(57)【要約】少なくとも１つの生物学的サンプルを含むサンプル検定に関する数値データを解析するためのコンピュータされた方法および装置であり、データは、各それぞれのサンプルに関するデータのセットを含み、各データのセットは、複数のデータ値を含み、各データ値は、時間におけるある点でそれぞれのサンプルの状態を表す。方法および装置は、各データ値にそれぞれ数値を割り当て、各データ値から追加のバックグラウンド値を取り除くことによってデータ値を訂正し、各患者に関する単一の計量を計算し、かつその値を、遺伝子型を判定するために２つの知られている参照値と比較する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの生物学的または化学的サンプルを含むサンプル検定に関する数値データを解釈するためのシステムに関するコンピューティングされた方法であって、前記数値データは、各それぞれのサンプルに関するデータのセットを含み、該各データのセットは、複数のデータ値を含み、各データ値は、時間におけるある点で前記それぞれのサンプルの状態を表し、前記方法は、各データのセットに関して、
前記複数のデータ値の大きさを表す縦軸と、前記複数のデータ値を得るために、前記サンプルの読み取り値が取られた時間期間を表す横軸とを有するグラフ上の点として、該各複数のデータ値を表すステップと、
前記複数のデータ値の少なくとも１つの前記大きさに基づき、前記複数のデータ値を訂正するステップと、
各データ値のセットに関して前記複数の訂正されたデータ値を低減するステップと、
前記低減された複数のデータ値は、所定の参照値に対応するかどうかを判定するステップと、
前記サンプルは、前記判定するステップの結果に基づき所定の特徴を有するかどうかを指示するように前記システムを制御するステップと
を具えたことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記訂正するステップは、前記グラフ上で前記複数のデータ値に隣接するデータ値の前記大きさに関する前記複数のデータ値の少なくとも１つの前記大きさの調整を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
所定の閾値と前記複数の訂正されたデータ値を比較するステップと、
前記複数のデータ値が前記所定の閾値を超えたどうかに基づいて、前記複数の訂正されたデータ値をさらに訂正するステップと
をさらに具えたことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記比較するステップが、前記複数の訂正されたデータ値が前記所定の閾値を超えたと判定した場合、前記制御するステップは、前記サンプルが存在しないことを示すように前記システムを制御することを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記低減するステップは、前記グラフ上で時間におけるそれぞれの点で、各データのセットに関する各複数の訂正されたデータ値を組み合わせ、かつ前記判定するステップで使用する複数の組み合わせられた訂正されたデータ値を代表する値を計算することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記訂正するステップは、前記複数のデータ値のシーケンスの始まりで、複数の前記データ値に基づいて前記訂正値を計算することを含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記判定するステップが、前記低減された複数のデータ値が前記所定の特徴に対応すると判定した場合、前記制御するステップは、前記サンプルが前記所定の特徴を有することを示すように前記システムを制御することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記判定するステップが、前記低減された複数のデータ値が前記所定の特徴に対応しないと判定した場合、前記制御するステップは、前記サンプルが前記所定の特徴が無いことを示すように前記システムを制御することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの生物学的または化学的サンプルを含むサンプル検定に関する数値データを解析するためのシステムに関するコンピューティングされた方法であって、前記数値データは、各それぞれのサンプルに関するデータのセットを含み、該各データのセットは、複数のデータ値を含み、各データ値は、時間におけるある点で前記それぞれのサンプルの状態を表し、前記方法は、各データのセットに関して、
各複数のデータ値にそれぞれ数値を割り当てるステップと、
前記データのセットに関する前記複数の数値を訂正するステップと、
前記複数の訂正された数値を閾値と比較する第１の比較ステップと、
前記複数の訂正された数値が前記閾値を超えるかどうかに基づいて、前記複数の訂正された数値を訂正する第２の訂正ステップと、
前記複数の第２の訂正された数値を、所定の検定に対応する参照値と比較する第２の比較ステップと、
前記サンプル検定は、前記参照値比較の結果に基づいて所定の特徴を有するかどうかを示すように前記システムを制御するステップと
を具えたことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記割り当てるステップは、前記それぞれの時間における点を表すシーケンスにおいて、前記データ値を配置するステップを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記訂正するステップは、前記シーケンスの始まりで複数の前記数値に基づいて訂正値を計算することを含むことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記訂正するステップは、前記数値の隣接する数値に関して前記複数のデータ値の各数値を調整することをさらに含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の比較ステップは、前記訂正された複数の数値の平均値を計算し、かつ前記平均の訂正された数値を前記閾値と比較することを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の訂正ステップは、前記訂正された数値の隣接する数値に関して、該各訂正された数値を訂正することを含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の訂正ステップは、時間におけるそれぞれの点を表す各データのセットに関する前記複数の訂正された数値のそれぞれの数値を組み合わせ、かつ前記複数の組み合わせられた数値を表す数値に、前記複数の組み合わせられた数値を加算することを含むことを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の比較ステップは、前記数値を前記参照値と比較することを含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記各データ値を、前記データ値に対応する時間における前記それぞれの点を表すそれぞれの時間値に割り当てるステップをさらに具えたことを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
前記制御するステップは、前記訂正された複数の調整された数値が、前記閾値を超えるかどうかを報告するように前記システムを制御することを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの生物学的または化学的サンプルを含むサンプル検定に関する数値データを解析するためのシステムを制御する指示のコンピュータ読み取り可能な媒体であって、前記数値データは、各それぞれのサンプルに関するデータのセットを含み、該各データのセットは、複数のデータ値を含み、各データ値は、時間におけるある点で前記それぞれのサンプルの状態を表し、前記指示の媒体は、
前記複数のデータ値の大きさを表す縦軸と、前記複数のデータ値を得るために、前記サンプルの読み取り値が取られた時間期間を表す横軸とを有するグラフ上の点として、該各複数のデータ値を表すために前記システムを制御するように構成された第１の指示のセットと、
前記複数のデータ値の少なくとも１つの前記大きさに基づき、前記複数のデータ値を訂正するように前記システムを制御するように構成された第２の指示のセットと、
各データ値のセットに関して前記複数の訂正されたデータ値を低減するために前記システムを制御するように構成された第３の指示のセットと、
前記低減された複数のデータ値は、所定の参照値に対応するかどうかを判定するために前記システムを制御するように構成された第４の指示のセットと、
前記サンプルは、前記判定するステップの結果に基づき所定の特徴を有するかどうかを指示するように前記システムを制御するために前記システムを制御するように構成された第５の指示のセットと
