(57)【要約】本発明は、特定の表現型を有する新生物を、この特定の表現型を有する新生物の中で選択的に複製する腫瘍溶解性ウイルスを使用することにより診断する方法を、提供する。例えば、レオウイルスは、正常細胞の中で複製しない。しかし、レオウイルスは、活性化されたｒａｓ経路を伴う細胞の中で選択的に複製し、活性化されたｒａｓ経路はこれらの細胞の死を引き起こす。従って、少なくとも部分的に、亢進されたｒａｓ経路活性が原因となって新生物となる細胞を、レオウイルス複製に対する感受性により診断し得る。本発明は、他の腫瘍溶解性ウイルスを使用して、インターフェロン感受性腫瘍、ｐ５３欠損腫瘍およびＲｂ欠損腫瘍のような他の腫瘍の診断ならびに／あるいは処置に、さらに適用され得る。本明細書中に開示される、この診断または処置において有用なキットもまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルの中でｒａｓ活性化新生物細胞を検出する方法であって、該サンプルとレオウイルスとを接触させる工程および該レオウイルスが該サンプルの中で複製する能力を決定する工程を含み、該レオウイルスが複製する該能力が該サンプルにおけるｒａｓ活性化新生物細胞の存在を示す、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが、哺乳動物由来である、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記哺乳動物が、ヒトである、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記レオウイルスは、哺乳動物レオウイルスである、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記哺乳動物レオウイルスが、血清型３レオウイルスである、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記血清型３レオウイルスが、Ｄｅａｒｉｎｇ株レオウイルスである、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記レオウイルスが、鳥レオウイルスである、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが、肺癌、前立腺癌、直腸結腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、造血癌ならびに中枢神経系癌および末梢神経系癌からなる群から選択される新生物を有する動物由来である、方法。
【請求項９】
動物においてｒａｓ活性化新生物を診断する方法であって、以下：
（ａ）該動物由来の生物学的サンプルを提供する工程であって、該サンプルが細胞を含有する、工程；
（ｂ）該サンプルとレオウイルスとを、該レオウイルスがｒａｓ活性化細胞の中で複製することが可能となる条件下で接触させる工程；
（ｃ）該レオウイルスが該サンプルの中で複製する能力を決定する工程；および、
（ｄ）該レオウイルスが該サンプルの中で複製し得る場合に、該動物を、ｒａｓ活性化新生物を有するとして同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記動物が、ヒトである、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、前記レオウイルスが、哺乳動物レオウイルスである、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記哺乳動物レオウイルスが、血清型３レオウイルスである、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記血清型３レオウイルスが、Ｄｅａｒｉｎｇ株レオウイルスである、方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法であって、前記ウイルスが、鳥レオウイルスである、方法。
【請求項１５】
請求項９に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが、肺癌、前立腺癌、直腸結腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、造血癌ならびに中枢神経系癌および末梢神経系癌からなる群から選択される新生物由来である、方法。
【請求項１６】
動物においてｒａｓ活性化新生物を処置するかもしくは改善させる方法であって、以下：
（ａ）該動物の中のｒａｓ活性化新生物を、該動物由来の一群の細胞を提供することにより同定する工程、該細胞とレオウイルスとを、該レオウイルスがｒａｓ活性化細胞の中で複製することが可能となる条件下で接触させる工程、および該レオウイルスが該細胞の中で複製し得る場合に、該細胞を、ｒａｓ活性化新生物を含有するとして同定する工程；ならびに
（ｂ）該動物に、ｒａｓ活性化新生物について選択性である有効量の治療剤を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記治療剤が、レオウイルス、ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフ（ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｏｒｆ）ウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルスならびにγ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルスからなる群から選択される腫瘍溶解性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）ウイルスである、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記動物が、哺乳動物である、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記哺乳動物が、ヒトである、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、前記レオウイルスが、哺乳動物レオウイルスまたは鳥レオウイルスある、方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、前記レオウイルスが、Ｄｅａｒｉｎｇ株レオウイルスである、方法。
【請求項２２】
請求項１６に記載の方法であって、前記生物学的サンプルが、肺癌、前立腺癌、直腸結腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、造血癌ならびに中枢神経系癌および末梢神経系癌からなる群から選択される新生物由来である、方法。
【請求項２３】
哺乳動物において新生物の存在を診断する方法であって、該哺乳動物由来の細胞のサンプルと腫瘍溶解性ウイルスとを接触させる工程を包含し、該ウイルスの該サンプルの中で複製する能力が該哺乳動物の中の新生物の存在を示す、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記ウイルスが、レオウイルス、ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルス、γ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、ならびにＤｅｌｔａ２４ウイルスからなる群から選択される、方法。
【請求項２５】
生物学的サンプルの中で、特定の表現型を有する新生物細胞を検出する方法であって、該サンプルと、該特定の表現型を有する新生物細胞の中で選択的に複製する腫瘍溶解性ウイルスとを接触させる工程、および該ウイルスの該サンプルの中で複製する能力を決定する工程を包含し、該ウイルスの複製する該能力が該サンプルにおける該特定の表現型を有する新生物細胞の存在を示す、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記特定の表現型が、インターフェロン耐性、ｐ５３欠損、Ｒｂ欠損、およびＰＫＲ欠損からなる群から選択される、方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法であって、前記ウイルスが、以下：
