(57)【要約】本発明は、ヘパリン結合性（ＨＢ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）阻害剤の少なくとも１種、又は、ＨＢ−ＥＧＦ受容体若しくはＥｒｂＢ受容体の阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種の、ＩＬ−６依存性形質細胞腫細胞のアポトーシスの誘導及び／又はこの細胞の増殖阻害に有用な薬剤を調製するための使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン結合性（ＨＢ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）阻害剤の少なくとも１種、又は、ＨＢ−ＥＧＦ受容体若しくはＥｒｂＢ受容体の阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種の、ＩＬ−６依存性形質細胞腫細胞のアポトーシスの誘導及び／又はこの細胞の増殖阻害に有用な薬剤を調製するための使用。
【請求項２】
ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の阻害剤の少なくとも１種、又は、ＨＢ−ＥＧＦ受容体若しくはＥｒｂＢ受容体の阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種と、ＩＬ−６阻害剤の少なくとも１種、又は、ＩＬ−６受容体阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種との、ＩＬ−６依存性形質細胞腫細胞のアポトーシスの誘導及び／又はこの細胞の増殖阻害に有用な薬剤を調製するための併用。
【請求項３】
前記ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の阻害剤は、ヘパリン、特に低分子量ヘパリン、ジフテリア毒素及び抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体から選択される
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＨＢ−ＥＧＦ受容体の阻害剤は、ＥｒｂＢ又はこれ以外のＨＢ−ＥＧＦ受容体に特異的なモノクローナル抗体、及び、関連する変換経路の阻害剤から選択される
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
前記ＩＬ−６阻害剤は、コルチコイド、ＩＬ−６生産の阻害剤、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体及び拮抗する変異型ＩＬ−６から選択される
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ＩＬ−６受容体阻害剤は、ｇｐ８０鎖又はｇｐ１３０鎖に特異的であるか、又は、関連する変換経路の阻害剤である
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
有効成分としてヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）阻害剤の少なくとも１種、又は、ＥｒｂＢ受容体の阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む
ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
有効成分としてヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）阻害剤の少なくとも１種、又は、その受容体の阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種を、ＩＬ−６阻害剤の少なくとも１種又はＩＬ−６受容体阻害剤の少なくとも１種又はその受容体の阻害剤の少なくとも１種又は関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種と組み合わせて含み、前記阻害剤は、薬学的に許容される担体と共に又は別々にパッケージされている
ことを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多発性骨髄腫の治療に関する。より詳しくは、本発明は、ヘパリン結合性（ＨＢ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）阻害剤の少なくとも１種、又は、ＨＢ−ＥＧＦ受容体若しくはＥｒｂＢ受容体の阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種の、ＩＬ−６依存性形質細胞腫細胞のアポトーシスの誘導及び／又はこの細胞の増殖阻害に有用な薬剤を調製するための使用に関する。
【０００２】
また、本発明は、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の阻害剤の少なくとも１種、又は、ＨＢ−ＥＧＦ受容体若しくはＥｒｂＢ受容体の阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種と、ＩＬ−６阻害剤の少なくとも１種、又は、ＩＬ−６受容体阻害剤の少なくとも１種、又は、関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種との、ＩＬ−６依存性形質細胞腫細胞のアポトーシスの誘導及び／又はこの細胞の増殖阻害に有用な薬剤を調製するための併用に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びＩＬ−６ファミリーのその他のサイトカインは、多発性骨髄腫に関与する形質細胞悪性細胞の重要な増殖因子である（非特許文献１、２）。
【０００４】
また、ＩＬ−６は主として骨髄周辺の細胞によって生産されるということ（非特許文献２、３）、及び、この細胞によるＩＬ−６の生産は多発性骨髄腫との相互作用の後に誘導されるということ（非特許文献４、５）も公知である。
【０００５】
現在、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）をコードする遺伝子が骨髄腫細胞中に過剰に発現しているということ、及び、骨髄腫細胞系のＩＬ−６誘導性増殖はＣＤ９／ＨＢ−ＥＧＦ／ＥｒｂＢ１の自己分泌ループの存在に関連しているということが分かっている。
【０００６】
