(57)【要約】本発明は、（ｉ）ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる少なくとも１種の物質、および／またはＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる少なくとも１種の核酸、ならびに（ii）細胞傷害活性を有する少なくとも１種の物質、および／または細胞傷害活性を有する物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる少なくとも１種の核酸を含んでなる組み合わせ物に関する。本発明はまた、ＣＳＦ−１の発現を阻害することができるオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、抗腫瘍療法の実施のために特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる少なくとも１種の物質、および／またはＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる少なくとも１種の核酸、ならびに
（ｉｉ）少なくとも細胞傷害活性を有する少なくとも１種の物質、および／または少なくとも細胞傷害活性を有する物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる少なくとも１種の核酸
を含んでなる、組み合わせ物。
【請求項２】
ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１に含まれる９７番目のヌクレオチドから９９番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズすることができるものである、請求項２に記載の組み合わせ物。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１に含まれる１２１番目のヌクレオチドから４５０番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズすることができるものである、請求項２に記載の組み合わせ物。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１に含まれる１３１番目のヌクレオチドから３９１番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズすることができるものである、請求項４に記載の組み合わせ物。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１に含まれる１３５番目のヌクレオチドから１５２番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズすることができるものである、請求項５に記載の組み合わせ物。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１に含まれる２８４番目のヌクレオチドから３０１番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズすることができるものである、請求項５に記載の組み合わせ物。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１に含まれる３４１番目のヌクレオチドから３５８番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズすることができるものである、請求項５に記載の組み合わせ物。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが、８〜３０ヌクレオチドを含んでなるものである、請求項２〜８のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが、１２〜２５ヌクレオチドを含んでなるものである、請求項９に記載の組み合わせ物。
【請求項１１】
ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質が抗体である、請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項１２】
少なくとも細胞傷害活性を有する物質が、ＤＮＡと相互作用する物質、抗代謝産物、トポイソメラーゼ阻害剤、スピンドルエージェントおよび細胞分裂抑制剤から選択されるものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項１３】
少なくとも細胞傷害活性を有する物質が腫瘍関連抗原である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項１４】
少なくとも細胞傷害活性を有する物質が、サイトカイン、化学吸引活性を示すポリペプチド、自殺遺伝子によってコードされるタンパク質、抗血管形成性タンパク質因子および細胞性アポトーシス活性化活性を示すポリペプチドから選択されるものである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み合わせ物。
【請求項１５】
ＣＳＦ−１の発現を阻害しうる８〜１００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号１に含まれる１２１番目のヌクレオチドから４５０番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズしうる、オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１に含まれる１３１番目のヌクレオチドから３９１番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズしうる、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号１に含まれる１３５番目のヌクレオチドから１５２番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズしうる、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号１に含まれる２８４番目のヌクレオチドから３０１番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズしうる、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号１に含まれる３４１番目のヌクレオチドから３５８番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズしうる、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
８〜３０のヌクレオチドを含んでなる、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
１２〜２５のヌクレオチドを含んでなる、請求項２０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
核酸と結合する物質と結合しているものである、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
核酸と結合する前記物質が、カチオン脂質、ポリペプチドおよびカチオンポリマーから選択されるものである、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項１５〜２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドをコードする配列を含んでなる、核酸。
【請求項２５】
プラスミドベクターである、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
ウイルスベクターである、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２７】
核酸と結合する物質と結合しているものである、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２８】
核酸と結合する前記物質が、カチオン脂質、ポリペプチドおよびカチオンポリマーから選択されるものである、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の少なくとも１種のオリゴヌクレオチドおよび医薬上許容されるベヒクルを含んでなる、組成物。
【請求項３０】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の組み合わせ物および医薬上許容されるベヒクルを含んでなる、組成物。
【請求項３１】
癌治療用の医薬品の製造のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組み合わせ物の使用。
【請求項３２】
抗腫瘍療法の効果を向上させるための医薬品の製造のための、ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質の使用。
【請求項３３】
癌治療を目的とする医薬品の製造のための、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、（ｉ）ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる少なくとも１種の物質、および／またはＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる少なくとも１種の核酸、ならびに（ii）細胞傷害活性を有する少なくとも１種の物質、および／または細胞傷害活性を有する物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる少なくとも１種の核酸を含んでなる組み合わせ物に関する。本発明はまた、ＣＳＦ−１の発現を阻害しうるオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、抗腫瘍療法の適用に特に有用である。
【０００２】
現在、抗腫瘍療法に関連して得られる最も有望な結果は、化学的化合物に基づく療法（化学療法）と放射線の使用に基づく療法（放射線療法）とを合わせた組合せ療法に関するものである。この型の治療法において患者が経験する重篤な副作用の他に、１０〜５０％の再発が観察される（療法がいかに早期に適用されたかによる）。
【０００３】
