(57)【要約】本発明は、近接して結合される核酸タグ間の相互作用に基づく標的分子または標的分子間相互作用を検出する方法に関する。また、このような方法に使用するための試薬キットを提供する。
2005504308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子を検出する方法であって、
ａ）試料を２つ以上の結合実体に接触させるステップと、
ｂ）結合実体と標的分子との結合を可能にするステップと、
ｃ）結合実体に付着した核酸タグ間の相互作用を可能にするステップであって、該相互作用により新規配列を含む少なくとも１つのタグが生成され、該相互作用に引き続き該核酸タグが共有結合で架橋されないステップと、
ｄ）ステップｃ）で生成させた少なくとも１つのタグ中に新規配列を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
２つ以上の相互作用分子間の相互作用を検出する方法であって、
ａ）相互作用分子を、互いに相互作用することが可能なようにインキュベーションするステップと、
ｂ）相互作用分子に付着した核酸タグ間に相互作用を起こすステップであって、該相互作用により新規配列を含む少なくとも１つのタグが生成され、該相互作用に引き続き該核酸タグが共有結合で架橋されないステップと、
ｃ）ステップｂ）で生成させた少なくとも１つのタグ上に新規配列を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項３】
核酸タグ間の相互作用が、組み換えによって起こる請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
標的分子を検出する方法であって、
ａ）試料を２つ以上の結合実体に接触させるステップと、
ｂ）結合実体と標的分子との結合を可能にするステップと、
ｃ）結合実体に付着した核酸タグ間に組み換えを起こさせることにより、新規配列を生成させるステップと
ｄ）核酸タグ間の組み換えにより生成させた新規配列を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項５】
相互作用分子間の相互作用をモニターする方法であって、
ａ）相互作用分子を、互いに相互作用できるように、一緒にインキュベーションするステップと、
ｂ）相互作用分子に付着した核酸タグ間で組み換えを起こさせることより、新規配列を生成させるステップと、
ｃ）核酸タグ間の組み換えにより生成した新規配列を検出するテップと、
を含む方法。
【請求項６】
組み換えが、２つの別々の核酸タグを生成し、それぞれのタグが新規配列を有する、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
組み換えが、部位特異的であり、少なくとも１つのリコンビナーゼ酵素を使用することに依存する、請求項３乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組み換えが、ａｔｔＰおよびａｔｔＢ認識配列に依存する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
組み換えが、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＬｏｘＰ部位に依存する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
組み換えが、少なくとも１種のトランスポゼース酵素を使用することに依存する請求項２乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
組み換えが、モザイク末端認識配列を認識するＴｎ５トランスポゼース酵素に依存する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
リコンビナーゼまたはトランスポゼースが、反応液に添加された後に活性化される、請求項７乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
リコンビナーゼまたはトランスポゼースが、活性化バッファーを反応液に添加することによって活性化される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
組み換えが、核酸タグ間の相同組み換えによって起こる、請求項３乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸タグが、結合実体または相互作用分子に直接的に付着する、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸タグが、結合実体または相互作用分子に間接的に付着する、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
核酸タグが、二重鎖ＤＮＡまたは二重鎖ＲＮＡを含む、請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
核酸タグが、線状もしくは環状、またはこれらの混合である、請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
２つ以上の結合実体が、多量体標的分子の同一のモノマー単位内の対応する部位に結合する、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
２つ以上の結合実体が、標的分子の異なる領域に結合する、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
１つ以上の競争的分子の存在下で実行される、請求項１乃至２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
競争的分子が、核酸タグの少なくとも１つと相互作用することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
競争的分子が、核酸タグの少なくとも１つと組み換えによって相互作用することができる、請求項２２に記載の方
【請求項２４】
完全に溶液中で実行される、請求項２１乃至２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
新規配列の検出が、該新規配列の少なくとも一部の増幅によって実行される、請求項１乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
増幅が、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、または３ＳＲによって実行される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
新規配列の検出がリアルタイムで実行される、請求項１乃至２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
新規配列の検出が、分子的信号を用いる増幅反応の産物をリアルタイムで検出することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
相互作用分子または結合実体を複数の核酸タグで標識する、請求項１乃至２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
相互作用分子または結合実体を、２乃至１００の核酸タグで標識する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
それぞれが核酸タグで標識される２つ以上の結合実体を含む試薬キットであって、該核酸タグが相互作用し新規配列を含む少なくとも１つのタグを生成することができ、該核酸タグが相互作用に引き続き共有結合で架橋されないキット。
【請求項３２】
それぞれが核酸タグで標識される２つ以上の結合実体を含む分子間相互作用のモニターに使用するための試薬キットであって、該核酸タグが相互作用し新規配列を含む少なくとも１つのタグを生成することができ、該核酸タグが相互作用に引き続き共有結合で架橋されないことを特徴とするキット。
【請求項３３】