ＨＢ−ＥＧＦは、可溶な形態又は膜貫通タンパク質の形態で生産される因子である（非特許文献６、７）。上記膜性の形態のものはジフテリア毒素受容体である。また、ＨＢ−ＥＧＦは、上皮増殖因子受容体（ＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４）のリガンドである（非特許文献６、７）。これは、様々な腫瘍細胞によって生産され、自己分泌腫瘍増殖因子として作用する（非特許文献６、７）。
【非特許文献１】
Ｋａｗａｎｏ  Ｍ．，Ｈｉｒａｎｏ  Ｔ．，Ｍａｔｓｕｄａ  Ｔ．，Ｔａｇａ  Ｔ．，Ｈｏｒｉｉ  Ｙ．，Ｉｗａｔｏ  Ｋ．，Ａｓａｏｋａ  Ｈ．，Ｔａｎｇ  Ｂ．，Ｔａｎａｂｅ  Ｏ．，Ｔａｎａｋａ  Ｈ．，Ｋｕｒａｍｏｔｏ  Ａ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ．「ヒト多発性骨髄腫のためのＢＳＦ−２／ＩＬ−６の自己分泌産生及び必須要求（“Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｅｑｕｉｍｅｎｔ  ｏｆ  ＢＳＦ−２／ＩＬ−６  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．）”」Ｎａｔｕｒｅ  １９８８，３３２，８３−８５
【非特許文献２】
Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．，Ｚｈａｎｇ  Ｘ．Ｇ．，Ｊｏｕｒｄａｎ  Ｍ．，Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｊ．，Ｈｏｕｓｓｉａｕ  Ｆ．，Ａａｒｄｅｎ  Ｌ．，Ｐｉｅｃｈａｃｚｙｋ  Ｍ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ  Ｒ．「骨髄腫細胞の増殖及び分化に対するインターロイキン−６の、非自己分泌性でパラ分泌性の調節（“Ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｍａ−ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６．”）」Ｂｌｏｏｄ  １９８９，７３，５１７−５２６
【非特許文献３】
Ｐｏｒｔｉｅｒ  Ｍ．，Ｒａｊｚｂａｕｍ  Ｇ．，Ｚｈａｎｇ  Ｘ．Ｇ．，Ａｔｔａｌ  Ｍ．，Ｒｕｓａｌｅｎ  Ｃ．，Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ．，Ｍａｎｎｏｎｉ  Ｐ．，Ｍａｒａｎｉｎｃｈｉ  Ｄ．，Ｐｉｅｃｈａｃｚｙｋ  Ｍ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ  Ｒ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．「多発性骨髄腫における腫瘍性環境中でのインターロイキン−６遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ発現（“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．”）」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，２１，１７５９−１７６２
【非特許文献４】
Ｃｈａｕｈａｎ  Ｄ．，Ｕｃｈｉｙａｍａ  Ｈ．，Ａｋｂａｒａｌｉ  Ｙ．，Ｕｒａｓｈｉｍａ  Ｍ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ．，Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  Ｔ．Ａ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋ．Ｃ．「多発性骨髄腫細胞の付着に誘導される、骨髄間質細胞におけるインターロイキン−６の発現は、ＮＦ−κｂの活性化に関与している（“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａ  ｂ．”）」Ｂｌｏｏｄ  １９９６，８７，１１０４−１１１２
【非特許文献５】
Ｌｏｋｈｏｒｓｔ  Ｈ．Ｍ．，Ｌａｍｍｅ  Ｔ．，ｄｅ  Ｓｍｅｔ  Ｍ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｓ．，ｄｅ  Ｗｅｇｅｒ  Ｒ．Ａ．，ｖａｎ  Ｏｅｒｓ  Ｒ．，Ｂｌｏｅｍ  Ａ．Ｃ．「骨髄腫患者の初代培養腫瘍細胞は、骨髄を長期培養するとインターロイキン−６の分泌を誘導する。（“Ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．”）」Ｂｌｏｏｄ  １９９４，８４，２２６９−２２７７
【非特許文献６】
Ｄａｖｉｓ−Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ  Ｋ．Ｍ．，Ｂｅｓｎｅｒ  Ｇ．Ｅ．「ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）の構造と機能（“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＢ−ＥＧＦ）．”）」Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．１９９８，３，ｄ２８８−２９９
【非特許文献７】
Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｒ．，Ｍｅｋａｄａ  Ｅ．「ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子：ジャクスタクリン増殖因子（“Ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ａ  ｊｕｘｔａｃｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．”）」Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２０００，１１，３３５−３４４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的に適したＨＢ−ＥＧＦ阻害剤は、例えば後述の実施例で定義する条件下で、形質細胞腫細胞の増殖を阻害できる物質又はこの細胞のアポトーシスを誘導できる物質であればよい。
【０００８】
ＨＢ−ＥＧＦを阻害できる物質の具体的に挙げられる例としては、ヘパリン、特に低分子量ヘパリン、ジフテリア毒素及び抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体、特に後述の実施例で記載するもの等の抗ＨＢ−ＥＧＦモノクローナル抗体、がある。
【０００９】
