(57)【要約】ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に対するホストの免疫反応誘発のために、リコンビナントアデノウイルスおよびホストへの投与方法が提供される。前記リコンビナントアデノウイルスは、多種の野生型または変異体HIV抗原、例えば切断部位または細胞質ゾルドメインをもたないHIVエンベロープタンパク質、構造タンパク質、例えばGagおよびその天然型、分泌型または膜結合型のタンパク分解フラグメント、HIV酵素、例えば逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼ、並びに調節タンパク質、例えばTat、RevおよびNefを発現することができる。前記HIV抗原の免疫原性をさらに高めるために、免疫刺激因子、例えばサイトカインもまた発現させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIV抗原をコードするHIV配列を含むリコンビナントアデノウイルスであって、前記リコンビナントアデノウイルスによる前記HIV抗原の発現が、前記リコンビナントアデノウイルスによるホストの感染時に前記ホストでHIV抗原に対する免疫反応を誘発する前記リコンビナントアデノウイルス。
【請求項２】
前記リコンビナントアデノウイルスが複製不能である請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３】
前記HIV抗原がHIV-1またはHIV-2の抗原である請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４】
前記HIV抗原がHIV株BH10またはｐNL4-3の抗原である請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５】
前記HIV抗原がHIVクレードA、B、C、D、E、FまたはGの抗原である請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６】
前記HIV抗原がHIV糖タンパク質または表面抗原である請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７】
前記HIV糖タンパク質がHIVエンベロープタンパク質である請求項６のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８】
前記HIVエンベロープタンパク質が野生型または変異体gp160、gp120またはgp41である請求項７のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９】
前記HIVエンベロープタンパク質の切断部位が変異によって不活化された請求項7のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１０】
前記HIVエンベロープタンパク質のC-末端の細胞質ゾルドメインが欠失した請求項７のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１１】
前記HIVエンベロープタンパク質の切断部位およびC-末端細胞質ゾルドメインの両方が欠失した請求項７のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１２】
前記HIVエンベロープタンパク質が、配列番号14、16、20、21、22、23および24から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる請求項７のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１３】
前記HIV配列がさらに、RT、PR、Tat、Vif、NefおよびRevから成る群から選択されるHIVタンパク質をコードする請求項７のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１４】
前記HIV抗原がマルチクレードの可変ループを含む改変HIVエンベロープタンパク質である請求項７のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１５】
前記マルチクレードの可変ループが少なくとも２つのHIVクレードに由来するV3ループである請求項14のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１６】
前記少なくとも２つのHIVクレードが、HIV-1単離株のM群のクレードA、B、C、D、E、FおよびGから成る群から選択される請求項15のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１７】
前記V3ループが、配列番号25、26、27、28、29、30および31から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる請求項15のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１８】
マルチクレードの可変ループを含む前記改変HIVエンベロープタンパク質が、配列番号32、52および54から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる請求項14のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項１９】
前記リコンビナントアデノウイルスに感染した細胞による前記HIV抗原の分泌を促進するシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項1のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２０】
前記シグナルペプチドがHIV gp120のシグナルペプチドである請求項19のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２１】
前記シグナルペプチドが配列番号74によってコードされる請求項19のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２２】
前記リコンビナントアデノウイルスに感染した細胞の表面にHIV抗原を結合させる膜固着ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項1のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２３】
前記膜固着ドメインがHIV gp41のトランスメンブレンドメインである請求項22のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２４】
前記膜固着ドメインが配列番号75によってコードされる請求項22のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２５】
前記HIV抗原がHIV構造タンパク質である請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２６】
前記HIV構造タンパク質が野生型HIV Gagである請求項25のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２７】
前記HIV構造タンパク質がHIV Gagのタンパク分解フラグメントである請求項25のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２８】
HIV Gagのタンパク分解フラグメントがp17/24、p17およびp24から成る群から選択される請求項27のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項２９】
HIV Gagのタンパク分解フラグメントが天然型、分泌型または膜結合型である請求項27のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３０】
Gagのタンパク分解フラグメントが、配列番号34、35、36、40、41、42、46、47および48から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる請求項2７のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３１】
HIVプロテアーゼまたはHIV逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３２】
HIVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが配列番号56である請求項31のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３３】
前記HIV抗原がHIV Gagである請求項31のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３４】
前記プロテアーゼがHIV Gagとの融合タンパク質として発現される請求項33のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３５】
前記プロテアーゼが、HIV Gagのプロモーターとは異なるプロモーターから別個に発現される請求項33のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３６】
前記プロテアーゼが、IRESまたはスプライシングドナー／アクセプターメカニズムを介してHIV Gagのための同じプロモーターから別個のタンパク質として発現される請求項33のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３７】
HIVプロテアーゼおよびHIV逆転写酵素の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３８】
前記HIV抗原がHIV Gagである請求項37のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項３９】
前記HIVプロテアーゼおよびHIV逆転写酵素の融合タンパク質がHIV Gagとの融合タンパク質として発現される請求項38のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４０】
前記HIVプロテアーゼおよびHIV逆転写酵素の融合タンパク質が、HIV Gagのプロモーターとは異なるプロモーターから別個に発現される請求項38のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４１】
前記HIVプロテアーゼおよびHIV逆転写酵素の融合タンパク質が、IRESまたはスプライシングドナー／アクセプターメカニズムを介してHIV Gagのための同じプロモーターから別個のタンパク質として発現される請求項38のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４２】
HIVプロテアーゼ、HIV逆転写酵素およびHIVインテグラーゼの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４３】
前記HIV抗原がHIV Gagである請求項42のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４４】
前記HIVプロテアーゼ、HIV逆転写酵素およびHIVインテグラーゼの融合タンパク質がHIV Gagとの融合タンパク質として発現される請求項43のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４５】
前記HIVプロテアーゼ、HIV逆転写酵素およびHIVインテグラーゼの融合タンパク質が、HIV Gagのためのプロモーターとは異なるプロモーターから別個に発現される請求項43のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４６】
前記HIVプロテアーゼ、HIV逆転写酵素およびHIVインテグラーゼの融合タンパク質が、IRESまたはスプライシングドナー／アクセプターメカニズムを介してHIV Gagのための同じプロモーターから別個のタンパク質として発現される請求項43のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４７】
アデノウイルスとは異種であり免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列であって、ホストにおけるその発現がHIV抗原の免疫原性を強化する前記免疫刺激因子配列をさらに含む請求項１のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４８】
前記HIV配列が前記アデノウイルスのE1領域に配置され、前記免疫刺激因子配列が前記アデノウイルスのE4領域に配置される請求項47のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項４９】
HIV配列および免疫刺激因子配列の両配列が前記アデノウイルスのE1またはE４に配置され、内部リボソームエントリーサイトを介し、またはスプライシングドナー−アクセプターメカニズムを介して二シストロンとして同じプロモーターから発現される請求項47のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５０】
前記HIV抗原または免疫刺激因子の発現がアデノウイルスのプロモーターによって制御される請求項47のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５１】
前記HIV抗原または免疫刺激因子の発現が非アデノウイルスプロモーターによって制御される請求項47のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５２】
前記非アデノウイルスプロモーターが、CMVプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスLTRプロモーターおよびニワトリ細胞質β-アクチンプロモーターから成る群から選択される請求項51のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５３】
前記免疫刺激因子がサイトカインである請求項47のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５４】
前記サイトカインが、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子から成る群から選択される請求項53のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５５】
前記免疫刺激因子が異なるサイトカインの組み合わせである請求項47のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５６】
前記サイトカインの組み合わせが同じプロモーターから発現されるが、IRESメカニズムまたはレトロウイルスのスプライシングドナー／アクセプターメカニズムにより別個のタンパク質として発現される請求項55のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５７】
第一のHIV抗原をコードする第一のHIV配列であって、その発現が第一のプロモーターの転写制御下にある前記第一のHIV配列；および
第二のHIV抗原をコードする第二のHIV配列であって、その発現が前記第一のプロモーターとは異なる領域に配置された第二のプロモーターの転写制御下にある前記第二のHIV配列を含むリコンビナントアデノウイルスであって、前記第一および第二のHIV配列の発現が、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記第一および第二のHIV抗原に対する免疫反応を誘発する前記リコンビナントアデノウイルス。
【請求項５８】
前記リコンビナントアデノウイルスが複製不能である請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項５９】
前記第一および第二のHIV抗原が同じものである請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６０】
前記第一および第二のHIV抗原が異なる請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６１】
前記第一または第二のHIV抗原がHIVエンベロープタンパク質である請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６２】
前記HIVエンベロープタンパク質が野生型または変異体gp160、gp120またはgp41である請求項61のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６３】
前記HIVエンベロープタンパク質の切断部位が変異によって不活化される請求項62のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６４】
前記HIVエンベロープタンパク質のC-末端の細胞質ゾルドメインが欠失している請求項62のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６５】
前記HIVエンベロープタンパク質の切断部位およびC-末端細胞質ゾルドメインの両方が欠失している請求項62のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６６】
前記第一または第二のHIV配列がさらに、RT、PR、Tat、Vif、NefおよびRevから成る群から選択されるHIVタンパク質をコードする請求項61のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６７】
前記第一または第二のHIV抗原が、マルチクレードの可変ループを含む改変HIVエンベロープタンパク質である請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６８】
前記マルチクレードの可変ループが少なくとも２つのHIVクレードに由来するV3ループである請求項67のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項６９】
前記少なくとも２つのHIVクレードが、HIV-1単離株のM群のクレードA、B、C、D、E、FおよびGから成る群から選択される請求項68のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７０】
前記V3ループが、配列番号25、26、27、28、29、30および31から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる請求項68のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７１】
前記リコンビナントアデノウイルスに感染した細胞による前記第一および第二のHIV抗原の分泌を促進するシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７２】
前記シグナルペプチドがHIV gp120のシグナルペプチドである請求項71のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７３】
前記シグナルペプチドが配列番号74によってコードされる請求項71のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７４】
前記リコンビナントアデノウイルスに感染した細胞の表面に前記第一および第二のHIV抗原を結合させる膜固着ドメインをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７５】
前記膜固着ドメインがHIV gp41のトランスメンブレンドメインである請求項74のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７６】
前記膜固着ドメインが配列番号75によってコードされる請求項74のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７７】
前記第一および第二のHIV抗原がHIV構造タンパク質である請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７８】
前記HIV構造タンパク質が野生型HIV Gagである請求項77のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項７９】
前記HIV構造タンパク質がHIV Gagのタンパク分解フラグメントである請求項77のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８０】
HIV Gagのタンパク分解フラグメントがp17/24、p17およびp24から成る群から選択される請求項77のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８１】
HIV Gagのタンパク分解フラグメントが天然型、分泌型または膜結合型である請求項77のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８２】
Gagのタンパク分解フラグメントが、配列番号34、35、36、40、41、42、46、47および48から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる請求項77のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８３】
HIVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む請求項77のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８４】
HIVプロテアーゼをコードするポリヌクレオチドが配列番号56である請求項83のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８５】
前記第一のHIV抗原が野生型または変異体のHIVエンベロープタンパク質であり、前記第二のHIV抗原が野生型または変異体のHIV構造タンパク質である請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８６】
前記野生型または変異体のHIV構造タンパク質が野生型GagまたはGagのタンパク分解フラグメントである請求項85のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８７】
前記第一および第二のHIV抗原の両抗原が野生型または変異体のHIVエンベロープタンパク質である請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８８】
前記第一および第二のHIV抗原の両抗原が野生型または変異体のHIV構造タンパク質である請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項８９】
アデノウイルスにとって異種であり免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列であって、ホストにおけるその発現が前記第一および第二のHIV抗原の免疫原性を強化する前記免疫刺激因子配列をさらに含む請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９０】
前記第一および第二のHIV配列並びに免疫刺激因子配列が、内部リボソームエントリーサイトを介し、またはスプライシングドナー−アクセプターメカニズムを介して二シストロンとして同じプロモーターから発現される請求項89のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９１】
前記免疫刺激因子がサイトカインである請求項89のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９２】
前記サイトカインが、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子から成る群から選択される請求項91のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９３】
前記第一または第二のプロモーターがアデノウイルスプロモーターである請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９４】
前記第一または第二のプロモーターが非アデノウイルスプロモーターである請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９５】
前記非アデノウイルスプロモーターが、CMVプロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスLTRプロモーターおよびニワトリ細胞質β-アクチンプロモーターから成る群から選択される請求項94のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９６】
前記第一のプロモーターが前記アデノウイルスのE1領域にあり、前記第二のプロモーターが前記アデノウイルスのE4領域に配置される請求項57のリコンビナントアデノウイルス。
【請求項９７】
第一のHIV抗原をコードする第一のHIV配列を含む第一のリコンビナントアデノウイルスをホストに投与することを含む、HIV感染に対するホストの免疫を強化する方法であって、前記リコンビナントアデノウイルスによるホストの感染時に、前記第一のリコンビナントアデノウイルスによる前記第一のHIV抗原の発現が前記第一のHIV抗原に対する免疫反応を前記ホストで誘発する前記HIV感染に対するホストの免疫を強化する方法。
【請求項９８】
前記ホストへのリコンビナントアデノウイルスの投与が、筋肉内、気管内、皮下、鼻腔内、皮内、直腸内、経口的または非経口的に実施される請求項97の方法。
【請求項９９】
前記リコンビナントアデノウイルスがさらに、アデノウイルスにとって異種であり、免疫刺激因子をコードする1つまたは２つ以上の免疫刺激因子配列を含み、前記ホストにおけるその発現が前記HIV抗原の免疫原性を強化する請求項97の方法。
【請求項１００】
さらに前記ホストに免疫刺激因子を投与することを含む請求項97の方法。
【請求項１０１】
前記免疫刺激因子が、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子から成る群から選択されるサイトカインである請求項100の方法。
【請求項１０２】
さらに、第二のHIV抗原をコードする第二のHIV配列を含む、第一のリコンビナントアデノウイルスと異なる血清型の第二のリコンビナントアデノウイルスをホストに投与することを含み、前記リコンビナントアデノウイルスによるホストの感染時に、前記第二のリコンビナントアデノウイルスによる前記第二のHIV抗原の発現が前記第二のHIV抗原に対する免疫反応を誘発する請求項97の方法。
【請求項１０３】
前記第一のリコンビナントアデノウイルスの血清型がアデノウイルス血清型５であり、前記第二のリコンビナントアデノウイルスの血清型が、アデノウイルス血清型１−４および６−51から成る群から選択される請求項102の方法。
【請求項１０４】
前記第一のリコンビナントアデノウイルスによってコードされる前記第一のHIV抗原が前記第二のリコンビナントアデノウイルスによってコードされる第二のHIV抗原と同じものである請求項102の方法。
【請求項１０５】
前記第一のリコンビナントアデノウイルスによってコードされる前記第一のHIV抗原が前記第二のリコンビナントアデノウイルスによってコードされる前記第二のHIV抗原と異なる請求項102の方法。
【請求項１０６】
前記第二のリコンビナントアデノウイルスが前記第一のリコンビナントアデノウイルスと同じアデノウイルス骨格を有するが、ただし前記第二のリコンビナントアデノウイルスのファイバー領域の血清型が前記第一のリコンビナントアデノウイルス中のファイバー領域の血清型と異なる請求項102の方法。
【請求項１０７】
前記第二のリコンビナントアデノウイルスのファイバー領域のノブ、シャフトまたはペントンベースドメインが前記第一のリコンビナントアデノウイルス内の対応するものとは異なる血清型であることを除いて、前記第二のリコンビナントアデノウイルスが前記第一のリコンビナントアデノウイルスと同じアデノウイルスの骨格を有する請求項102の方法。
【請求項１０８】
前記第二のリコンビナントアデノウイルスが前記第一のリコンビナントアデノウイルスの投与後少なくとも1週間で前記ホストに投与される請求項102の方法。
【請求項１０９】
さらに第一のリコンビナントアデノウイルスの投与後に前記ホストから血清を採集することを含む請求項97の方法。
【請求項１１０】
前記ホストがヒトまたはヒト以外の霊長類である請求項109の方法。
【請求項１１１】
さらに、前記血清を少なくとも12時間保存し、続いて前記血清を前記ホストまたは別のホストに投与することを含む請求項109の方法。
【請求項１１２】
前記別のホストがヒトまたはヒト以外の霊長類である請求項111の方法。
【請求項１１３】
さらに、前記第一のリコンビナントアデノウイルスの投与後に前記第一のHIV抗原に対する抗体を前記ホストから単離し、続いて前記抗体を前記ホストまたは別のホストに投与することを含む請求項97の方法。
【請求項１１４】
その発現が第一のプロモーターの転写制御下にある第一のHIV抗原をコードする第一のHIV配列および、その発現が前記第一のプロモーターとは異なる領域に配置された第二のプロモーターの転写制御下にある第二のHIV抗原をコードする第二のHIV配列を含むリコンビナントアデノウイルスであって、前記第一および第二のHIV配列の発現が、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記第一および第二のHIV抗原に対する免疫反応を誘発する前記リコンビナントアデノウイルスを投与することを含むHIV感染に対するホストの免疫を強化する方法。
【請求項１１５】
さらに、前記リコンビナントアデノウイルスの初回投与後に再度少なくとも1回前記リコンビナントアデノウイルスを前記ホストに投与することを含む請求項114の方法。
【請求項１１６】
以下の工程を含む第一および第二の病原性ウイルスの感染に対するホストの免疫を強化する方法：
天然のアデノウイルスにとって異種であり、第一の病原性ウイルスに由来する第一のウイルス抗原をコードする第一の抗原を含む第一のリコンビナントアデノウイルスを前記ホストに投与して、ここで前記第一のリコンビナントアデノウイルスによる前記第一のウイルス抗原の発現が、前記第一のリコンビナントアデノウイルスによるホストの感染時に前記第一のウイルス抗原に対する免疫反応を誘発する工程；及び
天然のアデノウイルスにとって異種であり、第二の病原性ウイルスに由来する第二のウイルス抗原をコードする第二の抗原配列を含む第二のリコンビナントアデノウイルスをホストに投与して、ここで前記第二のリコンビナントアデノウイルスによる前記第二のウイルス抗原の発現が、前記第一のリコンビナントアデノウイルスによるホストの感染時に前記第二のウイルス抗原に対する免疫反応を誘発する工程。
【請求項１１７】
前記第一または第二のリコンビナントアデノウイルスのホストへの投与が、筋肉内、気管内、皮下、鼻腔内、皮内、直腸内、経口的または非経口的に実施される請求項116の方法。
【請求項１１８】
前記第一のリコンビナントアデノウイルスの血清型がアデノウイルスの血清型５であり、前記第二のリコンビナントアデノウイルスの血清型がアデノウイルスの血清型１−４および６−51から成る群から選択される請求項116の方法。
【請求項１１９】
前記第一のリコンビナントアデノウイルスによってコードされる第一のウイルス抗原が、前記第二のリコンビナントアデノウイルスによってコードされる前記第二のウイルス抗原と同じものである請求項116の方法。
【請求項１２０】
前記第一のリコンビナントアデノウイルスによってコードされる前記第一のウイルス抗原が、前記第二のリコンビナントアデノウイルスによってコードされる前記第二のウイルス抗原と異なる請求項116の方法。
【請求項１２１】
前記第二のリコンビナントアデノウイルスのファイバー領域が前記第一のリコンビナントアデノウイルスのそれと異なる血清型であるという点を除いて、前記第二のリコンビナントアデノウイルスが、前記第一のリコンビナントアデノウイルスと同じアデノウイルス骨格を有する請求項116の方法。
【請求項１２２】
前記第二のリコンビナントアデノウイルスのファイバー領域のノブ、シャフトまたはペントンベースドメインが前記第一のリコンビナントアデノウイルス内の対応するものとは異なる血清型であるという点を除いて、前記第二のリコンビナントアデノウイルスが前記第一のリコンビナントアデノウイルスと同じアデノウイルス骨格を有する請求項116の方法。
【請求項１２３】
前記第二のリコンビナントアデノウイルスのファイバー領域のノブドメインが前記第一のリコンビナントアデノウイルス内の対応するものとは異なる血清型であるという点を除いて、前記第二のリコンビナントアデノウイルスが前記第一のリコンビナントアデノウイルスと同じアデノウイルス骨格を有する請求項116の方法。
【請求項１２４】
前記第二のリコンビナントアデノウイルスが、前記第一のリコンビナントアデノウイルスの投与後少なくとも1週間で前記ホストに投与される請求項116の方法。
【請求項１２５】
前記第一または第二のリコンビナントアデノウイルスが複製不能である請求項116の方法。
【請求項１２６】
前記第一のリコンビナントウイルスがさらに、天然のアデノウイルスにとって異種であり、第一または第二の病原性ウイルスに由来する第三のウイルス抗原をコードする第三の抗原配列を含む請求項116の方法。
【請求項１２７】
前記第一および第三の抗原配列が前記第一のリコンビナントアデノウイルスの天然の原ウイルスのE1およびE3またはE4領域にそれぞれ配置される請求項126の方法。
【請求項１２８】
前記第一および第三の抗原配列が同じプロモーターによって二シストロンとして発現される請求項126の方法。
【請求項１２９】
前記第一および第二の抗原配列が内部リボソームエントリーサイトを介するか、またはスプライシングドナー−アクセプターメカニズムを介して二シストロンとして発現される請求項128の方法。
【請求項１３０】
前記第一のリコンビナントウイルスがさらに、天然のアデノウイルスにとって異種であり、第一または第二の病原性ウイルスに由来する第三のウイルス抗原をコードする第三の抗原配列を含み、さらに
前記第二のリコンビナントウイルスがさらに、天然のアデノウイルスにとって異種であり、第一または第二の病原性ウイルスに由来する第四のウイルス抗原をコードする第四の抗原配列を含む請求項116の方法。
【請求項１３１】
前記第一および第三の抗原配列が前記第一のリコンビナントアデノウイルスの天然の原ウイルスのE1およびE3またはE4領域にそれぞれ配置され、さらに前記第二および第四の抗原配列が前記第二のリコンビナントアデノウイルスの天然の原ウイルスのE1およびE3またはE4領域にそれぞれ配置される請求項130の方法。
【請求項１３２】
前記第一および第三の抗原配列が同じプロモーターによって二シストロンとして発現され、さらに前記第二および第四の抗原配列が同じプロモーターによって二シストロンとして発現される請求項131の方法。
【請求項１３３】
前記二シストロン性発現が内部リボソームエントリーサイトを介するか、またはスプライシングドナー−アクセプターメカニズムを介する請求項132の方法。
【請求項１３４】
前記第一および第二の病原性ウイルスが同じものである請求項116の方法。
【請求項１３５】
前記第一および第二の病原性ウイルスが同じ血清型であるが、異なるサブタイプまたはクレードである請求項116の方法。
【請求項１３６】
前記第一および第二の病原性ウイルスが同じウイルスの異なる型である請求項116の方法。
【請求項１３７】
前記第一および第二の病原性ウイルスが異なるウイルスである請求項116の方法。
【請求項１３８】
前記第一または第二の病原性ウイルスがヒト免疫不全ウイルスである請求項116の方法。
【請求項１３９】
前記第一または第二のウイルス抗原がHIV表面タンパク質、コア／キャプシドタンパク質、調節タンパク質、酵素または付属タンパク質である請求項138の方法。
【請求項１４０】
前記第一または第二のウイルス抗原が、HIV gp120、gp41、Gag、p17、p24、p2、p7、p1、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、VpuおよびNefから成る群から選択される請求項138の方法。
【請求項１４１】
前記第一または第二の病原性ウイルスがインフルエンザウイルスである請求項116の方法。
【請求項１４２】
前記第一または第二のウイルス抗原がインフルエンザウイルスの糖タンパク質である請求項141の方法。
【請求項１４３】
前記第一または第二のウイルス抗原がインフルエンザウイルス糖タンパク質HA1、HA2またはNAである請求項142の方法。
【請求項１４４】
前記第一または第二の病原性ウイルスがエボラウイルスである請求項116の方法。
【請求項１４５】
前記第一または第二のウイルス抗原がエボラ糖タンパク質である請求項144の方法。
【請求項１４６】
前記第一または第二のウイルス抗原がエボラGP1またはGP2タンパク質である請求項145の方法。
【請求項１４７】
前記第一または第二のウイルス抗原がエボラヌクレオキャプシドタンパク質である請求項146の方法。
【請求項１４８】
前記第一または第二の病原性ウイルスがマルブルグウイルスである請求項116の方法。
【請求項１４９】
前記第一または第二のウイルス抗原がマルブルグ糖タンパク質である請求項148の方法。
【請求項１５０】
前記第一または第二のウイルス抗原がマルブルグヌクレオキャプシドタンパク質である請求項148の方法。
【請求項１５１】
前記第一または第二の病原性ウイルスがアルボウイルスである請求項116の方法。
【請求項１５２】
前記第一または第二のウイルス抗原がアルボウイルスの糖タンパク質である請求項151の方法。
【請求項１５３】
前記第一または第二の病原性ウイルスが肝炎ウイルスである請求項116の方法。
【請求項１５４】