（ａ）水疱性口内炎ウイルス；
（ｂ）ＯＮＹＸ−０１５ウイルス；
（ｃ）Ｄｅｌｔａ２４ウイルス；ならびに
（ｄ）ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルスならびにγ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルス、
からなる群から選択される、方法。
【請求項２８】
動物において、特定の表現型を有する新生物を診断する方法であって、以下：
（ａ）該動物由来の生物学的サンプルを提供する工程であって、該サンプルが細胞を含有する、工程；
（ｂ）該サンプルと、該特定の表現型を有する新生物細胞の中で選択的に複製する腫瘍溶解性ウイルスとを接触させる工程；
（ｃ）該ウイルスの該サンプルの中で複製する能力を決定する工程；および
（ｄ）該ウイルスが該サンプルの中で複製し得る場合に、該動物を、該特定の表現型を有する新生物を有するとして同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記特定の表現型が、インターフェロン耐性、ｐ５３欠損、Ｒｂ欠損、およびＰＫＲ欠損からなる群から選択される、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記前記ウイルスが、以下：
（ｉ）水疱性口内炎ウイルス；
（ｉｉ）ＯＮＹＸ−０１５ウイルス；
（ｉｉｉ）Ｄｅｌｔａ２４ウイルス；ならびに
（ｉｖ）ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルスならびにγ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルス、
からなる群から選択される、方法。
【請求項３１】
動物において、特定の表現型を有する新生物を処置するかもしくは改善させる方法であって、以下：
（ａ）該動物の中の特定の表現型を有する新生物を、該動物由来の一群の細胞を提供することにより同定する工程、
該細胞と、該特定の表現型を有する新生物細胞の中で選択的に複製する腫瘍溶解性ウイルスとを接触させる工程、および
該ウイルスが該細胞の中で複製し得る場合に、該細胞を、該特定の表現型を有する新生物を含有するとして同定する工程；ならびに、
（ｂ）該動物に、該特定の表現型を有する新生物細胞について選択性である有効量の治療剤を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記特定の表現型が、インターフェロン耐性、ｐ５３欠損、Ｒｂ欠損、およびＰＫＲ欠損からなる群から選択される、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記前記ウイルスが、以下：
（ｉ）水疱性口内炎ウイルス；
（ｉｉ）ＯＮＹＸ−０１５ウイルス；
（ｉｉｉ）Ｄｅｌｔａ２４ウイルス；ならびに
（ｉｖ）ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルスならびにγ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルスからなる群から選択されるウイルス、
からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願番号第６０／３９２，０３１号（２００２年６月２８日に出願）；および同第６０／４４３，１８８号（２００３年１月２９日に出願）の利益を主張する。これらの先の出願の各々の全体の開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、腫瘍の根源を検出する方法、特に、ｒａｓ活性化腫瘍の診断におけるレオウイルスの使用に関連する。さらに、異なる選択性を有する他の腫瘍溶解性（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ）ウイルスもまた、特定の腫瘍型の診断において使用され得る。
【０００３】
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ＷＯ９４／１８９９２（１９９４年９月１日公開）
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【０００４】
上記または本出願のどこかに引用される出版物、特許および特許出願のすべては、個々の出版物、特許出願または特許の各々の開示があたかも詳細にかつ別々にその全体が参考として援用されることが示されている場合と同じ程度に、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
腫瘍学および細胞生物学の分野における最近の発展により、研究者らは、癌の根底にある原因を特異的に標的にする薬剤開発プログラムを開始することが可能となった（特に、この原因が特異的な遺伝子産物の欠損または変異である場合に）。従って、臨床医が各々の癌患者についての癌の原因を決定するツールを有する場合、特異的な原因について最適化された効力であつらえた処置体制を、選択し得る。
【０００６】
ｒａｓ癌遺伝子は、多くの腫瘍の原因である。ｒａｓ遺伝子自身の活性化変異は、すべてのヒト腫瘍の約３０％で（Ｂｏｓ,Ｊ．Ｌ．,１９８９）、主に膵臓癌腫（９０％）、散発性直腸結腸癌腫（５０％）および肺癌腫（４０％）、ならびに骨髄性白血病（３０％）で生じる。ｒａｓ遺伝子自身の変異に加えて、ｒａｓ経路におけるｒａｓの上流または下流にある因子の活性化もまた、腫瘍と関係がある。例えば、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２または上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターの過剰発現は、乳癌で見られ（２５−３０％）、そして血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプターまたはＥＧＦレセプターの過剰発現は、神経膠腫およびグリア芽細胞腫で蔓延する（４０−５０％）。ＥＧＦレセプターおよびＰＤＧＦレセプターは、両方とも、これらのそれぞれのリガンドと結合する際にｒａｓを活性化するとして知られ、そしてｖ−ｅｒｂＢは、細胞外ドメインを欠いた恒常的に活性化されたレセプターをコードする。まとめると、ｒａｓ癌遺伝子またはｒａｓ経路における上流要素の直接の変異が、すべての腫瘍の約３分の２において生じると考えられる。
【０００７】
腫瘍形成におけるｒａｓ経路の重大な役割が得られたので、腫瘍がｒａｓ経路の活性化と関係があるか否かを決定することが可能となって、特別にあつらえた処置体制が開発され得ることが所望される。しかし、本発明の以前には、癌とｒａｓ経路との関係を診断する簡便かつ高感度の方法がなかった。ｒａｓ構造遺伝子における変異を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により高い感度で検出し得る一方、高いｒａｓ活性の原因となり得る、ｒａｓ経路における多くの他の因子（例えば、ｒａｓ遺伝子産物の異常な高発現レベルを引き起こすｒａｓ遺伝子の隣接配列における変異、ｒａｓ経路におけるｒａｓの上流または下流にある因子の構造遺伝子における変異、またはこれらの上流または下流の因子の発現レベルに影響する制御変異）がある。従って、ｒａｓ遺伝子についてのＰＣＲは、ｒａｓ経路の活性化と関係する必ずしもすべての癌を、正確には同定しない。ｒａｓ活性化腫瘍を診断する簡便かつ正確な方法が、必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、特定の表現型を有する新生物、特に、ｒａｓ経路の異常に高い活性により媒介された新生物を、レオウイルスまたは他の同様な腫瘍溶解性ウイルスを使用することにより診断する方法を、提供する。レオウイルスは、正常細胞の中で複製しない。しかし、レオウイルスは、活性化されたｒａｓ経路を伴う細胞の中で選択的に複製し、活性化されたｒａｓ経路はこれらの細胞の死を引き起こす。これらの細胞の中のｒａｓ経路は、ｒａｓ構造遺伝子の変異または、ｒａｓ経路におけるこの経路の活性化を引き起こす任意の他の因子の異常が原因となって、活性化され得る。従って、少なくとも部分的に、亢進されたｒａｓ経路活性が原因となって新生物となる細胞を、レオウイルス複製に対する感受性により診断し得る。
