(57)【要約】本発明は、分子薬理学分野に関する。更に詳しくは、本発明は、上皮腫瘍および主に発ガン性ＨＰＶに関連する腫瘍などの治療に有利に用いることのできるペプチドの開発に関する。本発明の主な目的は、カゼインキナーゼII（ＣＫII）によってリン酸化される部位と直接相互作用することでリン酸化ドメインをブロックせしめるような構造を有するペプチドを同定することにある。本発明においては、in vitroでＣＫIIによるリン酸化を阻害し、ＨＰＶ−１６悪性転換細胞（ＣａＳｋｉ細胞）に対して細胞毒性を示し、更にインターフェロン（ＩＦＮ）の細胞分裂抑制効果に対する前記の悪性転換細胞の感受性を増大することを特徴とする、互いに異なるアミノ酸配列からなる１１種の環状ペプチドが開示される。さらに本発明は、その他の細胞透過性を有するペプチドや化学物質と結合または融合した上記ペプチドの用途、および上記ペプチドとその化学的模倣分子の両者の用途をも開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼインキナーゼII（ＣＫII）によってリン酸化される基質のリン酸化部位に結合し、該基質の活性を阻害する、以下に示す一文字略記のアミノ酸配列ａ〜ｋのいずれかからなるペプチド、および
合成または遺伝子組み換えによって得られる、該ペプチドの相同体または模倣変異体。
ａ．  ＣＳＶＲＱＧＰＶＱＫＣ 、
ｂ．  ＣＳＳＣＱＮＳＰＡＬＣ 、
ｃ．  ＣＱＩＰＱＲＴＡＴＲＣ 、
ｄ．  ＣＡＫＱＲＴＤＰＧＹＣ 、
ｅ．  ＣＷＭＳＰＲＨＬＧＴＣ 、
ｆ．  ＣＲＮＣＴＶＩＱＦＳＣ 、
ｇ．  ＣＨＹＩＡＧＴＶＱＧＣ 、
ｈ．  ＣＰＬＶＳＬＲＤＨＳＣ 、
ｉ．  ＣＫＱＳＹＬＨＨＬＬＣ 、
ｊ．  ＣＦＱＰＬＴＰＬＣＲＣ 及び
ｋ．  ＣＱＳＹＨＥＬＬＬＱＳ。
【請求項２】
環状構造を有することを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
融合ポリペプチド中に含まれることを特徴とする、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドから選ばれる少なくとも一種を、適切な担体と共に包含することを特徴とする、医薬組成物。
【請求項５】
さらにサイトカインを包含することを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該サイトカインがインターフェロン（ＩＦＮ）であることを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを用いることを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項８】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に関連する腫瘍およびＨＰＶに関連しない腫瘍の両者を治療することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前癌状態にあるＨＰＶ関連病変部位を処置するために、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを用いることを特徴とする方法。
【請求項１０】
該ペプチドをサイトカインと併用することを特徴とする、請求項７〜９に記載の方法。
【請求項１１】
該サイトカインがＩＦＮであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＰＶ耐性を有する患者のＩＦＮ療法のために該ペプチドを用いることを特徴とする、請求項７〜９に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドをコードするＤＮＡ配列を包含することを特徴とする、哺乳類発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、分子薬理学分野に関する。更に詳しくは、本発明は、ＨＰＶに関連する上皮腫瘍などの治療に有利に用いることのできるペプチドの開発に関する。該ペプチドは、カゼインキナーゼII（ＣＫII）によるリン酸化部位と直接相互作用することで、リン酸化ドメインをブロックせしめるものである。
【０００２】
ＣＫIIとは、細胞増殖に関与するセリン−トレオニン酵素であり、細胞内においては、悪性転換の際に主として細胞核内に局在する（Tawfic S, Yu S, Wang H, Faust R, Davis A, Ahmed K, 2001, Histol. Histopathol. 16:573-582）。
【０００３】
