(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチドの３´および５´−末端に結合された分離標識を使用するオリゴヌクレオチドの精製方法に基づいている。一態様において、本発明の特徴は、オリゴヌクレオチドの分離方法にある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドの分離方法であって、
ａ）複数種のオリゴヌクレオチドを用意し、この複数種のオリゴヌクレオチドは少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種の非二官能性オリゴヌクレオチドを包含し、この少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドはそれぞれ、当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの第一末端に結合している第一分離標識および当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの第二末端に結合している第二分離標識を含有しており、上記第一分離標識または第二分離標識の切断が３´ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを生成するものであり；
ｂ）上記複数種のオリゴヌクレオチドを、当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドを分離媒体に付着させるのに有効な条件下、当該分離媒体と接触させ；次いで
ｃ）少なくとも１種の非二官能性オリゴヌクレオチドを選択的に溶出する；
ことを包含する、上記分離方法。
【請求項２】
上記非二官能性オリゴヌクレオチドが脱プリン化または截形にされたオリゴヌクレオチドを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記第一分離標識または上記第二標識のどちらかが、非共有相互作用によって上記分離媒体と相互作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記第一分離標識または上記第二分離標識のどちらかが、共有結合によって上記分離媒体と相互作用する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記共有結合が、ジスルフィド、ヒドラゾ、アルコキシアミノおよび反応性カルボニル結合からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記非共有相互作用が、疎水性、親水性、水素結合、金属錯体形成、イオン性および抗原−抗体相互作用からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
上記第一分離標識と上記第二分離標識とが相違している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記第一分離標識または上記第二分離標識のどちらかが、アルコキシトリチル、アルコキシピキシル、アルキルジチオホルムアセタール、メチルチオアルキル、メルカプトジメトキシトリチルまたはメルカプトトリチルの誘導体および直鎖状または分枝鎖状ジオールの形態で導入された炭化水素鎖、およびその組合せからなる群から選択される分離単位を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記アルコキシトリチルが、４−デシルオキシメトキシトリチル（Ｃ10Ｔｒ）、４−ヘキシルオキシメトキシトリチル（Ｃ6Ｔｒ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）およびモノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記アルコキシピキシルが、４−オクタデシルオキシフィニルキサンチル（Ｃ18−Ｐｘ）を包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
上記分離単位が、メルカプトジメトキシトリチルまたはメルカプトトリチルの誘導体を含有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
上記分離単位が、メチルチオアルキル基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
上記分離単位が、直鎖状または分枝鎖状ジオールの形態で導入された炭化水素鎖である、請求項８に記載方法。
【請求項１４】
上記第一分離標識または上記第二標識のどちらかの切断可能単位が、酸不安定性、フッ素イオン不安定性、光不安定性、レドックス不安定性および求電子不安定性分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記レドックス不安定性分子が、ジチオホルムアセタール基を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記第一分離標識または上記第二標識のどちらかの切断可能単位が、シロキシルまたはジシリルオキシ基を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
上記分離媒体が、親和性、疎水性相互作用性、親水性相互作用性、金属錯体形成性、イオン交換性、共有カプリング性および抗原−抗体親和性分離媒体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
上記分離媒体が、イオン交換性分離媒体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
上記分離媒体が、逆相分離媒体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
上記分離媒体が、混合−モード型分離媒体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
上記混合−モード型分離媒体が、逆相およびイオン交換性分離媒体を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記混合−モード型分離媒体が、共有カプリング性分離媒体を包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
上記共有カプリング性分離媒体が、ジスルフィド結合の形成に基づく、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記方法が、少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの溶出をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
上記分離媒体が、第一分離媒体および第二分離媒体を包含し、この第一分離媒体は上記第一分離標識に付着するのに有効なものであり、また上記第二分離媒体は上記第二分離標識に付着するのに有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
上記方法が、
ｄ）上記第一分離標識または上記第二分離標識のどちらかを切断し、および
ｅ）上記非切断分離標識に欠落しているオリゴヌクレオチドを溶出する、
ことをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドの分離方法であって、
ａ）複数種のオリゴヌクレオチドを用意し、この複数種のオリゴヌクレオチドは少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種の非二官能性オリゴヌクレオチドを包含し、この少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドはそれぞれ、当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの第一末端に結合している第一分離標識および当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの第二末端に結合している第二分離標識を含有しており、上記第一分離標識または第二分離標識の切断が３´ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを生成するものであり；
