(57)【要約】アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有し、インシュリンおよび／またはインシュリン様増殖因子受容体に結合でき、様々なペプチドライブラリーから同定されたペプチド配列を開示する。本発明はまた、インシュリンおよびインシュリン様増殖因子受容体に存在し、本発明のペプチドに選択的に結合する少なくとも２個の異なる結合部位を同定する。アゴニストとして、本発明のペプチドは内在性ペプチドホルモンを補給または代替する治療薬として開発するために有用となり得る。アンタゴニストペプチドも、治療薬として開発し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の調節方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を調節するために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には式１の配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５が含まれ、式中Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、およびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニンから成る群から選択されるが、ｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない調節方法。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を調節する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｈ２Ｃ−Ａ−Ｈ６（配列番号２２２８）および
ｂ．ＲＰ９（配列番号２２２９）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｓ１７５（配列番号２２４８）および
ｂ．１２−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２５０）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｃ１（配列番号２２３０）
ｂ．Ｃ１ＫＫ（配列番号２２６６）および
ｃ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｇ３３（配列番号２２４９）および
ｂ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項５に記載の方法。
【請求項８】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の減少方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を減少させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には式２の配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３が含まれ、式中、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであり、ｉｉ）前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインをさらに含むが、ｉｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない減少方法。
【請求項９】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を減少させる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ３３−ＩＧＦ（配列番号２２３２）、
ｂ．ＲＰ６ＫＫ（配列番号２２３３）、
ｃ．ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２３４）、
ｄ．ＲＰ４３（配列番号２２３５）、
ｅ．ＲＰ３３−ＩＧＦ（配列番号２２６６）および
ｆ．ＲＰ６（配列番号２２３６）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の増加方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を増加させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には式６の配列、Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０X７１Ｘ７２X７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１が含まれ、式中、Ｘ６２、Ｘ６５、Ｘ６６、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０およびＸ８１は任意のアミノ酸であり、Ｘ６３はロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンから成る群から選択され、Ｘ７０およびＸ７４はバリン、イソロイシン、ロイシン、およびメチオニンから成る群から選択され、Ｘ６４はアスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択され、Ｘ６７はトリプトファンで、Ｘ７５はチロシンおよびトリプトファンから成る群から選択され、Ｘ７２およびＸ７９はシステインであるが、ｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない増加方法。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を増加させる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｄ８１５（配列番号２２５２）および
ｂ．ＲＰ３１−ＩＧＦ（配列番号２２５３）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の調節方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を調節するために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には式１の少なくとも２個の部分配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５が含まれ、式中Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、またはセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニンから成る群選択されるが、ｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない調節方法。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を調節する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ９−ＲＰ９（Ｃ−Ｃ、配列番号２２３７）、
ｂ．ＲＰ９−ＲＰ９（配列番号２２３８）および
ｃ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ９（配列番号２２３９）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列は、インシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列、ＲＰ９−１２−ＲＰ９（配列番号２２５４）を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノ酸が、少なくとも３個のアミノ酸によって隔てられた２個以上のシステインを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列は、インシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列、Ｇ３３−ＲＰ９（配列番号２２４０）を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｄ１１２−１２−Ｄ１１２（配列番号２２５５）および
ｂ．Ｇ３３−６−Ｇ３３（配列番号２２５６）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の減少方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を減少させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には、式２の少なくとも２個の部分配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３が含まれ、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであり、ｉｉ）前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインをさらに含むが、ｉｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない減少方法。
【請求項２２】
前記アミノ酸配列は、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を減少させる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アミノ酸配列は、インシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列、ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２４１）を含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の調節方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を調節するために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には、式１の部分配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５および式２の部分配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３が含まれ、式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、およびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンから成る群から選択され、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであり、ｉｉ）前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、ｉｉｉ）前記部分配列は式１から式２へと方向が定められ、ｉｖ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない調節方法。
【請求項２５】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を調節する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アミノ酸配列は、インシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列、ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）および
ｂ．Ｄ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２５７）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の増加方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を増加させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には、式１の部分配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５および式２の部分配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３が含まれ、式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、およびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンから成る群から選択され、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであり、ｉｉ）前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、ｉｉｉ）前記部分配列は式１から式２へと方向が定められ、ｉｖ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない増加方法。
【請求項２９】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択された哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を増加させる請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２（配列番号２２５８）および
ｂ．ＲＰ６−ＲＰ９（配列番号２２５９）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の減少方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を減少させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には、式１の部分配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５および式６の部分配列、Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１が含まれ、式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンから成る群から選択され、Ｘ６２、Ｘ６５、Ｘ６６、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０およびＸ８１は任意のアミノ酸であり、Ｘ６３はロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンから成る群から選択され、Ｘ７０およびＸ７４はバリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンから成る群から選択され、Ｘ６４はアスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択され、Ｘ６７はトリプトファンで、Ｘ７５はチロシンおよびトリプトファンから成る群から選択され、Ｘ７２およびＸ７９はシステインであり、ｉｉ）前記部分配列は式１から式６へと方向が定められ、ｉｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない減少方法。
【請求項３２】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を減少させる請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記アミノ酸配列は、インシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列、Ｇ３３−Ｄ８Ｂ１２（配列番号２２４３）を含む請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の調節方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を調節するために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、ｉ）前記アミノ酸配列には、式１の部分配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５および式６の部分配列、Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１が含まれ、式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンから成る群から選択され、Ｘ６２、Ｘ６５、Ｘ６６、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０およびＸ８１は任意のアミノ酸であり、Ｘ６３はロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンから成る群から選択され、Ｘ７０およびＸ７４はバリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンから成る群から選択され、Ｘ６４はアスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択され、Ｘ６７はトリプトファンであり、Ｘ７５はチロシンおよびトリプトファンから成る群から選択され、Ｘ７２およびＸ７９はシステインであり、ｉｉ）前記部分配列は式６から式１へと方向が定められ、ｉｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない調節方法。
【請求項３５】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を調節する請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アミノ酸配列は、インシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列、Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（配列番号２２４４）を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（配列番号２２４４）および
ｂ．Ｄ８１５−ＲＰ９（配列番号２２６０）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の減少方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を減少させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｈ２Ｃ−Ａ−Ｈ６（配列番号２２２８）、
ｂ．ＲＰ９（配列番号２２２９）、
ｃ．Ｃ１（配列番号２２３０）、
ｄ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）、
ｅ．ＲＰ３３−ＩＧＦ（配列番号２２３２）、
ｆ．ＲＰ６ＫＫ（配列番号２２３３）、
ｇ．ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２３４）、
ｈ．ＲＰ４３（配列番号２２３５）、
ｉ．ＲＰ６（配列番号２２３６）、
ｊ．ＲＰ５２（配列番号２２４５）、
ｋ．ＲＰ５４（配列番号２２４６）、
ｌ．ＲＰ３３Ｋ−ＩＧＦ（配列番号２２６６）、
ｍ．Ｃ１ＫＫ（配列番号２２６６）および
ｎ．ＲＰ５６(配列番号２２４７)
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列を含む減少方法。
【請求項３９】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の減少方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を減少させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ９−ＲＰ９（Ｃ−Ｃ、配列番号２２３７）、
ｂ．ＲＰ９−ＲＰ９（Ｃ−Ｎ、配列番号２２３８）、
ｃ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ９（配列番号２２３９）、
ｄ．Ｇ３３−ＲＰ９（配列番号２２４０）、
ｅ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２４１）、
ｆ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）、
ｇ．Ｇ３３−Ｄ８Ｂ１２（配列番号２２４３）および
ｈ．Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（配列番号２２４４）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列を含む減少方法。
【請求項４０】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の増加方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を増加させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｓ１７５（配列番号２２４８）、
ｂ．Ｇ３３（配列番号２２４９）、
ｃ．１２−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２５０）、
ｄ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）、
ｅ．Ｄ８１５（配列番号２２５２）、
ｆ．ＲＰ３１−ＩＧＦ（配列番号２２５３）、
ｇ．ＲＰ４８（配列番号２２６１）および
ｈ．ＲＰ６０（配列番号２２６２）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む増加方法。
【請求項４１】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞におけるインシュリン様増殖因子受容体活性の増加方法であって、前記細胞をインシュリン様増殖因子受容体の活性を増加させるために十分な量のあるアミノ酸配列と接触させることを含み、前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ９−１２−ＲＰ９（配列番号２２５４）、
ｂ．Ｄ１１２−１２−Ｄｌ１２（配列番号２２５５）、
ｃ．Ｇ３３−６−Ｇ３３（配列番号２２５６）、
ｄ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）、
ｅ．Ｄ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２５７）、
ｆ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）、
ｇ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２（配列番号２２５８）、
ｈ．ＲＰ６−ＲＰ９（配列番号２２５９）、
ｉ．Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（配列番号２２４４）、
ｊ．ＲＰ６−Ｌ−Ｄ８Ｂ１２（配列番号２２６３）、
ｋ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３１−ＩＧＦ（配列番号２２６４）、
ｌ．ＲＰ３１−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２６５）および
ｍ．Ｄ８１５−ＲＰ９（配列番号２２６０）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む増加方法。
【請求項４２】
式１の配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含むアミノ酸配列を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子であって、式中Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンから成る群から選択され、前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインをさらに含むが、但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない調節因子。
【請求項４３】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を調節する請求項４２に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項４４】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｃ１（配列番号２２３０）、
ｂ．Ｃ１ＫＫ（配列番号２２６６）および
ｃ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列を含む請求項４３に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項４５】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｇ３３（配列番号２２４９）および
ｂ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項４３に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項４６】
Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであるように式２配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含むアミノ酸配列を含むインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニストであって、前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではないアンタゴニスト。
【請求項４７】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を減少させる請求項４６に記載のインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト。
【請求項４８】
前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ３３−ＩＧＦ（配列番号２２３２）、
ｂ．ＲＰ６ＫＫ（配列番号２２３３）、
ｃ．ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２３４）、
ｄ．ＲＰ４３（配列番号２２３５）、
ｅ．ＲＰ３３Ｋ−ＩＧＦ（配列番号２２６６）および
ｆ．ＲＰ６（配列番号２２３６）
から成る群から選択される配列を含む請求項４７に記載のインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト。
【請求項４９】
少なくとも２個の式１の部分配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含むアミノ酸配列を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子であって、式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンから成る群から選択され、前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない調節因子。
【請求項５０】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を調節する請求項４９に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項５１】
前記アミノ酸配列は、インシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列、Ｇ３３−ＲＰ９（配列番号２２４０）を含む請求項５０に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項５２】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｄ１１２−１２−Ｄ１１２（配列番号２２５５）および
ｂ．Ｇ３３−６−Ｇ３３（配列番号２２５６）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項５０に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項５３】
少なくとも２個の式２の部分配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含むアミノ酸配列を含むインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニストであって、式中、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであり、前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではないアンタゴニスト。
【請求項５４】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を減少させる請求項５３に記載のインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト。
【請求項５５】
アミノ酸配列は、ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２４１）を含む請求項５４に記載のインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト。
【請求項５６】
式１の部分配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５および式２の部分配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含むアミノ酸配列を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子であって、式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンから成る群から選択され、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであり、前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、前記部分配列は式１から式２へと方向が定められ、但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではない調節因子。
【請求項５７】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を調節する請求項５６に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項５８】
前記アミノ酸配列は、インシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト配列、ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）を含む請求項５７に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項５９】
前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）および
ｂ．Ｄ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２５７）
から成る群から選択されるインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト配列を含む請求項５７に記載のインシュリン様増殖因子受容体調節因子。
【請求項６０】
式１の部分配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５および式２の部分配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含むアミノ酸配列を含むインシュリン様増殖因子受容体アゴニストであって、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンから成る群から選択され、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであり、前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、前記部分配列は式２から式１へと方向が定められ、但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではないアゴニスト。
【請求項６１】
前記アミノ酸配列が、乳癌細胞、膵臓癌細胞、および骨髄細胞から成る群から選択される哺乳類細胞においてインシュリン様増殖因子受容体活性を調節する請求項６０に記載のインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト。
【請求項６２】
前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２（配列番号２２５８）および
ｂ．ＲＰ６−ＲＰ９（配列番号２２５９）
から成る群から選択される配列を含む請求項６１に記載のインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト。
【請求項６３】
ａ．Ｈ２Ｃ−Ａ−Ｈ６（配列番号２２２８）、
ｂ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）、
ｃ．ＲＰ３３−ＩＧＦ（配列番号２２３２）、
ｄ．ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２３４）、
ｅ．ＲＰ４３（配列番号２２３５）、
ｆ．Ｇ３３−ＲＰ９（配列番号２２４０）、
ｇ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２４１）、
ｈ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）、
ｉ．Ｇ３３−Ｄ８Ｂ１２（配列番号２２４３）、
ｊ．Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（配列番号２２４４）、
ｋ．ＲＰ５２（配列番号２２４５）、
１．ＲＰ５４（配列番号２２４６）、
ｍ．ＲＰ３３Ｋ−ＩＧＦ（配列番号２２６６）および
ｎ．ＲＰ５６（配列番号２２４７）
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むインシュリン様増殖因子受容体アンタゴニスト。
【請求項６４】
ａ．１２−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２５０）、
ｂ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）、
ｃ．ＲＰ３１−ＩＧＦ（配列番号２２５３）、
ｄ．Ｄ１１２−１２−Ｄｌ１２（配列番号２２５５）
ｅ．Ｇ３３−６−Ｇ３３（配列番号２２５６）、
ｆ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）、
ｇ．Ｄ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２５７）、
ｈ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２（配列番号２２５８）、
ｉ．ＲＰ６−ＲＰ９（配列番号２２５９）、
ｊ．Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（配列番号２２４４）、
ｋ．Ｄ８１５−ＲＰ９（配列番号２２６０）、
ｌ．ＲＰ４８（配列番号２２６１）および
ｍ．ＲＰ６０（配列番号２２６２）
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むインシュリン様増殖因子受容体アゴニスト。
【請求項６５】
ａ．インシュリン様増殖因子受容体をあるアミノ酸配列と接触させて複合体を形成することであって、ｉ）前記アミノ酸配列は、式１の配列、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５を含み、式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ５はフェニルアラニンおよびチロシンから成る群から選択され、Ｘ３はアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシンおよびセリンから成る群から選択され、Ｘ４は、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンから成る群から選択され、ｉｉ）前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、ｉｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではなく、
ｂ．（ａ）の複合体を化合物ライブラリーと接触させること、
ｃ．（ａ）の複合体を切断する化合物を同定すること、および
ｄ．前記化合物がインシュリン様増殖因子受容体にアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すかどうかを判定し、この活性によってインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定が示されること
を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定方法。
【請求項６６】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｃ１（配列番号２２３０）、
ｂ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）、
ｃ．Ｇ３３（配列番号２２４９）、
ｄ．Ｃ１ＫＫ（配列番号２２６６）および
ｅ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）
から成る群から選択される配列を含む請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ａ．インシュリン様増殖因子受容体をあるアミノ酸配列と接触させて複合体を形成することであって、ｉ）前記アミノ酸配列は、式２の配列、Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３を含み、式中、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３はロイシンであり、ｉｉ）前記アミノ酸配列が、少なくとも３個のアミノ酸で隔てられた２個以上のシステインを含み、ｉｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではなく、
ｂ．（ａ）の複合体を化合物ライブラリーと接触させること、
ｃ．（ａ）の複合体を切断する化合物を同定すること、および
ｄ．前記化合物がインシュリン様増殖因子受容体でアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すかどうかを判定し、この活性によってインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定が示されること
を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定方法。
【請求項６８】
前記アミノ酸配列は、
ａ．ＲＰ３３−ＩＧＦ（配列番号２２３２）、
ｂ．ＲＰ６ＫＫ（配列番号２２３３）、
ｃ．ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２３４）、
ｄ．ＲＰ４３（配列番号２２３５）、
ｅ．ＲＰ３３Ｋ−ＩＧＦ（配列番号２２６６）および
ｆ．ＲＰ６（配列番号２２３６）
から成る群から選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ａ．インシュリン様増殖因子受容体をあるアミノ酸配列と接触させて複合体を形成することであって、ｉ）前記アミノ酸配列は、式６の配列、Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１を含み、式中、Ｘ６２、Ｘ６５、Ｘ６６、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ７８、Ｘ８０およびＸ８１は任意のアミノ酸であり、Ｘ６３はロイシン、イソロイシン、メチオニンおよびバリンから成る群から選択され、Ｘ７０およびＸ７４はバリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンから成る群から選択され、Ｘ６４はアスパラギン酸およびグルタミン酸から成る群から選択され、Ｘ６７はトリプトファンであり、Ｘ７５はチロシンまたはトリプトファンから成る群から選択され、Ｘ７２およびＸ７９はシステインであり、ｉｉ）但し、前記アミノ酸配列はインシュリン、インシュリン様増殖因子、抗インシュリン受容体抗体、抗インシュリン様増殖因子受容体抗体、またはそれらの断片ではなく、
ｂ．（ａ）の複合体を化合物ライブラリーと接触させること、
ｃ．（ａ）の複合体を切断する化合物を同定すること、および
ｄ．前記化合物がインシュリン様増殖因子受容体にアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すかどうかを判定し、この活性によってインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定が示されること
を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定方法。
【請求項７０】
前記アミノ酸配列は、
ａ．Ｄ８１５（配列番号２２５２）および
ｂ．ＲＰ３１−ＩＧＦ（配列番号２２５３）
からなる群から選択される配列を含む請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ａ．インシュリン様増殖因子受容体をあるアミノ酸配列と接触させて複合体を形成すること、
ｂ．（ａ）の複合体を化合物ライブラリーと接触させること、
ｃ．（ａ）の複合体を切断する化合物を同定すること、および
ｄ．前記化合物がインシュリン様増殖因子受容体にアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すかどうかを判定し、この活性によってインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定が示されること
を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定方法であって、前記アミノ酸配列は
ａ．Ｈ２Ｃ−Ａ−Ｈ６（配列番号２２２８）、
ｂ．ＲＰ９（配列番号２２２９）、
ｃ．Ｃ１（配列番号２２３０）、
ｄ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）、
ｅ．ＲＰ３３−ＩＧＦ（配列番号２２３２）、
ｆ．ＲＰ６ＫＫ（配列番号２２３３）、
ｇ．ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２３４）、
ｈ．ＲＰ４３（配列番号２２３５）、
ｉ．ＲＰ６（配列番号２２３６）、
ｊ．ＲＰ９−ＲＰ９（Ｃ−Ｃ、配列番号２２３７）、
ｋ．ＲＰ９−ＲＰ９（Ｃ−Ｎ、配列番号２２３８）、
ｌ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ９（配列番号２２３９）、
ｍ．Ｇ３３−ＲＰ９（配列番号２２４０）、
ｎ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２４１）、
ｏ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）、
ｐ．Ｇ３３−Ｄ８Ｂ１２（配列番号２２４３）、
ｑ．Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（配列番号２２４４）、
ｒ．ＲＰ５２（配列番号２２４５）、
ｓ．ＲＰ５４（配列番号２２４６）、
ｔ．ＲＰ３３Ｋ−ＩＧＦ（配列番号２２６６）、
ｕ．Ｃ１ＫＫ（配列番号２２６６）および
ｖ．ＲＰ５６（配列番号２２４７）
から成る群から選択される配列を含む方法。
【請求項７２】
ａ．インシュリン様増殖因子受容体をアミノ酸配列と接触させて複合体を形成すること、
ｂ．（ａ）の複合体を化合物ライブラリーと接触させること、
ｃ．（ａ）の複合体を切断する化合物を同定すること、および
ｄ．前記化合物がインシュリン様増殖因子受容体にアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すかどうかを判定し、この活性によってインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定が示されること
を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定方法であって、前記アミノ酸配列は
ａ．Ｓ１７５（配列番号２２４８）、
ｂ．Ｇ３３（配列番号２２４９）、
ｃ．１２−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２５０）、
ｄ．Ｌ−ＲＰ９ｅｘ（配列番号２２３１）、
ｅ．Ｄ８１５（配列番号２２５２）、
ｆ．ＲＰ３１−ＩＧＦ（配列番号２２５３）、
ｇ．ＲＰ９−１２−ＲＰ９（配列番号２２５４）、
ｈ．Ｄ１１２−１２−Ｄｌ１２（配列番号２２５５）、
ｉ．Ｇ３３−６−Ｇ３３（配列番号２２５６）、
ｊ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）、
ｋ．Ｄ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２５７）、
ｌ．ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（配列番号２２４２）、
ｍ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２（配列番号２２５８）、
ｎ．ＲＰ６−ＲＰ９（配列番号２２５９）、
ｏ．Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（配列番号２２４４）、
ｐ．Ｄ８１５−ＲＰ９（配列番号２２６０）、
ｒ．ＲＰ４８（配列番号２２６１）、
ｓ．ＲＰ６−Ｌ−Ｄ８Ｂ１２（配列番号２２６３）、
ｔ．ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３１−ＩＧＦ（配列番号２２６４）、
ｕ．ＲＰ３１−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（配列番号２２６５）および
ｖ．ＲＰ６０（配列番号２２６２）
から成る群から選択される配列を含む方法。
【請求項７３】
ａ．インシュリン様増殖因子受容体に結合するあるアミノ酸配列を単離するために、アミノ酸配列のライブラリーをスクリーニングすることであって、前記ライブラリーは式１、式２および式６から成る群から選択される少なくとも１種の式配列を含むペプチド配列から誘導され、
ｂ．（ａ）で単離したアミノ酸配列が、ＦＤＣ−Ｐ２、ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａから成る群から選択されるインシュリン様増殖因子応答性の細胞のインシュリン様増殖因子受容体にアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示すかどうかを判定することであって、この活性によってインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定が示されること
を含むインシュリン様増殖因子受容体調節因子の同定方法。
【請求項７４】
インシュリン様増殖因子応答性の哺乳類細胞の生存を高める方法であって、前記細胞の生存を高めるために十分な量のあるアミノ酸配列に前記細胞を接触させることを含み、前記アミノ酸配列は式１、式２および式６から成る群から選択された少なくとも１種の式配列を含むインシュリン様増殖因子受容体アゴニストである方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホルモン受容体の活性化または阻害の分野に関する。より具体的には、本発明はインシュリンまたはインシュリン様増殖因子受容体にアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる分子構造、特にペプチドの同定に関する。本発明はまた、公知の構造から有用な分子モデルを得る分子モデリングの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、１９９８年９月２日出願の米国特許出願番号０９／１４６１２７号の一部継続出願である２０００年３月２９日出願の米国特許出願番号０９／５３８０３８号の一部継続出願である２００１年９月２４日出願の米国特許出願番号０９／９６２７５６号の一部継続出願で、全て本明細書に全体を参考として援用した。
【０００３】
インシュリンは代謝可能な増殖促進ホルモンで、グルコース、タンパク質および脂質の代謝、並びにＲＮＡおよびＤＮＡ合成を刺激するように細胞に働きかける。インシュリンのよく知られた効果は、グルコースの体内濃度の制御である。この効果は主に肝臓、脂肪および筋肉組織で発揮される。肝臓では、インシュリンはグルコースのグリコーゲンへの取り込みを刺激し、グルコースの産生を阻害する。筋肉および脂肪組織では、インシュリンはグルコースの取り込み、貯蔵、および代謝を刺激する。糖尿病を発症した集団では、非常に一般的にグルコース利用の不足が生じている。
【０００４】
インシュリンは、特異的細胞表面受容体、インシュリン受容体（ＩＲ）に結合することによって標的細胞にシグナル伝達を開始する。この結合によって、ＩＲの細胞外ドメインに構造的変化が引き起こされ、細胞膜に伝えられ、受容体のチロシンキナーゼ活性の活性化が生じる。次に、これによって、ＩＲのチロシンキナーゼの自己リン酸化と、ホスホイノシトール−３−キナーゼ、Ｒａｓ  ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、およびホスホリパーゼＣγなどのＳＨ２ドメインを含有する可溶性エフェクター分子のＩＲへの結合が引き起こされる（Lee and Pilch, 1994, Am. J. Physiol. 266:C319-C334）。
【０００５】
インシュリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）は、組織増殖および修復の多くの側面に関与する１本鎖の小タンパク質（ＭＷ＝７５００Ｄａ）である。インシュリンと大きさ、配列、および構造が同一であるが、ＩＲに対する親和性が１００〜１０００倍低い（Mynarcik等、1997, J. Biol. Chem. 272:18650-18655）。ＩＧＦ−１ｍＲＮＡは、多くの組織で検出することができるが、環状ＩＧＦ−１の大部分は、成長ホルモンによって刺激された後肝臓で産生される（Butt等、1999, Immunol. Cell Biol 77:256-262）。機能的に、ＩＧＦ−１は細胞の分裂促進因子および抗アポトーシス因子として作用するようである。
【０００６】
最近の研究では、様々な疾患状態における内因性ＩＧＦ−１の役割が分析されてきた。ＩＧＦ−１はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で正常および癌の前立腺細胞の増殖を促進することがいくつかの報告によって示された（Angelloz-Nicoud and Binoux, 1995, Endocrinol 136:5485-5492; Figueroa等、1995, J. Clin. Endocrinol. Metab. 80:3476-3482; Torring等、1997, J. Urol. 158:222-227）。ＩＧＦ−１血清濃度の上昇は前立腺癌の危険性の増大に関連することが示されており、前立腺特異的抗原よりも発症の早期前兆となり得る（ＰＳＡ; J.M. Chan等、1998, Science 279:563-566）。遊離ＩＧＦ−１の血清濃度は、ＩＧＦ−１に結合してＩＧＦ−１Ｒとの相互作用を妨害するＩＧＦ結合性タンパク質（ＩＧＦＢＰ）の存在によって制御される（C.A. Conover, 1996, Endocr. J. 43S:S43-S48; Rajaram等、1997, Endocr. Rev. 18:801-831に概略されている）。ＰＳＡはＩＧＦＢＰ−３を切断するプロテアーゼで、血清中の遊離ＩＧＦ−１の増加を引き起こすことが示された（P. Cohen等、1992, J. Clin. Endocrinol. Metab. 75:1046-1053; P. Cohen等、1994, J. Endocrinol. 142:407-415; H. Lilja, 1995, Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 220:47-56）。この発見と一致して、環状ＩＧＦ−１の濃度が高く、ＩＧＦＢＰ−３の濃度が低い人では、結腸癌を発症する危険性が高いことが発見された（J. Ma等、1999, J. Natl. Cancer Instit. 91:620-625）。最近の研究ではまた、ＩＧＦ−１濃度と卵巣癌の関係が示された。
