(57)【要約】マイクロアレイ上の個々のプローブを再スケールし、ゲノムＤＮＡハイブリダイゼーションシグナルに由来するプローブセットに従属する係数を用いて補正する。ｇＤＮＡ結合のダイナミックレンジは、濃度シグナル曲線を測定することによって求める。直線性レンジ内におけるマルチプルハイブリダイゼーションの際の各プローブのシグナルを測定する。次いで、２セットの実験について、濃度非感受性プローブを見出す。各セットの平均で除したその標準偏差と比較した閾値を基に、プローブを破棄する。補正係数を用いて、各プローブの補正された強度を算出する。不確実性の高いプローブ（一実施形態では０．５）を破棄する。各プローブの重み係数を、不確実性係数に沿って決定する。最後に、不在、微量または存在といった、各遺伝子の呼び出しを行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
直線性レンジ内のマルチプルハイブリダイゼーションの間に各オリゴプローブからのシグナルを測定し、
各オリゴプローブの補正係数を、そのシグナル平均が定数と等しくなるよう求めることによって算出し、次いで
各オリゴプローブの不確実性係数を決定すること
を特徴とするオリゴプローブを補正する方法。
【請求項２】
各プローブについて観察されたシグナルの平均および標準偏差を算出することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記補正係数を、シグナル平均が定数と等しくなるよう求めることに基づいて算出する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記不確実性係数が平均と標準偏差の比に基づく、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
不確実性係数が所定の値よりも大きいプローブを、再設計するかまたは無視するかを決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記所定の値が約1.0である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
直線性レンジ内のマルチプルハイブリダイゼーションの間に各オリゴプローブからのシグナルを測定する手段と
各オリゴプローブの補正係数を、そのシグナル平均が定数と等しくなるよう求めることによって算出する手段と、
各オリゴプローブの不確実性係数を決定する手段
とを含むことを特徴とするオリゴプローブを補正するシステム。
【請求項８】
gDNA結合のダイナミックレンジを決定し、
直線性レンジ内のgDNAを用いるマルチプルハイブリダイゼーションの間に各プローブからのシグナルを測定し、
種々のハイブリダイゼーション由来のシグナル強度を標準化し、
各プローブの補正係数を算出し、次いで、
各プローブの不確実度係数を算出すること
を特徴とするプローブの補正係数を得る方法。
【請求項９】
各プローブについて観察されたシグナルの平均および標準偏差を算出することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記補正係数を、そのシグナル平均が定数と等しくなるよう求めることに基づいて算出する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記不確実性係数が平均と標準偏差の比に基づく、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記不確実性係数が所定の値よりも大きいプローブを、再設計するかまたは無視するかを決定することをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１３】
前記所定の値が約1.0である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
gDNA結合のダイナミックレンジを決定し、
直線性レンジ内のgDNAを用いるマルチプルハイブリダイゼーションの間に各プローブからのシグナルを測定し、
種々のハイブリダイゼーション由来のシグナル強度を標準化し、
各プローブの補正係数を算出し、次いで、
各プローブの不確実性係数を算出すること
を特徴とするプローブの補正係数を得る方法。
【請求項１５】
対応する補正係数を用いてプローブの補正されたシグナルを算出し、
プローブの重み係数を算出し、
遺伝子の発現レベルを、重み係数の関数として算出し、および
遺伝子発現の不確実性を算出すること
を特徴とするオリゴプローブの補正係数を用いる、コンピュータにより実施される方法。
【請求項１６】
補正されたシグナルを、細胞当たりのコピー数に変換することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
他の遺伝子の測定値を、細胞当たりのコピー数に変換することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記他の遺伝子の測定値を、補正されたシグナルに対する既知の細胞当たりのコピー数に基づいて補正する、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブの重み係数が、各プローブと関連している不確実性係数に比例する、請求項15に記載の方法。
【請求項２０】
前記プローブの重み係数が、遺伝子についてのすべてのプローブの不確実性係数の合計で除したプローブの不確実性係数と等しい、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記遺伝子の発現レベルが、重みの合計掛ける遺伝子を検出するために用いたプローブの対応する補正されたシグナル割る遺伝子を検出するために用いたプローブの数である、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子発現レベルの不確実性が、プローブの不確実性係数の合計掛ける対応する補正されたシグナル割る遺伝子を検出するために用いたプローブの数に基づく、請求項15に記載の方法。
【請求項２３】
各プローブが関連不確実性係数を有し、最高の不確実性を有するプローブを補正係数を用いる前に破棄する、請求項15に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子発現レベルの不確実性に基づいて遺伝子の呼び出しを行うことをさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項２５】
呼び出しを行うことが、
プローブの平均強度からバックグラウンドを差し引き、
プローブ強度を全体的に標準化し、
各プローブに補正係数を適用し、次いで、
遺伝子のZスコアに基づいて呼び出し値を決定すること
をさらに含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記呼び出しは人によって行われる、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
コンピュータにオリゴプローブの補正係数を用いる方法を実施させるための装置を備えた、コンピュータによって読み取り可能な媒体であって、前記方法が、
プローブの補正されたシグナルを、対応する補正係数を用いて算出し、
プローブの重み係数を算出し、
遺伝子の発現レベルを、重み係数の関数として算出し、次いで、
遺伝子発現の不確実性を算出すること
を含む、媒体。
【請求項２８】
プローブの補正されたシグナルを、対応する補正係数を用いて算出するモジュールと、
プローブの重み係数を算出するモジュールと、
遺伝子の発現レベルを、重み係数の関数として算出するモジュールと、
遺伝子発現の不確実性を算出するモジュール
とを含むことを特徴とするオリゴプローブの補正係数を用いるシステム。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、あらゆる目的のためにその全文が参照により本明細書に組み込まれ、2002年1月18日に出願された米国仮出願第60/349,874号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、プローブを用いる遺伝子発現レベルの検出の分野、特に、プローブの補正および補正されたプローブの使用に関する。
【０００３】
（背景技術）
DNAの配列情報が容易に入手できる遺伝子発現解析は、現在、より一般的になってきている。遺伝子についての情報を得る一つの方法には、プローブのアレイの使用を含む。一種のプローブはセルのシリコンアレイ上に作製され、各セルに結合しているDNA断片またはオリゴマーからなる。DNAプローブは、標的遺伝子から産生される標識されたRNA転写物、また、より典型的には、そのcDNA対応物をハイブリダイズするために用いられる。アレイ中のDNAプローブをRNA転写物またはcDNAに曝露し、次いでこれらは、適合すれば、DNAプローブと結合またはハイブリダイズする。結合していないRNAまたはcDNAを洗い流し、アレイをレーザー光線に曝露し、フルオロフォアと結合した、結合されたRNAに蛍光を生じさせる。蛍光量を測定し、遺伝子の発現レベルが表される。
【０００４】
種々のプローブを用いて、毎年、何百万もの独立した遺伝子発現測定値が作成されている。測定値を正確に調査しおよび体系的にまとめることには重大な障害がある。プローブは異なる感度を示すために、異なるプローブの結果を比較することが困難である。いくつかの問題に直面するが、これには異なる遺伝子間の発現レベルをどのように比較するか、絶対的な発現値をどのように決定するか、およびクロスハイブリダイゼーションシグナルをどのように排除するかが含まれる。本発明は、これらの困難を克服する手段を提供する。
【０００５】
（発明の要約）
マイクロアレイ上の個々のプローブを再スケールし、ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）ハイブリダイゼーションシグナルに由来するプローブセットに従属する係数を用いて補正する。複数のステップを実施して係数を導く。gDNA結合のダイナミックレンジは、濃度シグナル曲線を測定することによって求める。直線性レンジ内におけるマルチプルハイブリダイゼーションの際の各プローブのシグナルを測定する。
【０００６】
次いで、２セットの実験について、濃度非感受性プローブを見出す。各セットの平均で除したその標準偏差と比較した、閾値を基にプローブを破棄する。一実施形態では、各セットの閾値は異なっている。セットの閾値は、約0.34と0.07の間で変化する。さらなる実施形態では、プローブを破棄するために相関係数（correlation coefficient）を用いる。2セットについて破棄されたプローブの共通集合を見出し、種々のハイブリダイゼーションからのプローブ強度を全体的に標準化するために用いる。
【０００７】
各オリゴについて観察されるハイブリダイゼーションシグナルの平均および標準偏差を算出し、各オリゴの補正係数(correction coefficient)を、そのシグナル平均が定数と等しくなるよう求めることによって算出する。各オリゴの不確実性係数(uncertainty factor)を、標準偏差と平均間の比として算出する。
【０００８】
補正係数を用いて、各プローブの補正された強度を算出する。不確実性の高いプローブ（一実施形態では０．５）を破棄する。各プローブの重み係数(weighting factor)を、不確実性係数と一緒に決定する。最後に、不在、微量または存在といった、各遺伝子の呼び出しを行う。プローブ強度を全体的に標準化し、補正係数を各プローブに適用する。プローブの強度を比較し、対応する遺伝子の有意スコアを算出する。スコアを用いて呼び出し(call)を行う。
【０００９】
一実施形態では、遺伝子識別子、補正前後双方の遺伝子発現の値、各遺伝子の呼び出し、総プローブ、用いたプローブ、不確実性、平均、標準偏差および各プローブの補正された強度の群から選択される要素を含むアウトプットが提供される。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
以下の記載では、本明細書の一部を形成し、本発明が実施されうる特定の実施形態が例示目的で示される、添付の図面を参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施することが可能であるよう十分に詳細に記載されており、その他の実施形態を利用できること、および本発明の範囲から逸脱することなく、構造的、論理的、電気的変更を成すことができることは理解されるべきである。したがって、以下の説明は、限定された意味でとられるべきではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。
【００１１】
詳細な説明により、マイクロアレイ上の個々のオリゴプローブをどのように再スケールし、標準化するかを記載する。プローブセットに従属する係数を、ゲノムDNAハイブリダイゼーションシグナルから導く。係数の誘導に続いて、詳細な説明の第2の部分では、それらをどのように用いて、不在、微量または存在といった、各遺伝子の呼び出しを行うかを記載する。前記の誘導および補正係数の使用を実施するための簡易化したコンピュータシステムも提供する。結論では、本発明の特定の態様をまとめ、用いた本発明の実施形態に応じて、潜在的な利益を記載する。詳細な説明には、擬似コードを組み込み、人、機械またはコンピュータのいずれかによって実施される方法を表す。コンピュータによって実施される場合には、ソフトウェアモジュールまたはその他の形態のソフトウェアを表す。機能は、個々のモジュールで実施するか、または1種以上のモジュールに合わせることもできる。
【００１２】
係数誘導：
図1は、係数誘導を示す簡易化したフローチャートである。
ステップ1.