ｂ）上記複数種のオリゴヌクレオチドを、当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドを分離媒体に付着させるのに有効な条件下、当該分離媒体と接触させ；
ｃ）少なくとも１種の非二官能性オリゴヌクレオチドを選択的に溶出し、；
ｄ）分離媒体上に保有されているオリゴヌクレオチドから上記第一分離標識を切断し；次いで
ｅ）上記第二分離官能性基が欠落している非二官能性オリゴヌクレオチドを溶出する；
ことを包含する、上記方法
【請求項２８】
上記切断工程を、ＴＢＡＦを用い促進させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記切断工程を、酸を用い促進させる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ａ）複数種のオリゴヌクレオチドであって、このオリゴヌクレオチドはそれぞれ、上記オリゴヌクレオチドの第一末端に結合している第一分離標識および上記オリゴヌクレオチドの第二末端に結合している第二分離標識を含有しており、この第一分離標識または第二分離標識の切断が３´ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを生成する複数種のオリゴヌクレオチド；
ｂ）分離媒体であって、上記複数種のオリゴヌクレオチドが上記分離媒体に付着する分離媒体；
を含有する組成物。
【請求項３１】
上記分離媒体が、第一分離媒体および第二分離媒体を包含し、上記第一分離媒体および第二分離媒体が相違する分離媒体である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
上記第一分離標識または第二分離標識がアルキルチオメチル基を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
上記第一分離標識または第二分離標識のどちらかの切断可能単位が、ヒドロカルビルジチオメチル基を包含する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、有機化学の精製に関し、さらに特に、化学合成されたオリゴヌクレオチドの精製に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
オリゴヌクレオチドの化学合成中に、充分ではないカプリングおよび／または副反応が生じることがあり、これにより不充分の長さを有するか、または不完全なオリゴヌクレオチドが生成される。さらに、酸−触媒脱プリン化が生じることがあり、これはオリゴヌクレオチド脱保護化中にオリゴヌクレオチド幹鎖の切断をもたらす。この結果として、オリゴヌクレオチドの化学合成中に、一団のオリゴヌクレオチドが生成され、所望のオリゴヌクレオチドを得るためには、精製しなければならない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
本発明は、オリゴヌクレオチドの３´−および５´−末端に結合させた分離標識（tag）を用いるオリゴヌクレオチドの精製方法に基づいている。一態様において、本発明の特徴は、オリゴヌクレオチドの分離方法にある。この方法は、ａ）複数種のオリゴヌクレオチドを用意し、この複数種のオリゴヌクレオチドは少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種の非二官能性オリゴヌクレオチド（例えば、脱プリン化されたまたは截形にされたオリゴヌクレオチド）を包含し、この少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドはそれぞれ、少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの第一末端に結合している第一分離標識および少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの第二末端に結合している第二分離標識を含有しており、この第一分離標識または第二分離標識の切断が３´−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを生成するものであり；
【０００４】
ｂ）上記複数種のオリゴヌクレオチドを、当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドを分離媒体に付着させるのに有効な条件下、上記分離媒体と接触させ；次いでｃ）少なくとも１種の非二官能性オリゴヌクレオチドを選択的に溶出する；ことを包含する。この方法はさらに、少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの選択的溶出を包含することができる。この方法はまた、第一分離標識または第二分離標識のどちらかを切断し；次いで未切断分離標識に欠けているオリゴヌクレオチドを溶出する；ことを包含することができる。
【０００５】
第一分離標識または第二分離標識は、非共有相互作用（例えば、疎水性、親水性、水素結合性、金属−錯体形成性、イオン性、または抗原−抗体相互作用）により、または共有結合（例えば、ジスルフィド、ヒドラゾ、アルコキシアミノ、または反応性カルボニル結合）により、分離媒体と相互作用させることができる。上記第一分離標識と上記第二分離標識とは相違することができる。第一分離標識または第二分離標識は、アルコキシトリチル、アルコキシピキシル、アルキルジチオホルムアセタール、メチルチオアルキル、メルカプトジメトキシトリチルまたはメルカプトトリチルの誘導体および直鎖状または分枝鎖状ジオールの形態で導入された炭化水素鎖、およびその組合せからなる群から選択される分離単位を含有することができる。
【０００６】
このアルコキシトリチルは、４−デシルオキシメトキシトリチル（Ｃ10Ｔｒ）、４−ヘキシルオキシメトキシトリチル（Ｃ6Ｔｒ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）およびモノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）からなる群から選択することができる。このアルコキシピキシルは、４−オクタデシルオキシフィニルキサンチル（Ｃ18−Ｐｘ）であることができる。分離単位は、メルカプトジメトキシトリチルまたはメルカプトトリチルの誘導体であることができる。分離単位は、メチルチオアルキル基であることができる。分離単位は、直鎖状または分枝鎖状ジオールの形態で導入された炭化水素鎖であることができる。
【０００７】
第一分離標識または上記第二分離標識のどちらかの切断可能単位は、酸不安定性、フッ素イオン不安定性、光不安定性、レドックス不安定性および求電子不安定性分子からなる群から選択することができる。レドックス不安定性分子は、ジチオホルムアセタール基を包含することができる。第一分離標識または上記第二分離標識のどちらかの切断可能単位は、シロキシルまたはジシリルオキシル基を包含することができる。第一分離標識または上記第二分離標識のどちらかの切断可能単位は、アルキルチオメチル基またはヒドロカルビルジチオメチル基を包含することができる。
【０００８】
分離媒体は、親和性、疎水相互作用性、親水相互作用性、金属錯体形成性、イオン交換性、共有カプリング性および抗原−抗体親和性の分離媒体からなる群から選択することができる。特に、この分離媒体は、イオン交換性分離媒体、逆相分離媒体または混合−モード型分離媒体であることができる。この混合−モード型分離媒体は、逆相分離媒体およびイオン交換性分離媒体または共有カプリング性分離媒体（例えば、ジスルフィド結合の形成に基づく分離媒体）を包含することができる。分離媒体は、第一分離媒体および第二分離媒体を包含することができ、この場合、第一分離媒体は上記第一分離標識に付着するのに有効なものであり、また上記第二分離媒体は上記第二分離標識に付着するのに有効な媒質である。
