(57)【要約】  試験サンプル中の被検体を決定するための粒子増感アッセイであって、該アッセイには、非特異的な粒子の集合を低減するための添加剤が、実質的に非特異的集合を低減する量で添加されている。2005512074.tif 000013
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験サンプル中の関心のある被検体の存在を検出するためのアッセイであって、
（ａ）（ｉ）前記試験サンプルと、
（ｉｉ）被検体−特異的結合パートナーが固定化された感作粒子の既知量と、
（ｉｉｉ）以下の化学式を有する化合物である、前記粒子の非特異的集合を低減する添加剤の既知量とを組み合わせることにより反応混合液を形成するステップと、
【化１】
2005512074.tif 000009
（ｂ）前記粒子の特異的な集合を起こすために前記被検体に結合することを前記粒子に固定化された結合パートナーが可能にする条件下で、非特異的な粒子の集合を低減するのに十分な量の前記添加剤が存在する前記反応混合液を、インキュベーションするステップと、
（ｃ）前記サンプル中の前記被検体の量に比例する特異的な集合の程度を、決定するステップとを含み、
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、ｍは１−３で、Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、ｎは０−３である、
試験サンプル中の関心のある被検体の存在を検出するためのアッセイ。
【請求項２】
試験サンプル中の関心のある被検体の存在を決定するための間接アッセイであって、
（ａ）前記関心のある被検体を含むかもしれないサンプルを用意するステップと、
（ｂ）関心のある被検体が固定化された感作粒子の懸濁液の既知量を用意するステップと、
（ｃ）被検体−特異的結合パートナーの既知量を用意し、
前記粒子の非特異的な集合を低減する添加剤であって、以下の化学式を有する化合物である添加剤を用意するステップと、
【化２】
2005512074.tif 000010
（ｄ）前記結合パートナーと、前記粒子に固定化された被検体との間の結合、または、前記サンプル中の被検体との結合が、前記粒子の特異的集合を起こすことを可能にする条件下で、前記サンプルを、前記感作粒子と、前記結合パートナーと、非特異的粒子集合を低減するのに十分な量存在している前記添加剤と組み合わせるステップと、
（ｅ）前記結合パートナーと結合する、前記粒子に固定化された被検体の量であって、前記サンプル中の被検体の量に反比例する量を決定するステップとを含み、
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、ｍは１−３で、Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、ｎは０−３である、
試験サンプル中の関心のある被検体の存在を決定するための間接アッセイ。
【請求項３】
前記添加剤は、前記反応混合液の全体積に基づいて約０．０２Ｍから０．２Ｍまでの範囲の濃度で存在する、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記添加剤は、トリエタノールアミン、トリメタノールアミン、Ｎ−ブチルジエタノールアミン、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグアニジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステル、３−ジメチルアミノプロピオニトリル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、および、１−ジメチルアミノ−２−プロピルアミンからなるグループから選択される、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記添加剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステルである、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記添加剤は、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリドである、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記粒子はラテックス粒子を含む、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記試験サンプルは、全血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、尿、糞便、粘液、細胞抽出物および組織抽出物からなるグループから選択される、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記（ｄ）のステップは、前記試験サンプルを前記結合パートナーおよび前記添加剤と最初に混合して、得られた混合物を前記感作粒子と組み合わせることを含む、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記（ｄ）のステップは、前記試験サンプルを前記感作粒子および前記添加剤と最初に混合して、得られた混合物を前記結合パートナーと組み合わせることを含む、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記被検体は、薬物、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、核酸および殺虫剤からなるグループから選択される、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸と、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体と、抗体断片とからなるグループから選択される、請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項１３】
試験サンプル中の被検体をアッセイするためのキットであって、
第１および第２の容器手段を含み、第１の容器手段は、被検体−特異的結合パートナーが固定化された感作粒子を含み、第２の容器手段は、前記粒子の非特異的な集合を低減するために十分な量の添加剤を含み、該添加剤は以下の化学式を有する化合物であって、
【化３】