110で濃度シグナル曲線を測定することによってｇＤＮＡ結合のダイナミックレンジを決定する（一実施形態では、1、2、3、4、5、6、9、15および24マイクログラムのgDNAを用いた）。
ステップ2.
120で直線性レンジ内のgDNAを用いるマルチプルハイブリダイゼーションの際の各オリゴのシグナルを測定する（4、5および6マイクログラムを用い、各々は3つのレプリカチップを有している）。
ステップ3.
130で濃度非感受性プローブを見出し、このステップのアウトプットを、標準化関数のインプットとして用いる。
2セットの実験を行う：
セット1：1、2、3、6および9マイクログラム；各チップの遺伝子発現の平均を算出する。全チップの平均遺伝子発現の平均（ave）および標準偏差（sd）算出する。次いで、CV1＝sd/ave＝0.34を算出する。
セット2：4、5および6マイクログラム、セット1と同様に、CV2＝sd/ave＝0.14を算出する。
【００１３】
ケース1：
セット1中の各プローブについて、aveおよびsdを算出し、次いで、CV＝sd/aveを算出する。CV＜CV1（0.34）の場合には、このプローブを破棄する。擬似コードを以下の記述に選択的に用いる。
【表１】
2005517157.tif 000002
【００１４】
セット2中の各プローブについて、aveおよびsdを算出し、次いで、CV＝sd/aveを算出する。
CV＜CV2（0.14）である場合には、このプローブを破棄する。
【表２】
2005517157.tif 000003
【００１５】
セット1およびセット2から破棄したプローブを確保し、その共通集合を見出し、それをステップ4のインプットとして用い、ステップ4のその他のインプットはダミーインプットである。一実施形態では、合計16559プローブを破棄する。
【００１６】
ケース2：
セット1中の各プローブについて、aveおよびsdを算出し、CV＝sd/aveを算出する。
CV＜0.5*CV1（0.34*0.5＝0.17）である場合には、このプローブを破棄する。
【表３】
2005517157.tif 000004
【００１７】
セット2中の各プローブについて、aveおよびsdを算出し、CV＝sd/aveを算出する。
CD＜CD2*0.5（0.14*0.5＝0.07）である場合には、このプローブを破棄する。
【表４】
2005517157.tif 000005
【００１８】
セット1およびセット2から破棄したプローブファイルを確保し、これら2セットをステップ4のインプットとして用いる（すなわち、これら2セットの和集合を用いる）。
一実施形態では、合計10237プローブを破棄した。
【００１９】
ケース3：
セット1中の各プローブについて、aveおよびsdを算出し、CV＝sd/aveを算出する。
CV＜0.5*CV1（0.34*0.5＝0.17）である場合には、このプローブを破棄した。
【００２０】
セット2中の各プローブについて、aveおよびsdを算出し、CV＝sd/aveを算出する。
CD＜CD2*0.5（0.14*0.5＝0.07）である場合には、このプローブを破棄する。
【表５】
2005517157.tif 000006
セット1およびセット2から破棄したプローブファイルを確保し、これら2セットの共通集合を見出し、それをステップ4のインプットとして用い、ステップ4のその他のインプットはダミーインプットである。
合計410プローブを破棄した。
【００２１】
ケース4：
セット2の実験において各チップの平均を見出す（4、5、6マイクログラム）。
セット2中の各プローブについて、セット2中の各チップの平均を用いてその相関係数（CC）を算出する。
CC＜＝0.5である場合には、このプローブを破棄する。
【００２２】
破棄したプローブファイルを確保し、ステップ4のインプットとして用いる。ステップ4のその他のインプットはダミーインプットである。
一実施形態では、合計4896プローブを破棄した。
【表６】
2005517157.tif 000007
これをステップ4のインプットとして用いる。
【００２３】
ステップ4.
130で、種々のハイブリダイゼーションからのプローブ強度を全体的に標準化する（すなわち、チップ中の遺伝子発現の平均によって標準化する）。
【表７】
2005517157.tif 000008
【００２４】
ステップ5．
140で、各オリゴについて観察されたハイブリダイゼーションシグナルの平均（Si）および標準偏差（SDi）を算出する。
【００２５】
ステップ6.
150で、シグナル平均が定数（すなわち、1）と等しくなるよう求めることによって、各オリゴの補正係数（Ci）を算出する。
Ci＝1/Si
【００２６】
ステップ7.
160で、各オリゴの不確実性係数を、標準偏差と平均間の比として算出する。
di＝SDiSi
cal_coeff.plを実行することで、ステップ5、6、7を行う。
インプットはステップ4のアウトプットである。
Output：
Result_coeff
FORMAT：
B_gene_number total_probes_for_this_gene gene_name
probe_coordinate_x y correction_coefficient_for_this_probe probe_unccrtainty
probe_standard_deviation（5カラム）
負の値（補正係数）は、このプローブが悪いプローブであることを意味する。
【００２７】
補正係数の使用：
ステップ8.
170で、不確実性が高いプローブを破棄する（ユーザー定義である0.5が推奨される）。さらなる実施形態において、これもまた、補正係数を得ることの一貫として行われ得る。210で、各プローブの補正した強度を算出する。
Sicor＝Si*Ci
【００２８】
ステップ9.
220で、各プローブの重み係数を、230で発現レベルを算出する。加重遺伝子発現（Vi）を以下の数式：
【数１】
2005517157.tif 000009
にて決定する。
またはプローブセット中の最小値および最大値を用いずに算術平均を算出する。mは、この遺伝子に対して用いたプローブの数である。
【００２９】
ステップ10.
240、遺伝子発現レベルDの不確実性を、以下の数式：
【数２】
2005517157.tif 000010
にて算出する
【００３０】
ステップ11.
250で、遺伝子の絶対呼び出し値を決定する。
1.  バックグラウンド補正
1.1  チップを16の領域に分割する。
1.2  この領域のセル強度値の下部2％の平均をとる。これをこの領域のバックグラウンドとする。この領域のすべてのプローブの平均強度からバックグラウンドを差し引く。
2.  プローブ強度を全体的に標準化する。
3.  補正係数を各プローブに適用する。
4.  遺伝子の絶対呼び出し値を決定する。
【００３１】
各遺伝子について、すべての用いたプローブを見出す。各プローブの強度を0.8と比較し、次いで、この遺伝子の、Zスコアに基づいたランクを算出する。
A：不在-1、M：微量0、P：存在1
【表８】
2005517157.tif 000011
【００３２】
ステップ8〜11は、一実施形態中で「rank」または「rank_weight」スクリプト（c++プログラム。ソースファイルはblock.cpp, block.h, main.cpp）を実施することによって行われる。
【表９】
2005517157.tif 000012
1. image_file_name_orgexp：3カラム：gene_number gene_name gene_expression（補正係数適用前）、を含むタブ区切り形式ファイル。
2. image_file_name_corexp：4カラム：gene_number gene_name gene_expression（補正係数適用後）この遺伝子に対する呼び出し値、を含むタブ区切り形式ファイル。
3. image_file_name.correct_intensity：タブ区切り形式ファイル。各遺伝子は、
B_gene_number gene_name total_probes used_probes（4カラム）
probe_coordinate_x y corrected_intensity_for_this_probe（3カラム）
から開始する。
4. image_file_name.gene_exp_uncertainty：7カラム：
【表１０】
2005517157.tif 000013
を含むタブ区切り形式ファイル。
5. image_file_name.ave_all：チップ中の遺伝子発現の平均および標準偏差
【００３３】
Z-スコアおよび呼び出し値の算出
一実施形態では、Z-スコアおよび呼び出し値は以下のとおり算出できる。各遺伝子について、補正したプローブ強度としてC、および用いたプローブの総数としてJを得る。各遺伝子に用いたプローブは、その遺伝子についての有効情報を提供するよう決定された、チップまたはアレイ上のプローブのサブセットである。例えば、各遺伝子に相当する16のプローブを含むアレイに関して、例えば不適当な配列または望まないクロスハイブリダイゼーションの結果として、16のプローブ全てが有効なハイブリダイゼーション反応を提供しないこともある。次いで、各遺伝子について：
1.  各プローブの差の絶対値|C-0.8|を得；
2.  |C-0.8|＝0である場合を考慮から除外し；
3.  残っている差の絶対値を、適切であれば付属のランクを用いて、最小から最大まで並べ；
4.  各々のこのようなランクにC-0.8＞0の場合は「+」記号、C−0.8＜0の場合は「-」記号をつけ；
5.  ランクの総計S：S＞0であれば、S＝S-0.5そうでなければS＝S+0.5を算出し、
6.  分散値V：V＝sqrt（J*（J+1）*（2*J+1）/6）を算出し；
7.  Z-スコア：Z＝S/Vを算出し、次いで正規分布を用いてZスコアを統計上のP値へと変換でき；および
8.  Zにユーザー定義の閾値を割り当て、各遺伝子について呼び出し値を算出し、この遺伝子に対する適切な呼び出し（存在、微量、不在）をユーザーの設定した閾値に基づいて行うことができる。呼び出し値＝1ならば転写物がサンプル中に存在し、呼び出し値＝0ならば転写物は微量に存在し、呼び出し値＝-1ならば転写物は存在しない。前記擬似コードでは、閾値Zの例を0.5と設定した。
【００３４】
本方法の優位性は、一つには、その遺伝子の全てのプローブの単一の平均値ではなく、遺伝子に対して各々個別の使用可能なプローブの値を使用することに基づいている。
【００３５】
異なる呼び出し方法の比較
1  .標準偏差で遺伝子発現を比較する
2.  負の対照の平均値、中央値、25パーセンタイル、および75パーセンタイルで遺伝子発現を比較する
3.  不確実性で遺伝子発現を比較する。
4.  ランクに基づく試験、各プローブをgDNAチップ中の標準化され、スケールされた発現と比較する（理想的には1であるが、実際は0.8を使用）。
5.  4と同様のランクに基づく試験、遺伝子発現の平均値（ステップ11を参照）も考慮する。
性能試験：
1.  レプリカチップ中の誤呼び出し（A-P、A-M、M-P、特にA-Pの誤呼び出し）
2.  39イネチップ(rice chip)中の負および正の対照の呼び出し
3.  39イネチップ中の円錐花序特異的遺伝子OS006783、根特異的遺伝子OS000876の呼び出し
ランクに基づく方法、特に方法5が最も成績が良い。これは「rank」および「rank_weight」の双方で実施される。
