(57)【要約】  複素環窒素を含む種々の重合体を有する新規なメンブランについて記載する。これらのメンブランは電流測定バイオセンサなどの電気化学センサに用いることができる。特に、これらのメンブランは電気化学センサの測定電極への検体の流束を効果的に制御し、それによりかなりの範囲の検体の濃度にわたり電気化学センサが機能するように改良するものである。この種のメンブランを備えた電気化学センサについても述べている。
2005520172.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学センサ用メンブランにおいて、
架橋剤と、および
次の式を有する重合体と、を含み、
2005520172.tif 000016
ここで、水平方向の実線は重合体主鎖を表し、
Ａは、水溶性成分で置換したアルキルであり、
Ｄは、フェニルアルキル、アルコキシスチレン、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、ポリ（エチレングリコール）含有成分、およびポリヒドロキシ含有成分からなる群から選択され、
ｎ、ｌ、ｐおよびｑの各々は独立して、正の数である電気化学センサ用メンブラン。
【請求項２】
Ａは、負に帯電している請求項１記載のメンブラン。
【請求項３】
Ａは、スルホン酸、カルボキシレート、およびホスフェートからなる群から選択される請求項１記載のメンブラン。
【請求項４】
Ａは、スルホプロピル、スルホブチル、カルボキシプロピル、およびカルボキシペンチルからなる群から選択される請求項１記載のメンブラン。
【請求項５】
Ａは、式Ｌ−Ｇからなり、ここで、ＬはＣ２−Ｃ１２直鎖または分岐アルキル結合剤であり、Ｇは負に帯電したカルボキシまたはスルホン酸である請求項１記載のメンブラン。
【請求項６】
Ｌは、アリール、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＨ、アルデヒド、ケトン、エステル、またはアミドで置換されている請求項５記載のメンブラン。
【請求項７】
Ｄは、スチレンまたはＣ１−Ｃ１８アルキルメタクリレートである請求項１記載のメンブラン。
【請求項８】
前記重合体は、
2005520172.tif 000017
と、
2005520172.tif 000018
と、および
2005520172.tif 000019
からなる群から選択される前記式を有する請求項１記載のメンブラン。
【請求項９】
前記重合体の平均分子量が、約５０，０００を上回る請求項１記載のメンブラン。
【請求項１０】
前記重合体の平均分子量が、約２００，０００を上回る請求項１記載のメンブラン。
【請求項１１】
前記重合体の平均分子量が、約１，０００，０００を上回る請求項１記載のメンブラン。
【請求項１２】
前記重合体に、さらに、次の式のようなＢ含有共重合体が含まれ、
2005520172.tif 000020
ここで、Ｂは変性剤であり、ｍは正の数である請求項１記載のメンブラン。
【請求項１３】
Ｂは、キレート化剤、負に帯電した成分、疎水性炭化水素成分、親水性ヒドロキシルまたはポリヒドロキシ成分、珪素重合体、およびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される請求項１２記載のメンブラン。
【請求項１４】
Ｂは、約１００〜約２０，０００の分子量を有するポリ（エチレングリコール）である請求項１２記載のメンブラン。
【請求項１５】
前記重合体は、
2005520172.tif 000021
と、および
2005520172.tif 000022
からなる群から選択される前記式を有する請求項１２記載のメンブラン。
【請求項１６】
［ｎ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％が、約１％〜約２５％である請求項１２記載のメンブラン。
【請求項１７】
［ｍ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％が、約１％〜約１５％である請求項１２記載のメンブラン。
【請求項１８】
［ｌ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％が、約２０％〜約９０％である請求項１２記載のメンブラン。
【請求項１９】
［ｐ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％が、約１％〜約５０％である請求項１２記載のメンブラン。
【請求項２０】
前記重合体の少なくとも一つの複素環窒素成分は独立して、ピリジン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２１】
前記重合体の少なくとも一つの複素環窒素成分は独立して、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、１−ビニルイミダゾール、２−ビニルイミダゾール、および４−ビニルイミダゾールからなる群から選択される請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２２】
グルコースまたはラクテートの流束が、メンブランを横断するのを制限するのに十分な請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２３】
グルコースまたはラクテートの流束が、メンブランを生体内で横断するのを制限するのに十分な請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２４】
前記架橋剤に少なくとも一つのエポキシド反応基が含まれている請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２５】
前記架橋剤の分子量が、約２００〜約２，０００である請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２６】
前記架橋剤が、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）の誘導体である請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２７】
前記重合体対前記架橋剤の重量比が、約４：１〜約３２：１である請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２８】
前記重合体対前記架橋剤の重量比が、約８：１〜約１６：１である請求項１または１２記載のメンブラン。
【請求項２９】
ポリ（エチレングリコール）の層をさらに含む請求項１記載のメンブラン。
【請求項３０】
電気化学センサにおいて、
電極の導電性物質と接触した感知層を含む作用電極と、
感知層の上に配設され、架橋剤と次の式を有する重合体を含むメンブランと、
2005520172.tif 000023
ここで、水平方向の実線は重合体主鎖を表し、
Ａは、水溶性成分で置換したアルキルであり、
Ｄは、フェニルアルキル、アルコキシスチレン、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、ポリ（エチレングリコール）含有成分、およびポリヒドロキシ含有成分からなる群から選択され、
ｎ、ｌ、ｐおよびｑの各々は独立して、正の数であり、且つ
作用電極と電気化学的に連通している対向電極と、
を備える電気化学センサ。
【請求項３１】
Ａが、負に帯電している請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項３２】
Ａは、スルホン酸、カルボキシレート、およびホスフェートからなる群から選択される請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項３３】
Ａは、スルホプロピル、スルホブチル、カルボキシプロピル、およびカルボキシペンチルからなる群から選択される請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項３４】
Ａは、式Ｌ−Ｇからなり、ここでＬはＣ２−Ｃ１２直鎖または分岐アルキル結合剤であり、Ｇは負に帯電したカルボキシまたはスルホン酸である請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項３５】
Ｌは、アリール、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＨ、アルデヒド、ケトン、エステル、またはアミドで置換されている請求項３４記載の電気化学センサ。
【請求項３６】
Ｄは、スチレンまたはＣ１−Ｃ１８アルキルメタクリレートである請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項３７】
前記重合体は、
2005520172.tif 000024
と、
2005520172.tif 000025
と、および
2005520172.tif 000026
からなる群から選択される前記式を有する請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項３８】
前記重合体の平均分子量が、約５０，０００を上回る請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項３９】
前記重合体の平均分子量が、約２００，０００を上回る請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項４０】
前記重合体の平均分子量が、約１，０００，０００を上回る請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項４１】
前記重合体に、さらに、次の式のようなＢ含有共重合体が含まれ、
2005520172.tif 000027
ここで、Ｂは変性剤であり、ｍは正の数である請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項４２】
Ｂは、キレート化剤、負に帯電した成分、疎水性炭化水素成分、親水性ヒドロキシルまたはポリヒドロキシ成分、珪素重合体、およびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される請求項４１記載の電気化学センサ。
【請求項４３】
Ｂは、約１００〜約２０，０００の分子量を有するポリ（エチレングリコール）である請求項４１記載の電気化学センサ。
【請求項４４】
前記重合体は、
2005520172.tif 000028
と、および
2005520172.tif 000029
からなる群から選択される前記式を有する請求項４１記載の電気化学センサ。
【請求項４５】
