(57)【要約】本発明は、ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、官能基を含み、環状コア構造を示すスキャフォールドを準備し；スキャフォールドの環状構造を保持したまま、残基Rと結合した反応基を含む試薬を用いて、該スキャフォールドの官能基と該反応基を反応させることによりスキャフォールドを誘導体化し；得られた誘導体の環状構造を開環させ；その生成物と、反応基を含むベースマトリックスを反応させることを含む方法を提供する。このスキャフォールドは少なくとも2つの官能基(1つはベースマトリックスの反応基と結合させるための硫黄含有基であり、1つはイオン基へと転換可能な基である)を提供する。【化１】2005517517.tif 000018
2005517517.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)各々が官能基Fを含み、環状コア構造を示す少なくとも1つのスキャフォールドを準備し、
(b)スキャフォールドの環状構造を保持したまま、残基Rと結合した反応基Zを含む試薬を用いて、該スキャフォールドのF基と該試薬の反応基を反応させることによりスキャフォールドを誘導体化し、
(c)得られた誘導体の環状構造を開環させ、
(d)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を反応させる
ステップを含み、該スキャフォールドが少なくとも2つの官能基(1つはベースマトリックスの反応基と結合させるための硫黄含有基であり、1つはイオン基へと転換可能な基である)を提供し、これらの官能基は環状構造上の隣接した位置に存在し、ステップ(c)において開環が2つの官能基間の結合を切断することによってなされる、方法。
【請求項２】
スキャフォールドが一般式(I)
【化１】
2005517517.tif 000014
[式中、A、BおよびXは互いに無関係に炭素原子、または酸素、硫黄、窒素および／またはシリカなどの任意のヘテロ原子であり、mは0〜4の間、例えば1〜3の間の任意の整数、好ましくは1または2であり、官能基Fは1つのXで表されるか、または所望によりリンカーを介してA、BおよびXのいずれか1つと結合した形で表され、該リンカーは1〜50個の原子からなる]
で定義できる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式(I)において官能基FがC-Y(ここで、Yは例えばBr、Cl、I、メシレートまたはトシレートを表す)など、通常求核置換に用いられるような脱離基；酸、またはWC=O(ここで、Wは例えばN-ヒドロスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール、パラ-ニトロフェノールまたはクロロ蟻酸イソプロピルから形成される)などの活性化酸；例えば-OH、-SHまたは-NH2などの求核基；およびC=Cを含む群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
式(I)においてA、BおよびXが炭素原子であり、mが1であり、Fが-NH2である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式(I)においてスキャフォールドがホモシステインチオラクトン：
【化２】
2005517517.tif 000015
である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(b)で用いられる誘導体化剤が一般式
【化３】
2005517517.tif 000016
[式中、
Zはスキャフォールドの官能基Fと反応しうる基であり、
Rは、好ましくは約1〜20個、例えば1〜10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝状、環状の飽和、不飽和および芳香族炭化水素基である]
で示すことができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)環状構造を有する少なくとも1つのスキャフォールド誘導体を準備し、
(b)誘導体の環状構造を開環させ、
(c)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を反応させる
ステップを含み、該スキャフォールド誘導体が一般式(III)
【化４】
2005517517.tif 000017
[式中、A、BおよびXは互いに無関係に炭素原子、または酸素、硫黄、窒素および／またはシリカなどの任意のヘテロ原子であり、mは0〜4の間、例えば1〜3の間の任意の整数、好ましくは1または2であり、該官能基は環状構造上の隣接した位置に存在し、ステップ(c)において開環が2つの隣接する位置の間の結合を切断することによってなされ、Z-RがA、BおよびXのいずれか1つと結合している]
で定義できる、方法。
【請求項８】
Rが、好ましくは約1〜20個、例えば1〜10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝状、環状の飽和、不飽和および芳香族炭化水素基である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
スキャフォールド誘導体がホモシステインチオラクトン誘導体である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ(b)とは別にその前に、ベースマトリックスの反応基(該反応基は炭素-炭素二重結合である)を臭素化するステップも含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(b)とは別にその前に、ベースマトリックスの反応基(該反応基は炭素-炭素二重結合である)をラジカル反応に好ましい条件下で活性化するステップも含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項２〜５のいずれか一項に記載の一般式(I)で定義される化合物、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の一般式(III)で定義される誘導体を含むキットであって、固体としての該化合物または誘導体を、分離媒体として用いるための、ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドの製造においてそれを用いるための使用説明書とともに含む、キット。
【請求項１３】
高塩リガンドを製造するためのキットである、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体の結合特性を至適化する方法であって、
(a)活性化スキャフォールド誘導体水溶液を準備し、
(b)この溶液を、第一の特性によって定義され、該スキャフォールド誘導体と結合しうるベースマトリックス粒子の懸濁液と接触させ、
(c)溶液を粒子から分離し、
(d)この分離した溶液を、第一の特性とは異なる特性によって定義され、該スキャフォールド誘導体と結合しうるベースマトリックス粒子の懸濁液と接触させ、
(e)溶液を粒子から分離し、
(f)所望によりステップ(d)および(e)を1回または数回繰り返し、
(g)このようにして得られた分離媒体の容量を通常のイオン交換実験によって評価する
ステップを含む方法。
【請求項１５】
該特性が活性化スキャフォールドに結合しうるベースマトリックス粒子に存在する活性基の濃度である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該特性が活性化スキャフォールドに結合しうるベースマトリックス粒子に存在する活性基の性質である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
スキャフォールド誘導体が請求項１〜８のいずれか一項に記載のように製造される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は分離、特に混合モード陽イオン交換リガンドを用いたイオン交換による分離の分野に関する。より詳しくは、本発明は、混合モード陽イオン交換体を製造する方法、また、このような製造のために必須の出発材料を含むキットに関する。
【０００２】
背景
クロマトグラフィーとは、密接に関連する一連の分離方法を包含する。クロマトグラフィーと他のほとんどの物理的・化学的分離方法とを区別する特徴は、一方の相は固定されており、他方の相が移動する2つの相互に不混の相を接触させるということである。移動相へ導入したサンプル混合物は移動相によってシステムを通って運ばれるので、固定相および移動相以前に何回も一連の相互作用(分配)を受ける。相互作用はサンプル中の成分の物理的または化学的特性の違いを用いている。これらの違いは、固定相を含むカラムを移動する移動相の影響下で個々の成分の移動速度を規定する。固定相との相互作用が高まる順に分離された成分が現れる。最も保持性の低い成分が最初に溶離し、最も強く保持された物質が最後に溶離する。サンプル成分がカラムから溶離する際に、ある成分が隣り合った溶質の領域と重ならないように十分に遅れる場合に分離が得られる。
【０００３】
カラムはクロマトグラフィーの中枢であり、単独の装置によって得ることのできる、その装置種に用途の広さを与える。特に、特定の各々の目的に最適な固定相を設計するために多大な努力が続けられている。このような固定層は通常、官能基、すなわち結合基を含むリガンドを結合させた支持体またはベースマトリックスからなる。容易に理解されるように、リガンドの選択は膨大であるが、概説として、いくつかの異なるクラスのリガンドを以下に示す。
【０００４】
アフィニティー吸着では、セリンプロテアーゼが、パラアミノ基を介してp-アミノベンズアミジンを共有結合させたマトリックスに吸着／脱着されている。
【０００５】
混合モード陰イオン交換体は例えばWO 9729825 (Amersham Pharmacia Biotech AB)に開示されており、電荷、および酸素と正電荷アミン窒素から炭素原子2〜3個離れたところにあるアミノ窒素が関与する水素結合に基づく相互作用が得られる。この公報は、この種のリガンドが結合物質を溶離させるのに相対的に高いイオン強度を必要とする陰イオン交換体となりうるという発見に基づいている。
