(57)【要約】本発明は、核酸の切断および修飾のための新規な切断剤およびポリメラーゼを提供する。この切断剤およびポリメラーゼは、例えば、核酸配列および核酸配列における変化の検出および特徴付けのための用途を見い出す。いくつかの態様において、種々の酵素の5'ヌクレアーゼ活性が標的依存的な切断構造を切断するために使用され、それによって特異的核酸配列またはその特異的変化の存在を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を含む組成物であって、ここで酵素は異種機能性ドメインを含み、異種機能性ドメインは核酸切断アッセイ法において機能性の変化をもたらし、酵素は配列番号：
2005518223.tif 000527
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項２】
請求項1に記載の酵素をコードする核酸を含む組成物であって、ここで該核酸は配列番号：
2005518223.tif 000528
からなる群より選択される、組成物。
【請求項３】
請求項2に記載の核酸を含む発現ベクターを含む、組成物。
【請求項４】
請求項3に記載の発現ベクターを含む宿主細胞を含む、組成物。
【請求項５】
請求項1に記載の組成物を含むキット。
【請求項６】
少なくとも1種の核酸切断基質をさらに含む、請求項5に記載のキット。
【請求項７】
核酸切断基質にハイブリダイズ可能な少なくとも1種のRNAをさらに含む、請求項6に記載のキット。
【請求項８】
標識されたオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項5に記載のキット。
【請求項９】
侵襲性のオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項5に記載のキット。
【請求項１０】
核酸を切断するための方法であって、
a）i）請求項1に記載の酵素；および
ii）基質核酸を含む試料
を提供する工程；ならびに
b）該基質核酸を該酵素に曝露する工程、
を包含する方法。
【請求項１１】
基質核酸の酵素への曝露工程が少なくとも1種の切断産物を産生する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
c）切断産物を検出する工程をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
基質核酸を含む試料が細胞溶解物を含む、請求項10に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許出願番号第10/084,839号の一部継続出願である。この米国特許出願第10/084,839号は、米国出願番号第09/864,636号の一部継続出願であり、かつ米国出願番号09/864,426号の一部継続出願であり、これらの各々は、米国出願番号第09/577,304号および同第09/758,282号の一部継続出願であり、かつ米国出願番号第09/350,309号の一部継続出願である。米国出願番号第09/350,309号は、米国出願番号第08/756,386号、現在米国特許第5,985,557号の分割出願であり、かつまた同時係属の出願番号第09/381,212号の一部係属出願であり、この米国特許出願第09/381,212号は、PCT出願番号第US98/05809号の国内移行であり、これは、米国出願番号第08/823,516号（現在米国特許第5,994,069号）；米国出願番号第08/759,038号（現在米国特許第6,090,543号）；米国出願番号第08/756,386号（現在米国特許第5,985,557号）；米国出願番号第08/682,853号（現在米国特許第6,001,567号）；米国出願番号第08/599,491号（現在米国特許第5,846,717号）およびPCT出願US97/01072の優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、核酸、特にRNAの直接的検出、特徴付け、および定量のために設計された新規な酵素に関する。本発明は、標的RNA配列上で形成された特異的核酸切断構造を認識し、かつ部位特異的な様式で核酸切断構造を切断して、非標的切断産物を産生する酵素を提供する。本発明は、DNAおよびRNAの核酸の鎖を含む複合体のDNAメンバーを特異的に切断する改善された能力を有する酵素を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
分子医薬において、直接的かつ定量的なRNA検出のための単純かつ費用効果の高い方法は、RNAウイルスの分析および特異的遺伝子発現の測定を非常に容易にする。これらの両方の事柄は、現在、この分野において急を要する問題である。この必要性にも関わらず、本当に直接的である技術はほとんど出現していない。PCRに基づく検出アッセイ法は、増幅の前に逆転写酵素によるRNAからDNAへの転換を必要とし、これは、正確な定量を損ない得る変異を導入する。さらに、PCRおよび指数関数的な増幅に基づく他の方法（例えば、NASBA）は、相互汚染を避けるための骨の折れる封じ込め測定を必要とし、かつ、量の小さな差異（例えば、2〜3倍）を区別する困難さを有する。RNAを直接的に検査する他の試験は、時間のかかるオートラジオグラフィーの工程（例えば、RNase保護アッセイ法）または一晩の反応時間（例えば、分枝DNAアッセイ法）を含む、種々の欠点に悩まされている。米国において毎年行われている150万を超えるウイルス負荷測定では、RNAの定量的測定のための高価でない、迅速な、高処理能力の系についての莫大な潜在性が明確に存在する。
【０００４】
mRNAの、直接的、定量的検出は、多数の異なる遺伝子の発現をモニターするために重要である。特に、サイトカイン発現（例えば、インターロイキンおよびリンホカイン）のレベルは、広範な種々の疾患の進行（Van Deurenら、J. Int. Fed. Clin. Chem., 5: 216 [1993], Van Deurenら、J. Inf. Dis., 169: 157 [1994], Perenboomら、Eur. J. Clin. Invest, 26: 159 [1996], Guidottiら、Immunity 4: 25 [1996]）ならびに、移植レシピエントのモニタリング（Grantら、Transplantation 62: 910 [1996]）における免疫応答の臨床的測定として利用されてきた。さらに、ウイルス負荷のモニタリングおよびウイルス遺伝子型の同定は、HIVまたはC型肝炎ウイルス（HCV）のような病原体によるウイルス感染に苦しむ個体にとって大きな臨床的意義を有する。ウイルス負荷（すなわち、血流中のウイルス粒子の絶対数）とAIDSへの進行に対する時間との間には高い相関が存在する（Mellorら、Science 272: 1167 [1996], Saagら、Nature Medicine 2: 625 [1996]）。上記の理由のために、ウイルス負荷は、核酸に基づく定量的試験によて測定されるように、HIVポジティブ患者の処置の効力および臨床的状態を評価するための標準的なモニタリング手順となっている。感染の間の可能な限り初期にウイルス負荷を減少させること、および規則的な基準上のウイルスレベルを評価することが必須であると考えられている。HCVの場合において、ウイルス遺伝子型が大きな臨床的意義を有し、これは、肝臓疾患の重篤度およびインターフェロン治療に対する応答性への相関を有する。さらに、HCVは培養中で増殖できないので、新規な抗ウイルス治療が評価され得るのは、ウイルス遺伝子型のような特性と臨床的結果との間の相関を確立することによってのみである。
【０００５】
上記に言及した方法が低処理能力の研究的適用、または限定された臨床的適用のためには実用的であったのに対して、いかなる遺伝子系にも容易に適用可能なRNAの大スケールの定量的分析がより革新的なアプローチを必要とすることは明らかである。理想的な直接的検出方法は、直接的検出アッセイ法の利点（例えば、容易な定量および最小のキャリーオーバー汚染のリスク）を二重オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ法によって提供される特異性とを組み合わせる。
【０００６】
上記に記載した多くの方法は、標的分子を他の核酸と区別するためにハイブリダイゼーション単独に頼っている。これらの方法のいくつかは高感度であり得るが、これらはしばしば、密接に関連するmRNA、とりわけ同じ試料中で異なるレベルで発現しているようなRNAを正確に定量化および区別することができない。上記に言及した方法はいくつかの目的のためには実用的であるのに対して、特定のRNAを密接に関連した分子から区別する際に特に強力な技術についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、核酸、特にRNAの直接的検出、特徴付け、および定量のために設計された新規な酵素に関する。本発明は、標的RNA配列上で形成された特異的核酸切断構造を認識し、かつ部位特異的な様式で核酸切断構造を切断して、非標的切断産物を産生する酵素を提供する。本発明は、DNAおよびRNAの核酸の鎖を含む複合体のDNAメンバーを特異的に切断する改善された能力を有する酵素を提供する。
【０００８】
本発明は、種々の供給源（中温性、好冷性、好熱性、および超好熱性の生物を含む）からの構造特異的切断剤（例えば、ヌクレアーゼ）を提供する。好ましい構造特異的ヌクレアーゼは熱安定性である。熱安定性構造特異的ヌクレアーゼは、それらが、核酸ハイブリダイゼーションが極度に特異的である温度において操作され、対立遺伝子特異的検出（一塩基のミスマッチを含む）を可能にするという意味において特に有用であることが意図される。1つの態様において、熱安定性構造特異的ヌクレアーゼは、テルムス(Thermus)種（テルムス アクアチクス(Thermus aquaticus)、テルムス フラヴス(Thermus flavus)、およびテルムス テルモフィルス(Thermus thermophilus)を含むがこれらに限定されない）の未変性のポリメラーゼ由来の変化したポリメラーゼを含む熱安定性5'ヌクレアーゼである。しかし、本発明は、熱安定性5'ヌクレアーゼの使用に限定されない。FEN-1、RAD2、およびXPGのクラスのヌクレアーゼからの熱安定性構造特異的ヌクレアーゼもまた好ましい。
【０００９】
本発明は、標的配列（例えば、変異、多型など）を検出するための方法を提供し、この方法は、標的配列を含むと疑われる試料を提供する工程；標的配列の存在下で侵襲性切断構造を形成し得るオリゴヌクレオチド；および侵襲性切断構造の存在を検出する剤を提供する工程；ならびに、上記試料を上記オリゴヌクレオチドおよび上記剤に曝露する工程を包含する。いくつかの態様において、この方法はさらに、上記剤および侵襲性切断構造を含む複合体を検出する（直接的または間接的）工程を包含する。いくつかの態様において、上記剤は切断剤を含む。いくつかの好ましい態様において、試料をオリゴヌクレオチドおよび剤に曝露する工程は、標的配列が上記試料中に存在する場合に、侵襲性切断構造が上記標的配列と上記オリゴヌクレオチドとの間に形成される条件下で、上記試料を上記オリゴヌクレオチドおよび上記剤に曝露することを包含し、ここで、上記侵襲性切断構造は切断剤によって切断されて切断産物を形成する。いくつかの態様において、この方法はさらに、切断産物を検出する工程を包含する。いくつかの態様において、標的配列は、第1の領域および第2の領域を含み、第2の領域は第1の領域の下流でありかつそれに隣接しており、ここで上記オリゴヌクレオチドは第1および第2のオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも第1のオリゴヌクレオチドの一部が標的配列の第1の部分に対して完全に相補的であり、第2のオリゴヌクレオチドは3'部分および5'部分を含み、そして上記5'部分は上記標的核酸の第2の部分に対して完全に相補的である。
【００１０】
本発明はまた、このような標的配列を検出するためのキットを提供し、上記キットは、標的配列の存在下で侵襲性切断構造を形成することができるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、このキットは、侵襲性切断構造（例えば、切断剤）の存在を検出するための剤をさらに含む。いくつかの態様において、このオリゴヌクレオチドは第1および第2のオリゴヌクレオチドを含み、上記第1のヌクレオチドは、標的核酸の第1の領域に相補的な5'部分を含み、上記第2のオリゴヌクレオチドは3'部分および5'部分を含み、上記5'部分は第1の部分の下流でありかつ第1の部分に隣接している標的核酸の第2の領域に相補的である。いくつかの好ましい態様において、標的配列は含む。
【００１１】
本発明はまた、非標的切断産物を検出することによって標的核酸分子の存在を検出するための方法を提供し、該方法は以下の工程を包含する：切断剤；標的核酸の供給源（ここで上記標的核酸は第1の領域および第2の領域を含み、上記第2の領域は上記第1の領域の下流かつ第1の領域に隣接する）；第1のオリゴヌクレオチド（ここで少なくとも第1のオリゴヌクレオチドの一部が標的核酸の第1の部分に完全に相補的である）；ならびに、3'部分および5'部分を含む第2のオリゴヌクレオチド（ここで、5'部分は標的核酸の第2の部分に完全に相補的である）を提供する工程；上記切断剤、上記標的核酸、上記第1のオリゴヌクレオチド、および上記第2のオリゴヌクレオチドを混合して、第1のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が上記標的核酸の第1の領域にアニールするような反応条件下で、反応混液を作製する工程であって、ここで、第2のヌクレオチドの少なくとも5'部分が、切断構造を作製するために標的核酸の第2の領域にアニールし、そして、切断構造の切断が非標的切断産物を生成するために起こる工程；ならびに、上記切断構造の切断を検出する工程。
【００１２】
切断構造の切断の検出は、任意の様式で実行され得る。いくつかの態様において、切断構造の切断の検出は、非標的切断産物を検出する工程を包含する。なお他の態様において、切断構造の切断の検出は、蛍光、分子量、または蛍光エネルギー移動の検出を含む。他の検出方法には、放射能、発光、燐光、蛍光偏光、および電荷が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、検出は以下の工程を包含する方法によって実行される：非標的切断産物；タンパク質結合領域の一本鎖部分を定義するようにアニールされた2つの一本鎖核酸を含む組成物；およびタンパク質を提供する工程；ならびに、非標的切断産物を、タンパク質がタンパク質結合領域に結合するような条件下でタンパク質結合領域の一本鎖部分に曝露する工程。いくつかの態様において、上記タンパク質は核酸産生タンパク質を含み、ここで、この核酸酸性タンパク質はタンパク質結合領域に結合し、かつ核酸を産生する。いくつかの態様において、上記タンパク質結合領域は、テンプレート依存性RNAポリメラーゼ結合領域（例えば、T7 RNAポリメラーゼ結合領域）である。他の態様において、上記検出は以下の工程を包含する方法によって実行される：非標的切断産物；RNAポリメラーゼ結合領域の一本鎖を規定する配列を含む核酸の連続した一本鎖；テンプレート依存性DNAポリメラーゼ；およびテンプレート依存性RNAポリメラーゼを提供する工程；ならびに、非標的切断産物を、非標的切断産物がRNAポリメラーゼ結合領域の一本鎖部分に結合して、結合した非標的切断産物を生成するような条件下でRNAポリメラーゼ結合領域に曝露する工程；結合した非標的切断産物を、二本鎖RNAポリメラーゼ結合領域が生成されるような条件下でテンプレート依存性DNAポリメラーゼに曝露する工程；ならびに、二本鎖RNAポリメラーゼ結合領域を、RNA転写物が産生されるような条件下で、テンプレート依存性RNAポリメラーゼに曝露する工程。いくつかの態様において、上記方法はさらに、RNA転写物を検出する工程を包含する。いくつかの態様において、テンプレート依存性RNAポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼである。
【００１３】
本発明は第2のオリゴヌクレオチドの3'部分の性質に限定されない。いくつかの好ましい態様において、第2のオリゴヌクレオチドの3'部分は、標的核酸に相補的でない3'末端ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第2のオリゴヌクレオチドの3'部分は標的核酸に相補的でない単一のヌクレオチドからなる。
【００１４】
上記方法のいずれの成分も固体支持体に結合され得る。例えば、いくつかの態様において、第1のオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合される。他の態様において、第2のオリゴヌクレオチドが固体支持体に結合される。
【００１５】
切断剤は、侵襲性切断構造を切断することができる任意の薬剤であり得る。いくつかの好ましい態様において、切断剤は構造特異的ヌクレアーゼを含む。特に好ましい態様において、構造特異的ヌクレアーゼは、熱安定性構造特異的ヌクレアーゼ（例えば、熱安定性5'ヌクレアーゼ）を含む。熱安定性構造特異的ヌクレアーゼには、好熱性生物（例えば、テルムス アクアチクス、テルムス フラヴス、およびテルムス テルモフィルス）由来の熱安定性DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の一部に相同なアミノ酸配列を有するものが含まれるがこれらに限定されない。他の態様において、熱安定性構造特異的ヌクレアーゼは、FEN-1、RAD2、またはXPGのヌクレアーゼのクラスからのヌクレアーゼを含むか、またはキメラ構造が上記の切断剤のいずれかの1つまたは複数の部分を含む。
【００１６】
上記方法は、標的核酸の性質によって限定されない。いくつかの態様において、標的核酸は、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAである。いくつかの態様において、二本鎖核酸は、切断構造の形成の前に一本鎖にされる（例えば、熱によって）。いくつかの態様において、標的核酸の供給源は、ゲノムDNAを含む試料を含む。試料には、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳、リンパ、痰、および精液が含まれるがこれらに限定されない。
【００１７】
いくつかの態様において、上記方法のための反応条件は、二価カチオンの供給源を提供する工程を包含する。いくつかの好ましい態様において、上記二価カチオンは、Mn2+およびMg2+を含む群より選択される。いくつかの態様において、上記方法のための反応条件は、標的核酸と比較して過剰濃度の第1および第2のオリゴヌクレオチドを提供する工程を包含する。
【００１８】
いくつかの態様において、上記方法は、上記標的核酸の第1の部分の上流の上記標的核酸の第3の部分に相補的な第3のオリゴヌクレオチドを提供する工程をさらに包含し、ここで、上記第3のオリゴヌクレオチドは反応混液と混合される。
【００１９】
本発明はまた、非標的切断産物を検出することによって標的核酸分子の存在を検出するための方法を提供し、上記方法は、以下の工程を包含する：切断剤；標的核酸の供給源（上記標的核酸は第1の領域および第2の領域を含み、上記第2の領域は上記第1の領域の下流かつ上記第1の領域に隣接する）；複数の第1のオリゴヌクレオチド（ここで、少なくとも第1のオリゴヌクレオチドの一部が標的配列の第1の部分に対して完全に相補的であり、第2のオリゴヌクレオチドは3'部分および5'部分を含み、そして上記5'部分は上記標的核酸の第2の部分に対して完全に相補的である）を提供する工程；上記切断剤、上記標的核酸、上記複数の第1のオリゴヌクレオチド、および上記第2のオリゴヌクレオチドを混合して、少なくとも第1のオリゴヌクレオチドの一部が上記標的核酸の第1の領域にアニールするような条件下で、反応混液を作製する工程であって、ここで、第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも5'部分が、切断構造を作製するために標的核酸の第2の領域にアニールし、そして、切断構造の切断が非標的産物を生成するために起こり、そして上記条件は複数の切断構造が形成すること、および標的核酸から切断されることを可能にする工程；ならびに、上記切断構造の切断を検出する工程。いくつかの態様において、上記条件は、複数の第1のオリゴヌクレオチドが標的核酸から解離することを可能にする等温条件を含む。本発明は特定の標的核酸上で形成された切断構造の数によって制限されるのに対して、いくつかの好ましい態様において、2つまたはそれ以上（3、4、5、...、10、...、10000、...）の複数の第1のオリゴヌクレオチドが特定の標的核酸を有する切断構造を形成し、ここで、上記切断構造は非標的切断産物を産生するために切断される。
【００２０】
本発明はまた、上記の方法からの切断産物がさらなる侵襲性切断反応において使用される方法を提供する。例えば、本発明は、以下の工程を包含する方法を提供する：切断剤；第1の標的核酸（上記第1の標的核酸は第1の領域および第2の領域を含み、上記第2の領域は上記第1の領域の下流かつ上記第1の領域に隣接する）；第1のオリゴヌクレオチド（ここで、少なくとも上記第1のオリゴヌクレオチドの一部が第1の標的核酸の第1の部分に対して完全に相補的である）；3'部分および5'部分を含む第2のオリゴヌクレオチド（ここで、上記5'部分は上記第1の標的核酸の第2の部分に対して完全に相補的である）；第2の標的核酸（上記第2の標的核酸は第1の領域および第2の領域を含み、上記第2の領域は上記第1の領域の下流かつ上記第1の領域に隣接する）；および第3のオリゴヌクレオチド（ここで、少なくとも上記第3のオリゴヌクレオチドの一部が第2の標的配列の第1の部分に対して完全に相補的である）を提供する工程；第1の切断構造を生成する工程（ここで、上記第1のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が上記第1の標的核酸の第1の領域にアニールし、そして、上記第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも5'部分が上記第1の標的核酸の第2の領域にアニールし、そして第1の切断構造の切断が切断剤を介して起こり、それによって、第1のオリゴヌクレオチドを切断して第4のオリゴヌクレオチドを生成し、上記第4のオリゴヌクレオチドは3'部分および5'部分を含み、ここで、上記5'部分は上記第2の標的核酸の第2の部分に完全に相補性である）；第3のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が上記第2の標的核酸の第1の領域にアニールするような条件下で、第2の切断構造を生成する工程（ここで、第4のオリゴヌクレオチドの少なくとも5'部分が第2の標的核酸の第2の領域にアニールし、そして第2の切断構造の切断が起こり切断断片を生成する）；ならびに、上記第2の切断構造の切断を検出する工程。いくつかの好ましい態様において、第4のオリゴヌクレオチドの3'部分は、第2の標的核酸に対して相補的でない3'末端ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、第3のオリゴヌクレオチドの3'部分は、第2の標的核酸に共有結合される。いくつかの態様において、第2の標的核酸は5'領域をさらに含み、ここで第2の標的核酸の5'領域は第3のオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
本発明はさらに、以下を含むキットを提供する：切断剤；標的核酸の第1の領域に相補的な5'部分を含む第1のオリゴヌクレオチド；ならびに、3'部分および5'部分を含む第2のオリゴヌクレオチド（上記5'部分は第1の部分の下流かつ第1の部分に隣接する標的核酸の第2の領域に相補的である）。いくつかの態様において、第2のオリゴヌクレオチドの3'部分は、標的核酸に対して相補的でない3'末端ヌクレオチドを含む。好ましい態様において、第2のオリゴヌクレオチドの3'部分は、標的核酸に対して相補的ではない単一ヌクレオチドからなる。いくつかの態様において、このキットは、固体支持体をさらに含む。例えば、いくつかの態様において、第1および／または第2のオリゴヌクレオチドが上記固体支持体に結合される。いくつかの態様において、このキットは緩衝液をさらに含む。いくつかの好ましい態様において、上記緩衝液は、二価カチオン（例えば、Mn2+イオンおよび／またはMg2+イオン）の供給源を含む。いくつかの特定の態様において、このキットは、第1の標的核酸の第1の部分の上流の標的核酸の第3の部分に相補的な第3のオリゴヌクレオチドをさらに含む。いくつかの態様において、このキットは第2の標的核酸をさらに含む。なお他の態様において、このキットは第2の標的核酸の第1の領域に対して相補的な5'部分を含む第3のオリゴヌクレオチドをさらに含む。なお他の態様において、このキットは標的核酸をさらに含む。いくつかの特定の態様において、第3のオリゴヌクレオチドの3'部分は第2の標的核酸に共有結合されている。他の特定の態様において、第2の標的核酸は5'部分をさらに含み、ここで上記第2の標的核酸の5'部分は第3のオリゴヌクレオチドである。なお他の態様において、このキットはARRESTOR分子（例えば、ARRESTORオリゴヌクレオチド）をさらに含む。
【００２２】
本発明は、切断構造を含む組成物をさらに提供し、上記切断構造は以下を含む：a）標的核酸（この標的核酸は第1の領域、第2の領域、第3の領域、および第4の領域を有し、ここで、上記第1の領域は上記第2の領域に隣接しかつ上記第2の領域から下流に位置し、上記第2の領域は上記第3の領域に隣接しかつ上記第3の領域から下流に位置し、および、上記第3の領域は上記第4の領域に隣接しかつ上記第4の領域から下流に位置する）；b）標的核酸の第4の領域に対して相補的である第1のオリゴヌクレオチド；c）5'部分および3'部分を有する第2のオリゴヌクレオチド（ここで、第2のオリゴヌクレオチドの5'部分は標的核酸の第2の領域に相補的な配列を含み、そして第2のオリゴヌクレオチドの3'部分は標的核酸の第3の領域に相補的な配列を含む）；ならびにd）5'部分および3'部分を有する第3のオリゴヌクレオチド（ここで、第3のオリゴヌクレオチドの5'部分は標的核酸の第1の領域に相補的な配列を含み、そして第3のオリゴヌクレオチドの3'部分は標的核酸の第2の領域に相補的な配列を含む）。
【００２３】
本発明は、標的核酸の4つの領域の長さによって限定されない。1つの態様において、標的核酸の第1の領域は11〜50ヌクレオチドの長さを有する。別の態様において、標的核酸の第2のヌクレオチドは、1〜3ヌクレオチドの長さを有する。別の態様において、標的核酸の第3の領域は、6〜9ヌクレオチドの長さを有する。なお別の態様において、標的核酸の第4の領域は6〜50ヌクレオチドの長さを有する。
【００２４】
本発明は、第1、第2、第3、および第4のオリゴヌクレオチドの性質または組成物によって限定されない；これらのオリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、PNA、およびこれらの組み合わせを含み得、ならびに、修飾されたヌクレオチド、汎用的な塩基、付加物などを含む。さらに、第1、第2、第3、および第4のオリゴヌクレオチドは、3'末端にジデオキシヌクレオチドを含み得る。
【００２５】
1つの好ましい態様において、標的核酸は、第1、第2、第3、および第4のオリゴヌクレオチドの少なくとも1つに完全に相補的ではない。特に好ましい態様において、標的核酸は第2のオリゴヌクレオチドに完全に相補的ではない。
【００２６】
上記に注記されるように、本発明は、検出方法における構造特異的ヌクレアーゼの使用を意図する。1つの態様において、本発明は、非標的切断産物を検出することによって標的核酸分子の存在を検出する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：a）i）切断手段、ii）標的核酸の供給源（標的核酸は、第1の領域、第2の領域、第3の領域、および第4の領域を有し、ここで第1の領域は第2の領域に隣接しかつ第2の領域から下流に位置し、第2の領域は第3の領域に隣接しかつ第3の領域から下流に位置し、そして第3の領域は第4の領域に隣接しかつ第4の領域から下流に位置する）；iii）標的核酸の第4の領域に対して相補的である第1のオリゴヌクレオチド；iv）5'部分および3'部分を有する第2のオリゴヌクレオチド（ここで、第2のオリゴヌクレオチドの5'部分は標的核酸の第2の領域に対して相補的な配列を含み、そして第2のオリゴヌクレオチドの3'部分は標的核酸の第3の領域に対して相補的な配列を含む）；iv）5'部分および3'部分を有する第3のオリゴヌクレオチド（ここで、第3のオリゴヌクレオチドの5'部分は標的核酸の第1の領域に対して相補的な配列を含み、そして第3のオリゴヌクレオチドの3'部分は標的核酸の第2の領域に対して相補的な配列を含む）を提供する工程；b）切断手段、標的核酸、第1のオリゴヌクレオチド、第2のオリゴヌクレオチド、および第3のオリゴヌクレオチドを、第1のオリゴヌクレオチドが標的核酸の第4の領域にアニールするような反応条件下で混合し、反応混液を作製する工程（ここで、第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも3'部分が標的核酸にアニールし、そして第3のオリゴヌクレオチドの少なくとも5'部分が切断構造を作製するために標的核酸にアニールし、そして切断構造の切断が起こり非標的切断産物を生成し、各非標的切断産物は3'-ヒドロキシル基を有する）；ならびにc）非標的切断産物を検出する工程。
【００２７】
本発明は、標的核酸の性質によって限定されない。1つの態様において、標的核酸は、一本鎖DNAを含む、別の態様において、標的核酸は二本鎖DNAを含み、および、工程c）の前に、反応混液は、二本鎖DNAが実質的に一本鎖にされるように処理される。別の態様において、標的核酸はRNAを含み、そして第1および第2のオリゴヌクレオチドはDNAを含む。
【００２８】
本発明は、切断手段の性質によって限定されない。1つの態様において、切断手段は構造特異的ヌクレアーゼであり；特に好ましい構造特異的ヌクレアーゼは熱安定性構造特異的ヌクレアーゼである。
【００２９】
別の好ましい態様において、熱安定性構造特異的ヌクレアーゼはキメラヌクレアーゼである。
【００３０】
代替的な好ましい態様において、非標的切断産物の検出は、反応産物の電気泳動的分離、続いて分離した非標的切断産物の可視化を含む。
【００３１】
別の好ましい態様において、1つまたは複数の第1、第2、および第3のオリゴヌクレオチドは、3'末端にジデオキシヌクレオチドを含む。ジデオキシヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが利用された場合、非標的切断産物の検出は、好ましくは以下の工程を包含する：a）非標的切断産物を、少なくとも1種の標識したヌクレオチドが非標的切断産物の3'ヒドロキシル基に付加されて標識された非標的切断産物が生成するような条件下で、テンプレート非依存的ポリメラーゼおよび少なくとも1種の標識したヌクレオシド三リン酸とともにインキュベートする工程；およびb）標識された非標識切断産物の存在を検出する工程。本発明は、利用されるテンプレート非依存性ポリメラーゼの性質によって限定されない；1つの態様において、テンプレート依存性ポリメラーゼは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）およびpolyAポリメラーゼからなる群より選択される。TdTまたはpolyAポリメラーゼが検出工程において利用される場合、第2のオリゴヌクレオチドは5'末端標識を含み得、この5'末端標識は標識されたヌクレオシド三リン酸上に存在する標識とは異なる標識である。本発明は、5'末端標識の性質によって限定されない；広範な種々の適切な5'末端標識が当該分野で公知であり、これには、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Cy3アミダイト、Cy5アミダイト、およびジゴキシゲニンが含まれる。
【００３２】
別の態様において、非標的切断産物の検出は、以下の工程を含む：a）非標的切断産物を、少なくとも1種のヌクレオチドが非標的切断産物の3'ヒドロキシル基に付加されてテール付加非標的切断産物を生成するような条件下で、テンプレート非依存性ポリメラーゼおよび少なくとも1種のヌクレオシド三リン酸とともにインキュベートする工程；ならびにb）テール付加非標的切断産物の存在を検出する工程。本発明は、利用されるテンプレート非依存性ポリメラーゼの性質によって限定されない；1つの態様において、テンプレート非依存性ポリメラーゼは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）およびpolyAポリメラーゼからなる群より選択される。TdTまたはpolyAポリメラーゼが検出工程において利用される場合、第2のオリゴヌクレオチドは5'末端標識を含み得る。本発明は、5'末端標識の性質によって限定されない；広範な種々の適切な5'末端標識が当該分野で公知であり、これには、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、REDMOND RED色素、Cy3アミダイト、Cy5アミダイト、およびジゴキシゲニンが含まれる。
【００３３】
好ましい態様において、上記反応条件は、二価カチオンの供給源を提供する工程を含み；特に好ましい二価カチオンはMn2+イオンおよびMg2+イオンである。
【００３４】
本発明はさらに、非標的切断産物を検出することによって標的核酸分子の存在を検出する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：a）i）切断手段、ii）標的核酸の供給源（標的核酸は、第1の領域、第2の領域、および第3の領域を有し、ここで第1の領域は第2の領域に隣接しかつ第2の領域から下流に位置し、そして第2の領域は第3の領域に隣接しかつ第3の領域から下流に位置する）；iii）5'部分および3'部分を有する第1のオリゴヌクレオチド（ここで、第1のオリゴヌクレオチドの5'部分は標的核酸の第2の領域に対して相補的な配列を含み、そして第1のオリゴヌクレオチドの3'部分は標的核酸の第3の領域に対して相補的な配列を含む）；iv）11〜15の間の長さのヌクレオチドを有し、さらに5'および3'部分を有する第2のオリゴヌクレオチド（ここで、上記第2のヌクレオチドの5'部分は、標的核酸の第1の領域に対して相補的である配列を含み、そして上記第2のヌクレオチドの3'部分は、標的核酸の第2の領域に対して相補的である配列を含む）を提供する工程；b）切断手段、標的核酸、第1のオリゴヌクレオチド、および第2のオリゴヌクレオチドを、第1のオリゴヌクレオチドの少なくとも3'部分が標的核酸にアニールするような反応条件下で混合し、反応混液を作製する工程（ここで、第2のオリゴヌクレオチドの少なくとも5'部分が切断構造を作製するために標的核酸にアニールし、そして切断構造の切断が起こり非標的切断産物を生成し、各非標的切断産物は3'-ヒドロキシル基を有する）；ならびにc）非標的切断産物を検出する工程。好ましい態様において、切断手段は、構造特異的ヌクレアーゼ、好ましくは熱安定性構造特異的ヌクレアーゼである。
【００３５】
本発明は、標的核酸の種々の領域の長さによって限定されない。好ましい態様において、標的核酸の第2の領域は1〜5ヌクレオチドの間の長さを有する。別の好ましい態様において、1つまたは複数の第1および第2のオリゴヌクレオチドは3'末端にジデオキシヌクレオチドを含む。ジデオキシヌクレオチド含有オリゴヌクレオチドが利用される場合、非標的切断産物の検出は、好ましくは以下の工程を包含する：a）非標的切断産物を、少なくとも1種の標識したヌクレオチドが非標識切断産物の3'ヒドロキシル基に付加されて標識された非標的切断産物を生成するような条件下で、テンプレート非依存性ポリメラーゼおよび少なくとも1種の標識したヌクレオシド三リン酸とともにインキュベートする工程；ならびにb）標識された非標識切断産物の存在を検出する工程。本発明は、利用されるテンプレート非依存性ポリメラーゼの性質によって限定されない；1つの態様において、テンプレート非依存性ポリメラーゼは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）およびpolyAポリメラーゼからなる群より選択される。TdTまたはpolyAポリメラーゼが検出工程において利用される場合、第2のオリゴヌクレオチドは5'末端標識を含み得、この5'末端標識は標識されたヌクレオシド三リン酸上に存在する標識とは異なる標識である。本発明は、5'末端標識の性質によって限定されない；広範な種々の適切な5'末端標識が当該分野で公知であり、これには、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、REDMOND RED色素、Cy3アミダイト、Cy5アミダイト、およびジゴキシゲニンが含まれる。
【００３６】
別の態様において、非標的切断産物の検出は以下の工程を包含する：a）非標的切断産物を、少なくとも1種のヌクレオチドが非標的切断産物の3'ヒドロキシル基に付加されてテール付加非標的切断産物を生成するような条件下で、テンプレート非依存性ポリメラーゼおよび少なくとも1種のヌクレオシド三リン酸とともにインキュベートする工程；ならびにb）テール付加非標的切断産物の存在を検出する工程。本発明は、利用されるテンプレート非依存性ポリメラーゼの性質によって限定されない；1つの態様において、テンプレート非依存性ポリメラーゼは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）およびpolyAポリメラーゼからなる群より選択される。TdTまたはpolyAポリメラーゼが検出工程において利用される場合、第2のオリゴヌクレオチドは5'末端標識を含み得る。本発明は、5'末端標識の性質によって限定されない；広範な種々の適切な5'末端標識が当該分野で公知であり、これには、ビオチン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、REDMOND RED色素、Cy3アミダイト、Cy5アミダイト、およびジゴキシゲニンが含まれる。
【００３７】
本発明の新規な検出方法は、標的のDNAおよびRNA（疾患または癌と関連しているか、または関連し得るヒトまたは他の動物からの遺伝子を含む、野生型および変異型の対立遺伝子を含む標的DNAおよびRNAを含むがこれらに限定されない）の検出のために利用され得る。さらに、本発明の方法は、微生物の株（細菌、真菌、原生動物、繊毛虫類、およびウイルスを含む）の検出および／または同定のために（そして特に、HCVウイルスのようなRNAウイルスの検出および同定のために）使用され得る。
【００３８】
本発明はさらに、核酸、特にRNAの直接的検出、特徴付け、および定量のために設計された新規な酵素を提供する。本発明は、標的RNA配列上で形成された特定の核酸切断構造を認識し、かつ、この核酸切断構造を部位特異的な様式で切断して非標的切断産物を産生する酵素を提供する。本発明は、DNAおよびRNAの核酸鎖を含む複合体のDNAメンバーを特異的に切断する、改善された能力を有する酵素を提供する。
【００３９】
例えば、本発明は、未変性のDNAポリメラーゼと比較して構造が変化して、その結果、核酸（例えば、RNA）を含む構造の切断に基づく検出アッセイ法において変化した（例えば、改善された）性能を示すDNAポリメラーゼを提供する。特に、本発明の変化したDNAポリメラーゼは、RNA標的鎖を含む切断構造（例えば、侵襲性切断構造）のDNAメンバーの切断に基づく検出アッセイ法において改善された性能を示す。
【００４０】
検出アッセイ法における改善された性能は、いくつかの改善された特色のいずれか1つ、またはそれらの組み合わせから生じ得る。例えば、1つの態様において、本発明の酵素は、特定の標的化構造に対する改善された切断の速度（kcat）を有し得、その結果、より大量の切断産物が所定の時間の間に産生され得る。別の態様において、本発明の酵素は、不適切または非特異的な構造の切断の活性または速度の減少を有し得る。例えば、本発明の特定の態様において、改善の1つの局面は、特定の構造の切断の検出可能な量と、任意の代替的な構造の切断の検出可能な量との間の差が増加することである。そのようなものとして、未変性の酵素の速度と比較して、特定の標的酵素構造の切断の速度の減少を有し、さらに任意の代替的な構造の切断の速度の減少を有し、その結果、特定の構造の切断の検出可能な量と、任意の代替的な構造の切断の検出可能な量との間の差が増加する酵素を提供することが本発明の範囲に入る。しかし、本発明は、改善された差を有する酵素に限定されない。
【００４１】
好ましい態様において、本発明の酵素は、その酵素が由来する任意の未変性のDNAポリメラーゼの活性と比較して、上記に記載したような変化したヌクレアーゼ活性を有し、かつ変化した合成活性もまた有するDNAポリメラーゼである。DNAポリメラーゼが、未変性のDNAポリメラーゼの活性と比較して、減少した合成活性ならびにRNA標的上での改善されたヌクレアーゼ活性を示すように変化されることが特に好ましい。減少した合成活性を有する酵素およびその酵素をコードする遺伝子は記載されている（例えば、Kaiserら、J. Biol. Chem., 274: 21387 [1999]、 Lyamichevら、Prot. Natl. Acad. Sci., 96:6143 [1999]、 米国特許第5,541,311号、同第5,614,402号、同第5,795,763号、および同第6,090,606号を参照されたい。これらは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）。本発明は、得られる5'ヌクレアーゼが合成活性を妨害することがなく、かつRNA検出アッセイ法において改善された性能を有するような修飾の組み合わせを意図する。
【００４２】
本発明は、DNAポリメラーゼが、未変性のDNAポリメラーゼの活性から変化したヌクレアーゼ活性を示すように、未変性の配列と比較して配列が変化されたDNAポリメラーゼをコードするDNA配列を意図する。例えば、1つの態様において、そのDNA配列は、特定の標的化構造に対する改善された切断の速度（kcat）を有する酵素をコードし、その結果、より大量の切断産物が所定の時間の間に産生され得る。別の態様において、そのDNAは、不適切または非特異的な構造の切断の活性または速度の減少を有する酵素をコードする。特定の態様において、改善の1つの局面は、特定の構造の切断の検出可能な量と、任意の代替的な構造の切断の検出可能な量との間の差が増加することである。未変性の酵素の速度と比較して、特定の標的酵素構造の切断の速度の速度の減少を有し、さらに任意の代替的な構造の切断の速度の減少を有し、その結果、特定の構造の切断の検出可能な量と、任意の代替的な構造の切断の検出可能な量との間の差が増加する酵素をコードするDNAを提供することが本発明の範囲に入る。しかし、本発明は、改善された差を有するポリメラーゼに限定されない。
【００４３】
好ましい態様において、DNA配列は、その改善された酵素が由来する任意の未変性のDNAポリメラーゼの活性と比較して、上記に記載したような変化したヌクレアーゼ活性を有し、かつ変化した合成活性もまた有するDNAポリメラーゼをコードする。コードされたDNAポリメラーゼが、未変性のDNAポリメラーゼの活性と比較して、減少した合成活性ならびにRNA標的上での改善されたヌクレアーゼ活性を示すように変化されることが特に好ましい。
【００４４】
本発明は、変化したヌクレアーゼ活性を導入するために必要とされる変化の性質によって限定されることは意図されない。本発明はまた、観察される変化または改善のいずれかの程度によって限定されることは意図されない。ポリメラーゼもまた、合成を修飾するために変化される場合、本発明が、修飾されたタンパク質もしくは修飾されていないタンパク質のポリメラーゼ活性によって、またはポリメラーゼ合成を修飾するための変化の性質によって限定されることは意図されない。
【００４５】
本発明は、種々の供給源からの構造特異的ヌクレアーゼを意図し、これには、中温性、好冷性、好熱性、および超好熱性の生物が含まれるがこれらに限定されない。好ましい構造特異的ヌクレアーゼは熱安定性である。熱安定性構造特異的ヌクレアーゼは、それらが、下流のプローブオリゴヌクレオチドの融解温度（Tm）付近でINVADERアッセイ法（例えば、米国特許第5,846,717号、同第5,985,557号、5,994,069号、同第6,001,567号、および同第6,090,543号、ならびにPCT国際公開公報第97/27214号および同第98/42873号を参照されたい。これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）を操作することを可能にするという意味で特に有用であるように意図され、その結果、切断されたプローブおよび切断されていないプローブが反応の過程の間、標的を断続的にサイクル化され得る。1つの態様において、熱安定性構造特異的ヌクレアーゼは、テルムス種（テルムス アクアチクス、テルムス フラヴス、テルムス テルモフィルス、テルムス フィリフォルミス(Thermus filiformis)、およびテルムス スコトドクトゥス(Thermus scotoductus)を含むがこれらに限定されない）の未変性のポリメラーゼ由来の変化したポリメラーゼを含む群から選択される熱安定性5'ヌクレアーゼである。しかし、本発明は、熱安定性5'ヌクレアーゼの使用に限定されない。例えば、本発明の特定の態様は、低温における標的を断続的にサイクル化し得る短いオリゴヌクレオチドプローブを使用し、これは、非熱安定性酵素の使用を可能にする。
【００４６】
いくつかの好ましい態様において、本発明は、酵素を含有する組成物を提供し、ここでこの酵素は、異種機能性ドメインを含み、この異種機能性ドメインは核酸切断アッセイ法における機能性の変化（例えば、改善）を提供する。本発明は、核酸切断アッセイ法の性質に限定されない。例えば、核酸切断アッセイ法には、核酸が、酵素の存在下で直接的または間接的に切断される任意のアッセイ法が含まれる。特定の好ましい態様において、核酸切断アッセイ法は、侵襲性切断アッセイ法である。特に好ましい態様において、切断アッセイ法は、少なくとも1種のRNA成分を有する切断構造を利用する。別の特に好ましい態様において、切断アッセイ法は、少なくとも1種のRNA成分を有する切断構造を利用し、ここで切断構造のDNAメンバーが切断される。
【００４７】
いくつかの好ましい態様において、酵素は5'ヌクレアーゼまたはポリメラーゼを含む。特定の好ましい態様において、5'ヌクレアーゼは熱安定性5'ヌクレアーゼを含む。他の好ましい態様において、ポリメラーゼは、それが天然に存在するポリメラーゼの活性よりも減少したDNA合成活性を示すように、ポリメラーゼの天然に存在する配列と比較して配列が変化している。特定の好ましい態様において、ポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼを含む（例えば、テルムス種（テルムス アクアチクス、テルムス フラヴス、テルムス テルモフィルス、テルムス フィリフォルムス、およびテルムス スコトドクトゥスを含むがこれらに限定されない）からのポリメラーゼ）。
【００４８】
本発明は、異種機能性ドメインによって提供される変化した機能性の性質によって限定されない。変化の例証的な例には、異種機能性ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改善されたヌクレアーゼ活性、改善された基質結合活性、および／または改善されたバックグラウンド特異性を提供するアミノ酸配列（例えば、1つまたは複数のアミノ酸）を含む酵素が含まれるがこれらに限定されない。
【００４９】
本発明は、異種機能性ドメインの性質によって限定されない。例えば、いくつかの態様において、異種機能性ドメインは、ポリメラーゼのポリメラーゼドメインからの2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む（例えば、キメラ機能性ドメインの挿入によって酵素に導入されるか、または変異によって作製される）。特定の好ましい態様において、2つまたはそれ以上のアミノ酸の少なくとも1つは、ポリメラーゼドメインのパーム領域またはサム領域由来である。本発明は、2つまたはそれ以上のアミノ酸がそこから選択されたポリメラーゼと同じであることによって限定されない。特定の好ましい態様において、ポリメラーゼは、テルムス テルモフィルスポリメラーゼを含む。特に好ましい態様において、2つまたはそれ以上のアミノ酸は、配列番号：1のアミノ酸300-650由来である。
【００５０】
本発明の新規な酵素は、標的のDNAおよびRNA（疾患または他の症状と関連しているか、または関連し得るヒト、他の動物、または植物からの遺伝子を含むがこれらに限定されない、野生型および変異型の対立遺伝子を含む標的DNAおよびRNAを含むがこれらに限定されない）の検出のために利用され得る。さらに、本発明の酵素は、微生物の株（細菌、真菌、原生動物、繊毛虫類、およびウイルスを含む）の検出および／または同定のために（そして特に、C型肝炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスのようなRNAゲノムを有するウイルスの検出および同定のために）使用され得る。例えば、本発明は、以下の工程を含む核酸を切断するための方法を提供する：本発明の酵素および基質核酸を提供する工程；ならびに上記基質核酸を上記酵素に曝露する工程（例えば、検出され得る切断産物を産生するため）。
【００５１】
1つの態様において、本発明は、配列番号：
2005518223.tif 000002
を含む群より選択されるアミノ酸配列を有する熱安定性5'ヌクレアーゼを提供する。別の態様において、この5'ヌクレアーゼは、配列番号：
2005518223.tif 000003
を含む群より選択されるDNA配列によってコードされる。
【００５２】
本発明はまた、5'ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有するDNAを含む組換えDNAベクターを提供し、このヌクレオチド配列は、配列番号：
2005518223.tif 000004
を含む群より選択される。好ましい態様において、本発明は、構造特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を有するDNAを含む組換えDNAベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、このヌクレオチドは、配列番号：
2005518223.tif 000005
を含む群より選択される。本発明は、利用される宿主細胞の性質によって限定されない。当業者は、種々の原核宿主細胞および真核宿主細胞において発現され得る構造特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の発現のために適切な発現ベクターを十分に認識している。好ましい態様において、宿主細胞は大腸菌細胞である。
【００５３】
本発明は、未変性の5'ヌクレアーゼ酵素と比較して、それらがRNAを含む構造の切断に基づく検出アッセイ法において改善された性能を示すように5'ヌクレアーゼ酵素を変化させる方法を提供する。特に、本発明の方法によって産生された変化された5'ヌクレアーゼは、RNA標的鎖を含む切断構造（例えば、侵襲性切断構造）のDNAメンバーの切断に基づく検出アッセイ法において改善された性能をを示す。本発明の方法から生じる改善された5'ヌクレアーゼは、本明細書中で議論される方法のいずれかにおいて改善され得る。任意の候補酵素における改善を評価するためのプロセスの例が提供される。
【００５４】
例えば、本発明は、核酸切断アッセイ法における改善された機能性を有する変化された酵素を産生するための方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：酵素および核酸試験基質を提供する工程；変化された酵素を産生するために異種機能ドメインを酵素に導入する工程；変化された酵素を核酸試験基質と接触させて、切断産物を産生する工程；ならびに、切断産物を検出する工程。いくつかの態様において、異種機能性ドメインの導入は、酵素の1つまたは複数のアミノ酸を変異させる工程を包含する。他の態様において、酵素への異種機能性ドメインの導入は、タンパク質（例えば、別の酵素）由来の機能性ドメインを酵素に付加する工程を包含する（例えば、タンパク質の機能性ドメインを付加する前に酵素配列の一部を除去することによって機能性ドメインを置換する）。好ましい態様において、核酸試験基質は切断構造を含む。特に好ましい態様において、切断構造はRNA標的核酸を含む。なお他の好ましい態様において、切断構造は侵襲性切断構造を含む。
【００５５】
本発明はまた、核酸処理キットを提供する。1つの好ましい態様は、少なくとも1種の改善された5'ヌクレアーゼを含む組成物を含むキットである。別の好ましい態様は、a）少なくとも1種の改善された5'ヌクレアーゼを含む組成物；ならびにb）INVADERオリゴヌクレオチドおよびシグナルプローブオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。本発明のキットのいくつかの態様において、改善された5'ヌクレアーゼは、真正細菌種からのDNAポリメラーゼ由来である。さらなる態様において、真正細菌種は熱安定性である。なおさらなる態様において、その熱安定性細菌はテルムス属の細菌である。なおさらなる態様において、その熱安定性細菌はテルムス アクアチクス、テルムス フラヴス、テルムス テルモフィルス、テルムス フィリフォルムス、およびテルムス スコトドクトゥスからなる群より選択される。好ましい態様において、改善された5'ヌクレアーゼは、配列番号：
2005518223.tif 000006
を含む群より選択されるDNAによってコードされる。なお他の好ましい態様において、本発明のキットは、核酸切断産物を検出するための試薬をさらに含む。さらなる好ましい態様において、切断産物を検出するための試薬は、引き続く侵襲性切断反応における使用のためのオリゴヌクレオチドを含む（例えば、米国特許第5,994,069号を参照されたい）。特に好ましい態様において、引き続く侵襲性切断反応のための試薬は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）効果を産生する部分で標識されたプローブを含む。
【００５６】
本発明はまた、核酸を処理するための方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：a）マンガンを含有する溶液中のエンドヌクレアーゼからなる第1の構造特異的ヌクレアーゼ；および核酸基質を提供する工程；b）基質が実質的に一本鎖であるように、増加させた温度で核酸基質を処理する工程；c）一本鎖基質が1つまたは複数の切断構造を形成するような条件下で、温度を減少させる工程；d）1つまたは複数の切断産物が産生されるように、切断手段を切断構造とともに反応させる工程；ならびに、e）1つまたは複数の切断産物を検出する工程。本発明の方法のいくつかの態様において、エンドヌクレアーゼは、CLEAVASE BN酵素、テルムス アクアチクス DNAポリメラーゼ、テルムス テルモフィルス DNAポリメラーゼ、大腸菌 Exo III、および出芽酵母Rad1/Rad10複合体を含むがこれらに限定されない。なお他の好ましい態様において、ヌクレアーゼは、野生型DNAポリメラーゼのそれよりも減少したDNA合成活性を示すが、野生型DNAポリメラーゼと実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が変化した、熱安定性DNAポリメラーゼに由来する5'ヌクレアーゼである。なお他の態様において、核酸は、RNAおよびDNAからなる群より選択される。さらなる態様において、工程（a）の核酸は二本鎖である。