【０００９】
もう一つの態様において、本発明の特徴は、オリゴヌクレオチドの分離方法にある。この方法は、ａ）複数種のオリゴヌクレオチドを用意し、ここで当該複数種のオリゴヌクレオチドは少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドおよび少なくとも１種の非二官能性オリゴヌクレオチドを包含し、また当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドはそれぞれ、少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの第一末端に結合している第一分離標識および当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドの第二末端に結合している第二分離標識を含有しており、またこの第一分離標識または第二分離標識の切断が３´−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドの生成をもたらすものであり；
【００１０】
ｂ）上記複数種のオリゴヌクレオチドを、当該少なくとも１種の二官能性オリゴヌクレオチドを分離媒体に付着させるのに有効な条件下、上記分離媒体と接触させ；ｃ）二官能性オリゴヌクレオチドを溶出することなく、第一分離標識に欠けている非二官能性オリゴヌクレオチドを溶出し；ｄ）分離媒体上に保有されているオリゴヌクレオチドから第一分離標識を切断し；次いでｅ）上記第二分離官能性基が欠落している非二官能性オリゴヌクレオチドを溶出する；ことを包含する。この切断工程は、ＴＢＡＦまたは酸を用いて促進させることができる。
【００１１】
さらにもう一つの態様において、本発明の特徴は複数種のオリゴヌクレオチドを含有する組成物にあり、各オリゴヌクレオチドはそれぞれ、オリゴヌクレオチドの第一末端に結合している第一分離標識およびオリゴヌクレオチドの第二末端に結合している第二分離標識を含有しており、ここで第一分離標識または第二分離標識の切断が３´ヒドロキシ基を有するオリゴヌクレオチドを生成する複数種のオリゴヌクレオチド；およびｂ）分離媒体であって、上記複数種のオリゴヌクレオチドが上記分離媒体に付着する分離媒体；を含有する。分離媒体は、第一分離媒体および第二分離媒体を包含することができ、この第一分離媒体および第二分離媒体は相違する分離媒体である。
【００１２】
別段の定義がなされていないかぎり、本明細書に記載されている技術および科学用語、ならびに略語は全部が、本発明が属する技術の当業者にとって常習的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されている方法および材料と類似の、または同等の方法および材料を本発明で用いることができるが、適当な方法および材料を下記で説明する。本明細書に記載されている刊行物、特許出願書、およびその他の参考文献の全部を、それらの全記載を引用してここに組入れる。対立する場合、定義を包含する本明細書が管理するものとする。さらに、材料、方法および例は例示のためのみのものであって、制限しようとするものではない。
本発明の一つまたは二つ以上の態様の詳細は、添付図面および下記説明に示されている。その他の特徴および利点は、下記詳細な説明から、および特許請求の範囲から明白であると見なされる。
【００１３】
（詳細な説明）
一般に、本発明の方法は、複数種の化学合成されたオリゴヌクレオチド、例えば固体支持体上で合成されたオリゴヌクレオチドを、当該オリゴヌクレオチドの第一末端および第二末端に結合している分離標識に基づき分離することを可能にする。「オリゴヌクレオチド」の用語は、３´−５´ホスホジエステル幹鎖を有するリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドのオリゴマー、ならびに標準的３´−５´ホスホジエステル結合とは相違する幹鎖構造を有するリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド（例えば、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）、メチルホスホネート、またはホスホロチオエート結合）のオリゴマーを包含する。「オリゴヌクレオチド」の用語はまた、非標準的塩基基、例えばイノシンまたはヌブラリン、修飾された塩基基、修飾された糖基、およびこのような基の組合せを含有するオリゴマーを包含する。
【００１４】
一例として、窒素系塩基または糖基は、反応官能性基（例えば、Ｃ５プロピン、ハライド、またはビオチン）およびラベル（例えば、放射性、発光性、電気発光性、可視性、近−ＩＲ性、および蛍光性）を含有するように修飾することができる。非標準的塩基を含有するオリゴヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドの合成方法は、当技術で公知である。一例として、オリゴヌクレオチドは、βシアノエチルホスホルアミダイト法により組立てることができる。一例として、オリゴヌクレオチド合成方法を開示する、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ発行、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８４，ＷＯ９２／０９６１５；およびＷＯ９８／０８８５７を参照することができる。ジスルフィド固定リンカーを用いるＰＮＡ類の固体相合成の例は、Ａｌｄｒｉａｎ  Ｈｅｒｒａｄａ，Ｇ等によるＪ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．４，２６６−２８１（１９９８）に見出すことができる。自動式オリゴヌクレオチド合成装置を使用し、オリゴヌクレオチドを合成することができる。このような合成装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．を包含する種々の会社から入手することができる。
【００１５】
第一末端および第二末端に分離標識を有するオリゴヌクレオチドは、本明細書で「二官能性」と称する。二官能性オリゴヌクレオチドは、充分の長さのオリゴヌクレオチド、すなわち所望の長さを有し、また両方の分離標識を含有するオリゴヌクレオチド、ならびに両方の分離標識を含有するが、所望の長さよりも短い長さを有するオリゴヌクレオチドを包含する。「非二官能性」は、両方の分離標識を有していない全部のオリゴヌクレオチドを表わす。
【００１６】
分離標識
「分離標識」の用語は、オリゴヌクレオチドの３´または５´末端のどちらかに結合している化学基または分子であって、分離標識を有するオリゴヌクレオチドを、このような官能性基が欠けている別種のオリゴヌクレオチドから分離することを可能にする基または分子を意味する。有用な分離標識は、化学的にまたは光化学的に選択的に切断されるものであり、分離標識はオリゴヌクレオチドの各末端から分離することができるものである。従って、分離標識は「分離単位」および「切断可能単位」を包含し、これらは同一または相違する化学基であることができる。分離標識は、化学合成中に、例えば固体支持体上にオリゴヌクレオチドを結合させるリンカーの一部として、結合させることができる。別法として、分離標識は、本発明が属する技術の当業者にとって公知の方法を用いて合成前、または合成後に付加することができる。
【００１７】
分離標識は、オリゴヌクレオチドの末端、すなわちオリゴヌクレオチドの最初のヌクレオチドの前およびオリゴヌクレオチドの最後のヌクレオチドの後の位置に位置する。一例として、３０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド、すなわち３０ｍｅｒの末端に結合している分離標識は、ヌクレオチド１の前およびヌクレオチド３０の後に位置している。第一末端および第二末端がオリゴヌクレオチドの特定的または特異的末端を意味するものではないことに留意すべきである。むしろ、第一末端および第二末端は、各オリゴヌクレオチドに２個の末端が存在することを単純に示している。
