(57)【要約】発明はリンパ球細胞を製造する方法、ならびにその実行に有益な道具、試薬およびキットに関する。より具体的には、発明は医薬品質の機能細胞の産業製造に適合した、ガンマデルタＴ細胞を大量に調製する方法に関する。発明はまたガンマデルタＴ細胞を活性化する方法、前記方法に適合した道具、ならびに得られた細胞組成物およびそれらヒトもしくは動物ガンマデルタT細胞にも関し、特に医薬品、治療、実験、化粧品および産業での研究に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガンマデルタＴリンパ球組成物を調製する方法であって、培養開始時にガンマデルタＴリンパ球の合成活性化化合物の存在下に少なくとも５０００万個の単核細胞を含む生物調製物を培養し、続いてサイトカイン存在下に培養する工程を少なくとも１つ含む方法。
【請求項２】
生物調製物が血液、血漿または血清サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物調製物がサイタフェレーシスに由来するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生物調製物が１０．１０7個を超えた細胞を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
生物調製物があらかじめ凍結されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞を培養中約５．１０6細胞／ml未満の密度に維持する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞を約１０日以上、好ましくは１０から２５日の間の期間培養する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ガンマデルタＴリンパ球の合成活性化化合物がガンマデルタＴリンパ球のＴ細胞受容体リガンドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ガンマデルタＴリンパ球の合成活性化化合物をホスホハロヒドリン化合物、ホスホエポキシド化合物およびビスホスホナート化合物より成る群から選択する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ガンマデルタＴリンパ球の合成活性化化合物を以下の化合物より成る群：
３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＢｒＨＰＰ）
３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＩＨＰＰ）
３−（クロロメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＣＩＨＰＰ）
３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−３リン酸（ＢｒＨＰＰＰ）
３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−３リン酸（ＩＨＰＰＰ）
α，γ−ジ−［３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル］−３リン酸（ｄｉＢｒＨＴＰ）
α，γ−ジ−［３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル］−３リン酸（ｄｉＩＨＴＰ）
３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−２リン酸（Ｅｐｏｘ−ＰＰ）
３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−３リン酸（Ｅｐｏｘ−ＰＰＰ）
α，γ−ジ−３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−３リン酸（ｄｉーＥｐｏｘ−ＴＰ）
から選択する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サイトカインをインターロイキン−２およびインターロイキン−１５より成る群から選択する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
サイトカインを約１５０Ｕ／ml〜約５００Ｕ／mlの範囲を含む濃度で使用する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
得られる組成物が次の特徴：
−組成物はガンマデルタＴ細胞を８０％を超えて含み、かつ
−組成物は１億個を超える、生存する機能的ガンマデルタＴ細胞を含む、
を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
機能的ガンマデルタＴリンパ球を含む細胞組成物を調製する方法であって、前記方法が少なくとも：
−サイタフェレーシス由来の細胞を、ガンマデルタＴリンパ球の合成活性化化合物、ならびにインターロイキン−２およびインターロイキン−１５から成る群より選択されるサイトカインの存在下で培養し、ここで前記培養を細胞密度が実質的に５．１０6細胞／ml未満に確実に維持する条件で実施すること、および
−得られた細胞の一部または全てを回収し、ここで上記細胞が機能的ガンマデルタＴリンパ球を含んでいること、を含む方法。
【請求項１５】
ガンマデルタＴリンパ球を基礎とする医薬組成物を調製する方法であって、前記方法が：
−請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法に従い細胞を培養すること、
−得られた細胞の一部または全てを回収し、ここで上記細胞が機能的ガンマデルタＴリンパ球を含んでいること、および
−細胞を医薬的に許容可能な担体または賦形剤に調剤すること、
を含む方法。
【請求項１６】
機能的ガンマデルタＴリンパ球が、８０％超を構成し、かつ１億個超のガンマデルタＴリンパ球を含む細胞集団を含む医薬組成物。
【請求項１７】
ヒト血清アルブミンを追加して含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
同時、別々または長期間にわたり用いることを意図して、ＩＬ−２およびＩＬ−１５より成る群から好んで選択されるサイトカインを追加して含む、請求項１６または１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
機能的ガンマデルタＴリンパ球を少なくとも８０％含み、かつ１億個超のガンマデルタＴリンパ球を含む、血液細胞のインビトロまたはエキソビボ培養物。
【請求項２０】
被検体の免疫防御を刺激するための、特に感染症もしくは寄生虫病、または癌を処置するための医薬組成物を調製するための、請求項１９に記載の細胞培養物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明はリンパ球を製造する方法、ならびにその実行に有益な道具、試薬およびキットに関する。より具体的には、発明は医薬品質の機能細胞の産業生産に適応した、ガンマデルタＴ細胞を大量に調製する方法に関する。発明はまたガンマデルタＴ細胞を活性化する方法、前記方法に適応した用具、ならびに生ずる細胞組成物およびその使用にも関する。本出願はヒトまたは動物のガンマデルタＴ細胞の製造に応用でき、特に医薬品、治療、実験、化粧品および産業での研究に使用できる。
【０００２】