【００５７】
本発明はまた、核酸処理キットを提供し、このキットは以下を含む：a）少なくとも1種の精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼを含む組成物；およびb）マンガンを含有する溶液。キットのいくつかの態様において、精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼは、ピロコックス ヴォエセイ(Pyrococcus woesei) FEN-1エンドヌクレアーゼ、ピロコックス フリオサス(Pyrococcus furiosus) FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノコックス ヤナシイ(Methanococcus jannaschii) FEN-1エンドヌクレアーゼ、メタノバクテリウム テルモアウトトロフィクム(Methanobacterium thermoautotrophicum) FEN-1エンドヌクレアーゼ、アルカエグロブス フルギドゥス(Archaeoglobus fulgidus) FEN-1、スルホロブス ソルファタリクス(Sulfolobus solfataricus)、ピロバクルム アエロフィルム(Pyrobaculum aerophilum)、テルモコックス リトラリス(Thermococcus litoralis)、アルカエグロブス ヴェネフィクス(Archaeaglobus veneficus)、アルカエグロブス プロフンドゥス(Archaeaglobus profundus)、アシディアヌス ブリエルリ(Acidianus brierlyi)、アシディアヌス アンビヴァレンス(Acidianus ambivalens)、デスルフロコックス アミロリティクス(Desulfurococcus amylolyticus)、デスルフロコックス モビリス(Desulfurococcus mobilis)、ピロディクティウム ブロキイ(Pyrodictium brockii)、テルモコックス ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)、テルモコックス ジリギイ(Thermococcus zilligii)、メタノピルス カンドレリ(Methanopyrus kandleri)、メタノコックス イグネンス(Methanococcus ignens)、ピロコックス ホリコシ(Pyrococcus horikoshii)、アエロピルム ペルニクス(Aeropyrum pernix)、およびキメラFEN-1エンドヌクレアーゼからなる群より選択される。他の態様において、本発明のキットは、少なくとも1種の二次構造特異的ヌクレアーゼをさらに含む。いくつかの好ましい態様において、第2のヌクレアーゼは、野生型DNAポリメラーゼのそれよりも減少したDNA合成活性を示すが、野生型DNAポリメラーゼと実質的に同じ5'ヌクレアーゼ活性を保持するようにアミノ酸配列が変化した、熱安定性DNAポリメラーゼに由来する5'ヌクレアーゼである。キットのなお他の態様において、第2のヌクレアーゼのアミノ酸配列の一部は、テルムス属の好熱真正細菌由来の熱安定性DNAポリメラーゼのアミノ酸配列の一部と相同である。さらなる態様において、好熱菌はテルムス アクアチクス、テルムス フラヴス、およびテルムス テルモフィルスからなる群より選択される。なお他の好ましい態様において、本発明のキットは切断産物を検出するための試薬をさらに含む。
【００５８】
本発明はさらに、スルホロブス ソルファタリクス、ピロバクルム アエロフィルム、テルモコックス リトラリス、アルカエグロブス ヴェネフィクス、アルカエグロブス プロフンドゥス、アシディアヌス ブリエルリ、アシディアヌス アンビヴァレンス、デスルフロコックス アミロリティクス、デスルフロコックス モビリス、ピロディクティウム ブロキイ、テルモコックス ゴルゴナリウス、テルモコックス ジリギイ、メタノピルス カンドレリ、メタノコックス イグネンス、ピロコックス ホリコシ、およびアエロピルム ペルニクスのエンドヌクレアーゼを含むエンドヌクレアーゼとともに使用される、本明細書中に記載される組成物、混合物、方法、およびキットのいずれかを提供する。これらには以下が含まれる：生物由来の精製されたFEN-1エンドヌクレアーゼ（本明細書中で提供される配列によって記載される特定のエンドヌクレアーゼ、ならびに改変体およびホモログを含む）を含む組成物、これらの組成物を含むキット、これらの生物からのエンドヌクレアーゼの少なくとも一部を含むキメラエンドヌクレアーゼを含む組成物、このような組成物を含むキット、これらの生物からのエンドヌクレアーゼをコードする核酸を含む組成物（ベクターおよび宿主細胞を含む）、このような組成物を含むキット、エンドヌクレアーゼに対して生成された抗体、これらの生物からのエンドヌクレアーゼを含む混合物、切断アッセイ法においてエンドヌクレアーゼを使用する方法（例えば、侵襲性切断アッセイ法、CFLPなど）、およびこのような方法のために有用な成分を含むキット。これらのエンドヌクレアーゼの生成、構造、使用、および特徴付けは本明細書中に提供される。
【００５９】
本発明はまた、本明細書中に開示される方法および酵素を改善するための方法を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に開示された酵素を提供する工程、およびその酵素を修飾する工程（例えば、生物学的であるか否か、または任意の他の修飾であるかに関わらず、アミノ酸配列を変化させること、配列を付加するかまたは減じること、翻訳後修飾を付加すること、任意の他の成分を付加すること）を包含する、任意の意図された目的（例えば、切断反応、増幅反応、結合反応における使用、または任意の他の使用）のために酵素を改善する方法を提供する。同様に、本発明は、本明細書中に開示された方法を改善するための方法を提供し、この方法は、1つまたは複数の変更（例えば、本発明の方法において提供される組成物の変更、工程の順序の変更、または工程の付加もしくは減じること）を伴う方法の工程を実施する工程を包含する。
【００６０】
検出アッセイ法における改善された性能は、いくつかの改善された特徴のいずれか1つ、またはそれらの組み合わせから生じ得る。例えば、1つの態様において、本発明の酵素は、より多い量の切断産物が所定の時間の期間において産生され得るように、特定の標的化構造上で改善された切断速度（kcat）を有し得る。別の態様において、本発明の酵素は、不適切なまたは非特異的な構造の切断の活性または速度の減少を有し得る。例えば、本発明の特定の態様において、改善の1つの局面は、特定の構造の切断の検出可能な量と、任意の代替的な構造の切断の検出可能な量との間の差が増加することである。そのようなものとして、未変性の酵素の速度と比較して、特定の標的構造の切断の速度の減少を有し、さらに任意の代替的な構造の切断の速度の減少を有し、その結果、特定の構造の切断の検出可能な量と、任意の代替的な構造の切断の検出可能な量との間の差が増加する酵素を提供することが本発明の範囲に入る。しかし、本発明は、改善された差を有する酵素に限定されない。
【００６１】
いくつかの好ましい態様において、本発明は、酵素を含有する組成物を提供し、ここでこの酵素は、異種機能性ドメインを含み、この異種機能性ドメインは核酸切断アッセイ法における機能性の変化（例えば、改善）を提供する。本発明は、核酸切断アッセイ法の性質に限定されない。例えば、核酸切断アッセイ法には、核酸が、酵素の存在下で直接的または間接的に切断される任意のアッセイ法が含まれる。特定の好ましい態様において、核酸切断アッセイ法は、侵襲性切断アッセイ法である。特に好ましい態様において、切断アッセイ法は、少なくとも1種のRNA成分を有する切断構造を利用する。別の特に好ましい態様において、切断アッセイ法は、少なくとも1種のRNA成分を有する切断構造を利用し、ここで切断構造のDNAメンバーが切断される。
【００６２】
本発明は、異種機能性ドメインによって提供される変化した機能性の性質によって限定されない。変化の例証的な例には、異種機能性ドメインが、核酸切断アッセイ法において、改善されたヌクレアーゼ活性、改善された基質結合活性、および／または改善されたバックグラウンド特異性を提供するアミノ酸配列（例えば、1つまたは複数のアミノ酸）を含む酵素が含まれるがこれらに限定されない。
【００６３】
本発明は、異種機能性ドメインの性質によって限定されない。例えば、いくつかの態様において、異種機能性ドメインは、ポリメラーゼのポリメラーゼドメインからの2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む（例えば、キメラ機能性ドメインの挿入によって酵素に導入されるか、または変異によって作製される）。特定の好ましい態様において、2つまたはそれ以上のアミノ酸の少なくとも1つは、ポリメラーゼドメインのパーム領域またはサム領域由来である。本発明は、2つまたはそれ以上のアミノ酸がそこから選択されたポリメラーゼと同じであることによって限定されない。特定の好ましい態様において、ポリメラーゼは、テルムス テルモフィルスポリメラーゼを含む。特に好ましい態様において、2つまたはそれ以上のアミノ酸は、配列番号：1のアミノ酸300-650由来である。
【００６４】
本発明の新規な酵素は、標的のDNAおよびRNA（疾患または他の症状と関連しているか、または関連し得るヒト、他の動物、または植物からの遺伝子を含むがこれらに限定されない、野生型および変異型の対立遺伝子を含む標的DNAおよびRNAを含むがこれらに限定されない）の検出のために利用され得る。さらに、本発明の酵素は、微生物の株（細菌、真菌、原生動物、繊毛虫類、およびウイルスを含む）の検出および／または同定のために（そして特に、C型肝炎ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスのようなRNAゲノムを有するウイルスの検出および同定のために）使用され得る。例えば、本発明は、以下の工程を含む核酸を切断するための方法を提供する：本発明の酵素および基質核酸を提供する工程；ならびに上記基質核酸を上記酵素に曝露する工程（例えば、検出され得る切断産物を産生するために）。いくつかの態様において、基質核酸は細胞溶解物試料中に存在する。
【００６５】
定義
本発明の理解を容易にするために、多くの用語および語句が以下に定義される。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成規則によって関連付けられるポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチドまたは標的核酸のようなヌクレオチドの配列）に対する言及において使用される。例えば、配列「5'-A-G-T-3'」は配列「3'-T-C-A-5'」に対して相補的である。相補性は「部分的」であり得、ここでは、核酸塩基のいくつかのみが塩基対形成規則に従って一致する。あるいは、核酸間で「完全な」または「全体の」相補性が存在し得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な効果を有する。これは、増幅反応ならびに核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。いずれの用語もまた、個々のヌクレオチドにおける言及において、とりわけポリヌクレオチドの文脈内で使用され得る。例えば、オリゴヌクレオチド中の特定のヌクレオチドが、別の核酸鎖中のヌクレオチドに対するその相補性について、またはその欠如について、残りのオリゴヌクレオチドと核酸鎖との間の相補性と対照または比較して注記され得る。標準的でない塩基対を形成するために使用されるヌクレオチドアナログもまた、別のヌクレオチドアナログを伴うか（例えば、IsoC/IsoG塩基対）または天然に存在するヌクレオチドを伴うか（例えば、米国特許第5,912,340号に記載されるようなもの、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）に関わらず、この定義の意味の中で塩基対パートナーに対する相補性として見なされる。さらに、ヌクレオチドが複数の異なる塩基と塩基対を形成することが知られている場合（例えば、IsoGヌクレオチドの、IsoCおよびTヌクレオチドと対合する能力）、水素結合に基づく塩基対を形成し得る各々の塩基は、本明細書中で使用されるような「相補性」の意味の中に入る。「汎用的な」塩基、すなわち、いくつかの他の塩基と塩基対を形成し得るもの（例えば、「ゆらぎ」塩基イノシン）は、対合が形成され得る塩基に相補的であると見なされる。
【００６７】
用語「相同的」および「相同性」は、同一性の程度をいう。部分的な相同性および完全な相同性が存在し得る。部分的に相同的な配列は別の配列に対して100％同一よりも少ないものである。
【００６８】
本明細書中で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、相補性核酸の対合に対する言及において使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関連する条件のストリンジェンシー、および形成されるハイブリッドのTmのような因子によって影響される。「ハイブリダイゼーション」方法は、1つの核酸の、別の相補性核酸、すなわち、相補性ヌクレオチド配列を有する核酸に対するアニーリングを含む。相補性配列を含む核酸の2つのポリマーが、互いを見い出しかつ塩基対相互作用を通してアニーニングする能力は、十分に認識されている現象である。MarmurおよびLane、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46: 453 (1960) およびDotyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46: 461 (1960) による「ハイブリダイゼーション」プロセスの最初の観察は、このプロセスが現代生物学の必須のツールに洗練されることへと続いた。
【００６９】
相補性に関して、いくつかの診断的適用についてハイブリダイゼーションが完全なまたは部分的な相補性を示すか否かを決定することが重要である。例えば、病原体DNA（例えば、ウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物からのDNA）の存在または非存在を単に検出することが所望される場合、ハイブリダイゼーション方法が、関連する配列が存在する場合にハイブリダイゼーションを確実にすることのみが重要である；部分的に相補的なプローブおよび完全に相補的なプローブの両方がハイブリダイズする条件が選択され得る。しかし、他の診断的適用は、ハイブリダイゼーション方法が部分的相補性と完全な相補性との間を区別することを必要とし得る。遺伝的多型を検出することは関心対象のものであり得る。例えば、ヒトヘモグロビンは、部分的には、4つのポリペプチド鎖からなる。これらの鎖うち2つが141アミノ酸の同一の鎖（α鎖）であり、これらの鎖うち2つが146アミノ酸の同一の鎖（β鎖）である。β鎖をコードする遺伝子は多型を示すことが知られている。正常な対立遺伝子は6位にグルタミン酸を有するβ鎖をコードする。変異体対立遺伝子は6位にバリンを有するβ鎖をコードする。このアミノ酸の差異は、鎌状赤血球貧血として臨床的に知られる深刻な（個体が変異体対立遺伝子についてホモ接合性である場合に最も深刻である）生理学的影響を有する。アミノ酸変化の遺伝的基礎は、正常な対立遺伝子のDNA配列と変異体の対立遺伝子のDNA配列との間の一塩基の差異を含むことは周知である。
【００７０】
本明細書中において使用される核酸配列の相補性とは、1つの配列の5'末端が他方の配列の3'末端と対合するように核酸配列とともに整列された場合に、「逆平行結合」にあるオリゴヌクレオチドをいう。天然の核酸に一般に見い出されない特定の塩基は本発明の核酸に含まれ得、これには、例えば、イノシンおよび7-デアザグアニンが含まれる。相補性は完全である必要はなく；安定な二重鎖はミスマッチ塩基対またはマッチしてしない塩基を含み得る。核酸技術の当業者は、多数の変数（例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成、およびオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度、およびミスマッチ塩基対の発生率を含む）を考慮して、二重鎖の安定性を経験的に決定し得る。
【００７１】
本明細書中で使用される場合、用語「Tm」は、「融解温度」に対する言及において使用される。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分一本鎖に解離する温度である。核酸のTmを計算するためのいくつかの数式が当該分野で周知である。標準的な参考文献によって示されるように、Tm値の単純な見積もりは、数式Tm=81.5+0.41(% G+C) によって計算され得、このとき核酸は1M NaClの水溶液中にある（例えば、AndersonおよびYoung、Quantitative Filter Hydridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985) を参照されたい）。他の参考文献（例えば、Allawi, H.T.およびSantaLucia, J., Jr. Thermodynamics and NMR of internal G.T. mismatches in DNA. Biochemistry 36, 10581-94 (1997)）には、Tmの計算のために、構造的および環境的、ならびに配列の特徴を考慮に入れる、より洗練された計算が含まれる。
【００７２】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる温度、イオン強度、および他の化合物の存在の条件に対する言及において使用される。「高ストリンジェンシー」条件を用いると、核酸塩基対形成は、高い相補性塩基配列の頻度を有する核酸断片間でのみ生じる。従って、互いに完全に相補的でない核酸が一緒にハイブリダイズするかまたはアニールすることが所望される場合には、「弱い」かまたは「低い」ストリンジェンシーの条件がしばしば必要とされる。
【００７３】
「高ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに対する言及において使用される場合、約500ヌクレオチドの長さのプローブが利用される場合に、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l  NaH2PO4 H2O、および1.85g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.5％ SDS、5×デンハルト試薬、および100μg/ml 変性サケ精子DNAからなる溶液中、42℃での結合またはハイブリダイゼーション、続いて、0.1×SSPE、1.0％ SDSを含む溶液中、42℃での洗浄に等価な条件を含む。
【００７４】
「中程度のストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに対する言及において使用される場合、約500ヌクレオチドの長さのプローブが利用される場合に、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l  NaH2PO4 H2O、および1.85g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.5％ SDS、5×デンハルト試薬、および100μg/ml 変性サケ精子DNAからなる溶液中、42℃での結合またはハイブリダイゼーション、続いて、1.0×SSPE、1.0％ SDSを含む溶液中、42℃での洗浄に等価な条件を含む。
【００７５】
「低ストリンジェンシー条件」は、約500ヌクレオチドの長さのプローブが利用される場合に、5×SSPE（43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4 H2O、および1.85g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整）、0.1％ SDS、5×デンハルト試薬［50×デンハルトは、500mlあたり以下を含む：5g フィコール（400型, Pharmacia）、5g BSA（Fraction V; Sigma）］、および100  g/ml 変性サケ精子DNAからなる溶液中、42℃での結合またはハイブリダイゼーション、続いて、5×SSPE、0.1％ SDSを含む溶液中、42℃での洗浄に等価な条件を含む。
【００７６】
用語「遺伝子」は、非コード機能を有するRNA（例えば、リボソームRNAまたは転移RNA）、ポリペプチドまたは前駆体の産生のために必要な制御配列またはコード配列を含むDNA配列をいう。RNAまたはポリペプチドは、所望の活性または機能が保持される限り、全長コード配列によって、またはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。
【００７７】
用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団中で最も頻繁に観察され、従って、遺伝子の「正常な」または「野生型」形態と任意に呼ばれる。対照的に、用語「改変された」「変異体」または「多型」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合、配列の改変または機能的特性の改変（すなわち、変化した特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物をいう。天然に存在する変異体が単離され得；これらは、これらが、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較して変化した特徴を有するという事実によって同定されることに注意するべきである。
【００７８】
用語「組換えDNAベクター」は、本明細書中で使用される場合、所望の異種配列を含むDNA配列をいう。例えば、この用語は発現された配列または発現産物をコードする配列の使用に限定されないが、いくつかの態様において、異種配列は、宿主生物中におけるコード配列の複製、または特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現のいずれかのために必要である、コード配列および適切なDNA配列である。原核生物における発現のために必要なDNA配列には、プロモーター、選択的にオペレーター配列、リボソーム結合部位、およびおそらく他の配列が含まれる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００７９】
用語「LTR」は、本明細書中で使用される場合、プロウイルス（すなわち、レトロウイルスの組み込まれた形態）の各々の末端で見い出される長い末端反復をいう。LTRは、転写制御配列、ポリアデニル化シグナル、ならびに複製およびウイルスゲノムへの組み込みのために必要である配列を含む、多数の調節シグナルを含む。ウイルスLTRは3つの領域（U3、R、およびU5と呼ばれる）に分けられる。
【００８０】
U3領域は、エンハンサーおよびプロモーターエレメントを含む。U5領域は、ポリアデニル化シグナルを含む。R（反復）領域は、U3およびU5領域を分離し、そしてR領域の転写された配列は、ウイルスRNAの5'末端および3'末端の両方に見られる。
【００８１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、2つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは少なくとも5ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約10〜15ヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも約15〜30ヌクレオチドを含む分子として定義される。正確なサイズは多くの因子に依存し、これは次には、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。このオリゴヌクレオチドは、任意の様式で生成され得、これには、化学合成、DNA複製、逆転写、PCR、またはその組み合わせが含まれる。
【００８２】
モノヌクレオチドは、1つのモノヌクレオチドのペントース環の5'リン酸がホスホジエステル結合を介して1つの方向でその隣のヌクレオチドの3'酸素に結合するような様式でオリゴヌクレオチドを生成するように反応するので、オリゴヌクレオチドの1つの末端は、その5'リン酸がモノヌクレオチドのペントース環の3'酸素に結合していない場合に、「5'末端」と呼ばれ、そしてその3'酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸に結合していない場合に「3'末端」と呼ばれる。本明細書中で使用される場合、核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドに対して内部である場合においてさえ、5'末端および3'末端を有するといわれ得る。核酸鎖に沿った第1の領域は、核酸の鎖に沿って5'から3'の方向に進んだときに第1の領域の3'末端が第2の領域の5'末端の前にある場合に、別の領域の上流であるといわれる。
【００８３】
2つの異なる非重複オリゴヌクレオチドが、同じ直鎖状の相補的核酸配列の異なる領域にアニールし、かつ一方のオリゴヌクレオチドの3'末端が他方の5'末端に向いている場合に、前者は「上流の」オリゴヌクレオチド、および後者は「下流の」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。同様に、2つの重複するオリゴヌクレオチドが同じ直鎖状の相補的核酸配列にハイブリダイズし、第1のオリゴヌクレオチドが、その5'末端が第2のオリゴヌクレオチドの5'末端の上流にあり、かつ第1のオリゴヌクレオチドの3'末端が第2のオリゴヌクレオチドの3'末端の上流にあるように配置されている場合、その第1のオリゴヌクレオチドは「上流の」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得、そして第2のオリゴヌクレオチドは「下流の」オリゴヌクレオチドと呼ばれ得る。
【００８４】
用語「プライマー」とは、プライマー伸長が開始される条件下に置かれた場合に、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、天然に存在し得、精製された制限酵素消化物中に存在し得、または合成的に製造され得る。
【００８５】
プライマーは、テンプレートの特定の配列の鎖に「実質的に」相補的であるとして選択される。プライマーは、プライマー伸長が起こるためにテンプレート鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなくてはならない。プライマー配列は、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、残りのプライマー配列が鎖に実質的に相補的であれば、相補的でないヌクレオチド断片がプライマーの5'末端に結合していてもよい。プライマー配列がテンプレートの配列とハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、それによって、プライマーの伸長産物の合成のためのテンプレートプライマー複合体を形成するという条件で、相補的でない塩基またはより長い配列がプライマーに分散され得る。
【００８６】
用語「標識」は、本明細書中で使用される場合、検出可能な（好ましくは定量可能な）効果を提供するために使用され得、かつ核酸またはタンパク質に結合され得る任意の原子または分子をいう。標識には以下が含まれるがこれらに限定されない：色素；32Pのような放射性標識；ビオチンのような結合部分；ジゴキシゲニンのようなハプテン；発光性、燐光発生性、または蛍光発生性部分；および、蛍光色素単独、または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）による励起スペクトルを抑制またはシフトさせ得る部分との組み合わせ。標識は、蛍光、放射能、比色定量、重量測定、X線散乱または吸収、磁力、酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供し得る。標識は、荷電した部分（正電荷または負電荷）であり得、または代替的には、電荷が中性であり得る。標識は、標識を含む配列が検出可能である限り、核酸またはタンパク質の配列を含み得るか、それらの配列からなり得る。
【００８７】
用語「シグナル」は、本明細書中で使用される場合、任意の検出可能な効果をいい、例えば、標識またはアッセイ反応によって引き起こされるか、または提供される。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、用語「検出器」は、シグナルまたは効果の存在を、ユーザまたはシステムの別の要素（例えば、コンピュータまたはコントローラ）に伝達し得る、システムまたはシステムの要素、例えば、機器（例えば、カメラ、蛍光測定装置、電荷と連係したデバイス、シンチレーションカウンターなど）または反応性媒体（X線フィルムまたはカメラフィルム、pH指示薬など）をいう。検出器は以下のシステムであり得る：蛍光または化学発光を含む、紫外光、可視光、または赤外光を検出し得る光度測定システムまたは分光光度測定システム；放射能検出システム；核磁気共鳴スペクトル測定、質量分析スペクトル測定、または表面増強ラマン散乱のようなスペクトル測定システム；ゲル電気泳動もしくはキャピラリー電気泳動、またはゲル排除クロマトグラフィーのようなシステム；あるいは、当該分野で公知の他の検出システムまたはその組み合わせ。
【００８９】
用語「切断構造」は、本明細書中で使用される場合、少なくとも1種のプローブオリゴヌクレオチドおよび標的核酸の相互作用によって形成される構造をいい、これは、二重鎖を含む構造を形成し、得られた構造は切断剤（酵素を含むがこれに限定されない）によって切断可能である。この切断構造は、二次構造に関わりなく（すなわち、二重鎖構造の形成が必要とされない）核酸分子を切断するホスホジエステラーゼのような剤による非特異的切断のための基質である核酸分子とは対照的に、切断手段による特異的切断のための基質である。
【００９０】
用語「折りたたまれた切断構造」は、本明細書中で使用される場合、二次構造を含む一本鎖の核酸基質の領域をいい、その領域は酵素的切断手段によって切断可能である。この切断構造は、二次構造に関わりなく（すなわち、基質の折りたたみが必要とされない）核酸分子を切断するホスホジエステラーゼのような剤による非特異的切断のための基質である核酸分子とは対照的に、切断手段による特異的切断のための基質である。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、用語「折りたたまれた標的」とは、少なくとも1つの二次構造の領域を含む核酸鎖をいう（すなわち、核酸の一本鎖中で、少なくとも1つの二本鎖領域および少なくとも1つの一本鎖領域）。折りたたまれた標的は、二次構造の領域に加えて、三次構造の領域を含み得る。
【００９２】
用語「切断手段」または「切断剤」は、本明細書中で使用される場合、切断構造を切断することができる任意の手段をいい、酵素を含むがこれに限定されない。この切断手段は5'ヌクレアーゼ活性を有する未変性のDNAP（例えば、Taq DNAポリメラーゼ、大腸菌 DNAポリメラーゼI）を含み得、および、より詳細には、5'ヌクレアーゼを有するが合成活性を欠く改変されたDNAPを含み得る。「構造特異的ヌクレアーゼ」または「構造特異的酵素」は、核酸分子における特定の二次構造を認識し、これらの構造を切断する酵素である。本発明の切断手段は、切断構造の形成に応答して核酸分子を切断し；切断手段が切断構造中の任意の特定の位置で切断構造を切断する必要はない。
【００９３】
切断手段は単に5'ヌクレアーゼ活性を有する酵素に限定されない。切断手段は、種々の供給源から提供されるヌクレアーゼ活性を含み得、これらには、CLEAVASE酵素、FEN-1エンドヌクレアーゼ（RAD2タンパク質およびXPGタンパク質を含む）、Taq DNAポリメラーゼ、および大腸菌 DNAポリメラーゼIが含まれる。
【００９４】
用語「熱安定性」は、酵素（例えば、5'ヌクレアーゼ）への言及において使用される場合、酵素が、高い温度、すなわち約55℃以上で機能的であるかまたは活性である（すなわち、触媒作用を実行し得る）ことを示す。
【００９５】
用語「切断産物」とは、本明細書中で使用される場合、切断手段の切断構造との反応（すなわち、切断手段を用いる切断構造の処理）によって生成される産物をいう。
【００９６】
用語「標的核酸」とは、少なくともプローブオリゴヌクレオチドとの少なくとも部分的な相補性を有し、かつINVADERオリゴヌクレオチドとの少なくとも部分的な相補性もまた有し得る配列を含む核酸分子をいう。標的核酸は、一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAを含み得、およびヌクレオチドアナログ、標識、および他の修飾を含み得る。
【００９７】
用語「プローブオリゴヌクレオチド」とは、INVADERオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下において標的核酸と相互作用して切断構造を形成するオリゴヌクレオチドをいう。標的核酸とアニールした場合、プローブオリゴヌクレオチドおよび標的は切断構造を形成し、そして切断がプローブオリゴヌクレオチド内で起こる。
【００９８】
用語「非標的切断産物」とは、標的核酸に由来しない切断反応の産物をいう。上記に議論したように、本発明の方法において、切断構造の切断は、一般的に、プローブオリゴヌクレオチド内で起こる。この標的核酸依存性切断によって生成されたプローブオリゴヌクレオチドの断片は、「非標的切断産物」である。
【００９９】
用語「INVADERオリゴヌクレオチド」とは、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションの領域の近傍の位置で標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをいい、ここで、このINVADERオリゴヌクレオチドは、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションの領域と重複する部分（例えば、化学的部分またはヌクレオチド-その標的に相補的であるか否かにか関わらない）を含む。いくつかの態様において、INVADERオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドの5'末端に位置する配列と実質的に同じである配列をその3'末端に含む。
【０１００】
用語「実質的に一本鎖」は、核酸基質に対する言及において使用される場合、基質分子が、内部の鎖の塩基対形成相互作用によって結合される核酸の2つの鎖として存在する二本鎖基質とは対照的に、核酸の一本鎖として主に存在することを意味する。
【０１０１】
用語「配列の変化」とは、本明細書中で使用される場合、2つの核酸間の核酸配列の違いをいう。例えば、野生型構造遺伝子およびこの野生型構造遺伝子の変異体型は、一塩基置換および／または、1つもしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入の存在によって配列が変化し得る。構造遺伝子のこれらの2つの形態は、互いに配列が変化しているといわれる。この構造遺伝子の第2の変異体型が存在し得る。この第2の変異体型は、この遺伝子の野生型遺伝子および第1の変異体型の両方と配列が異なっているといわれる。
【０１０２】
用語「遊離する」とは、本明細書中で使用される場合、遊離した断片がもはやその残りのオリゴヌクレオチドに共有結合していないように、例えば、5'ヌクレアーゼの作用による、より大きな核酸断片（例えば、オリゴヌクレオチド）からの核酸断片の放出をいう。
【０１０３】
用語「Km」とは、本明細書中で使用される場合、酵素についてのMichaelis-Menten定数をいい、所定の酵素が、酵素の触媒反応においてその最大速度の2分の1を生じる特定の基質の濃度として定義される。
【０１０４】
用語「ヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合、天然に存在するかおよび／または合成のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ならびにヌクレオチド誘導体を含むがこれらに限定されない。例えば、この用語は以下を含む：天然に存在するDNAまたはRNAのモノマー、ペプチド核酸（PNA）のようなバックボーン修飾を有するヌクレオチド（M. Egholmら、Nature 365:566 [1993]）、ホスホロチオエートDNA、ホスホロジチオエートDNA、ホスホルアミデートDNA、アミド結合DNA、MMI結合DNA、2'-O-メチルRNA、αDNAおよびメチルホスホネートDNA、糖修飾を有するヌクレオチド（例えば、2'-O-メチルRNA、2'-O-フルオロRNA、2'-アミノRNA、2'-O-アルキルDNA、2'-O-アリルDNA、2'-O-アルキニルDNA、ヘキソースDNA、ピラノシルRNA、およびアンヒドロヘキシトールDNA）および塩基修飾を有するヌクレオチド（例えば、C-5置換ピリミジン（置換基は以下を含む：フルオロ-、ブロモ-、クロロ-、ヨード-、メチル-、エチル-、ビニル-、ホルミル-、エチニル-、プロピニル-、アルキニル-、チアゾリル-、イミダゾリル-、ピリジル-）、C-7置換基を有する7-デアザプリン（置換基は以下を含む：フルオロ-、ブロモ-、クロロ-、ヨード-、メチル-、エチル-、ビニル-、ホルミル-、アルキニル-、アルケニル-、チアゾイル-、イミダゾリル-、ピリジル-））、イノシン、ならびにジアミノプリン。
【０１０５】
用語「塩基アナログ」は、本明細書中で使用される場合、7-デアザプリン（例えば、7-デアザアデニンおよび7-デアザグアニン）のような修飾したかまたは天然に存在しない塩基をいい；塩基は、例えば、標準的でない塩基対形成のような相互作用の変化を提供するために修飾され、以下を含むがこれらに限定されない：IsoC、IsoG、および米国特許第5,432,272号；同第6,001,983号；同第6,037,120号；同第6,140,496号；5,912,340号；同第6,127,121号、および同第6,143,877号（これらの各々はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）に記載される他の修飾された塩基およびヌクレオチド；プリンまたはピリミジン環システムに基づかない複素環式塩基アナログ、および他の複素環式塩基。ヌクレオチドアナログには塩基アナログが含まれ、デオキシリボヌクレオチドならびにリボヌクレオチドの修飾型が含まれる。
【０１０６】
用語「多型遺伝子座」は、集団のメンバー間の変化を示す集団中に存在する遺伝子座である（例えば、大部分の一般的な対立遺伝子は0.95未満の頻度を有する）。対照的に、「単型遺伝子座」は、集団のメンバー間に変化がほとんど見られないか、または見られない遺伝子座である（一般的に、大部分の一般的な対立遺伝子は、集団の遺伝子プールにおいて0.95の頻度を超える遺伝子座として取られる）。
【０１０７】
用語「微生物」は、本明細書中で使用される場合、小さすぎて肉眼では観察できない生物を意味し、これには、細菌、ウイルス、原生動物、真菌、および繊毛虫が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０８】
用語「微生物遺伝子配列」とは、微生物に由来する遺伝子配列をいう。
【０１０９】
用語「細菌」とは、真正細菌種および古細菌種を含む任意の細菌種をいう。
【０１１０】
用語「ウイルス」とは、自律的複製が不可能な（すなわち、複製には宿主細胞の機構の使用を必要とする）、偏性の、限外顕微的な、細胞内寄生生物をいう。
【０１１１】
用語「多剤耐性」または「複数薬剤耐性」とは、微生物の処理において使用される抗生物質または抗微生物剤の1種より多くに耐性である微生物をいう。
【０１１２】
本明細書および特許請求の範囲における用語「試料」は、その最も広い意味において使用される。一方では、この用語は標本または培養物（例えば、微生物学的培養物）を含むことを意味する。他方では、この用語は、生物学的試料および環境試料の両方を含むことを意味する。試料は、合成起源の試料を含み得る。
【０１１３】
生物学的試料は、ヒトを含む動物、体液、固体（例えば、糞便）、または組織、ならびに、液体の食物および固体の食物、および食物製品および食品成分（例えば、酪農品目、野菜、肉および肉の副産物、ならびに廃棄物）であり得る。生物学的試料は、家畜用動物、ならびに野生動物または野獣の種々のファミリーのすべてから得られ得、有蹄動物、クマ、魚、ウサギ、齧歯動物などのような動物を含むがこれらに限定されない。
【０１１４】
環境試料には、表面物質、土、水、および産業的試料のような環境物質、ならびに食物および乳製品加工器具、装置、設備、用具、使い捨ておよび使い捨てでない品目から得られた試料が含まれる。これらの例は、本発明に適用できる試料の型を限定するものと解釈されない。
【０１１５】
用語「標的核酸の供給源」とは、核酸（RNAまたはDNA）を含む任意の試料をいう。特に好ましい標的核酸の供給源は、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳、リンパ、痰、および精液を含むがこれらに限定されない生物学的試料である。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドは、そのオリゴヌクレオチドが他のオリゴヌクレオチド（または標的核酸配列）よりも高いモル濃度で存在する場合、別のオリゴヌクレオチド（または標的核酸配列）に対して「過剰に」存在しているといわれる。プローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドが、切断反応において相補的標的核酸配列の濃度に対して過剰に存在している場合、その反応は、存在する標的核酸の量を示すために使用され得る。代表的には、過剰に存在する場合、プローブオリゴヌクレオチドは少なくともモル濃度が100倍過剰に存在し；標的核酸が約10fモル以下存在する場合には、代表的には少なくとも1pモルの各プローブオリゴヌクレオチドが使用される。
【０１１７】
第1および第2の標的核酸を「含むと疑われる」試料は、標的核酸分子のいずれかを含み得るか、両方を含み得るか、またはいずれも含み得ない。
【０１１８】
用語「電荷が釣り合った」オリゴヌクレオチドとは、改変されたオリゴヌクレオチドが電荷を有するように改変されたオリゴヌクレオチド（反応におけるインプットオリゴヌクレオチド）をいい、その結果、改変されたオリゴヌクレオチドが切断されるか（すなわち、短縮化される）または伸長されるかのいずれかの場合、得られる産物がインプットオリゴヌクレオチド（「電荷が釣り合っていない」オリゴヌクレオチド）とは異なる電荷を有し、それによって、インプットオリゴヌクレオチドおよび反応したオリゴヌクレオチドの電荷に基づく分離を可能にする。用語「電荷が釣り合った」は、改変されたかまたは電荷が釣り合ったオリゴヌクレオチドが正味の中性の電荷を有すること（これはあり得る場合であるが）を意味するものではない。電荷が釣り合うとは、このインプットオリゴヌクレオチドから生成した特定の反応産物が、インプットオリゴヌクレオチドからの電荷に基づいて分離され得るようなオリゴヌクレオチドの設計および改変をいう。
【０１１９】
例えば、INVADERオリゴヌクレオチド指向性切断アッセイ法において、このアッセイ法では、プローブオリゴヌクレオチドが配列：
2005518223.tif 000007
（すなわち、配列番号：136（改変された塩基なし））を有し、かつプローブの切断が第2および第3の残基の間で起こり、このオリゴヌクレオチドの1つの可能な電荷が釣り合ったバージョンは、
2005518223.tif 000008
である。この改変されたオリゴヌクレオチドは正味の負電荷を有する。切断後、以下のオリゴヌクレオチドが生成される：5'Cys3-アミノT-アミノ-T 3'および
2005518223.tif 000009
（配列番号：136の3-22残基）。5'Cys3-アミノT-アミノ-T 3'は、検出可能な部分（正に荷電したCy3色素）および2つのアミノ修飾塩基を有する。アミノ修飾塩基およびCy3色素は、リン酸基によって寄与される負電荷を超える正電荷に寄与し、従って、5'Cy3-アミノT-アミノ-T 3' オリゴヌクレオチドは正味の正電荷を有する。他方のより長い切断断片は、インプットプローブのように、正味の負電荷を有する。5'Cys3-アミノT-アミノ-T 3'断片がインプットプローブからの電荷に基づいて分離可能であるので（電荷が釣り合ったオリゴヌクレオチド）、これは、電荷が釣り合っていないオリゴヌクレオチドといわれる。より長い切断産物は、インプットオリゴヌクレオチドからの電荷に基づいて分離されることができない。なぜなら、両方のオリゴヌクレオチドが正味の負電荷を有するからである；従って、より長い切断産物は電荷が釣り合っていないオリゴヌクレオチドではない。
【０１２０】
用語「正味の中性の電荷」は、修飾したオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドに対する言及において使用される場合、存在する電荷の総計（すなわち、チミジン上のR-NH3+基、シトシンのN3窒素、リン酸基の存在または非存在など）が、所望の反応または分離の条件下で実質的に０であることを示す。正味の中性の電荷を有するオリゴヌクレオチドは電場中では移動しない。
【０１２１】
用語「正味の正電荷」は、修飾したオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドに対する言及において使用される場合、存在する電荷の総計（すなわち、チミジン上のR-NH3+基、シトシンのN3窒素、リン酸基の存在または非存在など）が、所望の反応条件下で+1以上であることを示す。正味の正電荷を有するオリゴヌクレオチドは電場中では陰極に向かって移動する。
【０１２２】
用語「正味の負電荷」は、修飾したオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドに対する言及において使用される場合、存在する電荷の総計（すなわち、チミジン上のR-NH3+基、シトシンのN3窒素、リン酸基の存在または非存在など）が、所望の反応条件下で-1以下であることを示す。正味の負電荷を有するオリゴヌクレオチドは電場中では陽極に向かって移動する。
【０１２３】
用語「重合手段」または「重合剤」とは、オリゴヌクレオチドへのヌクレオシド三リン酸の付加を容易にすることができる任意の薬剤をいう。好ましい重合手段はDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼを含む。
【０１２４】
用語「ライゲーション手段」または「ライゲーション手段」とは、ライゲーション（すなわち、核酸の2つの鎖の末端に位置する3'-OHと5'-Pとの間のホスホジエステル結合の形成）を容易にすることができる任意の薬剤をいう。好ましいライゲーション手段はDNAリガーゼまたはRNAリガーゼを含む。
【０１２５】
用語「反応剤」は、その最も広い意味で本明細書中で使用される。反応剤は、例えば、酵素的反応剤、化学的反応剤、または光（例えば、紫外光、特に短波長の紫外光がオリゴヌクレオチド鎖を開裂させることが知られている）を含み得る。オリゴヌクレオチドを短縮化（すなわち、切断）するか、または伸長させるかのいずれかのためにオリゴヌクレオチドと反応させることができる任意の剤は、用語「反応剤」の中に含まれる。
【０１２６】
用語「付加物」は、オリゴヌクレオチドに付加され得る任意の化合物または要素を示すために、本明細書中ではその最も広い意味において使用される。付加物は、電荷（正電荷または負電荷）を有し得るか、または電荷が中性であり得る。付加物は、共有結合または非共有結合を介してオリゴヌクレオチドに付加され得る。付加物の例には、以下が含まれるがこれらに限定されない：インドジカルボシアニン色素アミダイト、アミノ置換ヌクレオチド、エチジウムブロマイド、エチジウムホモダイマー、（1,3-プロパンジアミノ）プロピジウム、（ジエチレントリアミノ）プロピジウム、チアゾールオレンジ、（N-N'-テトラメチル-1,3-プロパンジアミノ）プロピルチアゾールオレンジ、（N-N'-テトラメチル-1,2-エタンジアミノ）プロピルチアゾールオレンジ、チアゾールオレンジ-チアゾールオレンジホモダイマー（TOTO）、チアゾールオレンジ-チアゾールブルーヘテロダイマー（TOTAB）、チアゾールオレンジ-エチジウムヘテロダイマー1（TOED1）、チアゾールオレンジ-エチジウムヘテロダイマー2（TOED2）、およびフルオレセイン-エチジウムヘテロダイマー（FED）、ソラレン、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジンなど。
【０１２７】
第1のオリゴヌクレオチドが標的核酸の領域に相補的であり、第2のオリゴヌクレオチドが同じ領域（またはこの領域の一部）に相補性を有する場合、「配列重複の領域」が標的核酸に沿って存在する。重複の程度は、相補性の性質に依存して変化する（例えば、図29および67における領域Xおよび付随する議論を参照されたい）。
【０１２８】
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」または「精製する」は、試料からの夾雑物の除去をいう。例えば、組換えCLEAVASEヌクレアーゼは細菌宿主細胞中で発現され、そしてそのヌクレアーゼは宿主細胞タンパク質の除去によって精製され；これらの組換えヌクレアーゼの割合はそれによって試料中で増大される。
【０１２９】
用語「組換えDNA分子」は、本明細書中で使用される場合、分子生物学技術によって互いに結合したDNAのセグメントからなるDNA分子をいう。
【０１３０】
用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、組換えDNA分子から発現されるタンパク質分子をいう。
【０１３１】
本明細書中で使用される場合、用語「部分（一部）」とは、タンパク質に対する言及において（「所定のタンパク質の部分（一部）」においてのように）使用される場合、そのタンパク質の断片をいう。この断片は、4アミノ酸残基から全体のアミノ酸配列マイナス1アミノ酸まで（例えば、4、5、6、...、n-1）のサイズの範囲であり得る。
【０１３２】
用語「核酸配列」は、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、およびその断片または一部、ならびに、一本鎖または二本鎖であり得、およびセンス鎖またはアンチセンス鎖を表すゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAをいう。同様に、「アミノ酸配列」は、本明細書中で使用される場合、ペプチドまたはタンパク質の配列をいう。
【０１３３】
用語「ペプチド核酸（「PNA」）」は、本明細書中で使用される場合、天然の核酸において見い出されるが、核酸の代表的な糖リン酸バックボーンよりもむしろペプチドバックボーンに結合されるような塩基または塩基アナログを含む分子をいう。ペプチドへの塩基の結合は、例えば、塩基が、オリゴヌクレオチドのそれと同様の様式で核酸の相補的塩基との塩基対形成を可能にするようなものである。これらの小さな分子はまた、抗遺伝子剤と呼ばれ、核酸のそれらの相補鎖への結合による転写伸長を停止する（Nielsenら、Anticancer Drug Des. 8: 53 63 [1993]）。
【０１３４】
本明細書中で使用される場合、用語「精製された」または「実質的に精製された」とは、それらの天然の環境から取り出されたか、単離されたか、または分離された、核酸またはアミノ酸の配列のいずれかであって、それらが天然に付随していた他の成分を、少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、および最も好ましくは90％含まない分子をいう。それゆえに、「単離されたポリヌクレオチド」または「単離されたオリゴヌクレオチド」は、実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【０１３５】
本明細書中で使用される場合、用語「融合タンパク質」とは、外因性のタンパク質断片（CLEAVASE BN／トロンビンヌクレアーゼでないタンパク質からなる融合パートナー）に結合された関心対象のタンパク質（例えば、CLEAVASE BN／トロンビンヌクレアーゼおよびその一部または断片）を含むキメラタンパク質をいう。融合パートナーは、宿主細胞において発現された場合、組換えキメラタンパク質（例えば、CLEAVASE BN／トロンビンヌクレアーゼ）の溶解度を高め得、宿主細胞または培養上清、またはその両方からの組換え融合タンパク質の精製を可能にするアフィニティータグ（例えば、hisタグ）を提供し得る。所望される場合、この融合タンパク質は、当該分野で公知の種々の酵素的または化学的手段によって、関心対象のタンパク質（例えば、CLEAVASE BN／トロンビンヌクレアーゼまたはその断片）から取り除かれ得る。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合、用語「キメラタンパク質」および「キメラのタンパク質」とは、2つまたはそれ以上の親のタンパク質に由来するアミノ酸配列部分を含む単一のタンパク質分子をいう。これらの親の分子は、遺伝学的に別個の起源からの類似のタンパク質から、単一の生物からの異なるタンパク質、または異なる生物からの異なるタンパク質からであり得る。例示の目的で、しかし限定の目的ではなく、本明細書のキメラ構造特異的ヌクレアーゼは、FEN-1遺伝子のような遺伝子を有する2種またはそれ以上の生物からの、天然に存在しないヌクレアーゼを形成するように組み合わされたFEN-1遺伝子に由来するアミノ酸配列の混合物を含み得る。用語「キメラの」は、本明細書中で使用される場合、天然に存在する遺伝子からのいかなる特定の割合の寄与をも与えることは意図されず、また、その一部が組み合わされる様式を限定することも意図されない。本明細書中に記載される方法を試験することによって決定されるような切断活性を有する任意のキメラ構造特異的ヌクレアーゼ構築物は、本発明の範囲内にある改善された切断剤である。
【０１３７】