2005512074.tif 000011
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、ｍは１−３で、Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、ｎは０−３である、
試験サンプル中の被検体をアッセイするためのキット。
【請求項１４】
前記添加剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステルである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記添加剤は、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリドである、請求項１３に記載のキット。
【請求項１６】
前記添加剤は、前記反応混合液の全体積に基づいて約０．０２Ｍから０．２Ｍまでの範囲の濃度で存在する、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
前記試験サンプルは、全血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、尿、糞便、粘液、細胞抽出物および組織抽出物からなるグループから選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１８】
前記被検体は、薬物、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、核酸および殺虫剤からなるグループから選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１９】
前記結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸と、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体と、抗体断片とからなるグループから選択される、請求項１３に記載のキット。
【請求項２０】
前記粒子はラテックス粒子である、請求項１３に記載のキット。
【請求項２１】
関心のある被検体をアッセイするために有用な組成物であって、
被検体−特異的結合パートナーを固定化した微粒子と、該粒子の非特異的な集合を低減するのに十分な量の添加剤とを含み、該添加剤は以下の化学式を有する化合物であり、
【化４】
2005512074.tif 000012
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、ｍは１−３で、Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、ｎは０−３である、
関心のある被検体をアッセイするために有用な組成物。
【請求項２２】
前記添加剤は、トリエタノールアミン、トリメタノールアミン、Ｎ−ブチルジエタノールアミン、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグアニジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステル、３−ジメチルアミノプロピオニトリル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、および、１−ジメチルアミノ−２−プロピルアミンからなるグループから選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記添加剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステルである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記添加剤は、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリドである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記粒子はラテックス粒子である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記被検体は、薬物、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、核酸および殺虫剤からなるグループから選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸と、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体と、抗体断片とからなるグループから選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２８】
前記添加剤は、前記反応混合液の全体積に基づいて約０．０２Ｍから０．２Ｍまでの範囲の濃度で存在する、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子増感アッセイ（ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｓｓａｙ）における非特異的な集合（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を低減するための方法に関する。より具体的には、前記方法は、非特異的集合を低減する添加剤を添加することを含み、該添加剤は、アッセイ反応混合液に添加されるとき、非特異的な粒子の集合を著しく低減または除去することによって、サンプル中の被検体の定量的または定性的な測定の精度および信頼性を向上させる。
【背景技術】
【０００２】
免疫アッセイは、特定の被検体または「抗原」を特異的に認識し結合する抗体の能力を利用するアッセイシステムである。抗原は、動物または人間の体内に導入されるとき、免疫反応すなわち抗体産生を誘導することができる物質である。抗体によって認識され、抗体が結合する抗原の領域は、「エピトープ」と呼ばれる。
【０００３】
最も単純な免疫アッセイは、標的分子（すなわち前記「被検体」）に結合可能な抗体を、前記被検体を含むと疑われるサンプルにインキュベーションすることのみを伴う。前記抗体と前記被検体との結合により形成される免疫複合体の存在によって前記標的分子の存在が決定され、前記免疫複合体の濃度に比例する。複合体を形成しない抗体からのかかる免疫複合体の分離を促進するために、固相が用いられるのが典型的である。粒子増感アッセイのようなより洗練された免疫アッセイでは、前記標的分子の濃度は、ラテックス粒子のような支持体に前記抗体が結合すること、および、前記被検体を含むサンプルの存在下で前記支持体に結合した抗体をインキュベーションすることによって決定される。
