(57)【要約】全血からｍＲＮＡを、簡単かつ再現性よくハイスループットに定量するための方法、装置、キットおよび自動化システムを開示する。より詳しくは、該方法、装置、キットおよび自動化システムは、オリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けた白血球フィルターの組み合わせを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）全血を採取するステップ、
（ｂ）赤血球と白血球以外の血液成分とを該全血から濾過により除去し、フィルターメンブレン上に白血球を得るステップ、
（ｃ）フィルターメンブレン上の該白血球を溶解し、ｍＲＮＡを含有する溶解物を生成させるステップ、
（ｄ）該溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化プレートに移入し、該ｍＲＮＡを捕捉するステップ、および
（ｅ）該特異的ｍＲＮＡを定量するステップ
を含む、全血中の特異的ｍＲＮＡのハイスループット定量法。
【請求項２】
前記全血は白血球の回収前に抗凝血剤を添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全血は白血球の回収前にヘパリンを添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記全血は濾過前に凍結される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フィルターメンブレンはマルチウェルフィルタープレートに取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記フィルターメンブレンがＰＢＴ繊維膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記白血球が、重ね合わせた複数のフィルターメンブレン上に捕捉される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記フィルターメンブレン上の白血球を低張緩衝液で洗浄し、赤血球および他の血液成分をさらに除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記フィルターメンブレンを乾燥させるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フィルターメンブレンがエタノールで洗浄され、該フィルターメンブレンが乾燥するまで真空吸引される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記固定化プレートが、マルチウェルオリゴ（ｄＴ）固定化プレートを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶解物のオリゴ（ｄＴ）固定化プレートへの移入が遠心分離を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶解物のオリゴ（ｄＴ）固定化プレートへの移入が真空吸引を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶解物のオリゴ（ｄＴ）固定化プレートへの移入が正圧の負荷を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍＲＮＡの定量が、前記特異的ｍＲＮＡのｃＤＮＡ合成および得られたｃＤＮＡの増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記定量されたｍＲＮＡがaアクチンｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記定量されたｍＲＮＡがＣＤ４  ｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
白血病に関与する転座遺伝子のｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
微小転移癌由来の癌特異的遺伝子のｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
感染白血球由来のウイルス由来ｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記定量されたウイルス由来ｍＲＮＡがＨＩＶである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＩＶ  ｍＲＮＡの定量がＨＩＶを診断するために用いられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記定量されたウイルス由来ｍＲＮＡがＣＭＶである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルス由来ｍＲＮＡの定量がＣＭＶを診断するために使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルス由来ｍＲＮＡの定量が、保存血をウイルス性疾患の存在についてモニターするために使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルス由来ｍＲＮＡの定量が、抗ウイルス薬の感受性を試験するために使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
白血病に関与するアポトーシス遺伝子のｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
サイトカインのｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｍＲＮＡの定量が、白血球に対する抗癌剤の副作用を試験するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡ修復遺伝子のｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ修復遺伝子のｍＲＮＡの定量が、放射線に対するＤＮＡ修復遺伝子の感受性を試験するために使用される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
アレルゲン応答遺伝子のｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アレルゲン応答遺伝子のｍＲＮＡの定量が、アレルゲン刺激を試験するために使用される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ドナー細胞媒介性サイトカインのｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ドナー細胞媒介性サイトカインのｍＲＮＡの定量が、移植片拒絶を試験するために使用される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）  ｉ）  複数のサンプルデリバリーウェル、
