(57)【要約】ＩＬ−２１ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードするＩＬ−２１核酸配列を含むベクター、変異体、及びそれらのフラグメントを有効量で投与し、それによって、癌の軽減、改善及び／又は除去による抗癌剤として作用させることによる、被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける癌の治療及び／又は予防方法；並びに、被験体における癌の治療及び／又は予防のために、ＩＬ−２１ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＩＬ−２１ベクター、変異体、及びそれらのフラグメントを免疫治療剤及び／又は化学療法剤と共投与することによる被験体における癌の治療及び／又は予防方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物での癌の治療方法であって、哺乳動物の癌の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントを、癌に罹患した哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
哺乳動物での癌の治療方法であって、哺乳動物の癌の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを、癌に罹患した哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３】
哺乳動物での癌の治療方法であって、哺乳動物の癌の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む発現ベクターを、癌に罹患した哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項４】
発現ベクターはｐＯＲＦである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
癌は黒色腫である、請求項１、２、３、又は４に記載の方法。
【請求項６】
癌は肉腫である、請求項１、２、３、又は４に記載の方法。
【請求項７】
癌は結腸癌である、請求項１、２、３、又は４に記載の方法。
【請求項８】
ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントを、ワクチン、抗原特異的Ｔリンパ球、サイトカイン、又はそれらの組合せと共投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを、ワクチン、抗原特異的Ｔリンパ球、サイトカイン、又はそれらの組合せと共投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
発現ベクターを、ワクチン、抗原特異的Ｔリンパ球、サイトカイン、又はそれらの組合せと共投与する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ワクチンは、組換えウイルスワクチン又はペプチドワクチンである、請求項８、９、又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、又はＩＬ−１５である、請求項８、９、又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗原特異的Ｔリンパ球は、腫瘍特異的Ｔリンパ球である、請求項８、９、又は１０に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物での免疫関連疾患の治療方法であって、哺乳動物の免疫関連疾患の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントを、免疫関連疾患に罹患した哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１５】
哺乳動物での免疫関連疾患の治療方法であって、哺乳動物の免疫関連疾患の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを、免疫関連疾患に罹患した哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１６】
哺乳動物での免疫関連疾患の治療方法であって、哺乳動物の免疫関連疾患の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む発現ベクターを、免疫関連疾患に罹患した哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１７】
発現ベクターはｐＯＲＦである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物での癌の予防方法であって、哺乳動物の癌の予防に有効な量において、ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントを、哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１９】
哺乳動物での癌の予防方法であって、哺乳動物の癌の予防に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを、哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２０】
哺乳動物での癌の予防方法であって、哺乳動物の癌の予防に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む発現ベクターを、哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項２１】
発現ベクターはｐＯＲＦである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌は黒色腫である、請求項１８、１９、２０、又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
癌は肉腫である、請求項１８、１９、２０、又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
癌は結腸癌である、請求項１８、１９、２０、又は２１に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントを、ワクチン、抗原特異的Ｔリンパ球、サイトカイン、又はそれらの組合せと共投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを、ワクチン、抗原特異的Ｔリンパ球、サイトカイン、又はそれらの組合せと共投与する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
発現ベクターを、ワクチン、抗原特異的Ｔリンパ球、サイトカイン、又はそれらの組合せと共投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
ワクチンは、組換えウイルスワクチン又はペプチドワクチンである、請求項２５、２６、又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、又はＩＬ−１５である、請求項２５、２６、又は２７に記載の方法。
【請求項３０】
抗原特異的Ｔリンパ球は、腫瘍特異的Ｔリンパ球である、請求項２５、２６、又は２７に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＬ−２１ポリペプチド、その変異体、又はそれらのいずれかのフラグメント、及び医薬として許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項３２】
ＩＬ−２１核酸分子、又はそのフラグメント、及び医薬として許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤を含有する医薬組成物。
【請求項３３】
ＩＬ−２１核酸分子は、発現ベクター中に構築されている、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
発現ベクターはｐＯＲＦである、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ワクチン、抗原特異的Ｔリンパ球、サイトカイン、又はそれらの組合せを更に含有する、請求項２９又は３０に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
ワクチンは、組換えウイルスワクチン又はペプチドワクチンである、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、又はＩＬ−１５である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
抗原特異的Ｔリンパ球は、腫瘍特異的Ｔリンパ球である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、哺乳動物における癌／悪性腫瘍の治療及び予防の方法に関する。より詳細には、本発明は、有効量が癌を改善し、軽減し、又は除去するように、必要のある被験体、好ましくはヒトに有効量のインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）を投与することによる癌の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
サイトカインは、自然免疫と獲得免疫の両方の蛋白質メディエーターのファミリーである。それらは、細胞、特に、サイトカイン合成と放出の隣接領域にある細胞の行動を修飾する細胞外蛋白質である。特に、サイトカインは、造血と免疫応答の制御に重要である。より詳細には、サイトカインは、シグナル伝達によりその作用を媒介する。従って、大部分のサイトカインは細胞に結合し、クラスＩ又はクラスＩＩサイトカインレセプターのどちらかを介しシグナルを伝達する。クラスＩサイトカインレセプターファミリーとして、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１５、並びに造血増殖因子、レプチン及び成長ホルモンに対するレセプターが挙げられるがそれらに限定されない。一方、クラスＩＩサイトカインレセプターファミリーとして、ＩＬ−１０やインターフェロンに対するレセプターが挙げられる（Ｃｏｓｍａｎ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ５：９５−１０６，１９９３）。
【０００３】
ＩＬ−２やＩＬ−１５に最も密接に関連したサイトカインが同定され、ＩＬ−２１と命名され、そのクラスＩレセプターはＩＬ−２１Ｒと命名されている。Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋらの示唆によると、ＩＬ−２１は、骨髄からのナチュラルキラー細胞の増殖と成熟に、抗ＣＤ４０によって共刺激された成熟Ｂ細胞の増殖に、抗ＣＤ３によって共刺激されたＴ細胞の増殖に役割を果たす（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：５７−６３，２０００）。ＩＬ−２１Ｒの完全長クローンの配列決定の示すところでは、このｃＤＮＡは、クラスＩサイトカインレセプターに共通の構造モチーフを有する５３８個のアミノ酸からなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでいた（Ｃｏｓｍａｎ，上記；  Ｂａｚａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８７：６９３４−６９３８，１９９０）。細胞外モチーフは、単一のサイトカイン認識モジュール、２対の保存システイン残基、及び「ＷＳＸＷＳ」モチーフを含む。細胞内ドメインは、古典的ボックス１とボックス２モチーフを含む強い細胞内シグナリングモチーフを含み（Ｍｕｒｋａｍｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８８：１１３４９−１１３５３，１９５１；  Ｄｒａｃｈｍａｎ及びＫａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９４：２３５０−２３５５，１９９７；  Ｇｕｒｎｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９２：５２９２−５２９６，１９９５）、このことは、レセプターがシグナリングサブユニットであり得ることを示す。ＩＬ−２１Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２５４０６７（ヒトＩＬ−２１Ｒ）及びＡＦ２５４０６８（マウスＩＬ−２１Ｒ））は、ＩＬ−２ＲとＩＬ−４Ｒαと最大のアミノ酸配列類似性を有することが示された。次いで、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋらは、マウス脾臓細胞ライブラリーからマウスＩＬ−２１Ｒをクローニングし、ヒトＩＬ−２１Ｒと全体の構造的及び機能的モチーフを共有することを見出した（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら，上記）。また、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋらは、全てのクラスのリンパ球（Ｂ、Ｔ、及びナチュラルキラー細胞）に対するＩＬ−２１の強力な効果を記述している（Ｐａｒｒｉｃｈ−Ｎｏｖａｋら，上記）。更に、Ｏｚａｋｉらは、ＩＬ−２１Ｒがリンパ系組織で豊富に発現しているのを見出し（ここでは、発現はＴ細胞抗原レセプターを介して起こる）、このことは、免疫系が役割を果たすことを示唆する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９７：１１４３９−１１４４４，２０００）。
