(57)【要約】本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学および医学分野に関するものである。本発明は、規則正しい反復性抗原または抗原決定基アレイを含む組成物、および特にＡβ１−６ペプチド−ＶＬＰ組成物を提供する。さらに具体的には、本発明は、ウイルス様粒子およびそれに結合した少なくとも１個のＡβ１−６ペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、コンジュゲートおよび規則正しい反復性アレイのそれぞれの製造方法を提供する。本発明組成物は、アルツハイマー病処置用ワクチンの製造に、そしてアルツハイマー病を阻止または治療し、免疫応答、特に抗体応答を有効に誘導するための治療用ワクチンとして有用である。さらに、本発明組成物は、示された状況内で自己特異的免疫応答を有効に誘導するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１個の第一付着部位を有するコア粒子、および
（ｂ）少なくとも１個の第二付着部位を有する少なくとも１個の抗原または抗原決定基
を含む組成物であって、
抗原または抗原決定基がＡβ１−６ペプチドであり、そして
第二付着部位が、
（ｉ）自然の状態では抗原または抗原決定基をもたない付着部位、および
（ii）自然の状態で抗原または抗原決定基をもつ付着部位
から成る群から選択されるものであり、
第二付着部位が第一付着部位と会合し得、そしてＡβ１−６ペプチドおよびコア粒子がその会合を通して相互作用することにより、規則正しい反復性抗原アレイを形成する組成物。
【請求項２】
コア粒子が、
ｉ）ウイルス、
ii）ウイルス様粒子、
iii）バクテリオファージ、
iv）ＲＮＡ−ファージのウイルス様粒子、
ｖ）細菌線毛
vi）ウイルスキャプシド粒子、および
vii）（ｉ）、（ii）、（iii）、（iv）、（ｖ）または（vi）の組換え形態
から成る群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
コア粒子がウイルス様粒子を含み、好ましくは、ウイルス様粒子であり、好ましくはウイルス様粒子が組換えウイルス様粒子である、請求項１または２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項４】
ウイルス様粒子が、
（ａ）Ｂ型肝炎ウイルスの組換えタンパク質、
（ｂ）麻疹ウイルスの組換えタンパク質、
（ｃ）シンドビスウイルスの組換えタンパク質、
（ｄ）ロタウイルスの組換えタンパク質、
（ｅ）口蹄疫ウイルスの組換えタンパク質、
（ｆ）レトロウイルスの組換えタンパク質、
（ｇ）ノーウォークウイルスの組換えタンパク質、
（ｈ）アルファウイルスの組換えタンパク質、
（ｉ）ヒトパピローマウイルスの組換えタンパク質、
（ｊ）ポリオーマウイルスの組換えタンパク質、
（ｋ）バクテリオファージの組換えタンパク質、
（ｌ）ＲＮＡ−ファージの組換えタンパク質、
（ｍ）Ｔｙの組換えタンパク質、
（ｎ）Ｑβ−ファージの組換えタンパク質、
（ｏ）ＧＡ−ファージの組換えタンパク質、
（ｐ）ｆｒ−ファージの組換えタンパク質、
（ｑ）ＡＰ２０５ファージの組換えタンパク質、および
（ｑ）（ａ）〜（ｑ）からの組換えタンパク質のいずれかのフラグメント
から成る群から選択される組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項２または３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５】
ウイルス様粒子がＢ型肝炎ウイルスコア抗原である、請求項２〜３項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより構成される、請求項２〜３項のいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
ＲＮＡ−ファージが、
（ａ）バクテリオファージＱΒ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
から成る群から選択される、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＱΒの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより構成される、請求項２〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージｆｒの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより構成される、請求項２〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより構成される、請求項２〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
組換えタンパク質が、ＲＮＡ−ファージのコートタンパク質を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される、請求項３〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
アミノ酸を有するＲＮＡファージのコートタンパク質が、
（ａ）配列番号４、
（ｂ）配列番号４および配列番号５の混合物、
（ｃ）配列番号６、
