(57)【要約】本発明は、プラス鎖のＲＮＡウイルスによる感染症を処置するための、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用に関し、ここで、ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１は、ウイルスゲノムの翻訳可能なドメインのセグメントに少なくとも部分的に相補的なドメインを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用であって、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示す、前記使用。
【請求項２】
（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための医薬を製造するための、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用であって、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示す、前記使用。
【請求項３】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害することができる、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼの発現を阻害することができる、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ウイルスＲＮＡの読みとり方向におけるセグメントが、ヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼをコードするウイルスゲノムの前に、またはこの領域中に配置されている、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
相補的な領域が、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
鎖Ｓ１が、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
ｄｓＲＮＡが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端であるこの末端において、オーバーハングを有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
ｄｓＲＮＡが、経口的に、吸入、注入または注射により、特に静脈内または腹腔内注入もしくは注射により投与するのに適する製剤中に存在する、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
製剤が、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水溶液または生理学的に許容される緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水溶液とから、特に専らなる、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
ｄｓＲＮＡが、生理学的に許容される溶液中に、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
ｄｓＲＮＡを、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり最大５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇおよび最適には最大２５μｇの投与量で用いる、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための医薬であって、該医薬が、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ここで、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示す、前記医薬。
【請求項１７】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、請求項１６に記載の医薬。
【請求項１８】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害することができる、請求項１６または１７に記載の医薬。
【請求項１９】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼの発現を阻害することができる、請求項１６〜１８のいずれかに記載の医薬。
【請求項２０】
ウイルスＲＮＡの読みとり方向におけるセグメントが、ヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼをコードするウイルスゲノムの前に、またはこの領域中に配置されている、請求項１６〜１９のいずれかに記載の医薬。
【請求項２１】
相補的な領域が、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１６〜２０のいずれかに記載の医薬。
【請求項２２】
鎖Ｓ１が、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１６〜２１のいずれかに記載の医薬。
【請求項２３】
ｄｓＲＮＡが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する、請求項１６〜２２のいずれかに記載の医薬。
【請求項２４】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端であるこの末端において、オーバーハングを有する、請求項２３に記載の医薬。
【請求項２５】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項１６〜２４のいずれかに記載の医薬。
【請求項２６】
医薬が、経口的に、吸入、注入または注射により、特に静脈内または腹腔内注入もしくは注射により投与するのに適する製剤である、請求項１６〜２５のいずれかに記載の医薬。
【請求項２７】
製剤が、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水溶液または生理学的に許容される緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水溶液とから、特に専らなる、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
