(57)【要約】本発明は、ヒトゲノム中の遺伝子によりコード化されている、本発明のトランスポーターペプチドのアミノ酸配列を提供するものである。本発明は特に、単離ペプチド及び核酸分子、トランスポーターペプチドのオルトログ及びパラログの同定方法、及びトランスポーターペプチドのモジュレータの同定方法を提供するものである。
2005506032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記グループから選択されるアミノ酸配列から成る単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、又は３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項２】
下記グループから選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体のアミノ酸配列であって、該対立変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログのアミノ酸配列であって、該オルトログは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコード化されていることを特徴とするアミノ酸配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項２記載のペプチドに選択的に結合する単離抗体。
【請求項４】
下記グループから選択されるヌクレオチド配列から成る単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログをコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項５】
下記グループから選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列；
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の対立変異体をコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列；
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のオルトログをコード化するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子の対向鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオチド配列；及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列のフラグメントをコード化するヌクレオチド配列であって、該フラグメントは、少なくとも１０の隣接するアミノ酸を含むことを特徴とするヌクレオチド配列。
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列。
【請求項６】
請求項５記載の核酸分子を含む遺伝子チップ。
【請求項７】
請求項５記載の核酸分子を含むヒト以外の遺伝子組み換え動物。
【請求項８】
請求項５記載の核酸分子を含む核酸ベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する方法。
【請求項１１】
請求項２記載の何れかのペプチドを製造する方法であって、（ａ）〜（ｄ）の何れかのアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を宿主細胞内に導入し、ペプチドがヌクレオチド配列から発現される条件下で宿主細胞を培養する方法。
【請求項１２】
サンプル中における請求項２記載の何れかのペプチドの存在を検出する方法であって、サンプル中の該ペプチドの存在を特異的に検出する試薬とサンプルとを接触させ、該ペプチドの存在を検出する方法。
【請求項１３】
サンプル中における請求項５記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、ストリンジェントな条件下で該核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとサンプルとを接触させ、サンプル中の該核酸分子とオリゴヌクレオチドが結合するかどうかを判定する方法。
【請求項１４】
請求項２記載のペプチドのモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドと試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの機能又は活性を変調したかどうかを判定する方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記試薬は前記ペプチドを発現する発現ベクターを含む宿主細胞に対して与えられる方法。
【請求項１６】
請求項２に記載の何れかのペプチドに結合する試薬を同定する方法であって、ペプチドと試薬とを接触させ、接触混合物中にペプチドと試薬とが結合した複合体が形成されるかどうかをアッセイする方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法により同定された試薬と、薬学的に許容可能なそれらの担体とを含む薬剤組成物。
【請求項１８】
ヒトトランスポータータンパク質により媒介される疾患又は症状を治療する方法であって、請求項１６記載の方法で同定された試薬を薬学的に有効な量、患者に投与する方法。
【請求項１９】
請求項２に記載のペプチドの発現のモジュレータを同定する方法であって、該ペプチドを発現する細胞と試薬とを接触させ、該試薬が該ペプチドの発現を変調したかどうかを測定する方法。
【請求項２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を持つアミノ酸配列を有する単離ヒトトランスポーターペプチド。
【請求項２１】
請求項２０のペプチドにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を持つアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２２】
ヒトトランスポーターペプチドをコード化している単離核酸分子であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子と少なくとも８０％の相同性を有している核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２の核酸分子において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１又は３に示される核酸分子と少なくとも９０％の相同性を有している核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、トランスポータータンパク質の分野に属し、カリウムチャンネルサブファミリー、組み換えＤＮＡ分子、及びタンパク質生成に関連するものである。本発明は特に、リガンドの輸送に影響する新規なペプチド及びタンパク質、及びこのようなペプチド及びタンパク質分子をコード化する核酸分子を提供するものであり、これら全てはヒトの治療及び診断用の化合物、方法の開発において有用である。
【０００２】
背景技術
トランスポーター
トランスポータータンパク質は、イオンや巨大分子のような分子の細胞内部及び外部への流動を調節することによって、細胞増殖、細胞分化、信号プロセスといった多くの異なる細胞機能を調節している。トランスポーターは、真核生物のほぼ全ての細胞中の形質膜において見出される。トランスポーターは、膜電位、吸収、細胞膜を通過する分子及びイオン分泌の調節といった種々の細胞機能を媒介している。塩化物イオンチャンネルのようなトランスポーターが、ゴルジ体やエンドサイトーシス小胞の細胞内膜に存在する場合には、小器官のｐＨも調節される。Ｇｒｅｇｅｒ， Ｒ． （１９８８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５０：１１１−１２２を参照されたい。
【０００３】
トランスポーターは、一般的に構造及び作用様式のタイプによって分類される。さらに、トランスポーターは、例えば、糖トランスポーター、塩素チャンネル、カリウムチャンネル等のように、時には輸送される分子のタイプによって分類される。単一のタイプの分子を輸送するチャンネルには、多くの種類が存在し得る（チャンネルタイプの詳細については、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｓ．Ｐ．Ｈ． ａｎｄ Ｊ．Ａ． Ｐｅｔｅｒｓ： Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ． ６５−６８ （１９９７）、及び ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／￣ｍｓａｉｅｒ／ｔｒａｎｓｐｏｒｔ／ｔｉｔｌｅｐａｇｅ２．ｈｔｍｌ に述べられている）。
【０００４】
下記の一般的な分類案が、当業者において公知であり、現在の発見において準拠されている。
【０００５】
チャンネル型トランスポーター。このクラスの膜貫通チャンネルタンパク質は、細菌から高度の真核生物までの全てのタイプの生体の膜において、至る所で見出される。このタイプの輸送システムは、キャリヤー媒介機構の証拠無しに、膜貫通水性孔、又はチャンネルの通過による（エネルギー独立プロセスによる）促進拡散に触媒的作用を及ぼす。これらのチャンネルタンパク質には、βストランドも存在し得るが、通常、主にα−へリックススパンから成っており、チャンネルを含み得る。しかしながら、外膜ポーリン型チャンネルタンパク質は、このクラスからは除外され、クラス９に含まれる。
【０００６】
キャリヤー型トランスポーター。ユニポート（単一種が促進拡散により輸送される）、アンチポート（２以上の種が深く結びついたプロセスの反対方向に輸送され、化学浸透圧性エネルギー以外のエネルギーの直接形態に結びつかない）、及び／又はシンポート（２以上の種が深く結びついたプロセスの同一方向に共に輸送され、化学浸透圧性エネルギー以外のエネルギーの直接形態に結びつかない）に触媒的な作用を及ぼすキャリヤー媒介プロセスを用いる場合、輸送システムはこのクラスに含まれる。
【０００７】
ピロリン酸結合加水分解−駆動性性能動性トランスポーター。能動的な溶質の取り込み及び／又は押し出しを駆動するために、ＡＴＰにおけるピロリン酸又は末端ピロリン酸結合、あるいは他のヌクレオシド三リン酸を加水分解する場合、輸送システムはこのクラスに含まれる。この輸送タンパク質は、一時的にリン酸化されてもされなくても良いが、基質はリン酸化されない。
【０００８】
ＰＥＰ依存性、ホスホリル転移−駆動性トランスロケーター。細菌性のホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼの輸送システムはこのクラスに含まれる。この反応の生成物は、細胞外の糖に由来する、糖−リン酸塩である。
【０００９】
脱炭酸−駆動性能動性トランスポーター。細胞質基質の脱炭酸により、溶質（例えば、イオン）の取り込み又は押し出しが駆動される輸送システムは、このクラスに含まれる。
【００１０】
酸化還元−駆動性能動性トランスポーター。酸化された基質から還元された基質への電子の流れによってエネルギー化された溶質（例えば、イオン）の輸送を駆動する輸送システムは、このクラスに含まれる。
【００１１】
光−駆動性能動性トランスポーター。溶質（例えば、イオン）輸送の駆動のために光エネルギーを用いている輸送システムは、このクラスに含まれる。
【００１２】
機械−駆動性能動性トランスポーター。膜を通じ、電気化学的勾配に沿ったイオン（又は他の溶質）の流れを可能とすることにより、細胞又は小器官の運動を駆動する場合、輸送システムはこのクラスに含まれる。
【００１３】
（β構造の）外膜ポーリン。これらのタンパク質は、膜貫通孔又はチャンネルを形成し、通常、そのエネルギーは、膜を通じた溶質の移動に依存しない。これらのタンパク質の膜貫通部分は、β−バレルを形成するβ−ストランドのみからなる。これらのポーリン型タンパク質は、グラム陰性細菌、ミトコンドリア、及び真核性プラスチドの外膜において見出される。
【００１４】
メチルトランスフェラーゼ−駆動性トランスポーター。現在、１つのタンパク質、Ｎａ＋輸送メチルテトラヒドロメタノプテリン：補酵素Ｍメチルトランスフェラーゼがこのカテゴリーに分類するものとして特徴付けられている。
【００１５】
非リボソーム合成チャンネル形成ペプチド、又はペプチド様分子。これらの分子は、通常、Ｌ−、及びＤ−アミノ酸鎖、及び乳酸塩のような小分子構成成分であり、オリゴマー状の膜貫通イオンチャンネルを形成する。電位は、膜貫通チャンネルの構築を促進することによって、チャンネルの形成を誘導し得る。これらのタンパク質はしばしば、細菌及び菌類により、生物戦における薬剤として生成され得る。
【００１６】
非タンパク質様輸送複合体。タンパク質又はペプチドから成らない、又はこれに由来しない生物膜中のイオン伝導性物質は、このカテゴリーに分類される。
【００１７】
機能的に特徴付けられたトランスポーターであって、配列データの無いもの。特に生理学的に重要なトランスポーターであるものの、ファミリーに割り当てることができない場合には、このカテゴリーに含まれる。
【００１８】
トランスポーターであると推定され、確立したトランスポーターファミリーのメンバーでないもの。トランスポータータンパク質と推定されるもののファミリーはこの番号の下に分類され、メンバーの輸送機能が確立された場合には他へと分類され、提案された輸送機能が反証された場合には、ＴＣ分類システムから除外される。これらのファミリーには、輸送機能が示唆されているものの、この機能の実証が未だ完全でないメンバーが含まれる。
【００１９】
補助トランスポータータンパク質。１以上の生物膜を通じた輸送を何らかの方法で促進するものの、直接に輸送に関連していないタンパク質は、このクラスに含まれる。このタンパク質は、常に１以上の輸送タンパク質と結びついて機能する。これらは、輸送のためのエネルギー結合に関連した機能を与えるか、複合体形成のための構造的な役割を果たすか、又は調節機能を果たし得る。
【００２０】
分類未知のトランスポーター。分類未知のトランスポータータンパク質ファミリーは、この番号の下に分類され、輸送プロセス及びエネルギー結合機構が特徴付けられた場合には他へと分類される。これらのファミリーには、輸送機能は確立されているものの、輸送様式、又はエネルギー結合機構の知られていないメンバーの少なくとも１つが含まれる。
【００２１】
イオンチャンネル
トランスポーターにおける重要なタイプの１つとしてイオンチャンネルがある。イオンチャンネルは、イオンの細胞内部及び外部への流動を調節することによって、細胞増殖、細胞分化、信号プロセスといった、多くの異なる細胞機能を調節している。イオンチャンネルは、真核生物のほぼ全ての細胞中の形質膜において見出される。イオンチャンネルは、膜電位、吸収、上皮膜を通過するイオン分泌の調節といった種々の細胞機能を媒介する。塩化物イオンチャンネルのようなイオンチャンネルが、ゴルジ体やエンドサイトーシス小胞の細胞内膜に存在する場合には、小器官のｐＨも調節される。Ｇｒｅｇｅｒ， Ｒ． （１９８８） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ５０：１１１−１２２を参照されたい。
【００２２】
イオンチャンネルは、一般的に構造及び作用様式のタイプによって分類される。例えば、細胞外リガンド依存性チャンネル（ＥＬＧｓ）は、それぞれ４つの膜貫通ドメインを有する５つのポリペプチドサブユニットから成っており、細胞外リガンドのチャンネルへの結合によって活性化される。さらに、イオンチャンネルは、例えば、塩素チャンネル、カリウムチャンネル等のように、時には輸送されるイオンのタイプによって分類される。単一のタイプのイオンを輸送するチャンネルには、多くの種類が存在し得る（チャンネルタイプの詳細については、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｓ．Ｐ．Ｈ． ａｎｄ Ｊ．Ａ． Ｐｅｔｅｒｓ （１９９７）． Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ． ６５−６８ 及び ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｏｌｏｇｙ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／￣ｍｓａｉｅｒ／ｔｒａｎｓｐｏｒｔ／ｔｏｃ．ｈｔｍｌ に述べられている）。
【００２３】
構造に基づいたイオンチャンネルのタイプには多くのものがある。例えば、多くのイオンチャンネルは、後述のグループの１つに分類される：細胞外リガンド依存性チャンネル（ＥＬＧ）、細胞内リガンド依存性チャンネル（ＩＬＧ）、内向整流チャンネル（ＩＮＲ）、細胞間（ギャップ接合）チャンネル、電位依存性チャンネル（ＶＩＣ）。さらに、輸送されるイオンのタイプ、細胞位置、薬剤感応性に基づいた他のチャンネルファミリーも認められている。これらの活性、リガンドタイプ、イオンタイプ、疾患との関連、薬剤能のそれぞれについての詳細な情報、及び本発明に関連する他の情報については、当該技術分野において周知である。
【００２４】
細胞外リガンド依存性チャンネルＥＬＧは、一般的に５つのポリペプチドサブユニットから成っている（Ｕｎｗｉｎ， Ｎ． （１９９３）， Ｃｅｌｌ ７２： ３１−４１； Ｕｎｗｉｎ， Ｎ． （１９９５）， Ｎａｔｕｒｅ ３７３： ３７−４３； Ｈｕｃｈｏ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６６： １７８１−１７９２； Ｈｕｃｈｏ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３９： ５３９−５５７； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｓ．Ｐ．Ｈ． ａｎｄ Ｊ．Ａ． Ｐｅｔｅｒｓ （１９９７）， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ． ４−６； ３６−４０； ４２−４４ 及び Ｘｕｅ， Ｈ． （１９９８） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ４７： ３２３−３３３）。それぞれのサブユニットは４つの膜貫通ドメインを有しており、このことはタンパク質がＥＬＧの他のメンバーであることを同定する方法に用いられている。ＥＬＧはリガンドと結合し、これに応じてイオンの流れを変調する。ＥＬＧの例としては、例えばＧＡＢＡＩ受容体のような、神経伝達物質受容体ファミリーのタンパク質の殆どのメンバーが含まれる。このイオンチャンネルのファミリーの他のメンバーとしては、グリシン受容体、リアノジン受容体、及びリガンド依存カルシウムチャンネルが含まれる。
【００２５】
電位依存性イオンチャンネル（ＶＩＣ）スーパーファミリー
ＶＩＣファミリーのタンパク質は、細菌、古細菌、真核生物の広い範囲にわたって見出されるイオン感応性チャンネルタンパク質である（Ｈｉｌｌｅ， Ｂ． （１９９２）， Ｃｈａｐｔｅｒ ９： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ； Ｃｈａｐｔｅｒ ２０： Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ． Ｉｎ： Ｉｏｎｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｓｉｎａｕｒ Ａｓｓｏｃ． Ｉｎｃ．， Ｐｕｂｓ．， Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ； Ｓｉｇｗｏｒｔｈ， Ｆ．Ｊ． （１９９３）， Ｑｕａｒｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２７： １−４０； Ｓａｌｋｏｆｆ， Ｌ． ａｎｄ Ｔ． Ｊｅｇｌａ （１９９５）， Ｎｅｕｒｏｎ １５： ４８９−４９２； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｓ．Ｐ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７）， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ． ７６−８４； Ｊａｎ， Ｌ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， （１９９７）， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０： ９１−１２３； Ｄｏｙｌｅ， Ｄ．Ａ， ｅｔ ａｌ．， （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０： ６９−７７； Ｔｅｒｌａｕ， Ｈ． ａｎｄ Ｗ． Ｓｔｕｈｍｅｒ （１９９８）， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ８５： ４３７−４４４．）。これらはしばしば、ホモオリゴマー構造、又はいくつかの非類似サブニットのヘテロオリゴマー構造（例えば、ａ１−ａ２−ｄ−ｂ Ｃａ２＋チャンネル、ａｂ１ｂ２ Ｎａ＋チャンネル、又は（ａ）４−ｂ Ｋ＋チャンネル）をとっているものの、通常、チャンネル又は主な受容体は、ａ（又はａ１）サブユニットに関連している。機能的に特徴付けられているメンバーは、Ｋ＋、Ｎａ＋、又はＣａ２＋において明らかである。Ｋ＋チャンネルは、通常、６つの膜貫通スパン（ＴＭＳ）を有するａサブユニットのホモ四量体構造からなっている。ａ１、及びＣａ２＋、Ｎａ＋チャンネルのサブユニットのそれぞれは、約４倍の大きさであり、４つのサブユニットを有し、このそれぞれが疎水性ループにより分けられる６つのＴＭＳを有しており、合計で２４個のＴＭＳを有している。これらの大きなチャンネルタンパク質は、ほとんどのＫ＋チャンネルのホモ四量体構造と同等の、ヘテロ四量体ユニット構造を形成している。Ｃａ２＋、及びＮａ＋チャンネルにおける全４つのユニットは、ホモ四量体Ｋ＋チャンネルの単一のユニットに対して相同的である。真核性のチャンネルを経たイオンの流動は、通常、膜内外の電位により（電位感応性の指示によって）制御されるが、いくつかのものは、リガンド又は受容体の結合により制御される。
【００２６】
ＶＩＣファミリーのＫ＋感応性チャンネルタンパク質と推定されるいくつかのものが、原核生物において確認されている。これらのうちの１つ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓのＫＣＳＡＫ＋チャンネルの構造は、３．２Åの分解能で解明された。このタンパク質は、４つの同一のサブユニットを有し、このそれぞれは２つの膜貫通螺旋構造を有しており、逆円錐、又は円錐構造に配置されている。円錐は、“選択性フィルター”Ｐドメインを、その外部末端の中に抱えている。この細い選択性フィルターはわずか１２Åの長さであるのに対して、チャンネルの残部は幅広く、親水性の残基が並んでいる。水に満たされた大きな空孔とへリックスの２つの極は、孔の中でＫ＋を安定化する。選択性フィルターは、結合された２つのＫ＋イオンを、それぞれが互いに７．５Å離れて有している。イオン伝導は、静電的な引力と斥力とのバランスの結果生じていると提案されている。
