(57)【要約】本発明は、哺乳類細胞において、ストア感受性Ｃａ２＋流入を調節し、それによりグルコース取り込みを調節する薬剤を同定するための方法に関する。かかる化合物は、グルコースの取り込みの減少に関連した疾病、例えば、２型糖尿病の治療に有用でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類細胞においてグルコース取り込みを調節する薬剤の同定方法であって、以下の工程：
哺乳類細胞を候補薬剤と接触させる工程；
該候補薬剤が細胞内へのストア介在性Ｃａ２＋流入（ＳＭＣＥ）を調節するかを決定する工程；および
該候補薬剤が細胞においてグルコース取り込みを調節するかを決定する工程；
を含む方法。
【請求項２】
該候補薬剤が細胞内へのＳＭＣＥを増大させるかを決定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
哺乳類細胞において該候補薬剤がグルコース取り込みを増大させるかを決定する工程を含む、請求項２の方法。
【請求項４】
哺乳類細胞においてグルコース取り込みを調節する薬剤の同定方法であって、以下の工程：
候補薬剤をＳＭＣＥ調節因子と接触させる工程；
該候補薬剤がＳＭＣＥ調節因子の機能を調節するかを決定する工程；および、
該候補薬剤が哺乳類細胞においてグルコース取り込みを調節するかを決定する工程；
を含む方法。
【請求項５】
該候補薬剤がＳＭＣＥ調節因子の機能を刺激するかを決定する工程を含む、請求項４の方法。
【請求項６】
該候補薬剤が哺乳類細胞においてグルコース取り込みを増大させるかを決定する工程を含む、請求項５の方法。
【請求項７】
哺乳類細胞においてグルコース取り込みを調節する薬剤の同定方法であって、以下の工程：
哺乳類細胞を細胞内へのＳＭＣＥを調節する候補薬剤と接触させる工程；
該候補薬剤の存在下で細胞におけるグルコース取り込みを測定する工程；および
該候補薬剤が細胞でのグルコース取り込みを調節するかを決定する工程
を含み、該候補薬剤の不在下と比べて該候補薬剤の存在下で変化した細胞でのグルコース取り込みが、該候補薬剤がグルコース取り込みを調節することを示すものである方法。
【請求項８】
該候補薬剤が細胞内へのＳＭＣＥを増大させ、そのことが細胞のグルコース取り込みを増大させるものである、請求項７の方法。
【請求項９】
哺乳類細胞においてグルコース取り込みを調節するための方法であって、哺乳類細胞を、ＳＭＣＥを調節し、それによって細胞のグルコース取り込みを調節するのに有効量の薬剤と接触させることを含む方法。
【請求項１０】
該薬剤がＳＭＣＥを増大させ、それによって細胞のグルコース取り込みを増大させるものである、請求項９の方法。
【請求項１１】
細胞が骨格筋細胞である、請求項９の方法。
【請求項１２】
細胞をインスリンと接触させる工程をさらに含む、請求項９の方法。
【請求項１３】
２型糖尿病の治療方法であって、それを必要とする個体に、ＳＭＣＥを促進し、それによって細胞のグルコース取り込みを調節するのに有効量の薬剤を投与することを含む方法。
【請求項１４】
薬剤の投与に続いて、または同時にインスリンを投与することをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１５】
個体が２型糖尿病であるかを診断することをさらに含む、請求項１３の方法。
【請求項１６】
２型糖尿病の治療方法であって、以下の工程：
かかる治療を必要とする個体に、ＳＭＣＥを感作し、それによって細胞のグルコース取り込みを調節するのに有効な量の薬剤を投与する工程；および
該薬剤の投与に続いて、または同時に、個体にインスリンを投与する工程
を含む方法。
【請求項１７】
個体が２型糖尿病であるかを診断することをさらに含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
２型糖尿病の治療のための医薬の製造における、ＳＭＣＥを促進し、それによって細胞のグルコース取り込みを調節するのに有効な薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、哺乳類細胞において、ストア感受性Ca2+流入を調節し、それによりグルコース取り込みを調節する薬剤を同定するための方法に関する。かかる化合物は、グルコース取り込みの減少に関連した疾病、例えば、２型糖尿病の治療に有用でありうる。
【０００２】
（背景技術）
