(57)【要約】共焦点画像化システムを用いる、複数の表面上でのバイオフィルムの発達を測定する自動化方法であって、このシステムは、ａ）１以上の波長を含む電磁放射線のビームを形成する放射線源システムと、ｂ）対象物の１以上の面上にこのビームを指向しかつ集束する光学システムと、ｃ）この対象物から放射される電磁放射線を検出して、画像データを作製する検出システムと、ｄ）この電磁放射線を用いて複数の面においてこの対象物をスキャンする走査システムとを備え、この方法は、ｉ）この複数の表面上でバイオフィルムを成長させる工程と、ｉｉ）複数の面において電磁放射線を用いてこのバイオフィルムをスキャンして複数の画像を作成することによってこのバイオフォルム内の１以上の蛍光部分の存在を検出する工程と、ｉｉｉ）コンピューターソフトウェアの制御下にデータ処理システムによってこの画像を解析してこのバイオフィルムの構造を決定する工程からなる。
2005525551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点画像化システムを用いる、複数の表面上でのバイオフィルムの発達を測定する自動化方法であって、該共焦点画像化システムは、
ａ）１以上の波長を含む電磁放射線のビームを形成する手段と、
ｂ）バイオフィルムの１以上の面上に該ビームを指向しかつ集束する手段と、
ｃ）該バイオフィルムから放射される電磁放射線を検出する検出デバイスと、
ｄ）該電磁放射線を用いて複数の面において該バイオフィルムをスキャンする走査デバイスと、
を備え、該方法は、
ｉ）該複数の表面上で該バイオフィルムを成長させる工程と、
ｉｉ）複数の面において電磁放射線を用いて該バイオフィルムをスキャンして複数の画像を作成することによって、該バイオフォルム内の１以上の蛍光部分の存在を検出する工程と、
ｉｉｉ）コンピューターソフトウェアの制御下にデータ処理システムによって該画像を解析して該バイオフィルムの構造を決定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、
ａ）前記ビーム形成手段が電磁放射線の細長いビームを生じ、該ビームは１以上の波長を含み、かつ放射線が伝搬する光学軸に対して横向きに伸び；
ｂ）前記指向しかつ集束する手段が、前記バイオフィルムが位置する第一の面における第一の細長い領域上に該細長いビームを集束して、１以上の第二の細長い領域上に該バイオフィルムから放射された電磁放射線を指向し、各々の第二の細長い領域は、該第一の面に接合する異なる第二の面上であり、
ｃ）該第二の接合面の少なくとも１つにおいて、又は該第二の接合面の少なくとも１つに接合する第三の面において、前記検出デバイスが、検出エレメントの長方形のアレイを備え、その上に対象物から放射された電磁放射線が同時発生し、
ｄ）前記走査デバイスが、該バイオフィルムに対して該細長いビームを動かすことによって、又は該細長いビームに対して該バイオフィルムを動かすことによって該バイオフィルムをスキャンし、その結果、該照射された電磁放射線が、検出エレメントの長方形のアレイに送達されて、該検出デバイスによって、該放射された電磁放射線を代表する複数の電気的シグナルに、該走査と同調して変換される、
方法。
【請求項３】
前記工程ｉｉｉ）の画像解析を行なう前に、各々の画像を修復する工程をさらに包含する、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
生成された電磁放射線のビームが、３５０〜７００ｎｍの範囲に１以上の波長を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
複数の時点で、前記バイオフィルムの発達を測定する工程をさらに包含する、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光部分が、遺伝子の産物である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子が蛍光タンパク質をコードする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光タンパク質が、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３Ｉ、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ、Ｉ１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群より選択される１以上の変異を有する改変緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記改変ＧＦＰが、Ｆ６４Ｌ−Ｖ１６３Ａ−Ｅ２２２Ｇ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｓ１７５Ｇ及びＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｖ１６３からなる群より選択される３つの変異を有する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光部分が、バイオフィルム内の環境変化又は酵素活性をモニタリングし得るバイオセンサーである、請求項６乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光部分が、化合物上で酵素の作用によって生成される、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が、βガラクトシダーゼ、ニトロリダクターゼ、アルカリホスファターゼ、及びβラクタマーゼからなる群より選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、検出工程ｉｉ）を実行する前に前記バイオフィルムに対して蛍光化合物を加える工程をさらに包含する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光化合物が、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＣｙｐＨｅｒ、クマリン、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ  ６３３  ＤＲＡＱ５、Ａｌｅｘａ  ４８８、アクリドン、キナクリドン、蛍光標識されたタンパク質、蛍光標識されたレクチン及び蛍光標識された抗体からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光化合物が、前記バイオフィルム内の環境変化をモニタリングし得る、請求項１３又は請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記表面が容器を形成する、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記容器がマイクロタイタープレートである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記バイオフィルム内の微生物クラスターのサイズを決定し得る、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、前記バイオフィルムの３次元構造を決定し得る、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、前記バイオフィルム内の微生物クラスターの間の距離の分布を決定し得る、請求項１乃至請求項１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記バイオフィルムの構造内の微生物クラスターの配向を決定し得る、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、前記バイオフィルムの構造内の任意のチャネルの存在及びサイズを決定し得る、請求項１乃至請求項２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、前記バイオフィルムの構造内の前記チャネルと他の任意のチャネルとの接続性を決定し得、これによってチャネルのネットワークを規定し得る、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、前記チャネルネットワークのフラクタル次元を決定し得る、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオフィルムが、光学的に識別可能な微生物集団を含む、請求項１乃至請求項２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオフィルムが、遺伝子的に識別可能な微生物集団を含む、請求項１乃至請求項２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、前記集団の空間的分布を決定し得る、請求項２５又は請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
バイオフィルムの発達に対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法であって、
ｉ）該試験薬の存在下で請求項１乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法を決定する工程と、
ｉｉ）該試験薬の存在下でのバイオフィルムの発達と、該試験薬の非存在下でのバイオフィルムの発達について公知の値とを比較する工程とを包含し、
該試験薬の存在下での該バイオフィルムの発達と、該試験薬の非存在下での該公知の値との差異が、該バイオフィルムの発達の際の該試験薬の効果の指標である、方法。
【請求項２９】
前記公知の値が電子的データベース又は光学的データベースに記録される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
バイオフィルムの発達に対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法であって、
ｉ）容器中の該試験薬の存在下及び非存在下でバイオフィルムを成長させる工程と、
ｉｉ）請求項１乃至請求項２７のいずれか１項記載の方法に従ってバイオフィルムの発達を測定する工程とを包含し
該因子の有無による該バイオフィルムの発達の差異が、該バイオフィルムの発達の際の該試験薬の効果の指標である、方法。
【請求項３１】
前記試験薬の有無における前記バイオフィルムの発達の間の活性の前記差異が、正規化され、光学的又は電子的に記憶され、参照化合物の値と比較される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記試験薬が前記バイオフィルム内の遺伝子発現に影響する、請求項２８乃至請求項３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記試験薬が前記バイオフィルム内の特定の微生物集団の遺伝子発現に選択的に影響する、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記試験薬がバイオフィルムの発達を阻害する、請求項２８乃至請求項３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
前記試験薬が前記バイオフィルムの発達を促進する、請求項２８乃至請求項３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
前記試験薬が、電磁放射線、イオン化放射線、電場、音響エネルギー及び磨耗からなる群より選択される物理的因子である、請求項２８乃至請求項３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
前記試験薬が、蛍光化合物又は蛍光標識された化合物であり、それによってそのバイオフィルム全体にわたる分布の測定を容易にする、請求項２８乃至請求項３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記試験薬が、有機化合物、無機化合物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド及びタンパク質核酸からなる群より選択される、請求項２８乃至請求項３５又は請求項３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
バイオフィルムの発達を測定するための請求項１乃至請求項３８のいずれか１項記載の共焦点画像化システムの使用。
【請求項４０】
蛍光画像化システムを用いる、スキャンされる対象物の３次元構造を解析する方法であって、該蛍光画像化システムは、
ａ）１以上の波長を含む電磁放射線のビームを形成する放射線源システムと、
ｂ）該対象物の１以上の面上に該ビームを指向しかつ集束する光学的システムと、
ｃ）該対象物から放射された電磁放射線を検出し、画像化データを作成する検出システムと、
ｄ）電磁放射線を用いて複数の面において該対象物をスキャンする走査システムとを備え、
該方法は、該対象物の３次元構造に関連するデータを決定するために該画像データを処理する工程を包含し、該方法は、自動化された画像データ閾値化工程を包含し、該閾値化工程は、
ｉ）該画像データにおける強度値を解析する工程と、
ｉｉ）該画像データについての閾値を算出する工程と、
ｉｉｉ）該閾値を用いて該画像データを処理して、閾値画像データを作成する工程とを包含する、方法。
【請求項４１】
前記方法工程ｉ）が、前記画像データにおける強度値の統計学的特性を計算するように配列される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
統計学的特性の前記計算の間、前記方法が強度ヒストグラムを算出するように配列され、閾値を算出する前記工程の間、前記方法が該閾値を算出するために強度ヒストグラムを用いるように配列される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記統計学的特性の前記計算の間、前記方法が平均強度及び／又は強度の標準偏差を算出するように配列される、請求項４１又は請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記閾値画像データが二値画像データである、請求項４０乃至請求項４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