【０００７】
高濃度のＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒと乳癌との間にもまた関係があるようである（L.C. Happerfield等、1997, J. Pathol. 183:412-417）。環状ＩＧＦ−１と閉経前の女性の乳癌との間に正の相関が認められた（S.E. Hankinson等、 1998, Lancet 351:1393-1396）。乳癌患者の予後の悪さは、ＩＧＦ−１Ｒ陽性のエストロゲン受容体（ＥＲ）陰性細胞の発現と相関していた（A.A. Butler等、1998, Cancer Res. 58:3021-3027）。近年、研究者等によっていくつかの乳癌細胞株でハイブリッドＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ受容体が確認された（G. Pandini等、1999, Clin. Cancer Res. 5:1935-1944; E.M. Bailyes等、1997, Biochem. J. 327(Pt 1):209-215、以下参照）。このデータによって、これらのハイブリッドは機能的ＩＧＦ−１Ｒのような挙動をし、乳癌におけるＩＧＦ−１シグナル伝達に主要な役割を果たすことが示された。
【０００８】
Ｉ型糖尿病（Carroll等、1997, Diabetes 46:1453-1458; Crowne等、1998, Metabolism 47:31-38）、萎縮性側索硬化症（Lai等、1997, Neurology 49:1621-1630）、および糖尿病性運動神経障害（Apfel and Kessler, 1996, CIBA Found. Symp. 196:98-108）を含めたいくつかの疾患の治療における組換えヒトＩＧＦ−１の使用についてまた、臨床的研究が行われてきた。骨粗鬆症（Canalis, 1997, Bone 21:215-216）、免疫変調（Clark, 1997, Endocr. Rev. 18:157-179）、およびネフローゼ症候群（Feld and Hirshberg, 1996, Pediatr. Nephrol. 10:355-358）などのその他の治療にＩＧＦ−１を使用できる可能性についても研究中である。明らかに、ＩＧＦ−１Ｒ活性は多くの疾患状態に関係しており、ＩＧＦ−１アゴニストおよびアンタゴニストは臨床に適用できる可能性があることを示唆している。
【０００９】
インシュリンおよびＩＧＦ−１はいずれも、他の領域の中で、近接したＡ、Ｂ、およびＣペプチド領域を含む前駆体タンパク質として発現し、ＣペプチドはＡおよびＢペプチドを連結する介在ペプチドである。成熟インシュリン分子は、ジスルフィド結合によって連結したＡ鎖およびＢ鎖から成り、連結するＣペプチドは翻訳後のプロセシングで除去された。ＩＧＦ−１は、より小さなＣペプチド並びにＡ鎖のＣ末端に小さなＤ延長部分を保持しており、成熟ＩＧＦ−１はインシュリンよりもやや大きくなっている（Blakesley, 1996）。ヒトＩＧＦ−１のＣ領域は、ＩＧＦ−１Ｒに対して高い親和性で結合するために不可欠である（Pietrzkowski等、1992, Cancer Res. 52(23):6447-51）。具体的に、この領域内に位置するチロシン３１は、高い親和性の結合にとって不可欠である。さらに、ＩＧＦ−１のＤドメインが欠失すると、変異ＩＧＦ−１のＩＲへの結合親和性が増大し、一方ＩＧＦ−１Ｒへの親和性が減少する（Pietrzkowski等、1992）。この２種類のホルモンのさらなる違いは、インシュリンと違ってＩＧＦ−１は自己会合が非常に弱く、６量体にならないことである（De Meyts, 1994）。
【００１０】
ＩＧＦ−１およびインシュリンは、ＩＧＦ−１Ｒおよび１Ｒに競合して交差反応する（L. Schaffer, 1994, Eur. J. Biochem. 221:1127-1132）。さらに、全体のアミノ酸同一性は４５％であるにもかかわらず、インシュリンおよびＩＧＦ−１は互いの受容体に弱く結合するのみである。非同族受容体に対する各ペプチドの親和性は同族受容体よりも約３桁低い（Mynarcik等、1997, J. Biol. Chem. 272:18650-18655）。この結合親和性の差は、アミノ酸およびリガンド特有の３次構造に関与する特有のドメインの差によって一部説明することができる（Blakesley等、1996, Cytokine Growth Factor Rev. 7(2):153-9）。
【００１１】
ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲは、成長因子受容体のチロシンキナーゼ受容体スーパーファミリーの関連因子である。他のファミリー因子はインシュリン関連受容体（ＩＲＲ）であるが、天然のリガンドは知られていない。ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲはいずれも、ジスルフィド結合ヘテロテトラマーを形成する２個のαサブユニットおよび２個のβサブユニットを含む（β−α−α−β）。これらの受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、１個の膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼ活性を示す細胞質ドメインを備えている。細胞外ドメインは、完全なαサブユニットおよびβサブユニットのＮ末端の一部から成り、一方βサブユニットの細胞内部分はチロシンキナーゼドメインを含有する。その他のチロシンキナーゼ受容体とは対照的に、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＲおよびＩＲＲはジスルフィド結合２量体として細胞表面に存在し、細胞シグナル伝達には受容体のオリゴマー化よりもドメインの再編成の方が必要である（Adams等、2000, Cell. Mol. Life Sci. 57:1050-1093; Garrett等、1998, Nature 394:395-399; Frasca等、1999, Mol. Cell Biol. 19: 3278-3288; De Meyts等、1994, Hormone Res. 42:152-169）。さらに、インシュリンおよび（１個のαサブユニットおよび１個のβサブユニットを含む）ＩＧＦ−１半受容体は、ヘテロ２量体化してＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒハイブリッドを形成することができる（(M.A. Soos等、1990, Biochem. J. 270:383-390; J. Kasua等、1993, Biochemistry 32:13531-13536; B.L. Seely等、1995, Endocrinology 136:1635-1641）。
【００１２】
多くの細胞において、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒハイブリッドは最も一般的な受容体サブタイプである（Bailyes等、1997, Biochem. J. 327(pt.1):209-215）。ヒト組織において、ハイブリッドに組み込まれるＩＧＦ−１Ｒ全体の割合は、４０％と６０％との間で変化する（M. Federici等、1997, Mol. Cell. Endocrin. 129(2):121-6）。ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒハイブリッドはまた、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの過剰発現の結果としてヒト癌細胞で過剰発現する（Pandini等、1999, Clin. Cancer Res. 5:1935-1944; A. Belfiore等、1999, Biochemie, 81(4):403-7; V. Papa等、1990, J. Clin. Invest. 86:1503-1510; V. Papa等、1993, Cancer Res. 53:3736-3740）。特に、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒハイブリッド濃度の増加は、乳癌細胞株および乳癌組織標本で認められた（Pandini等、1999, Clin. Cancer Res. 5:1935-1944）。同様に、高濃度のＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒハイブリッドが甲状腺癌標本および細胞株に認められた（A. Belfiore等、1999, Biochemie, 81(4):403-7)。機能について研究したところ、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒハイブリッドは主にＩＧＦ−１によって活性化されることが示された（M.A. Soos等、1993, Biochem. J. 290(pt.2):419-426; A.L. Frattali等、1993, J. Biol. Chem. 268:7393-7400）。したがって、ＩＲ／ＩＧＦ−１ＲハイブリッドはＩＧＦ−１の他の結合部位をもたらし、それによってこの因子に対する細胞の感受性を高めることが示唆された（Bailyes等、1997, Biochem. J. 327(pt.1):209-215;Pandini等、1999, Clin. Cancer Res. 5:1935-1944; A. Belfiore等、1999, Biochemie, 81(4):403-7）。
【００１３】
ＩＲは、（グリコシル化の程度に応じて）分子量３５０〜４００ｋＤａの糖タンパク質である。これは、単一のポリペプチド鎖として合成され、タンパク質分解によって切断され、ジスルフィド結合モノマーα−βインシュリン受容体が生成される。２個のα−βモノマーは、αサブユニットの間でジスルフィド結合によって結合して、受容体の２量体型を形成する（β−α−α−β型構造）。αサブユニットは７２３個のアミノ酸から成り、システインの豊富な領域（アミノ酸１５６〜３１２）によって２個の大きな相同ドメイン、Ｌ１（アミノ酸１〜１５５）およびＬ２（アミノ酸３１３〜４６８）に分けることができる（Ward等、1995, Prot. Struct. Funct. Genet. 22:141-153）。インシュリン結合決定基の多くは、αサブユニットに存在するようである。ＩＲのβサブユニットは６２０個のアミノ酸残基および３個のドメイン、細胞外、膜貫通、および細胞質を有する。細胞外ドメインはジスルフィド結合によってαサブユニットに結合している。細胞質ドメインには、チロシンキナーゼドメインが含まれ、その３次構造は解明されている（Hubbard等、1994, Nature 372:746-754）。ＩＲ特有の特性は、リガンドがないと２量体であることである。
【００１４】
創薬研究の一助として、ＩＲの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインをイムノグロブリンの定常ドメインＦｃまたはλサブユニットと代替することによって可溶型の膜結合受容体を構築した（Bass等、1996, J. Biol. Chem. 271:19367-19375）。この組換え遺伝子は、ヒト胚腎２９３細胞で発現した。発現したタンパク質は、完全にヘテロテトラマーに処理され、インシュリンに結合する能力は完全長のホロ受容体と同様であった。
【００１５】
ＩＧＦ−１Ｒは、１８０ｋＤａの前駆体として合成され、グリコシル化されて、２量体化し、タンパク質分解を受けて成熟受容体になる（T.E. Adams等、2000, Cell. Mol. Life Sci., 57:1050-1093, 2000）。成熟受容体／複合体は、２個の細胞外αサブユニットおよびチロシンキナーゼ活性を有する２個の膜貫通βサブユニットから成る。ＩＧＦ−１Ｒは、それ自体ＩＧＦ−１産生の主要部位であり、肝臓以外のほとんど全ての正常な成人組織において発現する（Butt等、1999, Immunol. Cell Biol. 77:256-262）。ＩＧＦ−１がＩＧＦ−１Ｒに結合した後、Ｓｒｃおよびｒａｓを含めた様々なシグナル伝達経路並びにＭＡＰキナーゼカスケードおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路が活性化する（Chow等、1998, J. Biol. Chem. 273:4672-4680）。
【００１６】
ＩＲの配列は、ＩＧＦ−１Ｒの配列と相同性が高く、両受容体の３次構造は同一である可能性が示唆される。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒのリガンド結合領域を含有するαサブユニットは、アミノ酸全体について４７〜６７％の同一性が示されている。システイン豊富なＬ１、およびＬ２と称する一般的な３個のドメインは、αサブユニットの配列分析によって両受容体で報告された。システインの豊富な領域のシステイン残基は、２種類の受容体の間で良く保存されているが、システインの豊富な領域はアミノ酸全体の同一性の４８％のみしか占めていない。特に、ＩＧＦ−１Ｒの最初の３個のドメインの結晶構造は決定された（Garrett 等、1998, Nature 394:395-399）。Ｌドメインは、１本鎖右巻きβへリックス（β鎖のへリックス構造）から成り、一方システインの豊富な領域は８個のジスルフィド結合単位から成る。
【００１７】
構造は同一であるが、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲは異なる生理的機能を果たす。ＩＲは主に代謝機能に関与し、一方ＩＧＦ−１Ｒは増殖および分化を促す。これと一致して、ＩＧＦ−１を除去すると（すなわち、ＩＧＦ−１ノックアウトマウスでは）、胚増殖が不十分で、出生後の生長が損なわれ、不妊症となる。さらに、ＩＧＦ−１Ｒノックアウトマウスの大きさは正常の４５％しかなく、出生時に呼吸不全によって死んでしまう（Liu等、1993, Cell 75:59-72）。しかし、インシュリンおよびＩＧＦ−１はいずれも分裂促進効果および代謝効果の両方を誘導することができる。各リガンドはそれ自体の受容体によって両活性をもたらすのかどうか、またはインシュリンはＩＧＦ−１Ｒに対して弱い親和性で結合することによって分裂促進効果を発揮するのかどうか、およびＩＧＦ−１はＩＲを介して代謝効果を発揮するのかどうかは、未だに議論が続いている（De Meyts, 1994, Horm. Res. 42:152-169）。
【００１８】
また、これら２種類の受容体で同一性が認められたにもかかわらず、特定のリガンドの結合におけるドメインの役割は異なっている。キメラ受容体の研究によって（ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットのドメイン交換）、研究者等はリガンドと特異的受容体との相互作用部位は異なることを報告した（T. Kjeldsen等、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4404-4408; A.S. Andersen等、1992, J. Biol. Chem. 267:13681-13686）。たとえば、ＩＧＦ−１Ｒのシステインの豊富なドメインは、高親和性のＩＧＦ結合に欠かせないが、インシュリン結合にはそうではないことが測定された。ＩＧＦ−１Ｒ領域のアミノ酸１９１〜２９０をＩＲの対応する領域（アミノ酸１９８〜３００）へ導入すると、調節されたＩＲは高い親和性でＩＧＦ−１およびインシュリンの両方に結合した。反対に、ＩＲの対応する領域をＩＧＦ−１Ｒに導入すると、調節したＩＧＦ−１ＲはＩＲには結合したが、ＩＧＦ−１には結合しなかった。
【００１９】
ＩＲとＩＧＦ−１Ｒの結合領域の間のその他の違いは、Ｎ末端およびＣ末端領域に対する依存度の違いである。ＩＲの（推定Ｌ１およびＬ２ドメイン内に位置する）Ｎ末端およびＣ末端領域の両方は、インシュリンの高親和性結合には重要であるが、ＩＲまたはＩＧＦ−１ＲのいずれにおいてもＩＧＦ−１結合にほとんど影響を及ぼさないようである。ＩＧＦ−１ＲのＮ末端残基（アミノ酸１〜６２）を対応するＩＲの残基（アミノ酸１〜６８）と代替すると、ＩＧＦ−１Ｒのインシュリン結合能がもたらされる。この領域内の残基Ｐｈｅ−３９、Ａｒｇ−４１およびＰｒｏ−４２は、インシュリンとの相互作用に主に寄与することが報告されている（Williams等、1995）。これらの残基をＩＧＦ−１Ｒの同等部位に導入すると、インシュリンに対する親和性が著しく増大し、一方これらの残基をＩＲのアラニンと代替するとインシュリン親和性が著しく減少した。同様に、ＩＲのＣ末端のアミノ酸７０４〜７１７の間の領域は、インシュリン特異性に主要な役割を果たすことが示された。これらの残基をアラニンと代替するとまた、インシュリン結合性が喪失する（Mynarcik等、1996, J. Biol. Chem. 271(5):2439-42; C. Kristensen等、1999, J. Biol. Chem. 274(52):37351-37356）。
【００２０】
ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒのアラニンスキャンすることによって、インシュリンおよびＩＧＦ−１はいくつかの共通した接触部位を使用してＩＧＦ−１Ｒに結合することができるが、その接触部位はインシュリンがＩＲに結合するために使用する接触部位とは異なることが示唆されている（Mynarcik等、1997）。したがって、この文献のデータから、ある解説者は「インシュリンおよびＩＧＦ−１のそれぞれの受容体に対する結合接触部分は接触部分内では相同であるが、実際に接触させて特異性を決定する側鎖は２種類のリガンド−受容体系の間では全く異なる可能性がある」との説明を導き出した（De Meyts, 1994）。
【００２１】
インシュリンおよびインシュリン類縁体の様々なインシュリン受容体構造への結合についてのデータに基づいて、結合モデルが提案された。このモデルによって、受容体分子の２個の異なる表面に位置する２個のインシュリン結合部位を備えたインシュリン受容体が示され、したがって各アルファサブユニットはインシュリン結合に関与している。このように、インシュリン受容体の活性化は、インシュリンによるアルファサブユニットの交差結合に関与するものと考えられる。同様の機構がＩＧＦ−１Ｒで作動する可能性があるが、受容体結合相互反応の１つは異なるようである（Schaffer, 1994, Eur. J. Biochem. 221:1127-1132）。
【００２２】
１つの受容体またはその他の受容体に特異性の高い分子構造の同定は、効果的かつ安全な治療薬を開発するために重要である。たとえば、インシュリンアゴニストとして開発された分子は、ＩＧＦ−１の分裂促進活性および新生物増殖を促進する可能性を排除するために、ほとんど、または全くＩＧＦ−１活性を有してはならない。したがって、インシュリンおよびＩＧＦ−１の３次構造は共通であるが、それぞれの受容体に対する選択性を備えるために十分異なっているかどうかを判定することが重要である。同様に、インシュリンおよび／またはＩＧＦ−１の活性結合領域に類似しており、選択的アゴニストまたはアンタゴニスト活性を与えるその他の分子構造を同定することが望ましいだろう。
【００２３】
ある種のタンパク質は重要な薬剤であるが、治療薬として使用するには製造および製剤コストが高いこと、通常注射によって投与すること、および血流中での安定性が制限されることを含めたいくつかの困難な問題が存在する。したがって、インシュリンまたはＩＧＦ−１を含めたタンパク質を分子量の小さい薬物に代替することは多くの注目を集めている。しかし、今までのところ、これらの努力によって効果的な薬剤代替の発見には至っていない。
【００２４】
タンパク質ホルモンと機能が類似したペプチドが今までに報告されている。Yanofsky等(1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7381-7386)は、ＩＬ−１受容体にナノモルの親和性を有するＩＬ−１のアンタゴニストであるモノマーの単離を報告している。この試みには、多くのファージディスプレイペプチドライブラリーの構築および使用と高度なファージパンニングの手法が必要とされる。
【００２５】
Wrighton等(1996, Science 273:458-464)およびLivnah等(1996, Science 273:464-471)は、ｉｎ  ｖｉｖｏで完全なアゴニスト活性を有するエリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体に結合する２量体ペプチドを報告した。これらのペプチドは環状で、ＩＬ−１受容体アンタゴニストのようにペプチド内にジスルフィド結合を有し、天然のリガンドとはあまり配列同一性が示されなかった。Ｘ線結晶解析によって、２個のＥＰＯ受容体の２量体化を可能にする非共有ペプチドホモダイマーペプチドが自然に形成されることが明らかになったことは重要である。
【００２６】
ＷＯ９６／０４５５７は、生物学的標的の活性部位に結合したペプチドおよび抗体の同定を報告しており、その後競合アッセイで使用して生物学的標的に対してアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する小分子が同定された。Renchler等(1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3623-3627)は、ヒトＢ細胞リンパ腫で設定された細胞死を誘導する抗原結合受容体の合成ペプチドリガンドを報告した。
【００２７】
ごく最近、Cwirla等(1997, Science 276:1696-1698)はヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体に結合し、天然のＴＰＯリガンドの結合と競合するペプチドの２種類のファミリーの同定を報告した。科学的手段によって２量体化したとき親和性の最も高いペプチドは、ＴＰＯ、天然リガンドと同じようにｉｎ  ｖｉｖｏでアゴニストの能力を有することがわかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明は、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ活性化に関与する部位を特異的に認識するアミノ酸配列の同定に関する。特異的アミノ酸配列を同定し、ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒに対するアゴニストまたはアンタゴニスト活性を測定した。このような配列は、有効な治療薬として、またはその他のより効果的な治療薬を開発するための導入化合物として開発することができる。さらに、これらの配列はハイスループットスクリーニングで使用して、これらの部位に結合し、インシュリンまたはＩＧＦ−１の機能に類似した、または拮抗する小分子を同定し、情報を提供することができる。さらに、本発明によって提供されたペプチド配列を使用して、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒにおいて元のペプチドの結合および／または活性を増加させるか、そうでなければ調節する配列変種を同定するため使用できる第２のペプチドライブラリーを設計することができる。本発明のペプチド配列はまた、結合させて本明細書で説明したようなスクリーニング、診断、および治療適用に使用できるダイマーまたはその他の多量体ペプチドを作製することが可能である。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明の一態様では、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの結合および活性特性用に多数のペプチドをスクリーニングした。これらのアミノ酸配列を分析することによって、それ自体、またはアゴニストまたはアンタゴニスト活性を付与されたより大きなアミノ酸配列の核配列として使用できるある種のコンセンサス配列を同定した。各モチーフ群内で同定された様々なペプチドの特異的配列に応じて様々な程度でアゴニストまたはアンタゴニスト活性ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒに結合するいくつかの一般的なアミノ酸配列を開示した。より大きなアミノ酸配列の一部のとき、コンセンサス配列の親和性および／または薬理活性を調節できるアミノ末端またはカルボキシル末端の延長もまた提供する。さらに、複数のコンセンサス配列を含有するペプチド（たとえば、ダイマーペプチド）を提供する。
【００３０】
ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒに結合する本発明のアミノ酸配列には、
ａ．Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５は芳香族アミノ酸で、Ｘ３は極性アミノ酸である（式１、群１、Ａ６モチーフ）、
ｂ．Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３、式中、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸で、Ｘ１０およびＸ１３は疎水性アミノ酸である（式２、群３、Ｂ６モチーフ）、
ｃ．Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１、式中、Ｘ１４およびＸ１７は疎水性アミノ酸で、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１８およびＸ１９は任意のアミノ酸で、Ｘ２０およびＸ２１は芳香族アミノ酸である（式３、逆Ｂ６、ｒｅｖＢ６）。
ｄ．Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１、式中、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ４０およびＸ４１は任意のアミノ酸で、Ｘ３５およびＸ３７はＩＲに結合するための任意のアミノ酸であることが可能で、一方Ｘ３５は好ましくは疎水性アミノ酸で、Ｘ３７は好ましくはＩＧＦ−１Ｒに結合するためのグリシンで、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する。Ｘ２３およびＸ２６は、疎水性アミノ酸である。この配列はさらに、好ましくはＸ２５およびＸ４０に少なくとも２個のシステイン残基を含有し、Ｘ３１およびＸ３２は小アミノ酸である（式４、群７、Ｅ８モチーフ）。
ｅ．Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１、式中、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ５３、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ６０およびＸ６１は任意のアミノ酸で、Ｘ４３、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５０、Ｘ５４は疎水性アミノ酸で、Ｘ４７およびＸ５９は好ましくはシステインで、Ｘ４８は極性アミノ酸で、Ｘ５１、Ｘ５２およびＸ５７は小アミノ酸である（式５、ミニＦ８モチーフ）。
ｆ．Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１、式中、Ｘ６２、Ｘ６５、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ８０およびＸ８１は任意のアミノ酸で、Ｘ６３、Ｘ７０、Ｘ７４は疎水性アミノ酸で、Ｘ６４は極性アミノ酸で、Ｘ６７およびＸ７５は芳香族アミノ酸で、Ｘ７２およびＸ７９は好ましくはループを形成できるシステインである（式６、群２、Ｄ８モチーフ）。
ｇ．ＨＸ８２Ｘ８３Ｘ８４Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７Ｘ８８Ｘ８９Ｘ９０Ｘ９１Ｘ９２、式中、Ｘ８２はプロリンまたはアラニンで、Ｘ８３は小アミノ酸で、Ｘ８４はロイシン、セリンまたはトレオニンから選択され、Ｘ８５は極性アミノ酸で、Ｘ８６、Ｘ８８、Ｘ８９およびＸ９０は任意のアミノ酸で、Ｘ８７、Ｘ９１およびＸ９２は脂肪族アミノ酸である（式７）。
ｈ．Ｘ１０４Ｘ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４、式中、Ｘ１０６からＸ１１１までの少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは２個のアミノ酸は３個のアミノ酸によって分離されたトリプトファンで、Ｘ１０４、Ｘ１０５およびＸ１０６の少なくとも１個、およびＸ１１２、Ｘ１１３およびＸ１１４の少なくとも１個はシステインである（式８）、および
ｉ．配列ＪＢＡ５、ＤＹＫＤＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰＫＫ（配列番号１５４１）またはＪＢＡ５マイナスＦＬＡＧ（登録商標）タグおよび末端リジン、ＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰ（配列番号１５４２）を含むアミノ酸配列（式９）。
ｊ．ＷＸ１２３ＧＹＸ１２４ＷＸ１２５Ｘ１２６（配列番号１５４３）、式中、Ｘ１２３はプロリン、グリシン、セリン、アルギニン、アラニンまたはロイシンから選択され、より好ましくはプロリンで、Ｘ１２４は任意のアミノ酸であるが、好ましくは荷電した、または芳香族アミノ酸で、Ｘ１２５は疎水性アミノ酸で、好ましくはロイシンまたはフェニルアラニンで、最も好ましくはロイシンである。Ｘ１２６は任意のアミノ酸であるが、好ましくは小アミノ酸である（式１０、群６モチーフ）が含まれる。
【００３１】
一実施形態では、ＩＲの部位に競合的に結合する好ましいアミノ酸配列ＦＹＸ３ＷＦ（配列番号１５４４）（式１、群１、Ａ６モチーフ）を含むペプチドを同定した。驚くべきことに、アミノ酸配列ＦＹＸ３ＷＦ（配列番号１５４４）を含むペプチドは、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒでアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有することができる。
【００３２】
本発明はまた、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒへの結合について互いに、またリガンドと競合するいくつかのペプチドの能力の違いに基づいて、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒ上の少なくとも２個の異なる結合部位（部位１および部位２）を同定する。したがって、本発明はＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒの１個または両方の部位に特異的に結合するアミノ酸配列を提供する。さらに、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒの特異的部位に結合する能力に基づいてアゴニストまたはアンタゴニスト特性を有する特異的アミノ酸配列を提供する。
【００３３】
本発明の他の実施形態では、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒの１個または複数の部位（たとえば、部位１または部位２）に結合するアミノ酸配列は一緒に共有結合して多価リガンドを形成する。これらの多価リガンドは、複数のＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒと複合体を形成することができる。同一か、または異なるアミノ酸配列は、一緒に共有結合して、ホモ、またはヘテロ複合体を形成する。
【００３４】
本発明の様々な態様では、モノマーサブユニットはそれらのＮ末端またはＣ末端で共有結合して、Ｎ−Ｎ、Ｃ−Ｃ、Ｎ−Ｃ、またはＣ−Ｎ結合ダイマーペプチドを形成する。１例では、ダイマーペプチドを使用して同一の対応する部位によって結合した受容体複合体、たとえば、部位１−部位１または部位２−部位２ダイマーを形成する。あるいは、ヘテロダイマーペプチド、たとえば、部位１−部位２または部位２−部位１ダイマーを使用して、１受容体の異なる部位を結合するか、または異なる部位によって受容体複合化を引き起こす。本発明の新規の一態様では、部位２−部位１ダイマーはインシュリンアゴニストとしての用途が見いだされ、一方ある部位１−部位２ダイマーではインシュリンアンタゴニストとしての用途が見いだされる。
【００３５】
様々な実施形態において、本明細書で以下に説明するように、インシュリンアゴニストには部位１−部位１ダイマーペプチド配列Ｓ３２５、Ｓ３３２、Ｓ３３３、Ｓ３３５、Ｓ３３７、Ｓ３５３、Ｓ３７４〜Ｓ３７６、Ｓ３７８、Ｓ３７９、Ｓ３８１、Ｓ４１４、Ｓ４１５およびＳ４１８が含まれ、一方その他のインシュリンアゴニストには部位２−部位１ダイマーペプチド配列Ｓ４５５、Ｓ４５７、Ｓ４５８、Ｓ４６７、Ｓ４６８、Ｓ４７１、Ｓ４９９、Ｓ５１０、Ｓ５１８、Ｓ５１９およびＳ５２０が含まれる。好ましい一実施形態では、インシュリンアゴニストにはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの両方でインシュリン様活性を示すＳ５１９ダイマーペプチドの配列が含まれる。
【００３６】
本発明はまた、インシュリンまたはＩＧＦ−１の結合特性に類似した化合物を同定するアッセイ法を提供する。このような化合物は細胞を用いるアッセイでインシュリンまたはＩＧＦ−１機能のアンタゴニストまたはアゴニストとして作用することが可能である。
【００３７】
本発明はさらに、ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒに結合する化合物を同定するキットを提供する。インシュリン受容体またはＩＧＦ−１受容体に結合する治療化合物もまた提供する。
【００３８】
本発明の他の実施形態は、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸配列である。この核酸を含有するベクター並びにＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒに結合し、アゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を発現する宿主細胞もまた、本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明はまた、ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒの活性部位に結合するアミノ酸配列を提供し、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒにおいてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を与える構造基準を確認することを提供する。
【００４０】
本発明はさらに、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒにいずれかにおいてアゴニスト、部分的アゴニスト、またはアンタゴニスト活性を有する特異的アミノ酸配列を提供する。このようなアミノ酸配列は、それ自体治療薬として有用な可能性があり、またはＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒにおいてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する他の分子、特に小さな有機分子を同定するために使用することが可能である。
【００４１】
さらに、本発明は本発明のアミノ酸配列から得られた構造情報を提供し、これは適切なＩＲ結合部位において所望する活性を有するその他の分子を構築するために使用することが可能である。
【００４２】
図１Ａ〜１Ｏ、２Ａ〜２Ｅ、３Ａ〜３Ｅ、４Ａ〜４Ｉ、４３Ａ〜４３Ｂ、４４Ａ〜４４Ｂ：ＩＧＦ−１Ｒおよび／またはＩＲに対するペプチドライブラリーのパンニングによって同定されたアミノ酸配列。このアミノ酸は１文字略号によって示す。バックグラウンドを上回る比は、４０５ｎｍ（Ｅ−Ｔａｇ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＩＲ）でのシグナルを無脂乳の４０５ｎｍでのシグナルで除することによって決定する。ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ比の比較は、ＩＧＦ−１Ｒの比をＩＲの比によって除することによって決定する。ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒの比の比較は、ＩＲの比をＩＧＦ−１Ｒの比で除することによって決定する。ＨＩＴは結合剤を示す。ＣＡＮＤは結合剤候補を示す。ＬＤＨは乳酸脱水素酵素への結合を示す（陰性対照）。Ｓｐ／Ｉｒｒは、非特異的結合を上回る特異的結合の比を示す。
【００４３】
各ライブラリーの設計図は、最初に太字で示す。設計図において、記号「Ｘ」は任意の位置を示し、下線を引いたアミノ酸はヌクレオチドレベルのドープ位置を示し、その他の位置は一定に保持されている。Ｂ６Ｈライブラリーの他の略号では、「Ｏ」はＮＧＹコドンを示し、ＹはＣまたはＴで、「Ｊ」はＲＨＲコドンで、ＲはＡまたはＧで、ＨはＡ、ＣまたはＴで、「Ｕ」はＶＶＹコドンを示し、ＶはＡ、Ｃ、またはＧで、ＹはＣまたはＴである。２０Ｅ２ライブラリーの「ｈ」は、ＮＴＮコドンを示す。
【００４４】
リストに挙げた配列の略号には、以下のものが含まれる。ＱはＴＡＧ終止コドンに対応する位置をしめす。＃はＴＡＡ終止コドンに対応する位置を示す。＊はＴＧＡ終止コドンに対応する位置を示し、？は未知のアミノ酸を示す。発現したときＷはＴＧＡ終止コドンと代替すると考えられる。Ｑ残基は、ＴＡＧ終止コドンで読み過ごされた翻訳を示す。２０ＣおよびＡ６Ｌライブラリーを除いて、全てのライブラリーはリストに挙げた配列のＮ末端に短いＦＬＡＧ（登録商標）エピトープＤＹＫＤ（配列番号１５４５、Hopp等、1988, Bid/Technology 6:1205-1210）を有し、Ｃ末端にＡＡＡＧＡＰ（配列番号１５４６）を有するように設計する。２０ＣおよびＡ６Ｌライブラリーは、完全長ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１５４７）を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明は、インシュリン受容体（ＩＲ）および／またはインシュリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合するモチーフを含むアミノ酸配列に関する。ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒへの結合に加えて、このアミノ酸配列はまた、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒでアゴニスト、部分的アゴニストまたはアンタゴニスト活性のいずれかを有する。さらに、このアミノ酸配列はＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ上の結合部位（部位１または２）を分離するために結合する。
【００４６】
このアミノ酸はアゴニストまたはアンタゴニスト活性の付与に関与する部位でＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに結合することができるが、天然インシュリンおよびＩＧＦ−１配列をベースとしておらず、このような配列との明白な相同性も反映していない。
【００４７】
本発明のアミノ酸配列は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であることが可能である。本明細書で使用したこれらの用語は、本明細書で述べた本発明の範囲内に含まれる様々なアミノ酸配列の大きさに関して限定されるものと考えてはならない。したがって、本明細書で開示したＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ結合モチーフを少なくとも１個を含み、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに結合する任意のアミノ酸配列は本発明の範囲内である。好ましい実施形態では、アミノ酸配列はインシュリンまたはＩＧＦ−１アゴニストまたはアンタゴニスト活性をもたらす。本発明のアミノ酸配列は、一般的に人工的で、すなわち、天然には生じないペプチド、ポリペプチド、またはそれらの断片である。本発明のアミノ酸配列には、インシュリン、インシュリン様増殖因子、インシュリン受容体またはインシュリン様増殖因子受容体、またはそれらの断片に対する抗体は含まれない。本発明で有用なアミノ酸配列は、化学合成、ファージディスプレイ、タンパク質またはポリペプチドの断片への切断、または結合能を有するために十分な長さのアミノ酸配列を形成するか、または得ることができる任意の手段などの様々な手段によって得ることが可能である。
【００４８】
本発明によって提供されたアミノ酸配列は、計画した目的に適した結合をもたらすために十分なＩＲに対する親和性を持っていなければならない。したがって、治療薬として使用するために、本発明によってもたらされたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の親和性は、約１０−７Ｍから約１０−１５Ｍの間でなければならない。より好ましくは、親和性は１０−８Ｍから約１０−１２Ｍである。最も好ましくは、親和性は１０−１０Ｍから約１０−１２Ｍである。その他のリガンドを同定するための競合結合アッセイの試薬として使用するためには、このアミノ酸配列の受容体に対する親和性は、約１０−５Ｍから約１０−１２Ｍの間であることが好ましい。
【００４９】
本発明は、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒの活性部位に結合するいくつかの異なる結合モチーフについて説明する。結合モチーフは、いくつかの異なるアミノ酸配列の分析、ならびに２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０８５２８、および２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等の米国出願番号０９／５３８０３８号といった関連出願に記載されたように、特定の位置のアミノ酸配列で特定のアミノ酸またはアミノ酸の種類が生じる頻度の分析に基づいて同定する。
【００５０】
本発明の範囲にはまた、本明細書で開示した教示に基づいた代替、添加または欠失を含有し、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに同様または調節された親和性で結合するアミノ酸配列が含まれる。たとえば、配列タグ（たとえば、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ）または１個または複数のリジンなどのアミノ酸を本明細書で詳述したように本発明のペプチド配列に（たとえば、Ｎ末端またはＣ末端に）添加することができる。配列タグは、ペプチド精製またはビオチン化に使用することができる。あるいは、以下に説明した配列タグ（たとえば、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ）を含むか、または特定のアミノ酸に対する強い選択性に関与しないアミノ酸残基を含有するコンセンサスモチーフのカルボキシ末端およびアミノ末端に位置するアミノ酸残基は、任意選択で除去して切断型配列をもたらすことが可能である。アミノ酸配列の安定性またはビオチン化を促進するリジンなどのある種のアミノ酸（たとえば、Ｃ末端またはＮ末端残基）は、配列の用途、たとえば、可溶性の、または固相支持体に結合したより大きな配列の一部として配列を発現することに応じて除去することが可能である。
【００５１】
ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに結合するペプチド、およびこのようなペプチドを同定する方法およびキットは、全体を参考として援用した２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０８５２８、および２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等の米国出願番号０９／５３８０３８号に開示されている。
【００５２】
Ａ．コンセンサスモチーフ
以下のモチーフは、ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒに対する結合活性を与えるものとして同定された。
１．Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５（式１、群１、Ａ６モチーフ）、式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５は芳香族アミノ酸で、好ましくはフェニルアラニンまたはチロシンである。最も好ましくはＸ１およびＸ５はフェニルアラニンで、Ｘ２はチロシンである。Ｘ３は小さな極性アミノ酸であってよいが、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、またはセリンから選択され、最も好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸である。Ｘ４は、最も好ましくはトリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニンで、最も好ましくはトリプトファンである。Ａ６モチーフの特に好ましい実施形態は、ＦＹＤＷＦ（配列番号１５５４）およびＦＹＥＷＦ（配列番号１５５５）である。Ａ６モチーフは、ＩＧＦ−１Ｒでアゴニスト活性を有するが、ＩＲではＡ６に隣接したアミノ酸の個性に応じてアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する。図５Ａ参照。
【００５３】
Ａ６モチーフを含み、ＩＲでアゴニスト活性を有するアミノ酸配列には、Ｄ１１７／Ｈ２Ｃ：ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ（配列番号：１５５６）；Ｄ１１７／Ｈ２マイナス末端リジン：ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳ（配列番号：１５５７）；ＲＰ９：ＧＳＬＤＥＳＦＹＤＷＦＥＲＱＬＧＫＫ（配列番号：１５５８）；ＲＰ９マイナス末端リジン：ＧＳＬＤＥＳＦＹＤＷＦＥＲＱＬＧ（配列番号：１５５９）；およびＳ１７５：ＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ（配列番号：１５６０）が含まれるが、これだけに限定されはされない。好ましいＲＰ９配列には、ＧＬＡＤＥＤＦＹＥＷＦＥＲＱＬＲ（配列番号：１５６１）、ＧＬＡＤＥＬＦＹＥＷＦＤＲＱＬＳ（配列番号：１５６２）、ＧＱＬＤＥＤＦＹＥＷＦＤＲＱＬＳ（配列番号：１５６３）、ＧＱＬＤＥＤＦＹＡＷＦＤＲＱＬＳ（配列番号：１５６４）、ＧＦＭＤＥＳＦＹＥＷＦＥＲＱＬＲ（配列番号：１５６５）、ＧＦＷＤＥＳＦＹＡＷＦＥＲＱＬＲ（配列番号：１５６６）、ＧＦＭＤＥＳＦＹＡＷＦＥＲＱＬＲ（配列番号：１５６７）、およびＧＦＷＤＥＳＦＹＥＷＦＥＲＱＬＲ（配列番号：１５６８）が含まれる。群１（式１、Ａ６）アミノ酸配列の非限定的を図１Ａ〜１Ｏに示す。
【００５４】
２．Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３（式２、群３、Ｂ６モチーフ）で、式中、Ｘ６およびＸ７は芳香族アミノ酸で、好ましくはフェニルアラニンまたはチロシンである。最も好ましくは、Ｘ６はフェニルアラニンで、Ｘ７はチロシンである。Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１およびＸ１２は任意のアミノ酸である。Ｘ１０およびＸ１３は疎水性アミノ酸で、好ましくはロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンまたはメチオニンであるが、より好ましいのはロイシンまたはイソロイシンである。Ｘ１０は、ＩＲに結合するためにはイソロイシンが最も好ましく、ＩＧＦ−１Ｒに結合するためにはロイシンが最も好ましい。Ｘ１３はロイシンが最も好ましい。式２のアミノ酸配列は、ＩＧＦ−１Ｒでアンタゴニストとして、ＩＲでアゴニストとして機能することができる。式２モチーフの好ましいコンセンサス配列は、ＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌ（配列番号：１５６９）、ＦＹＸ８Ｘ９ＬＸ１１Ｘ１２Ｌ（配列番号：１５７０）、ＦＹＸ８ＡＩＸ１１Ｘ１２Ｌ（配列番号：１５７１）、およびＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２Ｌ（配列番号：１５７２）である。
【００５５】
本発明で使用するための他の式２モチーフには、ＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２Ｌ（配列番号１５７３）が含まれ、以下の式２Ａ（「ＮＮＲＰ」）、Ｘ１１５Ｘ１１６Ｘ１１７Ｘ１１８ＦＹＸ８ＹＦＸ１１Ｘ１２ＬＸ１１９Ｘ１２０Ｘ１２１Ｘ１２２（配列番号１５７４）として示され、式中、Ｘ１１５〜Ｘ１１８およびＸ１１８〜Ｘ１２２は、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒへの結合を可能にする任意のアミノ酸であることが可能である。Ｘ１１５は、トリプトファン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアルギニンから成る群から選択することが好ましい。アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、およびアルギニンはより好ましい。トリプトファンは最も好ましい。トリプトファンが好ましいのは、クローンにおける存在がランダム代替で期待される頻度よりも３から５倍高いことに基づき、一方、アスパラギン酸、グルタミン酸およびアルギニンは、ランダム代替で期待される代替よりも約２倍の頻度で存在する。
【００５６】
Ｘ１１６は、アスパラギン酸、ヒスチジン、グリシン、およびアスパラギンから成る群から選択されることが好ましい。Ｘ１１７およびＸ１１８はグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはアラニンが好ましい。より好ましくはＸ１１７はグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびアスパラギンで、一方、Ｘ１１８はグリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはアラニンがより好ましい。Ｘ８は、式２Ａモチーフに存在するときは、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、またはセリンが好ましい。Ｘ１１は、式２Ａモチーフに存在するときは、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、またはトリプトファンが好ましいが、最も好ましいのはグルタミン酸である。Ｘ１２は、式２Ａモチーフに存在するときは、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リジンまたはグルタミンが好ましいが、最も好ましいのはアスパラギン酸である。Ｘ１１９はグルタミン酸、グリシン、グルタミン、アスパラギン酸またはアラニンが好ましいが、最も好ましいのはグルタミン酸である。Ｘ１２０は、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンまたはグルタミンが好ましいが、最も好ましいのはグルタミン酸である。Ｘ１２１は、トリプトファン、チロシン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、またはアスパラギン酸が好ましいが、最も好ましいのはトリプトファンまたはチロシンである。Ｘ１２２はグルタミン酸、アスパラギン酸またはグリシンが好ましいが、最も好ましいのはグルタミン酸である。好ましいアミノ酸残基は、ランダム現象で期待されるものよりも２倍を上回るクローンでの頻度に基づいて同定されるが、一方、より好ましい配列は期待される頻度の約３〜５倍で生じる。
【００５７】