を具えたことを特徴とするコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２０】
前記第２の指示のセットは、前記グラフ上で前記複数のデータ値に隣接するデータ値の大きさに関する前記複数のデータ値の少なくとも１つの大きさの調整するために前記システムを制御するようにさらに構成されたことを特徴とする請求項１９記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２１】
所定の閾値と前記複数の訂正されたデータ値を比較し、かつ前記複数の訂正されたデータ値は前記所定の閾値を超えたどうかに基づいて、前記複数の訂正されたデータ値をさらに訂正するために前記システムを制御するように構成された第６の指示のセットをさらに備えることを特徴とする請求項１９記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２２】
前記第４の指示のセットは、前記複数のデータ値が前記所定の閾値を超えたと判定した場合、前記第５の指示のセットは、前記サンプルは存在しないことを示すために前記システムを制御することを特徴とする請求項２１記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２３】
前記第３の指示のセットは、前記グラフ上で時間におけるそれぞれの点で、各データのセットに関する該各複数の訂正されたデータ値を組み合わせ、かつ前記判定するステップで使用する複数の組み合わせられた訂正されたデータ値を表す値を計算するために前記システムを制御するようにさらに構成されたことを特徴とする請求項１９記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２４】
前記第５の指示のセットは、前記判定するステップに基づき所定の特徴を報告するために前記システムを制御するようにさらに構成されたことを特徴とする請求項１９記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２５】
前記第５の指示のセットは、前記判定するステップが、前記低減された複数のデータ値が前記所定の特徴に対応すると判定した場合、前記サンプルが前記所定の特徴を有することを示すために前記システムを制御するようにさらに構成されたことを特徴とする請求項１９記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２６】
前記第５の指示のセットは、前記判定するステップが、前記低減された複数のデータ値が前記所定の特徴に対応しないと判定した場合、前記サンプルは前記所定の特徴が無いことを示すために前記システムを制御するようにさらに構成されたことを特徴とする請求項１９記載のコンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２７】
少なくとも１つの生物学的または化学的サンプルを含むサンプル検定に関する数値データを解釈するためのシステムに関するコンピューティングされた装置であって、前記数値データは、各それぞれのサンプルに関するデータのセットを含み、該各データのセットは、複数のデータ値を含み、各データ値は、時間におけるある点で前記それぞれのサンプルの状態を表し、前記装置は、各データのセットに関して、
前記複数のデータ値の大きさを表す縦軸と、前記複数のデータ値を得るために、前記サンプルの読み取り値が取られた時間期間を表す横軸とを有するグラフ上の点として、該各複数のデータ値を表す手段と、
前記複数のデータ値の少なくとも１つの前記大きさに基づき、前記複数のデータ値を訂正する手段と、
各データ値のセットに関して前記複数の訂正されたデータ値を低減する手段と、
前記低減された複数のデータ値は、所定の参照値に対応するかどうかを判定する手段と、
前記サンプルは、前記判定するステップの結果に基づき所定の特徴を有するかどうかを指示するように前記システムを制御する手段と
を実行することを特徴とする装置。
【請求項２８】
前記訂正する手段は、前記グラフ上で前記複数のデータ値に隣接するデータ値の前記大きさに関する前記複数のデータ値の少なくとも１つの前記大きさの調整する手段を含むことを特徴とする請求項２７記載の装置。
【請求項２９】
所定の閾値と前記複数の訂正されたデータ値を比較する手段と、
前記複数のデータ値が前記所定の閾値を超えたどうかに基づいて、前記複数の訂正されたデータ値をさらに訂正する手段と
をさらに具えたことを特徴とする請求項２７記載の装置。
【請求項３０】
前記比較する手段が、前記複数の訂正されたデータ値が前記所定の閾値を超えたと判定した場合、前記制御する手段は、前記サンプルは存在しないことを示すように前記システムを制御することを特徴とする請求項２７記載の装置。
【請求項３１】
前記低減する手段は、前記グラフ上で時間におけるそれぞれの点で、各データのセットに関する各前記複数の訂正されたデータ値を組み合わせる手段と、前記判定する手段で使用する複数の組み合わせられた訂正されたデータ値を表す値を計算する手段とを含むことを特徴とする請求項２７記載の装置。
【請求項３２】
前記制御する手段は、前記判定する手段に基づき前記所定の特徴を報告するように前記システムを制御することを特徴とする請求項２７記載の装置。
【請求項３３】
前記判定する手段が、前記低減された複数のデータ値が前記所定の特徴に対応すると判定した場合、前記制御する手段は、前記サンプルが前記所定の特徴を有することを示すように前記システムを制御することを特徴とする請求項２７記載の装置。
【請求項３４】
前記判定する手段が、前記低減された複数のデータ値が前記所定の特徴に対応しないと判定した場合、前記制御する手段は、前記サンプルが前記所定の特徴を無いことを示すように前記システムを制御することを特徴とする請求項２７記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許および出願に対する相互参照
本出願は、２００２年７月２６日に出願された「Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｒｅａｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｓｓａｙｓ」という名称の前に出願された米国特許仮出願第６０／３９８６０１号明細書に対して優先権を主張する実用特許出願である。関連する主題は、（特許文献１）の「Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  Ｒｅａｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｓｓａｙｓ」という名称のＡｎｄｒｅｗ  Ｍ．Ｋｕｈｎ、Ｔｏｂｉｎ  Ｈｅｌｌｙｅｒ、およびＲｉｃｈａｒｄ  Ｌ．Ｍｏｏｒｅの同時係属米国出願、および「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅａｄｅｒ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｓｓａｙｓ」という名称Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｐ．Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｖ．Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、Ｂｒｉａｎ  Ｇ．Ｓｃｒｉｖｅｎｓ、Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｃ．Ｐｏｐｅ、Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｈａｎｓｅｎ、およびＦｒａｎｋ  Ｌ．Ｆａｉｌｉｎｇの（特許文献２）に開示され、前記出願および特許の内容全体が、参照によって本明細書に明白に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、全般的に、どのサンプルがある所定の特徴を持つかを判定するために、核酸検定などの生物学的検定においてそれぞれのサンプルから取られた読み取り値のセットを解析するためのコンピュータ化された方法および装置に関する。より詳細には、本発明は、読み取り期間中の異なる時点で取られた生物学的サンプルの光学読み取り値を所得し、読み取り値に存在する付加的なバックグラウンド値を訂正し、かついくつかの遺伝学的な変種の１つ（例えば、突然変異、野生型など）に訂正された読み取り値を分類するコンピュータ化された方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
人ゲノムの分類は、人間における数百万のＤＮＡ配列の変種を見出すことを導き、変種の多くは、単一のヌクレオチド相違によって定義される。多くの場合において、これらの単一ヌクレオチド多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、ＳＮＰ）は、患者の遺伝子型が、診断および多くの健康状態の治療を促進することができるように、人間の疾患および健康状態と関連付けられることができる。
