(57)【要約】【課題】  本発明は新規なHMGA対立遺伝子、生育、脂肪質、肉質および飼育効率特性のための遺伝標識としてのHMGA対立遺伝子の使用に関する。【解決手段】  動物の成長、肥満、肉質および飼育効率のための遺伝標識；このような標識を識別するための方法；望ましい成長、肥満、肉質および飼育効率を生じさせると思われる動物を判定し、将来の繁殖のため、その動物を選別する方法が開示されている。この標識は、HMGAヌクレオチド配列中の或る多形性の有無に基づくものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表現型形質を示唆する遺伝子型を有する動物を識別するための方法であって、該動物から核酸サンプルを採取し、該サンプルのHMGA１又はHMGA2遺伝子中の多形性、又はそれに結合された多形性により特徴づけられる遺伝子型の存在について検定する工程であって、ここで該遺伝子型が表現型形質と有意に関連することが示されているものであり；該動物中に存在する遺伝子型に基づいて、該動物を該表現型形質と関係付ける工程とを具備してなることを特徴とする方法。
【請求項２】
BLAST比較による判定において、該多形性が、HMGA遺伝子又はその均等物のアミノ酸変化を生じさせるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
該多形性がHMGA１遺伝子内に位置している請求項１記載の方法。
【請求項４】
該遺伝子型がNae  I又はBan I多形性である請求項３記載の方法。
【請求項５】
該遺伝子型がHMGA２遺伝子内に位置している請求項１記載の方法。
【請求項６】
該遺伝子型がHhaI多形性である請求項５記載の方法。
【請求項７】
該検定工程が、制限断片長多形性（RFLP）分析、ミニシーケンシング、MALD-TOF、SINE、ヘテロジュプレックス分析、一本鎖高次構造多型分析（SSCP）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、および温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)からなる群から選択されるものである請求項1記載の方法。
【請求項８】
該動物がブタである請求項１記載の方法。
【請求項９】
該多形性を含むHMGAヌクレオチド配列又はその一部の量を増幅する工程を更に含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該増幅が、１以上の多形性Nae I、Ban I又はHha Iサイトを含むHMGAヌクレオチド配列の領域を増幅することができる前方又は逆プライマーを選択する工程を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該前方又は逆プライマーが、SEQ IN No: 1および2、3および4、5および6、7および8、9および10、11および12、13および14、15および16、又は17および18からなる群から選択されるものである請求項９記載の方法。
【請求項１２】
改善された成長、肥満、肉質および飼育効率の形質を表すものと思われる動物を選別する方法であって、該動物から生物学的サンプルを採取する工程と；改善された成長、肥満、肉質および飼育効率の形質に関係する該動物中の遺伝子型の存在を検定する工程とを具備してなり；該遺伝子型がa) HMGAヌクレオチド配列中の多形性であって、１以上のNae I、Ban I又はHha Iサイトを生じさせる多形性により特徴づけられるものであることを特徴とする方法。
【請求項１３】
該多形性を含むHMGAコード化ヌクレオチド配列又はその一部の量を増幅する工程を更に含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
HMGAたんぱく質の発現をコード化するヌクレオチド配列又は対立遺伝子であって、該ヌクレオチド配列がNae I、Ban I又はHha I多形性サイトに起因する変異対を含むことを特徴とするもの。
【請求項１５】
請求項１１によるHMGAたんぱく質。
【請求項１６】
表現型形質を有意に関係づけられる所望の遺伝子型を有する動物を識別するための方法であって、該動物から核酸サンプルを採取する工程であって、該サンプルがHMGA１又はHMGA2遺伝子を含むものである工程と；Nae I、Ban I又はHha Iと同一のサイトを認識する制限酵素で該サンプルを消化し断片を得る工程と；、上記消化から得られた断片を分離する工程と；HMGA１又はHMGA2遺伝子の対立遺伝子中のNae I、Ban I又はHha Iサイトの有無を認識する工程と；を具備してなり、ここで該対立遺伝子型の存在は、その動物が表現型形質と有意に関連することを示す遺伝子型を有することを示唆するものであることを特徴とする方法。
【請求項１７】
所望の形質のため、動物を選別する方法であって、動物から核酸サンプルを採取する工程と；Nae I、Ban I又はHha I、制限サイトにより特徴づけられるHMGA１又はHMGA2遺伝子中のヌクレオチドである多形性を識別する工程と；所望の形質と関係するヌクレオチドを有する動物を選択する工程と；を具備してなることを特徴とする方法。
【請求項１８】
HMGA遺伝子中の多形性について間接的に選択する方法であって、動物から核酸サンプルを採取する工程と；Nae I、Ban I又はHha I、制限サイトにより特徴づけられるHMGA１又はHMGA2遺伝子中の多形性を、HMGA遺伝子に関係するものとして知られているDNAマーカーを用いて識別する工程であって、ここで該DNAマーカーは更にヌクレオチド置換の間接的識別を行うのに使用される好ましい形質と関係することが知られているもの；このヌクレオチド置換に基づいて該動物を選択する工程と；を具備してなることを特徴とする方法。
【請求項１９】
表現型形質を示す所望の遺伝子型を有する動物を識別する方法であって、意中の血統又は種から動物サンプルを採取することによりHMGA遺伝子型と、意中の形質との間の関連を判定する工程と；上記サンプル中の各動物からの核酸サンプルを用意する工程と；多形性について選別することによりHMGA遺伝子の遺伝子型を判定する工程であって、ここで該多形性の存在が好ましい表現型形質を示唆する遺伝子型を有する動物であることを示すものであり；該HMGA遺伝子型と、該形質との間の関連を計算する工程と；を具備してなることを特徴とする方法。
【請求項２０】
繁殖のため、動物を選択する方法であって、動物から核酸サンプルを採取する工程と；該サンプルのHMGA１又はHMGA2遺伝子中の多形性の存在を検定する工程であって、ここで該多形性が表現型と有意に関連することが予め示されているもの；標識遺伝子型の作用の予測値に基づいて、HMGA１又はHMGA2遺伝子型を選択モデルの一部として使用する工程と；上記予測値に基づいて、動物を選択し、繁殖のために使用する工程と；を具備してなることを特徴とする方法。
【請求項２１】
屠札での均一性を得るため、動物を選別する方法であって、動物から核酸サンプルを採取する工程と；該サンプルのHMGA遺伝子中の多形性の存在を検定する工程であって、ここで多形性が肉質に関連するものであり；該動物中に存在する多形性に基づいて該動物を選別する工程と；を具備してなることを特徴とする方法。
【請求項２２】
所望の成長、肥満、肉質および飼育効率を生じさせると思われる動物を選別する方法であって、動物から遺伝物質サンプルを採取する工程と；成長、肥満、肉質および飼育効率の増大と関連する該動物中の遺伝子型の存在を検定する工程とを具備してなり；ここで該遺伝子型が以下の点で特徴づけられるもの：HMGA遺伝子中の多形性。
【請求項２３】
BLAST比較による判定において、該多形性が、HMGA遺伝子又はその均等物のアミノ酸変化を生じさせるものである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該多形性がHMGA１又はHMGA2遺伝子内に位置している請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
該遺伝子型がNae I, Ban I又はHha I多形性である請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
該検定工程が、制限断片長多形性（RFLP）分析、ミニシーケンシング、MALD-TOF、SINE、ヘテロジュプレックス分析、一本鎖高次構造多型分析（SSCP）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、および温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)からなる群から選択されるものである請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
該動物がブタである請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
該多形性を含むHMGAヌクレオチド配列又はその一部の量を増幅する工程を更に含む請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
該増幅が、１以上の多形性Nae I、Ban I又はHha Iサイトを含むHMGAヌクレオチド配列の領域を増幅することができる前方又は逆プライマーを選択する工程を含む請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
HMGAたんぱく質を発現の際にコード化するヌクレオチド配列又は対立遺伝子であって、該ヌクレオチド配列が、SEQ IN NOS: １９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８又は２９を含むもの。
【請求項３１】
請求項３０によるHMGAたんぱく質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規なHMGA対立遺伝子、生育、脂肪質、肉質および飼育効率特性のための遺伝標識としてのHMGA対立遺伝子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子学的差異は個々の動物間および種族間に存在し、これは交配技術により開発し、望ましい特徴の動物を得ることができる。例えば、中国種は思春期到達年齢が早く、同腹子数が大きいことが知られており、米国種は生育速度が速く、脂肪が少ないことが知られている。しかし、望ましい特性のための遺伝率はしばしば低く、表現型変異に基づいて個体を選択する標準的な繁殖方法は遺伝的変異性又は複雑な遺伝子相互作用を十分に考慮していない。
【０００３】
（RFLP）分析法がブタDNAを研究するために、幾つかのグループで使用されている。Jungらによる“Theor. Appl. Genet.”, 77:271-274(1989)(参照として、ここに組み込まれる)には、２つのブタ種間の遺伝的変異性を示すため、RFLP分析技術を用いることが開示されている。多形性が、これら種におけるブタ白血球抗原（SLA）クラスI遺伝子について実証されている。Hogansonらによる“Abstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science"、3月26-28，1990(参照として、ここに組み込まれる)には、中国ブタについてブタ主組織適合複合（MHC）遺伝子の多形性について報告がなされ、更にRFLP分析により実証されている。Juneらによる“Theor. Appl. Genet.”, 77:271-271(1989)(参照として、ここに組み込まれる)には、ある種のオスブタにおけるSLAクラスIのRFLP分析について報告されている。これら研究者によれば、その結果からブタSLA/MHCクラスI遺伝子と、生産および性能特性との間に関連があることの可能性が示唆されている。更に、これら研究者によれば、SLAクラスI制限断片（フラグメント）を遺伝標識として使用することにより、将来においてブタ成長性能を改善する可能性があることが示唆されている。
【０００４】
特定の好ましい遺伝対立遺伝子を追跡するためには、主作用遺伝子のためのDNA分子標識を識別する新規、かつ、長いプロセスが要求される。この標識は主作用を有する単一遺伝子に、又は相加作用を有する多くの遺伝子に連結されているかも知れない。DNA標識は幾つかの利点を有する。すなわち、分離を容易に測定することができ、曖昧でない。DNA標識は共優性である。すなわち、ヘテロ接合と、ホモ接合を明確に識別することができる。いったん、マーカーシステムが確立されると、選択決定を非常に容易に行うことができる。なぜならば、DNA標識は、個々の乳児動物又は胚からでもその組織又は血液サンプルが収集された後、いつでも検定することができるからである。
【０００５】
