(57)【要約】すべて心臓肥大および心不全を発症した5つの独立したトランスジェニック創始系統を作製した。最も重篤な表現型をもつ系統を詳細に分析した。トランスジェニック心臓11βHSD2 mRNA発現は、非トランスジェニックマウスに対して4,000倍超増加し、発現された酵素は、触媒活性を有することが見出された。5ヶ月齢において、トランスジェニックマウスは、血圧における増加がない状態で、重篤な心筋肥大を発症した。トランスジェニックマウスの左心室における間質性線維症は、ピクロシリウスレッド染色により明らかになった。マウスの心臓は、ひどく拡張し、心筋細胞サイズは増加した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非トランスジェニックのアイソジェニックなマウスと比較して、心臓において11-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ2(11βhsd2)の増加した量の酵素活性を発現させるトランスジェニックマウス。
【請求項２】
心筋細胞において酵素を発現させる請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
酵素が心筋細胞特異的プロモーターの転写制御下において発現される、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
酵素がα-ミオシン重鎖プロモーターの転写制御下において発現される、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
酵素が以下のものからなる群より選択されるプロモーターの転写制御下において発現される、請求項1記載のトランスジェニックマウス：β-ミオシン重鎖プロモーター、心臓トロポニンCプロモーター、心臓トロポニンTプロモーター、および心臓トロポニンIプロモーター。
【請求項６】
少なくとも50％より高い酵素活性を発現させる、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
少なくとも100％より高い酵素活性を発現させる、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
少なくとも250％より高い酵素活性を発現させる、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
少なくとも500％より高い酵素活性を発現させる、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０】
少なくとも1000％より高い酵素活性を発現させる、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１１】
酵素がマウス酵素である、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１２】
酵素がα-ミオシン重鎖プロモーターの制御下にある、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１３】
酵素がcDNA配列から発現される、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１４】
酵素が配列番号：1または31に示される配列から発現される、請求項1記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１５】
以下の段階を含む、心臓線維症、心臓肥大、または心不全を軽減する能力について試験薬剤をスクリーニングする方法：
試験薬剤を請求項1記載のマウスへ投与する段階；
マウスにおいて心臓線維症、心臓肥大、または心不全に関連する生物学的現象をモニターする段階であって、生物学的現象に陽性の効果を有する試験薬剤が、心臓線維症、心臓肥大、または心不全を軽減するための候補薬である、段階。
【請求項１６】
モニターされる生物学的現象が心臓質量である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
モニターされる生物学的現象が早期死亡である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
モニターされる生物学的現象が心室の拡張である、請求項15記載の方法。
【請求項１９】
モニターされる生物学的現象が心臓のコラーゲン含有量である、請求項15記載の方法。
【請求項２０】
モニターされる生物学的現象が間質性線維症である、請求項15記載の方法。
