(57)【要約】本発明は、血圧レベルを低下させるための本発明のＤＰＩＶ阻害剤およびそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態の新規使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における血圧レベルまたは関連障害を低減させるための薬学的組成物の調製のためのジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）またはＤＰＩＶ様酵素活性の少なくとも１種の阻害剤の使用。
【請求項２】
前記阻害剤は、ジペプチド化合物、トリ、テトラおよびペンタペプチドを含むペプチド化合物、ペプチジルケトン、アミノケトン誘導体ならびに側鎖修飾ＤＰＩＶ阻害剤からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ペプチジルペプチダーゼＩＶ様酵素は、線維芽細胞活性化タンパク質α、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ  β、ジペプチジルアミノペプチダーゼ様タンパク質、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼ、静止細胞プロリンジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、アトラクチンおよびジペプチジルペプチダーゼＩＶ関連タンパク質（ＤＰＰ８）、ジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ９）、ＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２、ＤＰＲＰ３またはＫＩＡＡ１４９２からなる群から選択される、請求項１または２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４】
前記ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様酵素の構造は未知である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記阻害剤は、アミノ酸およびチアゾリジンまたはピロリジン基から形成されるジペプチド様化合物ならびにそれらの塩である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ジペプチド化合物は、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−グルタミニルチアゾリジン、Ｌ−グルタミニルピロリジン、Ｌ−グルタミン酸チアゾリジン、Ｌ−グルタミン酸ピロリジン、アラニルピロリジン、Ｎ−バリルプロリル−Ｏ−ベンゾイルヒドロキシルアミンおよびそれらの塩からなる群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記阻害剤は、下記一般式：
【化１】
2005505531.tif 000030
（式中、
Ａは、Ｄ−アミノ酸を除くアミノ酸であり、
Ｂは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸、ピペコリン酸を除き、かつＮ−アルキル化アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン）を除く任意のアミノ酸であり、
Ｄは、任意のアミノ酸であるか、または欠如しており、かつ
Ｅは、任意のアミノ酸であるか、または欠如しているか、あるいは
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸、ピペコリン酸を除き、Ｎ−アルキル化アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン）を除き、かつＤ−アミノ酸を除く任意のアミノ酸であり、
Ｄは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸およびピペコリン酸から選択される任意のアミノ酸であり、かつ
Ｅは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸、ピペコリン酸を除き、かつＮ−アルキル化アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン）を除く任意のアミノ酸である）
により表されるジペプチジルペプチダーゼＩＶ触媒の競合調整に有用なペプチド化合物である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記阻害剤は、下記一般式：
【化２】
2005505531.tif 000031
（式中、
Ａは、以下の：
【化３】
2005505531.tif 000032
から選択され、
Ｘ1は、Ｈ、あるいはアシルもしくはオキシカルボニル基またはアミノ酸もしくはペプチド残基であり、
Ｘ2は、Ｈ、−(ＣＨ)n−ＮＨ−Ｃ5Ｈ3Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）またはＣ5Ｈ3Ｎ−Ｙ（二価ピリジル残基）であり、かつＹは、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ2またはＣＮから選択され、
Ｘ3は、Ｈ、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたフェニルあるいはピリジル残基であり、
Ｘ4は、Ｈ、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたフェニルあるいはピリジル残基であり、
Ｘ5は、Ｈ、あるいはアルキル、アルコキシまたはフェニル残基であり、
Ｘ6は、Ｈまたはアルキル残基であり、
ｎ＝１に関して、
Ｘは、Ｈ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ+Ｒ2Ｒ3Ｒ4（ここで、
Ｒ2は、無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたアシル残基、あるいはすべてのアミノ酸およびペプチド残基、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたアルキル残基を表し、
Ｒ3は、アルキルおよびアシル官能基を表し、ここでＲ2およびＲ3は、飽和および不飽和炭素環式もしくは複素環式構造の１つまたは複数の環構造の一部であってもよく、
Ｒ4は、アルキル残基を表し、ここでＲ2およびＲ4またはＲ3およびＲ4は、飽和および不飽和炭素環式もしくは複素環式構造の１つまたは複数の環構造の一部であってもよい）
から選択され、
ｎ＝０に関して、
Ｘは、以下の：
【化４】
2005505531.tif 000033
（式中、
Ｂは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ5（ここで、Ｒ5は、Ｈ、アルキリデンまたはアシルである）を表し、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈは独立して、無置換および置換のアルキル、オキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、カルボニルアルキル、アシル、カルバモイル、アリールおよびヘテロアリール残基から選択される）
から選択され、
ｎ＝０およびｎ＝１に関して、
Ｚは、Ｈ、あるいはＣ1〜Ｃ9の分岐鎖もしくは単鎖アルキル残基またはＣ2〜Ｃ9の分岐鎖もしくは単鎖アルケニル残基、Ｃ3〜Ｃ8のシクロアルキル残基、Ｃ5〜Ｃ7のシクロアルケニル残基、アリールまたはヘテロアリール残基、あるいはすべての天然アミノ酸もしくはそれらの誘導体のすべての側鎖から選択される側鎖から選択される）
により表されるペプチジルケトン（それらのすべての立体異性体および薬学的に許容可能な塩を包含する）である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記阻害剤は、下記一般式５、６、７、８、９、１０および１１：
【化５】
2005505531.tif 000034
（式中、
Ｒ1は、Ｈ、分岐状もしくは線状Ｃ1〜Ｃ9アルキル残基、分岐状もしくは線状Ｃ2〜Ｃ9アルケニル残基、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル残基、Ｃ5〜Ｃ7シクロアルケニル残基、アリール残基またはヘテロアリール残基、あるいは天然アミノ酸またはそれらの誘導体の側鎖であり、
Ｒ3およびＲ4は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノまたはハロゲンであり、
Ａは、Ｈ、またはＣＮ、ＳＯ3Ｈ、ＣＯＮＨＯＨ、ＰＯ3Ｒ5Ｒ6、テトラゾール、アミド、エステル、酸無水物、チアゾールおよびイミダゾールから選択される官能基のような炭酸の同配体であり、
Ｂは、以下の：
【化６】
2005505531.tif 000035
（式中、
Ｒ5は、Ｈ、−(ＣＨ)n−ＮＨ−Ｃ5Ｈ3Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）およびＣ5Ｈ3Ｎ−Ｙ（二価ピリジル残基）（Ｙ＝Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ2またはＣＮ）であり、
Ｒ10は、Ｈ、アシル、オキシカルボニルまたはアミノ酸残基であり、
Ｗは、Ｈ、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｗ1は、Ｈ、アルキル、アルコキシまたはフェニル残基であり、
Ｚは、Ｈ、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｚ1は、Ｈまたはアルキル残基である）
から選択され、
Ｄは、環式Ｃ4〜Ｃ7アルキル、Ｃ4〜Ｃ7アルケニル残基（これらは、無置換であり得るかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル基で置換され得る）または環式４〜７員環ヘテロアルキル残基もしくは環式４〜７員環へテロアルケニル残基であり、
Ｘ2は、Ｏ、ＮＲ6、Ｎ+(Ｒ7)2またはＳであり、
Ｘ3〜Ｘ12は独立して、ＣＨ2、ＣＲ8Ｒ9、ＮＲ6、Ｎ+(Ｒ7)2、Ｏ、Ｓ、ＳＯおよびＳＯ2（すべての飽和および不飽和構造を含む）から選択され、
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は独立して、Ｈ、分岐状もしくは線状Ｃ1〜Ｃ9アルキル残基、分岐状もしくは線状Ｃ2〜Ｃ9アルケニル残基、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル残基、Ｃ5〜Ｃ7シクロアルケニル残基、アリール残基またはヘテロアリール残基から選択され、
但し、
式６：ＡがＨでない場合、Ｘ6はＣＨであり、
式７：ＡがＨでない場合、Ｘ10はＣであり、
式８：ＡがＨでない場合、Ｘ7はＣＨであり、
式９：ＡがＨでない場合、Ｘ12はＣである）
により表されるアミノケトン誘導体（それらのすべての立体異性体および薬学的に許容可能な塩を包含する）である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素活性の前記阻害剤は、下記一般式：
【化７】
2005505531.tif 000036
（式中、
Ａは、側鎖に少なくとも１種の官能基を有するアミノ酸であり、
Ｂは、Ａの側鎖の少なくとも１種の官能基に共有結合された化学化合物、特に、
−最大２０個のアミノ酸の鎖長を有するオリゴペプチド、または
−最大２００００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するポリエチレングリコール、
−８〜５０個の炭素原子を有する任意に置換された有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物
であり、
Ｃは、Ａにアミド結合されたチアゾリジン、ピロリジン、シアノピロリジン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリンまたはピペリジン基である）
により表される（それらのすべての立体異性体および薬学的に許容可能な塩を包含する）、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
Ａは、トレオニン、チロシン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインからなる群から選択される側鎖に少なくとも１つの官能基を有するアミノ酸、好ましくはα−アミノ酸、特に天然α−アミノ酸である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記阻害剤は、薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤および治療上有効な量の前記阻害剤またはそれらの薬学的に許容可能な酸付加塩を含む薬学的組成物である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記阻害剤（複数可）は、薬学的に許容可能なキャリアおよび／または希釈剤と組み合わせて使用される、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の阻害剤は、多重投与で投与される、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記哺乳類は、臨床上不適切な基底および食後高血糖症または血圧レベルあるいはその両方を示す、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
血圧低下をもたらす糖尿、高脂血症、代謝性アシドーシスおよび真性糖尿病のような哺乳類代謝の病理学的異常の防止または軽減のための請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
１４０ｍｍＨｇを超える血圧の哺乳類において血圧レベルを低下させるための請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の使用であって、前記少なくとも１種の阻害剤は定期的に投与される使用。
【請求項１８】
前記少なくとも１種の阻害剤または薬学的組成物の経口投与を含む請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶおよびジペプチジルペプチダーゼＩＶ様酵素活性の阻害剤、より詳細には上記化合物を含有する薬学的組成物、および哺乳類における血圧レベルおよび関連障害を低減させるための上記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）は、好ましくは末端から２番目の位置においてプロリン残基を含有するペプチド鎖由来のＮ末端ジペプチドを切断するセリンプロテアーゼである。哺乳類系におけるＤＰＩＶの生物学的役割は完全には明らかにされていないが、ＤＰＩＶは、神経ペプチド代謝、Ｔ細胞活性化およびリンパ系細胞へのＨＩＶの侵入において重要な役割を果たすと考えられる。
【０００３】
本発明は、特に血圧レベルおよび関連障害を低減させるための、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素の阻害により媒介される状態の予防および治療のためのＤＰＩＶ阻害剤の新規使用、ならびに例えばＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素を阻害するのに有用な薬学的組成物および上記酵素活性を阻害する方法を提供する。
【０００４】
本発明は、治療方法、特に哺乳類において血圧レベルを低下させる方法、ならびにかかる方法において使用するための化合物および組成物に関する。ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ、ＥＣ  ３．４．１４．５、ＣＤ２６）は、上皮細胞および白血球サブセットを含む多数の組織で発現されるプロリン後（より少ない程度で、アラニン後、セリン後またはグリシン後）切断性セリンプロテアーゼである。さらに、ＤＰＩＶは、その細胞外ドメインにおいてその活性を示す膜関連エクトペプチダーゼ(ectopeptidase)である。
【０００５】
低分子量ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤の例は、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキサミド誘導体、Ｎ−置換２−シアノピロールおよびピロリジン、Ｎ−（Ｎ’−置換グリシル）−２−シアノピロリジン、Ｎ−（置換グリシル）−チアゾリジン、Ｎ−（置換グリシル）−４−シアノチアゾリジン、アミノ−アシル−ボロノ−プロリル阻害剤、シクロプロピル融合ピロリジンおよび複素環式化合物のような作用物質である。ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害剤は、特にこれらの阻害剤、それらの定義、使用およびそれらの生産についてＵＳ６，３８０，３９８号、ＵＳ６，０１１，１５５号、ＵＳ６，１０７，３１７号、ＵＳ６，１１０，９４９号、ＵＳ６，１２４，３０５号、ＵＳ６，１７２，０８１号、ＷＯ９５／１５３０９号、ＷＯ９９／６１４３１号、ＷＯ９９／６７２７８号、ＷＯ９９／６７２７９号、ＤＥ１９８  ３４  ５９１号、ＷＯ９７／４０８３２号、ＤＥ  １９６  １６  ４８６  Ｃ２号、ＷＯ９８／１９９９８号、ＷＯ００／０７６１７号、ＷＯ９９／３８５０１号、ＷＯ９９／４６２７２号、ＷＯ９９／３８５０１号、ＷＯ０１／６８６０３号、ＷＯ０１／４０１８０号、ＷＯ０１／８１３３７号、ＷＯ０１／８１３０４号、ＷＯ０１／５５１０５号、ＷＯ０２／０２５６０号およびＷＯ０２／１４２７１号（これらの教示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【０００６】
ＤＰＩＶ様酵素という用語は、構造的および／または機能的にＤＰＩＶ／ＣＤ２６に関連した酵素タンパク質に関する(Sedo & Malik, ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様分子：相同タンパク質または相同活性？(Dipeptidyl peptidase IV-like molecules: homologous protein or homologous activities?) Biochimica et Biophysica Acta 2001, 36506: 1-10)。本質的に、酵素のこの小群は、オリゴまたはポリペプチドのＮ末端からＨ−Ｘａａ−ＰｒｏジペプチドおよびＨ−Ｘａａ−Ａｌａジペプチドを放出するように進化中に進化されてきた。ＤＰＩＶ用酵素は、Ｐｒｏ位置、同様にＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｙまたはＶａｌのような小さな疎水性側鎖を有する他のアミノ酸で適合するという共通の特徴を示す。加水分解性効率は、Ｐｒｏ＞Ａｌａ＞＞Ｓｅｒ、Ｔｈｒ＞＞Ｇｌｙ、Ｖａｌと並べられる。同じタンパク質は、Ｐｒｏ後またはＡｌａ後切断を確立させることができるような少量で利用可能であるに過ぎなかった。タンパク質：ＤＰＩＶ、ＤＰ  ＩＩ、ＦＡＰα（セプラーゼ）、ＤＰ６、ＤＰ８およびＤＰ９は、構造的に関連し、かつ高い配列相同性を示す一方で、アトラクチンは、類似の活性および阻害パターンを特徴とする強烈な機能的ＤＰＩＶ様酵素である。
【０００７】
さらに、ＤＰＩＶ様酵素は、ＷＯ０１／１９８６６号、ＷＯ０２／０４６１０号、ＷＯ０２／３４９００号およびＷＯ０２／３１１３４号に開示されている。ＷＯ０１／１９８６６号は、ＤＰＩＶおよび線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）対して構造的および機能的類似性を有する新規ヒトジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＰＰ８）を開示している。ＷＯ０２／３４９００号は、ＤＰＩＶおよびＤＰＰ８のアミノ酸配列を有する有意な相同性を有する新規ジペプチジルペプチダーゼ９（ＤＰＰ９）を開示している。ＷＯ０２／３１１３４号は、３つのＤＰＩＶ様酵素、すなわちＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２およびＤＰＲＰ３を開示している。配列解析により、ＷＯ０１／１９８６６号に開示されるようにＤＰＲＰ１はＤＰＰ８と同一であり、ＷＯ０２／０４６１０号に開示されるようにＤＰＲＰ２はＤＰＰ９と同一であり、ＤＰＲＰ３はＫＩＡＡ１４９２と同一であることが明らかとなった。
【０００８】
高血圧（高血圧症）は概して、動脈において異常に高い圧力が、発作、動脈瘤、心不全、心臓麻痺および腎臓損傷のような問題の危険性を増加させる無症状状態である。多くの人々にとって、高血圧症という言葉は、過度の不安、いらいらまたはストレスを連想させる。しかしながら、医療用語では、高血圧症は、原因に関係なく血圧上昇の状態を指す。高血圧症は通常、生体器官が損傷を受けるまで長年の間、症状を引き起こさないことから、「サイレントキラー」と呼ばれている。高血圧は、１４０ｍｍＨｇ以上を平均とする安静時の収縮期血圧、９０ｍｍＨｇ以上を平均とする安静時の拡張期血圧、またはその両方として定義される。高血圧では、通常収縮期血圧および拡張期血圧がともに上昇する。