【０００４】
固定化された前記抗体に結合させられた標的分子は、さまざまな方法のいずれかで検出可能である。例えば、前記支持体は、前記標的分子の第２のエピトープに結合可能な標識された第２抗体の存在下でインキュベーションされる場合（すなわち「サンドイッチ」免疫アッセイ）がある。したがって、前記標識された抗体の前記支持体上への固定化は前記標的の存在を要し、前記サンプル中の前記標的の濃度に比例する。代替的なアッセイでは、前記サンプルは標識された標的および抗体結合部位の既知量とインキュベーションされる。前記サンプル中の標的分子の存在は、前記標識された標的分子と抗体結合部位について競合する。したがって、前記抗体に結合可能な標識された標的分子の量は、前記サンプル中の標的分子の濃度に反比例する。これは、競合免疫アッセイとして知られている。
【０００５】
さまざまな免疫アッセイの形式は、該アッセイが結合した種を未結合の種から分離する必要があるか否かに応じて、さらに２つの主要なクラスに分けることができる。不均一系（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）免疫アッセイは、かかる精製を必要とするので、分離または単離のステップを含む。これに対し、均一系（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）アッセイは、未結合種から結合種を分離することが不必要なように設計される。均一系アッセイは分離のステップを欠き、より自動化が容易であるため、多数の患者のスクリーニングを含む用途においては不均一系アッセイよりも望ましい。
【０００６】
粒子増感アッセイでは、１または２以上の粒子結合抗体と被検体との間の反応によって生じる免疫複合体形成の結果、粒子集合が起こる。前記免疫複合体が十分大きい場合には、光を散乱させたり、自発的に（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ）沈殿したりすることができるようになる。かかるケースでは、凝集（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）検出法、比濁（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ）検出法または濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ）検出法が用いられることがある。比濁法は、粒子の懸濁液によって散乱された光か、光の直接の光路に置かれていないデテクタに向かって反射した光かを測定する（非特許文献１）。これに対し、濁度法は、粒子または集合体の懸濁液を透過した光の減少を測定する。前記減少は、前記集合体による光の反射、散乱および吸収によって生じる。凝集アッセイは、抗体−抗原複合体の沈殿を測定する。かかるアッセイは、極めて敏感な場合があり、自動化になじむ。比濁法および濁度法は、最初に存在していた抗体を前記アッセイ中に形成された免疫複合体から分離する必要がないため、かかるアッセイは均一系免疫アッセイである。
【非特許文献１】Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｃ．、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２３：１４５６−１４６４（１９７７）
【０００７】
かかる凝集反応に典型的に用いられる粒子担体は、ラテックス粒子（例えば、天然ゴムまたは合成ゴムラテックス、ポリスチレンラテックス、ポリビニルトルエンラテックスの粒子）である。ポリスチレンラテックスは、合成物であって、非ラテックス担体よりも長い貯蔵寿命を有する。さらに、ラテックスはタンパク質その他の物質にしっかりと結合し、結合された前記タンパク質の抗原性は実質的に害されない。これらの望ましい特徴のために、ラテックス粒子は多くのさまざまな血清学的な臨床テスト試薬について原材料として用いられてきた。
【０００８】
しかし、さまざまな抗原または抗体で感作された（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ）ラテックス粒子は、貯蔵中に自発的な集合を起こす傾向がしばしばある。さらに、ラテックスが貯蔵中に自発的な集合を起こさないタイプのものであるときでも、血清のような体液と混ぜた際に非特異的な集合を起こすことがときどきある。非特異的な集合は、被検体の存在および／または濃度の決定に干渉し、誤診につながる可能性がある。その結果、多大な時間および努力が、非特異的な集合を除去する手段の研究に費やされてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
粒子増感アッセイにおける非特異的干渉を低減する現在知られた方法は、以下を含む。ウシ血清アルブミンを添加すること、少なくとも２０倍まで試験サンプルを大幅に希釈すること、以下の特許文献１に開示されるようなデタージェントを添加すること、Ｍｅｒｚら（非特許文献２）によって説明された５６°Ｃ３０分間の加熱と、Ｃｏｌｌｅｔ−Ｃａｓｓａｒｔら（非特許文献３）によって説明されたプロテアーゼ反応を用いる酵素処理とを含む、試験サンプルを厳重に前処理すること、Ｃａｍｂｉａｓｏら（非特許文献４）によって説明された酸化／還元試薬を用いて処理すること、および、以下の特許文献２に説明されたイオン交換クロマトグラフィーを用いて成分を分離すること。しかし、これらの方法は全ての場合に有効ではない。さらに、これらの方法は、時間がかかり、必要な操作の結果、免疫アッセイの潜在的な感度および精度を劇的に落とすという望ましくない効果をもたらす場合がある。
【特許文献１】米国特許第４，０６０，５９７号明細書
【特許文献２】米国特許第４，２７０，９２３号明細書
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．、５：５９６（１９７７）
【非特許文献３】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、２７：１２０５、（１９８１）
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．２８：１３，（１９７９）