【００３６】
異なる補正係数の比較
1.result_coeff_0.14_0.34_intersect（ステップ3ケース1より）
2.result_coeff_0.17_0.07_union（ステップ3ケース2より）
3.result_coeff_0.17_0.07_intersect（ステップ3ケース3より）
4.result_coeff_concen_corr（ステップ3ケース4より）
5.result_coeff_no_conc_9_chip（濃度非感受性プローブは考慮せずに4、5、6マイクログラムのチップを使用、各々が3つのレプリカを有し、合計9チップ）
性能試験：
1.  レプリカチップ中の誤呼び出し（A-P、A-M、M-P、特にA-Pの誤呼び出し）
2.  39イネチップ中の負および正の対照の呼び出し
3.  39イネチップ中の円錐花序特異的遺伝子OS006783、根特異的遺伝子OS000876の呼び出し
ランクに基づく方法を使用（すなわち、呼び出し方法5）
一般に、「result_coeff_no_conc_9_chip」補正係数が最良の成績を挙げるものである。
「result_coeff_0.14_0.34_intersect」の成績はわずかに劣る。
推奨：
補正係数として「result_coeff_no_conc_9_chip」を使用し、
「rank」および「rank_weight」は同様に実行するが、「rank_weight」のほうが「rank」よりもM-Pの誤呼び出しが僅かに多い。
用法：
実行：rank file_containing_image_file_names  result_coeff_no_conc_9_chip 0.5
または：rank_weight file_containing_image_file_names
result_coeff_no_conc_9_chip 2.55
【００３７】
オリゴプローブの補正のための係数を作成し、使用するコンピュータプログラムを実行するための一実施形態を図3に例示する。コンピュータシステム310は、パーソナルコンピュータまたはコンピュータプログラムを実行可能なその他のコンピュータを含む。図3は、プロセッサ320、メモリ330、およびバス340を備えるコンピュータシステム310の簡略図である。このコンピュータシステムはさらに回路ならびに入力装置345および出力装置350のためのプログラミングを含む。入力装置345はディスクドライブ、キーボード、タッチパッド、およびプロセッサ320およびメモリ330へ情報を与えるためのその他の装置を含む。出力装置350はプリンタ、ディスプレイ、およびその他の出力接続を含む。
【００３８】
一実施形態では、コンピュータシステム310はネットワークと接続している通信回線360を含む。データベースサーバー370もネットワークと、ひいては回線360を経由してコンピュータシステム310と接続している一装置である。コンピュータシステムはデータベースをクエリーし、データベースから結果を受け取る。ある実施形態では、通信回線はローカルまたは広域ネットワークである。さらなる実施形態では、データベースサーバー機能は、ディスクドライブなどの入力/出力装置345/350を利用するプロセッサ320によって与えられる。
【００３９】
バス340を経由して接続しているように示したが、システム310の部品は、バス340を経由して接続されているのに加えて、またはその代わりに、互いに直接接続することもできる。部品間を接続するその他の従来法（例えば、従来型のワイヤレス通信手段）も使用できる。さらに、種々のレベルの部品間の統合も本発明によって意図される。例えば、部品を一部または全部、他の部品または部品類と統合することもできる。
【００４０】
以下の詳細な実施例を参照することにより本発明をさらに説明する。これらの実施例は例示目的のためだけに提供されるものであって、特に明記しない限り限定するものではない。
【実施例】
【００４１】
（実施例1）：GeneChip（登録商標）標準プロトコール
イネ遺伝子アレイおよび種々の組織および発達段階から抽出したイネRNA由来のプローブを用いて、このチップでの遺伝子の発現プロフィールを同定することができる。
【００４２】
植物遺伝子発現を定量的に測定するために、GeneChip（登録商標）を使用するための標準プロトコールを、以下に概説したように実施する：
全RNAの定量
1.  植物組織から全RNAを抽出し、GeneQuant（Amerxham Biosciences、Piscataway、NJ）を用いて定量する。
1OD260＝40mgRNA/ml；A260/A280＝1.9〜約2.1
2.  ゲルをランして抽出されたRNAの完全性および純度をチェックする。
【００４３】
二本鎖cDNAの合成
cDNA合成のためのGibco/BRL SuperScript Choice System（カタログ番号1B090-019）を用いてcDNAを調製する。T7-（dT）24オリゴヌクレオチドを調製し、HPLCによって精製する。（5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-（dT）24-3'；配列番号662）。
ステップ1.プライマーハイブリダイゼーション
70℃で10分間インキュベートする
直ちに遠心し、短時間氷上に置く
ステップ2.温度調節：
42℃で2分間インキュベートする
ステップ3.以下を用いて実施される第1鎖合成：
DEPC水-1：1
RNA（10：g最終）-10：1
T7＝（dT）24プライマー（100pmol最終）-1：lpmol
5×第1鎖cDNAバッファー-4：1
0.1M DTT（10mM最終）-2：1
10mM dNTPミックス（500：M最終）-1：1
Superscript II RT 200U/：l-1：1
合計20：1
十分に混合する
42℃で1時間インキュベートする
ステップ4.第2鎖合成：
反応物を氷上に置き、直ちに回転させる
DEPC-水-91：1
5×第2鎖cDNAバッファー-30：1
10mM dNTPミックス（250mM最終）-3：1
イー・コリ（E.coli）DNAリガーゼ（10U/：l）-1：1
イー・コリDNAポリメラーゼ1-10U/：l-4：1
RnアーゼH 2U/：l-1：l
T4DNAポリメラーゼ5U/：l-2：1
0.5M EDTA（0.5M最終）-10：1
合計162：1
混合/遠沈/16℃で2時間インキュベート
ステップ5.反応の完了：
16℃で5分間インキュベートする
【００４４】
二本鎖cDNAの精製
1.  PLG（フェーズロックゲル（Phase Lock Gel）、Eppendorf 5 Prime Inc.、PI-188233）を14,000×でを遠心分離し、162：1のcDNAをPLGに移す
2.  162：1のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（pH8.0）を加え、2分間遠心分離する
3.  上清を新しい1.5ml試験管に移し、以下を加える
グリコーゲン（5mg/ml）              2
0.5M NH4OAC（0.75×Vol）          120
ETOH（2.5×Vol、-20℃）            400
4.  十分に混合し、14,000×で20分間遠心分離する
5.  上清を除去し、0.5mlの80％EtOH（-20℃）を加える
6.  5分間遠心分離し、風乾するか、5〜10分間スピードバックによって乾燥させる
7.  44：1DEPC H2Oを加える
cDNAの質およびサイズ分布を解析する
1：1比の二本鎖合成産物対ローディングバッファーを用いてゲルをランする
【００４５】
ビオチニル化cRNAの合成
（Enzo BioArray 高収量RNA転写物標識キット  カタログ番号900182）
精製cDNA                          22：1
10×Hyバッファー                   4：1
10×ビオチンリボヌクレオチド        4：1
10×DTT                            4：1
10×Rnアーゼインヒビターミックス   4：1
20×T7 RNAポリメラーゼ             2：1
合計                              40：1
5秒間遠心分離し、37℃で4時間インキュベートする
30〜45分毎にゆっくりと混合する
【００４６】
cRNAの精製および定量
（Qiagen Rneasy Miniキット  カタログ番号74103）
cRNA                          40：1
DEPC  H2O                        60：1
RLTバッファー                    350：1  ボルテックス処理によって混合
EtOH                            250：1  ピペッティングによって混合
合計                    700：1
RNAが固着する間1分以上待つ
2000rpmで5分間遠心する
RPEバッファー                500：1
10.000rpmで1分間遠心する
RPEバッファー                500：1
10,000rpmで1分間遠心する
10,000rpmで1分間遠心してカラムを乾燥させる
DEPC H2O                    30：1
1分間待ち、次いで、10K 1分間の遠心によってcRNAを溶出する
DEPC H2O                    30：1
これまでの工程を反復する
濃度を決定し、1：g/：1濃度に希釈する
【００４７】
cRNAのフラグメンテーション
cRNA（1：g/：1）                    15：1
5×フラグメンテーションバッファー*  6：1
DEPC H2O                         9：1
30：1
*5×フラグメンテーションバッファー
1M Tris（pH8.1）      4.0ml
MgOAc              0.64g
KOAC               0.98g
DEPC H2O
合計                20ml
フィルター滅菌する
アレイは以下で洗浄され、染色される：
ストリンジェント洗浄バッファー（Stringent Wash Buffer）**
非ストリンジェント洗浄バッファー（Non-Stringent Wash Buffer）***
SAPE染色液（SAPE Stain）****
抗体染色液（Antibody Stain）*****
適切な抗体増幅プロトコールを用いてフルイディクスステーション（fluidics station）上で洗浄される
**ストリンジェントバッファー：12×MES 83.3ml、5M NaCl 5.2ml、10％ Tween 1.0ml、H2O 910ml、
フィルター滅菌する
***非ストリンジェントバッファー：20×SSPE 300ml、10％Tween 1.0ml、H2O 698ml、フィルター滅菌し、消泡剤1.0。
****SAPE染色液、2×染色バッファー600：1、BSA48：1、SAPE12：1、H2O 540：1。
*****抗体染色液：2×染色バッファー300：1、H2O 266.4：1、BSA 24：1、ヤギIgG 6：1、ビオチン化Ab 3.6：1
【００４８】
遺伝子発現プロフィールの特性決定.
