(57)【要約】配列CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT；配列番号４のオリゴヌクレオチドからなる化合物であって、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記化合物。この化合物は、上昇したインビボの安定性と改良されたインビトロかつインビボの抗腫瘍活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT；配列番号４のオリゴヌクレオチドからなる化合物であって、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記化合物。
【請求項２】
腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてインビボでアンドロゲン感受性前立腺腫瘍細胞を処理することを含む、前立腺腫瘍細胞のアンドロゲン非依存性状態への進行を遅らせる方法であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４の配列を有し、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記方法。
【請求項３】
前立腺癌に罹っている個体でアンドロゲン離脱を開始して前立腺腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死滅を誘導し、この個体に腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を投与し、こうして個体の前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性状態に進行するのを遅らせることを含む、前立腺癌に罹っている個体の前立腺癌を治療する方法であって、ＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４の配列を有し、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記方法。
【請求項４】
化学療法剤を個体に投与する工程をさらに含む、請求項３の方法。
【請求項５】
化学療法剤はタキサンまたはミトキサントロンである、請求項４の方法。
【請求項６】
ＴＲＰＭ−２以外の抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害する第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドを個体に投与する工程をさらに含む、請求項３の方法。
【請求項７】
第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンスＢｃｌ−２オリゴヌクレオチドである、請求項６の方法。
【請求項８】
個体に化学療法剤を投与する工程をさらに含む、請求項６の方法。
【請求項９】
化学療法剤はタキサンまたはミトキサントロンである、請求項８の方法。
【請求項１０】
腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を個体に投与することを含む、同じ種類の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現する癌に罹った個体の癌細胞の化学感受性または放射線感受性を増強する方法であって、ＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４の配列を有し、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記方法。
【請求項１１】
アンドロゲン感受性前立腺腫瘍細胞の集団を腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することを含む、生きた前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン感受性である状態から、生きた腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性である状態への、前立腺腫瘍細胞の集団の進行を遅らせるであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４の配列を有し、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、テストステロン抑制前立腺メッセージ−２（testosterone-repressed prostate message-2）（ＴＲＰＭ−２）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する、癌のアンチセンス治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、欧米で男性が罹る最も一般的な癌であり、男性の癌による死亡の２番目に大きな死因である。前立腺癌はアンドロゲン感受性腫瘍であるため、例えば去勢によるアンドロゲン離脱は、進行性前立腺癌患者の一部の治療で使用されている。アンドロゲン離脱により、前立腺腫瘍の広範なアポトーシスが起き、従って疾患が退行する。しかし去勢に誘導されたアポトーシスは完全ではなく、生きている腫瘍細胞が最終的にアンドロゲン非依存性へ進行する。この進行は、生存とクオリティオブライフの改善への大きな障害であり、従ってアンドロゲン非依存性細胞を標的とする試みがなされている。これらの試みは、アンドロゲン非依存性腫瘍細胞を標的とした非ホルモン療法に集中している（ヤゴダ（Yagoda）ら、Cancer 71 (Supp. 3):1098-1109 (1993)：オー（Oh）ら、J. Urol. 60:1220-1229 (1998)）が、これまで生存率を改善した非ホルモン剤は無い。
【０００３】
ＴＲＰＭ−２は、広範囲の活性を有するとされている遍在するタンパク質である。前立腺上皮細胞では、去勢直後にＴＲＰＭ−２の発現が上昇し、ラット前立腺細胞では去勢後３〜４日でピークレベルに達し、多量の細胞死滅と一致する。これらの結果により一部の研究者は、ＴＲＰＭ−２は細胞死滅のマーカーであり、アポトーシスのプロモーターであると結論している。一方セルトリ細胞と一部の上皮細胞が、細胞死滅レベルの上昇を伴わず高レベルのＴＲＰＭ−２を発現するという観察結果は、この結論が正しいかどうかに対して疑問と提起している。
【０００４】
センシバー（Sensibar）ら、Cancer Research 55:2431-2437 (1995)は、前立腺細胞の死滅におけるＴＲＰＭ−２の役割をより明瞭に解明するためのin vitro実験について報告した。彼らは、ＴＲＰＭ−２をコードする遺伝子でトランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞を使用し、このタンパク質の発現が腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）（ＬＮＣａＰ細胞はこれに非常に感受性が高く、細胞死滅は通常約１２時間以内に起きる）の作用を変えるかどうかを観察した。トランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞をＴＮＦαで処理すると、数時間ＴＲＰＭ−２レベルが一過性に上昇するが、これらのレベルは、細胞死滅に先行するＤＮＡ断片化が観察されるまでに消滅した。ＴＲＰＭ−２配列の塩基１〜２１に対応するアンチセンス分子（しかし他のＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドではない）を使用すると、ＴＲＰＭ−２の発現が大幅に低下し、ＴＮＦαに暴露されるＬＮＣａＰ細胞のアポトーシス性細胞死滅が上昇した。このためセンシバー（Sensibar）らは、ＴＲＰＭ−２の過剰発現がＴＮＦαの細胞障害作用から細胞を防御し、ＴＲＰＭ−２欠失が細胞死滅の原因であるという仮説をたてたが、その作用機序は不明である。
【０００５】
センシバー（Sensibar）らはＴＲＰＭ−２の可能な役割についての情報を提供するが、ＴＲＰＭ−２の発現がトランスフェクトされた遺伝子に基づくモデル系のみからの結果しか開示していない。さらに、他の実験室で増殖させＬＮＣａＰ細胞中では、ＴＲＰＭ−２の発現レベルは非常に低いかまたは無かった。前立腺腫瘍細胞をアンドロゲン離脱に付すと、インビボで生じる状態ははるかに複雑であり、その結果多くのタンパク質が発現レベルを変化させる。すなわち、センシバー（Sensibar）らのデータから、ＴＲＰＭ−２が他のタンパク質と一緒に存在する時同じ機能を果たすかどうか、またはインビボでのアンドロゲン離脱後のＴＲＰＭ−２のレベルの変化が治療上の利点を与えるかどうかを予測することは不可能である。実際、アンドロゲン離脱後の種々の段階（多量のアポトーシス性細胞死滅が起きている段階を含む）で、前立腺腫瘍細胞中でＴＲＰＭ−２が多量に発現されるという事実は、インビボでのＴＲＰＭ−２の役割がもっと複雑かも知れないことを示唆する。
【０００６】
本分野は、前立腺腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死滅のいくつかの面に関するデータを提供するが、アンドロゲン非依存性の開示の遅延を提供する方法については教示も示唆もしていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、配列CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT；配列番号４のオリゴヌクレオチドからなる化合物を提供し、ここで、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである。この新しい化合物は、インビボで安定性が上昇しており、インビトロとインビボで改良された抗腫瘍活性を有することがわかった。この化合物は、前立腺腫瘍細胞のアンドロゲン非依存性状態への進行を遅らせるのに、前立腺癌に罹った個体の前立腺癌を治療するのに、同じ種類の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現する癌に罹った個体の癌細胞の化学または放射線感受性を増強するのに、および生きた前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン感受性である状態から、生きた腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性である状態への、前立腺腫瘍細胞の集団の進行を遅らせるのに、使用することができる。
【０００８】
