(57)【要約】  発明は（ｉ）三次元組織構造の形成を保証する条件でインビトロ培養した動物細胞、および（ｉｉ）その中に上記細胞が拘束されている内因性細胞外マトリックスを含むこと、ならびに前記細胞の中にミネラル−および／または骨−形成特性を有する細胞を含むことを特徴とする、インビトロ培養した細胞構築物に関する。発明は移植および埋め込み術（組織再構築または修復）分野、ならびに組織研究および医薬品開発および／または医薬品組成物に使用可能な分子の毒性または有効プロフィールの分析に関して医薬産業に特に有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）三次元組織構造の形成を保証する条件でインビトロ培養した動物細胞、および（ｉｉ）上記細胞を中に拘束する内因性細胞外マトリックスを含むこと、ならびにミネラリゼーションおよび／または骨化能を有する細胞を上記細胞の中に含むことを特徴とする、インビトロ培養した細胞構築物。
【請求項２】
３０〜１２０ミクロン、好ましくは５０〜１２０ミクロンの間の厚みを有することを特徴とする、請求項１に記載の構築物。
【請求項３】
動物細胞が哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である、請求項１または２のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項４】
動物細胞が未分化幹細胞および／または成熟組織に由来する細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の構築物。
【請求項５】
成熟組織由来の細胞が筋肉、骨、歯、軟骨、腱および／または靱帯、特に歯周靱帯または前十字靱帯からの細胞であることを特徴とする、請求項４に記載の構築物。
【請求項６】
歯周靱帯由来の細胞が繊維芽細胞、上皮細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞、および／またはこれら各種細胞タイプの前駆細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の構築物。
【請求項７】
未分化幹細胞が間葉性細胞または骨髄抽出物からの単離細胞であることを特徴とする、請求項４に記載の構築物。
【請求項８】
単一細胞集団または複数の細胞集団の組合せを含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項９】
厚みの中に培養支持体に対する基底層および頂上層を含み、上記基底層がコラーゲンに富み、さらにミネラリゼーションおよび／または骨化を保証する繊維芽細胞および前駆細胞を含み、そして上記頂上層が上記基底層に比べコラーゲンに富んでいないことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の構築物。
【請求項１０】
内因性細胞外マトリックス内に拘束された１以上の細胞層を含む構築物の形成を保証する条件にて、合成マトリックスまたは足場の非存在下に細胞をインビトロ培養すること、およびその細胞支持体より構築物を剥がし、構築物そのものを折り重ねるか、または巻いて厚みを増した再構築組織を生成する工程を含む方法により得ることを特徴とする、細胞構築物または組織。
【請求項１１】
内因性細胞外マトリックス内に拘束された１以上の細胞層を含む構築物の形成を保証する条件で、合成マトリックスまたは足場非存在下に、歯周靱帯または前十字靱帯からの細胞をインビトロ培養すること、および好ましくはその細胞支持体より構築物を剥がし、構築物そのものを折り重ねるか、または巻いて厚みを増した再構築組織を生成する工程を含む方法により得ることを特徴とする、細胞構築物または組織。
【請求項１２】
内因性細胞外マトリックス内に拘束された１以上の細胞層を含む構築物の形成を保証する条件およびミネラリゼーションまたは骨化を刺激する条件での、合成マトリックスまたは足場非存在下のインビトロ培養を含む方法により得ることを特徴とする、細胞構築物または組織。
【請求項１３】
（ｉ）三次元組織構造の形成を保証する条件でインビトロ培養した動物細胞、および（ｉｉ）上記細胞を中に埋め込む（または拘束する）内因性細胞外マトリックスを含むことを特徴とし、約１００μm以上の厚みを有する、インビトロ培養した細胞構築物。
【請求項１４】
（ｉ）哺乳動物の靱帯、腱、歯および／または骨よりサンプリングし、三次元組織構造の形成を保証する条件でインビトロ培養した細胞、および（ｉｉ）上記細胞を中に埋め込む（または拘束する）内因性細胞外マトリックスを含むことを特徴とし、且つ約１００μm以上の厚みを持つことを特徴とする、細胞構築物。
【請求項１５】
（ｉ）哺乳動物の靱帯、腱、歯および／または骨よりサンプリングし、三次元組織構造の形成を保証する条件でインビトロ培養した細胞、および（ｉｉ）上記細胞を中に埋め込む（または拘束する）内因性細胞外マトリックスを含むこと、約１００μm以上の厚みを持つこと、ならびにミネラリゼーション能および／またはミネラル化した領域を有する細胞を含むことを特徴とする、細胞構築物。
【請求項１６】
ａ）細胞外マトリックスの合成および新合成した内因性細胞外マトリックス内に拘束された１以上の細胞層を含む構築物の形成に適した条件にて対象の細胞を培養する工程、および
ｂ）構築物を回収する工程、
を含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞構築物を調製するための方法。
【請求項１７】
工程ａ）およびｂ）の前に、以下の工程ａ′）およびｂ′）
を追加して含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法：
ａ′）１以上の組織より対象の細胞を取り出す工程、および
ｂ′）上記で取り出した細胞を好適培地中、典型的にはアスコルビン酸またはその誘導体存在下で増幅する工程。
【請求項１８】
細胞構築物を回収する工程ｃ）、および上記構築物の厚みを人工的に増す、特に構築物自体を折り重ねる、巻く、または構築物を収縮することで人工的に増す工程ｄ）を追加して含むことを特徴とする、請求項１６または１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞をミネラル化支持体または材料、上記材料の粒子、分化因子、コンディショニング培地、合成物質および／または天然物質より成る群から選択した刺激物の存在下に培養することを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ミネラル化支持体または材料がハイドロキシアパタイト、生体ガラス、骨代替物、セラミック、サンゴ、または上記化合物の一つでその表面をコーティングした複合材料を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ミネラル化支持体または材料を、構築物のミネラリゼーションを誘導できる物質を表面移植することで生体活性化した不活性材料より作ることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
埋め込み物を調製することを目的とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の構築物の使用。
【請求項２３】
埋め込み物が歯科用または靱帯用埋め込み物であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
構築物を埋め込み物表面に巻き付けること、ならびに前記構築物を伴った上記埋め込み物を細胞の増殖および／または分化を維持または刺激し、その間に埋め込み物表面での前記構築物の各種細胞層の合併および再成形を促進できる条件で培養することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の構築物を用いた埋め込み物調製のための方法。
【請求項２５】
治療使用を目的にデザインした分子のインビトロ評価への、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の構築物の使用。
