(57)【要約】被検体の代謝表現型の選択された態様を、それらの被検体に試験物質を投与することなく特徴付けるための、または、投与せずに、代謝表現型に依存する被検体の投与後応答を予測するための、モデルを作成する方法であって、該方法は：投与物質を投与する前に、複数の被検体に関する投与前データを得ること；投与物質を投与した後に、前記の複数の被検体に関する投与後データを得ること；および、投与前データにおける被検体間の変動を、投与後データにおける被検体間の変動と相関させて、観察された相関に基づいて投与前から投与後の予測モデルを作成すること；からなる。このモデルは、被験対の代謝表現型の選択された態様を決定するために、または投与せずに被験体の投与後応答を予測するために、用いることができる。これは、関与する生化学的変換または経路を調べる特定の物質を投与された場合の複数の被検体に関する投与前および投与後データの相関を説明するモデルについて、未投与の被検体に関するデータを分析すること；および、予め決定された該モデルの基準に従って、未投与の被験体の代謝表現型を説明する数的測度または分類を作成すること；によって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の代謝表現型の選択された態様を、それらの被検体に試験物質を投与することなく特徴付けるための、または、投与せずに、代謝表現型に依存する被検体の投与後応答を予測するための、モデルを作成する方法であって、
投与物質を投与する前に、複数の被検体に関する投与前データを得ること；
投与物質を投与した後に、上記の複数の被検体に関する投与後データを得ること；および、
投与前データにおける被検体間の変動を、投与後データにおける被検体間の変動と相関させて、観察された相関に基づいて投与前から投与後の予測モデルを作成すること；
からなる、上記方法。
【請求項２】
投与前および／または投与後データが、尿、血液、血漿、血清、唾液、汗、涙、呼気または呼気濃縮物のような生体液であるサンプルから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与前および／または投与後データが、植物組織、植物液もしくはホモジェネート、植物抽出物もしくは植物滲出物、例えば精油であるサンプルから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
投与前および／または投与後データが、ヒトまたは動物組織、魚組織または油、組織抽出物、組織培養抽出物、細胞培養上清もしくは抽出物であるかまたは微生物由来のものであるサンプルから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
投与前および／または投与後データが、化学組成または物理学的パラメータに関するデータを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
投与前および／または投与後のサンプルまたは被検体が、分析前に処理されて（例えば、１またはそれ以上の現存の物質の誘導体を生じるように、１またはそれ以上の化学試薬で処理されて）、データリカバリが高められる、またはサンプル安定性が改良される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
投与前および／または投与後データが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーおよび／または質量分析（ＭＳ）、赤外（ＩＲ）分光、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような任意の他の化学分析技術を用いて得られる、または例えば、ＧＣ−ＭＳのように、このような技術を統合した任意組合わせを用いて得られる、複合データから誘導されるか、または該投与前および／または投与後データは該複合データである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
投与前および／または投与後データが、物理学的データまたはそれから誘導されるデータである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
適当な物質の投与によって、複数の生化学的変換のそれぞれについて表現型検査モデルを作成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
適当な物質の投与によって、複数の投与物質のそれぞれについて応答予測モデルを構築する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
パターン認識の前に、既存の変量の比率および／または他の組合わせをとることによって、元の投与前データセットを拡張する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
任意特定の物質を投与された被検体の群について、パターン認識方法を、投与物質の変動代謝または投与物質に対する変動応答におけるパターンを同定するために用いる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
任意特定の物質を投与された被検体の群について、指導なしのパターン認識方法を、投与後データ中の関与する変動に相関する投与前データ中の変動を同定するために用いる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
任意特定の物質を投与された被検体の群について、指導付きのパターン認識方法を、投与後データ中の関与する変動に相関する投与前データ中の変動を同定するために用いる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
任意特定の物質を投与された被検体の群について、直交シグナル修正（ＯＳＣ）のようなデータ・フィルタリング方法を、投与後データ中の関与する変動に無相関である投与前データ中の変動を除外するのに用いる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
代謝表現型の情報を与える、または投与に対する応答を予測するために用いることができる、生体マーカーまたは生体マーカー組合わせを同定するために用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
被検体の代謝表現型の選択された態様を決定する方法であって、
関与する生化学的変換または経路を調べる特定の物質を投与された複数の被検体に関する投与前および投与後データの相関を説明するモデルについて、未投与の被検体に関するデータを分析すること；
予め決定された該モデルの基準に従って、未投与の被験体の代謝表現型を説明する数的測度または分類を作成すること；
からなる方法。
【請求項１８】
未投与の被験体に関するデータが、尿、血液、血漿、血清、唾液、汗、涙、呼気もしくは呼気濃縮物のような生体液から、または植物組織、植物液、植物のホモジェネート、植物抽出物、もしくは植物滲出物、例えば精油から、またはヒトもしくは動物組織、魚組織もしくは油から、または組織抽出物、組織培養抽出物、細胞培養上清もしくは細胞培養抽出物から、または微生物由来のサンプルから、またはデータリカバリもしくはサンプル安定性を高めるための処理を施した後の上述のサンプル種のいずれか１つから、得られる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
更に、被検体に関して特徴的な複合データおよび／または物理学的データを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーおよび／または任意の他の技術を用いて、または技術の任意組合わせを用いて、作成することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
代謝表現型に影響を受ける危険性評価を行うために、および／または特別な健康モニター方式の使用を標的化するために、および／または予備的／予防的処置の使用を標的化するために、および／または保険目的で危険性を特徴付けるために、および／または任意の他の目的、例えば育種用に被検体を選択するために用いられる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の表現型検査方法。
【請求項２１】
投与物質に対する被験体の応答を予測する方法であって、
特定の投与物質を投与された複数の被験体に関する投与前および投与後データの相関を特徴付けるモデルについて、未投与の被験体に関するデータを分析すること；および、
該モデルの予め決定された基準に従って、未投与の被験体が投与物質を投与された場合
に予期される応答についての、数的予測またはクラス予測を作成すること；
からなる方法。
【請求項２２】
予め決定された基準に従って、被験体が受容すべき物質の最大または最小用量を予測できる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
予め決定された基準に従って、被験体が受容すべき投与物質の量を予測できる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
予め決定された基準に従って、被験体に物質を投与する際にとるべき頻度を予測できる、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
予め決定された基準に従って、被験体が受容すべき物質の投与数を予測できる、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
予め決定された基準に従って、被験体にとって適当な徐放性製剤を選択できる、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
未投与の被験体に関するデータが、データリカバリまたはサンプル安定性を高めるための処理の後に、尿、血液、血漿、血清、唾液、汗、涙、呼気もしくは呼気濃縮物のような生体液から、または植物組織、植物液、植物のホモジェネート、植物抽出物、もしくは植物滲出物、例えば精油から、またはヒトもしくは動物組織、魚組織もしくは油から、または組織抽出物、組織培養抽出物、細胞培養上清もしくは細胞培養抽出物から、または微生物由来のサンプルから、または上述のサンプル種のいずれか１つから、得られる、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
更に、被検体に関して特徴的な複合データおよび／または物理学的データを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーおよび／または任意の他の技術を用いて、または技術の任意組合わせを用いて、作成することを含む、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
被験体の代謝表現型の選択された態様を決定するか、または投与物質に対する被験体の応答を予測する方法であって、予め同定されている請求項１６に記載の１またはそれ以上の生体マーカーについて、未投与の被験体に関するデータを分析することを含む方法。
【請求項３０】
生体マーカーが、色変化のような可視的変化を生じる１またはそれ以上の添加試薬と反応する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
室内実験もしくは臨床試験のために、または任意他の目的のために、表現型が同質のまたは類似した被検体の群を選択するために用いられる、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
生物学的変動が表現型の異質性によって引き起こされる場合に、実験データにおけるこのような変動を、生体液または組織の投与前分析に基づいて有理化するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
全体として、データは被験体から得られた物理的および／または化学的測定に基づく、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
投与前の状態に関する変化、例えば血圧を低下させる薬剤で処置されたヒト被験体の血
圧の減少を、投与後データが説明する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
特定のモデルおよび／または方法の制限に適合しない試験データを同定できる、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
被験体が、動物、特にヒト、マウス、ラット、ブタ、乳牛、雄牛、ヒツジ、ウマ、イヌもしくはウサギのような哺乳動物、または任意の家畜、または競走馬のようなスポーツ用もしくは育種用の任意の動物である、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
被験体が植物、魚もしくは任意の他の水生生物である、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
被験体が、生物学的組織、組織培養、細胞培養または微生物培養である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
データは、単一の被検体とみなされる被検体の群を代表する、またはそれを代表すると考えられるサンプルから得られる、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
投与物質は、任意の物質、または物質の混合物もしくは製剤であって、特に医薬物質もしくは薬用物質、または医薬物質もしくは薬用物質となる可能性のある研究中もしくは開発中の物質、更にまた、例えば毒素、農薬、除草剤、食料物質もしくは飼料物質、食料添加剤もしくは飼料添加剤、並びに液体、気体、蒸気および煙、例えばタバコの煙のような任意の流体である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
投与物質は、任意のマトリクスまたは媒体において、任意の方法または経路により、例えば注射により、食べることにより、飲むことにより、吸入により、または喫煙により、被検体の生存期間またはその任意特定の部分もしくはごく一部分のような任意の期間にわたって、積極的にまたは受動的に投与され、このような投与は、環境への暴露もしくは汚染に起因するか、または医療処置、歯科的処置、獣医科的処置もしくは外科的処置に起因するものを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
被験体のアセチレーター表現型を、試験物質を該被験体に投与することなく同定するための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
物質の投与に対する被験体の応答がアセチレーター表現型に依存する場合に、該応答を予測するための、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
イソニアジド誘導毒性に対する被験体の感受性を予測するための、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
ガラクトサミン誘導毒性に対する被験体の感受性を予測するための、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
パラセタモール誘導毒性に対する被験体の感受性を予測するための、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のモデルを作成する装置。
【請求項４８】
応答予測のための、および／または代謝表現型検査のための装置であって、
各モデルが特定の投与物質を投与された複数の被検体に関する投与前および投与後デー
タの相関をモデリングする、１またはそれ以上のモデル；
少なくとも１つのモデルについて、未投与の被験体に関するデータを分析し、それにより、用いたモデルに従って、未投与の被験体の代謝表現型の１またはそれ以上の態様を決定するかまたは投与に対するその応答を予測する処理機；
からなる装置。
【請求項４９】
装置が更に、１またはそれ以上の、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のモデルを作成するように設けられている、請求項４８に記載の装置。
【請求項５０】
更に、ＮＭＲスペクトロスコピー、質量分析、赤外分光または高性能液体クロマトグラフィーのような物理的および／または化学的分析を行なう、１またはそれ以上の分析機器またはデバイスを含む、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５１】
請求項１６に記載の１またはそれ以上の生体マーカーを同定するための装置。
【請求項５２】
請求項１６または５１に記載されたように予め同定されている１またはそれ以上の生体マーカーの使用に基づく、応答予測または代謝表現型検査のための、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５３】
代謝表現型検査のための、または投与に対する被験体の応答を予測するための装置であって、試験用の被検体からのサンプルを受ける試験領域を含み、該試験領域は、サンプル中の１またはそれ以上の生体マーカーと化学的に反応して試験領域の外観を変化させることができる１またはそれ以上の試薬を含み、該生体マーカーは予め請求項１６および／または５１により同定されており、そしてこの結果として生じた試験領域の外観は代謝表現型に特徴的であるかまたは投与に対する応答を予測している、上記の装置。
【請求項５４】
被験体に適当な投与計画を同定できる、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法を実行する装置。
【請求項５５】
特定の生体マーカーに対して作成された抗体の使用に基づく、請求項４７〜５４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５６】
選択された生体マーカーは、例えば固体支持体上に固定された酵素を用いる酵素触媒反応によって検出および／または定量される、請求項４７〜５５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法により作製される１またはそれ以上のモデルを含む装置。
【請求項５８】
更に、特定のモデルの制限に適合しない試験データを同定するように設定されている、請求項４７〜５７のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体の代謝表現型を同定する方法、並びに代謝表現型による影響を受ける応答を予測する方法、および代謝表現型に影響を受ける危険因子を決定する方法に関する。特に、本発明は、被検体の生体液を分析することによって、被検体の代謝表現型を同定する方法、および１またはそれ以上の処理に対する被検体の応答を予測する方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
生化学反応
生物の全体的な代謝表現型は、その代謝特性の総計であり、その遺伝組成と「環境」との相互作用により決定され、ここで環境とは、可能な最も広い意味において考えられる。「代謝表現型」という用語は、生物の代謝特性の個々の態様にも適用できる。
【０００３】
膨大な配列の生化学反応（代謝変換）が生体内で起こり、これらの反応の圧倒的大多数は酵素により触媒される。
【０００４】
酵素は、生化学反応を加速する生化学的触媒として機能する、特殊化されたタンパク質である。通常の細胞活動に必要な反応の多くは、酵素なしでは、通常の体内ｐＨおよび温度において十分な速さで進行しない。酵素は触媒として反応速度を高めるが、反応の終わりに通常の状態に戻り、変化しない。
【０００５】
酵素による作用を受ける分子は「基質」と呼ばれ、酵素は特定の基質に対して著しい特異性を示す。例えばグルコースオキシダーゼはグルコースを酸化するが、ガラクトースは酸化しない。この特異性は、酵素表面上の基質結合部位により決定される。この部位は、１またはそれ以上の基質に対する好ましい結合能力を与える特定のアミノ酸配列である。或る酵素は広い基質特異性を有する一方で、逆に個々の基質に対して特異的であるものもある。従って、例えばグルコース、マンノースおよびフルクトースは全てヘキソキナーゼによりリン酸化されるが、グルコキナーゼはグルコースに対して特異的である。
【０００６】
生化学および分子生物学の国際組合（ＩＵＢＭＢ）は、６つの大きな酵素クラス：
１．酸化還元酵素
２．トランスフェラーゼ
３．加水分解酵素
４．リアーゼ
５．イソメラーゼ
６．リガーゼ
を有する酵素分類体系を確立している。
【０００７】
これらの個々のクラスはそれぞれ更に、個々の酵素が属するサブクラスに分けられる。完全な詳細は現在ワールドワイドウェブ（http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme）上で入手できる。
【０００８】
一例として、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．１．１．２）は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンとグアニジノアセテートのＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインとクレアチンへの転化を触媒する。これはメチルトランスフェラーゼの一例である。
【０００９】
酵素触媒反応の速度に影響を及ぼし得る因子としては、存在する基質の量、存在する生成物の量、存在する酵素の量、およびそれぞれの酵素分子の活性が挙げられる。酵素分子の活性は、その固有の活性、補助因子および置換基の存在を含む様々な因子によって、またアロステリック部位の結合によって影響を受け得る。酵素量および酵素１分子あたりの活性は共に、被験体間の遺伝的変動による影響を受け得る。酵素量および分子あたりの活性は、協力して全体的な酵素活性を与え、これは異なる被験体間でかなり変化し得る。このような変動は、種々の酵素および代謝変換の全範囲に独立して影響を及ぼし得、この変動はそれぞれの被験体について異なる全体的代謝表現型の発生に寄与する。生化学的変換が起きるために必要とされる任意他の物質のレベルにおける変動もまた、代謝表現型に寄与する。例えば、薬剤をグルクロン酸化する被験体の能力の変動は、ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）のレベルにおける被験体間の変動に起因し得る。
【００１０】