本発明は、アンチセンスＴＲＰＭ−２オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１１２９８９に関し、これは、ヒトＴＲＰＭ−２配列の翻訳開始コドンと次に６つのコドンを標的とする２１量体オリゴヌクレオチドである（CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT；配列番号４）（ジーンバンク（GenBank）No：ＮＭ＿００１８３１）である。ＩＳＩＳ１  １１２９８９はまた本明細書において、２’−ＭＯＥ修飾ＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび２’−ＭＯＥ  ＡＳＯと呼ばれる。このオリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有する。ヌクレオチド１〜４と１８〜２１（「ウィング」）の糖残基は、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７：「デオキシギャップ」）は２’−デオキシヌクレオチドである。ウィング中のシトシン（すなわち、ヌクレオチド１、４および１９）は５−メチルシトシンである。本発明はまた、癌の治療におけるＩＳＩＳ１１２９８９組成物の使用に関する。本発明は、癌細胞がＴＲＰＭ−２を発現する癌の治療に応用できる。ＴＲＰＭ−２を発現する重要な癌細胞群には、前立腺癌細胞、ヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）細胞、非小細胞肺癌細胞、尿路移行上皮癌細胞、卵巣癌細胞、および一部の乳癌細胞がある。
【０００９】
親出願（２００１年８月３０日に出願された米国特許出願第０９／９４４，３２６号と、２００１年８月１０日に出願された米国特許出願第０９／９１３，３２５号）に報告されているように、去勢誘導性腫瘍細胞死滅の増加とアンドロゲン非依存性へのアンドロゲン感受性前立腺癌細胞の進行の遅延は、細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害することにより達成される。３つのモデル系（インビボシオノギ（Shionogi）腫瘍、ヒトＴＲＰＭ−２トランスフェクトＬＮＣｃＰ、およびヒトＰＣ−３モデル）で実験が行われ、これらはまとめて、アンドロゲン非依存性の遅延を引き起こすそのような阻害は、アンドロゲン感受性前立腺腫瘍細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）で処理することにより達成できることを証明した。
【００１０】
親出願で報告された最初の実験では、シオノギ腫瘍モデルのアンドロゲン非依存性の開始を遅らせるマウスＴＲＰＭ−２アンチセンス分子（配列番号１）の能力を評価した。ＴＲＰＭ−２の発現を阻害してアンドロゲン非依存性の開始を遅らせるアンチセンスＯＤＮの能力を、シオノギ腫瘍モデル中の去勢後腫瘍容積を測定することにより評価した。試験動物（ｎ＝７）を、緩衝化食塩水溶液中の１２．５mg/kgの繰り返し用量のアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）を毎日１回腹腔内投与して処理した。対照として、動物（ｎ＝７）をミスマッチＯＤＮ（配列番号２）で処理した。図１に示すように、試験群と対照群ともに去勢直後に腫瘍容積の予測された低下を示したが、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ処理したマウスの腫瘍は、対照より速く退縮した。対照群はまた、アンドロゲン非依存性の進展に関連する腫瘍容積の予測された増加を示した。これに対してアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを使用して処理したマウスでは、去勢の４９日後に腫瘍の再増殖はほとんど起きなかった。最終的にはアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ処理マウスで腫瘍は再発したが、再発までの中央（median）時間は対照群の約２倍であった。すなわち、ＴＲＰＭ−２の阻害は、アンドロゲン離脱の直後に起きる細胞死滅量を増加させるのに有効なだけでなく、アンドロゲン非依存性の開始を遅らせるのにも有効である。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理したマウスで腫瘍容積がより迅速に低下したのは、早期開始とより広範な去勢誘導性アポトーシスのせいである。これは、真空下でシオノギ腫瘍試料中のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）切断断片を検出することにより確認された（ミヤケ（Miyake）ら、Cancer Res. 60:170-176 (2000)）。
【００１１】
親出願において、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ配列に相補的などのヒトアンチセンスＯＤＮがこの目的のために最も有効であるかの評価についての実験が報告された。図２に示されるように、種々のｍＲＮＡ領域にまたがる一連の１０個のアンチセンスホスホロチオエートＯＤＮが調製された。これらの１０個のＯＤＮの配列を、配列番号３〜１２として添付の配列リストに示す。１０個のヒトアンチセンスＯＤＮを、ＴＲＰＭ−２トランスフェクションＬＮＣｃＰ細胞とヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞を使用して、これらがＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの発現を阻害する能力について評価した。図３に示すように、試験したアンチセンスＯＤＮは、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ発現の種々のレベルの阻害を示し、最良の結果は配列番号４、５および１２で達成された。配列番号５は、ＬＮＣｃＰ細胞中でＴＲＰＭ−２発現の阻害を引き起こしたセンシバー（Sensibar）らが使用した配列に対応し、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの最初の２１塩基に相補的である。最も有効なダウンレギュレーションは配列番号４で起きた。有効な配列のすべてに共通しているのは、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの開始部位または停止部位との重なりである。すなわち、ＴＲＰＭ−２発現の阻害は、アンチセンスＯＤＮの投与、特に翻訳開始部位または停止部位にまたがるＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの領域に相補的なアンチセンスＯＤＮの投与により達成される。
【００１２】
また親出願において、前立腺癌に罹っている個体（ヒト個体を含む）の治療的処置は、個体でアンドロゲン離脱を開始して前立腺腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死滅を誘導し、この個体に腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を投与し、こうして個体の前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性状態に進行するのを遅らせることにより、行うことができることが報告された。アンドロゲン離脱の開始は、外科的去勢（両方の睾丸の除去）または医学的去勢（テストステロンの薬剤誘導性抑制）により行われる、これは現在前立腺癌について行われている治療法である。医学的去勢は、ＬＨＲＨ剤または抗アンドロゲン剤を含む種々の処方により行われる（グリーブ（Gleave）ら、CMAJ 160:225-232 (1999)）。可逆的アンドロゲン離脱が行われる間欠的療法が、グリーブ（Gleave）ら、Eur. Urol. 34 (Supp. 3):37-41 (1998)に記載されている。ＴＲＰＭ−２発現の阻害は一過性であり、理想的にはアンドロゲン離脱と同時に起きる。ヒトではこれは、発現の阻害がアンドロゲン離脱の１日か２日以内に開始して約３〜６ヶ月有効であることを意味する。
【００１３】
また親出願において、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮがヒト腎細胞癌（ＲＣＣ）の化学感受性を上昇させることが測定されたと報告された。ＲＣＣは、目的応答率が１０％を超える活性な化学療法剤が無い化学抵抗性疾患である。尿管閉塞およびアミノ配糖体を含む種々の刺激後に、アポトーシスを受けている腎の近位曲尿細管細胞中のＴＲＰＭ−２発現の上昇が観察されている。ＲＣＣ中のＴＲＰＭ−２発現の機能的重要性はあまり報告されていないが、試験結果は、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮがヒトＲＣＣ  ＣａＫｉ−２細胞で化学感受性を上昇させることを示した（実施例６も参照、下記）。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮはまた、放射線照射に対する感受性を上昇させることがわかった（実施例７と図８を参照）。
【００１４】
親出願において、使用されるＯＤＮはインビボの安定を上昇させるように修飾してできることが報告された。例えばＯＤＮは、ヌクレアーゼ消化に対する抵抗性が上昇したホスホロチオエート誘導体（非ブリッジホスホリル酸素のイオウ原子による置換）として使用してもよい。２’−ＭＯＥ（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾（ＩＳＩＳ骨格）もまた有効であり、アンチセンスＴＲＰＭ−２オリゴヌクレオチドのインビトロとインビボの抗腫瘍活性を改良する。
【００１５】
本発明は、２’−ＭＯＥ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（上記のＩＳＩＳ１１２９８９）、去勢誘導性腫瘍細胞死滅を増強し、アンドロゲン非依存性への前立腺腫瘍細胞の進行を遅らせるための、かつ前立腺癌に罹っている個体（ヒト個体を含む）の治療のためのＩＳＩＳ１１２９８９の使用法、およびそのような方法での使用に有効なＩＳＩＳ１１２９８９を含有する治療薬とを開示する。本発明の治療法は、進行した前立腺癌を有する個体の治療に最も一般的に使用されるであろう。
【００１６】
ＩＳＩＳ１１２９８９の投与は、そのままの投与および薬剤学的に許容される液性担体中での投与を含む、当該分野で公知の種々の機構を使用して行うことができる。例えばアンチセンス送達のための液性担体は、米国特許第５，８５５，９１１号および５，４１７，９７８号に開示されている（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。一般にＩＳＩＳ１１２９８９は、静脈内（i.v.）、腹腔内（i.p.）、皮下（s.c.）もしくは経口経路、または直接局所的腫瘍注入により投与される。親出願に報告されたシオノギマウスモデルを使用した実験から、アンチセンスオリゴヌクレオチドは腫瘍細胞中で選択的に活性があるようである。
【００１７】
投与されるＩＳＩＳ１１２９８９の量は、前立腺細胞中のＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効なものである。この量は、使用される担体の性質により変化することは理解されるであろう。ある組成物の適切な量の決定は当該分野の技術範囲内であり、適切な治療レベルを評価するのに設計される標準的シリーズの試験により行われる。
【００１８】