【０００９】
従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプルの中でｒａｓ活性化新生物細胞を検出する方法であって、このサンプルとレオウイルスとを接触させる工程およびこのレオウイルスがこのサンプルの中で複製する能力を決定する工程を含み、このレオウイルスが複製するこの能力がこのサンプルにおけるｒａｓ活性化新生物細胞の存在を示す、方法を提供する。
【００１０】
この生物学的サンプルは、好ましくは哺乳動物、特に、ヒト由来である。ｒａｓ活性化細胞の中で複製することが可能である任意のレオウイルスが、本発明において使用され得る（例えば、哺乳動物レオウイルスまたは鳥レオウイルス）。この哺乳動物レオウイルスは、好ましくは血清型３レオウイルスであり、そしてさらに好ましくはＤｅａｒｉｎｇ株レオウイルスである。
【００１１】
好ましい実施形態において、この生物学的サンプルは、肺癌、前立腺癌、直腸結腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、造血癌ならびに中枢神経系癌および末梢神経系癌からなる群から選択される新生物を有する動物由来である。
【００１２】
本発明の別の局面は、動物においてｒａｓ活性化新生物を診断する方法であって、以下：
（ａ）この動物から生物学的サンプルを提供する工程であって、このサンプルが細胞を含有する、工程；
（ｂ）このサンプルとレオウイルスとを、このレオウイルスがｒａｓ活性化細胞の中で複製することが可能となる条件下で接触させる工程；
（ｃ）このレオウイルスがこのサンプルの中で複製する能力を決定する工程；および、
（ｄ）このレオウイルスがこのサンプルの中で複製し得る場合に、この動物を、ｒａｓ活性化新生物を有するとして同定する工程、
を包含する、方法を提供する。
【００１３】
この動物は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。ｒａｓ活性化細胞の中で複製することが可能である任意のレオウイルスが、本発明において使用され得る（例えば、哺乳動物レオウイルスまたは鳥レオウイルス）。この哺乳動物レオウイルスは、好ましくは血清型３レオウイルスであり、そしてさらに好ましくはＤｅａｒｉｎｇ株レオウイルスである。
【００１４】
好ましい実施形態において、この生物学的サンプルは、肺癌、前立腺癌、直腸結腸癌、甲状腺癌、腎臓癌、副腎癌、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、造血癌ならびに中枢神経系癌および末梢神経系癌からなる群から選択される新生物を有する動物由来である。
【００１５】
本発明の別の局面は、動物においてｒａｓ活性化新生物を処置するかもしくは改善させる方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）この動物の中のｒａｓ活性化新生物を、この動物由来の一群の細胞を除去することにより同定する工程、これらの細胞とレオウイルスとを、このレオウイルスがｒａｓ活性化細胞の中で複製することが可能となる条件下で接触させる工程、およびこのレオウイルスがこれらの細胞の中で複製し得る場合に、これらの細胞を、ｒａｓ活性化新生物細胞を含有するとして同定する工程；ならびに
（ｂ）この動物に、ｒａｓ活性化新生物について選択的である有効量の治療剤を投与する工程、
を包含する。ｒａｓ活性化新生物について選択的であるこの治療剤は、好ましくは腫瘍溶解性ウイルスである。この腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくはレオウイルス、ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフ（ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｏｒｆ）ウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルス、γ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、あるいはニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ）ウイルスである。ｒａｓ活性化新生物について選択的である他の治療剤として、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター（ＦＴＩ）およびＲＡＦキナーゼインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の任意の実施形態において、このレオウイルスは、組換えレオウイルスであり得る。この組換えレオウイルスは、異なるサブタイプのレオウイルスを伴う哺乳動物細胞の共感染により産生され得る。この組換えレオウイルスは、自然発生的または非自然発生的であり得る。この組換えレオウイルスは、レオウイルスの２つ以上の株、特に、Ｄｅａｒｉｎｇ株、Ａｂｎｅｙ株、Ｊｏｎｅｓ株、およびＬａｎｇ株からなる群から選択されるレオウイルスの２つ以上の株由来であり得る。この組換えレオウイルスは、異なる血清型（例えば、血清型１レオウイルス、血清型２レオウイルスおよび血清型３レオウイルスからなる群から選択される）由来のレオウイルスの再編成からもまた生じ得る。この組換えレオウイルスは、自然発生的改変コートタンパク質コード配列または変異されたコートタンパク質コード配列を含有し得る。
【００１７】
レオウイルスに加えて、多数の他の腫瘍溶解性ウイルスもまた、ｒａｓ活性化新生物について選択的であり、従って、これらは、レオウイルスと同じ様式で本発明を実施するために使用され得る。これらのウイルスとして、ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルス、またはγ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。従って、例えば、本発明の１つの局面は、生物学的サンプルの中で、ｒａｓ活性化新生物細胞を検出する方法を提供し、この方法は、このサンプルと、ＰＫＲ欠損細胞の中で選択的に複製する腫瘍溶解性ウイルスとを接触させる工程、およびこのウイルスのこのサンプルの中で複製する能力を決定する工程を包含し、ここで、このウイルスの複製するこの能力がこのサンプルにおけるｒａｓ活性化新生物細胞の存在を示す。好ましくは、この腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルスならびにγ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルスからなる群から選択される。
【００１８】
さらに、特定の腫瘍細胞に選択的に感染することが可能である多くの他の腫瘍溶解性ウイルスもまた、レオウイルスと同じ様式で本発明において有用である。例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、インターフェロン耐性腫瘍を診断するために使用され得、ＯＮＹＸ−０１５ウイルスは、ｐ５３欠損ウイルスを診断するために使用され得、そしてＤｅｌｔａ２４ウイルスは、Ｒｂ欠損腫瘍を診断するために使用され得る。しかし、本発明において有用な腫瘍溶解性ウイルスは、好ましくはアデノウイルスでなく、特にＯＮＹＸ−０１５ウイルスではない。
【００１９】