骨格筋は、インスリン介在性グルコース取り込みの量的に最も重要な部位であり、この取り込みは２型糖尿病患者では減少している。インスリンが骨格筋におけるグルコースの取り込みをどのように増大させるかについての理解は、近年増えつつあるものの、未解決の問題はまだ多く残されている(Ryder et al. (2001) Acta Physiol Scand 171:249-257)。インスリンの働きが細胞内Ca2+の増加に関与するかについては討論されてきた。(Klip and Ramlal (1987) J Biol. Chem. 262:9141-9146; Youn et al. (1994) Am J Physiol 267:R888-R894)。多くの研究では、インスリン介在性の遊離細胞内Ca2+濃度の増加を検出することができなかった(Klip and Ramlal (1987) J Biol. Chem. 262:9141-9146; Cheung et al. (1987) Am J Physiol 252:C163-C172; Kelly et al. (1989) J Biol. Chem. 264:12754-12757)。さらに、培養培地中、わずかな［Ca2+］の存在下で、単離した齧歯類の骨格筋をインキュベートしても、インスリン介在性グルコース取り込みは十分に変化しなかった(Clausen (1980) Cell Calcium 1:311-325)。実際には、細胞内Ca2+濃度の広く全身的な増加により（例えば、Ca2+イオノフォアの使用による）、どちらかといえば、インスリン介在性グルコース取り込みが減少する(Draznin et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:14385-14388; Lee et al. (1995) Am. J. Physiol. 268:R997-R1002)。
【０００３】
近年の研究により、Ca2+およびCa2+-結合タンパク質カルモジュリンが、骨格筋(Shashkin et al. (1995) J Biol Chem 270:25613-25618; Brozinick et al. (1999) Biochem J 339:533-540; Bruton et al. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96:3281-3286; Bruton et al. (2001) Acta Physiol Scand 171:259-265)および含脂肪細胞(Whitehead et al. (2001) J Biol Chem 276:27816-27824)におけるインスリン刺激性グルコース輸送に関与することが示唆された。骨格筋において、この見方を支持する最も直接的な証拠は、インスリンが膜付近の遊離[Ca2+] ([Ca2+]mem)を増大させ、この増大はインスリン介在性グルコース取り込みを阻害する介入によって弱まるという知見にある(Bruton et al. (1999) Proc Natl Acad Sci U S A 96:3281-3286)。[Ca2+]memにおけるインスリン誘導性の増大は、Ｌ型Ca2+チャネルブロッカーによって阻害される。しかし、Ｌ型Ca2+チャネルの関与は、これらのチャネルが通常は脱分極によって活性化されるため、またインスリンの使用がわずかな過分極を起こすために、不明のままである(Bruton et al., 前記)。
【０００４】
カルシウムチャネルポリペプチドをコードする核酸は、例えば、WO 00/40614に開示されている。カルシウムチャネルは、細胞内へ、および細胞外へのCa2+イオンの制御された輸送(flux)を容易にする膜貫通型の多サブユニットタンパク質である。通常、「興奮性の」細胞、例えば神経細胞および骨格筋細胞は、電位依存性カルシウムチャネルを有する。「非興奮性の」細胞において、カルシウム流入は、主に刺激に応答して起き、それにより細胞内ストアからのカルシウム放出が起こると考えられている。この過程は、「ストア感受性の」カルシウム流入と呼ぶが、あまり理解されていない。
【０００５】
近年の研究により、「ストア感受性カルシウム」(SOC)、「カルシウム放出活性化カルシウム」(CRAC)、または「ストア介在性の」Ca2+流入(ＳＭＣＥ)チャネルの存在が骨格筋において示唆された(Putney et al. (2001) J Cell Sci 114:2223-2229; Kurebayashi and Ogawa (2001) J Physiol 533:185-199)。しかし、この過程の生理学的重要性は、骨格筋でも、その他ほとんどの興奮性細胞でも不明である。
【０００６】
（発明の開示）
驚くべきことに、骨格筋において「ストア介在性の」Ca2+流入（ＳＭＣＥ）は、インスリン刺激性グルコース取り込みを調節することが明らかになった。単離したマウスの速く収縮および遅く収縮する骨格筋において、２−ＡＰＢまたはＭＤＬによるＳＭＣＥの薬理学的阻害により、インスリン介在性２−デオキシグルコース取り込みの投薬量依存的な減少が生じた。これらの化合物はいずれも基底２−デオキシグルコース取り込みに影響しなかった。fula-2蛍光強度のMn2+クエンチング率を、ＳＭＣＥの間接的な基準として用いた。２−ＡＰＢの使用により、Mn2+クエンチング率が約７０％減少し、この減少はインスリンによって部分的に逆転した。Mn2+クエンチングに対する２−ＡＰＢの効果は、細胞外グルコースの不在時よりも存在時の方が大きかった。インスリンの継続した存在下での２−ＡＰＢの除去により、Mn2+クエンチング率はインスリン単独使用時と比べて約２０％増加した。Mn2+クエンチングでのこの増加は、インスリン介在性２−デオキシグルコース取り込みにおける３０％までの増加を伴った。２−ＡＰＢ曝露は、収縮介在性２−デオキシグルコース取り込みには影響しなかった。これらの結果は、Ca2+流入の増加により、インスリン介在性グルコース取り込みが増加するという、骨格筋におけるＳＭＣＥおよびインスリン活性の変化の生理学的役割を支持する。よって、ＳＭＣＥは、２型糖尿病の将来的な薬理学的治療のための適当な標的となりうる。