種々の上皮充実性腫瘍にはＣＫIIが高濃度に存在することが報告されているが、そうした発見に基づいて、この酵素によって誘発されるリン酸化反応が、細胞の悪性転換において主要な働きをし、そして腫瘍の進行マーカーとなることなどが推察されている（Seldin DC, Leder P, 1995, Science 267:894-897およびFaust RA, Gapany M, Tristani P, Davis A, Adams GL, Ahmed K, 1996, Cancer Letters 101:31-35）。一方、トランスジェニックマウスにおけるＣＫIIの過剰発現は、マウスの乳房上皮細胞上にＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路を増加し、乳腺での腫瘍形成を引き起こす（Landesman-Bollag E, Romien-Mourez R, Song DH, Sonenshein GE, Cardiff RD, Seldin DC, 2001, Oncogene 20:3247-3257）。
【０００４】
上皮腫瘍については、ＨＰＶに関連するものが大きな割合を占める。例えば、尿生殖器における腫瘍の大半がこのガンウイルスに関連しているほか、麟片状の子宮頚管細胞に由来する腫瘍の９９．７％にＨＰＶのＤＮＡ配列が存在することが報告されている（Walboormers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Munoz N, 1999, J. Pathol 189:12-19）。また、全世界で年間約５０万人の子宮頚ガン患者に関する同様の報告がＷＨＯによってなされている（Parkin DM, Laara E, Muir CS, 1980, Int. J. Cancer 41:184-1972）。キューバ国においては、子宮頚ガンのために例年３７０人の女性が死亡している（Organizacion Panamericana de la Salud,1999, Basic Country Health Profiles for the Americas. Cuba, 206-219）。
【０００５】
ＨＰＶは、その病変部位が悪性転換するか否かによって発ガン性か非発ガン性かに分類されている（Lorincz AT, Temple GF, Kurman RJ, Jenson AB, Lancaster WD, 1987, J. Natl. Cancer Inst. 79:671-677）。ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８は一般に悪性転換する上皮内の腫瘍の形成に関与し、また、いずれのＨＰＶ型も、形成異常（displasia）及び悪性子宮頚ガンの９０％を超えるものに関与している（Fujinaga Y, Shimada M, Okasawa K, Fukushima M, Kato I, Fujinaga K, 1991 J. Gen. Virol 72:1039-1044）。
【０００６】
ＨＰＶ関連腫瘍を根絶するための治療用ワクチンも予防用ワクチンも未だ無いため、ウイルス転写やウイルス性ガンタンパク質を標的とする阻害剤を利用する治療方法に、より多くの関心が集まっている。例えば、今までにコンジローム、足底いぼ、呼吸性乳頭腫症などの、ＨＰＶに関連する特定の疾病に対して幾分効力のあるＩＦＮのような生体調節因子が使用されている（Koromilas AE, Li S, Matlashewski G, 2001. Cytokine & Growth Factor Reviews 12:157-170）。本発明者らは、ＨＰＶ悪性転換細胞（ＨｅＬａ細胞）を用いた実験によって、連続的にＩＦＮ−αに暴露された前記の細胞においては、それに伴うＨＰＶのｍＲＮＡ発現の阻害によって悪性表現型から復帰した細胞を産生することを見出した（Lopez-Ocejo O, Perea SE, Reyes A, Vigoa L, Lopez-Saura P, 1993. J. IFN Res 13:369-375）。本発明者らはまた、同じ細胞モデル内において、ＩＦＮ−αが内因性ウイルス転写の抑制によってＨＰＶ ｍＲＮＡを調節することを見出した（Perea SE, Lopez-Ocejo O, Garcia-Milian R, Arana MJ, 1995, J. IFN & Cytokine Res 15:495-501）。子宮頚ガン患者を対象としたパイロットスタディにおいても、ＩＦＮ−α処置によってｍＲＮＡの発現が調節され、この結果は、細胞系を用いた実験結果と一致した（Garcia-Milian R, Rios MA, Diaz D, Silveira M, Guilar O, Amigo M, Arana MJ, Perea SE, 1996, J. IFN and Cytokine Res 16:709-713）。