オリゴヌクレオチドの第一末端および第二末端上の分離標識は、同一または相違することができる。一例として、分離標識は各末端で疎水性であることができ、または一方の末端が疎水官能性基であるとともに、他方の末端が共有官能性であることができる。
【００１８】
二官能性オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチド化学合成は代表的に、固体支持体を利用し、この固体支持体にリンカーを経て１種または２種以上の保護ヌクレオチドをヌクレオチドの３´−酸素に結合させる。追加のヌクレオチドモノマーを順次的に付加すると、生成するオリゴヌクレオチドは、３´末端から５´末端方向に延長される。所望の長さのオリゴヌクレオチド鎖が得られた後、このオリゴヌクレオチドを固体支持体から分離し、次いでその保護基を分離する。リンカーの用語は、支持体上で合成される分子を支持体に結合させる役目を果たす原子、例えば炭素、窒素、酸素などの鎖を含有する分子を意味する。
【００１９】
リンカーは通常、支持体上での合成の開始前に共有結合を経て支持体に結合させ、合成される分子の先駆体に１個または２個以上の結合用部位を提供する。時として、リンカーは、最終的完全長さオリゴヌクレオチドの一部ではない１種または２種以上のヌクレオチド、例えばｐｏｌｙＴを包含するものと理解されるべきである。リンカーの一部であるが、最終的完全長さのオリゴヌクレオチドの一部ではないヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの３´−末端であるとは考えない。代表的に、リンカーは、オリゴヌクレオチドを、例えばアンモニアを用い固体支持体から分離することができるように塩基不安定性である。塩基不安定性リンカーの非制限的例には、スクシニルアルキルアミンがある。
【００２０】
オリゴヌクレオチドの３´末端上の分離標識は、固体支持体と第一ヌクレオチド、すなわちオリゴヌクレオチドの３´−末端との間の結合要素であることができる。このオリゴヌクレオチドの３´末端上の分離標識は代表的に、水性アンモニア中における処理下に安定であり、従ってオリゴヌクレオチドを固体支持体から分離した場合、このような分離標識はオリゴヌクレオチドから分離されない。分離標識の分離単位は、例えば疎水性、親水性、イオン性、水素結合性、および／または共有相互作用性を包含する１種または２種以上の化学的相互作用に基づき分離媒体と相互作用することができる。一例として、分離単位と分離媒体との間の相互作用は、イオン交換（例えば、アニオンまたはカチオン交換）、疎水性（例えば、逆相）、金属−キレート形成（例えば、Ｎｉ（＋２）錯体形成／ヒスチジン標識付加）、タンパク質相互作用（例えば、酵素／基質）、ハプテン／抗原／抗体、および／または共有（例えば、チオール／ジスルフィド、ヒドラゾ、アルコキシアミノ、または反応性カルボニル）を包含する。特に、１，１０−デカンジオールまたはその他の疎水性ジオール化合物などの直鎖状または分枝鎖状ジオールを、分離標識の疎水性分離単位の形成に出発材料として使用することができる。
【００２１】
オリゴヌクレオチドの３´末端上の分離標識の切断可能単位は、オリゴマーの第一ヌクレオチドの３´酸素に結合させることができる。オリゴヌクレオチドの３´末端上の適当な切断可能単位は、切断された後、遊離３´ＯＨを生成させる。ジシロキシオキシル基（「ＤＳｉ」）、アルキルチオメチルおよびヒドロカルビルジチオメチル基、光不安定性基（例えば、ｏ−ニトロベンジル基）、レドックス活性基（例えば、ジスルフィド−含有またはヒドロカルビルジチオメチル基）、および求電子性試薬（例えば、アルキルチオメトキシ基）は、リンカーの構成要素であることができる適当な切断可能単位の例である。ジシロキシル−含有リンカーは、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ等によるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４：４６３２−４６３８（１９９６）；Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ等によるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７（２４）：４７１０−１４（１９９９）；またはＷＯ９８／０８８５７に呈示されている方法を使用し、生成させることができる。
【００２２】
光不安定官能性基は、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇの方法［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：２５１−２５４（１９９３）］を使用し、リンカー中に導入することができる。ヒドロカルビルジチオメチル基含有リンカーは、米国特許第６，３０９，８３６号に呈示されている方法を使用し導入することができる。特に、３´−メチルチオアルキルホスホルアミダイトは、Ｖｅｅｎｅｍａｍ等の方法［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：１５４７−１５６２（１９９１）］に従い５´ジメトキシトリチル、３´−メチルチオメチルチミジンから調製することができる。ＤｕｃｈａｒｍｅおよびＨａｒｒｉｓｏｎの方法［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：６６４３−６６４６（１９９５）］を使用し、５´ジメトキシトリチル，３´−メチルチオメチルチミジンを５´−ジメトキシトリチル，３´−メチルチオブタノールチミジンに変換することができ、この基は次いで、周知の方法に従いホスフィチル化し、３´−メチルチオアルキルホスホルアミダイトを生成することができる。
【００２３】
上記基はまた、オリゴヌクレオチドの５´−末端上の分離標識として使用することもできる。５´−末端分離標識は、この末端としての５´末端ヌクレオチドと一緒に導入することができ、適当に誘導体化されたホスホルアミダイト合成中にオリゴマーに付加される。オリゴヌクレオチドの５´末端に適する分離標識は、末端ヒドロキシル残基の保護に加え、分離官能性基を付与し、また合成されたオリゴマーから選択的に切断することができる分離標識を包含する。この末端ヌクレオチドは、分離官能性基としての役目を果たす塩基性−ＯＨまたは−ＮＨ2保護基および／または糖を包含することができる。さらに、数種の有用な官能性基をオリゴヌクレオチドの５´−末端に導入することができる。これらの官能性基には、相当して誘導体化されているホスフェート、チオール、アミン、アルコキシアミンまたはビオチンが包含され、これらは公知方法により調製することができる。一例として、チオールまたはホスフェートは、Ｃｏｎｎｏｌｌｙのトリチル−Ｓ法［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２８（４）：４６３−６６（１９８７）］により付加することができる。ヒドロカルビルジチオメチル基は、米国特許第６，３０９，８３６号に記載の方法を使用し、ヒドロキシルに付加することができる。
【００２４】
有用な５´分離官能性基は、周知の疎水性基、例えばジメトキシトリチル（「ＤＭＴｒ」）、ピキシル、アルコキシトリチル、およびアルコキシピキシル保護基を包含する。一例として、オクタデシルオキシピキシルフィニルキサンチル（「Ｃ18Ｐｘ」）、４−デシルオキシメトキシトリチル（「Ｃ10Ｔｒ」）、４−ヒドロキシメトキシトリチル（「Ｃ6Ｔｒ」）、およびモノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、直鎖状または分枝鎖状ジオールの形態で導入された炭化水素鎖、アルキルジチオホルムアセタール、メチルチオアルキルおよびメルカプトジメトキシトリチルまたはメルカプトトリチルの誘導体は、分離官能性基として使用することができる。５´分離標識はまた、分離した反応で付加することもできる。相違する種類の置換トリチル基は、米国特許第５，３１９，０７９号に記載されているようなトリチル交換法で合成オリゴヌクレオチドの５´位置に導入することができる。