【０００７】
従って、第１の態様において、本発明は哺乳類細胞におけるグルコースの取り込みを調節する薬剤の同定方法であって、以下の工程：哺乳類細胞を候補薬剤と接触させる工程；該候補薬剤が細胞内へのストア介在性Ca2+流入（ＳＭＣＥ）を調節するかを決定する工程；および、該候補薬剤が細胞でのグルコース取り込みを調節するかを決定する工程、を含む方法を提供する。該方法は、例えば、該候補薬剤が細胞内へのＳＭＣＥを増大させるかを決定する工程を含むことができる。該方法は、該候補薬剤が哺乳類細胞でのグルコース取り込みを増大させるかを決定する工程も含むことができる。
【０００８】
好ましくは、該薬剤はＳＭＣＥチャネルの開く確率を増大させ、それによって細胞でのCa2+の流入およびグルコース取り込みを増大させる。かかるＳＭＣＥの促進物は、グルコース取り込みの減少を伴う病状、例えば２型糖尿病の治療に有用でありうる。候補薬剤は多くの化学物質の種類を包含するが、典型的には有機化合物である。候補薬剤を、合成または天然化合物のライブラリーを含む広範囲のソースから得ることができる。候補薬剤は、例えば、ペプチド、ペプチド様物質、アミノ酸、アミノ酸類似物、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似物、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似物または他の小分子を含むことができる。
【０００９】
他の具体例において、本発明は、哺乳類細胞においてグルコース取り込みを調節する薬剤の同定方法であって、以下の工程：候補薬剤をＳＭＣＥ調節因子と接触させる工程；該候補薬剤がＳＭＣＥ調節因子の機能を調節するかを決定する工程；および、該候補薬剤が哺乳類細胞でのグルコース取り込みを調節するかを決定する工程、を含む方法を特徴とする。該方法は、該候補薬剤がＳＭＣＥ調節因子の機能を刺激するかを決定する工程を含むことができる。該方法は、該候補薬剤が哺乳類細胞におけるグルコース取り込みを増大させるかを決定する工程も含む。該方法は、該薬剤がＳＭＣＥ調節因子に結合するかを決定する工程も含むことができる。ＳＭＣＥ調節因子は、具体的にはポリペプチドでありうる。ＳＭＣＥ調節因子の例は、「SOC/CRACカルシウムチャネルポリペプチド」として呼ばれており、WO 00/40614に開示される。具体的には、ヒトSOC/CRACカルシウムチャネルポリペプチドのアミノ酸配列は、WO 00/40614において配列番号２８、３０および３２として開示される。この文脈では、「機能」は、例えば、細胞でのカルシウム流入およびグルコース取り込みを変化させることを含む。
【００１０】
もう１つの具体例において、本発明は、哺乳類細胞においてグルコース取り込みを調節する薬剤の同定方法であって、以下の工程：細胞内へのＳＭＣＥを調節する候補薬剤と哺乳類細胞を接触させる工程；該候補薬剤の存在下で細胞のグルコース取り込みを測定する工程；および、該候補薬剤が細胞でのグルコース取り込みを調節するかを決定する工程であって、該候補薬剤の不在下と比べて該候補薬剤の存在下で変化した細胞でのグルコース取り込みが、該候補薬剤がグルコース取り込みを調節することを示すものである工程、を含む方法を特徴とする。１つの例において、該候補薬剤は細胞内へのＳＭＣＥを増大させ、それにより細胞でのグルコース取り込みが増大する。
【００１１】
様々なアッセイを用いて、カルシウムチャネルの機能をアゴニストまたはアンタゴニストとして調節する化合物をスクリーニングすることができる。かかるスクリーニングアッセイの数例は、例えば、米国特許第5,643,750号に記載されている。
【００１２】
Fura 2アッセイ
動物細胞で発現したヒトカルシウムチャネルを、カルシウムチャネルの開放および阻害後の細胞内カルシウム濃度の測定のために、カルシウム感受性蛍光色素（例えば、fura-2、fluo-3またはindo-1）の存在下で使用することができる(例えば、Rosario et al. (1989) Neurosci. 29: 735-747参照)。この場合、細胞内カルシウム濃度の変化を、蛍光測定法（分光測定法）によって測定することができる。例えば、培養細胞にfura-2を添加することができる。次いで、MnCl2を加え、fura-2蛍光のクエンチング（減退）率を測定する。次いで、候補薬剤を加え、Mn2+クエンチング率における変化を測定する（実施例５を参照）。
【００１３】
遺伝子にコードされたCa2+指示剤に基づくアッセイ
