(57)【要約】分析の方法において、検体を生体分子に結合させることによってサンプル中の検体（４）の存在を検出するために、基質（１）の固体表面に結合した生体分子（３）が用いられる。検体（４）及び他の生体分子の非特異的結合を防止すべく、生体分子（３）間の表面を覆っている生体分子−反撥性分子（５）と共に、この生体分子（３）をこの基質表面に直接的に結合させる。本発明は、バイオセンサーに関するものでもあり、ここで検体（４）及び他の生体分子の非特異的結合を防止すべく、生体分子（３）間の表面を覆っている生体分子−反撥性分子（５）と共に、この生体分子（３）をこの基質表面に直接的に結合させる。生体分子−反撥性分子（５）は自己組織化した親水性ポリマーであってもよい。本発明を用いる一つの実施例は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使った免疫学的分析である。
2005504294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体が生体分子に結合することによりサンプル中の検体（４）の存在を検出するために、基質（１）の固体表面に結合した生体分子（３）が使用される分析方法であって、検体（４）と他の生体分子の非特異的結合を防止すべく、生体分子（３）間の表面を覆う生体分子反撥性分子（５）と共に生体分子（３）が基質表面に直接結合することを特徴とする方法。
【請求項２】
該生体分子反撥性分子（５）が、スルフィド、ジスルフィド又はチオール基のような官能基を介して基質（１）表面に共有結合的に結合することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該基質が、その表面の生体分子（３）に結合する検体（４）の増加を示唆するように、シグナル変化を誘起する能力をもつセンサー基質であり、該シグナルが基質（１）に送られ、この変化したシグナルが検知され、そして基質（１）表面の生体分子（３）に結合した検体（４）の量がこの検出シグナルによって測定されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該基質（１）の表面に直接結合した生体分子（３）及び生体分子反撥性分子（５）に加え、固定化された生体分子を含む別の粒子（２）が用いられ、それが基質（１）上の該生体分子（３）に結合した検体（４）を介してこの基質に結合することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
生体分子（３）が蛋白質、ペプチド、酵素、抗体、抗体のフラグメント、抗原又は抗原の一部分であり、そしてその生体分子がチオール、ジスルフィド又はスルフィド基を介して、基質（１）及び／又は粒子（２）の表面に結合することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体分子反撥性分子（５）がポリマー、特に、親水性ポリマーであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
基質（１）が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を起こし得る基質であり、ＳＰＲ測定によってこの分析が行われることを特徴とする請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
この分析が、水晶振動微量天秤（ＱＣＭ）のような厚み剪断モード共鳴体によって行われることを特徴とする請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
基質（１）が金属、半導体或いは導電性ポリマーであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
生体分子（３）が、抗体或いは免疫学的に活性な抗体フラグメントのような免疫学的な結合分子であり、そしてこの分析が免疫学的分析であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
基質及び基質（１）に結合した生体分子（３）が使用される分析用のバイオセンサーであって、検体（４）と他の生体分子との非特異的結合を防止すべく、生体分子（３）間の表面を覆う生体分子反撥性分子（５）と共にこの生体分子（３）がこの基質表面に直接結合することを特徴とするバイオセンサー。
【請求項１２】
生体分子反撥性分子（５）が、スルフィド、ジスルフィド又はチオール基のような官能基を介してこの基質に共有結合的に結合することを特徴とする請求項１１記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
生体分子反撥性分子（５）がポリマー、特に、親水性ポリマーであることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