ＨＰＶ ｍＲＮＡの発現の調節因子としてのＩＦＮの用途についてこれほど有望な知見がなされているにも関わらず、これまでのデータが示すところによると、臨床試験に参加した患者の４０％から５０％の間で、ＩＦＮへの反応にばらつきがあるとともに、このサイトカインに対する抵抗現象が存在する（Arany I, Tyring SK, Stanley MA, Tomai MA, Miller RL, Smith MH, McDermott, DJ, Slade HB, 1999, Antiviral Res 43:55-63）。Ｅ７ガンタンパク質がＩＦＮに対する抵抗現象の中心的役割を果たすことを示す分子的レベルの証拠及び臨床的な証拠もある。例えば、Ｅ７はＩＦＮ誘導転写因子（ｐ４８）に結合し、転写活性をブロックすることでＩＦＮに対する応答に影響を及ぼすという報告がある（Barnard P and McMillan NAJ, 1999, Virology 259:305-313）。さらに、Ｅ７の存在下にＩＦＮ調節因子（IFN regulatory factor）（ＩＲＦ−１）を改変する試みも報告されている（Park JS, Kim EJ, Kwon HJ, Hwang ES, Namkoong SE, Um SJ, 2000, J Biol Chem 275:6764-6769) (Perea SE, Massimi P, Banks L, 2000, J Mol Med 5:661-666)。臨床試験においては、ＩＦＮに対する応答はＨＰＶを含有する病変部位におけるＥ７の発現に依存すると考えられている（Frazer IH, McMillan NAJ, 1997, 「乳頭腫症と尖形コンジローム（Papillomatosis and condyloma acuminate）」. インターフェロンの臨床応用（Clinical Applications of the Interferons） (R Stuart Harris and RD Penny, eds) Pp 79-90. Chapman and Hall Medical, London）。Ｅ７ガンタンパク質は、発ガン性ウイルスに誘発される細胞の悪性転換において主要な役割を果たす。従って、一次感染細胞においてＥ７で誘導した不死化は、不死化作用の初期段階から細胞の突然変異や染色体異常を引き起こす（Mougin C, Humbey O, Gay C, Riethmuller D, 2000, J. Gynecol Obstet. Biol. Reprod 29:13-20）。一方、本発明者らは、Ｅ７遺伝子による安定したトランスフェクションによって、ＩＦＮ感受性腫瘍細胞に、ＩＦＮ耐性表現型を付与することができることを実証した（Moro A, Calixto A, Suarez E, Arana MJ, Perea SE, 1998, Bioch Bioph Res Comm 245:752-756）。同様に、Ｅ７ガンタンパク質は、腫瘍サプレッサー遺伝子の機能を結合によってブロックするが、これは網膜芽細胞（Retinoblastoma）（Ｒｂ）のＣｙｓ２４やインシュリン様成長因子結合プロテイン‐３”（Insulin-like Growth Factor Binding Protein-3”）（ＩＧＦＢＰ−３）のＣ末端ドメインに結合するのと同様のメカニズムであることが報告されている（Nevins JR, 1992, Science 258:424-429) (Zwerschke W and Jansen-Durr P, 2000, Advances in Cancer Res 78:1-29)。同じく、Ｅ７中のＳｅｒ３１／Ｓｅｒ３２のダブレットを含むドメインがＣＫIIの酵素基質となるらしいという報告があり（Hashida T, Yasumoto S, 1990, Biochem. Biophys Res. Comm 172:958-964）、前記ガンタンパク質の転換能力（Barbosa MS, Edmonds C, Fisher C, Schiller JT, Lowy DR, Vousden K, 1990, EMBO J 9:153-160) (Chien W-M, Parker JN, Schmidt-Grimminger D-C, Broker TR, Chow LT, 2000, Cell Growth & Differentiation 11:425-435)およびＩＦＮシグナルカスケード（IFN signaling cascade）の阻害（Perea SE, Lopez-Ocejo O, Garcia Milian R, Banks L, Arana MJ, 1996, Eur. Cytokine Net 7:503）の両方にも、このドメインの存在は必須不可欠である。
【０００７】
ＨＰＶのＩＦＮ耐性やガン形成におけるＣＫIIによってリン酸化される部位の役割に基き、このようなリン酸化ドメインをブロックせしめる薬剤を設計することは、ガンの治療における有効手段となりうる。しかし、Ｅ７または他の細胞基質内成分に含まれる、ＣＫIIによってリン酸化される部位を阻害する分子については今まで何ら開示がなかった。
【０００８】