前記画像データ閾値化工程が、少なくとも１つのバリデーション規則を記憶する工程と、該少なくとも１つのバリデーション規則を用いて該閾値化された画像データをバリデートする工程とをさらに包含する、請求項４０乃至請求項４４のいずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、画像を形成する画素の総数に関する規則を包含する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、画像の予め決定された一部を形成する多数の画素に関する規則を包含する、請求項４５又は請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、多数の個々に単離された画素に関する規則を包含する、請求項４５乃至請求項４７のいずれか１項記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１つのバリデーション規則が、閾値を上回るか又は下回るように設定された画素の割合に関する規則を包含する、請求項４５乃至請求項４８のいずれか１項記載の方法。
【請求項５０】
前記画像データ処理アルゴリズムが、画像データ修復工程を有し、該修復工程が、該画像データ閾値化工程を実施する前に該画像データを修復する工程を包含する、請求項４０乃至請求項４９のいずれか１項記載の方法。
【請求項５１】
前記対象物がバイオフィルムである、請求項４０乃至請求項５０のいずれか１項記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、試験薬の有無において前記バイオフィルムの発達の間の活性の差異を比較するように適合される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
請求項４０乃至請求項５２のいずれか１項記載の方法を行なうように適合されたコンピューターソフトウェア。
【請求項５４】
請求項５３記載のコンピューターソフトウェアを記憶するデータキャリア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点画像化システムを用いて微生物バイオフィルムの発達を自動的に測定する方法、並びに微生物遺伝子発現及びバイオフィルム発達に対する試験化合物の効果を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物バイオフィルムは、通常はポリサッカライドの細胞外マトリックスに包埋されている、表面又は内面に結合している同種又は異種の微生物集団からなる（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎら，１９９５，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４１，４３５〜４６４）。これらのバイオフィルムは、ほとんどの任意の湿潤な表面において急速に形成し得、環境における微生物のコロニー形成の正常な方式である（Ｗｏｏｄら，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７９，２１〜２７）。細菌は頻繁に、バイオフィルム発達と関連するが、真菌及び藻類を含む多くの微生物もバイオフィルムを形成する。
【０００３】
微生物バイオフィルムは、工業、機械の汚れ、配管の目詰まり、並びに海洋の機材及び船舶の外側に対する付着において広範な問題を生じる。バイオフィルムはまた、医学においても重要な問題であって、虫歯、歯周病及び嚢胞性肺線維症のような多数のヒトの感染に関わっている（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１３１８〜１３２２）。医学的装置の汚染から生じる感染はしばしば、バイオフィルムとして存在する細菌に起因する（Ｇｏｒｍａｎら，１９９４，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１１２，５５１〜５５９）。
【０００４】
バイオフィルムの細菌はしばしば、工業及び医学において深刻な問題を生じ得る、自由遊泳性であるそれらの細菌のプランクトン様の対応物に比べて、著明に異なる表現型を示す。最も重要なのは、抗生物質処置に対する耐性の増大である。Ｓｏｕｋｏｓら（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，１７，４０５〜４０９）は、バイオフィルム内の細菌は、同じ種のプランクトン様の細胞に比べて抗生物質処置に対する感受性が１５００分の１であり得るということを報告している。
【０００５】
最近の研究では、「菌体密度感知シグナル（ｑｕｏｒｕｍ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ）」と名付けられた分子が、微生物によって定常的に分泌されて、細胞外マトリックス及びバイオフィルム形成の生成に関与する遺伝子を活性化することが示されている（Ｃｈｉｃｕｒｅｌ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０８，２８４〜２８６）。微生物のレセプター部位に結合するようなこれらの天然に存在するシグナルの分子模倣物を生成すること、それによってバイオフィルム形成を制御することに対して、現在、労力が払われている（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ及びＳｔｅｗａｒｔ，２００１，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｊｕｌｙ，６１〜６５）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、微生物バイオフィルムの制御は、食品、健康、消費財、工学及び製薬産業を含む多くの産業にとって重要な課題を提起する。ここ１０年間で、この問題に取り組むためにかなりの労力が払われているが、バイオフィルムに対して有効な新規な抗微生物剤の発見及び開発の試みは、適切なスクリーニングアッセイがないせいで、妨げられている。プランクトン様の微生物は、高スループットのスクリーニング技術に容易に順応できるが、インヒビター、菌体密度感知シグナル模倣物又はアゴニストに対するバイオフィルムの成長及び感受性のアセスメントは、困難であり、時間を浪費し、かつ技術的困難性に悩まされる。
【０００７】
バイオフィルムの成長及び発達に対してある因子が有する影響を決定する任意のアッセイ又は方法は、必然的に、その発達及び構造のアセスメントを包含する。電子顕微鏡は伝統的に、高い解像度のおかげで、バイオフィルムの組成及び構造を研究するための選り抜きの方法である（Ｌｉｓｔｇａｒｔｅｎ，１９７６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ，４７，１〜１８）。しかし、この技術は時間浪費的であって、調製プロセスを通じて構造的な歪みを生じ得、高スループットスクリーニングには順応できない。
【０００８】
電子顕微鏡に関する上記の多くの問題は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＣＭ）の出現によって取り組まれているが、これによって、バイオフィルムの構造を、脱水も、固定も、染色も必要なしに、天然の状態で研究することが可能になる。ＬＳＣＭの光学的切片化特性によって、ピントがぼけることなく、極めて薄い光学的切片（ほぼ０．３μｍ）を、バイオフィルム全体にわたって深さを漸増しながら採取することが可能になる。本質的に蛍光分子（例えば、緑色蛍光タンパク質）又は蛍光標識プローブが励起されて、生じた蛍光が光電子増倍管によって検出されてデジタル画像を生じる。次いで、このデジタル処理されたデータが、再構築されて、構造に関する３次元（３Ｄ）情報を得ることができる。共焦点顕微鏡は、現在、バイオフィルム構造（Ｗｏｏｄら，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７９，２１〜２７）、生理学及び生化学（Ｐａｌｍｅｒ＆Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，２６３〜２６８）を検討するために用いられている。しかし、このような研究は、時間を浪費し、現実には極めて特異的であり、１つか２つの特殊化したバイオフィルム構造に集中しているに過ぎない。
【０００９】
ＬＳＣＭは、バイオフィルムの形態、構造及び組成を検討するための優れたツールを提供するが、高スループットのスクリーニングのプラットフォームとしては当然の選択というわけではない。なぜなら、この画像化及びデータ捕獲プロセスは極めて低いからである。Ｋｕｅｈｎら（Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，６４，４１１５〜４１２７）は、バイオフィルムを解析する「自動化」ＬＳＣＭを報告しているが、この発明の中心は、半自動化された画像解析のためのコンピュータープログラムである。このシステムはポイントスキャン検出法に基づいており、使用者の入力／介入を必要とする「オフライン」の半自動化画像解析に関与する。これらのデータ捕獲及び解析的方法には、バイオフィルム成長のための「ガラスフローセル」の使用をともない、自動かつ高スループットのスクリーニングに対してこのアプローチを適用することは厳しく制限される。バイオフィルムに対する試験薬の影響を評価する他のスクリーニング方法は、米国特許第６，３２６，１９０号に開示されており、ここでは、コロニーカウント及びバイタル染色のような種々の方法を用いてバイオフィルム成長を確認している。しかし、特に注目すべきは、共焦点顕微鏡を用いて任意のアッセイを自動化するのにおいて強調された問題である。
【００１０】
本発明は、自動化に順応できる、バイオフィルム発達を解析するためのＬＳＣＭベースの方法を提供することにともなう上述の問題に取り組む。さらに、本発明の方法は、バイオフィルムの成長及び発達の新規な調節因子についての高スループットのスクリーニングのためのプラットフォームを提供し得る。文献（例えば、ＷＯ９６／０１４３８）に記載された画像内容解析に基づく自動焦点（オートフォーカス）法とは対照的に、本発明は、位置感知解析を利用する。
【００１１】
ＷＯ９９／４７９６３は、ライン−スキャン共焦点画像化システム及び関連するデータ処理ルーチンを用いて高等生物の細胞抽出物、細胞又は組織において種々のアッセイを実施することによる、疾患の診断及び処置のために有用な薬理学的因子を特定するための「共焦点顕微鏡画像化システム」を開示する。この画像化システムを用いて、化合物スクリーニングに十分に急速な様式で、単一の細胞及び集団上でマルチパラメーターの蛍光画像化を実施することができる。このシステムは、高い解像度で発蛍光団の存在を測定し得る。しかし、この出願内のどこにも、その３Ｄ画像を作成するために、又はバイオフィルムの発達を解析するために、微生物学的集団を特徴付けるシステムを使用するというなんらかの開示はない。さらに、ＷＯ９９／４７９６３に記載されたこの画像解析アルゴリズムは、単一の面からデータを解析するのに適切であるに過ぎず、複数の面からの解析には適切ではない。
【００１２】
出願人らは、ＷＯ９９／４７９６３に記載されるような共焦点画像化システムは、本発明の画像解析方法と組み合わせて用いる場合、バイオフィルムを特徴付けるために用いることが可能であり、バイオフィルム発達を調節する化合物の高スループットスクリーニングのためのプラットフォームとして機能し得るということを見出した。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ及び高スループットスクリーニング適用におけるその使用は、Ｇｏｏｄｙｅｒら、２００１、Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，７th  Ａｎｎｕａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｘｈｉｂｉｔｉｏｎ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＵＳＡ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ＧＦＰ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓに報告されている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第一の態様によれば、共焦点画像化システムを用いる、複数の表面上でのバイオフィルムの発達を測定する自動化方法が提供されるが、この共焦点画像化システムは、
ａ）１以上の波長を含む電磁放射線のビームを形成する手段と、
ｂ）バイオフィルムの１以上の面上にこのビームを指向しかつ集束する手段と、
ｃ）このバイオフィルムから放射される電磁放射線を検出する検出デバイスと、
ｄ）この電磁放射線を用いて複数の面においてこのバイオフィルムをスキャンする走査デバイスとを備え、
この方法は、
ｉ）この複数の表面上でこのバイオフィルムを成長させる工程と、
ｉｉ）複数の面において電磁放射線を用いてこのバイオフィルムをスキャンして複数の画像を作成することによって、このバイオフォルム内の１以上の蛍光部分の存在を検出する工程と、
ｉｉｉ）コンピューターソフトウェアの制御下にデータ処理システムによってこの画像を解析してこのバイオフィルムの構造を決定する工程と、
を包含する。
【００１４】
バイオフィルムは、その環境に対して反応性である動的な構造である（Ｗａｔｎｉｃｋ及びＫｏｌｔｅｒ，２０００，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８２，２６７５〜２６７９）。本発明の状況において、「発達」という言葉は、バイオフィルムに関して用いられる場合、バイオフィルムの成長、静止状態又は退縮を述べていると解釈されるべきである。
【００１５】
好ましい実施形態において、データ取得の速度を増大する方法は、
ａ）上記ビーム形成手段が、電磁放射線の細長いビームを生じ、このビームが１以上の波長を含み、かつ放射線が伝搬する光学軸に対して横向きに伸び；
ｂ）上記指向しかつ集束する手段が、上記バイオフィルムが位置する第一の面における第一の細長い領域上にこの細長いビームを集束して、１以上の第二の細長い領域上にこのバイオフィルムから放射された電磁放射線を指向し、ここで各々の第二の細長い領域は、この第一の面に接合する異なる第二の面上であり、
ｃ）この第二の接合面の少なくとも１つにおいて、又はこの第二の接合面の少なくとも１つに接合する第三の面において、上記検出デバイスが、検出エレメントの長方形のアレイを備え、その上に対象物から放射された電磁放射線が同時発生し、
ｄ）上記走査デバイスが、このバイオフィルムに対してこの細長いビームを動かすことによって、又はこの細長いビームに対してこのバイオフィルムを動かすことによってこのバイオフィルムをスキャンし、その結果、この照射された電磁放射線が、検出エレメントの長方形のアレイに送達されて、この検出デバイスによって、この放射された電磁放射線を代表する複数の電気的シグナルに、この走査と同調して変換される、