【０００４】
患者の遺伝子型の判定は、様々な方法で達成されることができる。患者のＤＮＡの配列を求めることは、比較的高価でありかつ時間がかかるプロセスである。ＤＮＡプローブなどの他の方法は、特定のターゲット配列の存在を迅速にかつ信頼性良く識別することができる。特定のＤＮＡの配列の存在に関する試験は、ＤＮＡプローブ技術を使用して１時間以内で完了されることができる。
【０００５】
臨床診断の目的のためのＤＮＡプローブの使用において、核酸増幅反応は、通常、ターゲット核酸を多くのコピーまたはアンプリコンに増やすように実行される。核酸増幅反応の例は、ストランド置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤＡ）およびポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を含む。増幅を引き起こす反応の進行にわたる任意の外部対照を必要としない等温プロセスは、ＰＣＲ、ＳＤＡとは異なる。核酸アンプリコンの検出は、全てターゲットＤＮＡと特定のプローブとの間のハイブリダイゼーション（結合）を伴ういくつかの方法で実行される。
【０００６】
多くの普通のＤＮＡプローブ検出方法は、蛍光染料の使用を含む。１つの知られている検出方法は、蛍光エネルギー転移である。この方法において、検出器プローブは、外部源によって励起されたときに光を放出する蛍光染料と、その本来の状態で蛍光染料から光の放出を抑制するクエンチャとの両方でラベル付けされる。ＤＮＡ増幅が発生したとき、蛍光でラベル付けされたプローブは、結果として生じたアンプリコンに結合し、クエンチャ分子からフルオロを分離するプロセスにおける２次構造における変化を受け、それによって蛍光が検出されることを可能にする。蛍光における変化は、ターゲットＤＮＡ配列がサンプル内に存在することの指示として考えられる。
【０００７】
光で流体サンプルを励起することができ、次に、励起に応答して流体サンプルによって生成された任意の光を検出できる、いくつかのタイプの光学読み取り装置またはスキャナが存在する。例えば、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによって製造されたＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００などのＸＹプレート走査装置は、マイクロウェルのアレイ内に格納された複数の流体サンプルを走査することができる。装置は、特定のサンプルに向かって光を放出し、かつそのサンプルから生成された光を検出するための走査ヘッドを含む。動作の間、光学ヘッドは、サンプルウェルの１つに対して適切な位置に移動される。光放出デバイスは、サンプルウェルに向けて光学ヘッドを通って光を伝達するように作動される。ウェル内の流体サンプルが、放出された光に応答して蛍光を発すれば、蛍光光は、走査ヘッドによって受けられかつ光学検出器に伝達される。検出された光は、光学検出器によって電気信号に変換され、その電気信号の振幅は、検出された光の強度を示す。この電気信号は、コンピュータによって処理され、電気信号の振幅に基づいて、ターゲットＤＮＡが流体サンプル内に存在するかまたは不在かを判定する。マイクロウェルトレイ内の各ウェル（例えば、全部で９６マイクロウェル）が、このように読み取られることができる。
【０００８】
本願出願人によって製造されたＢＤＰｒｏｂｅＴｅｃ（登録商標）ＥＴシステムとして知られている、他のより有効でかつ多用途のサンプルウェル読み取り装置は、上記で参照して米国特許第６０４３８８０号に記載されている。そのシステムにおいて、それぞれ８個のマイクロウェルの１２列を有する標準のマイクロウェルなどの（全部で９６個のマイクロウェル）マイクロウェルアレイは、走査バーを通って駆動される移動可能なステージに配置される。走査バーは、各列におけるマイクロウェルが互いに分離される距離に実質的に対応する距離だけ、互いから分離される８個の光放出／検出ポートを含む。したがって、サンプルマイクロウェルの列全体は、ステージの各移動で読み取られることができる。
【０００９】
以下により詳細に記載されるように、ステージは、光走査バー上で前後に移動され、各サンプルマイクロウェルの複数の読み取り値は、所望の間隔で取られる。１つのサンプルにおいて、各マイクロウェルの読み取り値は、１時間の期間に関して１分間の間隔で取られる。したがって、各マイクロウェルの６０個の読み取り値は、ウェル読み取り期間の間に取られる。これらの読み取り値は、次に、どのサンプルが特定のターゲットの疾患または状態を含むかを判定するために使用される。
【００１０】
サンプルウェル内に含まれるサンプルが、ターゲットの遺伝子配列を含むかどうか判定するために、サンプルウェル読み取り値データを解析するためのいくつかの方法が知られている。例えば、上述されたような核酸増幅反応は、ターゲット核酸を複数のアンプリコンに増やさせる。アンプリコンに結合された蛍光でラベル付けされたプローブは、光で励起されたときに蛍光を発する。核酸増幅反応が進行する間に、アンプリコンの数が時間にわたって増大するので、蛍光の量は応じて増大する。したがって、時間の所定の期間が経過した後（例えば、１時間）、ターゲットの配列を有するサンプル（「陽性」）からの蛍光放出の大きさは、ターゲットの配列を有さないサンプル（「陰性」）からの蛍光放出の大きさより非常に大きい。ターゲットの配列を有さないサンプルの蛍光の大きさは、本質的に試験の期間中変化しない。
【００１１】
本発明の実施形態は、増幅が増えにつれて増大する信号に関して記載されるが、増幅が進行するにつれて、信号（蛍光など）が低減する同様のシステムが存在する。当業者は、本発明の新規な教示および利点から実質的に逸脱することなく、そのような修正が、例示的な実施形態において可能であることは理解するであろう。したがって、全てのそのような修正は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００１２】
サンプル内に存在する場合、対立遺伝子ＡおよびＢなどの２つのターゲット配列は、この手順を通して増幅される（同じまたは別個のマイクロウェル内で）。各配列の増幅の大きさは、患者の遺伝子構造を判定するために他と比較されることができる。蛍光放出の大きさが、対立遺伝子Ａ配列に関して大きく、かつ対立遺伝子Ｂに関して小さいなら、患者の遺伝子型は、対立遺伝子Ａに関して同型接合体である。逆に、蛍光放出の大きさが、対立遺伝子Ｂに関して大きく、かつ対立遺伝子Ａに関して小さいなら、患者の遺伝子型は、対立遺伝子Ｂに関して同型接合体である。両方の配列が、有意な蛍光放出を示すなら、両方の配列が存在し、かつ患者は対立遺伝子ＡおよびＢに関して異型接合体である。
【００１３】
したがって、各配列の関して取られた最後の読み取りの値は、サンプルを、いくつかの特徴（例えば、対立遺伝子Ａ、対立遺伝子Ｂ、対立遺伝子ＡおよびＢに関する異型接合体）の１つに分類するために比較されることができる。どちらかの配列も、有意な蛍光放出を示さないなら、一方の増幅または両方の増幅は、ターゲット配列の存在に関連しない要因によって抑制される。
【００１４】
この「エンドポイント検出」方法は、ターゲットＤＮＡ配列の存在の特定において一般に有効であることができるが、この方法が、「陰性」サンプルを配列に関して「陽性」であると誤って特定すること、またはその逆はまれである。すなわち、任意の個別のサンプル読み取りの値の精度は、サンプル内に形成される泡、励起光の妨害、および／または光学読み取り装置上の残骸の存在のためのサンプルからの蛍光放出などの要因によって悪影響を受けることがある。したがって、特定のサンプルの最終読み取り値が誤っており、かつその読み取り値だけが解析されるなら、誤った結果を得る可能性は高い。
【００１５】
これらの欠点を回避するために、他の方法が開発された。ある方法において、サンプル読み取り値の大きさにおける全体の変化は、計算され、かつ陽性の結果を示す大きさを有し知られている値と比較される。したがって、変化の大きさが所定の値より大きいなら、サンプルは、ターゲットの配列を含む陽性サンプルとして識別される。一方、変化の大きさが所定の値より小さいなら、サンプルは、ターゲットの配列を含まないとして識別される。
【００１６】
他の知られている方法は、加速インデックス方法であり、この方法では、サンプル読み取り値における増大変化を測定し、所定の値とそれら変化とを比較する。この方法は非常に有効であるが、その結果の精度は、個々の読み取り値に存在する誤差に影響されやすい。
【００１７】
【特許文献１】米国特許出願第０９／５７４０３１号明細書