核酸タグが、組み換えによって相互作用することができる、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
それぞれが核酸タグで標識された２つ以上の結合実体を含む試薬キットであって、該核酸タグが組み換えを起こし新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することができることを特徴とするキット。
【請求項３５】
それぞれが核酸タグで標識される２つ以上の相互作用分子を含む、分子間相互作用のモニターに使用するための試薬キットであって、該核酸タグが組み換えを起こし新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することができることを特徴とするキット。
【請求項３６】
リコンビナーゼをさらに含む請求項３３乃至３５のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項３７】
核酸タグがＬｏｘＰ部位を含み、且つ、リコンビナーゼがＣｒｅリコンビナーゼである、請求項３６に記載の試薬キット。
【請求項３８】
少なくとも１つの核酸タグがａｔｔＰ配列を含み、ａｔｔＰ配列を含むタグ以外の少なくとも１つの核酸タグがａｔｔＢ配列を含み、リコンビナーゼがａｔｔＢ配列とａｔｔＰ配列との間の部位特異的な組み換えを触媒することができる、請求項３６に記載の試薬キット。
【請求項３９】
少なくとも１つの核酸タグがａｔｔＬ配列を含み、該ａｔｔＬ配列を含む以外の少なくとも１つの核酸タグがａｔｔＲ配列を含み、リコンビナーゼがａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列との間の部位特異的な組み換えを触媒することができる、請求項３６に記載の試薬キット。
【請求項４０】
トランスポゼースをさらに含む請求項３３乃至３５のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項４１】
核酸タグがモザイク末端認識配列を含み、且つトランスポゼースがＴｎ５トランスポゼースである請項４０に記載の試薬キット。
【請求項４２】
２つ以上の核酸タグと、該タグを相互作用分子または結合実体に付着させる手段と、を含む試薬標識キットであって、新規配列を含む少なくとも１つのタグを生成するように相互作用することができる核酸タグを少なくとも１対含み、２つの該核酸タグが相互作用に引き続き共有結合で架橋されないことを特徴とする、前記キット。
【請求項４３】
核酸タグが、組み換えによって相互作用することができる、請求項４２に記載の試薬標識キット。
【請求項４４】
２つ以上の核酸タグと、該タグを相互作用分子または結合実体に付着させる手段と、を含む試薬標識キットであって、新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することができるように組み換えを起こすことが可能な核酸タグを少なくとも１対含むことを特徴とする、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的分子または標的分子間の相互作用を検出する方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の核酸、タンパク質、またはより単純な分子などの標的分子を検出するための感度の高い様々な方法がある。このような分子の存在は、例えば進行中の感染症や環境汚染を示す指標として用いることができる。これらの方法が極めて高感度で単一分子ほどの微細な単位まで検出可能であるためには、特異性も高いものでなければならない。このような高い特異性は、多くの場合、２つのレポーターを検出対象の標的分子と結合させることにより達成される。
【０００３】
例えば、高感度ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の場合、２本の短い核酸プローブすなわちプライマーが標的核酸を認識する。したがって、標的核酸の検出は、両プライマーが同一標的分子に結合し、しかもその標的分子を介して連結されるときのみ達成される。プライマーの、他の分子との非特異的相互作用は、両プライマーがこの非特異的相互作用によって結合され、しかも非特異的相互作用によって連結されない限り、検出されない。反応の条件は、後者の可能性が極めて低いということである。このＰＣＲ法及び当技術分野で既知の他の分子増幅法には、例えばＮＡＳＢＡ（Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９９１）、３ＳＲ（Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）などがあり、標的核酸を検出するために用いることが可能である。
【０００４】
タンパク質などのその他の分子を検出するには、標的分子に特異的な抗体を、引き続き検出される核酸配列に連結させることが可能である。ただ、この例では、標的結合抗体が１つしかないため、検出の高感度性が失われている。
【０００５】
しかし、二重ファージ法（Ｄｕａｌ  Ｐｈａｇｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を用いれば、極めて高感度で特異性の高い標的分子の検出が可能である。二重ファージアッセイでは、信号を生成するのに２個のファージが必要であり、この２個のファージは、標的分子を介して互いに導かれるか連結されなければならない。これを達成するための最も簡単な方法は、標的分子に特異的な抗体などのリガンドにファージを連結させることである。この方法では、核酸、タンパク質、および単純または複雑な分子をはじめとする様々な標的分子を検出することが可能である。
【０００６】
米国特許第５，６３５，６０２号および同５，６６５，５３９号には別の方法が開示されている。その方法によれば、２個の標的特異的抗体の両方を、同じ核酸断片に連結させ、その核酸がブリッジを形成するようにする。この核酸ブリッジは、標的に結合した後特異的に開裂し再会合する。核酸ブリッジは２つのＰＣＲプライマー結合部位を含むため、完全な核酸ブリッジ（すなわち、開裂して再会合したもの）の存在は、再形成された核酸を認識する２本のプローブ及びＰＣＲを用いて確認することができる。この方法だと、アッセイの特異性が高くなる。何故なら、両方の抗体分子が標的に結合し、その結果空間的に接近すれば、核酸が開裂後に再形成される可能性がより大きいからである。目的の標的以外の分子に抗体が１つだけ非特異的に結合する場合、核酸ブリッジの再形成は起こらないと思われる。この方法のデメリットとして、標的抗原の非存在下で核酸ブリッジ分子全ての開裂を確保しなければならないという問題である。しかも、この方法は複雑であり、ＤＮＡ制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡライゲーション酵素を必要とする多くのステップを経なければならない。
【０００７】
欧州特許第０８３２４３１号は、特定の抗原を免疫学的に検出する方法に関する。この方法は、特定のマクロ分子に対する親和性を有する第１の固定試薬、ならびにそのマクロ分子の異なる決定基に対して特異的である第２および第３のアフィニティ試薬の使用に基づく。この第２および第３の試薬は、近接して保持されている場合架橋可能なオリゴヌクレオチドによって修飾される。このため、架橋されたオリゴヌクレオチドが増幅され、その結果特定の抗原を検出することが可能となる。
【０００８】
国際公開第０１／６１０３７号は、いわゆる近接プローブを使用して溶液中で分析物を検出するアッセイに関する。近接プローブは、結合部分と核酸からなる。近接プローブが分析物に結合すると核酸は接近し、その結果ライゲートされて通常増幅によって検出することが可能となる。この技術は、ライゲーションが効率の悪い反応であるおそれがあるという点でデメリットがある。そのうえ、反応混合物からリガーゼを除去した後に検出プロセスを実行しなければならない。
【０００９】