（ｄ）配列番号７、
（ｅ）配列番号８、
（ｆ）配列番号９、
（ｇ）配列番号９および配列番号１０の混合物、
（ｈ）配列番号１１
（ｉ）配列番号１２、
（ｋ）配列番号１３、
（ｌ）配列番号１４、
（ｍ）配列番号１５、
（ｎ）配列番号１６、および
（ｏ）配列番号２８
から成る群から選択される、請求項２〜３のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１３】
組換えタンパク質が、ＲＮＡ−ファージの突然変異コートタンパク質を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される、請求項３〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
ＲＮＡ−ファージが、
（ａ）バクテリオファージＱβ、
（ｂ）バクテリオファージＲ１７、
（ｃ）バクテリオファージｆｒ、
（ｄ）バクテリオファージＧＡ、
（ｅ）バクテリオファージＳＰ、
（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、
（ｇ）バクテリオファージＭ１１、
（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、
（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、
（ｋ）バクテリオファージｆ２、
（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、および
（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５
から成る群から選択される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、置換による少なくとも１個のリシン残基の除去により修飾されている、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、置換による少なくとも１個のリシン残基の付加により修飾されている、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、少なくとも１個のリシン残基の欠失により修飾されている、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１８】
ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質が、挿入による少なくとも１個のリシン残基の付加により修飾されている、請求項１３〜１４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１９】
第二付着部位が第一付着部位と少なくとも１個の共有結合を介して会合し得る、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
第二付着部位が第一付着部位と少なくとも１個の非ペプチド結合を介して会合し得る、請求項１〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
Ａβ１−６ペプチドがコア粒子と融合している、請求項１〜２０のいずれかの記載の組成物。
【請求項２２】
Ａβ１−６ペプチドが、
（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を有するヒトＡβ１−６ペプチド、
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を有するネズミＡβ１−６ペプチド、
（ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列を有する霊長類Ａβ１−６ペプチド、
（ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を有するウサギＡβ１−６ペプチド、
（ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列を有するアフリカツメガエルＡβ１−６ペプチド、
（ｆ）配列番号８７のアミノ酸配列を有するラットＡβ１−６ペプチド、
（ｇ）配列番号８８のアミノ酸配列を有するモルモットＡβ１−６ペプチド
から成る群から選択される、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
Ａβ１−６ペプチドが配列番号７５のアミノ酸配列を有する、請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
さらにアミノ酸リンカーを含み、そのアミノ酸リンカーが第二付着部位を含むか、またはそれにより構成される、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
第二付着部位または第二付着部位をもつアミノ酸リンカーが、そのＣ−末端でＡβ１−６ペプチドに結合している、請求項１〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
第二付着部位または第二付着部位をもつアミノ酸リンカーが、
（ａ）ＧＧＣ、
（ｂ）ＧＧＣ−ＣＯＮＨ２、
（ｃ）ＧＣ、
（ｄ）ＧＣ−ＣＯＮＨ２、
（ｅ）Ｃ、および
（ｆ）Ｃ−ＣＯＮＨ２