本発明により、始めに腫瘍から回収された生物学的サンプルと、ＶＳＶ、ＯＮＹＸ−０１５およびＤｅｌｔａ２４からなる群から選択されるウイルスとを接触させ、次いで、陽性の診断に際してこの腫瘍を適切な治療剤で処置することにより、インターフェロン耐性腫瘍、ｐ５３欠損腫瘍、またはＲｂ欠損腫瘍を処置または改善する方法が、さらに提供される。
【００２０】
本発明のまた別の局面は、レオウイルスおよびこのレオウイルスの複製を検出するための手段を含むキットを提供する。この検出手段は、このレオウイルスの核酸に特異的な一対のプライマーであり得、そして必要に応じてＰＣＲのための試薬を含み得る。この検出手段はまた、レオウイルスタンパク質に特異的な抗体、および二次抗体のような付随する試薬であり得る。この検出手段はさらに、感染した細胞の形態を顕微鏡下で観察するために適したスライドおよび色素、もしくはこのレオウイルスの力価を決定するために使用され得るウイルス培養培地および細胞であり得る。同様に、本発明はまた、特異的な腫瘍細胞の中で複製することが可能である別のウイルス、およびこのウイルスの複製を検出するための手段を含むキットをも提供する。これらのウイルスの例としては、ＶＳＶ、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、およびＤｅｌｔａ２４ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の別の局面は、本発明に従って腫瘍の表現型を検査するために使用され得る少なくとも２つのウイルスを含むキットを提供する。これらのウイルスは、好ましくは異なる表現型を有する新生物について選択的である。好ましくは、これらのウイルスは、レオウイルス、ＶＳＶ、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、およびＤｅｌｔａ２４ウイルスからなる群から選択される。
【００２２】
本発明のまた別の局面は、特定の表現型の新生物の診断のために有用なウイルス、およびこの新生物について選択的な治療剤を含むキットを提供する。
【００２３】
さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、新生物細胞の中で選択的に複製するが、正常細胞の中で選択的に複製しないので、本発明の別の局面は、哺乳動物において新生物の存在を診断する方法を提供し、この方法は、該哺乳動物由来の細胞のサンプルと腫瘍溶解性ウイルスとを接触させる工程を包含し、ここで、該ウイルスの該サンプルの中で複製する能力が、該哺乳動物の中の新生物の存在を示す。
【００２４】
本発明の他の局面は、本出願の全体の開示を考慮して明らかとなる。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、腫瘍溶解性ウイルスを使用することにより特定の表現型を有する新生物を診断する方法を提供する。特に、ｒａｓ経路の異常に高い活性により媒介された腫瘍は、レオウイルスを使用して診断され得る。レオウイルスは、正常細胞の中で複製しない。しかし、レオウイルスは、活性化されたｒａｓ経路を伴う細胞の中で選択的に複製し、この複製はこれらの細胞の死を引き起こす。従って、ｒａｓ活性化腫瘍を、この腫瘍のレオウイルス複製に対する感受性により診断し得る。次いで、これらの診断は、この腫瘍の処置または改善をより効果的に容易にする。
【００２６】
本発明はさらに、他の腫瘍（例えば、インターフェロン耐性腫瘍、ｐ５３欠損腫瘍およびＲｂ欠損腫瘍）を診断ならびに／あるいは処置または改善するために適用され得る。本明細書中に開示される、診断または処置において有用なキットもまた、提供される。
【００２７】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本出願において使用される用語を、別の方法で示さない限り、以下のように定義する。
【００２８】
（定義）
本明細書中で使用される場合、「新生物細胞」（「増殖異常（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を有する細胞」としても知られる）とは、正常な増殖阻害特性を有さずに増殖する（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）細胞を指す。新生物細胞を含む腫瘍（ｎｅｗ  ｇｒｏｗｔｈ）とは、「新生物」または「腫瘍」である。新生物とは、異常な組織増殖（一般に別個の物体を形成し、細胞増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）により正常な組織増殖よりも急速に増殖する）である。新生物は、正常組織との構造的組織化および機能的強調の部分的なあるいは全体的な欠如を示し得る。本明細書中で使用される場合、新生物は、造血新生物および固形新生物を含むように意図される。
【００２９】
新生物は、良性（良性腫瘍）または悪性（悪性腫瘍もしくは癌）であり得る。悪性腫瘍は、３つの主要な型に大きく分類され得る。上皮構造から生じる悪性新生物は、癌腫と呼ばれ、結合組織（例えば、筋肉、軟骨、脂肪または骨）に起源を持つ悪性新生物は、肉腫と呼ばれ、そして免疫系の構成要素を含む造血構造（血液細胞の形成に関係する構造）に影響する悪性腫瘍は、白血病およびリンパ腫と呼ばれる。他の新生物としては、神経線維腫症が挙げられるが、これに限定されない。
【００３０】
「ＰＫＲ欠損細胞」とは、ＰＫＲが正常細胞の中の場合と同様には活性化されない細胞である。このようなＰＫＲ欠損性は、例えば、ＰＫＲ遺伝子の中の変異あるいはＰＫＲタンパク質もしくはＰＫＲ活性の減少したレベルが原因となり得る。例えば、ｒａｓ活性化新生物細胞は、ＰＫＲ欠損性である。なぜなら、この活性化されたｒａｓ経路は、リン酸化されたＰＫＲをブロックするからである。ＰＫＲタンパク質レベルまたはＰＫＲ活性レベルについてのアッセイは、当該分野で公知である。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ｒａｓ活性化新生物細胞」または「ｒａｓ媒介性新生物細胞」は、少なくとも部分的に、ｒａｓ経路の活性化が原因となって異常に高速度で増殖する細胞を、指す。このｒａｓ経路は、ｒａｓ遺伝子構造変異、ｒａｓ遺伝子発現の亢進したレベル、ｒａｓ遺伝子メッセージの亢進した安定性、あるいは、ｒａｓまたはｒａｓ経路におけるｒａｓから下流もしくは上流の因子の活性化を引き起こしてｒａｓ経路活性を増大させる任意の変異または他の機構によって、活性化され得る。例えば、ＥＧＦレセプター、ＰＤＧＦレセプターまたはＳｏｓの活性化は、ｒａｓ経路の活性化を生じる。ｒａｓ媒介性新生物細胞として、ｒａｓ媒介性癌細胞（これらは、ｒａｓ経路の活性化が原因となって悪性な様式で増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）する細胞である）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
「ｒａｓ活性化腫瘍」とは、このｒａｓ経路が活性化された腫瘍である。
【００３３】
「インターフェロン耐性腫瘍」または「インターフェロン耐性の表現型を有する腫瘍」とは、インターフェロン−α、インターフェロン−βまたはインターフェロン−γにより処置あるいは改善され得ない腫瘍である。
【００３４】
「ｐ５３欠損腫瘍」または「ｐ５３欠損性の表現型を有する腫瘍」とは、細胞性腫瘍サプレッサーであるｐ５３のレベルが正常細胞の中よりも低い腫瘍である。
【００３５】
「Ｒｂ欠損腫瘍」または「Ｒｂ欠損性の表現型を有する腫瘍」とは、細胞性腫瘍サプレッサーであるＲｂのレベルが正常細胞の中よりも低い腫瘍である。
【００３６】