用語「核酸の連続鎖」は、本明細書中で使用される場合、ニックまたは他の破損を有さない、連続し、共有結合性の、バックボーン構造を有する核酸の鎖を意味する。各ヌクレオチドの塩基部分の配置は、塩基対形成したか、一本鎖か、またはミスマッチ形成したかに関わらず、連続鎖の定義の中にある要素ではない。連続鎖のバックボーンは、天然に存在する、修飾されていない核酸において見い出されるリボースリン酸またはデオキシリボースリン酸の組成に限定されない。本発明の核酸は、バックボーンの構造における修飾を含み得、これには、ホスホロチオエート残基、ホスホネート残基、2'置換リボース残基（例えば、2'-O-メチルリボース）、および代替的な糖（例えば、アラビノース）含有残基が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３８】
用語「連続二重鎖」は、本明細書中で使用される場合、二重鎖中で塩基対の進行において破損が存在しない二本鎖核酸の領域をいう（すなわち、二重鎖に沿った塩基対は、連続鎖の領域の境界を有するギャップ、突出部、またはミスマッチを受け入れるために歪んでいない）。本明細書中で使用される場合、この用語は、二重鎖内の塩基対の配置のみをいい、核酸鎖のバックボーン部分における連続性の意味合いは伴わない。中断していない塩基対形成を有するが、一方または両方の鎖においてニックを有する二重鎖核酸は、連続二重鎖の定義の中に入る。
【０１３９】
用語「二重鎖」とは、一方の鎖上のヌクレオチドの塩基部分が水素結合を通して、第2の鎖上に整列したそれらの相補的塩基に結合する核酸の状態をいう。二重鎖型にある状態は、核酸の塩基の状態を反映する。塩基対形成によって、核酸の鎖はまた、一般的に、大きな溝および小さな溝を有する二重らせんの三次構造をとる。らせん型をとることは、二重鎖になる作用に内在的に含まれることである。
【０１４０】
用語「二重鎖依存的タンパク質結合」とは、二重鎖またはらせん型にある核酸に依存する、核酸へのタンパク質の結合をいう。
【０１４１】
用語「二重鎖依存的タンパク質結合部位または領域」とは、本明細書中で使用される場合、特異的二重鎖依存性核酸結合タンパク質によって特定のアフィニティーで結合する核酸中の別個の領域または配列をいう。これは、部位特異的でないタンパク質の一般化された二重鎖依存性結合（例えば、特定の配列または部位に対してほとんど言及されない、クロマチンを結合するヒストンタンパク質）とは対照的である。
【０１４２】
用語「タンパク質結合タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、特定のタンパク質またはタンパク質のクラスへの結合する際の配列または構造によって同定される核酸領域をいう。既知の配列に対する比較によってこの領域の同定を可能にするための十分な遺伝的情報を含むが、実際の結合のために不可欠な構造を有さないかもしれない領域（例えば、二重鎖依存性核酸結合タンパク質部位の一本鎖）を含めることはこの定義の範囲に含まれる。本明細書中で使用される場合、「タンパク質結合領域」は、制限エンドヌクレアーゼ結合領域を除外する。
【０１４３】
用語「完全な二本鎖タンパク質結合領域」は、本明細書中で使用される場合、二重鎖依存性タンパク質の結合活性または他の活性を可能にするために必要とされる連続する二重鎖の最小領域をいう。この定義は、完全な活性を有するいくつかの二重鎖依存性核酸結合タンパク質が、2つの一本鎖の一方または他方において観察されるような標準的なタンパク質結合領域よりも短くあり得る二重鎖の領域と相互作用し得るという観察を含むことが意図される。換言すれば、領域における1つまたは複数のヌクレオチドは、結合を抑制することなく、対合しないままで残っていることが許容され得る。本明細書中で使用される場合、用語「完全な二本鎖結合領域」とは、結合機能を供給する最小の配列をいう。いくつかのこのような領域が複数の場所において二重鎖でない配列を許容し得るので、同時に必要とはされないが、単一のタンパク質結合領域は、二重鎖となった場合にタンパク質結合のために十分に適合可能である、いくつかのより短いサブ領域を有し得る。
【０１４４】
用語「テンプレート」とは、相補的コピーが、ヌクレオシド三リン酸から、テンプレート依存性核酸ポリメラーゼの活性を通して構築される核酸の鎖をいう。二重鎖中で、テンプレート鎖は、慣例により、「ボトム」鎖として描写および記載される。同様に、非テンプレート鎖は、しばしば、「トップ」鎖として描写および記載される。
【０１４５】
用語「テンプレート依存性RNAポリメラーゼ」とは、上記に記載されたテンプレート鎖のコピーを通して新規なRNA鎖を作製し、かつテンプレートの非存在下でRNAを合成しない核酸ポリメラーゼをいう。これは、テンプレートを参照することなく、核酸を合成または伸長させるテンプレート非依存性核酸ポリメラーゼの活性と対照的であり、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたはポリAポリメラーゼである。
【０１４６】
用語「ARRESTOR分子」とは、引き続く作用または反応に関与することから、1つまたは複数の反応成分を停止させるために、侵襲性切断反応に付加されるか、または含められる剤をいう。これは、いくつかの反応成分を封鎖するかまたは不活性化することによって（例えば、核酸成分を結合することまたは塩基対形成することによって、あるいはタンパク質成分に結合することによって）なされ得る。用語「ARRESTORオリゴヌクレオチド」とは、任意の反応の1つまたは複数の局面（例えば、第1の反応および／または任意の引き続く反応または作用；ARRESTORオリゴヌクレオチドが任意の特定の反応または反応工程に限定されることは意図されない）を停止または阻止するために侵襲性切断反応において含められるオリゴヌクレオチドをいう。これは、いくつかの反応成分を封鎖すること（例えば、別の核酸への塩基対形成、またはタンパク質成分への結合）によってなされ得る。しかし、この用語は、反応成分が封鎖される状況のみに関して限定されることは意図されない。
【０１４７】
本明細書中で使用される場合、用語「キット」とは、物質を送達するための任意の送達系をいう。反応アッセイ法の文脈において、このような送達系は、反応試薬（例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など）および／または補助物質（例えば、緩衝剤、アッセイ法を実行するための指示書など）の、1つの場所から別の場所への、保存、輸送、または送達を可能にする系を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助物質を含む1つまたは複数の同封物（例えば、箱）を含む。本明細書中で使用される場合、用語「細分化キット」とは、各々が全体のキットの成分を分けた部分を含む、2つまたはそれ以上の別々の容器を備える送達系をいう。この容器は、一緒にまたは別々に意図するレシピエントに送達され得る。例えば、第1の容器はアッセイ法における使用のための酵素を含み得るのに対して、第2の容器はオリゴヌクレオチドを含む。用語「細分化キット」は、米国連邦食品医薬品化粧品法第520（e）節の下で調節される分析物特異的試薬（ASR）を含むキットを含むことが意図されるがこれに限定されない。確かに、各々が全体のキット成分を分けた部分を含む、2つまたはそれ以上の別々の容器を備える送達系は、用語「細分化キット」に含まれる。対照的に、「組み合わせキット」とは、単一の容器中に反応アッセイ法の成分のすべてを含む（例えば、所望の成分の各々を収納する単一の箱中）送達系をいう。用語「キット」は、細分化キットおよび組み合わせキットの両方を含む。
【０１４８】
本明細書中で使用される場合、用語「機能性ドメイン」とは、タンパク質の1つまたは複数の機能的特徴を提供するタンパク質（例えば、酵素）の領域または領域の一部をいう。例えば、酵素の機能性ドメインは、基質結合能力および触媒活性が含まれるがこれらに限定されない、1つまたは複数の酵素の活性を直接的または間接的に提供し得る。機能性ドメインは、機能性ドメイン中の1つまたは複数のアミノ酸の変異を通して特徴付けされ得、ここで、アミノ酸の変異は関連する機能性を変化させ（アッセイ法において経験的に測定されるように）、それによって機能性ドメインの存在を示す。
【０１４９】
本明細書中で使用される場合、用語「異種機能性ドメイン」とは、その天然の環境にはないタンパク質の機能性ドメインをいう。例えば、異種機能性ドメインは、1つの酵素から別の酵素に導入された機能性ドメインを含む。異種機能性ドメインはまた、いくつかの方法（例えば、変異されたか、複数コピーに付加されたかなど）において変化されたタンパク質に対して未変性の機能性ドメインを含む。異種機能性ドメインは、複数の連続したアミノ酸を含み得るか、または、2つもしくはそれ以上の末端のアミノ酸もしくはアミノ酸断片（例えば、介在する、異種でない配列を有する2つまたはそれ以上のアミノ酸または断片）を含み得る。異種機能性ドメインは、異種アミノ酸が自然界ではアミノ酸配列に天然に付随することが見い出されていないか、または自然界では見い出されていないタンパク質の部分に付随するアミノ酸配列に結合されるか、またはそれを含むという意味で、内因性機能性ドメインから区別される。
【０１５０】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸切断アッセイ法における変化した機能性」とは、その天然の状態とは異なる（例えば、どのようにして自然界において見い出されたかが異なる）いくつかの様式で変化された酵素の性質をいう。変化には、異種機能性ドメインの付加（例えば、変異を通して、またはキメラタンパク質の作製を通して）が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、酵素の変化した特徴は、核酸切断アッセイ法における酵素の性能を改善するものであり得る。改善の型には以下が含まれるがこれらに限定されない：改善されたヌクレアーゼ活性（例えば、改善された反応の速度）、改善された基質結合（例えば、所望の結果［例えば、より高い特異性、改善された基質代謝回転など］を産生する特定の核酸種［例えば、RNAまたはDNA］の結合の増加または減少）、および改善されたバックグラウンド特異性（例えば、所望されない産物がより少なく産生される）。本発明は、改善された機能性を試験するために使用される核酸切断アッセイ法に限定されない。しかし、本発明のいくつかの好ましい態様において、侵襲性切断アッセイ法は、核酸切断アッセイ法として使用される。特定の特に好ましい態様において、RNA標的を利用する侵襲性切断アッセイ法は、核酸切断アッセイ法として使用される。
【０１５１】
本明細書中で使用される場合、用語「N末端」および「C末端」は、ポリペプチド配列に対する言及において、それぞれ、ポリペプチドのN末端領域およびC末端領域の部分を含むポリペプチドの領域をいう。ポリペプチドのN末端領域の部分を含む配列は、主としてポリペプチド鎖のN末端の半分からのアミノ酸を含むがこのような配列に限定されない。例えば、N末端配列は、ポリペプチドのN末端の半分およびC末端の半分の両方からの塩基を含むポリペプチド配列の内部部分を含み得る。同じことは、C末端領域に適用される。N末端領域およびC末端領域は、それぞれ、ポリペプチドの最終的なN末端およびC末端を規定するアミノ酸を含み得るが、必ずしもそうである必要はない。
【０１５２】
本発明の一般的説明
INVADER技術（例えば、米国特許第5,846,717号、同第5,985,557号、同第5,994,069号、および同第6,001,567号、ならびにPCT国際公開公報第97/27214および同第98/42873号を参照されたい、これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）は、特定の核酸配列（mRNAの単一の点変異および類似の改変体を含む）の検出および定量に適用され得るシグナル増幅系を提供する。さらに、この技術は、対立遺伝子特異的なハイブリダイゼーションに独占的に依存するのではないので、同じ試料中で密接に関連するRNAを定量するために十分に適している。本発明は、核酸、特にRNA核酸のINVADERアッセイ法に基づく検出のために酵素を作製するための、改善された酵素および方法を提供する。本発明はまた、本発明の改善された酵素を使用するINVADERアッセイ法の実行のためのキットを提供する。
【０１５３】
INVADERアッセイ法は、構造特異的酵素による特異的構造の酵素的切断によって標的に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出する（INVADER assays, Third Wave Technologiesを参照されたい；例えば、米国特許第5,846,717号；同第5,985,557号；同第6,090,543号；同第6,001,567号；第5,985,557号；同第6,090,543号；同第5,994,069号；Lyamichevら、Nat. Biotech., 17: 292 (1999)、Hallら、PNAS, USA, 97: 8272 (2000)、国際公開公報第97/27214および同第98/42873号を参照されたい。これらの各々は、すべての目的のためにその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。特定の核酸配列の定量的測定のためのその使用に加えて、高い特異性は一塩基の変化を検出する能力を提供する。INVADER技術の基礎は、配列よりもむしろ構造に応答した特定の位置でのDNAおよびRNA分子の切断である。切断は、代表的には5'ヌクレアーゼ酵素によって触媒される。5'ヌクレアーゼ酵素は、2つのオリゴヌクレオチドプローブ（上流のINVADERプローブおよび下流のシグナルプローブ）が核酸標的にタンデムにハイブリダイズして、基質複合体を生成する場合に形成される正確な構造を認識する（図1A）。INVADER技術の高い特異性は、配列特異的プローブハイブリダイゼーションを構造特異的酵素的切断と組み合わせることから生じる。基質複合体は正確な酵素認識：ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド間の重複のために重要な特徴を含む。侵襲性構造を形成するために、上流INVADERオリゴヌクレオチドの3'末端は、少なくとも1つの塩基でシグナルプローブのハイブリダイズした領域と重複しなくてはならない（Lyamichevら、Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999]）。この重複は、上流INVADERオリゴヌクレオチドの3'部分と下流プローブオリゴヌクレオチドの標的相補的領域の5'部分との間の配列の重複によって作製され得る。このように重複された配列の領域は、一塩基まで小さくてもよい。重複した配列（すなわち、重複）の長さに関わらず、上流INVADERオリゴヌクレオチドの3'末端塩基は標的鎖に相補的である必要はなく、任意のヌクレオチドであり得る。いくつかの態様において、この末端のヌクレオチドは、ヌクレオチドに類似する化学的特性を有する部分（例えば、ヌクレオチドアナログまたは有機環状化合物）によって置換され得る（例えば、米国特許第5,985,557号を参照されたい）。代替的な態様において、重複は、2つのプローブの標的-相補的領域間の配列のいかなる重複も含む必要はない（Lyamichevら、Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999]および米国特許第5,985,557号）。この態様において、INVADERおよびシグナルプローブは、連続しかつ重複していない標的の隣接する領域に相補的な領域を有する。配列が共有されていない場合、上流INVADERオリゴヌクレオチドの3'末端は、標的鎖に相補的でない、少なくとも1つのさらなるヌクレオチドまたはヌクレオチド様アナログを含む（Lyamichevら、Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999]）。これは、配列重複とは対照的に、物理的重複といわれ得る。いずれの型の重複も、INVADERアッセイ法の侵襲性切断の重要な特徴である重複のための要件を満たす。これらの態様のいくつかは図2に図解的に示される。上記に記載される重複の構成とは対照的に、プローブが、連続しかつ重複していない標的の隣接する領域に相補的な領域を有し、かつ上流のオリゴヌクレオチドの3'末端は任意のさらなる塩基また��部分を有しない場合、侵襲性構造は形成されない（図3A）。標的鎖に相補的でない下流のオリゴヌクレオチドの5'末端上の1つまたは複数のさらなる塩基の存在でさえ、必須の重複を作製しない。この後者の構造（図3B）は、米国特許第5,874,283号に記載されるように、「侵襲性切断」ではないが、このような構造は本発明の特定の態様において用途を見い出す。
【０１５４】
いくつかの5'ヌクレアーゼは、上流のオリゴヌクレオチドが切断反応において活性であることは必要でないかもしれない。切断は、上流のオリゴヌクレオチドなしではより遅くなり得るが、これはなお起こり得る（Lyamichevら、Science 260: 778 [1993]、Kaiserら、J. Biol. Chem. 274, 21387 [1999]）。DNA鎖が、プローブオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするテンプレートまたは標的鎖である場合、DNAポリメラーゼおよびいくつかのフラップエンドヌクレアーゼ（FEN）（例えば、メタノコックス ヤナシイ由来のもの）由来の5'ヌクレアーゼは、重複を提供する上流オリゴヌクレオチドなして十分に良好に切断し得る（Lyamichevら、Science 260: 778 [1993]、Kaiserら、J. Biol. Chem. 274, 21387 [1999]、および米国特許第5,843,669号、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）。他のFEN（例えば、アルカエグロブス フルギドゥス（Afu）およびピロコックス フリオサス（Pfu）からのもの）は、それらが、重複のための本質的に絶対的な要件を有すると見なされ得る、非重複構造（すなわち、上流オリゴヌクレオチドを失ったか、または重複しない上流のオリゴヌクレオチドを有するかのいずれか）で行うよりも、ずっと速い速度でDNA標的上の重複した構造を切断する（Lyamichevら、Nat Biotechnol. 17: 292 [1999]、Kaiserら、J. Biol. Chem. 274, 21387 [1999]）。RNA標的がDNAオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズされて切断構造を形成する場合、多くのFENは、重複の存在に関わらず、下流のDNAプローブを不十分に切断する。このようなRNA含有構造において、DNAポリメラーゼ由来の5'ヌクレアーゼは重複のために強力な要件を有し、かつその非存在下では本質的に不活性である。
【０１５５】
重複のための厳重な要件を有する条件下でのINVADERアッセイ法を実行すること（例えば、DNA標的検出のためにAfu FEN、またはRNA標的検出のためにTth DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼを使用すること）は、単一のヌクレオチドまたは他の配列変化を検出する優秀な手段を提供する。1つの態様において、シグナルプローブは、変化していると疑われる標的塩基がこのプローブの標的-相補性領域の5'末端に位置するように選択される。上流INVADERオリゴヌクレオチドは、重複の一塩基を提供するように配置される。標的およびシグナルプローブが問題の塩基で相補的である場合、重複が形成し、切断が起こり得る。この態様は、図4Aに図示されている。しかし、標的がこの位置でプローブを相補しない場合、プローブ中のこの塩基は非相補的5'アームの一部となり、プローブ間の重複が存在せず、そして切断が抑制される。この態様は図4Bに図示されている。上述の態様のいずれかにおいて、下流のプローブは、標的に対して相補的でない領域を選択的に含み得る。好ましい態様において、シグナルプローブが標的にハイブリダイズする場合、この標的相補的でない領域はプローブの5'末端上にあり、対合していない5'フラップを産生する。CLEAVASE酵素による切断の際に、遊離した5'フラップは、シグナルのさらなる増幅のための引き続くINVADER反応に取り込まれ得る（例えば、米国特許第5,994,069号およびPCT国際公開公報第98/42873号を参照されたい。これらはその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。それが使用され得る1つの方法はINVADERオリゴヌクレオチドとしてであり、これは、提供される第2の標的および第2のプローブと合わせられ得る。第1の侵襲性切断反応において、CLEAVASE酵素によって遊離された5'フラップのハイブリダイゼーションの際に、第2の侵襲性構造複合体が完成し、その結果、それはCLEAVASE酵素によって認識され得、第2のプローブオリゴヌクレオチドが切断され得る（Kwiatkowskiら、Molec. Diagn., 4: 353 [1999]）、図1。
【０１５６】
INVADERアッセイ法は、しばしば、熱安定性CLEAVASE酵素を使用し、これは、下流のプローブオリゴヌクレオチドの融解温度（Tm）近くで操作される反応を可能にし、その結果、切断されたプローブおよび切断されていないプローブが反応の過程の間に標的に対して断続的にサイクル化する。好ましい態様において、より長いINVADERオリゴヌクレオチドは容易にサイクル化しないかもしれない。全長のプローブがINVADERオリゴヌクレオチドの存在下で標的に結合するたびにこれは切断され得、検出される配列に対して高度に特異的であり、および時間と標的濃度の両方に関して一般的に比例することの両方である切断産物の蓄積を生じる。標的は一般的に侵襲性切断における限定的な成分である。なぜなら、INVADERおよびシグナルプローブオリゴヌクレオチドは、一般的に、モル濃度過剰で供給されるからである。第2の関連する侵襲性切断において、これは限定的である第1の切断反応において作製された成分である（例えば、遊離した5'フラップ）。2つのこのような切断反応が連続して実行される場合、複合した反応からのシグナルは、標的核酸の量に関して直線的に蓄積するのに対して、反応の順番はシグナル増幅の非常に大きな増加を生じる（Kwiatkowskiら、Molec. Diagn., 4: 353 [1999]）。
【０１５７】
真正細菌のPolA DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼドメインおよび構造的に相同なDNA修復タンパク質（フラップエンドヌクレアーゼ（FEN）と呼ばれる）のいくつかは、INVADERおよびシグナルプローブオリゴヌクレオチド間で形成された二次構造を切断するように機能し得る（Kaiserら、J. Biol. Chem. 274, 21387 [1999]、Xuら、J. Biol. Chem., 2000年5月9日にwww.jbc.org/pips/pips.2.shtmlにて10.1074/jbc.M909135199としてオンラインで公開）。両方のクラスの酵素が、配列非依存性の、構造に基づくDNAの認識のために重要な、推定のヘリックス-ヘアピン-ヘリックス（HhH）DNA結合モチーフを含む（Dohertyら、Nucl. Acid. Res., 24: 2488 [1996]）。このタイプのDNA結合モチーフは、DNA標的上で実行されるアッセイ法のために適しているが、RNA標的を用いるアッセイ法のためには問題があり得、より低いアッセイ法の感度を生じる。RNA標的鎖上で形成される侵襲性の切断構造の認識の改善を有する新規な酵素は、RNA標的の検出および定量におけるINVADERアッセイ法の性能を大きく改善する。
【０１５８】
5'ヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼに関連する多数の酵素の改善が記載されてきた。例えば、変化した5'ヌクレアーゼ活性を有するか、または全体で5'ヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼが記載されてきた（米国特許第5,466,591号および同第5,795,762号、これらの各々はその全体が参照として本明細書に組み入れられる）。これらの特許は、それらのそれぞれの未変性のポリメラーゼとは異なるレベルの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を示す、熱安定性DNAポリメラーゼに関する。いくつかの態様において、熱安定性DNAポリメラーゼ中で特に保存されたアミノ酸ドメインは、そのポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を変化させるために変異または欠失される。
【０１５９】
変化したDNA合成活性を示すように未変性のポリメラーゼと比較して変化したDNAポリメラーゼが記載されてきた（Kaiserら、J. Biol. Chem. 274, 21387 [1999]、Lyamichevら、Proc. Natl. Acad. Sci., 96:6143 [1999]、 米国特許第5,541,311号、同第5,614,402号、同第5,795,763号、および米国特許出願第08/758,314号、これらは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）。好ましい態様において、これらのDNAポリメラーゼは、それらが未変性のDNAポリメラーゼのそれと比較して、減少した合成活性を示すように変化される。この点において、主として5'ヌクレアーゼであり、かつ合成活性の妨害の非存在下で構造特異的様式で核酸を切断することができる酵素が作製された。これらのポリメラーゼにおいてなされた変化は、RNAを含む構造の切断のそれらの効果に関して選択されなかった。
【０１６０】
テンプレート鎖としてRNAを使用する能力を有するDNAポリメラーゼ（逆転写酵素として知られる）には、通常、DNA鎖を有するヘテロ二重鎖において塩基対形成したRNAを特異的に切断するRNase活性が付随している。このようなRNase活性は、一般的に、RNaseHと呼ばれる。このRNaseH活性が除去された、変化した逆転写酵素が記載されている（例えば、米国特許第5,244,797号を参照されたい。その全体が参照として本明細書に組み入れられる）。この特許は、DNAポリメラーゼ活性を有し、かつRNaseH活性をほとんど有さないか、もしくはRNaseH活性を有さない逆転写酵素をコードする遺伝子に関する。本発明もまた、逆転写酵素を使用してmRNAからcDNAを産生する方法に関する。この特許は、DNA鎖およびRNA鎖を含む構造のDNAメンバーを切断する改善された能力を有する酵素を記載していないし、またこの特許は、RNA標的鎖を含む構造のDNAメンバーの切断に基づく検出アッセイ法における改善された性能を有する酵素に関しない。
【０１６１】
熱安定性RNaseH酵素は記載されている（米国特許第5,268,289号、同第5,459,055号、および同第5,500,370号、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）。これらの熱安定性酵素は、DNA鎖およびRNA鎖を含むヘテロ二重鎖のRNAメンバーを切断する。これらの特許は、DNA鎖およびRNA鎖を含む構造のDNAメンバーを切断する改善された能力を有する酵素を記載していないし、またこれらの特許は、RNA標的鎖を含む侵襲性構造のDNAメンバーの切断に基づく検出アッセイ法における改善された性能を有する酵素に関しない。
【０１６２】
RNA鎖およびDNA鎖を含む構造のDNAメンバーを切断する改善された能力を有する酵素についての必要性が依然としてある。特に、RNA標的鎖を含む侵襲性複合体のDNAメンバーの切断に基づく検出アッセイ法における改善された性能を有する熱安定性酵素についての必要性が依然としてある。
【０１６３】
発明の詳細な説明
INVADER侵襲性切断反応は、RNA標的鎖の検出において有用であることが示されてきた（例えば、米国特許第6,001,567号を参照されたい。その全体が参照として本明細書に組み入れられる）。DNAの検出のためにINVADERアッセイ法を用いる場合（Lyamichevら、Nat. Biotechnol., 17: 292 [1999]）、反応は、その反応において存在する標的RNAの各コピーについてプローブの多くのコピーの切断を許容する条件下で実行され得る。1つの態様において、反応は、切断されるプローブの融解温度（Tm）近くの温度で実行され得、その結果、切断されたプローブおよび切断されていないプローブが、温度のサイクル化なしで、標的鎖に対して容易に断続的にサイクル化する。全長プローブがINVADERオリゴヌクレオチドの存在下で標的に結合するたびに、これは5'ヌクレアーゼ酵素によって切断され得、切断産物の蓄積を生じる。この蓄積は、検出される配列について高度に特異的であり、反応の時間および標的濃度の両方に比例するように構成され得る。別の態様において、反応の温度はシフトされ得（すなわち、それはプローブの解離を引き起こす温度まで上昇され得る）、次いで、プローブの新規なコピーが標的にハイブリダイズし、酵素によって切断される温度に低下される。さらなる態様において、温度を上昇および低下させるプロセスは多くの回数反復されるか、またはPCRにおけるようにサイクル化される（MullisおよびFaloona, Methods in Enzymology, 155: 335 [1987], Saikiら、Science 230: 1350 [1985]）。
【０１６４】
上記に注記したように、Pol AタイプDNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼが、RNA標的鎖を含む侵襲性切断構造の切断のために好ましい。本発明は、RNAを含む構造の切断に基づく検出アッセイ法において改善された性能を有する酵素を提供する。特に、本発明の変化したポリメラーゼは、RNA標的鎖を含む侵襲性切断構造のDNAメンバーの切断に基づく検出アッセイ法において改善された性能を示す。
【０１６５】
本発明の5'ヌクレアーゼは、Pol AタイプDNAポリメラーゼに由来し得る。5'ヌクレアーゼのこのクラスにおいてなされた変化を記載する際に使用される用語は、当該分野において公知のDNAポリメラーゼ構造の記載に関する。大腸菌からのPol Aポリメラーゼのクレノウ断片（C末端の3分の2、これは、DNA合成活性有するが、5'ヌクレアーゼ活性を欠く）は、「パーム(palm)」と呼ばれるオープン領域を有し、ならびに、一方の側に「フィンガー(finger)」ドメインによって、および他方に「サム(thumb)」ドメインによって規定されるプライマー／テンプレート二重鎖を保持する間隙を有する右手に似た物理的形態と有すると記載されている（JoyceおよびSteitz、Trends in Biochemical Science 12: 288 [1987]）。これは、図5に図式的に示されている。この物理的形態は、すべてのPol Aポリメラーゼおよび多数のさらなるテンプレート依存性重合酵素（例えば、逆転写酵素）に共通であることが証明されたので、上記手の専門用語は当該分野で公知となっており、これらの酵素における活性の部位は、しばしば上記手のそれらの位置への言及によって記載される。参照のために、かつ本発明の限定を意図するものではなく、パームはポリメラーゼドメインのおよそ最初の200アミノ酸から作られ、サムは中間の140アミノ酸から、およびフィンガーは次の160アミノ酸による。これらは残りの領域から形成された間隙の基部を伴う（図6）。いくつかの酵素は、これらの構造的記載から逸脱し得るが、このようなドメインに対応する等価なドメインおよび配列は、既知の酵素配列に対する配列相同性によって、酵素の結晶構造の比較、および他の同様の方法によって、同定され得る。
【０１６６】
本発明の改善された酵素を作製する際に、いくつかのアプローチがとられているが、本発明は、任意の特定のアプローチに限定されない。最初の2つのDNAポリメラーゼ、TaqおよびTth（これは、RNA標的に対する異なる速度のDNA鎖切断活性を有する）が比較された。活性の差に関連するドメインを同定するために、一連のキメラ構築物が作製され、その活性が測定された。このプロセスは、Tthポリメラーゼの2つの領域を同定し、この領域は、Taqポリメラーゼに移された際に、未変性のTthタンパク質のそれと同等のRNA依存性切断活性をTaqPolに付与することができた。一旦これらの領域が同定されたら、活性に関与する特定のアミノ酸が試験された。2つのタンパク質は、全体のアミノ酸配列中で約87％同一であるので、同定された領域は少ない数のみのアミノ酸の差異を有していた。これらのアミノ酸を一つずつおよび組み合わせて変化させることにより、一組のアミノ酸がTthPolにおいて同定された。これは、TaqPolタンパク質に導入された際に、切断の速度が未変性のTthPolのそれまで増大した。
【０１６７】
これらのデータは、本発明の2つの重要な局面を実証する。第1に、特定のアミノ酸が変化されて、より弱い活性を有するポリメラーゼにTthPol様のRNA依存性切断活性を付与し得る。しかし、より広範には、これらの結果は、RNA含有切断構造の認識に関与するこれらのポリメラーゼの領域を提供する。これらの重要な領域の同定は、これらのDNAポリメラーゼの種々の機能への他のアミノ酸の関連についての公開された情報、および本発明の開発の間のコンピューター支援分子モデリングと組み合わせて、合理的な設計アプローチがさらなる改善された5'ヌクレアーゼを作製することを可能にした。この情報はまた、迅速なスクリーニング手順と連係した、集中（focused）ランダム変異誘発が、改善された特性を有する酵素を迅速に作製および同定することを可能にする。本発明のこれらの方法を使用して、改善されたポリメラーゼの広範なアレイが提供される。
【０１６８】
本発明の改善された5'ヌクレアーゼを作製および選択する際に使用される方法は、以下および実験的実施例において詳細に記載される。任意の5'ヌクレアーゼの切断活性をスクリーニングおよび特徴付けするための一般的手順は、実験的実施例に含まれる。方法の議論は以下の節に分けられる：I）キメラ構築物の作製および選択；II）キメラ構築物からの情報に基づく部位特異的変異誘発；III）分子モデリングおよび公開された物理的研究に基づく部位特異的変異誘発；およびIV）集中ランダム変異誘発。
【０１６９】
I）キメラ構築物の作製および選択
PolAタイプDNAポリメラーゼ（テルムス種からのDNAポリメラーゼ酵素を含むがこれに限定されない）は、2つの別個のドメイン、5'ヌクレアーゼドメインおよびポリメラーゼドメインを含み、これは図6に図解的に示されている。ポリメラーゼドメインはタンパク質のC末端の3分の2に存在し、かつDNA依存性およびRNA依存性の両方のDNAポリメラーゼ活性の原因である。N末端の3分の1の部分は、5'ヌクレアーゼドメインを含む。テルムス属のPol Aポリメラーゼにおいて、パーム領域はおよそ300-500アミノ酸からなり、サム領域は500-600アミノ酸を含むのに対して、フィンガー領域は、残りの650-830アミノ酸によって形成される（図6）。
【０１７０】
本発明の多くの実験において使用され、本明細書中に記載されるTaqおよびTthPolの誘導体、Taq DN RX HTおよびTth DN RX HTは、合成活性を減少させるため、およびキメラ構築を容易にするために改変されるが、改変されていないTaqPolおよびTthPolと本質的に同一の5'ヌクレアーゼ活性を有する。他に特定されない限り、以下の議論のTaqPol酵素およびTthPol酵素は、DN RX HT誘導体をいう。
【０１７１】
TthPolは、IL-6 RNAテンプレート（図10に示される）を用いた場合、TaqPolよりも4倍高い切断速度を有するが（図11および12に示される）、TaqPolおよびTthPolは、DNA標的構造における切断の類似性を示す（図10）。TaqPolおよびTthPolのアミノ酸配列（図8および9）は、約87％の同一性および92％より高い類似性を共有するので、酵素間の高度の相同性は、TthPolとTaqPolとの間の一連のキメラ酵素の作製を可能にした。キメラ酵素の活性は、RNA依存性5'ヌクレアーゼ活性に影響を与えるこれらのタンパク質の領域を同定するためのパラメーターとして使用された。
【０１７２】
図7および19に図解的に示されるTthPol遺伝子とTaqPol遺伝子との間のキメラ構築物は、両方の遺伝子に共通の制限エンドヌクレアーゼ部位であるEcoRIおよびBamHI、クローニングベクター部位SalIおよび新規な部位、NotI、BstBI、およびNdeI（部位特異的変異誘発によって、両方の遺伝子の相同位置で作製された）、によって規定されるDNA断片を交換することによって作製された。制限酵素は以下のように略号で示した： EcoRIはE; NotIはN; BstIはBs; NdeIはD; BamHIはB; およびSalIはS。
【０１７３】
各キメラ酵素の活性は、IL-6 RNA標的（図10）を用いる侵襲性シグナル増幅アッセイ法を使用して評価され、図12に示されるサイクル化切断速度は実験的実施例において記載されるように測定された。NotI部位でポリメラーゼおよび5'ヌクレアーゼを交換することによって作製された最初の2つのキメラ、TaqTth（N）およびTthTaq（N）（図7）の切断速度の比較は、TaqTth（N）がTthPolと同じ活性を有するのに対して、もう一方のTthTaq（N）はTaqPolの活性を保持している（図12）。この結果は、TthPolのより高い切断速度は、そのポリメラーゼドメインに付随することを示し、そしてポリメラーゼドメインの5'ヌクレアーゼ活性における重要な役割を示唆する。
【０１７４】
次の工程は、TaqPol配列の対応する領域と置換したときに、TthPol様RNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を生じるTthPolポリメラーゼの最小限の領域を同定することであった。この目的のために、TaqTth（N）キメラが、TaqPolの相同領域でそのTthPol配列を置換することによって一連の新規な構築物を生成するために選択された。最初に、TaqPolポリメラーゼドメインのN末端およびC末端部分が、切断点として共通のBamHI部位を使用して、TaqTth（N）の対応する領域で置換されて、TaqTth（N-B）およびTaqTth（B-S）キメラをそれぞれ作製した。アミノ酸328と593との間のTthPol配列を有するTaqTth（N-B）は、TaqTth（B-S）よりも約3倍活性が高く、TthPolよりも40％活性が高かった（図12）。この結果は、TthPolポリメラーゼドメインのNotI-BamHI部分がTthPolの優れたRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を決定することを確立する。
【０１７５】
これらのデータから、TthPolの中心部分が、TaqPol（TaqTth（N-B）構築物）の相同部分を置き換えた場合に、主としてTaqタンパク質からなるキメラタンパク質上の優れたRNA認識を付与し得ることが決定された。実際、このキメラタンパク質のサイクル化速度は親のTthPolの速度を超えていた。TthPolの活性改善領域の亜部分、各々の場合（TaqTth（N-D）およびTaqTth（D-B）、図7および12を参照されたい）において領域のおよそ50％を含むキメラの比較は、親のTaqPolと比較してRNA依存性活性における有意な改善を示さなかった。この結果は、領域の各々の半分の局面がこの活性のために必要とされることを示す。Tth挿入部分（TaqTth（Bs-B））のわずかに小さな部分のみを有する構築物は、親のTthPolタンパク質のそれに近かったが、TaqTth（N-B）構築物のそれよりも低い活性を示した。
【０１７６】
II）キメラ構築物からの情報に基づく部位特異的変異誘発
BstBI部位とBamHI部位との間のTthPolおよびTaqPolのアミノ酸配列の比較は、25のみの違いを示す（図13）。これらの間で、12の保存性変化および電荷の違いを生じる13の置換が存在する。キメラ酵素の分析は、いくつかの決定的なアミノ酸変化は、TthPolのBstBI-NdeI領域およびNdeI-BamHI領域の両方に位置することを示唆してきたので、部位特異的変異誘発が使用されて、それぞれ、TaqTth（D-B）キメラおよびTaqTth（N-D）キメラのBstBI-NdeI領域およびNdeI-BamHI領域にTthPol特異的アミノ酸を導入した。6つのTthPol特異的置換が、単一または二重のアミノ酸変異誘発によってTaqTth（D-B）のBstBI-NdeI領域において生成され、1つのみの二重の変異、W417L/G418Kが、IL-6標的を用いてTthPol活性を回復することができた（例えば、図14を参照されたい）。同様に、12のTthPol特異的アミノ酸がTaqTth（N-D）のNdeI-BamHI領域の相同位置に導入され、それらの内の1つのみ、E507Qが、TthPolのレベルまで切断速度を増加した（例えば、図14を参照されたい）。
【０１７７】
W417L、G418K、およびE507Qの置換がTthPolのレベルまでTaqPol活性を増加させるために十分であることを確認するために、これらの変異を有するTaqPol改変体が作製され、IL-6 RNA基質を用いたそれらの切断速度がTthPolのそれと比較された。図15は、W417L/G418K/E507Q変異体およびTaqPol G418K/E507Q変異体が、TthPolよりも1.4倍高い活性、TaqPolよりも4倍よりも高いを有するのに対して、TaqPol W417L/E507Q変異体は、TthPolと同じ活性を有し、これはTaqPolよりも約3倍高い。これらの結果は、TthPolのK418およびQ507が、TaqPolと比較してその優れたRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を規定する上で重要なアミノ酸であることを実証する。
【０１７８】
これらのアミノ酸がDNAポリメラーゼのRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を改善する能力は、2種のさらなる生物：テルムス フィリフォルムスおよびテルムス スコトドクトゥスのポリメラーゼA遺伝子に対応する変異を導入することによって試験された。TaqPolは、W417L変異およびE507変異（これは、これらの残基においてTaqPolをTthPolの対応する残基（K418およびQ507）により類似させた）を含むように改変された場合に、改善されたRNA依存性活性を示した。TfiPolは、P420KおよびE507Qを有するように改変されたのに対し（これは、TfiDN 2Mを作製した）、TscPolはE416KおよびE505Qを有するように改変され、TscDN 2Mを作製した。種々のDNAおよびRNA含有構造を切断するためのこれらの酵素の活性は、図21および22に図示されるIdT2、IrT3、ヘアピン、およびX構造を使用して、実施例1に記載されるように測定され、結果を図25および表7の両方に示した。両方の酵素は、TthPol酵素またはTaq 2M酵素のいずれかよりもはるかに低いRNA依存性切断活性を有する。しかし、上記に言及された変異のこれらのポリメラーゼへの導入は、改変されていない酵素と比較して、2倍を超えてRNA切断活性を増加させた（図25）。これらの結果は、本発明の方法を使用する、広範なポリメラーゼへの改善されたRNA依存性切断活性の遺伝子移入能力を実証する。
【０１７９】
III）分子モデリングおよび公開された物理的研究に基づく部位特異的変異誘発
Liら（Liら、Protein Sci., 7: 1116 [1998]）によって決定されたプライマー／テンプレートDNAを伴うTaqPol（Klentaq1）の大きな断片の複合体の結晶構造におけるG418H変異およびE507Q変異の位置は、図17に示される。E507Q変異は、それぞれ、プライマー鎖およびテンプレート鎖のバックボーンリン酸から最も近い距離の3.8Åおよび18Åでサムサブドメインの先端に位置する。サムとDNAプライマー／テンプレートの小さな溝との間の相互作用は、以前にクレノウ断片DNAポリメラーゼ（Breeseら、Science 260: 352 [1993]）およびTaqPol（Eomら、Nature 382: 278 [1996]）の共結晶構造によって示唆された。TaqPolのアミノ酸494-518に対応するクレノウ断片におけるサムの先端の24アミノ酸部分の欠失は、DNA結合アフィニティーを100倍よりも多く減少させる（Minnickら、J. Biol. Chem. 271: 24954 [1996]）。これらの観察は、E507残基を含むサム領域が上流の基質二重鎖との相互作用に関与するという仮説と一致する。
【０１８０】
TaqPolのパーム領域におけるW417L変異およびG418K変異（図17）は、重合モードにおいて結合した二重鎖DNAを伴うTaqPolの共結晶構造に従って、テンプレートの最も近いリン酸および上流の鎖から約25Åに位置する（Liら、Protein Sci., 7: 1116 [1998]、Eomら、Nature 382: 278 [1996]）。同じ距離は、エディットモードにおいて結合したクレノウ断片およびDNAのテンプレート鎖の類似のW513とP513との間のアミノ酸で観察された（Breeseら、Science 260: 352 [1993]）。従って、TaqPolと重複する基質との間の相互作用がないことは、この領域についての利用可能な共結晶研究から示唆され得る。
【０１８１】
酵素の作用の機構の理解は、本発明の実施のために必要ではなく、かつ本発明は作用のいかなる機構にも限定されないが、TaqPolのパーム領域における417位および418位のアミノ酸が、酵素が5'ヌクレアーゼとして機能する場合にのみ、上流の基質二重鎖と相互作用するが、TaqPolが重合モードに切り替わる場合には、これらのアミノ酸との相互作用が起こらないことが提案される。この仮説は、本明細書で「5'ヌクレアーゼモード」と呼ばれるDNAポリメラーゼによる基質結合の新規なモードを示唆する。いくつかの連続した証拠がこの仮説を支持する。本明細書に記載されるキメラ酵素の研究は、5'ヌクレアーゼおよびポリメラーゼの活性に関与するポリメラーゼドメインの領域を明確に分離する。従って、W417L変異およびG418K変異は、E507Q変異とともに、RNA標的鎖を有する基質上のTaqPolの5'ヌクレアーゼ活性に影響を与えるが（図15）、RNA依存性またはDNA依存性ののいずれかのDNAポリメラーゼ活性には効果を有さない（図16）。他方、TaqPolの活性部位における変異（例えば、R573A、R587A、E615A、R746A、N750A、およびD785N、これらは、重合モードにおけるポリメラーゼ活性および基質結合アフィニティーの両方に影響を与える、大腸菌 DNA Pol Iのクレノウ断片における置換に対応する）（Poleskyら、J. Biol. Chem. 265: 14579 [1990], Poleskyら、J. Biol. Chem. 267: 8417 [1992], Pandeyら、Eur. J. Biochem., 214:59 [1993]）は、5'ヌクレアーゼ活性に対してほとんど効果を有さないか、または効果を有さないことが示された。プログラムDALI（HolmおよびSander、J. Mol. Biol., 233: 123 [1993], HolmおよびSander、Science 273: 595 [1996]）およびInsightII（Molecular Simulation Inc., Naperville, IL）を使用する、TaqPol（Eomら、Nature 382: 278 [1996]）、大腸菌 Pol I、およびバチルス ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus) Pol I（Kieferら、Nature 391: 304 [1998]）のポリメラーゼドメインの重ね合わせは、アミノ酸402-451の間の（W417およびG418を含む）TaqPolのパーム領域が3つのポリメラーゼ間で構造的に高度に保存されているが、残りのパームサブドメイン間では構造的な類似性が存在しないことを示す。この観察は、真正細菌DNAポリメラーゼにおけるこの領域についての重要な役割を示唆する。
【０１８２】
5'ヌクレアーゼおよびポリメラーゼの活性は、リガーゼが末端に不適切に結合する場合、岡崎断片プロセシングまたはDNA修復の間に欠失または挿入を引き起こし得るギャップまたは突出よりはむしろニック構造を作製するように、正確に同調されるべきである。以前に提案されたモデル（Kaiserら、J. Biol. Chem., 274: 21387 [1999]）に従うと、上流鎖の3'末端ヌクレオチドが、その伸長を妨害するように5'ヌクレアーゼドメインによって封鎖され、従って、合成を停止する。3'ヌクレオチドとの相互作用は、下流鎖の置き換えられた5'アームを核小体で除去する5'ヌクレアーゼを明白に活性化する。この切断は、3'ヌクレオチドによって規定される部位における正確な切り出しによって起こり、従って、ニックを作製する。このモデルは、基質-酵素複合体の実質的な再配列を必要とし、これは、5'ヌクレアーゼモードへの複合体の移行を含み得、ポリメラーゼ活性部位からプライマー／テンプレートを分離する。
【０１８３】
ポリメラーゼ活性部位から離れた基質の再配置は、テンプレートと入る鎖との間に形成される二重鎖と、フィンガーサブドメインとサムサブドメインによって形成される間隙との間の相互作用によって誘導され得る。このような相互作用は、テンプレート／プライマー二重鎖をW417およびG418のアミノ酸と密接に接触させるサムにおけるコンホメーションの移行を強要し得る。このような変化を説明し得るサムの有意なフレキシブル性が以前に報告されている（Beeseら、Science 260: 352 [1993], Eomら、Nature 382: 278 [1996], Ollisら、Nature 313: 762 [1985], Kimら、Nature 376: 612 [1995], Korolevら、Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 9264 [1995], Liら、EMBO J., 17: 7514 [1998]）。間隙を開くことを補助し得るフィンガードメインのさらなるコンホメーション変化（例えば、Liら（Liら、EMBO J., 17: 7514 [1998]）によって記載された「クローズ」から「オープン」構造への移行）はこのモデルと一致している。5'ヌクレアーゼ結合モードはDNA Pol Iの公開された共結晶構造のいずれにおいても観察されなかったかもしれない。なぜなら、その構造の大部分は、重複する5'ヌクレアーゼ基質を有するものではなく、テンプレート／プライマー基質を有するポリメラーゼドメインについてのみ解析されたからである。
【０１８４】
200-300nMのKm値が、TaqPol、TthPol、およびTaqPol G418K/E507Qについて、RNA含有基質について決定された。これらの値は、すべてのDNA重複基質を有するTthPolについて見積もられた＜1nMのKm値よりもはるかに高く。このことは、RNAテンプレートが基質結合に悪影響を与えることを示唆する。低いアフィニティーは、酵素と、RNA標的を有する基質によって取られたA型の二重鎖またはRNA鎖のリボース2'ヒドロキシルのいずれかとの間の好ましくない相互作用によって説明され得る。これらの2つの要因の間で、後者がより可能性が高いようである。なぜなら、真正細菌DNAポリメラーゼの5'ヌクレアーゼは、RNA下流プローブ（これはおそらくA型を有する）を用いて基質を効率的に切断し得るからである（Lyamichevら、Science 260: 778 [1993]）。さらに、共結晶研究は、テンプレート／プライマー二重鎖が、そのDNAポリメラーゼとの複合体において、A型に近いコンホメーションを部分的に取ることを示唆する（Eomら、Nature 382: 278 [1996], Kieferら、Nature 391: 304 [1998], Liら、EMBO J., 17: 7514 [1998]）。G418K/E507Q変異は、TaqPolのkcatを2倍よりも多く増大させるが、Kmにはほとんど効果を有しない。このような効果は、変異が、単に結合定数を増加させるよりはむしろ、基質を切断のためにより適切な方向に位置付ける場合に予想される。
【０１８５】
上記に記載された変異の分析に加えて、酵素の特異的領域、酵素の構造-機能関係、および酵素-基質相互作用を研究するための別のアプローチは、分子の実際の物理学的構造を調べることである。
【０１８６】
結晶学的、NMR、ならびにコンピュータおよびソフトウェアの技術の進歩に伴って、分子構造の研究は、生体分子の構成、組織、および動力学に関心がある者にとって実行可能なツールとなった。分子モデリングは、タンパク質の構造の根底にある相互作用の性質およびタンパク質がいかにして基質と機能的に相互作用するかの理解を増大させた。種々のポリメラーゼまたはポリメラーゼタンパク質部分、HIV逆転写酵素、および他の核酸結合タンパク質の構造を記載する多くの刊行物が、タンパク質のコンホメーション、コンホメーションの変化、および機能のために必要な分子相互作用についての機構に関する洞察を提供してきた。
【０１８７】
例として、Doublieら（Doublieら、Nature 391: 251 [1998]）は、T7 DNAポリメラーゼの結晶構造を開示し、どのアミノ酸領域が基質結合（これは、重合のために基質を接触させるために必要である）に影響を有するらしいか、およびどのアミノ酸がコファクター（例えば、金属イオン）を結合するかについての情報を提供する。この論文および他の論文では、多くのポリメラーゼが配列類似性のみならず、構造相同性もまた、共有していることが注記されている。異なるポリメラーゼの特定の構造ドメインが重ね合わされた場合（例えば、T7ポリメラーゼ、クレノウ断片編集複合体、リガンドのないTaq DNAポリメラーゼ、およびTaqポリメラーゼ-DNA複合体）、保存性モチーフは明確に識別可能である。
【０１８８】
詳細には、これらのすべての異なる構造的供給源および参考文献からの情報を合わせることにより、DNA、RNA、またはヘテロ二重鎖と相互作用するタンパク質のモデルが作製され得る。次いで、このモデルは、基質認識および基質接触に関与し得るアミノ酸を同定するために試験され得る。アミノ酸の変化は、これらの観察に基づいて作製され得、5'ヌクレアーゼタンパク質の種々の活性に対する効果は、実験的実施例に記載されている本発明の方法のようなスクリーニング方法を使用して評価される。
【０１８９】
