(57)【要約】骨の移植のための、多孔性β−リン酸三カルシウム材料が提供される。多孔性ＴＣＰ本体における複数の細孔は、別個の空隙であり、そして相互接続されていない。細孔サイズの直径は、２０〜５００μｍの範囲、好ましくは、５０〜１２５μｍの範囲である。多孔性β−ＴＣＰ材料は、生物活性剤のためのキャリアマトリクスを提供し、そして結合剤の添加の際に、成形可能なパテ組成物を形成し得る。好ましくは、この生物活性剤は、生分解性剤中にカプセル化される。本発明は、多孔性β−ＴＣＰ、ならびに生物活性剤および結合剤を含有する、キットおよび移植デバイスを提供する。本発明はまた、表面領域を有するプロテーゼ移植物、この表面領域に配置される多孔性β−ＴＣＰ材料であって、必要に応じて少なくとも１種の生物活性剤または結合剤を含有する、多孔性β−ＴＣＰ材料を備える、移植可能なプロテーゼデバイスを提供する。
2005505311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−ＴＣＰであって、該細孔は、２０〜５００μｍの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２】
複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−ＴＣＰであって、該細孔は、４１０〜４６０μｍの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項３】
複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−ＴＣＰであって、該細孔は、４０〜１９０μｍの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項４】
複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−ＴＣＰであって、該細孔は、２０〜９５μｍの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項５】
複数の細孔を含むβ−リン酸三カルシウムの多孔性本体を備える、多孔性β−ＴＣＰであって、該細孔は、５０〜１２５μｍの細孔直径サイズを有する、単一の別個の空隙である、多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項６】
前記β−リン酸三カルシウムが焼結されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項７】
前記β−ＴＣＰが顆粒であり、そして０．１〜２ｍｍの粒子サイズを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項８】
前記β−ＴＣＰが顆粒であり、そして０．５〜１．７ｍｍの粒子サイズを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項９】
前記β−ＴＣＰが顆粒であり、そして１〜１．７ｍｍの粒子サイズを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１０】
前記β−ＴＣＰが顆粒であり、そして０．５〜１．０ｍｍの粒子サイズを有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１１】
全孔隙率が５〜８０％の範囲である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１２】
全孔隙率が４０〜８０％の範囲である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１３】
全孔隙率が６５〜７５％の範囲である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１４】
全孔隙率が７０％である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１５】
生物活性剤をさらに含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１６】
前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項１５に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１７】
前記骨形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドルサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−β、および骨原性活性を有するこれらの保存的アミノ酸配列改変体からなる群より選択される、請求項１６に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１８】
前記生物活性剤が、ヒトＯＰ−１のＣ末端アミノ酸１０２〜１０６と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨原性タンパク質である、請求項１５に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項１９】
形態形成タンパク質刺激因子をさらに含有する、請求項１６に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２０】
前記形態形成タンパク質刺激因子が、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、成長および分化因子（ＧＤＦ）、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ビタミンＤ、レチン酸およびＩＬ−６からなる群より選択される、請求項１９に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２１】
前記生物活性剤が、骨形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項１５に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２２】
前記生物活性剤が、生分解性剤中にカプセル化されている、請求項１５に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２３】
前記生分解性剤が、エチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ（グラキサノン）、ポリ（ホスファゼン）、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）およびこれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、ポリエチレン−ｃｏ−フマレート、１種以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、生体活性ガラス組成物、これらの混合物ならびにこれらの誘導体および修飾物からなる群より選択される、請求項２２に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２４】
前記ＰＬＧＡが、５ｋＤ〜５００ｋＤの分子量を有する、請求項２３に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２５】
前記ＰＬＧＡが、１０ｋＤ〜３０ｋＤの分子量を有する、請求項２３に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２６】
前記生物活性剤が、同種移植片または自己移植片である、請求項１５に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項２７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰおよび結合剤を含有する、成形可能なパテ組成物。
【請求項２８】
前記結合剤が、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリラクトン、マンニトール、白色鉱油、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２７に記載の成形可能なパテ組成物。
【請求項２９】
前記フィブリン膠が、ヒトフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物である、請求項２８に記載の成形可能なパテ組成物。
【請求項３０】
生物活性剤をさらに含有する、請求項２７に記載の成形可能なパテ組成物。
【請求項３１】
キットであって、以下：
ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ；および
ｂ）生物活性剤、
を備える、キット。
【請求項３２】
前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記骨形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドルサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−β、および骨原性活性を有するこれらの保存的アミノ酸配列改変体からなる群より選択される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記生物活性剤が、ヒトＯＰ−１のＣ末端アミノ酸１０２〜１０６と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨原性タンパク質である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
形態形成タンパク質刺激因子をさらに備える、請求項３２に記載のキット。
【請求項３６】
前記形態形成タンパク質刺激因子が、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、成長および分化因子（ＧＤＦ）、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ビタミンＤ、レチン酸およびＩＬ−６からなる群より選択される、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
キットであって、以下：
ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の、多孔性β−ＴＣＰ；および
ｂ）結合剤、
を備える、キット。
【請求項３８】
前記結合剤が、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリラクトン、マンニトール、白色鉱油、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記フィブリン膠が、ヒトフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
移植可能なプロテーゼデバイスであって、以下：
ａ）標的組織に隣接して移植可能な表面領域を有する、プロテーゼ移植物；および
ｂ）該表面領域の上に配置された、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰ。
【請求項４１】
前記多孔性β−ＴＣＰ内に分散された生物活性剤をさらに備える、請求項４０に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項４２】
前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項４１に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項４３】
前記骨形成タンパク質が、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドルサリン−１、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−β、および骨原性活性を有するこれらの保存的アミノ酸配列改変体からなる群より選択される、請求項４２に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項４４】
前記生物活性剤が、ヒトＯＰ−１のＣ末端アミノ酸１０２〜１０６と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む骨原性タンパク質である、請求項４１に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項４５】
形態形成タンパク質刺激因子をさらに含有する、請求項４２に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項４６】
前記形態形成タンパク質刺激因子が、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、成長および分化因子（ＧＤＦ）、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ビタミンＤ、レチン酸およびＩＬ−６からなる群より選択される、請求項４５に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項４７】
前記生物活性剤が、骨形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項４１に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項４８】
前記生物活性剤が、生分解性剤中にカプセル化されている、請求項４１に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項４９】
前記生分解性剤が、エチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ（グラキサノン）、ポリ（ホスファゼン）、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）およびこれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、ポリエチレン−ｃｏ−フマレート、１種以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、生体活性ガラス組成物、これらの混合物ならびにこれらの誘導体および修飾物からなる群より選択される、請求項４８に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項５０】
前記ＰＬＧＡが、５ｋＤ〜５００ｋＤの分子量を有する、請求項４９に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項５１】
前記ＰＬＧＡが、１０ｋＤ〜３０ｋＤの分子量を有する、請求項４９に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項５２】
前記デバイスが、股関節部デバイス、融合ケージ、および顎顔面デバイスからなる群より選択される、請求項４０に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項５３】
結合剤をさらに含む、請求項４０に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項５４】
前記結合剤が、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリラクトン、マンニトール、白色鉱油、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項５３に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項５５】
前記フィブリン膠が、ヒトフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物である、請求項５４に記載のプロテーゼデバイス。
【請求項５６】
多孔性β−ＴＣＰ顆粒を製造する方法であって、以下：
（ａ）ＴＣＰ粉末を細孔形成剤と混合する工程；
（ｂ）顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程；
（ｃ）該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程；および
（ｄ）該顆粒を焼結して多孔性β−ＴＣＰを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
多孔性β−ＴＣＰ顆粒を製造する方法であって、以下：
（ａ）ＴＣＰ粉末を細孔形成剤と混合する工程であって、該細孔形成剤の割合が、３７．５重量％である、工程；
（ｂ）顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程；
（ｃ）該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程；および
（ｄ）該顆粒を焼結して多孔性β−ＴＣＰを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５８】
多孔性β−ＴＣＰ顆粒を製造する方法であって、以下：
（ａ）ＴＣＰ粉末を細孔形成剤と混合する工程；
（ｂ）顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程；
（ｃ）該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程であって、該篩が、５００〜１０００μｍまたは１０００〜１７００μｍの範囲の大きさである、工程；および
（ｄ）該顆粒を焼結して多孔性β−ＴＣＰを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５９】
多孔性β−ＴＣＰ顆粒を製造する方法であって、以下：
（ａ）ＴＣＰ粉末を細孔形成剤と混合する工程；
（ｂ）顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程；
（ｃ）該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程；
（ｄ）該顆粒を７００〜８００℃で気化させる工程；および
（ｅ）該顆粒を焼結して多孔性β−ＴＣＰを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項６０】
多孔性β−ＴＣＰ顆粒を製造する方法であって、以下：
（ａ）ＴＣＰ粉末を細孔形成剤と混合する工程；
（ｂ）顆粒化溶液を添加して、脆い塊を形成する工程；
（ｃ）該脆い塊を篩に通して、顆粒を形成する工程；および
（ｄ）該顆粒を、１０００〜１２００℃で焼結し、次いでゆっくりと冷却して、多孔性β−ＴＣＰを形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項６１】
前記細孔形成剤が、ポリアクリレートのプレポリマー、ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、メチルアクリレートおよびメチルメタクリレートのコポリマー、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、結晶性セルロース、繊維状セルロース、ポリウレタン、ポリエチレン、ナイロン樹脂およびアクリル樹脂からなる群より選択される、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記顆粒化溶液が、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルブチラールおよび酢酸酪酸セルロースからなる群より選択される化合物を含む、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記多孔性β−ＴＣＰが、形成後に再度篩分けされる、請求項５６〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、２０〜５００μｍの直径を有する、組成物。
【請求項６５】
リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、４１０〜４６０μｍの直径を有する、組成物。
【請求項６６】
リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、４０〜１９０μｍの直径を有する、組成物。
【請求項６７】
リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、２０〜９５μｍの直径を有する、組成物。
【請求項６８】
リン酸三カルシウム粉末および細孔形成剤を含有する組成物であって、該細孔形成剤が、５０〜１２５μｍの直径を有する、組成物。
【請求項６９】
前記細孔形成剤の割合が、３０〜４０重量％である、請求項６４〜６８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
哺乳動物において骨形成を誘導する方法であって、該哺乳動物の欠損部位に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰを含有する組成物を移植する工程を包含する、方法。
【請求項７１】
前記組成物が、生物活性剤をさらに含有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記組成物が、結合剤をさらに含有する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
骨形成を必要とする部位において、生物活性剤を送達する方法であって、哺乳動物の欠損部位において、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性β−ＴＣＰおよび生物活性剤を含有する組成物を移植する工程を包含する、方法。
【請求項７５】
前記生物活性剤が、骨形成タンパク質である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記生物活性剤が、生分解性剤中にカプセル化されている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記生物活性剤の送達が、徐放性である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記生物活性剤が、骨形成タンパク質をコードする配列を含む核酸分子である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
軟骨形成を必要とする部位において、生物活性剤を送達する方法であって、哺乳動物の欠損部位において、生物活性剤および生分解性剤を含有する組成物を移植する工程を包含し、該生分解性剤は、２０〜５００μｍの粒子サイズを有し、該生物活性剤は、該生分解性剤中にカプセル化されている、方法。
【請求項８０】
生分解性剤中にカプセル化された生物活性剤を含有する組成物であって、該生分解性剤が、２０〜５００μｍの粒子サイズを有する、組成物。
【請求項８１】
生分解性剤中にカプセル化された生物活性剤を含有する組成物であって、該生分解性剤が、２０〜１４０μｍの粒子サイズを有する、組成物。
【請求項８２】
生分解性剤中にカプセル化された生物活性剤を含有する組成物であって、該生分解性剤が、７５〜１４０μｍの粒子サイズを有する、組成物。
【請求項８３】
前記生分解性剤が、エチレンビニルアセテート、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ（グラキサノン）、ポリ（ホスファゼン）、ポリグラクチン、ポリグラクチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−トリメチレンカーボネート）、ポリアリーレート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−ｃｏ−イミド）およびこれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、ポリエチレン−ｃｏ−フマレート、１種以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、生体活性ガラス組成物、これらの混合物ならびにこれらの任意の誘導体および修飾物からなる群より選択される、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記ＰＬＧＡが、５ｋＤ〜５００ｋＤの分子量を有する、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
前記ＰＬＧＡが、１０ｋＤ〜３０ｋＤの分子量を有する、請求項８３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
ヒト体内の骨組織は、身体結合組織質量の最も大部分を構成する。しかし、他の結合組織とは異なり、そのマトリクスは、組織化コラーゲン構造中に分散されたヒドロキシアパタイトと呼ばれる基本的な炭酸塩含有リン酸カルシウムの、生理学的に石灰化された小さな結晶子（クリスタライト）からなる。この組織の修復は、足場の形成、ならびに欠損の石灰化、続く本来の構造に達するための欠損部位の最終的な再構築に向かって方向付けられた、多数の細胞内機能にかかわる複雑なプロセスである。
【０００２】
