(57)【要約】本発明は、造血幹細胞（ＨＳＣ）またはその子孫を含む細胞試料を得る工程；グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンの二糖繰り返し配列の少なくとも１個を有する炭水化物配列またはその同等物の少なくとも１個の存在を検出する工程；およびその配列またはその同等物を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法に関する。本発明は、ＨＳＣまたはその子孫を単離するために、ＨＳＣまたはその子孫の細胞集団を濃縮する方法、およびそれらの発明の方法を用いて得られた細胞調製物、およびそれらの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞（ＨＳＣ）またはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンの二糖繰り返し配列の少なくとも１個を有する炭水化物配列またはその同等物の少なくとも１個の存在を検出する工程；および
その配列またはその同等物を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法。
【請求項２】
ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）またはその断片用のマーカーと細胞との相互作用を促進する手法で、試料をそのマーカーに暴露するか、またはそのマーカーと混合する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
マーカーが、細胞表面上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片を同定する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
マーカーが、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片への抗体；ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片へのアゴニストおよびアンタゴニスト；ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片への結合蛋白質；ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＨＡあるいはＨＡＳ蛋白質の存在によってＨＡまたはＨＡＳの発現を検出し得る核酸検出システム；ならびにＨＡ、ＨＡＳまたはその断片用の酵素、蛍光または比色アッセイからなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
結合蛋白質が、ヒアルロン酸結合蛋白質（ＨＡＢＰ）である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
マーカーが、そのマーカーの同定を強化させるための標識を包含する、請求項２記載の方法。
【請求項７】
蛍光、放射線または酵素標識が、検出を強化させるためのマーカーに結合している、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
細胞上のヒアルロン酸（ＨＡ）またはヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）もしくはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
ＨＡまたはＨＡＳを検出する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＨＡＳの一部に対応するペプチド配列またはその同等物を検出する、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
試料が、胚または成体の供給源に由来する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
細胞試料が、腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊髄、骨膜、骨内膜または他の骨腔をはじめとする骨髄に由来する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
細胞試料が、血液、胚の卵黄嚢、胎児肝臓、脾臓、末梢血、皮膚、真皮、ＥＳ細胞またはＥＳ細胞培養物に由来する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
試料が、組織試料、細胞懸濁物またはインビトロで増殖させた細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
試料を、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の検出前に、ＣＤ３４+細胞に対して濃縮する、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
その試料をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する抗体と混合する工程；
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在を検出する工程；および
ＨＳＣまたはその子孫上の抗体の存在を検出することによって、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含む請求項８記載の方法。
【請求項１７】
抗体が、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に特異的である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
その試料をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する結合蛋白質と混合する工程；
その結合蛋白質の存在を検出する工程；および
ＨＳＣまたはその子孫上のその結合蛋白質の存在を検出することによって、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含む請求項８記載の方法。
【請求項１９】
結合蛋白質が、ＨＡＢＰ、またはＨＡＢＰに基づく合成指示薬である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在によって同定された細胞を選択する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を濃縮した細胞集団を得る方法。
【請求項２１】
検出方法が、ＨＡもしくはＨＡＳへの抗体；またはＨＡへの結合蛋白質（ＨＡＢＰ）の使用を伴う、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在によって同定された細胞を選び出す工程、を含む集団からＨＳＣまたはその子孫を除去する方法。
【請求項２３】
選択前にＨＡまたはＨＡＳを検出するために抗体またはＨＡＢＰを用いる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ＨＳＣ関係状態または関連状態を処置または診断する方法における、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって単離または同定されたＨＳＣの使用。
【請求項２５】
ＨＳＣ関係状態または関連状態を処置または診断する薬剤の調製における、請求項１〜２３のいずれか１項記載の方法によって単離または同定されたＨＳＣの使用。
【請求項２６】
請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法および特異的細胞系列用の特異的マーカーを用いて細胞系列を同定および単離することを含む、ＨＳＣ集団内の亜集団を単離するための方法。
【請求項２７】
細胞系列が、リンパ球、骨髄球または赤血球細胞系列である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
その試料をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する抗体と混合する工程；
その抗体の存在を検出する工程；および
ＨＳＣまたはその子孫上の抗体の存在を検出することによって、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含む請求項１記載の方法。
【請求項２９】
抗体が、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に特異的である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
抗体が、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、クロマトグラフィー樹脂、固体支持体および薬物からなる群から選択される分子または化合物とコンジュゲートしている、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
酵素が、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
蛍光色素が、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドからなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
金属化合物が、フェリチン、コロイド金およびコロイド状超常磁性ビーズからなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
ハプテンが、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロンおよびニトロフェノールからなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
放射性化合物が、テクネチウム９９ｍ、125Ｉ、および放射性核種を含むアミノ酸からなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
放射性核種が、14Ｃ、3Ｈおよび35Ｓからなる群から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ＣＤ３４+を前濃縮し、請求項８記載のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の検出によってＨＳＣまたはその子孫を同定し、別のマーカーをＨＡ、ＨＡＳまたはその断片用のマーカーと別個か、または組合わせて用いてその亜集団を識別することを含む、ＨＳＣ集団内の亜集団を識別する方法。
【請求項３８】
亜集団を、ＨＡまたはＨＡＳの発現のレベルによって識別する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
識別された亜集団が、ＣＤ３４+、ＣＤ３８-、ＣＤ９０+（ｔｈｙ１）およびＬｉｎ-細胞からなる群から選択されるＨＳＣ集団の表現型である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
細胞および抗体またはマーカーを、抗体またはマーカーがＨＡまたはＨＡＳおよびＨＳＣまたはその子孫に特異的に結合するのに十分な条件下で混合し、その後定量する、試料中のＨＳＣまたはその子孫の数を測定するための診断アッセイ。
【請求項４１】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在を検出すること；
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在によって同定された細胞を選択することを含む、ＨＳＣまたはその子孫を濃縮した細胞集団を得る方法。
【請求項４２】
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片を認識してそれらに結合する抗体、マーカーまたは結合蛋白質をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に結合させる条件下で、その抗体、マーカーまたは結合蛋白質とＨＳＣまたはその子孫の混合物とを混合し、その抗体、マーカーまたは結合蛋白質によって認識された細胞を分離して、ＨＳＣまたはその子孫を実質的に濃縮した集団を得ることを含む、ＨＳＣまたはその子孫の集団を濃縮する方法。
【請求項４３】
請求項４１記載の方法と、物理的性質、細胞表面特性および生体染色特性の相違に基づく分離または単離技術からなる群から選択される分離または濃縮技術との使用を含むＨＳＣまたはその子孫を分離または濃縮する方法。
【請求項４４】
技術が、ＦＡＣＳ、または複数のカラーチャネル、低角度オブチューズ光散乱検出チャネル、もしくはインピーダンスチャネルによって改変されたＦＡＣＳである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
細胞を、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片への抗体を用いた正の選択によって、最初大まかな分離によって分離し、その後精密な分離によって分離する、請求項４２または４３記載の方法。
【請求項４６】
ＨＡまたはＨＡＳの同定の前に、前濃縮工程でＣＤ３４+細胞を濃縮する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
その細胞集団をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する結合蛋白質と混合する工程；および
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片を示す結合蛋白質の存在によって同定された細胞を選択する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を濃縮した細胞集団を得る方法。
【請求項４８】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
その細胞集団をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する抗体と混合する工程；および
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片を示すその抗体の存在によって同定された細胞を選択する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を濃縮した細胞集団を得る方法。