場合によっては、式１および式２のアミノ酸配列にはまた、２個のシステイン残基を含めることが可能で、本明細書で説明したようなモチーフ配列（たとえば、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５およびＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３）の外側または内側のいずれかに位置することが可能である。システイン残基の間の間隔は、たとえばＲＰ６２（ＣＤＦＹＣＡＬＳＲＬＳＧＱＰＲＤＲＭＰＮＹＰＧＴＳ、配列番号ＸＸ）のアミノ酸３個から、たとえばＲＰ３５（ＤＲＤＦＣＲＦＹＥＲＬＴＡＬＶＧＧＱＶＤＧＧＷＰＣ、配列番号ＸＸ）のアミノ酸１９個まで変化してよい。式１および式２のペプチドの大きさおよびシステイン位置は様々であってよい。たとえば、式２ペプチドＲＰ６（ＴＦＹＳＣＬＡＳＬＬＴＧＴＰＱＰＮＲＧＰＷＥＲＣＲ、配列番号ＸＸ）および誘導体、ＲＰ３０−ＩＧＦ、ＲＰ３３−ＩＧＦには１８個のアミノ酸によって分離された２個のシステイン残基が含まれる。対照的に、式１ペプチドＧ３３（ＧＩＩＳＱＳＣＰＥＳＦＹＤＷＦＡＧＱＶＳＤＰＷＷＣＷ、配列番号ＸＸ）には、１７個の残基によって分離された２個のシステインが含まれる。ある種の式および式２のペプチドでは、このシステイン残基の位置および間隔は、ＲＰ６およびＧ３３第２ライブラリーのバイオパンニングによって得られたペプチドからアミノ酸選択性の計算によって決定したところ、これらのペプチド中で非常に有利なことがわかった。理論に捕われたくはないが、式１および式２のアミノ酸配列で認められたシステイン対はシステインループ構造を形成することが可能である。
【００５８】
３．Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１（式３、逆向きＢ６、ｒｅｖＢ６）、式中、Ｘ１４およびＸ１７は疎水性アミノ酸で、Ｘ１４、Ｘ１７はロイシン、イソロイシン、およびバリンが好ましく、最も好ましいのはロイシンである。Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１８およびＸ１９は任意のアミノ酸であることが可能で、Ｘ２０は芳香族アミノ酸で、好ましくはチロシンまたはヒスチジンであるが、最も好ましいのはチロシンである。Ｘ２１は芳香族アミノ酸であるが、好ましくはフェニルアラニンまたはチロシンで、最も好ましいのはフェニルアラニンである。ＩＧＦ−１Ｒ結合性リガンドとして使用するために、Ｘ１８に非常に好ましいのは芳香族アミノ酸である。
【００５９】
４．Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８Ｘ３９Ｘ４０Ｘ４１（式４、群７、Ｆ８モチーフ）で、式中、Ｘ２２、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３３、Ｘ３４、Ｘ３５、Ｘ３６、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ４０およびＸ４１は任意のアミノ酸である。Ｘ３５およびＸ３７はＦ８モチーフをＩＲ結合性リガンドまたはＩＲ結合性リガンドの成分として使用するときは任意のアミノ酸であってよいが、ＩＧＦ−１Ｒ結合性リガンドとして使用するときはグリシンがＸ３７に非常に好ましく、疎水性アミノ酸、特にロイシンはＸ３５に好ましい。Ｘ２３は、疎水性アミノ酸である。メチオニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシンは、Ｘ２３に好ましいアミノ酸であるが、ＩＧＦ−１Ｒ結合性リガンドの調製に最も好ましいロイシンは、ＩＲ結合性リガンドの調製に特に好ましい。少なくとも１個のシステインがＸ２４からＸ２７に位置し、もう１個がＸ３９またはＸ４０に位置する。システインが一緒になって、システイン架橋結合を形成して、ループアミノ酸配列を作ることができる。さらに、２個のシステイン残基の間に１４個のアミノ酸が入ることが好ましく、ＩＧＦ−１ＲまたはＩＲに対する結合を維持するならば、その他の間隔もまた使用することが可能である。したがって、システインがその他の位置を占めるならば、Ｘ２４およびＸ３９の位置のシステインをその他のアミノ酸で代替することが可能である。
【００６０】
一実施形態では、たとえば、Ｘ２４の位置のシステインは、Ｘ２７の位置にあってもよく、Ｘ３９の位置のシステインが維持されているならば、小さなループを形成するだろう。これらの小さなループペプチドは、以下の式５として本明細書で説明する。Ｘ２７は、任意の極性アミノ酸であるが、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギンから、または前記のシステインで述べたように選択することが好ましい。Ｘ２７の位置にグルタミン酸が存在するとＩＲへの結合が減少するが、ＩＧＦ−１Ｒへの結合に対する影響は少ない。Ｘ３１は任意の芳香族アミノ酸であり、Ｘ３２は任意の小アミノ酸である。ＩＧＦ−１Ｒへの結合には、グリシンまたはセリンがＸ３１の位置に好ましいが、トリプトファンがＩＲへの結合に非常に好ましい。Ｘ３２の位置では、グリシンがＩＧＦ−１ＲとＩＲへの結合両方に好ましい。Ｘ３６は芳香族アミノ酸である。Ｆ８の好ましいコンセンサス配列は、Ｘ２２ＬＣＸ２５Ｘ２６ＥＸ２８Ｘ２９Ｘ３０ＷＧＸ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６Ｘ３７Ｘ３８ＣＸ４０Ｘ４１（配列番号１５７５）で、一方アミノ酸は前記で定義した通りである。より好ましいＦ８配列は、ＨＬＣＶＬＥＥＬＦＷＧＡＳＬＦＧＹＣＳＧ（「Ｆ８」、配列番号１５７６）である。Ｆ８配列モチーフを含むアミノ酸配列は、ＩＧＦ−１ＲよりもむしろＩＲに結合する。図２Ａ〜２Ｅに、式４アミノ酸配列の非限定的例を挙げる。
【００６１】
５．Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５Ｘ４６Ｘ４７Ｘ４８Ｘ４９Ｘ５０Ｘ５１Ｘ５２Ｘ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６Ｘ５７Ｘ５８Ｘ５９Ｘ６０Ｘ６１（式５、ミニＦ８モチーフ）で、式中、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ５３、Ｘ５５、Ｘ５６、Ｘ５８、Ｘ６０およびＸ６１は任意のアミノ酸である。Ｘ４３、Ｘ４６、Ｘ４９、Ｘ５０、Ｘ５４は疎水性アミノ酸であるが、Ｘ４３およびＸ４６はロイシンが好ましく、一方Ｘ５０はフェニルアラニンまたはチロシンが好ましいが、最も好ましいのはフェニルアラニンである。Ｘ４７およびＸ５９はシステインである。Ｘ４８は極性アミノ酸が好ましく、すなわち、アスパラギン酸またはグルタミン酸であるが、最も好ましいのはグルタミン酸である。５４の位置に小アミノ酸を使用するとＩＧＦ−１Ｒへの特異性が現れる可能性がある。Ｘ５１、Ｘ５２およびＸ５７は小アミノ酸で、好ましくはグリシンである。ミニＦ８に好ましいコンセンサス配列は、Ｘ４２Ｘ４３Ｘ４４Ｘ４５ＬＣＥＸ４９ＦＧＧＸ５３Ｘ５４Ｘ５５Ｘ５６ＧＸ５８ＣＸ６０Ｘ６１（配列番号１５７７）である。式５の配列を含むアミノ酸配列は、ＩＧＦ−１ＲまたはＩＲに好んで結合する。
【００６２】
６．Ｘ６２Ｘ６３Ｘ６４Ｘ６５Ｘ６６Ｘ６７Ｘ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１Ｘ７２Ｘ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８Ｘ７９Ｘ８０Ｘ８１（式６、群２、Ｄ８モチーフ）であって、式中、Ｘ６２、Ｘ６５、Ｘ６８、Ｘ６９、Ｘ７１、Ｘ７３、Ｘ７６、Ｘ７７、Ｘ８０およびＸ８１は任意のアミノ酸であってよい。Ｘ６６はまた、任意のアミノ酸であってよいが、グルタミン酸であることが非常に好ましい。Ｘ６６をグルタミンまたはバリンと代替すると、結合が弱まる恐れがある。Ｘ６３、Ｘ７０およびＸ７４は疎水性アミノ酸である。Ｘ６３はロイシン、イソロイシン、メチオニン、またはバリンが好ましいが、最も好ましいのはロイシンである。Ｘ７０およびＸ７４は、バリン、イソロイシン、ロイシン、またはメチオニンが好ましい。Ｘ７４はバリンが最も好ましい。Ｘ６４は極性アミノ酸で、より好ましいのはアスパラギン酸またはグルタミン酸で、最も好ましいのはグルタミン酸である。Ｘ６７およびＸ７５は芳香族アミノ酸である。一方トリプトファンはＸ６７に非常に好ましく、Ｘ７５はチロシンまたはトリプトファンが好ましいが、最も好ましいのはチロシンである。Ｘ７２およびＸ７９は、やはりループを形成すると考えられるシステインで、この位置のアミノ酸は、アミノ酸配列のシステインを移すことによって調節することが可能である。
【００６３】
２、３個のＤ８配列のみがバックグラウンドを上回ってＩＧＦ−１Ｒに結合できることが検出されたので、Ｄ８はＩＲに選択的に結合するアミノ酸配列として最も有用である。ＩＲに対する結合に好ましい配列は、Ｘ６２ＬＸ６４Ｘ６５Ｘ６６ＷＸ６８Ｘ６９Ｘ７０Ｘ７１ＣＸ７３Ｘ７４Ｘ７５Ｘ７６Ｘ７７Ｘ７８ＣＸ８０Ｘ８１（配列番号１５７８）である。このモチーフを含む特異的ペプチド配列の例には、Ｄ８：ＫＷＬＤＱＥＷＡＷＶＱＣＥＶＹＧＲＧＣＰＳＫＫ（配列番号１５７９）およびＤ８マイナス末端リジン：ＫＷＬＤＱＥＷＡＷＶＱＣＥＶＹＧＲＧＣＰＳ（配列番号１５８０）が含まれる。好ましいＤ８モノマー配列には、ＳＬＥＥＥＷＡＱＩＱＣＥＩＹＧＲＧＣＲＹ（配列番号１５８１）およびＳＬＥＥＥＷＡＱＩＱＣＥＩＷＧＲＧＣＲＹ（配列番号１５８２）が含まれる。好ましいＤ８ダイマー配列には、ＳＬＥＥＥＷＡＱＩＥＣＥＶＹＧＲＧＣＰＳ（配列番号１５８３）およびＳＬＥＥＥＷＡＱＩＥＣＥＶＷＧＲＧＣＰＳ（配列番号１５８４）が含まれる。群２（式６、Ｄ８）アミノ酸配列の非限定的例を図３Ａ〜３Ｅに示す。
【００６４】
７．ＨＸ８２Ｘ８３Ｘ８４Ｘ８５Ｘ８６Ｘ８７Ｘ８８Ｘ８９Ｘ９０Ｘ９１Ｘ９２（式７）、式中、Ｘ８２はプロリンまたはアラニンであるが、最も好ましいのはプロリンである。Ｘ８３は小アミノ酸で、プロリン、セリンまたはトレオニンがより好ましく、プロリンが最も好ましい。Ｘ８４はロイシン、セリンまたはトレオニンから選択されるが、最も好ましいのはロイシンである。Ｘ８５は極性アミノ酸で、グルタミン酸、セリン、リジンまたはアスパラギンが好ましく、セリンがより好ましい。Ｘ８６は任意のアミノ酸であってよいが、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはグルタミンなどの極性アミノ酸が好ましい。Ｘ８７は脂肪族アミノ酸で、ロイシン、メチオニンまたはイソロイシンが好ましく、ロイシンが最も好ましい。アミノ酸Ｘ８８、Ｘ８９およびＸ９０は任意のアミノ酸であってよい。Ｘ９１は脂肪族アミノ酸であるが、Ｘ９２のようにロイシンが非常に好ましい。フェニルアラニンも、位置９２に使用してよい。式７の好ましいコンセンサス配列は、ＨＰＰＬＳＸ８６ＬＸ８８Ｘ８９Ｘ９０ＬＬ（配列番号１５８５）である。式７のモチーフは、ＩＲに結合するが、ＩＧＦ−１Ｒにはほとんど、または全く結合しない。
【００６５】
８．他の配列は、Ｘ１０４Ｘ１０５Ｘ１０６Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１Ｘ１１２Ｘ１１３Ｘ１１４（式８）で、Ｘ１０６からＸ１１１までの少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは２個のアミノ酸はトリプトファンである１１個のアミノ酸を含む。さらに、２個のトリプトファンアミノ酸は、３個のアミノ酸によって分離された配列に存在するとき、好ましくはプロリン、トレオニンおよびチロシンの順番で、プロリンはアミノ末端のトリプトファンに隣接していることが好ましい。したがって、Ｘ１０７Ｘ１０８Ｘ１０９Ｘ１１０Ｘ１１１の最も好ましい配列はＷＰＴＹＷ（配列番号１５８６）である。アミノ末端の３個のアミノ酸（Ｘ１０４、Ｘ１０５、Ｘ１０６）の少なくとも１個、およびＸ１０７〜Ｘ１１１にすぐ隣接したカルボキシ末端（Ｘ１１２、Ｘ１１３、Ｘ１１４）の少なくとも１個のアミノ酸はシステイン残基が好ましく、それぞれＸ１０５およびＸ１１３が最も好ましい。理論に捕われることなく、ループ構造が形成できるようにシステイン間の間隔をとることが好ましい。Ｘ１０４およびＸ１１４はいずれも、たとえばアラニンおよびグリシンなどの小アミノ酸である。Ｘ１０４はアラニンで、Ｘ１１４はグリシンであることが最も好ましい。Ｘ１０５は任意のアミノ酸であってよいが、好ましくはバリンである。Ｘ１１２はアスパラギンが好ましい。したがって、最も好ましい配列は、ＡＣＶＷＰＴＹＷＮＣＧ（配列番号１５８７）である。
【００６６】
９．ＪＢＡ５、ＤＹＫＤＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰＫＫ（配列番号１５４１）、または末端リジンのないＪＢＡ５、ＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰ（配列番号１５４２）（式９）を含むアミノ酸配列。式９のモチーフは、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの両方にアゴニスト活性を有するシステインループを形成すると考えられている他のモチーフである。ＩＲ結合はＥＬＩＳＡによって検出できないが、式９のＩＲへの結合は、インシュリンと競合し、アゴニスト性である。
【００６７】
１０．ＷＸ１２３ＧＹＸ１２４ＷＸ１２５Ｘ１２６（配列番号１５４３）（式１０、群６）、式中、Ｘ１２３はプロリン、グリシン、セリン、アルギニン、アラニンまたはロイシンから選択されるが、より好ましくはプロリンで、Ｘ１２４は任意のアミノ酸であるが、好ましくは荷電した、または芳香族アミノ酸で、Ｘ１２５は疎水性アミノ酸で、好ましくはロイシンまたはフェニルアラニンで、最も好ましくはロイシンである。Ｘ１２６は任意のアミノ酸であるが、好ましくは小アミノ酸である。本発明の一実施形態では、式１０、群６モチーフはＷＰＧＹ（配列番号１５８８）である。このモチーフを含む特異的ペプチド配列の例には、Ｅ８：ＫＶＲＧＦＱＧＧＴＶＷＰＧＹＥＷＬＲＮＡＡＫＫ（配列番号１５８９）およびＥ８マイナス末端リジン：ＫＶＲＧＦＱＧＧＴＶＷＰＧＹＥＷＬＲＮＡＡ（配列番号１５９０）が含まれる。好ましい群６配列には、ＷＡＧＹＥＷＦ（配列番号１５９１）、ＷＥＧＹＥＷＬ（配列番号１５９２）、ＷＡＧＹＥＷＬ（配列番号１５９３）、ＷＥＧＹＥＷＦ（配列番号１５９４）、およびＤＳＤＷＡＧＹＥＷＦＥＥＱＬＤ（配列番号１５９５）が含まれる。群６アミノ酸配列の非限定的例を図４Ａ〜４Ｂに示す。
【００６８】
代表的な群１（式１、Ａ６）、群２（式６、Ｄ８）、および群６（式１０）および群７（式４、Ｆ８）アミノ酸配列のＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒ結合活性を図８および９Ａ〜９Ｂに要約する。群１（式１、Ａ６）アミノ酸配列には、コンセンサス配列ＦｙｘＷＦ（配列番号１５９６）が含まれ、一般的に細胞を用いるアッセイでアゴニストである。群２（式６、Ｄ８）アミノ酸配列は、コンセンサス配列ＶＹＧＲ（配列番号１５９７）およびそれぞれ２個のシステイン残基を有する２個の内部配列から成る。したがって、群２ペプチドはジスルフィド結合で架橋した環状ペプチドを形成することができる。これらのコンセンサス配列はいずれも、成熟インシュリンとアミノ酸２個または３個以上の有意な直線的配列類似性を示さない。群７（式４、Ｆ８）のアミノ酸配列は、有意な配列相同性がない２個の代表的な内部配列から成るが、１３〜１４残基離れた２個のシステイン残基を有し、したがってジスルフィド架橋によって固定される長いループを有する環状ペプチドを形成することができる。
【００６９】
Ｂ．アミノ末端およびカルボキシル末端の延長はモチーフの活性を調節する
前述したモチーフに加えて、本発明はまた、ＩＲ、ＩＧＦ−１Ｒのいずれか、またはその両方へのモチーフの結合を促進することができるアミノ末端またはカルボキシ末端に好ましい配列を提供する。さらに、以下に説明する延長の使用は、ＩＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはその両方への結合を可能にするその他の代替、添加または欠失を有するモチーフの使用の可能性を排除しない。
【００７０】
１．式１
任意のアミノ酸は、Ａ６のアミノ末端を延長するために使用してよいが、アミノ末端の延長部で、活性を調節するある種のアミノ酸を同定することができる。Ａ６に好ましいカルボキシ末端の延長は、Ａ６−Ｘ９３Ｘ９４Ｘ９５Ｘ９６Ｘ９７で、式中、Ｘ９３は任意のアミノ酸であってよいが、好ましくはアラニン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアルギニンから成る群から選択することが好ましく、Ｘ９４およびＸ９７は任意のアミノ酸で、Ｘ９５はグルタミン、グルタミン酸、アラニンまたはリジンであることが好ましいが、最も好ましいのはグルタミンである。しかし、Ｘ９５にグルタミン酸が存在するといくらかのＩＲ選択性がもたらされることが可能である。さらに、Ｘ９５の位置にアスパラギンまたはアスパラギン酸を有する配列を得ることができないので、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒへの十分な結合を維持または促進するためにはこれらのアミノ酸を避けるべきであることが示唆される。Ｘ９６は疎水性または脂肪族アミノ酸であることが好ましく、ロイシン、イソロイシン、バリン、またはトリプトファンであることがより好ましいが、ロイシンが最も好ましい。Ｘ９６に疎水性残基、特にトリプトファンを使用してＩＲ選択性を増強することが可能である。
【００７１】
２．式２
アミノ末端およびカルボキシ末端の延長を有するＢ６は、Ｘ９８Ｘ９９−Ｂ６−Ｘ１００で表すことができる。Ｘ９８は任意選択でアスパラギンであり、Ｘ９９は独立してグリシン、グルタミン、およびプロリンから成る群から選択したアミノ酸である。Ｘ９８のアスパラギン酸およびＸ９９のプロリンの存在は、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの両方への結合の増強に関係する。疎水性アミノ酸は、Ｘ１００のアミノ酸に好ましく、脂肪族アミノ酸はより好ましい。ＩＲに最も好ましいのはロイシンで、ＩＧＦ−１Ｒにはバリンである。負に荷電したアミノ酸は、式２Ａのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に好ましい。
【００７２】
３．式３
式３のアミノ末端の延長は、Ｘ１０１Ｘ１０２Ｘ１０３−ｒｅｖＢ６と定義され、式中、Ｘ１０３は疎水性アミノ酸、好ましくはロイシン、イソロイシンまたはバリンであり、Ｘ１０２およびＸ１０１は好ましくは極性アミノ酸であり、より好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒへの結合を促進するために有用となり得る。式３のカルボキシ末端のアミノ酸に好ましいものは明らかではない。
【００７３】
４．式１０
好ましい一実施形態では、式１０の配列ＷＸ１２３ＧＹＸ１２４ＷＸ１２５Ｘ１２６（配列番号１５４３）には配列ＤＳＤを含むアミノ末端の延長および／または配列ＥＱＬＤ（配列番号１５９８）を含むカルボキシ末端が含まれ得る。
【００７４】
Ｃ．ＩＲ結合選択性
前述したように、本発明のモチーフを含むアミノ酸配列は、モチーフの特定またはそれらに隣接する領域の特定の位置に適切なアミノ酸を選択することによって、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒのいずれかに対する選択性を高めるように構築することができる。ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに好ましいアミノ酸を提供することによって、本発明は非同族受容体での活性を最小限に抑えるアミノ酸配列を構築する手段を提供する。たとえば、ＩＲに対する親和性および活性が高く、ＩＧＦ−１Ｒに対する親和性および活性が低い本明細書で開示したアミノ酸配列は、所望しない細胞増殖、ＩＧＦ−１アゴニストの活性を促進する傾向が減少しているのでＩＲアゴニストとして望ましい。特異的配列のＩＧＦ−１Ｒ結合親和性に対するＩＲ結合親和性の比を図１Ａ〜１Ｏ、２Ａ〜２Ｅ、３Ａ〜３Ｅ、４Ａ〜４Ｉ、４４Ａ〜４４Ｂに挙げる。インシュリン治療薬としては、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒ結合親和性比は、１００以上が好ましい。反対に、ＩＧＦ−１Ｒ治療薬として使用するためには、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒ比は、０．０１未満であるべきである。選択的にＩＧＦ−１Ｒに結合するペプチドの例を以下に示す。
【００７５】
2005505579.tif 000002
2005505579.tif 000003
2005505579.tif 000004
2005505579.tif 000005
【００７６】
ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒへの相対的結合の他に、同族受容体への相対的効果もまた有効な治療薬を選択するために重要な考慮点である。したがって、ＩＲで効果的であるが、ＩＧＦ−１Ｒではほとんど、またはあまり顕著な活性を有さない配列はまた、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒでの相対的結合親和性にかかわりなく、重要なＩＲ治療薬と見なすことができる。たとえば、ＩＲに対するＡ６の選択性は、位置Ｘ９５のカルボキシル末端の延長にグルタミン酸を含めることによって増強することができる。Ｂ６モチーフのＩＲ選択性は、Ｘ１１にトリプトファンまたはフェニルアラニンを有することによって増強することが可能である。Ｘ１３のトリプトファンはまた、ＩＲの選択性を支持する。Ｘ１３のトリプトファンアミノ酸はまた、この位置のロイシンよりもＩＲの選択性を増強するために使用することが可能である。逆向きＢ６モチーフでは、Ｘ１５の大きなアミノ酸がＩＲ選択性を支持する。逆に、小さなアミノ酸はＩＧＦ−１Ｒへの選択性を与えることが可能である。Ｆ８モチーフでは、Ｘ２３の位置のＬは、ＩＲ結合に本質的に欠かせない。さらに、Ｘ３１のトリプトファンはまた、非常に好ましい。Ｘ３２では、グリシンはＩＲ選択性に好ましい。
【００７７】
Ｄ．ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの複数の結合部位
本明細書で開示した競合データによって、少なくとも２個の別々の結合部位がＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒ上に存在し、本発明によって提供した異なる配列モチーフを認識することが明らかになった。
【００７８】
図６に示したように、競合データによって、Ａ６モチーフを含むペプチドはＩＲ上の同一部位（部位１）に競合して結合し、一方Ｄ８モチーフは第２の部位（部位２）に競合することが示される。ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒ上の別々の結合部位に結合するペプチドを同定することによって、その活性を増大または減少させるＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒへの様々な結合機構がもたらされる。ＩＲへのこのような機構の例を図７に例示する。
【００７９】
以下の表に、部位１または部位２に結合する、群に基づいた配列を示す。
【００８０】
2005505579.tif 000006
2005505579.tif 000007
＊＊パンニングデータ全体の分析に基づいて、それぞれの位置のアミノ酸選択性を計算してこれらの「理想的な」ペプチドを定めた。＊合成し、現在精製中のペプチド。〜  計画中のペプチド。
【００８１】
本発明の様々な態様において、部位１モチーフを含むアミノ酸配列は、ＩＲの部位１またはＩＧＦ−１Ｒの部位１に結合することが可能である。同様に、部位２モチーフを含むアミノ酸配列は、ＩＲの部位２またはＩＧＦ−１Ｒの部位２に結合することが可能である。しかし、特異的ペプチドはＩＧＦ−１ＲよりもＩＲに対して高い結合親和性を示すことが可能で、一方その他のペプチドはＩＲよりもＩＧＦ−１Ｒに対して高い親和性を示すことが可能である。さらに、ＩＲの部位１および部位２は干渉せず、すなわち、部位１結合配列はＩＲで部位２結合配列と競合しない。対照的に、ＩＧＦ−１Ｒの部位１および部位２はいくらか干渉し、アロステリック効果が示唆された。これらの態様を以下に説明した実施例に例示する。
【００８２】
Ｅ．多価リガンド
本発明は、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの異なる部位に優先的に結合するリガンドを提供する。Ａ６アミノ酸配列モチーフによって、ＩＲの部位１に対する結合がもたらされる（図６）。Ｄ８アミノ酸配列モチーフによって、ＩＲの部位２に対する結合がもたらされる（図６）。したがって、多重体リガンドを、本発明に従って、アミノ酸配列を共有結合することによって調製してもよい。多価リガンドに対して意図する目的に応じて、同一または異なる部位に結合するアミノ酸配列を一緒にして単一分子を形成することが可能である。多価リガンドを異なる受容体の同一の対応する部位、または受容体の異なるサブユニットに結合するように構築する場合、受容体に結合するリガンドのアミノ酸配列は同一または異なっていることが可能で、異なるアミノ酸配列を使用するとしても、いずれも同一部位に結合する。
【００８３】
多価リガンドは、別々に個々の部位に結合するアミノ酸配列を発現させ、次に一緒に共有結合させるか、または内部に結合するための特異的アミノ酸配列の組み合わせを含む単一アミノ酸配列として多価リガンドを発現させるかによって調製することが可能である。
【００８４】
アミノ酸配列を様々に組み合わせて一緒にして、特異的な所望する特性を備えた多価リガンドを生成することが可能である。したがって、アゴニストはアゴニストと一緒にすることが可能で、アンタゴニストはアンタゴニストと一緒にすることが可能で、アゴニストをアンタゴニストと一緒にすることも可能である。同一部位に結合するアミノ酸配列を一緒にして、多価リガンドを形成すると、複数の受容体単位と一緒に架橋できる分子を生成するために有用となり得る。多価リガンドはまた、異なる部位に結合するアミノ酸配列を一緒にするように構築することが可能である（図７）。
【００８５】
本明細書でＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒでアゴニスト特性を有するモノマーを開示した発見に関して、多価リガンドの調製は、単一分子上の複数結合部位の存在によってより望ましい薬物動態学的特性を有するリガンドを調製するために有用である。さらに、異なる部位に異なる親和性で結合するアミノ酸を組み合わせることによって、全体の能力およびＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒへのリガンドの親和性を調節する手段がもたらされる。
【００８６】
１．ハイブリッドの構築
一実施形態では、少なくとも２個のペプチドのハイブリッド（たとえば、ダイマーペプチド）を任意の適切な発現系において発現する組換え融合タンパク質として生成することが可能である。これらのポリペプチドは、リガンド結合配列の他のアミノ酸配列を含有する融合構築体、あるいはシグナル配列またはリガンド結合に関係のないその他の配列を除去した切断タンパク質として受容体に結合する。融合タンパク質の精製を容易にする配列はまた、構築体の一部として発現することが可能である。このような配列は、任意選択でその後除去して、成熟結合性リガンドを生成することが可能である。組換え体の発現によってまた、大量のリガンドを生成する手段がもたらされる。さらに、組換え体の発現を使用して、組み合わせの異なるアミノ酸配列を発現させ、これらの組み合わせの方向、すなわちアミノ末端からカルボシル末端への方向を調節することが可能である。
【００８７】
以下の一実施形態では（図２８）、ＭＢＰ−ＦＬＡＧ（登録商標）−ＰＥＰＴＩＤＥ−（ＧＧＳ）ｎ（配列番号１７７７）−ＰＥＰＴＩＤＥ−Ｅ−ＴＡＧ、ペプチドダイマーを生成する融合構築体には、マルトース結合性タンパク質アミノ酸配列（ＭＢＰ）または発現したペプチド配列のアフィニティークロマトグラフィー精製を可能にするために有用な同様の配列が含まれる。次に、この様な精製を容易にする配列にＦＬＡＧ（登録商標）を結合させて、最初の配列を除去する切断部位を提供することが可能である。次に、介在リンカーを含むダイマーが生じ、タグ配列をカルボキシル末端部分に含めて、ペプチド発現の同定／精製を容易にすることが可能である。前記に示した代表的構築体において、ＧおよびＳはグリシンおよびセリン残基で、リンカー配列を形成する。非限定的例として、ｎは１、２、３または４で、それぞれ３、６、９および１２個のアミノ酸のリンカー配列を生じることができる。
【００８８】
組換えタンパク質発現によるダイマーペプチドの生成に加えて、ダイマーペプチドはまたペプチド合成によって生成することが可能で、それによってＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ合成（Merrifield, 1997）などの合成技術を使用して完全なペプチドを構築することができる。
【００８９】
ダイマーペプチドを構築するその他の方法には、ペプチドの末端を活性化して、したがって第２のペプチドと共有結合できるリンカー分子を導入することが含まれる。このようなリンカーの例には、オキシアミノ基で活性化したジアミノプロピオン酸が含まれるが、それだけに限定されない。好ましいリンカーは、式Ｏ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＨ＝Ｏを有するジアルデヒドで、式中、ｎは少なくとも２から６であるが、好ましくは６で、長さが約２５から３０オングストロームのリンカーが生成される。その他の好ましいリンカーを表３に示す。たとえば、リンカーはカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかでモノマーに結合して、ダイマーペプチドを形成することが可能である。また、成分を逆転させることができ、すなわち、結合するペプチドに、Ｎ末端セリンの過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化、またはその他の隣接した水酸基またはアミノ基の酸化のいずれかによってアルデヒド基を備えることができ、リンカーには（たとえば、ポリエチレングリコールリンカーの末端に）２個のオキシアミノ基または還元アミノ化によって結合したアミノ基を含めることができる。
【００９０】
特定の実施形態では、部位１−部位２および部位２−部位１方向が可能である。さらに、Ｎ−末端からＮ−末端（Ｎ−Ｎ）、Ｃ−末端からＣ−末端（Ｃ−Ｃ）、Ｎ−末端からＣ−末端（Ｎ−Ｃ）、およびＣ−末端からＮ−末端（Ｃ−Ｎ）結合が可能である。したがって、ペプチドの方向は、部位１から部位２、または部位２から部位１が可能で、Ｎ−末端とＮ−末端、Ｃ−末端とＣ−末端、Ｎ−末端とＣ−末端、またはＣ−末端とＮ−末端を結合することが可能である。場合によっては、特定の方向は、その他のために、たとえば最大限のアゴニストまたはアンタゴニスト活性に好ましい可能性がある。
【００９１】
予期せぬ驚くべき結果として、モノマーサブユニットの方向および結合は２量体活性を劇的に調節することを発見した（以下の実施例参照）。特に、ある種の部位１／部位２ヘテロダイマー配列は、構成要素モノマーサブユニットの方向および結合に応じてＩＲでアゴニストまたはアンタゴニスト活性を示す。たとえば、部位１−部位２方向（Ｃ−Ｎ結合）、たとえばＳ４５３ヘテロダイマーは、ＩＲでアンタゴニスト活性を示す（図１８Ａ、表７）。対照的に、部位２−部位１方向（Ｃ−Ｎ結合）、たとえばＳ４５５ヘテロダイマーは、ＩＲでアゴニスト活性を示す可能性がある（図１８Ｄ、表７）。同様に、部位１−部位２（Ｃ−Ｎ結合）ヘテロダイマー、たとえば、Ｓ４２５およびＳ４５９は、ＩＲでアンタゴニスト活性を示すが（表７）、一方部位１−部位２（Ｃ−ＣまたはＮ−Ｎ結合）ヘテロダイマー、たとえばＳ４３２〜Ｓ４３８、Ｓ４５４およびＳ４５６はアゴニスト活性を示す（表７）。
【００９２】
組換え遺伝子発現によって、または従来の化学的結合技術によって生成して、様々なアミノ酸配列を様々な長さのリンカーによって結合することができる。結合した配列を組換えによって、約４オングストロームの平均アミノ酸鎖長に基づいて発現する場合、２個のアミノ酸配列を連結するリンカーは一般的に約１２から約４８Åに対応する約３個から約１２個の範囲のアミノ酸である。したがって、結合する配列の間の好ましい距離は、約２から約５０Åである。より好ましくは４から約４０である。アミノ酸配列の間のリンカーの柔軟性の程度は、リンカーを構築するために使用するアミノ酸の選択によって調節することができる。グリシンとセリンの組み合わせは、柔軟で、比較的非制限的なリンカーの生成に有用である。より堅いリンカーは、結合配列内により複雑な側鎖を有するアミノ酸を使用して構築することができる。
【００９３】
２．特異的ダイマーの特性決定
いずれもＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒの同一部位に対して高い親和性で結合するモノマーサブユニット（たとえば、部位１−部位１または部位２−部位２）、またはＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒの異なる部位に結合するモノマーサブユニット（たとえば、部位１−部位２または部位２−部位１）を含む特異的ダイマーを本明細書で開示する。
【００９４】
その他のペプチドの組み合わせ本発明の範囲内で、本明細書で説明した実施例で示したように測定することが可能である。
【００９５】
Ｆ．ペプチド合成
分子生物学、タンパク質化学および免疫学における多くの従来技術を使用して本発明によるアミノ酸配列を生成することが可能である。本発明には、図１〜４、８および９および表７に示された、特に添加（たとえば、リンカーまたはスペーサー配列）、欠失、調節または修飾を含まない特異的配列が含まれる。本発明にはさらに、他の配列、調節配列、およびそれらの機能的断片を含む変種が含まれる。好ましい実施形態では、アミノ酸配列変種または断片は、参照配列の少なくとも１つの機能特性（たとえば、結合、アゴニスト、またはアンタゴニスト活性）を備えている。たとえば、変種ペプチドには、遺伝子操作した変異種が含まれ、適用の図および表に示したアミノ酸配列とは１個または複数のアミノ酸残基の添加、欠失、または代替によって異なることが可能である。調節は、参照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端の位置、またはそれらの末端の間のいかなる位置においても、参照配列のアミノ酸の間に独立して点在するか、または参照配列内に１個または複数の連続した基で生じることが可能である。さらに、変種には、本発明に従って合成または天然には生じないアミノ酸を含めることが可能である。
【００９６】
アミノ酸配列変種は保存性の変化を有することが可能で、代替アミノ酸は同一の構造または化学的特性を備えており、たとえばロイシンはイソロイシンと代替されている。滅多に起こらないが、ペプチド変種は非保存性の変化を有することが可能で、たとえばグリシンはトリプトファンと代替される。どのアミノ酸残基が結合または生物学的活性を失わずに代替、挿入または欠失することができるかを決定する指針は、当業界で周知のコンピュータプログラム、たとえばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して見いだすことができる。指針はまた、本明細書で開示したデータによって作成される。特に、図１〜４、８、９、４３、４４および表７は、特にアミノ酸配列のＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに関する機能（たとえば、結合、アゴニスト、またはアンタゴニスト活性）を維持しながら、どのアミノ酸残基が削除、添加、代替または調節できるかを教示する。
【００９７】
本発明の目的として、アミノ酸を以下の群に分ける。アルコール基を有するアミノ酸はセリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）である。脂肪族アミノ酸はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）およびメチオニン（Ｍ）である。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン（Ｆ）、ヒスチジン（Ｈ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）である。疎水性アミノ酸はアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）、およびチロシン（Ｙ）である。陰性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）である。以下のアミノ酸、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、およびトレオニン（Ｔ）は極性アミノ酸である。陽性アミノ酸は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、およびアルギニン（Ｒ）である。小アミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、およびバリン（Ｖ）である。非常に小さいアミノ酸は、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）である。折り返し形成に関与するらしいアミノ酸は、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、プロリン（Ｐ）、およびトレオニン（Ｔ）である。非限定的例として、これら定義された群それぞれのアミノ酸は、前述の式で互いに保存的代替として代替することが可能で、本明細書で説明した特異的選択に含められる。
【００９８】
前記の定義された基に示されたものよりも保存性の乏しい代替基を選択することによって、実質的に機能を変化させることができる。たとえば、調節領域におけるペプチド構造、たとえばアルファへリックス、またはベータシート構造、標的部位の分子の電荷または疎水性、または側鎖の嵩の大きさにさらに著しい影響を与える非保存的代替を行うことができる。一般的にペプチドの特性に最も大きな変化をもたらすことが予測される代替は、１）親水性残基、たとえばセリルまたはトレオニルを疎水性残基、たとえばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルによって代替すること、２）システインまたはプロリンを任意の他の残基と（または、によって）代替すること、３）正に帯電した側鎖を有する残基、たとえばリジル、アルギニル、またはヒスチジルを負に帯電した残基、たとえばグルタミルまたはアスパルチルと代替すること、または４）嵩のある側鎖を有する残基、たとえばフェニルアラニンを側鎖のない残基、たとえばグリシンと代替することである。
【００９９】
アミノ酸選択性はある種のペプチドまたは本発明のペプチド群のために同定された。たとえば、ＲＰ９、Ｄ８、および群６（式１０）ペプチドに好ましいアミノ酸を以下の表１７〜１９に示す。場合によっては、システイン対はまた好ましい可能性がある。たとえば、本明細書で説明したある種の式１および式２ではシステイン対が好ましい。本発明によれば、本発明のアミノ酸配列には、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のアミノ酸によって分離することが可能で、式１または式２モチーフ配列の内側または外側に位置することが可能な２個以上のシステイン残基を含めることが可能である。システイン残基は１７個または１８個のアミノ酸によって分離されることが好ましい。
【０１００】
１個または複数の残基が調節した（すなわち、リン酸化、硫酸化、アシル化、ＰＥＧ化など）アミノ酸配列および１個または複数の調節残基を含む変異体はまた、変種に含まれる。アミノ酸配列はまた、放射性同位元素、蛍光、および酵素標識を含めるが、それだけに限定はされない直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識で調節することが可能である。蛍光標識には、たとえば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセイン（たとえば、ＦｌｕｏｒＸ、ＤＴＡＦ、およびＦＩＴＣ）、ローダミン（たとえば、ＴＲＩＴＣ）、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルー、およびルシファーイエローが含まれる。好ましい同位体標識には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉおよび１８６Ｒｅが含まれる。好ましい酵素標識には、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼ（米国特許第３６５４０９０号、第３８５０７５２号および４０１６０４３号を参照のこと）が含まれる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの分子架橋反応によって結合することができる。酵素標識は、視覚によって検出するか、または熱量計、分光光度計、蛍光光度計、電流測定、またはガス計量によって測定することができる。アビジン／ビオチン、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ（商標））などのその他の標識系は当業界で公知で、市販されている（たとえば、ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＮＥＮ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡを参照）。
【０１０１】
１．ペプチドの組換え合成
組換えペプチドを得るために、これらのペプチドをコードするＤＮＡ配列を、当業界で周知の方法（Sambrook等、1989を参照）によって無傷宿主細胞または無細胞翻訳系で発現させるための任意の適切なベクターにクローニングすることが可能である。ベクター、宿主、または翻訳系の特定の選択は、本発明の実施に重要ではない。
【０１０２】
細菌、酵母および哺乳類ベクターを含めた多数のベクターが様々な宿主細胞または無細胞系における複製および／または発現のために報告されており、遺伝子治療並びに簡単なクローニングまたはタンパク質発現のために使用することが可能である。本発明の一態様では、発現ベクターには、本明細書で説明したような少なくとも１個の制御配列に操作可能に結合したＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストペプチドをコードする核酸が含まれる。制御配列は当業界では公知で、適切な宿主細胞で所望するタンパク質を直接発現するために選択される。したがって、制御配列という用語には、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御因子が含まれる（D.V. Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7参照）。エンハンサーおよびその他の発現制御配列は、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1983)に記載されている。発現ベクターの設計は形質移入する宿主細胞および／または発現を所望するペプチドの種類の選択などの要素に左右され得ることを理解されたい。
【０１０３】
いくつかの制御因子（たとえば、プロモーター）は単離されており、様々な宿主における異種タンパク質の転写および翻訳に効果的であることが示された。このような制御領域、単離方法、操作方法などは、当業界で公知である。細菌プロモーターの非限定的例には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）プロモーター、ラクトースプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター、ａｒａＢＡＤ（アラビノース）オペロンプロモーター、ラムダ由来Ｐ１プロモーターおよびＮ遺伝子リボース結合部位、およびｔｒｐおよびｌａｃＵＶ５プロモーターの配列から得られたハイブリッドｔａｃプロモーターが含まれる。酵母プロモーターの非限定的例には、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）プロモーター、ガラクトエピメラーゼプロモーター、およびアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ１）プロモーターが含まれる。哺乳類細胞の適切なプロモーターには、ウイルスプロモーター、たとえば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、および牛パピローマウイルス（ＢＰＶ）のプロモーターが含まれるが、限定はされない。好ましい複製および遺伝系には、Ｍ１３、ＣｏｌＥ１、ＳＶ４０、バキュロウイルス、ラムダ、アデノウイルス、ＣＥＮ  ＡＲＳ、２μｍ  ＡＲＳなどが含まれる。発現ベクターは独自に複製することが可能であるが、宿主細胞のゲノムに挿入することによってまた、当業界で周知の方法で複製することが可能である。
【０１０４】
真核細胞で発現を行うために、遺伝子発現を調節するターミネーター配列、ポリアデニル化配列、およびエンハンサー配列が必要とされ得る。遺伝子の増幅を引き起こす配列もまた、所望され得る。さらに、細菌、酵母および動物細胞を含めるが、それだけに限定されない細胞からの組換え生成物の分泌を容易にする配列、たとえば、分泌シグナル配列および／またはタンパク質前駆体またはタンパク質前駆体配列もまた、含めることが可能である。これらの配列は、当業界でよく報告されている。ＤＮＡ配列は、所望するならば、所与の宿主生物または発現系でより効果的に発現するために、最適化することができる。たとえば、コドンを調節して、所与の宿主細胞または無細胞翻訳系で良く確立された技術を使用して好ましいコドン利用に順応させることができる。
【０１０５】
コドン使用データは、入手可能な公開情報源、たとえば、http:/www.kazusa.or.jp/codon/のＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅから得ることができる。さらに、コドン選択性にしたがってヌクレオチド配列情報にアミノ酸配列情報を翻訳するコンピュータプログラム（すなわち、バックトランスレーションプログラム）は広く入手できる。たとえば、Genetics Computer Group (GCG), Accelrys, Inc., Madison, WIのバックトランスレートプログラムおよびEntelechon GmbH, Regensburg, ドイツのバックトランスレーションアプレットを参照のこと。したがって、本命書で開示したペプチド配列を使用して、当業者は翻訳系または選択した宿主細胞で最適な発現濃度をもたらす核酸を設計することができる。
【０１０６】
発現ベクターおよびクローニングベクターには、選択マーカー、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子が含まれるようである。この遺伝子が存在することによって、挿入部分を発現する宿主細胞のみの増殖が保証される。一般的な選択遺伝子は、１）抗生物質またはその他の毒性物質、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキセートなどに対する耐性を与えるタンパク質、２）栄養要求性欠乏を補足するタンパク質、または３）天然培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、たとえば桿菌用にＤ−アラニンラセミ化酵素をコードする遺伝子である。マーカーは、誘導性または非誘導性遺伝子であってよく、一般的に正の選択を可能にする。マーカーの非限定的例には、アンピシリン耐性マーカー（すなわち、ベータ−ラクタマーゼ）、テトラサイクリン耐性マーカー、ネオマイシン／カナマイシン耐性マーカー（すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミン合成酵素などが含まれる。適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、様々な宿主に適切なマーカーは当業者に理解されている。
【０１０７】
本発明で使用するための適切な発現ベクターには、ｐＵＣ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびｐＲＥＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドが含まれるが、それだけに限定されない。ベクターは、クローニングまたは発現のための１種または複数の複製遺伝系、宿主で選択するための１種または複数のマーカー、たとえば抗生物質耐性、および１種または複数の発現カセットを含むことができる。挿入するコード配列は、標準的方法によって合成したり、天然の材料から単離したり、またはハイブリッドとして調製することができる。確立された方法を使用して、コード配列を転写調節因子（たとえば、プロモーター、エンハンサー、および／またはインスレーター）および／またはその他のアミノ酸をコードする配列に連結することを実施できる。
【０１０８】
本発明で使用するために適切な無細胞発現系には、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽抽出物、イヌ膵臓ミクロソーム膜、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ３０抽出物、および共役転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が含まれるが、それだけに限定はされない。これらの系は、クローニングベクター、タンパク質コード領域および適切なプロモーター要素を含有するＤＮＡ断片またはＲＮＡ配列を添加して、組換えペプチドの発現を可能にする。
【０１０９】
適切な宿主細胞の非限定的例には、細菌、古細菌（ａｒｃｈｅａ）、昆虫、菌類（たとえば、酵母）、植物、および動物細胞（たとえば、哺乳類、特にヒト）が含まれる。特に関心が持たれるのは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａおよび不死化哺乳類骨髄細胞株およびリンパ球細胞株である。培養して哺乳類細胞を増殖させる技術は周知である（Jakoby and Pastan (著), 1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, NY参照）。通常使用される哺乳類宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株であるが、その他の細胞株、たとえば発現性が高いか、またはその他の特性をもたらすものを使用できることは当業者であれば理解されよう。
【０１１０】
宿主細胞は、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化リチウム、酢酸リチウム／ポリエチレングリコール、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、リポソームを各々媒介とするＤＮＡ取り込み、スフェロプラスト、注入、微量注入、微粒子銃、ファージ感染、ウイルス感染、またはその他の確立された方法を含む任意の適切な方法によって適切に形質転換、形質移入、または感染することができる。あるいは、関心のある核酸を含有するベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写して、得られたＲＮＡを周知の方法、たとえば注入によって宿主細胞に導入することができる（Kubo等、1988, FEBS Letts. 241:119参照）。前述の核酸を導入した細胞は、このような細胞の後代にもまた含んでいることを意味する。
【０１１１】
本発明のペプチドをコードする核酸は、本明細書で説明した組換えファージライブラリー（たとえば、ＲＡＰＩＤＬＩＢ（登録商標）またはＧＲＡＢＬＩＢ（登録商標）ライブラリー）から直接単離することが可能である。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して、鋳型として組換えファージライブラリーを用いて本発明の核酸を生成することができる。ＰＣＲで使用したプライマーは、本明細書で提供した配列情報を使用して合成することができ、さらに所望するならば、適切な新規制限部位を導入して、組換え発現用の所与のベクターへの取り込みが容易になるように設計することができる。
【０１１２】
本発明のペプチドをコードする核酸はまた、化学合成、たとえばBeaucage等、1981, Tetra. Letts. 22:1859-1862で記載されたホスホラミダイト法、またはMatteucci等、1981, J. Am. Chem. Soc., 103:3185によるトリエステル法によって生成することができ、市販の、自動オリゴヌクレオチド合成機で実施することができる。２本鎖断片は、相補鎖を合成して適切な条件下で一緒に鎖をアニーリングするか、またはＤＮＡポリメラーゼと適切なプライマー配列を使用して相補鎖を添加することによって、化学合成１本鎖生成物から得ることができる。
【０１１３】
本発明のペプチドをコードする核酸は、適切な宿主細胞で複製することによって大量に生成することができる。所望するアミノ酸配列をコードする少なくとも１０個の隣接した塩基を含む天然または合成核酸断片を、原核細胞または真核細胞に導入して複製することができる組換え核酸構築体、通常ＤＮＡ構築体に取り込ませることができる。通常、核酸構築体は、単細胞宿主、たとえば酵母または細菌での複製に適しているが、（ゲノムに組み込む、組み込まないにかかわらず）培養した哺乳類または植物または真核細胞、細胞株、組織、または生物への導入もまた目的とすることができる。本発明の方法によって生成した核酸の精製については、たとえば、Sambrook等、1989; F.M. Ausubel等、1992, Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York, NYに記載されている。
【０１１４】
これらの核酸は、ペプチドの変種または切断型ならびに特に図１〜４、８および９および表７に示した参照ペプチドをコードすることができる。ベクターまたはその他の発現媒体の核酸またはそれらの部分を適合する原核または真核宿主細胞で発現させることによって、本発明の核酸およびペプチドを大量に調製することができる。もっともよく使用される原核宿主は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ種であるが、その他の原核細胞、たとえばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓもまた使用することができる。哺乳類またはその他の真核宿主細胞、たとえば酵母、糸状菌、植物、昆虫、または両生類または鳥類もまた、本発明のタンパク質の産生に使用することができる。たとえば、昆虫細胞系（すなわち、鱗翅類宿主細胞及びバキュロウイルス発現ベクター）は、大規模タンパク質生成に特に適している。
