(57)【要約】タンパク質活性化レセプターのアンタゴニストを含む組成物および方法を提供する。特に、本発明は、タンパク質活性化レセプター２に結合し、このレセプターの活性化に関連するプロセスを阻害する、タンパク質、ペプチドおよび生体分子の使用に関する。具体的には、本発明は、異常細胞増殖、血管形成、炎症および癌等に付随する疾病および疾患の治療のための、新規な組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質、ペプチド、生体分子またはそれらの活性断片を含む、タンパク質活性化レセプターの活性を阻害するための組成物。
【請求項２】
前記タンパク質活性化レセプターは、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３またはＰＡＲ−４を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質、ペプチド、または生体分子は、ＬＩＧＫ（配列番号１）、ＬＩＧＫＶ（配列番号２）、ＫＧＩＬ（配列番号３）、ＫＧＩ（配列番号４）、ＡＧＩ（配列番号５）、ＩＧＡ（配列番号６）、ＫＧＡ（配列番号７）、ＫＧＡ（配列番号８）、ＫＡＩ（配列番号９）、ＩＡＫ（配列番号１０）、ＲＧＩ（配列番号１１）、ＩＧＲ（配列番号１２）、Ｄａｂ−ＧＩ（配列番号１３）、Ｄａｐ−ＧＩ（配列番号１４）、ＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１５）、ＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１６）、ＬＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１７）、Ｄａｂ−ＧＩＬ（配列番号１８）、ＬＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１９）、Ｄａｐ−ＧＩＬ（配列番号２０）、ＬＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２１）、Ｏｒｎ−ＧＩＬ（配列番号２２）、Ｏｒｎ−ＧＩ（配列番号２３）、ＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２４）、ＥＮＭＤ５４５、ＥＮＭＤ５４７およびそれらの活性断片を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記タンパク質活性化レセプターはＰＡＲ−２を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記タンパク質活性化レセプターはＰＡＲ−２を含み、前記タンパク質、ペプチド、または生体分子はＬＩＧＫ（配列番号１）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記タンパク質活性化レセプターはＰＡＲ−２を含み、前記タンパク質、ペプチド、または生体分子はＥＮＭＤ５４７を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
被検体におけるタンパク質活性化レセプターの活性を阻害する方法であって、タンパク質、ペプチド、生体分子またはそれらの活性断片の、該被検体への投与を含む方法。
【請求項９】
前記タンパク質活性化レセプターは、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３またはＰＡＲ−４を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質、ペプチド、生体分子は、ＬＩＧＫ（配列番号１）、ＬＩＧＫＶ（配列番号２）、ＫＧＩＬ（配列番号３）、ＫＧＩ（配列番号４）、ＡＧＩ（配列番号５）、ＩＧＡ（配列番号６）、ＫＧＡ（配列番号７）、ＫＧＡ（配列番号８）、ＫＡＩ（配列番号９）、ＩＡＫ（配列番号１０）、ＲＧＩ（配列番号１１）、ＩＧＲ（配列番号１２）、Ｄａｂ−ＧＩ（配列番号１３）、Ｄａｐ−ＧＩ（配列番号１４）、ＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１５）、ＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１６）、ＬＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１７）、Ｄａｂ−ＧＩＬ（配列番号１８）、ＬＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１９）、Ｄａｐ−ＧＩＬ（配列番号２０）、ＬＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２１）、Ｏｒｎ−ＧＩＬ（配列番号２２）、Ｏｒｎ−ＧＩ（配列番号２３）、ＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２４）、ＥＮＭＤ５４５、ＥＮＭＤ５４７およびそれらの活性断片を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質活性化レセプターはＰＡＲ−２を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質活性化レセプターはＰＡＲ−２を含み、前記タンパク質、ペプチド、または生体分子はＬＩＧＫ（配列番号１）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質活性化レセプターはＰＡＲ−２を含み、前記タンパク質、ペプチド、または生体分子はＥＮＭＤ５４７を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
異常なタンパク質活性化レセプターの活性に関連する疾病を治療するための方法であって、タンパク質活性化レセプターの活性を阻害することが可能な、タンパク質、ペプチド、生体分子またはそれらの活性断片を含む組成物の、係る治療が必要な被検体への投与を含む方法。
【請求項１６】
前記タンパク質、ペプチド、生体分子は、ＬＩＧＫ（配列番号１）、ＬＩＧＫＶ（配列番号２）、ＫＧＩＬ（配列番号３）、ＫＧＩ（配列番号４）、ＡＧＩ（配列番号５）、ＩＧＡ（配列番号６）、ＫＧＡ（配列番号７）、ＫＧＡ（配列番号８）、ＫＡＩ（配列番号９）、ＩＡＫ（配列番号１０）、ＲＧＩ（配列番号１１）、ＩＧＲ（配列番号１２）、Ｄａｂ−ＧＩ（配列番号１３）、Ｄａｐ−ＧＩ（配列番号１４）、ＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１５）、ＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１６）、ＬＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１７）、Ｄａｂ−ＧＩＬ（配列番号１８）、ＬＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１９）、Ｄａｐ−ＧＩＬ（配列番号２０）、ＬＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２１）、Ｏｒｎ−ＧＩＬ（配列番号２２）、Ｏｒｎ−ＧＩ（配列番号２３）、ＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２４）、ＥＮＭＤ５４５、ＥＮＭＤ５４７およびそれらの活性断片を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾病は、血管形成疾患、好ましくない新生血管形成、炎症、腫瘍成長、敗血症、神経因性炎症性疼痛、喘息、術後腸閉塞および癌を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾病は炎症を含み、前記タンパク質、ペプチド、生体分子はＬＩＧＫ（配列番号１）を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾病は炎症を含み、前記タンパク質、ペプチド、生体分子はＥＮＭＤ５４７を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質活性化レセプターのアンタゴニストを含む組成物および方法に関する。特に、本発明は、タンパク質活性化レセプターに結合し、このレセプターの活性化に関連するプロセスを阻害する、タンパク質、ペプチドおよび生体分子の使用に関する。具体的には、本発明は、異常細胞増殖、血管形成、炎症および癌等に関連する疾病および疾患の治療のための、新規組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の増殖はすべての生物体において常時起きているプロセスであって、それには多くの因子とシグナルが関わり合っていて、それらが微妙にバランスをとりながら正常な細胞のサイクルを維持している。一般的な細胞分裂のプロセスは連続した二つのプロセスからなっていて、それらは核の分裂（有糸分裂）と細胞質の分裂（細胞質分裂）である。生物体は絶えず細胞を成長させ、交替させているので、細胞の増殖は、ほとんどすべての生物学的プロセスを正常に機能させるためには欠くことのできない中核的なプロセスである。哺乳類の細胞が成長や分裂をするかどうかを支配しているのは、細胞が成長可能となるスペースの利用を含めた各種のフィードバック調節メカニズム、および隣接する環境における特定の促進性および抑止性の因子の分泌などである。
【０００３】
正常な細胞の増殖に混乱が生じたり、ある程度阻害されたりすると、その結果各種の生体機能の秩序に影響が現れる。増殖が阻害されるには無数の因子が原因となり得て、たとえば、各種のシグナル伝達物質の欠乏または過剰、あるいは環境の変化などである。異常な細胞増殖による特徴的な障害としては、癌、胚の異常発育、黄体の不適切な形成、創傷治癒の困難、さらには炎症および免疫反応での機能不全などがある。
【０００４】
癌の特徴は異常な細胞増殖にある。癌細胞は宿主にとっては危険となる多くの特性をもっており、しばしば他の組織に浸潤していくことができ、また毛細血管での内部成長をひきおこすことができるので、その結果増殖中の癌細胞に十分な血液の供給がもたらされる。癌細胞の決定的な特徴の一つは、正常な細胞の分裂を制御している調節メカニズムに対して異常に反応し、ほとんど調節不能な状態で分裂を続け、宿主を殺してしまうことにある。
【０００５】
血管形成および血管形成関連の疾患は細胞の増殖と密接な関係がある。本明細書において用いる「血管形成」という用語は、組織または器官の内部に新しい血管が形成されることを意味している。正常な生理的条件においては、ヒトまたは動物において血管形成が起きるのは極めて特定の限られた状態の場合だけである。たとえば、血管形成が通常認められるのは、創傷治癒、胎児および胚の発育、黄体、子宮内膜および胎盤の形成の場合である。「内皮」という用語は本明細書においては、漿液腔、リンパ管および血管の表面に並んでいる扁平な細胞の薄い層と定義する。これらの細胞を本明細書においては「内皮細胞」と定義する。「内皮阻害活性」という用語は、一般的に血管形成を阻害するための分子の能力を意味する。内皮細胞増殖の阻害の結果、血管形成も阻害される。
【０００６】
血管形成は制御が効く場合も効かない場合も、同様の過程を経て進行すると考えられる。内皮細胞および周皮細胞は、基底膜によって包まれ、毛細血管を形成している。血管形成は、内皮細胞および白血球から放出される酵素によって基底膜が浸食されることから始まる。次いで血管の内腔に並んでいる内皮細胞が、基底膜を突き抜ける。血管形成の刺激物が刺激することにより内皮細胞が浸食された基底膜を通過して移動する。この移動した細胞が親の血管から離れて「芽」を形成し、そこで内皮細胞が有糸分裂をして増殖する。
内皮細胞の芽が互いにつながり合い、毛細管状のループを形成して、新しい血管を作る。
【０００７】