受容体遺伝子における遺伝的違いの使用は選択のための貴重なマーカーシステムになっている。例えば、米国特許No.5,550,024およびNo.5,374,526（Rothschildら）(参照として、ここに組み込まれる)には、ブタエストロゲン受容体遺伝子中の多形性を開示しており、これは大きい同腹子数と関係するものである。米国特許No.5,935,784 (参照として、ここに組み込まれる)には、ブタプロラクチン受容体遺伝子中の多形性マーカーを開示しており、これは大きい同腹子数および総合的繁殖効率と関係するものである。
【０００６】
生のブタ肉の品質は多数の遺伝的および非遺伝的因子により影響される。この後者の因子には、農場、輸送、屠殺、処理条件などが含まれる。この肉についての科学者はこれらの因子について可なりの研究をし、その結果、可なりの品質上の改善に至っている。これら研究の一部は動物の遺伝的背景に向けられ、幾つかの研究により、遺伝的因子の重要性が明らかになっている。これにより家畜産業は動物の選択的繁殖および遺伝子技術の利用がブタの品質を向上させる上で重要な役割を果すことを認識するに至っている。
【０００７】
DNAレベルの情報は特定の主遺伝子を固定する助けとなっているが、それは更に、我々が既に選択した量的形質の選択についても助けとなる。表現型データに加えて、分子上の情報は選択の正確性従って選択応答の正確性を増大することができる。このような標識補助選択（MAS）プログラムにおける別の応答のサイズが理論的観点から多くの研究者により検討されてきた。一般的に言って、MASは遺伝率が低い形質および表現型的に測定することが高価となる形質については、より有益である。例えば、成長、肥満、肉の品質および飼育効率などの形質は一般的にはこのように考慮されていないが、これらの形質について標識を使用することは依然として可なり有益である。例えば、MeuwissenおよびGoddardは形質の異なるタイプについてMASの影響を考えている。最も大きい影響は、肉質などの形質についてであり、この場合、屠殺の後に測定され、マーカー情報の導入により６４％までの更なる応答を達成することができる。この数値は成長形質については比較的小さく、すなわち、８％であり、これは生きている動物について測定することができる。しかし、いったん、関連が実証されると、動物が検査され、表現型的に選択される前にこのマーカー情報を使用することができ、その場合、38％までの応答を予測することができる。
【０００８】
事実、経済的な形質を遺伝子的に改善する最良なアプローチは、選択される個体群から、関連するDNAマーカーを直接発見することである。表現型測定は、或る動物について成育組織の細胞核群から連続的に行うことができる。これら形質の殆どの完全な検定は屠殺の後にのみ可能であるから、データは選別された動物から収集されなければならず、潜在性の飼育動物について収集することはできない。
【０００９】
この表現型データは、関連するDNAマーカーの検出を可能にするため、実験個体群を使用して識別されたマーカーを確認するため、あるいは候補遺伝子を試験するために収集される。有意なマーカー又は遺伝子がついで、選択プロセスに直接含められる。分子情報の利点は、飼育動物の非常に若い年齢の時点で、それを得ることができることである。これは、成長性能テストが完了する前に、DNAマーカーに基づいてその動物を予め選択できることである。これは総括的テストおよび選択システムについて非常に有利である。
【００１０】
上記記載から、遺伝子レベルで改良された特徴を有する動物を識別し、選択することにより動物中の経済的に有益な特徴を改善するのに使用できるマーカーの識別について、その必要性が存在することが理解されるであろう。
【特許文献１】米国特許No.5,550,024
【特許文献２】米国特許No.5,374,526（Rothschildら）
【特許文献３】米国特許No.5,935,784
【特許文献４】米国特許No.4,683,195
【特許文献５】米国特許No.4,683,202
【特許文献６】米国特許No.4,965,188
【非特許文献１】Jungらによる“Theor. Appl. Genet.”, 77:271-274(1989)
【非特許文献２】Hogansonらによる“Abstract for Annual Meeting of Midwestern Section of the American Society of Animal Science"、3月26-28，1990
【非特許文献３】Juneらによる“Theor. Appl. Genet.”, 77:271-271(1989)
【非特許文献４】Sosnicki, A.A., E.R. Wilson, E.B. Sheiss, A. deVries, 1998, “高品質のブタの生産のためのコスト的に有効な方法があるか？”、Reciprocal Meat Conference Proceedings, Vol. 51
【非特許文献５】Ausubelら（eds）、“Short Protocols in Molecular Biology”第4版、John Wiley and Sons 1999
【非特許文献６】SmithおよびWatermanの局所的ホモロジー・アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482(1981)）
【非特許文献７】NeedlemanおよびWudschのホモロジー・アライメント・アルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:443（1970）)
【非特許文献８】PearsonおよびLipmanの相似法のための検索（Proc. Natl. Sci. 85:2444(1988)）
【非特許文献９】Intellegenetics, Mountain View（カルフォニア州）によるPC/GeneプログラムにおけるCLUSTAL;Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGAP, BESTFIT, BLAST, FASTAおよびTFASTA, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA
【非特許文献１０】HigginsおよびSharp, Gene 73:237-244(1988)
【非特許文献１１】HigginsおよびSharp, CABIOS 5:151-153(1989)
【非特許文献１２】CorpetらNucleic Acids Research 16:10881-90(1988)
【非特許文献１３】HuangらComputer Applications in the Biosciences、8:155-65(1992)
【非特許文献１４】PearsonらMethods in Molecular Biology,24:307-331(1994)
【非特許文献１５】Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubelら、Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, ニューヨーク（1995）
【非特許文献１６】Altschulら、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)
【非特許文献１７】Henikoff  &  Henikoff（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915
【非特許文献１８】Karlin  &  Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993)
【非特許文献１９】WootenおよびFederhen, Comput. Chem., 17:149-163(1993)
【非特許文献２０】ClaverieおよびStates, Comput. Chem., 17:191-201(1993)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、好ましい経済的特徴、例えば成長、肥満、肉質および飼育効率を示すHMGAコード化ヌクレオチド配列に基づく、又はその配列内の遺伝標識を提供することである。
本発明の他の目的は、この遺伝標識の存在を判定するための検定法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、望ましい形質のための選択並びに繁殖方法の正確性を増大することができる動物の評価方法を提供することである。
本発明の更に他の目的は、上記標識の存在の判定を著しく迅速化することのできるPCR増幅試験法を提供することである。
本発明の他の目的および利点を以下に一部記載するが、同時に、その記載並びに発明の実施からも自明であろう。本発明の目的および利点は、付記した特許請求の範囲に指摘して手段および組合せから獲得することができるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、血統を追跡するための動物の遺伝学的識別として、あるいは動物の成長、肥満、肉質および飼育効率の形質に関係する遺伝標識として有用なEMGAコード化ヌクレオチド配列の交番遺伝子型の発見に関係する。これらの遺伝子が種々の種、動物中において保持されている限りにおいて、ここに開示した異なる対立遺伝子は、他の経済的又は肉生産動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ニワトリなどにおけるこれら遺伝子の変異性にも関連するものと予想される。
【００１３】
上記目的を達成するため、更に、ここに具体的に、又は広い概念で記載されているように、本発明の目的に従って、本発明は、交番遺伝子型の発見に基づくものであり、これは成長、肥満、肉質および飼育効率において好ましい形質を有すると思われる動物を、成長、肥満、肉質および飼育効率において余り好ましくない形質を示す対立遺伝子を有する動物から、遺伝子学的に分類又は分別するための方法を提供するものである。なお、ここで、“成長、肥満、肉質および飼育効率において好ましい形質”とは、多くの測定可能な成長、肥満、肉質および飼育効率の形質の１つが、或る個体群の平均値よりも可なり改善（増大又は減少）されていることを意味するもので、従って、この情報は、成長、肥満、肉質および飼育効率について最適化された均一な個体群を達成するため、繁殖において使用することができ、この場合、所望とする特徴次第で、或る種の形質については改善がなされ、他の形質については劣る場合も含まれるものである。経済的形質の幾つかの例の考察については以下の文献を参照することができる。すなわち、Sosnicki, A.A., E.R. Wilson, E.B. Sheiss, A. deVries, 1998, “高品質のブタの生産のためのコスト的に有効な方法があるか？”、Reciprocal Meat Conference Proceedings, Vol. 51。
【００１４】
従って、本発明は、好ましい成長、肥満、肉質および飼育効率を示す動物および/又は好ましい成長、肥満、肉質および飼育効率を示す可能性の少ない動物を識別するため、その動物を分別し、最良の成長、肥満、肉質および飼育効率を得るための繁殖および選別を最適化する方法を提供するものである。
【００１５】
これらの形質を検定するための方法は、一般的に、１）動物から生物学的サンプルを採取する工程；２）上記1）で得たゲノムDNA又はたんぱくを分析し、どのHMGA対立遺伝子が存在するかを判定する工程とからなっている。HMGA遺伝子中の一連の多形性を選別又は識別プロトコルと組合せて、これらマーカーの夫々の利点を最適化させる単模式種データも使用することができる。
【００１６】
多形性の幾つかはHMGAたんぱくのアミノ酸組成の変化が関連し、又、これがこの変化の存在を示唆するものであるから、検定方法はHMGAたんぱくのアミノ酸組成を確認することを含むものであってもよい。この型の精製分析のための方法は、一般に、抗体を用いた蛍光標識（tagging）を含む手段を介してのたんぱく質の単離、たんぱく質の分離、精製（すなわち、逆相HPLCシステムを介して）、および存在するアミノ酸配列を特定するための自動化たんぱく質シーケンサーの使用が含まれる。この検定のためのプロトコルは標準的なもので、公知であり、Ausubelら（eds）、“Short Protocols in Molecular Biology”第4版、John Wiley and Sons 1999に開示されている。 
【００１７】
好ましい例において、遺伝子サンプルが分析される。簡単に述べると、遺伝物質のサンプルを動物から採取し、それを分析して、改善された成長、肥満、肉質および飼育効率と関連するHMGAヌクレオチド配列中の多形性の有無を判定する。
当業者に公知のように、配列の差異について核酸分子を比較する場合、種々の技術を利用することができる。例えば、制限断片長多形性分析、ヘテロジュプレックス分析、一本鎖高次構造多型分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、および温度勾配ゲル電気泳動を利用することができる。
【００１８】