【０００９】
真性糖尿病の二次的影響として、血圧および消化プロセスを制御する神経が損傷を受けるようになる。このことが血圧の揺動、嚥下困難および持続的な下痢を伴う胃腸機能の変質をもたらす。さらに、真性糖尿病の二次的影響として、アテローム性動脈硬化症斑が、心臓、脳、脚および陰茎で構築され、大または中間サイズの動脈を封鎖する。小血管壁は損傷を受け、その結果、血管は一般に酸素を運ばず、漏出し得る。
【００１０】
さらに、高血圧の定義および分類は、The Merck Manual of Medical Information-Home Edition , Merck & Co., 2000に付与される。人の収縮期血圧および拡張期血圧が種々のカテゴリーに分類される場合、より高度なカテゴリーを用いて血圧を分類する。例えば、１６０／９２はステージ２の高血圧症として分類され、１８０／１２０はステージ４の高血圧症として分類される。心血管問題の危険性を最小限に抑えるための最適な血圧は、１２０／８０ｍｍＨｇ以下である。しかしながら、異常に低い読み値が評価されなくてはならない。
【００１１】
カテゴリー 収縮期血圧 拡張期血圧
正常血圧                            １３０ｍｍＨｇ以下    ８５ｍｍＨｇ以下
高い正常血圧                        １３０〜１３９        ８５〜８９
ステージ１（穏やかな）高血圧症      １４０〜１５９        ９０〜９９
ステージ２（中程度の）高血圧症      １６０〜１７９        １００〜１０９
ステージ３（重度の）高血圧症        １８０〜２０９        １１０〜１１９
ステージ４（非常に重度の）高血圧症  ２１０以上            １２０以上
【００１２】
人が高血圧を有する場合、脳、眼、心臓および肝臓への損傷のため、その重度のまたは長年にわたる未処置の症状（例えば、頭痛、疲労、悪心、嘔吐、息切れ、情動不安および視力障害）が見られる。時折、重度の高血圧を伴う人々は、脳腫張により引き起こされる昏睡状態、さらには昏睡を発症する。高血圧性脳症と呼ばれるこの状態は、緊急処置を必要とする。
【００１３】
未処置の高血圧は、心臓疾患（例えば、心不全または心臓麻痺）、腎不全および初段階での発作を発症する人の危険性を増大させる。高血圧は、発作にとって最も重要な危険因子である。高血圧はまた、人が対処することができる心臓麻痺に対する３つの主な危険要因のうち１つであり、他の２つは、喫煙および高血中コレステロールレベルである。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、哺乳類において血圧レベルまたは関連障害を低減させるための、式１〜１２を有するＤＰＩＶ阻害剤、およびそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態の新規使用を提供する。
ＤＰＩＶ酵素活性を欠如する突然変異Ｆ３４４ラットにおけるエクトペプチダーゼＤＰＩＶの発現の減少およびＤＰＩＶ様活性の欠如は、血圧の低下をもたらす。ＤＰＩＶ酵素活性を欠如する突然変異Ｆ３４４亜株および野生型様Ｆ３４４を試験した。２週間かけての浸透圧ミニポンプによるイソロイシルシアノピロリジンＴＦＡおよびフマル酸イソロイシルチアゾリジンの長期胃内注入は、ラットの血圧を用量依存的に減少させた。したがって、血圧は、種々のＤＰＩＶ阻害剤（フマル酸イソロイシルチアゾリジン、イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡ）を用いた長期処理により減少され、２つの異なるＤＰＩＶ阻害剤／リガンドにより防御様クラスの効果を示唆している。おそらく、フマル酸イソロイシルチアゾリジンおよびイソロイシルシアノピロリジンＴＦＡは、ＤＰＩＶ基質の増加したレベルにより高血圧から保護し、相当する効果を間接的に媒介する。
【００１５】
本発明は、特異的酵素エフェクターによる哺乳類の血中の酵素ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＩＶすなわちＣＤ２６）の活性またはＤＰＩＶ様酵素活性の減少が、内因性または外因的に投与されたインスリン向性ペプチド（インクレチン）である胃阻害性ポリペプチド／グルコース依存性インスリン向性ポリペプチド１〜４２（ＧＩＰ1-42）およびグルカゴン様ペプチド−１  ７〜３６アミド（ＧＬＰ−１7-36）（またはこれらのペプチドの類縁体）の分解の減少をもたらす。したがって、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素による分解に起因するこれらのペプチドまたはそれらの類縁体の濃度の低下が減少または遅延される。
【００１６】
ＤＰＩＶ活性の減少により引き起こされる内因性または外因的に投与されたインクレチンまたはそれらの類縁体の安定性の増大の結果として、それらのインスリン向性効果が高められ、ランゲルハンスの膵島からのインスリン分泌の強力な刺激、および血液からのグルコースのより迅速な除去をもたらす。結果として、グルコース耐性が改善される。
【００１７】
したがって、炭水化物および脂質代謝の異常、糖尿および糖尿病性ケトアシドーシスを含む真性糖尿病に関連した代謝異常、ならびに持続性の上昇した循環グルコース濃度の結果である微小血管疾患および巨大血管疾患、多発性神経障害および糖尿病性網膜症のような長期変質は防止または軽減され、特に高血圧レベルが減少される。
【００１８】
本発明は、血中グルコースの上昇した濃度および上昇した血圧レベルを低下させるための新規アプローチである。本発明は、簡素で商業的に有用であり、かつ特に上昇されたかまたは異常な血中グルコースおよび／または血圧レベルにより引き起こされるヒト疾患の療法で使用されるのに適している。
【００１９】
添付の図面を参照して、本発明はさらに理解され得る。
本発明の目的は、血中グルコースおよび／または血圧のレベルを低下させる簡素かつ新規方法であり、ここで酵素のエフェクターにより誘導される哺乳類の血中の酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶすなわちＣＤ２６）の活性またはＤＰＩＶ様酵素活性の減少が内因性（または外因的に投与された）インスリン向性ペプチドである胃阻害性ポリペプチド１〜４２（ＧＩＰ1-42）およびグルカゴン様ペプチドアミド−１  ７〜３６（ＧＬＰ−１7-36）（またはこれらのペプチドの類縁体）の分解の減少により引き起こされる。したがって、一般にＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素による分解に起因するこれらのペプチドまたはそれらの類縁体の濃度の低下は、減少または遅延される。
【００２０】
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの哺乳類の身体におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶすなわちＣＤ２６）の酵素活性またはＤＰＩＶ様酵素活性の減少が、改善されたグルコース耐性および高血圧の減少をもたらすという目覚しい見解に基づく。
【００２１】
本発明者等は以下の事項を観察した：
１．ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶすなわちＣＤ２６）またはＤＰＩＶ様酵素活性の減少が、グルコース刺激性の内因的に放出されるまたは外因的に投与されるインクレチン（またはそれらの類縁体）の安定性の増加を引き起こし、その結果、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様タンパク質のエフェクターの投与を用いて、循環中のインクレチン分解を制御することができること、
２．インクレチン（またはそれらの類縁体）の増強された生物学的安定性が、インスリン応答の変更をもたらすこと、
３．ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶすなわちＣＤ２６）またはＤＰＩＶ様酵素の減少により引き起こされる循環インクレチンの増強された安定性が、インスリン誘導性グルコース廃棄の続く変更をもたらし、ＤＰＩＶエフェクターを適用することによりグルコース耐性を改善することができることを示すこと、
４．高血圧レベルが減少されること。
【００２２】
したがって、本発明は、臨床上不適切な基底および食後高血糖症および血圧レベルを示す哺乳類において見られるような上昇した血中グルコースおよび／または血圧レベルを低下させるための、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）またはＤＰＩＶ様酵素活性のエフェクターの使用に関する。本発明による使用は、より具体的には、糖尿、高脂血症、糖尿病性ケトアシドーシス、糖尿病性網膜症および真性糖尿病のような哺乳類の代謝の病理学的異常の防止または軽減におけるＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素活性のエフェクターの投与を特徴とする。さらなる好ましい実施態様では、本発明は、治療上有効な量のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）またはＤＰＩＶ様酵素活性のエフェクターをかかる治療を必要とする哺乳類へ投与することを含む、臨床上不適切な基底および食後高血糖症を示す哺乳類において見られるような哺乳類の上昇した血中グルコースを低減させる方法に関する。
【００２３】
別の好ましい実施態様では、本発明は、臨床上不適切な基底および食後高血糖症を示す哺乳類において見られるような哺乳類の上昇した血中グルコースおよび／または血圧レベルを低下させる方法において使用するためのジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）またはＤＰＩＶ様酵素活性のエフェクターに関する。
【００２４】
本発明によるＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素の投与されるエフェクターは、酵素阻害剤、基質、偽基質、ＤＰＩＶ遺伝子発現の阻害剤、標的酵素タンパク質の結合タンパク質または抗体として、あるいはかかる種々の化合物の組合せとして、哺乳類においてＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様タンパク質濃度または酵素活性を減少させる薬学的組成物中で使用され得る。本発明によるエフェクターは、例えば、アラニルピロリジド、イソロイシルチアゾリジンならびに偽基質Ｎ−バリルプロリル，Ｏ−ベンゾイルヒドロキシルアミンとしてのジペプチド誘導体またはジペプチド擬似体のようなＤＰＩＶ阻害剤である。かかる化合物は、文献［DEMUTH, H.-U., セリンおよびシステインプロテアーゼの不可逆的阻害における最近の開発(Recent developments in the irreversible inhibition of serine and cyctein proteases). J. Enzyme Inhibition 3, 249 (1990)］中で既知であるか、あるいは文献中に記載される方法に従って合成され得る。
【００２５】
本発明による方法は、哺乳類の血中の上昇した循環グルコース濃度の減少に対する、および高血圧レベルの減少に対する新規アプローチである。
【００２６】
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ）阻害の分野に、特に、哺乳類における高血圧レベルまたは関連障害を低減するためのＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の阻害剤の新規使用に、ならびに上記化合物を含有する薬学的組成物に関する。
【００２７】
当該技術分野における他の提唱される方法と対比して、本発明は特に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの低分子量阻害剤による経口的に利用可能な療法を提供する。本発明は、哺乳類における血圧レベルまたは関連障害を低減させるための新規アプローチを表す。本発明は、利用しやすいく、商業的に有用であり、かつ特にヒトの疾患に関する療法レジメンで使用するのに適切である。
【００２８】
これらの見解に基づいて、本発明による血圧におけるＤＰＩＶ発現および酵素活性の役割の研究により、ＤＰＩＶ阻害剤の経口投与が血圧レベルの低下をもたらすことが明らかとなった。
【００２９】
本発明の目標は、高いバイオアベイラビリティを示すジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤および／またはリガンドの開発である。別の好ましい実施態様では、本発明は、標的組織において正確に予測可能な活性時間を有するＤＰＩＶ阻害剤を提供する。
【００３０】
経口的に利用可能な低分子量作用物質の例は、一般式Ａ−Ｂ−Ｃ（式中、Ａはアミノ酸を表し、ＢはＡとＣとの間の化学結合またはアミノ酸を表し、Ｃは、それぞれジペプチジルペプチダーゼＩＶの不安定または安定阻害剤を表す）を有する安定および不安定ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤のプロドラッグである。プロドラッグは、ＷＯ９９／６７２４８号およびＷＯ９９／６７２７９号に記載されており、プロドラッグの供給、定義、使用および生産に関するそれらの教示は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。特にＡ、ＢおよびＣの詳細な定義は、参照により本明細書に援用される。
【００３１】
本発明は、酵素ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＩＶすなわちＣＤ２６）の活性またはＤＰＩＶ様酵素活性の減少、あるいはＤＰＩＶ特異的リガンドの結合が、酵素のエフェクターにより誘導される哺乳類の生物における有益な効果を発揮し、因果関係の結果として、哺乳類の血圧の減少を引き起こす新規方法に関する。結果として、血圧が増大した哺乳類は、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素活性の阻害剤による治療から利益を得る。
【００３２】
本発明による方法および使用は、ＤＰＩＶまたは関連酵素活性を、これらの酵素の阻害剤またはリガンドを用いて阻害することにより、ヒトを含む動物における増大した血圧を防止すること、あるいは血圧および関連障害を低減させることを含む。ＤＰＩＶ阻害剤の経口投与は、ほとんどの状況で好ましくあり得る。
【００３３】
ここで、減少されたＤＰＩＶ様活性および／または結合の血圧および血中グルコース低減作用に焦点を当てた以下の例を参照して、本発明について説明する。
【００３４】
１つの例示的実施態様では、本発明は、これ以降ジペプチド様化合物と称されるアミノ酸およびチアゾリジンまたはピロリジン基から形成されるジペプチド様化合物およびジペプチド化合物に類似した化合物ならびにそれらの塩の使用に関する。好ましくは、アミノ酸とチアゾリジンまたはピロリジン基はアミド結合で結合される。
【００３５】
アミノ酸は好ましくは、例えばロイシン、バリン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、イソロイシン、アスパラギンおよびアスパラギン酸のような天然アミノ酸から選択されるジペプチド化合物が、本発明による目的に特に適切である。
【００３６】
本発明による使用されるジペプチド様化合物は、１０μＭの（ジペプチド化合物の）濃度で、少なくとも１０％、特に少なくとも４０％のジペプチジルペプチダーゼＩＶの活性またはＤＰＩＶ類似酵素活性の減少を示す。少なくとも６０％または少なくとも７０％の活性の減少も必要とされる場合が多い。好ましいエフェクターはまた、最大２０％または３０％の活性の減少を示し得る。
【００３７】
好ましい化合物は、Ｎ−バリルプロリル，Ｏ−ベンゾイルヒドロキシルアミン、アラニルピロリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジンおよびそれらの塩（特に、フマル酸塩）のようなイソロイシルチアゾリジン、ならびにＬ−アロ−イソロイシルピロリジンおよびその塩である。特に好ましい化合物は、下記式１および２を有するグルタミニルピロリジンおよびグルタミニルチアゾリジンである：
【００３８】
【化８】
2005505531.tif 000002
【００３９】
さらに好ましい化合物を表１に挙げる。
ジペプチド様化合物の塩は、１：１又は２：１のジペプチド（類縁体）構成成分対塩構成成分のモル比で存在し得る。かかる塩は、例えば(Ｉｌｅ−Ｔｈｉａ)2フマル酸である。
【００４０】
【表１】
2005505531.tif 000003
【００４１】
他の好ましい実施態様において、本発明は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ触媒の競合調整に有用な式３：
【００４２】
【化９】
2005505531.tif 000004
【００４３】
（式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは独立してタンパク形成性（proteinogenic）アミノ酸、非タンパク形成性（non-proteinogenic）アミノ酸およびＤ−アミノ酸を含む任意のアミノ酸部分であり、式中、Ｅおよび／またはＤはなくても良い。
式（３）に関するさらなる条件：
Ａは、Ｄ−アミノ酸を除くアミノ酸であり、
Ｂは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸、ピペコリン酸を除き、かつＮ−アルキル化アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン）を除く任意のアミノ酸であり、
Ｄは、任意のアミノ酸であるか、または欠如しており、かつ
Ｅは、任意のアミノ酸であるか、または欠如しているか、あるいは
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸、ピペコリン酸を除き、Ｎ−アルキル化アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン）を除き、かつＤ−アミノ酸を除く任意のアミノ酸であり、
Ｄは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸およびピペコリン酸から選択される任意のアミノ酸であり、かつ
Ｅは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−(２)−カルボン酸、ピペコリン酸を除き、かつＮ−アルキル化アミノ酸（例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン）を除く任意のアミノ酸である）
のペプチド化合物の使用を提供する。
【００４４】
本発明で使用することができるアミノ酸例は、ＬおよびＤ−アミノ酸、Ｎ−メチル−アミノ酸、ＩｌｅおよびＴｈｒのアロおよびトレオ形態であり、例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸またはω−アミノ酸であり得て、それらのうちα−アミノ酸が好ましい。
【００４５】
請求項および説明中のアミノ酸の例としては、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、及びシステイン（Ｃｙｓ）；スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ），アラニン（Ａｌａ），プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、β−アラニン（β−Ａｌａ）、２−アミノオクタン酸（Ａｏａ）、アゼチジン−(２)−カルボン酸（Ａｃｅ）、ピペコリン酸（Ｐｉｐ）、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸等；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモアルギニン（Ｈａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ブチル−Ａｌａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ブチル−Ｇｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅｌｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）、及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；アセチル−Ｌｙｓ；ホスホリル−セリン（Ｓｅｒ（Ｐ））、ベンジル−セリン（Ｓｅｒ（Ｂｚｌ））、及びホスホリル−チロシン（Ｔｙｒ（Ｐ））等の変性アミノ酸；２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、アミノエチルシステイン（ＡＥＣｙｓ）、カルボキシメチルシステイン（Ｃｍｃ）、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）、デヒドロアミノ−２−酪酸（Ｄｈｂ）、カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、シス−ヒドロキシプロリン（ｃｉｓＨｙｐ）、トランス−ヒドロキシプロリン（トランスＨｙｐ）、イソバリン（Ｉｖａ）、ピログルタミン酸（Ｐｙｒ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、２−アミノ安息香酸（２−Ａｂｚ）、３−アミノ安息香酸（３−Ａｂｚ）、４−アミノ安息香酸（４−Ａｂｚ）、４−（アミノメチル）安息香酸（Ａｍｂ）、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（４−Ａｍｃ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、２−アミノ−４−シアノ酪酸（Ｃｂａ）、シクロアルカン−カルボン酸、が挙げられる。
