(57)【要約】安定化剤と混合された、改善された鉱物質除去された骨マトリクス（ＤＢＭ）または他のマトリクス組成物が提供される。この安定化剤は、（１）拡散障壁、（２）酵素インヒビター、（３）競合基質、または（４）マスキング部分として働く。拡散障壁は、ＤＢＭに見られる骨誘導因子が、移植部位においてタンパク質分解酵素および解糖酵素によって分解されることから保護するように、障壁として働く。安定化剤は、デンプン、改変デンプン、セルロース、デキストラン、ポリマー、タンパク質、およびコラーゲンのような、任意の生分解性物質であり得る。この安定化剤がインビボで分解または溶解するにつれて、ＴＧＦ−β、ＢＭＰおよびＩＧＦのような骨誘導因子は、活性化または露出され、そしてこの活性化された因子は、細胞を、血管周囲の空間から損傷の部位へと補充するように、そして骨形成細胞に分化させるように、作用する。
2005505351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な骨成長誘導組成物であって、以下：
マトリクス；
少なくとも１つの成長因子；および
安定化剤であって、該安定化剤は、該組成物の骨誘導性を増強し、該安定化剤なしの組成物と比較して、改善された骨形成能を生じる、安定化剤、
を含有する、組成物。
【請求項２】
前記安定化剤が、拡散障壁、酵素インヒビター、競合基質、マスキング材料、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記安定化剤が、天然ポリマー、非天然ポリマー、改変または誘導体化された天然ポリマー、改変または誘導体化された非天然ポリマー、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され；そして前記マトリクスが、該安定化剤の内部に少なくとも部分的に埋め込まれている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記天然ポリマーが、脂質、多糖類、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記脂質が脂肪酸である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記多糖類がデンプンである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記安定化剤が再吸収性または生分解性である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記非天然ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリデキストラン、ポリエステル、ポリビニルアルコール、チロシンポリカーボネート、チロシンポリアリーレート、ポリオルトエステル、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリエーテル、ポリフマレートポリエステル、およびこれらのコポリマーからなる群より選択される再吸収性ポリマーである、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記マトリクスが少なくとも部分的に粒状である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
前記マトリクスが、セラミック、ポリマー、骨、鉱物質除去された骨、細胞外マトリクス、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記セラミックが、リン酸カルシウムまたは硫酸カルシウムを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リン酸カルシウムが、非晶質リン酸カルシウム、結晶性が乏しいヒドロキシアパタイト、ナノクリスタルヒドロキシアパタイト、化学量論的ヒドロキシアパタイト、カルシウム不足ヒドロキシアパタイト、置換ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物、およびリン酸一カルシウムからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記マトリクスが、非天然再吸収性ポリマーまたはその誘導体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリデキストラン、ポリエステル、ポリビニルアルコール、チロシンポリカーボネート、チロシンポリアリーレート、ポリオルトエステル、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリエーテル、ポリフマレートポリエステル、およびこれらのコポリマーからなる群より選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記成長因子が、骨原性因子、血管新生因子、脈管形成因子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記骨原性因子が、ＢＭＰ、ＴＧＦ、ＩＧＦ、ＭＣＳＦ、スタチン、およびＧＳＦからなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
移植可能な骨成長誘導組成物であって、以下：
粒状セラミック；
該セラミックに会合した、成長因子；および
再吸収性ポリマーまたは生分解性ポリマー；
を含有し、ここで、該粒状セラミックが、該ポリマー内に分散しており、そして該組成物の骨誘導性が、該粒状セラミックおよび会合した増殖因子のみの組成物の骨誘導性より大きい、組成物。
【請求項１８】
前記ポリマーが、多糖類、脂質、再吸収性ポリマー、再吸収性プラスチック、これらの誘導体、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記セラミックが、リン酸カルシウムセラミックである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリマーがデンプンである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
脂質をさらに含有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
鉱物質除去された骨マトリクス（ＤＢＭ）および安定化剤を含有する、鉱物質除去された骨マトリクス（ＤＢＭ）組成物。
【請求項２３】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも１ｍｍの粒子を含有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも１．５ｍｍの粒子を含有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも２ｍｍの粒子を含有する、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＤＢＭが、粒子を含有する、請求項２２に記載の組成物であって；
該粒子が、テーパ状、楔形状、または円錐形状であり；そして
該粒子が、最大寸法が少なくとも１ｍｍであり、そして別の寸法が約１００ミクロンである、組成物。
【請求項２７】
前記安定化剤が、拡散障壁、酵素インヒビター、競合基質、マスキング物質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
前記安定化剤が、天然ポリマー、非天然ポリマー、改変または誘導体化された天然ポリマー、改変または誘導体化された非天然ポリマー、およびこれらの組み合わせからなる群より選択され；そして前記マトリクスが、該安定化剤の内部に少なくとも部分的に埋め込まれている、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
前記天然ポリマーが、脂質、多糖類、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記脂質が脂肪酸である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記多糖類がデンプンである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記安定化剤が再吸収性および／または生分解性である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
前記安定化剤が、プロテアーゼインヒビター、グリコシダーゼインヒビター、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記競合基質が、ポリペプチド、ポリアミノ酸、多糖類、これらの組み合わせ、およびこれらの誘導体からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記安定化剤が、レクチン、抗体、成長因子結合タンパク質、およびこれらの誘導体または組み合わせからなる群より選択されるマスキング剤である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記非天然ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー（ＰＬＧＡ）、ポリデキストラン、ポリエステル、ポリビニルアルコール、チロシンポリカーボネート、チロシンポリアリーレート、ポリオルトエステル、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリエーテル、ポリフマレートポリエステル、およびこれらのコポリマーからなる群より選択される再吸収性ポリマーである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３７】
前記安定化剤が、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、抗トロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、４−アミノフェニルメタンスルホニル−フルオリド（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニンＡ、アルファメニンＢ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチンＡ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトンＡ、エベラクトンＢ、ＥＧＴＡ、エラスタチナール、フォロキシミチン、ヒルジン、ロイヒスチン、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、フェベスチン、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチパイン、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、ＥＤＴＡナトリウム、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３８】
鉱物質除去された骨マトリクス（ＤＢＭ）および拡散障壁を含有する、鉱物質除去された骨マトリクス組成物。
【請求項３９】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも１ｍｍの粒子を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも１．５ｍｍの粒子を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも２ｍｍの粒子を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ＤＢＭが粒子を含有する、請求項３８に記載の組成物であって、
該粒子が、テーパ状、楔形状、または円錐形状であり；そして
該粒子が、最大寸法が少なくとも１ｍｍであり、そして別の寸法が約１００ミクロンである、組成物。
【請求項４３】
前記拡散障壁が、天然ポリマー、非天然ポリマー、改変または誘導体化された天然ポリマー、改変または誘導体化された非天然ポリマー、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され；そして前記ＤＢＭが、該拡散障壁の内部に少なくとも部分的に埋め込まれている、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４４】
前記天然ポリマーが、脂質、多糖類、またはこれらの組み合わせである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記脂質が脂肪酸である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記多糖類がデンプンである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ポリマーが再吸収性および／または生分解性である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
鉱物質除去された骨マトリクス組成物であって、鉱物質除去された骨マトリクス（ＤＢＭ）および会合した賦形剤を含有し、ここで、該組成物は、賦形剤を含まないＤＢＭ単独の組成物より１０％より高い骨誘導性を有する、組成物。
【請求項４９】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも１ｍｍの粒子を含有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも１．５ｍｍの粒子を含有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも２ｍｍの粒子を含有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＤＢＭが、粒子を含有する、請求項４８に記載の組成物であって；
該粒子が、テーパ状、楔形状、または円錐形状であり；そして
該粒子が、最大寸法が少なくとも１ｍｍであり、そして別の寸法が約１００ミクロンである、組成物。
【請求項５３】
賦形剤を含まないＤＢＭ単独より２０％以上大きな骨誘導性を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５４】
賦形剤を含まないＤＢＭ単独より３５％以上大きな骨誘導性を有する、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５５】
前記賦形剤が、拡散障壁、酵素インヒビター、競合基質、マスキング物質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５６】
前記賦形剤が、天然ポリマー、非天然ポリマー、改変または誘導体化された天然ポリマー、改変または誘導体化された非天然ポリマー、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され；そして前記ＤＢＭが、該賦形剤の内部に少なくとも部分的に埋め込まれている、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５７】
前記賦形剤が、多糖類、脂質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記賦形剤が、脂質／多糖類の組み合わせである、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
前記脂質が、ホスファチジルコリンであり、そしてデンプンが、アミロース耐性デンプンである、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
骨誘導性が、移植の少なくとも７日後に、無胸腺症ラットの後筋肉またはウサギの脊椎傍空間において測定される、請求項４８に記載の組成物。
【請求項６１】
骨誘導性が、移植の少なくとも１４日後に測定される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
骨誘導性が、移植の少なくとも２１日後に測定される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
骨誘導性が、移植の少なくとも２８日後に測定される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６４】
骨誘導性が、移植の少なくとも４０日後に測定される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６５】
骨誘導性が、移植の少なくとも６０日後に測定される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６６】
ＤＢＭおよび賦形剤を含有するＤＢＭ組成物であって、１０μｇ  ＢＭＰ−コラーゲンスポンジ調製物の少なくとも２５％の骨誘導性を有する、組成物。
【請求項６７】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも１ｍｍの粒子を含有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも１．５ｍｍの粒子を含有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
前記ＤＢＭが、最大寸法が少なくとも２ｍｍの粒子を含有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ＤＢＭが、粒子を含有する、請求項６０に記載の組成物であって；
該粒子が、テーパ状、楔形状、または円錐形状であり；そして
該粒子が、最大寸法が少なくとも１ｍｍであり、そして別の寸法が約１００ミクロンである、組成物。
【請求項７１】
１０μｇ  ＢＭＰ−コラーゲンスポンジ調製物の少なくとも５０％の骨誘導性を有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７２】
１０μｇ  ＢＭＰ−コラーゲンスポンジ調製物の少なくとも７５％の骨誘導性を有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７３】
１０μｇ  ＢＭＰ−コラーゲンスポンジ調製物の少なくとも９０％の骨誘導性を有する、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７４】
前記賦形剤が、拡散障壁、酵素インヒビター、競合基質、マスキング物質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７５】
前記賦形剤が、天然ポリマー、非天然ポリマー、改変または誘導体化された天然ポリマー、改変または誘導体化された非天然ポリマー、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択され；そして前記ＤＢＭが、該賦形剤の内部に少なくとも部分的に埋め込まれている、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７６】
前記賦形剤が、多糖類、脂質、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
前記賦形剤が、脂質／多糖類の組み合わせである、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７８】
前記脂質が、ホスファチジルコリンであり、そしてデンプンが、アミロース耐性デンプンである、請求項７７に記載の組成物。
【請求項７９】
骨誘導性が、移植の少なくとも７日後に、無胸腺症ラットの後筋肉またはウサギの脊椎傍空間において測定される、請求項６６に記載の組成物。
【請求項８０】
骨誘導性が、移植の少なくとも１４日後に測定される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
骨誘導性が、移植の少なくとも２１日後に測定される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８２】
骨誘導性が、移植の少なくとも２８日後に測定される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８３】
骨誘導性が、移植の少なくとも４０日後に測定される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８４】
骨誘導性が、移植の少なくとも６０日後に測定される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８５】
前記安定化剤が、三次構造破壊剤である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項８６】
前記三次破壊剤が、アルキル化剤およびスルフヒドリル改変剤からなる群より選択される、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記三次元破壊剤が、グアニジン塩酸塩、ジチオトレイトール、ヨード酢酸、ヨウ化メチル、およびヨウ化アルキルからなる群より選択される、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８８】
鉱物質除去された骨マトリクス組成物を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
ＤＢＭを提供する工程、
安定化剤を提供する工程；および
該ＤＢＭを該安定化剤と接触させて、より安定なＤＢＭ組成物をインビボで形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項８９】
前記ＤＢＭを提供する工程が、該ＤＢＭをプロテアーゼインヒビターで処理する工程を包含する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
薬物送達デバイスであって、以下：
鉱物質除去された骨マトリクス；
該マトリクス上に吸着されて送達される、生理活性剤；および
安定化剤、
を備える、薬物送達デバイス。
【請求項９１】
前記生理活性剤が、骨誘導因子である、請求項９０に記載の薬物送達デバイス。
【請求項９２】
前記生理活性剤が、骨形態発生タンパク質、ＴＧＦ−βおよびＩＧＦからなる群より選択される、請求項９０に記載の薬物送達デバイス。
【請求項９３】
前記生理活性剤が、骨形態発生タンパク質である、請求項９０に記載の薬物送達デバイス。
【請求項９４】
前記生理活性剤が、前記マトリクスに共有結合している、請求項９０に記載の薬物送達デバイス。
【請求項９５】
前記生理活性剤が、前記マトリクスに非共有結合している、請求項９０に記載の薬物送達デバイス。
【請求項９６】
前記生理活性剤が、低分子、化合物、細胞、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、薬物、およびウイルスからなる群より選択される、請求項９０に記載の薬物送達デバイス。
【請求項９７】
前記生理活性剤が、抗生物質、抗腫瘍性物質、成長因子、造血因子、創傷治癒因子、および栄養素からなる群より選択される、請求項９０に記載の薬物送達デバイス。
【請求項９８】
骨欠損部位における移植のための、骨誘導組成物であって、該組成物は、水和多糖類のキャリア中の、骨誘導性の鉱物除去された骨マトリクスを含有し、該キャリア中に存在する多糖類の型および量は、水和の際に、該組成物に流動性を取り入れるために十分であり、そして無胸腺症ラットモデルアッセイによって測定する場合に、少なくとも１の骨誘導活性を与える、骨誘導組成物。