【０００６】
結合物質を溶離させるのに相対的に高いイオン強度を必要とする混合モードリガンドが存在する陽イオン交換体が、WO 9965607 (Amersham Pharmacia Biotech AB)で提案されている。さらに、WO 9729825(米国特許第6,090, 288号)およびWO 9965607では、いずれも相対的に高い溶離イオン強度を必要とする陰イオンおよび陽イオン交換リガンドが記載されている。
【０００７】
一般構造M-SP1-L(ここで、Mは親水性でありうる支持体マトリックスであり、SP1はスペーサーであり、Lは置換されていてもよい単環式または二環式ホモ芳香族またはヘテロ芳香族部分を含む。なお、このホモ芳香族部分は炭素原子だけで形成される芳香環を含む)の分離媒体がWO 9808603 (Upfront Chromatography)に開示されている。これらの置換基は主として酸性のものである。この分離媒体はイオン交換ではなくむしろ疎水性相互作用による、タンパク質、特に免疫グロブリンの吸着のために提案されている。
【０００８】
WO 9600735、WO 9609116および米国特許第5,652,348号(Burton et al)も、疎水性相互作用に基づく分離媒体を開示している。吸着および脱着は、液体の塩濃度の各々上昇または低下により、またはpHの変化により吸着／脱着するリガンドおよび／または物質上の電荷の変化により支持される。リガンドは典型的には、芳香族構造を含みうる疎水性部分を含む。また、リガンドの幾つかは、pH変化による媒体の疎水性／親水性バランスの変更を可能にするための荷電可能な構造も含みうる。荷電可能な構造は、アミン基でありうる。
【０００９】
最後に、米国特許第5,789, 578号(Burton et al)は、支持体マトリックスに結合した炭素-炭素二重結合にチオール基を付加することにより、3-メルカプトプロピオン酸、グルタチオンなどのチオール含有リガンドを固定化することを提案している。
【００１０】
しかし、所望のリガンドの構造が決定されたとしても、さらにその適した調製方法の選択に重要な懸念が残る。
【００１１】
例えば、最近、高塩リガンドと呼ばれる新種のリガンドが開示されている(例えばWO 0011605 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)参照)。これらのリガンドは混合モード陽イオン交換リガンドとして機能することができ、高塩濃度に耐えることができ、従ってサンプルを実質的に希釈する必要がないので、タンパク質精製などの多くの工業用途で大いに注目されていることが示されている。このように高塩リガンドは、これまでに記載されている方法に比べて必要なサンプルの総量が少なくなり、従ってこのような適用に必要とされる設備ならびに労力の総コストが低減されるので、分離に有利に用いられる。
【００１２】
しかし、混合モード陽イオン交換リガンドが、分離に用いた場合のコストおよび労力を低減したとしても、これまでに記載されているその調製方法は、それらを実用上不利なものとする欠点を含む。一般に、良好な多様性を得るために、このようなリガンドの調製は4つのステップを含む。すなわち、
(i)クロマトグラフィー支持体に反応基を導入し、所望によりこれを活性化する
(ii)結果的に修飾された支持体を酸性基を含有するチオール化合物と反応させる
(iii)固相支持体の酸性基を有機溶媒中好適な試薬(例えば、DCCの存在下でのNHS)で活性化させる
(iv)好適な残基Rを含むアミノ酸誘導体を付加して、支持体に結合された最終的なリガンドを得る。
上記に開示された一連のステップに伴う1つの問題は、実際には結果として2種の異なるリガンド、すなわちステップ(iii)または(iv)においてうまくいかなかった変換から生じる酸基を含有するチオエーテルリンカーと目的の最終生成物を含む生成物が得られるということである。このような2種の異なるリガンドの混合物からなるクロマトグラフィー支持体を分離工程に用いた場合にはいくつかの問題が起こりうる。例えば、分析が困難となり、一般に必要とされているような確実な調製および使用方法でなくなる。同じ理由から、媒体が2種のリガンドの混合物として得られる場合、特定の各々の適用のためにこのようなクロマトグラフィー支持体の調製および使用を至適化することが困難となる。また、このような混合物は本質的に、よく定義された媒体よりも特異的分離が劣る。
【００１３】
また、上記の従来の方法に関わるもう1つの問題としては、ステップ(i)からの手順において大きなクロマトグラフィー支持体分子が存在するということである。言い換えれば、全手順を大容量で行う必要があり、極めて特殊な大規模設備が必要となり、このような設備の稼働に内在する実質的コストが必要となる。
【００１４】
上記に開示される先行技術に伴うさらにもう1つの欠点は、全てのステップが固相支持体で行われるということである。上述の大規模な特殊設備の使用はまた、さらに時間がかかり複雑な洗浄工程に関わるさらなる不利な点も含む。特に水性溶媒から有機溶媒およびその逆に移行するステップ(ii)〜(iii)および(iii)〜(iv)がそうである。
【００１５】
現在のところ機能的に上記の方法に代わるものはないので、本分野では、分離工程に用いられる混合モード陽イオン交換リガンドの製造のための改良法が必要である。
【００１６】
発明の概要
よって、本発明の1つの目的は、混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、得られたリガンドの組成の制御が容易な方法を提供することである。この目的は付属のクレームに記載のような新規なスキャフォールドまたはスキャフォールド誘導体を出発材料として用いることにより達成することができる。
【００１７】
本発明のもう1つの目的は、混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法を提供し、本方法は簡略化され、これまでに記載の方法よりもコストが低い。この目的は試薬を含む固相支持体またはゲルが、付属のクレームに記載のように、最終のステップまでプロセスに導入されない(これにより従来必要であった多量の試薬が必要なくなる)方法によって達成することができる。この目的はまた、付属のクレームに開示されているように、これまでに開示されている方法よりも全体として必要なステップが少ない方法によって達成することができる。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、これまでに記載されている方法よりも環境上許容性の高い代替物からなる方法を提供することである。この目的は、付属のクレームに記載のように、先行技術の方法よりも必要とされる溶媒が少ない方法によって達成することができる。また、本発明の方法が全体的に少量で行うことができるという上記で開示された特徴はまた、少量であることで必要な洗浄液が少なく、エネルギー消費も少なくなるので、環境上より有利な代替法の一助となる。
【００１９】
本発明のさらなる目的および利点は以下の詳細な説明から明らかとなる。
【００２０】
定義
「負電荷を有する」および「負に帯電する」とは、その物質が1以上の負電荷を有し、かつ／または正味の負電荷を有することを意味する。
【００２１】
本明細書において「混合モード陽イオン交換リガンド」および「多モード陽イオン交換リガンド」とは、結合させる物質と相互作用する少なくとも2つの異なる、しかし、共働作用する部位を提供しうるリガンドをさす。これらの部位の一方はリガンドと目的物質の間の誘引型の電荷-電荷相互作用を与える。もう一方の部位は典型的には電子アクセプター-ドナー相互作用および／または疎水性および／または親水性相互作用を与える。電子ドナー-アクセプター相互作用としては、水素結合、π-π、電荷移動、双極子-双極子、誘起双極子などのような相互作用が挙げられる。
【００２２】
「媒体」とは、ベースマトリックス、すなわち、クロマトグラフィーに用いる支持体と結合したリガンド、すなわち、結合基を含む。本明細書においてこれには液体は含まない。
【００２３】
「高塩」リガンドとは、同じ条件下で操作する参照イオン交換体に比べて相対的に高い塩濃度(例えば、0.3M NaCl)の存在下でタンパク質と結合しうるリガンドをさす。これは実験の部で後述されるような先端分析法を用いて調べることができる。
【００２４】
「電子ドナー-アクセプター相互作用」とは、電子の遊離対を有する負電荷原子がドナーとして働き、ドナーの電子対のアクセプターとして働く電子不足原子と結合することを意味する(例えば、Karger et al. , An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973) 42頁参照)。
【００２５】
典型的なアクセプター原子／基は、金属イオン、シアノ、ニトロ中の窒素などのような電子不足原子または基であり、ヒドロキシおよびカルボキシ中のHO-、アミドおよびアミン中の-NH-、チオール中のHS-などのような負電荷原子への水素結合を含む。
【００２６】
陽イオン交換体とは、除去する物質が正電荷を有し、陽イオン交換体が負に帯電している(=陽イオン交換体条件)ことを意図する。水性の液体中に存在する両性物質については、これはpH≦pI+0.5、好ましくはpH≦pIを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】上記「背景」の節で一般用語として示したような多モード陽イオン交換体の通常の合成の一例を示す。
【図２】スキャフォールドとしてホモシステインチオラクトンを用いた多モード陽イオン交換体の合成のための本発明の一実施例を示す。
【図３】例としてのスキャフォールドホモシステインチオラクトンによる、多モード陽イオン交換体ライブラリーの多様性の例を示す。
【図４】同じセットの反応性溶液から異なる媒体ライブラリーを合成する一般法を概略的に図示する。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明の第一の態様は、ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)各々が官能基Fを含み、環状コア構造を示す少なくとも1つのスキャフォールドを準備し、
(b)スキャフォールドの環状構造を保持したまま、残基Rと結合した反応基を含む試薬を用いて、該スキャフォールドのF基と該試薬の反応基を反応させることによりスキャフォールドを誘導体化し、