持続的で無秩序な血管形成は、疾患状態の重複、腫瘍の転移および内皮細胞の異常成長の場合に起こり、これらの状態で観察される病理学的な損傷をもたらす。無秩序な血管形成が生じる場合の多様な病理学的疾患状態は、血管形成依存性、血管形成付随性または血管形成関連性の疾患に分類されてきた。これらの疾患は、異常あるいは好ましくない細胞増殖、とりわけ内皮細胞増殖の結果である。
【０００８】
腫瘍の成長は血管形成依存性であるという仮説は１９７１年にJudah Folkmanによって初めて提唱された(N. Engl. Jour. Med. 285: 1182-1186, 1971)。ごく簡単に説明すれば、この仮説では、一旦腫瘍の「獲得」が起きると、腫瘍細胞集団の増大に先だって必ず、腫瘍の上に集中して新しい毛細血管が増加すると提唱している。この腫瘍の「獲得」は現在では、腫瘍成長における前駆血管の段階を指すと理解されており、そこでは、腫瘍細胞の集団が数立方ミリメートルの体積を占め、細胞の数は数百万をこえることはなく、当の宿主の微小血管の中で生きている。腫瘍の体積がこの段階の後に拡大するためには、新しい毛細血管の誘導が必要である。たとえば、マウスにおいて、初期の前駆血管の段階における肺の微少転移巣は、組織の切片を高倍率の顕微鏡で調べない限り見つけられない。腫瘍の成長が血管形成依存性であるという概念を支持するさらなる間接的な証拠は、米国特許第５，６３９，７２５号、同第５，６２９，３２７号、同第５，７９２，８４５号、同第５，７３３，８７６号および同第５，８５４，２０５号に見出されるが、これらの特許すべてはここに引用することにより本明細書に援用する。
【０００９】
以上のことから明らかなのは、細胞増殖、特には内皮細胞増殖、さらに最たるものとして血管形成が癌の転移において主要な役割を果たしていることである。この異常あるいは好ましくない増殖活性を制圧し、阻害しあるいは排除することができれば、腫瘍は、たとえ既に存在していても、成長しないであろう。この疾患状態では、異常あるいは好ましくない細胞の増殖および血管形成を妨げることによって、新たな微小血管系の浸入によるダメージを回避することができる。細胞増殖過程の制御のための治療法は、これらの疾患を抑止あるいは軽減させることを可能とする。
【００１０】
近年、異常なタンパク質活性化レセプターの活性と、ある種の疾病および疾患とが相関するという研究が行われた。特に興味深いのは、炎症、血管形成、および敗血症等の疾病に関連することが発見された、タンパク質活性化レセプター−２である。幾つかの試みがなされたが、タンパク質活性化レセプター−２の効果的なアンタゴニストは同定されなかった。必要なのは、異常または好ましくない細胞機能、特に、好ましくない細胞増殖、血管形成、炎症および癌に関連する機能を阻害することのできる、組成物および方法である。この組成物は、内因性タンパク質活性化レセプターのリガンドの活性に打ち勝ち、タンパク質活性化レセプターの活性化を阻害することにより、タンパク質活性化レセプターの不適切な活性化に付随する異常な生理状態の発生を阻害する、タンパク質、ペプチドおよび生体分子を含むべきである。最後に、タンパク質活性化レセプターの活性化を阻害するための組成物および方法は、無毒であり、副作用がほとんどないことが好ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
異常または好ましくない細胞機能、特に、血管形成、新生血管形成、炎症、腫瘍成長、敗血症、神経因性および炎症性の疼痛、喘息および術後腸閉塞に関する細胞活性および増殖を阻害するのに効果的な、組成物および方法を提供する。この組成物は、タンパク質活性化レセプターに結合するリガンドの全て、またはその活性部分を含む、天然または合成タンパク質、ペプチド、タンパク質断片または生体分子を含み、必要に応じて薬学的に許容可能な担体と組み合わせられる。
【００１２】
本発明に有用な、代表的なリガンドまたはアンタゴニストとしては、タンパク質活性化レセプター１（ＰＡＲ−１）またはタンパク質活性化レセプター２（ＰＡＲ−２）、タンパク質活性化レセプター３（ＰＡＲ−３）、およびタンパク質活性化レセプター４（ＰＡＲ−４）等の、タンパク質活性化レセプターに結合するタンパク質、ペプチドおよび生体分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の好ましいリガンド組成物としては、ＬＩＧＫ（配列番号１）、ＬＩＧＫＶ（配列番号２）、ＫＧＩＬ（配列番号３）、ＫＧＩ（配列番号４）、ＡＧＩ（配列番号５）、ＩＧＡ（配列番号６）、ＫＧＡ（配列番号７）、ＫＧＡ（配列番号８）、ＫＡＩ（配列番号９）、ＩＡＫ（配列番号１０）、ＲＧＩ（配列番号１１）、ＩＧＲ（配列番号１２）、Ｄａｂ−ＧＩ（Ｄａｂ＝ジアミノブタン酸）（配列番号１３）、Ｄａｐ−ＧＩ（Ｄａｐ＝ジアミノプロピオン酸）（配列番号１４）、ＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１５）、ＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１６）、ＬＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１７）、Ｄａｂ−ＧＩＬ（配列番号１８）、ＬＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１９）、Ｄａｐ−ＧＩＬ（配列番号２０）、ＬＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２１）、Ｏｒｎ−ＧＩＬ（配列番号２２）、Ｏｒｎ−ＧＩ（配列番号２３）およびＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２４）、ＥＮＭＤ５４５（図１）、ＥＮＭＤ５４７（図１）ならびに図２に提供された各種ペプチド類似構造を含むタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、機能的および構造的誘導体を含むリガンドおよびアンタゴニスト、ならびに上に列挙された生体分子の等価物も、本発明の範囲内であると考えられる。
【００１３】
タンパク質、ペプチド、タンパク質断片または生体分子は、上で特定されたリガンドおよびアンタゴニストの全てまたはその活性部分を含むことが好ましい。「活性部分」という用語は、本明細書で使用する場合には、タンパク質活性化レセプターの活性化を阻害するタンパク質、ペプチドまたは生体分子の一部を意味する。タンパク質活性化レセプターの活性を阻害する、同族体、ペプチド、もしくはタンパク質断片、または上で特定されたリガンドおよびアンタゴニストの組み合わせも、本発明に含まれる。
【００１４】
タンパク質活性化レセプターの活性を阻害することによって、本明細書で記載された方法および組成物は、異常なタンパク質活性化レセプターの活性に関連する疾患および疾病を阻害するのに有用であると考えられる。炎症や癌等の、タンパク質活性化レセプターが媒介する疾患およびプロセスを治療するために本明細書で提供する方法は、本明細書で記載された組成物を、タンパク質活性化レセプターの活性、特に、ＰＡＲ−２の活性を阻害するのに十分な用量で、ヒトまたは動物に投与することを含む。この方法は、特に、血管形成を阻害することによって、腫瘍の成長を処置または抑制するのに特に有用である。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、異常または好ましくないタンパク質活性化レセプターの活性が媒介する疾患およびプロセスを処置するための方法および組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、血管形成、新生血管形成、炎症、腫瘍成長、敗血症、神経因性および炎症性の疼痛、喘息および術後腸閉塞に関する、異常または好ましくない細胞機能、特に、細胞活性および増殖を阻害するための方法および組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、癌の成長を処置しあるいは抑制するための方法と組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる別の目的は、副作用を最小限とした癌の治療法のための方法と組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、血管形成が媒介する疾患およびプロセスを処置するための方法と
組成物を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる別の目的は、タンパク質活性化レセプターの活性を阻害する、タンパク質、ペプチド、生体分子、活性断片およびそれらの同族体を使用することを含む方法および組成物を提供することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、タンパク質活性化レセプターに結合するリガンドを含む抗血管新生化合物を投与することによって、血管形成によってもたらされる疾患およびプロセスを処置するための方法と組成物を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、異常なタンパク質活性化レセプターの活性によってもたらされる疾患およびプロセスを処置するための方法および組成物を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、タンパク質活性化レセプターの異常な活性を測定することによって疾患および疾病を診断するための方法および組成物を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる別の目的は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、タンパク質活性化レセプターに結合するリガンドを含む組成物を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる別の目的は、筋内、静脈内、経皮、経口、または皮内投与され得る薬学的に許容可能な担体をさらに含むタンパク質活性化レセプターに結合するリガンドを含む方法および組成物を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる別の目的は、血管形成が媒介する疾患およびプロセスを処置するための組成物および方法を提供することであり、それら疾患に含まれるのは、血管腫、固形腫瘍、血液由来腫瘍(blood borne tumor)、白血病、転移、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管形成、クローン病、プラーク新生血管形成、動静脈の異常形成、角膜疾患、ルベオーシス、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、水晶体後方線維増殖症、関節炎、糖尿病性新生血管形成、黄斑変性症、創傷治癒、消化性潰瘍、ヘリコバクターに関連する疾患、骨折、ケロイド、血管形成、造血、排卵、月経、胎盤形成、およびネコ引っ掻き熱などであるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明の上記およびその他の目的、特徴および優れた点については、以下の開示した実施形態の詳細な説明および添付した特許請求の範囲を参照すれば明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下には、本発明を実施する場合の、現在考え得る最良の実施形態が記載されている。ここにおける記載は、本発明の一般的な原理を説明するためになされたものであり、限定的に解釈されるべきではない。本明細書で言及する引用文献の全文が、参照によりその全てを本明細書に援用されるが、それらは、米国仮出願第６０／３９１，６５５（２００２年６月２６日出願）、米国仮出願第６０／３９８，６６２（２００２年７月２６日出願）、米国仮出願第６０／４５８，０９５（２００３年３月２７日出願）および米国仮出願第６０／４６６，２９６（２００３年４月２９日出願）を含む。