【０１１５】
発現ベクターを有する宿主細胞（すなわち、形質転換体またはクローン）は、ベクター構築体の様式に応じたマーカー使用して選択される。このマーカーは、同一または異なるＤＮＡ分子、好ましくは同一のＤＮＡ分子に存在することが可能である。原核細胞宿主では、形質転換体は、たとえば、アンピシリン、テトラサイクリンまたはその他の抗生物質に対する耐性によって選択することができる。温度感受性に基づいた特定の生成物の産生はまた、適切なマーカーであり得る。
【０１１６】
目的によっては、ペプチドに精製を容易にする他の配列（たとえば、エピトープまたはタンパク質）タグを含めて、組換え系でペプチドを生成することが好ましい。エピトープタグの非限定的例には、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素（ＨＡ）、ポリヒスチジン（６Ｘ−ＨＩＳ）（配列番号１７７８）、ＧＬＵ−ＧＬＵ、およびＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１７７９）またはＤＹＫＤ（配列番号１５４５、ＦＬＡＧ（登録商標））エピトープタグが含まれる。タンパク質タグの非限定的例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびマルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）が含まれる。１つの取り組みとして、関心のある配列タグを備えた融合物を生成するベクターにペプチドのコード配列をクローニングすることができる。適切なベクターには、ｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびｐＭＡＬ（商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）プラスミドが含まれるが、それだけには限定されない。発現後、エピトープまたはタンパク質タグの付いたペプチドは、適切な固相マトリックスのクロマトグラフィーによって翻訳系または宿主細胞の粗溶解物から精製することができる。場合によっては、精製後エピトープまたはタンパク質タグを（すなわち、プロテアーゼ切断によって）除去することが好ましい可能性がある。
【０１１７】
細胞または細胞外溶解物などの原料から直接ペプチドを精製する方法は当業界では周知である（Harris and Angal, 1989参照）。このような方法には、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、調製用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、向流分配、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それだけに限定はされない。ペプチドは、多くの原料となり得るもの、たとえば、哺乳類、トリ、魚、および昆虫原料を含めたヒトまたは動物から得られた血漿、体組織、または体液溶解物から精製することが可能である。
【０１１８】
抗体をベースとした方法もまた、ペプチドの精製に使用することができる。それらから得られたこれらのペプチドまたは断片を認識する抗体を生成し、単離することができる。次に、ペプチドを粗溶解物から抗体結合固相マトリックスのクロマトグラフィーによって精製することができる（Harlow and Lane, 1998参照）。
【０１１９】
２．ペプチドの化学合成
あるいは、排他的固相合成、部分的固相合成、断片縮合または古典的な溶液合成を含めるが、それだけに限定されない市販の自動化方法によってペプチドを化学的に合成することができる。ペプチドは、たとえばMerrifield(1965、1997)によって記載されたような固相ペプチド合成によって調製することが好ましい。
【０１２０】
当業界で公知の方法では、ペプチドは排他的固相合成、部分的固相合成、断片縮合または古典的な溶液合成を含めるが、それだけに限定されない市販の自動化方法によって化学的に合成することができる。さらに、組換え方法およびペプチド産生合成方法を組み合わせて、半合成ペプチドを生成することができる。本発明のペプチドは、Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; 1997によって記載された固相ペプチド合成によって調製することが好ましい。一実施形態では、アルファ−アミノ末端を保護したアミノ酸で合成を実施する。不安定な側鎖を有する３官能性アミノ酸はまた、適切な基で保護して、ペプチドの組み立ての間に生じる望ましくない化学反応を防御する。アルファ−アミノ保護基はその後の反応をアミノ末端に行うために選択的に除去する。アルファ−アミノ保護基の除去条件は、側鎖保護基を除去しない。
【０１２１】
アルファ−アミノ保護基は、当業界の段階的ペプチド合成に有用であることが知られているものである。アシル型保護基、たとえば、ホルミル、トリフルオロアセチル、アセチル、芳香族ウレタン型保護基、たとえば、ベンジルカルボニル（Ｃｂｚ）、代替ベンジルオキシカルボニルおよび９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、脂肪族ウレタン保護基、たとえば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、およびアルキル型保護基、たとえば、ベンジル、トリフェニルメチルが含まれる。好ましい保護基はＢｏｃである。Ｔｙｒの側鎖保護基には、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、４−Ｂｒ−Ｃｂｚおよび２，６−ジクロロベンジルが含まれる。Ｔｙｒの好ましい側鎖保護基は、２，６−ジクロロベンジルである。Ａｓｐの側鎖保護基には、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチル、およびシクロヘキシルが含まれる。Ａｓｐの好ましい側鎖保護基は、シクロヘキシルである。ＴｈｒおよびＳｅｒの側鎖保護基には、アセチル、ベンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジルおよびＣｂｚが含まれる。ＴｈｒおよびＳｅｒの好ましい保護基はベンジルである。Ａｒｇの側鎖保護基は、ニトロ、Ｔｏｓ、Ｃｂｚ、アダマンチルオキシカルボニルおよびＢｏｃが含まれる。Ａｒｇの好ましい保護基はＴｏｓである。Ｌｙｓの側鎖保護基には、Ｃｂｚ、２−Ｃｌ−Ｃｂｚ、ＴｏｓまたはＢｏｃが含まれる。２−Ｃｌ−Ｃｂｚは、Ｌｙｓの好ましい保護基である。
【０１２２】
選択された側鎖保護基は、結合の間は無傷のままで、アミノ末端保護基の脱保護中または結合条件中に除去されない。側鎖保護基はまた、最終ペプチドを調節しない反応条件を使用して、合成完了時に除去可能でなければならない。
【０１２３】
固相合成は、通常適切な固相支持体にアルファ−アミノ保護（側鎖保護）アミノ酸を結合することによってカルボキシ末端で実施する。エステル結合は、クロロメチルまたはヒドロキシメチル樹脂に結合させるときに形成され、得られたペプチドはＣ末端に遊離のカルボキシル基を有する。あるいは、ベンズヒドリルアミンまたはｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を使用するとき、アミド結合が形成され、得られたペプチドはＣ末端にカルボキシアミド基を有する。これらの樹脂は市販されており、その調製はStewart等、1984, Solid Phase Peptide Synthesis (2nd Edition), Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記載されている。
【０１２４】
必要であれば側鎖およびアルファ−アミノ基を保護したＣ末端アミノ酸を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−カルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾールを含めた様々な活性剤を使用してベンズヒドリルアミン樹脂に結合する。樹脂支持体へ結合した後、アルファ−アミノ保護基は、ジオキサン中でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）またはＨＣｌを使用して０と２５℃との間で除去する。メチオニン導入後ジメチルスルフィドをＴＦＡに添加して、Ｓ−アルキル化の可能性を抑える。アルファ−アミノ保護基を除去した後、残存する保護アミノ酸を必要な順番で段階的に結合させて所望する配列を得る。
【０１２５】
様々な活性化剤を、ＤＣＣ，Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−カルボジイミド、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサ−フルオロホスフェート（ＢＯＰ）およびＤＣＣ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を含めた結合試薬に使用することができる。各保護アミノ酸を過剰に使用して（＞２．０等量）、結合は通常Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはＤＭＦ、ＣＨ２Ｃｌ２またはそれらの混合物中で実施する。結合反応の完了の範囲は、それぞれの段階で、たとえば、Kaiser等、1970, Anal. Biochem. 34:595によって記載されたようなニンヒドリン反応によってモニターする。不完全な結合が見いだされた場合、結合反応を繰り返す。結合反応は、市販の器具で自動的に実施することができる。
【０１２６】
所望するペプチドを完全に組み合わせた後、ペプチド樹脂を液体ＨＦなどの試薬で０℃で１〜２時間切断して、ペプチドを樹脂から切断して、側鎖保護基全てを除去する。通常アニソールなどの捕捉剤を液体ＨＦと共に使用して、切断中に形成される陽イオンをペプチドに存在するアミノ酸残基のアルキル化から防御する。ペプチド樹脂は、所望するならば切断前にＴＦＡ／ジチオエタンで脱保護することができる。
【０１２７】
固相支持体上の側鎖と側鎖の環化には、酸性アミノ酸（たとえば、Ａｓｐ）および塩基性アミノ酸（たとえば、Ｌｙｓ）の側鎖官能基の選択的切断を可能にする直交保護機構を使用する必要がある。Ａｓｐの側鎖用の９−フルオロメチル（Ｆｍ）保護基およびＬｙｓの側鎖用の９−フルオロメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基をこの目的のために使用することができる。これらの場合、Ｂｏｃ−保護ペプチド樹脂の側鎖保護基をＤＭＦに溶かしたピペリジンで選択的に除去する。環化は、ＤＣＣ、ＤＣＣ／ＨＯＢｔ、またはＢＯＰを含めた様々な活性化剤を使用して固相支持体上で実施する。ＨＦ反応は、前述したような環化ペプチド樹脂上で実施する。
【０１２８】
３．ペプチドライブラリー
本発明に従って作製し、スクリーニングしたペプチドライブラリーはＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの新規リガンドを提供するために有用である。ペプチドライブラリーは、本明細書で詳述した方法および当業界で一般的に使用可能な方法にしたがって設計してパンニングすることができる（Ｄｏｗｅｒ等の１９９８年３月３日出願米国特許第５７２３２８６号参照）。一態様では、市販のファージディスプレイライブラリーを使用することができる（たとえば、ＲＡＰＩＤＬＩＢ（登録商標）またはＧＲＡＢＬＩＢ（登録商標）、ＤＧＩ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ、Ｐｈ．Ｄ．Ｃ７Ｃ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。他の態様では、オリゴヌクレオチドライブラリーは当業界で公知の方法にしたがって調製することができ、ペプチド発現用に適切なベクターに挿入することができる。たとえば、バクテリオファージ構造タンパク質をコードするベクター、好ましくは接触可能なファージタンパク質、たとえばバクテリオファージ外殻タンパク質を使用することができる。当業者は、本発明で様々なバクテリオファージを使用できることを理解するであろうが、好ましい実施形態では、ベクターは線状バクテリオファージ、たとえば、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、Ｍ１３であるか、それらから得られたものである。特に、ｆｄ−ｔｅｔベクターは、文献で詳しく説明されている（たとえば、Zacher等、1980, Gene 9:127-140; Smith等、1985, Science 228:1315-1317; Parmley and Smith, 1988, Gene 73:305-318参照）。
【０１２９】
ファージベクターは、バクテリオファージ構造タンパク質をコードする遺伝子の５’領域に位置するクローニング部位を含有するように選択、または含有するように構築し、したがってペプチドは以下に説明したように親和性に富んだ方法で受容体に接近することができる。構造ファージタンパク質は、外殻タンパク質が好ましい。適切な外殻タンパク質の例はｐＩＩＩである。適切なベクターは、ペプチドを成熟外殻タンパク質のＮ末端からアミノ酸残基約１００個またはそれ以内の距離で発現するように、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列の定方向クローニングを行うことが可能である。外殻タンパク質は、一般的にリーダー配列を有するタンパク質前駆体として発現する。
【０１３０】
したがって、加工したバクテリオファージ外部タンパク質のＮ末端がペプチドの最初の残基であるように、すなわち、リーダータンパク質をコードする配列の３’末端と成熟タンパク質をコードする配列の５’末端または５’末端の一部との間であるように、オリゴヌクレオチドライブラリーを挿入することが好ましい。ライブラリーは、ライブラリー要素の様々な領域（および以下に説明したような任意のスペーサー）を含有するオリゴヌクレオチドを選択したクローニング部位にクローニングすることによって構築する。公知の組換えＤＮＡ技術を使用して（Sambrook等、1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989参照）、特に、１）望ましくない制限部位を除去し、所望する制限部位を添加し、２）除去した配列の正確な部分（たとえば、正確なシグナルペプチダーゼ部位）を再構築し、３）もしあるならばスペーサー残基を挿入し、かつ／または４）（必要であれば）翻訳フレームを修正して活性のある感染性のファージを生成するオリゴヌクレオチドを構築する。
【０１３１】
オリゴヌクレオチドの中心部分は、一般的に１個または複数のＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒ結合配列、および任意選択で、スペーサー配列を含有する。この配列は最終的に、組み立てたバクテリオファージ粒子の外部の接触可能な表面上において、成熟した外郭タンパク質のＮ末端と融合した、または内部にある（スペーサーを有するか、または有さない）ペプチドとして発現する。ライブラリーの大きさは、可変コドンの数にしたがって変化し、したがって、所望するペプチドの大きさも変化する。一般的に、ライブラリーの構成要素は、少なくとも約１０６、通常は少なくとも１０７で、一般的に１０８以上である。無作為なアミノ酸集団をコードする一連のコドンを形成し、最終的にベクターにクローニングするオリゴヌクレオチド集団を作製するために、（ＮＮＫ）ｘ（式中、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり（名目上は等モルである））、ＫはＧまたはＴ（名目上は等モルである）であり、ｘは一般的に約５、６、７、８またはそれ以上である）などのコドンモチーフを使用し、それによってペンタ、ヘキサ、ヘプタ、およびオクタペプチド、またはそれより大きいペプチドを生成する。したがって、ＮＮＫまたはＮＮＳは１）全てのアミノ酸をコードし、２）１つの終止コドンだけをコードし、３）コドン偏奇を６：１から３：１に減少させる。
【０１３２】
より長いペプチドでは、作製したライブラリーの大きさはクローニング過程において制約される可能性があることを理解されたい。適切な組換えベクターにおいて無作為に作製したオリゴヌクレオチド混合物からペプチドを発現させることは、当業界では公知である（Oliphant等、Gene 44:177-183参照）。たとえば、コドンモチーフ（ＮＮＫ）６は３２個のコドンを生成し、１個は１２個のアミノ酸それぞれのため、３個は５個のアミノ酸それぞれのため、３個は３個のアミノ酸それぞれのためであり、１個は（アンバー）終止コドンである。このモチーフ方法は、標準的オリゴヌクレオチド合成方法で使用できるくらい公平にコドン分配を行うことができるが、１コドン残基を含有するペプチドに対して偏りを引き起こす。特に、ヘキサコドンの完全な集合体はたった１コドンアミノ酸からなるペプチドそれぞれをコードする配列を１個であるが、たった３コドンのアミノ酸についてペプチドそれぞれをコードする配列は７２９（３６）個ある。
【０１３３】
１コドン残基に対する偏りを最小限に抑える他の試みには、２０個の活性化トリヌクレオチドの合成が含まれ、それぞれは２０個の遺伝子的にコードされたアミノ酸の１つのコドンを表す。これらは、通常の手段によって合成され、塩基および５−ＯＨ−保護基を維持しながら支持体から除去され、モノヌクレオシドの活性化に使用した方法によって（一般的に、McBride and Caruthers, 1983, Tetrahedron Letters 22:245参照）（ｂ−シアノエチル基によってリン酸を保護して）３’Ｏ−ホスホルアミダイトを添加することによって活性化する。縮重オリゴヌクレオチドは、基礎単位としてこれらのトリマーを使用して調製する。トリマーを所望するモル比で混合して、合成機に投入する。比は通常ほぼ等モルであるが、縮合したオリゴヌクレオチド集合体によってコードされたある種のアミノ酸の過剰、または過小発現を行うために、等しくない比に制御することが可能である。オリゴコドンを形成するためのトリマーの縮重は、基礎単位として活性化モノヌクレオシドを使用した従来の合成の説明と本質的に同じように実施する（たとえば、Atkinson and Smith, 1984, Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, Ed., p. 35-82参照）。この方法によって、可能性のあるペプチド配列を等しい配分で（または、制御した等しくない分配で）コードすることができるクローニング用オリゴヌクレオチド集団が作製される。有利なことに、（ＮＮＫ）６モチーフによって生じる偏りの範囲は、追加されるアミノ酸残基毎に３倍増加するので、この方法をより長いペプチド配列の作製に使用することができる。
【０１３４】
前記で定義したようにコドンモチーフが（ＮＮＫ）ｘであるとき、またｘは８と等しいとき、可能なペプチドは２．６ｘ１０１０個である。オクタペプチドのほとんどを含有するライブラリーは、作製することが困難な可能性がある。したがって、オクタペプチドのサンプリングは、可能性のある配列の約１０％までを使用したサブセットライブラリーを構築することによって実施することができ、その後組換えバクテリオファージ粒子のサブセットをスクリーニングする。所望するならば、サブセットライブラリーの多様性を拡大するために、回収されたファージサブセットに突然変異誘発を行い、次に次の段階のスクリーニングを行うことが可能である。この突然変異誘発段階は、２つの一般的方法で実施することができる。回収されたファージの可変領域を突然変異させるか、または最初の可変配列に隣接した領域に他の可変アミノ酸を添加することが可能である。
【０１３５】
初回のパンニングで見いだされた活性ペプチド（すなわち、結合剤）の周りを多様化するために、陽性ファージを配列決定して活性ペプチドの正体を決定することができる。次に、これらのペプチド配列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成することができる。主要なオリゴヌクレオチド配列にわずかな調節をもたらすために、各段階で取り込む塩基全ての濃度を低くして、合成を実施する。次に、この（少し）縮重したオリゴヌクレオチドの混合物を当業界で公知の方法によってアフィニティーファージにクローニングすることができる。この方法によって、第２ライブラリーの一部として計画的に制御して調節した開始ペプチド配列が生成する。しかし、個々の陽性ファージを突然変異前に配列決定することが必要で、したがって小数の回収されたファージの多様性を拡大するために有用である。
【０１３６】
選択ファージを多様にするその他の取り組みによって、回収されたファージの集団、またはサブセットの突然変異誘発が可能になる。この取り組みに従って、パンニングによって回収されたファージを集め、１本鎖ＤＮＡを単離する。たとえば、亜硝酸、蟻酸またはヒドラジンで処理することによってＤＮＡを突然変異させる。これらの処理によって、様々な損傷をＤＮＡにもたらす。次に、損傷を受けたＤＮＡを逆転写酵素でコピーして、損傷部位に遭遇すると間違って塩基が取り込まれる。次に、ペプチドコード配列に隣接する部位に特異的な制限酵素で切断することによって、受容体結合性ペプチドをコードする配列を含有する部分を単離する。次に、この突然変異部分を損傷を受けていないベクターＤＮＡに再クローニングして、このＤＮＡを細胞に形質転換して、公知の方法に従って第２ライブラリーを作る。一般的な突然変異誘発方法は当業界で公知である（Myers等、1985, Nucl. Acids Res. 13:3131-3145; Myers等、1985, Science 229:242-246; Myers, 1989, Current Protocols in Molecular Biology Vol. l, 8.3.1-8.3.6, F. Ausubel等著、J. Wiley and Sons, New York参照）。
【０１３７】
他の一般的取り組みでは、活性であることが見いだされたペプチドへのアミノ酸の添加は、様々な方法を使用して実施することができる。１つには、初期パンニングで選択されたペプチドの配列を個々に決定して、決定された配列に取り込まれ、縮重した配列に隣接した新規オリゴヌクレオチドを合成する。次に、これらをクローニングして第２ライブラリーを作製する。あるいは、ペプチドを有するファージ集団に第２のＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ結合配列を添加する方法を使用することができる。一方法に従って、制限部位を第１ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ結合配列の隣に挿入する。この酵素は、その認識配列の外側を切断することが好ましい。認識部位は最初の結合配列から塩基数個分離れていてよい。第２のＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ結合配列を挿入するために、ファージＤＮＡの集団を消化して、クレノウフラグメントでオーバーハングを充填することによって平滑末端にする。次に、２本鎖の、平滑末端の縮重合成オリゴヌクレオチドをこの部位に連結して、第１結合配列に並置した第２結合配列を生成する。次に、この第２ライブラリーを増幅して、前記のようにスクリーニングする。
【０１３８】
場合によっては、ある種の受容体に結合するより長いペプチドを合成することが適切であり得るが、その他の場合では、スペーサー（たとえば、リンカー）残基によって分離された２個以上のＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ結合配列を有するペプチドを提供することが望ましい可能性がある。たとえば、結合配列は、ペプチド領域を異なる方法で受容体に提示させるスペーサーによって分離することが可能である。結合領域の間の距離は、１残基と少なくてもよく、少なくとも２〜２０残基で、あるいは少なくとも１００残基までであることが可能である。好ましいスペーサーの長さは、３、６、９、１２、１５または１８残基である。大きな結合部位または直列型結合部位（たとえば、ＩＲの部位１および部位２）を探査するために、結合領域を２０個から３０個までのアミノ酸残基のスペーサーによって分離することが可能である。存在するとき、スペーサー残基の数は、一般的には少なくとも２残基で、２０残基未満であることも多い。
【０１３９】
オリゴヌクレオチドライブラリーは、スペーサー（たとえば、リンカー）によって分離された結合配列を有することが可能で、したがって式（ＮＫＫ）ｙ−（ａｂｃ）ｎ−（ＮＮＫ）ｚによって表すことが可能で、式中、ＮおよびＫは以前定義したとおりであり（以前定義したようにＳはＫで代替できることに注意されたい）、ｙ＋ｚは約５、６、７、８またはそれ以上に等しく、ａ、ｂおよびｃはスペーサーアミノ酸をコードするコドンを含む同一または異なるヌクレオチドを表し、ｎは約３、６、９または１２個まで、またはそれ以上のアミノ酸である。スペーサー残基は多少柔軟性があり、たとえば、オリゴ−グリシン、またはオリゴ−グリシン−グリシン−セリンを含み、ファージタンパク質に結合することによって比較的制約されない大きな結合部位の部位と相互反応する能力を備えたライブラリーの異なるドメインをもたらす。固いスペーサー、たとえば、オリゴ−プロリンはまた、別々に挿入するか、またはグリシンスペーサーを含めたその他のスペーサーと組み合わせることが可能である。互いに近接したＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ結合配列を有し、互いに結合配列を向き合わせるスペーサーを使用して、たとえば、配列グリシン−プロリン−グリシンのスペーサーによってもたらされように、２個の配列の間の折り返しを使用することが望ましい。このような折り返しを安定化するために、それぞれの可変領域の片端または両端にシステイン残基を添加することが望ましいか、または必要である可能性がある。システイン残基は、その後ジスルフィド結合を形成し、ループ内に一緒に可変領域を保持し、このようにしてまた、環状ペプチドに類似させることが可能である。もちろん、当業者は環化のために様々な他の種類の共有結合もまた使用できることを理解するであろう。
【０１４０】
前述のようなスペーサー残基はまた、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ結合配列の片端または両端に配置することが可能である。たとえば、ペプチドの両端にシステイン残基を備えることによって、介在スペーサーのない環状ペプチドを設計することができる。前述のように、柔軟性のあるスペーサー、たとえば、オリゴ−グリシンは、ペプチドと選択した受容体との相互作用を容易にすることが可能である。あるいは、固いスペーサーは、ペプチドをまるで固いアームの末端に存在するようにさせることが可能で、残基、たとえばプロリン残基の数は、アームの長さだけでなく、ペプチドをアームに入れる方向もまた決定する。荷電した、および／または非荷電の親水性アミノ酸（たとえば、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓなど）によって構成された親水性スペーサー、または疎水性アミノ酸（たとえば、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｌａなど）の疎水性スペーサーを使用して、ペプチドを様々な局所環境で受容体結合部位に提示することが可能である。
【０１４１】
注目すべきことは、いくつかのペプチドは、大きさおよび／または配列のために、キャリアファージの感染性に重大な欠陥を引き起こす可能性がある。これは、各回のパンニングの後の再感染および増幅の間に、集団からファージが失われる原因となる。感染性の欠陥に伴う問題を最小限に抑えるために、溶出したファージから調製したＤＮＡを適切な宿主細胞、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉに好ましくはエレクトロポレーション（たとえば、Dower等、 Nucl. Acids Res. 16:6127-6145）または周知の化学的手段によって形質転換することができる。細胞は、マーカーが発現するために十分な期間培養し、選択はＤＮＡ形質転換で一般的に行われるように適用する。コロニーを増幅して、確立した方法に従って親和性濃縮のためにファージを収穫する。親和性濃縮で同定されたファージを宿主細胞に感染させて再度増幅することが可能である。適切な抗生物質、たとえば、テトラサイクリンまたはアンピシリンで増殖させることによって、うまくいった形質転換体を選択する。これは、固体または液体増殖培地で実施することができる。
【０１４２】
固体培地での増殖では、細胞は高密度で、たとえば、選択的抗生物質を含有するＬ−寒天の大きな表面上に増殖し（ｍ２当たり約１０８から１０９個の形質転換体）、本質的に集密地を形成する。細胞および押し出されたファージは、表面から掻き取って、ファージは初回のパンニングのために調製する（Parmley and Smith, 1988, Gene 73:305-318参照）。液体培地での増殖では、細胞はＬ−ブロスおよび抗生物質中で約１０倍以上の倍加で増殖することができる（Sambrook等、1989, Molecular Cloning, 2nd ed参照）。液体培地における増殖は、ライブラリーの大きさのためにより便利で、一方固体培地での増殖は、増幅過程中に生じる偏りの機会が少ない。
【０１４３】
所望するクローンの親和性濃縮のために、一般的に約１０３から１０４個のライブラリー等価物（ライブラリー等価物は各組換え体の１つである、構成要素１０９個のライブラリーの１０４個の等価物は、１０９ｘ１０４＝１０１３ファージである）、一般的に少なくとも１０２個のライブラリー等価物、約１０５から１０６個までを所望するペプチドを探し出す受容体（またはその一部）と共にインキュベートする。受容体は、親和性濃縮機構に適したいくつかの形態の１つである。１実施例では、受容体を粒子表面上に固定し、次に一般的に当業界で公知の方法に従ってペプチドを有するファージライブラリーを固定受容体上でパンニングする。他の機構では、受容体を認識可能なリガンドに結合させる（つなぎ鎖を介して結合することが可能である）。このようなリガンドの特異的な例は、ビオチンである。受容体は、調節されているので、ファージライブラリーとインキュベートすると、溶液中の量反応物との結合が生じる。次に、得られた複合体をビオチン部分によってストレプトアビジンに結合させる。ストレプトアビジンをプラスティックプレート上または粒子上に固定することが可能で、この場合、複合体（ファージ／ペプチド／受容体／ビオチン／ストレプトアビジン）は物理的に維持される。または、ストレプトアビジンをたとえば蛍光体で標識して、検出のため、および／または蛍光活性化セルソータなどの分類方法による単離のために活性化ファージ／ペプチドにタグを付けることが可能である。
【０１４４】
非特異的相互反応によってＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに結合したファージは、洗浄によって除去する。必要な洗浄の程度および厳密性は、関心のある受容体／ペプチドそれぞれについて決定する。結合インキュベーションおよびその後の洗浄条件を調節することによって、回収されたペプチドの結合特性にある程度の制御を行うことができる。温度、ｐＨ、イオン強度、２価陽イオン濃度、および洗浄量および期間は、受容体に対するペプチドの親和性が特定の範囲内になるように選択する。ゆっくりした解離速度に基づいて選択することは、通常高い親和性が予測され、最も実際的な方法である。これは、飽和量の遊離リガンドの存在下でインキュベーションを継続すること、または量、数、および洗浄の長さを増加することにのいずれかによって実施することが可能である。それぞれの場合において、解離したペプチド−ファージの再結合を回避し、時間を長くすると、ますます高い親和性のペプチド−ファージが回収される。特定の条件下で受容体を結合するペプチドを見いだすために、結合および洗浄方法をさらなる調節を適用すること可能である。受容体分子に対していくらかの親和性および特異性をもたらすペプチド配列がわかったら、この結合モチーフ周辺の多様性を修飾することが可能である。たとえば、様々なペプチド領域を同定された配列の片端または両端に置くことが可能である。公知の配列は文献から同定するか、または本発明の状況では初回のパンニングから得ることが可能である。
【０１４５】
Ｇ．スクリーニングアッセイ
本発明の他の実施形態では、ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒで薬理学的に活性のあるリガンドを同定するスクリーニングアッセイを提供する。リガンドには数多くの化学的種類が含まれる可能性があるが、一般的には有機分子、好ましくは分子量が５０ダルトンを上回り、約２５００ダルトン未満の小さな有機化合物である。このようなリガンドには、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基、特に水素結合を含めることができ、一般的に少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２個の官能化学基が含まれる。リガンドは、環状炭素構造または複素環構造および／または１個または複数の前記官能基で代替された芳香族またはポリ芳香族構造を含むことが多い。リガンドはまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類縁体、またはそれらの組み合わせを含めた生体分子を含むことができる。
【０１４６】
リガンドには、たとえば、１）Ｉｇの付いた融合ペプチドおよびランダムペプチドライブラリー（たとえば、Lam等、1991, Nature 354:82-84; Houghten等、1991, Nature 354:84-86参照）およびＤ型および／またはＬ型立体配置のアミノ酸から成るコンビナトリアルな化学的に得られた分子ライブラリーの構成要素を含む可溶性ペプチドなどのペプチド、２）ホスホペプチド（たとえば、ランダムおよび部分的に縮重した、直接的ホスホペプチドライブラリーの構成要素、たとえば、Songyang等、1993, Cell 72:767-778）、３）抗体（たとえば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、人化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、および一本鎖抗体ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ発現ライブラリー断片、および抗体のエピトープ結合断片）、および４）小さな有機および無機分子が含まれる。
【０１４７】
リガンドは、合成または天然化合物のライブラリーを含めた多種多様な原料から得ることができる。合成化合物ライブラリーは、たとえばＭａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、ＮＨ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）から市販されている。希少化学物質ライブラリーは、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から市販されている。細菌、菌類、植物または動物抽出物を含めた天然化合物ライブラリーは、たとえば、Ｐａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ）から市販されている。さらに、数多くの手段が無作為化オリゴヌクレオチドの発現を含めた多種多様な有機化合物および生体分子の無作為な、および目的にかなった合成に有用である。
【０１４８】
あるいは、細菌、菌類、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、容易に作製することができる。分子ライブラリーの合成方法は、容易に使用できる（たとえば、DeWitt等、1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb等、1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann等、1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho等、1993, Science 261:1303; Carell等、1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell等、1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and in Gallop等、1994, J. Med. Chem. 37:1233参照）。さらに、天然または合成化合物ライブラリーおよび化合物は従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に調節することができ（たとえば、Blondelle等、1996, Trends in Biotech. 14:60参照）、コンビナトリアルライブラリーを作製するために使用することができる。他の取り組みでは、既に同定された薬物にアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの目的にかなった、または無作為な化学調節を行うことができ、類縁体はＩＲ調節活性でスクリーニングすることができる。
【０１４９】
コンビナトリアルライブラリーを作製する数多くの方法が当業界では公知で、生物学的ライブラリー、空間的に接近できる並行固相または液相ライブラリー、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法に関与するものが含まれる。生物学的ライブラリーの取り組みは、ポリペプチドまたはペプチドライブラリーに限定されるが、一方その他の４種類の取り組みはポリペプチド、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる（K. S. Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12:145）。
【０１５０】
リガンドが共通の結合部位に競合して結合するかどうかを決定するために、ライブラリーは一般的に当業界で公知の方法によって溶液中でスクリーニングすることができる。このような方法には、溶液中で（たとえば、Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ上で（Lam, 1991, Nature 354:82-84）、チップ（Fodor, 1993, Nature 364:555-556）、細菌または胞子（Ladnerの米国特許5,223,409）、プラスミド(Cull等、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869）、またはファージ上で（Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla等、1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; 上掲のLadner）ライブラリーをスクリーニングすることを含めることができる。
【０１５１】
スクリーニングアッセイが結合アッセイの場合、ＩＲ、または本明細書で開示したＩＲ結合性ペプチドの１つに標識を結合させることが可能で、この標識は検出可能なシグナルを直接的または間接的にもたらすことができる。様々な標識には、放射性同位元素、蛍光分子、化学ルミネセンス分子、酵素、特異的結合分子、粒子、たとえば、磁気粒子などが含まれる。特異的結合分子には、対、たとえばビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシンなどが含まれる。特定の結合要素として、相補的要素は通常、公知の方法にしたがって検出できる分子で標識する。
【０１５２】
様々なその他の試薬をスクリーニングアッセイに含めることが可能である。これらには、塩、天然タンパク質、たとえば、アルブミン、界面活性剤などの試薬が含まれ、最適なタンパク質−タンパク質結合を可能にし、かつ／または非特異的またはバックグラウンド相互反応を減少させるために使用される。アッセイの効率を高める試薬、たとえばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などを使用することができる。これらの成分は、必要とされる結合を引き起こす順番で添加する。インキュベーションは、最適な活性を促進する温度、一般的に４℃と４０℃との間で実施する。インキュベーション時間は、最適な活性のために選択するが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために最適化することもまた可能である。通常、０．１時間と１時間の間で十分である。一般に、複数のアッセイ混合物を異なる試験薬濃度で並行して測定し、これらの濃度に対する異なる応答を得る。一般的に、これらの濃度の１つは陰性対照で、すなわち、ゼロ濃度または検出濃度未満である。
【０１５３】
本発明にしたがって提供されたスクリーニングアッセイは、本明細書に全体を援用した国際出願ＷＯ９６／０４５５７に開示されたアッセイに基づく。簡単に説明すると、ＷＯ９６／０４５５７は、標的上の活性部位に結合し、標的にアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するレポーターペプチドの使用を開示している。これらのレポーターは、組換えライブラリーから同定され、ランダムアミノ酸配列を有するペプチドか、または無作為化した少なくとも１個のＣＤＲ領域を有する可変抗体領域（ｒＶａｂ）のいずれかである。このレポーターペプチドは、細胞組換え発現系、たとえばＥ．ｃｏｌｉ、またはファージディスプレイ（WO 96/04557 and Kay等、1996, Mol. Divers. 1(2):139-40参照、いずれも本明細書に参考として援用する）で発現することが可能である。ライブラリーから同定されたレポーターは次に、本発明に従ってそれ自体治療薬として、またはその他の分子、好ましくはレポーターと同じ特性を有し、アゴニストまたはアンタゴニスト活性をもたらす薬剤候補として開発することが可能な小さな活性分子をスクリーニングするための競合結合アッセイで使用することができる。これらの小さな有機分子は経口的に活性を有することが好ましい。
【０１５４】
インシュリンを有機小分子によって代替する異種スクリーニングの基礎となるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの競合受容体結合アッセイの基本的な様式は、以下の通りである。ＩＲの活性部位の占有は、時間分解蛍光検出（ＴＲＦＤ）によってビオチン化ペプチド（ｂＰ）に結合したストレプトアビジン標識ユーロピウム（ｓａＥｕ）で定量する。このアッセイで、ｓａＥｕはｂＰおよびＩＲと３要素複合体（すなわち、ＩＲ：ｂＰ：ｓａＥｕ複合体）を形成する。ＴＲＦＤアッセイ様式は良く確立されており、感受性が高く、定量的である（Tompkins等、1993, J. Immunol Methods 163:209-216）。このアッセイでは１本鎖抗体またはビオチン化ペプチドを使用することができる。さらに、いずれのアッセイ様式も、ＩＲの活性部位に結合するビオチン化リガンドとインシュリンの競合を忠実に表す。
【０１５５】
これらのアッセイでは、可溶性ＩＲをマイクロタイターウェルの表面上にコーティングし、ＰＢＳに溶かしたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．５％および無脂乳２％の溶液でブロックし、次にビオチン化ペプチドまたはｒＶａｂでインキュベートする。次に、未結合ｂＰを洗い流し、ｓａＥｕを受容体結合ｂＰの複合体に添加する。酸性促進溶液を添加すると、結合ユーロピウムが遊離Ｅｕ３＋として遊離し、促進溶液の成分と蛍光の強い安定な複合体を形成する。次に、ＩＲ：ｂＰ結合ｓａＥｕを高い蛍光状態に変換し、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩ（ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）などの検出器によって検出する。
【０１５６】
ファージディスプレイライブラリーはまた、前述のようにＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに結合するリガンドについてスクリーニングすることができる。これらのライブラリーの構築および分析、ならびに結合剤のバイオパンニングまたは選択の基本的な方法の詳細は、発表されている（たとえば、WO 96/04557; Mandecki等、1997, Display Technologies - Novel Targets and Strategies, P. Guttry (ed), International Business Communications, Inc. Southborogh, MA, pp. 231-254; Ravera等、1998, Oncogene 16:1993-1999; Scott and Smith, 1990, Science 249:386-390); Grihalde等、1995, Gene 166:187-195; Chen等、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1997-2001; Kay等、1993, Gene 128:59-65; Carcamo等、1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11146-11151; Hoogenboom, 1997, Trends Biotechnol. 15:62-70; Rader and Barbas, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8:503-508参照、いずれも本明細書に参考として援用する）。
【０１５７】
公知の薬剤活性化合物の模倣物質の設計は、「リード」化合物を基にした薬剤開発への既知の手法である。活性化合物を合成することが困難であるか、または高価な場合、あるいは特定の投与方法に適さない場合にこれは望ましい可能性があり、たとえば、ペプチドは消化管でプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるので、一般的に経口組成物には適さない活性剤である。模倣物質の設計、合成、および試験は、一般的に分子の標的特性を大規模スクリーニングすることを回避するために使用される。
【０１５８】
所与の標的特性を有する化合物から模倣物質を設計するためには、通常いくつかの段階が用いられる。まず、標的特性の決定に不可欠かつ／および重要な化合物の特定部分を決定する。ペプチドの場合、これはペプチドのアミノ酸残基を系統立てて変化させることによって（たとえば、各残基を次々と代替することによって）実施することができる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、「ファルマコフォア」として知られている。
【０１５９】
ファルマコフォアが発見されたら、その物理特性（たとえば、立体化学、結合、大きさ、および／または電荷）に従って、各種のデータ（たとえば、分光技術、Ｘ線回折データ、およびＮＭＲ）を使用して、構造を設計する。コンピュータ分析、（元素間の結合よりもファルマコフォアの電荷および／または量を設計する）類似性マッピング、およびその他の技術をこの設計方法に使用することができる。
【０１６０】
この取り組みの一種では、リガンドおよびその結合相手の３次元構造を設計する。これは、リガンドおよび／または結合相手が結合の構造を変化させる場合に特に有用で、模倣物質の設計においてはモデルでこのことを考慮する。
【０１６１】
次に鋳型分子を選択して、ファルマコフォアに類似した化学基をこの鋳型に繋げる。この鋳型分子およびそれに繋げられた化学基は、模倣物質が容易に合成されるように選択すると便利で、薬理学的に許容されるようであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでは分解されず、導入化合物の生物学的活性を保持している。次に、発見された模倣物質をスクリーニングして、標的特性を示す範囲を確かめ、またはそれを阻害する範囲を確かめる。次に、さらに最適化または調節を実施して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、または臨床試験用の１個または複数の最終模倣物質に到達することができる。
【０１６２】
本発明は、ＩＲおよび／またはＩＧＦ−１Ｒでアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒ特異的アミノ酸配列を提供する。本明細書で説明した方法に従って他の配列を得ることも可能である。
【０１６３】
Ｈ．本発明によって提供されるペプチドの使用
本発明によって提供されたＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒアゴニストおよびアンタゴニストは、その他のより有望な、または選択的な治療薬を同定するための導入化合物として、たとえば、競合スクリーニングアッセイによってその他の有用なリガンドを同定するためのアッセイ試薬として、さらにＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒを分析するための研究手段として、および薬剤組成物の有効な治療薬として有用である。一実施形態では、１個または複数の開示ペプチドはＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに結合するその他のリガンド（たとえば、小さな、有機分子）を同定するためのキットの成分として提供することができる。このようなキットにはまた、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ、またはそれらの機能的断片を含めることができる。このキットのペプチドおよび受容体成分は、（たとえば、放射性同位元素、蛍光分子、化学ルミネセンス分子、酵素またはその他の標識で）標識されていてよく、または標識されていなくてもよく、標識試薬も提供することが可能である。キットにはまた、緩衝液、安定剤などの周辺試薬を含めることができる。使用説明書も提供することができる。
【０１６４】
他の実施形態では、本発明によって提供されるペプチド配列は、ペプチド配列から得られ、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒの部位１および／または部位２に結合する要素を含んだ第２のペプチドライブラリーを設計するために使用することができる。このようなライブラリーを使用して、良く確立された方法で、関連出願、２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０８５２８、および２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等の米国出願番号０９／５３８０３８号に記載されたように、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒで元のペプチドの結合および／または活性を増加させるか、そうでなければ調節する配列変種を同定することができる。
【０１６５】
本発明によって提供されたＩＲアゴニストアミノ酸配列は、インシュリン類縁体として有用で、したがって糖尿病またはその他のインシュリンの応答または産生減少に関連した疾患の治療として開発することが可能である。インシュリン補給物または代替物として使用するためのアミノ酸配列には、Ｄ１１７／Ｈ２Ｃ：ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫ（配列番号：１７８０）；Ｄ１１７／Ｈ２Ｃマイナス末端リジン：ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳ（配列番号：１５５７）；Ｄ１１８：ＤＹＫＤＦＹＤＡＩＱＬＶＲＳＡＲＡＧＧＴＲＤＫＫ（配列番号：１７８１）；Ｄ１１８マイナスＦＬＡＧ（登録商標）タグおよび末端リジン：ＦＹＤＡＩＱＬＶＲＳＡＲＡＧＧＴＲＤ（配列番号：１７８２）；Ｄ１１９：ＫＤＲＡＦＹＮＧＬＲＤＬＶＧＡＶＹＧＡＷＤＫＫ（配列番号：１７３３）；Ｄ１１９マイナス末端リジン：ＫＤＲＡＦＹＮＧＬＲＤＬＶＧＡＶＹＧＡＷＤ（配列番号：１７３３の残基１〜２１）；Ｄ１１６／ＪＢＡ５：ＤＹＫＤＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰＫＫ（配列番号：１５４１）；Ｄ１１６／ＪＢＡ５マイナスＦＬＡＧ（登録商標）タグおよび末端リジン：ＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＡＧＬＣＰ（配列番号：１５４２）；Ｄ１１３／Ｈ２：ＤＹＫＤＶＴＦＴＳＡＶＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＫＫ（配列番号：１７８３）；Ｄ１１３／Ｈ２マイナスＦＬＡＧ（登録商標）タグおよび末端リジン：ＶＴＦＴＳＡＶＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳ（配列番号：１７８４）；およびＳ１７５：ＧＲＶＤＷＬＱＲＮＡＮＦＹＤＷＦＶＡＥＬＧ（配列番号：１５６０）が含まれる。好ましいペプチドダイマー配列は、Ｓ３２５、Ｓ３３２、Ｓ３３３、Ｓ３３５、Ｓ３３７、Ｓ３５３、Ｓ３７４−Ｓ３７６、Ｓ３７８、Ｓ３７９、Ｓ３８１、Ｓ４１４、Ｓ４１５およびＳ４１８によって示される（表７参照）。その他の好ましいダイマー配列は、Ｓ４５５、Ｓ４５７、Ｓ４５８、Ｓ４６７、Ｓ４６８、Ｓ４７１、Ｓ４９９、Ｓ５１０、Ｓ５１８、Ｓ５１９およびＳ５２０配列によって表される。（表７参照）。特に好ましいのは、Ｓ５１９ダイマー配列で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでインシュリンに匹敵する活性を示す（図３１Ａ〜Ｃ、３２Ａ〜Ｂ、および３３）。