【請求項２１】
モニターされる生物学的現象が心筋細胞膨大である、請求項15記載の方法。
【請求項２２】
モニターされる生物学的現象が心室壁の菲薄化である、請求項15記載の方法。
【請求項２３】
試験薬剤が化合物の組み合わせを含む、請求項15記載の方法。
【請求項２４】
化合物の組み合わせが、心臓障害を治療するとして知られている少なくとも1つの化合物を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
化合物の組み合わせが、以下のものからなる群より選択される少なくとも1つの化合物を含む、請求項23記載の方法：アンジオテンシン受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、ベータ遮断薬、ACE阻害剤、利尿薬、およびジゴキシン。
【請求項２６】
モニターされる生物学的現象が炎症である、請求項15記載の方法。
【請求項２７】
モニターされる生物学的現象が心臓機能である、請求項15記載の方法。
【請求項２８】
モニターされる心臓機能が駆出分画である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
モニターされる心臓機能が左室径短縮率である、請求項27記載の方法。
【請求項３０】
マウスが、心筋細胞特異的プロモーターに操作可能に連結された、配列番号：1または31に記載の11βhsd2をコードする配列を含む、請求項15記載の方法。
【請求項３１】
モニターされる生物学的現象が肥大性応答遺伝子の発現である、請求項15記載の方法。
【請求項３２】
以下の段階を含む、トランスジェニックマウスを作製する方法：
構築物を形成するために11βhsd2をコードするDNAを心臓特異的プロモーターに連結する段階；
トランスジェニック卵を形成するためにマウス受精卵の前核へ構築物を注入する段階；および
トランスジェニック卵を偽妊娠の雌マウスへ着床させる段階であって、それにより子孫が形成される、段階。
【請求項３３】
さらに以下の段階を含む、請求項32記載の方法：
11βhsd2をコードするDNAと心臓特異的プロモーターとの間の接合部を含むDNA配列を同定することにより、子孫において構築物の存在を確認する段階。
【請求項３４】
さらに以下の段階を含む、請求項32記載の方法：
子孫において11βhsd2の増加した発現を確認する段階。
【請求項３５】
増加した発現が11βhsd2特異的mRNAを測定することにより決定される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
増加した発現が11βhsd2タンパク質を測定することにより決定される、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
増加した発現が11βhsd2酵素活性を測定することにより決定される、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
11βhsd2をコードするDNAが配列番号：1または31に記載の配列を有する、請求項32記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、2002年2月13日に出願された仮出願番号60/355,812号の恩恵を主張する。仮出願の開示は、全体として本明細書に明白に組み入れられている。
【０００２】
発明の背景
本特許文書の明細の一部は、著作権保護にかかる材料を含む。著作権所有者は、特許商標局の特許資料または記録において出る場合、特許文書または特許明細の誰によるファクシミリ複写にも異議はないが、そうでなければ、いかなる著作権権利でもすべて留保する。
【技術分野】
【０００３】
発明の分野
本発明は、心臓治療学の分野に関する。特に、心不全を治療するための新規な薬物を同定および開発するためのモデル系に関する。
【０００４】
先行文献の背景