生体材料に基づくリン酸カルシウムの移植は、一般的に適合性があり、そして、骨修復を助長することが見出されている。骨修復は、リン酸カルシウムに関連する多くの物理化学的可変物（例えば、リン酸に対するカルシウムのモル比に）により影響される。ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムは、骨移植において広範に使用される。ヒドロキシアパタイトは、化学式Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２を有し、そして、リン酸に対するカルシウムの比率は、約１．６７である。リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）は、式Ｃａ３（ＰＯ４）２を有し、そして、リン酸に対するカルシウムの比率は、約１．５である。リン酸三カルシウムは、非反応性および再吸収可能という生物学的特性を有する。このリン酸三カルシウムは、骨内殖のための足場として機能し、そして、骨による進行性の分解および置換を起こす（Ｌａｎｇｅら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６，４６７頁〜４７２頁（１９８６））。ＴＣＰは、ヒドロキシアパタイトよりも１０〜２０倍速く分解される。ＴＣＰ移植は、一般的に、骨形成の最終段階の間に、ヒドロキシアパタイトよりも優れた再構築を生じる。ＴＣＰは破骨細胞により再吸収される一方、ヒドロキシアパタイトの非常に遅い再吸収は、異物巨細胞により主に引き起こされるということは、注目すべきことである。巨細胞は、この巨細胞が再吸収するヒドロキシアパタイトの量に関して、限界を有する。
【０００３】
多孔性セラミック材料は、骨移植のためのマトリクスとして、しばしば選択される。このような材料が移植部位に包埋される場合、この多孔性材料は、孔を浸潤する骨溶解性細胞によって再吸収される。同時に、骨組織は、骨芽細胞によって再生される。特定の孔の大きさは、移植材料の孔に浸潤するために、骨芽細胞にとって必要とされる。パラメーター（例えば、移植される材料の結晶化度、溶解度、粒子の大きさ、多孔性、孔構造および孔の大きさ）は、骨適合性および骨統合に非常に影響し得る。上記のパラメーターの不適切な組合せは、不適切な骨修復を引き起こし得る。
【０００４】
骨置換のための移植可能な固体材料としての、通気孔を有する多孔性セラミックの使用は、記載されている（例えば、米国特許第５，１７１，７２０号を参照のこと；Ｆｒａｙｓｓｉｎｅｔら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１４  ４２３頁〜４２９頁（１９９３）もまた参照のこと）。しかし、このような多孔性セラミックは、脆性であり、そして、手術中に開業医によって容易に成形され得ない。
【０００５】
セラミック材料の過度に大きい孔の大きさおよび高い多孔性は、過剰な再吸収速度を引き起こし得、従って、マトリクスが、新しく合成された骨に足場を提供することを防ぐ。再吸収速度が骨増殖速度よりも速い場合、このことは、しばしば、炎症応答を引き起こし得る。セラミック材料の小さい孔の大きさおよび低い多孔性は、低い再吸収速度を引き起こし、これは、新しい骨中でのマトリクス粒子のカプセル化を生じる。
【０００６】
従って、欠損部位に適用され得、そして、再生プロセスを非常に増強し得る生体材料を同定することが、特に、他の生物活性剤（例えば、骨形成タンパク質および他の関連因子）とともに使用される場合、所望される。さらに、生物活性剤に対して機械的に耐久性のあるキャリアとして作用し、そして、治療を支持する、非常に耐性な骨置換材料であるマトリクスを同定し、そして使用することが所望される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、生体の骨組織の再生を改善するための組成物、細孔サイズ、多孔度および顆粒サイズを有する、多孔性のセラミック材料を同定すること、ならびにヒトまたは動物における骨欠損を修復することによって、これらの問題を解決する。本発明は、骨インプラント適用における使用のための多孔性のβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）材料を提供する。本発明は、多孔性形態のβ−ＴＣＰ顆粒を提供し、このβ−ＴＣＰ顆粒は、生体適合性であり、かつその構造形態の全体にわたって新しい骨の発生を支援する。
【０００８】
本発明はまた、骨伝導性を改善するために、形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ）の存在または非存在において生物活性剤（例えば、抗生物質、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）またはＢＭＰをコードする配列を含む核酸分子）を有する多孔性のβ−ＴＣＰを含む組成物を提供する。好ましい実施形態において、この生物活性剤は、生分解性剤にカプセル化されている。好ましくは、生分解因子の粒径は、２０〜５００μｍである。この多孔性のβ−ＴＣＰ材料または多孔性β−ＴＣＰ／生物活性剤混合物はまた、インプラント部位において成形する準備のための鋳造可能なパテ組成物を形成するためのバインダーと合わせて使用され得る。本発明はまた、多孔性のβ−ＴＣＰ、および少なくとも１つ以上のさらなる構成要素（生物活性剤およびバインダーを含む）を含むキットを提供する。
【０００９】
別の局面において、本発明はまた、多孔性のβ−ＴＣＰ材料を含み、そして必要に応じて１つ以上のさらなる構成要素（ＢＭＰのような生物活性剤、抗生物質、またはバインダーを含む）を含むインプラント可能なデバイスを提供する。本発明はまた、多孔性のβ−ＴＣＰ材料を含み、そして必要に応じて１つ以上のさらなる組成物（ＢＭＰのような生物活性剤、抗生物質、またはバインダーを含む）を含むインプラント可能なプロテーゼデバイスを提供する。多孔性のβ−ＴＣＰおよびＢＭＰを含むプロテーゼデバイスまたはインプラント可能なデバイスは、必要に応じてＭＰＳＦを含み得る。
【００１０】
本発明の他の目的は、多孔性β−ＴＣＰ材料を生成する方法を提供することである。この方法は、ＴＣＰ粉末を細孔形成剤と混合する工程、脆い塊を形成するための顆粒化溶液を加える工程、顆粒を形成するためにシーブを通して脆い塊を透過させる工程および、多孔性のβ−ＴＣＰを形成するために顆粒を燒結する工程を包含する。
【００１１】
本発明はまた、哺乳動物において骨形成を誘導する方法を提供し、この方法は、哺乳動物の欠損部位に、多孔性のβ−ＴＣＰならびに必要に応じてバインダーおよび／または生物活性剤を含む組成物を移植する工程を包含する。本発明は、骨形成を必要とする部位に生物活性剤を送達する方法を記載し、この方法は、哺乳動物の欠損部位に、多孔性のβ−ＴＣＰおよび生物活性剤を含む組成物を移植する工程を包含し、ここで、生物活性剤は、必要に応じて生分解性剤にカプセル化される。本発明はまた、軟骨形成を必要とする部位に生物活性剤を送達する方法を記載し、この方法は、哺乳動物の欠損部位に、生物活性剤および生分解性剤を含む組成物を移植する工程を包含し、ここで、生物活性剤は、生分解性剤にカプセル化される。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される発明が完全に理解されるために、以下の詳細な説明を示す。
【００１３】
「アミノ酸配列相同性」は、アミノ酸配列の同一性および類似性の両方を含むことが理解される。相同な配列は、同一および／または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで類似残基は、整列した参照配列中の対応するアミノ酸残基に対して保存的置換であるか、または整列した参照配列中の対応するアミノ酸残基の「許容された点変異」である。従って、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、任意の７０％の整列した残基が、参照配列中の対応する残基と同一であるか、または参照配列中の対応する残基の保存的置換であるペプチド配列である。特に好ましい形態形成のペプチドは、Ｃ末端の１０２から１０６アミノ酸（これは、ヒトＯＰ−１、ＢＭＰ−２および関連タンパク質の保存された７つのシステインドメインを定義する）と少なくとも６０％、そして好ましくは７０％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００１４】
アミノ酸配列相同性は、当該分野で周知の方法によって決定され得る。例えば、７つのシステインドメインの配列に対する候補アミノ酸配列の相同性パーセントを決定するために、２つの配列は初めに整列される。このアライメントは、例えば、ｔｈｅ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｉｎ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，ｐｐ．４４３（１９７０）およびＡｌｉｇｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．によって生産される市販のソフトウェアパッケージ）を用いて作成され得る。両方の供給源による教示は、本明細書中に参考として援用される。開始アライメントを、関連タンパク質のファミリーの複数配列アライメントとの比較によって精緻化し得る。一旦アライメントを作成し、そして精緻化すると、相同性パーセントスコアを、計算する。続いて、２つの配列の整列したアミノ酸残基をお互いの類似性について比較する。類似性因子は、類似の大きさ、形および電荷が挙げられる。アミノ酸類似性を決定する特に好ましい方法の１つは、Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５，ｐｐ．３４５−３５２（１９７８  ＆  Ｓｕｐｐ．）（これは、本明細書中で参考として援用される）中に記載されるＰＭＡ２５０マトリクスである。類似性スコアを、整列したペアのアミノ酸類似性スコアの合計として初めに計算する。挿入および欠損を、相同性パーセントおよび同一性パーセントの目的のために無視する。従って、ギャップペナルティーをこの計算において使用しない。次いで、未加工スコアを、候補配列および７つのシステインドメインの幾何学的平均スコアによる分離によって正規化する。幾何学的平均は、これらのスコアの産物の平方根である。正規化した未加工スコアは、相同性パーセントである。
【００１５】
「生体適合性」とは、身体の種々の防御系（例えば、細胞性免疫応答および体液性免疫応答（例えば、炎症性応答および外来性の身体繊維症性応答））に関連する有害な効果を誘発しない材料をいう。この用語「生体適合性」はまた、その材料が患者内に移植された場合に、所望でない細胞傷害性または全身性の効果がその材料によって全く引き起こされないことを、意味する。
【００１６】
「結合剤（ｂｉｎｄｅｒ）」とは、骨原性タンパク質および／または多孔性マトリクスと混合された場合に骨形成を促進する、任意の生体適合性材料をいう。特定の好ましい結合剤は、標準的な骨原性デバイスよりも、少ない量の骨原性タンパク質を使用してこのような修復を促進する。他の好ましい結合剤は、標準的な骨原性デバイスと、同じ量の骨原性タンパク質を使用して修復を促進し得、いくつかは、修復を促進するために、より多くの骨原性タンパク質を必要とする。本明細書中に教示されるように、当業者は、単なる慣用的な実験を使用して、任意の適切な結合剤と共に使用するためのタンパク質の有効量を決定し得る。好ましい結合剤の他の特徴としては、デバイスに、とりわけ、以下を付与する能力である：柔軟性、成形性および／または可鍛性；注入性；骨、軟骨、筋肉および他の組織に対する接着性；手術中の洗浄時および／または灌流時の崩壊に対する耐性；ならびに手術中、縫合中および術後の取り外れに対する耐性。さらに、特に好ましい実施形態において、結合剤は、低い割合で存在する場合に、上記の特徴および利点を達成し得る。
【００１７】
「生分解性剤」とは、吸収可能な生体適合性の材料（例えば、移植部位で徐々に分解する材料）をいう。この材料は、生理活性因子をカプセル化し得、その生理活性因子の時限放出送達または持続放出送達を提供する。生分解性の材料には、天然ポリマーおよび合成ポリマーが包含される。生分解性の材料の例は、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびこれらのコポリマーである。
【００１８】
「骨」とは、主に、ヒドロキシアパタイトの形態の沈着されたカルシウムおよびリン酸の複合体、コラーゲン（主に、Ｉ型コラーゲン）ならびに骨細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞）を含む、石灰化（鉱化）された結合組織、ならびに、実際の軟骨内骨の内側で形成される、骨髄組織をいう。骨組織は、他の組織（軟骨組織を含む）とは有意に異なる。特に、骨組織は、細胞および二相性媒体から構成される血管化された組織であり、この二相性媒体は、鉱化された無機成分（主に、ヒドロキシアパタイト結晶）および有機成分（主に、Ｉ型コラーゲン）を含む。グリコサミノグリカンは、この有機成分の２％未満ならびにこの二相性媒体自体または骨組織自体の１％未満を構成する。さらに、軟骨組織と比較して、骨組織に存在するコラーゲンは、高度に組織化された平行な配置で存在する。骨の欠損は、変性性、外傷性または癌性の病因に関係なく、再建手術に困難な問題を引き起こす。哺乳動物の関節に生じるような多組織複合体の一部を含む骨格部分の再生または修復は、特に困難である。
【００１９】
「骨形成」は、軟骨内骨の形成または膜内骨の形成を意味する。ヒトにおいて、骨形成は、胎児発生の最初の６〜８週間の間に開始する。間葉系起源の前駆幹細胞が、所定の部位に移動し、ここで、これらの幹細胞が、（ａ）凝縮し、増殖し、そして骨形成細胞（骨芽細胞）に分化するか（頭蓋において観察される、「膜内骨形成」と呼ばれるプロセス）、または（ｂ）凝縮し、増殖し、そして中間体として軟骨形成細胞（軟骨芽細胞）に分化し、その後、骨形成細胞に置換される。より詳細には、間葉系幹細胞は、軟骨細胞に分化する。次いで、これらの軟骨細胞が、石灰化され、肥大し、そして、ここでその部位に存在する、分化された骨芽細胞によって作製された、新しく形成された骨によって置換される。その後、この鉱化された骨が、広範に再構築され、その後、機能的な骨髄要素が満たされた小骨に占有される。このプロセスは、長骨において観察され、「軟骨内骨形成」といわれる。出生後、骨は、胎児の軟骨内骨発生の細胞プロセスを模倣することによって、損傷時にそれ自体を修復する能力を有する。つまり、骨髄、骨膜および筋肉由来の間葉系前駆幹細胞は、欠損部位に移動し、そして上記事象のカスケードを開始するよう誘導され得る。ここで、これらは、蓄積し、増殖し、そして軟骨に分化し、その後、軟骨は、新しく形成された骨と置換される。
【００２０】
「骨形成タンパク質（ＢＭＰ）」とは、ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の相同性に基づいてＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰファミリーのタンパク質（ＢＭＰファミリー）に属するタンパク質をいう。タンパク質は、そのタンパク質が、ＢＭＰタンパク質ファミリーを特徴付ける保存されたＣ末端システインリッチドメイン内で、少なくとも１つの公知のＢＭＰファミリーメンバーと、少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する場合に、本発明に従うＢＭＰファミリーに属する。ＢＭＰファミリーのメンバーは、全体で５０％未満のＤＮＡ配列同一性またはアミノ酸配列同一性を有してもよい。
【００２１】
「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する残基である。つまり、保存的置換およびその参照残基は、類似のサイズ、形状、電荷、化学特性（共有結合または水素結合を形成する能力を含む）などを有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら、前出における受け入れられた点変異について規定された基準を満たす置換である。保存的置換の例は、以下のグループ内の置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、トレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。用語「保存的改変体」または「保存的改変」はまた、親アミノ酸配列に特異的な抗体が、得られた置換ポリペプチド配列にも特異的である（すなわち、「交差反応」または「免疫反応」する）、その所定の親アミノ酸配列におけるアミノ酸残基に代わる置換アミノ酸残基の使用を含む。
【００２２】
「欠損」または「欠損部位」は、骨、関節、軟骨または靭帯の修復、構築、融合、再生または増強を必要とする部位をいう。この部位は、整形外科的な構造上の破壊または異常であり得るか、または骨が正常に成長しない部位であり得る。この欠損は、骨およびその上に存在する軟骨の両方の構造破壊を含む骨軟骨性欠損をさらに規定し得る。欠損は、「間隙」の構成をとり得、これは、三次元欠損（例えば、隙間、管腔、穴、または骨もしくは関節の構造的完全性における他の実質的な破壊）を意味することが理解される。欠損は、事故、疾患、外科的処置および／またはプロテーゼの不具合の結果であり得る。特定の実施形態において、この欠損は、内因性または自然発生的な修復を行い得ない容量を有する間隙である。長骨におけるこのような欠損は、被験体の骨の直径のほぼ２倍であり、「臨界サイズ」欠損とも呼ばれる。例えば、イヌ尺骨欠損モデルにおいて、従来技術は、このような欠損を約３〜４ｃｍであると認識する。一般に、臨界サイズ欠損は、約１．０ｃｍであり、自然修復し得ない。例えば、Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０５，ｐｐ．２９９−３０８（１９８６）；およびＶｕｋｉｃｅｖｉｃら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，ｐｐ．２０７−２２４（１９９３）（ＪＡＩ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。ウサギおよびサルの分節性欠損モデルにおいて、その隙間は、それぞれ、約１．５ｃｍおよび２．０ｃｍである。他の実施形態において、この欠損は、非臨界サイズの分節性欠損である。一般に、これらは自然修復し得る。特定の他の実施形態において、この欠損は、骨軟骨性プラグのような骨軟骨性欠損である。このような欠損は、上に存在する軟骨全体を横切り、そして少なくとも部分的に、下に存在する骨構造に侵入する。対照的に、軟骨または肋軟骨下の欠損は、それぞれ、部分的または全体的に、上に存在する軟骨を横切るが、下に存在する骨には関与しない。本発明を使用して修復され易い他の欠損としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：非癒着骨折；骨管腔；腫瘍切除；新たな骨折（伸延されているかまたはされていない）；例えば、顔面床再構築、特に、眼窩床再構築、顎堤もしくは洞の増強、歯周欠損および抜歯槽における頭側、顎顔面側および顔面側の異常；頭蓋形成、頤形成、下顎増強、口蓋再構成および他の大骨再構築；顎椎、胸椎および腰椎における椎骨形成、椎体間融合、ならびに胸椎および腰椎における後外側融合；骨再生についての骨髄炎において；四肢融合、足根関節融合、全股関節部、膝および関節の融合または関節形成；腱および／または靱帯組織欠損（例えば、膝の前靱帯、後靱帯、外側靱帯および内側靱帯、膝蓋骨およびアキレス腱など）の矯正；ならびに疾患（例えば、癌、関節炎（変形性関節症を含む）、および他の骨変性障害（例えば、離断性骨軟骨炎））から生じる欠損。
【００２３】
「顆粒化溶液」とは、特定の程度のコンシステンシーおよび粘着性を有し、顆粒の形成を促進する溶液をいう。
【００２４】
「形態形成タンパク質」とは、形態形成活性を有するタンパク質をいう（以下を参照のこと）。好ましくは、本発明の形態形成タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属する少なくとも１つのポリペプチドを含む。形態形成タンパク質は、局所環境の合図に依存して、前駆細胞を増殖するように誘導し得るか、そして／または、軟骨、骨、腱、靱帯、神経もしくは他の型の組織形成を導く分化経路に入るように誘導し得、従って、形態形成タンパク質は、異なる環境下で様々にふるまい得る。例えば、骨原性タンパク質は、ある処置部位で骨組織を誘導し得、そして異なる処置部位で神経組織を誘導し得る。
【００２５】
「形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ）」とは、形態形成タンパク質が前駆細胞から組織形成を誘導する能力を刺激し得る因子をいう。ＭＰＳＦは、形態形成タンパク質誘導活性の増強に対して直接的または間接的な効果を有し得る。ＭＰＳＦは、活性化を誘導する形態形成タンパク質を増強する直接的または間接的な効果を有し得る。例えば、ＭＰＳＦは、別のＭＰＳＦの生理活性を増強し得る。ＭＰＳＦの生理活性を増強する因子としては、例えば、ＭＰＳＦの合成、半減期、他の生体分子（例えば、結合タンパク質および結合レセプター）との反応性、またはバイオアベイラビリティーを増強する因子が挙げられる。
【００２６】
「骨原性タンパク質（ＯＰ）」とは、前駆細胞が軟骨および／または骨を形成するのを誘導し得る、形態形成タンパク質をいう。骨は、膜内骨または軟骨内骨であり得る。多くの骨原性タンパク質は、ＢＭＰタンパク質ファミリーのメンバーであり、従ってＢＭＰでもある。本明細書中、他で記載されるように、このクラスのタンパク質は、ヒト骨原性タンパク質（ｈＯＰ−１）によって代表される。本発明の実施において有用な他の骨原性タンパク質としては、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＤＰＰ、Ｖｇ１、Ｖｇｒ、６０Ａタンパク質、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１５、ＵＮＩＶＩＮ、ＮＯＤＡＬ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰまたはＮＥＵＲＡＬの骨原性活性形態、およびそれらのアミノ酸配列改変体が挙げられる。１つの現在好ましい実施形態において、骨原性タンパク質としては、以下のいずれか１つが挙げられる：ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ならびにそれらのアミノ酸配列改変体およびホモログ（その種ホモログを含む）。特に好ましい骨原性タンパク質は、ヒトＯＰ−１、ＢＭＰ−２および関連するタンパク質のＣ末端１０２−１０６アミノ酸（保存された７つのシステインドメインを規定する）と少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。本発明の特定の好ましい実施形態は、骨原性タンパク質ＯＰ−１を含む。本明細書中、他でさらに記載されるように、本発明との使用に適切な骨原性タンパク質は、ＲｅｄｄｉおよびＳａｍｐａｔｈ（Ｓａｍｐａｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４、７１０９−１３頁（本明細書中で参考として援用される））によって記載される当該分野で認識されているバイオアッセイを使用する、慣用的な実験手段によって同定され得る。
【００２７】
本発明において有用なタンパク質としては、骨原性タンパク質として同定された真核生物タンパク質（米国特許第５，０１１，６９１号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）（例えば、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３およびＣＢＭＰ−２タンパク質）、ならびにアミノ酸配列関連タンパク質（例えば、ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇ１（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＧＤＦ−１（ヒト由来、Ｌｅｅ、ＰＮＡＳ、８８、４２５０−４２５４頁（１９９１）を参照のこと）、６０Ａ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来、Ｗｈａｒｔｏｎら、ＰＮＡＳ、８８、９２１４−９２１８頁（１９９１）を参照のこと）、ｄｏｒｓａｌｉｎ−１（ニワトリ由来、Ｂａｓｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７３、６８７−７０２頁（１９９３）およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１２０３２を参照のこと）およびＧＤＦ−５（マウス由来、Ｓｔｏｒｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８、６３９−６４３頁（１９９４）を参照のこと））が挙げられる。上記の参考文献の教示は、本明細書中に参考として援用される。ＢＭＰ−３もまた、好ましい。さらなる有用なタンパク質としては、米国特許第５，０１１，６９１号（本明細書中に参考として援用される）に開示される、生合成性の形態形成構築物（例えば、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７およびＣＯＰ−１６）ならびに当該分野で公知の他のタンパク質が挙げられる。なお他のタンパク質としては、以下の形態形成活性形態が挙げられる：ＢＭＰ−３ｂ（Ｔａｋａｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２１９，６５６−６６２頁（１９９６）を参照のこと）、ＢＭＰ−９（ＷＯ９５／３３８３０を参照のこと）、ＢＭＰ−１５（ＷＯ９６／３５７１０を参照のこと）、ＢＭＰ−１２（ＷＯ９５／１６０３５を参照のこと）、ＣＤＭＰ−１（ＷＯ９４／１２８１４を参照のこと）、ＣＤＭＰ−２（ＷＯ９４／１２８１４を参照のこと）、ＢＭＰ−１０（ＷＯ９４／２６８９３を参照のこと）、ＧＤＦ−１（ＷＯ９２／００３８２を参照のこと）、ＧＤＦ−１０（ＷＯ９５／１０５３９を参照のこと）、ＧＤＦ−３（ＷＯ９４／１５９６５を参照のこと）およびＧＤＦ−７（ＷＯ９５／０１８０２を参照のこと）。上記の参考文献の教示は、本明細書中に参考として援用される。
【００２８】
「修復」は、欠損部の空隙または構造的不連続性を少なくとも部分的に充填するのに十分な、新しい骨および／または軟骨の形成を意味する。しかし、修復は、欠損をその欠損前の生理学的／構造的／機械的状態に回復するのに１００％効果的である完全な治癒のプロセスまたは処置を意味せず、またその必要もない。
【００２９】
「相乗的相互作用」とは、２以上の因子の合わせた効果が、それらの個々の効果の数的合計よりも多い、相互作用をいう。
【００３０】
（多孔性β−ＴＣＰ）