【請求項４９】
細胞集団用の特異的マーカーを、細胞集団を更に濃縮するために用いる、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
特異的マーカーが、特異的細胞系列用のものであり、これらの細胞を濃縮するため、またはこれらの細胞の反対を濃縮するために用いられる、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
細胞系列が、リンパ球、骨髄球または赤血球系列である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
マーカーが、間葉幹細胞またはケラチノサイト幹細胞を除去または選び出すことによって、ＨＳＣまたはその子孫を濃縮するために用いられる、請求項４８記載の方法。
【請求項５３】
別の幹細胞特異性マーカーの正の選択により更に濃縮することを含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５４】
幹細胞マーカーを、ＣＤ３４+、Ｔｈｙ−１+およびｃ−ｋｉｔ+からなる群から選択する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
請求項１９、２０および４１〜５４のいずれか１項記載の方法によって調製されるＨＳＣまたはその子孫の濃縮集団。
【請求項５６】
ＨＳＣまたはその子孫を除去した集団を残すために、ＨＡまたはＨＡＳを発現する細胞を選び出すことによって、ＨＳＣまたはその子孫を実質的に含まない集団を提供するためのＨＡまたはＨＡＳの使用。
【請求項５７】
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片への抗体または結合蛋白質を用いて、ＨＡまたはＨＡＳを検出する、請求項５６記載の使用。
【請求項５８】
ＨＡを、ＨＡＢＰによって検出する、請求項５６記載の使用。
【請求項５９】
ＨＳＣまたはその子孫に対する負の選択を受けていない対照細胞集団に比べて減少したＨＳＣ集団を有する細胞集団。
【請求項６０】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在を検出すること；
細胞上のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の存在によって同定されたそれらの細胞を単離すること、を含むＨＳＣまたはその子孫を単離する方法。
【請求項６１】
ＨＳＣの単離が、抗体コート化磁気ビーズ、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体と結合した細胞毒性剤、またはモノクローナル抗体と共に用いる細胞毒性剤、および固体マトリックスに結合した抗体の使用からなる群から選択される方法による、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
その細胞集団をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する結合蛋白質と混合すること；
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の結合蛋白質によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
その結合蛋白質によって同定された細胞を単離すること、を含むＨＳＣまたはその子孫を単離する方法。
【請求項６３】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
その細胞集団をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する抗体と混合すること；
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する抗体によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
その抗体によって同定された細胞を単離すること、を含むＨＳＣまたはその子孫を単離する方法。
【請求項６４】
抗体が、ＨＡまたはＨＡＳに特異的である、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
抗体が、全種のαＨＡポリクローナルヒツジ抗体である、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
請求項６０〜６５のいずれか１項記載の方法によって単離されたＨＳＣまたはその子孫。
【請求項６７】
細胞が、ＣＤ３４+、ＨＡ+である、請求項６６記載のＨＳＣ。
【請求項６８】
細胞が、ＣＤ３４+、ｔｈｙ１、ＨＡ+である、請求項６６記載のＨＳＣ。
【請求項６９】
細胞が、ＣＤ３４+、ＣＤ３８-、ｔｈｙ１+、ＨＡ+である、請求項６６記載のＨＳＣ。
【請求項７０】
ＣＤ３４+、ＣＤ３８-、ｔｈｙ１+およびＨＡ+細胞を含む細胞の濃縮集団を含む、濃縮したＨＳＣおよびその子孫の組成物。
【請求項７１】
自家生着における請求項７０記載の組成物の使用。
【請求項７２】
遺伝子欠損を修復するため、またはＨＳＣもしくはその子孫あるいはその子孫の生来欠けている遺伝子能力を提供するための、遺伝子導入によって改変された請求項７０記載の組成物の使用。
【請求項７３】
ＨＳＣまたはその子孫の再生および分化に関連する因子を単離および定義するための、請求項７０記載の組成物の使用。
【請求項７４】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
その細胞集団をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する結合蛋白質と混合すること；
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する結合蛋白質によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
その結合蛋白質による選択の前の細胞集団中の細胞の量に対する選択細胞の量を定量すること、を含むＨＳＣまたはそれらの子孫の含量を測定する方法。
【請求項７５】
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
その細胞集団をＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する抗体と混合すること；
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片に対する抗体によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
そのＨＡまたはＨＡＳ抗体による選択の前の細胞集団中の細胞の量に対する選択細胞の量を定量すること、を含むＨＳＣまたはその子孫の含量を測定する方法。
【請求項７６】
ＨＳＣ関連状態の診断のための、請求項７４または７５記載の方法の使用。
【請求項７７】
その状態が、白血病、上皮性悪性腫瘍、非上皮性悪性腫瘍、およびＨＳＣまたはそれらの子孫の活性増加を引き起こす一般的感染からなる群から選択される、請求項７６記載の使用。
【請求項７８】
ＨＳＣまたはそれらの子孫の活性増加が、造血幹細胞集団内で起こる、請求項７７記載の使用。
【請求項７９】
ＨＳＣまたはそれらの子孫の活性増加が、リンパ球系列内で起こる、請求項７７記載の使用。
【請求項８０】
定量が、リンパ球系列から分化して、抗体産生、細胞免疫系の調節、血液中の異物の検出、または宿主にとって異物である細胞の検出をもたらす、Ｂ細胞およびＴ細胞を示すことの提供である、請求項７４または７５記載の方法。
【請求項８１】
細胞集団から同定されたＨＳＣまたはそれらの子孫を有する抗体処置試料を無処置試料と比較して、ＨＳＣを含む成分を同定することを含む、請求項７５記載の方法。
【請求項８２】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の指示薬および担体を含む、集団内のＨＳＣまたはその子孫を検出するための組成物。
【請求項８３】
ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の指示薬が、ＨＳＣまたはその子孫上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を同定し得る検出手段を包含する、請求項８２記載の組成物。
【請求項８４】
指示薬が、ＨＡ、ＨＡＳまたはその断片への抗体または結合蛋白質である、請求項８３記載の組成物。
【請求項８５】
結合蛋白質が、ＨＡＢＰである、請求項８４記載の組成物。
【請求項８６】
特異的細胞系列を識別するための別のマーカーを含む、請求項８３記載の組成物。
【請求項８７】
細胞集団中のＨＳＣまたはその子孫の存在を同定することによって、ＨＳＣまたはその子孫に関連する状態を診断する方法。
【請求項８８】
ＨＳＣまたはその子孫中のＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の発現および／または活性を調整することを含む、ＨＳＣまたはその子孫の増殖および／または分化を制御する方法。
【請求項８９】
ＨＳＣ内のＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性の調整を、ＨＡまたはＨＡＳのアンタゴニスト、阻害剤、擬似物質または誘導体を用いて実行する、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
請求項１９、２０および４１〜５４のいずれか１項記載の方法によって調製されたＨＳＣまたはその子孫の濃縮集団を含む組成物の有効量を投与することを含む、ＨＳＣ関連状態を処置する方法。
【請求項９１】
ＨＳＣ関連状態が、大球性貧血および再生不良性貧血；血小板減少症；形成不全；汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）；脊髄形成異常；自己免疫性血小板減少性紫斑症（ＩＴＰ）；ＨＩＶ誘導性ＩＴＰおよび白血病からなる群から選択される、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
エリトロポエチン、コロニー刺激因子、インターロイキンから選択される因子、およびＨＳＣまたはその子孫に関連するストローマ細胞を用いて、１種以上の選択系列への成熟、増殖および分化をもたらすことによる、免疫無防備状態の宿主を再生させるための細胞の使用、または特異的系列のための細胞源としての細胞の使用。
【請求項９３】
造血細胞の分化および成熟に関連する因子の単離および評価におけるＨＳＣおよびその子孫の使用。
【請求項９４】
遺伝子疾患の処置のためのＨＳＣの使用。
【請求項９５】
遺伝子欠損を修復するための自家幹細胞または同種異型幹細胞の遺伝子改変による、ＨＳＣに関連する遺伝子疾患の処置のための請求項９４記載の使用。
【請求項９６】
疾患が、β−サラセミア、鎌状赤血球貧血、またはアデノシンデアミナーゼ、レコンビナーゼもしくはレコンビナーゼ調節遺伝子内の欠損である、請求項９５記載の使用。
【請求項９７】
ＨＳＣまたはその子孫の非制御的増殖から生じるＨＳＣ関連状態を処置する方法であって、ＨＳＣまたはその子孫内でのＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の発現を制御することを含む方法。
【請求項９８】
ＨＳＣまたはその子孫の非制御的増殖から生じるＨＳＣ関連状態を処置する方法であって、ＨＳＣまたはその子孫内でのＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の発現および／または活性を低下させることを含む方法。
【請求項９９】
状態が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
ＨＳＣまたはその子孫の分化から生じるＨＳＣ関連状態を処置する方法であって、ＨＳＣまたはその子孫内でのＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の発現および／または活性を制御することを含む方法。
【請求項１０１】
ＨＳＣまたはその子孫の分化から生じるＨＳＣ関連状態を処置する方法であって、ＨＳＣまたはその子孫内でのＨＡ、ＨＡＳまたはその断片の発現および／または活性を低下させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の細胞型、特に造血幹細胞（ＨＳＣ）およびＨＳＣ由来細胞の特異的集団の同定に関する。本発明は、幹細胞およびその子孫の分離および使用の方法も提供する。幹細胞およびそれらの子孫の発育を調節する方法も得られる。
【０００２】
緒言
その細胞の濃縮集団を得る努力の中で、特異的細胞型を同定することに大きな関心が寄せられている。濃縮集団を保持することよって、特異的細胞型がより明確に理解され、移植、遺伝子療法、白血病のような癌、乳癌を含む新生物性癌をはじめとする疾患の処置、または組織および皮膚の修復を含む様々な状況での使用が得られる。
【０００３】
幹細胞は、最終的に植物または動物の様々な部分に寄与する細胞を生成する。幹細胞の一種が、造血幹細胞である。
【０００４】
造血幹細胞は、非常に様々な範囲の活性を担うことができる。それらは、リンパ球、骨髄球および赤血球をはじめとする数種の系列に分裂される。Ｂ細胞およびＴ細胞を含むリンパ球系列は、抗体を産生し、細胞免疫を調節して、血中の疾患誘導性生物のような異物を検出する。単球、顆粒球および巨核球をはじめとする骨髄球系列は、血液の異物を監視し、新生物細胞から防御し、異物を取り除いて、血小板を産生する。赤血球系列は、酸素を運搬する赤血球細胞を包含する。
【０００５】
造血幹細胞は、自己再生能、多系列の増殖および分化能、ならびに造血およびリンパ球系を長期間支持する能力を有している。それらは、主として可能性がより限定された細胞を含む造血前駆細胞コンパートメント（haematopoietic progenitor compartment）（ＨＰＣ）内で亜集団を形成する。ＨＰＣ細胞は、主として骨髄ストローマ内に存在し、そこではストローマ細胞と、細胞外マトリックス成分と、サイトカインとの複雑な相互作用によって、細胞増殖および分化が調節されている。ＨＰＣ細胞は、様々な生理学的、病理学的および医原的環境下の血中にも存在する。ＨＰＣは、骨髄または末梢血から採取されることができ、消耗的（即ち破壊的）線量の化学療法および／または放射線療法を受けた患者に静注することによって、骨髄を再度生着させて造血および免疫を再生させる。こうしてＨＳＣ細胞移植は、血液および固形の悪性疾患、骨髄不全、ならびに造血、免疫または代謝の先天性異常の患者の管理において、相当な臨床的用途を持つ。
【０００６】