【請求項２６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の構築物を調製するための、または請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の調製方法を実行するための、容器および培養試薬を含むキット。
【請求項２７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞構築物および薬学的に許容可能な賦形剤を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞構築物で覆われた部分を含むことを特徴とする埋め込み物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
従来技術の紹介と状況
本発明は生物学、バイオテクノロジー、毒物学、薬学および医学の技術分野に関する。その応用は、特にヒトおよび動物の健康分野に関する。より具体的には、発明はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）またはエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でのヒトまたは動物組織の、典型的にはそれらを構成する細胞からの培養および構築に関する新規方法を記載する。上記方法は、その分化を望ましい方向に向けると同時に、使用する細胞の全分化能も保護する。発明はまたこの様に再構築された細胞構築物および組織、ならびにそれらを用いて可能となる各種使用にも関する。さらに前記方法を実行するための道具およびキットも提供する。
【０００２】
発明は移植および埋め込み（implant）術（組織の再構築または修復）、ならびに医薬品産業の分野での組織の研究や医薬品開発および／または医薬品組成物に利用可能な分子の毒性または薬効プロファイルの分析に特に有用である。
【０００３】
組織再構築は哺乳動物での正常および病的組織の構造および機能の相互関係を理解するために、生物工学技術と生命科学を支配する原理とを結びつける。求められている最終目標の一つは生物学的代替物を作製して生物機能をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボで試験し、保存し、維持し、または改良すること、および再構築が望まれる元の組織に可能な限り近い組織または細胞構築物をインビトロにおいて作製することである。
【０００４】
実験研究（遺伝研究、毒性研究等）、または薬理学もしくは治療目的（細胞治療、組織修復等）での高等真核生物細胞の使用はますます広がりつつある。この目的のために細胞または組織を得るための各種方法、特に主に生検のサンプリングおよびエキソビボ処理に基づく初代培養細胞調製のための方法が開発されている。
【０００５】
組織再構築（例えば血管に関し）について報告されている方法は、主に再構築対象となる組織からの細胞の培養を支持し、そして可能にするようデザインされた多孔性の膜または外因性の合成の足場（scaffold）を使用することに基づいている。さらに組織培養は合成マトリックスまたは多孔性膜が無い状態でも行われているが、それらは主に特殊な組織に限られており、直接的な治療使用に適した特徴を有していない。
【０００６】
発明の一般的な説明
本発明が解決を提案する問題は、上記構築物の細胞資源および上記構築物の特性の助けをかりて、レシピエント宿主被検体の組織の中に生物学的統合が可能な機能的細胞構築物を得ることである。発明の精神に於いて特に有利な組織は、宿主内に移植した時に欠損した性質を補償し、修復しまたは回復する目的で機能的に働くことができる組織、換言すれば上記宿主内に永続的に組み込まれ、統合され、そして／または宿主細胞により漸進的に再成形される組織である。
【０００７】
発明の第一の具体的側面は、ミネラリゼーションおよび／または骨化能力を持つ細胞を含む再構築組織または細胞構築物に関する。
【０００８】
発明の別の側面は、宿主細胞内に永続的に取込み、または統合でき、そしてミネラリゼーションおよび／または骨化の領域を含むことができる再構築細胞または組織構築物に関する。
【０００９】
発明の組織または細胞構築物は、様々なタイプの細胞から単独または組合わせて、特に靱帯、歯、骨、腱細胞より作製され、そして上記細胞を拘束する細胞外マトリックスを含むだろう。
【００１０】
発明の具体的側面は、靱帯細胞、特に歯周靱帯から再構築した組織に基づく。
【００１１】
発明の別の具体的側面は、大きな厚みを持ち、典型的には約１００μm以上の厚みを持ち、特にその中に細胞およびマトリックスが機能的に組織化されている再構築組織を提供することである。
【００１２】
本発明は、一般的には動物細胞から、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞から、組織の支持を目的とする合成の足場（scaffold）またはマトリックスを使用せずにインビトロで培養して再構築する細胞組織（または構築物）に関する。従って細胞構築物は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばヒト細胞と、内因性細胞外マトリックス成分（即ち上記細胞が産生した）のみから有利に調製されるだろう。
【００１３】
発明の別の側面は、上記の様な再構築細胞組織を含む治療用組成物に基づく。具体的には、発明は上記の再構築組織または細胞集合物を含み、被検体内への埋込みを目的にデザインされた細胞性ドレッシング（dressing）（または生物活性ドレッシング）を提供する。
【００１４】
発明はまた再構築組織を調製すること、およびそれを自己、同種または異種の関係、好ましくは自己の関係で被検体内に埋め込むことを含む、治療法または組織修復法に関する。
【００１５】
発明は被検体の組織欠損の治療または修復、埋め込み物（implants）の調製、インビトロまたはエキソビボ研究の実施等にとって有用である。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明はインビトロで調製する細胞構築物、その製造および使用に関する。
【００１７】
発明の具体的目的は、
（ｉ）３次元組織構築物の形成を保証する条件にてインビトロで培養した動物細胞、
および
（ｉｉ）上記細胞を中に拘束する内因性細胞外マトリックスを含み、
さらに前記細胞の中にミネラリゼーションおよび／または骨化能を有する細胞を含む細胞構築物により特に関する。
【００１８】
発明の精神に於いては、用語「構築物」または「細胞構築物」とは広がりを持つ形態の細胞組織または集合体を示す。それは互いの上面に積み重なりあった１以上の細胞層、一般的には１〜２０細胞層、好ましくは約２〜１５層を含む集合体または組織であろう。構築物の細胞は、構築物の細胞そのものが合成する緻密な３次元細胞外マトリックスの中に拘束されており、これが発明の構築物にその構造と支えを与える。構築物という用語は、一般的にはインビトロ培養した１以上の細胞層を含み、上記細胞が産生する細胞外マトリックス内に拘束され、そして構築物の細胞が生物学的に活性である、換言すれば分裂、増殖、再成形、生物学的因子の分泌等が可能である人工的な組織構築物（即ち、具体的にはインビトロで作られ、培養または維持された組織構築物）を意味する。細胞の起源および培養条件に従って、構築物は一般に極性を有し、基底面および頂上面は異なる性質を持っている。
【００１９】
ミネラリゼーション
発明による細胞構築物または再構築組織の特に有利な特徴は、それらがミネラリゼーションおよび／または骨化能力を保持している細胞を含むことができるという事実に基づいている。本明細書はさらに、それによりミネラル化した領域を作るミネラリゼーション能を有する組織または構築物を人工的に再構成できることを示す。発明のこの側面は特に予想外かつ重要であるが、それは欠損部の再構成に適合した生物学的特性を持ち、そして／または宿主への組み込み能力が大きく向上している組織の構築が可能になるからである。
【００２０】
発明の精神に於いては、ミネラリゼーション／骨化能を有する細胞とは、自然に、または特殊な刺激を受けて細胞外マトリックス内にリン酸カルシウムもしくは炭酸カルシウム、またはそれら各種イオンの混合物を、典型的には粒子、沈積、パッチ（patches）等の形に形成および／または蓄積するのを触媒する酵素活性を生ずる細胞を意味する。典型的には、それら細胞は、培養状態でアルカリホスファターゼおよび／または追加タンパク質（ＢＭＰ、ＢＳＰ、ＯＰＮ、ＯＣＮ等）を産生し、それにより無機リン酸塩を生成する細胞である。