生体分子反撥性分子（５）がその表面で自己組織化することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
この基質が、その表面の生体分子（３）に結合する検体（４）の増加を示唆するように、シグナルに変化を誘起し得るタイプのものであり、該センサーが更に、このシグナルを基質（１）に向けて発する手段、及び基質（１）との相互作用によるシグナル変化を検出する手段を含むことを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
基質（１）が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に適合する素材であり、シグナルを発する手段が発光装置であり、このシグナルを検出する手段が、この基質と誘電体間の界面から反射されたシグナルを感知するために供される、１個又は複数個の光検出器であることを特徴とする請求項１５記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
バイオセンサーが、水晶発振微量天秤（ＱＣＭ）センサーのような厚み剪断モード共鳴体センサーであることを特徴とする請求項１５記載のバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分析のための方法に関する。又、本発明はその方法を実施するためのバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断の補助及び環境分析に使う、簡単で、迅速且つ簡便なセンサー類の必要性が高まっている。
【０００３】
抗原と抗体間の非常に特異的で強固な結合は、従来から、臨床検査室において放射免疫測定（ラジオイムノアッセイ）、固相法の酵素免疫測定及び蛍光免疫測定によって求められてきた。抗原−抗体複合体の定量は放射性同位元素、酵素或いは蛍光プローブのような標識分子に依存している。大抵の場合、数回のインキュベーション、洗浄及び分離の行程が完了するまでその結果は得られない。
【０００４】
現在では、固定化抗体を使って抗原濃度をその場観測することができ、且つ、標識物の使用を必要としない免疫センサーが開発されつつある。しかし、従来の固定化法を使うと抗体分子の配向が制御できないため、利用できる結合部位の割合が制限される〔Ａｔｔｉｌｉ，Ｂ．；Ｓｕｌｅｉｍａｎ，Ａ．；Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．５４（１９９６）１７４〕。一方、部位特異的な固定化ではより高い活性が得られる。制御された抗体の固定化の選択肢には、プロテインＡやプロテインＧへの抗体のＦｃ部分との特異的な結合、抗体Ｆａｂ’−フラグメント上の遊離スルフヒドリル基（ＳＨ−基）を介した支持層への共有結合、及びビオチン／（ストレプト）アビジン化学反応によるビオチン化抗体の表面への結合が含まれる〔Ｍｏｒｇａｎ，Ｈ．；Ｔａｙｌｏｒ，Ｄ．Ｍ．；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｖｏｌ．７（１９９２）４０５；Ｖｉｋｈｏｌｍ，Ｉ．；Ａｌｂｅｒｓ，Ｗ．Ｍ．；Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｖｏｌ．１４（１９９８）３８６５；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．；Ｈｅｙｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｅｇｇｅｒ，Ｍ．；Ｇａｕｂ，Ｈ．Ｅ．；Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｖｏｌ．９（１９９３）１３６；Ｓｃｈｏｅｎｈｏｆｆ，Ｍ．；Ｌｏｅｓｃｈｅ，Ｍ．；Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．；Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｃ．；Ｐｒｏｇｒ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．（１９９２）２４３；Ｋｒｕｌｌ、Ｕ．Ｊ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．Ｓ．；Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｔ．；Ｈｅｃｋｌ，Ｗ．Ｍ．；Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒ．Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｖｏｌ．１８（１９９１）２１２；Ｈｅｙｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｅｇｇｅｒ，Ｍ．；Ｇａｕｂ，Ｈ．Ｅ．；Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．９４（１９９０）５０７３〕。