こうして、自家ＨＰＣ細胞を供給することが必要とされているが、その自家ＨＣＰ細胞は、ＨＰＣ細胞集団が化学療法および／または放射線療法によって枯渇された患者に再導入される前に、インビトロで培養されてもよい。そのようなＨＰＣ細胞の集団は、自然に正常レベルを回復するのに数週または数ヶ月かかる場合がある。患者自身からの自家細胞を使用すれば、移植細胞の拒絶が避けられる。
【０００７】
インビボでは、ＨＰＣ細胞は一般に、骨髄ストローマ内に存在する。インビトロでのＨＰＣ細胞は、より分化した前駆細胞を増殖および放出する前に、骨髄ストローマに接着することができる。幹細胞は、多系統に著しく増殖および分化して、最終的に赤血球、血小板、様々な白血球、ならびにＴおよびＢリンパ球のような免疫細胞のような、完全に分化した細胞または子孫を生成する。こうして、ＨＰＣ細胞または幹細胞を、それが枯渇した患者に再導入すれば、これらの造血細胞型の十分な集団を得る。
【０００８】
造血幹細胞が相対的に不足することで、一般に幹細胞および造血系の分化についての広範囲な研究が妨げられてきた。造血幹細胞を濃縮した細胞集団が容易に入手できれば、幹細胞の挙動に影響を及ぼす生物学的改変物質の同定が可能になる。例えば、（１）特定の系列への幹細胞の献身（dedication）という初期の工程；（２）そのような献身の阻害；および（３）幹細胞増殖を制御する能力、に関連する未だ発見されていない増殖因子があるかもしれない。
【０００９】
濃縮集団中の十分な数の幹細胞を利用できることは、例えば癌の化学療法のような幹細胞を破壊する処置を受けた患者の造血を再生させるのにも極めて有用となる。
【００１０】
造血を成体哺乳類の骨髄（ＢＭ）に局在化させるには、原始造血幹細胞（ＨＳＣ）と、ストローマ細胞が介する骨髄の造血微小環境（ＨＭ）間の発達上での調節された相互作用を伴う、という提案が、かなりの証拠によって裏づけられている。
【００１１】
ＢＭ内の成熟した造血細胞の解剖学的位置は、より原始的な細胞の空間的分布よりもより良く理解されている。マウスにおける過去の研究で、系列の限定されたクローン化造血前駆細胞（ＨＰＣ）も、縦方向の中心静脈近くで大腿骨の軸を交差する明確に定義された空間的分布に最大数あって同じであることが確証された。これに対して、分類体系的により原始的な前駆体である脾臓コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｓ）は、骨髄の中心領域に少なく、骨に隣接した領域である骨内膜に最大濃縮があるという逆の分布を示す。
【００１２】
静注された細胞によって造血を回復するには、ＢＭ  ＨＭ内のＨＰＣのホーミング、移動および定着（lodgement）をはじめとする複数の調和したイベントが必要となる。初期のイベントであるホーミングは、ＨＳＣをＢＭへ循環させる特異的な募集であり、骨髄の微小血管上皮によるＨＳＣの選択的認識、および上皮細胞を通した血管外造血部位への移動を伴う。これに対して、定着は、管外遊出後のイベントを包含し、血管外コンパートメント内の適切なＨＭ隙間（niches）に細胞を選択的に移動させること、と定義されている。現在のデータは、ホーミングが、成熟した白血球の、組織への管外遊出に関わるものと同様の細胞接着分子（ＣＡＭ）のカスケードを伴うことを示唆している。原始造血細胞は、インテグリン、シアロムチン、ＩｇスーパーファミリーおよびＣＤ４４ファミリーの様々なメンバーをはじめとする幅広いＣＡＭのレパートリーを示す。現在のデータは、ＢＭへのＨＳＣホーミングにおける、Ｐ−セレクチンのシアロムチンレセプターであるＰＳＧ−１、β1インテグリン  ＶＬＡ−４、およびＳＤＦ−１のレセプターであるＣＸＣＲ４の重要な役割を示唆している。これに対して、ＢＭへのホーミングの後、ＨＳＣ定着の部位に影響を及ぼす分子については、ほとんど知られていない。
【００１３】
しかし、細胞表面マーカーによるこれらの特異的細胞型の同定が、一般に同定の最良の手段であることが証明されている。別の細胞表面抗原の同定が、造血幹細胞の同定、分離および更なる特徴づけにおいて、非常に価値があることは明らかである。
【００１４】
最年まで、ＢＭ内の造血幹細胞（ＨＳＣ）の空間分布を定義することは、不可能であった。これは、ＨＳＣが手に入りにくく、疑いのない現場（in-situ）同定を可能にする、単一の独特な抗原マーカーが無かったためである。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、先行技術の問題の幾つかを克服する、または少なくとも軽減することにある。
【００１６】
発明の概要
出願人は、ヒアルロン酸（ＨＡ）およびヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）が、造血幹細胞（ＨＳＣ）内で発現されることを見出した。ＨＡは、一般に多数の細胞の細胞外マトリックス内に見出される高分子量直鎖状炭化水素である。
【００１７】
本発明の１つの態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法を提供する。
【００１８】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその同等物もしくはその断片を同定するいずれの手段が用いられてもよい。しかし、本発明の好ましい態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
その試料をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する抗体と混合する工程；
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在を検出する工程；および
ＨＳＣまたはその子孫上の抗体の存在を検出することによって、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法を提供する。
【００１９】
好ましくは抗体は、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に特異的ないずれかの抗体である。本発明で用いられる抗体は、ＨＡを示し、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に特異的に結合するのに十分な特異性を保持する天然または組換え体のどちらか、合成または天然由来のどちらか、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらかの、いずれの抗体またはその断片も包含する。
【００２０】
本発明の更に別の好ましい態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
その試料をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の結合蛋白質と混合する工程；
その結合蛋白質の存在を検出する工程；および
ＨＳＣまたはその子孫上のその結合蛋白質の存在を検出することによって、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法を提供する。
【００２１】
結合蛋白質、特にＨＡ結合蛋白質（ＨＡＢＰ）は、ＨＡを検出するのに有用である。ＨＡＢＰは、生化学工業株式会社から得てもよい。しかし、その結合蛋白質の性質に基づくいずれの同等物も、ＨＡを同定するために用いられてよい。その結合蛋白質の結合部分が同定されて、指示薬またはＨＡとして合成的に調製されると考えられる。したがって、ＨＡＢＰを基剤とする合成指示薬は、本発明の範囲内のものである。
【００２２】
本発明は、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在によって同定された細胞を選択する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を濃縮された細胞集団を得る方法も包含する。
【００２３】
好ましくは検出方法は、ＨＡまたはＨＡＳへの抗体の使用を伴うか、あるいはＨＡへの結合蛋白質（ＨＡＢＰ）が用いられて、ＨＡまたはその同等物を検出することもできる。
【００２４】
同じく、別の好ましい実施形態において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在によって同定されたそれらの細胞を選び出す工程、を含む集団からＨＳＣまたはその子孫を除去する方法を提供する。
【００２５】
更に、選択の前のＨＡまたはＨＡＳを検出するために、抗体またはＨＡＢＰが使用されてもよい。
【００２６】
本発明に記載された方法は、ＨＳＣもしくはその子孫を細胞集団から分離するため、またはそのような集団中のＨＳＣ含量を測定するために利用されてもよい。ＨＳＣが分離または同定されれば、それらがＨＳＣ関係状態または関連状態を処置または診断する方法に用いられてもよく、あるいは更なる分離技術が、ＨＳＣ集団内の亜集団を分離するために用いられてもよい。リンパ球、骨髄球または赤血球細胞のような特異的細胞系列用の特異的マーカーが、様々な細胞系列を同定および分離するために用いられてもよい。
【００２７】
発明の記載
本発明に１つの態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンの二糖繰り返し配列の少なくとも１個を有する炭水化物配列またはその同等物の少なくとも１個の存在を検出する工程；および
その配列またはその同等物を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法を提供する。
【００２８】
本明細書に記載された炭水化物配列は、ＨＳＣまたはその子孫上に特異的に発現されることが見出されている。その配列は、グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンを含む二糖繰り返し単位またはその同等物の少なくとも１個を包含する。複数の繰り返し二糖単位が、二糖繰り返し配列の連続分子として結合されて直鎖状分子を提供してもよく、あるいはその炭水化物繰り返し配列に、グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンの二糖ではない分子またはその同等物が散在されていてもよい。しかし、少なくとも２個の二糖単位が順序正しくグルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンまたはそれらの同等物、その後にグルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミンまたはそれらの同等物を含む少なくとも４個の糖であることを提供する、少なくとも１個の繰り返し二糖によってＨＳＣまたはその子孫を同定できる。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「その同等物」は、同様の方法で作用する配列または分子を意味するが、その配列または分子の活性または作用を実質的に変化させない欠失、付加または置換を有していてもよい。
【００３０】
本発明の別の態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を有するＨＳＣを同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法を提供する。
【００３１】
出願人は、ＨＳＣおよびその子孫が、ＨＡを合成および発現することを示した。ＨＡ合成および発現は、多数の哺乳類系に見出されており、主に原始造血細胞内に発現される。ＨＡは、骨髄内の移植ＨＳＣの定着に不可欠であり、それらの空間分布を著しく変化させるヒアルロニダーゼを用いて特異的に除去されることが見出されている。加えて、インビトロでＨＳＣの表面上のＨＡを代わりのリガンドに結合させると、ＨＳＣの増殖および分化が十分に抑制される。
【００３２】
その産生に関連する分子は、これまでＨＳＣやそれらの同定に関連づけられていなかった。特に、その分子は、ＨＳＣまたはその子孫からの発現に関連づけられていなかった。
【００３３】
ＨＡは、繰り返し二糖単位（グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミン）のある単鎖高分子量多糖類であり、３種のＨＡＳ遺伝子（Ｈａｓ１、Ｈａｓ２、Ｈａｓ３）のうちの１種によってコード化された３種のヒアルロン酸シンターゼ（ＨＡＳ）のうちの１種によって合成される。最後のものは、血漿膜に存在する、絶対不可欠な膜グリコシルトランスフェラーゼであり、ＨＡを細胞表面の蛋白質に共有結合しない遊離直鎖状ポリマーとして細胞周囲の空間に転移させる。つまりＨＡは、多くの異なる器官に存在しており、ＢＭ微小環境内のＥＣＭの成分である。細胞表面ＨＡは、正常および新生物の両方の様々な細胞型の接着、運動および増殖に有意に影響を及ぼす。多価性である（隣接細胞の多数のレセプターを架橋させる）ことによって、内在性の細胞表面ＨＡとその主たるレセプターＣＤ４４との相互作用は、複数の細胞型の凝集を媒介する。細胞のＨＡへの暴露、またはＨＡもしくはＨＡＳの異所性発現のどちらかによって、細胞の運動または浸潤が増加する。その上、ＨＡ分解またはＨＡレセプターの遮断のどちらかの結果として、細胞運動の阻害も起こる。ＨＡは、細胞増殖、分化および組織修復にも影響を及ぼし、ＨＡが、腫瘍の病原および転移部に関わる場合もある。
【００３４】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはＨＡＳの断片が、ＨＳＣ上で検出されてもよい。好ましくはＨＡまたはＨＡＳ分子が検出される。しかし、ＨＡＳ分子の断片によって、ＨＡが指示されてもよい。そのような断片が、ＨＡＳ分子の一部に対応するペプチド配列またはその同等物を含んでいてもよい。
【００３５】
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、言語「含む」、および「含んでいる」並びに「包含する」のようなその言葉の変形は、その他の添加剤、成分、整数または工程を除外するものではない。
【００３６】
ＨＳＣまたはその子孫の試料は、胚または成体の供給源をはじめとするいずれの供給源から発していてもよい。好ましくはそのＨＳＣ供給源は、腸骨稜、脛骨、大腿骨、脊髄、骨膜、骨内膜または他の骨腔をはじめとする骨髄からのものである。ＨＳＣは、血液、胚の卵黄嚢、胎児肝臓、脾臓、末梢血、皮膚、真皮に由来してもよく、またはＥＳ細胞もしくはＥＳ細胞培養物に由来してもよい。
【００３７】
その試料は、いずれかの供給源に由来し、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片用のマーカーの相互作用によってＨＳＣまたはその子孫を同定した組織試料もしくは細胞懸濁物またはインビトロで増殖させた細胞であってもよい。試料は、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の検出前に、ＣＤ３４+細胞を濃縮されてもよい。