(c)得られた誘導体の環状構造を開環させ、
(d)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を反応させる
ステップを含み、該スキャフォールドが少なくとも2つの官能基(1つはベースマトリックスの反応基と結合させるための硫黄含有基であり、1つはイオン基へと転換可能な基である)を提供し、これらの官能基は環状構造上の隣接した位置に存在し、ステップ(c)において開環が2つの官能基間の結合を切断することによってなされる方法である。ステップ(C)の加水分解は例えば塩基の付加またはその他いずれかの好適な方法によって行うことができる。硫黄含有基の機能は、クロマトグラフィー支持体に容易かつ安定な接着点を提供することである。例えばS-H基の求核性が高くなれば、求核置換またはラジカル付加によるカップリングにおいて高い効率が得られる。
【００２９】
ある実施形態では、ステップ(c)の環状構造の開環は、下記実験の部のAで例示されるように、水酸化ナトリウムの添加によるなど、加水分解により行われる。もう1つの実施形態では、このような開環は、下記実験の部のBで例示されるように、アミノ酸またはアミンの添加によるなど、求核剤の添加により行われる。しかし、この環状構造を開環させるのに、求核置換をもたらすいずれの化合物を添加してもよい。必要なことは、開環によりイオン基へと変換可能な1つの基と、ゲルおよび／またはスペーサーとの結合に実質的に利用できる1つのチオール基が生じることということだけである。
【００３０】
より詳しくは、本方法の1つの実施形態では、スキャフォールドは一般式(I)
【化１】
2005517517.tif 000003
[式中、A、BおよびXは互いに無関係にsp2またはsp3混成軌道を有する炭素原子、または酸素、硫黄、窒素および／またはシリカなどの任意のヘテロ原子である]
で定義される。簡単な実施形態では、A、BおよびXは全て炭素原子である。mは0〜4、例えば1〜3の任意の整数、好ましくは1または2であり、多くの適用では1である。当業者には分かるであろうが、数値mは最終的な分離媒体におけるリガンドの長さに影響を及ぼす。従ってこれは、例えば混合モード陽イオン交換リガンド上の選択された活性基、意図する分離、ベースマトリックスとその上にある反応基の間にスペーサーがあるかないかによって決める。官能基Fは1つのXで表されるか(すなわち、環状構造に組み込まれている一部として)、またはおそらくリンカーを介してA、BおよびXのいずれか1つと結合した形で表される。このようなリンカーは最終的な分離媒体の目的の特性によって、1〜50個からなり、この際に主として考慮することは本分離媒体製造法に望ましくない副作用が起こらないようにするということである。このリンカーの所望の特性は、主としてベースマトリックスと反応基の間のスペーサーの特性に対応している。
【００３１】
より詳しくは、上記のスペーサー自体は従来のイオン交換体においてと同様に通常のものであり、従って、直鎖、分枝状、環状構造の飽和、不飽和および芳香族炭化水素基を含みうる(例えば、1〜20、例えば1〜10までの炭素原子を有する)。このような基は水酸基、ハロゲン、アルコキシおよびアリールオキシ、ならびに対応するチオ類似体、および／またはアミノ基を含みうる。炭素鎖は1以上の位置において、特定の適用ではアミノ窒素、エーテル酸素、チオエーテル硫黄などが挿入されていてもよい。また、アミドおよびケトンにおけるようにカルボニル基、および加水分解に対して相応の安定性を有するその他の基が存在してもよい。酸素、硫黄および窒素から選択される多くて1つの原子は、同じ1つのSp3混成軌道を有する炭素原子と結合していることが好ましい。さらにこのスペーサーは、例えば水素化都合、π相互作用、疎水性または親水性相互作用などに関わることによって上述したように物質と陽イオン交換体との結合を増強する1以上の電子ドナーまたはアクセプター原子または基を提供しうる。
【００３２】
よって、本発明の方法は従来の方法よりもステップが少なく、従って、実施した際に時間が節減でき、そして結果的にコストも節減できる。また、ベースマトリックス(有利にはゲル)が最終のステップまで工程に導入されないので、従来必要であった時間のかかる洗浄工程を制限することで多大な節減もできる。
【００３３】
本発明の方法の1つの実施形態では、式(I)において官能基FがC-Y(ここで、Yは例えばBr、Cl、I、メシレートまたはトシレートを表す)など、通常求核置換に用いられるような脱離基；酸、またはWC=O(ここで、Wは例えばN-ヒドロスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール、パラ-ニトロフェノールまたはクロロ蟻酸イソプロピルからなる)などの活性化酸；例えば-OH、-SHまたは-NH2などの求核基；およびC=Cからなる群から選択される。
【００３４】
本方法の有利な実施形態では、式(I)においてA、BおよびXが炭素原子であり、mが1であり、Fが-NH2である。
【００３５】
特に有利な実施形態では、用いるスキャフォールドはホモシステインチオラクトンであり、これは容易に入手できる製品である(例えば、Aldrichまたはその他研究室用化学薬品の周知の供給者より)。
【化２】
2005517517.tif 000004
【００３６】
この実施形態は、現在のところ本発明を実施する最良の様式である。本願の実験の部では、ラセミ混合物のスキャフォールドが用いられている。しかし、当業者ならば、特定の適用において、D型またはL型のいずれか、あるいはそれらを特定の割合で含む混合物を用いるほうが有利である場合もあることが分かるであろう。最適な形態は通常の実験で容易に試験できる。
【００３７】
本発明の方法の1つの実施形態では、ステップ(b)で用いる誘導体化剤は一般式
【化３】
2005517517.tif 000005
[式中、Zは反応基であり、その働きはスキャフォールドの官能基Fと反応することである]で示される。このように、各実施形態では、Zの性質は上述のようにFと反応性があるように選択し、かつ、Rは直鎖、分枝状、環状構造の飽和、不飽和および芳香族炭化水素基(例えば、1〜20、例えば1〜10までの炭素原子を有する)を含みうる。このような基は水酸基、ハロゲン、アルコキシおよびアリールオキシ、ならびに対応するチオ類似体、および／またはアミノ基を有しうる。炭素鎖は1以上の位置において、特定の適用ではアミノ窒素、エーテル酸素、チオエーテル硫黄などが挿入されていてもよい。また、アミドおよびケトンにおけるようにカルボニル基、および加水分解に対して相応の安定性を有するその他の基が存在してもよい。酸素、硫黄および窒素から選択されるせいぜい1つの原子は、同じ1つのSp3混成軌道を有する炭素原子と結合していることが好ましい。さらに、Rは上述したように物質と陽イオン交換体との結合を可能とする1以上の電子ドナーまたはアクセプター原子または基を提供する。Rは、全体として負に帯電し、陽イオン交換体として働きうる場合に最終的なリガンドがフルインターバルウインドウ(full interval window)を提供する荷電基を含んでもよい。
【００３８】
このように、最終的な分離媒体がイオン交換モードに有用であることから、所望により、残基Rはその多モード特性を導入するために用いられる。当業者ならば分かるであろうが、最終媒体は、Rが上述のスペーサーによって隔てられた結合において機能する2以上の部分からなるリガンドを含むことができる。
【００３９】
本発明はまた、本発明の方法の生成物、すなわち、混合モード陽イオン交換リガンド、例えば高塩リガンドも含む。本発明のリガンドは先行技術の方法の結果よりもずっと均一な化合物を製造することができる。本発明に含まれる特定の例は以下の実験の部の表に示す通りである。
【００４０】
本発明の方法の1つの実施形態では、その方法はまた、ステップ(b)とは別にその前に、ベースマトリックスの反応基(該反応基は炭素-炭素二重結合を含む)を臭素化するステップも含む。このような臭素化は当技術分野で周知のものである。
【００４１】
もう1つの実施形態では、本方法は代わりに、ステップ(b)とは別にその前にベースマトリックスの反応基(該反応基は炭素-炭素二重結合を含む)をラジカル反応に好ましい条件下で活性化するステップを含む。ラジカル反応は周知のいずれかの方法、例えばUVなどの光線を用いることでラジカル開始剤として知られる、反応を開始させる化学物質の添加によって開始させることができる。従って、この種の反応および条件は当業者で周知であり、文献にも包括的に述べられている。
【００４２】
しかし、当業者には分かるであろうが、ベースマトリックス上に存在する反応基を制限する基準は、スキャフォールドの環状構造の開環によって生じた末端の一方と十分な程度で反応することができるものでなければならないということだけである。また、これは、最終的な分離媒体で必要とされる構造を壊さないように、開環したスキャフォールド誘導体の残りの部分とは実質的に反応性がないものでなければならない。よって、スキャフォールドの1つの官能基の選択およびベースマトリックス上に存在する反応基の選択は、それらが互いに反応できるように行う必要がある。また、最も簡便な実施形態とはいえないとしても、ベースマトリックス上の反応基は同一であっても異なっていてもよい。
【００４３】
ベースマトリックスについてであるが、有機もしくは無機材料、またはストレアミン型の混成材料(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)のようなそれらの組合せに基づいている。ベースマトリックスは好ましくは親水性であり、不溶性であって水中で多少膨潤するポリマーの形態である。誘導体化して親水性とした疎水性ポリマーもこの定義に含まれる。好適なポリマーとしては、例えばアガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、プルランなどのような多糖類に基づくポリヒドロキシポリマー；ならびにポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)およびポリメタクリレート(例えば、ポリグリシジルメタクリレート)などの完全合成ポリマー；スチレンとジビニルベンゼンに基づくポリビニルアルコールおよびポリマー；ならびに上記ポリマーに対応する2種以上のモノマーが含まれるコポリマーがある。水に可溶なポリマーを、例えば架橋により、または吸着もしくは共有結合を介して不溶性部分と結合させることにより誘導体化して不溶性としてもよい。OH基へ変換できる基を呈するモノマーの重合によるか、または例えば親水性ポリマーなどの好適な化合物を吸着させることで最終的なポリマーを親水化することにより疎水性ポリマー(例えば、モノビニルとジビニルベンゼンのコポリマー)に親水基を導入することもできる。ベースマトリックスに用いられる好適な無機材料としては、シリカ、酸化ジルコニウム、グラファイト、酸化タンタルなどがある。このマトリックスは陽イオン交換リガンドにより均一に誘導体化することもできるし、あるいはまた、特に設計した方法で一部だけを誘導体化することができる。