【０００５】
しかし最近、Ｆａｂ’−フラグメントが高いエピトープ密度を保持したまま金に直接吸着することが示された〔Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｖ．；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍ．；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．７２（２０００）７０３〕。通常、金属表面では表面エネルギーが高いため、生体分子は変性して活性が低下する。その吸着の機構が広範囲に研究され、材料表面と生体分子表面の疎水斑との間の疎水性相互作用に関連付けられている。蛋白質は最初の吸着の後で変性し、折りたたみが開放されて、より疎水性の基がより露出するようになるためその活性を失う〔Ａｎｄｒａｄｅ，Ｊ．Ｄ．；Ｈｌａｄｙ，Ｖ．；Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．７９（１９８６）１−６３〕。
【０００６】
生体分子を結合させるため、種々の連結分子（リンカー）を使って単分子層を表面に形成してバイオセンサーとし、そこで表面プラズモン共鳴によって検出を行うことを記述した特許文献として、米国特許第５２４２８２８号、欧州特許第４４２９２２号及び欧州第４８５８７４号が挙げられる。
【０００７】
受容体分子を、分子開放を最小限に保って配向性と再現性を持たせて変換器境界（トランスデューサー  インターフェース）上に結合できれば、活性と特異性が最適に保持できて、高感度を必要とするセンサー用途にそれが使えるであろう。受容体分子を指定部位に固定できれば、最大の結合効率が得られるであろう。
【０００８】
バイオセンサーの適用で克服すべきもう一つの問題は非特異的な結合である。生体反撥性表面が、生化学、生物学、バイオテクノロジー及びヘルスケアなどの分野で大きな関心を惹く問題になってきた。それは、生体分子及び細胞と種々の表面を有する細胞の相互作用を制御する必要があるためである。蛋白質−反撥性のある表面は、血液に接触する埋込み装置、分離工程用膜、クロマトグラフィー用担体、コンタクトレンズ及び血液やタンパク質の保存器具にとって不可欠である。
【０００９】
生体分子反撥性の表面は、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリ（メタクリ酸ヒドロキシエチル）、ポリエチレンオキシド及びポリエチレングリコールのような非イオン性で親水性のポリマーを固定化することによって調製できる〔Ｋｏｅｂｅｒｌｅ，Ｐ．；Ｌａｓｃｈｅｗｓｋｙ，Ａ．；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｏｇａａｒｄ，Ｄ．；Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｖｏｌ．３３（１９９２）４０２９；Ｓａｉｔｏ，Ｎ．；Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｔ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．；Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｖｏｌ．２９（１９９６）３１３〕。蛋白質吸着に対する抵抗は、生体反撥性表面の柔軟分子鎖と溶液状態にある生体分子のエントロピー的反発力及び流体力学的反発力が、総合した吸引力に勝ることに基づいている。ポリマー類は物理的被覆、化学的カップリング或いはグラフト共重合によって吸着される。
【００１０】
オリゴエチレングリコールを供する自己組織化したアルカンチオールを適切な連結基を有する分子と混合し、その上にバイオセンサーに応用するために生体分子が結合され得る〔Ｏｓｔｕｎｉ，Ｅ．；Ｙａｎ，Ｌ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．；Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂ ｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  Ｖｏｌ．１５（１９９９）３−３０〕。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、高度な特異的結合で検体を分析するための方法とバイオセンサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