Ｅ７ガンタンパク質に関しては、Ｒｂ結合部位（Ｃｙｓ２４）（Webster KR, Koleman KG, 1997, US5625031)(Oliff AI, Riemen MW, EP 0412762 A2 910213)およびその他のＣ末端領域（３９−９８）をブロックするペプチド（Pidder J-D, Zwerschke W, 2000, EP0969013）のみが開示されているにすぎない。
【０００９】
今までに臨床試験または前臨床試験のおこなわれたワクチン候補の中には、ＨＰＶ−Ｅ７特異的ＣＴＬ応答を引き起こすことを目的としたものがある（Chen C, Wang CC, Hung C, Pardoll DM, Wu T, 2000, Vaccine 18:2015-2022）（Chen CH, Ji H, Suh KW, Choti MA, Pardoll DM, Wu TC, 1999, Gene Ther 12:1972-1981）。しかし、これらのようにＣＴＬ応答に的を絞ったアプローチ法では、ＨＰＶの生態に関連した他の様々な障害に直面する。例えば、発ガン性ＨＰＶはＣＴＬ応答にとって必須不可欠なＭＨＣクラスＩ抗原の産生を抑制する（Connor ME, Stern PL, 1990, Int J Cancer 46:1029-1034）。さらに、Ｅ７の発現は、腫瘍周辺における局部的免疫抑制と関連付けられているが、これはまたＣＴＬ応答の適切な発生にも影響を及ぼす（Le Buanec H, D’Anna R, Lachgar A, Zagury JF, Bernard J, Ittlele D, d’Alessio P, Hallez S, Giannouli C, Burny A, Bizzini B, Gallo RC, Zagury D, 1999, Biomed Pharmacother 53:424-431) (Lee SJ, Cho YS, Shim JH, Lee KA, Ko KK, Choe YK, Park SN, Hoshino T, Kim S, Dinarello CA, Yoon DY, 2001, J Immunol 167:497-504)。上記の要件からすると、Ｅ７を標的とした医薬とＣＴＬワクチンとを組み合わせることは非常に有望であるといえる。
【００１０】
同様に、予防用ＨＰＶワクチンに関するアプローチ法には、以下に挙げる種々の生物学上のまたは社会的な面での課題があるため、高い利益と同時にコスト面での高いリスクがつきまとう。その課題とは即ち、１）ＨＰＶに一次感染した後の潜伏期が長いこと、２）ＨＰＶ感染のメカニズムに対する理解が不足していること、３）適切なＨＰＶ増殖実験にふさわしい動物モデルがないこと、４）ＨＰＶの種特異性、そして５）予防用ＨＰＶワクチンによる社会的影響についての評価には長い時間を要すること、である。従って、ウイルス性ガンタンパク質を特異的なターゲットとする医薬の使用は、免疫システムの操作に的を絞った様々な上記のアプローチ法に勝る利点を備えている。
【００１１】
発明の概要 
本発明の要点およびその新規性は、ＣＫIIによるリン酸化部位を直接阻害するとともに、ＨＰＶ−１６子宮頚管細胞に対してin vivoで細胞毒性をも示す環状ペプチドを初めて提供することにある。更にこれらのペプチドは、ＩＦＮの細胞分裂抑制効果に対する細胞の感受性を増大させる。
【００１２】
発明の詳細の説明 
本発明は、ＣＫIIによってリン酸化される基質のリン酸化部位に結合し、該基質の活性を阻害する、以下に示す一文字略記のアミノ酸配列ａ〜ｋのいずれかからなるペプチドを主に開示する。
ａ．  ＣＳＶＲＱＧＰＶＱＫＣ   （配列番号１）、
ｂ．  ＣＳＳＣＱＮＳＰＡＬＣ   （配列番号２）、
ｃ．  ＣＱＩＰＱＲＴＡＴＲＣ   （配列番号３）、
ｄ．  ＣＡＫＱＲＴＤＰＧＹＣ   （配列番号４）、
ｅ．  ＣＷＭＳＰＲＨＬＧＴＣ   （配列番号５）、
ｆ．  ＣＲＮＣＴＶＩＱＦＳＣ   （配列番号６）、
ｇ．  ＣＨＹＩＡＧＴＶＱＧＣ   （配列番号７）、
ｈ．  ＣＰＬＶＳＬＲＤＨＳＣ   （配列番号８）、
ｉ．  ＣＫＱＳＹＬＨＨＬＬＣ   （配列番号９）、
ｊ．  ＣＦＱＰＬＴＰＬＣＲＣ   （配列番号１０）及び
ｋ．  ＣＱＳＹＨＥＬＬＬＱＳ   （配列番号１１）。
【００１３】
さらに本発明は、合成または遺伝子組み換えによって得られる、該ペプチドの相同体または模倣変異体（mimetic variant）、および上記に記載のいずれかのペプチドを含有する融合ポリペプチドを開示する。対応する基質中に存在するＣＫIIリン酸化部位をブロックせしめる構造を有するいかなるペプチドも、該ペプチドの相同変異体とみなす。同様に、ＣＫIIリン酸化部位をブロックせしめる構造を有する（ペプチドではない）化学分子はすべて、該ペプチドの模倣変異体とみなす。
【００１４】
本発明のさらなる一つの目的は、本発明のペプチドから選ばれる少なくとも一種を、適切な担体と共に包含することを特徴とする、医薬組成物を提供することにある。