以前に議論したドメイン交換分析は、RNA依存性5'ヌクレアーゼ活性において重要であるTthDNの配列がタンパク質のポリメラーゼドメインに存在することを実証した。従って、核酸認識に関するポリメラーゼドメインの構造データの研究は、変化した際に、5'ヌクレアーゼ反応においてRNA認識を変化させるアミノ酸を位置付けする1つの方法を提供する。例えば、本発明の開発の間に行われた分析は、大腸菌 PolIのポリメラーゼドメイン、クレノウ断片によるプライマー／テンプレートに関連する公開された分析を試験した。表1は、クレノウ断片について決定された速度論的定数のサンプリングを示し、およびこれらの測定に対する多数の変異の効果を示す。TaqPolにおける、対応するかまたは同様に位置付けされたアミノ酸は、右側のカラムに示される。DNAテンプレートまたはプライマー／テンプレート二重鎖を有するクレノウ断片の相互作用に注目すべきインパクトを有する変異はまた、Kdおよび相対的なDNAアフィニティー値の変化によって示されるように、TaqPolおよび関連するキメラ誘導体または変異誘導体における対応する部位で作製された場合に、効果を有し得ることが仮定された。クレノウ断片に導入された場合、より高いKd値またはより低い相対的DNAアフィニティー値を生成する変異の選択は、TaqPolにおいて作製および試験された。これらのTaq誘導体には、表1の右側のカラムに星印で示されるものが含まれるがこれらに限定されない。
【０１９０】
いくつかのクレノウ改変体について（例えばR682変異体）、試験のための選択はDNAアフィニティー測定に基づいてなされなかったが、分子モデリングによりテンプレート／プライマー二重鎖のいくつかの局面とそのアミノ酸との間の相互作用を示唆した。同様に、Taqポリメラーゼ（またはTaq誘導体）のさらなる領域が、構造的データおよび分子モデリングからの情報に基づいて変異誘発のために標的化された。モデリングに基づいて、サム領域はRNAテンプレートと接触することが仮定された。従って、変化された場合、サム領域におけるその接触を変化させ得るアミノ酸が捜索された。例えば、図6および17は、アミノ酸502、504、および507がサムの先端に位置することを示す。これらのアミノ酸を変化させることは、酵素-基質相互作用に影響を有し得ることが仮定された。実施例1に記載される活性スクリーニング方法を使用して、有益な効果を産生する変異が同定された。このアプローチは、多数の改善された酵素を作製するために使用された。例えば、TaqPolのH784位（クレノウのアミノ酸H881に相当）は、フィンガー領域のアミノ酸であり、それ自体、プライマー／テンプレート基質結合に関与し得る。クレノウ酵素中のH881アミノ酸がアラニンで置換された場合、この変化は、DNAに対するこの酵素のアフィニティーを、野生型レベルの30〜40％のみまで減少させる。類似の置換は、TaqPol誘導体化酵素において試験された。Taq誘導体W417L/G418K/E507Qを出発物質とし、アミノ酸784はヒスチジン（H）からアラニン（A）に変化されてW417L/G418K/E507Q/H784A変異体（Taq 4Mと呼ばれる）を産生した。この改変体は、RNA 試験 IrT1（図24）試験基質に対する改善された5'ヌクレアーゼ活性を示した（データは表2）。アミノ酸R587はサム領域中にあり、そしてコンピュータモデル中のプライマー／テンプレート二重鎖へのその密接な近接度に基づいて、変異のために選択された。R587A変異がTaq 4A改変体に付加される場合、試験 IrT1試験基質に対する活性は、なおさらに改善された。さらに、この減少は、4M改変体と比較して、図22に示されるX構造の切断において、この酵素の機能のさらなる改善を構成する。
【０１９１】
重合においてDNA結合を減少させるすべてのアミノ酸変化が5'ヌクレアーゼ活性に影響を与えるわけではない。例えば、それぞれ、サムドメインおよびフィンガードメイン中にもあるアミノ酸に影響を与える変異E615A、R677Aは、それぞれ、図21および22における試験基質を使用して測定されるように、および、これらの変化を欠く親の改変体と比較されるように、5'ヌクレアーゼ活性に有害な効果を有するか、または効果を有さないかのいずれかである。R677A変異はTaqSS改変体に付加され、かつそれと比較されたのに対して、E615A変異はTaq 4A改変体に付加され、かつそれと比較された。本明細書中に記載された試験方法は、DNAを含む構造およびRNAを含む構造の両方について、侵襲性基質および非侵襲性基質の両方の切断活性における変化のための任意の改変体を分析する便利な手段を提供する。従って、本発明は、すべての適切な改善された酵素を同定するための方法を提供する。
【０１９２】
核酸標的に対する酵素のアフィニティーを増大し得る変化もまた調べられた。上記に記載された変異の多くは、それらが、非DNA鎖を含む構造をより多く受容する酵素を作製する目的で、クレノウ断片酵素にDNAに対する減少したアフィニティーを有するようにしたために選択された。一般的に、未変性のDNAポリメラーゼは、DNA/DNA二重鎖に対するそれらのアフィニティーと比較して、RNA/DNA二重鎖に対するより低いアフィニティーを示す。本発明の開発の間、RNA標的鎖よりはむしろ、DNAを有する構造についてのいかなる優先度をも回復または増大することなしに、核酸基質についての本発明のタンパク質の一般的なアフィニティーを増大させることが探索された。異なる変化を有するアミノ酸の置換は、タンパク質と核酸基質との間の相互作用を変化させる手段として試験された。例えば、正に荷電したアミノ酸残基（例えば、リジン（K））の付加が負に荷電した核酸に対するタンパク質のアフィニティーを増大し得ることが仮定された。
【０１９３】
上記に注記されるように、サム領域中での変化は、タンパク質の核酸基質との相互作用に影響を与え得る。1つの例において、変異G504K（サムの先端）は、Taq4Mに導入されそしてRNA標的上で15％ヌクレアーゼ活性の上昇を引き起こした。さらなる正に荷電した変異（A502KおよびE507K）は、親のTaq4M酵素と比較して50％、RNA標的依存性活性をさらに改善する。
【０１９４】
本発明の開発の間に増加した結果と合わせた、公開された研究および分子モデリングからのデータの使用は、アミノ酸の変化が少なくとも切断機能の1つの局面において観察可能な差異を引き起こす可能性のある、タンパク質の領域の同定を可能にした。領域は、この方法において標的化されることができるのに対して、異なるアミノ酸における変化（タンパク質中の近接しているかまたは直接隣接しいているものでさえ）異なる効果を有することができることが観察された。例えば、A502K置換は、Taq 4MのRNA依存性切断活性の顕著な増加を引き起こしたのに対して、アミノ酸499（502から3アミノ酸しか離れていない）をGからKに変化させることは、最小の改善を与えた。実験的実施例において見られ得るように、本発明のアプローチは、候補領域においていくつかのアミノ酸を変化させ（単独でまたは組み合わせて）、次いで、変化の効果を迅速に評価するために、実施例1に提供されるスクリーニング方法を使用することであった。この方法において、合理的設計アプローチは、タンパク質工学の作業に容易に適用される。
【０１９５】
これらのタンパク質のポリメラーゼドメインにおいて見出されるサム領域、パーム領域、およびハンド領域に加えて、5'ヌクレアーゼおよびヌクレアーゼドメインに特異的な領域が試験された。種々の5'ヌクレアーゼの比較研究は、アミノ酸配列は酵素から酵素で劇的に変化するが、大部分に共通する構造的特徴が存在することを示した。これらの特徴のうちの2つは、ヘリックス-ヘアピン-ヘリックスモチーフ（H-h-H）およびアーチまたはループ構造である。H-h-Hモチーフは、非配列特異的DNA結合を媒介すると考えられている。これは、少なくとも14のタンパク質のファミリーで見い出されており、これには、ヌクレアーゼ、N-グリコシラーゼ、リガーゼ、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、およびポリメラーゼが含まれる（Dohertyら、Nucl. Acid. Res., 24: 2488 [1996]）。DNAテンプレートプライマーに結合したラットDNAポリメラーゼpolβの結晶学的構造は、polβ HhHモチーフのバックボーン窒素と、DNA二重鎖のプライマーのリン酸の酸素との間の非特異的な水素結合を示す（Pelletierら、Science 264: 1891 [1994]）。TaqおよびTthポリメラーゼの5'ヌクレアーゼドメインのHhHドメインは同様の様式で機能し得るので、酵素のHhH領域における変異が活性を変化させることが意図される。変異は、モチーフの形状および構造を変化させるために、またはモチーフの電荷を変化させて、基質に対するアフィニティーの増加または減少を引き起こすために導入され得る。
【０１９６】
多様な供給源（例えば、真核生物、真正細菌、古細菌、およびファージ）からの多くの5'ヌクレアーゼに共通な別の構造は、アーチまたはループドメインである。バクテリオファージT5の5'エキソヌクレアーゼの結晶構造は、2つのヘリックスによって形成された別個のアーチを示し、1つは正に荷電しており、1つは疎水性残基を含む（Ceskaら、Nature 382: 90 [1996]）。興味深いことに、T5とTaqとの間で保存されている3つの残基（Lys83、Arg86、およびTyr82）はすべてアーチの中にある。これらは、Taq DNAポリメラーゼのアミノ酸Lys83、Arg86、およびTyr82に相当する。Taq（5'ヌクレアーゼ）の結晶構造はまた、決定されている（Kimら、Nature 376: 612 [1995]）。
【０１９７】
メタノコックス ヤナシイ由来のフラップエンドヌクレアーゼ-1の結晶構造もまた、このようなループモチーフを示す（Hwangら、Nat. Struct. Biol., 5: 707 [1998]）。Mja FEN-1分子のバックボーン結晶構造は、T5エキソヌクレアーゼ、Taq5'-エキソヌクレアーゼ、およびT4 RNase Hの上に重ね合わせされ得る。これらのすべてに共通の興味深い特徴は長いループである。FEN-1のループは、多数の正に荷電した残基および芳香族残基からなり、一本鎖DNA分子を収容するのに十分大きな寸法を有する穴を形成する。T5エキソヌクレアーゼにおける対応する領域は、らせん状アーチを形成する3つのヘリックスからなる。T5エキソヌクレアーゼにおけるらせん状アーチによって形成される穴のサイズは、Mja FEN-1におけるL1ループによって形成されるものの半分よりも小さい。T4 RNase HまたはTaq 5'ポリメラーゼにおいて、この領域は乱れている。アーチのいくつかの領域は金属を結合するのに対して、アーチの他の領域は核酸基質と接触する。pol IファミリーのDNAポリメラーゼからの6つの5'ヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列のアラインメントは、10つの保存性酸性残基を含む6つの高度に保存された配列を示す（Kimら、Nature 376 [1995]）。
【０１９８】
アーチ領域における変化の効果が試験された。Taqポリメラーゼにおいて、アーチ領域はアミノ酸80-95および96-109によって形成されている。部位特異的変異誘発がアーチ領域上で実行された。FENおよびポリメラーゼ5'ヌクレアーゼのアミノ酸配列のアラインメントは、3つのアミノ酸置換変異（P88E、P90E、およびG80E）の設計を示唆した。これらの置換は、親の酵素のように、Taq4Mポリメラーゼ変異体上で作製された。結果は、図22に示されたHP基質およびX基質に対するバックグラウンド活性が、すべての変異体において非常に強力に抑制されるが、正しい基質（IdTおよびIrT、図24）に対する所望の5'ヌクレアーゼ活性もまた減少することを示した。TaqポリメラーゼとTthポリメラーゼの間の配列相同性にも関わらず、これらは、HP基質およびX基質に対して非常に異なる活性を有する。TaqポリメラーゼおよびTthポリメラーゼのアーチ領域のアラインメントもまた、広範な配列相同性の領域ならびにマイナーな差異を実証する。これらの差異は、Taq4Mを使用してTaq4M L109F/A110Tを生成する変異L109FおよびA110T、ならびにTaq 4M L109F/A110T/A502K/G504K/E507K/T514S変異体を生成する変異体Taq 4M A502K/G504K/E507K/T514Sの設計をもたらした。これらの2つの変異はTaq4M酵素を強烈に転換し、バックグラウンド基質特異性によって、Tth酵素にむしろ近くなるのに対し、DNAおよびRNAの両方の基質に対する5'ヌクレアーゼ活性はほとんど変化されない。
【０１９９】
IV）集中ランダム変異誘発
上記に記載されるように、物理的研究および分子モデリングが単独でまたは組み合わせて使用されて、酵素の領域を同定し得る。ここで、アミノ酸の変化は、切断機能の少なくとも1つの局面において観察可能な違いを引き起こす可能性がある。上記の節において、この情報の使用は、特定のアミノ酸またはアミノ酸の組み合わせを選択および変化させるために記載された。変化された機能を有する酵素を生成する別の方法は、変異をランダムに導入することである。このような変異は、当該分野で公知である多数の方法によって導入され得、この方法には以下が含まれるがこれらに限定されない：ヌクレオチドの誤取り込みをしやすい条件下でのPCR増幅（REF）、縮重領域（すなわち、反応において、異なり個別であるがさもなくば類似のオリゴヌクレオチドが異なる塩基を有し得る、塩基の位置）を有するプライマーを使用する増幅、および化学合成。ランダム変異誘発の多くの方法が当該分野において公知であり（Del Rioら、Biotechniques 17: 1132 [1994]）、本発明の酵素の産生に組み入れられ得る。本明細書中に含まれる変異誘発の任意の特定の手段の議論は、例示の目的のみのために示され、限定を意図するものではない。ランダム変異誘発が、全体のタンパク質の特定の領域のみが変化するように実行される場合、これは「集中ランダム変異誘発」と記載され得る。実験的実施例において記載されるように、集中ランダム変異誘発アプローチは、HhHおよびサムドメインを変化させるために適用され、酵素改変体のいくつかが以前に作成された。これらのドメインは、このアプローチの例を提供するために選択された。ランダム変異誘発アプローチは、任意の特定のドメイン、または単一のドメインに限定されることは意図されない。これは、任意のドメイン、または任意の完全なタンパク質に適用され得る。このように改変されたタンパク質は、実施例1に記載されるスクリーニング反応において、図22および24に図示される試験基質を使用して、切断活性について試験され、その結果は表5および6に記載される。
【０２００】
ランダム範囲誘発は、HhH領域上で、親のTaqSSまたはTth DN H785A変異体を用いて実行された。生成された8つの変異体のいずれも、親の酵素と比較して活性の改善を示さなかった（表5）。実際、残基198-205間の領域の変異は、DNA基質およびRNA基質の両方で約2-5倍低い活性を有する。このことは、この領域が基質認識のために必須であることを示唆する。サム領域における変異誘発は、DNA標的で5'ヌクレアーゼ活性を20-100％改善し、RNA標的では約10％改善する新規な変異を生じた（表6）。
【０２０１】
各々の別個のサブドメインにおける多数のアミノ酸が基質接触において役割を果たしている。これらの変異誘発は、基質結合を変化させることによって基質特異性を変化させ得る。さらに、基質と直接的に接触しないアミノ酸に導入された変異はまた、より長い範囲または一般的なコンホメーション変化効果を通して、基質特異性を変化させ得る。これらの変異は、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって導入され得、この方法には、ランダム変異誘発、部位特異的変異誘発、およびキメラタンパク質の生成が含まれるがこれらに限定されない。
【０２０２】
上記に注記されるように、ランダム変異誘発の多数の方法が当該分野で公知である。本明細書中に記載される集中ランダム変異誘発において適用される方法は、全体の遺伝子に適用され得る。さらなる有用なキメラ構築物が、分子繁殖（例えば、米国特許第5,837,458号ならびに国際公開公報第00/18906号、同第99/65927号、同第98/31837号、および同第98/27230号を参照されたい。これらは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる）の使用を通して作製され得ることもまた、意図される。選択される変異誘発方法に関わりなく、本明細書中に記載された迅速スクリーニング方法は、組換え分子の大きなコレクション中で、有益な変化を同定する迅速かつ有効な手段を提供する。これは、ランダム変異誘発手順を、有益な改善を有する変化された5'ヌクレアーゼの大きなコレクションを作製するための扱いやすくかつ実用的なツールにする。実施例のように使用される酵素のために利用されるクローニングおよび変異誘発のストラテジーは、他の熱安定性および熱安定性でないA型ポリメラーゼに適用可能である。なぜなら、これらの酵素の間のDNA配列の類似性が非常に高いからである。当業者は、配列の違いがクローニングストラテジーの違いを必要とすること、例えば、異なる制限エンドヌクレアーゼの使用がキメラを生成するために必要であり得ることを理解する。存在する代替的部位の選択、または代替的部位の変異誘発を介した導入は十分に確立されたプロセスであり、当業者には公知である。
【０２０３】
酵素の発現および精製は、種々の分子生物学方法によって達成され得る。以下に記載される実施例はそのような方法の1つを教示するが、本発明は、クローニング、タンパク質発現、または精製の方法によって限定されないことが理解される。本発明は、核酸構築物が適切な宿主における発現が可能であることを意図する。多くの方法が、種々のプロモーターおよび3'配列を遺伝子構造に結合させて効率的な発現を達成するために利用可能である。
【０２０４】
V）部位特異的変異誘発
本発明のいくつかの態様において、任意の適切な技術（例えば、上記に記載された技術の1つまたは複数を含むがこれらに限定されない）が使用されて、異種ドメインを有する改善された切断酵素（例えば、配列番号：221）を生成する。従って、いくつかの態様において、部位特異的変異誘発（例えば、市販のキット（例えば、Transformer Site Directed mutagenesisキット（Clontech））を使用するプライマー特異的変異誘発）が、本発明の切断酵素をコードする核酸を生成するために核酸配列の全体にわたって複数の変化を作製するように使用される。いくつかの態様において、複数のプライマー指向性変異誘発の工程は、本発明の切断酵素をコードする核酸を産生するためにタンデムで実行される。
【０２０５】
いくつかの態様において、複数のプライマー特異的変異誘発の工程は、本発明の切断酵素の選択された部分における変化を産生するために、核酸配列の選択された部分に指向される。他の態様において、1つの選択された部分における変化を有する核酸は、異なる選択された部分に変異を有する核酸を用いて組換えられ（例えば、クローニング、分子繁殖、または、当該分野で公知である他の組換え方法のいずれかを通して）、それによって、複数の選択された部分に変異を有し、かつ本発明の切断酵素をコードしている核酸を作製する。各々の選択された部分における変異は、上記に記載される方法のいずれかまたは上記の方法の任意の組み合わせのいずれか（ランダム変異誘発および部位特異的変異誘発の方法を含むがこれらに限定されない）によって導入され得る。
【０２０６】
例えば、本発明の1つの例証的な態様において、配列番号：222の核酸配列（配列番号：221の切断酵素をコードする核酸配列）は、配列番号：104の核酸配列に対して複数のプライマーの核酸配列変異を作製することによって生成される（配列番号：104の構成については実施例7を参照されたい）。いくつかの態様において、各々の変異は別々の変異誘発反応を使用して導入される。得られる核酸（配列番号：222）がすべての変異を含むように、反応は連続して実行される。本発明の別の例証的な態様において、配列番号：222の核酸配列は、配列番号：111のヌクレアーゼ部分（例えば、図6に図示されるような）において、上記に記載されるように、複数のプライマーの特異的変異を作製することによって生成される。次いで、変異体ヌクレアーゼ部分が、実施例4に記載される組換え方法を使用して、NotI部位で配列番号：104の「ポリメラーゼ」部分と合わされ、それによって、配列番号：222を有する単一の核酸を作製し、および配列番号：221の切断酵素をコードする。変異誘発後、得られる変化されたポリメラーゼが産生され、任意の適切なアッセイ法（例えば、実施例1および6に記載されるものが含まれるがこれらに限定されない）を使用して切断活性について試験された。いくつかの態様において、配列番号：221の切断酵素をコードする核酸配列（例えば、配列番号：222）は、任意の適切な方法を使用してさらに改変される。
【０２０７】
実施例
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい態様および局面を例証する役目を果たし、かつその範囲を限定するものとして解釈されない。
【０２０８】
以下に続く開示において、以下の略号が使用される：Afu（アルカエグロブス フルギドゥス）；Mth（メタノバクテリウム テルモアウトトロフィクム）；Mja（メタノコックス ヤナシイ）；Pfu（ピロコックス フリオサス）；Pwo（ピロコックス ヴォエセイ）；Taq（テルムス アクアチクス）；Taq DNAP, DNAP Taq, およびTaq Pol I（T.アクアチクス DNAポリメラーゼI）；DNAPStf（DNAP TaqのStoffel断片）；DNAREc1（大腸菌 DNAポリメラーゼI）；Tth（テルムス テルモフィルス）；Ex.（例）；Fig.（図）；℃（摂氏温度）；g（重力場）；hr（時間）；min（分）；olio（オリゴヌクレオチド）；rxn（反応）；vol（体積（容量））；w/v（重量対体積）；v/v（体積対体積）；BSA（ウシ血清アルブミン）；CTAB（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）；HPLC（高速液体クロマトグラフィー）；DNA（デオキシリボ核酸）；p（プラスミド）；μl（マイクロリットル）；ml（ミリリットル）；μg（マイクログラム）；mg（ミリグラム）；M（モル濃度）；mM（ミリモル濃度）；μM（マイクロモル濃度）；pmole（ピコモル）；amole（アトモル）；zmole（ゼプトモル）；nm（ナノメーター）；kdal（キロダルトン）；OD（光学密度）；EDTA（エチレンジアミン四酢酸）；FITC（フルオレセインイソチオシアネート）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）；NaPO4（リン酸ナトリウム）；NP-40（Nonidet P-40）；Tris（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）；PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド）；TBE（トリス-ホウ酸-EDTA、すなわち、HClではなくホウ酸で緩衝化しEDTAを含むトリス）；PBS（リン酸緩衝化生理食塩水）；PPBS（1mM PMSFを含む、リン酸緩衝化生理食塩水）；PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；Tween（ポリオキシエチレン-ソルビタン）；ATCC（American Type Culture Collection, Rockville, MD）；Coriell（Coriell Cell Repositories, Camden, NJ）；DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellculturen, Braunschweig, Germany）；Ambion（Ambion, Inc., Austin, TX）；Boehringer（Boehringer Mannheim Biochemical, Indianapolis, IN）；MJ Research（MJ Research, Watertown, MA）；Sigma（Sigma Chemical Company, St Louis, MO）；Dynal（Dynal A.S., Oslo, Norway）；Gull（Gull Laboratories, Salt Lake City, UT）；Epicentre（Epicentre Technologies, Madison, WI）；Lampire（Biological Labs, Inc., Coopersberg, PA）；MJ Research（MJ Research, Watertown, MA）；National Bioscieces（National Bioscieces, Plymouth, MN）；NEB（New England Biolabs, Beverly, MA）；Novagen（Novagen, Inc., Madison, WI）；Promega（Promega, Corp., Masison, WI）；Stratagene（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA）；Clonetech（Clonetech, Palo Alto, CA）；Pharmacia（Pharmacia, Piscataway, NJ）；Milton Roy（Milton Roy, Rochester, NY）；Amersham（Amersham International, Chicago, IL）；およびUSB（U. S. Biochemical, Cleveland, OH）。Glen Research（Glen Research, Sterling, VA）；Coriell（Coriell Cell Repositories, Camden, NJ）；Gentra（Gentra, Minneapolis, MN）；Third Wave Technologies（Third Wave Technologies, Madison, WI）；PerSeptive Biosystems（PerSeptive Biosystems, Framington, MA）；Microsoft（Microsoft, Redmond, WA）；Qiagen（Qiagen, Valencia, CA）；Molecular Probes（Molecular Probes, Eugene, OR）；VWR（VWR Scientific, ）；Advanced Biotechnologies（Advanced Biotechnologies, INC., Columbia, MD）；およびPerkin Elmer（PE BiosystemsおよびApplied Biosystemsとしても知られる、Foster City, CA）。
【０２０９】
実施例１
5'ヌクレアーゼ活性についてのコロニーの迅速スクリーニング
未変性の5ヌクレアーゼおよび本発明の酵素を種々の機能について直接的に試験し得る。これらには、RNAまたはDNAの標的に対する5'ヌクレアーゼ活性、および標的検出反応において存在し得る構造を表す代替的な基質を使用するバックグラウンド特異性が含まれるがこれらに限定されない。適切な試験構造を有する核酸分子の例は、図18A-Dおよび図21-24に図解的に示される。以下に記載されるスクリーニング技術は、迅速かつ効率的に5'ヌクレアーゼを特徴付けするため、および新規な5'ヌクレアーゼが改善されたかまたは所望される活性を有するか否かを決定するために開発された。RNAまたはDNAの標的に対して改善されたサイクル化速度を示すか、または減少した標的非依存性切断を生じる酵素は、より徹底的な調査に値する。一般的に、ランダム変異誘発によって開発された改変タンパク質を、図18Aおよび18Bに示されるように基質上での迅速コロニースクリーニングによって試験した。次いで、迅速タンパク質抽出を行い、代替的構造上の活性の試験（例えば、図18C-Dに示されるように）をタンパク質抽出物を使用して実行した。最初のスクリーニングまたはさらなるスクリーニングのいずれか、および改善された活性のための酵素の特徴付けを、他の切断複合体（例えば、図21-24に図示されるようなもの）を使用して実行し得る。本発明の範囲は、このような試験切断構造を形成するために使用される特定の配列によって限定されることは意図されない。当業者は、迅速スクリーニングのための類似の構造を形成するために比較し得る核酸をいかにして設計および作製するかを理解する。
【０２１０】
この試験の順序を、時間および試薬を節約するために、全体の試験の数を減少するように選択し得る。酵素機能についての試験の順序は、本発明の限定を意図するものではない。次いで、RNAまたはDNAの標的を用いて妥当なサイクル化速度を示す変異体を一晩培養し得、迅速タンパク質抽出を行う。代替的には、切断試験のいずれかのサブセットまたはすべてを同時に行い得る。
【０２１１】
便宜上、各々の型の迅速スクリーニングを1枚の別個のマイクロタイタープレート上で行い得る。例えば、1枚のプレートをRNA INVADER活性を試験するために設定し得、1枚のプレートをDNA INVADER活性について試験するために設定し得る。90の異なるコロニーを1枚のプレート上でスクリーニングし得る。スクリーニングされたコロニーは、種々の供給源由来であり得る（例えば、変化されていない（未変性の）5'ヌクレアーゼのクローン、1回の変異誘発反応からのクローン（例えば、単一のプレートからの多くのコロニー）または種々の反応からのクローン（複数のプレートから選択されたコロニー））。
【０２１２】
理想的には、ポジティブ対照およびネガティブ対照を、同じ試薬の調製物を使用して、変異体と同じプレート上で実行するべきである。良好なポジティブ対照の1つの例は、改変していない酵素を含むコロニー、またはその活性が新規な変異体と比較される、以前に改変された酵素である。例えば、変異誘発反応をTaq DN RX HT構築物（以下に記載する）に対して実行する場合、改変されていないTaq DN RX HT構築物を、酵素活性に対する変異誘発の効果を比較するために標準として選択する。さらなる対照酵素もまた、迅速スクリーニングセットに組み込み得る。例えば、Tth DN RX HT（以下に記載する；他に特定しない限り、以下の議論のTaqPol酵素およびTthPol酵素はDN RX HT誘導体をいう）もまた、Taq DN RX HTとともに酵素活性についての標準として含め得る。このことは、任意の変化された酵素の、異なる活性を有する2つの既知の酵素との比較を可能にする。ネガティブ対照もまた、バックグラウンド反応レベル（すなわち、比較されるヌクレアーゼ以外の供給源に起因する切断またはプローブの分解）を決定するために実行するべきである。良好なネガティブ対照コロニーは、コロニーおよび変異誘発において使用されるベクターのみを含むものであり、例えば、pTrc99Aベクターのみを含むコロニーである。
【０２１３】
最初の迅速スクリーニングのための特異的変異誘発反応から選択されるコロニーの数に影響を与え得る2つの因子は1）変異誘発反応から得られるコロニーの総数、および2）変異誘発反応が部位特異的であるか、または全体の遺伝子もしくは遺伝子の領域にわたってランダムに分布していたかである。例えば、5-10コロニーのみがプレート上に存在している場合、すべてのコロニーを容易に試験し得る。100個のコロニーが存在する場合、これらのサブセットを分析し得る。一般的に、10-20のコロニーを部位特異的変異誘発反応から試験するのに対して、80〜100以上のコロニーを、単一のランダム変異誘発反応から日常的に試験する。
【０２１４】
これらの実験的態様において記載される変化された5'ヌクレアーゼは、示される場合、以下に記載されるように試験した。
【０２１５】
A. 迅速スクリーニング：RNA標的に対するINVADER活性（図18A）
2×基質混液を調製した。これは、20mM MOPS、pH 7.5、10mM MgSO4、200mM KCl、2μM FRET-プローブオリゴ 配列番号：223
2005518223.tif 000010
、1μM INVADERオリゴ 配列番号：224
2005518223.tif 000011
、および4nM RNA標的 配列番号：225
2005518223.tif 000012
を含む。5μlの2×基質混液を、96ウェルマイクロタイタープレート（Low Profile MULTIPLATE 96, M.J. Research, Inc.）の各試料ウェルに分散させた。
【０２１６】
細胞懸濁物を、単一のコロニー（変異体、ポジティブ対照、およびネガティブ対照のコロニー）を拾い上げ、各々を20μlの水に懸濁することによって調製した。これを、96ウェルマイクロタイタープレート形式で、コロニー毎に1つのウェルを使用して好都合に行い得る。
【０２１７】
5μlの細胞懸濁物を、最終的な反応条件が、10mM MOPS、pH 7.5、5mM MgSO4、100mM KCl、1μM FRET-プローブオリゴ、0.5μM INVADERオリゴ、および2nM RNA標的であるように適切な試験ウェルに付加した。ウェルを、10μlのClear CHILLOUT 14（M. J. Research, Inc.）液体ワックスで覆い、試料を85℃で3分間加熱し、次いで59℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、以下のパラメーター：励起485/20、放射530/30を使用してCytofluor蛍光プレートリーダーで読み取った。
【０２１８】
B. 迅速スクリーニング：DNA標的に対するINVADER活性（図18B）
2×基質混液を調製した。これは、20mM MOPS、pH 7.5、10mM MgSO4、200mM KCl、2μM FRET-プローブオリゴ 配列番号：223
2005518223.tif 000013
、1μM INVADERオリゴ 配列番号：224
2005518223.tif 000014
、および1nM DNA標的 配列番号：226
2005518223.tif 000015
を含む。5μlの2×基質混液を、96ウェルマイクロタイタープレート（MJ Low Profile）の各試料ウェルに分散させた。
【０２１９】
細胞懸濁物を、単一のコロニー（変異体、ポジティブ対照、およびネガティブ対照のコロニー）を拾い上げ、それらを20μlの水に懸濁することによって調製した（一般的には96ウェルマイクロタイタープレート形式）。
【０２２０】
5μlの細胞懸濁物を、最終的な反応条件が、10mM MOPS、pH 7.5、5mM MgSO4、100mM KCl、1μM FRET-プローブオリゴ、0.5μM INVADERオリゴ、および0.5nM DNA標的であるように適切な試験ウェルに付加した。ウェルを、10μlのClear CHILLOUT 14（M.J. Research, Inc.）液体ワックスで覆い、反応液を85℃で3分間加熱し、次いで59℃で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、プレートを、以下のパラメーター：励起485/20、放射530/30、ゲイン40、ウェルあたりの読み取り10を使用してCytofluor flourescanプレートリーダーで読み取った。
【０２２１】
C. 迅速タンパク質抽出（粗細胞溶解物）
RNAまたはDNAのいずれかのINVADERアッセイ法においてポジティブなまたは予期しない結果を与えた変異体を、X構造またはヘアピン構造（それぞれ、図18CおよびD）に対するバックグラウンド活性について、さらに詳細に分析した。迅速コロニースクリーニング形式を上記のように利用し得る。単に基質を変化させることによって、バックグラウンドまたは異常な酵素活性につての試験を行い得る。別のアプローチは、ポジティブクローンの少量の一晩培養物からの迅速タンパク質抽出を行い、さらなるタンパク質機能についてこの粗細胞溶解物を試験することである。1つの可能な迅速タンパク質抽出手順を以下に詳述する。2〜5mlのLB（プラスミド選択のための適切な抗生物質を含む；例えば、Maniatis, 第1、2、および3巻を参照されたい）に、残りの20μl容量の水-細胞懸濁物を接種し、37℃で一晩インキュベートした。約1.4mlの培養物を1.5mlの微量遠心管に移し、そして細胞をペレット化するために、室温で3-5分間、最高速度で微量遠心分離した（例えば、Eppendorf 5417卓上微量遠心分離機で14,000rpm）。上清を除去し、細胞ペレットを100μlのTESバッファーpH 7.5（Sigma）に懸濁させた。リゾチーム（Promega）を最終濃度0.5μg/μlで添加し、試料を室温で30分間インキュベートした。次いで、試料を70℃で10分間加熱してリゾチームを不活化させ、細胞細片を、最高速度で5分間での微量遠心分離によってペレット化した。上清を除去し、この粗細胞溶解物を以下の酵素活性アッセイ法において使用した。
【０２２２】
D. 迅速スクリーニング：バックグラウンド特異性X構造基質（図18C）
反応を上記に詳述されるような条件下で実行した。1μlの粗細胞溶解物を9μlの反応成分に加えて、10μlの最終容量および以下の最終濃度とした：10mM MOPS、pH 7.5、5mM MgSO4、100mM KCl、1μM FRET-プローブオリゴ（配列番号：223）、0.5μM X構造INVADERオリゴ 配列番号：227
2005518223.tif 000016
、および0.5nM DNA標的（配列番号：226）。ウェルを、10μlのClear CHILLOUT 14（M.J. Research, Inc.）液体ワックスで覆い、反応物を85℃で3分間加熱し、次いで59℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを、以下のパラメーター：励起485/20、放射530/30、ゲイン40、ウェルあたりの読み取り10を使用してCytofluor蛍光プレートリーダーで読み取った。
【０２２３】
E. 迅速スクリーニング：バックグラウンド特異性ヘアピン基質（図18D）
反応を上記に詳述されるような条件下で実行した。1μlの粗細胞溶解物を9μlの反応成分に加えて、10μlの最終容量および以下の最終濃度とした：10mM MOPS、pH 7.5、5mM MgSO4、100mM KCl、1μM FRET-プローブオリゴヌクレオチド（配列番号：223）、および0.5nM DNA標的（配列番号：226）。ウェルを、10μlのClear CHILLOUT 14（M.J. Research, Inc.）液体ワックスで覆い、反応物を85℃で3分間加熱し、次いで59℃で1時間インキュベートした。1時間のインキュベーション後、プレートを、以下のパラメーター：励起485/20、放射530/30、ゲイン40、ウェルあたりの読み取り10を使用してCytofluorプレートリーダーで読み取った。
【０２２４】
F. IrT1標的およびIdT標的を用いる活性アッセイ法（図24）
5'ヌクレアーゼ活性アッセイ法を、10mM MOPS、pH 7.5、0.05％ Tween 20、0.05％ Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、100mM KCl、および5mM MgSO4を含む10μl反応溶液中で実行した。プローブ（配列番号：167）の濃度は2mMであった。実施例3におけるように調製した基質（IrT1（配列番号：228）またはIdT（配列番号：229）、それぞれ10または1nMの最終濃度）および約20ngの酵素を上記の反応バッファーと混合し、CHILLOUT（MJ Research）液体ワックスを重層した。反応を、反応温度57℃にし、MgSO4の添加により開始し、そして10分間インキュベートした。次いで、反応を、10mM EDTAおよび0.02％メチルバイオレット（Sigma）を含む95％ホルムアミド10μlの添加によって停止させた。試料を、電気泳動の直前に90℃で1分間加熱し、その後電気泳動を、7M尿素を有する20％変性アクリルアミドゲル（19:1架橋）を通して、および45mM Tris-ホウ酸、pH 8.3、1.4mM EDTAのバッファー中で行った。他に示さない限り、1μlの各停止反応溶液をレーン毎にロードした。次いで、ゲルをFMBIO-100蛍光ゲルスキャナー（Hitachi）で、505nmフィルターを使用してスキャンした。切断された産物の画分を、FMBIO分析ソフトウェア（バージョン6.0、Hitachi）を用いて、切断されていない基質および切断された基質に対応するバンドの強度から決定した。切断産物の画分は、測定値が切断の初速度を概算することを保証するために20％を超えなかった。代謝回転速度を、これらの反応条件下で、標的分子あたり1分間あたりに生成した切断されたシグナルプローブの数として規定した（1/分）。
【０２２５】
G. X構造（X）およびヘアピン（HP）標的を用いる活性アッセイ法（図22）
5'ヌクレアーゼ活性アッセイ法を、10mM MOPS、pH 7.5、0.05％ Tween 20、0.05％ Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、100mM KCl、および5mM MgSO4を含む10μl反応溶液中で実行した。ヘアピン構造アセンブリー（22A、配列番号：230および231）またはX構造アセンブリー（22B、配列番号：230-232）のいずれかの形成のための各オリゴを最終濃度1μMで添加し、そして実施例3に記載されるように調製した約20ngの試験酵素を上記の反応バッファーと混合し、CHILLOUT（MJ Research）液体ワックスを重層した。反応を、反応温度60℃にし、MgSO4の添加により開始し、そして10分間インキュベートした。次いで、反応を、10mM EDTAおよび0.02％メチルバイオレット（Sigma）を含む95％ホルムアミド10μlの添加によって停止させた。試料を、電気泳動の直前に90℃で1分間加熱し、その後電気泳動を、7M尿素を有する20％変性アクリルアミドゲル（19:1架橋）を通して、および45mM Tris-ホウ酸、pH 8.3、1.4mM EDTAのバッファー中で行った。他に示さない限り、1μlの各停止反応溶液をレーン毎にロードした。次いで、ゲルをFMBIO-100蛍光ゲルスキャナー（Hitachi）で、505nmフィルターを使用してスキャンした。切断された産物の画分を、FMBIO分析ソフトウェア（バージョン6.0、Hitachi）を用いて、切断されていない基質および切断された基質に対応するバンドの強度から決定した。切断産物の画分は、測定値が切断の初速度を概算することを保証するために20％を超えなかった。代謝回転速度を、これらの反応条件下で、標的分子あたり1分間あたりに生成した切断されたシグナルプローブの数として規定した（1/分）。
【０２２６】
H. ヒトIL-6標的を用いる活性アッセイ法（図10）
5'ヌクレアーゼ活性アッセイ法を、10mM MOPS、pH 7.5、0.05％ Tween 20、0.05％ Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、100mM KCl、および5mM MgSO4を含む10μl反応溶液中で実行した。DNA IL-6基質を含む反応は、0.05nM IL-6 DNA標的（配列番号：163）および1μMの各プローブ（配列番号：162）およびINVADER（配列番号：161）オリゴヌクレオチドを含み、60℃で30分間実行した。IL-6 RNA標的（配列番号：160）を含む反応を、IL-6 RNA標的濃度が1nMであり、反応を57℃で60分間実行した以外は同じ条件下で実行した。各反応は、実施例3に記載されるように調製した、約20ngの試験酵素を含んだ。
【０２２７】
I. 合成r25mer標的を用いる活性アッセイ法（図23）
合成r25mer標的（配列番号：233）を含む反応を、そのr25mer標的濃度が5nMであり、かつその反応を58℃で60分間実行した以外は同じ反応条件下（10mM MOPS、pH 7.5、0.05％ Tween 20、0.05％ Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、100mM KCl、および5mM MgSO4）および1μMの各々のプローブ（配列番号：234）およびINVADER（配列番号：235）オリゴヌクレオチドで実行した。約20ngの各試験酵素を反応に加えた。酵素を実施例3に記載されるように調製した。
【０２２８】
上記に記載されたいずれかの試験は、酵素活性のための最適条件を引き出すために改変され得る。例えば、酵素滴定を行って、最大切断活性および最も低いバックグラウンドシグナルのための最適酵素濃度を決定し得る。例として、しかし限定のためではなく、多くの変異酵素を10、20、および40ngの量で使用した。同様に、温度滴定もまた、試験に取り込まれ得る。タンパク質の構造を改変することはその温度の要件を変化させ得るので、温度の範囲を、問題の変異体のために最も良好に適している条件を同定するために試験し得る。
【０２２９】
このようなスクリーニング（約20ngの変異体酵素を使用する）からの結果の例を、表3-8および図12、14、15、19、および25に示す。
【０２３０】
実施例2
DNAポリメラーゼおよび変異体ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼのクローニングおよび発現
A.テルムス アクアチクスおよびテルムス テルモフィルスのDNAポリメラーゼ
1. TaqPolおよびTthPolのクローニング
テルムス属の真正細菌からのA型DNAポリメラーゼは、広いタンパク質配列同一性（重合ドメインにおいて90％、DNAStar, WIからのDNA分析ソフトウェアにおけるLipman-Pearson法を使用）を共有し、重合アッセイ法およびヌクレアーゼアッセイ法の両方において同様にふるまう。それゆえに、テルムス アクアチクス（TaqPol）、テルムス テルモフィルス（TthPol）、およびテルムス スコトドクトゥスのDNAポリメラーゼについての遺伝子をこのクラスの代表として使用した。他の真正細菌（大腸菌、肺炎連鎖菌、マイコバクテリウム スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)、テルムス テルモフィルス、テルムスsp.、テルモトガ マリティマ(Thermotoga maritima)、テルモシホ アフリカヌス(Thermosipho africanus)、およびバチルス ステアロテルモフィルスを含むがこれらに限定されない）からのポリメラーゼ遺伝子は同等に適合可能である。
【０２３１】
a. 最初のTaqPol単離：変異体TaqA/G
Taq DNAポリメラーゼ遺伝子を、テルムス アクアチクス、YT-1株からのゲノムDNA（Lawyerら、前出）から、配列番号：236および237に記載されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。得られるDNA断片は、コード配列の5'末端に制限エンドヌクレアーゼEcoRIについての認識配列、およびコード鎖の3'末端にBglII配列を有する。BglIIを用いる切断は、BamHIによって生成される末端と互換性のある5'突出すなわち「付着末端」を残す。PCR増幅したDNAをEcoRIおよびBamHIで消化した。ポリメラーゼ遺伝子についてのコード領域を含む2512bpの断片をゲル精製し、次いで誘導性プロモーターを含むプラスミドに連結した。
【０２３２】
本発明の1つの態様において、pTTQ18ベクター（これは、ハイブリッドtrp-lac（tac）プロモーターを含む）を使用した（M.J.R. Stark, Gene 5: 255 [1987]）。tacプロモーターは、大腸菌 lacリプレッサータンパク質の制御下にある。リプレッションは、遺伝子産物の合成が所望の細菌増殖のレベルが達成されるまで抑制されることを可能にし、その時点で、リプレッションは特異的インデューサー、イソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の付加によって除去される。このような系は、形質転換体の増殖を遅くし得るかまたは妨害し得る外来性のタンパク質の制御された発現を可能にする。
【０２３３】
特に強力な細菌プロモーター（例えば、合成Ptac）は、複数コピーのプラスミド上に存在する場合に十分に抑制されないかもしれない。毒性の高いタンパク質がこのようなプロモーターの制御下に置かれた場合、少量の発現の漏れの部分が、インデューサーの非存在下においてでさえ、細菌にとって有害であり得る。本発明の別の態様において、クローニングされた遺伝子産物の合成を抑制するための別の選択肢が意図される。プラスミドベクターシリーズpET-3において見い出される、バクテリオファージT7由来の非細菌性プロモーターを使用して、クローニングされた変異体Taqポリメラーゼ遺伝子を発現させた（StudierおよびMoffatt、J. Mol. Biol., 189: 113 [1986]）。このプロモーターは、T7 RNAポリメラーゼによってのみ、転写を開始する。適合性のある株（例えば、BL21 (DE3) pLYS）において、ファージT7 RNAポリメラーゼについての遺伝子は、lacオペレーターの制御下で細菌ゲノムに含まれている。この配置は、複数コピーの遺伝子（プラスミド上）の発現がT7 RNAポリメラーゼの発現（これは単一コピーで存在するので容易に抑制される）に完全に依存しているという利点を有する。
【０２３４】
適切な誘導性プロモーターを有するベクターの例が2つのみ存在する。他のものは当業者に周知であり、発現系の選択によって本発明の改善されたヌクレアーゼが限定されることは意図されない。
【０２３５】
pTTQ18ベクターへのライゲーションのために、Taqポリメラーゼコード領域（以下に議論する理由のためmutTaqと呼ばれる、配列番号：238）を含有するPCR産物DNAをEcoRIおよびBglIIで消化し、そしてこの断片を標準的な「付着末端(sticky end)」条件下で（Sambrookら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1.63-1.69頁 [1989]）プラスミドベクターpTTQ18のEcoRI部位およびBamHI部位に連結した。この構築物の発現は、翻訳される融合産物を産生し、ここでは未変性タンパク質の最初の2つの残基（Met-Arg）がベクター由来の3つの残基（Met-Asn-Ser）によって置き換わっているが、PCR産物のタンパク質配列の残りの部分は変化していない（配列番号：239）。この構築物を大腸菌のJM109株に形質転換し、その形質転換体を未変性タンパク質を発現する細菌の増殖を許容しない、不完全な抑制条件下でプレーティングした。これらのプレーティング条件は、あらかじめ存在していた変異（例えば、増幅プロセスの間にTaqポリメラーゼの忠実度のなさから生じるもの）を含む遺伝子の単離を可能にする。
【０２３６】
この増幅／選択プロトコールを使用して、変異したTaqポリメラーゼ遺伝子（mutTaq）を含むクローンを単離した。この変異体を最初にその表現型によって検出した。ここでは、粗細胞抽出物中の温度安定性5'ヌクレアーゼ活性が正常であったが、重合活性はほぼ存在しなかった（野生型Taqポリメラーゼ活性のおよそ1％未満）。ポリメラーゼ活性をプライマー伸長反応によって測定した。その反応を、10mM MOPS、pH 7.5、5mM MgSO4、100mM KClを含む10μlのバッファー中で実行した。各反応において40ngの酵素を使用して、10μM ポリ（A）286または1μM ポリ（dA）273のいずれかのテンプレート、45μM dTTP、および5μM F1-dUTPの存在下で、60℃で30分間、10μM（dT）25-30プライマーを伸長させた。反応を、10μlの停止溶液（95％ホルムアミド、10mM EDTA、0.02％メチルバイオレット色素）を用いて停止させた。試料（3μl）を、15％変性アクリルアミドゲル（19:1架橋）上で分画し、取り込まれたF1-dUTPの画分を、505nm放射フィルターを備えたFMBIO-100蛍光ゲルスキャナー（Hitachi）を使用して定量した。
【０２３７】
組換え遺伝子のDNA配列分析は、これが2つのアミノ酸置換を生じるポリメラーゼドメイン中の変化を有することを示した。この変化とは： 1394位のヌクレオチドにおけるAからGへの変化（これは、465位のアミノ酸においてGluからGlyへの変化を引き起こす）（天然の核酸配列およびアミノ酸配列、配列番号：153および157に従って番号付けしている）、および別の、2260位のヌクレオチドにおけるAからGへの変化（これは、754位のアミノ酸においてGlnからArgへの変化を引き起こす）である。GlnからGlyへの変異は非保存性位置であるので、およびGluからArgへの変異は、実質的にすべての既知のA型ポリメラーゼにおいて保存されているアミノ酸を変化させるので、後者の変異はこのタンパク質の合成活性を削減することの原因である可能性が最も高いものである。この構築物のヌクレオチド配列は配列番号：39に示される。この配列によってコードされる酵素はTaq A/Gといわれる。
【０２３８】
b. 最初のTtHPol単離
細菌種テルムス テルモフィルス（Tth）由来のDNAポリメラーゼ酵素を、発現ベクターにこのタンパク質についての遺伝子をクローニングすること、および大腸菌細胞においてそれを過剰発現させることによって産生した。ゲノムDNAを、ATCCからの乾燥させたテルムス テルモフィルス株HB-8の1バイアル（ATCC#27634）から調製した。DNAポリメラーゼ遺伝子を、以下のプライマー：
2005518223.tif 000017
および
2005518223.tif 000018
を使用してPCRによって増幅した。得られたPCR産物を、EcoRIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、そしてEcoRI/SalI消化プラスミドベクターpTrc99G（実施例2C1に記載）に挿入して、プラスミドpTrcTth-1を作製した。このTthポリメラーゼ構築物は、1つのヌクレオチドを欠いており、これは、5'オリゴヌクレオチドから偶発的に除外されたものであり、フレームから外れたポリメラーゼ遺伝子を生じる。この誤りは、実施例4および5に記載されるように、以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000019
を使用してpTrcTth-1の部位特異的変異誘発によって訂正され、プラスミドpTrcTtH-2を作製した。このタンパク質およびこのタンパク質をコードする核酸配列はTthPolと呼ばれ、それぞれ、配列番号：243および244として列挙される。
【０２３９】
c. 組換えタンパク質の大スケール調製
組換えタンパク質を、TaqDNAポリメラーゼ調製プロトコールに派生する以下の技術によって以下のように精製した（Engelkeら、Anal. Biochem., 191: 396 [1990]）。pTrc99A、TaqPol、pTrc99GTthPolのいずれかを含む大腸菌細胞（JM109株）を100mg/mlアンピシリンを含む3mlのLBに接種し、37℃で16時間増殖させた。一晩培養物の全体を100mg/mlアンピシリンを含む200mlまたは350mlのLBに接種し、激しく振盪しながらA600が0.8になるまで37℃で増殖させた。IPTG（1Mストック溶液）を最終濃度1mMで添加し、増殖を37℃で16時間継続した。
【０２４０】