さらに、癌の分野で行なわれた研究の結果は、遺伝子療法プロトコールを抗腫瘍治療に適用することを示唆している。例えば、この点で、タイプ１６ヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ７遺伝子を発現するワクチンの組換えベクターを用いる腫瘍細胞に対する免疫に関するMeneguzziら（1991, Virology, 181, 61-69）による研究（米国特許第５７４４１３３号明細書または米国特許第６００７８０６号明細書もまた参照されたい）、または組換えウイルスベクターの腫瘍内投与後の腫瘍部位上のサイトカインの産生が腫瘍増殖阻害に関連する免疫応答の誘導を可能にしたことを示したLeroyら（1998, Res. Immunol. 149, 681-684）による研究は特筆すべきである。また、ＩＬ２を発現することができる遺伝子改変細胞において得られた結果（Roschlitz et al., 1999, Cancer Gene Ther., 6, 271-281）または腫瘍抗原およびインターロイキンを発現するウイルスベクターにおいて得られた結果（Bizouarne et al., 1996, In "Breast Cancer Advances in Biology and Therapeutics", F. Calvo, M. Crepin and H. Magdalenat eds., 303-308；総説はZhang, 1999, Cancer Gene Therapy, 6, 113-138を参照されたい）について述べることができる。
【０００４】
しかしながら、これら種々の療法において観察された抗腫瘍応答は有望なものではあるが、従来の治療（すなわち、化学療法や放射線療法）に続いて観察される臨床的応答よりも優れているわけではない。
【０００５】
したがって、必要となる細胞傷害活性以外は副作用をほとんどまたは全く伴うことなく、実施が容易で、腫瘍量の長期にわたる抑制および治療患者の生存率向上を可能にする、効果的抗腫瘍療法の実現をまず可能にするような新規産物および／または新規方法を得ることが望ましい。
【０００６】
ＣＳＦ−１（コロニー刺激因子１）は特に単球によって発現されるサイトカインであり、それはこれら細胞の分化、増殖および生存因子である。その受容体は、原発癌遺伝子ｃ−ｆｍｓの産物である（Sherr et al., 1990, Blood, 75, 1-12）。ＣＳＦ−１はまた、ヒト子宮内膜および胎盤において腫瘍細胞のいくつかによって生理的に発現される。免疫組織化学およびin situハイブリダイゼーションによってなされた研究は、侵襲性腫瘍細胞におけるＣＳＦ−１の発現の特異性を示したが、そのような産生は管内性または非侵襲性腫瘍細胞においては観察されない（Scholl et al. J. Natl. Cancer. Inst., 1994, 86, 120-126; J. Cellular, Biochem., 1992, 50, 350-356; Mol. Carcinog., 1993, 7207-211）。侵襲性腫瘍細胞によるＣＳＦ−１の産生は、特に患者の血漿中のその濃度の増加に対応し、正常被験者における３００ｐｇ／ｍｌ以下と比較して、１０００ｐｇ／ｍｌ以上となり得る。この種の濃度は、疾患の進行期および好ましくない短期予後を示す（Scholl et al., Br. J. Cancer, 1994, 69, 342-346; Scholl et al., Breast Cancer Res. Treat. 1996, 39:275-283）。
【０００７】
さらに、ＣＳＦ−１は腫瘍細胞の移動性および侵襲性を刺激することが示されている（Dorsch et al., Eur. J. Imm., 1993, 23, 186-90; Wang et al. J. Immunol., 1988, 141, 575-579; Filderman et al., Cancer Research, 1992, 52, 3661-3666）。ＣＳＦ−１はまた、骨髄系における前駆体に走化性の影響を及ぼし、これは腫瘍における単球の浸潤を促進する。しかしながら、これら単球の存在は、免疫系による腫瘍の破壊を観察するには充分ではない（Dorsch et al., 1993, Eur. J. Immunol., 23, 186-190）。乳房、卵巣または膵臓の腫瘍を患っている患者で通常見られる高血清含量では、ＣＳＦ−１はこれら単球の分化をマクロファージに方向づけし、腫瘍抗原を表示し、したがって腫瘍細胞に対する効果的細胞傷害性免疫応答を開始する能力を有する樹状細胞に方向づけしないようである（Scholl et al., 1996, Breast Cancer. Res. Treat., 39, 275-283; Baron et al., J. Cell. Sci., 2000, 114, 999-1010）。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、治療される患者において、腫瘍細胞の死を誘導し、ＣＳＦ−１濃度および／またはＣＳＦ−１活性を抑制する組み合わせ物に関する。これら二特性の関連は、抗腫瘍療法の面で特に興味深い。本発明者らは、ＭＵＣ−１ムチンをコードするベクターを用いて腫瘍細胞に対して患者を免疫することからなる抗腫瘍療法に対して最良臨床応答を示すのは、ＣＳＦ−１の血清含量が最低である患者であったことを示した。より詳細には、このような組み合わせ物は、特異的細胞死を誘導することによって細胞、特に腫瘍細胞の増殖を阻害または遅延する手段、より優れた抗原表示および／または宿主生物の免疫細胞のより優れた刺激を提供する。本発明は、従来の技術に代わる、特にヒトまたは動物における癌の治療のための、有利で効果的な技術を提供する。
【０００９】
したがって、本発明は、
（ｉ）ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる少なくとも１種の物質、および／またはＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質をコードする少なくとも１種の配列を含む少なくとも１種の核酸、ならびに
（ii）少なくとも細胞傷害活性を有する少なくとも１種の物質、および／または少なくとも細胞傷害活性を有する物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる少なくとも１種の核酸
を含む、組み合わせ物に関する。
【発明の具体的説明】
【００１０】
「ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質」とは、ＣＳＦ−１の発現を阻害することができる物質およびＣＳＦ−１のその受容体への結合を阻害することができる物質を意味する。
【００１１】
「ＣＳＦ−１の発現を阻害することができる」とは、該物質の作用が標的細胞によって産生されるＣＳＦ−１の量を減らすことを意味する。とくに、ＣＳＦ−１の発現を阻害する物質の能力は、ＣＳＦ−１を発現している細胞をＣＳＦ−１の発現を阻害することができる物質と接触させて、該細胞によって発現されたＣＳＦ−１の量を測定することによってインビトロで確認することができる（Birchenall-Roberts et al., J. Immunol., 1990, 145, 3290-3296）。
【００１２】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質は、オリゴヌクレオチドである。
【００１３】
ＣＳＦ−１の発現を阻害することができる特に重要なオリゴヌクレオチドの一つは、Birchenall-Robertsら（J. Immunol., 1990, 145, 3290-3296）によって記述されたオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドは、ＣＦＳ−１コード配列の開始コドン（すなわち、配列番号１に含まれる９７番目のヌクレオチドから９９番目のヌクレオチドまでの領域）にハイブリダイズすることができ、標的細胞によるＣＦＳ−１の発現を効果的に阻害する。
【００１４】
本発明者らはまた、ＣＳＦ−１の発現を阻害することができる新規のオリゴヌクレオチドも同定している。
【００１５】
したがって、本発明はまた、８〜１００のヌクレオチド長で、ＣＳＦ−１の発現を阻害することができるオリゴヌクレオチドに関し、それは、配列番号１に含まれる１２１番目のヌクレオチドから４５０番目のヌクレオチドまで、好ましくは１３１番目のヌクレオチドから３９１番目のヌクレオチドまで、より好ましくは１３５番目のヌクレオチドから１５２番目のヌクレオチドまで、または２８４番目のヌクレオチドから３０１番目のヌクレオチドまで、または３４１番目のヌクレオチドから３５８番目のヌクレオチドまでの領域にハイブリダイズすることができることを特徴とする。
【００１６】
オリゴヌクレオチドという用語は、一本鎖ヌクレオチドポリマーを指す。ヌクレオチドは当業者に周知であり、少なくとも一つの核酸塩基、少なくとも一つの−オース基、および少なくとも一つの燐酸基からなる。
【００１７】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、特にそれらのインビボでの安定性、標的配列への結合および／または細胞によるそれらの捕捉を向上するために、修飾されていてもよい。
【００１８】
特に、本発明において用いることのできる修飾オリゴヌクレオチドとしては、１つまたはいくつかのホスホロチオエート、ホスホトリエステルおよび／またはメチルホスホネート結合を含んでなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。好ましい実施態様によれば、本発明によるオリゴヌクレオチドには、１つまたはいくつかのホスホロチオエート結合が含まれる。
【００１９】
また、修飾オリゴヌクレオチドには、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよび／またはウラシルの１つまたはいくつかの誘導体を含んでなるオリゴヌクレオチドが含まれる。これら誘導体には、ヒポキサンチン、５−（１−プロピニル）−2'−デオキシシチジン、５−（１−プロピニル）−2'−デオキシウリジン、６−メチルアデニン、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニンおよび２，６−ジアミノプリンが含まれるが、これらには限定されない。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるオリゴヌクレオチドには、１つまたはいくつかの５−（１−プロピニル）−2'−デオキシウリジン、および／または１つまたはいくつかの５−（プロピニル）−2'−デオキシシチジンが含まれる。
【００２０】
また、修飾オリゴヌクレオチドには、１つまたはいくつかの−オース基（-ose group）が置換されたオリゴヌクレオチドが含まれる。「置換された−オース基」とは、2'、3'および／または5'位置における水素または水酸基が他の化学官能基によって置換されている−オース基を意味する。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるオリゴヌクレオチドは１つまたはいくつかの2'−メトキシエトキシル、2'−プロポキシおよび／または2'−フルオロ基を含む。
【００２１】
他の修飾オリゴヌクレオチドは当業者に公知であり、本発明において使用することができる。特に、参照によりその内容が本明細書の一部とされる米国特許第６，２３８，９２１号明細書に記載のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２２】
オリゴヌクレオチドは、当業者に周知の技術を用いて、特に固相合成技術を用いて、調製することができる（Sproat et al., 1984, Solid-phase synthesis of oligodeoxyribonucleotides by the phosphotriester method, in Oligonucleotide Synthesis - A practical approach, Gait, M.J. Ed., IRL Press, Oxford p. 83-115を総説として参照されたい）。