分子間相互作用をモニターするためにも、高感度の方法が必要となる。このような相互作用のモニターリングに依存しているのが創薬やプロテオミクスである。当技術分野で既知の多種多様な方法が現在用いられており、例えばシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）（Ｂｏｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｔｏｗｅｒｓ，１９８９）や様々な酵母ハイブリッド法（Ｍａ  ａｎｄ  Ｐｔａｓｈｎｅ，１９８８；  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ，１９９４）が挙げられる。
【００１０】
二重ファージ法もまた分子間相互作用のモニターリングに利用することができる。この場合、相互作用を調べる対象となる各分子がそれぞれリガンド結合部位を有しており、この各リガンド結合部位に、直接的または間接的に、１つのファージ型が結合できる。したがって、２つのファージ型を連結させることによって、分子間の相互作用をモニターすることができる。分子が相互作用すれば２つのファージ型は互いに導かれ、相互作用しなければ分離したままである。この方法がプロテオミクスや創薬に応用されている。
【発明の説明】
【００１１】
本発明は、２つ以上の結合実体の標的分子への結合を検出するため、および分子間相互作用をモニターするための改良された方法を提供することを目的とする。
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、標的分子を検出する方法（以下「検出法」と呼ぶ）であって、
ａ）試料を２つ以上の結合実体と接触させるステップと、
ｂ）結合実体と標的分子との結合を可能にするステップと、
ｃ）結合実体に付着した核酸タグ間の相互作用を可能にするステップで、該相互作用が新規配列を含む少なくとも１つのタグを生成させ、該相互作用に引き続き該核酸タグは共有結合で架橋されないステップと、
ｄ）ステップｃ）で生成させた少なくとも１つのタグの中に新規配列を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法が提供される。
【００１３】
この方法は、目的とする標的分子に特異的な結合実体に付着された核酸タグ間の相互作用に依存する。この相互作用は、新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成する。ここで、新規配列とは、当該タグが相互作用可能になる前に存在していた核酸タグの配列とは異なる配列を意味する。新規配列の生成は、結合実体が標的分子上の近接結合部位へ結合することによって接近する核酸タグ間の相互作用というプロセスによって起こる。
【００１４】
結合実体が標的分子に結合すると、核酸タグが接近し、その結果タグ間の相互作用が促進されるという効果が生じる。標的上の近接部位に結合実体が結合すると、その結果、核酸タグが極めて近位になる。このことは、検出反応の特異性を高め、さらに、信号対ノイズ比をバックグラウンド以上に改善する比率の向上をもたらす。バックグラウンドは、結果的にランダム配列生成事象となると思われる非特異的結合に起因している。
【００１５】
検出法の最も好ましい実施形態では、核酸タグが相互作用に続いて共有結合で架橋されない。このことは、相互作用の前に別々の結合実体に付着された核酸タグが、その相互作用の間に一過性の架橋が生じたかどうかに関わらず、その相互作用の結果として永久に連結されるのではないことを意味する。永久的な架橋がないため、結合実体／相互作用分子間には核酸ブリッジ構造がまったく形成されない。通常、相互作用は別々のタグを生成し、少なくともそのうちの１つが新規配列を有する。本方法では、２つの別々のタグを生成する２つの核酸タグ間で相互作用が生じ、それぞれのタグが新規配列を有することが最も好ましい。この後者の実施形態では、相互作用の結果、２つのタグ間で核酸の「交換」が効率的に行われる。
【００１６】
核酸タグが、相互作用に引き続き共有結合架橋しないという事実は、相互作用により生成される新規配列タグの検出という点で、重要な技術的メリットをもたらす。例えば、それぞれに新規配列を有する２つの別々のタグが生成すると、別々に検証可能な２つの産物が得られる。さらに、新規配列の検出が増幅反応で達成されるとすれば、タグが物理的に架橋されたままであった場合に存在したと考えられる立体的な拘束が増幅のステップ中になく、この反応はより効率的なものとなるであろう。
【００１７】
新規配列を有する少なくとも１つのタグの生成が導かれ、タグが共有結合で連結されない限り、核酸タグはいかなる種類の反応によっても「相互作用」させてよい。本発明の最も好ましい実施形態では、核酸タグ間の相互作用は組み換えによって起こる。
【００１８】
近接した核酸タグ間の相互作用手段として組み換えを自然に用いることは、例えばライゲーションのような従来技術による方法よりも、技術的にメリットが大きい。それは核酸タグが相互作用の結果架橋されるか否かにかかわらない。
【００１９】
したがって、本発明はまた、標的分子を検出する方法であって、
ａ）試料を２つ以上の結合実体に接触させるステップと、
ｂ）結合実体が標的分子に結合することを可能にするステップと、
ｃ）結合実体に付着した核酸タグ間で組み換えを可能にし、それにより新規配列を生成させるステップと、
ｄ）核酸タグ間の組み換えにより生成した新規配列を検出するステップと、
を含む方法を提供する。
【００２０】
本願明細書では、「組み換え」とは、検出可能な少なくとも一つの新規の配列を生成するために、核酸タグ間の核酸配列のあらゆる交換または配列の挿入または欠損を含むものと定義する。例えば、部位特異的な組換事象（例えば、特異的リコンビナーゼを必要とする）、転位事象（例えば、特定のトランスポサーゼを必要とする）および相同組み換え事象が挙げられる。
【００２１】
通常、核酸配列間で広範な相同性を必要としない限り、部位特異的な組み換え事象は、非相同組み換え事象である。多くの場合、部位特異的組み換えは短い組み換え部位配列（通常、数十の塩基対）の存在を必要とする。多くの部位特異的な組み換え系は、相互作用する核酸分子において同一の組み換え部位配列の存在を必要とする。しかし、他の系では、それぞれがバクテリオファージλおよび大腸菌染色体に由来する組込み部位ａｔｔＰおよびａｔｔＢと同様に、組み換え部位はほとんど、または全く配列相同性を共有しない。
【００２２】
好ましい実施形態では、新規の配列の生成を導く核酸タグ間の組み換えはリコンビナーゼにより触媒される。これは、特定のリコンビナーゼ酵素により認識される核酸タグの部位特異的な配列を含むことにより達成してもよい。
【００２３】
使用してよい適切な部位特異的組み換え系としてはＣｒｅ／ｌｏｘＰ系が挙げられる。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系では核酸タグがｌｏｘＰ部位を含み、組換え系はＣｒｅリコンビナーゼにより触媒される。他の適切な系は、バクテリオファージλ統合系であり、核酸タグはａｔｔＰおよびａｔｔＢ認識配列またはａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列を含み、これらの部位を認識する酵素により組み換えが触媒されることを可能にする。ａｔｔＢとａｔｔＰ部位との間、またはａｔｔＬとａｔｔＲ配列との間の組み換えは、λファージ酵素インテグラーゼにより触媒され、宿主付属因子ＩＨＦを必要とする。λファージ組み換え系は周知であり、組み換えに必要な酵素は（例えば、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）のＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング系の成分として）市販されている。これらの特定の組み換え系は、実施例に挙げられているが、これらの特異的な系の使用により、本発明を制限するものではない。Ｆｌｐ／ＦＲＴ系等の公知の他の部位特異的な組み換え系も使用可能である。
【００２４】
さらに別の実施形態では、組み換えは転位事象に依存しても良く、トランスポサーゼの使用に依存してもよい。
【００２５】
このような組み換え系の１つの適切な例としては、モザイク末端認識配列を認識するＴｎ５トランスポサーゼに依存する組み換え系がある。しかし、本発明では、この特異的な系の使用に制限せずに、公知の他の転位系を使用してもよい。
【００２６】