好ましい例において、多形性は制限断片長多形性であり、その検定法は、単離した遺伝物質から動物HMGA遺伝子を識別すること；この遺伝子を種々の長さの遺伝子の制限断片を生じさせる制限酵素に曝すこと；電気泳動又はHPLC分離などにより制限断片を分離し制限パターンを形成すること；得られた制限断片パターンを、所望のマーカーを有している、又は有していないことが知られているHMGAヌクレオチド配列と比較することからなる。もし、動物がそのマーカーについて陽性の場合、その動物は繁殖プログラムに含められると考えることができる。もし、動物がそのマーカー遺伝子型について陽性でない場合、その動物はグループからえりのけられ、別途、使用される。単模式種データの使用は、成長、肥満、肉質および飼育効率の異なる点について多重対立遺伝子のスクリーニングと合体させることもできる。
【００１９】
最も好ましい例において、これらの遺伝子はプライマーおよびDNAポリメラーゼを用いて単離され、多形性を含むこれら遺伝子の特異的領域を増幅させる。次に、この増幅された領域を、制限酵素で消化し、断片が再び分離される。RFLPパターンの可視化は断片の簡単な染色により、あるいは増幅で使用されたプライマー又は三燐酸ヌクレオシドのラベリングにより行うことができる。
【００２０】
他の実施例において、本発明は特別の個体群における成長、肥満、肉質および飼育効率についての遺伝標識を識別する方法を提供する。同一の種，交雑種又は類似遺伝血統の動物のオス、メスを繁殖させ、各動物により得られた成長、肥満、肉質および飼育効率を判定する。各動物のHMGA遺伝子の一方又は双方における多形性が識別され、成長、肥満、肉質および飼育効率と関連づけられる。好ましくは、RFLP分析を用いてこの多形性が判定される。
【００２１】
他の実施例において、本発明は動物以外の任意の特定の経済的動物における成長、肥満、肉質および飼育効率についての遺伝標識を識別する方法を提供する。異なる動物内において、この遺伝子の高く保持された性質に基づいて、ここに記載して殆どルーチン的な試験により、この遺伝標識をここに記載した教示に基づいて、異なる動物種に適用し、成長、肥満、肉質および飼育効率について選択することができる。同一の種，交雑種又は類似遺伝血統の動物のオス、メスを繁殖させ、各動物により得られた成長、肥満、肉質および飼育効率を判定し、相互に関連させる。配列が入手可能な他の動物について、配列のBLAST比較を利用して、その特定の対立遺伝子がここに記載したものと類似のものか否かが確認される。同類の多形性が他の動物中および他の密接に関連する遺伝子中に存在するであろう。“類似の多形性”の用語は、ここにBLAST比較により判定したものと同一の多形性である。
【００２２】
以下の用語は、2又はそれ以上の核酸又はポリヌクレオチド間の配列の関係を記述するのに使用される。つまり、（a）“参照配列”、（ｂ）“比較ウインドウ”、（ｃ）“配列同一性”、（ｄ）“配列同一性のパーセント”、（e）“実質的同一性”である。
（a）ここで使用されている“参照配列”とは、配列の比較のためのベースとして使用される配列と定義される。この場合、参照HMGA配列である。参照配列は、特定の配列の部分集合又はそのものであってもよい。例えば、全長cDNA又は遺伝子配列の断片又は完全なcDNA又は遺伝子配列であってもよい。
（ｂ）ここで使用されている“比較ウインドウ”にはポリヌクレオチド配列の同一限界内の特定された断片を参照するものを包含し、ここで、このポリヌクレオチド配列は参照配列と比較することができ、この比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は２つの配列の最適な整合のため参照配列（これには付加又は削除が含まれない）と比較して付加又は削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。一般に、比較ウインドウは少なくとも20の長さの連続したヌクレオチド、更に任意に30，40，50，100又はそれ以上の長さのヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチド配列にギャップが含まれることによる参照配列との高い類似性を避けるため、ギャップ・ペナルティーが一般的に導入され、更にギャップ・ペナルティーがマッチ（適合）する数から減じられる。
【００２３】
比較のため配列の整合方法は当業者にとって公知である。比較のため配列の最適の整合は、SmithおよびWatermanの局所的ホモロジー・アルゴリズム（Adv. Appl. Math. 2:482(1981)）により；NeedlemanおよびWudschのホモロジー・アライメント・アルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:443（1970）) により；PearsonおよびLipmanの相似法のための検索（Proc. Natl. Sci. 85:2444(1988)）により；これらのアルゴリズムのコンピュータ化履行、これには、特に限定されないが、例えばIntellegenetics, Mountain View（カルフォニア州）によるPC/GeneプログラムにおけるCLUSTAL;Wisconsin Genetics Software PackageにおけるGAP, BESTFIT, BLAST, FASTAおよびTFASTA, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA;上記CLUSTALプログラムは、HigginsおよびSharp, Gene 73:237-244(1988); HigginsおよびSharp, CABIOS 5:151-153(1989);Corpetら，Nucleic Acids Research 16:10881-90(1988)；Huangら,Computer Applications in the Biosciences、8:155-65(1992);Pearsonら、Methods in Molecular Biology,24:307-331(1994)に詳細に記載されている。データベース相似検索に使用することができるプログラムのBLASTファミリーには以下のものが含まれる。すなわち、ヌクレオチド・データベース列に対するヌクレオチド質問列のためのBLASTN;たんぱくデータベース列に対するヌクレオチド質問列のためのBLASTX; たんぱくデータベース列に対するたんぱく質問列のためのBLASTP; ヌクレオチド・データベース列に対するたんぱく質問列のためのTBLASTN; およびヌクレオチド・データベース列に対するヌクレオチド質問列のためのTBLASTXである。Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubelら、Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, ニューヨーク（1995）。
【００２４】
特に断りのない限り、ここに記載された配列同一性/相似性の値は、デフォルト・パラメータを使用するプログラムのBLAST 2.0スイートを使用して得られた値を指すものである。Altschulら、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1997)。BLAST分析を行うためのソフトウエアは市販されている（例えば、National Center for Biotechnology Information (http://www.hcbi.nil.nih.gov/)）。
【００２５】
このアルゴリズムは、質問列中の長さWの短いワードを識別することによりハイ・スコアリング・シーケンス・ペア（HDPs）を最初に識別することが含まれる。ここで、このワードは、データベース中の同一長さのワードと整合させたとき、或る正の値の閾値スコアTと適合又は満足するものである。又、Tは近傍ワードスコア閾値として参照される（Altschulら）。これらの最初の近傍ワードヒット（hits）は、これらを含むより長いHSPsを発見する検索を開始させるためのシードとして作用する。ついで、このワードヒットは、累積アラインメント（alignment：整合）スコアが増加できる範囲で、各列に沿って双方向に延ばされる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM（適合残部のペアについてはリワードスコア；常に＞０）およびN（非適合残部についてはペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、この累積スコアを計算するためスコアリングマトリックスが使用される。各方向におけるワードヒットの延長は以下の場合に停止される。すなわち、累積整合スコアがその最大達成値から量X分外れたとき；累積スコアが、1又はそれ以上の負のスコアリング残部アラインメントの蓄積のためにゼロ又はそれ以下になったとき；又はいずれかの列の末端に到達したときである。BLASTアルゴリズム・パラメータW,TおよびXは、上記アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列についての）はデフォルトとして、11のワード長（W）、10の予測（E）、100のカットオフ、M=5,N=-4および双方のストランドの比較を使用する。アミノ酸配列については、BLASTNプログラムは、デフォルトとして、3のワード長（W）、10の予測（E）およびBLOSUM62スコアリングマトリックスを使用する(Henikoff  &  Henikoff（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと)。
【００２６】
配列同一性パーセンBLASTアルゴリズムは更に、2つの配列間の相似性の統計的分析を行う（Karlin  &  Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993)）。BLASTアルゴリズムにより提供される相似性の1つの測定は、最も小さい合計確率（P(N)）であり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の適合が偶然にも生じ得る確率を示唆するものである。
【００２７】
BLAST検索はたんぱく質がランダム配列としてモデル化できることを想定している。しかし、多くの実際のたんぱく質は非ランダム配列の領域を含むものであって、ホモポリマー区域、短周期繰返し、1又はそれ以上のアミノ酸で富化された領域などが含まれる。このような低複雑度領域は、たんぱく質の他の領域が全く非類似であったとしても、関連のないたんぱく質間に整合させることができる。多くの低複雑度フィルタープログラムを使用して上述のような低複雑度整合を減少させることができる。例えば、SEG(WootenおよびFederhen, Comput. Chem., 17:149-163(1993))およびXNU(ClaverieおよびStates, Comput. Chem., 17:191-201(1993))低複雑度フィルターを単独又は組合せで使用することができる。
【００２８】
（c） ここで、２つの核酸又はポリペプチド配列の関連において“配列同一性”又は“同一性”とは、特定の比較ウインドウにおいて最大対応のために整合させたときに同一である２つの配列における残部を参照する場合も含まれる。配列同一性のパーセントを、たんぱく質を参照して使用したとき、一致していない残部の位置がアミノ酸の保存的置換によりしばしば異なることと理解されべきである。ここで、アミノ酸残部は類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残部に対し置換され、従って分子の機能的特性は変化しない。配列が保存的置換により異なる場合、配列同一性パーセントを上に向けて調整し置換の保存的性質を修正してもよい。このような保存的置換により異なる配列は、“配列類似性”又は“類似性”を有すると言われる。上記調整を行うための手段は当業者にとって周知である。一般に、これには、保存的置換を完全なミスマッチとして出なく、部分的ミスマッチとして評点することが含まれ、それにより配列同一性パーセントを増大させる。従って、例えば、同一性のアミノ酸に評点1が与えられ、非保存的置換にゼロの評点が与えられた場合、保存的置換にはゼロと1との間の評点が与えらる。保存的置換の評点は例えばMeyersおよびMillerのアルゴリズム（Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17(1988)）に従って計算することができ、例えば、プログラムPC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, カルフォニア、USA)にて履行される。
【００２９】
（d）ここで、“配列同一性のパーセント” とは、比較ウインドウにおいて２つの最適に整合された配列を比較することにより決定される値を意味する。この場合、比較ウインドウ中のヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適整合のための参照配列（付加又は削除を含まない）と比較して付加又は削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。このパーセントは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残部が双方の配列中に発現し整合位置を発生させる位置の数を判定し、その整合位置の数を比較ウインドウ中の位置の総数で割り、その結果に100をかけて、配列同一性の百分率を得ることにより計算される。