【００２３】
「ハイブリダイズすることができる」とは、本発明によるオリゴヌクレオチドが標的配列に特異的に結合できることを意味する。ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドの第一のヌクレオチドおよび標的配列中の第二のヌクレオチドとの間の水素結合の結果である。二つのヌクレオチド間の結合が可能となる前提として、二つのヌクレオチドは相補的でなければならない。ハイブリダイゼーションが起きるには、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドの１００％が標的配列のヌクレオチドに相補的である必要はないことは、当業者に公知である。本発明の一つの実施態様によれば、本発明によるオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの８０％以上が標的配列のヌクレオチドに相補的であり、好ましくはこの百分率は９０％以上、理想的には１００％である。
【００２４】
オリゴヌクレオチドと標的配列との間のハイブリダイゼーションは、当業者に周知の方法を用いて確認することができる。特に、Southernら（Ciba Found. Symp., 1997, 209, 38-44）に記載の方法は特筆すべきものである。
【００２５】
当業者は、任意の標的配列にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの配列を決定することができ、この目的のために設計されたソフトウェアを使用することができる（Song et al., Acta Pharmacol Sin., 2000, 21, 80-86）。
【００２６】
「標的配列」とは、発現を調節する必要のあるポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡ配列、発現を調節する必要のあるポリペプチドをコードする前記配列の転写の制御に関与するゲノムＤＮＡ配列、およびこれらゲノムＤＮＡ配列に関して転写されたｍＲＮＡを意味する。
【００２７】
有利には、本発明によるオリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド、好ましくは１２〜２５ヌクレオチド、理想的には１６〜１９ヌクレオチドを含んでなる。
【００２８】
本発明によるオリゴヌクレオチドがデオキシリボ核酸のみからなる特定の場合には、それは核酸配列から転写され得る。したがって、本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドをコードする配列を含んでなる核酸に関する。
【００２９】
ＣＳＦ−１のその受容体への結合を阻害することができる物質には、例えば、ＣＳＦ−１またはその受容体への結合が可能な抗体、ペプチド、脂質または糖が含まれる。
【００３０】
好ましい実施態様によれば、ＣＳＦ−１のその受容体への結合を阻害することができる物質は抗体である。「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ｓｃＦｖおよび抗体の断片を意味する。より具体的には、抗体「断片」とは、ポリクローナルまたはモノクローナル起源の別にかかわらず、天然抗体のフラグメントＦ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ（Blazar et al., 1997, J. of Immunology 159, 5821-5833; Bird et al., 1988, Science 242, 423-426）およびＢａｂｓ（Ward et al., 1989, Nature 341, 544）を意味する（例えば、Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques and Applications, H. Zola (CRC Press, 1988)およびMonoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, J. Hurrel (CRC Press, 1982)を参照されたい）。さらに、天然抗体結合の特異性を保持する抗体フラグメントの合成に関する技術の一般的総説は、Winterら（1991, Nature 349, 293-299）に見出すことができる。ＣＳＦ−１またはその受容体に結合することができるいくつかの抗体は、市販されている（例えば、Oncogene Science, Manhasset, NY, USAから）。例えば、Birchenall-Robertsら（J. Immunol., 1990, 145, 3290-3296）に記載のモノクローナル抗体がある。
【００３１】
本発明の他の実施態様によれば、ＣＳＦ−１のその受容体への結合を阻害することができる物質は、ＣＳＦ−１またはＣＳＦ−１受容体に結合することができるペプチドである。これらペプチドは、先行技術において利用可能な方法によって調製し得る。例えば、これらペプチドは、ファージディスプレイ技術（Smith, G.P., Curr. Opin. Biotechnol. 2:668-673 (1991)）によって調製し得る。
【００３２】
「少なくとも細胞傷害活性を有する物質」とは、その物質が標的細胞に対する特異的な免疫応答を誘導もしくは活性化するか、そのような細胞の増殖および／または分裂を阻害することができることを意味する。好ましい例によれば、この細胞傷害活性の結果、該細胞は死滅する。本発明の好ましい実施態様によれば、標的細胞は腫瘍細胞である（この場合、細胞傷害活性は抗腫瘍活性と称される）。
【００３３】
任意の物質、特に抗腫瘍物質の細胞傷害活性は、細胞生存測定、理想的には短期生存能試験（例えば、トリパンブルー試験またはＭＴＴ試験）によって、もしくは癌化生存試験（コロニー形成）（Brown and Wouters, 1999, Cancer Research, 59, 1391-1399）によってインビトロで、または動物モデルにおける腫瘍の増殖（大きさおよび／または量）の測定（Ovejera and Houchens, 1981, Semin. Oncol., 8, 386-393）によってインビボで評価することができる。
【００３４】
本発明の一つの実施態様によれば、少なくとも細胞傷害活性を有する物質は、ＤＮＡと相互作用する物質、抗代謝産物、トポイソメラーゼ阻害剤およびスピンドルエージェント（spindle agent）から選択される。
【００３５】
ＤＮＡと相互作用する物質は、抗癌療法に現在使用されている物質である。特に、アルキラント、メチル供与体（例えば、ニトロソウレア）、オルガノプラチン（特にシスプラチン、カルボプラチンおよびオキザリプラチン）およびＤＮＡ分割剤（DNA splitting agent）が含まれる。
【００３６】
抗代謝産物は、細胞性代謝を阻害することによって作用し、これもまた当業者に周知である。とくに、メトトレキサートおよびラルチトレキセドのような葉酸類似体（代謝拮抗剤）、クラドリビン、フルダラビン、メルカプトプリンおよびペンタスタチンのようなプリン類似体、シタラビン、フルオロウラシルおよびゲムシタビンのようなピリミジン類似体がある。
【００３７】
トポイソメラーゼ阻害剤には、特にトポイソメラーゼ阻害剤Ｉ（例えば、イリノテカンおよびトポテカン）、トポイソメラーゼII阻害剤（例えば、アントラサイクリン）が含まれる。
【００３８】
スピンドルエージェントは、有糸分裂紡錘体の形成または消失をブロックし、その結果、細胞の有糸分裂を阻害する物質である。これには、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびタキソイドが含まれる。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様によれば、少なくとも細胞傷害活性を有する物質は、腫瘍関連抗原（ＡＡＴ）の中から選択される。腫瘍細胞のいくつかは特異的抗原を発現する。これらＡＡＴは、免疫療法において用いられ、腫瘍細胞に対する免疫応答を開始させることができる（例えば、Bacchia et al., Haematologica, 2000, 85, 1172-206）に総説がある）。
【００４０】
本発明において使用できるＡＴＴには、ＭＡＲＴ−１（Kawakami et al., J. Exp. Med. 180:347-352, 1994）、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＰ−１００（Kawakami et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91:6458-6462, 1994）、ＣＥＡ、チロシナーゼ（Brichard et al., J. Exp. Med. 178:489, 1993）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、突然変異したｒａｓ発癌遺伝子、発癌遺伝子ｐ５３、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＡＰおよびｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（（Boon et al., Ann. Rev. Immunol., 12:337, 1994）などが含まれるが、これらには限定されない。
【００４１】
本発明の他の実施態様によれば、少なくとも一つの細胞傷害活性を有する物質は、サイトカイン、化学吸引活性を有するポリペプチド（例えばケモカイン）、「自殺遺伝子」と称される遺伝子によってコードされるタンパク質、抗血管形成性タンパク質因子および細胞性アポトーシス活性化活性を有するポリペプチドの中から選択される。
【００４２】
サイトカインは、抗原刺激または炎症反応に続いて天然に産生される分子であって（Gillis and Williams, 1998, Curr. Opin. Immunol., 10, 501-503）、それに関していくつかの癌の治療における有用性が特にOettger（Curr. Opin. Immunol., 1991, 3, 699-705）によって示されている。本発明のこの第一の変形によれば、少なくとも細胞傷害活性を有する物質は、好ましくは、α、βおよびγインターフェロン、インターロイキン、そしてとくに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびコロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ）から選択されるサイトカインを表す。
【００４３】
好ましい一実施態様によれば、該サイトカインはインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）から選択される。特に、インターロイキン−２は、活性化されたＴリンパ球の増殖、免疫系の細胞の増加および活性化に重要である（特に、核酸配列に関してＥＰ０２０６９３９を参照されたい）。ＩＦＮ−γは食細胞を活性化し、主要組織適合性複合体におけるクラスＩまたはクラスＩＩ表面抗原の発現を増加させる（特に、核酸配列に関してＥＰ０２０６２０を参照されたい）。これら核酸配列は、参照により本明細書の一部とされる。