本発明は、ヒトまたは動物における欠損部位での骨形成、骨再生および骨修復に適切な細孔サイズおよび粒子サイズを有する、多孔性β−ＴＣＰを提供する。本発明に記載される多孔性β−ＴＣＰ本体は、多くの細孔を有するβ−ＴＣＰを含む。各細孔は、壁によって分けられた単一の別々の空隙であり、相互連絡されていない。本発明の多孔性β−ＴＣＰ自体は、隣接する細孔の間に毛細系の空隙路または相互連絡を含む、海綿状または開窓状の構造とは異なる。本発明の多孔性β−ＴＣＰの細孔直径は、２０〜５００μｍの範囲である。１つの実施形態において、細孔直径は、４１０〜４６０μｍの範囲である。好ましい実施形態において、細孔直径は、４０〜１９０μｍである。別の実施形態において、細孔直径は、２０〜９５μｍの範囲である。より好ましい実施形態において、細孔直径は、５０〜１２５μｍの範囲である。これらの細孔は、β−ＴＣＰ材料が生体内に包埋された場合に、浸潤する骨溶解細胞および骨芽細胞のための滞留空間を提供する。１つの実施形態において、細孔は、球形であり、かつ均一に分布している。２０〜５００μｍの範囲の直径を有する球形の細孔が、骨芽細胞浸潤に適切である。球形の細孔はまた、その多孔性の本体に、新しい骨が合成されている期間中に必要な機械的強度を提供し、従って、この期間中の骨折を防止する。
【００３１】
リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）は、Ｃａ３（ＰＯ４）２の式を有し、そのＣａ／Ｐ比は、約１．５である。ＴＣＰ粉末は、アパタイト結晶構造を有する。焼結時に、このアパタイト構造は、ひし形のβ−ＴＣＰ構造に変換する。高温で、準安定なα−ＴＣＰ構造もまた形成し得る。α−ＴＣＰは、過度の可溶性を有することが公知であり、このことは、吸収の速度が硬組織による置換速度に相補的であることを可能にしない。さらに、α−ＴＣＰは、有害な炎症性応答を生じ得る。好ましい実施形態において、ＴＣＰは、１１００〜１２００℃の高温で焼結される。１３００℃より上では、ＴＣＰは、準安定なα−ＴＣＰに変換される。ＴＣＰの焼結は、体液中でのその可溶性を減少し、これは、その化学活性における、その対応する減少を導き、その結果、多孔性ＴＣＰは、身体中で十分に許容され、急性の炎症反応は回避される。従って、多孔性β−ＴＣＰは、好ましく焼結される。より好ましくは、β−ＴＣＰは、９５〜１００％純粋のβ−ＴＣＰを含む。
【００３２】
本発明の多孔性β−ＴＣＰ材料は、任意の形状およびサイズを有し得る。一つの実施形態において、多孔性β−ＴＣＰは、顆粒状であり、そして０．１ｍｍ〜２ｍｍの間の粒子サイズを有する。好ましい実施形態において、この粒子サイズは、０．５ｍｍ〜１．７ｍｍである。より好ましい実施形態において、この粒子サイズは、１．０ｍｍ〜１．７ｍｍである。最も好ましい実施形態において、この粒子サイズは、０．５ｍｍ〜１ｍｍである。０．１ｍｍ未満の顆粒サイズを有するβ−ＴＣＰは、適切ではない。なぜならば、これは、流れる体液によって容易に排出されるからである。一方、骨形成は、より大きな粒子においてより明白であるが、２ｍｍよりも大きな顆粒サイズを有するβ−ＴＣＰもまた、適切ではない。なぜならば、多すぎる間隙または過剰に大きな間隙が、顆粒間に形成し、これにより、新しく合成された骨へのβ−ＴＣＰの効率的な結合が妨げられるからである。
【００３３】
β−ＴＣＰの多孔性は、再吸収の速度に影響を与える。この多孔性が高すぎると、この顆粒の強度が下がる。この多孔性が低すぎると、再吸収の速度が下がる。全孔隙率を、水銀侵入パラメーター法（ｍｅｒｃｕｒｙ  ｉｎｔｒｕｓｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）または同様の方法を使用して測定する。一つの実施形態において、この全孔隙率は、５％〜８０％の範囲である。別の実施形態において、この全孔隙率は、４０％〜８０％の範囲である。より好ましい実施形態において、この全孔隙率は、６５％〜７５％である。最も好ましい実施形態において、この全孔隙率は、７０％である。
【００３４】
本発明の多孔性β−ＴＣＰはまた、１種以上の生物活性剤とともに合わされ得る。この生物活性剤は、骨の増殖を増強する薬剤もしくは医学的に有用である物質、またはそれらの組み合わせであり得る。この生物活性剤としては、以下が挙げられ得るがこれらに限定されないことが想定される：骨形成タンパク質、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、サイトカイン、ＭＰＳＦ、ホルモン、ペプチド、脂質、栄養剤、治療組成物（例えば、抗生物質および化学療法剤）、インスリン、化学誘引物質、化学走性因子、酵素、酵素インヒビター。生物活性剤（例えば、ビタミン、細胞骨格剤）、軟骨フラグメント、同種移植片、自家移植片、生細胞（例えば、軟骨細胞、骨髄細胞、間葉腫幹細胞）、組織移植片、免疫抑制剤が、多孔性β−ＴＣＰに添加され得ることもまた、想定される。
【００３５】
一つの実施形態において、この生物活性剤は、骨形成タンパク質である。好ましい実施形態において、この骨形成タンパク質は、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドルサリン−１（ｄｏｒｓａｌｉｎ−１）、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、およびＴＧＦ−βである。より好ましい実施形態において、この骨形成タンパク質は、ＯＰ−１である。
【００３６】
別の実施形態において、この骨形成タンパク質の形態形成活性は、ＭＰＳＦの添加によって増強される。好ましい実施形態において、このＭＰＳＦは、インスリン様増殖因子  Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、成長および分化因子（ＧＤＦ）、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ビタミンＤ、レチン酸およびＩＬ−６からなる群から選択される。好ましい実施形態において、このＭＰＳＦは、ＩＧＦ−１、ＩＬ−６、ＦＧＦ、ＰＴＨから選択される。より好ましい実施形態において、このＭＰＳＦは、ＩＧＦ−１である。
【００３７】
別の実施形態において、この生物活性剤は、好ましくは、抗菌剤または抗生物質であり、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：エリスロマイシン、バシトラシン、ネオマイシン、ペニシリン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、バイオマイシン、クロロマイセチンおよびストレプトマイシン、セファゾリン、アンピシリン、アザクタム、トブラマイシン、クリンダマイシンならびにゲンタマイシン。使用される抗生物質の濃度は、当該分野で周知である。このような抗生物質は、公知であり、そして骨セメント物質と組み合わせて使用される。例えば、Ｈｏｆｆら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｑ．、６３Ａ、７９８頁、（１９８１）；およびＤｕｅｌａｎｄら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．、１６９、２６４−２６８頁、（１９８２）を参照のこと。これらの２つの参考文献の開示は、本明細書中で参考として援用されている。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、この生物活性剤は、修復細胞である。好ましい実施形態において、この修復細胞は、哺乳動物の細胞、より好ましくは、修復または再構築される組織の細胞と同一の型のヒト細胞である。修復細胞の適切な例としては、骨細胞（ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌ）（例えば、骨髄幹細胞、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞、破骨細胞、および骨前駆体細胞）が挙げられる。別の実施形態において、この細胞は、ＢＭＰをコードする核酸分子でトランスフェクトされる。
【００３９】
なお別の好ましい実施形態において、この生物活性剤は、ＢＭＰをコードする配列、好ましくは、ＯＰ−１（配列番号１０）を含む、核酸分子である。好ましい実施形態において、この核酸分子は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子にである。このＢＭＰをコードする核酸配列は、組換え発現ベクターに挿入され得る。ベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＨ７１７、ｐＨ７３１、ｐＨ７５２、ｐＨ７５４およびｐＷ２４が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＰ６ベクターは、ＲＮＡのインビトロ転写のために使用され得る。ＢＭＰを発現するために有用な転写プロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルスプロモーター（ＡｄＭＬＰ）、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター（ｍＭＴ−Ｉ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）、マウス乳腺癌ウイルス長い末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、およびヒトサイトメガロウイルス大中間体−初期プロモーター（ｈＣＭＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのプロモーターの全てのＤＮＡ配列は、当該分野で公知であり、そして市販されている。ＤＮＡ配列がまた、組換えウイルス（例えば、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）のゲノム中に挿入され得る。次いで、この修復細胞または骨前駆体細胞を、ベクターまたはウイルスを用いて、トランスフェクトするか、または感染させて、ＢＭＰタンパク質を発現する。この核酸配列は、修復細胞または骨前駆体細胞を、過渡的または安定的にトランスフェクトし得る。
【００４０】
一つの実施形態において、この核酸分子は、移植部位に直接注入される。好ましくは、この核酸は、マンニトール、スクロース、ラクトース、トレハロース、リポソーム、タンパクリポソーム、（ウイルスエンベロープタンパク質を含む）およびポリリジン−糖タンパク質複合体からなる群から選択されるキャリアにおいてトラップされる。例えば、Ｌｅｄｌｅｙ、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１０、１頁（１９８７）；Ｎｉｃｏｌａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０、１０６８頁（１９８３）を参照のこと。別の好ましい実施形態において、核酸は、身体から取り出された骨前駆細胞および修復細胞のような標的細胞に、トランスフェクトまたは感染される。次いで、このトランスフェクトされた細胞または感染された細胞は、身体内に再移植される。
【００４１】
最も好ましい実施形態において、この生物活性剤は、生分解性剤中にカプセル化される。この生分解性剤が、この破骨細胞によってゆっくりと再吸収されると、このカプセル化された生物活性剤は、このマトリクスに徐々に放出される。この移植部位において、異なる生分解性剤、好ましくは、再吸収速度の異なる薬剤との組み合わせを介して、この生物活性剤を送達し、複数のブースト送達系を達成し得る。別の好ましい実施形態において、この生分解性剤は、多層である。各層は、異なる生分解性剤、好ましくは、再吸収速度の異なる薬剤と含む。生物活性剤をカプセル化する方法としては、エマルジョン−溶媒エバポレーション法（Ｇｒａｎｄｆｉｌｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２６、４６７−４７９頁（１９９２））およびＨｅｒｂｅｒｔら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５、３５７−３６１頁（１９９８）に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されない。上記の参考文献は、本明細書中で参考として援用されている。後者の方法は、タンパク質をカプセル化するのに特に適切である。他の方法は、米国特許第６，１１０，５０３号、同第５，６５４，００８号および同第５，２７１，９６１号に記載されており、これらは、本明細書中で参考として援用されている。好ましい実施形態において、このＯＰ−１は、カプセル化プロセスの間に、ラクトースを添加することにより安定化される。
【００４２】
本発明の生分解性剤は、ビーズ形態またはミクロスフェア形態であり得る。この生分解性剤は、天然ポリマーおよび合成ポリマーの両方を含む、再吸収可能な生体適合性ポリマーであり得る。天然ポリマーは、代表的に、身体において酵素分解によって吸収されるが、再吸収可能な合成ポリマーは、代表的に、加水分解性機構によって分解する。生分解性剤の粒子サイズは、２０μｍ〜５００μｍ、好ましくは、２０μｍ〜１４０μｍ、より好ましくは、５０μｍ〜１４０μｍ、そして最も好ましくは、７５μｍ〜１４０μｍであることが好ましい。
【００４３】
一つの実施形態において、生分解性剤は、以下からなる群から選択される：エチレン酢酸ビニル、天然コラーゲンおよび合成コラーゲン、ポリ（グラキサノン）、ポリ（ホスファゼン）、ポリグラクチン、ポリグラクト酸（ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリアルドン酸（ｐｏｌｙａｌｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ポリアルカノエート、ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカルボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−コ−グルコリド）、ポリ（グルコリド−コ−トリメチレンカルボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカルボネート）、ポリアリールエート、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−コ−イミド）およびそれらのコポリマー、アミノ酸のポリマー、ポリエチレン−コ−フマレート、１種以上のα−ヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー、生物活性ガラス組成物、それらの混合物、ならびにそれらの任意の誘導体および改変体。好ましくは、この改変体は、このポリマーの全体の構造の５０％未満で変化する。
【００４４】
好ましい実施形態において、この生分解性剤は、以下からなる群から選択される：ポリオルトエステル、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（ζ−カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ζ−カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボネート）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）、ポリアクリレートおよびそれらのコポリマー。
【００４５】
別のより好ましい実施形態において、この生分解性剤は、以下からなる群から選択される：ポリ（グラキサノン）、ポリ（ホスファゼン）、エチレン酢酸ビニル、ポリグラクチン、ポリグラクト酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート、それらのコポリマー、ならびに天然コラーゲンおよび合成コラーゲン。
【００４６】
なお別のより好ましい実施形態において、この生分解性剤は、以下からなる群から選択される：ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、無水物（ポリ無水物、ポリ（無水物−コ−イミド）およびそれらのコポリマー）、アミノ酸のポリマー、プロピレン−コ−フマレート、１種以上のヒドロキシカルボン酸モノマーのポリマー（例えば、α−ヒドロキシ酢酸（グリコール酸）および／またはα−ヒドロキシプロピオン酸（乳酸））、生物活性ガラス組成物。α−ヒドロキシプロピオン酸は、そのＤ体もしくはＬ体で、またはラセミ混合物として使用され得る。
【００４７】
最も好ましい実施形態において、この生分解性剤は、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）である。生物活性剤の放出の所望の速度に依存して、ラクチドとグリコリドモノマーとのモル比が、調節され得る。好ましい実施形態において、このモル比は、５０：５０である。一般に、モル重量が高くなればなるほど、生分解は遅くなる。好ましくは、このポリマーの重量範囲は、約５，０００ダルトン〜５００，０００ダルトンであり、より好ましくは、１０，０００ダルトン〜３０，０００ダルトンである。
【００４８】
（多孔性β−ＴＣＰの製造方法）
本発明はまた、多孔性β−ＴＣＰ顆粒を製造する方法に関する。この多孔性β−ＴＣＰを調製するのに使用されるＴＣＰは、当該分野で公知の方法に従って調製される。ＴＣＰは、スプレー乾燥を介して、好ましくは、１０μｍ未満の粒子サイズで収集される。粒子サイズが非常に大きい場合、細孔の形成を干渉する。
【００４９】
次いで、微細なＴＣＰ粉末を、任意の固体残留物を残すことなく、高温度でガス分解生成物に分解する細孔形成剤と混合する。本発明の細孔形成剤は、ビーズ形態または樹脂形態であり得る。１つの実施形態において、細孔形成剤は、熱分解可能な物質（例えば、ナフタレン）、ポリアクリレートのプレポリマー、ポリメタクリレートのプレポリマー、ポリメチルメタクリレート、メチルアクリレートとメチルメタクリレートとのコポリマーおよびそれらの混合物、ポリスチレン、ポリエチレングリコール、結晶性セルロース粉末、繊維性セルロース、ポリウレタン、ポリエチレン、ナイロン樹脂、ならびにアルリル樹脂。より好ましい実施形態において、細孔形成剤は、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレンおよびポリエチレングリコールからなる群から選択される。細孔形成剤は、焼結後に、２０μｍ〜５００μｍ、より好ましくは、４０μｍ〜１９０μｍ、そして最も好ましくは、５０μｍ〜１２５μｍの直径の細孔サイズを形成することが、好ましい。
【００５０】
細孔形成剤の均整および粒子サイズは、空隙率およびポア構造に影響を与える。過剰な量の細孔形成剤は、相互に連絡する細孔をもたらし、そしてβ−ＴＣＰの密度およびそれにより焼結した本体の機械的強度を減少させる。不足した量の細孔形成剤は、不十分に展開した細孔構造を生じ得る。細孔形成剤の割合は、好ましくは、１０重量％〜５０重量％、より好ましくは、３０重量％〜４０重量％、最も好ましくは、３７．５重量％である。
【００５１】
次いで、顆粒化溶液を、ＴＣＰ粉末と細孔形成剤との混合物に添加し、脆い塊を形成する。これは、続く篩手順を改善する。達成される所望の粘性および分散媒体の水性特性に依存して、顆粒化溶液を形成するために使用される化合物が、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルブチラール、およびセルロースアセテートブチレートからなる群から選択され得る。好ましくは、顆粒化溶液中の化合物は、ポリビニルピロリドン、デンプンおよびゼラチンからなる群から選択される。
【００５２】
次いで、この脆い塊を篩にかけ、顆粒サイズの範囲を選択する。この篩プロセスによって選択された顆粒のサイズは、２５０μｍ〜１７００μｍ、より好ましくは、１０００μｍ〜１７００μｍ、最も好ましくは、５００μｍ〜１０００μｍの範囲であり得る。次いで、この篩にかけた顆粒は、９０℃〜１１０℃、より好ましくは、１０５℃で乾燥される。
【００５３】
次いで、この乾燥した顆粒を、７００℃〜８００℃まで加熱し、細孔形成剤を除去する。次いで、この温度を、焼結のために、１０００℃〜１２００℃、より好ましくは、１１５０℃まで上昇させる。この焼結した顆粒を、ゆっくりとした冷却手順に供し、純粋な結晶性β−ＴＣＰを得た。好ましい実施形態において、この温度を、６時間で、１１５０℃から３９℃まで下げる。焼結後、重量の減少および縮みが、このサンプルにおいて生じた。細孔が、ＴＣＰに形成され、そしてこの細孔が、燒結したＴＣＰの骨格によって取り囲まれる。この焼結した顆粒を、以前に使用したように同じサイズの篩を使用して再度篩にかけ、そして上記のようにバインダーと混合して、成形可能なパテ組成物を形成する。
【００５４】
あるいは、多孔性β−ＴＣＰ顆粒を、ＴＣＰ粉末を細孔形成剤と混合することによって調製し得る。この混合物を、均一性を達成するようにブレンドして、そしてプレス、回転式タブレットマシーンまたはチルソネータ（ｃｈｉｌｓｏｎａｔｏｒ）を使用して、スラッグへと圧縮する。このスラッグを、７００℃〜８００℃まで加熱して、細孔形成剤を除去し、そして１０００℃〜１１００℃、好ましくは、１１５０℃で焼結する。次いで、この多孔性スラッグを、２５０μｍ〜１７００μｍ、より好ましくは、１０００μｍ〜１７００μｍ、そして最も好ましくは、５００μｍ〜１０００μｍの範囲の適切な粒子サイズに粉砕する。次いで、多孔性顆粒を、バインダーとともに混合して、成形可能なパテ組成物を形成する。
【００５５】
（成型可能なパテ組成物）
本発明の多孔性β−ＴＣＰは、生体適合性結合剤と組み合わされて、成型可能なパテ組成物を形成し得る。成型可能なパテは、十分な粘度を有するペーストまたは半固体の形態であり得る。成型可能なパテ組成物は、新たな骨成長が望ましい空隙、欠損または他の領域内に位置づけそして成形することを可能にする。パテの粘着性はまた、整形外科適用、顎顔面適用、および歯科適用のための移植材料に関連する粒子の移動の問題を防ぐ。
【００５６】
本発明に従う結合剤は、生分解性で生体適合性でなければならず、流体流れ特性を有しなければならない。本明細書中において有用であると企図される結合剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：当該分野で認識される懸濁剤、粘度生成剤、ゲル形成剤、および乳化剤。他の候補は、局所的投与、経口投与、または非経口投与のために成分を懸濁するために使用される薬剤である。なお他の候補は、錠剤結合剤、崩壊剤またはエマルジョン安定化剤として有用な薬剤である。なお他の候補は、化粧品、化粧道具（ｔｏｉｌｅｔｒｉｅｓ）および食品において使用される薬剤である。ＵＳＰ  ＸＸＩＩ  −ＮＦ  ＸＶＩＩ（Ｔｈｅ  Ｎｉｎｅｔｅｅｎ  Ｎｉｎｅｔｙ  Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（１９９０））のような参考説明書は、このような薬剤を分類し、そして説明する。好ましい結合剤としては、生物学的供給源または合成供給源からの再吸収可能な高分子が挙げられ、これらには、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、アルキルセルロース（メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウムまたは他の塩を含む）、ヒドロキシアルキルセルロース（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを含む）、アルキルヒドロキシアルキルセルロース（メチルヒドロキシエチルセルロースを含む）のようなセルロース誘導体、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン（ｃｈｒｏｎｄｒｏｉｔｉｎ）硫酸などが挙げられる。
【００５７】
カルボキシメチルセルロール（ＣＭＣ）ナトリウムは、好ましい結合剤である。ＣＭＣは、以下のような供給業者から市販されるが、これらに限定されない：Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｑｕａｌｏｎｅ（登録商標）Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ；ＦＭＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｅｌａｎｅｓｅ，Ｌｔｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；およびＨｅｎｋｅｌ  ＫＧａＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ。カルボキシメチルセルロールナトリウムは、セルロースのポリカルボキシメチルエーテルのナトリウム塩であり、代表的な分子量は、９０，０００〜７００，０００の範囲である。異なる粘度を有する種々の等級のカルボキシメチルセルロールナトリウムが市販される。種々の等級のカルボキシメチルセルロールナトリウムの粘度は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第２版），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ＆  Ｒｏｙａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎに報告される。例えば、低粘度５０〜２００ｃＰ、中程度粘度４００〜８００ｃＰ、高粘度１５００〜３０００ｃＰ。多数の等級のカルボキシメチルセルロールナトリウムが市販され、最も頻繁に使用される等級は、０．７の置換の程度（ａ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）（ＤＳ）を有する。ＤＳは、アンヒドログルコース単位当たりの置換されたヒドロキシル基の平均数として規定される。ポリマーの水溶性を決定するのはこのＤＳである。置換の程度および記載された濃度の水溶液の標準粘度は、任意のカルボキシメチルセルロールナトリウムラベル上に示される。低粘度ＣＭＣ（Ａｑｕａｌｏｎｅ（登録商標）Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）が現在好ましい。現在好ましい置換の程度は、０．６５〜０．９０の範囲（ＤＳ＝０．７、Ａｑｕａｌｏｎｅ（登録商標）Ｔｙｐｅ  ７Ｌ）である。
【００５８】