本発明の目的に適したＨＢ−ＥＧＦ受容体阻害剤は、例えば後述の実施例で定義する条件下で、形質細胞腫細胞の増殖を阻害できる物質又はこの細胞のアポトーシスを誘導できる物質であればよい。
【００１０】
適切なＥｒｂＢ受容体阻害剤の例としては、特に抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体、例えばＵＢＩ社（レイクプラシッド、ニューヨーク州、アメリカ）より市販されているモノクローナル抗体ＬＡ−１が挙げられる。
【００１１】
本発明の目的に使用できるＩＬ−６阻害剤の例としては、コルチコイド、変異型ＩＬ−６又はこれ以外のＩＬ−６阻害剤、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体、特にｇｐ８０鎖又はｇｐ１３０鎖に特異的な抗ＩＬ−６モノクローナル抗体等、例えばダイアクロン社（ブザンソン）製モノクローナル抗体Ｂ−Ｅ８、並びに、フランス国立医学研究所（ＩＮＳＥＲＭ）及びダイアクロン社が所有しているダイアクロン社製の抗ＩＬ−６ｇｐ１３０トランスデューサー抗体であるモノクローナル抗体Ｂ−Ｒ３等のＩＬ−６受容体阻害剤が挙げられる。
【００１２】
本発明において用いられる上記各阻害剤の有効量は、実験データから推測される量と薬理学的に等価としなければならない。
【００１３】
言うまでもなく、上記有効量は、骨髄腫の進行状態、並びに、患者の年齢、生物学的特性及び病態、並びに、患者又はその病態に左右される上記以外の薬理学的パラメーターによって決まる。上記以外の薬理学的パラメーターとは、例えば、Ｌｕらに記載されている方法（Ｌｕ  Ｚ．Ｙ．，Ｂｒａｉｌｌｙ  Ｈ．，Ｗｉｄｊｅｎｅｓ  Ｊ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ  Ｒ．，Ｒｏｓｓｉ  Ｊ．Ｆ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．「身体における全インターロイキン−６（ＩＬ−６）産生の測定：対ＩＬ−６治療効力の予想（“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＩＬ−６  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．”）」Ｂｌｏｏｄ  １９９５，８６，３１２３−３１３１）で算出される１日当たりのＩＬ−６生産量、増殖特性、ＣＲＰ／ＩＬ−６のレベル、モノクローナルタンパク質のイソタイプ、骨髄腫の予後因子、及び、生体機能、特にクレアチニンクリアランスや肝機能等、である。
【００１４】
上記有効量は、Ｌｕらに記載されている方法（Ｌｕ  Ｚ．Ｙ．，Ｂｒａｉｌｌｙ  Ｈ．，Ｗｉｄｊｅｎｅｓ  Ｊ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ  Ｒ．，Ｒｏｓｓｉ  Ｊ．Ｆ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．「身体における全インターロイキン−６（ＩＬ−６）産生の測定：対ＩＬ−６治療効力の予想（“Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＩＬ−６  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．”）」Ｂｌｏｏｄ  １９９５，８６，３１２３−３１３１）で決定できる。
【００１５】
一般的に、ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤又はＨＢ−ＥＧＦ受容体阻害剤の投与量は、血漿１ｍＬ当たり１０〜１０００μｇであってよい。
【００１６】
ＩＬ−６阻害剤又はＩＬ−６受容体阻害剤の投与量は、血漿１ｍＬ当たり１０〜１０００μｇであってよい。
【００１７】
別の特徴によると、本発明は、有効成分として有効量のＨＢ−ＥＧＦ阻害剤の少なくとも１種又はＨＢ−ＥＧＦ受容体阻害剤の少なくとも１種を、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む、抗骨髄腫作用（骨髄腫増殖阻害作用）を有する医薬組成物に関する。
【００１８】
ある好ましい変形形態において、本発明の医薬組成物は、有効成分として有効量のＨＢ−ＥＧＦ阻害剤の少なくとも１種、又は、ＨＢ−ＥＧＦのＥｒｂＢ受容体の阻害剤、具体的にはＥｒｂＢ１受容体若しくはＥｒｂＢ４受容体の阻害剤の少なくとも１種、又は、変換経路の阻害剤の少なくとも１種を、有効量のＩＬ−６阻害剤の少なくとも１種又はＩＬ−６受容体阻害剤の少なくとも１種又はＩＬ−６誘導性変換経路の阻害剤の少なくとも１種と組み合わせて含む。上記阻害剤は、薬学的に許容される担体と共に又は別々にパッケージされている。
【００１９】
従来の薬学的に許容される担体、例えばモノクローナル抗体の安定剤又はヒトアルブミンを含む溶液、であればいずれも使用できるが、非経口投与に適した薬学的に許容される担体を使用することが好ましい。
【００２０】
更に本発明は、有効量のＨＢ−ＥＧＦ阻害剤の少なくとも１種又はＨＢ−ＥＧＦ受容体阻害剤の少なくとも１種又は関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種を、有効量のＩＬ−６阻害剤の少なくとも１種又はＩＬ−６受容体の少なくとも１種又は関連する変換経路の阻害剤の少なくとも１種と任意に組み合わせて、骨髄腫患者に投与する骨髄腫の治療方法に関する。ここで、上記阻害剤の投与は、同時に又は逐次的に行われ、かつ、薬理学的パラメーターから又は臨床データから推測されるデータに従って決定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ここで、本発明は、骨髄腫の場合において、形質細胞悪性細胞の増殖を阻害できること、又は、この細胞のアポトーシスを引き起こすことができることを証明する、実施した試験により詳しく記載される。
【００２２】