ガンマデルタＴ細胞は、健康個体（ヒト、サル）では通常末梢血液細胞の１〜５％を占めている。これら細胞は防御的免疫反応の開始に関係しており、そしてこれら細胞は抗原提示細胞によるＭＨＣ分子の提示なしに、抗原との直接の相互作用によって、それらの抗原性リガンドを認識することが知られている。ガンマ９デルタ２Ｔ細胞（ガンマ２デルタ２Ｔ細胞と呼ばれることもある）は可変領域がＶγ９およびＶδ２のＴＣＲ受容体を持つガンマデルタＴ細胞である。ヒト血液中のガンマデルタＴ細胞の大部分はこのタイプの細胞である。ガンマデルタＴ細胞は活性化されると強力なＭＨＣ非拘束型の細胞傷害活性を発揮し、特に各種タイプの細胞の殺傷、とりわけ病原性細胞の殺傷に効果的である。この様な細胞としてはウイルス感染細胞（Poccia et al.,J.Leukocyte Biology, 1997,62:1-5）またはマイコバクテリア（Constant et al.,Infection and Immunity、Dec.1995、vol.63,no.12:4628〜4633）もしくは原生動物（Behr et al.,Infection and Immunity、1996、vol.64,no.8:2892〜2896）といったその他細胞内寄生生物が感染した細胞がある。それらはまた癌細胞でもよい（Poccia et al.,J.Immunol.,159:6009〜6015；Fourine and Bonnevile、Res.Immunol.,66th Forum in immunology,147:338〜347）。従って、前記細胞の活性をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、エキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で調整できれば、感染症（特にウイルス性または寄生生物性）、癌、アレルギー、更には自己免疫および／または炎症性疾患といった様々な病気の処置に、新規の効果的治療方法を提供することになるだろう。
【０００３】
かかる細胞をエキソビボまたはインビトロで製造する各種方法がこれまでも報告されている。例えば国際特許出願ＷＯ９９／４６３６５はインターロイキン−１２およびＣＤ２リガンド存在下での血液−リンパ系細胞の第一培養、およびそれに続くＴ細胞マイトジェン化合物およびインターロイキン−２存在下での第二培養を含む方法を開示している。上記方法は複雑で、数段階の細胞処理と幾つかの代謝活性経路を必要とする。さらにこの方法はガンマデルタＴ細胞が十分豊富である細胞組成物を提供しない。
【０００４】
国際特許出願ＷＯ００／１２５１６およびＷＯ００／１２５１９はガンマデルタＴ細胞を活性化できる化合物を記載している。これら明細書は上記化合物をインビボでの免疫反応の活性化に用いることを提案しており、さらにガンマデルタＴ細胞をエキソビボまたはインビトロで活性化する方法に上記化合物を用いることも記載している。しかし、これら明細書はガンマデルタＴ細胞から実質構成される細胞集団を作り出す産業レベルの方法を提供してはいない。
【０００５】
細胞治療に用いることを目的とするガンマデルタＴ細胞の使用を考案するには、高度に精製された大量のガンマデルタＴ細胞を提供する、細胞を培養し製剤化する方法を持つ必用がある。ＬＡＫ細胞またはＴ細胞クローン注入例は、このような処置法は大量の細胞を注入したときのみ有効であることを示している（Bordignon, Haematologica,1999,84:1110〜1149参照）。一般的、そしてこれらの例に基づくと、純度８０％超の細胞を少なくとも１億個、薬局方記載の条件の下に、再現性のあるかたちで思いどおりに得る方法が必要である。
【０００６】
本明細書は以下にガンマデルタＴ細胞の製造に関する新規方法を記載する。方法は大量細胞の産業レベルの製造に適しており、医薬品質の機能的なガンマデルタＴ細胞の製造が可能である。方法はサイタフェレーシスを利用し直接行われ、大量の不均一な細胞から出発してガンマデルタＴ細胞を強力に刺激し、増幅し、ガンマデルタＴ細胞を９０％以上含むことができる組成物を生ずるだろう。さらに発明の方法は、１段階または１代謝活性経路しか必要としないために簡便である。方法は様々な使用、特に治療薬としての使用に適した細胞組成物の製造を可能にする。
【０００７】
発明の第一の目的は、ガンマデルタＴ細胞組成物の調製方法に特に基づいており、上記方法は培養開始時にガンマデルタＴ細胞の合成活性化化合物が存在する状態で、少なくとも５０００万個の単核細胞を含む生物調製物を培養し、それに続いて一般的には１０〜２５日間、サイトカイン存在下に培養する少なくとも１つの工程を含む。得られる組成物は以下の優れた特徴を有する：
−それらはガンマデルタＴ細胞を８０％を超えて含み、そして
−それらは生存する機能的ガンマデルタＴ細胞を１億個を超えて含む。
【０００８】
発明の方法の優れた特徴は、大量の未分画細胞から出発し、最終的には機能的ガンマデルタＴ細胞が高濃縮された調製物が得られることである。細胞を約５．１０6細胞／ml、好ましくは３．１０6、より好ましくは約２．１０6細胞／ml未満の細胞密度で培養し、維持すると有利である。実際、実施例はかかる密度で細胞が効率的に増幅することを示している。
【０００９】
発明の別の目的はガンマデルタＴ細胞を含む細胞組成物を調製する方法であって、上記方法は：
−血液細胞調製物（一般的にはサイタフェレーシスの細胞）をガンマデルタＴ細胞の合成活性化化合物、ならびにインターロイキン−２およびインターロイキン−１５から成る群より選択されるサイトカイン存在下に培養し、かつ上記培養を細胞密度が実質的に５．１０6細胞／ml、好ましくは３．１０6未満に維持する条件で実施すること、および
−生じた細胞の一部または全てを回収し、上記細胞が機能的ガンマデルタＴ細胞を含んでいること、を含む。
【００１０】
細胞密度を維持することは様々な方法で達成されるが、とりわけ連続希釈、培地の追加、培養用具の交換といった方法で達成されるだろう。
【００１１】
発明の別の目的は、培養開始時に少なくとも５０００万個の血液単核細胞を含む生物調製物をガンマデルタＴ細胞の合成活性化化合物存在下に培養し、続いて一般的には１０〜２５日間サイトカイン存在下に培養する少なくとも１つの工程を含む、血液細胞のガンマデルタＴ細胞を豊富にする方法である。前記方法で得た調製物は、ガンマデルタＴ細胞を８０％を超えて、または９０％を超えて含むことができる。
【００１２】
以下に示すように、使用する細胞はヒトのものが好ましく、凍結した生物サンプル由来でもよく、そして１０日間以上、好ましくは１０日間〜３０日間の間培養することが好ましい。
【００１３】
発明の別の目的は医薬組成物であり、上記組成物は８０％超が機能的ガンマデルタＴ細胞より構成される細胞集団を含み、かつ１億個以上のガンマデルタＴ細胞を含む。好ましくは、組成物はまた医薬的に許容可能な物質または担体を含み、より好ましくはヒト血清アルブミンのような安定化剤を含む。細胞は自己細胞、換言すれば同一の生物調製物（または同一供与者）に由来する細胞であることが好ましい。より好ましくは、細胞は先に記載したような方法で得られたものである。
【００１４】
発明の別の目的は、インビトロまたはエキソビボでの血液細胞の培養物に関し、培養物は機能的ガンマデルタＴ細胞を少なくとも８０％、およびガンマデルタＴ細胞を１億個を超えて含む。
【００１５】
発明はまた被検体の免疫防御を刺激する、より具体的には感染症、寄生虫病または癌の処置のための医薬組成物を調製するための前記細胞培養物の使用に関する。
【００１６】
発明はまたガンマデルタＴ細胞の活動を高めることにより、具体的には被検体の免疫防御を高めることにより改善できる病気を処置する方法であって、有効量の上記医薬組成物または細胞組成物を被検体に投与することを含む方法に関する。投与は注射、特に全身注射（静脈、腹膜内、筋肉内、動脈内、皮下等）または局所（例えば腫瘍内または腫瘍を取り巻く、もしくは潤している領域の中）に実施するのが好ましい。注射は繰り返し実施してもよい。注射する細胞は自己由来（または同系）であることが好ましく、換言すれば患者自身（または双子のかたわれから）より得た生物調製物より調製したものであることが好ましい。方法は癌、感染症または寄生虫病といった各種病気の処置に有益である。
【００１７】
前述した如く、本発明はとりわけ医薬品、治療、実験、化粧品、産業での研究に用いることができる。方法は、医薬品使用のため、特に被検体の免疫反応を高める、例えば癌や感染症、または寄生虫病の処置のための細胞組成物の調製に適している。
【００１８】
生物調製物