【００３８】
骨髄の単離のために、限定するものではないが低濃度、一般に約５〜２５ｍＭの許容され得る緩衝液と共に、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）または他の天然由来因子を簡便に補充した塩溶液をはじめとする適切な溶液が、骨を洗い流すために用いられることができる。簡便な緩衝液としては、限定するものではないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液および乳酸緩衝液が挙げられる。さもなければ、従来の技術によって、骨髄が骨から吸引されることができる。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「子孫」は、ＨＳＣに由来する全ての細胞を包含し、いずれか特定の細胞型に分化又は特異化されていない原始細胞を包含する。
【００４０】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を検出する方法は、ＨＳＣまたはその子孫を含む試料の種類に依存する。一般に試料は、細胞とのマーカー相互作用を促進する手法で、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片用のマーカーに暴露するか、またはマーカーと混合する。例えば、試料が血液試料中のように細胞懸濁液なら、マーカーは単に、細胞懸濁液に添加すればよい。これは、マーカーがＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を物理的に同定することを意図する場合に適用し得る。
【００４１】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片用のマーカーは、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を同定するいずれの手段を包含してもよく、好ましくはそれは、細胞表面のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を同定するマーカーであり、限定するものではないが、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片への抗体、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片へのアゴニストおよびアンタゴニスト、ヒアルロン酸結合蛋白質（ＨＡＢＰ）のようなＨＡへの結合蛋白質、またはＨＡＳもしくはその断片への結合蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはＨＡあるいはＨＡＳ蛋白質のいずれかの存在によってＨＡまたはＨＡＳの発現を検出し得る核酸検出システム、ならびにＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片用の酵素、蛍光または比色アッセイが挙げられる。ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に結合し、固定されていてもよい結合蛋白質またはリガンドが、ＨＡ陽性細胞の単離および同定の手段として働いてもよい。パンニングなどの技術を、ＨＡ陽性細胞の単離及び同定にこのようなアプローチに役立ててもよい。検出の方法は、選択されたマーカーの種類によって当業者には明白であろう。
【００４２】
マーカーは、マーカーの同定を強化させるための標識の添加を包含してもよい。例えば、当業者によく知られた蛍光、放射線または酵素マーカーが、検出を強化させるためにマーカーに結合されていてもよい。
【００４３】
ＨＡＳに適用される用語「その断片」は、ＨＡＳを同定し得るＨＡＳの一部を包含するもので、ＨＡＳ分子全体ではない。これの例としては、ＨＡＳに同一性を与えるＨＡＳのエピトープまたはＨＡＳの活性部分が挙げられる。
【００４４】
本発明の好ましい態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
その試料をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する結合蛋白質と混合する工程；
その結合蛋白質の存在を検出する工程；および
ＨＳＣまたはその子孫上のその結合蛋白質の存在を検出することによって、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法を提供する。
【００４５】
結合蛋白質、特にＨＡ結合蛋白質（ＨＡＢＰ）は、ＨＡを検出するのに有用である。ＨＡＢＰは、生化学工業株式会社から得てもよい。しかし、その結合蛋白質の性質に基づくいずれかの同等物が、ＨＡを同定するために用いられてもよい。その結合蛋白質の結合部分が同定されて、指示薬またはＨＡとして合成的に製造されると考えられる。したがって、ＨＡＢＰに基づく合成指示薬は、本発明の範囲内のものである。
【００４６】
ＨＡＢＰの使用は、製造業者の指導に従ってもよい。しかし、結合蛋白質は、ＨＳＣまたはそれらの子孫に結合したＨＡＢＰの同定を促進するために更に標識されていてもよい。
【００４７】
本発明の別の好ましい態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞試料を得る工程；
その試料をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する抗体と混合する工程；
その抗体の存在を検出する工程；および
ＨＳＣまたはその子孫上の抗体の存在を検出することによって、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を有するＨＳＣまたはその子孫を同定する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を同定する方法うを提供する。
【００４８】
好ましくは抗体は、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に特異的ないずれかの抗体である。本発明で用いられる抗体は、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に特異的に結合するのに十分な特異性を保持し、ＨＡまたはＨＡＳを示す天然または組換え体のどちらか、合成または天然由来のどちらか、モノクローナルまたはポリクローナルのどちらかの、いずれの抗体またはその断片も包含する。本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗体全体、および機能的部分を含む抗体断片を包含する。用語「抗体」は、抗体全体が結合特異性を有するエピトープに結合をもたらす軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域の十分な部分を含むいずれかの単一特異性および／または二重特異性化合物を包含する。断片は、少なくとも１個の重鎖または軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの可変領域を含むことができ、限定するものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片およびＦｖ断片が挙げられる。
【００４９】
組換え抗体は、当該技術分野で知られるいずれの組換え手段によっても生成されることができる。そのような組換え抗体としては、限定するものではないが、細菌内で産生された断片、および定常領域の大部分がヒト抗体の定常領域に置換された非ヒト抗体が挙げられる。加えて、そのような「ヒト化」抗体は、遺伝子技術によって組換え抗体を発現する宿主脊椎動物から得られることができる。
【００５０】
加えて、単一特異性ドメインを、当該技術分野で知られるいずれの方法によって、別の適切な分子化合物に結合できる。その結合は、例えば化学的なものか、または遺伝子工学によることができる。
【００５１】
その抗体を、限定するものではないが、酵素、磁気ビーズ、コロイド状磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物、クロマトグラフィー樹脂、固体支持体または薬物をはじめとする他の適切な分子および化合物とコンジュゲート（conjugate）することができる。抗体にコンジュゲートすることができる酵素としては、限定するものではないが、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。抗体にコンジュゲートすることができる蛍光色素としては、限定するものではないが、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッド（Texas Red）が挙げられる。抗体にコンジュゲートすることができる別の蛍光色素については、Haugland, R. P. Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994)を参照されたい。抗体にコンジュゲートすることができる金属化合物としては、限定するものではないが、フェリチン、コロイド金、そして特にコロイド状超常磁性ビーズが挙げられる。抗体にコンジュゲートすることができるハプテンとしては、限定するものではないが、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサザロン（oxazalone）およびニトロフェノールが挙げられる。抗体にコンジュゲートする、または組み込むことができる放射性化合物は、当該技術分野で知られており、限定するものではないが、テクネチウム９９ｍ、125Ｉ、ならびに限定するものではないが14Ｃ、3Ｈおよび35Ｓをはじめとするいずれかの放射性核種を含むアミノ酸が挙げられる。
【００５２】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片への抗体は、抗体またはその機能的部分を生成するための当該技術分野で知られた方法によって得られてもよい。そのような方法としては、限定するものではないが、所望の特異性の細胞表面抗体を有するＢ細胞を分離すること、軽鎖および重鎖の可変領域を発現するＤＮＡをクローニングすること、ならびに適切な宿主細胞内で組換え遺伝子を発現させることが挙げられる。標準的モノクローナル抗体生成技術は、抗体が不死化された抗体産生ハイブリドーマ細胞から得られる場合に用いられることができる。これらのハイブリドーマは、ＨＳＣまたはその子孫によって動物を免疫化し、好ましくは免疫化宿主脾臓から単離された免疫化動物からのＢリンパ球を、適合性のある不死化細胞、好ましくはＢ細胞ミエローマと融合させることによって産生されることができる。
【００５３】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片への抗体は、いずれの供給源から得られてもよい。それらは、市販のものであってもよい。実際上は、細胞上のＨＡまたはＨＡＳまたはＨＡもしくはＨＡＳの断片の存在を検出するいずれの手段も、本発明の範囲内のものである。そのような抗体の例が、Biogenesisの全種（pan-species）のαＨＡポリクローナルヒツジ抗体である。
【００５４】
本発明に概説された方法は、細胞の集団からＨＳＣまたはその子孫を同定するのに特に有用である。しかし別のマーカーが、全般的ＨＳＣ集団内の亜集団を更に識別するために用いられてもよい。好ましくは、ＣＤ３４+細胞の前濃縮（pre-enrichment）工程が、当該技術分野で用いられる方法によって行われる。この工程の後に、ＨＡまたはＨＡＳの測定が行われてもよい。
【００５５】
別のマーカーを用いる工程が、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片用のマーカーと別個に、または組合わせて適用されてもよい。
【００５６】
様々な亜集団が、ＨＡまたはＨＡＳの発現のレベルによって識別されてもよい。これは、細胞表面で発現されたＨＡとして明示されてもよく、そのＨＡは、本明細書に概説された方法によって検出されてもよい。しかし、本発明は、限定するものではないが、ＣＤ３４+、ＣＤ３８-、ＣＤ９０+（ｔｈｙ１）およびＬｉｎ-細胞をはじめとするＨＳＣ集団の様々な表現型間を識別するために用いられてもよい。好ましくは同定される細胞は、限定するものではないが、ＣＤ３４+、ＣＤ３８-、ＣＤ９０+（ｔｈｙ１）またはＬｉｎ-細胞を含む群から選択される。
【００５７】
本発明の別の態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在によって同定された細胞を選択する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を濃縮した細胞集団を得る方法が提供される。
【００５８】
したがって本発明は、ＨＳＣまたはその子孫の集団を濃縮する方法を包含する。その方法は、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を認識して結合する抗体またはマーカーをＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に結合させる条件下で、その抗体もしくはマーカーまたは結合蛋白質とＨＳＣまたはその子孫の混合物とを混合して、抗体またはマーカーによって認識された細胞を分離してＨＳＣまたはその子孫を実質的に濃縮した集団を得ることを伴う。その方法を、試料中のＨＳＣまたはその子孫の数についての診断アッセイとして用いることができる。細胞および抗体またはマーカーが、抗体またはマーカーをＨＡまたはＨＡＳおよびＨＳＣまたはその子孫に特異的に結合させるのに十分な条件下で混合され、その後定量される。ＨＳＣまたはその子孫は、単離されるか、または更に精製されることができる。
【００５９】
好ましくは、マーカーはＨＡに結合するＨＡ結合蛋白質（ＨＡＢＰ）である。ＨＡＢＰの適切な供給業者は、生化学工業株式会社である。
【００６０】
先に論じたように、細胞集団は、先に論じたそれらの試料をはじめとするＨＳＣまたはその子孫のいずれの供給源から得られてもよい。
【００６１】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在の検出は、細胞上のＨＡまたはＨＡＳを同定するいずれの方法によって実行されてもよい。好ましくはその検出は、ＨＡまたはＨＡＳに対するマーカーまたは結合蛋白質の使用による。ＨＡまたはＨＡＳ用のマーカーは、先に論じたいずれのマーカーであってもよい。しかし、ＨＡまたはＨＡＳへの抗体または結合蛋白質は、ＨＡまたはＨＡＳ用のマーカーとして特に有用である。
【００６２】
先に論じたように、ＨＡまたはＨＡＳまたはＨＡもしくはＨＡＳの断片が、検出されてもよい。好ましくは、ＨＡまたはＨＡＳの分子全体が検出される。しかし、分子を識別する分子の一部も、同じく有効であると考えられる。