【０１６６】
本発明によって提供されるＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストアミノ酸配列は、乳癌、前立腺癌、結腸癌、および卵巣癌を含めるが、それだけには限定されない癌の治療に有用である。乳癌によって亡くなる人は、毎年４００００人を超え、手術、化学療法、放射線治療、および免疫治療などの現在の治療による成功には限りがある。本明細書で開示されたＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストアミノ酸配列はまた、糖尿病性網膜炎の治療または予防に有用である。最近の報告で、既に同定されたＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストは、糖尿病性網膜炎の原因となる網膜新生血管形成を抑制できることが示された（Smith等、1999, Nat. Med. 5:1390-1395）。好ましいＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストアミノ酸配列には、ＲＰ３３−ＩＧＦおよびＲＰ３３Ｋ−ＩＧＦの配列（表２４〜２６）を含むものが含まれる。
【０１６７】
本発明によって提供されたＩＧＦ−１Ｒアゴニストアミノ酸は、脳卒中および糖尿病性神経障害を含めた神経障害の治療薬として開発するために有用である。いくつかの別々のグループの報告によって、ＩＧＦ−１Ｒは広範な脳虚血の減少に関与していることが示され、糖尿病性神経障害の治療にＩＧＦ−１を使用することが裏付けられた（Auer等、1998, Neurology 51:S39-S43; Apfel, 1999, Am. J. Med. 107:34S-42Sに概略されている）。本発明のＩＧＦ−１Ｒアゴニストペプチドは、細胞の生存を促進させ、かつ／または細胞でのアポトーシスを阻害するために有用な可能性がある。好ましいＩＧＦ−１Ｒアゴニストアミノ酸配列には、Ｇ３３、ＲＰ４８、ＲＰ６０およびＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３１−ＩＧＦ（表２７〜２９）の配列を含むものが含まれる。
【０１６８】
Ｉ．投与方法
本発明のアミノ酸は、タンパク質およびペプチドの送達および遺伝子治療で当業界で公知の標準的担体を含む薬剤組成物として投与することが可能である。好ましくは、薬剤組成物には、薬剤として（すなわち、生理的に）許容される担体、薬剤品添加物、または希釈剤、および活性成分として複数のＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒのアゴニストまたはアンタゴニストペプチドが混合して含まれる。活性成分としてペプチドを含有する薬剤組成物の調製は、当業界でよく理解されている。一般的に、このような組成物は注入物質として、液体溶液または懸濁物のいずれかで調製するが、固形製剤は溶液、または懸濁液に入れるのに適しており、液体はまた、注射前に調製することができる。調製物はまた、乳化することができる。活性治療成分は、薬剤として（すなわち、生理的に）許容され、活性成分に適合した薬剤品添加物と混合することが多い。適切な薬剤品添加物は、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望するならば、この組成物には活性成分の有効性を高める少量の湿潤剤または乳化剤、ｐＨ−緩衝剤などの補助物質を含めることができる。
【０１６９】
ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストペプチドは、中和した生理的に許容される塩の形態で薬剤組成物に製剤することができる。適切な塩には、酸添加塩（すなわち、ペプチド分子の遊離アミノ基で形成されたもの）が含まれ、それらは、たとえば、塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基によって形成された塩はまた、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。
【０１７０】
薬剤組成物は、経口または非経口経路によって全身投与することができる。非限定的な非経口投与経路には、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経皮、吸入、経鼻、動脈内、クモ膜下、経腸、舌下、または経直腸が含まれる。アミノ酸配列の性質は不安定なため、非経口投与が好ましい。好ましい投与様式には、鼻内または気管支吸収用のエアロゾル、静脈内、筋肉内、胸骨内または皮下注射用の懸濁液および経口投与用の化合物が含まれる。
【０１７１】
たとえば、静脈内投与は、単回用量を注射することによって実施することができる。本発明の薬剤組成物に関して使用したとき、「単回用量」という用語は、ヒトへの１回用量に適した物理的に区分された単位を意味しており、それぞれの単位には、必要な希釈剤、すなわち、濃縮された、または純粋な物質を希釈するために使用する液体で、その物質を使用するために正確な（希釈）濃度にする液体と関連して所望する治療効果をもたらすように計算された予め決定した量の活性物質が含まれる。注射による投与のために、組成物を滅菌溶液または懸濁液に溶かすか、または保存剤、安定化剤、および受容者の体液（すなわち、血液）と等張の溶液または懸濁液にさせるための物質を含むことが可能な、薬剤として、生理的に許容される水性または油性溶媒で、エマルジョンにすることが可能である。
【０１７２】
使用に適した薬剤品添加物は、水、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセロール、希釈エタノールなど、およびそれらの混合物である。安定剤の例は、ポリエチレングリコール、タンパク質、糖類、アミノ酸、無機酸および有機酸で、それ自体または混合物として使用できる。使用する量または分量、ならびに投与経路は、個々に決定し、当業者に公知の同種類の適用または指示で使用する量に対応する。
【０１７３】
薬剤品組成物は、製剤に適合した方法および治療有効量で投与する。投与量は治療する対象、活性成分を利用する対象の免疫系の能力、および所望するＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ活性の調節程度に左右される。投与に必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に任されており、個々の固体に特異的である。しかし、適切な用量の範囲は、固体の体重１キログラム当たり１日当たり活性ペプチド約１０から２００ｎｍｏｌであり、投与経路に左右され得る。初回投与および追加投与の適切な計画はまた、調節可能であるが、一般的に初回投与の後１時間以上の間隔でその後の注射またはその他の投与を繰り返す。あるいは、血中のピコモル濃度（たとえば、約１ｐＭから約１０ｎＭ）を維持するために十分な連続的静脈内注入も考慮される。製剤の例には、亜硫酸水素ナトリウムＵＳＰ（３．２ｍｇ／ｍｌ）、エデト酸２ナトリウムＵＳＰ（０．１ｍｇ／ｍｌ）およびｑ．ｓ．ａ．ｄ．（１ｍｌ）注射用の水の混合物にＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストペプチドが含まれる。
【０１７４】
薬剤製剤を調製する他の指針は、たとえば、Gilman等(編), 1990, Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press;およびRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA; Avis等(eds), 1993, Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Dekker, New York; Lieberman等(eds), 1990, Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Dekker, New Yorkに見いだすことができる。
【０１７５】
本発明はさらに、本明細書で説明したＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストペプチド、および生理的に許容される担体、薬剤品添加物、または希釈剤を含む組成物について考慮する。
【０１７６】
本明細書で説明した構築体はまた、１種または複数の本発明のアミノ酸配列の発現を可能にする遺伝子移入および遺伝子治療方法で使用することができる。本発明のアミノ酸配列は、遺伝子治療で使用して、それによってインシュリンの投与または発現に依らずに糖尿病を治療する代替方法を提供することができる。遺伝子治療で使用するインシュリンの発現には、前駆体生成物の発現が必要で、これはその後切断およびジスルフィド結合形成を含めたプロセシングを受けて活性生成物を形成するはずである。活性を有する本発明のアミノ酸配列は比較的小さく、したがって活性になるために複合体プロセシング段階は必要とされない。したがって、これらの配列はより遺伝子治療に適した生成物を提供する。
【０１７７】
当業界で公知の遺伝子移入系は、本発明の遺伝子治療方法を実用するために有用となり得る。これらには、ウイルスおよび非ウイルス移入方法が含まれる。ポリオーマ、すなわちＳＶ４０（Madzak等、1992, J. Gen. Virol., 73:1533-1536）、アデノウイルス（Berkner, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol, 158:39-6; Berkner等、1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia等、1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin等、1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld等、1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson等、1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet等、1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256）、ワクシニアウイルス（Mackett等、1992, Biotechnology, 24:495- 499）、アデノ関連ウイルス（Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:91- 123; Ohi等、1990, Gene, 89:279-282）、ＨＳＶおよびＥＢＶを含めたヘルペスウイルス（Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158:67-90; Johnson等、1992, J. Virol., 66:2952-2965; Fink等、1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield等、1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse等、1990, Biochem. Pharmacol. 40:2189-2199)およびトリのレトロウイルス(Brandyopadhyay等、1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos等、1992, J. Virol., 66:3391-3397）、マウス（Miller,1992, Curr Top. Microbiol. Immunol. 158:1-24; Miller等、1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge等、1984, Mol. Cell-Biol., 4:1730-1737; Mann等、1985, J. Virol., 54:401-407）およびヒト由来（Page等、1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher等、1992, J. Virol., 66:2731-2739）を含めたいくつかのウイルスは遺伝子移入ベクターとして使用されてきた。ほとんどのヒト遺伝子治療方法は、望ましいマウスレトロウイルスをベースとしてきた。
【０１７８】
当業界で公知の非ウイルス遺伝子移入方法には、リン酸カルシウム共沈（Graham等、1973, Virology, 52:456-467; Pellicer等、1980, Science, 209:1414-1422）、機械的方法、たとえば微量注入（Anderson等、1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5399-5403; Gordon等、1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7380-7384; Brinster等、1981, Cell, 27:223-231; Constantini等、1981, Nature, 294:92-94）、リポソームによる膜融合移入（Felgner等、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413-7417; Wang等、1989, Biochemistry, 28:9508-9514; Kaneda等、1989, J. Biol. Chem., 264:12126-12129; Stewart等、1992, Hum. Gene Ther. 3:267-275; Nabel等、1990, Science, 249:1285-1288; Lim等、1992, Circulation, 83:2007-2011; U.S. Patent Nos. 5,283,185 and 5,795,587）およびＤＮＡの直接取り込みおよび受容体によるＤＮＡ移入（Wolff等、1990, Science, 247:1465-1468; Wu等、1991, BioTechniques, 11:474-485; Zenke等、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3655-3659; Wu等、1989, J. Biol. Chem., 264:16985-16987; Wolff等、1991, BioTechniques, 11:474-485; Wagner等、1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:4255-4259; Cotten等、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4033-4037; Curiel等、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850-8854; Curiel等、1991, Hum. Gene Ther. 3:147-154）などの化学的技術が含まれる。
【０１７９】
多種の細胞および細胞株（たとえば、初代細胞株または確立された細胞株）および組織は、本発明の構築体を安定して形質移入するか、または受容することができる。使用可能な細胞の例には、幹細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、マクロファージ、その他の白血球（たとえば、骨髄細胞、マクロファージ、または単球）、異なる発生段階の免疫系細胞、赤血球系列細胞、膵臓細胞、肺細胞、筋肉細胞、肝細胞、脂肪細胞、神経細胞、グリア細胞、その他の脳細胞、同等の正常細胞に対応する様々な細胞系列の形質転換細胞（たとえば、Ｋ５６２、ＨＥＬ、ＨＬ６０、およびＭＥＬ細胞）、および前記の全てから得られた樹立細胞または形質転換細胞が含まれるが、それだけに限定はされない。さらに、本発明の構築体は、様々な手段によって直接組織に移入することが可能で、その細胞を含む組織に安定して組み込まれる。さらに、本発明のペプチドのＤＮＡ配列を含有する構築体は、発生の初期段階で遺伝子治療を実施するために、胚段階および胎児段階を含めた様々な発生段階の初代細胞に導入することができる。
【０１８０】
１つの取り組みとして、プラスミドＤＮＡをアデノウイルスヘキソンタンパク質に特異的な抗体と複合したポリリジンと複合させ、得られた複合体をアデノウイルスベクターに結合させる。次に、３分子複合体を使用して細胞を感染させる。アデノウイルスベクターは、ＤＮＡが損傷を受ける前にエンドソームを効果的に結合させ、内部移行し、分解させる。
【０１８１】
他の取り組みとして、リポソーム／ＤＮＡを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子移入を行う。標準的リポソーム調製では、遺伝子移入方法は非特異的であるが、局在的なｉｎ  ｖｉｖｏでの取り込みおよび発現は、たとえば、直接ｉｎ  ｓｉｔｕで投与した後の腫瘍堆積物で報告されている（Nabel, 1992, Hum. Gene Ther. 3:399-410）。
【０１８２】
適切な遺伝子移入ベクターは、プロモーター配列、好ましくは細胞特異的で発現させる配列の上流に位置するプロモーターを有する。このベクターはまた、任意選択で、ベクターに含まれる核酸配列がうまく形質移入し、発現したことを示すものとして、発現用の１種または複数の発現可能なマーカー遺伝子を含むことが可能である。さらに、ベクターは望ましくない免疫原性を最小限に抑え、所望する遺伝子生成物の長期発現を最大限にするために最適化することができる（Nabe, 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:324-326参照）。さらに、ベクターは、治療のために標的とする細胞の種類に基づいて選択することができる。
【０１８３】
宿主細胞のトランスフェクションまたは感染のための媒体またはベクター構築体の例には、複製に欠陥のあるウイルスベクター、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス（レトロウイルス）ベクター、たとえば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびアデノ関連ウイルスベクターが含まれる。アデノ関連ウイルスベクターは１本鎖で、効率的に複数コピーの核酸を細胞核に送達させる。好ましいのはアデノウイルスベクターである。通常、ウイルスはいかなる原核ＤＮＡも実質的に含まず、いくつかの異なる機能的核酸配列を含むことができる。このような機能的配列の例は、プロモーター（たとえば、強力なプロモーター、誘導性プロモーターなど）および宿主細胞で活性のあるエンハンサーを含めた転写および翻訳開始および終止制御配列を含むＤＮＡ領域であることが可能である。機能的配列の一部としてまた、関心のあるタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ポリヌクレオチド配列）が含まれる。部位特異的組み込みのために隣接する配列もまた含めることができる。状況によっては、５’隣接配列は相同的組換えが可能で、したがって、たとえば転写濃度を増加または減少させる誘導性または非誘導性転写をもたらすために、転写開始領域の性質を変化させる。
【０１８４】
一般的に、コードされ発現したペプチドは、細胞内、すなわち細胞質、核、または細胞小器官に保持されているか、または細胞によって分泌されることが可能である。分泌するために、シグナル配列をペプチド配列に融合させることができる。既に説明したように、マーカーはベクター構築体を含有する細胞で分泌させるために存在させることが可能である。マーカーは誘導性または非誘導性の遺伝子で、一般的に誘導下、または非誘導下それぞれにおいて、陽性選択を可能にする。マーカー遺伝子の例には、ネオマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミン合成酵素などが含まれる。使用したベクターはまた、当業者によって通常使用されるように、一般的に複製起点および宿主細胞での複製に必要なその他の遺伝子を含む。一例として、複製起点を含む複製系および特定のウイルスによってコードされたる製関連タンパク質は、構築体の一部として含まれる。複製に必要な生成物をコードする遺伝子が最終的に細胞に形質転換されないように複製系を選択すべきである。このような複製系は、複製欠損アデノウイルス（G. Acsadi等、1994, Hum. Mol. Genet. 3:579-584参照）およびエプスタイン−バーウイルスによって示される。複製欠損ベクター、特に複製を欠損したレトロウイルスベクターの例は、ＢＡＧ（Price等、1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:156; Sanes等、1986, EMBO J., 5:3133）である。最終的遺伝子構築体は、１種または複数の関心のある遺伝子、たとえば、生体活性代謝分子をコードする遺伝子を含むことが可能である。さらに、ｃＤＮＡ、合成的に生成したＤＮＡまたは染色体ＤＮＡは、当業者に公知で、実施されている方法および手法を利用して使用することができる。
【０１８５】
遺伝子治療の１つの取り組みでは、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストペプチドをコードするベクターを直接受容細胞に注射する（ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子治療）。あるいは、目的とする受容物の細胞を体外培養して、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストペプチドをコードするように遺伝子的に調節して、供与者に再度移植する（ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療）。ｅｘ  ｖｉｖｏ方法では、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子移入方法よりも優れて効果的にウイルス遺伝子が移入されるという利点がある。ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療によれば、宿主細胞をまずＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒアゴニストまたはアンタゴニストペプチドをコードする少なくとも１個の遺伝子を含有する操作ベクターで形質移入して、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水などの生理的に許容される担体または薬剤品添加物に懸濁して、次に宿主または宿主細胞に投与する。所望する遺伝子産物は注射した細胞で発現し、したがって遺伝子産物は宿主に導入される。それによって、導入された遺伝子産物は、インシュリンまたはＩＧＦ−１濃度変化に関連する障害（たとえば、糖尿病）を治療または改善するために使用することができる。
【０１８６】
説明した構築体は、薬剤調製物または薬剤として許容される担体および生理的薬剤品添加物を含有する組成物の形態で投与することが可能で、この調製物では、ベクターはヒトおよび非ヒト哺乳類を含めた関心のある受容生物の細胞、組織、または器官を標的とするウイルスベクター構築体などであり得る。この組成物は、滅菌した生理的食塩水またはその他の注射可能な水溶液などの適切な薬剤として許容される液体または溶液に成分を分散させることによって形成することができる。このような組成物で使用した成分の量は、当業者によって日常的に決定することができる。この組成物は、皮下、静脈内、筋肉内および胸骨内を含めた非経口注射経路によって投与することができる。
【０１８７】
Ｊ．癌治療薬
最近の実験では、ＩＧＲ−１Ｒノックアウトマウスの胚繊維芽細胞は、ＳＶ４０Ｔ抗原、活性化Ｈａ−ｒａｓ、活性化Ｓｒｃその他などの発癌遺伝子による形質転換に対する耐性が高いことが示された（B. Valentinis and R. Baserga, 2001, Mol. Pathol., 54:133-137）。このことによって、ＩＧＦ−１Ｒはこれらの発癌遺伝子の悪性形質転換を媒介するために必要であることが示唆された。さらに、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１Ｒは、様々な種類のヒト癌の形質転換因子として作用することが示された（前記参照）。ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２はまた、いくつかの組織の悪性形質転換において因子として関係した。ＩＧＦＢＰ（ｄｅｓ（１〜３）ＩＧＦ−１ｌ）に対する親和性が減少したＩＧＦ−１の切断型を発現するトランスジェニックマウスでは、乳腺腫瘍発症率の増加が示された（Hadsell等、2000, Oncogene 19:889-898）。さらに、乳腺でＩＧＦ−１ｌを過剰発現するマウスでは、乳腺腫瘍形成の増加が示された（Bates等、1995, Br. J. Cancer 72:1189-1193）。皮膚の基底層でＩＧＦ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスでは、表皮の過形成および自然発生腫瘍の増加促進が示された（DiGiovanni等、2000, Cancer Res. 60:1561-1570）。
【０１８８】
ＩＧＦ−１Ｒはまた、その他のホルモン受容体と関わり合うようである。エストロゲンはＩＧＦ−１Ｒの発現を増加させるように作用できることを示唆するかなりの証拠がある。このことは、ＩＧＦ−１Ｒの発現がエストロゲン受容体（ＥＲ）の発現と相関する乳癌において特に重要である。ＩＧＦ−１Ｒ発現は、ＥＲ陽性患者の腫瘍ではより高い。したがって、ＩＧＦ−１Ｒ発現は、乳癌患者の予後マーカーとして使用することができる。さらに、ＩＲＳ−１、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達カスケードにおける重要な中間体の濃度が高いことは、腫瘍の大きさおよびＥＲ陽性腫瘍を有する患者の短い無病生存率と相関している（D. Sachdev and D. Yee, 2001, Endocr. Relat. Cancer 8:197-209）。さらに、抗エストロゲン治療によって、ＩＧＲ−１ＲおよびＩＲＳ−１の発現が減少することが示された（Chan等、2001, Clin. Cancer Res. 7:2545-2554）。したがって、ＩＧＦ−１ＲとＥＲとの関わり合いは、複雑な可能性がある。さらに、ＩＧＦシグナル伝達は、乳腺における悪性形質転換を促進することが明らかである。興味深いことに、ＩＧＦ−１で処理したＥＲ陽性ＭＣＦ−７細胞は、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の活性化の持続および血清欠乏によって誘導されたアポトーシスに対する防御が示された。対照的に、ＥＲ陰性ＭＤＡ−ＭＢ細胞は、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路の一時的な活性化のみが示された（Bartucci等、2001, Cancer Res. 61:6747-6754）。
【０１８９】
研究によってまた、ＩＧＦ−１Ｒ媒介シグナル伝達とＥｒｂＢ受容体による上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）誘導シグナル伝達の間の関係が明らかになった。ＩＧＦ−１ＲおよびＥｒｂＢ−２（Ｎｅｕ／Ｈｅｒ２）は、ヘレグリンまたはＩＧＦ−１の刺激によって誘導されるヘテロオリゴマーを形成することが認められた（Balana等、2001, Oncogene, 19:34-47, 2001）。グリア芽細胞種では、ＥｒｂＢ受容体チロシンキナーゼの化学阻害剤に対する耐性は、ＩＧＦ−１Ｒ発現の増加および構成的ＰＩ３Ｋシグナル伝達と相関していた（Chakravarti等、2002, Cancer Res. 62:200-207）。ＥｒｂＢ−２の過剰発現している乳癌細胞株では、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の増加が抗ＥｒｂＢ−２受容体モノクローナル抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）／ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの存在下で認められた（Lu等、2001, J. Natl. Cancer Inst. 93:1852-1857）。
【０１９０】
様々な悪性細胞におけるＩＧＦシグナル伝達を調節することによって、癌ではＩＧＦ−１Ｒが関与していることの証拠がさらにもたらされた。アンチセンスＲＮＡによるＩＧＦ−１Ｒの阻害によって、頸部癌細胞における形質転換表現型が減少した。ＩＧＦ−１Ｒのアンチセンスはまた、ヌードマウスにおけるグリア芽細胞種およびメラノーマ異種移植を阻害した（Resnicoff等、1994, Cancer Res. 54:4848-4850; Resnicoff等、1994, Cancer Res. 54:2218-2222; Nakamura等、2000, Cancer Res. 60:760-765, 2000）。実験によってまた、ＩＧＦ−１Ｒは転移表現型の発生および維持に関与することが示された。特に、ＥＲ陽性乳癌細胞においてＩＧＦ−１Ｒ（４８６終止）の優性陰性変異体が多く発現すると、細胞の接着性、浸潤、および転移が阻害されることが示された（Dunn等、1998, Cancer Res. 58:3353-3361）。さらに、肺癌細胞は、ＩＧＦ−１Ｒの過剰発現に続いて転移表現型の増大を示した（Long等、1998, Exp. Cell Res. 238:116-121）。さらに、ＩＧＦ−１Ｒの活性化は、アポトーシス経路を阻害することが示された。乳腺におけるアポトーシスは、ＩＧＦ−１トランスジェニックマウスにおいて阻害された（Hadsell等、2000, Oncogene 19:889-898）。さらに、アンチセンス方法または優性陰性変異体のいずれかによるＩＧＦ−１Ｒ機能の発現低下は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の大量アポトーシスを引き起こした。ＩＧＦ−１はまた、ｃ−ｍｙｃ発癌遺伝子による形質転換に関連したアポトーシスおよび化学療法剤によって誘導されたアポトーシスを阻害することが示された。ＩＧＦ−１の抗アポトーシスシグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路によるものであるが、その他の経路が同様の効果をもたらすことが可能である（Butt等、1999, Immunol Cell Blol. 77:256-262; B. Valentinis and R. Baserga, 2001, Mol. Pathol 54:133-137）。
【０１９１】
これらの観察を総合すると、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−１Ｒのアンタゴニストまたは阻害剤の同定の重要性が示される。モノクローナル抗体、アンチセンス方法、および天然リガンドから得られたペプチド断片を使用してＩＧＦ−１Ｒの臨床的に適切な阻害剤を開発する試みがなされた（Dunn等、1998, Cancer Res. 58:3353-3361; Z. Pietrzkowski等、1992, Cancer Res. 52:6447-6451; Z. Pietrzkowski等、1993, Cancer Res. 53:1102-1106; Rubini等、1999, Exp. Cell Res. 251:22-32）。他の手法を使用して、本発明は、１種または複数の癌を診断、治療およびモニターで使用できるＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストペプチド、またはそれらの小分子模倣物質を含む方法、キット、および組成物（たとえば、薬剤組成物）を提供する。場合によっては、本発明の組成物、方法、およびキットはまた、ＩＧＦに関連した病状（たとえば、癌）の予後を測定するために使用することができる。有利なことに、本明細書で開示されたある種のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストペプチドは、ＩＧＦ−１受容体の部位１または部位２に特異的である。
【０１９２】
本発明によれば、非限定的癌の種類には、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および混合型の癌、たとえば、腺扁平上皮癌、中胚葉混合腫瘍、癌肉腫、および奇形癌が含まれる。代表的な癌には、膀胱癌、肺癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、頭部および頸部癌、前立腺癌、およびメラノーマが含まれるが、それだけに限定はされない。具体的には、ＡＩＤＳ関連癌（たとえば、カポシ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫）、骨癌（たとえば、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫および関連の癌）、および血液学的／血液癌（たとえば、成人リンパ芽球性白血病、小児急性リンパ芽球性白血病、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、慢性リンパ球白血病、慢性骨髄性白血病、毛様細胞性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人ホジキン病、小児ホジキン病、妊娠中のホジキン病、菌状息肉腫、成人非ホジキンリンパ種、小児非ホジキンリンパ腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ワルデンストレーム大グロブリン血症、多発性骨髄腫／プラズマ細胞新生物、異形成脊髄症候群、および骨髄増殖性疾患）が含まれる。
【０１９３】
脳癌（たとえば、成人脳腫瘍、小児脳幹膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児小脳星状細胞腫、小児上衣細胞種、小児神経髄芽細胞種、テント上原始神経管外胚葉および松果体、および小児視覚路および視床下部神経膠腫）、消化管／胃腸癌（たとえば、肛門癌、肝臓外胆管癌、胃腸カルチノイド腫瘍、結腸癌、食道癌、胆嚢癌、成人原発肝癌、小児肝癌、膵臓癌、直腸癌、小腸癌、および胃癌）、筋骨格癌（たとえば、小児横紋筋肉腫、成人軟部組織肉腫、小児軟部組織肉腫、および子宮肉腫）および内分泌性癌（たとえば、副腎皮質癌、胃腸カルチノイド腫瘍、島細胞癌（膵臓内分泌腺）、副甲状腺癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、および甲状腺癌）もまた含まれる。
【０１９４】
さらに、神経癌（たとえば、神経芽細胞腫、下垂体腫瘍、および原発性中枢神経系リンパ腫）、目の癌（たとえば、眼内メラノーマおよび網膜芽種）、泌尿器癌（たとえば、膀胱癌、腎（腎細胞）癌、陰茎癌、移行細胞腎盂および尿管癌、睾丸癌、尿道癌、ウィルムス腫瘍およびその他の小児腎腫瘍）、呼吸／胸部癌（たとえば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫および悪性胸腺種）、胚細胞癌（たとえば、小児頭蓋外胚細胞種および生殖腺外胚細胞種）、皮膚癌（たとえば、メラノーマ、およびメルケル細胞種）、婦人科癌（たとえば、子宮頚癌、子宮内膜癌、妊娠栄養膜腫瘍、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞種、卵巣低悪性度腫瘍、子宮肉腫、膣癌、および外陰癌）および未知の原発癌が含まれる。
【０１９５】
特異的な乳癌には、非浸潤性癌、たとえば非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、分泌管内癌非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、乳頭癌およびコメド癌、または浸潤性癌、たとえば、腺癌、または癌、たとえば、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、浸潤性乳管および小葉癌、髄様癌、粘液性（コロイド）癌腫、コメド癌、パジェット病、乳頭癌、管状癌、および炎症性癌が含まれるが、それだけに限定はされない。具体的な前立腺癌には、腺癌および肉腫、または前癌状態、たとえば前立腺上皮内腫瘍形成（ＰＩＮ）を含めることができる。具体的な肺癌には、気管支カルチノイド（気管支腺種）、軟骨種過誤腫（良性）、孤立リンパ腫、および肉腫（悪性）腫瘍などの腫瘍に関連するもの、ならびに多病巣性リンパ腫に関連する肺癌が含まれる。気管支癌は、扁平上皮癌、小細胞癌、非小細胞癌、または腺癌として存在することが可能である。
【０１９６】
本発明のＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストペプチドは、独立して、またはその他のＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストまたは阻害剤と組み合わせて投与することが可能である。あるいは、開示したＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストペプチドは、その他の癌治療法、たとえば、手術、照射、生物応答調節、免疫治療、ホルモン治療、および／または化学療法と組み合わせて使用することができる。前立腺癌のための化学療法薬の非限定的例には、ドセタキセル、パクリタキセル、エストラムスチン、エトポシド、ビンブラスチン、ミトキサントロン、およびパクリタキセルが含まれる。乳癌のための化学療法薬および生物剤の非限定的例には、シクロホスファミド、メソトレキセート、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、タモキシフェン、パクリタキセル、ドセタキセル、ナベルビン、カペシタビン、マイトマイシンＣ、インターフェロン、インターロイキン−２、リンパ球活性化キラー細胞、腫瘍壊死因子、およびモノクローナル抗体（たとえば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体に対するｍＡｂ（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））が含まれる。肺癌の化学療法薬および生物剤の非限定的例には、白金化合物（たとえば、シスプラチンまたはカルボプラチン）、ビンカアルカロイド（たとえば、ビノレルビン、ビンクリスチンまたはビンブラスチン）、タキシン（たとえば、ドセタキセルまたはパクリタキセル）および様々なトポイソメラーゼ阻害剤が含まれるが、それだけに限定はされない。
【実施例】
【０１９７】
本明細書で説明した実施例は、本発明の様々な態様を例示することを意味し、本発明をいかなる方法においても限定するものではない。
【０１９８】
以下の物質は、以下に説明した実施例で使用した。可溶性ＩＧＦ−１ＲはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、カタログ番号３９１−ＧＲ／ＣＦ）から入手した。インシュリン受容体は、Ｂａｓｓ等、１９９６に従って調製した。インシュリンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号１−０２５９）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒのいずれかから入手した。ＩＧＦ−１Ｒは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから入手した（カタログ番号１００−１１）。合成ペプチドは、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、ＡｎａＳｐｅｃ．Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、ＰｅｐｔｉｏＧｅｎｉｃｓ（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）またはＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって＞８０％の純度で合成された。Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｐｌａｔｅは、Ｆｉｓｈｅｒを介してＮＵＮＣから入手した（カタログ番号１２５６５３４７）。ＨＲＰ／抗Ｍ１３複合体は、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手した（カタログ番号２７−９４２１−０１）。ＡＢＴＳ溶液は、ＢｉｏＦ／Ｘから入手した（カタログ番号ＡＢＴＳ−０１００−０４）。
【０１９９】
（実施例１）
モノマーおよびダイマーペプチド
Ａ．クローニング
モノマーおよびダイマーペプチドを構築して、ＩＭＰＡＣＴ（商標）−ＣＮシステム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のｐＴＹＢ２ベクターを使用してキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）との融合タンパク質として発現させた。ｐＴＹＢ２ベクターは、ＤＴＴを添加すると自己切断を開始するタンパク質スプライシング因子（インテインと称する）をコードする。インテイン自己切断は、親和性タグからダイマーを分離して、精製を可能にする。
【０２００】
ｐＴＹＢ２構築体では、ペプチド配列のＣ末端はインテイン／ＣＢＤ配列のＮ末端と融合した。２個のペプチド隣接エピトープタグには、Ｎ末端の短縮ＦＬＡＧ（登録商標）およびＣ末端のＥタグが含まれた。この融合物は、インテイン／ＣＢＤコードするベクター断片を関心のあるペプチドをコードするＰＣＲ生成物と連結することによって作製した。
【０２０１】
ベクター断片は、ｐＴＢＹ２ベクターを適切な制限部位で消化することによって得られた。消化したＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで分離し、切り出して、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）によって精製した。標的タンパク質のＰＣＲ生成物を得るために、適切な配列にアニーリングするプライマーを合成した。ベクターと挿入物を１５℃で一晩連結させた。連結生成物はＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製して、エレクトロポレーションはＤＮＡ  １０ｎｇおよびＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１  ４０μｌを含有するエレクトロポレーションキュベット（ギャップ  ０．１ｍｍ、容量  ０．５ｍｌ）において１５００Ｖで実施した。
【０２０２】
エレクトロポレーション直後に、グルコース  ２％を含有する予備加温した（４０℃）２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴ−Ｇ）１ｍｌを形質転換体に添加した。形質転換体は３７℃で１時間増殖させ、次に２ｘＹＴ−ＡＧ上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。個々のクローンを単離して、２ｘＹＴ−Ｇに接種するために使用した。培養は３７℃で一晩行った。プラスミドＤＮＡを培養物から単離して、正確な構築体が得られたことを確認するために配列決定を実施した。
【０２０３】
Ｂ．ペプチド−ＣＢＤ融合タンパク質の小規模発現
ペプチド−ＣＢＤ融合タンパク質をコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）は、２ｘＹＴ−ＡＧにおいて３７℃で撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）一晩増殖させた。翌日、培養物を使用して培地（２ｘＹＴ−Ｇ）に接種して、ＯＤ６００  ０．１を得た。ＯＤ６００が０．６に達したら、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度０．３ｍＭで添加して、融合タンパク質の発現を誘導した。細胞は、３時間増殖させた。翌日、遠心によって細胞をペレットにして、細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した。正確な分子量の融合タンパク質の産生は、モノクローナル抗体抗Ｅ−Ｔａｇ−ＨＲＰ複合体を使用したウェスタンブロット分析によって確認した（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０２０４】
Ｃ．可溶性ペプチド−ＣＢＤ融合タンパク質の大規模発現および精製
融合タンパク質をコードするプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５６６を２ｘＹＴ−ＡＧ培地で撹拌しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で８時間増殖させた。培養物を２Ｌ量の２ｘＹＴ−Ａで希釈し直してＯＤ６００  ０．１を実現した。ＯＤ６００が０．５に達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで添加した。細胞を３０℃で一晩増殖させた。翌日、細胞を遠心によって単離した。細胞ペレットの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、次にマウスモノクローナル抗体抗Ｅ−Ｔａｇ−ＨＲＰ複合体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用したウェスタンブロット分析を行って発現した生成物を視覚化して分析した。
【０２０５】
Ｄ．精製
細胞ペレットは超音波によって機械的に、または弱い界面活性剤で化学的に処理することによって粉砕した。細胞残渣を遠心によって除去した後、透明な溶解物中の可溶性タンパク質をクロマトグラフィー精製用に適切な開始緩衝液での希釈または透析によって調製した。ＣＢＤ融合物はキチンアフィニティークロマトグラフィーによって製造者の指示に従って（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）精製した。溶解物をキチンアフィニティーカラムに添加して、カラムを１０倍量のカラム緩衝液で洗浄した。総容積の３倍量のＤＴＴ含有切断緩衝液をカラムに添加して、カラムを一晩インキュベートした。翌日、ＤＴＴを含まない切断緩衝液を流し続けることによって標的タンパク質を溶出した。精製したタンパク質の純度および強度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび標準的方法によるウェスタンブロット分析によって分析した。
【０２０６】
（実施例２）
ＰＥＧをベースとした２量体ペプチド
Ａ．アルデヒド含有ペプチドの合成
このペプチドは、Ｒｉｎｋ  ａｍｉｄｅ  Ｔｅｎｔａｇｅｌ（０．２１ｍｍｏｌ／ｇ）での段階的固相合成によって合成した。３等量のＦｍｏｃ−アミノ酸を使用した。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨをＮ末端ペプチドに結合させるか、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）を選択的に保護したリジン側鎖に結合させるかによって、セリン残基をペプチドに導入した。次に、ペプチドを脱保護して、ＴＩＳ（トリイソプロピルシラン）を含有する９５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、水溶液）で処理することによって樹脂から切断した。２０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）−８０％リン酸緩衝液  ｐＨ７．５（４５μｌ／μｍｏｌ  ペプチド）に溶かした２等量のＮａＩＯ４を室温（ＲＴ）で５分間使用する過ヨウ素酸酸化によって、２−アミノアルコール部分がα−オキソアシル基に変換された。酸化の直後に、ペプチドを精製した。
【０２０７】
Ｂ．ＰＥＧをベースとしたダイマーの合成
未保護の酸化ペプチド（４．２等量）は、ＤＭＳＯ  ９０％−ＮａＯＡｃ緩衝液  ２０ｍＭ、ｐＨ５．１  １０％に溶かしたジオキシアミノ−ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−リンカー（１等量）で２量体化した（４．２μｌ／μｍｏｌペプチド）。この溶液を３８℃で１時間放置して、反応の進行はＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱着／イオン化質量分析計）によってモニターした。この後、粗ダイマーを半分取ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって精製した。
【０２０８】
様々なリンカーの分子量および挿入ペプチド距離は以下の表３に示す。
【０２０９】
2005505579.tif 000008
2005505579.tif 000009
【０２１０】
（実施例３）
インシュリン受容体結合の決定
ＩＲを様々な濃度の試験物質で１２５Ｉ標識インシュリンと共にインキュベートして、Ｋｄを計算した。この方法では、ヒトインシュリン受容体（ＨＩＲ）またはヒトＩＧＦ−１受容体（ＨＩＧＦ−１Ｒ）は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で可溶化した後に形質移入細胞から精製した。アッセイ緩衝液は、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）１００ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）  ０．５％、ガンマグロブリン  ０．２％およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０２５％を含有した。１２５Ｉ標識リガンド（ＴｙｒＡ１４−１２５Ｉ−ＨＩまたはＴｙｒ３１−１２５Ｉ−ＩＧＦ１）の２０００ｃｐｍ（３ｐＭ）の３０〜６０％が結合するように受容体濃度を選択して、試験物質の希釈系列を添加した。４℃で２日間平衡化させた後、各試料（２００μｌ）に２５％  ＰＥＧ６０００  ４００μｌを添加することによって沈殿させ、遠心して、１５％  ＰＥＧ６０００  １ｍｌで洗浄して、ガンマカウンタで計数した。
【０２１１】
インシュリン／ＩＧＦ−１競合曲線は、１部位結合モデルに合致しており、受容体濃度、インシュリン親和性、および非特異的結合について計算した変数を試験物質の結合定数の計算に使用した。インシュリン競合の代表的曲線を図１０Ａ〜１０Ｃ、１１Ａ〜１１Ｄに示す。定量データは以下の表４に示す。
【０２１２】
表４は、ＲＰ９モノマーペプチドおよび様々なＲＰ９モノマー切断型のＩＲ親和性を示す。結果は、ＲＰ９のＮ末端配列（ＧＳＬＤ、配列番号１７８５）およびＣ末端配列（ＬＧＫＫ、配列番号１７８６）は実質的にＨＩＲ結合親和性に影響を及ぼすことなく除去できることを示している（表４）。
【０２１３】
2005505579.tif 000010
【０２１４】
図１０Ａ〜１０Ｃは、部位１−部位２ヘテロダイマーペプチド５３７、５３８および５３９は対応するモノマー（Ｄ１１７および５４０）およびホモダイマー（５２１および５３５）よりも実質的に高い親和性で（数桁の規模で）ＩＲに結合したことを示している。図１１Ａ〜１１Ｄは、部位１−部位２ヘテロダイマーペプチド、５３７および５３８がモノマーペプチドＤ１１７よりも著しく高い親和性でＩＲに結合したことを示している。
【０２１５】
（実施例４）
インシュリンアゴニスト活性を測定するための脂肪細胞アッセイ
インシュリンは３Ｈグルコースの脂肪細胞への取り込みおよび脂質への変換を増大させる。３Ｈの脂質相への取り込みは、脂質相をシンチレーション混合物に分配し、水溶性３Ｈ生成物を除去することによって測定された。最大下のインシュリン投与量での３Ｈグルコースの取り込みに対する化合物の影響を測定し、結果は完全なインシュリン応答に対する増加として表した。この方法は、Moody等、1974, Horm. Metab. Res. 6(1):12-6を適合化させた。
【０２１６】
マウス精巣上体脂肪体を切除して、消化緩衝液（クレブス−リンガー  ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ、ＨＳＡ  ４％、グルコース  １．１ｍＭ、１型コラゲナーゼ  ０．４ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）で細分して、３６．５℃で１．５時間まで消化した。濾過後、洗浄して（クレブス−リンガー  ＨＥＰＥＳ、ＨＳＡ  １％）、アッセイ緩衝液（クレブス−リンガー  ＨＥＰＥＳ、ＨＳＡ  １％）に再懸濁して、遊離脂肪細胞を試験溶液および約ＥＤ２０インシュリンを含有する９６ウェルピコプレート（Ｐａｃｋａｒｄ）にピペットで入れた。
【０２１７】
３Ｈグルコース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＴＲＫ２３９）をグルコース最終濃度０．４５ｍＭで添加することによってアッセイを開始した。アッセイは、Ｌａｂｓｈａｋｅｒインキュベーションタワーで４００ｒｐｍにて３６．５℃で２時間インキュベートし、次にＰｅｒｍａｂｌｅｎｄ／トルエンシンチレーション（または同等物）を添加することによって停止させ、プレートを密封して、少なくとも１時間放置して、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐカウンターまたは同等物で検出した。完全なインシュリンの標準曲線（８用量）を各プレートの対照とした。