鉱質コルチコイド受容体(MR)は、DNAの特定の領域(MRE-鉱質コルチコイド応答要素)に結合する細胞内転写因子であり、特定のアルドステロン誘導タンパク質をコードする遺伝子の転写を増加させる。アルドステロンは、鉱質コルチコイド受容体に結合することにより、心不全における不適応性心臓線維症および肥大を媒介することが示された。MRがEvansら(1987)により初めてクローニングされて研究された時、困惑させる現象が注目された。MRのグルココルチコイドコルチゾールに対する親和性が、アルドステロンに対する親和性より約10倍高かった。コルチゾールは、アルドステロンより約100倍高い濃度で循環しているため、MRは、アルドステロンよりむしろ、グルココルチコイドにより圧倒的に占有されることになる。遠位ネフロン、遠位結腸、汗および唾液腺におけるアルドステロン選択性を保証する機構は、酵素11βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ2型(11βHSD2)の高レベルの共発現である。この酵素は、コルチゾールを、MRに結合することができないそれの不活性11-ケト同族体コルチゾンに変換する。MRは、生理学的なグルココルチコイドとアルドステロンを区別しないが、11βHSD2は、この酵素がアルドステロンを結合することができないという点において、識別することができる。それゆえに、11βHSD2は、上皮の標的組織においてグルココルチコイドを不活性化し、アルドステロンがMRに結合して活性化するのを可能にする。興味深いことに、心臓および脳において、11βHSD2は存在せず、それゆえ、これらの組織におけるMRは、常に、グルココルチコイドにより占有されることになる。グルココルチコイドがMRのアゴニストである腎臓においてとは違って、上皮外組織において、グルココルチコイドは、MRのアンタゴニストであるようにみえる。
【０００５】
心不全の動物モデルおよび心疾患を治療するための新規な薬剤を同定および開発するための方法に関して、当技術分野において、継続的な必要性がある。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明の第一の態様において、トランスジェニックマウスが提供される。マウスは、非トランスジェニックのアイソジェニックなマウスと比較して、その心臓において、酵素11-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ2(11βhsd2)の増加した量の活性を発現させる。
【０００７】
本発明の第二の態様において、心臓線維症、心臓肥大、または心不全を軽減する能力について試験薬物をスクリーニングするための方法が提供される。試験薬物は、トランスジェニックマウスへ投与される。マウスは、非トランスジェニックのアイソジェニックマウスより、その心臓において、11-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ2(11βhsd2)のより高い酵素活性を発現させる。心臓線維症、心臓肥大、または心不全に関連する生物学的現象がマウスにおいてモニターされる。生物学的現象に陽性の効果を生じる試験薬物は、心臓線維症、心臓肥大または心不全を軽減するための候補薬として同定される。
【０００８】
本発明の第三の態様により、トランスジェニックマウスを作製するための方法が提供される。11βhsd2をコードするDNAは、心臓特異的プロモーターに連結され、構築物を形成する。構築物は、マウスの受精卵へ注入され、トランスジェニック卵を形成する。トランスジェニック卵は、偽妊娠の雌のマウスへ着床され、子孫が形成される。
【０００９】
本発明の第四の態様により、マウスの11-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ2(11βhsd2)をコードする単離かつ精製された核酸が提供される。核酸は、配列番号：1または31に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
完全な明細を読むことにより当業者にとって明らかであると思われる本発明のこれらおよび他の態様は、心不全を研究するため、および心不全を治療するための治療方法を開発するための優秀なモデル系を当技術分野に供給する。
【００１１】
発明の詳細な説明
非トランスジェニックのアイソジェニックマウスより、心臓において、11-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ2(11βhsd2)のより高い酵素活性を発現させるマウスは、心臓線維症、心臓肥大、および心不全のような心疾患の症状を発生させることが、本発明の知見である。構造的および機能的の両方の変化がトランスジェニックマウスにおいて観察される。そのような変化は、限定されるものではないが、心臓肥大、早期死亡、心室の拡張、心臓におけるコラーゲン沈着、間質性線維症、心筋細胞膨大、心室壁の菲薄化、減少した駆出分画、および減少した左室径短縮率(fractional shortening)を含む。このように、トランスジェニックマウスは、心疾患を治療するための治療薬を同定および開発するための優れたモデル系を示している。
【００１２】