代謝表現型は、典型的に酵素触媒反応に関して考えられるが、その最も広い意味においての代謝表現型とは、ある種の被験体内で起こり得る非酵素反応のそれぞれに関する基準（measures）をも包含する。更に、被験体の全体的代謝表現型は、例えば腸バクテリアのような、被験体内でまたは被験体上で生きている他の生物の性質および量に影響を受けるであろう。重要なことには、被験体の遺伝子型はその被験体の生きている間中一定であるが、被験体の全体的代謝表現型は、年齢と共に、そして病気、感染および栄養状態のような他の「環境的」影響と共に有意に変化し得る。
【００１１】
代謝表現型の変動は、薬剤のような生体異物の代謝における被験体間の差異を引き起こす。代謝におけるこのような差異は、これらが作用物質への暴露の程度の差異を招き得るために、投与物質への異なる応答（例えば、効果の程度、毒性の程度等）に寄与する主な因子である。従って、例えば毒性物質の非毒性代謝産物への速い代謝は急速な解毒をもたらすが、毒素の代謝が遅い代謝者は、毒作用をより示しがちである。逆に、薬剤の有効成分または誘導体の速い代謝は、治療効果の低減をもたらし得る。投与物質への異なる応答に寄与する他の因子としては、消化管からの吸収における被験体間差異および受容体の異なる感受性が挙げられる。毒薬に対する感受性および応答における遺伝的変動性は、Toxicology Letters (2001) 120巻において、「Genetic variability in susceptibility and response to toxicants」という題の記事において、Ingelman-Sundberg(259-268頁)により、およびMillerら(269-280頁)により概説されている。ヒト薬剤代謝における個体間の変動性は、PacificiおよびPelkonenにより編集され、Taylor & Francis (2001)により出版された本「Interindividual Variability in Human Drug Metabolism」の主題である。
【００１２】
体液および代謝表現型の変動の影響
細胞内液の生化学的組成の態様は、細胞外組織液に反映され、従って組織に接触する循環血に反映される。従って、細胞液の生化学的組成における変質は、細胞外組織液の生化学的組成および血液の生化学的組成に対して影響を及ぼす傾向がある。血液組成の変質は、同様に、尿組成の変質に反映され得る。従って、異常な細胞代謝過程は血液および尿のような生体液の変質した組成に反映される傾向があり、結果として、これらの液体は身体の状態に対する診断ウィンドーを提供する。このような液体の主な変質は、しばしば、肝臓毒または腎臓毒のような毒素が投与される場合に引き起こされ、主な酵素欠損のような固有の因子をこれらの液体から同定することもできる。従って、例えば古典的なフェニルケトン尿症において、フェニルアラニンヒドロキシラーゼの欠損は、フェニルアラニンのチロシンへの変換の不全を引き起こし、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸およびフェニル酢酸のレベルが増加した変質した尿組成を生じる（Textbook of Biochemistry With Clinical Correlations, 第4版, 1997, T. M. Devlin編, Wiley-Liss出版、を参照のこと）。これは、遺伝的に決定される代謝異常の一例であり、このような疾患は「代謝の先天異常」として知られている（例えば、Newsholme and Leech, 1983, Biochemistry for the Medical Sciences, John Wiley and Sons出版、を参照のこと）。記載される尿中変化の同定は、酵素欠損を同定するのに役立つ。
【００１３】
深刻な代謝欠陥と同様に、代謝表現型における他のより小さな個体間差異が存在し、これは正常な代謝過程の崩壊および結果として生じる疾患を引き起こすのには十分ではない。しかしながら、生物が、大用量の特定の化学化合物、例えば薬剤物質のような異常な変化に付される場合、このような差異が明らかとなり得る。更に、このような差異は、環境汚染物質およびタバコの煙のような有害物質への長期間の暴露に関係するガンのような疾患についての変質された危険因子の原因であり得る。
【００１４】
生物学的サンプルのＮＭＲスペクトル分析
生物学的液体の低分子量組成を調べるための核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーの使用は、現在十分に確立されている（例えば、Nicholson and Wilson (1989), High resolution proton magnetic resonance spectroscopy of biological fluids, Progress in NMR Spectroscopy, 21, 449-501 ; Lindon ら (1999), NMR spectroscopy of biofluids, Annual reports on NMR spectroscopy, 38）。ＮＭＲ用高磁場の出現は、この発達の一因である。このような磁力は該技術の感度を大きく改良し、クリオプローブの使用は更なる改良をもたらす。複雑な混合物の試験にとって更なる利点は、磁場強度の増大により、ＮＭＲシグナルの分散が改良されることであり、即ち、シグナルがより展開して、互いに重なり合う傾向が減少することである。現代のＮＭＲスペクトロスコピーの能力を大きく改良した他の要因としては、より高い感度をもたらすプローブ設計における改良、計算機能力の迅速な利用可能性、および例えば水性サンプルにおける水のシグナルの選択的抑制のための改良されたパルスシーケンスの発達が挙げられる。フロープローブの出現は、従来の高精度で壊れ易いガラスサンプル管に比べて、サンプルのスループットを大幅に増加させることができる。
【００１５】
生体液についてのその有用性に加えて、ＮＭＲスペクトロスコピーは少量（約１０〜２０ｍｇ）の固体組織サンプルの試験に良好に用いることができる（例えばMoka ら (1997), Magic angle spinning proton nuclear magnetic resonance spectroscopic analysis of intact kidney tissue samples, Analytical Communications, 34, 107-109）。しかしながら、これにはマジック角回転（ＭＡＳ）として知られる特別な技術が必要とされ、またＭＡＳ−ＮＭＲスペクトロスコピーは液状ＮＭＲスペクトロスコピーと比べて時間のかかる操作である。操作者が手動でサンプルを変える場合、ＭＡＳ−ＮＭＲスペクトロスコピーでは典型的には１日に１０個のサンプルを試験することができるのに対して、自動化された液状ＮＭＲスペクトロスコピーでは、１日に１５０より多くのサンプルを試験することができる。
【００１６】
大部分の有機化合物はプロトンを含有し、これは分析されるサンプル中に十分な化合物が存在する限り、1ＨＮＭＲスペクトロスコピーで検出できる。これは即ち、原則として、1ＨＮＭＲスペクトロスコピーが大抵は有機化合物の一般的検出器であることを意味する。特定のサンプル成分からの1ＨＮＭＲスペクトロスコピーシグナルの検出能は、存在する成分の量、プロトンの種類および分子環境、並びにＮＭＲ実験の性質に左右される。主な制限は、置換性プロトン、例えばヒドロキシル基中のものは観察できないことである。本質的に、いかなる特定の有機化合物の1ＨＮＭＲスペクトルも、その化合物に特異的である。更に、ＮＭＲスペクトルは容易に解明できて予測可能であるから、化合物の構造特徴、およびしばしばその完全構造を、その1ＨＮＭＲスペクトルから推論することができる。
【００１７】
生体液の従来型１次元（１Ｄ）1ＨＮＭＲスペクトルにおいて、検出可能なあらゆる成分の個々のスペクトルは、その相対濃度に応じて付加的であり、これは定量を容易にする。実際には、尿および血漿のような生体液の高磁場1ＨＮＭＲスペクトルは情報が著しく豊富であり、非常に多くの低分子量〜中分子量成分が１回の実験で検出できる。リポタンパク質およびタンパク質のような高分子量成分もまた血漿中に存在するが、その1ＨＮＭＲスペクトルは、共振核の制限された移動度に起因する、シグナルが広がるという影響を受ける。このような広がりは、このような成分に由来する情報およびこのような成分についての情報の量を減じる。
【００１８】
生体液ＮＭＲスペクトロスコピーの用途
ＮＭＲスペクトロスコピーと比べて、従来の臨床化学分析は一般に、より正確な定量を提供し、またより良好な検出限界を提供することができる。一方で、1ＨＮＭＲスペクトロスコピーは主に、分析を要する成分を特定する必要がなく、検出可能なあらゆる成分のレベルが１回の実験中に測定されるという点で、従来の臨床化学分析よりも有利である。従って、1ＨＮＭＲスペクトロスコピーにより、予期せぬ変化を観察することができ、前もって予見できない物質を同定することができる。従って1ＨＮＭＲスペクトロスコピーは、型にはまらない研究のための同時多種分析検出器として大きな強みを有し、新規生体マーカーの検出に理想的に適している。
【００１９】
ＮＭＲスペクトロスコピーを用いて投与後の生体液を分析して、毒素に対する応答を同定および追跡することが知られている（例えば、Holmesら (1992) NMR spectroscopy and
pattern recognition analysis of the biochemical processes associated with the progression and recovery from nephrotoxic lesions in the rat induced by mercury(II) chloride and 2-bromoethanamine, Mol. Pharmacol., 42, 922-930）。毒性研究に関して、生体液ＮＭＲスペクトロスコピーは、投与物質の代謝および／または投与物質により引き起こされる内因的生体液成分の変化を検出することができ、毒作用の評価並びにグルクロン酸化およびメルカプツール酸形成のような関連する防衛過程の同定に用いることができる。また、生体液ＮＭＲスペクトロスコピーは、毒性の機構を解明する有意の可能性を有する。
【００２０】
特定の先天性代謝異常は、ＮＭＲスペクトロスコピーを用いて生体液サンプルから容易に同定できることが知られている（例えば、 Moolenaarら (2003) Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy of body fluids in the field of inborn errors of metabolism, Ann. Clin. Biochem., 40, 1, 16-24）。また、生体液のＮＭＲスペクトロスコピーは、他の疾患症状の診断および治療に対する応答の追跡に用いることができる。
【００２１】
生体系の代謝状態をモニターするためのＮＭＲに基づく手法の成功に従って、「代謝学（metabonomics）」という用語が作り出されている（Nicholsonら(1999), ‘Metabonomics' : understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data, Xenobiotica, 29, 1181-1189）。代謝学とは、「病態生理学的刺激または遺伝子改変に対する生体系のマルチパラメトリックな代謝応答の定量的測定」として定義される。代謝学は、それぞれ遺伝子発現およびタンパク質レベルにおける変化の検出に基づくゲノミクスおよびプロテオミクス技術に対して相補的である。他の技術に対する代謝学の利点は、代謝学が、代謝的に重要かどうか分からない潜在的な影響についてよりもむしろ、代謝の結果全体を見ることにある。
【００２２】
パターン認識
生物学的（生体液または生体由来）ＮＭＲスペクトルのセットからの有用な生化学情報の抽出において、その問題点は、その著しい複雑性である。これらの複雑な、マルチパラメトリックなデータセットを調べる効率的な方法は、コンピュータを使用したパターン認識方法を用いることである。
【００２３】
パターン認識（ＰＲ）は、推測的に、データセットのパターンを探すために、または他の既知の因子と相関するデータセットの要素を探すために、用いることができる多変量データ分析方法の総称である（例えばBeebeら, 1998, Chemometrics, A Practical Guide, John Wiley and Sons, New York等参照）。本来これは、多数の異なる対象からなるデータセットについて、様々なパラメータ（または「変量」）が測定されているということを仮定したものである。時折生じる欠測値が認められ得るとはいえ、これらのパラメータが何であろうと、一般には同一のパラメータはデータセットにおける全ての対象で測定されている。ＮＭＲスペクトルのセットに関連して、様々なパラメータは一般にスペクトル全体内の異なるスペクトルウィンドーの積分（integration）であるが、異なる対象は異なるスペクトルである。ＰＲ方法は、「管理（supervised）」または「非管理（unsupervised）」のものとして都合よく分類でき、そしてこれらの多変量統計分析方法の幾つかを以下の項で説明する。
【００２４】
非管理ＰＲ方法
非管理ＰＲ方法は、他のいかなる独立した知識をも参照することなしに、多変量のデータセットにおける固有のクラスター・パターンを決定するのに用いられる。非管理パターン認識方法の例としては、主成分分析（ＰＣＡ）、階層的クラスター分析（ＨＣＡ）、および非線形マッピング（ＮＬＭ）が挙げられる。
【００２５】
主成分分析（ＰＣＡ）
主成分分析（ＰＣＡ）（例えば、Sharafら, 1986, Chemometrics, J. Wiley and Sons,
New York）は、最も有用で簡単に適用される非管理ＰＲ技術の一つである。主成分（ＰＣ）は、出発変量と適当な重み係数との線形結合から得られる潜在的変量である。これらのＰＣの特性は：（ｉ）各ＰＣは、他の全てのＰＣに直交する（即ち、無相関である）こと、および（ｉｉ）最初のＰＣはデータセットの変動（情報量）の最大部分を含み、その後のＰＣは相応してこれよりも少量の変動を含むこと、である。
【００２６】
数学的用語において、データ行列Ｘは、「スコア」行列Ｔ、および「ローディング行列」Ｐから成るものとしてみなすことができ、Ｘ＝ＴＰt（ここで、上付き文字「ｔ」は転置を意味する）である。共分散行列Ｃは、データ行列Ｘから計算される。次に、共分散行列の固有値および固有ベクトルは、対角化（diagonalisation）によって決定される。固有ベクトル・プロットにおける異なる対象の座標（主成分、即ちＰＣ）は、「スコア」を示し、スコア行列Ｔを含む。固有ベクトル係数は「ローディング」を示し、ローディング行列Ｐを含み、ＰＣに対して記述子の寄与を与える。
【００２７】
任意の２つの主成分スコアのプロットは、しばしば「スコア・プロット」と呼ばれる。ＰＣ１対ＰＣ２のスコア・プロットは、低次のＰＣプロットが有用ではあろうが、最大情報量の２次元データを提供する。このようなスコア・プロットは、データセットにおける固有のクラスタリングを視覚化するのに用いることができる。
【００２８】
管理された方法
適当ならば、管理されたパターン認識方法はまた、多変量データを分析するのに用いる用いることができる。このような分析において、データセット（Ｘ）は可能ならば、１またはそれ以上の既知の因子（Ｙ）、例えばクラスの構成員（class membership）、またはＸデータセットの外側の１またはそれ以上のパラメータの値に関連する。このような方法において、ＸおよびＹデータの「トレーニング・セット」は、必要なＹ因子をＸデータから評価する統計的「モデル」を構築するために用いられる。次いでこのモデルは、その信頼性および予測能を測定するために独立したデータ（バリデーションデータセットと呼ばれる）で試験される。一度バリデートされるとモデルは、Ｘデータのみが利用可能である場合の、サンプルについての関連したＹ因子を予測するために正当に用いることができる
。
【００２９】
管理されたパターン認識方法の例としては、次のものが挙げられる：クラス分析のソフト独立モデリング（SIMCA）；部分最小２乗分析（ＰＬＳ）；線形判別分析（ＬＤＡ）；Ｋ−隣接分析（ＫＮＮ）；人工ニューラル・ネットワーク（ＡＮＮ）；確率的ニューラル・ネットワーク（ＰＮＮ）；ルール誘導（rule induction）（ＲＩ）；およびBayesian方法。例えば：（SIMCAについて） Wold （1976） Pattern recognition by means of disjoint principal components models, Pattern Recog., 8, 127;（PLSについて） Frankら（1984） Prediction of product quality from spectral data using the partial least squares method, J. Chem. Info. Comp., 24, 20;（LDAについて） Nillson, 1965, Learning Machines, McGraw-Hill, New York;（KNNについて） Beebeら, 1998, Chemometrics, A Practical Guide, John Wiley and Sons, New York 等;（ANNについて） Anker and Jurs （1992） Prediction of C-13 nuclear magnetic resonance chemical shifts by artificial neural networks, Anal. Chem., 64, 1157;（PNNについて） Speckt （1990） Probabilistic neural networks, Neur. Networks, 3, 109;（RIについて） Quinlan （1986） Induction of decision trees, Machine Learning, 1, 81;（Bayesian方法について） Bretthorst, 1990, An introduction to parameter estimation using Bayesian probability theory, In: Maximum Entropy and Bayesian Methods, Ed. Fougere, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands, 53-79を参照のこと。
【００３０】
部分最小２乗（ＰＬＳ）
ＰＬＳは、前述のＰＣＡ方法の回帰拡張である。ＰＬＳにおいて、データ行列Ｘの対象間の変動はＸ−スコア、Ｔ、により説明され、Ｙ−ブロック逆行（Y-block regressed against）における変動は、Ｙ−スコア、Ｕ、において説明される。基本的に、ＰＬＳはＴとＵとの間の共分散を最大化する。ＰＬＳモデルについて、ＰＬＳ重み、Ｗ、のセットが計算され、Ｙにおける変動の説明への各Ｘ−変量の影響を含む。Ｙ−ブロックに対応する重みセットは、Ｃで示される。また、Ｘ−ローディングの行列Ｐも計算される。これらのローディングは共に、解釈のために、およびＸの適当な分解を行うために用いられる。
【００３１】
従って、ＸおよびＹのＰＬＳ分解は次のように記載することができる：
Ｘ＝ＴＰt＋Ｅ
Ｙ＝ＴＣt＋Ｆ
ここで、ＥおよびＦはそれぞれＸおよびＹの残差であり、上付き文字「ｔ」は関連行列の転置である。
【００３２】
次に、ＰＬＳ回帰係数Ｂは次のようにして得られる：
Ｂ＝Ｗ（ＰtＷ）-1Ｃt
次に、Ｙ、Ｙestの概算は、次式に従って計算できる：
Ｙest＝ＸＷ（ＰtＷ）-1Ｃt＝ＸＢ
【００３３】
部分最小２乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）
ＰＬＳ−ＤＡは、対象の既知のクラス（Ｙ）間の最大分離を説明するデータ行列（Ｘ）における「潜在的な」変量を得る、指導付きの多変量方法である。ＰＬＳ−ＤＡは、前述のＰＣＡ方法の回帰拡張であるＰＬＳに基づく。ＰＣＡが単純に研究対象を説明する変量内に存在する最大変動を見つけるために機能するのに対して、ＰＬＳ−ＤＡは、対象の既知のクラス間の最大分離を見つけるために機能する。これは、クラス情報を保持する「擬似」ベクトルまたは行列（Ｙ）に対するＰＬＳ回帰により成される。計算されたＰＬＳ成分は、これによって、この情報がデータ中に存在する場合、クラス（Ｙ）を分離するＸにおける変動の説明に収束される。クラスの構成員は、実際のモデリングの前に既知でなければならない。一度モデルが計算され、バリデートされたならば、未知のクラスの対象に
ついてクラスの構成員の予測に正当に用いることができる。
【００３４】
ＰＬＳおよびＰＬＳ−ＤＡに対するニューラル・ネットワーク
ＰＬＳおよびＰＬＳ−ＤＡのような方法は、入力変量間の線形結合（linear associations）の抽出に基づき、これは分析力を有意に限定し得る。ニューラル・ネットワークに基づくパターン認識技術は、特に予測される因子が多数の非関連原因に影響を受ける場合に、改良された予測能を提供することができる。それにもかかわらず、ＰＬＳおよびＰＬＳ−ＤＡのような方法はしばしば十分に強力であり、比較的「ブラック・ボックス」ニューラル・ネットワーク方法よりも、モデル構築において特に重要であった入力データセットの態様に関して幾つかの情報を容易に得ることができるという点において、有意な利点を提供する、即ち、ニューラル・ネットワークモデルに比較して、ＰＬＳおよびＰＬＳ−ＤＡモデルは解釈に関してより明白である。
【００３５】
ＰＲ方法の代謝学データへの適用
パターン認識方法は、代謝学データ、例えば複合ＮＭＲスペクトロスコピー・データの分析に適用され、首尾よく用いられている。例えば、Anthonyら（1994）Pattern recognition classification of the site of nephrotoxicity based on metabolic data derived from proton nuclear magnetic resonance spectra of urine, Mol. Pharmacol., 46, 199-211；Beckwith-Hallら（1998） Nuclear magnetic resonance spectroscopic and principal components analysis investigations into biochemical effects of three model hepatotoxins, Chem. Res. Tox. , 11, 260-272；Gartlandら（1990） Pattern recognition analysis of high resolution 1H NMR spectra of urine. A non-linear mapping approach to the classification of toxicological data, NMR in Biomedicine, 3, 166-172；Holmesら（1992） NMR spectroscopy and pattern recognition analysis of the biochemical processes associated with the progression and recovery from nephrotoxic lesions in the rat induced by mercury（II） chloride and 2-bromoethanamine, Mol. Pharmacol., 42, 922-930；Holmesら（1994） Automatic data reduction and pattern recognition methods for analysis of 1H NMR spectra of human urine from normal and pathological states, Anal. Biochem., 220, 284-296参照。