【０２１８】
データは、（約）ＥＤ２０インシュリン応答に対する化合物の影響として図によって示し、データは完全なインシュリン応答に正規化した。アッセイはまた、基準または最大インシュリン濃度で実施することができる。インシュリンおよびＩＧＦ−１の代表的な用量−応答曲線を図１２〜１８に示す。定量的データを表５〜７に示す。
【０２１９】
遊離脂肪細胞（ＦＦＣ）アッセイでは、切断型合成ＲＰ９モノマーペプチドＳ３９０およびＳ３９４は、完全長ＲＰ９モノマーペプチドと同様の能力を示した（図１２Ａ〜１２Ｄ）。切断型合成ＲＰ９ホモダイマーペプチドＳ４１５およびＳ４１７はＦＦＣアッセイで高い能力を示したが、完全長ＲＰ９ホモダイマーペプチドよりは能力は下回っていた（図１３Ａ〜１３Ｃ、ペプチド５２１および５３５と比較、以下に説明したとおり）。ＦＦＣアッセイにおける組換えＲＰ９ホモダイマーペプチド５２１および５３５の能力は図１４Ａ〜１４Ｃに示す。曲線は平坦で、結合機構は単純な分子内結合によって生じる可能性はないことが示唆される（図１４Ａ〜１４Ｃ）。
【０２２０】
結果はさらに、合成ＲＰ９ホモダイマーペプチドＳ３３７およびＳ３７４では、合成ＲＰ９モノマー、Ｓ３７１と比較してＨＩＲ結合アッセイの増加およびＦＦＣアッセイにおける能力の増加を示した（表５）。同様に、合成ＲＰ９ホモダイマーペプチドＳ３１４およびＳ３１７では、合成ＲＰ９モノマー、Ｓ３７１、および様々なＲＰ９切断型と比較してＨＩＲ結合親和性の増加およびＦＦＣアッセイでの能力の増加が示された（表６）。
【０２２１】
2005505579.tif 000011
Ｍ＝モノマー、Ｄ＝ダイマー、Ｃ−Ｔｅｒｍ＝Ｃ末端リンカー（Ｃ−Ｃ）、Ｎ−Ｔｅｒｍ＝Ｎ末端リンカー（Ｎ−Ｎ）、２３および１７は特異的化学リンカーを示す（表３参照）。ＦＦＣでは、０は効果無し、＋はアゴニスト、−はアンタゴニストである。
【０２２２】
2005505579.tif 000012
Ｍ＝モノマー、Ｄ＝ダイマー、Ｃ−Ｔｅｒｍ＝Ｃ末端リンカー（Ｃ−Ｃ）、Ｎ−Ｔｅｒｍ＝Ｎ末端リンカー（Ｎ−Ｎ）、２３は特異的化学リンカーを示す（表３参照）。ＦＦＣでは、０は効果無し、＋はアゴニスト、−はアンタゴニストである。Ｆｏｒｍ．＝式、Ｍｏｎ．＝モノマー
【０２２３】
部位１−部位１ダイマーペプチド５３７および５３８は、標準濃度のインシュリンを使用したＦＦＣでは不活性であった（図１５Ａ〜１５Ｃ）。しかし、部位１−部位２ダイマーペプチド５３７および５３８は、誘発濃度のインシュリンの存在下でのＦＦＣアッセイではアンタゴニストであった（図１６Ａ〜１６Ｃ）。対照的に、部位２−部位１ダイマーペプチド５３９は、ＦＦＣアッセイで完全なアゴニストで、傾斜はインシュリンと同様であった（図１７Ａ〜１７Ｂ）。
【０２２４】
部位１−部位２ダイマーペプチドのＦＦＣアッセイ活性は、モノマーサブユニットの方向によって影響を受けることが他の実験で確かめられた（図１８Ａ〜１８Ｄ）。特に、部位１（Ｓ３７２またはＳ３７３）および部位２（Ｓ４５１またはＳ４５２）モノマーサブユニットを含むダイマーペプチドは、部位１−部位２方向（Ｃ−Ｎ結合）（ダイマーペプチドＳ４５３）ではアンタゴニスト活性、部位１−部位２方向（Ｎ−ＮまたはＣ−Ｃ結合）（ダイマーペプチドＳ４５４およびＳ４５６）では中程度のアゴニスト活性、部位２−部位１方向（Ｃ−Ｎ結合）（ダイマーペプチドＳ４５５）では高濃度のアゴニスト活性が示された（図１８Ａ〜１８Ｄ）。
【０２２５】
以下の表７は、部位１−部位１ダイマーペプチドＳ３２５、Ｓ３２９、Ｓ３３２、Ｓ３３３、Ｓ３３４、Ｓ３３５、Ｓ３３６、Ｓ３３７、Ｓ３４９、Ｓ３５０、Ｓ３５１、Ｓ３５２、Ｓ３５３、Ｓ３５４、Ｓ３６１、Ｓ３６２、Ｓ３６３、Ｓ３７４、Ｓ３７５、Ｓ３７６、Ｓ３７８、Ｓ３７９、Ｓ３８０、Ｓ３８１、Ｓ４１４、Ｓ４１５、Ｓ４１６、Ｓ４１７、Ｓ４１８、Ｓ４２０、およびＳ４２４を含めた様々合成ペプチドのＨＩＲ結合親和性およびＦＦＣアッセイ能力を示す。これらの合成ダイマーペプチドは、モノマーサブユニットの方向に関係なく、ダイマーペプチド５２１および５３５に匹敵する特性を示した。特に、合成部位１−部位２ダイマーペプチドＳ４２５、Ｓ４５３およびＳ４５９は、部位１−部位２のダイマーペプチド５３７および５３８に匹敵するアンタゴニスト特性を示した。合成部位１−部位２のダイマーペプチドＳ４５５、Ｓ４５７およびＳ４５８は、ダイマーペプチド５３９に匹敵するアゴニスト特性を示した。合成部位１−部位２ダイマーペプチドＳ４３６、Ｓ４３７、Ｓ４３８、Ｓ４５４、Ｓ４５６はＦＦＣアッセイにおいて部分的アゴニストとして作用し（すなわち、これらのペプチドはインシュリンの１００％未満の最大応答を示す）、表では「＋＋」および「＋＋＋」として示してある。
【０２２６】
表７はまた、切断型モノマーおよびダイマーペプチドの特性を示しており、それによってＨＩＲ結合親和性を実質的に損なうことなくＮまたはＣ末端残基を切除することができることが示される（たとえば、合成ペプチドＳ３８６からＳ３９２、Ｓ３９４からＳ４０３、およびＳ４３６からＳ４４５を参照）。特に、ある部位２−部位１ダイマーはＩＲ親和性が２＊１０−１１である（たとえば、Ｓ５１９およびＳ５２０参照）。これらのペプチドはまた、脂肪細胞アッセイで非常に効果があり（図３１Ａ〜３１Ｂ）、ＨＩＲキナーゼアッセイでも強い効果を示す（図３２Ａ〜３２Ｂ）（以下に説明したキナーゼアッセイ）。
【０２２７】
2005505579.tif 000013
2005505579.tif 000014
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７、９、１２、１３、１４、１７、１９、２０、２１、２２、２３および２４は、特異的な化学リンカーを表す（表３参照）。ＦＦＣでは、０は効果無し、＋はアゴニスト、−はアンタゴニストである。３列で示したペプチドは、化学結合によって、またはたとえばリジンなどの２個のアミノ基を有するアミノ酸の２本の枝に合成することによって、Ｎ−ＮまたはＣ−Ｃを結合させた異なる２種類のペプチドから成る。Ａｃｙ＝１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、Ｃｈａ＝シクロヘキシルアラニン、Ａｉｂ＝２−アミノイソブチル酸、Ｈｙｐ＝ヒドロキシプロリン、大文字ではないアミノ酸はＤアミノ酸である。Ｌｉｇ＝側鎖アミノ基に２−アミノヒドロキシアセチル基（ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２）を有するジアミノプロピオン酸、Ｌｉｇ’＝側鎖アミノ基に２−アミノヒドロキシアセチル基（ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２）を有するリジン、Ａｌｄ＝Ｎ末端またはリジンの側鎖アミノ基に結合したセリンの過ヨウ素酸酸化によって得られたアルデヒド基。
【０２２８】
結果によって、さらにＳ１７５−Ｓ１７５ダイマーペプチドがＳ１７５モノマーペプチド（＋＋対＋＋＋）よりもアゴニスト活性が少ないことが示された。Ｃ−Ｎ結合を有するＳ１７５−Ｓ１７５ダイマーペプチドは、Ｃ−ＣまたはＮ−Ｎ結合を有するＳ１７５−Ｓ１７５ダイマーペプチドと比較してアゴニスト活性が少ないか、または同等であった。Ｆ８−Ｆ８ダイマーペプチドは親モノマーのように、アゴニスト活性を示さなかった。
【０２２９】
（実施例５）
基質リン酸化アッセイ（ＨＩＲキナーゼ）
ＷＧＡ（コムギ麦芽凝集素）−精製組換えヒトインシュリン受容体を、基質リン酸化緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭ（ｐＨ８．０）、ＭｎＣｌ２  ３ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０５％、ＢＳＡ  ０．１％、ＡＴＰ  １２．５μＭ）中で様々な濃度のインシュリンまたはペプチドと混合した。合成ビオチン化基質ペプチド（ビオチン−ＫＳＲＧＤＹＭＴＭＱＩＧ）を添加して最終濃度２μｇ／ｍｌにした。ＲＴで１時間インキュベートした後、ＥＤＴＡ  ５０ｍＭを添加して反応を停止させた。反応物をストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ、カタログ番号２３６００１）に移して、ＲＴで１時間インキュベートした。プレートはＴＢＳで３回洗浄した（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ（ｐＨ８．０）、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ）。
【０２３０】
その後、ＴＢＳに溶かした西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）結合ホスホチロシン抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号Ｅ１２０Ｈ）２０００倍希釈物を添加した。プレートを３０分間インキュベートして、ＴＢＳで３回洗浄した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、デンマーク）を添加した。Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃの１基質を添加した。１０〜１５分後、１％酢酸添加することによって反応を停止した。基質リン酸化の程度を示す吸光度は、分光光度計で波長４５０ｎＭで測定した。
【０２３１】
結果から、部位１−部位２ダイマー、ペプチド５３９の能力は、試験したアッセイ全てにおいてインシュリンの０．１％から１％であり（表８）、用量−応答曲線（図１７Ａ〜１７Ｂ）の形状はインシュリンの用量−応答曲線と同様であることが示され、インシュリン様作用機構であることが示唆された。さらに、部位１−部位２ダイマーペプチド５３７および５３８はまた、特異的インシュリン受容体アンタゴニストとしての活性があった（表８、図１６Ａ〜１６Ｃ）。特に、部位２−部位１ダイマーペプチド５３９は部位１−部位１ホモダイマーペプチド５２１および５３５よりもキナーゼアッセイで活性があったが（図１９Ａ〜１９Ｂ）、ＦＦＣ能力は低かった（図１４Ａ〜１４Ｃ、図１７Ａ〜１７Ｂ）。同様の結果が図２０Ａ〜Ｂおよび図２１Ａ〜Ｂに示されている。このデータによって、ホモダイマーおよびヘテロダイマーペプチドは異なる作用機構を使用することが示唆された。
【０２３２】
2005505579.tif 000023
Ａ＝アゴニスト、Ｎ＝アンタゴニスト、ｎａ＝適用せず、Ｆｏｒｍ．＝式、Ｍｏｎ．＝構成モノマー、Ｌｉｎｋ．＝リンカー、Ｐｏｔ．＝能力、ＨＩおよびＨＩＧＦ−１Ｒは対照である。いずれも両端にタグを有する。ダイマーは全てＣ−Ｎ結合である。リンカー配列には下線が引いてある。
【０２３３】
（実施例６）
ＩＲ自己リン酸化アッセイ
ＩＲ活性化は、３２Ｄ細胞に形質移入したインシュリン受容体構築体の自己リン酸化を検出することによってアッセイした（Wang等、1993, Science 261:1591-1594; clone 969）。ＩＲ形質移入３２Ｄ細胞を９６ウェル組織培養用プレートに５ｘ１０６細胞／ウェルで接種し、３７℃で一晩インキュベートした。試料は刺激用培地（ＨＥＰＥＳ  ２５ｎＭを含むＲＰＩＭ１６４０  ｐＨ７．２）プラス、またはマイナスインシュリンで１：１０に希釈した。細胞培養プレートから培養培地を傾瀉し、希釈した試料を細胞に添加した。プレートは、３７℃で３０分間インキュベートした。刺激用培地をプレートから傾瀉して、細胞溶解緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．２、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．５％、ＡＥＢＳＦ  １ｍＭ、アプロチニン  １０ＫＩＵ／ｍｌ、ロイペプチン  ５０μＭ、およびオルトバナジン酸ナトリウム  ２ｍＭ）を添加した。細胞を３０分間溶解した。
【０２３４】
アッセイのＥＬＩＳＡ部分では、細胞溶解物をＢＳＡ−ブロックした抗ＩＲ単位ｍＡｂ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。２時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで６回洗浄して、ビオチン化抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加した。さらに２時間インキュベートした後、プレートを再度６回洗浄した。次にストレプトアビジン−Ｅｕを添加して、プレートを１時間インキュベートした。プレートを再度洗浄後、ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ増強溶液（アセトン−フタル酸水素カリウム、１００ｍＭ、ｐＨ３．２、２−ナフチルトリフルオロ酢酸  １５ｍＭ、トリ（ｎ−オクチル）−ホスフィンオキシド  ５０ｍＭ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．１％）を各ウェルに添加して、プレートを振盪機にＲＴで２０分間置いた。各ウェルの試料の蛍光は、ＶＩＣＴＯＲ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＥＧ＆Ｇ  Ｗａｌｌａｃ）を使用して６１５ｎｍで測定した。
【０２３５】
あるいは、ＩＲ自己リン酸化は、ホロ酵素リン酸化アッセイを使用して測定した。このアッセイでは、精製インシュリン受容体（コムギ麦芽凝集素発現系から単離）をＡＴＰ  １０μＭを含有する自己リン酸化緩衝液（ＨＥＰＥＳ５０ｍＭ、ｐＨ．８．０、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００  ０．０２５％、ＭｎＣｌ２  ５ｍＭ、オルトバナジウム酸ナトリウム  ５０μＭ）５０μｌに溶かしたインシュリン  ２５ｎＭ、またはペプチド  １０μＭまたは５０μＭと２２℃で４５分間インキュベートした。β−メルカプトエタノールを含有するゲル添加緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）５０μｌを添加することによって反応を停止させた。試料は４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで泳動した。タンパク質をニトロセルロース膜に移すことによってウェスタンブロット分析を実施した。この膜をミルク  ３％を含有するＰＢＳで一晩ブロックした。この膜を抗ホスホチロシン４Ｇ１０  ＨＲＰ標識抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で２時間インキュベートした。タンパク質バンドはＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を使用して視覚化した。
【０２３６】
（実施例７）
蛍光をベースとしたＨＩＲ結合アッセイ
Ａ．時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ
時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）は、ペプチド競合研究のために使用した。一連のアッセイでは、モノマーおよびダイマーペプチドがビオチン化ＲＰ９モノマーペプチド（ｂ−ＲＰ９）とＨＩＲ−イムノグロブリン重鎖キメラへの結合を競合する能力について試験した（ｓＩＲ−Ｆｃ、Bass等、1996）。このアッセイは、最終量３０μｌで３８４ウェル白色マイクロプレート（ＮＵＮＣ）を使用して実施した。最終的なインキュベーション条件は、ｂ−ＲＰ９  ２２ｎＭ、ＳＡ−ＡＰＣ  １ｎＭ（ストレプトアビジン−アロフィコシアニン）、Ｅｕ３＋−ｓＩＲ−Ｆｃ（ＬＡＮＣＥ（商標）標識、ＰＥ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）１ｎＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８  ２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、およびＢＳＡ  ０．１％（Ｃｏｈｎ画分Ｖ）であった。ＲＴで１６〜２４時間インキュベートした後、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光シグナルをＶｉｃｔｏｒ２１４２０プレートリーダー（ＰＥ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）で読み取った。一次データのバックグラウンドを修正して、緩衝液対照に正規化して、次に特異的結合の割合として表した。
【０２３７】
結果を図２２Ａ〜２２Ｂに示す。図２１Ａはｂ−ＲＰ９競合データを示す。これらの図では、Ｚ’−因子は０．５より大きく（Ｚ’＝１−（３σ＋＋３σ−）／｜μ＋−μ−｜；Zhang等、1999, J. Biomol. Screen. 4:67-73）、シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）の比は、約４〜５であった。図２２Ａでは、各データ点は２連のウェルの平均を表す。線は以下の式、ｙ＝ｍｉｎ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０＾（（ｌｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ））によるデータの４変数非線形回帰分析に最も合致することを表す。これを使用してＩＣ５０値を決定した。
【０２３８】
他の一連のアッセイでは、モノマーおよびダイマーペプチドがビオチン化Ｓ１７５（ｂ−Ｓ１７５）またはｂ−ＲＰ９とｓＩＲ−Ｆｃへの結合を競合する能力について試験した。ＴＲ−ＦＲＥＴアッセイは、最終量３０μｌで３８４ウェル白色マイクロプレートで実施した。最終的なインキュベーション条件は、ｂ−Ｓ１７５  ３３ｎＭまたはｂ−ＲＰ９  ２２ｎＭ、ＳＡ−ＡＰＣ  １ｎＭ、Ｅｕ３＋−ｓＩＲ−Ｆｃ  １ｎＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８  ２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、およびＢＳＡ  ０．１％であった。ＲＴで１６〜２４時間インキュベートした後、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光シグナルをＶｉｃｔｏｒ２１４２０プレートリーダーで読み取った。一次データのバックグラウンドを修正して、緩衝液対照に正規化して、次に特異的結合の％として表した。
【０２３９】
結果を図２３Ａ〜２３Ｂに示す。これらの図では、各データ点は２連のウェルの平均を表す。線はデータの４変数非線形回帰分析に最も合致することを表し、ＩＣ５０値を決定するために使用した。図２３Ａはｂ−Ｓ１７５競合データを示し、図２３Ｂはｂ−ＲＰ９競合データを示す。
【０２４０】
Ｂ．蛍光偏光アッセイ
蛍光偏光アッセイ（ＦＰ）は、ペプチド競合研究のために使用した。一連のアッセイでは、モノマーおよびダイマーペプチドがフルオレセイン−ＲＰ９（ＦＩＴＣ−ＲＰ９）と可溶性ＨＩＲ外部ドメインへの結合を競合する能力について試験した（ｓＩＲ、Kristensen等、1998, J. Biol. Chem. 273:17780-17786）。このアッセイは、最終量３０μｌで３８４ウェル白色マイクロプレート（ＮＵＮＣ）を使用して実施した。最終的なインキュベーション条件は、ＦＩＴＣ−ＲＰ９  １ｎＭ、ｓＩＲ  １０ｎＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８、２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、ＢＧＧ（ウシガンマグロブリン）０．０５％、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）０．００５％であった。ＲＴで１６〜２４時間インキュベーションした後、５２０ｎｍでの蛍光シグナルをＡｎａｌｙｓｔ（商標）ＡＤプレートリーダー（ＬＪＬ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）で読み取った。１次データはＦＩＴＣ−ＲＰ９を添加しないでｓＩＲ  １０ｎＭを使用してバックグラウンド修正して、緩衝液対照に対して正規化して、次に特異的結合の割合として表した。Ｚ’因子は０．５より大きく、アッセイのダイナミックレンジは約１２５ｍＰであった。図２４〜２７では、各データ点は２連のウェルの平均を表す。線はデータの４変数非線形回帰分析に最も合致することを表し、ＩＣ５０値を決定するために使用した。Ｚ’因子は０．５より大きく、アッセイのダイナミックレンジは約１２５ｍＰであった。結果を図２４Ａ〜２４Ｂに示す。
【０２４１】
他の一連のアッセイでは、モノマーおよびダイマーペプチドがＦＩＴＣ−ＲＰ９と可溶性ヒトインシュリンミニ受容体（ｍＩＲ、Kristensen等、1999, J. Biol. Chem. 274:37351-37356）への結合を競合する能力について試験した。ＦＰアッセイは、最終量３０μｌで３８４ウェル白色マイクロプレートを使用して実施した。最終的なインキュベーション条件は、ＦＩＴＣ−ＲＰ９  ２ｎＭ、ｍＩＲ  ２０ｎＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８、２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、ＢＧＧ  ０．００１％、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）０．００５％であった。ＲＴで１６〜２４時間インキュベーションした後、５２０ｎｍでの蛍光シグナルをＡｎａｌｙｓｔ（商標）ＡＤプレートリーダーで読み取った。１次データはＦＩＴＣ−ＲＰ９を添加しないでｍＩＲ  ２０ｎＭを使用してバックグラウンド修正して、緩衝液対照に対して正規化して、次に特異的結合の割合として表した。結果を図２５Ａ〜２５Ｂに示す。
【０２４２】
モノマーおよびダイマーペプチドはまた、フルオレセイン−インシュリン（ＦＩＴＣ−インシュリン）とｓＩＲへの結合を競合する能力について試験した。ＦＰアッセイは、最終量３０μｌで３８４ウェル白色マイクロプレートを使用して実施した。最終的なインキュベーション条件は、ＦＩＴＣ−インシュリン  ２ｎＭ、ｓＩＲ  ２０ｎＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８、２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、ＢＧＧ  ０．０５％、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）０．００５％であった。ＲＴで１６〜２４時間インキュベーションした後、５２０ｎｍでの蛍光シグナルをＡｎａｌｙｓｔ（商標）ＡＤプレートリーダーで読み取った。１次データはＦＩＴＣ−インシュリンを添加しないでｓＩＲ  ２０ｎＭを使用してバックグラウンド修正して、緩衝液対照に対して正規化して、次に特異的結合の割合として表した。結果を図２６Ａ〜２６Ｂに示す。
【０２４３】
その他のアッセイでは、ペプチドモノマーおよびダイマーペプチドがフルオレセイン−インシュリンとｍＩＲへの結合を競合する能力について試験した。ＦＰアッセイは、最終量３０μｌで３８４ウェル白色マイクロプレートを使用して実施した。最終的なインキュベーション条件は、ＦＩＴＣ−インシュリン  ２ｎＭ、ｍＩＲ  ２０ｎＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８、２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、ＢＧＧ（ウシガンマグロブリン）０．０５％、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）０．００５％であった。ＲＴで１６〜２４時間インキュベーションした後、５２０ｎｍでの蛍光シグナルをＡｎａｌｙｓｔ（商標）ＡＤプレートリーダーで読み取った。１次データはＦＩＴＣ−ＲＰ９を添加しないでｍＩＲ  ２０ｎＭを使用してバックグラウンド修正して、緩衝液対照に対して正規化して、次に特異的結合の％として表した。結果を図２７Ａ〜２７Ｂに示す。
【０２４４】
Ｃ．概要
以下の表９は、ＴＲ−ＦＲＥＴおよびＦＰ方式でＩＲ構築体、ｓＩＲ−Ｆｃ、ｓＩＲ、およびｍＩＲを使用した競合アッセイによって計算した結合データをまとめた表である。表９のデータは、ほとんどのダイマーペプチド（たとえば、Ｓ２９１およびＳ３７５またはＳ３３７）はＦＦＣアッセイにおいて対応するモノマーペプチド（たとえば、それぞれＨ２ＣまたはＲＰ９）よりも大きなアゴニスト活性を示すことを示す。アッセイレポーターがモノマーペプチド（すなわち、ＲＰ９またはＳ１７５）である場合、競合アッセイにおいてモノマーペプチドとインシュリンとの間に差があることが既に示された。この差はまた、表９で示したようにダイマーペプチドによっても示された。表９はさらに、Ｅ８（Ｄ１２０）などの群６モノマーペプチドはＦＩＴＣ−ＲＰ９またはｂ−ＲＰ９ペプチドとｓＩＲ−Ｆｃへの結合を競合することができるが、ＦＩＴＣ−ＲＰ９などのペプチドリガンドとはｍＩＲへの結合を競合しなかったことを示す。異なるＩＲ構築体を使用した実験によって、配列モチーフに基づいた部位１ペプチドの区別が可能になった（すなわち、群６（式１０）対群１（式１、Ａ６）。
【０２４５】
2005505579.tif 000024
ＦＲＥＴ−時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ、ＦＰ＝蛍光偏光アッセイ、ＲＲＡ＝放射受容体アッセイ、ＦＦＣ＝遊離脂肪細胞アッセイ、Ｎ−Ｎ＝Ｎ末端結合、Ｃ−Ｃ＝Ｃ末端結合、いずれも部位１（式１）モノマーまたは部位１−部位１（式１−式１）ダイマーである。
【０２４６】
前記に概略した機能的研究に基づいて、以下のペプチドダイマーを設計した。
【０２４７】
2005505579.tif 000025
リンカー配列には下線を引き、太字である。モノマー配列は以下に示す。ダイマーは全てＣ−Ｎ結合である。
【０２４８】
2005505579.tif 000026
【０２４９】
（実施例８）
マルトース結合性タンパク質へのペプチド融合
Ａ．クローニング
ファージディスプレイの関心のあるペプチド配列をマルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ）融合物へ移すことが望ましいのは、いくつかの理由による。第１に、より敏感な親和性を判断するために、多価のファージディスプレイペプチドを単価系に変換するべきである。この目的のために、ペプチド配列を一般的にシステイン残基を含まないモノマーとして存在するＭＢＰに融合する。第２に、競合実験は、同一または異なるペプチドに実施することができ、１個はファージディスプレイし、他方はＭＢＰに融合した。最後に、精製したペプチドはＤＮＡ配列で操作した部位で融合タンパク質を切断することによって得ることができる。
【０２５０】
図２８は、ＭＢＰ−ペプチド構築体の概略を示した図である。この構築体では、ペプチド配列のＮ末端をＭＢＰのＣ末端に融合させる。２個のペプチド隣接エピトープタグ、Ｎ末端に短縮したＦＬＡＧ（登録商標）およびＣ末端にＥ−Ｔａｇを含める。対応する遺伝子融合物は、関心のあるペプチドをコードするＰＣＲ産物とフレーム内のＭＢＰをコードするベクター断片とを連結することによって作製した。ベクター断片は、プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、この断片を小エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理することによって得られた。消化したＤＮＡ断片を１％アガロースゲルで分離して、切り出して、ＱＩＡＥＸＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。関心のある２０個のアミノ酸ペプチド配列は最初に、ファージディスプレイベクターｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でコード化した。これらの配列を得るために、短縮ＦＬＡＧ（登録商標）をコードする配列またはＥ−Ｔａｇエピトープにアニールし、必要な制限酵素部位ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩもまた含有するプライマーを合成した。ＰＣＲ生成物は、個々のファージクローンから得られ、制限酵素で消化して、挿入断片を作製した。ベクターおよび挿入物を１５℃で一晩連結した。連結生成物はＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、エレクトロポレーションはＤＮＡ  １０ｎｇおよびＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２５０８（ＲＲ１  ｌｏｎ：ｍｉｎｉＴｎ１０（Ｔｅｔｒ）（ｍａｌＢ）（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９  Ｐｒｏ＋  ｚｊｃ：：Ｔｎ５（Ｋａｎｒ）  ｆｈｕＡ２）エレクトロポレーション細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）４０μｌを含有するエレクトロポレーション容器（ギャップ  ０．１ｍｍ、容量０．５ｍｌ）内で１５００ｖで実施した。パルス直後に、グルコース  ２％を含有する予備加温した（４０℃）２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴ−Ｇ）１ｍｌを添加して、形質転換体を３７℃で１時間増殖させた。細胞形質転換体を２ｘＹＴ−ＡＧプレートに播種し、３７℃で一晩増殖させた。配列決定によって正確な構築体を含有するクローンを確認した。
【０２５１】
Ｂ．可溶性ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質の小規模発現
ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５０８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）は、２ｘＹＴ−ＡＧで３７℃で一晩（２５０ｒｐｍ）増殖させた。翌日、この培養物を使用して培地（Ｇ含有２ｘＹＴ）に接種して、ＯＤ６００  ０．１を実現した。ＯＤ６００が０．６に達したら、ＩＰＴＧを最終濃度０．３ｍＭで添加して発現を誘導して、次に細胞を３時間増殖させた。この細胞を遠心によってペレットにして、全細胞の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。分子量の正確な融合タンパク質の産生は、モノクローナル抗体抗Ｅ−Ｔａｇ−ＨＲＰ複合体を使用したウェスタンブロット分析によって確認した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０２５２】
Ｃ．可溶性ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質の大規模発現
ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質をコードするプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２５０８は、２ｘＹＴ−ＡＧ培地で３７℃で８時間（２５０ｒｐｍ、３７℃）増殖させた。培養物を２ｘＹＴ−ＡＧで２次培養してＯＤ６００  ０．１を実現し、３０℃で一晩増殖させた。この培養物を使用して以下の組成物（ｇ／ｌ）、グルコース（３．００）、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５．００、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．２５）、ＫＨ２ＰＯ４（３．００）、クエン酸（３．００）、ペプトン（１０．００）、および酵母抽出物（５．００）、ｐＨ６．８の培地を有する発酵容器に接種した。
【０２５３】
培地のグルコースが消費されるまで（ＯＤ６００＝約６．０〜７．０）、培養物を７００ｒｐｍ、３７℃で増殖させた。融合タンパク質の発現は、ＩＰＴＧ  ０．３ｍＭを添加することによって誘導し、培養物はグルコース５０％を一定速度２ｇ／ｌ／ｈで供給した供給バッチ様式の発酵で２時間増殖させた。細胞は、遠心によって培地から取り出した。細胞ペレットの試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後マウスモノクローナル抗体抗Ｅ−Ｔａｇ−ＨＲＰ複合体を使用したウェスタンブロット分析を行い発現した生成物を視覚化した。
【０２５４】
Ｄ．精製
細胞ペレットは超音波によって機械的に、または弱い界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で化学的に処理することによって粉砕した。細胞残渣を遠心によって除去した後、可溶性タンパク質を適切な開始緩衝液で希釈または透析してクロマトグラフィー精製用に調製した。ＭＢＰ融合物は最初にアミロースアフィニティークロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーのいずれかによって精製した。最終的な精製は、抗Ｅ−Ｔａｇ抗体アフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して実施した。親和性樹脂は、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水  ０．０２５Ｍ、ｐＨ７．４）で平衡化して、結合したタンパク質はＥｌｕｔｉｏｎ緩衝液（グリシン  １００ｍＭ、ｐＨ３．０）で溶出した。精製タンパク質の純度および強度は、標準的方法によってＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析によって分析した。
【０２５５】
ＭＢＰ融合では、ＩＲアゴニスト活性は以下の表１０に示した部位１−部位１ダイマーペプチドで認められた。ＭＢＰ融合物の他の結合データはまた、以下の表１１に示す。
【０２５６】
2005505579.tif 000027
2005505579.tif 000028
＊ＭＢＰ（融合物の陰性対照）は、ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）の小断片に融合させる。＊＊ＭＢＰ−ｌａｃＺ融合タンパク質は購入形態ＮＥＢとしてプラスミドｐＭａｌ−ｃ２から得られた。Ｆｕｓ．＝融合物、Ａｃｔ．＝活性、Ｃｏｎｃ．＝濃度、Ｎ＝アンタゴニスト、Ａ＝アゴニスト、ＬＦ＝長いＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１７７７）、ＳＦ＝短いＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ（ＤＹＫＤ、配列番号１５４５）、ｎａ＝適用せず、Ｆｏｒｍ．＝式、ダイマーはいずれもＣ−Ｎ結合である。リンカー配列には下線を引いてある。
【０２５７】
2005505579.tif 000029
これらの融合物の濃度は、発現特性に応じて変化する。各融合物には２種類、非切断のもの（−）および因子Ｘａ（＋）によって切断したものがある。融合タンパク質はＴｒｉｓ緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ２００ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ、マルトース  ５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に溶かしており、切断融合物（＋）は同様のＴｒｉｓ緩衝液（５００μｌ）＋因子Ｘａ  １２μｇに溶かしてある。（因子Ｘａの製造元：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。Ｃｏｎｃ．＝濃度、Ｆｏｒｍ．＝式、ダイマーはいずれもＣ−Ｎ結合である。リンカー配列には下線を引いてある。
【０２５８】
Ｅ．ＢＩＡｃｏｒｅ分析
インシュリン受容体に結合する融合タンパク質および合成ペプチドのＢＩＡｃｏｒｅ分析では、インシュリン（酢酸ナトリウム緩衝液  １０ｍＭ  ｐＨ５に５０μｇ／ｍｌで溶かす）をアミン結合によってＣＭ５センサーチップ（フローセル−２）に固定した。いかなる非特異的結合も修正するために、フローセル−１はバックグラウンド用に使用した。インシュリン受容体（４５０ｎＭ）をフローセルに注入して、ＩＲのインシュリンへの結合は共鳴単位（ＲＵ）で測定した。インシュリンに結合した受容体は、２２０ＲＵで読み取った。表面はＮａＯＨ  ２５ｍＭで再生させた。試験管内で室温で受容体とインシュリンを予備インキュベートすると、共鳴単位が１６ＲＵに成るのが完全に阻害された。したがって、競合研究のために系を確認した。いくつかのマルトース結合融合タンパク質、ペプチド、およびｒＶａｂは、予めインシュリン受容体とインキュベートしてから、競合研究のためにインシュリンチップに注射した。結合／共鳴単位の減少は、いくつかのＭＢＰ−融合タンパク質はインシュリン結合部位をブロックすることができることを示している。結果を表１２および１３に示す。表のアミノ酸配列は、以下に示した４４７および２Ａ９配列以外は、図８および９Ａ〜９Ｂに同定する。
【０２５９】
2005505579.tif 000030
Ａ７（２０Ａ４）、Ｄ８、およびＤ１０ペプチド配列は図８および図９Ａ〜９Ｂに示す。４４７ペプチド配列は、ＬＣＱＲＬＧＶＧＷＰＧＷＬＳＧＷＣＡ（配列番号２１５６）である。
【０２６０】
2005505579.tif 000031
各ペプチドの濃度は約４０μＭで、ＩＲの濃度は４５０ｎＭであった。２０Ｄ１、２０Ａ４、およびＤ８ペプチド配列は図８および９Ａ〜９Ｂに示す。残りのペプチド配列は以下の通りである。４４７＝ＬＣＱＲＬＧＶＧＷＰＧＷＬＳＧＷＣＡ（配列番号２１５６）、２Ａ９＝ＬＣＱＳＷＧＶＲＩＧＷＬＴＧＬＣＰ（配列番号２１５７）、２０Ｃ１１＝ＤＲＡＦＹＮＧＬＲＤＬＶＧＡＶＹＧＡＷＤ（配列番号１６５９）、Ｈ２＝ＶＴＦＴＳＡＶＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳ（配列番号１７８４）。
【０２６１】
２個のＤ１１７（Ｈ２Ｃ）ペプチドを含む部位１アゴニストの調製に関して、ほんの３個のアミノ酸のリンカー（１２Å）は、９個のアミノ酸（３６Å)結合領域で調製した対応するリガンドよりもＩＲの部位１に対する親和性が大きい（図２９）。
【０２６２】
Ｆ．ＭＢＰ融合タンパク質によるＩＲの自己リン酸化の刺激
ＭＢＰ融合ペプチドは前述のように調製し、次に３２Ｄ細胞に形質移入したインシュリン受容体構築体の自己リン酸化をアッセイした（Wang等、１９９３、クローン９６９）（前記の実施例参照）。図３０に示したこれらの実験の結果は、Ｈ２ＣモノマーおよびＨ２Ｃ−Ｈ２Ｃホモダイマーペプチドがｉｎ  ｖｉｖｏでＩＲの自己リン酸化を刺激することを示す。６個のアミノ酸リンカーを有するＨ２Ｃダイマーペプチド（部位１−部位１）（Ｈ２Ｃ−６ａａ−Ｈ２Ｃ）は自己リン酸化アッセイで最も活性があった。その他の活性ダイマーペプチド、特にＨ２Ｃ−９ａａ−Ｈ２Ｃ、Ｈ２Ｃ−１２ａａ−Ｈ２Ｃ、Ｈ２Ｃ−３ａａ−Ｈ２ＣおよびＦ８はまた、図３０に示す。
【０２６３】
Ｇ．ＭＢＰ融合ペプチドのインシュリン受容体結合親和性および脂肪細胞能力
ＭＢＰ融合ペプチドのインシュリン受容体への結合親和性および脂肪細胞能力を測定するアッセイの結果を以下の表１４に示す。
【０２６４】
2005505579.tif 000032
2005505579.tif 000033
2005505579.tif 000034
ＥＴＡＧ＝ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ（配列番号２２０５）、ＭＢＰ．．．ＮＮＮＮＬ＝ＭＢＰのｃ末端におけるＭＢＰへの融合結合部分、いずれのダイマーもＣ−Ｎ結合である。
【０２６５】
（実施例９）
インシュリンアゴニストのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ダイマーペプチドＳ５１９のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を試験するために、静脈血グルコース試験をＷｉｓｔａｒラットで実施した。体重約３００ｇのオスのＭｏｌ：Ｗｉｓｔａｒラットを２群に分けた。血液グルコース濃度を測定するために、血液試料１０μｌを尾静脈から採取した。ラットをＨｙｐｎｏｒｍ／Ｄｏｒｍｉｃｕｍでｔ＝−３０分に麻酔し、血液グルコースをｔ＝−２０分およびｔ＝０分に再度測定した。ｔ＝０で試料を採取した後、ラットの尾静脈に溶剤または等張水性緩衝液に溶かした試験物質を注射量１ｍｌ／ｋｇに対応する濃度で注射した。血液グルコースは、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１２０および１８０分の時点で測定した。Ｈｙｐｎｏｒｍ／Ｄｏｒｍｉｃｕｍ投与は２０分間隔で繰り返した。図３３に示した結果では、（２０ｎｍｏｌ／ｋｇの）Ｓ５１９ペプチドは、（２．５ｎｍｏｌ／ｋｇでの）ヒトインシュリンで認められるのと同様の濃度まで血液グルコースを低下させることが示された（ｎ＝８）。Ｓ５１９ペプチドおよびヒトインシュリンは、ｉｎ  ｖｉｖｏ効果において、大きさも応答の開始も同等であることが示された（図３３）。
【０２６６】
（実施例１０）
ＩＧＦ−１結合性ペプチド
３種類の主要なペプチドＩＧＦ−１結合性ペプチド、部位１  Ａ６（ＦｙｘＷＦ）（配列番号１５９６）、部位１  Ｂ６（ＦｙｘｘＬｘｘＬ）（配列番号１７３２）、および部位２（システインループ）はＩＧＦ−１Ｒパンニング実験によって得られた。２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０８５２８号、および２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等、米国出願第０９／５３８０３８号を参照のこと。活性ペプチドには、２０Ｅ２およびＲＰ６（Ｂ６−様、式２）、Ｓ１７５（Ａ６−様、式１）、Ｇ３３（Ａ６−様、式１）、ＲＰ９（Ａ６−様、式１）、Ｄ８１５（部位２）、およびＤ８Ｂ１２（部位２）ペプチドが含まれる。ＩＧＦ−１結合性ペプチドは、以下に説明した様々なアッセイによって分析した。
【０２６７】
Ａ．ファージ競合
ファージ競合研究は、部位１（ＲＰ９）および部位２（Ｄ８１５）モノマーペプチドで実施した。プレートをＩＧＦ−１Ｒ（炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６に１００ｎｇ／ウェルで溶かす）で４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳに溶かした４％無脂乳で室温で６０分間ブロックした。救出ファージ  １００マイクロリットルを各ウェルに添加した。様々な濃度のペプチドを添加し、混合物を室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗Ｍ１３抗体を各ウェルに添加した。標識抗体を室温で６０分間インキュベートした。洗浄後、ＡＢＴＳ  １００μｌをウェル毎に添加し、プレートをマイクロタイターリーダーで４５０ｎＭで読み取った。
【０２６８】
ファージには、ＲＰ９（Ａ６様、式１）、ＲＰ６（Ｂ６様、式２）、Ｄ８Ｂ１２（部位２）、およびＤ８１５（部位２）が含まれる。ペプチドにはＲＰ９およびＤ８１５が含まれる。
【０２６９】
2005505579.tif 000035
【０２７０】
図３４Ａ〜３４Ｅに示した結果によって、ＲＰ９およびＤ８１５ペプチドは、部位１および部位２ファージの両方と競合することが示された。これらの結果は、ＩＧＦ−１Ｒとの相互反応のアロステリック的な性質を示している。
【０２７１】
ファージ競合研究はまた、６または１２アミノ酸リンカーを含有する部位２−部位１ダイマーペプチドで実施した。プレートはＩＧＦ−１Ｒ（炭酸緩衝液、ｐＨ９．６に１００ｎｇ／ウェルで溶かす）で４℃で一晩コーティングした。ウェルをＰＢＳに溶かした４％無脂乳で室温で６０分間ブロックした。救出ファージ  １００マイクロリットルを各ウェルに添加した。様々な濃度のペプチドを添加し、混合物を室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄して、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗Ｍ１３抗体  １００μｌを各ウェルに添加した。標識抗体を室温で６０分間インキュベートした。洗浄後、ＡＢＴＳ  １００μｌをウェル毎に添加し、プレートをマイクロタイターリーダーで４５０ｎＭで読み取った。ファージには、ＲＰ９、ＲＰ６、Ｄ８Ｂ１２およびＤ８１５が含まれていた。ペプチドには、Ｄ８１５−６Ｌ−ＲＰ９およびＤ８１５−１２Ｌ−ＲＰ９が含まれる。リンカー配列には下線を引き、以下に示す。
【０２７２】
2005505579.tif 000036
【０２７３】
Ｄ８Ｂ１２、Ｄ８１５、ＲＰ６およびＲＰ９アミノ酸配列は前の項で示す。図３５Ａ〜３５Ｅで示した結果は、ダイマーは部位１および部位２ファージの両方と競合することを示している。このことは、両ダイマー単位はＩＧＦ−１Ｒで活性であることを示している。
【０２７４】
Ｂ．ＩＧＦ−１増殖アッセイ
ＩＬ−３およびヒトＩＧＦ−１Ｒ受容体を発現するＦＤＣ−Ｐ２細胞は、通常の方法に従って、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）  １５％および（１Ｌ−３を含有する）ＷＥＨＩ調整培地  ５％を補給したＲＰＭＩｋ−１６４０培地で増殖させた。実験の前に、細胞をプレートに撒き、ＰＢＳで２回洗浄した。この後、細胞を２％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁し、９６ウェルプレートに７５μｌ中２ｘ１０４細胞／ウェルで添加した。これは、細胞プレートと称した。
【０２７５】
ペプチドはＲＰＭＩ−ＦＢＳ  １５％（試験培地）に懸濁した。アゴニストアッセイでは、培地は９６ウェルプレートの列２〜１２に添加した。ペプチドは、試験培地２００μｌ中最終濃度６０μＭで列１に添加した。ペプチドは、列２〜１１に連続希釈（１：１）した。列１２にはいかなるペプチドも添加しなかった（対照、ＩＧＦ−１を有さない細胞）。アンタゴニストアッセイでは、ＩＧＦ−１  １０ｎｇ／ｍｌを含有する培地（ＥＤ５０試験培地）を９６ウェルプレートのウェル全てに添加した。列１にはＥＤ５０試験培地に溶かしたペプチド  １００μｌを１２０μＭの濃度で添加した。ペプチドは列２〜１１に連続希釈（１：１）した。列１２にはいかなるペプチドも添加しなかった（対照、ＩＧＦ−１を有さない細胞）。
【０２７６】
アゴニストおよびアンタゴニストアッセイでは、作業プレートから７５μｌを比較細胞プレートの適切な列に移した。アゴニストおよびアンタゴニスト両アッセイのための開始ペプチド濃度は、３０μＭであった。各ペプチドは、２連で実施した。プレートを３７℃で４５〜４８時間インキュベートした。ＷＳＴ−１（細胞増殖試薬、Ｒｏｃｈｅカタログ番号１６４４８０７）１０マイクロリットルを各ウェルに添加し、プレートはＥＬＩＳＡリーダーで（４４０／７７０の２波長）で１時間毎に４時間にわたって読み取った。図は、シグマプロットを使用して生データから作製した。ペプチドには以下のものが含まれる。
【０２７７】
2005505579.tif 000037
【０２７８】
ＩＧＦ−１増殖アッセイの結果は図３６〜４２に示す。図３６によって、ペプチドＧ３３（部位１、ＥＤ５０約１０μＭ）およびＤ８１５（部位２、ＥＤ５０約２μＭ）はＩＧＦ−１Ｒでアゴニスト活性を示し、一方ペプチドＲＰ９およびＲＰ６はアゴニスト活性を示さないことが示された。図３７によって、ペプチドＲＰ６（部位１、ＥＤ５０約１μＭ）およびＲＰ９（部位１、ＥＤ５０約７μＭ）はＩＧＦ−１Ｒでアンタゴニスト活性を示し、一方ペプチドＧ３３およびＤ８１５はアンタゴニスト活性を示さないことが示された。図３８によって、ペプチドＳ１７５および２０Ｅ２はＩＧＦ−１Ｒで弱いアゴニスト活性を表すことが（ＥＤ５０＞１０μＭ）示された。図３９によって、６個または１２個のアミノ酸リンカーを有するＤ８１５−ＲＰ９ダイマーは、ＩＧＦ−１Ｒでアゴニストとして作用することが示された。図４０によって、ダイマーペプチドＤ８１５−６−Ｇ３３は、ＩＧＦ−１Ｒでアゴニストとして不活性であることが示される。図４１によって、モノマーペプチドＲＰ６はＩＧＦ−１Ｒでアンタゴニストとして作用することが示された。ＦＤＣ−２Ｐで測定したＩＧＦ−１標準曲線を図４２に示す。
【０２７９】
部位１および部位２ペプチドのＩＧＦ−１Ｒデータを以下の表１５にまとめて示す。
【０２８０】
2005505579.tif 000038
Ａ＝アゴニスト、Ｎ＝アンタゴニスト、ｎｄ＝測定せず、ＮＡ＝適用せず、Ｆｏｒｍ．＝式、Ｍｏｎ．＝モノマー、Ａｎｔａｇ．＝アンタゴニスト活性、Ｌｉｎｋ．＝リンカー、リンカー配列には下線を引いてある。
【０２８１】
（実施例１１）
ＩＧＦ−１結合性タンパク質のペプチドライブラリーのパンニング
Ａ．第２ライブラリーのパンニング
可溶性ＩＧＦ−１Ｒ（「ｓＩＧＦ−１Ｒ」）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。可溶性タンパク質（純度＞９５％）には、マウス骨髄腫細胞株から単離したＩＧＦ−１Ｒのヘテロテトラマー（アルファ２−ベータ２）細胞外ドメインが含まれる。ｓＩＧＦ−１Ｒ（５００ｎｇ／ウェル）を９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐプレート、ＮＵＮＣ）の適切な数のウェルに添加して、４℃で一晩インキュベートした。次に、ウェルをＭＰＢＳ（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標）無脂粉乳  ２％を含有するＰＢＳ緩衝液  ｐＨ７．５）で室温（ＲＴ）で１時間ブロックした。Ｇ３３およびＲＰ６第２ライブラリー用の各回のパンニングに８個のウェルを使用した。ファージはＭＰＢＳとＲＴで３０分間インキュベートして、１００μｌを各ウェルに添加した。
【０２８２】
第１回目に投入したファージの力価は４ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍｌであった。２回目および３回目に投入したファージの力価は約１０１１ｃｆｕ／ｍｌであった。ファージは室温で２から３時間結合させた。次にウェルをＭＰＢＳ  ２００μｌ／ウェルで１３回迅速に洗浄した。結合したファージは、グリシン−ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ｐＨ２．２  １００μｌ／ウェルで３０秒間インキュベートすることによって溶出した。次に、得られた溶液をＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。対数増殖期のＴＧ１細胞に溶出したファージを感染させ、次に２ｘＹＴ−ＡＧを含有する２４ｃｍｘ２４ｃｍプレート２枚に撒いた。プレートを３０℃で一晩インキュベートした。翌朝、細胞を掻き取って取り出し、１０％グリセロール中で−８０℃で保存した。その後のアフィニティー濃縮では、これらの保存ストックから細胞を増殖させ、ファージは前述したように調製した。最小限７２個のクローンを第２、第３および第４回のパンニングによって無作為に採取し、結合活性をスクリーニングした。アミノ酸配列を決定したクローンのＤＮＡ配列決定を図４３Ａ〜４３Ｂにまとめて示した。
【０２８３】
Ｂ．ペプチドダイマーライブラリーのパンニング
マイクロタイタープレートは、以下の通りに標準的方法によってコーティングしてブロックした。プレートをＮａＨＣＯ３  ０．２Ｍ、ｐＨ９．４に溶かしたｓＩＧＦ−１Ｒ（前記の実施例参照）または可溶性ＩＲ（Ｂａｓｓ構築体、Bass等、1996, J. Biol. Chem. 271:19367-19375）でコーティングした。ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ（１回および２回）５０ｎｇ、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ（３回）２５ｎｇ、またはＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ（４回）１２．５ｎｇを含有する溶液１００マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐプレート、Ｎａｌｇｅ  ＮＵＮＣ）の適切な数のウェルに添加して、４℃で一晩インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳに溶かした無脂乳２％溶液（ＭＰＢＳ）によってＲＴで少なくとも１時間ブロックした。
【０２８４】
ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒでコーティングした８個のウェルを各回のパンニングに使用した。ファージ１００マイクロリットルを各ウェルに添加した。第１回目に投入したファージの力価は３ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍｌであった。次の回に投入したファージの力価は約１０１２ｃｆｕ／ｍｌであった。ファージは室温で２〜３時間インキュベートした。次にウェルをＰＢＳ  ３００μｌ／ウェルで１３回迅速に洗浄した。結合したファージは、グリシン−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ２．０  １５０μｌ／ウェルで１５分間インキュベートすることによって溶出した。得られた溶液を収集して、次にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。対数増殖期のＴＧ１細胞は、ヘルパーファージ、アンピシリン、およびグルコース（最終濃度２％）を添加する前に２ｘＹＴ培地中で３７℃で１時間溶出したファージで感染させた。
【０２８５】