本発明のトランスジェニックマウスは、特に、心臓において、11βhsd2を発現させるが、それは、典型的には、発現されないまたは非常に低レベルで発現される。11βhsd2は、心筋細胞および/または他の心臓細胞において発現されうる。心筋層における発現もまた有用でありうる。組織特異的発現を達成するために、心筋細胞特異的プロモーターを用いることが望ましい。適するプロモーターは、α-ミオシン重鎖(αMHC)プロモーター、β-ミオシン重鎖プロモーター、心臓のトロポニンCプロモーター、心臓のトロポニンTプロモーター、および心臓のトロポニンIプロモーターを含む。心臓特異的発現を提供するいずれのプロモーターも用いられうる。心臓特異的発現は、主に心臓における発現を含む。他の組織における微量の発現は、許容されうる。望ましくは、プロモーターは、少なくとも50％、少なくとも100％、少なくとも200％、少なくとも500％、または少なくとも1000％より高い酵素活性を生じる。しかしながら、導入遺伝子を含まないアイソジェニックマウスの心臓と比較して、トランスジェニックマウスの心臓における発現においていかなる統計上有意な増加も有用でありうる。
【００１３】
11βhsd2コード配列は、限定されるものではないが、マウス、ウマ、ニワトリ、ヒト、ラット、ウサギおよびウシを含む任意の哺乳動物から得られうる。特に有用なコード配列は、配列番号：1に示されるものである。これらの配列の多型変異体も、本発明から逸脱することなく、用いられうる。それは、GENBANKにおいてアクセッション番号NM_008289として提供されている配列とは有意に異なる。用いられるコード配列は、ゲノム配列またはcDNA配列を含む任意の使用可能な形でありうる。
【００１４】
本発明のトランスジェニックマウスは、心臓線維症、心臓肥大、または心不全を軽減する能力について試験薬物をスクリーニングするために用いられうる。いずれの試験薬剤も用いられうる。試験薬剤は、単一の化合物、既知組成の化合物の組み合わせ、または天然産物抽出物のような多様な化合物を含む組成物でありうる。試験薬剤は、既知または新規な化合物、心疾患を治療するために有用であることが知られているもの、またはそのような目的について以前に知られていないものを含みうる。他の薬剤と組み合わせて試験されうる、心疾患を治療するために有用であることが知られている典型的な薬剤には、以下のものが含まれる：アンジオテンシン受容体遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、ベータ遮断薬、ACE阻害剤、利尿薬、およびジゴキシン。試験薬剤は、化合物ライブラリー由来、天然産物ライブラリー由来、合成的に作製されうる、または組換えで作製されうる。試験薬剤の供給源は、本発明の実施にとって重大な意味を持たない。
【００１５】
試験薬剤に供されたトランスジェニックマウスは、心臓線維症、心臓肥大、または心不全に関連した任意の生物学的現象についてモニターされうる。生物学的現象に陽性の効果を生じることが見出される試験薬剤は、心臓線維症、心臓肥大、または心不全を軽減するための候補薬である。候補薬が、臨床試験に用いられうる前に、他の系においてさらに試験される必要があることを、当業者は認識しているものと思われる。すべての候補薬が、後のすべての試験に合格し、成功裡に臨床試験に用いられるとは限らないことを、当業者はさらに認識しているものと思われる。安全性、効力、市場性、耐容性などについて使用されうる任意のさらなる試験は、本発明のトランスジェニックマウスにおいて実施される試験と併用されうる。
【００１６】
トランスジェニックマウスにおいてモニターされうる生物学的現象は、限定はないが、心臓肥大、炎症、早期死亡、心室の拡張、心臓におけるコラーゲン沈着、間質性線維症、駆出分画、左室径短縮率、心筋細胞膨大、肥大性応答遺伝子の発現、および心室壁の菲薄化を含む。構造的心臓障害または機能的心臓障害のいずれの測定も、本発明のトランスジェニックマウスモデルにおける試験薬剤の効果を評価するために用いられうる。測定されうるパラメーターは、限定はないが、収縮期血圧、左心室機能、心エコー技術を用いる拡張および肥大、心臓、腎臓、大動脈および脳における11βhsd2酵素活性、左心室コラーゲン含有量の組織学的特徴付け、線維症、11βhsd2、ANP、MRおよびMMP-9についてのmRNAの定量的PCR評価、ならびにMMP-13発現を含む。
【００１７】