下記に報告する試験は、モンペリエ教育病院の細胞治療学科（ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ  Ｔｅａｃｈｉｎｇ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）及びフランス国立医学研究所Ｕ４７５学科（ＩＮＳＥＲＭ  Ｕｎｉｔ  Ｕ４７５）において得られた、文献（Ｚｈａｎｇ  Ｘ．Ｇ．，Ｇａｉｌｌａｒｄ  Ｊ．Ｐ．，Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ  Ｎ．，Ｌｕ  Ｚ．Ｙ．，Ｇｕ  Ｚ．Ｊ．，Ｊｏｕｒｄａｎ  Ｍ．，Ｂｏｉｒｏｎ  Ｊ．Ｍ．，Ｂａｔａｉｌｌｅ  Ｒ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．「ヒト多発性骨髄腫における腫瘍幹細胞の研究モデルとしてのヒト骨髄腫細胞系の再現性ある取得（“Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ．”）」Ｂｌｏｏｄ  １９９４，８３，３６５４−３６６３：Ｒｅｂｏｕｉｓｓｏｕ  Ｃ．，Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ．，Ａｕｔｉｓｓｉｅｒ  Ｐ．，Ｔａｒｔｅ  Ｋ．，Ｃｏｓｔｅｓ  Ｖ．，Ｌｉａｕｔａｒｄ  Ｊ．，Ｒｏｓｓｉ  Ｊ．Ｆ．，Ｂｒｏｃｈｉｅｒ  Ｊ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．「インターロイキン−６トランスデューサーｇｐ１３０依存性の、ヒト多発性骨髄腫のＳＣＩＤモデル（“Ａ  ｇｐ１３０  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＳＣＩＤ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ．”）」Ｂｌｏｏｄ  １９９８，９１，４７２７−４７３７：Ｇｕ  Ｚ．Ｊ．，Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ．，Ｚｈａｎｇ  Ｘ．Ｇ．，Ｈａｌｌｅｔ  Ｍ．Ｍ．，Ｃｌｅｍｅｎｔ  Ｃ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．「毛様体神経栄養因子、インターロイキン−６、インターロイキン−１１、白血病阻害因子又はオンコスタチンＭを特異的に阻害する抗ｇｐ１３０トランスデューサーモノクローナル抗体（“Ａｎｔｉ−ｇｐ１３０  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１，ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｒ  ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ．”）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９６，１９０，２１−２７）に記載されているヒト骨髄腫細胞系（ＨＭＣＬ）ＸＧ−１、ＸＧ−６、ＸＧ−１３及びＸＧ−１４を用いて行った。
【００２３】
上記ＸＧ−１、ＸＧ−６、ＸＧ−１３及びＸＧ−１４の４種の骨髄腫細胞系の増殖は、外因性ＩＬ−６の添加に完全に依存していることが知られている。ＩＬ−６が回収されると、上記細胞は３〜４日で進行性のアポトーシスを受ける。上記ＨＭＣＬを、Ｘ−ＶＩＶＯ２０無血清培地（バイオウィタッカー社（Ｂｉｏｗｉｔｔａｋｅｒ）、メリーランド州、アメリカ）に５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６を加えた中で維持した。
【００２４】
以下を上記試験で用いた。
−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社（ミネアポリス、ミネソタ州、アメリカ）より市販されているＥＧＦ及び組み換えＥＧＦ
−シグマ社（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）より市販されている変異型ジフテリア毒素
−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社より市販されている抗ＨＢ−ＥＧＦ中和抗体
−ＵＢＩ社（レイクプラシッド、ニューヨーク州、アメリカ）製で、ＥＵＲＯＭＥＤＥＸ社（Ｓｏｕｆｆｅｌｗｅｙｅｒｓｈｅｉｍ、フランス）より市販されている抗ＥｒｂＢ１受容体モノクローナル中和抗体（ｍＡｂ）ＬＡ−１
−ＴＥＢＵ社（Ｌｅ  Ｐｅｒｒａｙ、イブリーヌ、フランス）より市販されている精製ヤギ免疫グロブリン
−Ｗｉｊｄｅｎｅｓら（Ｗｉｊｄｅｎｅｓ  Ｊ．，Ｃｌｅｍｅｎｔ  Ｃ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．，Ｍｏｒｅｌ−Ｆｏｕｒｒｉｅｒ  Ｂ．，ＶＩｔａ  Ｎ．，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｐ．，Ｐｅｔｅｒｓ  Ａ．「抗ＩＬ−６モノクローナル抗体によって検出すると、ヒト組み換えＩＬ−６二量体はその受容体に結合する。（“Ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ＩＬ−６  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＩＬ−６  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”）」Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，２８，１１８３）に記載されている抗ＩＬ−６ｇｐ１３０トランスデューサーモノクローナル中和抗体Ｂ−Ｒ３
【００２５】
上記試験で用いた方法を以下に詳しく述べる。
【００２６】
＜骨髄腫細胞における細胞間シグナル遺伝子の発現＞
細胞間シグナルタンパク質をコードする２６８個の遺伝子の発現を、骨髄腫細胞系（ＨＭＣＬ）、及び、エプスタイン・バーウイルス（ＬＣＬ）に感染したリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）について、クロンテック社（バーゼル、スイス）の方法に従いＡＴＬＡＳ  ＤＮＡ膜を用いて評価した。
【００２７】
ポリ（Ａ＋）ＲＮＡを各細胞から抽出し、これを用いて放射性元素（３２Ｐ）標識ｃＤＮＡを合成した。
【００２８】
その後、この放射標識ｃＤＮＡを同一のＤＮＡチップ２個とクロンテック社推奨の方法に従ってハイブリダイズさせ、放射能をフォスフォイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｉｍａｇｅｒ）（アマシャム社、サクレー、フランス）で測定した。
【００２９】
＜フローサイトメトリーによる解析＞
骨髄腫細胞５×１０５個を、ヒトＥＧＦ受容体特異的（抗ＥＧＦ−Ｒ）マウスモノクローナル抗体０．５μｇ、又は、ヒトの抗原を認識しないマウスモノクローナル抗体（イムノテック社（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、マルセイユ、フランス）と共に、ＡＢ型血清３０％を含むリン酸バッファー（ＰＢＳ）中で４℃において３０分間培養して、ＥｒｂＢ１の発現を評価した。その後細胞を洗浄し、ポリエチレングリコール（ＰＥ）標識抗マウス・ヤギモノクローナル抗体と共に、ＡＢ型血清３０％を含むＰＢＳ中で４℃において３０分間培養した。