【特許文献２】米国特許第６０４３８８０号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、サンプルを様々な遺伝的な変種の１つに分類するために、サンプルウェルで取られた読み取り値を表すデータを解析するための方法および装置に関する継続する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の目的は、データ値に基づきサンプル内の特定の遺伝子型を確かめるために、生物学的サンプルの読み取り値を取ることから得られたデータの値を正確に解釈するための方法および装置を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、サンプル内の特定の遺伝子型を確かめるために、所定の時間の期間でサンプルから検出された蛍光放出の大きさを表すデータを正確に解釈する、光学サンプルウェル読み取り装置を使用する方法および装置を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、複雑な算術計算を使用することなく、解析の結果に悪影響を与えることがあるデータにおける誤差を訂正する、サンプルウェル内に含まれる生物学的サンプルの読み取り値から得られたデータを解析するための方法および装置を提供することである。
【００２２】
本発明のこれらの目的および他の目的は、少なくとも１つの生物学的サンプルを含むサンプル検定に関する数値データを解析するコンピュータ化された方法および装置を提供することによって実質的に達成され、データは、各それぞれのサンプルに関するデータのセットを含み、各データのセットは、複数のデータ値を含み、各データ値は、時間におけるある点でそれぞれのサンプルの状態を表す。方法および装置は、各データ値にそれぞれ数値を割り当て、訂正されたデータ値を作成するために各データ値から追加されたバックグラウンド値を取り除き、配列変種を区別するために２つの核酸配列からの増幅結果を比較し、かつ比較結果に基づき患者の遺伝子型を示すためにシステムを制御する。さらに、配列変種を区別する前に、フィルタリング、正規化、および他の訂正操作をデータに対して実行し、結果の精度に悪影響を及ぼす可能性があるデータにおける異質な値を訂正することができる。
【００２３】
方法および装置は、各ターゲット配列に関する複数のデータ値を、値の大きさを表す縦軸と、前記複数のデータ値を得るために、サンプルの読み取り値が取られた時間期間を表す横軸とを有するグラフ上の点として表し、さらに、対応する１つの値の大きさを表す訂正された点のプロットの各配列に関する各点を用いて、各ターゲット配列に関するグラフ上の点の訂正されたプロットを生成するために、各データ値に存在する追加のバックグラウンド値を取り除くために、各配列からのデータ値を訂正することによって、多くの上記機能を実行することができる。対立遺伝子Ｂのデータ値に対する対立遺伝子Ａのデータ値の比の対数を取ることによって、各ターゲット配列（例えば、対立遺伝子Ａまたは対立遺伝子Ｂ、突然変異または野生型）に関する複数の相対大きさを記載する他の複数の値が生成される。この複数の値は、次に、確立密度推定に基づき複数の値において最も可能性がある値によって、各患者のサンプルに関する単一の計量に加算される。この最も可能性がある値は、遺伝子型（例えば、対立遺伝子Ａ、対立遺伝子Ｂ、または異型接合体）を判定するために、２つの知られている参照値と比較される。例えば、最も可能性がある値が、２つの参照値の間であれば、サンプルは、異型接合体であると判定されることができる。値が、大きな（小さな）参照値より上であれば、サンプルは対立遺伝子Ａ（対立遺伝子Ｂ）であろう。参照値の構成は、どのターゲット配列が、各増幅曲線と関連するかに応じる。
【００２４】
本発明のその目的および他の目的は、添付の図面とともに読まれるときに、以下の詳細な記載からより容易に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明の実施形態によるウェル読み取り装置１００が、図１に示される。装置１００は、キーパッド１０２を含み、キーパッド１０２は、操作者がデータを入力し、したがって装置１００の動作を制御することを可能にする。装置１００は、ＬＣＤ表示スクリーン他などの表示スクリーン１０４をさらに含み、操作者がデータを入力しかつ装置１００の動作を制御することを可能にする「ソフトキー」を表示し、かつ操作者のコマンドに応答する情報、ならびに以下に記載される方法でサンプルから集められた走査情報に関するデータを表示する。装置は、またディスクドライブ１０６などの格納デバイスを含み、装置１００によって生成されたデータを格納し、または格納デバイスから装置がデータを読み取ることができる。
【００２６】
装置１００は、ステージアセンブリ１１０へのアクセスを可能にするドア１０８をさらに含み、格納アセンブリ１１０に、サンプルトレイアセンブリ１１２が装填されることができる。図２に示されるように、サンプルトレイアセンブリ１１２は、トレイ１１４を含み、トレイ１１４内にマイクロウェルアレイ１１６が装填され、マイクロウェルアレイ１１６は、それぞれ８個のマイクロウェルの１２個の列に配置された９６個の個別のマイクロウェル１１８を有する、標準マイクロウェルアレイであることができる。トレイ１１４は、開口１２０を有し、開口１２０は、各開口１２０がマイクロウェルアレイ１１６のマイクロウェル１１８を収容するように、トレイを完全に通過し、かつ各８個のマイクロウェルの１２個の列に配置される。サンプルが、マイクロウェル１１８に配置された後、カバー１２２は、それぞれのマイクロウェル１１８内に各流体サンプルを保持するようにマイクロウェル１１８上に固定されることができる。サンプルトレイアセンブリ１１２およびサンプル収集技術のさらなる詳細は、前述の米国特許第６０４３８８０号に記載される。
【００２７】
各マイクロウェルは、以下に記載されるように、特定の疾患を識別するため、または各対立遺伝子に関して特定である１つのプローブで遺伝子位置を特徴付けるための２つのタイプの検出器プローブを含むことができる。マイクロウェルアレイ１１６が、特定の疾患または各患者サンプルにおける状態を試験するために使用されるなら、マイクロウェル１１８は、マイクロウェルのグループに配置され、特定の患者からの流体サンプルは、特定の患者に対応するウェルのグループで配置される。
【００２８】
マイクロウェルアレイ１１６における９６個のマイクロウェル１１８のいくつかは、特定の遺伝子型に関する対照サンプルウェルとして指定されることができ、１つの対照サンプルウェルは、同型接合体の対立遺伝子Ａサンプルを含み、他の対照ウェルは、同型接合体の対立遺伝子Ｂサンプルを含み、かつ第３のマイクロウェルは、両方の対立遺伝子ＡおよびＢの同型接合体の混合物を含む。また、いずれの対立遺伝子を含まない追加のマイクロウェル１１８は、陰性の対照マイクロウェルとして指定されることができる。したがって、この例において、最大９２個の患者サンプルは、このように配置された各マイクロウェルアレイ１１６に関して試験されることができる（すなわち、９２個のサンプルに加えて、１つの対立遺伝子Ａの対照、１つの対立遺伝子Ｂの対照、対立遺伝子ＡおよびＢの混合物を含む１つの異型接合体対照、および１つの陰性対照）。
【００２９】
上述の記載は、患者サンプルの試験に焦点を合わせているが、類似のアプローチは、遺伝的突然変異に関するバクテリアなどのハプロイド生物を試験するために使用されることができる。この場合、各マイクロウェルは、特定の位置で２つの対立遺伝子を見分けるために使用され、一方適切な陽性および陰性対照も、各遺伝的変種のために含まれる。サンプルからの蛍光読み取り値の解析は、核酸ターゲットのソースに関わらず類似する。
【００３０】
患者の流体サンプルが、サンプルトレイアセンブリ１１２内のマイクロウェルアレイ１１６の適切なマイクロウェル１１８に配置された後、サンプルトレイアセンブリ１１２は、ウェル読み取り装置１００のステージアセンブリ１１０内に装填される。ステージアセンブリ１１０は、図３においてより詳細に示される。特にステージアセンブリ１１０は、サンプルトレイアセンブリ１１２を受けるための開口１２４を含む。ステージアセンブリ１１０は、ウェル読み取り装置１００の読み取り成分の完全性の較正および確認で使用される、複数の対照ウェル１２６をさらに含む。８個の較正ウェル１２７の列が、これらの対照ウェル１２６内にあり、その目的は以下により詳細に記載される。ステージアセンブリ１１０は、さらにカバー１２８を含み、カバー１２８は、サンプルトレイアセンブリ１１２が開口１２４内に装填され、かつサンプル読み取りが開始されるときに、サンプルトレイアセンブリ１１２および対照ウェル１２６を覆う。ステージアセンブリ１１０のさらなる詳細は、上記で参照した米国特許第６０４３８８０号に記載される。
【００３１】
ステージアセンブリ１１０内に装填されたサンプルトレイアセンブリ１１２のマイクロウェル１１８内に含まれるサンプルを読み取るために、ステージアセンブリ１１０は、図４に示されるような光センサバー１３０を通過して搬送される。光センサバー１３０は、複数の光放出／検出ポート１３２を含む。光放出／検出ポート１３２は、ステージアセンブリ１１０が、光放出／検出ポート上にそれらのマイクロウェル１１８を配置したとき、８個のマイクロウェル１１８の列に向かって光を放出し、かつマイクロウェル１１８内に含まれるサンプルから放出された蛍光光を検出するために制御される。この例において、光センサバー１３０は、マイクロウェル１１８のその列が、光放出／検出ポート１３２上に配置されたときに、マイクロウェルアレイ１１６の列における８個のマイクロウェル１１８と実質的に整列するように構成される、８個の光放出／検出ポート１３２を含む。