【００４６】
ω−アミノ酸としては、例えば５−Ａｒａ（アミノライリン酸(aminoraieric acid)）、６−Ａｈｘ（アミノヘキサン酸）、８−Ａｏｃ（アミノオクタン酸）、９−Ａｎｃ（アミノバン酸）、１０−Ａｄｃ（アミノデカン酸）、１１−Ａｕｎ（アミノウンデカン酸）、及び１２−Ａｄｏ（アミノドデカン酸）が挙げられる。
【００４７】
別のアミノ酸としては、インダニルグリシン（Ｉｇｌ）、インドリン−２−カルボン酸（Ｉｄｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、（２−Ｎａｌ）、４−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＨ2））、４−ベンゾイルフェニルアラニン（Ｂｐａ）、ジフェニルアラニン（Ｄｉｐ）、４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｂｒ））、２−クロロフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（２−Ｃｌ））、３−クロロフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（３−Ｃｌ））、４−クロロフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、３，４−クロロフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（３，４−Ｃｌ2））、３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、３，４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３，４−Ｆ2））、ペンタフルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｆ5））、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−グアニジノ））、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）、３−ジョドフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｊ））、４−ジョドフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｊ）、４−メチルフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｍｅ）），４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ２））、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、４−ホスホノメチルフェニルアラニン（Ｐｍｐ）、シクロヘキシグリシン（Ｇｈｇ）、３−ピリジニルアラニン（３−Ｐａｌ）、４−ピリジニルアラニン（４−Ｐａｌ）、３，４−デヒドロプロリン（Ａ−Ｐｒｏ）、４−ケトプロリン（Ｐｒｏ（４−Ｋｅｔｏ））、チオプロリン（Ｔｈｚ）、イソニペコチン酸（Ｉｎｐ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、プロパルギルグリシン（Ｐｒａ）、６−ヒドロキシノルロイシン（ＮＵ（６−ＯＨ））、ホモチロシン（ｈＴｙｒ）、３−ジョドチロシン（Ｔｙｒ（３−Ｊ））、３，５−ジジョドチロシン（Ｔｙｒ（３，５−Ｊ2））、ジ−メチル−チロシン（Ｔｙｒ（Ｍｅ））、３−ＮＯ2−チロシン（Ｔｙｒ（３−ＮＯ2））、ホスホチロジン（Ｔｙｒ（ＰＯ3Ｈ2））、アルキルグリシン、１−アミノインダン−１−カルボン酸、２−アミノインダン−２−カルボン酸（Ａｉｃ）、４−アミノ−メチルピロール−２−カルボン酸（Ｐｙ）、４−アミノ−ピロリジン−２−カルボン酸（Ａｂｐｃ）、２−アミノテトラリン−２−カルボン酸（Ａｔｃ）、ジアミノ酢酸（Ｇｌｙ（ＮＨ2））、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソイノール−カルボン酸（Ｄｉｓｃ）、ホモシクロヘキシルアラニン（ｈＣｈａ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ  ｏｄｅｒ  Ｈｏｆ）、トランス−３−フェニル−アゼチジン−２−カルボン酸、４−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、３−ピリジルアラニン（３−Ｐｙａ）、４−ピリジルアラニン（４−Ｐｙａ）、スチリルアラニン、テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸（Ｔｉｑ）、１，２，３，４−テトラヒドロノルハルメイン−３−カルボン酸（Ｔｐｉ）、及びβ−（２−チエニル）−アラニン（Ｔｈａ）が挙げられる。
【００４８】
遺伝子コードでコードされるアミノ酸に代わる他のアミノ酸置換もまた、本発明の範囲内のペプチド化合物に包含することができ、この一般スキーム内に分類することができる。
【００４９】
タンパク質形成性アミノ酸は、天然タンパク質由来のα−アミノ酸として定義される。非タンパク質形成性アミノ酸は、他のアミノ酸すべてとして定義され、これらは一般的な天然タンパク質の構成単位ではない。
【００５０】
得られたペプチドは、遊離Ｃ末端酸としてまたはＣ末端アミドの形態として合成され得る。遊離酸ペプチドまたはアミドは、側鎖修飾によって変えられ得る。このような側鎖修飾としては、ホモセリン形成、ピログルタミン酸形成、ジスルフィド結合形成、アスパラギンまたはグルタミン残基のアミド分解、メチオニンのメチル化、ｔ−ブチル化、ｔ−ブチルオキシカルボニル化、４−メチルベンジル化、チオアニシル化、チオクレゾール化、ベンシルオキシメチル化、４−ニトロフェニル化、ベンシルオキシカルボニル化、２−ニトロベンコイル化、２−ニトロスルフェニル化、４−トルエンスルホニル化、ペンタフルオフェニル化、ジフェニルメチル化、２−クロロベンジルオキシカルボニル化、２，４，５−トリクロロフェニル化、２−ブロモベンジルオキシカルボニル化、９−フルロエニルメチルオキシカルボニル化、トリフェニルメチル化、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル化、水酸化、メチオニンの酸化、アスパラギン酸またはグルタミン酸のホルミル化、アセチル化、アニシル化、ベンシル化、ベンコイル化、トリフルオアセチル化、カルボキシル化、ペントース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、ヘキソースまたはＮ−アセチルヘキサミンによるリン酸エステル化、硫酸化、システイニル化、グリコシル化、ファルネシル化、ミリストイル化、ビオチン化、パルミトイル化、ステアロイル化、ゲラニルゲラニル化、グルタチオニル化、５’−アデノシル化、ＡＤＰ−リボシル化、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ピリドキサルリン酸、リポ酸、４’−ホスホパンテテインまたはＮ−ヒドロスクシンイミドによる修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
式（３）を有する化合物では、アミノ酸部分Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥはそれぞれ、標準的な用語法に従って通常の様式でアミド結合により隣接部分に結合され、その結果、アミノ酸（ペプチド）のアミノ末端（Ｎ末端）が左側に描かれ、アミノ酸（ペプチド）のカルボキシル末端（Ｃ末端）が右側に描かれる。
【００５２】
本出願人等による本発明に至るまで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプロリン特異的セリンプロテアーゼジペプチジルペプチダーゼＩＶの既知のペプチド基質は、トリペプチドジプロチンＡ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）、ジプロチンＢ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ）およびジプロチンＣ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）である。本出願人等は予期せぬことに、上記および下記の本明細書中に開示する化合物が、競合触媒により哺乳類においてｉｎ  ｖｉｖｏでジペプチジルペプチダーゼＩＶの基質として作用し、薬理学的用量で血圧を低下させ、糖尿、高脂血症、代謝性アシドーシスおよび真性糖尿病のような哺乳類の代謝の病理学的異常を軽減することを発見した。
【００５３】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素のモジュレーターとして有用な本発明の特に好ましい化合物としては、Ｗｉｓｔａｒラットへのｉ．ｖ．および／またはｐ．ｏ．投与後にｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＰＩＶ阻害において効果的にＤＰＩＶ結合に関するＫi値を示す化合物が挙げられる。
【００５４】
さらに好ましい化合物は、式４：
【００５５】
【化１０】
2005505531.tif 000005
【００５６】
（式中、
Ａは、以下の：
【００５７】
【化１１】
2005505531.tif 000006
【００５８】
から選択され、
Ｘ1は、Ｈ、あるいは全アミノ酸およびペプチド残基を含むアシルもしくはオキシカルボニル基であり、
Ｘ2は、Ｈ、−(ＣＨ)n−ＮＨ−Ｃ5Ｈ3Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）またはＣ5Ｈ3Ｎ−Ｙ（二価ピリジル残基）であり、かつＹは、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ2またはＣＮから選択され、
Ｘ3は、Ｈ、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたフェニルあるいはピリジル残基であり、
Ｘ4は、Ｈ、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたフェニルあるいはピリジル残基であり、
Ｘ5は、Ｈ、あるいはアルキル、アルコキシまたはフェニル残基であり、
Ｘ6は、Ｈまたはアルキル残基であり、
ｎ＝１に関して、
Ｘは、Ｈ、ＯＲ2、ＳＲ2、ＮＲ2Ｒ3、Ｎ+Ｒ2Ｒ3Ｒ4（ここで、
Ｒ2は、無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたアシル残基、あるいはすべてのアミノ酸およびペプチド残基、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたアルキル残基を表し、
Ｒ3は、アルキルおよびアシル官能基を表し、ここでＲ2およびＲ3は、飽和および不飽和炭素環式もしくは複素環式構造の１つまたは複数の環構造の一部であってもよく、
Ｒ4は、アルキル残基を表し、ここでＲ2およびＲ4またはＲ3およびＲ4は、飽和および不飽和炭素環式もしくは複素環式構造の１つまたは複数の環構造の一部であってもよい）
から選択され、
ｎ＝０に関して、
Ｘは、以下の：
【００５９】
【化１２】
2005505531.tif 000007
【００６０】
（式中、
Ｂは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ5（ここで、Ｒ5は、Ｈ、アルキリデンまたはアシルである）を表し、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈは独立して、無置換および置換のアルキル、オキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、カルボニルアルキル、アシル、カルバモイル、アリールおよびヘテロアリール残基から選択される）
から選択され、
ｎ＝０およびｎ＝１に関して、
Ｚは、Ｈ、あるいはＣ1〜Ｃ9の分岐鎖もしくは単鎖アルキル残基またはＣ2〜Ｃ9の分岐鎖もしくは単鎖アルケニル残基、Ｃ3〜Ｃ8のシクロアルキル残基、Ｃ5〜Ｃ7のシクロアルケニル残基、アリールまたはヘテロアリール残基、あるいはすべての天然アミノ酸もしくはそれらの誘導体のすべての側鎖から選択される側鎖から選択される）
のペプチジルケトン（それらのすべての立体異性体および薬学的に許容可能な塩を包含する）である。
【００６１】
さらに、本発明によれば、それらのすべての立体異性体および薬学的に許容可能な塩を包含する式５、６、７、８、９、１０および１１の化合物：
【００６２】
【化１３】
2005505531.tif 000008
【００６３】
（式中、
Ｒ1は、Ｈ、分岐状もしくは線状Ｃ1〜Ｃ9アルキル残基、分岐状もしくは線状Ｃ2〜Ｃ9アルケニル残基、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル残基、Ｃ5〜Ｃ7シクロアルケニル残基、アリール残基またはヘテロアリール残基、あるいは天然アミノ酸またはそれらの誘導体の側鎖であり、
Ｒ3およびＲ4は独立して、Ｈ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノまたはハロゲンであり、
Ａは、Ｈ、またはＣＮ、ＳＯ3Ｈ、ＣＯＮＨＯＨ、ＰＯ3Ｒ5Ｒ6、テトラゾール、アミド、エステル、酸無水物、チアゾールおよびイミダゾールから選択される官能基のような炭酸の同配体であり、
Ｂは、以下の：
【００６４】
【化１４】
2005505531.tif 000009
【００６５】
（式中、
Ｒ5は、Ｈ、−(ＣＨ)n−ＮＨ−Ｃ5Ｈ3Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）およびＣ5Ｈ3Ｎ−Ｙ（二価ピリジル残基）（Ｙ＝Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ2またはＣＮ）であり、
Ｒ10は、Ｈ、アシル、オキシカルボニルまたはアミノ酸残基であり、
Ｗは、Ｈ、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｗ1は、Ｈ、アルキル、アルコキシまたはフェニル残基であり、
Ｚは、Ｈ、あるいは無置換であるかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｚ1は、Ｈまたはアルキル残基である）
から選択され、
Ｄは、環式Ｃ4〜Ｃ7アルキル、Ｃ4〜Ｃ7アルケニル残基（これらは、無置換であり得るかまたは１つ、２つもしくは複数のアルキル基で置換され得る）または環式４〜７員環ヘテロアルキル残基もしくは環式４〜７員環へテロアルケニル残基であり、
Ｘ2は、Ｏ、ＮＲ6、Ｎ+(Ｒ7)2またはＳであり、
Ｘ3〜Ｘ12は独立して、ＣＨ2、ＣＲ8Ｒ9、ＮＲ6、Ｎ+(Ｒ7)2、Ｏ、Ｓ、ＳＯおよびＳＯ2（すべての飽和および不飽和構造を含む）から選択され、
Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9は独立して、Ｈ、分岐状もしくは線状Ｃ1〜Ｃ9アルキル残基、分岐状もしくは線状Ｃ2〜Ｃ9アルケニル残基、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル残基、Ｃ5〜Ｃ7シクロアルケニル残基、アリール残基またはヘテロアリール残基から選択され、
但し、
式６：ＡがＨでない場合、Ｘ6はＣＨであり、
式７：ＡがＨでない場合、Ｘ10はＣであり、
式８：ＡがＨでない場合、Ｘ7はＣＨであり、
式９：ＡがＨでない場合、Ｘ12はＣである）
が開示され、使用され得る。
【００６６】
説明および特許請求の範囲全体にわたって、「アシル」という表現は、Ｃ1-20アシル残基、好ましくはＣ1-8アシル残基を意味することができ、Ｃ1-4アシル残基が特に好ましく、「シクロアルキル」は、Ｃ3-12シクロアルキル残基、好ましくはＣ4、Ｃ5またはＣ6シクロアルキルを意味することができ、「炭素環式化合物」は、Ｃ3-12炭素環式化合物残基、好ましくはＣ4、Ｃ5またはＣ6炭素環式化合物残基を意味することができる。「ヘテロアリール」は、１〜４個、好ましくは１個、２個または３個の環原子がＮ、ＳまたはＯのようなヘテロ原子で置き換えられたアリール残基として定義される。「複素環式化合物」は、１個、２個または３個の環原子がＮ、ＳまたはＯのようなヘテロ原子で置き換えられたシクロアルキル残基として定義される。「ペプチド」は、ジペプチドからデカペプチドまでから選択され、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドおよびペンタペプチドが好ましい。「ペプチド」形成のためのアミノ酸は、上記に列挙したアミノ酸から選択することができる。
【００６７】
体内における、ＤＰＩＶ、ＤＰＩＶ活性およびＤＰＩＶ関連タンパク質を包含する多種多様なメカニズムにおけるタンパク質の広範な分布により、ＤＰＩＶによる全身療法（経腸または非経口投与）は一連の望ましくない副作用を生じ得る。
【００６８】
さらに、解決すべき課題は、局部的に限定された病態生理学的および生理学的プロセスの標的化された影響付与に使用することができる化合物を提供することであった。本発明の課題は、特に局部的に活性な基質の活性の調節における標的化された介入の目的で、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ類似活性の局部的に限定された阻害を獲得することに存する。
本発明によれば、下記一般式（１２）：
【００６９】
【化１５】
2005505531.tif 000010
【００７０】
（式中、
Ａは、側鎖に少なくとも１種の官能基を有するアミノ酸であり、
Ｂは、Ａの側鎖の少なくとも１種の官能基に共有結合された化学化合物であり、
Ｃは、Ａにアミド結合されたチアゾリジン、ピロリジン、シアノピロリジン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリンまたはピペリジン基である）
の化合物により、この問題は解決される。
【００７１】
上記化合物は、例えば、血管の内皮においてＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素に作用することにより、血圧を減少させるのに使用することができる。
【００７２】
本発明の好ましい実施態様によれば、一般式（１２）を有する少なくとも１つの化合物および作用部位に適切な少なくとも１つの慣例の補助薬を含む薬学的組成物が使用される。
【００７３】
好ましくは、Ａは、トレオニン、チロシン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインである側鎖に１つ、２つ、またはそれ以上の官能基を有するα−アミノ酸、特に天然α−アミノ酸である。
【００７４】
好ましくは、Ｂは、最大２０個のアミノ酸の鎖長を有するオリゴペプチド、最大２００００ｇ／ｍｏｌの分子質量を有するポリエチレングリコール、８〜５０個の炭素原子を有する任意に置換された有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物である。
【００７５】
説明および特許請求の範囲全体にわたって、「アルキル」という表現は、Ｃ1-50アルキル基、好ましくはＣ6-30アルキル基、特にＣ8-12アルキル基を意味することができ、例えば、アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはブチル基であってもよい。例えば「アルコキシ」という表現の「アルコ」という表現、および例えば「アルカノイル」という表現の「アルカノ」という表現は、「アルキル」に関する場合として定義される。芳香族化合物は、好ましくは置換もしくは任意に無置換のフェニル、ベンジル、ナフチル、ビフェニルまたはアントラセン基として定義され、それらは好ましくは少なくとも８個のＣ原子を有する。「アルケニル」という表現は、Ｃ2-10アルケニル基、好ましくはＣ2-6アルケニル基を意味することができ、それらは任意の所望の位置で二重結合（単数または複数）を有し、また置換されてもよく、あるいは無置換であってもよい。「アルキニル」という表現は、Ｃ2-10アルキニル基、好ましくはＣ2-6アルキニル基を意味することができ、それらは任意の所望の位置で三重結合（単数または複数）を有し、また置換されてもよく、あるいは無置換であってもよい。「置換」または置換基という表現は、１つまたは複数、好ましくは１つまたは２つのアルキル、アルケニル、アルキニル、一価もしくは多価アシル、アルカノイル、アルコキシアルカノイルまたはアルコキシアルキル基による任意の所望の置換を意味することができる。上述の置換基は続いて、１つまたは複数の（しかし、好ましくはゼロ）アルキル、アルケニル、アルキニル、一価もしくは多価アシル、アルカノイル、アルコキシアルカノイルまたはアルコキシアルキル基を側鎖として有してもよい。それぞれ８〜５０個のＣ原子、好ましくは１０〜２０個のＣ原子を有する有機アミン、アミド、アルコールまたは酸は、式(アルキル)2Ｎ−またはアルキル−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｎ(アルキル)2または−ＣＯ−ＮＨ(アルキル)、−アルキル−ＯＨまたは−アルキル−ＣＯＯＨを有することができる。