【０００４】
抗腫瘍活性に関与する多くの免疫応答を媒介することが知られている幾つかのサイトカインは、組換えＤＮＡ法により産生され、抗腫瘍効果が評価された。臨床試験では、サイトカインの投与により、種々の型の新生物を有する患者において客観的腫瘍応答が起こった。より詳細には、構造的にＩＬ−２１に関連する抗腫瘍免疫の作出に重要なサイトカインであるＩＬ−２は、腫瘍抗原刺激部位で局所的に作用でき、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）とナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、細胞免疫活性を活性化し、全身的腫瘍細胞破壊を媒介できる。
【０００５】
ＩＬ−２の静脈内、リンパ内、又は病巣内投与により、一部の癌患者で臨床的に有意な応答が起こった。しかし、重度の毒性（例えば、低血圧、肺浮腫、腎前性高窒素血症、心臓不整脈、心筋梗塞）は、全身的ＩＬ−２投与の投与量と効能を制限する。全身的投与のサイトカインの毒性は驚くべきではない。これらの薬剤は、局所的細胞相互作用を媒介し、通常、パラクリン様式では限定された量で分泌されるからである。
【０００６】
癌研究の進歩にかかわらず、癌の新規な治療が必要とされる。新規な免疫治療アプローチは、ＩＬ−２やインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）などのサイトカイン、又は細胞治療を用いて工夫されている。しかし、ＩＬ−２などのこれらの薬剤の多くの毒性は顕著である。更に、多数の患者は、現在利用できる免疫治療剤や化学療法剤に十分に応答しない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、悪性腫瘍／癌の症状の予防、治療、又は改善のために、有効治療量の抗癌剤（ここで抗癌剤はＩＬ−２１である）を、その必要のある患者に投与することによる、悪性腫瘍／癌の治療又は予防の方法に関する。悪性腫瘍／癌の例としては、例えば、黒色腫、リンパ腫、肉腫、結腸癌などが挙げられる。
【０００８】
本発明の１実施態様は、癌の改善、軽減又は除去によって癌を治療するための有効量において、ＩＬ−２１蛋白質、ポリペプチド、又は変異体を単独で、又は担体、緩衝剤、もしくは生理食塩水と組合せて被験体に投与することを含む、被験体、好ましくはヒトにおける癌の治療又は予防の方法に関する。
【０００９】
更なる実施態様は、ＤＮＡプラスミドを単独で、又は担体、緩衝剤、もしくは生理食塩水と組合せて被験体に投与することを含む、被験体、好ましくはヒトにおける癌の治療又は予防の方法（ここで、プラスミドは、完全長ＩＬ−２１  ｃＤＮＡを含み、そして癌の改善、軽減又は除去によって癌を治療するために、プラスミドの取り込みが生じ、且つＩＬ−２１蛋白質の十分な発現と分泌が起こるのに有効な量で、プラスミドと担体が投与される）に関する。
【００１０】
更に別の実施態様では、有効量のＩＬ−２１ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＩＬ−２１蛋白質をコードするベクター、変異体、及びそれらのフラグメントを、癌の治療及び／又は予防のための免疫治療剤及び／又は化学療法剤と組合せて投与することによる被験体における癌の治療及び／又は予防の方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物における癌の治療方法を提供する。１方法では、方法は、哺乳動物の癌の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントを、癌に罹患した哺乳動物に投与することを含む。別の方法では、方法は、哺乳動物の癌の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを、癌に罹患した哺乳動物に投与することを含む。ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントは発現ベクターの形態であり得、それにより、方法は、哺乳動物の癌の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む発現ベクターを、癌に罹患した哺乳動物に投与することを含む。
【００１２】
本発明は更に、哺乳動物における免疫関連疾患の治療方法を提供する。１方法では、方法は、哺乳動物の免疫関連疾患の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントを、免疫関連疾患に罹患した哺乳動物に投与することを含む。別の方法では、方法は、哺乳動物の免疫関連疾患の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを、免疫関連疾患に罹患した哺乳動物に投与することを含む。ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントは発現ベクターの形態であり得、それにより、方法は、哺乳動物の免疫関連疾患の治療に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む発現ベクターを、免疫関連疾患に罹患した哺乳動物に投与することを含む。
【００１３】
哺乳動物における癌の予防方法も本発明によって提供される。１方法では、方法は、哺乳動物の癌の予防に有効な量において、ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントを、哺乳動物に投与することを含む。別の方法では、方法は、哺乳動物の癌の予防に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを、哺乳動物に投与することを含む。ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントは発現ベクターの形態であり得、それにより、方法は、哺乳動物の癌の予防に有効な量において、ＩＬ−２１ポリヌクレオチド又はそのフラグメントを含む発現ベクターを、哺乳動物に投与することを含む。
【００１４】
本発明はまた、ＩＬ−２１ポリペプチド、その変異体、又はそれらのいずれかのフラグメント、及び医薬として許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤を含有する医薬組成物を提供する。更に、ＩＬ−２１核酸分子、又はそのフラグメント、及び医薬として許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤を含有する医薬組成物が提供される。
【００１５】
ＩＬ−２１は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１５に構造的に関連するＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生されるサイトカインであり（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，５７−６３（２０００））、Ｂ、Ｔ、ＮＫ細胞を含む全てのクラスのリンパ球に対し強力な効果を有することが知られる。それは、抗ＣＤ３抗体によって提供される増殖シグナルと共にＴ細胞に相乗的に作用し、ＣＤ４０を介する刺激に応答して成熟Ｂ細胞の増殖を促進する。更に、ＩＬ−２１は、Ｆｌｔ３リガンドとＩＬ−１５と共同して、インビトロで骨髄前駆体からのＮＫ細胞の増殖と分化を促進し、溶解アッセイで標的細胞に対し溶解エフェクター機能を増大する（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら（２０００），上記）。ヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列とヌクレオチド配列は当業界公知で、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＡＧ２９３４８及びＡＦ２５４０６９として、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトで公的に利用できる。更に、マウスＩＬ−２１のアミノ酸配列とヌクレオチド配列は当業界公知で、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｎｏ．ＡＡＧ２９３４９及びＡＦ２５４０７０として、公的に利用できる。
【００１６】
違うように定義されていなければ、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は等価の任意の方法と材料が本発明の実施又は試験で使用できるが、好適な方法と材料をここで記載する。
【００１７】
本明細書で使用する「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」は、ＩＬ−２１の全てまたは一部をコードする、任意のオリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列、それらのいずれかのフラグメントもしくは部分を指す。核酸分子又はポリヌクレオチドは、ゲノムもしくは合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡであり得、それは、単一鎖又は二本鎖であり得、コーディング（センス）鎖又は非コーディング（アンチ−センス）鎖であり得る。非限定的な例では、フラグメントは、１０−６０ヌクレオチドより長い核酸配列であり得、好ましくは、少なくとも６１−１００ヌクレオチドの長さ、又は１０１ヌクレオチド以上の長さのフラグメントが挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用するとき、「ＩＬ−２１ポリヌクレオチド」は、ＩＬ−２１分子をコードする任意の核酸配列を指す。例えば、ＩＬ−２１ポリヌクレオチドは、完全長ＩＬ−２１  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を含み得る。ＩＬ−２１ポリヌクレオチドはまた、イントロン配列、５’及び／又は３’非翻訳配列、コーディング領域、シグナル配列、分泌蛋白質コーディング領域、又は上述の任意の組合せを含み得る。ＩＬ−２１ポリヌクレオチドのフラグメント、エピトープ、ドメイン、縮重配列、変異体も、本発明の方法と医薬組成物に適切である。
【００１９】
ＩＬ−２１ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドからなり得、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。ＩＬ−２１ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾塩基又は修飾ヌクレオチド間結合を含み得る（修飾は、ポリヌクレオチドの安定性を増加するか、又は何らかの様式でポリヌクレオチドを改良する）。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基や、イノシンなどの異常 (unusual) 塩基が挙げられる。種々の修飾がＤＮＡとＲＮＡになされ得る；このように、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、又は代謝的な修飾形態を包含する。
【００２０】
同様に、本明細書で使用されるとき、「ＩＬ−２１アミノ酸配列」又は「ＩＬ−２１ポリペプチド」は、天然起源又は合成である、ＩＬ−２１オリゴペプチド、ペプチド、又は蛋白質配列、及びそれらのフラグメントもしくは部分を指す。そのアミノ酸配列フラグメント又は部分は、約５〜約３０アミノ酸、好ましくは約５〜約１５アミノ酸の長さであり得る。このようなフラグメントや部分は望ましくは、ＩＬ−２１ポリペプチドの生物活性又は機能を保持する。
【００２１】
用語「アミノ酸配列」は、本明細書で使用されるとき、天然起源の「蛋白質分子」のアミノ酸配列、「ポリペプチド」もしくは「蛋白質」などのアミノ酸配列や同様の用語を指すように本明細書では記載され、記載の蛋白質分子から連想される完全且つ天然のアミノ酸配列に限定するようには意味されない。このような分子はまた、ＩＬ−２１の機能部分を含む、融合蛋白質、キメラ蛋白質又は他の関連蛋白質を含み得る。本明細書で使用される語句「ＩＬ−２１の機能部分」は、ＩＬ−２１生物活性を有するＩＬ−２１の任意の部分を指す。更に、用語「ＩＬ−２１ポリペプチド」と「ＩＬ−２１蛋白質」は、本明細書では交換可能に使用され、本発明のＩＬ−２１核酸配列のコードされた産物を指す。
【００２２】
更に、本明細書で使用されるとき、ＩＬ−２１「ポリペプチド」は、広義のＩＬ−２１ポリヌクレオチドから産生される翻訳されたアミノ酸配列を有する分子を指す。「分泌」ＩＬ−２１蛋白質は、シグナル配列の結果として小胞体（ＥＲ）、分泌小胞、又は細胞外空間に指向できる蛋白質、並びに細胞外空間に放出されるＩＬ−２１蛋白質を指す。ＩＬ−２１分泌蛋白質が細胞外空間に放出されるならば、ＩＬ−２１分泌蛋白質は、細胞外プロセシングを受け得、「成熟」ＩＬ−２１蛋白質を産生できる。細胞外空間への放出は、エクソサイトーシスや蛋白質分解切断を含む多数の機構によって起こり得る。
【００２３】