誘導された細胞をペレット化し、そして細胞ペレットを重量測定する。等量の2×DGバッファー（100mM Tris-HCl、pH 7.6、 0.1mM EDTA）を添加し、ペレットを攪拌によって懸濁した。50mg/mlのリゾチーム（Sigma）を1mg/mlの最終濃度で添加し、細胞を室温で15分間インキュベーションした。デオキシコール酸（10％溶液）をボルテックスしながら0.2％の最終濃度に滴下して加えた。1容量のH2Oおよび1容量の2×DGバッファーを加え、得られる混合物を氷上で2分間超音波処理して混合物の粘度を低下させた。超音波処理後、3M (NH4)2SO4を最終濃度0.2Mで添加し、溶解物を14000×gで20分間、4℃で遠心分離した。上清を取り除き、70℃で60分間インキュベートした。この時点で10％ポリエチレンイミン（PEI）を0.25％まで添加した。氷上で30分間のインキュベーション後、混合物を14,000×gで20分間、4℃で遠心分離した。この時点で、上清を取り除き、以下のように(NH4)2SO4の付加によってタンパク質を沈殿させた。
【０２４１】
2容量の3M (NH4)2SO4をタンパク質を沈殿させるために添加した。この混合物を、室温で一晩16時間インキュベートし、14,000×gで20分間、4℃で遠心分離した。このタンパク質ペレットを、0.5mlのQバッファー（50mM Tris-HCl、pH 8.0、0.1mM EDTA、0.1％ Tween 20）に懸濁した。Mja FEN-1調製のために、固体(NH4)2SO4を最終濃度3M（約75％飽和）で添加し、氷上にて30分間インキュベートし、そしてタンパク質を遠心分離で沈殿させ、上記のように懸濁させた。
【０２４２】
懸濁させたタンパク質調製物をA279の測定により定量し、透析し、そして、100μg/ml BSAを有する50％グリセロール、20mM Tris-HCl、pH 8.0、50mM KCl、0.5％ Tween 20、0.5％ Nonidet P-40中で保存した。
【０２４３】
B. テルムス フィリフォルミスおよびテルムス スコトドクトゥスのDNAポリメラーゼ
（1. テルムス フィリフォルミスおよびテルムス スコトドクトゥスのクローニング）
DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellculturen, Braunschweig, Germany, strain #4687）から入手した凍結乾燥したテルムス フィリフォルミス（Tfi）の1バイアルを、1mlのCastenholz培地（DSMZ培地86）中で再水和させ、50℃まであらかじめ加熱した500mlのCastenholz培地に接種した。この培養物を激しく振盪しながら70℃で48時間インキュベートした。増殖後、細胞を8000×g、10分間の遠心分離によって収集し、細胞ペレットを10mlのTE（10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA）に懸濁し、そして細胞を1mlアリコートにて-20℃で凍結させた。1つの1mlアリコートを融解し、リゾチームを1mg/mlで添加し、そして細胞を23℃で30分間インキュベートした。20％ SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）の溶液を最終濃度0.5％で加え、続いて緩衝化フェノールで抽出した。水相をさらに1:1フェノール：クロロホルムで抽出し、最後はクロロホルムで抽出した。10分の1容量の3M酢酸ナトリウム、pH 5.0および2.5容量のエタノールを水相に加えて、混合した。DNAを、20,000×g、5分間の遠心分離によってペレット化した。このDNAペレットを70％エタノールで洗浄し、風乾し、そして200μlのTEに再懸濁し、増幅のために直接使用した。テルムス スコトドクトゥス（Tsc、ATCC #51532）を増殖させ、ゲノムDNAを、テルムス フィリフォルミスについて上記に記載されたのと同様に調製した。
【０２４４】
Tfi（GenBankアクセッション番号#AF030320）からのDNAポリメラーゼI遺伝子は単一の断片として増幅することができなかった。それゆえに、これを発現ベクターpTrc99aに2つの別々の断片でクローニングした。この2つの断片は重複しかつNot1部位を共有しており、この部位はPCRオリゴヌクレオチド中のTfi DNAポリメラーゼのオープンリーディングフレーム（ORF）の1308位にサイレント変異を導入することによって作製された。この遺伝子の3'の半分を、Advantage cDNA PCRキット（Clonetech）を使用して、以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000020
を用いて増幅した。この反応からのPCR産物は、約1200塩基対の長さであった。これを制限酵素NotIおよびSalIで切断し、得られたDNAを、NotIおよびSalIで切断したpTrc99aに連結してpTrc99a-Tfi3'を作製した。この遺伝子の5'の半分を、以下の2つのプライマー：
2005518223.tif 000021
を使用して上記と同様に増幅した。得られた1300塩基対の断片を、制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、NotIおよびEcoRIで切断したpTrc99a-Tfi3'に連結してpTrc99a-TfiPol、配列番号：249（対応するアミノ酸配列は配列番号：250に列挙される）を産生した。
【０２４５】
テルムス スコトドクトゥスからのDNAポリメラーゼI遺伝子を、Advantage cDNA PCRキット（Clonetech）を使用して、以下の2つのプライマー：
2005518223.tif 000022
を使用して増幅した。このPCR産物を制限酵素EcoRIおよびSalIで切断し、EcoRIおよびSalIで切断したpTrc99aに連結して、pTrc99a-TscPol、配列番号：253（対応するアミノ酸配列は配列番号：254に列挙される）を作製した。
【０２４６】
2. テルムス フィリフォルミスおよびテルムス スコトドクトゥスの発現および精製
プラスミドを、タンパク質発現のためにプロテアーゼ欠損大腸菌株BL21（Novagen）またはJM109株（Promega Corp., Madison, WI）に形質転換した。100μg/mlアンピシリンを含む200mlのLBを含むフラスコに、LBプレートからのシングルコロニーまたは適切な株の凍結ストックからのいずれかを接種した。激しく振盪しながらの37℃、数時間の増殖後、培養を200μlの1Mイソチオプロピル-ガラクトシド（IPTG）の添加によって誘導した。37℃での増殖を収集の前16時間継続した。細胞を8000×gで15分間の遠心分離によってペレット化し、続いて5mlのTEN（10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA、100mM NaCl）中で細胞ペレットの懸濁を行った。100μlの50mg/mlリゾチームを加え、細胞を室温で15分間インキュベートした。デオキシコール酸（10％）を最終濃度0.2％で加えた。徹底的な混合後、細胞溶解物を氷上で2分間超音波処理して、混合物の粘度を低下させた。細胞細片を4℃、15分間、20,000×gでの遠心分離によってペレットにした。上清を取り除き、70℃で30分間インキュベートし、その後10％ポリエチレンイミン（PEI）を0.25％まで加えた。氷上での30分間のインキュベーション後、混合物を20,000×g、4℃、20分間遠心分離しした。この時点で、酵素を含有する上清を取り除き、タンパク質を、1.2gの硫酸アンモニウムの添加によって沈殿させ、4℃で1時間のインキュベーションを行った。タンパク質を、4℃で10分間、20,000×gでの遠心分離によってペレット化した。このペレットを、4mlHPLCのバッファーA（50mM TrisHCl、pH 8.0、1mM EDTA）に再懸濁した。このタンパク質を、Econo-Pacヘパリンカートリッジ（Bio-Rad）およびDionex DX 500 HPLC装置を使用するアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。手短に述べると、カートリッジをHPLCバッファーAで平衡化し、酵素抽出物をカラムにロードし、そして同じバッファー中のNaClのリニアグラジエント（0-2M）を用いて溶出した。純粋なタンパク質はNaCl 0.5Mから1Mの間で溶出する。酵素のピークを収集し、50％グリセロール、20mM Tris-HCl、pH 8、50mM KCl、0.5％ Tween 20、0.5％ Nonidet P-40、100mg/ml BSA中で透析した。
【０２４７】
C.ポリメラーゼ活性が減少しているが5'ヌクレアーゼ活性は変化していないポリメラーゼ変異体の生成
C節で生成したすべての変異体を、実施例2A1Cに記載されるように発現および精製した。
【０２４８】
1. 改変されたTaqPol遺伝子：TaqDN
TaqDNと呼ばれるTaqDNAポリメラーゼの重合欠損変異体を構築した。TaqDNヌクレアーゼは、785位の野生型アスパラギン酸残基の代わりにアスパラギン残基を含む（D785N）。
【０２４９】
TaqDNヌクレアーゼをコードするDNAを、部位特異的変異誘発の2ラウンドでTaqA/Gをコードする遺伝子から構築した。第1のグラウンドで、TaqA/G遺伝子（配列番号：238）の1397位のGおよび2264位のGを各位置でAに変化させ、野生型TaqPol遺伝子を再作製した。変異誘発の第2のラウンドにおいて、野生型TaqPol遺伝子を、2356位のGをAに変化させることによってTaq DN遺伝子に転換させた。これらの操作を以下のように実行した。
【０２５０】
TaqA/GヌクレアーゼをコードするDNAを、pTTQ18プラスミドからpTrc99Aプラスミド（Pharmacia）に2段階の手順で再クローニングした。第1に、pTrc99Aベクターを、pTrc99Aマップの270位のGを除去することによって改変し、pTrc99Gクローニングベクターを作製した。この目的のために、pTrc99AプラスミドDNAをNcoIで切断し、3'の陥凹末端を4種すべてのdNTPの存在下で、37℃で15分間、大腸菌ポリメラーゼIのクレノウ断片を使用して充填した。65℃、10分間のインキュベーションによるクレノウ断片の不活化後、プラスミドDNAをEcoRIで切断し、末端を再度、4種すべてのdNTPの存在下で、37℃で15分間、クレノウ断片を使用して充填した。次いで、クレノウ断片を65℃、10分間のインキュベーションによって不活化した。プラスミドDNAをエタノール沈殿させ、ライゲーションによって再環状化し、そして大腸菌 JM109細胞（Promega）を形質転換するために使用した。プラスミドDNAを単一のコロニーから単離し、pTrc99Aマップの270位のGの欠失をDNA配列決定によって確認した。
【０２５１】
第2の工程において、TaqA/GヌクレアーゼをコードするDNAを、EcoRIおよびSalIを使用してpTTQ18プラスミドから取り出し、TaqA/Gヌクレアーゼ遺伝子を有するDNA断片を1％アガロースゲル上で分離し、GenecleanIIキット（Bio 101, Vista, CA）を用いて単離した。精製された断片を、EcoRIおよびSalIで切断されたpTrc99Gベクターに連結した。ライゲーション混合物を、コンピテント大腸菌 JM109細胞（Promega）を形質転換するために使用した。プラスミドDNAを単一コロニーから単離し、TaqA/Gヌクレアーゼ遺伝子の挿入を、EcoRIおよびSalIを使用する制限分析によって確認した。
【０２５２】
pTrc99AベクターにクローニングされたTaqA/Gヌクレアーゼ遺伝子を有するプラスミドDNA pTrcAGを、QIAGEN Plasmid Maxiキット（QIAGEN, Chatsworth, CA）を使用して、製造業者のプロトコールに従って、200mlのJM109の一晩培養物から精製した。pTrcAGプラスミドDNAを、2種の変異誘発プライマー、E465（配列番号：255）（Integrated DNA Technologies, Iowa）およびR754Q（配列番号：256）（Integrated DNA Technologies）、ならびに選択プライマーTrans Oligonucleotide AlwNI/SpeI（Clontech, Palo Alto, CA, カタログ番号#6488-1）を使用して、TRANSFORMER Site-Directed Mutagenesis Kitプロトコール（Clontech, Palo Alto, CA）に従って変異誘発させ、修復された野生型TaqPol遺伝子（pTrcWT）を産生した。
【０２５３】
pTrc99Aベクターにクローニングされた野生型TaqPol遺伝子を有するpTrcWTプラスミドDNAを、QIAGEN Plasmid Maxiキット（QIAGEN, Chatsworth, CA）を使用して、製造業者のプロトコールに従って、200mlのJM109の一晩培養物から精製した。次いで、pTrcWTを、変異誘発プライマー、D785N（配列番号：257）（Integrated DNA Technologies）および選択プライマーSwitch Oligonucleotide SpeI/AlwNI/SpeI（Clontech, Palo Alto, CA, カタログ番号#6373-1）を使用して、TRANSFORMER Site-Directed Mutagenesis Kitプロトコール（Clontech, Palo Alto, CA）に従って変異誘発させ、Taq DNヌクレアーゼをコードするDNAを含むプラスミドを作製した。Taq DNヌクレアーゼをコードするDNA配列は配列番号：258に提供され；Taq DNヌクレアーゼのアミノ酸配列は配列番号：259に提供される。
【０２５４】
2. 改変されたTthPol遺伝子：Tth DN
Tth DN構築物を、上記に記載したTthPolを変異させることによって作製した。787位にアスパラギン酸をコードする配列を、上記のように部位特異的変異誘発によって、アスパラギンをコードする配列に変化させた。以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000023
を用いるpTrcTth-2の変異誘発を実行して、プラスミドpTrcTthDNを作製した。変異タンパク質およびタンパク質をコードする核酸配列をTthDNと呼ぶ（それぞれ配列番号：261および262）。
【０２５５】
3. Taq DN HTおよびTth DN HT
6アミノ酸ヒスチジンタグ（his-タグ）をTaq DNおよびTth DNのカルボキシ末端に付加した。部位特異的変異誘発を、TRANSFORMER Site-Directed Mutagenesis Kit（Clontech）を使用して、製造業者の指示書に従って実行した。プラスミドpTaq DNおよびpTth DNで使用される変異誘発オリゴヌクレオチドは、配列117-067-03、
2005518223.tif 000024
および配列136-037-05、
2005518223.tif 000025
であった。選択プライマーTrans Oligo AlwNI/SpeI（Clontech、カタログ番号#6488-1）を両方の変異誘発反応のために使用した。得られた変異体遺伝子は、Taq DN HT（配列番号：265、核酸配列；配列番号：266、アミノ酸配列）およびTth DN HT（配列番号：267、核酸配列；配列番号：268、アミノ酸配列）と名付けられた。
【０２５６】
4. Taq DN HTおよびTth DN HTの精製
Taq DN HTおよびTth DN HTの両方のタンパク質を大腸菌株JM109において実施例2B2において記載されるように発現させた。硫酸アンモニウム沈殿および遠心分離の後、タンパク質ペレットを0.5mlのQバッファー（50mM Tris-HCl、pH 8.0、0.1mM EDTAm、0.1％ Tween 20）に懸濁した。このタンパク質を、His-Band ResinおよびBuffer Kit（Novagen）を使用して、製造業者の指示書に従ってアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製した。1mlのHis-Bind樹脂をカラムに移し、3カラム容量の滅菌水で洗浄し、5容量の1×充填バッファーを用いて充填し、そして3容量の1×Binding Bufferを用いて平衡化した。4mlの1×Binding Bufferをタンパク質試料に加え、試料溶液をカラムにロードした。3mlの1×Binding Bufferおよび3mlの1×Wash Bufferを用いる洗浄の後、結合したHis-Tagタンパク質を1mlの1×Elute Bufferで溶出した。次いで、純粋な酵素を50％グリセロール、20mM Tris-HCl、pH 8.0、50mM KCl、0.5％ Tween 20、0.5％ Nonidet P40、および100μg/ml BSA中で透析した。酵素濃度を279nmにおける吸収を測定することによって決定した。
【０２５７】
実施例3
TthPolのRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性はDNAポリメラーゼドメインのN末端部分の移入によってTaqPol上に付与され得る
A. DNAまたはRNAのいずれかの標的鎖を有する基質構造の調製および精製
下流（配列番号：162）および上流（配列番号：161）のプローブならびにIL-6 DNA（配列番号：163）（図10）標的鎖を、PerSeptive Biosystems instrument上で、標準的なホスホルアミデート化学（Glen Research）を使用して合成した。5'末端でビオチン標識した合成RNA-DNAキメラIrT標的を（図20A）、2'-ACE RNA化学（Dharmacon Research）を利用して合成した。2'-保護基を、製造業者の指示書に従って酸触媒加水分解によって除去した。それらの5'末端を5'-フルオレセイン（Fl）または5'-テトラクロロ-フルオレセイン（TET）で標識した下流プローブを、Resource Qカラム（Amersham-Pharmacia Biotech）を使用して、逆相HPLCによって精製した。648ヌクレオチドのIL-6 RNA標的（配列番号：160）（図10）を、ヒトIL-6 cDNAのクローニングされた断片（Mayら、Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8957 [1986]において公開された配列のヌクレオチド64-691）のT7 RNAポリメラーゼランオフ-転写によって、Magascript Kit（Ambion）を使用して合成した。すべてのヌクレオチドを、20％変性ポリアクリルアミドゲル上での分離、続いて切り出しおよび主要なバンドの溶出によって最終的に精製した。オリゴヌクレオチド濃度を、260nmにおける吸収を測定することによって決定した。ビオチン標識したIrT標的を、10mM MOPS、pH 7.5、0.05％ Tween 20、0.05％ P-40、および10μg/ml tRNAを含むバッファー中の5倍過剰のストレプトアビジン（Promega）とともに、室温で10分間インキュベートした。
【０２５８】
B. キメラを作製するための制限部位の導入
キメラタンパク質の形成のために使用される制限部位を、以下に記載するように、便宜上選択した。以下の実施例における制限部位を、結晶構造および他の分析によって機能性ドメインであると示された領域を取り囲むように戦略的に配置した（図6、7、および19を参照されたい）。天然に存在するか、または特異的性変異誘発を介して作製されたかのいずれかの異なる部位を、関連する生物からの他のA型ポリメラーゼ遺伝子を有する類似の構築物を作製するために使用し得る。変異がすべてタンパク質機能に関してサイレントであることが所望される。核酸配列およびタンパク質のアミノ酸配列を研究することによって、対応するアミノ酸配列に効果を有さない核酸配列の変化を導入し得る。必要とされる核酸の変化がアミノ酸に影響を与える場合、新規なアミノ酸が、置き換えられたアミノ酸と同じかまたは類似の特徴を有するように変化を作製し得る。これらの選択肢がいずれも可能でない場合、核酸の変化がタンパク質の活性、特異性、または機能に変化を引き起こしたかどうかを決定するための、機能についての変異体酵素を試験し得る。本発明は、本発明の改善された酵素の作製のために選択または導入された特定の制限部位によって限定されることは意図されない。
【０２５９】
C. Tth DN RX HT およびTaq DN RX HTの生成
変異誘発を実行して、Taq DN HTおよびTth DN HTの両方の酵素のポリメラーゼドメインに3つのさらなる独特な制限部位を導入した。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従ってTransformer Site-Directed Mutagenesis Kit（Clonetech）を使用して実行した。2つの異なる選択プライマー、Trans Oligo AlwNI/SpeIまたはSwicth Oligo SpeI/AlwNI（Clontech, Palo Alto CA, カタログ番号#6488-1またはカタログ番号#6373-1）のうちの1つを、記載されたすべての変異誘発反応のために使用した。所定の反応において使用される選択オリゴは、ベクター中に存在する選択制限部位に依存する。すべての変異誘発プライマーを標準的な合成化学によって合成した。生じるコロニーを大腸菌株JM109において発現させた。
【０２６０】
NotI部位（アミノ酸328位）を、Taq DN HT遺伝子およびTth DN HT遺伝子のセンス鎖にそれぞれ対応する変異誘発プライマー
2005518223.tif 000026
および
2005518223.tif 000027
を使用して作製した。BstI部位（アミノ酸382位）およびNdeI部位（アミノ酸443位）をセンス鎖変異誘発プライマー
2005518223.tif 000028
および
2005518223.tif 000029
を使用して両方の遺伝子に導入した。変異体プラスミドを過剰発現させ、Qiagen QiaPrep Spin Mini Prep Kit（カタログ番号#27106）を使用して精製した。このベクターをDNA配列決定および制限酵素地図作製によって制限部位の存在について調べた。これらの構築物を、Tth DN RX HT（DNA配列   配列番号：273、アミノ酸配列  配列番号：274）およびTaq DN RX HT（DNA配列   配列番号：275、アミノ酸配列  配列番号：276）と名付けた。
【０２６１】
D. キメラ
図19に示されるキメラ構築物を、両方の遺伝子にとって共通である制限エンドヌクレアーゼ部位EcoRI（E）およびBamHI（B）、クローニングベクター部位SalI（S）、ならびに、部位特異的変異誘発によって両方の遺伝子の相同位置で作製された新規な部位、NotI（N）、BstBI（Bs）、NdeI（D）によって規定される異種DNA断片を交換することによって作製した。これらのキメラ酵素を生成する際に、2つの異なるDNAの部分を一緒に連結して最終構築物を産生した。プラスミドベクターならびにTaqまたはTthの部分（または両方の部分）の配列を含む、より大きなDNAの部分は「ベクター」と呼ばれる。TaqまたはTthのいずれか（または両方の部分）のポリメラーゼの配列を含む、より小さなDNAの部分は、「挿入物」と呼ばれる。
【０２６２】
すべての制限酵素をNew England BiolabsまたはPromegaから入手し、付随するバッファーとともに、製造業者の指示書に従って、反応において使用した。反応を、20μl容量で、反応あたり約500ngのDNAを用いて、特定の酵素についての最適温度で行った。酵素が反応バッファー条件および反応温度に関して適合可能である場合には、1種より酵素を単回の反応において使用した（二重消化）。問題の酵素がバッファー条件に関して適合可能でない場合には、最も低い塩条件を要求する酵素を最初に使用した。この反応の完了後、バッファー条件を、第2の酵素に対して最適またはより良好に変化させ、そして第2の反応を実行した。これらは一般的な制限酵素消化ストラテジーであり、基本的な分子生物学の当業者に周知である（Maniatis、前出）。
【０２６３】
消化された制限断片を、最適なライゲーション効率のためにゲルで単離した。2μlの10×ローディング色素（50％グリセロール、1×TAE、0.5％ブロモフェノールブルー）を20μl反応に加えた。その全量を、100mlのアガロースゲル溶液あたり1μlの1％臭化エチジウム溶液を含む1％、1×TAEアガロースゲル上でロードおよび泳動した。消化された断片をUV光の下で可視化し、適切な断片（サイズによって決定される）をゲルから切り出した。次いで、これらの断片を、製造業者の指示書に従ってQiagen Gel Extractio Kit（カタログ番号#28706）を使用して精製した。
【０２６４】
ライゲーションを、10μl容量で、付随する反応バッファーとともに、反応あたり400ユニットの、New England Biolabsから入手したT4 DNAリガーゼ酵素（カタログ番号#202L）を使用して行った。ライゲーション反応を、1μlの各々のQiagen精製した断片（約20-50ngの各DNA、ゲル単離物からの回収に依存する）を用いて室温で1時間行った。次いで、ライゲーション産物を大腸菌株JM109に形質転換し、適切な増殖および選択培地（例えば、形質転換体を選択するための100μg/mlアンピシリンを有するLB）にプレーティングした。
【０２６５】
各々のライゲーション反応のために、所望の構築物が存在するかどうかを決定するために6つの形質転換体を試験した。プラスミドDNAを、製造業者の指示書に従って、QiaPrep Spin Mini Prep Kitを使用して精製および単離した。この構築物を、DNA配列決定および制限酵素地図作製によって確認した。
【０２６６】
キメラ酵素の発現および精製を以下のように行った。プラスミドを大腸菌株JM109（Promega）に形質転換した。JM109の対数増殖期培養物（200ml）を0.5mM IPTG（Promega）で誘導し、収集の前にさらに16時間増殖させた。可溶性タンパク質を含む粗抽出物を、5mlの10mM Tris-HCl、pH 8.3、1mM EDTA、0.5mg/ml リゾチーム中、室温で15分間のインキュベーションの間のペレット化した細胞の溶解によって調製した。この溶解物を、5mlの10mM Tris-HCl、pH 7.8、50mM KCl、1mM EDTA、0.5％ Tween 20、0.5％ Nonidet P-40とともに混合し、72℃で30分間加熱し、そして細胞細片を12,000×gで5分間の遠心分離によって取り除いた。タンパク質の最終的な精製を、Econo-Pacヘパリンカートリッジ（Bio-Rad）およびDionex DX 500 HPLC装置を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって行った。手短に述べると、カートリッジを50mM Tris-HCl、pH 8、1mM EDTAで平衡化し、同じバッファーに対して透析した酵素抽出物をカラムにロードし、そして同じバッファー中のNaCl（0-2M）のリニアグラジエントを用いて溶出した。HPLC精製したタンパク質を、50％（vol/vol）グリセロール、20mM Tris-HCl、pH 8.0、50mM KCl、0.5％ Tween 20、0.5％ Nonidet P-40、および100μg/ml BSA中で透析および保存した。酵素はSDS-PAGE上で均一なまでに精製され、酵素濃度を279nmの吸収を測定することによって決定した。
【０２６７】
1. TaqTth（N）およびTthTaq（N）の構築
実行された第1の交換は2つの酵素のポリメラーゼドメインを含んだ。ヌクレアーゼドメイン（タンパク質のN末端）のポリメラーゼドメイン（タンパク質のC末端側部分）からの分離を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNotIを用いて両方の遺伝子を切断することによって達成した。Tth DN RX HT遺伝子からのおよそ900塩基対の断片をTaq DN RX HT遺伝子の相同部位にクローニングし、そしてTaq DN RX HT遺伝子からのおよそ900塩基対の断片をTth DN RX HT遺伝子の相同部位にクローニングし、2種のキメラ、TaqTth（N）（DNA配列  配列番号：69；アミノ酸配列  配列番号：2）（これは、Taq DN RX HTの5'ヌクレアーゼドメインおよびTth DN RX HTのポリメラーゼドメインを有する）、およびTthTaq（N）（DNA配列  配列番号：70；アミノ酸配列  配列番号：3）（これは、Tth DN RX HTの5'ヌクレアーゼドメインおよびTaq DN RX HTのポリメラーゼドメインから構成される）を産生した。
【０２６８】
2. TaqTth（N-B）の構築
Taq DN RX HT構築物を酵素NdeIおよびBamHIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるようにゲルによって単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、NdeIおよびBamHIを用いて切断し、より小さな（約795塩基対）Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NdeI-BamHI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NdeI-BamHIベクターに連結し、TaqTth（N-B）（DNA配列  配列番号：71；アミノ酸配列  配列番号：4）を生成した。
【０２６９】
3. TaqTth（B-S）の構築
Taq DN RX HT構築物を酵素BamHIおよびSalIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるようにゲルによって単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、BamHIおよびSalIを用いて切断し、より小さな（約741塩基対）Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth BamHI-SalI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq BamHI-SalIベクターに連結し、TaqTth（B-S）（DNA配列  配列番号：72；アミノ酸配列  配列番号：5）を生成した。
【０２７０】
4. TaqTth（N-D）の構築
Taq DN RX HT構築物を酵素NotIおよびNdeIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、NotIおよびNdeIを用いて切断し、より小さな（約345塩基対）Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NotI-NdeI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NotI-NdeIベクターに連結し、TaqTth（N-D）（DNA配列  配列番号：73；アミノ酸配列  配列番号：6）を生成した。
【０２７１】
5. TaqTth（D-B）の構築
Taq DN RX HT構築物を酵素NdeIおよびBamHIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、NdeIおよびBamHIを用いて切断し、より小さな（約450塩基対）Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NdeI-BamHI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NdeI-BamHIベクターに連結し、TaqTth（D-B）（DNA配列  配列番号：74；アミノ酸配列  配列番号：7）を生成した。
【０２７２】
6. TaqTth（Bs-B）の構築
Taq DN RX HT構築物を酵素BstBIおよびBamHIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、BstBIおよびBamHIを用いて切断し、より小さな（約633塩基対）Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NdeI-BamHI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NdeI-BamHIベクターに連結し、TaqTth（Bs-B）（DNA配列  配列番号：75；アミノ酸配列  配列番号：8）を生成した。
【０２７３】
7. TaqTth（N-Bs）の構築
Taq DN RX HT構築物を酵素NotIおよびBstBIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Tth DN RX HT構築物もまた、NotIおよびBstBIを用いて切断し、より小さな（約162塩基対）Tth断片をゲルにより単離および精製した。Tth NotI-BstBI挿入物を、上記に詳述されるようにTaq NotI-BstBIベクターに連結し、TaqTth（N-Bs）（DNA配列  配列番号：76；アミノ酸配列  配列番号：9）を生成した。
【０２７４】
8. TthTaq（B-S）の構築
Tth DN RX HT構築物を酵素BamHIおよびSalIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Taq DN RX HT構築物もまた、BamHIおよびSalIを用いて切断し、より小さな（約741塩基対）Tth断片をゲルにより単離および精製した。Taq BamHI-SalI挿入物を、上記に詳述されるようにTth BamHI-SalIベクターに連結し、TthTaq（B-S）（DNA配列  配列番号：77；アミノ酸配列  配列番号：10）を生成した。
【０２７５】
9. TthTaq（N-B）の構築
Tth DN RX HT構築物を酵素NotIおよびBamHIを用いて切断し、より大きなベクター断片を上記に詳述されるように単離した。Taq DN RX HT構築物もまた、NotIおよびBamHIを用いて切断し、より小さな（約795塩基対）Tth断片をゲルにより単離および精製した。Taq NotI-BamHI挿入物を、上記に詳述されるようにTth NotI-BamHIベクターに連結し、TthTaq（N-B）（DNA配列  配列番号：78；アミノ酸配列  配列番号：11）を生成した。
【０２７６】
これらのキメラタンパク質の切断活性を、実施例1、A部に記載されるように特徴付けし、RNA標的に対する切断サイクル化速度の比較は図12に示される。本発明の説明においてさらに議論されるように、これらのデータは、TthPolタンパク質の中央の3分の1において見い出されるエレメントが、TaqPolの一部を含むキメラタンパク質に対するTthPol様RNA依存性切断活性を付与するのに重要であることを示す。
【０２７７】
実施例4
RNA依存性5'ヌクレアーゼ活性に影響を与える変化は、RNA依存性DNAポリメラーゼ活性に必ずしも影響を与えない
TthPolは、TaqPolよりも活性なRNAテンプレート依存性DNAポリメラーゼを有することが知られている（MyersおよびGelfand、Biochemistry 30: 7661 [1991]）。テルムス DNA Pol I酵素のRNAテンプレート依存性5'ヌクレアーゼ活性がそれらのRNA依存性ポリメラーゼ活性と関連するか否かを決定するために、TaqPolおよびTthPolのポリメラーゼ欠損バージョンを作製するために使用したD785NおよびD787Nの変異を、それぞれ逆にした。ポリメラーゼ活性は、TaqTth（N）（DNA配列  配列番号：79；アミノ酸配列  配列番号：12）キメラタンパク質、TaqTth（N-B）（DNA配列  配列番号：80；アミノ酸配列  配列番号：13）キメラタンパク質、TaqTth（B-S）（DNA配列  配列番号：81；アミノ酸配列  配列番号：14）キメラタンパク質、およびTaqPol（W417L/G418K/E507Q）（DNA配列  配列番号：82；アミノ酸配列  配列番号：15）変異タンパク質に同様に回復された。
【０２７８】
ポリメラーゼ機能は、未変性の、非DN配列のBamHI-SalI断片を選択されたキメラまたは変異酵素に挿入することによって、上記に言及された酵素変異体のすべてにおいて回復された。例えば、変異構築物TaqTth（N-B）を、制限酵素BamHI（およそアミノ酸593位）および制限酵素SalI（およそアミノ酸840位）で切断した。より大きなベクター断片を、実施例3Dに記載されるようにゲルによって精製した。未変性のTaqPol構築物もまた、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびSalIを用いて切断し、未変性のアミノ酸配列を含む、より小さな挿入物断片をまた、ゲルによって精製した。次いで、挿入断片を、実験的実施例3Dに詳述されるようにベクターに連結した。
【０２７９】
これらのタンパク質のポリメラーゼ活性を、ポリ（dA）またはポリ（A）テンプレートのいずれかの存在下で、フルオレセイン標識されたdUTPを用いるdT25-35オリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって評価した。プライマー伸長反応を、10mM MOPS、pH 7.5、5mM MgSO4、100mM KClを含む10μlバッファー中で実行した。40ngの酵素を使用して、10μM ポリ（A）286または1μM ポリ（dA）273のいずれかのテンプレート、45μM dTTP、および5μM Fl-dUTPの存在下で、60℃、30分間、10μM dT25-30プライマーを伸長させた。反応を、10μlの停止溶液（95％ホルムアミド、10mM EDTA、0.02％メチルバイオレット色素）を用いて停止させた。試料（3μl）を、15％変性アクリルアミドゲル上で分画し、取り込まれたF1-dUTPの画分を、上記のように、505nmフィルターを備えたFMBIO-100蛍光ゲルスキャナー（Hitachi）を使用して定量した。
【０２８０】
図16に示されるように、DNA依存性ポリメラーゼ活性は、この実験において使用されたすべての構築物について非常に類似しているのに対して、TthPol、TaqTth（N）、およびTaqTth（B-S）のRNA依存性ポリメラーゼ活性は、TaqPol、TaqTth（N-B）、およびTaqPol W417L/G418K/E507Q変異体の活性よりも少なくとも6倍高い。これらの結果の分析から、TthPolの高いRNA依存性DNAポリメラーゼ活性は、ポリメラーゼドメインのC末端の半分（およそアミノ酸593-830）によって決定されること、およびRNA依存性5'ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性は互いに関連性がなく、異なる領域によって制御されていることが結論され得る。
【０２８１】
実施例5
Taq DN RX HTにおける特異的点変異はキメラ研究からの情報から発展した
キメラ研究（実施例3、上記）は、高いRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を決定するTthPol配列の部分がおよそアミノ酸382とアミノ酸593との間に位置するBstBI-BamHI領域を含むことを示唆する。Tth DN RX HTおよびTaq DN RX HT（それぞれ配列番号：165および164）のBstBIとBamHIとの間のアミノ酸配列の領域の比較は、25のみの違いを示した（図13）。これらの間で、12のアミノ酸の変化が保存性であるのに対して、13の違いは電荷の違いを生じた。キメラ酵素の分析は、決定的な変異がTth DN RX HTのBstBI-NdeIおよびNdeI-BamHIの両方の領域に位置していることを示唆したので、部位特異的変異誘発を使用して、それぞれ、Taq Tth（D-B）およびTaq Tth（N-D）のBstBI-NdeIおよびNdeI-BamHIの領域にTth DN RX HT特異的アミノ酸を導入した。
【０２８２】
6つのTth DN RX HT特異的置換を、単一または二重のアミノ酸変異誘発によってTaq Tth（D-B）のBstBI-NdeI領域において生成させた。同様に、12のTth DN RX HT特異的アミノ酸変化を、Taq Tth（N-D）のNdeI-BamHI領域の相同位置に導入した。
【０２８３】
プラスミドDNAを、製造業者の指示書に従ってQIAGEN Plasmid Maxi Kit（QIAGEN, Chatsworth, CA）を使用して、200mlのJM109の一晩培養物から精製して、すべての変異誘発反応のための十分な出発物質を得た。すべての部位特異的変異を、製造業者のプロトコールに従ってTransformer Site Directed mutagenesis Kit（Clontech）を使用して導入した；各部位について使用された変異誘発プライマーのための特異的配列情報は以下に提供される。2種の異なる選択プライマーTrans Oligo AlwNI/SpeIまたはSwitch Oligo SpeI/AlwNI（Clontech, Palo Alto, CA カタログ番号#6488-1またはカタログ番号#6373-1）の1つを、記載されるすべての変異誘発反応のために使用した。所定の反応において使用される選択オリゴは、ベクター中に存在する制限部位に依存する。すべての変異誘発プライマーを、標準的な合成化学によって合成した。得られたコロニーは大腸菌株JM109であった。
【０２８４】
1. TaqTth（D-B）E404H（DNA配列  配列番号：83；アミノ酸配列  配列番号：16）の構築
部位特異的変異誘発を、E404H変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-01
2005518223.tif 000030
を使用してpTrc99A TaqTth（D-B）DNAに対して実行した。
【０２８５】
2. TaqTth（D-B）F413H/A414R（DNA配列  配列番号：84；アミノ酸配列  配列番号：17）の構築
部位特異的変異誘発を、F413H変異およびA414R変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-02
2005518223.tif 000031
を使用してpTrc99A TaqTth（D-B）DNAに対して実行した。
【０２８６】
3. TaqTth（D-B）W417L/G418K（DNA配列  配列番号：85；アミノ酸配列  配列番号：18）の構築
部位特異的変異誘発を、W417L変異およびG418K変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-03
2005518223.tif 000032
を使用してpTrc99A TaqTth（D-B）DNAに対して実行した。
【０２８７】
4. TaqTth（D-B）A439R（DNA配列  配列番号：86；アミノ酸配列  配列番号：19）の構築
部位特異的変異誘発を、A439R変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-04
2005518223.tif 000033
を使用してpTrc99A TaqTth（ND-B）DNAに対して実行した。
【０２８８】
5. TaqTth（N-D）L451R（DNA配列  配列番号：87；アミノ酸配列  配列番号：20）の構築
部位特異的変異誘発を、L415変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-05
2005518223.tif 000034
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２８９】
6. TaqTth（N-D）R457Q（DNA配列  配列番号：88；アミノ酸配列  配列番号：21）の構築
部位特異的変異誘発を、L415Q変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-06
2005518223.tif 000035
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９０】
7. TaqTth（N-D）V463L（DNA配列  配列番号：89；アミノ酸配列  配列番号：22）の構築
部位特異的変異誘発を、V463L変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-07
2005518223.tif 000036
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９１】
8. TaqTth（N-D）A468R（DNA配列  配列番号：90；アミノ酸配列  配列番号：23）の構築
部位特異的変異誘発を、A468R変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-08
2005518223.tif 000037
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９２】
9. TaqTth（N-D）A472E（DNA配列  配列番号：91；アミノ酸配列  配列番号：24）の構築
部位特異的変異誘発を、A472E変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-09
2005518223.tif 000038
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９３】
10. TaqTth（N-D）G499R（DNA配列  配列番号：92；アミノ酸配列  配列番号：25）の構築
部位特異的変異誘発を、G499R変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-10
2005518223.tif 000039
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９４】
11. TaqTth（N-D）E507Q（DNA配列  配列番号：93；アミノ酸配列  配列番号：26）の構築
部位特異的変異誘発を、E507Q変異を導入するために変異誘発プライマー276-046-04
2005518223.tif 000040
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９５】
12. TaqTth（N-D）Y535H（DNA配列  配列番号：94；アミノ酸配列  配列番号：27）の構築
部位特異的変異誘発を、Y535H変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-11
2005518223.tif 000041
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９６】
13. TaqTth（N-D）S543N（DNA配列  配列番号：95；アミノ酸配列  配列番号：28）の構築
部位特異的変異誘発を、S543N変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-12
2005518223.tif 000042
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９７】
14. TaqTth（N-D）I546V（DNA配列  配列番号：96；アミノ酸配列  配列番号：29）の構築
部位特異的変異誘発を、I546V変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-13
2005518223.tif 000043
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９８】
15. TaqTth（N-D）D551S/I553V（DNA配列  配列番号：97；アミノ酸配列  配列番号：30）の構築
部位特異的変異誘発を、D551S変異およびI553V変異を導入するために変異誘発プライマー240-60-14
2005518223.tif 000044
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）DNAに対して実行した。
【０２９９】
16. TaqDN RX HT W417L/G418K/E507Q（DNA配列  配列番号：98；アミノ酸配列  配列番号：31）の構築
TaqDN RX HT W417L/G418K/E507Q三重変異体を、TaqTth（D-B）W417L/G418KをTaqTth（N-D）E507Qと合わせることによって作製した。TaqTth（D-B）W417L/G418Kを制限酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より大きなベクター断片を実施例3に詳述するように単離した。TaqTth（N-D）E507Qを構築物をまたNdeIおよびBamHIで切断し、より小さな断片（約795塩基対）を、実施例3に詳述されうようにゲルによって単離および精製した。NdeI-BamHI挿入物を、実施例3に詳述されるようにゲル精製したベクターに連結した。
【０３００】
17. TaqDN RX HT W417L/ E507Q（DNA配列  配列番号：99；アミノ酸配列  配列番号：32）の構築
上記のTaqDN RX HT W417L/G418K/E507Qを出発物質とし、変異誘発プライマー337-01-02：
2005518223.tif 000045
を部位特異的変異誘発反応において使用して、アミノ酸418位のKを野生型アミノ酸Gに戻すように変化させた。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従って、および実験的実施例4に記載されるように、Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit（Clonetech）を使用して行った。
【０３０１】
18. TaqDN RX HT G418K/E507Q（DNA配列  配列番号：100；アミノ酸配列  配列番号：33）の構築
上記のTaqDN RX HT W417L/G418K/E507Qを出発物質とし、変異誘発プライマー337-01-01：
2005518223.tif 000046
を部位特異的変異誘発反応において使用して、アミノ酸417位のLを野生型アミノ酸Wに戻すように変化させた。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従って、および実験的実施例4に記載されるように、Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit（Clonetech）を使用して行った。
【０３０２】
変異体タンパク質の発現および精製を実施例3に詳述されるように行い、これらのタンパク質の切断活性を実施例1、A部に記載されるように特徴付けした。これらの変異体タンパク質の選択のRNA標的に対する切断サイクル化速度の比較は図14に示される。本発明の説明においてさらに議論されるように、これらのデータは、領域417/418におけるアミノ酸およびアミノ酸507が、RNA依存性活性の増強を独立して提供することができないTthPolの部分（すなわち、TthのD-B部分およびN-D部分）と合わせたTaqPolの部分を含むキメラタンパク質に対して、TthPol様のRNA依存性切断活性を付与する際に重要であることを示す。本発明の説明において記載されるように、W417L、G418K、およびE507Qのみの置換を有するTaq DN RX HT改変体を作製した。実施例1に記載されるように、IL-6 RNA基質に対するそれらの切断速度を、Tth DN RX HTの切断速度と比較することによって、これらの変異は、Tth DN RX HTレベルに対するTaq DN RX HT活性を増加させるのに十分であると決定された。図15は、Taq DN RX HT W417L/G418K/E507Q変異体およびTaq DN RX HT G418K/E507Q変異体がTth DN RX HTよりも1.4倍高い活性、Taq DN RX HTよりも4倍よりも高い活性を有するのに対して、Taq DN RX HT W417L/ E507Q変異体がその酵素と同じ活性を有し、それはTaq DN RX HTよりも約3倍高いことを示す。これらの結果は、TthPolのK418およびQ507が、TaqPolと比較して増強されているRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を提供する際に特に重要なアミノ酸であることを実証する。
【０３０３】
実施例6
Taq DN RX HT G418K/E507Q 5'ヌクレアーゼ活性のRNA依存性5'ヌクレアーゼ特性の、最適な塩および温度に関したTth DN RX HTへの類似
RNA標的との切断速度の増加に加えて、G418K/E507Q変異がTaq DN RX HT変異体の特性において顕著な変化を引き起こしたか否かを決定するために、Taq DN RX HT G418K/E507Q（配列番号：33）酵素、Taq DN RX HT（配列番号：276）酵素、およびTth DN RX HT（配列番号：274）酵素を、温度ならびに塩および二価イオンの濃度を変化させた条件下でRNAテンプレート依存性5'ヌクレアーゼアッセイ法において比較した。本研究において使用された基質の上流DNA鎖およびテンプレートRNA鎖は、図20Aに示されるように、単一のIrT分子（配列番号：166）に連結され、そして標識された下流プローブ（配列番号：167）は大過剰で存在した。標的RNA鎖の5'末端は、反応の間の酵素によるいかなる非特異的分解も妨害するために、ビオチン-ストレプトアビジン複合体でブロックされた（Lyamichevら、Science  260: 778 [1993], Johnsonら、Science 269: 238 [1995]）。Taq DN RX HT G418K/E507Q、Taq DN RX HT、およびTth DN RX HTについての切断速度を、図20Bにおいて温度の関数としてプロットする。黒丸は酵素Taq DN RX HTを表し、白丸は酵素Tth DN RX HTを表し、および×は酵素Taq DN RX HT G418K/E507Qを表す。IrT基質を用いてのTth酵素およびTaq DN RX HT酵素の活性の違いは、実施例1に記載された切断アッセイ法において試験された場合のIL-6 RNA基質を用いて見い出された違いよりもさらに大きい。G418K/E507Q変異は、Taq酵素の活性を10倍より多く増加させ、Tth酵素と比較して25％増加させる。3つすべての酵素は、侵襲性シグナル増幅反応の典型的な温度プロフィールを示し、同じ最適温度を有する。Taq DN RX HTのDNA依存性5'ヌクレアーゼ活性に対するG418K/E507Q変異の有意な効果は、IrT（配列番号：168）と類似のすべてのDNA基質を用いて、同じ条件下では見い出されなかった。
【０３０４】