［ｎ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％が、約１％〜約２５％である請求項４１記載の電気化学センサ。
【請求項４６】
［ｍ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％が、約１％〜約１５％である請求項４１記載の電気化学センサ。
【請求項４７】
［ｌ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％が、約２０％〜約９０％である請求項４１記載の電気化学センサ。
【請求項４８】
［ｐ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％が、約１％〜約５０％である請求項４１記載の電気化学センサ。
【請求項４９】
前記重合体の少なくとも一つの複素環窒素成分は独立して、ピリジン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５０】
前記重合体の少なくとも一つの複素環窒素成分は独立して、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、１−ビニルイミダゾール、２−ビニルイミダゾール、および４−ビニルイミダゾールからなる群から選択される請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５１】
前記メンブランは、グルコースまたはラクテートの流束がメンブランを横断するのを制限するのに十分なものである請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５２】
前記メンブランは、グルコースまたはラクテートの流束がメンブランを生体内で横断するのを制限するのに十分なものである請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５３】
前記架橋剤に少なくとも一つのエポキシド反応基が含まれている請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５４】
前記架橋剤の分子量が、約２００〜約２，０００である請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５５】
前記架橋剤が、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）の誘導体である請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５６】
前記重合体対前記架橋剤の重量比が、約４：１〜約３２：１である請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５７】
前記重合体対前記架橋剤の重量比が、約８：１〜約１６：１である請求項３０または４１記載の電気化学センサ。
【請求項５８】
前記メンブランが、ポリ（エチレングリコール）の層をさらに含む請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項５９】
前記感知層に酵素、酵素安定剤、および架橋剤が含まれている請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項６０】
前記感知層に酵素、重合体媒介物、および架橋剤が含まれている請求項３０記載の電気化学センサ。
【請求項６１】
電気化学センサ用メンブランにおいて、
架橋剤と、および
次の式を有する重合体とを含み、
2005520172.tif 000030
ここで、水平方向の実線は重合体主鎖を表し、
Ａは強酸であり、
ｎ、ｌ、ｐおよびｑの各々は独立して、正の数である電気化学センサ用メンブラン。
【請求項６２】
Ａが結合している複素環窒素は、双性イオン性である請求項６１記載のメンブラン。
【請求項６３】
Ａは、カルボン酸より強い酸である請求項６１記載のメンブラン。
【請求項６４】
前記重合体に、さらに、次の式のようなＢ含有共重合体が含まれ、
2005520172.tif 000031
ここで、Ｂは変性剤であり、ｍは正の数である請求項６１記載のメンブラン。
【請求項６５】
Ｂは、キレート化剤、負に帯電した成分、疎水性炭化水素成分、親水性ヒドロキシルまたはポリヒドロキシ成分、珪素重合体、およびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される請求項６１記載のメンブラン。
【請求項６６】
前記重合体の少なくとも1 つの複素環窒素成分は独立して、２ービニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、１−ビニルイミダゾール、２−ビニルイミダゾール、および４−ビニルイミダゾールからなる群から選択される請求項６１または６４記載のメンブラン。
【請求項６７】
グルコースまたはラクテートの流束が、メンブランを横断するのを制限するのに十分な請求項６１または６４記載のメンブラン。
【請求項６８】
グルコースまたはラクテートの流束が、メンブランを生体内で横断するのを制限するのに十分な請求項６１または６４記載のメンブラン。
【請求項６９】
前記架橋剤に少なくとも一つのエポキシド反応性基が含まれている請求項６１または６４記載のメンブラン。
【請求項７０】
前記架橋剤の分子量が、約２００〜約２，０００である請求項６１または６４記載のメンブラン。
【請求項７１】
前記架橋剤が、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）の誘導体である請求項６１または６４記載のメンブラン。
【請求項７２】
前記重合体対前記架橋剤の重量比が、約４：１〜約３２：１である請求項６１または６４記載のメンブラン。
【請求項７３】
前記重合体対前記架橋剤の重量比が、約８：１〜約１６：１である請求項６１または６４記載のメンブラン。
【請求項７４】
電気化学センサにおいて、
電極の導電性物質と接触した感知層を含む作用電極と、
感知層の上に配設され、架橋剤と次の式を有する重合体を含むメンブランと、
2005520172.tif 000032
ここで、水平方向の実線は重合体主鎖を表し、
Ａは、水溶性成分で置換したアルキルであり、
ｎ、ｌ、ｐおよびｑの各々は独立して、正の数であり、且つ
作用電極と電気化学的に連通している対向電極と、
を備える電気化学センサ。
【請求項７５】
Ａが結合している複素環窒素は、双性イオン性である請求項７４記載の電気化学センサ。
【請求項７６】
Ａは、カルボン酸より強い酸である請求項７４記載の電気化学センサ。
【請求項７７】
前記重合体に、さらに、次の式のようなＢ含有共重合体が含まれ、
2005520172.tif 000033
ここで、Ｂは変性剤であり、ｍは正の数である請求項７４記載の電気化学センサ。
【請求項７８】
Ｂは、キレート化剤、負に帯電した成分、疎水性炭化水素成分、親水性ヒドロキシルまたはポリヒドロキシ成分、珪素重合体、およびポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される請求項７７記載の電気化学センサ。
【請求項７９】
前記重合体の少なくとも一つの複素環窒素成分は独立して、ピリジン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、およびそれらの誘導体からなる群から選択される請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８０】
前記重合体の少なくとも一つの複素環窒素成分は独立して、２−ビニルピリジン、３−ビニルピリジン、４−ビニルピリジン、１−ビニルイミダゾール、２−ビニルイミダゾール、および４−ビニルイミダゾールからなる群から選択される請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８１】
前記メンブランは、グルコースまたはラクテートの流束がメンブランを横断するのを制限するのに十分なものである請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８２】
前記メンブランは、グルコースまたはラクテートの流束がメンブランを生体内で横断するのを制限するのに十分なものである請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８３】
前記架橋剤に少なくとも一つのエポキシド反応基が含まれている請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８４】
前記架橋剤の分子量が、約２００〜約２，０００である請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８５】
前記架橋剤が、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）の誘導体である請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８６】
前記重合体対前記架橋剤の重量比が、約４：１〜約３２：１である請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８７】
前記重合体対前記架橋剤の重量比が、約８：１〜約１６：１である請求項７４または７７記載の電気化学センサ。
【請求項８８】
前記感知層に酵素、酵素安定剤、および架橋剤が含まれている請求項７４記載の電気化学センサ。
【請求項８９】
前記感知層に酵素、重合体媒介物、および架橋剤が含まれている請求項７４記載の電気化学センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、検体の流束を制限するメンブランに関する。特に、本発明は、複素環窒素含有重合体からなるメンブランに関する。このメンブランは、バイオセンサ、特に生体内に移植することができるバイオセンサにおいて有用な要素である。
【背景技術】
【０００２】
酵素を利用したバイオセンサは、検体濃度依存性の生化学反応信号を光学的または電気的信号などの測定可能な物理信号に変換することができる装置である。この種のバイオセンサが、臨床、環境、農業および生物工学の分野で検体検出のために広く使用されている。人体体液の臨床検査で測定することができる検体として、例えば、グルコース、ラクテート、コレステロール、ビリルビンおよびアミノ酸が挙げられる。血液などの体液中に含まれる検体の検出は、疾病の診断および経過観察にとって重要である。
【０００３】