といったものである。
【００１６】
好ましくは、この方法は、画像解析を行なう前に、各々の画像を修復する工程をさらに包含する。画像修復とは、画像の不鮮明かつノイズの多い観察から、その質を改善するか又は観察された画像から容易に利用できない情報を取得するという目的で、その画像を回復するという課題をいう。空間的解像度に影響する要因は主に、放射された光子の散乱、並びに画像化システムによってもたらされた逸脱（収差）及び歪みである。画像化されるべき対象物が供給源とコリメーターとの距離に比べて小さい場合、この劣化現象は、ほぼ移動不変性（ｓｈｉｆｔ−ｉｎｖａｒｉａｎｔ）であると考えることができる。ノイズを無視することは、歪みのない画像と画像化システムの伝達関数との畳み込み（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）処理によってモデル化することができる。多くのタイプの画像修復が文献に報告されている。例えば、Ｗｉｅｎｅｒフィルタ、ウェーブレットに基づく正規化、管理下逆折り畳み法（ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）、反復性盲目的逆折り畳み法（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｂｌｉｎｄ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）など。異なる方法の間の比較については、例えば、Ｌｉｘｉｎ  Ｓｈｅｎ，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ，１１，５〜１０又はＭｉｇｎｏｔｔｅら、２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ（２００２），１１，１１〜２４を参照のこと。
【００１７】
適切には、生成された電磁放射線のビームは、３５０〜７００ｎｍの範囲で１以上の波長を含む。波長の好ましい範囲としては、３５４〜３７４ｎｍ、４０３〜４２３ｎｍ、４７８〜４９８ｎｍ、５６０〜５８０ｎｍ、６３７〜６５７ｎｍ及び６８０〜７００ｎｍが挙げられる。好ましい波長としては、３６４ｎｍ、４１３ｎｍ、４８８ｎｍ、５７０ｎｍ、６４７ｎｍ及び６９０ｎｍが挙げられる。
【００１８】
適切には、蛍光部分は、このバイオフィルム内の微生物の固有の特徴である。
【００１９】
好ましくは、この蛍光部分は、バイオフィルム内の微生物によって発現される遺伝子の産物である。例えば、この微生物は、この遺伝子を構成的に又は誘導性の方式で発現するように遺伝子的に形質転換されていてもよい。さらに好ましくは、この遺伝子は、微生物における蛍光部分の発現を最適化するように変更されているコドンを含んでもよい。
【００２０】
好ましくは、この遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。蛍光タンパク質及び色素タンパク質の蛍光タンパク質誘導体は、Ａｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｎｅｍｏｎｉａ種、例えば、Ａ．ｍａｊａｎｏ及びＡ．ｓｕｌｃａｔａ、Ｒｅｎｉｌｌａ種、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ種、Ｃｌａｕｌａｒｉａ種、Ｄｅｎｄｒｏｎｅｐｈｔｈｙｌａ種、Ｒｉｃｏｒｄｉａ種、Ｓｃｏｌｙｍｉａ種、Ｚｏａｎｔｈｕｓ種、Ｍｏｎｔａｓｔｒａｅａ種、Ｈｅｔｅｒａｃｔｉｓ種、Ｃｏｎｙｌａｃｔｉｓ種及びＧｏｎｉｏｐａｒａ種を含む広範な種々の生物から単離されている。
【００２１】
Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａに由来する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の使用は、多くの細胞及び分子生物学的なプロセスに対する革命的な調査法である。しかし、野生型（天然の）ＧＦＰ（ｗｔＧＦＰ）の蛍光特徴は、細胞レポーターとしての使用に理想的に適合しないので、細胞内レポーターとしての使用にさらに適切な特性を有するＧＦＰの改変体の変異型を生成するために多くの労力が費やされている（Ｈｅｉｍら、１９９４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ），９１，１２５０１；Ｅｈｒｉｇら、１９９５，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３６７，１６３〜６；ＷＯ９６／２７６７５；Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．ら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，３１５〜９；ＵＳ  ６１７２１８８；Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｂ．Ｐ．ら、１９９６，Ｇｅｎｅ，１７３，３３〜３８；ＵＳ  ６１９４５４８；米国特許第６０７７７０７号及び英国特許出願第０１０９８５８．１号（‘Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  Ｌｔｄ．’）。英国特許出願第０１０９８５８．１号に開示された好ましい実施形態は、Ｆ６４Ｌ−Ｖ１６３Ａ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｓ１７５Ｇ−ＧＦＰ及びＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｖ１６３Ａ−ＧＦＰからなる群より選択されるＧＦＰ誘導体を含む。
【００２２】
好ましくは、蛍光タンパク質は、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙ６６Ｆ、Ｓ６５Ｔ、Ｓ６５Ａ、Ｖ６８Ｌ、Ｑ６９Ｋ、Ｑ６９Ｍ、Ｓ７２Ａ、Ｔ２０３Ｉ、Ｅ２２２Ｇ、Ｖ１６３Ａ、Ｉ１６７Ｔ、Ｓ１７５Ｇ、Ｆ９９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｖ１６３Ａ、Ｆ６４Ｌ、Ｙ１４５Ｆ、Ｎ１４９Ｋ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｙ、Ｔ２０３Ｈ、Ｓ２０２Ｆ及びＬ２３６Ｒからなる群より選択される１以上の変異を有する改変ＧＦＰである。最も好ましくは、この蛍光タンパク質は、Ｆ６４Ｌ−Ｖ１６３Ａ−Ｅ２２２Ｇ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ、Ｆ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｓ１７５Ｇ及びＦ６４Ｌ−Ｓ６５Ｔ−Ｖ１６３からなる群より選択される３つの変異を有する、改変ＧＦＰである。
【００２３】
好ましくは、蛍光部分は、バイオフィルム内の環境変化又は酵素活性をモニタリングし得るバイオセンサーである。例えば、この部分は、ｐＨ変化に対して応答性である蛍光生体内感知（バイオセンシング）タンパク質であってもよいし（例えば、Ｌｌｏｐｓｉｓら，１９９８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）９５，６８０３〜６８０８）、又はバイオフィルム内のカルシウムイオンのような特定のイオン濃度に対して感受性であってもよい。
【００２４】
必要に応じて、この蛍光部分は、化合物上で酵素の作用によって生成される。好ましくは、この酵素は、βガラクトシダーゼ、ニトロリダクターゼ、アルカリホスファターゼ、及びβラクタマーゼからなる群より選択される。この酵素は、微生物によって固有に発現されてもよいし、又はこの微生物は、誘導性にもしくは構成的な方式でこの酵素を発現するように遺伝子的に形質転換されていてもよい。
【００２５】
好ましい実施形態において、この方法は、検出工程を実行する前にバイオフィルムに対して蛍光化合物を加える工程をさらに包含する。
【００２６】
好ましくは、蛍光化合物は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＣｙｔｏＣｙ５、ＣｙｐＨｅｒ、クマリン、ＦＩＴＣ、ＤＡＰＩ、Ａｌｅｘａ  ６３３  ＤＲＡＱ５、Ａｌｅｘａ  ４８８、アクリドン、キナクリドン、蛍光標識されたタンパク質、蛍光標識されたレクチン及び蛍光標識された抗体からなる群より選択される。「アクリドン」及び「キナクリドン」とは、それぞれ、ＷＯ０２／０９９４２４及びＷＯ０２／０９９４３２に開示された蛍光化合物を意味する。必要に応じて、未結合の蛍光化合物は、検出工程を行なう前に各々の容器から除去することができる。
【００２７】
好ましくは、蛍光化合物を用いて、バイオフィルム全体にわたって存在する環境変化をモニターすることができる。このように、例えば、微生物バイオフィルムの酸化還元電位及びｐＨは、本発明を用いて測定し得る局所環境変化を受け易い。ｐＨ感受性色素、例えば、ＣｙＤｙｅ「ＣｙｐＨｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，参考ＰＡ１５４０５を参照のこと）を用いて、バイオフィルム内のｐＨの変化を決定することができる。例えば、Ｃｙ５と比較して、ＣｙｐＨｅｒは、ｐＨ５．０で９５％の蛍光を有するが、ｐＨ７．４ではわずか５％の蛍光しか有さないので、それによってバイオフィルム内の局所的なｐＨにおける変動の定量的な測定が可能になる。
【００２８】
必要に応じて、蛍光化合物を用いて、バイオフィルム内又は周囲の化学物質の濃度、例えば、酸素もしくはカルシウムの濃度、又は特定のタンパク質もしくは核酸の濃度を測定することができる。
【００２９】
好ましくは、表面は容器の形態である。さらに詳細には、容器はマイクロタイタープレートである。このマイクロタイタープレートは、２４個、９６個、３８４個又はさらに高密度のウェル、例えば、８６４個もしくは１５３６個のウェルを備えてもよい。好ましくは、このマイクロタイタープレートは、基部を通じてバイオフィルムの画像化が伝達されるように、透明な基部を有する（Ｇｉｌｂｅｒｔら、２００１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，９１，２４８〜２５４）。
【００３０】
適切には、この方法は、光学的かつ共焦点でバイオフィルムを切片化すること、続いて３Ｄ容積の解析によって、このバイオフィルム内の微生物クラスターのサイズを決定することができる。
【００３１】
適切には、この方法は、光学的かつ共焦点でバイオフィルムを切片化すること、続いて３Ｄ容積の解析によって、このバイオフィルムの３Ｄ構造を決定することができる。
【００３２】
適切には、この方法は、光学的かつ共焦点でバイオフィルムを切片化すること、続いて３Ｄ容積の解析によって、このバイオフィルム内の微生物クラスター間の距離の分布を決定することができる。
【００３３】
適切には、この方法は、このバイオフィルムの構造内の微生物クラスターの配向を決定することができる。このクラスターの配向は、液体フロー、重力、電場などのような外部要因によって影響され得る。
【００３４】
適切には、この方法は、このバイオフィルムの構造内のチャネルの存在及び任意のチャネルのサイズを決定することができる。このようなチャネルによって、バイオフィルムへの栄養物のアクセス経路、及びバイオフィルムからの有害廃棄物の出口経路が得られる。
【００３５】
従って、例えば、図１６Ａ、図１６Ｃ及び図１６Ｄ（ここでは黒い領域がチャネルに相当する）から判明するように、バイオフィルム構造中でチャネルは容易に同定できる。好ましくは、この方法によって、バイオフィルムの構造内のこのチャネルと任意の他のチャネルとの接続性を決定し、これによってチャネルのネットワークを規定することができる。さらに好ましくは、この方法は、このチャネルネットワークのフラクタル次元を決定することができる。
【００３６】
バイオフィルムは、多孔性媒体と考えることが可能であり、ここでは異なる分子が微生物のクラスターの間のチャネルのネットワークに拡散し得る。このネットワークの幾何学的構造とこのネットワークを通じた拡散特性と折り合わせることが可能であることが重要である。なぜなら、これは、栄養物、酸素、抗生剤又は他の分子がこのバイオフィルム内に移動可能である容易さの指標となるからである。多孔性媒体は、チャネルがランダムにブロックされている、ランダムにマルチ接続された物質である。これらのチャネルによって占有される自由空間の割合は、空隙率と呼ばれる。チャネルネットワークのダルシー透過性は、抵抗器（レジスタ）のネットワークの伝導率と等価である；これは、液体がこのネットワークをどれほど容易に通過できるかを記している。空隙率の値が臨界空隙率Ｃcrを上回る場合、ネットワークの連続的な通過が存在し、この分子は、このネットワークの末端から他方へ拡散し得る。このチャネルの分布が、ランダムであって、長距離の相関が無視できる場合、透過性は、Ｃcrに近い普遍的なべき法則に従い、顕微鏡的な詳細、接続の性質などに依存しない。このネットワークを通じた液体の流れは、このネットワークの透過性、従って最終的にはこのネットワークの全体的な形状に関連している。多くの場合、このネットワークの形状は、フラクタルとして記載することができ、フラクタル次元はこのネットワークについて規定し得る。臨界の値では、半径Ｒの球に含まれるチャネルの平均量は、ＲDに比例するが、ここでＤは３未満である。従って、このネットワークは、通常の三次元固体よりも低い効率で三次元空間を満たす、多孔性構造と考えることが可能であり、このネットワークは、通常のユークリッド次元よりも少ないフラクタル次元を有するということができる。まとめると、フラクタル次元を決定することは、ネットワークの形状を説明することであり、従ってバイオフィルムの多孔性についての指標となる。さらに詳細には、例えば、Ｇｏｕｙｅｔ，Ｐｈｙｓｉｑｕｅ  ｅｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｒａｃｔａｌｅｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｍａｓｏｎ，１９９２，第３章を参照のこと。
【００３７】
別の実施形態において、バイオフィルムは、光学的に識別可能な微生物集団を含む。これらの集団は、例えば、同じ微生物種を含んでも、異なる生物種（蛍光標識を用いた処置に対する異なる標識パターンに基づいて識別できる）を含んでもよい。好ましくは、この方法で、この集団の空間的分布を決定することができる。
【００３８】