IrT基質を用いての、Taq DN RX HT G418K/E507Q、Taq DN RX HT、およびTth DN RX HTの5'ヌクレアーゼ活性に対するKCl濃度およびMgSO4濃度の効果は、図20CおよびDに示される。すべての酵素の活性は、Taq DN RX HT G418K/E507QおよびTth DN RX HTについて100mM、ならびにTaq DN RX HTについて50mMの最適なKCl濃度で、同様の塩依存性を有する。すべての酵素についてのMgSO4最適濃度は約8mMである。図20に表されるデータの分析は、Taq DN RX HTよりもTaq DN RX HT G418K/E507Qの特性がTth DN RX HTのそれにずっと近いことを示唆し、これは、RNA標的を用いての基質の認識におけるG418K/E507Q変異の鍵となる役割を確証する。
【０３０５】
DNA標的に対してRNAの存在下での5'ヌクレアーゼ活性の減少の機構を理解するために、過剰量のIrT基質（配列番号：166）および下流プローブ（配列番号：167）を使用し、ならびに酵素濃度を制限して、3つすべての酵素のMichaelis定数（Km）および最大触媒速度（kcat）を決定した。これらの測定のために、10mM MOPS、pH 7.5、0.05％ Tween 20、0.05％ Nonidet P-40、10μg/ml tRNA、4mM MgSO4、1nMの酵素（Taq DN RX HT、Tth DN RX HT、またはTaq DN RX HT G418K/E507Q）、ならびに異なる濃度（0.125、0.25、0.5、または1μM）のIrT標的および下流プローブの等モル濃度混合物を含む、10μl反応を構築した。各酵素および各基質の濃度についての切断反応速度キネティックスを46℃で測定した。反応を、10mM EDTAおよび0.02％メチルバイオレット（Sigma）を含む95％ホルムアミド10μlの添加によって停止させた。1μlの各停止反応消化物を、7M尿素を有する20％変性アクリルアミドゲル（19:1架橋）上で、および45mM Tris-ホウ酸、pH 8.3、1.4mM EDTAのバッファー中で分画した。ゲルをFMBIO-100蛍光ゲルスキャナー（Hitachi）で、585nmフィルターを使用してスキャンした。切断された産物の画分（FMBIO分析ソフトウェア、バージョン6.0、Hitachiを用いて、切断されていない基質および切断された基質に対応するバンドの強度から決定した）を、反応時間の関数としてプロットした。切断の初速度を、切断反応速度キネティックスの直線部分の傾きから決定し、酵素濃度および反応時間（分）で除算した切断産物の濃度として規定した。IrT基質を用いての各酵素のMichaelis定数Kmおよび最大触媒速度kcatを、基質濃度の関数として切断の初速度のプロットから決定した。
【０３０６】
3つすべての酵素が同様のKm値（200-300nMの範囲）およびkcat値（Taq DN RX HTおよびTth DN RX HTについて約4分-1、ならびにTaq DN RX HT G418K/E507Qについて約9分-1）を有することが見い出された。G418K/E507Q変異がTaq DN RX HTのkcatを2倍より多く増大させるがKmにはほとんど効果を有しないことは、変異が単に結合定数を増大させるよりはむしろ、基質を切断のためにより適切な方向に配置することを示唆する。
【０３０７】
実施例7
RNA依存性5'ヌクレアーゼ活性をさらに改善するための分子モデリングの使用
A. 点変異体
変化した機能を有する酵素を開発するために、あらかじめ決定された位置における部位特異的変異誘発またはランダム変異誘発によって配列の変化を導入した。部位特異的変異誘発のための位置は、キメラ研究、関連する公開された文献、および分子モデリングからの証拠に基づいて選択された。7つのさらなる変異体酵素をTth DN RX HT酵素から開発し、12個の7つのさらなる変異体酵素をTaq DN RX HT酵素から開発した。両方を以前に議論した。変異体酵素のいくつかは、複数の変異誘発反応の結果であり、すなわち、1つより多くの変化が最終産物を得るために導入された。変異反応を、他に言及しない限り、実施例2C2に記載されたTth DN RX HT構築物（配列番号：273）または実施例2C1に記載されたTaq DN RX HT構築物（配列番号：275）を使用して行った。プラスミドDNAを、すべての変異誘発反応についての十分な出発物質を得るために、製造業者のプロトコールに従ってQIAGEN Plasmid Maxi Kit（QIAGEN, Chatsworth, CA）を使用して、200mlのJM109の一晩培養物から精製した。すべての部位特異的変異を、製造業者のプロトコールに従ってTransformer Site Directed mutagenesis Kit（Clontech）を使用して導入した。2つの異なる選択プライマー、Trans Oligo AlwNI/SpeIまたはSwicth Oligo SpeI/AlwNI（Clontech, Palo Alto CA, カタログ番号#6488-1またはカタログ番号#6373-1）のうちの1つを、記載されたすべての変異誘発反応のために使用した。所定の反応において使用される選択オリゴは、ベクター中に存在する制限部位に依存する。部位特異的変異誘発およびランダム変異誘発の両方のためのすべての変異誘発プライマーを標準的な合成化学によって合成した。両方のタイプの反応について生じるコロニーは大腸菌株JM109であった。ランダム変異誘発方法は以下に記載される。
【０３０８】
変異体を実施例1に詳述される迅速スクリーニングプロトコールを介して試験した。次いで、より詳細な分析が所望される場合、またはより大きなタンパク質の調製物が必要とされる場合、変異体タンパク質の発現および精製を、実施例3に詳述されるように行った。
【０３０９】
1. Tth DN RX HT H641A、Tth DN RX HT H748A、Tth DN RX HT H786Aの構築
部位特異的変異誘発を、H641A変異（DNA配列  配列番号：101；アミノ酸配列  配列番号：34）を導入するために、変異誘発プライマー583-001-02：
2005518223.tif 000047
を使用して、またはH748A変異体（DNA配列  配列番号：102；アミノ酸配列  配列番号：35）を生成するために、変異誘発プライマー583-001-03：
2005518223.tif 000048
を使用して、またはH786A変異体酵素（DNA配列  配列番号：103；アミノ酸配列  配列番号：36）を生成するために、変異誘発プライマー583-001-04：
2005518223.tif 000049
を使用して、pTrc99A Tth DN RX HT DNAに対して実行した。
【０３１０】
2. Tth DN RX HT（H786A/G506K/G509K）の構築
上記に生成された変異体Tth DN RX HT H786Aを出発物質として、部位特異的変異誘発を、「TthAKK」と名付けられたこの改変体（DNA配列  配列番号：104；アミノ酸配列  配列番号：37）を生成するために、変異誘発プライマー604-022-02：
2005518223.tif 000050
を使用して行った。
【０３１１】
3. Taq DN RX HT（W417L/G418K/E507Q/H784A）の構築
変異誘発オリゴヌクレオチド158-029-02：
2005518223.tif 000051
を部位特異的変異誘発反応において使用してH784A変異を導入し、「Taq4M」と名付けられたこの構築物（DNA配列  配列番号：105；アミノ酸配列  配列番号：38）を生成した。
【０３１２】
4. Taq4M H639A、Taq4M R587A、Taq4M G504K、およびTaq4M G80Eの構築
部位特異的変異誘発を、Taq4M H639A変異体（DNA配列  配列番号：106；アミノ酸配列  配列番号：39）を生成するためのプライマー473-010-11：
2005518223.tif 000052
Taq4M R587A（DNA配列  配列番号：107；アミノ酸配列  配列番号：40）を生成するためのプライマー473-010-10：
2005518223.tif 000053
Taq4M G504K（DNA配列  配列番号：108；アミノ酸配列  配列番号：41）を生成するためのプライマー300-081-06：
2005518223.tif 000054
およびTaq4M G80E変異体（DNA配列  配列番号：109；アミノ酸配列  配列番号：42）を生成するためのプライマー330-088-04：
2005518223.tif 000055
を使用して、Taq4M変異体に対して行った。
【０３１３】
5. Taq 4M P88E/P90EおよびTaq 4M L109F/A110Tの構築
上記のTaq 4Mを出発物質として、部位特異的変異誘発を、P88E/P90E変異（DNA配列  配列番号：110；アミノ酸配列  配列番号：43）を生成するためのプライマー473-087-03：
2005518223.tif 000056
またはL109F/A110T変異（DNA配列  配列番号：111；アミノ酸配列  配列番号：44）を生成するためのプライマー473-087-05：
2005518223.tif 000057
を使用して行った。
【０３１４】
6. Taq DN RX HT（W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/H784A）の構築
2つのPCR反応を、最初に構築物Taq4M（Taq W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A）をテンプレートとして使用して実行した。プライマー158-84-01
2005518223.tif 000058
およびプライマー535-33-02
2005518223.tif 000059
を使用して、620塩基対PCR断片を生成した。別の510塩基対PCR産物を、プライマー535-33-01
2005518223.tif 000060
およびプライマー330-06-03
2005518223.tif 000061
を使用して生成した。これら2つのPCR産物は、最終組換えPCR増幅が外側のプライマー158-84-01および330-06-03を使用して行われ、1182塩基対の生成物が得られるように重複している。この組換えPCR産物を製造業者の指示書に従って制限酵素NotIおよびBamHIで消化し、793塩基対断片を得た。親のプラスミドTaq4Mもまた同じ酵素で消化し、ライゲーションのためのベクターとして使用した。すべてのDNA断片をライゲーションの前にTAEアガロースゲルで精製した。この断片をベクターに連結し、JM109細胞に形質転換し、このようにして、変異G499R、A502K、I503L、およびE507K、ならびに制限エンドヌクレアーゼ部位AgeIを組み込んだ。この構築物を「Taq 8M」（DNA配列  配列番号：112；アミノ酸配列  配列番号：45）と名付ける。
【０３１５】
B. ランダム変異誘発
変化した機能を有する多数の酵素をランダム変異誘発を介して生成させた。ランダム変異誘発のための標的とされたタンパク質の領域を分子モデリングのデータおよび文献中の情報に基づいて選択した。異なる変異誘発プライマーを使用して、タンパク質の異なる領域に変異を導入した。他に言及されない限り、ランダム変異誘発を上記のTaq改変体であるTaq 4M G504K（Taq DN RX HT W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A/）（配列番号：108）で実行し、変異誘発反応において生成された変異体PCR断片をTaq8M（配列番号：112）中の相同領域と交換した。
【０３１６】
ランダム変異誘発をまた、上記のTth DN RX HT H786A（配列番号：103）で実行した。Tth DN RX HT H786Aテンプレートを用いて生成された変異体PCR断片を、変化されていないTth DN RX HT H786Aにおける相同領域と交換した。
【０３１７】
1. アミノ酸残基500-507または513-520におけるランダム変異体
第1の変異誘発オリゴヌクレオチド535-054-01：
2005518223.tif 000062
を、158-84-01：
2005518223.tif 000063
とともに使用して、Taqポリメラーゼ改変体Taq DN RX HT W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A（配列番号：108）のアミノ酸500〜507位からのランダムな残基を導入した。これを、括弧内の塩基の91％のみが変化していないのに対して、残りの塩基の9％が他の3ヌクレオチドの等価な混合物であるように、プライマー535-054-01を合成することによって達成した。このオリゴの、最初の、変化していない配列は、G499R、A502K、およびQ507Kの変化を含んだ。
【０３１８】
領域500-507の変異を生成するために、プライマー535-045-01およびプライマー158-84-01を、Advantage cDNA PCRキット（Clonetech）および標的として上記のTaq改変体を使用して、PCR反応において使用した。次いで、このPCR断片を1％ TAEアガロースゲル上で泳動し、切り出し、そしてQIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen, Valencia CA, カタログ番号#28706）を用いて精製した。精製された断片を、NotIおよびAgeIで切断し、NotIおよびAgeIで線状化したpTaq8Mに連結した。JM109大腸菌細胞（Promega）を、連結した産物を用いて形質転換した。クローンを以下に記載されるように試験した。
【０３１９】
第2の変異誘発オリゴヌクレオチド（別々の反応において使用された）535-054-02：
2005518223.tif 000064
を、330-06-03：
2005518223.tif 000065
とともに使用して、アミノ酸513-520からのランダムな残基を導入した。プライマー535-054-02の括弧内の塩基もまた、91％野生型でありかつ3％が他の3種のオリゴヌクレオチドの各々である。
【０３２０】
領域513-520の変異を生成するために、プライマー535-054-02およびプライマー535-054-02を、上記のように、Taq DN RX HT W417L/G418K/G504K/E507Q/H784A（配列番号：108）をテンプレートとして用いるPCR反応において使用した。得られるPCR断片を上記のように精製し、制限酵素AgeIおよびBamHIで切断した。次いで、切断した断片を、AgeIおよびBamHIで線状化したpTaq8Mに連結した。JM109大腸菌細胞（Promega）を、連結した産物を用いて形質転換した。クローンを実施例1に記載されるように試験した。これらから開発された変異体には以下が含まれる：
Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/K504N/E507K/H784A（M1-13）（DNA配列  配列番号：113；アミノ酸配列  配列番号：46）。
Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/L500I/A502K/G504K/Q507H/H784A（M1-36）（DNA配列  配列番号：114；アミノ酸配列  配列番号：47）。
Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A（M2-24）（DNA配列  配列番号：115；アミノ酸配列  配列番号：48）。
Taq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/V518L/H784A（M2-06）（DNA配列  配列番号：116；アミノ酸配列  配列番号：49）。
【０３２１】
2. TthDN RX HT H786Aランダム変異体
TthDN RX HT H786A（配列番号：36）酵素のヘリックス-ヘアピン-ヘリックス領域における変異体を生成するために、2つの異なるPCR反応を、H786A（配列番号：103）をテンプレートとして使用して実行した。2つのPCR産物は、組換えPCR反応が実行し得るように重複している（Higuchi, PCR Technology, H. A. Erlich偏、Stockton Press, New York, 61-70頁 [1989]）。次いで、PCR産物を、断片の末端およびTthDN H786A配列中に位置する制限酵素部位を使用することによってTthDN H786A変異体の相同領域と交換した。
【０３２２】
上記に議論したTthDN H786Aを出発物質として、そしてプライマー604-08-06：
2005518223.tif 000066
およびプライマー390-76-08：
2005518223.tif 000067
を使用して、620塩基対のPCR断片を生成した。PCR反応を、製造業者の指示書に従ってAdvantage cDNA PCR kit（Clontech）を使用して実行した。このPCR産物はアミノ酸1-194を含む。この反応を通しては変異は導入されなかったが、しかし、制限酵素部位EcoRIは5'末端に存在する。
【０３２３】
上記に議論したTthDN RX HT H786Aを出発物質として、そしてプライマー604-08-05：
2005518223.tif 000068
およびプライマー209-74-02：
2005518223.tif 000069
を使用して、787塩基対のPCR断片を生成した。PCR反応を上記のように行った。この断片は、変異誘発プライマー、604-08-05の存在に起因するランダム変異を含んでいる。このプライマーの括弧内の塩基を、配列の91％が野生型であるのに対して、さらなる9％が残りの3塩基の間で均等に分けられるように合成した。
【０３２４】
2つのPCR産物は重複しており、組換えPCR反応において合わせられた。プライマー390-76-08およびプライマー209-74-02を加え、製造業者の指示書に従ってAdvantage cDNA PCR kit（Clontech）を再度使用した。1380塩基対の産物をこの反応から生成した。
【０３２５】
この組換えPCR産物を、製造業者の指示書に従って制限酵素EcoRIおよびNotIで切断して986塩基対の断片を得た。TthDN RX HT H786Aを同じ酵素で切断することによって調製した。次いで、この断片をベクターに連結し、JM109細胞に形質転換した。この反応のセットから開発された新規な変異体は以下には以下が含まれる：
TthDN RX HT H786A/P197R/K200R（DNA配列  配列番号：117；アミノ酸配列  配列番号：50）。
TthDN RX HT H786A/K205Y（DNA配列  配列番号：118；アミノ酸配列  配列番号：51）。
TthDN RX HT H786A/G203R（DNA配列  配列番号：119；アミノ酸配列  配列番号：52）。
【０３２６】
3. Taq DN RX HT W417L/G418K/H784A/L109F/A110T/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S（Taq SS）の構築
上記のTaq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A（配列番号：115）変異体を出発物質として、プライマー473-087-05：
2005518223.tif 000070
を、L109F変異およびA110T変異を組み入れるための部位特異的変異誘発反応において適切な選択プライマーとともに使用して、「TaqSS」（DNA配列  配列番号：120；アミノ酸配列  配列番号：53）と名付けられたこの酵素を生成した。
【０３２７】
4. Taq DN RX HT W417L/G418K/H784A/P88E/P90E/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514Sの構築
上記のTaq DN RX HT W417L/G418K/G499R/A502K/I503L/G504K/E507K/T514S/H784A（配列番号：115）変異体を出発物質として、プライマー473-087-03：
2005518223.tif 000071
を、P88E変異およびP90E変異を組み入れるための部位特異的変異誘発反応において適切な選択プライマーとともに使用して、この酵素（DNA配列  配列番号：121；アミノ酸配列  配列番号：54）を生成した。
【０３２８】
5. TaqSSランダム変異誘発
ランダム変異誘発をTaqSS変異体（配列番号：120）のヘリックス-ヘアピン-ヘリックスドメインにさらなる変化を導入するために使用した。変異誘発を上記の実施例9に記載されるように行った。第1の工程において、異なるが重複する2種のPCR産物を生成した。オリゴ390-76-08（配列番号：314）および604-08-04：
2005518223.tif 000072
を用いて生成したPCR産物の1つは、EcoRI部位を断片に組み入れているが、いかなる変異も組み入れていない。第2のPCR産物は、変異誘発プライマー604-08-03：
2005518223.tif 000073
およびプライマー209-74-02（配列番号：316）を利用する。この断片はランダム点変異を含み、そして第1の断片を用いた組換えPCRを介して合わせられた場合には、制限酵素EcoRIおよびNotIで切断され得、TaqSS（これもまたEcoRIおよびNotIで切断されている）に連結され得る。次いで、連結された構築物をJM109に形質転換した。コロニーを以下に記載するようにスクリーニングした。この変異誘発から開発された酵素には以下が含まれる：
TaqSS K198N（DNA配列  配列番号：112；アミノ酸配列  配列番号：55）。
TaqSS A205Q（DNA配列  配列番号：123；アミノ酸配列  配列番号：56）。
TaqSS I200M/A205Q（DNA配列  配列番号：124；アミノ酸配列  配列番号：57）。
TaqSS K203N（DNA配列  配列番号：125；アミノ酸配列  配列番号：58）。
TaqSS T204P（DNA配列  配列番号：126；アミノ酸配列  配列番号：59）。
【０３２９】
6. TaqSS R677Aの構築
アーチ領域およびポリメラーゼ領域の両方における配列の変化を有する酵素を産生するために、さらなる点変異をTaqSSにおいて生成した。部位特異的変異誘発を、上記のようにオリゴ473-060-10：
2005518223.tif 000074
を使用して実行して、TaqSS R677A変異体（DNA配列  配列番号：127；アミノ酸配列  配列番号：60）を産生した。
【０３３０】
7. TaqTthAKK（DNA配列  配列番号：128；アミノ酸配列  配列番号：61）およびTthTaq5M（DNA配列  配列番号：129；アミノ酸配列  配列番号：62）の構築
キメラ変異体TaqTthAKKおよびTthTaq5Mを、Tth DN RX HT（H786A/G506K/Q509K）（配列番号：104；ここではTthAKKと略す）または Taq 4M G504（配列番号：108；ここではTaq 5Mと略す）を制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNotIを用いて切断することによって生成した。より小さな挿入物断片ならびにより大きなベクター断片を実施例3Dに詳述するようにゲル精製し、挿入物断片を実施例3Dに記載されるように2つの変異体間で交換し、連結した。スクリーニングおよび構築物配列の確認もまた、実施例3Dに記載のように行った。
【０３３１】
実施例8
他のポリメラーゼにおけるRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性の改善
TaqPol/TthPol組換え、変異誘発、およびモデリングから得られた情報を使用して、さらなるDNAポリメラーゼにおける比較し得る変異を作製し、これらの酵素の切断活性に対する効果を試験した。テルムス フィリフォルムス（TfiPol）およびテルムス スコトドクトゥス（TscPol）を実施例2に記載されるようにクローニングおよび精製した。これら2つのタンパク質の変異誘発は以下に記載される。
【０３３２】
A. TfiPolDN2Mの構築
pTrc99a-TfiPol（配列番号：249）の変異誘発を、製造業者の指示書に従ってQuikChange site-directed mutagenesis kit（Stratagene）を用いて行った。P420K変異を以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000075
を用いて作製した。E507Q変異を以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000076
を用いて作製した。D785N変異を以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000077
を用いて作製した。3つすべての変異を含むプラスミドを、pTrc99a-TfiPolDN2M（DNA配列  配列番号：130；アミノ酸配列  配列番号：63）と呼ぶ。
【０３３３】
B. TscPolDN2Mの構築
pTrc99a-TscPol（配列番号：253）の変異誘発を、製造業者の指示書に従ってQuikChange site-directed mutagenesis kit（Stratagene）を用いて行った。E416K変異を以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000078
を用いて作製した。E505Q変異を以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000079
を用いて作製した。D783N変異を以下のオリゴヌクレオチド：
2005518223.tif 000080
を用いて作製した。3つすべての変異を含むプラスミドを、pTrc99a-TscPolDN2M（DNA配列  配列番号：131；アミノ酸配列  配列番号：64）と呼ぶ。
【０３３４】
C. Tsc、Tfi、Tth、およびTaq変異体のキメラ
1. TfiTth AKK（DNA配列  配列番号：132；アミノ酸配列  配列番号：65）、TscTth AKK（DNA配列  配列番号：133；アミノ酸配列  配列番号：66）、TfiTaq5M（DNA配列  配列番号：134；アミノ酸配列  配列番号：67）、およびTscTaq5M（DNA配列  配列番号：135；アミノ酸配列  配列番号：68）
Tth DN RX HT（H86A/G506K/Q509K）（ここではTthAKK、配列番号：104と略す）またはTaq 4M G504（ここではTaq 5M、配列番号：108と略す）とTfi DN 2M（配列番号：130）またはTsc DN 2M（配列番号：131）との間のキメラ酵素を生成するために、さらなる制限エンドヌクレアーゼ部位を、部位特異的変異誘発によってTfiおよびTscと名付けられた変異体に導入した。変異誘発プライマー700-011-01
2005518223.tif 000081
および700-011-02
2005518223.tif 000082
を使用して、Tfi DN 2Mのアミノ酸1位にEcoRI部位、およびアミノ酸331位にNotI部位を導入した。変異誘発プライマー700-011-03
2005518223.tif 000083
および700-011-04
2005518223.tif 000084
を使用して、Tsc DN 2Mのアミノ酸1位にEcoRI部位、およびアミノ酸327位にNotI部位を導入した。PCR反応を、製造業者の指示書に従ってAdvance cDNA PCR kit（Clonetech）を使用して、およびTfi DN 2MまたはTsc DN 2Mのいずれかを標的として、それらに対応するプライマーとともに使用して行った。1017塩基対のPCR産物をEcoRIおよびNotIの両方で切断して993塩基対の挿入物断片を得、これを実施例3Dに記載されるようにゲル精製した。変異体Taq4M G504K（配列番号：108）およびTth DN RX HT（H786A/G506K/Q509K）（配列番号：104）もまたEcoRIおよびNotIで切断し、より大きなベクター断片を上記のようにゲル精製した。ライゲーションを実施例3Dにおいて詳述されるように実行し、同様に新規な構築物のスクリーニングおよび確認を行った。
【０３３５】
実施例9
改善されたRNA依存性5'ヌクレアーゼ活性を有するさらなる酵素
Tfi DN 2M（ΔN）の生成
後のクローニング工程を容易にするために、内因性制限酵素部位（NotI）をTfiPolDN2M遺伝子（配列番号：130、実施例8Aに記載される）のポリメラーゼ領域から除去し、独特のNotI部位をより有利な位置に挿入した。
【０３３６】
内因性NotI部位を以下のように除去した：QUIKCHANGE Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を製造業者の指示書に従って、変異誘発プライマー：
2005518223.tif 000085
を用いて使用した。新規な構築物をTfi DN 2M（ΔN）（DNA配列  配列番号：340；アミノ酸配列  配列番号：341）と名付けた。
【０３３７】
Tfi DN 2M（N）、Tsc DN 2M（N）の生成
Tfi DN 2M（ΔN）（配列番号：340）中に独特なNotI部位（アミノ酸328位）を導入するために、プライマー886-088-07
2005518223.tif 000086
およびプライマー700-010-03
2005518223.tif 000087
をPCR反応において、Tfi DN 2M（ΔN）（配列番号：340）をテンプレートとして用いて使用した。得られるPCR断片を精製し、制限酵素NotIおよびSalIを用いて切断した。次いで、切断断片を、TfiTthAKK（配列番号：132、実施例8Cに記載）構築物（これもまたNotIおよびSalIで消化された）に連結した。新規な構築物をTfi DN 2M（N）（DNA配列  配列番号：345；アミノ酸配列  配列番号：346）と名付けた。
【０３３８】
変異体Tsc Pol DN 2M（以前に上記の実施例8Bに記載）にNotI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するために、PCRを、プライマー：886-088-05
2005518223.tif 000088
および700-010-03
2005518223.tif 000089
を用いて、TscPolDN2M（配列番号：131）をテンプレートとして使用して実行した。次いで、PCR産物のNotI-SalI消化産物を、NotIおよびSalI消化したTscTthAKKベクター（配列番号：133）にサブクローニングした。得られる構築物を、Tsc DN 2M（N）（DNA配列  配列番号：347；アミノ酸配列  配列番号：348）と名付けた。
【０３３９】
Tfi DN 2M（N）AKKおよびTsc DN2M（N）AKKの生成
変異の「AKK」セット（G504K/E507K/H784A/D785N）を生成するために、部位特異的変異誘発をTfi DN 2M（N）変異体（DNA配列  配列番号：345）で、プライマー959-022-01から-04：
2005518223.tif 000090
を使用して行い、Tfi DN 2M（N）AKK変異体（DNA配列  配列番号：358；アミノ酸配列  配列番号：359）を生成した。この構築物を「TfiAKK」と名付けた。
【０３４０】
変異の「AKK」セット（G502K/E505K/H782A/D783N）をTscDN 2M（N）（DNA配列  配列番号：347）に導入するために、プライマー959-022-05から-08：
2005518223.tif 000091
を使用してTsc2M（N）AKK（DNA配列  配列番号：364；アミノ酸配列  配列番号：365）を生成した。この構築物を「Tsc AKK」と名付けた。
【０３４１】
TthAKK（P195A）およびTthAKK（P195K）の組換えPCR構築物による点変異の構築
TthAKK構築物のヌクレアーゼドメインのアミノ酸195位に変異（P195AまたはP195Kのいずれか）を導入するために、変異誘発プライマー785-073-01（P195A）
2005518223.tif 000092
または785-073-02（P195K）
2005518223.tif 000093
および209-074-02：
2005518223.tif 000094
をPCR反応において使用して、787塩基対断片を生成する。別のPCR断片を、プライマー：390-076-08
2005518223.tif 000095
および785-073-03
2005518223.tif 000096
を反応において、同じテンプレートとともに使用した。
【０３４２】
2つのPCR断片は重複しており、組換えPCR反応において合わせた。外側の390-076-08および209-074-02を加え、Advantage cDNA PCR kit（Clontech）を製造業者の指示書に従って使用した。1380塩基対の生成物をこの反応から生成した。
【０３４３】
組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、986塩基対断片を産生した。TthAKK構築物を同じ酵素で切断することにより調製した。次いで、その断片をベクターに連結し、JM109細胞に形質転換した。この反応のセットから開発した新規な変異体には以下が含まれる：TthAKK（P195A）（DNA配列  配列番号：373；アミノ酸配列  配列番号：374）およびTthAKK（P195K）（DNA配列  配列番号：375；アミノ酸配列  配列番号：376）。
【０３４４】
TthAKK（N417K/L418K）の構築
同じアプローチを使用してTthAKK（N417K/L418K）を構築した。2つの重複するPCR断片を、変異誘発プライマー785-73-07
2005518223.tif 000097
および700-10-03
2005518223.tif 000098
ならびにプライマー158-084-01
2005518223.tif 000099
および785-73-08
2005518223.tif 000100
によって生成した。2つの生成物を合わせて、外側のプライマー700-10-03および158-084-01で増幅した。組換えPCR産物を制限酵素NotIおよびBamHIで切断し、NotI/BamHIであらかじめ切断したTthAKK構築物に連結した。この変異体をTthAKK（N417/L418K）（DNA配列  配列番号：379；アミノ酸配列  配列番号：380）と名付けた。
【０３４５】
TthAKK（P255L）の部位特異的変異誘発構築物によるさらなるTthAKK点変異の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-05および886-049-06：
2005518223.tif 000101
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してTthAKK（P255L）（DNA配列  配列番号：383；アミノ酸配列  配列番号：384）を生成した。
【０３４６】
TthAKK（F311Y）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-09および886-049-10：
2005518223.tif 000102
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してTthAKK（F311Y）（DNA配列  配列番号：387；アミノ酸配列  配列番号：388）を生成した。
【０３４７】
TthAKK（N221H/R224Q）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-01および886-049-02：
2005518223.tif 000103
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してTthAKK（N221H/R224Q）（DNA配列  配列番号：391；アミノ酸配列  配列番号：392）を生成した。
【０３４８】
TthAKK（R251H）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-03および886-049-04：
2005518223.tif 000104
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してTthAKK（R251H）（DNA配列  配列番号：395；アミノ酸配列  配列番号：396）を生成した。
【０３４９】
TthAKK（P255L/R251H）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-088-01および886-088-02：
2005518223.tif 000105
を使用して、TthAKK構築物（P255L）に対して実行してTthAKK（P255L/R251H）（DNA配列  配列番号：399；アミノ酸配列  配列番号：400）を生成した。
【０３５０】
Tth AKK L429V（DNA配列  配列番号：401；アミノ酸配列  配列番号：402）の構築
パーム領域のランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
2005518223.tif 000106
および逆方向プライマー680-79-04
2005518223.tif 000107
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してパーム領域にランダム変異を導入した。括弧は91％の示される塩基および3％の他のすべての塩基の合成を示す。
【０３５１】
Tth AKK E425V（DNA配列  配列番号：405；アミノ酸配列  配列番号：406）の構築
パーム領域のランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
2005518223.tif 000108
および逆方向プライマー680-79-04
2005518223.tif 000109
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してパーム領域にランダム変異を導入した。括弧は91％の示される塩基および3％の他のすべての塩基の合成を示す。
【０３５２】
Tth AKK L422N/E425K（DNA配列  配列番号：407；アミノ酸配列  配列番号：408）の構築
パーム領域のランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
2005518223.tif 000110
および逆方向プライマー680-79-04
2005518223.tif 000111
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してパーム領域にランダム変異を導入した。括弧は91％の示される塩基および3％の他のすべての塩基の合成を示す。
【０３５３】
Tth AKK L422F/W430C（DNA配列  配列番号：409；アミノ酸配列  配列番号：410）の構築
パーム領域のランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
2005518223.tif 000112
および逆方向プライマー680-79-04
2005518223.tif 000113
を使用して、Tth AKK DNAに対して実行してパーム領域にランダム変異を導入した。括弧は91％の示される塩基および3％の他のすべての塩基の合成を示す。
【０３５４】
Tth AKK A504F（DNA配列  配列番号：411；アミノ酸配列  配列番号：412）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
2005518223.tif 000114
および逆方向プライマー680-80-06
2005518223.tif 000115
を使用して、TthAKK構築物に対して実行してA504アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０３５５】
Tth AKK A504V（DNA配列  配列番号：415；アミノ酸配列  配列番号：416）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
2005518223.tif 000116
および逆方向プライマー680-80-06
2005518223.tif 000117
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してA504アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０３５６】
Tth AKK A504S（DNA配列  配列番号：417；アミノ酸配列  配列番号：418）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
2005518223.tif 000118
および逆方向プライマー680-80-06
2005518223.tif 000119
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してA504アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０３５７】
Tth AKK S517G（DNA配列  配列番号：419；アミノ酸配列  配列番号：420）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
2005518223.tif 000120
および逆方向プライマー680-80-10
2005518223.tif 000121
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してS517アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０３５８】
Tth AKK A518L（DNA配列  配列番号：423；アミノ酸配列  配列番号：424）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
2005518223.tif 000122
および逆方向プライマー680-80-10
2005518223.tif 000123
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してA518アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０３５９】
Tth AKK A518R（DNA配列  配列番号：426；アミノ酸配列  配列番号：427）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
2005518223.tif 000124
および逆方向プライマー680-80-10
2005518223.tif 000125
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してA518アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０３６０】
Taq5M L451R（DNA配列  配列番号：428；アミノ酸配列  配列番号：429）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-05
2005518223.tif 000126
を使用して、Taq 5M構築物に対して実行してTaq 5M酵素にL451R変異を導入した。
【０３６１】
Tth AKK A504K（DNA配列  配列番号：431；アミノ酸配列  配列番号：432）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-69-04
2005518223.tif 000127
および逆方向プライマー680-69-05
2005518223.tif 000128
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してTth AKK酵素にA504K変異を導入した。
【０３６２】
Tth AKK H641A（DNA配列  配列番号：435；アミノ酸配列  配列番号：436）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-69-08
2005518223.tif 000129
および逆方向プライマー583-01-02
2005518223.tif 000130
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してTth AKK酵素にH641A変異を導入した。
【０３６３】
Tth AKK T508P（DNA配列  配列番号：439；アミノ酸配列  配列番号：440）の構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー680-70-01
2005518223.tif 000131
および逆方向プライマー680-70-02
2005518223.tif 000132
を使用して、Tth AKK構築物に対して実行してTth AKK酵素にT508P変異を導入した。
【０３６４】
キメラおよびキメラにおける変異
Tth Akk酵素とαペプチド間との融合
TthAKK-lacZ-α-ペプチドキメラ融合物を、コロニーの青色-白色スクリーニングに基づく全長融合タンパク質の発現を不可能性にする変異（フレームシフト、欠失、挿入などを含む）の検出を可能にするために構築した（Wuら、Nucleic Acids Research, 24: 1710 [1996]）。
【０３６５】
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー959-041-03
2005518223.tif 000133
および959-041-04
2005518223.tif 000134
を使用してTthAKK DNAに対して実行して、lacZαペプチドの挿入のためにTth AKKのC末端に6×Hisタグに続いてSalI部位を有するpTthAKK-Lを生成した。αペプチド（201アミノ酸）を、プライマー959-041-01
2005518223.tif 000135
および959-093-01
2005518223.tif 000136
を用いて最初にpCRII-TOPOベクター（Invitrogen）からPCR増幅した。次いで、PCR産物を制限酵素SalIで消化し、これもまた同じ酵素で切断したpTthAKK-Lベクターに連結して、キメラ構築物TthAKK-αペプチド（DNA配列  配列番号：481；アミノ酸配列  配列番号：482）を生成した。挿入物の向きを配列決定によって確認した。
【０３６６】
TthTsAKK酵素およびTthTfiAKK酵素の構築
TthAKK構築物を酵素EcoRIおよびNotIで切断し、より小さな挿入物断片をゲル精製した。TscAKKまたはTfiAKK構築物をまたEcoRIおよびNotIで切断し、より大きな断片をゲル単離および精製した。Tth挿入物（ヌクレアーゼドメイン）をTscAKKベクターおよびTfiAKKベクター（ポリメラーゼドメイン）に連結し、TthTscAKK（DNA配列  配列番号：447；アミノ酸配列  配列番号：448）キメラ構築物およびTthTfiAKK（DNA配列  配列番号：449；アミノ酸配列  配列番号：450）キメラ構築物を生成した。
【０３６７】
基質特異性を改善するためのTfiポリメラーゼのFT変異
Taq（FT）TthAKKの構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー473-087-05
2005518223.tif 000137
を使用して、TaqTthAKK5M構築物に対して実行してL107F/A108T変異を導入し、Taq（FT）TthAKK（DNA配列  配列番号：484；アミノ酸配列  配列番号：485）を導入した。
【０３６８】
Tfi（FT）TthAKKの構築
部位飽和変異誘発を、変異誘発プライマー785-096-01：
2005518223.tif 000138
および785-096-02：
2005518223.tif 000139
を使用して、TfiTthAKK5M構築物に対して実行してL107F/V108T変異を導入し、Tfi（FT）TthAKK（DNA配列  配列番号：349；アミノ酸配列  配列番号：488）を導入した。
【０３６９】
Tfi（FT）DN 2M（N）変異体およびTsc（FT）DN 2M（N）変異体
L107F/V108T変異を、Tfi DN 2M（N）変異体（DNA配列  配列番号：345）のNotI断片およびSalI断片を単離すること、およびあらかじめNotI-SalI消化したTfi（FT）TthAKK（DNA配列  配列番号：349；アミノ酸配列  配列番号：488）にそれを挿入し、Tfi（FT）DN 2M（N）変異体（DNA配列  配列番号：350；アミノ酸配列  配列番号：351）を産生した。L107FまたはE108T変異をこのTscに基づく構築物に加えるために、同じ手順を行った。Tsc DN 2M（N）変異体のNotIおよびSalI切断した断片（DNA配列 配列番号：348）を、あらかじめNotI-SalI消化したTsc（FT）TthAKK（DNA配列  配列番号：491）ベクターにそれを挿入し、Tsc（FT）DN 2M（N）変異体（DNA配列  配列番号：352；アミノ酸配列  配列番号：353）を産生した。
【０３７０】
Tfi（FT）AKKおよびTsc（FT）AKKの構築
以前に記載したTfi（FT）DN 2M（N）構築物（DNA配列  配列番号：350）を出発物質として、プライマー959-022-01から-04：
2005518223.tif 000140
を、部位特異的変異誘発によって「AKK」セットの変異（H784A、G504K、およびE507K）を導入するために使用した。得られる変異体構築物を、Tfi（FT）AKK（DNA配列  配列番号：366；アミノ酸配列  配列番号：367）と名付けた。
【０３７１】
同様に、プライマー959-022-05から-08：
2005518223.tif 000141
を、部位特異的変異誘発において、Tsc（FT）DN 2M（N）構築物（DNA配列  配列番号：352）をテンプレートとして用いて、Tsc（FT）AKK（DNA配列  配列番号：368；アミノ酸配列  配列番号：369）を生成するために使用した。
【０３７２】
Tsc（FT）TthAKKの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー785-008-03
2005518223.tif 000142
および逆方向プライマー680-21-03
2005518223.tif 000143
を使用して、TscTthAKKに対して実行して、L107F/E108T変異を導入およびTsc（FT）TthAKK（DNA配列  配列番号：454；アミノ酸配列  配列番号：491）を生成した。
【０３７３】
Taq（FT）TscAKK酵素およびTaq（FT）TfiAKK酵素の構築
Taq（FT）TthAKK構築物を酵素EcoRIおよびNotIで切断し、より小さな挿入物断片をゲル単離した。TscAKK構築物またはTfiAKK構築物をまた酵素EcoRIおよびNotIで切断し、より大きな断片をゲル単離および精製した。Taq（FT）挿入物（ヌクレアーゼドメイン）をTscAKKベクターおよびTfiAKKベクター（ポリメラーゼドメイン）に連結してTaq（FT）TscAKK（DNA配列  配列番号：443；アミノ酸配列  配列番号：444）キメラ構築物およびTaq（FT）TfiAKK（DNA配列  配列番号：445；アミノ酸配列  配列番号：446）キメラ構築物を生成した。
【０３７４】
TaqEFT-Tth（AKK）（DNA配列  配列番号：501；アミノ酸配列  配列番号：502）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー436-013-08
2005518223.tif 000144
および436-013-09
2005518223.tif 000145
を使用して、Taq（FT）-TthAKK DNA（配列番号：484）に対して実行して、K70E変異を導入した。
【０３７５】
Taq（EFT）TthAKKの酵素活性を改善するためのさらなる変異
TaqEFT-Tth（AKK）-A/M1（DNA配列  配列番号：505；アミノ酸配列  配列番号：506）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-01
2005518223.tif 000146
および1044-038-02
2005518223.tif 000147
を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、G4EA変異を導入した。
【０３７６】
TaqEFT-Tth（AKK）-B/M2（DNA配列  配列番号：509；アミノ酸配列  配列番号：510）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-03
2005518223.tif 000148
および1044-038-04
2005518223.tif 000149
（それぞれ配列番号：511および512）を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、H29F変異を導入した。
【０３７７】
（TaqEFT-Tth（AKK）-C/M3（DNA配列  配列番号：513；アミノ酸配列  配列番号：514）の構築）
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-05
2005518223.tif 000150
および1044-038-06
2005518223.tif 000151
（それぞれ配列番号：515および516）を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、K57R変異を導入した。
【０３７８】
TaqEFT-Tth（AKK）-D/M5（DNA配列  配列番号：517；アミノ酸配列  配列番号：518）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-09
2005518223.tif 000152
および1044-038-10
2005518223.tif 000153
（それぞれ配列番号：519および520）を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、S125T変異を導入した。
【０３７９】