【００２５】
例として、二官能性オリゴヌクレオチドは、下記工程の１つまたは２つ以上を使用し製造することができる。３´−末端分離標識は水性アンモニア中で切断可能であるリンカー（例えば、単純エステル基の導入）により固体支持体上に結合させることができる。簡単に言えば、リンカーは、例えば１０００Åの制御有孔ガラス（ＣＰＧ）などの固体支持体に結合させることができ、この場合、固体支持体は充分に疎水性の直鎖状または分枝鎖状ジオールのホスホルアミダイト誘導体の一回または反復導入によって、１種または２種以上の標準的ヌクレオチドにより予備誘導体化されているものであることができる。適当に保護されているヌクレオチドは、乾燥ピリジンおよびイミダゾール中で１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンを使用してシリル化し、次いで選択されたジオール（例えば、テトラエチレングリコール）と反応させることができる。
【００２６】
シリル化ヌクレオシドの末端ヒドロキシル基を次いで、ホスホルアミダイトに変換し、次いでリンカー末端に存在する遊離ヒドロキシル基に付加することができる。ホスホルアミダイト誘導体のリンカー遊離末端へのカプリングは、オリゴヌクレオチドの出発３´ヌクレオチドを導入する。追加のヌクレオチドホスホルアミダイトを引続いて公知オリゴヌクレオチド合成方法を使用しカプリングさせ、所望の長さを有するオリゴヌクレオチドを生成することができる。最後に、５´−末端分離標識は、成長するオリゴヌクレオチド鎖の５´末端で適当に誘導体化されているヌクレオチドホスホルアミダイトのカプリングによって充分の長さのオリゴヌクレオチドに導入することができる。濃アンモニアを用いる脱保護化および固体支持体からのオリゴヌクレオチドの分離後、構造１で表わされる二官能性オリゴヌクレオチドを得ることができる。
【００２７】
2005517018.tif 000002
【００２８】
上記構造１にかかわり、「Ｔ」は、完全オリゴヌクレオチドを固体支持体から分離した後の二官能性オリゴヌクレオチドの３´−末端上に残留する１種または２種以上のヌクレオチドまたは非ヌクレオチド均等物を表わす。一例として、構造１において、「Ｔ」は、１個または２個以上のチミジンヌクレオチドを表わす。
【００２９】
可変性「ｎ」は、０、１または２であることができ、ＣＰＧオリゴヌクレオチド固体支持体に付加した分離標識の分離単位の数を表わす。本発明の分離標識には、種々の分離単位を使用することができる。構造１で表わされる態様において、可変性「ｎ」は、例えばホスホ−１，１０−デカンジオール単位の数を表わす。１，１０−デカンジオールの数が増加するに従い、３´−末端分離官能性基の疎水性は増大する。この態様において、総合的３´−末端リンカーは、１個または２個以上のチミジンヌクレオチド、ホスホ−１，１０−デカンジオール単位、ホスホ−トリエチレングリコール単位およびジシロキシル要素（すなわち、分離単位の切断可能単位）を包含する。
2005517018.tif 000003
は、オリゴヌクレオチドを表わす。「Ｒ」は、オリゴヌクレオチドの５´−ＯＨに結合した５´−末端分離標識を表わす。
【００３０】
或る態様において、３´−メチルチオアルキルホスホルアミダイトの代わりに、上記ジシロキシアミダイトが用いられる。３´−メチルチオアルキルホスホルアミダイトは次いで、１，１０−デカンジオールの遊離ヒドロキシル基にカプリングさせることができる。オリゴヌクレオチド合成サイクルおよび標準的水性アンモニア脱保護化後、合成されたオリゴヌクレオチドは下記構造２を有する：
【００３１】
2005517018.tif 000004
【００３２】
或る態様において、適当に誘導体化された固体支持体に１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド，１´［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトをカプリングさせることによって調製された固体支持体に、ジシロキシル連鎖を付加することができる。ジチオスレイトールを使用し、ジスルフィド連鎖を還元し、それによりチオール反応官能性基を含有する分離媒体に共有結合させることができるオリゴヌクレオチドを創生することができる。還元後、ジシロキシル−含有支持体上で合成されるオリゴヌクレオチドは、構造３を有する：
【００３３】
2005517018.tif 000005
【００３４】
分離媒体
上記分離標識は、二官能性オリゴヌクレオチドの単離に使用することができる分離媒体のタイプを決定する。従って、特定の分離単位に対応するいずれか公知の分離媒体を使用し、二官能性オリゴヌクレオチドと非二官能性オリゴヌクレオチドとを分離することができ、これにより精製された二官能性オリゴヌクレオチドを得ることができる。有用な分離媒体は、１種または２種以上の化学相互作用、例えば疎水性、親水性、イオン性および／または共有相互作用性に基づき分離単位と相互作用する化学基または分子を含有する。一例として、イオン交換によって（例えば、アニオンまたはカチオン交換）、疎水性相互作用によって（例えば、逆相）、金属−錯体形成によって（例えば、Ｎｉ（＋２）錯体形成性ヒスチジン標識付け）、親和性相互作用によって、ハプテン／抗原／抗体によって、および／または共有型相互作用によって（例えば、チオール／ジスルフィド）、分離単位と相互作用することができる基を含有する分離媒体は有用である。
【００３５】
使用できる分離媒体の種類に制限はなく、例えば誘導体化されたシリカ、樹脂、適当に修飾された膜または膜が付加されている粒子、およびその他の支持体が包含される。適当な分離媒体は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗｙ，ＮＪ）；Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ、この会社は現在、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅにより支配されている）；ＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）；Ｖｙｄａｃ（Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）；および／またはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から市場で入手することができる。分離媒体の非制限的例は、疎水性媒質、例えばシリカ−ベースＣ４、Ｃ８およびＣ１８支持体、または非シリカ−ベース、例えばブチルセファロース、オクチルセファロースを包含する。
【００３６】
イオン交換材料（特に、アニオン交換材料）は、ＭｉｎｉＱ、ＭｏｎｏＱ、Ｑセファロース、ＳＡＸトリメチルアミノプロピル、ＤＥＡＥセファロース、およびＥＭＤ  ＤＥＡＥ−６５０を包含する。親和性分離媒体は、１対の、例えば不動化したストレプタビジン（streptavidin）とイミノビオチン−標識付けしたオリゴヌクレオチド、不動化したニトロストレプタビジン（nitrostreptavidin）とビオチン−標識付けしたオリゴヌクレオチド（Ｍｏｒａｇ等によるＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２４３：２５７−２６３）または不動化したサリシルヒドロキサミン酸（salicylhydroxyamic acid）とフェニルボロン酸標識付けされたオリゴヌクレオチド（Ｂｅｒｇｓｅｉｄ等によるＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２９（５）：１１２６−１１３３）により代表される。共有結合の形成に頼る分離媒体は、ピリジンジチオプロピル−セファロースとチオール標識付けされたオリゴヌクレオチド、不動化したヒドロキシルアミンまたはヒドラジド様アガロースアジピン酸ヒドラジドとアルデヒド標識付けされたオリゴヌクレオチドにより例示することができる。例示された樹脂および膜を使用する方法および推奨される条件は周知であり、また当業者が容易に利用することができる。
【００３７】