電流（電流測定バイオセンサ）または電荷（電量分析バイオセンサ）などの電気信号を介して検体を検出するバイオセンサには、多くの重要な生物検体の生化学反応に電子伝達が含まれるので特に興味深い。例えば、グルコース酸化酵素とグルコースの反応には、グルコースから酵素への電子伝達が含まれ、グルコノラクトンと還元された酵素を生成する。電流測定によるグルコース・バイオセンサの例では、グルコースは体液中でグルコース酸化酵素の触媒反応を介して酸素により酸化され、グルコノラクトンと過酸化水素を生じ、その際過酸化水素は電解酸化され、体液中のグルコースの濃度に相関付けられる。（トメ−デュレ，Ｖ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６８，３８２２（１９９６）(Thome-Duret, V., et al., Anal. Chem. 68, 3822 (1996))（非特許文献１）およびファン  アントワープ (Van Antwerp)の米国特許第５，８８２，４９４号（特許文献１））電流測定によるグルコース・バイオセンサのもう一つの例では、グルコノラクトンへのグルコースの電解酸化は、酵素の反応中心を電極へ電気的に「接続する」重合体酸化還元反応媒介物により仲介される。（セレーギ，Ｅ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６６，３１３１（１９９４）(Csoregi, E., et al, Anal. Chem. 66, 3131 (1994)) （非特許文献２）、セレーギ，Ｅ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６７，１２４０（１９９５）(Csoregi, E., et al, Anal. Chem. 67, 1240 (1995)) （非特許文献３）、シュミッケ，Ｄ．Ｗ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６８，２８４５（１９９６）(Schmidtke, D. W., et al., Anal. Chem. 68, 2845 (1996))（非特許文献４）、シュミッケ，Ｄ．Ｗ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ７０，２１４９（１９９８）(Schmidtke, D. W., et al., Anal. Chem. 70, 2149 (1998))（非特許文献５）およびシュミッケ，Ｄ．Ｗ．ら，Proceedings of National Academy of Science, U. S. A.  ９５，２９４（１９９８）(Schmidtke, D. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 294 (1998)) （非特許文献６））
【０００４】
電流測定によるバイオセンサは、典型的には、少なくとも一つの測定電極または作用電極、および一つの参照電極を含む２つまたは３つの電極を用いる。２電極システムでは、参照電極が対向電極としての機能も果たす。３電極システムでは、第３の電極が対向電極である。測定電極または作用電極は非腐食性の炭素または金属導体からなり、ポテンシオスタットなどの回路を介して参照電極に接続されている。
【０００５】
例えば、哺乳類などの動物の生体や人体に移植できるように設計されたバイオセンサがいくつかある。移植可能な電流測定バイオセンサでは、作用電極は、通常、電極の電導性物質と直接接触している感知層および感知層の上にある拡散制限メンブランからつくられている。この感知層は、通常、酵素、うしの血清アルブミン（ＢＳＡ）などの酵素安定剤、および感知層成分を架橋する架橋剤からなる。あるいは、感知層は、酵素、重合体媒介物、および上述した「接続された酵素」バイオセンサにおけるような感知層成分を架橋する架橋剤からなる。
【０００６】
移植可能な電流測定グルコースセンサでは、感知層へのグルコースの流束を制御したり制限するためにメンブランが有効である場合や、必要な場合が多い。すなわち、メンブランのないグルコースセンサでは、感知層へのグルコースの流束は、グルコースの濃度とともに直線的に増加する。感知層に到達するグルコースがすべて消費されると、測定された出力信号はグルコースの流束に、したがって、グルコースの濃度に直線的に比例する。しかし、グルコースの消費が感知層における化学的または電気化学的活性の動力学により制限される場合は、測定された出力信号はもはやグルコースの流束により制御されず、且つもはやグルコースの流束や濃度に直線的に比例しない。この場合、感知層に到達するグルコースのみがセンサが飽和する前に消費され、その場合、測定された信号は増加を止めるか、グルコースの濃度とともにわずかだけ増加する。一方、拡散制限メンブランを備えたグルコースセンサでは、メンブランが感知層へのグルコースの流束を減らすので、センサは飽和せず、したがって、より広いグルコース濃度範囲で有効に作動する。
【０００７】
特に、メンブランを備えたグルコースセンサでは、グルコースの消費速度は感知層の動力学によるよりもむしろメンブランを貫通するグルコースの拡散または流束により制御される。メンブランを貫通するグルコースの流束はグルコースに対するメンブランの浸透性により規定され、この浸透性は、通常、一定であり、そして溶液またはバイオ流体中のグルコースの濃度により監視されている。感知層に到達するグルコースがすべて消費されると、感知層までメンブランを貫通するグルコースの流束は溶液中のグルコースの濃度とともに直線的に変わり、そして測定された変換速度または信号出力を決めるように、測定された変換速度または信号出力は溶液中のグルコース濃度に直線的に比例する。必ずしも必要としないが、溶液中の出力信号とグルコースの濃度の間の直線関係は移植可能なセンサを較正する場合、理想的である。
【０００８】
上述したように、過酸化水素の電気酸化を利用した移植可能な電流測定グルコースセンサは、センサ出力が監視されている体液または生体組織中のグルコースの濃度によってのみ制御されることを保証するために過剰の酸素反応物を必要とする。すなわち、このセンサは体液または生体組織に通常存在する酸素により影響を受けないように設計される。グルコースセンサが通常移植される生体組織では、酸素濃度は非常に低く、約０．０２ｍＭ〜約０．２ｍＭであり、一方、グルコースの濃度は高く、約３０ｍＭ以上である。グルコース拡散制限メンブランがない場合は、センサは非常に低いグルコース濃度で非常に迅速に飽和する。したがって、酸素透過性が十分なメンブランを有するセンサには、感知層へのグルコースの流束を制限する利点があり、いわゆる「酸素欠乏問題」、すなわち、感知用酸素が不足する状態が起きるのが最小限に抑制されるか排除される。
【０００９】
上述したように、酵素接続された電極を用いる移植可能な電流測定グルコースセンサでは、酸素は必要な反応物ではないので、酸素欠乏問題はない。それにも関わらず、これらセンサは、グルコース拡散制限メンブランを必要とする。なぜなら、通常、この種のメンブランを備えていないグルコースセンサでは、電流出力はグルコース濃度１０ｍＭ付近またはそれ以下で最高レベルに到達する。グルコース濃度１０ｍＭは臨床で問題になるグルコース濃度の最高値である３０ｍＭよりはるかに低い。
【００１０】
このメンブランは感知層における化学的および生化学的反応性を顕著に低下させ、したがって、酵素に損傷を与えるラジカル種の生成を低下させるので、拡散制限メンブランも、酵素で接続された電極を用いるバイオセンサにおいて有効である。拡散制限メンブランは、センサ成分がセンサ層から浸出するのを防止し、運動に関連したノイズを低減する機械的保護装置としても作用することができる。
【００１１】
機械的に強く、生物適合性があり、且つ簡単に製造できるグルコース拡散制限メンブランを開発する試みがいろいろなされた。例えば、機械的な孔を有する薄膜を重ねた多孔性のメンブランが記載されており（ヤング(Young) らの米国特許第４，７５９，８２８号（特許文献２））、また、ポリウレタンからつくられたメンブランも知られている（ショー，Ｇ．Ｗ．(Shaw, G. W.) ら，Biosensors and Bioelectronics 6 ，４０１（１９９１）（非特許文献７）、ビンドラ，Ｄ．Ｓ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６３，１６９２（１９９１） (Bindra, D. S., et al., Anal. Chem. 63 1692 (1991) （非特許文献８）、シヒリ，Ｍ．(Shichiri, M.)ら，Horm Metab. Res., Suppl. Ser 20 ，１７（１９８８）（非特許文献９））。これらいろいろなメンブランの機械的孔やクラックの中をグルコースが拡散しているものと考えられる。さらに、不連続な疎水性領域と親水性領域を有する不均一なメンブラン（ググ (Gough)の米国特許第４，４８４，９８７号（特許文献３））および疎水性機能と親水性機能を有する均一なメンブラン（アレン (Allen)らの米国特許第５，２８４，１４０号（特許文献４）および第５，３２２，０６３号（特許文献５））が知られている。しかし、これら周知のメンブランはすべてつくるのが困難であり、そして物理特性が不十分である。
【００１２】
ジイソシアネート、ジオール、ジアミンおよび珪素重合体からつくられた、改良されたメンブランがファン  アントワープ (Van Antwerp)の米国特許第５，７７７，０６０号（特許文献６），ファン  アントワープ (Van Antwerp)らの米国特許第５，７８６，４３９号（特許文献７）およびファン  アントワープ (Van Antwerp)の米国特許第５，８８２，４９４号（特許文献８）に記載されている。それらに記載されているように、メンブラン材料はフラスコで同時に重合と架橋がなされ、得られた重合体物質はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）のような強い有機溶媒に溶解され、そして得られた溶液は感知層に塗布されてメンブランが形成される。残念なことに、ＴＨＦのような非常に強い有機溶媒は、感知層の中の酵素の性質を変え、また、センサの一部である導電性インク並びに可塑性物質を溶かす。さらに、重合および架橋反応は反応フラスコで完了するので、溶液が感知層に塗布されてメンブランを形成する時には結合を形成する反応は全く起きない。その結果、メンブラン層と感知層の間の接着は十分ではない。
【００１３】
国際公開第０１／５７２４１  Ａ２号（特許文献９）を有する公開された特許協力条約（ＰＣＴ）による出願において、ケリー (Kelly)とシェイフェー(Schiffer)は小さな親水性モノマーを光分解重合によることによりグルコース拡散制限メンブランをつくる方法について述べている。しかし、この種のメンブランを用いたグルコースセンサの感度は、幅広く散らばっており、メンブラン製造プロセスに制御性が欠けていることを示している。さらに、この重合には非常に小さな分子が含まれているので、重合後に小さな可溶性の分子が残り、これらの分子がセンサから浸出する可能性がある。したがって、この種のグルコース拡散制限メンブランを用いたグルコースセンサは、生体内に移植するのに適切でない。