ＩＬ−２１ポリペプチドの「変異体」は、１個以上のアミノ酸が変更したアミノ酸配列を指す。変異体は「保存的」変化を有し得、それでは、置換されたアミノ酸は、構造的又は化学的に類似の性質を有し、例えば、ロイシンのイソロイシンによる置換である。より稀には、変異体は「非保存的」変化を有し得、例えば、グリシンのトリプトファンによる置換である。マイナー変異はまた、アミノ酸欠失もしくは挿入又は両方を含む。機能的、生物的又は免疫活性を喪失することなくいずれのアミノ酸残基が置換、挿入、又は欠失され得るかを決定する指針は、当業界周知のコンピュータープログラム、例えば、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアを用いて、見出すことができる。本発明の目的のために、変異体は、好ましくは、ＩＬ−２１のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性のアミノ酸酸列を有する。さらに好ましくは、変異体は、ＩＬ−２１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性のアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、変異体は、ＩＬ−２１のアミノ酸配列と９５％を超える同一性のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
ＩＬ−２１ポリペプチドは、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、エステル化、ミリストイル化、アミド化などの１つ以上の修飾を有し得る（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−１２（１９８３））。
【００２５】
ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする「変更」核酸配列は、同じ又は機能的に等価なＩＬ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生じる、異なるヌクレオチドの欠失、挿入及び／又は置換を含む核酸配列を含む。変更核酸配列は更に、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの多型を含み得る；このような多型は、特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて、容易に検出され得るか、又は検出され得ない。コードされた蛋白質はまた、サイレント変化を生成し、機能的に等価なＩＬ−２１蛋白質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換を含み得る。意図的なアミノ酸置換は、ＩＬ−２１蛋白質の生物活性が保持される限りは、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の性質における類似性を基になされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられ得る；正に荷電したアミノ酸としては、リジン、アルギニンが挙げられ得る；類似の親水性値を有する非荷電の極性ヘッド基を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；及びフェニルアラニン、チロシンが挙げられ得る。
【００２６】
「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）は、アミノ酸残基のペプチド骨格と類似するアミド結合を介して結合したオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）を含むアンチセンス分子又はアンチ遺伝子剤を指す。典型的には、ＰＮＡは、アミド結合を介して結合した少なくとも５ヌクレオチドのオリゴを含む。ＰＮＡは、ＤＮＡに対する結合親和性を向上するように、正に荷電したアミノ酸残基で終結してもよいし、終結しなくともよい。例えば、このようなアミノ酸としては、とりわけ、リジン、アルギニンが挙げられる。これらの低分子は、核酸の相補鎖への結合によって転写伸長を停止させる（Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９３，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，８：５３−６３）。ＰＮＡはペグ化されて、細胞内での延命を可能とし、細胞では、ＰＮＡは、相補的単一鎖のＤＮＡとＲＮＡに優先的に結合する。
【００２７】
「生物活性を有する」ＩＬ−２１ポリペプチドとは、特定の生物アッセイで測定したとき、投与量に依存性して又は依存せずに、成熟形態を含むＩＬ−２１ポリペプチドの活性と類似の（必ずしも同一ではない）活性を示すポリペプチドを指す。投与量依存性が存在する場合、それは、ＩＬ−２１ポリペプチドと比較したとき、ＩＬ−２１ポリペプチドのそれと同一である必要はないが、所定の活性における投与量依存性が実質的に類似している必要がある（即ち、候補ポリペプチドは、ＩＬ−２１ポリペプチドに対し、より大きな活性、又は約２５倍以下の活性、好ましくは約１０倍以下の活性、最も好ましくは約３倍以下の活性を示す）。ＩＬ−２１の生物活性は、参考文献（例えば、Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら，（２０００），上記）に記載されている。
【００２８】
ポリヌクレオチドのＩＬ−２１核酸分子を合成するのに使用される種々の技術は、当業界公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，上記；及びＬｅｍａｉｔｒｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４：６４８−６５２（１９８７）を参照のこと。あるいは、核酸分子又はポリヌクレオチドは、Ｅｕｒｇｅｎｔｅｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍなどの会社によって商業的に合成され得る。
【００２９】
ＩＬ−２１ポリペプチド、その変異体、又はそれらのいずれかのフラグメントの合成方法も当業界公知である。ポリペプチド（変異体又はフラグメントを含む）は、当業者に周知の標準的ペプチド合成技術を用いて合成できる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：１９８４に要約されている）。特に、ポリペプチドは、固相合成方法を用いて合成できる（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｂａｒａｎｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３０：７０５−７３９（１９８７）；及び米国特許第５，４２４，３９８号参照）。所望ならば、これは、自動ペプチド合成機を用いてなされ得る。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）又は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸ブロッキング基の除去及び樹脂からのポリペプチドの分離は、例えば、低温での酸処理によって達成できる。次いで、ポリペプチド含有混合物は、例えば、ジメチルエーテルによって抽出されて、非ペプチド有機化合物を除去でき、合成ポリペプチドは、樹脂粉末から抽出できる（例えば、２５％ｗ／ｖ酢酸を使用）。ポリペプチドの合成後、場合によっては、更なる精製（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて）を行って、不完全ポリペプチド又は遊離アミノ酸を除去できる。アミノ酸及び／又はＨＰＬＣ分析は、合成ポリペプチドに対して行われ、その同一性を検証することができる。本発明のその他の適用に関し、当業者に公知である化学連結又は遺伝子手段により、より大きな融合蛋白質の一部としてポリペプチドを産生することが好ましくあり得る。
【００３０】
本発明の１実施態様は、被験体における癌、前癌、もしくは免疫関連疾患、障害、もしくは状態の治療又は予防の方法に関する。被験体は任意の被験体であり得るが、好ましくは被験体は哺乳動物である。本明細書の目的のために、哺乳動物としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及びヒトが挙げられるが、それらに限定されない。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。方法は、有効量のＩＬ−２１蛋白質、ポリペプチド、又はそれらの変異体もしくはフラグメントを投与して、癌、前癌、又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態を、軽減、改善又は除去することを含む。本明細書で使用するとき、用語「軽減」「改善」「除去」及び本明細書で使用されるそれらの派生語は、必ずしも完全な軽減、改善又は除去を意味しない。むしろ、潜在的な利益又は予防／治療効果を有するものとて当業者が認識する、種々の程度の軽減、改善又は除去がある。この点に関し、軽減、改善又は除去は、本発明の方法により達成される任意のレベルであり得る。本明細書で使用するとき、用語「治療」、「予防」及び本明細書で使用するそれらの派生語は、必ずしも完全な治療又は予防を意味しない。むしろ、潜在的な利益又は予防／治療効果を有するものとして当業者が認識する種々の程度の治療及び予防がある。この点に関し、治療又は予防は、本発明の方法により達成される任意のレベルであり得る。ＩＬ−２１蛋白質、ポリペプチド、又はそれらの変異体もしくはフラグメントは、他の成分が結合している誘導体の形態（例えば、放射性同位体、ビオチンタグ、又はフルオロセインタグで標識されている形態が挙げられるがそれらに限定されない）であり得る。特定の器官、腫瘍、又は細胞型への特異的なターゲティングを可能とするために、標的化剤も使用できる。このような標的化剤は、ホルモン、免疫グロブリン、サイトカイン、細胞レセプターなどであり得る。ＩＬ−２１蛋白質、ペプチド、又はそれらの変異体は、単独で、又は他の試薬又は治療剤と組合せて投与できる。
【００３１】
本発明の別の実施態様はまた、ＩＬ−２１蛋白質又はポリペプチドが当業界公知の方法によって医薬として許容できる担体と共に処方されている医薬組成物の投与による、癌、前癌、もしくは免疫関連疾患を有する被験体の癌、前癌、又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態の治療又は予防方法に関する。
【００３２】
本発明の更に別の実施態様は、腫瘍又はリンパ腫の軽減、改善又は除去に有効な量のＩＬ−２１蛋白質、ポリペプチド、又はそれらの変異体もしくはフラグメント、あるいはＩＬ−２１蛋白質、ペプチド、又はそれらの変異体を含有する医薬組成物の投与による、固形腫瘍又はリンパ腫を有する被験体、好ましくは哺乳動物被験体、より好ましくはヒト被験体の治療方法に関する。治療され得るその他の疾患、障害及び／又は状態の例としては、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、並びに特に、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚部、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、結腸、子宮の癌が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、癌は、黒色腫、肉腫、又は結腸癌である。
【００３３】
本発明の別の実施態様は、癌、前癌、又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態の軽減、改善又は除去に有効な量の、ＩＬ−２１核酸分子、ポリヌクレオチド、又はＩＬ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの投与による、癌、前癌、又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態を有する被験体の治療又は予防方法に関する。
【００３４】
本発明は、ヒトの癌、新生物、及び／又は悪性腫瘍の治療のための新規抗癌剤の使用方法に関する。癌（例えば、固形腫瘍又はリンパ腫などが挙げられるがそれらに限定されない）を有する被験体の治療での抗癌剤としての使用のために、ＩＬ−２１発現に適したプラスミドが開発されてきた。１つのアプローチは、インビボでの樹立された腫瘍細胞への組換え遺伝子の直接投与に依存するものであり、インサイチュで増殖しているときに腫瘍細胞を遺伝的に改変し、局所的量のＩＬ−２１を産生し、分泌するようにすることである。腫瘍細胞による局所的量のＩＬ−２１の分泌は、次なる腫瘍の軽減又は根絶を引き起こし得る。本方法において、遺伝子は、固形腫瘍部位に直接的に導入され、局所細胞は遺伝子を取り込み、発現する。骨格筋や心筋などの幾つかの部位では、発現可能なＤＮＡが担体を使用することなく注入され得る。他の組織では、例えば、カチオン性脂質（例えば、脂質複合体又はリポソーム）と複合体を形成したＤＮＡを導入することによって、ＤＮＡ発現は促進され得る。脂質成分は、ＤＮＡ／脂質複合体に接近した場合、細胞へのＤＮＡの侵入を促進する。それによって、薬物様の様式における患者へのＤＮＡの送達は促進され得る。
【００３５】
従って、癌を有する被験体の治療又は予防の１方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、バキュロウイルス、ワクシニアウイルスなどの高効率発現系へのＩＬ−２１蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子の挿入により達成できる。生存不能なベクターを使用する技術は、製造と投与の安全性が容易であるという利点を有する。従って、ＩＬ−２１核酸配列は抗癌剤として有用である。本発明のＩＬ−２１蛋白質又はペプチドをコードするＤＮＡ配列は、癌細胞に対する細胞応答を発揮する量で、遺伝子銃を用いて投与できる。ナノグラム量がこのような目的に有用である。
【００３６】
本発明の更なる実施態様は、固形悪性腫瘍又はリンパ腫の軽減、改善又は除去に適した有効量のＩＬ−２１プラスミドの被験体への投与による、固形悪性腫瘍又はリンパ腫を有する被験体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの治療又は予防方法に関する。ＩＬ−２１プラスミドＤＮＡは、患者の固形腫瘍細胞又は結節に直接導入できる。