【００３６】
データ・フィルタリング
パターン認識方法は「フィルタ処理していない」データに適用することができるが、無関係の変動を除外するために、しばしばデータをフィルタ処理することが好ましい。このようなフィルタリングは、関係がある変動と無関係の変動とを識別するためにある程度の管理を必要とする。
【００３７】
データ・フィルタリングの１つの方法は、単に選択されたスペクトル領域を除去し、次に残りを処理することを含む。従って、例えば水抑制（water suppression）で得られる水性サンプルの1ＨＮＭＲスペクトルにおいて、残留水シグナルの大きさは、水抑制の有効性に従って変化し、これらの無関係なシグナルは除去できる。
【００３８】
別法として、関与する変動に相関しない（即ち直交する）データの変動は、「直交フィルタリング」により除外できる。好ましい直交フィルタリング方法の１つは、慣例的に、直交シグナル修正（Orthogonal Signal Correction）（ＯＳＣ）と呼ばれ、ここで、関与する変動に直交する潜在的変量が除外される（Woldら（1998） Orthogonal Signal Correction of Near Infrared Spectra, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 44, 175-185）。
【００３９】
直交シグナル修正
ＯＳＣ方法は、Ｙ−ベクトルと相関しない対象間のＸ変動を説明する最長ベクトルを見
つけて、これをデータ行列から除外する。従って、結果として生じるデータセットはフィルタリングされており、これによって、パターン認識は、無相関の直交変動よりもむしろ、関与する特徴に相関する対象群内の変動に集中する。この方法は、必要となる都度に繰返すことができるが、但し「過剰適合（over-fitting）」は避けなければならない。
【００４０】
ＰＬＳにおいて、重みＷは、ＸとＹとの共分散を最大とするように計算される。ＯＳＣにおいては対照的に、重みＷはＸとＹとの共分散を最小とするように計算され、これはできる限りＹに直交するように成分を計算することと同様である。このような成分は、Ｙに直交し従って不要な変動を含み、従ってスペクトル・データＸから該成分を差し引いて、関与する変動に集中させた、フィルタリングされた予測行列を作ることができる。
【００４１】
ＰＣＡが異なるクラスの分離を示唆する場合、直交シグナル修正（ＯＳＣ）をこの分離の最適化に用いることができ、これによって続く多変量パターン認識分析の性能を改良し、モデルの予測能を強化する。
【００４２】
モデリングおよび予測
元々のＰＬＳ、ＰＬＳ−ＤＡおよびニューラル・ネットワーク分析は、既知の挙動または種類のサンプルからの「モデル構築」または「モデリング」データを用いる予測的数学的「モデル」の構築の概念である。
【００４３】
一度モデルが計算されると、モデルを計算するのに使用されない既知の挙動または種類のサンプルについてのデータを用いてバリデートすることができる。このようにして、モデルの予測能を試験できる。一度バリデートされると、このようなモデルは、挙動または種類が未知であるサンプル（試験データ）の挙動または種類を予測するために正当に用いることができる。分析前に該試験データは、あらゆるフィルタリングの適用を含め、モデリング・データと同様にして処理しなければならない。
【００４４】
任意の特定モデルは、使用されるデータがそれを定式化するものであることでのみ正しい。従って、全てのモデリングおよび試験データは、同じ（または同等の）条件下で、同じ（または同等の）実験パラメータを使用して、比較可能な固体から得ることが好ましい。
【００４５】
表現型検査の従来技術
代謝的に抗原投与を受けていない被験体（即ち未投与）からの生体液ＮＭＲスペクトルのセット内の変動は、ＰＣＡのような非管理ＰＲ方法により試験でき、種々のグループ分けが一定の実験条件下で時々観察できる（例えば、Bollardら（2001） Investigations into biochemical changes due to diurnal variation and estrus cycle in female rats using high resolution (1)HNMR spectroscopy of urine and pattern recognition, Anal. Biochem., 295, 2, 194-202）。しかしながら、この方法は、代謝変換に関する種々のグループ分けの有意性について、必ずしも明確の情報を提供するわけではない（例えば、Baud-Camusら（2001） Determination of N-acetylation phenotype using caffeine as a metabolic probe and high-performance liquid chromatography with either ultraviolet detection or electrospray massspectrometry, Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 760, 1, 55-63）。異なるグループ間の識別を提供するスペクトル特徴の試験によって、分離の有意性を解釈することが可能となり得る。しかしながら、これは有意性の証明を提供しない、不確かな標的化されていない手法であって、異なる代謝表現型に結び付いた、潜在的で僅かなそして複雑な変動を調べるためには、非常に非効率的な方法である。
【００４６】
逆に、標的化された手法において、ＮＭＲスペクトロスコピーまたは他の技術を用いて
、試験物質（例えばアセチレーター（acetylator）表現型の場合のカフェイン）を投与後に、生体液中で検出された成分のパターンを使用して、被験体が特定の代謝変換を行う能力を明らかにすることが知られている。言い換えれば、ＮＭＲスペクトロスコピーおよび他の技術は、投与後の生体液を用いて被験体の代謝表現型を決定するのに用いることができる。これらの分析において、通常、重要な成分は、未変化の投与物質および／またはその代謝産物である。簡素化のために、「投与された化合物の代謝産物」という用語は、これ以降、投与された化合物それ自体を包含するものとして考える。しばしば、このような成分の比率は、関連する代謝能力の測度として決定される。このような分析から、種々の代謝変換全体についての被験体の能力を、適当な試験物質の利用可能性に応じて決定できる。しかしながら、一般に、被験体が１種類の変換を行う能力は、他の全ての変換に関する該被験体の能力から独立していることが望まれる。従って、種々の生化学的変換に関する被験体の能力を調べる場合には、複数の試験物質が必要となることが予想される。このような分析が時折行われるが、ヒトまたは動物被験体へのいかなる物質の不必要な投与も、安全および倫理的な見地から望ましくなく、このような方法の広範囲での使用は考えられない。更なる問題は、試験物質の投与が酵素誘導を引き起こし得るため、その後しばらくは改変された代謝状態となることである。従って、例えばこのような表現型検査は、毒性研究に関しては疑わしい。
【００４７】
本明細書において用いられる生体マーカーという用語は、通常には、被験体もしくは被験体サンプルにおける化学的もしくは生化学的存在物または統計的に関連した存在物組合せを意味するか、またはその存在、非存在もしくはレベルに関して有意性を有する被験体において生理学的応答を意味し、これは特定の生理学的状態、疾患または毒性過程の暗示、または代謝もしくは疾患過程の特定の種類に対する傾向の暗示であり、そしてまた、臨床転帰に関連し得る。
【００４８】
このような生体マーカーの例としては、化学的および生物学的分子、例えば代謝基質、代謝中間体または代謝産物、構造タンパク質、核酸、輸送タンパク質および受容タンパク質、免疫タンパク質、代謝または遺伝子制御に関するタンパク質、触媒タンパク質、酵素およびその関連因子が挙げられる。生体マーカーの更なる例としてはまた、生物学的過程の活性レベル、例えば遺伝子およびタンパク質発現、並びに細胞シグナル経路の活性レベルが挙げられる。
【００４９】
生体マーカーという用語はまた、前述の分子または過程の存在、非存在またはレベルに関する、またはこれらに特徴的な、測定可能な任意のシグナル；例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーおよび／または任意のほかの化学分析技術、例えば質量分析（ＭＳ）、赤外（ＩＲ）分光法、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような技術により、またはこのような技術を統合した任意組合せ、例えばＧＣ−ＭＳを用いて、行われた測定のアウトプットから得られるシグナルまたはシグナルパターン、を意味するものとして理解される。
【００５０】
本明細書においてサンプルに関して用いられる化学組成という用語は、該サンプルを構成する化学および／または生化学種の組合せを包含する。
【００５１】
本明細書においてサンプルに関して用いられる物理学的パラメータという用語は、クロマトグラフィー、誘導化、分留および分離、結晶化、沈降、スペクトル分析、分子量分析、回折、溶解度分析、濁度、屈折率または抵抗性、融点または沸点の分析のような方法で得られる特徴的な物理学的測度を包含する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００５２】
本発明は、被検体の代謝表現型を同定する方法、並びに代謝表現型による影響を受ける応答を予測する方法、および代謝表現型に影響を受ける危険因子を決定する方法に関する。特に、本発明は、被検体の生体液を分析することによって、被検体の代謝表現型を同定する方法、および１またはそれ以上の処理に対する被検体の応答を予測する方法を包含する。
【００５３】
上述のとおり、認識されていた代謝表現型検査の仕方は、被験体に投与して投与後の生体液を分析することによるものである。本発明は、これから根本的に離れて、生体液中の投与物質の代謝産物レベルにおける変動が、物質が投与される前の生体液の代謝産物プロファイルにおける変動と相関するという、予期せぬ発見に基づく。すなわち本発明は、物質の投与前に、該物質に対する被検体の応答の予測を可能とするものである。更に、本発明によって、試験物質を被検体に投与する必要なしに、被検体の代謝表現型を決定することを可能とする。明らかなことには、物質が副作用を引き起こす可能性がある場合に、例えば薬品治療において、被検体の応答を予測できることは極めて有用である。更に、上述の理由（安全性、倫理および酵素誘導）により、いかなる投与も必要とせずに被検体の代謝表現型を決定できることは極めて有利である。この新規の、根本的に異なった方法論は、投与後の挙動に相関する投与前の挙動を検出するための、非常に標的化された手法を提供する。
【００５４】
従って、一つの態様において、本発明は、個体に投与される可能性のある物質に対するその被検体の応答を予測するモデルを構築する一般的方法を提供する。この方法において、投与される物質は、被検体の代表的個体群（以下、モデル構築個体群と称する）に投与される。関心のある応答は、あらゆる適当な手段によって、モデル構築個体群の全ての構成員において測定される。投与前にモデル構築個体群から採取される生体液または他のサンプルは、1ＨＮＭＲスペクトロスコピーによって、または他の適当な技術（例えば近赤外分光、高速液体クロマトグラフィー、質量分析またはガスクロマトグラフィー）によって、またはこのような技術の組合わせによって試験される。投与前データおよび投与後の応答データは一緒になって、モデル構築データを構成する。ＰＬＳまたはＰＬＳ−ＤＡのようなケモメトリクスパターン認識（ＰＲ）技術（Chemometric pattern recognition（PR）technique）を、モデル構築データに適用して、投与後の応答における変動を投与前データにおける変動に相関させる。ときには、ＯＳＣのようなデータ・フィルタリング方法が、投与前データにおける無相関の変動を除外するためにＰＲの前に用いられる。一度構築されバリデートされたならば、該モデルは、同じ物質に対する応答を予測することが求められる場合、モデル構築個体群と同じ種類の１またはそれ以上の被験体からの適当な投与前データに関して使用可能である。１種の物質用に作られたモデルは近縁の物質に関して使用可能であるかもしれないが、通常、関与する物質のそれぞれについて新規モデルが必要とされる。
【００５５】
もう一つの態様において、本発明は、被検体の代謝表現型の１またはそれ以上の要素を特徴付けるモデルを構築する一般的方法を提供する。この方法において、投与される物質および該物質の量は、関与する特定の代謝変換を調べるために慎重に選択される。選択された物質は、被検体の代表的個体群（以下、モデル構築個体群と称する）に投与される。関心のある代謝産物は、投与後の生体液または他のサンプルにおいて、1ＨＮＭＲスペクトロスコピーにより、または他の適当な方法により、都合よく測定される。この分析から、関連する代謝変換に関する各被検体の能力の基準が決定される。投与前にモデル構築個体群から採取される生体液または他のサンプルは、1ＨＮＭＲスペクトロスコピーによって、または他の適当な技術（例えば近赤外分光、高速液体クロマトグラフィー、質量分析またはガスクロマトグラフィー）によって、またはこのような技術の組合わせによって試験される。投与前データおよび投与後の応答データは一緒になって、モデル構築データを構成する。ＰＬＳまたはＰＬＳ−ＤＡのようなケモメトリクスパターン認識（ＰＲ）技術を、モデル構築データに適用して、投与後の能力測定における変動を投与前データにおける変動に相関させる。ときには、ＯＳＣのようなデータ・フィルタリング方法が、投与前データにおける無相関の変動を除外するためにＰＲの前に用いられる。一度構築されバリデートされたならば、該モデルは、関連する代謝能力を決定することが求められる場合、モデル構築個体群と同じ種類の１またはそれ以上の被験体からの適当な投与前データに関して使用可能である。
【課題を解決するための手段】
【００５６】
本発明の第１の態様において、被検体の代謝表現型の選択された態様を、それらの被検体に試験物質を投与することなく特徴付けるための、または、投与せずに、代謝表現型に依存する被検体の投与後応答を予測するための、モデルを作成する方法が提供され、該方法は：
投与物質を投与する前に、複数の被検体に関する投与前データを得ること；
投与物質を投与した後に、前記の複数の被検体に関する投与後データを得ること；および、
投与前データにおける被検体間の変動を、投与後データにおける被検体間の変動と相関させて、観察された相関に基づいて投与前から投与後の予測モデルを作成すること；
からなる。
【００５７】
投与前および／または投与後データは、生体液である例えば尿、血液、血漿、血清、唾液、汗、涙、呼気もしくは呼気濃縮物といったサンプルから、または植物組織、植物液もしくはホモジェネート、例えば精油を含む植物抽出物もしくは植物滲出物、といったサンプルから、またはヒトもしくは動物組織、魚組織もしくは油、組織抽出物、組織培養抽出物、細胞培養上清もしくは抽出物または微生物由来のものであるサンプルから得られる。投与前および／または投与後データは、化学組成および／または物理学的パラメータに関するデータを含み得る。
【００５８】
投与前および／または投与後のサンプルまたは被検体を、分析前に処理して（例えば、１またはそれ以上の存在する物質の誘導体を生じるように、１またはそれ以上の化学試薬で処理して）、例えばデータリカバリを高めるか、またはサンプル安定性を改良することができる。
【００５９】
投与前および／または投与後のデータは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーおよび／または任意の他の化学分析技術、例えば質量分析（ＭＳ）、赤外（ＩＲ）分光、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて得られる、またはこれらの技術を統合した任意組合わせ、例えばＧＣ−ＭＳを用いることにより得られる複合データから誘導することができる。
【００６０】
投与前および／または投与後データは、物理学的データであってもまたはそれから誘導されるデータであってもよい。
【００６１】
好ましくは、表現型検査モデルは、適当な物質の投与によって複数の生化学的変換のそれぞれについて作製される。同様に、適当な物質の投与によって、複数の投与物質のそれぞれについて応答予測モデルを構築できる。
【００６２】
パターン認識の前に、既存の変量の比率および／または他の組合わせをとることによって、元の投与前データセットを拡張することができる。これは例えば、得られたデータの比率を含む更なるデータを形成することによって達成できる。
【００６３】
任意特定の物質を投与された被験体の群について、パターン認識方法を、投与物質の変
動的代謝または該投与物質に対する変動的応答におけるパターンを同定するために用いることができる。管理または非管理パターン認識方法は、投与後データにおける重要な変動に相関する投与前データにおける変動を同定するために用いることができる。
【００６４】
直交シグナル修正（ＯＳＣ）のようなデータ・フィルタリング方法は、投与後データにおける重要な変動に相関しない投与前データにおける変動を除外するために用いることができる。
【００６５】
該方法は、代謝表現型の情報を提供するかまたは投与に対する応答を予測するために用いることができる、生体マーカーまたは生体マーカー組合せを同定するために用いることができる。
【００６６】
本発明の第２の態様において、被検体の代謝表現型の選択された態様を決定する方法が提供され、該方法は：
関与する生化学的変換または経路を調べる特定の物質を投与された複数の被検体に関する投与前および投与後データの相関を説明するモデルについて、未投与の被検体に関するデータを分析すること；
予め決定された該モデルの基準に従って、未投与の被験体の代謝表現型を説明する数的測度（numerical measure）または分類を作成すること；
からなる。
【００６７】
該モデルの予め決定された基準としては、投与前データと投与後データとの間の関係を定義し、投与前データに基づく被検体の特徴付けを可能にし、そして外れ値である試験データの同定を可能にする、１またはそれ以上の数学的方程式が挙げられる。
【００６８】
未投与の被験体に関するデータは、尿、血液、血漿、血清、唾液、汗、涙、呼気もしくは呼気濃縮物のような生体液から、または植物組織、植物液、植物ホモジェネート、例えば精油を含む植物抽出物もしくは植物滲出物、またはヒトもしくは動物組織、魚組織もしくは油から、または組織抽出物、組織培養抽出物、細胞培養上清もしくは細胞培養抽出物から、または微生物由来のサンプルから、またはデータリカバリもしくはサンプル安定性を高める処理を施した後の上記のサンプル種のいずれか１つから、得ることができる。
【００６９】
被検体に関して特徴的な複合データおよび／または物理学的データを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーおよび／または任意の他の技術を用いて、または技術の任意組合わせを用いて、作成することができる。
【００７０】
代謝表現型に影響を受ける危険性評価を行うために、および／または特別な健康モニター方式の使用を標的化するために、および／または予備的／予防的処置の使用を標的化するために、および／または保険目的で危険性を特徴付けるために、および／または任意の他の目的、例えば育種用に被検体を選択するために、該表現型検査方法を用いることができる。
【００７１】
本発明の更なる態様において、投与物質に対する被験体の応答を予測する方法が提供され、該方法は：
特定の投与物質を投与された複数の被験体に関する投与前および投与後データの相関を特徴付けるモデルについて、未投与の被験体に関するデータを分析すること；および、
該モデルの予め決定された基準に従って、未投与の被験体が投与物質を投与された場合に予期される応答についての、数的予測またはクラス予測を作成すること；
からなる。
【００７２】
予め決定された基準に従って、被検体が受容すべき物質の最大または最小用量が、被検体が受容すべき投与物質の量と同様に予測できる。また、被検体に物質を投与する頻度は、被検体が受容すべき物質の投与回数と同様に予測できる。被検体に対して適当な徐放性処方も選択できる。
【００７３】
被検体に関して特徴的な複合データおよび／または物理学的データを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトロスコピーおよび／または任意の他の技術を用いて、または技術の任意組合わせを用いて、作成することができる。
【００７４】
被検体の代謝表現型の選択された態様を決定する方法、または被検体の投与物質に対する応答を予測する方法は、更に、予め同定されている１またはそれ以上の生体マーカーについて、未投与の被験体に関するデータを分析することを含んでよい。生体マーカーは、色変化のような可視的変化を生じる１またはそれ以上の添加試薬と反応できる。好ましくは、生体マーカーは、投与物質を投与する前の複数の被検体に関する投与前データと、投与物質を投与した後の複数の被検体に関する投与後データを相関させることによって選択される。
【００７５】
該方法は、室内実験もしくは臨床試験のために、または任意他の目的のために、表現型が同質のまたは類似した被検体の群を選択するために用いることができる。
【００７６】
該方法は、生物学的変動が表現型の異質性によって引き起こされる場合に、実験データにおけるこのような変動を、生体液または組織の投与前分析に基づいて有理化するために用いることができる。
【００７７】
該データは、全体として、被検体から引き出される物理的および／または化学的測定に基づき得る。このような測定の例としては、血圧、心拍、ピーク・フロー、高さ、重さ等が挙げられる。
【００７８】
投与後データは、投与前の状態、例えば血圧を低下させる薬剤で処置されたヒト被検体の血圧の減少、に関する変化を説明することができる。
【００７９】
好ましくは、特定のモデルおよび／または方法の制限に適合しない試験データが同定される。
【００８０】