別の実施形態では、１つの結合実体と結合する１つの核酸タグが、第ニ結合実体と結合する核酸タグに転移可能なトランスポサーゼにより認識される転移因子を含む。この例では、全ての核酸タグが部位特異的組み換えまたは転位部位を含む必要は無い。
【００２７】
別の実施形態では、組み換えは相同組み換えにより生じてもよい。相同組み換えにより生成される新規の配列が増幅反応により検出されると、プライマー結合部間のどこにでも発生する、あらゆる組み換え事象がプライマー結合部位の新規の組み合わせを使用する増幅により検出されるよう、増幅に必要とされるプライマー結合部位を核酸タグの最末端および相同領域外に配置することが有利である。
【００２８】
部位特異的組み換えを達成するために、正しい組み換え部位配列を有する核酸タグは、適切なリコンビナーゼ（またはトランスポサーゼ）の存在下で近接しなければならない。リコンビナーゼまたはトランスポサーゼ酵素は本方法の結合ステップが実行される反応媒体に存在してもよく、別の試薬添加ステップで添加してもよい。例えば、結合実体が標的分子に結合した後に添加してもよい。
【００２９】
ある実施形態では、核酸を近くに配置するために、不活性化状態の酵素から開始し、標的分子への結合実体の結合後にのみ、酵素が活性化することが有利であると思われる。酵素の活性化は、例えば、反応媒体の組成、ｐＨ、または温度を変えることにより達成されてもよい。
【００３０】
この発明の前後関係では「結合実体」を、標的分子に特異的に結合する、あらゆる分子として定義する。結合実体の例としては、例えば、標的特異的結合活性（例えばＦａｂ断片）を保持する抗体、レクチン、受容体、転写因子、補助因子、核酸、およびその断片等が挙げられる。これらの結合実体は、単に列挙しているに過ぎず、本発明を限定するものでは無い。
【００３１】
標的分子自体は、特定の検出法の提供を要求する、いかなる分子でもよい。標的分子は、単一の分子、多量体、凝集体または分子集合体または複合体を含んでもよい。多量体は、一般に共有結合性または非共有結合性相互作用により連結する単一分子の複数の反複を含む。複合体は、通常、共有結合性または非共有結合性相互作用により相互作用する異分子から成る。
【００３２】
結合実体は、単一の標的分子の異なる領域を結合してもよい。したがって、結合実体が標的分子の各領域に結合する際、核酸タグは接近する。
【００３３】
標的分子が多量体または凝集体である場合、結合実体は多量体または凝集体を形成するユニットの単量体成分の等価結合部に結合してもよい。
【００３４】
核酸タグを結合実体に連結する適切な方法は公知であり、例えばバイオコンジュゲーション（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ；エム  アスラムおよびエイ  デント（Ｍ  Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ  Ｄｅｎｔ）マクミラン  リファレンス社編（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｔｄ）１９９８））等の使用説明書に記載されている技術を参照。
【００３５】
好ましい実施形態では、結合実体は検出感度を高める核酸タグの多数のコピーにより標識されてもよい。１つの結合実体１部につき、約１〜１００の核酸タグが存在することが最も好ましいが、より多数存在しても、本発明の範囲内にある。
【００３６】
好ましい実施形態では、核酸タグは結合実体に直接付着してもよい。直接連結は共有結合連鎖を経て達成される。
【００３７】
アミン誘導体化された核酸タグは、複数の化学的架橋化合物のいずれか一つを使用して結合実体に連結してよい。
【００３８】
核酸タグが間接的に結合実体に付着することもまた、本発明の範囲内である。例えば、付着はリンカー分子により達成してもよい。適切なリンカー分子は、ビオチン／ストレプトアビジンまたはビオチン／アビジン等の高親和性により結合する生物学的な結合対の成分を含む。
【００３９】
検出法の多くの用途では、タグは検出反応の開始時、少なくとも標的分子に対する結合実体の結合前に結合実体に付着する。最も好ましくは、結合実体は、核酸タグで予め標識されて供給されるか、別の試薬標識ステップでタグが付着される。しかし、結合反応が起こっている間に、すなわち結合実体が標的に結合した後に結合実体に核酸タグを付着する可能性も除外されない。
【００４０】
本願明細書では「核酸タグ」とは、組み換え等により、新規の配列を生成するために相互作用をすることができる、あらゆる天然の核酸、および天然または合成の類似体を含むと定義される。適切な核酸タグは、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ、二本鎖または一本鎖ＲＮＡから成るタグを含む。部分的に二本鎖のタグおよび部分的に一本鎖のタグも考慮される。一本鎖タグで標識された成分と、一本鎖タグと相互作用可能な二本鎖タグで標識されたその他の成分等、一本鎖タグと二本鎖タグを組み合わせて使用することも考慮される。相互作用が組み換えにより達成される場合、核酸タグは、組み換え反応に関与可能な、あらゆる核酸を含み、適当な例として、線条または環状の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が含まれる。最も好ましくは、核酸タグは、ｄｓＤＮＡを含む。「核酸」とは、非自然または誘導体化された塩基を組み込んだ核酸類似体または修飾された主鎖を有する核酸類似体等、天然の核酸と類似の方法で「相互作用する」ことが可能な合成類似体を含む。特に、用語「二本鎖ＤＮＡ」または「ｄｓＤＮＡ」は、非自然の塩基を含むｄｓＤＮＡを含むと解釈される。
【００４１】
ある配列がタグ間で「相互作用」可能となることを求められ、新規の配列の少なくとも一つのタグを生成する場合を除いて、核酸タグの正確な配列は本発明にとっては本質的な問題ではない。例えば、部位特異的な組み換えを可能とするため、特定の配列が必要となる。異なる結合実体に付着するタグは、通常は、異なる配列であり、その結果として核酸タグ間の相互作用事象により検出可能な少なくとも一つの新規の配列が生成する。しかし、上記タグが新規の配列を生成するために相互作用可能な場合、同一配列のタグを使用することは除外されない。
【００４２】
核酸タグ間で相互作用により生成される新規の配列を検出するステップは、公知のあらゆる適切な技術を使用して達成してもよい。
【００４３】
最も好ましくは、新規の配列の検出は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲまたは公知の他のあらゆる増幅技術等の増幅反応を含む。増幅は、新規の配列に特異的な増幅プライマーを用いて達成する。新規のタグ配列に対する特異性を提供するために、完全に新規な配列の領域に対応するプライマー結合部位を選択するか、あるいは、最初のタグに存在しないプライマー結合部位の新規の組合せを選択してもよい。
【００４４】
熟練した読者は、新規の配列がまた、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ等の、等温増幅技術に必要とされるＲＮＡポリメラーゼ結合部位またはプロモータ配列等の新規配列の検出を必要とするプライマー結合部位以外の配列を含むことが可能であることを理解するだろう。
【００４５】
好ましい実施例では、増幅反応生成物の「リアルタイム」検出を用いた増幅により、新規の配列が検出される。これは、増幅生成物の形成の連続的なモニターリングが可能な、あらゆる増幅技術を用いて達成可能である。
【００４６】
増幅反応生成物をリアルタイムに検出する多くの技術は、公知である。これらの多くから、連続的モニターが可能な蛍光読み取り（具体的には分子ビーコンおよび蛍光共振エネルギー転移プローブ）が産生される。ＰＣＲ反応のリアルタイム定量化は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム（アプライドバイオシステム社製）を使用して達成可能である。
【００４７】