ｉｉ）該ウェルの下部にある白血球捕捉フィルター、および
ｉｉｉ）該フィルターの下部にあって、その上面に固定化されたオリゴ（ｄＴ）を有するｍＲＮＡ捕捉ゾーン
を備えるマルチウェルプレート、ならびに
（ｂ）前記プレートを受容し、前記プレートとの間に密封部をつくるのに適合した真空ボックス
を備えるハイスループットｍＲＮＡ定量装置。
【請求項３７】
前記真空ボックスが真空源を受容するのに適合したものである、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記真空ボックスがプラスチック製である、請求項３６に記載の装置。
【請求項３９】
前記密封部が、マルチウェルプレートの下方に配置されたプラスチック系ガスケットを備える、請求項３６に記載の装置。
【請求項４０】
前記真空ボックスと前記マルチウェルプレートの間にマルチウェルサポーターが挟持される、請求項３６に記載の装置。
【請求項４１】
前記白血球が、重ね合わせた複数のフィルターメンブレン上に捕捉される、請求項３６に記載の装置。
【請求項４２】
（ａ）請求項３６に記載のハイスループットｍＲＮＡ定量装置、
（ｂ）低張緩衝液、
（ｃ）エタノール、および
（ｄ）溶解緩衝液
を含むハイスループットｍＲＮＡ定量キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
［発明の分野］
本発明は、全血からのｍＲＮＡのハイスループット単離および定量に関する。より詳しくは、本発明はオリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けられた白血球フィルターの組み合わせを用いて、ｍＲＮＡを単離および増幅するための方法および装置に関する。
【０００２】
［関連出願の記載］
分子生物学の分野の研究により、細胞の発生起源および機能活性が、そのリボ核酸（ＲＮＡ）の研究から推論され得ることが明らかになった。この情報は、感染を診断するため、癌遺伝子発現細胞の存在を検出するため、家族性障害を発見するため、宿主の防御機構の状態をモニターするため、およびＨＬＡ型または他のマーカーの実体を調べるため、診療上有効に用いられ得る。ＲＮＡは、３種類の機能的に異なる形態：リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）で存在する。安定なｒＲＮＡおよびｔＲＮＡは、翻訳の触媒プロセスに関与し、ｍＲＮＡ分子は遺伝情報を伝達する。全ＲＮＡのわずか約１〜５％がｍＲＮＡで、約１５％がｔＲＮＡで、および約８０％がｒＲＮＡで構成される。
【０００３】
ｍＲＮＡは、特に遺伝子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを定量的に観察するために使用される場合は、重要な診断用ツールとなる。ヒト末梢血は、ｍＲＮＡを解析するための優れた臨床材料である。例えば、血中における特定のキメラｍＲＮＡの検出は、異常細胞が存在することを示し、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の分子診断に使用される。このことは、以下の文献に記載されている。
カワサキ(Kawasaki), E. S., クラーク(Clark) S. S.,コイン(Coyne) M. Y., スミス(Smith) S. D., シャンプリン(Champlin) R., ウィッテ(Witte) O. N.およびマコーミック(McCormick) F. P. 1988。 インビトロで増幅された白血病特異的ｍＲＮＡ配列の検出による慢性骨髄性白血病および急性リンパ性白血病の診断(Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic luekemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro)。 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5698-5702, 
パハマン(Pachmann) K., チャオ(Zhao) S., シェンク(Schenk) T., カンタルジャン(Kantarjian) H., エルナジャール(El-Naggar) A. K., シチリアーノ(Siciliano) M. J., グオ(Guo) J. Q., アーリンハウス(Arlinghaus) R. B.およびアンドリーフ(Andreeff) M. 2001。 インサイチュ増幅により測定された個々の慢性骨髄性白血病細胞のｂｃｒ−ａｂｌｅ  ｍＲＮＡの発現(Expression of bcr-able mRNA individual chronic myelogenous leukaemia cells as determined by in situ amplification)。 Br. J. Haematol. 112:749-59。
癌特異的ｍＲＮＡを測定することにより、微小転移癌細胞も血中において検出することができる。癌特異的ｍＲＮＡとしては、大腸癌に対する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺癌に対する前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、甲状腺癌に対するサイログロブリン(ウィンゴ(Wingo) S. T., リンゲル(Ringel) M. D., アンダーソン(Anderson) J. S., パテル(Patel) A. D., ルークス(Lukes) Y. D., ジュー(Djuh) Y. Y., ソロモン(Solomon) B., ニコルソン(Nicholson) D., バルドゥッキ-シラノ(Balducci-Silano) P. L., レバイン(Levine)
M. A., フランシス(Francis) G. L.およびタトル(Tuttle) R.. M. 1999。 健常被験体の末梢血中のサイログロブリンｍＲＮＡの定量的逆転写ＰＣＲ測定(Quantitative reverse transcription-PCR measurement of thyroglobulin mRNA in peripheral blood of healty subject). Clin. Chem. 45:785-89)、および黒色腫に対するチロシナーゼ(ペルキー(Pe
lkey) T. J., フライアソン(Frierson) H. F. Jr.およびブランス(Bruns) D. E. 1996. 