モノマー／ポリマー骨格上に適切な末端固定基を有する生体分子−反撥性分子、或いは末端固定基を備えた親水性モノマー／ポリマー“ブラシ”が、金、銀、銅、アルミニウム、パラジウム及びガリウム砒素のような固体上に化学的にグラフトして、同じ表面に結合した生体分子、特に、抗体フラグメントのような免疫学的な結合分子（受容体）と一緒に、単分子層が形成され得る。これらの生体分子−反撥性分子は、生体分子、特に、抗体フラグメントのような免疫学的な結合分子（受容体）がグラフトするのと同じ表面に直接グラフトされ、その結果、それらが混合単分子層を形成する。生体分子−反撥性分子は、生体分子の間に残る空間に検体が非特異的に結合することを阻止する。表面プラズモン共鳴、水晶振動微量天秤及び電気抵抗のような技術で免疫反応を検出できる。固定化手順によって、検体である生物学的高分子の非特異的な結合が顕著に低下する。それは、Ｆａｂ’−フラグメントの間の表面親水性が高く非イオン性であり、更に、抗体フラグメントの適切な高配向の抗原結合をもたらすからである。
【００１３】
免疫学的結合分子（受容体）のような生体分子を配向状態で固定できることで、生体分子に結合する検体分子を定量的に分析するための便利な方法が提供される。抗体フラグメント固定の一つの方法が、参考までに本明細書に載せてある、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｖ．；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍ．；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．７２（２０００）７０３に示されている。
【００１４】
この分析では、固体表面を有する基質が適合でき、かつ、使用される基質と合せて検出限界が低く出来る測定法が用いられる。固体表面に対して親和性を有す基と共に生体分子が直接的に結合される固体表面は、基質、固定化生体分子及び結合検体の組合せと相互作用するように基質に発せられ、次いで検知されるシグナルの変化を引起こすことが出来るタイプのものであり、このシグナル変化は基質の固体表面上の物質の増加を示す（基質表面に固定された生体分子に選択的に結合した検体分子の蓄積）。
【００１５】
良好な感度を達成するのに特に適切で、性能を改善する場合の検出の方法は、表面プラズモン共鳴、厚み剪断モード、表面弾性波及び電気化学的測定である。
本発明の目的及び特長は、図面と併せて以下の詳細説明からもっと良く理解できるであろう。
【００１６】
生体分子は、官能基と共に基質の固相表面に直接固定され、解析のための配向した受容体の単分子層を形成する。この生体分子として、タンパク質、ペプチド、酵素、抗体、抗体の断片（例えばＦａｂ’）、抗原或いは抗原の一部が挙げられる。この解析のためには、それらの分子は、検出されるべき検体に特異的な結合部位を有すべきであり、以後それらを結合分子或いは受容体とも呼ぶことにする。
【００１７】
官能基を介して基質の固相表面に生体分子を直接的に結合させ、これと一緒に生体分子−反撥性モノマー／ポリマー分子も同じ表面に結合させると、生体分子は、活性な検体−選択的結合部位（例えば抗原結合部位、エピトープなど）が露出された状態で表面上で自己組織化し、また、同様に自己組織化した生体分子−反撥性分子は、生体分子間に残された固体表面を覆って、生体分子の活性結合部位の間隙に検体分子が非特異的に結合することを阻止する。生体分子と生体分子−反撥性モノマー／ポリマーは、両者ともに基質の固体表面に対する親和性を示して末端固定基として作用する官能基を有する。例えば、末端にスルフヒドリル基（ＳＨ−基）を有する有機化合物は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、アルミニウム（Ａｌ）及びパラジウム（Ｐｄ）のような金属の表面に、金属と硫黄原子の共有結合を介して化学吸着し、単分子層被膜を形成する。上述のような様式で自己組織化を示す系には、硫黄含有官能基を介して金属表面に自発的に化学吸着するチオール類、ジスルフィド類及びスルフィド類が含まれる。
【００１８】
この分析法がＳＰＲ測定の場合、使用される基質は、金、銀、銅、アルミニウム及びパラジウムのようなＳＰＲ−適合性素材のフィルムである。しかし、本発明はいかなる特定の分析法にも限定されるものではない。
【００１９】
例えば前躯体をチオール基に還元して、生体分子の構造の一部を変換することによって、この生体分子に官能基を持たせることが出来る。代わりに、官能基又はその前駆体を有するこの連結分子を生体分子に結合させて、自己組織化にとって好適な機能を付与し、次いでこの生体分子を溶液から表面に化学吸着させることができる。こうすることで官能基を有するこの生体分子が１段階で基質の固体表面に直接的に吸着され、配向状態で生体分子が単分子層となったバイオセンサーが形成される。生体分子−反撥性モノマー／ポリマー分子が化学吸着により表面に結合されて、同じように配向状態で単分子層が形成される。生体分子−反撥性モノマー／ポリマー分子を、生体分子の固定化と同時に或いは固定化後のいずれかに、同じ表面に結合させ得る。
