ／ｍｌに近い所定のレベルに正確に設定されてもよい。
【０１２０】
結果として、本発明の装置および方法は、膣炎または他の変数の存在によって影響されないが、それは、胎膜破裂を検出するための先行技術の方法の正確度にマイナス影響を与えていた。炎症滲出液中のＰＡＭＧ−１の最大濃度は、３ｎｇ／ｍｌである（実施例８、表１０、１１）。同一濃度のＰＡＭＧ−１は、膣分泌液への血清の混合が１０〜１５％を超えないときに、発生する可能性がある。加えて、血清対羊膜ＰＡＭＧ−１の濃度の大きな割合が、本発明の装置および方法を、低ＰＡＭＧ−１検出閾値でさえ、膣分泌液中の血清の存在のため、偽陽性結果を産出する可能性を有意に少なくする。ここに記載されるように、即座に且つ便利なやり方で、装置および方法を容易に使用するように適合させることができ、それによって、装置および方法を外来患者の条件で使用することを可能にする。例えば、方法を、装置を前もってほとんど使用したことがないかまたは全く使用したことがない患者が操作し得る使い易い装置に、組み込むことができる。装置を使用するために、測定前に、試料濃度の特別なタイミング、稀釈または整合は必要ない。これによって、装置および方法が、高度に信頼性のある、オペレータの誤操作に対してあまり影響を受けないものになる。この方法はまた、試料内のＰＡＭＧ−１の存在、および、膣内の羊水の存在を、簡単に、イエス／ノーで決定することができるように設計されることも可能である。
【０１２１】
本発明は、妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の存在に基づいて、胎膜の破裂を検出するための方法および装置を提供する。その結果、胎膜破裂を検出するための本発明の方法は、単に、膣分泌液中のＰＡＭＧ−１を検出するステップを含むのみであり、膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の存在は、胎膜破裂の発生を示す。本発明の重要な部分は、妊婦の膣分泌液中で非常に低いバックグラウンド濃度のタンパク質ＰＡＭＧ−１を検出する一対の抗体を段階的に選択することである。血中タンパク質に対する毛細管壁の透過性は、タンパク質の翻訳後修飾および他の分子との相互作用に依存するため、膣分泌液中に低濃度でＰＡＭＧ−１が存在することが予想し得た（マリナロー、Ｊ．Ａ．ら、「Ｏ−グリコシル化は、循環からヒトＩＧＦ−結合タンパク質−６のクリアランスを遅延する」、European Journal of Endocrinology、２０００年５月、第１４２巻（５）、５１２頁；シュネーベルガー、Ｅ．Ｅ．、「血管内皮層内のタンパク質および小胞輸送」、Fed Proc.、１９８３年５月、第４２巻（８）、２４１９−２４頁；ミンシャル、Ｒ．Ｄ．ら、「内皮細胞内の小胞形成およびトラフィッキング、および、内皮障壁機能の調整」、Histochem. Cell Biol.、２００２年２月、第１１７巻（２）、１０５−１２頁；デルベッキオ、Ｐ．Ｊ．ら、「巨大分子への内皮単層の透過性」、Fed Proc、１９８７年６月、第４６巻（８）、２５１１−２５１５頁；シフリンガー−バーンボイム、Ａら、「内皮単層の選択性：透過性増大における効果」、Microvascular Research、１９９８年１１月、第３６巻（３）、２１６−２２７頁；ギネア、Ｎ．、ミルグロム、Ｅ．Ａ．、「ＬＨ／ＣＧレセプター用の新規機能：標的器官の内皮障壁にわたるホルモンのトランスサイトーシス」、Semin. Reproduct. Med.、２００１年、第１９巻（１）：９７−１０１頁）。翻訳後修飾を受けたか、または、別の分子と非共有結合を確立したＰＡＭＧ−１分子の中に、膣分泌液中への浸透が最小であるものがなければならない。膣分泌液中のそのような分子の濃度は、低くなければならない。異なる分子の低いかまたは高い浸透は、毛細管壁の選択的透過性および選択的分泌過程のためである。妊婦の膣分泌液中に羊水が存在することは胎膜破裂の兆候であることが知られているため、膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の検出を使用して、胎膜破裂の存在を検出することもできる。膣分泌液中のＰＡＭＧ−１を検出するための方法および装置の例は、ここに、より詳細に説明される方法および装置を含む。方法は、膣分泌液の試料内のＰＡＭＧ−１の検出に基づいて胎膜破裂を検出するステップをさらに含み、これもまたここに、より詳細に説明される。