【特許文献１】米国特許第５，８８２，４９４号
【特許文献２】米国特許第４，７５９，８２８号
【特許文献３】米国特許第４，４８４，９８７号
【特許文献４】米国特許第５，２８４，１４０号
【特許文献５】米国特許第５，３２２，０６３号
【特許文献６】米国特許第５，７７７，０６０号
【特許文献７】米国特許第５，７８６，４３９号
【特許文献８】米国特許第５，８８２，４９４号
【特許文献９】国際公開第０１／５７２４１  Ａ２号
【特許文献１０】米国特許第６，０１１，０７７号
【特許文献１１】米国特許第６，１３４，４６１号
【特許文献１２】国際公開第０１／３６６６０  Ａ２号
【非特許文献１】トメ−デュレ，Ｖ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６８，３８２２（１９９６）
【非特許文献２】セレーギ，Ｅ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６６，３１３１（１９９４）
【非特許文献３】セレーギ，Ｅ．ら，アナリティカル・ケミストリ６７，１２４０（１９９５）
【非特許文献４】シュミッケ，Ｄ．Ｗ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６８，２８４５（１９９６）
【非特許文献５】シュミッケ，Ｄ．Ｗ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ７０，２１４９（１９９８）
【非特許文献６】シュミッケ，Ｄ．Ｗ．ら，Proceedings of National Academy of Science, U. S. A., ９５，２９４（１９９８）
【非特許文献７】ショー，Ｇ．Ｗ．ら，Biosensors and Bioelectronics 6 ，４０１（１９９１）
【非特許文献８】ビンドラ，Ｄ．Ｓ．ら，アナリティカル・ケミストリ  ６３，１６９２（１９９１）
【非特許文献９】シヒリ，Ｍ．ら，Horm Metab. Res., Suppl. Ser 20 ，１７（１９８８）
【非特許文献１０】ベルクシュトローム，Ｋ．ら，J Biomed. Mat. Res. ２６，７７９（１９９２）
【非特許文献１１】チェン，Ｔ．ら，「ｉｎ  ｓｉｔｕの組み立てられ質量輸送制御マイクロメンブランおよび移植された電流測定グルコースセンサにおけるマイクロメンブランの利用」，アナリティカル・ケミストリ，Ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．１６，３７５７〜３７６３ページ  （２０００年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は複素環窒素基を含む架橋重合体、特にポリビニルピリジンとポリビニルイミダゾールの重合体からなるメンブラン、およびこの種のメンブランを備えた電気化学センサに関する。このメンブランは、電気化学センサにおいて作用電極への検体の流束を制限するのに役立つので、このセンサは広範囲の検体濃度にわたり直線的に応答し、且つ簡単に較正することができる。本発明のメンブランを備えた電気化学センサは、多様な条件においてかなりの感度と安定性、および大きな信号対ノイズ比を示す。
【００１５】
本発明の一つの態様によると、このメンブランは、双性イオン性部分、非ピリジン系共重合体成分、および任意に親水性か疎水性、および／または緩衝アルコール溶液中でその他の望ましい特性を有する別の部分で変性した重合体をその場で架橋して形成される。この変性重合体は、複素環窒素基を含む前駆重合体からつくられる。好ましくは、前駆重合体は、ポリビニルピリジンかポリビニルイミダゾールである。電気化学センサにおいて使われた場合、このメンブランは「接続された酵素」電極の酵素含有感知層などのセンサの感知層に到達する検体の流束を制限し、且つ感知層を保護する。このメンブランのこのような特性は、直線的な検出範囲とセンサの安定性を顕著に拡大する。
【００１６】
メンブラン形成プロセスにおいて、非ピリジン系共重合体成分は、一般に、重合体の溶解度を高め、そして重合体または得られたメンブランに望ましい物理的または化学的特性を与えることができる。随意に、得られたメンブランを検体が浸透する性質を「微調整」するために、親水性または疎水性の変性剤を使用することができる。重合体または得られたメンブランの生物適合性を高めるために、ポリ（エチレングリコール）などの随意の親水性変性剤、ヒドロキシルまたはポリヒドロキシル変性剤を使用することができる。本発明のメンブランの形成において、重合体の双性イオン性部分は分子間静電結合を介して、通常、共有結合に帰せられる基本的な架橋を超えた追加の架橋層を与え、メンブランを強化すると考えられている。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、移植可能な電流測定バイオセンサなどのバイオセンサで使用することができるほぼ均一な検体拡散制限メンブランの製造に関する。このメンブランは、架橋剤と変性重合体のアルコール緩衝溶液を酵素含有感知層の上に塗布し、この溶液を１〜２日硬化させることによりその場で形成される。架橋剤と重合体の混合溶液は、この溶液の一つまたは複数の液滴をセンサ上に置くか、センサをこの溶液に浸漬などして関知層に塗布することができる。一般に、メンブランの厚さは、溶液の濃度、塗布された溶液の液滴の数、センサを溶液に浸漬する時間、またはこれらの要因の組み合わせにより調節することができる。本発明の拡散制限メンブランを備えた電流測定グルコースセンサは、優れた安定性および広いグルコース濃度範囲にわたりグルコース濃度に対して迅速且つ直線的な応答を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に示す括弧付の語句の定義は、本明細書で使用される特定の用語を定義したものである。
【００１９】
用語「アルキル」には、直鎖または分岐飽和脂肪族炭化水素が含まれる。アルキル基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、および同種のものが挙げられる。但し書きがなければ、用語「アルキル」はアルキル基およびシクロアルキル基の両方を含む。
【００２０】
用語「アルコキシ」と構造体のそれ以外の部分に酸素原子を介して結合されるアルキル基のことである。アルコキシ基の例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、および同種のものが挙げられる。また、但し書きがなければ、用語「アルコキシ」は、アルコキシ基とシクロアルコキシ基の両方を含む。
【００２１】
用語「アルケニル」とは、少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和の直鎖または分岐の脂肪族炭化水素のことである。アルケニル基の例として、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−メチル−１−プロペニル、および同種のものが挙げられる。
【００２２】
「反応基」は、ある化合物と反応して、その他の化合物の少なくとも一部を分子に結合させることができる前期分子の官能基である。反応基としては、カルボキシ、活性化エステル、ハロゲン化スルホニル、スルホン酸エステル、イソシアネート、イソチオシアネート、エポキシド、アジリジン、ハロゲン基、アルデヒド、ケトン、アミン、アクリルアミド、チオール、アシルアジド、ハロゲン化アシル、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ハロゲン化アルキル、イミダゾール、ピリジン、フェノール、スルホン酸アルキル、ハロトリアジン、イミドエステル、マレイミド、ヒドラジド、ヒドロキシ、および光化学反応性アジドアリールの基が挙げられる。活性化エステルとは、一般に、当該技術分野で認識されているとおり、スルホ基、ニトロ基、シアノ基、またはハロ基のような電子求引基によって置換されたスクシンイミジル、ベンゾトリアゾリル、またはアリールのエステル、またはカルボジイミドによって活性化されるカルボン酸がある。
【００２３】
「置換」官能基（例えば、置換アルキル、アルケニル、またはアルコキシ基）は、次から選ばれた少なくとも１つの置換基を含む。すなわち、ハロゲン、アルコキシ、メルカプト、アリール、アルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、−ＯＨ、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリアルキルアンモニウム、アルカノイルアミノ、アリールカルボキサミド、ヒドラジノ、アルキルチオ、アルケニル、および反応基である。
【００２４】
「架橋剤」は、少なくとも２つの分子または同じ分子の少なくとも２つの部分が一緒に結合することができる少なくとも２つの反応基を含む分子である。少なくとも２つの分子の結合は分子間架橋と呼ばれ、一方、同じ分子の少なくとも２つの部分の結合は分子内架橋と呼ばれる。２個以上の反応基を有する架橋剤は、分子間架橋剤と分子内架橋の両方を同時に行うことができる。
【００２５】
用語「前駆重合体」は、いろいろな変性剤基を結合して変性重合体を形成する前の出発重合体を指している。
【００２６】
用語「複素環窒素基」は、環構造にｓｐ2 混成窒素を含む環状構造を指している。
【００２７】
用語「ポリビニルピリジン」は、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリ（３−ビニルピリジン）、またはポリ（２−ビニルピリジン）、並びにビニルピリジンと第２または第３の共重合体成分のいずれかの共重合体を指している。
【００２８】
用語「ポリビニルイミダゾール」は、ポリ（１−ビニルイミダゾール）、ポリ（２−ビニルイミダゾール）、またはポリ（４−ビニルイミダゾール）を指している。
【００２９】
「メンブラン溶液」は、複素環窒素基、架橋剤および緩衝剤またはアルコール緩衝混合溶媒を含む変性重合体を含む架橋してメンブランを形成するのに必要なすべての化合物を含む溶液である。
【００３０】
「体液」または「生物流体」とは、測定することができる検体が含まれる任意の体液または体液の誘導体であり、例えば、血液、間質液、血しょう、皮膚の体液、汗、および涙である。
【００３１】
「電気化学センサ」とは、電気化学的酸化または還元の反応によって試料中の検体の存在を検知するために、またはその検体の濃度または量を測定するために形成された装置である。通常、上記のような反応は、典型的には、検体の量または濃度への関連づけができる電気信号に変換することができる。
【００３２】