【００２０】
生体分子−反撥性分子を単純な化学吸着によって表面に結合させ得る。生体分子−反撥性分子は、好ましくは、ポリマー鎖の一末端にスルフィド、ジスルフィイド又はチオール基のような適切な官能基（末端固定基）を介して表面に共有結合される。使用される生体分子−反撥性ポリマーは、通常、反対側の末端にＯＨ−基を含む。表面と反撥を受ける生体分子の間の、ファン・デル・ワールス力、静電力、エントロピー力及び水素結合力などの総合的な吸引力は、固体表面上の柔軟な分子鎖と溶液中の生体分子の熱運動の故に、エントロピー的な反撥及び流体力学的な反撥よりも小さくなければならない。ポリアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）、ポリエチレンオキシド及びポリエチレングリコールのような中性の親水性ポリマーを固定化することにより、そのような表面が調製できる。更に、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタンのような他のポリマー類の生物学的適合性が検討されている。
【００２１】
図１に示した本発明の一つの実施態様によれば、受容体３の役割をするＦａｂ’−フラグメントを、抗体の結合ドメインの反対側にある遊離チオール基を介して結合させ、そして／或いは、露出した遊離チオール基を有する抗体／受容体が金属、半導体又は（伝導性）ポリマーの表面或いはそれらの混合物、即ちセンサー応用における基質１の表面に直接的に結合される。受容体が結合しているのと同じ、金属、半導体又は（伝導性）ポリマーの表面上の、生体分子間の空いたスペースに、親水性の生体分子−反撥性の表面を創りだすポリマー分子５を配向状態で結合させ、その結果として基質表面への検体分子の非特異的な結合を遮断する。
【００２２】
本明細書における用語「生体分子−反撥性」は、分析される溶液中の生体分子に反撥し、受容体分子間の間隙へ、それが非特異的に結合することを阻止することを意味する。
【００２３】
ポリマー分子５は、ポリマー鎖が表面から突き出すように、そしてその官能基（例えばチオール、スルフィド、ジスルフィドなど）が結合部位の役割をしてポリマー鎖の末端に位置するように配向している。表面の生体分子−反撥性分子の層の厚さは、基質１表面の生体分子の厚さＬ（生体分子の高さ）よりも若干小さ目が好ましい。
【００２４】
固体の基質１は、その外表面に受容体３の役割を演じる生体分子及び生体分子−反撥性ポリマー分子５を結合しており、適切な厚さと適切な素材のフィルムであり、以下に説明する方法の一つによって、その表面での増加量を検出するためにそれを使用できる。基質１との接触が起こる溶液中で、検体４（抗原）と基質１上の受容体３（Ｆａｂ’−フラグメント）の間で免疫学的な反応が起こるであろう。検体の検出には、特に、表面プラズモン共鳴、水晶振動微量天秤（ＱＣＭ）が一例となる厚み剪断モード共鳴体技術、表面弾性波（ＳＡＷ装置）及び電気化学的計測などを基にした方法が挙げられる。しかし、生体分子の特異結合部位間での非特異的結合部位を塞ぐために、生体分子−反撥性モノマー／ポリマー分子を使う本特許は、いかなる特定の分析的検出方法にも限定されるものではない。
【００２５】
表面に結合し得る生体分子の一例として、抗体フラグメントが前に提示された。抗体全体を、例えばそのＦｃ部分に供された遊離チオール基を介して基質表面に固定させることも本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
本発明のもう一つの実施態様によれば、遊離チオール基を介して結合することで、同様に、別の粒子２、例えば上述と同じ素材で構成されたコロイド及びナノ粒子を塗布するのに、受容体３／Ｆａｂ’−フラグメントが使われる。検出されるべき検体が比較的小さな分子で濃度が低い場合に、検出シグナルを増幅させるためにこれらの粒子が使われる（図２）。溶液中の検体４／抗原と基質表面の受容体３／Ｆａｂ’−フラグメントの間で免疫学的な反応が起こり、一方、検体４／抗原は、受容体／Ｆａｂ’−フラグメントで被膜されたコロイド／ナノ粒子のような、バインダー生体分子が結合した粒子２と相互作用する。生体分子−反撥性ポリマー分子５は、基質表面の受容体３の間で上述と同様の態様で使われる。その結果、シグナルを増幅するコロイド／ナノ粒子のネットワークが構築されるであろう。図２は、いかにして被膜された粒子２が検体４（抗原）を介して基質表面の受容体３と結合するかを示している。受容体３が遊離チオール基を介して結合され得るそのような粒子２の一つの例は、金粒子である。
【００２７】