本発明の前立腺癌を治療する方法は、化学療法剤および／または異なる標的に対する追加のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与をさらに含んでよい。例えば親出願において、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、タキサン（パクリタキセルまたはドセタキセル）およびミトキサントロンのような従来の化学療法剤に対する感受性を上昇させることが、シオノギ腫瘍モデルを使用して証明された（図１２Ａと１２Ｂ）。図１２Ａと１２Ｂに記載のように、タキソールまたはミトキサントロンの存在下でアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを用いる治療は、タキソールまたはミトキサントロンとミスマッチ（ＭＭ）ＯＤＮとの組合せと比較して、腫瘍容積を減少させた。相乗作用を示す可能性のある他の物質には、他の細胞障害性物質（例えば、シクロホスファミド、トポイソメラーゼインヒビター）、血管形成インヒビター、分化物質およびシグナル伝達インヒビターがある。同様に、ＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドと他のアンチセンス種（例えばアンチセンスＢｃｌ−２  ＯＤＮ）との組合せは、ＯＤＮ単独よりインビトロでシオノギ細胞を死滅させるのに優れていることが証明された。すなわち親出願において、ＴＲＰＭ−２は他のアンチセンス分子（例えば、アンチセンスＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘｌおよびｃ−ｍｙｃオリゴヌクレオチド）と共同して作用してより大きな効果を与えることが証明された。
【００１９】
本発明において、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力、組織半減期および毒性を、第２世代骨格２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（２’−ＭＯＥ）リボース修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ１１２９８９または２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチド）と比較する試験を行った。これらの試験の方法と結果を実施例１３に示す。試験の結果は、２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルを用量依存的かつ配列特異的に低下させることを示した。２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較してより強力にＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡを抑制した。パクリタキセルのＩＣ50は、両方の化合物によって等しく低下した。インビボの組織半減期は、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドより２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドについてかなり長かった。インビボでのパクリタキセルの効果の上昇には、毎週の２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、毎日のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与と同等であった。２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドは、副作用無しでＴＲＰＭ−２発現を強力に抑制し組織半減期を延長させた。これらの結果は、効果を上昇させる可能性があり、臨床治験で投与間隔を長くすることを可能にすることにより、従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドより、２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することを支持する。
【００２０】
本発明は、アンドロゲン感受性の前立腺腫瘍細胞をインビボでＩＳＩＳ１１２９８９（これは、腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害する）で処理することにより、アンドロゲン非依存性状態への前立腺腫瘍細胞の進行を遅らせる方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、前立腺癌に罹っている個体の前立腺癌を治療する方法に関する。この方法は、個体でアンドロゲン離脱を開始して前立腺腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死滅を誘導し、この個体に腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を投与し、こうして個体の前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性状態に進行するのを遅らせる工程を含む。ＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物はＩＳＩＳ１１２９８９である。この方法は、個体に化学療法剤を投与する工程をさらに含む。好ましくは化学療法剤はタキサンまたはミトキサントロンである。この方法は、ＴＲＰＭ−２以外の抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害する第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する工程をさらに含んでよい。好ましくは第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＢｃｌ−２オリゴヌクレオチドである。あるいはこの方法は、これらのさらなる工程の両方の組合せを含有してもよい。
【００２２】
本発明はまた、同じ型の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現する癌に罹っている個体の、癌細胞の化学感受性または放射線感受性を増強する方法を提供する。この方法は、癌細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を個体に投与することを含み、ここでＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物はＩＳＩＳ１１２９８９である。
【００２３】
本発明はまた、生きた前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン感受性である状態から、生きた腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性である状態への、前立腺腫瘍細胞の集団の進行を遅らせる方法を提供する。この方法は、アンドロゲン感受性前立腺腫瘍細胞の集団をＩＳＩＳ１１２９８９（これは、腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害する）で処理することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明を以下の非限定例を参照してさらに説明する。
【実施例１】
【００２５】
移植性のＳＣ−１１５ＡＤマウス乳癌のトロント亜株からの細胞を使用して、シオノギ腫瘍モデル実験を行った。インビボ試験のために、シオノギ癌の約５×１０6 細胞を、成体オスＤＤ／Ｓ株マウスの皮下に注入した。シオノギ腫瘍の直径が１〜２cmになった時（通常、注入後２〜３週間）、メトキシフルラン麻酔下で腹部切開により去勢を行った。マウスの維持、腫瘍ストック、および手術手順は既に記載されている（ブルチョブスキー（Bruchovsky）ら、Cancer Res. 50:2275-2282 (1990)；レニー（Rennie）ら、Cancer Res. 48:6309-6312 (1988)；ブルチョブスキー（Bruchovsky）ら、Cell 13:272-280 (1978)；グリーブ（Gleave）ら、Genitourinary Oncology, pp. 367-378, ランゲ（Lange）ら編、リッペンコット（Lippencott） (1977)；グリーブ（Gleave）ら、J. Urol. 157:1727-1730 (1997)；ブルチョブスキー（Bruchovsky）ら、The Prostate 6:13-21 (1996)）。
【００２６】
マウスホスホロチオエートアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）、またはアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとは配列が２塩基異なるミスマッチ対照（配列番号２）で処理するために、マウスをランダムに選択した。各実験群は７匹のマウスからなる。去勢の１日後、リン酸緩衝化生理食塩水に溶解した１２．５mg/kgのアンチセンスＴＲＰＭ−２またはミスマッチ対照ＯＤＮを、毎日１回各マウスに４０日間腹腔内注射した。腫瘍容積を毎週２回測定し、式：長さ×幅×奥行き×０．５２３６により計算した。グリーブ（Gleave）ら、Cancer Res. 52:1598-1605 (1992)。データ点は、上記腫瘍容積±標準偏差として報告された。
【００２７】
この試験の結果を図１に示す。図から明らかなように、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理したマウスではシオノギ腫瘍は急速に退縮し完全な退縮が起きた。さらにアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮによる処理はアンドロゲン非依存性の発生（これは対照動物の２１日以後の腫瘍容積の上昇に反映される）を実質的に遅らせた。アンチセンスＴＲＰＭ−２またはミスマッチ対照に関連する副作用はなかった。
【００２８】
ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルへのインビボＯＤＮ処理の作用を調べるために、マウスからのシオノギ腫瘍組織についてノーザンブロット解析を行った。去勢の１日目から開始してマウスを毎日１２．５mg/kgのアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（ｎ＝６）またはミスマッチ対照（ｎ＝６）を腹腔内注入して処理した。去勢の４日後に、腫瘍組織を採取し、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡについてノーザンブロット解析で分析した。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、ミスマッチＯＤＮ処理腫瘍と比較して、シオノギ腫瘍のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルを７５％低下させた（図３）。
