(57)【要約】  脊椎動物細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するため、および患者において炎症性サイトカインカスケードを阻害するための組成物および方法が開示される。この組成物は、脊椎動物のHMGAボックス、および脊椎動物のHMGBボックスに特異的に結合する抗体調製物含む。この方法は、プロ炎症性サイトカインの放出を阻害する、または炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに充分な量の組成物を用いて細胞または患者を処理する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質で処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ａボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ａボックスを含んでなるポリペプチド。
【請求項２】
高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質で処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ａボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ａボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチド。
【請求項３】
薬学的に許容され得る賦形剤中に、高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質で処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ａボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ａボックスを含むポリペプチドを含んでなる組成物。
【請求項４】
薬学的に許容され得る賦形剤中に、高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質で処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ａボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ａボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチドを含んでなる組成物。
【請求項５】
ＨＭＧで処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスに特異的に結合するがＨＭＧの非Ｂボックスエピトープには特異的に結合しない抗体の精製調製物。
【請求項６】
ＨＭＧで処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、薬学的に許容され得る賦形剤中に、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスに特異的に結合するがＨＭＧの非Ｂボックスエピトープには特異的に結合しない抗体の精製調製物を含んでなる組成物。
【請求項７】
脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を誘発し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックスを含むが、全長ＨＭＧを含まないポリペプチド。
【請求項８】
脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチド。
【請求項９】
脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を誘発し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックスを含むが、全長ＨＭＧを含まないポリペプチドをコードするベクター。
【請求項１０】
脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を誘発し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチドをコードするベクター。
【請求項１１】
脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスに特異的に結合するがＨＭＧの非Ｂボックスエピトープには特異的に結合しない抗体の精製調製物の量で哺乳動物細胞を処理することを含む、哺乳動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害する方法。
【請求項１２】
脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害するのに充分な量の高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質で処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ａボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ａボックスを含むポリペプチドで哺乳動物細胞を処理することを含む、哺乳動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害する方法。
【請求項１３】
脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害するのに充分な量の高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質で処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ａボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ａボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチドポリペプチドで哺乳動物細胞を処理することを含む、哺乳動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害する方法。
【請求項１４】
前炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに充分な量で、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスに特異的に結合するがＨＭＧの非Ｂボックスエピトープには特異的に結合しない抗体の精製調製物を患者に投与することを含む、炎症性サイトカインカスケードの活性化に特徴を有する患者における状態を処置する方法。
【請求項１５】
脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害するのに充分な量の高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質で処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ａボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ａボックスを含むポリペプチドを患者に投与することを含む、炎症性サイトカインカスケードの活性化に特徴を有する患者における状態を処置する方法。
【請求項１６】
脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害するのに充分な量の高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質で処理された脊椎動物細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害し得る、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ａボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ａボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチドを患者に投与することを含む、炎症性サイトカインカスケードの活性化に特徴を有する患者における状態を処置する方法。
【請求項１７】
細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激するのに充分な量の、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックスを含むが、全長ＨＭＧを含まないポリペプチドで細胞を処理することを含む、細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激する方法。
【請求項１８】
細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激するのに充分な量の、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチドで細胞を処理することを含む、細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激する方法。
【請求項１９】
細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激するのに充分な量の、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックスを含むが、全長ＨＭＧを含まないポリペプチドをコードするベクターで細胞を処理することを含む、細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激する方法。
【請求項２０】
細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激するのに充分な量の、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチドをコードするベクターで細胞を処理することを含む、細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激する方法。
【請求項２１】
細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激するのに充分な量の、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックスを含むが、全長ＨＭＧポリペプチドを含まないポリペプチドの有効量を患者に投与することを含む、患者において減量をもたらすかまたは肥満を処置する方法。
【請求項２２】
細胞からの前炎症性サイトカインの放出を刺激するのに充分な量の、脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックス生物学的活性フラグメントまたは天然には存在しないＨＭＧ  Ｂボックス生物学的活性フラグメントであるポリペプチドの有効量を患者に投与することを含む、患者において減量をもたらすかまたは肥満を処置する方法。
【請求項２３】
化合物と
（ａ）脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスに曝露された場合に前炎症性サイトカインを放出する細胞；および（ｂ）ＨＭＧ  Ｂボックスとを結合させ、次いで、該化合物が該細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害するかどうかを決定する工程を含む、
化合物が炎症を阻害するかどうかを決定する方法。
【請求項２４】
化合物と
（ａ）脊椎動物の高移動度群タンパク質（ＨＭＧ）Ｂボックスまたはその生物学的活性フラグメントに曝露された場合に前炎症性サイトカインを放出する細胞；および（ｂ）ＨＭＧ  Ｂボックスまたはその生物学的活性フラグメントとを結合させ、次いで、該化合物が該細胞からの前炎症性サイトカインの放出を阻害するかどうかを決定する工程を含む、
化合物が炎症を阻害するかどうかを決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、2001年5月15日に出願された米国仮出願第60/291,034号の利益を主張する。これらの教示の全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府による援助
本出願の全体または一部は、米国国立衛生研究所からの助成金第RO1 GM 57226-02号によって援助された。米国政府は本発明における一定の権利を所有する。
【０００３】
発明の背景
多くの場合、プロ炎症性サイトカイン、たとえば、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン（IL）-1α、IL-1β、IL-6、血小板活性化因子（PAF）、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）、およびその他の化合物によって炎症が誘導される。いくつかの異なる細胞型によって、最も重要なことは免疫細胞（たとえば、単核白血球、マクロファージおよび好中球）だけでなく、繊維芽細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、およびニューロンなどの非免疫性細胞によって、これらのプロ炎症性サイトカインが産生する。これらのプロ炎症性サイトカインは、炎症性サイトカインカスケードの初期段階の間における種々の障害の一因である。
【０００４】
炎症性サイトカインカスケードは、炎症およびアポトーシスを含む多数の疾患の心身に有害な特質の一因である。含まれるものは、局所的な反応および全身的な反応の両者を特徴とする疾患であり、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、胃腸管および付随する組織に関する疾患（たとえば、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎および虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、セリアック病、肝炎、クローン病、腸炎ならびにホウィップル病など）；全身のまたは局所的な炎症性疾患および状態（たとえば、ぜん息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、およびサルコイドーシスなど）；泌尿生殖器系および付随する組織に関連する疾患（たとえば、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、および尿道炎など）；呼吸器系および付随する組織に関連する疾患（たとえば、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、成人呼吸促進症候群、塵肺症（pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis）、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎および副鼻腔炎など）；種々のウイルスによる感染に起因する疾患（たとえば、インフルエンザ、ＲＳウイルス、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびヘルペスウイルスなど）、細菌による感染に起因する疾患（たとえば、播種性菌血症、デング熱など）、真菌による感染に起因する疾患（たとえばカンジダ症など）および原虫および多細胞の寄生生物に起因する疾患（たとえば、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、および包虫嚢胞など）；皮膚病および皮膚の状態（たとえば、やけど、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、および膨疹など）；循環器系および付随する組織に関連する疾患（たとえば、脈管炎（vasulitis）、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、うっ血性心不全、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、およびリウマチ熱など）；中枢神経系または末梢神経系および付随する組織に関連する疾患（たとえば、アルツハイマー病、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギヤン（Guillame）・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、およびブドウ膜炎など）；骨、関節、筋肉および結合組織の疾患（たとえば、種々の関節炎および関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、慢性関節リウマチ、および滑膜炎など）；その他の自己免疫疾患および炎症性障害（たとえば、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、およびライター症候群など）；ならびに種々の癌、腫瘍および増殖性の障害（たとえばホジキン病など）；そしてあらゆる場合における、あらゆる原発病に対する炎症性の応答または宿主免疫応答である。
【０００５】
初期のプロ炎症性サイトカイン（たとえばTNF、IL-1など）は炎症に介在し、そして高移動度群-1（HMG1）（HMG-1およびHMGB1としても知られている）の後期の放出を誘導する。このHMG1は血清中に蓄積し、そして遅発性の死亡およびさらなる初期のプロ炎症性サイトカインの誘導に介在するタンパク質である。
【０００６】
HMG1は、高移動度群（HMG）と称される、DNAの構造と安定性に重要なDNA−結合タンパク質のファミリーの設立時の構成員として最初に同定された。配列の特異性に関わりなく二本鎖DNAと結合する、遍在的に発現している核タンパク質として、ほぼ４０年前に同定された。
【０００７】
HMG1の結合によってDNAが曲げられて、グルココルチコイドレセプターおよびＲＡＧリコンビナーゼの遺伝子の転写を促進する核タンパク質複合体の形成が促され、その安定性が高められる。HMG1分子は三つのドメインを有する：HMGのＡボックスおよびHMGのＢボックスと称される二つのDNA結合モチーフ、および酸性のカルボキシ末端である。この二つのHMGボックスでは８０アミノ酸とL-型のドメインが高度に保存されている。HMGボックスはさらに、RNAポリメラーゼＩ転写因子、ヒト上流側結合因子およびリンパ特異的因子を含めた他の転写調節因子においても発現される。
【０００８】
HMG1が、内毒素血症における遅発性の死亡のサイトカインメディエイタとして関わっているという最近の証拠がある。この研究では、細菌性のエンドトキシン（リポ多糖体（LPS））が単核白血球／マクロファージを活性化して、活性化に対する後期の応答としてHMG1が放出され、その結果、毒性を示す血清のHMG1レベルが上昇することが実証された。抗体の投与が初期のサイトカイン応答の後になるまで遅れた場合でさえ、HMG1に対する抗体は、エンドトキシンの致死性を抑制する。他のプロ炎症性サイトカインのように、HMG1は単核白血球の強力な活性化因子である。HMG1を気管内に適用すると、急性の肺疾患が引き起こされ、そして抗HMG1抗体がエンドトキシン誘導性の肺水腫から保護する。セプシスまたは出血性ショックを伴う重篤な患者では、血清HMG1レベルが上昇している。そしてそのレベルは、生き残った個体と比較して生き残らなかった個体で有意に高い。