このアッセイにおいて、Ca2+はカメレオン（cameleon）、すなわち蛍光Ca2+指示タンパク質を用いて測定される。カメレオンは、シアン蛍光タンパク質、カルモジュリン（CaM）、グリシルグリシンリンカー、ミオシン軽鎖キナーゼのCaM結合ドメイン、および黄色蛍光タンパク質からなる。CaMへのCa2+結合により、この分子のコンフォーメーション変化が起こり、そのことによって蛍光が変化する。
【００１４】
受容体結合アッセイ
ヒトカルシウムチャネルで形質転換した培養細胞を培養し、膜の調製に使用することができる。これらの膜調製物を、新規リガンドのスクリーニングのための様々なクラスの放射標識物質との結合研究（競合アッセイ）に使用することができる。既知のカルシウムチャネル結合物質の例は、以下の：フェニルアルキルアミン；ベンゾチアゼピン；ジヒドロピリジン；ビスフェニルブチルピペラジン；およびΩコノトキシンである。
【００１５】
カルシウム45流動アッセイ
ヒトカルシウムチャネルで形質転換した培養細胞の膜を通じたカルシウム流入を変化させ、放射標識されたカルシウム(45Ca)を用いて測定し (例えば、Messing et al. (1985) J. Pharmacology and Exp. Therapeutics 235: 407-411参照)、それをカルシウムチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストの機能試験／スクリーニングに使用することができる。
【００１６】
電気生理学 
ＳＭＣＥによって生じたカルシウムの流れを電気生理学的に測定することができる（例えば、Carbone et al. (1990) Pflugers Arch. 416: 170-179参照)。組み換え動物細胞株を用いて、潜在的なカルシウムチャネルのアンタゴニストまたはアゴニストの効果を物理的に測定し、ヒトカルシウムチャネルにて直接薬理学的に特徴づけることができる。
【００１７】
間接測定方法
多くの細胞プロセスは、細胞内カルシウムイオン濃度（例えば、受容体介在性シグナル伝達、様々な酵素反応、例えば、リン酸化、脱リン酸化、神経伝達物質の放出、Ｃａ依存的な遺伝子調節など）によって制御される。これらの生化学的反応のうちのいくつかを、特定のアッセイを用いて測定することができる。従って、組み換えカルシウムチャネルを発現した細胞システムにおいて、カルシウム依存的な細胞プロセスに対するカルシウムチャネルモジュレーターの効果を間接的に（生理学的に）検出することができる(例えば、Zernig et al. (1986) Eur. J. Pharmacol. 128: 221-229参照)。
【００１８】
標的変異誘発（targeted mutagenesis）、例えば、様々なカルシウムチャネルのサブタイプのＤＮＡセグメントの点変異、挿入、欠失、置換によって導入された修飾によって、生理学的プロセスに対する直接的な効果を検出することも可能である(例えば、Yool and Schwarz (1991) Nature 349: 700-704参照)。
【００１９】
もう１つの態様において、本発明は、哺乳類細胞におけるグルコース取り込みの調節方法であって、ＳＭＣＥを調節するのに有効な量の薬剤と哺乳類細胞を接触させ、それにより細胞でのグルコース取り込みを調節することを含む方法を提供する。１つの例において、該薬剤は、ＳＭＣＥを増大させ、それによって細胞でのグルコース取り込みを増大させる。細胞は、例えば、骨格筋細胞でありうる。該方法は、さらに、該細胞をインスリンと接触させる工程を含むことができる。
【００２０】
本発明は、２型糖尿病の治療方法であって、それを必要とする個体に、ＳＭＣＥを促進して細胞のグルコース取り込みを調節するのに有効量の薬剤を投与することを含む方法も提供する。該薬剤を、単独で、またはインスリンの投与と一緒に（同時に、または後で）のいずれかにて投与することができる。該方法は、個体が２型糖尿病に罹っていることを診断する工程をさらに含むことができる。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、２型糖尿病の治療方法であって、以下の工程：かかる治療を必要とする個体に、ＳＭＣＥを感作し、その結果細胞のグルコース取り込みを調節するのに有効量の薬剤を投与する工程；および、該薬剤の投与の後または同時にインスリンを個体に投与する工程を含む。該方法は、個体が２型糖尿病に罹っていることを診断する工程をさらに含むことができる。
【００２２】
用語「治療」とは、哺乳類の疾病のあらゆる治療を意味し、以下の：（ｉ）疾病の予防、すなわち、疾病の臨床的兆候を進行させないようにすること；（ｉｉ）疾病の阻害、すなわち、臨床的兆候の進行を止めること；および／または（ｉｉｉ）疾病の軽減、すなわち、臨床的兆候の緩解、を含む。用語「治療上有効量」とは、治療される疾病状態の治療を提供するのに十分な投薬量を意味する。これは、患者、疾病および行われる治療によって様々である。
【００２３】