オリゴヌクレオチド分離用装置は、１個または２個以上のＨＰＬＣカラム、および／または分離カートリッジを包含することができる。種々の部品（例えば、バルブ、ポンプ、注入部品およびフラクション採取器）、ならびにカラムまたはカートリッジを包含する装置は、二官能性オリゴヌクレオチドの分離を自動化するように配置することができる。カラムまたはカートリッジは、特定のオリゴヌクレオチドに好適な単離順序に応じて、順次様相または平行様相で操作することができる。
【００３８】
二官能性オリゴヌクレオチドは、第一分離標識および第二分離標識の性質に応じ、単一の分離媒体または多種の分離媒体（すなわち、混合モード）を使用し不充分な長さのオリゴヌクレオチドから分離することができる。或る種の態様において、二官能性オリゴヌクレオチドは、単一のカラムを使用し、ある種の場合、一回の操作で非二官能性オリゴヌクレオチドから分離することができる。一例として、疎水性である第一分離標識および第二分離標識を含有する二官能性オリゴヌクレオチドは、下記のとおりに１種または２種以上のタイプの逆相分離媒体を使用し、非二官能性オリゴヌクレオチドから分離することができる。二官能性オリゴヌクレオチドと非二官能性オリゴヌクレオチドとの混合物は、二官能性オリゴヌクレオチドおよび当該分離媒体とさらに強力に相互作用する分離標識を含有する非二官能性オリゴヌクレオチドを保有する適当な分離媒体と接触させることができる。
【００３９】
保有されているオリゴヌクレオチドを次いで、カラムから溶出し、次いでさらに強力な相互作用性を有する分離標識を切断する。生成するオリゴヌクレオチドの混合物は、分離媒体と接触させることができ、次いで所望のオリゴヌクレオチドを得ることができる。分離単位は分離媒体に付着させながら、すなわち二官能性オリゴヌクレオチドを最初に溶出することなく、二官能性オリゴヌクレオチドから分離することができるものと理解されるべきである。同様に、分離標識は、分離媒体に付着させながら、１個の分離標識のみを保有するオリゴヌクレオチドから分離することができる。
【００４０】
オリゴヌクレオチド混合物の分離は、カラム中の分離媒体を用いて行うことができる（すなわち、混合−モード）。一例として、分離媒体を含有するカラムの第一領域を第一分離標識と相互作用させることができ、他方、同一カラムの相違する領域に存在する相違する分離媒体を第二分離標識と相互作用させることができる。別法として、相違する分離媒体をカラム内で間隔を開けて存在させる。
【００４１】
精製後、オリゴヌクレオチド濃度は、ＵＶ吸収（λｍａｘ  ２６０ｎｍ）によって測定することができる。最終精製生成物中の成分の定量的および定性的比較は、ＵＶ検出器を備えた液体クロマトグラフイ装置から直接に得ることができる。一例として、ピーク領域は、全発色団含有成分用のＨＰＬＣクロマトグラムから直接に計算することができる。集積ピーク領域の比を使用し、所望の生成物の純度を計算することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明を下記例でさらに説明する。これらの例は特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を制限するものではない。
【００４３】
例
例で用いられる反応剤、ならびに分析および調製方法
別段の記載がないかぎり、下記反応剤および方法を、この方法の項に従う例で使用した。
５´−Ｏ−（４，４´−ジメトキシ）トリチルチミジリル３´−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピル−ジシロキシル−３）−（１−Ｏ−３，６，９−トリオキサ）ウンデカン−１１−オンおよびそのホスホルアミダイト誘導体は、ＰＣＴ公開Ｎｏ．ＷＯ９８／０８５７に従い製造した。市販のＣＰＧ（１０００Å；ＣＰＧ  Ｉｎｃ．，Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ；またはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、Ｐｏｎ，ＲＴにより記載された方法［“Ｃｈａｐｔｅｒ  １９  Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２０  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，４６５−４９７，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ（１９９３）］と類似の方法によりチオプロピルシラン化した。
【００４４】
ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド，１´−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイトは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから入手した。
オリゴヌクレオチド合成は、ＡＢＩ３９４ＤＮＡ合成装置（Synthesizer）で行った。全部のカプリングは、０．２μｍｏｌ規模合成にかかわる製造業者により推奨された条件下に、環外アミン官能性基がベンゾイル（ｄＡ、ｄＣ）および／またはイソブチリル（ｄＧ）基により保護されているアミダイト化合物を用いて行われた。必要に応じ、最後のヌクレオシドホスホルアミダイトは、別種の５´保護基により誘導体化されているヌクレオシドホスホルアミダイトで置き換えるか、または最終ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）基は、トリチル交換法（米国特許第５，３１９，０７９号参照）に従い、別のトリチル誘導体と交換した。
【００４５】
アンモニア脱保護化オリゴヌクレオチドの分析用液体クロマトグラフイは、ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ１８（５μｍ）カラム、ダイオードアレイ検出器を備えたＨｉｔａｃｈｉ−Ｍｅｒｃｋ  Ｌａ  Ｃｈｒｏｍ  ＨＰＬＣ装置において、溶媒Ａ：０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート（「ＴＥＡＡ」）中のアセトニトリル（「ＭｅＣＮ」）５％ｖ／ｖ、ｐＨ７．０および溶媒Ｂ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ中アセトニトリル８０％ｖ／ｖ、ｐＨ７．０の４０分間直線状勾配を用いて行った。
【００４６】
ジシロキシル基を分離するために、乾燥テトラヒドロフラン（「ＴＨＦ」）中の０．５Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライド（「ＴＢＡＦ」）（２００μｌ）を、部分的に蒸発されたオリゴヌクレオチド溶液に添加した。ここで、水は丸底１０ｍｌフラスコの壁部上に薄い膜のみを形成している。この混合物を、２０℃で２時間かけてインキュベートした。別法として、ジシロキシルリンカーは、６５℃で３時間かけて、乾燥ＤＭＦ中の０．５Ｍ  ＴＢＡＦ２００μｌを用いて切断することができる。トリチルおよびピキシル基は、完全長さのオリゴヌクレオチドを２０℃で２０分間にわたり８０％水性酢酸溶液に曝し、次いで酸を蒸発させることによって分離した。
【００４７】
単離し、充分に脱保護化したオリゴヌクレオチドは、分析用イオン交換ＭｉｎｉＱ  ＨＰＬＣカラムにおいて、溶媒Ａ（０．０１Ｍ  ＮａＯＨ）および溶媒Ｂ（０．０１Ｍ  ＮａＯＨ＋１．０Ｍ  ＮａＣｌ）からなる変性（ｐＨ１２）塩勾配溶出プロフィールを４０分間かけて０％から８０％Ｂで操作し分析した。２５塩基よりも長いオリゴヌクレオチドは、ｓｓＤＮＡ  １００−Ｒ毛細管キット（毛細管長さ：３０ｃｍ）を使用するＢｅｃｋｍａｎ  ＭＤＱ装置で毛細管電気泳動により分析した。
【実施例１】
【００４８】
例１：非二官能性オリゴヌクレオチドから第一分離標識および第二分離標識を含有する二官能性オリゴヌクレオチドの化学合成および一回操作ＨＰＬＣ分離、第一および第二分離標識を相違する条件下に分離する場合