【００３７】
１実施態様は、癌、前癌、又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態の軽減、改善又は除去に有効な量における、ＩＬ−２１ポリペプチド又はその変異体、ポリヌクレオチド、及び／又はＩＬ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、他の適切な治療剤との併用投与による、被験体における癌、前癌、もしくは免疫関連疾患、障害、もしくは状態の治療又は予防方法に関する。併用療法で使用する適切な薬剤の選択は、通常の薬学原則に基づいて当業者によってなされ得る。治療剤の併用は、上記の種々の障害の治療又は予防の効果をもたらすように相乗的に作用し得る。このアプローチを用いることで、各薬剤のより低い投与量での使用により治療効力が達成され得、有害な副作用の可能性を軽減し得る。
【００３８】
より詳細には、ＩＬ−２１遺伝子を含むプラスミドの投与により固形腫瘍（悪性又は良性）を治療又は予防するとき、ＩＬ−２１プラスミドが固形腫瘍部位に直接導入され、そこで局所細胞が遺伝子を取り込み、発現する。幾つかの部位（例えば、骨格筋、心筋が挙げられるがそれらに限定されない）では、発現可能なＤＮＡは、担体を用いずに注入され得る。腫瘍細胞などの他の組織では、ＤＮＡ発現は、ＤＮＡと担体（例えば、脂質）の導入により促進され得る。脂質成分は、ＤＮＡ／脂質複合体に接近した場合、細胞へのＤＮＡの侵入を促進し得る。それによって、薬物様の様式での患者へのＤＮＡの送達は促進される。
【００３９】
特に、直接的遺伝子導入アプローチは、ＩＬ−２１発現に適したプラスミドを利用する。好適なプラスミドは、単純化された真核発現ベクターである、環状で二重鎖のＤＮＡプラスミドである。ＩＬ−２１遺伝子は、プラスミドが細胞に導入されるときＩＬ−２１が発現するように、プラスミドに挿入され得る。ＩＬ−２１の発現を助長且つ増大させるために、他の遺伝子もまた含み得る。１実施態様では、ＩＬ−２１はｐＯＲＦ−ｍｃｓ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に挿入できる（多重クローニング部位（ｍｃｓ）は、以下の制限部位：Ｓｇｒ  ＡＩ，Ｓａｌ  Ｉ，Ｂａｍ  ＨＩ，Ｐｓｔ  Ｉ，Ｎｃｏ  Ｉ，及びＮｈｅ  Ｉの幾つかを含む）。従って、ＩＬ−２１は、伸長因子１α／真核生物開始因子４ｇ（ＥＦ−ｌα／ｅＩＦ４ｇ）の転写制御下に置かれる。当業者に周知の方法を用いて、ＩＬ−２１ポリペプチド並びに適当な転写及び翻訳制御エレメントをコードする配列を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法としては、インビトロ組換え技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。このような技術は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，及びＡｕｓｕｂｅｌら，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載されている。
【００４０】
種々の発現ベクター又は宿主系が、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする配列を含み、且つ発現するように利用できる。このような発現ベクター／宿主系としては、組換えバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターによって形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターによって形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）が感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））、又は細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）によって形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。使用する宿主細胞は、本発明に限定的なものではない。
【００４１】
「制御（ｃｏｎｔｒｏｌ）エレメント」又は「調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）エレメント」は、宿主細胞蛋白質と相互作用し、転写と翻訳を行うベクターの非翻訳領域、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域である。このようなエレメントは、それらの強度及び特異性で変化し得る。使用するベクター系と宿主に依存して、構成型と誘導型プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを使用できる。例えば、細菌系にクローニングするとき、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）又はＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導型プロモーターが使用できる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞で使用できる。植物細胞のゲノム（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ；及び貯蔵蛋白質遺伝子）由来のプロモーター又はエンハンサーあるいは植物ウイルス由来のプロモーター又はエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーター又はリーダー配列）は、ベクター中にクローンできる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子又は哺乳動物ウイルスからのプロモーターが好適である。ＩＬ−２１をコードする配列の多重コピーを含む細胞系を作出する必要があるならば、ＳＶ４０又はＥＢＶに基づくベクターを、適当な選択可能マーカーと共に用いることができる。
【００４２】
細菌系では、発現されるＩＬ−２１産物に応じて意図される使用に依存して、多数の発現ベクターが選択できる。例えば、多量の発現蛋白質が、抗体の誘導のために必要ならば、容易に精製される融合蛋白質の高レベル発現を指向させるベクターが使用できる。このようなベクターとしては、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）（ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする配列は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔ及び続く７残基の配列とフレームが一致するようにベクターに連結され、それによりハイブリッド蛋白質が産生され得る）（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ及びＳｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：５５０３−５５０９参照）などの、多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニング及び発現ベクターが挙げられるがそれらに限定されない。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として外来ポリペプチドを発現するように使用できる。一般的に、このような融合蛋白質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、次いで、遊離グルタチオンの存在下の溶出によって、溶解細胞から容易に精製できる。このような系で作出される蛋白質は、ヘパリン、トロンビン、又は第ＸＡ因子（factor  ＸＡ）プロテアーゼ切断部位を含むように設計でき、それにより、目的のクローン化ポリペプチドがＧＳＴ部分から随意に放出され得る。
【００４３】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用できる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターと３分節リーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１又はＥ３領域への挿入は、感染した宿主細胞中でＩＬ−２１ポリペプチドを発現できる生存可能なウイルスが得られるように用いられ得る（Ｌｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８１：３６５５−３６５９）。更に、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞での発現を増大できる。
【００４４】
特定の開始シグナルもまた、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用できる。このようなシグナルはＡＴＧ開始コドンと隣接配列を含む。ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、上流配列を、適当な発現ベクターに挿入する場合、更なる転写又は翻訳制御シグナルは必要とされないことがあり得る。しかし、コーディング配列又はそのフラグメントのみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供され得る。更に、好ましくは、開始コドンは、インサート全体の翻訳が保証されるように正しいリーディングフレーム中にある。外因性翻訳エレメント及び開始コドンは、天然と合成の両方の種々の起源であり得る。発現効率は、使用する特定の細胞系に適当なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆら，１９９４，Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．，２０：１２５−１６２）に記載のもの）を含めることによって、増強され得る。
【００４５】
１実施態様では、アゴニスト、アンタゴニスト、及びそれらのフラグメントを含むＩＬ−２１ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドは、シグナル伝達経路を調節するのに有用である。本発明の１実施態様では、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを個体に投与することで、新生物障害（上記の癌及び腫瘍の型が挙げられるがそれらに限定されない）を治療又は予防できる。
【００４６】
治療で使用されるポリペプチドはまた、しばしば「遺伝子治療」とも言われる治療様式で、被験体中で内因的に産生させることができる。即ち、例えば、被験体からの細胞は、エキソビボにおいてポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）によって、並びに、例えばレトロウイルスベクターの使用によって操作され得る。次いで、細胞は被験体に導入できる。遺伝子治療、そして特に細胞の投与量と頻度に関する更なる詳細は、米国特許第５，３９９，３４６号（引用により本明細書に全体として含まれるものである）に記載されている。
【００４７】
ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする遺伝子は、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント又はそれらの相補的配列を高レベルで発現する発現ベクターにより細胞又は組織を形質転換することによって活性化 (turn on) 又は不活性化 (turn off) できる。このような構築体を用いて、翻訳されないセンス又はアンチセンス配列を細胞に導入できる。ＤＮＡに組み込まれない場合でさえ、このようなベクターは、内因性ヌクレアーゼにより能力が喪失するまでＲＮＡ分子を転写し続け得る。一過性発現は、非複製ベクターの場合は１ヶ月以上持続し、適当な複製エレメントがベクター系の一部であるように設計される場合には一層長く持続し得る。
【００４８】
遺伝子発現の修飾は、対照、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする遺伝子の５’領域又は調節領域（例えば、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及びイントロン）に、アンチセンス分子又は相補的核酸配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡ）を設計することによって得られ得る。例えば、出発部位から−１０〜＋１０位の転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドが好適である。同様に、「３重ヘリックス」塩基対形成技術を用いて阻害を達成し得る。３重ヘリックス塩基対形成は有用である。それは、ポリメラーゼ、転写因子、又は制御分子の結合に十分であるように２重ヘリックスが開く能力の阻害を引き起こすからである。３重ＤＮＡを用いる最近の治療進歩が記載されている（例えば、Ｇｅｅら，１９９４，Ｉｎ：Ｈｕｂｅｒ及びＣａｒｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，ＮＹ参照）。転写物のリボソームへの結合の防止によりｍＲＮＡの翻訳をブロックするように、アンチセンス分子又は相補的配列を設計することもできる。
【００４９】