【００７６】
伸長した側鎖官能基にも関わらず、式（１２）を有する化合物は、依然として酵素ジペプチジルペプチダーゼＩＶおよび類似酵素の活性中心に結合することができるが、もはやペプチド輸送体ＰｅｐＴ１により活発に輸送されない。本発明による化合物の得られた減少した輸送性または大いに制限された輸送性は、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の局部阻害または部位特異的阻害を招く。
【００７７】
本発明により使用される式（１２）を有する化合物または他の化合物およびプロドラッグは、それぞれ、ラセミ体の形態でまたはエナンチオマー的に純粋な化合物の形態で、好ましくは式（１２）のＡ部分に関してＬ−トレオまたはＬ−アロ形態で、存在し得るか、あるいは使用され得る。
【００７８】
したがって、側鎖修飾を伸長／拡大すること（例えば、７個以上の炭素原子数）により、輸送性の劇的な減少を獲得することが可能である（実施例１２を参照）。表１２．１の実施例は、側鎖の空間的大きさを増大させるにつれ、物質の輸送性の減少が見られることを明らかに示す。側鎖を空間的および立体的に拡大すること（例えば、一置換フェニル基、ヒドロキシルアミン基またはアミノ酸残基の原子団の大きさを超える）により、本発明によれば、標的物質の輸送性を改質または抑制することが可能である。
【００７９】
本発明によれば、式（１２）を有する化合物は、部位特異的様式で哺乳類の身体においてＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様活性を阻害する。したがって、効果的かつ劇的に減少した副作用で、局部生理学的および病態生理学的状態（炎症、乾癬、関節炎、自己免疫疾患、アレルギー、癌、転移、血管の内皮における血圧）に影響を及ぼすことが可能である。
【００８０】
式（１２）を有する好ましい化合物は、オリゴペプチドが３〜１５、特に４〜１０のアミノ酸鎖長を有し、かつ／またはポリエチレングリコールが少なくとも２５０ｇ／ｍｏｌ、好ましくは少なくとも１５００ｇ／ｍｏｌから最大１５０００ｇ／ｍｏｌまでのモル質量を有し、かつ／または任意に置換された有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物が少なくとも１２個の炭素原子、好ましくは最大３０個の炭素原子を有する化合物である。
【００８１】
本発明の化合物は、酸付加塩、特に薬学的に許容可能な酸付加塩に変換して、酸付加塩、特に薬学的に許容可能な酸付加塩として使用することができる。薬学的に許容可能な塩は概して、アミノ酸塩基性側鎖が無機塩または有機塩でプロトン化された形態をとる。代表的な有機塩または無機塩としては、塩化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸またはトリフルオロ酢酸が挙げられる。式（１）〜（１２）を有する化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩形態はすべて、本発明の範囲により包含されると意図される。
【００８２】
遊離化合物とそれらの塩の形態の化合物との間の密接な関係を考慮すれば、化合物が本状況において言及される場合はいつでも、相当する塩がその状況下で可能または適切である場合には相当する塩もまた意図される。
【００８３】
本発明はさらに、その範囲内に本明細書中に提供する化合物のプロドラッグを包含する。一般に、かかるプロドラッグは、ｉｎ  ｖｉｖｏで所望の治療上活性な化合物に容易に変換可能な化合物の機能性誘導体である。したがって、これらの場合では、本発明の使用は、特許請求した化合物の１つまたは複数のプロドラッグ型による記載の様々な障害の治療を包含するが、プロドラッグ型は、被験体に投与した後にｉｎ  ｖｉｖｏで上記指定化合物へと変換する。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製に関する従来の手順は、例えば、「プロドラッグの設計(Design of Prodrugs)」, ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985ならびに特許出願ＤＥ１９８  ２８  １１３号およびＤＥ  １９８  ２８  １１４号
（これらは、完全に参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【００８４】
本発明による化合物またはプロドラッグが少なくとも１つのキラル中心を有する場合、本発明による化合物またはプロドラッグはしたがって、エナンチオマーとして存在し得る。本発明による化合物またはプロドラッグが２つ以上のキラル中心を保有する場合、化合物はさらにジアステレオマーとして存在し得る。かかる異性体およびそれらの混合物はすべて本発明の範囲内に包含されることが理解されよう。さらに、化合物またはプロドラッグの幾つかの結晶形態が多形として存在してもよく、したがって化合物またはプロドラッグは本発明の包含されることが意図される。さらに、化合物の幾つかは、水（すなわち、水和物）または一般的な有機溶媒を伴う溶媒和物を形成してもよく、かかる溶媒和物もまた本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００８５】
化合物（それらの塩を含む）はまた、それらの水和物の形態で得ることができ、あるいはそれらの結晶化に使用した他の溶媒を含むことができる。
【００８６】
上述のように、本発明の化合物およびプロドラッグ、ならびにそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態は、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性を阻害するのに有用である。本発明の化合物およびプロドラッグ、ならびにそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態のＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性を阻害する能力は、実施例７および実施例８に記載するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＫi値およびＩＣ50値の決定のためのＤＰＩＶ活性アッセイを用いて実証され得る。
【００８７】
本発明およびそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態の化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでＤＰＩＶを阻害する能力は、実施例１１に記載するように、Ｗｉｓｔａｒラットへの経口または血管内投与により実証され得る。本発明の化合物は、Ｗｉｓｔａｒラットへの経口投与および血管内投与両方の後に、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＰＩＶ活性を阻害する。
【００８８】
ＤＰＩＶは、多種多様の哺乳類器官および組織、例えば腸の刷子縁(Gutschmidt S. et al., ラット空腸絨毛に沿った刷子縁領域におけるタンパク質内容物の「原位置での」測定およびそれらの４つの酵素活性との相関関係("In situ"- measurements of protein contents in the brush border region along rat jejunal villi and their correlations with four enzyme activities). Histochemistry 1981, 72(3), 467-79)、外分泌上皮、肝細胞、腎細管、内皮、筋線維芽細胞(Feller A.C. et al., ヒト組織においてジペプチジルペプチダーゼＩＶを検出するモノクローナル抗体(A monoclonal antibody detecting dipeptidylpeptidase IV in human tissue). Virchows Arch. A. Pathol. Anat. Histopathol. 1986; 409(2):263-73)、神経細胞、ある特定の表面上皮（例えば、ファローピウス管、子宮および精嚢腺）の、例えば精嚢腺上皮の管腔細胞質における、およびブルンナー腺の粘液細胞における外側膜(Hartel S. et al., ラット器官におけるジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶ。免疫組織化学および活性組織化学の比較(Dipeptidyl peptidase (DPP) IV in rat organs. Comparison of immunohistochemistry and activity histochemistry). Histochemistry 1988; 89 (2): 151-61)、生殖器官（例えば、精巣上体尾および膨大部、精嚢およびそれらの分泌物(Agrawal & Vanha-Perttula, ウシ生殖器官および分泌物中のジペプチジルペプチダーゼ(Dipeptidyl peptidases in bovine reproductive organs and secretions). Int. J. Androl. 1986, 9(6):435-52)に存在する。ヒト血清では、２つの分子形態のジペプチジルペプチダーゼが存在する(Krepela E. et al., 正常ヒト血清中の２つの分子形態のジペプチジルペプチダーゼＩＶの実証(Demonstration of two molecular forms of dipeptidyl peptidase IV in normal human serum). Physiol. Bohemoslov. 1983, 32(6):486-96)。血清高分子量形態のＤＰＩＶは、活性化Ｔ細胞の表面上で発現される(Duke-Cohan J.S. et al., 血清高分子量ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＣＤ２６）は活性化Ｔ細胞から放出される新規抗原ＤＰＰＴ−Ｌに類似している(Serum high molecular weight dipeptidyl peptidase IV(CD26) is similar to a novel antigen DPPT-L released from activated T cells). J. Immunol. 1996, 156(5): 1714-21)。
【００８９】
本発明の化合物およびプロドラッグ、ならびにそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＰＩＶを阻害することができる。本発明の一実施態様では、すべての哺乳類組織および器官由来のＤＰＩＶのすべての分子形態、相同体およびエピトープ（これらのうち依然として未知であるものも（含む））は、本発明の範囲に包含されると意図される。
【００９０】
プロリン特異的プロテアーゼの希少群の中で、ＤＰＩＶはもともとポリペプチド鎖のアミノ末端にある末端から２番目の残基としてプロリンに特異的な唯一の膜結合酵素であると考えられていた。しかしながら、ＤＰＩＶと構造的に非相同的であっても、相当する酵素活性を有する他の分子が最近同定された。今日までに同定されているＤＰＩＶ様酵素は、例えば、線維芽細胞活性化タンパク質α、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ  β、ジペプチジルアミノペプチダーゼ様タンパク質、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジペプチダーゼ、静止細胞プロリンジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＩＩ、アトラクチンおよびジペプチジルペプチダーゼＩＶ関連タンパク質（ＤＰＰ８）であり、Sedo & Malikによる総論に記載されている(Sedo & Malik, , ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様分子：相同タンパク質または相同活性？(Dipeptidyl peptidase IV-like molecules: homologous proteins or homologous activities?) Biochimica et Biophysica Acta 2001, 36506: 1-10)。さらに、ＤＰＩＶ様酵素は、ＷＯ０１／１９８６６号、ＷＯ０２／０４６１０号およびＷＯ０２／３４９００号に開示されている。ＷＯ０１／１９８６６号は、ＤＰＩＶおよび線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）対して構造的および機能的類似性を有する新規ヒトジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＰＰ８）を開示している。ＷＯ０２／０４６１０号のジペプチジルペプチダーゼＩＶ様酵素は当該技術分野で既知である。Gene Bankデータベースでは、この酵素はＫＩＡＡ１４９２として登録されている。本発明の別の好ましい実施態様では、すべての哺乳類組織および器官由来のＤＰＩＶの様酵素活性を含むタンパク質の、すべての分子形態、相同体およびエピトープ（これらのうち依然として開示されていないものも（含む））は、本発明の範囲に包含されると意図される。
【００９１】
本発明の化合物およびプロドラッグ、ならびにそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態の、ＤＰＩＶ様酵素を阻害する能力は、実施例９に記載するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＫi値の決定のための酵素活性アッセイを用いて実証され得る。ブタジペプチジルペプチダーゼＩＩに対する本発明の化合物のＫi値は典型的に、グルタミニルピロリジンについてはＫi＝８．５２*１０-5Ｍ±６．３３*１０-6、およびグルタミニルチアゾリジンについてはＫi＝１．０７*１０-5Ｍ±３．８１*１０-7として決定された。
【００９２】
別の実施態様では、本発明の化合物およびプロドラッグ、ならびにそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態は、非ＤＰＩＶおよび非ＤＰＩＶ様プロリン特異的酵素に対してほんの弱い阻害活性を有するか、そうでなければ阻害活性を全く有さない。実施例１０に記載するように、例としてグルタミルチアゾリジンおよびグルタミニルピロリジンを用いた場合、ジペプチジルペプチダーゼＩおよびプロリルオリゴペプチダーゼの阻害は見られなかった。プロリダーゼに対して、両方の化合物がＤＰＩＶと比較して顕著に低い有効性を示した。プロリダーゼに対するＩＣ５０値は、グルタミニルチアゾリジンについてはＩＣ５０が３ｍＭ未満、およびグルタミニルピロリジンについてはＩＣ５０＝３．４*１０-4Ｍ±５．６３*１０-5として決定された。
【００９３】
本発明は、状態を治療するのに治療上有効な量および投薬レジメンで、本発明の化合物またはそれらの薬学的組成物のいずれかを投与することを含む、治療を必要とする被験体におけるＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素活性の調整により媒介される状態を防止または治療する方法を提供する。さらに、本発明は、被験体におけるＤＰＩＶ活性の調整による媒介される状態の防止または治療用の薬剤の調製のための、本発明の化合物およびプロドラッグ、ならびにそれらの相当する薬学的に許容可能な酸付加塩形態の使用を包含する。上記化合物は、静脈内、経口、皮下、筋内、皮内、非経口およびそれらの組合せを含むがこれらに限定されない任意の従来の投与経路により患者に投与され得る。
【００９４】
さらなる例示的実施態様では、本発明は、薬学的組成物における式１〜１２の化合物ならびにそれらの相当する薬学的に許容可能なプロドラッグおよび酸付加塩形態の配合を提供する。
【００９５】
本明細書中で使用する場合、「被験体」という用語は、治療、観察または実験の対象である動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトを指す。
【００９６】
本明細書中で使用する場合、「治療上有効な量」という用語は、治療される疾患または障害の症状の軽減を包含する、研究者、獣医、医師または他の臨床医により求められる組織系、動物またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する活性な化合物または薬学的作用物質の量を意味する。
【００９７】
本明細書中で使用する場合、「組成物」という用語は、治療上有効な量で特許請求した化合物を含む生成物、ならびに直接的または間接的に特許請求した化合物の組合せから生じる任意の生成物を包含することが意図される。
【００９８】
本発明で使用される薬学的組成物を調製するために、従来の薬学的配合技法に従って、有効成分としての１つまたは複数の式１〜１２を有する化合物またはその相当する薬学的に許容可能なプロドラッグもしくは酸付加塩形態を、薬学的キャリアと緊密に混合し、そのキャリアは、投与（例えば、経口または筋内のような非経口）に望ましい調製物の形態に応じた多種多様の形態をとってもよい。経口投薬形態で組成物を調製する際、通常の薬学的媒質のいずれかを使用してもよい。したがって、例えば懸濁剤、エリキシル剤および液剤のような液体経口調製物に関して、適切なキャリアおよび添加剤としては好適には、水、グリコール、油、アルコール、風味剤、防腐剤、着色剤等が挙げられる。例えば粉末、カプセル、ジェルキャップおよび錠剤のような固体経口調製物に関して、適切なキャリアおよび添加剤としては、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等が挙げられる、投与でのそれらの容易性のために、錠剤およびカプセルは最も好適な経口投与単位形態を表し、これらの場合、固体薬学的キャリアが使用される。望ましい場合、錠剤は、標準的な技法により糖コーティングまたは腸溶コーティングされてもよい。非経口に関して、キャリアは通常、滅菌水を含むが、例えば溶解の助長のような目的で、あるいは防腐のために、他の成分を含んでもよい。
【００９９】
注射可能懸濁液もまた調製されてもよく、この場合、適切な液体キャリア、沈殿防止剤等が使用され得る。本明細書中の薬学的組成物は、１投薬単位（例えば、錠剤、カプセル、粉末、注射、茶匙１杯等）につき、上述のように有効な用量を送達するのに必要な有効成分の量を含有する。本明細書中の薬学的組成物は、１投薬単位（例えば、錠剤、カプセル、粉末、注射、坐剤、茶匙１杯等）につき、約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ（好ましくは、約５〜約５００ｍｇ）を含有し、１日当たり約０．１〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）（好ましくは、１日当たり１〜５０ｍｇ／ｋｇ）の投与量で付与され得る。しかしながら、投与量は、患者の要件、治療される状態の重篤性、および用いられる化合物に応じて様々であり得る。毎日の投与または周期的後服薬のいずれかの使用が用いられ得る。通常、投与量は、患者の性質、彼／彼女の状態および所望の治療効果に基づいて医師により調節される。
【０１００】
好ましくは、これらの組成物は、経口、非経口、鼻内、舌下または直腸投与のために、あるいは吸入または通気による投与のために、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液または懸濁液、定量エーロゾルまたは液体スプレー、ドロップ、アンプル、自己注射器装置または坐剤のような単位投薬形態で存在する。あるいは、組成物は、１週間に１度または１ヶ月に１度の投与に適した形態で提示されてもよく、例えば、活性な化合物の不溶性塩（例えば、デカン酸塩）は、筋内注射用のデポ調製物を提供するように適応され得る。錠剤のような固体組成物を調製するために、主要な有効成分は、薬学的キャリア、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴムのような従来の錠剤生成用成分、および他の薬学的希釈剤、例えば水と理想的には混合されて、本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩の均質な混合物を含有する固体前配合組成物を形成する。これらの前配合組成物を均質であるとする場合、有効成分は理想的には組成物全体にわたって一様に分散され、その結果、組成物は、錠剤、丸剤およびカプセルのような均等に有効な投薬形態に容易に分割され得ることを意味する。続いて、この固体前配合組成物は、約０．０１〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５〜約５００ｍｇの本発明の有効成分を含有する上述の型の単位投薬形態に分割される。