【０１２２】
上記に検討されたように、胎膜破裂を検出するための本発明による方法および装置は、高度に特異的であり、感度があり、正確である。感度および正確度は、妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の低バックグラウンド濃度と、本発明の装置の感度の予めかなり高く設定された閾値との間の広いギャップによって達成され、閾値は次に、羊水の膣内への漏れを形成する胎膜の破裂時に、膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の典型的な濃度よりも低い。閾値の正確な設定は、次に、ＰＡＭＧ−１に対して検査領域１４で少なくとも１つまたはそれ以上の追加抗体を使用することによって達成され、本発明の装置の感度の所定の閾値を正確に設定する（実施例９）。その結果として、本発明の方法および装置は、モノクローナル抗体Ｍ２７１およびＭ５２の高度に特異的な対および少なくとも１つの追加抗体Ｍ４２を使用することによって、偽陰性および偽陽性の結果を産生するのを回避するように設計される。結果として、方法および装置の正確度は、胎膜破裂を検出するための先行技術の方法の正確度を減じていた膣感染症または他の一定の変数の存在によって悪影響を受けることはない。妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１を検出するための本発明の好適な装置および方法はまた、使用するのが容易で便利で迅速となるようにも設計されており、それによって、本特許の装置を外来ベースで使用することを可能にする。例えば、方法は、装置を前もってほとんどまたはまったく使用したことがない患者が操作することができる使い勝手のよい装置に、組み込むことができる。装置を使用するために、測定前に、試料濃度の特別なタイミング、稀釈または整合は必要ない。これによって、胎膜破裂を検出するための本発明の方法および装置は高度に信頼性のあるものになり、オペレータのミスの影響を受けることは非常に少ない。本発明の装置の臨床試験の結果は、実施例１０に提示される。膣炎における膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の濃度の測定は、実施例８に提示される。実施例８から、炎症滲出液中のＰＡＭＧ−１の最大観察濃度は３ｎｇ／ｍｌに近いことがわかる。
【実施例】
【０１２３】
下記の実施例は、羊水からのＰＡＭＧ−１の単離、ＰＡＭＧ−１に対する一対の抗体の選択、そのような抗体の特異性の研究、および、膣炎における炎症滲出液中のＰＡＭＧ−１の濃度をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、本発明の一定の態様を例示するために提供されており、それらは、本発明の範囲を限定するようには意図しない。
【０１２４】
（実施例１）血液中および羊水中のＰＡＭＧ−１の濃度
ＰＡＭＧ−１濃度は、非妊婦、妊婦（妊娠３７〜４０週）の血清、および、羊水（妊娠３９〜４０週）で、実施例３に説明されるように生成されたモノクローナル抗体対を使用して、ＥＬＩＳＡによって測定された。
【０１２５】