【００４４】
特定の実施態様によれば、本発明による組み合わせ物は、少なくとも細胞傷害活性を有する少なくとも二つの物質、すなわちインターロイキン−２（ＩＬ−２）およびガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）を含んでなる。
【００４５】
本発明の他の変形によれば、少なくとも細胞傷害活性を有する物質は、化学吸引（走化性）活性を有するポリペプチド（すなわちケモカイン）である。ケモカインは、サイトカインファミリーのサブクラスを形成する。それらは、それらの化学吸引的性質、とくに天然走化性プロセス中に、特に炎症または感染が存在する組織に向けた免疫系の細胞の吸引力によって、およびそれらの抗血管形成的性質によって、他のサイトカインから区別される。
【００４６】
ケモカインは、低分子量（８〜１０ｋｄ）を有するタンパク質で、小さく（７０〜８０アミノ酸）、これらアミノ酸配列は低ホモロジー比（ケモカインによって１０〜７０％と異なる）を有し、現在約５０の異なるケモカインが明らかにされている。それでも、これらケモカインは、それらが有するシステイン残基の位置によって四つの大ファミリーに分けられている。Ｎ−末端が単一アミノ酸によって分けられた二つのシステインからなるαファミリー（タイプＩＬ−８、ＮＡＰ−２、ＧＣＰ−２ケモカイン）およびＮ−末端が二つの隣接システインからなるβファミリー（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１、ＭＣＰ１タイプケモカイン）は最もよく特徴づけされている（Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci., 15, 159-165; Murphy, P.M., 1994, Annu. Rev. Immunol., 12, 593-633）。
【００４７】
本発明において、好ましいケモカインは、ケモカインタイプＭＩＰ１、特に、Wolpeら（1988, J. Exp. Med. 167, 570-581）によって性質を示されたケモカインＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１βからなる群から選択されるケモカインである。
【００４８】
ＭＩＰ１αは、それに関する核酸およびペプチド酸配列がObaruら（1986, J. Biochem., 99, 885-894）に記載されており、その内容は参照により本明細書の一部とされるが、Ｔリンパ球および単球によって産生される。それは、呼吸器管の感染中の好酸球およびＴリンパ球、慢性関節リウマチ、消化器系炎症、または細菌性髄膜炎中のＴリンパ球および好中球の走化性を可能にする。それはまた、造血性前駆体の増殖を阻害する。
【００４９】
ＭＩＰ１βは、それに関する核酸およびアミノ酸配列がBrownら（1989, J. Immunol., 142, 679-68）に記載されており、その内容は参照により本明細書の一部とされるが、これもまた、Ｔリンパ球および単球によって産生される。それは、骨関節炎および細菌性髄膜炎の症例において単球および好中球に対して走化的性質を発揮する。ＭＩＰ１αと同様に、それは造血性前駆体の増殖を阻害する。
【００５０】
当業者に公知の前記ＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１βタンパク質の天然変異体があり、例えば、ＭＩＰ１αに関してはＧＯＳ１９、ＬＤ７８、ｐＡＴ４６４、ＴＹ５（マウス）またはＳＩＳａ（マウス）と称するものがあり、ＭＩＰ１βに関してはｐＡＴ７４４、Ａｃｔ−２、Ｇ−２６ｎ、  Ｈ−４００（マウス）またはｈＳＩＳｇ（マウス）がある。ＭＩＰ１βの特定の場合は、例えば、Ａｃｔ−２（Lipes et al., 1988, PNAS, 85, 9704-9708）に対応する配列を選択してもよく、その内容は参照により本明細書の一部とされる。
【００５１】
本発明の他の変形によれば、少なくとも細胞傷害活性を有する物質は、「自殺遺伝子」と称される遺伝子によってコードされるポリペプチドである。いくつかの研究によって、それ自体は毒性ではないが、例えばヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体のような非活性物質（プレドラッグ、前駆体）を、例えば伸長中のDNAまたはRNA鎖中に組み入れ得るように修飾されたヌクレオシドのような、細胞に高度に毒性の物質に変換することができ、特に結果として細胞分裂阻害や細胞機能不全をもたらしてそのようなポリペプチドを含む細胞を死に到らし得るような触媒酵素的性質を有するポリペプチドが同定されている。そのようなポリペプチドをコードする遺伝子は「自殺遺伝子」と称される。多くの自殺遺伝子／プレドラッグの対が現在利用可能である。例えば、次のような対がある。
−  単純疱疹ウイルスタイプ１チミジンキナーゼ（ＴＫ−ＨＳＶ−１）とアシクロビルまたはガンシクロビル（ＧＣＶ）（Caruso et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-7028; Culver et al., 1992, Science 256, 1550-1552; Ram et al., 1997, Nat. Med., 3, 1354-1361）、
−  ラットチトクロムp450とシクロホスファミド（Wei et al., 1994, Human Gene Therapy 5, 969-978）、
−  Escherichia coli (E. coli、大腸菌）のプリンヌクレオシドホスホリラーゼと６−メチルプリンデオキシリボヌクレオシド（Sorscher et al., 1994, Gene Therapy 1, 233-238）、
−  E. coliのグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼと６−チオキサンチン（Mzoz et Moolten, 1993, Human Gene Therapy 4, 589-595）、および
−  シトシンデアミナーゼ（ＣＤａｓｅ）と５−フルオロシトシン（５ＦＣ）。
【００５２】
有利な具体例によれば、本発明は、少なくとも細胞傷害活性を有する前記物質が、チミジンキナーゼ活性、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性、グアニンまたはウラシルまたはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性およびシトシンデアミナーゼ活性から選択される少なくとも１種の酵素活性を有する具体例に関する。
【００５３】
より詳細には、ＣＤａｓｅはピリミジンの代謝経路において作用する酵素であって、それにより、ウラシル中の加水分解的脱アミノによって外因性シトシンが変換される。ＣＤａｓｅ活性は、原核生物および下等真核生物において示された（Jund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615; Beck et al., 1972, J. Bacteriol. 110, 219-228; De Haan et al., 1972, Antonie van Leeuwenhoek 38, 257-263; Hoeprich et al., 1974, J. Inf. Dis. 130, 112-118; Esders and Lynn, 1985, J. Biol. Chem. 260, 3915-3922）が、これらは哺乳動物には存在しない（Koechlin et al., 1966, Biochem Pharmacol. 15, 435-446; Polak et al., 1976, Chemotherapy 22, 137-153）。サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）のＦＣＹ１遺伝子および大腸菌（E. coli）のＣｏｄＡはこれら二つの生物のＣＤａｓｅをそれぞれコードするが、これらは公知であり、これらの配列は公開されている（EP 402 108; Erbs et al., 1997, Curr. Genet. 31, 1-6; WO93/01281）。ＣＤａｓｅはまた、それが５−フルオロ−ＵＭＰ（５−ＦＵＭＰ）に変換された時にとくに高度に細胞傷害性となる化合物５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）中のシトシンの類似体５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を脱アミンする。この酵素をコードする遺伝子の不活化突然変異またはこの酵素の自然的欠損のいずれかの理由でＣＤａｓｅ活性を有しない細胞（例えば哺乳動物細胞）は、５−ＦＣに抵抗性である（Jund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615；Kilstrup et al., 1989, J. Bacteriol., 171, 2124-2127）。一方、ＣＤａｓｅ活性をコードする配列が転移された哺乳動物細胞における５−ＦＣへの感受性（Huber et al., 1993, Cancer Res. 53, 4619-4626; Mullen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 33-37; WO 93/01281）は、伝達できることが示された。さらに、この場合、変換されないバイスタンダー細胞もまた、５−ＦＣに感受性となる（Huber et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8302-8306）。このバイスタンダー効果と称される現象は、ＣＤａｓｅ活性を発現する細胞による、細胞膜を介する単純拡散によってバイスタンダー細胞を毒する５−ＦＵの排泄によるものである。５−ＦＵのこの能動的拡散の性質は、バイスタンダー効果がｔｋを発現する細胞との接触を要求するｔｋ／ＧＣＶ参照系よりも、有利である（Mesnil et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1831-1835）。したがって、この効果は、遺伝子療法、特に抗癌療法のためのＣＤａｓｅの使用においてさらなる利点となる。
【００５４】
しかしながら、５−ＦＣへの感受性は細胞系によって著しく異なる。例えば、低感受性は、大腸菌（E. coli）のｃｏｄＡ遺伝子を発現するレトロウイルスによって変換されたヒト腫瘍系ＰＡＮＣ−１（膵臓の癌腫）およびＳＫ−ＢＲ−３（乳房の腺癌）において観察される（Harris et al., 1994, Gene Therapy 1, 170-175）。この望ましくない現象は、ＣＤａｓｅの酵素作用によって形成される５−ＦＵの細胞傷害性５−ＦＵＭＰへの内因性変換の欠乏または低さによって説明できた。このステップは、通常、オロテートホスホリボシル転移酵素（Peters et al., 1991, Cancer 68, 1903-1909）によって哺乳動物において進行するが、いくつかの腫瘍では認められず、かくしてＣＤａｓｅに基づく遺伝子療法が効果を表さない。下等原核生物および真核生物において、ウラシルはウラシルホスホリボシル転移酵素によってＵＭＰに変換される（したがってＵＰＲＴａｓｅ活性を表す）。この酵素はまた、５−ＦＵを５−ＦＵＭＰに変換する。したがって、酵母サッカロミセス・セレビシエのｆｕｒ１突然変異体は、ＵＰＲＴａｓｅ活性が存在しないときはＣＤａｓｅによる５−ＦＣの脱アミンに由来する５−ＦＵは細胞傷害性５−ＦＵＭＰに変換されないことから、高濃度の５−ＦＵ（１０ｍＭ）および５−ＦＣ（１０ｍＭ）に対して抵抗性である（Jund and Lacroute, 1970, J. Bacteriol. 102, 607-615）。大腸菌（E. coli）およびサッカロミセス・セレビシエのＵＰＲＴａｓｅをそれぞれコードするｕｐｐおよびＦＵＲ１遺伝子は、クローニングされ、配列決定されている（Andersen et al., 1992, Eur. J. Biochem. 204, 51-56; Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157）。