この明細書を通じて、用語「標準的なプロトコール」および「標準的な手順」とは、分子生物学技術の文脈で用いられる場合、通常の研究室マニュアル、例えば：Current Protocols in Molecular Biology, editors F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994、またはSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989に記載されたプロトコールおよび手順として理解されるべきである。
【００２４】
以下、添付の実施例において、本発明は記載されるが、本発明の例示目的であり、保護の範囲を限定するものではない。
【００２５】
（研究設計および方法）
成体オスマウス(NMRI系統)を室温で飼育し、適宜餌を与えた。動物を、迅速な首関節脱臼によって屠殺し、筋肉を除いた。足の長指伸筋(EDL; 主に速筋繊維)およびヒラメ筋（主に遅筋繊維）を用いて２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）取り込みを測定した。短指屈筋（FDB、主に速筋繊維）を単一繊維実験に用いた。全ての手順は、地域の倫理委員会によって承認された。
【００２６】
２−ＤＧ取り込みを、本質的に各文献に記載のように(Shashkin et al. (1995) J Biol Chem 270:25613-25618; Le Marchand-Brustel et al. (1979) J Clin Invest 64:1505-1515)測定した。簡単に説明すると、筋を2 mmol l-1 ピルビン酸(グルコース無し)を含み、ＳＭＣＥチャネルに直接働くとされる比較的特異性のあるＳＭＣＥ阻害剤である２−ＡＰＢ(Braun et al. (2001) J Biol Chem 276:1063-1070; Broad et al. (2001) J Biol Chem 276:15945-15952)か２−ＡＰＢとは異なる様式で働くもう１つのＳＭＣＥ阻害剤であるＭＤＬ (van Rossum et al. (2000) J Biol Chem 275:28562-28568)のいずれかのＳＭＣＥのアンタゴニストを含むか含まないＫｒｅｂｓ重炭酸バッファー中にて、３５℃でインキュベートした。他の実験においては、SRCa2+取り込み阻害剤である２，５−ジ（ｔｅｒｔ−ブチル)−１，４−ベンゾヒドロキノン(TBQ) (Westerblad et al. (1994) J Physiol 474:291-301)中で筋をインキュベートした。いくつかの実験においては、初めの３０分のインキュベーションの後、インスリン(10 ミリユニット ml-1)を加えた。さらに３０分後、２−ＤＧ(1 mmol l-1；1 mCi mmol-1)およびイヌリン(0.2 μCi/ml 培地)を加えた。２−ＤＧを加えて２０分後、筋をブロットし、液体窒素で凍結した。次いで、筋を測量し、７０℃でＮａＯＨ中にて消化し、冷却し、遠心し、上清部分をシンチレーションカクテルに加え、3H (2-DG) および14C (イヌリン)について計測した。
【００２７】
ＥＤＬ筋に対するいくつかの実験において、インスリンの継続した存在下で２−ＡＰＢ除去後に２−ＤＧグルコース取り込みを測定した。初めの３０分間のインキュベーションの後、インスリン(10ミリユニット ml-1)を加え、残りの実験の間溶液中に加えたままにした。さらに３０分後、２−ＡＰＢ (100 μM)を加えた。３０分後、筋を２−ＡＰＢを含まない培地に移し、さらに１０分後、筋を２−ＤＧ（前記）に２０分間晒し、その後ブロットし、凍結した。対照筋を２−ＡＰＢを添加しないこと以外同じように処理した。
【００２８】
収縮介在性２−ＤＧ取り込みに対する２−ＡＰＢの効果をＥＤＬ筋で研究した。まず、筋を２回の強直性収縮(50 Hz, 継続時間100 ms)／秒によって１０分間刺激した。これにより、グリコーゲン貯蔵量は静止値の２０％未満に減少した（データ示さず）。刺激後、筋を２０分間静止させ、次いで２−ＤＧに２０分間晒し、ブロットし、凍結した（上記のように）。いくつかの筋を、刺激後の４０分間の回復期の間中２−ＡＰＢ(100 μM)に晒した。
【００２９】
単一のＦＤＢ筋繊維に対する実験を２４℃で行った。単離した繊維を刺激チャンバーに乗せ、標準的なタイロード溶液によって連続的に灌流した(Lannergren et al. (1987) J Physiol 390:285-293)。遊離筋形質[Ca2+] ([Ca2+]i)を、蛍光Ca2+指示薬indo-1を用いて測定した(Andrade et al. (1998) J Physiol 509:565-575)。間接的なＳＭＣＥの測定を、Mn2+の流入およびfura-2の蛍光強度のクエンチング率によって得た(Hopf et al. (1996) J Biol Chem 271:22358-22367)。MnCl2 (100 μmol l-1)をバス溶液（bath solution)に加え、495 ± 5 nmでの蛍光発光を測定しながらfura-2を注入した筋繊維を360 ± 5 nm (我々の実験条件下でのfura-2の等吸収点の波長)にて興奮させた。蛍光の減少率が安定している間、すなわち、バス溶液の変化によって誘導される一過的な変化を無視して、Mn2+クエンチング率を測定した。インスリンの使用後２分、つまりインスリンが作用する時間までは測定を行わなかった。