図３は実施例１で用いたＳＰＲ測定の原理を示しており、これは本発明の一つの実施態様におけるバイオセンサーの一例としても役立つ。ＳＰＲ測定の原理及びＳＰＲ適合材料の性質については、例えば本明細書中に参考までに盛込まれている欧州特許第５３７２５２号及び対応する米国特許第５３２２７９８号を参照できる。用いられるＳＰＲ構成については、本明細書中に参考までに盛込まれているＳａｄｏｗｓｋｉらのＯｐｔ．Ｅｎｇ．Ｖｏｌ．３４（１９９５）２５８１−２５８６で、より詳細に述べられている。Ｈｅ−Ｎｅレーザーからの波長６３２．８ｎｍの線形的ｐ−偏光が、プリズムを通して、有名なＫｒｅｔｓｓｃｈｍａｎｎ配置に基づいて配置された、金箔フィルムで被膜したスライド上に当てられる。この光の強度を、光が部分的に共鳴している特定の角度において、時間の関数として測定する。光度の非常に小さな変化は、プリズムからの光（試料光）とレーザー光（参照光）からの光を観測するために２つの違った断光周波数で、２つのロックイン増幅器を使うことによって測定できる。この場合、ＳＰＲ検出の動的範囲は限られるが、この方法は、むしろ共鳴ピークが広くなる溶液中での測定に適している。Ｆａｂ’−フラグメントと生体分子−反撥性ポリマーが直接的に結合している金基質を、屈折率整合オイルを使ってプリズムに付着させた。流動セルをこのフィルムの測定部の上に置き、緩衝液で満たした。タンパク質溶液をポンプでこのセルに送り込み、光の強度変化を適切な入射角度で約１０−１５分間、検出した。
【００２８】
図４は、厚み剪断モード共鳴体原理を使ったＱＣＭ測定の原理を示すもので、これも本発明のセンサーに応用できる。測定の原理については、本明細書中に参考までに盛込まれているＶｉｋｈｏｌｍ，Ｉ．；Ａｌｂｅｒｓ，Ｗ．Ｍ．；Ｌａｎｇｍｕｉｒ  Ｖｏｌ．１４（１９９８）３８６５の記述を参照できる。この検出法の基となる一般原理は、共鳴周波数の減退を観察することであり、それは一方の電極表面での生体分子に検体が結合することに起因する共鳴体量の変化に比例する。水晶振動微量天秤には、水晶共鳴子Ｃの両面についた電気伝導層１から構成される電極が付いている。一方の電極（電気伝導層１）の表面には、生体分子３と生体分子−反撥性ポリマー分子５が例えば図１に示した様式で固定され、検出すべき検体を含む溶液と接触させてこの電極面が置かれる。電線と電気接点を保護するために、この共鳴体の両端をシリコンゴムで覆う。この検出は電気的共鳴の測定で行われ、共鳴周波数はコンピュータに接続されたスペクトル／ネットワーク解析装置を使って決定される。
【００２９】
他の実施可能な検出方法として、表面弾性波装置や電気化学的水晶振動微量天秤の利用が挙げれる。
【００３０】
結論として、本発によれば、生体分子−反撥性分子と抗体Ｆａｂ’−フラグメントを金属表面に共有結合でグラフトすることにより、特異的な抗原に対して反応する表面を得ることができる。Ｆａｂ’−フラグメントと一緒に親水性ポリマーを使うことで表面の非特異的結合性が低くなり、その結果、免疫学的測定における感度と選択性が改善される。更にこの技術は、表面を光パターニングすることにより、多系列スクリーニングに容易に応用できる。
【００３１】
以下に、本発明を例示するいくつかの試験について説明するが、これによって本発明の範囲が限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
モデル抗体はポリクローナルヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈからのクロマトグラフィー精製品）で、ウシ、ウマ及びマウスの血清蛋白質との交叉反応を最小限に抑えたものである。この抗原はクロマトグラフィーで精製したヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製）である。Ｆ（ａｂ’）２  は使用前にジチオトレイトール（ＤＴＴ、Ｍｅｒｃｋ）を用いて、次に示すようにＦａｂ’−フラグメントに分割した：濃度１．２−１．３  ｍｇ／ｍｌのＦ（ａｂ’）２（１００μｌ）を、５０μｌのＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ＝６．０）及び、ＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液に溶解した１０μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ溶液とミクロ透析チューブ内で混合した。この透析チューブを、２５０ｍｌのアルゴンガスでパージしたＨＥＰＥＳ／ＥＤＴＡ緩衝液に浸漬し、アルゴンガス中にて室温で約１８時間、透析した。このＦａｂ’−フラグメントをアルゴン下に保ち、直ちに結合に使用した。
【００３３】
Ｆａｂ’−フラグメントは、抗体結合ドメインの反対側に、近づき易く反応性のチオール基を有している。
【００３４】