抗体Ｍ１、Ｍ２７１、Ｍ１５２、およびＭ３９２は、０．０５Ｍ  炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中、１８時間、６°Ｃでポリスチレンに吸着された（各ウェル中、１００μｌの抗体溶液）。ポリスチレンへの非特異的な吸着は、各ウェルに２００μｌで、ｐＨ７．０でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１％溶液で除去され、３７°Ｃで１時間インキュベートされた。
【０１２６】
１００μｌのＰＡＭＧ−１抗原が、５０、２５、１２、６、３、１５および０．７ｎｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに加えられた。血清または羊水の試料は、０．０１％ＢＳＡおよびＰＢＳの０．０５％Ｔｗｉｎ２０の緩衝液で稀釈された。稀釈された試料はウェルに加えられ、ウェルは３７°Ｃで１時間インキュベートされた。反応は、０．０５Ｍ  クエン酸塩−リン酸塩緩衝液（ｐＨ４．７）でオルソフェニレンンジアミンの溶液によって展開され、３７°Ｃで２０分間インキュベートされた。光学密度は波長４９２ｎｍで読み取られた。
【０１２７】
第１の層の抗体の濃度と接合体の濃度とが求められ、結果として、約４５度の最大スロープでＰＡＭＧ−１用の標準光学密度曲線になり（１光学ユニットの増加は、１ｎｇ／ｍｌの試料内のＰＡＭＧ−１濃度の増加に対応する）、上限（ＰＡＭＧ−１濃度５０ｎｇ／ｍｌ用）は、１．５光学ユニットであり、ゼロ濃度点は０．１光学ユニットを超えない。調査用の試料（血清、羊水、膣分泌液および子宮頸部分泌液）は、−４０°Ｃで凍結された。各試料は、３回検査された。血清は、元々の濃度の１／５に稀釈された。羊水試料は、元々の濃度の１／２０００に稀釈された。試料が１．５ユニットを超える光学密度を有した場合には、試料はさらに稀釈され、再検査された。
【０１２８】
得られたデータは下記の表１〜３に要約される。
【表１】
2005535887.tif 000003
【表２】
2005535887.tif 000004
【表３】
2005535887.tif 000005
【０１２９】
（実施例２）ＰＡＭＧ−１の単離
Ｄ．ペトルニンは、１９８０年にＰＡＭＧ−１の単離の修正された方法を提案した（ペトルニン、Ｄ．Ｄ．、コズリアエバ、Ｇ．Ａ．（Kozlyaeva, G. A.）、タタリノフ、Ｙｕ．Ｓ．（Tatarinov, Yu. S.）、シェブチェンコ、Ｏ．Ｐ．（Shevchenko, O. P.）、Bulletin of Experimental Biology and Medicine、第５号、５５８頁、１９８０年（ロシア語）。スキームのステップは、下記の表４に概説される。
【表４】
2005535887.tif 000006
【０１３０】
ＰＡＭＧ−１は、妊娠１６〜２５週の羊水から分離された。流体は、医学的理由から妊娠が終了した女性から得られた。塩化ランタンの１０％溶液を２０：１の容量比で（そのため、最終濃度は０．５％であった）、羊水に加え、４°Ｃで１８時間保った。沈殿物が形成され、８，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離で分離された。沈殿物をＮａ2ＨＰＯ4の飽和溶液に溶解し、８，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離による処理で生成された不溶性ランタン塩の沈殿物を分離した。得られた溶液を、５０％飽和硫酸アンモニウムで４°Ｃで１８時間インキュベートすることによって分画し、得られた沈殿物を、両方の場合で、溶解された沈殿画分の容量を羊水の初期容量に戻すように蒸留水で溶解した。次いで、６０％飽和硫酸リチウムによって溶液を沈降し、沈殿物を少量の蒸留水で溶解した。透析後、混合物をピロリン酸カルシウムで、同量の吸湿剤をタンパク質溶液へ加え、混合し、１０〜１５分間インキュベートすることによって吸着し、吸湿剤を遠心分離で分離した。
【０１３１】
（実施例３）本発明の安定ハイブリッド系の生産