「酸化還元反応媒介物」とは、直接または一つ以上の追加の電子伝達剤によって、検体、あるいは検体還元または検体酸化酵素と、電極の間で電子を運ぶ電子伝達剤である。重合体主鎖を含む酸化還元反応媒介物は、「酸化還元反応重合体」とも呼ばれる。
【００３３】
用語「参照電極」には、但し書きがなければ、ａ）参照電極、およびｂ）対向電極としても機能する参照電極（すなわち、対向／参照電極）の両方が含まれる。
【００３４】
用語「対向電極」には、但し書きがなければ、ａ）対向電極、およびｂ）参照電極としても機能する対向電極（すなわち、対向／参照電極）の両方が含まれる。
【００３５】
一般に、本発明のメンブランは複素環窒素基を含む変性重合体をアルコール緩衝混合溶媒中で架橋させ、次いでメンブラン溶液を時間をかけて硬化させてつくる。この重合体には、重合体主鎖の一部としてポリ（複素環窒素含有成分）、および双性イオン性部分、疎水性部分、および随意に生物適合性部分を含む追加の成分が含まれている。得られたメンブランは、生物流体に関連した空間などの一つの空間から酵素含有感知層に関連した空間などのもう一つの空間への検体の流束を制限することができる。本発明の接続された酵素感知層とグルコース拡散制限層からつくられた電流測定グルコースセンサは、非常に安定で且つ直線的検出範囲が広い。
【００３６】
複素環窒素含有重合体
本発明の重合体は、次の一般式，式１ａを有し、
【化１ａ】
2005520172.tif 000003
ここで、水平方向の線は重合体主鎖を表し、Ａは、水溶性基、好ましくはスルホン酸、ホスフェート、またはカルボキシレートなどの負に帯電した基、より好ましくはスルホン酸などの強い酸基で置換されたアルキル基であるので、水溶性基が結合している４級複素環窒素は双性イオン性であり、Ｄは以下で詳細に説明するように、この重合体の共重合体成分であり、ｎ、ｌ、およびｐの各々は独立して、丸括弧内左から２番目に示した関連する重合体ユニットの平均数であり、そしてｑは角型括弧内に示した重合体ユニットの数である。
【００３７】
式１ａの複素環窒素基には、ピリジン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、またはそれらの誘導体があるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、複素環窒素基は２−、３−、または４−ビニルピリジンなどのビニルピリジン、１−、２−、または４−ビニルイミダゾールなどのビニルイミダゾールである。より好ましくは、複素環窒素基は４−ビニルピリジンであるから、より好ましい重合体はポリ（４−ビニルピリジン）である。本発明のこの種のポリ（４−ビニルピリジン）の誘導体の一例は、次の一般式，式１ｂを有し、
【化１ｂ】
2005520172.tif 000004
ここで、Ａ、Ｄ、ｎ、ｌ、ｐおよびｑは、式１ａに関連して上述したとおりである。
【００３８】
本発明の重合体が上述した一般式１ａまたは１ｂを有する場合は、Ａはカルボン酸より強い強酸であり、Ｄ成分は随意成分であるからｐはゼロの場合もある。本発明のこの種の重合体は、次の一般式，１ｃを有し、
【化１ｃ】
2005520172.tif 000005
ここで、Ａは強酸であり、そして複素環窒素基、ｎ、ｌおよびｑはすべて上述したとおりである。適切な強酸の例にはスルホン酸およびフッ化カルボン酸がある。Ａが十分強酸である場合、Ａが結合している複素環窒素は双性イオン性になり、したがって、メンブラン形成中に架橋剤と分子内静電結合を形成しうると考えられている。これらの分子内静電結合は架橋の普通の共有結合を超えたもう一つの架橋レベルを与え、したがって、得られたメンブランの強度を高めると考えられている。その結果、Ａが適切に強い酸である場合は、スチレンのような強化成分であることが多いこのＤ成分は上述した式１ａと１ｂの重合体から排除することができる。Ａが比較的弱い酸である場合は、複素環窒素は双性イオン性ではないか、または分子内静電結合を形成することができないので、本発明の重合体には上述した式１ａと１ｂに示したようにＤが含まれる。
【００３９】
Ａの例には、スルホプロピル、スルホブチル、カルボキシプロピル、およびカルボキシペンチルがあるが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施形態では、Ａ基の式は−Ｌ−Ｇであり、ここでＬはＣ２−Ｃ１２直鎖または分岐アルキル結合剤であり、アリール、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＨ、アルデヒド、ケトン、エステル、またはアミド基で随意に、また独立して置換されており、Ｇは負に帯電したカルボキシまたはスルホネート基である。Ｌの置換基のアルキル部分には、１〜６個の炭素があり、好ましくはアリール、−ＯＨまたはアミド基である。
【００４０】
Ａは、適切な結合剤Ｌおよび負に帯電したＧ基または（後に負に帯電したＧ基に転換できる）前駆体を含むアルキル化剤を用いた４級化を介して複素環窒素基に結合することができる。適切なアルキル化剤の例には、２−ブロモエタンスルホン酸、プロパンスルトン、ブタンスルトン、ブロモ酢酸、４−ブロモ酪酸および６−ブロモヘキサン酸があるが、これらに限定されるものではない。前駆体基を含むアルキル化剤の例には、エチルブロモアセテートとメチル６−ブロモヘキサノエートがあるが、これらに限定されるものではない。これらの前駆体のエチルおよびメチルエステル基は、普通の加水分解により負に帯電したカルボキシ基に容易に変換される。
【００４１】
代わりに、Ａは、別の反応基を有するアルキル化剤を用いた窒素の４級化とそれに続く普通の方法、すなわち、負に帯電したＧ基および反応基を含むもう一つの分子にこの別の反応基を結合して複素環窒素基に結合することができる。通常、これらの反応基の一つは求電子物質であり、その他の反応基は求核物質である。反応基およびそれらの基から形成された結合の選択された例を表１に列挙する。
［表１］反応基、および得られる結合の例
2005520172.tif 000006
例えば、Ａは、６−ブロモヘキサン酸を用いて複素環窒素を４級化し、続いてカルボジイミド結合剤の存在下で３−アミノ−１−プロパンスルホネートのアミン基にカルボキシ基を結合してＡを重合体の複素環窒素基に結合することができる。
【００４２】
Ｄは、式１ａまたは１ｂのポリ（複素環窒素−ｃｏ−Ｄ）重合体の成分である。Ｄの例には、フェニルアルキル、アルコキシスチレン、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、およびポリ（エチレングリコール）またはポリヒドロキシル基を含む分子があるが、これらに限定されるものではない。本発明の出発物質として適切なポリ（複素環窒素−ｃｏ−Ｄ）重合体は、市販品として入手可能である。例えば、ポリ（２−ビニルピリジン−ｃｏ−スチレン）、ポリ（４−ビニルピリジン−ｃｏ−スチレン）およびポリ（４−ビニルピリジン−ｃｏ−ブチルメタクリレート）は、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー・インコーポレイテッド (Aldrich Chemical Company, Inc.) から入手できる。その他のポリ（複素環窒素−ｃｏ−Ｄ）重合体は、重合体化学の当業者であれば、周知の方法を用いて容易に合成することができる。好ましくは、Ｄはスチレンまたは（４−ビニルピリジン−ｃｏ−スチレン）またはポリ（４−ビニルピリジン−ｃｏ−ブチルメタクリレート）、より好ましくは前者などのポリビニルピリジン−ポリ−ＤのＣ１−Ｃ１８アルキルメタクリレート成分である。Ｄは、疎水性、親水性、溶解度、生物適合性、弾性および強度を含めてメンブランの望ましい種々の特性に寄与できるが、これらに限定されるものではない。Ｄは、検体の浸透性および望ましくない成分、例えば、妨害成分の非浸透性により、重合体からつくられたメンブランを「微調節」したり、最適化するように選択することができる。
【００４３】
文字ｎ、ｌ、およびｐは、それぞれ、各重合体ユニットの各共重合体成分の平均値を表す。文字ｑは、反復重合体ユニットを有する共重合体の平均値より大きいブロック共重合体の平均値である。例えば、本発明の重合体のｑ値は、約９５０以上で、ｎ、ｌ、およびｐは、それぞれ、１、８および１である。したがって、文字ｑは、重合体全体の分子量に関係している。好ましくは、この重合体の平均分子量は、約５０，０００以上、より好ましくは約２００，０００以上、最も好ましくは約１，０００，０００以上である。
【００４４】
本発明の重合体は、さらに、次の一般式、すなわち、式２ａに示したような随意の共重合体を含むことができる。
【化２ａ】
2005520172.tif 000007
ここで、重合体主鎖、Ａ、Ｄ、ｎ、ｌ、ｐおよびｑは、式１ａ〜１ｃに関連して上述したとおりであり、ｍは関連する重合体ユニットまたは丸括弧内左から２番目に示した重合体ユニットの平均数であり、そしてＢは変性剤である。複素環窒素基が好適な４−置換ピリジンである場合は、本発明の重合体はポリ（４−ビニルピリジン）の誘導体であり、且つその一般式は次に記載した式２ｂである。
【化２ｂ】
2005520172.tif 000008
さらに、Ａが上述した適当に強い酸である場合は、Ｄ共重合体は随意であり、その場合、本発明の重合体の一般式は次の式２ｃである。
【化２ｃ】
2005520172.tif 000009
【００４５】
式２ａ〜２ｃのいずれでも、Ｂは、メンブランに何らかの望ましい化学的、物理的または生物学的特性を付与できる変性剤基である。この種の望ましい特性には、検体選択性、疎水性、親水性、弾性、および生物適合性がある。変性剤の例として、負に帯電した、妨害化学物質がメンブランに入るのを最小限に抑制する負に帯電した分子、メンブランとセンサ基板物質の間の接着力を高める疎水性炭化水素分子、水和に役立ちメンブランに生物適合性を付与する親水性ヒドロキシルまたはポリヒドロキシ分子、メンブランに弾性およびその他の特性を付与する珪素重合体、および生物材料の生物適合性を高めることが知られているポリ（エチレングリコール）が挙げられる（ベルクシュトローム，Ｋ．(Bergstrom, K.) ら，J Biomed. Mat. Res. ２６，７７９（１９９２）（非特許文献１０））。さらに、Ｂの例には、カルシウムキレート化剤などの金属キレート化剤およびその他の生物適合性物質があるが、これらに限定されるものではない。メンブランの生物適合性を改良するのに適したポリ（エチレングリコール）の分子量は、一般に、約１００〜約２０，０００、好ましくは約５００〜約１０，０００、そしてより好ましくは約１，０００〜約８，０００である。
【００４６】