【００２１】
発明は構築物を、実施する培養および／または処理工程とは関係なく、その中にある細胞がミネラル化領域生成能力を保持する外移植体から作製してもよいことを示す。
【００２２】
上記ミネラリゼーションは一般には細胞構築物のミネラル化面および／または骨化面形成を誘導するが、これらは一般に培養支持体に暴露した面に相当する。以下本文中に記載する様に、上記の面はコラーゲンに富んでもいる。実際ミネラル化は構築物内に存在するコラーゲン繊維内に起こるため、構築物をミネラル沈積物内にしっかり固定することができる。さらに培養支持体近傍では前駆細胞の数が増し、これがマトリックスおよびコラーゲンの網目状構造により開始されるミネラリゼーションを促進する。
【００２３】
発明のこの特徴は、ミネラリゼーションの生成が組織のコラーゲン繊維のミネラル化層内での固定を促進し、再構築組織を元の組織、特にセメント物質を含む組織により近づけるという意味に於いて、靱帯、腱、歯、骨、関節等の構造修復を目的とする細胞構築物を作製する上で特に重要かつ有利である。
【００２４】
発明の構築物のミネラル化細胞は一般的には間葉細胞またはその前駆細胞である。そのミネラリゼーション能は培養条件および／または構築物内細胞の処理により、そして／あるいは上記細胞の特殊な組織起源により保存されている。
【００２５】
細胞組成物
前述の如く発明による再構築組織または構築物は動物細胞、特に哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を含むのが有利である。それらは未分化幹細胞または成熟組織由来の細胞、あるいはかかる細胞の組合せでよい。細胞を成熟組織よりサンプリングする場合には、それら細胞は特に外部因子の作用を受け細胞外マトリックスを産生できるか、またはミネラリゼーションおよび／もしくは骨可能を保持または獲得できる細胞であればいずれのタイプでもよい。それ故組織構築に用いる細胞は様々な細胞集団に由来するものでよく、従って不均質な集団を形成してもよい。
【００２６】
例えばそれらは筋肉、骨、歯、軟骨、腱または靱帯等の成熟組織、特に歯および靱帯、具体的には歯周靱帯または前十字靱帯に由来する細胞でよい。細胞が歯周組織に由来する場合、少なくとも初代培養に於いては、それらは歯周靱帯、セメント質および象牙質細胞、即ち主に繊維芽細胞（約８０％）由来の細胞を含むのが好ましい。歯周靱帯由来の細胞は一般には繊維芽細胞、上皮細胞、セメント芽細胞、骨芽細胞および／またはこれら各種細胞の前駆細胞を含む。それら細胞が歯に由来する場合、それら細胞には象牙質芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄細胞、上皮細胞、セメント芽細胞および／またはこれら各種細胞の前駆細胞が含まれる。主に未分化幹細胞を含むサンプルの場合には、それらの分化を好適培養方法によって方向付けすることも重要である。細胞は軟骨細胞または骨芽細胞でもよい。上記細胞は間葉幹細胞および／または骨髄抽出物から単離した細胞を起源とするものでもよい。しかし、ミネラリゼーションおよび／または骨化の特別な領域を示す発明の構築物を得る上で、例えば骨芽細胞もしくは軟骨芽細胞タイプの細胞、または前骨芽細胞もしくは前軟骨芽細胞タイプの上記細胞の前駆細胞、あるいは骨髄から集めたその他細胞の存在は必ずしも必要ではない。
【００２７】
発明の組織は、本来の組織の細胞構成および構造を模するために、組織内に均一に分布するまたはしない単一細胞集団または複数種類の細胞（または集団）の組合せもしくは混合物より構成される。異なる種類の細胞が存在する場合には、前記細胞タイプの少なくとも１種類はミネラリゼーションおよび／もしくは骨化能力を持つことが望ましい。ミネラリゼーション能力を持たない細胞タイプを別途刺激し、または形質転換してミネラリゼーションおよび／または骨化を誘導してもよい。
【００２８】
構築物の細胞（例えば繊維芽細胞）を、例えば細胞を化学物質に曝露することにより、物理的刺激またはその他を加えることにより、または遺伝子組換法を用いることにより、天然には存在しない化合物を発現するよう誘導することもできる。
【００２９】
各種細胞集団を培養開始時に、たとえ特定の割合で一度に、あるいは例えば連続的に複数の構築物を組合せて一つにまとめてもよい。
【００３０】
発明の具体的な目的は、インビトロ培養した靱帯細胞、特に歯周靱帯または前十字靱帯から作製される（または含む）上記の様な細胞構築物である。発明は人工ミネラル化組織がこのタイプの細胞から作られること、それが再成形して厚みのある構築物を形成すること、そしてそれが機能的な生物学的秩序を表すことを示している。
【００３１】
内因性細胞外マトリックス
前述した通り、発明の組織または構築物は内因性、即ち培養細胞が産生する細胞外マトリックスに取り囲まれた、あるいは埋込まれまたは拘束されて細胞を含む。細胞外マトリックスは、一般には（および原則的には）、繊維直径のインビボ制御に関係するといわれる硫酸化プロテオグリカンならびに単純または硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の小繊維に顕著に組織化されたコラーゲン繊維の網目状構造を含む。単純ＧＡＧは一般にはヒアルロン酸（ＨＡ）および／またはフィブロネクチンを含有し、硫酸化ＧＡＧではジ−ヒアルロン酸、ジ−コンドロイチン−０−硫酸、ジ−コンドロイチン−４−硫酸、ジ−コンドロイチン−６−硫酸、ジ−コンドロイチン−４，６−硫酸、ジ−コンドロイチン−４−硫酸−ＵＳ−２Ｓ、および／またはジ−コンドロイチン−６−硫酸−ＵＳ−２Ｓが典型例である。細胞外マトリックスはバイグリカンまたはバーシカンのようなデコリン、および特に間葉および修復中の組織に見いだされるマトリックスの細胞外糖タンパク質であるテネイシンを更に含んでもよい。培養細胞は細胞間を隔てる空間をコラーゲンＩＩＩおよびフィブロネクチンに富む粗なマトリックスで徐々に満たし、続いてこのマトリックスをタイプＩコラーゲンで再成形してより緻密なものにする。
【００３２】
発明の実施には、細胞外マトリックスの正確な組成を知る必要はない。典型的には、構築物は内因性細胞外マトリックス合成能力を持つ細胞を含み、その組成は意図的に変更（例えば合成物質の取込み、細胞の遺伝的修飾等）しない限り、元の組織に見いだされるものに類似している。
【００３３】
具体的実施態様では、本発明は、培養支持体に対する基底層および頂上層を含み、上記基底層はコラーゲンに富むと同時に繊維芽細胞およびミネラリゼーションおよび／または骨化を保証する前駆細胞に富み、そして上記頂上層は上記基底層に比べコラーゲンに富んでおらず、一般的にはより増殖性の細胞を含む前記構築物に関する。
【００３４】
構築物の寸法
発明の構築物の面積および厚みの寸法は変化してもよい。さらに発明の構築物は様々な形態を持つ、または採用する。寸法または形状は、当業者または使用者により望まれる用途に合わせることができるだろう。
【００３５】
発明の構築物または組織の特に有利な特徴は、それらが相当な厚さを持つこと、典型的には３０〜１２０ミクロン、好ましくは５０〜１２０μmの間、より更に好ましくは約１００μm以上を包含する厚みを持つことである。実際本発明の明細書は、大きな厚みを持ち、その中で細胞が組織化、分化および増殖でき、特別な細胞壊死を誘導することなしに構築物内に機能極性を作り出すことができる細胞構築物をインビトロで作製できることを示している。
【００３６】
前記特徴は、その中で細胞が組織化して有利な生物学的特性を発現する再構築組織を提供するが故に好都合である。例えば、組織厚が増すことにより細胞は異なった振る舞いをする。具体的には物質の組織内、即ち細胞環境内での全体的な内因性物質の拡散が低下し、これが細胞の潜在効果を高めてそれらの再組織化および再成形化を導く。この組織化がまたミネラリゼーション、組織の極性化、頂上面の上への増殖層の発現、構築物の支持体および／または被検体でのその統合を促進する。
【００３７】