【００２７】
真核生物において、それぞれのＶＩＣファミリーチャンネルタイプは、薬理学的及び電気生理学的データに基づいたいくつかのサブタイプがある。このため、Ｃａ２＋チャンネルには５つのタイプ（Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、及びＴ）がある。Ｋ＋チャンネルには、少なくとも１０のタイプがあり、それぞれ異なる刺激に対して、異なる方法で応答している：電位感応性（Ｋａ、Ｋｖ、Ｋｖｒ、及びＫｓｒ）、Ｃａ２＋感応性（ＢＫＣａ、ＩＫＣａ、及びＳＫＣａ）、受容体結合（ＫＭ、及びＫＡＣｈ）。Ｎａ＋チャンネルには、少なくとも６つのタイプ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、μ１、Ｈ１、及びＰＮ３）がある。原核生物及び真核生物の両者の四量体チャンネルは、それぞれのａサブユニットがＴＭＳを６つよりはむしろ２つ有するものとして知られており、これらの２つのＴＭＳは、電位感応性チャンネルタンパク質に見られる６つのＴＭＳユニットのうちの、ＴＭＳ５及び６に対して相同的である。Ｓ． ｌｉｖｉｄａｎｓのＫＣＳＡは、このような２ＴＭＳチャンネルタンパク質の例である。これらのチャンネルには、ＫＮａ（Ｎａ＋活性化）、及びＫＶｏｌ（細胞容量感応性）Ｋ＋チャンネルと同様に、酵母のＴｏｋ１Ｋ＋チャンネル、マウスのＴＷＩＫ−１内向き整流Ｋ＋チャンネル、及びマウスのＴＲＥＫ−１Ｋ＋チャンネルのような、遠く関連しているチャンネルも含まれ得る。ＶＩＣファミリーのタンパク質との配列の類似が不十分なため、Ｐドメイン及び２つのフランキングＴＭＳを有している内向き整流Ｋ＋ＩＲＫチャンネル（ＡＴＰ調節、Ｇタンパク質活性化）は、他のファミリーに分類される。しかしながら、Ｐ領域において実質的に配列が類似している場合、それらは相同的であることが示唆される。ＶＩＣファミリーメンバーのｂ、ｇ、ｄサブユニットが存在している場合には、しばしばチャンネル活性化／不活性化の調節の役割を果たす。
【００２８】
カリウムイオンチャンネル
本発明により提供されるタンパク質は、ＴＲＥＫカリウムチャンネル、特にＴＲＥＫ２と相同性の高い、新規なヒトカリウムチャンネルタンパク質である。ＴＲＥＫは、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＡＡＫ、ＴＷＩＫ、及びＴＡＳＫと共に、脂肪酸−促進性カリウムチャンネルの機械感応性のクラスに属し、同様に４つの膜貫通螺旋ドメイン及び２つの孔ドメインを有するタンデムポアカリウムチャンネルの構造的ファミリーに属する。
【００２９】
ＴＲＥＫチャンネルは、前部／視索前野視床下部において高度に発現し、ここで体温調節に寄与している。視床下部ＴＲＥＫチャンネルは、熱によって可逆的に開口されることができる。タンパク質キナーゼＡによるＴＲＥＫのリン酸化は、熱による開口を反転する。ＴＲＥＫチャンネルは２ｍｍバリウムイオンによって部分的にブロックされ得る。ＴＲＥＫ及びＴＲＡＡＫチャンネルは軸索小胞に関連付けることができる；ＴＲＥＫ及びＴＲＡＡＫは、軸索輸送を経て坐骨神経内に転座する。神経保護薬剤リルゾールは、ＴＲＥＫ及びＴＲＡＡＫを活性化し、これらのチャンネルは神経変性に関連しているかもしれないことが示唆される。リルゾールは筋萎縮性側索硬化の治療に用いられる。２つの孔チャンネルは、クロロホルム、イソフルラン、ハロセンのような一般的な麻酔薬によって活性化される。ＴＲＥＫチャンネルの組織分布、及びＴＲＥＫ発現レベルの個人間の相違は、麻酔の最適投与量の決定において重要である。
【００３０】
ＴＲＥＫ２はヒト（Ｌｅｓａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００ Ｓｅｐ １５；２７５（３７）：２８３９８−４０５）、及びラット（Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００ Ｊｕｎ ９；２７５（２３）：１７４１２−９）からクローンされた。ヒトＴＲＥＫ遺伝子はヒト染色体１４ｑ３１上に位置する。ヒトＴＲＥＫ２はＴＲＥＫ１と７８％の相同性を有し、膵臓、腎臓において高度に発現し、脳、精巣、結腸、及び小腸ではより低いレベルで発現している。ＴＲＥＫ２は、中枢神経系、特に小脳、後頭葉、果核、視床で豊富に発現される（Ｌｅｓａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００ Ｓｅｐ １５；２７５（３７）：２８３９８−４０５）。ＴＲＥＫ２はまた、脾臓でも発現される（Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００ Ｊｕｎ ９；２７５（２３）：１７４１２−９）。ＴＲＥＫチャンネルは、活性化及び非−不活性化外向き整流カリウム流動を迅速に生成し、このような流動はポリ不飽和脂肪酸（例えば、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸）、リゾホスファチジルコリン、及び酸性ｐＨによって高度に促進される。ＴＲＥＫ２は細胞内ｃＡＭＰによりブロックされる。ＴＲＥＫ２は多くの神経伝達物質受容体、及びＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）により、上方調節又は下方調節される。例えば、Ｇ（ｓ）共役受容体５ＨＴ４ｓＲ、又はＧ（ｑ）共役受容体ｍＧｌｕＲ１の活性化はＴＲＥＫ２を阻害し、Ｇ（ｉ）共役受容体ｍＧｌｕＲ２はＴＲＥＫ２流動を促進する。これらの観測は、ＴＲＥＫ２が神経伝達物質作用のターゲットとして重要な役割を果たすことを示唆している（Ｌｅｓａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０００ Ｓｅｐ １５；２７５（３７）：２８３９８−４０５）。
【００３１】
ＴＲＥＫのようなカリウムチャンネルの更なる情報については、Ｍａｉｎｇｒｅｔ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ ２０００ Ｊｕｎ １；１９（１１）：２４８３−９１； Ｂｅａｒｚａｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２０００ Ａｐｒ ７；１１（５）：９２７−３０； Ｂｅａｒｚａｔｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２０００ Ａｐｒ ７；１１（５）：９２７−３０； Ｄｕｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０００ Ｍａｙ；５７（５）：９０６−１２； ａｎｄ Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １９９９ Ｍａｙ；２（５）：４２２−６を参照。
【００３２】
上皮Ｎａ＋チャンネル（ＥＮａＣ）ファミリー
ＥＮａＣファミリーは、２４以上の配列解析されたタンパク質からなっている（Ｃａｎｅｓｓａ， Ｃ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｎａｔｕｒｅ ３６７： ４６３−４６７， Ｌｅ， Ｔ． ａｎｄ Ｍ．Ｈ． Ｓａｉｅｒ， Ｊｒ． （１９９６）， Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １３： １４９−１５７； Ｇａｒｔｙ， Ｈ． ａｎｄ Ｌ．Ｇ． Ｐａｌｍｅｒ （１９９７）， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７７： ３５９−３９６； Ｗａｌｄｍａｎｎ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９７）， Ｎａｔｕｒｅ ３８６： １７３−１７７； Ｄａｒｂｏｕｘ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９８）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： ９４２４−９４２９； Ｆｉｒｓｏｖ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９８）， ＥＭＢＯ Ｊ． １７： ３４４−３５２； Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ， Ｊ．−Ｄ． （１９９８）． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃ． Ｂｉｏｌ． １０： ４４３−４４９）。この全ては動物由来であり、他の真核生物又は細菌には相同体が認められない。脊椎動物の上皮細胞からのＥＮａＣタンパク質は、系統樹において共にきっちりと群を成している：電位非感応性ＥＮａＣ相同体は、脳においても見出される。ｄｅｇｅｎｅｒｉｎを含む、１１の配列解析されたＣ． ｅｌｅｇａｎｓタンパク質は、それぞれがお互いに関連しているのと同様に、脊椎動物のタンパク質とも遠く関連している。少なくともこれらのタンパク質のうちのいくつかは、接触感応性のための機械伝達性複合体を部分的に形成する。相同性のＨｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ（ＦＭＲＦ−アミド）−活性化Ｎａ＋チャンネルは、最初に配列解析された神経伝達物質依存性イオンチャンネル型受容体ペプチドである。
【００３３】
このファミリーのタンパク質は、全て同一の外見上の形態を示し、それぞれ細胞の内側にＮ、及びＣ末端、２つの両親媒性膜貫通スパンセグメント、及び大きな細胞外ループを示す。細胞外ドメインは、多くの高度に保持されたシステイン残基を含んでいる。これらは受容体機能を果たすと提案されている。
【００３４】
哺乳類のＥＮａＣは、Ｎａ＋のバランスの維持、及び血圧の調節において重要である。３つの相同性ＥＮａＣサブユニット、α、β、γは、高度のＮａ選択性チャンネルを形成するために集合することが示された。３つのサブユニットの化学量論は、ヘテロ四量体構成におけるα２、β１、γ１である。
【００３５】
神経伝達物質受容体のグルタミン酸依存性イオンチャンネル（ＧＩＣ）ファミリー
ＧＩＣファミリーのメンバーは、ヘテロ五量体複合体であり、５つのサブユニットのそれぞれは８００〜１０００のアミノアシル残基の長さである（Ｎａｋａｎｉｓｈｉ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ， （１９９０）， Ｎｅｕｒｏｎ ５： ５６９−５８１； Ｕｎｗｉｎ， Ｎ． （１９９３）， Ｃｅｌｌ ７２： ３１−４１； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ， Ｓ．Ｐ．Ｈ ａｎｄ Ｊ．Ａ． Ｐｅｔｅｒｓ （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ｐｐ． ３６−４０）。これらのサブユニットは、細胞外に局在するＮ末端（グルタミン酸結合ドメイン）、及び細胞質に局在するＣ末端とともに、αへリックス構造と推定される部分として３回又は５回膜を貫通している。これらはリガンド依存性イオンチャンネルと遠く関連しているかもしれず、もしそうであれば、それらは膜貫通領域に堅固なβ構造を有している。しかしながら、単独での配列比較に基づいて、これら２つのファミリー間の相同性を実証することはできない。このサブユニットは、ａ、ｂ、ｇ、ｄ、ｅ、及びｚの６つのサブファミリーに分類される。
【００３６】
ＧＩＣチャンネルは、（１）α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸（ＡＭＰＡ）−、（２）カイニン酸−、（３）Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）−選択性グルタミン酸受容体の３つのタイプに分類される。ＡＭＰＡとカイニン酸のサブユニットはお互いに３５〜４０％の同一性を示すが、ＮＭＤＡ受容体サブユニットの前者のサブユニットに対する同一性は２２〜２４％である。これらは、大きなＮ末端を細胞外グルタミン酸結合ドメインとして有しており、これはグラム陰性細菌のＡＢＣ型取り込みパーミアーゼの周辺質グルタミン及びグルタミン酸受容体と相同的である。公知のＧＩＣファミリーメンバーは、全て動物由来である。異なるチャンネル（受容体）タイプでは、異なるイオン選択性及び伝導特性を示す。ＮＭＤＡ選択性高伝導チャンネルは、１価のカチオン及びＣａ２＋に対して、高い透過性を持つ。ＡＭＰＡ、及びカイニン酸選択性イオンチャンネルは、主に１価のカチオンを透過し、Ｃａ２＋に対してはわずかな透過性を有するのみである。
【００３７】
塩化物チャンネル（ＣＩＣ）ファミリー
ＣＩＣファミリーは、グラム陰性、及びグラム陽性細菌、シアノ細菌、古細菌、酵母、植物、動物由来の配列解析されたタンパク質１２種からなる大きなファミリーである（Ｓｔｅｉｎｍｅｙｅｒ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９１）， Ｎａｔｕｒｅ ３５４： ３０１−３０４； Ｕｃｈｉｄａ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９３）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： ３８２１−３８２４； Ｈｕａｎｇ， Ｍ．−Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４２： ５９５−５９８； Ｋａｗａｓａｋｉ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ， （１９９４）， Ｎｅｕｒｏｎ １２： ５９７−６０４； Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９５）， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ． ２９：５９８−６０６； ａｎｄ Ｆｏｓｋｅｔｔ， Ｊ．Ｋ． （１９９８）， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ６０： ６８９−７１７）。これらのタンパク質は、本質的に至る所に存在しているが、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノム中にはコード化されていない。配列解析されたタンパク質は、３９５（Ｍ． ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）から９８８（ヒト）までの大きさで様々である。いくつかの生物には、多数のＣＩＣファミリーパラログが含まれている。例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓは２つのパラログを有し、一方は４５１残基、他方は８９９残基を有している。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａは、少なくとも４つの配列解析されたパラログ（７７５〜７９２残基）を有し、ヒトも少なくとも５つのパラログ（８２０〜９８８残基）を有し、また、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓもまた、少なくとも５つのパラログ（８１０〜９５０残基）を有している。哺乳類においては、９つの公知のメンバーがあり、対応する遺伝子のうちの３つの変異によって、ヒトの疾病が引き起こされる。Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、それぞれ、わずか１つのＣＩＣファミリーのメンバーを有している。大きなＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓパラログを除いて、全ての細菌性タンパク質は小さい（３９５〜４９２残基）が、全ての真核生物タンパク質はより大きい（６８７〜９８８残基）。これらのタンパク質は、１０〜１２の推定膜貫通α−螺旋スパン（ＴＭＳ）を示し、ホモ二量体として膜中に存在すると考えられる。このファミリーのメンバーの１つ、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＣｌＣ−Ｏでは、２つのチャンネルを、サブユニットにつき１つ有していることが報告されており、この他のものは、ただ１つだけ有するものと考えられている。
【００３８】
ＣＩＣファミリーとして機能的に特徴付けられる全てのメンバーは塩化物を輸送し、いくつかのものは電位調節プロセスにおいて塩化物を輸送する。これらのチャンネルは、種々の生理学的機能（細胞容積調節、膜電位安定化、信号伝達、経上皮輸送等）に作用する。ヒトにおける異なる相同体は、異なる選択性を示す。すなわち、ＣｌＣ４及びＣｌＣ５は、ＮＯ３−＞Ｃｌ−＞Ｂｒ−＞Ｉ−の伝導性配列を共有しているのに対して、ＣｌＣ３は、Ｉ−＞Ｃｌ−の選択性を有する。ＣｌＣ４、及びＣｌＣ５チャンネル、及び他のものは、電位が＋２０ｍＶ以上の場合にのみ、外向きの整流を示す。
【００３９】
動物の内向き整流Ｋ＋チャンネル（ＩＲＫ−Ｃ）ファミリー
ＩＲＫチャンネルは、“最小限のチャンネル形成構造”として、ＶＩＣファミリーのチャンネルタンパク質に特有のＰドメインのみ、及び２つのフランキング膜貫通スパンを有する（Ｓｈｕｃｋ， Ｍ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ２４２６１−２４２７０； Ａｓｈｅｎ， Ｍ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９５）， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２６８： Ｈ５０６−Ｈ５１１； Ｓａｌｋｏｆｆ， Ｌ． ａｎｄ Ｔ． Ｊｅｇｌａ （１９９５）， Ｎｅｕｒｏｎ １５： ４８９−４９２； Ａｇｕｉｌａｒ−Ｂｒｙａｎ， Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９８）， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７８： ２２７−２４５； Ｒｕｋｎｕｄｉｎ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９８）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３： １４１６５−１４１７１）。これらは、膜中にホモ、又はヘテロオリゴマーとして存在し得る。これらは、Ｋ＋を細胞の外部へとよりも内部へと流す大きな傾向を持っている。電位依存性は、外部Ｋ＋、内部Ｍｇ２＋、内部ＡＴＰ、及び／又はＧタンパク質により調節され得る。ＩＲＫチャンネルのＰドメインは、ＶＩＣファミリーのそれと類似した限定配列を示すが、この配列の類似は相同性を確立するには不十分である。内向き整流器は、細胞膜電位を調整する役割を果たし、脱分極の際にこれらのチャンネルが閉じることで、プラトー相での長期間の活動電位の保持が可能となる。内向き整流器は、ＶＩＣファミリーチャンネルに見出される、固有の電位を感知する螺旋構造を持たない。ごくまれには、例えば、Ｋｉｒ１．１ａ、Ｋｉｒ６．２のそれらは、ＡＢＣスーパーファミリーのメンバーとの直接の相互作用によって、ＡＴＰ感応性のような、ヘテロマー複合体に対して特異な機能、及び調節特性を与えることが提案されている。ＳＵＲ１スルホニル尿素受容体（ｓｐＱ０９４２８）は、ＡＴＰに応答してＫｉｒ６．２チャンネルを調節するＡＢＣタンパク質であり、またＣＦＴＲはＫｉｒ１．１ａを調節し得る。ＳＵＲ１の変異は、膵臓でのインシュリン分泌が調節されないことにより特徴付けられる常染色体劣性障害である、遺伝性の持続性幼少時高インシュリン低血糖症（ＰＨＨＩ）の原因となる。
【００４０】
ＡＴＰ依存性カチオンチャンネル（ＡＣＣ）ファミリー
ＡＣＣファミリー（Ｐ２Ｘ受容体とも呼ばれる）は、ＡＴＰに応答し、多種の神経細胞からのエキソサイトーシスにより、機能性神経伝達物質が放出される（Ｎｏｒｔｈ， Ｒ．Ａ． （１９９６）， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８： ４７４−４８３； Ｓｏｔｏ， Ｆ．， Ｍ． Ｇａｒｃｉａ−Ｇｕｚｍａｎ ａｎｄ Ｗ． Ｓｔｕｈｍｅｒ （１９９７）， Ｊ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ． １６０： ９１−１００）。これらは、薬理学的性質に基づいて、７つのグループ（Ｐ２Ｘ１〜Ｐ２Ｘ７）に分けられる。神経細胞−神経細胞、及び神経細胞−平滑筋接合部において機能するこれらのチャンネルは、血圧及び痛覚を制御する役割を果たしている。これらはまた、リンパ球及び血小板おいても生理的に機能し得る。これらは動物においてのみ見出される。
【００４１】
ＡＣＣファミリーのタンパク質は、配列は完全に類似している（＞３５％同一性）ものの、主にＣ末端ドメインに局在している、サブユニット当たり３８０〜１０００の変異性のアミノアシル残基を有している。これらは２つの膜貫通スパンを有しており、一方はＮ末端から３０〜５０残基辺り、他方は３２０〜３４０残基の近辺である。これら２つのスパンの間（約２０残基）の細胞外受容体ドメインは、グリシル及びシステイル残基が多数保持されており、高度に保持されている。親水性のＣ末端は２５〜２４０残基の長さで様々である。これらは、（ａ）細胞内に局在しているＮ、及びＣ末端、（ｂ）２つの推定膜貫通スパン、（ｃ）大きな細胞外ループドメイン、及び（ｄ）多数の保持された細胞外システイル残基において、形態の類似した上皮Ｎａ＋チャンネル（ＥＮａＣ）タンパク質と類似している。しかしながら、ＡＣＣファミリーのメンバーは、これらと明らかに相同的ではない。ＡＣＣチャンネルはおそらくヘテロ−、又はホモマルチマーであり、小さな１価のカチオン（Ｍｅ＋）を輸送する。また、いくつかのものはＣａ２＋も輸送し、ごくわずかのものは小さな代謝産物も輸送する。
【００４２】
リアノジン−イノシトール１，４，５三リン酸受容体Ｃａ２＋チャンネル（ＲＩＲ−ＣａＣ）ファミリー
リアノジン（Ｒｙ）感応性、及びイノシトール１，４，５三リン酸（ＩＰ３）感応性Ｃａ２＋放出チャンネルは、動物細胞の細胞内貯蔵部位からＣａ２＋を放出し、これにより種々のＣａ２＋依存性生理プロセスを調節する（Ｈａｓａｎ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１６： ９６７−９７５； Ｍｉｃｈｉｋａｗａ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９４）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９： ９１８４−９１８９； Ｔｕｎｗｅｌｌ， Ｒ．Ｅ．Ａ．， （１９９６）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３１８： ４７７−４８７； Ｌｅｅ， Ａ．Ｇ． （１９９６） Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ， Ｖｏｌ． ６， Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｃｈａｎｎｅｌｓ （Ａ．Ｇ． Ｌｅｅ， ｅｄ．）， ＪＡＩ Ｐｒｅｓｓ， Ｄｅｎｖｅｒ， ＣＯ．， ｐｐ ２９１−３２６； Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｍｅｍ． ６： ２７３−２８９）。Ｒｙ受容体は主に筋細胞筋小胞体（ＳＲ）膜に、ＩＰ３受容体は主に脳細胞小胞体（ＥＲ）膜に存在し、ここでチャンネルの活性化（開く）によるＣａ２＋の細胞質への放出を行う。