【００４４】
好ましいマトリックスはシラン、エステル、アミド基のような加水分解に不安定な基およびシリカ自体に存在する基を欠いている。特にこれは使用する液体と直接接触する基に関して特に当てはまる。マトリックスは多孔性でも無孔性でもよい。つまり、マトリックスは取り除く物質に対して全体的または部分的に透過性(多孔性)であっても、完全に不透性(無孔性)であってもよい。あるいはマトリックスは、1〜1000μm、好ましくは高速適用では5〜50μm、分取目的では50〜300μmの範囲の不規則型または球形の粒子形態であってもよい。注目されるマトリックスの形態は、液体より密度の高い、または低いものである。この種のマトリックスは流動床または膨張床クロマトグラフィーならびに種々のバッチ型方式(例えば、攪拌タンク)で大規模操作に特に適用可能である。流動床および膨張床方式はWO 9218237(Amersham Pharmacia Biotech AB)およびWO 9200799(Kem-En-Tek)に記載されている。親水性マトリックスとは、マトリックスの接近可能な表面が、水性リガンドがマトリックスを透過できるという点で親水性であることを意味する。通常、親水性ベースマトリックスの接近可能な表面は、例えば酸素および／または窒素原子を含む複数の極性基を曝す。このような極性基の例としては、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシ、エステル、低級アルキルのエーテル(例えば、(-CH2CH2O-)nH、ここでnは整数)がある。
【００４５】
本発明の第二の態様は、ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)環状構造を有する少なくとも1つのスキャフォールド誘導体を準備し、
(b)誘導体の環状構造を開環させ、
(c)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を結合させる
ステップを含み、該スキャフォールド誘導体が一般式(III)
【化４】
2005517517.tif 000006
[式中、A、BおよびXは互いに無関係にsp2またはsp3混成軌道を有する炭素原子、または酸素、硫黄、窒素および／またはシリカなどの任意のヘテロ原子であり、mは0〜4の間、例えば1〜3の間の任意の整数、好ましくは1または2であり、該官能基は環状構造上の隣接した位置に存在し、ステップ(c)において開環が2つの隣接する位置の間の結合を切断することによってなされ、Z-RがA、BおよびXのいずれか1つ、好ましくはBと結合している]
で定義できる方法である。
ステップ(b)は本発明の第一の態様に関して上述されたように実施することができる。
【００４６】
当業者には分かるであろうが、この態様は、1つの出発生成物が容易に製造できるスキャフォールド誘導体であること以外は、本発明の第一の態様に対応する。よって、第二の態様は、第一の態様を簡略化した代替法であり、スキャフォールドおよび誘導体化剤の性質が容易に保存できる生成物を生成することができる場合に特に有利である。いくつかのケースでは、このような誘導体は商業的に入手可能であるか、一度に製造してその後保存、使用できると考えられる。本態様で用いるスキャフォールド誘導体の性質および特性に関するさらなる詳細はそれぞれスキャフォールドおよび誘導体化剤に関する上述に見出せる。
【００４７】
本発明の第三の態様は上記で定義されたような一般式(I)で定義される化合物、またはこれまた上記で定義されたような一般式(III)で定義される誘導体を含むキットである。本キットは、固体としてのかかる化合物または誘導体を、分離媒体として用いるための、ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドの製造においてそれを用いるための使用説明書とともに含む。もう1つの実施形態では、この化合物または誘導体は好適な溶媒に溶解させた形で存在する。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、陽イオン交換に有用な分離媒体を特定するスクリーニング方法である。上述のように、Rの選択は最終的な分離媒体の所望の特性に応じて異なる多様な分子の中から行うことができる。下記の実験の部では、試験されるR基の数例を示すが、これらは単に本方法の用途の広さを説明するため、また、本発明の範囲内にある特定の実施形態を計画しようとする当業者にある程度の指針を与えるために示すものである。実験の部では、R'はRに相当するものとする。よって、本発明は、極めて多様な目的の混合モード陽イオン交換リガンド分離媒体の設計を可能とする。例えば、可能性のある混合モード陽イオン交換リガンドを試験するため、特定の標的に対して最適な特徴を与える組合せを見つけるためにあるオリジナル分子の特定の部分が体系的に変更されている、R基のコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。このようなコンビナトリアルライブラリーは最近では周知のものであり、多くの分野で用いられていることから、当業者ならば有機化学者または生化学者の共通の一般知識に基づき独自のライブラリーを設計することができる。
【００４９】
例えば、ライブラリーの試験は、例えば
(a)(i)各々リガンドの種類が異なる(リガンド1、2、3、4....n)、試験する1種以上の陽イオン交換体(試験陽イオン交換体、交換体1、2、3、4....n；n=整数>0)、および
(ii)対照リガンドを有する対照陽イオン交換体(交換体1、2、3、4....nと対照陽イオン交換体とでは、支持体マトリックス、対イオンなどは実質的に同じ)
を含むライブラリーを準備し；
(b)所定の条件にて、その物質に対して交換体1の、pH範囲1〜12のどこかでの最大貫流容量を求め；
(c)ステップ(b)と同じ条件にて、その物質に対して対照陽イオン交換体の、pH範囲1〜12のどこかでの最大貫流容量を求め；
(d)ステップ(b)と(c)で得られた最大貫流容量の間の関係をもとに、陽イオン交換体(1)がその物質の除去に用いるのに適当であるかどうかを判定し；
(e)必要であれば、交換体2、3、4....nの少なくとも1つについてステップ(b)〜(c)を繰り返す
というステップを含みうる。
【００５０】
対照陽イオン交換体と試験する個々の陽イオン交換体の間で置換度が異なる場合は、ステップ(d)を行う際にそれを考慮しなければならない。陽イオン交換体1、2...nについて例えば3倍、5倍または10倍を超える倍率で置換度の変動が大きい場合には特にこのことが当てはまる。
【００５１】
本発明の最後の態様は、混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体の結合特性を至適化する方法、好ましくはスクリーニング法であり、
(a)活性化スキャフォールド誘導体水溶液を準備し、
(b)この溶液を、第一の特性によって定義され、該スキャフォールド誘導体と結合しうるベースマトリックス粒子の懸濁液と接触させ、
(c)溶液を粒子から分離し、
(d)この分離した溶液を、第一の特性とは異なる特性によって定義され、該スキャフォールド誘導体と結合しうるベースマトリックス粒子の懸濁液と接触させ、
(e)溶液を粒子から分離し、
(f)所望によりステップ(d)および(e)を1回または数回繰り返し、
(g)このようにして得られた分離媒体の容量を通常のイオン交換実験によって評価する
ステップを含む。
【００５２】
ある実施形態では、このような特性は、活性化スキャフォールドを結合しうるベースマトリックス粒子上に存在する反応基の密度である。もう1つの実施形態では、このような特性は、活性化スキャフォールドを結合しうるベースマトリックス粒子上に存在する反応基の性質である。しかし、本方法は粒径、多孔度、剛性、またはpH、時間、温度などのカップリング条件といった実用上多様な特性とともに用いることができ、1つの必須の特徴は、最適な値を特定するためにこのような種々の条件の1組に反応性溶液を通すということである。本方法のある有利な実施形態では、本態様で使用するスキャフォールド誘導体は上記の方法に従って製造されたものである。
【００５３】
本発明で使用する陽イオン交換体における陽イオン交換リガンドのレベルは、通常、0.001〜4mmol/mlマトリックス、例えば、0.002〜0.5mmol/mlマトリックスの間から選択され、0.005〜0.3mmol/mlマトリックスが好ましい。可能性のあるそして好ましい範囲は、とりわけ、マトリックス、リガンド、除去する物質などの種類により決定される。従って、陽イオン交換リガンドのレベルは、通常、アガロースベースのマトリックスに対しては0.01〜0.3の範囲であり、0.06〜0.2mmol/mlが好ましい。デキストランベースのマトリックスに関しては、この範囲は典型的には0.01〜0.6mmol/mlマトリックスであり、サブレンジは0.01〜0.2mmol/mlマトリックスである。ある変形において、例えば、Rが芳香族である場合、混合モードリガンドのレベルはしばしばこの範囲の下半分である。従って、本発明のこれらの変形において、陽イオン交換リガンドのレベルは、0.150mmol/mlマトリックスより小さく、かつ／または１mmol/gマトリックス乾燥重量より小さい。「mmol/mlマトリックス」とは、水で飽和された完全に沈降したマトリックスについていう。容量範囲とは、完全に脱プロトン化された形態のマトリックスが酸性官能基を滴定する容量をさす。これはまた、リガンドの主要なイオン基以外の、例えば、スペーサーまたは残基Rで負に帯電した基に起因する可能性も含む。