発明の方法は、これにより大量の未分画血液細胞を含む生物調製物からガンマデルタＴ細胞を効率的に製造できるようになることに関し有益である。従って方法は、血液、血漿または血清サンプル、例えばサイタフェレーシスのサンプルに直接実施されるだろう。一般には血液の単核細胞調製物、特に末梢血由来調製物が用いられる。末梢血細胞調製物は通常ＴまたはＢリンパ細胞を約３０〜７０％、ＮＫ細胞を５〜１５％、そしてガンマデルタＴ細胞を１〜５％含んでいる。もちろん発明の方法を実施する前の生物調製物を処理して、例えば特定の細胞亜集団を選別する、または特定の細胞亜集団を除くことは可能である。しかしながら、発明の機能的ガンマデルタＴ細胞細胞組成物の製造にはこのような前処理は必要ない。即ち、方法は一般には被験者より採集した血液細胞サンプル、特には全単核細胞（言い換えれば未分画細胞）サンプルに直接実施する。上記サンプルは全血（ＰＢＭＣ）を対象としたサイタフェレーシスまたはフィコール勾配法のような、当業者周知の、世界中で臨床使用されている通常の方法により得ることができる。発明の実施に関する好適細胞源は、サイタフェレーシスで得るもののように、全末梢単核細胞から構成されている。従って、具体的実施態様では、本発明の方法は、サイタフェレーシスまたはサイタフェレーシスの一部を上記条件の下に培養する第一工程を含む。サイタフェレーシスは一般に１０9個を超えた単核細胞を提供する。１回のサイタフェレーシスからは複数の小分けサンプルを調製することができ、それらは発明の方法により個別に処理できる。従ってある患者については、発明のガンマデルタＴ細胞の複数バッチを個別かつ異なった時に製造できる。この小分けにより、細胞に対する品質および機能活性試験の実施が可能となり、組成物の安全性をより正確に知ることができる。
【００１９】
この局面では、本明細書は事前に凍結した単核細胞調製物より機能的ガンマデルタＴ細胞を製造できることを示す。事実、実施例に示す結果は、サイタフェレーシスは長期間凍結できること、そして融解後の細胞を効率的に活性化し、増幅して機能的ガンマデルタＴ細胞組成物を製造できることを示している。事前に凍結した細胞が使用可能であることは、特に自己細胞バンクの調製の観点より本発明に極めて重要な利点となる。
【００２０】
発明の方法の具体的実施態様は、従って事前に凍結した生物調製物（特に単核細胞）よりガンマデルタＴ細胞を調製することを含む。
【００２１】
発明の具体的目的はまた、（ｉ）事前に凍結した血液単核細胞をガンマデルタＴ細胞の合成活性化化合物およびサイトカイン存在下に、ガンマデルタＴ細胞の増殖を保証する条件で培養すること、および（ｉｉ）生じたガンマデルタＴ細胞を回収すること、または製剤化することを含む、機能的ガンマデルタＴ細胞の製造方法にも関する。血液単核細胞はサイタフェレーシス由来のものが好ましい。
【００２２】
発明の別の具体的目的は、（ｉ）被検体の血液単核細胞を、典型的には約１０7〜５．１０9細胞／mlを含む小分け物の形で凍結すること（または獲得すること）、（ｉｉ）細胞または個々の小分け物を融解し、それらをガンマデルタＴ細胞の合成活性化化合物およびサイトカイン存在下に、ガンマデルタＴ細胞の増殖を保証する条件で培養すること、および（ｉｉｉ）生じたガンマデルタＴ細胞を回収すること、または製剤化することを含む、機能的ガンマデルタＴ細胞の製造方法にも関する。血液単核細胞はサイタフェレーシス由来のものが好ましい。
【００２３】
細胞は様々な方法で凍結できるだろう。好ましい方法では、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）および／またはグリセロールのような安定化剤を使用する。かかる安定化剤は融解後の細胞生存率という観点において細胞膜を安定化し、細胞の効率的な凍結を可能にする。ゼラチン、ポリマー、タンパク質等を基礎とするその他技術または媒体を用いてもよい。特に好適な媒体は血清とＤＭＳＯの容量比（Ｖ／Ｖ）が９０／１０のものであり、この場合使用する血清は細胞増殖促進の役割も果たす。ＤＭＳＯの割合は溶液の容積比で５〜１５％の間であろう。血清は４％のヒト血清アルブミン液、例えばＡｌｕｂｍｉｎｅ−ＬＦＢ４％（販売認可番号５５８６３２−９）に替えてもよい。しかしヒト血清アルブミンの場合、容量比はより高くなり、例えば２０％までであろう。一般には細胞を上記好適凍結媒体内に懸濁してから、次に例えば液体窒素蒸気のような凍結雰囲気内に置く。凍結はそれに好適なチューブまたはバックを用い、無菌状態で、同一の血液細胞調製物を小分け物の形にして行うのが有利である。こうして凍結した細胞は長期間保管できるため、被検体より繰り返しサンプリングすることなしに長期間にガンマデルタＴ細胞の製造が可能となる。
【００２４】
発明の方法の重要な特徴は、処理する生物材料の量である。例えば方法は５０．１０6を超えた単核細胞を含む生物調製物を用いるのが好ましく、一般的には５０００万個〜１０億個の細胞の間であり、例えば約５０００万個、１億個、２億個、または３億個の細胞である。典型的な方法では、生物調製物は１億個を超えた細胞を含む。より大量の細胞が使用できることが判っている。典型的な生物調製物では、出発時のガンマデルタＴ細胞の割合は１０％未満、通常ガンマデルタ細胞の割合は５％未満であるため、１億個の細胞の生物調製物は１００〜５００万個のガンマデルタＴ細胞を含んでいる。発明の方法はかかる調製物より１０8個を超えたガンマデルタＴ細胞を含む組成物を産生する。
【００２５】
さらに、出発調製物のガンマデルタＴ細胞含有率は約１〜５％に過ぎないが、発明の方法により得た組成物は、ガンマデルタＴ細胞を８０％超含み、９０％超もある。従って、発明の方法は大量かつ医薬品品質の細胞の製造に特に有効であり、また適している。
【００２６】
ガンマデルタＴ細胞の合成活性化化合物
発明の方法の優れた一側面はガンマデルタＴ細胞の合成活性化化合物の使用である。即ち発明は、合成化合物を利用した単一の代謝活性化だけでガンマデルタＴ細胞を効果的かつ方向づけられた活性化および増幅できることを示している。
【００２７】
合成活性化化合物という用語は、ガンマデルタＴ細胞を活性化できる、人工的に作られた分子を発明が使用することを表している。かかる化合物は一般にはガンマデルタＴ細胞のＴ細胞受容体に結合できるリガンド（例えば化学分子）である。活性化化合物は多様な性質であるが、とりわけてもペプチド、脂質、化学物質である。それは精製または化学合成により産生した内因性リガンド、あるいは上記リガンドの断片または誘導体、あるいは同じ抗原特異性を有する抗体でもよい。好ましくは、それはＴＣＲ受容体と選択的に結合しガンマデルタＴ細胞を活性化できる合成化合物である。選択的結合とは、前記化合物が他の膜受容体に比べガンマデルタＴ細胞のＴＣＲに対しより高い親和性で相互作用すること、それ故にガンマデルタＴ細胞の増殖および活性を選択的または方向づけられた活性化に導くことを意味する。
【００２８】
国際特許出願ＷＯ００／１２５１６に記載のホスホハロヒドリン類（ＰＨＤ）、ＷＯ００／１２５１９に記載のホスホエポキシド類（ＰＥＤ）またはKunzmann（Blood、2000,96:384）ら記載のビスホスホネート化合物といった様々な合成活性化化合物が用いられるだろう。
【００２９】
発明の実施に有利に用いることができる具体的合成活性化化合物は以下の式（Ｉ）および（ＩＩ）でそれぞれ表されるホスホハロヒドリン類およびホスホエポキシド類である：
【００３０】
【化１】
2005517440.tif 000002
【００３１】
式中Ｘはハロゲン原子であり（好ましくはヨウ素、臭素、または塩素原子から成る群から選ばれる）であり、Ｒ１はメチル基またはエチル基であり、Ｃａｔ＋は無機または有機カチオン（プロトンを含む）を表し、それらは同じでもまたは異なっており、そしてｎは２〜２０の間の整数である。上記化合物は当業者周知の各種化学方法、特に国際特許出願ＷＯ００／１２５１６およびＷＯ００／１２５１９に記載の方法により作ることができるだろう。具体的化合物は上記の式（Ｉ）および（ＩＩ）で表される２−または３−リン酸化合物である。
【００３２】
好適実施態様では、ＰＥＤまたはＰＨＤ化合物を用いる。
具体的化合物は次の通りである：
３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＢｒＨＰＰ）
３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＩＨＰＰ）