【００２９】
プロテイナーゼ活性化レセプター−２（ＰＡＲ−２）は、トリプシン、トリプターゼ、マトリプターゼ、組織因子（ＴＦ）／因子ＶＩＩａ（ｆＶＩＩａ）複合体と好中球プロテアーゼ−３等の他のプロテアーゼの、タンパク質分解活性に反応してシグナル伝達する、７つの膜貫通Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）である。アミノ末端のタンパク質分解切断により、一連のペプチドリガンドのメカニズムを通して該レセプターを活性化する新規アミノ末端が露わとなる；本質的に、末端はレセプターのリガンド結合ポケットに
挿入するリガンドになる。短い合成活性化ペプチド（ＰＡＲ  ２ＡＰ、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）（ヒト）、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ2（マウス）（配列番号２６））は、レセプターを活性化する。リガンドが結合すると、細胞内のカルシウム濃度が増加する。
【００３０】
ＰＡＲ−２は、血管形成、新生血管形成および炎症に関与することが幾つかの研究例により示された。ＰＡＲ−２は、疼痛伝達、組織損傷および心血管機能の調節にも関連していた。例えば、Milia等は、心血管系におけるＰＡＲ−２の幅広い発現、ＰＡＲ−２によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの内皮細胞の有糸分裂誘発の媒介、およびＰＡＲ−２によるｉｎ  ｖｉｖｏでの血管拡張および微小血管浸透性の促進について議論している：これらのステップの全ては、血管形成における必須のステップと考えられる（Milia等、Circulation Research Vol. 91 (4) 2002 pp.346-352）。Milia等は、全て炎症に関与すると考えられる、腫瘍壊死因子−α、インターロイキン−β、およびリポ多糖を含むサイトカインによる、ＰＡＲ−２発現のアップレギュレーションについてさらに議論している（Ｉｄ．）。
【００３１】
さらに、最近の研究により、ＰＡＲ−２の活性化は神経因性の炎症および痛覚をもたらすということが示され、場合によってはニューロン上でのＰＡＲ−２の活性化は、炎症誘発性のサイトカインの生成、および一連の炎症シグナルをもたらすことが示された。ＰＡＲ−２は、関節リウマチ等の慢性炎症性疾患の発症において本質的な役割を果たすことも示された。
【００３２】
異常な生理的状態におけるＰＡＲ−２活性の現在の知識に基づくと、ＰＡＲ−２活性は、これらに限定されるものではないが、血管形成、新生血管形成、炎症、腫瘍成長、敗血症、神経因性および炎症性の疼痛、喘息および術後腸閉塞等の、多数の疾病および疾患に関連すると考えられる。
【００３３】
本発明者等は、本明細書において、ＰＡＲ−２アゴニストＴＦ／ｆＶＩＩａのタンパク質分解活性は、凝集におけるその役割とは独立して、腫瘍成長および血管形成を促進させることを示す。今までＰＡＲ−２の特異的アンタゴニストが同定されなかったため、ＰＡＲ−２の役割および疾患への関連性のさらなる特徴化および分析は難しかった。本明細書で本発明者等は、ＰＡＲ−２シグナル伝達の特異的アンタゴニストに関して初めて記載する。これらのＰＡＲ−２アンタゴニストは、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管形成および腫瘍成長の強力な阻害剤である。本発明者等による先行研究は、腫瘍成長および血管形成におけるＰＡＲ−２に関する潜在的な役割を示唆したため、これらの阻害剤は、腫瘍成長または血管形成を阻害することができるかどうかを決定するためにさらなる評価が行われた。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＰＡＲ−２シグナル伝達の阻害により、血管形成および腫瘍成長の両方を強力に阻害する。したがって、これらの阻害剤の研究は、ＰＡＲ−２活性が血管形成および腫瘍成長を制御することを示す。これらのデータは、正常および異常なプロセスにおけるＰＡＲ−２の生理学の研究にとって強力な手段である見込みのあるＰＡＲ−２シグナル伝達の強力かつ特異的なアンタゴニストに関する本発明者等の知見を支持する。
【００３４】
本明細書に記載された研究は、ＰＡＲ−２アンタゴニストの最初の同定を提供する。ＰＡＲ−２の重要な生理的機能を示す、多数の報告が出版された。これらの活性は、痛覚から炎症、喘息、および神経因性疼痛の範囲にまで及ぶ。これらの各研究において、特異的なＰＡＲ−２アンタゴニストの欠如、およびこのレセプターの将来の特徴化におけるそれらの重要な価値に対して具体的に言及する。
【００３５】
ＰＡＲ−２が幾つかの疾患および疾病に関連するという発見に基づく、ＰＡＲ−２アンタゴニストに関する科学界および医学界の認知にも関わらず、係るアンタゴニストに対して長らく望まれてきた要求を現在の発見まで満たすことはできなかった。確かに、他の研究はＰＡＲ−２活性を阻害することを含む方法を説明すると主張しているが、それらはい
ずれも特異的なアンタゴニストを実際に同定しておらず、例えば、係る研究の１つではむしろ、トリプシン、トリプターゼ、マトリプターゼまたは組織因子（ＴＦ）／因子ＶＩＩａ（ｆＶＩＩａ）複合体による、ＰＡＲ−２のアミノ末端のタンパク質分解切断を妨げることに注目している（例えば、国際公開公報第０１／５２８８３号を参照）。係る研究では、ＰＡＲ−２アンタゴニストに対する要求を認知しているが、特異的なペプチドを同定したり、または係るペプチド、タンパク質または生体分子に関して潜在的に起こり得る立体配座や立体配置に関するガイダンスを提供することには失敗している。しかしながら、本発明者等はこれらの失敗を克服し、特異的なペプチドを成功裏に同定し、さらにはＰＡＲ−２アンタゴニストの設計および説明を可能にする、タンパク質／ペプチド構造の特定の立体配座も発見した。
【００３６】
上記のように、ＰＡＲは、血栓または炎症性のプロテイナーゼ活性のセンサーとして機能する、Ｇタンパク質結合レセプターのファミリーである。ＰＡＲ−２レセプターを欠損するノックアウトマウスは、慢性炎症のアジュバント単関節炎モデルにおいて関節腫張または組織損傷をほとんど示さず、それにより炎症におけるＰＡＲ−２の役割を再確認した。別の実験において、本発明者等は、初期および転移性の腫瘍の両方の成長にとって、組織因子の凝集経路が必要とされることを示した。これは、ｆＸａではなくＴＦ／ｆＶＩＩａ複合体の活性を必要としたが、これはＴＦ／ｆＶＩＩａ活性の、通常の生理的な標的である。したがって、以下の理論によって拘束されることは望まないが、異常な生理的状態において、ＴＦ／ｆＶＩＩａ複合体はｆＸａ以外のものを標的としていると考えられ、本明細書における研究に基づき、本発明者等はその標的がＰＡＲ−２であると考える。
【００３７】
ＰＡＲ−２に対するペプチドアンタゴニストを設計するために、本発明者等はまず、アゴニストペプチドであって、先端の欠失した、またはアラニンで単置換したかのいずれかの、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）（このシグナル伝達ペプチドは、科学文献においてＰ２ＡＰまたは２ＡＰまたはＡＰ２としても知られている）のシグナル伝達活性を精密に調査した。これは、シグナル伝達活性を保持するペプチドを排除するために行われ、阻害研究において細胞を脱感作する。図４Ａは、２つの先端の欠失した分子、ＬＩＧＫ（配列番号１）およびＬＩＧＫＶ（配列番号２）と比較した、ＰＡＲ−２アゴニストＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）のカルシウム動員曲線を示す。いずれの先端の欠失した分子も、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）に対比して、カルシウム動員を誘導できず、これは、カルシウム放出の典型的なスパイクに続くシグナルの衰退を示した。類似の研究を、アラニンで置換したＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）ペプチドに関して行った（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ＳＬＩＧＫＶのＳ、Ｌ、Ｉ、またはＫにおける置換は、シグナル伝達活性を抑制もしくは有意に減少させ、一方、２つの置換ペプチド、ＳＬＩＡＫＶ（配列番号３１）およびＳＬＩＧＫＡ（配列番号３３）は、強いシグナル伝達活性を示すことがわかった。
【００３８】
本発明者等は、ＰＡＲ−２シグナル伝達活性を欠如するこれらのペプチドの１つが、シグナル伝達する能力を欠如する一方でＰＡＲ−２レセプターに結合する能力を保持するため、むしろＰＡＲ−２アンタゴニストとして機能し得ると仮定した。このように、係るペプチドは、内因性のアゴニストペプチドの結合およびシグナル伝達を阻害または置換するため、競合阻害剤として機能する。ＰＡＲ−２シグナル伝達を阻害するこれらのペプチドの潜在力を評価するために、細胞を潜在的アンタゴニストペプチドで所定時間前処理し、次いでＰ２ＡＰで処理した。ＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）から誘導された２つのペプチド、ＬＩＧＫ（配列番号１）およびＬＩＧＫＶ（配列番号２）は、アンタゴニスト活性を示した。図５は、Ｐ２ＡＰシグナル伝達を阻害するため増加濃度のＬＩＧＫ（配列番号１）を使用した、代表的な投薬研究の結果を示す。この研究において、濃度１ｍＭのＬＩＧＫ（配列番号１）は、１００μＭのＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）のシグナル伝達を完全に阻害した。ＬＩＧＫ（配列番号１）とＬＩＧＫＶ（配列番号２）との活性を比較する類似の研究では、ＬＩＧＫ（配列番号１）ペプチドは、ＬＩＧＫＶ（配列番号２）と比較し
て、ＰＡＲ−２シグナル伝達のより強力な阻害剤であること（ＩＣ５０＜０．５ｍＭ）がわかった（図６）。さらなるペプチドとしては、ＫＧＩＬ（配列番号３）、ＫＧＩ（配列番号４）、ＡＧＩ（配列番号５）、ＩＧＡ（配列番号６）、ＫＧＡ（配列番号７）、ＫＧＡ（配列番号８）、ＫＡＩ（配列番号９）、ＩＡＫ（配列番号１０）、ＲＧＩ（配列番号１１）、ＩＧＲ（配列番号１２）、Ｄａｂ−ＧＩ（Ｄａｂ＝ジアミノブタン酸）（配列番号１３）、Ｄａｐ−ＧＩ（Ｄａｐ＝ジアミノプロピオン酸）（配列番号１４）、ＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１５）、ＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１６）、ＬＩＧ−Ｄａｂ（配列番号１７）、Ｄａｂ−ＧＩＬ（配列番号１８）、ＬＩＧ−Ｄａｐ（配列番号１９）、Ｄａｐ−ＧＩＬ（配列番号２０）、ＬＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２１）、Ｏｒｎ−ＧＩＬ（配列番号２２）、Ｏｒｎ−ＧＩ（配列番号２３）およびＩＧ−Ｏｒｎ（配列番号２４）、ＥＮＭＤ５４５（図１）、ＥＮＭＤ５４７（図１）ならびに図２に提供された各種ペプチド類似構造が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
ＬＩＧＫ（配列番号１）がＰＡＲ−２シグナル伝達の特異的阻害剤であることを示すために、ＡＴＰおよびＰＡＲ−１活性化ペプチドであるＳＦＬＬＲＮ（配列番号３４）を用いて、ＬＩＧＫで前処理した細胞上で活性化研究を行った。これらの両方の分子は、Ｇタンパク質結合レセプターを通してシグナル伝達し、ＰＡＲ−１アゴニストペプチドがＰＡＲ−２を通して高濃度でシグナル伝達できるほど、ＰＡＲ−１はＰＡＲ−２に対して非常に高く相同する。両方の場合において、ＰＡＲ−２アンタゴニストであるＬＩＧＫ（配列番号１）は、シグナル伝達に対する阻害効果を有さなかった（図７）。