室温で流動可能な結合剤の他に、結合剤としては、ゼラチンのような試薬が挙げられ、このゼラチンは、温かいかまたは熱い水溶液中で可溶化し、そして冷却時に非流動性のゲルに変換される。ゼラチン組成物は、この組成物が、移植のために哺乳動物の体温より上の温度で流動性であるが、このような体温においてまたはこのような体温よりわずかに高い温度で比較的非流動性のゲルに転移するように、処方される。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明の結合剤は、高分子量ヒドロゲルのクラスから選択され、これには、ヒアルロン酸ナトリウム（約５００〜３０００ｋＤ）、キトサン（約１００〜３００ｋＤ）、ポロキサマー（約７〜１８ｋＤ）、およびグリコサミノグリカン（約２０００〜３０００ｋＤ）が挙げられる。好ましい実施形態において、グリコサミノグリカンは、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサングルコサミンである。ヒドロゲルは、３次元ネットワークを有するゲルの形態の架橋親水性ポリマーである。ヒドロゲルマトリクスは、正味正または正味負の電荷を保有し得るか、あるいは中性であり得る。代表的な正味負の電荷のマトリクスは、アルギネートである。正味正の電荷を保有するヒドロゲルは、コラーゲンおよびラミニンのような細胞外マトリクス成分によって代表され得る。市販の細胞外マトリクス成分の例としては、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを有するダルベッコ改変イーグル培地）およびＶｉｔｒｏｇｅｎＴＭ（０．０１２Ｎ  ＨＣＬ中に溶解された、精製ペプシン可溶化ウシ真皮コラーゲンの滅菌溶液）が挙げられる。正味中性のヒドロゲルの例は、高架橋ポリエチレンオキシドまたはポリビニルアルコールである。
【００６０】
別の実施形態において、本発明の結合剤はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、およびポリラクトンを含む群より選択されるポリマーのクラスから選択され得る。数日〜数週間にわたるインサイチュ組織内方増殖（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）によりこの材料中において次第にポリマーを置換するために、ポリマーの分子量は、ポリマーの必要とされる分解速度と適合性であるべきである。
【００６１】
別の好ましい実施形態において、結合剤は、ポリエチレングリコールである。低分子量ポリエチレングリコールおよび高分子量ポリエチレングリコールの混合物は、適切な粘度を有するペーストを生成し得る。例えば、分子量４００〜６００ダルトンのポリエチレングリコールおよび１５００ダルトンのポリエチレングリコールの適切な比の混合物は、有効である。
【００６２】
なお別の実施形態において、結合剤は、デキストラン、デキストラン硫酸、ジエチルアミノエチルデキストラン、デキストランリン酸、またはこれらの混合物からなる、約２００，０００〜５，０００，０００の平均分子量を有する多糖類のクラスから選択される。低分子量多糖類は、より速いデキストラン吸収速度という利点を有し、多孔性β−ＴＣＰ材料のより速い暴露を生じる。デキストランが長期間その部位に残ることが望ましい場合、比較的高分子量のデキストランが使用され得る。他の好ましい多糖類としては、デンプン、分画された（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）デンプン、アミロペクチン、寒天、アラビアゴム、パルラン（ｐｕｌｌｕｌｌａｎ）、アガロース、カラゲナン、デキストリン、フルクタン、イヌリン、マンナン、キシラン、アラビナン、グリコゲン、グルカン、キサンタンガム、グアールガム、ローカストマメゴム、トラガカントゴム、カラヤゴム、ならびにこれらの誘導体および混合物が挙げられる。
【００６３】
別の好ましい実施形態において、結合剤は、マンニトール、白色鉱油、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠（ｇｌｕｅ）、およびこれらの混合物からなる群より選択される。フィブリン膠が、現在好ましい結合剤であり、これは、哺乳動物フィブリノーゲンおよびトロンビンの混合物を含む。ヒトフィブリノーゲンは、限定しないが、Ｔｉｓｓｕｃｏｌ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏ  ＡＧ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ），Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ（登録商標）（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｂｉｏｃｏｌｌ（登録商標）（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓａｎｇｕｉｎｅ  ｄｅ  Ｌｉｌｌｅ，Ｐｏｕｒｓ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＴｒａｎｓｇｌｕｔｉｎｅ（登録商標）（ＣＮＴＳ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）のような製品で市販される。フィブリン膠はまた、他の哺乳動物供給源（例えば、ウシ供給源およびマウス供給源）からのフィブリノーゲンおよびトロンビンから作製され得る。
【００６４】
結合剤が、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、ペプチド、ムチン、コンドロイチン硫酸、キトサン、ポロキサマー、グリコサミノグリカン、多糖類、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびポリグリコール酸のコポリマー、ポリヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリグルタミン酸、ポリラクトン、マンニトール、白色鉱油、マンニトール／デキストランの組み合わせ、マンニトール／白色鉱油の組み合わせ、ゴマ油、フィブリン膠、ならびにこれらの混合物からなる群より選択されることが好ましい。
【００６５】
より好ましくは、結合剤は、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびこれらの混合物からなる群より選択される。最も好ましくは、結合剤は、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびカルボキシメチルセルロースカルシウムからなる群より選択される。
【００６６】
最小量の結合剤は、容易な成形性を与え、そして組織内方増殖の間に十分な粒子粘着および形状保持を提供するのに必要な量である。１つの実施形態において、多孔性β−ＴＣＰ：カルボキシメチルセルロールナトリウムの重量比は、１：０．１〜１：１．２５の範囲である。好ましい実施形態において、多孔性β−ＴＣＰ：ＣＭＣナトリウムの比は、１：０．４である。
【００６７】
本発明はまた、骨移植のためのキットに関し、これは、本発明の多孔性β−ＴＣＰ材料、ならびに骨形成タンパク質および抗生物質からなる群より選択される少なくとも１種のさらなる生理活性剤を含む。多孔性β−ＴＣＰ材料および骨形成タンパク質を含むキットは、形態形成タンパク質刺激因子をさらに含み得る。１つの実施形態において、このキットは、結合剤をさらに含む。別の実施形態において、キットは、本発明の多孔性β−ＴＣＰ材料および結合剤を含む。
【００６８】
（骨形成タンパク質ファミリー）
ＢＭＰファミリー（その代表的な骨形成／骨原性タンパク質ファミリーメンバーについて名付けられる）は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する。主に配列相同性に基づいて単離された、報告されている「ＢＭＰ」（ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１８）のうち、ＢＭＰ−１以外の全てが、骨形成タンパク質のＢＭＰファミリーのメンバーとして分類されたままである（Ｏｚｋａｙｎａｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，２０８５−９３頁（１９９０））。
【００６９】
ＢＭＰファミリーは、形態形成タンパク質である構造的に関連するメンバー（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａデカペンタプレージック遺伝子複合体（ＤＰＰ）産物、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓのＶｇ１産物およびそのマウスホモログ、Ｖｇｒ−１を含む）を含む（例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６，５９７−６４１頁（１９９０）（これは、本明細書中において参考として援用される）を参照のこと）。
【００７０】
ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＯＰ−１（ＢＭＰ−７）のＣ末端ドメインは、ＢＭＰ−２のＣ末端ドメインと約６０％同一であり、そしてＢＭＰ−６およびＯＰ−１のＣ末端ドメインは、８７％同一である。ＢＭＰ−６は、マウスＶｇｒ−１のヒトホモログであるようであり（Ｌｙｏｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，４５５４−５９頁（１９８９））；２つのタンパク質は、アミノ酸配列レベルで、全体的に、９２％同一である（米国特許第５，４５９，０４７号、これは、本明細書中において参考として援用される）。ＢＭＰ−６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｖｇ−１産物に対して５８％同一である。
【００７１】
（骨形成タンパク質の生化学的構造および機能的特性）
天然に存在する骨モルフォゲンは、それらのＣ末端領域（ドメイン）において、実質的なアミノ酸配列相同性を共有する。代表的には、上記天然に存在する骨原性タンパク質は、前駆体として翻訳され、この前駆体は、代表的に約３０残基未満のＮ末端シグナルペプチド配列、続いて、約１００〜１４０アミノ酸の成熟Ｃ末端ドメインを生じるように切断される「プロ」ドメインを有する。シグナルペプチドは、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４，４６８３−４６９１頁（１９８６）の方法を使用して所与の配列において予測され得る切断部位において、翻訳時に迅速に切断される。プロドメインは、代表的に、完全にプロセスされた成熟Ｃ末端ドメインよりも約３倍長い。
【００７２】
ＢＭＰタンパク質ファミリーのメンバーの別の性質は、二量化するそれらの見かけの能力である。いくつかの骨由来の骨原性タンパク質（ＯＰ）およびＢＭＰは、それらの活性形態のホモダイマーおよびヘテロダイマーとして見出される。ＯＰおよびＢＭＰがヘテロダイマーを形成する能力は、形態形成タンパク質にさらなるまたは変更された形態形成誘導能力を与え得る。ヘテロダイマーは、ＯＰレセプター分子およびＢＭＰレセプター分子のホモダイマーとは定性的または定量的に異なる結合親和性を示し得る。次いで、変更された結合親和性は、異なるシグナル伝達経路を媒介するレセプターの異なる活性化を導き得、これは、最終的に、異なる生物学的活性または結果を導き得る。変更された結合親和性はまた、組織型特異的様式または細胞型特異的様式で示され得、これによって、特定の前駆体細胞型のみが増殖および／または分化を受けるように誘導し得る。
【００７３】
好ましい実施形態において、形態形成ポリペプチドの対が、それぞれが、参照モルフォゲンのアミノ酸配列と規定の関係を共有する配列を含むアミノ酸配列を有する。本明細書中において、好ましい骨原性ポリペプチドは、骨原性的に活性なヒトＯＰ−１（配列番号１）に存在する配列と規定の関係を共有する。しかし、本明細書中に開示される任意の１つ以上の天然に存在する配列または生合成配列が、参照配列として使用され得る。好ましい骨原性ポリペプチドは、少なくともヒトＯＰ−１のＣ末端の６システインドメイン（配列番号１の残基３３５〜４３１）と規定の関係を共有する。好ましくは、骨原性ポリペプチドは、少なくともヒトＯＰ−１のＣ末端の７システインドメイン（配列番号１の残基３３０〜４３１）と規定の関係を共有する。すなわち、骨形成活性を有する二量体タンパク質の好ましいポリペプチドは、それぞれ、参照配列に対応するかまたはそれらに対して機能的に等価な配列を含む。
【００７４】
機能的に等価な配列は、参照配列内に配置されるシステイン残基の機能的に等価な配置を含み、これは、これらのシステインの直線的配置を変更するが、二量体形態形成タンパク質の折り畳み構造におけるそれらの関係（形態形成活性に必要であり得るような鎖内ジスルフィド結合または鎖間ジスルフィド結合を形成する能力を含む）を実質的に損なわないアミノ酸の挿入または欠失を含む。機能的に等価な配列は、１つ以上のアミノ酸残基が、参照配列（例えば、ヒトＯＰ−１のＣ末端の７システインドメイン（本明細書中において、保存７システイン骨格（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｅｖｅｎ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｓｋｅｌｔｏｎ）とも呼ばれる）の対応する残基とは異なるが、但し、この差異は、骨形成活性を破壊しない配列を含む。従って、参照配列の対応するアミノ酸の保存的置換が好ましい。参照配列の対応する残基に対する保存的置換であるアミノ酸残基は、対応する参照配列に物理的または機能的に類似するアミノ酸残基（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合を形成する能力を含む）など）である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら、上記（この教示は、本明細書中において参考として援用される）における受容される点変異について規定される基準を満たす置換である。
【００７５】
保存的置換は、代表的に、類似の特性を有する別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換（例えば、以下の基内での置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン）を含む。用語「保存的変動（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」はまた、非置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用を含むが、但し、この置換ポリペプチドに対して惹起される抗体はまた、非置換ポリペプチドと免疫反応する。
【００７６】
骨原性タンパク質ＯＰ−１は、記載されている（例えば、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５，３５４，５５７号（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。その成熟したネイティブ形態の、天然起源の骨原性タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定された場合に約３０〜３６ｋＤａの見かけの分子量を代表的に有する、グリコシル化ダイマーである。還元された場合、この３０ｋＤａのタンパク質は、約１６ｋＤａおよび約１８ｋＤａの見かけの分子量を有する、２つのグリコシル化ペプチドサブユニットを生じる。還元状態において、このタンパク質は、検出可能な骨原性活性を有さない。非グリコシル化タンパク質（これもまた、骨原性活性を有する）は、約２７ｋＤａの見かけの分子量を有する。還元された場合、この２７ｋＤａのタンパク質は、哺乳動物において軟骨内性骨の形成を誘導し得る、約１４ｋＤａ〜１６ｋＤａの分子量を有する２つの非グリコシル化ポリペプチドを生じる。骨原性タンパク質は、種々のグリコシル化パターンを有する形態、種々のＮ末端を有する形態、およびネイティブタンパク質の活性な短縮形態または変異形態を含み得る。上記のように、特に有用な配列としては、ＤＰＰ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来）、Ｖｇ１（Ｘｅｎｏｐｕｓ由来）、Ｖｇｒ−１（マウス由来）、ＯＰ−１タンパク質およびＯＰ−２タンパク質（米国特許第５，０１１，６９１号およびＯｐｐｅｒｍａｎｎら（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）、ならびにＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４（ＷＯ８８／００２０５、米国特許第５，０１３，６４９号およびＷＯ９１／１８０９８（本明細書中に参考として援用される））、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６（ＷＯ９０／１１３６６、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０１６３０（本明細書中に参考として援用される））、ＢＭＰ−８およびＢＭＰ−９と呼ばれるタンパク質の、Ｃ末端の９６アミノ酸配列または１０２アミノ酸配列を含む配列が挙げられる。
【００７７】
本発明の好ましい形態形成タンパク質および骨原性タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む：ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＯＰ−１、ＣＯＰ−３、ＣＯＰ−４、ＣＯＰ−５、ＣＯＰ−７、ＣＯＰ−１６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３ｂ、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＢＭＰ−１５、ＢＭＰ−１６、ＢＭＰ−１７、ＢＭＰ−１８、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１０、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１２、ＭＰ１２１、ドーサリン−１（ｄｏｒｓａｌｉｎ−１）、ＤＰＰ、Ｖｇ−１、Ｖｇｒ−１、６０Ａタンパク質、ＮＯＤＡＬ、ＵＮＩＶＩＮ、ＳＣＲＥＷ、ＡＤＭＰ、ＮＥＵＲＡＬ、ＴＧＦ−β、ならびにこれらのアミノ酸配列改変体およびアミノ酸配列ホモログ（これらの種ホモログを含む）。好ましくは、形態形成タンパク質は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む：ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５およびＢＭＰ−６；より好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）およびＢＭＰ−２；ならびに、最も好ましくは、ＯＰ−１（ＢＭＰ−７）。
【００７８】
これらの配列ならびにこれらの化学特性および物理特性を開示する刊行物としては、以下が挙げられる：
【００７９】
【化１】
2005505311.tif 000003
。上記の刊行物は、参考として本明細書中に援用される。別の実施形態において、有用なタンパク質は、生物学的に活性な生合成構築物を含み、これには、新規の生合成形態形成タンパク質および２つ以上の公知のモルフォゲン由来の配列を用いて設計されたおよびキメラタンパク質を含む。
【００８０】
本発明の別の実施形態において、形態形成タンパク質は、組織形成を誘導するためにＭＰＳＦと協調して使用するために合成的に調製され得る。合成的に調製される形態形成タンパク質は、ネイティブであり得るか、または非ネイティブタンパク質（すなわち、別の天然で見出されないタンパク質）であり得る。
【００８１】
非ネイティブの骨原性タンパク質は、一連のコンセンサスＤＮＡ配列を用いて合成される（米国特許第５，３２４，８１９号（本明細書中に参考として援用される））。これらのコンセンサス配列は、天然の骨原性産物から得られた部分アミノ酸配列のデータ、および推定または実証された発達機能を有することが文献中に報告されている他の遺伝子との観察されるそれらの相同性に基づいて設計された。
【００８２】
いくつかの生合成コンセンサス配列（コンセンサス骨原性タンパク質または「ＣＯＰ」と呼ばれる）が、原核生物中で融合タンパク質として発現された。精製された融合タンパク質は、切断され得、再び折り畳まれ得、少なくとも１つのＭＰＳＦ（必要に応じて、マトリクスまたはデバイス中で）と組み合わされ得、確立された動物モデルに移植され得、そして骨誘導活性および／または軟骨誘導活性を有することが示され得る。現在好ましい合成骨原性タンパク質は、ＣＯＰ−５（配列番号２）および／またはＣＯＰ−７（配列番号３）と示される２つの合成アミノ酸配列を含む。
【００８３】
Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら（米国特許第５，０１１，６９１号および同第５，３２４，８１９号（これらは、本明細書中に参考として援用される）は、以下：
【００８４】
【化２】
2005505311.tif 000004
に示されるようなＣＯＰ−５およびＣＯＰ−７のアミノ酸配列を記載する。
【００８５】
これらのアミノ酸配列において、ダッシュ（−）は、関連タンパク質中の比較され得る配列を単に並べるためにつなぎとして使用される。アライメントしたアミノ酸配列間の差異を強調する。
【００８６】
これらのＢＭＰファミリーのメンバーおよび他のＢＭＰファミリーのメンバーのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列は、公開されており、そして新規に同定されたタンパク質がこのＢＭＰファミリーに属するか否かを決定するために当業者によって使用され得る。新規ＢＭＰ関連遺伝子産物は、少なくとも１つの形成活性を保有するという類似性によって予想され、このようにしてＢＭＰとして分類される。
【００８７】
本発明の１つの好ましい実施形態において、形態形成タンパク質は、ダイマー種を生成するためにジスルフィド結合されるサブユニット対を含み、ここで、このサブユニットの少なくとも１つが、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属する組換えペプチドを含む。本発明の別の好ましい実施形態において、形態形成タンパク質は、非共有結合的な相互作用を介して形成されるダイマー種を生成するサブユニットの対を含み、ここで、このサブユニットの少なくとも１つが、ＢＭＰタンパク質ファミリーに属する組換えペプチドを含む。非共有結合的な相互作用としては、ファンデルワールス力、水素結合、疎水性相互作用および静電気相互作用が挙げられる。ダイマー種は、ホモダイマーであってもヘテロダイマーであってもよく、そして細胞増殖および／または組織形成を誘導し得る。
【００８８】
特定の好ましい実施形態において、本明細書中において有用な骨形成タンパク質としては、そのアミノ酸配列が、上記の天然に存在するタンパク質から選択される参照形態形成タンパク質と、少なくとも７０％のアミノ酸配列の相同性または「類似性」、および好ましくは８０％の相同性または類似性を共有する配列を含む、骨形成タンパク質である。好ましくは、参照タンパク質は、ヒトＯＰ−１であり、その参照配列は、ヒトＯＰ−１の骨原性的に活性な形態中に存在するＣ末端の７システインドメイン（配列番号１の残基３３０〜４３１）である。特定の実施形態において、参照モルフォゲンポリペプチドに対して機能的に等価であると推測されるポリペプチドは、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のようなコンピュータープログラムによって簡便に実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎら（前出）の方法を用いて、それらと共にアライメントされる。上記のように、候補配列中の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は、規定された関係を計算するために無視され、慣習的に、候補配列と参照配列との間のアミノ酸配列相同性またはアミノ酸配列同一性のレベルとして表現される。「アミノ酸配列相同性」は、アミノ酸配列同一性およびアミノ酸配列類似性の両方を含むことが、本明細書中で理解される。相同配列は、同一なアミノ酸残基および／または類似のアミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基が、アライメントされた参照配列中の対応するアミノ酸残基の代わりの保存的置換であるか、またはアライメントされた参照配列中の対応するアミノ酸残基の「点変異を許容する」。従って、参照配列と７０％のアミノ酸相同性を共有する候補ポリペプチド配列は、アライメントされた残基の任意の７０％が、参照配列中の対応する残基と同一であるか、または参照配列中の対応する残基の保存的置換である。目下好ましい実施形態において、参照配列は、ＯＰ−１である。従って、本明細書中において有用な骨形成タンパク質としては、天然に存在するか生合成的に産生される（例えば、「ムテイン」または「変異タンパク質」を含む）かにかかわらず、好ましい参照配列の対立遺伝子改変体、系統発生対応物および他の改変体、ならびに一般的な形態形成タンパク質ファミリーの新規メンバー（上記に示され、そして同定されるものを含む）が挙げられる。特定の特に好ましい形態形成ポリペプチドは、ヒトＯＰ−１の好ましい参照配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を共有し、なおより好ましくはそれらと少なくとも６５％のアミノ酸同一性を共有する。
【００８９】
別の実施形態において、有用な骨原性タンパク質としては、本明細書中に規定されるように、保存された７システインドメインを共有し、そしてＣ末端活性ドメイン内で少なくとも７０％のアミノ酸配列相同性（類似性）を共有する骨原性タンパク質が挙げられる。なお別の実施形態において、本発明の骨原性タンパク質は、本明細書中に規定される一般配列（ｇｅｎｅｒｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＯＰＸ（配列番号４）、および本発明の一般配列７（配列番号５）および８（配列番号６）、または一般配列９（配列番号７）および１０（配列番号８）を含む）のうちの任意の１つを有する、骨原性的に活性なタンパク質として規定され得る。