グアニンおよびアデニンのみからなる、すなわちＧ（ＡＧ）12である２５ヌクレオチド（２５−ｍｅｒ）を含有するオリゴヌクレオチドを、上記方法に従い合成した。オリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから購入したＣＰＧオリゴヌクレオチド固体支持体上で合成した。このＣＰＧ固体支持体は、いずれかの標準デオキシヌクレオシドが予め充填された状態で利用することができた。この２５−ｍｅｒは、下記一般構造に従い合成した。この一般構造は部分的に脱保護化され、ＣＰＧ固体支持体から分離された後のオリゴヌクレオチドを示している。
【００４９】
2005517018.tif 000006
【００５０】
上記一般構造にかかわり、「Ｔ」は市販ＣＰＧオリゴヌクレオチド固体支持体に結合した１個のチミジン単位を表わす。可変性「ｎ」は０、１または２であり、ＣＰＧオリゴヌクレオチド固体支持体に付加されたホスホ−１，１０−デカンジオール単位の数を表わす。このオリゴヌクレオチドの３´末端に結合した分離標識（３´分離標識）は、ホスホ−１，１０−デカンジオール単位、ホスホ−トリエチレングリコール単位、およびジシロキシルリンカー（ＤＳｉ）を含有する。３種の相違する分離標識を製造した。ここで、ｎ＝０、１または２であり、これらをそれぞれ、ＤＳｉ、ＤＳｉＣ１０およびＤｓｉＣ２０と称する。
2005517018.tif 000007
は、オリゴヌクレオチドを表わす。「Ｒ」は、５´−ヒドロキシル分離標識（５´分離標識）、例えばオクタデシルオキシピキシル（Ｃ18Ｐｘ）、４−デシルオキシメトキシトリチル（Ｃ18Ｔｒ）、４−ヘキシルオキシメトキシトリチル（Ｃ6Ｔｒ）、またはジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）を表わす。この５´分離標識は、オリゴヌクレオチドの５´末端に疎水性性質を導入した。
【００５１】
合成されたオリゴヌクレオチドは、表１に記載の９種のシステムに従い種々の３´および５´分離標識を受容した。各３´分離標識または５´分離標識を変えると、充分の長さのオリゴヌクレオチドおよび３´または５´分離標識のどちらかを含有するいずれかの断片の両方の疎水性性質が変えられた。
【００５２】
2005517018.tif 000008
【００５３】
化学合成されたオリゴヌクレオチドを、濃アンモニアを用い、６５℃のオーブン中に配置されているＣＰＧ固体支持体と１２時間にわたり接触させることによって脱保護化し、当該固体支持体から分離した。アンモニア処理し、塩基性保護基、ホスフェート保護基を分離し、またオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合しているエステル基を切断した。オリゴヌクレオチド合成中に生成されたアプリン部位(apurinic sites)を含有するオリゴヌクレオチドを、全部のアプリン部位の塩基接触切断処理により同時的に切断した。３´−ジシロキシ分離標識および５´−酸不安定性分離標識は、堅固に残された。この脱保護化されたオリゴヌクレオチドを部分的に濃縮し、またＮＡＰ１０セファデックス（Sephadex）カラムで脱塩した。濃縮され、脱塩された脱保護化オリゴヌクレオチドを、上記方法に従い５μｍ  Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ１８カラムを用いるＨＰＬＣによって分析した。
【００５４】
図１は、ＲＰ１８保有物性を示している、すなわち表１のシステム１−９に従い合成された充分の長さを有し、また非二官能性であるオリゴヌクレオチドを包含する種々の２５−ｍｅｒについて、アセトニトリル溶出による見掛け上パーセンテージを示している。
【００５５】
Ｃ18Ｐｘ５´分離標識を含有するオリゴヌクレオチドをまた、製造したが、図１には示されていない。この理由は、Ｃ18Ｐｘ５´分離標識を含有する試料が図１に示されている範囲外の強力な溶出条件を必要としたことにある。比較を容易にするために、図１に示されている各オリゴヌクレオチド試料を、下記４種のカテゴリイの一つに入れ標識グループＡ）表１に示されている３´および５´分離標識の両方を有する二官能性オリゴヌクレオチド、黒丸印；グループＢ）表１に示されている５´分離標識のみを有する非二官能性オリゴヌクレオチド（例えば、脱プリン化され、切断されたオリゴヌクレオチドの５´−末端）、黒四角印；グループＣ）表１に示されている３´分離標識のみを有する非二官能性オリゴヌクレオチド（例えば、未成熟的に截形にされたオリゴヌクレオチドおよび脱プリン化され、切断されたオリゴヌクレオチドの３´−末端）、白丸印；グループＤ）表１に示されている５´および３´分離標識の両方が欠けている非二官能性オリゴヌクレオチド（例えば、同一オリゴヌクレオチド鎖内に位置する少なくとも２個のアプリン部位の切断から得られるオリゴヌクレオチド断片）、白四角印。
【００５６】
システム１、５および９に従い製造されたオリゴヌクレオチド混合物は、充分な長さを有するオリゴヌクレオチド、すなわちグループＡ）の単離を促進させるアセトニトリル溶出プロフィールを用い、一回のクロマトグラフイ操作で充分に分離された。３´および５´分離標識を次いで、下記方法を使用し、充分な長さを有するオリゴヌクレオチドから放出させた。単離され標識グループＡ）フラクションを乾燥させ、次いで８０％水性酢酸中に２０分間にわたり懸濁し、酸不安定性分離標識を分離した。次いで、充分な長さを有するオリゴヌクレオチドを再乾燥させ、次いで０．５Ｍ  ＴＢＡＦ中に２時間にわたり懸濁し、シロキシル官能性基を分離した。最終生成物を使い捨てゲル濾過カラム、例えばＮＡＰ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩させた。
【実施例２】
【００５７】
例２：多回ＨＰＬＣ操作を用いる非二官能性オリゴヌクレオチドからの二官能性オリゴヌクレオチドの分離
２０〜１０５の核酸塩基長さ範囲を有するオリゴヌクレオチドを、例１の方法に従い、システム７（表１）の３´および５´分離標識戦略を使用して製造した。この反応混合物は、充分の長さを有するオリゴヌクレオチド（グループＡ）およびグループＢ、ＣおよびＤに属するさらに短い副生成物オリゴヌクレオチドを含有していた。この反応混合物を無勾配方式（６０％ＭｅＣＮ、０．１Ｍ  ＴＥＡＡ）で操作される５μｍＲＰ１８カラム（上記の通り）を用い、このカラム上に付加し、分離した。
【００５８】
図２ａは、溶出プロフィールの様相を示している。図２ａの短い縦線（hash mark）は採取された溶出液フラクションの出発点および終了点を示している。採取された溶出液フラクションは、グループＡおよびＣに属するオリゴヌクレオチドのみを含有していた。この採取された溶出液フラクシヨンを濃縮し、次いで乾燥ＴＨＦ中の０．５Ｍ  ＴＢＡＦ（２００μｌ）で処理し、３´−ジシロキシル分離標識を分離した。この濃縮された溶出液に、トリエチルアミン（２０μｌ）を添加し、ＴＢＡＦ処理中の５´−ＤＭＴｒ単位の切断を防止した。３´−分離標識を有していないオリゴヌクレオチドを含有する溶出液を、ＴＢＡＦ処理後に脱塩させ、次いで３２％ＭｅＣＮで平衡化されているＲＰ１８上に付加した。図２ｂは、３２％ＭｅＣＮ溶出プロフィール様相を示している。図２ｂの短い縦線（hash mark）は採取された溶出液フラクションの出発点および終了点を示している。採取された溶出液フラクションは、完全な５´−分離標識を有する充分な長さのオリゴヌクレオチドのみを含有していた。この採取された溶出液フラクションを引続いて、公知方法を使用し、乾燥させ、および脱トリチル化した。
【００５９】
このオリゴヌクレオチドの無勾配分離方法は、非常に迅速であり、３〜４分以内に所望のオリゴヌクレオチドの単離をもたらした。オリゴヌクレオチドの長さおよび／または配列の変化は、この単離時間に有意な影響を与えなかった。無勾配法の追加の利点は、各操作間にカラムを再平衡化する必要がなかったことにあった。
【００６０】
例３：混合−モード型分離による非二官能性オリゴヌクレオチドからの二官能性オリゴヌクレオチドの分離