【００３０】
データは、平均±ＳＥＭとして示される。統計学的解析は、対応のある、または対応のないｔ検定、あるいは一元配置分散分析、次いでStudent-Newman-Keuls多重比較検定として実施した。Ｐ値＜０．０５のであれば、統計学的に有意であると考えられる。
【実施例】
【００３１】
実施例１：ＳＭＣＥの薬理学的阻害はインスリン介在性２−ＤＧ取り込みが減少させる
２−ＡＰＢの使用によって、ＥＤＬとヒラメ筋のいずれにおいても、インスリン介在性２−ＤＧ取り込みが投薬量依存的に減少したが、遅筋であるヒラメ筋ではいくらか感受性が高いようであった（図１Ａ）。この阻害が該薬剤の一般的で非特異的な阻害効果によるものではないことを示すために、２−ＡＰＢに晒す間、収縮機能を試験した。100 μmol l-1 ２−ＡＰＢに晒して３０分後、強縮力（tetanic force）は11 ± 3% (n = 5; P ＜ 0.05)増大し、弛緩速度はわずかに減少した；よって、細胞は電気刺激に応答して活動電位を生じることができ、それらの収縮機構は損なわれていなかった。減速した弛緩を伴う強縮力の増大は、ＡＴＰ駆動型SR Ca2+取り込みが阻害される状況に類似している(Westerblad et al. (1994) J Physiol 474:291-301)。２−ＤＧグルコース取り込みに対する２−ＡＰＢの効果がSR Ca2+取り込みの阻害によるものではないことを示すために、我々はＴＢＱを用いて対照実験を行った。TBQ (500 nmol l-1)の使用によって、強縮力が4 ± 2%増大し(n = 4；力の変化は２−ＡＰＢを用いたものと有意に異なってはいなかった)、弛緩がわずかに遅くなった。ＴＢＱはインスリン介在性２−ＤＧ取り込みに効果はなかった。ヒラメ筋において、インスリン介在性取り込みは、TBQなし、100 nmol l-1および500 nmol l-1で、それぞれ163 ± 8 (n = 6)、150 ± 7 (n = 6)および179 ± 8 (n = 4) μmol l-1 分-1であった。ＥＤＬ筋における対応値は、それぞれ、89±5 (n = 6)、93 ± 5 (n = 6) および103 ± 4 (n = 4) μmol l-1 分-1であった。
【００３２】
もう１つのＳＭＣＥ阻害剤であるＭＤＬの使用によっても、ＥＤＬとヒラメ筋の両方におけるインスリン介在性２−ＤＧ取り込みが投薬量依存的に減少した（図１Ｂ）。２−ＡＰＢと同様に、ヒラメ筋はＥＤＬ筋よりもより感受性が高いようであった。しかし、２−ＡＰＢとは逆に、100 μmol l-1 ＭＤＬの使用によって、強縮力は徐々に減少し、３０分晒した後の力は22 ± 2% (n = 4; P ＜ 0.01)減少した。この減少は該薬剤を洗い流しても戻らなかった。
【００３３】
基底２−ＤＧ取り込みに関する平均データ（すなわち、インスリンの不在における）を表１に示す。インスリン介在性２−ＤＧ取り込みとは逆に、基底取り込みは２−ＡＰＢまたはＭＤＬの使用によって有意に影響されない。ＴＢＱも基底２−ＤＧ取り込みに対して有意な影響を及ぼさなかった。従って、ＳＭＣＥの阻害はインスリン介在性２−ＤＧ取り込みを顕著に減少させるが、基底条件下での取り込みには影響しない。
【００３４】
表Ｉ：２−ＤＧ取り込みの基底速度
【表１】
2005530505.tif 000002
データ(μmol l-1 分-1)は、平均±SEM (n)である。２−ＡＰＢ濃度は、EDLには0.1 mmol l-1、ヒラメ筋には1.0 mmol l-1であった。
【００３５】
実施例２：ＳＭＣＥの薬理学的阻害はMn2+のクエンチング率を減少させる
fura-2蛍光のMn2+クエンチングを用いて、インスリンおよび２−ＡＰＢの使用と関連したＳＭＣＥ活性における変化を評価した。Mn2+を標準的なタイロード溶液（5.5 mmol l-1グルコースを含む）に加えた後、クエンチング率（初めの蛍光強度のパーセントとして示される）は0.72 ± 0.05 % 分-1 (n = 12)であった。図２Ａは、単一の筋繊維を２−ＡＰＢ(100 μmol l-1)に、次いで２−ＡＰＢの継続存在下のインスリン(10 mU ml-1)に晒したクエンチング実験の間のfura-2蛍光の元の記録を示す。２−ＡＰＢを加えるとクエンチング率が顕著に減少し、インスリンの使用後に部分的に回復したことがわかる。さらなる５つの実験でも同様の結果が得られ、平均データを図２Ｂに示す。従って、２−ＡＰＢの使用によって、クエンチング率は約７０％減少し、インスリンはこの減少を約半分回復させる。２−ＡＰＢの使用に伴うクエンチング率の顕著な減少は、細胞内へのCa2＋流入率における比例した減少を反映し、それは[Ca2+]iに影響しうる。従って、我々は、２−ＡＰＢ曝露に関連した全体の[Ca2+]iにおける変化を測定した（indo-1を用いて）。２−ＡＰＢの使用によって、70 ± 10から51 ± 9 nmol l-1 (n = 5; P ＜ 0.01) への[Ca2+]iの明確な減少が生じた。