【００３２】
光放出／検出ポート１３２は、それぞれ光ファイバケーブル１３４によって、ＬＥＤ他などのそれぞれ光放出デバイス１３６に結合される。光放出／検出ポート１３２は、それぞれ光ファイバケーブル１３８によって、光増倍管他などの光検出器１４０にさらに結合される。光センサバー１３０および関連する構成部品、ならびにステージアセンブリ１１０が、マイクロウェル１１８内に含まれるサンプルの読み取りのために光センサバー１３０を通過して搬送される方法のさらなる詳細は、上記で参照した米国特許第６０４３８８０号に記載される。
【００３３】
一般に、各マイクロウェルに関する１つの読み取りは、時間における特定の間隔で行われ、各マイクロウェルに関するさらなる読み取りは、所定の時間期間に関して時間におけるそれぞれの間隔で行われる。この例において、１つのマイクロウェル読み取りは、１時間の期間に関するほぼ１分間の間隔で各マイクロウェル１１８に関して得られる。各較正ウェル１２７の１つの読み取り、ならびに各光放出／検出ポート１３２に関する１つの「ダーク」読み取りは、各１分間の間隔で行われる。したがって、各マイクロウェル１１８の６０個のマイクロウェル読み取り、ならびに各較正ウェル１２７の６０個の読み取り、および６０個のダーク読み取りは、１時間の期間の間に得られる。
【００３４】
さらに、ウェル読み取り装置のこの実施形態は、２つの独立した光学系を有し、１つの光学系はＦＡＭダイに関するものであり、１つの光学系はＲＯＸダイに関するものである。各光学系は、標準９６個ウェルのマイクロ滴定プレートの各列の関するものである、８個の光学チャネルを含む。光学チャネルは、ソースＬＥＤ、励起フィルタ、および分岐された光ファイバ束からなり、分岐された光ファイバ束は、ソースファイバおよび放出ファイバを単一の読み取り位置に統合する。１つの光学系内の全ての光学チャネルは、放出フィルタおよび光増倍管（Ｐｈｏｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ、ＰＭＴ）の一般的なセットで終端する。各分岐された光ファイバ束は、ソースＬＥＤからの光を読み取りヘッドの位置へ結合し、読み取りヘッドは、マイクロ滴体プレート１１４の列内の単一のウェルを問い合わせる。各光学系に関する８個の光ファイバ束の統合された端部は、移動するステージ１１０の下に位置するそれらのそれぞれ読み取りヘッドに取り付けられる。この構成は、列位置が、適切なＬＥＤを活性化することによって選択され、かつ行位置がステージ１１０を移動することによって決定されることを可能にする。動作の間、流体サンプルが放出されたソース光に応答して蛍光を発するなら、蛍光によって生成された光は、光ファイバの統合された端部によって受けられ、かつ第２の光ファイバを通ってＰＭＴへ送られる。検出された光は、ＰＭＴによって電流に変換され、その電流の大きさは、検出された光の強度を表す。
【００３５】
読み取り値は、サンプル上に放出された励起光に応答してマイクロウェルサンプルによって生成された蛍光放出の強度の測定値である。これらの強度値は、相対蛍光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｕｎｉｔ、ＲＦＵ）の大きさで格納される。蛍光放出の高い強度を有するサンプルの読み取りは、低い蛍光放出を有するサンプルで行われた読み取りによって提供されるＲＦＵ値よりはるかに大きなＲＦＵ値を提供する。
【００３６】
各サンプルウェルに関する全数の読み取り（例えば、６０回の読み取り）が取られると、各サンプルに関する読み取り値は、ウェル読み取り装置１００が、ターゲットの配列の存在および配列変種を区別できるように、ウェル読み取り装置１００によって解釈されなければならない。ウェル読み取り装置１００のマイクロ処理ユニットは、サンプルウェル読み取り値を表すデータに対して以下の動作を実行するソフトウエアによって制御される。記載される動作は、各サンプルマイクロウェル１１８に関して取られた読み取り値に対して本質的に同一の方法で適用される。したがって、例示する目的で、動作は、第１のサンプルマイクロウェル１１８として参照される１つのサンプルマイクロウェル１１８に関して取られた読み取り値に関して記載される。
【００３７】
上述されたように、サンプルトレイアセンブリ１１２内の全てのサンプルマイクロウェル１１８が読み取られる各１分間の間隔の間に、光センサバー１３０は、一度で較正ウェルを読み取る。したがって、各マイクロウェルサンプルの６０個の読み取りが行われた後、各較正ウェル１２７は、光センサバー１３０のそれぞれの光放出／検出ポート１３２によって６０回読み取られ、６０個の較正ウェル読み取り値の８個のセットを結果として生じる。例示の目的で、現在議論している第１のサンプルマイクロウェル１１８も読み取る、光放出／検出ポート１３２によって読み取られた較正ウェル１２７の較正読み取り値は、ｎ１からｎ６０によって表される。この手順は、各蛍光ダイに関して行われる。
【００３８】
代わりに上述されたように、各１分間の間隔の間に、光検出器１４０は、読み取りが、全ての光放出デバイス１３６が活性化されることなく行われる「ダーク」読み取り値を得るように制御される。これは、光検出器１４０が、系内に存在する可能性がある任意の周囲光を検出することを可能にする。ダーク読み取り値は、各光放出／検出ポート１３２に関して取られる。したがって、全てのマイクロウェル１１８の６０個の読み取り値が得られた後で、６０個のダーク読み取り値の８個のセット（すなわち、８個の各光放出／検出ポート１３２に関する６０個のダーク読み取り値の１つのセット）が得られる。例示の目的で、現在議論している第１のサンプルマイクロウェル１１８を読み取る光放出／検出ポート１３２によって得られるダーク読み取り値は、ｄ１からｄ６０によって表される。
【００３９】
図５は、２つのターゲットの配列の１つに関する１時間の読み取り期間の間に得られた、１つのウェルに関する６０個の読み取り値の関係を示すグラフである。例示の目的で、これらの読み取り値は、ｒ１からｒ６０によって表される。これらの読み取り値は、読み取りが読み取り期間の間に行われた分で表した時間に対する、縦軸上に表されたＲＦＵ値を用いて、図５のグラフ上にプロットされる。
【００４０】
グラフから理解されることができるように、読み取り期間の終わりで取られた読み取り値に関するＲＦＵ値は、読み取り期間の始めで行われた読み取り値のＲＦＵ値より大きい。例示の目的で、この例は、ウェルが試験される特定のターゲット配列を含むウェルに関する読み取り値における傾向を示す。
【００４１】
図５から同様に理解されることができるように、「未加工のデータ」の読み取り値のグラフは、示されるようなノイズスパイクおよびステップを含む。記載されるプロセスは、サンプルウェルで取られた誤った読み取り値の結果である、グラフにおける任意のノイズスパイク、ステップ、または他の明らかな異常性を取り除く。
【００４２】
図６に示されるフローチャートは、ウェルサンプルが、試験される特定のターゲット配列および結果としての遺伝子型を含むかどうかを判定するために、図５に示されるウェル読み取り値ｒ１からｒ６０のグラフを解釈するための全体プロセスを表す。図６におけるステップ１０００からステップ１７００は、各２つの複数のターゲット配列データ値に別個に適用される。これらの複数は、それぞれ別個のターゲット配列に対応する２つの蛍光波長の読み取り値の結果であり得る。図６におけるプロセスは、ソフトウエアによって制御されるようにウェル読み取り装置１００のコントローラ（図示せず）によって実行され、ソフトウエアは、ウェル読み取り装置１００に存在するメモリ（図示せず）内、またはディスクドライブ１０６内に挿入されたディスクに格納されることができる。
【００４３】
データ値訂正
コントローラによって実行される第１のプロセスは、データ値訂正である。正しくない値を訂正しまたは取り除くためにデータ値を訂正するプロセスが、以下の様々なプロセスで実行されることができることは、当業者には理解されよう。例えば、以下のステップは、どのようにサンプルが分類されるかを判定するために使用される単一の値に、データ値を低減する前にデータ値を訂正するために実行されることができる。
【００４４】
ダーク訂正動作
図６に示されるように、ソフトウエアは、最初に較正装置データ読み取り値ｎ１からｎ６０およびウェル読み取り値ｒ１からｒ６０に対するダーク訂正を実行するようにコントローラを制御する。このステップの詳細は、図７のフローチャートに示される。
【００４５】