【００９０】
本発明において有用な骨形成ポリペプチドのファミリー、およびそれらのメンバーは、一般アミノ酸配列によって規定され得る。例えば、一般配列７（配列番号５）および一般配列８（配列番号６）は、それぞれ、９７アミノ酸配列および１０２アミノ酸配列であり、そして現在までに同定された好ましいタンパク質ファミリーのメンバー（少なくともＯＰ−１、ＯＰ−２、ＯＰ−３、ＣＢＭＰ−２Ａ、ＣＢＭＰ−２Ｂ、ＢＭＰ−３、６０Ａ、ＤＰＰ、Ｖｇｌ、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、Ｖｇｒ−１、およびＧＤＦ−１を含む）間で共有される相同性を適応する。これらのタンパク質についてのアミノ酸配列は、上記に要約されるように、本明細書中および／または当該分野に記載される。一般配列としては、６システイン骨格および７システイン骨格によって規定される（それぞれ、一般配列７および一般配列８）Ｃ末端ドメイン中のそれらの配列によって共有されるアミノ酸同一性、ならびにこれらの配列内の可変位置に対する代替の残基の両方を含む。一般配列は、適切なシステイン骨格を提供し、ここで、分子間ジスルフィド結合または分子内ジスルフィド結合が形成され得、そして折り畳まれたタンパク質の三次構造におそらく影響を与える特定の重要なアミノ酸を含む。さらに、この一般配列は、３６位（一般配列７）および４１位（一般配列８）にさらなるシステインを許容し、それによって形態形成的に活性な配列のＯＰ−２、ＯＰ−３を含む。
【００９１】
【化３】
2005505311.tif 000005
ここで、各Ｘａａは、以下のように規定される１つ以上の特定されたアミノ酸の群から選択される：「ｒｅｓ．」は、「残基」を意味し、そして、
【００９２】
【化４】
2005505311.tif 000006
2005505311.tif 000007
2005505311.tif 000008
である。
【００９３】
一般配列８（配列番号６）は、一般配列７の全てを含み、さらに、そのＮ末端に以下の配列（配列番号９）を含む。
【００９４】
一般配列８（配列番号６）は、一般配列７のすべてを含み、そしてさらにそのＮ末端に以下の配列（配列番号９）：
配列番号９
【００９５】
【化５】
2005505311.tif 000009
を含む。
【００９６】
従って、残基７で始まって、一般配列８中の各「Ｘａａ」は、一般配列７に関して規定された特定のアミノ酸であり、一般配列７について記載される各残基番号は、一般配列８において５ずれることが特徴である。従って、一般配列７における「ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＬｙｓ）」は、一般配列８におけるｒｅｓ．７のＸａａを指す。一般配列８において、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｌａまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＭｅｔ）であり；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＧｌｎ）であり；そしてｒｅｓ．５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、またはＴｙｒ）である。
【００９７】
別の実施形態において、有用な骨原性タンパク質としては、以下にように規定される、一般配列９および１０により規定されるタンパク質が挙げられる。
【００９８】
詳細には、一般配列９および１０は、以下のタンパク質の複合アミノ酸配列である：ヒトＯＰ−１、ヒトＯＰ−２、ヒトＯＰ−３、ヒトＢＭＰ−２、ヒトＢＭＰ−３、ヒトＢＭＰ−４、ヒトＢＭＰ−５、ヒトＢＭＰ−６、ヒトＢＭＰ−８、ヒトＢＭＰ−９、ヒトＢＭＰ  １０、ヒトＢＭＰ−１１、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ６０Ａ、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｖｇ−１、ウニＵＮＩＶＩＮ、ヒトＣＤＭＰ−１（マウスＧＤＦ−５）、ヒトＣＤＭＰ−２（マウスＧＤＦ−６、ヒトＢＭＰ−１３）、ヒトＣＤＭＰ−３（マウスＧＤＦ−７、ヒトＢＭＰ−１２）、マウスＧＤＦ−３、ヒトＧＤＦ−１、マウスＧＤＦ−１、ニワトリＤＯＲＳＡＬＩＮ、ｄｐｐ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＳＣＲＥＷ、マウスＮＯＤＡＬ、マウスＧＤＦ−８、ヒトＧＤＦ−８、マウスＧＤＦ−９、マウスＧＤＦ−１０、ヒトＧＤＦ−１１、マウスＧＤＦ−１１、ヒトＢＭＰ−１５およびラットＢＭＰ３ｂ。一般配列７と同様に、一般配列９は、Ｃ末端の６システイン骨格を収容する９７アミノ鎖配列であり、一般配列８と同様に、一般配列１０は、７システイン骨格を収容する１０２アミノ酸配列である。
【００９９】
一般配列９
【０１００】
【化６】
2005505311.tif 000010
ここで、各Ｘａａは、以下のように規定される１つ以上の特定のアミノ酸の群から独立して選択される：「ｒｅｓ．」は、「残基」を意味し、そしてｒｅｓ．１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、ＬｅｕまたはＧｌｕ）であり；ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＧｌｕ）であり；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＡｓｐ）であり；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＰｈｅ）であり；ｒｅｓ．５のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＧｌｕ）であり；ｒｅｓ．６のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＡｓｎ）であり；ｒｅｓ．７のＸａａ（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、ＡｌａまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＰｈｅ）であり；ｒｅｓ．９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．１０のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＭｅｔ）であり；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、ＳｅｒまたはＧｌｙ）であり；ｒｅｓ．１２のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｕまたはＨｉｓ）であり；ｒｅｓ．１３のＸａａ＝（ＴｒｐまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．１４のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．１５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＴｒｐ）であり；ｒｅｓ．１８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＰｈｅ）であり；ｒｅｓ．２０のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＰｈｅ）であり；ｒｅｓ．２１のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＬｙｓまたはＴｈｒ）であり；ｒｅｓ．２２のＸａａ＝（ＡｌａまたはＰｒｏ）であり；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．２４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＧｌｎまたはＧｌｙ）であり；ｒｅｓ．２８のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．３０のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＬｅｕ）であり；ｒｅｓ．３１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．３２のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．３３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＰｈｅまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．３４のＸａａ  ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＰｒｏ）であり；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＨｉｓ）であり；ｒｅｓ．３６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕまた���Ｇｌｙ）であり；ｒｅｓ．３７のＸａａ＝（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、ＧｌｙまたはＴｙｒ）であり；ｒｅｓ．３８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＶａｌまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＰｒｏまたはＰｈｅ）であり；ｒｅｓ．４０のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、ＨｉｓまたはＭｅｔ）であり；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．４２のＸａａ＝（Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．４３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＴｙｒ）であり；ｒｅｓ．４４のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＰｒｏ）であり；ｒｅｓ．４５のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＨｉｓ）であり；ｒｅｓ．４６のＸａａ＝（Ｇｌｎ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）であり；ｒｅｓ．４７のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＡｓｎまたはＨｉｓ）であり；ｒｅｓ．４８のＸａａ＝（Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＩｌｅ）であり；ｒｅｓ．４９のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＩｌｅ）であり；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．５１のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＡｌａまたはＴｙｒ）であり；ｒｅｓ．５３のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．５４のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＡｓｐ）であり；ｒｅｓ．５５のＸａａ＝（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＨｉｓ）であり；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、ＧｌｙまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）であり；ｒｅｓ．５９のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＧｌｙ）であり；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＴｈｒまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｃｙｓ、ＶａｌまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．６３のＸａａ＝（Ａｌａ、ＶａｌまたはＴｈｒ）であり；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＴｙｒ）であり；ｒｅｓ．６６のＸａａ（Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．６７のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＴｈｒまたはＴｙｒ）であり；ｒｅｓ．６８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．６９のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＧｌｙまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．７０のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、ＬｅｕまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔ���ｒ、ＡｓｎまたはＧｌｙ）であり；ｒｅｓ．７２のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔ）であり；ｒｅｓ．７４のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＭｅｔ）であり；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．７６のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｌｅｕ、ＡｓｎまたはＧｌｕ）であり；ｒｅｓ．７７のＸａａ＝（Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、ＧｌｙまたはＰｒｏ）であり；ｒｅｓ．７８のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．７９のＸａａ＝（Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、ＧｌｎまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．８１のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｈｒまたはＡｌａ）であり；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＡｓｐまたはＡｌａ）であり；ｒｅｓ．８３のＸａａ＝（Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＬｙｓまたはＩｌｅ）であり；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、ＧｌｕまたはＧｌｙ）であり；ｒｅｓ．８５のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．８６のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＧｌｕまたはＩｌｅ）であり；ｒｅｓ．８７のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ＰｒｏまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．８８のＸａａ＝（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｙまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＭｅｔまたはＡｌａ）であり；ｒｅｓ．９０のＸａａ＝（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．９１のＸａａ＝（ＶａｌまたはＡｌａ）であり；ｒｅｓ．９２のＸａａ＝（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｖａｌ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒ）であり；ｒｅｓ．９３のＸａａ＝（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、ＡｒｇまたはＴｈｒ）であり；ｒｅｓ．９５のＸａａ＝（Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＴｈｒ）であり；ｒｅｓ．９７のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＬｅｕまたはＳｅｒ）である。さらに、ｒＢＭＰ３ｂおよびｍＧＤＦ−１０のｒｅｓ．５３の後にＩｌｅが存在し；ＧＤＦ−１のｒｅｓ．５４の後にＴが存在し；ＢＭＰ３のｒｅｓ．５４の後にＶが存在し；ＢＭＰ−８およびＤｏｒｓａｌｉｎのｒｅｓ．７８の後にＧが存在し；ｈＧＤＦ−１のｒｅｓ．３７の後にＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏが存在する。
【０１０１】
一般配列１０（配列番号８）は、一般配列９（配列番号７）のすべてを含み、そしてさらに、そのＮ末端に以下の配列（配列番号９）
配列番号９
【０１０２】
【化７】
2005505311.tif 000011
を含む。
【０１０３】
従って、残基６で始まって、一般配列１０における各「Ｘａａ」は、一般配列９に関して規定される特定のアミノ酸であり、一般配列９について記載される各残基番号は、一般配列１０において５だけずれることが特徴である。従って、一般配列９における「ｒｅｓ．１のＸａａ＝（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＧｌｕ）」は、一般配列１０におけるｒｅｓ．６のＸａａを指す。一般配列１０において、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＡｌａまたはＣｙｓ）であり；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＴｙｒまたはＡｌａ）であり；ｒｅｓ．４のＸａａ＝（Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＴｙｒ）であり；そしてｒｅｓ．５のＸａａ＝（Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＬｅｕ）である。
【０１０４】
上記のように、本発明において有用な特定の現在好ましい骨形成ポリペプチド配列は、ｈＯＰ−１の好ましい参照配列を規定するアミノ酸配列と、６０％を超える同一性、好ましくは６５％を超える同一性を有する。これらの特に好ましい配列としては、ＯＰ−１タンパク質およびＯＰ−２タンパク質の、対立遺伝子改変体および系統発生対応物改変体（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ６０Ａタンパク質を含む）が挙げられる。従って、特定の特に好ましい実施形態において、有用な形態形成タンパク質としては、本明細書中で「ＯＰＸ」と呼ばれる一般アミノ酸配列（配列番号４）内のポリペプチド鎖の対を含む活性タンパク質が挙げられ、この一般アミノ酸配列は、７システイン骨格を規定し、そしてＯＰ−１およびＯＰ−２の、いくつかの同定された改変体間のホモログを収容する。本明細書中に記載される場合、所定の位置の各Ｘａａは、マウスもしくはヒトのＯＰ−１もしくはＯＰ−２のＣ末端配列中の対応する位置に存在する残基から、独立して選択される。
【０１０５】
【化８】
2005505311.tif 000012
ここで、ｒｅｓ．２のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．３のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．１１のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．１６のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｅｕ）であり；ｒｅｓ．１９のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．２３のＸａａ＝（ＧｌｕまたはＧｌｎ）であり；ｒｅｓ．２６のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．３５のＸａａ＝（ＡｌａまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．３９のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＡｓｐ）であり；ｒｅｓ．４１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＣｙｓ）であり；ｒｅｓ．５０のＸａａ＝（ＶａｌまたはＬｅｕ）であり；ｒｅｓ．５２のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＴｈｒ）であり；ｒｅｓ．５６のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＬｅｕ）であり；ｒｅｓ．５７のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＭｅｔ）であり；ｒｅｓ．５８のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．６０のＸａａ＝（Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＡｓｎ）であり；ｒｅｓ．６１のＸａａ＝（Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＶａｌ）であり；ｒｅｓ．６５のＸａａ＝（ＰｒｏまたはＡｌａ）であり；ｒｅｓ．７１のＸａａ＝（ＧｌｎまたはＬｙｓ）であり；ｒｅｓ．７３のＸａａ＝（ＡｓｎまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．７５のＸａａ＝（ＩｌｅまたはＴｈｒ）であり；ｒｅｓ．８０のＸａａ＝（ＰｈｅまたはＴｙｒ）であり；ｒｅｓ．８２のＸａａ＝（ＡｓｐまたはＳｅｒ）であり；ｒｅｓ．８４のＸａａ＝（ＳｅｒまたはＡｓｎ）であり；ｒｅｓ．８９のＸａａ＝（ＬｙｓまたはＡｒｇ）であり；ｒｅｓ．９１のＸａａ＝（ＴｙｒまたはＨｉｓ）であり；そしてｒｅｓ．９７のＸａａ＝（ＡｒｇまたはＬｙｓ）である。
【０１０６】
なお別の好ましい実施形態において、有用な骨原性活性タンパク質は、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、参照モルホゲン配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする核酸によりコードされる配列を含むアミノ酸を含む、ポリペプチド鎖を有し、この参照モルホゲン配列は、例えば、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、６０Ａ、ＧＤＦ−３  ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７などの保存された７つのシステインドメインを規定するＣ末端配列である。本明細書中で使用される場合、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、３７℃で一晩、４０％ホルムアルデヒド、５×  ＳＳＰＥ、５×デンハート溶液、および０．１％  ＳＤＳ中での、公知技術に従うハイブリダイゼーション、ならびに５０℃での０．１×  ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ中での洗浄として、規定される。標準的ストリンジェント条件は、市販の標準的分子クローニングの教科書中に十分に特徴付けられている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）：Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編．１９８４）；ならびにＢ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１０７】
上記のように、本発明において有用なタンパク質は、一般的に、上記のポリペプチドのフォールディングされた対を含む、ダイマータンパク質である。そのような形態形成タンパク質は、還元された場合に不活性であるが、酸化ホモダイマーとして活性であり、本発明の他のものと組み合わせて酸化された場合に、ヘテロダイマーを生じる。従って、形態形成活性タンパク質中の形態形成ポリペプチドのフォールディングされた対のメンバーは、上記の特定のポリペプチドのいずれかから独立して選択され得る。
【０１０８】