【００１０】
非特異的な粒子集合を低減する別のアプローチは、ｄｅ  Ｓｔｅｅｎｗｉｎｋｅｌらに付与された以下の特許文献３に説明されたような、カオトロピック試薬またはカオトロピック様試薬の添加である。しかし、前記試薬は、互いに有効性の程度がばらばらな広範囲の非類似で無関係な化合物を含む。
【特許文献３】米国特許第４，３６２，５３１号明細書
【００１１】
Ｉｔｏら（特許文献４）は、非特異的反応の抑制剤として有用な尿素化合物を説明する。これらの尿素化合物は、カルボジイミドの加水分解産物であり、これらの合成は、危険で比較的高価なカルボジイミド前駆体の大量処理を要する。
【特許文献４】米国特許第５，５０６，１５１号明細書
【００１２】
これらの理由で、かかる免疫アッセイ中の生理学的なサンプルから非特異的な干渉の影響を低減または除去する、集合反応混合液の添加剤の研究が続いている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は、サンプル中の関心のある被検体の存在および／または濃度を決定するための改良された粒子増感アッセイに関する。より具体的には、本発明は、非特異的な集合を実質的に低減または除去する添加剤を前記アッセイに添加することによって粒子増感アッセイにおける非特異的な集合を低減する方法に関する。
【００１４】
したがって、本発明の１の局面は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のステップを含む、試験サンプル中の関心のある被検体の存在を決定するためのアッセイを提供する。
【００１５】
（ａ）（ｉ）関心のある被検体を含むかもしれない試験サンプルと、
（ｉｉ）被検体−特異的結合パートナーが固定化された、感作された粒子（以下「感作粒子」という。）の既知量と、
（ｉｉｉ）以下の化学式を有する化合物である、前記粒子の非特異的集合を低減する添加剤の既知量とを組み合わせることにより反応混合液を形成するステップ。
【００１６】
【化１】
2005512074.tif 000002
【００１７】
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、
ｍは１−３で、
Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、
Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
ｎは０−３である。
【００１８】
（ｂ）前記粒子に固定化された結合パートナーが、前記粒子の特異的集合を起こすために前記被検体に結合することを可能にする条件下で、前記添加剤が非特異的粒子集合を低減するのに十分な量存在する前記反応混合液を、インキュベーションするステップ。
【００１９】
（ｃ）前記サンプル中の前記被検体の量に比例する、特異的な集合の程度を決定するステップ。
【００２０】
本発明の別の局面は、サンプル中の関心のある被検体の存在を決定するための改良された間接アッセイであって、該アッセイに非特異的な集合を低減する添加剤を添加することを含み、前記添加剤は以下の化学式を有する化合物である、アッセイを提供する。
【００２１】
【化２】
2005512074.tif 000003
【００２２】
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、
ｍは１−３で、
Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、
Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
ｎは０−３である。
【００２３】
本発明の別の局面は、サンプル中の関心のある被検体の存在を決定するための粒子増感アッセイにおいて有用な組成物であって、前記関心のある被検体か、被検体−特異的結合パートナーかのいずれかを固定化した、感作粒子と、該粒子の非特異的集合を低減する添加剤とを含み、該添加剤は以下の化学式を有する化合物である、組成物を提供する。
【００２４】
【化３】
2005512074.tif 000004
【００２５】
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、
ｍは１−３で、
Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、
Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
ｎは０−３である。
【００２６】
試験サンプル中の関心のある被検体の存在を検出するためのテストキットも開示される。前記テストキットは、粒子増感アッセイにおいて非特異的な集合を低減するための添加剤を含む、少なくとも１つの容器を含む。
【００２７】
本発明のその他の目的、長所および新規な特徴は、一部は以下の説明に列挙され、一部は、以下の明細書を検討すると当業者には明らかとなり、あるいは、本発明の実施により習得されるかもしれない。本発明の目的および長所は、添付する請求の範囲に具体的に指摘される手段、組み合わせおよび方法によって実現および達成される場合がある。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、サンプル中の関心のある被検体の存在を決定するための改良された粒子増感アッセイに関する。より具体的には、本発明は、粒子増感アッセイにおいて、該アッセイに非特異的粒子集合を実質的に低減または除去する添加剤を添加することによって、非特異的集合を実質的に低減する方法を提供する。１の実施態様では、前記アッセイは、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のステップを含む。
【００２９】
（ａ）（ｉ）関心のある被検体を含むかもしれない試験サンプルと、
（ｉｉ）被検体−特異的結合パートナーを固定化した感作粒子の既知量と、
（ｉｉｉ）以下の化学式を有する化合物である、前記粒子の非特異的集合を低減する添加剤の既知量とを組み合わせることによって、反応混合液を形成するステップ。
【００３０】
【化４】
2005512074.tif 000005
【００３１】
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、
ｍは１−３で、
Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、
Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
ｎは０−３である。
【００３２】
（ｂ）前記粒子に固定化された結合パートナーが、前記粒子の特異的集合を起こすために前記被検体に結合することを可能にする条件下で、前記添加剤が非特異的粒子集合を低減するのに十分な量存在する前記反応混合液を、インキュベーションするステップ。
【００３３】
（ｃ）前記サンプル中の前記被検体の量に比例する、特異的集合の程度を決定するステップ。
【００３４】
前記反応混合液は、前記試験サンプルと、感作粒子と、該粒子の非特異的結合を低減する添加剤とをアッセイ培地に組み合わせることによって形成される。ここで用いられるところの「サンプル」または「試験サンプル」という用語は、互いに取り換え可能なように用いられ、前記関心のある被検体を含むことが疑われるいずれかのサンプルを指す。前記試験サンプルは、未処理（未希釈）であってもよく、あるいは、化学的および／または物理的に処理され、希釈され、または分析の前に濃縮されてもよい。サンプルの例は、全血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、尿、糞便、粘液、細胞または組織の抽出物を含む、生理学的な液体と、関心のある被検体を含むことが疑われる、その他のタイプの液体、組織または材料のような生物学的な出所（ｓｏｕｒｃｅ）由来のサンプルを含むが、これらに限られない。
【００３５】
ここで用いられるところの「被検体」または「関心のある被検体」は、サンプル中の存在および／または濃度が決定されるべき物質を指す。「被検体」という用語は、特異的結合パートナー（例えば、前記被検体に特異的に結合する結合分子または物質）が存在するか、あるいは、特異的結合パートナーが調製可能である、いずれかの物質を含む。代表的な被検体は、薬物、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、核酸および殺虫剤（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）を含むが、これらに限られない。
【００３６】
ここで用いられるところの「抗体」という用語は、外来物質の検出に反応して産生される免疫グロブリンを指し、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）分子と、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのような、その機能的な断片とを含む。
【００３７】
本発明のアッセイを実行するには、被検体−特異的結合パートナーか、前記関心のある被検体かでコーティングされた、不溶性粒子を含む感作粒子を用意することが必要である。前記不溶性粒子は、結合分子または関心のある被検体を表面に配置できるいずれかの天然または合成の材料でもかまわない。かかる材料は、ラテックス重合体材料、例えば、ポリスチレン、アクリロニトリルおよびポリブタジエンのようなオレフィン系不飽和単量体の重合体と、これらの誘導体および共重合体（Ｂａｎｇｓ、Ｌ．Ｂ．、「Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｌａｔｅｘ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（均質なラテックス粒子）」（１９８４年）および米国特許第４，３０５，９２５号明細書を参照せよ）と、ガラスと、アクリルアミドと、メタクリル酸と、ナイロンと、微視的な酸化物の粉末と、デキストランと、セルロースと、これらの誘導体とを含む。本発明は、前記粒子がカルボン酸修飾ラテックス粒子のようなラテックス粒子であるような、アッセイの実施態様に特に向けられている。
【００３８】
感作粒子の調製方法は当業者に周知である。「感作粒子」という用語は、１または２以上の層の被検体−特異的結合パートナーまたは関心のある被検体を固定化した不溶性粒子を指す。「固定化された」という用語は、前記結合パートナーまたは前記被検体が前記粒子に共有結合（化学的な結合）または非共有結合（例えば、物理的な吸着）によって結合していることを指す。
【００３９】
前記結合パートナーまたは被検体の前記不溶性粒子への結合は、従来技術の適用の問題である。一般に、結合パートナーまたは被検体は、物理的（受動的）吸着と、促進された（強制された）吸着と、共有結合とのような、標準的な技術に従って前記粒子上に配置される場合がある。引用によりここに特に取り込まれる米国特許第４，１８１，６３６号明細書は、水溶性活性化剤を介して免疫学的活性のある材料に結合されたカルボン酸化ラテックス重合体を開示する。引用によりここに特に取り込まれる米国特許第４，２６４，７６６号明細書は、水溶性ポリヒドロキシ化合物が共有結合で結合することができる、カルボン酸基およびアミノ基のような活性基を有するラテックス重合体に向けられている。引用によりここに特に取り込まれる米国特許第４，５２１，５２１号および第４，３０５，９２５号明細書も参照せよ。これらの特許明細書に開示された技術またはその他の当業者に周知の技術が、前記結合パートナーまたは被検体を前記粒子に結合するのに用いられる場合がある。
【００４０】
本発明の直接アッセイにおいては、前記感作粒子は、被検体−特異的結合パートナーが固定化された不溶性粒子を含む。ここで用いられるところの「結合パートナー」という用語は、前記関心のある被検体を認識し、該被検体に結合する、分子または物質を指し、他の分子または物質とはほとんど交差反応性を示さない。典型的な結合分子は、抗原、抗原断片、レセプター、核酸およびポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および抗体断片を含むが、これらに限られない。特定の被検体に特異的な、かかる結合分子は、商業的な出所から入手できる場合があるが、当業者に周知の標準的な手順に従って調製される場合もある。被検体：特異的結合パートナーの対の例は、ハプテン：抗体、ビオチン：アビジン、ホルモン：レセプター、ポリペプチド：抗体、および、オリゴヌクレオチド：相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを含むが、これらに限られない。
【００４１】
本発明の間接アッセイにおいては、感作粒子は、関心のある被検体が固定化された不溶性粒子を含む。
【００４２】