【００３０】
骨髄腫細胞５×１０５個を、抗ヒトＨＢ−ＥＧＦヤギ抗体０．５μｇで、又は、免疫グロブリン（Ｉｇ）を１００μｇ／ｍＬ含む１％ヤギ血清のＰＢＳ溶液で、４℃において３０分間かけて標識し、膜性ＨＢ−ＥＧＦを検出した。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヤギ・ブタ免疫グロブリンと共に、１００μｇ／ｍＬを含むＰＢＳ中で４℃において３０分間培養した。標識細胞の割合及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社、アメリカ）又は別種のフローサイトメーターで測定した。
【００３１】
＜細胞増殖試験＞
細胞を、９６ウェル平底マイクロタイタープレート中において、１０４細胞／ウェルの割合でＸ−ＶＩＶＯ２０無血清培地中で５日間培養した。異なる濃度のサイトカイン、増殖因子又はサイトカイン／増殖因子阻害剤を、それぞれ培養ウェル６個ずつに、培養の開始時に加えた。培養終了時に、細胞をトリチウム標識チミジン（アマシャム社、オルセー、フランス）で１２時間かけて標識し、回収した後、Ｄｅ  Ｖｏｓら（ＤｅＶｏｓ  Ｊ．，Ｊｏｕｒｄａｎ  Ｍ．，Ｔａｒｔｅ  Ｋ．，Ｊａｓｍｉｎ  Ｃ．，Ｋｌｅｉｎ  Ｂ．「ＪＡＫ２チロシンキナーゼ阻害剤チロホスチンＡＧ４９０は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）及びＳＴＡＴの経路を下方制御し、骨髄腫細胞におけるアポトーシスを誘導する。（“ＪＡＫ２  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ  ＡＧ４９０  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＳＴＡＴ）  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．”）」Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００，１０９，８２３−８２８）に記載されている方法で計数した。
【００３２】
＜骨髄腫細胞の長期的な増殖＞
骨髄腫細胞の長期的な増殖に対するＥＧＦ又はＩＬ−６の効果を調べるために、この細胞を培地で１回洗浄し、３７℃においてＸ−ＶＩＶＯ２０培地中で５時間培養し、更に２回洗浄した。
【００３３】
その後上記細胞を、細胞濃度１０５個／ｍＬで、ＨＢ−ＥＧＦ（５０μｇ／ｍＬ）又はＩＬ−６（５００ｐｇ／ｍＬ）と共に、抗ｇｐ１３０モノクローナル中和抗体Ｂ−Ｒ３（ＩＮＳＥＲＭ／ダイアクロン社）１０μｇ／ｍＬを共存させて若しくは共存させずに、又は、抗ＥｒｂＢ１モノクローナル中和抗体（ＬＡ−１）１０μｇ／ｍＬを共存させて若しくは共存させずに培養した。
【００３４】
＜アポトーシスを起こした細胞の検出＞
骨髄腫細胞を、平底マイクロプレート中において、３×１０５細胞／ウェルの割合でＸ−ＶＩＶＯ２０培地中で、異なる量のＩＬ−６／ＨＢ−ＥＧＦ又はＩＬ−６／ＨＢ−ＥＧＦ阻害剤と共に３〜４日間培養した。
【００３５】
培養終了時に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣの溶液（ＨＥＰＥＳバッファーで１／５０倍に希釈：１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、ＮａＣｌ１４０ｍＭ及びＣａＣｌ２５ｍＭ）中に懸濁した。
【００３６】
上記を２０分間室温で培養し、ＨＥＰＥＳバッファーで２回洗浄した。蛍光をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで解析した。
【００３７】
全量２μｇのＲＮＡを使用して、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用い、かつ、プライマーとして
オリゴｄ（Ｔ）１２−１Ｒ（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用いて、ｃＤＮＡを製造した。ＰＣＲに供する試料は２５μＬ中にそれぞれ、ｃＤＮＡリーディング鎖１μＬ、各プライマー（センス及びアンチセンス）１μＭずつ、各ｄＮＴＰ０．２ｍＭずつ、
ＭｇＣｌ２１．５ｍＭ、ポリメラーゼ用バッファー１種、Ｔａｑポリメラーゼ（ライフテクノロジー社）２Ｕ及びα−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク社）１μＣｉを含むものであった。下記のプライマーを用いた。
−Ｔｙｒｏ３  ５’−ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＴＧＡ  ＣＴＡ  ＡＧＣ  ＣＣＣ（センス）及び
−５’−ＡＡＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＡＣＴ  ＴＡＡ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＧＧ（アンチセンス）；
−ＨＢ−ＥＧＦ  ５’−ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＧＧ（センス）及び
−５’−ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＡＧＴ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＣＡＡ（アンチセンス）；
−ＦＲＺＢ  ５’−ＡＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＴＣＧ  ＡＡ（センス）及び
−５’−ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＣ（アンチセンス）；
−β２−ミクログロブリン（β２−Ｍ）  ５’−ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＴＣ（センス）及び５’−ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＴＡＣ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＣＧ（アンチセンス）
【００３８】