本発明の材料および方法において有用な骨形成タンパク質としては、上記のポリペプチド鎖のいずれかを含むタンパク質（天然に存在する供給源から単離されたか、組換えＤＮＡ技術もしくは他の合成技術により生成されたかに、関わらない）が挙げられ、そしてこれらのタンパク質の対立遺伝子改変体および系統発生対応物改変体、ならびにそれらのムテイン、ならびに種々の短縮構築物および融合構築物が挙げられる。欠失変異体または付加変異体もまた、活性であると想定され、そのような変異体としては、保存的Ｃ末端６システインドメインまたは７システインドメインを変更し得る変異体であって、但し、その変更が、フォールディングされた構造においてこれらのシステインの関係を機能的には破壊しない、変異体が挙げられる。従って、そのような活性形態は、本明細書中に開示される特に記載された構築物の等価物であると見なされる。それらのタンパク質としては、種々のグリコシル化パターンを有する形態、種々のＮ末端を有する形態、アミノ酸配列相同性の領域を有するあるファミリーの関連タンパク質、および宿主細胞において組換えＤＮＡの発現により生成されたネイティブタンパク質もしくは生合成タンパク質の活性短縮形態もしくは活性変異形態が挙げられ得る。
【０１０９】
本明細書中に企図される骨形成タンパク質は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において、インタクトなｃＤＮＡもしくは短縮型ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡから発現され得、そして精製され得、切断され得、リフォールディングされ得、そして形態形成活性組成物を形成するように二量体化され得る。現在好ましい宿主細胞としては、限定はしないが、原核生物（Ｅ．ｃｏｌｉを含む）または真核生物（酵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞もしくはＢＳＣ細胞）を含む）が、挙げられる。当業者は、他の宿主細胞が都合良く使用され得ることを理解する。本発明の実施において有用な骨形成タンパク質の詳細な説明（その骨形成タンパク質の生成方法、使用方法、および骨原性活性について試験する方法を含む）が、多数の刊行物（米国特許第５，２６６，６８３号および同第５，０１１，６９１号を含む）（それらの開示は、本明細書中に参考として援用される）ならびに本明細書中にて引用される刊行物のいずれか（それらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に開示されている。
【０１１０】
従って、本開示および当該分野において利用可能な知識を考慮すると、遺伝子工学の当業者は、種々の異なる生物学的種のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーから、適切なアミノ酸配列をコードする遺伝子を単離し得るかまたはオリゴヌクレオチドからＤＮＡを構築し得、その後、その遺伝子またはＤＮＡを、種々の型の宿主細胞（原核生物および真核生物の両方を含む）において発現させて、哺乳動物における軟骨性骨形成を刺激可能である大量の活性タンパク質を生成し得る。
【０１１１】
（形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ））
本発明に従う形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ）は、形態形成タンパク質が前駆細胞からの組織形成を誘導する能力を刺激可能である因子である。このＭＰＳＦは、この形態形成タンパク質による組織誘導に対して付加的効果を有し得る。好ましくは、このＭＰＳＦは、この形態形成タンパク質による組織誘導に対して相乗効果を有し得る。
【０１１２】
本発明の形態形成タンパク質により増殖および／または分化するように誘導される前駆細胞は、好ましくは、哺乳動物細胞である。前駆細胞としては、哺乳動物の軟骨芽細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、神経芽細胞、および血管組織前駆細胞、それらの発生初期前駆体すべて、ならびにそれらから発生する細胞すべて（例えば、軟骨芽細胞、プレ軟骨芽細胞、および軟骨細胞）が、挙げられる。しかし、形態形成タンパク質は、進化の間に高度に保存されており、非哺乳動物前駆細胞もまた、同じ種または交差種の形態形成タンパク質およびＭＰＳＦの組み合わせによって刺激される可能性がある。従って、有害な免疫学的反応を引き起こすことなくヒト中に異種細胞を移植するための計画が利用可能になった場合は、本明細書中に示される手順に従って形態形成タンパク質およびＭＰＳＦによって刺激される非哺乳動物前駆細胞が、ヒトにおける組織再生および組織修復のために有用である。
【０１１３】
１つ以上のＭＰＳＦが、誘導されることが所望される組織型、および形態形成タンパク質およびＭＰＳＦが投与される部位に従って、１つ以上の形成タンパク質とともに使用するために選択される。形態形成タンパク質／ＭＰＳＦの組み合わせの特定の選択およびそれらが組み合わされる相対濃度は、本明細書中に記載される手順を使用して、選択された処置部位で誘導される組織型を最適にするために系統的に変化され得る。
【０１１４】
本発明の好ましい形態形成タンパク質刺激因子（ＭＰＳＦ）は、ホルモン、サイトカイン、および増殖因子からなる群より選択される。骨形成タンパク質とともに骨形成および／または軟骨形成を誘導するために最も好ましいＭＰＳＦは、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−１）、エストラジオール、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、成長および分化因子（ＧＤＦ）、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）、インスリン、プロゲステロン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、ビタミンＤ（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３）、レチノイン酸およびインターロイキン（特に、ＩＬ−６）からなる群より選択される、少なくとも１つの化合物を含む。
【０１１５】
本発明の別の好ましい実施形態において、このＭＰＳＦは、別のＭＰＳＦの生物活性を増加可能である、化合物または因子を含む。ＭＰＳＦの生物活性を増加させる因子としては、例えば、そのＭＰＳＦの合成、半減期、他の生体分子（例えば、結合タンパク質およびレセプター）との反応性またはバイアベイラビリティを増加させる、因子が挙げられる。これらの因子は、ホルモン、増殖因子、ペプチド、サイトカイン、キャリア分子（例えば、タンパク質または脂質）、またはこのＭＰＳＦの発現もしくは安定性を増加させる他の因子を包含し得る。
【０１１６】
例えば、選択されたＭＰＳＦがＩＧＦ−Ｉである場合、ＩＧＦ−Ｉの生物活性を増加させる薬剤としては、ＧＨ、ＰＴＨ、ビタミンＤおよびｃＡＭＰの誘導物質が挙げられ、これらは本発明に従うＭＰＳＦとして機能し得る。さらに、ほぼ全ての循環中のＩＧＦ−Ｉおよびほぼ全ての細胞外空間は、ＩＧＦ−Ｉの生物活性を増加または阻害し得る、高い親和性で結合するＩＧＦＢＰと呼ばれるタンパク質の群により結合される（例えば、ＪｏｎｅｓおよびＣｌｅｍｍｏｎｓ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６、第３〜３４頁（１９９５））。従って、ＩＧＦＢＰのレベルを変化させ、その結果生物活性なＩＧＦ−Ｉ濃度を限界まで増加させる、ＩＧＦＢＰおよび薬剤もまた、本発明に従ってＭＰＳＦとして機能する。
【０１１７】
ＩＧＦ−Ｉ生物活性を増加させるこれらの薬剤または他の薬剤は、初期のＭＰＳＦとして単独で使用されるか、または１つ以上の薬剤が、ＩＧＦ−Ｉと組み合わせて、付加的なＭＰＳＦとして使用されて、形態形成タンパク質の組織誘導活性を刺激し得る。軟骨および骨の形成のための少なくとも２つのＭＰＳＦを含む、１つのこのような好ましい組み合わせは、骨形成タンパク質のＯＰ−１、ＩＧＦ−ＩおよびＰＴＨである。
【０１１８】
好ましくは、このＭＰＳＦは、哺乳動物において、形態形成タンパク質の組織誘導活性を相乗的に刺激し得る量で存在する。哺乳動物に投与される場合に、最適に組織形成を誘導する、形態形成タンパク質およびＭＰＳＦの相対濃度は、本明細書中に記載した手順を使用して、当業者によって経験的に決定され得る。
【０１１９】
（移植デバイス）
本発明はまた、骨の形成、再生および修復を促進するための移植デバイスにも関する。この移植デバイスは、本発明の多孔性β−ＴＣＰ材料、および必要に応じて少なくとも１つの生物活性剤を含む。
【０１２０】
多孔性β−ＴＣＰ材料を含む移植デバイスは、遊走性の前駆体細胞を集合させるための一時的な足場および基層として、そしてそれら細胞のその後の固着および増殖のための基点として役立つ。
【０１２１】
好ましい実施形態において、移植デバイスは、多孔性β−ＴＣＰマトリクスおよび生物活性剤を含み、この生物活性剤はマトリクス中で分散または吸収される。生物活性剤としては、骨形成タンパク質、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、サイトカイン、ＭＰＳＦ、ホルモン、ペプチド、脂質、栄養剤および治療的組成物（抗生物質および化学治療剤を含む）、インスリン、化学誘引物質、化学走化性因子、酵素、酵素阻害剤が挙げられ得るが、これらに限定されないことが想定される。また、ビタミン、細胞骨格物質、自家移植片、同種移植片、軟骨断片、生細胞（例えば、軟骨細胞、骨髄細胞、間葉幹細胞）、組織移植片、免疫抑制剤のような生物活性剤が、多孔性β−ＴＣＰに添加され得ることが想定される。
【０１２２】
多孔性β−ＴＣＰマトリクスは、生物活性剤に徐放性送達システムおよび支持システムを提供し、この生物活性剤は、マトリクス材料が徐々に吸収されるので、移植部位で長期に渡って放出される。好ましい実施形態において、生物活性剤は生分解性剤中にカプセル充填される。生分解性剤の吸収および生物活性剤の徐放は、徐放性の放出システムを提供する。生物活性剤の送達の用量および速度は、多孔性マトリクスの性質、生分解性剤の性質、および生分解性剤中にカプセル充填される生物活性剤、多孔性マトリクスおよび生分解性剤間の結合相互作用の性質に基づいて、制御され得る。好ましい実施形態において、この生物活性剤は、骨形成タンパク質、またはＢＭＰをコードする核酸分子である。最も好ましい実施形態において、そのＢＭＰはＯＰ−１である。
【０１２３】
好ましい実施形態において、生物活性剤はＢＭＰである。より好ましい実施形態において、そのＢＭＰはＯＰ−１である。多孔性β−ＴＣＰマトリクスは、ＢＭＰおよびＭＰＳＦを非特異的なタンパク質分解から保護し得、そして組織成長の間に前駆体細胞の誘導に関係する細胞応答の各々の段階を調節し得る。
【０１２４】
研究により、マトリクスおよび形態形成タンパク質を組み合わせる方法論が、組織誘導を上手く達成することに役割を果たすことが示されている。特定の組み合わせおよび特定の組織細胞型に関する、形態形成タンパク質対ＭＰＳＦの最適な割合は、当業者に経験的に決定され得る。より多くの量は、広範な移植について使用され得る。マトリクス中にＢＭＰおよびＭＰＳＦを処方するために使用される手順は、タンパク質およびマトリクスの両方の物理的状態および化学的状態に対して感受性である。
【０１２５】
多孔性β−ＴＣＰを用いた好ましい骨原性デバイスにおいて、骨原性タンパク質は、マトリクスから出て移植部位中へと拡散して、そして細胞の流入および流出を可能とする。原性タンパク質は前駆体細胞が分化および増殖することを誘導する。前駆体細胞は、マトリクス中へと遊走し得、そして分化した細胞は多孔性マトリクスから出て移植部位中へと移動し得る。骨マトリクス／原性タンパク質の移植片の境界面におけるその後の細胞反応としては、以下が挙げられる：移植されたマトリクスとのフィブリンおよびフィブロネクチンの結合、間葉細胞の遊走および増殖、前駆体細胞の軟骨芽細胞への分化、軟骨形成、軟骨の石灰化、血管侵入、骨形成、再造形、および骨髄分化。多孔性β−ＴＣＰ材料を有する好ましい骨原性デバイスが、様々な整体外科手順、歯周手順および再構築手順において、骨形成に適用され得る。
【０１２６】
移植デバイスはまた、生物活性剤および／または多孔性β−ＴＣＰ材料との混合物において、結合剤も含み得る。この結合剤を添加して成形可能なパテを形成し、このパテは、欠損部位に適合させて、そして新生組織の形態をとるように造形され得る。成形可能なパテの組成物が、周囲の組織または寸断された（ｍａｓｔｉｃａｔｅｄ）筋肉によって場所が保持され得る。組織欠損にまたがり、そして新生組織の所望される形態をとるように、マトリクスを造形することが好ましい。例えば、非接合型欠損についての骨修復の場合、非接合部にまたがる範囲を使用することが望ましい。ラットの研究により、新生骨は、本質的に移植されたデバイスの範囲を有するように形成されることが示される。従って、この材料は、皮下移植または筋肉内移植に対して使用され得る。骨形成の進行において、この材料は生体に徐々に吸収されて、そして移植片の形状で、または移植片に非常に近い形状で、骨に置き換えられる。
【０１２７】
（プロテーゼデバイス）
本発明の多孔性β−ＴＣＰ材料が、プロテーゼデバイスにおいて使用され得ることもまた、企図される。プロテーゼデバイスは、哺乳動物の標的組織に隣接して移植され得る、表面領域、および表面領域上に配置される組成物を含む。プロテーゼデバイスは、処置される哺乳動物における、整体外科的な欠損、損傷または奇形を補修することに有用である。好ましくは、哺乳動物はヒト患者である。プロテーゼデバイスは、金属、セラミックまたはポリマーの複合体材料を含む材料から作製され得る。好ましいプロテーゼデバイスは、Ｃｏ−Ｃｒ−Ｍｏ合金、チタン合金およびステンレス金属から選択される、負荷を受けるコアを含む。好ましいプロテーゼデバイスは、股関節部デバイス、融合ケージ（ｆｕｓｉｏｎ  ｃａｇｅ）および顎顔面デバイスからなる群より選択される。
【０１２８】
この組成物は、本発明のβ−ＴＣＰ材料および、必要に応じて、多孔性β−ＴＣＰ中に分散した生物活性剤または結合剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含む。好ましい実施形態において、生物活性剤は生分解性剤でカプセル充填される。好ましい実施形態において、生物活性剤は、ＢＭＰ（より好ましくはＯＰ−１である）またはＢＭＰをコードする核酸である。骨原性タンパク質に覆われたプロテーゼデバイスは、人工器官と存在する骨との間の結合強度を増強させ得る（Ｒｕｅｇｅｒら、米国特許第５，３４４，６５４号、本明細書中で参考として援用される）。この組成物は、合成により構築された骨材料のための（例えば、人工股関節部、疾患の骨の置換え、欠損の補正または歯の固着のための）コーティングとして作用する。この組成物は、増強された組織成長を移植片の表面中へと促進させるのに十分な量で、移植片の表面上に配置される。増強された組織成長を促進するために十分な組成物の量は、Ｒｕｅｇｅｒら、米国特許第５，３４４，６５４号（本明細書中で参考として援用される）において記載されるバイオアッセイを使用して、当業者により経験的に決定され得る。好ましくは、動物研究を実施して、ヒト患者において同様のプロテーゼデバイスを使用する前に、組成物の成分の濃度を最適化する。
【０１２９】
別の好ましい実施形態において、組成物は、腰、膝、肘および他の関節において全関節形成の臨床手順に適用され、ここで、疾患のまたは損傷した生来の関節を、義装関節で置き換える。例えば、全股関節形成において、寛骨臼杯（ａｃｅｔａｂｕｌａｒ  ｃｕｐ）は、生来の寛骨臼を置換するために、骨盤の寛骨臼窩（ａｃｅｔａｂｕｌａｒ  ｓｏｃｋｅｔ）において、この組成物が挿入される。この杯は、組成物により位置が保持され、そして固定ネジにより締め付けられる。一般的に、空洞または窩は、寛骨臼杯の外側表面に適合する。この組成物はまた、全関節更新外科手術にも適用されて、関節プロテーゼデバイスと骨との間の結合を強化する。
【０１３０】
なお別の好ましい実施形態において、この組成物は椎骨形成（ｖｅｒｔｅｂｒｏｐｌａｓｔｙ）と呼ばれる臨床手順に適用される。この組成物を椎骨体の内部へと注入する。この方法を骨粗鬆症の処置に使用して、骨密度を増加させる。
【０１３１】
好ましい実施形態において、プロテーゼデバイスは、融合ケージ、合わせ釘、および本発明の組成物を含むための体内融合のような、ポケットまたはチャンバーを有する他のデバイスからなる群から選択される。好ましくは、椎体間融合デバイスは、チタン、ＰＥＥＫ（ポリ（エーテルエーテルケトン））および同種移植片からなる群から選択される材料から生産される。頚部、胸部および腰部の脊椎における椎体間融合は、前方または後方からのアプローチを介して施行される。あるいは、本発明の組成物は、椎体間融合を達成するために関連椎体間デバイスを用いずに使用され得る。
【０１３２】
脊椎の融合ケージを、損傷した脊椎の椎間板の除去後に残る椎骨内空間中に設置して、局所的動作を排除してそして椎骨の椎骨質融合に関係する。米国特許第５，０１５，２４７号（本明細書中で参考として援用される）において記載されるように、この融合ケージは円柱状の中空のメンバーの形状であり、融合される２つの隣接した椎骨間の空間よりも大きな外径を有する。円柱状の中空の移植片中の内部空間は、本発明の組成物で満たされ得る。この円柱状の移植片はまた、ネジ山の外側を含み、隣接の椎骨において形成された穿刺孔中にネジ込み挿入（ｔｈｒｅａｄｅｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）を可能とする。あるいは、いくつかの融合移植片は、椎間板内の空間中に嵌入されるよう設計されている。米国特許第６，１４６，４２０号（本明細書中で参考として援用される）において記載されるように、この融合デバイスは、不可欠な中央成分を有する、向かい合った末端部分を含む。この中央成分は、ずっと小さな直径を有し、そのため融合デバイスは中央成分の周囲に環状のくぼみを形成する。本発明の組成物は、向かい合った末端部分の間の環状のくぼみ中に配置され得る。
【０１３３】
好ましい実施形態において、プロテーゼデバイスは、骨および椎間板靱帯の（ｄｉｓｃｏｌｉｇａｍｅｎｔｏｕｓ）不安定性を補修するために使用され得る。本発明の組成物は、椎骨内の領域に適用されて、その結果、優れた融合を生じ得、そして結果として１回の背部のアプローチを介して損傷した運動セグメントの最終的な安定化を達成し得る。この適用は、胸腰の脊椎（ｔｈｏｒａｃｏｌｕｍｂａｒ  ｓｐｉｎｅ）の骨折のための２回目の手術（この手術は、現在では、しばしば必要とされるが付加的に高い危険性を伴う）を受ける必要性を除き得る。また、この方法は、自己海綿骨移植と関連される問題を回避し、そして高い罹患率の自己海綿骨移植の関連される危険性を回避し得る。Ｒｕｅｇｅｒら、Ｏｒｔｈｏｐａｄｅ、２７、第７２〜７９頁（１９９８）を参照のこと。
【０１３４】
別の好ましい実施形態において、プロテーゼデバイスは顎顔面デバイスである。顎顔面デバイスは、癌の外科手術、事故、先天的な奇形に起因する、顔面の欠損を外観上修正するために適用される。咀嚼器官の欠陥を回復するためには、最低限の骨重量を有する患者は、最初に本発明の組成物を用いて処置されて外科手術部位を充填および増加させる。顎顔面の固着システムおよび伸延システムを、米国特許第５，８９９，９４０号（本明細書中で参考として援用される）において例示されるように適用して、存在する骨質を増加させ得る。顎顔面の骨移植部位に対して、組織片および合成膜を保存するために、固定デバイス（例えば、標準的なネジ山のついた骨ネジおよび単純なピンポイント（ｐｉｎ  ｐｏｉｎｔ）びょうまたは自動固定式かつネジ山式の骨びょうネジデバイス（米国特許第５，９７１，９８５号、本明細書中で参考として援用される））を使用する。一旦その部位が治癒すると、２回目の外科手術を実施して、適切な長さの骨内部の（ｅｎｄｏｓｓｅｏｕｓ）歯の移植片を挿入し、そして咀嚼機能を回復する。
【０１３５】
本発明はまた、本発明の移植可能なプロテーゼデバイスの、哺乳動物の標的組織中へのインビボ組み込みを促進する方法を提供し、以下の工程を含む：ａ）プロテーゼデバイスの表面上に、多孔性β−ＴＣＰ材料、必要に応じて、少なくとも１つの生物活性剤または結合剤を含む組成物を提供する工程、ならびにｂ）このデバイスを、標的組織およびプロテーゼデバイスの表面が、標的組織とそのデバイスとの間の組織成長を可能とする十分な時間の間に、少なくとも部分的に接触した状態で維持される位置にて、哺乳動物に移植する工程。
【０１３６】
（骨形成の誘導および送達の方法）
本発明はまた、哺乳動物において骨形成を誘導する方法を提供する。好ましくは、その哺乳動物はヒトの患者である。この方法は、哺乳動物の欠損部位に、本発明の多孔性β−ＴＣＰを含む組成物を移植する工程を包含する。好ましい実施形態において、その組成物はさらに結合剤および／または生物活性剤を含み得る。その欠損は軟骨内欠損、骨軟骨欠損または分節欠損であり得る。この方法は、非接合性骨折；骨空洞；腫瘍切除；新たな骨折（粉砕または非粉砕）；頭蓋、顎顔面および顔面の奇形（例えば、顔面骨の再構築、特に、眼窩底再構築における奇形）、歯槽堤または歯槽湾曲部（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｉｎｕｓ）の増強、歯周部欠損および歯抜去ソケット；頭蓋形成、おとがい形成、顎増強、口蓋再構築、および他の大規模な骨の再構築；椎骨形成（ｖｅｒｔｅｂｒｏｐｌａｓｔｙ）、頚部、胸部および腰部の脊椎における椎体間融合、ならびに胸部および腰部の脊椎における後方側面融合（ｐｏｓｔｅｒｉｏｌａｔｅｒａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）；骨再生に関する骨髄炎において；四肢融合、足根関節融合、全体的な股関節部、膝および関節の融合または関節形成；腱および／または靭帯の組織欠損の修正（例えば、前方、後方、側方および内側の膝靭帯）、膝蓋骨およびアキレス腱、など、ならびに癌、関節炎（変形性関節炎を含む）に起因する、それらの欠損、ならびに骨軟骨炎（ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｉｔｉｓ  ｄｅｓｓｉｃａｎ）のような、他の骨変性障害、に適用されるが、これらに限定されない。この方法は、骨増強、骨補てつ、硬組織移植、骨の足場、固定システム（例えば、ネジ、縫合糸、縫合留め具、ステープル（ｓｔａｐｌｅ）、外科手術のびょう、クリップ、プレートおよびネジ）において、使用され得る。
【０１３７】
本発明はまた、骨形成を必要とする部位に生物活性剤を送達する方法を提供し、この方法は、哺乳動物の欠損部位に多孔性β−ＴＣＰおよび生物活性剤を移植する工程を含む。生物活性剤を送達する方法は、さらに結合剤を含む。好ましい実施形態において、この生物活性剤は生分解性剤でカプセル充填される。好ましい実施形態において、この生物活性剤は、骨形成タンパク質ファミリーに属する。別の好ましい実施形態において、生物活性剤は、ＢＭＰをコードする配列を含む核酸分子である。好ましくは、この核酸はキャリアにトラップされる。なお別の実施形態において、生物活性剤は、ＢＭＰをコードする核酸でトランスフェクトされた、骨細胞または細胞である。別の好ましい実施形態において、この生物活性剤の送達は、徐放性放出である。好ましくは、生分解性剤は、生体適合性かつ非免疫原性のポリマーであり、より好ましくは、ＰＬＧＡである。生物活性剤は、好ましくはＯＰ−１である。生物活性剤の放出速度は、ＰＬＧＡの分子量を変化させることにより、制御され得る。ＰＬＧＡの分解は、水分がセメントマトリクスに浸透して長いポリマー鎖を加水分解して短い水溶性フラグメントにする場合に、開始する。この結果、ＰＬＧＡの物理的特性を損なわずにＰＬＧＡの分子量の減少が生じる。次第に、このポリマーはさらに浸食されて、そのポリマーの崩壊へと導き、それによって生物活性剤を放出する。例えば、１０ｋＤ〜３０ｋＤのＰＬＧＡの場合、ＯＰ−１についての放出速度は１週間〜６週間である。
【０１３８】
本発明はまた、軟骨形成に必要とされる部位に生物活性剤を送達する方法を記載し、この方法は哺乳動物の欠損部位に生物活性剤および生分解性剤を含む組成物を移植する工程を包含し、ここで生物活性剤は生分解性剤中にカプセル充填される。好ましくは、生物活性剤はＯＰ−１であり、生分解性剤はＰＬＧＡである。
【実施例】
【０１３９】
（実施例１：リン酸三カルシウムの調製）
石灰（酸化カルシウム水和物）のスラリーを調製して、そしてスラリーを一定に攪拌して、希釈したリン酸をそのスラリーに滴下する。酸化カルシウム対リン酸のモル比率は、３：２である。その生成物の特徴を、Ｘ線回折により評価して、そして必要な場合、その比率に調整を施す。生じたスラリーを噴霧乾燥により回収する。スラリーをフィルター濾過により回収する場合、乾燥したケーキをアモルファスＴＣＰの微細な粉末まで粉砕する。好ましくは、アモルファスＴＣＰの粒子径は１０μｍよりも小さい大きさである。
【０１４０】
（実施例２：β−ＴＣＰ顆粒の調製）
ＴＣＰ粉末を、ポリスチレンビーズ（ＮＵＮＣ  Ａ／Ｓ−Ｄｅｎｍａｒｋ）（０〜１６０μｍビーズ）と混合した。１０％  ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）顆粒化溶液を、溶液が透明になるまで、ビーカーまたはフラスコ中にＰＶＰ  Ｃ−３０（Ｐｌａｓｄｏｎｅ  Ｃ−３０，ＩＳＰ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ロット番号ＴＸ６０８１０）を、水を攪拌しながら少量ずつ添加することによって調製した。約３７ｍｌの１０％  ＰＶＰ溶液を、５ｍｌずつＴＣＰ混合物に添加して、脆い塊を形成した。表１に例示するように、混合物を、異なる割合の細孔形成ビーズおよびＴＣＰにより調製した。
【０１４１】
【表１】
2005505311.tif 000013
この脆い塊を、振動運動下で５００μｍ未満、５００〜１０００μｍ、または１０００〜１７００μｍ篩に通過させて、対応する粒子サイズ範囲を有する湿潤顆粒を生成した。この篩を通した材料を、１０５℃にて２〜３時間、真空下で乾燥させた。
【０１４２】
次いで、乾燥させた顆粒を、燃焼サイクル（ｂｕｒｎ  ｏｆｆ  ｃｙｃｌｅ）に供して、細孔形成材料を蒸発／炭化処理（ｃａｒｂｏｎｉｚｅ）し、引き続き、１１５０℃にて焼結させた。１８時間かけて温度を３９℃から３００℃に上昇させ、１時間にわたり３００℃に保持し、１８時間かけて７００℃に上昇させ、２時間にわたり７００℃に保持し、６時間かけて１１５０℃に上昇させ、６時間にわたり１１５０℃に保持し、６時間かけて、ゆっくりと３９℃まで冷却した。焼結サイクルの後、得られた材料を、Ｘ線回折により多孔性結晶β−ＴＣＰであることを確認した。
【０１４３】
３７．５％  ｗ／ｗ，５００〜１０００μｍの焼結した顆粒を、再度篩に通して、結合剤（カルボキシメチルセルロースナトリウム）と混合して、成形可能なパテを形成した。このパテ混合物を、異なる割合のβ−ＴＣＰおよびＣＭＣにより形成した。β−ＴＣＰおよびＣＭＣの全ての組み合わせは、適切な接着特性を有するパテを生じ、過剰な水中で壊れなかった。このパテの粘着性は、ＣＭＣの割合が増大するにつれて増した。β−ＴＣＰ／ＣＭＣが１：０．４（ｗ／ｗ）のパテは、取り扱いに関する最良の特性を示した。種々のサンプルのレオロジー特性を決定した。