配列番号：1または31に記載の11βhsd2をコードするヌクレオチド配列は、心筋細胞特異的プロモーターおよび/またはポリアデニル化シグナルに操作可能に連結されうる。それは、プラスミドもしくはウイルスのような自己複製ベクター内であってもよく、または、それは、単離かつ精製されたDNAセグメントであってもよい。好ましくは、構築物は、マウスの染色体に組み込まれる。より好ましくは、それは、内因性マウス11βhsd2座に組み込まれる。
【００１８】
本明細書に記載されるものと類似した付加的なトランスジェニックマウスは、当技術分野においてよく知られている技術を用いて作製されうる。簡単には、11βhsd2をコードするDNAが、心臓特異的プロモーターに連結されて、構築物を形成する。典型的には、これは、リガーゼを用いて行われうるが、DNAの2つの別々の断片を連結するための他の方法が当技術分野において知られており、いずれのそのような方法も用いられうる。構築物は、マウスの受精卵の前核へ注入されて、トランスジェニック卵を形成する。もう一度言うが、この目的を達成するための当技術分野において公知のいずれの技術も用いられうる。トランスジェニック卵は、偽妊娠の雌マウスへ着床され、子孫が形成される。子孫における構築物の存在は、11βhsd2をコードするDNAと心臓特異的プロモーターの間の接合部を含むDNA配列を同定することにより検査されうる。これは、限定されるものではないが、PCR、ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、シーケンシングなどを含む、当技術分野において公知の任意の技術を用いて行われうる。子孫における11βhsd2の発現の増加は、例えば、ノーザンブロッティング法、RT-PCR法などを用いて11βhsd2特異的mRNAを測定すること、例えば、ウェスタンブロッティング法を用いて11βhsd2タンパク質を測定すること、または、例えば、酵素アッセイ法を用いて11βhsd2酵素活性を測定することにより、決定されうる。
【００１９】
心臓特異的発現のために用いられうる適するプロモーターは、α-ミオシン重鎖プロモーター(J. Biol. Chem. 266:9180-9185、1991)およびβ-ミオシン重鎖プロモーターのもの、心臓トロポニンCプロモーター、心臓トロポニンTプロモーター、ならびに心臓トロポニンIプロモーターを含む。ポリアデニル化シグナルはまた、11βhsd2のコード配列の3'末端にあるのが望ましい。いずれのポリアデニル化シグナルも用いられうる。好ましいシグナルは、ヒト成長ホルモン由来のものである。
【００２０】
酵素活性は、当技術分野において公知の任意の技術を用いて測定されうる。一つの適する方法は、薄層クロマトグラフィーを使用し、Slight, S.H.ら、(1996) Journal of Molecular and Cellular Cardiology 28:781-787に記載されている。もう一つの適するアッセイ法は、Lombes, M.ら、(1995) Circulation 92:175-182に記載されている。
【００２１】
いくつかの遺伝子は、心臓肥大において上昇したレベルで発現されていることが当技術分野において知られている。これらの遺伝子は、心臓肥大応答遺伝子として集合的に知られている。これらの遺伝子は、限定はないが、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)およびβ-ミオシン重鎖(β-MHC)を含む。これらの遺伝子のいずれか一つまたは複数の発現は、トランスジェニック11βHSD2マウスへの試験薬物の効果を評価する場合、モニターされうる生物学的現象として用いられうる。
【００２２】
本発明のトランスジェニック11βhsd2マウスは、トランスジェニックであろうとなかろうといずれでもいいが、他の系統と共に飼育されうる。他の系統は、ノックアウトマウスまたは古典的な変異体でありうる。マウスは、異なる遺伝的背景において導入遺伝子の効果を測定するために戻し交配または異系交配されうる。一つの特に好ましい形質の組み合わせは、トランスジェニック心臓特異的11βhsd2のMR心臓性欠失との組み合わせである。そのような組織特異的欠失は、CRE-lox系を用いて作製されうる。
【００２３】
実施例
実施例1
11βHSD2マウスの作製
マウス11βHSD2 cDNAを、マウス腎臓全RNAからPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)によりクローニングし、pCR2.1(Invitrogen、CA)へサブクローニングした。マウス11βHSD2 cDNAの全コード配列を含む制限断片をpCR2.1から離し、Jeffrey Robbins氏のご厚意で提供されたα-MHCクローン26のSal I/Hind III部位へライゲーションした。α-MHCプロモーター、11βHSD2 cDNAおよびhGHポリアデニル化シグナルを含むトランスジェニック構築物を、Not I消化によりプラスミドバックボーンから離した。