【００１５】
また、本発明は、本発明のペプチド単独、または該ペプチドをそれ以外の適切な分子、例えばサイトカインやインターフェロンとを組み合わせて、１）腫瘍細胞の増殖を阻害する、２）ＨＰＶに関連したガンおよびＨＰＶに関連しないガンの両者を治療する、および３）前癌状態にあるＨＰＶ関連病変部位を処置するために、本発明に記載のペプチドを用いることも包含する。
【００１６】
さらに本発明のペプチドは、インターフェロン療法に対して耐性のＨＰＶ感染患者の治療に用いることもできる。
本発明のさらなる一つの目的によれば、上記に記載の本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を包含することを特徴とする哺乳類発現ベクターが開示される。
【００１７】
本発明のペプチドは環状構造を有し、その主たる特徴は、ＣＫIIによるリン酸化部位に結合してその生化学的作用を阻害する能力を有することである。本発明のペプチドは、添付の配列表に記載されている。また、本発明のペプチドがin vivoでＨＰＶ−１６悪性転換細胞に及ぼす効果についても以下に説明する。
【００１８】
本明細書に記載のペプチドは、ＣＫIIによるリン酸化に最適なコンセンサスドメインとして従来報告されているRRREEETEEEからなるアミノ酸配列を有するドメイン（Promega Cat:V5661）のリン酸化を阻害する能力、およびＨＰＶ−１６ Ｅ７ガンタンパク質の２８〜３８番領域に含まれるリン酸化部位のリン酸化を阻害する能力の両者によって定義される。
【００１９】
本明細書に記載のペプチドを定義するにあたり、１１個のアミノ酸からなる環状ペプチドのライブラリを１つ構築し、糸状ファージのＰ８領域中に発現させた。前記ライブラリのスクリーニングは、合成したＥ７の２８〜３８番領域を標的として行ったが、この領域もまたビオチンに共有結合させて固体表面に固定化した。Ｅ７の２８〜３８番領域に結合したファージの選択は、ファージのＰ８領域に対する特異的な抗体を用いた免疫学的検出によって行った。最後に、Ｅ７の２８〜３８番領域に結合する能力の高い１１種のファージに相当するＤＮＡの塩基配列を決定し、そのＤＮＡに相当するペプチドを固相法によって化学合成した。さらに、合成したペプチドをＨＰＬＣで精製し、質量分析にかけた後、in vitroおよびin vivoにおける効力を重視して評価した。
【００２０】
本発明によれば、本明細書に記載の１１種の環状ペプチドは、アミノ酸配列が互いに異なっていても、同様にＣＫIIのリン酸化反応を阻害する。この事実が意味するところは、これらのペプチドとＣＫIIによるリン酸化部位との相互作用が、ペプチドのアミノ酸配列そのものというよりはむしろ、主にその構造に基づいて起こるということである。
【００２１】
本発明では、基質のＣＫIIリン酸化部位を阻害する能力は、直鎖状ペプチドのほうが環状ペプチドに比べて低いことを示した。このような知見によって、ＣＫIIリン酸化ドメインへのこれらペプチドの結合能力におけるペプチドの構造の重要性が強調される。また、この知見は、ＣＫIIリン酸化ドメインに結合するその他の化学的模倣分子の効力も示唆している。
【００２２】
ＣＫIIの内因性基質上に対して細胞内作用を達成するためには、本明細書に記載のペプチドを、以下に挙げるようなタンパク質類に基づく細胞透過性ペプチドに化学的に結合させるかまたは遺伝学的に融合させることができる。そのようなタンパク質類とは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus）(HIV-1) Tat 1 (Schwarze SR, Dowdy SF, 2000,. Trends Pharmacol 21:45-48)、Drosophyla antenapedia遺伝子にコードされる転写因子(Derossi D, et al, 1996, J. Biol Chem 271:18188-18193)、単純ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質（Herpes Simplex Virus (HSV) VP22 protein）(Lindgreen M, et al., 2000, Trends Pharmacol Sci 21:99-103)、ペネトラチン(penetratin)とトランスポルタン(transportan)（Gariepy J, Kawamura K, 2001, Trends Biotech 19:21-28）等である。本発明のin vivoにおける効用についての仮説を検証するため、HIV-1 Tat 1 タンパク質について報告されている細胞透過性ペプチド(GRKKRRQRRRPPQC) および SV 40 T ラージ抗原の一部である一つの核移行シグナル(KKKRKVE)とに本明細書に記載の環状ペプチドを融合したものを合成した。
【００２３】