【０１４４】
（実施例３：骨誘導のためのラットモデルバイオアッセイ）
このアッセイは、エーテル麻酔下でのレシピエントラットの皮下部位におけるサンプルの移植からなる。雄性Ｌｏｎｇ−Ｅｖａｎｓラット（２８〜３２日齢）を使用し得る。無菌条件下で胸郭領域の皮膚に垂直切開（１ｃｍ）を作製し、ポケットを、鈍的剥離（ｂｌｕｎｔ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）により調製した。約２５ｍｇの試験サンプルを、ポケットの深くに移植し、この剥離を、金属皮膚クリップを使用して閉じる。移植日を、実験の１日目とした。移植物を、その後の異なる時間（すなわち、１２日、１８日）にて除去した。従属栄養（ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）部位により、垂直向性部位の使用から生じる、あり得る不明確性を有さない骨誘導の研究が可能になる。
【０１４５】
骨の成長を、移植物のカルシウム含有量により生化学的に決定する。カルシウム含有量は、移植物中に形成された骨の量に比例する。従って、骨の形成は、ラットにおける移植物のカルシウム含有量を決定することにより計算され、「骨形成単位」として表す。ここで、１骨形成単位は、移植物の最大骨形成活性の１／２に必要なタンパク質の量である。インタクトな鉱物質除去されたラット骨マトリクスにより示される骨誘導は、このアッセイにおける比較目的のために、最大骨分化活性ととみなされる。
【０１４６】
（軟骨内骨形成の間の細胞事象）
首尾よい移植物は、タンパク質誘導性軟骨内骨発生の段階を通じて、制御された発達を示す。この段階は、以下を含む：（１）多形核白血球による一過性の浸潤；（２）間葉細胞移動および増殖；（３）軟骨細胞の出現；（４）軟骨マトリクス形成；（５）軟骨カルシウム沈着（ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）；（６）血管侵襲、骨芽細胞の出現、および新たな骨の形成；（７）破骨細胞の出現、骨の再構築および移植したマトリクスの分解；ならびに（８）小骨における造血性骨髄分化。ラットにおける時間経過は、添加されるＯＰ−１の量を増大することにより加速され得る。１以上のＭＰＳＦの漸増量もまたこの時間経過を加速し得ることがあり得る。新たな骨の形状は、移植したマトリクスの形と同じになる。
【０１４７】
（組織学的評価）
移植物における骨形成の程度を決定するためには、組織学的切片化および染色が好ましい。移植物を、Ｂｏｕｉｎｓ溶液中で固定し、パラフィン中に包埋し、そして６〜８μｍ切片に切断する。トルイジンブルーまたはヘマトキシリン／エオシンでの染色により、軟骨内骨の最終的な発生が明らかに示される。１２日目の移植物は、通常、移植物が新たに誘導された骨を含むか否かを決定するに十分である。
【０１４８】
（生物学的マーカー）
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性を、骨原性についてのマーカーとして使用し得る。この酵素活性を、移植物のホモジナイゼーション後に分光光度計により決定し得る。活性は、インビボで９〜１０日にピークに達し、その後ゆっくりと減少する。組織学により骨発生を示さない移植物は、これらのアッセイ条件下では、アルカリホスファターゼ活性がほとんどないか、まったくない。このアッセイは、定量およびラットから移植物が除去された後に迅速に骨形成の予測を得るために有用である。あるいは、骨形成の量は、移植物のカルシウム含有量を測定することにより決定され得る。
【０１４９】
軟骨内骨または他の型の組織形成と相関する遺伝子発現パターンもまた、ノーザンブロット分析のような、当業者に公知の手順を使用してｍＲＮＡレベルを定量することによりモニターされ得る。このような発生的遺伝子発現マーカーを使用して、骨形成タンパク質／ＭＰＳＦ処置の後に、組織分化経路を介した発達を決定し得る。これらのマーカーとしては、骨芽細胞関連マトリクスタンパク質（例えば、プロコラーゲンα２（Ｉ）、プロコラーゲンα１（Ｉ）、プロコラーゲンα１（ＩＩＩ）、オステオネクチン、オステオポンチン、ビグリカン、および骨再生に関してのアルカリホスファターゼ（例えば、Ｓｕｖａら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，８，ｐｐ．３７９−８８（１９９３）；Ｂｅｎａｙａｈｕら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，ｐｐ．６２−７３（１９９４）を参照のこと））が挙げられる。
【０１５０】
（実施例４：骨修復のヒツジモデルバイオアッセイ）
骨格が成熟した雌性ヒツジを、この研究に含めた。３つの欠損を、各動物の左脛骨および右脛骨の両方について近位骨幹端の領域にドリルで作製した。欠損は、直径６ｍｍであり、少なくとも１０ｍｍの深さであった。この欠損のサイズは、全ての試験動物で一貫していた。この欠損を、骨間線維脂肪骨髄の構造を維持するように作製した。この骨髄は、移植物材料間で障壁として働き、試験マトリクス材料の骨間の混合を防止する。表２に例示されるように、β−ＴＣＰパテＩ、β−ＴＣＰパテＩＩ、β−ＴＣＰパテＩＩＩ、β−ＴＣＰパテＩＶおよびコラーゲンを、ＯＰ−１ありまたはなしで欠損部位にて試験した。ＯＰ−１は、β−ＴＣＰ処方物中に直接添加したかまたはＰＬＧＡ中にカプセル化したかのいずれかであった。表３は、ＯＰ−１がＰＬＧＡ中にカプセル化される処方物の例を示す。各動物における６つの欠損部位のうち、試験物質を含まない１つの欠損部分を、コントロールとして使用した。
【０１５１】
３〜４インチの切開を、近位頸骨骨幹端に作製した。皮膚および下にある筋肉を切開して、骨膜を露出した。この骨膜に切込みを入れ、可能であれば、外科的な閉鎖のために、インタクトなままにした。３つの横断孔を骨幹端に作製した。第１の最も上にあるものは、頸骨の関節表面の約２ｃｍ下に作製した。欠損を、骨の長軸と合わせた線を形成するように作製した。移植物は、中心間を測定して、１．６ｃｍの間隔を空けた。
【０１５２】
処置して４週間後および８週間後に材料を採取した。動物を、７５〜１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＶのペントバルビタールで安楽死させた。近位頸骨を採取し、切断して、最適の組織固定を可能にした。標本を、１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定した。標本を、実現可能であれば、１つの標本中に全ての移植物部位を捕捉するように切断した。固定の後、標本を脱石灰化し、プラスチック中に包埋し、Ｅｘａｃｋｔ技術を使用して長手軸方向に切片を作製し、組織学的解釈のために適切な切片厚に挽いた。
【０１５３】
放射線写真評価（図９〜１６，２７および２８）および組織学的評価（図１〜８）を、全ての移植部位に対して術後４週間および８週間に行った。３つの欠損全てを同時に画像化し、側方から円筒状欠損を見るために、前後の放射線写真を撮影した。定性的組織学的説明により、新たな骨形成、残りの移植物材料および病理学的応答の全ての証拠が同定された。各標本についての画像を記録し、骨形成、急性炎症および慢性炎症ならびに残りのマトリクスについてのスコアを示した。
【０１５４】
標本の取り扱い特性および止血特性を、移植のときに記録した。材料は、パテまたは顆粒形態から半固体円筒状の形態およびコンシステンシーの範囲であった。
【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
【表３】
2005505311.tif 000015
（処方物取り扱い）
Ｌｙｏｐｈｉｌ  １およびＬｙｏｐｈｉｌ  ２（プラシーボ）を、２．５ｍｌの再構成培地を１バイアルのＬｙｏｐｈｉｌ（全ての成分を、使用時まで２〜８℃にて凍結保存した）に添加し、均一な（透明〜濁っている）ゲルが形成されるまで２分間にわたり穏やかに培地を振盪することにより再構成した。０．４ｍｌの再構成したＬｙｏｐｈｉｌゲルを、多孔性β−ＴＣＰマトリクスにゆっくりと注意しながら添加した。細いスパチュラを利用して、多孔性β−ＴＣＰマトリクスをゲルと混合して、パテ様材料を形成した。
【０１５７】
０．３％（ｗ／ｗ）ＯＰ−１を使用してカプセル化したＰＬＧＡミクロスフィア（粒子サイズ７５〜１５０μｍ，Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．）を、多孔性β−ＴＣＰマトリクスと混合した。
【０１５８】
パテ材料を、直ぐに移植した。移植材料を、滅菌紙の折りたたんだ小片を使用して配置した。この紙を、試験材料で満たし、その部位において材料を連続して詰め込みながら、欠損へと試験材料を注ぎ込むために使用した。配置前の取り扱い特性および欠損部位における取り扱い特性を記録した。
【０１５９】
β−ＴＣＰパテＩ処方物、β−ＴＣＰパテＩＩ処方物、β−ＴＣＰパテＩＩＩ処方物、β−ＴＣＰパテＩＶ処方物を、顆粒状乾燥粉末として注いだ。ビヒクル溶液と一旦あわせると、これらのパテは、乾燥した脆い顆粒状の外観を有した。これらの処方物は、Ｌｙｏｐｈｉｌ溶液の全てを吸収した。これらの処方物を、スパチュラを使用して移植した。一旦移植部位に入れると、これらの材料は、血液と十分に混ざった。
【０１６０】
コラーゲン処方物を綿毛状の粉末として注いだ。これらが一旦ビヒクル溶液と混合されると、ざらざらとしたパテ状の外観を有した。この処方物は、移植部位中にシリンジを使用して容易に配置され得る。この移植部位は、血液と十分に混ざった。
【０１６１】
（組織学的結果）
近位頸骨切片は、３つの欠損を含んだ。これらの欠損は、厚みのある大きな切片にされた。その結果、この３つの欠損全てが、１つの切片に含められた。厚みのある切片の観察、臨床的アッセイ、およびこの切片のｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線に基づくと、この切片は、サンプルの代表であると考えられた。この方向により、欠損の上に重なる骨膜反応および試験材料に対する骨髄内応答の評価が可能になった。標本を、４週間および８週間の外植片から評価した（図１〜８）。１つの頸骨切片内の３つの欠損全ては、プラシーボまたはＯＰ−１溶液のいずれかを受容した。プラシーボおよびＯＰ−１インプラントのこの分離により、移植物材料の活性または不活性な生物学的性質の決定が容易になった。
【０１６２】
（ＯＰ−１およびプラシーボ移植物材料の４週間の評価）
４週間にて、β−ＴＣＰパテＩ（８９Ａ）は、全ての部位中に存在した（図３の中央部位および図２の遠位部位）。概して、このマトリクスは、有意に再吸収されず、活発な再吸収を受けることもなかった。ＯＰ−１で処置した部位は、いくらかの新たな骨形成を生じたが、顕著な骨形成は生じなかった（図３中央部位）。プラシーボで処置した部位は、皮質のレベルで骨形成を有した（図２遠位部位）。
【０１６３】
β−ＴＣＰパテＩＩ（８９Ｂ）は、４週間で有意な量にてすべての部位に存在した（図３遠位部位および図１近位部位）。マトリクス再吸収の有意な証拠はなかった。ＯＰ−１処理した部位は、目立って皮質レベルおよび骨膜レベルで少量の新たな骨形成を生じた（図３遠位部位）。試験した４つのβ−ＴＣＰパテ処方物のうち、β−ＴＣＰパテＩＩは、他の３つの処方物より大きな炎症を生じた。異物巨細胞（ＦＢＧＣ）は、この炎症と関連して報告された。
【０１６４】
β−ＴＣＰパテＩＩＩ（８９Ｃ）は、４週間で、処置した６つの部位全てに有意な量にて存在した（図１中央部位および図４近位部位）。ＯＰ−１処置は、残りのマトリクス容積を顕著には変化させなかった。皮質レベルでの骨形成が、ＯＰ−１処置標本において存在し（図４近位部位）、プラシーボ処置した部位においてはあまり共通しなかった（図１中央部位）。ＯＰ−１処置とは無関係に、β−ＴＣＰマトリクスに応答した炎症は、ほとんどまたは全く観察されなかった。
【０１６５】
β−ＴＣＰパテＩＶ（８９Ｆ）は、４週間にて、処置した６つの部位全てに有意な量にて存在した（図１遠位部位および図４中央部位）。残りのマトリクス容積に対する効果は、ＯＰ−１処置により明らかではなかった。ＯＰ−１処置部位は、明らかな皮質および膜応答を伴うマトリクス全体を通じたより大きな骨形成を生じた（図４中央部位）。ＯＰ−１処置とは無関係に、β−ＴＣＰマトリクスに応答した炎症はほとんどまたは全く観察されなかった。
【０１６６】
（ＯＰ−１およびプラシーボで処置した移植物材料についての８週間の評価）
β−ＴＣＰパテＩ（８９Ａ）は、８週間で全ての部位に存在した（図７近位部位および図６遠位部位）。ＯＰ−１処置移植物は、概して、強い骨誘導応答の証拠を示した（図７近位部位）。２つのＯＰ−１処置部位において、β−ＴＣＰマトリクスは、有意に分解されたようであった。ＯＰ−１で処置した部位は、骨髄腔内のマトリクスへの中程度の骨浸潤を伴って、皮質レベルで顕著な新たな骨形成活性を生じた。プラシーボ処置部位は、皮質のレベルにてあまり骨形成を生じなかった（図６遠位部位）。
【０１６７】
β−ＴＣＰパテＩＩ（８９Ｂ）は、８週間で、有意な量にて全ての部位に存在した（図５近位部位および図７中央部位）。マトリクス再吸収の有意な証拠は存在しなかった。ＯＰ−１処置部位は、目立って、皮質および骨膜レベルならびに欠損部位における閉鎖にて少量の新たな骨形成を生じた（図７中央部位）。プラシーボ処置材料は、皮質レベルおよび皮質欠損のカルシウム粒子ブロック閉鎖にてあまり骨形成を生じなかった（図５近位部位）。この材料に応答して以前に認められた炎症は、明らかではなかった。
【０１６８】
β−ＴＣＰパテＩＩＩ（８９Ｃ）は、８週間で、処置した６つ全ての部位に有意な量にて存在した（図５中央部位および図７遠位部位）。ＯＰ−１処置は、残りのマトリクス容積を顕著に変化させなかった。皮質レベルにおける骨形成および顕著な骨膜応答は、ＯＰ−１処置標本において明らかであった（図７遠位部位）。ＯＰ−１処置とは無関係に、β−ＴＣＰマトリクスに応答した炎症は、ほとんどまたは全く観察されなかった。
【０１６９】
β−ＴＣＰ  パテ  ＩＶ（８９Ｆ）は、８週目に処理した６つの部位全てにおいて有意な量で存在した（図５、遠位部位、および、図８、近位部位）。いくつかの部位では、残りのマトリクスが他の部位よりも少なかった。一般に、ＯＰ−１処理は、残りのマトリクスの量に対して明らかな効果を有さなかった。ＯＰ−１処理した部位は、明らかな皮質応答および骨膜応答を有するより多い骨形成を、マトリクス全体にわたって生じた（図８、近位部位）。ＯＰ−１処理非依存的にβ−ＴＣＰマトリクスに反応する炎症は、ほとんど観察されないか、全く観察されなかった。
【０１７０】
（上記の結果の結論）
ＦＢＧＣ応答と結びついた急性炎症および慢性炎症を示したコラーゲンマトリクスと比較して、４回の多孔性β−ＴＣＰ処方は、４週目および８週目に、炎症をほとんど生じないか、全く生じなかった。多孔性β−ＴＣＰ材料におけるＯＰ−１処理は、皮質レベルでの顕著な骨形成、および骨欠損閉鎖をしばしば生じる反応性の骨膜応答を一貫して示した。大きな顆粒（１〜２ｍｍ）β−ＴＣＰ  パテ  ＩＶ処方によって、骨はマトリクスにより深く内殖し得るようであるが、小さな顆粒β−ＴＣＰ  パテにおいて観察されたものと比較してより大きな顆粒間空間が存在した。
【０１７１】
（パラフィン組織学研究）
粒子内および粒子周囲における骨形成に対する、インプラント材料の粒子サイズおよび多孔度の効果を評価するために、ヒツジモデルバイオアッセイからの組織を、パラフィン切片、ならびにヘマトキシリンおよびエオシンの染色を使用して評価した。
【０１７２】
近位部位、中位部位および遠位部位におけるインプラント部位を４匹の動物（１３８、２９９、２９７および２９５）から単離するために、脛骨標本を切片化した。これらの外移植片を、脱石灰し、パラフィンに包埋し、切片化して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１７３】
切片を、光学顕微鏡を使用して観察し、粒子サイズおよび多孔度の効果について判断した。骨形成において層状化した標本について、皮質レベルからの応答は、強固かつ深く、そしてこの応答は、髄質区画において適度であった。この層状化に起因して、骨内膜皮質から２〜３ｍｍの深さのレベルまで伸長するレベルを評価した。
【０１７４】
４つのセラミック処方物の各々を、細孔における骨形成、および粒子をまたぐ骨架橋について評価した。隣接するストロマから粒子内に完全に単離された細孔を計数することによって、細孔における骨形成を評価した。明るくかつ概して丸い細孔を、計数した。細孔を計数する場合、骨を有したものと有さなかったものとの比を生成した。これを、細孔占有率（ｐｏｒｅ−ｆｉｌｌ）比と記す。
【０１７５】
その視野を走査することによって、細孔の計数を行った。少数の細孔を有する材料において、その視野を走査した場合に、その多数を計数した（図２５）。多くの細孔を有する材料において、領域を計数し、そして新たな領域を観察し、次いで計数した（図２６）。この領域の平均または総数を、比で示した。
【０１７６】
粒子間を架橋する骨を、０〜２とスコア付けした。隣接する粒子を骨が架橋しない場合、スコア０を粒子に付与した。少数の粒子の対が一貫して架橋を示した場合、スコア１を付与した。多くの粒子が生き生きした（ｖｉｔａｌ）骨小柱によって連結された場合、スコア２を付与した。
【０１７７】
表４および５は、４週目でのプラシーボおよびＯＰ−１についての細孔占有率比および骨架橋スコアを示す（図１７〜２０）。表６および７は、８週目でのプラシーボおよびＯＰ−１についての細孔占有率比および骨架橋スコアを示す（図２１〜２４）。骨架橋は、β−ＴＣＰ  パテが３７．５％（ｗ／ｗ）の細孔形成剤で作製されておりかつ０．５〜１ｍｍのより小さな顆粒サイズを有することを、より表した（図４〜７）。細孔占有率比によると、２５％（ｗ／ｗ）および３７．５％（ｗ／ｗ）の細孔形成剤で作製されているβ−ＴＣＰ  パテが、概して等しかった。１２．５％（ｗ／ｗ）の細孔形成剤で作製されているβ−ＴＣＰは、より低い孔占有率比を有した（図４〜７）。細孔占有率比は、粒子当たりより多くの細孔を有するより大きなサイズの粒子（１〜２ｍｍ）に起因して、８９Ｆ処方物において、一貫してより高かった。小さな粒子（０．５〜１ｍｍ）と比較して、大きな粒子を架橋するためにより多くの骨が必要とされた事実に起因して、より大きな粒子において骨架橋はほとんど存在しなかった。
【０１７８】
【表４】
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注釈：切片２９７Ｒ−Ｄは、動物２９７の右側（Ｒ）、遠位部位（Ｄ）由来である。切片２９７Ｌ−Ｐは、動物２９７の左側（Ｌ）、近位部位（Ｐ）由来である。切片２９７Ｌ−Ｍは、動物２９７の左側（Ｌ）、中央部位（Ｍ）由来である。切片２９７Ｌ−Ｄは、動物２９７の左側（Ｌ）、遠位部位（Ｄ）由来である。
【０１７９】
【表５】
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注釈：切片２９５Ｌ−Ｍは、動物２９５の左側（Ｌ）、中央部位（Ｍ）由来である。切片２９５Ｌ−Ｄは、動物２９５の左側（Ｌ）、遠位部位（Ｄ）由来である。切片２９５Ｒ−Ｐは、動物２９５の右側（Ｒ）、近位部位（Ｐ）由来である。切片２９５Ｒ−Ｍは、動物２９５の右側（Ｒ）、中央部位（Ｍ）由来である。
【０１８０】
【表６】
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注釈：切片２９９Ｒ−Ｄは、動物２９９の右側（Ｒ）、遠位部位（Ｄ）由来である。切片２９９Ｌ−Ｐは、動物２９９の左側（Ｌ）、近位部位（Ｐ）由来である。切片２９９Ｌ−Ｍは、動物２９９の左側（Ｌ）、中央部位（Ｍ）由来である。切片２９９Ｌ−Ｄは、動物２９９の左側（Ｌ）、遠位部位（Ｄ）由来である。
【０１８１】
【表７】
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注釈：切片１３８Ｌ−Ｐは、動物１３８の左側（Ｌ）、近位部位（Ｐ）由来である。切片１３８Ｌ−Ｍは、動物１３８の左側（Ｌ）、中央部位（Ｍ）由来である。切片１３８Ｌ−Ｄは、動物１３８の左側（Ｌ）、遠位部位（Ｄ）由来である。切片１３８Ｒ−Ｐは、動物１３８の右側（Ｒ）、近位部位（Ｐ）由来である。
【０１８２】
（パラフィン組織学研究の結論）
β−ＴＣＰ処方物について、細孔における骨形成は、空隙率が増加するにつれてより明らかとなる。細孔における骨形成は、３７．５％の細孔形成物で作製される材料と比較して、１２．５％の細孔形成物で作製される材料においてはほとんどなかった。骨形成は、より大きな粒子（１〜２ｍｍ）においてより明らかであるが、これらの大きさの粒子において骨架橋はほとんど観察されなかった。
【０１８３】
コラーゲン処方物は、骨形成を生じず、顕著な病原性応答を生じた。さらに、これらの処方物は、顕著なＦＢＧＣＲおよび慢性線維性炎症（ｆｉｂｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）応答を生じた。
【０１８４】
（実施例５：骨修復についてのネコモデルバイオアッセイ）
大腿骨切り術欠損（ｆｅｍｏｒａｌ  ｏｓｔｅｏｔｏｍｙ  ｄｅｆｅｃｔ）を、外科的に調製する。さらなる介入なしに、シミュレートした骨折欠損は、一貫して非合併に進行する。作製した骨欠損へ移植した骨原性組成物およびデバイスの効果を、以下の研究プロトコルによって評価する。
【０１８５】
簡単には、手順は、以下のとおりである：１６匹の成体ネコ（各々体重は１０ｌｂｓ．未満）は、側方外科アプローチを介して右大腿にて１ｃｍ骨欠損の一側性の調製物を受ける。他の実験において、２ｃｍの骨欠損を作製し得る。大腿を、８穴プレートの側方配置によって即座に内部固定して、欠損の正確な寸法を保護する。異なる４つの型の材料を、外科的に作製したネコ大腿欠損に移植し得る：Ｉ群は、試験材料なしのネガティブコントロール群である；ＩＩ群は、生物学的に活性な多孔性β−ＴＣＰで移植される；ＩＩＩ群は、多孔性β−ＴＣＰおよび骨原性タンパク質で移植される；そして、ＩＶ群は、多孔性β−ＴＣＰ、骨原性タンパク質およびＭＰＳＦで移植される。
【０１８６】
全ての動物を、術後にケージ内で適宜移動させる。全てのネコに、骨を標識するためにテトラサイクリン（皮下的に（ＳＱ）２５ｍｇ／ｋｇ、４週にわたって各週）を注射する。
【０１８７】
大腿および骨切り術部位の正確な前後野（ａｎｔｅｒｉｏ−ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｖｉｅｗ）を一貫して生成するように設計されたクッション性のＸ線ジグ内に配置した、軽く麻酔した動物を、標準化したＸ線で撮影することによって、インビボでの放射性形態計測研究を、手術の４週後、８週後、１２週後および１６週後に即座に行った。全てのＸ線を、同一様式で正確に、各動物上の同一位で正確に、行う。骨修復を、無作為な点での分析による鉱化作用の関数として計算する。切除した骨の最終標本のＸ線撮影研究を、屠殺後の２つの平面で行う。
【０１８８】
切除した試験大腿および正常大腿を、骨デンシトメトリーによって即座に研究し得るか、または生理食塩水に浸した２層のタオルで包み、シールしたプラスチックバッグ中に配置し、さらなる研究まで−２０℃で保存した。特別に設計した、Ｉｎｓｔｒｏｎ試験機械に連結した鋼製の４点曲げのジグで、欠損まで負荷をかけて、骨強度、硬度、吸収エネルギーおよび欠損までの変形を定量することによって、骨修復強度、欠損までの負荷（ｌｏａｄ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）および欠損までの労働（ｗｏｒｋ−ｔｏ−ｆａｉｌｕｒｅ）を、試験する。試験大腿および正常大腿の研究は、ポンドで骨強度（負荷）を、そしてジュールで欠損までの労働を得る。正常大腿は、９６（＋／−１２）ポンドの強度を示す。骨原性デバイスを移植した大腿の強度は、（「くびれた（ｈｏｕｒｇｌａｓｓ）」形状の骨欠損修復に起因して）骨折の部位での表面領域について補正されるべきである。この補正によって、結果は、正常骨強度と蜜に相関するはずである。
【０１８９】
生物メカニカル試験に続いて、骨を、欠損部位で２つの縦断切片に即座にスライスし、秤量し、そして容量を測定する。蛍光染色取り込み評価を用いる標準的な石灰化した骨の組織形態学のために、２分の１を固定し、そして、脱石灰化したヘマトキシリン／エオシン染色組織学調製のために、２分の１を固定する。
【０１９０】
骨修復由来部位の切片化した標本を、０．１５Ｍの冷ＮａＣｌ、３ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．０）中で、Ｓｐｅｘ  Ｆｒｅｅｚｅｒミルによってホモジナイズする。次いで、上清のアルカリホスファターゼ活性、および沈殿物の酸可溶性画分の総カルシウム含量を測定する。
【０１９１】
（実施例６：骨修復についてのウサギモデルバイオアッセイ）
このアッセイは、Ｏｐｐｅｒｍａｎｎら、米国特許第５，３５４，５５７号に詳細に記載される。Ｃｏｏｋら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，７６−Ａ、８２７〜３８頁（１９９４）もまた参照のこと（これらは、本明細書中に参考として援用される）。１．５ｃｍの尺骨非合併欠損を、Ｘ線で示された骨端閉鎖を有する、成熟した（１０ｌｂｓ未満）Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギに作製する。この実験は、以下のような群当たり少なくとも８羽のウサギへのデバイスの移植を含み得る：Ｉ群  試験材料なしのネガティブコントロール移植；ＩＩ群  多孔性β−ＴＣＰでの移植；ＩＩＩ群  多孔性β−ＴＣＰおよび骨形成性タンパク質での移植；ＩＶ群  多孔性β−ＴＣＰ、骨原性タンパク質およびＭＰＳＦの組み合わせでの移植。尺骨欠損を、各群のウサギにおいて８週の研究の全過程について追跡する。
【０１９２】
別の実験において、１．５ｃｍの尺骨欠損の骨髄腔を、ＭＰＳＦの存在下または非存在下での多孔性β−ＴＣＰ中の活性化した骨原性タンパク質でパックする。骨を、介在様式で同種移植する。ネガティブコントロール尺骨は、８週目まで治癒されず、古典的な「象牙」の外観を示す。明瞭なコントラストにおいて、骨原性タンパク質／ＭＰＳＦ処理したインプラントは、４週目までＸ線撮影では「現れず」、６〜８週目までに再鉱化の開始する。これらの同種移植片は、８週目までに穏やかな増殖性骨形成を伴って両端で治癒する。この型のデバイスは、同種移植片修復を促進させるように働く。
【０１９３】