３−（クロロメチル）−３−ブタノール−１−イル−２リン酸（ＣＩＨＰＰ）
３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル−３リン酸（ＢｒＨＰＰＰ）
３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル−３リン酸（ＩＨＰＰＰ）
α，γ−ジ−［３−（ブロモメチル）−３−ブタノール−１−イル］−３リン酸（ｄｉＢｒＨＴＰ）
α，γ−ジ−［３−（ヨードメチル）−３−ブタノール−１−イル］−３リン酸（ｄｉＩＨＴＰ）
３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−２リン酸（Ｅｐｏｘ−ＰＰ）
３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−３リン酸（Ｅｐｏｘ−ＰＰＰ）
α，γ−ジ−３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブチル−３リン酸（ｄｉーＥｐｏｘ−ＴＰ）
【００３３】
別の具体的実施態様では、例えば１−ヒドロキシ−３−（メチルペンチルアミノ）プロピリデン−バイホスホン酸のようなアミノバイホスホネート化合物を用いる。
【００３４】
別の異なる態様では、合成活性物質はＨｉｎｔｚらが記載する（FEBS Lett.,Dec 7 2001、509(2):317〜22）ような（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブタ−２−エニルピロリン酸である。
【００３５】
効率は低いが、発明の実施に有用なその他化合物としては国際特許出願ＷＯ９５／２０６７３に記載のホスホ抗原またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）（米国特許ＵＳ５，６３９，６５３）がある。
【００３６】
活性化化合物の投与量は、当業者により、細胞量および用いる化合物の性質に合わせ調節されるだろう。一般には、培養開始時では化合物は約１０μＭ以下で用いられる。発明の方法の重要な優位点は、培養開始時に必用な選択的代謝活性化がひとつだけであるという事実である。即ち一度培養を開始すれば、それ以上合成活性化化合物を培地に加える必用はない。
【００３７】
サイトカイン
発明の方法はサイトカイン（単独または場合により、他の生物活性作用物質と組合せもしくは結合して）、特にインターロイキンを利用する。このサイトカインはインターロイキン−２またはインターロイキン１５が有利である。事実本明細書は、同じ受容体を利用する前記インターロイキンが、上記条件においてガンマデルタＴ細胞を効率的に産生することを示している。
【００３８】
用いるインターロイキンはヒトまたは動物起源いずれでもよいが、ヒト起源のものが好ましい。それは野生型蛋白質でも、または生物活性な断片もしくは変異体でもよく、言い換えれば発明の方法の条件で、その受容体に結合してガンマデルタＴ細胞の活性化を誘導できるものであればよい。
【００３９】
具体的には用語「変異体」は、例えば多型、スプライシング、突然変異等で生ずる全ての天然の変種を意味する。上記天然型変異体は、従って野生型配列に対する１以上の突然変異、あるいは１または複数の残基の置換、欠失等を含むだろう。変異体という用語はまた別種、例えば齧歯類、牛等に由来するポリペプチドも包含する。しかしヒトサイトカインが有利に使用される。用語「変異体」はさらにサイトカインの合成変異体、具体的には野生型配列に対し１以上の突然変異、あるいは１または複数個の欠失、置換および／または付加を含むポリペプチドのサイトカインの合成変異体を包含する。好ましい変異体は、野生型サイトカインと少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％の一次配列同一性を有利的に示す。よりさらに好ましくは、好適変種は野生型サイトカインと少なくとも９０％の一次配列同一性を示す。同一度は当業者周知の、例えばＣＬＵＳＴＡＬ法のような様々な方法およびソフトウエアーを用いて決定されるだろう。
【００４０】
前記の如く、発明の範囲のなかでは、上記生物活性を保存しているサイトカイン断片を用いることもできる。上記断片は例えば触媒ドメイン、受容体結合部位、二次構造（ループ、シート等）、コンセンサス部位等のサイトカインの領域または機能ドメインを少なくとも１つ含んでいる。発明を実施するためには、用いる断片はインターロイキン−２またはインターロイキン−５の特性を有利に保存し、膜受容体に結合してガンマデルタＴ細胞の発生を促進する。
【００４１】
用いるサイトカインは野生型アミノ酸配列に追加して加えられたアミノ酸、脂質、糖等の異質残基を含んでも良い。異質残基は、化学的、酵素的、放射性標識された基でもよい。具体的には異質成分は安定化剤、細胞内へのポリペプチドの浸透を促進するか、またはその親和性を改善する作用物質等であろう。
【００４２】
サイトカインは、例えばペプチド、ポリペプチド、または生物活性蛋白質等のその他分子と融合し、または複合体を形成した可溶性の精製体でもよい。サイトカインは当業者周知の生物学的、遺伝学的、化学的または酵素学的方法、特には好適宿主細胞での対応核酸の発現により調製してもよい。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のようなサイトカインは商業的に得ることもできる。好ましくは、ヒト組換え体サイトカイン、一般にはヒト組換え体インターロイキン−２またはヒト組換え体インターロイキン−１５を使用する。
【００４３】
発明の方法で使用するサイトカインの投与量は、出発細胞の性質により変わるだろう。さらに、サイトカイン濃度は培養中に変更してもよい。一般にサイトカインは１００〜５００Ｕ／mlの範囲の濃度、典型的には約１５０〜５００Ｕ／mlの範囲の濃度で用いる。方法の進行に伴って、例えば培地にサイトカインを追加してサイトカイン濃度を調整してもよい。好ましくは１５０〜４００Ｕ／mlの範囲のサイトカイン投与量を用いる。具体的実施態様では、培養を第一投与量のサイトカイン存在下に開始し、次に第一投与量より高い第二投与量存在下に培養を続け、細胞増殖を上げることもできる。従って、発明の具体的目的は、少なくとも以下の工程を含む、単核細胞サンプルからガンマデルタＴ細胞組成物を調製する方法に基づいている：
−ガンマデルタＴ細胞合成活性化化合物およびサイトカイン存在下に単核細胞を培養し、前記サイトカインが第一有効投与量存在する第一の培養工程、および
−上記サイトカインの第二有効投与量存在下に上記細胞を培養し、上記第二有効投与量が上記第一有効投与量より高い第二の培養工程。
【００４４】
実際発明は、合成活性化化合物の使用がサイトカインＩＬ２に対する高親和性受容体のガンマデルタＴ細胞表面での発現を促進することおよび低用量のＩＬ−２によりガンマデルタＴ細胞の特異的増殖が十分可能であること、前記低用量では低親和性受容体を有する細胞の増殖は促進しないことを示している。しかし高親和性受容体は培養７〜１０日後には消失し、低親和性受容体にとって替わられる。そのため方法の性能を向上して機能的ガンマデルタＴ細胞の増殖を高めるには、次に細胞をより高いサイトカイン用量存在下で培養しなければならない。この実施態様では、最初のサイトカイン用量は約３００Ｕ／ml以下、好ましくは約１５０Ｕ／ml程度であることが望ましく、そして２番目のサイトカイン用量は約３００Ｕ／mlを超えて、好ましくは約３５０Ｕ／ml、典型的には４００Ｕ／ml超であることが望ましい。
【００４５】
別の実施態様では、サイトカインを含む新鮮培地を様々な時点で追加することにより、サイトカインの濃度を方法の期間を通じて実質的に一定に保つ。この実施態様では、サイトカインの濃度は２５０〜５００Ｕ／mlの範囲、例えば３００〜４５０Ｕ／mlの範囲に維持されるのが好ましい。
【００４６】
培養
発明の方法は、活性化化合物（培養開始時）およびサイトカイン存在下に一定期間、ガンマデルタＴ細胞を選択的に活性化および増幅できる条件で細胞を培養することを含む。
【００４７】