該被検体は、動物、特にヒト、マウス、ラット、ブタ、乳牛、雄牛、ヒツジ、ウマ、イヌもしくはウサギのような哺乳動物、または任意の家畜、または競走馬のようなスポーツ用もしくは育種用の任意の動物であってよい。または、該被検体は、植物、魚もしくは任意の他の水生生物、または生物学的組織、組織培養、細胞培養もしくは微生物培養であってよい。
【００８１】
データは、単一の被検体とみなされる被検体の群を代表する、またはそれを代表すると考えられるサンプルから得ることができる。
【００８２】
例えば、複数の同種被検体（例えば植物）から得られるサンプルは一緒にして粉砕され、得られた物質を、単一の植物被検体に関するとみなされるデータを得るために用いることができる。
【００８３】
投与物質は、任意の物質、または物質の混合物もしくは製剤であってよく、例えば、特に医薬物質もしくは薬用物質、または医薬物質もしくは薬用物質となる可能性のある研究中もしくは開発中の物質、更にまた例えば毒素、農薬、除草剤、食料物質もしくは飼料物
質、食料添加剤もしくは飼料添加剤、並びに液体、気体、蒸気および煙、例えばタバコの煙のような任意の流体が挙げられる。
【００８４】
投与物質は、任意のマトリクスまたは媒体において、任意の方法または経路により、例えば注射により、食べることにより、飲むことにより、吸入により、または喫煙により、被検体の生存期間またはその任意特定の部分もしくはごく一部分のような任意の期間にわたって、積極的にまたは受動的に投与されてよく、このような投与は、例えば環境への暴露もしくは汚染に起因するか、または医療処置、歯科的処置、獣医科的処置もしくは外科的処置に起因するものを含む。
【００８５】
該方法は、被検体のアセチレーター表現型を、試験物質を該被検体に投与せずに同定するために用いることができる。加えて、または別法として、該方法は、物質の投与に対する被験体の応答がアセチレーター表現型に依存する場合、該応答を予測するために用いることができる。
【００８６】
該方法は、イソニアジド誘導毒性またはガラクトサミン誘導毒性に対する被検体の感受性を予測するために用いることができる。
【００８７】
本発明はまた、モデルを作成する装置に関する。
【００８８】
本発明の更なる態様において、応答予測のための、および／または代謝表現型検査のための装置が提供され、該装置は：
各モデルが特定の投与物質を投与された複数の被検体に関する投与前および投与後データの相関をモデリングする、１またはそれ以上のモデル；
少なくとも１つのモデルについて、未投与の被験体に関するデータを分析し、それにより、用いたモデルに従って、未投与の被験体の代謝表現型の１またはそれ以上の態様を決定するかまたは投与に対するその応答を予測する処理機；
を含む。
【００８９】
加えて、または別手段として、被検体の代謝表現型の選択された態様を、それらの被検体に試験物質を投与することなく特徴付けるための、または、投与せずに、代謝表現型に依存する被検体の投与後応答を予測するための、１またはそれ以上のモデルを作成するように設けられ、該装置は：
投与物質を投与する前に、複数の被検体に関する投与前データを得るように；
投与物質を投与した後に、前記の複数の被検体に関する投与後データを得るように；および、
投与前データにおける被検体間の変動を、投与後データにおける被検体間の変動と相関させて、観察された相関に基づいて投与前から投与後の予測モデルを作成するように、設けられる。
【００９０】
好ましくは、該装置は更に、物理的および／または化学的分析、例えばＮＭＲスペクトロスコピー、質量分析、赤外分光または高速液体クロマトグラフィーの、１またはそれ以上の分析機器またはデバイスを含んでもよい。
【００９１】
また、該装置は、１またはそれ以上の生体マーカー、特に予め前述のように同定されている１またはそれ以上の生体マーカーの使用に基づく応答予測または代謝表現型検査のための生体マーカーを同定するように設けることもできる。
【００９２】
本発明の更なる態様において、代謝表現型検査のための、または投与に対する被検体の応答を予測するための装置が提供され、該装置は、試験用の被検体からのサンプルを受け
る試験領域を含み、該試験領域は、サンプル中の１またはそれ以上の生体マーカーと化学的に反応して試験領域の外観を変化させることができる１またはそれ以上の試薬を含み、該生体マーカーは予め前述のように同定されており、そしてその結果として生じた試験領域の外観は代謝表現型に特徴的であるかまたは投与に対する応答を予測するものである。
【００９３】
好ましくは、該装置は被検体にとって適当な投与計画を同定する。
【００９４】
該装置は、特定の生体マーカーに対して作成された抗体の使用に基づいてよい。選択された生体マーカーは、例えば固体支持体上に固定化された酵素を用いる酵素触媒反応により検出および／または定量できる。
【００９５】
また、本発明は、本発明の方法により作成される１またはそれ以上のモデルを含む装置に関する。
【００９６】
更に該装置は、特定のモデルの制限に適合しない試験データを同定するように設けることができる。
【００９７】
本発明は、多くの応用を有する：
（１）修正処理を必要としない「良好な」被検体
被検体の代謝特徴決定（表現型検査）によって、次のものが可能になる：
‐危険性評価、例えば膀胱癌、特に特定の表現型に関連するもの。
‐適当とする場合における、即ち危険性の高い被験体における、特別な健康モニター方式の標的化された採用。
‐適当とする場合における、即ち危険性の高い被験体における、予備的／予防的処置の標的化された使用。
‐保険目的の、被験体に関する危険性の度合いの測定。
‐例えば家畜の育種において、望ましい特徴による被験体の選択。
‐室内実験または臨床試験のための、表現型が同質の被験体サブセットの選択。
【００９８】
（２）薬品処置、医療処置、歯科的処置、獣医科的処置または他の処置を要する被検体
被検体の代謝特徴決定（表現型検査）および／または投与もしくは処置に対する被検体の応答の予測によって、次のものが可能になる：
‐被害を受け易い被検体に対して薬剤を投与しないことによる、または薬剤用量および／または投与頻度および／または投与期間を減少することによる、医薬品副作用（例えば昏睡、致死）の回避。
‐薬品処置の軽い副作用（例えば悪心、眠気）の発生および重篤度の予測。
‐副作用を最小限に抑えながらも、体内における適当なレベルの活性薬剤物質を維持することに基づく、至適薬品処置（処置過程の化合物、用量、投与頻度および投与期間）の選択。
‐医療処置、歯科的処置、獣医科的処置、および物質、例えばハロタンのような麻酔剤に対する副作用の回避。
‐適当な医療的、歯科的または獣医科的手段または処置の選択。
【００９９】
（３）薬剤開発および認可（licensing）
異なる被検体において異なる効果（例えば有効性、毒性）を有する薬剤は、投与前代謝表現型検査を行ない、それに従って処置を調整することを前提として認可され得る。これによって、次のものが可能になる：
‐有効性または毒性のいずれかにおける変動的応答による「整理」（薬剤開発過程中の化合物の放棄）の減少。
‐有効性または毒性の問題が、個体群全体というよりもむしろ特定被検体サブセットに
限定される場合の、特定の未承認薬剤の再生／再認可。
【０１００】
薬剤開発研究（例えば毒性または有効性についての）に関して、投与前代謝表現型検査によって、次のものが可能になる：
‐変動が、異なる被検体間または異なる被検体サブセット間の表現型の差に起因する場合の、変動的な結果の解釈。
‐必要とされる特定の代謝特性を有する所望の試験群の選択。
【０１０１】
（４）生体マーカーの同定
適当なモデルは、試験データの分析に直接使用する代わりに、代謝表現型を決定するための、または代謝表現型により決定される応答を予測するための、生体マーカーまたは生体マーカー組合わせの同定に用いることができる。次いで、関連がある生体マーカーを明らかにして、例えば検尿（urine dipstick）またはＨＰＬＣ方法のような簡易分析方法を、これらの生体マーカーに基づいて開発することができる。これにより、ＮＭＲスペクトロスコピーのような高度な技術に対する依存度を減少して、より遠隔で、例えば地方の研究室、薬局、病院または医者の診療所において、試験することができる。
【０１０２】
ここで、実施例を示すだけのものとして添付図面を参照して、本発明を更に説明する。
図１−１は、ガラクトサミンＨＣｌ（略称ＧａｌＮＨＣｌ）（８００ｍｇ／ｋｇ）投与後のガラクトサミンの変動尿中排泄を示す；
図１−２は、ＧａｌＮＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）投与後の、Ｎ−アセチル化体の変動尿中排泄を示す；
図１−３は、応答者においてＧａｌＮＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）によって誘導された幾つかの尿中変化を示す；
図１−４は、ガラクトサミンＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）投与後のヒプレート（hippurate）およびヒスチジンの変化した尿中排泄を示す；
図１−５は、ガラクトサミン研究からの−１日目（投与前）尿ＮＭＲスペクトルのＰＣＡからのＰＣ１対ＰＣ５のスコア・プロットを示す；
図１−６は、ガラクトサミン研究からの−１日目（投与前）尿ＮＭＲスペクトルのＰＣＡからのＰＣ１対ＰＣ５のローディング・プロットを示す；
【０１０３】
図２−１は、イソニアジド（４００ｍｇ／ｋｇ）をオスSprague-Dawleyラットに投与した後０〜７時間に採取された尿サンプルのＮＭＲスペクトルにおいて見られる、Ｎ−アセチル化代謝産物の種々のパターン例を示す；
図２−２は、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与された動物からの１日目（投与から０〜７時間）尿サンプルのＮＭＲスペクトルのＮ−アセチル領域(δ２．２３〜δ２．１３)のＰＣＡからの、ＰＣ１対ＰＣ２のスコア・プロットを示す；
図２−３は、イソニアジド代謝の２種の任意選択的初期経路を示す；
【０１０４】
図３−１は、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）投与後０〜７時間に採取された尿サンプルのＮＭＲスペクトルにおける比率（ピーク高さ「ａ」／ピーク高さアラントイン）の投与前予測を示す；
図３−２は、図３−１に記載された結果を生じさせたＰＬＳ分析に関する回帰係数を示す；
図３−３は、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットから、投与後０〜７時間に採取された尿中に排泄された代謝産物Ｃの量の投与前予測を示す。
図３−４は、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットから、投与後０〜７時間に採取された尿中の比率［（フラクションＣ）／（フラクションＡ＋Ｂ）］の投与前予測を示す。
図３−５は、図３−４に関するモデルの内部バリデーションを示す。
図３−６は、外部試験セットについての［（フラクションＣ）／（フラクションＡ＋Ｂ）］の投与前予測を示す。
【０１０５】
図４−１は、パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間におけるＮ−アセチル化化合物（δ約２．２２〜約２．１１）の全尿中排泄の投与前予測を示す。（このパラメータについての第１モデル）。
図４−２は、パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中に排泄された「ＭＡ」量の投与前予測を示す。（このパラメータについての第１モデル）。
図４−３は、パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中のＮ−アセチル化化合物（δ約２．２２〜約２．１１）の全尿中排泄の投与前予測を示す。（このパラメータについての第２モデル）。
図４−４は、図４−３に関するモデルの内部バリデーションを示す。
図４−５は、パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中のパラセタモールグルクロニド（「Ｇ」）の尿中排泄の投与前予測を示す。
図４−６は、図４−５に関するモデルの内部バリデーションを示す。
図４−７は、パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中の「ＭＡ」の尿中排泄の投与前予測を示す。（このパラメータについての第２モデル）。
図４−８は、図４−７に関するモデルの内部バリデーションを示す。
図４−９は、図４−７に関するモデルの外部バリデーションを示す。
図４−１０は、パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中の「Ｐ」の尿中排泄の投与前予測を示す。
図４−１１は、図４−１０に関するモデルの内部バリデーションを示す。
図４−１２は、パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中に排泄された「Ｓ」の量の、投与前予測値に対する観測値を示す。
図４−１３は、パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中に得られた尿サンプルのＧ／Ｓ比の、投与前予測値に対する観測値を示す。
【０１０６】
図５−１は、パラセタモールを投与したヒト男性について、投与後最初の３時間における体重１ｋｇあたりのＮ−アセチル化化合物（δ２．２１０〜２．１３５）の全尿中排泄の投与前予測を示す。
図５−２は、図５−１に関するモデルの外部バリデーションを示す。
図５−３は、パラセタモールを投与したヒト男性について、投与後最初の３時間において尿中に排泄された、体重１ｋｇあたりのパラセタモールグルクロニド（「Ｇ」）の量の投与前予測を示す。
図５−４は、図５−３に関するモデルの外部バリデーションを示す。
図５−５は、パラセタモールを投与したヒト男性について、投与後最初の３時間において尿中に排泄された、体重１ｋｇあたりの「Ｐ」の量の投与前予測を示す。
図５−６は、図５−５に関するモデルの外部バリデーションを示す。
図５−７は、パラセタモールを投与したヒト男性について、投与後最初の６時間における体重１ｋｇあたりのＮ−アセチル化化合物（δ２．２１０〜２．１３５）の全尿中排泄の投与前予測を示す。
図５−８は、図５−７に関するモデルの外部バリデーションを示す。
【０１０７】
Ａ．モデル構築手順の好ましい特徴
１．モデル構築個体群
モデル構築個体群を構成する被験体は、可能な限り、試験個体群を構成することになる被験体を代表するものでなければならない。食餌は、生体液の組成に影響することがあるので、従って、被検体間の食餌の変動は、生体液から得られたモデルついて重大となり得る。該方法は、食餌の変動による影響を受けないように十分に堅牢であるのが理想的であるが、これは各モデルについての試験を要する。変動的な食餌によって起こり得る影響に
対する予防策として、特定のモデルに関するモデル構築データ、バリデーションデータおよび試験データは全て、同じ食餌を受けた被験体から得ることが望ましい。これは、ヒトで行うよりも、実験動物で行う方が容易である。実際、標準的な動物の食餌と標準的なヒトの食餌が関連する全ての課題について特定されるならば、これは異なるモデルの範囲に対する、被験体の尿サンプルの迅速な検査を可能にするため、有利となり得る。一般に、モデル構築個体群の大きさが大きいほど、作製されるモデルはより堅牢なものになる。一度モデルを構築したならば、モデル構築個体群の構成員ではない被験体群を用いて、バリデートする必要がある。
【０１０８】
２．投与
投与される物質、用量レベル、投与の頻度および投与方法は、用途に応じて決まる。目的が、代謝表現型検査のための方法を生みだすことである場合、該投与物質は当該の変換の程度を特徴付けるための、１またはそれ以上の代謝産物を与える必要がある。理想的には、選択された代謝産物は当該の変換にのみ影響を受け、他の複雑要因には付されない。従って、投与される化合物はおそらく、小さな単純な化学化合物であって、おそらくは、単化学官能性または２化学官能性を有する化合物であろう。このような表現型検査モデルを構築するためには、選択された物質の単一用量は十分な量であるが、代謝的に異なる固体間の識別を可能にするのに十分に多い量であることが必要であろう。目的が応答予測のためのモデルの構築である場合、投与計画は、被験体において予測される応答のためのものと同一でなければならない。
【０１０９】
３．サンプル
ａ．投与前サンプル
投与前サンプルは、関連する代謝情報を含むように選択する必要がある。必要ならば、１種より多くのサンプルを用いて、その情報量を組合わせることができる。該サンプルは容易に得られるものであって、そのサンプリング手順は痛みおよび不都合さを最小限にするものであることが好ましい。投与前のサンプリング時と投与時との間に、代謝表現型に変化が生じる可能性を最小限に抑えるために、投与前サンプルはできる限り投与時に近い時点で採取すべきである。尿は、豊富な代謝情報を含み、特にヒト被験体にとってほとんどまたは全く不都合を感じずにサンプリングすることができるので、理想的な投与前サンプルである。更に、ヒトでは、尿は基本的に要求に応じてサンプリングできる。ラットのような動物からの尿の採取は、これよりもわずかに困難である；この場合、要求時に採取することはできず、ラットのような小動物は一般に、尿採取のために特別な処理をして、数時間個別のケージ内に収容しなければならない。
【０１１０】
血液もまた代謝情報を含み、少量で、比較的容易に大型の動物またはヒトから「針刺し（pin-prick）」方法によりサンプリングできる。しかしながら、凝固を防ぐために特別な処理を行う必要があり、例えば血清を使用したり、またはヘパリンリチウムを含む容器を使用する。特に小動物から大量の血液を採取することはより困難であり、専門技術と瀉血専門医が必要である。血液をサンプリングする部位および被験体を固定する容易さに応じて、麻酔および／または沈静が必要となり得る。血漿または血清は、通常、分析される、血液から得られる２種の液体である。
【０１１１】
唾液、汗、呼気もしくは呼気濃縮物、涙および母乳は、容易に採取され、検査の性質に応じて関連する代謝情報を含み得る他の体液である。
【０１１２】
ｂ．投与後サンプル
投与後サンプルの種類は、用途に応じて決められる。投与後サンプルは、被験体全体、例えばヒトまたはラットであってよく、または上述の項ａ．に挙げたような生物から得られるサンプルであってよい。必要に応じて、１種より多くのサンプルを用いることができ
る。
【０１１３】
ｃ．サンプルの安定性
特別な処理を行わなければ細菌または他の手段によって劣化し得る生物学的サンプルには、その安定性を確保するために特別な処理が必要である。上述のように、血液または血漿の凝固を防ぐためには、特別な処理が成されねばならない。尿サンプル、特に糞便または他の汚染に曝された可能性のあるものは、好ましくは、アジ化ナトリウムのような抗菌剤を含む容器中に採取する。アジ化ナトリウムは1ＨＮＭＲスペクトロスコピーに対して不可視であるという利点を有する。尿サンプルが有意な期間にわたって、即ち数分間というよりはむしろ数時間にわたって採取される場合には、採取容器またはバッグは氷または他の手段によって冷却されることが好ましい。一度採取され、安定化されたならば、全ての生物学的液体は、すぐに分析されるか、または分析に用いられるまで深冷（−２０℃以下）されて保存される。好ましくは、任意の「固体」組織サンプルは、採取後すぐに液体窒素中で「スナップ」凍結され、分析に用いられるまで−８０℃で保存される。採取および保存容器は、可塑剤または他のプラスチック成分が漏出してサンプルが汚染されないようなものを選択するべきである。
【０１１４】
４．サンプル調製
分析の前に、何等かのサンプル調製または処理が必要となり得る。異なる研究者により用いられる正確な手順には多くの変形があり得るが、1ＨＮＭＲスペクトロスコピー分析用サンプルは、典型的には以下のようにして調整される：
【０１１５】
ａ．尿サンプル
典型的には、尿４００μｌを、リン酸緩衝液（０．２ＭＮａ2ＨＰＯ4と０．２ＭＮａＨ2ＰＯ4との８１：１９（ｖ／ｖ）混合物；ｐＨ７．４）２００μｌと混合して尿サンプルをＮＭＲ分析用に調製し；不十分量の尿を利用する場合、不足分を純水で補って最小で２００μｌとした尿を用いる。尿−緩衝剤混合物を室温で緩衝化が起りうるように１０分間静置し、次いで１３,０００ｒｐｍで更に１０分間遠心分離して、懸濁した粒子を除去した。「透明な」緩衝化尿５００μｌをＮＭＲ管に移し、ＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液５０μｌを加える。ＴＳＰ（ナトリウム３−トリメチルシリル−［２，２，３，３−2Ｈ4］−１−プロピオネート）は、ＮＭＲ実験で用いられる化学シフト標準化合物（δ０）であり、Ｄ2Ｏは、ＮＭＲスペクトロメータのために磁場／周波数ロックを与える。ＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液の濃度は、ＮＭＲ管中でＴＳＰ終濃度０．１ｍＭとなるようにする。
【０１１６】
ｂ．血漿サンプル
典型的には、血漿１５０μＬを、生理食塩水（１０％（ｖ／ｖ）Ｄ2Ｏと９０％（ｖ／ｖ）Ｈ2Ｏとの混合物中の０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）３５０μＬと混合して、血漿サンプルを1ＨＮＭＲ分析用に調製する。サンプル中のタンパク質と結合する可能性があるため、ＴＳＰのような化学シフト標準化合物は加えない。
【０１１７】
用いる分析技術に応じて、サンプルの化学的誘導化は、データリカバリを高めるために用いることができる。従って、例えば、そのままでは紫外線または可視光線の吸収をモニターする分光測光検出器で検知されない化合物に、適当な発色団を付けることができる。他の選択は、蛍光分析による化合物の検出能を高めるために蛍光マーカーを付けることである。このような化学的誘導化によって、検出不可能であった化合物を検出可能にすることができ、またその他のものについては検出限界を改善することができる。化学的誘導化はまた、異なるサンプル成分のクロマトグラフィーによる分離を容易にするために用いることができる。また、そのままでは分析中に問題を引き起こし得る血漿タンパク質のような好ましくないサンプル成分を除去するのに、物理的および／または化学的処理を用いることができる。
【０１１８】
５．物理的−化学的分析技術
ａ．投与後サンプルの分析
分析技術は、測定されるパラメータに関して、並びにサンプルの数および性質、例えば生物全体または生体液の種類に関して、選択されなければならない。種々のモデルにおいて重要と成り得る非常に多くのパラメータは、非常に多くの分析機器および分析方法が必要となり得ることを意味する。
【０１１９】