ＰＣＲ産物のサイズは、以下の通りであった。Ｔｙｒｏ３＝３４４ｐｄｂ、ＨＢ−ＥＧＦ＝６０５ｐｄｂ、ＦＲＺＢ（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連受容体Ｂ）＝５９９ｐｄｂ、β２−Ｍ＝２６９ｐｄｂ。増幅の条件は、９４℃で１分間、５９℃（Ｔｙｒｏ３）又は６２℃（ＨＢ−ＥＧＦ）又は６０℃（ＦＲＺＢ又はβ２−Ｍ）で４５秒間、及び、７２℃で１分間とし、この操作の後７２℃において１０分間最終の伸張反応を行った。サイクル数は、Ｔｙｒｏ３について２６サイクル、ＨＢ−ＥＧＦについて３２サイクル、ＦＲＺＢ又はβ２−Ｍについて２５サイクルとした。反応産物を４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、乾燥後Ｘ線フィルムに露光した。
【実施例１】
【００３９】
＜骨髄腫細胞の生存及び増殖に対する自己分泌ＨＢ−ＥＧＦの重要な作用＞
ＨＢ−ＥＧＦは、その発現が多発性骨髄腫（ＭＭ）の病理生物学に関連している可能性のある遺伝子である。ＤＮＡチップを用いることにより、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子は骨髄腫細胞系３種（ＸＧ−１、ＸＧ−７及びＸＧ−１４のＨＭＣＬ）で顕著に過剰発現しているが、
ＬＣＬでは４例中いずれでも過剰発現していないということが分かった。また、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子の発現を、細胞系及び初代培養細胞においてＲＴ−ＰＣＲ法で調べた。ＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡは、ＨＭＣＬ６例中３例で検出されたが、ＬＣＬでは４例中いずれでも検出されなかった。このことは、ＤＮＡチップを用いて得られた結果を追認するものである。興味深いことに、ＨＢ−ＥＧＦのｍＲＮＡは、ＰＣＬでは４例中４例の精製悪性形質細胞においてＲＴ−ＰＣＲ法で増幅されなかったのに対し、ＭＭに罹患している２人の患者由来の精製骨髄細胞では強く発現していることが分かった。正常な形質細胞においては、４試料中１試料で弱く発現していることが知られていた。ＥｒｂＢ１遺伝子は、ＥｒｂＢ４遺伝子とは対照的に、ＭＭ細胞で及びＬＣＬで強く発現しており、このことは、ＨＢ−ＥＧＦは腫瘍細胞のＥｒｂＢ１受容体に結合することによりこの細胞の自己分泌増殖因子となっているかもしれないということを示唆する。そのため、ＨＢ−ＥＧＦ活性を遮断することによって、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を強く発現しているＭＭ細胞系ＸＧ−１の増殖を調節できるかどうかを調べた。図１Ａで強調されているように、ＨＢ−ＥＧＦに特異的な中和抗体を添加すると、ＸＧ−１の増殖が添加量に依存して阻害された。抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体５０μｇ／ｍＬにより、上記の阻害は８０％にまで上がった。この阻害効果が過剰量の組み換えＨＢ−ＥＧＦを添加することにより覆されたことから、上記の抗体遮断効果は特異的であることが分かる（図１Ｂ）。これに対し、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体はＥＢＶ−１  ＬＣＬの増殖に対して効果がなかった（図１Ｃ）。
【００４０】
上記の観察から、ＨＢ−ＥＧＦがＩＬ−６の生存及びＸＧ−１骨髄腫細胞の増殖に関連する新規の増殖因子であることが明らかに示される。
【００４１】
膜性ＨＢ−ＥＧＦもまた、上記培養した細胞を抗ＨＢ−ＥＧＦヤギ抗体又はコントロールヤギ血清と共に培養した後、ＦＩＴＣ標識抗ヤギＩｇブタ抗体と共に培養することにより、骨髄腫細胞において同定された。蛍光をＦＡＣＳｃａｎ細胞蛍光光度計で測定した。２回の実験を代表する１回分の実験の結果を示す。
【００４２】
得られた結果を図２に示すが、図中、蛍光強度は横座標に示し、計数した細胞数は縦座標に示した。
【００４３】
上記の結果は、膜性ＨＢ−ＥＧＦが上記細胞の表面に存在することを示している。下記表１中のデータに示すように、ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子をより強く発現しているＸＧ−１及びＸＧ−１４細胞で標識がより濃かったことが、「サイトカイン／受容体」ＤＮＡチップ技術又はＲＴ−ＰＣＲ法によって分かった。
【００４４】
【表１】
2005504038.tif 000002
【実施例２】
【００４５】
＜変異型ジフテリア毒素によるＩＬ−６誘導性骨髄腫細胞増殖の阻害＞
骨髄腫細胞（１０４細胞／ウェル）を、ＩＬ−６を５００ｐｇ／ｍＬ含み、かつ、変異型ジフテリア毒素（ｍＤＴ）を濃度を徐々に増やして含むＸ−ＶＩＶＯ２０無血清培地中で５日間培養した。１つの培養群においては、１μｇ／ｍＬの組み換えＨＢ−ＥＧＦを、培養の開始時に、１００μｇ／ｍＬのｍＤＴ及び５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６と共に添加した。培養ウェル６個について測定したトリチウム標識チミジンの結合の標準誤差を結果として示す。図３に、上記細胞における３〜４回の実験を代表する１回分の実験の結果を示す。＊は、ｍＤＴ無しで又はＨＢ−ＥＧＦ無しで培養した細胞群の場合と比較して、平均値に統計的な差があることを示唆する（Ｐ＜０．０５、スチューデントのＴ検定により試験）。＊＊は、１００μｇ／ｍＬのｍＤＴと共に培養した細胞群の場合と比較して、平均値に統計的な差があることを示唆する。
【００４６】
図３は、この自己分泌ＨＢ−ＥＧＦは、４種のうち２種のＨＭＣＬ、すなわちＸＧ−１及びＸＧ−１４のＨＭＣＬのＩＬ−６依存性の増殖を促進することにおいて重要であるということを示す。実際、ＨＢ−ＥＧＦの特異的阻害剤である変異型ジフテリア毒素（ｍＤＴ）により、ＩＬ−６誘導性ＨＭＣＬ増殖が減少した。このｍＤＴによる阻害効果は組み換えＨＢ−ＥＧＦを過剰量添加することで相殺されたが、これより、上記阻害効果が変異型ジフテリア毒素の非特異的毒性によるものではないということが分かる（図３）。
【実施例３】
【００４７】
＜ＨＢ−ＥＧＦアンタゴニストは、高濃度のＩＬ−６と共に培養された骨髄腫細胞の増殖を阻害しない＞
骨髄腫細胞（１０４細胞／ウェル）を、（Ａ）５００ｐｇ／ｍＬ若しくは５ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６及び徐々に濃度を増やした変異型ジフテリア毒素（ｍＤＴ）と共に、又は、（Ｂ）徐々に濃度を増やしたＩＬ−６と共に、Ｘ−ＶＩＶＯ２０無血清培地中で５日間培養した。図４に示した結果は、培養ウェル６個について測定したトリチウム標識チミジンの結合の標準誤差である。２回の実験を代表する１回分の実験の結果を示す。
【００４８】