細胞はヒト細胞、具体的には血液細胞の培養に適合する様々な培地および装置で培養してもよい。これらは合成培地、補充培地等でよい。有用な培地の例としては、具体的には市販されているＲＰＭＩ、ＰｒｏｌｉｆｉｘＳ３、Ｓ６、ＡｍｐｉｃｅｌｌＸ３（Bio Media）、Ｘ−ＶＩＶＯ−１０および１５（Biowhittaker）、ＡＩＭ  Ｖ（Invitrogen）、Ｍｅｄｉｕｍ  ＩおよびＩＩ（Sigma）、ＳｔｅｍＳｐａｎ  Ｈ２００（Stem cell）、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（CellGenix）等を挙げることができる。上記培地には抗生物質、ヒトまたは動物血清、好ましくは治療目的の細胞培養への使用が認可されているもの、アミノ酸および／またはビタミン等を補充してもよい。好ましい培地はＲＰＭＩ培地であり、ウシ胎児血清を補充するのが好ましい。特に好ましい培地は、放射線照射したウシ血清であり、治療用細胞培養での使用が法律に則り許可されているものである。このタイプの血清は複数の会社から販売されている。培養はプレート、バッグ、フラスコ、ボトル、チューブ、アンプル、バイオリアクター等、様々な用具で実施されるだろう。培養は密封できる無菌用具内で実施するのが有利である。培養体を振とうする必要はない。通気型バックは特に好適である。実施する方法に応じ、特に細胞を希釈しその増幅を促進するために用具を培養中に交換してもよい。しかしこの様な交換は強制されるものではなく、方法の開始から最後まで大容積の用具を使用し続けてもよい。
【００４８】
一般には、バッグを使用する場合は、生物調製物または細胞は、最初の細胞密度が０．２〜３．１０6細胞／mlになるような容積の培地に入れる。実際、明細書は細胞密度を０．２〜３．１０6細胞／mlの間、より好ましくは２．１０6細胞／ml近傍に維持すると、ガンマデルタＴ細胞の増幅が大きく促進されることを示している。バイオリアクターを用いれば、より高濃度の細胞を得ることができるだろう。
【００４９】
細胞密度は例えば連続希釈、培地添加、培養用具の交換等、様々な方法で一定に保つことができる。もとより細胞密度を方法の間一定に保つことはできないが、それは細胞が連分裂し続けているからである。従って様々な時点で密度を制御または調節して、可能な限り密度を０．５〜３．１０6細胞／mlの間に保つことが有利である。
【００５０】
方法はその期間を変えて、および／または複数回のサイクルで実施してもよい。一般に、方法の期間は約１０日を超えてであり、典型的には約１０〜３０日の間、または約１０〜２５日の間である。各種変更も考えられる。例えば第一段階では活性化化合物のみ存在し、サイトカインなしの状態で培養することも可能である。上記第一段階の長さは例えば１〜７２時間の間であり、典型的には４８時間未満である。上記段階はガンマデルタＴ細胞を刺激してこれら細胞による高親和性サイトカイン受容体の若干の発現を誘導することを意図としている。この第一段階が終了したらサイトカインを含む培地で培養を継続するが、活性化化合物を再添加する必用はない。典型的には、この段階終了時にはサイトカインは含むが活性化化合物は含まない培地を細胞に加える。その後約１０日を超えて、典型的には１０〜２５日の範囲で培養を続ける。前述のように培養中に細胞密度を調べ、そして／または調整することが好ましく、使用するサイトカインの用量は一定に保っても、または変更してもよい。
【００５１】
別の変更では、活性化化合物およびサイトカイン存在下に培養を開始して、典型的には１０〜３４日間の範囲培養を継続し、その間細胞密度およびサイトカイン濃度を制御することも可能である。その場合、細胞密度を考慮しながらサイトカインを含む新鮮培地（一般には活性化化合物は含まない）を細胞に加える。さらに前述のように、必用に応じて操作中に細胞をより大容積の用具に分離または移してもよい。
【００５２】
このように発明の方法は、以下の特徴を有利に備えた細胞組成物を提供する：
−それらはガンマデルタＴ細胞を８０％超、有利には８５％超、さらに有利には９０％を超えて含んでおり、そして
−それらは１億個超の生存して機能するガンマデルタＴ細胞を含んでいる。
【００５３】
多くのドナーにおいてかかる特徴を再現して得るためには、例えばサイタフェレーシスで得た多数の細胞、おおまかに５０００万個のＰＭＰＣを使って培養を開始する必用がある。
【００５４】
方法は簡単、迅速で、１回の代謝活性化のみ必要とし、細胞操作回数は極めて少ない。さらに事前に凍結した細胞を用い行うこともできる。従って前記方法はガンマデルタＴ細胞の医薬利用に特に有利である。
【００５５】
使用／調剤
得た細胞は即時使用しても、貯蔵を考慮し処理してもよい。一般に、細胞は特にポリマーまたは中性蛋白質のような安定化剤を含有する培地に包まれる。ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）を使用することが有利であり、また非経口等級の調製物が市販されている。ここに示す結果は、それらを注射することを考慮し、細胞を４℃でヒト血清アルブミン溶液の形に調剤できることを示す。この局面での発明の具体的目的は、ガンマデルタＴ細胞およびヒト血清アルブミンを、一般には２〜１０％、有利には約４％含む組成物である。
【００５６】
発明の別の目的は医薬組成物であり、組成物は８０％超が機能的ガンマデルタＴ細胞から構成され、そして１億個を超えたガンマデルタＴ細胞を含有する細胞集団を含む。好ましくは、組成物は機能的ガンマデルタＴ細胞を８５％を超えて、より好ましくは９０％を超えて含む。一般には、組成物はさらに医薬的に許容可能な物質または担体、およびより好ましくはヒト血清アルブミンのような安定化剤を含む。より具体的には、細胞は上記のような方法により獲得し、または獲得できる。
【００５７】
発明の別の目的は、ガンマデルタＴ細胞に基づく医薬組成物を調製する方法であって；
−本明細書に記載の方法に従い細胞を培養すること、
−獲得した細胞の一部または全てを回収し、前記細胞が機能的ガンマデルタＴ細胞を含むこと、そして
−細胞を医薬的に許容可能な作用物質または担体を用いて調剤すること、
を含む、方法に関する。
【００５８】
発明の別の目的は、インビトロまたはエキソビボでの血液細胞培養物であって、上記培養物がガンマデルタＴ細胞を少なくとも８０％含む培養物に関する。
【００５９】
発明はまた、被験者の免疫防御促進のための、より具体的には感染症、寄生虫病、癌、自己免疫もしくは炎症性疾患の処置のための医薬組成物を調製するための、上記の細胞培養物の使用に関する。
【００６０】
発明はまた癌もしくは感染症、または寄生虫病を処置する方法であって、被検者に有効量の上記医薬組成物または細胞組成物を投与することを含む方法に関する。
【００６１】
処置という用語は、症状、病気の原因または部位が軽減または消失すること、病気の進行、例えば腫瘍の生育が逆行または遅くなること、患者の状態が改善すること、ウイルスまたは寄生虫量が減ること、疼痛または苦痛が緩和すること、生存率が上がること等を意味する。
【００６２】
有効量という用語は、より具体的には癌または感染細胞に対する患者の免疫反応を刺激するのに効果的である量を指している。細胞は１回投与当たり１０6〜１０10細胞を一般に含む用量で投与するが、これと異なる量を用いてもよい。使用する細胞の量は、病気や臨床プロトコール（特に注射回数および部位）に従って、実施者により調節してもよい。
【００６３】
投与は、注射、特に全身注射（静脈、腹膜内、筋肉内、動脈内、皮下等）または局所注射（例えば腫瘍内または腫瘍を取り囲むまたは潤している領域内）により行うのが有利である。繰り返し注射してもよい。注射する細胞は、自己（または同系）細胞が好ましく、即ちそれらは患者自身（または双子の片われから）からの生物調製物より調製する。同種組成物も想定できるだろう。
【００６４】
典型的な実施態様では、注射は用量を上げながら反復して行われ、各投与段階自体には例えば１〜６週間の範囲の時間間隔で数回（一般には１〜４回）注射を行うことを含むだろう。初期投与量は一般には細胞１億個超であり、例えば１億個〜５０億個の範囲であり、そして投与量は最大１００億個まで上げてもよいだろう。特定の臨床プロトコールは、１０億個から始めて、投与量を４０億個、次に８０億個、さらに１２０億個の細胞まで増加（各投与段階は３週間隔で３回連続して注射することを含む）することを包含する。