【００４０】
次に本発明者等は、ＬＩＧＫペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏでＰＡＲ−２アンタゴニスト活性を有するかどうかを評価した。これは、血管透過性がＰＡＲ−２アゴニストペプチドによって誘導される水腫モデルを使用して研究した。このモデルにおいて、ＰＡＲ−２ペプチドは予想された重篤な水腫を誘導する（図８）。この血管応答は、ＰＡＲ−２アンタゴニストＬＩＧＫ（図９）による共処理で阻害された。したがって、ＬＩＧＫは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＡＲ−２シグナル伝達をブロックするように機能する。
【００４１】
本発明者等による先行研究は、ＴＦ／ｆＶＩＩａのタンパク質分解活性は、非止血メカニズムを通して血管形成および腫瘍成長を促進することを示した。ＴＦ／ｆＶＩＩａによるＰＡＲ−２の切断は、ＴＦ／ｆＶＩＩａがこれらのプロセスを促進するメカニズムを表す場合があるという学説が立てられた。これらの理由のために、本発明者等は、ＬＩＧＫの腫瘍成長を阻害する能力を特徴付けることを試みた。ＰＡＲ−２活性は、最初にルイス肺癌（ＬＬＣ）の実験転移モデルにおいて評価した。
【００４２】
この腫瘍成長モデルでは、腫瘍細胞を肺へ戻した後、接種後３日目に処理を開始し、成長を開始させた。このモデルでは（図１０）、ＰＡＲ−２アンタゴニストＬＩＧＫは、転移性の腫瘍成長の非常に強力な阻害剤であることがわかった。４ｍｇ／日の投与量で、腫瘍成長は７５％阻害された。ＬＩＧＫは、複数回の独立した実験において用量依存性も示し、２ｍｇ／日でおよそＩＣ５０であった（図１１）。
【００４３】
類似の実験を、ＬＬＣの原発腫瘍モデルにおいて行った。このモデルでは、腫瘍体積が１００ｍｍ3に到達した時に処理を開始した。転移モデルと一致して、ＬＩＧＫはＬＬＣの原発腫瘍の非常に強力な阻害剤であることが証明された（図１２）。１ｍｇ／日で、腫瘍成長は６２％阻害された。
【００４４】
ＴＦ／ｆＶＩＩａ阻害剤は、強力な抗血管新生剤でもあるため、本発明者等はマトリゲルの血管新生モデルにおいて、ＬＩＧＫの抗血管新生活性を試験した。このアッセイでは、ｂＦＧＦを混合したマトリゲルを皮下に移植し、処理を２４時間後に開始する。ｂＦＧＦのコントロールプラグでは高度に血管が新生し、血液が充填した血管で満たされた。Ｌ
ＩＧＫで処理した動物由来のマトリゲルプラグは、プラグ中のヘモグロビン含量に基づいて、血管形成は用量に依存して阻害されることが示された（図１３）。ＬＩＧＫの最も高い投与量では、血管形成は８０％より大きく阻害された。これらのデータは、ＬＩＧＫが強力な抗血管新生活性を有することを示しており、さらに、ＬＩＧＫが腫瘍成長の阻害を可能とするメカニズムを示唆する。
【００４５】
これらの腫瘍モデルにおけるＰＡＲ−２の役割を確認するために、本発明者等は、ＬＩＧＫアンタゴニストペプチドの構造に基づいて、新規のペプチド類似アンタゴニストの合成を試みた。これらの阻害剤の構造は、ＬＩＧＫ配列に基づいており、一般に、一方には塩基性部分（例えば、リシン）と、その部分をもう一方の疎水性部分に結合させるリンカーとを有する立体配座を含む。本研究の結果に基づき、本発明者等は、非加水分解性で、経口活性を有し、合成が容易な、非ペプチドＰＡＲ−２アンタゴニストの設計を試みた。ある実施形態では、本発明者等は、ＬＩＧＫ由来の末端のＬｅｕおよびＬｙｓに類似する分子を、またＬＩＧＫ中のＩｌｅおよびＧｌｙに類似する疎水性のリンカーを組み込んだ。幾つかの係る構造および生体分子の一覧表を図２に提供する。本発明者等によって得られたペプチド類似体によるアプローチを示すフローチャートを図１７に提供し、ペプチド類似体の設計を示す図面を図１８に提供する。
【００４６】
特に興味深いＬＩＧＫアンタゴニストペプチドの１つのペプチド類似アンタゴニストは、ＥＮＭＤ−５４７である。ＥＮＭＤ−５４７の構造は、ピペリジン環を含み、６アミノ−ヘキサン酸部分が係るピペリジン環の窒素分子に結合し、イソ吉草酸が逆側の窒素に結合する（図１）。ＥＮＭＤ−５４７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＡＲ−２シグナル伝達の極めて強力な阻害剤であることが発見された（図１４）。ＬＩＧＫペプチドのように、ＥＮＭＤ−５４７は、ＡＴＰまたはＰＡＲ−１（図示せず）によるシグナル伝達に対して阻害効果を有さない。最後に、転移性の腫瘍成長研究では、ＥＮＭＤ−５４７は強力な抗腫瘍活性を有しており、母体となるＬＩＧＫ分子のおよそ５倍の活性であった（図１６）。総合すると、抗腫瘍活性を有する第二の特異的なＰＡＲ−２阻害剤の同定は、ＰＡＲ−２がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の成長および発生において重要な役割を果たすという本発明者等の主張を支持する。さらに、その増強された抗腫瘍活性のために、この分子は他のＰＡＲ−２アンタゴニスト分子の設計および合成に関する見通しを提供し得る。
【００４７】
総合すると、これらの研究は、ＰＡＲ−２が血管形成および腫瘍成長の促進において非常に重要な役割を果たすことを示す。さらに、本発明者等は、凝集の活性化が凝集とは独立したプロセスを通して腫瘍成長や血管形成の促進を起こし得る、非常に説得力のある手法を示す。以下の理論によって拘束されることを望まないが、ＴＦ／ｆＶＩＩａ複合体は、これらの血管形成および腫瘍モデルにおいてＰＡＲ−２を活性化する原因となり得ると考えられる。しかしながら、幾つかの他のプロテイナーゼはＰＡＲ−２を活性化することができ、これらの新規のＰＡＲ−２活性を促進し得る（ＬＩＧＫは、ＰＡＲ−２を活性化するプロテイナーゼとは独立してＰＡＲ−２の活性化を阻害する）。これらのプロセスに最も深く関連する酵素は、マスト細胞のトリプターゼ、トリプシンおよびマトリプターゼである。これらの各酵素は、ＰＡＲ−２の生理機能において明らかに重要な役割を果たしており、この具体的なケースにおいて、何れも考慮から排除することはできない。したがって、ＴＦ／ｆＶＩＩａ−ＰＡＲ−２経路は、本明細書において示された前血管形成および前腫瘍活性にとって、非常に強力な候補である。ＴＦ／ｆＶＩＩａシグナル伝達複合体の特異的な阻害剤は、シグナル伝達レセプターの特異的な阻害剤と同様に、同一の抗腫瘍性および抗血管新生活性を有する。ＴＦに関する最近の研究は、この分子は血管内皮細胞上に発現する最初期遺伝子であることを示す。したがって、このＰＡＲ−２活性剤はアップレギュレートされ、血管形成の部位に存在する。本発明の研究は、ＬＩＧＫに対する抗血管新生活性、およびこの血管形成活性が有し得ると予測される抗腫瘍活性を示し、直接的な抗腫瘍活性を排除するものではない。
【００４８】
さらに、ＬＬＣの腫瘍成長の際、ＰＡＲ−２アンタゴニスト分子の直接的な抗腫瘍効果も存在すると考えられる。本発明者等の研究は、ＬＩＧＫがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＬＬＣに抗増殖効果を有さないことを示した（データは示さず）が、ＰＡＲ−２アゴニストは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞成長を促進することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏで類似の活性を有し得る。ＰＡＲ−２ノックアウトマウスに関する腫瘍研究を実施することによって、どの部分でＰＡＲ−２アンタゴニストが作用するかという問題に対処することが可能であり、これは、ＰＡＲ−２発現腫瘍を用いて取り組んだ。
【００４９】
「活性部分」という用語を、本明細書で使用する場合には、タンパク質活性化レセプターの活性を阻害するために必要なリガンドまたは分子の部分として定義する。活性部分は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイあるいは他の既知の技術によって、タンパク質活性化レセプターの発現を阻害する能力を有する。
【００５０】
上記のように、本発明の化合物は、必要に応じて薬学的担体と組み合わせられ得る。「担体」という用語は、本明細書で使用する場合には、当業者に既知の送達メカニズムを含み、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および他のアジュバントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の低密度リポタンパク質レセプターリガンド組成物は、アジュバント、保存剤、希釈剤、乳化剤、安定剤、および既知であって従来技術の薬学的組成物に対して使用される他の成分をさらに含むことができると理解される。当該技術において既知の、任意のアジュバントシステムは、本発明の組成物に対して使用されることが可能である。係るアジュバントとしては、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、多分散β−（１，４）結合アセチル化マンナン（「アセマンナン」）、CytRx Corporation（ジョージア州ノークロス）製ＴＩＴＥＲＭＡＸ（登録商標）（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーアジュバント、Chiron Corporation（カリフォルニア州エメリービル）製修飾脂質アジュバント、Aguila Biopharmaceuticals（マサチューセッツ州ウォーチェスター）製サポニン誘導体アジュバント、死滅した百日咳菌（Bordetella pertussis）、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、硫酸デキストラン等の大型（large）ポリマーアニオン、およびミョウバン、水酸化アルミニウム、またはリン酸アルミニウム等の無機ゲル、オバルブミン；フラジェリン；サイログロブリン；任意の種の血清アルブミン；任意の種のガンマグロブリン；およびＤ−および／またはＬ−アミノ酸のポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明の方法によれば、血液凝固成分を結合するリガンドのすべてまたは活性部分を備えたタンパク質、ペプチドまたはタンパク質断片を含む本明細書に記載された組成物は、薬学的に許容可能な担体と必要に応じて組み合わされ、好ましくない細胞増殖が認められるヒトまたは動物に対して、好ましくない細胞増殖、特に内皮細胞増殖、癌のような血管形成または血管形成関連の疾患を阻害するのに十分な量で投与する。
【００５２】
定義
本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語は１、あるいはそれより大きいことを意味し、前後関係で不適切でない限り、複数形を含むと定義する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「タンパク質活性化レセプター」という語句は、全てのタンパク質活性化レセプター（ＰＡＲ）を包含すると定義し、ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３およびＰＡＲ−４を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
本明細書において用いられる「アンタゴニスト」という用語は、タンパク質、ペプチド
またはタンパク質活性化レセプター活性を阻害する生体分子と定義する。
【００５５】
「ペプチド」という用語はアミノ酸（典型的にはＬ−アミノ酸）の連鎖であり、そのα炭素は、一つのアミノ酸のα炭素についたカルボキシル基と他のアミノ酸のα炭素についたアミノ基との間の縮合反応により形成されたペプチド結合によって連なっている。連鎖の一方の端にある末端アミノ酸（すなわち、アミノ末端）には遊離のアミノ基が存在し、連鎖のもう一方の端にある末端アミノ酸（すなわち、カルボキシ末端）には遊離のカルボキシル基が存在する。このようにして、「アミノ端末」（Ｎ−端末と略す）という用語は、ペプチドのアミノ末端にあるアミノ酸の遊離のαアミノ基を指すか、または、ペプチド内部の任意の場所のアミノ酸のαアミノ基（ペプチド結合に加わっているならイミノ基）を指す。同様に、「カルボキシ端末」（Ｃ−端末と略す）という用語は、ペプチドのカルボキシ端末にあるアミノ酸にある遊離のカルボキシル基を指すか、または、ペプチド内部の任意の場所のアミノ酸のカルボキシル基を指している。