特にステップ１０１０において、ダーク読み取り値ｄ１からｄ６０は、それぞれ訂正された較正装置読み取り値ｃｎ１からｃｎ６０を提供するように、それぞれ対応する較正装置データ読み取り値ｎ１からｎ６０から減算される。すなわち、ダーク読み取り値ｄ１は、訂正された較正装置読み取り値ｃｎ１を提供するために較正装置データ読み取り値ｎ１から減算され、ダーク読み取り値ｄ２は、訂正された較正装置読み取り値ｃｎ２を提供するために較正装置データ読み取り値ｎ２から減算され、以下同様に続く。
【００４６】
処理は次にステップ１０２０に進み、ステップ１０２０において、ダーク読み取り値ｄ１からｄ６０は、それぞれ訂正されたウェル読み取り値ｃｒ１からｃｒ６０を提供するように、それぞれ対応するウェル読み取り値ｒ１からｒ６０から減算される。すなわち、それぞれ、ダーク読み取り値ｄ１は、訂正されたウェル読み取り値ｃ１を提供するためにウェル読み取り値ｒ１から減算され、ダーク読み取り値ｄ２は、訂正されたウェル読み取り値ｃｒ２を提供するためにウェル読み取り値ｒ２から減算され、以下同様に続く。
【００４７】
平坦化動作
訂正された較正装置読み取り値および訂正されたウェル読み取り値の全てが得られた後で、処理は、図６に示されるフローチャートのフィルタリング動作ステップ１１００へ続き、ステップ１１００において、ノイズは、上述のステップ１０１０の間に得られる訂正された較正装置読み取り値ｃｎ１からｃｎ６０からフィルタリングされる。ある実施形態において、５点ランニング中間が、ｘｎ１からｘｎ６０として示される平滑化された較正装置値を生成するために、訂正された較正装置読み取り値ｃｎ１からｃｎ６０に適用される。
【００４８】
正規化動作
平滑化された較正装置値ｘｎ１からｘｎ６０の全てが得られると、処理は、図６のフローチャートに示される動的正規化ステップ１２００へ続く。動的正規化プロセスの詳細は、図８のフローチャートに示される。特にこの例において、平滑化された較正装置値ｘｎ１からｘｎ６０、ならびに訂正されたウェル読み取り値ｃｒ１からｃｒ６０は、動的正規化値ｎｒ１からｎｒ６０を計算するために使用される。
【００４９】
ステップ１２１０において、計算に用いられる任意のスカラー値が設定される。この例において、スカラー値は３０００である。処理は、次にステップ１２２０へ進み、ステップ１２２０において、スカラー値、訂正されたウェル読み取り値、および平滑化された正規化値は、動的正規化値を計算するために使用される。特に、動的正規化値を計算するために、対応する訂正されたウェル値はスカラー値で乗算され、次にその積は、対応する平滑化された較正装置値によって除算される。例えば、動的正規化値ｎｒ１を得るために、訂正されたウェル読み取り値ｃｒ１は、３０００（スカラー値）で乗算され、次に平滑化された較正装置の値ｘｎ１によって除算される。同様に、動的正規化値ｎｒ２は、３０００で訂正されたウェル読み取り値ｃｒ２を乗算し、次に平滑化された較正装置の値ｘｎ２によって除算することによって計算される。このプロセスは、全ての６０個の動的正規化値ｎｒ１からｎｒ６０が得られるまで継続する。
【００５０】
ノイズスパイクの取り除き
処理は、次に、図６のフローチャートのステップ１３００に示されるような、ウェルデータに対するインパルスノイズのフィルタリング動作を実行するように続く。ステップ１３００において、平滑化手順が、平滑化された正規化値ｘ１からｘ６０を得るために動的正規化値ｎｒ１からｎｒ６０に適用される。ある実施形態において、プロセスは、３点ランニング中間フィルタの２回の繰り返しを含む。
【００５１】
図６のフローチャートのステップ１０００からステップ１３００が、上述のように実行された後で、したがって、ウェル読み取り値は、平滑化されかつ正規化され、第２の平滑化された正規化値ｚ１からｚ５０によって表される。したがって、図９のグラフに示されるように、第２の平滑化された正規化値ｚ１からｚ６０が、対応するウェル読み取り値が得られた対応する時間期間に関してプロットされたとき、グラフにおけるノイズスパイクが取り除かれる。
【００５２】
しかしながら、これら平滑化および正規化動作は、図９に示されるグラフに存在するステップを取り除かない。グラフに現れるステップを結果として生じる読み取り値におけるこの増大は、５０番目のウェル読み取り値が得られた後（すなわち、５０分間の時間の経過後）であるが、５１番目のウェル読み取り値が得られる前に形成されるウェル内の気泡の存在によって引き起こされる可能性がある。したがって、ウェル読み取り値ｒ５１からｒ６０の大きさ、およびしたがって平滑化されかつ正規化された値ｚ５１からｚ６０の大きさは、この気泡の存在のために増大される。したがって、ステップのサイズに比例する値によって、平滑化された正規化値ｚ５１からｚ６０を低減することが必要である。
【００５３】
ステップ取り除き
ステップ検出
ステップ取り除き動作は、図６のフローチャートで示されるようなステップ１４００で実行される。ステップ取り除き動作の詳細は、図１０におけるフローチャートに示されている。
【００５４】
これらタイプのグラフは、ただ１つまたは２つの可能性のあるステップを一般に有し、２つ以上のステップを有することはほとんど無いことが判定される。したがって、グラフにおける全てのステップは、２回ステップ位置決定プロセスを実行した後、位置決定されかつ取り除かれる。したがって、図１０のフローチャートにおけるステップ１４０５において、カウント値は、プロセスが最大回数繰り返すことを可能にするように設定される。この例において、カウント値は、プロセスが２回繰り返すことを可能にするように２回に設定される。プロセスは、次にステップ１４１０に進み、ステップ１４１０において、相違値ｄｒ１からｄｒ５９が計算され、相違値は、隣接する第２の平滑化された正規化値ｚ１からｚ６０の間の相違を表す。すなわち、第１の相違値ｄｒ１は、第２の平滑化された正規化値ｚ２から第２の平滑化された正規化値ｚ１を引いたものとして計算される。第２の相違値ｄｒ２は、第２の平滑化された正規化値ｚ３から第２の平滑化された正規化値ｚ２を引いたものとして計算される。このプロセスは、５９個の相違値ｄｒ１からｄｒ５９が得られるまで繰り返される。
【００５５】
処理は、次にステップ１４１５に続き、ステップ１４１５において、相違値ｄｒ１からｄｒ５９が、全体の平均値を提供するためにともに加算され、次に相違の平均’ｄｒを提供するために５９で除算される。処理は、次にステップ１４２０へ続き、ステップ１４２０で、分散値ｖａｒ（ｄｒ）が、標準統計式を使用して計算される。
【００５６】
プロセスは、次に合計値「ｓ」が計算されるステップ１４２５へ続く。この合計値は、各相違値ｄｒ１からｄｒ５９から相違の平均’ｄｒを減算し、５９個の４倍の結果のセットを得るように各結果を４乗し、かつ次に全ての５９個の４倍の結果を合計することによって計算される。すなわち、相違の平均’ｄｒは、第１の結果を提供するために第１の相違値ｄｒ１から減算される。この第１の結果は、次に、第１の４倍にされた結果を提供するために４乗される。相違の平均’ｄｒは、第２の相違値ｄｒ２から減算され、減算の第２の結果は、次に、第２の４倍にされた結果を提供するために４乗される。このプロセスは、全ての５９個の４倍にされた結果が計算されるまで、残りの相違値ｄｒ３からｄｒ５９に関して繰り返される。５９個の４倍にされた結果は、合計値「ｓ」を提供するために加算された。
【００５７】
ステップ１４３０において、処理は、分散値ｖａｒ（ｄｒ）がゼロに等しいかどうかを判定することによって、ステップを取り除くプロセスが、完了するかどうかを判定する。分散値ｖａｒ（ｄｒ）がゼロに等しいなら、処理はステップ１４６０へ進み、ステップ１４６０で、カウント値が２に等しいかどうかが判定される。カウント値が２に等しいなら、処理はステップ１５００に続く。処理がその第１の繰り返しにあるなら、処理はステップ１４３３に続き、ステップ１４３３において、カウント値は、１だけ増分され、ステップ１４１０からステップ１４２５が、上述のように繰り返される。しかしながら、分散値ｖａｒ（ｄｒ）がゼロに等しくないなら、次にステップ検出プロセスに進むことができる。ステップが存在するかどうかを判定するために、ステップ１４３５において、臨界値ＣＲＩＴ  ＶＡＬは４．９に等しく設定される。この臨界値は、一般に、統計理論に基づいてステップを検出する可能性を最大化するために選択される。処理は、次にステップ１４４０へ進み、ステップ１４４０で、２乗にされかつ５９で乗算された分散値ｖａｒ（ｄｒ）の積によって除算された合計値「ｓ」の商は、ＣＲＩＴ  ＶＡＬより大きいかどうかが判定される。計算された商が、ＣＲＩＴ  ＶＡＬより大きくないなら、ステップは存在せず、処理はステップ１４３３に続く。
【００５８】
ステップ取り除き
しかしながら、商が、ＣＲＩＴ  ＶＡＬの値より大きいなら、次に処理はステップ１４４５へ進み、ステップ１４４５で、処理は、ステップの位置を判定するために実行される。これは、各それらの相違結果の絶対値を取り、相違結果を生成するために各１から５９の相違値ｄｒ１からｄｒ５９から相違の平均’ｄｒを減算することによって達成される。このステップは、最大絶対値に関連付けられたパスに対応する。ステップが発生するパスを、ｍａｘｐｔ  ｄｒとして表す。上述されたように、この例において、ステップは値ｚ５０で発生すると推定される。したがって、ｍａｘｐｔ  ｄｒは５０に設定される。