【０００９】
HMG1はさらに、RAGEのリガンドとしても関与している。RAGEは免疫グロブリンスーパーファミリーの複数のリガンドのレセプターである。RAGEは内皮細胞、平滑筋細胞、単核白血球、および神経で発現し、そしてリガンド相互作用によって、MAPキナーゼ、P21 ras、およびNF-kBを経由するシグナルが変換される。内毒素血症の間に出現するHMG1の動態が遅延していることから、HMG1が治療の標的として好ましいものかもしれないが、HMG1のシグナル伝達と毒性についての分子的機序についてはほとんど知られていない。
【００１０】
それゆえに、HMG1のプロ炎症性活性の特質を同定すること、特にこの活性に対して反応し得る単数（または複数）の活性ドメインおよびその他のドメインのあらゆる阻害効果を同定することは有用である。
【００１１】
発明の要旨
本発明は、（１）HMGのＡボックスがHMGのプロ炎症性作用の競合的インヒビターとして機能すること、そして（２）HMGのＢボックスが優勢なHMGのプロ炎症性活性を有するという発見に基づくものである。
【００１２】
したがって、本発明は、脊椎動物のHMGのＡボックスもしくは生物学的に活性なそのフラグメントを含むポリペプチド、または非天然HMGのＡボックスもしくは生物学的に活性なそのフラグメントを含むポリペプチドに関する。HMGのＡボックスまたはこれらの態様は、HMGで処理された脊椎動物の細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害することが可能である。HMGのＡボックスは、哺乳動物のHMGのＡボックスであることが好ましく、哺乳動物のHMG1のＡボックス、たとえばヒトHMG1のＡボックスであることがより好ましく、配列番号：４または配列番号：２２の配列を含むかまたはそれから成るHMG1のＡボックスが最も好ましい。一つの好ましい態様において、脊椎動物の細胞は哺乳動物のマクロファージである。さらに本発明は、これらのポリペプチドをコード化しているベクターを包含する。
【００１３】
他の態様において、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤中に、上記のHMGのＡボックスポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントを含有する組成物に関する。これらの態様において、組成物は、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態を抑制することが可能である。組成物はさらに、早期セプシスメディエイタのアンタゴニストを含むことが可能である。早期セプシスメディエイタのアンタゴニストとしては、TNF、IL-1α、IL-1β、MIFおよびIL-6からなる群より選択されるサイトカインのアンタゴニストが好ましく、TNFもしくはMIFに対する抗体、またはIL-1レセプターのアンタゴニストがより好ましい。
【００１４】
これらの態様において、好ましくは、状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎および虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホウィップル病、ぜん息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、臓器虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、塵肺症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、ＲＳウイルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、やけど、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギヤン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、慢性関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、ライター症候群、ならびにホジキン病からなる群より選択される。より好ましくは、状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎および虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、ぜん息、アレルギー、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、やけど、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶ならびに対宿主性移植片病からなる群より選択される；最も好ましくは、状態は、エンドトキシンショックまたは同種移植拒絶である。状態が同種移植拒絶の場合、組成物は同種移植拒絶を抑制するのに用いられる免疫抑制剤、好ましくはシクロスポリンをさらに含んでいてもよい。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、脊椎動物の高移動度群タンパク質（HMG）のＢボックスに特異的に結合するが、HMGの非−Ｂボックスエピトープとは特異的に結合しない抗体の精製調製物に関する。これらの態様において、抗体は、HMGのＢボックスのポリペプチドの生物活性、たとえば、HMGによって処理された脊椎動物の細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害することが可能である。好ましい態様において、HMGのＢボックスは哺乳動物のHMGのＢボックスであり、たとえば、ヒトHMGのＢボックス、より好ましくはHMG1のＢボックス、最も好ましくは配列番号：５または配列番号：２０のアミノ酸配列を有するHMG1のＢボックスである。別の態様において、抗体はHMG1のＢボックスの特定のポリペプチド配列と結合する。ここでこの配列は配列番号：２０のアミノ酸１〜２０（配列番号：１６）もしくは配列番号：５のアミノ酸１〜２０（配列番号：２３）を含むか、または配列番号：２０のアミノ酸１〜２０（配列番号：１６）もしくは配列番号：５のアミノ酸１〜２０（配列番号：２３）から成る。この脊椎動物の細胞が哺乳動物のマクロファージであることも好ましい。いくつかの態様において、抗体はヒト化されていることが好ましい。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤中に上記の任意の抗体調製物を含有する組成物に関する。これらの態様において、この組成物は、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態を抑制することが可能である。これらの組成物は、既に記述されている早期セプシスメディエイタのアンタゴニストを都合よく含むことも可能である。これらの組成物によって都合よく治療される好ましい状態は、炎症性サイトカインカスケードの活性化によって介在される状態またはその活性化を特徴とする状態であり、たとえば、既に記述されているＡボックス組成物と共に列挙されている状態である。
【００１７】
さらに、本発明は、脊椎動物のHMGのＢボックスもしくは生物学的に活性なそのフラグメント、または非天然HMGのＢボックスもしくは生物学的に活性なそのフラグメントを含有するポリペプチドに関するが、HMGタンパク質の全長は含まない。これらの態様において、ポリペプチドは脊椎動物の細胞からプロ炎症性サイトカインの放出を引き起こすことが可能である。これらの態様のポリペプチドはHMGのＢボックスであることが好ましく、HMG1のＢボックスであることがより好ましく、配列番号：５または配列番号：２０として与えられるアミノ酸配列を伴うHMG1のＢボックスが最も好ましい。別の態様において、HMGのＢボックスのフラグメントは、配列番号：１６もしくは配列番号：２３の配列を含むか、または配列番号：１６もしくは配列番号：２３の配列から成る。好ましい態様において、脊椎動物の細胞は哺乳動物のマクロファージである。さらに本発明は、これらのポリペプチドをコード化しているベクターを包含する。
【００１８】
さらに本発明は、哺乳動物細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する方法に関する。この方法は、細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するのに十分な量の、上記のＡボックスもしくはＡボックスの生物学的に活性なフラグメントのポリペプチド組成物、または上記のＢボックスもしくはＢボックスの生物学的に活性なフラグメント抗体組成物のいずれか一方で細胞を処理する工程を含む。これらの態様において、細胞としてはマクロファージが好ましい。さらに、プロ炎症性サイトカインとしては、TNF、IL-1α、IL-1β、MIFおよびIL-6からなる群より選択されるものが好ましい。細胞がマクロファージであって、かつプロ炎症性サイトカインが好ましくはTNF、IL-1α、IL-1β、MIFおよびIL-6からなる群より選択されるものであることが、より好ましい。この方法では、炎症性サイトカインカスケードの活性化に特徴を有する状態を患っている患者の細胞、またはその状態のリスクを有する患者の細胞を処理することがより好ましい。好ましい状態は既に列挙されている。
【００１９】
関連する態様において、本発明は、炎症性サイトカインカスケードの活性化に特徴を有する患者の状態を治療する方法に関する。この方法は、炎症性サイトカインカスケードを阻害するのに十分な量の、ＡボックスもしくはＡボックスの生物学的に活性なフラグメントのポリペプチド組成物、または上記のＢボックスもしくはＢボックスの生物学的に活性なフラグメント抗体組成物のいずれかを患者に投与する工程を含む。好ましい状態は既に列挙されている。
【００２０】
さらなる態様は、細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を刺激する方法に関する。この方法は、プロ炎症性サイトカインの放出を刺激するのに十分な量の、Ｂボックスポリペプチドもしくは生物学的に活性なそのフラグメント、または上記のＢボックスポリペプチドもしくはＢボックスの生物学的に活性なフラグメントのベクターによって、細胞を処理する工程を含む。関連する態様において、本発明は、患者の体重を効果的に減らすまたは肥満症を治療する方法に関する。この方法は、効果的な量のHMGのＢボックスポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントを患者に投与する工程を含む。一つの態様において、HMGのＢボックスポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントは、薬学的に許容され得る賦形剤中にある。
【００２１】
さらに本発明は、炎症を抑制する化合物かどうかを決定する方法に関する。この方法は、（ａ）脊椎動物のHMGのＢボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントにさらされた場合に、プロ炎症性サイトカインを放出する細胞；および（ｂ）HMGのＢボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントと、化合物を組み合わせる工程と、次いで細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を化合物が阻害するかどうかを決定する工程を含む。HMGのＢボックスが、哺乳動物のHMGのＢボックス、たとえばHMG1のＢボックスであることが好ましい。好ましいプロ炎症性サイトカインは既に記述されている。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明を実施する際には、特に指示のない限り、細胞培養、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および免疫学の標準的な技術を採用する。これらの技術は当業者の間で熟知されている。このような技術は文献中に十分に説明されている。たとえば、Sambrookら、1989、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubelら（1995）、「Short Protocols in Molecular Biology」、John WILey and Sons；Methods in Enzymology（数巻）；Methods in Cell Biology（数巻）、およびMethods in Molecular Biology（数巻）などを参照のこと。
【００２３】
本発明は、HMG1の、プロ炎症性サイトカインおよび炎症性サイトカインカスケードの産生を誘導する能力の種々の特性をさらに解明する一連の発見に基づく。具体的には、HMG1のプロ炎症性活性ドメインがＢボックスであること（そして特に、Ｂボックスの最初の２０アミノ酸であること）、およびＢボックスに特異的な抗体がプロ炎症性サイトカインの放出および炎症性サイトカインカスケードを阻害すること、その結果炎症性サイトカインカスケードによって引き起こされる有害な症状を緩和できることが発見された。さらに、Ａボックスが炎症性サイトカイン放出の弱いアゴニストであること、ならびにＢボックスおよびHMG1のプロ炎症性活性を競合的に阻害することも発見されている。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、「HMGポリペプチド」または「HMGタンパク質」とは、実質的に純粋であるものか、または実質的に純粋でありかつ単離されたポリペプチドである。ここで、この単離されたポリペプチドとは、そのポリペプチドと自然の状態で付随している成分から分離されたものか、または同一のアミノ酸配列を有する組み換えによって作製されたポリペプチドであって、炎症を強める、および／または細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を増やす、および／または炎症性サイトカインカスケードの活動を高めるものである。一つの態様において、HMGポリペプチドは上記の生物活性のうちの一つを有する。別の態様において、HMGポリペプチドは上記の生物活性のうちの二つを有する。第三の態様において、HMGポリペプチドは上記の生物活性のうちの三つすべてを有する。
【００２５】
HMGポリペプチドは哺乳動物のHMGポリペプチド、たとえばヒトHMG1ポリペプチドであることが好ましい。HMGポリペプチドが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：１８から選択される配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有することが好ましく、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を有することがより好ましく、そして少なくとも９５％の配列同一性を有することが最も好ましい。ここで、配列同一性はBLASTプログラムおよび本明細書に記載のパラメータを用いて決定される。HMGポリペプチドの例には、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、または配列番号：１８の配列を含有するかまたはそれからなるポリペプチドが挙げられる。好ましくはHMGポリペプチドは、本明細書で記載されているようなＢボックスのDNA結合ドメインおよび／またはＡボックスのDNA結合ドメイン、および／または酸性カルボキシ末端を含有する。HMGポリペプチドのその他の例は、ジェンバンク（GenBank）登録番号AAA64970、AAB08987、P07155、AAA20508、S29857、P09429、NP_002119、CAA31110に記載されており、これらの教示の全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。HMGポリペプチドのさらなる例としては、哺乳動物のHMG1、HMG2、HMG-2A、HMG14、HMG17、HMG IおよびHMGY；非哺乳動物のHMG T1およびHMG T2（ニジマス）、HMG-X（アフリカツメガエル）、HMG D/Z（ショウジョウバエ）、酵母ポリペプチドNHP10タンパク質（HMGタンパク質ホモログNHP 1）および非ヒストン染色体タンパク質；HMG 1/2様タンパク質（コムギ、トウモロコシ、ダイズ）；上流側結合因子（UBF-1）、一本鎖認識タンパク質（SSRP）すなわち構造特異的認識タンパク質；HMGホモログTDP-1；哺乳動物の性決定領域Ｙタンパク質（SRY、精巣決定因子）；真菌類のタンパク質：mat-1、ste 11およびMc 1；SOX 14（ならびにSOX 1〜3、6、8、10、12および21）；リンパ特異的因子（LEF-1）；Ｔ細胞特異的転写因子（TCF-1）；ならびにSP100-HMG核自己抗原が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「Ａボックス」とも本明細書で言われる「HMGのＡボックス」とは、実質的に純粋であるものか、または実質的に純粋でありかつ単離されたポリペプチドである。ここで、この単離されたポリペプチドとは、そのポリペプチドと自然の状態で付随している成分から分離されたものであって、HMGポリペプチドの全長よりも短いアミノ酸配列からなり、そして次の生物活性：炎症を阻害すること、および／または細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害すること、および／または炎症性サイトカインカスケードの活動を減少することのうちの一つ以上を有するものである。一つの態様において、HMGのＡボックスのポリペプチドは、上記の生物活性のうちの一つを有する。別の態様において、HMGのＡボックスのポリペプチドは、上記の生物活性のうちの二つを有する。第三の態様において、HMGのＡボックスのポリペプチドは、上記の生物活性のうちの三つすべてを有する。HMGのＡボックスが、全長HMGの生物活性のたった１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％しか持たないことが好ましい。一つの態様において、HMGのＡボックスのアミノ酸は、配列番号：４もしくは配列番号：２２の配列、または哺乳動物におけるHMGタンパク質の対応する領域中のアミノ酸配列からなる。HMGのＡボックスはさらに、上記のＡボックスの配列と同一のアミノ酸配列を有する組み換えによって作製されたポリペプチドでもある。HMGのＡボックスは哺乳動物のHMGのＡボックス、たとえばヒトHMG1のＡボックスであることが好ましい。本発明のHMGのＡボックスのポリペプチドは、配列番号：４もしくは配列番号：２２の配列、または哺乳動物におけるHMGタンパク質の対応する領域中のアミノ酸配列を含有するかまたはそれからなることが好ましい。多くの場合、HMGのＡボックスは約８５アミノ酸未満かつ約４アミノ酸より多くを有する。その内部にＡボックスの配列を有するポリペプチドの例としては、HMG1、HMG2、HMG4；構造特異的認識タンパク質（SSRP）；PMS1タンパク質ホモログ１；SOX-1タンパク質、SOX-2タンパク質、およびSOX-14タンパク質；ならびにMTT1が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載された方法、たとえば本明細書に記載されたＡボックスとの配列比較および生物活性の試験により、このようなポリペプチドにおけるＡボックスの配列を決定および単離することが可能である。
【００２７】