ｄｓＲＮＡが、溶液中の、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中の医薬中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１６〜２７のいずれかに記載の医薬。
【請求項２９】
医薬が、ｄｓＲＮＡを、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇおよび最適には２５μｇの最大投与量を可能にする量で含む、少なくとも１つの投薬単位において利用可能である、請求項１６〜２８のいずれかに記載の医薬。
【請求項３０】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスの細胞中での複製を阻害する方法であって、少なくとも１つの２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を、細胞中に導入し、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示す、前記方法。
【請求項３１】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼの発現を阻害する、請求項３０〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ウイルスＲＮＡの読みとり方向におけるセグメントが、ヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼをコードするウイルスゲノムの前に、またはこの領域中に配置されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
相補的な領域が、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項３０〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
鎖Ｓ１が、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項３０〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ｄｓＲＮＡが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する、請求項３０〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端であるこの末端において、オーバーハングを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項３０〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
ｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項３０〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、（＋）鎖ＲＮＡウイルスのゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示す、前記２本鎖リボ核酸。
【請求項４２】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである、請求項４１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４３】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害することができる、請求項４１または４２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４４】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼの発現を阻害することができる、請求項４１〜４３のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４５】
ウイルスＲＮＡの読みとり方向におけるセグメントが、ヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼをコードするウイルスゲノムの前に、またはこの領域中に配置されている、請求項４１〜４４のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４６】
相補的な領域が、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項４１〜４５のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４７】
鎖Ｓ１が、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項４１〜４６のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４８】
ｄｓＲＮＡが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する、請求項４１〜４７のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４９】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端であるこの末端において、オーバーハングを有する、請求項４８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５０】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項４１〜４９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５１】
ｄｓＲＮＡが、経口的に、吸入、注入または注射により、特に静脈内または腹腔内注入もしくは注射により投与するのに適する製剤中に存在する、請求項４１〜５０のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５２】
製剤が、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水溶液または生理学的に許容される緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水溶液とから、特に専らなる、請求項５１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５３】
ｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項４１〜５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための、２本鎖リボ核酸の使用、並びに医薬を製造するためのこのようなリボ核酸の使用、（＋）鎖ＲＮＡウイルスの複製を阻害するための医薬および方法に関する。
【０００２】
細胞中の標的遺伝子の発現を阻害するための方法は、DE 101 00 586 C1から知られており、ここで、２本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチドが、細胞中に導入される。２本鎖構造の１本の鎖は、ここでは、標的遺伝子に相補的である。
【０００３】
遺伝情報のキャリアとして、（＋）鎖ＲＮＡウイルスは、細胞内部において、タンパク質合成がそこで直接起こり得るＲＮＡを示す。これにより、転写が不必要になる。翻訳されない３’および５’領域を除いて、ウイルスゲノムの全長は、ポリタンパク質に翻訳される。個別の、機能的に活性な構造タンパク質および非構造タンパク質は、切断の結果、ポリタンパク質から出現する。非構造タンパク質配列は、ウイルスゲノム中の構造タンパク質配列に続く。非構造的なＮＳ３タンパク質は、セリンプロテアーゼドメインを有する多機能性酵素であり、ＮＴＰアーゼおよびヘリカーゼ活性を示す。（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症の処置のための以前の方法は、わずかな成功しか経験せず、ほとんどの感染した患者において、疾患の状態の継続的な改善をもたらさなかった。
【０００４】
本発明の課題は、従来技術によるこれらの欠点を克服することにある。特に、（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための有効な使用を利用可能とする。さらに、（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための医薬およびこのような医薬を製造するための使用を、利用可能とする。さらに、（＋）鎖ＲＮＡウイルスの複製を阻害するための方法を、利用可能とする。
【０００５】
この課題は、請求項１、２、１６、３０および４１における特徴により解決される。有利な態様は、請求項３〜１５、１７〜２９、３１〜４０および４２〜５３における特徴から得られる。
【０００６】
本発明において、（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用が意図され、ここで、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１は、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に(segmentally)相補的である領域を示す。さらに、本発明は、（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための医薬を製造するための、このようなｄｓＲＮＡの使用に関する。
【０００７】
いずれが、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域の部分であるかは、問題ではない。驚異的なことに、ウイルスゲノムは、多くのタンパク質をコードするが、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域の任意のセグメントに相補的である鎖Ｓ１を有するｄｓＲＮＡが用いられる際には、これは、（＋）鎖ＲＮＡウイルスの複製の阻害に十分である。このようなｄｓＲＮＡは、ウイルスＲＮＡゲノムの完全性を、ＲＮＡ干渉により恒常的に破壊し得る。この理由のために、それは、このようなウイルス感染症を処置するのに、理想的に適している。処置により、疾患の状態の継続的な改善がもたらされる。
【０００８】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であることができる。この分野における有効な処置は、現在まで、Ｃ型肝炎ウイルスに対する有効なワクチンを製造することが可能ではなかったため、特に重要である。ヒトにおいて、ＨＣＶ感染症により、重大な疾患に至り得、特に慢性肝炎から、肝硬変および肝臓癌に至り得る。
【０００９】
感染した細胞において、ｄｓＲＮＡは、（＋）鎖ＲＮＡウイルスの（＋）鎖ＲＮＡを、前述のセグメントの領域において酵素的に切断されるようにする。切断部位の前のウイルスＲＮＡの読みとり方向における領域は、尚翻訳することができ、少なくとも部分的に機能的なタンパク質をもたらすことができる。これらのタンパク質の発現は、必ずしも阻害されない。この方法の有利な態様において、ｄｓＲＮＡは、ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害することができる。また、部分的な阻害が結果として起こり得、即ち、従って、完全なポリタンパク質の一部のみが発現されるか、または、発現されたポリタンパク質の合計量が、減少する。
【００１０】
ｄｓＲＮＡは、好ましくは、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼの発現を阻害することができる。このためには、ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が相補的であるセグメントを、ウイルスＲＮＡの読みとり方向において、ヘリカーゼをコードするウイルスゲノム領域の前、またはこの領域中に配置することができる。驚異的なことに、ウイルスヘリカーゼの発現の阻害は、特に有利である。本発明者らは、ウイルスヘリカーゼの存在により、ｄｓＲＮＡの複製阻害作用が減少することを見出した。ヘリカーゼの発現の阻害のために、ｄｓＲＮＡの作用は、他のウイルスタンパク質の発現の阻害における場合よりも、強力である。
【００１１】
ｄｓＲＮＡの相補的な領域は、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有することができる。この構造を有するｄｓＲＮＡは、特に、ウイルス感染症の処置において、および特にウイルス複製の阻害において、効率的である。ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１は、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有することができる。これらのヌクレオチドの数はまた、ｄｓＲＮＡにおける可能な塩基対の最大の数である。このようなｄｓＲＮＡは、特に細胞内で安定である。