【請求項９９】
前記多糖類が、デンプンおよびセルロースからなる群より選択される、請求項９８に記載の骨誘導組成物。
【請求項１００】
前記デンプンが、コーンスターチ、コムギデンプン、ジャガイモデンプン、コメデンプン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９８に記載の骨誘導組成物。
【請求項１０１】
前記セルロースが、前記骨誘導組成物の約０．５重量％〜約３．０重量％未満のレベルのメチルセルロースである、請求項９８に記載の骨誘導組成物。
【請求項１０２】
骨由来の粒子、およびデンプンまたはデンプンの組み合わせを含有する、移植片材料。
【請求項１０３】
リン酸カルシウム粒子、デンプンまたはデンプンの組み合わせ、および生物学的に活性な因子を含有する、移植片材料。
【請求項１０４】
鉱物質除去された骨マトリクス（ＤＢＭ）、および安定化剤を含有する、組成物であって、該安定化剤が、インビボでの該ＤＢＭの活性の半減期を延長させる、組成物。
【請求項１０５】
ＤＢＭおよび賦形剤を含有する組成物であって、該賦形剤が、該ＤＢＭの放出速度を遅くさせるか、または該ＤＢＭの骨誘導性寿命を延長させる、組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本発明出願は、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ」と表題がつけられた、Ｋｎａａｃｋらによる、２００２年６月２７に出願された、同時係属仮出願ＵＳＳＮ６０／３９２，４６２、および「Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」と表題がつけられた、Ｔｒａｉａｎｅｄｅｓらによる、２００１年１０月１２に出願された、同時係属仮出願ＵＳＳＮ６０／３２９，１５６（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に対して優先権を主張する。
【０００２】
（背景）
損傷、疾患、創傷、手術などにより生じる骨欠損の迅速かつ効果的な修復は、整形外科手術の長年の目標である。この目標に向けて、多数の組成物および材料が、骨欠損の修復用に使用または提案されている。この組成物および材料の生物学的特性、物理的特性、および機械的特性は、種々の整形外科的適用における、それらの安定性および性能に影響する主要な因子の１つである。
【０００３】
自己由来の海綿質（「ＡＣＢ」）は、骨移植片についてのゴールドスタンダード（ｇｏａｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）と考えられている。ＡＣＢは、骨誘導性（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）であり、非免疫原性であり、そして、定義により、特定のレシピエントに適切な、適切な構造的かつ機能的特徴の全てを有する。残念なことに、ＡＣＢは、制限された数の状況においてのみ利用可能である。ある個体は、移植に適切な寸法および品質のＡＣＢを欠如している。さらに、ドナー部位の病的状態は、患者および担当医に重大な問題を提起し得る。
【０００４】
代替の骨移植片材料の同定または開発において、多くの努力が注ぎ込まれている。鉱物質除去骨マトリクス（「ＤＢＭ」）インプラントは、特に有用であることが報告されている（例えば、米国特許第４，３９４，３７０号；同第４，４４０，７５０号；同第４，４８５，０９７号；同第４，６７８，４７０号および同第４，７４３，２５９号；Ｍｕｌｌｉｋｅｎら、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．３３：７１，１９８１；Ｎｅｉｇｅｌら、Ｏｐｔｈａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１２：１０８，１９９６；Ｗｈｉｔｅｍａｎら、Ｊ．Ｈａｎｄ．Ｓｕｒｇ．１８Ｂ：４８７，１９９３；Ｘｉａｏｂｏら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．２９３：３６０，１９９３を参照のこと（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される））。鉱物質除去骨マトリクスは、代表的には死体に由来する。骨は、無菌的に取り出され、そして／または任意の感染性因子を死滅させるために処理される。次いで、この骨は、ミリングまたはグラインディングにより微粒子化され、次いで、無機質成分が、（例えば、酸性溶液中に骨を浸漬することにより）抽出される。残ったマトリクスは、打ち延べられ、そして、レシピエントの特定の部位への移植のために、さらに処理ならびに／または形成および成型され得る。この様式で調製された鉱物質除去骨は、タンパク質、糖タンパク質、成長因子、およびプロテオグリカンを含む種々の成分を含む。移植の後、ＤＢＭの存在は、損傷の部位への細胞補充を誘導する。補充された細胞は、骨形成細胞へと最終的に分化し得る。細胞のこのような補充は、創傷治癒の速度の増加を導き、その結果、患者のより速い回復をもたらす。
【０００５】
現在のＤＢＭ処方物は、様々な欠点を有する。第１に、ＤＢＭのコラーゲンベースのマトリクスは比較的安定であるが、ＤＢＭマトリクス内の活性因子は、迅速に分解される。ＤＢＭの骨形成活性は、移植後の２４時間以内に有意に低下され得、そして、ある場合では、骨形成活性は、６時間以内に不活化され得る。従って、ＤＢＭと関連する因子は、移植後の短い時間に損傷の部位へ細胞を補充するためにのみ利用可能である。数週間から数ヶ月も要し得る治癒過程の間、移植された材料は、細胞を補充する際に、わずかな補助を提供し得るか、または補助を提供し得ない。
【０００６】
ＤＢＭ内に存在する活性因子に加えて、ＤＢＭインプラントの全体の構造はまた、インプラントの骨治癒の能力に寄与すると考えられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、改善された鉱物質除去骨マトリクス（「ＤＢＭ」）組成物、本発明の組成物を調製および使用するための関連方法、および本発明の組成物を含むキットを提供する。本発明は、以下の認識を包含する：以前に利用可能なＤＢＭ組成物で観察される骨誘導性能力の急速な低下は、（１）骨誘導性因子の分解（例えば、プロテアーゼ、糖分解酵素、または宿主もしくはＤＢＭ自体に存在する他の酵素の結果として）；（２）ＤＢＭからの骨誘導性因子の拡散；および／または（３）ＤＢＭ中の骨誘導性因子の活性の低下から生じ得る。従って、本発明は、骨誘導性因子が、分解および／または組成物からの拡散から保護される、ＤＢＭ組成物を提供する。本発明はまた、例えば、時間制御放出様式での、ＤＢＭにおいて見出された骨誘導性因子の活性化を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明はまた、ＤＢＭ組成物の全体の効力に寄与する、改善された形状保持特徴を提供する。また、いくつかの実施形態では、本発明のＤＢＭ組成物は、生理活性因子を投与するための送達デバイスとして用いられ得る。
【０００８】
ＤＢＭ内の活性因子の保護は、（１）拡散障壁（例えば、ポリマー、デンプン）、（２）酵素インヒビター（例えば、プロテアーゼインヒビター）、（３）競合物質、および／または（４）マスキング部分を用いて提供される。本発明の特定の実施形態は、安定化剤（例えば、ポリマーまたは他の因子（例えば、プロテアーゼインヒビター））を含むＤＢＭ組成物を提供する。好ましくは、拡散障壁としてのポリマーは、時間を掛けて代謝され、その結果、骨誘導性因子は、時間を掛けてＤＢＭ組成物からアンマスキングおよび／または放出されるか、またはその分解速度を遅らせる。本発明の拡散障壁はまた、ＤＢＭ組成物に存在する因子に対する活性化酵素の拡散を減少させることによる代替手段を介して作用し得る。好ましくは、このようなアンマスキング、放出、制御放出、または制御された分解は、数時間よりも長い時間、好ましくは、１日〜数日よりも長い時間、および、恐らく、数週間、もしくは、さらに、数ヶ月続く期間にわたって生じる。特定の好ましい実施形態では、分解、放出、および活性化の速度は、時間を掛けて骨誘導性の所望のレベルを有するＤＢＭ組成物を生じるためにバランスを取られる。安定化剤を含む本発明の組成物は、代表的に、安定化剤を欠く比較可能な組成物で見られるよりも、長い時間の骨誘導活性を示す。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態では、安定化剤は、ポリマー（例えば、生分解性ポリマー（例えば、ＤＢＭ組成物からの骨誘導性因子の拡散を阻害もしくは遅らせるポリマー、ならびに／または骨誘導性因子に対する分解酵素および／もしくは活性化酵素の接近をブロックするポリマー））を含み得る。生分解性ポリマーの例としては、デンプン、デキストラン、セルロース、ポリエステル、タンパク質、ポリカーボネート、ポリアリーレート（ｐｏｌｙａｒｙｌａｔｅ）、およびＰＬＧＡが挙げられる。好ましくは、このポリマーは、生体適合性および生分解性である。
【００１０】
他の実施形態では、本発明のＤＢＭ組成物は、１つ以上の活性化酵素、プロテアーゼ、またはグリコシダーゼの活性を阻害する因子を含み得、そして／またはこれらの因子で処理され得る。このような阻害因子は、（宿主に由来しようと、ＤＢＭに由来しようと）特定の酵素の活性を低下させる（この酵素は、さもなければ、ＤＢＭ中の骨誘導性因子または他の活性因子と相互作用し、それにより、骨誘導性または創傷治癒を低下させる）ことが予想される。あるいは、またはさらに、本発明のＤＢＭ組成物は、時限放出処方物（例えば、生分解性ポリマー内にカプセル化される）中に存在する、阻害因子を含み得る。活性化酵素（すなわち、骨誘導性因子の放出、提示、または作製をもたらす酵素）の場合、活性化酵素の活性を低下させる阻害因子は、好ましくは、移植の直後に一気にというよりはむしろ、長期間にわたって、増大した骨誘導性をもたらす。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態は、組成物またはその一部が、骨誘導性を失う速度を制御または調整するように、特に処方されたＤＢＭ組成物を含む。一例を挙げれば、ＤＢＭ組成物は、複数の異なるＤＢＭ調製物から調製され得、これらの各々は、異なるサイズのＤＢＭ粒子を含み、そして／または異なる量または型の安定化剤を含む。例えば、ＤＢＭ調製物または粉末は、例えば、安定化ポリマーの性質または量、ポリマーの架橋の程度、安定化コーティングの厚さ、粒子のサイズ、安定化酵素もしくは分解酵素のインヒビターの量などを変化させることにより決定される、様々な半減期を有するように調製され得る。全ての本発明のＤＢＭ組成物において異なるＤＢＭ調製物の量または位置を調整することは、本発明の組成物の一部または全ての特徴を改変し得る。この様式で、例えば、処方物は、患者、損傷の型、損傷の部位、回復の期間、潜在的疾患など、に対してカスタマイズされ得る。
【００１２】
別の局面では、本発明は、本発明の改善されたＤＢＭ組成物を調製する方法を提供する。例えば、本発明は、特定の部位または損傷のための、改善されたＤＢＭ組成物を処方する方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ＤＢＭ移植片を調製および適用するためのシステムおよび試薬、ならびにＤＢＭインプラントを用いて骨欠損を処置するためのシステムおよび試薬を提供する。例えば、ＤＢＭ組成物は、シリンジのような送達デバイス中にペーストとして提供され得る。好ましくは、ＤＢＭ組成物は滅菌であり、そしてパッケージ化され、その結果、滅菌条件下（例えば、手術室の中）で適用され得る。
【００１４】
本発明は、ＤＢＭ組成物を特徴付けするためのシステム、ならびに改善された特性を有するＤＢＭ含有材料を同定および調製するためのシステムをさらに提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、生理活性因子（例えば、成長因子（例えば、骨形成タンパク質、成長因子、ホルモン、血管形成因子、サイトカイン、インターロイキン、オステオポンチン、オステオネクチン））を、宿主動物に送達するためのシステムを提供する。生理活性因子のための送達ビヒクルとしてのＤＢＭ組成物の使用は、生理活性因子を別々に投与する必要なしに、インプラントに応答する改善された治癒の予期せぬ結果のために提供する。この部位における生理活性因子の導入に伴う１つの問題は、完全な治癒が起こる前に、この因子が、頻繁に、治癒プロセスの間に、レシピエントの循環系（例えば、血液、リンパ）によって希釈および再分配されることである。再分配のこの問題のひとつの解決策は、骨インプラントに生理活性成分を固定することである。ＤＢＭ組成物を用いて送達され得るいくつかの好ましい生理活性因子は、自然の治癒プロセス（すなわち、再吸収、血管新生、新脈管形成、新しい成長など）を促進する因子を含む。本発明のＤＢＭ組成物を用いて送達され得る生物学的因子のリストを、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ａに挙げる。本発明のこの局面の好ましい実施形態では、ＤＢＭが、安定化因子と共に、生物学的に活性な因子を送達するために用いられる本発明の組成物が提供される。安定化因子は、分解から生物学的に活性な因子を保護し、その結果、レシピエント動物への送達の後のその活動寿命を延長することが予想される。特定の実施形態では、生理活性因子は、骨誘導性因子であり、そして特定の実施形態では、ＤＢＭは、１を超える生理活性因子、好ましくは、２を超える生理活性因子、そして、より好ましくは、時折、３を超える生理活性因子を送達するために用いられ得る。生理活性因子は、ＤＢＭと会合し得る。例えば、生理活性因子は、静電的相互作用、水素結合、πスタッキング、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用などを介して、ＤＢＭと会合し得る。特定の実施形態では、生理活性因子は、特定の相互作用（例えば、レセプターとそのリガンドとの間の相互作用、または抗体とその抗原との間の相互作用）を介してＤＢＭに付着される。他の実施形態では、生理活性因子は、非特異的相互作用（例えば、疎水性相互作用）を介してＤＢＭに付着される。
【００１６】
（定義）
〜と会合している：安定化因子または他の化学的実体が、インプラントの骨誘導性を有意に増大させるのに十分に長く、インプラントにより保持される場合、安定化因子または他の化学的実体は、ＤＢＭまたは本発明に従う他の骨形成マトリクスと会合している。具体例としては、以下が挙げられる：１）シミュレートされた体液における、インビトロ拡散アッセイにおいて決定されるように、ＤＢＭから自由に拡散できない；および／または２）溶液中で自由なものと比較して、ＤＢＭにおいて延長した半減期を有する。いくつかの実施形態では、会合は、共有結合であり；他の場合では、会合は、非共有結合である。非共有結合相互作用の例としては、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用が挙げられる。例えば、生理活性因子は、マトリクスから生理活性因子の拡散を抑制するポリマー性安定化因子によって、ＤＢＭまたは他の本発明のマトリクスと会合されていてもよい。あるいはまたはさらに、この生理活性因子は、ＤＢＭとそれ自身が会合されている１つ以上の実体との物理的相互作用によって、ＤＢＭと会合されていてもよい。例えば、実施例１２のＢＭＰ−２は、ＤＢＭと会合していると考えられ、そしてＢＭＰ−２Ｘは、ＢＭＰ−２よりもＤＢＭとより密接に会合していると考えられる。
【００１７】
鉱物質除去骨活性とは、鉱物質除去骨の骨誘導活性をいう。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、鉱物質除去骨マトリクスとは、骨生組織から無機物質を取り出すことにより生成される、任意の材料をいう。好ましい実施形態において、本明細書中で用いられるＤＢＭ組成物は、５重量％未満のカルシウム、および、好ましくは、１重量％未満のカルシウムを含む調製物を含む。部分的鉱物質除去骨（例えば、５重量％よりも多いカルシウムを有するが、カルシウムの本来の開始量の１００％未満を含む調製物）もまた、本発明の範囲内と考えられる。
【００１９】
拡散障壁とは、障壁の一方の側面から他方の側面への（詳細には、外側から内側への、またはその反対の）物質の拡散速度を低下させる、任意の材料、コーティング、フィルム、または物質をいう。特定の実施形態における拡散障壁は、タンパク質、多糖類、セルロース、人工ポリマー、ＰＬＧＡなどを含むポリマーであり得、このポリマーは、活性化因子（水、酵素などを含む）および／または分解酵素の、ＤＢＭ組成物への拡散を防ぐ。拡散障壁はまた、ＤＢＭ組成物からの骨誘導性因子の移動を防ぎ得る。特定の実施形態では、拡散障壁は、生分解性であり、長期間にわたり骨誘導性因子の分解、活性化、または放出を導く。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、マトリクスとは、移植部位への送達のために、少なくとも１つの成長因子と会合し得る、天然または非天然の実質的に固体のビヒクルをいう。このマトリクスは、完全に不溶性であり得るか、または移植後にゆっくりと可溶化され得る。移植後に、好ましいマトリクスは、少なくとも１〜７日間、最も好ましくは、２または４週間以上の間、および頻繁に６０日を超えて、実質的にインタクトなまま、再吸収または分解する。成長因子は、殆どの鉱物質除去骨の場合のようにマトリクス上に内因的に存在し得るか、マトリクスに外因的に添加され得る。マトリクスはまた、内因性の成長因子と外因性の成長因子との組み合わせを含み得る。マトリクスは、粒子形態もしくは繊維形態であり得るか、またはモノリシックであり得る。マトリクスは、多数の材料ならびに繊維および粒子のような組合わせの多数の形態を含み得る。１つの好ましい実施形態では、マトリクスは、加熱プレスした鉱物質除去骨繊維から構成される。他の実施形態では、マトリクスは、拡散障壁としての使用に適する、以下に記載されるような再吸収可能な可塑性ポリマーを含む。他の好ましい実施形態では、粒子状の非結晶リン酸カルシウムが、ＢＭＰ（より詳細には、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４またはその誘導体）のような吸着された成長因子と関連して、マトリクスとして用いられる。外因性成長因子の添加を必要とする、さらに他のマトリクス実施形態としては、粒子状セラミック、好ましくは、硫酸カルシウムまたはリン酸カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましいマトリクスは、リン酸カルシウム（その調製は当業者に周知である）である。（例えば、Ｄｒｉｅｓｓｅｎｓら、「Ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｏｎｅ  ｃｅｍｅｎｔｓ」Ｗｉｓｅ，Ｄ．Ｌ．編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐａｒｔ  Ｂ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ；Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｐａｔｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９４（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。リン酸カルシウムマトリクスとしては、リン酸二カルシウム二水和物、モネタイト、リン酸三カルシウム、リン酸四カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ナノ結晶性（ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）ヒドロキシアパタイト、結晶性が乏しい（ｐｏｏｒｌｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ）ヒドロキシアパタイト、置換ヒドロキシアパタイト、およびカルシウム不足ヒドロキシアパタイトが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、骨誘導性とは、骨形成を刺激し得る質をいう。動物の軟部組織における異所性の骨の形成を誘導し得る任意の材料は、骨誘導性であると考えられる。例えば、殆どの骨誘導性材料は、Ｅｄｗａｒｄｓらの方法に従ってアッセイした場合、無胸腺ラットにおける骨形成を誘導する（「Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｎｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ」Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐｅａｄｉｃｓ＆Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，３５７：２１９−２２８，１９９８年１２月；本明細書中で参考として援用される）。いくつかの例において、骨誘導性は、細胞補充および補充された細胞の誘導を介して、骨形成表現型を生じると考えられる。骨誘導性はまた、培養細胞（初代、二代目、または外埴）における骨形成表現型を誘導する能力として、組織培養物中で決定され得る。この組織培養方法を、Ｚｈａｎｇら（「Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ」Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．６８（１１）：１０７６−８４，１９９７年１１月（本明細書中で参考として援用される））により記載されるインビボでの異所性骨形成アッセイを用いて較正することを勧める。証明されたインビボでの異所性骨形成モデルに対するインビトロアッセイの較正は重要である。なぜならば、化合物の組織培養物中で明確な「骨形成」表現型を誘導する能力は、常に、インビボでの新規の骨形成の誘導と相関し得るとは限らないからである。ＢＭＰ、ＩＧＦ、ＴＧＦ−β、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および脈管形成因子は、骨髄または血管周囲の空間から損傷の部位へ細胞を補充し、次いで、骨形成の原因となる線に置かれたこれらの補充された細胞の分化を生じることが見出された、わずかないくつかの骨誘導性因子である。骨または象牙質から単離されたＤＢＭは、両方共、骨誘導性材料であることが見出されている（Ｒａｙら「Ｂｏｎｅ  ｉｍｐｌａｎｔｓ」Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ３９Ａ：１１１９，１９５７；Ｕｒｉｓｔ，「Ｂｏｎｅ：ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５０：８９３，１９６５（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される））。
【００２２】