前記肝炎ウイルスがA、B、C、DまたはE型肝炎ウイルスである請求項153の方法。
【請求項１５５】
前記第一または第二のウイルス抗原がB型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質である請求項153の方法。
【請求項１５６】
前記第一または第二のウイルス抗原がB型肝炎ウイルスのSHBsAg、MHBsAgまたはLHBsAgである請求項155の方法。
【請求項１５７】
前記第一または第二のウイルス抗原がC型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質である請求項153の方法。
【請求項１５８】
前記第一または第二のウイルス抗原がC型肝炎ウイルスのNS3、NS4またはNS5抗原である請求項157の方法。
【請求項１５９】
前記第一または第二の病原性ウイルスが呼吸器系合胞体ウイルスである請求項116の方法。
【請求項１６０】
前記第一または第二のウイルス抗原が呼吸器系合胞体ウイルスの糖タンパク質または融合タンパク質である請求項159の方法。
【請求項１６１】
前記第一または第二の病原性ウイルスが単純疱疹ウイルスである請求項116の方法。
【請求項１６２】
前記第一または第二の病原性ウイルスが１型または２型単純疱疹ウイルスである請求項161の方法。
【請求項１６３】
前記第一または第二のウイルス抗原が２型単純疱疹ウイルスの糖タンパク質Dである請求項161の方法。
【請求項１６４】
前記第一または第二の病原性ウイルスがヒトパピローマウイルスである請求項116の方法。
【請求項１６５】
前記第一または第二のウイルス抗原がヒトパピローマウイルスのE6またはE7である請求項164の方法。
【請求項１６６】
前記第一または第二のウイルス抗原が、前記第一または第二の病原性ウイルスの主要な抗原、中和抗原またはエピトープを含む、完全長の抗原性ウイルスタンパク質または前記抗原性ウイルスタンパク質の部分である請求項116の方法。
【請求項１６７】
前記第一または第二のウイルス抗原が、前記第一または第二の病原性ウイルスの糖タンパク質から変異し、それによって前記第一または第二のウイルス抗原がウイルス成分として機能を失っているがその抗原性は保持している改変抗原である請求項116の方法。
【請求項１６８】
前記第一または第二のウイルス抗原の改変が、前記糖タンパク質のタンパク分解切断部位の欠失並びに前記糖タンパク質の免疫抑制ペプチド領域の複製および再配置を含む請求項167の方法。
【請求項１６９】
前記第一または第二のリコンビナントアデノウイルスがさらに、天然のアデノウイルスにとって異種であり、免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列を含む請求項116の方法。
【請求項１７０】
前記刺激因子がサイトカインである請求項169の方法。
【請求項１７１】
前記サイトカインが、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子から成る群から選択される請求項170の方法。
【請求項１７２】
さらに、前記第一および第二のリコンビナントアデノウイルスの投与後に前記ホストから血清を採集することを含む請求項116の方法。
【請求項１７３】
前記ホストがヒトまたはヒト以外の霊長類である請求項172の方法。
【請求項１７４】
さらに、少なくとも12時間血清を保存し、続いて前記血清を前記ホストまたは別のホストに投与することを含む請求項172の方法。
【請求項１７５】
前記別のホストがヒトまたはヒト以外の霊長類である請求項174の方法。
【請求項１７６】
前記第一および第二のリコンビナントアデノウイルスの投与後に、前記ホストから前記第一または第二のウイルス抗原に対する抗体を前記ホストから単離し、続いて前記抗体を前記ホストまたは別のホストに投与する工程をさらに含む請求項116の方法。
【請求項１７７】
前記ホストまたは前記別のホストがヒトまたはヒト以外の霊長類である請求項176の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明はヒトおよび他のホストで免疫反応を刺激するためのワクチンに関する。特に本発明は、ホストでヒト免疫不全ウイルス（HIV）の異種抗原を発現し、HIV感染に対し免疫反応を誘発するリコンビナントウイルスに関する。
背景技術
ワクチン開発のための従来の技術は、主として変性ウイルスまたは細菌から産生された精製ウイルスタンパク質を使用するという考えを基にしている。このようなタイプのワクチンは限定された数の感染性因子にのみ有効であり、防御率も限られる。
膜（エンベロープ）糖タンパク質（GP）を含むウイルス（エボラウイルスおよびHIVウイルスを含む）の場合、変性ウイルスまたは精製ウイルスタンパク質の使用はしばしば満足な作用を示さない。これにはいくつかの理由が存在するのであろう。第一に、これらウイルスのGPは変性工程に鋭敏で、その結果タンパク質のエピトープがこの変性工程で変化する。第二に、GPの糖部分は中和抗体の重要な抗原決定基である。比較してみると、細菌で産生されるタンパク質は糖付加が適切ではなく、幾分異なる構造に折り畳まれ、前記構造は天然のウイルスタンパク質の抗原性とは異なる抗原性を有するであろう。さらに、弱毒または変性ウイルスによるワクチンの多くは、免疫原性の乏しい抗原に対しては弱い免疫反応しか提供しない。さらにまた、このようなワクチン調製物の防御はしばしば限定的で、所望されるような生涯にわたる免疫を提供しない。
【０００２】
他のワクチン方法は体内に直接注入されたプラスミドによって抗原を発現させる（いわゆる裸出DNAまたはDNAワクチン技術）。これらの方法は、抗原をコードする遺伝子を保持するDNAプラスミドをin vivoで細胞にトランスフェクトすることによって、前記プラスミドを意図的に導入することを必要とする。前記プラスミドは免疫反応を惹起する抗原を発現する。DNAワクチンによって刺激される免疫反応の有効性は、おそらくプラスミドの取り込みが低レベルであるため、さらに細胞での抗原発現が低レベルであるために非常に低い。DNAワクチンはまた、ベクターの分解のために抗原発現期間が極めて短いことが特徴である。さらにまた、DNAワクチンは、大量生産が困難かつ高価である。
さらに、複製能を有する生ワクシニアウイルスが、B型肝炎（HBV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、インフルエンザおよびマラリア抗原の遺伝子発現のために改変された。いくつかの事例では、しかしながらリコンビナントワクチンの免疫反応はしばしば特性および規模が限定される。したがって、例えばワクシニアインフルエンザリコンビナントによる末梢免疫は下気道感染に対して良好な防御を提供するが、一方、上気道免疫を誘発することはできない。他方、リコンビナントワクチンによる末梢免疫は、例えば胃腸管の場合のように、全身免疫ではなく局所免疫が要求されるときには有効ではないであろう。
【０００３】
エボラウイルスGPを発現しているリコンビナントワクシニアウイルスによるワクチン接種が試みられ、モルモットで部分的防御が提供された（K.J. Gilligan et al., Vaccines, 97:87-92(1997)）。GPまたはヌクレオキャプシドタンパク質（NP）のいずれかを発現するDNA構築物によるワクチン接種によってマウスはエボラウイルスの致死的攻撃から防御される（L. Vancerzanden et al., Virology, 246(1):134-144(1998)）。しかしながら、これらのアプローチはいずれもそれぞれの制限事項を有し、これらの制限事項はヒトでのエボラウイルスワクチンの選択を理想からほど遠いものにしている。例えば、ワクシニアウイルスはベクター感染細胞を迅速に殺し、結果としてワクチン抗原は極めて短時間発現されるだけである。しかしながら、このタイプのアプローチの主要な限界は、ワクシニアウイルスの複製は主としてワクシニアタンパク質に対して免疫系の反応を惹起し、わずかな割合の免疫反応が病原性ウイルスの抗原に誘導されるだけである。この現象は“抗原希釈”と称されている。
これらの欠陥を克服しようとしたこれまでの試み（より強力なプロモーターを有するウイルス（例えばポックスウイルス）によるワクチン抗原の発現を含む）では顕著な成功が得られていない。
さらにまた、HIV感染に対する防御の付与ではいずれのワクチンも有効ではなかった。ワクチン開発の試みはしたがって成功していない。HIVと反応するある種の抗体、特に抗GP160/120は、HIV感染の無症候期および症候期の両期を通じて高レベルで存在し、そのような抗体は、防御的役割を果すのではなく、実際にはウイルスのホスト細胞への付着および侵入を促進する可能性を示している。より重要なことには、従来のワクチンは、新規に放出されるビリオンの供給源である感染細胞に対して有効な細胞性反応を誘発しない。
【０００４】
発明の要旨
ウイルス遺伝子ワクチンが提供される。これらのワクチンは病原性ウイルスの自然感染を摸倣するが、免疫されるべきホスト（例えばヒト、家畜および他の哺乳類）で前記病原性ウイルスに本来附随する疾患をひき起こさないようにデザインされる。
本ワクチンは、複製欠損または複製不能リコンビナント良性ウイルスである。前記良性ウイルスは、広範囲の病原体（例えばウイルス、細菌および寄生虫）に由来する抗原を発現するようにデザインされ、したがってこれらの抗原を本来発現する前記広範囲のウイルス、細菌および寄生虫の治療に用いることができる。前記良性ウイルスの感染によって、前記病原性ウイルスの抗原の発現がホスト細胞で惹起され、あたかも細胞が病原性ウイルスに感染したかのようにその天然の構造および経路で抗原が提示され、強力で長期にわたる免疫反応がホストで誘発される。
ある実施態様では、良性リコンビナントウイルスは、前記ウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発するために提供される。前記リコンビナントウイルスは以下を含む：前記良性ウイルスにとって異種であって病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードする抗原配列（前記ウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記病原性ウイルスおよび前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する）；および前記良性ウイルスとは異種であって免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列（前記ホストにおける前記配列の発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する）。前記リコンビナントウイルスは複製不能であり、病原性ウイルスに附随する疾患をホストで惹起しない。
【０００５】
この実施態様の応用例では、前記リコンビナント良性ウイルスは複製不能ウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ附随ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルスまたはワクシニアウイルスである。好ましくは、前記良性ウイルスはこのウイルスの天然の原ウイルスの病理学的領域をもたないがその感染性は保持している。
好ましい実施態様では、前記良性ウイルスは複製不能のアデノウイルスであり、より好ましくはアデノウイルス５型である。前記異種抗原配列は前記アデノウイルスのE1、E3またはE4領域に配置することができる。前記免疫刺激因子配列は前記アデノウイルスのE4、E3またはE1領域に配置することができる。
好ましい実施態様の応用例では、前記異種抗原配列および免疫刺激因子配列はアデノウイルスのE1、E3またはE4領域に配置することができ、この場合、前記異種抗原配列および免疫刺激因子配列は、内部リボソームエントリーサイトを介してまたはスプライシングドナー‐アクセプターメカニズムを介して二シストロンとして、１つのプロモーターから発現される。
ウイルス抗原または免疫刺激因子の発現は、天然の原ウイルスにとって同種のプロモーターによって制御することができる。また別には、ウイルス抗原の発現は、天然の原ウイルスにとって異種であるプロモーターによって制御することができる。例えば、天然の原ウイルスにとって異種である前記リコンビナントウイルスのプロモーターは、真核細胞プロモーター（例えばインスリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよびその初期プロモーター、サルウイルスSV40プロモーター、ラウスサルコーマウイルスLTRプロモーター／エンハンサー、ニワトリ細胞質β-アクチンプロモーター）および誘発性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘発性プロモーター）であろう。
【０００６】
前記病原性ウイルスは、ヒトまたは他の動物で病原性作用または疾患をひき起こすいずれの病原性ウイルスでもよい。したがって、リコンビナント良性ウイルスは、前記病原性ウイルスの感染からホストを防御するためのワクチンとして用いることができる。
応用例では、前記病原性ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の種々の株（例えばHIV-１およびHIV-2）であろう。前記ウイルス抗原は、HIV糖タンパク質（または表面抗原）（例えばHIV GP120およびGP41）またはカプシドタンパク質（または構造タンパク質）（例えばHIV P24タンパク質）であろう。
別の応用例では、前記病原性ウイルスはエボラウイルスであろう。そのウイルス抗原はエボラ糖タンパク質または表面抗原、例えばエボラGP1またはGP2タンパク質であろう。
さらに別の応用例では、前記病原性ウイルスは肝炎ウイルス、例えばA、B、C、DまたはE型肝炎ウイルスであろう。例えば、そのウイルス抗原はB型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質、例えばB型肝炎小型表面抗原（SHBsAg）（オーストラリア抗原とも称される）、B型肝炎中型表面抗原（MHBsAg）およびB型肝炎大型表面抗原（LHBsAg）であろう。前記ウイルス抗原はC型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質、例えばNS3、NS4およびNS5抗原であろう。
さらに別の応用例では、前記病原性ウイルスは呼吸器系合胞体ウイルス（RSウイルス）（RSV）であろう。例えば、前記RSVウイルス抗原はRSVの糖タンパク質（G-タンパク質）またはRSVの融合タンパク質であろう（その配列はGenBankから入手できる）。
さらに別の応用例では、病原性ウイルスは単純疱疹ウイルス（HSV）、例えばHSV-1およびHSV-2であろう。例えばHSVウイルス抗原はHSV-2の糖タンパク質Dであろう。
さらに別の応用例では、前記ウイルス抗原は、腫瘍抗原（例えば乳癌細胞のHer2およびリンパ腫細胞のCD20）、ウイルスオンコジーン（例えばヒトパピローマウイルスのE6およびE7）または細胞性オンコジーン（例えば変異ras）であろう。
他のウイルス関連タンパク質または抗原も当業者には容易に利用可能であることは特記されよう。病原性ウイルスおよび前記病原性ウイルスに附随するウイルス抗原の選択は本発明の制限的事項ではない。
【０００７】
前記リコンビナントウイルスはまた免疫刺激因子を発現し、ウイルス感染時のホスト細胞のサイトカイン放出反応を摸倣し、前記リコンビナントウイルスから一緒に発現されるウイルス抗原に対する免疫反応をいっそう増強させる。前記免疫刺激因子は好ましくはサイトカインであろう。サイトカインの例には、インターロイキン-2、インターロイキン-8、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
前記ウイルス抗原は完全長の抗原性ウイルスタンパク質であってもよいが、また前記病原性ウイルスの主要抗原、中和抗原もしくはエピトープを含む抗原性ウイルスタンパク質の一部分であってもよい。また別には、前記ウイルス性抗原は、前記病原性ウイルスの少なくとも２つの株の糖タンパク質の定常領域を含む。
ある応用例では、前記ウイルス抗原は、ウイルス成分として機能をもたないがその抗原性は保持するように前記病原性ウイルスの糖タンパク質から変異させた改変抗原であろう。ウイルス抗原のそのような改変には、糖タンパク質のタンパク分解切断部位内の欠失並びに糖タンパク質の免疫抑制ペプチド領域の複製および再配列が含まれる。
【０００８】
別の実施態様では、リコンビナントアデノウイルスが、このウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発するために提供される。前記リコンビナントウイルスは、アデノウイルスとは異種で病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードする抗原配列を含む。前記リコンビナントアデノウイルスがホストに感染した時、前記ウイルス抗原の発現によって前記ウイルス抗原に対する免疫反応が誘発される。
前記の実施態様の好ましい応用例では、前記リコンビナントウイルスは複製不能アデノウイルスである。特に、前記病原性ウイルスはHIVであり、種々の型（例えばHIV-1およびHIV-2）、株（例えばHIVのBH10株およびｐNL4-3株）、単離株、単離株群内のクレード（例えばHIV-1単離株のMグループのクレードA、B、C、D、E、FおよびG）を含む。前記ウイルス抗原は以下のものであろう：１）HIV糖タンパク質（または表面抗原）、例えばHIVエンベロープタンパク質Env（完全長の野生型（gp160）、切端型（例えばgp120およびgp41）または挿入、欠失もしくは置換を含む改変型）；２）HIV構造タンパク質Gag（完全長の野生型、またはプロテアーゼ処理生成物もしくは種々の形態のフラグメント（例えばHIVキャプシドタンパク質（例えばHIVp24およびp17）の天然形、分泌形もしくは膜結合形）；および３）HIV調節タンパク質（例えばTat、Vif、NefおよびRev）。
【０００９】
この応用例にしたがえば、前記HIV抗原は、配列番号14、16、20、21、22、23および24から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるHIVエンベロープタンパク質である。前記ポリヌクレオチドはさらにHIV調節タンパク質（例えばTat、Vif、NefおよびRev）をコードすることができる。
さらにまた前記の応用例にしたがえば、前記HIV抗原は、多種クレードの可変ループを含む改変HIVエンベロープタンパク質である。好ましくは、前記多種クレードの可変ループは種々のクレード（例えばHIV-1単離株のMグループのクレードA、B、C、D、E、FおよびG）に由来するV3ループである。多種クレードの可変ループを含む前記改変HIVエンベロープタンパク質は、種々のHIVクレードに由来する２つまたは３つ以上のループ、好ましくは、配列番号25、26、27、28、29、30および31から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされるV3ループを含むことができる。より好ましくは、多種クレードの可変ループを含む前記改変HIVエンベロープタンパク質は、配列番号32、52および54から成る群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる。
さらにまた前記応用例にしたがえば、前記HIV抗原はHIV構造タンパク質である。前記HIV構造タンパク質は、配列番号17によってコードされる完全長の野生型GagまたはGagのタンパク分解フラグメント（例えばp17/24、p17およびp24）であろう。フラグメントp17/24は、天然型であって配列番号34によってコードされるものでも、分泌型であって配列番号34によってコードされるものでも、または配列番号36によってコードされる膜結合型であってもよい。前記フラグメントp17は、天然型であって配列番号40によってコードされるものでも、分泌型であって配列番号41によってコードされるものでも、または膜結合型であって配列番号42によってコードされるものであってもよい。
同様に、p24は、天然型であって配列番号46よってコードされるものでも、分泌型であって配列番号47によってコードされるものでも、または膜結合型であって配列番号48によってコードされるものであってもよい。
【００１０】
前記リコンビナントウイルスは、さらにHIVプロテアーゼPIをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号56（その発現は同じリコンビナントウイルスまたは別のベクターから発現されるGagのタンパク分解処理を促進する）を含むことができる。PIはGagとの融合タンパク質として、または、異なるプロモーターから別個に、またはIRESもしくはスプライシングドナー／アクセプタースメカニズムを介してGagのための同じプロモーターから発現させてもよい。
前記リコンビナントウイルスはさらに、HIVプロテアーゼPIおよびHIV逆転写酵素RTの融合タンパク質（PI/RT）をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。PIは、Gagとの融合タンパク質として、または、異なるプロモーターから別個に、またはIRESもしくはスプライシングドナー／アクセプターメカニズムを介してGagのための同じプロモーターから発現させてもよい。
前記リコンビナントウイルスはさらに、HIV Pol遺伝子であってHIV酵素タンパク質（HIVプロテアーゼPI、逆転写酵素RTおよびインテグラーゼIN）をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。Polは、Gagとの融合タンパク質として、または異なるプロモーターから別個に、またはIRESもしくはスプライシングドナー／アクセプターメカニズムを介してGagのための同じプロモーターから発現させてもよい。
場合によって前記リコンビナントウイルスはさらに前記ウイルスとは異種である免疫刺激因子配列を含むことができる。前記配列は、ホストでのその発現によって前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する免疫刺激因子をコードする。
【００１１】
本発明はまたウイルスワクチンを提供し、前記ワクチンは、天然の病原性ウイルスの本来の感染にさらに近似する、病原性ウイルスの種々の株または型に対する強力で長期間持続する免疫反応をホストで誘発するために前記ホストに多種抗原を提示する。
ある実施態様では、ウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発するウイルスワクチンとしてリコンビナントウイルスが提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスにとって異種の複数の抗原配列であって各々が同じ病原性ウイルスまたは異なる種類の病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードするものを含み、前記複数の抗原配列の発現は、リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、病原性ウイルスに本来の状態で附随している悪性性をホストで惹起しないであろう。
前記実施態様にしたがえば、前記リコンビナントウイルスは任意のウイルス、好ましくは複製不能アデノウイルス、アデノ附随ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルスまたはワクシニアウイルスであろう。さらに前記良性ウイルスではその本来の原ウイルスの病原性領域は欠落しているがその感染性は保持されている。
さらにまた前記実施態様にしたがえば、前記複数の抗原配列は、同じ抗原配列のマルチコピーまたは互いに異なる多種の抗原配列であろう。
【００１２】
前記実施態様の応用例では、前記複数の抗原配列の少なくとも２つは、内部リボソームエントリーサイトまたはスプライシングドナーアクセプターメカニズムを介して１つのプロモーターから二シストロンとして発現される
場合によって、前記複数の抗原配列の少なくとも２つは１つのプロモーターから発現され融合タンパク質を生じる。
また前記実施態様にしたがえば、前記ウイルスゲノムはさらに、前記リコンビナントウイルスの本来の原ウイルスにとって異種の少なくとも１つのプロモーターを含み、前記プロモーターは前記複数の抗原配列の少なくとも２つの発現を制御する。前記リコンビナントウイルスの本来の原ウイルスにとって異種のプロモーターの例には、インスリンプロモーター、CMVプロモーターおよびその初期プロモーター、SV40プロモーター、レトロウイルスLTRプロモーター／エンハンサー、ニワトリ細胞質β-アクチンプロモーターおよび誘発性プロモーター、例えばテトラサイクリン誘発性プロモーターが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
さらに前記実施態様にしたがえば、前記複数の抗原配列は病原性ウイルスの少なくとも２つの株の組み合わせであろう。
場合によって前記複数の抗原配列は少なくとも２つの異なる病原性ウイルスに由来する抗原の組み合わせであろう。例えば、前記複数の抗原配列は、HIV-1、HIV-2、１型単純疱疹ウイルス、２型単純疱疹ウイルス、エボラウイルス、マルブルク（Marburg）ウイルス、アルボウイルス（脳炎、黄熱病およびデング熱をおこす蚊によって媒介されるウイルス群）、およびA、B、C、DおよびE型肝炎ウイルス由来の抗原の組み合わせであろう。
【００１３】
前記実施態様の応用例では、前記リコンビナントウイルスはさらに１つまたは２つ以上の免疫刺激因子配列を含むことができる。前記配列は、前記良性ウイルスにとって異種であって免疫刺激因子をコードし、ホストにおけるその発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する。例えば、前記免疫刺激因子はサイトカインであろう。前記サイトカインの例には、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、G-CSFおよびGM-CSFが含まれるが、ただしこれに限定されない。
前記の応用例にしたがえば、前記1つまたは２つ以上の免疫刺激因子配列は同じ免疫刺激因子配列のマルチコピーであるか、または互いに異なる多種の免疫刺激因子配列であろう。
場合によって、前記免疫刺激因子配列の少なくとも２つは、内部リボソームエントリーサイトを介してまたはスプライシングドナー‐アクセプターメカニズムを介してマルチシストロンとして１つのプロモーターから発現される。また別には前記免疫刺激因子配列の少なくとも２つは１つのプロモーターから発現され融合タンパク質を形成してもよい。
【００１４】
本発明はまた、病原性細菌に対し強力で長期間持続する免疫反応を誘発する遺伝子ワクチンを提供する。ある実施態様では、リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発させる細菌遺伝子ワクチンとして提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスにとって異種の複数の抗原配列であって各々が病原性細菌に由来する細菌抗原をコードするものを含み、前記複数の細菌抗原配列の発現は、リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記細菌抗原および前記細菌抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、前記病原性細菌に本来の状態で附随する悪性性をホストで惹起しないであろう。
前記病原性細菌は、ホストで病原性作用を惹起する任意の病原性細菌、例えば以下の細菌であろう：結核菌（Bacillus tuberculoses）、炭疽菌（Bacillus anthracis）（草食動物の炭疽病を起す）およびスピロヘータボレリア＝ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）（動物でライム病をおこす）。前記複数の抗原配列は、病原性細菌の致死因子、防御抗原、浮腫因子またはその組み合わせであろう。
【００１５】
本発明はまた、病原性寄生虫に対し強力で長期間持続する免疫反応を誘発する寄生虫ワクチンを提供する。ある実施態様では、前記リコンビナントウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発する寄生虫ワクチンとして、リコンビナントウイルスが提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記良性ウイルスにとって異種の複数の抗原配列であって各々が病原性寄生虫に由来する寄生虫抗原をコードするものを含み、前記複数の寄生虫抗原配列の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記寄生虫抗原および前記寄生虫抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、病原性寄生虫に本来の状態では附随している悪性性をホストで惹起しないであろう。
前記病原性寄生虫はホストで病原性作用または疾患をひき起こす任意の病原性寄生虫、例えばクリプトスポリジウム、エイメリア、ヒストモナス、ロイコチトゾーン、プラスモジウム、トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニア、トリパノソーマ、ジアルジア、バーベシアおよびタイレリアであろう。前記複数の抗原配列は前記病原性寄生虫のコートタンパク質、アタッチメントタンパク質またはその組み合わせであろう。
本発明はまた本発明のウイルスワクチンを含む医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、上記で述べた任意のリコンビナントウイルスおよび医薬的に許容できる担体または希釈剤を含むことができる。
前記医薬組成物はまた、リコンビナントウイルスから発現されるウイルス抗原に対する免疫反応を強化するアジュバントを含むことができる。前記アジュバントの例には、バチルスカルメット‐ゲリン（Calmette-Guerin）、内毒素リポ多糖類、カサガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン、インターロイキン-2、GM-CSFおよびチトキサン（cytoxan）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００１６】
本発明はまたキットに関する。これらのキットは、本発明の１つまたは２つ以上の任意のワクチンを、前記ワクチンをホストにデリバーするための組成物および／またはホストに前記ワクチンを送達するために装置（例えば注射筒）と一緒に含むことができる。
本発明はまた、上記に述べたリコンビナントウイルスを用いてホストの免疫を強化する方法を提供する。
ある実施態様では、前記方法は、リコンビナントウイルスを免疫反応の誘発に有効な量でホストに投与することを含む。前記リコンビナントウイルスは以下を含む：前記リコンビナントウイルスとは異種であり病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードする抗原配列（前記ウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現している細胞に対する免疫反応を誘発する）；および前記良性ウイルスとは異種である免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列（ホストにおけるその発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する）。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であり、病原性ウイルスに本来の状態では附随している悪性性を前記ホストで惹起しない。
前記リコンビナントウイルスは、医薬的に許容できる任意の投与ルートによりホストに投与することができる。前記リコンビナントウイルスは、筋肉内、気管内、皮下、鼻腔内、皮内、粘膜内、直腸内ルート、経口および非経口投与によりホストに投与することができる。
【００１７】
別の実施態様では、多種抗原を用いて病原性ウイルスに対するホストの免疫を強化する方法が提供される。前記方法は、免疫反応を誘発するために有効な量でリコンビナントウイルスをホストに投与することを含む。前記リコンビナントウイルスは、前記良性ウイルスにとって異種の複数の抗原配列であって各々が病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードするものを含む。前記複数の抗原配列の発現は、リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、前記病原性ウイルスに本来の状態では附随している悪性性をホストで惹起しないであろう。
場合によって、前記リコンビナントウイルスはさらに、前記リコンビナントウイルスとは異種であり、免疫刺激因子をコードする１つまたは２つ以上の免疫刺激因子配列で、その発現が前記ウイルス抗原の免疫原性をホストで強化するものを含むことができる。
【００１８】
さらに別の実施態様では、マルチリコンビナントウイルスワクチン（またはウイルス）を用いることによって病原性ウイルスに対するホストの免疫を強化する方法が提供される。マルチリコンビナントウイルスは、それぞれのリコンビナントウイルス中に異なる抗原を保持することができる。前記マルチリコンビナントウイルスは同時にまたは段階的にホストに投与することができる。
前記方法は、第一および第二のリコンビナントウイルスを免疫反応の誘発に有効な量でホストに投与することを含む。前記第一のリコンビナントウイルスは、前記第一のリコンビナントウイルスにとって異種であり病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードする抗原配列を含む。前記ウイルス抗原の発現は、リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記第二のリコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスにとって異種であり免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列を含む。前記免疫刺激因子の前記ホストでの発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する。前記第一および第二のリコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であり、病原性ウイルスに本来の状態で附随する悪性性をホストで惹起しない。
【００１９】
前記実施態様にしたがえば、前記第一および第二のリコンビナントウイルスは任意の良性ウイルス、例えば複製不能アデノウイルス、アデノ附随ウイルス（AAV）、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルス、アルファウイルス、ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスおよびワクシニアウイルスであろう。
場合によって、前記第一および第二のリコンビナントウイルスの両ウイルスが複製不能アデノウイルスであろう。さらに場合によって、第一および第二のリコンビナントウイルスの一方はリコンビナントアデノウイルスであり、他方はリコンビナントAAV、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルス、アルファウイルス、ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスまたはワクシニアウイルスであろう。
さらに別の実施態様では、病原体に対するホストの免疫を強化する方法が提供される。前記方法は、リコンビナントウイルスおよび１つまたは２つ以上の免疫刺激因子を投与することを含む。前記リコンビナントウイルスは上記に述べたリコンビナントウイルスのいずれかであろう。特に、前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスにとって異種である、前記病原体由来の１つまたは２つ以上の抗原をコードする１つまたは２つ以上の抗原配列を含む。前記抗原の発現は、リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記抗原および前記抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは、好ましくは複製不能であり、前記病原体に本来の状態で附随する悪性性をホストで惹起しない。前記病原体は病原性ウイルス、例えばHIV、肝炎ウイルスおよびエボラウイルス、病原性細菌または寄生虫であろう。
【００２０】
この実施態様にしたがえば、前記免疫刺激因子は、前記リコンビナントウイルスに感染した細胞によって発現される抗原の免疫原性を強化する任意の分子であろう。好ましくは、前記免疫刺激因子は以下を含むサイトカインであるが、ただしこれらに限定されない：インターロイキン-2、インターロイキン-8、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子およびその組み合わせ。前記サイトカインは、精製タンパク質単独形または1つもしくは２つ以上の医薬的に許容できる賦形剤との製剤形でホストに投与することができる。また別には、前記サイトカインは、ホストの細胞にトランスフェクトしたときまたはホスト細胞の形質転換時に前記サイトカインのコード配列を発現する発現ベクターの形態で投与してもよい。
本発明の上記実施態様のいずれかにしたがえば、前記方法は、さらに前記リコンビナントウイルスを再度ホストに投与して前記免疫反応を追加支援することを含むことができる。前記リコンビナントウイルスによるそのようなブースター接種は、好ましくは初回接種の後数週間から数ヶ月実施される。高レベルの感染防御または前記病原体の感染により生じる疾患の有効な治療を担保するために、規則的な間隔で（例えば数年毎に１回）ブースター免疫をホストに再実施することが有用であろう。ブースター免疫で投与されるリコンビナントウイルスは、初回免疫で投与されたリコンビナントウイルスと同じでも異なっていてもよい。
【００２１】
本発明の方法の上記実施態様のいずれかにしたがえば、さらに前記方法は前記リコンビナントウイルスによってコードされるものと同じまたは異なる抗原をコードするプラスミドベクターをホストに投与することを含むであろう。前記プラスミドベクターは好ましくは真核細胞プラスミド発現ベクターであり、前記は細胞のトランスフェクション時に前記抗原をホストで発現する。