構築物の厚さは様々な方法で変えることができるだろう。これは例えば薄い構築物自体を折り重ねるかまたは巻いて、異なる細胞層と合併するか再成形し、人工的にその厚みを増すことが好ましい。実際、本発明は培養で得たほぼ３細胞層を含む第一組織構築物をコンパクトにできること、そして上記コンパクト化（例えば折り重ねる、巻く等）によってその中で細胞が組織化し、分化し、そして有利な生物学的特性を展開する組織が得られることを示している。発明はまた組織または構築物を小片に切断し、次にそれを折り重ねるか巻くことができることも示す。厚さは構築物の端部を剥がし、それにより細胞を収縮させてコンパクト化しても人工的に増すことができるだろう。
【００３８】
この側面に於ける発明の具体的目的もまた、（ｉ）三次元組織構造の形成を保証する条件でインビトロ培養した動物細胞、および（ｉｉ）前記細胞を中に埋め込む（または拘束する）内因性細胞外マトリックスを含み、そしてその厚みが約１００μm以上であることを特徴とする、細胞構築物に基づいている。
【００３９】
より具体的には、構築物はミネラリゼーション能力を持つ細胞を含むか、それら細胞より作製するか、および／または靱帯、腱、歯または骨細胞を含むか、またはそれら細胞より作製する。
【００４０】
従ってより具体的な発明の目的は、（ｉ）哺乳動物の靱帯、腱、歯および／または骨よりサンプリングし、三次元組織構造の形成を保証する条件でインビトロ培養した細胞、および（ｉｉ）前記細胞を中に埋め込む（または拘束する）内因性細胞外マトリックスを含み、さらにその厚みが約１００μm以上であることを特徴とする、細胞構築物に基づいている。
【００４１】
従って発明の別のより好ましい目的は、（ｉ）哺乳動物の靱帯、腱、歯および／または骨よりサンプリングし、三次元組織構造の形成を保証する条件でインビトロ培養した細胞、および（ｉｉ）前記細胞を中に埋め込む（または拘束する）内因性細胞外マトリックスを含み、さらにその厚みが約１００μm以上であり、それがミネラリゼーション能力および／またはミネラル化した領域を有する細胞を含むことを特徴とする、細胞構築物に基づいている。
【００４２】
典型的には、細胞構築物は基底層（面）および頂上層（面）を含み、基底面はコラーゲンおよびミネラル化した領域に富んでいる。
【００４３】
前記の如く構築物または組織の面積は、当業者により接種細胞の量、培養時間、培養容器の大きさ等を変えることで目的に合わせられるだろう。さらに前記の如く、構築物はその後の構築物の使用に合った形、例えば三角形、四角形、円形等であり、その面積が前記使用に適合している、例えば１〜２０cm2、好ましくは１〜１５cm2、より更に好ましくは２〜１０cm2の範囲に含まれる小片に切断してもよい。
【００４４】
調製
発明の組織または構築物は様々な方法で作製できるだろう。本発明の目的でもある特に好ましい実施態様によれば、細胞構築物は：
ａ）細胞外マトリックス合成および新合成した内因性細胞外マトリックス内に拘束される１以上の細胞層を含む構築物の形成に適応した条件で対象の細胞を培養すること、および
ｂ）構築物を回収すること、
を典型的に含む方法により調製する。
【００４５】
前記方法は、上記工程ａ）およびｂ）の前に、以下の工程ａ′）およびｂ′）
を含んでもよい：
ａ′）例えば酵素消化、機械的処理、外移植等の好適方法により、１以上の組織より対象の細胞を取り出すこと、および
ｂ′）工程ａ′）で集めた前記細胞を、典型的にはアスコルビン酸またはその誘導体存在下に好適培地中で増幅すること。
【００４６】
方法はまた細胞構築物を回収する（例えば、剥離による）別の工程ｃ）、および構築物を折り重ねる（例えば連続して折りたたむ）かまたは巻いて、あるいは構築物を収縮して前記構築物の厚みを人工的に増す工程ｄ）を含んでもよい。
【００４７】
工程ａ′）では、細胞はいずれかの好適な方法、例えば酵素消化（例えばコラゲナーゼ）または当業者公知の外移植技術を用いて選択した組織より取り出されるだろう。この作業は機械的解体（例えばメスを使った）、酵素洗浄、細胞濃縮、機械的切断（例えばハサミ）等により行われるだろう。こうして集めた細胞は一般には様々な性質を持つ細胞、例えば成熟細胞と前駆細胞の集団から構成される。上記細胞は再構築対象となる組織または構築物の典型的な組成を表す。
【００４８】
こうして得た細胞を次に培地中に懸濁させ、増幅（または拡張もしくは増殖）工程ｂ′）を実施する。この工程は主に細胞数を増やし、組織構築を容易にすることを目的としている。この作業は利用できる細胞のタイプ、細胞量等に応じて様々な期間、例えば１〜１０日間またはそれ以上行われる。用いる培地は一般的には以下記載の基礎培地（アスコルビン酸または同様の分子を補給することもある）であり、これらは細胞増殖状態に合わせて週２または３回交換する。この工程終了時、即ち細胞が集密状態または集密度約５０％に達した時に、培養物を例えばトリプシンで処理して接着細胞を剥がす。組織の後処理と剥離を可能にするためにインキュベーター内に置く時間は、細胞のタイプまたは集密度に応じて短くも長くもなるだろう。例えば内皮細胞の場合は３分であり、繊維芽細胞では５分、ケラチノ細胞では８分といった具合である（実施例参照）。この間、細胞は少量の細胞外マトリックスのみ産生する。
【００４９】
次に、こうして得た増幅細胞を用いて構築物を調製する。そのためには細胞を好適容器内に接種し、細胞外マトリックスの合成と新規合成された内因性細胞外マトリックス内に拘束される１以上の細胞層を含む構築物の形成に適した条件で培養する。
【００５０】
典型的には、細胞は約１０3〜１０6細胞／cm2、好ましくは３．１０3〜５．１０5細胞／cm2、典型的には３，０００〜１２，０００細胞／cm2の間の密度で接種する。例えば典型的な実験では、例えば７５cm2の皿では約５．１０5細胞を使用することになる。
【００５１】
こうして細胞を十分な時間培養することで：
−望まれる面積を有し、内因性細胞外マトリックス内に拘束されている１以上、典型的には１〜３（厚さ約３０μm）の細胞層から成る構築物の作製、
−構築物の支持体への接着、
−表面にある細胞の増殖、および
−好ましくは、ミネラリゼーション（または骨化）の生成または開始、が可能となる。
【００５２】
前記培養物は２〜６週間、必要に応じて緩く攪拌しながら維持し、週あたり１〜３回培地交換をすると好都合であろう。
【００５３】
細胞外マトリックスを確実に形成するには、培養はアスコルビン酸またはその誘導体を含む基礎培地内で行うのが有利である。プロリンの水酸化および可溶性コラーゲン前駆体体であるプロコラーゲンの分泌を促進することを目的とし、更にアスコルビン酸が翻訳後に於ける酵素活性化の重要は補助因子であること、およびそれがタイプＩおよびＩＩＩコラーゲンの合成をアップレギュレーションすることからアスコルビン酸塩を添加する。アスコルビン酸をアスコルビン酸の合成誘導体の一つ、または細胞外マトリックス合成に作用する栄養素で置き換えてもよい。このため発明の方法は外因性のマトリックスの使用を必要としない。
【００５４】
使用した基礎培地は再構成の対象となる細胞のタイプ、および組織または構築物に適合した培地である。培地および培養条件は、構築物内での細胞増殖および細胞外マトリックスの合成を促進するものでなければならない。確定した組成を持つ培地、言い換えると特に動物の器官または組織の抽出物を含まない培地が望ましいが、発明による構築物の生成を促進するのであれば未確定の成分が存在してもよい。当業者公知の合成または組換え体による機能的同等物を規定成分の培地に加えてもよい。当業者は動物細胞の培養に必要な基礎成分を容易に決定できるだろう。本発明に使用してもよい市販の培地の具体例としては、ＤＥＭＥ（ダルベッコの改良型イーグル培地）、ＭＥＭ（最小必須培地）、ＲＰＭＩ１６４０、ＥＤＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅの改良型ダルベッコ培地）、ハム培地（特にハムのＦ−１２）またはＮＣＴＣ１０９といった無機塩、エネルギー源、アミノ酸およびビタミンＢが補充された培地がある。発明による好ましい基礎培地培地は、ＤＭＥＭ／ハムＦ１２の混合体（容積比５０：５０）である。血清を含んでもよい。基礎培地にはアミノ酸、特にコラーゲン構造の成分であるプロリンおよびグリシン、成長因子、ホルモンおよび無機塩といった化合物が一般に補充される。発明に有益な具体的な培地は国際特許出願ＷＯ９６／２１００３号に記載されている。他の培地は、実施例に記載されている。