【００３０】
（e）ここで、ポリヌクレオチド配列の“実質的同一性” とは、標準パラメータを使用して記載された整合プログラムの１つを用いた参照配列と比較して、少なくとも70％の配列同一性、好ましくは少なくとも80％の配列同一性、更に好ましくは少なくとも90％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を有する配列をポリヌクレオチドが含むことを意味する。コドン縮退、アミノ酸類似性、読取りフレーム位置決めなどを考慮して、これらの値を適当に調整し、２つのポリヌクレオチド配列によりコード化されたたんぱく質の対応する同一性を判定し得ることは当業者にとって明らかであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は通常、少なくとも60％の配列同一性、好ましくは少なくとも70％、80％、90％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも95％の配列同一性を意味する。
【００３１】
これらのプログラムおよびアルゴリズムは、標的遺伝子中の特定の多形性の、ここに記載されたものとの類似性を確かめることができる。この多形性は他の動物にも存在することが予想され、従って、これをここに記載されている以外の他の動物に適用することは、本明細書の教示を用いてパラメータをルーチン的に最適化するだけでよいことが理解されるであろう。
【００３２】
別のDNAマーカーの特定の対立遺伝子と、先に特別の形質と関連することを示した特定の遺伝子（例えば、ここに記載したHMGA遺伝子）と関係することが知られているDNAマーカーの対立遺伝子と間の連結を確立することも可能である。すなわち、この場合、HMGA遺伝子の一方又は双方を取り出し、別の染色体マーカーの特定の対立遺伝子の選択を介してHMGA関係マーカーの或る対立遺伝子を選択することにより、少なくとも短期間に、所望の成長、肥満、肉質および飼育効率を生じさせると思われる動物を選別することが可能であり、若しくは、間接的に、成長、肥満、肉質および飼育効率について望ましくないと思われる動物を除外することが可能である。なお、ここで、“遺伝標識”とは、結合されたマーカーであれ、マイクロサテライトの使用であれ、多形性と関係するたんぱく質の変化についての任意の検定手段により開示されたヌクレオチド多形性、あるいはこのマーカーにより示された原因となるたんぱく質の変化についての他の検定手段により開示されたヌクレオチド多形性を包含するだけでなく、動物の成長、肥満、肉質および飼育効率に対し影響するその標識の使用も含まれる。
【００３３】
ここに用いられているように、特定の多形性の指定は、しばしば制限酵素の名前によりなされることがある。しかし、これは、その部位が識別される唯一の方法が制限酵素の使用によりなされることを示唆するものではない。特定の多形性を識別するのに使用することのできる他の制限酵素を識別するためのデータベースおよび情報源は多数、入手可能である（例えば、http://Darwin.bio.geneseo.edu、これは配列の分析による制限酵素および識別されるべき多形性を提供することができる）。事実、ここに開示したように、特定の多形性又は対立遺伝子を識別するための多くの方法があり、その他、制限酵素を含まないが、同一の遺伝的又はたんぱく質的変形型を検定する方法もある。
【００３４】
添付した図面は本明細書の一部を構成するものであり、本発明の1実施例を記述と共に説明するためのものであって、これらは本発明の原理を説明するのに役立つものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
次に、本発明の好ましい具体例について、以下の実施例と共に記載するが、これらは本発明の原理について説明するものである。
【００３６】
本発明は動物の経済的に貴重な形質のための遺伝子標識に関係するものである。これらの標識は対立遺伝子を表し、これらは成長、肥満、肉質および飼育効率と有意に関連するものであり、従って、望ましい成長、肥満、肉質および飼育効率（その１つ又はそれらの全てについて）を生じさせるものと思われる動物を判定するための動物の選別方法が提供される。この場合、動物は、所望の成長、肥満、肉質および飼育効率と関連するHMGAヌクレオチド配列の一方又は双方における多形性の有無を識別することにより繁殖される。
【００３７】
すなわち、本発明は、特別の種、形質、個体群又はグループの動物中の遺伝標識およびそれを識別するための方法に関係するものであって、それにより所望の成長、肥満、肉質および飼育効率を生じさせると思われる動物を提供することができる。
【００３８】
本発明によれば、動物の改善された形質と関連する新規なHMGAヌクレオチド配列の対立遺伝子が識別される。本発明の１具体例において、Ban I又はNae I制限サイトにより識別可能な新規なブタHMGA１対立遺伝子が、より低い脂肪分および成長、肥満、肉質および/又は飼育効率と関連があることが実証されている。他の具体例においては、HMGA2中の新規なHha I対立遺伝子が脂肪および成長形質と関連のあるものとして識別されている。更に他の具体例においては、別の作用を共に有する遺伝標識が示されている。
【００３９】
この標識の有無を識別する方法としては、任意の方法を使用することができ、例えば、一本鎖高次構造多型分析（SSCP）、塩基切除シーケンス・スキャニング（BESS）、制限断片長多形性（RFLP）分析、ヘテロジュプレックス分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)、温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)、対立遺伝子PCR、リガーゼ鎖反応直接的シーケンシング、ミニシーケンシング、核酸交雑形成、HMGA遺伝子のマイクロ・アレイ・タイプ検出、HMGA遺伝子の他の結合シーケンスなどを使用することができる。更に、本発明の範囲には、この多形性の存在下で発生するたんぱく構造又は配列的変化を検査法することも含まれる。この多形性は因果的突然変異であってもなくても良いが、この変化の存在を示唆するものであって、この表現型の相違について遺伝子的又はたんぱく質的ベースを検査することができる。
【００４０】
以下に、本発明の多形性についての検定に使用される技法の一般的概略について説明する。
本発明において、動物から遺伝子的物質のサンプルが採取される。これらサンプルは、血液、組織、精液などから得ることができる。一般に、末梢血球が試料として使用され、遺伝子物質はDNAで或る。血球の十分な量を得ることにより、分析のための十分なDNAが得られる。この量については当業者が適宜決定し得るものであろう。DNAは公知の手法により血球から単離される。
【００４１】
核酸の単離および増幅
ゲノムDNAのサンプルは適当な供給源から単離される。その供給源としては、唾液、口内細胞、毛根、血液、せい帯血、羊水、間質液、腹膜液、絨毛、その他の適当な細胞、組織であって無傷の間期核又は中期細胞を有するものである。細胞は個体組織の他、新鮮な又は保存された器官、組織サンプル又は生検などから得ることができる。このサンプルは生物学的物質とは自然には混合しない化合物、例えば保存剤、抗凝固剤、緩衝液、定着剤、栄養剤、抗生物質などを含んでいてもよい。
【００４２】
これらの種々の供給源からゲノムDNAを単離する方法については、例えば、Kirby, DNA Fingerprinting, An Introduction, W.H. Freeman & Co.ニューヨーク（1992）に記載されている。ゲノムDNAは更に、一次又は二次細胞培養液から、又は上記組織サンプルの任意のものから得られる変形細胞ラインから単離することができる。
【００４３】
動物RNAのサンプルを使用することもできる。RNAは上記Sambrookらに記載されているHMGA遺伝子を発現する組織から単離することができる。RNAは全細胞質RNA、mRNA、ポリA+RNA又はそれらの任意の組合せであってもよい。最も良い結果を得るため、RNAは精製されるが、精製されていない細胞質RNAであっても良い。RNAは逆転写してDNAを形成し、これを増幅テンプレートとして使用し、それによりPCRがRNAの写しの特定の個体群を間接的に増幅することになる。例えば、上記Sambrook、Kawasakiら、PCR Technology（1992）のChapter 8、Bergら、Hum. Genet. 85:655-658（1990）参照のこと。
【００４４】
PCR増幅
この増幅のための最も一般的な手段は、ポリミラーゼ鎖反応（PCR）であり、これは米国特許No.4,683,195; No.4,683,202; No.4,965,188(参照として、ここに組み込まれる)に記載されている。血球中の標的領域を増幅するのにPCRを使用する場合、ヘパリン添加全血を封止した真空チューブに吸引し、他のサンプルから分離し、清潔な手袋で取扱うようにする。最良の結果を得るため、血液は収集後直ちに処理しなければならない。もし、これが不可能の場合は、使用するまで、4℃に保たれた密封容器に保存する必要がある。他の生理学的液体中の細胞も検査することができる。これらの液体を使用するとき、液体中の細胞は遠心分離により液体成分から分離する必要がある。
【００４５】
組織は滅菌使い捨て外科用メスおよび滅菌針（又は２つの外科用メス）を用いて5mmペトリ皿中で粗く裁断する必要がある。組織片からパラフィンを除去する手法は当業者に公知の種々の専門書に記載されている。
【００４６】
PCRによりサンプル中の標的核酸配列を増幅するため、この配列は増幅システムの成分にアクセスできるものでなければならない。標的DNAを単離するための1つの方法は、粗い抽出であり、これは比較的大きいサンプルについて有用である。簡単に述べると、血液サンプルからの単核細胞、羊水からの羊膜細胞、培養された絨毛細胞あるいはその他を、標準的手法により滅菌Ficoll-Hypaque勾配上に層状に形成することにより単離させる。間期細胞を収集し、DNA抽出前に滅菌燐酸緩衝塩液で3回洗浄する。もし、末梢血液リンパ球からのDNAを試験する場合は、浸透圧衝撃（蒸留水で10秒間ペレットを処理する）が行われ、最初の洗浄の後に残留赤血球が認められたとき、更に2回の洗浄が行われる。これは、PCR反応において、ヘモグロビンにより運ばれたヘム基の抑制作用を防止させるものである。PCR試験がサンプル採取の直後に行われない場合は、10６細胞の少量が滅菌Eppendorf管内にてペレット化され、乾燥ペレットが使用に至るまで−20℃で凍結される。
【００４７】
細胞は、50mMのTris-HCl(pH=8.3)、50mMのKCl、1.5mMのMgCl2、0.5% のTween 20、100μm/mLのプロティナーゼKで補足した0.5%  NP40からなる緩衝液中に再懸濁させる（100μL当り10６の核化細胞）。56℃で2時間培養させた後、細胞を95℃で10分間加熱し、プロティナーゼKを不活性化し、直ちにウェットアイス（スナップ‐クール）に移動させた。大きな凝集体が存在する場合は、同一の緩衝液内で更なる消化サイクルを行う必要がある。この抽出物の10μLを増幅のために使用する。
【００４８】
例えば、絨毛細胞又は一緒にした培養細胞などの組織からDNAを抽出する場合、プロティナーゼKを含有する上記緩衝液の量を、組織サンプルのサイズに従って変化させることができる。抽出物は50ないし60℃で4−10時間、ついで95℃で10分間培養し、プロティナーゼを失活させる。より長い培養の間、新鮮なプロティナーゼKを当初の濃度で約4時間後に添加する。
【００４９】
サンプルが小数の細胞を含むとき、抽出は文献、Higuchi, “Simple and Rapid Preparation of Samples for PCR”、PCR  Technology, Ehrlich, H.A. (ed.), Stockton Press, ニューヨーク(参照として、ここに組み込まれる)に記載されている方法で行うことができる。PCRは、骨髄および末梢血液培養物からの個々のコロニーから取り出された非常に少ない数の細胞（1000−5000）の標的領域を増幅するのに使用することができる。サンプル中の細胞を、20μLのPCR分解緩衝液（10mMの Tris-HCl(pH=8.3)、50mMの KCl、2.5mMのMgCl2、0.1mg/mlのゼラチン、0.45%のNP40、0.45% のTween 20）内に懸濁させ、使用するまで凍結させる。PCRを行う場合、0.6μLのプロティナーゼK(2mg/ml)をPCR分解緩衝液中にて細胞に添加する。このサンプルをついで、約60℃まで加熱し、1時間培養する。サンプルを95℃まで加熱し、10分間加熱を続け、ついで氷上で冷却することによりプロティナーゼKを失活させ、それにより消化を停止させる。