さらにまた本発明の方法の上記実施態様のいずれかにしたがえば、さらに前記方法は、第二のリコンビナントウイルスをホストに投与し、前記免疫反応を追加支援し、および／または前記リコンビナントウイルスに対するホストの免疫系の中和作用を最小限することを含むであろう。
場合によって、前記第二のリコンビナントウイルスは、初回免疫で投与された第一のリコンビナントウイルスに含まれた第一の抗原配列と異なる、第二の病原体由来の第二の抗原配列を含む。好ましくは、前記第二の抗原配列は、第一の抗原配列によってコードされたものと同じ型の抗原であるが、同じ病原体の異なる株、血清型またはサブタイプ／クレードに由来する抗原型をコードする。また別には、前記第二の抗原は第一の抗原に対し異なる型の抗原であってもよい。例えば、第一の抗原は、同じまたは異なる病原体の表面タンパク質であり、第二の抗原はコアタンパク質である。
【００２２】
さらにまた本発明の方法の上記実施態様のいずれかにしたがえば、さらに前記方法は、上記実施態様のリコンビナントウイルスのいずれかの投与前、同時、または投与後にホストにウイルスベクターを投与し、前記リコンビナントウイルスに対するホスト免疫系の中和作用を最小限にすることを含むであろう。好ましくは、前記ウイルスベクターは前記リコンビナントウイルスの投与後に投与される。
前記ウイルスベクターは前記リコンビナントウイルスの本来の子孫であろう。例えば、前記ウイルスベクターは野生型アデノウイルス５型（Ad5）で、一方、前記リコンビナントウイルスは遺伝的に改変されたAd5である。
場合によって、前記ウイルスベクターは、リコンビナントウイルスとは異なる血清型の野生型または遺伝的に改変されたウイルスであってもよい。例えば、前記リコンビナントウイルスは遺伝的に改変されたAd5であり、一方、前記ウイルスベクターはAd5血清型以外（例えば血清型1−4または6−51）の野生型または遺伝的に改変されたアデノウイルスベクターであろう。後に発見および／または分類される他の血清型もまた本発明の範囲内に包含されることを特記する。
さらに場合によって、前記ウイルスベクターは、前記リコンビナントウイルスとは異なるウイルスでもよい。例えば、前記リコンビナントウイルスは遺伝的に改変されたAd5であり、一方、前記ウイルスベクターは遺伝的に改変されたAAV、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルス、アルファウイルス、ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスまたはワクシニアウイルスである。前記ウイルスベクターは、異種抗原配列を含んでいてもいなくてもよい。好ましくは前記ウイルスベクターは別の抗原配列を含み、前記抗原配列は前記リコンビナントウイルスによって運ばれる抗原配列と同じまたは異なっている。
【００２３】
また場合によって、前記ウイルスベクターは、前記リコンビナントウイルスの本来の原ウイルスをベースにして改変したキメラベクターであってもよい。例えば、前記リコンビナントウイルスの本来の原ウイルスが５型アデノウイルスである場合、前記ウイルスベクターは、５型から他のアデノウイルス血清型由来の対応する領域に変更された骨格の一定領域を有するキメラアデノウイルス５型であろう。例えば、５型アデノウイルス骨格中のファイバーノブ、シャフトおよび／またはペントンベースは、アデノウイルスの1−4および6−51血清型に由来する骨格の対応する領域によって置き換えることができる。
さらに場合によって、前記ウイルスベクターはまた1つもしくは２つ以上の異種抗原配列および／または免疫刺激因子配列を含み、それらは前記リコンビナントウイルスのものと同じでも異なっていてもよい。
上記で述べた方法は疾患の予防または治療に用いることができる。治療方法では、本発明のリコンビナントウイルスの投与は“予防”または“治療”のいずれも目的とすることができる。予防的に提供されるとき、前記リコンビナントウイルスは一切の症状の出現前に提供される。前記リコンビナントウイルスの予防的投与は、その後の一切の感染または疾患の予防または軽減に役立つ。治療的に提供されるとき、前記リコンビナントウイルスは、感染または疾患の開始時（または開始後）に提供される。したがって、本発明は、疾患の原因因子への予想される暴露前または感染もしくは疾患の開始および／または進行後に提供することができる。
【００２４】
本発明の刷新的なアプローチはまた癌ワクチンの構築にも用いることができることは特記されよう。例えば、前記リコンビナントウイルスおよびその使用方法に上記実施態様のいずれかでウイルス抗原をコードする抗原配列を、腫瘍特異抗原をコードする配列に置き換えることができる。ホストでの腫瘍特異抗原の発現は、癌進行のリスクの高い患者で予防のための特異的な免疫反応（すなわち予防免疫）を誘発するはずである。前記はまた、他の治療とともに癌の治療を強化するために、腫瘍外科手術後の疾患再発予防（抗転移ワクチン）のために、またはin vivoでのCTLの数を増加させるために（したがって浸潤腫瘍の根絶におけるその有効性を改善する）用いることができる。さらにまた、本発明の方法は、担癌患者に戻す前にex vivoで強化される患者の免疫反応（養子免疫療法）を誘発することができる。
さらに本発明の方法の上記実施態様のいずれかにしたがえば、前記方法はさらに、前記リコンビナントウイルスの投与後にホストから血清を採集することを含むであろう。前記採集した血清は前記リコンビナントによってコードされた抗原に対する抗体を含んでいるはずである。場合によって、前記方法はさらに前記リコンビナントウイルスの投与後にホストから前記病原体に対する抗体を単離することができる。前記採集血清または単離抗体は一定期間更なる使用のために保存することができる。例えば、募集した健常人をホストとして用い、その採集血清または抗体を前記病原体の感染を予測して、または前記病原体の感染があったときに、前記病原体に対する受動免疫を誘発することにより予防剤または治療剤として後にその者または別個の者に投与することができる。場合によって、前記ホストはヒト以外の動物で、前記リコンビナントウイルスによって免疫された動物から採集された血清または単離された抗体を予防剤または治療剤として用い、前記病原体の感染が予想されるか、または前記病原体の感染時に（例えば生物学的兵器による戦争勃発時に）ヒトまたはヒト以外の動物を治療することができる。
前記リコンビナントウイルスに含まれる上記記載の抗原および免疫刺激因子のいずれかのDNA配列で改変および変更を実施し、なお前記変異体の機能的同等性を維持することができることは留意されよう。例えば、上記記載の抗原の野生型コドンを免疫されるホスト（例えばヒト）に好ましいコドンに置き換えることができる。得られた変異体は本発明の範囲内に包含される。
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子ワクチン、前記ワクチンを含む医薬組成物、並びに広範囲の病原性ウイルス、細菌および寄生虫の感染に対してホストを免疫する方法を提供する。本遺伝子ワクチンは、複製不全であり免疫ホストで悪性性を惹起しない良性ウイルスリコンビナントである。本発明の遺伝子ワクチンによる免疫付与は自然な状態のウイルス感染に近似する。本発明のワクチン接種では、前記遺伝子ワクチンに感染した細胞によって発現される抗原は、その本来の構造でホストの免疫系に提示される。さらに前記提示は、ワクチンとして変性タンパク質または変性ウイルスを用いる通常の“アウトサイド‐イン”の方法と比較して“インサイド‐アウト”メカニズムによって実施される。前記リコンビナントウイルスは多種の病原性抗原を発現する能力を有し、自然の状態での病原体感染に近似する。特に、多種の病原性抗原、例えばHIVエンベロープタンパク質Envおよび構造タンパク質Gag（野生型であれ変異体であれ）が前記リコンビナントウイルスによって発現され、液性免疫反応（すなわちＢ細胞、ヘルパーＴ細胞およびサプレッサーＴ細胞の抗体産生）だけでなく、特異的にこれらの抗原に対して誘導される細胞毒性Ｔリンパ球（CTL）を産生することによって細胞性反応もまた誘発される。さらに、自然の状態では細胞内タンパク質として本来発現される前記病原性抗原は分泌され、細胞表面に結合できるように改変され、したがって身体の免疫系に前記抗原をより良好に提示することができる。さらにまた、前記遺伝子ワクチンに感染した細胞は高レベルのサイトカインを遊離し、それによってウイルス感染により生じるストレス下で細胞の自然な反応にいっそう近似し、しかもなお前記細胞に対して病原性作用を生じない。そのような“病原性ウイルス感染シグナル”により、誤って前記ホストの免疫系は、前記感染細胞によって提示された抗原に対して強力な免疫防御を立ち上げる。したがって、ある意味では、本発明の遺伝子ワクチンは“狼の皮を被った羊”の如くに機能し、ウイルス抗原を提示して強力な免疫反応を誘発するが、前記病原体がホストに対しもたらす有害な作用を惹起しない。本発明のリコンビナントウイルスは、病原体の感染予防のためのワクチンとして用いられるだけでなく、前記病原体の感染に附随する疾患の治療のための薬剤としてもまた用いることができる。
【００２６】
ある実施態様では、リコンビナントウイルスは、前記ウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発するために提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスとは異種であり病原性ウイルスのウイルス抗原をコードする抗原配列（前記ウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する）；および前記リコンビナントウイルスとは異種であり、免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列（前記ホストにおけるその発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する）を含む。前記リコンビナントウイルスは複製不能であり、前記病原性ウイルスに本来附随する悪性性を前記ホストで惹起しない。
別の実施態様では、リコンビナントウイルスは、前記ウイルスに感染したホストで多種の抗原に対する免疫反応を誘発するウイルスワクチンとして提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記良性ウイルスとは異種であり、その各々が１つまたは２つ以上の病原性ウイルスに由来する種々のウイルス抗原をコードする複数の抗原配列（前記複数のウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する）を含む。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であり、前記病原性ウイルスに本来附随する悪性性を前記ホストで惹起しないであろう。
【００２７】
本発明のワクチンは、広範囲の多様な病原性ウイルス株（例えばHIV-1、HIV-2、１型単純疱疹ウイルス、２型単純疱疹ウイルス、エボラウイルス、A、B、C、DおよびE型肝炎ウイルス）または病原性細菌（例えば結核菌および炭疽菌）に対してホストを免疫するために用いることができる。
本発明のリコンビナントワクチンは、そのウイルスゲノム内に１つまたは２つ以上のウイルス抗原をコードする核酸配列を含むリコンビナントウイルスである。ホストが前記リコンビナントワクチンで免疫されたとき（すなわち前記リコンビナントウイルスに感染したとき）、前記ホスト細胞の前記ウイルスの感染は、前記感染細胞表面に出現するウイルス抗原の発現をもたらす。ウイルス抗原の発現は強力なプロモーターによって駆動されるので、その発現は高レベルで維持される。大量のウイルス抗原を細胞表面に認識するとき、ホストの免疫系は強力な防御を立ち上げ、それによって、前記ウイルス抗原が由来した病原性ウイルスに対し長期間持続する免疫を生じる。
細菌、酵母または昆虫細胞によって発現され単離されたタンパク質であるワクチンによる免疫と比較して、本発明のリコンビナントウイルスから発現されるウイルス抗原はその構造および機能において天然のウイルス抗原といっそう近似する。単離タンパク質ワクチンは、天然のウイルス抗原の本来の構造を示さない可能性があり、さらに細菌、酵母または昆虫細胞では適切に糖付加されない可能性がある。そのような単離タンパク質ワクチンがホストに注入されたとき、この抗原はホスト細胞の外側から提示される。この通常の“アウトサイド‐イン”アプローチでは、おそらくはワクチンの抗原性の変化および免疫清掃細胞による前記タンパク質ワクチンの迅速な除去のためにしばしば強力な長期間持続する免疫反応が得られない。
対照的に本発明の遺伝子ワクチン、すなわちリコンビナントウイルスは、“インサイド‐アウト”メカニズムによってウイルス抗原を提示する。前記ウイルス抗原は、前記ホスト細胞でリコンビナントウイルスに感染した後で発現される。これは、前記病原性ウイルスによるウイルス抗原の自然な産生および提示によりいっそう近似する。
【００２８】
最初に感染した細胞から蔓延することができない複製不能ウイルスを使用することによって、本発明は、複製能をもつ生きたウイルスを使用することによって発生しうる副作用の危険性を劇的に低下させる。例えば、生きたワクシニアウイルスをベースにしたワクチンはホスト細胞で複製することができ、これはホスト細胞に高レベルのストレスを強要し、最終的に細胞死をもたらすであろう。
さらにまた、ワクチンとして減弱または不活化ウイルスを使用する方法と比較して、本発明の遺伝子ワクチンを製造する工程ははるかに安全である。多数の人々または動物のワクチン接種には大量のワクチンが必要である。毒性の高いウイルス（例えばエボラウイルスおよびHIVの場合、生きたウイルスに由来する減弱または不活化ウイルスの大規模製造は、環境および前記生ウイルスを取り扱う人々に大きな危険を与えるであろう。
本発明のリコンビナントウイルスを用いて、同じウイルスベクターから多種の抗原配列を同時に発現させることができる。したがって、前記リコンビナントウイルスは、病原性ウイルスの同じ株に由来する、同じ病原性ウイルスの異なる株に由来する、または異なる種類のウイルス、細菌または寄生虫の異なる抗原に由来する多種の抗原をコードすることができる。これによって、本発明のワクチンを利用して広域スペクトルのウイルスおよび他の感染性因子に対して免疫することが可能になる。これらの多種抗原配列は前記リコンビナントウイルスゲノム内で再配置されるので、これらのウイルス配列の潜在的組換えで病原性ウイルスを生じる危険性は実質的に排除される。
【００２９】
本発明の遺伝子ワクチンはまた、好ましくは大量の免疫刺激因子（例えばサイトカイン）を発現する。自然のウイルス感染プロセスでは、ウイルス感染細胞はMHC-Iレセプターとの関係でそれらの表面にウイルス抗原をディスプレーし、一方、ウイルス粒子は機能的抗原提示細胞（前記細胞はMHC-IIレセプターと関連する抗原をディスプレーする）によって消化される。ウイルス感染に反応して、最大範囲のサイトカインおよびインターフェロンが生成され、前記ウイルス抗原に対する強力な液性および細胞性反応が生じる。同時に、多数のメモリー細胞が、新規感染の一切を打ち負かし続ける。単離タンパク質ワクチンを用いるワクチン接種では、前記タンパク質は免疫清掃細胞によって迅速に排除される。このプロセスの間、MHC-II抗原提示のみが惹起され、サイトカイン放出反応は生じないか、または大きく低下する。結果として、細胞性反応はほとんど発生せず、ほんのわずかの“メモリー”細胞が製造されるだけである。
対照的に、本発明のリコンビナントウイルスから生じるウイルス抗原およびサイトカインの同時発現は、感染細胞上で前記抗原を提示し、大量の免疫調節性サイトカインを産生することによって、ウイルス感染に対するホスト細胞の自然状態での反応に事実上近似する。前記遺伝子ワクチンに感染したホスト細胞から発現する高レベルのサイトカインにより、前記ホスト免疫系は“騙されて”、ワクチンに対する強力な反応を立ち上げ、それによって長期間持続する免疫を生じる。
さらに、前記遺伝子ワクチンによるワクチン接種は病原性ウイルスの本来のウイルス感染に近似するが、前記ワクチンそれ自体は、前記病原性ウイルスの有害な作用をもたない良性ウイルスである。例えば、病原性ウイルス、例えばHIV、インフルエンザウイルスおよびエボラウイルスの感染は、おそらく前記ウイルスの糖タンパク質の免疫抑制機能のためにホストに対して深刻な免疫抑制作用を有する。本発明にしたがえば、本遺伝子ワクチンに保持されるウイルス抗原配列は好ましくはその病原性領域または免疫抑制領域が欠失されている。ある意味では、本発明の遺伝子ワクチンは“狼の皮を被った羊”の如くに機能し、強力な免疫反応を誘発させるためにウイルス抗原を提示し、しかも有害な作用をホストにひき起こさない。
【００３０】
１．本発明の遺伝子ワクチン
本発明は、天然の病原性ウイルスの特性に近似するが、免疫抑制性および病原性を誘発せず、したがってホストに効果的な防御を開始させ、一方で感染の実際的な危険性がないワクチンを目的とする。本遺伝子ワクチンは複製不能または不完全ウイルスであり、前記ウイルス中に１つまたは２つ以上のウイルス抗原をコードする１つまたは２つ以上のDNA配列が、その感染には必須でないウイルスゲノム領域に挿入されている。前記リコンビナントウイルスは前記ウイルス抗原を発現し、前記抗原および前記抗原を発現する細胞に対してin vivoで細胞仲介免疫反応を誘発する。
ある実施態様では、ウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発するためにリコンビナントウイルスが提供される。前記リコンビナントウイルスは以下を含む：前記リコンビナントウイルスにとって異種であって病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードする抗原配列（前記ウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する）；および前記リコンビナントウイルスとって異種であって免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列（前記ホストにおける前記配列の発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を前記ホストで強化する）。前記リコンビナントウイルスは複製不能であり、前記病原性ウイルスに本来附随する悪性性をホストで惹起しない。
前記リコンビナントウイルスは、その天然の原ウイルスが複製不能にされるかぎり任意のウイルスから構築することができる。例えば、複製不能アデノウイルス、アデノ附随ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルスまたはワクシニアウイルスを用い、前記ウイルス抗原を前記リコンビナントウイルスの感染に必須でない領域に挿入することによって前記リコンビナントウイルスを作製することができる。したがって、前記リコンビナントウイルスが前記良性ウイルスの本来の原ウイルスの病理学的領域をもたないが、ホストに対するその感染性は維持していることが好ましい。
【００３１】
好ましい実施態様では、前記リコンビナントウイルスは複製不能のアデノウイルスである。
本発明のリコンビナントアデノウイルスは、免疫系の強い刺激を提供する高レベルの抗原発現を指令することができる。アデノウイルスに感染した細胞によって発現される抗原は、病原体感染細胞に近似する態様で前記感染細胞内でプロセッシングを受けディスプレーされる。この時期は感染細胞に対する細胞性免疫の誘発で非常に重要であると考えられているが、通常のワクチン法を用いたときには完全に欠如している。さらに、前記リコンビナントアデノウイルスは、非常に強力な抗原提示細胞である樹状細胞に感染することができる。さらに、前記リコンビナントアデノウイルスはまた免疫強化サイトカインをコードする遺伝子を保有し、免疫をさらに追加支援することができる。さらにまた、前記リコンビナントアデノウイルスは、ヒトの気道および腸上皮細胞に自然に感染し、したがって前記ワクチンは鼻内スプレーまたは経口摂取により薬剤デリバリーを達成することができる。さらい、本発明のリコンビナントアデノウイルスは複製不能であるので安全なはずである。
前記異種抗原配列は前記アデノウイルスのE1、E3またはE4領域に配置することができる。前記免疫刺激因子配列は前記アデノウイルスのE1、E3またはE4領域に配置することができる。
好ましい実施態様の応用例では、前記異種抗原配列および免疫刺激因子配列は前記アデノウイルスのE1、E3またはE4領域に配置され、この場合、前記異種抗原配列および免疫刺激因子配列は、内部リボソームエントリーサイトを介してまたはスプライシングドナー‐アクセプターメカニズムを介して二シストロンとして、１つのプロモーターから発現される。
ウイルス抗原または免疫刺激因子の発現は、前記リコンビナントウイルスの本来の原ウイルスにとって同種のプロモーターによって制御することができる。また別には、前記ウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスの本来の原ウイルスにとって異種であるプロモーターによって制御することができる。例えば、前記リコンビナントウイルスの本来の原ウイルスにとって異種のプロモーターは、真核細胞プロモーター（例えばインスリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよびその初期プロモーター、サルウイルスSV40プロモーター、ラウスサルコーマウイルスLTRプロモーター／エンハンサー、ニワトリ細胞質β-アクチンプロモーター）および誘発性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘発性プロモーター）であろう。
【００３２】
前記病原性ウイルスは、ホスト（例えばヒト、家畜または他の動物）で病原性作用または疾患をひき起こすいずれの病原性ウイルスでもよい。したがって、前記リコンビナントウイルスは、前記病原性ウイルスの感染からホストを防御するためのワクチンとして用いることができる。
応用例では、前記病原性ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の種々の株（例えばHIV-１およびHIV-2）であろう。前記ウイルス抗原は、HIV糖タンパク質（または表面抗原）（例えばHIV GP120およびGP41）、キャプシドタンパク質（または構造タンパク質）（例えばHIV P24タンパク質）、または他のHIV調節タンパク質（例えばTat、VifおよびRevタンパク質）であろう。
別の応用例では、前記病原性ウイルスはインフルエンザウイルスであろう。前記ウイルス抗原はインフルエンザ糖タンパク質（例えばインフルエンザHA1、HA2およびNA）であろう。
別の応用例では、前記病原性ウイルスはエボラウイルスであろう。前記ウイルス抗原はエボラ糖タンパク質または表面抗原、例えばエボラGP1またはGP2タンパク質であろう。
さらに別の応用例では、前記病原性ウイルスは肝炎ウイルス、例えばA、B、C、DまたはE型肝炎ウイルスであろう。前記ウイルス抗原は、A、B、C、DまたはE型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質であろう。例えば、前記ウイルス抗原はB型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質、例えばB型肝炎小型表面抗原（SHBsAg）（オーストラリア抗原とも称される）、B型肝炎中型表面抗原（MHBsAg）およびB型肝炎大型表面抗原（LHBsAg）であろう。前記ウイルス抗原はまたC型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質、例えばNS3、NS4およびNS5抗原であろう。
さらに別の応用例では、前記病原性ウイルスは呼吸器系合胞体ウイルス（RSウイルス）（RSV）であろう。例えば、前記RSVウイルス抗原はRSVの糖タンパク質（G-タンパク質）またはRSVの融合タンパク質（F-タンパク質）であろう（前記については配列がGenBankから入手できる）。
さらに別の応用例では、前記病原性ウイルスは単純疱疹ウイルス（HSV）、例えばHSV-1およびHSV-2であろう。例えばHSVのウイルス抗原はHSV-2の糖タンパク質Dであろう。
さらに別の応用例では、前記ウイルス抗原は、腫瘍抗原またはウイルスオンコジーン（例えばヒトパピローマウイルスのE6およびE7）もしくは細胞性オンコジーン（例えば変異rasまたはp53）であろう。
他のウイルス関連タンパク質または抗原も当業者には容易に利用可能であることは特記されよう。病原性ウイルスおよびウイルス抗原の選択は本発明の制限的事項ではない。
【００３３】
前記ウイルス抗原は完全長の抗原性ウイルスタンパク質でも、また前記病原性ウイルスの主要抗原、中和抗原もしくはエピトープを含む抗原性ウイルスタンパク質の一部分であってもよい。また別には、前記ウイルス抗原は、同一の病原性ウイルスの少なくとも２つの株間で保存された糖タンパク質領域を含む。
ある応用例では、前記ウイルス抗原は、ウイルス成分として機能をもたないがその抗原性は保持するように前記病原性ウイルスの糖タンパク質から変異させた改変抗原であろう。ウイルス抗原のそのような改変には、糖タンパク質のタンパク分解切断部位内の欠失並びに糖タンパク質の免疫抑制ペプチド領域の複製および再配列が含まれる。
前記リコンビナントウイルスはまた免疫刺激因子を発現して、ウイルス感染時のホスト細胞のサイトカイン放出反応に近似させ、さらに前記リコンビナントウイルスから一緒に発現されるウイルス抗原に対する免疫反応を増強させる。前記免疫刺激因子は好ましくはサイトカインであろう。サイトカインの例には、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
別の実施態様では、リコンビナントウイルスは、前記ウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発するために提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスとは異種であって病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードする抗原配列を含む。前記ウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。
この実施態様にしたがえば、前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能アデノ附随ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルスまたはワクシニアウイルスである。前記良性ウイルスは好ましくは、前記良性ウイルスの天然の原ウイルスの病原性領域は欠失しているが、前記ホストに対する感染性は保持している。
場合によって、前記リコンビナントウイルスは前記リコンビナントウイルスには異種であって、前記ホストにおけるその発現が前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する免疫刺激因子配列を含む。
【００３４】
本発明はまた、病原性細菌に対し強力で長期間持続する免疫反応を誘発する遺伝子ワクチンを提供する。ある実施態様では、リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発させる細菌遺伝子ワクチンとして提供される。前記リコンビナントウイルスのウイルスゲノムは、前記リコンビナントウイルスにとって異種の複数の抗原配列であって各々が病原性細菌に由来する細菌抗原をコードするものを含み、前記複数の細菌抗原配列の発現は、リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記細菌抗原および前記細菌抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、前記病原性細菌に本来附随する悪性性をホストで惹起しないであろう。
前記病原性細菌は、ホストで病原性作用または疾患を惹起する任意の病原性細菌、例えば以下の細菌であろう：結核菌（Bacillus tuberculoses）、炭疽菌（Bacillus anthracis）およびスピロヘータボレリア＝ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）（動物でライム病をおこす）。前記複数の抗原配列は、病原性細菌の致死因子、防御抗原、浮腫因子またはその組み合わせをコードすることができる。
【００３５】
本発明はまた、病原性寄生虫に対し強力で長期間持続する免疫反応を誘発する寄生虫ワクチンを提供する。ある実施態様では、リコンビナントウイルスは前記良性ウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発する寄生虫ワクチンとして提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスにとって異種の複数の抗原配列であって各々が病原性寄生虫に由来する寄生虫抗原をコードするものを含み、前記複数の寄生虫抗原配列の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記寄生虫抗原および前記寄生虫抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、前記病原性寄生虫に本来附随している悪性性を前記ホストで惹起しないであろう。
前記病原性寄生虫はホストで病原性作用または疾患をひき起こす任意の病原性寄生虫、例えばマラリアおよび原虫（例えばクリプトスポリジウム、エイメリア、ヒストモナス、ロイコチトゾーン、プラスモジウム、トキソプラズマ、トリコモナス、リーシュマニア、トリパノソーマ、ジアルジア、バーベシアおよびタイレリア）であろう。前記複数の抗原配列は前記病原性寄生虫のコートタンパク質、アタッチメントタンパク質またはその組み合わせをコードすることができる。
本発明はまた、天然の病原性ウイルスの自然な感染にさらに近似し、種々の株または型の病原性ウイルスに対して強力で長期間持続する免疫反応を誘発させるために多種抗原を提示するウイルスワクチンを提供する。
ある実施態様では、リコンビナントウイルスは、ウイルスに感染したホストで免疫反応を誘発するためにウイルスワクチンとして提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスにとって異種の複数の抗原配列であって各々が病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードするものを含み、前記複数の抗原配列の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を前記ホストで誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、病原性ウイルスに本来附随する悪性性を前記ホストで惹起しないであろう。
【００３６】
前記実施態様にしたがえば、前記リコンビナントウイルスは任意のウイルス、好ましくは複製不能アデノウイルス、アデノ附随ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルスまたはワクシニアウイルスであろう。さらに前記リコンビナントウイルスでは、好ましくは前記良性ウイルスの天然の原ウイルスの病原性領域は欠失しているが前記ホストに対するその感染性は保持されている。
さらにまた前記実施態様にしたがえば、前記複数の抗原配列は、同じ抗原配列のマルチコピーまたは互いに異なる多種の抗原配列であろう。
【００３７】
前記実施態様の応用例では、前記複数の抗原配列の少なくとも２つは、内部リボソームエントリーサイトまたはスプライシングドナーアクセプターメカニズムを介して１つのプロモーターから二シストロンとして発現される
また別には、前記複数の抗原配列の少なくとも２つは１つのプロモーターから発現され融合タンパク質を形成する。
また前記実施態様にしたがえば、前記リコンビナントウイルスはさらに、前記リコンビナントウイルスの天然の原ウイルスにとって異種の少なくとも１つのプロモーターを含み、前記プロモーターは前記複数の抗原配列の少なくとも２つの発現を制御する。前記リコンビナントウイルスの天然の原ウイルスにとって異種のプロモーターの例には、インスリンプロモーター、CMVプロモーターおよびその初期プロモーター、SV40プロモーター、ラウスサルコーマウイルスのLTRプロモーター／エンハンサー、ニワトリ細胞質β-アクチンプロモーターおよび誘発性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘発性プロモーター）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
さらに前記実施態様にしたがえば、前記複数の抗原配列は病原性ウイルスの少なくとも２つの株に由来する抗原の組み合わせであろう。
場合によって前記複数の抗原配列は少なくとも２つの異なる病原性ウイルスに由来する抗原の組み合わせであろう。例えば、前記複数の抗原配列は、HIV-1、HIV-2、１型単純疱疹ウイルス、２型単純疱疹ウイルス、インフルエンザウイルス、マルブルクウイルス、エボラウイルス、アルボウイルス（脳炎、黄熱病およびデング熱をおこす蚊によって媒介されるウイルス群）、およびA、B、C、DおよびE型肝炎ウイルス由来の抗原の組み合わせであろう。
【００３８】
前記実施態様の応用例では、前記リコンビナントウイルスのウイルスゲノムはさらに１つまたは２つ以上の免疫刺激因子配列を含むことができる。前記配列は、前記リコンビナントウイルスにとって異種であって免疫刺激因子をコードし、前記ホストにおけるその発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する。例えば、前記免疫刺激因子はサイトカインであろう。前記サイトカインの例には、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、G-CSFおよびGM-CSFが含まれるが、ただしこれに限定されない。
前記の応用例にしたがえば、前記1つまたは２つ以上の免疫刺激因子配列は同じ免疫刺激因子配列のマルチコピーでも、または互いに異なる多種の免疫刺激因子配列でもよい。
場合によって、前記免疫刺激因子配列の少なくとも２つは、内部リボソームエントリーサイトを介してまたはスプライシングドナー‐アクセプターメカニズムを介して二シストロンとして１つのプロモーターから発現されるであろう。また別には前記免疫刺激因子配列の少なくとも２つは１つのプロモーターから発現され融合タンパク質を形成することができる。
ウイルス抗原をコードするDNA配列は前記複製欠損ウイルスの非必須領域に挿入される。例えば、アデノウイルスの場合には前記核酸は好ましくはアデノウイルスのE1、E3および／またはE4領域に挿入され、もっとも好ましくはE4領域に挿入される。E1、E3およびE4領域が挿入部位として利用できるので、本発明はまた２つ以上のコード配列の別々の挿入も意図している。
【００３９】
本発明のリコンビナントウイルスワクチンでは、選択したウイルス抗原のヌクレオチド配列は、in vivoでのその転写または発現を対象者で指令する制御エレメントに機能的に連結される。同種または異種のウイルス性制御配列を用いることができる。有用な異種制御配列には一般的にホストまたはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。例にはサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、例えばCMV極初期プロモーター領域（CMVie）、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP）、単純疱疹ウイルスプロモーターおよびレトロウイルスLTRプロモーターが含まれるが、ただしこれらに限定されない。好ましくは、任意の強力な構成性プロモーターをウイルス抗原またはサイトカインに機能的に連結することができる。より好ましくは、前記ウイルスプロモーターはCMV極初期プロモーター（CMVie）である。
図1A−1Cは、本発明の遺伝子ワクチンとしてリコンビナントアデノウイルスベクターを構築する方法を示している。本発明のリコンビナントアデノウイルスベクターは、多種抗原遺伝子および多種サイトカイン遺伝子を含むシャトルプラスミドまたはベクターを用いて構築される。
【００４０】
図1Aは、２つの抗原遺伝子（抗原１および抗原２）を含むシャトルプラスミド（pLAd.Antigen）を示している。シャトルプラスミドpLAd.Antigenは、アデノウイルスゲノムの左末端（左側のロングターミナルリピート（L-TR）を含む）およびアデノウイルスパッケージングシグナル（Ψ）を含む。前記アデノウイルスのE1領域は多種の遺伝子発現カセットおよびCMVieプロモーターによって置換される。
抗原１および抗原２をコードする遺伝子は、SDおよびSA部位のスプライシングメカニズムによってCMVieプロモーターの転写制御下に置かれる。プラスミドpLAd.AntigennはまたSV40のポリアデニル化部位を、細菌でのDNA増殖のための原核細胞複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子とともに含む。
図1Bは、多種のサイトカイン遺伝子（例えばIL-2、INFおよびIL-8）を含む別のシャトルプラスミド（pRAD.Cytokines）を示している。前記シャトルプラスミドpRAd.Cytokainesはアデノウイルスゲノムの右末端（右側のロングターミナルリピートR-TRを含む）を含んでいる。E4領域の大半（orf6を除く）がサイトカイン遺伝子で置換されている。サイトカイン遺伝子の発現は、内部リボソームエントリーサイト（IRES）並びに、SDおよびSA部位のスプライシングメカニズムによりCMVieプロモーターの制御下にある。前記プラスミドpRAd.Cytokinesはまた、細菌でのDNA増殖のための原核細胞複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子とともにウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化部位を含んでいる。
前記リコンビナントアデノウイルスゲノムは２つのシャトルプラスミド、pLAd.AntigenおよびpRAd.Cytokinesから組み立てられる（前記プラスミドはそれぞれアデノウイルスゲノムの左右末端を保有する）。前記シャトルプラスミド、pLAd.AntigenおよびpRAd.Cytokinesは制限酵素、例えばXbaIおよびEcoRIでそれぞれ消化される。
【００４１】