さらに本発明は、非天然HMGのＡボックスを特色とする。非天然HMGのＡボックスが、配列番号：４または配列番号：２２の配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有することが好ましく、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を有することがより好ましく、そして少なくとも９５％の配列同一性を有することが最も好ましい。ここで、配列同一性はBLASTプログラムならびに本明細書に記載のパラメータおよびHMGのＡボックスの生物活性の一つ以上を用いて決定される。
【００２８】
さらに本発明は、Ａボックスの生物学的に活性なフラグメントを特色とする。「Ａボックスの生物活性を有するＡボックスのフラグメント」または「Ａボックスの生物学的に活性なフラグメント」とは、本明細書に記載されているようなHMGのＡボックスの活性を有するHMGのＡボックスのフラグメントを意味する。たとえば、Ａボックスのフラグメントは、脊椎動物の細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を減少させたり、炎症を軽減させたり、および／または炎症性サイトカインカスケードの活動を減少することが可能である。標準的な分子生物学の技術を用いて、Ａボックスのフラグメントを作製することが可能である。そして、細胞に投与した場合に、このフラグメントがその細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するかどうかを、たとえば、本明細書に記載された方法を利用して決定することによって、このフラグメントの機能を評価する。Ａボックスの生物学的に活性なフラグメントは、Ａボックスのポリペプチドの全長が、たとえば、細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害することや、または炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする症状を示す患者の治療に用いられる本明細書に記載された方法に用いることが可能である。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「Ｂボックス」とも本明細書で言われる「HMGのＢボックス」とは、実質的に純粋であるものか、または実質的に純粋でありかつ単離されたポリペプチドである。ここで、この単離されたポリペプチドとは、そのポリペプチドと自然の状態で付随している成分から分離されたものであって、HMGポリペプチドの全長よりも短いアミノ酸配列からなり、そして次の生物活性：炎症を強めること、細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を増やすこと、およびまたは炎症性サイトカインカスケードの活動を高めることのうちの一つ以上を有するものである。一つの態様において、HMGのＢボックスのポリペプチドは、上記の生物活性のうちの一つを有する。別の態様において、HMGのＢボックスのポリペプチドは、上記の生物活性のうちの二つを有する。第三の態様において、HMGのＢボックスのポリペプチドは、上記の生物活性のうちの三つすべてを有する。HMGのＢボックスが、全長HMGの生物活性の少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を有することが好ましい。別の態様において、HMGのＢボックスはHMGのＡボックスを含まない。別の態様において、HMGのＢボックスは、HMG1ポリペプチドの全長の長さの約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３５％、３０％、２５％、または２０％ポリペプチドである。別の態様において、HMGのボックスは、配列番号：５もしくは配列番号：２０の配列、または哺乳動物におけるHMGタンパク質の対応する領域中のアミノ酸配列を含有するかまたはそれからなるが、HMGポリペプチドの全長よりも更に短い。HMGのＢボックスのポリペプチドはさらに、上記のＢボックスの配列と同一のアミノ酸配列を有する組み換えによって作製されたポリペプチドでもある。HMGのＢボックスは哺乳動物のHMGのＢボックス、たとえばヒトHMG1のＢボックスであることが好ましい。多くの場合、HMGのＢボックスは約８５アミノ酸未満かつ約４アミノ酸より多くを有する。その内部にＢボックスの配列を有するポリペプチドの例としては、本明細書に記載のHMGのポリペプチド；一本鎖認識タンパク質（SSRP）すなわち構造特異的認識タンパク質；酵母ＮＨＰ１０タンパク質（HMGタンパク質ホモログＮＨＰ１）；HMGホモログＴＤＰ-1；性決定領域Ｙタンパク質（精巣決定因子）；SOX 14（ならびにSOX 1〜3、6、8、10、12および21）；リンパ特異的因子（LEF-1）；およびＴ細胞特異的転写因子（TCF-1）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書に記載された方法を用いて、たとえば本明細書に記載されたＢボックスとの配列比較および生物活性の試験により、このようなポリペプチドにおけるＢボックスの配列を決定および単離することが可能である。
【００３０】
さらに本発明は、非天然HMGのＢボックスのポリペプチドを包含する。非天然HMGのＢボックスのポリペプチドは、配列番号：５または配列番号：２０の配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有することが好ましく、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の配列同一性を有することがより好ましく、そして少なくとも９５％の配列同一性を有することが最も好ましい。ここで、配列同一性はBLASTプログラムならびに本明細書に記載のパラメータを用いて決定される。HMGのＢボックスは、配列番号：５もしくは配列番号：２０の配列、または哺乳動物におけるHMGタンパク質の対応する領域中のアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００３１】
他の態様において、本発明は、脊椎動物のHMGのＢボックスもしくはＢボックスの生物活性を有するそのフラグメント、または非天然HMGのＢボックスを含むが、全長HMGは含まないポリペプチドに関する。「Ｂボックスの生物活性を有するＢボックスのフラグメント」または「Ｂボックスの生物学的に活性なフラグメント」とは、HMGのＢボックスの活性を有するHMGのＢボックスのフラグメントを意味する。たとえば、Ｂボックスのフラグメントは、脊椎動物の細胞からプロ炎症性サイトカインの放出を誘導したり、または炎症を激しくしたり、または炎症性サイトカインカスケードを誘導することが可能である。このようなＢボックスのフラグメントの一例は、本明細書に記載されているようなHMG1のＢボックスの最初の２０アミノ酸を含むフラグメント（配列番号：１６または配列番号：２３）である。標準的な分子生物学の技術を用いて、Ｂボックスのフラグメントを作製することが可能である。そして、細胞に投与した場合に、このフラグメントがその細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を増加させるかどうかを、たとえば、本明細書に記載された方法を利用して適切なコントロールと比較して決定することによって、このフラグメントの機能を評価する。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「サイトカイン」とは、哺乳動物細胞によって天然に産生し、そしてマイクロモル濃度〜ピコモル濃度にて体液性調節因子としてインビボで作用する可溶性のタンパク質またはペプチドである。サイトカインは、正常な条件下または病的な条件下のいずれか一方において、個々の細胞および組織の機能活性を調節することが可能である。プロ炎症性サイトカインとは、炎症に関連する次のあらゆる生理的反応：血管拡張、充血、浮腫に関連する血管透過性亢進、顆粒球および単核食細胞の蓄積、またはフィブリンの沈着を引き起こす能力を有するサイトカインである。いくつかのケースにおいて、プロ炎症性サイトカインは、たとえば慢性心不全におけるアポトーシスを引き起こすことも可能である。ここでは、心筋細胞のアポトーシスを刺激するTNFが示されている（Pulkki, Ann. Med. 29： 339-343, 1997；およびTsutsuiら、Immunol. Rev. 174： 192-209, 2000）。
【００３３】
プロ炎症性サイトカインの非限定的な例は、腫瘍壊死因子（TNF）、インターロイキン（IL）-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、インターフェロンγ、HMG-1、血小板活性化因子（PAF）、およびマクロファージ遊走阻止因子（MIF）である。
【００３４】
炎症のメディエイタではない抗炎症性サイトカイン、たとえばIL-4、IL-10、およびIL-13などから、プロ炎症性サイトカインを区別することができる。
【００３５】
多くの場合、炎症性サイトカインカスケードにおいてプロ炎症性サイトカインが産生される。本明細書では、これを哺乳動物における少なくとも一つのプロ炎症性サイトカインのインビボでの放出と定義し、ここで、サイトカインの放出によって、哺乳動物の生理的状態が影響を受ける。したがって、プロ炎症性サイトカインの放出が心身に有害な生理的状態を引き起こすという本発明の態様において、炎症性サイトカインカスケードが阻害される。
【００３６】
天然または非天然のいずれか一方のHMGのＡボックスおよびHMGのＢボックスには、上記のHMGのＡボックスおよびHMGのＢボックスと配列同一性を有するポリペプチドが包含される。本明細書で用いられる場合、アミノ酸配列が少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％以上相同すなわち同一であるときは、二つのポリペプチド（またはポリペプチドの領域）は実質的に相同すなわち同一である。比較の意図が最適になるように配列を揃えること（たとえば、第一の配列の配列中にギャップを導入してもよい）によって、二つのアミノ酸配列（または二つの核酸配列）の同一性のパーセントを決定することができる。次いで、対応する位置のアミノ酸またはヌクレオチドを比較し、そして二つの配列間の同一性のパーセントは、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一性の％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。ある特定の態様において、比較の意図のために揃えたHMGポリペプチドの長さ、HMGのＡボックスのポリペプチドの長さ、またはHMGのＢボックスのポリペプチドの長さは、基準配列（例えば、図１２Ａ〜１２Ｅに規定された配列、および配列番号：１８，２０，および２２の配列）の長さの少なくとも３０％であり、少なくとも４０％が好ましく、少なくとも６０％がより好ましく、そして少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％がさらに好ましい。周知の方法、たとえば、数学的アルゴリズムを利用するものなどによって、二つの配列を実際に比較することができる。かかる数学的アルゴリズムの好ましく、非限定的な例は、Karlinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877（1993）によって記述されている。かかるアルゴリズムは、Schafferら、Nucleic Acids Res., 29: 2994-3005（2001）に記述されているBLASTＮプログラムおよびBLASTＸプログラム（バージョン２．２）内に組み込まれている。BLASTプログラムおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえばBLASTＮなど）のデフォルトパラメータを用いることができる。2002年4月10日において利用可能なhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照のこと。一つの態様において、検索するデータベースは非重複性（ＮＲ）データベースであり、そして配列比較のためのパラメータをフィルターなし；期待値１０；語長３；マトリックスはBLOSUM６２；そしてギャップ・コストはギャップ開始コストを１１およびギャップ延長コストを１と設定すればよい。
【００３７】
配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましく、非限定的な別の例は、MyersおよびMILler、CABIOS（1989）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ALIGNプログラム（バージョン2.0）内に組み込まれており、これはGCG（Accelrys）配列アラインメント・ソフトウェア・パッケージの一部である。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120ウェイト・レジデュー・テーブル、ギャップ・レングス・ペナルティー１２、及びギャップペナルティー４を用いればよい。配列分析のためのさらなるアルゴリズムが当該分野で公知であり、TorellisおよびRobotti、Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5（1994）に記述されているADVANCE and ADAM;ならびにPearsonおよびLipman、Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 2444-8（1988）に記述されているFASTAが含まれる。
【００３８】
別の態様において、GCGソフトウェア・パッケージ（2001年8月31日より利用可能なhttp://www.accelrys.comにて利用可能）中のGAPプログラムを用いて、Blossom 63マトリックスまたはPAM 250マトリックスのいずれか一方、ギャップ・ウェイト１２、１０、８、６、または４そしてレングス・ウェイト２、３、または４を用いて、二つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを求めることができる。さらに別の態様において、GCGソフトウェア・パッケージ（http://www.cgc.comにて利用可能）中のＧＡＰプログラムを用いて、ギャップ・ウェイト５０そしてレングス・ウェイト３にて、二つの核酸配列の間の同一性パーセントを求めることができる。
【００３９】
Ａボックスのポリペプチドおよび生物学的に活性なそのフラグメント
上記のように、本発明は、HMGで処理された脊椎動物の細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害できる、または炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態を治療するのに用いることができる脊椎動物のHMGのＡボックス、または生物学的に活性なそのフラグメントを含有するポリペプチド組成物に関する。
【００４０】
本発明のあらゆる組成物または方法がプロ炎症性サイトカインの放出に与える影響について言及する場合、「阻害する」または「減少させる」という用語の使用には、少なくともわずかではあるが無視できない程度のプロ炎症性サイトカイン放出の減少が包含される。好ましい態様においては、プロ炎症性サイトカインの放出が非処理コントロールよりも少なくとも２０％まで阻害され；より好ましい態様においては阻害は少なくとも５０％であり；さらに好ましい態様においては阻害は少なくとも７０％であり、そして最も好ましい態様においては阻害は少なくとも８０％である。このようなプロ炎症性サイトカイン放出の減少によって、インビボの態様における炎症性サイトカインカスケードの心身に有害な影響を減少させることが可能である。
【００４１】
すべての脊椎動物のHMGのＡボックスが高度の配列保存性を示すことから（たとえば、ラット、マウス、およびヒトHMGポリペプチドのアミノ酸配列比較についての図１３などを参照）、あらゆる脊椎動物のHMGのＡボックスが、HMGで処理された脊椎動物の細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害できると信じられている。それゆえに、あらゆる脊椎動物のHMGのＡボックスは、本発明の範囲内にある。HMGのＡボックスとしては哺乳動物のHMGのＡボックスが好ましく、たとえば、配列番号：４または配列番号：２２として本明細書に規定されているヒトHMG1のＡボックスなどの哺乳動物のHMG1のＡボックスがある。さらに、本明細書に記載されているようなHMGのＡボックスの生物活性を有するHMG1のＡボックスのフラグメントも本発明に包含される。
【００４２】
必要以上の実験を行うことなく、脊椎動物のHMGで処理された脊椎動物の細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する非天然HMGのＡボックス（または生物学的に活性なそのフラグメント）を作製することが可能であることも当業者は認識する。異なる源に由来するHMGのＡボックスのアミノ酸配列を揃え、そしてＡボックスが異なっているアミノ酸の位置の配列の一つで一つ以上を置換することによって、これらの非天然機能的Ａボックスを作製できる。比較されるＡボックスに存在するのと同一のアミノ酸残基を用いて、この置換を行うことが好ましい。あるいは、いずれか一方の残基から保存的置換がなされる。
【００４３】
保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を言う。保存的置換がなされるアミノ酸を、それらの側鎖の化学的性質にしたがってグループに分けることができる。たとえば、アミノ酸の一つのグループには、中性でかつ疎水性の側鎖を有するアミノ酸（ａ、ｖ、ｌ、ｉ、ｐ、ｗ、ｆ、およびｍ）が含まれる；別のグループは、中性でかつ極性の側鎖を有するアミノ酸（ｇ、ｓ、ｔ、ｙ、ｃ、ｎ、およびｑ）である；別のグループは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（ｋ、ｒ、およびｈ）である；別のグループは、酸性側鎖を有するアミノ酸（ｄおよびｅ）である；別のグループは、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（ｇ、ａ、ｖ、ｌ、およびｉ）である；別のグループは、脂肪族−ヒドロキシル基の側鎖を有するアミノ酸（ｓおよびｔ）である；別のグループは、アミン含有側鎖を有するアミノ酸（ｎ、ｑ、ｋ、ｒ、およびｈ）である；別のグループは、芳香族側鎖を有するアミノ酸（ｆ、ｙ、およびｗ）である；そして別のグループは、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（ｃおよびｍ）である。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは：ｒ−ｋ；ｅ−ｄ、ｙ−ｆ、ｌ−ｍ；ｖ−ｉ、およびｑ−ｈである。
【００４４】
保存的アミノ酸置換によってHMGのＡボックスのポリペプチドの生物活性が維持されることが期待できるのに対して、次のものは、ヒトHMG1のＡボックス（配列番号：４）と、ヒトHMG2のＡボックス（配列番号：１７）の配列番号：３の３２〜８５残基とを比較することによって非天然Ａボックスのポリペプチドが作られる方法の一例である。
【００４５】
HMG1  pdasvnfsef skkcserwkt msakekgkfe dmakadkary eremktyipp kget
HMG2  pdssvnfaef skkcserwkt msakekskfe dmaksdkary dremknyvpp kgdk
【００４６】