から成る群から選択される、請求項１〜２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも第二付着部位をもつＡβ１−６ペプチドが、ＮＨ２−ＤＡＥＦＲＨＧＧＣ−ＣＯＮＨ２（配列番号７７）である、請求項１〜２６のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子である、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
（ａ）請求項１記載の組成物、および
（ｂ）許容される医薬用担体
を含む医薬組成物。
【請求項３０】
さらにアジュバントを含む、請求項２９記載の医薬組成物。
【請求項３１】
ワクチン組成物がアジュバントを欠く、請求項２９または請求項３０記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれかに記載の組成物を含むワクチン組成物。
【請求項３３】
さらにアジュバントを含む、請求項３２記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
ワクチン組成物がアジュバントを欠く、請求項３２または請求項３３記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージの組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項３２〜３４のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＱβの組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項３２〜３５のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージｆｒの組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項３２〜３５のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項３８】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換えタンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項３２〜３５のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項３９】
Ａβ１−６ペプチドが、
（ａ）配列番号７５のアミノ酸配列を有するヒトＡβ１−６ペプチド、
（ｂ）配列番号７６のアミノ酸配列を有するネズミＡβ１−６ペプチド、
（ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列を有する霊長類Ａβ１−６ペプチド、
（ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を有するウサギＡβ１−６ペプチド、
（ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列を有するアフリカツメガエルＡβ１−６ペプチド、
（ｆ）配列番号８７のアミノ酸配列を有するラットＡβ１−６ペプチド、および
（ｇ）配列番号８８のアミノ酸配列を有するモルモットＡβ１−６ペプチド
から成る群から選択される、請求項３２〜３８のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項４０】
さらにアミノ酸リンカーを含み、そのアミノ酸リンカーが第二付着部位を含むか、またはそれにより構成される、請求項３２〜３９のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項４１】
第二付着部位をもつアミノ酸リンカーが、そのＣ−末端でＡβ１−６ペプチドに結合している、請求項４０記載のワクチン組成物。
【請求項４２】
第二付着部位をもつアミノ酸リンカーが、
（ａ）ＧＧＣ、
（ｂ）ＧＧＣ−ＣＯＮＨ２、
（ｃ）ＧＣ、
（ｄ）ＧＣ−ＣＯＮＨ２、
（ｅ）Ｃ、および
（ｆ）Ｃ−ＣＯＮＨ２
から成る群から選択される、請求項４０〜４１のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項４３】
少なくとも第二付着部位をもつ抗原または抗原決定基が、ＮＨ２−ＤＡＥＦＲＨＧＧＣ−ＣＯＮＨ２（配列番号７７）である、請求項３２〜４２のいずれか１項記載のワクチン組成物。
【請求項４４】
ウイルス様粒子が、ＲＮＡ−ファージＱβコートタンパク質のウイルス様粒子である、請求項４３記載のワクチン組成物。
【請求項４５】
（ａ）少なくとも１個の第一付着部位をもつコア粒子を提供し、
（ｂ）少なくとも１個の第二付着部位をもつ少なくとも１個の抗原または抗原決定基を提供し、
ただし、抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドであり、そして
第二付着部位が、
（ｉ）自然の状態では抗原または抗原決定基をもたない付着部位、および
（ii）自然の状態で抗原または抗原決定基をもつ付着部位
から成る群から選択されるものであり、そして
第二付着部位が第一付着部位と会合し得、そして
（ｃ）コア粒子および少なくとも１個の抗原または抗原決定基を合わせ、抗原または抗原決定基およびコア粒子がその会合を通して相互作用することにより、規則正しい反復性抗原アレイを形成する