図1Cに示すように、これら２つのシャトルプラスミド、pLAd.AntigenおよびpRAd.Cytokinesに由来するアデノウイルスの左右末端に対応するフラグメントを単離しアデノウイルスゲノムの中央部分（アデノウイルス骨格）に連結する。
前記連結したベクターのゲノムDNAを続いて293HK細胞（アデノウイルスのE1タンパク質を発現する）にトランスフェクトする。E1タンパク質の存在下で、前記E1欠失ベクターゲノムは複製することができ、ウイルス粒子にパッケージされる（すなわち本発明の遺伝子ワクチンとして使用することができるリコンビナントアデノウイルスベクターが生成される）。リコンビナントウイルスゲノムから欠失しているが天然のアデノウイルスゲノムに保存されているE1領域は、リコンビナントウイルスの天然の原ウイルス（アデノウイルス野生型）にとって本来存在する病原性領域の例である。
図5は上記の方法を用いることによって構築される遺伝子ワクチンの例を示す。複製欠損アデノウイルス（５型）は、ウイルス抗原およびサイトカインがE1領域に挿入されているベクターの骨格である。前記ウイルス抗原はCMVieプロモーターを用いて発現される。前記ウイルス抗原の遺伝子の後にIFN-γおよびGM-CSFをコードする遺伝子が続く。単一のｍRNAから前記３つのタンパク質の発現を達成するために２つのIRES配列を利用する。IL2およびIL4は、２シストロンカセットとして第二のCMVieプロモーターによって制御される。前記二シストロンカセットの後に第二の二シストロンカセットが続き、前記はE4領域内でIL12の２つのサブユニットを発現する。当業者には、本発明は上記に述べた構造に限定されず、また別のサイトカインを単独または前記サイトカインおよび／または他のサイトカインと組み合わせて用いることができることは理解されよう。これらサイトカインについての詳細な情報は下記の節で述べる。
【００４２】
２．ウイルス抗原と同時に発現されるサイトカイン
本発明のリコンビナントウイルスはまた免疫刺激因子を発現してウイルス感染時にホスト細胞のサイトカイン放出反応に近似させ、さらに前記リコンビナントウイルスから同時に発現されるウイルス抗原に対する免疫反応を増強させることができる。前記免疫刺激因子は免疫系をさらに刺激する免疫強化サイトカインであろう。前記リコンビナントウイルスは１種または多種のサイトカインを任意の組み合わせでコードすることができる。また別には、多種のサイトカインを２つ以上のリコンビナントウイルスによって発現させてもよいし、または他の技術、例えば裸出DNAプラスミドもしくはサイトカインタンパク質の注射によりホストにデリバーしてもよい。
サイトカインの例には、インターロイキン-2、インターロイキン-4、インターロイキン-8、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
サイトカインは免疫反応の質および強さを調節および形成する多形質発現性仲介物質であるので、本発明のワクチンで特に有用な免疫調節分子である。サイトカインは時にオートクラインまたは内分泌物質であるが、主にパラクリンホルモンでリンパ球および単球により通常的に産生される。
【００４３】
本明細書で用いられるように、“サイトカイン”という用語は、免疫系細胞によって産生され、免疫反応を調節もしくは加減するタンパク質またはペプチド類の１つを指す。そのような調節は液性または細胞仲介免疫反応で生じ、T細胞、B細胞、NK細胞、マクロファージ、抗原提示細胞または他の免疫系細胞のエフェクター機能の調節を含む。
サイトカインは典型的には小型のタンパク質または糖タンパク質で約30ｋDa未満の分子量を有する。本明細書で用いられるように、サイトカインという用語は、リンパ球および他の細胞型によって分泌されるサイトカイン（しばしばリンホカインと称される）を、単球、マクロファージおよび他の細胞型によって分泌されるサイトカイン（しばしばモノカインと称される）とともに包含する。本明細書で用いられるように、サイトカインという用語は、インターロイキン、例えばIL-2、IL-4、IL-5、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15およびIL-18（前記は白血球によって分泌される分子で主に造血系および免疫系細胞の増殖と分化に影響を与える）、並びにヒトの前炎症性サイトカイン、例えばIL-1a、TNF-aおよびTNF-bを含む。サイトカインという用語はまた、造血細胞増殖因子、特にコロニー刺激因子（例えばコロニー刺激因子-1、顆粒球コロニー刺激因子および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）を含む。
サイトカインは、天然に存在するサイトカインの配列を有していてもよいが、また、天然に存在するサイトカインの配列に対して実質的なアミノ酸配列類似性、例えば60−95％のアミノ酸配列類似性、好ましくは70−98％のアミノ酸配列類似性、もっとも好ましくは75−95％のアミノ酸配列類似性をもつアミノ酸配列であってもよい。
【００４４】
したがって、天然に存在する配列に対する限定的な改変を前記サイトカインの生物学的機能を損なわずに実施することが可能なことは理解されよう。例えば、その機能を破壊しないγインターフェロンの小さな改変はγインターフェロンの範疇に含まれる。これらの改変は、位置特異的突然変異誘発により意図的であっても、例えば突然変異により偶発的であってもよい。好ましいサイトカインは、IL-2、IL-8、IL-12またはγ-インターフェロン、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、GM-CSFもしくはG-CSFまたはその組み合わせである。
インターロイキン-２はヘルパーT細胞によって産生されるリンホカインで、免疫反応の規模およびタイプの制御に活性を有する（K.A. Smith, Ann. Rev. Immunol. 2:319-333 (1984)）。IL-2には他の機能もあり、NK細胞の活性化（N. Minato et al., J. Exp. Med. 154:750 (1983)）および大型有顆粒リンパ球およびB細胞の細胞分裂の刺激（M. Tsudo et al., J. Exp. Med. 160:612-616 (1984)）が含まれる。マウスおよびヒトでの研究で、in vivoおよびin vitroの両方において不完全な免疫反応性がIL-2によって増強されることが示された。例えば、外因性IL-2は、シクロホスファミド誘発免疫抑制マウス（V.J. Merluzzi et al., Cancer Res. 41:850-853 (1981)）、および無胸腺（ヌード）マウス（H. Wagner et al., Nature 284:278-80 (1982)）で免疫反応を回復させることができる。さらにまた、IL-2は、種々の免疫不全状態（例えば癩および癌）の患者に由来するリンパ球の反応性を回復させることができる（B.M. Vose et al., Cancer Immunol. 13:105-111 (1984)）。ネズミIL-2（T. Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:68-72 (1985)）およびヒトIL-2（T. Taniguchi et al., Nature 302:305-307 (1983)）の遺伝子がクローニングされ配列が決定された。
【００４５】
インターロイキン-４はT細胞由来因子で、休止B細胞に対する誘発因子として、B細胞分化因子として、さらにB細胞増殖因子として機能する（E. Sevenusar, J. Immunol. 17:67-72 (1987)）。ヒトIL-４の遺伝子が単離され配列が決定された（F. Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2061-2065 (1986)）。
IL-12は、分子量が75ｋDaでありジスルフィド結合した40ｋDaおよび35ｋDaサブユニットで構成されたヘテロダイマーのサイトカインであるという性状が最近になって示された。前記は抗原提示細胞（例えばマクロファージ）によって産生され、活性化T、BおよびNK細胞上のレセプターと結合する（B.B. Desai et al., J. Immunol., 148:3125-3132 (1992)；L.A. Vogel et al., Int. Immunol. 8:1955-1962 (1996)）。IL-12は以下を含むいくつかの作用を有する：１）T細胞およびNK細胞の増殖強化、２）T細胞、NK細胞およびマクロファージの細胞溶解活性の増強、３）IFN-()の産生誘発および前記より低いがTNF-αおよびGM-CSFの産生誘発、および４）TH1細胞の活性化（G. Trinchieri et al., Blood 84:4008-4027 (1994)）。IL-12はTh1クローン増殖の重要な補助刺激因子であり（Kennedy et al., Eur. J. Immunol. 24:227-2278 (1994)）、血清中のIgG2a抗体の産生増加をもたらすことが示された（S.C. Morris et al., J. Immunol. 152:1047-1056 (1994)；T.M. Germann et al., Eur. J. Immunol. 25:823-829 (1995)；A. Sher et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 795:202-207 (1996)；J.M. Buchanan et al., Int. Immunol., 7:1519-1528 (1995)；D.W. Metzger et al., Eur. J. Immunol., 27:1958-1965 (1997)）。IL-12の投与はまた、一時的にIgG1抗体産生を低下させることができ（S.C. Morris et al., J. Immunol. 152:1047-1056 (1994)；A.J. McKnight, J. Immunol. 152:2172-2179 (1994)；J.M. Buchanan et al., Int. Immunol., 7:1519-1528 (1995)）、Th2反応の抑制を示唆した。IL-2の精製およびクローニングはWO92/05256およびWO90/05147およびEP322,827で開示されている（“CLMF”と特定された）。上記の作用の全てが成獣で観察された。
【００４６】
インターフェロン（IFN）は比較的小さな種特異的単鎖ポリペプチドであり、多様な誘発物質（例えばウイルス、ポリペプチド、マイトジェンなど）への暴露の反応としてホスト細胞によって産生される。インターフェロンは、抗ウイルス性、抗増殖性および免疫調節特性を有し、したがって癌および他の種々のウイルス疾患の制御で非常に重要である（J. Desmyter et al., Lancet 11:645-647 (1976)；R. Derynck et al., Nature 287:193 (1980)）。ヒトインターフェロンは、それらの細胞起源および抗原性を基準に以下の３つの種類に分類される：α-インターフェロン（白血球）、β-インターフェロン（線維芽細胞）およびγ-インターフェロン（B細胞）。各群のリコンビナント形が開発され、市販ルートで入手できる。
γ-インターフェロンもまたT細胞に由来する分子で免疫反応に対し重要な作用を有する。前記分子はインターロイキン-2で刺激された活性化B細胞による免疫グロブリンの産生を促進する。γ-インターフェロンはまた、ウイルス抗原と結合した細胞で組織適合性抗原の発現を高め、細胞毒性T細胞を刺激する。ヒトγ-インターフェロンの遺伝子が単離され配列が決定された（P.W. Gray et al., Nature 295:503-508 (1982)）。
ヒトαインターフェロン（白血球インターフェロンとしても知られている）は約30種のタンパク質類を構成し、少なくとも14の別個の遺伝子および約16の対立遺伝子座によってコードされる。これらのαインターフェロンタンパク質種のいくつかは、抗ウイルス活性、抗増殖活性および免疫調節活性を有することが示された（例えば以下を参照されたい：Pestka et al., Ann. Rev. Biochem., 56:727 (1987)）。ヒトαインターフェロンの治療有効性はヒトの癌およびウイルス性疾患について確立された。例えば、リコンビナントインターフェロン（IFNα-2a、IFNα-2b、IFNα-2c）、細胞株由来インターフェロン（IFNα-n1）および白血球由来インターフェロン（IFNα-n3）は現在のところ、尖圭コンジローム、肝炎の治療に（Weck et al., Am. J. Med. 85(Suppl 2A):159 (1988)；Korenman et al., Annal. Intern. Med., 114:629 (1991)；Friedman-Kien et al., JAMA 259:533 (1988)）、いくつかの悪性疾患の退縮に（Baro et al., JAMA 266:1375 (1991)）、エイズ関連カポジ肉腫の治療に用いられ（Physicians Desk Reference, 47th edit., eds. Medical Economics Data, Montvale, N.J., p. 2194 and 2006 (1993)）、さらに現在のところ単独または他の抗ウイルス剤と組み合わせて後天的ヒト免疫不全症候群（エイズ）の治療として検討されている（Hirsch, Am. J. Med.,  85(Suppl 2A):159 (1988)）。
【００４７】
β-インターフェロンはその炭水化物含有量の化学的測定によって糖タンパク質であることが示された。前記は１つのN-グリコシジル結合部位を有する（E. Night, Jr. Proc. Natl. Acad. Sci., 73:520 (1976)；E. Night, Jr., & D. Fahey, J. Interferon Res. 2(3):421 (1982)）。β-インターフェロンの炭水化物部分を構成する糖の種類については多くは判明していないとしても、炭水化物部分はその抗原性、生物学的活性または疎水性については必須ではないことが示された（T. Taniguchi et al., 上掲書；E. Knight, Jr., 上掲書；およびE. Knight & D. Fahey, 上掲書）。β-インターフェロンはウイルスチャレンジによって線維芽細胞で誘発することができ、前記は約165アミノ酸を含む。β-インターフェロンの配列は公知である（Fiers et al., Philos. Tmas. R. Soc. London., B. Biol. Sci. 299:29-38 (1982)）。
GM-CSFは樹状細胞の成熟および機能で重要なサイトカインである。前記は樹状細胞上のレセプターと結合し、これらの細胞を刺激して成熟させ、抗原を提示させ、未感作（naive）T細胞を機動させる。樹状細胞は高度に効果的な抗原提示細胞系を形成する。周辺の抗原を捕捉した後、樹状細胞は類リンパ器官に遊走し、T細胞に抗原を提示する。これらの強力な抗原提示細胞の活性未感作T細胞と相互作用する能力は固有である。樹状細胞のこの強力な抗原提示性能は、部分的には、その固有のライフサイクル並びに主要組織適合抗原クラスIおよびII分子および補助刺激分子の高レベルの発現によるものであろう。ヒトGM-CSFの配列は公知である（Wong et al., Science 228:810-815 (1985)）。
【００４８】
顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は造血細胞増殖因子の１つであり、コロニー刺激因子とも称され、指定された原細胞を刺激して増殖させ分化血液細胞のコロニーを形成する。G-CSFは主に好中球の増殖および発達を刺激し、好中球減少症状の治療に有用である（Welte et al., PNAS-USA 82:1526-1530 (1985)；Souza et al., Science 232:61-65 (1986)；J. Gabrilove, Seminars in Hematology 26(2):1-14 (1989)）。G-CSFは循環顆粒球の数を増加させ、敗血症モデルで感染を軽減させることが示された。G-CSFの投与はまた、腫瘍壊死因子（TNF）（敗血症および拒否反応時の組織の損傷に重要なサイトカイン）の遊離を抑制する（例えば以下を参照されたい：Wendel et al., J. Immunol., 149:918-924 (1992)）。ヒトG-CSF（Nagata et al., Nature 319:415 (1986)）およびマウスG-CSF（Tsuchiya et al., PNAS 83:7633 (1986)）のｃDNAが単離され、G-CSFの更なる構造および生物学的な性状決定が可能になった。
ヒトでは、内因性G-CSFは血漿で検出できる（Jones et al., Bailliere's Clinical Hematology 2(1):83-111 (1989)）。G-CSFは線維芽細胞、マクロファージ、T細胞、栄養膜、内皮細胞および上皮細胞で産生され、17番染色体に位置する４つのエクソンと５つのイントロンで構成された一コピー遺伝子の発現生成物である。この遺伝子座の転写によって１つのｍRNAが生成され、前記は弁別的に処理されて１つが17７アミノ酸のタンパク質をコードし、他方が174アミノ酸のタンパク質をコードする２形態のG-CSFｍRNAを生じる（Nagata et al., EMBO J. 5:575-581 (1986)）。174アミノ酸を含む形態は、もっとも強力な固有のin vivoの生物学的活性をもつことが判明した。G-CSFは種交差反応性を示し、それによりヒトG-CSFは別のホスト（例えばマウス、イヌまたはサル）に投与したとき持続的な好中球性白血球増加症を誘発する（Moore et al., PNAS-USA 84:7134-7138 (1987)）。
本発明は、リコンビナントウイルスの特定の外来抗原ポリペプチドに対する免疫反応を強化する効果的な手段を提供する。本発明のワクチンでは、任意の外来抗原ポリペプチドを用いることができるが、前記ワクチンはHIVウイルスおよびエボラウイルスに対するワクチンで特に有用である。なぜならば前記ウイルスはホストの免疫系に対しマイナスの作用を有するからである。本発明のワクチンはまたB型およびC型肝炎ウイルスに対する免疫でも非常に有用である。
【００４９】
３．HIV感染に対する遺伝子ワクチン
本発明の遺伝子ワクチンはまたHIVウイルスに対する効果的なワクチンの要求に向けられている。本発明にしたがえば、前記遺伝子ワクチンはリコンビナント良性ウイルスである。前記ワクチンでは、ウイルスゲノムは１つまたは２つ以上のHIV由来抗原、例えばHIV糖タンパク質（例えばGP120およびGP41）またはキャプシドタンパク質（例えばP24）を保持する。これらHIV抗原の配列は改変することができる（例えばHIV糖タンパク質の免疫抑制領域の欠失させる）。
HIVウイルスは後天性免疫不全症候群（エイズ）として知られる疾患を惹起する。エイズは現代の疫病として記載されてきた。なぜならば、1981年のその最初の報告以来エイズの犠牲者は米国だけで60000人を越え、死亡は総計32000人を超えたからである。この疾患は、長期の無症状期とその後の免疫系および中枢神経系の進行性変性を特徴とする。前記ウイルスは、症状が出現するまで5年以上感染個体で潜伏し、したがって前記疾患の実際の影響は未だ不明である。多くのアメリカ人が認識せずに感染している可能性があり、彼らの体液と接触する他者を感染させるであろう。したがって、検査されない場合、エイズの個人的、社会的および経済的影響は計り知れないであろう。
HIVウイルスはレトロウイルスである。したがって、その遺伝物質はRNAであり、前記はウイルスの複製のための情報をコードする。ホスト細胞の感染時に、前記RNAはDNAへの転写のための鋳型として機能する（前記は逆転写酵素と称される酵素によって触媒される）。そのようにして生成されたDNAは細胞の核内に入り、そこでホストDNAにプロウイルスとして組み込まれる。適切に活性化されたとき、前記レトロウイルス由来DNAは転写され翻訳されてRNA含有ビリオンを生成する。前記は続いて発芽工程によって細胞から放出される。
【００５０】
個体がHIVに感染したとき、ウイルスはT4リンパ球と称される特定の種類の白血球細胞に優先的に付着しこれに侵入する（T4リンパ球はCD4と称される細胞表面マーカーの存在を特徴とする）。これらの白血球細胞は免疫系で不可欠の役割を果し、液性および細胞性の両免疫反応の必須の成分として機能する。HIVの有害な作用の多くはT4リンパ球の機能的抑圧または破壊によるものであろう。
無傷のHIVビリオンはおおよそ球形で、直径は約110nmである。ビリオンはスパイク様構造で被覆された外側膜を有し、前記外側膜は糖タンパク質（gp160／120）で構成される。さらに、gp41と称されるトランスメンブレンタンパク質が存在する。ビリオンの内部には２つの構造タンパク質が存在する。すなわち、リンタンパク質（p17）で構成された外側外皮およびリンタンパク質（p24）で構成された内側ヌクレオイドまたは中心コアである。前記ウイルスRNAは、RNA鋳型からウイルスDNA合成のために必要な逆転写酵素の２つのコピー、p66／51とともに前記コア内部に存在する。HIVのRNAゲノムは３つの主要な構造遺伝子（gag、polおよびenv）をコードする（前記３つの遺伝子はそのいずれかの末端でロングターミナルリピート（LTR）配列と接している）。Gag遺伝子はグループ特異的コアタンパク質、p55、p39、p24、p17およびp15をコードする。Pol遺伝子は逆転写酵素、p66／p51およびプロテアーゼ、p31をコードする。Env遺伝子は外側エンベロープ糖タンパク質、gp120およびその前駆体、gp160およびトランスメンブレン糖タンパク質、gp41をコードする。前記遺伝子のいくつか、特にenv遺伝子は高度に変動しやすい。さらに、他のレトロウイルスとは共有されない５つの他の遺伝子が存在する。これらは転写もしくは翻訳の調節に必要とされるか、または他の構造タンパク質をコードする。完全なHIVゲノムは既に配列が決定されている（以下を参照されたい：Ratner et al., Nature 313:277 (1985)、前記文献は参照により本明細書に含まれる）。
【００５１】
HIVエンベロープタンパク質は広範囲に記載され、多数のHIV株に由来するHIVエンベロープをコードするアミノ酸およびRNA配列が知られている（以下を参照されたい：G. Myers et al., Human Retrovirus and AIDS: A compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, N.M. (1992)）。HIVの種々の株のenv遺伝子は、850から880のアミノ酸のタンパク質をコードすると予想される。Env前駆体ポリプロテインの合成中の広範囲の糖付加によってgp160（約160キロダルトン）が生成される（前記はまた感染細胞で検出されるenv遺伝子生成物の主要な形態である）。Gp160はホモトリマーを形成し、ゴルジ装置で糖付加を受ける。
gp160の機能的ドメインは、N-末端からシグナルペプチド、可変領域１から５（前記はCD4結合部位（例えばThr257、Trp427、Asp368／Glu370およびAsp457）を含有する）、タンパク分解プロセッシング部位（gp120とgp41との間の切断部位とも称される）、融合ドメイン、ロイシンジッパーモチーフ、トランスメンブレンドメイン並びにレンチウイルス溶解ペプチド（LLP）１および２を含む。HIVの種々の単離ウイルスおよび株に由来するgp120のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列並びにその数は異なるであろうが、前記機能的ドメインをコードする領域は、Luciw（1996）の解説（”Fundamental Virology”, 3rd ed., eds., Fields et al., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Chapter 27, pp. 845-916）によって容易に特定できるであろう。
【００５２】
Env前駆体gp160のN-末端のシグナルペプチドは初期タンパク質を翻訳しているリボソームを小胞体に誘導し、細胞内タンパク分解酵素によってこのシグナルペプチドはEnv糖タンパク質の生合成中に除去される。Env前駆体gp160は細胞プロテアーゼによってそのプロセッシング部位で切断されてgp120（SUサブユニットと称される）およびgp41（TMサブユニットと称される）を生成する。gp120はエンベロープ糖タンパク質複合体の外部の、表面に露出したドメインの大半を含む。gp41はトランスメンブレンドメインを含み、トリマー構造を維持し、gp120と非共有結合的態様で相互作用する。Gp41のサブユニットは、融合ペプチド、ロイシンジッパー様領域、トランスメンブレンドメイン（TM）、LLP1およびLLP2を含む。
Gp120サブユニットは５つの可変領域および６つの保存領域を含む。gp120の可変（V）および保存（C）ドメインはMondrowらの命名法（”Computer-assisted analysis of envelope protein sequences of seven human immunodeficiency virus isolates: predictions of antigenic epitopes in conserved and variable regions”, J. Virol. 61:570-578 (1987)）にしたがって特定される。
gp120分子は、60000ダルトンのポリペプチドコアから成る（前記コアはN-結合糖付加によって広範囲に改変され見かけの分子量は120000ダルトンに増加している）。Gp120の一次配列中の18個のシステイン残基の位置および、gp120中の約24個のN-結合糖付加部位のうちの13個の位置は全てのgp120配列にとって共通である。超可変ドメインは広範囲のアミノ酸置換、挿入および欠失を含んでいる。これらドメインにおける配列の変動は、種々のウイルス分離株に由来するgp120分子間で全体の配列の30％に及ぶ変動性をもたらす。この変動にもかかわらず、全てのgp120配列はウイルスレセプターCD4へのウイルスの結合能およびgp41と結合してウイルス膜とホスト細胞膜との融合を誘発するウイルスの能力を保存している。
【００５３】
HIVウイルスはエンベロープの糖タンパク質と細胞表面レセプターとの相互作用によってホスト細胞に付着する。HIVがT４細胞と接触するとき、gp120はCD4レセプターと接触するらしい。最近、HIV-1のgp120（HXB-2株、Bクレード）のコアドメインの結晶構造は、前記タンパク質とヒトCDフラグメントおよびウイルス中和抗体（ケモカイン−レセプター結合を阻害する）の抗原結合フラグメントとの複合体形成によって解析された（Kwong et al., “Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with CD4 receptor and a neutralizing human antibody”, Nature 393:648-659 (1998)）。これらの実験によって、gp120コアは、２つのドメイン（“内側ドメイン”（gp41と向き合う）および“外側ドメイン”（オリゴマーのエンベロープ糖タンパク質複合体の表面にほとんどが露出している））を含む固有の分子構造を有することが明らかにされた。前記２つのgp120ドメインは、いずれのドメインの部分でもない“架橋シート”によって分けられている。CD4の結合は、前記架橋シートを露出させるgp120における構造的変化をひき起こし、内側および外側ドメインをお互いに対して移動させるのかもしれない。gp120に付加される炭水化物分子の大半は外側ドメインに付加されることもまた判明した。このことは、前記ウイルスはgp120上の外部抗原エピトープを隠蔽するために炭水化物分子を利用するという考えと一致する。
【００５４】
gp120は細胞のCD4レセプターと結合するだけでなくHIVコレセプター（例えば細胞性ケモカインレセプター、例えばCCR5）とも結合する。レセプターおよび／またはコレセプターとの結合時に、前記ウイルスエンベロープは細胞膜と融合し、ウイルスの内部コアが感染細胞に侵入し、ここでRNAからDNAウイルスへの転写が逆転写酵素によって触媒される。プロウイルスは、数ヶ月または数年間潜伏形として細胞内に留まり、この間感染個体は無症状である。しかしながら、ウイルスが後に活性化され、ウイルスの複製および免疫抑制を惹起した場合、前記個体はエイズに附随する日和見感染に感受性を示すであろう。
本発明のHIVワクチンのある実施態様では、リコンビナントウイルスは、HIVの感染に対して強力な免疫反応を誘発するために提供される。前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスとは異種であってヒト免疫不全ウイルス（HIV）に由来する抗原をコードする抗原配列（前記HIV抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記HIV抗原および前記HIV抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する）；および前記リコンビナントウイルスとは異種であって免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列（前記ホストにおけるその発現は前記HIV抗原の免疫原性を強化する）を含む。好ましい実施態様では前記リコンビナントウイルスは複製不能であり、HIVに本来附随する悪性性を前記ホストで惹起しない。前記リコンビナントウイルスは遺伝子ワクチンとして用いられ、ホストに投与されて強力で長期間持続するHIV感染に対する免疫を誘発する。
【００５５】
変性または減弱HIVビリオンを用いるHIVワクチン開発の他の方法と比較して、本発明の方法はより安全であり、より効果的に強力な免疫反応を誘発し、しかもHIVの再活性化（おそらくホストに感染した野生型HIVとの組換えによって生じる）の危険性を生じない。
本発明にしたがえば、遺伝子ワクチンによって発現されるHIV抗原はHIVに由来する任意の抗原、例えばHIV表面タンパク質、コア／キャプシドタンパク質、調節タンパク質、酵素タンパク質および付属タンパク質であろう。HIV表面タンパク質の例にはenv遺伝子生成物、例えばgp120およびgp41が含まれるが、ただしこれらに限定されない。HIVキャプシドタンパク質の例にはgag遺伝子生成物、例えばこのウイルスによってコードされるプロテアーゼPRによるPr55gagの切断生成物；成熟キャプシドタンパク質MA（p17）、CA（p24）、p2、NC（p7）、p1およびp6が含まれるが、ただしこれらに限定されない（Herderson et al., J. Virol. 66:1856-1865 (1992)）。ウイルス調節タンパク質の例には、tatおよびrev遺伝子生成物：TatおよびRevが含まれるが、ただしこれらに限定されない。ウイルス酵素タンパク質の例には、pol遺伝子生成物：p11（プロテアーゼまたはPR）、p51（逆転写酵素またはRT）およびp32（インテグラーゼまたはIN）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ウイルス付属タンパク質の例には、vif、vpr、vpx、vpuおよびnef遺伝子生成物：Vif、Vpr、Vpx、VpuおよびNefが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００５６】
ある実施態様では、HIV Nefタンパク質を本発明のリコンビナントウイルスによって発現されるHIV抗原として供することができる。例えば、Nefをコードする配列（例えばHIVのBH10株については815２−8523位のnef配列、およびHIVのｐNL4-3株については8787−9407位のnef配列）をベクターに挿入することができる。
別の実施態様では、HIVのRevタンパク質を本発明のリコンビナントウイルスによって発現されるHIV抗原として供することができる。例えば、Revをコードする配列（例えばHIVのBH10株については5969−6044位のrev1配列、およびHIVのｐNL4-3株については8369−8643位のrev2配列）をベクターに挿入することができる。
また別の実施態様では、完全長のHIVのGagタンパク質を本発明のリコンビナントウイルスによって発現されるHIV抗原として供することができる。例えば、完全長のGagをコードする配列（例えばHIVのBH10株については112−1650位のgag配列、およびHIVのｐNL4-3株については790−2292位のgag配列）をベクターに挿入することができる。
また別には、HIVのGagタンパク質のキャプシドタンパク質（例えばp24CA）を本発明のリコンビナントウイルスによって発現されるHIV抗原として供することができる。例えば、p24CAをコードする配列（例えばHIVのBH10株については1186−1878位の配列、およびHIVのｐNL4-3株については508−1200位の配列）をベクターに挿入することができる。
さらに別の実施態様では、前記リコンビナントウイルスによって発現されるHIV抗原はenv遺伝子生成物に由来する。例えば前記抗原はEnvタンパク質に由来する。
【００５７】
前記実施態様にしたがえば、改変または突然変異誘発を用いて、Envの機能を失わせながらなおその天然の抗原性のための中和エピトープを含むようにEnvの一定領域内で欠失または変異させることができる。例えば、Envのタンパク分解プロセッシング部位を欠失または変異させて、gp120およびgp41フラグメントを生成する細胞性プロテアーゼによる切断に対して耐性にさせることができる。欠失または変異はgp41のトランスメンブレンおよび細胞質ドメイン（例えばTM、LLP-1およびLLP-2ドメイン）で実施してもよい。変異Envタンパク質はホストに感染する野生型HIVに取り込まれ、その最終目的（ホストの免疫系の破壊）を助長するためにHIVによって利用される危険性が野生型Envと比較して低い。
例えば野生型HIV Envは以下の態様で改変することができる。HIVのBH10株に由来し、TatおよびRevコード配列を含む野生型gp120配列を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化し、ヌクレオチド5101で始まりヌクレオチド8252で終わるフラグメントを生成することができる。HIVのBH10株については7848−8150位のコード配列から、ｐNL4-3株については8620‐8785位のコード配列からヌクレオチドを欠失させることによって、Envの細胞質ゾルドメインを除去することができる。HIVのBH10株については77101−7112位およびｐNL4-3株については7736‐7747位のアミノ酸配列PEKRをコードする12ヌクレオチドを欠失させて、Envの切断部位を除去することができる。
【００５８】
さらにまたこの実施態様にしたがえば、前記改変Envタンパク質は中和エピトープを含まない領域で欠失を含むことができる。例えば、gp120のV1およびV5ドメインをgp120の天然の抗原性を損なうことなく欠失させることができる。中和エピトープを含まないgp120のV2およびV3ドメインの部分もまた欠失させることができる。主要中和ドメイン（PND）はV3ドメインに見出されたが、gp120のV2およびC4ドメインもまた中和エピトープを含むことが判明した。HIVの種々の株およびクレードで、中和エピトープのアミノ酸配列を変動させることができる。しかしながら、変動の程度は高度に拘束される。したがって、中和エピトープを含まない配列を決定する方が容易であろう。
例えば、HIVのBH10株については596１−6032位およびｐNL4-3株については6602‐6673位でEnvのV1領域をコードする配列を欠失させることができる。EnvのV2領域をコードする配列は、HIVのBH10株については6060−6161位およびｐNL4-3株については6700‐6796位で欠失させることができる。場合によって、EnvのV1およびV2の両領域をコードする配列は、HIVのBH10株については5961−6161位およびｐNL4-3株については6602‐6796位で欠失させることができる。
また別には、前記リコンビナントウイルスによって発現されるHIV抗原はgp120のサブユニットであってもよい。前記は１つまたは２つ以上の選択された可変（V）および／または保存（C）ドメインを含む。例えば、HIV抗原は、V2、V3およびC4ドメインを含むか、またはV3およびC4ドメインを含むgp120サブユニットであろう。V3ドメインの中和エピトープの位置は周知である。V2およびC4ドメインの中和エピトープは残基163と200の間、および約420と440の間にそれぞれ位置することが判明した。さらに、抗体結合のための残基はまた、V2ドメインでは残基171、174、177、181、183、187、188を含み、C4ドメインでは残基429および432を含む（Berman et al., Virology 265:1-9 (1999)；Berman AIDS Res. Human Retroviruses 15:115-132 (1998)）。
【００５９】
別の実施態様では、本発明のリコンビナントウイルスによって発現されるHIV抗原は、糖付加部位に欠失および／または変異を含む改変Envタンパク質であろう。HIV-1のgp120は、N-結合糖化のための24の潜在的部位（Asn-X-Ser／Thr）を含み、前記24の糖化モチーフの約13は種々のウイルス単離体で保存されている。HIV Env gpタンパク質の分析によって、24の潜在的糖化部位のうち17が炭水化物側鎖で改変されることが示された（Mizouchi et al., J. Biol. Chem. 265:8519-8524 (1990)；Leonard et al., J. Biol. Chem. 265:10373-10382 (1990)）。Env gpタンパク質の広範囲の糖化のために、gp120のペプチド骨格の極めてわずかの領域が炭水化物塊から突出しているだけである。前記糖化部位のいくつかは非中和エピトープで見出され、これらは真の中和エピトープに対する免疫を弱めるか、またはおとりエピトープとして機能する。したがって、これらの糖化部位の欠失または変異は、真の中和エピトープを露出させることによって抗原の免疫を強化することができる。