【００５５】
本発明の一つの実施態様によれば、少なくとも細胞傷害活性を有する物質はＵＰＲＴａｓｅ活性を有し、これは該ポリペプチドがウラシルまたはその誘導体の一つを一燐酸類似体、特に５−ＦＵを５−ＦＵＭＰに変換することができることを意味する。
【００５６】
本発明におけるＵＰＲＴａｓｅは、とくに原核生物、真菌類または酵母などいかなる起源のものでもよい。例えば、本発明において使用できる核酸配列は、それぞれ大腸菌（E. coli）（Anderson et al., 1992, Eur. J. Biochem 204, 51-56）、Lactococcus lactis（Martinussen and Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-6463）、Mycobacterium bovis（Kim et al., Biochem Mol. Biol. Int 41, 1117-1124）およびBacillus subtilis（Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 271-274）のＵＰＲＴａｓｅをコードするものであり得る。しかし、とくに、酵母ＵＰＲＴａｓｅ、特にサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）のＦＵＲ１遺伝子によってコードされるものの使用が好ましく、Kernら（1990, Gene 88, 149-157）によって明らかにされたその配列は、参照により本明細書の一部とされる。指針として、遺伝子の配列および対応するＵＰＲＴａｓｅの配列は文献および専門データバンク（SWISSPROT、EMBL、Genbank、Medlineなど）中に見出すことができる。
【００５７】
さらに、出願ＷＯ９９５４４８１には、Ｎ末端位置の最初の３５残基から削除されて天然タンパク質の３６位のメチオニンで始まるＵＰＲＴａｓｅの合成を可能にするコード部の５’の１０５個のヌクレオチドを欠くＦＵＲ１遺伝子が記載されている。ＦＵＲ１Ｄ１０５と称される突然変異遺伝子の発現産物は、サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）のｆｕｒ１突然変異体を補足することができる。一方、末端を切った変異体は天然酵素よりも高いＵＰＲＴａｓｅ活性を有する。したがって、とくに有利な一実施態様によれば、本発明によってコードされるポリペプチドは天然ＵＰＲＴａｓｅの欠失変異体である。欠失は、好ましくはオリジナルのＵＰＲＴａｓｅのＮ末端領域に位置する。それは全部（該Ｎ末端領域の全残基に係る）または一部（主構造における連続または非連続の一つまたはいくつかの残基に係る）である。一般に、ポリペプチドはＮ末端、中央およびＣ末端部分からなり、それぞれ分子のほぼ３分の１に相当する。例えば、２５１個のアミノ酸を有するサッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）のＵＰＲＴａｓｅは、そのＮ末端部は天然型の最初の位置にあるいわゆる開始メチオニンで始まる最初の８３残基からなる。大腸菌（E. coli）のＵＰＲＴａｓｅについては、そのＮ末端部は１から６９位までをいう。
【００５８】
さらに、特許出願ＷＯ９６／１６１８３およびＷＯ９９５５４４８１には、ＣＤａｓｅおよびＵＰＲＴａｓｅ活性を有する二つのドメインを有する酵素をコードする融合タンパク質の使用が記載され、発現プラスミドによって運ばれるハイブリッド遺伝子ｃｏｄＡ：：ｕｐｐまたはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１またはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１Δ１０５の転移はトランスフェクトされたＢ１６細胞の５−ＦＣへの感受性を増すことを示している。これら二つの出願に記載されたタンパク質および核酸配列は、本明細書の一部とされる。この実施態様によれば、ポリペプチドは少なくとも一つの第二ポリペプチドと同じ読み枠内で融合されたポリペプチドである。融合は第一ポリペプチド上のいかなる位置でも起き得るが、Ｎ末端またはＣ末端、とくにＮ末端が好ましい。ＣＤａｓｅおよびＵＰＲＴａｓｅ活性の融合は、標的細胞の５−ＦＣおよび５−ＦＵへの感受性の向上の手段を提供する。
【００５９】
当業者は、ＣＤａｓｅまたはＵＰＲＴａｓｅ配列を公表されたデータからクローニングすることができ、必要であれば変異体を作出することができ、変異型の酵素活性を最新の方法または出願ＷＯ９９５４４８１に示されたプロトコールに従って非細胞または細胞系において試験することができ、ＣＤａｓｅおよびＵＰＲＴａｓｅ活性ポリペプチドを、特に同じ読み枠内で、結果として対応する遺伝子の全部またはいくつかを融合させることができる。特許出願ＷＯ９６／１６１８３およびＷＯ９９５４４８１に記載のハイブリッドポリペプチドは、参照により本明細書の一部とされる。
【００６０】
他の変形によれば、少なくとも細胞傷害活性を有する物質は、抗血管形成性タンパク質因子である。血管形成は、現存する血管網からの新毛細血管形成にとって重要なプロセスである。この複雑なプロセスは、健康な組織では多くの血管形成および抗血管形成因子の影響のバランスによって細かに調節される。しかしながら、このプロセスはいくつかの病態、とくに腫瘍の形成において調節が損なわれ、血管形成因子が抗血管形成因子よりも強くなり、結果として腫瘍の広範の脈管化およびその急速成長および／または転移出現が可能となる。これが、本発明において、抗血管形成因子が細胞傷害性作用剤、とくに抗腫瘍剤として考慮される理由である。現在知られている種々の抗血管形成因子には、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子４（ＰＦ４）、トロンボスポンジン−１、ＰＲＰ（プロリフェリン関連タンパク質）、ＶＥＧＩ（血管内皮細胞増殖阻害剤）、メタロプロテアーゼおよびウロキナーゼが含まれる。
【００６１】
本発明の他の変形によれば、少なくとも細胞傷害活性を有する物質は、細胞性アポトーシスを活性化する活性を表すポリペプチド、特にタンパク質ｐ５３とすることができる。ｐ５３は、特に細胞サイクルに関与するタンパク質の発現の抑制に関与する核リンタンパク質（Ozbun et al., 1995, Adv. Cancer Res. 66, 71-141; Selter et al., 1994, Int. J. Biochem. 26, 145-154）であり、ゲノムおよび細胞性アポトーシスの安定性に関連する多数の細胞性プロセスに関係する（Harris et al, 1996, J. Natl. Cancer Inst. 88, 1442-1445; Kastan et al, 1991, Cancer Res. 51, 6304-6311; Kuerbitz et al., 1992, PNAS, 89, 7491-7495）。ｐ５３遺伝子は、同定されて配列決定されている。ｃＤＮＡ配列は、Matlashewskiら（1984, EMBO J., 3, 3257-3262）に記載されており、タンパク質配列は、Lamp（1986, Mol. Cell Biol., 6, 1379-1385）に記載されている。同様に、ｐ５３機能に影響することなくいくつかのアミノ酸が他のもので置換されている天然の機能性多型性変異体が確認されている。さらに、多数の突然変異が、結果としてこのタンパク質の機能を喪失させる癌に関する文献に記されている（Holstein et al., 1991, Science, 253, 49-53; Levine et al., 1991, Nature, 351, 453-456）。例えば、Bakerら（1989, Science, 244, 217）は、このｐ５３遺伝子の機能は結腸直腸腫瘍の７０％以上で欠失していることを観察している。本発明の状況では、ｐ５３ポリペプチドをコードする全核酸配列を使用するか、またはｐ５３機能が保持されるとすればこのポリペプチドの一部のみまたは派生または突然変異したポリペプチドを用いることができる。このタイプの配列は当業者に周知であり、例えばMatlashewskiら（1984, EMBO J., 3, 3227-3262）、Privesら（1994, Cell, 78, 543-546）またはChenら（1996, Gene and Deve, 10, 2438-2451）を参照することができ、その内容は本明細書の一部とされる。転写トランスアクチベーター（Farmer et al., 1992, Nature, 358, 83-86）または他のタンパク質との相互作用が可能なポリペプチド（Harris, 1996, Carcinogenesis, 17, 1187-1198）としてｐ５３ポリペプチドの性質を考えると、ｐ５３活性はＧ１／ＳおよびＧ２／Ｍ相における細胞サイクルの停止、アポトーシスの誘発、発癌遺伝子によって起きる細胞形質変換抑制または血管形成阻害の分析によって測定することができる。
【００６２】
本発明の一つの具体的な実施態様によれば、前記組み合わせ物はまた、少なくとも細胞傷害活性を有する物質によって細胞傷害性分子に変換され得るプロドラッグの医薬上許容される量を含んでなる。特に、この型のプロドラッグは、アシクロビルまたはガンシクロビル（ＧＣＶ）、シクロホスファミド、６−メチルプリンデオキシリボヌクレオシド、６−チオキサンチン、シトシンもしくはその誘導体の一つまたはウラシルもしくはその誘導体の一つからなる群から選択される。さらに、該プロドラッグが５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）である場合、該組み合わせ物はまた５−ＦＵの細胞傷害性効果を増強する物質の一つまたはいくつかを含んでもよい。具体的には、ノボピリミジン生合成法の酵素を阻害するドラッグ（例えば、下記のものを参照されたい）、複製に必要なｄＴＭＰのプールの低減を引き起こすチミジレート合成の阻害を５−ＦＵ代謝産物（５−ＦｄＵＭＰ）の存在下で増すロイコボリン（Waxman et al., 1982, Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18, 685-692）のようなドラッグ、そして最後にジヒドロ葉酸レダクターゼを阻害してＲＲＰＰ（ホルホリボシルピロリン酸）の取り込みプールを増加して細胞ＲＮＡ中の５−ＦＵを増すメトトレキサートのようなドラッグ（Cadman et al., 1979, Science 250, 1135-1137）がある。