【００５５】
培養はプレート、皿、フラスコ、バッグ等の好適用具で行われるだろう。典型的にはペトリ皿または同様の用具である。培養物は温度、湿度および混合気体の制御が可能なインキュベーター内で維持するのが有利である。好ましい培養条件は、例えば約３５〜４０℃の間を含む温度、好ましくは３７℃を含む温度、５〜１０％のＣＯ2を含む雰囲気および約７５〜９５％の間を含む相対湿度である。
【００５６】
この様にして作製した組織は、前記細胞が新規合成した細胞外マトリックスの緻密な三次元網目状構造に結合する細胞を含んでいる。この期間およびアスコルビン酸またはその誘導体の刺激に細胞が反応している間に、細胞は増殖し、積層してその成分が天然の細胞外マトリックスの成分と実質的に同一である細胞外マトリックスを産生する。細胞構築物を特に腱または靱帯、皮膚または真皮に由来する細胞から調製した場合、構築物は、培養約３週目に、特に培養支持体と直接接触する側の構築物半分に大部分が濃縮された形でコラーゲンを含むようになる。このコラーゲンの網目状構造の中でミネラリゼーションが開始するだろう。
【００５７】
発明の方法の有利な実施態様では、細胞はミネラリゼーション（または骨化）に関する細胞の能力の形成または維持を保証する条件で培養する。前記能力は使用する細胞に関係し、細胞、特に基底前駆細胞のミネラリゼーションおよび／または骨化を活性化または増加する刺激存在下に培養するのが好ましい。
【００５８】
具体的実施態様では、組織のミネラリゼーションは培養条件を変更することにより、意外な形で達成される。上記ミネラリゼーションには新合成マトリックス、特に培養支持体と接触する側の構築物の半分を構成するマトリックスが関係する。刺激は構築物または細胞を特定材料または上記材料の粒子と接触させること、分化因子、コンディショニング培地、合成物質を加えること、もしくはサンゴの様な天然物質を加えること、または機械的刺激により作り出せるだろう。使用可能なミネラル化物質の例は、特にハイドロキシアパタイト、生物活性ガラス（または生体ガラス）、ミネラル化コラーゲン代替物、骨代替物、セラミック、特にジルコニウムをベースとするもの、またはサンゴを含む支持体または粒子、もしくはその表面が少なくとも部分的に上記成分の一つでコーティングされている物質（例えば合成物質）である。例えば、ミネラル化材料はまた構築物のミネラリゼーションを誘導できる物質を表面に移植して生物活性化した不活性材料からも作られるだろう。有益な物質または因子の例としては、例えば培地に添加し、選択した支持体が作るミネラリゼーション刺激効果を増強するアジュバント（サイトカイン、デキサメタゾン、ベータグリセロリン酸、ベータ−アミノプロピオニトリル）が挙げられる。
【００５９】
故に好適実施態様では、発明はミネラル化支持体または材料、前記材料の粒子、分化因子、サイトカイン、コンディショニング培地、合成物質もしくは天然物質といった刺激に細胞を接触させる工程、細胞のミネラリゼーションを刺激する工程、または細胞のミネラリゼーション能力を刺激する工程を含む、ミネラル化したまたはミネラル化中の細胞構築物を調製する方法を包含する。刺激はミネラル化支持体または材料で誘導するのが好ましく、ハイドロキシアパタイトまたは生体ガラスを含むと有利である。最終的に生体ガラスは水和により吸収が起こり宿主内には移植体しか残らないため、このタイプの支持体は再構築する組織が移植を目的とする場合に特に適しており、また有利である。
【００６０】
従って発明の特定の目的は、細胞を細胞外マトリックスの合成およびミネラリゼーションを保証する条件でインビトロ培養することを含む、再構築細胞組織または構築物を調製する方法に基づいている。好適様式では、それはミネラル化処理、作用物質または支持体といった刺激存在下での培養であり、ミネラル化支持体上での培養、またはミネラル化粒子存在下での培養が有利である。発明によるミネラル化領域を持つ構築物の作製は、例えばＴＧＦ−β１といった増殖因子の添加を必要としない。
【００６１】
発明の特定の目的はまた、合成マトリックスまたは足場の非存在下に、内因性細胞外マトリックス内に拘束された１以上の細胞層を含む構築物の形成を保証する条件、およびミネラリゼーションまたは骨化を刺激する条件で細胞をインビトロ培養することを含む方法により得ることを特徴とする、構築物または細胞性組織に関する。
【００６２】
ミネラリゼーションは、一般的には構築物形成および細胞外マトリックス合成の工程と同時に実施または開始する。しかし一般的にミネラリゼーションは構築物を回収および／または人工的に厚くした後も持続する。
【００６３】
従って発明の特定の目的は、培養した細胞を、培養開始直後にミネラル化作用物質、例えば生体ガラスまたはハイドロキシアパタイトのマイクロ粒子またはナノ粒子存在下に置くことから成る。上記作用物質は前駆細胞の移動を促進し、それらのミネラルおよび／または骨形成能力を刺激する。
【００６４】
この様なミネラリゼーションおよび／または骨化は、レシピエント宿主の組織内での再構成組織または細胞構造物の統合を特に有利に改善する。
【００６５】
ミネラリゼーションは例えばパラゴンを用いた染色、またはＫｏｓｓａ染色法を利用して観察できるだろう。具体例としては、約５，０００細胞／cm2の密度で接種した歯周細胞を記載のように約３週間、ハイドロキシアパタイトマイクロ粒子存在下に培養してもよい（図５を見よ）。培養細胞は刺激を認識して、アリカリホスファターゼ型の特異的酵素を産生する。例えばβ−グリセロリン酸の様なリン酸化基質が加水分解を受けるだろう。こうして放出したリン酸塩は、カルシウムイオンと錯体を形成してリン酸カルシウムを形成し、組織を部分的に結晶化する。
【００６６】
前述した様に、組織または構築物はプレート、皿、フラスコ、バック等の好適用具の中で作られるだろう。典型的には、それはペトリ皿または同様の用具である。調製は合成三次元マトリックスまたは足場なしに行うのが好ましい。
【００６７】
発明の特定の目的は、歯周または十字靱帯からの細胞を細胞外マトリックスの合成を保証する条件でインビトロ培養することを含む、再構成構築物または組織を調製する方法に基づく。
【００６８】
構築物が生成したら公知の技術、典型的には剥離によって構築物を支持体から回収する。実際問題としての発明の特徴の一つは、培養支持体から前記構築物を単純に剥がすだけで再構成細胞構築物を容易に回収できることである。
【００６９】
さらに補助工程ｄ）では、こうして回収した構築物または組織にその厚みを増す処置（例えばコンパクト化）を、典型的には折り重ねる、巻く、凝集する等によって行う。一般には、人工的に厚みを増す前の細胞構築物の厚みは、それぞれの上に約２または３層の細胞を重層した厚み、あるいは約３０μmに相当する。実際には、細胞構築物に最低限の支持を与えるのに十分な量のマトリックスを分泌するまで細胞を培養し続ける。こうすることで細胞構築物を断裂することなしに培養支持体から剥がすことができ、厚みの増した、例えば薄い状態の細胞構築物に対し２〜５倍の厚みを増した細胞構築物を作ることができる。
【００７０】
発明の特定の目的はまた、合成マトリックスまたは足場の非存在下に、内因性細胞外マトリックス内に拘束された１以上の細胞層を含む構築物の形成を保証する条件で細胞をインビトロ培養すること、およびその培養支持体から構築物を剥がし、構築物自体を折り重ねるか巻いて厚さを増した再構築組織を作る工程を含む方法により作製することを特徴とする、細胞構築物または組織に関する。
【００７１】
発明の別の特定の目的はまた、それらを歯周靱帯または全十字靱帯細胞を合成マトリックスもしくは足場無しに、内因性細胞外マトリックス内に拘束された１以上の細胞層を含む構築物の形成を保証する条件でインビトロ培養すること、および好ましくはその培養支持体より構築物を剥がし、それ自体を折り重ねるか巻いて厚みの増した再構築組織を作製する工程を含む方法により作ることを特徴とする、細胞組織または構築物に関する。
【００７２】
発明の構築物は、一般的には培地が存在する状態で、様々な期間培養が続けられ、細胞再構成、持続的ミネラリゼーション等を増進する。それから構築物または組織は臨床（移植、埋め込み）または医薬品に応用されるだろう。
【００７３】
貯蔵／維持