【００５９】
プロセスは、次にステップ１４５０へ続き、ステップ１４５０の間に、相違値ｄｒ１からｄｒ５９の中間相違値が決定される。次に、ステップ１４５５において、ステップの後で生じる平滑化された正規化値は、ステップが生じた平滑化された正規化値に関して計算された相違の平均’ｄｒだけ低減され、次にステップ１４５０において計算された中間相違値だけ増大される。例えば、平滑化された正規化値ｚ５１からｚ６０は、それぞれ相違値ｄｒ５０（５０番目の読み取り後に生じるステップ）の大きさだけ低減され、次に平滑化された正規化値ｚ５１からｚ６０は、それぞれステップ１４５０において計算された中間相違値だけ増大される。図１１に示されるように、このプロセスは、ＲＦＵ値ｚ５１からｚ６０を表す曲線の全体部分を下方へ移動し、したがってステップを取り除く作用を有する。
【００６０】
プロセスは、次にステップ１４６０へ続き、ステップ１４６０において、全体プロセスが２回繰り返されたかどうかを判定する。カウント値が２に等しくないなら、カウント値は、ステップ１４３５において１だけ増大され、処理はステップ１４１０へ戻り、上述のように繰り返す。しかしながら、カウント値が２に等しいなら、処理は、図６に示されるフローチャートにおける周期的ノイズフィルタステップ１５００へ進む。
【００６１】
周期的ノイズフィルタリング動作
周期的ノイズフィルタリング動作１５００は、ステップが回復される図１１に示されるグラフに存在する可能性がある誤りをさらにフィルタリングして取り除くために実行される。特に、５点移動中間が、フィルタリングされた値ｆ１からｆ６０を提供するために、図１１のグラフに表される値ｚ１からｚ６０を読み取るために適用される。
【００６２】
ウェル存在動作
各値のセットに関するデータ値が第１に訂正されたときに、コントローラは、ウェルが存在するかどうか、または得られたデータが完全に誤りかどうかを判定するために、ウェル存在動作を実行することができる。処理は、図６に示されるステップ１６００に続き、ステップ１６００において、処理は、ウェル読み取り値ｒ１からｒ６０から上述のステップで得られたフィルタリングされた値ｆ１からｆ６０が、それぞれウェルから実際に取られたかどうか、すなわち換言すれば、ウェルが、サンプルトレイアセンブリ１１２のマイクロウェルアレイ１１６におけるその位置に実際に存在するかどうかを判定する。ウェル存在判定処理の詳細は、図１２のフローチャートに示される。
【００６３】
特に、ステップ１６１０において、ウェル読み取り値平均ｗｐａｖｇは、フィルタ値ｆ１０、ｆ２０、ｆ３０、ｆ４０、およびｆ５０を加算し、かつ５でこれらの値を除算することによって決定される。このウェル存在平均ｗｐａｖｇは、この例において１２５．０に設定されるウェル閾値ＷＰ  ＴＨＲＥＳと比較される。ステップ１６２０において、処理は、ウェル存在平均ｗｐａｖｇが、ゼロより大きくかつ両方のターゲットの配列に関して閾値ＷＰ  ＴＨＲＥＳより小さいことを判定するなら、処理は、ウェルが存在せず、かつ得られたデータが完全に誤りであると判定する。処理は、次に図６に示されるフローチャートにおいてステップ２１００に進み、ステップ２１００において、そのウェルに関する処理は終わり、コントローラは、ウェルが存在しないことの指示を提供することができる。しかしながら、処理は、いずれかのターゲットの配列が、閾値ＷＰ  ＴＨＲＥＳより大きいウェル存在平均ｗｐａｖｇを有することをステップ１６２０において判定するなら、プロセスは、ウェルが存在し、処理が図６に示されるフローチャートにおけるステップ１７００へ進むことを判定する。
【００６４】
バックグラウンド訂正動作
ウェル存在動作が、本当にウェルが存在することを判定するなら、コントローラは、複数のデータ値のさらなる訂正または調整に進むことができる。ステップ１７００において、処理は、ベースラインバックグラウンド訂正を確立する。ステップ１７１０において、例えば第１の５個のバックグラウンド値ｆ１からｆ５に基づきフィルタリングされた値の中間が計算される。ｆ１０からｆ１５などの他の範囲のフィルタリングされた値は、検定に応じて使用されることができる。この中間のフィルタリングされた値は、次に、各フィルタリングされた値ｆ１からｆ６０から減算される。さらに、中間のフィルタリングされた値を計算するために使用されるフィルタリングされた値は、これが必ずしも必要ではないが、中間の値を計算するために使用された後でそれぞれゼロに設定されることができる。このバックグラウンド訂正動作のさらなる詳細は、図１３のフローチャートに示される。手順は、両方のターゲットの配列に無関係に行われる。図１４のグラフに示されるように、この処理は、フィルタリングされた値ｆ１とｆ６０との間のグラフの部分を下方へ向けてかつ横軸へ移動する。
【００６５】
データ値低減
信号比動作
ステップ１０００からステップ１７２０によって定義される処理が、別個の増幅配列に対応する２つの複数の値に独立して適用されると、２つの複数は、図１７で示される２つの複数間の相対的相違を測定する単一の複数のデータに組み合わせられる。図１３におけるステップ１７２０に定義される曲線に関する方法の例は、ステップ１７００において定義されるバックグラウンドスライスの後で、各時間の点で、ステップ１７２０で提供される値のステップ１８００で比を取る。数値安定性を改善するために、ステップ１８１０は、ゼロによる除算を避けるために、除算の前に各データ点に小さな知られている公差値（ε）を加算する。例えば、１つの値のセット（ａ６からａ６０）は、比ｃ６＝ａ６／ｂ６からｃ６０＝ａ６０／ｂ６０に等しい第３の値のセットを作るために、他の値のセット（ｂ６からｂ６０）で除算される。この除算は、図１５におけるステップ１８２０で定義される。この実施形態における方法は、次に図１５におけるステップ１８３０に進み、ステップ１８３０で、これらの比の対数がｄ６＝ｌｏｇ（ａ６／ｂ６）を作るために計算される。一般性を失うことなく、自然対数は全ての関連する計算で使用される。
【００６６】
データ低減動作
２つの複数の値に関するデータ値が、単一の複数のデータ値に組み合わせられると、複数のデータ値は、複数の値を表す単一の値に低減される。各サンプルに関して、複数の値は、複数の分布、特に値の大きさを捕らえるステップ１９００における単一の計量に加算されることができる。この手順は、図１６におけるフローチャートにまとめられる。これ（例えば、平均、中間など）を達成するために、多数の異なる計算がある。一実施形態において、方法は、複数を表す最も可能性がある数を判定することである。これを達成するために、非母数の確率密度（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、１９８６）が、可能な値の範囲に関して計算され（図１６）、複数の合計計量は、次に、最大確率密度値に関連する値に対応する値になる。
【００６７】
図１６におけるステップ１９１０は、ステップ１８３０において判定された対数比データ点の範囲にわたる等しく離間された値のグリッドを作る。ステップ１９２０は、各グリッド値に関して非パラメトリック密度推定を計算し、ステップ１９３０は、最大確率密度値に関連するグリッド値を判定する。
【００６８】
遺伝子型判定
最も可能性がある数が判定されると、サンプルがどのように分類されるかを判定するための２つの知られている参照値に比較される。このプロセスは図１７に示されている。最も可能性がある数は、明確な遺伝子型（例えば、対立遺伝子Ａ、対立遺伝子Ｂ、同型接合体）に翻訳される。換言すれば、他の遺伝子変種が存在する（例えば、対立遺伝子Ｂ）場合に、１つの遺伝子変種（例えば、対立遺伝子Ａ）に関するステップ１９３０からの最も可能性がある値が、特定の参照値を超え、かつ第２の参照値より小さいことを判定される。最も可能性がある値が、より低い参照値（図１７におけるステップ２０１０でＡとしてラベル付けされる）より小さい場合に、サンプルは、対立遺伝子Ａを有すると判断される（ステップ２０２０）。ステップ２０３０において、最も可能性がある値が、より大きい参照値（図１７におけるステップ２０３０でＢとしてラベル付けされる）より大きく、サンプルは、対立遺伝子Ｂを有すると判断される（ステップ２０４０）。対立遺伝子は、ステップ２０２０またはステップ２０４０において割り当てられないなら、ステップ２０５０は、サンプルが対立遺伝子ＡおよびＢを有すると判断する。したがって、参照値は、サンプルの遺伝子型に関して最も正確な指示を提供する値として選択される。これは、その位置でそれぞれ特定の遺伝子変種に関して、同時に感受性および特定性を最大化する参照値を選択することによって達成されることができる。
【００６９】