リボザイム、即ち、酵素的ＲＮＡ分子もまた、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために使用できる。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、次いで、エンドヌクレオリティク切断を含む。適切な例として、ＩＬ−２１ポリペプチドをコードする配列のエンドヌクレオリティク (endonucleolytic) 切断を特異的かつ効率的に触媒できる、操作されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が挙げられる。
【００５０】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、以下の配列：ＧＵＡ，ＧＵＵ，及びＧＵＣを含むリボザイム切断部位のために、標的分子をスキャンすることによって最初に同定される。一旦同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短ＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドの機能不能をもたらす２次構造的な特性について評価され得る。標的候補の適切性はまた、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの接近性を、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて試験することにより評価され得る。
【００５１】
本発明の相補的リボ核酸及びリボザイムは、核酸分子の合成のための当業界公知の任意の方法によって製造できる。このような方法として、オリゴヌクレオチドを化学合成する技術、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成が挙げられる。あるいは、ＩＬ−２１をコードするＤＮＡ配列のインビトロとインビボ転写によってＲＮＡ分子を製造できる。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７又はＳＰなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターをもった種々のベクターに組み込むことができる。あるいは、相補的ＲＮＡを構成的又は誘導的に合成するｃＤＮＡ構築体を、細胞系、細胞、又は組織に導入できる。
【００５２】
ＲＮＡ分子は、細胞内安定性と半減期を増加するように修飾できる。可能な修飾としては、分子の５’及び／又は３’末端での隣接配列の付加、又は分子の骨格内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用が挙げられるがこれらに限定されない。この概念はＰＮＡの製造に固有だが、イノシン、キューオシン、ワイブトシンなどの非伝統的塩基、並びに、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び同様の修飾型（それらは、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない）を含めることによって、これらの全ての分子に拡張できる。
【００５３】
細胞又は組織へのベクターの多くの導入方法が利用でき、インビボ、インビトロ及びエキソビボでの使用に等しく適切である。エキソビボ療法に関しては、ベクターは、患者から採った幹細胞に導入でき、同じ患者に戻す自己移植のためにクローン増殖できる。トランスフェクション及びリポソーム注入によるトランスフェクションは、当業界周知の方法を用いて達成できる。
【００５４】
本発明の更なる実施態様は、上記治療的使用や効果の任意のもののために、医薬として許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤と組合せた医薬組成物の投与による癌、前癌、又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態の治療又は予防方法に関する。このような医薬組成物は、ＩＬ−２１核酸、ポリペプチド、もしくはペプチド、ＩＬ−２１レセプターに対する活性化抗体、擬似体、アゴニスト、アンタゴニスト、又はＩＬ−２１ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの調節剤を含み得る。更なる例において、自己免疫疾患の治療のために、又はＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用のブロックによって例示されるように、ＩＬ−２１レセプターとリガンド相互作用の阻害が利益ある効果を有する場合（Ｄｉｅｈｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：３６３−３７１，２０００；Ｄａｔｔａ及びＫａｌｌｅｄ，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４０：１７３５−１７４５，１９９７）、ＩＬ−２１レセプターに対する中和抗体又は阻害抗体を含む医薬組成物を投与することは有益であり得る。組成物は、単独で、又は少なくとも１つの他の薬剤（例えば、安定化化合物）と組合せて投与でき、任意の滅菌された生体適合性の医薬担体（例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水が挙げられるがそれらに限定されない）において投与できる。組成物は、単独で、又は他の薬剤、薬物、ホルモン、又は生物応答改変剤と組合せて患者に投与できる。
【００５５】
更なる実施態様では、本発明の蛋白質、活性化抗体、アゴニストもしくは調節剤、相補的配列、又はベクターを、単独で、又は他の適当な治療剤と組合せて投与できる。併用療法で使用する適当な薬剤の選択は、通常の薬学原則に基づき、当業者によりなされ得る。治療剤の併用は、上記の種々の障害の治療又は予防をもたらすように相乗的に作用させることができる。このアプローチを用いて、各薬剤のより低い投与量で治療効果を達することができ、有害な副作用の可能性を軽減し得る。
【００５６】
この点に関し、本発明における哺乳動物の癌の治療方法及び予防方法は、ＩＬ−２１ポリペプチド、変異体、それらのフラグメント、ＩＬ−２１ポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント、又はＩＬ−２１ポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントを含む発現ベクターと共に、他の治療剤もしくは予防剤を共投与することを含み得る。このような薬剤としては、例えば、ワクチン、抗原特異的Ｔリンパ球、及びサイトカインが挙げられる。ワクチンは、組換えウイルスワクチン又はペプチドワクチンであり得る。抗原特異的Ｔリンパ球は、例えば、腫瘍特異的Ｔリンパ球であり得る。サイトカインは任意のサイトカインであり得る。好ましくは、サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−７又はＩＬ−１５である。本発明における癌の治療／予防方法は、本明細書中に記載の方法の任意の組合せを含むことを当業者は理解する。
【００５７】
特に、組合せアプローチは、回収され、インビトロで増殖され、改変され、選別され、次いでインビボで再注入される腫瘍細胞に関する。より詳細には、この実施態様は、転移性黒色腫を有する選別された患者において癌の退行を媒介するのに有効なヒト腫瘍抗原を認識できる遺伝的に改変された免疫細胞による受動免疫療法（通常、養子免疫療法と言われる）に関する。抗原提示細胞上に提示される腫瘍抗原免疫支配的ペプチドに対してヒトリンパ球をインビトロで感作させるインビトロ技術が開発された。被験体における癌の治療及び／又は予防のために養子免疫療法の効果を増大させるため、ＩＬ−２１ポリペプチド又はポリヌクレオチドの投与が使用できる。
【００５８】
癌、前癌、又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態に対する特異的反応性を有する免疫された哺乳動物からのＴ細胞もまた、哺乳動物の静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下に、ＩＬ−２１ポリペプチド又はポリヌクレオチドに加えて、１０７〜１０１１Ｔ細胞を投与することによって、癌に罹患した個体の治療のためにインビボで使用できる。投与の好適な経路は、静脈内又は腹腔内である。
【００５９】
例えば、ＩＬ−２１遺伝子の組み込みは、腫瘍抗原の免疫原性を増加し得、これらの抗原を担持する樹立された肺転移の退行さえも媒介し得、これらの抗原を担持する樹立された肺転移の退行さえも媒介し得る。能動免疫療法およびその後の共免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及び好ましくはＩＬ−２１）の外来性投与もまた、免疫応答の改善に使用できる。
【００６０】
本発明の別の局面は、感染（例えば、細菌、真菌、原生動物、及びウイルスの感染）、又はＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２によって引き起こされる感染、癌、前癌、及び他の免疫関連疾患、障害、もしくは状態から哺乳動物を防御するために、抗体及び／又はＴ細胞免疫応答を生じさせるのに十分なＩＬ−２１ポリペプチド又はそのフラグメントを哺乳動物に接種することを含む、哺乳動物における免疫応答の誘導方法に関する。本発明の更に別の局面は、上記の疾患、障害又は状態から哺乳動物を防御するために抗体を生じさせる免疫応答を誘導するように、インビボでＩＬ−２１ポリヌクレオチドの発現を指向するベクターを介してＩＬ−２１ポリペプチドを送達することを含む、哺乳動物における免疫応答の誘導方法に関する。
【００６１】
本発明の更なる局面は、哺乳動物宿主に導入されるとき、哺乳動物においてＩＬ−２１ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する免疫又はワクチンの製剤又は組成物（ここで、組成物はＩＬ−２１ポリペプチド又はＩＬ−２１遺伝子を含む）に関する。製剤は適切な担体をさらに含み得る。ＩＬ−２１ポリペプチドは胃で分解され得るので、好ましくは、それは、非経口的に投与される（皮下、静脈内、筋肉内、皮膚内などの注射を含む）。非経口投与に適した製剤としては、水性及び非水性の滅菌注射溶液（それらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質（製剤をレシピエントの血液と等張にする）を含有しうる）；並びに水性及び非水性の滅菌懸濁剤（それらは、懸濁剤又は増粘剤を含有しうる）が挙げられる。製剤は、単位投与量容器又は複数投与量容器、例えば、密封アンプルやバイアルで提供でき、使用直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存できる。ワクチン製剤はまた、水中油系や当業界公知の他の系などの、製剤の免疫原性を高めるためのアジュバント系を含み得る。更に、癌、前癌、及び／又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態に対する免疫化又はワクチン化を高めるために、ＩＬ−２１はまた、単独で、又は他の薬剤と組合せて、アジュバントとして使用できる。投与量は、ワクチンの比活性に依存し、慣用的な実験によって容易に決定できる。
【００６２】
従って、本発明は、投与経路（静脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、クモ膜下、イントラプレルーラル (intraplerural)、子宮内、直腸、膣内、局所などが挙げられるがそれらに限定されない）を介して、ＩＬ−２１蛋白質又はペプチド（又はそれらをコードする核酸）を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物における癌、前癌、好ましくは腫瘍もしくはリンパ腫、及び免疫関連疾患、障害、もしくは状態の予防又は阻害方法方法に関する。
【００６３】
投与はまた、経粘膜又は経皮手段によってであり得る。浸透されるべき障壁に適切な経粘膜又は経皮投与浸透剤が製剤において使用される。このような浸透剤は一般的に当業界公知であり、例えば、経粘膜用の胆汁酸塩やフシジン酸誘導体が挙げられる。更に、界面活性剤が、浸透を容易にするために使用できる。経粘膜投与は、例えば、鼻内スプレー、又は坐剤によってであり得る。経口投与では、ＩＬ−２１蛋白質、ペプチド、又はそれらの変異体は、カプセルや錠剤などの通常の経口投与形態に製剤化される。
【００６４】
ＩＬ−２１分子を単独で投与する他に、医薬として許容できる担体と混合された、治療有効量の１以上のＩＬ−２１分子を含む医薬組成物が使用できる。この組成物は、非経口、静脈内、又は皮下で投与できる。投与されるとき、本発明で使用される治療組成物は好ましくは、パイロジェンを含有しない非経口的に許容できる水溶液の形態である。ｐＨ、等張性、安定性などを考慮したこのような非経口的に許容できる蛋白質溶液の製造は当業界の技術の範囲内である。
【００６５】
本発明で使用される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、延髄内、クモ膜下、室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腸、局所、舌下、膣内、又は直腸手段が挙げられるがそれらに限定されない任意の数の経路によって投与できる。
【００６６】
活性成分（即ち、ＩＬ−２１核酸及び／又はポリペプチド、及び／又はそれらの機能性フラグメント（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：５７−６３（２０００）（引用により本明細書に全部が含まれるものとする）））の他に、医薬組成物は、医薬として使用できる製剤への活性化合物の加工を容易にする補助剤を含む医薬として許容できる適切な担体又は賦形剤を含み得る。製剤と投与に関する技術の更なる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に記載されている。