最も好ましい実施形態では、全ての検出法はリアルタイムで実行される。これは、結合実体の結合、核酸タグの相互作用および相互作用の生成物の検出が単一反応ステップで同時に行われることを意味する。リアルタイム検出は、中間洗浄ステップを必要とせずに、結合ステップ、核酸タグ間の相互作用および相互作用の生成物の検出が、単一反応条件下で全て実施可能である必要がある。このことは、核酸タグ間の相互作用が組み換えにより実行されると、従来技術に対する本発明の主な技術的利点を示す。本実施例では、新規配列のリアルタイム検出は、結合実体の標的分子への結合に悪影響を与える温度変化を防ぐため、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ等の等温性増幅反応を使用して行われることが好ましい。
【００４８】
また別の好ましい実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の競争的分子の存在下で実施される。この実施形態は、完全に溶液中で実施するのが最も好ましい。競争的分子は、過剰な量で存在することが好ましい。競争的分子は、核酸タグの少なくとも一つと相互作用することが可能なように設計することが好ましい。しかし、競争的分子は、核酸タグ上に新規の検出可能配列を生成させないような異なる配列を有している。１つの好ましい方法では、組み換えにより、競争的分子を核酸タグと配列交換させることが可能である。競争的分子がいったん核酸タグの少なくとも一つと相互作用してしまうと、タグ間が相互作用して新規配列を生成することはもはや起こりえない。結合実体と標的分子との結合がなければ、自由溶液中の過剰な核酸タグは相互作用して検出可能な新規配列を生成しないうちに「片付け」られる。すなわち不活性化される。結合実体の標的分子との結合があれば、核酸タグは空間的に接近するため、互いに相互作用することが可能になり、競争的分子と相互作用しないで、検出可能な新規配列を生成することができる。
【００４９】
競争的分子を用いることにより、本方法は、いかなる標的分子をも固定化する必要なく、完全に溶液中で実施することが可能である。競争的分子を用いれば、また、結合実体が標的分子に特異的結合をしない場合に相互作用するタグに起因するバックグラウンド信号を低下させることができる。
【００５０】
標的分子の高感度で特異的な検出を、中間に洗浄ステップを入れる必要なく、単一の反応で行うことが可能であるという点で、本発明は、従来技術の方法に対する改良を提供する。よって、本方法は、例えばハイスループットの状況における自動化などにより適している。また、リコンビナーゼおよびトランスポゼースにより触媒される組み換えは、概して、ライゲーションより効率のよい方法である。これは、本方法の感度と再現性が、ライゲーションに依存する方法と比べて改良されていることを意味する。
【００５１】
本発明の「検出法」は、要求される特異性を持つ適切な「結合実体」が利用可能な、ほとんどいかなる「標的分子」の検出にも採用することができる。本方法を用いてテストする「試料」は、検出法の操作に不可欠な特異的結合反応を生じさせるものであれば、ほぼいかなる物質でもよい。
【００５２】
「検出法」は、標的分子、特にタンパク質、核酸、炭水化物等の標的生物学的分子の特異的検出を行うことが望ましいあらゆる分野の技術において有用である。検出法の１つの重要な適用分野が、臨床診断の分野である。（ただしこれに限定することを意図するものではない）。試料は通常、ヒトの患者から採取された生物学的流体、例えば、全血、血清、血漿、尿などの試料である。その他の重要な用途としては、環境試験ならびにモニターリングなどが挙げられる。
【００５３】
本発明の重要な実施形態では、上述のような検出法の特徴を、分子間相互作用をモニターするために用いることができる。したがって、本発明の第２の態様によれば、２つ以上の相互作用分子間の相互作用を検出する方法（本明細書中では「相互作用法」と呼ぶ）であって、
ａ）相互作用分子を、互いに相互作用することが可能なようにインキュベーションするステップと、
ｂ）相互作用分子に付着させた核酸タグ間に相互作用を起こさせるステップで、該相互作用が新規配列を含む少なくとも１つのタグを生成させ、該相互作用に引き続き該核酸タグは共有結合で架橋されないステップと、
ｃ）ステップｂ）で生成させた少なくとも１つのタグ上に新規配列を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法が提供される。
【００５４】
さらに本発明は、標的分子を検出する方法であって、
ａ）試料を２つ以上の結合実体に接触させるステップと、
ｂ）結合実体を標的分子に結合させるステップと、
ｃ）結合実体に付着させた核酸タグ間に組み換えを起こさせ、それにより新規配列を生成させるステップと
ｄ）核酸タグ間の組み換えにより生成させた新規配列を検出するステップと、
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００５５】
好ましい実施形態では、プロテオミクスにおいて、分子間相互作用を調べるために相互作用法を用いてもよい。例えば、第１の相互作用分子を第１の核酸タグで標識し、次いで、この第１の相互作用分子と相互作用する可能性のある分子のライブラリーを第２の核酸タグでそれぞれ標識してもよい。この第１の相互作用分子と分子ライブラリーの１つの成分との間に相互作用が起こると、この第１のタグと第２のタグとが接近し、それによりタグ間で相互作用が起こる。その結果、相互作用するパートナーを同定するために検出される新規配列が生成する。
【００５６】
また別の用途としては、創薬の分野がある。例えば、分子の特定の組み合わせ間の相互作用を研究し、分子間相互作用の阻害剤またはエンハンサーを同定するために、相互作用法を用いてもよい。相互作用分子間の相互作用により接近した核酸タグの相互作用に引き続いて検出される信号を低下させる能力の有無をスクリーニングすることによって、特定の相互作用の阻害剤となる可能性がある物質を同定することも可能であろう。
【００５７】
「相互作用分子」は、研究の対象とすることが望ましい相互作用分子の組み合わせであれば、事実上いかなる組み合わせにしてもよい。例えば、マルチサブユニット複合体のサブユニット同士、ニ量体を構成する一対の単量体、リガンドと受容体、酵素と基質または阻害剤等であってもよい。
【００５８】
「相互作用法」が検出法と異なるのは、核酸タグを、標的分子との結合能を持つ結合実体にではなく、評価の対象とすることが望ましい相互作用分子に付着させるという点だけである。したがって、相互作用法は、検出法に関して上述した特徴と類似点を持っている。このことは、熟練した読者には明らかであろう。
【００５９】
相互作用法は、検出法に関して上述した様々なアプローチを用いてリアルタイムで実行することが特に好ましい。分子間相互作用をリアルタイムでモニターできることは、特に創薬の分野で大きなメリットとなる。
【００６０】
本発明はまた、検出法または相互作用法を実行する際に使用するのが適切な試薬キットに関する。
【００６１】
検出法を実行する際に使用するのが適切な試薬キットは、それぞれが核酸タグで標識された２つ以上の結合実体を含んでよく、該核酸タグは相互作用し新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することができ、さらに該核酸タグは、相互作用に引き続き共有結合で架橋されないことを特徴とする。
【００６２】
好ましい実施形態では、核酸タグは組み換えにより相互作用することができる。したがって、本発明はさらに、核酸タグが組み換えを起こして新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することを特徴とする、それぞれが核酸タグで標識された２つ以上の結合実体を含む試薬キットを提供する。
【００６３】
相互作用法を実行する際に使用するのが適切な試薬キットは、それぞれが核酸タグで標識された２つ以上の相互作用分子を含んでよく、該核酸タグは相互作用し新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することができ、さらに該核酸タグは、相互作用に引き続き共有結合で架橋されないことを特徴とする。
【００６４】
好ましい実施形態では、核酸タグは組み換えにより相互作用することができる。したがって、本発明はさらに、核酸タグが組み換えを起こして新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することを特徴とする、それぞれが核酸タグで標識された２つ以上の結合実体を含む試薬キットを提供する。