本発明のアッセイにおいて反応混合液を形成することは、前記感作粒子の非特異的集合を実質的に低減または除去するのに十分な量の１または２以上の添加剤を添加することも含む。上記のとおり、前記被検体と結合パートナーとの間で特異的集合反応（複合体形成）が起こるのに加えて、粒子増感アッセイの前記粒子は非特異的集合も起こす。本発明の目的のためには、「特異的集合」および「複合体形成」という用語は、互いに交換可能なように使われ、いずれか一方が不溶性粒子に固定化されている、前記関心のある被検体と被検体−特異的結合パートナーとの間の特異的な認識および結合を指す。これらの用語は、１の被検体の１の結合パートナーへの結合と、２または３以上の感作粒子が前記被検体によって互いに連結して、２量体、３量体、および、より高次の集合した粒子のネットワークのような、粒子の集合体を生成する工程とを含む。
【００４３】
これに対し、ここで用いられるところの「非特異的結合」という用語は、一般的には、特異的結合によって生じたのではないいずれかの結合を指し、より具体的には、前記被検体による２または３以上の粒子の連結以外の手段による感作粒子の集合を指す。非特異的結合は、免疫複合体を形成させる試薬と、帯電したタンパク質と、アッセイ反応混合液中に存在する場合がある、抗体に干渉するタンパク質とを含む、複数の因子のために起こる。
【００４４】
本発明のアッセイにおいて使用するのに適する添加剤は、以下の化学式を有する化合物を含む。
【００４５】
【化５】
2005512074.tif 000006
【００４６】
上記の化学式において、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−（ＣＨ２）ｍＯＨ基かで、
ｍは１−３で、
Ｒ３は、水酸基か、シアノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基か、−ＣＯＯＸ基か、−ＣＨ（ＮＨ２）Ｙ基かで、
Ｘは、水素か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
Ｙは、水素か、置換アミノ基か、非置換アミノ基か、置換アルキル基か、非置換アルキル基かで、
ｎは０−３である。
【００４７】
ここで用いられるところの「アルキル基」は、１個から６個までの炭素と有する原子団を指し、１または２以上の置換基を有する、直鎖または分岐鎖アルキル基の場合がある。置換アルキル基の置換基は、例えば、水酸基、ニトロ基、アミノ基と、ケト基と、メトキシ基、エトキシ基、ブトキシ基のような低級アルコキシ基と、クロロ基、フルオロ基、ブロモ基およびヨード基のようなハロゲンとを含む。本発明の目的に適する添加剤の例は、図１に示されるものを含む。１の実施態様では、前記添加剤は、３−ジメチルアミノ−２−ベチルプロピルクロリド（ＡｃｒｏｓまたはＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。別の実施態様では、前記添加剤は、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンエチルエステル（Ｆｌｕｋａ−Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍ）である。
【００４８】
ここに開示される非特異的集合を低減する添加剤は、一般に商業的に入手可能な化合物であるか、あるいは、当業者に周知の単純な有機反応によって調製されるものである。さらに、前記添加剤は、効果を奏するために更に処理する必要はない。すなわち、前記添加剤は、製造者から得られた状態か、あるいは、前記添加剤を調製するための反応混合液から単離された状態かで、直接使用することができる。したがって、中途半端に処理された添加剤を不注意に本発明のアッセイに使用する可能性は防がれる。
【００４９】
本発明の目的のためには、粒子増感アッセイで非特異的集合を実質的に低減するのに十分な、ここに開示された添加剤の量は、全アッセイ溶液の体積にもとづいて、約０．０２Ｍないし０．２Ｍで、好ましくは約０．３５Ｍないし０．１２５Ｍである。本発明によると、非特異的集合が実質的に低減しているのは、既知濃度の著しく多数の患者のサンプルが検定され、目標の±１０％を実測する（ｒｅｃｏｖｅｒ）とき、あるいは、全く抗原を含まない、本当に陰性の著しく多数のサンプルが検定され、ひとつも集合を起こさないときである。集合は抗原存在下でのみ起こるべきである。
【００５０】
前記反応混合液の成分は、どのような順序で添加されてもかまわない。１の実施態様では、非特異的集合を低減するための添加剤が最初にサンプルとインキュベーションされ、それから、この混合液に感作粒子が添加される。
【００５１】
直接アッセイのためのインキュベーションのステップでは、前記試験サンプルと感作粒子と添加剤とを含む反応混合液が、該サンプル中の被検体と固定化された結合パートナーとの間での結合が起こる条件下でインキュベーションされる。粒子で増感された手順による、液体サンプル中の被検体の試験管内アッセイの一般的な方法は、当業者に周知であり、ここで詳細を説明する必要はない。前記被検体と感作粒子との間の結合の結果、検出可能な粒子の特異的集合が起こり、これにより、前記被検体の存在が示される。前記特異的集合は測定可能で、前記サンプル中の被検体の量と関係付けられる。ここに説明される添加剤が反応混合液に存在することは、非特異的な粒子の集合を著しく低減し、これによって、この測定の精度を向上させる。
【００５２】
本発明の別の実施態様では、本発明のアッセイは間接アッセイである。間接アッセイは、関心のある被検体を含む場合がある試験サンプルを、前記関心のある被検体を固定化した感作粒子と、被検体−特異的結合パートナーと、非特異的集合を低減する添加剤と組み合わせて、反応混合液を形成することを伴う。前記反応混合液は、前記結合パートナーと、前記サンプル中の被検体か前記粒子に固定化された被検体かとの間での結合を可能にする条件下でインキュベーションされる。競合アッセイでは、特異的粒子集合は、サンプル中に存在する被検体の量に依存した程度で起こる。すなわち、サンプル中に存在する被検体は、粒子に固定化された被検体と、結合パートナーについて競合する。サンプル中の被検体と結合パートナーとの結合が増大することは、固定化された被検体と結合パートナーとの結合を減少させる結果になる。今度はこれが特異的粒子集合を低減させ、濁度の減少という結果になる。したがって、サンプル中の被検体の存在および／または濃度は、反応混合液の濁度の変化を検出することによって決定できる。競合免疫アッセイでは、集合の程度は、試験サンプル中に存在する被検体の量に反比例する。反応混合液中にここで説明する添加剤が存在することは、非特異的粒子集合を著しく低減させ、これにより、被検体濃度の測定精度を向上させる。