【００６３】
様々な技術が、特定の系列の細胞を最初に除去することによって、細胞を分離または濃縮するのに使用できる。モノクローナル抗体および結合蛋白質は、細胞系列および／または分化の段階を同定するのに特に有用である。抗体は、大まかな分離のために固体支持体に結合できる。利用される分離技術は、回収される分画の生存力を最大限に保持しなければならない。「比較的大まかな」分離を得るために、異なる有効性のある様々な技術を用いることができる。利用される個々の技術は、分離の効率、関連する細胞毒性、実行の容易さおよび速度、ならびに精巧な装置および／また技術の熟達の必要性に依存する。
【００６４】
分離または濃縮のための手順としては、限定するものではないが、抗体コーティング磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した細胞毒性剤、またはモノクローナル抗体と共に用いられる細胞毒性剤、例えば限定するものではないが補体およびサイトトキシン、および固形マトリックス、例えばプレートに結合させた抗体による「パンニング（panning）」、エルトリエーション、あるいはいずれか別の従来技術を包含することができる。
【００６５】
分離または濃縮技術の使用としては、限定するものではないが物理的性質（密度勾配遠心法および向流式の（counter-flow）遠心エルトリエーション）、細胞表面特性（レクチンおよび抗体アフィニティー）、および生体染色特性（ミトコンドリア結合色素rho123およびＤＮＡ結合色素、Hoescht33342）の差異に基づくものが挙げられる。
【００６６】
正確な分離をもたらす技術としては、限定するものではないが、様々な精巧度、例えば複数のカラーチャネル、低角度オブチューズ光散乱検出チャネル（low angle and obtuse light scattering detecting channels）、またはインピーダンスチャネルなどを変更し得るＦＡＣＳが挙げられる。ＨＡの発現レベルによってこれらの細胞を分離および識別し得るいずれの方法を用いてもよい。
【００６７】
最初の分離では、通常は約１ｘ１０10細胞、好ましくは約５ｘ１０8〜9細胞で開始して、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片への抗体または結合蛋白質が、少なくとも１つの蛍光色素で標識できる一方、様々な特定系列に対する抗体または結合蛋白質を、少なくとも１つの異なる蛍光色素にコンジュゲートすることができる。各系列は分離工程で分離できるが、所望ならＨＡまたはＨＡＳおよび／または他のＨＳＣマーカーに対して正の選択をするのと同時にその系列が分離される。死亡細胞に結合する色素（限定するものではないがヨウ化プロピジウム（ＰＩ）など）を用いることによって、細胞を死亡細胞に対して選択できる。
【００６８】
分離の特定の順序は、本発明にとって重要ではないと思われるが、示された順序が好ましい。好ましくは細胞は、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片への抗体を用いた正の選択により、最初大まかな分離によって分離され、その後精密な分離によって分離される。ＨＡまたはＨＡＳの同定の前に、ＣＤ３４+細胞を濃縮する前濃縮工程が適用されることが好ましい。
【００６９】
本発明の好ましい態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
その細胞集団をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する結合蛋白質と混合する工程；および
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を示す結合蛋白質の存在によって同定された細胞を選択する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を濃縮した細胞集団を得る方法を提供する。
【００７０】
結合蛋白質は、上記のとおりである。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
その細胞集団をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する抗体と混合する工程；および
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を示す抗体の存在によって同定された細胞を選択する工程、を含むＨＳＣまたはその子孫を濃縮した細胞集団を得る方法を提供する。
【００７２】
細胞を単離するための抗体を用いるいずれの分離方法が用いられてもよく、それらは当業者にはよく知られている。ＨＳＣまたはその子孫の同定のための上記説明は、ここでも適用できる。
【００７３】
いずれかの細胞集団を更に濃縮するために、それらの細胞集団用の特異的マーカーが用いられてもよい。例えば、リンパ球、骨髄球または赤血球系列のような特異的細胞系列用の特異的マーカーが、これらの細胞を濃縮するため、またはこれらの細胞の反対を濃縮するために用いられてもよい。これらのマーカーは、間葉幹細胞またはケラチノサイト幹細胞を除去または選び出すことによって、ＨＳＣまたはその子孫を濃縮するために用いられてもよい。
【００７４】
上記方法は、他の幹細胞特異性マーカーの正の選択によって細胞を更に濃縮する工程を含むことができる。適切な陽性幹細胞マーカーとしては、限定するものではないが、ＣＤ３４+、Ｔｈｙ−１+およびｃ−ｋｉｔ+が挙げられる。
【００７５】
特定の因子による適切な選択と、ＨＳＣまたはその子孫を自己再生させ、ＨＳＣまたはその子孫をそれらのマーカーに関してスクリーニングさせるバイオアッセイの開発とによって、生存するＨＳＣまたはその子孫の濃縮された組成物を、様々な目的で生成できる。
【００７６】
本発明の更に別の態様において、本明細書に記載された方法によって調製されたＨＳＣまたはその子孫の濃縮集団を提供する。
【００７７】
同様に、別の好ましい実施形態において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得る工程；
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在を検出する工程；および
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在によって同定されたそれらの細胞を選び出す工程、を含む集団からＨＳＣまたはその子孫を除去する方法を提供する。
【００７８】
その濃縮と同様の手法において、ＨＡまたはＨＡＳが、ＨＳＣまたはその子孫を実質的に含まない集団を提供するために、逆の形で用いられてもよい。ＨＡまたはＨＡＳを発現するそれらの細胞を選択するための、上記で利用された方法は、前記細胞を選び出してＨＳＣまたはその子孫を除去した集団を残すために用いることができる。
【００７９】
好ましくはＨＡまたはＨＡＳは、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片への抗体または結合蛋白質を用いることによって検出される。より好ましくはＨＡは、結合蛋白質ＨＡＢＰによって検出される。マーカー、結合蛋白質または抗体がＨＳＣまたはその子孫に結合すれば、分離のためのいずれの上記方法を、ＨＳＣまたはその子孫を識別および選び出すために用いてもよい。
【００８０】
本発明の更に別の態様において、ＨＳＣまたはその子孫の負の選択を受けなかった対照細胞集団に比べて少ないＨＳＣ集団を有する細胞集団を提供する。
【００８１】
本発明の更に別の態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在を検出すること；
細胞上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の存在によって同定されたそれらの細胞を単離すること、を含むＨＳＣまたはその子孫を単離する方法を提供する。
【００８２】
ＨＳＣまたはその子孫は、上記のとおり濃縮のために用いられるいずれかの方法に、ＨＳＣを分離する別の工程を加えて単離されてもよい。有用な技術としては、抗体コート化磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体に結合した細胞毒性剤、またはモノクローナル抗体と共に用いられる細胞毒性剤、例えば限定するものではないが補体およびサイトトキシン、そして固体マトリックス、例えばプレートに結合させた抗体による「パンニング」、エルトリエーション、またはいずれか別の従来技術が挙げられる。当業者は、これらの技術に通じており、ＨＡまたはＨＡＳが選択されるものならば、いずれの公知の技術も用いることができる。
【００８３】
別の好ましい態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
その細胞集団をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する結合蛋白質と混合すること；
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する結合蛋白質によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
その抗体によって同定されたそれらの細胞を単離すること、を含むＨＳＣまたはその子孫を単離する方法を提供する。
【００８４】
その結合蛋白質は、上記のとおりである。
【００８５】
別の好ましい態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
その細胞集団をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する抗体と混合すること；
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する抗体によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
その抗体によって同定されたそれらの細胞を単離すること、を含むＨＳＣまたはその子孫を単離する方法を提供する。
【００８６】
ＨＡまたはＨＡＳに特異的で、目下入手できるいずれの抗体を用いてもよい。適切な抗体は、Biogenesisの全種（pan-species）のαＨＡポリクローナルヒツジ抗体である。
【００８７】
ＨＳＣまたはその子孫の集団が単離されれば、更に別の単離技術が、ＨＳＣまたはその子孫内の亜集団を単離するために用いられてもよい。細胞系列のためのＦＡＣＳのような細胞選択システムを含む特異的マーカーが、様々な細胞系列を同定および単離するために用いられてもよい。
【００８８】
別の態様において、本明細書に記載された方法によって単離されたＨＳＣまたはその子孫を提供する。好ましくはその細胞は、ＣＤ３４+、ＨＡ+である。より好ましくはその細胞は、ＣＤ３４+、ｔｈｙ１、ＨＡ+である。最も好ましくはその細胞は、ＣＤ３４+、Ｄ３８-、ｔｈｙ１+、ＨＡ+である。
【００８９】
本発明は、別の態様において、ＣＤ３４+、Ｄ３８-、ｔｈｙ１+およびＨＡ+細胞を含む細胞の濃縮集団を含む、濃縮したＨＳＣおよびその子孫の組成物も提供する。
【００９０】
組成物が、ＨＳＣまたはその子孫を濃縮されている場合、これらは自家生着（autologous engraftment）に用いられてもよい。更に、ＨＳＣまたはその子孫を使用することによって、対宿主性移植片病が避けられる。加えて、一般に個体またはＨＳＣのいずれかに関して、遺伝子欠損を修復するため、またはＨＳＣもしくはその子孫もしくはその子孫の生来欠いている遺伝子能力を提供するために、細胞は、適切な遺伝子導入によって改変されることができる。加えて、ＨＳＣ組成物は、再生および分化に関連する因子を単離および定義するために用いることができる。
【００９１】
本発明の更に別の態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
その細胞集団をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する結合蛋白質と混合すること；
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する結合蛋白質によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
その結合蛋白質による選択の前の細胞集団中の細胞の量に対する選択細胞の量を定量すること、を含むＨＳＣまたはその子孫の含量を測定する方法を提供する。
【００９２】
その結合蛋白質は、上記のとおりである。
【００９３】
本発明の更に別の態様において、
ＨＳＣまたはその子孫を含む細胞集団を得ること；
その細胞集団をＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する抗体と混合すること；
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片に対する抗体によって同定されたそれらの細胞を選択すること；
ＨＡまたはＨＡＳ抗体による選択の前の細胞集団中の細胞の量に対する選択細胞の量を定量すること、を含むＨＳＣまたはその子孫の含量を測定する方法を提供する。
【００９４】
選択したＨＳＣまたはその子孫の量を定量することによって、限定するものではないが、正常な状態および悪性腫瘍の状態、あるいはより具体的には、特に造血幹細胞集団、より具体的にはそれらの集団のリンパ球系列において、白血病、上皮性悪性腫瘍または非上皮性悪性腫瘍またはＨＳＣもしくはそれらの子孫の活性増加を引き起こし得る一般的感染のような、ＨＳＣ関連状態の診断方法を提供する。特にその定量は、抗体の産生、細胞免疫系の調節、血中の異物の検出、宿主にとって異物である細胞の検出などをもたらすリンパ球系列から分化するＢ細胞およびＴ細胞を示すことの提供であってもよい。単球、顆粒球、巨核球およびその他の細胞をはじめとする骨髄球系列は、血流中の異物の存在を監視し、新生物細胞から防御し、血流中の外来物質を取り除いて、血小板を産生する等を行う。赤血球系列は、酸素の運搬体として働く赤血球細胞をもたらす。
【００９５】
その方法は、細胞集団から同定されたＨＳＣまたはその子孫を有する抗体処置試料を無処置試料と比較して、ＨＳＣを含む成分を同定することによって実施されてもよい。対照では、全細胞数がカウントされることができる。診断目的には多数の試料が測定されてもよく、細胞数の変動が比較されて、ＨＳＣまたはそれらの子孫のレベルの増加または減少を監視してもよいと思われる。
【００９６】
本発明の更に別の態様において、集団中のＨＳＣまたはその子孫を検出するための、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の指示薬、および担体を含む組成物を提供する。
【００９７】
ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の指示薬は、ＨＳＣまたはその子孫上のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片を同定し得るいずれの検出手段を含んでいてもよい。好ましくはその指示薬は、ＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片への抗体または結合蛋白質である。
【００９８】
抗体は、ＨＡまたはＨＡＳの分子全体を検出してもよく、あるいはＨＡＳ内に含まれＨＡＳを示す特異的ペプチド配列を検出してもよい。
【００９９】
組成物は、別のマーカーを含んで、特異的細胞系列を識別してもよい。
【０１００】
本発明は、細胞集団内のＨＳＣまたはその子孫の存在を同定することによって、ＨＳＣまたはその子孫に関連する状態を診断する方法も提供する。例えば、造血幹細胞の増加または減少レベルが、血中の異常を示してもよい。これは、白血病のような疾患では重要になる場合があり、同じく増加は、感染を示すＴ細胞およびＢ細胞を含めたリンパ球系列へ分化するＨＳＣまたはその子孫の増加と解釈してよい。
【０１０１】
本発明の更に別の態様において、
ＨＳＣまたはその子孫内のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の発現および／または活性を調整すること、を含むＨＳＣまたはその子孫の増殖および／または分化を制御する方法を提供する。
【０１０２】
出願人は、ＨＡまたはＨＡＳがＨＳＣまたはその子孫内で発現されることを見出した。増殖の前のＨＡまたはＨＡＳの発現レベルは、続く細胞の増殖または分化に合わせて変動する。細胞内のＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性を調整することによって、細胞の増殖または分化を制御してもよい。
【０１０３】
本明細書で用いられる用語「ヒアルロン酸の発現および／または活性を調整する」は、非改変レベルに比較して、ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性を改変または変動させることを意味する。
【０１０４】
フレーズ「細胞の増殖および／または分化を制御する」は、インビトロまたはインビボのいずれかで、非調整細胞に比べて細胞の増殖および／または再生の程度、あるいは細胞の分化の程度を高める工程を包含する。細胞培養における細胞増殖の増加又は減少は、該当する分子への暴露の前後に細胞数をカウントすることによって、検出できる。増殖の程度は、細胞の密集の程度を顕微鏡検査することによって定量できる。細胞増殖は、チミジン取り込みアッセイを用いて定量できる。
【０１０５】
細胞分化の増加または減少は、様々な体細胞型または前駆細胞型に特異化された分化細胞型を同定することによって検出されてもよい。同定は、細胞型を同定するための、当業者に知られる細胞マーカーを用いて実施されてもよい。
【０１０６】
本明細書で用いられる「活性」は、ＨＳＣ細胞内のＨＡまたはＨＡＳの機能に関するもので、ＨＡを合成するＨＡＳの能力、あるいはシャペロンまたは上流もしくは下流のエフェクター分子に結合し、それによって増殖または分化に影響を及ぼす上流または下流の経路を活性化または抑制するＨＡの能力を包含する。
【０１０７】
本明細書で用いられる用語「発現および／または活性を調整する」は、ＨＡまたはＨＡＳの未改変レベルに比較して、ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性を改変または変化させることを包含する。発現および／または活性は、増殖または分化を増加または減少させるために、未改変レベルに比較して増加または減少されてもよい。
【０１０８】
ＨＳＣ内でのＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性の調整は、ＨＡまたはＨＡＳのアンタゴニスト、阻害剤、擬似物質または誘導体を用いて実行してもよい。本明細書で用いられる用語「アンタゴニスト」または「阻害剤」は、ＨＡまたはＨＡＳのいずれかに結合すると、ＨＡまたはＨＡＳの活性を遮断または調整する分子を指す。アンタゴニストおよび阻害剤は、蛋白質、核酸、炭水化物、抗体、またはＨＡもしくはＨＡＳに結合するリガンドをはじめとするいずれか別の分子を包含してもよい。適切なリガンドは、ＨＡに結合していてもよいＨＡＢＰである。蛋白質が、ＨＡを分解することができ、それによってＨＳＣ上で暴露されたＨＡのレベルに影響を及ぼし得るヒアルロニダーゼなどの酵素を包含してもよい。ＨＡまたはＨＡＳの活性および／または発現の他の調整物質としては、ある範囲の合理的に設計された合成阻害剤が挙げられる。
【０１０９】
ＨＡＢＰの適切な濃度は、５〜２０μｇ／ｍｌの範囲内である。ヒアルロニダーゼの場合、これは室温または同等の条件で約１５分間、０．１単位／ｍｌで用いてもよい。
【０１１０】
調整は、ＨＡＳ遺伝子もしくはＨＡＳ活性の発現および／もしくは活性の増加もしくは減少、結合特性の変化、または生物学的、機能的もしくは免疫学的性質のいずれか他の変化であってもよい。
【０１１１】
調整物質としては、限定するものではないが、酵素の発現および活性のための、ＨＡＳの上流および下流での調節物質が挙げられる。
【０１１２】
本明細書で用いられる用語「擬似物質」は、ＨＡまたはＨＡＳまたはその一部の構造の知識から開発され、そのためＨＡまたはＨＡＳ様分子の作用の一部または全てを実行することができる構造の分子を指す。
【０１１３】
ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性の調整は、直説法または間接法によって実行してもよい。ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性の調整は、当業者に知られる直説法を用いて実行されてもよく、限定するものではないが、ノックアウト法、アンチセンス法、三重らせん法、標的変異（targeted mutation）、遺伝子療法、転写に作用する薬剤による調節が挙げられる。ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性を調整する間接法は、サイトカインのような上流または下流の調整物質を標的とすることを包含してもよい。
【０１１４】
ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性の阻害は、ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性を直接的または間接的に標的とする様々な阻害剤を用いて実行してもよい。阻害は、ＨＡまたはＨＡＳの機能に関与する上流または下流の標的を阻害することによって実行してもよい。
【０１１５】
本発明の別の態様において、本明細書に記載された方法によって調製されたＨＳＣまたはその子孫の濃縮集団を含む組成物の効果的量を投与することを含む、ＨＳＣ関連状態を処置する方法を提供する。
【０１１６】
本明細書で用いられる「ＨＳＣ関連状態」は、ＨＳＣもしくはその子孫との相互作用から生じるいずれかの状態、またはＨＳＣもしくはその子孫に依存するいずれかの状態を意味する。ＨＳＣ関連状態の例は、貧血（大球性貧血および再生不良性貧血を含む）；血小板減少症；形成不全；汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）；脊髄形成異常；免疫性（自己免疫性）血小板減少性紫斑症（ＩＴＰ）；およびＨＩＶ誘導性ＩＴＰおよび白血病をはじめとする悪性状態が包含されてもよい。
【０１１７】
「処置」は、治療的処置および予防的または防御的測定の両方を指す。処置を必要とするものとしては、既に疾患または障害のあるものに加え、疾患または障害が防御されるべきものが挙げられる。
【０１１８】
記載された方法によって分離されたＨＳＣまたはこの子孫を含む本発明の組成物は、多数の方法での使用を見出すことができる。
【０１１９】
これらの細胞は、放射線照射された宿主および／もしくは化学療法を受けた宿主のような、免疫無防備状態の宿主を完全に再生するために用いられるか、または限定するものではないが、エリトロポエチン、コロニー刺激因子、例えばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦもしくはＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、例えばＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８などをはじめとする様々な因子、または特定の系列になるＨＳＣもしくはその子孫に関連するか、またはそれらの増殖、成熟および分化に関連するストローマ細胞を用いることによる１種以上の選択された系列への成熟、増殖および分化を提供することによって、特異的系列の細胞供給源として用いることができる。
【０１２０】
ＨＡまたはＨＡＳは、移植後の細胞の空間分布に関与することが見出された。ヒアルロニダーゼによる細胞の処置は、細胞の空間分布に影響を及ぼす。このため、患者の造血系の移植または再生のために用いられる細胞は、正常な細胞型および細胞分布を達成するためにＨＡの除去を阻害する化合物、またはＨＡもしくはＨＡＳの発現レベルを保持する化合物で前処理してもよい。
【０１２１】
ＨＳＣまたはその子孫は、造血細胞の分化および成熟に関連する因子の分離および評価に用いることもできる。つまり本発明は、ならし培地のような培地の活性を測定するアッセイ、または細胞増殖活性、特定系列への特定化との関与などについて液体を評価するアッセイにおいて造血幹細胞を使用することを包含する。
【０１２２】
ＨＳＣは、遺伝子疾患の処置に用いられることができる。つまり本発明は、遺伝子欠損を修復するための自家幹細胞または同種異型幹細胞の遺伝子改変によって、ＨＳＣに関連する遺伝子疾患を処置することを包含する。例えば、限定するものではないが、β−サラセミア、鎌状赤血球貧血、アデノシンデアミナーゼ欠損症、レコンビナーゼ欠損症またはレコンビナーゼ調節遺伝子欠損症などを含む疾患は、相同的組換えまたはランダムな組換えのいずれかによって野生型遺伝子を造血幹細胞に導入して修復されてもよい。
【０１２３】
遺伝子療法の用途において、遺伝子は、例えば欠損遺伝子の置換として、治療的に有効な遺伝子産物をインビボ合成するために、細胞内に導入される。「遺伝子療法」は、単独処置によって持続効果が達成される従来の遺伝子療法と、治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの単回または反復投与を伴う遺伝子療法剤の投与との両方を包含する。アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡが、インビボで特定の遺伝子の発現を遮断するための治療剤として用いられることができる。
【０１２４】
遺伝子療法の他の適応としては、正常幹細胞が化学療法時に利点を有して選択圧力を受けれるために薬物耐性遺伝子を導入することが挙げられる。適切な薬物耐性遺伝子としては、限定するものではないが、多剤耐性（ＭＤＲ）蛋白質をコード化する遺伝子が挙げられる。
【０１２５】
造血細胞に関連する疾患以外で、限定するものではないがホルモン、酵素、インターフェロン、増殖因子などの特定の分泌産物の不足に関係する疾患が、遺伝子改変によって処置できる。適切な調節開始領域を用いることによって、欠損蛋白質を誘導的に産生することができ、それによってそのような蛋白質を正常に生成する細胞型とは異なる細胞型においても、その蛋白質の生成が自然な生成と並行して行われることになる。リボザイム、アンチセンスまたは他のメッセージを挿入して、特定の遺伝子産物、または疾患、特に血液リンパ性疾患（hematolymphotropic diseases）の感受性を阻害することもできる。
【０１２６】
本発明の更に別の態様において、ＨＳＣまたはその子孫の非制御的増殖から生じるＨＳＣ関連状態を処置する方法であって、
ＨＳＣまたはその子孫内のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の発現を制御することを含む方法を提供する。
【０１２７】
本発明の好ましい態様において、ＨＳＣまたはその子孫の非制御的増殖から生じるＨＳＣ関連状態を処置する方法であって、
ＨＳＣまたはその子孫内のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の発現および／または活性を低下させることを含む方法を提供する。
【０１２８】
非制御的増殖が起こる典型的な状態は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）をはじめとする白血病のような悪性状態である。
【０１２９】
出願人は、ヒト白血病細胞がＨＡレベルの上昇を呈していることを示した。具体的には、ヒト白血病細胞系（ＨＬ−６０、Ｍｏ７ｅおよびＫ５６２）は、１種以上のＨＡＳ遺伝子を発現し、高レベルのＨＡを合成するが、そのＨＡは、ヒアルロニダーゼによって効率的に除去される。加えて、患者のＡＭＬ、ＣＭＬ、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ＰＬＬ、慢性骨髄単球性白血病（chronic monmoylocytic leukaemia）（ＣＭＭＬ）、混合型白血病、およびヘアリーセル白血病の試料からの白血病芽球によるＨＡ合成が増加している（表１に示した）。
【０１３０】
【表１】
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【０１３１】
正常な臍帯血ＣＤ３４+細胞に比較して、白血病細胞の大部分が、ＨＡを発現する芽細胞数の上向きの調節を呈した。ＣＭＬ  ＣＤ３４+細胞の明白な集団が、細胞表面ＨＡも有意に高レベルに発現した（図６）。患者の試料は全て、ＨＡＳ１を発現したが、少数の試料が、ＨＡＳ２および／またはＨＡＳ３を発現した。
【０１３２】
したがってこれらの白血病においては、ＨＡおよびＨＡＳが高レベルで発現される。ＨＡ発現のレベルを制御することによって、これらの細胞の増殖に影響を及ぼすことができる。ＨＡの発現レベルを低下させれば、増殖レベルを低下させることができる。これは、ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性を調整するための上記方法のいずれによって実行されてもよい。
【０１３３】
患者を処置するために、適切な調整物質が投与されてもよい。調整物質は、限定するものではないが経鼻、経口、経皮、筋肉内、腹腔内、皮下または静脈内をはじめとする様々な経路で投与されてもよい。
【０１３４】
これは、ＨＡＳに結合することによってＨＡ合成を防御する機能阻害抗体、または薬剤を用いて促進されてもよい。あるいは、細胞は、レトロウイルスによってＨＡＳアンチセンスを形質導入された細胞であってもよい。