固体腫瘍由来の循環腫瘍細胞および微小転移の分子的および免疫学的検出(Molecular and
immnological detection of circulating tumor cells and micrometastasis from solid tumors)。 Clin. Chem. 42:1369-81) などを挙げることができる。
さらに、これらの癌特異的ｍＲＮＡのレベルは治療後に変化し得るため、特異的ｍＲＮＡの定量は治療の追跡調査の際の有用な指標を提供する。
【０００４】
血液は、白血球（およそ５０００白血球／μＬ）に比べて無核赤血球（およそ５００万細胞／μＬ）を大量に含むため、通常はｍＲＮＡ解析の第１段階として、全血からの顆粒球またはリンパ球の単離が行なわれる。しかしながら、異なるサンプル間で白血球の特定のサブセットの回収が整合しないため、単離白血球の数は各サンプルについて測定され、その測定結果は、血液１μＬあたりのｍＲＮＡ量としてではなく、白血球数あたりのｍＲＮＡ量として表される。さらに、ｍＲＮＡ量は、長い単離プロセスの間に変化し得る。血液から癌細胞を単離するための方法は存在しないが、遺伝子増幅技術により、異なる遺伝子からなるプールからであっても特異的ｍＲＮＡレベルの同定および定量することが可能であるので、遺伝子特異的プライマーおよび遺伝子特異的プローブが入手可能な場合には、全血はｍＲＮＡ解析用の理想的な材料となる。
【０００５】
全血は大量のＲＮアーゼ（顆粒球由来）および無核赤血球を含むため、全血から純粋なｍＲＮＡを単離することは非常に困難である。種々のＲＮＡ抽出法を、全血に適用することができるが、そのアッセイ手順は多大な労力を要し、数回の遠心分離が必要であり、リボヌクレアーゼ活性を消失させるために慎重に取り扱うことが不可欠である。前記ＲＮＡ抽出法は、
デフリース(de Vries) T. J., フルコア(Fourkour) A., プント(Punt) C. J., ルイタ
ー(Ruiter) D. J.およびバンムイジェン(van Muijen) G. N. 2000. 細胞調製チューブで
の単核細胞回収後のチロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による末梢血中の黒色腫細胞の解析：全血グアニジニウム・イソチオシアネートＲＮＡ単離法との比較(Analysis of melanoma cells in peripheral blood by reverse transcription-polymerase chain reaction for tyrosinase and MART-1 after mononuclear cell collection with cell preparation tubes: a comparison with the whole blood guanidinium isothiocyanate RNA isoation method)。 Melanoma Research 10:119-26, 
ヨハンソン(Johansson) M., ピサ(Pisa) E. K., トーマネン(Tormanen) V., アースト
ランド(Arstrand) K.およびカーゲダル(Kagedal) Bl. 2000. 血中のチロシナーゼ転写物
の定量解析(Quantitative analysis of tyrosinase transcripts in blood)。 Clin. Chem. 46:921-27, 
ウィンゴS. T., リンゲル M. D., アンダーソン J. S., パテル A. D., ルークス Y. D., ジュー Y. Y., ソロモン B., ニコルソン D., バルドゥッキ-シラノ P. L., レバイン
M. A., フランシス G. L.およびタトル R.. M. 1999. 健常被験体の末梢血中のサイログロブリンｍＲＮＡの定量的逆転写ＰＣＲ測定。 Clin. Chem. 45:785-89
に記載される。
【０００６】
その結果、全血から大量のｍＲＮＡを単離および定量するための、迅速かつ容易な方法および装置が要求されている。具体的には、回収の再現性があり遺伝子増幅への継ぎ目のない一連のプロセスを有する、全血由来のｍＲＮＡをハイスループットに処理する技術が必要とされている。
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、オリゴ（ｄＴ）固定化マルチウェルプレートに取り付けた白血球フィルターの組み合わせを用いて、回収の再現性を有する、全血から直接ｍＲＮＡを単離および定量するための効率的なハイスループット方法および装置を開示する。
【０００８】
本発明の一態様は、（ａ）全血を採取するステップ、（ｂ）赤血球と血液成分とを該全血から濾過により除去し、それにより、フィルターメンブレン上に白血球を得るステップ、（ｃ）該白血球を細胞溶解させ、それにより、ｍＲＮＡを含有する溶解物を生成させるステップ、（ｄ）該溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化プレートに移入し、それにより、該ｍＲＮＡを捕捉するステップ、および（ｅ）該ｍＲＮＡを定量するステップを含む、全血中のｍＲＮＡのハイスループット定量法を含む。
【０００９】
本方法の好ましい一実施態様では、白血球を回収する前に、全血に抗凝血剤を添加する。捕捉される白血球の収量を増大させるため、複数のフィルターメンブレンを重ね合わせてもよい。フィルターメンブレン上に捕捉された白血球を、溶解緩衝液を用いて溶解し、白血球からｍＲＮＡを遊離させる。溶解物のオリゴ（ｄＴ）固定化プレートへの移入は、遠心分離により、真空吸引により、正圧により、またはエタノール洗浄に続く真空吸引により行われ得る。ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡを作製して該ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅することにより、定量される。
【００１０】
本発明の別の態様は、（ａ）複数のサンプルデリバリーウェル、該ウェルの下部の白血球捕捉フィルター、および該フィルターの下部のｍＲＮＡ捕捉ゾーン（これは、固定化されたオリゴ（ｄＴ）を有する）を備えるマルチウェルプレート、ならびに（ｂ）該プレートを受容し、該プレートにより密閉部が形成される真空ボックスを備える、全血中のｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置を含む。該装置の好ましい一実施態様では、白血球は、重ね合わせた複数のフィルターメンブレン上に捕捉される。該装置の別の好ましい実施態様では、真空ボックスが真空源を受容する。該装置の別の好ましい実施態様では、真空ボックスとマルチウェルプレートの間にマルチウェルサポーターが挟持される。
【００１１】
本発明の別の態様は、全血中のｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置、ヘパリン、低張緩衝液および溶解緩衝液を含むキットを含む。
【００１２】
本発明の別の態様は、血液サンプル、低張緩衝液および溶解緩衝液を装置に適用するロボット、自動真空吸引装置および遠心分離機、ならびに自動ＰＣＲ機を備える、全血中のｍＲＮＡをハイスループットに定量するための完全に自動化されたシステムを含む。
【００１３】
［好ましい実施態様の詳細な説明］
本発明は、大容量の未調製の全血の解析を可能にし、白血球のみに由来するｍＲＮＡを解析する効率的な手段を提供する。該手段は、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡを除去し、一貫してｍＲＮＡを回収することができ、自動化に容易に適合され得る。本発明は、リアルタイムＰＣＲを用いる絶対定量が可能であって、かつ変動係数が２０〜２５％の範囲の優れた再現性を有する感度の高い定量システムを提供する。さらにまた、本発明は種々の疾患標的に適用することができる（表Ｉ）。
【００１４】
【表１】
2005525114.tif 000002
【００１５】
本発明は、なんら特定の機械的構造に限定されるものではない。しかしながら、図１および２は、本発明のハイスループットｍＲＮＡ定量を実施するための、好ましい構造を示す。真空ボックス１０は、前記構造の基本を構成する。真空ボックスは、真空吸引に耐え得る充分強い任意の材料で作られたものであり得るが、その材料は使い捨てプラスチック材料が好ましい。真空ボックスは、真空吸引を行なうための真空源１２を受容するのに適合している。フィルタープラグ１４は、真空ボックスの真空吸引装置アダプター内に配置される。真空ボックス１０は、マルチウェルフィルタープレート４０、または任意選択でマルチウェルサポーター２０とかみ合うための縁１６を有することが好ましい。マルチウェルサポーター２０は、任意選択で、マルチウェルフィルタープレート４０を支持するように、真空ボックスの上部の内部に設けられる。好ましくはシリコン系ゴムまたは他の軟質プラスチックで構成される密封ガスケット３０が、マルチウェルサポーターの上面に配置される。密封ガスケットの上部にマルチウェルフィルタープレート４０が配置され、フィルタープレートは多数のサンプルウェル４６、サンプルデリバリーウェルの下に多重白血球捕捉フィルター４２、およびフィルターの下にｍＲＮＡ捕捉ゾーン４４を備える。固定化されたオリゴ（ｄＴ）が、ｍＲＮＡ捕捉ゾーンのウェルに含まれている。
【００１６】
好ましい一実施態様は、全血からｍＲＮＡを定量するための、簡単で再現性のあるハイスループット方法を含む。速やかなプロトコルであるため、採血後のｍＲＮＡの副次的な誘発または分解が最小限に抑えられ、９６ウェルのフィルタープレートおよびマイクロプレートの使用により、９６サンプルを同時処理することができる。手順間の操作が最少であることから、定量の手段としてＰＣＲを用いた場合であっても、サンプル間の変動が非常に少なく、変動係数（ＣＶ）値は３０％未満である。
【００１７】
一実施態様では、本方法は真空ボックスの作製を含む。好ましい一実施態様では、ポリアクリレートポリマーマトリックス（Ｒｅｄ  Ｚ、Safetec）などの血液カプセル封入体
を真空ボックスに入れ、血液を固化する。次いで、マルチウェルサポーターを真空ボックス内に配置する。次いで、シリコン系ゴムまたは他の軟質プラスチック製の密封ガスケットをマルチウェルプレートサポーターの上面に配置する。フィルタープラグ（Ｘ−６９５３、６０μ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌｕｇ  ＨＤＰＥ、Porex Products Groups）を真空ボッ
クスの真空吸引装置アダプター内に配置する。
【００１８】
この実施態様における方法は、フィルタープレートの作製を含む。白血球を捕捉するために、ガラス繊維膜または白血球フィルターメンブレンのいずれかを使用することができ