【００５０】
PCRのためDNAを抽出するための比較的容易な手法は、塩析手法であり、この方法は、Millerら、Nucleic Acids Res. 16:1215(1988)(参照として、ここに組み込まれる)に記載されている。単核細胞がFicoll-Hypaque勾配上で分離される。この細胞を3mlの分解緩衝液（10mMの Tris-HCl、400mMの NaCl、2mMのNa2 EDTA、pH=8.2）内にて再懸濁させる。プロティナーゼKの20mg/ml溶液50μLおよび20％SDS溶液150μLを細胞に添加し、ついで37℃で一晩培養させる。培養の間、揺動させることによりサンプルの消化が促進される。プロティナーゼKによる消化が、一晩の培養でも不完全なときは（断片が見える）、プロティナーゼKの20mg/ml溶液の50μLを追加として上記溶液に混合し、もう一晩、静かに揺らしながら、又は回転プラットホーム上で37℃で培養させる。適当な消化の後、1mlの6MのNaCl溶液をサンプルに加え、激しく混合する。得られた溶液を3000rpmで15分間、遠心分離する。ペレットには、析出された細胞質たんぱく質が含まれている。他方、上澄液にはDNAが含まれている。上澄液を、イソプロパノール4mlを含む15mlのチューブに移す。このチューブの内容物を静かに混合し、これを水相とアルコール相とが混合され、白色のDNAの析出物が形成されるまで行う。ついで、DNA析出物を取り出し、70％エタノール溶液中に浸漬させ、静かに混合する。次いで、このＤＮＡ検出物をエタノールから取り出し、空気乾燥させる。このDNA析出物を蒸留水中に入れ、溶解させる。
【００５１】
PCRのための高分子量DNAの抽出のためのキットには、ゲノム単離キットA.S.A.P.(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.)、ゲノムDNA単離システム（GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.）、Elu-Quik DNA精製キット（Schleicher & Schuell, Keene, N.H.）、DNA抽出キット（Stratagene, LaJolla, Calif.）、TurboGen単離キット（Invitrogen, San Diago, Calif）などが含まれる。製造メーカーの説明書によるこれらのキットの使用は、一般に、本発明の方法を実施する前のDNAの精製のために適している。
【００５２】
抽出したDNAの濃度および純度は、希釈した少量の260nmおよび280nmでの吸光度の分光測光分析により判定することができる。DNAの抽出後に、PCR増幅が行われる。PCRの各サイクルの第1の工程は、プライマー・イクテンションにより形成された核酸ジュプレックス（duplex）の分離が含まれる。ストランドがいったん、分離されると、PCRにおける次の工程は、分離されたストランドを標的シーケンスの側面に位置するプライマーで交雑化することが含まれる。これらプライマーはついで、延長され、標的ストランドの相補的コピーを形成する。PCR増幅を成功させるため、ジュプレックス・シーケンスに沿って各プライマーが交雑化する位置が、テンプレート（相補）から分離されたとき1つのプライマーから合成される延長生産物が他のプライマーの延長のためのテンプレートとして役立つように、プライマーは設計されている。変性、抗雑化および延長のサイクルは、必要な回数だけ繰り返され、それにより増幅された核酸の所望量が得られる。
【００５３】
PCR増幅の特に有用な具体例において、ストランドの分離は、反応を十分に高い温度で十分な時間をかけて加熱し、ジュプレックスの変性を生じさせるが、ポリメラーゼの非可逆的変性を生じさせないようにして行われる（米国特許No.4,965,188参照(参照として、ここに組み込まれる)）。典型的な熱変性は、約80ないし105℃の範囲の温度で、数秒ないし数分間で行われる。しかし、ストランドの分離は、物理的、化学的又は酵素的手段を含む適当な変性方法により達成することができる。ストランドの分離は例えば、ヘリカーゼ（helicase）により、あるいはヘリカーゼ活性を発現し得る酵素により誘起させてもよい。例えば、酵素RecAはATPの存在下でヘリカーゼ活性を有する。ヘリカーゼによるストランドの分離のための適当な反応条件は公知である（例えば、Kuhn Hoffman-Berling, 1978, CSH-Quantitative Biology, 43:63-67; およびRadding, 1982, Ann. Rev. Genetics 16:405-436(参照として、ここに組み込まれる)）。
【００５４】
PCRにおけるプライマーのテンプレート依存延長は、適当な塩、金属カチオン、pH緩衝システムからなる反応媒体中にて、４つの三燐酸デオキシリボヌクレオチド（典型的には、dATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）の適当量の存在下で重合剤により触媒される。適当な重合剤は、テンプレート依存DNA合成を触媒するものとして知られている酵素である。或る場合では、標的領域は、細胞により発現されるたんぱく質の少なくとも一部をコード化する。この場合、標的領域の増幅のためにmRNAを使用することができる。その他、PCRを使用して、更なる増幅のためRNAからcDNAライブラリーを発生させても良い。この場合、プライマー延長のための初期のテンプレートはRNAである。RNAテンプレートからの相補的コピーDNA（cDNA）配列を合成させるのに適した重合剤は、リバース・トランスクリプターゼ（RT）、例えばアビアン・ミエロブラストシス・ウイルスRT、モロネイ・ハツカネズミ白血病ウイルスRT、又はPerkin Elmer Cetus社により市販されているリバース・トランスクリプターゼ活性を有するThermus thermophilus (Tth)DNAポリメラーゼである。典型的には、ゲノムRNAテンプレートは、最初の逆転写工程の後の最初の変性工程の間において熱劣化され、DNAテンプレートのみが残される。DNAテンプレートと共に使用するのに適したポリメラーゼとしては、例えばE.coli DNAポリメラーゼI又はそのKlenowフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、すなわち、Thermus aquaticusから単離され、Perkin Elmer Cetus社から市販されている熱安定性DNAポリメラーゼが含まれる。この後者の酵素は、核酸の増幅およびシーケンシングに広く使用されている。Taqポリメラーゼを使用する反応条件は公知であり、Gelfand, 1989, PCR Technologyに記載されている。
【００５５】
対立遺伝子特異的PCR
対立遺伝子特異的PCRは、変異又は多形性の有無で異なる標的領域間を分化させる。PCR増幅プライマーは、標的配列の或る対立遺伝子にのみ結合するものが選択される。この方法はGibbs, Nucleic Acid Res. 17:12427-2448 (1989)に記載されている。
【００５６】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド選別方法
更なる診断的選別方法は対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）選別方法を使用する（Saikiら、Nature 324:163-166 (1986)参照）。1又はそれ以上の塩基対不適合を有するオリゴヌクレオチドは特別の対立遺伝子を発生させる。ASO選別方法は、変異体標的ゲノム又はPCR増幅DNAと、非突然変異オリゴヌクレオチドであって突然変異オリゴヌクレオチドと比較してオリゴヌクレオチドの小さい結合性を示すものとの間の不適合を検出するものである。オリゴヌクレオチドプローブは、低い圧迫下では、対立遺伝子の双方の多形性形に結合するが、高い圧迫下では、それらが対応する対立遺伝子に結合するように設計することができる。その他、本質的に二元応答が得られるように圧迫条件を案出することができる。すなわち、標的遺伝子の変異体に相当するASOがその対立遺伝子に対し交雑化し、野生型対立遺伝子に対し交雑化しないようにすることができる。
【００５７】
リガーゼ媒介対立遺伝子検出方法
リガーゼ媒介対立遺伝子検出により、被検体のDNAの標的領域を、冒されている又は冒されていない種族メンバーの標的領域とを比較することができる（Landegrenら、Science 241:107-1080 (1988)参照）。リガーゼを、Wuら、Genomics 4:560-569 (1989)に記載されているように、修復増幅反応における点突然変異の検出に使用することもできる。上記Wuら、およびBarany, Proc. Nat. Acad. Sci. 88:189-193 （1990）に記載されているように、修復増幅反応（LAR）は、テンプレート依存修復のシーケンス・ラウンド（sequential rounds）を使用する特定のDNA配列の増幅を利用するものである。
【００５８】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動
ポリメラーゼ鎖反応を使用して発生する増幅生産物は変性剤濃度勾配ゲル電気泳動を使用して分析することができる。溶液におけるDNAの異なるシーケンス依存溶融特性および電気泳動マイグレーションに基づいて、異なる対立遺伝子を識別することができる。DNA分子は、増大された温度又は変性条件下で断片で溶け、これは溶融領域と呼ぶ。各溶融領域は明確な塩基特異的溶融温度（TM）で協同的に溶ける。溶融領域は、長さが少なくとも20の塩基対であり、長さが数百もの塩基対もあり得る。
【００５９】
シーケンス特異的溶融領域の相違に基づく対立遺伝子間の分化は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して評価することができる（例えば、Erlich, ed.の第7章、PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman and Co., ニューヨーク（1992）(参照として、ここに組み込まれる)）。
【００６０】
一般に、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動により分析される標的領域は、標的領域の側面に位置するPCRプライマーを使用して増幅される。この増幅されたPCR生産物は直線的変性勾配を有するポリアクリルアミドゲルに適用される（Myerら、Meth. Enzymol. 155:501-527 (1986);およびMyerら、Genomic Analysis, A Practical Approach, K. Davies Ed. IRL Press Limited, Oxford, pp. 95-139 (1988)(参照として、ここに組み込まれる)）。この電気泳動システムは、標的シーケンスの溶融領域のTmより若干低い温度にて維持される。
【００６１】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動の別の方法において、標的シーケンスは最初に、Erlich, ed.の第7章に記載されているように、GCクランプと呼ばれるGCヌクレオチドの伸長部に固定されていても良い。好ましくは、GCクランプ中のヌクレオチドの少なくとも80％はグアニン又はサイトシンである。好ましくは、GCクランプは少なくとも30の塩基の長さのものである。この方法は特に、高いTmを有する標的シーケンスに適している。
【００６２】
一般に、標的領域は上述のようにポリメラーゼ鎖反応により増幅される。オリゴヌクレオチドPCRプライマーの１つは、その５´端部、つまりGCクランプ領域に、GCリッチシーケンスの少なくとも30の塩基を有していて、これは増幅の間、標的領域の５´端部に組み込まれる。この増幅された標的領域は上述のように変性勾配条件下で電気泳動ゲル上に走行される。単一の塩基の変化により相違するDNA断片はこのゲルを通って異なる位置に移行するが、これは臭化エチジウム・ステインにより可視化される。
【００６３】
温度勾配ゲル電気泳動
温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）は変性剤濃度勾配ゲル電気泳動と同一の基本原理に基づいているが、この場合の変性勾配は、化学的変性剤の濃度の差異の代わりに温度差により生じる点で異なる。標準的TGGEは電気泳動装置を利用しており、温度勾配は電気泳動路に沿って発現される。サンプルが化学的変性剤の均一濃度を有するゲルを介して移動するとき、増大する温度に遭遇する。TGGEの他の方法、つまり一時的温度勾配ゲル電気泳動（TTGE又はtTGGE）は、電気泳動ゲル全体の着実に増大する温度を使用して同一の結果を達成するものである。サンプルがゲルを介して移行するとき、ゲル全体の温度が増大し、サンプルはその移行と共に増大する温度に遭遇する。サンプルの作成（GCクランプの導入によるPCRの増幅を含めて）、および生産物の可視化は変性剤濃度勾配ゲル電気泳動の場合と同一である。