さらなる実施形態において、バイオフィルムは、遺伝子的に識別可能な微生物集団を含む。これらの集団は、異なる株又は種を含んでもよい；例えば、この集団は、野生型及び遺伝子操作された細菌株（ＧＦＰを構成的に発現する）から構成されてもよいし、又は２以上の株もしくは種（誘導性に又は構成的な方式で、光学的に別個の蛍光レポーター遺伝子を発現する）から構成されてもよい。好ましくは、この方法で、遺伝子発現及び集団の空間的分布を決定することができる。
【００３９】
本発明の第二の態様によれば、バイオフィルムの発達に対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法が提供されるが、この方法は、
ｉ）この試験薬の存在下で本明細書において前記された方法を実施する工程と、
ｉｉ）この試験薬の存在下でのバイオフィルムの発達と、この試験薬の非存在下でのバイオフィルムの発達について公知の値とを比較する工程とを包含し、
この試験薬の存在下でのこのバイオフィルムの発達と、この試験薬の非存在下でのこの公知の値との差異が、このバイオフィルムの発達の際のこの試験薬の効果の指標である。
【００４０】
好ましくは、この公知の値は、電子的データベース又は光学的データベースに記録される。必要に応じて、この値を、正規化して（例えば、バイオフィルムの１００％発達を表すように）、試験薬の存在下でこのバイオフィルムの正規化された発達と比較してもよい。この方法では、特定の最小量でバイオフィルム発達に影響する試験薬のみを、さらなる評価のために選択する。
【００４１】
本発明の第三の態様において、バイオフィルムの発達に対する効果を決定すべき試験薬をスクリーニングする方法が提供されるが、この方法は、
ｉ）この試験薬の存在下及び非存在下でバイオフィルムを成長させる工程と、
ｉｉ）本明細書において前記される方法に従ってこのバイオフィルムの発達を測定する工程とを包含し
この因子の有無によるこのバイオフィルムの発達の差異が、このバイオフィルムの発達の際のこの試験薬の効果の指標である。
【００４２】
従って、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン及びクロラムフェニコールのような抗生物質は、バイオフィルム発達を示差的に阻害することが分かる（図１７及び図１８を参照のこと）。
【００４３】
好ましくは、試験薬の有無によるバイオフィルムの発達の差異を正規化して、光学的に又は電子的に記録して、参照化合物の値と比較する。従って、例えば、発達の差異は、電子的データベースに対する阻害割合（又は刺激割合）として記憶することが可能であり、この値を、該当のバイオフィルムの標準的インヒビターに相当する値に対して比較する。この方法では、特定の予め決定された閾値を満たす（例えば、参照化合物程度有効であるか又はそれよりも有効であるとされる）試験薬のみを、以降の試験の目的物として選択し得る。
【００４４】
適切には、この試験薬は、バイオフィルム内の遺伝子発現に影響する。好ましくは、この試験薬は、このバイオフィルム内の特定の微生物集団の遺伝子発現に影響する。
【００４５】
適切には、この試験薬はバイオフィルム発達を阻害する。
【００４６】
適切には、この試験薬は、バイオフィルムの発達を促進する。このような化合物は、水処理及び廃水処理業のような産業に特に重要である。
【００４７】
好ましくは、この試験薬は、電磁放射線、イオン化放射線、電場、音響エネルギー及び磨耗からなる群より選択される物理的因子である。電磁放射線の適切な形態としては、紫外線照射が挙げられるが、イオン化合物照射の適切な形態としては、α線、β線及びγ線が挙げられる。磨耗は、バイオフィルムの表面に対する、ブラシ又は微粒子物質のような機械的物質の形態で、物理的実体を物理的に摩擦するか又は小片化する（ｓｃｒａｐｐｉｎｇ）工程を包含する。
【００４８】
好ましくは、試験薬は蛍光化合物であるか、又は蛍光標識された化合物であって、それによってそのバイオフィルム全体にわたる分布の測定を容易にする。さらに詳細には、この試験薬は、有機化合物、無機化合物、ペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、ポリヌクレオチド及びタンパク質核酸からなる群より選択される。
【００４９】
本発明の第四の態様に従って、バイオフィルムの発達を測定するための、本明細書に記載される共焦点画像化システムの使用が提供される。
【００５０】
本発明の第五の態様によれば、蛍光画像化システムを用いて、スキャンされる対象物の３次元構造を解析する方法が提供されるが、このシステムは、
ａ）１以上の波長を含む電磁放射線のビームを形成する放射線供給システムと、
ｂ）この対象物の１以上の面上にこのビームを指向しかつ集束する光学的システムと、
ｃ）この対象物から放射された電磁放射線を検出し、画像化データを作成する検出システムと、
ｄ）電磁放射線を用いて複数の面においてこの対象物をスキャンする走査システムとを備え、
この方法は、この対象物の３次元構造に関連するデータを決定するためにこの画像データを処理する工程を包含し、この方法は、自動化された画像データ閾値化工程を包含し、この閾値化工程は、
ｉ）画像データにおける強度値を解析する工程と、
ｉｉ）画像データについての閾値を算出する工程と、
ｉｉｉ）この閾値を用いてこの画像データを処理して、閾値画像データを作成する工程とを包含する。
【００５１】
複数の異なる画像の各々についての閾値の自動化された決定によって、蛍光画像化システムによって作成された画像データにおいて三次元構造を解析するための高スループットの画像解析システムが可能になる。この態様は特に、ただし排他的ではないが、バイオフィルムにあてはまる。１つの画像毎に、又は異なる面におけるバイオフィルムからとった１セットの画像の各々についての自動的な閾値化によって、以下を含む問題を克服することが可能である：例えば、異なる色素濃度、異なるレーザー出力又は異なるカメラ露光時間などの異なる実験パラメーターを用いた、バイオフィルムの異なるサンプルについての平均画像化強度における変動；サンプル内の面の深さの差異に起因するバイオフィルムサンプルの異なる面の画像についての画像強度の変動；並びに例えば、均一でないサンプル照射、又はサンプル厚みもしくは密度の均一でない変動に起因する、画像の局所的な強度の変動。
【００５２】
本発明の第六及び第七の態様によれば、本明細書に記載される本発明の方法を実行するための、それぞれコンピューターソフトウェア、及びこのようなコンピューターソフトウェアを記憶するデータキャリアが提供される。
【００５３】
本発明は、以下の図面を参照してさらに記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明は、未結合の発蛍光団の存在下、又は内在する蛍光化合物（潜在的な候補薬物を含む）の存在下で、バイオフィルム細胞の共焦点面から蛍光シグナルを画像化することができる。これらのアッセイは、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの染色液、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、Ｈｏｅｃｈｓｔの核染色液及びクマリン染色液が挙げられるがこれらに限定されない、任意の公知の発蛍光団又は蛍光標識を利用し得る（Ｈａｕｇｌａｎｄ  Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ編、１９９６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎを参照のこと）。
【００５５】
光学的構成
図１は、本発明の第一の実施形態を示す。この顕微鏡は、例えば、光学的範囲において、３５０〜７５０ｎｍで、１００又は１１０の電磁放射線の供給源と、円柱レンズ１２０と、第一スリットマスク１３０と、第一リレー・レンズ１４０と、ダイクロイックミラー（２色性ミラー）１５０と、対物レンズ１７０と、サンプルウェル１８２の二次元アレイを備えるマイクロタイタープレート１８０と、チューブレンズ１９０と、フィルタ２００と、第二スリットマスク２１０と、検出器２２０とを備える。これらの構成要素は、図１の面に対して垂直に延びるマスク１３０、２１０においてスリット開口部１３２、２１２を備える光学軸ＯＡにそって配置される。レンズ１４０、１７０及び１９０の焦点長さ、並びにこれらのレンズ間の間隔、並びにマスク１３０とレンズ１４０との間隔、対物レンズ１７０とマイクロタイタープレート１８０との間隔、及びレンズ１９０とマスク２１０との間隔は、共焦点顕微鏡を提供するような間隔である。この実施形態において、ランプ１００又はレーザー１１０からの電磁放射線は、円柱レンズ１２０を用いてラインに集束される。このラインの形状は、第一のスリットマスク１３０によって最適化される。
【００５６】
スリットマスク１３０は、対物面に対して面接合している、光学的システムの画面に示されている。スリットマスク１３０において開口部１３２によって形成される照射ストライプは、レンズ１４０、ダイクロイックミラー１５０及び対物レンズ１７０によって、サンプルウェル１８２の二次元アレイを備えるマイクロタイタープレート１８０上に中継される。図示の便宜のため、図１の光学的構成要素は、断面で、ウェルプレートは透視的に（遠近法で）示している。ウェルプレート１８０上への照射ラインの投影は、ライン１８４によって示されており、また図１の面に対して垂直であることが理解される。矢印Ａ及びＢによって示されるとおり、ウェルプレート１８０は、示していない方法によって、このアレイの次元に対して平行な２つの次元（Ｘ、Ｙ）で動かすことができる。
【００５７】
別の実施形態では、スリットマスク１３０は、対象の後焦点面（ＢＦＰ）１６０に対して接合した面にある、この光学システムのフーリエ面に存在する。
【００５８】
この場合、開口部１３２は、図の面に存在し、このレンズ１４０は、開口部１３２によって形成される照射ストリップを、対物レンズ１７０の後焦点面１６０上にリレーして、この対物レンズ１７０がこの照射ストリップを、図１の面に垂直な対物面におけるライン１８４に変換する。
【００５９】
さらなる別の実施形態において、スリットマスク１３０は、全体に取り除かれる。この実施形態によれば、照射源はレーザー１１０であり、これからの光が対物レンズ１７０の後焦点面１６０に集束される。これは、図１に示される円柱レンズ１２０と球面レンズ１４０との組み合わせによって達成されてもよいし、又はこの照射は、円柱レンズ１２０によってこの平面１６０中に直接集束されてもよい。
【００６０】
サンプル領域の画像、例えば、サンプルウェル１８２のサンプルの画像は、このサンプル内の面上に照射のラインを投射すること、それからの蛍光発光を検出器２２０上に画像化すること、及びこの検出器２２０の読み出しと同調して、照射のラインに対して垂直な方向に面１８０を動かすことによって得られる。図１に示される実施形態では、この蛍光発光を、対物レンズ１７０によって収集して、ダイクロック（二色性）ビームスプリッター１５０を通じて投影して、高感度修正済み対物レンズ１７０を有する共焦点画像化システムに適切であるように、レンズ１９０によって、フィルム２００及び第二のスリットマスク２１０を通して検出器２２０上に画像化する。このダイクロイックビームスプリッター１５０及びフィルタ２００は、照射波長で優先的に光をブロックする。
【００６１】
検出器２２０は、図面ではカメラであって、一次元であっても二次元であってもいずれでもよい。一次元の検出器を用いる場合、スリットマスク２１０は必要ない。所定の領域が画像化されるまで、この照射、検出及び翻訳の手順を続ける。サンプルを連続的な速度で移動する場合、機械的動きを簡略化する。カメラの読み取り時間が露光時間に比べて小さい場合、連続的な動きは最も有用である。好ましい実施形態では、カメラを連続的に読む。露光時間と読み取り時間の組み合わせの間、サンプルの移動ｄは、照射ラインの幅Ｗよりも大きくても小さくてもよい（例えば、０．５Ｗ≦ｄ≦５Ｗ）。マルチウェルプレートの全てのウェルを同様の方式で画像化し得る。
【００６２】
或いは、この顕微鏡は、この光学システムの視野によって主に制限される、隣接する多数のウェルにまたがる照射のラインを集束するように構成されてもよい。最終的に、２以上の顕微鏡を同時に用いてもよい。照射ストリップ１８４のサイズ及び形状は、対物レンズ後焦点面１６０におけるフーリエ変換ストリップの幅及び長さによって決定される。例えば、ライン１８４の長さは、１６０におけるラインの幅によって決定され、逆に、１８４の幅は、１６０における長さによって決定される。回折限界能のために、１６０での照射ストリップの長さが対象後開口部を一杯にするように選択する。照射ストリップ１８４のサイズ及び形状は、対物レンズにおける逸脱によって課される制限内での、円柱レンズ１２０の焦点長さと１２０でのビームサイズとの組み合わせ（すなわち、各々の次元での有効な開口数によって）、及び対物レンズの視野によって、制御し得るとことは当業者には明白である。
【００６３】
照射１８４のラインの寸法を、シグナル対ノイズ比を最適化するように選択する。結果として、それらはサンプルに依存する。アッセイ次第で、解像度は、回折限界とほぼ５μｍとの間で変化し得る。ビーム長は好ましくは、対物レンズの視野、代表例として、０．５〜１．５ｍｍによって決定される。例えば、Ｎｉｋｏｎ  ＥＬＷＤ，０．６  ＮＡ，対物レンズ４０×、は、約０．７５ｍｍの視野を有する。この対物レンズを用いた６３３ｎｍの放射線についての回折限界解像度は、約０．６μｍ、又は約１１００の分解能領域（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）である。
【００６４】
有効深さ分解能は原則的に、スリットマスク２１０における開口部２１２の幅、又は一次元検出器の幅、並びに対物レンズ１７０とレンズ１９０との組み合わせによって得られる画像倍率によって、決定される。共焦点顕微鏡の最高の距離分解能は１μｍに達する。Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｊ．Ｂ．Ｐａｗｌｅｙ，編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，第二版，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５）は、距離分解能ｄZについていくつか表現しているが、特に２つが最も適切であり、
ｄZ＝１．７７λ／（ＮＡ）2
ｄZ＝０．２２λ／ｎ．ｓｉｎ2（α／２）、
であって、λは、光の波長であって、ＮＡは顕微鏡対物レンズの開口数であって、ｎは、媒体の屈折率であって、αはＮＡを計算するために用いた角度をいう。両方の式とも、理想的な又はゼロサイズのピンホールを想定している。最初の式は、光軸（この方向は、一般にｚ方向と呼ばれるが、光軸に対して垂直な面はｘ−ｙ面である）に沿ったレイリー規準にあてはまる。空気中で集束された顕微鏡の対物レンズは、ｘ−ｙ面における焦点、並びにｘ−ｚ面又はｙ−ｚ面にそった別の分布でエアリーディスク断面を有する３Ｄ回折限界スポットを生じる。この式は、光ルミネセンス画像化における距離分解能を最もよく表している。二番目の式は、近軸（小角）理論を用いて誘導されるが、これは見られている対象物が完全に平面のミラーであると仮定する。低いＮＡでは、一番目の式は、正反射に起因する２つの係数以外は、二番目の式と一致する。これらの式は、近似に過ぎないと考えるべきであって、いくつかの状況では、正確に解像度を予測することができない。