また別の実施態様では、種々のHIV抗原が本発明の同一のリコンビナントウイルスによって発現させることができる。例えば、Env、TatおよびRevタンパク質をレトロウイルススプライシングドナー‐アクセプターメカニズムにより同じプロモーター（例えばCMV極初期プロモーター）から発現させることができる。場合によって、HIV Gagタンパク質（完全長型または切端型または改変型（例えばキャプシドタンパク質p24））もまた、他のHIV抗原（例えばEnv、TatおよびRev）とともに発現させることができる。さらに、これらHIV抗原は、１コピーまたはマルチコピーの免疫刺激因子（例えばIL-2、IL12、IFN-γおよびGMCSF）とともに同一のリコンビナントウイルスベクターによって発現させることができる。
例えば、HIV抗原をコードする配列をアデノウイルスベクターのE1領域に挿入し、レトロウイルススプライシングドナー‐アクセプターメカニズムまたはIRESメカニズムによりCMV極初期プロモーターから発現させることができる。免疫刺激因子をコードする配列は同じアデノウイルスベクターのE4領域に挿入し、レトロウイルススプライシングドナー‐アクセプターメカニズムまたはIRESメカニズムにより別のCMV極初期プロモーターから発現させることができる。
【００６０】
さらに別の実施態様では、本発明のリコンビナントウイルスでHIV抗原をコードする配列は、HIVウイルスの種々の株、単離ウイルスおよび／またはクレードに由来する配列を含むモザイク抗原である。HIVの株とは、一個体から単離されたHIV（単離体）で、性状が決定され株名が付与されたものである（例えばMN、LAI）。HIVの非均質性のために、２つの単離体は正確には同じものではない。関連するHIV単離体群は、それらの遺伝的類似性（例えばそれらのいエンベロープタンパク質の遺伝的類似性）にしたがって分類される。現在のところ２つのHIV-1単離体群、MおよびOが存在する。M群は少なくとも９つのクレード（サブタイプとも称される）、A−Iから成る。O群は同数のクレードから成るであろう。クレードは遺伝的に異なるが、全て感染性である。本発明の遺伝子ワクチンのデザインでモザイクウイルスを用いることによって、作製されたワクチンは、より広い範囲の“野生型”HIV株に対する抗HIV抗体およびHIV特異的細胞毒性Tリンパ球（CTL）の産生を刺激する能力が強化されるはずであると考えられる。
ある実施態様では、リコンビナントウイルスのモザイクHIV抗原は、以下を含む多種のHVI-1クレードに由来する抗原を含む：クレードA（アクセッション番号：HIV-1 92UG037WHO.0108HED）、B（アクセッション番号：pNL4-3）、C（アクセッション番号：HIV-1 92BR025WHO.109HED）、D（アクセッション番号：HIV-1 92UG024.2）、E（アクセッション番号：HIV-1 93TH976.17）、F（アクセッション番号：HIV-1 93BR020.17）およびG（アクセッション番号：HIV-1 92RU131.9）。場合によって、種々のクレードに由来するHIV抗原の制限フラグメント（例えばAvaIフラグメント）のマルチリピートをヘッド‐トゥ‐テールの態様で連結してさらに大型の複合体モザイクHIV抗原を作製してもよい。
【００６１】
例えば、アデノウイルスベクターではモザイクHIV抗原としてマルチクレードV3ループを構築することができる。場合によって、マルチクレードに由来するgp41欠損HIV抗原をモザイクHIV抗原として供することができる。また別には、クレードB（ｐNL4-3）から欠失したV1およびV2ループを含むマルチクレード由来HIV抗原をモザイクHIV抗原として供することができる。
さらに場合によって、アミノ酸配列SWLLLLLLSLSLLQATDFMSL（配列番号９）をコードするヒト遺伝子Thy-1GPAアンカー配列を前記リコンビナントウイルス構築物に付加することができる。
別の実施態様では、モザイクHIV抗原はEnvタンパク質を含み、前記はHIVの種々の株、単離物および／またはクレードに由来するgp120の可変および定常ドメインを含む。例えば、M群のクレードB由来V2ドメインをO群のクレードCのV3およびC4ドメインと混合し、モザイクHIV抗原を作製することができる。そのようなモザイク抗原による個体のワクチン接種によって、交叉クレード活性を有するCTLを刺激することができる。換言すれば、これらのCTLは種々のクレードに由来するHIVに感染した標的細胞を認識し、これを殺すことができる。
また別には、前記リコンビナントウイルスは、その各々がHIVの種々の株、単離体またはクレードに由来する抗原である複数のHIV抗原を発現することができる。例えば、HIVの種々のクレードに由来するenv遺伝子を縦並びにリコンビナントウイルスでクローニングし発現させ、ホスト細胞でこれらのクレードに由来する種々のEnvタンパク質を生成することができる。ホスト細胞におけるHIVの種々の株、単離体またはクレードに由来する種々のEnvタンパク質の発現は、本発明の遺伝子ワクチンの能力を強化し、より広いスペクトルの“野生型”HIV株に対して抗HIV抗体およびHIV特異的細胞毒性Tリンパ球（CTL）の生成を刺激するはずである。そのようなワクチンを接種されたホストは、種々のHIV株の感染から免疫を付与されることができる。
本発明の遺伝子ワクチンを用いることによって、HIVに感染していない個体をHIVに対して免疫することができる。HIV感染個体に対しては、本ワクチンはまた前記個体の免疫反応を追加支援し、この毒性ウイルスに対する戦いを助けることができる。本遺伝子ワクチンは高レベルの抗原および／または多様なHIV糖タンパク質およびキャプシドタンパク質を同時に発現できるので、ワクチン接種された個体は種々のHIV株、例えばHIV-1およびHIV-2に対して免疫されるはずである。さらに、本遺伝子ワクチンは高レベルのサイトカインを発現し天然のウイルス感染に対する身体の反応に近似するので、HIVに対するそのような遺伝子ワクチンに対する身体の免疫反応は強力で長期間持続し、それによってこの致死的ウイルスに対する生涯にわたる免疫を達成するはずである。
【００６２】
４．肝炎ウイルスに対する遺伝子ワクチン
本発明の遺伝子ワクチンはまた、肝炎ウイルス、例えばA、B、C、DおよびE型ウイルスに対して有効なワクチンの要求に向けられている。本発明にしたがえば、本遺伝子ワクチンは、ウイルスゲノムが肝炎ウイルスに由来する１つまたは２つ以上の抗原（例えば前記肝炎ウイルスの糖タンパク質およびコアタンパク質）を保持するリコンビナント良性ウイルスであろう。これらHIV抗原の配列は、例えば前記肝炎ウイルスの糖タンパク質またはコアタンパク質の病原性領域の欠失のように改変することができる。
特に本発明のリコンビナントウイルスは、B型肝炎の感染に対して個体を免疫するためにワクチンとして用いることができる。ウイルス性B型肝炎はB型肝炎ウイルス（HBV）によってひき起こされる。HBVは全世界で概算で400万人が感染し、もっとも普遍的な人類の病源体となっている。肝細胞癌（HCC）（人類を脅かすもっとも一般的な癌）は主として慢性HBV感染によって惹起される。
HBVはヘパドナビリデ（hepadnaviridae）科に属するたいていは二本鎖DNAウイルスである。HBVゲノムは、その圧縮形態、オーバーラップする読み枠の使用、およびビリオンは本質的にDNAを含むが逆転写工程に依存するためにウイルス界ではユニークである。HBVゲノムは４つの遺伝子、pol、env、プレ-コアおよびXを有し、前記はそれぞれウイルスDNAポリメラーゼ、エンベロープタンパク質、プレ‐コアタンパク質（ウイルスキャプシドに加工される）およびタンパク質Xをコードする。タンパク質Xの機能は明らかではないが、ホスト細胞遺伝子の活性化および癌の発達に必要とされるのかもしれない。
【００６３】
HBV感染の診断は一般に血清学を基準に実施される。実質的にHBVに感染した全個体が検出可能な血中肝炎表面抗原（HBsAg）を有する。HBV感染に対する優れたワクチンが得られたにもかかわらず、前記ワクチンはなお進行中の課題である。今日の肝炎ワクチンに関する概覧（多数の主要参考文献を含む）は下記文献で見出される：Eddleston, The Lancet p.1142, May 12, 1990；Viral Hepatitis and Liver Disease, B.N. Vyas, J.L. Dienstag and J.H. Hoofnagle eds., Grune and Stratton, Inc., (1984) ；Viral Hepatitis and Liver Disease, Proceedings of the 1990 International Symposium, eds F.B. Hollingers, S.M. Lemon and H. Margolis, publishued by Williams and Wilkins。
本発明にしたがえば、前記ウイルス抗原はB型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質であろう。前記は、例えば小型B型肝炎表面抗原（SHBsAg）（オーストラリア抗原とも称される）、 中型B型肝炎表面抗原（MHBsAg）および大型B型肝炎表面抗原（LHBsAg）である。
種々のタイプのHBV（例えばアジアC型およびアメリカA型）の抗原を前記リコンビナントウイルスで発現させ、前記のタイプのHBVに対する免疫反応を誘発することができる。前記HBV炎表面抗原（HBsAg）またはコア抗原（HBcAg）を本発明のリコンビナントウイルスによって別々にまたは一緒に（HBsAg＋HBcAg）発現させてもよい。
例えば、多種のHBV抗原をコードする配列をアデノウイルスベクターのE1またはE4領域に挿入し、レトロウイルススプライシングドナー‐アクセプターメカニズムまたはIRESメカニズムを介してCMV極初期プロモーターから発現させることができる。さらに、これらのHBV抗原は、１つまたは２つ以上の免疫刺激因子（例えばIL-2、IFN-γおよびGMSCF）と一緒に一コピーとしてまたはマルチコピーとして発現させてもよい。前記のサイトカインをコードする配列を、前記抗原配列に占領されていないE4またはE1領域に挿入し、レトロウイルススプライシングドナー‐アクセプターメカニズムまたはIRESメカニズムを介して別のCMV極初期プロモーターから発現させることができる。
【００６４】
挿入物の具体的な組み合わせには以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：HBsAg＋HBcAg；HBsAg＋HBcAg＋IL-2；HBsAg＋HBcAg＋IFN-γ＋GMCSF；およびHBsAg＋IFN-γ＋IFN-γ＋GMCSF。
前記免疫刺激因子をコードする配列を同じベクターのE4領域に挿入し、レトロウイルススプライシングドナー‐アクセプターメカニズムまたはIRESメカニズムを介して別のCMV極初期プロモーターから発現させることができる。
さらに本発明にしたがえば、前記ウイルス抗原はC型肝炎ウイルスの表面抗原またはコアタンパク質（例えばNS3、NS4およびNS5）抗原であろう。
例えば、HCV抗原をコードする配列はアデノウイルスベクターのE1またはE4領域に挿入し、１つまたは２つ以上の免疫刺激因子（例えばIL-2、IL-12、IFN-γおよびGMCSF）と別々にまたは一緒に一コピーとしてまたはマルチコピーとして発現させることができる。
具体的な組み合わせには以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：
（１）HCV野生型E2＋野生型E1；
（２）HCVコア；
（３）HCV E2＋E1＋コア；
（４）HCV E2＋E1＋コア＋IL-2；
（５）HCV E2＋E1＋コア＋IL-2＋IFN-γ＋GMCSF；および
（６）HCV E2＋E1＋コア＋IL-2＋IFN-γ＋IL-12。
別の実施態様では、HCV E1およびE2の超可変領域（HVR）のマルチコピー（例えばHVRの5コピー（５ｘHVR）をリコンビナントウイルスでウイルス抗原として供し、単独でまたは１つもしくはは２つ以上の免疫刺激因子（例えばIL-2、IL-12、IFN-γおよびGMCSF）と一緒に一コピーとしてまたはマルチコピーとして発現させることができる。
具体的な組み合わせには以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：
（１） E2−5ｘHVR＋E1；
（２） E2−5ｘHVR＋E1＋IL-2；
（３） E2−5ｘHVR＋E1＋コア＋IL-2；
（４） E2−5ｘHVR＋E1＋IL-2＋IFN-γ＋GMSCF；および
（５） E2−5ｘHVR＋E1＋コア＋IL-2＋IL-12。
本発明の遺伝子ワクチンを用いることによって、肝炎に感染していない個体を肝炎ウイルスに対して免疫することができる。肝炎ウイルス感染個体の場合は、本ワクチンはまた前記個体の免疫反応を追加支援し、肝炎ウイルスに対する戦いを助けることができる。本遺伝子ワクチンは高レベルの抗原および／または多様なHIV糖タンパク質およびキャプシドタンパク質を同時に発現できるので、ワクチン接種された個体は種々のHIV株、例えばHIV-1およびHIV-2に対して免疫されるはずである。さらに、本遺伝子ワクチンは高レベルの抗原および／または多様な肝炎糖タンパク質およびコアタンパク質を同時に発現することができるので、前記ワクチンを接種された個体は種々の肝炎ウイルス株および／または型（例えばA、B、C、DおよびE型肝炎ウイルス）に対し免疫を生じるはずである。さらに、本遺伝子ワクチンは高レベルのサイトカインを発現し天然のウイルス感染に対する身体の反応に近似するので、肝炎に対するそのような遺伝子ワクチンに対する身体の免疫反応は強力で長期間持続し、それによって肝炎ウイルスに対する生涯にわたる免疫が達成されるはずである。
【００６５】
５．エボラウイルスに対する遺伝子ワクチン
本発明の遺伝子ワクチンはまた致死的ウイルスであるエボラウイルスに対する有効なワクチンの要求に向けられている。本発明にしたがえば、本遺伝子ワクチンは、ウイルスゲノムがエボラ肝炎に由来する１つまたは２つ以上の抗原（例えばエボラウイルスの糖タンパク（例えばGP1およびGP2））を保持するリコンビナント良性ウイルスであろう。これらエボラ抗原の配列は、例えばエボラウイルスの免疫抑制領域および／または他の病原性領域の欠失のように改変することができる。
エボラウイルスは、人類にとって公知のもっとも致死性の高い（死亡率は90％に達する）ウイルスの１つである（K.N. Johnson, Ann. Intern. Med. 91(1):1179-9 (1979)）。エボラウイルス感染の犠牲者は凄惨な出血性症状を示し、数日で死亡する。このウイルスの自然界における存在場所は、感染の病因論の詳細と同様に不明である。このウイルスは肝細胞および細網内皮系細胞（例えばマクロファージ）に対し特別な親和性を有する。広範囲の肝破壊はこの疾患の特徴である。
エボラウイルス感染は稀ではあるが、エボラウイルスは人間の接触を介して容易に伝達され、極めて直接感染性が高いので、この疾患が世界的な流行病となる潜在性について保健衛生職員は懸念している。今日の迅速で広範囲な移動の性質のために工業化諸国において、アフリカで最近発生したような流行が発生する可能性がある。アフリカにおける最近のエボラウイルス感染事例は、この極めて危険な感染症の流行に備えるように強い警告を発している。さらに、エボラウイルスは、テロリスト国家または機関によって生物学的兵器として用いられた場合に恐るべき潜在能力を有する。ウイルス感染のほとんどの事例のように、エボラウイルス流行を防ぐ最良のアプローチはワクチン接種によるものである。しかしながら、これまでのところエボラウイルス感染に対する有効なワクチンも治療法も存在しない。
【００６６】
エボラウイルスはエンベロープを有する、マイナス鎖のＲＮＡウイルスであり、フィロビリデ（Filoviridae）科に属する。フィロウイルスには３つの株、エボラ、マルブルグおよびレストンがある。エボラウイルスは多数の異なる態様、例えば空気が取り込まれる開口部（このウイルスは空気媒介粒子で運ばれる）から身体に侵入し、さらにまた皮膚の任意の開口部（例えば創傷）から身体に侵入できる。
エボラウイルスは分断されていないRNAゲノムを有し、前記ゲノムは全てのウイルス構造タンパク質（核タンパク質、マトリックスタンパク質（VP24およびVP40））、非構造タンパク質（VP30、VP35）およびウイルスポリメラーゼをコードする（C.J. Peters, West J. Med.164(1):36-8 (1996)）。ウイルスタンパク質の中で前記エンベロープ糖タンパク質（GP）は転写エディットによって生成される２つの形態、分泌糖タンパク質（50−70ｋDa）およびトランスメンブレン糖タンパク質（130−170ｋDa）として存在する（A. Sanchez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(8):3602-7 (1996)）。前記GPの２つの形態は295アミノ酸の相同性を共有するが、それらは異なる結合特異性を有し、ウイルス感染過程で異なる役割を果たすことを示唆している。分泌糖タンパク質（sGP）は感染細胞によって合成され分泌される主要な形態である。前記はホストの免疫系を抑制する役割を果し（Z. Yang et al., Science 279(5353):1034-7 (1998)）、さらに、この２つのGPは部分的にその抗原性を共有するので、分泌糖タンパク質はウイルス粒子が中和抗体から逃れることを可能にするおとりとして供されるのかもしれない。エボラウイルス、ザイールに感染したヒト生存者に由来するモノクローナル抗体の分析によって、前記抗体の大部分はsGPに特異的でほんのわずかがGPに弱く結合することが明らかにされた（T. Maruyama et al., J. Infect. Dis. 179(Suppl):S235-9 (1999)；T. Maruyama et al., J. Virol. 73(7):6024-30 (1999)）。前記sGPが免疫系を抑制する正確なメカニズムは明確には理解されていないが、感染初期に合成される大量のsGPは、おそらく感染部位の好中球の抑制（Z. Yang et al., Science 279( 5353):1034-7 (1998)およびエボラウイルス感染患者で液性免疫反応が存在しないことについて中心的関与を果しているのであろう（S. Baiz et al., Nat. Med. 5(4):423-6 (1999)）。このタンパク質はまた多くのタイプの免疫細胞を過剰活性化させ、血管内の集団的アポトーシス（本質的に免疫系のシャットダウン）をもたらす（S. Baiz et al., Nat. Med. 5(4):423-6 (1999)）。エボラウイルスのライフサイクルにおけるsGPの重要性はまた、sGPが今日までに調べられた全てのエボラウイルスに存在するという事実によって示唆される（H. Feldmann et al., Arch. Virol. Suppl. 15:159-69 (1999)）。
【００６７】
膜糖タンパク質は、ビリオンの付着およびレセプター結合およびウイルス‐細胞膜融合を仲介することにより標的細胞への侵入に必要である（Wool-Lewis et al., J. Virol. 72(4):3155-60 (1998)；H. Ito et al., J. Virol. 73(10):8907-12 (1999)）。それらは単一のペプチド前駆体として合成され、細胞性酵素（フリンまたはカテプシンB）によって２つの成熟形（GP1およびGP2）に切断される。前記２つのGPはジスルフィド結合によって結合したままで、トランスメンブレン（TM）ドメインによってウイルス膜に結合したままである（H. Ito et al., J. Virol. 73(10):8907-12 (1999)；V.N. Malashkevich et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(6):2662-7 (1999)）。タンパク分解切断部位は４−５の塩基性アミノ酸残基を含み、前記はレトロウイルス、インフルエンザおよびパラミクソウイルスのGPで見出されるものと類似する（W. Garten et al., Biochimie, 76(3-4):217-25 (1994)）。切断事象はウイルスの感染性に必須で、おそらくはレトロウイルスまたはインフルエンザウイルスのGPの切断と同じ酵素によって切断される（W. Garten et al., Biochimie, 76(3-4):217-25 (1994)；V.E. Volcjkov et al., Virology, 245(1):110-9 (1994)）。さらに、エボラウイルスGPは、レトロウイルスおよびインフルエンザウイルスのGPと共通のウイルス感染仲介メカニズムを有する（W. Weissenhorn et al., Mol. Membr. Biol. 16(1):3-9 (1999)）。膜結合GPはウイルス感染の開始に重大な役割を果し、さらにビリオン表面上で暴露される主要なタンパク質であるので、それらはウイルスに対する中和抗体のための主要な標的である。
【００６８】
ホストに対してエボラウイルスを致死的にするこのウイルスの特性の１つは、ホストの免疫系を抑制するその能力である。エボラウイルス感染によって死亡した患者の血清学的分析では、液性または細胞性免疫反応の徴候は示されなかった（S. Baiz et al., Nat. Med. 5(4):423-6 (1999)）。対照的に、幾人かの生存者で、ウイルスタンパク質に対する抗体およびウイルス特異的T細胞活性が検出された（S. Baiz et al., Nat. Med. 5(4):423-6 (1999)）。その免疫抑制メカニズムは未だ理解されていないが、高レベルのｓGPおよびGP中の免疫抑制ペプチドが、エボラウイルス感染患者で液性および細胞性免疫反応が存在しないことの原因であろう。
エボラウイルスの初期感染に必要なタンパク質はウイルスの糖タンパク質である。したがって、前記糖タンパク質は中和抗体の標的である。しかしながら、エボラウイルスは“トリック”を開発し、感染から回復するには手遅れになるまでホストの免疫反応を妨げるかまたは遅らせる。エボラウイルスに対するワクチン製造の通常の方法は以下の理由からおそらく有効ではないであろう：（１）細菌、酵母または昆虫ウイルスによって産生されるウイルス糖タンパク質は適切に糖付加されず、したがって前記ウイルスタンパク質の本来の抗原性をもたない；（２）エボラウイルスはあまりに危険で不活化ウイルスワクチンとして大量に製造できない；（３）ウイルス不活化の方法はしばしばタンパク質の構造を破壊し、したがってその抗原性を変化させる。
【００６９】
本発明の好ましい実施態様は、エボラウイルスの１つまたは２つ以上の抗原をコードする核酸を有するリコンビナントウイルスワクチンである。エボラウイルス（ザイール株を含む）の制限マップおよび完全な配列情報はGenBankから入手できる。
本遺伝子ワクチンはリコンビナント良性ウイルスであり、前記は複製欠損または複製不能で、したがって最初に感染した細胞から拡散することができない。例えば、本発明のリコンビナントアデノウイルスワクチンは、エボラウイルスタンパク質がリコンビナントウイルスの機能と機能的に無関係であっても２週間またはそれ以上にわたって高レベルのエボラウイルス抗原の発現を仲介する。
本発明の別の実施態様では、前記リコンビナントウイルスは１つまたは２つ以上のエボラウイルス抗原を発現する。改変エボラウイルス抗原は好ましくはエボラウイルスエンベロープ糖タンパク質および／または免疫学的に活性なその部分である。好ましくは、前記糖タンパク質は改変GPおよびｓGP糖タンパク質である。前記エボラウイルスGPおよびｓGP糖タンパク質は改変されて、その病原性機能および免疫抑制機能は破壊されているが、その本来の抗原性の大半は維持されている（なぜならば、それら糖タンパク質はエボラウイルスが生産的に感染できる細胞内で発現され、折り畳まれ、糖付加され、細胞膜へ誘導されることができるからである）。前記改変は標準的な分子遺伝学的操作法（例えば制限消化およびポリメラーゼ連鎖反応）を用いて実施できる。
エボラウイルスエンベロープの糖タンパク質の好ましい改変はエボラウイルスGPの感染機能の破壊である。エボラウイルスの感染機能を破壊するいずれの改変も用いることができるが、好ましくは前記改変はGPの切断部位の５つのアミノ酸の欠失である（実施例１を参照されたい）。この切断部位は５つの塩基性アミノ酸残基、RRTRRを開放読み枠の出発点から501位に含んでいる。この欠失は、当業界で周知の方法によって実施されるPCR増幅を用いてエボラウイルスGPのｃDNAに導入することができる。
【００７０】
また別の好ましいエボラウイルスゲノムの改変はｓGPの合成を妨げる。合成を妨げるいずれの改変も用いることができる。好ましくは前記改変は、RNAエディット部位をUUUUUUUからUUCUUCUUに変更するように誘導される（実施例１を参照されたい）。
本ワクチンで使用されるエボラウイルス抗原の別の好ましい改変は、GP2に位置する免疫抑制（IS）ペプチドである。前記ISペプチドモチーフはアミノ酸585−609に位置する。アミノ酸590−600の間における10アミノ酸の欠失によってその機能が除去される。第二は、ISペプチドモチーフの各半分を倒置し複製する（図2を参照されたい）。これによってさらにその機能の破壊およびその発現性の増強が担保される。
さらに、前記コードタンパク質のアミノ酸配列を変更した、本発明のエボラウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列の変種または派生物を製造することができることは当業者には極めて明白であろう。前記変更された発現抗原は異なるアミノ酸配列を有するが、なおエボラウイルス抗原と反応する免疫反応を誘発し、機能的同等物と考えられる。さらに、完全長のタンパク質の一部分をコードする完全長遺伝子のフラグメントもまた構築することができる。これらのフラグメントは、エボラウイルス抗原と反応する抗体を誘発するタンパク質またはペプチドをコードすることができ、したがって機能的同等物と考えられる。
本発明のワクチンを個体に接種することによって、アデノウイルス粒子の細胞への侵入並びにエボラウイルス抗原（例えばエンベロープ糖タンパク質）および免疫刺激サイトカインの発現がもたらされる。細胞内でのエボラウイルス抗原の発現は、あたかも感染が生じたかのような強力で持続的な免疫反応を誘発する。本遺伝子ワクチンは天然の感染の免疫誘発の全て（天然のウイルスタンパク質の発現および長期間持続する抗原刺激を含む）を含むが、本物のウイルス感染の病原性はもたない。本発明のワクチンでは、エボラウイルスの免疫抑制メカニズムは能力を失っているが、抗原はその本来の形態で生じ、細胞膜と結合し、免疫刺激は数週間にわたって持続する。この新規なワクチンの効果は長期間持続し、エボラウイルス感染に対し高い防御率を提供する。
本発明はまた、上記に記載したワクチンを投与することを含むエボラウイルス感染に対してヒトを免疫する方法を目的とする。これらのワクチンをヒトに投与する技術は保健分野の業者には公知である。
本発明の遺伝子ワクチンを使用することによって、エボラウイルスに対して個体を免疫することができる。本遺伝子ワクチンは高レベルの複数の抗原および／または多様な糖タンパク質を同時に発現することができるので、ワクチン接種された個体は種々のエボラウイルス株に対して免疫されるはずである。さらに、本遺伝子ワクチンは高レベルのサイトカインを発現し、自然の状態のウイルス感染に対する身体の反応に近似するので、前記身体のそのようなエボラウイルスに対する遺伝子ワクチンに対する免疫反応は強力で長期間持続するはずで、それによってエボラウイルスに対する生涯にわたる免疫を達成できる。
【００７１】
６．投与製剤および投与ルート
本発明はまた、上記で述べたワクチンおよび医薬的に許容できる希釈剤、担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。さらに、前記ワクチンはまた、懸濁剤を含み、しばしばその活性を高めおよび／または保存期間を延長するために他の構成成分と混合された水性媒体または水を含むことができる。これらの構成成分は、塩、pH緩衝剤、安定剤（例えば脱脂粉乳またはカゼイン水解物）、乳化剤および保存料であろう。
前記リコンビナントウイルスから発現されるウイルス抗原に対する免疫反応を増強させるために前記医薬組成物にはアジュバントを含むことができる。前記アジュバントの例には、ムラミルジペプチド、水酸化アルミニウム、サポニン、多価陰イオン、両親媒性物質、バチルスカルメット‐ゲリン（BCG）、内毒素リポポリサッカライド、カサガイヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin; GKLH）、インターロイキン‐2（IL-2）、顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびサイトキサン（低用量で投与されたときは腫瘍誘発抑制を減少させると考えられている化学療法剤）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明はまた病源体に対するホストの免疫を高めるキットを提供する。これらのキットは、本発明の1つまたは２つ以上のワクチンを、前記ワクチンをホストにデリバーするための組成物および／または前記ワクチンをホストにデリバーするための装置（例えば注射筒）とともに含むことができる。
【００７２】
本発明のワクチンは、通常の能動的免疫方法、すなわち１回または反復投与により、投与製剤に適合した態様で、さらに予防的に有効な量（すなわち病原性ウイルスまたは細菌（例えば有毒エボラウイルス、A、B、C、DおよびE型肝炎ウイルス、並びに結核菌）によるチャレンジに対してヒトに免疫を誘発する前記抗原を発現させることができる抗原またはリコンビナント免疫微生物量）で投与することができる。免疫とは、非ワクチン接種者と比較してワクチン接種後に顕著なレベルの防御が誘発されることと定義される。
本発明のワクチン（すなわちリコンビナントウイルス）は、ホストに（好ましくはヒトに）任意の医薬的に許容できる投与ルートで投与することができる。前記投与ルートには筋肉内、気道内、皮下、鼻腔内、皮内、直腸、粘膜内、経口および非経口投与ルートが含まれるが、ただしこれらに限定されない。所望の場合、投与ルートは、免疫対象の病原性ウイルスのタイプおよび所望される身体の防御部位に応じて組み合わせるかまたは調節することができる。
投与ルートは誘発される免疫の性質および防御率に影響を及ぼす場合特に重要であろう。例えば、非経口投与は全身性免疫反応のみを活性化するが、経口投与はさらに粘膜免疫反応を提供する。本発明のリコンビナントウイルスの粘膜免疫誘発能力は、本ワクチンの粘膜伝達感染および性器伝達感染における応用を重要なものにする。
【００７３】
本リコンビナントウイルスの投与量または有効量は、例えば症状、選択されたウイルスまたは細菌抗原、年齢、体重およびホストの健康状態のような要件に左右され、ホスト間で変動するであろう。一般的には、投与されるべきウイルス粒子の量は、例えばワクチンの投与回数および所望される反応のレベルに左右されることは当業者には理解されよう。
個体に投与されるべき本発明のリコンビナントウイルスの適切な力価は、ウイルスまたは細菌抗原に対する免疫反応を調節し、前記抗原が由来した前記病原性ウイルスまたは細菌に対する抗体を誘発することができる力価である。有効な力価は、ワクチンを個体に投与した後免疫エフェクター細胞の活性を測定するアッセイを用いるか、または周知のin vivo診断アッセイを用いて治療の有効性をモニターすることによって決定できる。例えば、本発明のリコンビナントアデノウイルスの予防的な有効量または投与量は、約１ｘ104から１ｘ108のプラーク形成単位（pfu）ウイルス／mLの濃度を含む食塩水溶液の約100μLから約10ｍLの範囲である。他のプラスミドDNAベクターを用いるときは、各投与につき１−1000μgが好ましい投与量範囲である。前記投与量は初回免疫および追加免疫について同じでもよいが、初回免疫投与量と比較して追加免疫期で提供されるリコンビナントウイルスの量を変更することが好ましい。本発明のリコンビナントウイルスの接種量は、当業者には周知のように、具体的なリコンビナントウイルスの固有の特性によって、並びに前記特性および達成されるべき具体的な免疫学的効果に応じて決定される。
【００７４】
７．病源体に対するホストの免疫の強化方法
本発明はまた、病源体に対して上記で述べたリコンビナントウイルスによるホストの免疫を強化する方法を提供する。
ある実施態様では、本方法は、病原性ウイルスに対するホストの免疫を強化するために提供される。前記方法は、免疫反応を誘発するために有効量のリコンビナントウイルスをホストに投与することを含む。前記リコンビナントウイルスは、前記良性ウイルスにとって異種であって病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードする抗原配列（前記ウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する）；および前記良性ウイルスとって異種であって免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列（前記ホストにおける前記配列の発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する）を含む。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であり、前記病原性ウイルスに本来附随する悪性性をホストで惹起しない。
前記リコンビナントウイルスは医薬的に許容できる任意の投与ルートでホストに投与することができる。前記リコンビナントウイルスは、筋肉内、気道内、皮下、鼻腔内、皮内、粘膜内、直腸、経口および非経口投与ルートによりホストに投与することができる。
【００７５】
別の実施態様では、強力で長期間持続する免疫反応を多種の抗原に対して誘発する、前記多種抗原を含む病原性ウイルスに対しホストを免疫する方法が提供される。前記方法は、免疫反応を誘発するために有効量のリコンビナントウイルスをホストに投与することを含む。前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスにとって異種の複数の抗原配列であって各々が１つまたは２つ以上の病原性ウイルスに由来する異なるウイルス抗原をコードする配列を含み、前記複数の抗原配列の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、前記病原性ウイルスに自然の状態で附随している悪性性をホストで惹起しないであろう。
場合によって、前記リコンビナントウイルスはまた、前記リコンビナントウイルスとって異種であって免疫刺激因子をコードする１つまたは２つ以上の免疫刺激因子配列（前記ホストにおけるその発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する）を含むことができる。
さらに別の実施態様では、多種の遺伝子ワクチンまたはウイルスを用いることによって、病原性ウイルスに対してホストを免疫する方法を提供する。前記多種のリコンビナントウイルスは各リコンビナントウイルスで異なる抗原を保持することができる。前記多種のリコンビナントウイルスは同時にまたは段階的にホストに投与することができる。
前記方法は、免疫反応を誘発するために有効量の第一および第二のリコンビナントウイルスをホストに投与することを含む（この場合複数の抗体が産生される）。前記第一のリコンビナントウイルスは、前記第一のリコンビナントウイルスにとって異種であって病原性ウイルスに由来するウイルス抗原をコードする抗原配列を含み、前記ウイルス抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記ウイルス抗原および前記ウイルス抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記第二のリコンビナントウイルスは、前記第二のリコンビナントウイルスにとって異種であって免疫刺激因子をコードする免疫刺激因子配列（前記ホストにおけるその発現は前記ウイルス抗原の免疫原性を強化する）を含む。前記第一および第二のリコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であって、前記病原性ウイルスに自然の状態で附随している悪性性を前記ホストで惹起しないであろう。
【００７６】
前記実施態様にしたがえば、前記第一および第二のリコンビナントウイルスは任意の良性ウイルス、例えば複製不能アデノウイルス、アデノ附随ウイルス、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルス、アルファウイルス、ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスおよびワクシニアウイルスであろう。場合によって、前記第一および第二のリコンビナントウイルスの両ウイルスが複製不能アデノウイルスであろう。さらに場合によって、前記第一および第二のリコンビナントウイルスの一方はリコンビナントアデノウイルスであり、他方はリコンビナントワクシニアウイルスであろう。
さらに別の実施態様では、病源体に対するホストの免疫を強化する方法が提供される。前記方法はリコンビナントウイルスおよび１つまたは２つ以上の免疫刺激因子を投与することを含む。前記リコンビナントウイルスは上記に記載したリコンビナントウイルスのいずれかであろう。特に、前記リコンビナントウイルスは、前記リコンビナントウイルスにとって異種であって病原体に由来する１つまたは２つ以上の抗原をコードする１つまたは２つ以上の抗原配列を含む。前記抗原の発現は、前記リコンビナントウイルスによるホストの感染時に前記抗原および前記抗原を発現する細胞に対する免疫反応を誘発する。前記リコンビナントウイルスは好ましくは複製不能であり、前記病原体に自然な状態で附随する悪性性をホストで惹起しない。前記病源体は病原性ウイルス、例えばHIV、肝炎ウイルスおよびエボラウイルス、病原性細菌または寄生虫であろう。
本実施態様にしたがえば、前記免疫刺激因子は、前記リコンビナントウイルスに感染した細胞によって発現される抗原の免疫原性を強化する任意の分子であろう。好ましくは、前記免疫刺激因子はサイトカインであり、以下を含む（ただしこれらに限定されない）：インターロイキン-2、インターロイキン-8、インターロイキン-12、β-インターフェロン、λ-インターフェロン、γ-インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子および前記の組み合わせ。
【００７７】
前記サイトカインは精製タンパク質の形態でホストに投与することができる。また別には、前記サイトカインは、ホスト細胞にトランスフェクトまたは形質導入したしたときに前記サイトカインのコード配列を発現する発現ベクターの形態で投与することができる。