【０１０１】
新規組成物の錠剤または丸剤は好適にコーティングされ得るか、あるいはそうでなければ持続作用の利点をもたらす投薬形態を提供するように配合され得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬および外部投薬構成成分を含むことができ、後者は前者上のエンベロープの形態である。この２つの構成成分は、胃の中での崩壊に抵抗するように作用して、内部構成成分を十二指腸へと無傷で通過させるか、あるいはその放出を遅延させる腸溶層により分離され得る。各種材料が、かかる腸溶層またはコーティングに使用することができ、かかる材料は、シェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料とともに多数の高分子酸を含む。
【０１０２】
本発明の新規組成物が、経口投与用にあるいは注射により好適に組み込まれ得るこの液体形態としては、水溶液、適切に風味付けしたシロップ、水性懸濁液または油性懸濁液、および綿実油、ゴマ油、ヤシ油または落花生油のような食用油を伴う風味付けしたエマルジョン、ならびにエリキシル剤および類似の薬学的賦形剤が挙げられる。水性懸濁液に適切な分散剤または沈殿防止剤としては、合成ゴムおよび天然ゴム、例えばトラガカント、アラビアゴム、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンが挙げられる。
【０１０３】
本発明による化合物の調製プロセスが立体異性体の混合物を生じる場合、これらの異性体は、分取クロマトグラフィのような従来の技法により分離され得る。化合物は、ラセミ形態で調製されてもよく、あるいは個々のエナンチオマーが、エナンチオ特異的合成により、または分割により調製されてもよい。化合物は、例えば、光学的に活性な酸（例えば、（−）−ジ−ｐ−トルオイル−ｄ−酒石酸および／または（＋）−ジ−ｐ−トルオイル−ｌ−酒石酸）を用いた塩形成によるジアステレオマー対の形成、続く分別晶析および遊離塩の再生のような標準的な技法によりそれらの成分のエナンチオマーへと分割され得る。化合物はまた、ジアステレオマーエステルまたはアミドの形成、続くクロマトグラフィ分離およびキラル助剤の除去により分割され得る。あるいは、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割され得る。
【０１０４】
本発明の化合物の調製プロセスのいずれかの間、関連分子のいずれか上の感受性基または反応性基を保護することが必要であるか、かつ／または望ましい場合がある。これは、参照により本明細書中で十分に援用されるProtective Groups in Organic Chemistry, ed. J.F.W. McOmie, Plenum Press, 1973、およびT.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, 1991に記載されるような従来の保護基を用いて達成され得る。保護基は、当該技術分野に既知の方法を用いて、利便性のよい後続のステージで除去され得る。
【０１０５】
本発明に記載されるジペプチジルペプチダーゼＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素より調整される状態を治療する方法もまた、本明細書中に定義するような１つまたは複数の化合物のいずれかおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物を用いて実施され得る。薬学的組成物は、約０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約５〜５００ｍｇの化合物を含有してもよく、また選択される投与様式に適した任意の形態に配合されてもよい。キャリアとしては、結合剤、沈殿防止剤、潤滑剤、風味物質、甘味物質、防腐剤、色素およびコーティングを含むがこれらに限定されない必須かつ不活性な薬学的賦形剤が挙げられる。経口投与に適した組成物としては、丸剤、錠剤、カプレット、カプセル（それぞれ、即時放出、徐放および持続放出配合物を包含する）、顆粒および粉末のような固体形態、ならびに溶剤、シロップ、エリキシル剤、エマルジョンおよび懸濁剤のような液体形態が挙げられる。非経口投与に有用な形態としては、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が挙げられる。
【０１０６】
好適には、本発明の化合物は、単回日用量で投与され得るか、あるいは総日投与量が、１日２回、３回または４回の分割用量で投与され得る。さらに、本発明の化合物は、適切な鼻内デバイスの局所使用による鼻内形態で、あるいは当業者に既知の経皮パッチにより投与することができる。経皮送達系の形態で投与されるためには、投薬投与は当然のことながら、投薬レジメン全体にわたって断続的ではなく連続であり、したがって、投薬強度は、所望の治療効果を得るように変更される必要がある。
【０１０７】
より好ましくは、錠剤またはカプセルの形態の経口投与に関して、活性な薬剤構成成分は、経口用の無毒性の薬学的に許容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水等）と組み合わせることができる。さらに、望ましい場合または必要な場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤もまた混合物に組み込むことができる。適切な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、天然糖（例えば、グルコースまたはβラクトース）、トウモロコシ甘味物質、天然ゴムおよび合成ゴム（例えば、アラビアゴム、トラガカント）、またはオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられるが、これらに限定されない。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、または当該技術分野で既知である他の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
液体形態は、合成ゴムおよび天然ゴム（例えば、トラガカント、アラビアゴム、メチルセルロース等）のような適切な風味付けした沈殿防止剤または分散剤を含んでもよい。非経口投与に関して、滅菌懸濁液および溶液が望ましい。一般に適切な防腐剤を含有する等張調製物は、静脈内投与が望ましい場合に使用される。
【０１０９】
本発明の化合物はまた、小単層ベシクル、大単層ベシクルおよび多層ベシクルのようなリポソーム送達系の形態で投与することができる。リポソームは、当該技術分野で十分に説明されるプロセスを用いてコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンのような各種リン脂質から形成され得る。
【０１１０】
本発明の化合物はまた、ターゲッティング可能な薬剤キャリアとして可溶性ポリマーと連結させてもよい。かかるポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換したポリエチレンオキシドポリリシンを挙げることができる。さらに、本発明の化合物は、薬剤の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラス、例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーに連結されてもよい。
【０１１１】
本発明の化合物は、対処される障害が必要とされる場合はいつでも、上述の組成物のいずれかにおいて、また当該技術分野で確立された投薬レジメンに従って投与され得る。
【０１１２】
生成物の日投与量は、１日につき成人１人当たり０．０１〜１．０００ｍｇの広範囲で変更され得る。経口投与に関して、組成物は、好ましくは、治療されるべき患者への投与量の症状調節のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、１５０、２００、２５０および５００ミリグラムの有効成分を含有する錠剤の形態で提供される。薬剤の有効量は通常、１日につき約０．１ｍｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量レベルで供給される。好ましくは、範囲は、１日につき約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）である。化合物は、１日につき１〜４回のレジメンで投与され得る。
【０１１３】
投与されるべき最適投与量は、当業者により容易に決定され得て、使用する特定の化合物、投与様式、調製物の強度、投与様式に起因するバイオアベイラビリティ、および疾患状態の進行により様々である。さらに、患者の年齢、体重、食事および投与時期を含む治療される特定の患者に関連した要因が、投与量を調節する必要性をもたらす。
【０１１４】
本発明の化合物または組成物は、食前（例えば、飲食の１時間前、３０分前、１５分前または５分前）、食間または食後に摂取され得る。
食間に摂取する場合、本発明の化合物または組成物は、食事に混合され得るか、あるいは上述のように別個の投与形態で摂取され得る。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：ジペプチド様化合物の合成
１．１  イソロイシルチアゾリジン塩の一般的な合成
Ｂｏｃ保護したアミノ酸ＢＯＣ−Ｉｌｅ−ＯＨを酢酸エチル中に入れて、このバッチを約−５℃に冷却する。Ｎ−メチルモルホリンを滴下して、ピバル酸塩化物（実験室スケールで）またはネオヘキサノイル塩化物（パイロットプラントスケールで）を一定温度で滴下する。活性化するために反応を数分間攪拌する。Ｎ−メチルモルホリン（実験室スケール）および塩酸チアゾリジン（実験室スケール）を連続して滴下して、チアゾリジン（パイロットプラントスケール）を添加する。塩溶液を用いて実験室でのワーキングアップが従来の様式で達成され、パイロットプラントスケールでは、ＮａＯＨおよびＣＨ3ＣＯＯＨ溶液でバッチを精製する。
【０１１６】
ＢＯＣ保護基の除去は、ＨＣｌ／ジオキサン（実験室スケール）またはＨ2ＳＯ4（パイロットプラントスケール）を用いて実施する。実験室では、塩酸塩は、ＥｔＯＨ／エーテルから結晶化される。
【０１１７】
パイロットプラントスケールでは、ＮａＯＨ／ＮＨ3の添加により、遊離アミンが調製される。フマル酸を熱エタノール中に溶解して、遊離アミンを滴下して、フマル酸(Ｉｌｅ−Ｔｈｉａ)2（Ｍ＝５２０．７１ｇ／ｍｏｌ）が沈殿する。異性体およびエナンチオマーの分析は電気泳動により実施する。
【０１１８】
１．２  グルタミニルピロリジン遊離塩基の合成
アシル化：
Ｎ−ベンジル−オキシカルボニルグルタミン（２．０２ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ３５ｍｌ中に溶解して、−１５℃にした。混合物中に、ＣＡＩＢＥ（クロロギ酸イソブチル）（０．９３７ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（０．７９５ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を１５分間攪拌した。混合酸無水物の形成をＴＬＣ（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）で検査した。−１０℃に加温した後、ピロリジン（０．５９６ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温にして、一晩攪拌した。
【０１１９】
ワークアップ：
形成した沈降物を濾別して、溶媒を蒸発させた。得られた油状物質を酢酸エチル（２０ｍｌ）中に溶解して、硫酸水素ナトリウムの飽和溶液、続いて炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、水および食塩水で洗浄した。有機層を分離して、乾燥させて、蒸発させた。得られた生成物をＴＬＣで純度について検査した（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）。収量：１．１８ｇ、青白色固体。
【０１２０】
開裂：
得られた固体Ｚ保護化合物１．１８ｇを無水エタノール４０ｍｌ中に溶解し、この溶液に木炭（１０％、ＦＬＵＫＡ）上の約２０ｍｇのＰｄを添加し、この懸濁液を水素雰囲気下で３時間振とうした。反応の進行は、ＴＬＣ（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）によりモニタリングした。反応が完了した後、溶媒を除去して、遊離塩基を提供した。
収量：９９％。
純度はＴＬＣ：ｎ−ブタノ−ル／ＡｃＯＨ／水／酢酸エチル：１／１／１／１／，Ｒf＝０．４で検査した。反応生成物の同一性はＮＭＲ分析で検査した。
【０１２１】
１．３  グルタミニルチアゾリジン塩酸塩の合成
アシル化：
Ｎ−ｔ−ブチル−オキシカルボニルグルタミン（２．０ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ５ｍｌ中に溶解して、−１５℃にした。混合物中に、ＣＡＩＢＥ（クロロギ酸イソブチル）（１．０６ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（０．８９５ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を１５分間攪拌した。混合酸無水物の形成をＴＬＣ（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）で検査した。−１０℃に加温した後、４−メチルモルホリン（０．８９５ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）およびチアゾリジン塩酸塩（１．０２ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温にして、一晩攪拌した。
【０１２２】
ワークアップ：
形成した沈降物を濾別して、溶媒を蒸発させた。得られた油状物質をクロロホルム（２０ｍｌ）中に溶解して、硫酸水素ナトリウムの飽和溶液、続いて炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、水および食塩水で洗浄した。有機層を分離して、乾燥させて、蒸発させた。得られた生成物をＴＬＣで純度について検査した（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）。
収量：１．６４ｇ、固体。
【０１２３】
開裂：
得られた固体Ｂｏｃ保護化合物６４０ｍｇをジオキサン氷冷ＨＣｌ（１２．９８Ｍ、２０当量）３．１ｍｌ中に溶解し、氷上に置いた。反応の進行は、ＴＬＣ（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）によりモニタリングした。反応が完了した後、溶媒を除去して、得られた油状物質をメタノール中に溶解し、再び蒸発させた。得られた油状物質を五酸化リンで乾燥させて、ジエチルエーテルで２回粉砕した。純度はＨＰＬＣで検査した。
収量：０．２６５ｇ。
純度はＨＰＬＣで検査した。反応生成物の同一性はＮＭＲ分析で検査した。
【０１２４】
１．４  グルタミニルピロリジン塩酸塩の合成
アシル化：
Ｎ−ｔ−ブチル−オキシカルボニルグルタミン（３．０ｇ、１２．１８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ７ｍｌ中に溶解して、−１５℃にした。混合物中に、ＣＡＩＢＥ（クロロギ酸イソブチル）（１．６ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（１．３ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を１５分間攪拌した。混合酸無水物の形成をＴＬＣ（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）で検査した。−１０℃に加温した後、１当量のピロリジン（１．０ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温にして、一晩攪拌した。
【０１２５】
ワークアップ：
形成した沈降物を濾別して、溶媒を蒸発させた。得られた油状物質をクロロホルム（２０ｍｌ）中に溶解して、硫酸水素ナトリウムの飽和溶液、続いて炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、水および食塩水で洗浄した。有機層を分離して、乾燥させて、蒸発させた。得られた生成物をＴＬＣで純度について検査した（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）。
収量：２．７ｇ、固体。
【０１２６】
開裂：
得られた固体２．７ｇをジオキサン氷冷ＨＣｌ（１２．９８Ｍ、２０当量）１３．０ｍｌ中に溶解し、氷上に置いた。反応の進行は、ＴＬＣ（溶離液：ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ：９／１）によりモニタリングした。反応が完了した後、溶媒を除去して、得られた油状物質をメタノール中に溶解し、再び蒸発させた。得られた油状物質を五酸化リンで乾燥させて、ジエチルエーテルで２回粉砕した。
収量：９８０ｍｇ。
純度はＨＰＬＣで検査した。反応生成物の同一性はＮＭＲ分析で検査した。
【０１２７】
実施例２：選択ジペプチド化合物の化学的特性化
２．１  融点測定
融点は、Leica AktiengesellschaftからのＫｏｆｌｅｒ加熱プラットフォーム顕微鏡で（値は補正されない）、あるいはＤＳＣ装置(Heumann-Pharma)で測定した。
【０１２８】
２．２  旋光性
回旋値は、Perkin-Elmer companyからの「Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ３４１」（またはそれ以上）で種々の波長にて記録した。
【０１２９】
２．３  質量分析法に関する測定条件
質量スペクトルは、PE Sciex companyからの「ＡＰＩ  １６５」または「ＡＰＩ  ３６５」で、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いて記録した。操作は、適切な濃度ｃ＝１０μｇ／ｍｌを用いて実施され、物質は、ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ＝５０：５０、０．１％ＨＣＯ2Ｈ中に溶解し、注入はスプレーポンプ（２０μｌ／分）を用いて達成される。測定は、正モード［Ｍ＋Ｈ］+で行われ、ＥＳＩ電圧はＵ＝５６００Ｖである。
【０１３０】
２．４  結果
２．４．１  フマル酸イソロイシルチアゾリジン（異性体）に関する試験
【表２−１】
2005505531.tif 000011
【０１３１】
２．４．２  他のイソロイシルチアゾリジン塩に関する試験
【表２−２】
2005505531.tif 000012
【０１３２】
実施例３：Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａトリペプチドの合成
合成はすべて、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略を適用して、ペプチド合成機ＳＰ  ６５０(Labortec AG)で実施した。保護アミノ酸は、NovabiochemまたはBachemから購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は、Merckから購入し、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）はFlukaから購入した。
【０１３３】
予め負荷したＦｍｏｃ−Ｙａａ−Ｗａｎｇ樹脂（２．８ｇ／置換レベル０．５７ｍｍｏｌ／ｇ）を、２０％ピペリジン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄した後、２当量（１．１ｇ）のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨをＤＭＦ（樹脂１グラム当たり溶媒１２ｍｌ）中に溶解した。２当量（１．０４ｇ）の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）および４当量（１．１１ｍｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を添加して、反応容器に入れた。混合物を室温で２０分間振とうした。次に、カップリングサイクルを繰り返した。続いてＤＭＦ、ジクロロメタン、イソプロパノールおよびジエチルエーテルで洗浄した後、得られたＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｗａｎｇ樹脂を乾燥させて、次に６つの部分に分割した後、最終アミノ酸誘導体をカップリングさせた。