【００２９】
正常なマウス臓器について同等の分析を行った。同じ処理スケールでアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとミスマッチ対照で処理したシオノギ腫瘍マウスから脾臓、腎臓、前立腺、および脳の試料を採取し、ノーザンブロットにより分析した。ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルは腫瘍組織で有意に低かったが、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは正常臓器中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルに影響はなかった。
【実施例２】
【００３０】
アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）の配列選択性を、種々のレベルのアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮまたはミスマッチ対照（配列番号２）で処理後、インビトロで維持したシオノギ腫瘍細胞中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの発現レベルを比較して確認した。細胞へのＯＤＮの取り込みを促進するために、ＯＤＮを陽イオン性液性担体（リポフェクチン（ライフテクノロジーズ社（Life Technologies, Inc.））中で調製した。以下のプロトコールを使用して２日間にわたって細胞を２回処理した。無血清ＯＴＰＩ−ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社（Life Technologies, Inc.））中の４μg/mlのリポフェクチンで細胞を２０分間プレインキュベートし、次に選択された濃度のＯＤＮとリポフェクチンを含有する培地で４時間インキュベートした。次に培地を標準培地と交換した。
【００３１】
細胞中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの量を、ノーザンブロット解析を使用して評価した。図４に示すように、シオノギ細胞をアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理すると、用量依存的にＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡが低下した。これに対して、ミスマッチＯＤＮ（配列番号２）では使用したどの濃度でもＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡは影響を受けなかった。すなわち、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮの作用は明らかに配列特異的である。
【実施例３】
【００３２】
インビトロで維持したシオノギ細胞を種々の量のタキソール単独で、または５００nMのアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）もしくはミスマッチＯＤＮ（配列番号２）と組合せて処理した。実施例２に記載のように細胞を２回処理し、残っている生存細胞の割合を測定した。結果は図５に要約する。明らかなように、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを含めると用量応答曲線が左に移動し、ＩＣ50が５〜１０倍低下した。パクリタキセルの代わりにミトキサントロンを使用すると同様の結果が達成された（図１２Ａと１２Ｂ）。
【実施例４】
【００３３】
アンチセンスＢｃｌ−２  ＯＤＮ（配列番号１３）またはミスマッチＢｃｌ−２  ＯＤＮ（配列番号１４）を、アンチセンス／ミスマッチＴＲＰＭ−２  ＯＤＮおよびタキソールとの種々の組合せで添加して実施例３の実験を繰り返した。結果を図６に示す。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとアンチセンスＢｃｌ−２  ＯＤＮおよびタキソールとの組合せは、タキソールの細胞障害作用をさらに増強した。すなわち追加のアポトーシス物質の標的化は、治療的利益を与えるようである。
【実施例５】
【００３４】
ヒトの治療で使用される適切なアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ配列を同定するために、ヒトＴＲＰＭ−２遺伝子の１０個の異なる部位に対するアンチセンスＯＤＮ配列（図２、配列番号３〜１２）を合成し、ヒト前立腺癌ＰＣ−３とＴＲＰＭ−２を過剰発現するトランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞中のＴＲＰＭ−２遺伝子発現を低下させる能力について、実施例２と同じ処理プロトコールを使用して試験した。結果を図３に要約する。明らかなように配列番号４、５および１２は、ＴＲＰＭ−２発現の低下について活性であった。これらの３つの配列の重なりは、翻訳開始部位または停止部位に直ぐ隣接している。
【実施例６】
【００３５】
免疫染色を使用して、根治的摘出腎試料から得られた１７個のＲＣＣと正常腎組織中のＴＲＰＭ−２発現を解析した。ヒト腎癌細胞株ＡＣＨＮ、ＣａＫｉ−１、およびＣａＫｉ−２中のＴＲＰＭ−２発現を、ノーザンブロット解析とウェスタンブロット解析の両方で評価した。ノーザンブロット解析は、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ処理後のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ発現の変化を評価するために使用した。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮとタキソールの組合せ処理のＣａＫｉ−２細胞増殖に対する作用を、ＭＴＴ測定法を使用して調べた（ゼルウェーガー（Zellweger）ら、Neoplasia 3:360-367 (2001)）。
【００３６】
免疫染色は、隣接した正常腎組織と比較して１１個のＲＣＣ試料中でＴＲＰＭ−２発現の上昇を示した。ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡとタンパク質発現の両方が３つすべてのヒトＲＣＣ細胞株で検出可能であり、ＣａＫｉ−２について最も高値であった。アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）（しかし、ミスマッチ対照ＯＤＮ（配列番号２）は異なる）は、ＣａＫｉ−２中のＴＲＰＭ−２発現を用量依存的かつ配列特異的に阻害した（図７Ａ）。さらに、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮはミスマッチ対照ＯＤＮと比較して、タキソール化学感受性を実質的に増強しタキソールのＩＣ50を１log（５００nMから５０nM）低下させた。これらのデータは、ＴＲＰＭ−２とそのタンパク質クラステリン（clusterin）が、正常腎組織と比較してＲＣＣ中でより高レベルで発現され、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮが進行性ＲＣＣにおいて従来の化学療法の細胞障害作用を増強するのに有用となり得ることを証明している。
【実施例７】
【００３７】
アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮは、ＴＲＰＭ−２を発現する癌細胞の放射線感受性を上昇させる。ノーザンブロット解析を使用して我々は、放射線療法がヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞中のＴＲＰＭ−２遺伝子発現を用量依存的かつ時間依存的に上昇させることを見いだした（図８）。ＴＲＰＭ−２の過剰発現により、放射線誘導性細胞死滅に対する抵抗性が上昇した。ＴＲＰＭ２を過剰発現するＬＮＣａＰ細胞（ＬＮＣａＰ／Ｔ１）は、放射線療法に対してより抵抗性である（図９ＡとＢ）。ヒト前立腺癌ＰＣ−３を１００nMと５００nMのアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ（配列番号１）で処理すると、ミスマッチＯＤＮ（配列番号２）処理と比較して、４Gy放射線療法の単回治療後の細胞生存が有意に低下する（図１０）。図１１ＡとＢは、インビトロで１０、５０および１００nMのアンチセンスＴＲＰＭ−２オリゴで処理後のヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞の用量依存性放射線感受性を示す。
【実施例８】
【００３８】
ヒトアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮによる処理がＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞株で化学感受性を上昇させるかどうかを調べるために、ＰＣ−３腫瘍を有するマウスを、アンチセンスヒトＴＲＰＭ−２  ＯＤＮ＋ミセルパクリタキセルまたはミトキサントロン、およびミスマッチ対照ＯＤＮ＋ミセルパクリタキセルまたはミトキサントロンで処理した（図１２Ａと１２Ｂ）。ＯＤＮは２８日間投与し、０．５mgミセルタキソールまたは０．３mgミトキサントロンを２回投与した：１０日〜１４日、および２４日〜２８日。ミスマッチ対照ＯＤＮで処理した動物と比較して、アンチセンスＯＤＮで処理した動物では、腫瘍サイズの有意な低下が観察された。この作用は、ミセルパクリタキセルまたはミトキサントロンの２回目の投与後により顕著であった。
【実施例９】
【００３９】
オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホラミダイト
デオキシおよび２’−アルコキシアミダイト。２’−デオキシベータ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトは業者から得た（例えば、ケムジーンズ（Chemgenes）、ニーダム（Needham）、マサチューセッツ州、またはグレンシサーチ社（Glen Research, Inc.）、スターリング（Sterling）、バージニア州）。５’−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドは、公表された方法（サングヴィ（Sanghvi）ら、Nucleic Acids Research. 21:3197-3203 (1993)）に従って、市販のホスホラミダイト（グレンシサーチ社（Glen Research, Inc.）、スターリング（Sterling）、バージニア州、ケムジーンズ（Chemgenes）、ニーダム（Needham）、マサチューセッツ州）を使用して合成した。
【００４０】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト。２’−Ｏ−メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは以下のように、またはマーチン（Martin, P.）の方法、Helvetica Chimica Acta 78:486-504 (1995)に従って合成した。