一実施形態では、種々の組織および発達段階から抽出したイネRNA由来のイネ遺伝子アレイおよびプローブを用いて、遺伝子の発現プロフィールを、チップで同定する。イネアレイの場合には、23,000個を上回る遺伝子（約18,000個のユニークな遺伝子）、すなわち、イネゲノムのおよそ50％を含み、16のオリゴヌクレオチドプローブセットがミスマッチプローブセットを含まないという点を除いて、アラビドプシス(Arabidopsis)のGeneChip（登録商標）（Affymetrix）と類似している。したがって、各遺伝子に対する16のプローブセットの強度レベルを解析する内部ソフトウェアによって発現レベルを決定する。一連の所定の統計基準に適合しない場合には、最高および最低プローブを除去し、残りのセットを平均して発現値を得る。最終発現値を、本願では、ソフトウェアによって標準化する。本標準化および呼び出し方法と合わせたDNAチップの利点としては、定量的な結果、高い再現性のある系、全体的な遺伝子発現解析が可能であること、ノーザンブロット解析よりも高い感度が挙げられる。
【００４９】
（実施例2）：ブラシカ(Brassica)の種子の発芽前期間の、全体的なトランスクリプトームリモデリングのための本発明の適用
本発明を適用し、種子発芽前期間の全体的な転写調節を特性決定することが可能となった。種子発芽の最初のステップには、関与する細胞全体の基礎をなす生物学の全体的な変化が必要であり、その後、胚が成長および出芽というプロセスを開始することができる。種子の部分水和からなる発芽前処理が、種子発芽力を向上させるために用いられている。ここで、本発明者らは、ブラシカがアラビドプシスと十分に近縁であり、遺伝子発現の変化を調べるためにアラビドプシス全ゲノムマイクロアレイを使用できるかどうかを調べている。かかる異種間マイクロアレイハイブリダイゼーションは十分に特徴づけられ、認められた技術になってきている（Zhu, T., Chang, H. -S., Schmeits, J., Gil, P.、Shi, L., Budworth, P., Zou, G., Chen, X. and Wang, X.（2001）. Gene Expression Microarrays：Improvements and Applications Towards Agricultural Gene Discovery. J. Assoc. Lab. Automation 6, 95-98；Zhu, T., Budworth, P., Han, B., Brown, D., Chang, H. -S., Zou, G. and Wang, X.（2001）Toward elucidating the global gene expression patterns of developing Arabidopsis ：Parallel analysis of 8300 genes by a high-density oligonucleotide probe array. Plant Physiol. Biochem. 39, 221-242；Chismar, J. D., Mondala, T., Fox, H. S., Roberts, E., Langford, D., Masliah, E., Salomon, D. R. and Head, S. R.（2002）Analysis of result variability from high-density oligonucleotide arrays comparing same-species and cross-species hybridizations. Biotechniques 33, 516-524）。部分水和（「プライミング」）、部分的、漸進的脱水（「貯蔵寿命誘導」）と組合せた加熱、および完全脱水（加熱しない、回転ドラム中での低相対湿度でのインキュベーションによる）という発芽前処理の効果を、ゲノムスケールのマイクロアレイ技術を用いて調べている。アラビドプシス全ゲノムマイクロアレイ（Affymetrix GeneChip（登録商標））を用いて、ブラシカ種子における、乾燥種子の貯蔵寿命を延長するために用いた、最初の水和またはプライミングおよびその後の加熱および乾燥処理に対するゲノム転写の応答を特性決定した。
【００５０】
十分に確立された種子の処理手順、アラビドプシスとの密接な系統学的関係、およびブラシカの種の作物としての商品価値により、シロイヌナズナの機能的ゲノミクスの潜在的な受益者であることが明らかとなったので、ブラシカの種子を選択した。カリフラワー（ブラシカ・オレラセア・エル・コンバー・ボトリティス・エル・アレフ・バー・ボトリティス（Brassica oleracea L. convar botrytis L. Alef. var. botrytis））は、プライミングおよび貯蔵寿命誘導が十分に確立されており、工業規模で適用されている野菜作物である。比較的大型の種子が、温度および水分含量を再現可能な方法で制御するのを可能にするのに役立つ。DNA配列に基づいた系統学的解析により、ブラシカとアラビドプシス間の密接な関係が示されている。最近の比較ゲノム解析によって、ブラシカ・オレラセアにはいくつかのアラビドプシス遺伝子の相同体がないことがあるにもかかわらず、アラビドプシスとブラシカ間のシンテニーおよび微小シンテニー（microsynteny）の双方が明確に証明されている。
【００５１】
ここで、アラビドプシスとブラシカDNA間で一致したハイブリダイゼーションを示すプローブを同定し、データ解析に使用した。処理したブラシカの種子の得られた発現プロフィールにおいて、3つの全体的な発現パターンが認められた。17,886の検出された転写物のうち7,731は、水和によって誘導され、加熱による漸進的脱水によって再抑制されたクラスターに含まれており、応答パターンはタンパク質合成およびエネルギー生成の構成要素に特徴的であった。17,886の検出された転写物のうち4,916の遺伝子は、水和に応じて発現の低下を示した。これらの再抑制された転写物のうち多くは、加熱による漸進的脱水によって影響を受けず、応答は種子貯蔵タンパク質メッセージに特徴的であった。
【００５２】
本明細書に記載した方法を用いる、カリフラワーゲノムの、アラビドプシスアレイとのハイブリダイゼーションによって、オルソロガスな遺伝子の発現パターンのみが記載されるという確信が提供される。
【００５３】
実験手順
種子発芽処理． カリフラワー品種LintopおよびMaverickの種子を、Bruggink（Bruggink, G. T., Ooms J. J. J. and van der Toorn, P.（1999）. Induction of longevity in primed seeds. Seed Sci. Res. 9, 49-53）にしたがって、4日間プライミングし、続いて、貯蔵寿命誘導か直接乾燥のいずれかを行った。プライミングは、種子水分含量を54％（乾重量ベース）まで上げること、および種子を回転ドラム（10rpm）に移し、これを20℃で暗所で維持することからなるものとした。この期間の最後に、種子を、20℃および40％RHの移動空気に24時間曝露することによって直接乾燥させ、その後20℃および40％RHで保存した。あるいは、貯蔵寿命誘導条件（Brugginkら、1999）に移した。これらの条件は、相対湿度100％および温度32℃で48時間とそれに続く乾燥からなるものとした。この場合の乾燥とは、温度と相対湿度の、それぞれ20℃および28％までの直線的な低下からなるものとした。この期間の最後に、種子を、保存のために相対湿度40％および20℃においた。
【００５４】
潜在的な寿命を調べるために、乾燥した種子を75％RHおよび20℃で3日間平衡化し、次いで、アルミニウムバッグ上で分割し、続いて、これを密閉し、46℃の温浴に入れた。0、2、3、4、5および6日の期間の後、バッグを水から取り出し、開封し、発芽させるために種子を、各100個の種子の2つのレプリカとともに湿らせた濾紙上においた。20℃で、10日後、正常な実生に発達する種子のパーセンテージを調べた。
【００５５】
DNAおよびRNA抽出． 種々の処置の前後の種子を切断しRNAlaterバッファー（Ambion）中に保存した。DNAをCsCl2勾配遠心分離を用いて抽出した（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T.（1989）. Molecular cloning：A laboratory manual.2nd ed. Cold Spring Harbor Press、Plainview、NY）。全RNAを、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール（25：24：1）を用いて抽出し、エチレングリコールモノブチルエーテルを用いて沈殿させ、次いで、水に再懸濁し、LiCl沈殿によってさらに精製した（Sambrookら、1989）。RNAをゲル電気泳動によって完全性について、および分光測定によって純度についてさらに調べた。データの質を確実なものにするために、A260/A280比が1.9〜2.1であるサンプルのみをこの研究に包含させた。
【００５６】
マイクロアレイ実験およびデータ獲得． 合計3ugのゲノムDNAを、20ulの2.5×ランダムヘキサマーと混合し、100℃で5分間加熱した。混合物を氷上で直ちに冷却し、BioPrime DNA標識システム（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いてクレノーDNA断片の存在下で、ビオチンdNTPを用いて37℃で2時間標識した。RNA標識およびハイブリダイゼーションは、先に記載されたとおりに実施した（Zhu, T., Chang, H. -S., Schmeits, J., Gil, P., Shi, L., Budworth, P., Zou, G., Chen, X. and Wang, X.（2001）Gene Expression Microarrays：Improvements and Applications Towards Agricultural Gene Discovery. J. Assoc. Lab. Automation 6, 95-98；Zhu, T., Budworth, P., Han, B., Brown, D., Chang, H. -S., Zou, G. and Wang, X.（2001）Toward elucidating the global gene expression patterns of developing Arabidopsis ：Parallel analysis of 8300 genes by a high-density oligonucleotide probe array. Plant Physiol. Biochem. 39, 221-242）。簡単に説明すると、各サンプル由来の全RNA（5μg）を、100pmolの5'T7RNAポリメラーゼプロモーター配列を含むオリゴdT（24）プライマー、50mM Tris-HCl（pH8.3）、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM ジチオスレイトール（DTT）、0.5mM dNTPおよび200ユニットのSuperScript II逆転写酵素（Life Technologies）を用いて42℃で1時間逆転写した。cDNAの第2鎖は、25mM Tris-HCl（pH7.5）、100mM KCl、5mM MgCl2、10mM（NH4）SO4、0.15mM b-NAD+、1mM dNTPおよび1.2mM DTTを含有する反応液中で、40ユニットのイー・コリDNAポリメラーゼI、10ユニットの大腸菌DNAリガーゼおよび2ユニットのRNアーゼHを用いて合成した。反応は、16℃で2時間進行させ、EDTAを用いて終結させた。二本鎖cDNA産物は、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。
【００５７】