【００４３】
Ｒｙ受容体は、ジヒドロピリジン感応性Ｃａ２＋チャンネルの活性の結果として活性化される。後者は、電位感応性イオンチャンネル（ＶＩＣ）ファミリーのメンバーである。ジヒドロピリジン感応性チャンネルは、筋組織のＴ管系に存在している。
【００４４】
Ｒｙ受容体は、それぞれのサブユニットの分子量サイズが５００，０００ダルトン（約５，０００アミノアシル残基）以上のホモ四量体複合体である。これは、６つの推定膜貫通α−螺旋スパン（ＴＭＳ）を有している。ＶＩＣファミリーのメンバーであると推定されるように、推定孔形成配列は５つ目と６つ目のＴＭＳの間に存在している。大きなＮ末端親水性ドメイン、及び小さなＣ末端親水性ドメインは細胞質に局在している。低分解能の３次元構造データを得ることができる。哺乳動物は、おそらく哺乳動物の種の分岐以前の遺伝子の重複、分岐により発生した、少なくとも３つのイソ型を有している。ヒトとＣａｅｎｏｒａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓには、相同体が存在する。
【００４５】
ＩＰ３受容体は、Ｒｙ受容体と多くの点で類似している。（１）これらは、それぞれのサブユニットの分子量サイズが３００，０００ダルトン（約２，７００アミノアシル残基）以上のホモ四量体複合体である。（２）これらは、Ｒｙ受容体のそれと相同的なＣ末端チャンネルドメインを有している。（３）チャンネルドメインは６つの推定ＴＭＳを有し、５つめと６つめのＴＭＳの間に推定チャンネル内層領域を有している。（４）大きなＮ末端ドメインと小さなＣ末端尾部の両者が細胞質に面している。（５）これらは、チャンネルドメインの細胞質外ループ共有結合した炭水化物を有している。（６）これらは、哺乳動物において３つのイソ型（タイプ１，２，３）が一般的に認められており、これらは異なる調節に従い、また異なる組織分布を持っている。
【００４６】
ＩＰ３受容体は、３つのドメイン；Ｎ末端のＩＰ３結合ドメイン、中央部の結合、又は調節ドメイン、及びＣ末端のチャンネルドメイン、を有する。チャンネルはＩＰ３結合により活性化され、Ｒｙ受容体と同様に、ＩＰ３受容体チャンネルの活性は調節ドメインのリン酸化により調節され、種々のタンパク質キナーゼにより触媒される。これらは、脳の種々の細胞タイプの小胞体膜において多く見られるが、種々の組織に由来するいくつかの神経細胞の形質膜においても見出される。
【００４７】
Ｒｙ受容体及びＩＰ３受容体のチャンネルドメインは、一貫したファミリーからなっており、明確な構造の類似性を持っているにも関わらず、ＶＩＣファミリーのタンパク質の明確な配列の類似性を示さない。Ｒｙ受容体とＩＰ３受容体は、ＲＩＲ−ＣａＣ系統樹とは別のところで群を成している。これらの両者は、ショウジョウバエにおいて相同体を有している。ファミリーの系統樹に基づくと、このファミリーは、おそらく以下の連続によって進化している。（１）遺伝子の重複により、無脊椎動物においてＲｙ及びＩＰ３受容体が生じた。（２）無脊椎動物から脊椎動物へと進化した。（３）それぞれの受容体の３つのイソ型が、２つの個別の遺伝子重複の結果として生じた。（４）これらのイソ型が、哺乳動物の種の分岐以前に哺乳動物へと遺伝された。
【００４８】
小器官塩化物チャンネル（Ｏ−ＣＩＣ）ファミリー
Ｏ−ＣＩＣファミリーのタンパク質は、電位感応性の塩化物チャンネルであり、細胞内膜において見出されるものの、動物細胞の形質膜においては見出されない（Ｌａｎｄｒｙ， Ｄ， ｅｔ ａｌ．， （１９９３）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８： １４９４８−１４９５５； Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ， Ｓｅｔ ａｌ．， （１９９７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １２５７５−１２５８２； ａｎｄ Ｄｕｎｃａｎ， Ｒ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９７）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ２３８８０−２３８８６）。
【００４９】
これらは、ヒトの核膜、ミクロソームに対するウシタンパク質ターゲットにおいて見出されるが、アフリカツメガエルの卵母細胞において発現される場合、形質膜には見出されない。これらのタンパク質は、膜電位の調節、腎臓における上皮透過イオン吸着及び分泌において機能していると考えられている。これらは、２つの推定膜貫通α螺旋スパン（ＴＭＳ）を、細胞質Ｎ−及びＣ−末端、及びグリコシル化されているであろう大きな管腔ループとともに有している。ウシタンパク質は、４３７アミノアシル残基の長さであり、２つのＴＭＳを２２３〜２３９、３６７〜３８５の位置に持っている。ヒトの核タンパク質は、非常に小さい（２４１残基）。Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓの相同体は２６０残基の長さである。
【００５０】
トランスポータータンパク質、特にカリウムチャンネルサブファミリーのメンバーは、薬剤の作用、及び開発における重要なターゲットである。したがって、従来未知のトランスポータータンパク質を同定し、特徴付けることは、製薬開発の分野において非常に有用である。本発明は、従来未確認のヒトトランスポータータンパク質を提供することによって、これらの技術の進展に寄与するものである。
【００５１】
発明の要約
本発明は、ヒトトランスポーターペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列の同定に部分的に基づいているものであり、カリウムチャンネルサブファミリー、及びそれらの対立変異体、他の哺乳類のオルトログに関連するものである。これらの特異なペプチド配列、及びこのペプチドをコード化している核酸配列は、ヒト治療ターゲットの開発に用いることができ、治療タンパク質の同定に有用であり、トランスポーターを発現している細胞及び組織におけるトランスポーターの活性を変調するヒト治療薬剤の開発のターゲットとなり得る。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。
【００５２】
発明の詳細な説明
概論
本発明は、ヒトゲノムの配列解析に基づいている。ヒトゲノムの配列解析及び構築に際して、配列情報を解析することによって、当該分野において、トランスポータータンパク質又はその一部であると同定及び特徴付けられ、カリウムチャンネルサブファミリーに関連付けられるタンパク質／ペプチド／ドメインに対して、構造及び／又は配列の相同性を有するペプチドをコード化している、ヒトゲノムの従来未確認のフラグメントが明らかとなった。これらの配列を用いて、付加的なゲノム配列を構築し、転写及び／又はｃＤＮＡ配列を単離し、特徴付けた。この解析に基づいて、本発明は、カリウムチャンネルサブファミリーに関連するヒトトランスポーターペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列、これらのトランスポーターペプチド及びタンパク質をコード化する転写形態の核酸配列、ｃＤＮＡ配列及び／又はゲノム配列、核酸変異（対立遺伝子情報）、発現の組織分布、及び本発明のトランスポーターに対して構造又は配列の相同性を有する、最も関連性の高い既知のタンパク質／ペプチド／ドメインに関する情報を提供するものである。
【００５３】
本発明において提供されるペプチドは、従来未知であることに加えて、商業的に重要な製品及びサービスの開発において有用であるという点に基づいて選択され得るものである。特に、本発明のペプチドは、カリウムチャンネルサブファミリーにおける既知のトランスポータータンパク質、及びその発現パターンに対して相同性及び／又は構造上の相関性を有していることに基づいて選択される。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。この技術は、本発明の遺伝子と類似した発現パターンを有するこのファミリーのタンパク質及びペプチドにおける商業的重要性を確立するものである。本発明のペプチドのより具体的な性質及びその使用に関しては、本明細書、特に背景技術、図面の注釈に記載され、及び／又は既知のカリウムチャンネルファミリー又はトランスポータータンパク質サブファミリーのそれぞれにおいて周知である。
【００５４】
【実施例の詳細】
ペプチド分子
本発明は、トランスポーターファミリーのタンパク質のメンバーであると同定されるタンパク質分子をコード化する核酸配列を提供するものであり、これらはカリウムチャンネルサブファミリーに関連付けられる（図２にタンパク質配列、図１に転写／ｃＤＮＡ配列、図３にゲノム配列を示す）。図２に示されるペプチド配列、同様に本明細書に記載される対立変異体、特に本明細書及び図３の情報を用いて同定される対立変異体のような明らかな変異体は、ここでは本発明のトランスポーターペプチド、トランスポーターペプチド、又は本発明のペプチド／タンパク質と呼ばれる。
【００５５】
本発明は、図２に示されるトランスポーターペプチドのアミノ酸配列から成る、あるいは実質的に成る、あるいはこれを含む単離ペプチド及びタンパク質分子を提供する（図１に示される核酸分子である転写／ｃＤＮＡ、又は図３に示されるゲノム配列によりコード化される）とともに、本技術により調製、使用されるこれらのペプチドの明らかな変異体を提供するものである。これらの変異体については以下で詳述する。
【００５６】
ここで用いられる場合、ペプチドが細胞物質を実質的に含まない、又は化学前駆物質あるいは他の化学物質を含まない場合に、ペプチドは「単離」又は「精製」されたという。本発明のペプチドは、同質又は他の純度になるまで精製することができる。精製のレベルは使用目的に基づく。重要な性質としては、調製物中に他の成分が多量に存在していたとしても、要求されるペプチドの機能を発揮できるということである（単離核酸分子の性質については後述する）。
【００５７】
いくつかの使用では、「実質的に細胞物質を含まない」とは、他のタンパク質（すなわち汚染タンパク質）を約３０％（乾燥重量）未満、他のタンパク質を約２０％未満、他のタンパク質を約１０％未満、又は、他のタンパク質を約５％未満有するペプチド調製物を含む。ペプチドが組み換えにより製造される場合、培地がタンパク質調製物の容量に対して２０％未満のときには、実質的に培地は存在しないとすることもできる。
【００５８】
「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」という用語は、合成に関与した化学前駆物質又は他の化学物質から分離されたペプチド調製物をいう。ある例においては、「実質的に化学前駆物質又は他の化学物質を含まない」とは、化学前駆物質又は他の化学物質を約３０％（乾燥重量）未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約２０％未満、化学前駆物質又は他の化学物質を約１０％未満、又は、化学前駆物質又は他の化学物質を約５％未満有するトランスポーターペプチド調製物を含む。
【００５９】
単離トランスポーターペプチドは、自然に発現する細胞、発現のために変形された（組み換え）細胞から精製するか、又は、既知のタンパク質合成方法を用いて合成することができる。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。例えば、トランスポーターペプチドをコード化している核酸分子は、発現ベクター中にクローニングされ、さらにこの発現ベクターは宿主細胞に導入されて、タンパク質が宿主細胞内で発現する。そして、タンパク質は標準のタンパク質精製技術を用いた適当な精製スキームによって、細胞から単離することができる。これら多くの技術については、以下で詳述する。
【００６０】
したがって、本発明は、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）から成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）、及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなタンパク質のアミノ酸配列を図２に示す。このアミノ酸配列がタンパク質の最終的なアミノ酸配列であるとき、タンパク質はアミノ酸配列から成る。
【００６１】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）から実質的に成るタンパク質、例えば、図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）、及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このようなアミノ酸配列に微量の付加アミノ酸残基、例えば、最終的にタンパク質中に約１〜１００程度の付加残基、典型的には１〜２０の付加残基が存在する場合、タンパク質はアミノ酸配列から実質的に成る。
【００６２】
本発明はさらに、図２に示されるアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を含むタンパク質、例えば図１に示される転写／ｃＤＮＡ核酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）、及び図３に示されるゲノム配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）によりコード化されるタンパク質を提供するものである。このアミノ酸配列が、タンパク質の最終的なアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、タンパク質はアミノ酸配列を含む。このような場合、タンパク質はペプチドのみであるか、又はタンパク質と自然に結びついているアミノ酸残基、あるいはアミノ酸残基／ペプチド配列に非相同のアミノ酸残基のような、付加的なアミノ酸分子（コード化された配列と隣接する）を有することができる。このようなタンパク質は、少量の付加的アミノ酸残基を有するか、又は数百あるいはそれ以上の付加的アミノ酸を含むことができる。本発明のトランスポーターペプチドが含まれるタンパク質の好適な種として、天然の成熟タンパク質がある。これらの各種タンパク質を調製／単離する方法については、以下に簡単に述べる。
【００６３】
本発明のトランスポーターペプチドは、キメラ又は融合タンパク質を形成するために、非相同性の配列に結合することができる。このようなキメラ及び融合タンパク質は、トランスポーターペプチドに対して実質的に相同性のないアミノ酸配列を有する非相同タンパク質に、有効に結合されるトランスポーターペプチドを含む。「有効に結合される」とは、トランスポーターペプチドと非相同タンパク質がフレーム中で融合していることを示す。非相同タンパク質は、トランスポーターペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合されることができる。
【００６４】
いくつかの使用では、融合タンパク質は、トランスポーターペプチド自体の活性に影響を及ぼさない。融合タンパク質には、例えば、βガラクトシダーゼ融合、イースト２−ハイブリッドＧＡＬ融合、ポリＨｉｓ融合、ＭＹＣ標識、ＨＩ標識及びＩｇ融合といった酵素融合タンパク質が含まれるが、これに限られるものではない。このような融合タンパク質、特にポリＨｉｓ融合は、組み換えトランスポーターペプチドの精製に有用である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳類の宿主細胞）においては、タンパク質の発現及び／又は分泌は、非相同信号配列を用いることにより増加させることができる。
【００６５】
キメラ又は融合タンパク質は、標準の組み換えＤＮＡ技術により製造することができる。例えば、異なるタンパク質配列をコードしているＤＮＡフラグメントは、従来技術に従ってフレーム中に共に配置される。他の例では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む従来技術により合成することが可能である。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅にアンカープライマーを用い、２つの連続的な遺伝子フラグメント間に相補的な突出部を形成し、その後、アニールすることにより、キメラ遺伝子配列を再増幅することができる（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９９２参照）。さらに、発現ベクターとしては、既に融合部分（例えばＧＳＴタンパク質）をコード化した多くのものを、商業的に入手することができる。トランスポーターペプチドをコード化した核酸は、融合部がフレーム中でトランスポーターペプチドに結合するようにして、このような発現ベクター中にクローニングされることができる。
【００６６】
以上説明したように、本発明はまた、天然のペプチド成熟形態、ペプチドの対立遺伝子／配列変異体、非天然の組換え誘導変異体、ペプチドのオルトログ及びパラログなど、本発明のタンパク質のアミノ酸配列における明らかな変異体を提供、及び実施可能にするものである。このような変異体は、核酸組み換え技術やタンパク質生化学の分野で公知の技術を用いることにより、容易に生成することができる。しかしながら、この変異体には、本発明以前に公開されている何れのアミノ酸配列も含まれないものであると理解される。
【００６７】
このような変異体は、ここに示される分子技術や配列情報を用いることにより、容易に同定／製造することが可能である。さらに、このような変異体は、本発明のトランスポーターペプチドに対する配列及び／又は構造上の相同性に基づいて、他のペプチドと容易に区別することができる。相同性／同一性の程度は、主に、ペプチドが機能的変異体であるか又は非機能的変異体であるか、パラログファミリー中に存在する分化量、オルトログ間の進化的相違に基づいている。
【００６８】
２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較を行う目的で、配列はアラインされる（例えば、最適なアラインメントのために、ギャップが第一及び第二アミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入されることができ、非相同性配列は比較を行うために無視することができる）。好適な例としては、対象配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上が、比較目的に応じてアラインされる。そして、対応するアミノ酸配置又はヌクレオチド配置上の、アミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第一配列での配置が、第二配列において対応する配置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、分子はその配置上で同一である（ここで用いられているアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同意義である）。２つの配列間の同一性パーセントは、配列において共有される同一配置数の関数であり、ギャップ数及び各ギャップ長さを考慮し、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある。
【００６９】
配列の比較、及び２つの配列間における同一性、類似性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．， ｅｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８８； Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ： Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ， Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．， ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９３； Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ １， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．， ｅｄｓ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， １９９４； Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７； ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ， Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ． ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｄｓ．， Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１）。好適な例としては、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ・Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （４８）：４４４−４５３ （１９７０））を用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックス、又はＰＡＭ２５０マトリックス、及びギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６、４、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。他の好適な例としては、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２（１）：３８７（１９８４））を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ギャップ重量４０、５０、６０、７０、８０、長さ重量１、２、３、４、５、６を用いて決定される。さらに他の一例としては、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｙｅｒｓ・Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７ （１９８９））を用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用いて決定される。
【００７０】