本方法の上記記載のいずれかの実施態様にしたがえば、本方法はさらに免疫反応を追加支援するために再度前記リコンビナントウイルスをホストに投与することを含む。前記リコンビナントウイルスによるそのようなブースター接種は、好ましくは初回接種の数週間から数ヶ月後に実施される。感染に対する持続的な高レベルの防御または前記病源体の感染によって惹起される疾患の有効な治療を担保するために、規則的な間隔（例えば数年毎に１回）でホストにブースター免疫を再投与することは有用であろう。ブースター免疫で投与される前記リコンビナントウイルスは、初回免疫で投与されたリコンビナントウイルスと同じでも異なっていてもよい。
さらにまた本方法の上記実施態様のいずれかにしたがえば、本方法はさらに、前記リコンビナントウイルスによってコードされる抗原と同じまたは異なる抗原をコードするプラスミドベクターをホストに投与することを含む。前記プラスミドベクターは好ましくは、ホストの細胞にトランスフェクションしたときに抗原を発現する真核細胞プラスミド発現ベクターである。
さらにまた本方法の上記実施態様のいずれかにしたがえば、本方法はさらに、ホストに第二のリコンビナントウイルスを投与して免疫反応を追加支援するか、および／または前記リコンビナントウイルスに対するホストの免疫系の中和作用を最小限にすることを含む。
【００７８】
場合によって、第二のリコンビナントウイルスは第二の病源体に由来する第二の抗原配列を含む。前記第二の抗原配列は、初回免疫で投与された第一のリコンビナントウイルスに含まれる第一の抗原配列とは異なる。好ましくは、前記第二の抗原配列は、第一の抗原配列によってコードされるものと同じタイプの抗原をコードするが、ただし同じ病源体の異なる株、血清型またはサブタイプ／クレードに由来する。また別には前記第二の抗原は第一の抗原と比較して異なるタイプの抗原であってもよい。例えば、第一の抗原は同じまたは別個の病源体の表面タンパク質であり、第二の抗原は、コアタンパク質であろう。
さらにまた本方法の上記実施態様のいずれかにしたがえば、本方法はさらに、前記リコンビナントウイルスに対するホストの免疫系の中和作用を最小限にするために、前記リコンビナントウイルスの上記の実施態様のいずれかの投与の前、同時または後にウイルスベクターをホストに投与することを含む。好ましくは、前記ウイルスベクターは前記リコンビナントウイルスの投与後に投与される。
前記ウイルスベクターは前記リコンビナントウイルスの天然の原ウイルスである。例えば、前記ウイルスベクターは野生型アデノウイルス５型（Ad5）であり、一方前記リコンビナントウイルスは遺伝的に改変されたAd5であろう。
場合によって、前記ウイルスベクターは、前記リコンビナントウイルスとは異なる血清型の野生型または遺伝的に改変されたウイルスであろう。例えば、前記リコンビナントウイルスは遺伝的に改変されたAd5であり、一方前記ウイルスベクターは、Ad5以外の血清型の野生型または遺伝的に改変されたアデノウイルスベクター、例えば血清型１−４または６−51であろう。今後発見および／または分類される他の血清型もまた本発明の範囲内に包含されることは留意されよう。
【００７９】
例えば、前記リコンビナントウイルスは、１つまたは２つ以上の異種抗原および／または免疫刺激因子をコードするリコンビナントAd5であり、一方前記ウイルスベクターはまた、同じまたは異なる抗原および／または免疫刺激因子をコードするがただし異なる血清型のリコンビナントアデノウイルス（例えばAd2、Ad4、Ad9、Ad12、Ad35およびAd40）であろう。そのような血清型のローテーションは導入遺伝子の発現を強化し前記ワクチンの免疫原性を増強させると考えられる。この考えを立証するために、野生型の非Ad5ベクターを先ずマウスに投与し、注射後３週間で抗アデノウイルス抗体レベルをELISAによって測定することができる。続いて異種抗原（例えばHBVコアタンパク質）をコードするリコンビナントAd5を初回注射の４−５週間後に前記マウスに投与する。前記異種抗原（例えばHBVコアタンパク質）に対する抗体レベルを二次注射の４−５週間後に測定することができる。
また場合によって、前記ウイルスベクターは前記リコンビナントウイルスと別個のウイルスでもよい。例えば、前記リコンビナントウイルスは遺伝的に改変されたAd5であり、一方前記ウイルスベクターは遺伝的に改変されたAAV、SV40ウイルス、レトロウイルス、単純疱疹ウイルス、アルファウイルス、ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスおよびワクシニアウイルスであろう。前記ウイルスベクターは異種抗原配列を含んでいてもいなくてもよい。好ましくは、前記ウイルスベクターは、前記リコンビナントウイルスによって保持される抗原配列と同じまたは異なるまた別の抗原配列を含むことができる。
【００８０】
また場合によって、前記ウイルスベクターは、前記リコンビナントウイルスの天然の原ウイルスを基に改変したキメラベクターでもよい。例えば、前記リコンビナントウイルスの天然の原ウイルスがアデノウイルス５型である場合、前記ウイルスベクターは、５型から他のアデノウイルス血清型の対応する領域に変更された一定の領域の骨格を有するキメラアデノウイルス５型であろう。このアプローチは、骨格の一部分が別の血清型の対応するもので変更されているだけである場合クローニングが容易であるので有利であると考えられる。前記は、Ad5ファイバーDNAを含ませ、さらにAd5ファイバーDNAを部分的または完全に別の血清型のアデノウイルスのものと交換してシャトルベクターを構築することによって達成できる。図62に示したように、右のシャトルベクターpR-Ad.5/35-6mを構築してAd5のファイバー領域をAd35のファイバー領域と置き換える。この右のシャトルベクターを左のシャトルベクターおよびAd5の骨格と合体させてキメラAd5ベクターを作製することができる。
今日までにヒトアデノウイルスで51の血清型が特定され、AからFまで６つのサブグループが分類されている。細胞内へのアデノウイルスの侵入は、Adファイバーノブによる膜へのウイルスの付着、それに続くペントンベースRGDモチーフの細胞表面ανβ3およびανβ5への結合時の内在化から成る二段階工程である（De Long et al., J. Clin. Microbiol. 37:3940 (1999)；Sallusto et al., J. Exp. Med. 179:1109 (1994)；Huang et al., J. Virol. 69:2257-2263 (1995)；Mathias et al., J. Virol. 68:6811-6814 (1994)）。前記アデノウイルスファイバーは標的細胞との高効率結合に必須の仲介物質であると考えられる。CサブグループのAd5のファイバーはコクサッキーウイルスおよびアデノウイルスレセプター（CAR）を使って、高親和性結合を仲介する（Nemerow, Mol. Biol. Rev. 63:725-734 (1999)）。CAR欠損細胞では、Ad5の付着は、ファイバーとMHCクラスI重鎖α2ドメインとの間の相互作用、またはペントンと細胞インテグリンとの間の相互作用を含むまた別の経路により極めて低い効率で生じる（Bergelson et al., Science 275:1320-1323 (1997)）。
【００８１】
前記アデノウイルスファイバーは３つのドメインに分割することができる。保存されたN-末端テールはペントンベースとの結合に必要な配列を含む（De Long et al., J. Clin. Microbiol. 37:3940 (1999)）。竿様ファイバーシャフトは６から23の範囲の多数の繰返しを含みβシートを形成する（Davison et al., J. Virol. 73:4513 (1999)）。C-末端は小球状ノブドメインを含み、ファイバーシャフトとノブの両方が主要レセプター相互作用に必要である（Huang et al., J. Virol. 70:4502 (1996)）。
本発明にしたがえば、アデノウイルス５型の骨格中の例えばファイバーノブ（すなわち頭部）、シャフトおよび/またはペントンベース（すなわち尾部）は、アデノウイルス血清型１−４および６−51の骨格の対応する領域によって置き換えることができる。図63は、Ad5のファイバー領域の個々のドメインがAd35のファイバー領域の対応するドメインで置換されたキメラベクターの種々の実施態様を示す。好ましくは、Ad5のファイバー領域のノブドメインは、それがレセプター‐リガンド相互作用を決定すると考えられているので別のアデノウイルス血清型の対応するものと交換される。
例えば、前記リコンビナントウイルスは１つまたは２つ以上の異種抗原および／または免疫刺激因子をコードするリコンビナントAd5であり、前記キメラウイルスベクターはまた同じ抗原または異なる抗原および／または免疫刺激因子をコードするリコンビナントAd5であるが、ただし異なるアデノウイルス血清型（例えばAd2、Ad4、Ad9、Ad12、Ad35およびAd40）のファイバー領域を有する。そのような血清型のローテーションは導入遺伝子の発現を強化し、前記ワクチンの免疫原性を増強させると考えられる。この考えを立証するためにGFPを保持するAd5ベクターを先ずマウスに投与し、抗GFP抗体レベルを注射後４週間でELISAによって測定することができる。続いて別のリコンビナントAd5（GFPを保持するが異なる血清型（Ad9、Ad11またはAd35）のアデノウイルスのファイバー領域を含む）を初回注射の４−５週間後に前記マウスに投与する。GFPに対する抗体レベルを二次注射の４−５週間後に測定することができる。
【００８２】
上記で述べた方法を用いて疾患を予防または治療することができる。前記治療方法では、本発明のリコンビナントウイルスの投与は、“予防”目的または“治療”目的のどちらかである。予防的に提供されるときは、前記リコンビナントウイルスは一切の症状に先駆けて提供される。本リコンビナントウイルスの予防的投与は、その後に発生する一切の感染または疾患の予防または軽減のために供される。治療的に提供されるときは、本リコンビナントウイルスは感染または疾患の症状の開始時（または開始後）に提供される。したがって、本発明は、疾患をひき起こす因子への予想される暴露の前に、または感染もしくは疾患の開始および／または進行後に提供することができる。
本発明の刷新的な方法はまた癌ワクチンの構築にもまた用いることができることは特記されよう。例えば、腫瘍特異抗原をコードする配列を、本リコンビナントウイルスおよび前記ウイルスを使用する方法の上記実施態様におけるいずれかのウイルス抗原をコードする抗原配列と置き換えることができる。ホストにおける腫瘍特異抗原の発現は、患者に癌発達の危険性が高まるのを予防する免疫反応（すなわち予防的免疫）、または他の治療薬とともに癌の治療を強化する免疫反応、または最初の外科手術後に疾患の再発を予防する免疫反応（抗転移ワクチン）、またはin vivoでCTLの数を増加させ、したがって浸潤腫瘍の根絶におけるそれらの有効性を改善するツールとして（定着した疾患の治療）特異的な免疫反応を誘発するはずである。さらにまた、本発明の方法は、担癌患者に戻す前にex vivoで強化される免疫反応（すなわち養子免疫）を患者で誘発することができる。
さらに本発明の上記実施態様のいずれかにしたがえば、本方法はさらに前記リコンビナントウイルスの投与後にホストから血清を採集することを含むことができる。前記採集血清は前記リコンビナントウイルスによってコードされる抗原に対し抗体を含むはずである。場合によって、前記方法はさらに、前記リコンビナントウイルスの投与後に前記病源体に対する抗体をホストから単離することを含むことができる。前記採集血清または単離抗体はその後の使用のために一定期間保存することができる。例えば、健常な志願者をホストとして供し、前記志願者から採集した血清または抗体を前記病源体の感染時または感染予想時に、前記病源体に対する受動免疫を誘発することにより予防薬または治療薬として前記志願者または別の者に後で投与することができる。場合によって、前記ホストはヒト以外の動物であり、前記リコンビナントウイルスで免疫した動物から採集した血清または単離した抗体を予防薬または治療薬として用いて、前記病原体感染時または感染予想時（例えば生物兵器による戦争の勃発時）にヒトまたはヒト以外の動物を治療することができる。
【００８３】
前記リコンビナントウイルス中に含まれる上記に述べた抗原および免疫刺激因子のいずれかのDNA配列において改変および変更を実施し、なお変異体の機能的等価を維持できることは留意されるべきである。例えば、上記に記載した抗原の野生型コドンを免疫されるホスト（例えばヒト）に好ましいコドンで置き換えることができる。合成ポリヌクレオチドを作製して、“ヒト化”抗原のために前記好ましいコドンに包含することができる。そのようなヒト化工程は、好ましいコドンを使用することにより前記リコンビナントウイルスによって発現される抗原の翻訳効率を顕著に改善し、このことは続いてホストにおける高レベルの液性および／または細胞性免疫をもたらすことができるという点で有利であろう。上記で述べた変異体の全てが本発明の範囲内に包含される。
エンドヌクレアーゼ消化、連結および電気泳動の標準的な方法は製造元または供給元の指示にしたがって実施される。標準的な技術は詳細には記載されないが、当業者にはよく理解されているであろう。本発明の実施には、別に記載がなければ当業界において一般的なウイルス学的、微生物学的、分子生物学的技術およびDNA組換え技術における方法が用いられる。そのような技術は以下の文献で完全に説明されている。例えば以下を参照されたい：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual； DNA Cloning: A Practical Approach, Vol I & II (D. Glover ed.)；Oligonucleotide Synthesis (N. Giat, ed.)；Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition)；Transcription and Translation (B. Hames & Higgins, eds., Current Edition)；Fundamental Virology, 2nd Edition, Vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.)。
以下の実施例は本発明の説明のために提供されるが、本実施例は本発明を制限するものではない。
【００８４】
実施例
以下の方法は、種々の病原性ウイルスに対する本発明の遺伝子ワクチンの製造法を例示するために記載されている。本遺伝子ワクチンはアデノウイルスをベースにし、病原性ウイルス（例えばエボラウイルス、B型肝炎ウイルスおよびHIV）に由来する改変抗原が前記アデノウイルス骨格に挿入されている。さらに、前記リコンビナントアデノウイルスはまた種々のサイトカインをコードする多種の遺伝子を保持している。前記リコンビナントアデノウイルスは複製不能であるが、アデノウイルスの感染性は保有している。
下記に詳細に記載する方法に類似する方法にしたがって、当業者は他の病原性ウイルス、細菌および寄生虫に対する遺伝子ワクチンを構築できよう。
１．エボラウイルスに対する遺伝子ワクチン
エボラウイルスに対する遺伝子ワクチンの具体例および前記の構築方法を以下で詳細に述べる。
１）エボラウイルス膜の糖タンパク質の遺伝的改変
前記改変は、分子の標準的な遺伝子操作技術、例えば制限酵素消化およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて実施される。
エボラウイルスワクチンの最適な抗原を製造するためにエボラウイルスの糖タンパク質を改変する。前記GPタンパク質の２つの改変形を構築し、免疫抑制機構および感染機構を不活化したが、その野生型糖タンパク質の本来の完全な抗原性は維持される。ｍRNAエディットシグナルを欠失させて分泌糖タンパク質（sGP）（前記は免疫を抑制する）の産生を妨げ、さらに（２）前記糖タンパク質前駆体のタンパク分解切断部位を欠失させて機能的糖タンパク質（GP1およびGP2）の形成を防ぐ（A.Sanchez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8):3602-7 (1996)）。一方の形態では、免疫抑制ペプチド領域を欠失しその機能が妨げられ、他方の形態では、その機能を破壊するために免疫抑制ペプチドモチーフが分割されるが、その免疫原性は維持される。これらの工程は前記ワクチンのための有効で安全な抗原を産生する。
【００８５】
エボラウイルスのエンベロープ糖タンパク質（GP）はただ１つの前駆体タンパク質として合成され、輸送中に細胞性酵素（フリン）によって２つのサブユニット（GP1およびGP2）に切断される（V.E. Volchkov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(10):5762-7 (1998)）。このタンパク分解切断は、成熟糖タンパク質の形成および切断部位のC-末端に位置する融合ペプチドの遊離に必須である。前記成熟糖タンパク質はトリマーとしてビリオンに取り込まれる（各モノマーはジスルフィド結合によって連結されたGP1およびGP2のヘテロダイマーである）（A. Sanchez et al., J. Virol. 72(8):6442-7 (1998)）。エボラウイルスの糖タンパク質は、ウイルス膜の表面に露出した主要なタンパク質であり、ホスト細胞内へのウイルスの侵入開始に必要である。したがって、それらは中和抗体の主要な標的である。
前記糖タンパク質の切断部位は、その開放読み枠の開始部位から501位に５つの塩基性アミノ酸残基（RRTRR（配列番号10））を含んでいる。エボラウイルス糖タンパク質の切断部位は、他のウイルスの糖タンパク質（例えばRSVまたはMuLVのエンベロープタンパク質）で見出される保存配列と類似する。我々は、以前にこれら塩基性アミノ酸残基の欠失変異または点変異は切断を阻止し、RSVで糖タンパク質の機能を失わせることを示した（J.Y. Dong et al., J. Virol. 66(2):865-74 (1992)）。
エボラウイルス糖タンパク質の感染機能を破壊するために、前記切断部位の５つの塩基性アミノ酸残基を欠失させる。この欠失は、PCR増幅を用いてエボラウイルスGPｃDNAに導入される。また別には、前記切断部位は、例えば切断忌避をもたらす位置特異的変異によって変更することができる。
【００８６】
エボラウイルスのまた別の重要な特性は、二形態の糖タンパク質（分泌形（sGP）および膜結合形（GP））がただ１つの遺伝子から合成されるということである。前記２つの形態は、７つのウリジンの配列（開始部位から1020−1028位）（前記配列は４つのエボラウイルスサブタイプの全てで高度に保存されている）におけるまた別のRNAエディット事象の結果として生じる（A. Sanchez et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8):3602-7 (1996)）。sGPは未エディットｍRNAから合成され、おそらく免疫抑制機能を有する。GPはエディット完了ｍRNAから合成され、おそらく免疫抑制機能を有する。GPは７つのウリジンの１つに挿入をもつエディット完了ｍRNAから合成される。このRNAのエディットによってフレームシフトが発生し、完全なトランスメンブレン糖タンパク質をコードする第二の読み枠の翻訳が生じる（GP2）。
sGPの合成を防ぐために、前記RNAエディット部位をUUUUUUU（配列番号２）からUUCUUCUU（配列番号３）に改変する。ｃDNAでは、その等価配列はそれぞれAAAAAAA（配列番号４）およびAAGAAGAA（配列番号５）である。この改変によって２つの事柄が達成される：（１）全てのｍRNAはGPのみをコードする（−１のフレームシフトを有するエデッィト形と等しい）；および（２）UUUUUU（配列番号６）はUUCUUC（配列番号７）と同じアミノ酸残基をコードするが、前記６ウリジン列をポリメラーゼがさらに行進するのを妨げる。更なるエディットはもう１つのウリジンの欠失をもたらし、（−２）のフレームシフトを生じるであろう。この改変メカニズムは図２に示されている。
【００８７】
GP2に位置する免疫抑制（IS）ペプチドの欠失に関連する第三の改変は、エボラウイルス糖タンパク質に導入することができる。前記ISペプチドモチーフは（開始部位からアミノ酸585−609）はフィロウイルスで高度に保存され、免疫抑制性を有することが示された発癌性レトロウイルスの糖タンパク質内のモチーフと高い相同性を有する（V.E. Volchkov et al., FEBS Lett. 305(3):181-4 (1992)；C. Will et al., J. Virol. 67(3):1203-10 (1993)；M. Mitani et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 84(1):237-40 (1987)；J.S. Gatot et al., J. Biol. Chem. 273(21):12870-80 (1998)；J. Denner et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 12(5):442-50 (1996)）。第一に、10アミノ酸の欠失を前記モチーフのコア領域（アミノ酸590−600）に導入し、その機能を取り除く。第二に、前記モチーフの各半分を倒置させ複製して、機能を破壊し抗原性を増加させる。ISペプチドに対する抗体は、感染中のエボラウイルスの免疫抑制機能を阻害することができると考えられている。この改変の基本戦略は図3A−3Cに示されている。
図3A−3Cに示したように、前記免疫抑制ペプチド（IS）の改変はGP2遺伝子で実施される。図3Aは野生型のGPを示し、図3BはISペプチドの10アミノ酸が欠失したGPを示す。図3Cは、分割され倒置され複製されたISペプチドを示す。
これらの改変を用いて、機能をもたず免疫抑制を示さないが、天然のGPの抗原性を保持するエボラウイルス糖タンパク質が生成される。これら改変GP配列を用いて、エボラウイルスに対する本発明のワクチンの抗原が作製される。
得られた改変GP遺伝子のDNA配列は配列分析により確認される。続いて前記改変GP配列をこれらGPのホスト細胞での効率的な発現に必要なDNAエレメントを含むプラスミドベクターでクローニングする。その発現および細胞膜への正確な分布はHeLa細胞の一過性トランスフェクションによって決定する。前記の分析は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）または蛍光タグでそれぞれ標識した高度免疫ウマ血清由来ポリクローナル抗体および抗ウマ二次抗体を用いてウェスタンブロット分析およびFACSによって実施される。
【００８８】
２）改変エボラウイルスGPの高レベル発現を仲介する複製欠損アデノウイルスワクチンシリーズの構築
本発明のワクチンは、エボラウイルスの改変抗原を含むリコンビナント良性ウイルスを利用し、ホストを欺いてエボラウイルスに対する強力な免疫防御を開始させる。好ましい良性ウイルスは複製欠損アデノウイルスである。これらのベクターは、以下のいくつかの理由からワクチン発現のための優れた選択である。第一に、アデノウイルスベクターは、強力な免疫系の刺激を提供する高レベルの抗原発現を指令する。第二に、それらが発現する抗原は、病源体感染細胞に近似する態様で形質転換細胞中で加工されディスプレーされる。この抗原発現相は、感染細胞に対する細胞性免疫の誘発で非常に重要であり、通常のワクチン接種方法が用いられるときは前記発現相は完全に欠落している。第三に、アデノウイルスベクターは、非常に強力な抗原提示細胞である樹状細胞に感染する（J. Diao et al., Gene Ther. 6(5):845-53 (1999)；L. Zhong, et al., Eur. J. Immunol. 29(3):964-72 (1999)；Y. Wan et al., Int. J. Oncol. 14(4):771-6 (1999)；Y. Wan et al., Hum. Gene Ther. 8(11):1355-63 (1997)）。第四に、これらのベクターは、更なる免疫の追加支援のために免疫強化サイトカインを保持するように操作することができる。第五に、アデノウイルスは自然の状態でヒトの気道および腸の上皮細胞に感染し、したがって本ワクチンは経鼻スプレーまたは経口摂取によりデリバーすることができる。さらに最後に、本発明のアデノウイルスベクターは複製欠損であるために安全で、遺伝子治療実験の臨床試験では高投与量で用いられた（109から1012ip／用量）（H. Gahery-Segard et al., J. Clin. Invest. 100(9):2218-26 (1997)；G. Bellon et al., Hum. Gene Ther. 8(1):15-25 (1997)；R.C. Boucher et al., Hum. Gene Ther. 5(5):615-39 (1994)）。実際のところ、風邪の予防のために新兵募集では生ウイルスすら使用されている。
【００８９】
本ベクター構築系はまた、多種遺伝子または調節機構を発現する複合ベクターの作製にも用いられる。例えば、前記ベクター構築物を用いて、多種サイトカインをエボラGP抗原とともにただ１つの複合ベクターで発現させ、免疫誘発がさらに強化される。また別に、抗原およびサイトカインは別々のベクターに配置される。これによって、２つまたは３つ以上のベクターを同時に形質導入し（感染させ）サイトカインおよび抗原の異なる組み合わせを操作することができる。
前記アデノウイルスベクターの構築は図４に示されている。改変GPをコードするｃDNAをシャトルベクターｐLAｄ（図４A左側）を用いてアデノウイルスゲノムの左端にクローン化し、シャトルベクターpLAd/EBO-GPを得る。前記pLad/EBO-GPベクターは、左側のロングターミナルリピート（L-TR）およびアデノウイルスパッケージングシグナルΨを含むアデノウイルスゲノムの左端を含む。サイトカイン（例えばIL-2およびIL-4）をコードする遺伝子は、シャトルベクターpRAd（図4A、右側）を用いアデノウイルスベクターのE4領域に挿入され、シャトルベクターpRAdIL2,4が得られる。前記pRAdIL2,4は、右側のロングターミナルリピート（R-TR）を含むアデノウイルスゲノムの右端を含む。
E1領域にGP遺伝子およびE4領域にサイトカイン遺伝子の両者を含むアデノウイルスベクターを構築するために、pLAd/EBO-GPおよびpRAdIL2,4の両者を直線化し、アデノウイルスの骨格に連結する（図4B）。
リコンビナントアデノウイルスベクターを作製するために、前記連結したベクターゲノムを293細胞にトランスフェクトする（前記細胞では、２つのアデノウイルスの末端リピートを含む正確に連結されたゲノムだけが複製し感染性ウイルス粒子を産出する）。ヒト293細胞（Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72 (1977)）（ATCCからアクセッション番号CRL1573により入手できる）にはアデノウイルスE1aおよびE1bがそのゲノム内に安定に組み込まれている。293細胞は、ベクターの骨格から欠落しているアデノウイルスの必須のE1遺伝子を補充する。最終的ベクターはE1、E3および部分的E4を欠き、293細胞でのみ複製できるが、標的細胞では複製できない。前記アデノウイルスベクターは293細胞で増幅され、塩化セシウムグラディエントでの超遠心によって精製される。ベクターの力価は、段階希釈および293細胞感染後の感染性粒子（ip）の計測によって決定される。
【００９０】
３）遺伝子ワクチンに対する免疫反応の測定
in vitroアッセイを用いて、ワクチンに対する反応で発生する中和抗体の量を定量する。前記アッセイは、モロニーネズミ白血球ウイルス系によるレトロウイルスベクター系をベースにしている。GAGおよびPOLタンパク質を発現するベクターおよびパッケージング細胞は広範囲に性状が調べられ、市販ルートで入手できる。レポーターとしてβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を含むパッケージングベクター構築物が用いられる。エボラウイルスGPの膜型を発現する新規なベクター構築物をβ-Galレポーターベクターと一緒に同時トランスフェクトしてGAG-POLパッケージング細胞株を得る。前記は、その本来のエンベロープタンパク質の代わりにエボラウイルスGPを含むレトロウイルスベクター粒子を生成する。
【００９１】
４）どの改変GP抗原が動物モデルでより良好な中和抗体産生を提供するかの決定
２つのGP変種を含むアデノウイルスワクチンベクターを、CD-1マウスでエボラウイルスGPに対する免疫反応誘発能力について検査する（CD-1マウス：Chrles River Laboratories; Rockefeller Institute由来Swissマウスとの異系交配ストック）。特に、ISモチーフ含有および非含有GP変種によって誘発される、エボラウイルスGP抗原に対する中和抗体力価および細胞溶解性T-リンパ球（CTL）活性が比較される。30匹の８週齢マウスの３つの群の皮下に、105ipのアデノウイルスベクター（それぞれGP変種１（ISペプチド欠失）、GP変種２（ISペプチド分割および倒置）およびβ-ガラクトシダーゼ（コントロールベクター）を発現する）を注射する。ワクチン接種の１、２、４、８および16週間後に各群から６匹のマウスを殺し（炭酸ガスによる窒息および頚椎脱臼による）、血液および脾臓を採取する。さらに６匹のマウスに食塩水を擬似接種し、2日後に殺して免疫前コントロールを提供する。
コントロールβ-Galベクターを注射したマウスからベクター注射部位の組織切片を採取し、固定しX-gal溶液で染色して、感染後種々の時点でベクターが形質導入された細胞の数およびタイプを決定する。さらに、溶血素染色を実施し、ベクターデリバリー部位における種々の免疫細胞（好中球、マクロファージ、単球）の浸潤度を決定する。
既に報告されたように（F.W. Van Ginkel et al., Hum. Gene Ther. 6(7):895-903 (1995)；F.W. Van Ginkel et al., J. Immunol. 159(2):685-93 (1997)）、標準的な96ウェルプレートによるELISAプロトコルを用いてGP結合全抗体についてワクチン接種動物の血清をアッセイする。前記血清の中和活性は、エボラウイルスGPシュードタイプレトロウイルスベクター（Wool-Lewis et al., J. Virol. 72(4):3155-60 (1998)）を種々の血清濃度でインキュベートした後、HeLa細胞で前記ベクターの感染活性をモニターすることによって分析する。感染細胞溶解物におけるβ-ガラクトシダーゼの発現は、前記血清の中和活性のインジケーターとして供し（β-gal活性が低ければ低いほど、より多くのEBO-β-Galベクターが中和された）、非常に感度の高い蛍光発生基質（ガラクト-ライト（Galacto-Light）キット）および蛍光プレート読み取り装置を用いて測定する。抗GP血清により中和された感染率を血清非存在下および非GP活性化血清存在下における感染率と比較する。
細胞毒性リンパ球（CTL）を以前に記載されたようにマウスの脾臓から抽出する（F.W. Van Ginkel et al., Hum. Gene Ther. 6(7):895-903 (1995)；J.Y. Dong et al., Hum. Gene Ther. 7(3):319-31 (1996)）。前記脾臓細胞を非改変エボラウイルスGPタンパク質を含むアデノウイルスベクターを形質導入した一定数の剥離させたLnCap細胞（上皮起源の前立腺癌細胞）と混合する。エフェクター：標的細胞の比は10：１、３：１および１：１を用いる。前記細胞を96ウェルのプレートに播種し、24時間後に全ての非付着細胞（全てのエフェクターCTLおよび死んでいるまたは死につつあるLnCaP細胞を含む）を除去し、残存する生細胞（付着細胞）をMTT（3-(4,5-ジメチルチアゾル-20-イル)2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）切断アッセイによって定量する。前記アッセイは、リンパ球の細胞毒性活性の検出に用いられ（J. Ni et al., J. Clin. Lab. Anal. 10(1):42-52 (1996)）、感度、信頼性および迅速性に関して放射能アッセイに匹敵する。
【００９２】
５）多種サイトカインの免疫強化機能および遺伝子ワクチンの有効性におけるその影響
ワクチンの効果を増大させるために、免疫強化サイトカイン（例えばIL2、IL4、IL12、IFN-γおよびGM-CSF）を発現させるベクター仲介遺伝子トランスファーを用いる。先ず初めに、ウイルス抗原をコードするベクターとは別個に、各サイトカインを別々にクローニングするか、または複数のサイトカインを種々の組み合わせでアデノウイルスベクターにクローニングする。個々のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせの免疫強化作用をサイトカインをコードするベクターおよび抗原を保有するベクターを一緒に感染させることによって調べる。血清の抗体力価を、種々のサイトカイン発現ベクターと一緒にワクチンを接種した動物で有効な力価に到達するために要した時間と併せて比較する。これらの実験によって、免疫強化サイトカインが高レベルの抗体を誘発したか、誘発時間を短縮したか、さらにエボラウイルスに対する免疫を持続させたかの決定が可能になる。
もっとも性能のよい改変GP変種を決定した後、それによって誘発される免疫反応が、種々のサイトカインを保持するベクターの免疫部位への同時デリバリーによって強化される程度を分析する。インターロイキン2（単独、またはIL-2もしくはIL-12と組み合わせて）は、細胞毒性T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞およびB細胞の活性化並びに増殖を強く強化する（B.N. Michael et al., Cell Immunol. 158(1):105-15 (1994)；O. Bruserud et al., Eur. J. Haematol. 48(4):221-7 (1992)；S.E. Jacobsen et al., Res. Immunol. 146(7-8):506-14 (1995)；S.F. Wolf et al., Res. Immunol. 146(7-8):486-9 (1995)；R.I. Tepper Res. Immunol. 144(8):63307 (1993)；A. O'Garra et al., Res. Immunol. 144(8):620-5 (1993)；Y. Ohe et al., Int. J. Cancer 53(3):432-7 (1993)；G. Delespesse et al., Res. Immunol 146(7-8):461-6[36-43] (1995)）。INF-γは液性免疫反応を刺激し、血管壁の透過性をその分泌部位で高め（S.W. Chensue et al., J. Immunol. 154(11):5969-76 (1995)；B.E. Szente et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 203(3):1645-54 (1994)；R.B. Adams et al., J. Immunol. 150(6):2356-63 (1993)）、一方、GM-CSFはマクロファージおよび他の専門的APCを活性化し、感染部位にそれらを誘引する（D.C. Dale et al., Am. J. Hematol. 57(1):7-15 (1998)；Y. Zhao et al., Chung Hua I Hsueh Tsa Chih 77(10):32-6 (1997)）。
【００９３】
30匹の８週齢マウスの３つの群の皮下に、選択したGP変種ベクターの５ｘ104ipおよび以下のベクターの１つ（Ad-β-Gal、Ad-IL2、Ad-IL2/IL4、Ad-IL2/IL12、Ad-IFN-γおよびAd-GM-CSF）の５ｘ104ipの混合物を注射する。
実施例４に記載したように、１、２、４、８および16週間で各群から６匹のマウスを殺して分析する。全IgGの分析はELISAを用いて分析し、中和活性はEBO-GPシュードタイプレトロウイルスベクターのHeLa細胞への感染能力に対する阻害としてアッセイし、抗GPCTL活性は、実施例４に記載したように脾臓抽出CTLをAd-EBO-GP構築物を形質導入した標的LnCaP細胞と混合することによって実施する。血清中の種々のサイトカインレベルもまた利用可能な市販のアッセイを用いてELISAによって定量する。いくつかの事例では、これらのアッセイは、同じサイトカインのヒト型およびネズミ型間で識別され、アデノウイルスベクターを用いてデリバーされたサイトカインの発現レベルについて、およびそれらが免疫反応の発達にどのように相関するかについての直接的情報が提供される。
個々のサイトカインを分析した後、最良の性能を示すものを組み合わせて調べる。30匹の８週齢マウスの４つの群の皮下に、選択したGP変種ベクターの５ｘ104ipおよび３つまでの選択したサイトカイン発現ベクターの５ｘ104ipの混合物を注射する（もし３種未満のサイトカインベクターが用いられる場合は、ipの計測はAd-β-Galベクターで実施される）。１、２、４、８および16週で各群から６匹のマウスを殺し上記で述べたように分析する。
GPベクターおよび多種サイトカインの異なる種における強力で再現性のある免疫反応の性質を立証するために、上記のような実験をウサギで再現する。６匹の白色ニュージーランドウサギの５つの群に上記で述べたように以下のベクターの組み合わせの１つを大腿部の筋肉内に注射する：Ad-β-Galベクター（106ip）、選択したGPベクター（2.5ｘ105ip＋Ad-β-Galの7.5ｘ105ip）および3種のサイトカインベクターの組み合わせ（各サイトカインベクター2.5ｘ105ip）＋GPベクター(2.5ｘ105ip)。ワクチン接種の２日前に動物から採血し（免疫前採血）、続いて上記のスケジュールにしたがって採血する。５から10ｍLの血液が各セッションで抽出されるであろう。分析はマウスと同様な態様で実施される（上記を参照されたい）。
ヒトサイトカインをコードする遺伝子がマウスおよびウサギモデルで用いられるので、それら動物の免疫系は、これらタンパク質に対する非同一性（ヒトに対する）反応を生じるであろう。しかしながら、ヒトサイトカインとマウスサイトカインおよびそれらのレセプター間には高度な相同性が存在し、ヒトまたは他のホストのサイトカインをマウスで用いた実験についての発表された報告は高レベルの等価性を示している。必要な場合には、種を標的とするサイトカインの活性実験のために、これらサイトカインの種特異的な型を得て、本発明のアデノウイルスベクターでクローニングすることができる。
【００９４】
６）ワクチンの有効性と投与頻度の最適化および非霊長類および霊長類モデルでの安全性と病源体チャレンジ実験の実施