【００６５】
さらに、ガンマ９デルタ２細胞の増殖および生存は、サイトカインの活性、好ましくはインターロイキン２の活性に依存しているため、同時治療の実施が有利である。例えば、好適実施態様では、本発明の方法で得た細胞をサイトカイン、特にはＩＬ−２と同時治療的に注射する。好ましい投与計画は、体表面積１ｍ2当たり約１００万単位のサイトカインを約７日間、毎日皮下注射するものである。
【００６６】
従って発明の具体的目的の一つは、上記の細胞を含む組成物およびサイトカイン、好ましくはＩＬ−２もしくはＩＬ−１５、より好ましくはＩＬ−２を含み、これらを同時、別々に、または長期使用することを考慮した、組成物およびサイトカインに基づくものである。発明の別の目的は、被検体に上記細胞組成物およびサイトカイン、好ましくはＩＬ−２を投与することを含む処置法であって、前記細胞およびサイトカインを同時、別々、または長期間投与する処置方法に基づく。
【００６７】
さらにガンマデルタＴ細胞を、投与前に遺伝的に変更し、例えばとりわけても刺激因子、増殖因子、サイトカイン、トキシンを発現するようにしてもよい。
【００６８】
発明は（単独またはその他治療薬と組合せた）ガンマデルタＴ細胞の活性を上げることにより改善できる各種病気（および特にガンマデルタＴ細胞の細胞溶解活性に感受性な細胞を含む各種病気）の処置にとって有益である。例えば大部分の腎臓癌細胞株は発明の方法で得たガンマ９デルタ２細胞によりインビトロで効率的に殺傷される。ガンマデルタ細胞が細胞溶解活性を発揮する、組織学的に様々なタイプの癌：骨髄腫、膀胱癌、メラノーマ、星状細胞腫、神経芽腫を処理してもよい。上記引用例は限定的なものではなく、ガンマデルタ細胞による溶解に感受性であるその他タイプの癌も処理できる（肺、肝臓、頭頸部、結腸直腸癌等）。感染症の場合、ガンマデルタＴ細胞は多くの細胞内細菌およびマイコバクテリアを溶解することが知られている。例えばガンマ９デルタ２細胞の結核菌感染細胞またはペスト菌感染細胞に対する活性はよく知られている。上記細胞はまた野兎病のようなその他感染症にも機能する。抗ウイルス活性もＨＩＶ、インフルエンザ、センダイ、コクサッキー、ワクシニアウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）および単純ヘルペスウイルス−１（ＨＳＶ−１）が感染した細胞に対し実証されている（Sciammas et al.,TcR gamma delta and viruses、Microbes Infect.1999,1:203）。
【００６９】
本出願のその他局面および利点は以下の実施例により明らかになるが、これら実施例は例示を目的とするものであって何ら制限を加えるものではない。
【実施例】
【００７０】
実施例１
培養１０〜２０日後にガンマ９デルタ２Ｔ細胞の純度が８０％超であり、１億個超のガンマ９デルタ２細胞を獲得することを目的とする５０００万個超の未分画ＰＭＢＣ細胞から開始するガンマ９デルタ２Ｔ細胞の増幅
ＩＡ−材料
血液サンプル
３名の健康供血者かそれぞれから６−ｍＬチューブ（ＡＣＤ：クエン酸デキストロース）に全血を採血し、室温に貯蔵した。血液はサンプリング後約１８時間に処理した。
【００７１】
サイタフェレーシスバッグ
健康供血者よりサイタフェレーシスバッグ（１／２ボディーマス（body mass））を採取し、室温に貯蔵した。ＭＮＣ（単核細胞）は採取後約１８時間に処理した。
【００７２】
培地
合成またはその他の各種培養培地を使用した。細胞はＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ、参照番号Ｒ０８８３）で、場合により使用直前にＬ−グルタミン酸（０．３ｇ／ｌ最終濃度）を補充し培養した。
【００７３】
表１に示す各種合成培地も試験した。
【００７４】
幾つかの例では、培地にヒトまたは動物血清を補充した。この場合は、放射線照射したウシ胎児血清（２５ｋＧｙの放射線を照射した「Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ−Ｉ」、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製（参照番号ＳＨ３００８０．０３ＩＲ））およびヒト血清を用いた。
【００７５】
これら研究に用いたヒト血清は、Ｎａｎｔｅｓの輸血センターで健康供血者より調製したプール血清に由来する。この治療等級の血清（フランス監督官庁の許可を得ている）は、古典的なアルファベータＴ細胞を注射する細胞治療プロトコールで用いられている。
【００７６】
化合物および試薬
用いたヒト組換え体インターロイキン−２は、１８００万ＩＵを含むＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ａｌｄｅｓｌｅｕｋｉｎ）（Ｃｈｉｒｏｎ  ＢＶ、参照番号ＦＲＣ０１Ａ）であり、ＲＰＭＩ／１０％ＨＳ培地中に３６０，０００ＩＵ／mlの濃度になるよう小分けし−２０℃に貯蔵した。Ｆｉｃｏｌｌ（「リンパ球分離媒体」）は、密度１．０７７±０．００１（Ｓｉｇｍａ、参照番号９１３３５３）で使用した。ヒト血清アルブミンはアルブミン−ＬＦＢ４％であり、これは販売許可番号５５８６３２−９を取得している。ＤＭＳＯおよび生理食塩水はＢｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ社より得た。
【００７７】
培養用具
用いた培養用具は表２に掲載した。
【００７８】
抗体
用いた抗体は表３に掲載した。
【００７９】
ＩＢ−方法
Ｆｉｃｏｌｌ＋全血からのリンパ球の分離
この方法は細胞生物学研究室で一般に用いられている。簡単に述べると、全血をＦｉｃｏｌｌ処理し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配で回収する。Ｆｉｃｏｌｌを濯ぎ流し、「Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩ」を用い細胞数を測定した（一定の条件および一定の供血者について異なる３サンプルについて）。ＰＢＭＣを１０％ＤＭＳＯ（４％ヒト血清アルブミンまたはＦＣＳ中）を含む凍結溶液中に凍結した。
【００８０】
リンパ球のＭＮＣ（サイタフェレーシス）からの分離
この操作はサンプルからの「血小板除去」を行う第一段階を含み、この段階は以下のようにして各サイタフェレーシスバッグについて行った：
サイタフェレーシスバッグの中身を５０mlチューブに移し、これに２倍量のＲＰＭＩ培地を加えた。チューブを２００ｇで遠心分離し、上清を廃棄した。沈殿物を一つにまとめ（プール）、ＲＰＭＩ培地に懸濁した（適宜５０mlまで）。細胞数を測定し、再度約４００ｇ（２０℃）で遠心分離した。再び上清を廃棄し、沈殿物を最終濃度が約５億細胞／mlになるようウシ胎児血清に懸濁した。細胞数を測定し、細胞濃度を約３億細胞／mlにウシ胎児血清をつかって調節した。細胞懸濁液は通常氷上（４℃）に置いた。ＭＮＣを５から１５％ＤＭＳＯ（４％のヒト血清アルブミンまたはＦＣＳ溶液中に）を含む凍結溶液中に凍結するか、または直接培養できる。
【００８１】
細胞の凍結
凍結パラメータを最適化するために、４％ヒト血清アルブミンもしくはＦＣＳに懸濁した細胞を冷蔵凍結液（２０％ＤＭＳＯおよび４％ヒト血清アルブミンもしくはＦＳＣ）に容量対容量で希釈した。作業中、細胞懸濁液の入ったチューブを振とうしてから冷蔵容器内に入れるかまたは氷片上に置くと有利である。ホモジナイズした混合物を１．８mlの凍結用チューブに分注し（チューブあたり１ml）、これを凍結箱に入れて−８０℃で保管した。その後凍結チューブは液体窒素に移動して保管した（最低でも４時間後）。
【００８２】
ＭＮＣおよびＰＢＭＣを急速融解した後（３７℃の水槽に浸して）ＲＰＭＩ培地１２mlが入った１５mlチューブに移した。細胞をＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで洗浄してＤＭＳＯを除いた。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを使って細胞数を測定した（一定の条件および一定の供血者について異なる３サンプルについて）。