本発明の核酸及びタンパク質配列は、例えば他のファミリー又は関連した配列を発見するために、配列データベースに対して検索を行う「クエリー配列」として用いられることができる。このような検索は、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴ、及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０ （１９９０）） を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同性のあるヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２で行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質に相同性のあるアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用い、ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３で行うことができる。比較目的のギャップアラインメントを得るために、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２ （１９９７））を用いることができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる際には、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴやＮＢＬＡＳＴ）の既定のパラメータを用いることができる。
【００７１】
本発明のペプチドのうちの一つを含むタンパク質において、プロセシングを受ける前の全長形態と同様に、成熟プロセス形態は、本発明のトランスポーターペプチドのうちの１つに対して完全な配列同一性を有していることはもちろん、本発明のトランスポーターペプチドと同じ遺伝子位置によりコード化されているものとして、容易に同定することができる。図３のデータにより示されているように、本発明の新規なカリウムチャンネルタンパク質をコード化している遺伝子は、公知のＢＡＣ ＡＣ０２６５９７上に位置し、これはヒト染色体１８上に位置することが知られている。
【００７２】
トランスポーターペプチドの対立遺伝子変異体は、トランスポーターペプチドの少なくとも一部に対して高度の（著しい）配列相同性／同一性を有するヒトタンパク質であることはもちろん、同様に本発明のトランスポーターペプチドと同じ遺伝子位置においてコード化されているものとして、容易に同定することができる。遺伝子位置は、対象となるヒトに対してマッピングされたゲノム配列のような、図３に示されるゲノム情報に基づいて容易に決定することができる。図３のデータにより示されているように、本発明の新規なカリウムチャンネルタンパク質をコード化している遺伝子は、公知のＢＡＣ ＡＣ０２６５９７上に位置し、これはヒト染色体１８上に位置することが知られている。ここで用いられる場合、アミノ酸配列において、典型的には少なくとも約７０〜８０％、８０〜９０％、さらに典型的には少なくとも約９０〜９５％、又はそれ以上の相同性を有する場合には、２つのタンパク質（又はタンパク質の一領域）は著しい相同性を有している。本発明によれば、著しい相同性を有するアミノ酸配列は、より詳細には以下に述べられるようなストリンジェントな条件の下で、トランスポーターペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００７３】
図３には、本発明のトランスポータータンパク質をコード化している遺伝子において見出されたＳＮＰ情報を示す。ＳＮＰは、１３３４４７位置での非同義ｃＳＮＰ（Ｃ／Ａ転換）、及び制御／調節因子に影響し得るＯＲＦの５’位（９８１、１０１２、１９９０）での３つのＳＮＰを含む、２９４の異なるヌクレオチド位置で確認された。
【００７４】
トランスポーターペプチドのパラログは、トランスポーターペプチドの少なくとも一部に対して、ある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、ヒトの遺伝子によってコード化され、また同様の活性又は機能を有しているものとして、容易に同定することができる。アミノ酸配列が、与えられた領域又はドメインを通じて、典型的には少なくとも約６０％以上、さらに典型的には約７０％以上の相同性を有する場合、２つのタンパク質は典型的なパラログであると考えられる。このようなパラログは、より詳細には以下に述べられるような、モデレートからストリンジェントな条件の下で、トランスポーターペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズする核酸配列によりコード化される。
【００７５】
トランスポーターペプチドのオルトログは、トランスポーターペプチドの少なくとも一部に対してある程度の著しい配列相同性／同一性を有し、他の生体の遺伝子によってコード化されているものとして、容易に同定することができる。オルトログは、好適には、哺乳類、さらに好適には霊長類から単離され、ヒトの治療ターゲット及び治療薬剤の開発のために用いられる。このようなオルトログは、より詳細には以下に述べられるような、モデレートからストリンジェントな条件の下で、トランスポーターペプチドをコード化する核酸分子とハイブリダイズするような核酸配列によりコード化され、これはタンパク質を生成する２つの生体の関連性に依存している。
【００７６】
本発明のトランスポーターペプチドの非天然の変異体は、組み換え技術を用いて容易に生成することができる。このような変異体には、トランスポーターペプチドのアミノ酸配列中における欠失、付加、置換によるものが含まれるが、これに限定されるものではない。例えば、置換の１種として、保存的アミノ酸置換が挙げられる。この置換は、トランスポーターペプチドにおける特定のアミノ酸が、同様の特徴をもつ他のアミノ酸によって置換されるものである。保存的置換においては、脂肪族のアミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中の一つが他の一つに置換、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒとの交換、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの交換、芳香族残基ＰｈｅとＴｙｌとの置換がある。表現型に現れないアミノ酸置換に関する指針については、Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０）に述べられている。
【００７７】
変異トランスポーターペプチドは、完全に機能しているか、又は、例えばリガンド結合能、リガンド輸送能、信号伝達媒介能等のような活性の一つ以上において機能が欠落していることがある。完全機能的な変異体には、典型的には、保存的な変異、又は致命的でない残基あるいは領域内での変異体のみが含まれる。図２には、タンパク質解析の結果が示されており、致命的なドメイン／領域を特定するのに使用することができる。機能性変異体には、機能が変化しない、又は著しい機能変化の無い類似アミノ酸の置換も含まれる。他方、このような置換は、機能に対してある程度プラス又はマイナスの影響を及ぼすことがある。
【００７８】
非機能性変異体には、典型的には、一つ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、導入、反転、切断、又は致命的な残基あるいは領域での置換、欠失、導入、反転が含まれる。
【００７９】
機能において必須のアミノ酸は、例えば、特定部位の突然変異誘発、又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５ （１９８９））等の当該分野において既知の方法により、特に図２に示す結果を用いて確認することができる。後者の手順では、分子内の全ての残基において、単独のアラニン突然変異を導入する。この結果生じた変異体分子は、その後、トランスポーター活性のような生物活性、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖活性分析のようなアッセイのために試験される。結合対象／基質結合にとって重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、光学親和性ラベル等の構造解析によって決定される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２４：８９９−９０４ （１９９２）； ｄｅ Ｖｏｓ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【００８０】
本発明はトランスポーターペプチドのフラグメントを提供し、さらにこれに加えて、該フラグメント、特に図２に特定された残基を含むフラグメントを含む、及びから成るタンパク質及びペプチドを提供するものである。しかしながら、本発明に関連するフラグメントは、本発明より以前に公開されているフラグメントを含むものとは見なされない。
【００８１】
フラグメントは、ここで用いられる場合、トランスポーターペプチドに隣接するアミノ酸残基を、少なくとも８、１０、１２、１４、１６又はそれ以上含んでいる。このようなフラグメントは、１以上のトランスポーターペプチドの生物活性を保持する能力によって選択されるか、あるいは例えば、基質との結合又は抗原としての作用等の機能を果たす能力によって選択され得る。特に重要なフラグメントは生物活性フラグメントであり、これは例えば、８又はそれ以上のアミノ酸のペプチドである。このようなフラグメントは、典型的には、例えば活性部位、膜貫通ドメイン、又は基質結合ドメインのような、トランスポーターペプチドのドメイン又はモチーフを含んでいる。さらに、可能なフラグメントとしては、ドメイン又はモチーフ含有フラグメント、溶解性ペプチドフラグメント、抗原性構造含有フラグメントを含むが、これに限定されるものではない。予想されるドメイン及び機能性部位は、当業者にとって容易に入手可能な公知のコンピュータプログラム（例えばＰＲＯＳＩＴＥ分析）により、容易に確認することができる。このような分析結果の１つを図２に示す。
【００８２】
ポリペプチドは、一般に２０天然アミノ酸と呼ばれている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸をしばしば含むことがある。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシング及び翻訳後修飾等の自然の過程、又は当該分野において公知の化学修飾技術によって修飾され得る。トランスポーターペプチドにおいて自然に生じる一般的な修飾については、基本的なテキスト、詳細な研究論文及び文献に記述されており、これは当業者においては周知である（これらの特性のいくつかは図２において確認される）。
【００８３】
既知の修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合付加、ヘム部分の共有結合付加、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合付加、脂質又は脂質誘導体の共有結合付加、ホスファチジルイノシトールの共有結合付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化を含むが、修飾はこれに限定されるものではない。
【００８４】
このような修飾は当業者には周知であり、科学文献において非常に詳細に記述されてきた。グリコシル化、脂質付加、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ＡＤＰリボシル化など、特に一般的な修飾は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９３）のような、殆どの基本テキストにおいて記述されている。この点に関する詳細な文献としては、Ｗｏｌｄ， Ｆ．， Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｂ．Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １−１２ （１９８３）； Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２： ６２６−６４６ （１９９０）） ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ． （Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２ （１９９２） のような多くの文献を利用することができる。
【００８５】
したがって、本発明のトランスポーターペプチドは、置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによってコード化されていない、置換基が含まれている、成熟トランスポーターペプチドが、例えばトランスポーターペプチドの半減期を長くする化合物のような他の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合しているか、又は付加アミノ酸が、例えば成熟トランスポーターペプチドの主、副配列、又は精製配列、あるいは前タンパク質配列のような、成熟トランスポーターペプチドと融合しているといった、誘導体又は類似体をも包含するものである。
【００８６】
タンパク質／ペプチドの使用
本発明のタンパク質は、図面及び背景技術に示される機能情報に関連した、実質的及び特異的なアッセイにおいて、例えば、抗体を高める、又は他の免疫反応を誘発させるため、生物液中でのタンパク質（又はその結合対象、又はリガンド）レベルの定量のためのアッセイに用いる試薬（ラベル化試薬を含む）として、あるいは、対応するタンパク質を選択的に発現する組織のマーカー（組織の分化又は発達のある特定段階、あるいは疾患の状態）として使用することができる。タンパク質が、他のタンパク質と結合しているか又は結合し得る場合（例えば、トランスポーター−効果器タンパク質相互作用、トランスポーター−リガンド間相互作用）、このタンパク質を用いて結合相手を同定し、結合相互作用の阻害剤を同定するシステムを開発することができる。これらの一部又は全てを使用することにより、試薬グレード、又は商業製品としてのキットフォーマットへの開発が可能となる。
【００８７】
上に列記した使用を実際に行う方法は、当業者にとって周知のことである。このような方法を開示している参考文献としては、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”２ｄ ｅｄ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｅ． Ｆ． Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｄｓ．， （１９８９） “Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｅｒｇｅｒ， Ｓ． Ｌ． ａｎｄ Ａ． Ｒ． Ｋｉｍｍｅｌ ｅｄｓ．， （１９８７）がある。
【００８８】
本発明のペプチドの潜在的な用途は、主にタンパク質の起源に基づいており、同様にタンパク質の分類／作用に基づいている。例えば、ヒトから単離したトランスポーター、及びそれらのヒト／哺乳類オルトログは、哺乳類の治療用医薬、例えば、ヒト用の医薬、特に、トランスポーターを発現する細胞又は組織中での生物反応又は病理学的反応の変調に用いられる医薬を発見するためのターゲットとして有用である。図１に示す実験データは、本発明のトランスポータータンパク質が、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓で発現することを示した。具体的には、仮想ノーザンブロットでは精巣で発現することを示した。さらに、ＰＣＲベースの組織スクリーニングパネルでは、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、膵臓、及び精巣で発現することを示した。医薬製剤のうちの多くの割合のものが、トランスポータータンパク質、特にカリウムチャンネルサブファミリーメンバーの活性を変調するものとして開発されている（背景技術参照）。背景技術及び図面に記載されている構造情報及び機能情報、特に図１の発現情報と組み合わせることによって、本発明の分子の特異的及び本質的な使用が提供される。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。このような使用は、ここに示されている情報と、当業者において既知の情報、及びルーチン実験を用いて、容易に決定することができる。
【００８９】
本発明のタンパク質（本発明以前に開示されている変異体及びフラグメントを含む）は、カリウムチャンネルサブファミリーに関連付けられるトランスポーターに関連する生物学的アッセイに有用である。このようなアッセイは、特にこのトランスポーターを発現する細胞及び組織において、本発明の一つが属するトランスポーターサブファミリーに特異的なトランスポーター関連症状の診断及び治療に有用な、公知のトランスポーターの機能、活性、あるいは性質の何れかに関係している。図１に示す実験データは、本発明のトランスポータータンパク質が、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓で発現することを示した。具体的には、仮想ノーザンブロットでは精巣で発現することを示した。さらに、ＰＣＲベースの組織スクリーニングパネルでは、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、膵臓、及び精巣で発現することを示した。
【００９０】
本発明のタンパク質は、細胞系、又は無細胞系における薬剤スクリーニングアッセイにおいても有用である（Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９２， Ｓｅｐｔ １０（９）；９７３−８０）。細胞系では、天然型、すなわちトランスポーターを正常に発現する細胞であり、生体組織検査、又は細胞培地中で増殖することができる。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。他の例では、細胞系アッセイは、トランスポータータンパク質を発現する組み換え宿主細胞に関係している。
【００９１】
ポリペプチドは、自然状態又は変異型でトランスポーターに関連する特定の疾患又は症状を引き起こすタンパク質のトランスポーター活性を変調する化合物を同定するために用いることができる。本発明のトランスポーターと、適切な変異体及びフラグメントの両者は、トランスポーターへの結合能力を持つ候補化合物をアッセイするための高効率スクリーンにおいて使用することができる。これらの化合物は、さらにこれらのトランスポーター活性に対する影響を判定するために、機能性トランスポーターに対してスクリーニングを行うことができる。さらにこれらの化合物は、動物又は無脊椎動物系における、活性／効果を判定するために試験することができる。化合物は、トランスポーターを望ましい程度までに活性化（アゴニスト）又は不活性化（アンタゴニスト）するかどうか判定される。
【００９２】
さらに、本発明のタンパク質は、トランスポータータンパク質と、トランスポータータンパク質と通常相互作用する分子、例えば、トランスポータータンパク質が通常相互作用する信号経路の基質又は構成成分との間での相互作用を促進又は阻害する能力を持つ化合物（例えば、他のトランスポーター）をスクリーニングするのに用いることができる。このようなアッセイでは、一般的には、トランスポータータンパク質又はフラグメントが、ターゲット分子と相互作用し、タンパク質とターゲットとの複合物を検出するか、又は膜電位の変化、タンパク質のリン酸化、ｃＡＭＰ代謝回転、アデニル酸シクラーゼ活性化などの信号伝達に関連した効果のような、トランスポータータンパク質とターゲットとの間の相互作用の生化学的結果を検出することのできる条件で、トランスポータータンパク質と候補化合物とが結合される工程が含まれる。
【００９３】
候補化合物としては、例えば、１）最後部がＩｇの融合ペプチド、及びランダムペプチドライブラリを含む可溶性ペプチド（例えば、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４ （１９９１）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６ （１９９１）参照）、及びＤ−及び／又はＬ−型アミノ酸からできている組み合わせ化学誘導分子ライブラリを含むペプチド、２）ホスホペプチド（例えば、ランダム、又は部分的に変質したホスホペプチドライブラリ。例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８ （１９９３）参照）、３）抗体（例えば、ポリクローン抗体、モノクローン抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリフラグメントを含む単鎖抗体、及び抗体のエピトープ結合フラグメント）、４）小さな有機及び無機分子（例えば、組み合わせ及び天然生成物ライブラリから得られる分子）が含まれる。
【００９４】
ある候補化合物は、リガンド結合と競合する受容体の可溶性フラグメントである。他の候補化合物には、変異トランスポーター、又はトランスポーター機能に影響を及ぼす変異体を含む適切なフラグメントがあり、このためにリガンドとの競合が起こる。したがって、例えば、高い親和性を有するか、又はフラグメントがリガンドと結合し解離しないような、リガンドと競合するフラグメントが本発明に含まれる。
【００９５】
本発明はさらに、トランスポーター活性を変調（促進又は阻害）する化合物を同定するための、他のエンドポイントアッセイを含む。このアッセイは、一般的に、トランスポーター活性を示す信号伝達経路における挙動のアッセイに関連している。このため、リガンドの輸送、細胞膜電位の変化、タンパク質の活性化、トランスポータータンパク質に依存して信号カスケードに対する応答が上方又は下方調節される遺伝子発現の変化についてのアッセイを行うことができる。
【００９６】
トランスポーターにより媒介される、生物学的又は生化学的な機能は、何れもエンドポイントアッセイとして用いることができる。これらは、ここに記載されている全ての生化学的又は生化学的／生物学的挙動を含み、ここに引用される文献にはこれらのエンドポイントアッセイのターゲットが折り込まれており、また、他の機能については、当業者において公知であるか、又は図面、特に図２の情報を用いて、容易に確認することができる。特に、トランスポーターを発現する細胞又は組織の生物学的機能についてのアッセイを行うことができる。図１に示す実験データは、本発明のトランスポータータンパク質が、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓で発現することを示した。具体的には、仮想ノーザンブロットでは精巣で発現することを示した。さらに、ＰＣＲベースの組織スクリーニングパネルでは、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、膵臓、及び精巣で発現することを示した。
【００９７】
結合及び／又は活性化化合物は、キメラトランスポータータンパク質を用いることによりスクリーニングを行うこともでき、アミノ末端細胞外ドメイン又はその一部、あるいは、７つの膜貫通セグメントの何れか又は細胞内又は細胞外ループの何れか、及びカルボキシ末端細胞内ドメインのような膜貫通ドメイン全体あるいはサブリジョン又はその一部は、異種ドメイン又はサブリジョンにより置換され得る。例えば、リガンド結合領域は、異なるリガンドと相互作用するものとして用いられることができ、この場合、天然のトランスポーターによって認識される。したがって、異なる一組の信号伝達成分を、活性化のエンドポイントアッセイとして利用することができる。これにより、トランスポーターの由来する特定の宿主細胞以外のものにおいてアッセイを行うことが可能となる。
【００９８】