変性剤Ｂは、直接的または間接的に、重合体の複素環窒素に結合することができる。直接的結合では、複素環窒素基は、アルキル化基を含む変性剤と反応することができる。適切なアルキル化基には、ハロゲン化アルキル、エポキシド、アジリジン、およびスルホン酸エステルがあるが、これらに限定されるものではない。間接的結合では、重合体の複素環窒素は別の反応基を有するアルキル化剤を用いて４級化し、次いで望ましい特性と適切な反応基を有する分子に結合する。
【００４７】
上述したように、Ｂ含有共重合体は本発明のメンブランでは随意であるので、式２ａ〜２ｃのｍがゼロである場合は、このメンブランの一般式は、それぞれ、式１ａ〜１ｃである。４種の共重合体成分、すなわち、Ａ含有複素環窒素基、Ｂ含有任意の複素環窒素基、複素環窒素基、およびＤの相対的量は、それぞれ、［ｎ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％、［ｍ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％、［ｌ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％、および［ｐ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％のような、割合として表すことができる。適切な割合は、それぞれ、１〜２５％、０〜１５％（Ｂ含有複素環窒素基が随意である場合）または１〜１５％、２０〜９０％、および０〜５０％（Ｄが随意である場合）または１〜５０％、そして好ましい割合は、それぞれ、５〜２０％、０〜１０％（Ｂ含有複素環窒素基が任意である場合）または１〜１０％、６０〜９０％、および５〜２０％である。
【００４８】
適切な重合体の特定の例は、次の一般式，式３〜６を有する。
【化３】
2005520172.tif 000010
【化４】
2005520172.tif 000011
【化５】
2005520172.tif 000012
【化６】
2005520172.tif 000013
【実施例】
【００４９】
ポリビニルピリジン重合体の合成例
以下、本発明による種々のポリビニルピリジン重合体の合成例を示す。数値は概略の値である。
【００５０】
実施例１：式３の重合体の合成
実例として、上記式３の重合体の合成例を提示する。ポリ（４−ビニルピリジン−ｃｏ−スチレン）溶液（スチレン含有量約１０％）（２０ｇ、アルドリッチ）を１００ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中９０℃で撹拌し、次いで６−ブロモヘキサン酸（３．７ｇ）と１５〜２０ｍＬのＤＭＦの溶液を加えた。得られた溶液を９０℃で２４時間撹拌し、次いで１．５Ｌのエーテルに注入し、生成物から溶媒を移した。残りのゴム状固体をＭｅＯＨ（１５０〜２００ｍＬ）に溶解し、中間サイズの孔のあるフリットガラス漏斗で溶液を吸引ろ過し、未溶解の固体を除去した。ろ液をビーカー中のエーテル（１．５Ｌ）に撹拌しながら初めはゆっくりと入れ、次いで次第に速く入れた。得られた沈殿物を吸引ろ過により集め、高真空下、５０℃で２日間乾燥した。重合体のパラメータは、［ｎ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｌ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒８０％、および［ｐ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％であった。
【００５１】
実施例２：式５の重合体の合成
実例として、上記式５の重合体の合成例を提示する。ポリ（４−ビニルピリジン−ｃｏ−スチレン）溶液（スチレン含有量約１０％）（２０ｇ、アルドリッチ）を１００ｍＬの無水ＤＭＦ中９０℃で撹拌し、スルホン酸メタン（約８０ｍｇ）を加え、次いで１５〜２０ｍＬの無水ＤＭＦ中２ｇのメトキシ−ＰＥＧ−エポキシド（分子量５，０００）（シェアウォーター・ポリマーズ・インコーポレイテッド (Shearewater Polymers, Inc.) ）を加えた。得られた溶液を９０℃で２４時間撹拌し、１０ｍＬの無水ＤＭＦ中１、３−プロパンスルトン（２．３２ｇ）を加えた。溶液を連続的に９０℃で２４時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、８００ｍＬのエーテルに注入した。溶媒を移し、残りの沈殿をホットＭｅＯＨ（約２００ｍＬ）に溶解し、吸引ろ過し、１Ｌのエーテルから再度沈殿させ、高真空下５０℃で４８時間乾燥した。得られた重合体のパラメータは、［ｎ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｍ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｌ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒７０％、および［ｐ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％であった。
【００５２】
実施例３：ポリヒドロキシ変性剤Ｂを有する重合体の合成
実例として、以下に概略図として示したポリヒドロキシ変性剤Ｂを有する重合体の合成の実施例を提示する。生物適合性を有する種々のポリヒドロキシ化合物が知られている。（米国特許第６，０１１，０７７号（特許文献１０））次の合成図は、望ましい特性を有する変性剤基を結合剤を介して重合体主鎖に結合する方法を説明している。
2005520172.tif 000014
１，３−プロパンスルトン（０．５８ｇ、４．８ミリモル）および６−ブロモヘキサン酸（１．８５ｇ、９．５ミリモル）を、６０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解したポリ（４−ビニルピリジン−ｃｏ−スチレン）（スチレン約１０％）（１０ｇ）の溶液に添加する。得られた溶液を９０℃で２４時間撹拌し、次いで室温まで冷却する。Ｏ−（Ｎ−サクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム  テトラフロロボレート（ＴＳＴＵ）（２．８６ｇ、９．５ミリモル）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．６５ｍＬ、９．５ミリモル）を溶液に連続的に添加する。この溶液を５時間撹拌後、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（２．４ｇ、１２．４ミリモル）を添加し、得られた溶液を室温で２４時間撹拌する。この溶液を５００ｍＬのエーテルに注入し、吸引ろ過により沈殿物を集める。次いで、集めた沈殿物をＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏに溶解し、得られた溶液を同じＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏを用いて限外メンブランろ過にかけて小さな分子を除去する。透析した溶液を蒸発乾燥して、次のパラメータ、［ｎ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｍ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｌ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒７０％、および［ｐ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％を有する重合体を得る。
【００５３】
架橋剤
本発明の架橋剤は、ビー、トリー、またはテトラー官能基などの少なくとも２つの反応基を有する分子であり、複素環窒素基、ピリジン基、または重合体のＡ、ＢまたはＤを含むその他の反応基と反応しうる。好ましくは、架橋剤の反応基は、ゆっくり反応するアルキル化基であり、これらは重合体のピリジン基などの複素環窒素基を４級化することができる。適当なアルキル化剤には、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）の誘導体、エポキシド（グリシジル基）、アジリジン、ハロゲン化アルキル、およびスルホン酸エステルがあるが、これらに限定されるものではない。架橋剤のアルキル化基は、好ましくはグリシジル基である。好ましくは、グリシジル架橋剤の分子量は、約２００〜約２，０００で、且つ水溶性またはアルコールなどの水と混和する溶媒に可溶である。適当な架橋剤の例には、分子量約２００〜約６００のポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルやＮ，Ｎ−ジグリシジル−４−グリシジルオキシアニリンがあるが、これらに限定されるものではない。
メンブラン溶液の調合中、架橋反応を遅くするように、メンブランコーティング溶液は大規模生産の場合ポットライフが適度であることが望ましい。架橋反応が速いと、コーティング溶液の粘度が急速に変化し、コーティングを困難にする。理想的には、架橋反応はメンブラン溶液の調合中は遅く、常温または常温より高い温度ではメンブランの硬化中加速する。
【００５４】
メンブランの形成とセンサの製作
本発明のメンブラン製造プロセスの実施例について説明する。この実施例では、本発明の重合体および適切な架橋剤が、緩衝剤含有溶媒、通常、緩衝剤混合アルコール溶媒に溶解され、メンブラン溶液をつくる。好ましくは、この緩衝剤のｐＨは約７．５〜約９．５であり、アルコールはエタノールである。より好ましくは、緩衝剤は１０ミリモルの（２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン）スルホン酸エタン）（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（ｐＨ８）であり、且つエタノールと緩衝剤の容積比は約９５：５〜約０：１００である。架橋の化学、特にエポキシドまたはアジリジン架橋剤が使われた場合は、最小量の緩衝剤が必要である。重合体と架橋剤を溶解するのに必要な溶媒の量は、重合体と架橋剤の特性によって変動する。例えば、相対的に疎水性である重合体および／または架橋剤を溶解するには高い割合のアルコールが必要である。
【００５５】