る。マルチウェルフィルタープレートをガラス繊維膜または白血球フィルターメンブレンを用いて作製することにより、多数の血液検体を同時に処理することができ、アッセイを簡素化することができる。白血球を捕捉するためのフィルターの例は、米国特許第４，９２５，５７２号および同第４，８８０，５４８号に記載されており、これらの記載は参照により本明細書に援用される。一般に、繊維表面上への白血球の吸着は白血球を除去する機構であると考えられている。所与の重量の繊維の表面積は、その繊維の直径に反比例する。したがって、使用される繊維の直径が小さい場合、繊維が細いほど、より大きな吸着容量(capacity)を有することが期待され、さらに所望の有効性を達成するのに必要な量（繊維の重量として測定される量）はより少ないことが期待される。一般に使用されるいくつかの繊維（ポリエステル、ポリアミドおよびアクリル系繊維など）は、グラフト重合されるために必要とされるレベルのアルファ線による分解に対して充分な耐性を有し、かつ利用可能なモノマーが反応できる構造を有するため、放射線グラフト重合されるのに適している。ＰＢＴは、本発明の製造物の開発に使用された主な樹脂であり、本実施例で使用された樹脂である。しかしながら、繊維化されることができ、１．５マイクロメートル以下の細い繊維からなるマットまたは織物を形成することができる他の樹脂も存在し得る。該樹脂は、臨界ぬれ表面張力が必要に応じて最適範囲に調整されている。また、該樹脂はフィルタープレートの効率的な製造に適しており、さらに小型の白血球除去装置の製造に適している可能性があることに注意されたい。同様にして、適切に処理されたガラス繊維が、効果的な装置を作製するために使用可能であり得る。ＣＤ４  ｍＲＮＡの吸着は、ＰＢＴ系フィルターを使用した場合、ガラス繊維系フィルターを使用した場合とは対照的に４倍まで有効である。フィルタープレートは真空ボックス内に配置される。
別の好ましい実施態様では、全血から捕捉される白血球の量を増加させるために、複数のフィルターメンブレンを重ね合わせる。好ましい一実施態様では、フィルタープレートをプレートサポーターおよび密封ガスケット上に配置する。別の好ましい実施態様では、フィルタープレートはプラスチック製粘着テープ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ２２３−９４４４）で密封されており、所望数のウェルのテープをカットして利用可能にすることができる。別の好ましい実施態様では、サンプルが添加される各ウェルを低張緩衝液（２００μＬ  ５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）で洗浄する。
【００１９】
本方法は、血液の採取、マルチウェルフィルタープレートへの血液の添加、ならびに赤血球および他の非白血球成分の除去を含むことが好ましい。好ましい一実施態様では、抗凝血剤を含む血液回収用チューブ内に全血を吸引する。これにより白血球の濾過効率が増大する。抗凝血剤であるヘパリンは、白血球の濾過効率を増大させるのに特に有効である。
好ましい一実施態様では、血液サンプルを凍結してもよい。これによりｍＲＮＡを破壊するＲＮアーゼが一部除去される。ウェルを低張緩衝液で洗浄してもよい。フィルタープレート上の所望数のウェルに血液が添加されると、血液はフィルターメンブレンにより濾過される。該濾過は、遠心分離、真空吸引または正圧などの当業者に知られた任意の技術により行なわれ得る。
【００２０】
特に好ましい一実施態様では、血液サンプルをフィルタープレートウェルに添加した後、真空吸引を開始する（６ｃｍＨｇ）。各ウェルを、何回か低張緩衝液で洗浄する（２００μＬ  ５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４で１２回）。別の好ましい実施態様では、サンプルの入った各ウェルをエタノールで洗浄して（２００μＬ  １００％エタノールで１回）フィルターメンブレンを乾燥させ、真空吸引する際の白血球捕捉効率を有意に増加させる。別の好ましい実施態様では、次に減圧を負荷する（２０ｃｍＨｇで＞２分間）。
【００２１】
本方法は、細胞溶解、およびｍＲＮＡ捕捉ゾーン内に固定化されたオリゴ（ｄＴ）へのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションを含む。溶解緩衝液をフィルタープレートウェルに添加し（４０μＬ／ウェル）、インキュベーションし（室温で２０分間）、捕捉された白血
球からｍＲＮＡを遊離させる。好ましい一実施態様では、マルチウェルフィルタープレートを、プラスチック製バッグ内に密封し、遠心分離機にかける（ＩＥＣ  ＭｕｌｔｉＲＦ、２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）。次いで、溶解緩衝液を再度添加（２０μＬ／ウェル）した後、遠心分離機にかける（ＩＥＣ  ＭｕｌｔｉＲＦ、３０００ｒｐｍ、４Ｃで５分間）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機から取り出し、インキュベートする（室温で２時間）。
【００２２】
本方法はｍＲＮＡの定量を含む。好ましい実施態様では、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成およびＰＣＲを用いたｃＤＮＡの増幅を含む。好ましい一実施態様では、マルチウェルフィルタープレートを、溶解緩衝液（１５０μＬ／ウェルで３回、マニュアル）および洗浄緩衝液（１５０μＬ／ウェルで３回、マニュアルまたはＢｉｏＴｅｋ＃Ｇ４）で洗浄する。次いで、ｃＤＮＡ合成緩衝液をマルチウェルフィルタープレートに添加する（４０μＬ／ウェル、マニュアルまたはＩ＆Ｊ＃６）。Ａｘｙｍａｔ（Amgen  ＡＭ−９６−ＰＣ