発明の構築物または組織は好適用具内に、培地、栄養媒体または等張塩溶液が存在する状態で貯蔵されるだろう。典型的には、組織は皿、チューブ、フラスコ、アンプル、バッグ等の中に、好ましくは大量の培地が存在する状態で貯蔵または維持される。組織は即時に使用しても、また好ましくは冷所に貯蔵してもよいだろう。
【００７４】
使用
上記構築物または組織は、移植または埋め込み術分野、ならびに医薬品産業分野での、組織研究および分子、特に医薬品候補の毒性または有効プロフィールの分析に用いられるだろう。
【００７５】
従って発明の組織または構築物は、移植および埋め込み術の分野で用いられるだろう。この様な場合には、組織または構築物は大きな厚み、典型的には約１００μmの厚みを持つのが好ましい。従ってコンパクト化した構築物、例えば上記の様にそのものを折り重ねるか巻き、他の細胞層と併せて再成形してその厚さを増したもの、または支持体から単純に剥がして細胞の集合物を形成したものが好都合である。
【００７６】
組織修復への使用に関しては、発明の構築物は細胞ドレッシングまたは「パッチ」の形で用いられるか、または被検体に導入する埋め込み物の全てまたは一部をコーティングまたは覆うのに用いられるだろう。
【００７７】
発明の組織または細胞構築物は移植の中に直接用いてもよい。実際発明は、上記の細胞集合物を主に含む細胞ドレッシングの製造を提供する。従って本発明の目的の一つは、上記構築物または組織を含む医薬組成物に特に基づいている。有利なやり方では、それは上記の様な厚みのある、またはコンパクト化された組織である。ドレッシングは、簡単な手術時に腔所または損傷組織に直接用いてもよい。例えば組織を歯周細胞から再構築した場合、発明のドレッシングは歯周ポケットの治療に使用できるだろう。もしそれが靱帯細胞であれば、例えば前十字靱帯のような靱帯を再構築または修復できるだろう。組織がミネラリゼーションおよび／または骨化能を保存した状態の軟骨細胞から再構築されたのであれば、レシピエント宿主の疾患部位への直接の移植も想定できるだろう。
【００７８】
従って発明は、上記の様にインビトロ培養により再構築組織を調製すること、および上記組織を、おそらく薬学的に受入れ可能な溶液または賦形剤の中に包装した後上記組織に注入することを含む、組織修復または治療方法も提供する。この場合、場合によっては組織にコラーゲンの様な外因性マトリックスを結合してもよい。
【００７９】
別実施態様では、発明の組織または構築物を用いて埋め込み物を調製し、具体的には埋め込み物の全体または一部分を覆うかまたはコーティングする。それは歯科用埋め込み物（「リガプラント（Ｌｉｇａｐｌａｎｔ）」に関する実施例４を見よ）、靱帯用埋め込み物、骨または軟骨プロテーゼ等であろう。この様な場合には、作製した構築物は埋め込み物構造の回りに配置されるか、巻き付けられるのが一般的である。
【００８０】
歯科用埋め込み物は、例えばその上に交換する歯の歯冠を取り付ける冠部分と上記の歯の歯根部に相当する歯根部分とを含み、そしてその周囲に発明による細胞構築物を巻くことができる。従って本発明は、前記構築物を埋め込み物の表面に巻き付けること、ならびに前記構築物を伴った前記埋め込み物を細胞増殖および／または分化を維持または刺激し、その間に埋め込み物表面での前記構築物の各種細胞層の併合および再成形を促進できる条件で培養することを含む、上記のような構築物を用いた埋め込み物調製のための方法に関する。
【００８１】
具体的には、前記構築物は上記の条件で約３週間培養した歯周細胞から再構築できる（図４も参照）。次に培養支持体に面する側になる細胞構築物のミネラル化面を、増幅培地中にアスコルビン酸存在下に埋め込み物に直接触れさせる。すると細胞構築物のこの面により構築物全体が安定、強力、且つ特に有利な様式で埋め込み物に付着することができるようになる。これは、特に上記埋め込み物周囲で数が増加し、マトリックスおよびコラーゲンの網目状構造により開始されるミネラリゼーションを促進する前駆細胞のおかげである。さらにこうして再構築された構築物は歯の天然象牙質によく似ている。対象となる増幅培地に関して言えば、栄養制限が無い限りにおいて構造物の各種細胞層の合併と再成形を促進するものである。かくして発明によるミネラル化組織は、レシピエントの歯槽部位内への埋め込み物の統合を総合的に改善する。
【００８２】
従って発明による構造物を用いて例えば歯科用または靱帯用埋め込み物が調製できるだろう。
【００８３】
発明の別の目的は、発明による細胞組織または構築物の医薬産業での、組織研究および分子の毒性または有効プロフィール分析への使用に関する。具体的実施態様では、発明の再構築組織（またはその一部）を１以上の試験化合物に接触し、前記試験化合物の効果を、例えば前記試験化合物に対する細胞反応を特徴付けするように決定する。
【００８４】
試験化合物の性質は極めて多様であろう。例えば、それは単離化合物でも、または混合物質でもよい。化合物の性質は化学的でも生物的でもよい。具体的には、それはペプチド、ポリペプチド、核酸、脂質、炭水化物、化学分子、植物抽出物、コンビナトリアルライブラリー等であろう。試験化合物はまた組織に加えられる処理（放射線照射、ＵＶなど）でもよい。
【００８５】
発明の方法の実行では、試験化合物は使用者が選んだ各種濃度で用いられるだろう。
【００８６】
従って本発明は、試験化合物、特に治療使用を目的とした分子の生物学および／または毒物学的性質を（インビトロまたはエキソビボに）評価することへの上記再構築組織の使用をその目的としている。
【００８７】
さらに本発明は、治療使用を目的とした分子のスクリーニングへの上記再構築組織の使用を目的としている。
【００８８】
本出願は、上記再構築組織の調製および研究の方法を実行するためのキット、さらには使用のためのキットもまた目的とする。かかるキットは容器および／または培養試薬、ならびに／あるいは上記の組織構造物を含むと好都合である。
【００８９】
発明のその他側面および利点は以下実施例の中でより詳しく説明されるだろうが、これら実施例は例示を目的とするものであり、如何なる形でも制限を加えるものではない。
【実施例】
【００９０】
材料と方法
使用した培地および／または試薬（例えばビタミンＣ、アスコルビン酸２リン酸塩、コラゲナーゼ、デキサメタゾン等）は一般の市販品由来のもの、または市販品である。一般的には、これら試薬は使用前に滅菌した。
【００９１】
コラゲナーゼＡ（クロストリジオペプチダーゼＡ）はＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍが産生するバクテリアプロテアーゼである。このプロテアーゼはコラーゲンの三重螺旋内に存在するＰｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列（Ｘは天然アミノ酸を表している）のＸ−Ｇｌｙ結合に対して特異性を示す。コラゲナーゼは血清では阻害されないが、ＥＤＴＡにより阻害され、カルシウムによって活性化される。その至適ｐＨは６〜８である。凍結乾燥したものは、＋２〜＋８℃で安定であり、溶液の場合は−１５〜−２５℃で安定である。コラゲナーゼはＰＢＳ、ＨＢＳＳまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２の様な、カルシウムを含む緩衝溶液で戻す。
【００９２】
デキサメタゾンは分子量３９２．５のグルココルチコイドで、アルカリホスファターゼのレベルを上げる。それは市販品（Ｓｉｇｍａ  Ｄ−２９１５）から調製した。
【００９３】
分子量が２１６のβ−グリセロリン酸をアルカリホスファターゼで加水分解して、効率的なミネラリゼーションに必要とされるリン酸イオンにした。それは市販品（ＳｉｇｍａＧ−９８９１）から調製した。
【００９４】
培地の調製および管理のため、小分けした試薬は水槽内で融解して汚染除去してから層流フードの中に入れた。それらは、無菌技術を用いてＤＭＥＭ／Ｆ１２液体培地に添加された。
【００９５】
無抗生物質培地は、無菌性管理のために使用１〜２日前に調製した。それらは混合してから管理した。抗生物質は使用前に添加した。細菌試験は通常の方法で行った。貯蔵は一般的には＋２〜＋８℃であった。
【００９６】
【表１】
2005512541.tif 000002
【００９７】
【表２】