【０１３４】
Ｆｍｏｃ保護基を上述のように除去した。ＤＭＦ中のＢｏｃ−アミノ酸０．５４ｍｍｏｌ、ＴＢＴＵ０．５４ｍｍｏｌおよびＤＩＥＡ０．１０８ｍｍｏｌを２０分間振とうした。カップリングサイクルを繰り返した。最終的に、ペプチド樹脂を上述のように洗浄および乾燥した。
【０１３５】
２．５時間、以下のスカベンジャー：ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）＝９．５／０．２５／０．２５を含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の混合物を用いて、ペプチドを樹脂から切り出した。
【０１３６】
粗製ペプチドの収率は、平均して８０〜９０％であった。Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ１８カラム（７μｍ、２５０*２１．２０ｍｍ、１００Ａ）で、６ｍｌ／分で０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル濃度を増加させながら（４０分のうちに５％〜６５％）０．１％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏの線形勾配を用いて、粗製ペプチドをＨＰＬＣにより精製した。
【０１３７】
純粋なペプチドは凍結乾燥により得られ、エレクトロスプレー質量分析法およびＨＰＬＣ分析により同定された。
【０１３８】
３．１  結果−化学合成後のＸａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａトリペプチドの同定
【表３】
2005505531.tif 000013
1［Ｍ＋Ｈ+］は、正イオン化モードにおけるエレクトロスプレー質量分析法により決定された。
2ＲＰ−ＨＰＬＣ条件：
カラム    ：ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ１００  ＲＰ  １８（５μｍ）、１２５×４ｍｍ
検出（ＵＶ）：２１４ｎｍ
勾配系    ：アセトニトリル（ＡＣＮ）／Ｈ2Ｏ（０．１％ＴＦＡ）（１５分のうちに５％ＡＣＮから５０％へ）
流量      ：１ｍｌ／分
ｋi＝（ｔr−ｔo）／ｔo
ｔo＝１．１６分
ｔ−ブチル−Ｇｌｙは、下記：
【化１６】
2005505531.tif 000014
として定義される。
Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）およびＳｅｒ（Ｐ）は、それぞれベンジルセリンおよびホスホリルセリンとして定義される。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンとして定義される。
【０１３９】
実施例４：ペプチジルケトンの合成
【化１７】
2005505531.tif 000015
【０１４０】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ*ＨＣｌ  ２
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（３．００ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ１０ｍｌ中に溶解し、−１５℃にまで冷却した。混合物に、ＣＡＩＢＥ（１．８０ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（１．５２ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）を添加して、混合酸無水物の形成が完了するまで溶液を攪拌した。次に、混合物を−１０℃にして、ＮＭＭ（１．５２ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）を、続いてＨ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ*ＨＣｌ（２．２９ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温に到達させて、一晩放置した。溶媒の除去および通常のワークアップ後に、得られたエステル１をさらに特性化することなく採取した。エステル１をＨＣｌ／ＨＯＡｃ（５ｍｌ、６Ｎ）中に溶解して、Ｂｏｃ基の除去が完了するまで０℃で放置した。次に、溶媒を除去して、得られた油状物質をジエチルエーテルで処理して、白色固体２を得た。
収率２．５ｇ、８０％。
【０１４１】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ  ３
Ｚ−Ａｌａ−ＯＨ（３．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）および２（４．１８ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）を、１について上述するのと同じ様式で処理して、白色固体として３を得た。
収率：４．２ｇ、６４％。
【０１４２】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ  ４
３（４．２ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を水／アセトン（１／５  ｖ／ｖ）３０ｍｌ中に溶解して、ＮａＯＨ（１Ｎ）１１．６ｍｌを添加した。反応が完了した後、有機溶媒を蒸発により除去して、得られた溶液をＮａＨＣＯ3溶液（飽和）１５ｍｌで希釈した。次に、混合物を酢酸エチルエステル１０ｍｌで３回抽出した。その後、ＨＣｌ（水中１５％）を添加することにより溶液をｐＨ２にした。得られた混合物を酢酸エチルエステル３０ｍｌで３回抽出した。有機層を分離して、食塩水で３回洗浄して、乾燥させて（Ｎａ2ＳＯ4）、蒸発させた。
収率：３．５ｇ、８７％。
【０１４３】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ2−Ｂｒ  ５
４（２．００ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ１５ｍｌ中に溶解して、ＣＡＩＢＥ（０．６２３ｍｌ、４．７６ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（０．５２５ｍｌ、４．７６ｍｍｏｌ）を用いて混合酸無水物に変換した（化合物１を参照）。形成した沈殿物を濾別して、−１５℃にまで冷却した。次に、ジアゾメタン（エーテル３０ｍｌ中２３．８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で溶液に滴下した。０℃で１時間、混合物を放置した後、ＨＢｒ（ＡｃＯＨ中３３％）１．２７ｍｌを添加して、溶液を室温で３０分間攪拌した。その後、エーテル７０ｍｌを添加して、混合物を水２０ｍｌで洗浄した。有機層を分離して、乾燥させて（Ｎａ2ＳＯ4）、蒸発させた。
収率（粗製）：１．８ｇ、８０％。
【０１４４】
Ｚ−保護アシルオキシメチレンケトン
酸体（２当量）をＤＭＦ中に溶解して、等量のＫＦを添加した。懸濁液を室温で１時間攪拌させた。次に、ブロムメチレン（１当量）成分を添加して、溶液を一晩攪拌させた。その後、溶媒を真空下で除去して、得られた油状物質をクロロホルム中に溶解して、食塩水で洗浄した。続いて、有機層を分離して、乾燥させて（Ｎａ2ＳＯ4）、溶媒を除去した。シリカゲルおよびヘプタン／クロロホルムを用いたカラムクロマトグラフィにより生成物を精製した。
【０１４５】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ2Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ3  ６
酢酸（２３０μｌ、４．０２ｍｍｏｌ）、ＫＦ（０．２３４ｇ、４．０２ｍｍｏｌ）、５（１．００ｇ、２．０１ｍｍｏｌ）
収率：０．３５１ｇ、３６％。
【０１４６】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ2Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｐｈ  ７
安息香酸（０．２７５ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、ＫＦ（０．１３１ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、５（０．５６ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）
収率：０．３４ｇ、５６％。
【０１４７】
脱保護
Ｚ保護化合物をＨＢｒ／ＡｃＯＨ中に溶解して、攪拌した。反応が完了したら、エーテルを添加して、形成した白色沈殿物を濾別して、乾燥させた。
【０１４８】
Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ2Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ3*ＨＢｒ  ８
６（０．３５１ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）
収率：０．２５２ｇ、９８％。
【０１４９】
Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ2Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｐｈ*ＨＢｒ  ９
７（０．３４ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）
収率：０．２５１ｇ、９９％。
【０１５０】
実施例５：シクロアルキルケトンの合成
【化１８】
2005505531.tif 000016
【０１５１】
Ｂｏｃ−イソロイシナール  ２
塩化オキサリル（７１４μｌ、８．２８ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン１０ｍｌ中に溶解して、−７８℃にした。次に、ＤＭＳＯ（８１７μｌ、８．２８ｍｍｏｌ）を滴下した。溶液を−７８℃で２０分間攪拌した。続いて、１（１．００ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を２０分間攪拌した。その後、ＴＥＡ（２．５８ｍｌ、１８．４ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を室温に到達させた。混合物をヘキサン／酢酸エチル（２／１  ｖ／ｖ）で希釈して、ＨＣｌ（水中１０％）１０ｍｌを添加した。有機層を分離して、水相を塩化メチレン２０ｍｌで抽出した。有機層すべてを収集して、食塩水、続いて水で洗浄した後、乾燥させた。シリカゲルおよびヘプタン／クロロホルムを用いたカラムクロマトグラフィにより生成物を精製した。
収率：０．５２ｇ、５２％。
【０１５２】
Ｎ−１−［シクロペンチル（ヒドロキシ）メチル］−２−メチルブチルカルバミン酸ｔ−ブチル  ３
２（０．５２ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ１０ｍｌ中に溶解して、０℃にまで冷却した。次に、臭化シクロペンチルマグネシウム（２Ｍ溶液を１．４５ｍｌ）を添加した。反応が完了した後、水（２ｍｌ）を添加して、ＨＣｌ水を添加することにより溶液を中和した。続いて、塩化メチレンを添加して、有機層を分離して、乾燥させた（Ｎａ2ＳＯ4）。蒸発後、得られた油状物質をさらに特性化することなく使用した。
【０１５３】
Ｎ−［１−（シクロペンチルカルボニル）−２−メチルブチル］カルバミン酸ｔ−ブチル  ４
３（０．６１ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を１のように処理した。塩化オキサリル（３３３μｌ、３．８７ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（３８２μｌ、５．３７ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１．２ｍｌ、８．５９ｍｍｏｌ）
収率：０．１８０ｇ、３０％。
【０１５４】
塩化１−シクロペンチル−３−メチル−１−オキソ−２−ペンタアミニウム  ５
４（０．１８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）をＨＣｌ（ジオキサン中７Ｎ）２ｍｌ中に溶解した。反応が完了した後、溶媒を除去して、クロロホルム／メタノール／水勾配を用いたシリカゲルでのカラムクロマトグラフィにより得られた油状物質を精製した。得られた油状物質をエーテルで粉砕した。
収率：０．０６０ｇ、５４％。
【０１５５】
実施例６：側鎖修飾ＤＰＩＶ阻害剤の合成
６．１  Ｂｏｃ−グルタミニル−チアゾリジン（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａ）の合成
方法Ｂに従ったＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−ＯＨとＴｈｉａ*ＨＣｌとの反応（方法に関するセクション６．４を参照）、方法Ｇに従ったＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｉａの加水分解
【０１５６】
６．１．１  Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａに関する分析データ
【表４】
2005505531.tif 000017
【０１５７】
1薄層クロマトグラフィ
系Ａ：クロロホルム／メタノール  ９０：１０
系Ｂ：ベンゼン／アセトン／酢酸  ２５：１０：０．５
系Ｃ：ｎ−ブタノール／ＥＡ／酢酸／Ｈ2Ｏ  １：１：１：１
2ＨＰＬＣ分離条件
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離液：定組成、４０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
流速：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
【０１５８】
６．２  側鎖修飾Ｂｏｃ−グルタミルチアゾリジン
様々な大きさの基を導入することにより、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａをγ−カルボン酸官能基にて修飾した。基は、それらのアミノ基を用いてγ−カルボン酸官能基へアミド結合を形成することによりカップリングさせ、基に応じて各種カップリング方法が使用された。以下のアミノ成分を、記載の方法を用いてＢｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａに結合させた。
【０１５９】
【表５】
2005505531.tif 000018
【０１６０】
２つの場合で、反応生成物の精製が合成の一般的な説明と異なる。
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(Ｇｌｙ5)−Ｔｈｉａ
生成物はあらかじめ、一晩攪拌しながら混合物から析出させる。次に、それを濾別して、０．１Ｎ  ＨＣｌおよび多量の水で洗浄した後、真空中にてＰ4Ｏ10で乾燥させた。
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ(ＰＥＧ)−Ｔｈｉａ
一般的な手順に対比して、合成用の出発物質を５００倍過剰のＤＭＦ中に溶解する。反応が完了した後、ＤＭＦを真空中で完全に除去し、残渣を大量のメタノール中に溶解する。エーテルを注いで上層を形成した後、生成物は未反応のＰＥＧと一緒に析出する。ゲル濾過カラム（Pharmazia、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５、９０μｍ、２６０ｍｍ−１００ｍｍ）での分取ＨＰＬＣ分離により精密な精製を行った。
分離条件：溶離液：水、流速：５ｍｌ／分、λ＝２２０ｎｍ。
【０１６１】
６．２．２  側鎖修飾Ｂｏｃ−グルタミルチアゾリジンの合成データ
【表６】
2005505531.tif 000019
【０１６２】
2ＨＰＬＣ分離条件
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離液：定組成、４０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
流速：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
【０１６３】
６．３  側鎖修飾グルタミルチアゾリジン
方法Ｆを用いて、表６．２．２に記載する化合物からＮ末端Ｂｏｃ保護基を切断した。Ｇｌｙ誘導体で修飾した物質は分取ＨＰＬＣ分離により精製し、トリフルオロ酢酸塩として存在する。Ｈ−Ｇｌｕ（ＰＥＧ）−Ｔｈｉａは、Ｂｏｃ保護前駆体と同じ様式でゲル濾過カラム上で精製した。
【０１６４】
６．３．１  側鎖修飾Ｂｏｃ−グルタミルチアゾリジンの合成データ
【表７】
2005505531.tif 000020
【０１６５】
3ＨＰＬＣ分離条件
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離液：ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
グラジエント：２０％ＡＣＮ→９０％ＡＣＮ３０分間
流速：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
ｎ．ｄｍ．−測定せずまたは測定不能
【０１６６】
６．４  一般的な合成手順
方法Ａ：活性化試薬としてＣＦＩＢＥを用いた混合酸無水物法によるペプチド結合による結合
Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチド１０ｍｍｏｌを無水ＴＨＦ２０ｍｌ中に溶解する。溶液を−１５℃±２℃に冷却する。それぞれの場合において攪拌しながら、Ｎ−ＭＭ１０ｍｍｏｌおよびクロロギ酸イソブチルエステル１０ｍｍｏｌを連続して添加して、記載の温度範囲は厳密に従う。およそ６分後、アミノ成分１０ｍｍｏｌを添加する。アミノ成分が塩である場合、続いて反応混合物にＮ−ＭＭをさらに１０ｍｍｏｌ添加する。次に、反応混合物を冷却状態で２時間、および室温で一晩攪拌する。
ロータリーエバポレータを用いて反応混合物を濃縮し、ＥＡ中に溶解して、５％ＫＨ2ＳＯ4溶液、飽和ＮａＨＣＯ3溶液および飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄して、ＮａＳＯ4で乾燥させる。真空中で溶媒を除去した後、化合物をＥＡ／ペンタンから再結晶させる。
【０１６７】
方法Ｂ：活性化試薬としてビバル酸クロライドを用いた混合酸無水物法によるペプチド結合による結合
Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチド１０ｍｍｏｌを無水ＴＨＦ２０ｍｌ中に溶解する。溶液を０℃に冷却する。それぞれの場合において攪拌しながら、Ｎ−ＭＭ１０ｍｍｏｌおよびビバル酸クロライド１０ｍｍｏｌを連続して添加して、記載の温度範囲は厳密に従う。およそ６分後、混合物を−１５℃に冷却し、より低い温度に到達したら、アミノ成分１０ｍｍｏｌを添加する。アミノ成分が塩である場合、続いて反応混合物にＮ−ＭＭをさらに１０ｍｍｏｌ添加する。次に、反応混合物を冷却状態で２時間、および室温で一晩攪拌する。
さらなるワーキングアップが方法Ａの場合と同様に実施される。
【０１６８】
方法Ｃ：活性化試薬としてＴＢＴＵを用いたペプチド結合による結合
Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチド１０ｍｍｏｌおよびＣ末端保護アミノ成分１０ｍｍｏｌを無水ＤＭＦ２０ｍｌ中に溶解する。溶液を−１０℃に冷却する。それぞれの場合において攪拌しながら、ＤＩＰＥＡ１０ｍｍｏｌおよびＴＢＴＵ１０ｍｍｏｌを連続して添加する。反応混合物を０℃で１時間、続いて室温で一晩攪拌する。真空中でＤＭＦを完全に除去し、生成物を方法Ａで記載するようにワークアップする。
【０１６９】
方法Ｄ：活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の合成
Ｎ末端保護アミノ酸またはペプチド１０ｍｍｏｌおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド１０ｍｍｏｌを無水ＴＨＦ２０ｍｌ中に溶解する。溶液を０℃に冷却し、１０ｍｍｏｌのジシクロへキシルカルボジイミドを撹拌しながら添加する。反応混合物をさらに０℃で２時間、続いて室温で一晩攪拌する。得られたＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素を濾別し、真空中で溶媒を完全に除去し、残存生成物をＥＡ／ペンタンから再結晶させる。
【０１７０】
方法Ｅ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いたアミド結合による結合