たとえば、HMG1のＡボックスの中の三番目の位置のアラニン（ａ）残基を、HMG2のＡボックスの三番目の位置に存在するセリン（ｓ）残基に置換することによって、非天然HMGのＡボックスを作製することができる。当業者は、この置換によって、非天然機能的Ａボックスが提供されることを知る。というのは、ｓ残基はHMG2のＡボックスの中の位置にて機能するからである。あるいは、HMG1のＡボックスの三番目の位置を、アラニンまたはセリンに対して保存的な任意のアミノ酸、たとえば、グリシン（ｇ）、スレオニン（ｔ）、バリン（ｖ）またはロイシン（ｌ）によって置換することができる。これらの保存的置換により、機能的Ａボックスを生じることが期待できることを当業者は認識する。というのは、Ａボックスの三番目の位置は不変ではなく、そのために保存的置換によって、その位置で天然アミノ酸に対して適切な構造的置換体が提供されるからである。
【００４７】
上記の方法に従うことによって、機能し得ると予想される極めて多数の天然には存在しないHMGのＡボックスは、過度の実験を行うことなく作製され得、任意の特定の天然には存在しないHMGのＡボックスの機能性は、十分な正確さをもって予測され得る。いずれにしても、過度の実験を行うことなく、ただ単にHMGと一緒に細胞に添加することによって、任意の天然には存在しないHMGのＡボックスの機能性は、決定され得、Ａボックスが、例えば、本明細書に記載の方法を用いて、細胞によるプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するかどうかを、決定し得る。
【００４８】
ＡボックスまたはＡボックスの生物学的に活性なフラグメントが阻害するHMG−誘導性プロ炎症性サイトカインの放出がなされる細胞は、プロ炎症性サイトカインを産生するために誘導され得る任意の細胞であってよい。好ましい態様においては、その細胞は例えば、マクロファージ、単球、または好中球などの免疫細胞である。最も好ましい態様において、その細胞はマクロファージである。
【００４９】
現在公知または後ほど発見される任意の一つのプロ炎症性サイトカインの産生を阻害し得るＡボックスまたはＡボックスの生物学的に活性なフラグメントを含有するポリペプチドは、本発明の範囲内にある。好ましくは、抗体は、TNF、IL-1β、またはIL-6の産生を阻害し得る。最も好ましくは、抗体は、脊椎動物細胞によって産生される任意のプロ炎症性サイトカインの産生を阻害し得る。
【００５０】
本発明はまた、薬学的に許容され得る賦形剤中に上記のポリペプチドのいずれかを含有する組成物に関する。これらの態様において、組成物は、炎症性サイトカインカスケードの活性化により特徴付けられる状態を抑制し得る。この状態は、炎症性サイトカインカスケードが、例えば、エンドトキシンショックなどを伴う全身性反応を引き起こす状態であり得る。あるいは、この状態は、慢性関節リウマチにおけるような局部的な炎症性サイトカインカスケードによって、介在され得る。本発明を使用する有用に治療され得る状態の非限定的な例としては、本明細書の背景技術の節に列挙される状態が挙げられる。好ましくは、その状態は虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎もしくは虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホウィップル病、ぜん息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、器官虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、塵肺症、肺胞炎（alvealitis）、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、ＲＳウイルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギヤン・バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周疾患、慢性関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎（thryoiditis）、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植拒絶、対宿主性移植片病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バージャー病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、ライター（Retier）症候群、またはホジキン病である。より好ましい態様において、状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎もしくは虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、ぜん息、アレルギー、アナフィラキシーショック、器官虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、アルツハイマー病、セリアック病、うっ血性心不全、成人呼吸促進症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶または対宿主性移植片病である。最も好ましい態様において、状態は、エンドトキシンショックまたは同種移植拒絶である。状態が同種移植拒絶の場合、有利な組成物としてはまた、同種移植拒絶を抑制するのに用いられるシクロスポリンなどの免疫抑制剤が挙げられる。
【００５１】
これらの組成物中にポリペプチドと一緒に含まれる賦形剤は、治療適用における組成物の予想される投与経路に基づいて選択される。組成物の投与経路は、治療対象の状態に依存する。例えば、静脈注射は、エンドトキシンショックなどの全身性の障害を治療するために好ましく、そして経口投与は、胃潰瘍などの胃腸の障害を治療するのに好ましい。投与対象の組成物の投与経路および投薬量は、過度の実験を行わずに、標準的な用量−応答研究と関連して、当業者によって、決定され得る。これらの決定を行う際に考慮される関連事情としては、治療対象の状態、投与対象の組成物の選択、年齢、体重、および個々の患者の応答、ならびに患者の症状の重症度が挙げられる。従って、状態に依存して、抗体組成物は、患者に経口的に、非経口的に、鼻腔内に、膣に、直腸に、舌に、舌下に、頬側に、頬内におよび経皮的に投与され得る。
【００５２】
したがって、経口投与、舌投与、舌下投与、頬側投与および頬内投与のために設計された組成物は、過度の実験を行うことなく、当該分野で周知の手段によって、例えば、不活性な希釈剤または可食キャリアを用いて、作製され得る。組成物は、ゼラチンカプセル内に封入されるか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療の目的のため、本発明の医薬組成物は、賦形剤と混合され、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤、チューインガムなどの形態で使用され得る。
【００５３】
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などはまた、さらに結合剤、レシピエント、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、および矯味剤を含有し得る。結合剤のいくつかの例としては、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンが挙げられる。賦形剤の例としては、デンプンまたはラクトースが挙げられる。崩壊剤の例としては、アルギン酸、コーンスターチなどが挙げられる。潤滑剤の例としては、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カリウムが挙げられる。流動促進剤（glidant）の例は、コロイド状二酸化ケイ素である。甘味剤のいくつかの例としては、スクロース、サッカリンなどが挙げられる。矯味剤の例としては、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料などが挙げられる。これらの種々の組成物を調製する際に用いられる材料は、薬学的に純粋であって用いられる量で毒性が無いものであるべきである。
【００５４】
本発明の組成物は、例えば、静脈注射、筋肉注射、髄腔内注射または皮下注射によって、非経口的に容易に投与され得る。非経口投与は、本発明の抗体組成物を溶液または懸濁液内に混合することによって達成され得る。このような溶液または懸濁液としてはまた、無菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒が挙げられ得る。非経口用製剤はまた、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤およびＥＤＴＡなどのキレート剤が含まれ得る。酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの張度調整薬剤はまた、添加され得る。非経口用調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数用量バイアルの中に封入され得る。直腸投与としては、医薬組成物を直腸または大腸内に投与することが挙げられる。これは、座薬または浣腸剤を用いて実行され得る。坐剤製剤は、当該分野で公知の方法によって、容易に作製され得る。例えば、坐剤製剤は、グリセリンを約１２０℃に加熱し、抗体組成物をグリセリンに溶解し、加熱したグリセリンを混合し、そしてその後に精製水が添加されてもよく、そして熱い混合物を坐剤の型の中に注ぐことによって、調剤され得る。
【００５５】
経皮投与としては、皮膚を経由しての組成物の経皮吸収が挙げられる。経皮製剤としては、パッチ、軟膏剤、クリーム、ゲル、軟膏などが挙げられる。
【００５６】
本発明は、治療的に有効な量の組成物を哺乳動物に経鼻的に投与することを含む。本明細書で用いられる場合、経鼻的に投与することまたは経鼻投与としては、患者の鼻の通路または鼻腔の粘膜に組成物を投与することが挙げられる。本明細書で用いられる場合、組成物の経鼻投与用の医薬組成物は、投与のための周知の方法によって、例えば、鼻腔スプレー、点鼻剤、懸濁液、ゲル、軟膏剤、クリームまたは散剤として、調製された治療有効量のアゴニストを含む。組成物の投与はまた、鼻腔タンポンまたは鼻腔スポンジを用いて行われ得る。
【００５７】
本明細書に記載されるポリペプチド組成物はまた、早期セプシスメディエイタのアンタゴニストを含み得る。本明細書で用いられる場合、早期セプシスメディエイタは、炎症性サイトカインカスケードの誘導（例えばLPSへの曝露）後、すみやかに（すなわち３０〜６０分以内に）細胞から放出されるプロ炎症性サイトカインである。これらのサイトカインの非限定的な例は、TNF、IL-1α、IL-1β、IL-6、PAF、およびMIFである。早期セプシスメディエイタとして含まれるものはまた、これらのサイトカインについてのレセプター（例えば、腫瘍壊死因子レセプタータイプ１）およびこれらのサイトカインの産生に必要な酵素（例えば、インターロイキン-1β変換酵素）である。現在公知であるかまたは後ほど発見される任意の早期セプシスメディエイタのアンタゴニストは、炎症性サイトカインカスケードをさらに阻害することによって、これらの態様のために有用であり得る。
【００５８】
早期セプシスメディエイタのアンタゴニストの非限定的な例は、早期セプシスメディエイタのｍRNAに結合して、その発現を妨害するアンチセンス化合物（例えば、Ojwangら、Biochemistry 36：6033-6045, 1997；Parnpferら、Biol. Reprod. 52：1316-1326, 1995；米国特許第6,228,642号；Yahataら、Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6：55-61, 1996；およびTaylorら、Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8：199-205, 1998参照）、早期セプシスメディエイタのｍRNAを特異的に切断するリボザイム（例えば、Leavittら、Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10：409-414, 2000；Kisichら、1999；およびHendrixら、Biochem. J. 314（第2部）：655-661, 1996参照）、ならびに早期セプシスメディエイタに結合してその作用を阻害する抗体（例えば、KamおよびTargan、Expert Opin. Pharmacother. 1：615- 622, 2000；Nagahiraら、J. Immunol. Methods 222, 83-92, 1999；Lavineら、J. Cereb. Blood Flow Metab. 18：52-58, 1998；ならびにHolmesら、Hybridoma 19：363-367, 2000参照）がある。現在公知であるかまたは後ほど発見される早期セプシスメディエイタの任意のアンタゴニストは、本発明の範囲内にあるものと想定される。当業者は、過度の実験を行うことなく、日常的な用量−応答研究によって、任意の特定の炎症性サイトカインカスケードを阻害するためのこれらの組成物に用いる早期セプシスメディエイタの量を決定し得る。
【００５９】
Ｂボックスのポリペプチド、生物学的に活性なそのフラグメント、およびその抗体
上記のように、本発明は、HMGで処理された脊椎動物細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を増加し得る脊椎動物のHMGのＢボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントを含有するポリペプチド組成物に関する。
【００６０】
プロ炎症性サイトカインの放出に対する任意の本発明の組成物または方法の影響について言及する場合、「増加する」という用語の使用は、プロ炎症性サイトカイン放出における少なくともわずかではあるが無視できない増大が包含する。好ましい態様においては、プロ炎症性サイトカインの放出は、非処理対照よりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍増加される。このようなプロ炎症性サイトカイン放出の増加は、インビボの態様における炎症性サイトカインカスケードの効果を増加し得る。このようなポリペプチドはまた、体重の減少を誘導するためおよび／または肥満を治療するために使用され得る。
【００６１】
すべてのHMGのＢボックスが高度の配列保存性を示すことから（例えば、ラット、マウス、およびヒトHMGポリペプチドのアミノ酸配列比較についての図１３を参照）、機能的な、天然には存在しないＡボックスの作製に関して上記で考察したように、機能的な、天然には存在いしないHMG Ｂボックスは、一つ以上の保存アミノ酸の置換を行うことによって、または異なる供給源由来の天然に存在する脊椎動物のＢボックスを比較し、類似アミノ酸を置換することによって、過度の実験を行わずに作製され得ると考えられる。特に好ましい態様において、Ｂボックスは、ヒトHMG1のＢボックスの配列（二種の異なる長さ）であるか、またはＢボックスの生物学的活性を有するHMGのＢボックスのフラグメントである配列番号：５または配列番号：２０を含む。例えば、配列番号：２０の中に含まれている２０アミノ酸配列は、Ｂボックスの機能を担う。この２０アミノ酸のＢボックスフラグメントは、次のアミノ酸配列を有する：fkdpnapkrl psafflfcse （配列番号：１６）。別の例およびHMGのＢボックスの生物学的に活性なフラグメントは、配列番号：５のアミノ酸１〜２０（napkrppsaf flfcseyrpk；配列番号：２３）からなる。
【００６２】
本発明はまた、脊椎動物の高移動度群タンパク質（HMG）のＢボックスに特異的に結合するが、HMG1の非−Ｂボックスエピトープには特異的に結合しない抗体の精製調製物に関する。これらの態様において、抗体はＢボックスポリペプチドの生物学的活性活性、例えば、HMGによって誘導された脊椎動物細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害し得る。
【００６３】
HMGのＢボックスもしくはそのフラグメントに特異的な抗体、またはＢボックスもしくはエピトープを有するフラグメントを発現する細胞を作製することは、免疫原について免疫特異的な抗体を産生するために、免疫原として使用され得る。本明細書で用いられる場合、「抗体」としては、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、キメラ、単鎖、サル化抗体ならびにヒト化抗体、ならびにFabフラグメントが挙げられ、Fab免疫グロブリン発現ライブラリーの産物が挙げられる。
【００６４】
すべての脊椎動物のHMGのＢボックスが高度の配列保存性を示すので、任意の脊椎動物のHMGのＢボックスが、脊椎動物細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を誘導し得ると考えられる。従って、任意の脊椎動物のHMGのＢボックスに対する抗体は、本発明の範囲内にある。好ましくは、HMGのＢボックスは、哺乳動物のHMGのＢボックスであり、哺乳動物のHMG1のＢボックスがより好ましく、配列番号：５または配列番号：２０として本明細で提供されるヒトHMG1のＢボックスが特に好ましい。抗体はまた、Ｂボックスの生物学的活性を有するHMGのＢボックスフラグメントに指向され得る。
【００６５】
Ｂボックス免疫原に対して作製された抗体は、通常のプロトコールを利用して、Ｂボックス、Ｂボックスフラグメント、またはＢボックスもしくはＢボックスフラグメントを含有する細胞を、動物、好ましくはヒト以外に投与することにより、得られ得る。ポリペプチド、例えば、抗原的または免疫学的に等価な誘導体またはその融合タンパク質は、マウスまたはラットもしくはニワトリなどの他の動物を免疫化するために抗原として使用される。Ｂボックスまたはフラグメント免疫原は、Ｂボックスまたはフラグメントの安定性を提供し、免疫原性を増加するために融合タンパク質として提供され得る。免疫原は、免疫原キャリアタンパク質（例えばウシ血清アルブミン（BSA）またはスカシ貝のヘモシニアン（KLH））と、例えば、結合体化により結合され得る。あるいは、Ｂボックスまたはフラグメントの複数のコピーを含む複数免疫原性ペプチドは、キャリアの使用を不必要にするように、免疫原性を改良するために十分な抗原性を有し得る。２つの抗原結合性ドメイン（それぞれが異なるＢボックスエピトープに指向される）を有する二重特異性抗体はまた、慣用的な方法により作製され得る。
【００６６】
モノクローナル抗体を調製するために、連続細胞株培養により産生される抗体を提供する当該分野で公知の技術が使用され得る。例えば、KohlerおよびMilstein, Nature 256：495-497, 1975；Kozborら、Immunology Today 4：72, 1983；ならびにColeら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, 77-96頁、Alan R. Liss, Inc., 1985を参照のこと。
【００６７】
単鎖抗体を産生する技術（米国特許第4,946,778号）は、Ｂボックスまたはフラグメントに対する単鎖抗体を作製するために適用され得る。また、トランスジェニックマウス、またはその他の哺乳動物などの他の生物は、ヒト化抗体を発現するために使用され得る。
【００６８】