ビオチン化相補RNA（cRNA）を、T7RNAポリメラーゼ（ENZO BioArray High Yield RNA Transcript labeling キット、Enzo）によって合成cDNAからin vitro転写した。cRNAを、アフィニティー樹脂（Qiagen RNeasyスピンカラム）を用いて精製し、40mM Tris-酢酸（pH8.1）、100mM 酢酸カリウムおよび30mM 酢酸マグネシウムを含有するバッファー中で94℃で35分間インキュベートすることによってランダムに断片化して約35〜200塩基の分子を得た。標識したDNAおよびRNAサンプルを、100mM 2-N-モルホリノ-エタン-スルホン酸（MES）、1M NaCl、20mM EDTA、0.01％ Tween20を含有するハイブリダイゼーションバッファー中、0.1mg.ml-1の超音波処理ニシン精子DNAと混合し、ハイブリダイゼーションに先立って、99℃で5分間変性させ、45℃で5分間平衡化した。次いで、ハイブリダイゼーション混合液を、イネGeneChipマイクロアレイカートリッジに移し、60rpmのローティッセリー（rotisserie）上で45℃で16時間ハイブリダイズした。
【００５８】
次いで、ハイブリダイズしたアレイをすすぎ、フルイディクスステーション（Affymetrix）で染色した。先ず、洗浄バッファーA（6×SSPE（0.9M NaCl、0.06M NaH2PO4、0.006M EDTA）、0.01％ Tween20、0.005％ 消泡剤）を用いて25℃で10分間すすぎ、洗浄バッファーB（100mM MES、0.1M NaCl、0.01％ Tween20）を用いて50℃で20分間インキュベートし、次いで、ストレプトアビジンフィコエリスリン（SAPE）（100mM MES、1M NaCl、0.05％ Tween20、10mg/ml SAPE 2mg/ml BSA）を用いて25℃で10分間染色し、洗浄バッファーAを用いて25℃で20分間洗浄し、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体を用いて25℃で10分間染色した。染色後、アレイをSAPEを用いて25℃で10分間染色し、洗浄バッファーAを用いて30℃で30分間洗浄した。GeneChip Suite4.0（Affymetrix）を用いてAgilent GeneArray Scannerでプローブアレイを2回スキャンし、強度を平均した。
【００５９】
マイクロアレイデータ処理および解析． マイクロアレイのスキャンによって得たraw画像の.DATファイルを用いて、Affymetrix MAS4.0で、.CELファイルを作成した。次いで、各オリゴヌクレオチドプローブの特徴のシグナルを含むこのようにして作成した.CELファイルを、PERL5.6で書かれたカスタムスクリプトを用いて解析した。ゲノムDNAハイブリダイゼーションによって作成した.CELファイルを、個々のプローブレベルで比較し、アラビドプシスのゲノムの75％以下のシグナルでブラシカゲノムとハイブリダイズするプローブのデータベースを作成した。次いで、ブラシカRNAとハイブリダイズしたマイクロアレイのパーフェクトマッチプローブ値を、データベースと比較し、「悪い」プローブを解析から除去し；次いで、残っているプローブの72パーセンタイル値を算出した。次いで、これらの生のシグナル値を、シグナル値の5パーセンタイルから得られるバックグラウンド推定値を差し引くことによって補正し、100という標的平均にスケールした。データ解析の前に、遺伝子当たりをベースに、1という標的への中央値中心化によって値を標準化した。GeneSpring4.2（Silicon Genetics）を用いて自己組織化マップを作成し、これを用いていくつかの図も作成した。
【００６０】
非ハイブリダイズオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションデータの除去により、データの質が高まり、解釈が単純化される。この実施例に記載した実験のほとんどは、各25塩基対の382,166個のオリゴヌクレオチドプローブを含む特別に設計したオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて実施した。これらの配列は、25,996個のユニークなアラビドプシスの遺伝子（設計時のアラビドプシスのゲノム中の予想されたエクソンの99％を上回るものに相当する）と完全にマッチするよう設計した。したがって、各遺伝子は、平均で15のオリゴヌクレオチドプローブのプローブセットによって表される。各遺伝子IDの平均で15の強度値のプローブセットハイブリダイゼーションデータを用いて、その遺伝子の発現値を算出し、それを各プローブセットの標準化プローブセル強度値の72パーセンタイルとして採用する。
【００６１】
ブラシカの遺伝子発現解析に対するシロイヌナズナアレイの有用性を、ブラシカ・オレラセアとアラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）間のヌクレオチド置換率を推定することによって調べた。明らかなアラビドプシス相同分子種を含む3つの全長ブラシカコード配列を、ペアワイズMartinez/Needleman-Wunschアラインメントを用いて比較した（クロロフィラーゼI、アラビドプシス＝Atlgl9670、ブラシカ＝GB：AF337544；エチレン受容体ETR2、A.＝At3g23150、B.＝EMBL：AB078598；40sリボソームタンパク質、A.＝At3g02560、B.＝EMBL：AF144752）。これらの配列間のヌクレオチド置換率は、それぞれ20.5％、19.7％および20％であった。
【００６２】
これらの測定値の中央値がすべての遺伝子のものに近いと仮定すると（20％置換率または80％の配列同一性）、25塩基対のプローブがブラシカと100％同一である確率は、0.825と推定でき、99.62％のプローブはミスマッチを含むと予想される。これにもかかわらず、ブラシカのDNAとハイブリダイズしたアレイ上のプローブの75％が、アラビドプシスDNAとハイブリダイズした同一プローブのシグナル強度の50％以内にあるとわかった。12bp以上の同一配列を含むプローブは、GC含量および二次構造などの因子に応じて、ブラシカおよびアラビドプシス間では区別できないハイブリダイゼーションシグナルを生成可能であることがわかった（データは示していない）。前記の置換率の推定値を用いることで、68.7％のプローブが12個以上の連続同一塩基を含むと予想される。
【００６３】
アラビドプシスの生態型コロンビアゲノムDNAとハイブリダイズした2つの複製アレイにおける各オリゴヌクレオチドプローブのセル強度値を比較した。最初のレプリカアラビドプシスアレイのプローブの91.5％が、第2のアレイのプローブのシグナル強度の少なくとも50％のシグナル強度を有していた。次いで、ブラシカおよびアラビドプシスゲノムDNAとハイブリダイズしたアレイの比較を用いて、アラビドプシスDNAの少なくとも75％の強度でブラシカゲノムDNAとハイブリダイズする有用なプローブのリストを規定した。アレイは、各遺伝子についていくつかの重複性プローブを含むので、相当な数のプローブを解析から除いてもなお、しっかりとした結果を得ることが可能である。したがって、ブラシカのゲノムハイブリダイゼーションが、アラビドプシスのシグナルの75％未満であったすべてのプローブ（143,361プローブ、すなわち、37.5％）を「使用不可」とした。本発明者らは残る62.5％のプローブは、ブラシカ中の、プローブを設計したアラビドプシス遺伝子に対して、認識するオルソロガスなまたは関連する配列であるという高い確信を持っている。各プローブセット中のブラシカゲノムDNAが、アラビドプシスのシグナルの少なくとも75％でハイブリダイズしたプローブ（平均して遺伝子当たり9）のみを、発現解析アルゴリズムに用いた。
【００６４】
「使用可能」としたプローブのみを、対照ゲノムDNAハイブリダイゼーションからの発現値の相関関係に用いることの利点は、第4の同様にブラシカゲノムDNAとハイブリダイしたマイクロアレイを用いることによって証明される。使用不可プローブ除去後には、プローブセット当たりの平均プローブ数は15から9へ減少するものの、ブラシカとアラビドプシスのゲノムハイブリダイゼーション間の相関係数は、未改変解析の0.69から使用可能な「相同」プローブのみの使用によって0.75へ改善した。本方法のこの優位性は、通常の標準的な解析（すべてのプローブ）および「悪い」プローブを除いた解析（「使用可能プローブ」）のために、アラビドプシスおよびブラシカのゲノムDNAをアラビドプシスマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせて得られるすべてのシグナル値の散乱プロットを用いることによって明らかに見られる。散乱プロットは、mRNAサンプルとの複製ハイブリダイゼーションの再現性を示す。これらのデータは、本発明者らが、ブラシカのmRNAとハイブリダイズしたマイクロアレイの解析から推定する発現値が、アラビドプシスのものと高いヌクレオチドレベルの同一性を有する遺伝子の発現レベルの測定値を表しうるという仮説を支持する。本発明者らは、2つのマイクロアレイとハイブリダイズした同一のブラシカRNAサンプルを比較し、両アルゴリズムを用いて両配列を解析し、各アルゴリズムについてレプリカ間の相互関係を比較することによってRNA検出の再現性を比較した。両ケースの相互関係は極めて高く（0.99）、プローブの排除による再現性の喪失はなかった。したがって、本発明者らは、ブラシカRNAサンプル間の相対的発現値に強く影響を及ぼす、限定されたプローブセットの使用は予測していない（認められなかった）。
【００６５】
検出された17,886個の遺伝子の発現により、3つの別個の発芽前パターンが生じる． この優れた方法を用いることで、発芽前処理が種子発芽率および寿命およびそれらの条件下で発現された遺伝子のパターンにどのように影響を及ぼすかに関して信頼のおける結論を出した。解析に用いたRNAは、ブラシカの種子から抽出し、未処理であるか、発芽率を最適化するために設計された確立された手順に相当する4つの連続処理に付すのいずれかとした。解析では、未処理の種子、54％含水率までの部分水和または「プライミング」によって処理した種子、6％含水率まで乾燥させた種子（プライミングとそれに続く乾燥）およびプライミングによって処理したが、乾燥の代わりに、貯蔵寿命誘導と呼ばれる、加熱での部分脱水に曝した種子（Bruggink, G. T., Ooms J. J. J. and van der Toorn, P.（1999）Induction of longevity in primed seeds. Seed Sci. Res. 9, 49-53, Materials and Methods））。続いて、部分水和し、加熱で部分乾燥し（貯蔵寿命誘導し）、次いで完全に乾燥させた種子のRNAを回収した。
【００６６】
これらの種子処理により、両品種において発芽率および寿命に対して予想された作用がもたらされた。部分水和またはプライミング処理、およびプライミング処理とそれに続く加熱による部分脱水（貯蔵寿命誘導）処理の、発芽にかかる時間に対する作用を調べた。すべての場合で、処理した種子が、未処理よりも早く発芽した。プライミング後の誘導処理は、プライミング単独よりも早さにおいてわずかに大きな増加をもたらした。
【００６７】
未処理の種子の生存度は、両品種において4〜6日後にはその最初の値の半分に低下することが認められた。プライミング処理した種子については、この低下は約2日後に到達された。プライミング後に加熱により部分乾燥された（貯蔵寿命誘導）種子は、未処置の種子と同様の寿命を示した。要約すれば、プライミング処理された種子は、より早く発芽したが、より迅速に変質し、これは加熱による漸進的脱水という貯蔵寿命処理によって逆転した。
【００６８】