本発明のタンパク質はまた、トランスポーターと相互作用する化合物（例えば、結合相手及び／又はリガンド）を発見するため設計される方法である競争結合アッセイにも有用である。このために、化合物がポリペプチドと結合又は相互作用できる条件下で、化合物をトランスポーターポリペプチドと接触させる。可溶性トランスポーターポリペプチドもまた混合物中に加えられる。テスト化合物が可溶性トランスポーターポリペプチドと相互作用する場合、トランスポーターターゲットから形成される複合体の量、又は活性は減少する。このタイプのアッセイは、特にトランスポーターの特定領域と相互作用する化合物を模索する場合に有用である。このため、ターゲットとなるトランスポーター領域と競合する可溶性ポリペプチドは、対象となる領域に対応したペプチド配列を含むように設計されている。
【００９９】
無細胞系薬剤のスクリーニングアッセイを行うためには、タンパク質の一方又は両方の非複合化形態からの複合化形態の分離を効率化し、アッセイを自動化するために、トランスポータータンパク質又はフラグメント、そのターゲット分子の何れかを固定化するのが望ましい場合がある。
【０１００】
薬剤スクリーニングアッセイにおいては、マトリックスにタンパク質を固定化する技術を使用することができる。ある例では、タンパク質にマトリックスに結合することのできるドメインを付加した融合タンパク質を得ることができる。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質は、グルタチオンセファローズビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）又はグルタチオン誘導マイクロタイタープレート上に吸着され、細胞溶解物（例えば、３５Ｓ−ｌａｂｅｌｅｄ）と候補化合物とが結合され、複合体形成条件（例えば、塩及びｐＨの生理学的条件）の下で混合物がインキュベートされる。インキュベートの後、非結合ラベルの除去のためにビーズは洗浄され、マトリックスを固定化して、放射性ラベルを直接、又は複合体を分離した後の上澄みを測定することにより定量される。あるいは、複合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりマトリックスから分離することができ、標準の電気泳動技術を用いることによって、ゲルからビーズフラクション中のトランスポーター結合タンパク質のレベルを定量することができる。例えば、ポリペプチド又はそのターゲット分子のどちらかが、当業者に周知の技術を利用して、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を用いて固定化される。あるいは、タンパク質と反応し、タンパク質とターゲット分子との結合を妨げない抗体は、プレートのウェルに誘導化され、このタンパク質は抗体との結合によりそのウェルの中に捕らえられる。トランスポーター結合タンパク質の組成物と候補化合物は、トランスポータータンパク質存在ウェル中でインキュベートされ、ウェルに捕らえられた複合体の量を測定する。このような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ固定複合体による前述の方法に加えて、トランスポータータンパク質ターゲット分子に反応性のある抗体、又は、トランスポータータンパク質に反応性がありターゲット分子と競合する抗体を用いた複合体の免疫検出法、及びターゲット分子と関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイが含まれる。
【０１０１】
本発明のトランスポーターのうちの１つを変調する薬剤は、上述の分析方法を単独あるいは組み合わせて用いることにより同定することができる。一般的には、最初と最後に細胞系又は無細胞系のシステムを用いて、動物又は他のモデルシステムにおける活性を確認することが好ましい。このようなモデルシステムは、当業者に周知であり、本記載において容易に用いることができる。
【０１０２】
これらの薬剤スクリーニングアッセイによって同定されるトランスポータータンパク質活性のモジュレータは、トランスポーターを発現する細胞又は組織に処置することにより、トランスポーター経路により媒介される疾患を患う患者の治療に用いることができる。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。これらの治療方法には、薬剤組成物中のトランスポーター活性のモジュレータを患者の治療に必要な量投与する工程が含まれており、このモジュレータはここに記載されるようにして同定される。
【０１０３】
本発明の他の観点では、トランスポーターと結合又は相互作用する、又はトランスポーター活性に関連している他のタンパク質を同定するために、２−ハイブリッドアッセイ又は３−ハイブリッドアッセイ（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，２８３，３１７； Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２； Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１２０４６−１２０５４； Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ． （１９９３）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４； Ｉｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６； ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００参照）において、トランスポータータンパク質を「ｂａｉｔタンパク質」として使用することができる。このようなトランスポーター結合タンパク質は、例えば、下流因子としてのトランスポータータンパク質、又はトランスポーターターゲットによる信号伝達に関与している。あるいは、このようなトランスポーター結合タンパク質は、トランスポーター阻害剤であることがある。
【０１０４】
２−ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインから成る、大部分の転写調節因子のモジュラー性に基づいている。簡単に言うと、このアッセイでは２つの異なるＤＮＡ構造を利用する。一方の構造においては、トランスポータータンパク質をコードしている遺伝子は、既知の転写調節因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化している遺伝子に融合される。他方の構造においては、ＤＮＡ配列ライブラリから得られ、未確認のタンパク質（「ｐｒｅｙ」又は「ｓａｍｐｌｅ」）をコード化しているＤＮＡ配列が、既知の転写調節因子の活性化ドメインをコード化している遺伝子に融合される。「ｂａｉｔタンパク質」及び「ｐｒｅｙタンパク質」が生体内で相互作用することができ、トランスポーター依存複合体を形成する場合、転写調節因子のＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインは近接する。この近接により、転写調節因子に反応する転写調節部位に結合可能なリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を行うことができる。リポーター遺伝子の発現は検出することが可能であり、機能的転写調節因子を含んでいる細胞コロニーを単離及び使用して、トランスポータータンパク質と相互作用するタンパク質をコード化するクローン遺伝子を得ることができる。
【０１０５】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイによって同定される新規な薬剤に関する。したがって、ここに記載されるようにして同定された薬剤を適当な動物のモデルに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本発明で同定された薬剤（例えばトランスポーター変調薬剤、アンチセンストランスポーター核酸分子、トランスポーター特異抗体、又はトランスポーター結合対象）は、これらの薬剤の処方における有効性、毒性、副作用を判定するために、動物、又は他のモデルで用いることができる。あるいは、本発明で同定された薬剤は、このような薬剤の作用のメカニズムを決定するために、動物又は昆虫のモデルで使われることができる。さらに、本発明は、ここに記載される治療のためのスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤の使用に関する。
【０１０６】
本発明のトランスポータータンパク質は、ペプチドにより媒介される疾患又は疾患素質の診断のためのターゲットを提供するのに有用である。したがって、本発明は、細胞、組織、又は生体中におけるタンパク質（又はコード化したｍＲＮＡ）の存在、あるいはそのレベルを検出する方法を提供するものである。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。この方法は、生物サンプルと、トランスポータータンパク質との相互作用能力を有する化合物との接触に関係しており、ここでは相互作用について検出することができる。このようなアッセイは、単検出形態、又は抗体チップアレイのような多検出形態で与えられる。
【０１０７】
サンプル中のタンパク質を検出する１つの薬剤は、タンパク質に選択的に結合することのできる抗体である。生物サンプルには、被験者から単離されるか、又は被験者の内部に存在する組織、細胞、生物液体が含まれる。
【０１０８】
本発明のペプチドは、ペプチド変異体を持つ患者のタンパク質の活性、疾患又は疾患素質の診断に用いるためのターゲット、特に現存するタンパク質ファミリー以外のものとして知られる活性、及び症状のターゲットを提供するものである。したがって、ペプチドは生物学的サンプルから単離されることができ、また、異常ペプチドを生じる遺伝子突然変異の存在についてアッセイを行うことができる。これは、アミノ酸置換、欠失、挿入、再配置（異常なスプライシング挙動の結果生じる）、及び不適当な翻訳後の修飾を含む。分析方法としては、変容電気泳動移動度、変容トリプシンペプチド消化、細胞系又は無細胞系アッセイによる変容トランスポーター活性、リガンド又は抗体の変容結合パターン、変容等電点、直接アミノ酸配列、及びタンパク質の変異の検出に有用な他の公知のアッセイ技術を含む。このようなアッセイは、単検出形態、又は抗体チップアレイのような多検出形態で与えられる。
【０１０９】
ペプチドのＩｎ ｖｉｔｒｏ検出技術としては、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）、ウェスタンブロット、抗体、又はタンパク質結合剤のような検出試薬を用いた免疫沈降、免疫蛍光検査法を含む。あるいは、ラベルされた抗ペプチド抗体、又は他のタイプの検出試薬を被験者に導入することにより、被験者のｉｎ ｖｉｖｏ検出を行うことができる。例えば、被験者中のこのマーカーの存在及び位置を標準のイメージング技術によって検出することができる放射性マーカーを、抗体にラベルすることができる。被験者において発現されたペプチドの対立変異体を検出する方法、及びサンプル中のペプチドのフラグメントを検出する方法は、特に有用である。
【０１１０】
ペプチドはまた、ゲノム薬理学分析においても有用である。ゲノム薬理学では、薬剤の変化の傾向と、影響を受けたヒトの異常挙動に従って、薬剤に対しての応答における著しい遺伝的変異について臨床的に取り扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ， Ｍ． （Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２３（１０−１１）： ９８３−９８５ （１９９６））、及びＬｉｎｄｅｒ， Ｍ．Ｗ． （Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３（２）：２５４−２６６ （１９９７））を参照されたい。これらの変異の臨床的な結果、個人の代謝変異の結果として、ある個人に対しては治療薬剤が重い毒性となり、又はある個人に対しては治療の失敗に終わる。このように、個人の遺伝子型は、体内で治療化合物を作用させる方法、又は体が化合物を代謝する方法を決定することができる。さらに、酵素を代謝させる薬剤の活性は、薬剤の作用の強度と期間に影響する。このように、個人のゲノム薬理学は、個人の遺伝子型に基づいた予防、又は治療的な処置において、効果的な化合物、又はこのような化合物の効果的な投与量の選択を可能とする。遺伝子多形性の発見により、酵素代謝性の薬剤において、患者が期待される薬効を得られない、不自然な薬効を示す、又は標準の投薬量から重大な毒性を被るといったことの理由を説明することができる。多形性は、強い代謝系の表現型と弱い代謝系の表現型で表されることができる。したがって、遺伝子の多形性は、ある集団のトランスポーター機能の１つ以上が他の集団のそれと異なるような、トランスポータータンパク質の対立タンパク質変異に至るかもしれない。このように、ペプチドは治療法に影響する遺伝子の素因を確認するためのターゲットとなり得る。このため、リガンドベースの治療において、多形性は、末端アミノ基の細胞外ドメイン及び／又は他のリガンド結合領域におけるリガンド結合活性及びトランスポーター活性が、より高い、又はより低いことを引き起こし得る。したがって、多形性を含む集団においては、治療効果を最大にするように、リガンド投薬量は必然的に修正される。遺伝子型に代わるものとしては、特定の多形性のペプチドを同定することができる。
【０１１１】
ペプチドはまた、タンパク質の発現がない、発現が不適当、又は発現が不必要であることによって特徴づけられる障害の治療に有用である。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。したがって、治療方法としては、トランスポータータンパク質又はフラグメントの使用が含まれる。
【０１１２】
抗体
本発明は、本発明のペプチド、このようなペプチドを含むタンパク質、それらの変異体及びフラグメントの１つに選択的に結合する抗体を提供するものである。ここで用いられている場合、抗体がターゲットペプチドと結合し、無関係なタンパク質と強く結合しないような場合、抗体は選択的にターゲットペプチドと結合している。抗体がターゲットペプチドと実質的に相同性の無い他のタンパク質と結合していても、そのペプチドが抗体のターゲットとなるペプチドに対してフラグメント又はドメインにおける相同性を有している限り、抗体は選択的にペプチドを結びつけると考えられる。この場合、ペプチドに結合している抗体は、ある程度の交差反応性を持つにも関わらず、選択的であると理解される。
【０１１３】
ここで用いられる場合、抗体は当該分野で認められているものと同じ用語で定義され、これらは、哺乳類生体により生成され、抗原の攻撃に対して応答するマルチサブユニットタンパク質である。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２、及びＦｖのような抗体のフラグメントが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１１４】
ターゲットペプチドを得るための、抗体の生成及び／又は同定について、多くの方法が知られている。このような方法のいくつかは、Ｈａｒｌｏｗ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている。
【０１１５】
一般に、抗体を生成するためには、単離ペプチドを免疫原として用い、例えばラット、ウサギ又はマウスのような哺乳類生体に投与される。全長タンパク質、抗原性ペプチドフラグメント又は融合タンパク質が用いられる。特に重要なフラグメントは、図２に特定されているような機能性ドメインをカバーするものであり、また、タンパク質アラインメント法を使用し、図面に示されているようにして、容易に確認することができるファミリーと配列相同性又は相違性を持つドメインである。
【０１１６】
抗体は、トランスポータータンパク質の領域、又は単離されたフラグメントから好適に調製される。抗体は、ここに記載されるペプチドの何れの領域からも調製することができる。しかしながら、好適な領域としては、機能／活性及び／又はトランスポーター結合対象相互作用に関係している領域が含まれる。図２は特に重要な領域を特定するのに用いることができ、配列アラインメントは保持された特異な配列フラグメントを特定するのに用いることができる
【０１１７】
抗原性フラグメントは、一般的に、少なくとも８つの隣接するアミノ酸残基を含んでいる。しかしながら、抗原性ペプチドは、少なくとも１０、１２、１４、１６以上のアミノ酸残基を含むことができる。このようなフラグメントは、例えば、タンパク質の表面上に位置する領域、例えば、親水性領域に対応するフラグメントのような物理的な性質、あるいは配列の特異性（図２参照）に基づいて選択することができる。
【０１１８】
本発明の抗体の検出は、検出可能物質と抗体とのカップリング（すなわち、物理的な結合）によって容易にすることができる。検出可能物質の例としては、例えば、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が含まれる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、好適な補欠分子族の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアン酸塩、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、又はフィコエリトリンが含まれ、発光性物質の例としては、ルミノールが含まれ、生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ、そして、適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが含まれる。
【０１１９】
抗体の使用
抗体は、アフィニティクロマトグラフィ、又は免疫沈降のような標準の技術によって、本発明のタンパク質の１つを単離するために用いることができる。抗体は、細胞からの天然タンパク質、及び宿主細胞に表現される組換えによって生成されたタンパク質の精製を容易にすることができる。さらに、このような抗体は、組織や生体内のタンパク質の発現パターンを決定するため、細胞や組織内における本発明のタンパク質の存在の検出に、通常の開発段階を経ずに用いることができる。図１に示す実験データは、本発明のトランスポータータンパク質が、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓で発現することを示した。具体的には、仮想ノーザンブロットでは精巣で発現することを示した。さらに、ＰＣＲベースの組織スクリーニングパネルでは、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、膵臓、及び精巣で発現することを示した。さらに、このような抗体は、発現の量及びパターンを評価することによって、ｉｎ ｓｉｔｕ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、細胞溶解物中、及び上澄み中でのタンパク質の検出に用いることができる。また、このような抗体は、生物学的症状の発展又は進行間における、異常な組織分布、又は異常な発現を評価するのに用いることができる。全長タンパク質の循環フラグメントにおける抗体検出は、代謝回転を確認するのに用いることができる。
【０１２０】
さらに、抗体は、タンパク質機能に関連した疾患の活発な段階、又は該疾患素因を持つ個人といった、疾患の症状発現を評価するのに用いることができる。障害が不適当な組織分布、発展性の発現、タンパク質の発現レベル、又は発現／進行状態に起因する場合、抗体を通常のタンパク質に対して調製することができる。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。障害がタンパク質の特定の変異により特徴づけられる場合、この変異タンパク質に特異的な抗体を、特定の変異タンパク質の存在のアッセイを行うために用いることができる。
【０１２１】
抗体はまた、生体内の各種組織における、細胞の正常又は異常な細胞小器官の位置を評価するのに用いることができる。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。診断としての使用は、遺伝子のテストだけでなく、治療法をモニターすることにも適用することができる。したがって、治療が最終的に、発現レベル、又は異常配列及び異常組織配布の存在、又は発展性の発現を修正することを目指すものである場合、タンパク質又は関連するフラグメントに直接的に対する抗体を、治療の有効性をモニターするために用いることができる。
【０１２２】
さらに、抗体はゲノム薬理学分析において有用である。したがって、多形タンパク質に対して調製される抗体は、治療法の修正を必要とする個人を特定するために用いることができる。抗体はまた、電気泳動、等電点、トリプシンペプチド消化、当該分野において周知な他の物理的なアッセイによって分析される、異常タンパク質の免疫学的マーカーのような診断上のツールとしても有用である。
【０１２３】
抗体はまた、組織型の分類にも有用である。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。このように、特定のタンパク質が特定の組織中の発現と相関していた場合、このタンパク質に特異な抗体を、組織型を同定するために用いることができる。
【０１２４】
抗体はまた、タンパク質機能を阻害するのに有用であり、例えば、リガンドやタンパク質結合相手のような結合対象へのトランスポーターペプチドの結合をブロックする。これらの使用は、タンパク質の機能阻害に関連する治療法における、治療環境において適用されることができる。抗体は、例えば、結合をブロックすることにより、ペプチド活性の変調（アゴナイズ又はアンタゴナイズ）を阻害することに用いることができる。抗体は、機能のために必要な部位を含む特定のフラグメントに対して、又は細胞又は細胞膜と関係している完全タンパク質に対して調製される。図２に、本発明のタンパク質に関する構造情報を示す。
【０１２５】
本発明は、生物学的サンプル中のタンパク質の存在を検出するために抗体を用いたキットを包含する。キットには、ラベル化された、又はラベル化可能な抗体と、生物学的サンプル中でタンパク質を検出するための化合物又は試薬を含み、；サンプル中のタンパク質量を決定する手段；標準サンプルのタンパク質量と比較する手段；及び使用の説明、とを含む。このようなキットは、単一のタンパク質、又はエピトープを検出するために提供されるか、又は抗体検出アレイのように、多数のエピトープのうちの１つを検出するように設定されることができる。アレイとしては、核酸アレイが後述され、また抗体アレイのための同様の方法も開発されている。
【０１２６】
核酸分子
本発明は、さらに本発明のトランスポーターペプチド又はタンパク質をコード化する単離核酸分子（ｃＤＮＡ、転写及びゲノム配列）を提供するものである。このような核酸分子は、本発明のトランスポーターペプチドの１つ、又はこれらの対立変異体、又はこれらのオルトログ又はパラログをコード化する核酸分子から成る、実質的に成る、又は含んでいる。
【０１２７】