抗体がインビボ適用に治療的に使用される場合、抗体は、好ましくは、個体における免疫原性をより小さくするように修飾される。例えば、個体がヒトの場合、抗体は好ましくは「ヒト化」される；この場合、その抗体の相補性決定領域はヒト抗体内に移動される（例えば、Jonesら、Nature 321：522-525,1986；およびTempestら、Biotechnology 9：266-273, 1991などに記載されているとおり）。
【００６９】
ファージディスプレイ技術をまた利用して、抗Ｂボックス抗体を持つようにスクリーニングされたヒト由来のリンパ球のPCR増幅されたｖ−遺伝子のレパートリー、またはナイーブライブラリーのいずれかからポリペプチドに対する結合活性を有する抗体遺伝子を選択し得る（McCaffertyら、Nature 348：552-554, 1990；およびMarksら、Biotechnology 10：779-783, 1992）。これらの抗体の親和性はまた、チェーンシャッフリング（Clacksonら、Nature 352：624-628, 1991）により改善され得る。
【００７０】
HMGのＢボックスエピトープに特異的に結合する抗体が得られる場合、次いで、これらは、過度の実験を行わなくとも、プロ炎症性サイトカインの放出を阻害する能力について選別され得る。
【００７１】
任意の一つのプロ炎症性サイトカインの産生を阻害し得る抗HMGのＢボックスの抗体は、本発明の範囲内にある。好ましくは、この抗体は、TNF、IL-1β、またはIL-6の産生を阻害し得る。最も好ましくは、この抗体は、脊椎動物細胞によって産生された任意のプロ炎症性サイトカインの産生を阻害し得る。
【００７２】
HMGのＢボックスまたはその生物学的に活性なフラグメントに対する抗体を用いて、細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するか、または、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態を治療する方法に関して、その細胞は、プロ炎症性サイトカインを産生するために誘導され得る任意の細胞であり得る。好ましい態様においては、その細胞は、免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または好中球）である。最も好ましい態様においては、その細胞はマクロファージである。
【００７３】
他の態様において、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤中に上記の抗体調製物を含有する組成物に関する。これらの態様において、この組成物は、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態を抑制し得る。これらの組成物を用いて治療され得る状態は、既に列挙されている。
【００７４】
上記の抗体組成物はまた、前記されているような、早期セプシスメディエイタのアンタゴニストを含み得る。
【００７５】
これらの態様において記載されているＢボックスポリペプチドおよびその生物学的に活性なフラグメントは、インビトロまたはエクスビボで、あるいはインビボでの処理として、適切な単離細胞において炎症性サイトカインを誘導するために使用され得る。これらの処理のいずれににおいても、ポリペプチドまたはフラグメントは、コードされたＢボックスまたはＢボックスフラグメントに作動可能に連結された適切な対照配列を有するＢボックスまたはＢボックスフラグメントをコードするDNAベクターまたはRNAベクターを提供することにより投与され、その結果、ＢボックスまたはＢボックスフラグメントが処理細胞または患者において合成される。インビボでの適用としては、体重減少処置としてのＢボックスポリペプチドもしくはＢボックスフラグメントポリペプチドまたはベクターの使用が挙げられる。HMG1での治療が減量を誘導することを実証しているWO 00/47104（これらの教示の全体は、参考として本明細書に援用される）を参照のこと。HMGのＢボックスはHMGタンパク質の活性を有するので、Ｂボックスはまた、減量を誘導することが期待される。Ｂボックスの機能を有するHMGのＢボックスフラグメントはまた、減量を誘導することが期待される。
【００７６】
さらなる態様において、本発明はまた、哺乳動物細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害する方法に関する。この方法は、任意のHMGのＡボックス組成物または任意のHMGのＢボックス、または上記で考察されたHMGのＢボックスの生物学的に活性なフラグメント抗体組成物を用いて細胞を処理する工程を含む。
【００７７】
この方法は、プロ炎症性サイトカインを産生する任意の哺乳動物細胞からのサイトカイン放出を阻害するのに有用であると考えられる。しかしながら、好ましい態様においては、細胞はマクロファージである。なぜならば、プロ炎症性サイトカインのマクロファージ産生は、いくつかの重大な疾患に関連するからである。
【００７８】
この方法は、哺乳動物細胞によって産生された任意のプロ炎症性サイトカインの阻害に有用であると考えられる。好ましい態様において、プロ炎症性サイトカインはTNF、IL-1α、IL-1β、MIFまたはIL-6である。なぜならば、これらのプロ炎症性サイトカインは、特に重要な疾患のメディエイタであるからである。
【００７９】
これらの態様の方法は、インビトロでの適用（例えば、細胞におけるプロ炎症性サイトカイン産生の生物学的特性を決定するための研究において）に有用である。しかしながら、好ましい態様はインビボの治療適用であり、この場合、細胞は炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする状態を罹患しているか、またはそのリスクを有する患者の中にある。
【００８０】
これらのインビボの態様は、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される任意の状態（前記に列挙されている任意のものが挙げられる）にとって有用であると考えられる。好ましい状態としては、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎もしくは虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、ぜん息、アレルギー、アナフィラキシーショック、器官虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、アルツハイマー病、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶または対宿主性移植片病が挙げられる。最も好ましい態様において、その状態は、エンドトキシンショックまたは同種移植拒絶である。その状態が同種移植拒絶である場合、組成物はまた、同種移植拒絶を抑制するために用いられるシクロスポリンなどの免疫抑制剤を都合よく含み得る。
【００８１】
これらの方法はまた、早期セプシスメディエイタのアンタゴニストの投与を都合よく含み得る。これらのアンタゴニストの性質は、前記で考察されている。
【００８２】
さらに別の態様において、本発明は、炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする患者における状態を治療する方法に関する。この方法は、任意のHMGのＡボックス組成物（天然には存在しないＡボックスのポリペプチドおよびＡボックスの生物学的に活性なフラグメントを含む）、または上記で考察された、任意のHMGのＢボックスもしくはＢボックスの生物学的に活性なフラグメント抗体組成物（天然には存在しないＢボックスのポリペプチドまたは生物学的に活性なそのフラグメントを含む）を患者に投与する工程を含む。この方法は、炎症性サイトカインカスケードによって媒介される任意の状態（前記に列挙されている任意の状態が挙げられる）に有用であることが予測される。前記で記載したインビボでの方法と同じく、好ましい状態としては、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍もしくは十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎もしくは虚血性大腸炎、肝炎、クローン病、ぜん息、アレルギー、アナフィラキシーショック、器官虚血、再灌流障害、器官壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、アルツハイマー病、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄損傷、麻痺、同種移植拒絶または対宿主性移植片病が挙げられる。最も好ましい態様において、その状態は、エンドトキシンショックまたは同種移植拒絶である。状態が同種移植拒絶である場合、組成物はまた、同種移植拒絶を抑制するために用いられるシクロスポリンなどの免疫抑制剤を都合よく含み得る。
【００８３】
これらの方法はまた、早期セプシスメディエイタのアンタゴニストの投与を都合よく含み得る。これらのアンタゴニストの性質は、前記で考察されている。
【００８４】
他の態様において、本発明は、細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を刺激する方法に関する。この方法は、任意のＢボックスのポリペプチドまたは生物学的に活性なＢボックスフラグメントのポリペプチド（例えば本明細書に記載されているような配列番号：５、配列番号：２０、配列番号：１６、または配列番号：２３の配列）（天然には存在しないＢボックスのポリペプチドおよびフラグメントを含む）を用いて、細胞を処理する工程を含む。この方法は、インビトロでの適用（例えば、産生細胞の生物学におけるプロ炎症性サイトカイン産生の影響を研究するため）に有用である。この方法はまた、前記で考察されたようなインビボでの適用（例えば、患者において減量または肥満症の治療を実施する）に有用である。
【００８５】
従って、さらなる態様において、本発明は、患者において減量または肥満症の治療を実施する方法に関する。この方法は、薬学的に許容され得る賦形剤中の、本明細書に記載される任意のＢボックスポリペプチドまたはＢボックスフラグメントポリペプチド（天然には存在しないＢボックスのポリペプチドおよびフラグメントを含む）の有効量を患者に投与する工程を含む。
【００８６】
細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出のモジュレーターのスクリーニング
本発明はまた、化合物（試験化合物）が炎症および／または炎症反応を阻害するかどうかを決定する方法に関する。この方法は、（ａ）脊椎動物のHMGのＢボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントに曝露される場合に、プロ炎症性サイトカインを放出する細胞、および（ｂ）HMGのＢボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントとその化合物とを混合し、次いでその化合物が、細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するかどうかを、好適な対照と比較して決定する工程を含む。このアッセイにおいて、プロ炎症性サイトカインの放出を阻害する化合物は、炎症および／または炎症反応を治療するために使用され得る化合物である。HMGのＢボックスまたは生物学的に活性なHMGのＢボックスのフラグメントは、細胞に対して内因性であるか、または標準的な組換え分子生物学技術を用いて細胞内に導入され得る。
【００８７】
試験化合物が無い場合に、脊椎動物のHMGのＢボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントへの曝露に応答してプロ炎症性サイトカインを放出する任意の細胞は、本発明にとって有用であると予想される。選択された細胞が、試験された阻害性化合物を用いる治療対象の状態の病因において重要であることが想像される。多くの状態について、好ましい細胞はヒトのマクロファージであると予想される。
【００８８】
化合物が細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を阻害するかどうかを決定する任意の方法は、これらの態様にとって有用である。好ましい方法は、例えば任意の多数の市販のELISAアッセイを使用する、プロ炎症性サイトカインの直接測定であると想像される。しかしながら、いくつかの態様において、放出されたサイトカインの炎症性作用の測定、特に試験細胞によって産生されたプロ炎症性サイトカインがいくつか存在する場合が好ましい。前記で考察したように、多数の重要な疾患に関して、優勢なプロ炎症性サイトカインはTNF、IL-1α、IL-1β、MIFまたはIL-6であり；特にはTNFである。
【００８９】
本発明はまた、化合物が炎症反応および／または炎症を増加するかどうかを決定する方法に特徴を有する。この方法は、（ａ）脊椎動物のHMGのＡボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントに曝露された場合に、プロ炎症性サイトカインを放出する細胞；および（ｂ）HMGのＡボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントと、化合物（試験化合物）を混合し、次いでこの化合物が細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を増加するかどうかを好適な対照と比較して決定する工程を含む。このアッセイにおいて、プロ炎症性サイトカインの放出を減少させる化合物は、炎症反応および／または炎症を増加するために使用され得る化合物である。HMGのＡボックスまたはHMGのＡボックスの生物学的に活性なフラグメントは、細胞に対して内因性であり得るか、または標準的な組換え分子生物学の技術を用いて細胞内に導入され得る。
【００９０】
上記の炎症のインヒビターを同定するのに有用な細胞型と同様に、プロ炎症性サイトカインの放出が任意の試験化合物が無い場合に脊椎動物のHMGのＡボックスまたは生物学的に活性なそのフラグメントに曝露されたことに応答して、正常に阻害される任意の細胞は、本発明にとって有用であると予想される。選択された細胞が、試験された阻害性化合物を用いる治療対象の状態の病因において重要であることが想像される。多くの状態について、好ましい細胞はヒトのマクロファージであると予想される。
【００９１】
化合物が細胞からのプロ炎症性サイトカインの放出を増加するかどうかを決定する任意の方法は、これらの態様にとって有用である。好ましい方法は、例えば任意の多数の市販のELISAアッセイを使用する、プロ炎症性サイトカインの直接測定であると想像される。しかしながら、いくつかの態様において、放出されたサイトカインの炎症性作用の測定、特に試験細胞によって産生されたプロ炎症性サイトカインがいくつか存在する場合が好ましい。前記で考察したように、多数の重要な疾患に関して、優勢なプロ炎症性サイトカインはTNF、IL-1α、IL-1β、MIFまたはIL-6であり；特にはTNFである。
【００９２】
本発明の好ましい態様が、以下の実施例に記載される。本発明の範囲内にあるその他の態様は、本明細書中に開示されるような本発明の詳述または実践の斟酌から当業者には自明である。実施例および特許請求の範囲と共に、明細書は例示的にのみ考えられることが意図される。 
【実施例】
【００９３】
実施例１：材料と方法
HMG1のクローニングとHMG1変異体の作製
次の方法を用いて、ヒトHMG1のクローンと変異体とを調製した。組換え型全長ヒトHMG1（651塩基対；ジェンバンク登録番号U51677）を、以下のプライマー；フォワードプライマー：5’GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3’（配列番号：６）およびリバースプライマー：5’GCGGCCGCTTATTCATCATCATCATCTTC3’（配列番号：７）を用いて、ヒト脳Quick-Clone cDNA調製物（Clontech, Palo Alto, CA）からPCR増幅によってクローニングした。ヒトHMG1の変異体をクローニングし、次のようにして精製した。ヒトHMG1の切断型を、ヒト脳Quick-Clone cDNA調製物（Clontech, Palo Alto, CA）からPCR増幅によってクローニングした。用いたプライマーは次のものであった（それぞれフォワードおよびリバース）：
【００９４】
カルボキシ末端変異体（557bp）：5’GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3’（配列番号：８）および5’GCGGCCGCTCACTTGCTTTTTTCAGCCTTGAC3’（配列番号：９）。
【００９５】
アミノ末端＋Ｂボックス変異体（486bp）：5’GAGCATAAGAAGAAGCACCCA3’（配列番号：１０）および5’GCGGCCGCTCACTTGCTTTTTTCAGCCTTGAC3’（配列番号：１１）。
【００９６】
Ｂボックス変異体（233bp）：5’AAGTTCAAGGATCCCAATGCAAAG3’（配列番号：１２）および5’GCGGCCGCTCAATATGCAGCTATATCCTTTTC3’（配列番号：１３）。
【００９７】
アミノ末端＋Ａボックス変異体（261bp）：5’GATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3’（配列番号：１３）および5’TCACTTTTTTGTCTCCCCTTTGGG3’（配列番号：１４）。
【００９８】
それぞれの変異体にストップコドンを付加して、タンパク質のサイズの正確さを確実にした。製造業者（Invitrogen, Carlsbad, CA）の取扱説明書にしたがって、TAクローニング法を利用して、PCR産物をpCRII-TOPOベクターEcoRI部位にサブクローニングした。増幅後、このPCR産物を、EcoRIを用いて消化し、そしてGSTタグを有する発現ベクターpGEX（Pharmacia）にサブクローニングした；両鎖についてのDNAシークエンシングによって、正しい方向と陽性クローンとを確認した。この組換えプラスミドをプロテアーゼ欠損E. coli株BL21すなわちBL21（DE3）plysS（Novagen, Madison, WI）内に形質転換し、そしてイソプロピル-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）によって、融合タンパク質発現を誘導した。グルタチオンセファロース樹脂カラム（Pharmacia）を用いるアフィニティー精製を使用して、組換え型タンパク質を得た。
【００９９】
上記のようにして作製したHMGの変異体は、次のアミノ酸配列を有する：
【０１００】
野生型HMG1：
MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEEDEEEDDDDE（配列番号：１８）
【０１０１】
カルボキシ末端変異体：
MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSK（配列番号：１９）
【０１０２】
Ｂボックス変異体：
FKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAY（配列番号：２０）
【０１０３】
アミノ末端＋Ａボックス変異体：
MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGET（配列番号：２１）、ここで、Ａボックスは、配列PTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGET（配列番号：２２）からなる。
【０１０４】