遺伝子発現． アラビドプシスのDNAのシグナルの75％未満でアブラナDNAとハイブリダイズするプローブをシグナル（遺伝子発現値）算出から除外する、本明細書に記載したアルゴリズムを用いて、マイクロアレイデータを解析した。次いで、データをフィルターにかけて、検出閾値より低い転写物を排除することによって低レベルのランダム値を除いた。負の対照プローブの変動の係数に基づいて、25というシグナル値が検出性の閾値を表すと考えた。10個の用いたマイクロアレイのうち2つのレプリカデータ点が25というシグナルに到達しなかった遺伝子はいずれも解析から排除した（すべてのプローブが排除されるすべての遺伝子もこのステップで解析から除いた）。アラビドプシスプローブセットを用い、26,367個の遺伝子のうち17,886個の遺伝子が、本発明者らの予備フィルター基準に合致した；本発明者らは、残りの遺伝子は、アブラナ種子では確信を持って検出するのに十分なほど高レベルでは発現されないか、アラビドプシスとブラシカ間でかなり多型であると結論づける。これらの遺伝子すべての発現プロフィールを、遺伝子当たりをベースに、中央値に標準化された値とともに、記載した5つの処理点について図3Aに示す。値は、2つの独立したレプリカマイクロアレイ実験のシグナル値の平均を表す。
【００６９】
これらの遺伝子間において、種子中の検出可能なmRNAレベルで、3つの別個の発現パターンが明らかに現れることがわかった。中央値に中心化したデータを、自己組織化マップを用いてクラスタリングすることで、これら3つの主要なパターンを効率的に分離した。第1の、最大の、7,731転写物の群は、「水和」ステップによって誘導され、乾燥ステップによって比較的変化せず、「漸進的脱水」（貯蔵寿命誘導）ステップによって抑制され、再度乾燥によっては比較的変化しない。この挙動は、水和に対する種子応答の媒介に関与している遺伝子と一致しており、プライミングに対するその応答は、漸進的脱水/誘導処理によって逆転する。この群は、種子において検出される全遺伝子の43％に相当することから、種子水和に対する応答がゲノム規模で明らかに起きる。例えば、黄化実生において調査した転写物の10％が、光に対して強く応じることを示したその他の研究（Tepperman, J. M., Zhu, T., Chang, H. S., Wang, X. and Quail, P. H.（2001）Multiple transcription-factor genes are early targets of phytochrome A signaling. Proc Natl Acad SciU S A. 98, 9437-9442）と比較すると、この結果は、発芽および脱黄化などの初期発生移行の間の種子または実生ゲノムにおける変化の全体的な性質を強調するものである。
【００７０】
MIPS分類システム（http://mips.gsf.de/proj/thal/）を用いて、3つの実験パターンクラスターの各々において、どの機能的クラスのタンパク質が転写物によってコードされているかを調べた。このシステムには、アラビドプシスゲノム中のほとんどの遺伝子の推定される機能カテゴリーを提供するという利点がある。機能カテゴリーを、検出された転写物のすべてに割り当てた。ここで留意すべきは、検出された転写物は、未知のもののパーセンテージの低下（おそらくはこれらの遺伝子の多くは間違って注釈をつけられたか、低レベルで発現している）および代謝遺伝子（十分に特性決定され、高度に発現される群）の割合の増加を除いてゲノムの全体の割合と酷似しているということである。同時に調節される群の各々における各機能カテゴリーの相対量も調べた。水和処理によってアップレギュレートされる遺伝子のクラスター（クラスター1）は翻訳およびタンパク質合成に関与するタンパク質が豊富である（検出された転写物のうち361がこのカテゴリーに入り、それらのうち253がクラスター1中；カイ二乗によってP＝2.5×10-25で有意）。このクラスターでは、エネルギー産生およびタンパク質分解および折り畳みに関与しているタンパク質も過剰に表れた（752中の372の分解および折り畳み、p＝5.4×10-4、246中の118のエネルギー、P＞0.05）。これらの観察結果は、種子が水和されると、プロテアーゼ活性（Muntz, K.（1996）Proteases and proteolytic cleavage of storage proteins in developing and germinating dicotyledonous seeds. J. Exp. Bot. 47, 605-622）およびタンパク質合成（Bray, C. M.（1995）. Biochemical processes during the osmopriming of seeds. In：Kiegel, J. and Galili, G.（eds）Seed development and germination.1st edition, pp767-789. MarcelDekker、New York；Bewley, J. D. and Marcus, A.（1990）Gene expression in seed development and germination. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 38, 165-193）が活性化されるという単一のタンパク質または活性レベルでのこれまでの結果と一致しているが、これらのクラスの遺伝子に対する全体的な作用が見られることを証明している。
【００７１】
クラスター2中の5239個の遺伝子は、水和および脱水工程によってほとんど影響を受けない。したがって、この群の転写物は発芽前処理の作用機序とは直接的な関連はあまりない。にもかかわらず、この群はタンパク質合成構成要素では不十分であり、イオン恒常性に関与する遺伝子およびトランスポゾン転写物の予想される割合よりも高い（種子発芽におけるこれらの転写物の既知の役割の欠如と一致する）。しかし、いくつかの遺伝子の転写は、種子の水和によって影響を受けず、したがって、遺伝子発現の応答は、機能的に盲目な、発現パターンの全体的な変更の結果よりむしろ遺伝子または領域特異的に調節されるということを示すので、このクラスターの存在は有益である。
【００７２】
4916個の遺伝子を含む第3のクラスターは、一般的なMIPS機能カテゴリーのいずれにも強い濃縮を示さないが、一般的MIPSカテゴリーは貯蔵タンパク質を分離しない。この群は、先の2群よりも幾分か少ないタンパク質合成構成要素とより多い植物特異的タンパク質を含む（有意差なし）。このクラスターは、水和処理によって遺伝子のほとんどが強く抑制されるという点で第1のものとほとんど逆の応答パターンを有する。しかしながら、この群の、水和によって抑制される遺伝子はいずれも、漸進的脱水に応じたその後の誘導によって逆転しない。このクラスターの多数の遺伝子変化はわずかにのみ変化するが、いくつかの転写物は1桁より大きな規模で強く水和抑制される場合もある。
【００７３】
アラビドプシスアレイに対して検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを示すすべてのブラシカ遺伝子の発現を特性決定した。本発明者らは、ストリンジェンシーが強力に類似した配列マッチのみを結合可能にする条件下で、25bpのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたアラビドプシスDNAを用いて得られたもののうちブラシカDNA由来シグナルの75％を検出可能と規定した。したがって、ブラシカのうち本明細書において特性決定した遺伝子は、アラビドプシス中の相同分子種とヌクレオチド相同性レベルで密接に対応している。本発明の方法と結びつけた、アラビドプシスゲノムを基に設計されたオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いるブラシカの発現解析は、アブラナ科の種における遺伝子発現の解析にとって有効で価値のあるツールである。
【００７４】
17,886個の検出された転写物のうち12,647個が、発現レベルの上昇または低下によって最初の水和に応じるという結果により、最初の水和に対する種子のゲノムスケールの応答が示される。ゲノム全体の資源の配分のこの膨大な変化は、おそらくは、種子中のあらゆる細胞の代謝の完全な移行を反映している。転写活性のゲノムスケールの変更は、用いた品種または測定技術とは独立している。新規のmRNA（および推定されるタンパク質）合成の真の程度は、細胞中に予め存在する必要な成分での発芽進行ではなく、発芽の初期プロセスを制御していると思われるのがゲノムであるということを示す。本発明者らは、種子寿命に影響を及ぼす主要な因子はおそらくはタンパク質合成および呼吸というエネルギー集約型経路が誘導される程度であろうと結論づける。漸進的脱水は、これらの経路における遺伝子の発現を、未処理の種子にみられるレベルに抑制するのに有効な方法である。しかしながら、これらの経路の誘導は、種子が発芽率の上昇を示すのには必要ではない。発芽率に実質的に影響を及ぼし得る一因子は、貯蔵タンパク質メッセージの量である。この容易に測定される量を用いて、市販の種子に適用される発芽前処理の質および効率を特性決定することができる。
【００７５】
（実施例3）：アラビドプシスにおける天然の変動に対する転写調節の寄与
遺伝子の転写および翻訳の遺伝的制御は、ゲノム進化における重要な要素である。アラビドプシス寄託物間の天然変動の転写的基礎を理解するために、この実施例では、遺伝子発現におけるゲノムワイド変動の研究を示す。同一増殖条件下の種々の器官の8300個の遺伝子のmRNAレベルを、5つの寄託物：Col-0、C24、Ler、WS-2およびNO-0間でモニターした。寄託物間の遺伝子発現の比較性は、異なる寄託物の標的DNAに対して共通配列を共有するプローブセットを選択するGeneChipマイクロアレイとの比較ゲノムハイブリダイゼーションを基に確立した。寄託物間に実質的なゲノム配列変動のない6573のプローブセットを同定し、寄託物特異的遺伝子発現解析に用いた。寄託物対間のこれらの遺伝子の発現パターンの相関解析によって、各寄託物において別個の発現パターンを有する93の高度可塑性遺伝子の群を同定し、このことは異なる寄託物間のこれらの遺伝子の調節機構における変動の存在を示す。トランスポゾン関連タンパク質、キナーゼおよび疾病耐性タンパク質をコードする遺伝子を含む、ゲノムハイブリダイゼーションによって同定されるコード領域に高度の多型を有する遺伝子とは対照的に、この93の遺伝子群の遺伝子は、転写、環境センシング、ストレス応答および一次代謝において機能を有するものを含んでおり、このことは、これらのプロセスに関与する遺伝子はその調節エレメントにヌクレオチド多型を含む場合があり、これが、おそらくはアラビドプシス進化の間の自然淘汰の一次標的である可能性があるということを示唆する。わずかな研究のみが、遺伝子型の分子的研究を表現型のものと関連付けようとした（Streelman, J. T. and Kocher, T. D.（2000）. From phenotype to genotype. Evol. Dev. 2, 166-173）。
【００７６】
本研究の目的は、種々のシロイヌナズナ寄託物間の遺伝子発現の相違を同定し、遺伝子データと組合せて遺伝子発現の相違の原因である調節機構を理解することすることである。既知の遺伝的変動および表現型の変動を有する地理的に異なる集団の大きな収集物、調節およびコード配列の双方を含む利用可能なゲノム情報（Arabidopsis Genome Initiative 2000）、およびGeneChipマイクロアレイなどの利用可能な機能的ゲノムツール（Zhu, T. and Wang, X.（2000）Large-scale profiling of the Arabidopsis transcriptome. Plant Physiol. 124, 1472-1476）のために、かかる研究にアラビドプシスを選択した。この実施例では、アラビドプシスGeneChipマイクロアレイによって検出した、5つのアラビドプシスの寄託物におけるトランスクリプトーム変動および調節進化におけるその影響を報告する。
【００７７】
材料および方法.