【００５４】
本発明に従って製造された分離媒体は、陽イオン交換および特に混合モード陽イオン交換など、当業者に周知の常法により使用できる。現在のところ、本発明の方法に従って製造された分離媒体の最も有利な使用は、高塩リガンドとしてのものである。しかし、本分離媒体は通常の条件下での従来の陽イオン交換法においてこれまでに知られている媒体と同様の良好な容量で機能する(なお、これらの条件は約10mS未満での実施と定義できる)。本発明の方法に従って製造された分離媒体はまた、後述するように、上述の通常条件と高塩条件の間の範囲で満足のいく働きをするであろう。
【００５５】
よって、本方法に従って製造された分離媒体は、高塩リガンドとして知られる相対的に高いイオン強度で特定の物質を吸着する陽イオン交換体として有利に用いることができる。このような陽イオン交換体は、
(a)0.25M NaCl相当のイオン強度にて、水性対照液中で対象物質と結合することができなければならず、かつ、
(b)その物質に関して、pH2〜12の範囲のどこかに、従来の陽イオン交換体に対するその物質の貫流容量の200%以上、例えば300%以上または500%以上または1000%以上の最大貫流容量が可能となるものでなければならない。
【００５６】
「貫流容量」とは、当技術分野で周知の用語であり、その算出方法も周知であり、本願の下記実験の部にも記載されている。主としてこれらのパーセンテージの数値は陽イオン交換条件中に測定された測定値に当てはまる。
【００５７】
より詳しくは、吸着の間に、正に帯電した物質を含む液体サンプルを、陽イオン交換体と、物質とリガンドを陽イオン交換により結合させる条件下で接触させる。pHは、物質が少なくとも部分的に正に帯電し、少なくとも一部の陽イオン交換リガンドが負に帯電するように選択する。好ましい変形において、弱陽イオン交換体(例えば、陰イオン基が-COO-である場合)は、液体のpHをpKa±2、例えば±1のpH単位に緩衝させて用いる。陽イオン交換体のpKa値は、陽イオン交換体がNaOHで滴定される場合には変曲点であると考えられる。イオン強度(塩濃度または伝導度として測定)は、通常、イオン交換体、結合する物質、温度とpH、溶媒組成などの特定の組合せに関する溶出イオン強度よりも低い。多モード陰イオン交換体を用いる利点の1つは、従来の陽イオン交換体に比べて高いイオン強度でも吸着／結合を行うことができるということである。陽イオン交換体を、除去する物質と適合させることにより、吸着は対照イオン交換体を使用するときよりも高いイオン強度で行える(同じpHおよび他の点で同じ条件下で測定）。陽イオン交換体によっては、対照陽イオン交換体で得られる貫流容量の200%以上、例えば300%以上または500%以上、さらには1000%以上といった貫流容量さえ達成できる。
【００５８】
結合の際に用いる正確なイオン強度は用いるリガンド、マトリックス上でのその密度、結合する物質およびその濃度などによって異なる。有用なイオン強度は多くの場合、NaCl濃度(純水)≧0.1M、例えば≧0.3M、または≧0.5Mに対応する。
【００５９】
脱着には、通常、塩濃度(イオン強度)を脱着に必要な最小溶出イオン強度より高く引き上げること；pHを下げてリガンドの負電荷を低下させること；pHを高めて物質の正電荷を低下させること；および／またはリガンド類似体または用いる水性液の極性を小さくする薬剤(例えば、添加溶媒)を含めることなど、当技術分野で周知の手法が用いられる。これらの変化は物質を含有する水性液に比べてのものである。
【００６０】
陽イオン交換条件下での脱着は、脱着に用いる液体が、脱着する物質の少なくとも一部が正に帯電し、イオン強度がこれらの条件に対する最小溶出イオン強度を超える値に設定されるような条件(例えば、pH)を示すことを意味する。両性化合物については、最初に言及した選択肢はpH≧pI、例えばpH≧pI+0.5を意味する。
【００６１】
脱着はまた、脱着する物質の正味電荷がゼロ以下で、かつ／または陽イオン交換リガンドの実質的に全てが排除される条件(例えば、pH)で行える。
【００６２】
クロマトグラフィーおよび／またはバッチ法において、脱着する物質を伴うマトリックスはカラムまたは他の適当な容器中に、吸着液体と接触して存在する。次に、液体により提供される条件を、上記のように目的物質がマトリックスから放出および溶出されるまで変化させる。陽イオン交換条件下で行われる脱着のプロセスについては、イオン強度は通常、吸着の場合よりも引き上げ、多くの場合、少なくとも0.6M NaClに相当する。実際の値は上記の種々の因子によって異なる。
【００６３】
上記の条件における変化は、１以上のステップで(段階的勾配)または連続的に(連続的勾配)達成できる。マトリックスと接触している液体の種々の可変要素は、一個ずつまたは組み合わせて変え得る。
【００６４】
イオン強度を変えるのに有用な典型的な塩は、可溶性アンモニウム、または金属のリン酸塩、流酸塩など、特にアルカリ金属および／またはアルカリ土類金属塩から選択される。同じ塩が吸着ステップでも使用できるが、これより低い濃度である場合が多い。
【００６５】
陽イオン交換法に有用な典型的バッファーは、塩基部分が陰イオン性である酸／塩基対から選択することができる。挙げられる例としては、カルボン酸／カルボン酸塩(例えば、酢酸／酢酸塩)、リン酸塩などがある。脱着ステップまたはそれ以前のステップにおいてpHを高めると、脱着する物質の正電荷が小さくなり、脱着が助けられ、従って、マトリックスからの物質の放出に必要なイオン強度も小さくなる。使用するリガンドのpKaおよび物質のplによっては、pHの減少は陽イオン交換マトリックスからの物質の放出または陽イオン交換マトリックスへの物質の結合をもたらし得る。
【００６６】
脱着はまた、吸着液に比較して脱着液の極性を調節することで助けられ得る。これは、水混和性および／または低親水性有機溶媒を脱着液に包含させることにより達成し得る。このような溶媒の例としてはアセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アクリロニトリルなどがある。脱着液の極性の減少は脱着を助け、従ってまた、マトリックスからの化合物の放出に必要なイオン強度が小さくなる。脱着はまた、脱着液中の陽イオン交換リガンドの可溶性構造類似体(リガンド類似体)の包含により助けられ得る。このような類似体の十分な濃度は、少なくとも吸着液でのその濃度よりも大きくなければならない。
【００６７】
図面の詳細な説明
図１は、上記「背景」の節の一般用語で述べたように多モード陽イオン交換体の通常の合成の一例を示す。リガンドの合成が起こる固相支持体であるゲルがどのように存在している必要があるかは図面から明らかであろう。
図２は、スキャフォールドとしてホモシステインチオラクトンを用いた多モード陽イオン交換体の合成のための本発明の1つの実施形態を示す。基本的に本発明の方法は4ステップの先行技術に比べて2ステップからなり、リガンドのゲル部分は最終のステップに含める必要があるだけである。
図３は、例としてのスキャフォールドホモシステインチオラクトンによる、多モード陽イオン交換体ライブラリーの潜在的多様性を示す。可能性のあるR残基の数は膨大であり、上記により詳しく述べられているが、下記実験の部で具体例が示される。
図４は、同じセットの反応性溶液から異なる媒体ライブラリーを合成する一般法を図示する。このような方法は粒径、多孔度、剛性、またはpH、時間、温度などのカップリング条件といった実用上様々な特性とともに用いることができる。
【００６８】
以下、実施例により本発明を説明する。しかし、これらの実施例は単に例示のために示すものであり、付属のクレームで定義されるような本発明を制限しようとするものではないと考えられる。以下、また本願の他の部分に挙げられている参照文献は全て、出典明示により本明細書の一部とされる。
【００６９】
実験の部
新規な媒体を製造するためDL-ホモシステインチオラクトンを用いる一般法
A. 加水分解によるチオラクトンの開環
【化５】
2005517517.tif 000007
【００７０】
一般法
ステップ1:
ステップla:
ジクロロメタン(DCM)中、DL-ホモシステインチオラクトンIaおよびジイソプロピルアミン(DIPEA)の溶液Aを0℃まで冷却した。DCM中に塩化アシルまたは塩化スルホニルまたは無水物または活性化酸を含有する溶液Bを0℃まで冷却し、0〜5℃の間で維持した溶液Aに滴下した。この混合物を室温で一晩攪拌した。
【００７１】
ステップlb:
ジクロロメタン(DCM)中、DL-ホモシステインチオラクトンIaおよびジイソプロピルアミン(DIPEA)の溶液Aを0℃まで冷却した。DCM中の塩化ヨードアセチル溶液を0〜5℃の間で維持した溶液Aに滴下した。この混合物を室温で一晩攪拌した。次いでDCM中にチオールを含有する溶液Bを反応混合物へ滴下し、攪拌をさらに17時間続けた。
【００７２】
ステップ 2:
ステップ1aまたはステップ1bから得られた混合物から溶媒を真空下で除去した。0℃でこの粗生成物に5N水酸化ナトリウム溶液をゆっくり加え、さらに室温で2時間攪拌した。
【００７３】
ステップ 3:
公知の手順に従って得た臭素化セファロース(登録商標)6FF(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)をステップ2で得たアルカリ溶液と混合し、50℃まで一晩温めた。反応後、このゲル(1容量)を濾過し、水(2×15容量)、エタノール(2×15容量)、0.2M酢酸(2×15容量)および水(2×15容量)で洗浄した。次いでこのゲルのイオン交換容量を酸で滴定して測定した(Chauhan V. S. et al., Tetrahedron, 44 (8), 2359-2366, 1988 (酸活性化))。これらのゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を下記の表１Ａに示す。
【実施例】
【００７４】
種々のR-Z基を用いた本発明の分離媒体の製造
実施例１〜４
以下の実施例は、D,LホモシステインチオラクトンIaをスキャフォールドとして用い、また記載の化学反応を用いた(上記スキーム1参照)。ホモシステインチオラクトンIaと塩化アシル、塩化スルホニル、無水物または活性化酸との反応によってアミドまたはスルホンアミド結合を形成した後、塩基性加水分解と得られた化合物を活性化したセファロース(登録商標)6FFまたはセファロース(登録商標)4FF(双方ともAmersham Biosciences AB, Uppsala, Swedenより入手)とさらに結合させたものを用いて、チオラクトン環の開環を実現した。