骨誘導性供給源とは、Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９８）の方法または同等の較正された試験に従って決定される０から４までの範囲のスコアをいう。Ｅｄｗａｒｄｓらの方法において、「０」のスコアは、新規の骨形成がないことを表し；「１」は新規の骨形成に関与する１％〜２５％のインプラントを表し；「２」は新規の骨形成に関与する２６〜５０％のインプラントを表し；「３」は新規の骨形成に関与する５１〜７５％のインプラントを表し；そして「４」は新規の骨形成に関与する７５％を超えるインプラントを表す。殆どの場合において、このスコアは、移植の２８日後に評価される。しかし、改善された本発明の処方物（特に、ＢＭＰに匹敵する骨誘導性を有するもの）については、骨誘導性スコアは、移植の７日後、１４日後、または２１日後のような、より早い時点で得られ得る。これらの場合において、キャリアなしで、ＤＢＭ粉末のような通常のＤＢＭコントロール、および、もし可能ならば、ＢＭＰのような陽性コントロールを含むことが重要である。時折、骨誘導性はまた、移植の４０日後、６０日後、またはさらに１００日後のような、より遅い時点で評価され得る。骨誘導性の割合とは、特定の参照スコアの活性の割合として表される、所定の時点での骨誘導性スコアをいう。
【００２３】
粒子または繊維とは、ＤＢＭ、ＤＢＭ組成物またはミリング、グラインディング、粉砕または他の方法により粒状形態につぶされた骨サンプルの調製物をいう。粒子または繊維のサイズは、代表的には５０ミクロンより大きく、好ましくは７５ミクロンより大きく、より好ましくは１００ミクロンより大きく、そして最も好ましくは１５０ミクロンより大きい。これらの寸法は、より球状の粒子については平均粒子直径をいい、そして、特に示される場合を除くその他の形状の粒子については、その粒子の最も小さい断面の寸法をいう。特定の実施形態において、組成物には、より大きなサイズの粒子、好ましくはその最大寸法で１ｍｍより大きいか、１．５ｍｍより大きいか、または最も好ましくは２ｍｍより大きなサイズさえ含まれ得る。粒子または繊維は、楔形、ロッド、球形、立方体、円板、卵形、不規則な形状などを含む任意の形状であり得る。例えば、特定の実施形態において、粒子は、楔形であり得、そしてその最大寸法において約２ｍｍであり得、そして別の寸法において１００ミクロン以下であり得る。粒子または繊維は、一定の粒径の粒子を集めるために、篩にかけられても選別されてもよい。これらの粒子または繊維は、溶液、スラリー、変形可能な固体、または液体と混合されて、ＤＢＭのグラフト、本発明のＤＢＭ組成物、または骨サンプルを投与または塗布する際に使用されるペーストを形成し得る。粒子または繊維の調製のための好ましい方法は、発行された米国特許第５，６０７，２６９号；同第５，２３６，４５６号；同第５，２８４，６５５号；同第５，３１４，４７６号；および同第５，５０７，８１３号に開示される；これらの各々は、本明細書中で参考として援用される。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、多糖類とは、炭水化物残基の任意のポリマーまたはオリゴマーをいう。２から数百〜数千までの任意の糖単位からなり得る。多糖類は、植物のような天然供給源から精製され得るか、または実験室にて新規に合成され得る。天然供給源から単離される多糖類は、化学的に修飾されて（例えば、リン酸化、架橋）、その化学的特性または物理的特性を変更し得る。多糖類はまた、直鎖または分岐鎖のいずれかであり得る。これらは、天然の炭化水素残基および／または非天然の炭化水素残基を含有し得る。これらの残基間の結合は、天然に見出される代表的なエーテル結合であり得るか、または合成化学者に利用可能な結合であり得る。多糖類の例としては、セルロース、マルチン（ｍａｌｔｉｎ）、マルトース、デンプン、改変デンプン、デキストラン、およびフルクトースが挙げられる。グリコサミノグリカンもまた多糖類とみなされる。
【００２５】
プロテアーゼインヒビターは、本明細書中で使用される場合、タンパク質を切断する酵素（すなわち、プロテアーゼ）の酵素活性を阻害し得る化合物である。これらの化合物により阻害されるプロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ（いくつかのマトリクスメタロプロテアーゼインヒビターの例は、図６に示される）、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、システインプロテアーゼなどが挙げられる。プロテアーゼインヒビターは、特定のプロテアーゼもしくはプロテアーゼのクラスのみを阻害するように特異的に作用し得るか、またはより一般的には全てではない場合には大部分のプロテアーゼを阻害することにより作用し得る。好ましいプロテアーゼインヒビターは、タンパク質ベースもしくはペプチドベースであり、そしてＡｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａのような化学品会社から市販されている。ＤＢＭ（またはリン酸カルシウムもしくはセラミックキャリア）に接着するタンパク質ベースまたはペプチドベースのインヒビターは、マトリクスと結合したままであり、自由に拡散可能なインヒビターよりも長い期間安定化効果を提供するので、特に好ましい。プロテアーゼインヒビターの例としては、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン（ａｍａｓｔａｔｉｎ）−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビンＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、４−アミノフェニルメタンスルホニル−フルオリド（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニン（ａｒｐｈａｍｅｎｉｎｅ）Ａ、アルファメニンＢ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチン（ｄｉｐｒｏｔｉｎ）Ａ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトン（ｅｂｅｌａｃｔｏｎｅ）Ａ、エベラクトンＢ、ＥＧＴＡ、エラスタチナール（ｅｌａｓｔａｔｉｎａｌ）、フォロキシミチン（ｆｏｒｏｘｙｍｉｔｈｉｎｅ）、ヒルジン、ロイヒスチン（ｌｅｕｈｉｓｔｉｎ）、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、フェベスチン（ｐｈｅｂｅｓｔｉｎ）、１，１０−フェナントロリン、ホスホルアミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチペイン（ａｎｔｉｐａｉｎ）、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、およびＥＤＴＡナトリウムが挙げられる。
【００２６】
本発明によれば、ペプチドまたはタンパク質は、ペプチド結合により一緒に連結された少なくとも２つのアミノ酸の鎖を含む。本発明のペプチドは、好ましくは天然のアミノ酸のみを含むが、非天然アミノ酸（すなわち、天然には存在しないがポリペプチド鎖に組み込まれ得る化合物）および／または当該分野で公知のアミノ酸アナログが代わりに使用され得る。また、本発明のペプチド中の１つ以上のアミノ酸は、例えば、化学実体（例えば、炭水化物基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、結合体化のためのリンカー、官能基化、またはその他の修飾など）の付加により改変され得る。
【００２７】
安定化剤は、ＤＢＭおよび／または成長因子を含む本発明の組成物中に含まれる場合に、特定された参照サンプルに対して測定するとその組成物の骨誘導性（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を増大させる任意の化学実体である。大部分の場合、この参照サンプルは、安定化剤を含まないが、他の全ての点において、安定化剤を含む組成物と同じである。安定化剤はまた、一般的にそれ自体の骨誘導性をほとんど有さないかまたは全く有さず、そして安定化剤を欠くが他は同一である組成物と比較した場合に本発明の組成物内１種以上の活性実体の半減期を増加することにより、または活性因子の放出を延長するかもしくは遅らせることにより、作用する。特定の実施形態において、この安定化剤は、プロテアーゼと糖分解酵素の間の障壁を提供して、それによりマトリクス内もしくはマトリクス上に見出される骨誘導性因子を分解および／もしくは放出から保護することにより作用し得る。他の実施形態において、安定化剤は、プロテアーゼまたは糖分解酵素の活性を阻害する化合物であり得る。好ましい実施形態において、安定化剤は、活性因子を放出しそして可溶化することが知られている酵素のアクセスを遅らせる。半減期は、マトリクスに結合された場合かまたはマトリクスから抽出された場合の、特定の因子の免疫学的アッセイまたは酵素学的アッセイにより決定され得る。あるいは、骨誘導性半減期の増加の測定、または骨誘導性プロセスの産物（例えば、骨、軟骨もしくは骨形成細胞、その産物もしくは指標）の増大された出現の測定は、増大された骨誘導性マトリクス組成物についての安定化効果の有用な指標である。強い骨誘導性応答の延長されたかまたは遅れた出現の測定は、一般的に、因子の活性の遅れた脱マスキングと関連した因子の安定性の増加の指標である。
【００２８】
標的化剤は、本発明の組成物に含まれた場合に、その組成物を特定の部位に指向させるか、または本発明の組成物をレシピエントの体内の特定の部位に留まらせる任意の化学実体である。標的化剤は、低分子、ペプチド、タンパク質、生物学的分子、ポリヌクレオチドなどであり得る。代表的な標的化剤は、抗体、既知のレセプターのリガンド、およびレセプターである。これらの標的化剤は、共有結合相互作用または非共有結合相互作用により本発明の組成物と結合され得、その結果本発明の組成物は、特定の組織、器官、損傷部位または細胞型に指向される。
【００２９】
（特定の好ましい実施形態の説明）
本明細書中に記載されるとおり、本発明は、改善されたＤＢＭまたは合成成長因子を含有する組成物に関する組成物および方法を提供する。以下に、本発明の好ましい実施形態の特定の局面を、より詳細に、そして図面を参照して記載する。当業者は、本発明の種々の実施形態または変形物が、具体的に以下に議論されていなくとも、添付の特許請求の範囲により規定されるとおりの本発明の範囲内にあることを理解する。
【００３０】
ＤＢＭは、主にタンパク質および糖タンパク質から構成され、コラーゲンは、ＤＢＭの主要なタンパク質置換体である。コラーゲンは、比較的珍しいコラゲナーゼ酵素によってのみ分解され、比較的安定であるが、ＤＢＭ中に存在する他のタンパク質および活性因子は、宿主内に存在する酵素により直ぐに分解される。これらの宿主由来の酵素としては、プロテアーゼおよび糖分解酵素（例えば、エンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼ、グリカナーゼ、グリコラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、ガラクトシダーゼなど）が挙げられる。ＤＢＭの骨誘導性活性に応答性の活性成長因子の多くは、活性化されるまでマトリクス中において潜在（ｃｒｙｐｔｉｃ）形態で存在する。活性化は、この因子の前機能（ｐｒｅ  ｏｒ  ｐｒｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の変化、または第１の成長因子に結合する第２の因子もしくは実体からの機能の開放を含み得る。本発明は、以下１）〜３）のいずれかにより、ＤＢＭに存在する活性因子がその骨誘導性活性を発揮し得る時間経過を変更する：１）ＤＢＭに存在する活性因子の分解を遅くして、それにより活性部分としてより長い残留期間を可能にすること、または２）インプラントからの１つ以上の活性因子の放出を延長すること、または３）１つ以上の潜在的因子の活性化の反応速度論を変更すること。本発明は、以下（１）〜（３）によりＤＢＭ組成物の有効な骨誘導性を増加させる：（１）潜在的因子の活性化の反応速度論を変更すること、（２）マトリクスからの活性因子の送達および／または放出を変更すること、および／または（３）ＤＢＭ組成物内もしくはＤＢＭ組成物から放出されるときの活性因子のタンパク質分解を低減すること。増加した骨形成は、骨形成表現型へのより多くの細胞の漸増によりおそらく起こる。
【００３１】
本発明は、宿主由来の酵素または内因性酵素による分解からの活性因子の保護に対する４つのアプローチを提供する。保護される因子は、ＤＢＭ調製に対して内因性であり得るか、または因子は、ＤＢＭもしくは合成マトリクス組成物のいずれかに添加され得る。保護は、ａ）拡散障壁、ｂ）酵素インヒビター、ｃ）競合性基質、および／またはｄ）マスキング部分の使用により提供される。このような４つのアプローチを使用して、潜在形態の骨誘導性因子の活性化および／または放出を制御し得る。例えば、拡散障壁または活性化酵素インヒビターは、活性化酵素がこの潜在因子に到達するのを防ぐか、またはその潜在因子に対して作用するのを防ぐ。好ましくは、ＤＢＭ組成物内の活性化因子の分解、放出および活性化は、経時的に所望の骨誘導性プロファイルが得られるようにバランスが保たれる。
【００３２】
（鉱物質除去された骨マトリクス）
ＤＢＭ調製物は、骨の形成を促進するために整形外科において長年使用されてきた。例えば、ＤＢＭは、骨折の修復、椎骨の融合、関節置換手術、および慢性関節リウマチのような内在する疾患に起因する骨の破壊の処置において用途を見出している。ＤＢＭは、骨伝導性プロセスおよび骨誘導性プロセスによりインビボで骨の形成を促進すると考えられる。骨伝導性は、移植された材料が新しい骨の成長の支持のための骨格として作用する場合に生じる。骨伝導性は、骨の成長が、大きいかまたは「決定的なサイズ」の欠損（骨の治癒は、ゆっくりとしか進行しないかまたは少しも進行しない）にわたって所望される場合に特に重要である。ＤＢＭ調製物の骨伝導性特性が、インプラントの実際の形状およびコヒーレンスにより提供されると、一般的に信じられている。従って、もつれた繊維を含むＤＢＭ組成物は、より繊維状でないより粒状の調製物と比較して、優れた骨伝導特性を有する傾向がある。ＤＢＭ置換物の形状および／またはコヒーレンスを保つ傾向のある安定化剤は、よりよい骨形成特性をもたらし得る。
【００３３】
移植されたＤＢＭ組成物の骨誘導性効果は、単離されたコラーゲンベースのマトリクス上に存在する活性成長因子の存在から生じると考えられる。これらの因子としては、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、およびＢＭＰタンパク質ファミリーのメンバーが挙げられる。骨誘導性因子の特定の例としては、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および脈管形成因子が挙げられる。オステオカルシンおよびオステオポンチンのような他の骨誘導性因子もまたＤＢＭ調製物に存在するようである。他の名称がつけられていないかまたは未発見の骨誘導性因子もまたＤＢＭに存在するようである。
【００３４】
種々の鉱物質除去された骨マトリクス調製物のいずれも、本発明の実施において利用され得る。任意の方法により調製されたＤＢＭが、使用され得、これらとしては、粒子または繊維ベースの調製物、繊維および粒状調製物の混合物、完全にかもしくは部分的に鉱物質除去された調製物、完全に鉱物質除去された調製物と部分的に鉱物質除去された調製物の混合物（Ｇｅｒｔｚｍａｎら（２００１年１２月４日に発行された米国特許第６，３２６，０１８号；本明細書に参考として援用される）に記載されるような表面を鉱物質除去された調製物を含む）が挙げられる。好ましいＤＢＭ組成物は、Ｄｏｗｄら、米国特許第５，５０７，８１３（本明細書中に参考として援用される）に記載される。添加物またはキャリア（例えば、ポリヒドロキシル化合物、多糖類、グリコサミノグリカンタンパク質、核酸、ポリマー、ポロキサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、樹脂、クレイ、カルシウム塩および／またはそれらの誘導体）を含むＤＢＭ調製物もまた有用である。
【００３５】
特定の実施形態において、本発明の組成物を処方するために利用されるＤＢＭ材料は、５０％より多く、好ましくは７５％より多く、より好ましくは８０％、８５％、９０％、または９５％より多く、そして最も好ましくは９８％より多くのリン酸カルシウムを除去される。ＤＢＭを生成するために使用される骨は、生体組織または死亡した組織の任意の供給源から得られ得る。しばしば、骨の供給源が、本発明の最終的なレシピエントに適合されることが好ましい。少なくとも、ドナーとレシピエントとが同じ種であることがしばしば望ましいが、外因性の供給源でさえ許容される。
【００３６】
一旦、骨サンプルが得られると、このサンプルは、ミリング、グラインディング、粉砕、または他の方法で粒状形態へとつぶされる。好ましい実施形態において、粒子は、その最小寸法において７５ミクロンより大きく、より好ましくは１００ミクロンより大きく、そしてより好ましくは１５０ミクロンより大きい。しかし、本発明の好ましい１つの方法は、任意の寸法において１００ミクロン未満、そして潜在的に７５ミクロン未満の粒子さえ含むインプラントを安定化するということに留意すべきである。鉱物質除去後に７５ミクロン以下の粒子は、制限された骨伝導性を有するかまたは骨伝導性を有さないことが知られており、本発明の局面を使用して、これらの小さなサイズの粒子の活性も増強し得る。これらの小さなサイズのＤＢＭを使用する調製物には、少なくとも１つの安定化剤が使用され、これらの安定化剤は、ＤＢＭ内の活性因子が骨誘導性応答を誘発するのを可能にするのに十分長い間、このような小粒子を除去し得る宿主細胞（例えば、マクロファージおよび外来の身体巨細胞）の流入を遅らせる。さらに、またあるいは、拡散障壁は、これらの粒子からの因子の流出を遅らせるために存在する。特定の実施形態において、粒子は、最大寸法で少なくとも直径２００ミクロンである。これらの粒子は、卵形、球形、立方形、円錐形、角錐、楔形などを含む任意の形状であり得る。特定の実施形態において、これらの粒子は、その最大の寸法において直径２００ミクロンである、楔形、ピラミッド、または円錐形である。他の実施形態において、ＤＢＭ組成物は、いくつかの異なるサイズおよび／または形状の粒子の混合物を含み得る。
【００３７】
粒状化（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｉｏｎ）後に、ＤＢＭは、骨から鉱物を除去するために処理される。塩酸は、業界で認められた選り抜きの鉱物質除去剤であり、一方、文献には、ＤＢＭを調製するための方法の数多くの報告が含まれる（例えば、Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ２２（５）：５２４−５３１、１９９９年５月；本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。本発明の目的のために、骨格を提供し、活性骨誘導性因子を含有する任意の材料が、ＤＢＭとみなされる。このＤＢＭは、当該分野で公知の方法により調製され得るか、または過度の実験をすることなく当業者により開発され得る他の方法により調製され得る。いくつかの例では、大きな断片または骨全体でさえ鉱物質除去され得、次いで鉱物質除去後に粒状化される。このようにして調製されたＤＢＭは、本発明の範囲内である。
【００３８】
改善されたＤＢＭ組成物の調製において、ＤＢＭ成分は、グラインディングされるか、または他の方法で処理されて、鉱物質除去の前または後に適切なサイズの粒子にされ得る。特定の実施形態において、粒径は、７５ミクロンより大きく、より好ましくは約１００〜約３０００ミクロンの範囲であり、そして最も好ましくは約２００〜約２０００ミクロンの範囲である。ＤＢＭ成分を所望のサイズにグラインディングした後、この混合物を篩にかけて所望のサイズの粒子を選別し得る。特定の実施形態において、ＤＢＭ粒子は、５０ミクロンの篩を通して篩分けされ得、より好ましくは７５ミクロンの篩、そして最も好ましくは１００ミクロンの篩を通して篩い分けされ得る。
【００３９】
小さなサイズの粒子を細胞取り込みから保護するため、および／または拡散障壁を提供するための１つの特に有用な方法は、これらの粒子をモノリシックの生体吸収性マトリクスに包埋し、次いでこの粒子を含有するモノリシックマトリクスを最も小さな寸法で７０ミクロンより大きい粒子サイズ、好ましくは１００ミクロンより大きい粒子サイズ、最も好ましくは１５０ミクロンより大きなサイズの粒子へと断片化することである。小さいＤＢＭ粒子を包埋するために好ましいマトリクスとしては、生体適合性ポリマーおよび硬化リン酸カルシウムセメントが挙げられる。一般的に、粒状ＤＢＭ／ポリマー重量比は、約１：５〜約１：３の範囲にわたる。リン酸カルシウムの場合、ＤＢＭは、７５重量％まで存在する。モノリスの粒状化は、従来のミリングもしくはグラインディング、または低温ミリングもしくは凍結後の粒状化を使用して達成され得る。１つの好ましい実施形態において、凍結乾燥されたＤＢＭは、吸収性ポリマーに包埋される。第２の好ましい実施形態において、凍結乾燥されたＤＢＭは、当該分野で公知の硬化リン酸カルシウムの１つに包埋される。
【００４０】
（安定化剤）
拡散障壁。拡散障壁は、本発明の処方物内の活性部分への、分解酵素および／または水の拡散を遅くする。含まれるＤＢＭへの拡散を遅らされた酵素は、活性因子をマトリクスから放出する能力を有し得るか、および／またはその活性因子を分解するかもしくは不活化する能力を有し得る。これらはまた、活性因子の移植部位からの拡散を遅らせることにより作用し得る。これらの方法で、障壁は、移植部位における活性因子のより長い耐性期間を提供する。このことは、より高度な種（例えば、ヒト）における骨形成（この場合、骨形成は、より長時間の活性因子の存在を必要とするようである）に特に有用である。
【００４１】
一般的に、拡散障壁として作用するために最も適切な材料は、ＤＢＭまたはとりわけ合成マトリクスと容易に混合されて、ゲル、ペースト、またはパテ状のコンシステンシーを形成するが、いくつかの実施形態では、障壁／マトリクス処方物は、比較的変形しない固体として調製される（例えば、後部外側脊髄融合において使用されるマトリクス調製物用）。好ましい実施形態において、拡散障壁自体は、予測可能な様式で分解して、拡散障壁の非存在下で通常起こるよりも遅い時間に活性因子を脱マスキングする。既知の加水分解速度を有する吸収性ポリマーは、拡散障壁として、および酵素により分解されるポリマーとして有用である。ＤＢＭとよく混ざるリパーゼ感受性の脂質ベースのキャリア（例えば、脂肪酸およびリン脂質）は、特に有用である。特定のＤＢＭの実施形態において、組成物は、ホスファチジルコリンを含まない。いくつかの特に有効な調製物は、骨誘導性因子の制御された脱マスキングにより延長された安定性を提供する。これらの調製物は、一般に、異なる分解時間を有し、同一の活性因子の少なくとも２種の異なる速度の脱マスキングを与える、２つ以上の拡散障壁の使用を含む。
【００４２】
本発明の安定化されたマトリクス／成長因子組成物の調製において有用な生分解性ポリマーとしては、タンパク質（例えば、コラーゲン）および多糖類（例えば、デンプン、改変デンプン、マルトリン（ｍａｌｔｒｉｎ））のような天然ポリマー、ならびにポリ−オルトエステルのような人工の吸収性ポリマーが挙げられる。これらのポリマーは、本発明の成長因子含有組成物と混合された場合に、この組成物中に含まれる活性因子に対する宿主の分解性酵素および／または水の拡散を遅らせて、それによりその中に含まれる活性因子の放出および／または分解を遅らせる。
【００４３】