【００６５】
有効深さ分解能を実験的に決定することが通常好ましい。これは、例えば、顕微鏡の解像限度よりも小さい直径を有する蛍光ポリスチレンビーズをサンプルとして用いることによって可能になる。従って、このビーズにより焦点面をステッピングすることによって得られたこの対象物の画像は、解像度未満の物体の画像であって、光学的システムの点像分布関数（点拡散関数）の定義として用いられ得る。Ｚ方向（軸方向）における最大半減での全幅は、光学システムの距離分解能の定義として用いられる。
【００６６】
照射の有効開口数（「ＮＡ」）は、対象物のＮＡよりも少ない。しかし蛍光発光は、対物レンズの全ＮＡで収集される。開口部２１２の幅は、さらに大きい照射容積からの発光を検出するために増大されなければならない。回折限界よりも数倍大きい開口幅で、幾何光学によって、検出体素（ボリュームエレメント）のサイズについて十分な近似が得られ：
側方幅：ａd＝ｄd／ｍ、
軸幅：ｚｄ＝√２ａd√ｔａｎα、
であって、ｍは倍率、ｄdは開口部２１２の幅、αは対物レンズ１７０に内在される半角である。本発明の重要な部分とは、照射開口部１３２、又は開口部を有さない実施形態におけるその等価物、及び検出開口部２１２が独立して制御可能であるということである。
【００６７】
マルチ波長構成
マルチ波長蛍光画像化を可能にする実施形態は、特定のタイプのアッセイに好ましい。２以上の測定が同時に行なわれることが一般に有利であって、しばしば必要である。なぜなら、生物学的応答における重要なパラメーターの１つは時間であるからである。
【００６８】
独立した波長又は色の数は、実施される特定のアッセイに依存する。１つの実施形態では、３つの照射波長が用いられる。図２（ａ）及び図２（ｂ）は、三色のラインスキャン共焦点画像化システムにおけるレイ・パスを、それぞれ上面及び側面から示す。一般に、このシステムは、電磁放射線のいくつかの供給源Ｓnと、平行レンズＬnと、第一の空間的フィルタＳＦ1において細長いビーム中に円柱状ラインＣＬによって集束される平行化されたビームを生成するミラーＭnと、第一の空間的フィルタＳＦ1と第二の空間的フィルタＳＦ2と画像化レンズＩＬとの間の共焦点顕微鏡、ビームスプリッターＤＭ1及びＤＭ2と、サンプル由来の蛍光放射線の異なる波長成分を分離かつ検出する検出器Ｄnとを備える。空間的フィルタＳＦ1及びＳＦ2は好ましくはスリットマスクである。
【００６９】
詳細には、図２（ａ）は、色λ1、λ2及びλ3の供給源Ｓ1、Ｓ2及びＳ3、並びにそれぞれの供給源からの光を平行にするレンズＬ1、Ｌ2及びＬ3を示す。レンズＬ1、Ｌ2及びＬ3は好ましくは、このシステム中の他のレンズの任意の色度を補償するように調節される。ミラーＭ1、Ｍ2及びＭ3を用いて、供給源Ｓｎからの照射カラーを組み合わせる。ミラーＭ1及びＭ2は、部分的に伝達され、部分的に反射され、好ましくはダイクロイック（二色性）である。例えば、Ｍ2は、優先的にλ3を伝達し、かつ優先的にλ2を反射しなければならない。従って、λ3がλ2より大きいことが好ましい。共焦点モードにおける顕微鏡の操作には、供給源Ｓｎからの組み合わせた励起ビームが、対物面ＯＰにおいて、「ライン（ｌｉｎｅ）」又は高度に偏心性の楕円に集束されることが必要である。上記の図１と組み合わせて考察されるとおり、これを達成するために種々の構成が用いられてもよい。図２において示された実施形態において、合わされた照射ビームは、円柱レンズＣＬによって、空間的フィルタＳＦ1におけるスリットと一致する細長い楕円へ集束される。図２ａ及び図２ｂに示されるとおり、スリットマスクＳＦ1は、照射光の伝達に対して垂直に位置付けられたシステムの画面にかつ図２ａのページの面におけるその長軸にそって存在する。レンズＴＬ及びＯＬは、ＳＦ1を含む面からの照射ラインを対物面ＯＰにリレーする。回転ミラーＴＭは、便利のためである。別の実施形態では、ＤＭ3は、ＴＬとＯＬとの間にあり、ＣＬは照射光をＢＦＰに直接集束する。他の実施形態は、当業者に明白である。
【００７０】
図２（ｂ）を参照すれば、サンプルによって放射されかつ対物レンズＯＬによって集光される光は、チューブレンズＴＬによって空間フィルタＳＦ2上に画像化される。ＳＦ2は好ましくは、このページの面に対して垂直に延びるように配置されたスリットである。従って、フィルタＳＦ2を通過した光は実質的にラインの照射である。ＳＦ2は一次画面におかれてもよいし、又はそれに接合した任意の面におかれてもよい。ＤＭ3は部分的に反射され、部分的に伝達され、好ましくは「多色（ｍｕｌｔｉｃｈｒｏｉｃ）」である。優先的に特定の波長帯を反射してその他の波長帯を優先的に透過する、マルチ波長の「ダイクロイック」ミラー又は「マルチクロイック」ミラーを得ることができる。
【００７１】
本明細書において、δλ1は、λ1によって励起された蛍光発光であると規定される。これは一般に、λ1よりもいくらか長い波長の分布であり、δλ2及びδλ3は、同じように規定される。ＤＭ3は、優先的にλnを反射して、δλnを優先的に透過するが、ここでｎ＝１、２、３である。ＳＦ2によって伝達された光は、一次画面に接合した面に存在する検出デバイス上に画像化される。図２（ａ）では、空間的フィルタＳＦ2の画像は、３つの検出器Ｄn全ての上のレンズＩＬによって作成される。この実施形態は好ましくは、それぞれの検出器によって作成された画像の間のほぼ完璧な登録を必要とする適用である。別の実施形態では、個々のレンズＩＬnは、検出デバイスと関連し、レンズ対ＩＬ及びＩＬnは、それぞれの検出器Ｄn上に空間的フィルタＳＦ2の画像をリレーするように機能する。この光は、ミラーＤＭ1及びＤＭ2によって検出器の間でスプリットされる。ミラーは部分的に透過し、部分的に反射し、優先的にダイクロイック（二色性）である。ＤＭ1は優先的にδλ1を反射して、優先的にδλ2及びδλ3を透過する。ブロッキングフィルタＢＦ1は優先的に、δλ1を透過し、存在する他の全ての波長を効率的にブロックする。ＤＭ2は優先的にδλ2を反射して、δλ3を優先的に透過する。ブロッキングフィルタＢＦ2及びＢＦ3はそれぞれ、δλ2及びδλ3を優先的に透過し、存在する他の全ての波長を効率的にブロックする。
【００７２】
オートフォーカス
本発明のこの実施形態によれば、サンプルは複数の面の各々に存在し、これが画像化システムの対物面中に走査機構によって移動され得る。従って、本発明は、そのシステムの対物面内の画像化システムの視野においてサンプルの現在選択された面を維持するオートフォーカスシステムを提供する。平面性の正確さはこのシステムの被写界深度によって決定される。好ましい実施形態では、被写界深度はほぼ１０μｍであって、この視野はほぼ１ｍｍ2である。
【００７３】
このオートフォーカスシステムによって、対物レンズ、従って焦点面の正確な動きが可能になる。このオートフォーカスシステムの操作には無視できる遅れを伴う。すなわち、応答時間は、画像取得時間に対して短く、例えば、０．０１〜０．１秒である。さらに、オートフォーカス光源は、照射光源及びサンプル特性とは独立している。他の利点のなかでも、この構成によって、画像化システムの光軸に沿うサンプルキャリアの位置を対物面の位置と独立して決定することが可能になる。
【００７４】
シングルビームオートフォーカスの１つの実施形態は、波長λ4の別の光源Ｓ4及び検出器Ｄ4が示される図２及び図３に提供される。波長λ4は、サンプル蛍光とは別個である必要があり、優先的には、サンプルにおいて感知可能な蛍光を励起できない波長でなければならない。従ってλ4は優先的には、近赤外線、例示的には８００〜１０００ｎｍである。部分的に透過し、部分的に反射するミラーＤＭ4は優先的にダイクロイックであって、λ4を反射して、λn及びδλnを透過するが、ここでｎ＝１、２、３である。本出願に適切である、光学に基づくオートフォーカス機構は公知である。例えば、サーボ制御に適切な位置誤差シグナルの生成のための乱視用レンズベースのシステムは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｏｐｔｉｃｓ  ２３，５６５〜５７０（１９８４）に開示されている。「スキュービーム」を利用する焦点誤差検出システムは、ＳＰＩＥ  ２００，７３〜７８（１９７９）に開示されている。後者のアプローチは図２及び３によって容易に実現されるが、ここでＤ4はスプリット検出器である。
【００７５】
しかし、ウェルの底にバイオフィルムが存在するマイクロタイタープレートを用いる使用のためには、サーボループが、ウェルの間で移動するように壊されなければならない。これは、照射が別のウェルに動かされる各時点で再度焦点を合わすことが必要なせいで、実質的な時間の遅延を生じ得る。
【００７６】
サンプル面及び対物面の相対的位置の連続的な閉鎖回路型（クローズドループ）制御が、図４に示される本発明の好ましい実施形態で提供される。このシステムは電磁放射線の２つの独立したビームを利用する。１つは、Ｓ5に由来するが、これは連続表面、例示的にはマイクロタイタープレートの底に集束される。もう一方は、Ｓ4に由来するが、これは不連続表面、例えば、マイクロタイタープレートのウェルの底に集束される。１つの実施形態では、Ｓ4及びＳ5に由来するビームはそれぞれ、波長λ4及びλ5を有する。波長λ4のビームは、Ｌ4によって平行にされ、絞りＩ4によって絞られて、対物レンズＯＬによって不連続表面上に集束される。
【００７７】
波長λ5のビームは、Ｌ5によって平行にされ、絞りＩ5によって絞られて、対物レンズＯＬと連動したレンズＣＦＬによって連続表面上に集束される。この反射された光は、それぞれレンズＩＬ4及びＩＬ5によって、検出器Ｄ4及びＤ5上に集束される。部分的に透過し、部分的に反射するミラーＤＭ4は優先的にはダイクロイックであり、λ4及びλ5を反射して、λn及びδλnを透過するが、ここでｎ＝１、２、３である。このミラーＭ4、Ｍ5及びＭ6は部分的に透過し、部分的に反射する。λ4及びλ5が別個である場合、Ｍ6は優先的にダイクロイックである。
【００７８】
バイオフィルムがマイクロタイタープレートに存在する実施形態によれば、λ4はウェルの底に集束される。対物面は、種々の距離でウェルの底からオフセットされ得る。これは、Ｌ4を調節することによって、或いはサーボ制御ループにおけるオフセット調節によって達成される。説明の都合上、λ4は対物面に集束すると仮定する。
【００７９】
オートフォーカスシステムの操作は以下のとおりである。サンプルウェルの底が、対物レンズＯＬの焦点面にない場合、検出器Ｄ4は、エラーシグナルを生じて、これがスイッチＳＷを通じてＺ制御に与えられる。このＺ制御は、マイクロタイタープレートが対物レンズに向かうか又は対物レンズから離れるように動くモーター（示さず）を制御する。
【００８０】
擬似閉鎖回路型（クローズドループ）（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｌｏｓｅｄ  ｌｏｏｐ）制御が、シングルビームオートフォーカスの好ましい実施形態で提供されるが、これは以下のとおりである。スキャンの末端で、コンピューター端末は、ＳＷを操作してサンプルアンドホールドデバイスに制御を切り換える。このデバイスは、プレートが次のウェルに移動されて、その後にＳＷがＤ4に切り換えて戻される間、Ｚ制御の出力を一定レベルに維持する。
【００８１】
検出デバイス
開示された装置の特徴は、対物面に接合された面に独立した検出要素であるマニフォールドを有する検出デバイスの使用である。上記で考察されたように、ライン照射は原則的に、迅速な画像化を必要とする適用には有利である。しかし、ポイント照射に比較してライン照射の平行処理において固有の潜在的な速度上昇は、画像化システムが照射ラインにそってサンプルの各ポイントから放射された光を同時に検出可能である場合にしか実現可能ではない。
【００８２】
１つの実施形態は、連続的読み取りラインカメラを用い、好ましい実施形態では、長方形のＣＣＤをラインカメラとして用いる。両方の実施形態とも画像内のライン間でも、画像間でも不感時間を有さない。本発明のさらなる利点は、さらに大きい有効な視野が、以下に考察される、ステージスキャン実施形態において達成可能であるということである。
【００８３】
検出デバイスに必要な特性はさらに、以下の好ましい実施形態を考慮することによって明らかになり得る。対物レンズの解像限界は１μｍ未満、代表的には約０．５μｍであり、この検出器は約１０００の独立した素子のアレイを備える。解像度、視野（ＦＯＶ）及び画像取得速度は、独立した変数ではなく、これらのパフォーマンスパラメーターの間で妥協する必要がある。概して、光学システムの倍率は、解像度を犠牲にすることなく、できるだけ大きいＦＯＶを画像化するように設定される。例えば、約１ｍｍの視野は、１μｍの画素化で１０００素子のアレイ上に画像化し得る。検出素子が２０μｍ平方である場合には、このシステムの倍率は２０倍に設定される。これでは１μｍの解像度は得られないということに注意のこと。
【００８４】
画素化は、解像度と等価ではない。例えば、対物レンズの固有の解像限界は、０．５μｍであって、対物面中の各々０．５μｍ×０．５μｍの領域が画素上にマッピングされ、得られるデジタル画像の真の解像度は、０．５μｍではない。真の０．５μｍの解像度を達成するためには、画素化は、対物面において約０．２μｍ×０．２の領域に相当する必要がある。好ましい実施形態では、画像化システムの倍率は、光学の真の解像度を達成するように設定される。
【００８５】
好ましくは、高い検出有効性、低いノイズ及び大きい読み出し速度のためには、用いられる検出器はＣＣＤカメラである。図５においては、長方形のＣＣＤカメラは、検出器の素子のｍ×ｎのアレイを有することが示されているが、ここでｍは実質的にｎより小さい。蛍光発光の画像は、リードレジスターに対して好ましくは近位である１つの行をカバーする。これによって移行時間が最小限になり、照射された行とリードレジスターとの間の行からのシグナルへの偽計数の蓄積が回避される。
【００８６】
原則的に、光学システムの倍率を設定することが可能であり、その結果ＣＣＤカメラ上のスリットＳＦ2の画像の高さは、図５に示されるとおり、１画素である。
【００８７】
実際上、照射ラインとカメラの行の軸との完全な整列を維持することは困難であり、図２及び図３に例示されるように、多波長の実施形態において３つのカメラと照射の間の整列を維持することはさらに困難である。わずかな検出素子、例示的には２〜５個を一緒に結合することによって、カメラの各々の列における整列の状況は弛緩し得るが、読み取りノイズ又は読み取り時間において被るペナルティーは最小のままである。
【００８８】