【００７５】
溶液Aは全て新しく調製したが、カップリング反応後の(ステップ3での)濾過から得られた混合溶液を再利用することも可能であり、さらに別のゲルと反応させることも可能である。以下の実施例では最初の反応からの濾液(アリル411μmol/mLを加えたゲル)をステップla、2および3に従ってアリル250μmol/mLを加えたゲルとともにさらに用いた。表１Ａでは、アリル411μmol/mLを加えたゲルから得られた結果をa)で示し、アリル250μmol/mLを加えたゲルから得られた結果をb) で示し、アリル230μmol/mLを加えたゲルから得られた結果をc)で示す。
【００７６】
実施例1〜4に関して、溶液Aは6mL DCM中、1.58gのDL-ホモシステインチオラクトン、HCl(10.3mmol)および3.58mLのジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(20.6mmol)を用い、ステップ1aに従って調製した。
【００７７】
実施例１：塩化アシル
1a. 溶液Bを、4mL DCM中の3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイルクロリド2.37g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FF(Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden)をこの混合物へ加えた。ゲル1aのイオン交換容量は232.6μmol/mLであった。
1b. 溶液Bを、4mL DCM中の4-クロロベンゾイルクロリド1.80g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1bのイオン交換容量は251.1μmol/mLであった。
1c. 溶液Bを、4mL DCM中の2,4-ジクロロベンゾイルクロリド2.15g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1cのイオン交換容量は253.3μmol/mLであった。
1d. 溶液Bを、4mL DCM中の3-(トリフルオロメチル)ベンゾイルクロリド2.14g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1dのイオン交換容量は239.9μmol/mLであった。
1e. 溶液Bを、4mL DCM中の4-(トリフルオロメチル)ベンゾイルクロリド2.14g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1eのイオン交換容量は247.1μmol/mLであった。
【００７８】
1f. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化ニコチノイル1.83g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1fのイオン交換容量は253.3μmol/mLであった。
1g. 溶液Bを、4mL DCM中のチオフェン-2-アセチルクロリド1.65g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1gのイオン交換容量は261.5μmol/mLであった。
1h. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化ブチリル1.10g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1hのイオン交換容量は260.6μmol/mLであった。
1i. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化オクタノイル1.67g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1iのイオン交換容量は233.6μmol/mLであった。
1j. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化イソバレリル1.24g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1jのイオン交換容量は232.4μmol/mLであった。
1k. 溶液Bを、4mL DCM中の2-(2-メトキシ-エトキシ)アセチルクロリド1.57g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1kのイオン交換容量は234.0μmol/mLであった。
【００７９】
実施例２：塩化スルホニル
2a. 溶液Bを、4mL DCM中のトルエン-4-スルホニルクロリド1.96g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2aのイオン交換容量は199.0μmol/mLであった。
2b. 溶液Bを、4mL DCM中の2,5-ジメトキシベンゼンスルホニルクロリド2.43g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2bのイオン交換容量は182.6μmol/mLであった。
2c. 溶液Bを、4mL DCM中の4-アセトアミドベンゼンスルホニルクロリド2.40g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2cのイオン交換容量は159.7μmol/mLであった。
2d. 溶液Bを、4mL DCM中の2,4,6-トリメチルベンゼンスルホニルクロリド2.25g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2dのイオン交換容量は176.5μmol/mLであった。
2e. 溶液Bを、4mL DCM中の塩化メタンスルホニル1.18g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル2eのイオン交換容量は163.2μmol/mLであった。
【００８０】
実施例３：無水物
3a. 溶液Bを、4mL DCM中の無水安息香酸2.33g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル3aのイオン交換容量は255.1μmol/mLであった。
3b. 溶液Bを、4mL DCM中の無水プロピオン酸1.34g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル3bのイオン交換容量は238.3μmol/mLであった。
【００８１】
実施例４：活性化酸
4a. 活性化酸をカルボン酸から次のように新たに調製した。20mLテトラヒドロフラン(THF)中の馬尿酸1.84g(10.3mmol)およびN-メチルモルホリン1.13mLの溶液を-8℃まで冷却した後、5mL THF中のイソブチルクロロホルメート1.33mLをゆっくり添加した。この混合物を0℃で2時間、さらに室温で一晩攪拌して溶媒を蒸発させた。溶液Bを4mL DCM中に粗物質を溶解して調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル4aのイオン交換容量は182.4μmol/mLであった。
【００８２】
実施例５：塩化ヨードアセチルおよびチオール
以下の実施例は、D,LホモシステインチオラクトンIaをスキャフォールドとして用い、また記載の化学反応を用いた(上記スキーム1参照)。ホモシステインチオラクトンIaと塩化ヨードアセチルとの反応によってアミドを形成した。チオールを、残りのハロゲンの求核置換反応により得られたリガンド上に導入した。塩基性加水分解と得られた化合物と活性化したセファロース(登録商標)6FFまたはセファロース(登録商標)4FFを結合させたものを用いてチオラクトン環の開環を実現した。
【００８３】
実施例５の全てに対し、溶液AはDCM 4mL中、0.35gのDL-ホモシステインチオラクトン、HCl(2.3mmol)および0.841μLのジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(4.8mmol)を用いてステップ1bに従って調製した。冷却した反応混合物に、2mL DCM中0.52gの塩化ヨードアセチル(2.5mmol)を加えた。
【００８４】
5a. 溶液Bを、1mL DCM中のベンジルメルカプタン284μl(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5aのイオン交換容量は118.2μmol/mLであった。
5b. 溶液Bを、1mL DCM中のフルフリルメルカプタン243μl(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5bのイオン交換容量は114.1μmol/mLであった。
5c. 溶液Bを、1mL DCM中の4-メルカプト安息香酸373mg(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5cのイオン交換容量は184.8μmol/mLであった。
5d. 溶液Bを、1mL DCM中の2-メチル-1-プロパンチオール251μL(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5dのイオン交換容量は155.0μmol/mLであった。
5e. 溶液Bを、1mL DCM中の2,2,2-トリフルオロエタンチオール205μL(2.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液5mLを加えた。ステップ3に従い、アリル230μmol/ゲルmLを加えた4mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル5eのイオン交換容量は125.4μmol/mLであった。
【００８５】
【表１】
2005517517.tif 000008
【表２】
2005517517.tif 000009