「腫瘍溶解性ウイルス」とは、新生物細胞を選択的に殺傷するウイルスである。新生物細胞の殺傷を、当該分野で確立された任意の方法（例えば、生細胞数、細胞病理性効果、これらの新生物細胞のアポトーシス、新生物細胞の中でのウイルス性タンパク質の合成（例えば、代謝性ラベリング、ウイルス性タンパク質のウェスタン分析、もしくは複製のために必須なウイルス性遺伝子の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による）、または腫瘍の大きさの減少を決定する工程）により検出し得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「レオウイルス」とは、レオウイルス属に分類される任意のウイルスを指す。名称、レオウイルス（呼吸性ウイルスおよび腸管オーファンウイルス）とは、これらのウイルスが、ヒトにおけるいずれの既知の病状とも関係ないが、気道および腸管道の両方から単離され得ることを示唆する記述的頭字語である。用語「レオウイルス」とは、レオウイルス属に分類されるすべてのウイルスを指す。
【００３８】
ヒトレオウイルスは、３つの血清型からなる：１型（Ｌａｎｇ株もしくはＴ１Ｌ株）、２型（Ｊｏｎｅｓ、Ｔ２Ｊ株）および３型（Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株、Ｔ３Ｄ株）。これらの３つの血清型は、中和アッセイおよび赤血球凝集素阻害アッセイに基づいて容易に同定可能である（例えば、Ｎｉｂｅｒｔら，１９９６を参照のこと）。
【００３９】
レオウイルスは、自然に生じ得るかまたは改変され得る。レオウイルスは、これが自然の中の供給源から単離され得、そして実験室内で人により意図的に改変されなかった場合に、「自然に生じる」。例えば、レオウイルスは、「フィールド供給源」由来であり得、すなわち、レオウイルスに感染したヒト由来であり得る。
【００４０】
レオウイルスは、改変され得るが、活性なｒａｓ経路を有する哺乳動物細胞を溶解して感染することがいまだ可能であり得る。このレオウイルスは、増殖中の（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ）細胞への投与の前に、化学的にまたは生化学的に前処理され得る（例えば、プロテアーゼ、例えば、キモトリプシンもしくはトリプシンによる処理により）。プロテアーゼによる前処理により、ウイルスの外側コートまたはカプシドが除去され、そしてウイルスの感染性が増加し得る。レオウイルスは、リポソームまたはミセルの中でコートされ得て（ＣｈａｎｄｒｏｎおよびＮｉｂｅｒｔ，１９９８）レオウイルスに対する免疫が発達した哺乳動物から、免疫応答を減少させるか防止する。例えば、ビリオンは、ミセルの存在下でキモトリプシンにより処理され得、硫酸アルキル界面活性剤の凝集を形成させて、新たな感染性サブビリオン粒子を産生する。
【００４１】
このレオウイルスは、２つ以上の遺伝学的に別個のレオウイルス由来のゲノムのセグメントの組換え／再編成から生じる組換えレオウイルスであり得る。この組換えレオウイルスは、病原性表現型の相違を伴う２つ以上の型のレオウイルス由来であり得、従って、これは異なる抗原決定基を含み、これにより、以前にレオウイルスサブタイプに暴露した哺乳動物による免疫応答を減少または防止する。組換えレオウイルスは、起源となるレオウイルスと比べて異なる生物学意的活性（例えば、新生物細胞の中での複製活性および体内分布）もまた呈示し得る。レオウイルスゲノムのセグメントの組換え／再編成は、宿主生物体への少なくとも２つの遺伝学的に別個のレオウイルスによる感染の後に自然に起こり得る。組換えビリオンを、例えば、許容性宿主細胞への遺伝学的に別個のレオウイルスの共感染により、細胞培養物の中で産生し得る（Ｎｉｂｅｒｔら１９９６）。
【００４２】
従って、本発明は、２つ以上の遺伝学的に別個のレオウイルス（ヒトレオウイルス（例えば、１型（例えば、Ｌａｎｇ株）、２型（例えば、Ｊｏｎｅｓ株）、３型（例えば、Ｄｅａｒｉｎｇ株もしくはＡｂｎｅｙ株））、非ヒト哺乳動物レオウイルス、または鳥レオウイルスが挙げられるが、これに限定されない）のゲノムセグメントの再編成から生じる組換えレオウイルスの使用を企図する。本発明は、２つ以上の遺伝学的に別個のレオウイルス由来のゲノムセグメントの再編成から生じる組換えレオウイルスの使用（ここで、少なくとも１つの親ウイルスは、遺伝子工学的に作製されるか、１つ以上の化学的に合成されたゲノムセグメントを含むか、化学的変異導入もしくは物理的変異導入により処理されたか、またはそれ自身の組換え現象の結果である）をさらに企図する。本発明はさらに、化学的変異導入（硫酸ジメチルおよび臭化エチジウムが挙げられるが、これに限定されない）あるいは物理的変異導入（紫外線光および他の形態の放射が挙げられるが、これに限定されない）の存在下で組換えを受けた組換えレオウイルスの使用をさらに企図する。
【００４３】
本発明は、１つ以上のゲノムセグメントにおける欠失または複製を含む組換えレオウイルス、宿主細胞ゲノムとの組換えの結果としての付加的な遺伝学的情報を含む組換えレオウイルス、あるいは合成遺伝子を含む組換えレオウイルスをさらに企図する。
【００４４】
腫瘍の「表現型を検査すること」とは、表現型に従って腫瘍を分類することを意味する。例えば、腫瘍の表現型として、ｒａｓ経路活性化、インターフェロン耐性、ｐ５３欠損性およびＲｂ欠損性が挙げられる。これらの表現型は、互いに排他的でなく、すなわち、腫瘍は、１つより多くのクラスの中に表現型を検査され得る。
【００４５】
「生物学的サンプル」とは、生物学的被験体（例えば、動物）から回収されたサンプルである。
【００４６】
「有効量」とは、意図した目的を達成するために十分である量である。例えば、レオウイルスの、疾患または医学的状態を処置または改善する目的のために有効な量とは、疾患または医学的状態の症状の減少あるいは完全な除去を生じるために十分な量である。所定の治療剤の有効量は、要因（例えば、薬剤の特性、投与の経路、治療剤を受け入れる動物の大きさおよび種、ならびに投与の目的）とともに変化する。各々の個々の場合における有効量は、当該分野で確立した方法に従って、当業者により経験的に決定され得る。
【００４７】
疾患または医学的状態を「処置または改善すること」とは、疾患または医学的状態の症状の減少あるいは完全な除去を意味する。
【００４８】
治療剤は、この薬剤が他の疾患または医学的状態よりも特定の疾患または医学的状態のために効果的である場合に、特定の疾患または医学的状態について「選択的」である。同様に、治療剤は、この薬剤が他の新生物細胞よりも高い効率でこれらの特定の群の新生物細胞を殺傷する場合に、特定の群の新生物細胞について選択的である。
【００４９】
（方法）
本発明は、腫瘍の正確な表現型を検査することにおいて有用であり、これにより、特定の腫瘍のためにあつらえた処置レジメンの開発を容易にする。好ましい実施形態において、レオウイルスは、腫瘍保有動物から回収された生物学的サンプルに感染させるために使用される。レオウイルスは、ｒａｓ活性化新生物細胞に選択的に感染するが、正常細胞またはｒａｓ経路が活性化されない腫瘍細胞には選択的に感染しないので、本方法により、開業医が、腫瘍がｒａｓ経路の活性化と関係があるか否かを正確に決定することが可能となる。ｒａｓ活性化であると診断された場合、腫瘍をｒａｓ特異的処置レジメン（例えば、レオウイルス療法（米国特許番号第６，１３６，３０７号））で処置し得る。
【００５０】
ｒａｓ経路は、細胞増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を引き起こす複雑なシグナル伝達経路である。ｒａｓは、この経路において中心の中継物であり、上流要素（例えば、増殖因子レセプター）からシグナルを受け取り、これらを下流要素へと伝える。
【００５１】