【００３６】
まずインスリンを使用し、次いで２−ＡＰＢを加える別の一連のクエンチング実験を行った。図３Ａは、インスリン曝露によってわずかにクエンチング率が増大したという１つのかかる実験の元の記録を示す。クエンチング率の増大は、さらにもう１つの繊維においても観察されたが、試験した他の４つの繊維では減少するか、全く変化を示さなかった。よって、平均データは有意なインスリン誘導性のクエンチング率の変化を示さなかった（図３Ｂ、黒丸）。続くインスリンの存在下での２−ＡＰＢの曝露によって、クエンチング率が顕著に減少した。興味深いことに、継続したインスリンの存在下での２−ＡＰＢの除去により、別の１連の実験で測定された元の[Ca2+]iよりもクエンチング率は有意に高くなった（図３Ｃ）。平均データ(n = 4)は、インスリン使用時に全体の[Ca2+]iが変化しないが、続く２−ＡＰＢの使用によって[Ca2+]iは急速かつ有意に(P ＜ 0.05)減少し(56 ± 9 nmol l-1)、インスリンおよび２−ＡＰＢを洗い流すと戻る(76 ± 12 nmol l-1)ことを示す。
【００３７】
ここまでの実験に記載された全てのクエンチング実験は、インキュベーションバッファーにグルコースを加えて行われ、一連のMn2+クエンチング実験は、0 mmol l-1のグルコースを含むタイロード溶液中で行われた。グルコースなしでのクエンチングの基底速度は、5.5 mmol l-1グルコース中でのものと有意に異なるものではなかった（前記参照）。一方、グルコースなしでのインスリンの添加によって、試験された全ての繊維におけるクエンチング率が少し（約１０％）増大した（図３Ｂ、白丸）。２−ＡＰＢの添加および除去に対する応答は、0および5.5 mmol l-1グルコースで質的に類似していたが、クエンチング率は概して前者で高かった。この違いの理由をさらに調査しなかった。 
【００３８】
前記のMn2+クエンチング実験のほとんどで、２−ＡＰＢに晒す前後に強縮刺激(70 Hz, 継続時間350 ms)に対する収縮応答を試験したところ、強縮[Ca2+]iと力はいずれも注目すべき変化を示さなかった（データ示さず）。
【００３９】
インスリンの継続存在下での２−ＡＰＢの除去により、２−ＤＧ取り込みは増大した。図３ＢはMn2+クエンチング率が２−ＡＰＢ除去後に増大したことを示す。これを考慮して、我々は同様の実験条件下でのＥＤＬ筋における２−ＤＧ取り込み速度を測定した。結果は、あらかじめ２−ＡＰＢおよびインスリンに晒した筋における２−ＤＧ取り込みが、インスリン単独のものと比較して顕著に(~30%)増大したことを示した（図４）。
【００４０】
実施例３： ２−ＡＰＢ曝露は収縮介在性２−ＤＧ取り込みに影響しない
インスリンに加えて、反復収縮も骨格筋におけるグルコース取り込みの顕著な増大を誘導する。２−ＡＰＢも収縮介在性２−ＤＧ取り込みに影響を及ぼすかを試験するために、ＥＤＬ筋を強い反復強縮刺激に１０分間晒し、次いで２−ＡＰＢの存在または不在下で回復させた。刺激プロトコールにより、力の産生は元の値より~10%減少し（図５Ａ）、２−ＤＧ取り込みは２−ＡＰＢの存在および不在のいずれにおいても約３倍増大した（図５Ｂ）。
【００４１】
従って、ＳＭＣＥはグルコース取り込みを活性化するこの別の経路には関与していないようである。このような反復収縮によって[Ca2+]iが顕著に増大することに注意すべきである。この増大はグルコース取り込みを支持するのに十分でありうるため、ＳＭＣＥの活性化は必要ではないだろう。
【００４２】
実施例４：グルコース取り込みを調節する薬剤の同定
ヒト細胞においてＳＭＣＥの活性およびグルコース取り込み速度を調節する薬剤を、当技術分野で既知の方法、例えば、以下の方法のいずれかによって同定することができる：
【００４３】
クエンチングアッセイ
このアッセイは、fura-2蛍光のMn2+クエンチング率を測定することによって、Ca2+流入を間接的に測定する（実施例２を参照）。簡単に説明すると、培養細胞を標準的な方法でfura-2AMとともにロードする(例えば、Basavappa et al. (1999) Biochem Biophys Res Comm 254:699-702).。ローディング後、それらを約１時間休ませ、全てのfura-AMが活性型に変化するのを確認する。次いでMnCl2 (100-500 μM)をバス溶液に加え、fura-2蛍光のクエンチング（減退）率を１０分間測定する（励起および発光波長は実施例２の通り）。次いで、候補薬剤をインスリン有無のバスに加え、Mn2+クエンチングの可能な変化を測定する。増大したクエンチングは、Ca2+流入の増大を示唆し、グルコース取り込みの増大を反映しうる。
【００４４】
遺伝子にコードされた蛍光Ca2+指示剤に基づくアッセイ