【０１３５】
本発明の更に別の態様において、ＨＳＣまたはその子孫の分化から生じるＨＳＣ関連状態を処置する方法であって、
ＨＳＣまたはその子孫内のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の発現および／または活性を制御することを含む方法を提供する。
【０１３６】
増加と同様に、分化は、ＨＳＣまたはその子孫内でのＨＡまたはＨＡＳの発現によって影響を受ける。
【０１３７】
本発明の好ましい態様において、ＨＳＣまたはその子孫の分化から生じるＨＳＣ関連状態を処置する方法であって、
ＨＳＣまたはその子孫内のＨＡまたはＨＡＳもしくはその断片の発現および／または活性を低下させることを含む方法を提供する。
【０１３８】
ＨＡまたはＨＡＳの発現および／または活性の適切な調整物質を利用して分化を減少させることによって、特に非制御的分化からくる癌において分化を制御できる。調整は、上記のとおり実行されてもよい。
【０１３９】
本発明で用いられる手順の実施例を、より完全にここに記載する。しかし、以下の記載が例示に過ぎず、上記発明の概要の制限としてとらえるべきでないことは理解されるはずである。
【０１４０】
実施例
【０１４１】
実験
（ａ）臍帯血  Mercy Hospital for Women (East Melbourne, Australia)での正常な帝王切開分娩の後にインフォームドコンセントに従って、臍帯血（ＣＢ）試料を得た。
【０１４２】
（ｂ）マウス  ６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ  Ｈ−２Ｄマウス、ならびに共通遺伝子系のＣ５７ＢＩ／６Ｊ（Ｌｙ５．２）マウスおよびＰＴＲＰＡ（Ｌｙ５．１）マウスを、Animal Resource Center (Perth, WA, Australia)から購入し、実験での使用の前に少なくとも１週間、従来どおり清潔に飼育した。ＣＤ４４-/-マウス（２）には、Dr. Tak Mak(Amgen Institute, Ontario Cancer Institute, University of Toronto)から贈与された。マウスは全てマウス用飼料（Barastok, St. Arnaud, Victoria, Australia）および酸性水を自由に摂取させた。
【０１４３】
（ｃ）放射線照射  造血を回復する細胞の能力を、２台の向き合った137Ｃｓ線源（Gammmacell 40; Atomic Energy of Canada, Ottawa, Canada）から１．４Ｇｙ／分の線量を４時間間隔で２等量に分けることにより致死量に近い放射線量（９．５Ｇｙ）を受けたマウスで分析した。
【０１４４】
（ｄ）造血細胞の単離  マウスを頚部脱臼によって屠殺した。ＢＭを、大腿骨、脛骨および腸骨稜からごく普通に採取した。これらの骨を、２％加熱非働化（ＨＩ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Hyclone, Logan, UT）を補充したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で完全に摩砕した。骨断片を複数回洗浄して、上清の細胞懸濁液および洗浄画分を４０μｍフィルター（Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey）で濾過して、大きな骨粒子を除去した。骨髄を遠心分離（４００ｇ、５分間）して、新たな緩衝液で再懸濁させた。細胞上清を４０μｍフィルターで再度濾過して、２％ＨＩ  ＦＣＳ補充ＰＢＳ（緩衝液）で１０7細胞／ｍｌに希釈した。
【０１４５】
（ｅ）造血細胞濃縮方法
（ｉ）マウス  低密度（＜１．０７７７ｇ／ｃｍ3）の骨髄単核細胞を、動物用のNycoprep（Accurate Chemical and Scientific corporation, Westbury, NY）を用いて不連続密度遠心分離法によって単離した。更に処理する前に、単離した細胞を緩衝液で洗浄した。Ｌｉｎ-細胞を、先に記載されたもの（１）と同様の手法で単離した。簡単に説明すると、低密度細胞を、ビオチン化または非コンジュゲート化されたラット抗マウス一次抗体：抗Ｂ２２０（ＣＤ４５Ｒ；Ｂ細胞）；抗Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ；マクロファージ）；抗Ｇｒ−１（Ｌｙ−６Ｇ；好中球）；抗Ｌｙｔ−２（ＣＤ８）、抗Ｌ３Ｔ４（ＣＤ４）、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５（Ｔ細胞）；ならびに抗Ｔｅｒ１１９（赤血球細胞）のカクテルで標識した。チャネルの蛍光の平均および／または検出した陽性細胞のパーセント値が最大に変動する濃度で、フローサイトメトリー分析によって抗体の各バッチを評価した。２倍強度の抗体カクテル５０μＬを等量の緩衝液中の５ｘ１０6個の細胞に添加して、細胞と抗体の懸濁液を氷上で２０分間インキュベートした。過去に記載されたとおり（１）、Ｌｉｎ-細胞を、ＭＡＣＳシステム（Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany）を用いて、免疫磁気選択法によって除去した。簡単に説明すると、ヤギ抗ラットＩｇＧマイクロビーズ（Miltenyi Biotec）１３μｌを、洗浄した抗体標識細胞の懸濁液８７μｌ（緩衝液に１０7細胞）に添加して、細胞をビーズと４℃で１５分間インキュベートした。細胞を緩衝液で洗浄して、ＰＢＳ  １．５ｍｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／１０8細胞で再懸濁させた。その後、細胞を最大２ｍｌまでカラム（Ｄカラム、最大容量１ｘ１０9細胞、一般には最大表示容量の半分より多量には通さない）に添加し、メッシュに通して、５分間放置して磁化させた。２０ゲージ針によってＰＢＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＢＳＡ  ５０ｍｌで細胞を溶離させることによって、Ｌｉｎ-細胞（非磁気分画）を採取した。
（ii）ローダミン１２３（Ｒｈ）標識  Ｌｉｎ-細胞を緩衝液で洗浄して、１ｘ１０6細胞／ｍｌに再懸濁させて、Ｒｈ（Molecular Probes, Eugene, OR）の最終濃度０．１μｇ／ｍｌ（緩衝液で希釈）で３７℃の暗所で２０分間インキュベートした。細胞を遠心分離して１０6細胞／ｍｌに再懸濁させて、３７℃の暗所で１５分間流出させ、遠心分離してＰＢＳ０．５％ＨＩ  ＦＣＳで１０8細胞／ｍｌに再懸濁させた。細胞を最終濃度１：８０（６．８μｇ／ｍｌ）のヤギ抗ラットフィクロエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート二次抗体（Biosource International; Camarillo, CA）と暗所の氷上で更に２０分間インキュベートした。最後に、細胞を緩衝液で洗浄して、５ｘ１０6細胞／ｍｌに再懸濁させ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の前に氷上で保存した。
（iii）幹細胞抗原１（Ｓｃａ−１）およびｃ−ｋｉｔ標識
Ｌｉｎ-細胞を洗浄、遠心分離して、Ｓｃａ−１  ＦＩＴＣ（Pharmingen; １μｇ／５ｘ１０6細胞）およびｃ−ｋｉｔ  ＰＥ（Pharmingen; １μｇ／５ｘ１０6細胞）およびストレパビジン−Ｒｅｄ６７０（Gibco；１／１６０最終濃度）のカクテル中で、暗所の氷上で２０分間再懸濁させた。最後に、細胞を緩衝液で洗浄して、５ｘ１０6細胞／ｍｌに再懸濁させて、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の前に氷上で保存した。
（iv）ヒト  フィコール−ハイパック密度勾配（ｄ＝１．０７７ｇ／ｍｌ、Pharmacia Biotech, Sweeden）を用いた不連続密度遠心分離によって、低密度の単核細胞をＣＢから分離し、４００ｇの遠心分離によって３回洗浄した。分離した細胞は、更に処置する前にＰＢＳで洗浄した。Ｌｉｎ-細胞を、先に記載のとおり分離した。簡単に説明すると、抗ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２４（Ｂ細胞および赤血球）；抗ＣＤ３、ＣＤ２およびＣＤ５６（Ｔ細胞およびＮＫ細胞）；抗ＣＤ１６、ＣＤ６６ｂおよびＣＤ１１ｂ（顆粒球および単球）；抗ＣＤ１４、ＣＤ３６（単球、血小板および赤血球）をはじめとする系列抗体のカクテルで細胞を標識した。ヤギ抗マウスＩｇＧマイクロビーズおよび上記のようなＭＡＣＳシステムを用いた免疫磁気的選択によって、Ｌｉｎ-細胞を除去した。
（ｖ）ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＣＤ１５標識  Ｌｉｎ-細胞を洗浄、遠心分離して、ＣＤ３４  ＦＩＴＣおよびＣＤ３８ＰＥまたはＣＤ１５  ＦＩＴＣ（Becton Dickinson, San Jose, CA;メーカーが推奨する濃度）のカクテルで、暗所の氷上で２０分間再懸濁させた。最後に、細胞の緩衝液で洗浄して、５ｘ１０6細胞／ｍｌに再懸濁させ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の前に氷上で保存した。
【０１４６】
（ｆ）ヒアルロン酸標識  細胞表面のヒアルロン酸（ＨＡ）の存在を、最終濃度２０μｇ／ｍｌのビオチン化ヒアルロン酸結合蛋白質（ＨＡＢＰ；生化学工業、東京（日本））を用いて氷上で２０分間検出した。細胞を洗浄して、上記のとおりストレプアビジン−ＰＥまたはＲｅｄ−６７０（Gibco BRL, Grand Island, NY）で標識した。
【０１４７】
（ｇ）ヒアルロニダーゼ処置  ＨＡＢＰ標識が特異的であることを保証し、生着した細胞の空間分布における細胞表面ＨＡの重要性を評価するために、骨髄の亜集団を０．１単位ヒアルロニダーゼ（ＨＹ）（Sigma Aldrich）で２１℃で１５分間処置して、ＨＡを除去した。細胞をＰＢＳ  ０．５％ＨＩ  ＦＣＳで洗浄した。
【０１４８】
（ｈ）フローサイトメトリー  ２００ｍＷで４８８ｎｍ光を発光する５ワットアルゴンイオンレーザー（Coherent Innova 90, Palo Alto, CA）と、５０ｍＷで３５０／３６０ｎｍ光を発光するSpectra-Physics紫外線（ＵＶ）レーザー（Mountain View, CA）とを搭載したＦＡＣＳｔａｒplusセルソーターで、標識した細胞をソーティングした。前方光散乱パスの４８８ｎｍバンドパス１０フィルターと１ディケード対数減光フィルター（1-decade logarithmic neutral density filter）とで、光散乱シグナルを回収した。Ｒｈ発光緑色蛍光パルスは、ＦＩＴＣ５３０ｎｍバンドパス１５フィルターで回収した。フィコエリトリン（ＰＥ）の励起によって発光した赤橙色蛍光パルスを、４４０ダイクロイックショートパスミラーで反射させ、５７５ｎｍバンドパスダイクロイック２６フィルターで回収した。Ｒｅｄ６７０の励起によって発光したパルスを、ロングパスＲＧ６５５フィルターで回収した。
【０１４９】
（ｉ）細胞培養  複数のサイトカインおよび様々な濃度のＨＡＢＰを含有する無血清培地（serum deprived media）１００μｌを含有する９６穴プレートに、培養する細胞を直接ソーティングした。１％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌヒトインシュリン、２００μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、および２１μｇ／ｍｌ  ＬＤＬを含有するイスコブ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）(Gibco BRL)で、マウス細胞を培養した。ヒト細胞は、０．５％  ブミネート（buminate）(Baxter, Glendale, CA)を含有するX Vivo 10培地（Bio Whittaker, Verviers, Belgium）で培養した。
【０１５０】
（ｊ）５−（および６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識  空間分布分析用に移植される細胞を、先に記載されたとおり（１）に蛍光色素ＣＦＳＥ（Molecular Probes, Eugene, OR）で標識した。簡単に説明すると、ＰＢＳ  ０．５％ＨＩ  ＦＣＳで細胞を洗浄して、ＰＢＳ  ０．５％ＨＩ  ＦＣＳで１０6細胞／ｍｌの密度に再懸濁させて、３７℃で２分間プレインキュベートした。ＤＭＳＯで５ｍＭに希釈し、その後ＰＢＳで５μＭに希釈したＣＦＳＥを添加して、０．５μＭの最終濃度を得、色素溶液細胞混合物を、３７℃で更に１０分間インキュベートした。２０％ＦＣＳを含有する氷冷ＰＢＳを色素溶液細胞液の容量の１０倍量添加して染色を止めた。最後に、細胞をＰＢＳで洗浄して、注入のためにレシピエント毎に０．３ｍｌまでのＰＢＳに再懸濁させた。
【０１５１】
（ｋ）移植片  細胞を、外側尾静脈に注入することによって移植した。注入した細胞の実際の数は、Ｌｉｎ-Ｓｃａ+ＨＡ+細胞５００個、Ｌｉｎ-Ｓｃａ+ＨＡ-細胞５００個、Ｌｉｎ-ＨＡ+細胞５０００〜６０００個、Ｌｉｎ-ＨＡ-細胞５〜６ｘ１０5個、Ｌｉｎ-Ｒｈdull細胞１．１ｘ１０5個、およびＬｉｎ-Ｒｈbright細胞５．５ｘ１０5個の無処置およびヒアルロン酸処置細胞であった。
【０１５２】
（ｌ）移植細胞の空間分布の分析  移植後１５時間目に、ＣＦＳＥ陽性細胞の空間分布を、先に記載されたとおり（１）分析した。簡単に説明すると、２％パラホルムアルデヒド、０．０５％グルタルデヒドを、下降大動脈に生理学的圧力で灌流することによって、ＢＭを固定した。大腿骨を取り出して、１０％ＥＤＴＡで脱灰した。その後、骨を脱水させてパラフィンに包埋した。各大腿骨の縦方向切片３．５μｍを切断し、色あせ防止用封入剤（Vectashield, Vector Laboratories）に封入した。切片は全て、ＦＩＴＣおよびテキサスレッドの２重フィルターセット（５７８ｎｍでの緑色励起および６１０ｎｍでの赤色励起）を用いた蛍光顕微鏡（Zeiss Camperdown, NSW, Australia）で分析した。このフィルターセットは、発光帯域幅が短く、ＣＦＳＥ陽性ＢＭ細胞を宿主の骨髄細胞と容易に識別できるために特別に選択した。
【０１５３】
移植のレシピエント毎に少なくとも６個の縦方向切片からＣＦＳＥ標識細胞（陽性細胞）の位置を分析することによって、移植細胞の空間分布を決定した。各切片が大腿骨全体をより多く含むようにしながら、中心の縦方向切片を横方向切片に対比させて分析した。各細胞の一度だけの分析が確実に行われるよう、それぞれ別の３．５μｍ切片も分析した。陽性細胞の位置は、骨内膜（骨内膜の１２細胞以内と先に恣意的に定義された（３））または中心（いずれかの骨内膜から１２細胞より多く）のいずれかと設定した（１）。