ＭＰＳＦの存在下で骨原性タンパク質で処理したインプラントは、促進された修復を示し得るか、またはより低濃度の骨原性タンパク質の使用と同速度で機能し得る。上記するように、ウサギモデルをまた使用して、特定の骨原性タンパク質／ＭＰＳＦ組み合わせが局所骨形成を誘導し得る効率を試験し得、そしてその条件を最適化し得る。
【０１９４】
（実施例７：骨修復についてのイヌ尺骨欠損バイオアッセイ）
このアッセイを、Ｃｏｏｋら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０１、３０２〜１１２頁（１９９４）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように本質的に行う。簡単には、尺骨セグメント化欠損モデルを使用して、３５〜４５ｋｇの雄成犬における骨治癒を評価する。５００ｍｇの多孔性β−ＴＣＰを含む実験用コンポジットを、漸増濃度の、１つ以上の推定のＭＰＳＦの非存在下または存在下で、ＯＰ−１の量を変化させながら再構成する。任意の骨形成性タンパク質を、このアッセイにおいてＯＰ−１の代わりに使用し得る。欠損部位での移植を行い、１つのキャリアコントロールならびにＯＰ−１およびＯＰ−１／ＭＰＳＦ組合わせの一連の実験を試験する。移植１２週後にコンポジットを受けた動物の尺骨にて、機械的な試験を行う。術後１２週または１６週のいずれかで動物を屠殺するまで、毎週、前肢のＸ線撮影を得る。欠損部位および隣接する正常骨からの組織学的切片を分析する。
【０１９５】
１つ以上のＭＰＳＦの存在によって、イヌにおける骨修復速度が上昇し得る。１つ以上のＭＰＳＦの存在によってまた、同様または同一の結果を達成するために、コンポジット当たり低減した濃度の骨原性タンパク質を使用し得る。
【０１９６】
（実施例８：骨修復についてのサルの尺骨欠損および脛骨欠損バイオアッセイ）
この骨治癒アッセイを、Ｃｏｏｋら、Ｊ．Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ、７７Ａ、７３４〜５０頁（１９９５）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、アフリカミドリザルにおいて本質的に行う。簡単には、２．０ｃｍ骨骨膜欠損を、尺骨体の中央に作製し、そして漸増濃度の、１つ以上の推定のＭＰＳＦの非存在下または存在下で、ＯＰ−１を含む多孔性β−ＴＣＰ材料を含むインプラントで埋める。漸増濃度の、１つ以上の推定のＭＰＳＦの非存在下または存在下で、ＯＰ−１の量を変化させながら、多孔性β−ＴＣＰ材料を含む実験用コンポジットを再構成し、そして脛骨の骨幹に作製した２．０ｃｍ  骨骨膜欠損を埋めるために使用する。任意の骨原性タンパク質を、このアッセイにおいてＯＰ−１の代わりに使用し得る。欠損部位での移植を行い、１つのキャリアコントロールならびにＯＰ−１およびＯＰ−１／ＭＰＳＦ組合わせの一連の実験を試験する。コンポジットを受けた動物の尺骨および脛骨にて、機械的な試験を行う。欠損部位および隣接する正常骨からのＸ線撮影および組織学的切片を、Ｃｏｃｋらに記載されるように分析する。
【０１９７】
１つ以上のＭＰＳＦの存在によって、サルにおける骨修復速度が上昇し得る。１つ以上のＭＰＳＦの存在によってまた、同様または同一の結果を達成するために、コンポジット当たり低減した濃度の骨原性タンパク質を使用し得る。
【０１９８】
（実施例９：ヤギモデルでの骨折治癒バイオアッセイ）
ヒツジでのこの骨折治癒アッセイを、本質的にＢｌｏｋｈｉｕｓら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２，７２５−７３０頁（２００１）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されたようにして実施する。骨幹中部の閉鎖骨折（ｃｌｏｓｅｄ  ｍｉｄｓｈａｆｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を、特注の三点屈曲デバイスを用いて、成体雌性ヤギの左脛骨に作製した。この骨折は、その脛骨の外側に配置された外固定装置で安定化される。３つの異なる型の物質を、注射を介してこのヤギの欠損部に移植する；第Ｉ群は、試験物質を有さないネガティブコントロール群である；第ＩＩ群は、生物学的に活性な多孔性β−ＴＣＰを移植される；第ＩＩＩ群は、多孔性β−ＴＣＰおよび骨形成性タンパク質を移植される；ならびに第ＩＶ群は、多孔性β−ＴＣＰおよびＰＬＧＡ中にカプセル化された骨形成性タンパク質を移植される。試験物質を、骨折した隙間に配置する。機械的試験（四点非破壊性屈曲試験）を、２週間目および４週間目に、混合物を受容した動物において実施する。この機械的試験後、この骨折した隙間の前側、後側、側面、および内側の切片を切り出し、Ｘ線写真撮影および組織学的切断を実施する。
【０１９９】
（実施例１０：ヒツジ腰椎の不安定な運動セグメントの融合アッセイ）
このアッセイは、骨および椎間板靭帯（ｄｉｓｃｏｌｉｇａｍｅｎｔｏｕｓ）の不安定性の治癒を研究する。脊椎の運動セグメントは、一方が他方の上に横たわる２つの椎体、および椎間板から構成される、機能的単位である。
【０２００】
１試験群は、１２個体のヒツジからなる。２つのコントロール群（各々１２個体のヒツジ）を使用する。全身麻酔の導入後、腰椎下部に外科手術領域を作製し、そしてこの動物をうつ伏せ位置に置く。腰椎下部の棘突起上に約１２ｃｍ長の皮膚切開を作製する。皮下組織および筋膜の横切開（ｔｒａｎｓｓｅｃｔｉｏｎ）後、後部の筋肉を脇に移動させる。
【０２０１】
挿管麻酔を、１．５ｍｌのキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））の筋内注射によって適用する。さらなる投薬を、必要に応じて投与し得る。鎮静は、耳静脈への穿刺後に、静脈内留置カテーテルを配置することを必要とする。麻酔を、このカテーテルを通して、体重１ｋｇあたり３〜５ｍｇのチオペンタール（Ｔｒａｐａｎａｌ（登録商標））を与えることによって導入する。気管内挿管後、この動物に、酸素（３０％）、亜酸化窒素（笑気）およびイソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎ（登録商標））を用いて通気する。外科手術全体を通して、０．２〜０．４ｍｇの投薬量を有する鎮痛性のクエン酸二水素フェンタニール（Ｆｅｎｔａｎｙｌ（登録商標））を投与する。同時に、体重１ｋｇあたり０．５ｍｇの投薬量でアトラクリウムベシラート（ａｔｒａｃｕｒｉｕｍ  ｂｅｓｉｌａｔｅ）（Ａｔｒａｃｕｒｉｕｍ（登録商標））を投与することによって、弛緩を達成する。
【０２０２】
腰椎体Ｌ４〜Ｌ６の椎弓根（ｐｅｄｉｃｌｅ）を完全に露出させた後、椎弓根Ｌ４およびＬ６の両側への器械使用を行う。これは、椎弓根において見出される直径に依存して、直径５ｍｍまたは６ｍｍの椎弓根スクリューを使用することによって実施される。その後、上方運動セグメントＬ４／Ｌ５の椎間板の両側の椎弓根横断的（ｔｒａｎｓｐｅｄｉｃｕｌａｒ）除去を、椎弓根観察（ｐｅｄｉｃｕｌｏｓｃｏｐｉｃ）制御下で、Ｌ５椎弓根に対して行う。罹患した椎体の終板は、剥ぎ取られる。
【０２０３】
試験サンプルの身体間（ｉｎｔｅｒ−ｃｏｒｐｏｒａｌ）および身体内適用を、試験群の全１２個体のヒツジにおいて、椎弓根横断カニューレを介して行う。この試験サンプルは、種々の濃度の多孔性β−ＴＣＰ、骨形成性タンパク質、またはＰＬＧＡ中にカプセル化された骨形成性タンパク質を含む。１２個体のヒツジからなる第１のコントロール群では、多孔性β−ＴＣＰのみを適用する。第２のコントロール群では、本発明の組成物の代わりに、自己の海綿質（ｓｐｏｎｇｉｏｓａ）を投与する。
【０２０４】
最後に、内固定を完全に導入する。内固定の型ならびに必要な器械使用および外科手術手順は標準化されており、そして当業者に周知である。ドレーンを配置し、そして創傷を、筋膜および浅在筋膜についての吸収性縫合糸ならびに皮膚ステープルを使用して閉鎖する。
【０２０５】
外科手術手順全体を行う間に、Ｘ線画像増幅器が、術中透視のために利用可能である。これは、上記工程を遂行する間に正確に方向を見極めることを容易にする。
【０２０６】
自己の海綿質を投与された１２個体のヒツジの収集を、麻酔下で、以下のようにして行う：左腸骨稜皮膚および筋膜に、長軸方向に約８ｃｍ長の切開を作製することによって、切込みを入れる。殿部の筋肉を骨膜下で移動させ、そして骨切り術後に、海綿質移植片を腸骨稜から収集する。出血の制御およびドレーンの配置を、層における創傷の閉鎖に際して行う。この収集手順は標準化されており、そして当業者に公知である。
【０２０７】
（臨床的観察）
神経学的試験を毎日実施して、動物の歩行および術後に生じ得る神経学的欠損を評価する。手術による創傷を毎日、綿密に調べる。体重を、手術前および安楽死時に測定する。
【０２０８】
（Ｘ線分析）
評価する前に、腰椎を完全に新たに切開し、そして内固定を注意深く取り除く。手術した脊椎セグメントの前後方向および単純な横方向でのＸ線写真を、０週間目および８週間目に、ミリアンペア、キロボルトおよび秒数について一貫した条件下で取得して、融合評価を助ける。融合状態を、Ｌｅｎｋｅら，Ｊ．Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ，５，４３３−４４２頁（１９９２）（本明細書中で参考として援用される）に記載された段階評価系を使用して評価する。この系によると、Ａは、大きく固い柱状の両側性の融合塊を示し（明らかに固い）；Ｂは、小さな対側性の融合塊を有する、大きく固い片側性の融合塊を示し（おそらく固い）；Ｃは、見かけ上亀裂を有する、薄い両側性の融合塊を示し（おそらく固くない）；そしてＤは、移植片の両側性の吸収または明らかな両側性の偽関節を有する融合塊を示す（明らかに固くない）。
【０２０９】
さらに、コンピューター処理した断層撮影走査を実施して、横断面および矢状面再構成において、融合塊を評価する。各融合塊について、一貫した倍率およびＸ線条件下で、２ミリメートルの切片間隔および引き続いて矢状面における再構成を使用することによって、約４０の連続的なコンピューター処理した断層撮影走査を作製する。
【０２１０】
（生体力学的試験）
各群の４つの検体を、生体力学的に評価する。Ｘ線分析後、靱帯および骨の構造を維持しつつ、注意深くすべての筋肉を取り出す。脊椎を−２０℃で凍結させる。これらの各検体について、運動セグメントＬ４／Ｌ５の上部椎骨の上半分および下部椎骨の下半分を、ポリメチルメタクリレート（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ３０４０；Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｋｕｌｚｅｒ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｈｒｈｅｉｍ／Ｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に包埋する。次いで、各検体を固定し、そして非破壊性試験様式で、脊椎テスター（ｓｐｉｎｅ  ｔｅｓｔｅｒ）において前負荷なしで試験する。交互の順序での屈曲／伸長、軸の右回転／左回転、および右側／左側の屈曲モーメントを、脊椎テスターのジンバルに組み込まれたステッパー電動機によって、１．７度／秒の一定速度で連続的に適用する。２回のプレサイクルを適用して、粘弾性応答における粘着性成分の影響を最少にし、そしてデータを、３サイクル目に収集する。運動、中立域および２つの剛性のパラメーターの範囲を、得られた負荷−変形曲線から決定する。
【０２１１】
（組織学／組織形態計測）
各群の８つの検体を、術後の２週間後、４週間後、または８週間後に組織学的に評価する。Ｘ線分析後、脊椎を１０％ホルマリン溶液中で固定する。各々の検体の横断面を得て、骨の融合、細胞性反応、生体適合性、およびセメントの形成／分解の徴候を評価する。手術部位での融合塊の質的な組織学的評価を、巨細胞、炎症細胞、または移植された物質がカプセル化され得る箇所での繊維性応答の存在について下す。さらに、小柱状の融合塊において見出される類骨、および海綿質の量を評価する。組織形態計測的な変量（例えば、類骨の割合、類骨の厚さ、骨表面１ｍｍあたりの骨芽細胞の数、および骨表面１ｍｍあたりの破骨細胞の数）を決定する。
【０２１２】
（蛍光色素標識）
８個体の動物を、手術後２週間目に体重１ｋｇあたり９０ｍｇのキシレノールオレンジ、手術後４週間目に体重１ｋｇあたり１０ｍｇのカルセイングリーン（Ｃａｌｃｅｉｎ  ｇｒｅｅｎ）、および手術後６週間目に体重１ｋｇあたり２５ｍｇのドキシサイクリンハイクラートイエロー（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｈｙｃｌａｔｅ  ｙｅｌｌｏｗ）の静脈内適用に供する。このレジメンは、ＲａｈｎおよびＰｅｒｒｅｎによって公表された方法に従う。例えば、Ｒａｈｎら，Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４６，１２５−１２９頁（１９７１）；Ｒａｈｎら，Ａｋｔ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌ，１０，１０９−１１５頁（１９８０）を参照のこと。次いで、蛍光色素の逐次分析を、定性的評価および定量的な動的評価のために、検体においてＵＶ光の下での蛍光顕微鏡検査法によって実施する。
【０２１３】
（実施例１１：イヌにおける骨軟骨性欠損の修復）
合計１２個体の成体雄性イヌを利用する。肋軟骨下の骨を貫通する、両側性の骨軟骨性欠損（直径５．０ｍｍおよび深さ６ｍｍ）を、各々の内側大腿顆（ｍｅｄｉａｌ  ｆｅｍｏｒａｌ  ｃｏｎｄｙｌｅ）の中心負荷支点領域に作製する。６個体の動物において、右側の欠損は、ＰＬＧＡにカプセル化された高用量のＯＰ−１を受ける。すべての動物の左肢は、コラーゲンマトリクス＋ＣＭＣを受け、コントロールとして機能する。残りの６個体のイヌは、右側でＰＬＧＡにカプセル化された低用量のＯＰ−１を受け、そして左側でコントロールを受ける。この動物を、移植後１６週間目に屠殺する。屠殺に際して、遠位大腿をひとまとめにして回収し、そして欠損部位を、Ｍｏｒａｎら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．７４Ｂ，６５９−６６７頁（１９９２）（本明細書中で参考として援用される）のスキームに基づいて、組織学的にそして全体的に評価する。
【０２１４】
標準的な無菌技術を使用して、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）ガス麻酔下で外科手術を実施し、そしてこの動物を、心電図および心拍数モニターによってモニターする。前外科的な薬物を、麻酔誘導の約２０〜３０分前に投与する。前外科的な薬物は、酒石酸ブトルファノール（０．０５ｍｇ／体重１ｋｇ）からなる。麻酔を、ペントタールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｅｎｔｏｔｈａｌ）（１７．５ｍｇ／体重１ｋｇ）の静脈内注射によって投与する。誘導後、気管内チューブを配置し、そしてイソフルランの吸入によって麻酔を維持する。約４ｃｍ長の内側傍膝蓋骨の切開（ｍｅｄｉａｌ  ｐａｒａｐａｔｅｌｌａｒ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ）を作製することによって外科手術を実施する。膝蓋骨を側方に引っ込めて、大腿顆を露出させる。右側の内側顆において、軟骨層を通って伸長して肋軟骨下の骨を６ｍｍの深さまで貫通する５．０ｍｍ直径の欠損を、特別に設計または改変された５．０ｍｍのドリルビットを用いて作製する。生理食塩水で多量に洗浄して骨砕片および溢流した骨髄細胞を取り除いた後で、ＰＬＧＡにカプセル化された適切な濃度のＯＰ−１を、ブラントプローブ（ｂｌｕｎｔ  ｐｒｏｂｅ）を用いてかまたは手によって、注意深く各欠損部位に充填する。十分な量のＯＰ−１を欠損内に配置し、その結果、その欠損部位は、交連している表面（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ）で平らになる。移植された物質を保護しつつ、その結合部を洗浄して、その欠損部内に配置されていない任意の移植片を取り除く。次いで、結合部カプセルおよび軟組織を、再吸収可能な縫合糸を用いて、層において細密に閉鎖する。この手順を、コントロールの配置を有する対側で繰り返す。
【０２１５】
酒石酸ブトルファノール（０．０５ｍｇ／体重１ｋｇ）を、必要に応じて、皮下投与する。動物に、外科手術後４日間にわたって抗生物質を筋内投与し、そして外科手術後すぐに、慣用的な前後方向のＸ線を撮ることにより、適切な外科的配置を保証する。動物が体重負荷に耐え得るようになるまで、この動物を３×４フィートの回復ケージ内で飼育する。次いで、動物を走行に移し、そして無制限に運動させる。
【０２１６】
後肢のＸ線を、術前、術後すぐ、および１６週間目（屠殺時）に得る。術前のＸ線写真を使用して、以前から存在する異常はないことを保証し、そして骨格成熟を確証付ける。術後のＸ線写真を使用して、欠損の配置を評価する。屠殺時のＸ線写真を使用して、肋軟骨下の骨および交連している表面の治癒率および回復率を評価する。Ｘ線写真を、評価する日より前の１週間以内に得る。
【０２１７】
適切な時点で、静脈内でのバルビツレートの過剰投薬を使用して、動物を屠殺する。遠位大腿を直ちにひとまとめにして収集し、そして生理食塩水を浸漬したタオルに保存し、その動物の番号、右または左の明示、および他のあらゆる必要な識別子を記したプラスチックバッグ内に入れる。欠損部位の強力な写真を撮り、そして注意深く標識を付ける。屠殺する前に、静脈血を、示差的な細胞を用いた慣用的な血球算定のために採血する。軟組織を、欠損部位から細密に切開して取り出す。大腿の近位端を取り出す。すべての検体を、全体的な段階評価および写真撮影のすぐ後で、組織学的評価のために調製する。水冷したダイヤモンド鋸で、各欠損部位を切り離す。
【０２１８】
欠損部位および修復組織の全体的な外観を、Ｍｏｒａｎら（前出）の研究に基づいて段階評価する。点数を、関節内の接着、関節表面の修復、軟骨の侵食および外観の存在に従って割り当てる。
【０２１９】
個々の検体を、４％パラホルムアルデヒド溶液に浸漬することによって固定し、そして脱灰した組織学的処理のために調製する。３つのレベルから３つの切片を、各ブロックから切り出した。レベル１および３は、欠損の周界に最も近い。レベル２は、欠損の中心に位置付けられる。各レベルからの３つの切片を、トルイジンブルーおよびサフラニンＯおよびファストグリーンで染色し得る。切片を、Ｍｏｒａｎら（前出）のスキームに基づいて段階評価する。この分析は、修復組織の性質、構造的特徴および細胞変化に基づいて、点数を割り当てる。記述統計を、全体的および組織学的パラメーターについて算出する。
【０２２０】
本発明者らは、本発明の多数の実施形態を記載したが、本発明者らによる基本的な構成を改変して、本発明の生成物およびプロセスを利用する他の実施形態を提供し得ることは明らかである。従って、本発明の範囲は、例として提示された特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によって規定されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】図１は、プラシーボを用いた４週間での動物番号２９７Ｌ（左脛骨）の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆを含む。
【図２】図２は、プラシーボを用いた４週間での動物番号２９７Ｒ（右脛骨）の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａを含む。
【図３】図３は、ＯＰ−１を用いた４週間での動物番号２９５Ｌ（左脛骨）の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａ、β−ＴＣＰパテ８９Ｂを含む。
【図４】図４は、ＯＰ−１を用いた４週間での動物番号２９５Ｒ（右脛骨）の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆ、コントロールを含む。
【図５】図５は、プラシーボを用いた８週間での動物番号２９９Ｌ（左脛骨）の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆを含む。
【図６】図６は、プラシーボを用いた８週間での動物番号２９９Ｒ（右脛骨）の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａを含む。
【図７】図７は、ＯＰ−１を用いた８週間での動物番号１３８Ｌ（左脛骨）の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ａ、β−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃを含む。
【図８】図８は、ＯＰ−１を用いた８週間での動物番号１３８Ｒ（右脛骨）の組織画像を示す。一番上から下まで、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｆ、コントロール、コラーゲン４８Ｃを含む。
【図９】図９は、プラシーボを用いた４週間での動物番号２９７Ｌ（左脛骨）のＸ線写真画像を示す。右から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆを含む。
【図１０】図１０は、プラシーボを用いた４週間での動物番号２９７Ｒ（右脛骨）のＸ線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａを含む。
【図１１】図１１は、ＯＰ−１を用いた４週間での動物番号２９５Ｌ（左脛骨）のＸ線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａ、β−ＴＣＰパテ８９Ｂを含む。
【図１２】図１２は、ＯＰ−１を用いた４週間での動物番号２９５Ｒ（右脛骨）のＸ線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆ、コントロールを含む。
【図１３】図１３は、プラシーボを用いた８週間での動物番号２９９Ｌ（左脛骨）のＸ線写真画像を示す。右から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆを含む。
【図１４】図１４は、プラシーボを用いた８週間での動物番号２９９Ｒ（右脛骨）のＸ線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａを含む。
【図１５】図１５は、ＯＰ−１を用いた８週間での動物番号１３８Ｌ（左脛骨）のＸ線写真画像を示す。右から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ａ、β−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃを含む。
【図１６】図１６は、ＯＰ−１を用いた８週間での動物番号１３８Ｒ（右脛骨）のＸ線写真画像を示す。左から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｆ、コントロール、コラーゲン４８Ｃを含む。
【図１７】図１７は、プラシーボを用いた４週間での動物番号２９７Ｌ（左脛骨）のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆを含む。
【図１８】図１８は、プラシーボを用いた４週間での動物番号２９７Ｒ（右脛骨）のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、コラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａを含む。
【図１９】図１９は、ＯＰ−１を用いた４週間での動物番号２９５Ｌ（左脛骨）のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａ、β−ＴＣＰパテ８９Ｂを含む。
【図２０】図２０は、ＯＰ−１を用いた４週間での動物番号２９５Ｒ（右脛骨）のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆ、コントロールを含む。
【図２１】図２１は、プラシーボを用いた８週間での動物番号２９９Ｌ（左脛骨）のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ｆを含む。
【図２２】図２２は、プラシーボを用いた８週間での動物番号２９９Ｒ（右脛骨）のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、中位および遠位であり、それぞれコラーゲン４８Ｃ、β−ＴＣＰパテ８９Ａを含む。
【図２３】図２３は、ＯＰ−１を用いた８週間での動物番号１３８Ｌ（左脛骨）のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ａ、β−ＴＣＰパテ８９Ｂ、β−ＴＣＰパテ８９Ｃを含む。
【図２４】図２４は、ＯＰ−１を用いた８週間での動物番号１３８Ｒ（右脛骨）のパラフィン走査画像を示す。一番上から、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれβ−ＴＣＰパテ８９Ｆ、コントロール、コラーゲン４８Ｃを含む。
【図２５】図２５は、骨増殖を有する５つの細孔の１つを示す切片２９５Ｌの中位部位を示し、ここでＥＰは空の細孔であり、そしてＦＰは充填された細孔である。
【図２６】図２６は、骨増殖を有する７つまたは８つの細孔を示す切片２９９Ｌの遠位部位を示し、ここでＥＰは空の細孔であり、そしてＦＰは充填された細孔である。
【図２７】図２７は、ＰＬＧＡでカプセル化されたＯＰ−１を用いた４週間での動物番号５３３３Ｌ（左脛骨）のＸ線写真画像を示す。左からの、これらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、処方物５および処方物４を含む。
【図２８】図２８は、ＰＬＧＡでカプセル化されたＯＰ−１を用いた８週間での動物番号５３３３Ｌ（左脛骨）のＸ線写真画像を示す。左からこれらの部位は、近位、中位および遠位であり、それぞれコントロール、処方物４および処方物５を含む。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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