【００６３】
「核酸」とは、二本鎖または一本鎖、線状または環状、天然分離または合成されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡの断片を意味し、サイズに限定されずに核酸の断片または領域を定義するために使用される修飾または非修飾ヌクレオチドの正確な配列を表すものである。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明による核酸はベクターである。好ましくは、本発明によれば、「核酸」はプラスミドまたはウイルス起源の組換えベクターを表す。本発明において使用できるプラスミドは多くのものから選択できる。これにはクローニングおよび／または発現ベクターを含んでもよい。一般に、当業者に公知で、多くは市販されていて入手可能であるが、遺伝子操作技術を用いて作出または修飾することもできる。例えば、pBR322（Gibco BRL)、pUC（Gibco BRL)、pBluescript（Stratagene）、pREP4、pCEP4（Invitrogene)またはpPoly（Lathe et al., 1987, Gene 57, 793-201）に由来するプラスミドがある。好ましくは、本発明において使用されるプラスミドは、産生細胞および／または宿主細胞における複製を開始する複製開始点を含む（例えば、開始点ColE1はE. coli中で産生されるプラスミドについて用いられ、oriP／EBNA1系は哺乳動物宿主細胞において自己複製的であることが要求される場合に使用される（Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates et al., Nature 313, 812-815））。それはまた、トランスフェクトされた細胞を選択または同定するための選択遺伝子を含んでもよい（例えば、栄養要求性突然変異の相補物、抗生物質に対する抵抗性をコードする遺伝子）。もちろん、任意の細胞における持続性および／または安定性を向上させる補足因子（モノマー型におけるプラスミドの持続を促進するcer配列）（Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103）、インテグレーション配列および細胞ゲノムを含んでもよい。
【００６５】
ウイルスベクターとして考えられるものとしては、ポックスウイルス (例えば、ワクチンウイルス、とくにＭＶＡ、カナリポックスウイルス)、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、フォーミーウイルス、またはアデノ随伴ウイルス由来のものが挙げられる。好ましくは、非複製および非取り込み性ベクターが用いられる。この点において、アデノウイルスベクターが本発明の実施に完全に適している。しかしながら、本発明の実施を考慮した場合、ベクターの性質はあまり重要ではないことに留意されたい。
【００６６】
レトロウイルスは、その多くが分裂中の細胞に感染して取り込まれる性質を有し、この点で癌への適用に特に適切である。本発明による組換えレトロウイルスは、一般に、ＬＴＲ配列、パッケージング領域、およびレトロウイルスＬＴＲもしくは後述するような内部プロモーターの制御下に置かれた本発明によるヌクレオチド配列を含む。それはいかなる起源（ネズミ、霊長類、ネコ科動物、ヒトなど）からのレトロウイルスに由来するものでもよく、特にＭｏＭｕｌＶ（Moloneyネズミ白血病ウイルス）、ＭＶＳ（ネズミ肉腫ウイルス）またはFriendネズミレトロウイルス（Ｆｂ２９）が挙げられる。それは、ウイルス粒子の構成に必要なｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはｅｎｖウイルスポリペプチドを供給できるパッケージング系において、in transで増殖される。この型の細胞系は文献中に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ ＣＲＩＰ ＧＰ＋Ａｍ−１２など）。本発明によるレトロウイルスベクターは、修飾、特にＬＴＲにおける修飾（真核生物プロモーターによるプロモーター領域の置換）またはパッケージング領域における修飾（例えばＶＬ３０型などの異種パッケージング領域による置換）などを含むことができる（出願ＷＯ９６０１３２４およびＦＲ２７６２６２５を参照されたい）。
【００６７】
不完全アデノウイルスベクター、すなわちＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＬ１−Ｌ５領域の中から選択される複製のために必須の少なくとも一つの領域の全部または一部を欠くようなものもまた、複製のために使用し得る。Ｅ１領域の欠失が好ましい。しかしながら、それは、目的のウイルス粒子の産生を確実にするために不完全必須機能が相補系および／または補助ウイルスの手段によってin transで補われるのであれば、特にＥ２、Ｅ４および／またはＬ１−Ｌ５領域の全部または一部に影響を及ぼす他の修飾／欠失と組み合わせてもよい。これに関して、例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１５２およびＷＯ９７／０４１１９に記載されているような従来技術によるベクターを使用することができる。具体例として、Ｅ１領域の主要部および転写ユニットＥ４の欠失は特に有利である。クローン化能力の増強のため、アデノウイルスベクターはまた、非必須のＥ３領域の全部または一部を更に欠失させてもよい。別の代替法によれば、パッケージングのために必須な配列、すなわちＩＴＲ（逆向き末端反復）、５’および３’ならびにパッケージング領域のみを保持する最小のアデノウイルスベクターを使用することができる。さらに、本発明によるアデノウイルスベクターの起源は、種および血清型の双方の点で異なっていてもよい。それは、ヒトまたは動物（例えば、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、サル）起源のアデノウイルスのゲノム、または少なくとも二つの異なる起源からのアデノウイルスゲノムの断片からなるハイブリッドに由来するものとすることができる。より詳細には、イヌ起源のＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２アデノウイルス、トリ起源のＤＡＶおよびウシ起源のタイプ３Ｂａｄは特記に値する（Zakharchuk et al., Arch．Virol.，1993，128:171-176; Spibey and Cavanagh，J．Gen．Virol., 1989，70:165-172; Jouvenne et al.，Gene，1987, 60:21-28; Mittal et al., J. Gen. Virol.，1995，76:93-102)。しかしながら、好ましくは、ヒト起源のアデノウイルスベクター、好ましくは血清型Ｃアデノウイルス、特にタイプ２または５由来のものが用いられる。本発明によるアデノウイルスベクターは、大腸菌（E. coli）においてインビトロでのライゲーションまたは相同組換えによって（例えば、国際出願ＷＯ９６／１７０７０を参照されたい）、または相補系における組換えによって産生される。異なるアデノウイルスベクターおよびそれらの調製方法は公知である（例えば、Graham and Prevect, 1991, in Methods in Molecular Biology, Vol 7, p109-128; Ed: E.J. Murey, The Human Press Incを参照されたい)。
【００６８】
核酸が、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリペプチドをコードする少なくとも１種の配列を含んでなる場合、該核酸はまた、標的細胞への転移後の該配列の発現を確実にするために必要な因子、特に該細胞において有能なプロモーター配列および／または調節配列、ならびに、できれば該ペプチドの分泌または標的細胞の表面での発現を可能にするために必要な配列を含んでなることは言及されるべきである。発現に必要な因子には、ヌクレオチド配列のＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を可能にする因子の全て、特に該細胞において有能なプロモーター配列および／または調節配列、ならびに、できれば該ペプチドの分泌または標的細胞の表面での発現を可能にするために必要な配列が含まれる。これらの因子は、調節可能なものまたは構成的なものとすることができる。もちろん、プロモーターは、選択されたベクターおよび宿主細胞に適したものとされる。例えば、言及に値するものとして、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）遺伝子の真核生物プロモーター、ＭＴ（メタロチオネイン；Mc Ivor et al., 1987，Mol．Cell Biol., 7，838-848)、α−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、筋肉クレアチンキナーゼ、アクチン、肺サーファクタント、免疫グロブリン、β−アクチンをコードする遺伝子プロモーター(Tabin et al., 1982, Mol．Cell Biol., 2，426-436）、ＳＲα（Takebe et al.，1988, Mol．Cell. Biol．8，466-472）、ＳＶ４０ウイルス（シミアンウイルス）、ＬＴＲまたはＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）の初期遺伝子プロモーター、ＭＰＳＶプロモーター、ＴＫ−ＨＳＶ−１プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）の初期遺伝子プロモーター、ワクチンｐ７．５Ｋ  ｐＨ５Ｒ、ｐＫ１Ｌ、ｐ２８、ｐ１１のウイルスのプロモーター、ならびにアデノウイルスプロモーターＥ１ＡおよびＭＬＰ、またはこれらプロモーターの組合せが挙げられる。それはまた、腫瘍細胞における遺伝子の発現を刺激するプロモーターであってもよい。例えば、特記されるプロモーターとして、乳癌および前立腺癌で過剰発現されるＭＵＣ−１遺伝子 (Chen et al.，1995，Ｊ．Clin．Invest．96，2775-2782)、結腸癌で過剰発現されるＣＥＡ（癌胚芽抗原) (Schrewe et al.，1990，Mol．Cell．Biol．10, 2738-2748)、黒色腫で過剰発現されるチロシン血症（Vile et al.，1993, Cacer Res. 53, 3860-3864)、乳癌および膵臓癌で過剰発現されるＥＲＢ−２（Harris et al.，1994，Gene Therapy 1，170-175）、および肝臓癌で過剰発現されるα−フェトプロテイン (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465) のそれぞれのプロモーターが挙げられる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期遺伝子プロモーターは特に好ましい。特に治療対象の腫瘍が特別な細胞型に由来するか、あるいは一定条件下で活性化できる場合には、組織特異性プロモーター領域を使用することもまた可能である。文献により、この型のプロモーター配列に関する多くの情報が提供されている。同様に、転写を損なわずに翻訳ステップの前にスプライスされる「ニュートラル」核酸配列、すなわちイントロンは、この型の核酸構築に導入され得る。この型の配列およびそれらの使用は文献（ＷＯ９４／２９４７１）に記載されている。前記核酸はまた、細胞内輸送、複製および／または取り込み、分泌、転写または翻訳に必要な配列を含���でもよい。この型の配列は、当業者に周知である。さらに、本発明において使用できる核酸は、標的細胞ゲノムへの取り込みが不可能になるように修飾された核酸、またはトランスフェクションの有効性にそれ自体影響を及ぼさないスペルミンのような薬剤を用いて安定化された核酸でもよい。