【００４１】
２，２’−アンヒドロ［１−（ベータ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］。５−メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ（Yamasa）、日本国銚子から市販されている）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）および重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００mL）に加えた。混合物を攪拌しながら加熱還流し、制御しながら二酸化炭素を排出させた。１時間後、わずかに黒くなった溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップを、攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）に注いだ。生成物はガムを形成した。エーテルをデカントし、残渣を最小量のメタノール（約４００mL）に溶解した。溶液を新鮮なエーテル（２．５Ｌ）に注いで硬いガムを得た。エーテルをデカントし、ガムを真空オーブン（６０℃で１mmHgで２４時間）で乾燥して固体を得、これを粉砕して淡褐色の粉末を得た（５７ｇ、粗収率８５％）。ＮＭＲスペクトルは構造に一致し、そのナトリウム塩としてフェノールで汚染された（約５％）。この物質をそのまま次にの反応に使用した（または、酢酸エチル中のメタノールの勾配（１０〜２５％）を使用するカラムクロマトグラフィーでさらに精製して白色の固体を得ることができる、融点２２２〜４℃）。
【００４２】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン。２，２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ホウ酸塩（２３１ｇ、０．９８Ｍ）および２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を２Ｌのステンレスの圧力容器に入れ、あらかじめ加熱した１６０℃の油浴に入れた。１５５〜１６０℃で４８時間加熱後、容器を開け、溶液を蒸発乾固させ、ＭｅＯＨ（２００mL）で粉砕した。残渣を熱アセトン（１Ｌ）に懸濁した。不溶性の塩をろ過し、アセトン（１５０mL）で洗浄し、ろ液を蒸発させた。残渣（２８０ｇ）をＣＨ3ＣＮ（６００mL）に溶解し蒸発させた。シリカゲルカラム（３kg）を、０．５％Ｅｔ3ＮＨを含有するＣＨ2Ｃｌ2／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）に充填した。残渣をＣＨ2Ｃｌ2（２５０mL）に溶解し、シリカ（１５０ｇ）に吸着させた後、カラムに充填した。生成物を充填溶媒で溶出して１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。純粋ではない画分を再処理して追加の生成物を得た。
【００４３】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０mL）と一緒に蒸発させ、乾燥した残渣をピリジン（１．３Ｌ）に溶解した。塩化ジメトキシトリチルの最初のアリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチルの第２のアリコート（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）を加え、反応物をさらに１時間攪拌した。次にメタノール（１７０mL）を加えて反応を停止させた。ＨＰＬＣは、約７０％の生成物の存在を示した。溶媒を留去して、ＣＨ3ＣＮ（２００mL）で粉砕した。残渣をＣＨＣｌ3（１．５Ｌ）に溶解し、２×５００mLの飽和ＮａＨＣＯ3 と２×５００mLの飽和ＮａＣｌで抽出した。Ｎａ2ＳＯ4で有機相を乾燥させ、ろ過し、再度溶媒を留去した。２７５ｇの残渣が得られた。残渣を３．５kgのシリカゲルカラムで精製し、０．５％Ｅｔ3ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）を充填し、これで溶出した。純粋な画分を蒸発させて、１６４ｇの生成物を得た。不純な画分から約２０ｇのさらなる生成物が得られ、総収量１８３ｇ（５７％）が得られた。
【００４４】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン。２’−Ｏ−メトキシエチル−５−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２mLのＤＭＦと１８８mLのピリジンから調製した３：１混合物の７５０mL）と無水酢酸（２４．３８mL、０．２５８Ｍ）を一緒にし、室温で２４時間攪拌した。ＭｅＯＨを加えてＴＬＣ試料を最初にクエンチして、ＴＬＣにより反応を追跡した。反応の完了（ＴＬＣに判定）後、ＭｅＯＨ（５０mL）を加え、混合物を３５℃で蒸発させた。残渣をＣＨＣｌ3 （８００mL）に溶解し、２×２００mLの飽和重炭酸ナトリウムと２×２００mLの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層を２００mLのＣＨＣｌ3で逆抽出した。合わせた有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発して１２２ｇの残渣を得た（約９０％の生成物）。残渣を３．５kgのシリカゲルカラムで精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出した。純粋な生成物画分を蒸発させて９６ｇ（８４％）を得た。さらに１．５ｇを後の画分から回収した。
【００４５】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン。３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）をＣＨ3ＣＮ（７００mL）に溶解して第１の溶液を調製し、とっておいた。トリエチルアミン（１８９mL、１．４４Ｍ）をＣＨ3ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）の溶液に加え、−５℃に冷却し、頭上スターラーを使用して０．５時間攪拌した。０〜１０℃に維持した攪拌溶液にＰＯＣｌ3を３０分にわたって滴下して加え、生じた混合物をさらに２時間攪拌した。最後の溶液に第１の溶液を４５分にわたって滴下して加えた。生じた反応混合物を低温室で一晩保存した。反応混合物から塩をろ過し、溶液を蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）に溶解し、不溶性固体をろ過して除去した。ろ液を１×３００mLのＮａＨＣＯ3 と２×３００mLの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去した。残渣をＥｔＯＡｃで粉砕して標題化合物を得た。
【００４６】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン。ジオキサン（５００mL）とＮＨ4ＯＨ（３０mL）中の３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）の溶液を、室温で２時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（２×２００mL）と共沸させた。残渣をＭｅＯＨ（３００mL）に溶解し、２リットルのステンレス圧力容器に移した。ＮＨ3 ガスを飽和させたＭｅＯＨ（４００mL）を加え、容器を１００℃に２時間加熱した（ＴＬＣは完全な変換を示した）。容器の中身を蒸発乾固し、残渣をＥｔＯＡｃ（５００mL）に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００mL）で１回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を留去して、８５ｇ（９５％）の標題化合物を得た。
【００４７】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン。２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００mL）に溶解し、攪拌しながら無水安息香酸（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を加えた。３時間攪拌後、ＴＬＣは反応が約９５％完了したことを示した。溶媒を留去し、残渣をＭｅＯＨ（２００mL）と共沸させた。残渣をＣＨＣｌ3（７００mL）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3（２×３００mL）と飽和ＮａＣｌ（２×３００mL）で抽出し、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、溶媒を留去して残渣（９６ｇ）を得た。残渣を１．５kgのシリカカラムで、０．５％Ｅｔ3ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）を溶出溶媒として使用してクロマトグラフィーを行った。純粋な生成物画分を蒸発させて、９０ｇ（９０％）の標題化合物を得た。
【００４８】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト。Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）をＣＨ2Ｃｌ2（１Ｌ）に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）と２−シアノエトキシ−テトラ（イソプロピル）ホスファイト（４０．５mL、０．１２３Ｍ）を窒素雰囲気下で攪拌しながら加えた。得られた混合物を室温で２０時間攪拌した（ＴＬＣは反応が９５％完了したことを示した）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ3（１×３００mL）と飽和ＮａＣｌ（３×３００mL）で抽出した。水性洗浄液をＣＨ2Ｃｌ2（３００mL）で逆抽出し、抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ4 で乾燥し、濃縮した。得られた残渣を１．５kgのシリカカラムでＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３：１）を溶出溶媒として使用してクロマトグラフィーを行った。純粋な画分を合わせて、９０．６ｇ（８７％）の標題化合物を得た。
【実施例１０】
【００４９】