2005512541.tif 000003
【００９８】
実施例１
歯根よりサンプリングした細胞からの細胞シートの取り出しと培養
この実施例では、次の工程に従い細胞を取り出した：
【００９９】
歯組織検体は処理時間までは、可能な限り受け取りから２４時間以内、輸送培地内に維持した。次に組織を、抗生物質を含むＰＢＳで３回洗浄し、余分な血液を除いた。次に歯根を約５mlのコラゲナーゼＡ（培地について説明している段落を参照）の入った例えば直径６０mmのペトリ皿に入れる。メスを使って歯をその根の中間点から下、歯根下端部に向かってセメント質および象牙質の小断片が得られるまで解体した。この断片を３７℃で一晩（約１６〜２０時間）ＣＯ2インキュベーター内でインキュベーションした。細胞および組織断片をチューブに入れ、遠心分離し、培養培地に懸濁した。次に細胞および破壊物の懸濁液を培養培地４mlの入った採取用ペトリ皿に接種した。培養培地は細胞の増殖状態に合わせて週２〜３回交換した。トリプシン処理ができる様になるまで、培養を１０日〜約３週間続けた。ペトリ皿は約５０％集密度であることが好ましい。
【０１００】
培養細胞が集密前または集密状態の時、培養細胞を次の様に処理した：
【０１０１】
培養皿をＰＢＳ培養物で洗浄し、次にトリプシン−ＥＤＴＡを加えて培養物全体を覆った（７５cm2当たり約５ml）。フラスコを３７℃のインキュベーター内に置いた。細胞のタイプまたは集密度に応じてインキュベーション時間の長さを調整したが、好ましくは内皮細胞または繊維芽細胞では約５分、ケラチノ細胞の場合には約１５または１０分未満であった。細胞の剥離を、例えば顕微鏡を使った観察によりモニタリングおよび／または管理した。細胞懸濁液は振とうしてからチューブに移し、その一部約５０μｌを使って細胞数を測定した。遠心分離後（１２００rpmで約１０分）、上清を捨てて培養培地を加え、必要に応じて懸濁液が１ml当たり１００，０００、１００万、１０００万個の細胞を含む様にした。最終懸濁液は必要に応じ様々な濃度に調製できた。
【０１０２】
実施例２
構築物の作製
作製した組織は、それら細胞自身が新たに合成した細胞外マトリックスの密な三次元ネットワークと結合した細胞を含む。前記細胞外マトリックスは、外因性マトリックスを加える必要なしに、アルコルビン酸、その合成誘導体、または細胞外マトリックス合成に作用する栄養素による刺激に細胞が反応して作られる。
【０１０３】
前記組織は望まれる寸法により様々な大きさを持つ、多孔性または非多孔性の培養容器内で作られる。繊維芽細胞は３，０００〜１２，０００細胞／cm2の範囲内の密度で接種した。培養培地は定期的、例えば２〜６週間週３回、培養物を振とうし、または振とうせずに交換し、細胞増殖に好ましい環境（生理化学的）および栄養状態を維持した。
【０１０４】
組織再構築に関係する細胞は同一細胞集団に由来しても、または異なる細胞集団、即ち不均質な集団を形成しているものに由来してもよい。それらは歯周靱帯由来の繊維芽細胞、セメント芽細胞、象牙質芽細胞、エナメル芽細胞、歯髄細胞、靱帯および腱由来繊維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、間葉幹細胞、骨髄抽出細胞、または特に外因性因子の影響下にミネラリゼーション能を有するその他タイプの細胞、あるいは前記細胞の混合物であろう。しかし、例えば骨芽細胞または軟骨芽細胞型の細胞、または前骨芽細胞もしくは前軟骨芽細胞といったそれらの前駆細胞、あるいは骨髄から採られたその他細胞が存在することは、ミネラリゼーション領域を特に持つ発明による構築物を得る上で必ずしも必要ではない。
【０１０５】
組織はミネラリゼーション能を持たない複数のタイプの細胞より構成されてもよいが、それらは刺激を受けて前記ミネラリゼーションを誘発するものであろう。例えばそれらは皮膚および／または筋肉細胞由来の繊維芽細胞であろう。
【０１０６】
組織は複数のタイプの細胞から、一度に、均一に分布するまたは分布しない形で組み立ててもよい。
【０１０７】
組織のミネラリゼーションは、新合成マトリックスのミネラリゼーションを誘導するように培養条件を変更することで達成されるだろう。前記の刺激は、材料もしくは同一材料の粒子との接触、および／または分化因子、サイトカイン、コンディショニング培地、デキサメタゾン、ベータ−グリセロリン酸、ベータ−アミノプロピオニトリルを加えることにより、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、生物活性ガラス、セラミックタイプの合成物質、サンゴタイプの天然物質を加えることにより果たせるが、機械刺激でも果たすことができる。ミネラリゼーション領域を持つ発明の構築物の作製は、例えばＴＧＦ−ベータ１の様な成長因子を必要としない。
【０１０８】
実施例１でサンプリングした細胞については、培養期間終了時に、剥がし回収したシートを得た。この構造物を図１〜５に示す。
【０１０９】
実施例３
構造物のインビボ埋込み
本実施例は、組織構造物を含む発明の埋め込み物のインビボ導入を記載する。
【０１１０】
構造物は実施例１および２に記載のようにして、ヒト歯周靱帯細胞（ＰＤＬ）から調製し、次にそれを生体ガラス埋め込み物（４５Ｓ５）に巻き付けた。構造物は抗生物質（ゲンタマイシン）を補充したＤＭＥＭ培地に貯蔵した。無胸腺オスマウス（Ｓｗｉｓｓ  ＮＵ／ＮＵ、４週齢）を麻酔した。皮下埋め込み物を背側に挿入した。これを行うために、麻酔した各マウスに４つの小袋を作った。埋め込み物をこれら小袋内に挿入し、次にこれを縫合した。縫合はドレッシングで覆った。
【０１１１】
埋込１ヶ月後、マウスを屠殺して構造物をマウス起源の近接組織と一緒に回収した。これら全体を固定後、樹脂に包埋した。切片を作製し、パラゴンで染色した。切片を分析し、得た構造物を、同様に処理した皮膚繊維芽細胞から作った構造物、および埋め込まれなかった構造物と比較した。組織学切片は、マウス内に埋め込まれた発明のＰＤＬ−由来構造物は、本来の歯周靱帯に見られる構造に似ている、より密な繊維性の構造を示した。結果はさらに全ての繊維が細胞起源の厚いミネラリゼーション層によってインプラント表面に固着していることを示した。他の標本には、前記組織構造は認められなかった。
【０１１２】
これらの結果は、有利な生物特性を持ち、インビボでの使用に適合した構造物の作製を可能にするという、本発明の組織および方法が持つ利点を顕著に示している。発明の構造物のインビボ埋込みは、構造物の調製に用いた生検試料供給元にとって外因性である因子の補充を促進し、生物活性細胞を含む構造物の成熟を誘導する。
【０１１３】
実施例４
自己細胞からの「リガンプラント（Ｌｉｇａｐｌａｎｔ）」調製
「リガプラント」は患者の損失歯の代替物としてデザインされた、上記患者の細胞から再構築した靱帯を持つ製品であり、生体材料製の埋め込み物である。歯周靱帯は、主に細胞セメント質および非細胞性繊維によって歯根に固定された靱帯である。上記靱帯はまた骨内に埋め込まれた繊維性構造（シャーピィ繊維）によって歯槽骨とも結合している。セメント質に類似する固定部をインビトロ合成するのに適した条件を採用し、埋め込み物を埋め戻す前にその表面に靱帯を再構築した。製品を埋め戻すと歯槽側の固定部は直ぐに回復した。この新たに作られた組織構造物が存在することで、埋め込み物が骨と結合するのを防ぎ、治癒が進むように方向付けられた。患者の細胞を使用してリガプラントの靱帯部分を再構築することで、リガプラントは自己生成物になる。
【０１１４】
歯根中央部を解体して、欠損歯表面から不均一集団を取り出した。上記集団は主たるＰＤＬタイプ細胞：繊維芽細胞、セメント芽細胞、内皮細胞およびこれら各種細胞の前駆細胞を含んだ。これら細胞の存在は光学顕微鏡観察と、歯根表面生検から直接に得たこの集団に実施した分子生物学分析の両方で確認した。アルカリホスファターゼ、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、骨シアロ−タンパク質（ＢＳＰ）およびタイプＩコラーゲンをコードするメッセンジャーＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ検出より、これら集団が発現する細胞マーカーが多様である不均一な集団であること、さらに上記細胞から存在するＰＤＬを再構築する可能性があることが確認された。生成物を作製する過程に見られる細胞増殖期の間、培養物中に活動性繊維芽細胞の存在を示す証拠となる高レベルのタイプＩコラーゲン合成が観察された。同時に、アルカリホスファターゼおよび組織構造物をミネラル化できる細胞に特異的なマーカー（ＯＰＮ、ＯＣＮ、ＢＳＰ）も発現していた。