多くの増殖因子レセプター（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）レセプター、およびＥＧＦレセプター関連分子（例えばＨｅｒ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２））は、リガンド誘導性レセプター二量体化により活性化される内因性のチロシンキナーゼ活性を有する。これにより、レセプターのチロシン残基上での自己リン酸化およびＳｒｃ−相同性２（ＳＨ２）ドメイン含有タンパク質の結合が生じる。２つのこのようなＳＨ２タンパク質は、Ｇｒｂ２およびＳＨＣであり、これらは、間接的に、原形質膜関連、小型ＧＴＰ結合タンパク質であるＲａｓを活性化する。Ｒａｓ活性化は、リガンドの７回膜貫通ドメインＧ−タンパク質共役レセプターとの結合に応答してもまた生じる（例えば、Ｇｕｔｋｉｎｄ，１９９８）。Ｒａｓおよび他の増殖因子レセプターに制御されるシグナル経路の活性化は、最終的に細胞骨格における変化ならびに、細胞増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、分化、および形質転換のために必要である遺伝子発現における変化を引き起こす（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９８に総説される）。
【００５２】
これらの３つのヒトｒａｓ遺伝子（Ｈａ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、およびＫｉ−Ｒａｓ）は、４つのタンパク質（Ｋｉ−Ｒａｓ  ｍＲＮＡの選択的スプライシングによる）をコードする。正常な環境下では、Ｒａｓタンパク質は、活性な（ＧＴＰ結合）状態と不活性な（ＧＤＰ結合）状態との間を巡回する。Ｒａｓ活性化は、結合したＧＤＰのＧＴＰへの変換により生じ、これはグアニンヌクレオチド交換因子のファミリーにより促進される。Ｒａｓ不活性化は、結合ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解により生じる。この反応は、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）により促進される。多くのヒト癌において、Ｒａｓタンパク質は、これらのＧＴＰアーゼ活性を破壊する変異により、発癌的に活性化され、従ってＲａｓシグナルを制御しない（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９８に総説される）。
【００５３】
シグナル伝達および発癌性形質転換においてＲａｓの下流としての役目を果たし得る複数の候補Ｒａｓエフェクターが存在し、小型ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのメンバー、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびセリン／トレオニンタンパク質キナーゼｃ−Ｒａｆ−１が挙げられる（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，１９９８に総説される）。Ｒａｆ媒介性シグナルは、最もよく特徴付けられたＲａｓエフェクター経路である。活性化したＲａｓは、ＲａｆをＲａｆ活性化が生じる膜へリクルートする。活性化したＲａｆは、キナーゼカスケードであり、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）カスケードの最初の構成要素である。Ｒａｆは、ＭＥＫＩおよびＭＥＫ２（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ）タンパク質キナーゼをリン酸化して活性化し、順番に、ＭＥＫ１およびＭＥＫ２タンパク質キナーゼが、細胞外シグナル制御キナーゼＥＲＫ１およびＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１およびＭＡＰＫ２としても知られる）をリン酸化して活性化する。これらの下流標的である、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２と異なり、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２タンパク質は、これらの唯一の既知の基質がＥＲＫ１タンパク質、ＥＲＫ２タンパク質である、高特異性の酵素である。活性化の際、ＥＲＫ１およびＲＫ２は、種々の標的タンパク質（核転写因子を含む）をリン酸化し（そして従って制御し）、最終的な細胞応答を引き起こす。
【００５４】
従って、多数の現象は、ｒａｓ経路の活性化を引き起こし得る。例えば、変異は、これらの３つのｒａｓ構造遺伝子のいずれかにおいて生じ得る。構造的変異は、ｒａｓの上流にあるレセプター、ｒａｓから下流のシグナル伝達因子（例えば、ｒａｆまたはｍｅｋｌ、ｍｅｋ２）、あるいは最終的なエフェクターＭＡＰＫ１およびＭＡＰＫ２においてもまた生じ得る。同様に、ｒａｓ経路における任意のタンパク質の異常に高いレベルの発現を引き起こす制御変異は、分裂促進性細胞応答もまた生じ得る。このような制御変異は、ｒａｓ経路メンバーの制御配列の中のどこかで、あるいは、ｒａｓ経路メンバーの発現を制御する因子の構造領域または制御領域の中でさえ、生じ得る。結果として、ｒａｓ経路における任意の特異的なメンバーの異常性（ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）の検出は、ｒａｓ経路が活性化されるか否かを決定するための有効な方法でない。
【００５５】
ＭＡＰＫ（ｒａｓ経路の最終的なエフェクター）の活性を測定することは可能である。なぜならＭＡＰＫの恒常的な活性化はｒａｓ経路活性化を示すからである。しかし、このような生化学的アプローチは、相当な量のサンプル物質、ならびにＭＡＰＫの抽出および／または部分的な精製のような単調な手順を必要とする。
【００５６】
任意の特異的な遺伝子または遺伝子産物の異常（ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）よりもむしろｒａｓ活性化表現型を検出することにより、ｒａｓ経路活性化がｒａｓ構造遺伝子、ｒａｓ遺伝子の制御配列、またはｒａｓ経路における任意の他の因子の変異が原因であってもなくても、本発明は、有用である。さらに、本方法は、比較的簡便であり、サンプルから酵素を抽出または精製する必要がない。
【００５７】
レオウイルスがサンプルにおいて細胞に感染する能力は、当該分野の任意の方法により決定され得る。例えば、レオウイルス核酸複製を、使用したレオウイルスに特異的なプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応により測定し得る；レオウイルスタンパク質合成を、特異的抗体により検出し得る；感染した細胞を、顕微鏡下でおよび検出したレオウイルスにより誘導される細胞変性効果の証明下で観察し得る；そして、複製したレオウイルスを、サンプルから回収し得、ウイルス力価を決定し、ウイルスの複製が起こるか否かを評価する。レオウイルス複製の有無を決定する他の方法は、当業者に公知であるかまたは当業者により開発され得る。
【００５８】
腫瘍が、複数の発癌性異常を含み得ることは、注目されるべきである。特に、ｒａｓ活性化がしばしばｐ５３過剰発現乳癌に先立って生じることが、報告された（Ｓｍｉｔｈら，２０００）。しかし、ｒａｓ経路活性化に加えて他の発癌性異常の存在は、ｒａｓ活性化腫瘍のために特別にあつらえた治療レジメンの能力を阻害しない。例えば、レオウイルスは、ｒａｓ活性化新生物細胞を、たとえこれらの細胞が異常に高レベルのｐ５３をもまた含む場合でも、なお選択的に殺傷し得る。
【００５９】
さらに、レオウイルスは、ｒａｓ活性化新生物細胞の中で選択的に複製するが、正常細胞の中で選択的に複製しないので、本発明の別の局面は、哺乳動物において新生物の存在を診断する方法であって、この哺乳動物由来の細胞のサンプルとレオウイルスとを、このレオウイルスがｒａｓ活性化細胞の中で複製する条件で接触させる工程を包含し、このウイルスのこのサンプルの中で複製する能力が該哺乳動物の中の新生物の存在を示す、方法を提供する。
【００６０】
レオウイルスと同様に、多数の他の腫瘍溶解性ウイルスもまた、ｒａｓ活性化細胞の中で選択的に複製する。これらの腫瘍溶解性ウイルスは、レオウイルスと同じ様式で本発明を実施するために使用され得ることが、企図される。これらのウイルスは、代表的には二本鎖ＲＮＡキナーゼ（ＰＫＲ）に対して感受性である変異体であり、一方でこれらの野生型は、ＰＫＲに対して感受性でない。
【００６１】