ここで用いられる場合、「単離」核酸分子とは、核酸の天然起源における他の核酸の存在から分離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸の由来となる生物のゲノムＤＮＡにおいて、核酸のフランキング配列（すなわち、５’、及び３’末端に位置する配列）は含まない。しかしながら、例えば、約５ＫＢ、４ＫＢ、３ＫＢ、２ＫＢ又は特に１ＫＢ以上又はこれ以下、特に配列によりコード化された隣接ペプチドのように、いくつかのフランキングヌクレオチド配列があるが、同一の遺伝子の配列によりコード化されたペプチドは、ゲノム配列中のイントロンにより分離されている。重要な点は、核酸が、ここに記載されているような特定の操作、例えば、組み換え発現、プローブやプライマーの調製、核酸配列のための他の使用等に取り扱うことができるように、遠くの重要でないフランキング配列から分離されているということである。
【０１２８】
さらに、例えば、転写／ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組み換え技術により製造される場合には、他の細胞物質、又は培地、また化学的に合成される場合には前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない。しかしながら、この核酸分子は、他のコード化又は調整配列に融合されることができるが、これは単離されたものとして考えられる。
【０１２９】
例えば、ベクターに含まれる組み換えＤＮＡ分子は、単離されたものとして考えられる。さらに、単離したＤＮＡ分子の例としては、非相同的な宿主細胞に保持された組み換えＤＮＡ分子、又は溶液中で精製（部分的又は実質的に）されたＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明の単離したＤＮＡ分子の、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏＲＮＡ転写物が含まれる。本発明により単離された核酸分子としてはさらに、合成的に製造された分子が含まれる。
【０１３０】
したがって、本発明は、図１又は３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列から成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。ヌクレオチド配列がこの核酸分子の完全なヌクレオチド配列であるとき、核酸分子はヌクレオチド配列から成る。
【０１３１】
本発明はさらに、図１又は３［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列から実質的に成る核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子において、最終的にこのようなヌクレオチド配列がごくわずかの付加核酸残基とともに存在するとき、核酸分子はヌクレオチド配列から実質的に成る。
【０１３２】
本発明はさらに、図１又は３ ［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１（転写配列）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３（ゲノム配列）］において示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は図２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に示されるタンパク質をコード化する核酸分子を提供するものである。核酸分子の最終的な核酸配列の少なくとも一部がこの核酸配列である場合、核酸分子はヌクレオチド配列を含む。これによると、核酸分子は、そのヌクレオチド配列だけであるか、又は付加的な核酸残基、例えば、自然に関する核酸配列、又は非相同的な核酸配列を有することもできる。このような核酸分子は、ごくわずかの付加的なヌクレオチドを有するか、又は数百又はそれ以上の付加的なヌクレオチドを含むこともできる。これらの種々のタイプの核酸分子を容易に生成／単離する方法については、以下に簡単に述べる。
【０１３３】
図１及び３には、コード及び非コードの配列の両者が提供される。本発明のヒトゲノム配列（図３）、及びｃＤＮＡ／転写配列（図１）より、図中の核酸分子は、ゲノムイントロン配列、５’と３’の非コード配列、遺伝子調節領域、及び非コード遺伝子間配列を含んでいる。一般に、図１と図３の両者に記載されているこのような配列の特徴は、当該分野において公知の計算ツールを用いて容易に特定することができる。以下で議論されるように、いくつかの非コーディング部位、特にプロモーターのような遺伝子の調節因子は、例えば、非相同的な遺伝子発現の制御、遺伝子活性を変調する化合物同定のターゲット等の種々の目的にとって有用であり、ここに提供されるゲノム配列のフラグメントとして特別にクレームされている。
【０１３４】
単離した核酸分子は、成熟したタンパク質に加えて付加的アミノ末端あるいはカルボキシ末端アミノ酸、又は成熟ペプチド内のアミノ酸（例えば、成熟形態が１以上のペプチド鎖を有する場合）をコード化することができる。このような配列は、前駆体から成熟した形態へのタンパク質のプロセシングにおいて、タンパク質搬送の促進、タンパク質半減期の延長あるいは短縮、又はタンパク質のアッセイ又は製造の際の操作の効率化、又は他の事象における役割を果たし得る。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕの場合、付加アミノ酸は細胞酵素によって成熟したタンパク質へとプロセシングされる。
【０１３５】
上述したように、単離した核酸分子は、単独でトランスポーターペプチドをコード化している配列、成熟したペプチドをコード化している配列、そして、主、又は副配列（例えば、ｐｒｅ−ｐｒｏ、ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎ配列）のような付加的なコード配列を含むが、これに限定されるものではなく、付加的なコード配列に加えて、付加的な非コード配列、例えば、イントロンと非コード５´及び３´配列のような、転写されるものの翻訳はされずに、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化を含む）、リボソームの結合、及びｍＲＮＡの安定性の役割を果たすものを、含んでも含まなくても良い。加えて、核酸分子は、例えば、精製を容易にするようなペプチドをコード化した配列のマーカーと融合されることもできる。
【０１３６】
単離した核酸分子は、ｍＲＮＡのようなＲＮＡの形態、あるいはクローニング、化学合成技術又はその組み合わせによって生成するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態をとり得る。核酸、特にＤＮＡは、二重鎖、又は単鎖であり得る。単鎖の核酸は、コード鎖（センス鎖）、又は非コード鎖（アンチセンス鎖）であり得る。
【０１３７】
本発明はさらに、本発明のペプチドのフラグメントをコード化する核酸分子と同様に、上記したような本発明のトランスポータータンパク質の明らかな変異体をコード化する核酸分子を提供するものである。このような核酸分子は、対立変異体（同一位置）、パラログ（異なる位置）とオルトログ（異なる生体）のように自然に発生するか、あるいは組み換えＤＮＡ法又は化学合成によって生成され得る。このような非自然に発生する変異体は、核酸分子、細胞又は生体に適用されるものを含む突然変異生成技術によって生成され得る。したがって、上述したように、変異体にはヌクレオチドの置換、欠失、倒置、挿入が含まれる。変異は、コード、非コード領域のどちらか、又は両方で起こることができる。変異は、保持及び非保持アミノ酸置換の両方で生じることができる。
【０１３８】
本発明はさらに、図１及び３に示される核酸分子の非コードのフラグメントを提供するものである。好適な非コードのフラグメントとしては、プロモーター配列、エンハンサ配列、遺伝子変調配列、遺伝子終止配列が含まれるが、これに限定されるものではない。このようなフラグメントは、非相同的な遺伝子発現の制御、及び遺伝子変調薬剤の同定を行うためのスクリーニングの開発において有用である。プロモーターは、図３のゲノム配列における５’からＡＴＧ開始部位において容易に確認される。
【０１３９】
フラグメントは、１２又はそれ以上の隣接するヌクレオチド配列を含む。さらに、フラグメントは少なくとも３０、４０、５０、１００、２５０、又は５００のヌクレオチド長であり得る。フラグメントの長さは使用目的に基づく。例えば、フラグメントは、ペプチドのエピトープ結果領域をコード化することができるか、又はＤＮＡプローブ及びＤＮＡプライマーとして有用である。このようなフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知のヌクレオチド配列を用いて単離することができる。ラベル化されたプローブは、コード化領域と対応する核酸を単離するため、ｃＤＮＡライブラリ、ゲノムＤＮＡライブラリ、又はｍＲＮＡのスクリーニングに用いることができる。さらに、プライマーは、遺伝子の特定領域をクローンするためのＰＣＲ反応に用いることができる。
【０１４０】
プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドペアを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも１２、２０、２５、４０、５０又はそれ以上の連続的ヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズされたヌクレオチド配列領域を含む。
【０１４１】
オルトログ、ホモログ、及び対立変異体は、当該技術分野において周知の方法を用いて同定することができる。ペプチドの項で述べたように、これらの変異体は、ペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含み、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対して、典型的には、６０−７０％、７０−８０％、８０−９０％、より典型的には、少なくとも９０−９５％以上の相同性を有するものである。このような核酸分子は、図面に示されるヌクレオチド配列、又はこの配列のフラグメントに対して、モデレートな条件からストリンジェントな条件の下でハイブリダイズが可能なものとして、容易に同定することができる。対立変異体は、コード化している遺伝子の遺伝子位置により、容易に決定されることができる。図３のデータにより示されているように、本発明の新規なカリウムチャンネルタンパク質をコード化している遺伝子は、公知のＢＡＣ ＡＣ０２６５９７上に位置し、これはヒト染色体１８上に位置することが知られている。
【０１４２】
図３には、本発明のトランスポータータンパク質をコード化している遺伝子において見出されたＳＮＰ情報を示す。ＳＮＰは、１３３４４７位置での非同義ｃＳＮＰ（Ｃ／Ａ転換）、及び制御／調節因子に影響し得るＯＲＦの５’位（９８１、１０１２、１９９０）での３つのＳＮＰを含む、２９４の異なるヌクレオチド位置で確認された。
【０１４３】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ここで用いられる場合、互いにハイブリダイズして残存する、ペプチドをコード化しているヌクレオチド配列が、互いに少なくとも６０−７０％の相同性を有する程度にハイブリダイズ、及び洗浄が行われる条件を意味している。この条件では、ハイブリダイズして残る配列が、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又はそれ以上となる。このようなストリンジェントな条件は、当業者においては周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイズ条件の１つの例では、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリダイズし、その後、０．２ＸＳＳＣ０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃で洗浄する。低ストリンジェンシーのモデレートなハイブリダイズ条件の例は、当業者において周知である。
【０１４４】
核酸分子の使用
本発明の核酸分子は、プローブ、プライマー、化学合成中間体、及び生物学アッセイにおいて有用である。核酸分子は、図２に示されているペプチドをコード化する全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するため、及び図２に示すペプチドと同一又は関連したペプチドを生成する変異体（対立遺伝子、オルトログ等）に対応するゲノムクローンを単離するための、メッセンジャーＲＮＡ、転写／ｃＤＮＡ、及びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとして有用である。図３に示されるように、ＳＮＰは、挿入／欠失ＳＮＰ変異体（”ｉｎｄｅｌｓ”）を含む、２９４のヌクレオチド位置で確認された。
【０１４５】
プローブは、図に示されている核酸分子の全長における、何れの配列とも対応することができる。したがって、それは５’非コード領域、コード領域、及び３’非コード領域から誘導することができる。しかしながら、すでに述べたたように、フラグメントは本発明以前に公開されたフラグメントを含まないものと見なされる。
【０１４６】
核酸分子はまた、核酸分子の何れかの領域を増幅するＰＣＲのプライマーとしても有用であり、必要な長さ及び配列のアンチセンス分子の合成においても有用である。
【０１４７】
核酸分子はまた、組み換えベクターの製造にも有用である。このようなベクターとしては、ペプチド配列の一部、又は全部を発現する発現ベクターが含まれる。ベクターはまた、挿入ベクターも含み、これは他の核酸分子中に統合され、例えば、細胞ゲノム中で遺伝子及び／又は遺伝子生成物のｉｎ ｓｉｔｕ発現を変化させるために用いられる。例えば、内生コード配列では、１つ以上の特異的に導入された変異を含むコード領域の一部、又は全部との相同的な組み換えを経て置換され得る。
【０１４８】
核酸分子はまた、タンパク質の抗原部分を発現することにも有用である。
【０１４９】
核酸分子はまた、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法により、核酸分子の染色体の位置を決定するためのプローブとしても有用である。図３のデータにより示されているように、本発明の新規なカリウムチャンネルタンパク質をコード化している遺伝子は、公知のＢＡＣ ＡＣ０２６５９７上に位置し、これはヒト染色体１８上に位置することが知られている。
【０１５０】
核酸分子はまた、本発明の核酸分子の遺伝子調節領域を含むベクターの製造にも有用である。
【０１５１】
核酸分子はまた、ここに記載される核酸分子から生成されるｍＲＮＡの一部又は全部と対応しているリボザイムの設計にも有用である。
【０１５２】
核酸分子はまた、ペプチドの一部又は全部を発現しているベクターの製造にも有用である。
【０１５３】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現している宿主細胞の製造にも有用である。
【０１５４】
核酸分子はまた、核酸分子及びペプチドの一部又は全部を発現している遺伝子組み換え動物の製造にも有用である。
【０１５５】
核酸分子はまた、核酸発現の存在、レベル、形態、分布を決定するためのハイブリダイゼーションプローブとしても有用である。図１に示す実験データは、本発明のトランスポータータンパク質が、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓で発現することを示した。具体的には、仮想ノーザンブロットでは精巣で発現することを示した。さらに、ＰＣＲベースの組織スクリーニングパネルでは、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、膵臓、及び精巣で発現することを示した。
【０１５６】
したがって、プローブは、細胞、組織、生体中での核酸分子の存在の検出、又はレベルの決定に用いることができる。レベルを決定される核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。したがって、ここに記載されるペプチドに対応するプローブは、与えられた細胞、組織、生体中での発現及び／又は遺伝子コピー数の評価に用いることができる。これらの使用は、正常の場合と比較して、トランスポータータンパク質が増加又は減少していることに関係する障害の診断に適している。
【０１５７】
ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出技術には、ノーザンハイブリダイゼーション、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ検出技術には、サザンハイブリダイゼーション、及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１５８】
プローブは、トランスポータータンパク質を発現する細胞又は組織の判定を行う診断テストキットの一部として用いることができる。これは、例えば、被験者の細胞サンプル中の、トランスポーターをコード化した核酸分子、例えば、ｍＲＮＡ、又はゲノムＤＮＡのレベルを測定するか、又はトランスポーター遺伝子が変異していないか判定するものである。図１に示す実験データは、本発明のトランスポータータンパク質が、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓で発現することを示した。具体的には、仮想ノーザンブロットでは精巣で発現することを示した。さらに、ＰＣＲベースの組織スクリーニングパネルでは、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、膵臓、及び精巣で発現することを示した。
【０１５９】
核酸発現アッセイは、トランスポーター核酸発現を変調する化合物を同定するための薬剤スクリーニングにおいて有用である。
【０１６０】
したがって、本発明は、トランスポーター遺伝子の核酸発現、特に、細胞及び組織においてトランスポーターを媒介する生物学的、病理学的プロセスに関連した障害の治療に用いる化合物を同定する方法を提供するものである。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。この方法には、典型的には、トランスポーター核酸の発現を変調する化合物の能力についてアッセイを行うこと、及びその後、不必要なトランスポーター核酸発現により特徴づけられる障害を治療するのに用いることができる化合物を同定することが含まれる。このアッセイは、細胞系及び無細胞系において行われることができる。細胞系のアッセイには、天然にトランスポーター核酸を発現している細胞、又は特定の核酸配列を表現するために設計された組み換え細胞が含まれる。
【０１６１】
トランスポーター核酸発現のアッセイは、例えばｍＲＮＡレベルのような核酸レベル、又は信号経路に関連する副次化合物の直接的なアッセイと関連している。さらに、トランスポータータンパク質信号経路における応答性を向上、又は低下させる遺伝子の発現についてもアッセイすることができる。この例として、これらの遺伝子の調節領域は、ルシフェラーゼのようなリポーター遺伝子に有効に結合されることができる。
【０１６２】
したがって、トランスポーター遺伝子発現のモジュレータは、細胞と候補化合物とを接触させ、ｍＲＮＡの発現を判定する方法により同定することができる。候補化合物の存在下でのトランスポーターｍＲＮＡの発現レベルは、候補化合物非存在下でのトランスポーターｍＲＮＡの発現レベルと比較される。この比較に基づいて、候補化合物は核酸発現のモジュレータとして同定され、例えば、異常核酸発現により特徴付けられる障害の治療に用いることができる。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく大きい場合、候補化合物は核酸発現の促進剤として同定される。候補化合物存在下でのｍＲＮＡの発現が、非存在下のものと比較して統計的に著しく小さい場合、候補化合物は核酸発現の阻害剤として同定される。
【０１６３】
本発明はさらに、トランスポーターを発現する細胞及び組織におけるトランスポーター核酸発現を変調する遺伝子モジュレータとしての薬剤スクリーニングを経て同定された化合物をターゲットとして用いる治療方法を提供するものである。図１に示す実験データは、本発明のトランスポータータンパク質が、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓で発現することを示した。具体的には、仮想ノーザンブロットでは精巣で発現することを示した。さらに、ＰＣＲベースの組織スクリーニングパネルでは、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、膵臓、及び精巣で発現することを示した。変調には、上方調整（例えば、活性化又はアゴニゼーション）、下方調整（抑制又はアンタゴニゼーション）の両者、又は核酸発現が含まれる。
【０１６４】
あるいは、薬剤又は小分子がタンパク質を発現している細胞又は組織中でトランスポーター発現を阻害するものである限りは、トランスポーター核酸発現のモジュレータは、ここに記載されるスクリーニングアッセイを用いて同定される薬剤又は小分子であり得る。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。
【０１６５】
核酸分子はまた、臨床試験又は治療方法において、トランスポーター遺伝子の発現及び活性に対する変調化合物の効果をモニターするのに有用である。したがって、遺伝子発現パターンは、化合物、特に患者の耐性を向上させる化合物を用いた治療における、継続的効果のバロメータとなり得る。遺伝子発現パターンはまた、化合物に対する細胞の生理的反応を示すマーカーとなり得る。したがって、このようなモニタリングにより、化合物の投与量の増加、又は患者が耐性を示さない代替化合物の投与を行うことができる。同様に、核酸発現のレベルが望ましいレベルまで低下したならば、化合物の投与をこれに比例して減少することができる。
【０１６６】
核酸分子はまた、トランスポーター核酸発現の質的変化、特に疾患に至る質的変化の診断アッセイにも有用である。核酸分子は、ｍＲＮＡのようなトランスポーター遺伝子、及び遺伝子発現生成物における突然変異の検出に用いることができる。核酸分子は、トランスポーター遺伝子において自然発生した遺伝子突然変異を検出し、その変異を持つ被験者が変異により生じる障害の危険性を有しているかどうかを判定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。突然変異には、欠失、付加、又は遺伝子中の１以上のヌクレオチドの置換、倒置又は転移のような染色体の組み換え、異常メチル化パターンのようなゲノムＤＮＡの修飾、又は増幅のような遺伝子コピー数の変化が含まれる。機能障害に関連するトランスポーター遺伝子の変異体の検出は、疾患がトランスポータータンパク質の過剰発現、過小発現、変異発現の結果生じる場合に、活性又は感受性の診断ツールを提供するものである。
【０１６７】