Ｒ−ＲＤ）をマルチウェルフィルタープレート上に配置してもよく、次いで、これをヒートブロック（３７Ｃ、ＶＷＲ）上に配置してインキュベートする（＞９０分）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機にかけてもよい（２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）。ＰＣＲプライマーを３８４ウェルＰＣＲプレートに添加し、ｃＤＮＡをマルチウェルフィルタープレートから３８４ウェルＰＣＲプレートに移す。ＰＣＲプレートを遠心分離機にかけ（２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）、リアルタイムＰＣＲを開始する（ＴａｑＭａｎ／ＳＹＢＥＲ）。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施態様は、全血からのｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置を含む。該装置は、多数のサンプルデリバリーウェル、サンプルデリバリーウェルの下部の白血球捕捉フィルター、および該フィルターの下部のｍＲＮＡ捕捉ゾーン（ｍＲＮＡ捕捉ゾーンは、ウェル内のｍＲＮＡ捕捉ゾーンに固定化されたオリゴ（ｄＴ）を含む）を備えるマルチウェルフィルタープレートを含む。白血球回収効率を高めるため、いくつかのフィルターメンブレンを重ね合わせてもよい。マルチウェルプレートは真空ボックス上に取り付けられるが、真空ボックスはマルチウェルプレートを受容し、マルチウェルプレートにより密封部が形成される。該装置の好ましい一実施態様では、真空ボックスは、真空吸引を行なうための真空源を受容する。別の好ましい態様では、マルチウェルサポーターを、真空ボックス内のマルチウェルフィルタープレートの下方に配置する。該装置の別の好ましい実施態様では、シリコン系ゴムなどの軟質プラスチック製であり得る密封ガスケットがマルチウェルサポーターとマルチウェルフィルタープレートとの間に挟持される。
【００２４】
別の好ましい実施態様は、全血からのｍＲＮＡをハイスループットに定量するためのキットを含む。該キットは、全血からのｍＲＮＡをハイスループットに定量するための装置、ヘパリン含有血液回収用チューブ、低張緩衝液および溶解緩衝液を含む。
【００２５】
別の好ましい実施態様は、血液サンプル、低張緩衝液および溶解緩衝液を装置に適用するためのロボット、自動真空吸引装置および遠心分離機、ならびに自動ＰＣＲ機を備える、全血中のｍＲＮＡをハイスループットに定量するための完全自動化システムを含む。
【実施例】
【００２６】
本発明の方法の種々のプロトコルを試験し、全血からβ−アクチンｍＲＮＡおよびＣＤ４  ｍＲＮＡを定量するために使用した。
【００２７】
３種類の抗凝血剤：ＡＣＤ、ＥＤＴＡおよびヘパリンを試験した結果、ヘパリンが最も高い白血球保持率をもたらした。ＡＣＤ血を移入する際にＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜が使用されたが、４層の膜を同時に使用しても、およそ１５〜４０％の白血球が通り抜けた。ＥＤ
ＴＡ血について試験したが、吸着容量および白血球保持についてはＡＣＤ血の場合と同様であることがわかった。しかしながら、もっとも注目すべきは、ヘパリン血中の白血球の１００％がＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜上に捕捉されたことである。ヘパリン血由来の白血球を１００％捕捉したことは、本発明を用いたｍＲＮＡの定量の信頼性を示す。これらのデータは、ｍＲＮＡを正確に定量するにはヘパリン血を使用することが非常に適しているのに対し、大容量の血液を要し、さほど定量的な結果が必要とされない場合にはＡＣＤ血が有用であることを示す。
【００２８】
凍結血サンプルと新鮮血サンプルを用いた結果を比較した。図３に示されるように、凍結サンプルの漏出細胞（leaked cell）からよりも新鮮血の漏出細胞からのほうが、より
多くのＣＤ４  ｍＲＮＡが回収された。
【００２９】
また、ガラス繊維フィルターの全血保持の有効性を、ＰＢＴ系フィルターメンブレンの保持値と比較して調べた。表ＩＩに示されるように、ガラス繊維膜は、膜を低張緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）で洗浄して赤血球を破壊した場合でさえ、４０μＬの全血しか受容しなかった。しかしながら、Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂフィルターは、表ＩＩに示されるように、ガラス繊維フィルターよりも有意に多くの量の全血を受容した。
【００３０】
【表２】
2005525114.tif 000003
【００３１】
様々な回数の低張緩衝液による洗浄を施して、赤血球および他の血液成分を除去した。図４に示されるように、サンプルを低張緩衝液で少なくとも３回洗浄すると、洗浄しない場合と比べて、捕捉されたＣＤ４  ｍＲＮＡの量が２倍以上になった。また、図４は、血液を低張緩衝液で１２回洗浄したときに、最も多くのｍＲＮＡが捕捉されたことを示す。
さらに最終ＣＤ４  ｍＲＮＡ定量に関して、白血球を回収するための種々の方法、すなわち血液サンプルの真空吸引による方法、遠心分離による方法、ならびにエタノール洗浄に続いて真空吸引による方法を比較した。図５は、真空吸引による方法が遠心分離による方法よりも良好なＣＤ４  ｍＲＮＡ定量をもたらすことを示し、かつ真空吸引前にエタノールで血液サンプルを洗浄する方法によると、最も多くのｍＲＮＡが得られることを示す。
【００３２】