表面プラズモン共鳴装置であるＳＰＲＤＥＶＩ（ＶＴＴ、Ｔａｍｐｅｒｅ）を測定に使用した。用いたガラススライドを、真空蒸着法によりチタン（４ｎｍ、金の結合性を高める）と金（３７ｎｍ）の薄いフィルムで被膜した。このスライドを、使用直前にＨ２Ｏ２：ＮＨ４ＯＨ：Ｈ２Ｏが１：１：５の熱溶液中で洗浄し水でゆすいだ。このスライドを屈折率整合油でＳＰＲプリズムに付着させ、その上に流動セルを組込んだ後、１０ｍＭのＨＥＰＥＳと１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ  ７．２）をセル内に流した。緩衝液の調製にはＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、米国）の高純水（１８．２Ｍオームｃｍ）を使用した。ＳＰＲ強度曲線を記録し、ＳＰＲ曲線の勾配の最も急な点に対応する固定角度でその場測定した。生体分子−反撥性ポリマーの単分子層はＮ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕アクリルアミドモノマーを基本としたもので、０．１２  ｍｇ／ｍｌの濃度でジスルフィド固定基を介して金表面にグラフトさせた。このＦａｂ’−フラグメントを表面に固定化し、次いで、生体分子−反撥性ポリマー分子を同じ表面にグラフトした。
【００３５】
図５は、典型的なＳＰＲ検知記録で、いろいろな分子が表面に結合した時のＳＰＲ強度変化を示している。上部の曲線は、受容体３（Ｆａｂ’−フラグメント）と生体分子−反撥性ポリマー分子５を合せた単分子層の形成と挙動を示し、下部の曲線は、生体分子−反撥性ポリマー分子５だけから成る単分子層を示している。このＦａｂ’−フラグメント及び生体分子−反撥性ポリマー分子の結合の瞬間を、それぞれａとｃの文字で示してある。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた瞬間をｄの文字で示してある。
【００３６】
この検知記録には、Ｆａｂ’−フラグメント或いは生体分子−反撥性ポリマーが金にグラフトした時に、最初に急なＳＰＲ強度の上昇が起きた後、一定値になり、次いで洗浄の段階（緩衝液によるゆすぎをｂで示す）で不可逆的に結合したＦａｂ’−フラグメント或いはポリマーがゆっくりと脱離することが示されている。このポリマーは、結合したＦａｂ’−フラグメントの間に接着し、その結果として生体分子が金の表面に非特異的に結合するのを防ぐと想定される。純粋なポリマー層へのＢＳＡの吸着はなく、抗体／ポリマー層へのＢＳＡの吸着時にほんの微小のＳＰＲ強度の上昇のみが観察された（ｄ点）。いくつかのＢＳＡ分子が抗体の近傍に吸着したものと推定される。Ｆａｂ’／ポリマー層にｈＩｇＧを注入した時にはＳＰＲ強度に大きな上昇が認められた（上部曲線のｅ点）が、抗体が入っていない純粋ポリマー層では強度の変化は観察されなかった（下部曲線のｅ点）。更に、抗体層はＨＣｌ−グリシン溶液によって再生させることが出来、このことは免疫反応が行われていたことを示している（上部曲線のｆ点）。
【００３７】
Ｆａｂ’−フラグメントと生体分子−反撥性ポリマーを合せた単分子層上のｈＩｇＧのＳＰＲ結合等温曲線を、１ｐｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの濃度範囲で測定した（図６）。図７には、抗体Ｆａｂ’−フラグメント、生体分子−反撥性分子、ＢＳＡ及びｈＩｇＧが引続いて金の薄膜フィルムと結合する時に生じるＳＰＲ強度変化を、Ｆａｂ’−フラグメント濃度の関数として示したものである。グラフトされる生体分子−反撥性分子の量は、結合した抗体フラグメントの量が増えると減少する。ＢＳＡの非特異的結合は、抗体濃度には殆ど無関係である。ｈＩｇＧの結合は、調べたＦａｂ’−フラグメント濃度域で定常値に達する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】抗体Ｆａｂ’−フラグメントが生体分子−反撥性分子と共に結合するセンサー表面、及びセンサーと抗原の相互作用を表わす模式図である。
【図２】コロイド／ナノ粒子を使った検出の増幅を示す、図１の代表例である。
【図３】本発明の一つの実施態様に基づく測定法の構成を示す。
【図４】本発明の他の実施態様に基づく測定法の構成を示す。
【図５】種々の高分子物質が薄い金フィルム上に結合した時のＳＰＲ変化を示す。
【図６】本発明に基づくセンサーを用いて得られたＳＰＲ結合の等温曲線を示す。
【図７】種々の高分子が薄い金フィルム上に結合した時のＳＰＲ強度の全変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月3日(2003.11.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体が生体分子に結合することによりサンプル中の検体（４）の存在を検出するために、基質（１）の固体表面に結合した生体分子（３）が使用される分析方法であって、検体（４）と他の生体分子の非特異的結合を防止すべく、生体分子（３）間の表面を覆う生体分子反撥性分子（５）と共に生体分子（３）が基質表面に共有結合的に直接結合することを特徴とする方法。
【請求項２】