トランスポーター遺伝子における突然変異をもたらしている個体は、種々の技術によって核酸レベルにおいて検出されることができる。図３には、本発明のトランスポータータンパク質をコード化している遺伝子において見出されたＳＮＰ情報を示す。ＳＮＰは、１３３４４７位置での非同義ｃＳＮＰ（Ｃ／Ａ転換）、及び制御／調節因子に影響し得るＯＲＦの５’位（９８１、１０１２、１９９０）での３つのＳＮＰを含む、２９４の異なるヌクレオチド位置で確認された。図３のデータにより示されているように、本発明の新規なカリウムチャンネルタンパク質をコード化している遺伝子は、公知のＢＡＣ ＡＣ０２６５９７上に位置し、これはヒト染色体１８上に位置することが知られている。ゲノムＤＮＡは、直接又は予めＰＣＲを用いて増幅した後で分析されることができる。ＲＮＡ又はｃＤＮＡも、同様にして用いることができる。ある使用においては、突然変異の検出は、例えば、アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥＰＣＲのような、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，６８３，１９５， 及び ４，６８３，２０２参照）、又は他のものとして、リゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０ （１９８８）； 及び Ｎａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４ （１９９４）参照）において、プローブ／プライマーの使用に関連し、特に後者は遺伝子中の変異位置の同定に有用である（Ａｂｒａｖａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：６７５−６８２ （１９９５）参照）。この方法には、患者から細胞サンプルを収集する工程と、サンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡ又はその両方）を単離する工程と、遺伝子（もし存在すれば）のハイブリダイズ及び増幅が起こりうる条件下で遺伝子に特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと核酸とを接触させる工程と、増幅生成物の存在又は非存在を検出するか、又は増幅生成物のサイズを検出し、コントロールサンプルの長さと比較する工程を含む。欠失及び挿入は、増幅生成物のサイズの変化を、正常な遺伝子型と比較することにより検出することができる。点突然変異は、増幅ＤＮＡと正常なＲＮＡ、又はアンチセンスのＤＮＡ配列とハイブリダイズすることによって確認することができる。
【０１６８】
あるいは、トランスポーター遺伝子の突然変異は、例えば、ゲル電気泳動により決定される制限酵素消化パターンの変更により、直接的に確認することができる。
【０１６９】
さらに、配列特定リボザイム（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，４９８，５３１）は、リボザイム開裂部位の成長又は減少により、特定の変異の存在の評点のために用いることができる。完全に一致する配列は、ヌクレアーゼ開裂消化分析評価、又は融点の違いによって、不一致の配列から分離することができる。
【０１７０】
特定位置での配列変化は、ＲＮａｓｅ及びＳ１保護、又は化学開裂法のようなヌクレアーゼ保護アッセイによって評価することができる。さらに、変異体トランスポーター遺伝子と野生型遺伝子との配列の相違は、直接ＤＮＡ配列解析によって決定することができる。種々の自動化された配列解析手段は、診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ， Ｃ．Ｗ．， （１９９５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）の実行において有用であり、これらには、マススペクトルによる配列解析（例えば、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９４／１６１０１； Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ３６：１２７−１６２ （１９９６）， ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３８：１４７−１５９ （１９９３）参照）も含まれる。
【０１７１】
遺伝子中の突然変異を検出する他の技術の例としては、ＲＮＡ／ＲＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖から、不一致の塩基を検出するために、開裂試薬から保護する方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２ （１９８５）， Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８５：４３９７ （１９８８）， Ｓａｌｅｅｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２１７：２８６−２９５ （１９９２））、変異体と野生型の核酸の電気泳動移動度を比較する方法（Ｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８６：２７６６ （１９８９）； Ｃｏｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． ２８５：１２５−１４４ （１９９３）； ａｎｄ Ｈａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． Ｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． ９：７３−７９ （１９９２））、及び変性剤の勾配を含んだポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型のフラグメントの動きを、勾配ゲル電気泳動を用いてアッセイする方法（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５ （１９８５））が含まれる。点突然変異を検出する他の技術の例としては、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、及び選択的プライマー伸長が含まれる。
【０１７２】
核酸分子は、治療方法としての効果を持つにも関わらず、必ずしも疾患を引き起こすわけではない遺伝子型のための、個人テストにおいても有用である。このため、核酸分子は、個人の遺伝子型と、治療に用いられる化合物に対する個人の応答との相関（薬理ゲノム相関）についての研究に用いることができる。したがって、ここに記載されている核酸分子は、治療のための適切な化合物及び投与量を選択するために、個人のトランスポーター遺伝子の変異についての評価に用いることができる。図３には、本発明のトランスポータータンパク質をコード化している遺伝子において見出されたＳＮＰ情報を示す。ＳＮＰは、１３３４４７位置での非同義ｃＳＮＰ（Ｃ／Ａ転換）、及び制御／調節因子に影響し得るＯＲＦの５’位（９８１、１０１２、１９９０）での３つのＳＮＰを含む、２９４の異なるヌクレオチド位置で確認された。
【０１７３】
このように、治療に影響する遺伝子変異を示す核酸分子は、個人におけるテイラー治療に用いることのできる診断ターゲットを提供するものである。したがって、これらの多形性を含んだ組み換え細胞及び組み換え動物の製造は、治療化合物及び薬剤投与についての効果的な臨床設計を可能とする。
【０１７４】
核酸分子は、細胞、組織、及び生体におけるトランスポーター遺伝子発現を制御するためのアンチセンス構成物として有用である。ＤＮＡアンチセンスの核酸分子は、転写に関連する遺伝子の部位に対して相補的になるよう設計され、それ故に、トランスポータータンパク質の生成と転写が防がれる。アンチセンスのＲＮＡ又はＤＮＡ核酸分子はｍＲＮＡへとハイブリダイズされ、これによりトランスポータータンパク質中でのｍＲＮＡの翻訳がブロックされる。
【０１７５】
あるいは、ある種のアンチセンス分子は、トランスポーター核酸の発現を減少させる不活性化ｍＲＮＡに用いることができる。したがって、これらの分子は、異常、又は不必要なトランスポーター核酸の発現により特徴づけられる障害の治療に用いることができる。この技術は、翻訳されるｍＲＮＡの能力が減少したｍＲＮＡの１以上の領域に相補的なヌクレオチド配列を含んだリボザイムによる開裂に関連している。可能な領域としては、コード領域、特に、リガンド結合のような、トランスポータータンパク質の触媒活性及び他の機能活性に対応したコード領域が含まれる。
【０１７６】
核酸分子はまた、トランスポーター遺伝子発現において異常な細胞を持つ患者の遺伝子治療のためのベクターを提供するものである。このため、組み換え細胞には、ｅｘ ｖｉｖｏで調製され患者に戻される細胞が含まれ、個人の体内に導入されてそこで個人の治療のために必要とされるトランスポータータンパク質を生成する。
【０１７７】
本発明は、生物学的サンプル中のトランスポーター核酸の存在を検出するために抗体を用いたキットも包含する。図１に示す実験データは、本発明のトランスポータータンパク質が、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓で発現することを示した。具体的には、仮想ノーザンブロットでは精巣で発現することを示した。さらに、ＰＣＲベースの組織スクリーニングパネルでは、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、膵臓、及び精巣で発現することを示した。例えば、キットは、ラベル化された、又はラベル化可能な核酸、又は生物学的サンプル中でトランスポーター核酸を検出することのできる試薬を含み、；サンプル中のトランスポーター核酸量を決定する手段；標準サンプルのトランスポーター核酸量と比較する手段、とを含むことができる。この化合物又は試薬は適当な容器に封入することができる。このキットは、さらにトランスポータータンパク質ｍＲＮＡ又はＤＮＡの検出キットとして使用するための説明を含むことができる。
【０１７８】
核酸アレイ
本発明はさらに、核酸検出キットを提供するものであり、これらは、例えば、図１及び３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１及び３）に示される配列情報に基づいた核酸分子のアレイ又はマイクロアレイである。
【０１７９】
ここで用いられている、「アレイ」又は「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体のような基盤の上に合成された、別個のポリヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのアレイのことである。１つの例として、マイクロアレイは、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，８３７，８３２， Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｗ０９５／１１９９５ （Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．）， Ｌｏｃｋｈａｒｔ， Ｄ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９６； Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １４： １６７５−１６８０） 及び Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６； Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３： １０６１４−１０６１９）に記載される方法にしたがって調製、使用され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。あるいは、このようなアレイは、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ５，８０７，５２２．に記載される方法により製造される。
【０１８０】
マイクロアレイ又は検出キットは、好適には、多数の特異的な単鎖の核酸配列を構成し、通常は合成アンチセンスのオリゴヌクレオチドか、又はｃＤＮＡのフラグメントのどちらかが固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチドは、好適には約６〜６０のヌクレオチド長、より好適には１５〜３０のヌクレオチド長、最も好適には２０〜２５のヌクレオチド長である。あるタイプのマイクロアレイ又は検出キットには、７〜２０のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのみを使うことが好適であり得る。マイクロアレイ又は検出キットは、既知の５’又は３’配列を含んだオリゴヌクレオチド、全長配列を含んだオリゴヌクレオチド、又は配列長さの特定領域から選択された特異なオリゴヌクレオチドを含むものであり得る。マイクロアレイ又は検出キットにおいて用いられるポリヌクレオチドは、遺伝子又は対象となる遺伝子において特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１８１】
マイクロアレイ又は検出キットにおいて、既知の配列のオリゴヌクレオチドを製造するために、対象となる遺伝子（又は、本発明により確認されたＯＲＦ）は、典型的には、核酸配列の５’から開始、又は３’で終了するコンピュータアルゴリズムを用いて試験される。典型的なアルゴリズムでは、遺伝子に特異的な長さに規定されたオリゴマーが同定され、ハイブリダイゼーションに好適な範囲にＧＣ成分を持ち、ハイブリダイゼーションの妨害となると予測される二次構造を持たない。ある条件では、マイクロアレイ又は検出キットにおいて、オリゴヌクレオチドのペアを用いることが好適であり得る。オリゴヌクレオチドの「ペア」は、好適には配列の中央に位置している１つのヌクレオチドを除いては、同一である。ペアの２つ目のオリゴヌクレオチド（一方とは不一致）はコントロールとして用いられる。オリゴヌクレオチドペアの数は、２から１００万の間である。オリゴマーは、光誘導化学プロセスを用いて、基盤上の指定領域で合成される。基盤は、紙、ナイロン又は他の膜、フィルタ、チップ、ガラススライド、又は他の適当な固形支持体である。
【０１８２】
他方、オリゴヌクレオチドは、ＰＣＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｗ０９５／２５１１１６ （Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ ｅｔ ａｌ．）に記載されているように、化学カップリング手段、及びインクジェットアプリケーション装置を用いて基盤の表面上で合成され、これらの全ては参考としてここに折り込まれる。他の観点では、ドット（又はスロット）ブロットに似た「格子」アレイでは、真空システム、加熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合工程を用いて、ｃＤＮＡ、又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に配置、結合させることができる。上記のようなアレイは、手工、又は利用可能な装置（スロットブロット、又はドットブロット装置）、材料（適当な固形支持体）、及び機械（ロボット装置を含む）を用いて製造され、また、８、２４、９６、３８４、１５３６、６１４４又はこれ以上、又は商業的に用いられる装置に効果的に使用される２から１００万の間の他の数のオリゴヌクレオチドを含んでもいても良い。
【０１８３】
マイクロアレイ又は検出キットを用いてサンプルの分析を行うために、生物サンプルから得られたＲＮＡ又はＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ中に調製される。ｍＲＮＡが単離され、そしてｃＤＮＡが調製され、アンチセンスのＲＮＡ（ａＲＮＡ）を調製するためのテンプレートとして用いられる。ａＲＮＡは蛍光性ヌクレオチドの存在化で増幅し、ラベル化されたプローブがマイクロアレイ又は検出キットにおいてインキュベートされ、そして、プローブの配列がマイクロアレイ又は検出キット中の相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。インキュベート条件は、正確に相補的に一致しているか、又は各種程度の相補性でハイブリダイゼーションが起こるように調節される。ハイブリダイズしていないプローブを除去した後、蛍光のレベルとパターンを判定するためにスキャナが用いられる。スキャンされたイメージは、マイクロアレイ又は検出キット上の、相補性の程度、及び各々のオリゴヌクレオチド配列の相対的な量を決定するために試験される。生物学的サンプルは、体液（例えば血、尿、唾液、痰、胃液、その他）、培養細胞、生体組織検査、又は他の組織調製品から得られる。検出システムでは、全ての異なる配列において、ハイブリダイゼーションの存在、非存在、及び量を、同時に計測するのに用いられる。このデータは、サンプル中での、配列、発現パターン、変異、変異体、又は多形性といった、大規模な相関性の研究に用いられる。
【０１８４】
本発明は、このようなアレイを用いて、本発明のトランスポータータンパク質／ペプチドの発現を同定するための方法を提供するものである。詳細には、このような方法は、テストサンプルと一つ以上の核酸分子とのインキュベートと、テストサンプル中の成分と核酸分子との結合についてのアッセイとが含まれる。このようなアッセイは、少なくとも遺伝子の一つが本発明の遺伝子及び／又は本発明のトランスポーター遺伝子の対立変異体である、多くの遺伝子を含むアレイに関連している。図３には、本発明のトランスポータータンパク質をコード化している遺伝子において見出されたＳＮＰ情報を示す。ＳＮＰは、１３３４４７位置での非同義ｃＳＮＰ（Ｃ／Ａ転換）、及び制御／調節因子に影響し得るＯＲＦの５’位（９８１、１０１２、１９９０）での３つのＳＮＰを含む、２９４の異なるヌクレオチド位置で確認された。
【０１８５】
テストサンプルと核酸分子のインキュベートの条件は様々である。インキュベーション条件は、使用されるアッセイの形式、使用される検出方法、及びアッセイに用いられる核酸分子のタイプ及び性質に依存する。一般的に入手可能なハイブリダイゼーション、増幅、又はアレイアッセイの形式の何れかを認識している当業者は、ここに記載されるヒトゲノムの新規フラグメントを用いるに当って、容易に適用を行うことができる。このようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ， Ｔ， Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８６）； Ｂｕｌｌｏｃｋ， Ｇ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｒｌａｎｄｏ， ＦＬ Ｖｏｌ． １ （１ ９８２）， Ｖｏｌ． ２ （１９８３）， Ｖｏｌ． ３ （１９８５）； Ｔｉｊｓｓｅｎ， Ｐ．， Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ （１９８５）に記載されている。
【０１８６】
本発明のテストサンプルには、細胞、タンパク質、細胞からの膜抽出物が含まれる。上記の方法に用いられるテストサンプルは、アッセイの形式、検出方法の性質、及びアッセイのサンプルとして用いられる組織、細胞、又はその抽出物に基づいて変化する。核酸抽出物又は細胞抽出物の調製は、当業者において周知であり、用いられるシステムと調和するサンプルを得ることにより、容易に適用することができる。
【０１８７】
本発明の他の例としては、本発明のアッセイを行うために必要な試薬を含むキットが提供される。
【０１８８】
特に本発明は、（ａ）ここに記載されるヒトゲノムのフラグメントと結合することのできる１以上の核酸分子を含む第一の容器、（ｂ）１以上の洗浄試薬、結合核酸を検出することのできる試薬を含む他の１以上の容器、とを含む１以上の容器に区分され、封入されたキットを提供するものである。
【０１８９】
詳細には、区分されたキットとしては、試薬が別々の容器に含まれているキットが含まれる。このような容器としては、小さいガラスの容器、プラスチック容器、帯状のプラスチック、ガラス又は紙、又はシリカのようなアレイ材料が含まれる。このような容器は、サンプルと試薬が混合して汚染しないように、１つの区分から他の区分へと試薬を効率的に移動することができ、またそれぞれの容器の試薬又は溶液は他の容器へと定量的に添加することができる。このような容器には、テストサンプルを入れる容器、核酸プローブを含む容器、洗浄試薬（例えば、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ−緩衝液等）を含む容器、及び結合プローブを検出に用いられる試薬を含む容器を含む。当業者は、本発明にかかる従来未知のトランスポーター遺伝子を認識し、ここに開示されている配列情報を用いて定型的に確認することができ、さらにこれを当業者において周知の確立されたキット形態、特に発現アレイに組み込むことができる。
【０１９０】
ベクター／宿主細胞
本発明はまた、ここに記載される核酸分子を含んだベクターを提供するものである。「ベクター」という用語は、ビヒクルのことを指し、好適には核酸分子であり、核酸分子の輸送をすることができるもののことである。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子はベクターの核酸と共有結合している。本発明のこの観点では、ベクターには、プラスミド、単鎖又は二重鎖のファージ、単鎖又は二重鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのウイルス性ベクター、又はＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、ＯＲＭＡＣのような人工染色体が含まれる。
【０１９１】
ベクターは宿主細胞中に染色体外の成分として保持され、そこで核酸分子の付加的なコピーを複製及び生成する。あるいは、ベクターは宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主細胞の複製の際に核酸分子の付加的なコピーを生成する。
【０１９２】
本発明は、核酸分子の保持のためのベクター（クローニングベクター）、又は核酸分子の発現のためのベクター（発現ベクター）を提供するものである。このベクターは、原核生物細胞又は真核生物細胞、又はその両方で機能することができる（シャトルベクター）。
【０１９３】
発現ベクターは、ベクター中で核酸分子と有効に結合したｃｉｓ作用性調節領域を含み、これにより宿主細胞中での核酸分子の転写が可能となる。この核酸分子は、転写に影響を及ぼす核酸分子と分離されて、宿主細胞に導入されることができる。したがって、第二の核酸分子は、ベクターからの核酸分子の転写を行うｃｉｓ調節制御領域と相互作用するトランス作用性因子を提供し得る。あるいは、トランス作用性因子は宿主細胞により提供され得る。最終的に、トランス作用性因子は、ベクター自身から作り出すことができる。しかしながら、いくつかの例では、核酸分子の転写及び／又は翻訳は無細胞系でも起こり得る。
【０１９４】
ここに記載される核酸分子の調整配列は、目的のｍＲＮＡ転写のためのプロモーターを含んで有効に結合されることができる。これらには、バクテリオファージλからの左部プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉからのｌａｃ、ＴＲＰ及びＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期及び後期のプロモーター、ＣＭＶの極初期のプロモーター、アデノウイルスの初期及び後期のプロモーター、及びレトロウイルスのＬＴＲが含まれるが、これに限定されるものではない。
【０１９５】