ことを含む、請求項１〜４４のいずれかに記載の組成物の製造方法。
【請求項４６】
請求項１〜４４のいずれかに記載の組成物を動物またはヒトに投与することを含む免疫化方法。
【請求項４７】
抗原または抗原決定基が自己抗原である、請求項４６記載の免疫化方法。
【請求項４８】
動物がヒトである、請求項４６または４７のいずれか１項記載の免疫化方法。
【請求項４９】
抗原または抗原決定基がヒトＡβ１−６ペプチドである、請求項４６〜４８のいずれか１項記載の免疫化方法。
【請求項５０】
医薬として使用される、請求項１〜４４のいずれか１項記載の組成物。
【請求項５１】
アルツハイマーおよび関連疾患処置用医薬の製造を目的とする、請求項１〜４４のいずれか１項記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、分子生物学、ウイルス学、免疫学および医学の分野に関するものである。本発明は、規則正しい反復性抗原または抗原決定基アレイを含む組成物、および特にＡβ１−６ペプチド−ＶＬＰ組成物を提供する。さらに具体的には、本発明は、ウイルス様粒子およびそこに結合している少なくとも１個のＡβ１−６ペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、コンジュゲートおよび規則正しい反復性アレイの各製造方法を提供する。本発明組成物は、アルツハイマー病処置用ワクチンの製造に、そしてアルツハイマー病を予防または治療し、免疫応答、特に抗体応答を効果的に誘導する治療ワクチン（pharmaccine）として有用である。さらに、本発明組成物は、示された状況の中で自己特異的免疫応答を効果的に誘導するのに特に有用である。
【０００２】
関連技術
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高齢者（６５歳以上）における痴呆の最も一般的な原因であり、公衆衛生にとって深刻な負担である。たとえば、アメリカ合衆国では４００万人の人々がこの病気に罹患していると報告されている。病気の発生は集団の老化とともに増加すると予測される。
【０００３】
アルツハイマー病の主たる病理学的徴候は、年齢に関連した行動上の変化、老人斑またはＡＤ斑と呼ばれる不溶性斑へのβ−アミロイド沈着、ニューロン内におけるタウタンパク質により構成される神経細線維もつれ、および前脳全体におよぶニューロンの消失である。高齢（６５歳およびそれ以上）で発生する晩期発症型ＡＤに加えて、３５〜６０歳間で発生する早期発症型ＡＤ、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）がある。ＡＤの病理学的異常は、晩期発症型または孤発性ＡＤよりもＦＡＤの方が広範囲におよび、重症であり、早期に発現する。ＡＰＰ遺伝子、プレセニリン１およびプレセニリン２遺伝子における突然変異はＦＡＤと相関関係を示している。
【０００４】
指摘されている通り、アルツハイマー病（ＡＤ）における重要な事象の一つは、細胞外の老人斑および脳血管壁周囲の沈着をもたらす不溶性線維塊としてのアミロイドの沈着（アミロイド産生）である（概説についてはSelkoe, D. J. （1999） Nature. 399, A23-31）参照）。老人斑およびコンゴ好染血管障害の主成分はアミロイドβ（Ａβ）であるが、これらの沈着はまた他のタンパク質、たとえばグリコサミノグリカンおよびアポリポタンパク質も含んでいる。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）として知られる大型糖タンパク質からタンパク質分解的に開裂されるもので、疎水性の一回膜貫通領域を有する６９５〜７７０アミノ酸のイソ型を含む。Ａβは、かなりのアミノ−およびカルボキシ−末端不均一性（先端切除）および修飾を示す長さ４３アミノ酸以下のペプチドの一群を形成する（Roher, A. E., Palmer, K. C., Chau, V., & Ball, M. J. （1988） J. Cell Biol. 107, 2703-2716. Roher, A. E., Palmer, K. C., Yurewicz, E. C., Ball, M. J., & Greenberg, B. D. （1993） J. Neurochem. 61, 1916-1926）。顕著なイソ形態はＡβ１−４０および１−４２である。それは、原線維に凝集し、最終的にはアミロイド形成に至るβシート形成の高い傾向を有する。
【０００５】
Ａβペプチドは、アルツハイマー病の神経病理学において中心的な役割を有する。Ａβペプチドの領域特異的な細胞外蓄積は、小膠細胞症、細胞骨格変化、ジストロフィー神経炎、およびシナプス消失を伴う。これらの病理学的改変は、この病気を定義する認知低下に結びつくと考えられる。
【０００６】
アルツハイマー病の処置を目的とする、いかなるアジュバントも存在せず、担体へのアミロイドベータタンパク質またはＡβ１−２８の結合も存在しない場合の１０−２ｍｇ／用量以下の量でのアミロイドベータタンパク質または特にＡβ１−２８の投与については欧州特許第５２６５１１号に記載されている。
【０００７】