ｍＤＴ又は抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によってＩＬ−６依存性骨髄腫細胞増殖が阻害されることが、骨髄腫細胞を濃度１００〜５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６で刺激した際に再現性よく観察された（図４ａ）。ＩＬ−６の濃度を増やした場合（５ｎｇ／ｍＬ）では、統計的に有意な阻害は見られなかった（図４ａ）。４種のＨＭＣＬは１００〜５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６を添加したことで既に大いに増殖したため、その１０〜３０倍量のＩＬ−６を添加しても増殖を増やせなかったということが指摘できるだろう（図４ｂ）。
【実施例４】
【００４９】
＜ＨＢ−ＥＧＦのアンタゴニストによる骨髄腫細胞のアポトーシスの誘導＞
骨髄腫細胞を、５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６と共に、１００μｇ／ｍＬの変異型ジフテリア毒素を共存させて又は共存させずに、３日間培養した。１つの群において、１μｇ／ｍＬのＨＢ−ＥＧＦを、培養の開始時に、５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６及び１００μｇ／ｍＬの変異型ジフテリア毒素と共に添加した。アネキシンＶ標識及び細胞蛍光分析によってアポトーシスを評価した。パネルの数値は、アポトーシスを起こしているアネキシンＶ陽性細胞の割合を示す。図５に、２回の実験を代表する１回分の実験の結果を示す。
【００５０】
アネキシンＶで標識することによって、ｍＤＴはＸＧ−１及びＸＧ−１４の２種のＨＭＣＬにおいてアポトーシスを誘導すること（図５）、すなわち骨髄腫細胞の大部分（８７％及び６２％）が１００μｇ／ｍＬのｍＤＴによってアポトーシスを受けることが分かった。ｍＤＴに誘導されたアポトーシスは、ｍＤＴと平衡できる組み換えＨＢ−ＥＧＦを多量に添加することによって相殺された（図５）。
【実施例５】
【００５１】
＜骨髄腫細胞におけるＥｒｂＢ１の発現＞
骨髄腫細胞を、抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体、又は、ヒトの抗原を認識しないコントロールネズミモノクローナル抗体で標識した。その後この細胞を、ＰＥ標識抗ネズミＩｇヤギ抗体で標識した。蛍光をＦＡＣＳｃａｎ細胞蛍光光度計で測定した。図６に、３回の実験を代表する１回分の実験の結果を示す。ＸＧ−１及びＸＧ−１４骨髄腫細胞は、ＥｒｂＢ１を最も強く発現していた。
【００５２】
これらの結果は、骨髄腫細胞はＥｒｂＢ１遺伝子を強く発現していて、その他のＥＧＦ−Ｒファミリー受容体の発現はそれより弱くかつ再現性がないことを示す表１の結果と一致する。
【実施例６】
【００５３】
＜抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体によるＩＬ−６誘導性骨髄腫細胞増殖の阻害＞
骨髄腫細胞（１０４細胞／ウェル）を、５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６及び徐々に濃度を増やした抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体（０〜１０μｇ／ｍＬ）と共に、Ｘ−ＶＩＶＯ２０無血清培地中で５日間培養した。１つの培養群においては、１μｇ／ｍＬの組み換えＨＢ−ＥＧＦを、培養の開始時に、１０μｇ／ｍＬの抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体及び５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６と共に添加した。培養ウェル６個について測定したトリチウム標識チミジンの結合の標準誤差を結果として示す。図７に、上記細胞系における２〜３回の実験を代表する１回分の実験の結果を示す。＊は、抗ＥｒｂＢ１  ｍＡｂ無しで又はＨＢ−ＥＧＦ無しで培養した細胞群の場合と比較して、平均値に統計的な差があることを示唆する（Ｐ＜０．０５、スチューデントのＴ検定により試験）。＊＊は、１０μｇ／ｍＬの抗ＥｒｂＢ１  ｍＡｂと共に培養した細胞群の場合と比較して、平均値に統計的な差があることを示唆する。
【００５４】
図７に示した結果は、ＸＧ−１細胞及びＸＧ−１４細胞の増殖がある濃度（１０μｇ／ｍＬ）の抗ＥｒｂＢ１抗体によって強く阻害されたことを示す。この抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体による阻害効果は、組み換えＨＢ−ＥＧＦを多量に添加することで相殺された。これより、骨髄腫細胞系はＥＧＦ遺伝子を発現していないということが指摘できるだろう（表１）。ＸＧ−１細胞及びＸＧ−１４細胞の増殖の抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体による強い阻害は、これらの細胞がＨＢ−ＥＧＦ遺伝子を強く発現していること、ＨＢ−ＥＧＦアンタゴニストによってこれらの細胞の増殖が顕著に阻害されたこと、及び、ＦＡＣＳで検出できたようなＥｒｂＢ１の発現と一致する。これらのデータは概して、ＸＧ−１及びＸＧ−１４骨髄腫細胞系のＩＬ−６誘導性の生存及び増殖は、ＨＢ−ＥＧＦ／ＥｒｂＢ１自己分泌ループに左右されることを示す。
【実施例７】
【００５５】
＜抗ＩＬ−６又は抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体によるＩＬ−６誘導性骨髄腫細胞増殖の阻害＞
ＸＧ−１骨髄腫細胞を、インターロイキン−６（ＩＬ−６）１００ｐｇ／ｍＬの存在下、Ｘ−ＶＩＶＯ２０培地中で９６時間培養した。
【００５６】
０日目、異なる濃度のＩＬ−６モノクローナル抗体（Ｂ−Ｅ８）及び／又は抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体（ＬＡ−１）を添加した。
【００５７】
図８に示した結果は、抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体が、抗ＩＬ−６モノクローナル抗体が上記細胞のＩＬ−６依存性の増殖を阻害する効果を増強しているということを示す。
【実施例８】
【００５８】
＜骨髄腫系におけるテトラスパニンＣＤ９の発現＞
骨髄腫細胞を、０．２ｎｇ／ｍＬ又は２ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６と共にＸ−ＶＩＶＯ２０培地中で２日間培養し、ＣＤ９の発現をフィコエリトリン標識抗ＣＤ９モノクローナル抗体で標識することによって評価した。標識細胞の割合及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）をＦＡＣＳｃａｎ細胞蛍光光度計で測定した。２回の実験を代表する１回分の実験の結果を示す。