【００１２】
ｄｓＲＮＡは、好ましくは、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する。１本鎖オーバーハングにより、ｄｓＲＮＡの、血液、血清および細胞中での安定性は、低下する一方、同時に、ｄｓＲＮＡの複製阻害作用は増大する。ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみにおいて、特に鎖Ｓ１の３’末端を示すこの末端において、オーバーハングを有する場合、特に有利である。２つの末端を有するｄｓＲＮＡにおいて、他方の末端は、したがって平滑であり、即ち、オーバーハングを有しない。驚異的なことに、ｄｓＲＮＡの複製阻害作用を増大させるために、ｄｓＲＮＡの一方の末端における１つのオーバーハングで十分であり、２つのオーバーハングで生じる程度に、安定性を低下させないことが、示された。１つのみのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それ自体で、種々の細胞培養培地中で、並びに血液、血清および細胞中で、十分に安定であり、特に有効であることが示された。ウイルスの複製の阻害は、オーバーハングが、鎖Ｓ１の３’末端に位置する際に、特に有効である。
【００１３】
好ましくは、ｄｓＲＮＡは、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、即ちこれは、２つの個別の鎖から構成される。ｄｓＲＮＡは、鎖Ｓ１（アンチセンス鎖）が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有する際に、特に有効である。ここで、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡ末端は、平滑である。
【００１４】
ｄｓＲＮＡは、経口的に、吸入、注入または注射により、特に静脈内または腹腔内注入もしくは注射により投与するのに適する製剤中に存在することができる。この製剤は、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水溶液または生理学的に許容される緩衝液とから、特に専らなることができる。生理学的に許容される緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水溶液であることができる。驚異的なことに、このような溶媒またはこのような緩衝液に単に溶解され、投与されたｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが特別のビヒクル中に包まれる(be packaged)ことを要することなく、細胞により取り込まれ、標的遺伝子の発現またはウイルスの複製を阻害することが、示された。
【００１５】
好ましくは、ｄｓＲＮＡは、生理学的に許容される溶液中に、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイド(capsoid)または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する。生理学的に許容される緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水溶液であることができる。ミセル構造、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、ｄｓＲＮＡの感染細胞中への取り込みを促進することができる。高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、ポリブチルシアノアクリレートなどの少なくとも１種の生分解性ポリマーからなる。高分子ナノもしくはマイクロカプセルは、これに含まれたか、または結合したｄｓＲＮＡを、体内で輸送し、放出することができる。ｄｓＲＮＡは、経口的に、吸入、注入または注射により、特に静脈内または腹腔内注入もしくは注射により、投与するか、または摂取することができる。
【００１６】
好ましくは、ｄｓＲＮＡを、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり最大５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇおよび最適には最大２５μｇの投与量で用いる。ｄｓＲＮＡは、この投与量においても、（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症の処置において、顕著な有効性を示すことが示された。
【００１７】
さらに、本発明は、（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための医薬であって、該医薬が、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ここで、１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示す、前記医薬に関する。好ましくは、該医薬は、ｄｓＲＮＡを、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇおよび最適には２５μｇの最大投与量を可能にする量で含む、少なくとも１つの投薬単位において利用可能である。この投薬単位を、単一の１日用量投与または摂取のために調合することができる。この場合、１日用量の全体が、単一の投薬単位に含まれている。投薬単位が、１日数回投与または摂取されるように調合されている場合、各用量中に含まれるｄｓＲＮＡの量は、合計の１日の投与量を達成するために、相応して一層少ない。投薬単位はまた、数日間にわたる単一の投与または摂取のために、例えば、ｄｓＲＮＡが数日にわたって放出されるように、調合することができる。この場合、投薬単位は、相応して複数の１日用量を含む。
【００１８】
さらに、本発明において、（＋）鎖ＲＮＡウイルスの細胞中での複製を阻害する方法が意図され、ここで、少なくとも１つの２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を、細胞中に導入し、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１は、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示す。本発明は、さらに、ｄｓＲＮＡに関し、ここで、該ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１は、（＋）鎖ＲＮＡウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示す。