サイトカインと抗原の最良の組み合わせを決定した後、ワクチンベクターの最終型を構築する。これらの複合リコンビナントアデノウイルスベクターはサイトカインと抗原を組み合わせたものをただ１つのベクターにより標的細胞にデリバーする。マウスおよびウサギの用量‐力価分析を実施し、最大レベルの免疫反応を惹起するために必要な最低用量を特定する。種々のワクチン投与ルート、例えば筋肉内および静脈内注射、経口接種および経鼻スプレーを比較する。安全性実験につては、マウスおよびウサギで用量上昇実験を毒性が観察されるまで、または有効用量の10倍レベルに達するまで実施する。最後に、霊長類でさらに別の安全性と病源体チャレンジ実験を実施する。
【００９５】
２．HIVに対する遺伝子ワクチン
HIVに対する遺伝子ワクチンおよびその構築方法についての具体的実施態様を以下のように詳細に述べる。
Ａ．HIVに対する複製欠損アデノウイルスワクチンの構築
１）Ad-E.T.R/IL2
多種のHIV抗原（Env、TatおよびRevを含む）およびインターロイキン-2（IL-2）のためのコード配列を同じベクターに保持する、アデノウイルスベクター、Ad-E.T.R/IL2を構築した。HIV抗原およびIL-2の発現はアデノウイルスベクターの別個の領域に配置されたプロモーターによって別々に制御される。このデザインは、ウイルス抗原および免疫刺激因子IL-2の両者の高レベル発現を担保し、アデノウイルスワクチンの免疫原性を強化することができると考えられる。次ぎの節に提示する実験データに示されているように、このアデノウイルスベクターは強力な液性免疫を動物でHIV抗原に対して誘発することができる。
アデノウイルスベクター、Ad-E.T.R/IL2は、上記で詳細に述べたエボラウイルスに対するアデノウイルスワクチンを構築する方法と類似する方法を用いて構築した。簡単に記せば、HIV-1のBH10株（HIV-1またはHTLV-IIIB、クレードB、アクセッション番号：M15654）のEcoRI／XhoI制限フラグメント（前記は野生型エンベロープgp160（完全長のgp120およびgp41）、完全長野生型Tatおよび完全長野生型Revをコードする）をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクターpLAd-E.T.R.（図16A）を得る。前記EcoRI／XhoI制限フラグメント（配列番号14）は図38に示されている。
IL-2をコードする配列（XbaI部位を欠失させるために、アミノ酸79位でCTAからCTTへのサイレント変異を含む）をアデノウイルスゲノムのE4領域にシャトルベクターを用いて挿入し、シャトルベクターpRAd-ORF6-IL2（図16B）を得る。この変異IL-2をコードするDNA配列（IL-2ΔX）（配列番号15）は図39に示されている。
pLAd-E.T.R.およびpRAd-ORF6-IL2の両ベクターを適切な制限酵素（例えばXbaIおよびEcoRI）を用いて直線化し、さらにアデノウイルスの骨格に連結し（図4B）リコンビナントアデノウイルスベクターAd-E.T.R/IL2を得る。
【００９６】
２）Ad-3C/EmΔCΔT300-G
多種のHIV抗原および３つの異なるサイトカインのためのコード配列を同じベクター内に保持する、また別のアデノウイルスベクター、Ad-3C/EmΔCΔT300-Gを構築した。前記多種HIV抗原は、gp120とgp41の間の切断部位および細胞質ゾルドメインの欠失を含む改変Env（gp160）並びにGagタンパク質を含み、前記サイトカインは、アミノ酸79位にCTAからCTTへのサイレント変異を有しXbaI部位が欠失したIL-2、IFN-γおよびGMCSFである。HIV抗原およびサイトカインの発現はアデノウイルスベクターの別個の領域に配置されたプロモーターによって別々に制御される。このデザインは、ウイルス抗原および免疫刺激因子IL-2の両者の高レベル発現を担保し、アデノウイルスワクチンの免疫原性を強化することができると考えられる。次ぎの節に提示する実験データに示されているように、このアデノウイルスベクターは強力な液性免疫をHIV抗原に対して動物で誘発することができる。
アデノウイルスベクター、Ad-3C/EmΔCΔT300-Gは、上記で詳細に述べたエボラウイルスに対するアデノウイルスワクチンを構築する方法と同様な方法を用いて構築した。簡単に記せば、HIV-1のBH10株に由来する配列（Env／gp160（ヌクレオチド5580−7850位）をコードする）を改変し、ヌクレオチド7101−7112位によってコードされる切断部位（PEKR（配列番号11））および長さが100アミノ酸の細胞質ゾルドメイン（ヌクレオチド7850−8150位によってコードされる）を欠失させ、続いて完全長のGagをコードする配列とともに、シャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの右端（E4領域）に挿入する。この改変EnvのDNA配列（EmΔCΔT（BH10）（配列番号16））および完全長Gag（配列番号17）（そのアミノ酸配列は配列番号18である（図41B））のDNA配列は図40および41Aにそれぞれ示されている。
【００９７】
これら２つのHIV抗原は、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、２つのスプライシングアクセプター部位SA1およびSA2でCMVプロモーターから別々に発現される。種々の遺伝子フラグメントの効率的なクローニングを促進するために、クローニングベクターSD/SA1.2.3を構築して、レトロウイルスSD部位および多種レトロウイルスSA部位（SA1、SA2、SA3およびSA4）を包含させた。本実施例では、前記SDおよびSA部位はモロニーネズミ白血病ウイルス（MMLV）に由来し、それらの配列は下記に示す：
SD部位（MMLVのnt 204−210）：AGGTAAG（配列番号72）；および
SA1-4部位（MMLVのnt 560−568）：CTGCTGCAG（配列番号73）。
【００９８】
前記SD部位、並びにSA1、SA2、SA3およびSA4（SA1-4）部位（前記は同じ配列を共有する）の各々を、標準的なPCR突然変異誘発を用いてクローニングベクターpSP73のマルチクローニング部位に挿入した。図37に示したように、SA1はSD部位の直下流に、続いてSA2、SA3およびSA4を挿入した。多種遺伝子の発現レベルをSD／SAメカニズムにより調べるために、GFP（緑色蛍光タンパク質）遺伝子をSD／SA1およびSA2、SA2およびSA3、SA3およびSA4の間、およびSA4の後ろに挿入した。これら４つの部位における発現レベル比は10：１：５：４である。
EmΔCΔTおよびGagをコードするDNA配列は、クローニングベクターSD/SA1.2.3のSD/SA1およびSA2の後ろにそれぞれ挿入した。得られたベクターをEcoRVおよびXhoIで消化し、EmΔCΔTおよびGagを含むフラグメントをアデノウイルスシャトルベクターに挿入し、pRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-G（図17A）を得た。レトロウイルスSD／SAメカニズムにより他のタンパク質を発現できるシャトルベクター（下記に示す）を同じ方法を用いて構築した。
多種の免疫刺激因子（IL-2（XbaI部位の欠失により生じサイレント変異を有する）、INF-γおよびGMCSFを含む）をコードする配列を、シャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムのE1領域に挿入した。これら３つの免疫刺激因子は、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、３つのスプライシングアクセプター部位SA1、SA2およびSA3で別のCMVプロモーターから別々に発現される。作製されたシャトルベクターはpLAd-3C（図17B）と称する。
pRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-GおよびpLAd-3Cの両ベクターを適切な制限抗（例えばXbaIおよびEcoRI）を用いて直線化し、アデノウイルス骨格に連結して（図4B）、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-3C/EmΔCΔT300-Gを得た。
【００９９】
３）Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G
さらに別のアデノウイルスベクター、Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-Gを構築した。前記ベクターは、ｐNL4-3株（アクセッション番号M19921）に由来する多種のHIV抗原および３つの異なるサイトカインのためのコード配列を同じベクター内に保持する。前記多種HIV抗原は改変Env（切断部位および長さが33アミノ酸の細胞質ゾルドメインの欠失を有するgp160）並びに完全長のReｖおよびGagタンパク質を含み、前記サイトカインは、アミノ酸79位にCTAからCTTへのサイレント変異を有しXbaI部位を欠失したIL-2、IFN-γおよびGMCSFである。HIV抗原およびサイトカインの発現はアデノウイルスベクターの別個の領域に配置されたプロモーターによって別々に制御される。このデザインは、ウイルス抗原および免疫刺激因子の両者の高レベル発現を担保し、アデノウイルスワクチンの免疫原性を強化することができると考えられる。次ぎの節に提示する実験データに示されているように、このアデノウイルスベクターは強力な液性免疫をHIV抗原に対して動物で誘発することができる。
アデノウイルスベクター、Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-Gは、上記で詳細に述べたエボラウイルスに対するアデノウイルスワクチンを構築する方法と同様な方法を用いて構築した。簡単に記せば、HIV-1のｐNL4-3株に由来する配列（Env／gp160（ヌクレオチド6221−8686位）をコードする）を改変し、切断部位をコードする配列（ヌクレオチド7101−7112位によってコードされる）および細胞質ゾルドメイン（ヌクレオチド8687−8785位によってコードされる）を欠失させ、続いて完全長のTat、ReｖおよびGag（HIVのBH10株に由来）をコードする配列とともに、シャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの右端（E4領域）に挿入した。
これら３つのHIV抗原は、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、３つのスプライシングアクセプター部位SA1、SA2およびSA3で１つのCMVプロモーターから別々に発現される。作製されたシャトルベクターはpRAd-EmΔCΔT99.T.R-G（図18）と称する。改変Env並びに完全長のTatおよびRevをコードするDNA配列（配列番号19）は図42に示されている。HIVのBH10株に由来する完全長のGagのDNAおよびアミノ酸配列は図41Aおよび41Bにそれぞれ示されている。
シャトルベクター、pRAd-EmΔCΔT99.T.R.-GおよびpLAd-3Cを適切な制限抗（例えばXbaIおよびEcoRI）を用いて直線化し、アデノウイルス骨格（図4B）に連結して、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-Gを得た。
【０１００】
４）Ad-EmΔV1,2ΔCΔT99.T.R-IL2/G.IL2
HIVのpNL4-3株に由来する多種HIV抗原のためのコード配列を保持するさらに別のアデノウイルスベクター、Ad-EmΔV1,2ΔCΔT99.T.R/G.IL2を構築した。Env/gp160（ヌクレオチド6221−8686位）をコードするHIVのpNL4-3株に由来する配列を改変して、ヌクレオチド6602−6796位にV1およびV2ループをコードする配列を欠失させ、アミノ酸配列GAG（配列番号13）をコードするヌクレオチド配列GGA GCT GGT（配列番号12）を挿入した。このHIVEnv/gp160をさらに改変し、7736−7747位のヌクレオチドによってコードされる切断部位（ΔC）、および8687−8785位のヌクレオチドによってコードされる33個のアミノ酸の細胞質ゾルドメイン（ΔT99）を欠失させた。完全長のReｖ（R）およびTat（T）をコードする配列とともに、改変envをアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）にシャトルベクターを用いて挿入した。前記挿入物（EmΔV1,2ΔCΔT.T.R）をコードするDNA配列（配列番号20）は図43に示されている。
さらにまた、IL-2（XbaI部位の欠失により生じたサイレント変異を有する（DNA配列番号15））を前記envの下流に挿入した。改変EnvおよびIL-2の両者は、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、２つのスプライシングアクセプター部位、SA1およびSA2／SA3で１つのCMVプロモーターから別々に発現される。作製されたシャトルベクターはpLAd-EmΔV1,2ΔCΔT.T.R-IL2（図19A）と称される。
IL-2（XbaI部位の欠失により生じたサイレント変異を有する（DNA配列番号15））およびHIVのBH10株由来のGagをコードする配列をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムのE4領域に挿入した。これら２つのタンパク質は、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、２つのスプライシングアクセプター部位、SA1およびSA2で１つのCMVプロモーターから別々に発現される。作製されたシャトルベクターはpRAd-ORF6-G.IL2（図19B）と称される。
pLAd-cmv-EmΔV1,2ΔCΔT.T.R-GおよびpRAd-ORF6-G.IL2の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔV1,2ΔCΔT.T.R-G/G.IL2を得た。
【０１０１】
５）Ad-EmΔCΔT.R.N/G.IL2
HIVのBH10株に由来する多種HIV抗原のためのコード配列を保持するさらに別のアデノウイルスベクター、Ad-EmΔC.T.R.N/G.IL2を構築した。完全長のEnv/gp160（ヌクレオチド5580−8150位）、Tat、RevおよびNefをコードするHIVのBH10株に由来する配列を、Envの切断部位をコードする配列を欠失させ、さらにSpeI制限部位を挿入することにより改変した。この挿入物のDNA配列（配列番号21）は図44に示されている。前記配列をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクター、pLAd-EmΔC.T.R.N（図20）を得た。
pLAd-EmΔC.T.R.NおよびpRAd-ORF6-G.IL2の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔC.T.R.N/G.IL2を得た。
【０１０２】
６）Ad-EmΔC.N/G.IL2
HIVのBH10株に由来する多種HIV抗原のためのコード配列を保持するさらに別のアデノウイルスベクター、Ad-EmΔC.N/G.IL2を構築した。完全長のEnv/gp160（ヌクレオチド5580−8150位、先行するKozak配列を有する）、Tat、RevおよびNefをコードするHIVのBH10株に由来する配列を、Env、TatおよびRevの切断部位をコードする配列を欠失させ、さらにSpeI制限部位を挿入することにより改変した。この挿入物のDNA配列（配列番号22）は図45に示されている。前記配列をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクター、pLAd-EmΔC.N（図21）を得た。
pLAd-EmΔC.NおよびpRAd-ORF6-G.IL2（図19B）の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔC.N/G.IL2を得た。
【０１０３】
７）Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2
HIVのBH10株に由来する多種HIV抗原のためのコード配列を保持するさらに別のアデノウイルスベクター、Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2を構築した。完全長のEnv/gp160（ヌクレオチド5580−8150位）をコードするHIVのBH10株に由来する配列を、切断部位をコードする配列および細胞質ゾルドメインをコードする300ヌクレオチド配列を欠失させて改変した（ただしなお完全長のTat（T）のための配列は含んでいる）。この挿入物のDNA配列（配列番号23）は図46に示されている。前記配列をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクター、pLAd-EmΔCΔT300.T（図22）を得た。
pLAd-EmΔCΔT300.TおよびpRAd-ORF6-G.IL2（図19B）の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔCΔT300.T/G.IL2を得た。
８）Ad-EmΔC/EmΔC
HIVのBH10株に由来する改変Envの２つのコピーのためのコード配列を保持するさらに別のアデノウイルスベクター、Ad-EmΔC/EmΔCを構築した。完全長のEnv/gp160（ヌクレオチド5580−8150位、Kozak配列に先行する）をコードするHIVのBH10株に由来する配列を、切断部位をコードする配列を欠失させて改変した。改変EnvのDNA配列（配列番号24）は図47に示されている。前記配列をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクター、pLAd-EmΔC（図23A）を得た。
改変Env（EmΔC）（配列番号24）をさらにシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムのE4領域に挿入し、シャトルベクター、pRAd-ORF6-EmΔC(図23B)を得た。PLAd-EmΔCおよびpRAd-ORF6-EmΔCの両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔC/EmΔCを得た。
【０１０４】
９）Ad-Em.V3m/G.IL-2
マルチクレードV3ループを有する改変HIV-1EnvおよびGagおよびIL-2のためのコード配列を保持するさらに別のアデノウイルベクターを構築した。HIV-1のM群内のクレードB、A、C、D、E、FおよびGのV3ループをコードする配列は図48に示されている。図48に示したように、V3ループをコードするクレードB（HIV-1 BH10株）のDNA配列については、ヌクレオチド885−992（配列番号25）を選択した。特にこの実施態様では、V3ループをコードするクレードA（HIV-1 192UG037WHO.01083hED株）のDNA配列については、ヌクレオチド888−992（配列番号26）を選択した。V3ループをコードするクレードC（HIV-1 192BR025WHO.01093hED株）のDNA配列については、ヌクレオチド876−980（配列番号27）を選択した。V3ループをコードするクレードD（HIV-1 192UG024.2株）のDNA配列については、ヌクレオチド888−989（配列番号27）を選択した。V3ループをコードするクレードE（HIV-1 193TH976.17株）のDNA配列については、ヌクレオチド894−998（配列番号29）を選択した。V3ループをコードするクレードF（HIV-1 193BR020.17株）のDNA配列については、ヌクレオチド888−992（配列番号30）を選択した。V3ループをコードするクレードG
（HIV-1 192RU131.9株）のDNA配列については、ヌクレオチド885−989（配列番号31）を選択した。
HIV-1のクレードA、C、D、E、FおよびGのV3ループをコードするDNA配列を連結して、マルチクレードV3ループを含む単一フラグメントを形成する。これらV3ループをそれらの同系HIVクレードからクローニングするためのプライマーは図57に示されている。HIVクレードBのV3ループはHIV-1 gp120の骨格内に既に含有されているので、クレードA、C、D、E、FおよびGからクローン化されたV3ループはクレードBのV3ループの後ろに挿入した。
【０１０５】
図24は、PCRによる連結マルチクレードV3ループの作製およびそれに続くクレードBの改変gp120をコードする構築物へのクローニングのための方法を示している。図24に示したように、クレードA、B、C、D、E、FおよびGのエンベロープV3ループ領域をコードする遺伝子フラグメントの各々は、図57に示した前進プライマーおよび逆方向プライマーセットを用いてそれぞれ個々にPCRによって増幅した。PCRサイクルのパラメーターは以下のとおりである：
変性：94℃、１分
アニーリング：50から60℃、30秒、および
伸長：72℃、１分
前記を20サイクル
１つのクレードのV3ループをコードするPCR生成物を別のPCR生成物とPCRを用いて連結した。例えば、クレードAおよびCのV3ループをコードするPCR生成物を一緒に混合し、図24に示したようにプライマー１および４を用いてPCRによって連結し増幅させてA/Cフラグメントを生成する。同様に、クレードDおよびEの連結されたV3ループをコードするPCR生成物はプライマー５および８を用いて作製してD/Eフラグメントを生成し、クレードFおよびGはプライマー９および12を用いF/Gフラグメントを生成する。
さらに図24を参照すれば、A/CおよびD/Eフラグメントをプライマー１および８を用いてPCRによって連結し、ベクターのEcoRIおよびBamHI部位でクローニングした。F/GフラグメントはBamHIおよびXbaIで制限消化し、配列A/C/D/Eと融合させてマルチクレード配列ACDEFG（V3m）を作製した。
マルチクレードACDEFG配列の２リピートを作製するために、マルチクレードACDEFGをコードする最後のPCR生成物をAvaで（プライマー１および12で）制限消化し、ヘッド-トゥ-テールで再度連結して２リピートのマルチクレード配列、２ｘV3mを生成する。続いて、V3mまたは２ｘV3mをコードするDNA配列を、gp120（前記は以下のように改変された）をコードする構築物中のクレードBのV3ループをコードする配列の後ろに挿入した。
HIVのBH10株（クレードB）のEnv（nt 5580−8150）をコードするDNA配列を以下のように改変した：ａ）切断部位（nt 7101−7112）をコードする配列を欠失させる；ｂ）V1およびV2ループ（nt 5961−6161）を欠失させ、アミノ酸配列GAG（配列番号13）をコードするヌクレオチド配列GGA GCT GGT（配列番号12）を挿入する；ｃ）ヌクレオチド6572位にマルチクレードV3ループ（V3m）を挿入する；およびｄ）gp41トランスメンブレンドメイン配列を、グリコホスファチジルイノシトール、SWLLLLLLSLSLLQATDFMSL（配列番号９）をコードするGPIアンカー配列と置換する。この改変Env（配列番号32）をコードするDNA配列は図49Aに示されている（そのアミノ酸配列は配列番号33（図49B）である）。前記配列をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクター、pLAd-Em.V3m（図25）を得た。
pLAd-Em.V3mおよびpRAd-ORF6-G.IL2の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmV3m/G.IL2を得た。
【０１０６】
10）シャトルベクターpLAd-Em.2xV3m
マルチクレードV3ループの発現レベルを高めるために、２リピートのV3m配列（2xV3m、上記で構築）をコードする配列を上記（９節）で述べた改変Envをコードする配列に挿入した。得られたシャトルベクターはpLAd-Em.2xV3mと称され、図26に示されている。
11）p17および／またはp24をコードするシャトルベクター
自然の状態ではPr55 Gagタンパク質は４つの異なるタンパク質、p17MA、p24CA、p7NCおよびp6に加工される。p17MAタンパク質は脂質エンベロープの内側に結合したままでエンベロープをウイルス粒子に固定する重要な役割を果す。全てのレトロウイルスのp24CAタンパク質は、効率的なウイルス複製および粒子の生成に必要な主要相同性領域（MHR）を含む。得られたエリスポット（ELISPOT）データは、p17MA（またはp17）およびp24CA（またはp24）は、ペプチドマッピング実験でPr55 gagタンパク質の特異的なCTL反応に顕著に寄与している可能性を暗示している。本発明にしたがえば、これらのHIV構造タンパク質はリコンビナントウイルスによって発現され、HIV感染に対する特異的なCTL反応を誘発する。さらに、これらの構造タンパク質を改変して、感染細胞によるこれらの細胞内タンパク質の分泌を促進するシグナルペプチド配列を包含させることができる。前記シグナルペプチドは、例えば配列番号74によってコードされるHIV gp120シグナルペプチドである（atgagagtgaaggagaaatatcagcacttgtggagatgggggtggagatggggcaccatgctccttgggatgttgatgatctgtagtgct）。さらにまた、HIVタンパク質の分泌型に多数の膜固着ドメイン（membrane anchoring domain）を付加することによって、そのような改変HIV構造タンパク質を膜結合性にして、HIV抗原を身体の免疫系により良好に提示するであろう。前記膜固着ドメインは、例えば以下の配列番号75によってコードされるHIV gp41トランスメンブレンドメインであろう（ttattcataatgaagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctgtagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaatcccgagggga）。これらの改変は、細胞内に捕捉されている天然の抗原よりもはるかに強力な免疫原性を前記変異抗原に付与するであろう。
【０１０７】
アデノウイルスシャトルベクターを構築して、プロセッシングを施されたGagタンパク質、p17、p24およびp17/24（前記の各々は３つの異なる形態、天然型、分泌型および膜結合型を有する）をコードした。
前記３つの形態を有するp17/p24のDNA配列（配列番号34−36）は図50Aに示されている（対応するアミノ酸配列（配列番号37−39）は図50Bに示されている）。前記DNA配列の各々をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムのE4領域に挿入し、それぞれシャトルベクター、pRAd-ORF6-p17/24（天然型、図27A）、pRAd-ORF6-p17/24sec（分泌型、図27B）、およびpRAd-ORF6-p17/24MB（膜結合型、図27C）を得た。
３形態のp17のDNA配列（配列番号40−42）は図51Aに示されている（対応するアミノ酸配列（配列番号43−45）は図51Bに示されている）。前記DNA配列の各々をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムのE4領域に挿入し、それぞれシャトルベクター、pRAd-ORF6-p17（天然型、図28A）、pRAd-ORF6-p17sec（分泌型、図28B）、およびpRAd-ORF6-p17MB（膜結合型、図28C）を得た。
３形態のp24のDNA配列（配列番号46−48）は図52Aに示されている（対応するアミノ酸配列（配列番号49−51）は図52Bに示されている）。前記DNA配列の各々をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムのE4領域に挿入し、それぞれシャトルベクター、pRAd-ORF6-p24（天然型、図29A）、pRAd-ORF6-p24sec（分泌型、図29B）、およびpRAd-ORF6-p24MB（膜結合型、図29C）を得た。
上記の構築pLAd-およびpLAd-シャトルベクターを様々に組み合わせて、多様なリコンビナントアデノウイルスベクターを作製した。下記はそのようなリコンビナントアデノウイルスベクターのいくつかの事例である。
【０１０８】
12）Ad-Em.2xV3m/p17/24MB
図30A−Bは、２コピーのマルチクレードV3ループを含む改変Envおよび膜結合型p17/p24をコードするリコンビナントアデノウイルスベクターの構築を示す。図30A−Bに示したように、pLAd-Em.2xV3m（ベクターの詳細は図26に示されている）およびpRAd-ORF6-p17/24MB（ベクターの詳細は図27Cに示されている）をEcoRIおよびXbaI制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルス骨格に連結して、ベクター、Ad-Em.2xV3m/p17/24MBを得た。
13）Ad-Em.2xV3m/p17MB
図31A−Bは、２コピーのマルチクレードV3ループを含む改変Envおよび膜結合型p17をコードするリコンビナントアデノウイルスベクターの構築を示す。図31A−Bに示したように、pLAd-Em.2xV3m（ベクターの詳細は図26に示されている）およびpRAd-ORF6-p17MB（ベクターの詳細は図28Cに示されている）をEcoRIおよびXbaI制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルス骨格に連結して、ベクター、Ad-Em.2xV3m/p17MBを得た。
14）Ad-Em.2xV3m/24MB
図32A−Bは、２コピーのマルチクレードV3ループを含む改変Envおよび膜結合型p24をコードするリコンビナントアデノウイルスベクターの構築を示す。図32A−Bに示したように、pLAd-Em.2xV3m（ベクターの詳細は図26に示されている）およびpRAd-ORF6-24MB（ベクターの詳細は図29Cに示されている）をEcoRIおよびXbaI制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルス骨格に連結して、ベクター、Ad-Em.2xV3m/p24MBを得た。
【０１０９】
15）Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24sec
HIV BH10株のEnv（Tat1（nt 5189−5403）およびTat2（nt 7734−7779）を含む）をコードするDNA配列を以下の手段によって改変した：切断部位（nt 7101−7112）をコードする配列の欠失；ｂ）V1およびV2ループ（nt 5961−6161）の欠失およびアミノ酸配列GAG（配列番号13）をコードするヌクレオチド配列GGA GCT GGT（配列番号12）の挿入；ｃ）nt 6572位に２コピーのマルチクレードV3ループ（2xV3m）配列を挿入；さらにｄ）長さが100アミノ酸（7850−8150位のヌクレオチドによってコードされる）細胞質ゾルドメインの欠失。改変Env（配列番号52）（そのアミノ酸配列は配列番号53、図53B）は図53Aに示されている。前記をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクター、pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T（図33）を得た。
pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.TおよびpRAd-ORF6-p17/24sec（図27B）の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24secを得た。
16）Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24MB
pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.TおよびpRAd-ORF6-p17/24MB（図27C）の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T./p17/24MBを得た。
【０１１０】
17）Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T./p17/24sec
HIV BH10株のEnv（Tat1（nt 5189−5403）、Rev1（nt 5328−5403）、Tat2（7734−7779）およびRev2（7734−8008）を含む）をコードするDNA配列を以下の手段によって改変した：切断部位（nt 7101−7112）をコードする配列の欠失；ｂ）V1およびV2ループ（nt 5961−6161）の欠失およびアミノ酸配列GAG（配列番号13）をコードするヌクレオチド配列GGA GCT GGT（配列番号12）の挿入；ｃ）nt 6572位に２コピーのマルチクレードV3ループ（2xV3m）配列を挿入；さらにｄ）長さが33アミノ酸の細胞質ゾルドメイン（nt 8687−8758）の欠失。改変Env（配列番号54）（そのアミノ酸配列は配列番号55、図54B）は図54Aに示されている。前記をシャトルベクターを用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクター、pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T.R（図34）を得た。
pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T.RおよびpRAd-ORF6-p17/24sec（図27B）の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24secを得た。
18）Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24MB
pLAd-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R（図34）およびpRAd-ORF6-p17/24MB（図27C）の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔCΔT99.2xV3m.T.R/p17/24MBを得た。
19）Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G.PI
ペプチドマッピングおよびエリスポットのデータによって、Gagタンパク質の特定の領域が、本発明のアデノウイルスベクターで免疫された動物でのCTL反応の誘発に重大な役割を果す可能性が示された。前記アデノウイルスベクターによるp17MAおよびp24CAの効率的な発現を促進するために、HIVのBH10株のpol領域に由来するプロテアーゼ（PI、DNA配列56、図55A；アミノ酸配列57、図55B）をコードするDNA配列を、シャトルベクターpRAd-ORF6-G.PI（図35）中のGagコード配列の下流領域に挿入した。図35に示したように、GagおよびPIは、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、２つのスプライシングアクセプター部位SA1およびSA2／SA3で１つのCMVプロモーターから別々に発現される。
pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T（図33）およびpRAd-ORF6/G.PI（図35）の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G.PIを得た。
20）Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G-PI
また別に、HIVプロテアーゼPIは、nt 1410位にC残基を挿入し、polをgagの読み枠と同じ読み枠内で読ませることによってGagとの融合タンパク質として発現させた。Gag-PI融合タンパク質のDNA配列（配列番号58）およびアミノ酸配列（配列番号59）はそれぞれ図56Aおよび56Bに示されている。図36に示したように、GagおよびPIは、同じ読み枠内で同じCMVプロモーターから発現される。得られたシャトルベクターはpRAd-ORF6/G-PIと称される。
pLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.T（図33）およびpRAd-ORF6/G-PI（図36）の両ベクターを適切な制限酵素を用いて直線化し、アデノウイルスの骨格（図4B）に連結し、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad-EmΔCΔT300.2xV3m.T/G-PIを得た。
21）pRAd-ORF6-Gag/PI-RT
HIV BH10株のpol領域のプロテアーゼ（PI）および逆転写酵素（RT）をコードするDNA配列をシャトルベクターpRAd-ORF6-Gag/PI-RT（図58）のGagコード配列に挿入した。図58に示したように、GagおよびPI-RTは、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、２つのスプライシングアクセプター部位SA1およびSA2／SA3でCMVプロモーターから別々に発現される。
右シャトルベクターpRAd-ORF6-Gag/PI-RT（図35）は上記に記載した任意の左シャトルベクター（ｐLAｄ）と組み合わせてリコンビナントアデノウイルスベクターを作製することができる。
【０１１１】
22）pRAd-ORF6-Gag-PI-RT
また別に、PI-RTは、nt 1410位にC残基を挿入し、polをgagの読み枠と同じ読み枠内で読ませることによってGagとの融合タンパク質として発現させた。図59に示したように、GagおよびPI-RTは、同じ読み枠内で同じCMVプロモーターから発現される。得られたシャトルベクターはpRAd-ORF6-Gag-PI-RTと称される。
右シャトルベクターpRAd-ORF6-Gag-PI-RTは上記に記載した任意の左シャトルベクター（ｐLAｄ）と組み合わせてリコンビナントアデノウイルスベクターを作製することができる。
23）pRAd-ORF6-Gag/Pol