【００８６】
B.求核剤によるチオラクトンの開環 :
1.アミノ酸:
【化６】
2005517517.tif 000010
【００８７】
実施例６：塩化ベンゾイルおよびフェニルセリン
以下の実施例は、D,LホモシステインチオラクトンIaをスキャフォールドとして用い、また記載の化学反応を用いた(上記スキーム2参照)。ホモシステインチオラクトンIaと塩化アシルとの反応によってアミド結合を形成した後、アミノ酸誘導体と得られた化合物を活性化したセファロース(登録商標)とさらに結合させたものを用いてチオラクトン環の開環を実現した。
【００８８】
下記表１Ｂにおいて、230μmol/mLのアリルを加えたゲルから得た結果をc)で示す。
【００８９】
6mL DCM中、1.58gのDL-ホモシステインチオラクトン、HCl(10.3mmol)および3.58mLのジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(20.6mmol)の溶液Aを調製し、0℃まで冷却した。4mL DCM中、1.45g(10.3mmol)の塩化ベンゾイルを用いて別の溶液を調製し、溶液Aに滴下した。室温で17時間攪拌した後、溶媒を除去した。この粗混合物に50mlのTHFおよび1.8mL(10.3mmol)のDIPEAおよび3.52g(20.6mmol)のDL-フェニルセリン水和物を加えた。反応を一晩50℃で加熱した。真空下で媒を除去し、10%炭酸カリウム水溶液50mLを加えた。水相を酢酸エチル(EtOAc)(3×15mL)で洗浄し、クエン酸で酸性化し、EtOAc(3×15mL)で抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空濃縮した。
【００９０】
5N水酸化ナトリウム溶液6mLをこの粗物質に加えた。アリル230μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこのアルカリ性混合物へ加え、50℃まで一晩温めた。反応後、このゲル(1容量)を濾過し、水(2×15容量)、エタノール(2×15容量)、0.2M酢酸(2×15容量)および水(2×15容量)で洗浄した。次いでゲルのイオン交換容量を、酸を滴定して測定した。これらのゲルのクロマトグラフによる評価を下記表１Ｂに示す。
ゲル6のイオン交換容量は148.3μmol/mLであった。
【００９１】
2.アミン:
【化７】
2005517517.tif 000011
【００９２】
実施例７：無水コハク酸およびアニリン
以下の実施例は、D,LホモシステインチオラクトンIaをスキャフォールドとして用い、また記載の化学反応を用いた(上記スキーム3参照)。ホモシステインチオラクトンIaと無水物との反応によってアミド結合を形成した後、アミンおよび得られた化合物を活性化したセファロース(登録商標)とさらに結合させたものを用いてチオラクトン環の開環を実現した。
【００９３】
下記表１Ｂにおいて、230μmol/mLのアリルを加えたゲルから得た結果をc)で示す。
【００９４】
50mLメタノール中、1.58gのDL-ホモシステインチオラクトン、HCl(10.3mmol)および3.58mLのジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(20.6mmol)の溶液を調製し、0℃まで冷却した。0.93g(9.3mmol)の無水コハク酸をチオラクトンへ少量ずつ加えた。室温にて17時間攪拌した後、溶媒を除去した。
【００９５】
この粗混合物へ、20mlのTHFおよび1.3mL(15.3mmol)を加えた。反応を一晩還流した。真空下で溶媒を除去し、10%炭酸カリウム水溶液50mLを加えた。水相を酢酸エチル(EtOAc)(3×15mL)で洗浄し、クエン酸で酸性化し、EtOAc(3×15mL)で抽出した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空濃縮した。
【００９６】
5N水酸化ナトリウム溶液6mLをこの粗物質に加えた。アリル230μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこのアルカリ性混合物へ加え、50℃まで一晩温めた。反応後、このゲル(1容量)を濾過し、水(2×15容量)、エタノール(2×15容量)、0.2M酢酸(2×15容量)および水(2×15容量)で洗浄した。次いでゲルのイオン交換容量を、酸を滴定して測定した。これらのゲルのクロマトグラフによる評価を下記表１Ｂに示す。
ゲル7のイオン交換容量は155.1μmol/mLであった。
【００９７】
【表３】
2005517517.tif 000012
【００９８】
実施例８〜１１：マトリックスの至適化
反応混合物は異なるマトリックスとの反応に数回用いることができ、かつ／または異なるレベルのアリルを加えた同じマトリックスにも使用できる。
【００９９】
実施例８
レベル1:
ゲル1jを上記のように調製した。溶液Bを、4mL DCM中の塩酸イソバレリル1.24g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1bに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル1jのイオン交換容量は232.4μmol/mLであった。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表２に示す。
【０１００】
レベル2:
411μmol/mLでマトリックスと結合させた(レベル1)後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル250μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)6FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル1j-2はイオン交換容量162.8μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表２に示す。
【０１０１】
レベル3:
250μmol/mLでマトリックスと結合させた(レベル2)後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル138μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)6FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル1j-3はイオン交換容量104.2μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を下記表２に示す。
【０１０２】
実施例９
レベル1:
ゲル3aをAの部で記載したように調製した。溶液Bを、4mL DCM中の無水安息香酸2.33g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル411μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)6FFをこの混合物へ加えた。ゲル3aのイオン交換容量は255.1μmol/mLであった。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表２に示す。
【０１０３】
レベル2:
411μmol/mLでマトリックスと結合させた後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル250μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)6FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル3a-2はイオン交換容量196.0μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表２に示す。
【０１０４】
レベル3:
250μmol/mLでマトリックスと結合させた後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル138μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)6FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル3a-3はイオン交換容量117.4μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を下記表２に示す。
【０１０５】
実施例１０
レベル1:
溶液Bを、4mL DCM中の塩化イソバレリル1.24g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1a(一般法)に従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル580μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)4FFをこの混合物へ加えた。ゲル1j-4のイオン交換容量は108.4μmol/mLであった。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を下記表２に示す。
【０１０６】
レベル2:
580μmol/mLでマトリックスと結合させた後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル240μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)4FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル1j-5はイオン交換容量128.1μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表２に示す。
【０１０７】
実施例１１
レベル1:
溶液Bを、4mL DCM中の無水安息香酸2.33g(10.3mmol)を用いて調製し、ステップ1aに従って溶液Aに加えた。ステップ2に従って溶媒を除去し、粗物質に5N水酸化ナトリウム溶液6mLを加えた。ステップ3に従い、アリル580μmol/ゲルmLを加えた5mLの臭素化セファロース(登録商標)4FFをこの混合物へ加えた。ゲル3a-4のイオン交換容量は1 48.1μmol/mLであった。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表２に示す。
【０１０８】
レベル2:
580μmol/mLでマトリックスと結合させた後、そのまま濾過して得た溶液を、アリル240μmol/mLを加えた活性化セファロース(登録商標)4FFと反応させた。カップリングはステップ3に従って行った。生じたゲル3a-5はイオン交換容量144.7μmol/mLを示した。このゲルのクロマトグラフによる評価(保持率およびイオン交換容量)を表２に示す。
【０１０９】
【表４】
2005517517.tif 000013
【０１１０】
実施例１２〜１４：イオン交換体の対照実験手順
材料
緩衝液
バッファー1：20mMリン酸ナトリウム、0.3M NaCl、pH 6.8
バッファー2：20mM酢酸ナトリウム、0.25M NaCl、pH 4.0
バッファー3：20mM酢酸ナトリウム、0.25M NaCl、pH 4.5
バッファー4：20mMリン酸ナトリウム、2M NaCl、pH 6.8
バッファー5：100mMリン酸ナトリウム、pH 7.0(BSAおよびIgGの溶出用)
【０１１１】
タンパク質溶液
1. BSA：バッファー2中4mg/mL
2. IgG：バッファー3中4mg/mL
全てのバッファーおよびタンパク質溶液は使用前に0.45μm Millipore Millex HAフィルターで濾過した。
【０１１２】
クロマトグラフィーシステム
全ての実験は室温にてUnicorn 3.1ソフトウェアを備えたAKTA Explorer 100クロマトグラフィーシステム(Amersham Pharmacia Biotech AB)を用いて実施した。サンプルは150mLのスーパーループを経由してカラムに注入した。全体にわたって1mL/分(約300cm/時)の流速を用いた。10mmフローセルを用い、280nmにて吸光度を測定することで溶出液を継続的にモニタリングした。
【０１１３】
実施例１２：先端分析法、「高塩」リガンド
各プロトタイプ陽イオン交換体をHR5/5カラム(充填ベッド容量=1mL)に充填し、適当なpHおよび塩濃度のバッファーで平衡化した。システムのボイド容量は、非結合条件下で好適なタンパク質溶液をカラムに適用することで測定した。溶出液のA280が、適用したタンパク質のA280の10%に達するのに要した時間をシステムのボイド容量とした(分で表示)。
【０１１４】
適当なバッファー(バッファー1、2または3)で平衡化したカラムへ、適当な平衡バッファー(上記参照)に溶解した試料タンパク質を流速1mL/分(すなわち、約300cm/時)を継続的に(例えば150mLのスーパーループを経由して)送り込んだ。溶出液のA280がカラムへ適用した試料のA280の10%レベルに達するまで試料の適用を続けた。このように得られたデータ[すなわち、充填ゲルベッド容量(Vc)、そのボイド容量、流速およびカラムへ供給したタンパク質の濃度]に基づいて、適用したタンパク質の濃度の10%(QB10%)のレベルで充填したゲルの貫流容量が算出できる。
【０１１５】
実施例１３：貫流および評価
吸収極大の10%(Qb10%)レベルでの貫流は以下の関係式を用いて計算した。
Qb10%= (TR10%-TRD) x C / Vc 
ここで、TR10% =吸収極大の10%における保持時間(分)
TRD = システムのボイド容量(分)
C = 供給タンパク質の濃度(4mg/mL)
Vc = カラムの充填ベッド容量(mL)
【０１１６】
実施例１４：「高塩」陽イオン交換リガンドと結合したタンパク質の回収
「高塩」陽イオン交換リガンドもそれと結合したタンパク質の回収率に関してスクリーニングするのが好ましい。これは付加的なものであるが、比較的高い吸着容量とそれに適用したタンパク質の高い回収率または量的回収を合わせ持つ、適正な種類のリガンドを選択するために重要な基準である。
【図１】
2005517517.tif 000019
【図２】
2005517517.tif 000020
【図３】
2005517517.tif 000021
【図４】
2005517517.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月24日(2004.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)各々が官能基Fを含み、環状コア構造を示す少なくとも1つのスキャフォールドを準備し、
(b)スキャフォールドの環状構造を保持したまま、残基Rと結合した反応基Zを含む試薬を用いて、該スキャフォールドのF基と該試薬の反応基を反応させることによりスキャフォールドを誘導体化し、
(c)得られた誘導体の環状構造を開環させ、
(d)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を反応させる
ステップを含み、該スキャフォールドが少なくとも2つの官能基(1つはベースマトリックスの反応基と結合させるための硫黄含有基であり、1つはイオン基へと転換可能な基である)を提供し、これらの官能基は環状構造上の隣接した位置に存在し、ステップ(c)において開環が2つの官能基間の結合を切断することによってなされる、方法。
【請求項２】
スキャフォールドが一般式(I)
【化１】
2005517517.tif 000023
[式中、A、BおよびXは互いに無関係に炭素原子、または酸素、硫黄、窒素および／またはシリカなどの任意のヘテロ原子であり、mは0〜4の間、例えば1〜3の間の任意の整数、好ましくは1または2であり、官能基Fは1つのXで表されるか、または所望によりリンカーを介してA、BおよびXのいずれか1つと結合した形で表され、該リンカーは1〜50個の原子からなる]
で定義できる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式(I)において官能基FがC-Y(ここで、Yは例えばBr、Cl、I、メシレートまたはトシレートを表す)など、通常求核置換に用いられるような脱離基；酸、またはWC=O(ここで、Wは例えばN-ヒドロスクシンイミド、ペンタフルオロフェノール、パラ-ニトロフェノールまたはクロロ蟻酸イソプロピルから形成される)などの活性化酸；例えば-OH、-SHまたは-NH2などの求核基；およびC=Cを含む群から選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
式(I)においてA、BおよびXが炭素原子であり、mが1であり、Fが-NH2である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式(I)においてスキャフォールドがホモシステインチオラクトン：
【化２】
2005517517.tif 000024
である、請求項１〜４いずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(b)で用いられる誘導体化剤が一般式
【化３】
2005517517.tif 000025
[式中、
Zはスキャフォールドの官能基Fと反応しうる基であり、
Rは、好ましくは約1〜20個、例えば1〜10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝状、環状の飽和、不飽和および芳香族炭化水素基である]
で示すことができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドを含む分離媒体を製造する方法であって、
(a)環状構造を有する少なくとも1つのスキャフォールド誘導体を準備し、
(b)誘導体の環状構造を開環させ、
(c)このようにして得られた開環生成物と、反応基を含むベースマトリックス(所望によりスペーサーを介してベースマトリックスに結合させてもよい)を反応させる
ステップを含み、該スキャフォールド誘導体が一般式(III)
【化４】
2005517517.tif 000026
[式中、A、BおよびXは互いに無関係に炭素原子、または酸素、硫黄、窒素および／またはシリカなどの任意のヘテロ原子であり、mは0〜4の間、例えば1〜3の間の任意の整数、好ましくは1または2であり、該官能基は環状構造上の隣接した位置に存在し、ステップ(c)において開環が2つの隣接する位置の間の結合を切断することによってなされ、Z-RがA、BおよびXのいずれか1つと結合している]
で定義できる、方法。
【請求項８】
Rが、好ましくは約1〜20個、例えば1〜10個の炭素原子を含む、直鎖、分枝状、環状の飽和、不飽和および芳香族炭化水素基である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
スキャフォールド誘導体がホモシステインチオラクトン誘導体である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ(b)とは別にその前に、ベースマトリックスの反応基(該反応基は炭素-炭素二重結合である)を臭素化するステップも含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ(b)とは別にその前に、ベースマトリックスの反応基(該反応基は炭素-炭素二重結合である)をラジカル反応に好ましい条件下で活性化するステップも含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項２〜５のいずれか一項に記載の一般式(I)で定義される化合物、または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の一般式(III)で定義される誘導体を含むキットであって、固体としての該化合物または誘導体を、分離媒体として用いるための、ベースマトリックスと結合した混合モード陽イオン交換リガンドの製造においてそれを用いるための使用説明書とともに含む、キット。
【請求項１３】
高塩リガンドを製造するためのキットである、請求項１２に記載のキット。
【国際調査報告】
2005517517.tif 000027
2005517517.tif 000028
2005517517.tif 000029
2005517517.tif 000030