３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を遠心して、２ｘＹＴ−ＡＫ培地に再懸濁した。次に、細胞を振盪機に戻して３７℃で一晩インキュベートした。次に一晩増幅したファージを沈殿させ、次のパンニングを行った。全部で９６個のクローンを３回および４回から無作為に採取して、結合活性をスクリーニングした。２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０８５２８および２０００年３月２９日出願のＢｅａｓｌｅｙ等の米国特許第０９／５３８０３８号で記載されたように、各回のいくつかのクローンのＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒへの結合を可溶性ペプチドとの競合によるファージＥＬＩＳＡでさらに試験した。競合は、ウェル当たりＲＰ９ペプチド、組換えＤ８ペプチド、または両者を５μｌ添加することによって競合を実施し、その後ウェル当たりファージ１００μｌを添加した。代表的なペプチドを以下の図４４Ａ〜４４Ｂおよび表１６に示す。
【０２８６】
2005505579.tif 000039
Ｐｅｐ．＝ペプチド、Ｆｏｒｍ．＝式、リンカー配列は太字で示し、下線を引いてある。ダイマーはいずれもＣ−Ｎ結合である。
【０２８７】
Ｃ．好ましいアミノ酸の決定
モノマーおよびダイマーペプチドの両方について、各ペプチドに好ましいアミノ酸を以下の通りに決定した。その位置で２０個のアミノ酸それぞれの予想される頻度はライブラリーのコドン利用および％ドーピングに基づいて計算した。次に、これを４回のバイオパンニングの後で各位置での各アミノ酸の実際の出現率と比較した。頻度＞２倍で出現したアミノ酸は好ましいと考えた。最も好ましいアミノ酸（類）は、パンニング後最も濃縮倍率の高いものであった。ＲＰ９、Ｄ８および式１０（群６）ペプチドに好ましいアミノ酸配列は、以下に示す。
【０２８８】
2005505579.tif 000040
【０２８９】
表１７は、ＲＰ９ペプチドに好ましいアミノ酸配列を示す。太字の残基は非常に好ましいことを示す。下線を引いた残基は、複数のアミノ酸が好ましい位置を示す。第１の列はパンニング方法に使用した条件を示す。「ＲＰ９」は親ＲＰ９の配列を示す。「基準」は、無作為ライブラリーのパンニング方法で説明したように、通常のパンを示す。「ｗ／ペプチド」は、ＲＰ９ペプチド  ２ｎＭの存在下でのパンニングを示す。「ｗ／インシュリン」は、インシュリン  ２ｎＭの存在下でのパンニングを示す。
【０２９０】
2005505579.tif 000041
【０２９１】
表１８は、Ｄ８ペプチドに好ましいアミノ酸配列を示す。太字の大文字の残基は、非常に好ましいものを示し（頻度＞９０％）、太字ではない大文字はいくらか好ましいものを示し（頻度が予測よりも５〜１５％高い）、小文字は少し好ましくないものを示す（頻度が予測よりも２〜５％高い）。同様の好ましさは、Ｄ８でモノマーおよびダイマーライブラリーの両方に認められた。下線のＹ／Ｗは、両残基のその位置での好ましさが等しいことを示す。元のＤ８配列では、この位置はＹによって占められている。
【０２９２】
2005505579.tif 000042
【０２９３】
表１９は、群６ペプチドに好ましい配列を示す。下線の残基は、好ましいＮ末端およびＣ末端の延長を示す。
【０２９４】
（実施例１２）
蛍光をベースとしたｈＩＧＦ−１Ｒ結合アッセイ
Ａ．異種時間分解蛍光アッセイ
組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｒｈＩＧＦ−１Ｒ）へのビオチン化組換えヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｒｈＩＧＦ−１）の結合に対する組換えペプチドＧ３３（ｒＧ３３）の影響は、異種時間分解蛍光アッセイ（ＴＲＦ、ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）、ＰＥ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）を使用して測定した。ｒｈＩＧＦ−１Ｒタンパク質には、アミノ酸残基９３２個までの受容体プレプロペプチドの細胞外ドメインが含まれた（A. Ullrich等、1986, EMBO J. 5:2503-2512）。２連のデータ点を競合剤各濃度で収集して、データの４変数非線形回帰分析（ｙ＝ｍｉｎ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０^（（ｌｏｇＩＣ５０−ｘ）＊Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ））に最も合致するように線を設定し、ＩＣ５０値を測定するために使用した。
【０２９５】
アッセイは、９６ウェルの透明なマイクロプレート（ＮＵＮＣ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）を使用して最終量１００μｌで実施した。マイクロタイタープレートをＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５緩衝液  １００μｌに溶かしたｒｈＩＧＦ−１Ｒ  ０．１μｇでコーティングして、室温（ＲＴ）で一晩インキュベートした。このプレートをＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８、２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ（ＴＢＳ）で３回洗浄した。この後に、ブロッキング緩衝液（ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｃｏｈｎ画分Ｖ）０．０５％を含有するＴＢＳ）２００μｌを添加して、ＲＴで１時間インキュベートした。このプレートをＷａｌｌａｃ’ｓ  ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）洗浄濃縮物１ｘ溶液で６回洗浄した。競合物を５０μｌの量で添加し、ＢＳＡ  ０．０５％を含有するＴＢＳでマイクロタイタープレートにおいて連続希釈した。非特異的結合（バックグラウンド）は、ｈＩＧＦ−１  ６０μＭの存在下で測定した。
【０２９６】
ＢＳＡ  ０．０５％を含有するＴＢＳで希釈したｂ−ｒｈＩＧＦ−１、１０ｎＭ、５０マイクロリットルを添加した。このプレートをＲＴで２時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＷａｌｌａｃ’ｓ  ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）洗浄濃縮物１ｘ溶液で６回洗浄した。次に、プレートをユーロピウム標識ストレプトアビジン１：１０００希釈物を含有するＷａｌｌａｃ’ｓ  ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）アッセイ緩衝液  １００μｌで処理し、ＲＴで２時間インキュベートした。その後、Ｗａｌｌａｃ’ｓ  ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）洗浄濃縮物の１Ｘ溶液を用いて６回洗浄した。Ｗａｌｌａｃ’ｓ  ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）エンハンサー  １００μｌを添加して、プレートをＲＴで３０分間振盪した。振盪後、６２０ｎｍの蛍光シグナルをＶｉｃｔｏｒ２  １４２０プレートリーダー（ＰＥ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）で読み取った。１次データをバックグラウンド修正して、緩衝液対照で正規化し、次に％特異的結合として表した。Ｚ’因子は０．５以上で（Ｚ’＝１−（３σ＋＋３σ−）／｜μ＋−μ−｜；Zhang等、1999, J. Biomol. Screen. 4:67-73）、シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）の比は、約２０であった。これらの実験の結果を図４５に示す。ｒＧ３３について計算したＩＣ５０値を以下の表２０に示す。
【０２９７】
ｂ−ｒｈＩＧＦ−１のｒｈＩＧＦ−１Ｒへの結合に対する組換えペプチドＤ８１５（ｒＤ８１５）、ＲＰ９、Ｄ８１５−６ａａ−Ｇ３３、Ｄ８１５−６ａａ−ＲＰ９およびＤ８１５−１２ａａ−ＲＰ９の影響を前記の蛍光アッセイを使用して測定した。ＩＧＦ−１を対照として使用した。２連のデータ点を各濃度の競合物質で収集し、線はデータの４変数非線形回帰分析に最も合致することを表し、ＩＣ５０値を決定するために使用した。ｒＤ８１５の結果を図４６に示す。ＲＰ９の結果を図４７に示す。Ｄ８１５−６−Ｇ３３の結果を図４８に示す。Ｄ８１５−６−ＲＰ９の結果を図４９に示す。Ｄ８１５−１２−ＲＰ９の結果を図５０に示す。ＩＧＦ−１の結果を図５１に示す。ｒＤ８１５、ＲＰ９、Ｄ８１５−６ａａ−Ｇ３３、Ｄ８１５−６ａａ−ＲＰ９、Ｄ８１５−１２ａａ−ＲＰ９ペプチドおよびＩＧＦ−１のＩＣ５０値を以下の表２０に示す。リンカー配列には下線を引いてある。
【０２９８】
2005505579.tif 000043
【０２９９】
ＩＧＦ−１と比較したペプチドまたはダイマー全ての能力の順番は、以下の通りに測定された。ＩＧＦ−１＞Ｄ８１５−１２ａａ−ＲＰ９＞＞Ｄ８１５−６ａａ−ＲＰ９＞ＲＰ９≒Ｄ８１５−６ａａ−Ｇ３３＞ｒＧ３３＞ｒＤ８１５。これらの結果から、延長リンカー（１２個対６個のアミノ酸）を使用したＤ８１５とＲＰ９との結合によってＩＧＦ−１のそれ自体の受容体に対する結合に類似した能力を備えた競合物質が得られることが示唆される。
【０３００】
Ｂ．時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ
組換えヒトＩＧＦ−１Ｒからのビオチン化２０Ｅ２（ｂ−２０Ｅ２、部位１）の解離に対する部位１ペプチド、部位２ペプチド、およびｒｈＩＧＦ−１の影響は、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を使用して測定した。最も合致したデータの非線形回帰分析を使用して解離速度定数を決定した。各データ点は１回測定値を示す。
【０３０１】
アッセイは、９６ウェル白色マイクロプレート（ＮＵＮＣ）で最終量１００μｌで実施した。最終のインキュベーション条件は、ｂ−２０Ｅ２  １６．５ｎＭ、ＳＡ−ＡＰＣ（ストレプトアビジン−アロフィコシアニン）  ２．２ｎＭ、Ｅｕ３＋−ｒｈＩＧＦ−１Ｒ（ＬＡＮＣＥ（商標）標識、ＰＥ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８、２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、およびＢＳＡ  ０．１％（Ｃｏｈｎ画分Ｖ）であった。反応はＲＴで６時間行い、平衡に到達させた。この後、様々なペプチド  最終濃度１００μＭまたはＩＧＦ−１  最終濃度３０μＭを添加した。ペプチドまたはＩＧＦ−１を添加して、解離の測定を開始した（時間ゼロ、秒）。６６５ｎｍでの蛍光シグナルは、Ｖｉｃｔｏｒ２  １４２０プレートリーダー（ＰＥ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）によって３０秒間隔で読み取った。
【０３０２】
これらの実験の結果を図５２に示す。緩衝液対照は、研究した時間の間には変化せず、平衡は時間ゼロでの希釈物の添加によって妨害されないことが示された。過剰な（＞ＩＧＦ−１Ｒの２０Ｅ２  Ｋｄの１０００倍）部位１ペプチド、たとえばＨ２Ｃ、２０Ｅ２、またはＲＰ６は、使用した特定なペプチドに応じては変化せず、ｂ−２０Ｅ２の解離速度はこれらのペプチドについて同様であった。Ｄ８Ｂ１２（部位２ペプチド）およびＩＧＦ−１（部位１および部位２両方に結合する）は、ｂ−２０Ｅ２の解離速度に有意な差を示す。このことは、これらの薬剤が部位１結合の非競合またはアロステリック調節剤として作用することを示唆する。
【０３０３】
ビオチン化２０Ｅ２（Ｂ−２０Ｅ２）の組換えヒトＩＧＦ−１Ｒへの結合に対する様々なペプチドまたはペプチドダイマーの影響は、前述のようにＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを使用して測定した。これらの実験では、各データ点は２連のウェルの平均を示す。線はデータの４変数非線形回帰分析（ｙ＝ｍｉｎ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０＾（（ｌｏｇＩＣ５０−Ｘ）＊Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ））に最も合致することを表し、ＩＣ５０値の決定に使用した。
【０３０４】
このアッセイは、最終量３０μｌで３８４ウェル白色マイクロプレート（ＮＵＮＣ）を使用して実施した。最終的なインキュベーション条件は、ｂ−２０Ｅ２  １５ｎＭ、ＳＡ−ＡＰＣ  ２ｎＭ、Ｅｕ３＋−ｒｈＩＧＦ−１Ｒ（ＬＡＮＣＥ（商標）標識、ＰＥ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）２ｎＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８  ２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、およびＢＳＡ  ０．１％（Ｃｏｈｎ画分Ｖ）であった。ＲＴで１６〜２４時間インキュベートした後、６６５ｎｍおよび６２０ｎｍでの蛍光シグナルをＶｉｃｔｏｒ２  １４２０プレートリーダー（ＰＥ  Ｗａｌｌａｃ、Ｉｎｃ．）で読み取った。一次データをバックグラウンド修正して、緩衝液対照に正規化して、次に％特異的結合として表した。Ｚ’−因子は０．５より大きく（Ｚ’＝１−（３σ＋＋３σ−）／｜μ＋−μ−｜；Zhang等、1999, J. Biomol. Screen. 4:67-73）、シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）の比は、約４であった。これらの実験の結果を図５３に示す。以下の表２１は、これらの実験で計算したＩＣ５０値を示す。特に、これらのアッセイにおいてＣ１ペプチドのＩＧＦ−１Ｒ親和性は約１ｎＭ（図５３）および約１０ｎＭ（表２１）であることが示された。
【０３０５】
2005505579.tif 000044
2005505579.tif 000045
【０３０６】
Ｃ．蛍光偏光アッセイ
蛍光−ＲＰ９（ＦＩＴＣ−ＲＰ９）の可溶性ヒトインシュリン受容体−イムノグロブリン重鎖キメラ（ｓＩＲ−Ｆｃ、Bass等、1996, J. Biol. Chem. 271:19367-19375）への結合に対する様々なペプチドモノマーおよびダイマーの影響は、蛍光偏光アッセイ（ＦＰ）を使用して測定した。これらの実験では、各データ点は２連のウェルの平均を示す。線はデータの４変数非線形回帰分析に最も合致することを表し、ＩＣ５０値の決定に使用した。
【０３０７】
このアッセイは、最終量３０μｌで３８４ウェル白色マイクロプレート（ＮＵＮＣ）を使用して実施した。最終的なインキュベーション条件は、ＦＩＴＣ−ＲＰ９  １ｎＭ、ｓＩＲ  １０ｎＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ０．０５Ｍ（ｐＨ８、２５℃）、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ、ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ、ＢＧＧ  ０．０５％（ウシガンマグロブリン）、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）０．００５％であった。ＲＴで１６〜２４時間インキュベーションした後、５２０ｎｍでの蛍光シグナルをＡｎａｌｙｓｔ（商標）ＡＤプレートリーダー（ＬＪＬ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．）で読み取った。１次データはＦＩＴＣ−ＲＰ９を添加しないでｓＩＲ  １０ｎＭを使用してバックグラウンド修正して、緩衝液対照に対して正規化して、次に％特異的結合として表した。Ｚ’因子は０．５より大きく、（Ｚ’＝１−（３σ＋＋３σ−）／｜μ＋−μ−｜；Zhang等、1999, J. Biomol. Screen. 4:67-73）アッセイのダイナミックレンジは約１２５ｍＰであった。これらの実験と並行して、ｒｈＩＧＦ−１Ｒおよびｂ−２０Ｅ２を使用してＴＲ−ＦＲＥＴアッセイを前述のように実施した。ＦＰおよびＴＲ−ＦＲＥＴ実験の結果を、以下の表２２に示す。
【０３０８】
2005505579.tif 000046
ＦＰ  ｓＩＲ−Ｆｃ列は、得られたＩＣ５０（ｎＭ）値を示す（対ＦＩＴＣ−ＲＰ９）。ＴＲ−ＦＲＥＴ  ｒｈＩＧＦ−１Ｒ列は、得られたＩＣ５０（ｎＭ）値を示す（対ｂ−２０Ｅ２）。結合比：値が高ければ高いほど、ＩＧＦ−１ＲよりもＩＲに高い親和性を示す。Ｆｏｒｍ．＝式、Ｂｎｄｇ．＝結合。
【０３０９】
これらの結果は、Ｓ１７５、ＲＰ４、およびＲＰ１５はＩＲに対して高い親和性を示し、ＩＲよりもＩＧＦ−１Ｒに対して高い結合比を示すことを示唆した。Ｈ２Ｃ、２０Ｅ２、ＲＰ９およびＣ１は、ＩＲでＳ１７５、ＲＰ４、およびＲＰ１５よりも少し能力が弱く、これらのペプチドはＩＲよりもＩＧＦ−１Ｒに対して低い結合比を有していた。Ｇ３３およびＥ８は、ＩＲでＳ１７５、ＲＰ４、およびＲＰ１５よりも能力が弱く、ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲに同じような結合を示した。ＲＰ１６は、ＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒで能力が乏しいが、ＩＲよりもＩＧＦ−１Ｒに対して高い親和性を有していた。
【０３１０】
（実施例１３）
ＩＧＦ−１Ｒ結合性ペプチド−他の単離物
インシュリン受容体結合部位に結合し、部位１および部位２と称する複数の、非重複領域にさらに分割するペプチドの単離および特性は、既に記載されている（Ｂｅａｓｌｅｙ等のＷＯ０１／７２７７１として公開された２０００年３月２９日出願の米国出願第０９／５３８０３８号、Ｐｉｌｌｕｔｌａ等の２００１年９月２４日出願の米国特許出願番号０９／９６２７５６号、Pillutla等、2002, J. Biol. Chem. 277:22590-22594）。ＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストを同定するために、多層方法を使用した。第１に、ＩＲと比較してＩＧＦ−１Ｒに対する選択性が高い部位１ペプチドを同定した。第２に、第２ライブラリーは、第１ライブラリーパンニングの情報を使用して作製した。これらの第２ライブラリーは、結合、特異性、および親和性に必要なアミノ酸を定義するために設計した。
【０３１１】
モチーフ内に必要な最適な配列を決定するために、ランダムライブラリーから同定したクローンに基づいた第２ライブラリーは、隣接領域は一定に保たれ、核は変化可能であるように作製した。このライブラリーは、ペプチド当たり核配列の（平均）アミノ酸残基の半分が変化するように、ライブラリーをドープオリゴヌクレオチドから調製した。これらのライブラリーをパンニングすることによって、結合に影響を与えるか、または与えない核内の代替を同定した。他の取り組みでは、結合親和性および／または特異性を与える隣接領域のアミノ酸は、核は一定に保たれており、隣接配列はドープされているか、または無作為化された第２ライブラリーを設計することによって定義した。両型のライブラリーでは、結合に最適なアミノ酸は、ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングすることによって選択した。適切な結合特性を有する第２ペプチドを同定したら、好ましいペプチドが定義された。これを行うために、各位置のアミノ酸は、ドープ戦略から予測される結果と結合集団で見いだされた実際の結果との比較に基づいて最適化した。
【０３１２】
Ａ．１次ペプチドライブラリー
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＴＧ１（遺伝子型＝Ｋ１２Δ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄΔ５／Ｆ’［ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃｌｑ、ｌａｃＺΔＭ１５］はＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から得られた。４０個のランダムアミノ酸を含有するペプチドをコードするＤＮＡ断片は、合成オリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ技術によって作製した。１４５塩基のオリゴヌクレオチドは、配列（ＮＮＫ）４０（式中、Ｎ＝Ａ、Ｃ、ＴまたはＧであり、Ｋ＝ＧまたはＴである）を含むように合成した。このオリゴヌクレオチドは、いずれも５’末端をビオチン化した２種類の短いオリゴヌクレオチドプライマーと共に、ＰＣＲ反応で鋳型として使用した。得られた生成物を精製して、濃縮して、ファージミドｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結した。連結生成物を精製して、コンピテント細菌細胞にエレクトロポレーションした。形質転換体を３７℃で１時間増殖させて、収集して、選択培地に撒いた。エレクトロポレーションしたＤＮＡの量に応じて、ランダム４０マーペプチド細胞ライブラリーの違いが１．６ｘ１０１０と１ｘ１０１１独立クローンとの間であることが認められた。ファージライブラリーは、標準的ファージ調製方法に従って、細胞ライブラリーを救出することによって作製した(G.P. Smith and J.K. Scott, 1993, Methods Enzymol. 217:228-257）。ファージ力価は、通常４ｘ１０１３ｃｆｕ／ｍｌであった。以前の実験では、細胞ライブラリーからランダムに選択されたクローンを配列決定することによって、クローン全体の５４％がインフレームであることが示された。短いＦＬＡＧ配列（ＤＹＫＤ、配列番号１５４５）は、免疫親和性タグとしてＮ末端に含められた。さらに、Ｅタグエピトープ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ、配列番号ＸＸ）は、ペプチドのカルボキシ末端に付けた。他の２０マーペプチドのランダムファージライブラリーは、同様の方法を使用して構築した。これらの細胞ライブラリーの違いは、＞１．１ｘ１０１１クローンと概算された。
【０３１３】
Ｂ．第２および第３ライブラリー
合成ＤＮＡ鋳型を生成したとき、所望する数のアミノ酸変異体をコドンレベルで親ペプチドに導入した。たとえば、アミノ酸の４５％において変化が所望されるとき（すなわち、９変化／２０アミノ酸）、遺伝子コードの縮重のためコドンレベルで６０％の変化が必要とされた（効率因子０．７５）。位置毎に、これはＤＮＡ合成レベルで２０％ドーピングに翻訳した。ＤＮＡ合成レベルでは、２０％ドーピングには合成鋳型における以下の比のヌクレオチドが含まれる。
Ａ    ８０％Ａ、    ６．６％Ｃ、  ６．６％Ｇ、  ６．６％Ｔ
Ｃ    ６．６％Ａ    ８０％Ｃ、    ６．６％Ｇ、  ６．６％Ｔ
Ｇ    ６．６％Ａ    ６．６％Ｃ、  ８０％Ｇ、    ６．６％Ｔ
Ｔ    ６．６％Ａ    ６．６％Ｃ、  ６．６％Ｇ、  ８０％Ｔ
【０３１４】
この表では、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ（下線を引いた太字）塩基は、親配列の元の塩基を表す。細胞ライブラリーのクローンを配列決定して、アミノ酸変異の数をペプチド当たりで調べると、変化の平均数は所望する値と相関することが発見された。合成鋳型が得られた後で、既に説明したように、ＤＮＡをｃＣＡＮＴＢＡ５Ｅファージミドベクターに連結して、ＴＧＩ株で細胞ライブラリーを作製した。ファージレスキューを実施して、パンニング実験で使用するファージライブラリーを作製した。
【０３１５】
Ｃ．ペプチドライブラリーのパンニング
標準的方法を使用してマイクロタイタープレート全てをコーティングしてブロックした。プレートは、ＮａＨＣＯ３、０．２Ｍ、ｐＨ９．４に溶かしたＩＧＦ−１Ｒでコーティングした。ＩＧＦ−１Ｒ  １００ｎｇを含有する溶液１００マイクロリットルを９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐプレート、Ｎｕｎｃ）の適切な数のウェルに添加して、４℃で一晩インキュベートした。次に、ウェルをＰＢＳに溶かした無脂乳（ＭＰＢＳ）２％溶液で室温で少なくとも１時間ブロックした。
【０３１６】
ＩＧＦ−１Ｒでコーティングした４個から８個のウェルをそれぞれのパンニングに使用した。ファージ１００マイクロリットルを各ウェルに添加した。初回に投入したファージ力価は約１０１３ｃｆｕ／ｍｌであった。次の回に投入したファージの力価は、約１０１２ｃｆｕ／ｍｌであった。ファージはＲＴで２〜３時間結合させた。次に、ウェルを迅速にＰＢＳ３００μ／ウェルで１３回洗浄した。結合したファージは、グリシン−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ２．０、１５０μｌ／ウェルで５分間インキュベートすることによって溶出した。得られた溶液を収集して、次にＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で中和した。
【０３１７】
対数増殖期のＴＧ１細胞に、ヘルパーファージ、アンピシリンおよびグルコース（最終濃度２％）を添加する前に、２ｘＹＴ培地中で３７℃で１時間溶出ファージを感染させた。さらに３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を遠心して、２ｘＹＴ−ＡＫ培地に再懸濁した。次に、細胞を振盪機に戻し、３７℃で一晩インキュベートした。次に、増幅したファージを一晩沈殿させ、次のパンニングを行った。全体で９６個のクローンを３回および４回から無作為に採取して、結合活性をスクリーニングした。
【０３１８】
Ｄ．ファージのＥＬＩＳＡ分析
ファージ集団では、凍結ストックから細胞を増殖させ、前述したようにファージを調製した。個々のクローンの分析では、コロニーを採取して、前述のようにファージを調製した。その後の段階は、集団ファージおよびクローンファージで同様であった。マイクロタイターウェルを前述のようにコーティングしてブロックした。ウェルをＩＧＦ−１ＲまたはＩＲのいずれかでコーティングした。ＭＰＢＳ（無脂乳２％を含有するＰＢＳ）に再懸濁したファージをウェルに添加して（１００μｌ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。次にファージ溶液を除去して、ウェルをＰＢＳで室温で３回洗浄した。
【０３１９】
西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）をＭＰＢＳで１：３０００に希釈して、各ウェルに添加した（１００μｌ／ウェル）。室温でさらに１時間インキュベートして、次に説明通りＰＢＳで洗浄した。ＡＢＴＳ溶液を添加すると発色した（１００μ／ウェル、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）。各ウェルをＳＤＳ  ０．５％に調節することによって発色を止めた。プレートは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）およびＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して４０５ｎｍで分析した。データ点は、適切なブランクを差し引いた後平均化した。クローンは、ウェルのＡ４０５がバックグラウンドの≧２倍であるならば、「陽性」と見なした。
【０３２０】
Ｅ．好ましいアミノ酸の決定
各ペプチドに好ましいアミノ酸は以下の通りに決定した。その位置で２０個のアミノ酸それぞれの予測される出現頻度をコドン使用およびライブラリーの％ドーピングに基づいて計算した。次に、バイオパンニングを４回行った後の実際の各位置での各アミノ酸の出現頻度とこれを比較した。頻度≧２倍で出現する任意のアミノ酸は好ましいと見なした。最も好ましいアミノ酸（類）は、パンニング後最も濃縮されたものと定義した。各位置で決定された好ましいアミノ酸を使用して、最も好ましい配列のペプチドを設計した。
【０３２１】
ＩＧＦ−１Ｒに結合する第２ライブラリーをパンニングすることによって同定された代表的なモノマーおよびダイマーペプチドは、図５４Ａ〜５４Ｂ、５５Ａ〜５５Ｂ、５６Ａ〜５６Ｂ、５７Ａ〜５７Ｂ、５８Ａ〜５８Ｂ、５９Ａ〜５９Ｂ、６０Ａ〜６０Ｃ、６１Ａ〜６１Ｂ、６２Ａ〜６２Ｂ、６３Ａ〜６３Ｂおよび６４Ａ〜６４Ｂに示す。１次ライブラリーパンニングによって、前述のＲＰ６、ＲＰ４８、ＲＰ５２、ＲＰ５４、ＲＰ５６およびＲＰ６０を含むいくつかのペプチドが生成された。好ましいアミノ酸に従って設計されたペプチド（すなわち、設計したペプチド）には、ＲＰ３０−ＩＧＦ、ＲＰ３１−ＩＧＦ、およびＲＰ３３−ＩＧＦが含まれた。
【０３２２】
（実施例１４）
ＩＧＦ−１アンタゴニストペプチド
Ａ．細胞および試薬
ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａ細胞株は、米国菌培養収集所（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞は通常牛胎児血清１０％およびグルタマックス１％を補給したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖させた。ＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインは、Ｒ＆Ｄ系の組換えタンパク質として得られた（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。
【０３２３】
Ｂ．細胞全体の溶解物
定量的ＩＲＳ−１リン酸化分析では、単層培養したＭＣＦ−７細胞（集密度８０％）約を使用した。血清を含まないＲＰＭＩ培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で約２０時間飢餓状態にした後ＩＧＦ−１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、またはＩＧＦ−１プラスペプチド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓによって製造された合成ペプチド）を含有するか、または陰性対照として何も添加しない同様の培地で細胞を１０分間刺激した。処理後、細胞をＰＭＳＦ  ０．２ｍＭおよびＮａ３ＶＯ４  １ｍＭ（全てＳＩＧＭＡ製）を含有する氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を同様の緩衝液中に掻き取って、２００ｘｇで３分間遠心することによってペレットにした。溶解は、ホスファターゼ阻害剤カクテル１および２（ＳＩＧＭＡ）およびプロテアーゼカクテル阻害剤錠剤（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（ＮａＣｌ  ０．８７６６％、ＳＤＳ  ０．１１％、デオキシコール酸  ０．５％（全てＳＩＧＭＡ製）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  １％（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））で氷上で５分間実施した。細胞溶解物は、１４０００ｘｇで５分間遠心することによって透明にして、得られた上清をエタノール−ドライアイスで素早く凍結して、−８０℃で保存した。タンパク質濃度は、Ｄcタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して測定した。
【０３２４】
Ｃ．免疫沈降およびウェスタンブロット分析
免疫沈降は、予め透明化した溶解物で、抗ＩＲＳ−１ポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１μｇを有する全タンパク質０．３〜０．５ｍｇおよびタンパク質Ａ／アガローススラリー（ＳＩＧＭＡ）２５μｌを使用して、４０℃で４時間実施した。タンパク質を固定したアガロースビーズをＩＰ洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、Ｎａ３ＶＯ４  １ｍＭ、ＰＭＳＦ  ０．２ｍＭ）で３回洗浄した。タンパク質の溶出および変性は、β−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）  ０．５Ｍを含むＬａｅｍｍｌｅ試料緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）３０μｌ中において９５℃で３分実施した。
【０３２５】
免疫沈降物は４〜１５％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ既製ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｄｉｕｍニトロセルロース膜（いずれもＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に移した。膜は無脂乳２％を含有するＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ）でブロックした。ＩＲＳ−１タンパク質を検出するために、ブロットを抗ＩＲＳ−１抗体、次にヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体第２抗体ＨＲＰ−複合体でインキュベートした。リン酸化ＩＲＳ−１を検出するために、ブロットを抗ホスホチロシン（４Ｇ１０）モノクローナル抗体ＨＲＰ複合体とインキュベートした。抗体は全て、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。ブロットを増強化学ルミネセンス基質（ＥＣＬウェスタンブロッティング分析システム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に曝露した。フィルムを現像し、定量分析のために蛍光シグナルを視覚化した。
【０３２６】
Ｄ．ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａ細胞アッセイ
合成的に生成したペプチドはＤＭＳＯ１００％中で３０ｍＭストックとして維持し、一方組換えダイマーは水で希釈した。合成および組換えペプチドは全て、−８０℃で保存した。ＤＭＳＯの最終濃度は、＜０．１％であった。ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）細胞はＦＢＳ１０％を含有するＲＰＭＩで保持した。細胞は全て、血清を含まないＲＰＭＩ培地で増殖させることによって一晩飢餓状態にした。細胞をトリプシン処理して、９６ウェルプレートに１５０μｌ／ウェルの量でウェル当たり１〜３ｘ１０３細胞で接種する前にＰＢＳで３回洗浄した。点は全て、９６ウェルプレートで２連で実施した。アンタゴニスト活性アッセイでは、ペプチドを添加する直前に、ウェルから培地全てをゆっくり除去した。ペプチドは、ＦＢＳ０．１％プラスＩＧＦ−１  ５０ｎＭを含有するＲＰＭＩを使用して別のプレートに最終量１５０μｌで１：２に連続希釈した。この混合物を細胞に移し、プレートをＣＯ２インキュベータ内で３７℃で７２時間インキュベートした。細胞数を定量するために、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）１０μｌを各ウェルに添加して、プレートを約２時間３７℃／ＣＯ２インキュベータに戻した。次に、測定値は４４０ｎｍで読み取り、参照として７００ｎｍを使用した。
【０３２７】
Ｅ．結合（ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎ）アッセイ
結合をアッセイするために、ＩＧＦ−１と比較したペプチドの相対能力は、ビオチン化ヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｈＩＧＦ−１）およびＨｉｓ−タグ可溶性組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｓｒｈＩＧＦ−１Ｒ−ｈｉｓ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用した競合系で分析した。受容体リガンド相互反応の検出は、増幅ルミネセンス近接ホモジニアスアッセイ（ＡＬＰＨＡＳｃｒｅｅｎ、ＢｉｏＳｉｇｎａｌ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ）で測定した。このアッセイは、３８４ウェルＮｕｎｃ（商標）白色ポリスチレンマイクロプレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）で最終量４０μｌで実施した。最終的なインキュベーション条件は、ｂ−ｈＩＧＦ−１  １ｎＭ、ｓｒｈＩＧＦ−１Ｒ−ｈｉｓ  １０ｎＭ、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４、２５℃）０．０２５Ｍ、ＮａＣｌ  ０．１００Ｍ、ＢＳＡ０．１％（Ｃｏｈｎ画分Ｖ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ニッケル結合アクセプタービーズ  １０μｇ／ｍｌ、およびストレプトアビジン結合ドナービーズ  １０μｇ／ｍｌであった。
【０３２８】
アッセイの第１段階では、ｈＩＧＦ−１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、ｂ−ｈＩＧＦ−１（以下参照）、およびペプチドを室温で２時間インキュベートした。競合物質の各濃度は、２連でアッセイした。非特異的結合は、ｈＩＧＦ−１  ３ｘ１０−５Ｍの存在下で測定した。アッセイの第２段階では、アクセプタービーズを添加して、０．５時間インキュベートを続けた。最終段階では、ドナービーズを添加して、インキュベートをさらに１時間続けた。インキュベーション期間の最後に、５２０ｎｍでの蛍光シグナルをＦｕｓｉｏｎ−α  ＨＴプレートリーダー（Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で読み取った。１次データは、バックグラウンド修正して、緩衝液対照に正規化して、次に％特異的結合として表した。データは、４変数非線形回帰分析（ｙ＝ｍｉｎ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０^（（ｌｏｇＩＣ５０−ｘ）＊Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ）））に合致させ、ＩＣ５０値を測定するために使用した。このアッセイのＺ’因子は、０．７より大きく（Ｚ’＝１−（３σ＋＋３σ−）／｜μ＋−μ−｜）、シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比は、４０と７０との間であった。
【０３２９】
ヒトＩＧＦ−１はＰｉｅｒｃｅ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（ＰＮ＃２１４３０、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して遊離アミノ基をビオチン化した。ＰＢＳ、ｐＨ７．２に溶かしたヒトＩＧＦ−１  ２ｍｇ／ｍｌは、理論的に全遊離アミノ基よりも２０倍過剰なｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと室温で３０分間インキュベートした。未反応のビオチンはＰＢＳに対して十分透析することによって除去し（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット）、結合の程度はＨＡＢＡ（２−（４’−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ製品文書番号２１４３０）によって測定した。ｈＩＧＦ−１当たりのビオチンの数は、３と５との間で変化した。
【０３３０】
Ｆ．ＦＤＣ−Ｐ２細胞アッセイ
合成的に生成したペプチドはＤＭＳＯ１００％に溶かして３０ｍＭストックとして保持し、一方組換えダイマーは水で希釈した。合成および組換えペプチドは全て、−８０℃で保存した。ＤＭＳＯの最終濃度は、＜０．１％であった。ＦＤＣ−Ｐ２（Ｊ．Ｐｉｅｒｃｅ博士、国立衛生研究所、Bethesda、ＭＤから恵与）細胞はＦＢＳ  １５％およびＷＥＨＩ（Ｇｅｎｏｑｕｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）５％を含有するＲＰＭＩでＣＯ２インキュベータ内で３７℃で維持した。実験を開始するために、細胞全てをＦＢＳ  １％を含有するＲＰＭＩで５時間飢餓状態にした。細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１ｘ１０４細胞で、７５μｌ／ウェルの量で接種した。ペプチドを最終濃度の２倍で添加し、全ての点は２連で実施した。アンタゴニストアッセイでは、２倍濃度のペプチドをＦＢＳ  ０．１％およびＩＧＦ−１  １ｎＭを含有するＲＰＭＩを使用して別のプレートに最終量７５μｌで１：２で連続希釈した。この混合物を細胞に移し、最終量を１５０μｌとした。プレートをＣＯ２インキュベータ内で３７℃で４８時間インキュベートした。細胞数を定量するために、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）１０μｌを各ウェルに添加し、プレートを約２時間３７℃／ＣＯ２インキュベータに戻した。次に、測定値は４４０ｎｍで読み取り、参照として７００ｎｍを使用した。
【０３３１】
Ｇ．結果
ペプチドＲＰ３３−ＩＧＦは、ＩＧＦ−１に類似したＩＧＦ−１Ｒへの親和性を示した（９ｎＭ、表２３）。その他のペプチド、たとえばＲＰ５４はマイクロモルの範囲の親和性を示した（表２３）。ＩＲで見いだされたこととは対照的に、競合実験ではＩＧＦ−１Ｒ部位１および部位２ペプチドは互いに競合できることが示された。このことは、ＩＧＦ−１Ｒの部位１と部位２との間の官能基相互反応はＩＲで認められるもの（データは発表せず）とは異なることを示唆している。
【０３３２】
どの部位１ペプチドがアンタゴニストとして作用できるかを決定するために、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２応答ヒト腫瘍細胞株を使用して増殖アッセイを確立した。１６種類のヒト腫瘍細胞株を血清を含まない条件下でＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の存在下での増殖能力についてスクリーニングした。２種類の細胞株、ＭＣＦ−７（乳癌）およびＭｉａＰａＣａ（膵臓癌）は、最良のＩＧＦ−１に対する用量応答曲線（ＥＤ５０＝５ｎＭ、図６５Ａ〜６５Ｆ）を示し、その後の実験で使用した。
【０３３３】
ペプチドを合成して、ＥＤ５０（５０ｎＭ）の１０倍のＩＧＦ−１用量での増殖アッセイでスクリーニングした。ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａ両方のＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２増殖を確実に阻害するＲＰ３３−ＩＧＦを含めたいくつかのアンタゴニストペプチドを同定した（図６６Ｂ〜６６Ｃ）。さらに、ペプチドＲＰ５２およびＲＰ５４は、少なくとも１細胞株においてアンタゴニストとして作用することが発見された（表２６、図７０Ａ〜７０Ｂ）。ペプチドＲＰ５２およびＲＰ５４はその他のペプチドとして分類され、本明細書で開示したいかなる式にも類別されなかった（たとえば、式１、式２など）。
【０３３４】
次に、アンタゴニストペプチドが重要なシグナル伝達中間体、ＩＲＳ−１の段階で受容体活性化を阻害するかどうかを決定するための実験を実施した。第１に、ＩＲＳ−１の最大活性化に必要な最適な時間およびＩＧＦ−１の濃度を確立した（図６７Ａ〜６７Ｂおよび図６８Ａ〜６８Ｂ）。ＩＲＳ−１の最大リン酸化は、処理１０分後に認められ、その後シグナルは減少した（図６７Ａ〜６７Ｂ）。このパターンは、おそらくプロテアソームに関連した機構によるＩＲＳ−１タンパク質の分解によるのであろう（Lee等、2000, Mol. Cell. Biol., 2000, 20:1489-1496）。第２に、ＲＰ３３−ＩＧＦを２個の関連のないペプチドと比較した。ＲＰ３３−ＩＧＦペプチドはＩＲＳ−１リン酸化を阻害するが、一方関連のないペプチドは増殖アッセイで何ら影響を及ぼさなかった（図６９Ａ〜６９Ｂ）。
【０３３５】
ＲＰ３３−ＩＧＦペプチドは元々ＲＰ６ＫＫ配列から得られたので、ＲＰ６ＫＫペプチドの活性もまた試験した。ＲＰ６ＫＫおよびＲＰ３３−ＩＧＦは両方ともＩＲＳ−１のＩＧＦ−１による活性化を効果的に阻害することが発見された（図６９Ａ〜６９Ｂ）。使用した濃度では、９０％以上のタンパク質はリン酸化されておらず、両ペプチドはＩＧＦ−１Ｒ活性化を効果的に阻害することが示された。しかし、ＲＰ３３−ＩＧＦはＲＰ６ＫＫとはアミノ酸が１１個異なり、ＲＰ３３−ＩＧＦは細胞増殖アッセイでは優れたＩＧＦ−１Ｒアンタゴニストであった（表２４〜２５）。両方ともアッセイ中に無傷のまま保持されることが見いだされたので（データは発表せず）、生物学的活性の違いはペプチドの安定性とは関係ないようであった。
【０３３６】
2005505579.tif 000047
１次および２次ライブラリーパンニングから同定されたＩＧＦ−１Ｒのペプチドアンタゴニスト。＊ペプチドが結合する部位は、標的としてＩＲおよびＩＧＦ−１Ｒの両方を使用した競合アッセイに基づいて指定した。＋親和性は、本明細書で説明したようにＩＧＦ−１に対してＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイを使用して測定した。$アンタゴニスト性は、本明細書で説明したようにＩＧＦ−１の存在下で、ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａ細胞を使用した増殖アッセイによって測定した。ＮＤ＝実施せず、Ｐｅｐ．＝ペプチド、Ａｆｆｉｎ．＝親和性、Ａｎｔａｇ．＝アンタゴニスト、Ｍｉｓｃ．＝その他のペプチド、システイン残基は四角で囲った。
【０３３７】
2005505579.tif 000048
ＭＣＦ−７細胞での細胞増殖アッセイにおいてＩＧＦ−１活性を阻害するモノマーおよびダイマーペプチド。Ｆｏｒｍ．＝式、Ｍｉｓｃ．＝その他のペプチド、システイン対は、陰付きで、下線を引いてある。式１および式２モチーフのＦＹ、ＷＦ、およびＬ残基は陰を付けて、太字で示す。
【０３３８】
2005505579.tif 000049
ＭｉａＰａＣａ細胞での細胞増殖アッセイにおいてＩＧＦ−１活性を阻害するモノマーおよびダイマーペプチド。Ｆｏｒｍ．＝式、Ｍｉｓｃ．＝その他のペプチド、システイン対は、陰付きで、下線を引いてある。式１および式２モチーフのＦＹ、ＷＦ、およびＬ残基は陰を付けて、太字で示す。
【０３３９】
2005505579.tif 000050
2005505579.tif 000051
ＦＤＣ−Ｐ２細胞での細胞増殖アッセイにおいてＩＧＦ−１活性を阻害するモノマーおよびダイマーペプチド。Ｆｏｒｍ．＝式、Ｌｉｇ＝側鎖アミノ基に２−アミノヒドロキシアセチル基（ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２）を有するジアミノプロピオン酸、１７、１９、１２などの数は特異的化学リンカーを表す（表３参照）、Ｃ−Ｃ＝Ｃ末端とＣ末端との結合、Ｎ−Ｎ＝Ｎ末端とＮ末端との結合、システイン対は、陰付きで、下線を引いてある。式１および式２モチーフのＦＹ、ＷＦ、およびＬ残基は陰を付けて、太字で示す。
【０３４０】
（実施例１５）
ＩＧＦ−１アゴニストペプチド
Ａ．ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａ細胞アッセイ
合成的に生成したペプチドはＤＭＳＯ１００％に溶かして３０ｍＭストックとして維持し、一方組換えダイマーは水で希釈した。合成および組換えペプチドは全て、−８０℃で保存した。ＤＭＳＯの最終濃度は、＜０．１％であった。ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）細胞はＦＢＳ１０％を含有するＲＰＭＩで維持した。細胞は全て、血清を含まないＲＰＭＩ培地で増殖させることによって一晩飢餓状態にした。細胞をトリプシン処理して、９６ウェルプレートに１５０μｌ／ウェルの量でウェル当たり１〜３ｘ１０３細胞で接種する前にＰＢＳで２回洗浄した。点は全て、９６ウェルプレートにおいて２連で実施した。アゴニスト活性アッセイでは、ペプチドを添加する直前に、ウェルから培地全てをゆっくり除去した。ペプチドは、ＦＢＳ  ０．１％を含有するＲＰＭＩを使用して別のプレートに最終量１５０μｌで１：２に連続希釈した。この希釈ペプチド溶液を細胞に移し、プレートをＣＯ２インキュベータ内で３７℃で７２時間インキュベートした。細胞数を定量するために、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）１０μｌを各ウェルに添加して、プレートを約２時間３７℃／ＣＯ２インキュベータに戻した。次に、測定値は４４０ｎｍで読み取り、参照として７００ｎｍを使用した。
【０３４１】
Ｂ．ＦＤＣ−２細胞アッセイ
ペプチドは、前記に示したように維持して保存した。ＦＤＣ−Ｐ２細胞（Ｊ．Ｐｉｅｒｃｅ博士から恵与、ＮＩＨ）はＦＢＳ  １５％およびＷＥＨＩ（Ｇｅｎｏｑｕｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）５％を含有するＲＰＭＩでＣＯ２インキュベータ内で３７℃で維持した。実験を開始するために、細胞全てをＦＢＳ  １％を含有するＲＰＭＩで５時間飢餓状態にした。細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１ｘ１０４細胞で、７５μｌ／ウェルの量で接種した。ペプチドを最終濃度の２倍で添加し、全ての点は２連で実施した。アゴニストアッセイでは、２倍濃度のペプチドをＦＢＳ  ０．１％を含有するＲＰＭＩを使用して別のプレートに最終量７５μｌで１：２に連続希釈した。この希釈ペプチド溶液を細胞に移し、最終量を１５０μｌとした。このプレートをＣＯ２インキュベータ内で３７℃で４８時間インキュベートした。細胞数を定量するために、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）１０μｌを各ウェルに添加し、プレートを約２時間３７℃インキュベータに戻した。次に、測定値は４４０ｎｍで読み取り、参照として７００ｎｍを使用した。
【０３４２】
これらの実験では、ペプチド競合能力は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ形式を使用して測定した。１次データは、バックグラウンド修正して、緩衝液対照に正規化して、次に％特異的結合として表した。データは、４変数非線形回帰分析（ｙ＝ｍｉｎ＋（ｍａｘ−ｍｉｎ）／（１＋１０^（（ｌｏｇＩＣ５０−ｘ）＊Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ））に合致し、ＩＣ５０値を測定するために使用した。このアッセイのＺ’因子は、０．７より大きく（Ｚ’＝１−（３σ＋＋３σ−）／｜μ＋−μ−｜）、シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比は、４０と７０との間であった。
【０３４３】
Ｃ．結果
ＭＣＦ−７およびＭｉａＰａＣａ細胞の両方の増殖を確実に刺激するいくつかのＩＧＦ−１Ｒアゴニストペプチドを同定した（表２７〜２８、図７３Ａ〜７３Ｄおよび図７４Ａ〜７４Ｉ）。ＩＧＦ−１Ｒアゴニスト活性を備えたモノマーペプチドには、ＲＰ６０、ＲＰ４８、Ｇ３３、Ｃ１およびＬ−ＲＰ９ｅｘが含まれた（表２７〜２８）。ＩＧＦ−１Ｒアゴニスト活性を備えたダイマーペプチドには、ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２、ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３１−ＩＧＦ、ＲＰ３１−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ、Ｄ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ、ＲＰ６−Ｌ−Ｄ８Ｂ１２、Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９、Ｄ１１２−１２−Ｄ１１２、ＲＰ９−１２−ＲＰ９およびＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６が含まれる（表２７〜２８）。アゴニストペプチドはまた、ＦＤＣ−Ｐ２細胞増殖アッセイを使用して同定した（表２９）。ＩＧＦ−１Ｒアゴニスト活性を備えたモノマーペプチドには、Ｇ３３−ｌｉｇ、Ｇ３３、Ｓ１７５、Ｄ８１５、ｌｉｇ−Ｄ８１５、ＲＰ３１−ＩＧＦおよびＤ８１５が含まれた（表２９）。ＩＧＦ−１Ｒアゴニスト活性を有するダイマーペプチドには、ＲＰ６−ＲＰ９、Ｇ３３−６−Ｇ３３およびＤ８１５−ＲＰ９が含まれた（表２９）。
【０３４４】
さらに、ＭＣＦ−７またはＭｉａＰａＣａ細胞増殖アッセイでアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するペプチドは、ＩＧＦ−１Ｒへの結合に対してＩＧＦ−１と競合を示した（図７１Ａ〜７１Ｆおよび図７２Ａ〜７２Ｅ）。ペプチドモノマーＲＰ６０、ＲＰ４８、ｓＧ３３、Ｌ−ＲＰ９ｅｘおよび１２−ＲＰ９ｅｘのペプチド競合能力は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ形式を使用して測定した（図７１Ａ〜７１Ｆ）。ダイマーペプチドｒＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２、ｒＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３１−ＩＧＦ、ｒＲＰ３１−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ、ｒＤ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ、ｒＤ１１２−１２−Ｄ１１２の能力もまた、測定した（図７２Ａ〜７２Ｅ）。