【００５９】
イソタイプが一致するコントロール抗体を用いて得られたＭＦＩ値を３〜５の間に設定した。表２（下記）の結果は、ＸＧ−１系及びＸＧ−１４系がテトラスパニンＣＤ９を強く発現しているということを示す。この発現はＩＬ−６によって調節されない。ＸＧ−１系及びＸＧ−１３系はこれを非常に弱く発現している。テトラスパニンＣＤ９はＨＢ−ＥＧＦの生物学的活性を顕著に増強できるＨＢ−ＥＧＦ受容体であるため、これらのデータは、ＸＧ−１系及びＸＧ−１４系のＩＬ−６に媒介される増殖を制御することにおいて、ＣＤ９／ＨＢ−ＥＧＦ／ＥｒｂＢ１自己分泌ループの重要性を高めるものである。
【００６０】
【表２】
2005504038.tif 000003
【実施例９】
【００６１】
＜抗ＣＤ９モノクローナル抗体による骨髄腫細胞の増殖の阻害＞
抗ＣＤ９ｍＡｂを、骨髄腫細胞のＩＬ−６に媒介される生存の促進においてＣＤ９が重要であるかどうかを調べるために用いた。
【００６２】
骨髄腫細胞（１０４細胞／ウェル）を、５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６及び５０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ９ｍＡｂ  ＳＹＢ−１と共に、Ｘ−ＶＩＶＯ２０無血清培地中で５日間培養した。１つの培養群においては、１μｇ／ｍＬの組み換えＨＢ−ＥＧＦを、培養の開始時に、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ９ｍＡｂ  ＳＹＢ−１及び５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６と共に添加した。培養ウェル６個について測定したトリチウム標識チミジンの結合の標準誤差を結果として示す。２回の実験を代表する１回分の実験の結果を示す。＊は、抗ＣＤ９ｍＡｂ無しで又はＨＢ−ＥＧＦ無しで培養した細胞群の場合と比較して、平均値に統計的な差があることを示唆する（Ｐ＜０．０５、スチューデントのＴ検定により試験）。
【００６３】
図９に示すように、抗ＣＤ９モノクローナル抗体ＳＹＢ−１は、ＸＧ−１骨髄腫細胞の増殖を遮断することができた。この阻害は、ＣＤ９への結合に対して抗ＣＤ９モノクローナル抗体と競合できる組み換えＨＢ−ＥＧＦを多量に添加することによって相殺された。
【実施例１０】
【００６４】
＜ＩＬ−６及びＨＢ−ＥＧＦによる、骨髄腫細胞の生存及び増殖の誘発における相乗的な効果＞
ＸＧ−１又はＸＧ−１４骨髄腫細胞を、１０５個／ｍＬの濃度でＸ−ＶＩＶＯ２０無血清培地中で、ヒトの抗原を認識しないネズミモノクローナル抗体１０μｇ／ｍＬを共存させてかつサイトカインを共存させずに、又は、５００ｐｇ／ｍＬのＩＬ−６若しくは１００ｎｇ／ｍＬの組み換えＨＢ−ＥＧＦを共存させて、培養した。いくつかの培養群においては、抗ＩＬ−６ｇｐ１３０トランスデューサーモノクローナル中和抗体Ｂ−Ｒ３又は抗ＥｒｂＢ１モノクローナル中和抗体ＬＡ−１を添加した。３〜４日毎に細胞の生存力及び細胞数を試験し、細胞を各群当たり１０５個／ｍＬの濃度で、初期濃度のサイトカイン及び／又はサイトカイン阻害剤を含む新しい培地で再度培養した。３回の実験を代表する１回分の実験における、培養で生産された細胞の累積数を結果として示す。
【００６５】
図１０に示すように、ＩＬ−６の非存在下で、ＸＧ−１及びＸＧ−１４の２種の骨髄腫細胞系は増殖せず、４〜５日間のうちに徐々に死んでいった。また、ＩＬ−６を添加すると活発な増殖が誘導された。ＩＬ−６に誘導された増殖は、抗ｇｐ１３０ｍＡｂ中和抗体によって完全に相殺された。更に、抗ＥｒｂＢ１モノクローナル中和抗体によって完全に相殺されたが、このことは上記データと一致する。組み換えＨＢ−ＥＧＦはＸＧ−１及びＸＧ−１４骨髄腫細胞の生存に対して有利に働き、また、その増殖はＩＬ−６に誘導される増殖よりも弱かった。上記骨髄腫細胞は組み換えＨＢ−ＥＧＦに媒介されて弱く増殖するが、この増殖は抗ＥｒｂＢ１モノクローナル抗体によって阻害された。更に、抗ｇｐ１３０モノクローナル中和抗体によって完全に阻害された。この自己分泌性のＩＬ−６遺伝子の発現もまた、ＡＴＬＡＳ  ＤＮＡチップを用いて、ＸＧ−１細胞及び他の骨髄腫細胞系（表１参照）において検出され、ＲＴ−ＰＣＲ法で確認された（図１１）。
【００６６】
また、これらのデータは、組み換えＨＢ−ＥＧＦによって骨髄腫細胞が弱く増殖することが、このように骨髄腫細胞において自己分泌的にＩＬ−６が弱く生産されることに関連しているということを示す。このことから、骨髄腫細胞の最適な生存及び増殖を誘発するための、ＩＬ−６ｇｐ１３０トランスデューサーに誘導される変換経路とＥｒｂＢ１に誘導される変換経路との間には協力関係があると推定される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体によるＨＢ−ＥＧＦ発現の阻害
【図２】骨髄腫細胞系における膜性ＨＢ−ＥＧＦの発現
【図３】変異型ジフテリア毒素による骨髄腫細胞系の増殖の阻害
【図４】変異型ジフテリア毒素によるＩＬ−６と共に培養した骨髄腫細胞系の増殖の阻害
【図５】変異型ジフテリア毒素による骨髄腫細胞系のアポトーシスの誘導
【図６】骨髄腫細胞系におけるＥｒｂＢ１の発現
【図７】抗ＥｒｂＢ１抗体による骨髄腫細胞系の増殖の阻害
【図８】抗ＩＬ−６抗体又は抗ＥｒｂＢ１抗体による骨髄腫細胞系の増殖の阻害
【図９】抗ＣＤ９モノクローナル抗体による骨髄腫細胞系の増殖の阻害
【図１０】ＩＬ−６及びＨＢ−ＥＧＦによる、骨髄腫細胞の生存及び増殖の誘発における相乗的な効果
【図１１】骨髄腫細胞系におけるＩＬ−６遺伝子の発現
【図１】
2005504038.tif 000004
【図２】
2005504038.tif 000005
【図３】
2005504038.tif 000006
【図４】
2005504038.tif 000007
【図５】
2005504038.tif 000008
【図６】
2005504038.tif 000009
【図７】
2005504038.tif 000010
【図８】
2005504038.tif 000011
【図９】
2005504038.tif 000012
【図１０】
2005504038.tif 000013
【図１１】
2005504038.tif 000014
【国際公開パンフレット】
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2005504038.tif 000016
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【国際調査報告】
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