【００６４】
一本鎖高次構造多型分析
HMGA座における標的シーケンス又は対立遺伝子は、一本鎖高次構造多型分析を用いて分化することができる。これは一本鎖PCR生産物の電気泳動移行における変化による塩基の相違を識別するものである（Oritaら、Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2766-2770 (1989)）。増幅されたPCR生産物は上述のように発生させることができ、加熱され、その他、変性され、一本鎖増幅生産物が得られる。一本鎖核酸を再度折り重ねたり、又は、塩基配列に部分的に依存した二次的構造を形成することができる。従って、一本鎖増幅生産物の電気泳動運動性により、対立遺伝子又は標的シーケンス間の塩基配列の相違を検出することができる。
【００６５】
不適合の化学的又は酵素的開裂
Grompeら、Am. J. Hum. Genet. 48:212-222（1991）に記載されているように標的シーケンス間の相違も不適合塩基対の示差化学的開裂により検出することができる。他の方法において、Nelsonら、Nature Genetics 4:11-18（1993）に記載されているように標的シーケンス間の相違を不適合塩基対の酵素的開裂により検出することができる。簡単に述べると、動物又は冒されている種族メンバーからの遺伝的物質を使用して不適合なしのヘテロハイブリッドDNAジュプレックスを発生させる。なお、ここで、“ヘテロハイブリッド”とは、DNAジュプレックス・ストランド（二重鎖）を意味し、1つの動物からのDNAの1つのストランドと、他の動物からの第2のDNAストランドとからなり、この場合、動物は関心のある形質についての表現型において異なるものをいう。不適合の存在しないヘテロハイブリッドの積極的選択により、小さな挿入、削除又はHMGA多形性を関連すると思われる他の多形性についての判定が可能となる。
【００６６】
無ゲルシステム
他の可能な技法としては、無ゲルシステム、例えばTaqMan(商標)（Perkin Elmer）が含まれる。このシステムにおいて、オリゴヌクレオチドPCRプライマーは、問題の突然変異の側面に位置し、その領域のPCR増幅を可能にする。従って、第3のオリゴヌクレオチドプローブが、遺伝子の異なる対立遺伝子間で変化しやすい塩基を含む領域に対し交雑化するように設計される。このプローブは、５´および３´端部で蛍光染料で標識づけられる。これらの染料は、互いに近接する間においては、その一方の蛍光が他方の染料により消され、検出できないように設計される。このプローブとの関連で、テンプレート上の５´に位置するPCRプライマーからのTaqDNAポリメラーゼの延長は、TaqDNAポリメラーゼの５´ヌクレアーゼ活性を介して、このアニールド・プローブの５´端部に固定された染料の開裂につながる。これは上記消滅作用を取り除き、プローブの３´端部での染料からの蛍光の検出を可能にする。異なるDNA配列間の区別が以下の事実を介して生ずることになる。すなわち、もし、テンプレート分子に対するこのプローブの交雑化が完全でない場合、すなわち、或る型の不適合が存在する場合、染料の開裂は生じないことになる。従って、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列が、結合されるべきテンプレート分子に対し完全に相補的である場合にのみ、上記消滅が除かれる。反応混合物には２つの異なるプローブシーケンスが含まれ、そのそれぞれが、存在するかも知れない異なる対立遺伝子に対抗して設計され、従って、1つの反応において双方の対立遺伝子の検出が可能となる。
【００６７】
更に他の技法として、インベイダー・アッセイ（Invader Assay）が含まれ、これは等温増幅を含み、これは蛍光の触媒的放出に依存するものである（Third Wave Technologyについてはwww.twt.com.を参照のこと）。
【００６８】
非PCRベースDNA診断法
HMGA配列に結合されたDNA配列の識別は、増幅工程なしで、動物中および種族メンバー中の制限断片長多形性を含む多形性に基づいて行うことができる。交雑化プローブは一般にはオリゴヌクレオチドであり、これは相補塩基対を介して、標的核酸の全て又は一部に結合している。プローブは一般には、完全な相補性に欠く標的シーケンスをプローブシーケンスと結合させるものであって、これは交雑化条件の厳しさに依存する。これらプローブは好ましくは直接的又は間接的に標識づけされていて、このプローブの有無について検定を行うことにより、標的シーケンスの有無を検出できるようになっている。直接的標識付け方法には、32P又は35Sを有するラジオアイソトープ・ラベリングが含まれる。間接的標識付け方法には、蛍光タグ、バイオチン錯体（アビジン又はストレプトアビジンに結合される）、又はペプチド又はプロテイン・タグが含まれる。可視的検出法には、ホトルミネセント、テキサス・レッド、ローダミンおよびその誘導体、レッド・ロイコ染料、３，３´、５，５´-テトラメチルベンジジン（TMB）、フルオレセインおよびその誘導体、ダンシル（dansyl）、アンベリフェロンなど又は西洋ワサビ・ペルオキダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどが含まれる。
【００６９】
交雑化プローブは、HMGAコード化シーケンスの1つが存在するブタ染色体に対し交雑化可能な任意のヌクレオチド配列が含まれ、これによりHMGA遺伝子の1つに結合された遺伝標識が画成され、これには制限断片長多形性、高変異性領域、反復性エレメント、変数タンデムリピートなどが含まれる。交雑化プローブは任意の遺伝子又は適当な相似体であってもよい。更に、適当な交雑化プローブには、エクソン断片、cDNAsの部分、又は染色体の関連領域に対し位置づけることが知られている遺伝子であってもよい。
【００７０】
本発明で使用される好ましいタンデムリピート交雑化プローブの例は、非常に厳密な交雑化条件で、特定の座で小数の断片（フラグメント）を認識できるもの、あるいは厳密な条件が引き下げられた時において、その座で多数の断片を認識できるものである。
【００７１】
1又はそれ以上の追加の制限酵素および/又はプローブおよび/又はプライマーを使用することができる。追加の酵素、構築されたプローブおよびプライマーは、当業者に公知の常套手段で判定することができ、それらも本発明の範囲の範疇に包含されるべきものである。
【００７２】
ここに記載した方法は、単一の制限酵素および単一のセットのプライマーの使用についてのものであるが、その方法に限定されるものではない。所望により、1又はそれ以上の追加の制限酵素および/又はプローブおよび/又はプライマーを使用することができる。事実、或る場合には、特定の単模式種を与えるマーカーを複数組み合わせることが好ましい場合もある。追加の酵素、構築されたプローブおよびプライマーは、常套の実験で、或いは、ここに記載した教示と組み合わせて判定することができる。
【００７３】
本発明によれば、HMGAヌクレオチド配列の一方又は双方における多形性が、成長、肥満、肉質および飼育効率に関連するものとして識別される。マーカーの有無が、1具体例として、制限エンドヌクレアーゼを用いるPCR RFLPにより検定することができ、増幅プライマーは、多形性を囲む領域の高い相同関係のため、相似性のヒト、ブタ又はHMGA配列の他のものを用いて設計することができる。若しくは、増幅プライマーは、ジーンバンク（GenBank）に例示されているような公知のHMGA配列（例えばヒト）を用いて設計することもできる。更に、この増幅プライマーは、ここに記載された教示又は参照文献の基づいて近い周りの遺伝子からの結合データから得られる配列からさえも設計することができる。多形性を囲む配列は、別のPCRテストの開発を容易にするものであり、その場合、この多形性に隣接する配列から取り出された約4ないし30の連続的塩基のプライマーを、ポリメラーゼ鎖反応との関連で使用し、所望の制限酵素で処理する前にその領域を著しく増幅することができる。これらプライマーは正確な相補体でなくてもよく、実質的に均等の配列でも問題はない。PCRによる増幅のためのプライマーの設計は当業者に公知であり、例えば、Ausubel (ed.), “Short Protocols in Molecular Biology, Fourth Edition”、John Wiley and Sons 1999に開示されている。以下に、プライマーの設計について簡単に説明する。
【００７４】
プライマーの設計手法
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）の使用の増大は、PCRのため、プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計および選択に助けとなる多くのプログラムの発展に刺激を与えてきた。そのようなプログラムの４つの例がインターネットから入手可能である：すなわち、Whitehead InstituteのMark DalyおよびSteve LincolnによるPRIMER(UNIX, VMS, DOSおよびMacintosh); セントルイスのワシントン大学のPhil GreenおよびLaDeana Hillerによるオリゴヌクレオチド選択プログラム（OSP）(UNIX, VMS, DOSおよびMacintosh); YoshiによるPGEN(DOSのみ); ウイスコンシン大学のBill EngelsによるAmplify(Macintoshのみ)などである。一般に、これらのプログラムは、既知の繰り返しシーケンスエレメントのビットを検索し、ついで推定プライマーの長さおよびGCコンテンツを分析することによりTmを最適化することによりPCRプライマーを設計するのに役立つ。市販のソフトウエアも入手可能であり、プライマー選択手法を最も一般的なシーケンス分析パッケージに迅速に組み入れることができる。
【００７５】
シーケンシングおよびPCRプライマー
シーケンシング又はPCRプライマーとして使用するためオリゴヌクレオチドを設計するには、標的を特異的に認識する適当なシーケンスの選択、およびオリゴヌクレオチドが安定な二次構造を有する可能性を排除するための上記シーケンスのテストが必要である。シーケンスにおける反転繰返しは上述のようなリピート識別又はRNAフォールディングプログラムを用いて識別することができる（prediction of Nucleic Acid Structure参照）。もし、あり得るステム構造が観察された場合は、プライマーの配列を、予測された二次構造を最小にするいずれかの方向に数個のヌクレオチド分シフトさせる。オリゴヌクレオチドの配列も、適当なベクトルあんど挿入DNAの双方のストランドのシーケンスと比較させる。明らかに、シーケンシングプライマーは、標的DNAに対する単一の適合を有するだけでよい。更に、好ましくない標的DNAシーケンスを伴う単一の不適合のみを有するプライマーも除外することが望ましい。ゲノムDNAを増幅するのに使用されるPCRプライマーについて、そのプライマーのシーケンスをGenBankのデータベースのシーケンスと比較し、何らかの有意な適合が生じるか否かを判定する必要がある。もし、オリゴヌクレオチド配列が公知のDNAシーケンス中に、更に最も重要であるところの、公知の反復エレメント中に存在する場合は、そのプライマーシーケンスは変更しなければならない。
【００７６】
本発明の方法および物質は、より一般的に、動物DNA、個々の動物の遺伝子型を評価するのに、或いは動物中の遺伝的相違を検出するのに使用することができる。特に、動物のゲノムDNAのサンプルを1以上の対照と参照して評価し、HMGA配列の１つに多形性が存在するか否かを判定することができる。好ましくは、RFLP分析は動物のHMGAシーケンスに関して行い、その結果を対照と比較する。この対照は、動物HMGA遺伝子の多形性が既知であるところの異なる動物のHMGAシーケンスの一方又は双方のRFLP分析の結果を示すものである。同様に、動物のHMGA遺伝型を、そのゲノムDNAのサンプルを得て、DNAにおけるHMGA遺伝子のRFLP分析を行い、その結果を対照と比較することにより判定することができる。再び、この対照は、異なる動物のHMGAシーケンスの一方のRFLP分析の結果を示すものである。これらの結果は、HMGA遺伝子中の多形性を特定することにより、動物を遺伝子学的に分類するものである。最後に、動物間における遺伝的相違を、少なくとも2つの動物からのゲノムDNAのサンプルを得て、HMGAヌクレオチド配列の１つにおける多形性の有無を識別し、その結果を比較することにより検出することができる。
【００７７】
これらの検定法は上述のように、成長、肥満、肉質および飼育効率に関連する遺伝標識を特定するのに有用であると共に、他の特徴と相関すると思われるHMGA遺伝子における他の多形性を識別するのにも、更に動物の遺伝子型および表現型の一般的な科学的分析を行うのにも有用である。
【００７８】