他に、アジュバントと組み合わせたＡβペプチド投与の使用により、Ａβ１−４２に対する細胞性または体液性免疫応答を誘導する方法もある。アルツハイマー病のトランスジェニックマウスモデルにおいて、動物は、突然変異ＡＰＰ（７１７）Ｖ−Ｆを含むヒトアミロイド前駆体タンパク質を過剰発現する（PDAPP-マウス; Johnson-Wood, K. et al., Proc. Natl. Acad. USA 94: 1550-1555, Games, D. et al., Nature 373: 523-527 （1995a）））ことによって、Ａβ１−４２が過剰産生され、斑、ジストロフィー神経炎、シナプス前部末端の消失、星状細胞増加症および小膠細胞症を発現する。最近の研究において、Schenk, D. et al., （Nature 400:173-77 （1999）および国際公開第99/27944号）は、６週令のＰＤＡＰＰ−マウスに対する、最初の４免疫化における、ヒトでは使用され得ない強いアジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）と混合した凝集Ａβ１−４２の投与、次いで後続免疫化におけるＰＢＳ中の凝集Ａβ１−４２の投与により、斑形成および付随するジストロフィー神経炎が本質的に阻止されたことを報告している。同著者らは、同じ戦略を用いた年長マウス（１１ヶ月令）の免疫化は、アルツハイマー病（ＡＤ）様神経病状の程度および進行を著しく低減化させることを報告した。上記戦略を用いて免疫化されたマウスからの脾臓細胞の増殖は、国際公開第９９／２７９４４号の実施例III（確立されたＡＤに対する治療効力についてのスクリーン）で報告されており、Ａβ１−４２特異的Ｔ細胞がワクチン接種手順により誘導されることが示されていた。ヒツジ抗マウスＩｇＧへのＡβフラグメントのカップリング、およびアジュバントＣＦＡ／ＩＦＡの存在下におけるカップリングされたフラグメントの免疫化については、国際公開第９９／２７９４４号に報告されている。Ａβに対する免疫応答促進を目的とするポリペプチド、たとえばジフテリア毒素に結合されたＡβフラグメントを含む組成物の使用はまた、国際公開第９９／２７９４４号に開示されている。しかしながら、免疫化のデータは全く提供されていない。
【０００８】
ＡβのＮ−末端（１−１６）内のエピトープを認識するモノクローナル抗体（抗体６Ｃ６）は、原線維β−アミロイドの神経毒性からＰＣ１２細胞を防御し、インビトロでβ−アミロイドを分離することが示された（Solomon B. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA （1997））。Ａβ１−２８に対して産生したモノクローナル抗体はまた、インビトロでβ−アミロイド凝集を抑制することが示された（Solomon B. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA （199６））。Frenkel et al., （J. Neuroimmunol. 88: 85-90 （1998））は、エピトープ「ＥＦＲＨ」であるものとして、後に２種の抗凝集性抗体、１０Ｄ５および６Ｃ６のエピトープを同定した（すなわちＡβ３−６）。対照的に、Ａβ１−７に特異的な抗体は、β−アミロイド凝集を阻止できなかった（Frenkel D. et al., J. Neuroimmunol. 95: 136-142 （1999））。
【０００９】
Ａβ１−４２は原線維を発生するものであり、事実、国際公開第９９／２７９４４号に記載されたワクチン組成物は、凝集体を形成し得るように処理されたＡβ１−４２を使用するものであった。上記原線維は神経細胞培養物に対し毒性を呈すること（Yankner et al., Science 245: 417-420 （1989））、および動物の脳に注射したとき毒性効果が観察されることが示された（Sigurdson et al., Neurobiol. Aging 17: 893-901 （1996）; Sigurdson et al., Neurobiol. Aging 18: 591-608 （1997））. Walsh et al., （Nature 416:535-539 （2002））。Walsh et al., （Nature 416:535-539 （2002））は、Ａβの天然オリゴマーが細胞内小胞内で形成されることを報告している。上記オリゴマーは、インビボでラットにおける長期相乗作用を阻害し、ヒト脳および脳脊髄液で見出される濃度でシナプス可塑性を破壊した。
【００１０】
別の試験において、Bard, F. et al. （Nature Medicine 6:916-19 （2000））は、Ａβ１−４２に対して産生した抗体の末梢投与により、相対的に中程度の血清レベルにもかかわらず、アミロイド荷重が低減化され得ることを報告した。この試験では、Ａβ１−４２に対して産生したポリクローナル抗体またはＡβの異なる領域から誘導された合成フラグメントに対して産生したモノクローナル抗体を使用した。すなわち、Ａβペプチドに対する抗体の誘導は、アルツハイマー病についての可能性のある治療的処置として有望な手段である。
【００１１】
β−アミロイド斑に随伴する抗原、たとえばβ−アミロイドペプチドおよびＡβ１−４０の粘膜投与については、国際公開第９９／２７９４９号に記載されている。粘膜投与は、アルツハイマー病に伴うある種のサイトカイン応答を抑制し、そして病気に結びついた炎症応答の抑制に伴うある種の他のサイトカイン応答を高めると言われている。炎症応答の抑制は、「抗炎症性サイトカインプロフィールを特徴とするＴ細胞の誘導」によりもたらされると考えられている。国際公開第９９／２７９４９号に記載されている適切な抗原には、ＡＤに特異的であり、ヒトまたは動物宿主の免疫Ｔ細胞により認識される抗原が含まれる。
【００１２】