該生体分子反撥性分子（５）が、スルフィド、ジスルフィド又はチオール基のような官能基を介して基質（１）表面に共有結合的に結合することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
該基質が、その表面の生体分子（３）に結合する検体（４）の増加を示唆するように、シグナル変化を誘起する能力をもつセンサー基質であり、該シグナルが基質（１）に送られ、この変化したシグナルが検知され、そして基質（１）表面の生体分子（３）に結合した検体（４）の量がこの検出シグナルによって測定されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
該基質（１）の表面に直接結合した生体分子（３）及び生体分子反撥性分子（５）に加え、固定化された生体分子を含む別の粒子（２）が用いられ、それが基質（１）上の該生体分子（３）に結合した検体（４）を介してこの基質に結合することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
生体分子（３）が蛋白質、ペプチド、酵素、抗体、抗体のフラグメント、抗原又は抗原の一部分であり、そしてその生体分子がチオール、ジスルフィド又はスルフィド基を介して、基質（１）及び／又は粒子（２）の表面に共有結合的に結合することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
生体分子反撥性分子（５）がポリマー、特に、親水性ポリマーであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
基質（１）が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を起こし得る基質であり、ＳＰＲ測定によってこの分析が行われることを特徴とする請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
この分析が、水晶振動微量天秤（ＱＣＭ）のような厚み剪断モード共鳴体によって行われることを特徴とする請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
基質（１）が金属、半導体或いは導電性ポリマーであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
生体分子（３）が、抗体或いは免疫学的に活性な抗体フラグメントのような免疫学的な結合分子であり、そしてこの分析が免疫学的分析であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
基質及び基質（１）に結合した生体分子（３）が使用される分析用のバイオセンサーであって、検体（４）と他の生体分子との非特異的結合を防止すべく、生体分子（３）間の表面を覆う生体分子反撥性分子（５）と共にこの生体分子（３）がこの基質表面に共有結合的に直接結合することを特徴とするバイオセンサー。
【請求項１２】
生体分子反撥性分子（５）が、スルフィド、ジスルフィド又はチオール基のような官能基を介してこの基質に共有結合的に結合することを特徴とする請求項１１記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
生体分子反撥性分子（５）がポリマー、特に、親水性ポリマーであることを特徴とする請求項１１又は１２に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
生体分子反撥性分子（５）がその表面で自己組織化することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
この基質が、その表面の生体分子（３）に結合する検体（４）の増加を示唆するように、シグナルに変化を誘起し得るタイプのものであり、該センサーが更に、このシグナルを基質（１）に向けて発する手段、及び基質（１）との相互作用によるシグナル変化を検出する手段を含むことを特徴とする請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
基質（１）が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に適合する素材であり、シグナルを発する手段が発光装置であり、このシグナルを検出する手段が、この基質と誘電体間の界面から反射されたシグナルを感知するために供される、１個又は複数個の光検出器であることを特徴とする請求項１５記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
バイオセンサーが、水晶発振微量天秤（ＱＣＭ）センサーのような厚み剪断モード共鳴体センサーであることを特徴とする請求項１５記載のバイオセンサー。
【国際調査報告】
2005504294.tif 000029
2005504294.tif 000030