本発明のデータによって、環状ペプチドは、ＨＰＶ−１６によって悪性転換された子宮頚ガン細胞（ＣａＳｋｉ細胞）に、用量依存的な細胞毒性を示すことがはっきりと示されている。これらの結果から、本明細書に記載のペプチドを、同種の組織から発生する腫瘍や、子宮頚管上皮内に形成される腫瘍などの前癌状態にある腫瘍の治療用に用いうることがわかる。同様に、in vivoでの実験データは、本明細書に記載の環状ペプチドが、対応する直鎖状ペプチドよりも効果的であることを示したので、アミノ酸配列よりも構造が重要であることを強調した。
【００２４】
同様に、本明細書に記載の環状ペプチドは、ＨＰＶ−１８を含有するＨｅｌａ細胞およびＨＰＶ陰性の非小細胞肺ガンに由来するＨ−８２細胞に対しても効果的である。これらの結果は、本発明においてin vitroの実験で得られた結果、即ち、環状ペプチドがＨＰＶ−１６ Ｅ７のＣＫIIリン酸化部位をブロックするのみならず、そのような部位を含むその他のタンパク質も同様に阻害するという結果とも相互に関連している。本明細書に記載のペプチドがＨＰＶ陰性腫瘍細胞に対しても効果的であるという事実は、その他の上皮腫瘍の治療のための潜在的用途についての論拠を提供する。本発明で得られたその他の結果から、本明細書に記載の環状ペプチドを用いてＣａＳｋｉ細胞を処理すると、ＩＦＮ−αの細胞分裂抑制効果に対するＣａＳｋｉ細胞の感受性を増大させることがわかる。ＨＰＶ−１６ Ｅ７のＣＫIIリン酸化部位がＩＦＮシグナルカスケードをブロックするためには必須である（Perea SE, Lopez-Ocejo O, Garcia Milian R, Banks L, Arana MJ, 1996, Eur. Cytokine Net 7:503）ことを証明する従来の証拠を考慮すると、ＨＰＶ感染した細胞に共通して見られるＩＦＮ耐性を回避するために、本明細書に記載のペプチドを有利に用いることができる。
【００２５】
本発明のさらなる目的の一つは、本明細書に記載のペプチドのそれぞれをコードするＤＮＡを開示することにある。本発明で開示するＤＮＡは、哺乳類発現ベクター中に導入して、さらにＨＰＶ−１６によって悪性転換しているか或いはしていない細胞の両者にトランスフェクトすることもできる。各ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含有するベクターは、ＨＰＶ関連ガンの遺伝子治療の代替療法としても有用である。
【００２６】
原則的に、本明細書に記載のペプチドは、他の薬剤や、治療用ワクチンなどによるＨＰＶに対する細胞応答と共に、ＨＰＶに関連する疾病の治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明を、以下の実施例によって説明する。
【実施例１】
【００２８】
ＣＫIIのリン酸化部位に対するペプチドの影響 
本実施例のアッセイはin vitroのリン酸化反応に基づくものであり、ＣＫIIによるリン酸化に最適なコンセンサスドメインであるＲＲＲＥＥＥＴＥＥＥからなる基質アミノ酸配列を用いて行った。反応は、２５ｍＭのＴｒｉｓ：ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１μＣｉの32Ｐ−γＡＴＰ、１００μＭのＡＴＰ、２ｍｇ／ｍｌの基質ペプチド、０．２ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌおよび１ＵのＣＫII酵素（Promega社製）を含有する５０μｌの反応系で行った。反応系は３７℃で１０分間インキュベートした。その後、反応液の５μｌをＰＥ−８１クロマトグラフィーペーパー（Whatmann社製）にスポットし、１０ｍＭのＨ3ＰＯ4で４回洗浄した。フィルターに結合した放射能を測定したところ、ｃｐｍの値は、各サンプルのＣＫII酵素活性を示した。同時に、ヘパリン等のＣＫII特異的阻害剤を内部対照として本実施例のアッセイに用いた。図１に示したデータから、環状ペプチドはＣＫIIによるリン酸化活性の８０％を阻害することがわかる。また、直鎖状ペプチドは、環状ペプチドよりも程度は低いものの、ＣＫIIによるＥ７の２８〜３８番領域のリン酸化を阻害した。これらの結果は、本明細書に記載したペプチドがＣＫIIのリン酸化部位を阻害することを示し、ペプチドと標的配列との相互作用においては、ペプチドの立体構造が重要な役割を果たすことを示唆する。
【実施例２】
【００２９】
ＨＰＶ−１６ Ｅ７のリン酸化部位に対するペプチドの影響 