用途が特定の応答、例えば特定の物質を投与した後の血圧の変化を測定することであるならば、最も適当な技術、例えば血圧計が選択される。物質の毒性に重点が置かれる場合、例えば適当なキットを備えた自動化臨床分析器を用いて、酵素活性のような血漿パラメータの範囲を測定するのが好ましいであろう。別法として、組織病理学的結果を、影響の種類に従って分類できるか、または重篤度に従って数的にスコアできる。目的が表現型検査モデルの構築である場合、投与後分析技術は通常、投与物質の１またはそれ以上の代謝産物の定量、または少なくとも相対的定量を提供することが必要となる。
【０１２０】
ｂ．投与前サンプルの分析
投与後サンプルと同様に、投与前サンプルのための分析技術の選択は、サンプルの性質に影響を受けるが、更に、選択される投与前分析技術は、代謝情報を示し得ることが必要である。体液または体組織の分析は、ＮＭＲスペクトロスコピーを用いて行うか、または他の、指標のない代謝産物を検出および定量できる技術を用いて行うのが好ましく、即ち選択される技術は、理想的には、特別な代謝産物の分析に特定する必要なしに、個々の代謝産物を検出し、定量する。これにより、該モデル内における最も有用な代謝産物の使用が、それらが現在未知であったとしても可能になる。これはまた、関与する新規代謝産物マーカーの同定も可能にする。モデル構築のためには、観察された代謝産物のそれぞれを同定する必要はないが、むしろ該分析技術は、各サンプルの信頼性のある定量的な指紋を与えるべきである。選択される技術は、容易に利用できるものであるのが理想的であるが、これには費用および高度な知識レベルが必要となるため、常に可能であるわけではない。ほとんどの分析化学研究室において標準的な分析装置である、可能な技術の１つは、例えばＵＶ−可視分光光度検出を用いる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である。ＨＰＬＣ技術は、多大な時間を消費するが、投与前サンプルから必要なデータの種類を提供することができる。ＨＰＬＣ用の検出器の選択は重要な要素であり、分析前のサンプルの化学的誘導化によりデータリカバリを容易にすることができる。ＮＭＲスペクトロスコピーの使用は、ＮＭＲ実験の任意特定の種類に限定されない。
【０１２１】
ｃ．種々の分析装置の変動的動作
異なる分析装置は異なった動作を示し、装置単体の動作は、経時的に変動し得る。ＯＳＣのようなデータ・フィルタリングは「指導付きの」ＰＲ分析における装置の変動の影響を最小限にするのに役立つが、好結果を示すモデルの構築のために投与前のサンプル間の僅かな変動を特徴付ける必要がある場合、このような装置の変動が特に重要となり得る。従って、理想的には、特定のモデル構築において、特定の型のすべての測定を、単一の場合に１つの特定の装置を使用して行う。単一の場合に全分析を行うことが不可能であるならば、確実に、異なる使用期間の間に有意に装置の動作が変動しないことが要求される。複数体または複数種の装置を、モデル構築個体群からの測定に用いる場合、各装置が同様の動作を示すことを確認するためにクロスチェックする必要がある。異なる装置間で動作に有意な差が存在する場合は、装置の除外または再校正を行う必要がある。
【０１２２】
６．多変量ＰＲ分析の前のデータ操作
ＰＲ分析の前に幾らかのデータ操作を行うことが有用となり得、または必要となり得る。
【０１２３】
理想的には、利用できる全ての物理的および／または化学的データを、ケモメトリクス分析のための入力データを作成するのに用いる。しかしながら、得られるデータの種類に応じて、多変量分析前に、幾らかデータを整理する必要があり得る。尿のような生体液の1ＨＮＭＲスペクトロスコピー・データについて、バッファリングに関わらず、化学シフトスケール上のピーク位置においてｐＨに誘導される小さなシフトに対処するために、このようなデータ整理が用いられてきた。従って、残留水シグナルのような特定の領域を除外した後に、各１Ｄ1ＨＮＭＲスペクトルの残りの部分を、連続するセグメント（典型的には、６００ＭＨｚスペクトロメータについて幅０．０４ｐｐｍ）への横座標および各セグメントについて得られる積分に従って分割する。このようなデータ整理が必要な場合、その前の試みで適当なモデルが得られなかったならば、例えば異なるスペクトルセグメント幅を使用するといった、異なるデータ整理方法を試すことが勧められる。ＯＳＣのようなデータ・フィルタリング技術の使用は、変量選択で補助することによって、データ整理を容易にすることができる。
【０１２４】
生体液ＮＭＲデータについて、データ整理された各スペクトルを「標準化」することは一般的な方法であり、これには多くのやり方がある。しばしば、各ＮＭＲスペクトルを標準化するか、またはスケールして、データセットにおける他の全てのＮＭＲスペクトルに等しい総積分を得る。更に、他のデータ操作は、例えば尿サンプルからの1ＨＮＭＲデータを、存在するならばδ５．４におけるアラントインピークについての一定積分に、または存在する場合にクレアチニンピークについての一定積分にスケールするのに有用となり得る。ヒトにおいて、尿クレアチニン排泄は、筋肉質量に関連し、これは即ちおおまかに体重に関連する。従って、尿データの一定クレアチニンへのスケールは、体重に関連する排泄の差を除外するのに役立つ。更に、尿中の代謝産物濃度の測度を決定することにより、および各被験体から排泄される尿の量を考慮に入れることにより、各被験体から排泄される代謝産物を正確に示すデータセットを得ることが可能となる。代謝産物の排泄が測定されていて、体重も既知であるが変動的である場合、尿データを体重単位当たりの排泄に標準化することが有用であり得る。また、データを「ブロック」して、特定の範囲内に入る値を有する変量を別個の群として処理することも有用であり得る。
【０１２５】
ＰＣＡ、ＰＬＳまたはＰＬＳ−ＤＡのような分析の特定の制限は、変量の非線形組合せがより有益であり得るという事実にもかかわらず、該分析は存在する変量の有用な線形組合せを見つけること基づくということである。従って、このような分析を行う前に、存在する変量の非線形組合せを加えることによって、Ｘデータ行列を拡張することが賢明であろう。特に、２変量の比率はしばしば、いずれか一方の絶対値よりも有意であり、比率をとることは、異なる代謝産物の相対量がしばしば重要である場合に、代謝表現型検査について特に役立つであろう。従って、拡張されたＸ行列は、それ自体に対する１変量の比率を除く、その元の全変量の１対１比率と共に、元のＸ変量を包含するべきである。この手法は、以下の単純な例において示される：
【表１】
2005534899.tif 000002
【０１２６】
これより僅かに複雑な例において、元の３個のＸ変量が拡張されて、新たに６個の変量行列を生じる：
【表２】
2005534899.tif 000003
【０１２７】
この手法の潜在的な利点は、２つのＸ変量から１つのＹ変量を予測したい場合に、以下の単純なＰＬＳ型の例において示される：
【表３】
2005534899.tif 000004
【０１２８】
元の行列には、Ｙ１を生じるような、Ｘ１とＸ２との一定線形組合せは存在しない。しかしながら、記載したようにＸ行列を拡張することによって、非常に単純な線形関係が明らかとなり、即ちＹ１＝２（Ｘ１／Ｘ２）である。
【０１２９】
データセットにおける各変量について、通常、ケモメトリクス分析を行う前に幾つかのスケール形式が必要となる。典型的なスケール手法としては、平均−中心化、単位分散スケールおよびパレートスケールが挙げられる。
【０１３０】
７．ケモメトリクス方法論
本発明の範囲は、特定の特異化されたケモメトリクス方法論の使用に限定されないことを理解しておくことが重要である。投与前後のデータ相関を同定および明らかにできるこのような方法論のいかなるものも用いることができる。
【０１３１】
ＰＬＳまたはＰＬＳ−ＤＡのような管理パターン認識（ＰＲ）方法は、通常標的化されたモデル構築、即ち投与前後のデータ相関を得るために用いられる。これらの管理方法は、ＰＣＡのような非管理ＰＲ方法を使用して、例えば投与化合物に対する応答の変動を調べることにより、または投与化合物の代謝の変動を調べることにより、行なうことができる。このような非管理分析は、外れ値を同定することにおいて、および分類方法を構築するかまたは数的結果モデルを構築するか決定することにおいて、有用となり得る（以下を参照）。
【０１３２】
時折、代謝表現型または応答予測の幾つかの態様の投与前識別用モデルを得るためのそれほど高度ではない手法において、ＰＣＡのような非管理方法を投与前データに適用することが適当であり得る。この手法は、鋭敏なディスクリミネータを決定する能力において管理方法よりも劣りはするが、簡単であるという利点を有する。このような方法は、投与後の挙動に従って、モデル構築投与前データポイントをコード化（例えば色分け）できることに基づく。この手法が成功するかしないかは、コード化された個体群を投与前に容易に識別できるかどうかによって決まる。一般に、この非管理手法は、異なる応答群についての比較的明確な投与前ディスクリミネータが存在する場合にのみ適当である。該ディス
クリミネータが複雑で、「隠されて」おり、重要なことには、ＯＳＣのようなデータ・フィルタリング方法をこの「非管理」手法に用いることができない場合には、適当ではない。
【０１３３】
モデル構築に用いられるケモメトリクス方法は、想定される、または必要とされる最終用途に応じて決まる。従って、ＰＬＳ−ＤＡのような分類方法は、目的が代謝表現型の幾つかの態様（例えば「速い」または「遅い」アセチル化）の分類方法、または投与物質に対する応答の種類（例えば「薬物有害反応を示す」または「薬物有害反応を示さない」）の予測方法を得ることである場合に、適当である。別法として、目的が代謝能の幾つかの態様の定量的測度を得ること、または投与物質に対する幾つかの応答の数的測度を予測することである場合、ＰＬＳのような方法が適当であろう。ニューラル・ネットワーク分析（ＮＮＡ）は用途に応じて有用となり得、ＮＮＡは、多くの独立した源の１つによって、与前の識別が可能となる場合、分類的役割において有利であることが分かっており、例えばＸデータがＡまたはＢまたはＣ型のものであるならば、応答はＹ１となり、Ｘデータがこれらの型のものでないならば、応答はＹ２となる。重要なことには、ニューラル・ネットワーク方法は、関与する識別を提供するそれらの投与前の特徴を容易に同定することはできない。ＰＣＡ、ＰＬＳおよびＰＬＳ−ＤＡのような方法は、識別力のある特徴を容易に同定することができ、これは任意の識別の科学的根拠を理解するのに、および他の分析方法を得て同様の識別を行うことが望まれる場合に、重要な利点である。
【０１３４】
時に、ＯＳＣのようなデータ・フィルタリング方法は、投与後データにおいて関与する変動に相関しない投与前データにおける変動を除外するのに用いられる。例えば、ＯＳＣは物理的および／または化学的分析に用いる分析装置の動作における任意の変動の影響を最小限に抑えるのに役立つ。
【０１３５】
外れ値のデータはいくらか矛盾するものであり、またはモデル構築の障害となるため、しばしば、比較的少数の外れ値はモデル構築データから除外する必要があり、ＰＣＡスコア・プロットおよびＤｍｏｄＸ値は外れ値を同定するために用いることができる。ＰＬＳモデルの場合、外れ値は以下の方法のいずれかによって正当に除外することができる：
ａ）Ｘスコア（ｔ１／ｔ２）の試験
ｂ）Ｘ残分（ＤｍｏｄＸ）の試験
ｃ）ＸおよびＹ間隔（space）におけるスコア間の相関（例えばｔ１／ｕ１）の試験
ｄ）Ｙスコア（例えばｕ１／ｕ２）の試験
ｅ）Ｙ残分（ＤｍｏｄＹ）の試験。
【０１３６】
８．応答予測用途
生体に投与される物質は、しばしば種々の異なる代謝変換に付される。その後の各代謝産物は、次いで順に、種々の更なる変換等を受ける。従って、元の１つの化合物の完全な代謝は、異なる経路および多くの異なる酵素の、非常に複雑な局面にかかわり得る。その結果、種々の表現型の様々な影響は、投与物質に対する応答の性質に寄与し、これらの全ての種々の影響を解明するのは非常に困難なものとなり得る。従って、応答予測用途に関して、好ましくは、本発明は、種々の影響を解明することなく、該応答を直接予測するのに用いられる。従って、例えばオスSprague-DawleyラットにガラクトサミンＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）（実施例１参照）を投与する場合に引き起こされる、非常に多様な程度の肝損傷（組織病理学および臨床化学パラメータにより示される）は、原則的に、投与前尿の変動に直接相関するため、応答の決定因である代謝因子を理解する必要なしに、ガラクトサミンＨＣｌに対する感受性の予測モデルを提供する。
【０１３７】
Ｂ．モデルバリデーション手順の好ましい特徴
モデル妥当性の確認は、あらゆる種類の数学的モデリングにおいて非常に重要である。
モデルの信頼性および予測能のバリデーションには、モデル構築に用いたデータから独立したバリデーションデータセットが必要である。モデルの予測能は、バリデーションデータセットについての該モデルを基にした予測に関する誤差の大きさに従って評価される。モデルの正確性は、該モデルについて評価された誤差の大きさを、バリデーションデータセットについての該モデルを基にした予測に関する誤差の大きさと比較することによって判断できる。「未知」のサンプルの未来予測について信頼性があるとみなされるモデルは、予測可能性および正確性の両要件を満たすべきである。
【０１３８】
ＰＬＳモデルの場合、「内部」および「外部」の両方のバリデーションは以下のようにして行われる：
ＰＬＳモデルの「内部」バリデーションは、第一にＲ2ＹおよびＱ2Ｙ値の決定により、そして第二に、Ｙデータの位置を、これらに対応するＸ行列中の列についてランダム化すること（典型的には、２０個の別個の列の並べ替えが行われる）の、Ｒ2ＹおよびＱ2Ｙ値に対する影響の観察により、行うことができる。Ｒ2ＹはＰＬＳモデルの能力の測度を与え、該モデルに含まれる全データを用いてＸデータからＹデータを説明する。しかしながら、過剰適合によって擬似的に高Ｒ2Ｙ値を得ることができ、ＰＬＳモデルのリアル・テストはその予測能である。Ｑ2ＹはＰＬＳモデルの予測能の測度を与え、これはクロスバリデーション手順により得られ、ここでＸＹデータの種々の部分が、該データの残りの部分から得られるモデルを使用する、ＸからＹの予測について順次に提供される。Ｑ2Ｙは通常Ｒ2Ｙより小さいが、Ｒ2ＹおよびＱ2Ｙは共に理論上の最大値１を有する。Ｒ2ＹおよびＱ2Ｙの実効値に従い、Ｒ2Ｙに近接するＱ2Ｙの値は良好な予測能を暗示する。ＰＬＳモデルの内部バリデーションの第２段階において、Ｙデータの位置がランダム化され、元のモデルが妥当であるならばＲ2ＹおよびＱ2Ｙの両値は実質的に減少する。Ｙデータの位置を、これらに対応するＸ行列中の列についてランダム化することにより、Ｑ2Ｙは大きく減少し、理想的には０になる。また、モデリング手順は常に、Ｘデータ中で、ランダム化されたＹデータを予測できるものを、ノイズでさえ、検出することを試みるため、Ｒ2Ｙ値は、ランダム化されたＹデータ上で実質的に減少するが、必ずしも０まで減少するとは限らない。
【０１３９】
ＰＬＳモデルの「外部」バリデーションは、モデル構築個体群の部分を形成せず、そのＹ値が該モデルにおけるＹデータの範囲にほぼかかるような動物のテストセットをとることによって行うことができる。妥当であるとみなされるモデルについて、試験サンプルの予測誤差（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ社製のＳＩＭＣＡソフトウェアにおいて、これはＲＭＳＥＰ−予測の平均平方誤差と示される）は、該モデルサンプルの推定誤差（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ社製のＳＩＭＣＡソフトウェアにおいて、これはＲＭＳＥＥ−推定の平均平方誤差と示される）と同じ範囲になくてはならない。
【０１４０】
Ｃ．試験手順の好ましい特徴
この発明の非常に重要な特徴の１つは、異常なまたは極端な代謝表現型を有する被験体の同定に関する。このような被験体は特に、有害なまたは特異な薬剤反応を受ける傾向があり得る。任意のモデル構築動作試験に含まれ得る被験体の数に適用される実際的制限を考えると、代謝表現型の全範囲に基づくモデルを構築することは不可能であり、希少な表現型は含まれるべきではないであろう。更に、民族的差異は表現型の変動の重要な情報源となるであろう。しかしながら、本発明の重要な特徴において、試験段階では、モデルにおける表現型の範囲に適合しない任意表現型は、外れ値としてみなすことができる。ＰＣＡおよびＰＬＳモデルの場合、例えばこれらの外れ値は、ＰＣもしくはＰＬＳスコアにより説明されるモデル平面もしくは超平面の方向において、またはモデル残差方向、モデルへの距離（ＤＭｏｄＸ、Ｙ）において、検出される。更に、ＰＬＳモデリングの場合、スコア方向における外れ値はＸ−間隔（Ｔ）において、Ｙ−間隔（Ｕ）において、およびＸとＹとの間の内部相関（Ｔ／Ｕ）において存在できる。外れ値として同定された被験体で
は、その代謝表現型は十分な信頼性をもって同定することができず、またはその当該投与物質に対する応答は、予測することができない。従って、応答予測用途において、このような外れ値に対して全く物質を投与しないか、または慎重に、例えば初期低用量を用いて処理するかのいずれかが賢明であろう。従って、モデル構築手順の実際的制限にも関わらず、該モデルは被験体の全てについて有用な情報を提供することができる。
【０１４１】
例えば、被験体の尿の単一のＮＭＲスペクトルは、種々の処理に対する被験体の応答を予測するための、または被験体の代謝表現型の幾つかの態様を評価するための、種々のモデルに対して比較することができる。ＮＭＲスペクトルは、必要なときに使用するために電気的に保存することができる。この種の手法は、代謝表現型の年齢に関連する変化を許容するために被験体の一生の異なる段階での試験が必要とされ得るが、必要とされる物理的および／または化学的試験の量を減少させる。
【０１４２】
通常、新規モデルは、１物質に対して誘導されるモデルが近縁の物質に関して使用可能であり得るにも関わらず、関与する物質のそれぞれについて必要とされる。
【０１４３】
本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のそれぞれについて、必要な変更を加えて得られるものである。本明細書に挙げられる先行技術文献は、法的に許容される最大限までここに加入される。
【０１４４】
〔実施例〕
実施例１
ガラクトサミン塩酸塩の投与に対するSprague-Dawleyラットの変動的応答。投与前生体液サンプルのＮＭＲスペクトルの、単純な応答をコード化したＰＣＡの使用に基づく、可能な応答予測方法の例
３０匹の若年齢に対応するオスSprague-Dawleyラットを、Charles River、フランス、から入手した。これらがそれぞれ健康な状態を示していることを確認するために観察した後に、水、および標準的な商業的実験用食餌（Usine d'Alimentation Rationnelle, Villemoisson-sur-Orge, フランス、製の食餌ＡＯ４Ｃ）を自由に摂取できるようにして、個々の代謝ケージ中に入れた。研究室の温度を２０±２℃に、そして相対湿度を６０±２０％に維持した。研究室の空気を、１時間に１４回フィルターを通して交換した。一定の「１２時間明−１２時間暗」サイクルに置いた。短期間、ケージに「順応」させてから研究を開始した。サンプリング方法は、表１．１に示すとおりである。
【表４】
2005534899.tif 000005
【０１４５】
投与時（開始１日目）に、成長中のラットはそれぞれ体重約２６０ｇであった。ガラクトサミン（略称ＧａｌＮ）ＨＣｌ（Sigma、フランス、社製）を生理食塩水に溶解して、腹腔内注射によりそれぞれ２００ｍｇ／ｋｇまたは８００ｍｇ／ｋｇで投与し；動物１０匹（番号１０１〜１１０）に低用量で投与し、動物１０匹（番号２０１〜２１０）に高用量で投与した。対照動物１０匹（番号１〜１０）にはトウモロコシ油を経口で投与した。
【０１４６】
ラット１０匹からなる各群から５匹ずつを、２日目にＣＯ2で安楽死させて、残りは、８日目に同様にして安楽死させた。早期に安楽死させたラットは番号６〜１０、１０６〜１１０および２０６〜２１０であった。後期に安楽死させたラットは番号１〜５、１０１〜１０５および２０１〜２０５であった。
【０１４７】
投与前後の尿サンプルを、毎日７時間、抗菌保存剤としてアジ化ナトリウム（１０％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム水溶液０．１００ｍｌ）を含む氷冷容器に採取した。投与の日には、さらに１晩尿を採取した（投与後７〜２４時間）。各採取の前に尿採取装置を消毒して、細菌、食物および糞による汚染を最小限に抑えた。尿サンプルをＮＭＲ分析まで急速冷凍保存した。
【０１４８】
血液を、イソフルレン麻酔を行って、眼窩洞からサンプリングした。血液を−３日目、および安楽死させる直前の２日目または８日目に全動物からサンプリングした。安楽死させてから、各ラットを組織病理学検査のためのサンプルとして、各ラットから肝サンプル１０個（各肝葉から２個）を採取するなどのサンプリングを行った。血液サンプルを抗凝結剤としてヘパリンリチウムを含む容器中に回収して、すぐに−４℃で遠心分離して血漿を分離した。各血漿サンプルの一部を、ＡＵ６００マルチパラメトリック臨床分析器（Olympus）により、多くの中からアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を含む臨床化学パラメータの範囲について、３０℃で分析した。
【０１４９】
尿４００μｌを、リン酸緩衝液（０．２ＭＮａ2ＨＰＯ4と０．２ＭＮａＨ2ＰＯ4との８１： １９（ｖ／ｖ）混合物；ｐＨ７．４）２００μｌと混合して尿サンプルをＮＭＲ分
析用に調製し；不十分量の尿を利用する場合は、不足分を純水で補って最小で２００μｌとした尿を用いた。尿−緩衝剤混合物を室温で１０分間静置して緩衝化して、次いで１３，０００ｒｐｍで更に１０分間遠心分離して、懸濁した粒子を除去した。「透明な」緩衝化尿５００μｌをＮＭＲ管に移して、ＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液５０μｌを加えた。ＴＳＰ（ナトリウム３−トリメチルシリル−［２，２，３，３−2Ｈ4］−１−プロピオネート）は、ＮＭＲ実験で用いられる化学シフト標準化合物（δ０）であり、Ｄ2Ｏは、ＮＭＲスペクトロメータのために磁場／周波数ロックを提供した。ＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液の濃度は、ＮＭＲ管中でＴＳＰ終濃度０．１ｍＭとなるようにした。水シグナルの大きさを減少するために用いられるNOESYPRESATパルスシーケンス（Claridge、１９９９）を用いて、Bruker AMX ６００ MHz NMRスペクトロメータにより、３０℃でＮＭＲ分析を行った。主要収集パラメータ（principal acquisition parameter）は次のとおり：
スペクトロメータ周波数：６００ＭＨｚ
スペクトル幅：約７２００Ｈｚ（１２ｐｐｍ）
Brukerパルスプログラム：noesypr１d
タイムドメインにおけるデータポイント数：６５５３６
スキャン数：６４
ダミースキャン数：４
収集時間：約４．５５秒