ここで、これら実施例および方法は、或る種の遺伝子が多形性を有するものと識別され、この多形性が、それを持つ動物の成長、肥満、肉質および飼育効率に影響を与える有益な形質と積極的に又は消極的に関連することを示すものである。遺伝子内の多形性の存在の識別はしばしば、或る対立遺伝子型に制限サイトを生じさせる単一の塩基代替により行われる。しかし、或る種の対立遺伝子は、ここに説明し、実証したように、多くの塩基変化を有し、それに関連して、どれが同一の多形性（対立遺伝子）を示唆するのかを検定することができる。更に、他の遺伝標識又は遺伝子をここに開示した多形性と結合させ、他の遺伝子又は遺伝断片を識別する検定を行うことを可能にすることができる。しかし、これらは終局的には、同一の多形性について、動物を遺伝的に特徴化することに依存するものである。ここに開示した対立遺伝子の相違に基づいて動物を分類、識別するあらゆる検定法は本発明の範囲に包含されると解する。
【００７９】
多形性がいったん識別され、特定の形質との関連が確立されれば、この多形性についての遺伝子型動物を選択するための多くのテスト方法があることが当業者にとって理解されるであろう。そのような別のテストの設計は当業者に知られたパラメータの最適化を単に表すものに過ぎず、従って、それらもここに詳述した本発明の範囲内に包含されるべきものである。
【実施例】
【００８０】
HMGI（新しい命名法におけるHMGA；Bustin, 2001）遺伝子ファミリーは２つの遺伝子からなり、これらはクロマチン構造および転写の制御に関連する３つのたんぱく質（HMG-I, -Yおよび-C）をコード化する。このHMGI/Yたんぱくは、単一遺伝子の別途スプライスしたRNAの生産物であるが、異なる遺伝子がHMGICをコード化する。
【００８１】
HMGIY（HMGA1）遺伝子はヒトの染色体領域６p21に位置し（Friedmannら、1993）、細胞成長および分化のための遺伝子発現の調節に関与する（ReevesおよびBeckerbauer, 2001）。従って、HMGI/Yたんぱくの異常型又は過剰発現がガン形成の多くのタイプと強く関係している（Hess, 1998; TalliniおよびDal Cin, 1999; Reeves, 2000）。HMGI/Yたんぱくが、含脂肪細胞特異的遺伝子の発現において転写的役割を果すから、このHMGI/Yは含脂肪細胞の成長および分化に重要な役割を有するかもしれない（Melilloら、2001）。
【００８２】
ヒトHMGIC（HMGA2）遺伝子が物理的に染色体12q14-12に割り当てられた。この領域は染色体転位の部位であって、これはしばしば脂肪腫、成熟した脂肪細胞から主としてなる腫瘍の原因となる（Asherら、1995）。これらの知見はHMGIC遺伝子の切断区域を発現するトランスジェニックマウスにおいて確認された。これらトランスジェニックマウスは脂肪過多および脂肪腫の異常に高い有病率を発生させた（Arlottaら、2000）。その他、HMGIC遺伝子ノックアウトマウスは、成熟体重の減少を示し、これは主に脂肪組織に影響を与えていた（Zhouら、1995）。これらの結果は、HMGA遺伝子の変異がヒトの肥満の変異および動物の肥満と関係するかもしれないことを示唆するものである。
【００８３】
HMGA１：  PCR-RFLPテスト
プライマー：
前方（forward）(HMGY1) -  5'AGA AGG AGC CCA GCG AAG T 3' SEQ ID NO:1
逆（reverse）(HMYS2)   -  5'ACA GTG CTC ACC CAA TGG C 3' SEQ ID NO:2
位置：  双方ともエクソンにおいて。
【００８４】
PCR条件:
(Mix 1)
10XPCR緩衝液                  1.0μl
MgCl2 (25mM)                  0.6μl
dNTPs (2.5mM)                 0.5μl
HMGY1 (25pmol/μl)            0.1μl
HMYS (25pmol/μl)             0.1μl
Taqポリミラーゼ(5U/μl)       0.07μl
ddH2O                         7.63μl
ゲノムDNA                     1.0μl
【００８５】
Mix 1とDNAとをPCR反応チューブ内にて一緒にする。上層（overlay）を鉱物油と混合する。以下のPCRプログラムに従って実施する。すなわち、９４℃で3分；９４℃で30秒間を36サイクル行い、６３．８℃で1分、７２℃で１分30秒間、７２℃で10分間の最終延長。1.6％のアガロース・ゲルに対しPCR2μlでチェックし、ネガチィブ対照において増殖が成功したこと、および所望のクリーンな結果を確認する。
【００８６】
消化は以下の手法により行うことができる。
BanI消化反応：
PCR生産物                4.0μl
NE緩衝液４               1.0μl
BSA (10mg/ml)            0.1μl
BanI(20U/μl)            0.2μl
ddH2O                    4.7μl
NaeI消化反応：
PCR生産物                4.0μl
NE緩衝液４               1.0μl
BSA (10mg/ml)            0.1μl
NaeI(10U/μl)            0.4μl
ddH2O                    4.5μl
【００８７】
PCR生産物、 緩衝液、酵素および水からなるカクテルを作る。37℃で少なくとも4時間又は一晩、培養する。得られた消化液を充填染料と混合し（2：5）、3％NuSieveアガロース・ゲル上で消化させる。
【００８８】
HMGA2: Hha PCR-RFLPテスト
HMGIC-5のためのプライマー：  5'ACT GAA GAG ACA TCC TCA CA 3' SEQ ID NO:3
HMGIC-T1：  5'CTA AAC CTG GGA CTG TGA AG 3' SEQ ID NO:4
Mix 2のためのプライマー: 660bp
HMGIC-SF：  5'GAT AGG ACT AGA TAC AAC TTA C 3' SEQ ID NO:5
HMGIC-T2：  5'GGA TAT ATT GCA TCT CTG GC 3' SEQ ID NO:6 
Mix 1: 250 bp
【００８９】
PCR条件:
Mix 1:
10X Promega緩衝液             1.0μL
MgCl2 (25mM)                  0.6μL
dNTPs mix (それぞれ2.5mM)     0.5μL
HMGIC 5 (25pmol/μL)          0.1μL
HMGIC T1 (25pmol/μL)         0.1μL
dd滅菌H2O                     7.4μl
Taqポリミラーゼ(5U/μL)       0.07μL
ゲノムDNA (12.5ng/μL)        1.0μL
Mix 2:
10X Promega緩衝液             1.0μL
MgCl2 (25mM)                  0.6μL
dNTPs mix (それぞれ2.5mM)     0.5μL
HMGIC SF (25pmol/μL)         0.1μL
HMGIC T2 (25pmol/μL)         0.1μL
dd滅菌H2O                     7.4μl
Taqポリミラーゼ(5U/μL)       0.07μL
ゲノムDNA (12.5ng/μL)        1.0μL
【００９０】
１．以下のPCRプログラムに従って実施する：すなわち、９４℃で２分；９４℃で30秒間を３５サイクル行い、５６℃（Mix 1）および５２℃（Mix 2）で1分間、７２℃で1分30秒間、７２℃で10分間の最終延長。PCR増幅（アニール温度：５６℃）のためにHMGIC-5およびHMGIC-T2プライマーを使用したとき、PCR断片（1.2kb）は双方のHhaI多形性サイトを含んでいる。
２．1％のアガロース・ゲルに対しPCR3μLでチェックし、増殖の成功およびクリーンなネガチィブ対照を確認する。
３．HhaI消化反応：  DNAを収容した各反応チューブに対し５μLを添加する。37℃で少なくとも4時間ないし一晩、培養する。得られた消化反応液を充填染料と混合し、3％NuSieveアガロース・ゲル上に全量を装填する。
【００９１】
PCR生産物                     5.0μl
10X NE緩衝液４                1.0μL
BSA (10mg/mL)                 0.3μL
HhaI酵素(20 U/μL)            0.3μL
dd滅菌H2O                     3.6μl
Figure Two BanI認識サイトがアンダーラインおよび太字で示されている。その1つは位置54で単一のヌクレオチド多形性を含んでいる。
図１にはNae I多形性サイト（GCYGGC）がアンダーラインされているHMGA配列が示されている。
Y=C又はT
3つのHhaI認識（GCGC）サイトがアンダーラインで示され、その内の２つがグレイ（glay）で強調されていて、DNA多形性を含んでいる。
Box 1はMix 1の近似PCR断片である。
Box 2はMix 2の近似PCR断片である。
K=G又はT
Y=C又はT。
【００９２】
我々は、ポリメラーゼ鎖反応から増幅されたブタのHMGA1およびHMGA2の双方の断片を配列し、分析した。ブタのHMGA2遺伝子断片、スパニング・エクソン5および3'UTRの配列は、DNAレベルで、対応するヒト配列に対し約79％の同一性を示した。ブタのHMGA1遺伝子断片、スパニング・エクソン6および７の配列は、DNAレベルで、対応するヒト・エクソン配列に対し約93％の同一性を示した。
【００９３】
我々は、ブタのHMGA1およびHMGA2の双方において、幾つかの単一ヌクレオチド置換（SNPｓ）を識別した。HMGA1遺伝子中に識別された２つのSNPｓは、制限酵素認識サイト、BanIおよびNaeI内にそれぞれ位置しており、HMGA2遺伝子中に識別された他の２つのSNPｓは、HhaI認識サイトに位置していた。これらSNPｓについてのPCR RFLPテストが開発され、バークシャーｘヨークシャー３世代ファミリーの動物およびPIC市販個体群からのDNAサンプルについて試験した。QRLおよび関連する分析が上述のDNAサンプル中のPCR RFLPテストからの遺伝子型を用いて行われた。双方のHMGA遺伝子が、バークシャーおよびヨークシャー交配参照ファミリーにおいて、脂肪関連形質についてのQTL領域下に位置していた。HMGA1遺伝子についての対立遺伝子１  NaeI多形性の存在は、ブタの幾つかの市販の個体群からの動物における少ないバックファット（背脂肪）と可なり関係している。更に、HMGA2遺伝子型もこれら市販の個体群における脂肪および成長形質と関連している。参照ファミリーにおける双方の遺伝子の組合せ分析の結果、脂肪形質に対するこの２つの遺伝子の付加的作用が明瞭に示されていた。
【００９４】
これらの結果は、これらの多形性がブタ生産のための多くの経済的に重要な形質およびブタの品質と関係することを示している。更に、これら多形性の使用は、繁殖プログラムのための好ましい性能および表現型を有する動物の正確な選別に有用であることが示されている。
【００９５】
PIC個体群中のHMGA遺伝子の関連分析：
平均（s.e.）およびシグマPが、2000年8月１日に、肉質ファイル中の全ての動物動について計算された。
全ての結果は混合モデルからのもので、オス親はランダム効果として用い、屠殺日は固定した。
【００９６】
LS平均有意レベル：        αおよびδ有意性
レベル：
a − b  p<.3               a  p<.3
c − d  p<.1               b  p<.1
e − f  p<.05              c  p<.05
g − h  p<.01              d  p<.01
i − j  p<.005             e  p<.005
k − l  p<.001             f  p<.001
m − n  p<.0005            g  p<.0005
o − p  p<.0001            h  p<.0001
−B−      評価は偏寄されている。
Geno P:   モデル形質=オス親 + 屠殺日 + 遺伝子型における遺伝子型についてのｐ値
Expl. ％σe2  “遺伝子型”による誤差変動の減少
αおよびδ    モデル形質=オス親 + 屠殺日 +  ADD + DOMからのマーカーの付加的および優性作用
結果は形質値に与えられている。
【００９７】
2005535292.tif 000002
【００９８】
2005535292.tif 000003
【００９９】
2005535292.tif 000004
【０１００】
2005535292.tif 000005
【０１０１】
2005535292.tif 000006
【０１０２】
2005535292.tif 000007
【０１０３】
2005535292.tif 000008