HMG1タンパク質を欠くGSTベクターから作製されたポリペプチドは、対照（GSTタグだけを含む）として含まれていた。野生型HMG1およびそのいくつかの変異体（カルボキシ末端とＢボックス）に結合する細菌性のDNAを不活性にさせるために、カルボキシ末端変異体およびＢボックスの変異体についてはDNアーゼI（Life Technologies）、または野生型HMG1についてはベンゾナーゼヌクレアーゼ（Novagen, Madison, WI）を、細菌溶解物1mLあたり約20単位添加した。処理前および処理後のHMG1タンパク質を含有するアガロースゲルの臭化エチジウム染色によって、DNAの分解を検証した。このタンパク質溶出液をポリミキシンＢカラム（Pierce, Rockford, IL）に通して任意の混入LPSを除去し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水に対して徹底的に透析を行って、余分な還元型グルタチオンを除去した。次いで、この調製物を凍結乾燥し、使用する前に、滅菌水に再溶解させた。カブトガニアメーバ様細胞分解産物アッセイ（Bio Whittaker Inc., WalkersvILle, MD）によって測定したところ、LPSのレベルは、すべての変異体についてタンパク質1μgあたり60pg未満であり、野生型HMG-1についてタンパク質1μgあたり300pg未満であった。SDS-PAGEによって、タンパク質の完全性を検証した。組換え型ラットHMG1（Wangら、Science 285：248-251,1999）をいくつかの実験に用いた。なぜならば、これは精製ヒトHMG1において観察されたような分解フラグメントが有さないからである。
【０１０５】
ペプチド合成
ペプチドを合成し、そしてユタ州立大学バイオテクノロジーセンター（Logan, Utah）にて、90％の純度にHPLC精製した。カブトガニアッセイによって測定したところ、この合成ペプチド調製物において、エンドトキシンは検出されなかった。
【０１０６】
細胞培養
マウスのマクロファージ様RAW 264.7細胞（American Type Culture Collection, RockvILle, MD）を、10％のウシ胎仔血清（Gemini, Catabasas, CA）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Life Technologies）を補充したRPMI 1640培地（Life Technologies, Grand Island, NY）中で培養し、血清が含まれていないOpti-MEM I培地（Life Technologies, Grand Island, NY）にて、90％コンフルエンスで用いた。ポリミキシンＢ（Sigma, St. Louis, MO）を100〜1,000単位/mLで定期的に添加して、上記のような、任意の混入LPSの活性を中和した；ポリミキシンＢ単独では、トリパンブルー（Wangら、前出）で評価される細胞の生存度に影響を与えなかった。合成ペプチドの研究の実験では、ポリミキシンＢを用いなかった。
【０１０７】
細胞からのTNFの放出の測定
30pg/mLの最小検出濃度である標準的なマウスの線維芽細胞L929（ATCC, American Type Culture Collection, RockvILle, MD）細胞毒性バイオアッセイ（Bianchiら、前出）により、TNFの放出を測定した。R & D System Inc.（Minneapolis, MN）から組換え型マウスTNFを入手した。マウスの線維芽細胞L929細胞（ATCC）を、5％のCO2の加湿インキュベーター内で、10％のウシ胎仔血清（Gemini, Catabasas, CA）、ペニシリン（50単位/mL）およびストレプトマイシン（50μg/mL）（Life Technologies）を補充したDMEM（Life Technologies, Grand Island, NY）で培養した。
【０１０８】
抗体の作製
HMG1のＢボックスに対するポリクローナル抗体をウサギ（Cocalico Biologicals, Inc., Reamstown, PA）中で惹起し、イムノブロッティングによって力価をアッセイした。プロテインＡアガロースを用いて、製造業者（Pierce, Rockford, IL）の取扱説明書にしたがって、抗HMG1抗血清からIgGを精製した。臭化シアン活性化セファロースビーズ（Cocalico Biological, Inc.）を用いることによって、抗HMG1のＢボックス抗体をアフィニティー精製した。Sigma（St. Louis, MO）から非免疫性ウサギIgGを購入した。イムノアッセイにおいて、抗体は全長HMG1およびＢボックスを検出したが、TNF、IL-1およびIL-6との交差反応しなかった。
【０１０９】
Na-125IによるHMG1の標識化と細胞表面の結合性
ヨードビーズ（Pierce, Rochford, IL）を用いて、製造業者の取扱説明書にしたがって、0.2mCiの無担体125I（NEN Life Science products Inc., Boston, MA）にて精製HMG1タンパク質（10μg）を放射標識した。300mMの塩化ナトリウム、17.5mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0および0.1％のウシ血清アルブミン（BSA）によって予め平衡化しておいたゲルクロマトグラフィーカラム（P6 Micro Bio-Spin Chromatography Columns, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）によって、未反応の125Iから125I-HMG1タンパク質を分離した。溶出されたHMG1の比活性は、タンパク質1μgあたり約2.8×106cpmであった。細胞表面の結合性研究を、以前記載された（Yangら、Am. J. Physiol. 275：C675-C683, 1998）とおりに実施した。RAW 264.7細胞を24穴のシャーレ上に置き、そしてコンフルエンスに達するまで増殖させた。細胞を、0.1％のBSAを含有する氷冷PBSにて二回洗浄し、そして120mMの塩化ナトリウム、1.2mMの硫酸マグネシウム、15mMの酢酸ナトリウム、5mMの塩化カリウム、10mMのトリス塩酸、pH7.4、0.2％のBSA、5mMのグルコースおよび25,000cpmの125I-HMG1を含有する0.5mLの結合緩衝液にて、４℃で２時間かけて結合を行わせた。インキュベーションの最後に、上清を取り除き、そして0.1％のBSAを含有する0.5mLの氷冷PBSにて、細胞を三回洗浄し、0.5mLの0.5NのNaOHおよび0.1％のSDSにて、室温で２０分間かけて溶解した。次いで、ガンマ線測定装置を用いて、溶解物中の放射能を測定した。（総結合量）−（過剰量の非標識化HMG1またはＡボックスタンパク質の存在下で得られた放射能）として、特異的結合を決定した。
【０１１０】
動物実験
Amgen（Thousand Oaks, CA）からTNFノックアウトマウスを入手し、B6×129経歴であった。年齢が一致する野生型のB6×129マウスを、この研究の対照として用いた。フロリダ大学の特定病原体未感染トランスジェニックマウス施設（Gainesville, FL）の施設内でマウスを飼育し、そして６〜８週齢で用いた。
【０１１１】
Harlen Sprague-Dawley（Indianapolis, IN）から、オスの６〜８週齢のBalb/cマウスおよびC3H/HeJマウスを購入し、実験に用いる前７日間、順応させた。すべての動物を、ノースショア大学病院動物施設内に、標準的な温度および明暗サイクル下で収容した。
【０１１２】
盲腸結紮および穿刺
以前に記載された（FinkおよびHeard, J. Surg. Res. 49：186-196, 1990；Wichmannら、Crit. Care Med. 26：2078-2086,1998；ならびにRemickら、Shock 4：89-95,1995）とおりに盲腸結紮および穿刺（CLP）を行った。簡潔に言えば、75mg/kgのケタミン（Fort Dodge, Fort Dodge, Iowa）および20mg/kgのキシラジン（Bohringer Ingelheim, St. Joseph, MO）を筋肉に注射して、Balb/cマウスを麻酔した。正中切開を行い、盲腸を切り離した。6-0プロレン縫合結紮を、回盲弁から離れた盲腸の先端から5.0mmのレベルで設けた。
【０１１３】
次いで、糞便が直接排出されないようにして、結紮した盲腸の断端を２２−ゲージの針によって一回穿刺した。次いで、盲腸を正常な腹腔内の位置に戻した。次いで、体液の漏出を防ぐために、別個に二層（腹膜および筋膜）において、6-0プロレンの直線縫合にて腹部を閉じた。通常の食塩水溶液を体重1kgあたり20mLで皮下に投与してすべての動物を蘇生させた。外科的処置の３０分後に、それぞれのマウスにイミペネム（0.5mg/マウス）（Primaxin, Merck & Co., Inc., West Point, PA）の皮下注射をした。次いで、動物を回復させた。処置後１週間まで、死亡率を記録した；生存マウスを２週間追跡して、遅発性の死亡がないことを保証した。
【０１１４】
D-ガラクトサミン感作マウス
D-ガラクトサミン感作モデルは、以前に記載されている（Galanosら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76：5939-5943, 1979；およびLehmannら、J. Exp. Med. 165：657-663, 1997）。20mgのD-ガラクトサミン−HCL（Sigma）/マウス（200μLのPBS中）および0.1または1mgのHMG1のＢボックスもしくはベクタータンパク質（200μLのPBS中）のいずれかで、マウスの腹膜内に注入した。毎日の死亡率を注入後７２時間まで記録した；生存マウスを２週間追跡し、その結果、Ｂボックスの毒性による遅発性の死亡は見られなかった。
【０１１５】
脾臓細菌培養
CLPの２４時間後および３０時間後に、14匹のマウスに、本明細書に記載のとおりに抗HMG1抗体（n=7）または対照（n=7）のいずれかで与え、剖検のために安楽死させた。以前に記載されている（Villaら、J. Endotoxin Res. 4：197-204, 1997）とおりに、脾臓細菌を回収した。無菌技術を用いて脾臓を取り除き、そして2mLのPBS中でホモジナイズした。PBSにて連続的に希釈した後、トリプシン処理ダイズ寒天プレート（Difco, Detroit, MI）上に、ホモジネートを0.15mlのアリコートとして平板培養し、そして３７℃にて一晩インキュベーションした後のＣＦＵを数えた。
【０１１６】
統計分析
特に明記しない限り、平均値±SEMとしてデータを表示する。スチューデントの両側ｔ検定、一元ANOVAの後の最小有意差検定またはフィッシャーの直接確率両側検定によって、グループ間の差を決定した。
【０１１７】
実施例２：サイトカイン活性の促進に関するHMG1ドメインのマッピング
HMG1は、二つの折り畳まれたDNA結合ドメイン（ＡボックスおよびＢボックス）と、負電荷を帯びた酸性のカルボキシル末端とを有する。HMG1のサイトカイン活性の構造的基盤を明らかにするために、そして炎症性タンパク質ドメインをマッピングするために、本発明者らは、変異誘発によってHMG1の全長および切断型を発現させ、そして単球培養物における活性を刺激するような精製タンパク質をスクリーニングした（図１）。全長HMG1、カルボキシ末端が欠失した変異体、Ｂボックスだけを含む変異体、およびＡボックスだけを含む変異体を作製した。これらのヒトHMG1の変異体を、本明細書に記載されたような特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって作製し、そして、製造業者の取扱説明書にしたがって、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（GST）遺伝子融合システム（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて、この変異体タンパク質を発現させた。簡潔に言えば、PCR法によって作製されたDNAフラグメントをGST融合ベクターに融合し、そしてE. coliで増幅させた。次いで、GSTアフィニティーカラムを用いて、発現したHMG1タンパク質およびHMG1変異体を単離した。
【０１１８】
マウスのマクロファージ様RAW264.7細胞（ATCC）からのTNF放出における変異体の影響を、次のようにして実証した。RAW 264.7細胞を、10％のウシ胎仔血清（Gemini, Catabasas, CA）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Life Technologies）を補充したRPMI 1640培地（Life Technologies, Grand Island NY）中で培養した。100単位/mLのポリミキシン（Sigma, St. Louis, MO）を添加して、任意の混入LPSの活性を抑制した。1μg/mLの全長（野生型）HMG1および各HMG1変異体タンパク質と一緒に、Opti-MEM I培地中で８時間、細胞をインキュベートし、そして馴化上清（細胞から放出されたTNFを含有する）を集めて、30pg/mLの最小検出濃度を有する標準的なマウスの線維芽細胞L929（ATCC）細胞毒性バイオアッセイ（Bianchiら、前出）によって、細胞から放出されたTNFを測定した。R & D System Inc.（Minneapolis, MN）から組換え型マウスTNFを入手し、これらの実験における対照として用いた。この研究の結果を図１に示す。図１中のデータは、特に指示のない限り、すべて平均値＋SEMとして表されている（N=6〜10）。
【０１１９】
図１に示されるように、野生型HMG1およびカルボキシ末端切断HMG1は、単球培養物（マウスのマクロファージ様RAW264.7細胞）によって、顕著にTNF放出を刺激した。Ｂボックスは、単球TNF放出の強力な活性化因子であった。Ｂボックスのこの刺激効果は特異的であった。なぜなら、ＡボックスはTNF放出をわずかに活性化しただけだからである。
【０１２０】
実施例３：HMG1のＢボックスタンパク質は用量依存的にサイトカイン活性を促進する
サイトカインの産生に与えるHMG1のＢボックスの効果をさらに検討するために、HMG1のＢボックスの量を変化させて、マウスのマクロファージ様RAW264.7細胞におけるTNF、IL-1Ｂ、およびIL-6の産生に与える効果を評価した。図２Ａ〜２Ｃに示されるように、0〜10μg/mLのＢボックスタンパク質を用いて、８時間かけてRAW264.7細胞を刺激した。調整済みの培地を回収して、TNF、IL-1βおよびIL-6のレベルについて測定した。本明細書に記載のとおりにTNFのレベルを測定し、そしてマウスのIL-1βおよびIL-6酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）キット（R & D System Inc., Minneapolis, MN）を用いて、IL-1βおよびIL-6のレベルを測定した。すべての実験に関して実験数を６回以上とした。この研究の結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。
【０１２１】
図２Ａに示されるように、RAW264.7細胞からTNFが放出される量は、細胞に投与されたＢボックスの量が増えるのにしたがって増加した。図２Ｂに示されるように、1μg/mLまたは10μg/mLのＢボックスを添加した結果、RAW264.7細胞からのIL−βの放出量が増加した。さらに、図２Ｃに示されるように、RAW264.7細胞から放出されるIL-6の量は、細胞に投与されたＢボックスの量が増えるのにしたがって増加した。
【０１２２】
Ｂボックスに誘導されるTNFの放出についての速度論も検討した。RAW264.7細胞において、Ｂボックスポリペプチド、またはコントロール（ベクター）として用いられるGSTタグポリペプチド（10μg/mL）のみによって、０から４８時間の間に誘導されるTNFの放出およびTNFのｍRNAの発現を測定した。本明細書に記載のとおりに、L929細胞毒性アッセイ（N=3〜5）によって、TNFタンパク質レベルについて上清を分析した。ｍRNAを測定するために、100mmのディッシュに細胞を広げ、そしてＢボックスポリペプチドまたはベクターのみを含有するOpti-MEM I培地中で、図２Ｄに示されるように、０、４、８、または２４時間処理した。４時間の時点で、ベクターだけのサンプルを評価した。ディッシュの細胞をこすり落とし、製造工程（Tel-Test 「Ｂ」 Inc., Friendswood, TX）の取扱説明書にしたがって、RNAzol B法によって総RNAを単離した。RNアーゼ・プロテクション・アッセイ（Ambion, Austin, TX）によって、TNF（287bp）を測定した。RNAサンプルをアガロース−ホルムアルデヒドゲル上で臭化エチジウム染色することによって、RNAを均等に付加していることと、RNAの完全性とを確認した。RNアーゼ・プロテクション・アッセイの結果を、図２Ｄに示す。図２Ｄに示されるように、高いレベルの遺伝子の転写でＢボックスによる単核白血球の活性化が生じたなぜなら、Ｂボックスタンパク質にさらされた単核白血球内で、TNFのｍRNAが顕著に増加したからである（図２Ｂ）。TNFのｍRNAの発現は４時間の時点が最大であり、８時間および２４時間の時点では減少していた。ベクターだけのコントロール（GSTタグ）は、TNFのｍRNA発現に影響を及ぼさなかった。Ｂボックスまたはベクター（GSTタグ）のみを投与し、０、４、８、２４、３２または４８時間後のRAW264.7細胞からのTNFタンパク質の放出を、本明細書に記載のL929細胞毒性アッセイを用いて測定する同様の研究を行った。コントロール（培地のみ）と比較したところ、Ｂボックスの処理によってTNFタンパク質の発現が刺激され（図２Ｆ）、ベクター単独ではそうではなかった（図２Ｅ）。データは、三つの独立した実験の代表値である。全体として、これらのデータから、HMG1のＢボックスドメインがサイトカイン活性を有すること、およびこのドメインは全長HMG1のサイトカイン刺激活性の原因であることが示唆される。
【０１２３】
要約すれば、HMG1のＢボックスは、単球培養物からのTNF、IL-1βおよびIL-6の放出を用量依存的に刺激した（図２Ａ〜図２Ｃ）。これは全長HMG1の炎症活性（Anderssonら、J. Exp. Med. 192: 565-570, 2000）に一致する。さらに、これらの研究から、８時間以内に、TNFタンパク質が最も多く放出されることが示唆される（図２Ｆ）。TNF放出のこの遅延性パターンは、HMG1そのものによって誘導されるTNFの放出と類似し、そしてLPSによって誘導されるTNFの動態よりも顕著に遅い（Anderssonら、上掲）。
【０１２４】
実施例４：HMG1のＢボックスの最初の２０アミノ酸がTNF活性を刺激する