【００５６】
一般的に、ペプチドを構成しているアミノ酸は順に番号が付され、アミノ端末側から始まり、ペプチドのカルボキシ端末の方向に向かって番号が増加する。したがって、一つのアミノ酸が他に「続く」という場合、そのアミノ酸は先のアミノ酸よりもペプチドのカルボキシ端末に近い位置にあることになる。
【００５７】
本明細書で「残基」という用語を使用する場合は、アミド結合によってペプチドに組み込まれたアミノ酸（ＤまたはＬ）を指す。したがって、そのアミノ酸は天然のアミノ酸であってもよいし、あるいは、他に制約がなければ、天然のアミノ酸と類似の機能を示すような既知の天然アミノ酸類似体（すなわちアミノ酸類似体）をも包含していてもよい。さらにアミド結合類似体では、当業者には既知のような、ペプチド骨格の修飾を含む。
【００５８】
本明細書において用いられる「本質的に構成される」という語句は、この語句が適用されるペプチドの本質的な特性を実質的に変化させる全ての要素を排除するために用いられる。したがって、「本質的に〜から構成される」ペプチドという記述は、このペプチドの生物学的活性を実質的に変化させる、アミノ酸の置換、付加あるいは欠失をすべて排除する。
【００５９】
さらに、技術者には理解される所であるが、上述のように、コードされた配列中の一つのアミノ酸、あるいは少数のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を変更、付加または欠失する、個々の置換、欠失または付加は、その変化によってアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸に置換する結果をもたらす点で、保存的に修飾した変化である。保存的な置換のための表は機能的に類似するアミノ酸を示しており、当業者にはよく知られている。以下の６つの各グループは、互いに保存的に置換することが可能なアミノ酸である。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６０】
「単離した」または「生物学的に純粋な」という語句は、自然の状態では通常随伴する成分を実質的あるいは本質的に含まない物質を指す。したがって、本明細書に記載したペプチドは、ｉｎ  ｓｉｔｕ環境で通常随伴する物質を含まないものである。典型的には、本明細書に記載した、単離した抗増殖ペプチドは、銀染色ゲル上でのバンド強度の測定で少なくとも約８０％の純度、通常は少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％
の純度を持っている。
【００６１】
当業者にはよく知られていることであるが、タンパク質の純度あるいは均質性は多くの方法で測定することができ、たとえば、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ついで染色により可視化する。目的によっては高い分解能が必要となり、ＨＰＬＣやそれに類似する精製方法が用いられる。
【００６２】
阻害性のペプチドの長さが比較的短い（すなわち、アミノ酸単位が約５０未満）場合には、標準的な化学的ペプチド合成技術を用いて合成することが多い。
【００６３】
固相合成で、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性の支持体に結合させ、次いで配列の残りのアミノ酸を順次付加させていくことが、本明細書に記載した抗増殖ペプチドの化学合成の好ましい方法である。固相合成についての技術は、当業者には既知である。
【００６４】
別法としては、本明細書に記載した阻害性ペプチドを組換え核酸合成法により合成する。一般的にこの方法は、ペプチドをコードする核酸配列を作り、特定のプロモーターの調節下でこの核酸を発現カセットに導入し、宿主にペプチドを発現させ、発現したペプチドまたはポリペプチドを単離し、必要があれば、ペプチドを再生することを含む。この手順を技術者に実施させるのに十分な技法は文献に記載されている。
【００６５】
発現が終わると、組換えペプチドを標準的な方法で精製することができる。それらの方法として、硫安塩析、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などがある。実質的に純粋な組成物としては約５０〜９５％の均一性を持つものが好ましいが、治療用の薬剤として用いるには、８０〜９５％以上の均一性を持つものが最も好ましい。
【００６６】
当業者ならば、化学合成、生物学的発現あるいは精製の後では、この抗増殖ペプチドが成分ペプチドの本来の立体配座とは実質的に異なる立体配座をとっている可能性があることを知っている。この場合しばしば、この抗増殖ペプチドを変性、還元し、次いでこのペプチドを好ましい立体配座に再度折り畳むことが必要となる。タンパク質を還元、変性し、再度折り畳む方法は当業者のよく知るところである。
【００６７】
本明細書で用いているように、「生物学的活性」という用語は生物学的システムから得られた化合物、またはそれらと反応する化合物、またはそれらの化合物の官能性、反応性および特異性が類似する化合物の、官能性、反応性および特異性を指している。生物学的に活性な化合物の適当な例としては、酵素、抗体、抗原それにタンパク質である。
【００６８】
「体液」という用語は、本明細書で使用する場合には、唾液、歯肉分泌物、脳脊髄液、胃腸液、粘液、尿生殖器分泌物、滑液、血液、血清、血漿、尿、嚢胞液、リンパ液、腹水、胸水、間質液、細胞内液、眼液、精液、乳腺分泌物、および硝子体液、および鼻腔分泌物を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６９】
本発明のタンパク質活性化レセプターの阻害タンパク質およびペプチドは、体液から単離可能で、体液として血清、尿、および腹水が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、あるいは細胞培養、組換え遺伝子発現、およびペプチド合成等の化学的または生物学的方法によって合成され得る。組み換え技術としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ源からの遺伝子増幅、および逆転写酵素／ＰＣＲを使用するＲＮＡ源からの遺伝子増幅が挙げられる。目的のリガンドは、既知のタンパク質抽出方法、特に、Novotny, W.F.等（J. Biol. Chem. 264:18832-18837 (1989)）によって記載された方法により、体液から抽出される。
【００７０】
ペプチドまたはタンパク質断片
ＰＡＲアンタゴニストを含むペプチドまたはタンパク質断片は、当業者に既知の技術および方法を使用して、上記のように産生し、阻害活性に関する試験を行う。全長タンパク質を、例えば、Enjyoji等（Biochemistry 34:5725-5735 (1995)）によって記載された方法等の各種方法を使用して、個々のドメインに切断または消化することが可能である。
【００７１】
これに代わる方法として、抗増殖活性を示すタンパク質の全体またはその大きな断片を、一度にアミノ酸を一つずつ除去しながら消化させて断片を得る方法がある。連続的に短くする断片のそれぞれについて、阻害活性の試験を行う。同様にして、長さを変化させた断片を合成して、抗阻害活性の試験を行う方法も可能である。断片の長さを増加あるいは減少させることにより、当業者に既知の消化、合成、スクリーニングの常法を用いて、当業者は阻害活性に必要とされるタンパク質内のアミノ酸の正確な数、属性および配列を決定しても良い。
【００７２】
阻害活性は、ＰＡＲの活性を阻害するタンパク質およびペプチドの能力を試験することによって、ｉｎ  ｓｉｔｕで評価される。好適なアッセイは当該技術においてよく知られており、この幾つかの例は以下の実施例で提供される。抗血管新生活性は、ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイの使用により査定ができ、これはCrum等によるScience 230: 1375 (1985)、および米国特許第５，００１，１１６号に記載されており、これらは本明細書で引用し援用する。このＣＡＭアッセイを以下に簡単にまとめる。受精したニワトリの胚を第３日または第４日に殻から取りだし、対象の断片を含むメチルセルロースのディスクを漿尿膜に移植する。この胚を４８時間後に検査し、もし透明な無血管性の領域がメチルセルロースのディスクの周囲に現れていたら、その領域の直径を測定する。この領域の直径が大きいほど、抗血管新生活性も大きい。別の好適なアッセイとして、ＨＵＶＥＣアッセイがある。
【００７３】
上記のように、当業者には理解される所であるが、コードされた配列中の一つのアミノ酸、あるいは少数のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を変更、付加または欠失する、個々の置換、欠失または付加は、その変化によってアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸と置換する結果をもたらす点で、保存的に修飾された変化である。保存的な置換のための表は、機能的に類似するアミノ酸を示しており当業者にはよく知られている。したがって、ペプチドの化学的な反応性が特許請求されたペプチドに対して有意な差がないならば、特許請求されたペプチドに比較して保存的に修飾された変化を有するペプチドもまた本発明に含まれる。
【００７４】
処方物
タンパク活性化レセプターと結合し得るタンパク質、ペプチドまたは生体分子のすべてまたはその活性部分を含む、天然または合成のタンパク質、ペプチドまたはタンパク質断片は、既知の技術を用いて、生理学的に許容可能な処方、たとえば薬学的に許容可能な担体で調製することが可能である。たとえば、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせてタンパク質、ペプチド、タンパク質断片、または生体分子を治療用の組成物の形態とすることができる。
【００７５】
別な方法として、望ましいリガンドのすべてまたはその活性部分を含む、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質断片の遺伝子をベクター中に導入し、遺伝子治療技術によって連続的に投与することもできる。このベクターは、たとえば腫瘍のような目標部位に対して特異性を有する担体に含めて投与してもよい。
【００７６】
これらの組成物は固体状、液状、エアロゾル状などの形態であってよい。固体状組成物
の例として、錠剤、クリームおよび埋込み型投与単位がある。錠剤は経口で投与して良い。治療用クリームは局所的に投与する。埋込み型投与単位は局部的に、たとえば腫瘍部位に投与することも、あるいは治療用組成物が規則的に放出されるようにたとえば皮下に埋込むこともできる。液状組成物の例として、皮下、静脈内、動脈内への注射剤としての処方や、局所および眼内投与のための処方などがある。エアロゾルの処方の例として、肺に投与するための吸入器用の処方がある。
【００７７】
組成物は標準的な投与経路を用いて投与することができる。一般的に、組成物は局所、経口、経腸、経鼻あるいは非経口（たとえば、静脈内、皮下、筋肉注射）経路によって投与される。さらに、この組成物を生分解性ポリマーのような徐放性マトリックス中に含ませることも可能で、このポリマーを送達希望部位、たとえば腫瘍部位の近傍に埋め込む。この方法は、単回投与、あらかじめ定めた時間間隔での反覆投与、およびあらかじめ定めた期間での徐放性投与を含む。
【００７８】