HIV BH10株のpol領域に由来するHIV酵素、PI、RTおよびINをコードするDNA配列をシャトルベクターpRAd-ORF6-Gag/Pol（図60）のGagコード配列に挿入した。図60に示したように、GagおよびPolは、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、２つのスプライシングアクセプター部位SA1およびSA2／SA3で１つのCMVプロモーターから別々に発現される。
右シャトルベクターpRAd-ORF6-Gag/Polは上記に記載した任意の左シャトルベクター（ｐLAｄ）と組み合わせてリコンビナントアデノウイルスベクターを作製することができる。
24）pRAd-ORF6-Gag-Pol
また別に、Polは、nt 1410位にC残基を挿入し、polをgagの読み枠と同じ読み枠内で読ませることによってGagとの融合タンパク質として発現させた。図61に示したように、GagおよびPolは、同じ読み枠内で同じCMVプロモーターから発現される。得られたシャトルベクターはpRAd-ORF6-Gag-Polと称される。
右シャトルベクターpRAd-ORF6-Gag-Polを上記に記載した任意の左シャトルベクター（ｐLAｄ）と組み合わせてリコンビナントアデノウイルスベクターを作製することができる。
【０１１２】
Ｂ．HIV抗原に対するアデノウイルスワクチンに対する動物の免疫反応
実験用マウスに上記で構築したアデノウイルスワクチン、Ad.tat.env.IL2（上記Ａ節、１項で述べたように“Ad-E.T.R/IL2”とも称される）を接種し、前記ベクターによって発現されるＨＩＶ抗原に対する免疫反応を誘発した。アデノウイルスの免疫原性は、HIV tatおよびenvに対する抗体の力価を測定することによって決定した。
図６および７は、それぞれ２群のマウスのHIV Envに対するAd.tat.env.IL2の抗原性を示している。前記群のC57BL/6マウス（Charles River Laboratories (Wilmington, MA)から供給）の筋肉内に、図に示したように種々の日付けで107pfuのAd.tat.env.IL2を接種した。血液（各動物につき約150−500μL）を接種後２週間毎に４匹の動物から採集し、血清を調製した。接種後77日で、これらのマウスをさらに107pfuのAd.tat.env.IL2で再チャレンジした。２回目のチャレンジ後毎日３匹の動物から血液を採集した。誘発されたHIV tatおよびenvに対する抗体の力価を、Ad.tat.env.IL2に感染させたHeLa細胞溶解物に対するELISAによって決定した。
簡単に記せば、Ad.tat.env.IL2に感染したHeLa細胞の溶解物を以下のように調製した。HeLa細胞に感染数（MOI）20のAd.tat.env.IL2を感染させた。感染後48時間でHeLa細胞を採集し、１％のトリトンX-100を含む緩衝液に再懸濁した。溶解物を15000xgで5分遠心してポスト核上清を得た。ELISAプレートのウェルをコーティングするために前記溶解物を10μg/ｍLに希釈した。標準的ELISAアッセイを実施して血清のOD450を測定し、マウスの免疫前血清のOD450の測定値に対して標準化することによってHIV tatおよびenvタンパク質に対する抗体の相対的力価を計算した。
図６に示したように、この群の３匹のマウスは、アデノウイルスベクター、Ad.tat.env.IL2によって発現されたHIV抗原に対し強力な免疫反応を示し、接種後約４２時間でHIV抗原に対する抗体は最高力価に達した。Ad.tat.env.IL2の２回目の接種によって、免疫反応はさらに押し上げられ、２回目の接種後約５日以内に非常に高い力価が得られた。
【０１１３】
図７に示したように、この群の３匹のマウスはまた、アデノウイルスベクター、Ad.tat.env.IL2によって発現されたHIV抗原に対し強力な免疫を有し、接種後約70日でHIV抗原に対する抗体は最高力価に達した。Ad.tat.env.IL2の２回目の接種によって、免疫反応はさらに押し上げられ、２回目の接種後約５日以内に非常に高い力価が得られた。
図12A−Bは、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad.3C.env.gag（上記Ａ節、２項で述べたように“Ad-3C/EmΔCΔT300-G”とも称される）によってマウスで誘発される抗体産生を示している。C57BL/6マウスの筋肉内に107pfuのAd.3C.env.gagを接種した。接種後77日で、これらのマウスにさらに107pfuのAd.3C.env.gagを再チャレンジした。これらのマウスの相対的抗体力価を精製リコンビナントGag（NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, Bethesda, MDから入手）に対してELISAによって、免疫後（または初回免疫後）10週（図12A）、および初回免疫後14週／追加免疫後3週（図12B）に決定した。図12Aおよび12Bに示したように、Ad.3C.env.gagを接種したマウスは、HIV抗原、Gagに対して強力な免疫反応を有した。
図13A−Bは、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad.3C.env.rev.gag（上記Ａ節、３項で述べたように“Ad-3C/EmΔCΔT99.T.R-G”とも称される）によってマウスで誘発される抗体産生を示している。C57BL/6マウスの筋肉内に107pfuのAd.3C.env.rev.gagを接種した。接種後77日で、これらのマウスにさらに107pfuのAd.3C.env.rev.gagを再チャレンジした。これらのマウスの相対的抗体力価を精製リコンビナントGagに対してELISAによって、免疫後（または初回免疫後）10週（図13A）、および初回免疫後14週／追加免疫後3週（図12B）に決定した。図13Aおよび13Bに示したように、Ad.3C.env.rev.gagを接種したマウスは、HIV抗原、Gagに対して強力な免疫反応を有した。
【０１１４】
Ｃ．HIV抗原に対するアデノウイルスワクチンの免疫による細胞毒性Tリンパ球（CTL）の活性化
HIV抗原に対するアデノウイルスワクチンの免疫による細胞毒性Tリンパ球（CTL）の活性化を２つの別個のアッセイ、IFNγアッセイおよびグランザイムAアッセイを用いて測定した。IFNγおよびグランザイムアッセイは、T細胞の抗原特異的活性化を測定するためにデザインされた。IFNγは、活性化されたCTLおよびTH1ヘルパーT細胞（前記は細胞性免疫経路で特異的に機能する）によって分泌される。グランザイムAはまた活性化CTLによって分泌される。基本的なアプローチは、問題の抗原を発現している標的細胞と脾臓細胞をインキュベートし、培養液中へのIFNγまたはグランザイムAの分泌を調べることである。
１）IFNγアッセイ
このアッセイは、標識細胞は脾臓細胞とのインキュベーション前に放射能標識されないという点を除いて、標準的な51Cr遊離溶解アッセイ（Current Protocols in Immunology, Coligan et al., eds.）の改変である。このアッセイの詳細な方法は以下の文献に記載されている：Di Fabio et al., (1994) “Quantitation of human influenza virus-specific cytotoxic T lymphocytes: correlation of cytotoxicity and increased numbers of IFN-gamma-（or IFNγ-）producing CD8+ T cells” Int. Immunol. 6:11-9。簡単に記せば、約1ｘ105の脾臓細胞を105の標的細胞（例えば標的抗原を有する適切なウイルスに感染）とともに総容積100μL中でインキュベートした。細胞は37℃で４時間インキュベートした。IFNγは25μLの培養液によりELISAで測定した。
HIV抗原に対するアデノウイルスワクチンを接種したマウスのCTLの活性化を上記に記載したIFNγアッセイを用いることによって測定した。簡単に記せば、12匹のC57BL/6マウスの筋肉内に107pfuのAd.tat.env.IL2を接種した。図8A−Cに表示した時点で４匹の接種マウスから脾臓を採集した。脾臓細胞は、既にAd.tat.env.IL2に感染したB16-F1細胞（C57BL/6に由来するメラノーマ細胞株、ATCC番号：CRL-6323）とともにインキュベートすることによって活性化された。刺激後7日で、活性化脾臓細胞を表示のウイルスに感染したB16-F1細胞と混合した。培養液中へのIFNγの分泌はELISA（R＆D Systems, Minneapolis, MN）によって測定した。
【０１１５】
図8A−Cは、接種後4から8週間の間に培養液中に分泌されるIFNγ量のパーセント増加を示している。図8Aに示したように、IFNγの分泌は、Ad.tat.env.IL2の接種後４週間で採集した４匹のマウスの脾臓細胞で顕著に増加した。対照的に、非特異的タンパク質（β-Gal）を発現するアデノウイルスベクター（Ad.lacZ）を感染させたB16-F1細胞または非感染B16-F1細胞とともに脾臓細胞をインキュベートしたときはIFNγの分泌増加はほとんど生じなかった。
図8Bに示したように、IFNγ分泌は、接種後６週間で採集したマウスの脾臓細胞でより増加した。注目すべきことには、マウス5の脾臓細胞ではIFNγ分泌増加はほぼ100％であった（図8B）。
図8Cに示したように、IFNγ分泌は、接種後8週間で採集したマウスの脾臓細胞で劇的に増加した。マウス11の脾臓細胞ではIFNγ分泌増加は300％を越えた（図8B）。
これらの結果は、HIVに対する強力な液性免疫反応（例えば、高力価抗体の誘発および特異的にHIV抗原を標的とするCTLの活性化）が、HIVウイルス抗原および免疫刺激因子（例えばIL-2）の両方を発現するアデノウイルスワクチンを動物に接種することによって達成されることを示している。前記免疫反応は、ウイルス感染疾患の回復時の反応に類似する。これらの結果は、天然のウイルス感染に近似する本発明の遺伝子ワクチンはHIVに対する有効なヒト用ワクチンとして極めて有望であることを示している。
【０１１６】
２）グランザイムAアッセイ
グランザイムAアッセイはDeitzらが記載したプロトコルを改変したものを用いて実施した（Deitz et al., (2000) “MHC I-dependent antigen presentation is inhibited by poliovirus protein 3A” Proc. Natl. Acad. Sci. 97:13790-13795）。Deitzらが記載したグランザイムAアッセイはKaneらが記載したプロトコルの改変であった（Kane et al. (1989) “Cytolytic T-lymphocyte response to isolated class I H-2 proteins and influenza peptides” Nature (London) 340:157-159９）。
グランザイムAアッセイは、IFNγアッセイの方法と類似の方法（ただし以下の例外を有する）にしたがって実施した。培養液中へのグランザイムAの分泌は酵素アッセイによって決定した。グランザイムAの単位は、反応の直線期における活性の勾配を計算することによって決定した。グランザイムAの１単位は、１時間に基質を１OD405に変換するために必要な酵素量と定義される。
簡単に記せば、約１x105の活性化脾臓細胞および約１x105の標的細胞をIFNγアッセイの場合のように一緒にインキュベートした。グランザイムA活性は20μLの培養液を180μLの反応混合物（0.2mMのBLT（N-α-ベンジルオキシカルボニル-L-リジンチオベンジルエステル、Sigma, St. Louis, MO）、0.22ｍMのCTNB（5,5'-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)、Sigma, St. Louis, MO））と96ウェルプレートで一緒にし、さらに室温でインキュベートすることによって決定した。405nmでの吸収を数時間にわたってモニターした。酵素活性の勾配は反応の直線期で決定し、酵素単位に変換した。
【０１１７】
図9は、接種後8週間で採集したマウスの脾臓細胞で培養液中に分泌されるグランザイムA量の増加を示す。図9に示したように、グランザイムAは、Ad.tat.env.IL2の接種後8週間で採集した４匹のマウスの脾臓細胞で顕著に増加した。対照的に、非特異的タンパク質（β-Gal）を発現するアデノウイルスベクター（Ad.lacZ）、B型肝炎表面抗原とIL-2の両抗原を発現するアデノウイルスベクターを感染させたB16-F1細胞または非感染B16-F1細胞とともに脾臓細胞をインキュベートしたときははるかに少ないグランザイムの分泌が生じただけであった。同様に、標的細胞とインキュベートされていないこれらの脾臓細胞では偶発的なグランザイムAの分泌はほとんど生じなかった。
図14Aは1匹のマウスの表示時点における一連のグランザイムAアッセイの結果を示す。前記時点は、Ad.3C.env.gagによる免疫の4、6、8週間後、および前記の二次接種の12／1、13／2、14／3（初回免疫／ブースター免疫）後を含む。
図14Bは、2匹のマウスの表示時点（Ad.3C.env.gagによる免疫後の2、4、6、8週間を含む）における一連のグランザイムAアッセイの結果を示す。
IFNγアッセイとは別個にグランザイムAアッセイを用いて得られたこれらの結果もまた、特異的にHIV抗原を標的とするCTLの強力な活性化が、HIVウイルス抗原および免疫刺激因子(例えばIL-2)の両者を発現するアデノウイルスワクチンをマウスに接種することによって誘発されることを示している。これらの結果はまた、本発明によって提供される遺伝子ワクチンはHIVに対する効果的なヒトワクチンとして極めて有望であるという考えを支持している。
【０１１８】
３）ELISPOTアッセイ
ELISPOTアッセイは、リコンビナントアデノウイルスベクター、Ad.3C.env.gagおよびAd.3C.env.gag.revを接種したマウスのCTL活性化を決定するために実施した。C57BL/6マウスに107pfuのAd.3C.env.gagまたはAd.3C.env.gag.revを接種した。2週間間隔でマウスを殺し、脾臓細胞を調製した（以下を参照されたい：Current Protocols in Immunology, Coligan et al. eds.）。11週で、2回目の107pfuのAd.3C.env.gagまたはAd.3C.env.gag.revを接種した。Env、GagまたはRevのいずれかを発現しているワクシニアウイルスを既に感染させた4ｘ104のMC57G細胞（ATCC#CRL-2295）とともに2ｘ105の脾臓細胞を96ウェルのマウスIFNγ‐ELISPOTプレート（R&D Systems, Minneapolis, MN）で30時間インキュベートした。非特異的活性化は抗原発現細胞の代わりに4μg/ｍLのPHA（Sigma, St. Louis, MO）を添加した後モニターした。IFNγスポットはキットの指示にしたがって可視化し数えた。野生型およびリコンビナントワクシニアウイルスはNIH AIDS Research and Reference Reagent Program（Bethesda, MD）から入手した。
図15Aは、Ad.3C.env.gagによる初回／ブースター免疫後13／2週間における4匹のマウスの一連のELISPOTの結果を示す。図15Bは、Ad.3C.env.gag.revによる初回／ブースター免疫後13／2週間における4匹のマウスの一連のELISPOTの結果を示す。これらの結果は、本発明の遺伝子ワクチンはHIVGagに対してCTLの強力な活性化を誘発することを示している。
【０１１９】
３．B型肝炎ウイルスに対する遺伝子ワクチン
B型肝炎ウイルスに対する遺伝子ワクチンおよびそれらの構築方法の具体例を下記で詳細に述べる。
１）B型肝炎に対する複製欠損アデノウイルスワクチンの構築
B型肝炎表面抗原（HBsAg）およびHBVコア抗原（HBcAg）のためのコード配列をそれぞれ含む２つのアデノウイルスワクチン、Ad.HBsAg.IL2およびAd.HBcAg.IL2を構築した。同じベクターに、インターロイキン-2（IL-2）をコードするDNA配列もまた含ませ、ウイルス抗原を発現させるプロモーターとは別のプロモーターによって発現させた。このデザインはウイルス抗原および免疫刺激因子IL-2の両者の高レベルの発現を担保し、アデノウイルスワクチンの免疫原性を強化すると考えられる。次ぎの節に提示した実験データによって示されるように、これら2つのアデノウイルスベクターは両ベクターとも、B型肝炎抗原に対して強力で持続的な免疫反応を動物で誘発できる。
これら２つのアデノウイルスベクター、Ad.HBsAg.IL2およびAd.HBcAg.IL2は、上記で詳細に記載したエボラウイルスに対するアデノウイルスワクチンを構築するための方法と類似の方法を用いて構築した。
【０１２０】
ａ）Ad.HBsAg.IL2
簡単に記せば、完全長のHBsAg（XbaI部位の欠失によってもたらされたサイレント変異を含む）をシャトルベクターpLAd（図4A、左側）を用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入し、シャトルベクターpLAd-CMV-HBsAgを得た。
IL-2をコードする配列（XbaI部位の欠失によってもたらされたサイレント変異を含む）をシャトルベクターpRAd（図4A、右側）を用いてアデノウイルスゲノムの右端（E4領域）に挿入し、シャトルベクターpRAd-CMV-IL2を得た。
pLAd-CMV-HBsAgおよびpRAd-CMV-IL2の両ベクターを適切な制限酵素（例えばXbaIおよびEcoRI）を用いて直線化し、アデノウイルス骨格（図4B）に連結して、Ad.HBsAg.IL2と称するリコンビナントアデノウイルスベクターを得た。
ｂ）Ad.HBcAg.IL2
簡単に記せば、完全長のHBsAg（XbaI部位の欠失によってもたらされたサイレント変異を含む）および完全長のHBcAgをコードする配列を、シャトルベクターpLAd（図4A、左側）を用いてアデノウイルスゲノムの左端（E1領域）に挿入した。HBsAgおよびHBcAgは、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、２つのスプライシングアクセプター部位SA1およびSA2で別のCMVプロモーターから別々に発現される。作製されたシャトルベクターは、pLAd-CMV-SD/SA1-HBsAg-SA2-HbcAgと称される。
多種の免疫刺激因子（IL-2（XbaI部位の欠失によってもたらされたサイレント変異を含む）、INFγおよびGMCSFを含む）をコードする配列をシャトルベクターpRAd（図4A、右側）を用いてアデノウイルスゲノムの右端（E4領域）に挿入した。これら３つの免疫刺激因子は、レトロウイルススプライシングドナー（SD）およびアクセプター（SA）メカニズムにより、3つのスプライシングアクセプター部位SA1、SA2およびSA3で別のCMVプロモーターから別々に発現される。作製されたシャトルベクターは、pRAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-IFNγ-SA3-GMCSFと称される。
pLAd-CMV-SD/SA1-HBsAg-SA2-HbcAgおよびpRAd-CMV-SD/SA1-IL2-SA2-IFNγ-SA3-GMCSFの両ベクターを適切な制限酵素（例えばXbaIおよびEcoRI）を用いて直線化し、アデノウイルス骨格（図4B）に連結して、Ad.HBcAg.IL2と称するリコンビナントアデノウイルスベクターを得た。
【０１２１】
２）HBV抗原に対するアデノウイルスワクチンに対する動物の免疫反応
上記のように構築したアデノウイルスワクチン、Ad.HBsAg.IL2およびAd.HBcAg.IL2を実験マウスに接種して、これら２つのベクターによってそれぞれ発現されるB型肝炎表面抗原およびコア抗原に対する免疫反応を誘発した。これらアデノウイルスベクターの免疫原性は、それぞれHBsAgおよびHbcAgに対する抗体力価を測定することによって決定した。
ａ）HBV表面抗原（HBsAg）抗体の力価
CD-1マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）の筋肉内に以下に示すいくつかの異なる濃度のAd.HBsAg.IL2を注射した：100、１ｘ106、１ｘ107、１ｘ108、５ｘ105、５ｘ106および５ｘ107pfuウイルス。図10Aは、１ｘ105および５ｘ105pfuを接種したマウスから採集した血清について測定された相対的な抗HBsAg抗体力価を示している。各々の測定血清は1：500に希釈した。図10Bは、１ｘ107および１ｘ108pfuを接種したマウスから採集した血清について測定された相対的な抗HBsAg抗体力価を示している。各測定血清は1：1500に希釈した。
Ad.HbsAgIL2によって誘発された抗HBsAg抗体の相対的力価を測定するために、各動物の血液（約150−500μL）を免疫マウスから2週間毎に採集し、血清を調製した。血液は室温で2−3時間インキュベートして凝血させた。続いて前記血液を一晩4℃で冷蔵して凝血を収縮させた。非凝血液体を清浄な試験管に移し、2000ｘGで5分遠心した。上清を別の清浄な試験管に移した。アジ化ナトリウム（NaN3）を保存料として0.05％で添加した。少量ずつの部分標本を短期保存のために4℃で保存し、長期保存は-80℃で実施した。
相対的抗HBsAg力価は、酵母から精製したリコンビナントHBsAg（Aldevron, LLC, Fargo, ND）に対してELISAにより測定した。図10Aに示したように、群1のマウスは、アデノウイルスベクター、Ad.HBsAg.IL2によって発現されるHBsAgに対して接種後8週間以内に上昇する強力な免疫反応を示した。5ｘ105pfuの低い力価の前記ベクターがHBsAgに特異的な高レベルの抗体の誘発に十分であった。
図10Bは、より高力価のAd.HBsAg.IL2による免疫原性を示している。図10Bに示したように、アデノウイルスベクターの力価が１ｘ107pfuから1ｘ108pfu1に増加したとき、Ad.HBsAg.IL2の免疫原性は劇的に増加した。
これらの結果は、B型肝炎表面抗原およびIL-2の両者を発現するアデノウイルスベクターは、前記ベクターを接種されたマウスで特異的に前記ウイルス抗原を標的とする強力な免疫反応を誘発することを示している。前記の結果はまた、本発明によって提供される遺伝子ワクチンはB型肝炎に対する効果的なヒトワクチンとして極めて有望であるという考えを支持している。
【０１２２】
ｂ）HBVコア抗原抗体の力価
C57BL/6マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）群の筋肉内に種々の日付けで１ｘ107pfuのAd.HBcAg.IL2を注射した。接種後2週間毎に血液を４匹の動物から採集し、血清を調製した。接種後91日（群3、図11A）または84日（群4、図11B）でマウスをさらに１ｘ107pfuのウイルスで再チャレンジした。２回目のチャレンジ後毎日３匹の動物から血液を採集した。抗体力価は、大腸菌（E. coli）から精製したリコンビナントHBcAg（Chemicon International, Inc., Temecula, CA）に対してELISAにより測定した。
図11Aに示したように、群３のマウスは、アデノウイルスベクター、Ad.HBcAg.IL2によって発現される肝炎コア抗原HBcAgに対して強力な免疫反応を示し、HBcAgに対する抗体の最高の力価は接種後約28日で得られた。Ad.HBcAg.IL2による2回目の接種は免疫反応を再び追加支援し、非常に高い力価が2回目の接種から約3日以内に得られた。
図11Bに示したように、群4のマウスはまた、アデノウイルスベクター、Ad.HBcAg.IL2によって発現される肝炎コア抗原HBcAgに対して強力な免疫反応を示し、HBcAgに対する抗体の最高の力価は接種後約34日で得られた。Ad.HBcAg.IL2による2回目の接種は免疫反応を再び追加支援し、非常に高い力価が2回目の接種から約3日以内に得られた。
これらの結果は、B型コア抗原およびIL-2の両者を発現するアデノウイルスベクターは、前記ベクターを接種されたマウスで特異的に前記ウイルス抗原を標的とする強力な免疫反応を誘発することを示している。前記の結果はまた、本発明によって提供される遺伝子ワクチンはB型肝炎に対する効果的なヒトワクチンとして極めて有望であるという考えを支持している。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１A−Cは本発明の遺伝子ワクチンの構築の仕方を示す。図１Aは、スプライシングドナー‐アクセプターメカニズムを介してSDおよびSA部位で二シストロンとしてCMVieプロモーターから発現される、多種抗原遺伝子（例えばAntigen 1およびAntigen 2）を保持するシャトルベクター、pLAd.Antigenの例を示す。図１Bは、内部リボソームエントリー部位IRESおよびスプライシングドナー‐アクセプターメカニズムを介してSDおよびSA部位で二シストロンとしてCMVieプロモーターから発現される、多種サイトカイン遺伝子（例えばIL-2、INFおよびIL-8遺伝子）を保持するシャトルベクター、pRAd.サイトカインの例を示す。図１Cは、シャトルベクターpLAd.Antigenに由来し多種の抗原遺伝子を含むフラグメント、およびシャトルベクターpRAd.サイトカインに由来し多種のサイトカイン遺伝子を含むフラグメントとアデノウイルス骨格を連結することによる遺伝子ワクチンの構築例を示す。
【図２】図２は野生型GP遺伝子を示す。前記遺伝子は糖タンパク質の２つの形態（sGPおよびGP）をコードし、RNAエディットシグナルを含み、前記シグナルは未エディットｍRNAおよびエディット完了ｍRNAを生成する。sGPは非エディットｍRNAから合成され、GPはエディット完了ｍRNA（７つのウリジンの１つに挿入を有する）から合成される。図２はまたsGPの合成を妨げるためにRNAに施される改変を示す。RNAエディット部位はUUU UUU UからUUC UUC UUに改変される。この改変によってエディットシグナルが除去され、GPのみをコードするｍRNAが得られる。
【図３】図３はGP2に位置する免疫抑制ペプチド（IS）の改変を示す。図３Aは野生型GPを示す。図３BはISペプチドから10アミノ酸が欠失したGPを示す。図３Cは、分割され、倒置され、さらに複製されたISペプチドを示す。略語は以下のとおりである：FP、融合ペプチド；IS、免疫抑制ペプチド；TM、トランスメンブレンドメイン。
【図４】図４Aおよび４Bは、エボラウイルスに対する遺伝子ワクチンとしてリコンビナントアデノウイルスベクターを作製するために用いられる方法を示す。図４Aは、エボラウイルス抗原のGP遺伝子を含むシャトルベクター、pLAd/EBO-GP並びに、IL-2およびIL-4遺伝子を含むシャトルベクター、pRAdIL2,4を示す。図４Bは、シャトルベクターpLAd/EBO-GPに由来しGP遺伝子を含むフラグメント、およびシャトルベクターpRAdIL2,4に由来しIL-2およびIL-4遺伝子を含むフラグメントとアデノウイルス骨格を連結することによるリコンビナントアデノウイルスベクターの構築を示す。
【図５】図５は、本発明の遺伝子ワクチンの例として複合アデノウイルスベクターを示す。箙ウイルスGP遺伝子をE1領域内でCMVieプロモーターによって発現させる。GP遺伝子の後にIFNγおよびGM-CSFが続き、これらは２つのIRES配列によって発現される。この構造は、１つのｍRNAから３つのタンパク質を発現させることを可能にする。IL-2およびIL-4の発現は、二シストロンカセットとして第二のCMVieプロモーターによって制御される。前記IL-2およびIL-4の後に第２の二シストロンカセットが続き、このカセットは、SV40初期プロモーターによってE4領域以内のIL12のサブユニットを発現させる。
【図６】図６は１つのマウス群におけるHIV抗原に対する抗体の相対的力価を示す。
【図７】図７は別のマウス群におけるHIV抗原に対する抗体の相対的力価を示す。
【図８】図８A−Cは、アデノウイルスベクター接種マウスから採集した活性化脾臓細胞の標的細胞刺激に対する反応でのIFNγの分泌を示す。
【図９】図９A−Cは、アデノウイルスベクター接種マウスから採集した活性化脾臓細胞の標的細胞刺激に対する反応でのグランザイムAの分泌を示す。
【図１０】図10Aは１つのマウス群におけるHIV表面抗原に対する抗体の相対的力価を示す。図10Bは別のマウス群におけるHIV表面抗原に対する抗体の相対的力価を示す。
【図１１】図11Aは１つのマウス群におけるHIVコア抗原に対する抗体の相対的力価を示す。図11Bは別のマウス群におけるHIVコア抗原に対する抗体の相対的力価を示す。
【図１２】図12Aは、Ad-3C/EmΔCΔT300-Gによる接種後10週のマウスにおけるHIVGagに対する抗体の相対的力価を示す。  図12Bは、Ad-3C/EmΔCΔT300-Gによる接種後14週／ブースター免疫後3週のマウスにおけるHIVGagに対する抗体の相対的力価を示す。
【図１３】図13Aは、Ad-3C/EmΔCΔT99-Gによる接種後10週のマウスにおけるHIVGagに対する抗体の相対的力価を示す。図13Bは、Ad-3C/EmΔCΔT99-Gによる接種後14週／ブースター免疫後3週のマウスにおけるHIVGagに対する抗体の相対的力価を示す。
【図１４】図14Aは、Ad.3C.env.gagによる免疫後4、6、8週後、および前記ベクターによる2回目接種後12／1、13／2、14／3（初回免疫／ブースター免疫）週のマウスのシリーズ１におけるグランザイムアッセイの結果を示す。図14Bは、Ad.3C.env.gagによる免疫後2、4、6、8週後、および前記ベクターの2回目接種後12／1、13／2、14／3（初回免疫／ブースター免疫）週のマウスのシリーズ１におけるグランザイムアッセイの結果を示す。
【図１５】図15Aは、Ad.3C.env.gagによる初回免疫／ブースター免疫の13／2週後のシリーズ１における4匹のマウスについてのELISPOTの結果を示す。図15Bは、Ad.3C.env.rev.gagによる初回免疫／ブースター免疫の13／2週後のシリーズ１における4匹のマウスについてのELISPOTの結果を示す。
【図１６】図16AはシャトルベクターpLAd-E.T.Rを示す。図16BはシャトルベクターpRAd-ORF6-IL2を示す。
【図１７】図17AはシャトルベクターｐRAd-ORF6-cmv-EmΔCΔT300-Gを示す。図17BはシャトルベクターpLAd-3Cを示す。
【図１８】図18はシャトルベクターｐRAd-EmΔCΔT99.T.R-Gを示す。
【図１９】図19AはシャトルベクターｐLAd-EmΔV1,2ΔCΔT.T.R-IL2を示す。図19BはシャトルベクターpRAd-ORF6-G.IL2を示す。
【図２０】図20はシャトルベクターｐLAd-EmΔC.T.R.Nを示す。
【図２１】図21はシャトルベクターｐLAd-EmΔC.Nを示す。
【図２２】図22はシャトルベクターｐLAd-EmΔCΔT300.Tを示す。
【図２３】図23AシャトルベクターｐLAd-EmΔCを示す。図23BはシャトルベクターｐRAd-ORF6-EmΔCを示す。
【図２４】図24はPCRによるマルチクレード挿入物の構築方法を示す。
【図２５】図25はシャトルベクターｐLAd-Em.V3を示す。
【図２６】図26はシャトルベクターｐLAd-Em.2xV3を示す。
【図２７】図27AはシャトルベクターpRAd-ORF6-p17/p24を示す。図27BはシャトルベクターpRAd-ORF6-p17/p24secを示す。図27CはシャトルベクターpRAd-ORF6-p17/p24MBを示す。
【図２８】図28AはシャトルベクターpRAd-ORF6-p17を示す。図28BはシャトルベクターpRAd-ORF6-p17secを示す。図28CはシャトルベクターpRAd-ORF6-p17MBを示す。
【図２９】図29AはシャトルベクターpRAd-ORF6-p24を示す。図29BはシャトルベクターpRAd-ORF6-p24secを示す。図29CはシャトルベクターpRAd-ORF6-p24MBを示す。
【図３０】図30A−BはAd-Em.2xV3m/p17/p24MBの構築方法を示す。
【図３１】図31A−BはAd-Em.2xV3m/p17MBの構築方法を示す。
【図３２】図32A−BはAd-Em.2xV3m/p24MBの構築方法を示す。
【図３３】図33はシャトルベクターｐLAd-EmΔCΔT300.2xV3m.Tを示す。
【図３４】図34はシャトルベクターｐLAd-EmΔCΔT99.2xV3m.T.Rを示す。
【図３５】図35はシャトルベクターｐRAd-ORF6-G.PIを示す。
【図３６】図36はシャトルベクターｐRAd-ORF6-G-PIを示す。
【図３７】図37はクローニングベクターSD/SA1.2.3を示す。
【図３８】図38は、HIV-1 BH10株由来のEnv/Tat/RevをコードするDNA配列を示す。
【図３９】図39は変異IL-2（IL-2ΔX）をコードするDNA配列を示す。
【図４０】図40は改変Env（EmΔCΔT（BH10））をコードするDNA配列を示す。
【図４１】図41Aは完全長HIV GagをコードするDNA配列を示す。図41Bは完全長HIV Gagのアミノ酸配列を示す。
【図４２】図42はEnV、並びに完全長のTaTおよびRevをコードするDNA配列を示す。
【図４３】図43はEmΔV1,2ΔCΔT.T.RをコードするDNA配列を示す。
【図４４】図44はEmΔC.T.R.NをコードするDNA配列を示す。
【図４５】図45はEmΔC.NをコードするDNA配列を示す。
【図４６】図46はEmΔCΔT300.TをコードするDNA配列を示す。
【図４７】図47はEm/EmをコードするDNA配列を示す。
【図４８】図48はクレードB、A、C、D、E、FおよびGのV3ループのDNA配列を示す。
【図４９】図49AはマルチクレードV3ループを含む改変EnvをコードするDNA配列を示す。図49BはマルチクレードV3ループを含む改変Envをコードするアミノ酸配列を示す。
【図５０】図50Aは、それぞれ天然型、分泌型および膜結合型のp17/p24をコードするDNA配列を示す。図50Bは、それぞれ天然型、分泌型および膜結合型のp17/p24をコードするアミノ酸配列を示す。
【図５１】図51Aは、それぞれ天然型、分泌型および膜結合型のp17をコードするDNA配列を示す。図51Bは、それぞれ天然型、分泌型および膜結合型のp17/p24をコードするアミノ酸配列を示す。
【図５２】図52Aは、それぞれ天然型、分泌型および膜結合型のp24をコードするDNA配列を示す。図52Bは、それぞれ天然型、分泌型および膜結合型のp24をコードするアミノ酸配列を示す。
【図５３】図53Aは、マルチクレードV3ループを含む改変EnvおよびTatをコードするDNA配列を示す。図53BはマルチクレードV3ループを含む改変EnvおよびTatをコードするアミノ酸配列を示す。
【図５４】図54Aは、マルチクレードV3ループを含む改変Env、TatおよびRevをコードするDNA配列を示す。図54Bは、マルチクレードV3ループを含む改変Env、TatおよびRevをコードするアミノ酸配列を示す。
【図５５】図55Aは、HIVプロテアーゼPIをコードするDNA配列を示す。図55BはHIVプロテアーゼPIをコードするアミノ酸配列を示す。
【図５６】図56Aは、HIV Gag-PIをコードするDNA配列を示す。図56BはHIV Gag-PIをコードするアミノ酸配列を示す。
【図５７】図57は多種のHIVクレードからV3ループをクローニングするためのPCRプライマーを示す。
【図５８】図58はシャトルベクターpRAd-ORF6-Gag/PI-RTを示す。
【図５９】図59はシャトルベクターpRAd-ORF6-Gag-PI-RTを示す。
【図６０】図60はシャトルベクターpRAd-ORF6-Gag/Polを示す。
【図６１】図61はシャトルベクターpRAd-ORF6-Gag-Polを示す。
【図６２】図62は右側のシャトルベクターpR-Ad.5/35-6mを示す。
【図６３】図63は、Ad5のファイバー領域の個々のドメインがAd35のファイバー領域の対応するドメインで置換されたキメラベクターの種々の具体例を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ−１】
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【図３０Ｂ−２】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ−１】
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【図３１Ｂ−２】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ−１】
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【図３２Ｂ−２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ−１】
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【図５０Ａ−２】
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【図５０Ｂ−１】
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【図５０Ｂ−２】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５３Ａ−１】
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【図５３Ａ−２】
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【図５３Ｂ】
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【図５４Ａ−１】
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【図５４Ａ−２】
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【図５４Ｂ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005525085.tif 000105
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2005525085.tif 000109