本発明の組成物中に含まれ得るポリマーとしては、例えば、脂質、多糖類、プロテオグリカン、およびタンパク質のような天然ポリマーが挙げられる。好ましい多糖類としては、デンプン、デキストラン、およびセルロースが挙げられ、そして好ましいタンパク質としては、コラーゲンが挙げられる。デンプン、デキストラン、およびセルロースのような多糖類は、未改変であり得るか、または物理的もしくは化学的に改変されて１つ以上のそれらの特性（例えば、水和状態におけるそれらの特徴、溶解度、分解に対する感受性もしくはインビボでの半減期）に影響を及ぼす。デンプンおよびセルロースのような多糖類は、これらがまた既知の分解速度を有するので魅力的である。一般的に、セルロースは、体内でよりゆっくりと分解し、数週間または数ヶ月のオーダーで分解するが、一方、多くのデンプンおよび脂質調製物は、数時間または数日のオーダーで、急速に分解する。天然状態のデンプンは、２種の多糖類（アミロースおよびアミロペクチン）の混合物である。デンプン分解酵素（例えば、アミラーゼ、ペクチナーゼ；およびβ−グルコシダーゼ）に対する特定のデンプンの感受性は、本発明の処方物を設計する際の考慮すべき重要な点である。当業者は、種々の植物供給源から調製されたデンプンのアミラーゼ感受性を認識しており、そしてこの知識を所望の安定性時間を有する処方物を製造するために適用し得る。好ましいデンプンは、１日あたり１０％、好ましくは１日あたり５０％、そして最も好ましくは１日あたり９０％程度分解する。ぺ口ナーゼおよび／またはアミラーゼによる分解に対してより感受性でないデンプン（アミラーゼ耐性デンプン；Ｓｔａｒｃｈ  Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して、酵素に対してより感受性のデンプンから調製された、改善されたＤＢＭまたは合成成長因子／マトリクス処方物より高い程度まで、インビボでの骨誘導性半減期を最大限に延長し得る。いくつかの改変されたデンプンは、アミラーゼに対する感受性が低く；従って、改変デンプンを含む改変ＤＢＭは、未改変のデンプンを有するＤＢＭと比較してより長い半減期をおそらく有する。デンプンのアミラーゼ感受性に影響を及ぼす１つの好ましい方法は、デンプン脂質の組合せによる。脂質およびデンプンの組合せによりアミラーゼ感受性に影響を及ぼすための手引きは、Ｃｒｏｗｅら「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｙｌｏｓｅ  ｂｙ  Ｆｒｅｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｒｃｈ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３０（８）：２００６−２００８，２０００年８月（本明細書中に参考として援用される）に示される。同様の考察は、脂質およびそれらの分解酵素リパーゼに適用される。リパーゼ分解に対する様々な程度の感受性を有する種々のモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドは、商業的供給源から入手可能である。いくつかの実施形態は、１種以上のポリマー材料（好ましくは生分解性）（例えば、チロシンポリカーボネート、ポリフマレート、チロシンポリアクリレート、およびポリ−オルトエステル（例えば、ポリラクチド、ポリガラクチド、およびこれらのコポリマー））を含む。これらのポリマーは、生分解性であり、そしてこれらの特性は、ポリマーの鎖長もしくは架橋の程度および／またはモノマーの化学構造を変更することにより改変され得る。さらに、コポリマーは、吸収性ポリマーの組合せを使用して調製され得る。
【００４４】
（酵素インヒビター）あるいはまたはさらに、本発明の組成物は、１つ以上の分解インヒビター（宿主生物および／または移植組成物中で見出される増殖因子活性分解剤に対して活性）の添加によって安定化され得る。これらのインヒビターはまた、ＤＢＭ組成物の骨誘導性因子の活性化を担う酵素の活性を阻害し得る。本発明の実施に有用な分解インヒビターまたは活性化インヒビターとしては、例えば、酸プロテアーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター（図６に示される；Ｗｈｉｔｔａｋｅｒら、「Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ」Ｃｅｌｌｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｓ  １７（１）：３−１４も参照のこと；これは、参考として本明細書中に援用される）、システインプロテアーゼインヒビター、グリコナーゼインヒビター、およびグルコシダーゼインヒビターが挙げられ得る。本発明の実施に有用な特定のプロテアーゼインヒビターとしては、例えば、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、アマスタチン−ＨＣｌ、α１−アンチキモトリプシン、アンチトロンビン  ＩＩＩ、α１−アンチトリプシン、４−アミノフェニルメタンスルホニル−フルオライド（ＡＰＭＳＦ）、アルファメニン  Ａ（ａｒｐｈａｍｅｎｉｎｅ  Ａ）、アルファメニン  Ｂ、Ｅ−６４、ベスタチン、ＣＡ−０７４、ＣＡ−０７４−Ｍｅ、カルパインインヒビター  Ｉ、カルパインインヒビター  ＩＩ、カテプシンインヒビター、キモスタチン、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶインヒビター、ジプロチン  Ａ、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、Ｅ−６４、エベラクトン  Ａ（ｅｂｅｌａｃｔｏｎｅ  Ａ）、エベラクトンＢ  、ＥＧＴＡ、エラスタチナール、フォロキシミチン（ｆｏｒｏｘｙｍｉｔｈｉｎｅ）、ヒルジン、ロイヒスチン（ｌｅｕｈｉｓｔｉｎ）、ロイペプチン、α２−マクログロブリン、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチン  Ａ、フェベスチン、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、キモスタチン、ベンズアミジンＨＣｌ、アンチパイン、ε−アミノカプロン酸、Ｎ−エチルマレイミド、トリプシンインヒビター、１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン（ＴＬＣＫ）、１−クロロ−３−トシルアミド−４−フェニル−２−ブタノン（ＴＰＣＫ）、トリプシンインヒビター、ＥＤＴＡナトリウム、およびメタロプロテイナーゼインヒビターのＴＩＭＰクラスが挙げられる。特に有用なインヒビターは、酸性条件下で安定であり、かつ酸性条件下で有効なインヒビターである。当業者によって認識されるように、骨誘導性因子が、ＤＢＭを形成するための骨のプロセシング中に失われなくなるか、分解されなくなればなるほど、一旦ＤＢＭ組成物が移植されると漸増に対してより利用可能になる。
【００４５】
（競合的基質）宿主の分解酵素または活性化酵素に対する競合的基質の使用はまた、ＤＢＭの骨誘導性因子または外因的に添加された増殖因子を安定化するために使用され得る。競合的基質の例としては、ジ−リジンおよびポリ−リジンが挙げられる。ジ−リジンおよび多糖は、グリコシダーゼ、アミラーゼ、および／またはペクチナーゼの競合的基質として使用され得る。競合的基質の立体異性体が特に有用である。
【００４６】
（マスキング実体）特定のマスキング実体は、一般的に、酵素的破壊から単一の実体または実体のクラスを特異的にブロックするために使用される。ブロックされる分解酵素または活性化酵素は、マトリクスに対して内因性であるかまたは外因性であり得る。マスキング実体は、一般的に、マトリクス上に存在するリガンド（それ自体は活性因子であっても活性因子でなくてもよい）に結合する。一旦結合すると、マスキング実体は、１つ以上の活性因子の破壊および／または放出を立体的に妨げる。時間が経つと、マスキング実体は結合しなくなるか、またはそれ自体が分解されてリガンドおよびもしくは分解を受け易い増殖因子から離れるかのいずれかである。拡散障壁は、マトリクスに結合した増殖因子の多くまたは全てに対する分解酵素または活性化酵素のアクセスを妨害することによって、マスキング実体の一般化形態を表す。
【００４７】
（増殖因子結合タンパク質）実質的に全ての細胞外マトリクス増殖因子が、増殖因子の活性を調節する結合タンパク質と関連することが知られている。これらの結合タンパク質の精製調製物が調製され得、そしてＤＢＭ調製物に添加されて、マスキング実体として機能する。代表的な増殖因子結合タンパク質としては、ノギン、コルジン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、フォリスタチン、ＴＧＦ−β結合タンパク質、およびインスリン様増殖因子結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。その結合タンパク質からの増殖因子の放出を誘導するための因子がまた、そのＤＢＭ組成物に添加され得る。特定の実施形態において、増殖因子の放出を誘導することが公知の因子は、生分解性ポリマー中にカプセル化され得、その結果、その因子は、長期間にわたって放出され、それによって、長期間にわたる増殖因子の放出を導く。
【００４８】
（レクチン）レクチンは、糖タンパク質の糖部分に結合し得るタンパク質である。増殖因子は一般的に糖タンパク質であるので、レクチンは、増殖因子に結合するために使用され得、そして活性な増殖因子へのプロテアーゼまたは増殖因子放出酵素のアクセスを、潜在的に遅らせるかまたは阻害する。理想的には、レクチンは、目的の活性な糖タンパク質上の末端糖の同定に従って、選択される。レクチンとしては、膜結合レクチン、Ｉ型レクチン、およびＰ型レクチンが挙げられるが、これらに限定されない。特定のレクチンとしては、ガレクチン、カルシウム依存性レクチン、セレクチン、コレクチン、およびアネキシンが挙げられる。
【００４９】
（抗体）活性な因子に特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、または活性な因子に結合することが公知のタンパク質（上記を参照のこと）に特異的なモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体が、本発明の処方物に添加されて、分解酵素または放出酵素から特定の増殖因子を保護し得る。
【００５０】
あるいは、またはさらに、本発明のＤＢＭ組成物は、分解因子が最適に機能しない条件または分解酵素が効果的に機能しない（例えば、低いｐＨ）条件（例えば、ｐＨ、温度など）への曝露を介して、安定化され得る。
【００５１】
（酵素インヒビター、競合基質、およびマスキング剤の添加）本発明の処方物へのこれらの実体のうちのいずれかの取り込みは、一般的に、当業者に公知の適切な適合性の緩衝液中に目的の分子を懸濁することによって達成される。この緩衝液は、比較的低い液体−対−固体容量比で凍結乾燥マトリクスと混合されて、スラリーを形成する。次いで、このスラリーは凍結乾燥されて、そして所望のＤＢＭ処方物を調製するために使用される。
【００５２】
本発明の１つの予期せぬ特徴は、本発明の酵素インヒビター、競合基質、またはマスキング剤のうちのいずれかの取り込みが、しばしば、マトリクス中に存在する活性な因子への、内因的に存在する分解酵素のアクセスを妨害することによって、ＤＢＭ処方物の貯蔵寿命を改善するというさらなる特徴を有することである。このことは特に、水を含んで調製されるＤＢＭ処方物について当てはまる（例えば、ヒドロゲルキャリア（例えば、ヒアルロン酸またはコラーゲン）または水和澱粉キャリアを有するＤＢＭ処方物）。
【００５３】
ＤＢＭ中で見出される骨誘導性因子の多くは、隠れた形態（ｃｒｙｐｔｉｃ  ｆｏｒｍ）であり、そして骨誘導性であるために「活性化」または「放出」されなければならない。骨誘導性因子の活性化は、コンフォメーション変化、翻訳後修飾、ペプチド切断、三次構造または四次構造の変化、ＤＢＭからの放出、結合タンパク質からの放出などを含み得る。例えば、この因子は、活性になるためにタンパク質分解性切断を必要とする、プレ形態またはプロ形態であり得る。さらに、骨誘導性因子は、結合タンパク質またはＤＢＭのマトリクスのタンパク質と会合し得る。同様のプロセス（例えば、活性因子の分解に関与するタンパク質分解）もまた、これらの因子の活性化に関与し得る。従って、分解を遅延させるために使用され得る上記と同様の方法の全てがまた、活性化速度に影響を与え得る。ＤＢＭ組成物を調製する当業者は、分解速度と活性化速度とのバランスをとり、長い間、移植片からの所望の骨誘導性レベルを達成し得る。さらに、ｐＨ、イオン濃度のような因子、またはタンパク質の機能および／またはタンパク質の折り畳みに影響を与える他の因子が、ＤＢＭ中で見出される骨誘導性因子の活性化に影響を与え得る。これらの因子はまた、その結合タンパク質からの因子の放出をもたらし得る。特定の実施形態において、例えば、ｐＨが因子の活性化において機能する場合、ＤＢＭ組成物は、長い間に分解し、そして副産物として酸を放出するポリマーのような化合物を含み得；それによって、ＤＢＭ組成物内の因子を活性化する。他の実施形態において、生分解性ポリマーは、ＤＢＭ組成物の骨誘導性因子を「活性化」し得る、イオンまたはプロテアーゼを放出し得る。
【００５４】
送達マトリクスからの骨誘導性因子の放出はまた、その骨誘導性において重要であり得る。多くの因子が、上記のような特定の結合タンパク質を介してか、または非特異的な相互作用を介して、ＤＢＭに結合することが見出され得る。この因子の一部は、活性であるためにマトリクスから放出される必要があり得るが、一方、その他の因子は、結合している間だけ活性であり得る。例えば、細胞は、特定の因子によってマトリクスに補充され得、次いで、一旦そうなると、この細胞は、マトリクスに結合した他の因子と相互作用し得る。細胞は、骨生成を誘導するために、マトリクスおよび因子の両方と相互作用する必要があり得る。骨誘導性因子の放出速度は、その因子のマトリクスへの結合またはそれらの結合タンパク質への結合に影響を与える、拡散障壁または薬剤によって、制御され得る。上記のように、特定の実施形態において、因子を放出するかまたは補充された細胞がマトリクスと相互作用することを可能にするように、長い間で分解する拡散障壁が、好ましい。拡散障壁の分解もまた、プロテアーゼがＤＢＭ移植片へと骨誘導性因子を活性化および／または放出することを可能にし得る。
【００５５】
当業者によって認識されるように、ＤＢＭ組成物は、骨誘導性因子の分解、活性化および放出のバランスをとるように調製され得、所望の骨誘導性活性を有する組成物を作製する。ＤＢＭ組成物の骨誘導性は、特定の適用、特定の移植片部位、または特定の患者に適切であり得る。例えば、特定の適用では、数週間〜数ヶ月の範囲の長期間にわたる骨誘導性を必要とし；一方、他の適用では、数日〜数週間の骨誘導性のみを必要とし得る。当業者は、所望の骨誘導性時間プロフィールを有するＤＢＭ組成物を調製し得る。
【００５６】
（増強についての試験）
本発明はまた、適切な安定化剤のスクリーニングのための簡単なインビトロ試験を提供する。生分解性安定化剤のありまたはなしで調製されたＤＢＭは、擬態の生理学的条件（例えば、ｐＨ７．４、生理学的生理食塩水）下で、ＤＢＭのタンパク質構成成分のいくつかまたは全てを分解し得ることが既知の酵素または酵素の組み合わせに曝される。このうち最も頻繁にあるのは、トリプシン、パパイン、ペプチダーゼなどのプロテアーゼである。マトリクスの分解またはマトリクス成分の分解についての証拠は、２つの調製物の間で比較される。分解プロセスを遅延させる材料は、さらなる試験のために良好な候補であるとみなされる。分解の好ましい指標としては、ＴＧＦ−βおよび／またはＩＧＦ分解の免疫学的検出が挙げられる。上記に示した酵素に加えて、コラゲナーゼまたは酵素の組み合わせならびにグリコシダーゼのような他の酵素もまた、使用され得る。これに関して特に有用なのは、血清または組織抽出物の天然の分解活性である。これらの条件下で、ＤＢＭ中に存在する特定のマーカータンパク質は、ラジオイムノアッセイもしくはウエスタンブロットを使用するゲル電気泳動のような免疫学的方法、または当該分野で公知の他の分析方法によって、追跡され得る。
【００５７】
上記のアッセイにおける候補安定化因子の同定後、その候補安定化因子を含むＤＢＭ処方物は、本明細書中のいずれかに記載の骨誘導性アッセイにおいて試験される。
【００５８】
（骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｅｒ））
改善されたＤＢＭに、他の骨誘導剤が添加され得る。これらの薬剤は、活性化形態または不活性化形態で添加され得る。これらの薬剤は、本発明の材料の調製の間、いつでも添加され得る。例えば、骨誘導因子は、鉱物質除去工程の後であって、かつ安定化剤の添加前に添加され得、その結果、その添加される骨誘導剤は、一旦移植されると外因性分解酵素から保護される。いくつかの実施形態において、ＤＢＭは骨誘導剤を含む溶液中で凍結乾燥される。特定の他の好ましい実施形態において、骨誘導剤は、水和した鉱物質除去骨マトリクス上に付着され、そして自由に溶解性ではなくなる。他の例において、骨誘導剤は、安定化剤添加後の改善されたＤＢＭに添加され、その結果、その骨誘導剤は、ＤＢＭの移植直後に利用可能になる。
【００５９】
骨誘導剤としては、骨の形成を導くかまたは骨の形成を増強する任意の薬剤を含む。骨誘導剤は、任意の様式でこれらを行い得、例えば、この薬剤は、骨形成の原因となる細胞の補充を導く、この薬剤は、引き続き鉱物質除去を受け得るマトリクスの分泌を導き得る、この因子は、骨の再吸収の低下を導き得る、などである。特に好ましい骨誘導剤としては、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、および脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）が挙げられる。１つの好ましい実施形態（実施例１２）において、この誘導剤は、ＤＢＭまたはキャリアへのその誘導剤の結合を促進するアミノ酸配列を含むように、遺伝子操作される。Ｓｅｂａｌｄら、ＰＣＴ／ＥＰ００／００６３７（これは、本明細書中に参考として援用される）は、ＤＢＭとの使用に適した、例示的に操作された増殖因子の生成を記載する。
【００６０】
（処方物）
本発明の改善された骨形成組成物は、特定の使用のために処方され得る。この処方物は、ＤＢＭ調製物の物理的特性、生物学的特性、または化学的特性を変更するために使用され得る。医師は、損傷の型、損傷の部位、患者の健康、感染の危険性などの因子を考慮にいれて、特定の適用のために必要とされる処方物を容易に決定し得る。
【００６１】
従って、本発明の組成物は、選択された再吸収／骨誘導性速度の低下を有するように調製され得るか、またはなお、移植片の異なる部位において異なる速度を有するように、調製され得る。例えば、処方プロセスは、特定の安定化剤の選択、そのような薬剤の量の選択と組み合わせて、特定のサイズまたは組成のＤＢＭ粒子の選択を含み得る。骨誘導因子が比較的一定の量で所定の期間にわたって活性である組成物を提供することが望ましくあり得るが、これは一例に過ぎない。より長い半減期を有する因子を含むＤＢＭ組成物は、あまり生分解性ではないポリマーを用いてか、または大量（例えば、より厚いコーティング）のポリマー化合物を用いて、調製され得る。あるいは、またはさらに、粒子サイズは、本発明のＤＢＭ組成物の半減期を決定するのに重要であり得る。特定の好ましい実施形態において、本発明の処方物は、粒子の混合物（各々が、異なる半減期を有する）を含み得る。このような混合物は、その損傷の必要性に依存して、数日〜数週間〜数ヶ月の範囲の長期間にわたって、骨誘導性因子の安定または可能な非マスキングを提供し得る。このような組成物は、コラーゲンスポンジ上の１０μｇのｒｈＢＭＰを用いた処置によって誘導される骨増殖に匹敵する、そして好ましくは、１００μｇのｒｈＢＭＰ、そして最も好ましくは１〜１０ｍｇのｒｈＢＭＰに匹敵する、ヒト患者における骨増殖を刺激するように処方され得る。
【００６２】
ＤＢＭの変形および粘性のような物理的特性もまた、特定の臨床適用に依存して選択され得る。改善されたＤＢＭの粒子は、他の材料または因子と混合されて、移植片の他の特徴を改善し得る。例えば、改善されたＤＢＭ材料は、他の薬剤と混合されて、創傷治癒を改善し得る。これらの薬剤としては、薬物、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、溶媒、化合物、生物学的分子が挙げられ得る。
【００６３】
ＤＢＭ（または本発明のＤＢＭ材料）の粒子はまた、種々の形状および形態に形成され得る。この粒子は、棒状、紐状、シート状、ウィーブ状、固形状、円錐状、平円盤状、線維状、くさび状などに形成され得る。特定の実施形態において、ＤＢＭ組成物中の粒子の形状およびサイズは、骨誘導性の時間経過に影響を与える。例えば、円錐形またはくさび形において、先細端が、ＤＢＭ組成物の移植直後に骨誘導性を引き起こし、一方、より厚い末端は、治癒プロセスの後期（例えば、数時間〜数日〜数週間後）に骨誘導性を導く。特定の実施形態において、この粒子は、その最も広い寸法にわたって、２ｍｍよりも長い長さ、１．５ｍｍよりも長い長さ、１ｍｍよりも長い長さ、このましくは５００μｍよりも長い長さ、そして最も好ましくは２００μｍよりも長い長さを有する。さらに、より大きい粒子サイズが、より小さい粒子よりも長期間にわたって骨形成を誘導する。異なる特徴（例えば、組成、サイズ、形状）の粒子が、これらの異なる形状および形態の形成に使用され得る。例えば、シート状のＤＢＭにおいて、長い半減期粒子の層は、より短い半減期粒子の層の間に交互に存在し得る（例えば、米国特許第５，８９９，９３９号、これは、本明細書中に参考として援用される）。ウィーブ状において、短い半減期の粒子から構成される鎖が、より長い半減期の鎖と一緒に編まれ得る。
【００６４】
本発明の１つの好ましい実施形態において、線維状ＤＢＭは、米国特許第５，５０７，８１３号（これは、参考として本明細書中に援用される）に記載されるように、そして以下の実施例１３および１４（埋め込まれたマトリクス構成）に記載されるように、マトリクス形態に成形される。次いで、この成形されたＤＢＭは、拡散障壁型マトリクス内に埋め込まれ、その結果、このマトリクスの一部は、マトリクス材料から離れて露出されたままになる。特に好ましいブロッキングマトリクスは、澱粉、ホスファチジルコリン、チロシンポリカーボネート、チロシンポリアリーレート、ポリラクチド、ポリガラクチド、または他の再吸収可能なポリマーもしくはコポリマーである。これらのマトリクスからこの方法で調製されたデバイスは、即時骨誘導性特徴および長期持続骨誘導性特徴の組み合わせを有し、そして特に、ヒト後外側脊椎固定指標における骨塊形成の促進に有用である。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、予め選択された３次元形状を有する本発明のＤＢＭ組成物は、ＤＢＭの個々の層の反復した適用によって、例えば、Ｃｉｍａら、米国特許第５，４９０，９６２号；および同第５，５１８，６８０号（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）；ならびにＳａｃｈｓら、米国特許第５，８０７，４３７号（これは、参考として本明細書中に援用される）によって記載されるように、３−Ｄプリンティングによって、調製される。異なる層が、個々の安定化されたＤＢＭ調製物を含み得るか、あるいは複数層の沈着後に、安定化剤を用いて処理したＤＢＭ層を含み得る。
【００６６】