HMG1のＢボックスのTNF−刺激活性をさらにマッピングした。この研究を次のようにして実施した。本明細書に記載のような合成ペプチド保護技術を用いて、Ｂボックスのフラグメントを作製した。図３に示されるように、HMG1のＢボックスのアミノ酸1〜20、16〜25、30〜49、45〜64、または60〜74を含有する５種のHMG1のＢボックスのフラグメント（配列番号：２０由来）を作製した。RAW264.7細胞を、図３に示されるようなＢボックス（１μg/mL）またはＢボックスの合成ペプチドフラグメント（10μg/mL）によって、１０時間かけて処理し、そして上清におけるTNFの放出を、本明細書に記載のようにして測定した。示されたデータは平均値±標準誤差である（n=3回の実験、それぞれの実験を二重に行い、そして３種の別個のロットの合成ペプチドを用いて確認した）。図３に示されるように、配列番号：２０のHMG1のＢボックスのアミノ酸1〜20に対応する合成ペプチド（fkdpnapkrlpsafflfcse；配列番号：１６）によって、TNF−刺激活性が保持されていた。1〜20アミノ酸長のTNF刺激活性の強さは、合成Ｂボックス（1〜74アミノ酸長）の全長またはHMG1の全長のいずれか一方のそれよりも弱かった。しかし、刺激効果は特異的であったなぜなら、HMG1のＢボックスの16〜25、30〜49、45〜64、または60〜74を含有するアミノ酸フラグメントについてのこの合成20アミノ酸長体は、TNFの放出を誘導しなかったからである。これらの結果は、Ｂボックスのマクロファージ刺激活性が、配列番号：２０のHMGのＢボックスドメインの最初の２０アミノ酸に特異的に位置づけられるという直接の証拠である。たとえば、プロ炎症性サイトカインの放出を刺激するために、または炎症性サイトカインカスケードの活性化を特徴とする患者の病状を治療するために、Ｂボックスポリペプチドの全長をコードしているポリペプチドと同じように、このＢボックスフラグメントを用いることが可能である。
【０１２５】
実施例５：HMG1のＡボックスタンパク質はサイトカイン活性を誘導するHMG1と用量依存的に拮抗する
弱いアゴニストとは定義上、アンタゴニストである。図１に示されるように、HMG1のＡボックスはTNFの産生をわずかに誘導するだけなので、HMG1のＡボックスがHMG1活性のアンタゴニストとして機能する能力を評価した。この研究は、次のようにして実施した。24穴のディッシュ中でサブコンフルエントとなったRAW264.7細胞を、ポリミキシンＢ（100単位/mL）の存在下でOpti-MEM I培地中で、HMG1（１μg/mL）および0、5、10、または25μg/mLのＡボックスを用いて、１６時間かけて処理した。Ａボックスを受け入れていないサンプル中の（本明細書に記載のL929細胞毒性アッセイを用いて評価される）TNF−刺激活性を、100％として表し、そしてＡボックスによる阻害を、HMG1単独のパーセントとして表した。RAW264.7細胞からのTNF放出に与えるＡボックスの影響の結果を図４Ａに示す。図４Ａに示されるように、Ａボックスは、約7.5μg/mLの見かけのEC50でTNFの放出を誘導するHMG1を用量依存的に阻害した。図４Ａにおけるデータは、平均値±標準偏差として表されている（n=2〜3回の独立した実験）。
【０１２６】
実施例６：HMG1のＡボックスタンパク質は、全長HMG1のサイトカイン活性およびHMG1のＢボックスのサイトカイン活性を阻害する
Ａボックスと全長HMG1とを共に添加することで刺激を受けるＲＡＷ  ２６４．７マクロファージの培養物から放出されるTNFを測ることによって、HMG1のＡボックスまたはGSTタグ（ベクターコントロール）による全長HMG1活性の拮抗作用についても測定した。RAW 264.7マクロファージ細胞（ATCC）を24穴組織培養プレート内に播き、そして90％の集密度にて用いた。ポリミキシンＢ（100単位/mL、Sigma, St. Louis, MO）の存在下でOptimum I培地（Life Technologies, Grand Island, NY）中で、示されるようにHMG1、および／またはＡボックスによって、この細胞を１６時間かけて処理し、そして（R & D System Inc., Minneapolis, MNのマウスELISAキットで）TNFを測定するために上清を回収した。HMG-1のみを用いて得られた活性のパーセントとして、TNF−誘導活性を表示した。これらの研究の結果を図４Ｂに示す。図４Ｂは、HMG1単独、Ａボックス単独、ベクター（コントロール）単独、HMG1とＡボックスとの組み合わせ、およびHMG1とベクターとの組み合わせの効果のヒストグラムである。図４Ｂに示されるように、HMG1のＡボックスは全長HMG1のTNF刺激活性を顕著に弱めた。
【０１２７】
実施例７：HMG1のＡボックスタンパク質は、HMG1に結合することによってHMG1のサイトカイン活性を阻害する
HMG1のＡボックスが、HMG1の結合を置換することによりアンタゴニストとして機能するかどうかを調べるために、125I−標識化−HMG1をマクロファージ培養物に添加して、２時間後に４℃にて結合性を測定した。RAW264.7細胞における結合アッセイを、本明細書に記載の通りに実施した。24穴のディッシュに広げたRAW264.7細胞中で、図５Ａに示される時間をかけて、125I−HMG1の結合性を測定した。示された比結合能は、（すべての細胞会合125I−HMG1（CPM/ウェル））−（5,000倍のモル濃度過剰な非標識HMG1の存在下での細胞会合ＣＰＭ／ウェル）に等しい。図５Ａは、時間経過に対する125I−HMG1の結合性のグラフである。図５Ａに示されるように、HMG1は一次結合速度式にぴったり当てはまることが示された。実施例１に記載されたようにして、結合の特異性を評価した。
【０１２８】
さらに、24穴のディッシュ上に広げ、そして125I HMG1のみとともにまたは非標識HMG1もしくはＡボックスの存在下でインキュベーションを行ったRAW264.7細胞中での125I−HMG-1の結合性を測定した。この結合アッセイの結果を図５Ｂに示す。データは、３回の別個の実験からの平均値±標準誤差として表す。図５Ｂは、非標識HMGB1もしくはHMGB1（HMG1）のＡボックスが存在しない場合、または非標識HMGB1もしくはHMGB1のＡボックスが5,000モル濃度過剰に存在する場合の125I−HMGB1の細胞表面の結合性のヒストグラムであり、総CPM/ウェルのパーセントとして測定されている。図５Ｂにおいて、「総」量は、４℃にて２時間の間の、非標識HMGB1またはＡボックスが存在しない場合の細胞関連性125I−HMGB1の秒あたりのカウント（CPM）/ウェルと等しい。「HMGB1」または「Ａボックス」は、非標識HMGB1またはＡボックスが5,000モル濃度過剰に存在する場合の細胞関連性125I−HMGB1のCPM/ウェルと等しい。このデータは、非標識HMGB1タンパク質が存在しない場合において得られる総カウント（2,382,179CPM/ウェル）のパーセントとして表される。これらの結果から、HMG1のＡボックスは、HMG1のTNF−刺激活性を阻害するインビトロでのHMG1活性の競合的アンタゴニストであることが示唆される。
【０１２９】
実施例８：抗Ｂボックスのポリクローナル抗体による、全長HMG1およびHMG1のＢボックスのサイトカイン活性の阻害。
HMG1のＢボックスに対して向けられた抗体が、全長HMG1またはHMG1のＢボックスの効果を調節する能力についても評価した。HMG1のＢボックスに対して向けられた、アフィニティー精製された抗体（Ｂボックス抗体）を、本明細書に記載されたようにして、そして標準的な技術を用いて作製した。抗体が、HMG1−誘導性またはHMG1のＢボックス誘導性の、RAW264.7細胞からのTNF放出に与える影響を評価するために、24穴のディッシュ中でサブコンフルエントとなったRAW264.7細胞を、HMG-1（1μg/mL）またはHMG1のＢボックス（10μg/mL）を用いて、抗Ｂボックス抗体（25μg/mLもしくは100μg/mL、抗原にてアフィニティー精製されたもの、Cocalico Biologicals, Inc., Reamstown, PA）、または添加された非免疫性IgG（25μg/mLもしくは100μg/mL；Sigma）がある場合または無い場合で１０時間かけて処理した。L929細胞毒性アッセイを用いて、本明細書に記載されたようにしてRAW264.7細胞からのTNFの放出を測定した。この研究の結果を図６に示す。これは、何も投与していない、1μg/mLのHMG1を投与、1μg/mLのHMG1＋25μg/mLの抗Ｂボックス抗体を投与、1μg/mLのHMG1＋25μg/mLのIgG（コントロール）を投与、10μg/mLのＢ−ボックスを投与、10μg/mLのＢ−ボックス＋100μg/mLの抗Ｂボックス抗体を投与または10μg/mLのＢ−ボックス＋100μg/mLのIgG（コントロール）を投与した場合の、RAW264.7細胞によって放出されるTNFのヒストグラムである。（Ｂボックス抗体を添加せずに）HMG1単独によって誘導された細胞からのTNFの放出量を、100％と設定した。図６に示されるデータは、３回の独立した実験の結果である。図６に示されるように、HMG1のＢボックスに対して向けられた、アフィニティー精製された抗体は、全長HMG1またはHMG1のＢボックスいずれか一方によって誘導されるTNFの放出を顕著に阻害した。これらの結果から、このような抗体を用いてHMG1の機能を調節する可能性が示唆される。
【０１３０】
実施例９：HMG1のＢボックスタンパク質は、D-ガラクトサミン−感作Balb/cマウスに対して毒性を示す
HMG1のＢボックスがインビボでのサイトカイン活性を有するかどうかについて詳細に調べるために、我々は、麻酔をかけていないD-ガラクトサミン（D-gal）感作Balb/cマウス（サイトカインの毒性を研究するために広く用いられているモデルである(Galanosら、上掲））にHMG1のＢボックスタンパク質を投与した。簡潔に言えば、D-gal（20mg）（Sigma）およびＢボックス（0.1mg/mL/マウスまたは1mg/mL/マウス）またはGSTタグ（ベクター；0.1mg/mL/マウスまたは1mg/mL/マウス）を、表１に示すように、マウス（20〜25グラム、オス、Harlan Sprague-Dawley, Indianapolis, IN）の腹膜内に注入した。生き残ったマウスを最大７日間監視して、遅発性の死亡が生じないことを保証した。この研究の結果を表１に示す。
【０１３１】
【表１】
2005512507.tif 000002
【０１３２】
この研究の結果から、HMG1のＢボックスは、D-ガラクトサミン−感作マウスにとって用量依存的に致死性であることが示された。死亡が生じたすべての例において、１２時間以内に死が生じた。Ｂボックスが除かれた精製GSTベクタータンパク質である比較調製物を用いて処理されたマウスでは、死亡は見られなかった。
【０１３３】
実施例１０：HMG1のＢボックスタンパク質が投与されたD-ガラクトサミン−感作Balb/cマウスまたはD-ガラクトサミン−感作C3H/HeJマウスの組織学
インビボでのHMG1のＢボックスタンパク質の致死性をさらに評価するために、HMG1のＢボックスを再度D-ガラクトサミン−感作Balb/cマウスに投与した。（グループあたり３匹の）マウスの腹膜内に、D-gal（20mg/マウス）＋Ｂボックスまたはベクター（1mg/マウス）を７時間かけて投与し、次いで首を切り落としてこれらのマウスを屠殺した。血液を回収し、そして器官（肝臓、心臓、腎臓、および肺）を集め、そして10％のホルムアルデヒドで固定した。組織学的に評価するために、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して組織切片標本を作製した（Criterion Inc., Vancouver, Canada）。これらの研究の結果を図７Ａ〜７Ｊに示す。これらはヘマトキシリンおよびエオシンで染色されたものであり、非処理マウスから得られた腎臓の切片標本（図７Ａ）、心筋層の切片標本（図７Ｃ）、肺の切片標本（図７Ｅ）、および肝臓の切片標本（図７Ｇおよび図７Ｉ）のスキャンイメージ、ならびにHMG1のＢボックスで処理されたマウスから得られた腎臓の切片標本（図７Ｂ）、心筋層の切片標本（図７Ｄ）、肺の切片標本（図７Ｆ）、および肝臓の切片標本（図７Ｈおよび図７Ｊ）のスキャンイメージである。コントロールマウスと比較しても、Ｂボックスの処理によって、腎臓（図７Ａおよび図７Ｂ）および肺（図７Ｅおよび図７Ｆ）に異常は引き起こされなかった。これらのマウスには虚血性の変化が見られ、そして心臓の心筋線維中の横紋が無くなっていた（図７Ｄ中の矢印で示されるような図７Ｃおよび図７Ｄ）。活動性肝炎（図７Ｇ〜図７Ｊ）によって示されるように、肝臓のダメージは、Ｂボックスによるものがほとんどであることが示された。図７Ｊにおいては、集積した多形核白血球に取り囲まれて、肝細胞の脱落が見られる。図７Ｊ中の矢印は、多形核の集積部位（点線）またはアポトーシスの肝細胞（実線）を指す。HMG1のＢボックスをインビボで投与することによっても刺激が与えられて、IL-6（315+93対20+7pg/mL、Ｂボックス対コントロール、p<0.05）およびIL-1β（15+3対4+1pg/mL、Ｂボックス対コントロール、p<0.05）の血清レベルが顕著に増加した。
【０１３４】
（エンドトキシンに応答しない）C3H/HeJマウスにＢボックスタンパク質を投与することも致死的であった。このことは、LPSのシグナル伝達が無い場合は、HMG1のＢボックスが致死的であることを示唆する。Ｂボックスの投与の８時間後に回収して、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した肺と腎臓の切片標本から、異常な形態学的変化は無いことが明らかになった。しかしながら、心臓からの切片標本を調査したところ、心筋線維中に無定形で淡紅色の細胞質に関連する横紋が無い状態の虚血の証拠があることが明らかになった。肝臓からの切片標本によって、いくつかの肝細胞の脱落とアポトーシス、そして臨時の多形核白血球を伴った軽度の急性炎症反応が示された。これらの特異的な病理学上の変化は、全長HMG1を投与した後で見られる変化に匹敵し、そしてＢボックス単独で、インビボでのHMG1に対する致死的な病理学上の応答を再現することが可能であることが確認される。
【０１３５】
HMG1のTNF−刺激活性がＢボックスによる致死性の介在に寄与するかどうかについて取り組むために、我々は、D-ガラクトサミン（20mg/マウス）で感作させ、そしてＢボックス（1mg/マウス、腹膜内に注入）にさらしたTNFノックアウトマウス（TNF-KO、Nowakら、Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 278: R1202-R1209, 2000）および同じ処理をした野生型コントロール（B6 x 129系統）における致死率を測定した。Ｂボックスは、野生型マウスに対して致死性がより強かった（さらされた９匹のうち６匹が死亡）。しかし、Ｂボックスで処理したTNF-KOマウスには致死性は見られなかった（さらされた９匹のうち０匹が死亡、p<0.05対野生型）。本明細書に記載のRAW 264.7マクロファージの培養物からのデータと共に、これらのデータは、現在のところ、HMG1のＢボックスがTNFを刺激する特異的なサイトカイン活性を与えることを示唆する。
【０１３６】
実施例１１：HMG1のタンパク質レベルは敗血症マウスにおいて高い
敗血症におけるHMG1の役割を調べるために、我々はマウスに敗血症を確立し、そして既に記載されている定量的イムノアッセイ（Wangら、上掲）を用いて血清HMG1を測定した。マウスを盲腸結紮穿刺（CLP）であって、穴を開けて外科的に盲腸憩室を作ることによって引き起こされる、十分に特徴付けられた敗血症のモデルに供した。これにより、複数菌感染性の腹膜炎および敗血症（Fink and Heard、上掲;Wichmannら、上掲;ならびにRemickら、上掲）が導かれる。次いで、HMG1の血清レベルを測定した（Wangら、上掲）。図８は、この研究の結果を示すグラフであり、このグラフでは、CLPに供して０時間後、８時間後、１８時間後、２４時間後、４８時間後、および７２時間後のマウスにおけるHMG1のレベルが説明されている。図８に示されるように、血清HMG1のレベルは、盲腸に穴を開けた後の最初の８時間では顕著には増加しなかった。次いで、１８時間後に顕著に増加した（図８）。増加した血清HMG1は、CLP後の少なくとも７２時間は高いプラトーレベルを維持し、既に記述されている、内毒素血症におけるHMG1の動力学の遅延（Wangら、上掲）とほとんど同一の動力学的特性であった。HMG1の放出のこのような時間的パターンは、マウスにおける敗血症の徴候の進展に綿密に一致した。盲腸に穴を開けた後の最初の８時間の間では、この動物は軽度の病気であると観察され、いくぶん活動が弱くなり、そして探索行動をしなくなっていた。その後の１８時間を越えると、この動物は重篤な状態になり、立毛してグループ内で互いに寄り添いあい、水や食べ物を探そうとせず、そして外部からの刺激または担当者による検査に対して最小限の反応しか示さなくなった。
【０１３７】
実施例１２：HMG1のＡボックスタンパク質による敗血症マウスの治療によりマウスの生存が増加する
敗血症の間に、HMG1のＡボックスがHMG1の致死性を阻害することができるかどうかを調べるために、マウスの盲腸を穿刺して、そして敗血症が生じてから最初の２４時間後に、Ａボックスを投与して治療した。オスのBalb/cマウスについて、本明細書に記載のようにしてCLPを実施した。動物をランダムに、１グループあたり15〜25匹のマウスとなるグループに分けた。HMG1のＡボックス（それぞれの時点に60もしくは600μg/マウス）またはベクター（GSTタグ、600μg/マウス）のみを、CLP後の最初の２４時間後から一日に二回、三日間、腹膜内に投与した。一日に二回、最大で２週間まで生存を監視して、遅発性の死亡が生じなかったことを保証した。この研究の結果を図９に図示する。これは、時間経過に対する60μg/マウスまたは600μg/マウスのベクター（GST；コントロール）が生存に与える影響のグラフである（P<0.03対フィッシャーの直接確率検定によって検定されたコントロール）。図９に示されるように、HMG1のＡボックスの投与によって、敗血症の致死性効果からマウスが救命されたことは明らかであり、そして生存率は、Ａボックスが除かれたベクタータンパク質（GST）から精製されたタンパク質で治療した動物における28％から、Ａボックス（P<0.03、フィッシャーの直接確率検定による）を受け取った動物における６８％にまで改善された。この敗血症モデルにおけるHMG1のＡボックスによる救命効果は、Ａボックスの用量に依存的であった；600μg/マウスのＡボックスで治療された動物が顕著に、より機敏にかつ活発となったこと、およびベクターに由来する調製物で治療されたコントロールまたは60μgのＡボックスだけで治療された動物のいずれか一方と比較しても摂食行動が回復したことが観察された。後者の動物は重篤な状態が続き、数日間活動と摂食とが減退し、そしてほとんどが死亡した。
【０１３８】
実施例１３：抗HMG1抗体による敗血症マウスの治療によりマウスの生存が増加する
重篤な状態にある敗血症マウスを、抗HMG1抗体によって受動免疫することも評価した。この研究において、オスのBalb/cマウス（20〜25グラム）に、本明細書に記載のとおりにCLPを施した。この外科的処置の後の最初の２４時間の時点と、そして三日間にわたって一日に二回、マウス１匹あたり600μgのアフィニティー精製された抗HMG1のＢボックスのポリクローナル抗体または（コントロールとしての）ウサギのIgGを投与した。生存率について２週間にわたって監視した。この研究の結果を図１０Ａに示す。これは、コントロール抗体または抗HMG1抗体のいずれか一方で治療された敗血症マウスの生存率のグラフである。この結果は、盲腸の穿刺を開始して２４時間後にマウスに投与した抗HMG1抗体が、非免疫性抗体を投与したものと比較して、死から動物を有意に救った（フィッシャーの直接確率検定によりp<0.02）ことを示している。抗HMG1抗体を投与した後の１２時間以内に治療された動物は、非免疫性抗体を受け取ったコントロールと比較して活動と応答性が高いことを示した。非免疫性抗体で処理された動物は依然として寄り添っており、体毛は乱れ、そして動作が緩慢であったのに対して、治療された動物は顕著に好転し、そして４８時間以内に通常の摂食行動を再開した。このモデルにおいて、抗HMG1抗体は細菌の増殖を抑制しなかった。なぜなら、我々は治療した動物のCLPの３１時間後の脾臓から比較可能な細菌数（ＣＦＵ、好気性菌のコロニー形成単位）を観察し、無関係の抗体を受け入れた動物（コントロールの細菌数＝3.5±0.9×104CFU/g；n=7）と比較したからである。その後、最大で２週間動物を監視したところ、遅発性の死亡は見られなかった。このことは、抗HMG1による治療によって致命的な敗血症から完全に救命され、そして単なる遅発性の死亡も起こさないことを示唆した。