【００６５】
試薬キットは、検出法および相互作用法に関して言及した好ましい特徴のうちいかなる点をも反映するものであってよい。例えば、本キットに含まれる核酸タグは、リコンビナーゼまたはトランスポゼースにより触媒される部位特異的な組み換えを介して相互作用を可能にする組み換え部位を含んでよい。組み換え部位と酵素との好ましい組み合わせは、検出法および相互作用法の説明において列挙した通りである。キットには、さらに、適切なリコンビナーゼまたはトランスポゼースという供給品が含まれてもよく、かつ組み換え反応に必要な任意の酵素の補因子や、アクセサリータンパク質という備品が含まれてもよい。
【００６６】
試薬キットには、適切な反応バッファーという備品が含まれてもよい。核酸タグ間の相互作用の産物の検出が増幅によって行われる場合、キットには、増幅反応に必要である試薬が含まれてもよい。例えば、プライマーセット、増幅酵素、増幅産物の検出用プローブ（蛍光標識プローブまたはその他の内容表示ラベルを含む）、正の対照用増幅鋳型、反応バッファー等のうち、任意のものが含まれてよい。
【００６７】
本発明はさらに、相互作用法または検出法において用いられ、相互作用分子または結合実体を標識するために使用することができる試薬標識キットに関する。本キットは、２つ以上の核酸タグと、該タグを相互作用分子／結合実体に付着させる手段と、を含み、相互作用し新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することができる核酸タグを少なくとも１対有し、さらに２つの該核酸タグが、相互作用に引き続き共有結合で架橋されないことを特徴とする。
【００６８】
さらに、核酸タグは、組み換えによって相互作用できることが最も好ましい。したがって、好ましい実施形態では、試薬標識キットは、２つ以上の核酸タグと該タグを相互作用分子に付着させる手段とを含み、組み換えを起こし新規配列を有する少なくとも１つのタグを生成することができる核酸タグを少なくとも１対有することを特徴とする。
【００６９】
１つの実施形態では、タグを相互作用分子または結合実体に付着させる手段は、核酸を結合実体または相互作用分子に架橋することができる化学試薬であってよい。
【００７０】
好ましい実施形態では、タグを付着させる手段は、間接的連結であってよい。間接的連結の好ましい種類は、例えば、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンのような生物学的結合ペアという成分によって提供される。この実施形態では、核酸タグの少なくとも一方を生物学的結合ペアの一方に連結させる。キットには、予め結合させた核酸タグという供給品が含まれてもよいし、あるいは、該タグを結合ペアの一方と結合する手段によって未だ連結されていないタグが含まれてもよい。キットにはさらに、結合ペアの一方と予め結合させた結合実体または相互作用分子のいずれかが含まれる。あるいは、選択した結合実体または相互作用分子を結合ペアの一方に結合させる手段が含まれる。
【００７１】
生物学的結合対の片方を相互作用分子に付着させる手段は、（その結合ペアの性質にもよるが）化学的架橋試薬であってよい。しかし、この手段は、結合実体または相互作用分子を融合タンパク質として発現させるために用いる発現ベクターを含んでよい。その場合の融合は、結合ペアのもう一方との直接の融合か、または結合ペアのもう一方の付着を可能にするポリペプチドタグとの融合である。一例として、ビオチン化融合タンパク質の発現ベクターが当技術分野で既知であり、市販されている。（例えば、米国マディソン、ＷＩのプロメガ社製ピンポイント（ＰｉｎＰｏｉｎｔ）ベクター系がある）。このようなベクターは、タンパク質を、ビオチンカルボキシラーゼキャリアータンパク質のビオチン化領域との融合として発現可能にする。融合タンパク質は、ＡＴＰ感受性酵素反応により、大腸菌宿主細胞中でビオチン化する可能性がある。したがって、試薬標識キットは、ビオチン化融合タンパク質を発現可能にするこのようなベクターと、ストレプトアビジン結合核酸タグとを含むものであってもよい。
【００７２】
本発明は、添付の図面と供に以下の実施例を参照することにより理解されよう。
【００７３】
図で用いられる記号に関するキーは、４１頁に見いだすことができる。
【００７４】
図１を参照すると、開始試薬は核酸タグが付された２つの結合実体（例えば抗体。上記手掛かりを参照）である。この実施形態では、一方の結合実体を環状タグで標識し、他方を線状タグで標識する。これらの結合実体を、特異的結合を介して標的分子と連結させる（ステップ１）。結合実体を標的に結合させた後、一方の核酸タグのＡｔｔＰ部位と他方の核酸タグのＡｔｔＢ部位との組み換えを可能にするリコンビナーゼ酵素を添加し、検出可能な新規配列（ステップ３）を持つ新規核酸分子を生成させる（ステップ２）。この例では、新規配列はＰＣＲに適したプライマー結合部位、またはプライマー結合部位とＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーターとの組み合わせを含むので、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ等温増幅技術によって増幅することができる（ステップ４）。標的分子の非存在下では、核酸タグが接近せず、組み換えおよびそれに続く増幅を起こすことができない。他の例では、両方の核酸タグが環状であり、上記のようにＡｔｔＰ部位とＡｔｔＢ部位との間で組み換えが生ずる。組み換え産物は、両方の環状構成要素由来の配列が組み込まれた新規核酸配列を持つより大きな環であり、上記方法によって検出することができる。
【００７５】
図２は、ＰＣＲプロセスに関わることができる増幅可能なセグメント等、付加的機能性を持った配列を生成する核酸タグ間での配列交換を示す。核酸タグ（線状または環状である）が付着２つの標的結合実体（例えば抗体）を、特異的結合を介して標的分子と連結させる（ステップ１）。結合実体を標的に結合させた後、Ｃｒｅリコンビナーゼを添加し、一方の核酸タグ上のＬｏｘＰ部位と他方の核酸タグのＬｏｘＰ部位との間で組み換えを可能にする（ステップ２）。２つの新たな核酸分子が直ちに形成され、そのうちの１つに検出可能な新規配列が含まれる（ステップ３）。この例では、新規配列は、ＰＣＲに適したプライマー結合部位、またはプライマー結合部位とＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーターとの組み合わせを含むことができ、さらにＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ等温増幅技術によって増幅することができる（ステップ４）。標的分子の非存在下では、核酸タグが接近せず、組み換えおよびそれに続く増幅を起こすことができない。
【００７６】
図３は、検出可能な新規配列をもたらす核酸タグ間の配列交換を示す。検出可能な新規配列の例として、核酸増幅プライマー結合部位またはＲＮＡポリメラーゼ結合部位、すなわち増幅による新規配列の検出を可能にするプロモーターが挙げられる。配列交換を促進する配列を三角形で示す。使用しうる一つの系は、ラムダファージを用いた部位特異的組み換え系である。この例では、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ組み換え配列がリコンビナーゼ存在下で組み換えをおこない、ａｔｔＰおよびａｔｔＢを生成する。
【００７７】
図４は、増幅および検出が可能な配列を露出させる核酸タグ間での配列交換を示す。２つの標的特異的結合部位が付着核酸タグ（線状または環状である）とともに示されている。結合実体を、特異的結合を介して標的分子と連結させる（ステップ１）。結合実体を標的に結合させた後、Ｃｒｅリコンビナーゼを添加し、一方の核酸タグ上のＬｏｘＰ部位と他方の核酸タグのＬｏｘＰ部位との間で組み換えを可能にする（ステップ２）。２つの新たな核酸分子が直ちに形成され、そのうちの１つに検出可能な新規配列が含まれる（ステップ３）。この新規配列は、増幅可能な配列を含むことができ、同一核酸分子上の他の部位とともにＰＣＲ、ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ等温増幅検出技術の基本として作用することができる（ステップ４）。核酸分子の非存在下では、核酸タグが接近せず、組み換え、検出可能な新規配列の生成、およびそれに続く増幅を起こすことができない。