植物材料、成長条件およびサンプル処理． 5つのアラビドプシス寄託物：Col-0、C24、WS-2、NO-0およびLerの種子は、アラビドプシス・ストックセンター（Arabidopsis stock center）（ABRC、Columbus、Ohio）から入手した。すべての植物体は、12：12明/暗サイクル下、22℃のコンバイロン（conviron）中で成長させた。RNAは、種々の齢の植物体で収集した、根、葉、花および長角果をはじめ種々の器官から抽出した。ゲノムDNAは、主に葉から抽出した。DNアーゼI消化を用いて、平均サイズが25nt〜150ntにわたるゲノムDNA断片を得た。DNA断片を、Winzelerら（Winzeler, E. A., Richards, D. R., Conway, A. R., Goldstein, A. L., Kalman, S., McCullough, M. J., McCusker, J. H., Stevens, D. A., Wodicka, L., Lockhart, D. J. and Davis, R. W.（1998）. Direct allelic variation scanning of the yeast genome. Science 281, 1194-1197）にしたがって、ターミナルトランスフェラーゼを用いて末端標識した。RNA抽出およびGeneChipマイクロアレイ実験は、Zhuらによって記載されたとおりに実施した（Zhu, T.、Budworth, P., Han, B.、Brown, D., Chang, H. S., Zou, G. and Wang, X.（2001）Toward elucidating the global gene expression patterns of developing Arabidopsis：Parallel analysis of 8300 genes by high-density oligonucleotide probe array. Plant Physiol. Biochem. 39, 221-242）。
【００７８】
データセット収集物、データ処理およびデータ解析． ゲノムDNAハイブリダイゼーションのマイクロアレイ実験をCol-0およびLerについてのみ2連で実施し、他の3種の寄託物についてはしなかった。ゲノムDNAハイブリダイゼーションのマイクロアレイデータを、以下の手順にしたがって処理した。まず、5未満であるシグナルの平均の相違はいずれも5に調整した。Affymetric,Inc.によれば、平均の相違は、パーフェクトマッチプローブおよびミスマッチプローブから得たシグナル間の相違の合計を、プローブ対の全数で除したものとして規定されている。次いで、5つの寄託物のうちいずれか1つにおいて「不在」または「微量」と呼び出された遺伝子を解析から除いた。Col-0およびLerレプリカからのアウトライヤー遺伝子（偽陽性）も除いた。アウトライヤーは、平均の相違が25以上であり、2つの複製間で少なくとも2倍異なる、両レプリカで「存在」と呼び出された遺伝子として規定した。残りの遺伝子については、2つのレプリカの平均をとり、mRNA発現でータの標準化に用いた。
【００７９】
相関解析のための遺伝子を、ゲノムDNAハイブリダイゼーションデータから処理した遺伝子リストから選択した。次いで、少なくとも1つの寄託物由来のすべてのRNAサンプル中で発現が検出できなかった（「不在」または「微量」と呼び出され、平均の相違が25未満である）遺伝子をさらに除いた。これらの遺伝子には、ゲノムDNAが存在していたが、RNAサンプルのいずれでも発現が検出できなかったものが含まれる。すべてのサンプル間で変動はない（フローリング（flooring）後には、発現値はすべて5に等しかった）ので、相関解析への干渉を避けるためにこれらの遺伝子は除いた。選択した遺伝子の発現値を、RNAハイブリダイゼーションからの平均の相違をゲノムハイブリダイゼーションからの平均の相違で除することによって、対応するゲノムDNAに対して標準化した。標準化した値をlog2変換し（log基数2）、相関解析に用いた。さらに、この最初のデータセットを、特定の発達段階の特定の器官について、本発明者らが5種の寄託物由来の5つのRNAサンプルを無作為に入れ替え、したがって、器官、齢、カテゴリー化を保っている順列に用いた。次いで、各遺伝子について、5種の異なる寄託物から10のペアワイズ比較を行い、ピアソン相関係数を算出した。比較した寄託物の所与のペアにおいてr＜0.5であった遺伝子数を算出した。入れ替えたデータを用いて、10の入れ替えデータセットの平均を算出した。
【００８０】
mRNA発現データのクラスタ分析を、相関解析に用いた同一の遺伝子リストで実施した。選択した遺伝子の発現値を、RNAハイブリダイゼーションからの平均の相違をゲノムハイブリダイゼーションからの平均の相違で除することによって、対応するゲノムDNAに標準化した。次いで、すべてのサンプル中の各遺伝子の標準化した発現値をlog2変換し、平均を中心化し、自己組織化マップ、続いて、両遺伝子の完全連鎖階層型クラスタリングおよびをクラスターを用いる実験に付し、Treeviewで可視化した。
【００８１】
GeneChipマイクロアレイデータの確認． C24由来のゲノムDNAを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって寄託物C24から遺伝子13903_at（At3g54050）および17392_s_at（At3g53260）のゲノム配列を得、Col-0由来の遺伝子のコード配列を基にしたプライマーを用いた。次いで、PCR産物を配列決定し、これらの配列を、タックマン（Taqman）アッセイのための遺伝子特異的プライマーおよびプローブの設計に用いた。遺伝子12222_s_at（At20990）、14097_at（At2g47770）、20561_at（At2g46930）、14634_at（At4g27440）、13483_at（At2g25650）、15290_at（At2g20840）、13111_at（At2g38040）、14072_at（At1g67480）、14172_at（At3g54140）、14947_at（At4g37450）、16892_at（At5g45890）、17860_at（At4g27410）、20545_at（At5g27470）のLer配列を、Col-0由来のこれらの遺伝子の全長cDNA配列またはCDSを、TIGR（ftp：//ftp.tigr.org/pub/data/a_thaliana/Ler）から入手可能なLer配列に対してblast検索することによって得た。最高のblastヒットを選択し、Col-0とLerに共通の配列を、タックマンアッセイのための遺伝子特異的プライマーおよびプローブの設計に用いた。定量的RT-PCR（タックマン）アッセイを、これまでに記載されたように、遺伝子特異的プライマーおよびプローブセットを用いてABI Prism 7700（Applied Biosystems、Foster City、CA）で実施した。1：5段階希釈からなる標準曲線を、50ng/μl、10ng/μl、2ng/μl、0.4ng/μ1および0.08ng/μlのRNA濃度で作製した。相対発現レベルを、相関係数が0.99以上の標準曲線と比較することによって補間した。相対発現レベルを、一定レベルで発現された、シロイヌナズナAPX3遺伝子の発現レベルに標準化した。すべての反応は3連で実施した。
【００８２】
結果
寄託物間の遺伝子発現の比較性の確立． 種々の寄託物間の遺伝子発現を比較するために、5つの寄託物、Col-0、C24、Ler、WS-2およびNO-0間で実質的な配列変動のないプローブセットを、ゲノムDNAハイブリダイゼーションによって選択した。種々の寄託物由来のゲノムDNAを断片化し、標識し、アラビドプシスGeneChipマイクロアレイとハイブリダイズした（Winzeler, E. A., Richards, D. R., Conway, A. R., Goldstein, A. L., Kalman, S., McCullough, M. J., McCusker, J. H., Stevens, D. A., Wodicka, L., Lockhart, D. J. and Davis, R. W.（1998）Direct allelic variation scanning of the yeast genome. Science 281, 1194-1197）。プローブセットレベルのハイブリダイゼーションシグナルを、オリゴヌクレオチドプローブセット（プローブセットはほとんどCol-0由来であった）（Zhu, T. and Wang, X.（2000）Large-scale profiling of the Arabidopsis transcriptome. Plant Physiol. 124, 1472-1476）と調べている寄託物由来の標的ゲノムDNA間の配列類似性の指標として用いた。種々の寄託物のプローブセット配列中の実質的な相違は、絶対「呼び出し値」、プローブセット中の陽性プローブ対のパーセンテージを測定するパラメータに基づいて決定した。一遺伝子のプローブセットからの一貫して検出可能なシグナル（すわなち「存在」呼び出し値）は、オリゴヌクレオチドプローブセット配列と調べた標的ゲノムDNA間に実質的な相違がないことことを意味し、一貫して低いシグナル（「不在」呼び出し値）は、オリゴヌクレオチドプローブセット配列と標的DNA間の実質的な配列相違を示唆する。したがって、遺伝子が一寄託物において「存在」と呼び出され、別の寄託物において「不在」と呼び出される場合には、これは2つの寄託物間でのこの遺伝子の配列の実質的な相違を示唆する。寄託物間で実質的に異なっている配列を含むおよそ1000未満のプローブセットを同定し、さらなる転写スキャン解析から排除した。これらの遺伝子のさらなる解析により、その大部分がトランスポゾン関連タンパク質、キナーゼおよび疾病耐性タンパク質をコードしていることが示された。
【００８３】
比較ゲノムハイブリダイゼーション実験の再現性を調べるために、同一ゲノムDNAを、2つの異なるマイクロアレイで平行してハイブリダイズした。2つの反復実験間で遺伝子の小画分のみが、有意な変化のある（2倍より大きい）ハイブリダイゼーションシグナルを示した：Col-0レプリカから0.4％およびLerレプリカから0.2％。これらの結果は、同一GeneChipマイクロアレイを用いたRNA検出についての再現性研究の結果と同様である（Zhu and Wang、2000）。
【００８４】
寄託物間の遺伝子発現プロフィールの比較可能性.