【０１０４】
2005535292.tif 000009
【０１０５】
2005535292.tif 000010
【０１０６】
2005535292.tif 000011
【０１０７】
2005535292.tif 000012
【０１０８】
2005535292.tif 000013
【０１０９】
2005535292.tif 000014
【０１１０】
参照文献
Arlotta, P., Tai, A. K., Manfioletti, G., Clifford, C., Jay, G., Ono, S. J. 2000.  “高起動グループI-Cたんぱく質の切頭型を発現するトランジェニックマウスは脂肪過多および脂肪腫の以上に高い有病率を生じさせる”。J. Biol. Chem. 275, 14394-14400.
Ashar, H. R., Fejzo, M. S., Tkachenko, A., Zhou, C. C., Chada, K. 1995.  “構築因子HMGI-Cの崩壊：DNA結合ATホックミチーフは脂肪腫内に溶解し、転写調節ドメインを区別する”。Cell, 82：57-65.
Bustin, M., 2001.  “高起動グループ(HMG)クロモソームたんぱくのための訂正命名法”。Trends Biochem. Sci. 26, 152-153.
Friedmann, M., Holth, L. T., Zoghbi, H. Y., Reeves, R. 1993.  “ヒトHMGI(Y)ノンヒストンたんぱく遺伝子の組織、誘導性発現およびクロモソーム局在化”。Nucleic Acids Res. 21, 4259-4267.
Hess, J. L. 1998.  “良性腫瘍でのクロモソーム局在化”。Am. J. Clin. Path. 109, 251-261.
Melillo, R. M,, Pierantoni, G. M., Scala. S., Battista, S., Fedele, M., Stella, A., De Biasio, M. C., Chiappetta, G., Fidanza, V., Condorelli, G., Santoro, M., Croce, C. M., Viglietto, G., Fusco. A. 2001.  “含脂肪細胞成長および分化におけるHMGI(Y)たんぱくの重要な役割”。Mol. Cell. Biol. 21, 2485-2495.
Tallini, G. Dal Cin, P. 1999.  “HMGI(Y)およびHMGI-C調節不全：ヒト腫瘍における一般的発生”。Adv. Anat. Pathod. 6, 237-246.
Reeves, R. 2000.  “構築転写およびクロマチン構造のHMGI(Y)族の構造および機能”。Environ. Health Perspect. 108, 803-809.
Reeves, R., Beckerbauer, L. 2001.“HMGI/Yたんぱく：転写およびクロマチン構造のフレキシブル・レギュレータ”。Environ. Health Perspect. 108, 803-809.
Zhou, X., Benson, K. F., Ashar, H. R., Chada, K. 1995. “発生的に調節された因子HMGI-Cにおけるマウスピグミー表現型の原因となる突然変異”。Nature 376, 771-774.
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図1aおよび１bはHMGAＩについてのBan I(a)およびNae I(b) PCR-RFLPテストの結果を示す図。
【図２】HMGA２  HhaI   PCR-RFLPテストの結果を示す図。
【図３】ブタhmga1のコンセンサス配列を示す図であって、ここで、（SEQ ID NO:19）において、2つのBanI認識サイトがアンダーラインおよび太字で示されている。その1つは位置54で単一のヌクレオチド多形性を含む。Nae I多形性サイト（GCYGGC）がアンダーラインで示されている。Y=C又はT
【図４】ブタhmga2のコンセンサス配列を示す図であって、ここで、長さ：1168であり、3つのHhaI認識（GCGC）サイトがアンダーラインで示され、その内の２つがグレイ（glay）で強調されていて、DNA多形性を含んでいる。SEQ ID NO: 20; Box 1はMix 1の近似PCR断片；Box 2はMix 2の近似PCR断片であり；K=G又はT; Y=C又はT。
【図５】表に示すバークシャーおよびヨークシャー交配種におけるブタ染色体１の組換え頻度を示すグラフ図（recomb. Frac., Kosambi cM）。
【図６】バークシャーおよびヨークシャー交配種におけるブタ染色体７の遺伝地図を示すグラフ図（性平均地図（recomb. Frac., Kosambi cM））。
【図７】HMGA１の別のプライマー位置および領域の要約を示す図。
【図８】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図９】HMGA1-ブタDNA配列（Contig ２要約）長さ：1103bp. SEQ ID NOS: 25-29.
【０１１２】
【配列表】
2005535292.tif 000015
2005535292.tif 000016
2005535292.tif 000017
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月10日(2005.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
【図１】図1Ａおよび図１ＢはHMGAＩについてのBan I(a)およびNae I(b) PCR-RFLPテストの結果を示す写真である。
【図２】HMGA２  HhaI   PCR-RFLPテストの結果を示す写真である。
【図３】ブタhmga1のコンセンサス配列を示す図であって、ここで、（SEQ ID NO:19）において、2つのBanI認識サイトがアンダーラインおよび太字で示されている。その1つは位置54で単一のヌクレオチド多形性を含む。Nae I多形性サイト（GCYGGC）がアンダーラインで示されている。Y=C又はT
【図４】ブタhmga2のコンセンサス配列を示す図であって、ここで、長さ：1168であり、3つのHhaI認識（GCGC）サイトがアンダーラインで示され、その内の２つがグレイ（glay）で強調されていて、DNA多形性を含んでいる。SEQ ID NO: 20; Box 1はMix 1の近似PCR断片；Box 2はMix 2の近似PCR断片であり；K=G又はT; Y=C又はT。
【図５】表に示すバークシャーおよびヨークシャー交配種におけるブタ染色体１の組換え頻度を示すグラフ図（recomb. Frac., Kosambi cM）である。
【図６】バークシャーおよびヨークシャー交配種におけるブタ染色体７の遺伝地図を示すグラフ図（性平均地図（recomb. Frac., Kosambi cM））である。
【図７】HMGA１の別のプライマー位置および領域の要約を示す図である。
【図８Ａ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図８Ｂ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図８Ｃ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図８Ｄ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図８Ｅ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図８Ｆ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図８Ｇ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図８Ｈ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig 1要約）長さ：2484bp. SEQ ID NOS: 21-24.
【図９Ａ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig ２要約）長さ：1103bp. SEQ ID NOS: 25-29.
【図９Ｂ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig ２要約）長さ：1103bp. SEQ ID NOS: 25-29.
【図９Ｃ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig ２要約）長さ：1103bp. SEQ ID NOS: 25-29.
【図９Ｄ】HMGA1-ブタDNA配列（Contig ２要約）長さ：1103bp. SEQ ID NOS: 25-29.
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2005535292.tif 000034
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2005535292.tif 000035
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2005535292.tif 000036
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2005535292.tif 000037
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2005535292.tif 000038
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ａ】
2005535292.tif 000039
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｂ】
2005535292.tif 000040
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｃ】
2005535292.tif 000041
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｄ】
2005535292.tif 000042
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｅ】
2005535292.tif 000043
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｆ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｆ】
2005535292.tif 000044
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｇ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｇ】
2005535292.tif 000045
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｈ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｈ】
2005535292.tif 000046
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ａ】
2005535292.tif 000047
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図  ９Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ｂ】
2005535292.tif 000048
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ｃ】
2005535292.tif 000049
【手続補正１８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ｄ】
2005535292.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月10日(2005.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2005535292.tif 000051
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2005535292.tif 000052
【国際調査報告】
2005535292.tif 000053
2005535292.tif 000054
2005535292.tif 000055
2005535292.tif 000056