処理は、次にステップ２１００に進み、ステップ２１００で、コントローラは、ウェル読み取り装置１００が、報告された値を報告し、かつ対応するウェル内のサンプルが判定された遺伝子型を有する指示を提供するように制御する。この指示は、表示スクリーン１０８上の表示の形態で、ディスクドライブ１０６のディスクに格納されるデータの形態で、および／またはウェル読み取り装置１００にあるプリンタまたはウェル読み取り装置１００に取り付けられたプリンタによる印刷出力の形態であることができる。
【００７０】
上述のように、他のサンプルマイクロウェル内に収集された患者数サンプルからのサンプルが読み取られかつ解析される方法は、本質的に第１のサンプルマイクロウェル内のサンプルに関して上述された方法と同一である。特に、各それぞれのサンプルマイクロウェル内のサンプルで取られた６０個の読み取り値は、上述のように図６におけるステップ１０００からステップ２１００にしたがって処理される。
【００７１】
上記処理は、次に、本質的に同一の方法で全ての患者サンプル（またはウェル）に関して実行されることができる。上述のように、各患者サンプルが、複数の遺伝子型に関して試験されるなら、マイクロウェルアレイ１１６は、（（９６−４χ）／χ）人の患者からのサンプルを収容することができ、ここでχは、調査中の遺伝子型の数である。したがって、各サンプルからの３個の異なる遺伝子突然変異の解析に関しては、最大（９６−（４×３））／３＝２８人の患者が、一時にスクリーニングされることができる。いくつかの異なる遺伝子試験に関する対照として作用するように、ターゲットＤＮＡなしに単一の陰性対照を可能とすることによって、そのサンプルが一時に解析されることができる患者の数を増大することが可能である。
【００７２】
任意の結果が患者に報告される前に、対立遺伝子Ａ、対立遺伝子Ｂ、異型接合体、および陰性対照サンプルの読み取り値から得られた値が、ステップ１０００からステップ２１００に関して上述された方法で処理され、結果としての値が、対照サンプルが本当に正確に読み取られることを確実するために解析されることにも留意されたい。任意のこれら対照サンプルの読み取り値が、不正確（例えば、対立遺伝子Ａ対照が、対立遺伝子Ｂとして識別される、またはその逆）である場合には、その位置に関して特定の遺伝子試験に対応する全てのサンプル読み取り値は、全体のランに関して疑義が差し込まれる。その試験に関する全てのサンプルデータは、廃棄されなければならず、新たなサンプルが、新たなマイクロウェルアレイで集められ、次に上述の方法で読み取られかつ評価されなければならない。
【００７３】
サンプル
人間のβ２ＡＲ遺伝子内の配列変種、およびその上流側の５’翻訳されていない領域は、本発明の方法による６個の異なるアダプタ媒介ＳＮＰ検出システムの開発に関するターゲットとして使用される。２つのバンパープライマーを含むＳＤＡシステム、２つの増幅プライマー、および２つの対立遺伝子に特定の信号プライマーは、それぞれ６個のＳＮＰサイト（−６５４、−３６７、−４７、＋４６、＋４９１、および＋５２３）に関して指定される。この例において列挙されている結果は、ＳＮＰ＋４６に対してだけ関する。２つの信号プライマーは、−３’末端（Ｎ−１）から上流側の配置された１つのベースである診断ヌクレオチドを除く同一の配列からなる。アダプタ配列の同一の対は、汎用リポータプローブの共通の対を使用する検出を可能にするために、信号プライマーの５’末端に添付される。信号オリゴヌクレオチドの変種位置は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはチミン（Ｔ）を含む。この研究の目的のために、「野生型」対立遺伝子（または対立遺伝子Ａ）は、ＧｅｎｏＢａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｍ１５１６９）で示される配列を参照し、一方「突然変異」（または対立遺伝子Ｂ）は、代わりのヌクレオチド（ＳＮＰ信号）を表す。対立遺伝子Ａおよび／または対立遺伝子Ｂを含むβ２ＡＲターゲット配列は、プールされた人間遺伝子ＤＮＡからｐＵＣ１９にクローンにされる。
【００７４】
特定の増幅生成物は、適切な信号プライマーの補体に対するレポータプローブのハイブリダイゼーションと関連付けられた蛍光強度における変化、信号プライマーの補体の後の拡張、および結果二重ストランド生成物の分裂を監視することによって検出される。各ウェルに関して、１つのフルオレセイン（ＦＡＭ）（突然変異）および１つのローダミン（ＲＯＸ）（野生型信号）読み取り値は、反応の過程中に非常にわずかに行われる。各サンプルに関するＦＡＭおよびＲＯＸ蛍光読み取り値は、図１９において１つのウェルに関して６０分間にわたってプロットされた。ｙ軸上の値は、ステップ１７２０で得られた値である。わずかなＦＡＭの増加に比較して、時間にわたるＲＯＸ蛍光における有意な増加が存在する。
【００７５】
図１９は、バックグラウンド訂正を定義するデータの後で発生する、各データ点に関する時間にわたってプロットされた対数比値のグラフを示す。これら値のヒストグラムは、これらデータに関する確率密度推定とともに、図２０に与えられる。図２１は、これらデータ（３．４５）に関する最も可能性がある値を定義するステップを例示する。このシステムに関して、±１間の値は、異型接合体の遺伝子型を示し、一方、−１より小さい値は、突然変異遺伝子型を示し、＋１より大きい値は、野生型遺伝子型を示す。この特定のサンプルは、野生型から生じる。
【００７６】
本発明のわずかな例示的な実施形態だけが、上記に詳細に記載されたが、当業者は、本発明の新規な教示および利点から実質的に逸脱することなく、多くの修正が例示的な実施形態において可能であることは容易に理解されよう。同様に、本発明は、範囲において広いことを意図されており、任意の制限が、範囲に対してミーンズプラスファンクションの形式で作成されたものであるように思われ、記載された請求項を達成するための全ての構造を広く包含することが意図されている。したがって、全てのそのような修正は、以下の請求項に定義されるように本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】サンプルウェル読み取り値を解釈するために本発明の実施形態を用いる、サンプルウェルアレイの光学的サンプルウェル読み取りのための装置の斜視図である。
【図２】図１に示されるサンプルウェル読み取り装置で使用するサンプルウェルトレイの分解斜視図である。
【図３】図２に示されるサンプルウェルトレイアセンブリを受けかつ搬送するための図１に示される装置で用いられるステージアセンブリの詳細斜視図である。
【図４】図３に示されるステージアセンブリによって光センサを通って搬送されるサンプルウェルトレイに関して、光センサバーおよび対応する光ファイバケーブル、図１に示される装置で用いられる発光ダイオードおよび光検出器の配置を示す図である。
【図５】図１に示される装置によって図２に示されるサンプルウェルトレイのサンプルウェルから検出された蛍光放出の大きさを示す値を示し、その値は、それらの対応する蛍光放出が検出された時間の関数としてプロットされたグラフである。
【図６】本発明の実施形態による図５に示されるグラフでデータを正規化し、フィルタリングし、調整し、かつ解釈するための方法のステップを示すフローチャートである。
【図７】図６に示されるフローチャートのダーク訂正処理ステップのステップを示すフローチャートである。
【図８】図６に示されるフローチャートの動的正規化処理ステップのステップを示すフローチャートである。
【図９】図５に示されるグラフ上で図６に示されるフローチャートにおける、ダーク訂正、インパルスノイズフィルタ、および動的正規化ステップの実行後の結果であるグラフである。
【図１０】図６に示されるフローチャートのステップ位置決定および除去処理ステップのステップを示すフローチャートである。
【図１１】図９に示されるグラフ上で図６に示されるフローチャートのステップ位置決定および修復ステップを実行した結果であるグラフである。
【図１２】図６に示されるフローチャートのウェル存在判定ステップのステップを示すフローチャートである。
【図１３】図６に示されるフローチャートのバックグラウンド訂正ステップのステップを示すフローチャートである。
【図１４】図１１に示されるグラフ上で図６に示されるフローチャートのバックグラウンド訂正ステップを実行した結果のグラフである。
【図１５】増幅比の自然対数を計算するステップを示すフローチャートである。
【図１６】対数比値に関する密度推定、および最大密度点に対応する比の値を判定するステップを示すフローチャートである。
【図１７】最大密度値を使用してサンプルに対して最終結果を割り当てるステップを示すフローチャートである。
【図１８】サンプルに関する突然変異および野生型増幅のグラフである。
【図１９】サンプルに関する時間にわたる対数比のデータ値のグラフである。
【図２０】サンプルに関する対数比のデータ値および確立密度曲線のヒストグラムである。
【図２１】サンプルに関する最も可能性がある値を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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