本明細書で用いられる徐放用マトリックスは、通常ポリマー材料から得られるマトリックスであって、これは酵素または酸／塩基による加水分解または溶解により分解可能なものである。体内に導入すると、このマトリックスに作用するのは酵素および体液である。徐放用マトリックスは生体適合性のある材料から選ぶのが好ましく、例えば、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸の重合体）、ポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸たとえばフェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコンなどである。生分解性のあるマトリックスとして、ポリラクチド、ポリグリコリドまたはポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）のいずれか１つのマトリックスであることが好ましい。
【００７９】
組成物の用量は治療すべき症状、使用する所定の組成物、および、たとえば体重や患者の容態のような他の臨床的な因子および投与経路などに依存する。
【００８０】
さらに、「有効な量」という用語は、ヒトまたは動物に投与したときにタンパク質活性化レセプター活性、特に好ましくない細胞の増殖を阻害し、その結果癌が減退するか、癌の拡大および増殖が阻害されるような、組成物の量を意味している。有効な量は、当業者が常法にしたがえば、容易に決定できる。
【００８１】
たとえば、本発明による阻害組成物は、非経口的にあるいは経口的に患者一人あたり約１．０μｇから１．０ｍｇの範囲で投与しても良いが、ただし、この範囲は限定的なものではない。適切な応答をもたらすのに必要な阻害組成物の実際の量は、それぞれの患者によって変化し、投与する組成物の強さ、および個々の患者の応答性に依存する。このようなことから、個々の患者に投与すべき具体的な量は、定常的な試験と当業者の訓練および経験に基づいて定められる。
【００８２】
この組成物は、疾患の治療のための他の組成物や手順と組み合わせて投与してもよい。たとえば、これまでのように、所望されない細胞増殖を従来通り治療するために、外科手術、放射線療法、化学療法にこの組成物の投与を組み合わせてもよいし、そして引き続いて、任意の残存する所望されない細胞増殖の成長を安定化させ、そして阻害するために、追加的な投与量を患者に投与してもよい。
【００８３】
タンパク質活性化レセプターアンタゴニストの抗体
本発明は、診断さらには治療の目的で使用され得るＰＡＲアンタゴニストの抗体をさら
に含む。本明細書において提供される抗体は、所望のリガンドに対して結合特異性を有する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である。リガンドに対する特異性が高いため、好ましい抗体はモノクローナル抗体である。この抗体は、他のタンパク質またはペプチドに対して最小の交差活性を示すか、または交差活性がない。抗体は、ＬＩＧＫ（配列番号１）、ＬＩＧＫＶ（配列番号２）、ＥＮＭＤ５４５、およびＥＮＭＤ５４７を含むペプチドに対して特異的である。ＡＰ２等のタンパク質活性化レセプターリガンドに対して作製された抗体も含まれる。
【００８４】
モノクローナル抗体は、ＬＩＧＫ（配列番号１）等の所望のペプチドの、全体または免疫原性部分で、マウスやウサギ等の動物を免疫化することによって調製される。脾臓細胞を免疫化した動物から回収し、感作脾臓細胞をマウスＳＰ２／Ｏ骨髄腫細胞（ATCC、バージニア州マナサス）等のミエローマ細胞株と融合することによってハイブリドーマを作製する。ポリエチレングリコールの添加により、細胞融合を誘導する。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む選択培地（ＨＡＴ）中で細胞を培養することにより、ハイブリドーマを化学的に選択する。
【００８５】
次いで、リガンドに対するモノクローナル抗体を産生する能力に関して、ハイブリドーマをスクリーニングする。リガンドに結合する抗体を産生するハイブリドーマをクローン化し、増幅させ、以後の産生のために凍結保存する。好ましいハイブリドーマは、ＩｇＧアイソタイプ、より好ましくはＩｇＧ１アイソタイプを有するモノクローナル抗体を産生する。
【００８６】
ポリクローナル抗体は、上記のようにアンチトロンビン等のリガンドで、マウスやウサギ等の動物を免疫化することによって調製される。次いで、血清を動物から回収し、リガンド、好ましくは上記のモノクローナル抗体と反応する抗原に対する結合反応性に関して、血清中の抗体をスクリーニングする。
【００８７】
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれか、あるいは両方は、以下に記載されるような生物学的なリガンドの同定および定量のために、検出可能なラベルで直接ラベルし得る。イムノアッセイにおける使用のためのラベルとして、一般に当業者には既知であり、酵素、放射性同位体、および蛍光、発光および色素生成物質（金コロイドやラテックスビーズ等の着色粒子を含む）がある。また、イムノアッセイにおいて、抗体−抗原複合体の未反応成分からの分離を促進するために抗体は固相に結合する。典型的な固相物質として、マイクロタイタープレート、試験管、磁石、プラスチックまたはガラスビーズおよびスライドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗体を固相に結合するための方法は、当業者にはよく知られている。
【００８８】
別の方法として、プロテインＡまたはＧあるいは二次抗体等の、免疫グロブリンに対して親和性を有するラベル物質との反応によって、抗体を間接的にラベルし得る。抗体は、二次物質と会合させ、抗体と会合する二次物質に対して親和性を有するラベルした三次物質で検出される。例えば、抗体をビオチンに結合させ、ラベルしたアビジンまたはストレプトアビジンを使用して、抗体−ビオチン複合体を検出する。同様に、抗体をハプテンに結合させ、ラベルした抗ハプテン抗体を使用して、抗体−ハプテン複合体を検出する。抗体をラベルし、複合体をアッセイするこれらの方法および他の方法は、当業者にはよく知られている。
【００８９】
上記の抗体の１つまたは複数を用いる高感度イムノアッセイを、本発明は提供する。このイムノアッセイは、様々なサンプル、特にヒトまたは動物の生体液等の生体サンプル中のリガンドの存在または量を検知するのに有用である。サンプルは、リガンドが存在し得る任意の発生源から獲得できる。例えば、サンプルとして血液、唾液、精液、涙、および
尿があるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
本発明のイムノアッセイで形成される抗体−抗原複合体は、サンドイッチイムノアッセイや競合イムノアッセイ等の、当業者に既知のイムノアッセイ方法を使用して検出される。抗体−抗原複合体は、抗原を捕捉するために使用される抗体に類似する抗体に暴露されるが、これは、検出可能なラベルでラベルされたものである。好ましいラベル法として、西洋ワサビペルオキシダーゼのような化学発光ラベル法、ルテニウムおよびエクオリンのような電気化学発光ラベル法、ルシフェラーゼのような生物発光ラベル法、ＦＩＴＣのような蛍光ラベル法、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素的なラベル法がある。
【００９１】
次いでラベル化された複合体を、用いたラベルを検出するのに特化した検出法や装置を用いて検出する。同じアッセイで、非特異性の抗体をコーティングした磁性ビーズと共に、可溶性の抗原を１種または複数培養すると、アッセイで分析する試料のバックグラウンド値が求められる。
【００９２】
治療すべき疾患と病状
本明細書に記述された方法および組成物は、異常または好ましくない細胞増殖が媒介するヒトおよび動物の疾患およびプロセスを処置するのに有用であるが、特に異常または好ましくない内皮細胞増殖として、血管腫、固形腫瘍、白血病、転移、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、化膿性肉芽腫、心筋血管新生、プラーク新血管形成、冠状側枝、虚血性の四肢血管新生、角膜疾患、ルベオーシス、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、水晶体後方線維増殖症、関節炎、糖尿病性新生血管形成、黄斑変性症、創傷治癒、消化性潰瘍、骨折、ケロイド、血管形成、造血、排卵、月経、胎盤形成が含まれるが、これらに限定されるわけではない。この方法および組成物は、血管形成を阻害するので、血管形成に関わる疾病や疾患に特に有用である。
【００９３】
本明細書に記述した方法および組成物は癌、関節炎、黄斑変性症、および糖尿病性網膜症の治療には特有用である。血管形成誘導による転移のある腫瘍を持つヒトまたは動物に対して本組成物を投与することは、そのような腫瘍の成長、拡大を防止する点で有用である。
【００９４】
本発明の方法および組成物は、以下の疾患を含む：内皮細胞による異常成長、酒さ様座瘡、聴神経腫、癒着、血管線維腫、動静脈奇形、動脈閉塞、関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、プラーク内の毛細管増殖、アテローム性動脈硬化型プラーク、アトピー性角膜炎、細菌性の潰瘍、バルトネラ症、ベーチェット病、良性腫瘍（例えば：血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、化膿性肉芽種）（神経線維腫および血管腫も参照）、良性、前悪性および悪性の外陰部の外傷、ベスト病、膀胱癌、胞胚の着床阻害、月経阻害（無月経誘発）、排卵ブロック、血液由来腫瘍（白血病、および骨髄の腫瘍性疾患等）；骨髄、白血球の無制限増殖が起こる、骨髄の急性または慢性の各種任意の腫瘍性疾患；（多発性骨髄腫も）、骨の成長および修復、乳癌、熱傷、固形腫瘍を含む癌の後の肥大：横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、血液由来腫瘍：白血病、骨髄の腫瘍性疾患；多発性骨髄腫疾患、血管腫、頚動脈閉塞症（頚動脈閉塞性疾患）（一般に、眼の閉塞に関連する個別の参考文献を参照）、頚動脈閉塞症（頚動脈閉塞性疾患）（眼、全身閉塞に関連する個別の参考文献を参照）、頚動脈閉塞性疾患（頚動脈閉塞症を参照）、中枢神経系悪性腫瘍、ある種の免疫反応（免疫疾病／反応を参照）、子宮頸癌、化学熱傷、コレステリン腫（特に中耳の）、脈絡膜新生血管形成、脈絡膜炎、慢性または急性の炎症、慢性的運動筋肉（chronically exercised muscle）、肝硬変、コンタクトレンズの過剰装着、角膜疾患、角膜移植片の新生血管形成、角膜移植片の拒絶、角膜の新生血管形成疾患（流行性の角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症、コンタクトレンズ過剰装着、ア