改善された本発明のＤＢＭ材料の調製プロセスにおいて、材料は、完全に無菌的に生成され得るか、または任意の感染因子（例えば、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎）を排除するように滅菌され得る。滅菌は、抗生物質、照射、化学滅菌（例えば、エチレンジオキシド）、または熱滅菌を用いて、達成され得る。脱脂、超音波処理、および凍結乾燥のようなＤＢＭ調製の分野で公知の他の方法もまた、改善されたＤＢＭを調製するのに使用され得る。鉱物質除去した骨の生物学的活性は、最も最終的な滅菌プロセスによって有害に影響されることが知られているので、本発明の組成物を滅菌する場合、注意を払わなければならない。好ましい実施形態において、本明細書中に記載されるＤＢＭ組成物は、無菌で調製されるか、または実施例１１に記載されるように滅菌される。
【００６７】
（適用）
本発明の改善された骨形成組成物は、骨の損傷の治癒を促進するために使用され得る。この組成物は、任意の型の損傷において身体の任意の骨において使用され得る。改善されたＤＢＭ組成物は、コラーゲンスポンジに対して、類似したタイミングかつ１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは２００μｇ〜１ｍｇに類似したレベルのｒｈＢＭＰで、ヒト患者中で骨を生成するように設計される。例えば、本発明の材料を用いて修復され得る特定の骨は、篩骨、前頭骨、鼻骨、後頭骨、頭頂骨、側頭骨、下顎骨、上顎骨、頬骨、きぬた骨、あぶみ骨、つち骨、頸椎、胸椎、腰椎、仙骨、胸骨、肋骨、鎖骨、肩甲骨、上腕骨、尺骨、橈骨、手根骨、中手骨、指節骨、回腸、坐骨、恥骨、骨盤、大腿骨、膝蓋骨、脛骨、腓骨、踵骨、距骨、中足骨が挙げられる。改善されたＤＢＭを用いた処置を受け易い損傷の型としては、損傷から生じる骨欠損、手術、感染、悪性腫瘍もしくは発生奇形の経過の間に生じる骨欠損が挙げられる。本発明の材料は、整形外科手順、神経外科手順、美容外科手順および口腔および顎顔面外科手順において有用であり得、例えば、以下において有用である：単純骨折および開放骨折の修復および癒着不能の、外部固定および内部固定、関節再構築（例えば、関節固定）、一般的な関節形成術、股関節部のカップ関節形成術（ｃｕｐ  ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ）、大腿部のおよび上腕骨の頭部置換、大腿部の頭部表面置換および間接全体の置換、脊椎固定術および内固定を含む脊柱の修復、腫瘍の手術（例えば、欠損の充填）、椎間板切除術、椎弓切除術、脊髄腫瘍の切除、前頸および胸の手術、脊髄損傷の修復、脊柱側弯症、脊柱前弯症、および脊柱後弯の処置、骨折の顎間固定、おとがい形成術、側頭下顎の間接の置換、歯槽隆線の増強および再構築、骨移植片のインレー、移植物の配置および修正、空洞の持ち上げなど。
【００６８】
本発明のＤＢＭ組成物はまた、薬物送達デバイスとして使用され得る。特定の好ましい実施形態において、本発明のＤＢＭ組成物との会合は、関連する生物学的活性薬剤の半減期を増大させる。特に好ましい本発明の薬物送達デバイスは、骨誘導増殖因子を送達するために使用される。送達される他の好ましい薬剤としては、創傷治癒を促進する因子または薬剤が挙げられる。しかし、本発明の組成物は、あるいはまたはさらに、他の薬学的薬剤（例えば、抗生物質、抗新生物形成剤、増殖因子、造血因子、栄養素など）を送達するために使用され得る。本発明のＤＢＭ組成物を用いて送達され得る生体活性薬剤としては、非コラーゲンタンパク質が挙げられる（例えば、オステオポンチン、オステオネクチン、骨シアロタンパク質（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、フィブロネクチン、ラミニン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、プロテオグリカン、デコリン、プロテオグリカン、β−グリカン、バイグリカン、アグレカン、ベリスカン（ｖｅｒｉｓｃａｎ）、テナスシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、マトリクスｇｌａタンパク質ヒアルロナン；細胞；アミノ酸；ペプチド；無機元素；無機化合物；有機金属化合物；タンパク質合成の補因子；酵素の補因子；ビタミン、ホルモン；免疫系の可溶性成分および不溶性成分；短縮形態を含む、可溶性レセプターおよび不溶性レセプター；短縮形態を含む、可溶性結合リガンド、不溶性結合リガンドおよび細胞表面結合リガンド；ケモカイン；インターロイキン；抗原；エンドサイトーシスによって取り込まれる生体活性化合物；組織または組織断片；内分泌組織；コラゲナーゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼなどのような酵素；実質細胞を伴う、ポリマー性細胞足場；脈管形成性薬物、生体活性薬剤を含むポリマー性キャリア；カプセル化生体活性薬剤；時間放出形態の生体活性薬剤；コラーゲン格子；抗原性薬剤；細胞骨格薬剤；軟骨断片；軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、間葉性幹細胞などの生細胞；組織移植物；細胞接着因子；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、増殖因子結合タンパク質（例えば、インスリン様増殖因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６）；脈管形成性薬剤；骨促進剤；サイトカイン；インターロイキン；遺伝子材料；骨促進作用をコードする遺伝子；骨促進作用をコードする遺伝子を含む細胞；人為的に遺伝子改変された細胞；外的に拡大された自家移植片細胞または異種移植片細胞；増殖ホルモン（例えば、ソマトトロピン）；骨消化剤；抗腫瘍剤；フィブロネクチン；細胞誘引剤および細胞接着剤；免疫抑制剤；骨再吸収インヒビターおよび骨再吸収刺激因子；有糸分裂促進因子；第２メッセンジャー分子を阻害および刺激する生体活性因子；細胞接着分子（例えば、細胞マトリクスおよび細胞−細胞接着分子）；２次メッセンジャー；間葉性幹細胞上の細胞表面決定基に特異的なモノクローナル���体；間葉性幹細胞上の細胞表面決定基に特異的なモノクローナル抗体の一部；凝固因子；ポリヌクレオチド；ならびにこれらの組み合わせ。ＤＢＭ組成物中に含まれる生体活性薬剤の量は、広範に変化し得、そして送達される薬剤、投与部位、患者の生理学的状態などの因子に依存する。特定の場合に決定される最適のレベルは、移植片の意図される使用に基づく。
【００６９】
例えば、本発明のＤＢＭ組成物は、以下の薬物からなる群より選択される１以上の化合物を含むように調製され得る：シナプスおよび神経効果器接合部位で作用する薬物（例えば、アセチルコリン、メタコリン、ピロカルピン、アトロピン、スコポラミン、フィゾスチグミン、スクシニルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドパミン、ドブタミン、イソプロテレノール、アルブテロール、プロプラノロール、セロトニン）；中枢神経系に対して作用する薬物（例えば、クロナゼパム、ジアゼパム、ロラゼパム、ベンゾカイン、ブピバカイン、リドカイン、テトラカイン、ロピバカイン、アミトリプチリン、フルオキセチン、パロキセチン、バルプロ酸、カルバマゼピン、ブロモクリプチン、モルヒネ、フェンタニール、ナルトレキソン、ナロキソン）；炎症応答を調節する薬物（例えば、アスピリン、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、ステロイド、クロモリンナトリウム、テオフィリン）；腎機能および／または心血管機能に影響を与える薬物（例えば、フロセミド、サイアザイド、アミロライド、スピロノラクトン、カプトプリル、エナラプリル、リジノプリル、ジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル、ジゴキシン、イソルジル（ｉｓｏｒｄｉｌ）、ドブタミン、リドカイン、キニジン、アデノシン、ジギタリス、メバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、メバロネート）；胃腸管機能に影響を与える薬物（例えば、オメプラゾール、スクラルファート）；抗生物質（例えば、テトラサイクリン、クリンダマイシン、アンホテリシンＢ、キニーネ、メチシリン、バンコマイシン、ペニシリンＧ、アモキシリン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、ドキシサイクリン、アシクロビル、ジドブジン（ＡＺＴ）、ｄｄＣ、ｄｄＩ、リバビリン、セファクロール、セファレキシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、クロラムフェニコール、イソニアジド、フルコナゾール、アマンタジン、インターフェロン）；抗癌剤（例えば、シクロホスファミド、メトトレキサート、フルオロウラシル、シタラビン、メルカプトプリン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ヒドロキシウレア、プレドニゾン、タモキシフェン、シスプラチン、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ））；免疫調節剤（例えば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、シクロスポリン、ＦＫ５０６、アザチオプリン、ステロイド）；血液および／または血液形成器官に対して作用する薬物（例えば、インターロイキン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン、ビタミン、鉄、銅、ビタミンＢ１２、葉酸、ヘパリン、ワルファリン、クマリン）；ホルモン（例えば、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ＴＳＨ、ＡＣＴＨ、インスリン、ＦＳＨ、ＣＧ、ソマトスタチン、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、サイロキシン、トリヨードサイロニン）；ホルモンアンタゴニスト；カルシウム沈着および骨の交替に影響を与える薬剤（例えば、カルシウム、ホスフェート、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ビタ��ンＤ、ビスホスホネート、カルシトニン、フッ化物）、ビタミン（例えば、リボフラビン、ニコチン酸、ピリドキシン、パントテン酸、ビオチン、コリン、イノシトール、カルニチン、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ）、遺伝子治療剤（例えば、ウイルスベクター、核酸保有リポソーム、ＤＮＡ−タンパク質結合体、アンチセンス剤）；または標的化剤のような他の薬剤など。
【００７０】
特定の実施形態において、送達されるべき薬剤は、移植されるマトリクスに吸着されるか、さもなければ移植されるマトリクスに会合する。この薬剤は、特異的相互作用もしくは非特異的相互作用；または共有結合的相互作用もしくは非共有結合的相互作用を介して、ＤＢＭ組成物のマトリクスに会合し得る。特異的相互作用の例としては、リガンドとレセプターとの間の相互作用、エピトープと抗体との間の相互作用などが挙げられる。非特異的相互作用の例としては、疎水性相互作用、静電相互作用、磁気相互作用、双極子相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などが挙げられる。特定の実施形態において、この薬剤は、リンカーを使用してマトリクスに結合され、その結果、この薬剤は、そのレセプターまたはインビボでの作用部位に自由に会合する。特定の好ましい実施形態において、送達されるべき薬剤は、化学的化合物（例えば、ＤＢＭ組成物のマトリクスによって認識されるペプチド）に結合され得る。別の実施形態において、送達されるべき薬剤は、ＤＢＭ組成物のマトリクス内に見出されるエピトープを認識する抗体またはそのフラグメントに結合される。特に好ましい実施形態において、この薬剤は、ＢＭＰ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、増殖因子または血管形成因子である。特定の実施形態において、少なくとも２つの生理活性薬剤が、ＤＢＭ組成物に結合される。他の実施形態において、少なくとも３つの生理活性薬剤が、ＤＢＭ組成物に結合される。
【００７１】
本明細書中に記載される増殖因子安定化ストラテジーはまた、合成マトリクス（例えば、セラミックス、骨セメントまたはポリマー）と会合した増殖因子に直接適用され得る。これらの実施形態において、１種、２種またはそれ以上の増殖因子が、合成マトリクスに会合する。増殖因子は、係留マトリクス（例えば、ＢＭＰのような増殖因子に会合した非晶性または結晶性のリン酸カルシウム）に会合し、この組成物は、拡散障壁（例えば、アミロース、脂肪酸または吸収性ポリマー）の存在下で調製されるか、または少なくとも２種以上のこれらの安定化剤と組み合わせて調製される。好ましい実施形態において、結晶性の乏しいリン酸カルシウムは、デンプン／レシチン拡散障壁と混合された増殖因子と会合する。
【００７２】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の実施例を考慮して、さらに理解される。これらの実施例は、本発明の特定の特別の実施形態を例示することが意図されるが、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例】
【００７３】
（実施例１：鉱物質除去骨マトリクス（ＤＢＭ）の調製）
ＤＢＭを、当該分野で公知の任意の方法または技術を使用して調製し得る（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  ２２（５）：５２４−５３１、１９９９年５月（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。以下は、Ｇｌｏｗａｃｋｉら「Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｎｅ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ」、Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １２（２）：２３３−２４１、１９８５年４月（本明細書中で参考として援用される）に由来する、鉱物質を除去した骨を調製するための例示的手順である。ドナー由来の骨または骨断片を清浄化して、いずれの付着した骨膜、筋肉、結合組織、腱、靭帯およびコラーゲンをも除去する。海綿質を、高密度の皮質骨から分離し得、そして大きい破片として処理する。皮質骨を、小片に切断して、引き続く洗浄および抽出の効力を改善し得る。大きい動物由来のより高密度の骨は、１ｃｍ未満のチップを生成するために、凍結され、そして叩かれる必要があり得る。得られた骨断片を、冷脱イオン水で完全に洗浄して、骨髄および軟組織を除去する。
【００７４】
次いで、清浄化した骨を、無水エタノールを頻繁に交換して、少なくとも１時間抽出する。代表的には、骨１００ｇ当たり合計４リットルのエタノールを使用する。次いで、この骨を、換気フードにおいて、無水ジエチルエーテルを頻繁に交換して、１時間抽出する。代表的には、骨１００ｇ当たり２リットルのエーテルを使用する。この骨を、これらのエタノールおよびエーテルの抽出によって脱水し、そして室温で保存し得る。
【００７５】
次いで、脱水した骨を凍結させ、次いで液体窒素衝撃製粉器で粉砕する。次いで、粉砕した骨を篩にかけて、７５〜２５０ミクロン、２５０〜４５０ミクロンおよび４５０ミクロンより大きい画分にする。次いで、この骨粒子画分を、０．５Ｍの塩酸（５０ｍｌ／ｇ）を用いて３時間、室温または４℃で、過熱を防ぐための断熱材を有する磁気スターラー上で鉱物質除去する。より大きい骨チップおよびブロックを、０．５Ｍの塩酸を頻繁に交換して、４℃で完全に抽出する。この鉱物質除去プロセスを、放射線透過写真術でか、灰化によってか、または非脱灰組織学的技術（フォン・コッサ染色）によって、モニタリングし得る。酸および遊離鉱物を、洗浄水のｐＨが、水のｐＨと一致するまで、冷脱イオン水で洗浄して除去する。洗浄水は、骨のより大きい粒子およびチップからデカントされ得るが；この洗浄水は、より微細な粒子から、遠心分離によって除去されなければならない。この洗浄工程は、出発骨粒子１グラム当たり、約５００ｍｌの水を必要とする。
【００７６】
鉱物質除去した骨粉末を、出発骨粒子１グラム当たり２００ｍｌのエタノールを使用して、１時間にわたって無水エタノールを交換して抽出する。この材料を、換気フードにおいて、出発骨粒子１グラム当たり１００ｍｌのエーテルを使用して、１時間にわたって無水エチルエーテルを交換して抽出する。最後に交換したエーテルを除去した後、鉱物質除去した骨粉末を、全ての残留エーテルが蒸発するまで、フード内に一晩置く。この粒子は、無臭で純白で分離しているはずである。鉱物質除去した骨材料を滅菌するために、これを、冷エチレンオキシドで処理し得るか、または照射し得る。
【００７７】
調製したＤＢＭのバイオアベイラビリティーを試験するために、２５ｍｇの材料を、剃毛し、麻酔した２８日齢のオスＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ＣＤラットにおいて、２つの胸郭皮下ポケットの各々に移植する。次いで、移植した試料を、移植の数日後に回収し得、そして調査し得る。誘導した組織の組成を、組織形態学的分析および生化学的技術によって、定量し得る。
【００７８】
（実施例２：ＤＢＭを調製する別の方法）
ＤＢＭを、当該分野で公知の任意の方法または技術を使用して調製し得る（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  ２２（５）：５２４−５３１、１９９９年５月（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００７９】
鉱物質除去した骨マトリクスを、長骨から調製した。骨幹領域を清浄化して、いずれの付着軟組織をも除去し、次いで製粉器で粉砕した。粉砕した材料を篩にかけて、直径約１００μｍ〜５００μｍの粒子を有する粉末を得た。この粒状の骨を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および０．６Ｎ  ＨＣｌの溶液を室温で使用し、その後新鮮な０．６Ｎ  ＨＣｌ溶液を使用して、約１（重量）％未満の残留カルシウムまで鉱物質除去した。この粉末材料を、ｐＨが４．０より高くなるまで、脱イオン水でリンスした。次いで、これを、７０％エタノール中に浸漬して、５％未満の残留水分まで凍結乾燥した。
【００８０】
（実施例３：好ましい本発明のＤＢＭ組成物の処方）
キャリアを、約６．５％（ｗ／ｗ）の改変デンプン（Ｂ９８０）を、約３０％（ｗ／ｗ）のモルトデキストリン（ｍａｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎ）（Ｍ１８０）および約６３．５％（ｗ／ｗ）の滅菌脱イオン水と混合することによって調製した。この混合物を７０℃まで加熱して、予めゼラチン化した。次いで、この予めゼラチン化した混合物を、蒸気オートクレーブに移し、そして１２４℃で２時間、滅菌／ゼラチン化した。次いで、得られた混合物は、プディングの粘稠度を有した。次いで、冷却したキャリア混合物を、ＤＢＭ（実施例２から）および水と、それぞれ約２４：１４：９の比で合わせた。次いで、安定化したＤＢＭを、胸腺欠損ラットに移植して、骨誘導性を評価した。
【００８１】
（代替的実施形態）事前のゼラチン化の時点または最終組成物混合の間に、水の代わりに水溶液（約２０％ｗ／ｖ）として、グリセロールのような他の成分を添加し、この成分は、受容可能な取り扱い特徴を有することが見出された。
【００８２】
（実施例４：安定化したＤＢＭ）
以下の表は、本発明の種々のＤＢＭ組成物の、異なる安定化剤を用いた調製を記載する。全ての調製物を、無菌的に調製し、そして全ての調製物を、ＤＢＭの粒子、線維または固体形態材料と共に使用し得る。
【００８３】
【表１】
2005505351.tif 000003
2005505351.tif 000004
【００８４】
（実施例５：保護剤のインビトロ評価）
安定化剤（または種々の濃度および／もしくは処方の安定化剤）を含むかまたは含まない、キャリアを有するＤＢＭサンプルを調製し、そして血清または個々の酵素（例えば、パパイン）と共にｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中でインキュベートし、そして、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間および２４時間にわたって、３７℃でインキュベートした。次いで、サンプルを抽出して、増殖因子および他のマトリクスタンパク質の濃度を、Ｕｅｌａｎｄら（「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｂｏｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｃｒｏｍｅｇａｌｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９９９年１月；８４（１）：１２３−７（本明細書中で参考として援用される））に概説されるように決定した。サンプルを、Ｕｅｌａｎｄら（１９９９）に記載され、そして本明細書中で参考として援用されるように、ネイティブまたは変性ＳＤＳゲル電気泳動、その後のウエスタンブロット分析またはウエスタンリガンドブロットのために調製した（Ｕｅｌａｎｄら（「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｂｏｎｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｃｒｏｍｅｇａｌｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  １９９９年１月；８４（１）：１２３−７；およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．（編）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第二版、２００２年、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（これらの各々は、本明細書中で参考として援用される））。
【００８５】
安定化剤を含まないサンプルよりも、増殖因子または他のタンパク質の少ない変性を示す、安定化剤を含むサンプルを、次いで、胸腺欠損ラットアッセイにおいて、７日目、１４日目、２１日目および２８日目に、骨誘導について試験した。抽出サンプルをまた、Ｚｈａｎｇら（１９９７）に記載されるような組織培養アッセイにおいて、生物学的活性について迅速に試験し得る。
【００８６】
（実施例６：筋間移植による骨増殖の誘導についての時間経過の決定）
本実施例は、７日目、１４日目、２８日目および３５日目の時点で、ＤＢＭ基剤粉末（実施例１）と比較した場合の、本発明の材料を使用する筋間部位における骨増殖の誘導の時間経過を特徴付ける。本実施例は、Ｅｄｗａｒｄｓら、「Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｂｏｎｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｒａｔ  Ｍｏｄｅｌ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ３５７：２１９−２２８、１９９８年１２月（本明細書中で参考として援用される）に見出されるＤＢＭの骨誘導を評価するためのラットモデルに類似する。