このアッセイでは、Ca2+をカメレオン、すなわち蛍光指示タンパク質を用いて測定する、カメレオンは、シアン蛍光タンパク質、カルモジュリン（CaM）、グリシルグリシンリンカー、ミオシン軽鎖キナーゼのCaM結合ドメイン、および黄色蛍光タンパク質からなる。CaMへのCa2+の結合により、この分子の構造変化が起こり、それにより蛍光が変化する。カメレオンは、特定のホストタンパク質と融合することによって特定の細胞内部位に標的化することができる(例えば、Miyawaki et al. (1997) Nature 388: 882-887)。このアッセイにおいて、まずカメレオンはいくつかの表面膜タンパク質に融合する。最終的に、それはインスリンによって活性化される候補様の標的と融合する。
【００４５】
Miyawaki et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 2135-2140に記載のようにカメレオンYC2.1のアデノウイルスベクターによって、培養細胞を感染する。ベクターを適当な表面膜ホストタンパク質（前記参照）と融合するように改変する。細胞を432nmで励起し、535nmおよび480nmで発光した光を測定することによって、Ca2+濃度を測定する。535 nm / 480 nm比の増大は、Ca2+濃度の増大を反映する。Ca2+濃度における変化の質的な測定（すなわち上昇または下降）を得るために、前記の発光波長のうちの１つを測定するだけでも可能であろう。Ca2+濃度は、対照条件下およびインスリン有無での候補薬剤添加後に測定される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１Ａ〜１Ｂは、「ストア介在性」Ca2+流入（ＳＭＣＥ）の薬理学的阻害がインスリン刺激性２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）取り込みを減少させることを示すグラフである。ＥＤＬ（左）およびヒラメ筋（右）におけるインスリン(10ミリユニット ml-1)曝露間の２−ＤＧ取り込みを、ＳＭＣＥの阻害剤であるジフェニルホウ酸 ２−アミノエチルエステル（ホウ酸２−アミノエトキシジフェニルとも呼ばれる) (２−ＡＰＢ) (A)、またはシス−Ｎ−（２−フェニルシクロペンチル）アザシクロトリデカ−１−エン−２−アミン (MDL-12,330Aとも呼ばれる) (ＭＤＬ) (B)の濃度に対してプロットした。白丸は、ＳＭＣＥ阻害剤の不在下でのインスリン刺激性の取り込み速度を示す。値は平均±ＳＥＭとして示され、試験した筋の数は各点で示される。破線は２−ＤＧ取り込みの平均基底速度（すなわち、インスリンおよびＳＭＣＥ阻害剤なし）を示す
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、２−ＡＰＢの使用によってfura-2蛍光強度のMn2+クエンチング率が減少し、該減少がインスリンによって部分的に回復することを示すグラフである。１Ａ：単一の筋繊維より得られたfura-2蛍光の元の記録。直線は安定な減少率を保持した時間での減退率を測定するために使用された直線適合（linear fit）を示す。２Ｂ：２−ＡＰＢ、および２−ＡＰＢ＋インスリンに晒した時のクエンチング率の平均データ(± SEM; n = 6)。各繊維において、２−ＡＰＢ使用前のクエンチング率を１００％とした。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、fura-2蛍光強度のMn2+クエンチング率がインスリンの存在下での２−ＡＰＢの使用によって減少し、次いで２−ＡＰＢを洗い流すと増加することを示すグラフである。３Ａ：単一の筋繊維より得られた元の記録；直線は直線適合を示す。３Ｂ：5.5 mmol l-1 (黒丸; n = 6) および0 mmol l-1 (白丸; n = 5)グルコースを含むバス溶液中で行われたＡで示された実験のタイプにおける、Mn2+クエンチングの相対比率の平均データ（±SEM）。各実験において、インスリンおよび２−ＡＰＢ使用前のクエンチング率を１００％とした（破線）。３Ｃ：インスリンの使用は全体の遊離筋形質[Ca2+] ([Ca2+]i) (indo-1で測定した)には効果はなかったが、次に２−ＡＰＢを使用すると顕著に減少した。記録は４つの実験の代表例である。
【図４】図４は、インスリンの継続存在下での２−ＡＰＢ除去後に２−ＤＧ取り込みが増加することを示すグラフである(P＜0.01)。各グループにおいて８つの筋より平均データ(±SEM)を得た。破線は基底条件下（すなわち、インスリンなし）での２−ＤＧ取り込みを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、２−ＡＰＢが収縮誘導性２−ＤＧ取り込みを阻害しないことを示すグラフである。５Ａ：反復強縮刺激(50 Hz, 継続時間100 ms, 2収縮/s)に晒されたＥＤＬ筋より得られた代表的な力の記録。５Ｂ：２−ＡＰＢの不在および存在下での反復収縮時間後、ならびに静止した対照筋での２−ＤＧ取り込みの平均データ(±SEM; n = 5)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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