【０１５４】
（ｍ）ＲＮＡ抽出  ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ Ｂ（Bresatec, SA, Australia）抽出法を用いて抽出した。簡単に説明すると、細胞を遠心分離して、０．２ｍｌ／１０6細胞のＲＮＡｚｏｌ  Ｂで細胞を溶解してＲＮＡを調製した。そのホモジネートをクロロホルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させた。ＲＮＡを洗浄して乾燥し、滅菌水で再懸濁させた。
【０１５５】
（ｎ）逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）  ランダムへキサマー（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweeden）およびSuperscript II逆転写酵素（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）を用いて、テンプレートｃＤＮＡを調製した。ＰＣＲを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施した：Genewarks（Adelaide, SA, Australia）によって合成された、マウスＨａｓ−１センス（５’ＣＧＴＧＧＡＣＴＡＣＧＴＧＣＡＧＧＴＣＴＧＴＧ３’）（配列番号１）およびアンチセンス（５’ＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＴＡＴＡＣＴＴＧＧＴＡＧＣ３’）（配列番号２）、マウスＨａｓ−２センス（５’ＧＡＣＣＡＣＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＧＧＡ３’）（配列番号３）およびアンチセンス（５’ＴＣＣＣＡＧＧＧＴＡＧＧＴＣＡＧＣＣＴＴ３’）（配列番号４）、マウスＨａｓ−３センス３’５’（５’ＧＡＧＣＧＴＧＴＧＣＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＴＧ３’）（配列番号５）およびアンチセンス（５’ＧＡＡＧＣＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴ３’）（配列番号６）、ヒトＨＡＳ−１センス（５’ＧＣＴＡＣＣＡＡＧＴＡＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣ３’）（配列番号７）およびアンチセンス（５’ＣＧＣＧＴＡＧＡＡＣＡＧＡＣＧＣＡＧＣＡＣＡＧ３’）（配列番号８）、ヒトＨＡＳ−２センス（５’ＧＣＴＣＧＣＡＡＣＡＣＧＴＡＡＣＧＣＡＡ３’）（配列番号９）およびアンチセンス（５’ＧＧＣＡＣＴＴＡＧＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＧ３’）（配列番号１０）、およびヒトＨＡＳ−３センス（５’ＡＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＧＡ３’）（配列番号１１）およびアンチセンス（５’ＧＧＡＧＣＧＣＧＣＧＧＴＡＴＡＣＴＴＡＧＴＴＣＧＧ３’）（配列番号１２）。ＰＣＲは全て、遺伝子機器（Innovonics, Melbourne, Australia）内でパラフィン油３０μｌの下、２５μｌの容量で実施した。各ＰＣＲは、１ｘTaqゴールド緩衝液、２００μＭ  ｄＮＴＰＳ（Boehringer Mannheim, Branchburg, NJ）、４μｇ／ｍｌ各プライマー、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０％ＤＭＳＯおよび０．５単位  Taq Gold(Boehringer Mannheim)で構成されていた。ＰＣＲは、９４℃で１０分の最初のサイクルでTaqゴールドの活性化、３０秒の変性を次のサイクル、６０℃で３０秒のアニーリングを１０サイクル、続いて５５℃で３０秒のアニーリングを更に２５サイクル、および７２℃で３０秒の伸長を３５サイクル、その後に７２℃で５分間の最後の伸長という条件で実施した。
【０１５６】
（ｏ）統計解析  平均間の差を、適宜、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはスチューデントｔ検定によって評価した。
【０１５７】
実施例１：マウス造血細胞におけるＨＡ発現
ＨＡの絶対特異性を実証するヒアルロン酸結合蛋白質（ＨＡＢＰ）のビオチン化形態の結合によるフローサイトメトリー分析によって、ＨＡの発現を実証した（４）。このアプローチを用いて、ＨＡＢＰ結合を２種のマウスＨＳＣ濃縮細胞亜集団、つまりＬｉｎ-Ｓｃａ+Ｋｉｔ+（図１ａ）およびＬｉｎ-Ｒｈdullで検出し、酵素ヒアルロニダーゼ（ＨＹ）による細胞の前処置によって完全に除去した（図１ｂ）。加えて、ＣＤ４４-/-マウス（２）から分離した同様の割合のＬｉｎ-Ｒｈ１２３dull細胞は、ＨＡＢＰの結合を呈し（２６．５％に比較して２５．０％）、細胞表面で検出されたＨＡが大部分のレセプターＣＤ４４（１９）への外来性ＨＡの結合によるものではなく、原始造血細胞自身でのデノボ合成によるものであることが実証された。重要なこととして、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＨＡＢＰ-細胞ではなくＬｉｎ-Ｓｃａ+Ｋｉｔ+、Ｌｉｎ-ＨＡＢＰ+細胞がＨａｓ−１、Ｈａｓ−２およびＨａｓ−３を発現していることを実証した（図２ａおよび２ｂ）。
【０１５８】
原始ＢＭ細胞によるＨＡの発現は、マウスの独特な特徴ではなく、ヒト造血細胞前駆体の特徴である。ＣＤ３４、ＣＤ３８およびＨＡＢＰを用いたヒト臍帯血（ＣＢ）のＦＡＣＳ分析（図３）では、推定されるヒトＨＳＣがＨＡを合成することが示された。興味深いこととして、成熟した細胞表現型に相関してＨＡ発現のレベルが有意に低下し、ＣＤ３４-ＣＤ３８+細胞ではＨＡ発現は検出されないことが示された。マウスでのデータによれば、分離されたヒトＣＤ３４+およびＬｉｎ-ＨＡ+細胞もＨＡＳ１、ＨＡＳ２およびＨＡＳ３を発現し、Ｌｉｎ-ＨＡ-はそれらを発現しなかった（図４）。これらのデータをまとめると、ＨＡがＨＳＣを濃縮したマウスおよびヒト造血細胞集団で合成および発現されることが実証される。
【０１５９】
しかし、ＨＳＣを再集団化させると、小さい割合でＬｉｎ-Ｒｈ１２３dull細胞のみを現した（５）。ＨＳＣがＨＡＢＰ+亜集団内に含まれるかどうかを検討するために、ＦＡＣＳを用いて、Ｌｉｎ-ＨＡＢＰ+とＬｉｎ-ＨＡＢＰ-、及びＬｉｎ-Ｓｃａ+ＨＡＢＰ+とＬｉｎ-Ｓｃａ+ＨＡＢＰ-の亜集団およびその細胞を単離して、共通遺伝子系Ｌｙ５．１／Ｌｙ５．２マウスモデルを用いてインビボでアッセイした（６）。Ｌｉｎ-ＨＡＢＰ+細胞５０００〜６０００個によって、移植後８週目には、致死量放射線照射されたレシピエントの末梢血（ＰＢ）の造血細胞系列の全てが再生した（表２）が、同数のＬｉｎ-ＨＡＢＰ+細胞ではそのようにならず、レシピエントは移植後１４〜１６日目に死亡した。加えて、５００個のＬｉｎ-Ｓｃａ+ＨＡＢＰ+細胞の移植によって、致死量放射線照射を受けたレシピエントの多数の造血細胞系列が、移植後４週目に再生した（表２）。こうしてＨＡは、長期間の再集団化能のあるＨＳＣで発現されたが、生着のレベルは、注入した非分別Ｌｉｎ-Ｓｃａ+細胞から予測されるものよりも有意に低かった（７）。しかし、６匹のレシピエントのうち１匹だけに、致死量放射線照射されたレシピエントを救命することができたＨＡＢＰ-細胞があり（Ｌｉｎ-Ｓｃａ+ＨＡＢＰ-細胞５００個の移植後）、この集団内にはＨＳＣの大部分が含まれないことが示唆される。１匹の生存したレシピエントでは、ＨＡ+細胞の移植の後に見られたのと同じ割合でドナー細胞があった（〜９％）。予測された生着レベルよりもこのように低かった理由は依然として不明であるが、ＨＡが単に受動的に構造的役割を担っているのではなく、特異的シグナル誘導分子であることも示唆される。
【０１６０】
【表２】
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【０１６１】
マウスにＬｉｎ-ＨＡＢＰ+細胞５０００〜６０００個（４匹）またはＬｉｎ-Ｓｃａ+ＨＡＢＰ+細胞５００個（２匹）のどちらかを注入して、移植後４〜８週目に分析した。末梢血を採取して、塩化アンモニウムを用いて赤血球細胞を溶解した。ドナー細胞の割合（％）を、Ｌｙ５．１抗体標識を利用して測定したところ、Ｌｉｎ-ＨＡＢＰ+細胞５０００〜６０００個またはＬｉｎ-Ｓｃａ+ＨＡＢＰ+細胞５００個の移植の後、それぞれ９±１．７％および９．４±０．０２％であった。
【０１６２】
白血球では、マクロファージおよび顆粒球（ＭＡＣ−１／ＧＲ−１）、Ｂ細胞（Ｂ２２０）およびＴ細胞（ＣＤ４／ＣＤ８）を標識し、ドナーの割合をＬｙ５．１抗体を用いて分析した*。
ＵＮは「不明」
【０１６３】
実施例３：ＨＳＣ増殖の負の調節物質としてのＨＡの潜在的役割
インビトロでのストローマ不含のサイトカイン依存的培養によって、代理の可溶性リガンドＨＡＢＰによるＨＡの連結反応が、マウスおよびヒト両方のＨＳＣ増殖を著しく抑制するが、初期に作用する造血細胞増殖因子の強力な組合わせによって刺激されることが実証された。マウスＨＳＣおよび推定のヒトＨＳＣ（それぞれＬｉｎ-Ｓｃａ+Ｋｉｔ+細胞およびＬｉｎ-ＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞）の両方を、マウスＨＳＣおよびヒトＨＳＣそれぞれでＳＣＦ（７５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１１、ＦＬＴ３リガンドおよびＩＬ−６（全て１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＧ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ３リガンド、ＭＧＤＦ（全て１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６およびＩＬ−３（両方とも１０ｎｇ／ｍｌ）のいずれかで構成された複数のサイトカインと様々な濃度のＨＡＢＰとの存在下、無血清条件で培養した。図５に示すように、これによって、ＨＡＢＰの濃度増加の存在に対応して細胞増殖が有意に阻害された。この予期しないデータから、造血に対するＨＡの著しい増殖阻害効果が示される。増殖阻害に加え、図５ａに示すように、ＨＡＢＰ量を増加させてＨＳＣをインキュベートすると、投入した集団の細胞表現型が維持され、細胞分化が阻害された。これに対して、ＨＡＢＰの非存在下で培養された細胞が有意な割合で分化して、ＣＤ１５陽性になった（図５ｂ）。この観察された増殖調節的役割は、インビトロでのＨＡの添加によって造血が不安定になることを示した近年の報告と一致するものである（８）。この試験では、外来性ＨＡをＬＴＢＭＣに添加すると、前駆体と成熟したＢＭ細胞の両方の産生が増加したが、ＨＹを添加すると細胞産生が阻害された。これらの培養で、ＨＡが骨髄球とリンパ球前駆体に共通する祖先の前駆体によって造血を調節していると考えられた。加えて、この観察されたＨＡの増殖調節的役割は、シアロムチンＰＳＧＬ−１：Ｐ−セレクチンの相互作用について近年記載されたものと非常に類似している（９）。その明確に検証された接着分子としての役割に加えて、ＰＳＧＬ−１は、ヒト造血細胞前駆体の強力な負の調節物質であることがここに示された。
【０１６４】
実施例４：移植されたマウスＨＳＣの空間分布におけるＨＡの役割
我々の研究室での更に近年のデータから、このＨＳＣにおけるＣＡＭの発現が機能的に重要で、それらの移植後の定着を調節することに関与することが示された。Ｌｉｎ-Ｒｈdull細胞を移植前にＨＹで処置すると、移植後１５時間目の骨内膜にある細胞数が、無処置細胞に比較して〜４０％減少した（それぞれ３９±３および６５±８）。これに対して、Ｌｉｎ-Ｒｈbright細胞のＨＹ処置では、Ｈａｓ遺伝子はいずれも合成されず（データは示さない）、同じ時点でそれらの空間分布が変化しないことが示された（それぞれ４１±３および３７±４）。これは、ＨＰＣではなくＨＳＣの空間配置を決定する際の特異的役割を示唆している。
【０１６５】
総括すると、我々のデータは、インビトロおよびインビボでＨＡのＨＳＣ合成および発現を初めて実証するものであり、少なくとも２種の哺乳類種の原始造血細胞の、非常に特異的であるがまだ認識されていない特徴を表している。ＨＳＣ上でのＨＡの存在は、幹細胞生物学において、具体的には移植後のＨＳＣの定着の調節において機能的に重要である。加えて、そのデータは、ＨＳＣ表面のＨＡが代わりのリガンドに結合することで、これらの細胞の増殖および分化を調節する際に重要な役割を演じていることも示唆している。
【０１６６】
【表３】
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【０１６７】
最後に、本明細書に概説した本発明の精神を逸脱することなく、様々な他の改良および／または変更が実施されてもよいことは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】マウスＨＳＣ（Ｌｉｎ-Ｓｃａ+Ｋｉｔ+細胞）上のＨＡの発現を示す。
【図１Ｂ】Ｌｉｎ-ＲｈdullＨＳＣ上のＨＡの発現、およびＨＹ処置による除去を示す。
【図２】マウス細胞内でのＨＡＳ遺伝子の発現を示す
【図３】成熟したＣＤ３４+細胞上のＨＡ発現を示す。
【図４】ヒトＨＳＣ内でのＨＡＳ遺伝子発現を示す。
【図５ａ（ｉ）】マウスＨＳＣの増殖阻害を示す。
【図５ａ（ｉｉ）】ヒトＨＳＣの増殖阻害を示す。
【図５ｂ（ｉ）】培養したＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＢ細胞の分化を示す。
【図５ｂ（ｉｉ）】培養したＣＤ３４+ＣＤ３８-ＣＢ細胞の表現型分析を示す。
【図６】様々な濃度のＨＡＢＰの存在下で培養された細胞のＣＤ３４+発現の維持を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ（ｉ）】
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【図５ａ（ｉｉ）】
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【図５ｂ（ｉ）】
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【図５ｂ（ｉｉ）】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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