可変幅検出空間フィルタである、図２及び３におけるＳＦ2、並びに図１の２１０（各々、対物面に接合した面に位置する）と組み合わせた検出デバイスとして１以上の長方形のＣＣＤカメラを有する好ましい実施形態のさらなる利点は以下によって解明される。上記で考察されたとおり、本発明の１つの実施形態では、検出空間フィルタは省略されて、組み合わされた検出空間フィルタ及び検出デバイスとして、ラインカメラが用いられる。ただし、上記に考察されたように、可変幅検出空間フィルタによって検出容積の最適化が可能になり、それによってサンプル依存性のシグナル対ノイズ比が最適化される。以下の好ましい実施形態によって、ラインカメラの利点、すなわち速度及び可変検出容積の自由度が保持される。倍率は、カメラの１つの行に高さｈの回折限界ラインを画像化するように設定される。検出空間フィルタの幅ｄは好ましくは可変性であり、
ｈ≦ｄ≦１０ｈである。
【００８９】
カメラの照射された列における検出器は、読み取りの前にビンニングされるが、これは、露光時間及び読み取り時間に比べれば無視できる程度の時間しか要しない操作である。
【００９０】
好ましい実施形態において、カメラは、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＮＴＥ／ＣＣＤ−１３４０／１００−ＥＭＤである。好ましい実施形態における読み取り速度は、２〜３個の電子の読み取りノイズで１ＭＨｚである。画素のフォーマットは１３４０×１００であり、カメラは、目的の領域から離れた行のほとんど（８０％）をシフトするように配線され、これによってカメラは事実上１３４０×２０にされる。
【００９１】
連続読み取りカメラの上述の利点、すなわち連続的な取得の間に不感時間が存在しないことに加えて、さらなる利点とは、サンプルの程度によってのみ限定される長さを有する長方形の画像の取得が可能になるということである。この長さは、カメラの幅及びライン照射の程度のうちの小さいほうによって決定される。好ましい実施形態において、結合されたバイオフィルムを、直径が７ｍｍである９６ウェルのマイクロタイタープレートにおけるウェルの底に配置する。１μｍ×１ｍｍのストリップを照射してこの照射された領域から放射された放射線を検出デバイスの上に画像化する。視野が約１ｍｍ2であるように光学的トレインを設計する。ウェルの底の画像は、１×７ｍｍの視野にわたって１μｍの画素化で生成し得る。
【００９２】
環境的制御
本発明の実施形態において、生きたバイオフィルムの上でアッセイを実施する。生きた細胞アッセイには頻繁に、適切に試行するための生理学的条件に対する合理的な近似が必要である。とりわけ重要なパラメーターは温度である。温度を上下させる、詳細にはサンプルの温度を３７℃に維持する手段を組み込むことが所望される。別の実施形態では、生きたバイオフィルムの生存度を維持するためには、相対的な湿度、及び／又はＣＯ2及び／又はＯ2を支配する制御が必要である。さらに、蒸発を最小限にするための湿度管理は、サンプル容積が小さい場合、重要である。
【００９３】
共焦点画像化システムと適合する、上昇した温度、好ましくは３７℃でマイクロタイタープレートを提供する３つの実施形態が続く。
【００９４】
この画像化システムは好ましくは、遮光性の囲いの中にある。第一の実施形態では、サンプルプレートは、この囲いの内側にその全体を所望の温度で維持することによってその温度で維持される。しかし３７℃では、高い湿度を意図的に維持しない限り、蒸発冷却がサンプルの容積を減らしてアッセイ期間を制限する。
【００９５】
第二の実施形態は、マイクロウェルプレートの加熱カバーを提供し、これによってこのプレートは固定されたカバーの下で動くことが可能になる。このカバーは、顕微鏡の光軸と整列されたウェルの上に単一の開口部を有する。この開口によって、プレートのその他の部分に対する加熱及び循環の制限を維持したままで、アクティブなウェルへ分配することが可能になる。加熱されたカバープレートとマイクロウェルプレートとの間の約０．５ｍｍのスペースによって、マイクロウェルプレートの自由な移動が可能になり、蒸発が最小限になる。問い合わせられるウェルの内容物が、ディスペンサーの開口部を通じて、環境条件に曝されるのは長くとも２〜３秒間であるので、この内容物は、測定の間に大きな温度変化を被ることはない。
【００９６】
第三の実施形態では、プレートの底の囲いとして、細い、加熱されたサファイアのウインドウを用いる。ウェルセパレーターに沿った抵抗性のヒーターのパターンによって、このウインドウの温度は所望のレベルに維持される。
【００９７】
さらなる実施形態において、３つの開示された方法を種々に組み合わせることができる。
【００９８】
組み込み型ディスペンサー
本発明の１つの実施形態によって、組み込み型ディスペンサーが提供される。９６ウェル又は３８４ウェルのプレートでのアッセイ実行のために、この範囲２０〜１００μＬにおいてさらなる容積が所望される。例えば、イオンチャネル活性のアゴニストの添加に適したシングルヘッドディスペンサーは、ＩＶＥＫ  Ｄｉｓｐｅｎｓｅ  ２０００である。該当するユニットは、ＣＡＶＲＯから入手可能である。より一般的には、各々のウェルに固有の化合物を分配することが可能であることが望ましい。１つの実施形態は、解析ステーション、固有の化合物を備えるソースプレート、及びチップクレンジングステーションの間で分配ヘッドを左右に動かすロボット様運動デバイス上にシングルヘッドディスペンサーを備える。チップクレンジングステーションは、固定されたチップディスペンサーの洗浄ステーション、及び使い捨て可能なチップディスペンサーのチップ交換ステーションである。このシステムは、比較的安価に所望の機能を提供するが、スループットが低く、化合物の吸引−廃棄−浄化のサイクルにはほぼ３０秒を要する。共焦点画像化システムへのＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ  ＭＰＨ−９６のようなマルチヘッドディスペンサーの組み込みによって別の実施形態が提供される。ＭＰＨ−９６は、上記される吸引−廃棄−洗浄のサイクルを履行し得るロボット様運動デバイスに装着された、９６個の独立して固定されたチップディスペンサーから構成される。
【００９９】
自動化されたスクリーニングアッセイにおいて使用される、本発明のさらなる好ましい実施形態において、画像化システムは、Ｚｙｍａｒｋ  Ｔｗｉｓｔｅｒのようなプレート取り扱いロボットを組み込まれる。
【０１００】
アッセイ
以下の実施例１〜３に記載されるアッセイ方法の多くのバリエーションは、本発明に従って、実施し得る。一般に、１以上の蛍光標識された種の特徴的な強度、及び／又は空間的分布、及び／又は一時的分布がアッセイを定量するために用いられる。
【０１０１】
データ処理システム
図６は、本発明に従って配列されたシステムのデータ処理成分の模式図を示す。このシステムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）  ｓｙｓｔｅｍに基づき、上記のような共焦点顕微鏡４００を備えるが、この顕微鏡は、検出器Ｄ1、Ｄ2、Ｄ3、Ｄ4、Ｄ5と、スイッチＳＷと、制御ユニット４０１と、画像データストア４０２と、入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイス４０４とを備える。別の配置が可能であることに注意のこと。この配置としては、Ｄ4及びＤ5が省略された配置、Ｄ4が省略された配置、及びＤ5が省略された配置が挙げられる。画像データストア４０２は、任意の適切な形態の記憶デバイスであってもよく、或いは省略されてもよく、このときこの出力データは、接続されたコンピューター端末４０５に伝達されて記憶されている。接続されたコンピューター端末４０５は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）４０８と、メモリー４１０と、データ記憶デバイス、例えばハードディスクドライブ４１２と、Ｉ／Ｏデバイス４０６とを備え、これがそれぞれ、このコンピューターと顕微鏡４００との相互接続、このコンピューターとスクリーン４２８のディスプレイ要素４３２とのスクリーンＩ／Ｏデバイス４３０を介した相互接続を容易にする。操作システムプログラム４１４は、ハードディスクドライブ４１２に記憶され、コンピューター端末４０５の低レベルの操作を公知の様式で制御する。プログラムファイル及びデータ４２０はまた、ハードディスクドライブ４１２上に記憶されて、接続されたデバイスを介したオペレーターへの出力、及びハードディスクドライブに記憶された出力データを公知の方式で制御する。接続されたデバイスは、スクリーン４２８の構成要素としてディスプレイ４３２と、ポインティングデバイス（示さず）と、キーボード（示さず）とを備え、さらなるＩ／Ｏデバイス（示さず）を介してオペレーターからの入力を受け取り、及びオペレーターへ情報を出力する。ハードドライブ４１２に記憶されるプログラムファイル４２０に含まれるのは、画像処理及び解析アプリケーション４１６と、アッセイ制御アプリケーション４１８と、顕微鏡４００から受容した画像データ及びデータ処理の間に得られた出力ファイルを記憶するデータベース４２２である。画像処理及び解析のアプリケーション４１８は、公知の画像処理及び解析ソフトウェアパッケージ、例えば、Ｍｅｄｉａ  ＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓのＩｍａｇｅ−Ｐｒｏ（商標）のカスタマイズされたバージョンであってもよい。
【０１０２】
共焦点顕微鏡４００を用いるアッセイの能力は、制御アプリケーション４１８を用いて制御され、画像データが得られる。少なくとも１つの検出器Ｄ1、Ｄ2、Ｄ3によるマイクロタイタープレート中の少なくとも１つのウェルについての画像データの取得の終了後、この画像データをコンピューター４０５に移して、コンピューター端末ハードドライブ４１２のデータベース４２２に記憶させ、この時点でこの画像データを、以下に詳細に記載されるように、画像処理及び解析のアプリケーション４１６を用いて処理し得る。
【０１０３】
データ解析
概して、データの取得及び解析には多数の別個の工程を包含する。蛍光は、１以上のデジタル画像に変換され、ここでこのデジタル値が、この検出デバイスの各々の画素上の蛍光放射線入射の強度に比例する。この工程においては、視野を横切る画像化システムの不均一な応答のために補正が行なわれ、ここではバックグラウンド−差引きデータを、いわゆるフラットフィールドファイルによって割る。
【０１０４】
画像処理及び解析のアプリケーション（４１６）によって、図７〜１４に記載されるようにデータ解析を実施する。図７は、解析アルゴリズムのフローダイアグラムに相当する。解析は第一ウェル（ｉ＝１）の第一Ｚ面（Ｚ＝１）で開始する（５００）。第一ウェルの第一Ｚ面の画像は、コンピューターのメモリーにロードされる（５１０）。この画像は、この装置の３つのカメラによって記録された画像に対応する１以上のカラープレーン（例えば、レッド（Ｒ）、グリーン（Ｇ）、及びブルー（Ｂ））から構成し得る。３カラープレーンからの情報は、３つの画像に分離され（５２０）、各々の画像が別々に処理される。３つ全ての画像が同じ方式で処理される。最初に、画像は、光学によって導入された湾曲及び逸脱（収差）について補償するように修復される（処理中のレッド画像（５４１）；処理中のグリーン画像（５４２）；及び処理中のブルー画像（５４３））。画像復元は、例えば、逆重畳であってもよいし、又は当該分野で周知の任意の他の画像復元技術であってもよい。この画像修復技術は通常、画像システムの光学特性に対するいくつかの情報（５３０）の入力を必要とする。例えば、逆重畳技術の場合、光学システムの点像分布関数（点拡散関数）（ＰＳＦ）が必要であるかもしれない。
【０１０５】
第二に、各々の画像は、画像データ処理アルゴリズムの画像データ閾値工程において閾値化される。この実施形態では、この閾値化工程は、灰色のスケールの画像を二成分の画像に変換するために、各々の画像（プロセス（５５１）、（５５２）及び（５５３））を二値化する工程を含むが、この工程では、例えば、１は、このバイオフィルム中の微生物によって占められた画像の画素に相当し、０は、微生物間の自由空間によって占められた画像の画素に相当する。本発明のこの実施形態では、二値化閾値の値は、ユーザーの介入なしに決定される。二値化閾値の値は、別々に各々の画像について決定される。或いは、単一の閾値が算出されて、各々のカラーチャネルのために別々に、各々のウェルの全ての画像、すなわち、異なる面における画像のスタックに適用されてもよい。
【０１０６】
図８は、解析アルゴリズムの画像データ二値化プロセス（プロセス５５１、５５２及び５５３）のフローチャートである。図９（ａ）〜（ｃ）は、レッドカラープレーン画像の二値化プロセス（５５１）のステージを図示しており、図１０（ａ）〜（ｃ）は、グリーンカラープレーン画像の二値化プロセス（５５２）のステージを図示している。
【０１０７】
図９（ａ）は、レッド（Ｒ）カラープレーン画像（６１４）を示しており、その強度値は、二値化プロセスにおいて解析される、この実施形態においては、図９（ｂ）に図示される強度ヒストグラム（６１６）を計算する工程（６０２）による。この強度ヒストグラム（６１６）は、第二の軸（６２０）上のレッド画像（６１４）の強度に対して、第一の軸（６１８）上に特定の強度を有する画像の多数の画素をプロットする。強度ヒストグラム（６１６）を用いて、解析された画素のセットの予め決定された割合の強度値を下回る強度値を決定する（６０４）。この予め決定された変位値は、７０％〜９５％の範囲内、好ましくは８５％〜９５％の範囲内、さらに好ましくは約９０％の値（Ｑ90）を有することが認識される。９０％分位（Ｑ90）は、画像の画素の総数（６１４）の９０％がその下にある強度値に相当する。９０％分位（Ｑ90）によって示される強度を用いて、レッド画像（６１４）の最適化された二値化閾値ＴR（６０６）を設定する。本実施例において、二値化閾値ＴRは２４の強度値である。
【０１０８】
次いで、レッド画像（６１４）をこの閾値（ＴR）を用いて二値化して（６０８）、二値画像を生成する。このマスクにおいて、この閾値（ＴR）より大きい強度を有するレッド画像（６１４）の任意の画素を１に設定して、この閾値（ＴR）以下の強度を有するレッド画像（６１４）の任意の画素を０に設定する。１に設定された画素は一般に、レッド画像（６１４）における細菌の要素に相当しており、０に設定された画素は、レッド画像（６１４）におけるバックグラウンドの要素に相当する。図９（ｃ）は、レッド二値画像（６２２）を図示しているが、その上では１に設定された画素は、ホワイトとして示され、０に設定された画素はブラックとして示される。次いで、二値化プロセス（５５１）が終わる（６１２）。
【０１０９】