【００６７】
経口投与用の医薬組成物は、経口投与で適切な投与量で、当業界周知の医薬として許容できる担体を用いて製剤化できる。このような担体により、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして医薬組成物が製剤化されることが可能となる。
【００６８】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と合わせ、生じた混合物を必要に応じて粉砕し、所望ならば適切な補助剤の添加後に顆粒の混合物を加工し、錠剤又は糖衣剤コアを得ることによって得られ得る。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、又は他の植物からの澱粉；メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；ゴム（アラビア、トラガカントが挙げられる）；並びにゼラチンやコラーゲンなどの蛋白質；などの炭水化物又は蛋白質充填剤である。所望ならば、架橋したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムなどの生理的に許容できるその塩などの崩壊剤又は可溶化剤を添加できる。
【００６９】
糖衣剤コアは、濃縮糖溶液（それはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は２酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒もしくは溶媒混合物を含み得る）などの生理的に適切なコーティングと共に使用できる。染料又は色素が、製品の識別のために又は活性化合物の量（即ち、投与量）を特徴付けるために、錠剤又は糖衣剤コーティングに添加できる。
【００７０】
経口的に使用できる医薬製剤としては、ゼラチンから構成されるプッシュフィット (push-fit) カプセル、並びに、ゼラチンとコーティング（例えば、グリセロールやソルビトール）から構成される規格化された (scaled) 軟カプセルが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、充填剤もしくは結合剤（ラクトース又は澱粉など）、潤滑剤（タルク又はステアリン酸マグネシウムなど）、必要に応じて安定化剤と混合された活性成分を含み得る。軟カプセルでは、活性化合物は、安定化剤と共に又は伴わずに、適切な液体（例えば、脂肪油、液体、もしくは液体ポリエチレングリコール）中に溶解又は懸濁され得る。
【００７１】
非経口投与に適した医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理的に適合性の緩衝剤（例えば、ハンクス液、リンゲル液、又は生理的緩衝化生理食塩水など）中で製剤化できる。水性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランなどの懸濁剤の粘度を増加する物質を含み得る。更に、活性化合物の懸濁剤は、適当な油性注射懸濁剤として製造できる。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。必要に応じて、懸濁剤はまた、高濃度溶液の製造を可能とするために、化合物の溶解性を増加する適切な安定化剤又は薬剤を含み得る。
【００７２】
局所又は鼻内投与では、浸透されるべき特定の障壁に適切である浸透剤又は透過剤が、製剤中で使用される。このような浸透剤は一般的に当業界公知である。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、当業界公知の方法、例えば、通常の混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、湿式粉砕、乳化、カプセル化、捕捉、又は凍結乾燥方法によって製造できる。
【００７４】
医薬組成物は、塩として提供され得、そして多数の酸（例えば、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸が挙げられるがこれらに限定されない）と共に形成され得る。塩は、対応する遊離塩基の形態よりも、水性溶媒又は他のプロトン性溶媒により可溶性である傾向を有する。他の場合、好適な製剤は凍結乾燥粉末であり得、それは、以下の任意のもの又は全てを含み得る：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１−２％スクロース、２−７％マンニトール、ｐＨ範囲４．５−５．５、使用前に緩衝液と合わせる。医薬組成物の製造後、それは適当な容器に入れられ、記載された条件の治療用のために標識される。ＩＬ−２１製品の投与について、このような標識は、量、頻度、投与方法を含む。
【００７５】
本発明での使用に適した医薬組成物としては、活性成分が、意図された目的を達成するための有効量で含有される組成物を含む。有効投与量又は量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。任意の化合物に関し、治療有効投与量は、細胞培養アッセイ（例えば、新生物細胞を用いる）又は動物モデル（通常、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタを用いる）で最初に評価することができる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲と投与経路の決定に使用できる。次いで、このような情報を使用し、外挿することで、ヒトでの投与のための有用な投与量と経路を決定できる。
【００７６】
治療有効投与量とは、癌、前癌、又は免疫関連疾患、障害、もしくは状態を改善、軽減又は除去する活性成分（例えば、ＩＬ−２１ポリペプチド、もしくはそのフラグメント、ＩＬ−２１レセプターに対する活性化抗体、アゴニスト、又はＩＬ−２１ポリペプチドの調節剤）の量を指す。治療効果と毒性は、細胞培養又は実験動物での標準的薬学方法（例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な投与量）及びＬＤ５０（集団の５０％に致死的な投与量））によって決定できる。毒性効果と治療効果の投与量比は治療指数であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表せる。より大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイと動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用の投与量範囲の決定に使用される。医薬組成物に含まれる好適な投与量は、毒性を殆ど又は全く有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される投与形態、患者の感受性、投与経路に依存してこの範囲内で変動する。
【００７７】
専門家は、個体に必要とされる治療に関する因子を考慮し、正確な投与量を決定する。活性部分の十分なレベルを提供するために、又は所望の効果を維持するために、投与量及び投与は調整される。考慮され得る因子としては、個体の疾患状態の重篤度、患者の一般的健康、年齢、体重、患者の性別、食事、投与の時間と頻度、薬剤併用、反応感受性、及び治療に対する耐性／応答が挙げられる。一般的な指針として、長期作用医薬組成物は、特定の組成物の半減期とクリアランス速度に依存して、３〜４日毎、毎週、又は２週間に１度投与できる。これらの投与量レベルの変動は、当業者により十分理解されるような、最適化に関する標準的な経験的慣用法を用いて調整できる。
【００７８】
通常の投与量は、投与経路に依存して、０．１〜１００，０００マイクログラム（μｇ）、合計投与量約１グラム（ｇ）まで変動し得る。特定の投与量と送達方法に関する指針は、文献に記載されており、当業界の専門家ならば一般的に利用できる。当業者は、蛋白質又はそれらの阻害剤の製剤よりもヌクレオチドの異なる製剤を用いよう。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、部位等に特異的である。
【００７９】
一般的に、少なくとも約１ｐｇ／レシピエント１ｋｇ体重、好ましくは少なくとも１ｎｇ／レシピエント１ｋｇ体重、より好ましくは少なくとも約１μｇ／レシピエント１ｋｇ体重以上のＩＬ−２１蛋白質又はペプチドの投与量をレシピエントに提供するのが望ましい。約１μｇ／１ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／１ｋｇ体重の範囲が好ましく、１０μｇ／１ｋｇ体重〜１０ｍｇ／１ｋｇ体重の範囲がより好ましいが、より低い又はより高い投与量もまた投与できる。所望の投与量は、レシピエント、好ましくはヒトにおける癌、前癌、及び免疫関連疾患、障害、もしくは状態の予防又は阻害に有効である。
【００８０】
上記の状態の治療方法に関連する投与計画は、薬物の作用を修飾する種々の因子、例えば、患者の状態、体重、性別、食事、感染の程度、投与時間、及び他の臨床的因子を考慮する担当医師により決定される。一般的に、１日の投与計画は、体重１ｋｇ当りＩＬ−２１プラスミドＤＮＡ約１〜約２．５ｍｇの範囲であり得る。投与量は、例えばＩＬ−２１の活性により調整され、投与計画は、１日当り体重１ｋｇ当り１μｇ及び５ｍｇを含み得ることを記載することは不合理でない。更に、ＩＬ−２１の投与量が、この範囲よりも高く、又は低く調整される特定の状況が存在し得る。例えば、ＩＬ−２１がアジュバントとして使用されるとき、投与量は、体重１ｋｇ当り又は注射部位当り１μｇなど、はるかに少ないものであり得る。これらは、他の抗癌剤との共投与、並びに／あるいは化学療法剤及び／又は放射線との共投与を含む。上記のように、治療方法及び組成物はまた、他のヒト因子との共投与を含むことができる。本発明のポリペプチドとの同時又は逐次の共投与のための他の適当なヘマトポエチン、ＣＳＦｓ、サイトカイン、リンホカイン、造血増殖因子、インターロイキンの非排他的リストとしては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ（より最近ではｃ−ｍｐｌリガンドと呼ばれている）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＬＩＦ、ｆｌｔ３リガンド、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子及び好酸球分化因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）（スチール因子又はｃ−ｋｉｔリガンドとしても知られる）、又はそれらの組合せが挙げられる。上記投与量は、治療組成物におけるこのようなさらなる成分を補償するように調整される。治療患者の進行は、癌プロフィール、例えば血液細胞計測などの周期的評価によってモニターできる。
【００８１】
本発明は、ここで以下の非限定的な実施例により説明される。
【実施例】
【００８２】
細胞株及び試薬：Ｂ１６黒色腫及びＭＣＡ２０５繊維肉腫腫瘍株を、１０％熱不活化ＦＢＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及びペニシリン−ストレプトマイシン（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから）を補充したＲＰＭＩ１６４０完全培地で培養した。ＣＤ４（ＧＫ１．５）及びＣＤＳ（２．４３）に対する抗マウスモノクローナル抗体は、ＮＣＩ  ＢＲＢ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から得た。マウスＮＫ細胞に対する抗アシアロＧＭ１抗体は和光純薬工業、大阪、日本から購入した。組換えマウスＩＬ−２１は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。ＦＡＣＳ分析に使用した抗体は、ＢＤ／ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【００８３】
統計学
【００８４】
処理群と対照群間の腫瘍増殖速度とマウス生存率を比較する統計的解析は、ＡＮＯＶＡ−ＳｔａｔＶｉｅｗプログラム（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を用いる繰返し測定試験によって行った。処理群と対照群間の腫瘍サイズと細胞数を比較する統計的解析は、ＳｔａｔＶｉｅｗプログラムを用いる非パラメーターＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験によって行った。
【００８５】
実施例１
【００８６】
本実施例は、ヒト及びマウスのＩＬ−２１のクローニングを示す。
【００８７】
ヒトＰＢＭＣとマウス脾細胞（Ｃ５７ＢＬ／６）を、５ｎｇ／ｍｌＰＭＡと２５０μｇ／ｍｌイオノマイシンによって２４時間活性化した。ＴＲＩＺＯＬ法（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって全ＲＮＡを抽出し、単離した。ＲＴ−ＰＣＲを行い、製造業者の使用説明書（ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってランダムプライマーによってｃＤＮＡの第１鎖を増幅した。ヒト又はマウスＩＬ−２１の特異的プライマー対を用いて、完全長ｃＤＮＡフラグメント（元々のシグナルペプチドを含む）をＰＣＲ増幅した。
【００８８】
使用したヒトＩＬ−２１プライマーは以下の通りであった：
ヒト正方向：５’−ｃｃａ−ｃｃｇ−ｇｃｇ−ｇｔａ−ｃｔｔ−ａｔｇ−ａｇａ−ｔｃｃ−ａｇｔ−ｃｃｔ−ｇｇｃ−３’  配列番号１
ヒト逆方向：５’−ｇｃｔ−ａｇｃ−ｔｃａ−ｇｇａ−ａｃｔ−ｔｔｃ−ａｃｔ−ｔｃｃ−ｇｔｇ−３’  配列番号２
【００８９】
使用したマウスＩＬ−２１プライマーは以下の通りであった：
マウス正方向：５’−ｃｃａ−ｃｃｇ−ｇｃｇ−ｇｇｔ−ｇｇｃ−ａｔｇ−ｇａｇ−ａｇｇ−ａｃｃ−ｃｔｔ−ｇｔｃ−３’  配列番号３