TaqEFT-Tth（AKK）-E/M6（DNA配列  配列番号：521；アミノ酸配列  配列番号：522）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-11
2005518223.tif 000154
および1044-038-12
2005518223.tif 000155
（それぞれ配列番号：523および524）を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、R206L変異を導入した。
【０３８０】
TaqEFT-Tth（AKK）-F/M7（DNA配列  配列番号：525；アミノ酸配列  配列番号：526）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-13
2005518223.tif 000156
および1044-038-14
2005518223.tif 000157
（それぞれ配列番号：527および528）を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、R269G変異およびR271K変異を導入した。
【０３８１】
TaqEFT-Tth（AKK）-G/M8（DNA配列  配列番号：529；アミノ酸配列  配列番号：530）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-15
2005518223.tif 000158
および1044-038-16
2005518223.tif 000159
（それぞれ配列番号：531および532）を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、E290G、S291G、P292E、A294P、およびL295Rの変異を導入した。
【０３８２】
TaqEFT-Tth（AKK）-H/M9（DNA配列  配列番号：533；アミノ酸配列  配列番号：534）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-17
2005518223.tif 000160
および1044-038-18
2005518223.tif 000161
（それぞれ配列番号：535および536）を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、A328C変異を導入した。
【０３８３】
TaqEFT-Tth（AKK）-I/M10（DNA配列  配列番号：537；アミノ酸配列  配列番号：538）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1080-015-01
2005518223.tif 000162
および1080-015-02
2005518223.tif 000163
を使用して、Taq（EFT）-Tth（AKK）DNA（配列番号：501）に対して実行して、E210K変異を導入した。
【０３８４】
TaqEFT-Tth（AKK）-M1-9（DNA配列  配列番号：541；アミノ酸配列  配列番号：542）の構築
7つの独立したPCR反応を、構築物TaqEFT（AKK）（配列番号：501）をテンプレートとして、以下の変異誘発プライマー対を用いて実行した：PCR反応1；1044-038-01
2005518223.tif 000164
および1044-038-04
2005518223.tif 000165
（これにより108塩基対断片を産生した）、PCR反応2；1044-038-03
2005518223.tif 000166
および1044-038-06
2005518223.tif 000167
（これにより117塩基対断片を産生した）、PCR反応3；1044-038-05
2005518223.tif 000168
および1044-038-10
2005518223.tif 000169
（これにより237塩基対断片を産生した）、PCR反応4；1044-038-09
2005518223.tif 000170
および1044-038-12
2005518223.tif 000171
（これにより276塩基対断片を産生した）、PCR反応5；1044-038-11
2005518223.tif 000172
および1044-038-14
2005518223.tif 000173
（これにより228塩基対断片を産生した）、PCR反応6；1044-038-13
2005518223.tif 000174
および1044-038-16
2005518223.tif 000175
（これにより113塩基対断片を産生した）、PCR反応7；1044-038-15
2005518223.tif 000176
および1044-038-18
2005518223.tif 000177
（これにより157塩基対断片を産生した）。7種のPCR産物は、プライマーの非存在下でのPCR増幅が適切な1005塩基対産物を産生してK70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R、およびA328Cの変異を導入するように重複している。この産物を、外側のプライマー：1044-038-01（配列番号：507）および1044-038-18（配列番号：536）を使用してさらに増幅し、pPCR-Script-Ampにクローニングした。この構築物からヌクレアーゼドメインを、プライマー：1044-038-01（配列番号：507）および1044-038-18（配列番号：536）を使用して再度増幅し、EcoRIおよびNotIで消化した。消化されたPCR産物を、EcoRIおよびNotIで消化されたTaqEFT-Tth（AAK）構築物に連結し、タンパク質発現およびスクリーニングのためにJM109に形質転換した。
【０３８５】
TaqEFT-Tth（AKK）-M1-10（DNA配列  配列番号：543；アミノ酸配列  配列番号：544）の構築
7つの独立したPCR反応を、構築物TaqEFT（AKK）（配列番号：501）をテンプレートとして、以下の変異誘発プライマー対を用いて実行した：PCR反応1；1044-038-01
2005518223.tif 000178
および1044-038-04
2005518223.tif 000179
（これにより108塩基対断片を産生した）、PCR反応2；1044-038-03
2005518223.tif 000180
および1044-038-06
2005518223.tif 000181
（これにより117塩基対断片を産生した）、PCR反応3；1044-038-05
2005518223.tif 000182
および1044-038-10
2005518223.tif 000183
（これにより237塩基対断片を産生した）、PCR反応4；1044-038-09
2005518223.tif 000184
および1080-42-02
2005518223.tif 000185
（これにより299塩基対断片を産生した）、PCR反応5；1080-42-01
2005518223.tif 000186
および1044-038-14
2005518223.tif 000187
（これにより228塩基対断片を産生した）、PCR反応6；1044-038-13
2005518223.tif 000188
および1044-038-16
2005518223.tif 000189
（これにより113塩基対断片を産生した）、PCR反応7；1044-038-15
2005518223.tif 000190
および1044-038-18
2005518223.tif 000191
（これにより157塩基対断片を産生した）。7種のPCR産物は、プライマーの非存在下でのPCR増幅が適切な1005塩基対産物を産生してK70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、E210K、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R、およびA328Cの変異を導入するように重複している。この産物を、外側のプライマー：1044-038-01（配列番号：507）および1044-038-18（配列番号：536）を使用してさらに増幅し、pPCR-Script-Ampにクローニングした。この構築物からヌクレアーゼドメインを、プライマー：1044-038-01（配列番号：507）および1044-038-18（配列番号：536）を使用して再度増幅し、EcoRIおよびNotIで消化した。消化されたPCR産物を、EcoRIおよびNotIで消化されたTaqEFT-Tth（AAK）構築物に連結し、酵素の発現およびスクリーニングのためにJM109に形質転換した。
【０３８６】
基質特異性をさらに改善するためのFEN酵素のK69E変異
Tth（K69E）AKK、Taq（K69E）TthAKK、Tfi（K69E）TthAKK、およびTsc（K69E）TthAKKならびに変異体の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー
2005518223.tif 000192
を使用して、TthAKK、TaqTthAKK、TfiTthAKK、およびTscTthAKKのDNAに対して実行して、K69E変異を導入し、Tth（K69E）AKK（DNA配列  配列番号：452；アミノ酸配列  配列番号：494）、Taq（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：495；アミノ酸配列  配列番号：496）、Tfi（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：497；アミノ酸配列  配列番号：498）、およびTsc（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：499；アミノ酸配列  配列番号：500）の変異体酵素を生成した。
【０３８７】
Tsc（167-334）TthAKKの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000193
および1044-041-01
2005518223.tif 000194
によって、テンプレートTth（K69E）AKK（DNA配列  配列番号：452）を用いて、ならびに、プライマー1044-041-02：
2005518223.tif 000195
および209-074-02
2005518223.tif 000196
によって、テンプレートTsc（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：454）を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-74-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tsc（167-33）TthAKK構築物（DNA配列  配列番号：455；アミノ酸配列  配列番号：456）を産生した。
【０３８８】
Tsc（222-334）TthAKKの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000197
および1044-041-03
2005518223.tif 000198
によって、テンプレートTth（K69E）AKK（DNA配列  配列番号：452）を用いて、ならびに、プライマー1044-041-04：
2005518223.tif 000199
および209-074-02
2005518223.tif 000200
によって、テンプレートTsc（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：454）を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tsc（222-334）TthAKK構築物（DNA配列  配列番号：459；アミノ酸配列  配列番号：460）を産生した。
【０３８９】
Tfi（222-334）TthAKKの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000201
および1044-058-05
2005518223.tif 000202
によって、テンプレートTth（K69E）AKK（DNA配列  配列番号：452）を用いて、ならびに、プライマー1044-058-06：
2005518223.tif 000203
および209-074-02
2005518223.tif 000204
によって、テンプレートTfi（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：497）を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tfi（222-334）TthAKK構築物（DNA配列  配列番号：463；アミノ酸配列  配列番号：464）を産生した。
【０３９０】
Tfi（167-334）TthAKKの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000205
および1044-058-07
2005518223.tif 000206
によって、テンプレートTth（K69E）AKK（DNA配列  配列番号：452）を用いて、ならびに、プライマー1044-058-08：
2005518223.tif 000207
および209-074-02
2005518223.tif 000208
によって、テンプレートTfi（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：498）を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tfi（167-333）TthAKK構築物（DNA配列  配列番号：467；アミノ酸配列  配列番号：468）を産生した。
【０３９１】
Tsc（111-334）TthAKKの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000209
および1044-058-01
2005518223.tif 000210
によって、テンプレートTth（K69E）AKK（DNA配列  配列番号：452）を用いて、ならびに、プライマー1044-058-02：
2005518223.tif 000211
および209-074-02
2005518223.tif 000212
によって、テンプレートTsc（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：499）を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tsc（167-333）TthAKK構築物（DNA配列  配列番号：471；アミノ酸配列  配列番号：472）を産生した。
【０３９２】
Tsc（1-167）TthAKKの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000213
および1044-058-03
2005518223.tif 000214
によって、テンプレートTsc（K69E）TthAKK（DNA配列  配列番号：499）を用いて、ならびに、プライマー1044-058-04：
2005518223.tif 000215
および209-074-02
2005518223.tif 000216
によって、テンプレートTth（K69E）AKK（DNA配列  配列番号：452）を用いて生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcpRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したベクターTthAKKに連結して、Tsc（1-167）TthAKK構築物（DNA配列  配列番号：475；アミノ酸配列  配列番号：476）を産生した。
【０３９３】
AfuFEN酵素の改変
pAfuFENの構築
プラスミドpAfuFEN1を記載されたように（米国特許出願第09/684,938号、国際公開公報第98/23774号、各々その全体が参照として本明細書に組み入れられる）調製した。手短に述べると、ゲノムDNAを、DSMZからの生きているA.フルギドゥス細菌（DSMZ#4304）の1バイアル（約5ml培養物）から、製造業者の指示書に従ってDNA XTRAXキット（Gull Laboratories, Salt Lake City, UT）を用いて調製した。最終的なDNAペレットを、100μlのTE（10mM Tris HCl、pH 8.0、1mM EDTA）に懸濁した。1μlのDNA溶液を、ADVANTAGE cDNA PCRキット（Clontech）を使用してPCRに利用した；PCRを製造業者の推奨に従って行った。
【０３９４】
5'末端プライマーはNcoI部位を作製するために1塩基対の置換を有すること以外は、Afu FEN-1遺伝子の5'末端に相補的である。3'末端プライマーはSalI部位を作製するために2塩基対の置換を含むこと以外は、FEN-1 ORFの3'末端に相補的である。5'プライマーおよび3'プライマーの配列は、それぞれ、
2005518223.tif 000217
である。得られる断片のクローニングは、プラスミドpTrc99-AFFEN1を作製するために、PfuFEN1遺伝子について、米国特許出願第5,994,069号（すべての目的のためにその全体が参照として本明細書に組み入れられる）に記載された。発現のために、pTrc99AfuHisプラスミドを、精製を容易にするためにヒスチジンテールを付加することによりpTrc99-AFFEN1を改変することによって構築した。このヒスチジンテールを付加するために、標準的PCRプライマー特異的変異誘発法を使用して、pTrc99-AFFEN1のコード領域の最後のアミノ酸コドンと停止コドンとの間に6つのヒスチジン残基についてのコード配列を挿入する。得られるプライマーをpTrcAfuHisと名付けた。次いで、タンパク質を記載されるように発現させ、Ni++アフィニティーカラムへの結合によって精製した。
【０３９５】
Afu（Y236A）、A46-5の構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー785-73-04：
2005518223.tif 000218
および700-10-03
2005518223.tif 000219
によって、ならびに、プライマー390-076-08：
2005518223.tif 000220
および785-73-06
2005518223.tif 000221
を用いて、テンプレートAfuFEN（DNA配列  配列番号：556）から生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー700-10-03および390-076-08を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素NcoIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したAfuFEN構築物に連結して、Afu（Y236A）構築物（DNA配列  配列番号：549；アミノ酸配列  配列番号：550）を産生した。
【０３９６】
Afu（Y236R）、A56-9の構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー785-73-05：
2005518223.tif 000222
および700-10-03
2005518223.tif 000223
を用いて、ならびに、プライマー390-076-08：
2005518223.tif 000224
および785-73-06
2005518223.tif 000225
を用いて、テンプレートAfuFENを使用して生成した。2つの産物を合わせて、外部のプライマー700-10-03および390-076-08を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素NcoIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したAfuFEN構築物に連結して、Afu（Y236A）構築物（DNA配列  配列番号：552；アミノ酸配列  配列番号：553）を産生した。
【０３９７】
2. FEN酵素およびテルムスポリメラーゼ誘導体のキメラ
以下の酵素構築物は、AfuFEN酵素ポリメラーゼドメインの部分およびテルムスポリメラーゼポリメラーゼドメインを合わせる。これらの組み合わせを、分子モデリングによって生成された情報に基づいて設計した。
【０３９８】
Afu336-Tth296（AKK）、AT1-1の構築
2つの重複するPCR断片を生成した。第1の断片を、AfuFEN構築物（配列番号：556）をテンプレートとして使用して、プライマー390-076-08：
2005518223.tif 000226
および390-065-05
2005518223.tif 000227
を用いて作製した。第2の断片を、TthAKK（配列番号：558）をテンプレートとして使用して、ならびにプライマー700-049-01：
2005518223.tif 000228
および390-076-09
2005518223.tif 000229
を使用して作製した。2つの産物は配列重複の領域を含み、2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-076-08および390-076-09を用いて組換えPCR反応において増幅した。組換えPCR産物を制限酵素BspEIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したAfuFEN構築物に連結して、Afu336-Tth296（AKK）構築物（DNA配列  配列番号：559；アミノ酸配列  配列番号：560）を産生した。
【０３９９】
Afu338-Tth296（AKK）、AT2-3の構築
2つの重複するPCR断片を生成した。第1の断片を、プライマー390-076-08：
2005518223.tif 000230
および700-049-02
2005518223.tif 000231
によって、AfuFEN構築物（配列番号：556）をテンプレートとして使用して作製した。第2の断片を、プライマー700-049-03：
2005518223.tif 000232
および390-076-09
2005518223.tif 000233
を使用して、TthAKK（配列番号：558）をテンプレートとして使用して、作製した。2つの産物は配列重複の領域を含み、2つの産物を合わせて、外部のプライマー390-076-08および390-076-09を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素BspEIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製したAfuFEN構築物に連結して、Afu336-Tth296（AKK）構築物（DNA配列  配列番号：563；アミノ酸配列  配列番号：564）を産生した。
【０４００】
Afu336-Taq5Mの構築
Taq5M構築物（配列番号：41）をNotIおよびSalIで切断し、より小さな挿入物断片をゲル単離した。Afu336-Tth296（AKK）構築物（DNA配列  配列番号：559）をまた同じ制限酵素で切断し、より大きなベクター断片を精製した。次いで、挿入物（Taq5Mポリメラーゼドメイン）をベクターに連結し、Afu336-Taq5M構築物（DNA配列  配列番号：565；アミノ酸配列  配列番号：566）を生成した。
【０４０１】
Afu336-TaqDNの構築
TaqDNHT構築物（配列番号：41）をNotIおよびSalIで切断し、より小さな挿入物断片をゲル単離した。Afu336-Tth296（AKK）構築物（DNA配列  配列番号：559）をまた同じ制限酵素で切断し、より大きなベクター断片を精製した。次いで、挿入物（TaqDNポリメラーゼドメイン）をベクターに連結し、Afu336-Taq5M構築物（DNA配列  配列番号：567；アミノ酸配列  配列番号：568）を生成した。
【０４０２】
テルムスポリメラーゼのランダムキメラ作製
変化した機能を有する多数の酵素を、DNAシャッフリングの原理に基づくテルムスポリメラーゼのランダムキメラ作製を介して生成した（VolkovおよびArnold、Methods in Enzymology 328: 456 [2000]）。以下の手順を使用して以下のキメラを開発した。
【０４０３】
ランダムキメラ作製のための関心対象の遺伝子をプライマー：390-076-08
2005518223.tif 000234
および209-74-02：
2005518223.tif 000235
を用いてPCR増幅して、約1.4kbpテンプレートを生成した。約2μgのDNAテンプレートを等しい比率で混合し、次いで30μl反応溶液で、DNaseI（0.33U）で15℃で約1分間消化し、50-200bpのサイズの断片を生成した。DNA断片を4％アガロースで精製し、製造業者の指示書に従ってQIAEXIIゲル抽出キット（QIAGEN）によって抽出した。精製された断片（10μl）を、断片アセンブリー反応（PCRプログラム：3分間94℃、次に、30秒間94℃、1分間52℃、2分間+5秒間72℃の40サイクル、次に4分間72℃）のために、10μlの2×PCRプレミックス（5倍希釈、クローニングしたPfuバッファー、0.4mM 各dNTP、0.06U/μl クローニングしたPfu DNAポリメラーゼ、STRATAGENEカタログ番号#600153、付属するバッファーを伴う）に加えた。次いで、再アセンブルした産物（10倍希釈物の1μl）を一対のネスト化プライマー：072-090-01
2005518223.tif 000236
および189-082-01
2005518223.tif 000237
を用いて、製造業者の指示書に従ってCLONTECH GC melt cDNAキット（カタログ番号#K1907-Y）を使用して増幅した。精製したPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで消化し、次いで同じ酵素で切断することによって調製したTthAKKに連結した。ライゲーション混合物をJM109コンピテント細胞に形質転換し、コロニーを酵素活性についてスクリーニングした。
【０４０４】
1. ランダムキメラS26およびS36の生成
これらのキメラ酵素を開発するためのテンプレートはTthAKK、TaqTthAKK、TscTthAKK、およびTfiTthAKKの構築物からのヌクレアーゼドメインであった。2つのクローンが最初の活性スクリーニングに基づいて活性の改善を示すことが見い出された。次いで、ランダムキメラS26（DNA配列  配列番号：571；アミノ酸配列  配列番号：572）およびS36（DNA配列  配列番号：573；アミノ酸配列  配列番号：574）を配列決定および単離した。
【０４０５】
2. 基質特異性を改善するためにS26およびS36へのL107F/E108T変異、L109F/V110T変異、およびK69E変異の導入
S26（FT）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー：785-008-03
2005518223.tif 000238
および680-21-03
2005518223.tif 000239
を使用してpS26 DNAに対して実行して、L107F/E108T変異を導入およびS26（FT）（DNA配列  配列番号：575；アミノ酸配列  配列番号：576）を生成した。
【０４０６】
S36（FT）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー：785-096-01
2005518223.tif 000240
および785-096-02
2005518223.tif 000241
を使用してpS36 DNAに対して実行して、L107F/V110T変異を導入およびS36（FT）（DNA配列  配列番号：577；アミノ酸配列  配列番号：578）を生成した。
【０４０７】
S26（K69E）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー： 
2005518223.tif 000242
を使用してS26 DNAに対して実行して、K69E変異を導入およびS26（K69E）（DNA配列  配列番号：579；アミノ酸配列  配列番号：580）を生成した。
【０４０８】
S26（FT/K69E）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー： 
2005518223.tif 000243
を使用してS26（FT）DNAに対して実行して、K69E変異を導入およびS26（FT/K69E）（DNA配列  配列番号：581；アミノ酸配列  配列番号：582）を生成した。
【０４０９】
3. さらなるランダムキメラ、N3D7、N1A12、N1C4、およびN2C3
これらのキメラを生成するために使用されたテンプレートは、構築物Tth（K69E）AKK、Taq（K69E）TthAKK、Tsc（K69E）TthAKK、およびTfi（K69E）TthAKKのヌクレアーゼドメインであった。4つのクローンが、初回の活性スクリーニングに基づいて改善された活性を示した。次いで、ランダムキメラN3D7（DNA配列  配列番号：583；アミノ酸配列  配列番号：584）、N1A12（DNA配列  配列番号：585；アミノ酸配列  配列番号：586）、N1C4（DNA配列  配列番号：587；アミノ酸配列  配列番号：588）、およびN2C3（DNA配列  配列番号：589；アミノ酸配列  配列番号：590）をそれぞれ配列決定および単離した。
【０４１０】
G、L、およびGLの改変体の生成
アミノ酸385におけるAspからGlyへの変化（D385G）およびアミノ酸455におけるArgからLeuへの変化（R455L）を有するTthポリメラーゼの改変体（アミノ酸配列  配列番号：2712；遺伝子配列  配列番号：2713）を使用して、誘導体酵素およびキメラ酵素を作製した。これらの2つのアミノ酸の変化を含む構築物を以下の「GL」の表記によって示す。1つのみの変化を含むキメラは「G」または「L」のいずれかとして示す。非重合改変体を作製するために、787位のアスパラギン酸をコードする配列を、上記のような部位特異的変異誘発によって、アスパラギンをコードする配列に変化させた。以下のヌクレオチド：
2005518223.tif 000244
を有するpTrcTth GL-2の変異誘発を、プラスミドpTrcTthDN GLを作製するために実行した。変異体タンパク質およびコードする核酸配列を、それぞれTthDN GL、配列番号：2714および2715と呼ぶ。
【０４１１】
A. Tth DN HT GL
6アミノ酸のヒスチジンタグ（his-タグ）を、Tth DNについて上記に記載されたようにTth DN HT GLのカルボキシ末端に付加した。得られた変異体遺伝子をTth DN HT GL（DNA配列  配列番号：2716；アミノ酸配列  配列番号：2717）と名付けた。このタンパク質を、上記のTth DN HTについて記載されるように発現させおよび精製した。
【０４１２】
B. Tth DN RX HT GLの生成
変異誘発を、3つのさらなる独特な制限部位をTth DN HT酵素のポリメラーゼドメインに導入するために実行した。部位特異的変異誘発を、製造業者の指示書に従ってTransformer Site-Directed Mutagenesis Kit（Clontech）を使用して実行した。2つの異なる選択プライマー、Trans Oligo AlwNI/SpeIまたはSwitch Oligo SpeI/AlwNI（Clontech, Palo Alto CA カタログ番号#6488-1またはカタログ番号#6373-1）のうちの1つを、記載されるすべての変異誘発反応のために使用した。所定の反応において使用される選択オリゴはベクターに存在する選択制限部位に依存する。すべての変異誘発プライマーを標準的な合成化学によって合成した。生成したコロニーを大腸菌株JM109において発現させた。
【０４１３】
NotI部位（アミノ酸328位）を、Tth DN HT GL遺伝子のセンス鎖に対応する変異誘発プライマー
2005518223.tif 000245
を使用して作製した。BstI部位（アミノ酸382位）およびNdeI部位（アミノ酸443位）を、センス鎖変異誘発プライマー
2005518223.tif 000246
を使用して遺伝子に導入した。変異体プラスミドを過剰発現させ、Qiagen QiaPrep Spin Mini Prep Kit（カタログ番号#27106）を使用して精製した。ベクターを、DNA配列決定および制限酵素地図作製によって制限部位の存在について試験した。この構築物を、Tth DN RX HT GL（DNA配列  配列番号：2718；アミノ酸配列  配列番号：2719）と名付けた。キメラ構築物をTth DN RX HT GLを使用して作製した。
【０４１４】
1. TaqTth（N）GLの構築
実行した最初の交換は2つの酵素のポリメラーゼドメインを含んだ。ヌクレアーゼドメイン（タンパク質のN末端ドメイン）のポリメラーゼドメイン（タンパク質のC末端ドメイン）からの分離には、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNotIを用いる両方の遺伝子の切断が伴った。Taq DN RX HT GL遺伝子からの約900塩基対断片を、Tth DN RX HT GL遺伝子の相同部位にクローニングし、キメラTaqTth（N）GL（DNA配列  配列番号：2675；アミノ酸配列  配列番号：2641）を産生し、これは、Taq DN RX HT GL 5'ヌクレアーゼドメインおよびTth DN RX HT GLポリメラーゼドメインを有する。
【０４１５】
2. TaqTth（N-B）GLの構築
Taq DN RX HT構築物を酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より大きなベクター断片を上記のようにゲル単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より小さな（約795塩基対）Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NdeI-BamHI挿入物をTaq NdeI-BamHIベクターに上記のように連結し、TaqTth（N-B）GL（DNA配列  配列番号：2676；アミノ酸配列  配列番号：2642）を生成した。
【０４１６】
3. TaqTth（N-D）Gの構築
Taq DN RX HT構築物を酵素NotIおよびNdeIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素NotIおよびNdeIで切断し、より小さな（約345塩基対）Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NotI-NdeI挿入物をTaq NotI-NdeIベクターに上記のように連結し、TaqTth（N-D）G（DNA配列  配列番号：2677；アミノ酸配列  配列番号：2643）を生成した。
【０４１７】
4. TaqTth（D-B）Lの構築
Taq DN RX HT構築物を酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素NdeIおよびBamHIで切断し、より小さな（約450塩基対）Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NdeI-BamHI挿入物をTaq NdeI-BamHIベクターに上記のように連結し、TaqTth（D-B）L（DNA配列  配列番号：2678；アミノ酸配列  配列番号：2644）を生成した。
【０４１８】
5. TaqTth（Bs-B）Lの構築
Taq DN RX HT構築物を酵素BstBIおよびBamHIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素BstBIおよびBamHIで切断し、より小さな（約633塩基対）Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NdeI-BamHI挿入物をTaq NdeI-BamHIベクターに上記のように連結し、TaqTth（Bs-B）L（DNA配列  配列番号：2679；アミノ酸配列  配列番号：2645）を生成した。
【０４１９】
6. TaqTth（N-Bs）Gの構築
Taq DN RX HT構築物を酵素NotIおよびBstBIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Tth DN RX HT GL構築物もまた酵素NotIおよびBstBIで切断し、より小さな（約162塩基対）Tth断片をゲル単離および精製した。Tth GL NotI-BstBI挿入物をTaq NotI-BstBIベクターに上記のように連結し、TaqTth（N-Bs）G（DNA配列  配列番号：2680；アミノ酸配列  配列番号：2646）を生成した。
【０４２０】
7. TthTaq（B-S）GLの構築
Tth DN RX HT構築物を酵素BamHIおよびSalIで切断し、より大きなベクター断片を上記のように単離した。Taq DN RX HT構築物もまた酵素BamHIおよびSalIで切断し、より小さな（約741塩基対）Taq断片をゲル単離および精製した。Taq BamHI-SalI挿入物をTth GL BamHI-SalIベクターに上記のように連結し、TthTaq（B-S）GL（DNA配列  配列番号：2681；アミノ酸配列  配列番号：2647）を生成した。
【０４２１】
8. TaqTth（D-B）L E404H（DNA配列  配列番号：2684；アミノ酸配列  配列番号：2650）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-01
2005518223.tif 000247
を使用してpTrc99A TaqTth（D-B）L DNAに対して実行して、E404H変異を導入した。
【０４２２】
9. TaqTth（D-B）L F413H/A414R（DNA配列  配列番号：2685；アミノ酸配列  配列番号：2651）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-02
2005518223.tif 000248
を使用してpTrc99A TaqTth（D-B）L DNAに対して実行して、F413H変異およびA414R変異を導入した。
【０４２３】
10. TaqTth（D-B）L W417L/G418K（DNA配列  配列番号：2686；アミノ酸配列  配列番号：2652）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-03
2005518223.tif 000249
を使用してpTrc99A TaqTth（D-B）L DNAに対して実行して、W417L変異およびG418K変異を導入した。
【０４２４】
11. TaqTth（D-B）L A439R（DNA配列  配列番号：2687；アミノ酸配列  配列番号：2653）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-04
2005518223.tif 000250
を使用してpTrc99A TaqTth（D-B）DNAに対して実行して、A439R変異を導入した。
【０４２５】
12. TaqTth（N-D）G L451R（DNA配列  配列番号：2688；アミノ酸配列  配列番号：2654）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-05
2005518223.tif 000251
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、L415変異を導入した。
【０４２６】
13. TaqTth（N-D）G R457Q（DNA配列  配列番号：2689；アミノ酸配列  配列番号：2655）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-06
2005518223.tif 000252
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、L415Q変異を導入した。
【０４２７】
14. TaqTth（N-D）G V463L（DNA配列  配列番号：2690；アミノ酸配列  配列番号：2656）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-07
2005518223.tif 000253
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、V463L変異を導入した。
【０４２８】
15. TaqTth（N-D）G A468R（DNA配列  配列番号：2691；アミノ酸配列  配列番号：2657）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-08
2005518223.tif 000254
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、A468R変異を導入した。
【０４２９】
16. TaqTth（N-D）G A472E（DNA配列  配列番号：2692；アミノ酸配列  配列番号：2658）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-09
2005518223.tif 000255
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、A472E変異を導入した。
【０４３０】
17. TaqTth（N-D）G G499R（DNA配列  配列番号：2693；アミノ酸配列  配列番号：2659）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-10
2005518223.tif 000256
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、G499R変異を導入した。
【０４３１】
18. TaqTth（N-D）G E507Q（DNA配列  配列番号：2694；アミノ酸配列  配列番号：2660）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー276-046-04
2005518223.tif 000257
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、E507Q変異を導入した。
【０４３２】
19. TaqTth（N-D）G Y535H（DNA配列  配列番号：2695；アミノ酸配列  配列番号：2661）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-11
2005518223.tif 000258
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、Y535H変異を導入した。
【０４３３】
20. TaqTth（N-D）G S543N（DNA配列  配列番号：2696；アミノ酸配列  配列番号：2662）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-12
2005518223.tif 000259
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、S543N変異を導入した。
【０４３４】
21. TaqTth（N-D）G I546V（DNA配列  配列番号：2697；アミノ酸配列  配列番号：2663）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-13
2005518223.tif 000260
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、I546V変異を導入した。
【０４３５】
22. TaqTth（N-D）G D551S/I553V（DNA配列  配列番号：2698；アミノ酸配列  配列番号：2664）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー240-60-14
2005518223.tif 000261
を使用してpTrc99A TaqTth（N-D）G DNAに対して実行して、D551S変異およびI553V変異を導入した。
【０４３６】
23. Tth DN RX HT GL H641A、Tth DN RX HT GL H748A、Tth DN RX HT GL H786Aの構築
部位特異的変異誘発を、以下のプライマーを使用して、pTrc99A Tth DN RX HT GL DNAに対して実行した：H641A変異（DNA配列  配列番号：2699；アミノ酸配列  配列番号：2665）を導入するための変異誘発プライマー583-001-02
2005518223.tif 000262
またはH748A変異体（DNA配列  配列番号：2700；アミノ酸配列  配列番号：2666）を生成するための変異誘発プライマー583-001-03
2005518223.tif 000263
またはH786A変異体酵素（DNA配列  配列番号：2701；アミノ酸配列  配列番号：2667）を生成するための変異誘発プライマー583-001-04
2005518223.tif 000264
。
【０４３７】
24. Tth DN RX HT GL（H786A/G506K/Q509K）
上記に生成される変異体Tth DN RX HT GL H786Aを出発物質として、部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー604-022-02：
2005518223.tif 000265
を使用して行い、「TthAKK GL」（DNA配列  配列番号：2702；アミノ酸配列  配列番号：2668）と名付けられたこの改変体を生成した。
【０４３８】
25. Tth DN RX HT H786Aランダム変異誘発
TthDN RX HT H786A GL（配列番号：2667）酵素のヘリックス-ヘアピン-ヘリックス領域における変異体を生成するために、2つの異なるPCR反応を、H786A変異体（配列番号：2701）をテンプレートとして使用して実行した。上記に議論されたTthDN GL H786Aを出発物質として、プライマー604-08-06：
2005518223.tif 000266
およびプライマー390-76-08：
2005518223.tif 000267
を使用して、620塩基対PCR断片を生成した。PCR反応を、製造業者の指示書に従ってAdvantage cDNA PCRキット（Clontech）を使用して実行した。このPCR産物はアミノ酸1-194を含む。この反応を介しては変異は導入されなかったが、しかし、制限酵素部位EcoRIは5'末端に存在する。
【０４３９】
上記に議論されたTthDN RX HT GL H786Aを出発物質として、変異誘発プライマー604-08-05：
2005518223.tif 000268
およびプライマー209-74-02：
2005518223.tif 000269
を使用して、787塩基対PCR断片を生成した。PCR反応を上記のように実行した。この断片は、変異誘発プライマー604-08-05の存在に起因するランダム変異を含む。このプライマーの括弧内の塩基は、その配列の91％が野生型であるのに対して、さらなる9％が残りの3種の塩基間で均等に分けられている。
【０４４０】
2つのPCR断片は重複しており、組換えPCR反応において合わされた。プライマー390-76-08および209-74-02を加え、Advantage cDNA PCRキット（Clontech）を製造業者の指示書に従って再度使用した。1380塩基対産物をこの反応から生成した。
【０４４１】
組換えPCR産物を製造業者の指示書に従って制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、986塩基対断片を産生した。TthDN RX HT GL H786Aを同じ酵素を用いて切断することによって調製した。次いで、この断片をベクターに連結し、JM109細胞に形質転換した。この反応のセットから開発された新規な変異体には以下が含まれる：
TthDN RX HT GL H786A/P197R/K200R（DNA配列  配列番号：2703；アミノ酸配列  配列番号：2669）。
TthDN RX HT GL H786A/K205Y（DNA配列  配列番号：2704；アミノ酸配列  配列番号：2670）。
TthDN RX HT GL H786A/G203R（DNA配列  配列番号：2705；アミノ酸配列  配列番号：2671）。
【０４４２】
26. TaqTthAKK GL（DNA配列  配列番号：2706；アミノ酸配列  配列番号：2672）の構築
キメラ変異体TaqTthAKK GLを、TthDN RX HT GL（H786A/G506K/Q509K）（配列番号：2702；ここではTthAKK GLと略す）およびTaq 4M G504（配列番号：108；ここではTaq 5Mと略す）を制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびNotIを用いて切断することによって生成した。Taq 5Mのより小さな挿入物断片およびTth AKK GLのより大きなベクター断片を、実施例3Dにおいて詳述するようにゲル精製し、そして挿入物断片を実施例3Dに記載されるように連結した。スクリーニングおよび構築物配列の確認もまた、実施例3Dと同様に行った。
【０４４３】
27. TfiTthAKK GL（DNA配列  配列番号：2707；アミノ酸配列  配列番号：2673）、TscTthAKK GL（DNA配列  配列番号：2708；アミノ酸配列  配列番号：2674）の構築
TfiAKK GL（配列番号：2702）とTfiDN 2M（配列番号：130）、またはTsc DN 2M（配列番号：131）との間のキメラ酵素を生成するために、TthDN RX HT GL（H786A/G506K/Q509K）DNA（配列番号：2702）をEcoRIおよびNotIで切断し、より大きなベクター断片を上記のようにゲル単離した。TfiおよびTscの993塩基対のEcoRI-NotI断片を実施例8において記載されるように調製した。ライゲーションを実施例3Dにおいて記載されるように実行し、スクリーニングおよび構築物配列の確認もまた同様に行った。
【０４４４】
28. TthAKK GL（P195A）およびTthAKK GL（P195K）
TthAKK GL構築物のヌクレアーゼドメインにおけるアミノ酸195位に変異（P195AまたはP195K）を導入するために、変異誘発プライマー785-073-01（P195A）
2005518223.tif 000270
または785-073-02（P195K）
2005518223.tif 000271
およびプライマー209-074-02
2005518223.tif 000272
をPCR反応において使用して、787塩基対断片を生成した。別のPCR断片を、プライマー390-076-08
2005518223.tif 000273
および785-073-03
2005518223.tif 000274
を反応において同じテンプレートとともに使用することによって得た。
【０４４５】
2つのPCR断片は重複しており、組換えPCR反応において合わせた。外側のプライマー390-076-08および209-074-02を加え、Advantage cDNA PCRキット（Clontech）を製造業者の指示書に従って使用した。1380塩基対の産物をこの反応から生成した。
【０４４６】
組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、986塩基対断片を産生した。TthAKK GL構築物を同じ酵素を用いて切断することによって生成した。次いで、この断片をベクターに連結し、JM109細胞に形質転換した。この反応のセットから開発した新規な変異体には以下が含まれる：TthAKK GL（P195A）（DNA配列  配列番号：2721；アミノ酸配列  配列番号：2722）およびTthAKK GL（P195K）（DNA配列  配列番号：723；アミノ酸配列  配列番号：2724）。
【０４４７】
29. TthAKK GL（N417K/L418K）の構築
同じアプローチを、TthAKK GL（N417K/L418K）を構築するために使用した。2つの重複するPCR断片を、変異誘発プライマー：785-73-07
2005518223.tif 000275
および700-10-03
2005518223.tif 000276
、ならびにプライマー158-084-01
2005518223.tif 000277
および785-73-08
2005518223.tif 000278
によって生成した。2つの産物を合わせ、外側のプライマー700-10-03および158-084-01を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素NotIおよびBamHIで切断し、NotI/BamHIであらかじめ切断したTthAKK GL構築物に連結した。この変異体をTthAKK GL（DNA配列  配列番号：2725；アミノ酸配列  配列番号：2726）と名付けた。
【０４４８】
30. TthAKK GL（P255L）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-05および886-049-06：
2005518223.tif 000279
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、TthAKK GL（P255L）（DNA配列  配列番号：2727；アミノ酸配列  配列番号：2728）を生成した。
【０４４９】
31. TthAKK GL（F311Y）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-09および886-049-10：
2005518223.tif 000280
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、TthAKK GL（F311Y）（DNA配列  配列番号：2729；アミノ酸配列  配列番号：2730）を生成した。
【０４５０】
32. TthAKK GL（N221H/R224Q）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-01および886-049-02：
2005518223.tif 000281