【００２４】
トランスジェニック構築物を、Qiaex IIキット(Qiagen、CA)によりアガロースゲルから精製し、10 mM トリス-HCl、0.1 mM EDTA、pH 7.5に1 ng/μlで再懸濁し、C57BL6マウスの受精卵の前核へ注入した。導入遺伝子を有するマウスは、プロモーターとcDNAとの間の接合領域を含む、マウスα-MHCプロモーター由来のセンスプライマー
2005525799.tif 000002
およびマウス11βHSD2 cDNA由来のアンチセンスプライマー
2005525799.tif 000003
を用いたPCR反応により同定された。創始系統間のコピー数をTaqman分析により測定した。コロニーは、ヘミ接合体状態において同腹仔交配により維持された。
【００２５】
実施例2
表現型の特徴分析
すべて心臓肥大および心不全を発生した5つの独立したトランスジェニック創始系統を作製した。最も重篤な表現型を有する系統を詳細に分析した。トランスジェニック心臓11βHSD2 mRNA発現は、非トランスジェニックマウスに対して4,000倍増加し、発現された酵素は、触媒活性を有することが見出された。5ヶ月齢において、トランスジェニックマウスは、血圧における増加がない状態で、重篤な心筋肥大を発生した。トランスジェニックマウスの左心室における間質性線維症が、ピクロシリウスレッド染色により明らかになった。マウスの心臓は、ひどく拡張し、心筋細胞のサイズは増加した。
【００２６】
予備的な組織学的試験により、両方の左心室および右心室は、拡張し、かつLVおよびRVの壁の厚さは、トランスジェニック動物由来の心臓において劇的に減少していることが示された。コラーゲン含有量の予備的な定量により、野生型マウスと比較して、トランスジェニック由来のLVにおいて10倍高いコラーゲン含有量が示された。これらのデータは、アルドステロンが心臓においてMRに結合することが可能である場合、最終的に心不全および死を代償不全になるように導く有意な有害作用が観察されていることを示唆する。これは、心不全のための治療の標準の上に、アルドステロン遮断が加えられる場合に生じる驚くべき心保護的な効果を説明しうる。
【００２７】
4週齢の時点から開始し、雄トランスジェニックマウスに、食しうるエプレレノン(eplerenone)(200 mg/kg/日の概算用量)を含む飼料または普通の飼料のいずれかを供給した。治療の2.5ヶ月後、治療しない群のマウスは、心機能の悪化を示した。対照的に、エプレレノンを受けたトランスジェニックマウスにおいて、心筋機能が有意に向上した。エプレレノン治療は、11βhsd2心臓特異的トランスジェニックマウスにおいて、左心室機能不全および心不全の発生を有意に減じた。
【００２８】
実施例3
超音波心エコー図法取得および分析
心エコーは、15-MHz直線アレイトランスデューサーを備えたSonos 5500心エコーシステム(Agilent、アンドーヴァー、MA)を用いて得られた。画像は、左側面臥位で横たわる1％〜2％ イソフルラン(AErrane；Baxter, Inc.、ディアフィールド、IL)で軽く麻酔をかけられたマウスから得られた。胸壁への過度の圧力を避けると同時に、適切な接触を維持するように気をつけた。左心室の2次元胸骨傍長軸および短軸画像が得られた。2次元標的化M-モード投影図が、150 mm/sの走査速度で乳頭筋のレベルにおいて胸骨傍短軸観点から記録された。すべての心エコーは、書き換え可能光磁気ディスクにデジタル方式で記録された。用いられた測定および計算は、以下のとおりである：左心室の拡張末期容量(EDV)および収縮末期容量(ESV)は、直接的測定収縮期(LVAs)および拡張期(LVAd)領域からのディスクの方法により計算された。駆出分画(EF)は、以下の式で、収縮期および拡張期容量から計算された：EF = (EDV - ESV)/EDV x 100。パーセント左室径短縮率(FS)は、以下のように計算された：FS = (LVEDd - LVIDs)/LVIDd x 100、LVIDdおよびLVIDsは、それぞれ、拡張末期および収縮末期のLV内部寸法である。心拍数(HR)は、MモードにおいてR-R間隔を測定し、式：HR = 60(秒/分)/R-R間隔(秒/拍動)を用いることにより計算された。すべての分析測定は、アメリカ心エコー図法学会(the American Society for Echocardiography)の推薦による最先端の方法を用いて行われた。