重合体対架橋剤の比は、最終生成物であるメンブランの特性にとって重要である。例を挙げると、架橋剤の量が不十分であったり、極めて大過剰である場合、架橋は不十分であり、メンブランは弱い。さらに、十分な量以上に架橋剤を使用するとメンブランは過度に架橋するので、メンブランは脆いか検体の拡散を妨げる。したがって、望ましい有用なメンブランをつくるには、最適な比率の既知の重合体と既知の架橋剤を使う必要がある。例を挙げると、重合体対架橋剤の最適重量比は、通常、上記式３〜６のいずれかの重合体および約２００〜約４００の分子量を有するポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル架橋剤の場合、約４：１〜約３２：１である。最も好ましくは、この範囲は約８：１〜約１６：１である。さらに、例を挙げると、重合体対架橋剤の最適重量比は、通常、上記式４の重合体の場合、約１６：１であり、この場合、［ｎ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｌ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒８０％、および［ｐ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、または上記式５の重合体の場合、［ｎ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｍ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｌ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒７０％、および［ｐ／（ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、そしてｒ≒１１０、約２００の分子量を有するポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル架橋剤である。
【００５６】
メンブラン溶液は種々のバイオセンサの上に被覆させることができる。このような被覆により、酵素含有感知層の上に配設されたメンブランが得られることから有用である。この種のバイオセンサの例には、グルコースセンサやラクテートセンサがあるが、これらに限定されるものではない。（本明細書でその全体が参考文献として引用されているヘラー (Heller) らの米国特許第６，１３４，４６１号（特許文献１１）を参照のこと）コーティングプロセスとしては、スピンコーティング、浸漬コーティング、または感知層の上にメンブラン溶液の液滴を滴下する方法などの普通に使われる方法がある。この操作に続いて、通常、１〜２日間周辺条件下で硬化させる。コーティングの詳細プロセス（浸漬時間、浸漬頻度、浸漬液の数、など）は、例えば、重合体、架橋剤、メンブラン溶液、溶媒、および緩衝剤の特性（すなわち、粘度、濃度、組成、など）によって変わる。コーティングプロセスには、英国のＮＩＭＡテクノロジーのＤＳＧ  ＤＩＬ−１６０浸漬コーティングまたはキャスティングシステムなどの普通の装置を使うことができる。
【００５７】
センサ製作の実施例
センサの製作は、通常、作用電極上への酵素含有感知層の堆積および感知層および好ましくは随意に対向兼参照電極上への拡散制限メンブラン層のキャスティングからなる。以下の手順は、図２Ａ〜２Ｃに描かれた２電極からなるセンサの製作に関する。例えば、３電極からなるその他のセンサは、類似の方法を用いてつくることができる。
【００５８】
ここで、センサ製作の具体的な実施例を提示する。ただし、数値は近似的な値である。感知層溶液は、本明細書でその全体が参考文献として引用されている特許協力条約（ＰＣＴ）出願の国際公開第０１／３６６６０  Ａ２号（特許文献１２）で開示されている１．７μｇの重合体性オスミウム媒介物化合物Ｌを含む７．５ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液（０．５μＬ、ｐＨ８）、２．１μｇのグルコース・オキシダーゼ（東洋紡）、および１．３μｇのポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（分子量４００）からつくった。化合物Ｌを次に示す。
2005520172.tif 000015
感知層溶液を炭素インク作用電極上に堆積し、室温で２日間硬化させ、多数のセンサをつくった。メンブラン溶液は、ＥｔＯＨ８０％とＨＥＰＥＳ緩衝剤（１０ｍＭ、ｐＨ８）２０％からなる溶液に６４ｍｇ／ｍＬにて溶解した上記式４の４容積の重合体を、エタノール８０％とＨＥＰＥＳ緩衝剤（１０ｍＭ、ｐＨ８）２０％からなる溶液に４ｍｇ／ｍＬにて溶解したポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（分子量２００）の１容積を混合して調製した。上述したセンサをメンブラン溶液に１０分間隔で１回に約５秒間３回浸漬した。次いで、このセンサを室温と普通の湿度で２４時間硬化させた。
【００５９】
本発明により調製した典型的なメンブランの断面の近似的な化学構造を図１に示している。この種のメンブランを２電極からなるセンサや３電極からなるセンサなどの種々のセンサで使用することができる。例を挙げると、このメンブランを２電極からなる電流測定グルコースセンサで使用することができ、このセンサを図２Ａ〜２Ｃ（集合的に図２）に示し、以下に説明する。
【００６０】
図２の電流測定グルコースセンサ１０には、通常、炭素を利用している作用電極１４とＡｇ／ＡｇＣｌ対向／参照電極１６の間に配設された基板１２が含まれている。センサまたは感知層１８は作用電極に配設されている。メンブランまたはメンブラン層２０は、Ａｇ／ＡｇＣｌ対向／参照電極を含めてグルコースセンサ１０全体を包んでいる。
【００６１】
グルコースセンサ１０の感知層１８は、上述の公開されたＰＣＴ出願、すなわち、国際公開第０１／３６６６０  Ａ２号（特許文献１２）で開示されている、低ポテンシャルの重合体性オスミウム錯体媒介物と架橋グルコース酸化酵素からなる。感知層で使用しうる酵素および媒介物含有配合物およびこの配合物を電極システムに塗布する方法は、例えば、米国特許第６，１３４，４６１号（特許文献１１）から当該分野において知られている。本発明によると、メンブラン・オーバーコートは、メンブラン溶液にセンサを３度浸漬して形成された。このメンブラン溶液には、４ｍｇ／ｍＬのポリ（エチレングリコール）グリシジルエーテル（分子量約２００）および６４ｍｇ／ｍＬの上記式４の重合体が含まれており、ここで［ｎ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％、［ｌ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒８０％、および［ｐ／（ｎ＋ｌ＋ｐ）］×１００％≒１０％であり、そしてこの３度浸漬したセンサの硬化は、常温と普通の湿度で少なくとも２４時間、すなわち、約１〜２日間行った。この種のメンブラン・オーバーコートのｑ値は、約９５０以上であり、ここでｎ、ｌおよびｐは、それぞれ、１、８および１である。
【００６２】
メンブラン表面の変性
本発明の重合体にはピリジン基などの複素環窒素基があるが、メンブラン形成中に架橋に使われているのはその内の数％に過ぎない。したがって、このメンブランはメンブラン・マトリックス内とメンブラン表面の両方に存在する過剰のこれらの基がある。随意に、このメンブランは複素環窒素基に富むメンブラン表面またはピリジンに富むメンブラン表面にもう一つの物質層を置くことによりさらに変性することができる。例えば、メンブラン表面は、ポリ（エチレングリコール）の層を添加することにより生物適合性を高めることができる。一般に、変性は、アルキル化反応基を有する望ましい分子を含む溶液のような変性溶液でメンブラン表面をコーティングし、次いで過剰の分子を除去するために適当な溶媒でコーティング溶液を洗浄することからなる。この変性により望ましい分子の単層を生じる。
図２に示したグルコースセンサ１０のメンブラン２０は、上述した方法で変性することができる。
【００６３】
実験実施例
本発明による拡散制限メンブランを有するセンサの特性および／または有効性を示す実験例を以下に提示する。数値は近似的なものである。
【００６４】
較正実験
第１の実施例では、較正実験を行った。この実験では、メンブランのない１５個のセンサを同時にテスト（セット１）し、別に本発明による拡散制限メンブランを有する８個のセンサを同時にテスト（セット２）した。実験はすべて３７℃で行った。セット２では、メンブランは、上記式４の重合体と約２００の分子量を有するポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＧＥ）架橋剤からつくった。セット１とセット２の各々に関する較正実験では、センサはＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７）に置き、グルコース濃度を上げた時の各センサの出力電流を測定した。測定した出力電流（セット１のμＡ、セット２のｎＡ）をセット１とセット２の各々について平均化し、次いで図３の較正グラフに示したようにグルコース濃度（ｍＭ）に対してプロットした。
【００６５】
図３に示したように、メンブランのないセット１の較正曲線は、グルコース濃度がゼロから約３〜５ｍＭまでの非常に狭い範囲ではほぼ直線である。この結果は、メンブランのないセンサはグルコース濃度が１０ｍＭ程度に上がるとグルコース濃度の変化に対して感度が不十分であることを示している。１０ｍＭ程度のグルコース濃度は、臨床で問題になる約３０ｍＭのグルコース濃度よりかなり低い濃度である。対照的に、本発明による拡散制限メンブランを有するセット２のセンサの較正曲線は、図３に示したように最良の適合線（ｙ＝１．２５０２ｘ＋１．１９５１、Ｒ２≒０．９９７）によって表されるように、例えば、ゼロから３０ｍＭまでという比較例はグルコース濃度の広い濃度範囲にわたり実質的に直線である。この結果は、メンブランを備えたセンサは、低濃度から高濃度までのグルコース濃度、特に臨床で問題になる約３０ｍＭのグルコース濃度において優れた感度を示す。
【００６６】
安定性に関する実験
第２の実施例では、安定性に関する実験を行った。この実験では、メンブランのないセンサと本発明による拡散制限メンブランを有するセンサを同時に３７℃でテストした。メンブランを備えたセンサのメンブランは、較正実験において上述したセット２のセンサと同じ重合体および同じ架橋剤からつくられた。この安定性に関する実験では、各センサを３０ｍＭという固定したグルコース濃度を有するＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７）に入れ、各センサの出力電流を測定した。測定した出力電流（メンブランのないセンサではμＡ、メンブランを備えたセンサではｎＡ）は、図４の安定性グラフに示したように、時間（時間）に対してプロットした。
【００６７】
図４に示したように、メンブランのないセンサの安定性曲線は、１時間あたり約４．６％μＡの減衰速度で急速に減衰した。この結果は、メンブランのないセンサでは、安定性が欠如していることを示している。対照的に、本発明によるメンブランを備えたセンサの安定性曲線は、比較的一定しており、１時間あたりの減衰速度は約０．０６％ｎＡであり、減衰はほとんどない。この結果は、本発明のメンブランを備えたセンサは安定性と信頼性がかなり優れていることを示している。すなわち、グルコース濃度３０ｍＭにおいて、メンブランのないセンサは、１時間あたりほぼ５％の速度で約２０時間にわたり感度を失うが、本発明によるメンブランを備えたセンサは、同じ期間にわたりほとんど感度の損失はないことを示した。