【００７８】
図５は、分子間相互作用をモニターする技術の使用を説明する。相互作用を研究する対象（図５では円形および月形）となる分子実体（相互作用分子）を、核酸タグにより直接的または間接的に標識する。相互作用分子が相互作用する場合、核酸タグが接近し、相互作用が可能になる（図中ステップ１参照）。例えば、リコンビナーゼ系では、タグが組み換え特異的認識配列（図中三角形）を有し、リコンビナーゼの存在下で核酸タグ間の配列交換が検出可能な新規配列（図中長方形）をもたらす。検出可能な新規配列の例としては、核酸増幅プライマー結合部位またはＲＮＡポリメラーゼ結合部位、すなわち増幅により新規配列の検出を可能にするプロモーターが挙げられる（ステップ４）。この例では、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ組み換え配列がリコンビナーゼ存在下で組み換えをおこない、ａｔｔＰおよびａｔｔＢを生成する。このような方法を用いて、相互作用することが知られている分子間の相互作用をモニターしたり、新規の相互作用分子を探索したり、また既知の分子間の相互作用を発見したりすることが可能である。本方法はまた、例えば、阻害剤の存在により相互作用の阻害を観察するために利用することもできるだろう。この後者のアプローチは、創薬のプログラムにおいて、生物学的に重要な分子実体の相互作用を阻害する分子を同定するために用いてもよい。
【００７９】
（実施例１）標的特異的リガンドで標識したＤＮＡ分子間の標的促進組み換えの証明
この実験は、二本鎖ＤＮＡの２つの分子を標的分子に結合させることにより接近させた場合、この２つのＤＮＡ分子間での組み換えが促進されることを示す。この例では、ＤＮＡ鎖は、標的分子であるストレプトアビジンのリガンドとして作用するビオチンにより誘導体化される（ストレプトアビジンの各分子は、４つのビオチンリガンドと結合することができる）。
【００８０】
１．組み換えに必要なバクテリオファージインテグラーゼ（ファージ特異的リコンビナーゼ）シグナル配列であるａｔｔＬおよびａｔｔＲを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、これらの配列を含む市販の２つのプラスミドから増幅した。ＰＣＲプライマーは、引き続きＰＣＲ産物の化学的誘導体化を可能にするアミノ末端基を有していた。
【００８１】
２．ＰＣＲ産物は、標準的技術を用いてアガロースゲル精製し、各ＰＣＲ産物１μｇを含有するＰＢＳ中でビオチンアミドカプロン酸３‐スルホン‐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル０．５ｍｇを用いてビオチン化した。
【００８２】
３．ビオチン化産物は、エタノール沈殿およびアガロースゲル精製で精製した。
【００８３】
４．ＰＢＳ１０μｌに各ビオチン化ＰＣＲ産物１００ｎｇを含有する２種類の反応液を調製した。一方の反応液には、ストレプトアビジン分子１０１０も含有させた。
【００８４】
５．ビオチンリガンドとストレプトアビジンとを、室温で２時間相互作用させた後、各反応液の１０倍段階希釈液０．５μｌをリコンビナーゼおよび適当なバッファーを含む組み換え反応液５μｌに添加した。
【００８５】
６．両反応液を２４℃で２時間インキュベーションした。
【００８６】
７．組み換え後、反応産物を検出するために、ＰＣＲで反応液を調べた。１本のＰＣＲプライマーはａｔｔＬ配列の配列５'側に向かい、１本はａｔｔＲ  配列の３'側に向かっていた。いかなるＰＣＲ産物も組み換えが生じたことを示すものである。
【００８７】
８．ＰＣＲの後、反応液をアガロースゲル電気泳動で分析した。
【００８８】
結果
組み換え特異的ＰＣＲ産物は、最も濃度が高いビオチン化ＤＮＡを含有させた反応液中に見られた。ストレプトアビジンを含有させた反応液において観察されたバンドは、ストレプトアビジンを含有しない反応液の約５倍も鮮明であった。リコンビナーゼの非存在下では（すなわち酵素による対照群なしでは）ＰＣＲ産物は観察されなかった。
【００８９】
考察
このことは、このような条件下で、ストレプトアビジンが二本鎖ＤＮＡ分子間の組み換えを促進することを示す。このことは、ＤＮＡ分子がビオチンリガンドを介してストレプトアビジンに結合するためである。このようにしてＤＮＡ分子同士が接近し、その結果ＤＮＡ分子間での組み換え率が向上する。
【００９０】
（実施例２）相互作用分子に付着しＤＮＡ分子間における促進された組み換えを介しての分子間相互作用の実証
この実験は、分子間相互作用をモニターするために組み換えを用いることが可能であることを示す。２つの反応体を二本鎖ＤＮＡで標識する。分子が相互作用すると２つのＤＮＡ分子が接近し、これらのＤＮＡ分子間での組み換えが促進される。この例で、われわれは１つのＤＮＡの二本鎖ｆｒされたストレプトアビジンと他のＤＮＡの二本鎖で標識されたビオチンとの相互作用をモニターした。
【００９１】
１．組み換えに必要なバクテリオファージインテグラーゼ（ファージ特異的リコンビナーゼ）シグナル配列であるａｔｔＬおよびａｔｔＲを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、これらの配列を含む市販の２つのプラスミドから増幅した。ＰＣＲプライマーには、引き続きＰＣＲ産物の化学的誘導体化を可能にするアミノ末端基が含まれていた。
【００９２】
２．ＰＣＲ産物は、標準的技術を用いてアガロースゲル精製し、さらに各ＰＣＲ産物ｌμｇを含有するＰＢＳ中に溶解したビオチンアミドカプロン酸３‐スルホン‐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル０．５ｍｇを用いてビオチン化した。
【００９３】
３．ビオチン化産物は、エタノール沈殿およびアガロースゲル精製で精製した。
【００９４】
４．ＤＮＡ標識ストレプトアビジンを生成するため、ストレプトアビジンとビオチン化ａｔｔＬ  ＰＣＲ産物とをモル比１：２で混合し、３０分間反応させた。
【００９５】
５．次に、標識したストレプトアビジンを固相上に固定化した。この例では、製造元の使用説明書に従い、標識ストレプトアビジンを無色マレイン酸（Ｒｅａｃｔｉ  Ｂｉｎｄ、ピアス社）マイクロタイタープレートのウェルに固定化した。標識ストレプトアビジン１０ｎｇ〜１０ｆｇの１０倍段階希釈液を固定化した。非標識ストレプトアビジン対照群も含まれた。
【００９６】
６．標識ストレプトアビジンを固定化した後、ウェルをビオチン化ａｔｔＲ  ＰＣＲ産物１０ｎｇ／ｍｌを含むＰＢＳ０．１％  （ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０とともにインキュベーションした。固定化した標識ストレプトアビジンを添加した対照ウェルは、ＰＢＳのみでインキュベーションした。
【００９７】
７．６０分後、ウェルをＰＢＳで５回洗浄し、供給された反応バッファーで１／１０に希釈したＣｒｅリコンビナーゼ（インビトロゲン社）１０ｇｌを添加した。ストレプトアビジンで標識され、かつａｔｔＲとともにインキュベーションした対照ウェルには、リコンビナーゼの添加は行わなかった。
【００９８】
８．２４℃で２時間組み換えを行った後、ウェルを３回洗浄し、蒸留水１００ｐｌを加えて１０分間１００℃に加熱することによって、ウェルから組み換え産物を溶出した。
【００９９】
９．次に、組み換え産物を検出するため、溶出液をＰＣＲで調べた。１本のＰＣＲプライマーはａｔｔＬ配列の配列５'側に向かい、１本はａｔｔＲ配列の３'側に向かっていた。いかなるＰＣＲ産物も組み換えが生じたことを示すものである。
【０１００】
１０．ＰＣＲの後、アガロースゲル電気泳動で反応液を分析した。
【０１０１】
結果
組み換え特異的ＰＣＲ産物は、標識ストレプトアビジンを含有するウェルから誘導した全溶出液中に見られた。非ストレプトアビジン対照群は、ストレプトアビジンで標識されてはいるがａｔｔＲインキュベーションがされていない対照ウェルと同様に陰性のままであった。リコンビナーゼの日存在下では、組み換え特異的産物は観察されなかった。