転写を促進する制御領域に加えて、発現ベクターはまた、リプレッサー結合部位やエンハンサのような転写を調整する領域を含むものであり得る。この例としては、ＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルスの極初期のエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、アデノウイルスエンハンサー、レトロウイルスＬＴＲエンハンサが含まれる。
【０１９６】
転写の開始及び制御領域を含む場合に加えて、発現ベクターはまた、転写のためのリボソーム結合部位である転写領域における、転写終了のために必要な配列を含むことができる。他の発現調整制御成分としては、ポリアデニル化信号と同様に、開始及び終止コドンが含まれる。当業者は、発現ベクターに有用な多数の調整配列を知り得る。このような調整配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）に記載されている。
【０１９７】
各種の発現ベクターは、核酸分子の発現に用いることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、ウイルス由来のベクター、例えば、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、人工酵母染色体のような酵母染色体成分、バクロウイルス、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、バクシニアウイルス、アデノウイルス、ポクスウイルス、シュードラビスウイルス、及びレトロウイルスのようなウイルス由来のベクターが含まれる。ベクターはまた、これらの起源の組み合わせから誘導することができ、例えば、コスミド及びファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝子成分から誘導することができる。原核及び真核生物の宿主細胞のための適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ． ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （１９８９）に記載されている。
【０１９８】
調整配列では、１以上の宿主細胞の構成的な発現（すなわち組織特異性）、又は、温度、養分添加、又はホルモンや他のリガンドのような外生の要因による１以上の細胞タイプでの指示的な発現を提供するものである。原核及び真核生物の宿主細胞において構成的、及び指示的に発現する種々のベクターは、当業者において周知である。
【０１９９】
核酸分子は、周知の方法によってベクター核酸内に導入されることができる。通常、最終的に発現するＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列と発現ベクターが１以上の限定酵素により開裂し、その後フラグメントが共に結合することによって、発現ベクターと結合される。制限酵素の消化及び結合の手順は、当業者において周知である。
【０２００】
適切な核酸分子を含んでいるベクターは、公知の技術を用いて、増殖又は発現のために適切な宿主細胞内へ導入することができる。バクテリア細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及び Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが含まれるがこれに限定されるものではない。真核生物細胞には、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのような昆虫細胞、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞のような動物細胞、及び植物細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０１】
ここに記載されているように、融合タンパク質としてのペプチドの発現が望ましい。したがって、本発明はペプチドの生成が可能な融合ベクターを提供するものである。融合ベクターは組み換えタンパク質の発現及び溶解性を向上することができ、また、例えば、アフィニティー精製のためのリガンドの作用によって、タンパク質精製を向上することができる。タンパク質分解性開裂部位は融合部分との結合位置に導入され、このために、目的となるペプチドは最終的に融合部分から分離される。タンパク質分解酵素としては、ファクターＸａ、スロンビン、エンテロトランスポーターが含まれるが、これに限定されるものではない。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はタンパク質Ａのそれぞれをターゲット組み換えタンパク質に融合した、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０ （１９８８））、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれるが、これに限定されるものではない。好適な指示的非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５ （１９８８）、ｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５：６０−８９ （１９９０））が含まれる。
【０２０２】
組み換えタンパク質の発現は、遺伝子背景を与えることによって、宿主バクテリアにおいて最大化することができ、宿主細胞は組み換えタンパク質のタンパク質分解性の開裂欠損能力を有する（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９０） １１９−１２８）。あるいは、対象となる核酸分子の配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような特定の宿主細胞のために優先的に使用されるコドンとなるように変更されることができる（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：２１１１−２１１８ （１９９２））。
【０２０３】
核酸分子はまた、酵母において作用する発現ベクターにより発現されることもできる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母中で発現するベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：２２９−２３４ （１９８７））、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３（１９８２））、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３ （１９８７））、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）が含まれる。
【０２０４】
核酸分子はまた、例えば、バクロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫細胞内で発現されることもできる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中のタンパク質の発現に利用されるベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２１５６−２１６５ （１９８３））、及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９ （１９８９））が含まれる。
【０２０５】
本発明のある例においては、ここに記載されている核酸分子は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類の細胞内で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ， Ｂ． Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０（１９８７））、及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ６：１８７−１９５ （１９８７））が含まれる。
【０２０６】
ここに列記されている発現ベクターとしては、核酸分子を発現するために有用であり、当業者が利用可能なベクターとして周知のもののみが示されている。ここに記載されている核酸分子の維持増殖、又は発現に好適な他のベクターは、当業者において周知である。これらは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｈ， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９に記載されている。
【０２０７】
ここに記載されている核酸配列がベクター中に逆方向にクローンされたベクターは、アンチセンスＲＮＡの転写を許す調整配列に結合可能であるが、本発明は、また、このようなベクターも包含するものである。このように、アンチセンス転写は、ここに記載され、コード、非コード領域の両方が含まれている核酸分子配列の、全部又は一部を生成することができる。そして、このアンチセンスのＲＮＡの発現は、センスＲＮＡの発現（調整配列、構成的、又は指示的発現、組織特異発現）に関して、前記した各パラメータに対応する。
【０２０８】
本発明はまた、ここに記載されるベクターを含む組み換え宿主細胞に関連するものである。したがって、宿主細胞には、原核生物細胞、酵母のような低真核生物細胞、昆虫細胞のような他の真核生物細胞、及び哺乳類の細胞のような高真核生物細胞が含まれる。
【０２０９】
組み換え宿主細胞は、当業者が容易に利用可能な技術により、ここに記載されるように構成されるベクターを細胞中に導入することにより、調製することができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、インフェクション、リポフェクション、及びＳａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ． （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ， ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９）に記載されているような他の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２１０】
宿主細胞は、１以上のベクターを含むことができる。このため、異なるヌクレオチド配列が、同じ細胞の異なるベクター中に導入されることができる。同様に、核酸分子は、単独で、又は発現ベクターのトランス作用因子を与えているような、関連のない他の核酸分子と共に導入されることができる。１以上のベクターが細胞内に導入される場合、ベクターは単独で導入されるか、共に導入されるか、又は核酸分子ベクターに結合されることができる。
【０２１１】
バクテリオファージ及びウィルスベクターの場合、これらは標準的なインフェクション及びトランスダクションの操作により、封入又はカプセル化されたウイルスとして細胞内に導入されることができる。ウィルスベクターは、複製可能、又は複製欠陥であり得る。ウイルスの複製に欠陥がある場合、複製は欠陥を補完する機能が提供される宿主細胞内で起こり得る。
【０２１２】
ベクターは一般に、組み換えベクターの構成物を含む細胞の部分母集団の選択を可能とする選択性マーカーを含む。このマーカーは、ここに記載される核酸分子を含む同一のベクター内か、又は別のベクター中に含まれることができる。マーカーには、原核生物宿主細胞のためのテトラサイクリン又はアンピシリン−抵抗遺伝子、及び真核生物宿主細胞のためのジヒドロフォレート還元酵素又はネオマイシン耐性が含まれる。しかしながら、表現型特性の選択性を提供するマーカーは何れの場合にも有効である。
【０２１３】
成熟タンパク質は、バクテリア、酵母、哺乳類の細胞、及び他の細胞において、適切な調整配列の制御下で生成されることができるが、無細胞系転写及び翻訳システムもまた、ここに記載されるＤＮＡ構成物から誘導されるＲＮＡを用い、これらのタンパク質を生成するために用いることができる。
【０２１４】
ペプチドの分泌が必要とされる場合、これがトランスポーターのようなタンパク質を含むマルチ膜貫通ドメイン内で達成されることは難しく、適切な分泌信号がベクター中に組み込まれる。信号配列は、これらのペプチドに内生であるか、又はペプチドに非相同であり得る。
【０２１５】
ペプチドが媒体内で分泌されない場合、典型的にはトランスポーターの場合、タンパク質は、凍結融解、超音波処理、機械的破壊、分解試薬等の標準的な破壊操作によって、宿主細胞から単離されることができる。ペプチドは、硫酸アンモニウム沈降、酸抽出、又はアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィ、又は高速液体クロマトグラフィを含む、公知の精製方法によって、回収、精製されることができる。
【０２１６】
また、ここに記載されているペプチドの組み換え製造における宿主細胞に依存して、ペプチドは種々のグリコシル化パターンを持ち、細胞に依存してバクテリア内で製造される際にグリコシル化されないかもしれないことが理解される。さらにペプチドは、ホストを媒介する過程の結果として、いくつかの場合で最初に修飾されたメチオニンを含むものであり得る。
【０２１７】
ベクター及び宿主細胞の使用
ここに記載されているペプチドを発現している組み換え宿主細胞には、種々の使用用途がある。まず、この細胞はトランスポータータンパク、又はペプチドの生成に有用であり、トランスポータータンパク質又はフラグメントを必要量生成するために、さらに精製を行うことができる。このため、発現ベクターを含む宿主細胞は、ペプチドの生成に有用である。
【０２１８】
宿主細胞は、トランスポータータンパク質、又はトランスポータータンパク質フラグメントに関連している細胞系のアッセイ、例えば上記したもの、同様に当業者において周知の他の形態のものの実行において有用である。このため、天然のトランスポータータンパク質を発現している組み換え宿主細胞は、トランスポータータンパク質機能を促進又は阻害する化合物のアッセイに有用である。
【０２１９】
宿主細胞はまた、機能的な影響を受けるトランスポータータンパク質変異体を同定するために有用である。変異が自然に生じて病理を引き起こすような場合、突然変異を含む宿主細胞は、天然のトランスポータータンパク質の効果を示さずに、トランスポータータンパク質変異体に要求される効果（例えば、機能を促進、又は阻害）を持つ化合物のアッセイに有用である。
【０２２０】
遺伝子的に工作された宿主細胞は、さらにヒト以外の遺伝子組み換え動物を生産するために用いることができる。遺伝子組み換え動物は、好適には哺乳類であり、例えば、１以上の細胞が組み換え遺伝子を含んだ、ラット又はマウスのような齧歯動物である。組み換え遺伝子は、成長中の遺伝子組み換え動物の細胞のゲノムに組み込まれ、１以上の細胞型又は組織において、成熟した動物のゲノム中に残存する外生のＤＮＡである。これらの動物は、トランスポータータンパク質の機能の研究、及びトランスポータータンパク質活性のモジュレータの同定及び評価に有用である。遺伝子組み換え動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、羊、犬、牛、ヤギ、鶏、及び両生類が含まれる。
【０２２１】
遺伝子組み換え動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精卵母細胞の雄性前核細胞内に核酸分子を導入し、卵母細胞が偽妊娠性の雌性育成動物中で育成されることにより作製される。何れのトランスポータータンパク質ヌクレオチド配列も、マウスのようなヒト以外の動物のゲノム中に組み換え遺伝子として導入されることができる。
【０２２２】
発現ベクターに有用な調整配列、又は他の配列は、何れも組み換え遺伝子配列の一部分を形成することができる。イントロン配列及びポリアデニル化信号が、すでに含まれていない場合には、これも含まれる。組織特異性調整配列は、特定の細胞に対しトランスポータータンパク質が直接発現するために、組み換え遺伝子に有効に結合されることができる。
【０２２３】
受胎操作及びマイクロインジェクションを通して、遺伝子組み換え動物を生産する方法、特にマウスのような動物を用いる方法は、当業界において一般化されており、例えば、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ４，７３６，８６６、及び ４，８７０，００９， ｂｙ Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ４，８７３，１９１ ｂｙ Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ａｎｄ ｉｎ Ｈｏｇａｎ， Ｂ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８６） に記載されている。また、同様の方法が、他の遺伝子組み換え動物の生産のために用いられている。最初の遺伝子組み換え動物は、ゲノム中の組み換え遺伝子の存在及び／又は動物の組織や細胞内での遺伝子組み換えｍＲＮＡの発現に基づいて確認されることができる。最初の遺伝子組み換え動物は、その後、さらに組み換え遺伝子を有する動物を繁殖するために用いられることができる。その上、組み換え遺伝子を有している遺伝子組み換え動物は、さらに他の組み換え遺伝子を有する他の遺伝子組み換え動物へと生育されることができる。遺伝子組み換え動物はまた、ここに記載されている相同的な組み換え宿主細胞を用いて製造された、全ての動物又は動物の組織が含まれる。
【０２２４】
他の例では、ヒト以外の遺伝子組み換え動物は、組み換え遺伝子の調節された発現を行う選択システムを含むものとして生産されることができる。このようなシステムの１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムについての記載は、例えば、Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６ （１９９２）参照。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼシステムである （Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５ （１９９１）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムが組み換え遺伝子の発現の調節に用いられる場合は、動物において、Ｃｒｅリコンビナーゼ及び選択されたタンパク質の両方をコード化している組み換え遺伝子が含まれていることが必要である。このような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコード化した組み換え遺伝子を持ち、他方はリコンビナーゼをコード化した組み換え遺伝子を持った２つの組み換え遺伝子動物を交配させることにより、「二重」遺伝子組み換え動物を構成することによって提供される。
【０２２５】
ここに記載されるヒト以外の遺伝子組み換え動物のクローンは、また、Ｗｉｌｍｕｔ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７）及び、ＰＣＴ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｓ． ＷＯ ９７／０７６６８ ａｎｄ ＷＯ ９７／０７６６９に記載されている方法に従って生産されることができる。簡単に述べると、遺伝子組み換え動物からの細胞、例えば体細胞は、単離されて、成長サイクルから出てＧ０相に入れられるように誘導することができる。静止細胞は、例えば、電気パルスの使用によって、単離された静止細胞と同種の動物の細胞核を取り除かれた卵母細胞に融合されることができる。再構成された卵母細胞は、桑実胚又は芽細胞に発達するように培養され、その後、偽妊娠性の雌性育成動物中に移される。この雌性育成動物から誕生する子孫は、細胞、例えば体細胞を単離した動物のクローンとなる。
【０２２６】
ここに記載されているペプチドを発現する組み換え細胞を含んだ遺伝子組み換え動物は、ｉｎ ｖｉｖｏの環境で、ここに記載したようなアッセイを行うために有用である。したがって、生体内に存在し、リガンド結合、トランスポータータンパク質活性化、信号伝達に影響を与えている各種の生理学的ファクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの無細胞系又は細胞系のアッセイでは明らかにならないかもしれない。このため、これらは、リガンド相互作用、トランスポータータンパク質機能及びリガンド相互作用に対する特定の変異体トランスポータータンパク質の影響、及びキメラトランスポータータンパク質の影響を含むトランスポータータンパク質機能を、ｉｎ ｖｉｖｏでアッセイするための、ヒト以外の遺伝子組み換え動物を提供するために有用である。また、実質的に又は完全に一つ以上のトランスポータータンパク質機能を除去する突然変異である、ｎｕｌｌ変異の影響を評価することも可能である。
【０２２７】
本明細書において、上に記載された全ての刊行物及び特許は、ここに参考として折り込まれている。本発明に記載された方法及びシステムの各種修正及び変形は、本発明の範囲及び精神から外れない限り、当業者において明らかなものである。本発明は、特定の好適な具体例に関連して記述されているが、特許請求の範囲に記載された発明は、このような特定の実施例に不当に限定されないと理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための上記方法の各種変形は、分子生物学又は関連分野の当業者において明らかであり、このようなものも特許請求の範囲に含まれるものである。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のトランスポータータンパク質をコード化するｃＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）。さらに、ここにはＡＴＧ開始、終止、及び組織分布のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。図１に示す実験データは、ヒトの精巣、骨髄、結腸、胎児の脳、心臓（成人及び胎児）、胎児の肝臓、腎臓、及び膵臓での発現を示した。
【図２】
図２は、本発明のトランスポータータンパク質の予測アミノ酸配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）。さらに、ここにはタンパク質ファミリー、機能、変更部位のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。
【図３】
図３は、本発明のトランスポータータンパク質をコード化している遺伝子領域のゲノム配列を示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）。さらに、ここにはイントロン／エクソン構造、プロモーター位置のような構造及び機能情報が示され、この分子配列に基づいた発明の特定用途を容易に決定することができる。図３に示されるように、ＳＮＰは、挿入／欠失ＳＮＰ変異体（”ｉｎｄｅｌｓ”）を含む、２９４のヌクレオチド位置で確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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