上記のようなレッド（Ｒ）カラープレーン画像（６１４）に対する二値化工程の適用と同じ方式で、グリーン（Ｇ）及びブルー（Ｂ）の両方のカラープレーン画像を二値化して（５５２、５５３）、閾値化レベルを設定するための同じ予め決定された分位を用いて、グリーン及びブルーの二値画像を形成する。図１０（ａ）は、グリーン（Ｇ）カラープレーン画像（６２４）を示す。図１０（ｂ）は、グリーン（Ｇ）カラープレーン画像（６２４）についての強度ヒストグラム（６２６）を示すが、これはレッド画像（６１４）についてと同じ第一及び第二の軸（６１８、６２０）上にプロットされる。この実施例では、二値化閾値ＴGは、ほぼ４の強度値であり、この値は、グリーンカラープレーン画像（６２４）について最適化されている。図１０（ｃ）は、グリーン２成分画像（６２８）を示す。１に設定された二値化された画素はホワイトであって、０に設定された二値化された画素はブラックである。
【０１１０】
図１１は、別の画像データ二値化プロセスを図示する。この別の二値化工程は、強度の局所的な変動を有する二値化画像に適切である。この強度の局所的な変動は、スキャンされているバイオフィルムの面の不均一な照射、又はスキャンされているバイオフィルムの厚みもしくは密度の変動に起因するかもしれない。不均一な照射の場合、強度の局所的な変動を最小化するフラットフィールド補正のような画像補正方法を用いることが可能である。
【０１１１】
別の二値化工程において、例えば、レッド（Ｒ）カラープレーン画像（６１４）の画像の１画素を選択する（６３０）。固定された領域を有する四角形を、選択された画素を中心として、これによってこの画像の画素の局所領域を選択する（６３２）。この四角形の領域を、サンプルのスキャンの前に決定する。選択された画素の局所領域について、両方の平均強度（ＡＩ）を計算して（６３４）、この強度の標準偏差（ＳＤ）を計算する（６３６）。次いで、画素の二値化閾値ＴPを計算する（６３８）。画素の二値化閾値（ＴP）は以下のように計算する：
ＴP＝ＡＩ＋（Ｍ×ＳＤ）
Ｍは、０．２〜４の範囲、好ましくは０．５〜３の範囲、さらに好ましくは約１の好ましい値で一定である。Ｍの値は、この二値化プロセスが他の画像、例えば、グリーン及びブルーのカラープレーン画像に適用される場合、最初は同じである。
【０１１２】
次に、選択された画素を二値化する（６４０）。選択された画素の強度が、この画素の閾値（ＴP）よりも大きい強度を有する場合、この画素を１に設定する。選択された画素の強度がこの画素の閾値（ＴP）よりも小さい強度を有する場合、この画素を０に設定する。チエック（６４２）を実施して、二値化されていない画像の他の画素（６１４）が存在するか否かを決定する。二値化されていないさらなる画像が存在する場合、画面のさらなる、異なる画素を選択することによって（６３０）、閾値化工程を繰り返す。画面のあらゆる画素の二値化後、この二値化工程を終了して（６４４）、二値画像を得る。
【０１１３】
三番目に、解析アルゴリズムにおいて、画像解析の任意の周知の技術（例えば、侵食拡張、例えばガウシアンフィルタを用いるフィルタリング）を用いることによって、画像からショットノイズを除く（プロセス（５６１）、（５６２）及び（５６３））。四番目に、三つのカラープレーンの処理された画像を、メモリー（５７２）、（５７３）、（５７４）に記憶する。単一のウェルについてのあらゆるＺ面についての全てのカラープレーンの画像を保持して、後期段階で３Ｄ解析を行なう（プロセス（５８１）〜（５８４）を参照のこと）。この画像をまた、サブルーチンのための入力（５７０）として用いる。サブルーチン（５７０）によって、各々のカラープレーンにおけるバイオフィルムの容積及びカラープレーンの間のオーバーラップの容積を決定する。
【０１１４】
このサブルーチンのフローチャートを図１２に示す。５番目に、このプログラムは、ディスクに対する容積測定の結果を記憶する（５７１）。６番目に、このプログラムは、このウェルについて処理されるべき別のＺ面が存在するか否かを決定する（５７５）。１つ存在すれば、次のＺ面（Ｚ＝Ｚ＋１）からの画像を用いて、プロセス（５１０）から全体のプロセスを繰り返す。七番目に、他のＺ面がない場合、このプログラムは、そのウェルについての最終の結果を計算する（５８０）。これらの最終の結果は、例えば、異なるカラープレーンについてのバイオフィルムの総容積、又は微生物の間の自由空間の総容積を含む。８番目に、このプログラムは、３Ｄ対象物解析を行なう。カラープレーンの各々のスタックを別々に処理する。各々のカラースタックに別々に同じサブルーチンを用いる。画像のスタックを、このプログラムの早期段階に記憶する。プロセス（５８１）は、レッドスラックを用いる（５７２）；プロセス（５８２）は、グリーンスタックを用いる（５７３）、プロセス（５８３）は、ブルースタックを用いる（５７４）。このサブルーチンは、微生物のクラスター及びそのクラスターの間のチャネルを同定する。これはまた、微生物のクラスター及びチャネルについての幾何形状パラメーターの統計的分布を決定する。このサブルーチンのフローチャートは、図１３に示されるが、これはあらゆるカラープレーンについて同じフローチャートである。９番目に、３Ｄ対象物解析サブルーチンからの結果を、対象物相互相関のサブルーチンについての入力として用いる（５８４）。このサブルーチンによって異なるカラープレーンに存在する対象物の間の任意の相関を特定する。このサブルーチンについてのフローチャートを図１４に示す。
【０１１５】
１０番目に、このウェルについての全ての結果をスクリーンに提示して（５９０）、ディスクに記憶する（５９１）。このスクリーンへ結果を提示する（５９０）前に、この結果をバリデーションプロセスにおいてバリデートして、質を、従って二値化プロセス（５５１、５５２、５５３）の成功を確認して、画像の画素が一般に１又は０に不正確に設定されていないことを確かめる。これは、例えば、二値化閾値が画像について正確に最適化されていない場合、又はこの二値化された画像のさらなる画像処理、例えば、ショットノイズを除去すること（５６１、５６２、５６３）が、比較的多数の画素の設定を誤って１に移動した場合に生じる。
【０１１６】
バリデーションプロセスが、質の劣る、従って不成功である画像の二値化を決定する場合、この解析アルゴリズムをこの画像について繰り返す。この解析アルゴリズムの繰り返しにおいて、二値化閾値が変えられる。従って、予め決定された分位を用いて二値化閾値を決定する実施形態については、この分位の割合は、必要に応じて、段階的増大又は減少によって改変される。別の二値化工程について、定数Ｍの値は、反復解析において同時に改変される。解析アルゴリズムの繰り返しの後、その結果を、二値化の成功を確認するバリデーションプロセスによって再度バリデートする。二値化の結果がやはり質に劣り、従って不成功であると考えられる場合、この解析アルゴリズムを再度繰り返し、このときは、必要に応じて、この分位の割合又はＭの値のさらなる改変を用いる。バリデーションプロセスによって、一旦、二値化の結果が成功したと考えられれば、この結果をスクリーンに提示する（５９０）。
【０１１７】
バリデーションプロセスは、以下に記載される１以上の工程を包含し得る。このバリデーションプロセスにおいて行なわれ得る工程の例は、１に設定される解析アルゴリズムの最終処理画像の画素のうち予め決定された割合、例えば約８０％程度のものをチェックする工程を含む。この画素の予め決定された割合より多くが１に設定される場合、このバリデーションプロセスによって、この閾値はかなり低く設定されたことが示される。結果的に、この結果は、不成功とみなされ、この解析アルゴリズムを、この画像について、さらに高い閾値を用いて繰り返す。二値化閾値が９０％分位（Ｑ90）を用いて設定された場合には、従って、この画像のうち最低の強度を有する画素のほぼ９０％が０に設定されることが記載された。二値化された画像のさらなる処理（ショットノイズを取り除く工程を含む）は、画素のわずかな割合を１〜０に設定し、従って、ほぼ１０％の画素よりもいくらか少ない割合が１に設定されることが期待される。バリデーションプロセスにおいて、画素のほぼ８０％を上回るものが１に設定されることが見出されれば、これによって、二値化閾値が改変され、かつ画像の解析アルゴリズムが繰り返されなければならないということが確認される。
【０１１８】
バリデーションプロセスにおいて行なわれ得る工程のさらなる例としては、処理された画像の画素のうち予め決定された割合、例えば約９％よりも少ないものが１に設定されていたか否かをチェックする工程が挙げられる。画素の９％未満が１に設定されていれば、この閾値は高く設定されすぎていたことが、このバリデーションプロセスによって示される。結果として、この結果は、不成功とみなされ、この解析アルゴリズムを、この画像について、さらに低い閾値を用いて繰り返す。
【０１１９】
バリデーションプロセスにおいて行なわれ得る工程のなおさらなる例としては、サンプルの１面についての画像の１に設定された画素の割合を、このサンプルの第二の異なる面の１に設定された画素の割合と比較する工程を含む。これらの２つの割合の間に有意な差異がある可能性は低い。予め決定された異なる値と比較されたこの差異が、統計学的に有意であることが決定された場合には、画像についてこの解析アルゴリズムを繰り返すが、このときには、首尾よい結果を得るためにこの閾値の適切に改変された値を用いる。
【０１２０】
バリデーションプロセスにおいて行なわれ得る工程の別の例は、１に設定された多数の隔離された画素をカウントする工程を含む。隔離とは、この画素が０に設定された画素によって全体に取り囲まれるということを意味する。この数が予め決定された値よりも大きいならば、この画像のバックグラウンドノイズに相当する画素が不正確に１に設定されているということ、及びこの解析アルゴリズムが増大した閾値を用いてこの画像について反復されなければならないということが、このバリデーションプロセスによって示される。
【０１２１】
このバリデーションプロセスにおいて行なわれ得る工程のさらなる例において、統計的特性、例えば、処理された画像の特定された細菌の平均サイズ又は最も好ましいサイズを、この特性についての予め決定された値及び期待される値と比較する。これらの値の間に有意な差異が存在する場合、この二値化閾値の値が改変されなければならず、解析アルゴリズムが反復されなければならないことが、このバリデーションプロセスによって示される。このバリデーションプロセスのこの例の改変型は、サンプルの１つの画面についての同定された細菌の統計的特性と、サンプルの第二の異なる画面の同定された細菌の統計的特性とを比較して、類似性についてチェックする工程を含む。
【０１２２】
次に、このプログラムは、処理する別のウェルが存在するか否かを決定する（５９２）。別のウェルが存在する場合、このプロセス全体を、次のウェル（ｉ＝ｉ＋１）の第一のＺ面（Ｚ＝１）を用いる処理から再度開始する（５１０）。処理する他のウェルが存在しない場合、このプログラムは終了される（５９３）。
【０１２３】
図１２は、図７のサブルーチン（５７０）のフローチャートである。このサブルーチンによって各々のカラーチャネルにおけるバイオフィルムの容積が決定される。サブルーチンは、工程６８６、６８７及び６８８において、プロセス（５６１）、（５６２）及び（５６３）からの各々のカラーチャネルの画像を入力として受容する。最初に、このサブルーチンは、２つのカラープレーンに同時に存在する、ボリュームエレメント（ボクセル（ｖｏｘｅｌ））を用いて表された３つの新しい画像を計算する（プロセス（６９０）においてレッド及びグリーン、プロセス（６９１）においてレッド及びブルー、プロセス（６９２）においてグリーン及びブルー）。これは、例えば、２つのカラープレーン画像の間（ボクセル間）の論理的ＡＮＤをとることによって達成される。第二に、６つの異なる容積を計算する：各々のカラープレーンにおけるバイオフィルムの容積（プロセス（６９３）においてレッド、プロセス（６９６）においてグリーン、プロセス（６９８）においてブルー）、２つのカラープレーンの間のオーバーラップするボクセルの容積（プロセス（６９４）、（６９５）、（６９７））。これらの容積を計算するためには、ボクセルの容積を知る必要がある。これは、前の実験で決定されており、ボクセル容積の値は、コンピューターメモリーに記憶される（６８９）。引き続き、サブルーチンは、この容積の値をメインプログラムのプロセス（５７１）に戻す（６９９）。
【０１２４】
図１３は、バイオフィルムのクラスター及びこのクラスターの間のチャネルの幾何形状パラメーターの統計的分布を決定する、３Ｄ対象物解析サブルーチン（５８１）〜（５８３）のフローチャートである。このサブルーチンは、ルーチン（５６１）、（５６２）又は（５６３）のいずれかに由来するカラーチャネルのうちの１つからの画像のＺスタックを入力（７００）として受容する。微生物クラスターの解析及びフリーのチャネルの解析は、２つの異なるフロープロセスにおいて得られる：クラスターについて（７２０）、（７３０）及び（７４０）、並びにチャネルについて（７１１）、（７２１）、（７３１）及び（７４１）。クラスター解析のために、最初に、プロセス中の別のオブジェクトとして各々別のクラスターを同定する（７２０）。オブジェクトは、ボクセルの他の全ての群から分離される隣接するボクセルの群として規定される。この群のボクセルは、３次元のスペース中のある容積を占める。プロセス（７２０）は、オブジェクトに含まれる全てのボクセルの座標を含む、そのオブジェクトのデータベースを構築する。このデータベースは、さらなる解析のためにプロセス（５８４）への出力として与えられる。第二に、このデータベースにおける各々のオブジェクトの幾何的特性を、プロセス（７３０）において決定する。これらの特性は、例えば、オブジェクトの容積、このオブジェクトの長軸及び短軸の長さ、このオブジェクトの方向余弦、このオブジェクトの縦横比を含み得る。三番目に、形状パラメーターの統計的分布をプロセス（７４０）においてウェルについて計算する。四番目に、この計算したデータを、プロセス（５９０）によるさらなる使用のために記憶する。他方では、フリーチャネル解析フロープロセスにおいて、最初に、プロセス（７１１）は画像を反転し、すなわち、１ｓを０ｓに変換し、その逆もまた同様である。第二にプロセス（７２１）は、チャネルのネットワークにおけるノード及び接続リンクの位置を同定する。ノードは、少なくとも２つのチャネルが出会うポイントとして規定され、リンクは２つのノードを接続するチャネルの一部として規定される。従って、この画像は、あらゆるノード及びあらゆるリンクを構成するボクセルの座標を用いる位相的データベースに変換される。三番目に、プロセス（７３１）は、全てのノード及びリンクの幾何的特性、例えば、ノードで接続されたリンクの数、リンクの長さ、リンクの直径、リンクの屈曲などを計算する。四番目に、プロセス（７４１）は、このノード及びリンクの特性の統計的分布を決定する。プロセス（７４１）はまた、ネットワークのいくつかの全体的記述子、例えば、ネットワークの接続性、ねじれ、フラクタル次元などを計算する。五番目に、全ての結果をプロセスに対する出力として示す（５９０）。