【００６９】
本発明の好ましい一つの変形によれば、本発明による組み合わせ物は、ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質をコードする少なくとも１種の配列および少なくとも細胞傷害活性を有する物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる少なくとも１種の核酸を含んでなる。
【００７０】
本発明において、それら物質の機能および性質が保持されるのであれば、ＣＳＦ−１活性を阻害しうる物質または少なくとも細胞傷害活性を有する物質または誘導もしくは突然変異した物質をコードする核酸配列の全部または一部のみを用いることが可能である。本発明の目的において、突然変異とは、一つまたはいくつかのヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加を意味する。同様に、ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質または少なくとも細胞傷害活性を有する物質をコードする配列と、他の型のポリペプチド（例えば、膜アンカー、分泌）をコードする配列との融合によって得られるハイブリッドポリペプチドをコードする配列を使用することも可能である。
【００７１】
本発明による核酸およびオリゴヌクレオチドは、有利には、核酸と結合する少なくとも１種の物質と結合していてもよい。
【００７２】
「核酸と結合する物質」とは、ベクターおよび／またはオリゴヌクレオチド、特にプラスミド起源のベクターのトランスフェクション効率および／または安定性、および／または宿主生物の免疫系に関してインビボでの該ベクターまたは該オリゴヌクレオチドの保護を特に向上させ得る物質、またはいくつかの物質の組合せを意味する（Rolland A., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier System, 15, (1998), 143-198）。これらの物質は、静電気的、疎水性、カチオン性、共有的相互作用、または好ましくは非共有的相互作用によって核酸と結合することができる。これらの型の物質は、当業者がアクセスできる文献に広範に開示されている（例えば、Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342; Remy et al., 1994,  Bioconjugate Chemistry 5, 647-654を参照されたい）。実例として、カチオンポリマー、カチオン脂質、さらにリポソーム、核もしくはウイルスタンパク質、または中性、双極性もしくは負に負荷された脂質が挙げられるが、これらに限定されない。これらの物質は、単独で、または組み合わせて使用することができる。そのような構成分の例、ならびに任意のベクターのトランスフェクション効率および／または安定性を向上させるそれらの能力を測定する方法は、特に特許出願ＷＯ９８／０８４８９、ＷＯ９８／１７６９３、ＷＯ９８／３４９１０、ＷＯ９８／３７９１６、ＷＯ９８／５３８５３、ＥＰ８９０３６２およびＷＯ９９／０５１８３に記載されている。特に、それはＤＯＴＭＡ（Felgner et al., 1987, PNAS, 84, 7413-7417）、ＤＯＧＳまたはTransfectamTM（Behr et al., 1989, PNAS, 86, 6982-6986）、ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ（Felgner et al., 1993, Methods, 5, 67-75）、ＤＣ−ＣＨＯＬ（Gao and Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285）、ＤＯＴＡＰＴＭ（McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-622）、またはLipofectamineTMなどの脂質物質からなるものであってもよい。
【００７３】
有利には、これらカチオン脂質は、次のような式を有するカチオン脂質（ＥＰ  ９０１  ４６３を参照されたい）から選択される：
【化１】
2005525314.tif 000002
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２は、同一でも異なってもよく、直鎖または分枝鎖のＣ６−Ｃ２３アルキルもしくはＣ６−Ｃ２３アルケニル、または直鎖または分枝鎖のＣ６−Ｃ２３アルキルカルボニルもしくはＣ６−Ｃ２３アルケニルカルボニルであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）または−ＮＲ３であり、Ｒ３は水素原子またはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
ｎは、１〜６の正の整数であり、
ｍは、１〜６の正の整数であり、ｎ＞１の場合、ｍは同一分子内で異なっていてもよい〕。
【００７４】
核酸と結合する物質はまた、カチオンポリマーであってもよく、例えば、ポリアミドアミン（Haensler and Szoka, Bioconjugate Chem. 4 (1993), 372-379）、デンドリマーポリマー（ＷＯ９５／２４２２１）、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５）、チトサン、ポリリジンなどのポリ（アミノ酸）（ＵＳ５５９５８９７またはＦＲ２７１９３１６）；ポリクオタナリー化合物；プロタミン；ポリイミン；ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５）；ポリビニルアミン；プルランやセルロースのようなＤＥＡＥで置換されたポリカチオンポリマー；ポリビニルピリジン；ポリメタクリレート；ポリアクリレート；ポリオキセタン；ポリチオジエチルアミノメチルエチレン（Ｐ（ＴＤＡＥ））；ポリヒスチジン；ポリオルニチン；ポリ−ｐ−アミノスチレン；ポリオキセタン；コポリメタクリレート（例えばＨＰＭＡコポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド）；ＵＳ−Ａ−３９１０８６２に記載の化合物、メタクリレート、デキストラン、アクリルアミド、ポリイミン、アルブミン、１−ジメチルアミノメチルメタクリレートおよびポリビニルピロリドンメチルアクリルアミノプロピルトリメチルの塩化アンモニウムとＤＥＡＥのポリビニルピロリド複合体；ポリアミドアミン；テロメア化合物（特許出願ＥＰ０９６５５８３）などがある。それでも、このリストは完全ではなく他の公知のカチオンポリマーを使用して本発明の核酸複合体を得ることができる。さらに、これらカチオン脂質およびポリマーはフッ素処理されてもよい（例えば、ＷＯ９８／３４９１０を参照されたい）。
【００７５】
核酸と結合する物質はまた、中性、双極性または負に荷電した脂質でもよい。これらの中性、双極性または負に荷電した脂質は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、セラミドまたはセレブロシドなどの動物または植物起源の天然リン脂質およびそれらの類似体；排他的にではないが通常は二つの同一の脂肪酸鎖からなるジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルグリセロールなどの合成リン脂質およびそれらの類似体；ホスファチジルコリン、カルジオリピン、ホスファチジルエタノールアミン、モノ−、ジ−、またはトリアシルグリセロールおよびアルファ-トコフェロールおよびそれらの類似体；ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル酸または同様なリン脂質の類似体；コレステロール、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、プロスタグランジン、ガングリオシド、ニオゾーム、または他のいかなる天然または合成アンフィフィルからなる群から選択することができる。
【００７６】
さらに、本発明において使用されるオリゴヌクレオチドおよび核酸はまた、ある細胞型またはある特定の組織（腫瘍細胞、肺上皮細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞など）へ前記核酸配列の転移を方向づけることができるターゲティング因子を含んでもよい。これらはまた、核およびミトコンドリアのようなある好ましい細胞内区画へのオリゴヌクレオチドまたは核酸の転移を再方向づけすることができる。これらはまた、細胞内側への貫入またはエンドソームの溶解を促進する因子を利用したものとすることができる。この型のターゲティング因子は、文献に広く記載されている。例えば、それはレクチン、ペプチド、とくにＪＴＳ−１ペプチド（特許出願ＷＯ９４／４０９５８を参照されたい）、オリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体、膜受容体の特異的リガンド、抗リガンドと反応できるリガンド、融合誘導ペプチド、核局在化ペプチドの全てもしくは一部、またはそのような構成分の組合せであってもよい。特に、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質の受容体を標的にするために使用されるガラクトシル残基、増殖因子受容体、サイトカイン、レクチン、接着タンパク質受容体などの受容体と相互作用できるリガンドでもよく、またＦａｂフラグメントなどの抗体フラグメント、インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのサブユニットＨＡ−２に由来する融合誘導ペプチドＩＮＦ−７（Plank et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924）、ＳＶ４０ウイルスのＴ抗原に由来する核局在化シグナルまたはエプスタインバーウイルスのＥＢＮＡ−１タンパク質でもよい。
【００７７】
本発明はまた、ＣＳＦ−１の発現を阻害することができる本発明によるオリゴヌクレオチド、および／またはそのようなオリゴヌクレオチドをコードする配列を含んでなる核酸、ならびに医薬上許容されるベヒクルを含んでなることを特徴とする医薬組成物に関する。本発明はまた、上述の組み合わせ物および医薬上許容されるベヒクルを含んでなることを特徴とする医薬組成物に関する。この型の支持物は、好ましくは等張、低張またはわずかに高張であって、例えばスクロース溶液のように、比較的弱いイオン強度を有する。さらに、この型の支持物は、いかなる溶媒、または水性もしくは非発熱性滅菌水のような部分水性液を含んでもよい。また、製剤のｐＨは、インビボ使用での必要条件を満たすように調整され、緩衝化される。製剤はまた、可溶化剤、安定化剤および保存剤と同様に、希釈剤、添加剤または医薬上許容される賦形剤を含むことができる。注入投与用には、製剤を水性、非水性または等張溶液中で使用することが好ましい。それは、適当な希釈剤によって即座に再構成できる液体または乾燥型（粉末、凍結乾燥物など）で単一用量または複数用量として提供される。