本実施例のアッセイはin vitroのリン酸化反応に基づくものであり、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Glutathione S Transferase）（ＧＳＴ）との融合タンパク質として大腸菌に発現させたＨＰＶ−１６ Ｅ７ガンタンパク質を用いて行った。酵素反応を行う前に、Ｅ７−ＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Pharmacia社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。反応は、２５ｍＭのＴｒｉｓ：ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１μＣｉの32Ｐ−γＡＴＰ、１００μＭのＡＴＰ、４０μｌのＥ７−ＧＳＴ含有ビーズ、０．２ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌおよび１ＵのＣＫII酵素（Promega社製）を含有する５０μｌの反応系で行った。反応系は３７℃で４０分間インキュベートした。その後、０．５ｍｌの緩衝液でビーズを３回洗浄し、最後にＥ７−ＧＳＴのリン酸化レベルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。リン酸化タンパク質の可視化は、予めＸ線フィルムを乾燥ゲルで感光したものを現像することで行った。Ｅ７のリン酸化の定量は、デンシトメトリー法で行った。図２に示したデータから、本明細書に記載の環状ペプチドは、いずれもＨＰＶ−１６ Ｅ７のＣＫIIリン酸化部位の阻害について同様に有効であることがわかる。
【実施例３】
【００３０】
ＨＰＶ−１６悪性転換細胞（ＣａＳｋｉ細胞）およびＨＰＶ−１８悪性転換細胞（ＨｅＬａ細胞）の増殖に対するペプチドの影響 
本実施例のアッセイでは、ＣａＳｋｉ細胞とＨｅＬａ細胞のそれぞれを、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Gibco社製）を添加したＤＭＥＭを用いて、９６穴プレート（Costar社製）に２×１０4細胞／ｍｌとなるように植えた。２４時間後、培地にペプチドを添加したが、その添加量は１５〜５００μＭとした。５％ＣＯ2の条件下で９６時間インキュベートした後、２０μｌのＭＴＳ溶液（１．９０ｍｇ／ｍｌ）（Promega社製）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを上記と同じ条件下で更に１時間インキュベートし、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果は、ペプチドを添加しなかった対照実験に対する増殖率（％）で表した。ここで使用したペプチドは、環状および直鎖状ペプチドをそれぞれ化学的に合成し、細胞質および核に浸透することができるＨＩＶ−１ Ｔａｔ−１細胞透過性ペプチド（HIV-１ Tat-1 cell penetrating peptide）（Schwarze SR, Dowdy SF, 2000,. Trends Pharmacol 21:45-48）と融合させたものである。本実施例で得られたデータから、本明細書に記載したペプチドは、ＣａＳｋｉ細胞（ＨＰＶ−１６）およびＨｅＬａ細胞（ＨＰＶ−１８）の両方に対して用量依存的な影響を与えることがわかる（図３Ａおよび図３Ｂ）。本実施例は、本発明のペプチドがＨＰＶ−１６のみならずＨＰＶ−１８にも有効であることを示した。
【実施例４】
【００３１】
ＨＰＶ陰性腫瘍細胞の増殖に対するペプチドの影響 
本実施例のアッセイでは、Ｈ−８２細胞（非小細胞肺ガン）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Gibco社製）を添加したＤＭＥＭを用いて、９６穴プレート（Costar社製）に２×１０4細胞／ｍｌとなるように植えた。２４時間後、培地にペプチドを添加したが、その添加量は１５〜５００μＭとした。５％ＣＯ2の条件下で９６時間インキュベートした後、２０μｌのＭＴＳ溶液（１．９０ｍｇ／ｍｌ）（Promega社製）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを上記と同じ条件下で更に１時間インキュベートし、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果は、ペプチドを添加しなかった対照実験に対する増殖率（％）で表した。ここで使用したペプチドは、本明細書に記載した環状ペプチドを、実施例３に記載のようなＨＩＶ−１ Ｔａｔ−１細胞透過性ペプチド（Schwarze SR, Dowdy SF, 2000,. Trends Pharmacol 21:45-48）と融合させたものである。本実施例で得られた結果から、本明細書に記載したペプチドは、Ｈ−８２細胞に対して用量依存的な影響を与えることがわかる。図４は、本発明のペプチドがＨＰＶ悪性転換細胞のみならず、非小細胞肺ガンのような局在的・組織的腫瘍細胞にも有効であることを示した。
【実施例５】
【００３２】
ＣａＳｋｉ細胞のＩＦＮ療法におけるＨＰＶ−１６応答に対するペプチドの影響 