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、TthAKK GL（N221H/R224Q）（DNA配列  配列番号：2731；アミノ酸配列  配列番号：2732）を生成した。
【０４５１】
33. TthAKK GL（R251H）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-049-03および886-049-04：
2005518223.tif 000282
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、TthAKK GL（R251H）（DNA配列  配列番号：2733；アミノ酸配列  配列番号：2734）を生成した。
【０４５２】
34. TthAKK GL（P255L/R251H）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー886-088-01および886-088-02：
2005518223.tif 000283
を使用してTthAKK GL（P255L）構築物に対して実行して、TthAKK GL（P255L/R251H）（DNA配列  配列番号：2735；アミノ酸配列  配列番号：2736）を生成した。
【０４５３】
35. Tth AKK GL L429V（DNA配列  配列番号：2737；アミノ酸配列  配列番号：2738）の構築
パーム領域ランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
2005518223.tif 000284
および逆方向プライマー680-79-04
2005518223.tif 000285
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、パーム領域にランダム変異を導入した。括弧は示される91％の塩基および3％の他のすべての塩基の合成を示す。
【０４５４】
36. Tth AKK GL E425V（DNA配列  配列番号：2739；アミノ酸配列  配列番号：2740）の構築
パーム領域ランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
2005518223.tif 000286
および逆方向プライマー680-79-04
2005518223.tif 000287
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、パーム領域にランダム変異を導入した。括弧は示される91％の塩基および3％の他のすべての塩基の合成を示す。
【０４５５】
37. Tth AKK GL L422N/E425K（DNA配列  配列番号：2741；アミノ酸配列  配列番号：2742）の構築
パーム領域ランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
2005518223.tif 000288
および逆方向プライマー680-79-04
2005518223.tif 000289
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、パーム領域にランダム変異を導入した。括弧は示される91％の塩基および3％の他のすべての塩基の合成を示す。
【０４５６】
38. Tth AKK GL L422F/W430C（DNA配列  配列番号：2743；アミノ酸配列  配列番号：2744）の構築
パーム領域ランダム化変異誘発を、変異誘発プライマー680-79-02
2005518223.tif 000290
および逆方向プライマー680-79-04
2005518223.tif 000291
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、パーム領域にランダム変異を導入した。括弧は示される91％の塩基および3％の他のすべての塩基の合成を示す。
【０４５７】
39. Tth AKK GL A504F（DNA配列  配列番号：2745；アミノ酸配列  配列番号：2746）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
2005518223.tif 000292
および逆方向プライマー680-80-06
2005518223.tif 000293
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A504アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０４５８】
40. Tth AKK GL A504V（DNA配列  配列番号：2747；アミノ酸配列  配列番号：2748）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
2005518223.tif 000294
および逆方向プライマー680-80-06
2005518223.tif 000295
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A504アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０４５９】
41. Tth AKK GL A504S（DNA配列  配列番号：2749；アミノ酸配列  配列番号：2750）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-03
2005518223.tif 000296
および逆方向プライマー680-80-06
2005518223.tif 000297
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A504アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０４６０】
42. Tth AKK GL S517G（DNA配列  配列番号：2751；アミノ酸配列  配列番号：2752）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
2005518223.tif 000298
および逆方向プライマー680-80-10
2005518223.tif 000299
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、S517アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０４６１】
43. Tth AKK GL A518L（DNA配列  配列番号：2753；アミノ酸配列  配列番号：2754）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
2005518223.tif 000300
および逆方向プライマー680-80-10
2005518223.tif 000301
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A518アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０４６２】
44. Tth AKK GL A518R（DNA配列  配列番号：2755；アミノ酸配列  配列番号：2756）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-80-07
2005518223.tif 000302
および逆方向プライマー680-80-10
2005518223.tif 000303
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、A518アミノ酸にランダム変異を導入した。
【０４６３】
45. Tth AKK GL A504K（DNA配列  配列番号：2757；アミノ酸配列  配列番号：2758）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-69-04
2005518223.tif 000304
および逆方向プライマー680-69-05
2005518223.tif 000305
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、Tth AKK GL酵素にA504K変異を導入した。
【０４６４】
46. Tth AKK GL H641A（DNA配列  配列番号：2759；アミノ酸配列  配列番号：2760）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-69-08
2005518223.tif 000306
および逆方向プライマー583-01-02
2005518223.tif 000307
を使用してTth AKK GL構築物に対して実行して、Tth AKK GL酵素にH641A変異を導入した。
【０４６５】
47. Tth AKK GL T508P（DNA配列  配列番号：2761；アミノ酸配列  配列番号：2762）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー680-70-01
2005518223.tif 000308
および逆方向プライマー680-70-02
2005518223.tif 000309
を使用してTthAKK GL構築物に対して実行して、Tth AKK GL酵素にT508P変異を導入した。
【０４６６】
48. Taq（FT）TthAKK GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー473-087-05
2005518223.tif 000310
を使用してTaqTthAKK GL構築物に対して実行して、L107F/A108T変異を導入し、Taq（FT）Tth AKK GL（DNA配列  配列番号：2779；アミノ酸配列  配列番号：2780）を生成した。
【０４６７】
49. Tfi（FT）TthAKK GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー785-096-01
2005518223.tif 000311
および785-096-02
2005518223.tif 000312
を使用してTfiTthAKK GL構築物に対して実行して、L107F/V108T変異を導入し、Tfi（FT）Tth AKK GL（DNA配列  配列番号：2720；アミノ酸配列  配列番号：2781）を生成した。
【０４６８】
50. Tsc（FT）TthAKK GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー785-008-03
2005518223.tif 000313
および逆方向プライマー680-21-03
2005518223.tif 000314
を使用してTscTthAKK GL構築物に対して実行して、L107F/E108T変異を導入し、Tsc（FT）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2764；アミノ酸配列  配列番号：2782）を生成した。
【０４６９】
51. TthAKK GL酵素とαペプチドとの間の融合
TthAKK GL-lacZ-ペプチドキメラ融合物を構築して、変異（フレームシフト、欠失、挿入など）の検出を可能にした。これは、コロニーの青色-白色スクリーニングに基づいて全長融合タンパク質の発現を不可能にする（Wuら、Nucleic Acids Research, 24: 1710 [1996]）。
【０４７０】
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー959-041-03
2005518223.tif 000315
および959-041-04
2005518223.tif 000316
を使用してTthAKK GL DNAに対して実行して、lacZαペプチドの挿入のためにTthAKK GLのC末端に6×Hisの後のSalI部位を有するpTthAKK GL-Lを生成した。αペプチド（201アミノ酸）を最初に、pCRII-TOPOベクター（Invitrogen）から、プライマー959-041-01
2005518223.tif 000317
および959-093-01
2005518223.tif 000318
を用いてPCR増幅した。次いで、PCR産物を制限酵素SalIで消化し、pTthAKK GL-Lベクター（これもまた同じ酵素で切断した）に連結して、キメラ構築物TthAKK GL-αペプチド（DNA配列  配列番号：2777；アミノ酸配列  配列番号：2778）を生成した。
【０４７１】
52. TaqEFT-TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2790；アミノ酸配列  配列番号：2791）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー436-013-08
2005518223.tif 000319
および436-013-09
2005518223.tif 000320
を使用してTaq（FT）-Tth（AKK）GL DNA構築物に対して実行して、K70E変異を導入した。
【０４７２】
53. TaqEFT-TthAKK GL-A/M1（DNA配列  配列番号：2792；アミノ酸配列  配列番号：2793）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-01
2005518223.tif 000321
および1044-038-02
2005518223.tif 000322
を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、G4EA変異を導入した。
【０４７３】
54. TaqEFT-Tth（AKK） GL-B/M2（DNA配列  配列番号：2794；アミノ酸配列  配列番号：2795）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-03
2005518223.tif 000323
および1044-038-04
2005518223.tif 000324
（それぞれ配列番号：511および512）を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、H29F変異を導入した。
【０４７４】
55. TaqEFT-Tth（AKK） GL-C/M3（DNA配列  配列番号：2796；アミノ酸配列  配列番号：2797）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-05
2005518223.tif 000325
および1044-038-06
2005518223.tif 000326
（それぞれ配列番号：515および516）を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、K57R変異を導入した。
【０４７５】
56. TaqEFT-Tth（AKK） GL-D/M5（DNA配列  配列番号：2798；アミノ酸配列  配列番号：2799）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-09
2005518223.tif 000327
および1044-038-10
2005518223.tif 000328
（それぞれ配列番号：519および520）を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、S125T変異を導入した。
【０４７６】
57. TaqEFT-Tth（AKK） GL-E/M6（DNA配列  配列番号：2800；アミノ酸配列  配列番号：2801）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-11
2005518223.tif 000329
および1044-038-12
2005518223.tif 000330
（それぞれ配列番号：523および524）を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、R206L変異を導入した。
【０４７７】
58. TaqEFT-Tth（AKK） GL-F/M7（DNA配列  配列番号：2802；アミノ酸配列  配列番号：2803）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-13
2005518223.tif 000331
および1044-038-14
2005518223.tif 000332
（それぞれ配列番号：527および528）を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、R269G変異およびR271K変異を導入した。
【０４７８】
59. TaqEFT-Tth（AKK） GL-G/M8（DNA配列  配列番号：2804；アミノ酸配列  配列番号：2805）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-15
2005518223.tif 000333
および1044-038-16
2005518223.tif 000334
（それぞれ配列番号：531および532）を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、変異E290G、S291G、P292E、A294P、およびL295Rを導入した。
【０４７９】
60. TaqEFT-Tth（AKK） GL-H/M9（DNA配列  配列番号：2806；アミノ酸配列  配列番号：2807）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1044-038-17
2005518223.tif 000335
および1044-038-18
2005518223.tif 000336
（それぞれ配列番号：535および536）を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、A328C変異を導入した。
【０４８０】
61. TaqEFT-Tth（AKK） GL-I/M10（DNA配列  配列番号：2808；アミノ酸配列  配列番号：2809）の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1080-015-01
2005518223.tif 000337
および1080-015-02
2005518223.tif 000338
を使用してTaq（EFT）-Tth（AKK）GL DNA（配列番号：2790）に対して実行して、E210K変異を導入した。
【０４８１】
62. TaqEFT-Tth（AKK） GL-M1-9（DNA配列  配列番号：2810；アミノ酸配列  配列番号：2811）の構築
7つの独立したPCR反応を、構築物TaqEFT（AKK）GL（配列番号：2790）をテンプレートとして、以下の変異誘発プライマー対を用いて実行した：PCR反応1；1044-038-01
2005518223.tif 000339
および1044-038-04
2005518223.tif 000340
（これにより108塩基対断片を産生した）、PCR反応2；1044-038-03
2005518223.tif 000341
および1044-038-06
2005518223.tif 000342
（これにより117塩基対断片を産生した）、PCR反応3；1044-038-05
2005518223.tif 000343
および1044-038-10
2005518223.tif 000344
（これにより237塩基対断片を産生した）、PCR反応4；1044-038-09
2005518223.tif 000345
および1044-038-12
2005518223.tif 000346
（これにより276塩基対断片を産生した）、PCR反応5；1044-038-11
2005518223.tif 000347
および1044-038-14
2005518223.tif 000348
（これにより228塩基対断片を産生した）、PCR反応6；1044-038-13
2005518223.tif 000349
および1044-038-16
2005518223.tif 000350
（これにより113塩基対断片を産生した）、PCR反応7；1044-038-15
2005518223.tif 000351
および1044-038-18
2005518223.tif 000352
（これにより157塩基対断片を産生した）。7種のPCR産物は、プライマーの非存在下でのPCR増幅が適切な1005塩基対産物を産生してK70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R、およびA328Cの変異を導入するように重複している。この産物を、外側のプライマー：1044-038-01（配列番号：507）および1044-038-18（配列番号：536）を使用してさらに増幅し、pPCR-Script-Ampにクローニングした。この構築物からヌクレアーゼドメインを、プライマー：1044-038-01（配列番号：507）および1044-038-18（配列番号：536）を使用して再度増幅し、EcoRIおよびNotIで消化した。消化されたPCR産物を、EcoRIおよびNotIで消化されたTaqEFT-Tth（AAK）GL構築物に連結し、タンパク質発現およびスクリーニングのためにJM109に形質転換した。
【０４８２】
63. TaqEFT-Tth（AKK）GL-M1-10（DNA配列  配列番号：2812；アミノ酸配列  配列番号：2813）の構築
7つの独立したPCR反応を、構築物TaqEFT（AKK）GL（配列番号：2790）をテンプレートとして、以下の変異誘発プライマー対を用いて実行した：PCR反応1；1044-038-01
2005518223.tif 000353
および1044-038-04
2005518223.tif 000354
（これにより108塩基対断片を産生した）、PCR反応2；1044-038-03
2005518223.tif 000355
および1044-038-06
2005518223.tif 000356
（これにより117塩基対断片を産生した）、PCR反応3；1044-038-05
2005518223.tif 000357
および1044-038-10
2005518223.tif 000358
（これにより237塩基対断片を産生した）、PCR反応4；1044-038-09
2005518223.tif 000359
および1080-42-02
2005518223.tif 000360
（これにより299塩基対断片を産生した）、PCR反応5；1080-42-01
2005518223.tif 000361
および1044-038-14
2005518223.tif 000362
（これにより228塩基対断片を産生した）、PCR反応6；1044-038-13
2005518223.tif 000363
および1044-038-16
2005518223.tif 000364
（これにより113塩基対断片を産生した）、PCR反応7；1044-038-15
2005518223.tif 000365
および1044-038-18
2005518223.tif 000366
（これにより157塩基対断片を産生した）。7種のPCR産物は、プライマーの非存在下でのPCR増幅が適切な1005塩基対産物を産生してK70E、G4EA、H29F、K57R、S125T、R206L、E210K、R269G、R271K、E290G、S291G、P292E、A294P、L295R、およびA328Cの変異を導入するように重複している。この産物を、外側のプライマー：1044-038-01（配列番号：507）および1044-038-18（配列番号：536）を使用してさらに増幅し、pPCR-Script-Ampにクローニングした。この構築物からヌクレアーゼドメインを、プライマー：1044-038-1（配列番号：507）および1044-038-18（配列番号：536）を使用して再度増幅し、EcoRIおよびNotIで消化した。消化されたPCR産物を、EcoRIおよびNotIで消化されたTaqEFT-Tth（AAK）GL構築物に連結し、酵素の発現およびスクリーニングのためにJM109に形質転換した。
【０４８３】
64. Tth（K69E）AKK、Taq（K69E）TthAKK、Tfi（K69E）TthAKK、およびTsc（K69E）TthAKK ならびに変異体の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー
2005518223.tif 000367
を使用してTthAKK GL、TaqTthAKK GL、TfiTthAKK GL、およびTscTthAKK GLのDNAに対して実行して、K69E変異を導入し、Tth（K69E）AKK GL（DNA配列  配列番号：2763；アミノ酸配列  配列番号：2783）、Taq（K69E）ThAKK GL（DNA配列  配列番号：2784；アミノ酸配列  配列番号：2785）、Tfi（K69E）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2786；アミノ酸配列  配列番号：2787）、およびTsc（K69E）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2788；アミノ酸配列  配列番号：2789）を生成した。
【０４８４】
65. Tsc（167-334）TthAKK GLの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000368
および1044-041-01：
2005518223.tif 000369
によってテンプレートTth（K69E）AKK GL（DNA配列  配列番号：2763）を用いて、ならびに、プライマー1004-041-02：
2005518223.tif 000370
および209-074-02：
2005518223.tif 000371
によってテンプレートTsc（K69E）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2764）を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthALL GLに連結し、Tsc（167-333）TthAKK GL構築物（DNA配列  配列番号：2765；アミノ酸配列  配列番号：2766）を産生した。
【０４８５】
66. Tsc（222-334）TthAKK GLの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000372
および1044-041-03：
2005518223.tif 000373
によってテンプレートTth（K69E）AKK GL（DNA配列  配列番号：2763）を用いて、ならびに、プライマー1004-041-04：
2005518223.tif 000374
および209-074-02：
2005518223.tif 000375
によってテンプレートTsc（K69E）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2764）を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthAKK GLに連結し、Tsc（222-334）TthAKK GL構築物（DNA配列  配列番号：2767；アミノ酸配列  配列番号：2768）を産生した。
【０４８６】
67. Tfi（222-334）TthAKK GLの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000376
および1044-058-05：
2005518223.tif 000377
によってテンプレートTth（K69E）AKK GL（DNA配列  配列番号：2763）を用いて、ならびに、プライマー1004-058-06：
2005518223.tif 000378
および209-074-02：
2005518223.tif 000379
によってテンプレートTfi（K69E）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2786）を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthAKK GLに連結し、Tfi（222-334）TthAKK GL構築物（DNA配列  配列番号：2769；アミノ酸配列  配列番号：2770）を産生した。
【０４８７】
68. Tfi（167-334）TthAKK GLの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000380
および1044-058-07：
2005518223.tif 000381
によってテンプレートTth（K69E）AKK GL（DNA配列  配列番号：2763）を用いて、ならびに、プライマー1004-058-08：
2005518223.tif 000382
および209-074-02：
2005518223.tif 000383
によってテンプレートTfi（K69E）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2787）を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthALL GLに連結し、Tfi（167-333）TthAKK GL構築物（DNA配列  配列番号：2771；アミノ酸配列  配列番号：2772）を産生した。
【０４８８】
69. Tsc（111-334）TthAKK GLの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000384
および1044-058-01：
2005518223.tif 000385
によってテンプレートTth（K69E）AKK GL（DNA配列  配列番号：2763）を用いて、ならびに、プライマー1004-058-02：
2005518223.tif 000386
および209-074-02：
2005518223.tif 000387
によってテンプレートTsc（K69E）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2788）を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthAKK GLに連結し、Tsc（167-333）TthAKK GL構築物（DNA配列  配列番号：2773；アミノ酸配列  配列番号：2774）を産生した。
【０４８９】
70. Tsc（1-167）TthAKK GLの構築
2つの重複するPCR断片を、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000388
および1044-058-03：
2005518223.tif 000389
によってテンプレートTsc（K69E）TthAKK GL（DNA配列  配列番号：2788）を用いて、ならびに、プライマー1004-058-04：
2005518223.tif 000390
および209-074-02：
2005518223.tif 000391
によってテンプレートTth（K69E）AKK GL（DNA配列  配列番号：2763）を用いて、生成した。2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-76-08および209-074-02を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素EcoRIおよびNotIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターTthAKK GLに連結し、Tsc（1-167）TthAKK GL構築物（DNA配列  配列番号：2775；アミノ酸配列  配列番号：2776）を産生した。
【０４９０】
71. Afu336-Tth296（AKK）GL、AT1-1の構築
2つの重複するPCR断片を生成した。第1の断片を、AfuFEN構築物（配列番号：556）をテンプレートとして使用してプライマー390-76-08：
2005518223.tif 000392
および390-065-05：
2005518223.tif 000393
を用いて作製した。第2の断片を、TthAKK GL（配列番号：2702）をテンプレートとして使用してプライマー700-049-01：
2005518223.tif 000394
および390-076-09：
2005518223.tif 000395
を用いて作製した。2つの産物は配列の重複の領域を含み、この2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-076-08および390-076-09を用いて組換えPCR反応において増幅した。組換えPCR産物を制限酵素BspEIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターAfuFEN構築物に連結し、Afu336-Tth296（AKK）GL構築物（DNA配列  配列番号：2814；アミノ酸配列  配列番号：2815）を産生した。
【０４９１】
72. Afu328-Tth296（AKK）GL、AT2-3の構築
2つの重複するPCR断片を生成した。第1の断片は、プライマー390-76-08：
2005518223.tif 000396
および700-049-02：
2005518223.tif 000397
によって、テンプレートAfuFEN（DNA配列  配列番号：556）を用いた。第2の断片は、プライマー700-049-03：
2005518223.tif 000398
および390-076-09：
2005518223.tif 000399
によって、テンプレートTthAKK GL（DNA配列  配列番号：2702）を用いた。この2つの産物を合わせて、外側のプライマー390-076-08および390-076-09を用いて増幅した。組換えPCR産物を制限酵素BspEIおよびSalIで切断し、同じ酵素で切断することによって調製されたベクターpAfuFENに連結し、Afu336-Tth296（AKK）GL構築物（DNA配列  配列番号：2816；アミノ酸配列  配列番号：2817）を産生した。
【０４９２】
上記のランダムキメラ作製のための手順を以下のキメラを開発するために使用した。
【０４９３】
73. ランダムキメラS26およびS36の生成
これらのキメラ酵素を開発するために使用されるテンプレートは、構築物TthAKK GL、TscTthAKK GL、TscTthAKK GL、およびTfiTthAKK GLからのヌクレアーゼドメインであった。2つのクローンが、一次活性スクリーニングに基づいて活性の改善を示すことが見い出された。次いで、ランダムキメラS26 GL（DNA配列  配列番号：2818；アミノ酸配列  配列番号：2819）およびS36（DNA配列  配列番号：2820；アミノ酸配列  配列番号：2821）を配列決定および単離した。
【０４９４】
74. S26（FT）GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー：785-008-03
2005518223.tif 000400
および680-21-03
2005518223.tif 000401
を使用してpS26 GL DNAに対して実行して、L107F/E108T変異を導入およびS26（FT）GL（DNA配列  配列番号：2822；アミノ酸配列  配列番号：2823）を生成した。
【０４９５】
75. S36（FT）GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー：785-096-01:
2005518223.tif 000402
および785-096-02
2005518223.tif 000403
を使用してpS36 GL DNAに対して実行して、L109F/V110T変異を導入およびS36（FT）GL（DNA配列  配列番号：2824；アミノ酸配列  配列番号：2825）を生成した。  
【０４９６】
76. S26（K69E）GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー： 
2005518223.tif 000404
を使用してS26 GL DNAに対して実行して、K69E変異を導入およびS26（K69E）GL（DNA配列  配列番号：2826；アミノ酸配列  配列番号：2827）を生成した。
【０４９７】
77. S26（FT/K69E）GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー： 
2005518223.tif 000405
を使用してS26（FT）GL DNAに対して実行して、K69E変異を導入およびS26（FT/K69E）GL（DNA配列  配列番号：2828；アミノ酸配列  配列番号：2829）を生成した。
【０４９８】
78. さらなるランダムキメラ、N3D7、N1A12、N1C4、およびN2C3
これらのキメラを生成するために使用されたテンプレートは、構築物Tth（K69E）AKK GL、Taq（K69E）TthAKK GL、Tsc（K69E）TthAKK GL、およびTfi（K69E）TthAKK GLのヌクレアーゼドメインであった。4つのクローンが、初回の活性スクリーニングに基づいて改善された活性を示した。次いで、ランダムキメラN3D7 GL（DNA配列  配列番号：2830；アミノ酸配列  配列番号：2831）、N1A12 GL（DNA配列  配列番号：2832；アミノ酸配列  配列番号：2833）、N1C4 GL（DNA配列  配列番号：2834；アミノ酸配列  配列番号：2835）、およびN2C3（DNA配列  配列番号：2836；アミノ酸配列  配列番号：2837）をそれぞれ配列決定および単離した。
【０４９９】
TthAKK GL酵素のDL、GR、およびDR改変体の生成
アミノ酸385におけるGlyからAspへの変化（D385G）および/またはアミノ酸455におけるLeuからArgへの変化（L455R）を有する一連のTthAKK GLの改変体を、部位特異的変異誘発によって作製した。これらの2つのアミノ酸の変化を含む構築物を「DR」として示す。1つのみの変化を含むキメラは「DL」または「GR」のいずれかとして示す。
【０５００】
1. TthAKK DL変異体の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1144-60-01 
2005518223.tif 000406
および1144-60-02
2005518223.tif 000407
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA（配列番号：2702）に対して実行して、G383D変異を導入およびTthAKK DL（DNA配列  配列番号：2838；アミノ酸配列  配列番号：2839）を生成した。
【０５０１】
2. TthAKK GR変異体の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1144-60-03 
2005518223.tif 000408
および1144-60-04
2005518223.tif 000409
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA（配列番号：2702）に対して実行して、L453R変異を導入およびTthAKK GR（DNA配列  配列番号：2840；アミノ酸配列  配列番号：2841）を生成した。
【０５０２】
3. TthAKK DR変異体の構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1144-60-01、1144-60-02、1144-60-03、および1144-60-04（それぞれ、配列番号：2858、2859、2860、および2861）を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA（配列番号：2702）に対して実行して、G383D変異およびL453R変異を導入し、TthAKK DR変異体（DNA配列  配列番号：2842；アミノ酸配列  配列番号：2843）を産生した。
【０５０３】
4. TthAKK（F29R）GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-01 
2005518223.tif 000410
および1249-26-02
2005518223.tif 000411
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA（配列番号：2702）に対して実行して、F29R変異を導入およびTthAKK（F29R）GL変異体（DNA配列  配列番号：2844；アミノ酸配列  配列番号：2845）を生成した。
【０５０４】
5. TthAKK（F29R/F30H）GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-03 
2005518223.tif 000412
および1249-26-04
2005518223.tif 000413
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA（配列番号：2702）に対して実行して、F29R/F30H変異を導入およびTthAKK（F29R/F30H）GL変異体（DNA配列  配列番号：2846；アミノ酸配列  配列番号：2847）を生成した。
【０５０５】
6. TthAKK（F29R/F30R）GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-05 
2005518223.tif 000414
および1249-26-06
2005518223.tif 000415
を使用してpTrc99A TthAKK GL DNA（配列番号：2702）に対して実行して、F29R/F30R変異を導入およびTthAKK（F29R/F30R）GL変異体（DNA配列  配列番号：2848；アミノ酸配列  配列番号：2849）を生成した。
【０５０６】
7. Tsc（F26R）TthAKK GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-01 
2005518223.tif 000416
および1249-26-02
2005518223.tif 000417
を使用してpTrc99A TscTth（AKK）GL DNA（配列番号：2708）に対して実行して、F29R/F30R変異を導入およびTsc（F26R）TthAKK GL変異体（DNA配列  配列番号：2850；アミノ酸配列  配列番号：2851）を生成した。
【０５０７】
8. Tsc（F26R/F27H）TthAKK GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-03 
2005518223.tif 000418
および1249-26-04
2005518223.tif 000419
を使用してpTrc99A TscTthAKK GL DNA（配列番号：2708）に対して実行して、F29R/F27H変異を導入およびTsc（F26R/F27H）TthAKK GL変異体（DNA配列  配列番号：2852；アミノ酸配列  配列番号：2853）を生成した。
【０５０８】
9. Tsc（F26R/F27H）TthAKK GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-05 
2005518223.tif 000420
および1249-26-06
2005518223.tif 000421
を使用してpTrc99A TscTthAKK GL DNA（配列番号：2708）に対して実行して、F26R/F27R変異を導入およびTsc（F26R/F27R）TthAKK GL変異体（DNA配列  配列番号：2854；アミノ酸配列  配列番号：2855）を生成した。
【０５０９】
10. Tsc（F28R）TthAKK GLの構築
部位特異的変異誘発を、変異誘発プライマー1249-26-03 
2005518223.tif 000422
および1249-26-04
2005518223.tif 000423
を使用してpTrc99A-TaqTthAKK GL DNA（配列番号：2706）に対して実行して、F28R変異を導入およびTaq（F28R）TthAKK GL変異体（DNA配列  配列番号：2856；アミノ酸配列  配列番号：2857）を生成した。
【０５１０】
（表２）
2005518223.tif 000424
参考文献
1. JBC (1990) 265: 14579-14591
2. JBC (1992) 267: 8417-8428
3. Eur. J. Biochem. (1993) 214: 59-65
4. JBC (1994) 269: 13259-13265
5. Nature (1996) 382: 278-281
【０５１１】
（表３） ポリメラーゼ領域における合理的変異
2005518223.tif 000425
【０５１２】
（表４） 合理的アーチ変異
2005518223.tif 000426
【０５１３】
（表５） アーチ／サムの組み合わせ
2005518223.tif 000427
【０５１４】
（表６）ヘリックス-ヘアピン-ヘリックスランダム変異誘発
2005518223.tif 000428
【０５１５】
（表７） ランダムサム変異
2005518223.tif 000429
【０５１６】
（表８） キメラ変異
2005518223.tif 000430
【０５１７】
上記の明細書中に言及されたすべての刊行物および特許は、参照として本明細書に組み入れられる。本発明の記載された方法および系の種々の改変および変化は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかである。本発明は特定の好ましい態様と関連して記載されてきたが、特許請求の範囲に記載された本発明は、このような特定の態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。確かに、本発明を実施するために記載された様式の種々の改変は、関連する分野の当業者には明白であり、上記の特許請求の範囲の中にあることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０５１８】
【図１】連続的侵襲性切断反応の模式図を示す。工程Aにおいて、上流のINVADERオリゴヌクレオチドおよび下流のプローブが標的核酸鎖と合わさって切断構造を形成する。工程Bにおいて、Aからの切断されたシグナルプローブの一部が、第2の標的核酸鎖および標識されたシグナルプローブと合わさって、第2の検出可能構造を形成する。工程Cにおいて、標識された第2の切断構造の切断は検出可能シグナルを産生する。
【図２】RNA標的鎖（配列番号：141）を含む侵襲性切断構造のいくつかの例の模式図を示す。パネルAは、INVADERオリゴヌクレオチド（配列番号：142）およびプローブ（配列番号：143）を示す。パネルBは、INVADERオリゴヌクレオチド（配列番号：144）およびプローブ（配列番号：143）を示す。パネルCは、INVADERオリゴヌクレオチド（配列番号：145）およびプローブ（配列番号：145）を示す。パネルDは、INVADERオリゴヌクレオチド（配列番号：145）およびプローブ（配列番号：146）を示す。
【図３】配列番号：147-152と標識された侵襲性切断構造でない構造の2つの例の模式図を示す。
【図４】標的配列の変化の検出のために有用な侵襲性切断の構成の模式図を示す。Aにおいて、2つのプローブ間の重複を有する侵襲性切断構造が形成され、そして矢印はこれが本発明の酵素によって切断可能であることを示す。Bにおいて、標的配列の変化は、下流のプローブに対する相補性の領域を取り除き、重複を削除する。パネルBにおける矢印の非存在は、パネルAにおいて図示されるものと比較した、この構造の切断の速度の減少を示す。
【図５】Liら（Liら、Protein Sci., 7: 1116 [1998]）によって決定された重合モードにおいてプライマー／テンプレートDNAを有するKlentaq1の3成分複合体のX線構造の図を示す。物理的形態の特徴間の正確な境界を表すことを意図することなく、テキスト中で「フィンガー」、「サム」、および「パーム」領域として言及される部分は、大まかに、それぞれ、円形、長方形、および長円形によって示される。
【図６】テルムス アクアチクスからのDNAポリメラーゼ遺伝子の模式図を示す。これらの研究において使用された制限部位は上記に示される。タンパク質の種々の構造的または機能的ドメインをコードするおよその領域は、下の両端に矢の付いた矢印によって示される。
【図７】TaqPol遺伝子およびTthPol遺伝子の一部を含むキメラ構築物の模式図を示す。白色および影を付けたボックスは、それぞれ、TaqPolおよびTthPolの配列を示す。数字はTaqPolのアミノ酸配列に相当する。TaqPolの5'ヌクレアーゼおよびポリメラーゼドメイン、ならびにポリメラーゼドメインのパーム、サム、およびフィンガーの領域が示される。組換えのために使用される制限部位についての略号は以下の通りである：E, EcoRI; N, NotI; Bs, BstI; D, NdeI; B, BamHI; およびS, SalI。
【図８】図8A-Hは、テルムス アクアチクス（配列番号：153）、テルムス フラヴス（配列番号：154）、およびテルムス テルモフィルス（配列番号：155）から単離されたポリメラーゼ遺伝子のヌクレアーゼ構造の比較を示し；コンセンサス配列（配列番号：156）は各行の一番上に示される。
【図９】図9A-Cは、テルムス アクアチクス（配列番号：157）、テルムス フラヴス（配列番号：158）、およびテルムス テルモフィルス（配列番号：1）から単離されたポリメラーゼのアミノ酸配列の比較を示し；コンセンサス配列（配列番号：159）は各行の一番上に示される。
【図１０】ヒトIL-6 RNA標的鎖（配列番号：160）および上流のプローブ（配列番号：161）との侵襲性シグナル増幅反応のための基質の配列および提案された構造を示す。下流のプローブ（配列番号：162）の切断部位は矢印で示される。IL-6 DNA標的鎖（配列番号：163）の配列は以下に示される。
【図１１】示された酵素、および、DNA標的鎖（A）またはRNA標的鎖（B）のいずれかを有する図10に記載のIL-6基質を使用する侵襲性切断アッセイ法の産物を示す蛍光イメージャーによって生成された画像を示す。
【図１２】Taq DN RX HT、Tth DN RX HT、およびTaq-Tthキメラ酵素のサイクル化切断活性を、RNA標的鎖を有するIL-6基質を用いて比較する。
【図１３】TaqPol（配列番号：164）およびTthPol（配列番号：165）のBstI-BamHI断片のアミノ酸配列の比較を示す。類似のアミノ酸の対は明るいグレーで影を付けている。電荷の違いを有する整列されたアミノ酸は暗いグレーで影を付けている。数字はTaqPolのアミノ酸配列に相当する。部位特異的変異誘発によってTthPolの対応するアミノ酸に変化したTaqPolのアミノ酸は（+）によって示される。
【図１４】Taq DN RX HT、Taq-Tthキメラ酵素、および示された付加的なアミノ酸修飾を有するキメラ酵素のサイクル化切断活性を、RNA標的鎖を有するIL-6基質を用いて比較する。
【図１５】Taq DN RX HT、Tth DN RX HT、および示されたアミノ酸修飾を有するTaq DN RX HTのサイクル化切断活性を、RNA標的鎖を有するIL-6基質を用いて比較する。
【図１６】TaqPol、TthPol、およびTaq-Tthキメラ酵素、および示されたアミノ酸修飾を有するTaqPolキメラ酵素のポリメラーゼ活性を比較する。
【図１７】Liら（Liら、Protein Sci., 7: 1116 [1998]）によって決定された重合モードにおいてプライマー／テンプレートDNAを有するKlentaq1の3成分複合体のX線構造の図を示す。アミノ酸G418およびE507が示される。
【図１８】図18A-Dは、酵素の種々の切断活性を測定するために使用され得る基質の例の模式図を示す。基質は、示されるように、検出および測定を容易にするために、例えば、蛍光色素およびFRET検出のためのクエンチング部分で標識され得る。図18Aおよび18Bの基質は、それぞれRNAおよびDNAの標的鎖を有する侵襲性切断構造である。18CはX構造の例を示し、18Dはヘアピン構造の例を示し、これらの両方が、侵襲性切断反応において存在し得る代替的な構造に対する酵素の活性を評価するために使用され得る。
【図１９】TaqPol遺伝子およびTthPol遺伝子の一部を含むキメラ構築物の模式図を示す。白いボックスおよび影を付けたボックスは、それぞれ、TaqPol配列およびTthPol配列を示す。キメラはまた、DN、RX、およびHT修飾を含む。表は、示された切断基質に対する各タンパク質の切断活性を比較する。
【図２０】図20Aは、侵襲性切断基質を含むRNAについての模式図を示す。標的分子（配列番号：166）の5'末端は、記載されるようにビオチンで修飾され、ストレプトアビジンでブロックされている。切断部位を有する下流プローブ（配列番号：167）もまた示される。パネルB-Dは、種々の反応温度、KCl濃度、およびMgSO4濃度の条件下での示される基質の切断におけるTaq DN RX HT G418K/E507Q変異体の特性の分析を示す。
【図２１】侵襲性切断活性について酵素を試験するために使用されるモデル基質についての模式図を示す。21Aに示される分子は、DNA標的鎖（配列番号：168）を提供するのに対して、21Bに示されるモデルは、標的鎖（配列番号：167）を含むRNAを提供する。21Aおよび21Bの両方が下流プローブ配列番号：166を示す。
【図２２】代替的な非侵襲性構造に対する切断活性について酵素を試験するために使用されるモデル基質についての模式図を示す。
【図２３】侵襲性切断活性について酵素を試験するために使用されるモデル基質についての模式図を示す。
【図２４】RNAまたはDNAの標的鎖に対する侵襲性切断活性について酵素を試験するために使用されるモデル基質についての模式図を示す。
【図２５】Tth DN RX HT、Taq 2M、TfiPol、Tsc Pol、ならびにTfiおよびTsc-由来変異酵素のサイクル化切断活性を比較する。
【配列表】
2005518223.tif 000431
2005518223.tif 000432
2005518223.tif 000433
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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