オリゴヌクレオチド合成。亜りん酸塩結合の段階的チア化のためにヨウ素（酸化のため）を０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドで置換した以外は、標準的ホスホラミダイト化学を使用して、自動ＤＮＡ合成機（アマシャム・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、モデル３８０Ｂ）で、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）オリゴヌクレオチドを合成した。チア化待ち工程を６８秒に延長し、次にキャッピング工程を行った。ＣＰＧカラムから切断し、５５℃（１８時間）で濃水酸化アンモニウムで脱ブロッキング後、０．５Ｍ ＮａＣｌ溶液から２．５倍量のエタノールで２回沈殿させてオリゴヌクレオチドを精製した。
【実施例１１】
【００５０】
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメリックホスホロチオエートオリゴヌクレオチド。上記のようにアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）の自動ＤＮＡ合成機モデル３８０Ｂを使用して、２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートと２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドセグメントを有するキメリックオリゴヌクレオチドを合成する。自動合成機と、ＤＮＡ部分に２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホラミダイト、および５’と３’ウィングに５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（メトキシエチル）−３’−Ｏ−ホスホラミダイトを使用して、オリゴヌクレオチドを合成する。テトラゾールと塩基の送達後の待ち工程を６００ｓに延長するのを、ＲＮＡについて４回そして２’−Ｏ−メトキシエチルについて２回繰り返して、標準的合成サイクルを修飾する。完全に保護されたオリゴヌクレオチドは支持体から切断され、ホスフェート基は、３：１アンモニア／エタノールで室温で一晩脱保護され、次に凍結乾燥して乾燥させる。メタノール性アンモニア中で室温で２４時間処理してすべての塩基を脱保護し、試料を再度凍結乾燥して乾燥させる。ペレットをＴＨＦ中の１Ｍ  ＴＢＡＦに室温で２４時間再懸濁して２’位を脱保護する。次に１Ｍ  ＴＥＡＡで反応を停止させ、次に試料をロトバック（rotovac）で１／２にした後、Ｇ２５サイズ排除カラムで脱塩する。回収されたオリゴヌクレオチドを次に分光光学的に収率について分析し、毛細管電気泳動と質量スペクトル法により純度について分析する。
【００５１】
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（２−２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメリックオリゴヌクレオチド。上記方法のように、ヨウ素による酸化を代用してキメラ構造のウィング部分内にホスホジエステルヌクレオチド間結合を作成し、硫化を代用（例えば、３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（Beaucage試薬）により）して中央ギャップについてホスホジエステルヌクレオチド間結合を作成することにより、［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメリックオリゴヌクレオチドを調製する。
【実施例１２】
【００５２】
オリゴヌクレオチド単離。制御多孔性ガラスカラム（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））から切断し、濃水酸化アンモニウム中で５５℃で１８時間脱ブロッキングした後、２．５倍量のエタノールを用いて０．５Ｍ  ＮａＣｌから２回沈殿させてオリゴヌクレオチドを精製する。合成したオリゴヌクレオチドを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により変性ゲル上で分析し、少なくとも８５％の完全長物質であることが判定された。合成で得られるホスホロチオエートとホスホジエステル結合の相対量は、31Ｐ核磁気共鳴分光法により定期的にチェックし、ある試験では、オリゴヌクレオチドをChiangら、J. Biol. Chem. 266:18162-18171 (1991)が記載したようにＨＰＬＣにより精製した。ＨＰＬＣ精製物質を用いて得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製材料を用いて得られたものと同様であった。
【実施例１３】
【００５３】
ヒトＰＣ−３細胞と腫瘍におけるＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルのノーザン解析で定量される変化。ＭＴＴ測定法は、ＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチド＋パクリタキセルのＰＣ−３細胞増殖に対する作用を測定した。ＰＣ−３腫瘍を有する無胸腺マウスをパクリタキセル＋ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド、２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで、２８日間処理した。毎週、体重と血清パラメータを測定して毒性を評価した。ＰＣ−３腫瘍中のホスホロチオエートと２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを、毛細管ゲル電気泳動（ＣＧＥ）を使用して評価した。
【００５４】
腫瘍細胞株。ホルモン抵抗性ヒト前立腺癌由来のＰＣ−３を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）から購入した。細胞を、５％熱不活性化胎児牛血清を補足したＤＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.）、ゲーサーズバーグ（Gaithersburg）、メリーランド州）で維持し、９０％コンフルエンスの時定期的に継代した。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド。この試験で使用したホスホロチオエートと２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを、既に記載されているように合成した（モニア（Monia）ら、J. Biol. Chem. 268:14514-14522 (1993)；ディーン（Dean）ら、J. Biol. Chem. 269:16416-16424 (1994)）。使用したＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの配列は、ヒトＴＲＰＭ−２翻訳開始部位１（5'-CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT-3'）（配列番号４）に対応した。対照として２塩基ＴＲＰＭ−２ミスマッチオリゴヌクレオチド（5'-CAGCAGCAGAGTATTTATCAT-3'）（配列番号１５）を使用した。従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ発現を用量依存的かつ配列特異的に強く阻害することはすでに証明された（ミヤケ（Miyake）ら、Clin. Cancer Res. 6:1655-1666 (2000)）。ホスホロチオエートと２’−ＭＯＥアンチセンス類似体、およびそれらの対照の配列は同じであった。２’−ＭＯＥの設計はCAGCAGCAGAGTCTTCATCATであり、ここで下線を引いた塩基は２’−ＭＯＥ残基を示す。
【００５６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる細胞の処理。陽イオン性脂質であるリポフェクチン（ライフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.））を使用して、細胞のアンチセンスオリゴヌクレオチド取り込みを上昇させた。ＰＣ−３細胞を無血清ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ライフテクノロジーズ社（Life Technologies Inc.））中の１０μg/mlリポフェクチンで２０分プレインキュベートした後、種々の濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。インキュベーション開始の４時間後、アンチセンスオリゴヌクレオチドとリポフェクチンを含有する培地を、上記の標準培地と交換した。
【００５７】
ノーザンブロット解析。酸−チオシアン酸グアニジウム−フェノール−クロロホルム法を使用して培養ＰＣ−３細胞とＰＣ−３腫瘍組織から、総ＲＮＡを単離した。すでにミヤケ（Miyake）ら, Oncogene 16:933-943 (1998) が記載したように、電気泳動、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を行った。逆転写−ＰＣＲによりヒト腎の総ＲＮＡから、ＴＲＰＭ−２についてはプライマー5'-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3'（センス）（配列番号１６）と5'-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3'（アンチセンス）（配列番号１７）を、そしてＧＡＰＤＨについては5'-TGCTTTTAACTCTGGTAAAGT-3'（センス）（配列番号１８）と5'-ATATTTGGCAGGTTTTTCTGA-3'（アンチセンス）（配列番号１９）を使用して、ヒトＴＲＰＭ−２とＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡプローブを作成した。ＴＲＰＭ−２についてのバンドの密度を、デンシトメーター分析によりＧＡＰＤＨのバンド密度に対して標準化した。
【００５８】
毛細管ゲル電気泳動（ＣＧＥ）。ＣＧＥ（ＰＡＣＥ５０００システム、ベックマン（Beckman）、フラートン（Fullerton）、カリホルニア州）を使用して、ＰＣ−３細胞中の完全長アンチセンスオリゴヌクレオチドの画分を測定し、２０％変性ＰＡＧＥとレーザースキャニングデンシトメトリー（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics）、サニーベール（Sunnyvale）、カリホルニア州）により確認した。ＣＧＥのために、１００μlのアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（濃度約０．１ＡＵ260）を、１００mMのトリスホウ酸（ｐＨ＝８．０）ランニング緩衝液を使用して４５cmのポリアクリルアミド充填毛細管カラム中へ、約５kVで界面動電注入のために使用した。約１０kVで３０分にわたって分離を行い、ピーク検出を２６０nMのＵＶ吸収により測定した。
【００５９】