本実施例のアッセイでは、ＣａＳｋｉ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Gibco社製）を添加したＤＭＥＭを用いて、９６穴プレート（Costar社製）に２×１０4細胞／ｍｌとなるように植えた。２４時間後、培地に１２０μＭのペプチドを添加した。更に２４時間後、ＩＦＮ−αを添加したが、その添加量は１，０００〜３１．５Ｕ／ｍｌとした。５％ＣＯ2の条件下で９６時間インキュベートした後、２０μｌのＭＴＳ溶液（１．９０ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを上記と同じ条件下で更に１時間インキュベートし、４９０ｎｍの吸光度を測定した。結果は、ＩＦＮを添加しなかった対照実験に対する増殖率（％）で表した。ここで使用したペプチドは、本発明の環状ペプチドの変異体を、実施例３に記載のようなＨＩＶ−１ Ｔａｔ−１細胞透過性ペプチドと融合させたものである。図５に見られるように、ＣａＳｋｉ細胞を本明細書に記載したペプチドと予めインキュベートすると、ＣａＳｋｉ細胞をＩＦＮ−αの細胞分裂抑制効果に対して高感受性になることがわかる。これらのデータは、本明細書に記載のペプチドがＩＦＮ療法に対して抗療性のＨＰＶ感染者の治療用にも有効であることを示している。
【実施例６】
【００３３】
ヌードマウスモデルに移植したヒトの腫瘍における、ＣＫIIリン酸化活性阻害ペプチドの抗腫瘍効果 
本実施例においては、生後６〜８週間令のメスのＢａｌｂＣヌードマウスを用いた。腫瘍の移植には、Ｈ−１２５細胞（非小細胞肺ガン）を１，０００，０００細胞／ｍｌとなるように生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁したものを用いた。この細胞懸濁液をマウスの腹部に皮下注射した。添付の配列表に記載の配列番号１のペプチドを、上記の細胞懸濁液と共にマウスに投与し、更に一日おきの投与を１ヶ月間継続した。本アッセイでは、１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量について評価した。ペプチドの抗腫瘍効果を調べるため、腫瘍の体積やマウスの生存率などのパラメータを測定した。図６に見られるように、腫瘍の進行の阻害の点において、３つの異なる用量が有効であった。これらのデータは、実験動物に移植したヒトの腫瘍モデルにおける、ＣＫIIリン酸化活性阻害ペプチドの抗腫瘍効果の有効性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
１．ＨＰＶ関連疾病のみならず、ＣＫIIの内部活性が高レベルである充実性腫瘍の治療にも有効な、幅広い応用スペクトルを有する医薬組成物を提供する。
２．２８〜３８番領域がＨＰＶ間で保存されているので、種々のＨＰＶ型に関連した疾病の治療に本発明の医薬組成物が有効である可能性を示す。
３．治療用分子として用いられる本明細書に記載のペプチドは、ヒトに投与した際に抗原性が低い。
４．容易にかつ経済的に製造可能な医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ＣＫIIリン酸化部位に対する本発明のペプチドの影響を示す。
【図２】図２は、ＨＰＶ Ｅ７のＣＫIIリン酸化部位に対する本発明のペプチドの影響を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣａＳｋｉ細胞の増殖に対する本発明のペプチドの影響を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＨｅＬａ細胞の増殖に対する本発明のペプチドの影響を示す。
【図４】図４は、肺ガン細胞の増殖に対する本発明のペプチドの影響を示す。
【図５】図５は、ＩＦＮの作用に対するＨＰＶ−１６悪性転換細胞の応答における、本発明のペプチドの影響を示す。
【図６】図６は、ヌードマウスに移植したヒト腫瘍における、ＣＫIIリン酸化活性阻害ペプチドの抗腫瘍効果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００３６】
配列番号１    合成配列に関する記載： ペプチド１
配列番号２    合成配列に関する記載： ペプチド２
配列番号３    合成配列に関する記載： ペプチド３
配列番号４    合成配列に関する記載： ペプチド４
配列番号５    合成配列に関する記載： ペプチド５
配列番号６    合成配列に関する記載： ペプチド６
配列番号７    合成配列に関する記載： ペプチド７
配列番号８    合成配列に関する記載： ペプチド８
配列番号９    合成配列に関する記載： ペプチド９
配列番号１０  合成配列に関する記載： ペプチド１０
配列番号１１  合成配列に関する記載： ペプチド１１
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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