【００８７】
この研究を、ヒト組織移植物に応答する種間不適合の可能性を最小化するために、胸腺欠損（ヌード）ラットにおいて実行した。後肢筋間部位を、異所的骨誘導特性の最初の決定のために使用した。なぜなら、この部位は、天然には骨を含まないからである。
【００８８】
５０〜７５ｇの範囲のメスのホモ接合体ｒｎｕ／ｒｎｕラットを、Ｈａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から獲得した。これらのラットを、手術の前に順応の目的で１週間収容した。滅菌水およびげっ歯類食餌を任意に提供して、調査を通じて滅菌マイクロアイソレータケージを使用した。
【００８９】
（移植物の配置）単一筋間（ＩＭ）部位を、３０匹のラットの各後肢において利用した。全ての動物について共通の陽性コントロールを提供するために、ラットＤＢＭ粉末の単一の４０ｍｇサンプルを、各ラットの左胸筋（ＬＰ）の筋内に、筋内で配置した。動物を、手術手順後に、通常に活動させた。
【００９０】
（移植物材料）ＤＢＭおよび試験材料を、室温で維持した。８個の１４５ｍｇの試験サンプルおよび８個の４０ｍｇのＤＢＭ粉末サンプルを、７日、１４日および２８日の移植時間について試験した。各々６個のサンプルを３５日目に試験した。４０ｍｇのＤＢＭ粉末サンプルを、１００μｌの滅菌ＡＬＬＯＰＲＥＰＴＭ（Ｏｓｔｅｔｏｔｅｃｈ、Ｅａｔｏｎｔｏｗｎ、ＮＪ）で再水和した。各サンプルを、１ｍｌの鈍く切断したシリンジ中にパックした。単一の動物が同じ移植物を２個受けないように、移植を無作為化した。
【００９１】
（麻酔）ラットを、ケタミン（２００ｍｇ）、キシラジン（４００ｍｇ）および生理食塩水（１０ｍｌ）の混合物で麻酔した。投薬量は３．５ｍｌ／ｋｇ体重であり、腹腔内投与した。
【００９２】
（手順）無菌手術手順を、層状空気流フードにおいて実行した。１ｃｍの皮膚切開を、側方アプローチを使用して各後肢の上部に作製し、そして皮膚を、鈍い解剖によって筋肉から分離した。筋肉平面に配置された表面切開によって、鋏の先端の挿入が可能になった。鈍い解剖を、この線から筋内に深く実行して、移植された材料を保持するためのポケットを作製した。単一の縫合を、筋肉ポケットの近くに挿入し、そして皮膚を金属クリップで閉じた。
【００９３】
左胸筋における試料の移植は、１ｃｍの皮膚切開を胸部上に作製すること、筋肉の鈍い解剖でのポケットの作製、そして鈍いシリンジを使用するラットＤＢＭ粉末の配置を含んだ。単一の縫合を筋肉ポケットの近くに挿入し、そして皮膚を金属クリップで閉じる。
【００９４】
ラットを、示された移植時間後に、ＣＯ２で安楽死させた。移植材料を、動悸によって位置決めし、鈍い解剖によって取り出し、そして注意深いタイミングで周りの組織を清浄化して除いた。移植物の型を見せられていない観察者が、移植物材料の巨視的評価を行った。色、血管分布、硬さおよび完全性を、以下の表に概説したスキームに従ってスコア付けした。（最も強い応答についての最も高いスコアは４であり、一方、骨誘導能をほとんどまたは全く示さない試料はスコア０である）。このモデルを用いる実験は、目盛の両極端でのみ、移植片性能の視覚的観察と組織学的観察との間の高い相関を示した。
【００９５】
【表２】
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2005505351.tif 000006
【００９６】
（組織学）取り出した材料を、中性の緩衝化ホルマリン中で固定した。ホルマリンでの固定後、サンプルを、１０％蟻酸中で脱灰し、段階的アルコール中で脱水し、ＪＢ−４（グリコールメタクリレート、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）中に包埋し、そして切片化した。５ミクロンの切片を、トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡によって評価した。
【００９７】
これらの外植片を、半定量的方法を使用して組織学的に評価した。簡潔には、５点の目盛に基づく数的スコアを、小瘤の各切片について割り当てた：４＝７５％より多くが新規骨形成に関与した；３＝５１％〜７５％が新規骨形成に関与した；２＝２６％〜５０％が新規骨形成に関与した；１＝１〜２５％の外植片が新規骨形成に関与した；そして０＝軟骨または軟骨細胞、活性な骨芽細胞、類骨、新たに形成されそして鉱化した骨、ならびに／または骨髄および関連の脂肪細胞の存在を含めて、軟骨内骨形成プロセスについての証拠なし。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
組織学的分析後、平均スコアを、各材料の型について算定した。この動物モデルを用いた以前の実験に基づいて、各群に、平均組織学的スコアに基づいて、骨誘導能の評価を割り当てた。
【０１００】
（結果）このプロトコルを、コントロールＧＰＳ１−２基剤ＤＢＭ粉末と比較して、試験材料（実施例３に記載されるデンプン安定化剤を有するＤＢＭ）で追試した。７日目の時点で、デンプン安定化剤を有するＤＢＭおよびＧＰＳ１−２粉末は、それぞれ、０．９±０．４および１．０±０の組織学的スコアで、同じレベルの誘導を達成した。全てのサンプルは、いくつかの軟骨細胞の存在を伴う、過剰細胞性であった。１４日目の時点で、デンプン安定化剤を有するＤＢＭは、ＧＰＳ１−２粉末よりも高い誘導レベルを達成し、組織学的スコアは、それぞれ、３．６±０．５および２．９±１．０であった。軟骨細胞のクラスターが、デンプン安定化剤を有するＤＢＭサンプル全てにおいて存在した。この時点で、粉末サンプルの半分はまた、軟骨細胞のクラスターまたは散在する細胞を有した。２８日目の時点で、軟骨細胞は、デンプン安定化剤を有するＤＢＭまたはＧＰＳ１−２粉末のいずれにおいても、ほとんど存在しなかった。ほとんどのサンプルは、この段階までに成熟した骨を示した。いくつかの組織浸潤が、デンプン安定化剤を有するＤＢＭサンプルのうち３つ、および粉末サンプルのうち２つにおいて注目された。デンプン安定化剤を有するＤＢＭサンプルおよび粉末サンプルのうち２つについての組織学的スコア。デンプン安定化剤を有するＤＢＭについての組織学的スコアは、１４日後にも一定のままであったが、粉末についての組織学的スコアは、１４日目と３５日目との間で、２．９±１．０から３．９±０．４に改善され、３５日目の時点ではこれらのサンプルについて注目される有意な変化はなかった。
【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
（結論）  本研究の結果は、デンプン安定化剤を含むＤＢＭについての誘導速度が、１４日目時点まで増加し、タイムコースの最後までずっと高いままであったことを示した。ＧＰＳ１−２粉末は、１４日目時点で比較的遅い速度での誘導を示したが、２８日目まではデンプン安定化剤サンプルを含むＤＢＭと同じであった。この時点で、両方の産物の骨誘導能力は、ほぼ同じであり、平均組織学スコアにおいて差異はたった０．３であり、３５日目時点で同じままであった。デンプン安定化剤サンプルを含むＤＢＭは、粉末コントロールと比較して速い骨形成速度を示した。存在する軟骨細胞の数の増加の定性的評価は、デンプン安定化剤サンプルを含むＤＢＭにおける骨形成増加を示した。
【０１０３】
（実施例７：骨欠損を治癒する際の本発明の組成物の効力の評価）
（背景情報）  細分化した（ｍｏｒｓｅｌｉｚｅｄ）自己癌性骨（ＡＢＧ）は、整形外科的臨床状況において骨移植が必要とされる場合に、骨誘導のための「ゴールドスタンダード」であると長い間みなされている。不運なことに、利用可能なＡＢＧの量は制限されており、採取手順に関連して、少なくとも５％の外科的合併症発生率が存在する。鉱物質除去（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ）骨マトリクス（ＤＢＭ）は、ＡＢＧと等しい治癒能力〜ＡＢＧより優れた治癒能力を有することが示されている。鉱物質除去骨マトリクスに対する主な不利点のうちの１つは、そのマトリクスが、欠損の３次元空間をしばしば保持しないことである。従って、欠損部位の浸潤は、周囲の筋組織から生じる。試験物質（デンプン安定化剤を含むＤＢＭ）は、３次元空間が維持されたように半固体構成を提供する。
【０１０４】
ウサギ尺骨欠損モデルが、多数のプロジェクトにおいて改変および使用されて、骨誘導（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ）増殖因子および骨誘導（ｏｓｔｅｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｅ）増殖因子の効力、ならびに自己骨移植片に対する置換物としてのマトリクスが試験されている。この研究の目的は、以前の処方物およびＡＢＧと比較して、新規なＤＢＭ処方物移植物質の骨誘導能力を評価することであった。
【０１０５】
（材料および方法）
（研究設計の要旨）
（Ａ．ウサギ両側２ｃｍ尺骨欠損）
（処理群）
１．ＤＢＭ＋デンプン
２．デンプンキャリア単独
３．自己移植片（組織学的データを比較のために使用した）。
【０１０６】
（外科手順）  ６ヶ月齢の雄性ニュージーランド白色ウサギを使用した。２．０ｃｍの連結されない欠損を、すべてのウサギの両側尺骨において外科的に作製した。完全な骨膜切開（ｐｅｒｉｏｓｔｅｃｔｏｍｙ）、徹底的な欠損の洗浄、および部分的な骨幹洗浄の後、開放外科技術を介して、（試験群に従って）各欠損に移植片を移植した。損傷を、主に層状に閉鎖した。試験群を、下記表に列挙する。麻酔が達成された後、両方の前肢を剃毛し、そのウサギを仰臥位（脚が上向きの位置）に調製した。両方の尺骨の上に長手方向切開（３〜４ｃｍ）を行い、その尺骨の骨幹（中軸）位置を露出させた。尺手根（手首）関節から１ｃｍにて遠位骨切り術を行い、尺手根関節から３．０ｃｍにて近位骨切り術を行って、２ｃｍの欠損を作製した。これらの骨切り術は、高速バーを用いて作製した。生じた骨幹骨の緩い塊を、インタクトなその骨膜とともに切開した。ウサギ前肢の非常に接着性の骨間膜に起因して、内固定は必要なかった。滅菌生理食塩水で洗浄して、血液、骨、および骨髄のレムナントを除去した後、移植物質をこの欠損中に配置した。深在筋膜層を、３−０クロム縫合糸を用いて、欠損の周囲の包みとして閉鎖した。皮膚を、中断したナイロン縫合糸を用いて閉鎖した。手術後の包帯／副子を適用し、手術後４日目に除去した。
【０１０７】
（Ｘ線写真）  前後方向のＸ線写真を手術直後に得、３週目、６週目、９週目および１２週目にさらにＸ線写真を撮影した。６週間目または１２週間目のいずれかに、軟部組織を切開および洗浄した後に、両方の脚の高分解能（Ｆａｘｉｔｒｏｎ）Ｘ線写真を撮影した。３人の詳細を知らない（ｂｌｉｎｄｅｄ）観察者が、骨形成および骨リモデリングについて各時点で評価する。
【０１０８】
（結果）  ３週間目のインビボＸ線写真は、デンプンベース処方物において骨形成が明らかであることを示した（図１）。６週目にて、小柱形成が観察され、そしてデンプンベース処方物を用いた臨界（ｃｒｉｔｉｃａｌ）サイズの欠損のほぼ完全な架橋が観察された（図２）。
【０１０９】
（結論）  このデンプンベース処方物は、骨形成が発生する速度を改善するようであった。
【０１１０】
（実施例８）  以下の表は、実施例３のデンプンベース拡散障壁ＤＢＭ処方物についての生体適合性および安全性の研究の結果をまとめる。
【０１１１】
下記表に列挙されるすべての研究（研究番号１２を除く）は、ＩＳＯ  ９００１を認証されかつＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）により完全に認定された、ＮＡＭＳＡ（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）によって実施された。ＦＤＡガイドラインに従った。ＮＡＭＳＡは、ＵＳＤＡに登録されている。ＮＡＭＳＡに提出されたすべてのサンプルを、有効なデータを確実にするに必要な実験室品質ガイドラインに従って試験した。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
（デンプン安定化剤を含むＤＢＭの生体適合性）  クリアランス研究によって、３０日未満での移植部位からのデンプン安定化剤キャリアを含むＤＢＭの除去を確認した。これにより、デンプン安定化剤キャリアを含むＤＢＭを、ＩＳＯ  １０９９３生体適合性研究についてのクラスＢ組織／骨移植片カテゴリーとして分類した。クラスＢ組織／骨移植片カテゴリーについて考慮するための４つの評価試験が、ＩＳＯガイドラインに列挙されている。それらは、細胞傷害性、感作、移植、および遺伝毒性である。急性全身性毒性もまた、特定の場合にて適用され得る。示唆される４つの試験に加えて、合計９つのさらなる安全性研究、生体適合性研究、および効力研究を実施した（実施例７を含む）。これらの研究を、上記表に要約する。
【０１１４】
（局所反応）
（Ａ．急性皮内注射研究および急性筋肉移植研究を実施した）。皮内研究は、生理食塩水およびデンプン安定化剤の綿実油抽出物の両方を含んだ。ウサギＤＢＭを用いて調製した、デンプン安定化剤を含むＤＢＭを、筋肉移植のために使用した。デンプン安定化剤を含むＤＢＭは、両方の研究において最小の刺激しか生じず、これは、筋肉移植におけるポジティブコントロールと比較した場合に非刺激物質であると見なされ、皮内抽出物として投与された場合、無視できるという第１の指標特徴付けを有した。デンプンキャリアを含まない筋内適用されたＤＢＭは、中程度の刺激物質であることが見出された。
【０１１５】
（Ｂ．細胞傷害性および遺伝毒性）  デンプン安定化剤の抽出物は、細胞溶解を誘導する能力も細菌変異原性を誘導する能力も示さなかった。細胞溶解研究は、デンプン安定化剤を含むＤＢＭの生理食塩水抽出物を使用した。遺伝毒性研究は、２つの細菌種（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉ）に対して試験した生理食塩水抽出物およびＤＭＳＯ抽出物の両方を使用した。
【０１１６】
（Ｃ．溶血および発熱性）  デンプン安定化剤の生理食塩水抽出物は、非発熱性および非溶血性であると見なされた。デンプン安定化剤を含むＤＢＭの生理食塩水抽出物を注射したウサギにおける体温は、発熱性を示さず、その抽出物は、プールした抗凝固ウサギ血液に添加した場合、溶血指標０を生じた。
【０１１７】
（Ｄ．感作）  キャリアの抽出物は、遅延皮膚接触感作を示さなかった。この研究は、キャリアの生理食塩水抽出物および綿実油抽出物を使用した。モルモットに、これらの抽出物の皮内注射を与え、回復期間の後、抽出物質のパッチで引き続いてチャレンジした。
【０１１８】
（Ｅ．デンプン安定化剤を含むＤＢＭの全身安全性／毒性）  デンプン安定化剤を含むＤＢＭ（ウサギＤＢＭ）を脊椎傍筋肉に筋肉内移植し（高用量を皮下移植もした、下記を参照のこと）、そして動物を６０日間モニターした。研究において、毒性の証拠は観察されなかった。これらの研究において、デンプン安定化剤を含むＤＢＭ（約１．１ｇｍ／ｃｃ）の約３．５ｃｃ（低用量）または１７．５ｃｃ（高用量）のいずれかを、ウサギに移植した。ｇｍ／ｋｇベースでの用量（約１．３ｇｍ／ｋｇ；約６．４１ｇｍ／ｋｇ）は、それぞれ、５．６×および２８×の平均ヒト移植用量（１５ｃｃ／７０ｋｇまたは０．２３ｇｍ／ｋｇ）とほぼ等価である。高用量の場合、脊椎傍移植部位における空間的制限に起因して、デンプン安定化剤を含むＤＢＭを３．５ｃｃのみ、脊椎傍に移植し、残りの１４ｃｃを、背胸郭に皮下移植した。
【０１１９】
試験動物についての剖検の結果は、いかなる処置効果も示さなかった。血液化学および尿検査の値は、すべて正常な範囲内にあった。但し、デンプン安定化剤を含むＤＢＭに応答する異所性骨形成の誘導に起因して増加することが予測された、血清アルカリホスファターゼを除く。
【０１２０】
（実施例９：試験物質の骨誘導性のアッセイ）
（目的）  本実施例の目的は、種々の可能性のある防御因子の特徴を評価することであり、特に、骨誘導性に対して負の影響を有さない防御因子を同定することである。好ましくは、その防御因子は、取扱い易く、洗浄可能であり、非毒性であり、分解性であり、そして成形可能である（好ましいコンシステンシーは、配管工のパテに似ている）。
【０１２１】
（方法および材料）  本研究は、無胸腺（ヌード）ラットモデルを使用して行う。好ましくは、単一のＤＢＭ調製物を、すべての処方物において使用する。可能性のある防御因子物質を、照射によって滅菌する。種々の試験組成物およびコントロールＤＢＭを、動物に、１種の物質あたり６〜８部位に移植する。１つの骨部位あたり４０ｍｇのＤＢＭを含む各試験組成物を、各動物の後肢に両側性筋肉内移植する。その体積は、キャリアの性質に依存して変化し得る。
【０１２２】
（結果）  このプロトコルを、異なる４つの試験組成物およびコントロールＤＢＭに適用した。試験組成物を、３０匹の動物に移植した。ＤＢＭを、８匹の個々の動物に移植した。防御因子を、オートクレーブによって滅菌した。以下の防御因子溶液を調製した。
【０１２３】
【表６】
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【０１２４】
以下の試験組成物処方物を調製した。
【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
さらに、どの動物にもポジティブコントロールとして、ＲＤＢＭを左胸筋に配置した。
【０１２７】
（結果）
【０１２８】
【表８】
2005505351.tif 000013
【０１２９】
（結論）どの試験組成物も、骨誘導性に対して負の影響を有さなかった。
【０１３０】
（実施例１０：ウサギモデルにおける骨誘導）
（導入および方法）  ５５匹の雄性ニュージーランド白色ウサギを、３つの処理群に割当てた。試験物質を、実施例３に記載されるように調製した。低用量処理群（ｎ＝２０）に割当てた動物には、プロトコルが特定された手順に従って、右脊椎傍筋に試験物質３．５ｍｌを与えた。高用量処理群に割り当てられた動物（ｎ＝２０）に、右脊椎傍筋に試験物質３．５ｍｌを与え、背胸郭領域の各側面の皮下組織に試験物質７．０ｍｌを与えた。コントロール処理群（ｎ＝１５）に割当てた動物に、右脊椎傍筋にコントロール物質（再水和ＤＢＭ粉末）３．５ｍｌを移植した。移植後７日目、１４日目、および２８日目に、低用量処理群および高用量処理群からの４匹動物およびコントロール群からの３匹の動物を、人道的に屠殺した。移植後６０日目に、残りの動物を屠殺した（低用量試験群および高用量試験群からの８匹およびコントロール処理群からの６匹）。移植部位を、各ウサギから収集し、そして１０％中性緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ）中に固定した。移植研究後６０日の間隔からの試験移植部位およびコントロール移植部位を、十分なホルマリン固定後３日間、カルシウム除去溶液中に配置した。すべての組織サンプルを、標準的組織学的技術を使用して処理し、５μｍで切片化し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１３１】
（結果）  試験物質について皮下移植部位および筋肉内移植部位にて、そしてコントロールＤＢＭについて筋肉内部位にて（移植後２８日目に皮下移植は観察されなかった）、骨誘導が着目された。新しい骨を、試験物質およびコントロール物質の鉱物質除去骨成分よりもわずかにエオシン好性であることによって、組織学的に特徴付けられた。新しい小柱を、ふくらんだ（ｐｌｕｍｐ）（活性）骨芽細胞、骨形成前駆体、類骨、およびほとんど鉱化していない類骨によって並べた。多くの場合、存在する骨細胞および骨リモデリングのいくらかの証拠が存在した。いくつかの場合、軟骨が存在した。移植後６０日目に、新しい骨を同様に特徴付けたが、厚さの増加が関係付けられ、リモデリング、および造血組織を含むしばしば緩い繊維血管支質（骨髄にて観察されるのと形態学的に同じ）が、小柱間で観察された。主観的に、試験物質は、コントロール物質よりも筋肉移植部位において、高い程度の骨形成を有した。存在する軟骨の量は、移植部位間で変動した。この変動は、個々の移植片についての微小環境における差異におそらく起因した。新しい骨形成に関与する前駆細胞は、多能性であり、特定の微小環境条件下で、繊維組織、軟骨、または骨を形成する。移植部位内の軟骨は、軟骨内骨化し、骨になる。皮下組織内に移植された試験物質と、筋肉内に移植された試験物質との間の、組織応答、骨形成、または軟骨形成におけるいかなる差異も、その２つの組織間の解剖学的差異および微小環境差異に起因した。骨形成は、移植２８日後に、試験物質移植部位とコントロール物質移植部位との両方にて着目された。リモデリングの量ならびにゆるい繊維血管支質および造血組織の存在により示されるような）骨の量および成熟度は、試験物質について６０日目で大いに増加した。
【０１３２】
【表９】
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【０１３３】
上記の表における評点は、０〜４段階に基づき、０は、新しい（生存可能な）骨／軟骨によって占有される移植片領域が０％であり；１は、新しい（生存可能な）骨／軟骨によって占有される移植片領域が１〜２５％であり；２は、新しい（生存可能な）骨／軟骨によって占有される移植片領域が２６〜５０％であり；３は、新しい（生存可能な）骨／軟骨によって占有される移植片領域が５１〜７５％であり；そして４は、新しい（生存可能な）骨／軟骨によって占有される移植片領域が７６〜１００％である。
【０１３４】
（実施例１１：最終滅菌）
本実施例は、本発明の調製物における骨誘導性の損失を最小化する、最終滅菌法を記載する。
【０１３５】
本発明のＤＢＭ調製物は、ヒト組織からクリーンルーム環境において生成される。完成された移植片は、個々のトレーパッケージに配置される。
【０１３６】
各トレーは、Ａｕｄｉｏｎｖａｃシール装置（Ａｕｄｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｂ．Ｖ．，Ｗｅｅｓｐ−Ｈｏｌｌａｎｄ）に配置され、この装置には、５０／５０の水素／アルゴンガスを含むシリンダが備えられる。トレーパッケージをシールする前に、これらを、脱気し、そしてこのガス混合物を２回充填する。シール後、このガス混合物は、各トレーパッケージに残る。
【０１３７】
次いで、これらのパッケージされた移植片は、シールされたパッケージであり、次いで、コバルト６０供給源からの１５ＫＧｙγ照射で処理し、移植片の生体負荷量を所望のレベルに減少させる。
【０１３８】
（実施例１２：ＢＭＰおよび／または他の増殖因子に対するＤＢＭ調製物の骨誘導性の比較）
本明細書中に示される一連の研究において、ハイブリッド組換えヒトＢＭＰ（ハイブリッドｒｈＢＭＰ、ｈｒｈＢＭＰ）を調製した。これらは、野生型ＢＭＰと比較して強力なヘパリン結合エピトープをそのＮ末端に有する。このヘパリン結合部位は、ＥＣＭへの結合を増強し、インビボでの適切な細胞との相互作用の能力を最大化するように、ＢＭＰの局所的滞留時間を増加する（Ｋｕｂｌｅｒら、「ＥＨＢＭＰ−２．Ｉｎｉｔｉａｌ  ＢＭＰ  ａｎａｌｏｇ  ｗｉｔｈ  ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」Ｍｕｎｄ  Ｋｉｅｆｅｒ  Ｇｅｓｉｃｈｔｓｃｈｉｒ．３  補遺１：Ｓ１３４−９，１９９９；本明細書中で参考として援用される）。
【０１３９】
これらの研究の目的は、ハイブリッドｒｈＢＭＰ−２ｘ（ｈｒｈＢＭＰ−２ｘ）の骨誘導性能力を、野生型ＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）の能力と比較して、ｈｒｈＢＭＰ−２ｘを、鉱物質除去された骨基質または失活（不活化）させた骨基質と合わせた場合に、相乗的な能力が存在するか否かを決定することであった。