ハイブリドーマ実験１。５ＢＡＬＢ／ｃマウスの膝窩リンパ節からのリンパ球が使用された。マウスは、足蹠（foot pad）にＰＡＭＧ−１を５回注入することによって免疫した。各注入は、１：１比率の１００μｇのＰＡＭＧ−１および完全フロインドアジュバントから構成された。細胞融合後、細胞は、１１５２ウェルに接種された。合計で３６３の一次ハイブリドーマが検査され、そのうちの３８がＰＡＭＧ−１陽性であった。次いで、モノクローナル抗体の特異性を、受胎能のタンパク質−アルファ−２−ミクログロブリン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、トロホブラストベータ−１−糖タンパク、ヒト胎盤性ラクトゲン、αフェトプロテイン、およびヒト血清アルブミンの交差反応結合を研究することによって検査した。モノクローナル抗体が他のタンパク質と交差反応しない１４の一次ハイブリドーマが選択された。次いで、限界稀釈の方法を使用して、一次ＰＡＭＧ−１特異性ハイブリドーマを２回クローン化した。最後に、明らかに最も安定しており且つモノクローナル抗体Ｍ１、Ｍ３８、Ｍ４２、Ｍ５２、Ｍ９１を生産的に産生する５つのクローンが選択された。
【０１３２】
ハイブリドーマ実験２。５匹のマウスの脾臓からのリンパ球が使用された。マウスを、１００μｇのＰＡＭＧ−１を腹腔内注入することによって５回免疫した。各注入は、１：１比率の１００μｇのＰＡＭＧ−１および完全フロインドアジュバントから構成された。１３４４個のウェルが使用され、５６２個のハイブリドーマが検査された。そのうち、４５個がＰＡＭＧ−１陽性であることがわかり、１９個は、他のタンパク質、例えばＰＡＭＧ−１特異的なタンパク質に、交差反応しなかった。交差反応しないハイブリドーマは２回クローン化され、最も安定しており且つモノクローナル抗体Ｍ１２２、Ｍ１５２、Ｍ２１１、Ｍ２７１、Ｍ３７１およびＭ３９２を集中に産生する６つのクローンが、さらなる使用のために選択された。
【０１３３】
したがって、１１個のモノクローナル抗体がＰＡＭＧ−１に対して作られ、次いで、実施例４に説明されるように、妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の最小バックグラウンド濃度を検出したこれらの抗体の対が選択された。
【０１３４】
本発明による特異的な細胞系
抗体Ｍ２７１およびＭ５２は、それぞれハイブリドーマ細胞系Ｍ２７１およびＭ５２によって生産される。ここでＭ２７１およびＭ５２、さらにＭ４２と称されるモノクローナル抗体を生産する細胞系は、後述される装置の感度の閾値を設定し調節するために使用されるモノクローナル抗体を生産する。
【０１３５】
表５は、２つのトライアルからのハイブリドーマの生産の結果を報告する。
【表５】
2005535887.tif 000007
【０１３６】
（実施例４）妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の最小濃度を検出する一対のモノクローナル抗体の対の選択
０．０５Ｍ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中、１μｇ／ｍｌの濃度のＰＡＭＧ−１を、ポリスチレンプレートに、１８時間、４°Ｃでインキュベートすることによって、吸着された。下記の表６に挙げられた抗体は、３ｍｇ／ｍｌから開始して連続稀釈法でウェルに加えられた。プレートは、次いで、３７°Ｃで１時間インキュベートされた。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたウサギ抗マウス抗ＩｇＧ抗体の抗体接合体が、ウェルに加えられた。反応は、０．０５Ｍクエン酸塩−リン酸塩緩衝液（ｐＨ４．７）でオルソフェニレンジアミンの溶液によって展開され、３７°Ｃで２０分間インキュベートされた。モノクローナル抗体の力価が定量された。
【表６】
2005535887.tif 000008
【０１３７】