【００６８】
応答性に関する実験
理想的には、電気化学センサのメンブランは、センサの感知層と検体を含む流体と生物流体の間の連通を妨害してはならない。すなわち、メンブランは検体の濃度変化に迅速に応答する。
【００６９】
第３の実施例では、応答性に関する実験を行った。この実験では、本発明による拡散制限メンブランを有する８個のセンサを、すべて３７℃で、同時にテストした（セット３）。セット３のセンサのメンブランは、較正実験において上述したセット２と同じ重合体および同じ架橋剤からつくった。この応答性に関する実験では、８個のセンサをＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７）に入れ、図５に示したグルコース濃度で例示したように、緩衝溶液のグルコース濃度を段階的に上げ、各センサの出力電流を測定した。次いで、測定した出力電流（ｎＡ）をセット３について平均化し、図５の応答性グラフに示したように時間（実際の時間、時間：分：秒）に対してプロットした。
【００７０】
本発明による拡散制限メンブランを有するセット３のセンサの応答曲線は、グルコース濃度を段階的に上げると、ただちに出力電流もこれと同様に段階的に上がる。すなわち、出力電流は、グルコース濃度を上げると一つの値から次の値にジャンプする。この結果は、本発明のメンブランを備えたセンサの応答性はかなり優れていることを示している。メンブランを備えたこれらの電気化学センサは応答性が優れているので、これらの電気化学センサは、グルコース感知などの検体感知に理想的である。
【００７１】
運動感度に関する実験
理想的には、電気化学センサのメンブランは、検体を含む流体または生物流体の運動または動作の影響を受けてはならない。これは、人体などの生体に移植されているセンサの場合、生体の運動は頻繁に運動に関連したノイズを生じるので、特に重要である。
【００７２】
この第４の実施例では、運動の感度に関する実験を行った。この実験では、メンブランのないセンサＡと本発明による拡散制限メンブランを有するセンサＢについて、すべて３７℃で別々にテストした。センサＢのメンブランは、較正実験において上述したセット２のセンサと同じ重合体および同じ架橋剤からつくった。この実験では、各テストで、センサはＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７）と磁気攪拌器を含むビーカーに入れた。この溶液のグルコース濃度は、図６の種々のｍＭラベルで示したように、応答性に関する実験において上述したのと同じ方法で段階的に上げた。攪拌器は、グルコース濃度を段階的に上げる間は激しく動かし、その後しばらくは使用するのを止めた。すなわち、図６では「撹拌開始」と「撹拌停止」の２つのラベルで表示している。スターラーの運転と停止は、いくつかのグルコース濃度でサイクル方式で繰り返し、各センサの出力電流は実験の間中測定した。測定された出力電流（センサＡの場合のμＡ、センサＢの場合のｎＡ）を図６の運動感度グラフに示す。
【００７３】
図６に示されるように、メンブランのないセンサＡの出力電流は、実験で用いたグルコースの濃度範囲で、攪拌がない場合に比べて攪拌がある場合は大きな影響を受ける。対照的に、本発明による拡散制限メンブランを有するセンサＢの出力電流は、約１０ｍＭのグルコース濃度までは、攪拌がない場合に比べて攪拌がある場合はほとんど影響を受けないが、グルコース濃度が約１５ｍＭの場合はこれらの条件によりわずかに影響を受ける。この結果は、本発明のメンブランを備えたセンサが、攪拌の有無の両方の環境下でかなり安定していることを示している。これらメンブランを備えた電気化学センサが流体運動の環境下で安定しているので、生体が動いても体内で検体を感知することができるため、これらのセンサは理想的なものとなる。
【００７４】
センサ再現性実験
メンブランの浸漬コーティングやキャスティングは、通常、英国のＮＩＭＡテクノロジーのＤＳＧ  ＤＩＬ−１６０などの浸漬機械を用いて行う。メンブランのキャスティングを再現性よく作ることは困難であると考えられていた。（チェン，Ｔ．ら，「ｉｎ  ｓｉｔｕの組み立てられ質量輸送制御マイクロメンブランおよび移植された電流測定グルコースセンサにおけるマイクロメンブランの利用」，アナリティカル・ケミストリ，Ｖｏｌ．７２，Ｎｏ．１６，３７５７〜３７６３ページ  （２０００年） (Chen, T., et al., In Situ Assembled Mass-Transport Cocntrolling Micromembranes and Their Application Implanted in Amperometric Glucose Sensors), Anal. Chem., Vol. 72, No. 16, Pp. 3757-3763 (2000))（非特許文献１１）驚いたことに、本発明のセンサは、次に説明する実験で証明されるように、非常に再現性よく作ることができる。
【００７５】
本発明により、センサを、キャスティング装置を用いてメンブラン溶液に３度浸漬し、次いでメンブラン溶液を硬化させることにより、４バッチのセンサ（バッチ１〜４）を別々に調製した。４バッチの各々において、メンブラン溶液は、（セット２および上で用いた他のセットにおけるように）式４の重合体および分子量約２００のポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（ＰＥＤＧＥ）架橋剤から同じ手順を用いて調製した。バッチ１と２のメンブラン溶液は、互いに別々に調製し、このメンブラン溶液からバッチ３と４に用いた。バッチ３と４のメンブラン溶液は同じであったが、バッチ３とバッチ４のセンサは別のキャスティング装置を用いて浸漬時間も変えて浸漬コーティングした。すなわち、バッチ１，２および３は市販されていない、組み立て装置を用いて浸漬コーティングし、バッチ４は上述したＤＳＧ  ＤＩＬ−１６０装置を用いて浸漬コーティングした。
【００７６】
較正テストは各バッチのセンサについて３７℃で行った。各バッチについて、センサをＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７）に入れ、次いでグルコース濃度（ｍＭ）を上げながら各センサの出力電流（ｎＡ）を測定した。４バッチの各々における各センサについて、図７Ｂ（バッチ１：５センサ）、図７Ｃ（バッチ２：８センサ）、図７Ｄ（バッチ３：４センサ）および図７Ｅ（バッチ４：４センサ）に示したように、出力電流対グルコース濃度のプロットに基づいて較正曲線を見いだした  。各バッチの較正曲線の平均傾斜は、次のとおりであった。
バッチ１：平均傾斜＝１．１０ｎＡ／ｍＭ（ＣＶ＝  ５％）
バッチ２：平均傾斜＝１．２７ｎＡ／ｍＭ（ＣＶ＝１０％）
バッチ３：平均傾斜＝１．１５ｎＡ／ｍＭ（ＣＶ＝  ５％）
バッチ４：平均傾斜＝１．１４ｎＡ／ｍＭ（ＣＶ＝  ７％）
さらに、各バッチについて、図７Ａに示すように、バッチ内でセンサの出力電流を平均化し、グルコース濃度に対してプロットした。バッチ１〜４の平均傾斜は、１．１７ｎＡ／ｍＭ（ＣＶ＝７．２％）であった。
【００７７】
各バッチ内およびバッチ間での曲線の傾斜が厳密に群に分けられるので、変動がかなり小さいことを示している。これらの結果は、本発明により調製したセンサがバッチ内とバッチ間の両方で再現性のよい結果を与えることを示している。
【００７８】
上述した実施例は、本発明のメンブランとこの種のメンブランを用いたセンサに多数の利点があることを示している。本発明のメンブランを用いたセンサの利点には、特に、感度、安定性、応答性、運動と両立、較正の容易さ、および簡単で且つ再現性のある製造が挙げられる。
【００７９】
本発明の様々な態様および特徴について、確証または理論に基づき説明または記載してきたが、本発明はこの特定の確証または理論のいずれにもに拘束されるものではないことは明らかである。本発明が関わる技術分野の当業者であれば、本発明に適用できると考えられる多数の構造のほか、様々な変更、プロセスがあることは、本明細書を見直せばすぐにわかることである。本発明の様々な態様および特徴を記載してきたが、本発明が添付の請求項の最大の範囲内で保護を受ける権利があることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明による検体拡散制限メンブランの典型的断面構造の例である。
【図２】図２Ａは、本発明による作用電極、連結された対向電極と参照電極、および両方の電極に入れられた浸漬により被覆したメンブランを有する２電極グルコースセンサの一部の側面図である。図２Ｂと２Ｃは、それぞれ、図２Ａのグルコースセンサの一部の平面図と底面図である。ここで、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは集合的に図２と呼ばれる。
【図３】本発明によるグルコース拡散制限メンブランを有するセンサおよびこの種のメンブランのないセンサに関する、平均値に基づく、電流対グルコース濃度のグラフである。
【図４】本発明によるグルコース拡散制限メンブランを有するセンサおよびこの種のメンブランのないセンサに関する、固定グルコース濃度における電流出力対時間のグラフである。
【図５】本発明によるグルコース拡散制限メンブランを有するセンサに関する、平均値に基づく、種々のグルコース濃度における電流出力対時間のグラフである。
【図６】本発明によるグルコース拡散制限メンブランを有するセンサおよびこの種のメンブランのないセンサに関する、撹拌有無の両方の場合の、種々のグルコース濃度における電流出力対時間のグラフである。
【図７】図７Ａは、本発明によるグルコース拡散制限メンブランを有するセンサの平均値に基づく、別々につくられた４個のバッチに関する電流出力対グルコース濃度のグラフである。図７Ｂ〜７Ｅは、それぞれ、本発明によるグルコース拡散制限メンブランを有するセンサの上述の４個のバッチの各々の個々のセンサに関する電流出力対グルコース濃度のグラフである。ここで、図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄおよび７Ｅは集合的に図７と呼ばれる。
【図１】
2005520172.tif 000034
【図２Ａ】
2005520172.tif 000035
【図２Ｂ】
2005520172.tif 000036
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【国際調査報告】
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