【００１９】
本発明の医薬、方法およびｄｓＲＮＡのさらなる有利な態様に関して、上述の記載を参照されたい。続いて、本発明を、図面を用いて例示的に説明する。
【００２０】
ＨＣＶは、約９６００個のヌクレオチドを有するゲノムを有する。これは、構造タンパク質Ｃ、Ｅ１およびＥ２、並びに非構造タンパク質ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂをコードする。細胞培養液中のＨＣＶについての分子生物学的分析が、極めて困難であるため、ウイルス遺伝子配列に対するｄｓＲＮＡの作用を、非病原性代替系(non-pathogenic substitute system)により試験する。このために、ネオマイシン耐性媒介ネオマイシンカセットで、構造タンパク質Ｃ、Ｅ１およびＥ２をコードするウイルスゲノムの部分を置換する。改変されたウイルスゲノムは、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI)、 National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USAに遺伝子受託番号AJ242654の下に登録されている。
【００２１】
これは、ＨｕＨ−７肝臓細胞（JCRB0403、JCRB細胞バンク、国立医薬品食品衛生研究所、郵便番号１５８、東京都世田谷区上用賀１−１８−１、日本国）にトランスフェクトされた。これは、これらの細胞中で、ネオマイシン類似体Ｇ４１８の存在下で、感染性粒子を生成せずに複製される。改変されたＨＣＶゲノム(Lohmann et al. Science 285, [1999], 110頁)の安定な複製を可能にする系はまた、Ｃ型肝炎ウイルスについて、「レプリコンモデル」に指定されている。
【００２２】
用いるＲＮＡは、配列表中の配列番号１〜配列番号４として表される以下の配列を示す：
ＮＳ３をコードする領域からの配列に対応するｄｓＲＮＡ１
Ｓ２：５’−      ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＵＣＧ  ＡＣＵ  ＵＣＡ  ＧＣＣ  ＵＧＧ−３’（配列番号１）
Ｓ１：３’−ＧＧ  ＵＣＵ  ＧＵＣ  ＡＧＣ  ＵＧＡ  ＡＧＵ  ＣＧＧ  Ａ  −５’（配列番号２）
ＮＳ３配列に何の関係も有しない陰性対照として、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター、受託番号Ｕ５５７６３、ＮＣＢＩのヌクレオチド８８６〜９０９の配列に相当するｄｓＲＮＡ２：
Ｓ２：５’−        ＣＵＡ  ＣＧＵ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＣＡ  ＵＣ  −３’（配列番号３）
Ｓ１：３’−  ＣＣ  ＧＡＵ  ＧＣＡ  ＧＧＵ  ＣＣＵ  ＣＧＣ  ＧＵＧ  ＧＵ  ＡＧ  −５’（配列番号４）
【００２３】
各々の場合において、Ｓ２は、センス鎖を表し、Ｓ１は、アンチセンス鎖を表す。即ち、鎖Ｓ２の配列は、ＨＣＶからの対応する配列と同一である。
【００２４】
ＨｕＨ７細胞を、２０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地中で、１ｍｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８の存在下で培養する。トランスフェクションのために、６ウェルプレートのウェル（直径３．５ｃｍ）あたり８０，０００個の細胞を、２ｍｌの培地中に蒔く。「フュージーン(Fugene)６」（カタログ番号１８１４４４３）、Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim, Germanyを用いて、添付されている指示に従ってトランスフェクションを補助した。このために、１００μｌの無血清培地（ＳＦＭ）を、５μｌのフュージーン６試薬と反応容器中で混合し、室温で５分間インキュベートした。
【００２５】
３μｇのｄｓＲＮＡ２（約０．１μｍｏｌ／ｌの最終的なｄｓＲＮＡ２濃度に対応する）、３μｇのｄｓＲＮＡ１（約０．１μｍｏｌ／ｌの最終的なｄｓＲＮＡ１濃度に対応する）、１．５μｇのｄｓＲＮＡ１および１．５μｇのｄｓＲＮＡ２（約０．０５μｍｏｌ／ｌの最終的なｄｓＲＮＡ１濃度に対応する）、または３００ｎｇのｄｓＲＮＡ１および２．７μｇのｄｓＲＮＡ２（約０．０１μｍｏｌ／ｌの最終的なｄｓＲＮＡ１濃度に対応する）を、各々他の反応容器中に調製した。各々の場合において、ｄｓＲＮＡ１およびｄｓＲＮＡ２のストック濃度は、２０μＭ（約３００ｎｇ／μｌに対応する）に等しかった。フュージーン６およびＳＦＭで構成されている混合物を、核酸に１滴ずつ加え、ピペットのチップで注意深く混合し、室温で１５分間インキュベートした。トランスフェクションのために、反応調製物を、細胞に１滴ずつ加えた。各々のトランスフェクションを、少なくとも２回実施し、少なくとも２つの独立した実験において立証した。
【００２６】
改変されたＨＣＶゲノムの複製に対するｄｓＲＮＡの作用を、定量ＰＣＲにより決定した。トランスフェクションの約３６時間後に、細胞を崩壊させ、これらが含んでいたＲＮＡを、ペクゴールドＲＮＡピュアキット(PeqGold RNAPure kit)(PEQLAB Biotechnology GmbH, Carl-Thiersch Str. 2b, 91052 Erlangen, Germany, 製造番号３０−１０１０)で、製造者の指示に従って単離した。
【００２７】
その後、同一の量のＲＮＡ（１００〜１０００ｎｇ）を、スーパースクリプト(Superscript)ＩＩ(Invitrogen GmbH, Karlsruhe Technology Park, Emmy-Noether-Str. 10, 76131 Karlsruhe, Germany, カタログ番号１８０６４−０１４)を用いた、逆転写のために用いた。１００ｐｍｏｌのオリゴ−ｄＴプライマーまたは５０ｐｍｏｌのランダムプライマーを、プライマーとして用いた。１０μｌのＲＮＡ（１００〜１０００ｎｇ）、０．５μｌのオリゴ−ｄＴプライマー（１００ｐｍｏｌ）、および１μｌのランダムプライマー（５０ｐｍｏｌ）を、１０分間７０℃でインキュベートし、次に氷上に短時間保管した。次に、７μｌの逆転写酵素混合物（４μｌの５×緩衝液；２μｌの０．１ｍｏｌ／ｌのＤＴＴ；各１μｌの１０ｍｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰ）、１μｌのスーパースクリプトＩＩ、および１μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤RNAsin（登録商標）[Promega GmbH, Schildkroetstr. 15, 68199 Mannheim, Germany]を、加えた。混合物を、１０分間２５℃で、次に１時間４２℃で、および最後に１５分間７０℃で保持した。