【００５３】
ここで開示された添加剤は、非特異的粒子集合を著しく低減することによって、いかなる粒子増感アッセイにおいても被検体のアッセイの精度および信頼性を向上させるうえで有用である。特に、（直接および競合均一系粒子増感アッセイを含む）ラテックスの凝集試験のような、均一系の、濁度法および比濁法のアッセイは、ここに説明された添加剤の使用を通じて改善することができる。
【００５４】
本発明の方法は、アッセイ結果と、均一系の参照方法との対応関係を改善する。すなわち、異なるサンプルは、異なる程度の非特異的集合を発生させる。したがって、部分的な感作粒子の集合だけが発生する可能性があり、これが特異的集合に加算される。この結果、実測値（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｖａｌｕｅ）が真の値と比べて少し高いか低いかいずれかになる。不均一系アッセイでは、アッセイの際、結合パートナーが反応混合液に添加される前に干渉の要因（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｔ）は除去されるので、被検体の真の濃度が実測される。干渉の要因は、アッセイされるべきサンプル中に見つかるいずれかの物質であって、抗体と抗原との間の反応を妨げるか該反応に参加するかのいずれかの物質であるが、前記反応からは独立した物質である。本発明の均一系の方法では、添加剤は、非特異的集合を防ぎ、これによって、部分的な集合を除去し、特異的集合だけが起こるようにする。この結果、関心のある被検体の真の濃度が実測され、均一系アッセイと不均一系アッセイとの間の対応関係がよくなる。
【００５５】
本発明のアッセイの特異的集合の検出においては、試験サンプル中の被検体の存在は視覚的に決定可能であるか、あるいは、適当な機器を使って決定可能である。典型的には、集合は、濁度法、比濁法、従来の光散乱法、準弾性散乱法、角異方性散乱測定法（ａｎｇｕｌａｒ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｉｃ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）その他の当業者に周知の方法を用いて測定される。集合した粒子から発生する信号は、検出され、測定されて、試験サンプル中の被検体の量に関係付けられる。集合は、反応混合液中の濁度の増大という結果を生じる。被検体の存在下において、直接アッセイでの特異的集合は、サンプル中の被検体の量に正比例するが、競合アッセイでは特異的集合の程度は試験サンプル中に存在する被検体の量に反比例する。このような測定は当業者に周知である。存在する被検体の量は、標準曲線（またはその他の標準的な結果）を用いて決定することができる。この技術は当業者に周知であり、これ以上説明する必要はない。
【００５６】
関心のある被検体を検出するためのアッセイで用いられる調合物は、少なくとも１または２以上の容器のテストキットとして組み立てることができる。これらのテストキットは、部分的に、あるいは、完全に、予め混合されていたり、または未混合であったりする場合があり、アッセイ構成要素の便利なひと揃いを用意することができる。
【００５７】
１の実施態様では、直接アッセイに用いられる本発明のキットは、第１および第２の容器手段を含み、第１の容器手段は被検体−特異的結合パートナーで感作された不溶性粒子を含み、第２の容器手段は、前記の非特異的粒子集合を低減する添加剤の少なくとも１つの非特異的粒子集合を低減する量を含む。代替的に、前記感作粒子および添加剤は同一の容器内に収容されることもある。
【００５８】
別の実施態様では、競合アッセイ用の本発明のキットは、第１、第２および第３の容器手段を含み、第１の容器手段は関心のある被検体で感作された不溶性粒子を含み、第２の容器手段は被検体−特異的結合パートナーを含み、第３の容器手段は、非特異的粒子集合を低減する量の前記の非特異的粒子集合低減用添加剤の少なくとも１つを含む。代替的には、前記容器の１つは、前記感作粒子と、ここに開示された非特異的集合低減用の添加剤との混合物を含む。
【００５９】
前記の添加剤を含む本発明の方法は、従来の非特異的集合低減方法に対する複数の長所を提供する。第１に、前記添加剤は低濃度で有効である。例えば、０．２Ｍという低い添加剤の濃度が、実質的に非特異的集合を低減するうえで有効である。
【００６０】
さらに、先行技術で知られた添加剤とは異なり、ここで開示される添加剤は、安価で、効果を奏するためにさらなる処理を要しない。したがって、中途半端に処理された添加剤を不注意に使用する可能性は除去される。これは、Ｉｔｏらに付与された米国特許第５，５０６，１５１号明細書に説明された尿素添加剤のような他の添加剤の使用に比べた改良点である、というのも、Ｉｔｏらの尿素の合成は、危険性があり、比較的高価なカルボジイミド前駆体を大量に処理する必要があるからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明の一般的な説明を終えたので、本発明は、例示のために提供されるのであって、本発明の限定を意図するものではない、以下の実施例を参照して、より容易に理解できるであろう。
【実施例１】
【００６２】
図１に示される１０個の異なる化合物が、理想的な患者マトリクス条件下で最良の応答が得られるように調合済みの反応バッファーに、５０ｍＭの濃度で個別に添加された。具体的には、前記１０個の化合物は、トリエタノールアミン（ＴＥＳ）、トリメタノールアミン（ＴＭＥ）、Ｎ−ブチルジエタノールアミン（Ｎ，Ｎ−ＢＵＴＹ）、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリド（３−Ｄ−２−ＭＯＬ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＭＧ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグアニジン（ＤＧＤ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステル（ＤＭＥＥ）、３−ジメチルアミノプロピオニトリル（ＤＭＰＮ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド（Ｎ，Ｎ−ＤＥＡＡ）、および、１−ジメチルアミノ−２−プロピルアミン（１−Ｄ−２−ＰＡ）である。添加剤なしの基本反応バッファーを含む対照もアッセイされた。用量応答曲線が検定されて、抗原（ジゴキシン（ｄｉｇｏｘｉｎ）薬物）の量の増大に対する抗体（ジゴキシン）の存在下での特異的な集合についての各添加剤の効果を決定した。図１に示される前記１０個の添加剤の１つを含む各バッファーについて、各濃度で得られた集合数（ａｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）が、表１に表される。非特異的集合を起こすサンプルは、表１に表される特異的な用量応答の最初と最後の数の間の集合数を生じる。