ＭＴＴ測定法。すでに記載されているＭＴＴ測定法（ミヤケ（Miyake）ら, Oncogene 16:933-943 (1998)）を使用して、従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド＋パクリタキセルまたはドセタキセル対２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチド＋パクリタキセルまたはドセタキセルの、ＰＣ−３細胞に対するインビトロ増殖阻害作用を比較した。簡単に説明すると９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに１×１０4 細胞を接種し、一晩付着させた。次に細胞を５００nMのＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで２日間、毎日１回処理した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後に、細胞を種々の濃度のパクリタキセルまたはドセタキセルで処理した。４８時間インキュベーション後、ＰＢＳ中の２０μlの５mg/ml ＭＴＴ（シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））を各ウェルに加え、次に３７℃で４時間インキュベートした。ホルマザン結晶をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。マイクロ培養プレートリーダー（ベクトンディッキンソンラブウェア（Becton Dickinson Labware）、リンカーンパーク、ニュージャージー州）を用いて５４０nmで光学密度を測定した。吸光度値をビヒクル処理細胞の吸光度値に対して標準化して、生存パーセントを測定した。各測定は三重測定で行った。
【００６０】
インビボ処理。ハロタン麻酔下（５％誘導−および１．５％維持−濃度）の６〜８週齢の無胸腺マウスのわき腹に、約１×１０6 のヒトＰＣ−３細胞を０．１mlのマトリゲル（Matrigel）（ベクトンディッキンソンラブウェア（Becton Dickinson Labware）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）とともに皮下接種した。ＰＣ−３腫瘍の直径が１０mmまで増殖した時（通常注入後４〜６週間）、動物の処理を開始した。
【００６１】
第１の実験では、従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド＋パクリタキセル、２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチド＋パクリタキセル、またはホスホロチオエートミスマッチ対照オリゴヌクレオチド＋パクリタキセルを用いて処理するために、マウスを３群の１つにランダム化した。各実験群は１０匹のマウスからなった。ランダム化後、１２．５mg/kgのＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドを、毎日１回で各マウスに２８日間腹腔内投与した。１０〜１４日、および２４〜２８日に、０．５mgのポリマー性ミセルパクリタキセルを１日に１回ルング（Leungo）らの方法（Prostate 44:156-163 (2000)）に従って静脈内注射した。腫瘍容積を毎週１回測定し、以下の式により計算した：長さ×幅×奥行き×０．５２３６。データ点は、平均腫瘍容積±標準偏差として報告された。３つの処理群のそれぞれで、３匹のマウスをランダム化直後に、最後のオリゴヌクレオチド／パクリタキセル処理の１週間後（３５日目）に採取することとし、複数の血清パラメータを測定してインビボのアンチセンスオリゴヌクレオチド毒性を比較した。
【００６２】
第２の実験で、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドで毎日１回、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドで毎週１回、２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドで毎週１回、またはホスホロチオエートミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで毎週１回処理するために、マウスを４群の１つにランダム化した。各実験群は８匹のマウスからなった。ランダム化後、１２．５mg/kgのＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドを、毎日１回または毎週１回、各マウスに４週間腹腔内投与した。すべての４群の動物にさらに、上記のようにポリマー性ミセルパクリタキセルを投与した。腫瘍容積を測定し、各データ点を上記のように報告した。
【００６３】
第３の実験で、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理するために、マウスを２群の１つにランダム化した。各実験群は１２匹のマウスからなった。１２．５mg/kgのＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドを、毎日１回各マウスに５日間腹腔内投与した。ＴＲＰＭ−２のノーザンブロット解析およびＣＧＥ解析のために、最後のアンチセンスオリゴヌクレオチド注入後の１、３、５および７日目にＰＣ−３腫瘍を採取した。すべての実験操作は、動物飼育に関するカナダ協議会（Canadian Council on Animal Care）のガイドラインに従い、適切な施設認定を使用して行った。
【００６４】
ＰＣ−３細胞中の２’−ＭＯＥ修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの阻害増強。ノーザンブロット解析を使用して、従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理の、ＰＣ−３細胞中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ発現に対する作用を比較した。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方とも、ＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡを用量依存的かつ配列特異的に低下させた。５００nMのアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を使用すると、２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドは従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドより強力であり、ＰＣ−３細胞中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルの低下は８０％対４０％であった。
【００６５】
従来のホスホロチオエートと２’−ＭＯＥ修飾ＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドはインビトロでＰＣ−３細胞の化学感受性を同等に増強する。インビトロで細胞障害性を増強する従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を比較するために、ＰＣ−３細胞をいずれかのＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドで毎日１回２日間処理し、種々の濃度のパクリタキセルまたはドセタキセルを含有する培地でインキュベートした。４８時間インキュベート後、ＭＴＴ測定法により細胞の生存能力を測定した。結果は、両方のタイプのＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドが同等に、パクリタキセルとドセタキセルの化学感受性をそれぞれ７０％および５０％以上増強した。
【００６６】
２’−ＭＯＥ修飾によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの組織半減期の延長。ＣＧＥを使用して、ＰＣ−３腫瘍中の時間依存性アンチセンスオリゴヌクレオチド代謝を分析した。２’−ＭＯＥ修飾により、アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ組織半減期は、従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して５倍以上上昇した（＞５日対＜１日）。９０％の２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドが完全長物質として１週間で検出できたが、投与停止の１日後はわずかに１０％のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドのみが完全長物質として見いだされた。最後のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後５日目と７日目は、腫瘍組織中に完全長のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドは検出できなかった。さらに、インビボのＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡ発現は、この期間に、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用すると、より効率的に阻害された。
【００６７】
２’−ＭＯＥ修飾ＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドはインビボのパクリタキセルの力価を増強する。インビボでパクリタキセルの細胞障害性を増強する従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド対２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を比較するために、ＰＣ−３腫瘍を有する無胸腺マウスをＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで２８日間処理した。１０〜１４日および２４〜２８日に、０．５mgのポリマー性ミセルパクリタキセルを毎日１回静脈内注射した。治療の開始後７週までに、両方のタイプのＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＣ−３腫瘍中のパクリタキセル化学感受性を増強させた。２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドによる処理と比較して、従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（４０％）より、平均腫瘍容積を低下させるのに有意に強力であった（８０％を超える）。いずれの化合物にも副作用は観察されなかった。
【００６８】