【０１３９】
我々の知る限り、敗血症が始まってからそれほどまで遅れて投与した場合、同じ程度に効果的な、特定のサイトカインを標的とした他の治療法はない。比較すると、このモデルにおいて抗TNFを投与することは、実際に死亡率を高めており、そして盲腸の穿刺をしてから８時間を超過した後に投与しても、抗MIF抗体は役に立たない（Remickら、上掲;およびCalandraら、Nature Med. 6: 164-170, 2000）。これらのデータから、死に至るケースであると確立された敗血症から救命するために、盲腸の穿刺から２４時間後ほどの長時間が経過してもHMG1を標的にすることが可能であることが明らかにされる。
【０１４０】
抗Ｂボックス抗体を用いて内毒素血症のマウスを救命するという別の例において、抗HMG1のＢボックス抗体のLPS−誘導性敗血症マウスを救命する能力について評価した。オスのBalb/cマウス（20〜25グラム、グループあたり26匹）に75％致死量のLPS（15mg／kg）を腹膜内に注入（IP）して、これらを処理した。LPS投与の０時間後、＋１２時間後および＋２４時間後の時点で、抗HMG1のＢボックスまたは非免疫性のウサギの血清（それぞれの時点でマウス１匹あたり0.3mL、IP）を与えた。マウスの生存率を時間経過に対して評価した。この研究の結果を図１０Ｂに示す。この図は、抗HMG1のＢボックス抗体または非免疫性血清を投与された敗血症マウスの生存率のグラフである。図１０Ｂに示されるように、抗HMG1のＢボックス抗体によって、敗血症マウスの生存率が改善された。
【０１４１】
実施例１４：抗RAGE抗体を用いるHMG1のシグナル経路の阻害
これまでのデータによって、脳の発達期間中の神経突起の伸長および創傷治癒における平滑筋細胞の移動に介在することができるHMG1のレセプターとして、RAGEが関与していることが示されている（Horiら、J. Biol. chem. 270: 25752-25761, 1995；Merenmiesら、J. Biol. Chem. 266: 16722-16729, 1991;およびDegryseら、J. Cell Biol. 152: 1197-1206, 2001）。我々は、抗RAGE抗体（25μg/mL）または非免疫性IgG（25μg/mL）の存在下で、HMG1（1μg/mL）、LPS（0.1μg/mL）、またはHMG1のＢボックス（1μg/mL）を用いて刺激されたRAW 264.7培養物における、TNFの放出を測定した。簡潔に言えば、この細胞を24穴組織培養プレート内に播き、そして90％の集密度にて用いた。LPS（大腸菌0111：B4、Sigma, St Louis, MO）を、使用前に２０分間超音波処理した。図１１Ａに示されているように、抗RAGE抗体（25μg/mL）または非免疫性IgG（25μg/mL）が存在する無血清Opti-MEM I培地（Life Technologies）中で、HMG1（1μg/mL）、LPS（0.1μg/mL）、またはHMG1のＢボックス（1μg/mL）によって、１６時間かけて細胞を処理し、そして本明細書に記載されているL929細胞毒性アッセイを用いてTNFを測定するために、上清を回収した。使用前に、IgGで精製されたポリクローナル抗RAGE抗体（カタログ番号sc-8230、N-16、Santa Cruz Biotech, Inc., Santa Cruz, CA）を、PBSに対して充分に透析した。この研究の結果を図１１Ａに示す。この図は、抗RAGE抗体または非免疫性IgG（コントロール）の存在下におけるHMG1、LPS、またはHMG1のＢボックスの、RAW264.7細胞からのTNFの放出に与える影響のヒストグラムである。図１１Ａに示されるように、非免疫性IgGと比較すると、抗RAGE抗体はHMG1のＢボックス誘導性のTNF放出を顕著に阻害した。この抑制は特異的であったなぜなら、抗RAGEはLPS刺激性のTNF放出をそれほど阻害しなかったからである。とりわけ、抗RAGEの最大の阻害効果はHMG-1のシグナル伝達をわずか40％低下させる程度であり、このことは、他のシグナル伝達経路がHMG1のシグナル伝達に関与している可能性を示唆する。
【０１４２】
HMG1またはHMG1のＢボックスがNF-kB-依存性ELAMプロモーターに与える影響を調べるために、次の実験を行った。マウスのMyD88-ドミナントネガティブ（DN）変異体（これはアミノ酸146〜296に対応する）をコードする発現プラスミドまたは空のベクターに加えて、NF-kB-依存性ELAMプロモーターのコントロール下にあるルシフェラーゼレポータープラスミドを用いて、Meansら（J. Immunol. 166: 4074-4082, 2001）によって記述されたようにして、RAW 264.7マクロファージの一過性共トランスフェクションを行った。次いで、全長HMG1（100ng/mL）、または精製HMG1のＢボックス（10μg/mL）によって、細胞の一部を５時間刺激した。次いで、細胞を回収し、そして、標準的な方法を利用してルシフェラーゼ活性を測定した。すべてのトランスフェクションを三通り実施し、少なくとも三回繰り返し、そしてただ一つの代表的な実験を図１１Ｂに示す。図１１Ｂに示されるように、HMG1は、MyD88ドミナントネガティブ体で同時トランスフェクションが行われていないサンプル中のルシフェラーゼ活性を刺激し、そしてMyD88ドミナントネガティブ体で同時トランスフェクションが行われたサンプル中では、刺激のレベルが減少した。この結果はHMGのＢボックスが投与されたサンプル中でも見られた。
【０１４３】
HMG1またはHMG1のＢボックスがNF-kBの活性化に与える影響についても調べた。恒常的にヒトトール様レセプター２（TLR2）またはヒトトール様レセプター４（TLR4）を発現するCHOレポーター細胞系については、既に記述されている（Meansら、J. Immunology, 163: 3920-3927, 1999）。これらのレポーター系は安定的にトランスフェクションが行われたELAM-CD25レポーター遺伝子も含有し、そしてNF-kBの活性化の結果として、それらの表面上にヒトCD25を発現する。IL-1（10ng/mL）、精製全長HMG-1（100ng/mL）、または精製Ｂボックス（10μg/mL）によって、CHO/TLR2細胞およびCHO/TLR4細胞が１８時間の間に刺激を受けた。刺激の次に、PE-標識化抗CD25モノクローナル抗体によって細胞を染色し、そしてフローサイトメトリーによってCD25の表面発現を測定した。この研究の結果を図１１Ｃに示す。刺激されなかったおよび刺激された細胞集団であって、平均的なFL1の蛍光に基づく下位の5％の細胞を排除するために留められた細胞集団中の、CD25+細胞のパーセントの割合（活性化の倍率）としてデータが表現されている。CHO/TLR4細胞では、HMG1およびHMG1のＢボックスのそれぞれによる刺激によって、CHO/TLR2サンプルと比較してCD25の発現が減少した。
【０１４４】
抗RAGE抗体、抗TLR2抗体、抗RAGE抗体と抗TLR2抗体との組み合わせまたはIgGが、RAW264.7細胞におけるHMG-1−介在性のTNF放出に与える影響についても調べた。RAW264.7細胞を24穴組織培養プレート内に播き、そして90％の集密度にて用いた。抗RAGE抗体（カタログ番号sc-8230、Santa Cruz Biotech, Inc., Santa Cruz, CA）、抗ＴＬＲ２抗体（アフィニティー精製されたポリクローナル抗体、カタログ番号sc-12504、D17、Santa Cruz Biotech, Inc.）またはIgG（非免疫性IgG、Sigma, St. Louis, MO）がある場合または無い場合に分けて、ポリミキシンＢ（100単位/mL、Sigma, St. Louis, MO）を含有するOptimum I培地（Life Technologies, Grand Island, NY）中で、HMG-1と一緒に細胞のインキュベーションを１６時間行った。使用前に、抗体をPBSに対して透析してアジ化ナトリウムを除去した。調整済みの培地を回収し、そして標準的なELISA法を利用して、TNFのELISAを行った。HMG-1単独によって得られた活性のパーセントとして、データ（n=3）を表した。この研究の結果を図１１Ｄに示す。抗RAGE抗体および抗ＴＬＲ２抗体は両者とも、HMG-1−介在性のTNF放出を有意に（＊P<0.05）阻害した。IgGは無関係であったのに対して、二種の抗体を組み合わせたものには、TNF放出の阻害についての相加効果が見られた。
【０１４５】
好ましい態様を参照して、本発明を詳細に示しかつ記載してきた。当業者によれば、添付の請求の範囲に含まれる本発明の意図から離れることなく、種々の形状および細部を変更してもよいことが理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】図１は、HMG1の変異体およびそれらのTNF放出に関する活性（pg/mL）の概略図である。
【図２−１】図２Ａは、RAW264.7細胞において、0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、または10μg/mLのＢボックスが、TNFの放出（pg/mL）に与える効果を示すヒストグラムである。図２Ｂは、RAW264.7細胞において、0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、または10μg/mLのＢボックスが、IL-1βの放出（pg/mL）に与える効果を示すヒストグラムである。図２Ｃは、RAW264.7細胞において、0μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、または10μg/mLのＢボックスが、IL-6の放出（pg/mL）に与える効果を示すヒストグラムである。
【図２−２】図２Ｄは、RNアーゼ・保護・アッセイのブロットのスキャンイメージであり、（投与後０時間、４時間、８時間、もしくは２４時間の時点の）Ｂボックスまたは（投与後４時間の時点の）ベクターのみが、RAW264.7細胞におけるTNFのｍRNA発現に与える影響を示している。図２Ｅは、HMG1のＢボックスの投与０時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、３２時間後、または４８時間後における、RAW264.7細胞からのTNFタンパク質放出（pg/mL）に与える効果のヒストグラムである。図２Ｆは、ベクターの投与０時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、３２時間後、または４８時間後における、RAW264.7細胞からのTNFタンパク質放出（pg/mL）に与える効果のヒストグラムである。
【図３】図３は、HMG1のＢボックスの変異体およびそれらのTNF放出に関する活性（pg/mL）の概略図である。
【図４Ａ】図４Ａは、0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、または25μg/mLのHMG1のＡボックスタンパク質が、RAW264.7細胞から放出されるTNFに与える影響の（HMG1介在性のTNF放出のみのパーセントとしての）グラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、HMG1（0もしくは1.5μg/mL）、HMG1のＡボックス（0もしくは10μg/mL）、またはベクター（0もしくは10μg/mL）単独、またはこれらの組み合わせが、RAW264.7細胞から放出されるTNFに与える影響の（HMG1介在性のTNF放出のみのパーセントとしての）ヒストグラムである。
【図５】図５Ａは、長期間（分間）にわたるRAW264.7細胞に結合する125I-HMGB1の結合性（CPM/ウェル）のグラフである。図５Ｂは、非標識のHMGB1もしくはHMG1のＡボックスが存在しない場合の４℃で２時間の間（総量）、または非標識HMGB1（HMGB1）もしくはＡボックス（Ａボックス）が5,000モル濃度過剰に存在する場合の125I-HMGB1の結合性のヒストグラムであり、ウェルあたりのCPMの総量のパーセントとして測定される。
【図６】図６は、HMG-1（0μg/mLもしくは1μg/mL）もしくはHMG1のＢボックス（0μg/mLもしくは10μg/mL）の単独のもの、または抗Ｂボックス抗体（25μg/mLもしくは100μg/mL）もしくはIgG（25μg/mLもしくは100μg/mL）と組み合わせたものが、RAW264.7細胞からのTNF放出に与える影響のヒストグラムである（HMG1介在性のTNF放出のみのパーセントとして表される）。
【図７−１】図７Ａは、非処理マウスから得られた腎臓の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージである。図７Ｂは、HMG1のＢボックスを投与されたマウスから得られた腎臓の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージである。図７Ｃは、非処理マウスから得られた心筋層の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージである。図７Ｄは、HMG1のＢボックスを投与されたマウスから得られた心筋層の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージである。図７Ｅは、非処理マウスから得られた肺の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージである。図７Ｆは、HMG1のＢボックスを投与されたマウスから得られた肺の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージである。図７Ｇは、非処理マウスから得られた肝臓の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージである。図７Ｈは、HMG1のＢボックスを投与されたマウスから得られた肝臓の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージである。
【図７−２】図７Ｉは、非処理マウスから得られた肝臓の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージ（高倍率）である。図７Ｊは、HMG1のＢボックスを投与されたマウスから得られた肝臓の切片標本をヘマトキシリンおよびエオシンで染色したもののスキャンイメージ（高倍率）である。
【図８】図８は、盲腸結紮穿刺（CLP）を施されたマウスにおけるHMGB1のレベル（ng/mL）の、時間（時間）に関するグラフである。
【図９】図９は、Ａボックス（60μg/マウスもしくは600μg/マウス）または未処理が、盲腸結紮穿刺（CLP）後のマウスの生存に与える影響の、時間（日間）に関するグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、抗HMG1抗体（黒丸）または未処理（白丸）が、盲腸結紮穿刺（CLP）後のマウスの生存に与える影響の、時間（日間）に関するグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、  抗HMG1のＢボックスの抗血清（黒四角）または未処理（＊）が、リポ多糖体（LPS）を投与されたマウスの生存（日間）に与える影響のグラフである。
【図１１−１】図１１Ａは、抗RAGE抗体または非免疫性IgGが、HMG1（HMG-1）、リポ多糖体（LPS）、またはHMG1のＢボックス（Ｂボックス）によって処理されたRAW264.7細胞からのTNFの放出に与える影響のヒストグラムである。
【図１１−２】図１１Ｂは、HMG1またはHMG1のＢボックスポリペプチドの刺激が、マウスのMyD88-ドミナントネガティブ（+MyD 88 DN）変異体（これはアミノ酸146〜296に対応する）または空のベクター（-MyD 88 DN）によって同時トランスフェクションを受けたRAW264.7細胞中におけるNFkB-依存性ELAMプロモーターの（ルシフェラーゼ活性によって測定される）活性化に与える影響のヒストグラムである。刺激されなかったおよび刺激された細胞からの、ルシフェラーゼの（バックグラウンドが差し引かれた）平均値の割合（活性化の倍率）＋標準偏差としてデータが表現されている。図１１Ｃは、IL-1、HMG1、またはHMG1のＢボックスによって刺激を受けた、構成的にヒトＴＬＲ２（白塗りの棒）またはヒトＴＬＲ４（黒塗りの棒）を発現するCHOレポーター細胞系が、CD25の発現に与える影響のヒストグラムである。刺激されなかったおよび刺激された細胞集団であって、平均的なFL1の蛍光に基づく下位の５％の細胞を排除するために留められた細胞集団中の、CD25+細胞のパーセントの割合（活性化の倍率）としてデータが表現されている。図１１Ｄは、抗RAGE抗体、抗TLR2抗体、抗RAGE抗体および抗TLR2抗体を共に、またはIgGを投与することが、RAW264.7細胞における（抗体が無い場合のTNF放出のパーセントとして測定される）HMG1−介在性のTNF放出に与える影響のヒストグラムである。
【図１２−１】図１２Ａは、ヒトHMG1ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１）である。図１２Ｂは、ラットおよびマウスHMG1のアミノ酸配列（配列番号：２）である。図１２Ｃは、ヒトHMG2のアミノ酸配列（配列番号：３）である。図１２Ｄは、ヒト、マウス、およびラットHMG1のＡボックスポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４）である。図１２Ｅは、ヒト、マウス、およびラットHMG1のＢボックスポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５）である。図１２Ｆは、ヒトHMG1についてのフォワードプライマーの核酸配列（配列番号：６）である。図１２Ｇは、ヒトHMG1についてのリバースプライマーの核酸配列（配列番号：７）である。図１２Ｈは、ヒトHMG1のカルボキシ末端変異体についてのフォワードプライマーの核酸配列（配列番号：８）である。図１２Ｉは、ヒトHMG1のカルボキシ末端変異体についてのリバースプライマーの核酸配列（配列番号：９）である。
【図１２−２】図１２Ｊは、ヒトHMG1のアミノ末端＋Ｂボックス変異体についてのフォワードプライマーの核酸配列（配列番号：１０）である。図１２Ｋは、ヒトHMG1のアミノ末端＋Ｂボックス変異体についてのリバースプライマーの核酸配列（配列番号：１１）である。図１２Ｌは、ヒトHMG1のＢボックス変異体についてのフォワードプライマーの核酸配列（配列番号：１２）である。図１２Ｍは、ヒトHMG1のＢボックス変異体についてのリバースプライマーの核酸配列（配列番号：１３）である。図１２Ｎは、ヒトHMG1のアミノ末端＋Ａボックス変異体についてのフォワードプライマーの核酸配列（配列番号：１４）である。図１２Ｏは、ヒトHMG1のアミノ末端＋Ａボックス変異体についてのリバースプライマーの核酸配列（配列番号：１５）である。
【図１３】図１３は、ラット（配列番号：２）、マウス（配列番号：２）、およびヒト（配列番号：１８）からのHMG1ポリペプチド配列のアラインメントである。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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