【０３４５】
ＦＤＣ−Ｐ２（骨髄細胞、ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＧＦ−１Ｒ受容体）、ＭＣＦ−７（乳癌細胞、ハイブリッドＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ受容体）およびＭｉａＰａＣａ（膵臓癌細胞、ハイブリッドＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ受容体）アッセイにおけるモノマーおよびダイマーの生物学的応答を比較した（表３０）。場合によっては、調節効果（アゴニストまたはアンタゴニスト）がある細胞株では認められたが、その他では認められなかった。たとえば、ＲＰ３０−ＩＧＦペプチドは、ＦＤＣ−Ｐ２およびＭｉａＰａＣａ細胞ではアンタゴニスト活性を示したが、ＭＣＦ−７細胞では示さなかった（表３０）。Ｃ１ペプチドはＦＤＣ−Ｐ２およびＭＣＦ−７細胞ではアンタゴニスト活性を示したが、ＭｉａＰａＣａ細胞では示さなかった。ＲＰ９−ＲＰ６、Ｌ−ＲＰ９ｅｘ、およびＤ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９ペプチドは、使用した細胞株に応じてアンタゴニスト活性またはアゴニスト活性のいずれかを示した（表３０）。したがって、本発明のペプチドを使用して特異的な調節効果で特異的細胞型を標的とすることは可能である。
【０３４６】
2005505579.tif 000052
ＭＣＦ−７細胞を使用して細胞増殖を刺激するモノマーおよびダイマーペプチド。Ｆｏｒｍ．＝式、Ｎ／Ａ＝適用せず、Ｍｉｓｃ．＝その他の配列、システイン対は、陰付きで、下線を引いてある。式１および式２モチーフのＦＹ、ＷＦ、およびＬ残基は陰を付けて、太字で示す。
【０３４７】
2005505579.tif 000053
ＭｉａＰａＣａ細胞を使用して細胞増殖を刺激するモノマーおよびダイマーペプチド。Ｆｏｒｍ．＝式、Ｎ／Ａ＝適用せず、Ｍｉｓｃ．＝その他の配列、システイン対は、陰付きで、下線を引いてある。式１および式２モチーフのＦＹ、ＷＦ、およびＬ残基は陰を付けて、太字で示す。
【０３４８】
2005505579.tif 000054
ＦＤＣ−Ｐ２細胞を使用して細胞増殖を刺激するモノマーおよびダイマーペプチド。Ｆｏｒｍ．＝式、Ｎ／Ａ＝適用せず、Ｌｉｇ＝側鎖アミノ基に２−アミノヒドロキシアセチル基（ＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２）を備えたジアミノプロピオン酸、システイン対は、陰付きで、下線を引いてある。式１および式２モチーフのＦＹ、ＷＦ、およびＬ残基は陰を付けて、太字で示す。
【０３４９】
2005505579.tif 000055
2005505579.tif 000056
ＮＤ＝実施せず、＋＝効果が観察された、Ｎｏ＝効果が観察されず、Ｃｙｓ＝推定システインループを含む
【０３５０】
本明細書に全体を参考として援用したのは、配列番号１から配列番号２２２７までが含まれる適用配列リストである。配列リストは、「ＣＲＦ］、「コピー１」および「コピー２」と称する３個のＣＤ−ＲＯＭに明示する。配列リストは、コンピュータで読み取れる「１８７８４０５６ＰＣ．ａｐｐ．ｔｘｔ」と称するＡＳＣＩＩファイルで、２００２年９月２３日にＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９８オペレーティングシステムでＩＢＭ−ＰＣ機器形式で作製された。１８７８４０５６ＰＣ．ａｐｐ．ｔｘｔの大きさは、９２７４７７バイトである。
【０３５１】
前記の組成および方法は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々な調節を行うことが可能で、前記の説明に含まれるか、添付した図面に示すか、または添付のクレームで定義した対象物全ては、例示として解釈されるものであり、限定を意味するものではない。
【０３５２】
本明細書で引用した特許、特許出願、出版物、本、参考マニュアル、教科書および要約の全ては、本発明が関係する従来技術をより完全に説明するために全体を参考として援用した。
【図面の簡単な説明】
【０３５３】
【図１Ａ】ＩＲに対してパンニングしたランダムな４０マーライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号１〜３）を示した図である。
【図１Ｂ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたランダムな４０マーライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号４〜６）を示した図である。
【図１Ｃ】ＩＲに対してパンニングしたランダムな２０マーライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号７〜２９）を示した図である。
【図１Ｄ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたランダムな２０マーライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号３０〜３３）を示した図である。
【図１Ｅ−１】ＩＲに対してパンニングしたＸ１〜１０ＮＦＹＤＷＦＶＸ１８〜２１（配列番号３４、「Ａ６Ｓ」とも称する）を含有するように構築した２１マーライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号３５〜９８）を示した図である。
【図１Ｅ−２】図１Ｅ−１の続きである。
【図１Ｅ−３】図１Ｅ−２の続きである。
【図１Ｆ−１】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＸ１〜１０ＮＦＹＤＷＦＶＸ１８〜２１（配列番号３４、「Ａ６Ｓ」とも称する）を含有するように構築した２１マーライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号９９〜１６６）を示した図である。
【図１Ｆ−２】図１Ｆ−１の続きである。
【図１Ｆ−３】図１Ｆ−２の続きである。
【図１Ｇ−１】ＩＲに対してパンニングした、指示したようなＡ６ペプチド（「Ａ６Ｌ」（配列番号１６７）とも称する）のコンセンサス核の外側に調節を含む様に構築されたライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号１６８〜２１６）を示した図である。
【図１Ｇ−２】図１Ｇ−１の続きである。
【図１Ｈ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングした、指示したようなＡ６ペプチド（「Ａ６Ｌ」（配列番号１６７）とも称する）のコンセンサス核の外側に調節を含む様に構築されたライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号２１７〜２４４）を示した図である。
【図１Ｉ−１】ＩＲに対してパンニングした（指示したような）Ｅ４Ｄペプチド（配列番号２４５）のコンセンサス核に調節を含む様に構築されたライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号２４６〜３０５）を示した図である。
【図１Ｉ−２】図１Ｉ−１の続きである。
【図１Ｉ−３】図１Ｉ−２の続きである。
【図１Ｊ−１】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングした（指示したような）Ｅ４Ｄペプチド（配列番号２４５）のコンセンサス核に調節を含む様に構築されたライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号３０６〜３４２）を示した図である。
【図１Ｊ−２】図１Ｊ−１の続きである。
【図１Ｋ−１】ＩＲに対してパンニングした配列Ｘ１〜６ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＸ２１〜２６（配列番号３４３、Ｈ２Ｃ−Ａ）を使用して構築したライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号３４４〜４３０）を示した図である。
【図１Ｋ−２】図１Ｋ−１の続きである。
【図１Ｋ−３】図１Ｋ−２の続きである。
【図１Ｋ−４】図１Ｋ−３の続きである。
【図１Ｌ−１】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングした配列Ｘ１〜６ＦＨＥＮＦＹＤＷＦＶＲＱＶＳＸ２１〜２６（配列番号３４３、Ｈ２Ｃ−Ａ）を使用して構築したライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号４３１〜４６７）を示した図である。
【図１Ｌ−２】図１Ｌ−１の続きである。
【図１Ｍ−１】配列Ｘ１〜６ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６〜２１（配列番号４６８、Ｈ２Ｃ−Ｂ）を使用して構築し、ＩＲに対してパンニングしたライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号４６９〜５７５）を示した図である。
【図１Ｍ−２】図１Ｍ−１の続きである。
【図１Ｍ−３】図１Ｍ−２の続きである。
【図１Ｍ−４】図１Ｍ−３の続きである。
【図１Ｍ−５】図１Ｍ−４の続きである。
【図１Ｎ−１】配列Ｘ１〜６ＦＨＸＸＦＹＸＷＦＸ１６〜２１（配列番号４６８、Ｈ２Ｃ−Ｂ）を使用して構築し、ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号５７６〜６５７）を示した図である。
【図１Ｎ−２】図１Ｎ−１の続きである。
【図１Ｎ−３】図１Ｎ−２の続きである。
【図１Ｏ−１】ＩＲに対してパンニングしたその他のライブラリーから得られた式１モチーフペプチド配列（配列番号６５８〜７１２）を示した図である。
【図１Ｏ−２】図１Ｏ−１の続きである。
【図１Ｏ−３】図１Ｏ−２の続きである。
【図２Ａ】ＩＲに対してパンニングしたランダム２０マーライブラリーから同定された式４モチーフペプチド配列（配列番号７１３）を示した図である。
【図２Ｂ−１】ＩＲに対してパンニングした、指示したように（１５％予測、「Ｆ８１５」と称する）Ｆ８ペプチド（配列番号７１３）における調節を含有する様に構築されたライブラリーから同定された式４モチーフペプチド配列（配列番号７１４〜７９６）を示した図である。
【図２Ｂ−２】図２Ｂ−１の続きである。
【図２Ｂ−３】図２Ｂ−２の続きである。
【図２Ｃ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングした、指示したように（１５％ドープ、「Ｆ８１５」と称する）Ｆ８ペプチド（配列番号７１３）における調節を含有するように構築されたライブラリーから同定された式４モチーフペプチド配列（配列番号７９７〜８１１）を示した図である。
【図２Ｄ−１】ＩＲに対してパンニングした、指示したように（２０％ドープ、「Ｆ８２０」と称する）Ｆ８ペプチド（配列番号７１３）における調節を含有するように構築されたライブラリーから同定された式４モチーフペプチド配列（配列番号８１２〜８６１）を示した図である。
【図２Ｄ−２】図２Ｄ−１の続きである。
【図２Ｅ−１】ＩＲに対してパンニングしたその他のライブラリーから同定した式４モチーフペプチド配列（配列番号８６２〜９２５）を示した図である。
【図２Ｅ−２】図２Ｅ−１の続きである。
【図２Ｅ−３】図２Ｅ−２の続きである。
【図３Ａ】ＩＲに対してパンニングして、ランダム２０マーから同定した式６モチーフペプチド配列（配列番号９２６〜９２８）を示した図である。
【図３Ｂ−１】ＩＲに対してパンニングした、指示したような（１５％ドープ、「Ｄ８１５」と称する）Ｄ８ペプチド（配列番号９２９）における調節を含有するように構築されたライブラリーから同定された式６モチーフペプチド配列（配列番号９３０〜９６７）を示した図である。
【図３Ｂ−２】図３Ｂ−１の続きである。
【図３Ｃ−１】ＩＲに対してパンニングした、指示したように（２０％ドープ、「Ｄ８２０」と称する）Ｄ８ペプチド（配列番号９２９）における調節を含有するように構築されたライブラリーから同定された式６モチーフペプチド配列（配列番号９６８〜１０１０）を示した図である。
【図３Ｃ−２】図３Ｃ−１の続きである。
【図３Ｄ−１】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングした、指示したように（２０％ドープ、「Ｄ８２０」と称する）Ｄ８ペプチド（配列番号９２９）における調節を含有するように構築されたライブラリーから同定された式６モチーフペプチド配列（配列番号１０１１〜１０５９）を示した図である。
【図３Ｄ−２】図３Ｄ−１の続きである。
【図３Ｅ】ＩＲに対してパンニングしたその他のライブラリーから同定した式６モチーフペプチド配列（配列番号１０６０〜１０６１）を示した図である。
【図４Ａ】図４Ａ−１および図４Ａ−２は、ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたランダム２０マーライブラリーから同定した式１０モチーフペプチド配列（配列番号１０６２〜１０７７）を示した図である。
【図４Ｂ】図４Ｂ−１および図４Ｂ−２は、ＩＲに対してパンニングしたランダム２０マーライブラリーから同定した式１０モチーフペプチド配列（配列番号１０７８〜１０８２）を示した図である。
【図４Ｃ】ＩＲに対してパンニングしたランダム２０マーライブラリーから同定した多種多様なペプチド配列（配列番号１０８３〜１０８６）を示した図である。
【図４Ｄ】ＩＲに対してパンニングしたランダム４０マーライブラリーから同定した多種多様なペプチド配列（配列番号１０８７〜１０８８）を示した図である。
【図４Ｅ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたランダム２０マーライブラリーから同定した多種多様なペプチド配列（配列番号１０８９〜１０９２）を示した図である。
【図４Ｆ】図４Ｆ−１および図４Ｆ−２は、ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＸ１〜４ＣＸ６〜２０ライブラリーから同定した多種多様なペプチド配列（配列番号１０９３〜１１１３）を示した図である。
【図４Ｇ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングした、指示したように（Ｆ８１５）Ｆ８ペプチド（配列番号１１１４）の変種を含有するように構築したライブラリーから同定した多種多様なペプチド配列（配列番号１１１５〜１１１８）を示した図である。
【図４Ｈ】ＩＲに対してパンニングした、指示したように（「ＮＮＫＨ」と称する）Ｆ８Ａ１１ペプチド（配列番号１１１９）の変種を含有するように構築したライブラリーから同定された多種多様なペプチド配列（配列番号１１２０〜１１４２）を示した図である。
【図４Ｉ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングした、指示したように（「ＮＮＫＨ」と称する）Ｆ８Ａ１１ペプチド（配列番号１１１９）の変種を含有するように構築したライブラリーから同定された多種多様なペプチド配列（配列番号１１４３〜１１５４）を示した図である。
【図５Ａ】式１、４、６および１０の代表的な特異的アミノ酸配列の概要（配列番号１１５５〜１１８０）を示した図である。
【図５Ｂ】式１、４、６および１０の代表的な特異的アミノ酸配列の概要（配列番号１１８１〜１２２０）を示した図である。
【図６】競合データに基づいてＩＲ上の２個の結合部位ドメインを示した図である。
【図７】ＩＲ上の複数の結合部位に対して起こり得る結合様式を示した概略図である。
【図８】１群のＩＲ結合性ペプチド（配列番号１２２１〜１２４３）のバイオパンニングの結果および配列アラインメントを示した図である。発見された配列の数はＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ受容体のいずれかに結合するファージのデータと共に図の右側に示す。吸収シグナルは、＋＋＋＋、＞バックグラウンドの３０倍、＋＋＋１５〜３０倍、＋＋、５〜１５倍、＋、２〜５倍、および０、＜２倍で示す。
【図９Ａ】２、６および７群のＩＲ結合性ペプチド（配列番号１２４４〜１２６１）のバイオパンニングの結果および配列アラインメントを示した図である。発見された配列の数はＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒ受容体のいずれかに結合するファージのデータと共に図の右側に示す。吸収シグナルは、＋＋＋＋、＞バックグラウンドの３０倍、＋＋＋１５〜３０倍、＋＋、５〜１５倍、＋、２〜５倍、および０、＜２倍で示す。
【図９Ｂ】図９Ａの続きである。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｃは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドで測定したインシュリン競合データを示した図である。図１０Ａは、競合曲線である。図１０Ｂは、ペプチドを示す印を示す。図１０Ｃは、ペプチドの説明である。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｄは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドで測定したインシュリン競合データを示した図である。図１１Ａは、競合曲線である。図１１Ｂは、ペプチドを示す印を示す。図１１Ｃは、ペプチドの説明である。図１１Ｄは、ペプチドのＩＲ結合親和性を示した図である。
【図１２】図１２Ａ−２１Ｄは、切断型合成ＲＰ９モノマーペプチド、Ｓ３９０およびＳ３９４の遊離脂肪細胞アッセイの結果を示した図である。図１２Ａは、ペプチドＳ３９０の結果を示した図である。図１２Ｂは、ペプチドＳ３９４の結果を示した図である。図１２Ｃは、ペプチドＳ３９０およびＳ３９４（配列番号１７９４および１７８８、それぞれ出現順）のアミノ酸配列を示した図である。図１２Ｄは、完全長ＲＰ９ペプチドの結果を示した図である。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｃは、切断型合成ＲＰ９ダイマーペプチド、Ｓ４１５およびＳ４１７の遊離脂肪細胞アッセイの結果を示した図である。図１３Ａは、ペプチドＳ４１５の結果を示した図である。図１３Ｂは、ペプチドＳ４１７の結果を示した図である。図１３Ｃは、ペプチドＳ４１５およびＳ４１７（配列番号１７９５および１７９６）のアミノ酸配列を示した図である。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｃは、ＲＰ９ホモダイマーペプチド、５２１および５３５の遊離脂肪細胞アッセイの結果を示した図である。図１４Ａは、ペプチド５２１の結果を示した図である。図１４Ｂは、ペプチド５３５の結果を示した図である。図１４Ｃは、ペプチド５２１および５３５のアミノ酸配列を示した図である。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｃは、ＲＰ９−Ｄ８ヘテロダイマーペプチド、５３７および５３８の遊離脂肪細胞アッセイの結果を示した図である。図１５Ａは、ペプチド５３７の結果を示した図である。図１５Ｂは、ペプチド５３８の結果を示した図である。図１５Ｃは、ペプチド５３７および５３８のアミノ酸配列を示した図である。
【図１６】図１６Ａ−１６Ｃは、ＲＰ９−Ｄ８ヘテロダイマーペプチド、５３７および５３８の遊離脂肪細胞アッセイの結果を示した図である。図１６Ａは、ペプチド５３７の結果を示した図である。図１６Ｂは、ペプチド５３８の結果を示した図である。図１６Ｃは、ペプチド５３７および５３８のアミノ酸配列を示した図である。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｂは、Ｄ８−ＲＰ９ヘテロダイマーペプチド、５３９の遊離脂肪細胞アッセイの結果を示した図である。図１７Ａは、ペプチド５３９の結果を示した図である。図１７Ｂは、ペプチド５３９のアミノ酸配列を示した図である。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｄは、方向および結合がそれぞれ部位１−部位２Ｃ−Ｎ（図１８Ａ）、部位１−部位２、Ｎ−Ｎ（図１８Ｂ）、部位１−部位２、Ｃ−Ｃ（図１８Ｃ）および部位２−部位１、Ｃ−Ｎ（図１８Ｄ）である構成モノマーペプチドを有する部位１／部位２ダイマーペプチドの遊離脂肪細胞アッセイの結果を示した図である。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドのヒトインシュリン受容体キナーゼアッセイの結果を示した図である。図１９Ａは、基質リン酸化曲線を示した図である。図１９ＢはＥＣ５０値を示した図である。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｂは、部位１−部位２および部位２−部位１ダイマーペプチドのヒトインシュリン受容体キナーゼアッセイの結果を示した図である。図２０Ａは、基質リン酸化曲線を示した図である。図２０ＢはＥＣ５０値を示した図である。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｂは、部位１−部位２および部位２−部位１ペプチドのヒトインシュリン受容体キナーゼアッセイの結果を示した図である。図２１Ａは、基質リン酸化曲線を示した図である。図２１ＢはＥＣ５０値を示した図である。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｂは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドが可溶性ヒトインシュリン受容体−イムノグロブリン重鎖キメラに対する結合をビオチン化ＲＰ９モノマーペプチドと競合する能力を評価するための時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイの結果を示した図である。図２２Ａは結合曲線を示した図である。図２２Ｂはペプチド配列（それぞれ出現順に配列番号２１１７、１９１６〜１９１７、１５５８、１９９４、１９６０〜１９６１、２００８、１７９４、２０１５〜２０１６、１５６０および２００１〜２００２）を示す印および説明を示した図である。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｃは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドが可溶性ヒトインシュリン受容体−イムノグロブリン重鎖キメラに対する結合をビオチン化Ｓ１７５モノマーペプチドあるいはビオチン化ＲＰ９モノマーペプチドと競合する能力を示す時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイの結果を示した図である。図２３Ａ〜２３Ｂは結合曲線を示した図である。図２３Ｃはペプチド配列（それぞれ出現順に配列番号２１１７、１９１６〜１９１７、１５５８、１９９４、１９６０〜１９６１、２００８、１７９４、２０１５〜２０１６、１５６０および２００１〜２００２）を示す印および説明を示した図である。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｂは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドが可溶性ヒトインシュリン受容体外部ドメインに対する結合を蛍光標識ＲＰ９モノマーペプチドと競合する能力を示す蛍光偏光アッセイの結果を示した図である。図２４Ａは結合曲線を示した図である。図２４Ｂはペプチド配列（それぞれ出現順に配列番号２１１７、１９１６〜１９１７、１５５８、１９９４、１９６０〜１９６１、２００８、１７９４、２０１５〜２０１６、１５６０および２００１〜２００２）を示す印および説明を示した図である。
【図２５】図２５Ａ−２５Ｂは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドが可溶性ヒトインシュリン受容体ミニドメインに対する結合を蛍光標識ＲＰ９モノマーペプチドと競合する能力を示す蛍光偏光アッセイの結果を示した図である。図２５Ａは結合曲線を示した図である。図２５Ｂはペプチド配列（それぞれ出現順に配列番号２１１７、１９１６〜１９１７、１５５８、１９９４、１９６０〜１９６１、２００８、１７９４、２０１５〜２０１６、１５６０および２００１〜２００２）を示す印および説明を示した図である。
【図２６】図２６Ａ−２６Ｂは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドが可溶性ヒトインシュリン受容体外部ドメインに対する結合を蛍光標識インシュリンと競合する能力を示す蛍光偏光アッセイの結果を示した図である。図２６Ａは結合曲線を示した図である。図２６Ｂはペプチド配列（それぞれ出現順に配列番号２１１７、１９１６〜１９１７、１５５８、１９９４、１９６０〜１９６１、２００８、１７９４、２０１５〜２０１６、１５６０および２００１〜２００２）を示す印および説明を示した図である。
【図２７】図２７Ａ−２７Ｂは、様々なモノマーおよびダイマーペプチドが可溶性ヒトインシュリン受容体ミニドメインに対する結合を蛍光標識インシュリンと競合する能力を示す蛍光偏光アッセイの結果を示した図である。図２７Ａは結合曲線を示した図である。図２７Ｂはペプチド配列（それぞれ出現順に配列番号２１１７、１９１６〜１９１７、１５５８、１９９４、１９６０〜１９６１、２００８、１７９４、２０１５〜２０１６、１５６０および２００１〜２００２）を示す印および説明を示した図である。
【図２８】マルトース結合性タンパク質の融合タンパク質を構築するための概略図である。
【図２９】ＩＲとマルトース結合性タンパク質融合ペプチドＨ２Ｃ−９ａａ−Ｈ２Ｃ、Ｈ２Ｃ、およびＨ２Ｃ−３ａａ−Ｈ２Ｃとの間の競合結合のＢＩＡｃｏｒｅ分析を示した図である。
【図３０】マルトース結合性タンパク質融合ペプチドによるｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＲ自己リン酸化の刺激を示した図である。
【図３１】図３１Ａ−３１Ｃは、インシュリンおよび部位２−部位１ペプチド、Ｓ５１９およびＳ５２０の遊離脂肪細胞アッセイの結果を示した図である。図３１Ａは、Ｓ５１９の結果を示した図である。図３１ＢはＳ５２０の結果を示した図である。図３１ＣはＥＣ５０値を示した図である。
【図３２】図３２Ａ−３２Ｂは、インシュリンおよび部位２−部位１ペプチドＳ５１９およびＳ５２０のヒトインシュリン受容体キナーゼアッセイの結果を示した図である。図３２Ａは、基質リン酸化曲線を示した図である。図３２Ｂは、算出したベストフィット値を示した図である。
【図３３】ウィスターラットに静脈内投与した部位２−部位１ペプチドＳ５１９の効果を示したｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果を示した図である。
【図３４】図３４Ａ−３４Ｅは、ＩＧＦ−１ペプチドＲＰ９（部位１）およびＤ８１５（部位２）のファージ競合実験の結果を示した図である。ファージ：ＲＰ９（Ａ６様）、ＲＰ６（Ｂ６様）、Ｄ８Ｂ１２（部位２）、およびＤ８１５（部位２）、ペプチド：ＲＰ９およびＤ８１５。図３４Ａ〜３４Ｂは、競合曲線を示した図である。図３４Ｃ〜３４Ｅは印およびペプチド群を示した図である。
【図３５】図３５Ａ−３５Ｅは、６〜１２個のアミノ酸リンカーを含有する部位２−部位１ダイマーペプチドのファージ競合実験を示した図である。ファージ：ＲＰ９、ＲＰ６、Ｄ８Ｂ１２、およびＤ８１５、ペプチド：Ｄ８１５−６Ｌ−ＲＰ９およびＤ８１５−１２Ｌ−ＲＰ９。図３５Ａ〜３５Ｂは、競合曲線を示した図である。図３５Ｃ〜３５Ｅは印およびペプチド群を示した図である。
【図３６】ＦＤＣ−Ｐ２細胞を使用したＩＧＦ−１アゴニストアッセイの結果を示した図である。部位１ペプチドＲＰ６、ＲＰ９、Ｇ３３、および部位２ペプチドＤ８１５をアゴニストアッセイで試験した。
【図３７】ＦＤＣＰ−２細胞を使用したＩＧＦ−１アゴニストアッセイの結果を示した図である。部位１ペプチドＲＰ６、ＲＰ９、Ｇ３３および部位２ペプチドＤ８１５をアンタゴニストトアッセイで試験した。
【図３８】ＦＤＣＰ−２細胞を使用したＩＧＦ−１アゴニストアッセイの結果を示した図である。部位１ペプチド２０Ｅ２、Ｓ１７５、およびＲＰ９をアゴニストアッセイで試験した。
【図３９】ペプチドモノマーおよびダイマーのアゴニストおよびアンタゴニスト実験の結果を示した図である。モノマー：Ｄ８１５およびＲＰ９、ダイマー：Ｄ８１５−６ａａ−ＲＰ９およびＤ８１５−１２ａａ−ＲＰ９。
【図４０】ペプチドモノマーおよびダイマーのアゴニストおよびアンタゴニスト実験の結果を示した図である。モノマー：Ｇ３３およびＤ８１５、ダイマー：Ｄ８１５−６ａａ−Ｇ３３。
【図４１】ペプチドモノマーおよびダイマーのアゴニストおよびアンタゴニスト実験の結果を示した図である。モノマー：Ｇ３３、Ｄ８１５およびＲＰ９、ダイマー：Ｄ８１５−６ａａ−ＲＰ９およびＤ−８１５−１２ａａ−ＲＰ９。
【図４２】ＦＤＣ−Ｐ２細胞を使用したＩＧＦ−１標準曲線を示した図である。
【図４３Ａ−１】図４３Ａ−４３Ｂは、ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＧ３３およびＲＰ６第２ライブラリーから同定されたペプチドモノマー（配列番号１２６２〜１４３２）を示した図である。図４３Ａは、Ｇ３３第２ライブラリーのペプチドを示した図である。
【図４３Ａ−２】図４３Ａ−１の続きである。
【図４３Ａ−３】図４３Ａ−２の続きである。
【図４３Ｂ−１】図４３Ｂは、ＲＰ６第２ライブラリーのペプチドを示した図である。
【図４３Ｂ−２】図４３Ｂ−１の続きである。
【図４３Ｂ−３】図４３Ｂ−２の続きである。
【図４４Ａ−１】図４４Ａ−４４Ｂは、ＩＲまたはＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたライブラリーから同定されたペプチドダイマー（配列番号１４３３〜１５４０）を示した図である。図４４Ａは、ＩＲに対してパンニングしたダイマーペプチドを示した図である。
【図４４Ａ−２】図４４Ａ−１の続きである。
【図４４Ｂ−１】図４４Ｂは、ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたダイマーペプチドを示した図である。
【図４４Ｂ−２】図４４Ｂ−１の続きである。
【図４４Ｂ−３】図４４Ｂ−２の続きである。
【図４５】ビオチン化組換えヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｒｈＩＧＦ−１）の組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｒｈＩＧＦ−１Ｒ）への結合に対する組換えペプチドＧ３３（ｒＧ３３）の影響を示す異種時間分解蛍光アッセイの結果を示した図である。
【図４６】ビオチン化組換えヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｒｈＩＧＦ−１）の組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｒｈＩＧＦ−１Ｒ）への結合に対する組換えペプチドＤ８１５（ｒＤ８１５）の影響を示す異種時間分解蛍光アッセイの結果を示した図である。
【図４７】ビオチン化組換えヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｒｈＩＧＦ−１）の組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｒｈＩＧＦ−１Ｒ）への結合に対する組換えペプチドＲＰ９の影響を示す異種時間分解蛍光アッセイの結果を示した図である。
【図４８】ビオチン化組換えヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｒｈＩＧＦ−１）の組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｒｈＩＧＦ−１Ｒ）への結合に対する組換えペプチドＤ８１５−６−Ｇ３３の影響を示す異種時間分解蛍光アッセイの結果を示した図である。
【図４９】ビオチン化組換えヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｒｈＩＧＦ−１）の組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｒｈＩＧＦ−１Ｒ）への結合に対する組換えペプチドＤ８１５−６−ＲＰ９の影響を示す異種時間分解蛍光アッセイの結果を示した図である。
【図５０】ビオチン化組換えヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｒｈＩＧＦ−１）の組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｒｈＩＧＦ−１Ｒ）への結合に対する組換えペプチドＤ８１５−１２−ＲＰ９の影響を示す異種時間分解蛍光アッセイの結果を示した図である。
【図５１】ビオチン化組換えヒトＩＧＦ−１（ｂ−ｒｈＩＧＦ−１）の組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ｒｈＩＧＦ−１Ｒ）への結合に対するＩＧＦ−１の影響を示す異種時間分解蛍光アッセイの結果を示した図である。
【図５２】組換えヒトＩＧＦ−１Ｒからのビオチン化２０Ｅ２（ｂ−２０Ｅ２、部位１）の解離に対する部位１ペプチド、部位２ペプチドおよびｒｈＩＧＦ−１の影響を示す時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイの結果を示した図である。
【図５３】組換えヒトＩＧＦ−１Ｒからのビオチン化２０Ｅ２（ｂ−２０Ｅ２、部位１）の解離に対する様々なペプチドモノマーおよびダイマーの影響を示す時間分解蛍光共鳴エネルギー移動アッセイの結果を示した図である。
【図５４Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してペプチドライブラリーをパンニングすることによって同定したアミノ酸配列を示した図である。このアミノ酸は１文字略号によって表す。バックグラウンドを上回る比は、４０５ｎｍでのシグナル（Ｅ−Ｔａｇ、ＩＧＦ−１Ｒ、またはＩＲ）を無脂乳の４０５ｎｍでのシグナルで除することによって決定する。ＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲ比の比較は、ＩＧＦ−１Ｒの比をＩＲの比によって除することによって決定する。ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒの比の比較は、ＩＲの比をＩＧＦ−１Ｒの比で除することによって決定する。Ｓｐ／Ｉｒｒ＝非特異的結合を上回る特異的結合の比。ＬＤＨ＝乳酸脱水素酵素（陰性対照）。
これらを含めて、各ライブラリーの設計は、最初の行に太字で示す。設計において、記号「Ｘ」は無作為の位置を示し、下線を引いたアミノ酸はヌクレオチドレベルのドープ位置を示し、その他の位置は一定に保持されている。リストに挙げた配列の略号には、以下のものが含まれる。ＱはＴＡＧ終止コドンに対応する位置を示す。＃はＴＡＡ終止コドンに対応する位置を示す。＊はＴＧＡ終止コドンに対応する位置を示し、？は未知のアミノ酸を示す。Ｑ残基は、ＴＡＧ終止コドンで読み過ごされた翻訳を示す。全てのライブラリーはリストに挙げた配列のＮ末端に短いＦＬＡＧ（登録商標）エピトープＤＹＫＤ（配列番号１５４５、Hopp等、1988, Bid/Technology 6:1205-1210）を有し、Ｃ末端にＥ−タグエピトープ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ，配列番号ＸＸ）を有するように設計された。ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＲＰ６第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。ＲＰ９ペプチドは式１、部位１モノマーである。
【図５４Ｂ】図５４Ａの続きである。
【図５５Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＲＰ９−ＮＰＢ２５第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。ＲＰ９−ＮＰＢ２５ペプチドは、２５個のアミノ酸Ｃ末端の延長を有する式２、部位１モノマーである。
【図５５Ｂ】図５５Ａの続きである。
【図５６Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＲＰ３０−ＩＧＦ−ＮＰＢ２０第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。ＲＰ３０−ＩＧＦ−ＮＰＢ２０ペプチドは、２０個のアミノ酸Ｃ末端の延長を有する部位１、式２モノマーである。
【図５６Ｂ】図５６Ａの続きである。
【図５７Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＮＰＢ２０−ＲＰ３０−ＩＧＦ第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。ＮＰＢ２０−ＲＰ３０−ＩＧＦペプチドは、２０個のアミノ酸Ｎ末端の延長を有する部位１、式２モノマーである。
【図５７Ｂ】図５７Ａの続きである。
【図５８Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＤ８１５第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。Ｄ８１５ペプチドは式６、部位２モノマーである。
【図５８Ｂ】図５８Ａの続きである。
【図５９Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＲＰ６−Ｄ８１５第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。ＲＰ６−Ｄ８１５ペプチドはリンカーのない部位１−部位２ダイマーである。
【図５９Ｂ】図５９Ａの続きである。
【図６０Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＲＰ６−６ａａ−Ｄ８１５第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。ＲＰ６−６ａａ−Ｄ８１５ペプチドはアミノ酸６個のリンカーを有する部位１−部位２ダイマーである。
【図６０Ｂ】図６０Ａの続きである。
【図６０Ｃ】図６０Ｂの続きである。
【図６１Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＲＰ６−ＲＰ９第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。ＲＰ６−ＲＰ９ペプチドはリンカーのない部位１−部位１ダイマーである。
【図６１Ｂ】図６１Ａの続きである。
【図６２Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＲＰ６−６ａａ−ＲＰ９第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。ＲＰ６−６ａａ−ＲＰ９ペプチドはアミノ酸６個のリンカーを有する部位１−部位１ダイマーである。
【図６２Ｂ】図６２Ａの続きである。
【図６２Ｃ】図６２Ｂの続きである。
【図６３Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＤ８１５−ＲＰ６第２ライブラリーから同定したペプチドを示した図である。Ｄ８１５−ＲＰ６ペプチドはリンカーのない部位２−部位１ダイマーである。
【図６３Ｂ】図６３Ａの続きである。
【図６４Ａ】ＩＧＦ−１Ｒに対してパンニングしたＤ８１５−６ａａ−ＲＰ６第２ライブラリーから同定されたペプチドを示した図である。Ｄ８１５−６ａａ−ＲＰ６ペプチドはアミノ酸６個のリンカーを有する部位２−部位１ダイマーである。
【図６４Ｂ】図６４Ａの続きである。
【図６５】図６５Ａ−６５Ｆは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２およびインシュリンに対応して測定した、ＭｉａＰａＣａおよびＭＣＦ−７細胞の細胞増殖における用量に関係した増加を示した図である。細胞をＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２またはインシュリンのいずれかで処理した。図６５Ａ：ＩＧＦ−１と共にインキュベートしたＭｉａＰａＣａ細胞の結果を示した図である。図６５Ｂ：ＭｉａＰａＣａ細胞をＩＧＦ−２と共にインキュベートした。図６５Ｃ：ＭｉａＰａＣａ細胞をインシュリンと共にインキュベートした。図６５Ｄ：ＭＣＦ−７細胞をＩＧＦ−１と共にインキュベートした。図６５Ｅ：ＭＣＦ−７細胞をＩＧＦ−２と共にインキュベートした。図６５Ｆ：ＭＣＦ−７細胞をインシュリンと共にインキュベートした。
【図６６】図６６Ａ−６６Ｃは、ペプチドＲＰ３３−ＩＧＦは、ＩＧＦ−１Ｒへの結合についてＩＧＦ−１による結合と競合し、細胞を用いたアッセイでは受容体活性に拮抗する。競合実験では、ＡＬＰＨＡスクリーンアッセイ様式を使用した（以下参照）。拮抗アッセイでは、ＲＰ３３−ＩＧＦを細胞に添加し、細胞をＩＧＦ−１と共にインキュベートして、細胞数を測定した。図６６Ａ：ＲＰ３３−ＩＧＦ濃度の関数としてのＩＧＦ−１結合阻害を示した図である。図６６Ｂ：ペプチドＲＰ３３−ＩＧＦによるＭＣＦ−７細胞のＩＧＦ−１Ｒへの拮抗作用を示した図である。図６６Ｃ：ペプチドＲＰ３３−ＩＧＦによるＭｉａＰａＣａ細胞のＩＧＦ−１Ｒへの拮抗作用を示した図である。
【図６７】図６７Ａ−６７Ｂは、ＩＧＦ−１は、ＭＣＦ−７細胞のＩＲＳ−１のリン酸化を一時的に刺激する。細胞をＩＧＦ−１で０、２、１０、３０、６０分刺激して、全タンパク質をそれぞれの分析のために免疫沈降させた。図６７Ａ：内在性ＩＲＳ−１のウェスタンブロット分析。図６７Ｂ：リン酸化ＩＲＳ−１のウェスタンブロット分析。列１：添加無し。列２：２分時。列３：１０分時。列４：３０分時。列５：６０分時。
【図６８】図６８Ａ−６８Ｂは、ＩＧＦ−１によって誘導されたＭＣＦ−７細胞のＩＲＳ−１のリン酸化は用量依存性である。濃度を増加させたＩＧＦ−１に細胞を曝露して、全タンパク質を免疫沈降させた。ＩＧＦ−１  ０．５０ｎＭで刺激することによって、ウェスタンブロット分析で確実に視覚化する最大下濃度のリン酸化が生じた。図６８Ａ：内因性ＩＲＳ−１のウェスタンブロット分析。図６８Ｂ：リン酸化ＩＲＳ−１のウェスタンブロット分析。列１：添加無し。列２：ＩＧＦ−１  ０．０５ｎＭ。列３：ＩＧＦ−１  ０．１ｎＭ。列４：ＩＧＦ−１  ５ｎＭ。列５：ＩＧＦ−１  １ｎＭ。列６：ＩＧＦ−１  ０．５ｎＭ。列７：ＩＧＦ−１  １０ｎＭ。列８：ＩＧＦ−１  ５０ｎＭ。
【図６９】図６９Ａ−６９Ｂは、ＭＣＦ−７細胞におけるＩＲＳ−１のＩＧＦ−１誘導リン酸化の合成ペプチドＲＰ６ＫＫおよびＲＰ３３−ＩＧＦによる阻害を示した図である。関連のないペプチドＫＣＢ１（ＶＳＩＧＥＣＧＧＬＲＨＨＲＶＲＥＬＣＬＶ、配列番号ＸＸ）およびＤＧＩ３−Ｄ１（ＥＣＲＷＦＲＰＷＲＣＰＧＬＬＳＴＧＧＧＲ、配列番号ＸＸ）を陰性対照として使用した。図６９Ａ：発現したＩＲＳ−１のウェスタンブロット分析。図６９Ｂ：リン酸化ＩＲＳ−１のウェスタンブロット分析。列１：添加無し。列２：ＤＧＩ３−Ｄ１。列３：ＫＣＢ１。列４：ＩＧＦ−１プラスＤＧＩ３−Ｄ１。列５：ＩＧＦ−１プラスＫＣＢ１。列６：ＩＧＦ−１プラスＲＰ６ＫＫ。列７：ＩＧＦ−１プラスＲＰ３３−ＩＧＦ。列８：ＩＧＦ−１。
【図７０】図７０Ａ−７０Ｃは、ペプチドＲＰ５４およびＲＰ５２はＩＧＦ−１Ｒへの結合をＩＧＦ−１と競合し、細胞増殖アッセイでアンタゴニストとして作用する。拮抗アッセイでは、ＲＰ５４またはＲＰ５２を細胞に添加し、細胞をＩＧＦ−１と共にインキュベートし、細胞数を測定した。図７０Ａ：ＭＣＦ−７細胞におけるＲＰ５４によるＩＧＦ−１Ｒの拮抗。図７０Ｂ：ＭｉａＰａＣａ細胞におけるＲＰ５４の拮抗。図７０Ｃ：ＭＣＦ−７細胞におけるＲＰ５２によるＩＧＦ−１の拮抗。
【図７１】図７１Ａ−７１Ｆは、ＭＣＦ−７細胞またはＭｉａＰａＣａ細胞増殖アッセイでＩＧＦ−１Ｒアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有するペプチドモノマーは、ＩＧＦ−１Ｒへの結合についてＩＧＦ−１と競合する。ペプチド競合能力は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ形式（以下参照）を使用して測定した。図７１Ａ：ＲＰ６０ペプチド。図７１Ｂ：ＲＰ４８ペプチド。図７１Ｃ：ｓＧ３３ペプチド。図７Ｄ：Ｃ１ペプチド。図７１Ｅ：Ｌ−ＲＰ９ｅｘペプチド。図７１Ｆ：１２−ＲＰ９ｅｘペプチド。
【図７２】図７２Ａ−７２Ｅは、ＭＣＦ−７細胞またはＭｉａＰａＣａ細胞増殖アッセイでＩＧＦ−１Ｒアゴニスト活性を有するペプチドダイマーは、ＩＧＦ−１Ｒへの結合についてＩＧＦ−１と競合する。ペプチド競合能力は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎアッセイ形式（以下参照）を使用して測定した。図７２Ａ：ｒＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２ペプチド（部位１−部位１）。図７２Ｂ：ｒＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３１−ＩＧＦペプチド（部位１−部位２）。図７２Ｃ：ｒＲＰ３１−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦペプチド（部位２−部位１）。図７２Ｄ：ｒＤ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦペプチド（部位１−部位１）。図７２Ｅ：ｒＤ１１２−１２−Ｄ１１２ペプチド（部位１−部位１）。
【図７３】図７３Ａ−７３Ｄは、ＭＣＦ−７細胞またはＭｉａＰａＣａ細胞増殖アッセイでＩＧＦ−１Ｒアゴニスト活性を有するペプチドモノマーを示した図である。図７３Ａ：ＲＰ６０ペプチド。図７３Ｂ：ＲＰ４８ペプチド。図７３Ｃ：Ｇ３３ペプチド。図７３Ｄ：Ｌ−ＲＰ９ｅｘペプチド。
【図７４Ａ】図７４Ａ−７４Ｉは、ＭＣＦ−７細胞またはＭｉａＰａＣａ細胞増殖アッセイでＩＧＦ−１Ｒアゴニスト活性を有するペプチドダイマーを示した図である。図７４Ａ：ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−Ｄ１１２（部位１−部位１）。
【図７４Ｂ】ＲＰ３０−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３１−ＩＧＦ（部位１−部位２）である。
【図７４Ｃ】ＲＰ３１−ＩＧＦ−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（部位２−部位１）である。
【図７４Ｄ】Ｄ１１２−１２−ＲＰ３０−ＩＧＦ（部位１−部位１）である。
【図７４Ｅ】ＲＰ６−Ｌ−Ｄ８Ｂ１２（部位１−部位２）である。
【図７４Ｆ】Ｄ８Ｂ１２−１２−ＲＰ９（部位２−部位１）である。
【図７４Ｇ】Ｄ１１２−１２−Ｄ１１２（部位１−部位１）である。
【図７４Ｈ】ＲＰ９−１２−ＲＰ９（部位１−部位１）である。
【図７４Ｉ】ＲＰ９−Ｌ−ＲＰ６（部位１−部位１）である。
【図１Ａ】
2005505579.tif 000057
【図１Ｂ】
2005505579.tif 000058
【図１Ｃ】
2005505579.tif 000059
【図１Ｄ】
2005505579.tif 000060
【図１Ｅ−１】
2005505579.tif 000061
【図１Ｅ−２】
2005505579.tif 000062
【図１Ｅ−３】
2005505579.tif 000063
【図１Ｆ−１】
2005505579.tif 000064
【図１Ｆ−２】
2005505579.tif 000065
【図１Ｆ−３】
2005505579.tif 000066
【図１Ｇ−１】
2005505579.tif 000067
【図１Ｇ−２】
2005505579.tif 000068
【図１Ｈ】
2005505579.tif 000069
【図１Ｉ−１】
2005505579.tif 000070
【図１Ｉ−２】
2005505579.tif 000071
【図１Ｉ−３】
2005505579.tif 000072
【図１Ｊ−１】
2005505579.tif 000073
【図１Ｊ−２】
2005505579.tif 000074
【図１Ｋ−１】
2005505579.tif 000075
【図１Ｋ−２】
2005505579.tif 000076
【図１Ｋ−３】
2005505579.tif 000077
【図１Ｋ−４】
2005505579.tif 000078
【図１Ｌ−１】
2005505579.tif 000079
【図１Ｌ−２】
2005505579.tif 000080
【図１Ｍ−１】
2005505579.tif 000081
【図１Ｍ−２】
2005505579.tif 000082
【図１Ｍ−３】
2005505579.tif 000083
【図１Ｍ−４】
2005505579.tif 000084
【図１Ｍ−５】
2005505579.tif 000085
【図１Ｎ−１】
2005505579.tif 000086
【図１Ｎ−２】
2005505579.tif 000087
【図１Ｎ−３】
2005505579.tif 000088
【図１Ｏ−１】
2005505579.tif 000089
【図１Ｏ−２】
2005505579.tif 000090
【図１Ｏ−３】
2005505579.tif 000091
【図２Ａ】
2005505579.tif 000092
【図２Ｂ−１】
2005505579.tif 000093
【図２Ｂ−２】
2005505579.tif 000094
【図２Ｂ−３】
2005505579.tif 000095
【図２Ｃ】
2005505579.tif 000096
【図２Ｄ−１】
2005505579.tif 000097
【図２Ｄ−２】
2005505579.tif 000098
【図２Ｅ−１】
2005505579.tif 000099
【図２Ｅ−２】
2005505579.tif 000100
【図２Ｅ−３】
2005505579.tif 000101
【図３Ａ】
2005505579.tif 000102
【図３Ｂ−１】
2005505579.tif 000103
【図３Ｂ−２】
2005505579.tif 000104
【図３Ｃ−１】
2005505579.tif 000105
【図３Ｃ−２】
2005505579.tif 000106
【図３Ｄ−１】
2005505579.tif 000107
【図３Ｄ−２】
2005505579.tif 000108
【図３Ｅ】
2005505579.tif 000109
【図４Ａ】
2005505579.tif 000110
【図４Ｂ】
2005505579.tif 000111
【図４Ｃ】
2005505579.tif 000112
【図４Ｄ】
2005505579.tif 000113
【図４Ｅ】
2005505579.tif 000114
【図４Ｆ】
2005505579.tif 000115
【図４Ｇ】
2005505579.tif 000116
【図４Ｈ】
2005505579.tif 000117
【図４Ｉ】
2005505579.tif 000118
【図５Ａ】
2005505579.tif 000119
【図５Ｂ】
2005505579.tif 000120
【図６】
2005505579.tif 000121
【図７】
2005505579.tif 000122
【図８】
2005505579.tif 000123
【図９Ａ】
2005505579.tif 000124
【図９Ｂ】
2005505579.tif 000125
【図１０】
2005505579.tif 000126
【図１１】
2005505579.tif 000127
【図１２】
2005505579.tif 000128
【図１３】
2005505579.tif 000129
【図１４】
2005505579.tif 000130
【図１５】
2005505579.tif 000131
【図１６】
2005505579.tif 000132
【図１７】
2005505579.tif 000133
【図１８】
2005505579.tif 000134
【図１９】
2005505579.tif 000135
【図２０】
2005505579.tif 000136
【図２１】
2005505579.tif 000137
【図２２】
2005505579.tif 000138
【図２３】
2005505579.tif 000139
【図２４】
2005505579.tif 000140
【図２５】
2005505579.tif 000141
【図２６】
2005505579.tif 000142
【図２７】
2005505579.tif 000143
【図２８】
2005505579.tif 000144
【図２９】
2005505579.tif 000145
【図３０】
2005505579.tif 000146
【図３１】
2005505579.tif 000147
【図３２】
2005505579.tif 000148
【図３３】
2005505579.tif 000149
【図３４】
2005505579.tif 000150
【図３５】
2005505579.tif 000151
【図３６】
2005505579.tif 000152
【図３７】
2005505579.tif 000153
【図３８】
2005505579.tif 000154
【図３９】
2005505579.tif 000155
【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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