【００６３】
ジゴキシンでコーティングされたラテックス粒子で非特異的集合を起こすことが知られている集合性物質（ａｇｇｒｅｇａｔｏｒ）として既に同定された８個の患者のサンプルが、図１に示される１０個の添加剤のそれぞれとともに抗体非存在下で検定された。添加剤なしの前記基本反応バッファーを含む対照も検定された。各患者ごとの１０個の添加剤の１つを含むバッファーのそれぞれについての得られた集合数が表２に表される。添加剤なしの前記基本バッファーからなる対照も検定された。
【００６４】
図２に示されるとおり、試験された１０個の化合物のうち５個、すなわち、ＴＥＡ、ＴＭＡ、３−Ｄ−２−ＭＯＬ、ＤＭＧおよびＤＭＥＥは、反応バッファーの非特異的集合の発生程度を低減することが示された。Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＭＧ）を添加剤として含む８番のサンプルを例外として、全ての既存の集合性物質は、前記添加剤入りの４．５ｎｇ／ｍＬの標準より低い程度を示した。残りの５個の化合物のうち、３個は非特異的集合のレベルを著しく低下させたので、より高濃度ではもっと有効かもしれない。Ｎ，Ｎ−ジメチルグアニジン（ＤＧＤ）およびＮ，Ｎ−ブチルジエタノールアミン（Ｎ，Ｎ−ＢＵＴＹ）は、非特異的集合の低減には最も効果が低かった。
【００６５】
最も強力に非特異的集合を低減した２個の化合物は、３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリド（３−Ｄ−３−ＭＣＬ）およびＮ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステル（ＤＭＥＥ）であった。したがって、前記反応バッファーに別々に０．０５Ｍの濃度で添加された３−Ｄ−３−ＭＣＬおよびＤＭＥＥを用いる第２の実験が（表１において要約された実験手順に従って）行われた。この実験は、特異的な応答と非特異的な応答とを試験した。両方のバッファーは、０から４．５ｎｇ／ｍＬまでの増大するジゴキシン濃度の標準を用いる抗体存在下で較正に成功した。較正の成功は、測定範囲全体に間隔を置いて設定されたレベルの既知の対照の使用を通じて確認された。（本発明の技術分野では非特異的集合を起こすことが知られている）リウマトイド因子（Ｒｕｍａｔｏｉｄ  Ｆａｃｔｏｒ）の濃度が亢進した１００人の患者由来のサンプルが、抗体非存在下で検定された。サンプルが非特異的集合を起こす場合には、抗体非存在下でも、０から４．５ｎｇ／ｍＬの測定範囲内の濃度を実測するであろう。実測された濃度が低いほど、非特異的集合の程度は高い。３−Ｄ−３ＭＣＬおよびＤＭＥＥの両方について、１００人の患者のうち、０から４．５ｎｇ／ｍＬの測定範囲内の濃度が出た患者は０人であり、患者全員が前記範囲より高い値であった。３−Ｄ−３−ＭＣＬおよびＤＭＥＥの両方とも、特異的集合には干渉しないで、これらのサンプル中での非特異的集合から、ジゴキシンでコーティングされたラテックス粒子を保護した。
【００６６】
【表１】
2005512074.tif 000007
【００６７】
ＴＥＡ：トリエタノールアミン
ＴＭＡ：トリメタノールアミン
Ｎ，Ｎ−ＢＵＴＹ：Ｎ−ブチルジエタノールアミン
３−Ｄ−２−ＭＯＬ：３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリド
ＤＭＧ：Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン
ＤＧＤ：Ｎ，Ｎ−ジメチルグアニジン
ＤＭＥＥ：Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステル
ＤＭＰＮ：３−ジメチルアミノプロピオニトリル
Ｎ，Ｎ−ＤＥＡＡ：Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド
１−Ｄ−２−ＰＡ：１−ジメチルアミノ−２−プロピルアミン
【００６８】
【表２】
2005512074.tif 000008
【００６９】
ＴＥＡ：トリエタノールアミン
ＴＭＡ：トリメタノールアミン
Ｎ，Ｎ−ＢＵＴＹ：Ｎ−ブチルジエタノールアミン
３−Ｄ−２−ＭＯＬ：３−ジメチルアミノ−２−メチルプロピル・クロリド
ＤＭＧ：Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン
ＤＧＤ：Ｎ，Ｎ−ジメチルグアニジン
ＤＭＥＥ：Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン・エチルエステル
ＤＭＰＮ：３−ジメチルアミノプロピオニトリル
Ｎ，Ｎ−ＤＥＡＡ：Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド
１−Ｄ−２−ＰＡ：１−ジメチルアミノ−２−プロピルアミン
【００７０】
本発明は、その本質的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形式で実施される場合がある。前記の時とは、全ての点で、例示としてのみ考慮されるべきであって、限定として考慮されるべきではない。実際、当業者は、ここに示された開示内容に基づいて、過度の実験を伴うことなく、更なる実施態様を想到し作成することが容易にできる。したがって、本発明の範囲は、以上の説明によってではなく、添付する請求の範囲によって示される。前記請求の範囲の意味および均等の範囲に属する全ての変更はこれらの範囲内に含まれるものとする。
【００７１】
ここに取り込まれ、明細書の一部をなす、添付図面は、本発明の好ましい実施態様を例示し、その説明とともに本発明の原理を説明するうえで役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明のアッセイに使用するのに適する複数の添加剤の構造式。
【図１】
2005512074.tif 000014
【国際調査報告】
2005512074.tif 000015
2005512074.tif 000016