例１のグループＡ、Ｂ、ＣおよびＤに属し、また中程度の疎水性を有する３´−分離標識（ｎ＝１）および強力に疎水性のＣ18Ｐｘ５´−分離標識を有することを特徴とする二官能性および非二官能性オリゴヌクレオチドを含有する複数種のオリゴヌクレオチドを、アニオン交換分離媒体を使用して分離した。
【００６１】
水：エタノール（９：１）中に溶解したオリゴヌクレオチド混合物を、水で平衡化されたＭｏｎｏＱカラム（ＭｏｎｏＱ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）に付加した。水とエタノールとの混合物を使用し、実質的に洗剤特性を有するオリゴヌクレオチドによるミセル形成を防止した。付加されたＭｏｎｏＱカラムを３カラム容量の水で洗浄した。１５分の間に０から１ＭのＮａＣｌのＮａＣｌ勾配を、カラムに適用し、これによりグループＤオリゴヌクレオチドを分離した。これを次いで、０から３０％の１Ｍ  ＮａＣｌ中ＭｅＣＮからの二回目のＭｅＣＮ勾配溶出に付し、グループＣオリゴヌクレオチドを溶出した。このＭｏｎｏＱカラムを次いで、水により、次いで１００％ＭｅＣＮにより平衡化した。次いで、ジクロロメタン（「ＤＣＭ」）中のトリクロロ酢酸（「ＴＣＡ」）（３％）をポンプによりカラムに通し、５´−末端分離標識を切断した。Ｃ18Ｐｘ５´−分離標識の放出は、裸眼で見ることができる着色したカルボカチオン（colored carbocation）によって達成された。従って、カルボカチオンの分離は、容易に追跡することができた。酸不安定性５´分離標識の分離に要する時間は、２分間よりも短かった。
【００６２】
ＭｏｎｏＱカラムを１００％ＭｅＣＮで、次いで水で洗浄した。もう一回の０から１ＭのＮａＣｌによるＮａＣｌ勾配を１５分間かけてカラムに適用し、これによりＴＣＡ処理中にグループＢから形成され標識グループＤのオリゴヌクレオチドが分離された。２回目の１Ｍ  ＮａＣｌ中の０から３０％のＭｅＣＮによるアセトニトリル勾配を、ＭｏｎｏＱカラムに適用し、ＴＣＡ処理中に充分の長さの生成物の脱ピキシル化により生成され標識グループＣオリゴヌクレオチドを溶出した。３´−末端ジシロキシル分離標識を次いで、例１に上記されているとおりに、蒸発させたフラクションをＴＢＡＦにより処理することによって採取された生成物から分離した。
【００６３】
例４：混合−モード型分離を用いる非二官能性オリゴヌクレオチドからの二官能性オリゴヌクレオチドの分離
５´−ジメトキシトリチル，３´−メチルチオメチルチミジンを、Ｖｅｅｎｅｍａｎ等による方法［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：１５４７−１５６２（１９９１）］に従い製造した。この生成物を、ＤｕｃｈａｒｍｅおよびＨａｒｒｉｓｏｎにより開示された反応［Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：６６４３−６６４６（１９９５）］と類似する反応で、５´−ジメトキシトリチル，３´−メチルチオブタノール（１）チミジンに変換した。生成するチミジン誘導体を、公知方法に従いホスフィチル化し、３´−メチルチオアルキルホスホルアミダイトを得た。
【００６４】
オリゴヌクレオチド合成を例３に記載のとおりに行うが、ジシロキシルアミダイトの代わりに、３´−メチルチオアルキルホスホルアミダイトを使用した。標準的水性アンモニア脱保護化後、合成された充分の長さを有するオリゴヌクレオチドは、下記一般構造を有していた：
2005517018.tif 000009
【００６５】
二官能性オリゴヌクレオチドは例３の方法を用いて単離するが、２回目のアセトニトリル勾配溶出の代わりに、下記溶出を行った。ＭｏｎｏＱカラムを０．１Ｍホスフェート：０．５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）により平衡化した。３´分離標識は、ホスフェート緩衝液：０．１Ｍ水性臭素（２０：１ｖ／ｖ）混合物を１ｍｌ／分の速度で通すことによって切断した。溶出液２ｍｌを非常に稀釈されている重硫酸ナトリウム溶液中に直接に採取し、いずれの過剰の臭素も鎮静化させた。最終脱塩処理後、３´および５´分離標識を有していないオリゴヌクレオチドが得られた。
【００６６】
例５：混合−モード型分離を用いる非二官能性オリゴヌクレオチドからの二官能性オリゴヌクレオチドの分離
１−Ｏ−ジメトキシトリチル−ヘキシル−ジスルフィド，１´−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（これは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡから入手できる）を、支持体に結合させた。例１に示されているように、ジシロキシル連鎖をアミダイト導入によって付加した。４２核酸塩基オリゴヌクレオチドは、標準条件を用いジシロキシル含有ＣＰＧ固体支持体上で化学合成した。末端５´位置をＣ18Ｐｘ保護チミジンで封鎖した。
【００６７】
カラムを還元剤ジチオスレイトール２５ｍｇとともに濃アンモニアに曝すことによって、オリゴヌクレオチドを支持体から放出させた。この混合物を５５℃で１２時間にわたりオーブン内に入れ、オリゴヌクレオチドの脱保護化およびジスルフィド分離を完了させた。
還元され、脱保護化された二官能性オリゴヌクレオチドは、下記一般構造を有していた：
2005517018.tif 000010
【００６８】
部分的濃縮後、この脱保護化されたオリゴヌクレオチド混合物を、ＮＡＰ１０Ｓセファデックスカラムで脱塩させ、これによりいずれの過剰のＤＴＴも分離した。この脱保護化されたオリゴヌクレオチド混合物を、約０．１ｍｌ／分の速度で、カートリッジの下方部分に配置された逆相シリカ支持体（Ｃ−８）を含有し、またカートリッジの上方部分に配置されているジチオピリジル誘導体化ＣＰＧ支持体を含有する二元カートリッジに適用した。適当な３´分離標識（この場合、遊離チオール）を、ジスルフィド結合を経てチオール反応性支持体に共有結合させた。３´−末端遊離チオールが欠落しているオリゴヌクレオチドは、下方の疎水性支持体に結合した。
【００６９】
３´遊離チオールが欠落しているオリゴヌクレオチドを、水：アセトニトリル（４：６）混合物により洗出した。このカラムを次いで、水により平衡化し、次いで０．１Ｍ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７．０）に溶解した１０μＭ  ＤＴＴにより洗浄した。これにより、ジスルフィド結合が切断され、二元カートリッジの上部半分に結合したオリゴヌクレオチドが放出された。これらの条件下に、放出されたオリゴヌクレオチドを二元カートリッジの下方部疎水性支持体に付着させた。この二元カートリッジを、３０％ＭｅＣＮ：０．１Ｍ  ＴＥＡＡ緩衝液で洗浄する。これによりカートリッジから非二官能性オリゴヌクレオチド断片が溶出された。上記したとおり、採取したフラクションを蒸発させ、８０％水性酢酸により２０分間かけて処理し、５´ピキシル分離標識を分離し、再蒸発させ、次いでＴＢＡＦにより処理し、ジシロキシル連鎖を分離させた。ＴＢＡＦは、使い捨て脱塩用カラムを用いて除去した。
【００７０】
本発明を、その詳細な説明をとともに説明したが、前記記載は例示しようとするものであって、特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲を制限するものではないものと理解されるべきである。別の態様、利点および修正は下記特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、それらの３´および５´末端に種々の分離官能性基を含有する複数種のオリゴヌクレオチドの分離特徴を示す。（実施例１）
【図２Ａ】図２ａは、分離されたオリゴヌクレオチドの溶出様相を例示するクロマトグラムである。（実施例２）
【図２Ｂ】図２ｂは、分離されたオリゴヌクレオチドの溶出様相を例示するクロマトグラムである。（実施例２）
【図１】
2005517018.tif 000011
【図２Ａ】
2005517018.tif 000012
【図２Ｂ】
2005517018.tif 000013
【国際調査報告】
2005517018.tif 000014
2005517018.tif 000015
2005517018.tif 000016