【０１４０】
（方法）
ハイブリッドｒｈＢＭＰ−２ｘの骨誘導活性を評価するために、１μｇ、５μｇおよび１０μｇのｈｒｈＢＭＰ−２ｘを、２００ｍｇの骨誘導性ヒト鉱物質除去化骨線維（ＤＢＦ）基質上に配置し、２１日間、無胸腺症ラットに異所的に移植した（ｎ＝６／グループ）。処理したＤＢＭと未処理のＤＢＭとの間の差異が明らかになるように、骨誘導能力が、通常観察される能力の約５０％になるように、ＤＢＦ基質を調製した。コントロールは、骨誘導性ヒトＤＢＦ基質単独、不活化させたヒトＤＢＦ基質単独（「失活させた」、ＧｕＨＣｌ抽出した）、ならびに１μｇ、５μｇおよび１０μｇのｈｒｈＢＭＰ−２ｘと組み合わせた不活化させたヒトＤＢＦ、ならびに５μｇの野生型ＢＭＰ−２と組み合わせた活性基質および不活化させた基質からなった。全てのサンプルを、５点スコアリング系（スコア４＝７５％を超える、骨形成の徴候を有する移植片の断面積、３＝５１〜７５％、２＝２６〜５０％、１＝１〜２５％、０＝骨形成なし）（Ｅｄｗａｒｄｓ  ＪＴ，Ｄｉｅｇｍａｎｎ  ＭＨ，Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ  ＮＬ．Ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．３５７：２１９−２８，１９９８；本明細書中で参考として援用される）を使用して、組織学的に測定した。
【０１４１】
（結果）
これらの方法の節に記載した組織学的スコアリングは、モルフォゲンを含むサンプルのほとんどをスコアするのに不十分であった。失活させたサンプル単独（不活性ＤＢＦ基質）は、０をスコアし；失活させたサンプル＋１μｇのｈｒｈＢＭＰ−２ｘは、０．８±０．４をスコアし；ＤＢＦ基質は、２．５±０．８をスコアし；他の全てのサンプルは、４をスコアした。
【０１４２】
小節の発生の程度をさらに識別するために、定量的なスコアリング系を考案し、サンプルの血管分布およびサンプル中に残る残留ＤＢＦを決定した。以下のスケールを使用した：
血管分布（観血的な骨髄）：なし＝０；微量＝１；少数の血管、小さい血管＝２；中程度の細胞性および血管サイズ＝３；広範な細胞性、大きい血管＝４
残留ＤＢＦ：なし＝０；微量＝１；低度＝２；中程度＝３；広範＝４。
【０１４３】
ｈｒｈＢＭＰ−２ｘで処理した活性ＤＢＦ基質は、残留ＤＢＭがほとんど存在しない、より分化した小節を生じ、広範な新しい骨形成および高度に発達した血管系は、最も高い濃度のモルファゲンでさえ、失活させたグループにおいて明らかでなかった。失活させたキャリアは、骨増殖の支持について、コラーゲンスポンジ（本質的に不活性な三次元構造）と比較され得る。野生型ｒｈＢＭＰ−２は、十分に発達した血管系および骨髄を生じたが、残留骨含量は、活性なＤＢＦ対応物より、はるかに高かった。
【０１４４】
（結論）
これらの結果は、改変されたｈｒｈＢＭＰ−２ｘは、その対応する野生型よりも、より強力な骨誘導特性を有することを示す。骨形成は、加速され、そして誘導された骨組織は、より高密度な構造を示した。相乗的な結果は、ｈｒｈＢＭＰ−２ｘを活性ＤＢＦ基質と組み合わせた場合に得られ、失活させたＤＢＦと組み合わせた場合には得られなかった。これらの知見の最も可能性のある説明は、移植部位でのｈｒｈＢＭＰ−２ｘのより長い半減期である。この部位での増殖因子の残留性は、異所的な骨形成部位において生じる周辺組織への浸出よりもむしろ、局所的な細胞とのより長い相互作用時間を可能にする。活性な基質は、外因的に添加された増殖因子の骨誘導特性を実質的に増加し、これはおそらく、鉱物質除去した骨に既に存在する多くの増殖因子の組み合わせの相互作用に起因する（Ｋｕｂｌｅｒら、「Ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｒａｔ  ＢＭＰ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」，Ｊ．Ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒｇ．１９（７）：２８３−８，１９９１；Ｋｕｂｌｅｒら、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＢＭＰ」，Ｍｕｎｄ  Ｋｉｅｆｅｒ  Ｇｅｓｉｃｈｔｓｃｈｉｒ．４  補遺  ２：Ｓ４６５−９，２０００；これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）。
【０１４５】
（実施例１３：規定した寸法を有する種特異的骨移植片を作製するプロセス）
ヒト、アカゲザル、イヌおよびウサギ由来の長骨を使用して、種特異的な固体形成移植片基質を調製した。骨を、無菌的に洗浄した。皮質骨を、米国特許第５，６０７，２６９号（本明細書中で参考として援用される）に記載の骨粉砕装置で処理して、約６５ｇの細長い骨線維を生成した。この細長い骨線維を、リアクタに置き、そして０．６Ｎ  ＨＣｌ＋２０〜２０００ｐｐｍ  非イオン性界面活性剤溶液中に、約５〜１０分間浸漬させた。ＨＣｌ／界面活性剤のドレイン後、０．６Ｎ  ＨＣｌを、骨総量１ｇ当たり１５ｍｌで、その細長い骨線維に沿ってリアクタ中に導入した。反応を、約４０〜５０分間進行させた。ふるいに掛けてドレインした後、得られた鉱物質除去した細長い骨線維を、骨総量１ｇ当たり１５ｍｌの滅菌脱イオン水で、１５分間隔で交換しながら、３回リンスした。水のドレイン後、骨線維を、アルコールで覆い、そして少なくとも３０分間浸漬させた。次いで、アルコールをドレインし、そして骨繊維を、滅菌脱イオン水でリンスした。次いで、骨線維を、乾燥骨線維１ｇ当たり約４．５ｍｌのグリセロールおよび乾燥骨線維１ｇ当たり約１０．５ｍｌの滅菌脱イオン水の混合物と、少なくとも６０分間接触させた。過剰な液体をドレインし、そして得られた液体組成物（約１１％（ｗ／ｖ）の鉱物質除去した細長い骨線維を含有する）を、複数の突出しているへこみ（約１．５ｃｍ×３．５ｃｍの幅および長さ、ならびに４ｍｍの深さ）を有するふたを備えた、約１１ｃｍ×１１ｃｍの型に移し、へこみが、線維内にはめ込み、可能な限り低い圧力をその組成物に付与するように、ふたを、穏やかに型の上に置いた。突出部の寸法は、目的の動物モデルに必要とされる骨移植片のサイズに特異的に作製され得る。得られた切片は、４．５ｃｍの長さ、２．５ｃｍの幅、および約８ｍｍの高さ（すなわち、厚さ）という寸法を有し、へこみの寸法は、３．５ｃｍの長さ、１ｃｍの幅、および４ｍｍの深さであった。次いで、型を、４６℃で４時間オーブンに置いた。次いで、組成物を、−７０℃で一晩凍結させ、次いで、４８時間凍結乾燥した。凍結乾燥後、型を取り外し、そしてスポンジ様に形成された組成物を、へこみを含む個々の小片に切断した。
【０１４６】
得られた組成物は、目に見える開いた孔を備える、明らかな連続性の三次元構造を有する、粘着性で、可撓性で、スポンジ様であり、ふたの突出部によって作製されたへこみを備える規定された形状を有し、使用前に再水和の必要がなく、迅速に水和可能であり、そして一旦流体で湿らされとその形状を維持し、保存のために凍結は必要とされなかった。
【０１４７】
（実施例１４：部分的に包埋されたＤＢＭ／ポリマー複合材を製造するための方法）
以下の方法を使用して、再吸収可能なポリマー中に部分的に包埋された、鉱物質除去された骨基質を生成する。このように部分的に包埋されたＤＢＭは、包埋されていないＤＢＭ部分から初期レベルの骨誘導性を提供し、次いで、ポリマーが時間に伴い分解されるにつれて、分解されていない活性なＤＢＭの連続的な供給源を提供する。この方法は、チロシンポリカーボネートＤＴ（Ｉｎｔｅｇｒａ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびポリ（Ｌ−ラクチド−コ−Ｄ，Ｌ−ラクチド  ７０／３０）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）中にＤＢＭを包埋するために、特によく適している。このデバイスは、外側後脊椎固定における特定の適用を有し、ここで、このデバイスは、横突間の骨形成を促進するために傍溝内に配置され得る。この方法は、上記実施例１０に記載の方法によって生成される適切に成形された基質を半分包埋するために使用され得るか、または、鉱物質除去された皮質骨線維の収集体（ここで、線維は、約１インチ長に切断され、そして互いに実質的に平行な線維の長軸を有する円柱状の束状に整列される）が、この方法によって部分的に包埋され得る。
【０１４８】
約１／２インチの高さの、ステンレス鋼の調節可能な直径環状クランプを使用して、鉱物質除去された骨の下部と共に、その土台ポリマーを保持する。線維の束または基質サンプルを、クランプで中心に集め、土台ポリマー材料を受けるためにクランプの内側周辺に空間を残す。次いで、ポリマーが融解されるまで、クランプの裏側に熱を適用する。次いで、ポリマーをなお流動可能にしながら、クランプを締め（直径を減少させる）、線維の束の下部にポリマーを流れさせる。次いで、ポリマー材料を冷却し、クランプを取り外し、固体ポリマーに線維の下部を包埋する。
【０１４９】
好ましい実施形態において、再吸収可能なポリマーを使用する。ポリマーを適切な粘性にまで融解する温度を使用し、鉱物質除去された骨の中または骨の周辺に、その融解されたポリマーを流す。最も頻繁には、使用される温度は、そのポリマーのガラス転移温度よりも約０℃〜約１５℃高い。６０℃より高い温度で有意な時間維持した場合、ＤＢＭの生物学的活性は低下し得るので、好ましいポリマーは、１００℃より低い、好ましくは８０℃より低い、そして最も好ましくは６０℃より低い、ガラス転移温度を有する。チロシンポリカーボネートＤＴについて、１０分間、１１５℃の温度を使用する。ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−Ｄ，Ｌ−ラクチド  ７０／３０）については、７０℃が適切である。この方法はまた、ポリマーの流動を容易にするために、熱の代わりに適切なポリマー溶媒を使用する場合に、適用可能である。
【０１５０】
（実施例１５：長期の半減期の拡散障壁との安定化されたＤＢＭの混合物を含むＤＢＭ調製物）
以下の２つの鉱物質除去された骨処方物を調製した：
鉱物質除去された骨処方物＃１。ＤＢＭを、鉱物質除去された約１５０〜１０００ミクロンの骨粒子から調製し、凍結乾燥し、次いで、１００％グリセロールで予め膨張させ、過剰のグリセロールを、濾過によって除去する。ラクトマー９−１（Ｌａｃｔｏｍｅｒ  ９−１）（カプロラクトングリコリドおよびステアロイル乳酸カルシウム（Ｔｙｃｏ  Ｉｎｃ．Ｎｏｒｔｈ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）を、１０：１（重量で）で、ＤＢＭと共に、均質なまでに混合する。この混合物を、７０℃の型中で融解成形した。冷却後、ポリマーＤＢＭモノリスを、低温ミル中で粉砕し、そして約１３０〜１２００ミクロンの粒子サイズへと、ふるいに掛ける。
【０１５１】
鉱物質除去された骨処方物＃２。レシチンベースのＤＢＭ調製物を、２８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００２）からの、Ｈａｎら、「Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｌｅｃｉｔｈｉｎ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  ＤＢＭ  ｏｎ  Ｂｏｎｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｕｄｅ  Ｒａｔｓ」要約（本明細書中で参考として援用される）の方法に従って調製する。手短に言うと、Ｐｏｓｐｈｏｌｉｐｏｎ  ９０Ｇ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌｅｃｉｔｈｉｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を、４０％  レシチン：６０％  ＤＢＭ〜６０％レシチン：４０％ＤＢＭの重量比で、鉱物質除去された骨と混合する。
【０１５２】
第３のデンプンベースの鉱物質除去された骨を、鉱物質除去された骨の全量の１／３のみを、デンプンキャリアに添加したことを除いて、実施例２に従って調製する。残りの２／３の鉱物質除去された骨の代わりに、本実施例の鉱物質除去された骨処方物＃１および＃２を等量添加する。次いで、この組成物を混合して、移植片調製物を形成する。
【０１５３】
（実施例１６：競合基材）
ポリ−Ｌ−リジンを、セリンプロテアーゼ酵素についての競合的インヒビターとして使用し得る。本実施例は、ポリ−Ｌ−リジンを組み込む鉱物質除去された骨の調製物を記載する。ポリ−Ｌ−リジン（１０〜３００ｋＤ）を、約１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の範囲で、１ｍＭ  ＨＣＬ中で調製する。鉱物質除去された骨を調製する。最終洗浄後、この鉱物質除去された骨を、５つの濃度のうちの１つの濃度のポリ−Ｌ−リジン溶液と混合し、厚いスラリー（約０．３３ｇｍ／ｍＬ）を形成する。この鉱物質除去された骨／基材混合物を、乾燥するまで、凍結乾燥する。このように調製された鉱物質除去された骨を、直接使用するか、またはキャリアを用いて処方する。
【０１５４】
（実施例１７：脂肪酸／デンプン拡散障壁基質）
鉱物質除去された骨を、実施例１４に記載されるように調製する。ここでは、ポリマー／ＤＢＭ調製物を省略し、等量のレシチン調製物で置き換えるという改変を行う。
【０１５５】
（実施例１８：無胸腺症ラットモデルにおけるＤＢＭ組成物の骨誘導）
本実施例の目的は、異所性の骨誘導性２８日移植片モデル（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．３５７：２１９−２２８，１９９８；Ｕｒｉｓｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５０：８９３−８９９，１９６５；これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）を使用して、ＤＢＭ組成物の骨誘導性能力を評価することである。このＤＢＭ組成物は、ＤＢＭ線維と組み合わせて、立方体形状のＤＢＭ粒子を含む（ＵＳＳＮ６０／１５９，７７４（１９９９年１０月１５日出願）；ＷＯ０２３２３４８（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。軟骨細胞が、この２８日移植後のＤＢＭの立方体中の主な細胞型である。本研究は、移植時間を４９日にまで広げ、鉱物質除去された皮質立方体内における継続的な骨リモデリングの証拠を確認する。
【０１５６】
材料および方法：約６００ｍｇの重さの等量のクランチサンプルを、２．５ｍｌの先端を鈍化したシリンジ中にパッケージした。１８匹の雌性無胸腺症ラットを、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得た。手術時の動物の体重は、１８６ｇと２３６ｇとの間の範囲にあった。２８日移植片および４９日移植片を評価した。
【０１５７】
移植部位を、組織学的に評価した。線維成分を、立方体と独立してスコアし、新しい骨形成に関与する線維領域の割合に基づく、５点の半定量的尺度に基づいて、数値スコアを割り当てた。立方体部分には、新しい骨形成に関与する中心ハヴァース系の割合に基づいて、スコアを割り当てた。
【０１５８】
結果：新しい骨、骨髄および脂肪細胞が、小節の線維部分の全体にわたって存在した。軟骨細胞は、全ての時点で中心ハヴァース系内に存在した。２８日の時点で、線維部分についての平均骨誘導性スコアは、線維部分について３．１±０．５であり、ハヴァース管の８９．８±５．８％が、立方体部分で占有されていた。立方体は、新しい骨または骨髄によって取り囲まれ、軟骨細胞のくぼみが、立方体内および立方体間に存在した。
【０１５９】
４９日の時点での平均骨誘導性スコアは、線維部分について３．５±０．５であり、ハヴァース管の９８．１±２．４％が、立方体部分を占有した。２８日目のサンプルとの顕著な差異としては、線維部分のほぼ完全なリモデリング、軟骨細胞の大きいくぼみ、ならびに立方体内の新しい骨の領域および立方体の縁でのリモデリングが挙げられる。
【０１６０】
結論：皮質立方体は、ＤＢＭ組成物の骨誘導性において重要な役割を果たす。立方体は、皮質骨から切断され、そして中心ハヴァース管は、天然の多孔性を提供する。２８日後に残留する軟骨は、骨形成の遅延と一致し、これはおそらく、血管成長の遅延に起因する。４９日目では、立方体は、線維よりもより遅くではあるが、リモデリングの徴候を示した。骨のリモデリングは、内部表面と比較して、外部表面でより速く発生した。立方体は、治癒応答中の正常な骨形成に必要とされる、重要な支持体基質および骨誘導性シグナルを提供し続ける。
【０１６１】
（実施例１９：本発明の組成物についての操作特徴の確立）
以下の実施例は、成形可能な骨誘導性移植片組成物を生成するための、本発明の安定化剤および／または拡散障壁への鉱物質除去された骨の添加を記載する。本実施例は、キャリアをＤＢＭと混合する、適切なキャリア粘性の確立、および競合組成物の最終的な操作特性の調整を記載する。
【０１６２】
キャリア粘性。本発明のデンプンベースの組成物を、約５％〜約４５％の範囲の種々のデンプン  対  水の比を用いて、実施例３に記載のように調製した。デンプン粉末を水と混合し、そしてこの混合物をオートクレーブし、滅菌した水和デンプン調製物を生成した。次いで、このオートクレーブしたデンプンを、粘性について試験した。５０００〜２００００ｓＣｐの範囲内の粘性を有するデンプン処方物を使用して、ＤＢＭ組成物を調製した。
【０１６３】
Ｒｈｅｏｃａｌｃ３２ソフトウエアによって支持される、適切なサンプルアダプター（スピンドル＃２７を備える、ＳＳＡ２７／１３ＲＰＹ  ｓ／ｎ  ＲＰ６６１６２）を備えるＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ（ＨＢ−ＤＶ  ＩＩＩ＋）を使用して、デンプンキャリアの粘性を決定した。
【０１６４】
キャリアおよびＤＢＭの混合。約５０００ｓＣｐｉの粘性を有するデンプンキャリアを、種々の量のＤＢＭ（約１０重量％〜約５０重量％のＤＢＭ）と混合し、塑像用粘土またはパン生地のコンシステンシーと同様のコンシステンシーを有する組成物を生成した。より少ない量のＤＢＭを使用する変更は、粘着性で、なおほぼ流動可能な生成物を有する、組成物を生じた。より多くのＤＢＭを使用する処方は、非常に固いコンシステンシーを有する生成物を生じ、高レベルのＤＢＭを有する処方物は、混合中に砕けやすくなり、破砕された。次いで、これらの処方物を、以下に記載するように、操作について定量的に評価した。
【０１６５】
組成物操作特性についてのアッセイ。以下の方法を使用して、本発明の組成物の操作特性におけるコンシステンシーを確認した。２５〜１２０Ｎの浸透抵抗性を有するデンプンベースのキャリアを使用する組成物は、受容可能であるとみなされ、３０〜９０Ｎの値が、より好ましい範囲を示し、そして４０〜６５Ｎの値が、さらにより好ましかった。
【０１６６】
１インチ直径×９インチ長のねじ付き（１４ｔｐｉ）押棒を、１ｋＮの力変換器を適合させたＭＴＳ  ８５８  Ｂｉｏｎｉｘ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍのアクチュエータに取り付けた。１．５インチ直径×６インチ長のＰＶＣパイプの片を、力変換器上の中心に垂直に位置付け、大きい秤量ボートを、その下に配置し、押出し成形された骨処方物を捕捉した。１インチＩ．Ｄ．×０．５インチ厚のスペーサーを、ＰＶＣチュービングの上に配置し、そして７．００ｇの骨混合物を、５ｃｃシリンジに測り取り、きれいな乾燥した５ｃｃシリンジプランジャーを使用して、シリンジの先端にロードした。このプランジャーは、ｏリングの直ぐ下を取り除き、平らな表面を作製した先端を有した。ロードしたシリンジを、プランジャーを上にして、スペーサー／ＰＶＣパイプアセンブリ内に、垂直に配置した。アセンブリ全体（ＰＶＣパイプ、スペーサーおよびシリンジ）を、押棒の下に、ロードした細胞に対して直接的に、中心に置いた。プランジャーの中心を、押棒の中心と整列させた。１ｋＮの負荷範囲を、各々の新しい骨処方物の第１の試験について使用した。骨混合物を押出し成形するために必要とされる最大の負荷が、９０Ｎ未満である場合、より高い正確性を達成するために、その後の試験において、１００Ｎの負荷範囲を使用した。試験サンプルを、５Ｎの負荷コントロール下に予め負荷し、変位を０点調節し、そして試験を行った。骨処方物を、５ｍｍ／分の速度で、圧縮における２０ｍｍの最大変位まで押出し成形した。次いで、各々の骨処方物を押出し成形するために必要とされる最大の力を、決定した。
【０１６７】
（実施例２０：アミラーゼ感受性の検出）
本実施例は、デンプンベースの安定化剤および拡散障壁（キャリア）に対するアミラーゼ耐性の評価を記載する。デンプンベースのキャリアのアミラーゼ耐性の増加は、移植後のキャリアの有効滞留時間を増加し、従って、キャリアの安定化効果を増強する。
【０１６８】
耐性デンプンの定量は、グルコースへのアミラーゼ耐性デンプンの分解を効果的に検出する、膵臓αアミラーゼおよびアミノグルコシダーゼの使用を必要とする。
【０１６９】
実施例３、９、１５および１７のデンプン組成物およびデンプン／脂質組成物の分解、ならびに新しい候補アミラーゼ耐性デンプンおよび改変デンプンを、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄ．製の耐性デンプンアッセイキット（Ａｍｙｌｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  α−Ａｍｙｌａｓｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ＡＯＡＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９９６．１１，ＡＡＣＣ  Ｍｅｔｈｏｄ  ７６．１３，ＩＣＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｎｏ．１６８）を使用してモニターした。最も遅い分解を有する処方物は、一般に、インビボで最も長い安定化効果を有する。
【０１７０】
（実施例２１：デンプン／脂質キャリア組成物）
以下の組成物を、実施例３、９、１５および１７に記載の様式と同様の様式で調製した。キャリアを、ＤＢＭとの混合前に、２０分間オートクレーブして滅菌した。
【０１７１】
組み合わせ＃１−約８％のＰｅｎｆｏｒｄ  Ｍａｐｓ  ２８１および５％のＬｅｃｉｔｈｉｎからなる（残りは水）、キャリア１
組み合わせ＃２−約８％のＰｅｎｆｏｒｄ  Ｍａｐｓ  ２８１および１５％のＬｅｃｉｔｈｉｎからなる（残りは水）、キャリア２
組み合わせ＃３−約６％のＧＰＣ  Ｂ９８０および５％のＬｅｃｉｔｈｉｎからなる（残りは水）、キャリア３
組み合わせ＃４−約６％のＧＰＣ  Ｂ９８０および１５％のＬｅｃｉｔｈｉｎからなる（残りは水）、キャリア４。
【０１７２】
４つのキャリアの組み合わせの各々を、約２５％の骨含量を生じるように、ヒトＤＢＭと混合した。次いで、これらの骨混合物を、先の実施例６に記載のように、骨誘導性について試験した。
【０１７３】
（他の実施形態）
前述は、本発明の特定の非限定的な好ましい実施形態の記載であった。当業者は、この記載に対する種々の変更および改変が、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の精神または範囲を逸脱することなくなされ得ることを理解する。