【０１０２】
考察
このことは、このような条件下であれば、リコンビナーゼアッセイを高感度で分子間相互作用をモニターするために使うことが可能であることを示す。さらなる実験の結果、標識ストレプトアビジンの無水マレイン酸ウェルとの結合は、磁気ビーズへの固定化またはプラスチック表面への受動的吸着によって置き換えられることがわかった。
【０１０３】
（実施例３）標的特異的リガンドで標識したＤＮＡ分子間の標識特異的組み換えの実証
この実験は、二本鎖ＤＮＡの２つの分子を標的分子に結合させることにより接近させた場合、この２つのＤＮＡ分子間での組み換えが促進されることを示す。この例では、ＤＮＡ鎖を、標的分子、ストレプトアビジンのリガンドの役割を果たすビオチンで誘導体化する（ストレプトアビジンの各分子は、４つのビオチンリガンドを結合することが可能である）。この例では、標的を、検出されないうちに固相表面に固定化する。
【０１０４】
１．組み換えに必要なバクテリオファージインテグラーゼ（ファージ特異的リコンビナーゼ）シグナル配列であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、これらの配列を含む市販の２つのプラスミドから増幅した。ＰＣＲプライマーには、引き続きＰＣＲ産物の化学的誘導体化を可能にするアミノ末端基が含まれていた。
【０１０５】
２．ＰＣＲ産物は、標準的技術を用いてアガロースゲル精製し、さらに各ＰＣＲ産物１ｐｇを含有するＰＢＳ中に溶解したビオチンアミドカプロン酸３‐スルホン‐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル０．５ｍｇを用いてビオチン化した。
【０１０６】
３．ビオチン化産物は、エタノール沈殿およびアガロースゲル精製で精製した。
【０１０７】
４．この例では、メーカーの使用説明書に従い、ストレプトアビジンを無色マレイン酸（Ｒｅａｃｔｉ  Ｂｉｎｄ、ピアス社）マイクロタイタープレートのウェルに固定化した。ストレプトアビジン１０ｎｇ〜１０ｆｇの１０倍段階希釈液が固定化された。非ストレプトアビジン対照も含めた。
【０１０８】
５．ストレプトアビジンを固定化した後、ａｔｔＬおよびａｔｔＲビオチン化ＰＣＲ産物のそれぞれを１０ｎｇ／ｍｌを含む０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ１００μｌとともにウェルをインキュベーションした。
【０１０９】
６．６０分後、ウェルをＰＢＳで５回洗浄し、供給された反応バッファーで１／１０に希釈したＣｒｅリコンビナーゼ（インビトロゲン社）１０μｌを添加した。ストレプトアビジンを添加し、ＡｔｔおよびａｔｔＬとともにインキュベーションした対照ウェルには、リコンビナーゼの添加は行わなかった。
【０１１０】
７．２４℃で２時間組み換えを行った後、ウェルを３回洗浄し、蒸留水１００μｌを加え、１０分間１００℃で加熱することによって、ウェルから組み換え産物を溶出させた。
【０１１１】
８．次に、組み換え産物を検出するため、溶出液をＰＣＲで調べた。１本のＰＣＲプライマーはａｔｔＬ配列の配列５'側に向かい、１本はａｔｔＲ  配列の３'側に向かっていた。いかなるＰＣＲ産物も組み換えが生じたことを示していた。
【０１１２】
９．ＰＣＲの後、アガロースゲル電気泳動で反応液を分析した。
【０１１３】
結果
組み換え特異的ＰＣＲ産物は、標識ストレプトアビジンを含有するウェルから誘導した全溶出液中に見られた。非ストレプトアビジン対照は、リコンビナーゼとともにインキュベーションしなかった対照ウェルと同様に陰性のままであった。
【０１１４】
考察
このことは、固定化した標的（この例ではストレプトアビジン）は、リガンド（ビオチン）に結合し、それによりビオチンに付着した二重鎖ＤＮＡ分子間で組み換えを促進することを示している。
【０１１５】
（実施例４）標的特異的リガンド結合の阻害、および付着ＤＮＡタグの組み換えの阻害の実証
この実験は、標的特異的リガンドと標的分子との結合を阻害する阻害剤をモニターまたは検出するための組み換えアッセイを示す。この例では、リガンド（ビオチン）を、組み換えにより相互作用が可能な２つの異なる二重鎖ＤＮＡ分子で誘導体化する。リガンドとストレプトアビジンとの結合は、遊離ビオチン（阻害剤）の存在により阻害される。
【０１１６】
１．組み換えに必要なバクテリオファージインテグラーゼ（ファージ特異的リコンビナーゼ）シグナル配列であるａｔｔＬおよびａｔｔＲを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、これらの配列を含む市販の２つのプラスミドから増幅した。ＰＣＲプライマーには、引き続きＰＣＲ産物の化学的誘導体化を可能にするアミノ末端基が含まれていた。
【０１１７】
２．ＰＣＲ産物は、標準的技術を用いてアガロースゲル精製し、さらに各ＰＣＲ産物１μｇを含有するＰＢＳに溶解したビオチンアミドカプロン酸３‐スルホン‐Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル０．５ｍｇを用いてビオチン化した。
【０１１８】
３．ビオチン化産物は、エタノール沈殿およびアガロースゲル精製で精製した。
【０１１９】
４．この例では、製造元の使用説明書に従い、ストレプトアビジン１ｎｇを無色マレイン酸（Ｒｅａｃｔｉ  Ｂｉｎｄ，  ピアス社）マイクロタイタープレートのウェルに固定化した。
【０１２０】
５．ストレプトアビジンを固定化した後、１００ｎｇ〜０．０１ｐｇの遊離ビオチン１０倍段階希釈液ならびにａｔｔＬおよびａｔｔＲビオチン化ＰＣＲ産物のそれぞれの１０ｎｇ／ｍｌを含む０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ１００μｌとともにウェルをインキュベーションした。
【０１２１】
６．６０分後、ウェルをＰＢＳで５回洗浄し、供給された反応バッファーで１／１０に希釈したＣｒｅリコンビナーゼ（インビトロゲン社）１０μｌを添加した。
【０１２２】
７．２４℃で２時間組み換えを行った後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、蒸留水１００ｐｌを加えて１０分間１００℃に加熱することによって、ウェルから組み換え産物を溶出した。
【０１２３】
８．次に、組み換え産物を検出するため、溶出液をＰＣＲで調べた。１本のＰＣＲプライマーはａｔｔＬ配列の配列５'側に向かい、１本はａｔｔＲ  配列の３'側に向かっていた。いかなるＰＣＲ産物も組み換えが生じたことを示していた。
【０１２４】
９．ＰＣＲの後、アガロースゲル電気泳動で反応液を分析した。
【０１２５】
結果
組み換え特異的ＰＣＲ産物は、１０ｐｇ以下の阻害剤を含有するウェルから誘導した全溶出液中に見られた。阻害剤量が減少するにつれ、シグナルが増大した。１０ｐｇを超える阻害剤は、リガンドの標的ストレプトアビジンへの結合を阻止することにより、完全に組み換えを阻害した。
【０１２６】
考察
このことは、組み換えアッセイは、リガンド結合の阻害剤を検出するために用いることが可能であり、また生成するシグナルは阻害の程度に反比例することを示している。
【０１２７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】検出法の１つの実施形態を図式的に示す。環状の二本鎖ＤＮＡおよび線状の二本鎖ＤＮＡでそれぞれ標識された２つの結合実体を用いたものである。
【図２】異なる配置の部位特異的組み換え部位を含む線状の二本鎖ＤＮＡでタグ標識された２つの結合実体を用いた、検出法の実施形態を図式的に例示する。
【図３】異なる配置の部位特異的組み換え部位を含む線状の二本鎖ＤＮＡでタグ標識された２つの結合実体を用いた、検出法の実施形態を図式的に例示する。
【図４】異なる配置の部位特異的組み換え部位を含む線状の二本鎖ＤＮＡでタグ標識された２つの結合実体を用いた、検出法の実施形態を図式的に例示する。
【図５】相互作用法の１つの実施形態を図式的に示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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