マウス逆方向：５’−ｇｃｔ−ａｇｃ−ｃｔａ−ｇｇａ−ｇａｇ−ａｔｇ−ｃｔｇ−ａｔｇ−ａａｔ−３’  配列番号４
【００９０】
ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを、ＴＡクローニングベクターにクローニングした。ヒトＩＬ−２１から１クローン及びマウスＩＬ−２１から３クローンを得た。これらのクローンはＤＮＡ配列決定から確認した。１つのヒトＩＬ−２１クローンは、その配列中に２つの変異を有した。マウスクローンの２つは正しい配列を有し、第３クローンはその配列中に１つの変異を有した。正しい配列を有するマウスＩＬ−２１ｃＤＮＡフラグメントを、Ｓｇｒ  ＡＩとＮｈｅ  Ｉで消化し、ｐＯＲＦ５−ｍｃｓベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングした。Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）のＥｎｄｏｆｒｅｅＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ精製キットを用いて、プラスミドＤＮＡのラージ調製物を単離した。
【００９１】
実施例２
【００９２】
本実施例はマウスＩＬ−２１のクローニングを示す。
【００９３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから新たに単離した脾細胞を５ｎｇ／ｍｌＰＭＡと２５０μｇ／ｍｌイオノマイシンで２４時間活性化した。ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、ランダムプライマーによってｃＤＮＡの第１鎖を増幅した。ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と配列番号３と４のプライマーを用い、完全長ｍＩＬ−２１ｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅した。完全長マウスＩＬ−２１ｃＤＮＡフラグメントを消化し、伸長因子−１α／ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＥＦ−ｌｏ／ＨＴＬＶ）ハイブリッドプロモーター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の制御下、ｐＯＲＦ−ｍｃｓベクターにクローニングし、ｐＯＲＦ／ｍＩＬ−２１とした。マウスＩＬ−２１の正しい配列を配列解析によって確認した。エンドトキシン夾雑を除くために、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用い、ｐＯＲＦ／ｍＩＬ−２１と対照ｐＯＲＦプラスミドＤＮＡのラージ調製物を精製した。
【００９４】
実施例３
【００９５】
本実施例は、発現ベクター内に含まれるＩＬ−２１ポリヌクレオチドの哺乳動物への投与方法及び哺乳動物におけるＩＬ−２１発現の解析を示す。
【００９６】
ｍＩＬ−２１をコードするプラスミドＤＮＡ又は対照ベクターｐＯＲＦ−ｍｃｓの注入は、Ｌｉｕら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０，１７３５−１７３７（１９９９）、及びＺｈａｎｇら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８，７１−７４（２０００）に記載の流体力学ベースの遺伝子送達技術を用いて行った。要約すると、２５ゲージ針を用い、５〜７秒で、種々の量のプラスミドＤＮＡを含む生理食塩水２ｍｌを、８〜１０週齢マウスに静脈注射した。注射した溶液の体積は、マウスの年齢と重量に基き、体重の１０％を超えなかった。注射後、明らかな副作用が観察されることなく、マウスはこの治療投薬計画に十分耐えた。
【００９７】
ＥＬＩＳＡシステムを用い、マウス血清中のｍＩＬ−２１発現を検出した。要約すると、捕捉抗体として、マウスＩＬ−２１に対するモノクローナル抗体を、４℃で９６ウエルプレートに一晩被覆した。翌日、被覆されたプレートに、血清サンプルの連続希釈を加え、一晩４℃でインキュベートした。標準方法を用い、検出抗体としてビオチン標識ラット抗マウスＩＬ−２１ポリクローナル抗体を用いた（ＩＬ−２１抗体はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより入手）。
【００９８】
この方法によって、プラスミドＤＮＡの注入後、肝細胞による蛋白質の大量の長期産生が可能となり、また、この方法は、注入の体積と速度に非常に依存していた。我々の研究の最適プロモーターを決定するため、我々は最初に、ＬＴＲ，ＣＭＶ，及びＥＦ−ｌｃｃ／ＨＴＬＶハイブリッドを含む異なるプロモーターで構成されたレポーター遺伝子（ケモカインＧＲＯ−α）のインビボ発現レベルを比較した。ＥＦ−ｌｃｃ／ＨＴＬＶハイブリッドプロモーターは、プラスミドＤＮＡの静脈内投与後、インビボで導入遺伝子の最高発現を生じさせた。ｍＩＬ−２１インビボ抗腫瘍研究のために、このベクター（ｐＯＲＦ−ｍｃｓ）が続いて用いられた。
【００９９】
シグナル配列を含む完全長マウスＩＬ−２１遺伝子は、活性化マウス脾細胞からＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、次いでｐＯＲＦ−ｍｃｓに連結した。尾静脈中へのｐＯＲＦ／ｍＩＬ−２１プラスミドＤＮＡの直接注入後、マウス血清でのｍＩＬ−２１発現の時間経過が次いで測定された。図１に示すように、ｐＯＲＦ／ｍＩＬ−２１プラスミド２０μｇの単一投与１日後で、サンドイッチ２重抗体ＥＬＩＳＡによって、高レベルのｍＩＬ−２１がマウス血清で検出された（６１０７±２３１９ｐｇ／ｍＬ）。マウスＩＬ−２１の血清レベルは、時間がたつと軽減したが、５日目で２７８±２７９ｐｇ／ｍＬほどとなお高く、８日目にベースラインに戻った。天然マウス又は同一量の対照プラスミドＤＮＡを注射したマウスの血清からは、ｍＩＬ−２１は検出できなかった。
【０１００】
インビボで免疫細胞集団に対するＩＬ−２１発現の影響を測定するために、プラスミド投与後、マウス脾細胞のＦＡＣＳ分析を行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２０（ｉｇｐＯＲＦ又はｍＩＬ−２１ＤＮＡプラスミドを静脈注射した。７日後、マウス脾細胞を得、全細胞数を計測した。細胞懸濁液を、特異的抗体結合蛍光色素で染色し、ＦＡＣＳ分析を行った。表１に示すように、２０μｇ  ｍＩＬ−２１プラスミドの単一投与７日後、脾臓中のＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ｐＯＲＦ対照群と比較してｍＩＬ−２１処理群では有意に増加した（それぞれ、５１．３±２．２％対３９．３±５．３％及び２６．８±０．９％対１９．８±４．１％，それぞれ、ｐ＝０．０２１９及び０．０４１８）。更に、脾臓においてＣＤｌｉｂ及び  Ｇｒ−１染色によって規定される骨髄性単球系譜の細胞の割合も、ｍＩＬ−２１投与後、有意に増加した（それぞれ、１４．０±０．７％対３１．４±０．６％，及び１１．４±１．０％対１８．５±１．６％，それぞれｐ＜０．０００１及びｐ＝０．００２７）。しかし、ＮＫ１．１＋／ＣＤ３”又はＤＸ５＋／ＣＤ３”亜集団によって規定される脾臓由来マウスＮＫ細胞の割合は、ｐＯＲＦ対照群と比較してｍＩＬ−２１処理群で有意に軽減した（それぞれ３．０±０．３％対０．７±０．１％及び３．６±０．３％対１．３±０．２％；それぞれｐ＝０．０００２及び０．０００１）。脾細胞で見られるものと同等の免疫細胞の表現型の同様の変化が、マウス末梢血で観察された。ｍＩＬ−２１プラスミド投与後、脾臓のサイズ、重量、全細胞数が増大したので、Ｔ細胞と骨髄性単球細胞亜集団の絶対数の増加は、対照マウスと比較してｍＩＬ−２１処理マウスでより一層著しかった（表１）。これらの観察は、ＤＮＡ注入後のインビボでのｍＩＬ−２１の機能的発現は、マウス免疫細胞に対し複数の生物学的効果を有することを示唆している。
【０１０１】
【表１】
2005530716.tif 000002
【０１０２】
本実施例の示すところによると、ｍＩＬ−２１の投与は、インビボで高レベルの発現を生じさせ、発現は、脾細胞亜集団を変化させる。
【０１０３】
実施例４
【０１０４】
本実施例は、ＩＬ−２１ポリヌクレオチドの投与による哺乳動物における癌の治療方法を示す。
【０１０５】
０日目に、５ｘ１０５  Ｂ１６黒色腫又はＭＣＡ２０５繊維肉腫腫瘍細胞を、８−１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＮＣＩ／Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）に皮下接種した。５日目に、室温に予め温めた生理食塩水２ｍｌに溶解したプラスミドＤＮＡを、腫瘍担持マウスに静脈注射した。７日後、ＤＮＡ注射を繰り返した。マウスに耳タグをし、デジタルカリパーを用い、１週に２又は３回、腫瘍の垂直直径を手探りで (blindly) 測定することによって腫瘍増殖速度を測定した。マウス生存率も記録した。
【０１０６】
ＩＬ−２１の全身的発現がインビボで腫瘍増殖を阻害できるかどうかを研究するために、ｍＩＬ−２１発現時間経過に基き、皮下腫瘍移植５日後にｍＩＬ−２１プラスミドを注入し、７日後、繰り返した。ｍＩＬ−２１の投与量増加に対する繊維肉腫腫瘍株ＭＣＡ２０５の応答が最初に測定された。図２に示すように、５〜２０μｇのプラスミドＤＮＡの全ての投与量は、投与量依存性様式で５日皮下ＭＣＡ２０５腫瘍増殖を阻害し、最大阻害は、３１日のｍＩＬ−２１プラスミドの２０μｇ投与量レベルで５５％であった（１８３±２５対４１０±３７ｍｍ２，ｐ＝０．００３９）。対照ｐＯＲＦ  ＤＮＡの同一量の投与は、腫瘍増殖に何の効果も有しなかった。重要なことだが、ｍＩＬ−２１のこの高レベルに曝した処理マウスで明らかな毒性効果は観察されなかった。比較すると、マウスでのＩＬ−２プラスミド最大耐性投与量である、マウスＩＬ−２ＤＮＡ１μｇを注射された腫瘍担持マウスは、なんら抗腫瘍効果を示さなかった（図２）。
【０１０７】
ＩＬ−２１の治療効果が他の型の腫瘍に適用できるかどうかを測定するために、弱い免疫原性とより攻撃的な腫瘍であるＢ１６黒色腫を、５日皮下モデルでｍＩＬ−２１で処理した。図３に示すように、ｍＩＬ−２１処理は、インビボでＢ１６黒色腫増殖を有意に阻害した（図３ａ、ｐ＜０．０００１）。この実験でｍＩＬ−２１で処理した５匹のマウスのうち、２匹は腫瘍の完全な退行を有し、他の３匹は、５匹のマウス全てが大きな腫瘍を有していた対照群と比較し、ずっと小さい腫瘍を有した。ｍＩＬ−２１処理のＢ１６担持マウスの生存はまた、対照マウスのそれよりも有意に長かった（図３ｂ、ｐ＝０．００３１）。腫瘍接種２５日後で、対照群の全てのマウスは死亡したが、一方、処理群のマウスの８０％は未だ生きていた。この実験は３回繰り返したが、同様の結果であった。別の結腸癌腫瘍株ＭＣ３８に対するＩＬ−２１の同様の抗腫瘍効果も観察された（データは示さず）。
【０１０８】
本実施例は、ＩＬ−２１がインビボで腫瘍増殖を有意に阻害し、生存を延ばすことを示す。
【０１０９】
実施例５
【０１１０】
本実施例は、ＩＬ−２１ポリヌクレオチドの投与がインビトロで腫瘍増殖を直接的には阻害しないことを示す。
【０１１１】
製造業者の使用説明書（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎアッセイキットを用い、７２時間ＭＴＳアッセイによって、インビトロで腫瘍細胞の増殖阻害を測定した。要約すると、ＭＣＡ２０５，Ｂ１６，２４ＪＫ及びＭＣ３８を含む１ｘ１０５マウス腫瘍細胞を、種々の量の組換えｍＩＬ−２１蛋白質を組合せた１ｍＬＲＰＭＩ完全培地を入れた２４ウエルプレート中に播いた。３日後、各ウエルからの培養培地１００μｌを集め、３７℃で２時間、ＭＴＳ試薬２０μｌとインキュベートした。４９０ｎｍの吸光度を測定して、群間の相対的細胞増殖を求めた。
【０１１２】
ＩＬ−２投与は、複数のサイトカインをアップレギュレートすることが知られ、流体力学ベースの遺伝子送達はそれ自体、ＩＬ−１２とＴＮＦ−αをアップレギュレートできる（Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８，７１−７４（２０００））。組換えＩＬ−２１蛋白質が、インビボ抗腫瘍実験で使用される腫瘍細胞に対し直接的阻害効果を示すかどうかを求めるために、７２時間ＭＴＳ腫瘍増殖阻害アッセイを行った。図４に示すように、範囲２０〜１００ｎｇ／ｍｌで、組換えｍＩＬ−２１は、ＭＣＡ２０５とＢ１６を含む４種の試験した腫瘍株で何の直接的阻害効果も示さなかった。４種の試験した腫瘍株はどれも、ＲＴ−ＰＣＲで測定するとＩＬ−２１Ｒを発現していない。更に、アネキシンＶに関する腫瘍細胞のＦＡＣＳ分析は、ＩＬ−２１処理後、腫瘍アポトーシスは増加しないということを示した。これらの結果は、ＩＬ−２１は、これらの研究で使用される腫瘍細胞に対し直接的阻害効果又は細胞障害効果を示さず、観察されたインビボ抗腫瘍活性は、免疫細胞の刺激などの他の機構が原因となるということを示唆している。
【０１１３】
本実施例は、ｍＩＬ−２１は、インビトロで直接的には腫瘍増殖を阻害しないことを示す。
【０１１４】
実施例６
【０１１５】
本実施例は、ＩＬ−２１が他のサイトカインの分泌を誘導しないことを示す。
【０１１６】
ｐＯＲＦ又はｐＯＲＦ／ｍＩＬ−２１プラスミドＤＮＡを２０μｇ、又は生理食塩水単独を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈注射した。ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−４、ｍＩＬ−１０、及びｍＩＬ−１２プラスミドＤＮＡ１μｇをそれぞれ、陽性対照マウスに注射した。注射１、４、８日後に、マウスを屠り、血清を採り、それを用いて複数のサイトカインを測定した（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）。