【０１７４】
（付録Ａ）
本発明のＤＢＭ組成物における生物学的に活性な薬剤は、生物学的活性を有する任意の物質である。これらの物質としては、以下が挙げられる：低分子、化合物、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質、ならびにこれらの合成的に操作されたアナログおよび生物学的に操作されたアナログ。
【０１７５】
本発明のＤＢＭ組成物において利用され得る生物学的に活性な化合物の例としては、以下が挙げられる：文字通り、任意の親水性または疎水性の生物学的に活性な化合物。好ましくは、必ずではないが、薬物は、適切な政府の機関または組織により、使用に安全かつ有効であると既にみなされたものである。例えば、連邦規則集２１の３３０．５、３３１〜３６１；４４０〜４６０節の下で、ＦＤＡにより列挙されたヒトに対する使用のための薬物；連邦規則集２１の５００〜５８２節により列挙された獣医学的な使用のための薬物（本明細書中に参考として援用される）は、すべて、本発明の新規なポリマーネットワークにおける使用に受容可能であると考えられる。
【０１７６】
それ自体は体温にて液体ではない薬物は、ＤＢＭおよび他のポリマーに組み込まれ得る。さらに、ペプチダーゼのような組織活性化酵素により通常溶解され得るペプチドおよびタンパク質は、ポリマーにおいてまたはＤＢＭにおいても受動的に保護され得る。
【０１７７】
用語「生物学的に活性な化合物」としては、動物、植物またはウイルスにおいて局所的または全身的な効果を生じる薬理学的に活性な物質が挙げられる。従って、この用語は、疾患の診断、治癒、緩和、処置もしくは予防における使用のため、または動物、植物もしくはウイルスにおける所望の肉体的もしくは精神的発達および状態の強化が意図される任意の物質を意味する。本明細書中で使用される用語「動物」は、哺乳動物（例えば、霊長類（ヒトを含む）、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス）；トリ；爬虫類；魚；昆虫；蛛形；原生動物（ｐｒｏｔｉｓｔ）（例えば、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ））；および原核生物細菌を意味するとみなされる。用語「植物」は、高等植物（被子植物、裸子植物）、真菌、および原核生物ラン藻類（すなわち、シアノバクテリア）を意味する。
【０１７８】
生物学的に活性な化合物は、生物学的活性を有する任意の物質（タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、核タンパク質、多糖類、糖タンパク質、リポタンパク質、ならびに合成操作されたおよび生物学的に操作されたそれらのアナログが挙げられる）であり得る。用語「タンパク質」は、当該分野で認識され、本発明の目的に関しては、ペプチドもまた含む。タンパク質またはペプチドは、任意の生物学的に活性な、天然に存在するか合成されたタンパク質もしくはペプチドであり得る。
【０１７９】
タンパク質の例としては、以下が挙げられる：抗体、酵素、ステロイド、成長ホルモン、および成長ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、ならびにそのアゴニストアナログおよびアンタゴニストアナログ、ソマトスタチンおよびそのアナログ、黄体形成ホルモンおよび卵胞刺激ホルモンのような性腺刺激ホルモン、ペプチドＴ、サイロカルシトニン、副甲状腺ホルモン、グルカゴン、バソプレッシン、オキシトシン、アンギオテンシンＩおよびアンギオテンシンＩＩ、ブラジキニン、カリジン、副腎皮質刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インスリン、グルカゴン、ならびに前述の分子の多くのアナログおよび同種分子（ｃｏｎｇｅｎｅｒ）。
【０１８０】
本発明の方法を使用して架橋ゲルに負荷され得る生物学的に活性な化合物のクラスとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗ＡＩＤＳ物質、抗癌物質、抗生物質、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）、抗ウイルス物質、酵素インヒビター、神経毒、オピオイド、催眠薬、抗ヒスタミン剤、潤滑剤、精神安定薬、抗痙攣薬（ａｎｔｉ−ｃｏｎｖｕｌｓａｎｔ）、筋肉弛緩剤および抗パーキンソン物質、抗痙攣薬（ａｎｔｉ−ｓｐａｓｍｏｄｉｃ）および抗筋肉収縮剤、縮瞳薬および抗コリン作動薬、抗緑内障化合物、抗寄生生物薬および／または抗原生動物化合物、抗高血圧薬、鎮痛薬、解熱薬、および抗炎症剤（例えば、ＮＳＡＩＤ）、局所麻酔剤、眼病薬（ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）、プロスタグランジン、抗うつ薬、抗精神病物質、抗嘔吐剤、造影剤、特定の標的化薬剤、神経伝達物質、タンパク質、細胞応答改変剤、ならびにワクチン。
【０１８１】
本発明の方法を使用してポリマーに負荷するに適切な化合物のクラスのより完全な列挙は、Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ  Ｗｉｒｋｓｔｏｆｆｅ（Ｖｏｎ  Ｋｌｅｅｍａｎｎら（編）Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７（本明細書中に参考として援用される））に見出され得る。特に生物学的に活性な物質の例は、以下に示される。
【０１８２】
抗ＡＩＤＳ物質は、自己免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を処置または予防するために使用される物質である。このような物質の例としては、以下が挙げられる：ＣＤ４、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）、９−（２−ヒドロキシエトキシメチル）−グアニンアシクロビル、ホスホノ蟻酸、１−アダマンタンアミン、ペプチドＴ、および２’，３’ジデオキシシチジン。
【０１８３】
抗癌物質は、癌を処置または予防するために使用される物質である。このような物質の例としては、以下が挙げられる：メトトレキセート、シスプラチン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、ジエチルスチルベストロール、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、アミノグルテチミド、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、クロラムブシル、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｌｉｎｅ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ：ジメチルトリアゼノミダゾールカルボキサミド）、メトトレキセート、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、シタラビン、シトシンアラビノキシド、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、チオグアニン。
【０１８４】
抗生物質は、当該分野で認識され、微生物の増殖を阻害するかまたは微生物を殺傷する物質である。抗生物質は、合成により生成されてもよいし、微生物により生成されてもよい。抗生物質の例としては、ペニシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バンコマイシン（ｖａｎｏｍｙｃｉｎ）、バシトラシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、およびセファロスポリンが挙げられる。
【０１８５】
抗ウイルス剤は、ウイルスを破壊するかまたはウイルスの複製を抑制し得る物質である。抗ウイルス剤の例としては、以下が挙げられる：α−メチル−Ｐ−アダマンタンメチルアミン、１，−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３カルボキサミド、９−［２−ヒドロキシ−エトキシ］メチルグアニン、アダマンタンアミン、５−ヨード−２’−デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、およびアデニンアラビノシド。
【０１８６】
酵素インヒビターは、酵素反応を阻害する物質である。酵素インヒビターの例としては、以下が挙げられる：塩化エデロホニウム、Ｎ−メチルフィゾスチグミン、臭化ネオスチグミン、硫酸フィゾスチグミン、タクリンＨＣｌ、タクリン、１−ヒドロキシマレエート、ヨードツベルシジン（ｉｏｄｏｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ｐ−ブロモテトラミソール、１０−（α−ジエチルアミノプロピオニル）−フェノチアジンヒドロクロリド、カルミダゾリウムクロリド、ヘミコリニウム−３、３，５−ジニトロカテコール、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビターＩ、ジアシルグリセロールキナーゼインヒビターＩＩ、３−フェニルプロパルギルアミン、Ｎ６−モノメチル−Ｌ−アルギニンアセテート、カルビドパ、３−ヒドロキシベンジルヒドラジンＨＣｌ、ヒドラジンＨＣｌ、クロルグリシン（ｃｌｏｒｇｌｙｓｉｎｅ）ＨＣｌ、デプレニルＨＣｌ，Ｌ（−）−、デプレニルＨＣｌ，Ｄ（＋）−、ヒドロキシルアミンＨＣｌ、リン酸イプロニアジド、６−ＭｅＯ−テトラヒドロ−９Ｈ−ピリド−インドール、ニアルアミド、パルジリンＨＣｌ、キナクリンＨＣｌ、セミカルバジドＨＣｌ、トラニルシプロミンＨＣｌ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル−２，２−ジフェニルバレレートヒドロクロリド、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｎｅ）、パパベリンＨＣｌ、インドメタシン、２−シクロオクチル−２−ヒドロキシエチルアミンヒドロクロリド、２，３−ジクロロ−α−メチルベンジルアミン（ＤＣＭＢ）、８，９−ジクロロ−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−２−ベンズアゼピンヒドロクロリド、ｐ−アミノグルテチミド、ｐ−アミノグルテチミドタータレート，Ｒ（＋）−，ｐ−アミノグルテチミドタータレート，Ｓ（−）−、３−ヨードチロシン、α−メチルチロシン，Ｌ−、α−メチルチロシン，Ｄ  Ｌ−、アセタゾールアミド、ジクロロフェナミド、６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾールスルホンアミド、およびアロプリノール。
【０１８７】
神経毒は、神経系（例えば、神経細胞）に対して毒性効果を有する物質である。神経毒としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アドレナリン作動性神経毒、コリン作動性神経毒、ドパミン作動性神経毒、および他の神経毒。アドレナリン作動性神経毒の例としては、Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−エチル−２−ブロモベンジルアミンヒドロクロリドが挙げられる。コリン作動性神経毒の例としては、アセチルエチルコリンマスタードヒドロクロリドが挙げられる。ドパミン作動性神経毒の例としては、６−ヒドロキシドパミンＨＢｒ、１−メチル−４−（２−メチルフェニル）−１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリジンヒドロクロリド、過塩素酸１−メチル−４−フェニル−２，３−ジヒドロピリジニウム、Ｎ−メチル−４−フェニル−１，２，５，６−テトラヒドロピリジンＨＣｌ、ヨウ化１−メチル−４−フェニルピリジニウムが挙げられる。
【０１８８】
オピオイドは、オピウム由来ではないアヘン誘導体様効果を有する物質である。オピオイドとしては、オピオイドアゴニストおよびオピオイドアンタゴニストが挙げられる。オピオイドアゴニストとしては、以下が挙げられる：硫酸コデイン、クエン酸フェンタニール、重酒石酸ヒドロコドン、ロペラミドＨＣｌ、硫酸モルフィン、ノスカピン、ノルコデイン（ｎｏｒｃｏｄｅｎｅ）、ノルモルフィン、テバイン。オピオイドアンタゴニストとしては、以下が挙げられる：ノル−ビナルトルフィミン(ｂｉｎａｌｔｏｒｐｈｉｍｉｎｅ)ＨＣｌ、ブプレノルフィン、クロルナルトレキサミン（ｃｈｌｏｒｎａｌｔｒｅｘａｍｉｎｅ）２ＨＣｌ、フナルトレキサミオン（ｆｕｎａｌｔｒｅｘａｍｉｏｎｅ）ＨＣｌ、ナルブフィンＨＣｌ、ナロルフィンＨＣｌ、ナロキソンＨＣｌ、ナロキソナジン（ｎａｌｏｘｏｎａｄｉｎｅ）、ナルトレキソンＨＣｌ、およびナルトリンドール（ｎａｌｔｒｉｎｄｏｌｅ）ＨＣｌ。
【０１８９】
催眠薬は、催眠効果を生じる物質である。催眠薬としては、以下が挙げられる：ペントバルビタールナトリウム、フェノバルビタール、セコバルビタール、チオペンタールおよびそれらの混合物、複素環式催眠薬、ジオキソピペリジン、グルタミリド（ｇｌｕｔａｒｉｍｉｄｅ）、ジエチルイソバレルアミド、α−ブロモイソバレリルウレア、ウレタンおよびジスルファン。
【０１９０】
抗ヒスタミン剤は、ヒスタミンの効果を競合的に阻害する物質である。例としては、ピリラミン、クロルフェニラミン、テトラヒドロゾリン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｚｏｌｉｎｅ）などが挙げられる。
【０１９１】
潤滑剤は、送達される環境の潤滑性を増大させる物質である。生物学的に活性な潤滑剤の例としては、水および生理食塩水が挙げられる。
【０１９２】
精神安定薬は、鎮静効果を提供する物質である。精神安定薬の例としては、クロロプロマジン、プロマジン、フルフェナジン（ｆｌｕｐｈｅｎｚａｉｎｅ）、レセルピン、デセルピジン、およびメプロバメートが挙げられる。
【０１９３】
抗痙攣薬は、痙攣を防止、減少または排除する効果を有する物質である。このような薬剤の例としては、プリミドン、フェニトイン、バルプロエート、Ｃｈｋおよびエトスクシミドが挙げられる。
【０１９４】
筋弛緩剤および抗パーキンソン薬剤は、筋肉を弛緩させるかまたはパーキンソン病と関連する症状を軽減もしくは排除する効果を有する物質である。このような薬剤の例としては、メフェネシン、メトカルバモール、塩酸シクロベンザプリン、塩酸トリヘキシフェニジル（ｔｒｉｈｅｘｙｌｈｅｎｉｄｙｌ）、レボドパ／カルビドパ、およびビペリデンが挙げられる。
【０１９５】
抗痙攣薬（ａｎｔｉ−ｓｐａｓｍｏｄｉｃ）および抗筋肉収縮剤は、筋肉の痙性または収縮を防止または軽減し得る物質である。このような薬剤の例としては、アトロピン、スコポラミン、オキシフェノニウム、およびパパベリンが挙げられる。
【０１９６】
縮瞳薬および抗コリン作動薬は、気管支拡張を引き起こす化合物である。例としては、エコチオフェート、ピロカルピン、サリチル酸フィゾスチグミン、ジイソプロピルフルオロホスフェート、エピネフリン、ネオスチグミン、カルバコール、メタコリン、ベタネコールなどが挙げられる。
【０１９７】
抗緑内障化合物としては、ベタキソロール（ｂｅｔａｘａｌｏｌ）、ピロカルピン、チモロール、チモロール塩、ならびにチモロールおよび／またはその塩とピロカルピンとの組み合わせが挙げられる。
【０１９８】
抗寄生生物薬、抗原生動物薬および抗真菌薬としては、イベルメクチン、ピリメタミン、トリスルファピリミジン、クリンダマイシン、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン、フルシトシン、ナタマイシン、およびミコナゾールが挙げられる。
【０１９９】
抗高血圧薬は、高血圧と対抗し得る物質である。このような物質の例としては、α−メチルドパおよびα−メチルドパのピバロイルオキシエチルエステルが挙げられる。
【０２００】
鎮痛薬は、疼痛を防止、減少または緩和し得る物質である。鎮痛薬の例としては、硫酸モルフィン、硫酸コデイン、メペリジン、およびナロルフィンが挙げられる。
【０２０１】
解熱薬は、発熱を緩和または低下させ得る物質であり、抗炎症剤は、炎症に対抗またはこれを抑制し得る物質である。このような薬剤の例としては、アスピリン（サリチル酸）、インドメタシン、インドメタシンナトリウム三水和物、サリチルアミド、ナプロキセン、コルヒチン、フェノプロフェン、スリンダク、ジフルニサル、ジクロフェナク、インドプロフェン、およびサリチルアミドナトリウムが挙げられる。
【０２０２】
局所麻酔薬は、局所的な領域において麻酔効果を有する物質である。このような麻酔薬の例としては、プロカイン、リドカイン、テトラカインおよびジブカインが挙げられる。
【０２０３】
眼病薬としては、フルオレセインナトリウム、ローズベンガル、メタコリン、アドレナリン、コカインおよびアトロピンのような診断剤が挙げられる。眼病手術の付加剤としては、α−キモトリプシンおよびヒアルロニダーゼが挙げられる。
【０２０４】
プロスタグランジンは、当該分野で認識され、種々の生物学的効果を有する、天然に存在する、化学的に関連する長鎖ヒドロキシ脂肪酸のクラスである。
【０２０５】
抗うつ剤は、うつ病を予防または緩和し得る物質である。抗うつ剤の例としては、イミプラミン、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、デシプラミン、アモキサピン、ドキセピン、マプロチリン、トラニルシプロミン、フェネルジン、およびイソカルボキサジドが挙げられる。
【０２０６】
抗精神病物質は、精神病性行動を改変する物質である。このような薬剤の例としては、フェノチアジン、ブチロフェノン、およびチオキサンテンが挙げられる。
【０２０７】
抗嘔吐剤は、悪心または嘔吐を防止または改善する物質である。このような物質の例としては、ドラマミンが挙げられる。
【０２０８】
造影剤は、インビボで所望の部位（例えば、腫瘍）を画像化し得る薬剤である。造影剤の例としては、インビボで検出し得る標識を有する物質（蛍光標識に結合した抗体）が挙げられる。用語抗体は、完全抗体またはそれらのフラグメントを含む。
【０２０９】
特定の標的化薬剤としては、治療剤を所望の部位（例えば、腫瘍）に送達し、そして治療効果を提供し得る薬剤が挙げられる。標的化薬剤の例としては、有利な効果を提供する毒素または他の薬剤を運び得る薬剤が挙げられる。この標的化薬剤は、毒素（例えば、リシンＡ）に連結した抗体、または薬物に連結した抗体であり得る。
【０２１０】
神経伝達物質は、興奮に際してニューロンから放出され、移動して、標的細胞の阻害または興奮のいずれかを行う物質である。神経伝達物質の例としては、ドパミン、セロトニン、ｑ−アミノ酪酸、ノルエピネフリン、ヒスタミン、アセチルコリン、およびエピネフリンが挙げられる。
【０２１１】
細胞応答改変剤は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のような走化性因子である。他の走化性因子としては、好中球活性化タンパク質、単球走化性因子タンパク質、マクロファージ炎症タンパク質、血小板因子、血小板塩基性タンパク質、およびメラノーマ増殖刺激活性；表皮増殖因子、トランスホーミング増殖因子（α）、線維芽細胞増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、神経増殖因子、および骨増殖／軟骨誘導因子（αおよびβ）、または他の骨形成タンパク質が挙げられる。
【０２１２】
他の細胞応答改変剤は、インターロイキン、インターロイキンインヒビターまたはインターロイキンレセプター（インターロイキン１〜インターロイキン１０を含む）；インターフェロン（α、βおよびγを含む）；造血因子（エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子を含む）；腫瘍壊死因子（αおよびβを含む）；トランスホーミング増殖因子（β）（β１、β２、β３、インヒビンおよびアクチビンを含む）；ならびに骨形成タンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図１は、骨形成の証拠を示す、インビボで３週間のＸ線写真である。
【図２】図２は、６週間のＸ線画像またはファキシトロン（ｆａｘｉｔｒｏｎ）画像である。
【図３Ａ】図３は、血管分布（Ａ）および残余の鉱物質除去骨繊維（ＤＢＦ）（Ｂ）の定量的評価である。Ａ．血管分布および骨髄細胞性は、ｈｒｈＢＭＰ−２ｘの漸増濃度を用いる用量依存様式で、活性ＤＢＦにおいて増加した。これは、不活化群においては明白ではなかった。５μｇの用量の野生型ｒｈＢＭＰ−２は、ハイブリッドＢＭＰに類似していた。Ｂ．残余のＤＢＦは、不活化群の各々において小結節の有意な部分を残した。残余のＤＢＦは、活性ＤＢＦ群におけるｈｒｈＢＭＰ−２ｘの量の増加と共に、用量依存的に減少した。野生型ｒｈＢＭＰ−２は、ｈｒｈＢＭＰ−２ｘとしてＤＢＦを再モデリングする際に有効ではなかった。
【図３Ｂ】図３は、血管分布（Ａ）および残余の鉱物質除去骨繊維（ＤＢＦ）（Ｂ）の定量的評価である。Ａ．血管分布および骨髄細胞性は、ｈｒｈＢＭＰ−２ｘの漸増濃度を用いる用量依存様式で、活性ＤＢＦにおいて増加した。これは、不活化群においては明白ではなかった。５μｇの用量の野生型ｒｈＢＭＰ−２は、ハイブリッドＢＭＰに類似していた。Ｂ．残余のＤＢＦは、不活化群の各々において小結節の有意な部分を残した。残余のＤＢＦは、活性ＤＢＦ群におけるｈｒｈＢＭＰ−２ｘの量の増加と共に、用量依存的に減少した。野生型ｒｈＢＭＰ−２は、ｈｒｈＢＭＰ−２ｘとしてＤＢＦを再モデリングする際に有効ではなかった。
【図４】図４は、未処理およびｈｒｈＢＭＰ−２ｘ処理した不活化ＤＢＦマトリクスと、未処理およびｈｒｈＢＭＰ−２ｘ処理した活性ＤＢＦマトリクスとの比較である。不活化：残余のＤＢＦのみが存在し、骨形成要素は明確ではない。不活化＋１０μｇ  ｈｒｈＢＭＰ−２ｘ：残余の骨の内側を覆う新規の骨；小結節の至る所に多くの脂肪細胞を有する多数の未成熟骨髄；小結節の外端での広範囲な骨形成、しかし縁は存在しない。ＤＢＦ：多数の軟骨細胞、骨、およびいくらかの骨髄形成を伴って存在する残余のＤＢＦの縁。ＤＢＦ＋１０μｇ  ｈｒｈＢＭＰ−２ｘ：中心に残るごくわずかな残余のＤＢＦを有し、小結節の至る所に多数の骨形成を伴う、成熟した新しい骨の薄い縁；十分に発達した造血性骨髄による広範な血管新生が存在する。
【図５】図５は、ｈｒｈＢＭＰ−２ｘ処理したＤＢＦマトリクスと野生型ｒｈＢＭＰ−２処理したＤＢＦマトリクスとの組織学的比較である。野生型群における、骨のより少ない小棘および多数の脂肪性の骨髄により証明されるように、ｒｈＢＭＰ−２群と比較して、ｈｒｈＢＭＰ−２ｘ処理群において有意な骨形成が存在した。より発達した血液の骨髄は、ハイブリッドｒｈＢＭＰ−２ｘ群において明確であった。
【図６】図６は、マトリクスメタロプロテイナーゼインヒビターのいくつかの例の化学構造である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2005505351.tif 000106
2005505351.tif 000107
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505351.tif 000108
【国際調査報告】
2005505351.tif 000109
2005505351.tif 000110
2005505351.tif 000111
2005505351.tif 000112
2005505351.tif 000113
2005505351.tif 000114
2005505351.tif 000115