【００２８】
特定のｃＤＮＡの量を、「ライトサイクラー(Light-Cycler)」(Roche Diagnostics GmbH)において生成したｃＤＮＡの同一の容積から、「タックマン(TaqMan)」法(PerkinElmer, Ferdinand-Porsche-Ring 17, 63110 Rodgau-Juegesheim, Germany)により、製造者の指示に従って、ライトサイクラー  ファスト  スタート  ＤＮＡ  マスター  ハイブリダイゼーション  プローブ  キット(LightCycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes Kit)(Roche Diagnostics GmbH)を用いて、定量した。検出を、５’末端においてフルオロフォア６’−ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）および３’末端において消光分子ＴＡＭＲＡ（カルボキシ−テトラ−メチル−ローダミン）でマークしたプローブにより、実施した。
【００２９】
フルオロフォアを、光により刺激し、刺激エネルギーを、これにすぐ近接している３’側の消光分子に伝える。ＰＣＲ反応の各々の伸長相の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により、プローブの加水分解がもたらされ、これと共に、消光分子からのフルオロフォアの空間的分離がもたらされる。６’−ＦＡＭの蛍光は、次第に小さく消光される。このために、これは増大し、定量的に決定される。
【００３０】
以下のものを、ＨＣＶ  ＮＳ３−ｃＤＮＡの定量のために用いた：
ＮＳ３プローブ：５’−ＣＡＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＧＡＣ−３’（配列番号５）
ＮＳ３プライマー：５’−ＣＣＴ  ＴＧＡ  ＴＧＴ  ＡＴＣ  ＣＧＴ  ＣＡＴ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＴＡＧ−３’（配列番号６）
ＮＳ３リバースプライマー：５’−ＴＧＡ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＧＣＣ  ＧＧＴ  ＡＡ−３’（配列番号７）
【００３１】
さらに、β２−ミクログロブリンｃＤＮＡを、標準物質として定量した。β２−ミクログロブリン（β２−ＭＧ）は、安定した量で構成的に発現するタンパク質である。以下のものを、定量のために用いた：
β２−ミクログロブリンプローブ：５’−ＡＡＣ  ＣＧＴ  ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＣＧ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＧＴＡ−３’（配列番号８）
β２−ミクログロブリンプライマー：５’−ＣＣＧ  ＡＴＧ  ＴＡＴ  ＡＴＧ  ＣＴＴ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  Ａ−３’（配列番号９）
β２−ミクログロブリンリバースプライマー：５’−ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＴＣＣ  ＡＴＡ  ＧＡ−３’（配列番号１０）
【００３２】
ＮＳ３プローブおよびβ２−ミクログロブリンプローブは、各々、５’末端においてＦＡＭマーキングおよび３’末端においてＴＡＭＲＡマーキングを示した。
【００３３】
ＨＣＶ  ＮＳ３  ｃＤＮＡの量を、β２−ＭＧ  ｃＤＮＡの量に対する比率の形で決定し、図１にグラフで表す。「ｐＥＧＦＰ」は、ｄｓＲＮＡ２のみでのトランスフェクションにより決定された値を表し（対照）、「ＨＣＶ  ０．１μｍｏｌ／ｌ」、「ＨＣＶ  ０．０５μｍｏｌ／ｌ」および「ＨＣＶ  ０．０１μｍｏｌ／ｌ」は、それぞれ０．１μｍｏｌ／ｌ、０．０５μｍｏｌ／ｌおよび０．０１μｍｏｌ／ｌのＮＳ３特異的ｄｓＲＮＡ１でのトランスフェクションにより決定された値を表す。
【００３４】
培地中の０．１μｍｏｌ／ｌ、０．０５μｍｏｌ／ｌおよび０．０１μｍｏｌ／ｌの最終濃度において、ｄｓＲＮＡ１でのトランスフェクションにより、非特異的な対照であるｄｓＲＮＡ２でのトランスフェクションと比較して、約６０倍大きい阻害がもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＨＣＶレプリコンモデルにおける、ＮＳ３特異的ｄｓＲＮＡのトランスフェクションによるＨＣＶ−ＲＮＡの減少を表したグラフである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月27日(2003.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用であって、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示し、ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼの発現を阻害することができる、前記使用。
【請求項２】
（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための医薬を製造するための、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の使用であって、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示し、ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼの発現を阻害することができる、前記使用。
【請求項３】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害することができる、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