【００８３】
フラスコおよびバッグでの培養開始（分離日）
２４ウエルプレートでの培養で用いる「リンパ球数／ウエル面積」の比が約１．１０6細胞／１．９cm2に等しくなるように、各種容器（または培養用具）内に接種するＭＮＣ数を選んだ（表４参照）。
【００８４】
各供血者の単核細胞を、開始容量および細胞数が同一である、即ち容器あたり細胞１億個、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／３μＭ  ＢｒＨＰＰ、１２０ＩＵ／mlのＩＬ−２の溶液５０ml（初期細胞濃度２００万個／ml）のはいった容器で培養した。培養中、各操作の指示に従って３６０ＩＵ／mlのＩＬ２を含む同一培地を追加した。
【００８５】
２４ウエルプレートでの培養開始（融解後）
ＰＢＭＣおよびＭＮＣを２４ウエルプレートを使い、ウエルあたり１００万細胞の割合で、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／３μＭ  ＢｒＨＰＰ／１２０ＩＵ／mlＩＬ−２溶液１．５ml（６０万細胞／mlに相当）で培養した。
【００８６】
細胞条件
細胞は加湿した５％ＣＯ２大気中、３７℃で、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／３６０ＩＵ／mlＩＬ−２の中で培養し、維持した。最初の培地交換は４日目に培地を追加する形で行い、以後３日おきに行った。このようにしてＩＬ２濃度は培養期間中増加した。
【００８７】
２４ウエルプレート内で増殖した細胞を、細胞密度が３．１０6細胞／mlに達した時点で垂直に置いた２５cm3フラスコに移した。フラスコまたはバック内で培養した細胞については、培地を追加して細胞密度を２．１０6細胞／mlに維持した：最大容積＝１５０ml。培養全期間を通して同じ培養容器を使用しているため、容積が上記最大値に達した場合には細胞の一部を取り除いて（および新鮮培地を追加して）細胞密度を２．１０6細胞／mlに保つ必要がある。
【００８８】
３週間の培養期間中、数回、具体的にはＤ１０、Ｄ１５、Ｄ２０に細胞数の測定および表現形の観察を行った。細胞数の測定および表現形観察はつぎのようにして行った：
−Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターによる全生細胞数測定
−ＣＤ５６／ＣＤ３二重標識
−Ｖδ２／ＣＤ３／ＣＤ６９三重標識
−アイソタイプコントロール：ＩｇＧ１ｋ−ＦＩＴＣ／Ｒ−ＰＥ／ｃｙＣ
−フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によるデータ取得
【００８９】
細胞の増加が速い場合には、細胞数の測定を別の時点で行い、新鮮培地を補充してもよい。
【００９０】
細胞の機能分析
得た細胞に各種試験を実施し、機能活性を評価した。具体的には上記試験は、細胞の細胞傷害活性およびそのＴＮＦ産生に関する。
【００９１】
細胞傷害性試験．この試験では標的細胞を51Ｃｒ（51Ｃｒ１０μl／２４ウエルプレートの１００万標的細胞）で同位体標識し、次に１時間、３７℃でインキュベーションした。細胞を３０００細胞／ウエルの割合でＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ（５０μｌ）に分配（２重で）し、５１Ｃｒの最大自然放出を決定した。次にエフェクター細胞（発明のガンマデルタＴ細胞）（ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳの５０μｌ）を次のエフェクター／標的細胞（Ｅ／Ｔ）比：３０／１、３／１、０．３／１で各標的細胞に加え、３から４時間、３７℃でインキュベーションした。細胞傷害活性（標的細胞の溶解）を、放出した放射活性を、βプレートカウンターを用い、上清２５μｌについて測定して決定した。
【００９２】
ＴＮＦ放出試験．細胞をＲＰＭＩで２回洗浄した後、３μＭのＢｒＨＰＰ存在下に９６−ウエルプレート、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２４時間培養した。ＴＮＦは上清について、Beckman Coulter Kit Immunotech、参照番号ＩＭ１１１２１を用いアッセイした。
【００９３】
ＩＣ−結果
培地選択
ヒトリンパ球の培養、特にガンマ９デルタ２Ｔ細胞の培養にはヒト血清を補充した培地が最も適していると考えられたが、これは主に血清増殖因子が種特異的種であることが多いことに拠る。しかしこの様な培地は、生物学的リスクと大量のヒト血清の使用することから、臨床的調製および使用が極めて難しい。
【００９４】
従ってより調製が簡便な培地で細胞を培養することを試みた。試みは、ＥｐｏｘＰＰで最初の活性化した３名の供血者の全血を用いて、２４ウエルプレートで小規模実験として行った（活性化条件については材料と方法を参照）。ガンマデルタＴ細胞の濃度および数を、細胞数測定およびフローサイトメトリーを使って約３０日間の培養期間を通じ調査した。ヒト血清またはＦＣＳのいずれかを補充したＲＰＭＩ培地、および２種類の合成培地（Ｘ−ＶＩＶＯ１０と１５）を用い、３名の健康供血者について行った増殖比較試験の結果を表５に示した。
【００９５】
驚いたことにガンマ９デルタ２Ｔ細胞の増殖に最適な培地はＦＣＳ補充ＲＰＭＩ培地であった。増殖の程度はＦＣＳより低く、また供血者間で変動があるものの、ヒト血清補充培地もまたガンマ９デルタ２Ｔ細胞を有意に増加した。さらにＦＣＳ補充培地に比べ、純度および細胞数が時間と共に劣化した。試験した合成培地（無血清）では、ガンマ９デルタ２Ｔ細胞の合成培地としては最もよいものであったが、それでも細胞増殖の程度は低かった（データ未提示）。
【００９６】
結論すると、ガンマデルタＴ細胞は好適培地において長期間高い増殖能を有していた。極めて有利、かつバッチ間再現性について良い結果（データ未提示）が得られてことから、以下の研究にはＦＣＳを選択した。治療目的の使用が認められた放射線照射バッチも使用できる。無血清培地、少量の血清を含む最善の合成培地の組合せ、または合成培地の組合せといったその他培地もまた、ガンマデルタＴ細胞の高い増殖潜在能力を示すかもしれない。
【００９７】
ＰＢＬ対サイタフェレーシス
培養終了時に大量のガンマ９デルタ２Ｔ細胞を産生することを目的とすることから、場合により凍結して細胞バンクにできる、多数の細胞を含む供給源を用いて開始することに関心があった。考え得る供給源の一つは、サイタフェレーシスで獲得する単核細胞である。しかしこの方法は細胞を変化させ、十分な細胞増殖を妨げる可能性がある。サイタフェレーシスのサンプルは多数の赤血球を含むことが多いため、血小板除去直後に、または血小板除去してからＦｉｃｏｌｌ処理した後にＭＮＣの増殖を試験した（材料と方法参照）。この様にしてサイタフェレーシス由来の細胞については、十分な増殖を示すことができるか試験し、確認した。この試験をまず小規模（２４ウエルプレート、材料と方法参照）で実施し、表６に３名の供血者の結果を示す。
【００９８】
驚くべきことに、全血由来のＰＢＭＣに比べ低いもののサイタフェレーシス細胞もまた高い増殖能を有していることが分かった。さらにＦｉｃｏｌｌ処理したＭＮＣは、未処理のＭＮＣより増殖が低いことが示された。増殖は低いが、多数の細胞を得るのに必要な出発時の細胞の量を考慮し、大規模培養はＦｉｃｏｌｌにかけない新鮮ＭＮＣ細胞をつかって開始することとした。
【００９９】
この様にして健康供血者（Ｄ１００、Ｄ１１９、Ｄ１２７）の新鮮ＭＮＣについて増殖試験を実施した。各種培養容器を試験した（材料と方法を参照）。培養は２００万細胞／mlの濃度で、１億個のＭＮＣ細胞（開始容量５０ml）より開始した。細胞は３μＭのＢｒＨＰＰで刺激した。新鮮培地５０ml（ＩＬ２を３５０Ｕ／ml含む）を４日目と７日目に加えた。１０日目より細胞を分析し、そして細胞数を測定し、２００万細胞／mlに調節した。つぎに細胞を３日おきに希釈し、細胞密度を２００万細胞／mlに維持した。結果を表７に示す。