白血球をガラス繊維膜またはＬｅｕｋｏｓｏｒｂ膜上に捕捉し、様々な回数の低張緩衝液による洗浄を施して、赤血球および他の血液成分を除去した。捕捉された白血球からｍＲＮＡを遊離させるため、溶解緩衝液（ＲＮＡｔｕｒｅ）をフィルタープレートに添加し（４０μＬ／ウェル）、プレートを室温で２０分間インキュベートした。溶解緩衝液中に増幅プライマーを含有させることが好ましい。図６は、溶解緩衝液がＲＮアーゼ阻害に重要な役割を果たし、溶解緩衝液により失活したＲＮアーゼが好酸球に充満していることを示す。次いで、マルチウェルフィルタープレートをプラスチック製バッグ内に密封し、遠心分離機にかけた（ＩＥＣ  ＭｕｌｔｉＲＦ、２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）。次いで、溶解緩衝液を再度添加し（２０μＬ／ウェル）、続いて遠心分離機にかけた（ＩＥＣ  ＭｕｌｔｉＲＦ、３０００ｒｐｍ、４Ｃで５分間）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機から取り出し、室温で２時間インキュベートして、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡテイルと固定化オリゴ（ｄＴ）とをハイブリダイゼーションさせた。次いで、マルチウェルフィルタープレートを１５０μＬの溶解緩衝液で３回洗浄して、残留リボヌクレアーゼを除去し、続いて１５０μＬの洗浄緩衝液（ＢｉｏＴｅｋ＃Ｇ４）で３回洗浄して、ｃＤＮＡ合成のインヒビターをいくらか含有する溶解緩衝液を除去した。
【００３３】
前述した最後の洗浄により、洗浄緩衝液はマルチウェルフィルタープレートから完全に除去され、予備混合したｃＤＮＡ緩衝液４０μＬを添加することにより各ウェル内でｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ緩衝液は、５×第１鎖緩衝液（Promega Ｍ５３１Ａ、１０ｍＭ
ｄＮＴＰ（Promega stock、２０×））、プライマー（５μＭ、＃２４）、ＲＮａｓｉ
ｎ（Promega Ｎ２１１Ａ、４００Ｕ／μＬ）、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Promega Ｍ１７０Ａ、２００Ｕ／μＬ）およびＤＥＰＣ水から構成される。図７は、ｍＲＮＡを定量するための最適ＭＭＬＶ濃度が０．２５ユニット／ウェルであることを示す。
【００３４】
Ａｘｙｍａｔ（Amgen ＡＭ−９６−ＰＣＲ−ＲＤ）をマルチウェルフィルタープレート上に配置し、次いでこれをヒートブロック（３７Ｃ、ＶＷＲ）上に配置してインキュベートした（＞９０分）。次いで、マルチウェルフィルタープレートを遠心分離機にかけた（２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）。ＰＣＲプライマーを３８４ウェルＰＣＲプレートに添加し、ｃＤＮＡをマルチウェルフィルタープレートから３８４ウェルＰＣＲプレートに移した。図８は、ＰＣＲのための最適ｃＤＮＡ値がおよそ２μＬ／ウェルであることを示す。ＰＣＲプレートを遠心分離機にかけ（２０００ｒｐｍ、４Ｃで１分間）、リアルタイムＰＣＲを開始した（ＴａｑＭａｎ／ＳＹＢＥＲ）。本発明の方法は高いｍＲＮＡ特異性を有し、ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲでのＣＤ４  ｍＲＮＡの増幅では、ＤＮＡコンタミネーションは検出されなかった（＜１０コピー／ウェル）。
【００３５】
図９に示されるように、本発明はｍＲＮＡ定量の変動係数が小さい。２時間のハイブリダイゼーションでは、これまでのｍＲＮＡ定量の変動係数がおよそ３００％であるのに対して、該変動係数が１３％未満であった。さらにまた、図１０に示される直線的な結果は
、捕捉されるｍＲＮＡの量が、１ウェルあたりに使用された全血の容量に正比例することを示し、本発明が信頼性および再現性のあるｍＲＮＡの定量法であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ハイスループットｍＲＮＡ装置の分解組立図である。
【図２】白血球フィルターおよびオリゴ（ｄＴ）固定化フィルターウェルを含む、ハイスループットｍＲＮＡ装置のマルチウェルプレートを示す図である。
【図３】新鮮血サンプルおよび凍結血サンプルのフィルタープレート上での白血球捕捉効率を示すグラフである。
【図４】ｍＲＮＡ定量に対する、血液洗浄の回数の効果を示すグラフである。
【図５】ｍＲＮＡ定量に対する、細胞溶解前におけるフィルタープレートの最終処理の効果を示すグラフである。
【図６】溶解緩衝液がＲＮアーゼを阻害する程度を示すグラフである。
【図７】ｍＲＮＡを定量するための逆転写酵素の最適濃度を示すグラフである。
【図８】ｍＲＮＡを捕捉するためのＰＣＲにおける、最適ｃＤＮＡ値を示すグラフである。
【図９】本発明のハイブリダイゼーションの動態を示すグラフである。
【図１０】１ウェルあたりに使用された全血容量とｍＲＮＡ定量との直線的な関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2005525114.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2005525114.tif 000010
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月27日(2005.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）全血を採取するステップ、
（ｂ）赤血球と白血球以外の血液成分とを該全血から濾過により除去し、フィルターメンブレン上に白血球を得るステップ、
（ｃ）フィルターメンブレン上の該白血球を溶解し、ｍＲＮＡを含有する溶解物を生成させるステップ、
（ｄ）該溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化プレートに移入し、該ｍＲＮＡを捕捉するステップ、および