ヘリカーゼが、ＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ウイルスＲＮＡの読みとり方向におけるセグメントが、ヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼをコードするウイルスゲノムの前に、またはこの領域中に配置されている、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
相補的な領域が、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
鎖Ｓ１が、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
ｄｓＲＮＡが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端であるこの末端において、オーバーハングを有する、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
ｄｓＲＮＡが、経口的に、吸入、注入または注射により、特に静脈内または腹腔内注入もしくは注射により投与するのに適する製剤中に存在する、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
製剤が、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水溶液または生理学的に許容される緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水溶液とから、特に専らなる、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
ｄｓＲＮＡが、生理学的に許容される溶液中に、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
ｄｓＲＮＡを、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり最大５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇおよび最適には最大２５μｇの投与量で用いる、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
（＋）鎖ＲＮＡウイルス感染症を処置するための医薬であって、該医薬が、２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含み、ここで、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示し、ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼの発現を阻害することができる、前記医薬。
【請求項１７】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である、請求項１６に記載の医薬。
【請求項１８】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害することができる、請求項１６または１７に記載の医薬。
【請求項１９】
ヘリカーゼが、ＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼである、請求項１６〜１８のいずれかに記載の医薬。
【請求項２０】
ウイルスＲＮＡの読みとり方向におけるセグメントが、ヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼをコードするウイルスゲノムの前に、またはこの領域中に配置されている、請求項１６〜１９のいずれかに記載の医薬。
【請求項２１】
相補的な領域が、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項１６〜２０のいずれかに記載の医薬。
【請求項２２】
鎖Ｓ１が、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項１６〜２１のいずれかに記載の医薬。
【請求項２３】
ｄｓＲＮＡが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する、請求項１６〜２２のいずれかに記載の医薬。
【請求項２４】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端であるこの末端において、オーバーハングを有する、請求項２３に記載の医薬。
【請求項２５】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項１６〜２４のいずれかに記載の医薬。
【請求項２６】
医薬が、経口的に、吸入、注入または注射により、特に静脈内または腹腔内注入もしくは注射により投与するのに適する製剤である、請求項１６〜２５のいずれかに記載の医薬。
【請求項２７】
製剤が、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水溶液または生理学的に許容される緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水溶液とから、特に専らなる、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
ｄｓＲＮＡが、溶液中の、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中の医薬中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項１６〜２７のいずれかに記載の医薬。
【請求項２９】
医薬が、ｄｓＲＮＡを、好ましさの低い順に、１日体重１ｋｇあたり５ｍｇ、２．５ｍｇ、２００μｇ、１００μｇ、５０μｇおよび最適には２５μｇの最大投与量を可能にする量で含む、少なくとも１つの投薬単位において利用可能である、請求項１６〜２８のいずれかに記載の医薬。
【請求項３０】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスの細胞中での複製を阻害する方法であって、少なくとも１つの２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を、細胞中に導入し、ｄｓＲＮＡの１本の鎖Ｓ１が、ウイルスゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示し、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼの発現を阻害する、前記方法。
【請求項３１】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