表６に示されモノクローナル抗体の濃度は、溶液中のＰＡＭＧ−１の濃度が１μｇ／ｍｌである限り、抗体がＰＡＭＧ−１に結合する最小濃度である。濃度が低くなればなるほど、最小濃度のＰＡＭＧ−１を検出する抗体の能力は高くなる。ＰＡＭＧ−１用に高感度のＥＬＩＳＡを展開するために、モノクローナル抗体Ｍ２７１およびＭ５２が選択されて、ＰＡＭＧ−１用の高感度ＥＬＩＳＡが開発された。
【０１３８】
モノクローナル抗体Ｍ２７１は、ＥＬＩＳＡでは、羊水の下記の個別タンパク質との交差反応を示さなかった。すなわち、受胎能アルファ−２−ミクログロブリン；ヒト絨毛性ゴナドトロピン；ヒト胎盤性ラクトゲン；トロホブラストベータ−１−糖タンパク；アルファフェトプロテイン；ヒト血清アルブミンである。
【０１３９】
それに加えて、カラムを有する実験では、Ｍ２７１抗体はセファロースに固定され、稀釈されていない羊水は、カラムを通って進んだ。電気泳動後にカラムから得られた溶出液は、ＰＡＭＧ−１の分子量（２８〜３０ｋＤａ）に整合する分子量に対応する１つのバンドを示した。高度に特異的なモノクローナル抗体Ｍ２７１が、本発明の装置の側方向流れストリップ装置のパッドに置かれた。
【０１４０】
抗体Ｍ２７１とは対照的に、抗体Ｍ５２は、ＥＬＩＳＡで、血清および羊水に豊富なＩＧＦＢＰ−３タンパク質と交差反応した。膣分泌液中の測定された非グリコシル化ＩＧＦＢＰ−３の濃度は、約６００ｎｇ／ｍｌであった（実施例９）。本発明のストリップ装置を有する実験において、この濃度のＩＧＦＢＰ−３は、濃度５ｎｇ／ｍｌで取られたＰＡＭＧ−１の認識を阻害しなかった。
【０１４１】
（実施例５）胎盤０１ミクログロブリンのための高感度ＥＬＩＳＡ検査
ＰＡＭＧ−１は、標準的なＥＬＩＳＡおよびＭ２７１−Ｍ５２抗体対を使用しては、膣分泌液中で検出することはできなかった。検出を可能にするために、検出に必要なＰＡＭＧ−１の濃度を０．０５ｎｇ／ｍｌへ下げることによって、ＥＬＩＳＡの感度が上げられた。
【０１４２】
した抗体Ｍ２７１−Ｍ５２を用いるサンドイッチイムノアッセイシステムを開発し、これは、１ミリリットル当たり５０ピコグラム（０．０５ｎｇ／ｍｌ）の感度を実証した。
【０１４３】
第１の層：モノクローナル抗体Ｍ２７１、濃度６μｇ／ｍｌ、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．５。
第２の層：ＰＡＭＧ−１、濃度３２００、１６００、８００、４００、２００、１００、５０ｐｇ／ｍｌ、および、１／２濃度に稀釈された子宮頸部分泌液および膣分泌液、ｐＨ＝７．０の緩衝液。
第３の層：１／１０００稀釈の緩衝液で接合体Ｍ５２。
【０１４４】
感度の上昇は、第１の層および第３の層を変えることによって得られた。高感度システムとは対照的に、感度１ｎｇ／ｍｌの標準システムでは、第１の層は、１０〜２０μｇ／ｍｌのＭ２７１濃度で形成され、接合体（西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたＭ５２）の稀釈は１／４０，０００であった。
【０１４５】
標準較正曲線が得られた。これは、下記の表７に示され、ＰＡＭＧ−１濃度は、１ミリリットル当たりのピコグラム（ｐｇ／ｍｌ）で与えられ、波長４５０ｎｍで観察される着色Ｅの光学密度は、標準的な無次元の単位である。
【０１４６】
【表７】
2005535887.tif 000009
【０１４７】
（実施例６）妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１
【表８】
2005535887.tif 000010
【０１４８】
最小濃度の測定に続いて、各抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された。ＥＬＩＳＡ検査において、１０μｇ／ｍｌの濃度で標識されていない抗体が、プレートのウェルに導入された。次いで、５０、１００、２００、４００、８００、１６００、３２００ｐｇ／ｍｌの濃度でＰＡＭＧ−１が、プラスチック上に第２の層として導入された。最後に、他の抗体の１つの接合体が、プレートの各ウェルに導入された。対で働く下記の抗体が選択された（ここでは、抗体−接合体として示される）：Ｍ１−Ｍ９１；Ｍ２７１−Ｍ５２；Ｍ１５２−Ｍ９１；Ｍ３９２−Ｍ３７１。