【０１１５】
これら特異的活動は工程を通し保存され、リガプラントの組織部分の構築に活用された。
【０１１６】
細胞を取り出しやすくするために、損失歯の歯根表面からの生検をコラゲナーゼで処理した。発明者が行った研究は、コラゲナーゼの使用が細胞増殖能または細胞による特異機能の発現（ミネラリゼーションおよび細胞外マトリックス産生）能力を低下しないことを実証した。採取期終了時には、集団はよく知られた形態（円形細胞；セメント芽細胞、細長い細胞：繊維芽細胞）を持つ不均質な細胞集団であった。
【０１１７】
まず細胞集団を増幅して回収細胞数を増やした。細胞増殖は、培養物が集密状態に達する前に継代培養を繰り返して、増殖曲線の対数相の中、高いレベルに維持した。この相にある間、培養条件（培地の組成、培養技術）により細胞の選別が行われた：内皮細胞は支持体に接着できないかまたは増殖できないために消失し、一方繊維芽細胞は増殖した。セメント芽細胞の存在は、それらに特異的なミネラリゼーションマーカーの発現レベルから検出できた。顕微鏡によるセメント芽細胞の識別を可能にしているそれら細胞の形態学的な違いが消失し、それら細胞の形が繊維芽細胞に類似のより紡錘型になることが示された。この現象は、ミネラル化細胞構造物内に存在する細胞、軟骨細胞、骨芽細胞を培養する間に共通して観察された。しかし、セメント芽細胞の脱分化はその形態に限定されると思われた。実際、β−グリセロリン酸を培養培地に加えるとインビトロでミネラリゼーション域の生成が誘導されることから、上記細胞が機能的であることが実証された。
【０１１８】
３回継代した後、細胞を剥がさずにビタミンＣを補充した増殖培地の入ったペトリ皿の中にそのまま残し、細胞外マトリックスの合成を刺激した。培養３週間後に形成した細胞の固体カーペットは、緻密な細胞外マトリックスの中に拘束された数層の細胞から構成されていた。皿１cm2当たり約５．１０５細胞に達したらできるだけ早く培養物を集密度以上に増殖させて、高レベルの細胞外マトリックス産生を誘導した。この工程の終了時には、培養物は構造化し緻密な細胞マトリックスの内側に細胞からできた厚いシートを持つ形になっていた。
【０１１９】
このシートを、機械的手段（巻きとる（rolling））を用いて皿の底から剥がし、それが十分な機械的性質を持っている場合には更に操作することができた。このシートをメスで１５cm2の小片に切り分けた。これを埋め込み物（直径５mm、長さ１１mmの円筒）の回りに数層になるように巻き付け「リガプラント」の細胞部分を作製した。
【０１２０】
これでこの未来の「リガプラント」は細胞にミネラル固定部分を作らせる分化の最終段階に入る態勢になった。この段階は、構築物をミネラリゼーション促進培地で２週間培養することで達成される。埋め込み物上へのシートの固定は、β−グリセロリン酸１０ｍＭを含む培養培地存在下での、細胞による細胞外マトリックスのミネラリゼーション合成により達成される。このミネラリゼーションは細胞−インプラント境界面の性質に支配されている。リン酸カルシウムセラミックを用いると、ミネラル化組織への直接結合が得られるだろう。生成物をインビボに埋め込むと、細胞はこの生体材料との接触に反応して、そこからセメントが再生されるミネラル固定層を産生する。
【０１２１】
かかる細胞組織がインビボでどのように分化し、そしてこの基礎的な固定がセメント質の形成にどのように展開を与えるのか知るために、発明者はシート−埋め込み物構築物をヌードマウス（Ｓｗｉｓｓ  ｎｕ／ｎｕ）の頭蓋部皮下に埋め込んだ。さらに発明者は生検部位（歯根部先端および中央部、頸部）および埋め込み物の材料のタイプ（象牙質、ハイドロキシアパタイト、カルシウムリン酸コーティングチタン）のような種々のパラメーターを変えることにより、埋込後４、８および１２週目の上記構築物の動的プロフィールを調べた。
【０１２２】
最も重要な結果は、歯根中央部のＰＤＬ生検から取り出した細胞から作製した細胞シートを、ハイドロキシアパタイト埋め込み物に応用した時に得られた。免疫標識（ヒト組織成分特異的な抗体）を用いて、発明者は構築物が周囲のマウス組織の存在により変性しないこと、および構築物がその起源に特異的な構造的特徴を保存していることを確認した。標識研究では、埋込後も再構築組織の起源が特定できた。発明者は埋め込み物およびそれに結合したヒト細胞と、周囲のマウス組織との間に明確な境界があることを観察した。
【０１２３】
細胞外マトリックスのミネラリゼーションの範囲を、組織切片に適当な処理を行い測定した。結果からハイドロキシアパタイト境界面にあるミネラル化層の厚みが時間と共に漸次変化することが分かった。このプロセスの進行に沿って、このミネラル基材中に埋め込まれたコラーゲン繊維の大きな展開がみられた。ミネラル部分に含まれる細胞はあらゆるところに認められた。この様な構造要素は細胞−生体材料境界面全体に存在した。この組織学的分析の結論は、大量のシャーピィ繊維を持つ、繊維性細胞セメント質を特徴とする組織がＰＤＬ細胞によって再生され、埋め込み物上にシートを固定することを示している。
【０１２４】
埋め込み物には強い応力が加わることから、それはなによりも最適な生体適合性であると同時に「骨統合型」埋め込み物と同様の機械強度を保持しているという観点から選ばれた材料で作らなければならない。埋め込み物用に選ばれた材料は、チタンを生体活性化して作られた。
【０１２５】
天然に産生されるアパタイト固定層は極めて薄く（〜１μm）、それは層（７１）内の脆弱断裂のリスクを排除し、埋め込み物表面の微小な凹凸を損なわない（それ故に金属相とミネラル相との間の機械的結合も損なわれない）。さらに、チタン活性化は化学的および生理学的な方法であることから、チタニウム−アパタイト結合は強力な共有結合であり、この２相間に連続的な遷移を構成する。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】Ｊ２に５，０００細胞／cm2の密度で接種した歯周靱帯から取り出した細胞（Ａ）および培養３週後の細胞（Ｂ）。細胞は増殖し、重層し、そして細胞外マトリックスを合成した。
【図２】直径１００mmのペトリ皿内静置培養３週間後の構築物全体像。
【図３】ミネラル化組織。パラゴン染色がミネラル沈積物を目立たせる。
【図４】歯科用埋め込み物およびその発明による組織との結合。
【図５】歯周ポケット治療用ハイドロキシアパタイトを加えミネラル化した組織。歯周細胞をハイドロキシアパタイトマイクロ粒子存在下に３週間培養した。新合成されたコラーゲンマトリックスはミネラリゼーション沈積物を含む（Ｋｏｓｓａ染色から）。
【図６】ハイドロキシアパタイト支持体表面で培養した歯周靱帯細胞（セメント質−エナメル質境界）から、本発明の方法に従い調製し、無胸腺マウス（Ｓｗｉｓｓ  ｎｕ／ｎｕマウス）の皮下に１２週間埋め込んだ構築物の組織切片（倍率１００倍）。サンプルを脱灰した後パラフィン包埋して、マッソントリクローム染色法で染色した。  細胞核は「細胞」部分の中に黒い点として現れる。ハイドロキシアパタイト支持体と接するミネラル化マトリックスのコラーゲン繊維（シャーピィ繊維）およびタンパク質は「ＨＡ」と示された多孔性の塊に対応する。  得られた組織構造物は、正常の歯に見られる繊維性細胞セメント質の構造に似ている。
【図７】免疫組織学標識によりタイプＶコラーゲンが検出された一枚のシートから構成された組織を示す図。明るいグレーの部分は対比染色を表し、濃いグレーは標識されたタイプＶコラーゲンである。
【図８】折り重ねるか、または巻いた後の図７の組織と同じ組織の図。標識プロフィールから再成形が起こっていることが分かる（組織の各折り重ねの極性は保存されていない）。明るいグレーは対比染色を表し、濃いグレーは標識されたタイプＶコラーゲンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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