ヘリカーゼが、ＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼである、請求項３０〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
ウイルスＲＮＡの読みとり方向におけるセグメントが、ヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼをコードするウイルスゲノムの前に、またはこの領域中に配置されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
相補的な領域が、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項３０〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
鎖Ｓ１が、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項３０〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
ｄｓＲＮＡが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する、請求項３０〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端であるこの末端において、オーバーハングを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項３０〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
ｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項３０〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
２本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）であって、該ｄｓＲＮＡの鎖Ｓ１が、（＋）鎖ＲＮＡウイルスのゲノムの翻訳可能な領域のセグメントに、少なくとも断片的に相補的である領域を示し、ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされた機能的なプロテアーゼまたはヘリカーゼの発現を阻害することができる、前記２本鎖リボ核酸。
【請求項４２】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである、請求項４１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４３】
ｄｓＲＮＡが、ウイルスゲノムからコードされたポリタンパク質の発現を阻害することができる、請求項４１または４２に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４４】
ヘリカーゼが、ＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼである、請求項４１〜４３のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４５】
ウイルスＲＮＡの読みとり方向におけるセグメントが、ヘリカーゼ、特にＨＣＶ−ＮＳ３ヘリカーゼをコードするウイルスゲノムの前に、またはこの領域中に配置されている、請求項４１〜４４のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４６】
相補的な領域が、好ましさの低い順に、２５個より少ない、１９〜２４個の、２０〜２４個の、２１〜２３個の、および特に２２または２３個のヌクレオチドを有する、請求項４１〜４５のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４７】
鎖Ｓ１が、好ましさの低い順に、３０個より少ない、２５個より少ない、２１〜２４個の、および特に２３個のヌクレオチドを有する、請求項４１〜４６のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４８】
ｄｓＲＮＡが、１〜４個、特に２または３個のヌクレオチドからなる１本鎖のオーバーハングを、該ｄｓＲＮＡの少なくとも１つの末端において有する、請求項４１〜４７のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項４９】
ｄｓＲＮＡが、１つの末端のみに、特に鎖Ｓ１の３’末端であるこの末端において、オーバーハングを有する、請求項４８に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５０】
ｄｓＲＮＡが、鎖Ｓ１に加えて鎖Ｓ２を有し、鎖Ｓ１が２３ヌクレオチド長であり、鎖Ｓ２が２１ヌクレオチド長であり、かつ、鎖Ｓ１の３’末端が２個のヌクレオチドで構成された１本鎖のオーバーハングを有するが、鎖Ｓ１の５’末端に位置するｄｓＲＮＡの末端は平滑である、請求項４１〜４９のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５１】
ｄｓＲＮＡが、経口的に、吸入、注入または注射により、特に静脈内または腹腔内注入もしくは注射により投与するのに適する製剤中に存在する、請求項４１〜５０のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５２】
製剤が、ｄｓＲＮＡと、生理学的に許容される溶媒、好ましくは生理食塩水溶液または生理学的に許容される緩衝液、特にリン酸緩衝生理食塩水溶液とから、特に専らなる、請求項５１に記載のｄｓＲＮＡ。
【請求項５３】
ｄｓＲＮＡが、溶液中に、特に生理学的に許容される緩衝液もしくは生理食塩水溶液中に、またはミセル構造、好ましくはリポソーム、ウイルスカプシド、カプソイドまたは高分子ナノもしくはマイクロカプセルに囲まれて、または高分子ナノもしくはマイクロカプセルに結合して存在する、請求項４１〜５２のいずれかに記載のｄｓＲＮＡ。
【国際調査報告】
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2005506087.tif 000029
2005506087.tif 000030
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2005506087.tif 000035
2005506087.tif 000036
2005506087.tif 000037