【０１４９】
これらの対の抗体を使用して、妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１濃度を測定した。最後に、対Ｍ２７１−Ｍ５２抗体が選定され、それのために膣分泌液中のＰＡＭＧ−１の測定された濃度は、最低であった。Ｍ２７１−Ｍ５２対のためのＰＡＭＧ−１の濃度は、高感度ＥＬＩＳＡを使用して測定された。選択された対Ｍ２７１−Ｍ５２および数種類の他の対は、非妊婦および妊婦の羊水および血清中のＰＡＭＧ−１の濃度を測定するために使用された（上記実施例１）。
【０１５０】
（実施例７）妊婦の子宮頸部分泌液および膣分泌液中のＰＡＭＧ−１
【表９】
2005535887.tif 000011
【０１５１】
（実施例８）膣炎の妊婦の膣分泌液中のＰＡＭＧ−１
【表１０】
2005535887.tif 000012
【表１１】
2005535887.tif 000013
2005535887.tif 000014
【０１５２】
（実施例９）ストリップ装置特性の改変
第１の実験において、Ｍ５２ ＭＡｂ溶液は、１、１／２、１／４、１／８、１／１６、および１／３２ｍｇ／ｍｌの濃度で調製された。各溶液は、１つのストリップ装置に配置された。３つのＭＡｂ（Ｍ５２、Ｍ２７１、Ｍ４２）の混合物も、元々の濃度の１、１／２、１／４、１／８、１／１６、および１／３２の濃度に稀釈され、各稀釈された溶液は、別個のストリップ装置に導入された。次いで、濃度５０ｎｇ／ｍｌのＰＡＭＧ−１含有溶液が、１２ストリップ装置の各々に加えられた。純粋Ｍ５２抗体の溶液は、検査領域の着色バンドを１／８の濃度で目に見えるようにし、ＭＡｂ混合物内で、着色バンドは１／２の濃度で目に見えるようになった。したがって、ＭＡｂの混合物は、ＰＡＭＧ−１分子の結合を阻害し、それによって、バンドの可視性を調節する。
【０１５３】
濃度がＭ５２では０．８ｍｇ／ｍｌ、Ｍ２７１では０．１ｍｇ／ｍｌ、および、Ｍ４２では０．１ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体が、多くのストリップ装置の検査領域内に置かれた。次いで、１２８００ｎｇ／ｍｌから７ｎｇ／ｍｌの広い範囲の濃度のうちの１つおよび１ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＰＡＭＧ−１が本発明のストリップ装置の各々の検査領域内に加えられた。検査バンドは、１２８００ｎｇ／ｍｌから７ｎｇ／ｍｌのＰＡＭＧ−１濃度の範囲でヒトの目で見ることができたが、１ｎｇ／ｍｌの濃度では見ることができなかった。同時に、同一濃度の純粋Ｍ５２溶液が使用された場合には、検査ストリップは１ｎｇ／ｍｌも含むＰＡＭＧ−１濃度の全範囲で見ることができたが、１ｎｇ／ｍｌにおける強度は低かった。これは、一定の病状例えば炎症のある患者に偽陽性の結果が発生する可能性を大いに高める。
【０１５４】
１．検査領域内の２つの抗体の組み合わせでの本発明のストリップ装置の感度の調節
第１の調査では、Ｍ５２抗体（０．４ｍｇ／ｍｌの濃度）のみが検査領域内に導入された。第２の調査では、Ｍ５２抗体（０．４ｍｇ／ｍｌの濃度）およびＭ２７１抗体（０．４ｍｇ／ｍｌの濃度）が検査領域内に導入された。金粒子と接合体化したＭ２７１抗体は、光学密度が５１０ｎｍの波長で１０であるように選択された濃度で、パッド領域に導入された。この接合体は、１０％サッカロースおよび２％カゼインの溶液でパッド内に導入された。ＰＡＭＧ−１は、２０、１０、５、および１ｎｇ／ｍｌの濃度で滴定された。
【０１５５】