種々の発達段階の種々の器官の転写プロフィールを、以下の戦略を用いて5つの寄託物間で比較した：（1）少なくとも1つのRNAサンプルで発現された遺伝子のみを、さらなる解析のために選択した；（2）マイクロアレイハイブリダイゼーションは、DNAプローブとハイブリダイズしている標的核酸分子間の配列相同性の程度、ならびに標的分子の量を検出するので、各器官の遺伝子の平均の相違をその特定の寄託物のゲノムDNAの平均の相違で除することによって、転写量を対応するゲノムDNAに標準化する。これは、RNAハイブリダイゼーションによって寄託物間で検出された相違が、転写レベルではなくDNA配列レベルの相違によって引き起こされる可能性を排除するためであった；および（3）標準化されたmRNA発現値を用いて、各遺伝子についての寄託物のすべてのありうる対（5つの異なる寄託物を有していたので10対）間のピアソン相関係数を算出し、またクラスタ分析にも用いた（（Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O. and Botstein, D.（1998）Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14863-14868）。
【００８５】
異種ハイブリダイゼーションによるGeneChipマイクロアレイによって検出された遺伝子発現変動を確認するために、寄託物特異的プライマーおよびプローブを用いた定量RT-PCRを実施した。18の異なるサンプルでGeneChipおよび定量RT-PCRによって13909_at（At3g54050）および17932_at（At2g53260）のmRNAレベルの比較を実施し、測定した。全般に、定量RT-PCR結果は、GeneChipマイクロアレイ結果と一致し、寄託物Col-0とC-24間でのこの遺伝子の発現の相違が確認された。しかしながら、マイクロアレイと定量RT-PCRの結果間の相関係数は、13903_atの0.85および17392_atの0.88（ゲノムDNA標準化がなされていないマイクロアレイデータ）から0.91（13903_at）および0.90（17392_at）（ゲノムDNA標準化を施したマイクロアレイデータ）に改善した。この結果は、種々の寄託物の転写解析に用いた本発明者らの解析戦略を支持するものであり、ゲノムDNA標準化により、種々の遺伝的背景のサンプルの転写プロファイリングにおけるDNA配列変動からの干渉が最小になることを示す。
【００８６】
さらに、本発明者らはまた、12個の遺伝子のmRNA発現レベルも確認し、そのうち7個は異なる発現レベルを示さず、そのうち5個は、マイクロアレイ実験から検出された、Lerと比較したCol-0の花の間で相違を示した。定量RT-PCR解析の結果は、ゲノムDNA標準化後にマイクロアレイ実験から得られたデータと全く一致し、このことにより、この戦略が種々の寄託物間での遺伝子発現多型の同定において上手く働くことが確認される。しかしながら、GeneChip実験では有意な相違を示さなかった17142_at、16892_at、17860_atなどのいくつかの遺伝子について、RT-PCRによっては約2倍の相違（17142_at：2.05倍、16892_at：2.17倍、17860_at：2.26倍）が検出され、このことは、RT-PCRが、遺伝子発現における相違の検出という点でGeneChip実験よりも感度が高い可能性があることを示唆する。
【００８７】
種々の段階の種々の器官からの寄託物間の転写プロフィールの全体的な類似性． RNAサンプルのうち少なくとも1つで発現を検出できた6573個の遺伝子の中では、ほとんどの遺伝子（5255）の発現パターンは、少なくとも5のペアワイズ比較において良好に相関しており（r＞0.5）（黄色のバー）、このことは、種々の寄託物のほとんどの遺伝子の発現パターンが類似していることを示す。しかしながら、本発明者らが種々の寄託物の同一器官からのRNAサンプルを無作為に入れ替えた場合には（詳細については材料および方法を参照）、寄託物比較の各ペアについて発現が相関しない遺伝子数が、最初のデータの93という総数から461へと大幅に増加し、このことにより、種々の寄託物の遺伝子発現プロフィールの中での高い相関は、任意の機会では完全には起こらないことが確認された。
【００８８】
標準化した遺伝子発現データを用いたクラスタ分析によって、発現プロフィールに基づいた寄託物間の関係をさらに解析した。遺伝子発現の相違は、同一器官における異なる寄託物中よりも同一寄託物の異なる器官中で大きいという知見によって明らかなように、すべてのサンプル間の全体的な関係によって、寄託物間の発現の相違は小さいことが確認された。維管束植物における2つの主要な進化事象に相当する2つのクラスターが、実験系図から現れた：根および若い実生をはじめとする軸起源器官のクラスターおよび栄養葉、花および長角果（繁殖葉）および関連花序をはじめとする補助的器官のクラスター。軸クラスターは、2つの異なる発達段階、2週および5週の根、ならびに、主に根組織からなる4日齢の実生からなる。補助的器官のクラスターは2つのサブクラスター、栄養葉のクラスターおよび繁殖葉由来の器官からなるクラスターにさらに分割することができる。しかしながら、器官の中では、特に、葉については、変動は発達の相違と寄託物の相違の双方が原因となっている。
【００８９】
発達の際の寄託物特異的遺伝子発現． C24は、タンパク質コード配列および遺伝子発現パターンでは、発達のほとんどの段階の間でCol-0と最も類似していた寄託物であるが、クラスタ分析では、これら2つの寄託物間で後期発達、例えば、11週齢の葉では有意な相違が検出され、これではC24はCol-0ともはやクラスター形成しなかった。C24とCol-0間の寄託物相違に相当する遺伝子を同定するため、およびそれらを同一齢の同一条件下で成長させたこれら2つの登録植物の種々の発達段階の相違を反映している可能性がある遺伝子と区別するために、本発明者らは、C24およびCol-0の2、5および11週齢の葉のゲノムDNA標準化発現データを用いて、Tusherによって開発されたマイクロアレイデータの統計解析（SAM）を用いた（Tusher, V. G., Tibshirani, R. and Chu, G.（2001）Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,5116-21）。ここで、本発明者らは、2、5および11週齢の葉からのサンプルを、3つの生物学的レプリカとして人為的に処理し、Col-0とC24間の相違を比較した。
【００９０】
SAMに基づいて、35個の遺伝子を、C24およびCol-0の葉間で異なって発現する可能性があると同定し、偽発見率は4.9％であった。次いで、これらの遺伝子を、MIPS機能分類にしたがって機能的に分類した。分類されない機能を有する遺伝子に加え、上位3つのカテゴリーは一次代謝、ストレス応答およびシグナル伝達において機能を有する可能性のある遺伝子を含んでいた。さらに、推定転写因子、例えば、ジンクフィンガー転写因子、EREBP-1をコードする5個の遺伝子が、35個の遺伝子のこの群内に含まれていた。さらに、キナーゼ、オーキシン誘導性タンパク質IAA9などのシグナル伝達タンパク質をコードする5個の遺伝子も含まれており、このことは、これら2つの異なる寄託物の区別におけるシグナル伝達経路および対応する転写事象の関与を示唆する。
【００９１】
考察． アラビドプシスGeneChipマイクロアレイを用いて、種々のシロイヌナズナ寄託物間でのmRNA発現の相違を研究した。現在、アラビドプシスの完全なゲノム情報および機能的ゲノム研究のための多数のツール、例えば、GeneChipマイクロアレイは、最もよく用いられる寄託物、Col-0についてのみ利用可能である。しかしながら、Col-0以外の寄託物を用いて多数の遺伝的および分子的研究が行われてきた。他の寄託物を用いる研究におけるゲノム情報およびツールの利用を容易にするために、本発明者らは、異種プローブ-標的ハイブリダイゼーションによってゲノムワイド遺伝子発現プロフィールを解析するための新規戦略を開発した。本発明者らは、ゲノムDNAハイブリダイゼーションシグナルを、RNAハイブリダイゼーションシグナルを標準化するための参照として用い、したがって、遺伝子発現変動から種々の寄託物間の配列変動を差し引いた。このアプローチを用いることで、Col-0以外の寄託物において異なって発現する遺伝子を容易に同定でき、それによって現在のGeneChipマイクロアレイの適用を広げることができる可能性がある。遺伝子発現における天然変動の遺伝的構造を理解するための酵母においてこれまでに報告された研究は、2つの親酵母間で差示的に発現された570個の遺伝子を、1種以上の遺伝子マーカーと関連付け、さらにこれらの遺伝子を2つのカテゴリー、シス作用性モジュレーターとトランス作用性モジュレーターにグループ化した。しかしながら、この研究にはゲノムDNA標準化は用いられなかった。
【００９２】
種々の寄託物の比較ゲノムハイブリダイゼーションのデータによって、本発明の方法を用いる現在利用可能なGeneChipマイクロアレイは、プローブセット配列の少なくとも97％が、本発明者らが調べた5つの寄託物のゲノム由来の遺伝子を検出できたので、Col-0以外のアラビドプシス寄託物の転写プロファイリングに適していることが確認された。ゲノムDNAハイブリダイゼーションより、C24（127すなわち1.5％）、Ler（292すなわち3.4％）、WS-2（202すなわち2.3％）およびNO-0（294すなわち3.4％）において、Col-0とは有意な相違を示す比較的少数の遺伝子のみが観察された。これは、遺伝子コード領域の配列変動は小さいことを示唆する。
【００９３】
要約すれば、本発明者らは、密接に関連した寄託物または種の間の遺伝子発現プロフィールの比較にとっての配列障害を克服するための戦略を開発した。本発明者らはさらに、分子遺伝的研究で最もよく用いられる5つのアラビドプシスの寄託物間で、そのコード領域から選択されたプローブ配列では有意な変動を示さない、6573個の遺伝子のうちの20％に遺伝子発現変動を検出した。この結果は、RT-PCRおよびデータマイニング結果によって確認された。種々のアラビドプシス寄託物間の遺伝子発現変動は、遺伝子コード領域、またはプロモーター領域の変動によって引き起こされ得る。種々の寄託物の大規模遺伝子発現プロファイリングというアプローチを、遺伝子情報と組合せて用いることで、推定遺伝子発現多型を同定し、これらの多型を、おそらくは進化の間に自然淘汰を受けた差示的調節機構と関連付けることが可能である。これはさらに、自然淘汰によるゲノム内の既存のDNAの適応度ならびに遺伝子調節機構の適応度を一定に評価することによって、進化の間のゲノムおよびトランスクリプトームダイナミクスの理解に役立つ可能性がある（Gibson, G.（2002）Microarrays in ecology and evolution：a preview. Mol. Ecol. 11, 17-24）。さらに、種々の寄託物間の表現型の変動は、おそらくは、植物の特定の環境条件への適応に重要である遺伝子の変動を反映しており、分子的表現型の検査のための強力なツールとしてのトランスクリプトーム解析は、遺伝子の変動と環境の間の相互作用を研究するための代替アプローチ（QTL解析に加えて）を提供するはずである。このアプローチは、寄託物間の機能変動を研究し、ひいては、この研究から得られた情報を基に、従来の育種によって価値ある変動を生殖質に導入するために使用できる可能性がある。この研究は、種々の寄託物間で、異なる転写調節機構がゲノムの形成にどのように寄与するかについての理解を深めることによって植物進化ゲノミクスの分野の解明を助けるものである。
【００９４】
本発明の詳細な説明および前記で示した実施例に照らして、本発明のいくつかの態様が達成されることを理解することができる。
【００９５】
本発明は、本発明が関する技術分野の他の当業者に原理および実際の適用を知らせるために、例示および実施例を通じて詳細に記載されているということが理解されるはずである。本発明の特定の策定と方法は、示した特定の実施形態についての記載に限定されるべきではなく、むしろ記載および実施例は、以下の特許請求の範囲およびその均等物の点から考えられるべきである。前記の実施例および記載の中には、本発明が機能しうる方法について何らかの結論を含むものもあるが、本発明者らはそれらの結論および機能に拘束されようとするのではなく、可能性ある解釈として提案しただけである。
【００９６】
示したような本発明の特定の実施形態は、包括的なものまたは本発明を限定するものとして意図されないこと、および当業者には前記の実施例および詳細な説明に照らして、多数の変更、改変および変法が明らかであることはさらに理解されるべきである。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲の趣旨および範囲に入る、すべてのかかる変更、改変および変法を包含するよう意図される。本明細書に記載したすべての参照文献は、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、オリゴプローブについての補正係数を得るための方法のフローチャートである。
【図２】図２は、図１のフローチャートによって得た補正係数を用いた方法のフローチャートである。
【図３】図３は、オリゴプローブについての係数を得て使用するシステムの例示的な実施形態を示すブロック表示である。
【図４】図４は、図１のフローチャートによって得た補正係数を用いる別の方法のフローチャートであり、呼び出しステップを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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