通常は、ウイルスが細胞に入る場合、ＰＫＲは、活性化されてタンパク質合成をブロックし、そしてこのウイルスは、この細胞の中で複製し得ない。いくつかのウイルスは、ＰＫＲを阻害するためのシステムを発展させ、ウイルスのタンパク質合成およびウイルスの複製を促進する。例えば、アデノウイルスは、大量の小型のＲＮＡである、ＶＡ１  ＲＮＡを作り出す。ＶＡ１  ＲＮＡは、広範囲の二次構造を有し、そして通常はＰＫＲを活性化する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と競合的にＰＫＲと結合する。ＰＫＲを活性化するためは、最小の長さのｄｓＲＮＡを必要とするので、ＶＡ１  ＲＮＡは、ＰＫＲを活性化しない。その代わりに、これは、大量であることによりＰＫＲを隔絶させる。その結果、タンパク質合成はブロックされず、アデノウイルスは細胞の中で複製し得る。
【００６２】
Ｒａｓ活性化新生物細胞は、ＰＫＲによるタンパク質合成阻害に支配されない。なぜならｒａｓはＰＫＲを不活性化するからである。従って、これらの細胞は、ウイルスがＰＫＲ阻害システムを有さない場合でさえも、ウイルスの感染に対して感受性である。従って、アデノウイルスの中のＰＫＲインヒビターが、ＰＫＲ機能をこれ以上阻害しないように変異される場合、生じるウイルスは、ＰＫＲによるタンパク質合成阻害が原因となって正常細胞に感染しないが、ＰＫＲ活性を欠くｒａｓ活性化新生物細胞の中では複製する。
【００６３】
従って、ＰＫＲ機能を阻害しないように改変または変異されたウイルスは、ｒａｓ活性化新生物細胞の中で選択的に複製する一方で、正常細胞は、耐性である。好ましくは、このウイルスは、ＶＡ１領域において変異されたアデノウイルス、Ｋ３Ｌ領域および／またはＥ３Ｌ領域において変異されたワクシニアウイルス、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子において変異されたパラポックスウイルス・オーフウイルス、ＮＳ−１遺伝子において変異されたインフルエンザウイルス、またはγ１３４．５遺伝子において変異されたヘルペスウイルスである。
【００６４】
これらのウイルスは、ウイルス性ＰＫＲインヒビターの既知の構造−機能関係に従って改変または変異され得る。例えば、Ｅ３タンパク質のアミノ末端領域は、ＰＫＲのカルボキシ末端領域ドメインと相互作用するので、このドメインの除去変異または点変異は、抗ＰＫＲ機能を妨げる（Ｃｈａｎｇら，１９９２，１９９３，１９９５；Ｓｈａｒｐら，１９９８；Ｒｏｍａｎｏら，１９９８）。ワクシニアウイルスのＫ３Ｌ遺伝子は、ｐＫ３（ＰＫＲの偽基質）をコードする。ここでは、Ｋ３Ｌの中の機能欠失変異が存在する。ｅＩＦ−２の中の残基７９〜８３と相同である、Ｋ３Ｌタンパク質のＣ末端部分の切断または点変異は、ＰＫＲ阻害活性を消失させる（Ｋａｗａｇｉｓｈｉ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，１９９７）。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、インターフェロン耐性腫瘍を診断するために使用され得る。インターフェロンは、細胞表面レセプターと結合し、最終的に標的細胞の中で抗ウイルス性応答と増殖阻害性シグナルおよび／またはアポトーシスシグナルとの両方を引き起こす。インターフェロンは理論的に腫瘍細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害するために使用されるが、この試みは、インターフェロン経路のメンバーの腫瘍特異的変異のためにあまり成功していない。
【００６６】
しかし、インターフェロンにより及ぼされる増殖阻害を避けるためにインターフェロン経路を停止させることにより、腫瘍細胞は、同時にこれらの抗ウイルス性応答を含み得る。実際、ＶＳＶ（エンベロープされた、ネガティブセンスＲＮＡウイルス）は、インターフェロンの存在下で種々のヒト腫瘍細胞株の中で急速に複製して種々のヒト腫瘍細胞株を殺傷し、一方で正常ヒト初代細胞培養物は、インターフェロンにより明確に保護されたことが、示された。ＶＳＶは、インターフェロン耐性でさらにＶＳＶ感受性である腫瘍を診断するために使用され得る。レオウイルスの実施形態のように、ＶＳＶベースの診断は、表現型の評価であり、かつインターフェロン耐性の機構に依存しない。
【００６７】
本発明の別の実施形態において、ＯＮＹＸ−０１５ウイルスは、ｐ５３欠損腫瘍を診断するために使用され得る。ｐ５３は、潜在的腫瘍サプレッサーであり、あらゆる細胞の中に存在し、細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ）を制御する。ウイルスは、細胞増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）機構に依存して複製するので、これらは、ｐ５３制御の支配下にあり、そして過剰複製し得ない。しかし、特定のアデノウイルスである、ＳＶ４０およびヒトパピローマウイルスは、ｐ５３を不活性化するタンパク質を含み、それにより自身の複製を可能にする（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ  １９９９）。
【００６８】
アデノウイルス血清型５については、このタンパク質は、Ｅ１Ｂ領域にコードされる５５Ｋｄタンパク質である。この５５ｋｄタンパク質をコードするＥ１Ｂ領域が、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，１９９６；ＷＯ９４／１８９９２）における場合のように除去される場合、５５ｋｄのｐ５３インヒビターは、もはや存在しない。結果として、ＯＮＹＸ−０１５が正常細胞に入る場合、ｐ５３は、細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）およびウイルスの複製を抑制するように機能する。従って、ＯＮＹＸ−０１５は、正常細胞の中で複製しない。他方で、ｐ５３機能を欠いた新生物細胞の中では、ＯＮＹＸ−０１５は複製し得そして最終的に細胞を死へと導き得る。従って、このウイルスは、サンプルの中でｐ５３欠損新生物細胞を検出するために使用され得る。当業者は、確立した技術を使用してアデノウイルス５または他のウイルスの中のｐ５３インヒビター遺伝子を変異させて崩壊させ得、そして生じるウイルスは、本方法においてｐ５３欠損腫瘍を診断するために有用である。
【００６９】
同様に、Ｄｅｌｔａ２４ウイルスは、Ｒｂ欠損腫瘍を診断するために使用され得る。Ｄｅｌｔａ２４ウイルスは、ＥｌＡ領域の中に２４塩基対の欠失を有する変異体アデノウイルスである（Ｆｕｅｙｏら，２０００）。この領域は、細胞性腫瘍サプレッサーＲｂへの結合およびＲｂ機能の阻害に重要であり、これにより、細胞性増殖機構、および従ってウイルス複製が、調節不能な様式で進行することを可能にする。Ｄｅｌｔａ２４は、Ｒｂ結合領域の欠失を有し、そしてＲｂと結合しない。従って、この変異体ウイルスの複製は、正常細胞の中でＲｂにより阻害される。しかし、Ｒｂが不活性化されて細胞が新生物性になる場合、Ｄｅｌｔａ２４は、もはや阻害されない。その代わり、この変異体ウイルスは、効率的に複製し、Ｒｂ欠損細胞を溶解する。従って、Ｄｅｌｔａ２４ウイルスは、サンプルがＲｂ欠損腫瘍細胞を含むか否かを決定するために使用され得る。
【００７０】
ｒａｓ活性化腫瘍細胞と同様に，ｐ５３欠損細胞またはＲｂ欠損細胞は、種々の理由の結果であり得る。例えば、ｐ５３またはＲｂの構造遺伝子における変異は、機能不全の遺伝子産物または乏しい転写を引き起こし得、ｐ５３遺伝子またはＲｂ遺伝子の調節配列の中の変異は、減少した量の転写を生じ得、ｐ５３遺伝子またはＲｂ遺伝子についての転写因子における変異は、欠失したｐ５３またはＲｂの産生を生じ得、あるいは、ｐ５３機能またはＲｂ機能のために必要な補因子における変異はまた、ｐ５３欠損性またはＲｂ欠損性の理由となり得る。本発明は、ｐ５３またはＲｂの遺伝子／タンパク質のみの構造的異常（ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）よりもむしろ表現型を検出するので、本発明は、ＰＣＲのような構造ベースの方法よりパワフルである。