下記の表において、数字は、スキャナでシグマスキャンプログラム（Sigma Scan program）によって測定された相対光学密度指数である。Ｍ２７１抗体はパッド内にあり、Ｍ２７１＋Ｍ５２の組み合わせは検査領域内にある。「＋」は、検査ストリップが見えることを示し（ヒトの目で検出されるように十分着色されている）、「−」は、検査バンドがヒトの目では検出することができないことを示す。
【表１２】
2005535887.tif 000015
【０１５６】
検査の感度は、第１の調査の５ｎｇ／ｍｌから第２の調査の２０ｎｇ／ｍｌへ変化した。ＭＡｂ Ｍ２７１を検査領域へ加えることによって、感度の４倍の阻害が得られたと結論づけてもよい。
【０１５７】
２．２つの抗体の組み合わせでのストリップ装置の検査バンドの色強度の調節
第１の調査では、Ｍ５２抗体（０．８ｍｇ／ｍｌの濃度）のみが検査領域内に導入された。第２の調査では、Ｍ５２抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ）、Ｍ２７１抗体（０．７ｍｇ／ｍｌ）およびＭ４２抗体（０．８ｍｇ／ｍｌ）が検査領域内に導入された。検査領域用の抗体の混合物は、下記のように調製された。８．６ｍｇ／ｍｌの濃度の１４μｌ（マイクロリットル）のＭ５２抗体溶液が、１３．９ｍｇ／ｍｌの濃度の７μｌのＭ４２溶液および１０．９ｍｇ／ｍｌの濃度の３μｌのＭ２７１溶液と、混合された。次いで、緩衝液が、１５０μｌの合計容量へ加えられ、溶液はストリップ装置内に導入された。
【０１５８】
下記の表には、相対光学密度が示される。
【表１３】
2005535887.tif 000016
【０１５９】
光学密度曲線のスロープ（勾配）は、第１の調査と第２の調査との間で異なった。１２ｎｇ／ｍｌのＰＡＭＧ−１濃度で、第２の調査のストリップの着色線は、第１の調査よりも明るかった。６ｎｇ／ｍｌのＰＡＭＧ−１濃度で、ストリップの着色線は、第１の調査では目に見えたが、第２の調査では見えなかった。
【０１６０】
抗体の組み合わせで、視覚的により明るいバンドが観察された。したがって、ほぼ同一の感度にもかかわらず、ヒトの目によって観察された着色の強度は異なった。
【０１６１】
３．４つの抗体の組み合わせを使用する本発明の装置の感度および着色強度曲線のスロープの調節
下記の表において、「＋」は、目に見える検査バンドのままであり、「−」は、検査バンドがヒトの目では検出することができない。
【表１４】
2005535887.tif 000017
したがって、抗体を組み合わせることによって、検査の感度を調節することができる。
【０１６２】
（実施例１０）臨床検査の結果
研究プロトコル
患者は、「臨床的評価」−対照、および本発明の装置によって、評価された。
試験対象患者基準
１）妊娠週齢  ２０．０〜４１．０週
２）ＰＲＯＭまたはＰＰＲＯＭを示唆する徴候または症候を報告している患者。
３）患者をＰＲＯＭまたはＰＰＲＯＭについて評価するために標本が得られるまで、デジタル式膣内診はしない。
４）患者は、標準臨床的評価（鬱血、ニトラジン、シダ状結晶形成）の収集目的のための無菌検鏡診察、および、ＰＡＭＧ−１アッセイ用の無菌スワブに同意する。
【０１６３】
除外基準
１）任意の源からの能動的な膣出血
２）前置胎盤
【０１６４】
シャープメモリアルメリーバーチホスピタルフォーウィメン（Sharp Memorial Mary Birch Hospital for Women）（サンジエゴ）から、および、サミットメディカルセンター（Summit Medical Center）（オークランド）から、２０００年１２月１５日現在で１９２症例の統計分析が利用可能である。
【０１６５】
１９２のうちの２症例で、本発明の装置が陽性反応を示したが、標準臨床的評価は、ＰＲＯＭのいかなる徴候も示さなかった。したがって、これらの２例は、元々は、本発明の装置から偽陽性結果としてみなされた（下記の「未訂正」データ参照のこと）。しかし、検査後、何時間かの間に両患者でＰＲＯＭの症候がすぐに明らかになった。ＰＲＯＭの診断は、第２の臨床的評価で確認され、本発明の装置の両方の結果は、真の陽性であると判断された（下記の「訂正済」カラムは、最終トライアルデータを表す）。