前飽和時間（Presaturation Time）：３秒
混合時間：０．１秒
【０１５０】
収集後、自由誘導減衰シグナルに適用した指数乗法により、０．３Ｈｚの線の広がりの適用に従い、３２７６８データポイントへとフーリエ変換した。スペクトルをフェーズして、ＮＭＲシグナル周りに一様なベースラインを得て、ＴＳＰピークに値δ０を割り与えることにより化学シフトスケールを設定した。データ整理の前に、−１日目のそれぞれのスペクトルのベースラインを、直線ベースライン修正アルゴリズムを用いて、０強度に移した。これら全てのスペクトル処理操作は、「xwinnmr」ソフトウェア（Bruker GmBH）を使用して、Silicon Graphicsコンピューターにより行った。
【０１５１】
投与後の尿のＮＭＲスペクトルの外観検査により、内因性代謝に対するガラクトサミンＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）の影響に関して、動物間で大きな変動があることが明らかになった（表１．５並びに図１−３および１−４参照）。外観試験に基づき、動物を（ｉ）「応答動物」、または（ｉｉ）「弱応答または無応答動物」のいずれかに容易に分類できた。更に、応答動物は、投与後０〜２４時間にわたって、その尿中に、弱応答または無応答動物に比べて、非常に多量のガラクトサミンを排泄することが分かり（図１−１および表１．６参照）、これはガラクトサミン代謝とその毒性との関係を示す。
【０１５２】
図１−１は、３種のＮＭＲスペクトルを示す。スペクトル「ａ」は、投与後０〜７時間に動物２０１から採取された１日目の尿のものである。スペクトル「ｂ」は、本物のＧａｌＮＨＣｌから得られたものである。スペクトル「ｃ」は、投与後０〜７時間に動物２０３から採取された１日目の尿のものである。スペクトル「ａ」および「ｃ」は、一定アラントイン（δ５．４）ピーク高さにスケールされる。ＧａｌＮは動物２０１からの尿中でははっきりと見られるが、動物２０３からの尿ではそうではない。
【０１５３】
更に、応答動物は、投与後２４〜３１時間に採取された尿サンプルのＮＭＲスペクトルにおいて、少なくとも大部分の弱応答または無応答動物のスペクトルにおいては存在しない、特定のＮ−アセチルピークの存在を示した（図１−２参照）。このピークを、暫定的にＮ−アセチルガラクトサミンに割り当てた。また、８００ｍｇ／ｋｇの投与に対する応答においての、動物間の大きな変動は、組織病理学的および臨床科学的データを反映した（表１．２〜１．４参照）。
【０１５４】
図１−２は、投与後２４〜３１時間に動物２０２（スペクトル「ａ」）および２０３（スペクトル「ｂ」）から採取された２日目の尿サンプルのＮＭＲスペクトルを示す。該スペクトルは、一定クレアチニンにスケールされる。Ｎ−アセチルガラクトサミンと考えられるＮ−アセチル化体は、スペクトル「ａ」においてははっきりと見られるが、スペクトル「ｂ」においてはそうではない。
【０１５５】
次いで、ガラクトサミン塩酸塩（８００ｍｇ／ｋｇ）を続けて投与した動物の、−１日目（投与前）の尿サンプルのＮＭＲスペクトルについてＰＣＡを行った。−１日目の尿は動物２０６のＮＭＲスペクトルを得るには不足していたため、このデータセットは９個のスペクトルで構成されていた。ＰＣＡの前に、−１日目のスペクトルのそれぞれを、「AMIX」ソフトウェア（BrukerGmBH）を使用して一定の様式で「データ整理」した。δ９．０〜δ６．２５およびδ４．５〜δ２．７６およびδ２．４８〜δ０．５の領域を保持して、特定のスペクトル領域を切り捨てた。保持した領域を、できる限り、連続的な０．０４ｐｐｍ幅のセグメントに分割して、各スペクトルの各セグメントについて積分を得た。次いで、データ整理値を均一に標準化して、各「スペクトル」について総積分値１０００を得た。結果として得られたデ−タセットを、多変量統計分析ソフトウェアパッケージ（Infometrix社製「Pirouette」）にロードした。次いで、各変動について、平均−中心化によってスケールしてＰＣＡを行った。結果として得られたスコア・プロットを、投与後の挙動に従って色分けして、検査によって、ＰＣ１対ＰＣ５のスコア・プロットが、応答動物と無応答動物との分離を与えることが分かった。このプロットおよび対応するローディング・プロットは、それぞれ図１−５および１−６に示す。図１−５の試験は、個々のラットのガラクトサミンＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）投与に対する応答が、既知の応答動物および無応答動物に対してどのようにマッピングされるかに従って、適当な投与前ＰＣＡスコア・プロットから予測できることを示唆している。図１−６は、このような分析が、応答動物および無応答動物の識別を可能にする投与前の特徴をどの程度明らかにできたかを示している。
【０１５６】
以下の種々の図および表は、ガラクトサミンＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）に対する種々のラットの変動応答の詳細を示し、投与前に応答動物および無応答動物を識別するのに、如何にＰＣＡを用いることができるかを示している。ＰＬＳ、ＰＬＳ−ＤＡまたはニューラル・ネットワーク分析を用いる指導付きのＰＲ方法は、本明細書に記載される指導なしの方法よりも良好に、応答動物と無応答動物との投与前識別を行うことができるようである。
【０１５７】
【表５】
2005534899.tif 000006
【０１５８】
【表６】
2005534899.tif 000007
【０１５９】
【表７】
2005534899.tif 000008
【０１６０】
【表８】
2005534899.tif 000009
【０１６１】
【表９】
2005534899.tif 000010
【０１６２】
【表１０】
2005534899.tif 000011
【０１６３】
図１−３は、動物２０２からの−１日目および＋３日目の尿サンプルのnoesypresatＮＭＲスペクトルの一部を示す。投与前サンプル（スペクトル「ａ」）は、投与前２４〜１７時間に採取した。投与後サンプル（スペクトル「ｂ」）は、投与後４８〜５５時間に採取した。スペクトル「ａ」と比較して、スペクトル「ｂ」は、クレアチン、ベタイン、グアニジノ酢酸（ＧＡＡ）およびタウリンの増加、並びにトリメチルアミン−Ｎ−オキシド（ＴＭＡＯ）および２−オキソグルタレートの減少を示した。
【０１６４】
図１−４は、動物２０１からの−１日目および＋３日目の尿サンプルのnoesypresatＮＭＲスペクトルの一部を示す。投与前サンプル（スペクトル「ａ」）は、投与前２４〜１７時間に採取した。投与後サンプル（スペクトル「ｂ」）は、投与後４８〜５５時間に採取した。スペクトルは一定アラントインにスケールした。スペクトル「ａ」と比較して、スペクトル「ｂ」はヒスチジン排泄の増加およびヒプレート排泄の減少を示した。
【０１６５】
【表１１】
2005534899.tif 000012
【０１６６】
動物２０６が排泄したガラクトサミンの測定量は、これが強応答動物であると考えた場合、予想されるよりも幾分低かった。これは膀胱に尿が残留していたためと考えられる。動物２０６が投与後０〜２４時間の間に排泄した尿はたった３．７ｍｌであり、この期間に動物が生産した尿の量では最低値であった。測定される尿容量が非常に少ない場合、代謝産物排泄は最も低く評価され；これは、膀胱中に、排尿を引き起こすには不十分である有意量の非常に高濃度の尿が存在するためと考えられる。
【０１６７】
図１−５は、高用量投与（８００ｍｇ／ｋｇ）動物からの、利用可能な−１日目の尿サンプル、９個の1ＨＮＭＲスペクトルのＰＣＡにより得られたＰＣスコア・プロットを示し；動物２０６からの不十分量の−１日目の尿は、ＮＭＲスペクトルを得るのに利用可能であった。データポイントは、無応答動物（動物番号２０３、２０４、２０５、２０７および２０８）については菱形、応答動物（動物番号２０１、２０２、２０９、２１０）については×印を用いてコード化したが、動物２０７は応答動物と無応答動物の境界線上にあったことについては言及されるべきである。このプロットは、ガラクトサミン８００ｍｇ／ｋｇによる悪影響を受ける動物および受けない動物の投与前尿スペクトル間で識別できる特徴が存在することを示す。応答動物は、無応答動物に比べて、尿クレアチンの高い投与前レベルを有し、１匹（動物２０１）を除く全ての応答動物は、投与前の尿の２―オキソグルタレート／クレアチニン比率について無応答動物よりも低い値を有した（図１−６も参照のこと）。
【０１６８】
図１−６におけるプロットされた点のそれぞれは、相当する０．０４ｐｐｍ幅スペクト
ルセグメントの中心に従って標識した。従って、例えば３．０２で標識された点は、δ３．０４〜δ３．００ｐｐｍのスペクトルセグメント（または変量）を表す。当該のポイントは、実質的に０ではなく、ＰＣ１および５に寄与するものである。図１−５と１−６の比較により、応答動物に比べて、無応答動物はδ３．０２を中心としたスペクトルセグメントの積分について比較的に高い値を有することが示される。この差異は、無応答動物において２−オキソグルタレートのレベルがより高いことに起因し、また２−オキソグルタレートは、δ２．４６を中心としたセグメントに寄与すると考えられる。トリメチルアミン−Ｎ−オキシドは、δ３．２６を中心としたセグメントに主に寄与し、従って無応答動物は、高レベルの尿中ＴＭＡＯを有し得る。これについて考えられる１つの解釈は、無応答動物が遅いアセチレーターであったということである。
【０１６９】
実施例２
変動的な尿イソニアジド代謝産物パターン、およびそのラットにおけるイソニアジドの毒性との関係。個体間の代謝能における極めて有意な差異の実施例
３０匹の若年齢に対応するオスSprague-Dawleyラットを、Charles River、フランス、から入手した。これらがそれぞれ健康な状態を示していることを確認するために観察した後に、水、および標準的食餌（Usine d'Alimentation Rationnelle, Villemoisson-sur-Orge,フランス、製の食餌ＡＯ４Ｃ）を自由に摂取できるようにして、個々の代謝ケージ中に入れた。研究室の温度を２０±２℃に、そして相対湿度を６０±２０％に維持した。研究室の空気を、１時間に１４回フィルターを通して交換した。一定の「１２時間明−１２時間暗」サイクルに置いた。ラットが約６週齢で体重約２００ｇであるときに、短期間、ケージに「順応」させてから研究を開始した。
【０１７０】
投与を、「１日目」として指定した日に行い、このとき成長中のラットはそれぞれ体重約２５０ｇであった。イソニアジド（Sigma、フランス、社製）を生理食塩水に溶解して、腹腔内注射によりそれぞれ２００ｍｇ／ｋｇまたは４００ｍｇ／ｋｇで投与し；動物１０匹（番号１０１〜１１０）に低用量で投与し、動物１０匹（番号２０１〜２１０）に高用量で投与した。対照動物１０匹（番号１〜１０）には食塩水を腹腔内注射により投与した。
【０１７１】
投与前後７時間の尿サンプルを、抗菌保存剤としてアジ化ナトリウム（１０％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム水溶液０．１ｍｌ）を含む氷冷容器に常に採取した。投与後７〜２４時間に、さらに１晩尿を採取した。各採取の前に尿採取装置を消毒して、細菌、食物および糞による汚染を最小限に抑えた。各尿サンプルの最終容量は、アジド溶液についての補正を行わずに決定した。尿サンプルを分析まで急速冷凍保存した。
【０１７２】
組織病理学検査のために、安楽死の直前に投与前血液サンプルを採取し、また安楽死の直後にもサンプリングを行なうことが意図された。実施例１と同様にして、ラット１０匹からなる各群から５匹ずつを、投与の１日後にＣＯ2で安楽死させて、これにより早期の血液および組織病理学検査用サンプルを得；残りは、投与の７日後に同様にして安楽死させて、これにより後期の血液および組織病理学検査用サンプルを得ることが意図された。早期に安楽死させるラットは番号６〜１０、１０６〜１１０および２０６〜２１０として、後期に安楽死させるラットは番号１〜５、１０１〜１０５および２０１〜２０５とすることが計画された。しかしながら、高用量のイソニアジドを投与した群の数匹の動物（番号２０４、２０５、２０７および２０９）は、突然の痙攣をおこして、死んだかまたは苦痛を回避させるために早くに安楽死させなければならなかった。注目すべきことには、比べると、他の高用量投与群の動物（番号２０１〜２０３、２０６、２０８および２１０）は、害の明確な臨床兆候を示さなかった。尿サンプルをＮＭＲ分析まで急速冷凍保存した。
【０１７３】
尿４００μｌを、リン酸緩衝液（０．２ＭＮａ2ＨＰＯ4と０．２ＭＮａＨ2ＰＯ4との８１： １９（ｖ／ｖ）混合物）２００μｌと混合して尿サンプルをＮＭＲ分析用に調製し；不十分量の尿を利用する場合は、不足分を純水で補って最小で２００μｌとした尿を用いた。尿−緩衝剤混合物を室温で１０分間静置して緩衝化して、次いで１３，０００ｒｐｍで更に１０分間遠心分離して、懸濁した粒子を除去した。「透明な」緩衝化尿５００μｌをＮＭＲ管に移して、ＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液５０μｌを加えた。ＴＳＰ（ナトリウム３−トリメチルシリル−［２，２，３，３−2Ｈ4］−１−プロピオネート）は、ＮＭＲ実験で用いられる化学シフト標準化合物（δ０）であり、Ｄ2Ｏは、ＮＭＲスペクトロメータのために磁場／周波数ロックを提供した。ＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液の濃度は、ＮＭＲ管中でＴＳＰ終濃度０．１ｍＭとなるようにした。水シグナルの大きさを減少するために用いられるNOESYPRESATパルスシーケンス（Claridge、１９９９）を用いて、Bruker AMX ６００ MHz NMRスペクトロメータにより、３０３ＫでＮＭＲ分析を行った。主要収集パラメータは次のとおり：
スペクトロメータ周波数：６００ＭＨｚ
スペクトル幅：約７２００Ｈｚ（１２ｐｐｍ）
Brukerパルスプログラム：noesypr１d
タイムドメインにおけるデータポイント数：６５５３６
スキャン数：６４
ダミースキャン数：４
収集時間：約４．５５秒
前飽和時間：３秒
混合時間：０．１秒
【０１７４】
収集後、ＮＭＲスペクトルを、自由誘導減衰シグナルに適用した指数乗法により、０．３Ｈｚの線の広がりの適用に従い、３２７６８データポイントへとフーリエ変換した。スペクトルをフェーズして、ＮＭＲシグナル周りに一様なベースラインを得て、ＴＳＰピークに値δ０を割り与えることにより化学シフトスケールを設定した。スペクトルおよび選択した展開を紙上にプロットした。スペクトルのセットを多変量パターン認識方法により調べる場合に、各スペクトルのベースラインを、直線ベースライン修正アルゴリズムを用いて、０強度に移した。これらのスペクトル処理操作は、「xwinnmr」ソフトウェア（Bruker GmBH）を使用して、Silicon Graphicsコンピューターにより行った。
【０１７５】
投与後０〜７時間に採取されたＮＭＲスペクトルの外観検査により、イソニアジドに由来すると考えられる特定の代謝産物のパターンにおいて、大きな変動があることが明らかになった。この変動は、３種の異なるＮ−アセチル化体に由来すると考えられる、２ｐｐｍの領域中の３つのピークにおいて特に明らかであった。これらの約２．２２、２．２０および２．１５ｐｐｍのピークは、これ以降はそれぞれピーク「ａ」、「ｂ」および「ｃ」と呼び、これらを生じる化合物は、これ以降は化合物「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と呼ぶ。各投与において、本質的に、これらの代謝産物の２種の異なるパターン型が存在すると考えられ、これらの異なるパターン（「１型」および「２型」と呼ぶ）の例は図２−１を示す。
【０１７６】
また、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）投与後０〜７時間に採取された尿サンプルの、データ整理されたＮＭＲスペクトルのＰＣＡにより、代謝の変動が明らかになった（図２−２参照）。この分析を行うために、利用可能な９種のサンプルのＮＭＲスペクトルを、まず、ＡＭＩＸプログラム（Bruker GmBH）を用いて一定の様式で「データ整理」した。Ｎ−アセチル領域δ２．２３〜δ２．１３を除く全スペクトル領域を切り捨てた。各スペクトルの残った部分を２つの連続した０．０５ｐｐｍ幅のセグメントに分割して、各セグメントについて積分を得た。次いで、データ整理された値を標準化して、各「スペクトル」について総積分値１０００を得た。結果として得られたデ−タセットを、多変量統計分析ソフトウェアパッケージ（Infometrix社製「Pirouette」）にロードし、各変量（スペクトルセグメント）の、平均を中心としたスケーリングを用いて主成分分析（ＰＣＡ）を行った。これは、たった２つの入力変量を用いる、ＰＣＡのごくありふれた例であるが、予め決定されたとおりの、異なる２種のＮ−アセチルパターン型の存在を支持し、１型動物は動物１０１、１０３および１０９であり、２型動物は動物１０２、１０５、１０６、１０７、１０８および１１０であった。図２−２において、１型動物のデータポイントは×印で示され、これに対して２型動物のデータポイントは菱形で示される。
【０１７７】
イソニアジドは、ヒトにおいてのその代謝がＮ−アセチレーター表現型による影響を受けるような物質の古典的な例であり、この例において観察された異なる代謝産物パターンは、試験群内の、遅い、および速い、Ｎ−アセチレーターの存在を示唆した。イソニアジド代謝産物パターンは、いくらかは用量依存性であるが、１日目（０〜７時間）の全ての尿スペクトルを、用量レベルに関係なしに一定のピーク高さ比率基準に基いて、１型または２型パターンのいずれかを有するものとして割り振ることができる（表２．１参照）。注目すべきことに、高用量レベルにおいて、Ｎ−アセチルの２型パターンを示す動物のみが、腎機能障害（尿中グルコースおよび／またはラクテートの増加により示される）、痙攣および死を含む特定の毒性応答を示すことが観察された（表２．１参照）。
【０１７８】
【表１２】
2005534899.tif 000013
【０１７９】
【表１３】
2005534899.tif 000014
【０１８０】
Ｎ−アセチルパターン型の決定基準：
低用量：１型：ｃ／ｂ≧２.２；ｃ／ａ≧１３.３
２型：ｃ／ｂ≦１.４；ｃ／ａ≦５.９
高用量：１型：ｃ／ｂ≧１.４；ｃ／ａ≧７.３
２型：ｃ／ｂ≦０.４；ｃ／ａ≦１.５
両用量において：１型：ｃ／ａ≧７.３            ２型：ｃ／ａ≦５.９
１型：ｃ／ｂ≧１.４            ２型：ｃ／ｂ≦１.４
【０１８１】
表２．１．第３部．腎機能障害は、２００ｍｇ／ｋｇ用量では検出されなかったが、４００ｍｇ／ｋｇ用量では数匹の動物が腎機能の障害を示した。更に、４００ｍｇ／ｋｇ用量では、観察されたアセチルパターン型と、腎機能障害が存在したかどうか、との間に相関がある。２型動物のみが、グルコースおよびラクテートの尿中レベルの増加により示される腎機能障害を示した。２型アセチルパターンを生じる動物である動物２０６は、尿中ラクテートに関していくらか異常な挙動を示した。しかしながら、この動物は、アセチルピーク高さの比率により定義される２型領域の最極端にあったことは、注目すべきである。
【０１８２】
【表１４】
2005534899.tif 000015
【０１８３】
【表１５】
2005534899.tif 000016
【０１８４】
表２．１は、Ｎ−アセチルパターンに反映される代謝の差異が、イソニアジド毒性に対して重大な影響を有することを示唆する。重大な代謝段階は、１）Ｎ−アセチル化によってＮ−アセチルイソニアジドになるか、または２）イソニアジドのアミド基の加水分解によってヒドラジンおよびイソニコチン酸になるか、のいずれかを行なうイソニアジドの最初の変換であると推測される（図２−３参照）。
【０１８５】
本発明者らは、観察された痙攣の原因はヒドラジンであると推測し、この研究において毒性応答を示す動物は、特定のＮ−アセチレーター表現型を有していたと仮定した。即ち、これらは比較的遅いＮ−アセチレーターであり、従って、おそらくは比較的速いＮ−アセチレーターであった他の高用量投与動物に比べて、イソニアジド４００ｍｇ／ｋｇ用量からより多くの毒性ヒドラジンを生産したと仮定した。この研究で観察されたイソニアジド（４００ｍｇ／ｋｇ）の変動的な影響を構成する因子の性質を確かめるために、ピーク「ａ」、「ｂ」を生じる化合物「Ａ」および「Ｂ」を同定しなければならない。化合物「Ｃ」はすでにＮ−アセチルイソニアジドであることが分かっている。
【０１８６】
この実施例は、周知のとおり、投与物質の代謝産物パターンが、異なる代謝表現型の識別に使用できることを示す。またこの実施例は、ＰＲ方法論の使用によって、これらの代謝産物パターンを取り出せることを示す。またこの実施例は、特定の物質の投与に対する個々の応答を決定するのに、代謝表現型が極めて重要であることを示す。次の実施例において、本発明によって、投与後の代謝挙動の変動を、投与前の生化学的サンプル中の変動に相関付けることができ、これによって予測モデルが提供される。
【０１８７】
実施例３
後からイソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与されたオスSprague−Dawleyラットの尿中イソニアジド代謝産物量の投与前予測。投与前から投与後の数的予測が得られることを示す実施例
７５匹の若年齢に対応するオスSprague-Dawleyラットを、Charles River、フランス、から入手した。これらが健康な状態を示していることを確認するためにスクリーニングした後に、これらを１０１〜１７５の番号を付けて、水、および標準的食餌（Usine d'Alimentation Rationnelle, Villemoisson-sur-Orge, フランス、製の食餌ＡＯ４Ｃ）を自由に摂取できるようにして、個々の代謝ケージ中に入れた。研究室の温度を２０±２℃に、そして相対湿度を６０±２０％に維持した。研究室の空気を、１時間に１４回フィルターを通して交換した。一定の「１２時間明−１２時間暗」サイクルに置いた。ラットが約６週齢で体重約２００ｇとなったときに、短期間、ケージに「順応」させてから研究を開始した。成長中のラットがそれぞれ体重約２５０ｇとなったときに、投与を行った。イソニアジド（Sigma、フランス、社製）を生理食塩水に溶解して、腹腔内注射により各ラットに２００ｍｇ／ｋｇで投与した。
【０１８８】
個々の投与前（投与前４８〜４１時間）および投与後（投与後０〜７時間）の尿サンプルを、抗菌保存剤としてアジ化ナトリウム（１０％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム水溶液０．１ｍｌ）を含む氷冷容器に採取した。各採取の前に尿採取装置を消毒して、細菌、食物および糞による汚染を最小限に抑えた。各尿サンプルの最終容量は、アジド溶液についての補正を行わずに決定した。
【０１８９】