【００２９】
実施例4
収縮期血圧の取得
訓練：マウスは、マウス制止体の中にいること、およびVisitech BP尾加圧帯システム、2000(Visitech Systems, Inc.、アペックス、NC)を用いるBP測定のための尾加圧帯に慣れてくるように、6日間、毎日、訓練セッションを受けた。各セッションは、各マウスについて15回の測定の1セットを含む。訓練は、平均血圧が少なくとも2日間、一貫した場合のみ、完成であると見なされた。
【００３０】
方法：血圧は、4頭のマウスの群について同時に測定された。動物を、マウス制止体で、加熱されたプラットフォーム(38℃または100°F)上に置き、それらの尾を尾加圧帯装置の中に置いた。マウスが尾において良好な血流を生じるよう十分に暖まることができるように、各セッションにおいて最小5回の予備的サイクルを行った。10回測定の1セットを各動物について収集した。動物が動いている間、または弱いシグナルの期間の間に得られた測定は、セットから削除された。個々のマウスについて得られたすべてのデータは、各日について平均をとった。
【００３１】
実験：血圧測定は、研究を通して毎月1回行われた。各BP測定は、6日間の訓練期間から開始し、データ収集のためにもう6日間継続した。最後の6日間からの血圧を記録し、データ分析のために用いた。データの平均をとり、その月について、各動物に対して1つのSBP値を得た。各動物について収集された測定の平均をとることにより、群に対して1つのSBPを得た。血圧は、平均SBP±標準誤差平均として表示される。
【００３２】
実施例5
統計学的方法の説明
治療群平均値は、生データにおける一元分散分析(ANOVA)に基づいて比較される。用いられる平均値比較方法は、最小有意差(LSD)である。LSD平均値比較方法は、群内にプールされた平均平方誤差をすべての平均値比較のための分散の共通推定値として用いる。これは、分散推定値が各独立した比較に対して変化するため、いくつかの独立した2サンプルスチューデントt検定を行うより好ましい。計算は、t検定について用いられるものと同じであるが、分散の推定値は、一元分散分析から得られる。このように、各平均値対の間の比較の基準は、一致している。
【００３３】
本発明は、本発明を行う現在のところ好ましい形態を含め、特定の実施例に関して記載されてきたが、添付された特許請求の範囲に示される本発明の真意および範囲内にある、上記の系および技術の多数の変化ならびに置換があることを当業者は認識しているものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】腎臓から単離されたマウス11βHSD2 cDNAの配列を示す(配列番号：1)。
【図２】ヒト(配列番号：4)、ウシ(Bos taurus)(配列番号：5)、ラット(配列番号：6)、ウサギ(配列番号：7)、ウマ(配列番号：8)、およびマウス(配列番号：9および10)を含む、異種間の11βHSD2の高度に保存されたアミノ酸の比較を示す。
【図３】残基379位〜386位の領域における、ヒト(配列番号：11)、ウシ(Bos taurus)(配列番号：12)、ラット(配列番号：13)、ウサギ(配列番号：14)、ウマ(配列番号：15)、およびマウス(配列番号：16および17)を含む、異種間の11βHSD2の連続したアミノ酸の比較を示す。
【図４】発表されたデータ(配列番号：18)と実験的に決定されたクローン化マウス11βHSD2(配列番号：19)との比較、および正常者(配列番号：20)とAME患者(配列番号：21)との比較を示す。
【図５】マウス野生型(配列番号：21〜25)と11βHSD2のスプライシングアイソフォーム(配列番号：26〜27)との比較を示す。
【図６】活性化補助因子結合ドメインおよび活性部位(それぞれ、配列番号：28および29)を含む野生型マウス11βHSD2のエキソン構造を示す。
【図７】図7Aおよび7Bは、11βhsd2心筋特異的トランスジェニックマウスにおけるエプレレノンの効果を示す。図7Aは、心エコーデータを示し、図7Bは、収縮期血圧データを示す。
【図８】αMHCプロモーターおよび11βhsd2のトランスジェニック構築物を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ａ−２】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【国際調査報告】
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