【０１００】
ある培養容器を用いた特定の供血者（例えばＮｅｘｅｌｌバッグを使った場合のＤ１００およびＤ１１９）で発明の条件の純度８０％超で、１億個のガンマ９デルタ２Ｔ細胞の値をＤ１０からの開始で得ることができた。これらの結果は、医薬品品質の機能的ガンマデルタＴ細胞の産生における発明の方法の有効性を実証している。
【０１０１】
実施例２
１０日後の細胞濃度維持研究
ＩＩＡ−ガンマ９デルタ２Ｔ細胞の増幅
前記方法に基づく別の実験を、特に記載ない限りにおいて実施例１と同一の材料と方法を用い、３名の新規供血者（Ｄ６２３、Ｄ７６２、Ｄ７１１）のＭＮＣについて実施した。培養開始条件は同一である。培地５０mlを４日目と７日目に加えた。１０日目に細胞を分析し、細胞数を測定した。１０日目まで培養は３重に実施した（供血者一人あたり同一培養を３個行った）。次に細胞密度を３濃度（２０万、５０万および１００万個／ml、各濃度について３重培養を一つ用いた）に調節し、細胞密度パラメータの影響を調べた。次に３日ごとに培養物を分析し、密度が２００万細胞／mlを越えた場合には、１０日目に密度を調節した。結果を表８に示す。
【０１０２】
１０日目以降、細胞収量および純度は実施例Ｉに比べ遙かに高いことが示された。従ってこの時点以後、培養を実施する上で細胞密度が重要な因子である。
【０１０３】
この様にしてガンマデルタＴ細胞の増殖能が良好であることが判明した。１００から４００万個のガンマＴデルタ細胞から出発して、２１日目には１１０から１３０億個の細部を、純度９０％超で獲得した。重要なことは、獲得した細胞の数が、開始時のガンマデルタＴ細胞の数に依存しないことである。
【０１０４】
ＩＩＢ−獲得した細胞の機能活性
刺激後、天然のガンマ９デルタ２Ｔ細胞はＴＮＦ（「組織壊死因子」）のようなサイトカインを産生し、幾つかの癌細胞に傷害性を示す。具体的にはガンマ９デルタ２Ｔ細胞は、Ｄａｕｄｉ（骨髄腫）細胞株を特異的に溶解するが、ＲＡＪＩ細胞株は溶解しないことが判っている。
【０１０５】
発明の細胞培養法で産生した細胞の機能性を２つのパラメータ：腎臓癌細胞株（細胞株７８６−０、ＡＴＣＣ、参照番号ＣＲＬ−１９３２）および骨髄腫細胞株（陰性コントロールとしてのＲＡＪＩ細胞）について試験した。
【０１０６】
２３日目に、本法（細胞密度２０万細胞、５０万細胞および１００万細胞／mlでの細部密度維持試験、上記参照）で獲得した細胞のこれら３種類の細胞株対する細胞障害活性を表９に示す。
【０１０７】
実際、本法で獲得した細胞は、予想通り腎臓癌およびＤａｕｄｉ細胞株に対し細胞障害性であたったが、ＲＡＪＩ細胞株に対しては有意な細胞障害性を示さなかった。細胞が腎臓癌細胞株７８６−０に対し細胞傷害性であることも示された。
【０１０８】
実施例３
凍結ＭＮＣ細胞に関する増殖試験
特に本法の実際的な実行方法は、凍結細胞を用いて開始できることであろう。事実、サイタフェレーシスは２０〜４０億個の細胞を提供できるが、この数は小分け凍結して、同一サイタフェレーシスより複数培養できる数に相当する。
【０１０９】
しかし、凍結は細胞の生存率および融解後の増殖能を大きく変化させる。
【０１１０】
実施例ＩＩの実験の３種類のＭＮＣサンプルを１０％ＤＭＳＯ／４％ＨＳＡ中に凍結した。凍結材料から新たに細胞の増幅を行った（実施例ＩＩと同一プロトコールにより）。この増幅の結果を表１０に示す。
【０１１１】
凍結細胞も極めて高純度の細胞を多数生成することができた。
【０１１２】
新鮮細胞と凍結細胞の機能活性も、新鮮細胞および凍結細胞から開始して得た細胞を同時に試験した。２種類の試験：細胞障害性試験およびＴＮＦ放出試験を行った。
【０１１３】
２１日目の新鮮細胞および凍結細胞に関する細胞障害性試験の結果を表１１に示す。
【０１１４】
２１日目の新鮮細胞および凍結細胞に関するＴＮＦ放出試験の結果を表１２に示す。
【０１１５】
これら機能試験の結果から、凍結細胞由来の細胞は新鮮細胞由来の細胞と大きな違いがないことが分かった。凍結媒体を変更すれば、細胞収量が上がる可能性がある。
【０１１６】
実施例４
注射調製物向け細胞製剤
ヒトへ注射する場合には、ＦＣＳを排除し、細胞を医薬的に許容可能な緩衝液内に取り込まなければならない。ＨＳＡを４％含有する媒体を試験した。
【０１１７】
新しい凍結サイタフェレーシスを用い、新たに細胞増幅を実施した。６種類の凍結条件について試験した：
２種類の凍結媒体：ＤＭＳＯ濃度１０％の４％ＨＳＡ液、ＤＭＳＯ濃度７．５％のＦＣＳ液。
両媒体を３細胞濃度：２５００、５０００、１５０００万細胞／mlについて試験した。
増幅プロトコールは、細胞数を７日目以降５０万個／mlに維持した以外は実施例ＩＩに同じであった。
【０１１８】
増幅結果を表１３に示す。
【０１１９】
これら凍結条件の違いの間では、ほとんど差は認められず、７．５％ＤＭＳＯ／ＦＣＳ凍結媒体について若干より良好な結果を得た。
【０１２０】
ＦＣＳ、７．５％ＤＭＳＯ中１５０００万細胞／mlの条件で産生した細胞調製物を４％ＨＳＡに製剤化した。
【０１２１】
組成物の容量を「ＣｙｔｏＭａｔｅ（商標登録）」を用い減らし、次に細胞を４％ヒト血清アルブミンで調整した。そのために、ペレットを４％ヒト血清アルブミン１００〜２００mlに懸濁し、１０００万から１億細胞／mlの間の濃度を持つ細胞浮遊液を得た。細胞数を測定し、細胞生存率を測定してから、細胞を５℃±３℃でバッグに保存し、調製物の安定性を試験した。
【０１２２】
製剤化した細胞製品を、製剤化後２、４、８および２２時間目に生存率について試験した（マラセジセル（malassez cell）を用いたトリパンブルー測定）。細胞産物は、少なくとも製剤化から２２時間後まで８０％以上の生細胞を含んでいた。
【０１２３】
製剤化した細胞製品について、ＴＮＦ放出試験を用い様々な時点で機能性を試験し、その安定性を評価した。
【０１２４】
結果を表１４に示す。
【０１２５】
製剤化した細胞は、製剤化後２２時間の時点でもＢｒＨＰＰ刺激によりＴＮＦを産生する能力を持っていることが判明した。さらに製剤化後８時間目までＴＮＦ産生に有意な差は認められなかった。
【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
【表２】
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【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
【表４】
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【０１３０】
【表５】
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【０１３１】
【表６】
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【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
【表８】
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【０１３４】
【表９】
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【０１３５】
【表１０】
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【０１３６】
【表１１】
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【０１３７】
【表１２】
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【０１３８】
【表１３】
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【０１３９】
【表１４】
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【国際調査報告】
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