尿４００μｌを、リン酸緩衝液（０．２ＭＮａ2ＨＰＯ4と０．２ＭＮａＨ2ＰＯ4との８１： １９（ｖ／ｖ）混合物；ｐＨ７．４）２００μｌと混合して尿サンプルをＮＭＲ分析用に調製し；不十分量の尿を利用する場合は、不足分を純水で補って最小で２００μｌとした尿を用いた。尿−緩衝剤混合物を室温で１０分間静置して緩衝化して、次いで１３,０００ｒｐｍで更に１０分間遠心分離して、懸濁した粒子を除去した。「透明な」緩衝化尿５００μｌをＮＭＲ管に移して、ＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液５０μｌを加えた。ＴＳＰ（ナトリウム３−トリメチルシリル−［２，２，３，３−2Ｈ4］−１−プロピオネート）は、ＮＭＲ実験で用いられる化学シフト標準化合物（δ０）であり、Ｄ2Ｏは、ＮＭＲスペクトロメータのために磁場／周波数ロックを与えた。ＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液の濃度は、ＮＭＲ管中でＴＳＰ終濃度０．１ｍＭとなるようにした。
【０１９０】
水シグナルの大きさを減少するために用いられるNOESYPRESATパルスシーケンス（Clari
dge、１９９９）を用いて、Bruker ６００ MHz NMRスペクトロメータにより、３０℃で、調製した尿サンプルのＮＭＲ分析を行った。Bruker DRXスペクトロメータを投与後ＮＭＲデータの収集に使用し、これに対してBruker AMXスペクトロメータを投与前ＮＭＲデータの収集に使用した。主要収集パラメータは次のとおり：
スペクトロメータ周波数：６００ＭＨｚ
スペクトル幅：約７２００Ｈｚ（１２ｐｐｍ）
Brukerパルスプログラム：noesypr１d
タイムドメインにおけるデータポイント数：６５５３６
スキャン数：３２（投与後スペクトル）；６４（投与前スペクトル）
ダミースキャン数：４
収集時間：約４．５５秒
前飽和時間：３秒
混合時間：０．１秒
【０１９１】
収集後、ＮＭＲスペクトルを、自由誘導減衰シグナルに適用した指数乗法により、０．３Ｈｚの線の広がりの適用に従い、３２７６８データポイントへとフーリエ変換した。スペクトルをフェーズして、ＮＭＲシグナル周りに一様なベースラインを得て、ＴＳＰピークに値δ０を割り与えることにより化学シフトスケールを設定した。投与後ＮＭＲスペクトルのそれぞれを紙上にプロットし、ローカライズされたベースラインの修正後に、選択されたピーク上で手動でピーク高さを測定した。高さを測定したピークは、δ５．４のアラントインピーク、実施例２においてそれぞれピーク「ａ」、「ｂ」および「ｃ」として知られる約δ２．２２、δ２．２０およびδ２．１５の３つのピーク、およびδ０のＴＳＰピークであった。多変量統計分析を導くデータ整理の前に、各デジタルスペクトルのベースラインを、直線ベースライン修正アルゴリズムを用いて、０強度に移した。上述のスペクトル処理およびプロッティング操作は、「xwinnmr」ソフトウェア（Bruker GmBH）を使用して、Silicon Graphicsコンピューターにより行った。
【０１９２】
データ整理後、Infometrix社製「Pirouette」ソフトウェアを用いて、投与後ＮＭＲスペクトルの「Ｎ−アセチル」領域（δ２．３〜δ２．１）のＰＣＡを行った。しかしながら、実施例２の結果とは対照的に、データセットに広範囲のパターンが存在するにもかかわらず、１型および２型スペクトルの明確なグループ分けは観察されなかった。実際は、分布内の適当な自然の境界を同定することはできず、個々の投与後スペクトルは、特定のクラスの構成員よりもむしろ、数的測度によって、良好に説明された。これは従って、次の投与前から投与後の相関分析が、クラス予測よりもむしろ数的予測に対して良好に基づくことを意味した。
【０１９３】
尿中代謝産物排泄の有用な測定を行うに関してある種の問題が存在し、従って、投与後サンプルの種々のＮ−アセチル化体の排泄を定量するために２種の異なる手法を用いた。第１の手法は、内因性尿成分、アラントインに関して、代謝産物Ａ、ＢおよびＣ（実施例２と同様に示す）の排泄を定量することであった。従って、各ＮＭＲスペクトルのピークａ、ｂおよびｃの強度を、δ５．４のアラントインピークに対するピーク高さの比率として記載した。δ４．０５のクレアチニンメチレンシグナルもまた目的のために用いることができたが、アラントインピークは、高都合の内部基準点であった。第２の手法は、ＴＳＰシグナルの大きさを基準とすることによって、成分Ａ、ＢおよびＣの単独の排泄の測定を行うことであり、該ＴＳＰシグナルを既知の一定量において各ＮＭＲサンプルに加え、各ラットが生産する尿の量を考慮に入れた。従って、例えば異なる動物による化合物Ｃの単独の排泄の相対的測度は、式（ピーク「ｃ」の高さ／ＴＳＰピークの高さ）＊（採取された尿の容量）を用いて得られた。動物１３８（その尿は全く利用できず、ＮＭＲサンプルを調製しなかった）を除く、全ての投与後ＮＭＲサンプルを、尿４００μＬを用いて一定の様式で調製したため、この測定は妥当であるということを本明細書に言及しておくこ
とが重要である。ピーク高さをミリメートルで測定し、尿容量をミリリットルで測定した。この第２の手法の制限は、設定時間内にわたって動物から採取された尿が、その時間内に膀胱を通過したものを表すとは限らないということであり、採取された尿が非常に少量である場合、このような排泄の「誤差」が特に起こり易いということは、経験的に示されている。定量する第１の手法の制限は、これまでの例により有用な基準点であり得ることが示されているにもかかわらず、内部標準化合物、この場合はアラントイン、の排泄は不変とは限らないということである。
【０１９４】
各投与前ＮＭＲスペクトルは、ＡＭＩＸプログラム（Bruker GmBH）を用いて一定の様式で「データ整理」した。特定のスペクトル領域（例えば、ＴＳＰおよび残留水シグナルを含む領域）を切り捨てて、各スペクトルの残りの部分を連続的な０．０４ｐｐｍ幅のセグメントに分割して、各セグメントについての積分を得た。次いで、データ整理されたスペクトルを標準化して、各「スペクトル」について等しい総強度を得た。次いで、Ｎ−アセチル化された種々の代謝産物「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」の投与後の排泄を予測可能にする投与前特徴を見つけるために、ＰＬＳ分析を行った。これらのＰＬＳ分析は、Umetrics社製のSIMCAソフトウェアを用いて行った。
【０１９５】
特定の動物について、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）投与後０〜７時間に採取された尿サンプルのＮＭＲスペクトルにおいて、δ５．４のアラントインピークの高さと相対的なピーク「ａ」および「ｂ」の高さを、投与前データから驚くほど良好に予測できることが分かった（ピーク「ａ」に関する図３−１および３−２参照）。ピーク「ａ」の場合を考えると、アラントインに対するそのピーク高さの比率は、ＮＭＲサンプルにおける（化合物Ａの量／アラントインの量）の比率の相対的測度を与える。１日目の尿採取期間の７時間にわたるアラントイン排泄が、この研究中の全ラットについて一定であると仮定する場合、比率(ピーク「ａ」の高さ／アラントインピークの高さ)は、該期間中に種々のラットにより排泄された化合物Ａの量の相対的測度を与える。従って、これらの結果は、適当なモデルを用いて、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）投与後に排泄される化合物ＡおよびＢの量を、数匹のラットについて投与前データから予測できることを示す。
【０１９６】
また、１日目の０〜７時間の採取期間中に３ｍＬを超える尿を生産した大部分の動物について、量（ピーク「ｃ」の高さ／ＴＳＰピークの高さ）＊（採取された尿の容量）は、投与前データから予測できることが分かった（図３−３参照）。ＮＭＲサンプルおよび対応するスペクトルを全て正確に同じ方法で調整し、得たとすると、この量は各ラットにより排泄される化合物Ｃの量の相対的測度である。従って、適当なモデルを用いて、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）投与後に排泄された化合物Ｃの量を、投与前データから推測することが可能である。
【０１９７】
図３−１は、オスSprague−Dawleyラットにイソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与後０〜７時間に採取された尿サンプルのＮＭＲスペクトルにおいて、（ピーク「ａ」の高さ／アラントインピークの高さ）の値を、投与前尿ＮＭＲスペクトロスコピー・データから推測するＰＬＳモデルのための、モデル構築データおよびバリデーションデータを示す。このデータポイントは、モデル構築データについては白抜きの三角、およびバリデーションデータについては黒色の三角を用いて示され、コード化される。白抜きの三角は、予測ＰＬＳモデルの構築にそのデータが用いられたラットについての観察結果および予測結果を示す。黒色の三角は、そのデータがモデル構築過程から除外された１１匹のラット（番号１１０、１１１、１２２、１２５、１２８、１３５、１４０、１４４、１４７、１６７および１７２）についての観察結果および予測結果を示す。この図の外観検査は、妥当なモデルが得られたこと、および投与前データの分析から、アラントインレベルに対するピーク「ａ」の排泄レベルを予測することが可能であることを示す。
【０１９８】
図３−１のＰＬＳ分析に関する回帰係数は、分析に用いた変量のそれぞれについて、図３−２に示される。上述のように、これらの変量は、投与前スペクトルの連続的セグメントの積分に由来した。ＰＬＳ分析に用いられる種々の変量は、図３−２において、関連する０．０４ｐｐｍ幅のスペクトルセグメントの中心における化学シフトに従って同定される。スペクトルセグメントについての回帰係数の大きさが、プラスであれマイナスであれ大きいほど、このセグメントの予測的寄与は大きくなり、例えば、δ３．４２を中心とする投与前スペクトルセグメントは、投与後のＡの濃度と、マイナス方向に相関する。
【０１９９】
図３−３は、イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）投与後のSprague−Dawleyラットによる化合物Ｃの排泄を、投与前尿ＮＭＲスペクトロスコピー・データから推測するＰＬＳモデルのための、モデル構築データおよびバリデーションデータを示す。図３−３のデータポイントは、モデル構築データについては白抜きの三角、およびバリデーションデータについては黒色の三角を用いて示され、コード化される。白抜きの三角は、該モデルの構築にそのデータが用いられた種々のラットについての観察値、および予測値を示す。黒色の三角は、そのデータがモデル構築過程から除外された８匹のラット（番号１０５、１０８、１１５、１１６、１２１、１４２、１５７および１６３）についての観察結果、および予測結果を示す。各動物により排泄された代謝産物Ｃの相対量は、（ピーク「ｃ」の高さ／ＴＳＰピークの高さ）＊（生産された尿の容量）として測定した。この図の外観検査は、妥当なモデルが得られたことを示す。
【０２００】
データの更なる分析において、異なった手法を用いて、イソニアジド投与後に排泄された化合物Ａ、ＢおよびＣを軽量した。この手法において、３つのピーク「ａ」、「ｂ」および「ｃ」を含むδ２．２４〜δ２．１２の領域を全体として第１積分を行った。次いで、領域δ２．２４〜２．１７（ピーク「ａ」および「ｂ」を含む）およびδ２．１７〜２．１２（ピーク「ｃ」を含む）についての別々の積分を、「フラクションＡ＋Ｂ」および「フラクションＣ」を与えるδ２．２４〜２．１２の総積分のフラクションとして得た。次いで、比率［フラクションＣ／（フラクションＡ＋Ｂ）］を、後者２つの量から計算した。この手法についての理論的説明は、表現型識別を提供する個々の比率（量Ｃ／量Ａ）および（量Ｃ／量Ｂ）が、単一の比率［フラクションＣ／（フラクションＡ＋Ｂ）］により有効に置換され得るということが認識されてはいるが、この積分が、ピーク高さ測定から得られるよりも良好に、相対量の見積りを提供するということである。フラクションＡ＋ＢまたはフラクションＣのいずれかが分かっている場合、比率［量Ｃ／（量Ａ＋量Ｂ）］を計算できる。従って、Umetrics社製のSIMCAソフトウェアを用いて、本発明者らは、投与前データからフラクションＡ＋Ｂ、フラクションＣおよび［フラクションＣ／（フラクションＡ＋Ｂ）］を予測するためのＰＬＳモデルの構築を試みた。これによって、［フラクションＣ／（フラクションＡ＋Ｂ）］の良好な予測をもたらす３つの可能な方法が提供された。
【０２０１】
（特定のスペクトルを除外した後の）スペクトルの一定総領域に標準化された投与前ＮＭＲデータを用いて、投与前データからフラクションＡ＋Ｂ、フラクションＣおよび比率［フラクションＣ／（フラクションＡ＋Ｂ）］の３つの量のそれぞれを個々に予測することに成功したＰＬＳモデルが得られたことが分かった。
【０２０２】
図３−４は、オスSprague−Dawleyラットにイソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与後０〜７時間に採取された尿中の［フラクションＣ／（フラクションＡ＋Ｂ）］についての、投与前予測値に対する観測値のプロットを示す。示された結果は、モデリング・データのみに関する。このプロットは、投与前および投与後データ間の相関が検出できることを示す。
【０２０３】
図３−５は、投与前データと投与後の［フラクションＣ／（フラクションＡ＋Ｂ）］の
値との間に観察された相関が無作為ではないことを証明する内部モデルバリデーション分析の結果を示す。
【０２０４】
図３−６は、外部から生成した試験セットについての［（フラクションＣ）／（フラクションＡ＋Ｂ）］の予測を示す。この場合、本発明のイソニアジド研究データを用いて構成された、投与前から投与後を予測するモデルは、実施例２に記載したイソニアジド研究からの９匹の低用量投与動物についての結果の、投与前から投与後を予測する試みにおいて用いられた。予測セット（黒丸）は、６匹の２型動物および３匹の１型動物から構成され、この結果、［フラクションＣ／（フラクションＡ＋Ｂ）］は２型試験動物について良好に予測できたが、１型試験動物についてはあまりよくは予測できなかった（RMSEE＝０．１５２４；RMSEP（１型および２型）＝０．４４１６；RMSEP（２型）＝０．２３２５）。しかしながら、モデリング・データ（白丸）の試験は、これが殆ど完全に２型動物から構成されたことを示し、これは、なぜ２型試験データが１型よりも良好に予測され得るかについての適当な説明を与える。しかしながら、このモデルが、別の研究において得られる試験データについて有用な予測を提供するのに十分に正確であったことについて言及しておくことが重要である。
【０２０５】
更なる研究によって、実施例２に見られるように、イソニアジド（４００ｍｇ／ｋｇ）によって誘導される毒性に対して、感受性であるかまたは非感受性であるかを投与前に予測できることが証明される。しかしながら、ここで得られた重大な結果は、特定の代謝表現型によって決定される投与後の結果を、投与前の生体液のＮＭＲスペクトルから予測できるということである。
【０２０６】
実施例４
後からパラセタモール（６００ｍｇ／ｋｇ）を投与されたオスSprague−Dawleyラットにおける、尿中パラセタモール代謝産物量の投与前予測。投与前から投与後の数的予測が得られることを示す実施例
年齢および体重が一致する７５匹のオスSprague-Dawleyラットを入手した。投与３日前で、ラットの平均体重は２６０．２ｇ（標準偏差：１２．６ｇ）であり、投与の時点でラットは約７週齢であった。これらを、水および標準的なげっ歯類用食餌を自由に摂取できるようにして、温度、湿度、および明／暗条件を制御した研究室内の個々のケージに入れた。ケージに順応させた後に研究を開始した。メチルセルロース（０．５％ｗ／ｖ）およびＴｗｅｅｎ８０（０．１％ｗ／ｖ）を含む水溶液中のパラセタモール（６００ｍｇ／ｋｇ）をラット６５匹に経口で投与した。ラット１０匹を対照セットとして用いて、ビヒクルのみを経口で投与した。各ラットから、個々の投与前後２４時間の尿サンプルを、保存剤としてアジ化ナトリウム溶液を一定量含む氷冷容器に採取した。投与前尿サンプルは、投与前４８〜２４時間に採取した。投与後尿サンプルは、投与後０〜２４時間に採取した。各尿サンプルの最終容量は、アジド溶液についての補正を行わずに決定した。一定量の尿、ｐＨ緩衝液およびＴＳＰ／Ｄ2Ｏ溶液を用いて、標準の手順に従って、全ての尿サンプルをＮＭＲ分析用に調整した。Bruker社製「xwinnmr」および「iconnmr」ソフトウェアを用いて、フロープローブを備えたBrukerＮＭＲスペクトロメータにより、６００ＭＨｚで1ＨＮＭＲスペクトルを得た。「noesypr１d」プログラムを用いて水抑制を行った。パラセタモールを投与したラットの投与後スペクトルは、特別なＮ−アセチルシグナルを示し、これは分解能を高めた後に、約２．１８、２．１６５、２．１５５および２．１５ｐｐｍに位置することが分かった。これらのシグナルは、最初に、それぞれパラセタモールスルフェート（ここでは「Ｓ」と示される）、パラセタモールグルクロニド（ここでは「Ｇ」と示される）、パラセタモールに由来するメルカプツール酸（ここでは「ＭＡ」と示される）、およびパラセタモールそれ自体（ここでは「Ｐ」と示される）によるものとして割り当てた。パラセタモールのメルカプツール酸（ＭＡ）は、時としてパラセタモールのＮ−アセチルシステイン抱合体と呼ぶこともある。パラセタモールグルクロニドおよびパラセタモールによるスパイクによって、これらのピーク割り当てが確認され、ＭＡアセチルの割り当ては、１．８６ｐｐｍにおける類似した大きさのピークから確認された。文献（Balesら（1984） Urinary excretion of acetaminophen and its metabolites as studied by proton NMR spectroscopy, Clin. Chem., 30, 10, 1631-1636）の言及は、パラセタモールのシステイン抱合体のＮ−アセチルピークがパラセタモールのＮ−アセチルピークに重なるかもしれないことを示唆しているが、実際は、システイン抱合体のＮ−アセチルピークは、メルカプツール酸からの等価のＮ−アセチルピークに重なるようである。これは、ＭＡおよびＰの両方の定量について幾らか疑いを残し、これからは、ＭＡおよびＰについてのモデルおよびデータについて言及する場合、測定された量は、システイン抱合体からの寄与を含み得ることを考慮にいれておくべきである。投与後の対照サンプルのスペクトルにおいては、有意の干渉は存在しなかった。パラセタモール自体を含む、種々のパラセタモール関連尿中代謝産物の定量は、他のシグナルもまた使用できたかも��れないが、化学範囲２．２２〜２．１１ｐｐｍ中の関連するアセチルシグナルを基準とすることによって行われた。約２．２２〜２．１１ｐｐｍのＮ−アセチルシグナルの完全なクラスターを、投与後スペクトル中の、ＴＳＰシグナルに対して第１積分を行って、各ＮＭＲサンプル中のＮ−アセチル化体の総量の測度を得た。次いで、投与後０〜２４時間中に各ラットによるＮ−アセチル化体の総排泄の相対的測度を、（総Ｎ−アセチル積分／ＴＳＰ積分）＊採取した尿の容量（ミリリットル）として計算した。続けて、各投与後スペクトルを、ガウスの乗法（ｌｂ−１、ｇｂ０．５）を用いて分解能強化を行い、Ｓ、Ｇ、ＭＡおよびＰの４成分からのシグナルを互いに対して積分した。これらの値を合計して、次いで各成分の量を全体のフラクションとして計算した。Ｎ−アセチルクラスターの他の成分は比較的重要ではないため、各動物の総アセチル排泄量の値との、Ｓ、Ｇ、ＭＡおよびＰのこれらのフラクション値の組合せから、該動物により排泄された各成分の量の見積もりを得た。Ｓ／Ｇ比を計算した。投与前スペクトルを２種の異なる方法で標準化した。第１の手法において、９．５〜０．５ｐｐｍの総スペクトル積分を、水抑制手順による影響を受ける、残留水シグナルおよび尿からのシグナルを含む６．３〜４．０ｐｐｍ領域を除外後に、一定総領域に調整した。第２の手法において、投与前スペクトルを、各ＮＭＲサンプルに一定量で添加されたＴＳＰに対して標準化した。続けて、ＴＳＰ−標準化された投与前スペクトルのそれぞれを、投与前採取中に採取された尿の相対量（ミリリットル）により増加させた。従って、この第２の手法において、投与前尿中代謝産物のそれぞれの、２４時間排泄の相対的測度が得られた。ケモメトリクス分析を行う前に、ＴＳＰシグナルを除外した。
【０２０７】
投与前から投与後を予測するためのＰＬＳモデルを、Umetrics社製のSIMCAソフトウェアを用いて構築した。
【０２０８】
図４−１は、パラセタモール（６００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットが０〜２４時間に排泄した全てのＮ−アセチル化化合物についてのＰＬＳ予測値に対する、観測値のプロットを示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものであり、このパラメータの第１モデルに関する。このプロットは、投与前および投与後データ間の明らかな相関を示す。該モデルについてのRMSEE値は、７．９８である。
【０２０９】
図４−２は、パラセタモール（６００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットが０〜２４時間に排泄したＭＡについてのＰＬＳ予測値に対する、観測値のプロットを示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものであり、このパラメータの第１モデルに関する。このプロットは、投与前および投与後データ間の明らかな相関を示す。該モデルについてのRMSEE値は、１．２８である。
【０２１０】
図４−３は、パラセタモール（６００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットが０〜２４時間に排泄した全てのＮ−アセチル化化合物についてのＰＬＳ予測値に対する、観測値のプロッ
トを示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものであり、このパラメータの第２モデルに関する。このプロットは、投与前および投与後データ間の明らかな相関を示す。該モデルについてのRMSEE値は、１２．９９である。
【０２１１】
図４−４は、図４−３に示される投与前予測を生成したモデルの良好な内部バリデーションを示す。このプロットは、図４−３により示される投与前および投与後のデータ間の相関が無作為ではないことを証明する。また、該モデルの外部バリデーションも良好であり、RMSEP値１２．８９を与え、これは該モデルのRMSEE値１２．９９と比較可能であった。
【０２１２】
図４−５は、パラセタモール（６００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットが０〜２４時間に排泄したパラセタモールグルクロニド（「Ｇ」）についてのＰＬＳ予測値に対する、観測値のプロットを示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものである。このプロットは、投与前および投与後データ間の明らかな相関を示す。該モデルについてのRMSEE値は、６．９９である。