インビボで２’−ＭＯＥ修飾ＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの毎週の投与は従来のホスホロチオエートＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドの毎日の投与と同等である。２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性の上昇とより長い組織半減期が、効力を低下させることなく投与間隔を延長できるかどうかを評価するために、ＰＣ−３腫瘍を有する無胸腺マウスを、毎日１回の従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して、毎週１回のＴＲＰＭ−２アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはミスマッチ対照オリゴヌクレオチドを用いて処理した。１０〜１４日および２４〜２８日に、０．５mgのポリマー性ミセルパクリタキセルを毎日１回静脈内注射した。パクリタキセルと組合せると、２’−ＭＯＥアンチセンスオリゴヌクレオチドの毎週の投与は、従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの毎日の投与と同等であり、治療の開始の６週間後に、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドの毎週の投与と比較して平均腫瘍容積を３１％低下させ、そして従来のホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドの毎週の投与と比較して平均腫瘍容積を２１％低下させた。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを使用して行われるアンドロゲン非依存性の開始の遅延を示す。
【図２】ＴＲＰＭ−２発現を阻害しアンドロゲン非依存性の開始を遅らせるために評価される１０個のアンチセンスオリゴヌクレオチドの位置を示す。
【図３】種々のアンチセンスＯＤＮの存在下でのＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡの発現レベルを示す。
【図４】種々の量のアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮまたはミスマッチ対照を用いてインビトロで処理したシオノギ細胞中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルを示す。
【図５】タキソールとアンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮの組合せの用量応答曲線を示す。
【図６】タキソール、アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮおよびアンチセンスＢｃｌ−２  ＯＤＮの組合せの用量応答曲線を示す。
【図７Ａ】アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理した後のヒト腎細胞癌中のＴＲＰＭ−２  ｍＲＮＡレベルの低下を示す。
【図７Ｂ】アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理した後の、タキソールに対するヒト腎細胞癌の化学感受性の上昇を示す。
【図８】種々の用量の放射線照射後のＰＣ−３前立腺癌細胞中のＴＲＰＭ−２発現を示す。
【図９Ａ】ＴＲＰＭ−２を過剰発現（ＬＮＣａＰ／Ｔ）し、かつ通常はこれを発現（ＬＮＣａＰ／Ｐ）するヒト前立腺細胞株の比較放射線抵抗性を示す。
【図９Ｂ】ＴＲＰＭ−２を過剰発現（ＬＮＣａＰ／Ｔ）し、かつ通常はこれを発現（ＬＮＣａＰ／Ｐ）するヒト前立腺細胞株の比較放射線抵抗性を示す。
【図１０】アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理後の、放射線に対するＰＣ−３細胞の感受性の上昇を示す。
【図１１Ａ】アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理後の、放射線に対するＰＣ−３細胞の感受性の上昇を示す。
【図１１Ｂ】アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮで処理後の、放射線に対するＰＣ−３細胞の感受性の上昇を示す。
【図１２Ａ】アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを投与した時の、化学療法剤パクリタキセルとミトキサントロンに対するシオノギ腫瘍細胞の感受性の上昇を示す。
【図１２Ｂ】アンチセンスＴＲＰＭ−２  ＯＤＮを投与した時の、化学療法剤パクリタキセルとミトキサントロンに対するシオノギ腫瘍細胞の感受性の上昇を示す。
【配列表】
2005530486.tif 000002
2005530486.tif 000003
2005530486.tif 000004
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【図１】
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【図２】
2005530486.tif 000008
【図３】
2005530486.tif 000009
【図４】
2005530486.tif 000010
【図５】
2005530486.tif 000011
【図６】
2005530486.tif 000012
【図７Ａ】
2005530486.tif 000013
【図７Ｂ】
2005530486.tif 000014
【図８】
2005530486.tif 000015
【図９Ａ】
2005530486.tif 000016
【図９Ｂ】
2005530486.tif 000017
【図１０】
2005530486.tif 000018
【図１１Ａ】
2005530486.tif 000019
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
2005530486.tif 000021
【図１２Ｂ】
2005530486.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成15年9月10日(2003.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT；配列番号４のオリゴヌクレオチドからなる化合物であって、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記化合物。
【請求項２】
腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてインビボでアンドロゲン感受性前立腺腫瘍細胞を処理することを含む、前立腺腫瘍細胞のアンドロゲン非依存性状態への進行を遅らせる方法であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４の配列を有し、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記方法。
【請求項３】
前立腺癌に罹っている個体でアンドロゲン離脱を開始して前立腺腫瘍細胞のアポトーシス性細胞死滅を誘導し、この個体に腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を投与し、こうして個体の前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性状態に進行するのを遅らせることを含む、前立腺癌に罹っている個体の前立腺癌を治療する方法であって、ＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４の配列を有し、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記方法。
【請求項４】
化学療法剤を個体に投与する工程をさらに含む、請求項３の方法。
【請求項５】
化学療法剤はタキサンまたはミトキサントロンである、請求項４の方法。
【請求項６】
ＴＲＰＭ−２以外の抗アポトーシスタンパク質の発現を阻害する第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドを個体に投与する工程をさらに含む、請求項３の方法。
【請求項７】
第２のアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンスＢｃｌ−２オリゴヌクレオチドである、請求項６の方法。
【請求項８】
個体に化学療法剤を投与する工程をさらに含む、請求項６の方法。
【請求項９】
化学療法剤はタキサンまたはミトキサントロンである、請求項８の方法。
【請求項１０】
腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物を個体に投与することを含む、同じ種類の正常組織とは異なる量でＴＲＰＭ−２を発現する癌に罹った個体の癌細胞の化学感受性または放射線感受性を増強する方法であって、ＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４の配列を有し、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記方法。
【請求項１１】
個体が罹っている癌は腎細胞癌と前立腺癌よりなる群から選択される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
癌細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物は、化学療法または放射線療法で細胞を処理する前に投与される、請求項１０の方法。
【請求項１３】
癌細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物は、化学療法または放射線療法で細胞を処理する間投与される、請求項１０の方法。
【請求項１４】
癌細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するのに有効な組成物が投与される期間内の２回の間に、細胞が化学療法剤で処理される、請求項１２の方法。
【請求項１５】
アンドロゲン感受性前立腺腫瘍細胞の集団を腫瘍細胞によるＴＲＰＭ−２の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することを含む、生きた前立腺腫瘍細胞がアンドロゲン感受性である状態から、生きた腫瘍細胞がアンドロゲン非依存性である状態への、前立腺腫瘍細胞の集団の進行を遅らせるであって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号４の配列を有し、オリゴヌクレオチドは全体にホスホロチオエート骨格を有し、ヌクレオチド１〜４と１８〜２１の糖残基は２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有し、残りのヌクレオチド（ヌクレオチド５〜１７）は２’−デオキシヌクレオチドであり、ヌクレオチド１、４および１９のシトシンは５−メチルシトシンである上記方法。
【国際調査報告】
2005530486.tif 000023