（ｅ）該特異的ｍＲＮＡを定量するステップ
を含む、全血中の特異的ｍＲＮＡのハイスループット定量法。
【請求項２】
前記全血は白血球の回収前に抗凝血剤を添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全血は濾過前に凍結される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フィルターメンブレンはマルチウェルフィルタープレートに取り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記白血球が、重ね合わせた複数のフィルターメンブレン上に捕捉される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記フィルターメンブレン上の白血球を低張緩衝液で洗浄し、赤血球および他の血液成分をさらに除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フィルターメンブレンがエタノールで洗浄され、該フィルターメンブレンが乾燥するまで真空吸引される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記溶解物のオリゴ（ｄＴ）固定化プレートへの移入が遠心分離、真空吸引または正圧の負荷を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡの定量が、前記特異的ｍＲＮＡのｃＤＮＡ合成および得られたｃＤＮＡの増幅を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記定量されるｍＲＮＡが、β−アクチンｍＲＮＡ、ＣＤ４  ｍＲＮＡまたは白血病に関与する転座遺伝子のｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
微小転移癌由来の癌特異的遺伝子のｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
感染白血球由来のウイルス由来ｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記定量されるウイルス由来ｍＲＮＡがＨＩＶであって、ＨＩＶを診断するために用いられる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記定量されるウイルス由来のｍＲＮＡがＣＭＶであって、ＣＭＶを診断するために使用される請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルス由来ｍＲＮＡの定量が、保存血をウイルス性疾患の存在についてモニターするために使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウイルス由来ｍＲＮＡの定量が、抗ウイルス薬の感受性を試験するために使用される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
白血病に関与するアポトーシス遺伝子のｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
サイトカインのｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｍＲＮＡの定量が、白血球に対する抗癌剤の副作用を試験するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ修復遺伝子のｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ修復遺伝子のｍＲＮＡの定量が、放射線に対するＤＮＡ修復遺伝子の感受性を試験するために使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アレルゲン応答遺伝子のｍＲＮＡが定量され、アレルゲン刺激を試験するために用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ドナー細胞媒介性サイトカインのｍＲＮＡが定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ドナー細胞媒介性サイトカインのｍＲＮＡの定量が、移植片拒絶を試験するために使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）  ｉ）  複数のサンプルデリバリーウェル、
ｉｉ）該ウェルの下部にある白血球捕捉フィルター、および
ｉｉｉ）該フィルターの下部にあって、その上面に固定化されたオリゴ（ｄＴ）を有するｍＲＮＡ捕捉ゾーン
を備えるマルチウェルプレート、ならびに
（ｂ）前記プレートを受容し、前記プレートとの間に密封部をつくるのに適合した真空
ボックス
を備えるハイスループットｍＲＮＡ定量装置。
【請求項２６】
前記密封部が、マルチウェルプレートの下方に配置されたプラスチック系ガスケットを備える、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記真空ボックスと前記マルチウェルプレートの間にマルチウェルサポーターが挟持される、請求項２５に記載の装置。
【請求項２８】
（ａ）請求項２５に記載のハイスループットｍＲＮＡ定量装置、
（ｂ）低張緩衝液、
（ｃ）エタノール、および
（ｄ）溶解緩衝液
を含むハイスループットｍＲＮＡ定量キット。
【国際調査報告】
2005525114.tif 000014
2005525114.tif 000015