【０２１３】
図４−６は、図４−５に示される投与前予測を生成したモデルの良好な内部バリデーションを示す。このプロットは、図４−５により示される投与前および投与後のデータ間の相関が無作為ではないことを証明する。また、該モデルの外部バリデーションも良好であり、RMSEP値７．２７を与え、これは該モデルのRMSEE値６．９９と比較可能であった。
【０２１４】
図４−７は、パラセタモール（６００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットが０〜２４時間に排泄した「ＭＡ」についてのＰＬＳ予測値に対する、観測値のプロットを示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものであり、このパラメータの第２モデルに関する。このプロットは、投与前および投与後データ間の明らかな相関を示す。該モデルについてのRMSEE値は、１．９０である。
【０２１５】
図４−８は、図４−７に示される投与前予測を生成したモデルの良好な内部バリデーションを示す。このプロットは、図４−７により示される投与前および投与後のデータ間の相関が無作為ではないことを証明する。また、該モデルの外部バリデーションも良好であり、RMSEP値１．３２を与え、これは該モデルのRMSEE値１．９０と比較可能であった。外部バリデーションは、図４−９に示され、ここで、白丸はモデル構築データであり、黒丸はモデル構築試験に用いられなかった試験データである。
【０２１６】
図４−１０は、パラセタモール（６００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットが排泄した「Ｐ」についてのＰＬＳ予測値に対する、観測値のプロットを示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものである。このプロットは、投与前および投与後データ間に相関があることを示す。該モデルについてのRMSEE値は、３．５１である。
【０２１７】
図４−１１は、図４−１０に示される投与前予測を生成したモデルの内部バリデーションを示す。このプロットは、図４−１０により示される投与前および投与後のデータ間の相関が無作為ではないことを証明する。また、該モデルの外部バリデーションも良好であり、RMSEP値３．３０を与え、これは該モデルのRMSEE値３．５１と比較可能であった。
【０２１８】
投与後に排泄される「Ｓ」の量の直接投与前予測は行わなかった。しかしながら、Ｎ−アセチル化体の総排泄についての予測から、排泄された「Ｇ」、「Ｐ」および「ＭＡ」の量の予測を引くことにより、投与後２４時間に各ラットが排泄した「Ｓ」の量の投与前予測を生み出すことができた。「Ｓ」についての該予測を「Ｇ」についての適当な予測と組合わせることによって、各ラットの投与後Ｇ／Ｓ比についての投与前予測を得ることができた。図４−１２は、排泄された「Ｓ」の量についての予測値に対する観測値を示す。図
４−１３は、Ｇ／Ｓ比についての予測値に対する観測値を示す。
【０２１９】
この研究の結果は、この新しい方法論が単に、アセチレーター表現型によって決定される応答の予測に制限されないことを示す。ここで与えられる結果は、グルクロン酸化およびメルカプツール酸形成、およびパラセタモール投与に際して起こるものの、量および相対的程度に関して、投与前予測を行うことができることを示す。尿中に排泄されるパラセタモールスルフェートの量の予測を行うのはあまり容易ではなかったが、得られた結果は、「差によって」予測可能であり得ることを示唆していた。パラセタモールに由来するメルカプツール酸（ＭＡ）は、毒性を有する反応性中間体のグルタチオンとの共役に起因すると考えられるために、毒物学的重要性を有する。グルクロン酸化、硫酸化、およびグルタチオン抱合体は、第２相代謝の最も有用な変換の３つであり、それぞれ、種々の外生的物質に関して主要な防御的役割を有する。従って、本データは、被検体に特異的な投与前予測が、多数の外生的化合物の代謝および毒性に関して成され得ることを示す。示された実施例を考えると、投与前の尿中ディスクリミネータが代謝表現型の多種多様な他の態様について存在すること、即ち、代謝表現型の多種多様な態様について、および１またはそれ以上のこれらの態様によって決定される投与応答について、投与前予測モデルを構築できることを、を信じるためのあらゆる理由が存在する。
【０２２０】
実施例５
後からパラセタモール（１０００ｍｇ）を投与されたヒト男性における、尿中パラセタモール代謝産物量の投与前予測。投与前から投与後の数的予測を行なうことがヒトにおいて可能であることを示す実施例
倫理的に認められた臨床試験のために、９９人の成人ヒト男性を募った。一定期間魚を食べない、およびアルコールを飲まないといった幾らかの食餌制限を規定した。研究に適格であるためには、被験体は、研究に先立っての一定期間パラセタモールまたは他の薬剤を摂取していないことが必要であった。各被験体の体重および身長を記録した。研究の日に、第１に、「スナップショット」流れの中間（mid-stream）の投与前尿サンプルを各被験体に提供してもらった。次に、各被験体は、一定量の水と一緒にパラセタモールＢＰの錠剤２×５００ｍｇを摂取した。投与後に、各被験体は、連続する２つの期間、即ち投与から０〜３時間および３〜６時間にわたって、その生成した全ての尿を提供することが要求された。これらの期間の各終了時に、各被験体は、可能な限り完全にその膀胱を空にすることが要求され、各被験体が各投与後期間中に生成した尿の質量を記録した。全尿サンプルを、標準の手順に従ってＮＭＲ分析用に調製し、これには尿４４０マイクロリットルを使用した。Brukerの「xwinnmr」および「iconnmr」ソフトウェアを用いて、BrukerＮＭＲスペクトロメータにより６００ＭＨｚで1ＨＮＭＲスペクトルを得た。「noesypr１d」プログラムを用いて水抑制を行った。「投与後スペクトルにおいて、２．２１０〜２．１３５ｐｐｍのＮ−アセチルシグナルをＴＳＰに対して第１積分して、各被験体による各期間中のＮ−アセチル化体の総排泄の測度を、（アセチル積分／ＴＳＰ積分）＊採取された尿の質量（ｇ）として決定した。この式は、尿サンプルの濃度がほぼ一定であるという仮定に基づく。検査として、多数の代表的サンプルのサンプル濃度を測定し、１．００〜１．０４ｇ／ｍｌの範囲にあることが分かり、即ちほぼ一定の濃度であるという仮定は妥当であった。続けて、投与後スペクトルを、ＦＩＤ（ｌｂ−１、ｇｂ０．５）のガウスの乗法を用いて分解能強化した。次いで可能ならば、パラセタモールスルフェート（Ｓ）、パラセタモールグルクロニド（Ｇ）および未変化のパラセタモール（Ｐ）を、２．２１０〜２．１３５ｐｐｍの総積分のフラクションとして直接測定した。３〜６時間の採取中に排泄された未変化のパラセタモール（Ｐ）の量の正確な測度を得ることはできず、このデータは使用しなかった。一般に、パラセタモールメルカプツール酸（ＭＡ）のレベルは、正確な測定を可能にするほどには十分な高さではなかった。特定の採取期間中に各被験体により排泄された個々のパラセタモール代謝産物（Ｓ、ＧおよびＰ）の量は、該被験体についてのＮ−アセチル化体の総排泄、および２．２１０〜２．１３５ｐｐｍの関連するフラクションの積分により（予め計算された）期間を掛け合わせることにより計算した。適当ならば、２つの採取についてのデータを合計して、投与後０〜６時間の全体の期間についてのデータを得た。任意特定の被験体が需要したパラセタモールの有効量はその体重に依存したため、Ｎ−アセチル、Ｓ、ＧおよびＰについての排泄結果を体重のデータと組合わせて、体重１ｋｇあたりの排泄を得た。ラットにおけるパラセタモール研究と同様に、パラセタモールのシステイン抱合体が未変化のパラセタモールの定量に影響を与えている可能性があることは、注目すべき���とである。投与前スペクトルを２種の異なる方法で（特定の領域を除外した後の、全スペクトル領域に対して、および一定クレアチニンに対して）標準化し、投与前から投与後を予測するＰＬＳモデルを、Umetrics社製のSIMCAソフトウェアを用いて構築した。
【０２２１】
図５−１は、パラセタモール（１０００ｍｇ）を摂取した男性ボランティアについての、体重１ｋｇあたりのＮ−アセチル化化合物の総排泄（０〜３時間の採取）のＰＬＳ予測値に対する観測値を示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものである。このプロットは、投与前および投与後データ間に明らかな相関が見られたことを示す。該モデルについてのRMSEE値は、１．１２であった。
【０２２２】
図５−２は、図５−１の基礎となるモデルに関して分析された外部試験セットについて、体重１ｋｇあたりのＮ−アセチル化化合物の総排泄（０〜３時間の採取）のＰＬＳ予測値に対する観測値を示す。RMSEP値は０．８０であり、これは該モデルのRMSEE値１．１２と好ましく比較される。
【０２２３】
図５−３は、パラセタモール（１０００ｍｇ）を摂取した男性ボランティアについての、体重１ｋｇあたりのパラセタモールグルクロニド（「Ｇ」）の排泄（０〜３時間の採取）のＰＬＳ予測値に対する観測値を示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものである。このプロットは、投与前および投与後データ間に相関が見られたことを示す。該モデルについてのRMSEE値は、０．８４であった。
【０２２４】
図５−４は、図５−３の基礎となるモデルに関して分析された外部試験セットについて、体重１ｋｇあたりの「Ｇ」の排泄（０〜３時間の採取）のＰＬＳ予測値に対する観測値を示す。RMSEP値は０．７０であり、これは該モデルのRMSEE値０．８４と好ましく比較される。
【０２２５】
図５−５は、パラセタモール（１０００ｍｇ）を摂取した男性ボランティアについての、体重１ｋｇあたりの「Ｐ」の排泄（０〜３時間の採取）のＰＬＳ予測値に対する観測値を示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものである。このプロットは、投与前および投与後データ間に相関が見られたことを示す。該モデルについてのRMSEE値は、０．１８５であった。
【０２２６】
図５−６は、図５−５の基礎となるモデルに関して分析された外部試験セットについて、体重１ｋｇあたりの「Ｐ」の排泄（０〜３時間の採取）のＰＬＳ予測値に対する観測値を示す。RMSEP値は０．１７０であり、これは該モデルのRMSEE値０．１８５と好ましく比較される。
【０２２７】
図５−７は、パラセタモール（１０００ｍｇ）を摂取した男性ボランティアについての、体重１ｋｇあたりのＮ−アセチル化化合物の総排泄（０〜６時間の期間）のＰＬＳ予測値に対する観測値を示す。示された結果は、モデリング・データのみについてのものである。このプロットは、投与前および投与後データ間に明らかな相関が見られたことを示す。該モデルについてのRMSEE値は、１．４７であった。
【０２２８】
図５−８は、図５−７の基礎となるモデルに関して分析された外部試験セットについて、体重１ｋｇあたりのＮ−アセチル化化合物の総排泄（０〜６時間の期間）のＰＬＳ予測値に対する観測値を示す。RMSEP値は１．１３であり、これは該モデルのRMSEE値１．４７と好ましく比較される。
【０２２９】
この研究から得られた結果は、該方法論がラットからヒトへ拡張できるという原理を裏付け、該方法論は全ての動物に良好に適用できると考えられる。特に、該方法は、完全な食餌制限に付されていないヒトにおいて機能し、またこのような制限が付されたならば、より改良された結果が期待されるということは注目に値する。ここで示される結果は、サンプルおよびデータの予備的分析を示し、改良されたモデルは可能であろう。ＵＶ−可視検出を有するＨＰＬＣのような標準分析方法の投与後サンプルに関する使用が、パラセタモール代謝産物の改良された定量を与え、従ってモデル構築を容易にすることができる。特に、このような技術の使用は、ここで使用されるＮＭＲ方法と比較してＰおよびＭＡの改良された定量を可能にし得る。更に、ＰＬＳ分析を行う前に、投与前変量（この場合、これは投与前ＮＭＲスペクトルの０．０４ｐｐｍ幅セグメントである）の比率および他の組合せをとることによって、改良されたモデルを得ることができると考えられる。
【０２３０】
仮定的実施例
本発明の主要な特徴は、投与に対する応答を予測できることであり、またこれにより、適当な投与物質および治療計画、例えば薬品治療、麻酔剤等を選択できることである。このような方法は、毒性、有効性および副作用のような予め決定された基準に基づいて、適当な投与物質の同定、最大または最小用量の同定、適当な用量、適当な投与頻度、適当な投与回数の同定、および適当な徐放性製剤の選択を可能にする。これらの方法の典型的な構築は、以下の仮定的実施例に示され、これは設定時間内に特定の種類の感染症を排除するための抗菌物質の最小用量を同定することを包含する。従って、特定の感染症に罹った異なるモデル構築個体群は、異なるレベルの抗菌剤で処置される。設定時間内にいずれの被験体においても感染症を排除しなかった用量レベルに関するデータは、分析から削除される。他のデータセットのそれぞれについて、分類モデルが構築され、感染症排除基準に適合した被験体の投与前の特性、および適合しなかった被験体の投与前の特性が同定される。被験体の試験データが、該モデルのそれぞれについて分析され、その表現型の被験体において感染症を排除するのにふさわしい最小用量を見つける。必ずしもこの用量が投与されるのではなく；このような投与は、例えばその投与レベルで被験体において、容認できない副作用が予期されるかどうかによって決められる。本発明のもう１つの特徴は、目的が何であろうと、表現型として均一な被験体のセットを選択する能力である。典型的には、必要とされるのは、代謝表現型の１要素、例えばＮ−アセチレーター表現型に関して均一であった被験体の群を選択することである。この例について、Ｎ−アセチル化を調べる投与物質を用いて、モデルが構築される。次いで、課された均一性基準に従って分類モデルが構築される。Ｎ−アセチレーター表現型が分からない被験体に関する試験データを、該モデルおよびそれに応じて分類された被験体に関して調べる。１つのクラスに分類される被験体は、投与物質のＮ−アセチル化に関して表現型として均一であると考えられる。
【０２３１】
同様に、本発明は、毒性または有効性研究のような研究において得られる変動的データの有理化を可能にする。例えば、一方の群では毒性を引き起こすが、他方の群ではそうではない投与計画は、投与前表現型検査の使用によって、一方の群は速いＯ−メチレーター（O-methylator）であるのに対して、他方の群は遅いＯ−メチレーターであることが分かった場合に、有理化され得る。このような指示は、投与物質の代謝の考察をもたらし、毒性代謝産物を生じるかまたは除くかする、重大なＯ−メチル化段階の同定をもたらすであろう。
【０２３２】
本発明のもう１つの特徴は、投与前生体マーカーまたは生体マーカー組合せの同定を容易にすることであり、これは、投与前サンプルにおけるそれらの存在または濃度が、特定の代謝表現型または投与され得る物質に対する特定の応答を指示することによる。例えば、ＰＣＡにおいて、当該の異なるクラスの分離を提供するスコア・プロットは、対応するローディング・プロットと比較される。次いで、クラス分離に対するそれらの相関の識別、および陽性または陰性の性質を提供する投与前変量を同定することができる。ときに、これらの変量は、特定の化合物に直接帰因し得る。ＮＭＲスペクトロスコピー・データの場合、特定の変量または変量組合せは、識別特徴を含むスペクトル領域を示す。次いで、モデル構築スペクトルのこれらの領域の試験によって、化合物（または「生体マーカー」）の識別は、原則的には同定できる。
【０２３３】
ときに、被験体のより幅広い群を代表するために多数の被験体からのサンプルをとることが必要である。例えば、通常は、１つの植物の場からは２、３の植物をサンプリングできるのみである。次いで、選択された植物の特徴の分析から、場全体から除草剤の特定の用量を選択することが望まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１−１】ガラクトサミンＨＣｌ（略称ＧａｌＮＨＣｌ）（８００ｍｇ／ｋｇ）投与後のガラクトサミンの変動尿中排泄を示す。
【図１−２】ＧａｌＮＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）投与後の、Ｎ−アセチル化体の変動尿中排泄を示す。
【図１−３】応答者においてＧａｌＮＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）によって誘導された幾つかの尿中変化を示す。
【図１−４】ガラクトサミンＨＣｌ（８００ｍｇ／ｋｇ）投与後のヒプレートおよびヒスチジンの変化した尿中排泄を示す。
【図１−５】ガラクトサミン研究からの−１日目（投与前）尿ＮＭＲスペクトルのＰＣＡからのＰＣ１対ＰＣ５のスコア・プロットを示す。
【図１−６】ガラクトサミン研究からの−１日目（投与前）尿ＮＭＲスペクトルのＰＣＡからのＰＣ１対ＰＣ５のローディング・プロットを示す。
【図２−１】イソニアジド（４００ｍｇ／ｋｇ）をオスSprague-Dawleyラットに投与した後０〜７時間に採取された尿サンプルのＮＭＲスペクトルにおいて見られる、Ｎ−アセチル化代謝産物の種々のパターン例を示す。
【図２−２】イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与された動物からの１日目（投与から０〜７時間）尿サンプルのＮＭＲスペクトルのＮ−アセチル領域(δ２．２３〜δ２．１３)のＰＣＡからの、ＰＣ１対ＰＣ２のスコア・プロットを示す。
【図２−３】イソニアジド代謝の２種の任意選択的初期経路を示す。
【図３−１】イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）投与後０〜７時間に採取された尿サンプルのＮＭＲスペクトルにおける比率（ピーク高さ「ａ」／ピーク高さアラントイン）の投与前予測を示す。
【図３−２】図３−１に記載された結果を生じさせたＰＬＳ分析に関する回帰係数を示す。
【図３−３】イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットから、投与後０〜７時間に採取された尿中に排泄された代謝産物Ｃの量の投与前予測を示す。
【図３−４】イソニアジド（２００ｍｇ／ｋｇ）を投与したラットから、投与後０〜７時間に採取された尿中の比率［（フラクションＣ）／（フラクションＡ＋Ｂ）］の投与前予測を示す。
【図３−５】図３−４に関するモデルの内部バリデーションを示す。
【図３−６】外部試験セットについての［（フラクションＣ）／（フラクションＡ＋Ｂ）］の投与前予測を示す。
【図４−１】パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間におけるＮ−アセチル化化合物（δ約２．２２〜約２．１１）の全尿中排泄の投与前予測を示す。（このパラメータについての第１モデル）。
【図４−２】パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中に排泄された「ＭＡ」量の投与前予測を示す。（このパラメータについての第１モデル）。
【図４−３】パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中のＮ−アセチル化化合物（δ約２．２２〜約２．１１）の全尿中排泄の投与前予測を示す。（このパラメータについての第２モデル）。
【図４−４】図４−３に関するモデルの内部バリデーションを示す。
【図４−５】パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中のパラセタモールグルクロニド（「Ｇ」）の尿中排泄の投与前予測を示す。
【図４−６】図４−５に関するモデルの内部バリデーションを示す。
【図４−７】パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中の「ＭＡ」の尿中排泄の投与前予測を示す。（このパラメータについての第２モデル）。
【図４−８】図４−７に関するモデルの内部バリデーションを示す。
【図４−９】図４−７に関するモデルの外部バリデーションを示す。
【図４−１０】パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中の「Ｐ」の尿中排泄の投与前予測を示す。
【図４−１１】図４−１０に関するモデルの内部バリデーションを示す。
【図４−１２】パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中に排泄された「Ｓ」の量の、投与前予測値に対する観測値を示す。
【図４−１３】パラセタモールを投与したラットについて、投与後２４時間中に得られた尿サンプルのＧ／Ｓ比の、投与前予測値に対する観測値を示す。
【図５−１】パラセタモールを投与したヒト男性について、投与後最初の３時間における体重１ｋｇあたりのＮ−アセチル化化合物（δ２．２１０〜２．１３５）の全尿中排泄の投与前予測を示す。
【図５−２】図５−１に関するモデルの外部バリデーションを示す。
【図５−３】パラセタモールを投与したヒト男性について、投与後最初の３時間において尿中に排泄された、体重１ｋｇあたりのパラセタモールグルクロニド（「Ｇ」）の量の投与前予測を示す。
【図５−４】図５−３に関するモデルの外部バリデーションを示す。
【図５−５】パラセタモールを投与したヒト男性について、投与後最初の３時間において尿中に排泄された、体重１ｋｇあたりの「Ｐ」の量の投与前予測を示す。
【図５−６】図５−５に関するモデルの外部バリデーションを示す。
【図５−７】パラセタモールを投与したヒト男性について、投与後最初の６時間における体重１ｋｇあたりのＮ−アセチル化化合物（δ２．２１０〜２．１３５）の全尿中排泄の投与前予測を示す。
【図５−８】図５−７に関するモデルの外部バリデーションを示す。
【図１−１】
2005534899.tif 000017
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図４−１０】
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【図４−１１】
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【図４−１２】
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【図４−１３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【国際調査報告】
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