Ｃ末端無保護アミノ成分１０ｍｍｏｌをＮａＨＣＯ3溶液（水２０ｍｌ中２０ｍｍｏｌ）に導入する。室温にて攪拌しながら、ジオキサン１０ｍｌ中に溶解させたＮ末端保護Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１０ｍｍｏｌを徐々に滴下する。反応混合物の攪拌を一晩続けて、次に溶媒を真空中で除去する。
さらなるワーキングアップが方法Ａの場合と同様に実施される。
【０１７１】
方法Ｆ：Ｂｏｃ保護基の切断
１．１Ｎ  ＨＣｌ／氷酢酸（方法Ｆ１）３ｍｌまたは１．１Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（方法Ｆ２）３ｍｌまたはＤＣＭ中５０％ＴＦＡ（方法Ｆ３）３ｍｌを、Ｂｏｃ保護アミノ酸ピロリジド、チアゾリジドまたはペプチド１ｍｍｏｌに添加する。室温での切断は、ＴＬＣを用いてモニタリングする。反応が完了した（およそ２時間）後、無水ジエチルエーテルを用いて、化合物を塩酸塩の形態で沈殿させ、吸引により単離し、真空中にてＰ4Ｏ10で乾燥させた。メタノール／エーテルを用いて、生成物を再結晶または再沈殿させる。
【０１７２】
方法Ｇ：加水分解
ペプチドメチルエステル１ｍｍｏｌをアセトン１０ｍｌおよび０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液１１ｍｌ中に溶解し、室温で攪拌する。加水分解の進行は、ＴＬＣを用いてモニタリングする。反応が完了した後、アセトンを真空中で除去する。ｐＨ２〜３に到達するまで、濃ＫＨ2ＳＯ4溶液を用いて残った水溶液を酸性化する。次に、ＥＡを用いて生成物を数回抽出する。合わせた酢酸エチル分画を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＮａＳＯ4で乾燥させて、溶媒を真空中で除去する。ＥＡ／ペンタンからの結晶化を実施する。
【０１７３】
実施例７：Ｋi−決定
Ｋi決定に関して、３７．５Ｕ／ｍｇのグルシルプロピル−４−ニトロアニリンに対する特異的活性および１．４１ｍｇ／ｍｌのストック溶液中の酵素濃度を有するブタの腎臓由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶを使用した。
アッセイ混合物：
それぞれ１*１０-5Ｍ〜１*１０-8Ｍの濃度範囲の試験化合物１００μｌを、種々の濃度（０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ）のグリシル−４−ニトロアニリン５０μｌおよびＨＥＰＥＳ（４０ｍＭ、ｐＨ７．６、イオン強度＝０．１２５）１００μｌと混合した。アッセイ混合物を３０℃で３０分間、プレインキュベートした。プレインキュベートした後、ＤＰＩＶ（１：６００希釈）２０μｌを添加して、プレートリーダー（ＨＴＳ７０００ｐｌｕｓ、Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany）を用いて３０℃およびλ＝４０５ｎｍで１０分間、４−ニトロアニリン放出に起因する黄色発色の測定を実施した。
【０１７４】
Ｋi値は、Ｇｒａｐｈｉｔバージョン４．０．１３、４．０．１３および４．０．１５(Erithacus Software, Ltd, UK)を用いて算出した。
【０１７５】
７．１  結果−ＤＰＩＶ阻害のＫi値
【表８−１】
2005505531.tif 000021
【０１７６】
【表８−２】
2005505531.tif 000022
【０１７７】
【表８−３】
2005505531.tif 000023
【０１７８】
ｔ−ブチル−Ｇｌｙは、下記：
【化１９】
2005505531.tif 000024
として定義される。
Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）およびＳｅｒ（Ｐ）は、それぞれベンジルセリンおよびホスホリルセリンとして定義される。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンとして定義される。
【０１７９】
実施例８：ＩＣ50値の決定
阻害剤ストック溶液１００μｌを緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６）１００μｌおよび基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、最終濃度０．４ｍＭ）５０μｌと混合し、３０℃でプレインキュベートした。精製ブタＤＰＩＶ２０μｌの添加により反応を開始させた。生成物ｐＮＡの形成は、ＨＴＳ７０００Ｐｌｕｓプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて４０５ｎｍにて１０分かけて測定し、傾きを算出した。最終阻害剤濃度は、１ｍＭ〜３０ｎＭの範囲であった。ＩＣ５０の算出に関して、ＧｒａＦｉｔ４．０．１３(Erithacus Software)を使用した。
【０１８０】
８．１  結果−ＩＣ50値の決定
【表９−１】
2005505531.tif 000025
【０１８１】
【表９−２】
2005505531.tif 000026
【０１８２】
ｔ−ブチル−Ｇｌｙは、下記：
【化２０】
2005505531.tif 000027
として定義される。
Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）およびＳｅｒ（Ｐ）は、それぞれベンジルセリンおよびホスホリルセリンとして定義される。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンとして定義される。
実施例９：ＤＰＩＶ様酵素−ジペプチジルペプチダーゼＩＩの阻害
ＤＰ  ＩＩ（３．４．１４．２）は、Ｎ末端がプロトン化されていない場合にオリゴヌクレオチドからＮ末端ジペプチドを放出する(McDonald, J.K., Ellis, S. & Reilly, T.J., 1996, J. Biol. Chem., 241, 1494-1501)。Ｐ1位におけるＰｒｏおよびＡｌａは好ましい残基である。酵素活性はＤＰＩＶ様活性として記載されるが、ＤＰ  ＩＩは酸性ｐＨの最適条件を有する。使用する酵素は、ブタの腎臓から精製した。
アッセイ：
１*１０-4Ｍ〜５*１０-8Ｍの濃度範囲のグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン１００μｌを、緩衝溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．０１５％Ｂｒｉｊ、１ｍＭ  ＤＴＴ）１００μｌ、リシルアラニルアミノメチルクマリン溶液（５ｍＭ）５０μｌおよびブタＤＰ  ＩＩ（緩衝溶液中に２５０倍希釈）２０μｌと混合した。プレートリーダー（ＨＴＳ７０００ｐｌｕｓ、Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany）を用いて３０℃およびλ（励起）＝３８０ｎｍ、λ（放出）＝４６５ｎｍで２５分間、蛍光測定を実施した。Ｋi値は、Ｇｒａｐｈｉｔ４．０．１５(Erithacus Software, Ltd, UK)を用いて算出し、グルタミニルピロリジンについてはＫi＝８．５２*１０-5Ｍ±６．３３*１０-6Ｍとして、およびグルタミニルチアゾリジンについてはＫi＝１．０７*１０-5Ｍ±３．８１*１０-7Ｍとして決定された。
【０１８３】
実施例１０：交差反応性酵素
グルタミニルピロリジンおよびグルタミニルチアゾリジンを、ジペプチジルプロテアーゼＩ、プロリルオリゴペプチダーゼおよびプロリダーゼに対するそれらの交差反応性効力について試験した。
【０１８４】
ジペプチジルペプチダーゼＩ（ＤＰ  Ｉ、カテプシンＣ）：
ＤＰ  ＩすなわちカテプシンＣは、それらの基質のＮ末端からジペプチドを切り離すリソソームシステインプロテアーゼである(Gutman, H.R. & Fruton, J.S., 1948, J. Biol: Chem., 174, 851-858)。ＤＰ  Ｉはシステインプロテアーゼとして分類される。使用する酵素は、Qiagen(Qiagen GmbH, Hiden, Germany)から購入した。十分に活性な酵素を獲得するために、酵素をＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．６）（４０ｍＭ  ＭＥＳ、４ｍＭ  ＤＴＴ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１５％Ｂｒｉｊ）中に１０００倍希釈し、３０℃で３０分間プレインキュベートした。
【０１８５】
アッセイ：
１*１０-5Ｍ〜１*１０-7Ｍの濃度範囲のグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン５０μｌを、緩衝液−酵素混合物１１０μｌと混合した。アッセイ混合物を３０℃で１５分間、プレインキュベートした。プレインキュベートした後、ヒスチジルセリル−β−ニトロアニリン（２*１０-5Ｍ）１００μｌを添加して、プレートリーダー（ＨＴＳ７０００ｐｌｕｓ、Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany）を用いて３０℃およびλ（励起）＝３８０ｎｍ、λ（放出）＝４６５ｎｍで１０分間、β−ニトロアニリン放出に起因する黄色発色の測定を実施した。
ＩＣ50値は、Ｇｒａｐｈｉｔ４．０．１５(Erithacus Software, Ltd., UK)を用いて算出した。グルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンによるＤＰ  Ｉ酵素活性の阻害は見られなかった。
【０１８６】
プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ）
プロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ．３．４．２１．２６）は、Ｘａａ−Ｐｒｏ結合のＮ末端部分にあるペプチドを切り離すセリン型エンドプロテアーゼである(Walter, R., Shlank, H., Glass, J.D., Schwartz, I.L. & Kerenyi, T.D., 1971, Science, 173, 827-829）。基質は、最大３０００Ｄａの分子量を有するペプチドである。使用する酵素は、組換えヒトプロリルオリゴペプチダーゼであった。組換え発現は、当該技術分野の状況において他の箇所で記載されるように標準条件下で大腸菌において実施された。
【０１８７】
アッセイ：
１*１０-4Ｍ〜５*１０-8Ｍの濃度範囲のグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン１００μｌを、緩衝溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．０１５％Ｂｒｉｊ、１ｍＭ  ＤＴＴ）１００μｌおよびＰＯＰ溶液２０μｌと混合した。アッセイ混合物を３０℃で１５分間、プレインキュベートした。プレインキュベートした後、グリシルプロリルプロリル−４−ニトロアニリン溶液（０．２９ｍＭ）５０μｌを添加して、プレートリーダー（sunrise, Tecan, Crailsheim, Germany）を用いて３０℃およびλ＝４５０ｎｍで１０分間、４−ニトロアニリン放出に起因する黄色発色の測定を実施した。ＩＣ50値は、Ｇｒａｐｈｉｔ４．０．１５(Erithacus Software, Ltd., UK)を用いて算出した。グルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンによるＰＯＰ活性の阻害は見られなかった。
【０１８８】
プロリダーゼ（Ｘ−Ｐｒｏジペプチダーゼ）
プロリダーゼ（ＥＣ３．４．１３．９）は、Bergmann & Fructonにより最初に記載された(Bergmann, M. & Fruton, JS, 1937, J. Biol. Chem. 189-202)。プロリダーゼは、Ｘａａ−ＰｒｏジペプチドからＮ末端アミノ酸を放出させ、６〜９のｐＨ最適条件を有する。
ブタの腎臓由来のプロリダーゼ(ICN Biomedicals, Eschwege, Germany)をアッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＮＨ4（ＣＨ3ＣＯＯ）2、３ｍＭ  ＭｎＣｌ2、ｐＨ７．６）中に溶解した（１ｍｇ／ｍｌ）。十分に活性化酵素を獲得するために、溶液を室温で６０分間インキュベートした。
【０１８９】
アッセイ：
５*１０-3Ｍ〜５*１０-7Ｍの濃度範囲のグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン４５０μｌを、緩衝溶液（２０ｍＭ  ＮＨ4（ＣＨ3ＣＯＯ）2、ｐＨ７．６）５００μｌおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−ＯＨ（アッセイ混合物中０．５ｍＭ）２５０μｌと混合した。アッセイ混合物を３０℃で５分間、プレインキュベートした。プレインキュベートした後、プロリダーゼ（アッセイ緩衝液中に１：１０で希釈）７５μｌを添加して、ＵＶ／Ｖｉｓ光度計ＵＶ１(Thermo Spectronic, Cambridge, UK)1を用いて３０℃およびλ＝２２０ｎｍで２０分間、測定を実施した。
ＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｉｔ４．０．１５(Erithacus Software, Ltd., UK)を用いて算出した。ＩＣ５０値は、グルタミニルチアゾリジンについてはＩＣ50３ｍＭより多いものとして、およびグルタミニルピロリジンについてはＩＣ50＝３．４*１０-4Ｍ±５．６３*１０-5として決定された。
【０１９０】
実施例１１：Ｗｉｓｔａｒラットへの血管内投与および経口投与後のＤＰＩＶ阻害活性の決定
動物
２５０〜３５０ｇの体重の雄Ｗｉｓｔａｒラット(Shoe: Wist(Sho))をTierzucht Schonwalde(Schonwalde, Germany)から購入した。
【０１９１】
収容条件
動物は、１２／１２時間の明／暗サイクル（午前６時に点灯）で制御温度（２２±２℃）を用いて従来条件下にて一匹ずつケージに入れた。標準的なペレット化飼料（ｓｓｎｉｆｆ（商標）、Soest, Germany)およびＨＣｌで酸性化した水道水を随意に与えた。
【０１９２】
頸動脈へのカテーテル挿入
収容条件で１週以上適応させた後、全身麻酔（Ｒｏｍｐｕｎ（商標）［２％］(BayerVital, Germany）０．２５ｍｌ／ｋｇ（体重）およびケタミン１０(Atarost GmbH & Co., Twistringen, Germany)０．５ｍｌ／ｋｇ（体重）のｉ．ｐ．注射）下でＷｉｓｔａｒラットの頸動脈にカテーテルを埋没させた。動物を１週間回復させた。カテーテルにヘパリン生理食塩水（１００ＩＵ／ｍｌ）を１週間につき３回流した。カテーテル故障の場合、第２のカテーテルを各々のラットの対側性の側方頸動脈に挿入した。手術から１週間回復させた後、この動物を研究に再度組み込んだ。第２のカテーテルの故障の場合には、その動物を研究から撤退させた。新たな動物を補充して、カテーテル埋没後少なくとも７日目に開始して、計画した順序で実験を続行した。
【０１９３】
実験設計
損なわれていないカテーテル機能を有するラットに、経口および血管内（動脈内）経路によりプラセボ（生理食塩水１ｍｌ、０．１５４ｍｏｌ／ｌ）または試験化合物を投与した。一晩絶食させた後、ヘパリン処理した動脈血試料１００μｌを−３０分、−５分および０分で収集した。試験物質は、生理食塩水（０．１５４ｍｏｌ／ｌ）１．０ｍｌ中に新たに溶解させて、供給用チューブ（７５ｍｍ、Fine Science Tools, Heidelberg, Germany)により経口的に、あるいは血管内経路により、０分で投与した。経口投与の場合、さらに１ｍｌ容量の生理食塩水を動脈カテーテルに注入した。動脈内投与の場合、カテーテルを生理食塩水３０μｌで直ちに流して、さらに生理食塩水１ｍｌを供給用チューブにより経口的に与えた。
【０１９４】
プラセボまたは試験物質の適用後、動脈血試料を意識のある拘束していないラットの頸動脈カテーテルから２．５、５、７．５、１０、１５、２０、４０、６０および１２０分に採取した。血液試料はすべて、血漿ＤＰＩＶ活性測定用の１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１０μｌを充填した氷冷エッペンドルフチューブ(Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg, Germany)中に収集した。エッペンドルフチューブを直ちに遠心分離した（１２０００ｒｐｍで２分間、Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ＥＢＡ  １２、Tuttlingen, Germany）。血漿分画は、分析するまで氷上で保管するか、分析するまで−２０℃で凍結させた。血漿試料にはすべて、以下のデータをラベルした：
・コード番号
・動物番号
・サンプリングの日付
・サンプリングの時間
【０１９５】
分析方法
血漿ＤＰＩＶ活性の決定のためのアッセイ混合物は、試薬８０μｌおよび血漿試料２０μｌから構成された。基質グリシルプロピル−４−ニトロアニリンからの黄色生成物４−ニトロアニリンの形成の動態測定を、３０℃で２分間プレインキュベートした後、３９０ｎｍにて同じ３０℃で１分間実施した。ＤＰＩＶ活性はｍＵ／ｍｌで表した。
【０１９６】
統計学的方法
ＰＲＩＳＭ（商標）３．０２(GraphPad Software, Inc.)により統計学的評価および表示を行った。パラメータはすべて、平均値およびＳＤを含む記述様式で分析された。
１１．１  結果−ｔmaxでのｉｎ  ｖｉｖｏＤＰＩＶ阻害
【０１９７】
【表１０】
2005505531.tif 000028
【０１９８】
実施例１２：容易に輸送可能ではないＤＰＩＶ阻害剤としての側鎖修飾グルタミルチアゾリジンの作用
構造Ｈ−Ｇｌｕ（Ｘ）−Ｔｈｉａを有する側鎖修飾グルタミルチアゾリジンを合成し、ポリエチレングルコールまたは様々な鎖長のグリシンオリゴマーをＸとして使用した（合成の説明に関する実施例の方法Ａを参照）。これらの誘導体の結合特性およびペプチド輸送体ＰｅｐＴ１によるそれらの輸送性を研究した。
【０１９９】
驚くべきことに、側鎖修飾がほんのわずかな程度であるがＤＰＩＶに対する化合物の結合特性を変更させることがわかった。一方、阻害剤のペプチド輸送体により輸送される能力は、側鎖修飾により劇的に減少する。
【０２００】
したがって、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素の側鎖修飾阻害剤は、身体中でＤＰＩＶの部位指向性阻害を達成するのに十分適している。
【０２０１】
１２．１  結果：選択したＤＰＩＶ阻害剤の輸送性
【表１１】
2005505531.tif 000029
【０２０２】
1ＰｅｐＴ１発現Ｐ．パストリス(P. pastoris)細胞への3Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（８０ｍＭ）の結合を５０％阻害する化合物の有効濃度（ＥＣ50値）
2２つの電極電圧クランプ法を用いたＸ．リービス(X. leavis)のＰｅｐＴ１発現卵母細胞での輸送特性。Ｉ＝輸送により発生した内向き電流。
【０２０３】
実施例１３：インクレチンＧＩＰ1-42およびＧＬＰ−１7-36のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＰＩＶ触媒性加水分解の阻害
精製酵素またはプールされたヒト血清を用いて、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性により引き起こされるインクレチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ加水分解を抑制することが可能である（図１）。
【０２０４】
本発明によれば、両ペプチドホルモンの酵素触媒性加水分解の完全な抑制が、プールされた２０％血清中で、３０ｍＭ  ＧＩＰ1-42または３０ｍＭ  ＧＬＰ−１7-36および２０ｍＭ  可逆的ＤＰＩＶ阻害剤であるイソロイシルチアゾリジン（１ａ）をｐＨ７．６および３０℃で２４時間かけてインキュベートすることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで達成される（１ｂおよび１ｃ、ともに上方のスペクトル）。合成ＧＩＰ1-42（５ｍＭ）および合成ＧＬＰ−１7-36（１５μＭ）を、０．１ｍＭ  ＴＲＩＣＩＮＥ  Ｐｕｆｆｅｒ中で、ヒト血清（２０％）とともにｐＨ７．６および３０℃で２４時間インキュベートした。インキュベーションアッセイの試料（ＧＩＰ1-42の場合２．５ｐｍｏｌ、およびＧＬＰ−１7-36の場合７．５ｐｍｏｌ）を種々の時間間隔後に抜き出した。マトリックスとして２’，６’−ジヒドロキシアセトフェノンを用いて試料を同時結晶化させて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により分析した。スペクトル（図１）は試料１つ当たりの２５０シングルレーザショットの蓄積を示す。
【０２０５】