【００７１】
一旦腫瘍の表現型が決定されれば、この腫瘍を、これの表現型に従って処置し得る。例えば、ｒａｓ活性化腫瘍を、レオウイルス、またはｒａｓ経路のインヒビターにより処置し得る。従って、本発明は、動物においてｒａｓ活性化新生物を処置するかもしくは改善させる方法であって、この動物におけるｒａｓ活性化新生物をこの動物から一群の細胞を取り出すことにより同定する工程、これらの細胞をレオウイルスと、このレオウイルスがｒａｓ活性化細胞の中で複製することが可能となる条件下で接触させる工程、このレオウイルスがこれらの細胞の中で複製し得る場合に、これらの細胞を、ｒａｓ活性化新生物細胞を含むとして同定する工程、ならびに有効量のレオウイルスを哺乳動物へ投与する工程を含む、方法もまた提供する。レオウイルス療法は、例えば、米国特許番号第６，１３６，３０７号に開示された。
【００７２】
さらに、本発明は、腫瘍を処置または改善する方法であって、サンプルを回収する工程、このサンプルの表現型をＶＳＶ、Ｄｅｌｔａ２４またはＯＮＹＸ−０１５ウイルスにより同定する工程、ならびにこの表現型に従って有効量の適切な治療剤を投与する工程を含む、方法もまた提供する。この治療剤は、ウイルス自体であり得、あるいは、ｐ５３欠損性またはＲｂ欠損性の場合には、ｐ５３またはＲｂ機能のアクチベータであり得る。Ｄｅｌｔａ２４およびＯＮＹＸ−０１５は、本発明の適用を明らかにするための単なる例であり、一方で当業者は、本開示に従っての腫瘍の診断および処置において有用な他のウイルスを同定または開発することが可能であることを、注意するべきである。
【００７３】
レオウイルスと同様に、免疫保護されたウイルスまたは他の腫瘍溶解性ウイルスの再集合体ウイルスの使用もまた、本発明の中に含まれる。さらに、本出願で特に考察したウイルスに加えて、当業者は、本明細書中の開示および当該分野で入手可能な知識に従って腫瘍溶解性ウイルスを使用して、本発明を実施し得る。この腫瘍溶解性ウイルスは、ミオウイルス科、サイフォウイルス科、ポドウイルス科、テクチウイルス科（ｔｅｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、コルチウイルス科、プラズマウイルス、リポスリクスウイルス科、フセロウイルス属、ポックスウイルス、イリドウイルス科、フィコドナウイルス科、バキュロウイルス科、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科，パポバウイルス科、ポリドナウイルス科、イノウイルス科、ミクロウイルス科、ジェミニウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、ヘパドナウイルス科、レトロウイルス科、シストウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科，オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レビウイルス科、ピコルナウイルス科、セキウイルス科、コモウイルス科、ポティウイルス科、カリチウイルス科、アストロウイルス科、ノダウイルス科、テトラウイルス科、トンブスウイルス科、コロナウイルス科、グラビウイルス科（ｇｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科、またはバルナウイルス科の科の中のメンバーであり得る。
【００７４】
本発明は、任意の動物、特に哺乳動物に適用され得る。好ましい哺乳動物として、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒトおよび非ヒト霊長類が挙げられる。最も好ましくは、この哺乳動物は、ヒトである。
【００７５】
（キット）
本発明は、腫瘍の診断および／または処置のために有用なキットを提供する。本発明の１つの局面は、レオウイルスおよびこのレオウイルスの複製を検出するための手段を含むキットを提供する。この検出手段は、このレオウイルスの核酸に特異的な一対のプライマーであり得、そして必要に応じてＰＣＲのための試薬を含み得る。この検出手段は、レオウイルスタンパク質に特異的な抗体であり得、そして必要に応じて二次抗体のような付随する試薬を含み得る。この検出手段はさらに、感染した細胞の形態を顕微鏡下で観察するために適したスライドおよび色素、もしくはこのレオウイルスの力価を決定するために使用され得るウイルス培養培地および細胞であり得る。同様に、本発明は、特異的な腫瘍細胞の中で複製することが可能である別のウイルス、およびこのウイルスの複製を検出するための手段を含むキットをもまた提供する。これらのウイルスの例として、ＶＳＶ、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、およびＤｅｌｔａ２４ウイルスが挙げられ、これらに限定されない。
【００７６】
本発明の別の局面は、本発明に従って腫瘍の表現型を検査するために使用され得る少なくとも２つのウイルスを含むキットを提供する。好ましくは、これらのウイルスは、レオウイルス、ＶＳＶ、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、およびＤｅｌｔａ２４ウイルスからなる群から選択される。
【００７７】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例において、以下の略語は、以下の意味を有する。定義されない略語は、これらの一般に受け入れられる意味を有する。
【００７９】
℃  ＝  セルシウス温度
ｈｒ  ＝  時間
ｍｉｎ  ＝  分
μＭ  ＝  マイクロモル濃度
ｍＭ  ＝  ミリモル濃度
Ｍ  ＝  モル濃度
ｍｌ  ＝  ミリリットル
μｌ  ＝  マイクロリットル
ｍｇ  ＝  ミリグラム
μｇ  ＝  マイクログラム
ＰＡＧＥ  ＝  ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｒｐｍ  ＝  回転／分
ＦＢＳ  ＝  ウシ胎仔血清
ＤＴＴ  ＝  ジチオスレイトール
ＳＤＳ  ＝  ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＢＳ  ＝  リン酸緩衝化生理食塩水
ＤＭＥＭ  ＝  ダルベッコ改変イーグル培地
α−ＭＥＭ  ＝  α改変イーグル培地
β−ＭＥ  ＝  β−メルカプトエタノール
ＭＯＩ  ＝  感染多重度
ＰＦＵ  ＝  プラーク形成単位
ＥＧＦ  ＝  上皮増殖因子
ＰＤＧＦ  ＝  血小板由来増殖因子
ＣＰＥ  ＝  細胞変性効果
ＶＳＶ  ＝  水疱性口内炎ウイルス
ＰＣＲ  ＝  ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＨ２  ＝  ｓｒｃ−相同性２
（実施例１）
（レオウイルスによる腫瘍の表現型検査）
塊が、６５歳の女性の中で、規則的なマンモグラムを受ける場合に見つかる。サンプルは、生検の間にこの塊から回収され、悪性腫瘍であるようである。この腫瘍がｒａｓ活性化細胞を含むか否かを決定するために、このサンプルを、細胞培養物の中に配置し、レオウイルスとともにインキュベートする。
【００８０】
レオウイルス血清型３のＤｅａｒｉｎｇ株を、Ｌ−９２９細胞の懸濁培養物の中で伝播させ、β−メルカプトエタノール（β−ＭＥ）を抽出緩衝液から省略したことを除いてＳｍｉｔｈ（Ｓｍｉｔｈら，１９６９）に従って精製する。精製したレオウイルスについての粒子／ＰＦＵ比は、代表的には１００／１である。この生検サンプルを、ＤＭＥＭの中で切り刻み、レオウイルスとともに２時間３７℃でインキュベートし、新鮮なＤＭＥＭ（２０％ＦＢＳ添加）に交換し、そして４８時間培養する。その後、培養物の上清を回収し、レオウイルス力価を決定する。この結果は、レオウイルスがサンプルの中で複製したことを示す。従って、この乳腫瘍は、ｒａｓ活性化腫瘍細胞を含む。
【国際調査報告】
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