【０１１７】
ＩＬ−２１が、抗腫瘍応答に寄与できえた他のサイトカインの２次分泌を誘導したかどうかを確かめるために、複数のサイトカイン免疫アッセイを用いて、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを含む多数のサイトカインに関し、血清サンプルを試験した。ｍＩＬ−２１又はｐＯＲＦプラスミド（各々２０μｇ）又は生理食塩水の単一注射１、４、８日後に、試験したサイトカインのどれもが、特に、抗腫瘍効果を有することが知られているＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを、一貫して評価されなかった。ｍＩＬ−２１処理マウスでのＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＦＮ−γの緩やかな上昇は、８日目でのみ観察されたが、それは、これらの値の高い標準偏差によって分かるように、その群で試験した３匹マウスのうち１匹のみのより高いレベルによるものであった。ｍＩＬ−２、ｍＩＬ−４、ｍＩＬ−１０、及びｍＩＬ−１２プラスミドＤＮＡを注射したマウスからの血清サンプルは、陽性対照として役立ち、全てにおいて、対応するサイトカインは高レベルを示した（表２）。これらの結果は、ＩＬ−２１の抗腫瘍効果は、これらのサイトカインによって媒介されないということを示している。
【０１１８】
【表２】
2005530716.tif 000003
【０１１９】
本実施例は、ＩＬ−２１が他のサイトカインの分泌を誘導しないことを示した。
【０１２０】
実施例７
【０１２１】
本実施例は、ＮＫ細胞がｍＩＬ−２１によって誘導される抗腫瘍活性に関与することを示す。
【０１２２】
抗マウスＣＤ４（ＧＫ１．５）及びＣＤＳ（２．４３）抗体を用いて以前に記載されたように（Ｗａｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４，１６８−１７２（１９９８））、インビボＣＤ４及びＣＤＳ枯渇（depletion）を行った。要約すると、腫瘍接種２日後と４日後に、抗ＣＤ４又はＣＤＳ抗体の２００μｇ／マウスを、腫瘍担持マウスに静脈注射した。その後、実験中、６又は７日毎に、抗体注射を腹腔内に繰り返し、ＣＤ４及びＣＤＳ細胞の枯渇を維持した。５日目と１２日目にマウスＩＬ−２１プラスミド注射を行った。ＣＤ４とＣＤＳノックアウトマウスも（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）同様の研究に用いた。更なるマウスを、各枯渇研究に含め、ＦＡＣＳ分析によってＣＤ４及びＣＤＳ細胞の枯渇を明らかにした。インビボＮＫ細胞枯渇に関し、製造業者の使用説明書（和光純薬工業）に従って抗アシアロＧＭ１抗体を用いた。要約すると、腫瘍接種２及び４日後に、腫瘍担持マウスに抗ＮＫ抗体を静脈注射し、その後、実験を通し６日毎に腹腔内に繰り返し、枯渇を維持した。腫瘍治療は５日目に開始し、７日後に繰り返した。
【０１２３】
製造業者の使用説明書に従い、ＢＤ／ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎからのアネキシンＶアポトーシス検出キットを用い、脾細胞のＦＡＣＳ染色によってアポトーシスを評価した。
【０１２４】
ＮＫ細胞の細胞溶解活性を、標準の５１クロム放出アッセイによって測定した。要約すると、ｍＩＬ−２１又はｐＯＲＦプラスミドＤＮＡを注射したマウスから単離したエフェクター脾細胞（注射４日後）を、３７℃で４時間、異なるＥ：Ｔ比で５１Ｃｒ標識ＹＡＣ−１標的細胞とインキュベートした。
【０１２５】
ｍＩＬ−２１の注射により、脾臓（表１）と末梢血液のＣＤ４＋とＣＤ８＋リンパ球の増殖が起こったので、ｍＩＬ−２１誘導の腫瘍退行を媒介するのにＴ細胞が関与するかどうかを確かめるために、特異的モノクローナル抗体を用いて、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞をインビボで枯渇させた。ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたマウスＩＬ−２１処理マウスは、ＭＣＡ２０５腫瘍増殖の有意の阻害をなお示し、このモデルでＴ細胞はＩＬ−２１抗腫瘍活性に関与しないことが示唆された（図５ａ、５ｂ、及び５ｄ）。ｍＩＬ−２１の非存在下のＣＤ４枯渇マウス又は対照マウスと比較して、腫瘍増殖速度はＣＤＳ枯渇マウスでは顕著に高く（図５ａ、５ｂ、及び５ｄ）、内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、弱免疫原性腫瘍株であるＭＣＡ２０５のベースラインの腫瘍原性に対し何らかの阻害効果を有しうることが示された。それにもかかわらず、ｍＩＬ−２１プラスミドの添加によって、ＭＣＡ２０５腫瘍増殖は有意に阻害され、ＩＬ−２１は、ＣＤＳ非依存性機構によって働き得ることが示された。実際、図５ｃに示すように、ｍＩＬ−２１の抗腫瘍活性は、ＮＫ細胞のインビボ枯渇後、完全に無くなった。これらの実験の示すところによると、ＭＣＡ２０５腫瘍に対するｍＩＬ−２１の阻害効果は主に、ＮＫ細胞によって媒介される。このことは、ＣＤ４又はＣＤＳノックアウトマウスを用いる同様の実験によって更に支持される。その実験の示すところによると、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の非存在下、ｍＩＬ−２１は腫瘍退行を誘導できる。しかし、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、この抗腫瘍効果に部分的役割を果たしうる可能性がまだある。ｍＩＬ−２１処理マウスの腫瘍増殖速度は、対照マウスと比較してＣＤＳ枯渇マウスでより大きいからである（図５ｂ及び５ｄ）。
【０１２６】
興味深いことに、表１に示すように、ＮＫ１．１＋／ＣＤ３”又はＤＸ５＋／ＣＤ３”脾臓ＮＫ細胞のパーセントと合計数は、ｐＯＲＦ対照ベクターを注入したマウスと較べてｍＩＬ−２１注入後、実際に軽減した。この軽減の機構を更に研究するために、インビボｍＩＬ−２１プラスミド注入後、ＮＫ細胞アポトーシスを評価した。図６ａに示すように、ＮＫ１．１＋／ＣＤ３”脾臓ＮＫ細胞のアネキシンＶ染色は、ｍＩＬ−２１プラスミド注入４日後で、１６．９％から４１．６％へと増加し、ｍＩＬ−２１は、インビボでＮＫ細胞に対するアポトーシス効果を有することを示した。ＩＬ−２１後のＮＫ細胞活性を評価するために、脾臓ＮＫ細胞を用い、ＮＫ標的ＹＡＣ−１に対する５１クロム放出アッセイを行った。インビボｍＩＬ−２１プラスミド注入４日後で、ＹＡＣ−１に対する脾臓ＮＫ細胞溶解は有意に増加した（図６ｂ）。同様の観察が、ＩＬ−２１トランスジェニックマウスでも観察された（データは示さず）。これらの結果の示すところによると、ＩＬ−２１はインビボでＮＫ細胞アポトーシスを誘導しうるが、一方、活性化及び溶解能力を高め、それは、脾臓ＮＫ細胞の数の軽減にもかかわらず、ｍＩＬ−２１処理マウスで観察されたＮＫ依存性抗腫瘍活性を説明できる。
【０１２７】
本実施例は、ＮＫ細胞が、ｍＩＬ−２１によって誘導される抗腫瘍効果に関与することを示した。
【０１２８】
本明細書で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が引用により含まれるように個々に、及び具体的に示され、本明細書にその全体が記載されているかのような程度まで、引用により本明細書に含まれるものである。
【０１２９】
本発明の説明の文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書で違うように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断りのない限り、許容範囲が制約のない用語（即ち、「・・を含むが、・・に限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書で値の範囲の記載は、本明細書で違うように記載されていなければ、その範囲内の各々の分離した値へ個々に言及することの略記方法として役立つことが単に意図され、各々の分離した値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に含まれるものである。本明細書で記載される方法の全ては、本明細書で違うように記載されるか、文脈によって明確に否定されなければ、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意及び全ての例、又は例示的言葉（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、違うようにクレームされていなければ、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして特許請求の範囲にない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０１３０】
本発明を実施するのに本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書で記載する。上記説明を読むと、それらの好適な実施態様のバリエーションが当業者に明白となろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを期待し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なるように実施されることを意図する。それ故、本発明は、適用法によって許されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び均等物を含むものである。更に、本明細書で違うように記載されていないか、文脈によって違うように明瞭に否定されていなければ、その全ての可能なバリエーション中の上記要素の任意の組合せも本発明に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、ＤＮＡ注入後、マウス血清でのｍＩＬ−２１の発現を示す。実施例に記載のように、０日目に生理食塩水２ｍｌにおいてｍＩＬ−２１又はｐＯＲＦ対照プラスミドＤＮＡ２０μｇを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに静脈内注射した。１、３、５、８日に、マウスを屠り、ｍＩＬ−２１  ＥＬＩＳＡ分析のために、血清サンプルを採った。データは２回の同様の実験のうちの１つを示す。各点は３匹のマウスからのデータを示す。エラーバーはＳＥＭである。
【図２】図２は、インビボのＭＣＡ２０５腫瘍の治療でのｍＩＬ−２１の投与量応答を示す。０日目に、５ｘ１０５  ＭＣＡ２０５腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種した。５日後、５〜２０μｇ／マウスの範囲のｍＩＬ−２１プラスミドＤＮＡの種々の量を、腫瘍担持マウスに静脈注射した。ｐＯＲＦ  ２０μｇ、又はｍＩＬ−２プラスミドＤＮＡ  １μｇを対照マウスに注射した。７日後に注射を繰り返した。各群は５匹のマウスからなっていた。
【図３】図３は、ｍＩＬ−２１プラスミドＤＮＡの注射が、インビボでＢ１６腫瘍増殖を有意に阻害し、腫瘍担持マウスの生存率を増加することを示す。図３Ａは、インビボでのＢ１６腫瘍増殖の阻害を示す。図３Ｂは、ｍＩＬ−２１処理後、Ｂ１６腫瘍担持マウスの生存を示す。０日目に、５ｘ１０５  Ｂ１６腫瘍を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種し、５日と１２日に、ｍＩＬ−２１  ＤＮＡ又はｐＯＲＦ対照ＤＮＡ  ２０μｇで処理した。腫瘍増殖とマウス生存率を記録した。データは、同様の結果の３回の実験のうちの１つを示す。各群は５匹のマウスからなっていた。３ａと３ｂでの対照と処理群間の差異は高度に有意であった（それぞれ、ｐ＝０．０００１及びｐ＝０．００３１）。
【図４】図４は、マウスＩＬ−２１がインビトロで腫瘍増殖を阻害しないことを示す。１×１０５腫瘍細胞／ウエルを、２４ウエルプレートに入れ、記載濃度で組換えｍＩＬ−２１の種々の量を、各ウエルに加え、３日間インキュベートした。次いで、ＭＴＳベースの細胞増殖アッセイのために、各ウエルからの培養培地を採った。データは、同様の結果の３回の独立実験のうち１つを示す。カラムは、各条件における３連の平均値（標準偏差を伴う）である。
【図５】図５は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＮＫ細胞枯渇マウスでのｍＩＬ−２１の抗腫瘍効果を示す。０日目に、５×１０５ＭＣＡ２０５腫瘍細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。ＣＤ４、ＣＤＳ又はＮＫ細胞に対する抗体を、それぞれ２日と４日に投与した。その後、実験全体を通し６〜７日毎に抗体の注射の繰返しによって枯渇を維持した。５日にｍＩＬ−２１処理を開始し、１週間後１度繰り返した。図５Ａは、ＣＤ４枯渇マウスを示す；図５Ｂは、ＣＤ８枯渇マウスを示す；図５Ｃは、ＮＫ枯渇マウスを示す；図５Ｄは、対照マウスを示す。各グループは６匹のマウスであった。データは、同様の実験で３回同様に実行された実験のうちの１つを示す。エラーバーはＳＥＭである。
【図６】図６は、マウスＩＬ−２１がインビボでＮＫ細胞アポトーシスと細胞溶解活性を高めることを示す。図６Ａは、ｐＯＲＦ又はｍＩＬ−２１プラスミド注入４日後にマウスから新たに単離された脾細胞が、アポトーシスを検出するために、ＮＫ１．１＋／ＣＤ３”ＮＫ細胞にゲート制御されたアネキシンＶで染色されたことを示す。図６Ｂは、ＮＫ細胞の細胞溶解活性を測定するために、５１Ｃｒ標識ＹＡＣ−１標的細胞とインキュベートされた同一の脾細胞を示す。データは、各群３匹マウスでの５回の独立実験の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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