（１ｂ）ｍ／ｚ  ４９８０．１±５．３のシグナルは、ＤＰＩＶ基質ＧＩＰ1-42（Ｍ４９７５．６）に相当し、質量ｍ／ｚ  ４７４５．２±５．５のシグナルは、ＤＰＩＶ放出された生成物ＧＩＰ３−４２（Ｍ４７４０．４）に相当する。
【０２０６】
（１ｃ）ｍ／ｚ  ３３２５．０±１．２のシグナルは、ＤＰＩＶ基質ＧＬＰ−１7-36（Ｍ３２９７．９）に相当し、質量ｍ／ｚ  ３１１６．７±１．３のシグナルは、ＤＰＩＶ放出された生成物ＧＬＰ−１9-36（Ｍ３０８９．６）に相当する。
【０２０７】
阻害剤を含有しない対照アッセイでは、インクレチンは、ほとんど完全に分解された（図１ｂおよび１ｃ、ともに下方のスペクトル）。
【０２０８】
実施例１４：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンによるＧＬＰ１7-36の分解の阻害
ＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジン（０．９％生理食塩水溶液中１．５Ｍ阻害剤のｉ．ｖ．注射）および対照の存在下または非存在下で、ラットの循環中の自然インクレチン（この場合、ＧＬＰ−１7-36）の代謝の分析。実験の時間的経過中、処理動物（ｎ＝５）において阻害剤イソロイシルチアゾリジン０．１ｍｇ／ｋｇの濃度では、インスリン向性ペプチドホルモンＧＬＰ−１7-36の分解は見られなかった（図２）。
【０２０９】
ＤＰＩＶ阻害剤の存在および非存在下でインクレチンの代謝産物を分析するために、試験動物および対照動物に、初期のｉ．ｖ．阻害剤および／または生理食塩水投与後に、さらに５０〜１００ｐＭの125Ｉ−ＧＬＰ−１7-36（比活性  約１μＣｉ／ｐＭ）のｉ．ｖ．注射を２０分施した。２〜５分のインキュベーション時間の後に血液試料を収集し、２０％アセトニトリルを用いて血漿を抽出した。続いて、ペプチド抽出物をＲＰ−ＨＰＬＣで分離した。１２〜１８分の間の溶離液の複数の分画を収集し、γ−カウンターで計数した。データは、最大値に対して１分間当たりのカウント（ｃｐｍ）として表される。
【０２１０】
実施例１５：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンのｉ．ｖ．投与後のインスリン応答および血中グルコースレベルの減少の調整
図は、イソロイシルチアゾリジン（０．１ｍｇ／ｋｇ）の存在下または非存在下でラットへのグルコースの十二指腸内（ｉ．ｄ．）投与に対する循環グルコースおよびインスリン応答を示す。未処理対照と比較した場合にＤＰＩＶエフェクターを与えた動物において循環グルコース濃度のより迅速な減少が見られる。観察される効果は用量依存的であり、ラット１ｋｇ当たりのＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジン０．０５ｍｇ／分の注入の終結後に可逆的である。ｉ．ｄ．グルコース刺激動物と対比して、阻害剤処理対照動物において同量のグルコースのｉ．ｖ．投与後には観察可能な匹敵する効果は見られなかった。図３では、選択した血漿パラメータ（Ａ−ＤＰＩＶ活性、Ｂ−血漿インスリンレベル、Ｃ−血中グルコースレベル）の阻害剤依存的変化を示すこれらの関係が示される。
【０２１１】
実施例１６：経口薬剤適用の１２週間の絶食時血中グルコースに対する脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットの長期処理の影響
ＤＰＩＶ−阻害剤フマル酸イソロイシルチアゾリジンの長期適用は、選択した糖尿病性ラットモデルにおいて絶食時血中グルコースを劇的に減少させ、ほとんど正常化させるに近い（図４）。
【０２１２】
動物
体重４４０ｇ（１１±０．５週齢）の６組の雄脂肪性（ｆａ／ｆａ）ＶＤＦ  Ｚｕｃｋｅｒラット同腹子を、対照群または処理群（フマル酸イソロイシルチアゾリジン）のいずれかに無作為に割り当てた。動物は、１２時間の明／暗サイクル（午前６時に点灯）で一匹ずつ収容し、標準的なラット食料および水を随意に接近可能にした。
【０２１３】
毎日のモニタリングおよび薬剤投与に関するプロトコル
処理群には、経口強制飼養により毎日２回（午前８時と午後５時）、１０ｍｇ／ｋｇのフマル酸イソロイシルチアゾリジンを１００日間与えたのに対して、対照動物には１％セルロース溶液から構成される同時用量の賦形剤を与えた。２日毎に、体重、朝夕の血中グルコース、ならびに食料および水の摂取量を評価した。グルコース決定用の血液試料は、尾の出血から獲得し、ＳｕｒｅＳｔｅｐグルコース分析器(Lifescan Canada Ltd., Burnaby)を用いて測定した。
【０２１４】
グルコース耐性の月１回の評価に関するプロトコル
実験開始から４週毎に、経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を行った：動物を、１７００時間の投薬後１８時間絶食させ、１ｇ／ｋｇのグルコースを経口投与した。この期間は、フマル酸イソロイシルチアゾリジンの循環半減期のおよそ１２倍と等価である。
【０２１５】
実施例１７：収縮期血圧に対するＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンによる脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットの長期経口処理の影響
ＤＰＩＶ阻害剤フマル酸イソロイシルチアゾリジンの長期適用は、選択した糖尿病性ラットモデルにおいて収縮期血圧の安定化をもたらした（図５）。
【０２１６】
動物
体重４４０ｇ（１１±０．５週齢）の６組の雄脂肪性（ｆａ／ｆａ）ＶＤＦ  Ｚｕｃｋｅｒラット同腹子を、対照群または処理群（フマル酸イソロイシルチアゾリジン）のいずれかに無作為に割り当てた。動物は、１２時間の明／暗サイクル（午前６時に点灯）で一匹ずつ収容し、標準的なラット食料および水を随意に接近可能にした。
【０２１７】
毎日のモニタリングおよび薬剤投与に関するプロトコル
処理群には、経口強制飼養により毎日２回（午前８時と午後５時）、１０ｍｇ／ｋｇのフマル酸イソロイシルチアゾリジンを１００日間与えたのに対して、対照動物には１％セルロース溶液から構成される同時用量の賦形剤を与えた。収縮期血圧は、尾を切断する方法を用いて毎週測定した。
【０２１８】
試験動物（ｎ＝５、雄Ｗｉｓｔａｒラット、２００〜２２５ｇ）に最初に１．５Ｍの０．９％生理食塩水溶液中イソロイシルチアゾリジン（▲）または同容量の純粋な０．９％生理食塩水溶液（■）（対照群  ｎ＝５）を与えた。試験群にはさらに、３０分の実験時間をかけて０．７５Ｍ／分の阻害剤を注入した（＊）。対照群には、同じ時間間隔中、阻害剤を含まない０．９％生理食塩水溶液を注入した。開始時間ｔ＝０に、動物すべてにｉ．ｄ．グルコース用量の１ｇ／ｋｇの４０％デキストロース溶液（ｗ／ｖ）を投与した。１０分の時間間隔ですべての試験動物の血液試料を収集した。グルコースは全血を用いて分析した（Ｌｉｆｅｓｃａｎ  Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  ＩＩ分析器）のに対して、ＤＰＩＶ活性およびインスリン濃度は血漿中で分析した。インスリンラジオイムノアッセイは、１０〜１６０ｍＵ／ｍｌの範囲にわたって感受性があった［PEDERSON, R.A., BUCHAN, A.M.J., ZAHEDI-ASH, S., CHEN, C.B. & BROWN, J.C. Reg. Peptides. 3, 53-63 (1982)］。ＤＰＩＶ活性は、分光光度分析により推定された［DEMUTH, H.-U. and HEINS, J., On the catalytic Mechanism of Dipeptidyl Peptidase IV. in  Dipeptidyl Peptidase IV (CD26) in Metabolism and the Immune Response (B. Fleischer, Ed.) R.G. Landes, Biomedical Publishers, Georgetown, 1-35 (1995)］。データはすべて、平均値＋／−標準誤差として表される。
【０２１９】
実施例１８：グルタミニルピロリジンの経口投与後の脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットにおける用量漸増研究
動物：
Ｎ＝３０のＺｕｃｋｅｒラット（ｆａ／ｆａ）（平均齢１１週（５〜１２週）、平均体重３５０ｇ（１５０〜４００ｇ））をCharles River(Sulzfeld, Germany)から購入した。配達された後、ほぼすべての脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットが明白な真性糖尿病の特徴を有するまで、ラットを１２週間以上保持した。グルタミニルピロリジン対プラセボ（生理食塩水）の３つの漸増用量を試験するためにＮ＝８の動物群が補充された。
【０２２０】
収容条件
動物は、１２／１２時間の明／暗サイクル（午前６時に点灯）で制御温度（２２±２℃）を用いて標準条件下にて一匹ずつケージに入れた。滅菌した標準的なペレット化飼料（ｓｓｎｉｆｆ（商標）、Soest, Germany)およびＨＣｌで酸性化した水道水を随意に与えた。
【０２２１】
頸動脈のカテーテル法
収容条件で適応させた２４〜３１週（平均：２５週）齢の脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットを研究のために十分に準備した。全身麻酔（Ｒｏｍｐｕｎ（商標）［２％］(BayerVital, Germany）０．２５ｍｌ／ｋｇ（体重）およびケタミン１０(Atarost GmbH & Co., Twistringen, Germany)０．５ｍｌ／ｋｇ（体重）のｉ．ｐ．注射）下で脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットの頸動脈にカテーテルを埋没させた。動物を１週間回復させた。カテーテルにヘパリン生理食塩水（１００ＩＵ／ｍｌ）を１週間につき３回流した。
【０２２２】
実験設計：
プラセボ（生理食塩水１ｍｌ、０．１５４ｍｏｌ／ｌ）または漸増用量のグルタミニルピロリジン（５、１５および５０ｍｇ／ｋｇ（体重））をＮ＝８の脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラット群に投与した。グルタミニルピロリジン３７５ｍｇをＤＭＳＯ(E. Merck, Darmstadt; Germany［ジメチルスルホキシドｐ．ａ．］  １０００μｌに溶解した。生理食塩水１０ｍｌを添加して、それぞれグルタミニルピロリジン３４．０９ｍｇを含有する分取量１ｍｌを−２０℃で保管した。試験物質の調製のために、用量依存的分取量を生理食塩水で希釈した。
【０２２３】
一晩絶食させた後、プラセボまたは試験物質を供給用チューブ（１５Ｇ、７５ｍｍ、Fine Science Tools, Heidelbergm Germany)により脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットへ−１０分に経口投与した。２ｇ／ｋｇ（体重）のグルコース（４０％溶液、B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany）を用いた経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を、第２の供給用チューブにより±０分に施した。尾の静脈からの静脈血試料を、−３０分、−１５分、±０分、ならびに５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、９０および１２０分に２０μｌのガラスキャピラリーに収集した。２０μｌのガラスキャピラリーは、血中グルコース測定のための溶液１ｍｌを充填した標準的なチューブに入れられた。
血漿試料にはすべて、以下のデータをラベルした：
・コード番号
・動物番号
・サンプリングの日付
・サンプリングの時間
【０２２４】
分析方法：
グルコースレベルは、グルコースオキシダーゼ手順（Ｓｕｐｅｒ  Ｇ  Ｇｌｕｃｏｓｅ分析器、Dr. Muller Geratebau, Freital, Germany）を用いて測定した。
【０２２５】
統計学的方法：
ＰＲＩＳＭ（商標）３．０２(GraphPad Software, Inc.)により統計学的評価および表示を行った。パラメータはすべて、平均値およびＳＤを含む記述様式で分析された。
【０２２６】
グルコース耐性に対する投薬の効果：
プラセボ処理した糖尿病性Ｚｕｃｋｅｒラットは、強力に上昇した血中グルコース可動域を示し、明白な真性糖尿病のグルコース不耐性を示した。５ｍｇ／ｋｇ（体重）のグルタミニルピロリジンの投与は、糖尿病性Ｚｕｃｋｅｒラットにおけるグルコース耐性の制限された改善をもたらした。上昇した血中グルコースレベルの有意な低減およびグルコース耐性の改善は、１５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ（体重）のグルタミニルピロリジンの投与後に達成された（図６参照）。
【０２２７】
実施例１９：グルタミニルチアゾリジンの経口投与後の脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットにおける用量漸増研究
動物：
Ｎ＝３０のＺｕｃｋｅｒラット（ｆａ／ｆａ）（平均齢１１週（５〜１２週）、平均体重３５０ｇ（１５０〜４００ｇ））をCharles River(Sulzfeld, Germany)から購入した。配達された後、ほぼすべての脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットが明白な真性糖尿病の特徴を有するまで、ラットを１２週間以上保持した。グルタミニルピロリジン対プラセボ（生理食塩水）の３つの漸増用量を試験するためにＮ＝８の動物群が補充された。
【０２２８】
収容条件
動物は、１２／１２時間の明／暗サイクル（午前６時に点灯）で制御温度（２２±２℃）を用いて標準条件下にて一匹ずつケージに入れた。滅菌した標準的なペレット化飼料（ｓｓｎｉｆｆ（商標）、Soest, Germany)およびＨＣｌで酸性化した水道水を随意に与えた。
【０２２９】
頸動脈のカテーテル法
収容条件で適応させた２４〜３１週（平均：２５週）齢の脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットを研究のために十分に準備した。全身麻酔（Ｒｏｍｐｕｎ（商標）［２％］(BayerVital, Germany）０．２５ｍｌ／ｋｇ（体重）およびケタミン１０(Atarost GmbH & Co., Twistringen, Germany)０．５ｍｌ／ｋｇ（体重）のｉ．ｐ．注射）下で脂肪性Ｚｕｋｅｒラットの頸動脈にカテーテルを埋没させた。動物を１週間回復させた。カテーテルにヘパリン生理食塩水（１００ＩＵ／ｍｌ）を１週間につき３回流した。
【０２３０】
実験設計：
プラセボ（生理食塩水１ｍｌ、０．１５４ｍｏｌ／ｌ）または漸増用量のグルタミニルチアゾリジン（５、１５および５０ｍｇ／ｋｇ（体重））をＮ＝８の脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラット群に投与した。各量のグルタミニルチアゾリジンを生理食塩水１０００μｌに溶解した。一晩絶食させた後、プラセボまたは試験物質を供給用チューブ（１５Ｇ、７５ｍｍ、Fine Science Tools, Heidelbergm Germany)により脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットへ−１０分に経口投与した。２ｇ／ｋｇ（体重）のグルコース（４０％溶液、B. Braun Melsungen, Melsungen, Germany）を用いた経口グルコース耐性試験（ＯＧＴＴ）を、第２の供給用チューブにより±０分に施した。尾の静脈からの静脈血試料を、−３０分、−１５分、±０分、ならびに５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、９０および１２０分に２０μｌのガラスキャピラリーに収集した。２０μｌのガラスキャピラリーは、血中グルコース測定のための溶液１ｍｌを充填した標準的なチューブに入れられた。
血漿試料にはすべて、以下のデータをラベルした：
・コード番号
・動物番号
・サンプリングの日付
・サンプリングの時間
【０２３１】
分析方法：
グルコースレベルは、グルコースオキシダーゼ手順（Ｓｕｐｅｒ  Ｇ  Ｇｌｕｃｏｓｅ分析器、Dr. Muller Geratebau, Freital, Germany）を用いて測定した。
【０２３２】
統計学的方法：
ＰＲＩＳＭ（商標）３．０２(GraphPad Software, Inc.)により統計学的評価および表示を行った。パラメータはすべて、平均値およびＳＤを含む記述様式で分析された。
【０２３３】
グルコース耐性に対する投薬の効果：
プラセボ処理した糖尿病性Ｚｕｃｋｅｒラットは、強力に上昇した血中グルコース可動域を示し、明白な真性糖尿病のグルコース不耐性を示した。５ｍｇ／ｋｇ（体重）１５ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇ（体重）のグルタミニルチアゾリジンの投与は、糖尿病性Ｚｕｃｋｅｒラットにおいて、用量依存性の上昇した血中グルコースレベルの低減およびグルコース耐性の改善をもたらした（図７参照）。
【０２３４】
実施例２０：Ｗｉｓｔａｒラットへの経口投与後のグルタミニルチアゾリジンのｉｎ  ｖｉｖｏ不活性化
動物／実験設計：
グルタミニルチアゾリジンを実施例９に記載するようにＷｉｓｔａｒラットへ経口投与した。
【０２３５】
分析方法：
プラセボまたはグルタミニルチアゾリジンの適用後、動脈血試料を意識のある拘束していないラットの頸動脈カテーテルから２．５、５、７．５、１０、１５、２０、４０、６０および１２０分に動脈血試料を採取して、グルタミニルチアゾリジンの分解生成物の形成を決定した。
分析のために、Ｃ１８カートリッジによる簡単な固相抽出手順を用いて、血漿から所定の化合物を単離した。ＡＰＣＩ正モードで操作するタンデム質量分析と結び付けたＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ６０  ＲＰ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｂカラムによる逆相液体クロマトグラフィを用いて抽出物を分析した。内部標準法を定量化に使用した。
【０２３６】
結果：
Ｗｉｓｔａｒラットへのグルタミニルチアゾリジンの経口投与後、化合物の分解が見られた。ＬＣ／ＭＣを用いて、分解生成物はピログルタミニルチアゾリジンとして定義することができる。図８および図９を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】ＧＩＰ1-42のＤＰＩＶ触媒加水分解およびイソロイシルチアゾリジンによるそれらの阻害（ａ）およびＧＬＰ7-36のＤＰＩＶ触媒加水分解およびイソロイシルチアゾリジンによるそれらの阻害（ｂ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。
【図２】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンの存在下でのＧＬＰ−１代謝産物の血清存在のＨＰＬＣ分析を示す。
【図３】ｉ．ｄグルコース刺激したラットの種々の血液パラメータに対するＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンの影響を示す。
【図４】薬剤適用の１２週中の絶食時血中グルコースに対するＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンによる脂肪性（ｆａ／ｆａ）ＶＤＦ  Ｚｕｃｋｅｒラットの長期経口処理の影響を示す。
【図５】薬剤適用の８週以内の収縮期血圧に対するＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンによる脂肪性（ｆａ／ｆａ）ＶＤＦ  Ｚｕｃｋｅｒラットの長期処理の影響を示す（収縮期血圧は、ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法を用いて測定した）。
【図６】それぞれ５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ（体重）のグルタミニルピロリジンおよびプラセボの経口投与後の糖尿病Ｚｕｃｋｅｒラットにおける血中グルコースレベルの用量依存的低減を示す。
【図７】それぞれ５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ（体重）のグルタミニルチアゾリジンおよびプラセボの経口投与後の糖尿病Ｚｕｃｋｅｒラットにおける血中グルコースレベルの用量依存的低減を示す。
【図８】Ｗｉｓｔａｒラットへのグルタミニルチアゾリジンの経口投与後に見られる分解生成物であるピログルタミニルチアゾリジンの化学構造を示す。
【図９】脂肪性Ｚｕｃｋｅｒラットへのグルタミニルチアゾリジンの経口投与後に得られるラット血漿抽出物のクロマトグラムを示す。２．９５分のピークはグルタミニルチアゾリジンを表し、６．５７分のピークはピログルタミニルチアゾリジンを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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