【００７８】
本発明はまた、ＣＳＦ−１を発現する細胞を、本発明によるオリゴヌクレオチドおよび／またはそのようなオリゴヌクレオチドをコードする配列を含んでなる核酸と接触させることからなる、ＣＳＦ−１の発現を阻害する方法に関する。
【００７９】
本発明の他の目的は、ＣＳＦ−１の発現を阻害することができるオリゴヌクレオチドまたはそのようなオリゴヌクレオチドをコードする配列を含んでなる核酸を、ヒトまたは動物体の治療、特に癌治療を目的とする薬剤の製造に使用することである。
【００８０】
本発明はまた、ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質の、抗腫瘍療法の効果を向上させる薬剤の製造のための使用に関する。
【００８１】
最適投与量は、治療対象の個体もしくは疾患または投与方法、または宿主器官／組織などの種々のパラメーターによって異なる。例えば、オリゴヌクレオチド投与量は、０．６〜６．５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で異なる。
【００８２】
本発明の他の目的は、上述の組み合わせ物を、ヒトまたは動物体の治療、特に癌治療を目的とする薬剤の製造に使用することである。
【００８３】
本発明による組み合わせ物は、同時、連続または期間にわたる使用に供される。同時とは、共投与を意味する。この場合、構成物（ｉ）および(ii）は、投与前に混合していてもよく、あるいは宿主細胞または生物に同時に投与してもよい。これらはまた、本発明による組み合わせ物の成分のどちらを先に投与するかにかかわらず、連続的に、すなわち順次投与してもよい。最後に、期間にわたる投与法、すなわち一定または不規則な間隔で二つの成分の一方および／または他方を止めたり、再開始する間欠投与法が可能である。二成分の投与方法および経路は異なっていてもよいことに留意されたい。
【００８４】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質、および／またはＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質をコードする少なくとも１種の配列を含んでなる核酸は、少なくとも細胞傷害活性を有する物質が投与される時点で、宿主生物の血漿中のＣＳＦ−１濃度が３５０ｐｇ／ｍｌ以下になるようにあらかじめ投与される。
【００８５】
投与される組み合わせ物の量は、例えば、ＣＳＦ−１の活性を阻害しうる物質の性質、少なくとも細胞傷害活性を有する物質の性質、治療対象の個体もしくは疾患、または投与方法、または宿主器官／組織などの異なるパラメーターによって異なる。例えば、子宮頸部の癌の場合、少なくとも細胞傷害活性を有する物質の用量としては、ＣＤＤＰを単回で７５ｍｇ／ｋｇ／日および５日間で５００ｍｇ／ｋｇ／日が挙げられる。
【００８６】
本発明によれば、多くの投与方法が使用可能である。例えば、全身的、消化器内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、リンパ内、腹腔内、腫瘍内、鼻腔内、肺内または気管内投与法がある。これらの最後の三つの実施態様に関しては、エアロゾルまたは輸注によるものが有利である。好ましくは、本発明によるオリゴヌクレオチドまたは組み合わせ物は、リンパ内、腫瘍内または腫瘍周囲投与法によって、換言すれば、接近可能な腫瘍においてはその周囲または患部器官もしくは腫瘍につながるリンパ管もしくは神経節中に投与される。
【００８７】
本発明はまた、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む本発明による組み合わせ物を、遺伝子治療が必要な宿主生物または細胞に投与することを特徴とする、遺伝子療法による疾患の治療法に関する。
【００８８】
遺伝子療法によって疾患を治療する場合、使用されるベクターの性質によって、核酸はその投与型において次のように含まれるのが有利である。
−  ベクターがプラスミド起源である場合、０．０１〜１００ｍｇのＤＮＡ、好ましくは０．０５〜１０ｍｇ、理想的には０．５〜５ｍｇ；
−  ベクターがウイルス起源の場合、１０４〜１０１４ｐｆｕ（プラーク形成単位）、有利には１０５〜１０１３ｐｆｕ、好ましくは１０５〜１０１２ｐｆｕ。
【００８９】
この療法にＵＰＲＴａｓｅ活性を有する物質が用いられる場合、ＣＤａｓｅ活性を有する第二物質を投与することが有利であり得る。この場合、ＵＰＲＴａｓｅおよびＣＤａｓｅの投与は、同時または連続でよく、その投与順序は重要ではない。そのような実施態様によれば、この療法にはまた、医薬上許容される量のプレドラッグ、有利にはシトシンの類似体、特に５−ＦＣを宿主生物または細胞に投与するような追加の工程が含まれる。実例として、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量を用いることができる。このプレドラッグは、標準的手順であらかじめ、本発明による組み合わせ物と同時に、または後に投与することができる。経口投与が好ましい。単一用量のプレドラッグまたは複数回用量を充分に長期間投与して、宿主生物または細胞内の毒性代謝産物の産生を可能にすることができる。
【００９０】
可能な適応症には、乳癌、卵巣、子宮の癌（とくにパピローマウイルスによって引き起こされる癌）、前立腺、肺、膀胱、肝臓、結腸、膵臓、胃、食道、喉頭、中枢神経系および血液の癌（リンパ腫、白血病など）および骨の癌（肉腫）がある。
【００９１】
本発明の有利な実施態様によれば、本発明による使用または治療法は、手術（特に腫瘍の一部または完全切除による）または放射線療法による患者の以前またはその後の治療に関連する。この特別な場合、本発明による治療は、このような第二療法の前、同時または後に適用される。好ましくは、この治療は、第二療法の後で行なう。
【００９２】
同様に、オリゴヌクレオチドまたは核酸の細胞内転移の効率は、例えば、エレクトロポレーション処理（Vicat et al., 2000, Human Gene Therapy, 11, 909-916）および／または投与された血管の透過性を修飾するように設計された処理（ＷＯ９８／５８５４２）との組合せによって、または文献に記された他の方法のいずれかによって有利に促進される。
【実施例】
【００９３】
以下の実施例は、本発明の様々な目的を説明することを目的とするものであり、したがって本発明の制限を意図するものではない。
【００９４】
実施例１
オリゴヌクレオチド
本研究に使用された全オリゴヌクレオチド（配列番号２から配列番号５まで）はEurogentec（Serraing、ベルギー）によって合成され、クロマトグラフィーによって精製された。本研究に使用されたオリゴヌクレオチドの修飾には二つの種類がある。第一は、ホスホジエステル骨格のホスホロチオエートへの修飾である。第二は、塩基の化学的性質の修飾であり、ウリジン（Ｕ）は５−（１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン（pdU）で置換されて、シトシン（Ｃ）は５−（１−プロピニル）−２’−デオキシシチジン（pdC）によって置換される。塩基の置換割合はＣおよびＵの含量の５０％に制限されている。
【００９５】
それ自体を配列番号１にハイブリダイズするのに用いるオリゴヌクレオチドの能力は、インビトロで熱変性試験実験によって調べた。オリゴヌクレオチド／配列番号１複合体の形成は、１μｍのオリゴヌクレオチドおよび１μｍの配列番号１を含む溶液の２６０ｎｍでの吸光度を温度との相関で測定することによってモニターした。全実験は、５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭカコジレート緩衝液（ｐＨ７．０）中で行なった。
【００９６】
細胞培養およびオリゴヌクレオチドのトランスフェクション
ＮＳ２Ｔ２Ａ１系は、乳房手術によって得られ、ＳＶ４０によって形質変換されたヒト乳房由来の細胞系である（Ma et al., Int. J. Cancer, 1998, 78:112-119）。この系は、細胞増殖と直線的に相関してＣＳＦ−１を分泌する。
【００９７】
細胞を、５％のウマ血清を加えた培地Ｍ５（Gibco、フランス）中でMaら（Int. J. Cancer 1998, 78:112-119）に記載のようにして培養した。播種は、６ウェルプレートに５×１０５細胞／ｍｌ／ウェルの濃度で行なった。オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションは、細胞が対数増殖期にあって６０％〜８０％のコンフルエンスに達した、２４時間後に行なった。
【００９８】
オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションは、サイトフェクチンGS-3815（Glen Research、Sterling、VA）を用いて行なった。オリゴヌクレオチドおよびサイトフェクチンをｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Gibco、フランス）を入れたポリスチレンチューブ中で別々に希釈して、サイトフェクチンを希釈オリゴヌクレオチドの等量と混合した。混合物を室温で１５分間放置して、オリゴヌクレオチド／サイトフェクチン複合体を形成させた。最後に、Ｍ５培地を溶液に加えて、サイトフェクチン２．４μｇ／ｍｌおよびオリゴヌクレオチド２５０ｎＭの最終濃度を得た。トランスフェクションは全て、最終容量１ｍｌのＭ５培地中で行なった。オリゴヌクレオチド／サイトフェクチン複合体を細胞に２４時間接触させた。上記の全ステップは、滅菌条件下で行なった。
【００９９】
全実験は、オリゴヌクレオチドの各濃度で、それぞれ３回ずつ行なった。
【０１００】
ＣＳＦ−１の定量
ＮＳ２Ｔ２Ａ１細胞の培養培地中に分泌されたＣＳＦ−１の量は、供給元（R&D Systems, Europe Ltd、英国）によって記されたプロトコールに厳密に従ってトランスフェクション開始２４時間後にＥＬＩＳＡ試験によって測定した。結果は、非トランスフェクト細胞系によって発現されたＣＳＦ−１に対するトランスフェクト細胞によって発現されたＣＳＦ−１の百分率として表す。
【０１０１】
結果
得られた結果を、次の表でグループ分けする。
【表１】
2005525314.tif 000003
【０１０２】
これらの結果は、本発明によるオリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされた細胞は、該オリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされなかった細胞よりも少ないＣＳＦ−１を発現することを明確に示している。
【配列表】
2005525314000001.app
【国際調査報告】
2005525314.tif 000004
2005525314.tif 000005
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