トピー性角膜炎、上方輪部角膜炎、および翼状片の乾燥角膜炎を含むが、これらに限定されない）、黄体形成、クローン病、創傷治癒の遅延（創傷治癒を参照）、糖尿病、糖尿病性（増殖性）網膜症、血管結合性または線維性組織の異常増殖により引き起こされる疾患（多産硝子体網膜症の全ての形態を含む）、イールズ病、胚発生、膿胸、子宮内膜症、子宮内膜、流行性の角結膜炎、ユーイング肉腫、内皮細胞の過剰または異常刺激（アテローム性動脈硬化症等）、眼関連疾患（ルベオーシス（角の新生血管形成）、血管結合組織または線維性組織の異常増殖（多産硝子体網膜症の全ての形態を含む）を含む）、女性の生殖系：卵胞、黄体、および母性脱落膜（maternal decisua）の新生血管形成；女性の生殖系：卵胞、黄体の新生血管形成、子宮内膜血管の修復、胚移植部位における血管形成（卵巣過剰刺激症候群）；女性の生殖系、正常な血管形成：胚発生、濾胞形成、黄体形成、正常な月経時の子宮内膜症、線維素溶解、線維増殖（創傷治癒における水晶体後方および過剰修復も参照）、線維化肺胞炎、真菌性潰瘍、胃腸感染症、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性ポリープ、腸の移植片対宿主反応、新生物性腫瘍、肥満細胞症、腸の虚血、緑内障、新生血管、痛風または痛風性関節炎、移植片対宿主拒絶（慢性および急性拒絶も参照）、創傷治癒の肉芽組織、肉芽熱傷、血管腫症（血管腫の全身形）、手足口病、毛髪成長、血管腫、血友病性関節、遺伝性疾患（オースラー・ウェーバー・ランデュ病、遺伝性の出血性毛細血管拡張症）、単純ヘルペス、帯状ヘルペス、ＨＨＴ（遺伝性出血性毛細管拡張症）、オースラー・ウェーバー・ランデュ病、肥厚瘢痕、手術、熱傷および外傷の後の肥大、過粘稠度症候群、免疫疾病、免疫反応、胚の着床（２〜８週、胞胚を意味する）、網膜炎を引き起こす感染症（網膜炎を参照）、微生物により引き起こされる感染性疾患、炎症（「慢性炎症」を参照）、炎症疾病、免疫および非免疫、炎症反応、関節炎症、カポジ肉腫、ハンセン病、白血病、ルイス肺、脂質変性（脂肪性角膜症）、脂肪腫、肺癌、狼瘡（紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡）、ライム病、黄斑変性、年齢関連性（網膜下新生血管形成）、辺縁角膜炎、黒色腫；Ｂ−１２黒色腫、髄膜腫、中皮腫、転移、腫瘍、モーレン潰瘍、マイコバクテリア疾患、骨髄腫、多発性骨髄腫疾患、近視、新生組織形成、白血球の無制限増殖が起こる骨髄の腫瘍性疾患（各種任意の急性または慢性の）（これは、白血病、新生血管緑内障を含む、血液由来腫瘍である→緑内障、新生血管を参照）、角の新生血管形成、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経線維腫症、神経線維肉種、非癒合骨折、眼内血管形成疾患（糖尿病性網膜症、未熟網膜症（水晶体後方線維増殖症）、黄斑変性、角膜移植辺拒絶、新生血管緑内障、オースラー・ウェーバー症候群（オースラー・ウェーバー・ランデュ病）等）、推定眼ヒストプラスマ症、眼新生血管疾患（およそ２０の眼疾患に関連）、眼腫瘍、視窩、口腔癌、オースラー・ウェーバー症候群（オースラー・ウェーバー・ランデュ病またはＨＨＴ（遺伝性の出血性毛細血管拡張症））、変形性関節症、骨髄炎、骨肉腫、パジェット病（変形性骨炎）、寄生虫症、扁平部炎、類天疱瘡、フリクテン症��多発性動脈炎、レーザー術後の合併症、白血球の増殖、白血球の無制限増殖が起こる骨髄の各種任意の急性または慢性の腫瘍性疾患（血管由来腫瘍を参照）、多産硝子体網膜症（ＰＶＲ）、前立腺癌、原虫感染症、弾性線維性仮性黄色腫、乾癬、翼状片（乾燥角膜炎）、肺線維症、化膿性肉芽腫、放射状角膜切開、拒絶、慢性および急性（移植片対宿主拒絶も参照）、網膜剥離（慢性）、網膜炎、網膜芽細胞腫を引き起こす感染、未熟網膜炎、水晶体後方線維増殖症、横紋筋肉腫、関節リウマチ、滑膜肥大性のリウマチ（関節炎）、酒さ（酒さ様座瘡）、ルベオーシス（虹彩）、サルコイドーシス、強膜炎、強皮症、乾性、（翼状片（乾性角膜炎）およびシェーグレン（乾性）症候群を参照）、鎌形赤血球貧血、シェーグレン（乾性）症候群、皮膚疾患（黒色腫、化膿性肉芽腫、乾癬および血管腫も参照）、皮膚疣贅およびＨＰＶ（ヒトパピローマウィルス）２型、固形腫瘍（適用は以下のリストを含む：横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫）、シュタルガルト病、スティーブンス・ジョンソン病、上輪部角膜炎（上輪部角膜炎、ＳＬＫ）、手術：肥厚性瘢痕、創傷肉芽形成および血管癒着、梅毒、全身性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、テリエン周辺変性、トキソプラズマ症、トラコーマ、外傷、結核症、腫瘍、腫瘍関連血管形成、腫瘍成長、潰瘍性大腸炎、潰瘍（真菌性、モーレン、消化性および細菌性等の）、正常なプロセスにおける好ましくない血管形成、（創傷治癒等
）、女性の生殖機能、骨修復、毛髪成長、ブドウ膜炎、慢性、血管機能不全、血管腫瘍、静脈閉塞、ビタミンＡ欠乏症、絨毛組織炎、慢性、ヴェーゲナー肉芽腫症、白血球、白血球の無制限増殖が起こる骨髄の各種任意の急性または慢性の腫瘍性疾患（血液由来腫瘍を参照）、創傷治癒および不適切な創傷治癒、創傷治癒の遅延、血管線維腫、動静脈の先天異常、関節炎、アテローム動脈硬化性プラーク、角膜移植片の新生血管形成、創傷治癒の遅延、糖尿病性網膜症、肉芽熱傷、血管腫、血友病性関節、肥厚性瘢痕、新生血管緑内障、非癒合骨折、オースラー・ウェーバー症候群、乾癬、化膿性肉芽腫、水晶体後線維増殖症、強皮症、固形腫瘍、トラコーマ、黄体形成、創傷治癒、慢性的運動筋肉、乾癬、糖尿病性網膜症、腫瘍血管形成、関節リウマチ、乾癬、固形腫瘍、慢性炎症疾患、関節炎症、滑膜肥大性のリウマチ（関節炎）、アテローム動脈硬化症、増殖性（糖尿病性）網膜症、固形腫瘍（慢性炎症疾患）、腫瘍成長、転移、口腔癌、子宮頸癌、膀胱癌および乳癌、黒色腫、化膿性肉芽種、腫瘍、糖尿病性網膜症、乾癬、関節リウマチ、ルイス肺、Ｂ−１２黒色腫および血管腫症；卵胞成熟から黄体における成熟小胞、子宮内膜；カポジ肉腫、創傷治癒、癒着、腫瘍成長、急性および／または慢性炎症および炎症反応、慢性および急性の拒絶。
【００９５】
以下の非限定的な実施例によって本発明の組成物や方法をさらに説明するが、これらは本発明の範囲に限定を課すように解釈されるべきではない。反対に、本明細書の説明を読んだ後で、本発明の精神および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者に示唆され得る種々の他の実施例、これらの変更形態および等価物に対して方策が持たれ得ることを明確に理解すべきである。
【００９６】
以下の実験は、当業者によく知られた方法およびプロトコルを使用して行われた。使用された手順に関する詳細は科学文献と、例えば、米国特許第５，９８１，４７１号、５，９１９，４５９号、６，３４６，５１０号、および６，４１３，５１３号にも見られる。
【実施例１】
【００９７】
ＰＡＲシグナル伝達活性
集密なＨＵＶＥＣまたはＨＴ２９大腸癌細胞を、蛍光染料Ｆｌｕｏ−４で３０〜６０分間ロードした。最終濃度は、０．０２％プルロニック酸の生理緩衝液中でＦｌｏ−４が４μＭであった。その後、細胞をアッセイ緩衝液（１ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、および２．５ｍＭプロベネシドを含有するＨＢＳＳ）で洗浄した。細胞を、各種用量のＰＡＲ−２活性化ペプチド、ＰＡＲ−１活性化ペプチドまたはＡＴＰで刺激した。Ｗａｌｌａｃ１４７０蛍光プレートリーダーを用いて、蛍光をモニターした（Al-ani等、Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 290:2, 753-760を参照）。
【００９８】
先端の欠失した２つの分子、ＬＩＧＫ（配列番号１）およびＬＩＧＫＶ（配列番号２）と、ＰＡＲ−２アゴニストＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）とを比較したカルシウム動員曲線を図４Ａに提供する。先端の欠失したいずれの分子も、ＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）に対比して、カルシウム動員を誘導できず、このことはカルシウム放出の典型的なスパイクに続くシグナルの衰退を示した。類似の研究を、アラニンで置換したＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）ペプチド（図４Ｂおよび図４Ｃ）に関して行った。ＳＬＩＧＫＶのＳ、Ｌ、Ｉ、またはＫにおける置換は、シグナル伝達活性を抑止または有意に減少させ、一方、２つの置換ペプチド、ＳＬＩＡＫＶ（配列番号３１）およびＳＬＩＧＫＡ（配列番号３３）は、強いシグナル伝達活性を示すことがわかった。
【００９９】
【表１】
2005537245.tif 000002
【実施例２】
【０１００】
ＰＡＲ−２アンタゴニストの同定および試験
ＰＡＲ−２シグナル伝達をブロックする、上で選択されたペプチドの潜在力を評価するために、細胞を潜在的アンタゴニストペプチドで所定時間前処理し、次いでＰ２ＡＰで処理した。使用した方法およびプロトコルは、実施例１に記載したものと同じであった。ＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）の２つの誘導ペプチド、ＬＩＧＫ（配列番号１）およびＬＩＧＫＶ（配列番号２）は、アンタゴニスト活性を示した。図５は、Ｐ２ＡＰシグナル伝達をブロックするために増加濃度のＬＩＧＫ（配列番号１）を用いた、代表的な投薬研究の結果を示す。この研究において、濃度１ｍＭのＬＩＧＫ（配列番号１）は、１００μＭのＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）のシグナル伝達を完全にブロックした。ＬＩＧＫ（配列番号１）とＬＩＧＫＶ（配列番号２）との活性を比較する類似の研究において、ＬＩＧＫ（配列番号１）ペプチドは、ＬＩＧＫＶ（配列番号２）と比較して、ＰＡＲ−２シグナル伝達のより強力な阻害剤であること（ＩＣ５０＜０．５ｍＭ）がわかった（図６）。
【実施例３】
【０１０１】
ＡＴＰおよびＳＦＬＬＲＮを使用したＬＩＧＫの阻害活性を評価するための活性化研究
ＬＩＧＫ（配列番号１）がＰＡＲ−２シグナル伝達の特異的阻害剤であることを示すために、ＡＴＰおよびＰＡＲ−１活性化ペプチドであるＳＦＬＬＲＮ（配列番号３４）を用いて、ＬＩＧＫで前処理した細胞上で活性化研究を行った。これらの両方の分子は、Ｇタンパク質結合レセプターを通してシグナル伝達し、ＰＡＲ−１アゴニストペプチドがＰＡＲ−２を通して高濃度でシグナル伝達できるほど、ＰＡＲ−１はＰＡＲ−２に対して非常に高く相同する。両方の場合において、ＰＡＲ−２アンタゴニストであるＬＩＧＫ（配列番号１）は、シグナル伝達に対する阻害効果を有さなかった（図７）。
【実施例４】
【０１０２】
ＰＡＲ−２に対するＬＩＧＫ阻害効果のｉｎ  ｖｉｖｏ分析
Ｃ５７ｂｌ／ｂマウスの足部に、増加量の各種ＰＡＲ−２アンタゴニストの存在下または非存在下で、５〜２５μｇのＳＬＩＧＫＶを注射した。１時間後、足部（足根）の厚さを測定し、炎症（水腫）を定量化した。
【０１０３】
次に本発明者等は、ＬＩＧＫペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏでＰＡＲ−２アンタゴニスト活性を有するかどうかを評価した。これは、血管透過性がＰＡＲ−２アゴニストペプチドによって誘導される水腫モデルを使用して研究した。このモデルにおいて、ＰＡＲ−２ペプチドは予想されたような重篤な水腫を誘導する（図８）。この血管応答は、ＰＡＲ−２ア
ンタゴニストＬＩＧＫ（配列番号１）による共処理で阻害された（図９）。したがって、ＬＩＧＫ（配列番号１）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＡＲ−２シグナル伝達をブロックするように機能する。
【実施例５】
【０１０４】
ルイス肺癌実験モデルにおけるＬＩＧＫの阻害活性
Ｃ５７／Ｂ１６マウスにルイス肺癌を静脈内注射した。３日後、腹腔内でＬＩＧＫ（配列番号１）を用いて肺腫瘍の処理を１１日間開始した。
【０１０５】
このモデルにおいて（図１０）、ＰＡＲ−２アンタゴニストＬＩＧＫは、転移性の腫瘍成長の非常に強力な阻害剤であることがわかった。４ｍｇ／日の投与量で、腫瘍成長は７５％阻害された。ＬＩＧＫは、複数回の独立した実験において用量依存性も示し、２ｍｇ／日でおよそＩＣ５０であった（図１１）。
【０１０６】
類似の実験を、ＬＬＣの原発腫瘍モデルにおいて行った。このモデルでは、腫瘍体積が１００ｍｍ3に到達した時に処理を開始した。転移モデルと一致して、ＬＩＧＫはＬＬＣの原発腫瘍の非常に強力な阻害剤であることが証明された（図１２）。１ｍｇ／日の投与量で、腫瘍成長は６２％阻害された。
【実施例６】
【０１０７】
マトリゲルアッセイにおけるＬＩＧＫの阻害活性
Ｃ５７／Ｂ１６マウスに０．５μｇのＦＧＦ−２を含有するマトリゲルを皮下注射した。１日目に処理を開始し、６日間ＬＩＧＫを皮下投与した。