【０１２５】
図１４は、３Ｄ対象物相互相関解析サブプロセス（５８４）のフローチャートである。このサブプロセスは３つの入力を受容する。これらは、ウェルの３つのカラープレーンについてのＺスタックである。レッドスタック（８０１）は、（５７２）で前に記憶されて、グリーンスタック（８０２）は（５７３）で前に記録されて、ブルースタック（８０３）は（５７４）で前に記録された。第一に、このプログラムは３つの新しい画像を計算するが、この画像は、プロセス（８１１）についてレッド及びグリーンの画像、プロセス（８１２）についてレッド及びブルーの画像、プロセス（８１３）についてグリーン及びブルーの画像、それぞれにおいて同時に存在するボクセルに相当する。これらの新しい画像は、それぞれ、レッド−グリーンオーバーラップ画像（ＲＧＯ）、レッド−ブルーオーバーラップ画像（ＲＢＯ）及びグリーン−ブルーオーバーラップ画像（ＢＧＯ）と呼ばれる。これは、例えば、２つのカラープレーンの画像のスタックの間（ボクセル間）の論理的ＡＮＤをとることによって達成される。ＲＧＯ画像の解析は、プロセス（８２１）、（８４１）、（８５１）及び（８６１）において行なわれ、以下にさらに詳細に記載される。同じ解析をプロセス（８２２）、（８４２）、（８５２）及び（８６２）におけるＲＢＯ画像において、プロセス（８２３）、（８４３）、（８５３）及び（８６３）におけるＧＢＯ画像において行う。ＲＧＯ画像の場合には、最初に、画像のスタックにおけるボクセルの各々の別のクラスターを、プロセス（８２１）において別のオブジェクトとして同定する。オブジェクトは、ボクセルの他の全ての群から分離される隣接するボクセルの群として規定される。この群のボクセルは、画像のＺスタックによって規定される３次元のスペース中の容積を占める。プロセス（８２１）は、オブジェクトに含まれる全てのボクセルの座標を含む、そのオブジェクトのデータベースを構築する。第二に、プロセス（８４１）は、３つのデータベースに含まれるオブジェクトのボクセル座標を比較する：このプロセスによって作成されたデータベース（８２１）、プロセス（５８１）によって作成されたレッドオブジェクトのデータベース（８３３）、及びプロセス（５８２）によって作成されたグリーンオブジェクトのデータベース。ＲＧＯデータベースにおけるオブジェクトのボクセル座標は、レッドオブジェクトデータベース（８３３）及びグリーンオブジェクトデータベース（８３２）におけるボクセル座標と同一であり、このレッド及びグリーンのスタックにおけるオブジェクトの間にオーバーラップが存在するといえる。ＲＧＯデータベースにおける対応するオブジェクトを選択する。さもなければ、ＲＧＯデータベースにおける対応するオブジェクトが欠失される。三番目には、ＲＧＯデータベースからのオブジェクトの幾何学的特性を、プロセス（８５１）において測定する。これらの特性は、例えば、オブジェクトの容積、このオブジェクトの長軸及び短軸の長さ、このオブジェクトの方向余弦、このオブジェクトの縦横比、（画像スタックのＸ、Ｙ及びＺ軸に関するその位置に関して）を含み得る。四番目に、形状パラメーターの統計的分布をプロセス（８６１）においてウェルについて計算する。（８２１）、（８４１）、（８５１）及び（８６１）と同一のプロセスを、ＲＢＯ画像スタック及びＧＢＯ画像スタックについて行なっている。
【０１２６】
最終的に、ＲＧＯデータベース、ＲＢＯデータベース及びＧＢＯデータベースは、このプロセスからの出力として示される（５９０）。
【実施例】
【０１２７】
実施例１
蛍光染色による細菌バイオフィルムの可視化
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ，ＪＭ１０９）の非蛍光株を、３７℃で３時間、Ｐａｃｋａｒｄのマイクロタイタープレート（Ｐａｃｋａｒｄのカタログ番号６００５１８２を参照）のウェルに対して接着させた。未接着の細菌を洗浄によって取り除き、結合した細胞を標準Ｌｕｒｉａ培地（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中において３７℃で一晩増殖させた。次いで、蛍光ＤＮＡ株Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１μＭ；Ｓｉｇｍａ）の添加によって、この細菌を可視化した。画像化システムにおける可視化において、細菌は濃密であったが均一ではなく、染色のパターンはパッチ増殖の指標を示した（図１５を参照のこと）。バイオフィルムの深度への蛍光強度のスキャンによってこのフィルムが数マイクロメートルの深さであったことが示された。
【０１２８】
実施例２
ＧＦＰを構成的に発現する大腸菌の接着した集団の３Ｄ可視化
ＧＦＰ−Ｆ６４Ｌ−Ｓ１７５Ｇ−Ｅ２２２Ｇ変異を有する大腸菌ＪＭ１０９がＧＦＰを構成的に発現すること以外は、上記の実施例１のとおり、マイクロタイタープレート中で大腸菌を増殖させる第二の実験を行なった。洗浄による未結合の細胞の除去後に、残りの細胞を、撹拌せずに、３７℃で約１０時間インキュベートした。過剰増殖でもなく１細胞厚みでもない、よく発達したバイオフィルムは、代表的なサンプルの代表であると思われたので、このようなバイオフィルムをスキャンした。４８８ｎｍでスキャンを行なってＧＦＰを可視化した。
【０１２９】
図１６Ａ〜図１６Ｄに示される画像は、０．７５×０．７５ｍｍの面積を覆う。装置の焦点面をバイオフィルムに１μｍずつ動かすことによって、深度情報が得られた。図１６Ａ、１６Ｃ及び１６Ｄに示される３つの画像は、このバイオフィルム内でとったスライス及びそれぞれのｚ位置を示す。図１６Ｂに示される画像は、３Ｄ化された画像であり、得られた３０の画像を合わせている。この水平及び垂直のラインは、ソフトウェア「カットライン」に相当しており、ここではこの画像の左及び底に対する関連の切断面をともなっている。この暗い領域は、バイオフィルムがないこと、又は図の明るい領域としてみられる微生物クラスター間の実質的なチャネルの存在を示す。
【０１３０】
図１６ＥはＺ面の位置の関数として画像の総強度の変動をグラフ表示する。
【０１３１】
実施例３
接着した大腸菌培養物の示差的３Ｄ解析
大腸菌ＣＬ１８２は、ＩＰＴＧ応答性ｔａｃプロモーターからの、アンピシリン耐性を与え、かつＧＦＰ（Ｆ６４Ｌ、Ｓ１７５Ｇ、Ｅ２２２Ｇ）を発現する低コピー数ベクター（ｐＧＥＸ−６Ｐ−１）を保有する。大腸菌ＸＬ１ブルーは、標準株であり、テトラサイクリン耐性を与えるトランスポゾン１０を保有する。この株を混合して選択抗生物質（テトラサイクリン、アンピリシリン又はクロラムフェニコール）の存在下で増殖させて、その効果をＩＮ細胞アナライザーを用いて可視化した。
【０１３２】
大腸菌培養物を、選択圧下で３７℃で１６時間バッチ培養で増殖させた。細胞を遠心分離によってペレット化して、洗浄して、冷ＰＢＳに再懸濁した。ＯＤ６００ｎｍを両方の培養について正規化（１に）して、溶液を冷ＰＢＳ中で１０倍に希釈した。細胞（１００μｌ）をＰａｃｋａｒｄのマイクロタイタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ＃６００５１８２）の表面に、４℃で１時間、定着させて接着させた。接着した大腸菌をＰＢＳ（１００μｌ）を用いて２回洗浄した。Ｌｕｒｉａブロス（１００μｌ）に、ＩＰＴＧ（０．２μＭ）の有無において、さらにアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を添加して、細胞を接着させ、３７℃で４時間及び１６時間インキュベートさせた。細胞をＰＢＳで２回洗浄して、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（０．１μＭをＰＢＳに含有）中で１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄して、ＵＶ（３６５ｎｍ）及びブルー（４８８ｎｍ）レーザーラインを用いて連続的に画像化して、それぞれＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２及びＧＦＰを励起させた。放射光を４５０ＢＰ６５フィルタ及び５６５ＢＰ５０フィルタを用いて捕獲して、１２ビット画像として収集した；２４個のスライスをそれらの間の１μｍの間隔による条件下で取得した。
【０１３３】
次いで、図７〜図１４に記載されるアルゴリズムを用いてこの画像を解析する。ボクセルの寸法を、解像度未満のビーズ及び解像度を超えるビーズを用いる実験を実施する前に確立した。従って、この解析によって、以前に記載されたように３次元における両方のカラープレーンにおけるバイオフィルムの量のデータが得られる。さらに、グリーンとブルーの蛍光のバイオフィルムの間のオーバーラップを３Ｄにおいて算出した。
【０１３４】
ＸＬ−１ブルー及びＣＬ１８２細胞の増殖の異なる阻害は、アンピシリン及びテトラサイクリンを用いて明確に実証され、定量された（図１３）。期待どおり、クロラムフェニコールはＸＬ−１ブルー及びＣＬ１８２の両方を強力に阻害した。さらに、ＩＰＴＧの非存在下で、ＣＬ１８２によるｔａｃプロモーターからのＧＦＰの発現の約２５％の低下が観察された。ボクセルのオーバーラップを解析することによって、バイオフィルムを通じて遺伝子の発現に対する位置情報が得られる。図１７は、抗生物質の存在下での大腸菌の２つの異なる株の平均接着培養容積（ｍｍ3）を示す。実験を４つの別のウェルにおいて繰り返して、これらのウェルの間の標準偏差を示す。
【０１３５】
ＣＬ１８２細胞をＬＢ＋ＩＰＴＧの存在下で培養して、グリーン及びブルーの発光ピクセルの容積が等しい場合、このことは、接着されたバイオマス容積内の全ての細胞がＧＦＰを発現していることを示唆する（グリーン：ブルー＝９．７２：９．７１）。これを、さらなる解析によって確認するが、この解析では、ブルーである全てのピクセルがまた可視的にグリーンであることが示された（図１８）。それにもかかわらず、ＧＦＰを発現しない、ＸＬ１ブルー細胞は、ＬＢ＋ＩＰＴＧにおいて増殖した場合、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２の存在下で強度のブルー染色を示す。これによって、ＣＬ１８２細胞からのＸＬ１−ブルー細胞の識別が可能になる（ＧＦＰ発現）。
【０１３６】
上記の実施形態は、本発明の例示的な実施例として理解されるべきである。本発明のさらなる実施形態が考えられる。任意の実施形態の１つに関して記載される任意の特徴は、単独で用いられてもよいし、又は記載された他の特徴と組み合わせて用いられてもよいし、また任意の他の実施形態の１以上の特徴と組み合わせて、もしくは任意の他の実施形態の任意の組み合わせで用いられてもよいということが理解されるべきである。さらに、上記されていない等価物及び改変もまた、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、本発明による、バイオフィルムを画像化するために用いたラインスキャン共焦点顕微鏡の模式図である。
【図２ａ】図２ａは、走査ミラーなしの、本発明の多色実施形態のレイ・パスの上面図及び側面図である。
【図２ｂ】図２ｂは、走査ミラーなしの、本発明の多色実施形態のレイ・パスの上面図及び側面図である。
【図２ｃ】図２ｃは、シングルビームオートフォーカスシステムのレイ・パスの上面図である。
【図３ａ】図３ａは、走査ミラーを備える、本発明の多色実施形態のレイ・パスの上面図及び側面図である。
【図３ｂ】図３ｂは、走査ミラーを備える、本発明の多色実施形態のレイ・パスの上面図及び側面図である。
【図３ｃ】図３ｃは、シングルビームオートフォーカスシステムのレイ・パスの上面図である。
【図４】図４は、ツービーム・オートフォーカス・システムの側面図である。
【図５】図５ａ乃至図５ｃは、長方形のＣＣＤカメラ及びリードアウトレジスターを図示する。
【図６】図６は、画像化データ処理システムのデータ処理構成要素を模式的に図示する。
【図７】図７は、本発明の実施形態による画像解析手順のフロー図である。
【図８】図８は、解析手順の画像データ二値化工程のフローチャートである。
【図９ａ】図９ａは、異なるカラーチャネルにおいてスキャンされたバイオフィルムの面の画像を図示する。
【図９ｂ】図９ｂは、図９ａのバイオフィルムの面の画像の強度ヒストグラムを図示する。
【図９ｃ】図９ｃは図９ａ及び図９ｂのバイオフィルムの平面の二値化された画像を図示する。
【図１０ａ】図１０ａは、異なるカラーチャネルにおいてスキャンされたバイオフィルムの面の画像を図示する。
【図１０ｂ】図１０ｂは図１０ａのバイオフィルムの面の画像の強度ヒストグラムを図示する。
【図１０ｃ】図１０ｃは図１０ａ及び図１０ｂのバイオフィルムの平面の二値化された画像を図示する。
【図１１】図１１は、解析手順の別の画像データ閾値化工程を図示する。
【図１２】図１２は、図７に示される手順のサブルーチンのフローチャートを示す。
【図１３】図１３は、３Ｄ対象物解析サブルーチンのフローチャートである。
【図１４】図１４は、３Ｄ対象物相互相関解析のフローチャートを図示する。
【図１５】図１５は、蛍光色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を用いて染色した大腸菌のバイオフィルムを示す顕微鏡写真である。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｄは、ＧＦＰ発現バイオフィルムの３Ｄ解析に相当する；図１６Ａ、図１６Ｃ及び図１６Ｄは、４μｍ、９μｍ及び１４μｍのスライスに相当し、図１６Ｂは、３Ｄ画像に相当する。図１６Ｅは、Ｚ面における細胞位置の関数として緑色細菌及び非緑色細菌の容積の変動を示す。
【図１７】図１７は、選択された抗生物質を用いる接着された培養物の示差的阻害を示す。黒いバーは、テトラサイクリン耐性ＸＬ１−ブルー大腸菌の接着された培養容積に相当する。灰色のバーは、ＧＦＰ発現、アンピシリン耐性ＣＬ１８２  大腸菌の接着された培養容積に相当する。平均＋／−標準偏差（ＳＤ）を示しており、ここではｎ＝４である。
【図１８】図１８は、ＧＦＰ発現及び非発現細胞の識別を図示する。蛍光緑色である接着されたバイオマスの容積を青色及び緑色の両方の量と比較して、同じであることを見出した。白抜きのバーは、接着された培養容積の平均緑色蛍光を示し、刻まれたバーは、接着された培養容積の総青色蛍光を示し、灰色のバーは、接着された培養物の容積を示し、ここでは青色及び緑色の蛍光が重複していることが見出された。これによって、この解析は緑色蛍光とＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色された細菌とが正確に共存したことが示される。平均＋／−標準偏差（ＳＤ）を示しており、ここではｎ＝４である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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