【０１６６】
組み合わせデータ                      組み合わせデータ
（未訂正）                            （訂正済）
DxPROM                                 DxPROM
a=84、b=5、c=2、d=101                     a=88、b=1、c=0、d=103
感度=a/(a+c)=84/(84+2)=97.7%           感度=84/(84+0)=100%
特異性=d/(b+d)=101/(5+101)=95.3%       特異性=103/(1+103)=99%
PPV=a/(a+b)=84/(84+5)=94.4%            PPV=88/(88+1)=99%
NPV=d/(d+c)=101/(101+2)=98.1%          NPV=103/(103+0)=100%
ただし、
ａは、観察された真陽性例の数であり、
ｂは、観察された偽陰性例の数であり、
ｃは、観察された偽陽性例の数であり、
ｄは、観察された真陰性例の数である。
感度＝a/ａ＋ｃ；特異性＝d/ｂ＋ｄ
陽性予測値：  ＰＰＶ＝a/ａ＋b
陰性予測値：  ＮＰＶ＝d/d＋ｃ
真陽性は、本発明の装置による陽性応答の数であり、ＰＲＯＭは、それに続く臨床的評価によって確認される。
真陰性は、その後の臨床的評価によって確認された陰性応答の数である。
偽陽性は、陽性応答の数であるが、ＰＲＯＭは、その後の臨床的評価によって確認されない。
偽陰性は、陰性応答の数であるが、ＰＲＯＭが、その後の臨床的評価によって確認される。
【表１５】
2005535887.tif 000018
2005535887.tif 000019
【表１６】
2005535887.tif 000020
【表１７】
2005535887.tif 000021
【表１８】
2005535887.tif 000022
2005535887.tif 000023
【０１６７】
注記：表１６、１７、１８の羊水の漏れは、膣帯下の量および超音波検査によって臨床的に評価された。
【０１６８】
患者は合併症の治療のために入院中であったため、陰性検査結果の拡大臨床観察が可能であった。
【０１６９】
本発明は、ここに記載された特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際、先の説明および添付の図面から、本明細書中に記載されたものに加えて、本発明の種々の改変が当業者には明らかである。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０１７０】
すべての値は、概算であり、説明のために提供されることをさらに理解すべきである。
【０１７１】
特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコルは、本願の全体にわたって引用され、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照として本明細書中に組み込まれる。
【表１９】
2005535887.tif 000024
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】胎膜の破裂を診断するべくＰＡＭＧ−１の存在を検出するために使用され得る本発明の装置の概略長手方向断面図である。
【図２】図１の装置の平面図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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