【０１０８】
ＬＩＧＫ（配列番号１）で処理した動物由来のマトリゲルプラグは、プラグ中のヘモグロビン含量に基づいて、血管形成は用量に依存して阻害されることが示された（図１３）。ＬＩＧＫ（配列番号１）の最も高い投与量では、血管形成は８０％を超えて阻害された。これらのデータは、ＬＩＧＫ（配列番号１）が有力な抗血管形成活性を有することを示しており、さらに、ＬＩＧＫ（配列番号１）が腫瘍成長の阻害を可能とするメカニズムを示唆する。
【実施例７】
【０１０９】
マウスにおける関節炎に対するＬＩＧＫ（配列番号１）の効果
０日目において、Ｂａｌｂ／ｃマウスに１〜２ｍｇの１Ｂ１１モノクローナル抗コラーゲンＩＩ抗体を静脈内注射した。１日目において、動物に２０μｇのＬＰＳを腹腔内注射し、７日間のＰＡＲ−２アンタゴニスト（２００ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）処理を開始した。処理終了後、マウスの両足の厚さ（腫大）を測定することによって疾患を定量化した。これを未処理のマウスと比較した。（賦形剤コントロールに対してｐ＜．０５）
【０１１０】
図１９に示したように、ＥＮＭＤ５４７およびＬＩＧＫ（配列番号１）の両方は、炎症を阻害した。図２０は、ＬＩＧＫ（配列番号１）（ＥＮＭＤ５２０と示す）の存在下で、マウスの関節炎の減衰を示す。図２１は、ＬＩＧＫ（配列番号１）ＥＮＭＤ５２０およびＥＮＭＤ５４７の存在下での関節炎の減衰を示す。
【実施例８】
【０１１１】
マウスにおける関節ＣＩＡが誘導する体重損失の防止
０日目において、Ｂａｌｂ／ｃマウスに１〜２ｍｇの１Ｂ１１モノクローナル抗コラーゲンＩＩ抗体を静脈内注射した。１日目において、動物に２０μｇのＬＰＳを腹腔内注射し、７日間のＰＡＲ−２アンタゴニスト（２００ｍｇ／ｋｇ／日、腹腔内）処理を開始した。処理終了後、マウスの両足の厚さ（腫大）を測定することによって疾患を定量化した
。これを未処理のマウスと比較した。このモデルは、ＬＰＳの投与に付随する有意の体重損失をもたらした。これらのマウスのＬＩＧＫによる処理は、このＬＰＳが誘導する体重損失を抑止した。
【０１１２】
図２２は、ＬＩＧＫ（配列番号１）、ＥＮＭＤ５２０の存在下における体重損失の防止を示す。
【実施例９】
【０１１３】
ＥＮＭＤ−５４７のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性
ＥＮＭＤ−５４７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＡＲ−２シグナル伝達の極めて強力な阻害剤であることが発見された（図１４）。ＬＩＧＫペプチドのように、ＥＮＭＤ−５４７はＡＴＰ（図４ｃ）またはＰＡＲ−１（図示せず）によるシグナル伝達に対して阻害効果を有さない。最後に、転移性の腫瘍研究において、ＥＮＭＤ−５４７は強力な抗腫瘍活性を有し、母体であるＬＩＧＫ分子のおよそ５倍の活性であった（図１６）。図２３は、ＬＩＧＫ（配列番号１）およびＥＮＭＤ５４７の抗腫瘍に関するデータを示す。総合すると、抗腫瘍活性を有する第二の特異的なＰＡＲ−２阻害剤の同定は、ＰＡＲ−２がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍の成長および発生において重要な役割を果たすという本発明者等の主張を支持する。さらに、その増強された抗腫瘍活性のために、この分子は他のＰＡＲ−２アンタゴニスト分子の設計および合成に関する見通しを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１は、ＥＮＭＤ５４７およびＥＮＭＤ５４５の構造を示す図を提供する。
【図２Ａ】図２Ａは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｉ】図２Ｉは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｊ】図２Ｊは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｋ】図２Ｋは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｌ】図２Ｌは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｍ】図２Ｍは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｎ】図２Ｎは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｏ】図２Ｏは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｐ】図２Ｐは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｑ】図２Ｑは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｒ】図２Ｒは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｓ】図２Ｓは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｔ】図２Ｔは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｕ】図２Ｕは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｖ】図２Ｖは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｗ】図２Ｗは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｘ】図２Ｘは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｙ】図２Ｙは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２Ｚ】図２Ｚは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２ＡＡ】図２ＡＡは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２ＢＢ】図２ＢＢは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図２ＣＣ】図２ＣＣは、ＰＡＲ−２アンタゴニストを含むペプチド類似構造を提供する。
【図３】図３は、ＰＡＲ−２とアンタゴニストとの提案された相互作用を示す図を提供する。
【図４Ａ】図４Ａは、先端の欠失した２つの分子、ＬＩＧＫ（配列番号１）およびＬＩＧＫＶ（配列番号２）と比較した、ＰＡＲ−２アゴニストＳＬＩＧＫＶ（配列番号２５）のカルシウム動員曲線を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＡＲ−２活性化ペプチドおよびそのアラニン置換した類似体に反応してＰＡＲ−２シグナル伝達を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＡＰ２ならびにその先端の欠失した形態およびアラニン置換類似体に反応してＰＡＲ−２シグナル伝達を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。
【図５】図５は、Ｐ２ＡＰシグナル伝達をブロックするために増加濃度のＬＩＧＫ（配列番号１）を使用した、代表的な投薬研究の結果を示す。
【図６】図６は、ＬＩＧＫ（配列番号１）またはＬＩＧＫＶ（配列番号２）の存在下におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害研究の結果を示すグラフを提供する。
【図７】図７は、ＬＩＧＫ（配列番号１）の、ＰＡＲ−２シグナル伝達に対する効果を示すグラフを提供する。
【図８】図８は、ＬＩＧＫ（配列番号１）の、ＰＡＲ−２水腫モデルに対する効果を示すグラフを提供する。
【図９】図９は、ＬＩＧＫ（配列番号１）の阻害効果を示すグラフを提供する。
【図１０】図１０は、ＬＩＧＫ（配列番号１）の、転移性の腫瘍成長に対する阻害効果を示すグラフを提供する。
【図１１】図１１は、複数回の独立した実験における、用量依存性を示すグラフを提供し、２ｍｇ／日でおよそＩＣ５０である。
【図１２】図１２は、ＬＩＧＫ（配列番号１）による、ＬＬＣの原発腫瘍成長の阻害を示す。
【図１３】図１３は、ＬＩＧＫ（配列番号１）の阻害効果を示す、マトリゲル血管形成アッセイの結果を示す。
【図１４】図１４は、ＥＮＭＤ５４７の存在下における、ＡＰ２刺激シグナル伝達の減少を示すグラフを提供する。
【図１５】図１５は、ＡＴＰおよびＡＰ２シグナル伝達に対するＥＮＭＤ５４７の効果を示す。
【図１６】図１６は、転移性の腫瘍成長における、ＬＩＧＫ（配列番号１）対ＥＮＭＤ５４７の効果を比較する阻害研究の結果を示す。
【図１７】図１７は、本発明者等によって調べられたペプチド類似体によるアプローチを示すフローチャートを提供する。
【図１８】図１８は、ペプチド類似体の設計を示す図面を提供する。
【図１９】図１９は、マウスにおけるＬＩＧＫ（配列番号１）の効果を示すために行われた炎症（関節炎）研究の結果を提供する。
【図２０】図２０は、ＬＩＧＫ（ＥＮＭＤ５２０と示す）の存在下、マウスにおける関節炎の減衰を示す（ＥＮＭＤ５２０と示す）。
【図２１】図２１は、ＬＩＧＫ（配列番号１）ＥＮＭＤ５２０およびＥＮＭＤ５４７の存在下における、関節炎の減衰を示す。
【図２２】図２２は、ＬＩＧＫ（配列番号１）、ＥＮＭＤ５２０の存在下における、体重損失の防止結果を示す。
【図２３】図２３は、ＬＩＧＫ（配列番号１）およびＥＮＭＤ５４７に関する抗腫瘍データを提供する。
【図２４】図２４は、ＰＡＲ−２アンタゴニストに対する、さらなるペプチド類似体構造を提供する。
【図２５】図２５は、断片、混合および逆ペプチドを使用した、阻害研究の結果を提供する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図２Ｑ】
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【図２Ｒ】
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【図２Ｓ】
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【図２Ｔ】
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【図２Ｕ】
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【図２Ｖ】
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【図２Ｗ】
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【図２Ｘ】
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【図２Ｙ】
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【図２Ｚ】
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【図２ＡＡ】
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【図２ＢＢ】
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【図２ＣＣ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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