線維状ファージのコートタンパク質へのＡβを認識するモノクローナル抗体のエピトープの融合については、国際公開第０１／１８１６９号に記載されている。コートタンパク質VIIIにおいて１５量体エピトープVHEPHEFRHVALNPV（配列番号８９）を表す線維状ファージによるマウスの免疫化により、Ａβ１−１６およびＡβ１−４０を認識する抗体が産生した。これはＡβペプチドを用いる阻害ＥＬＩＳＡにおいて立証されており、Ａβ１−４０を伴うＡβ１−１６への血清の結合阻害について１μＭのＩＣ５０が見出された。しかしながら、Solomon（国際公開第０１／１８１６９号）は、VHEPHEFRHVALNPV エピトープ（配列番号８９）をもつ線維状ファージに対して誘導された血清がＡＤのアミロイド斑または老人斑に結合するという指摘を全くしていない。
【００１３】
免疫化について、免疫応答が誘導される抗原とは異なる配列を用いる場合には若干の欠点がある。第一に、抗原または抗原決定基にとって異質である配列の一部に対する抗体が誘導され得る。第二に、外来フランキング配列エレメントの状況における抗原の立体配座は、完全長抗原の状況における場合とは異なり得る。すなわち、抗原と交差反応する抗体は誘導され得るが、抗原へのそれらの結合は最適状態におよび得ない。また、完全長Ａβに存在する残基とは異なる追加の側鎖がエピトープに存在するため、誘導された抗体の微細な特異性は抗原自体に対して誘導された抗体の特異性と対応し得ない。最後に、１５量体アミノ酸配列は、Ｔ細胞エピトープを含み得る。また、各ファージには通常３〜５コピーしか存在しない、線維状ファージコートのタンパク質IIIにおけるエピトープＹＹＥＦＲＨ（配列番号９０）の呈示についても国際公開第０１／１８１６９号に開示されている。免疫用担体として感染性ファージを使用する場合、幾つかの問題が生じる。第一に、大規模で大型免疫化キャンペーンにとって充分な量での感染源の製造は問題がある。第二に、ワクチン中における抗生物質耐性遺伝子を含むファージのＤＮＡの存在はそれほど問題ではなく、安全性の争点である。最後に、非感染性ファージがワクチンとして使用される場合における、ファージの大量照射の実行可能性および効力は未解決である。
【００１４】
ＡβがＴヘルパーエピトープを含むように修飾されたＡβ類似体についても報告されている（国際公開第０１／６２２８４号）。Ａβ類似体によるヒトＡＰＰについてのトランスジェニックであるＴｇＲＮＤ８＋マウスの免疫化により、アジュバントの非存在下でのＡβ１−４２による免疫化全体において４〜７.５倍高い抗体力価が得られた。
【００１５】
最近の研究は、ワクチン接種誘導による脳アミロイド沈着の縮小が、認知機能改善の可能性を有することを立証した（Schenk, D., et al. Nature 400: 173-177 （1999）; Janus, C. et al., Nature 408: 979-982 （2000）; Morgan, D. et al., Nature 408 : 982-985 （2000）。
【００１６】
アジュバントＱＳ２１中の凝集Ａβ１−４２により免疫化された患者の剖検は、Ｔリンパ球髄膜脳炎およびマクロファージによる脳白質の浸潤の存在を表した（Nicoll, J.A. et al., Nature Med. 9: 448-452 （2003））。
【００１７】
最近の発表で、ＡＮ１７９２、すなわち凝集Ａβ１−４２およびアジュバントＱＳ２１から成るワクチンにより免疫化された患者における髄膜脳炎の１８症例が報告された（Orgogozo J.-M. et al., Neurology 61: 46-54 （2003））。Ｔ細胞活性化は、病気に関与する可能性のある機構として報告されているが、病気と血清中の抗Ａβ１−４２力価の間に明白な関連は無かった。
【００１８】
精製タンパク質単独投与では、通常、強い免疫応答を誘導するのに充分ではないことは、充分に確立されている。単離抗原は、一般的にアジュバントと呼ばれる補助物質と一緒に与えられなければならない。これらのアジュバント内で、投与された抗原は、急速な分解に対して防御されており、アジュバントは、低レベルの抗原の放出を長く持続させる。本発明では、Ａβペプチドは、ＶＬＰへの結合を通して免疫原性にされており、アジュバントを必要とはしない。
【００１９】
すなわち、ワクチン接種の有効性を改良する一方法は、適用抗原の反復性の度合を増すことである。単離タンパク質とは異なり、ウイルスは、Ｔ細胞の助けがある場合も無い場合も共にアジュバントの非存在下において迅速で有効な免疫応答を誘導する（Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol: 15:235-270 （1991））。ウイルスは僅かのタンパク質により構成されることが多いが、それらは、それらの単離成分よりもかなり強い免疫応答を誘発することができる。Ｂ細胞応答については、ウイルスの免疫原性にとっての非常に重大な一因子は表面エピトープの反復性および秩序であることが知られている。多くのウイルスは、Ｂ細胞上のエピトープ特異的免疫グロブリンと有効に架橋するエピトープの規則正しいアレイを呈示する準結晶表面を呈する（Bachmann and Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 （1996））。Ｂ細胞における表面免疫グロブリンのこの架橋は、直接細胞周期進行およびＩｇＭ抗体の産生を誘導する強い活性化シグナルである。さらに、上記の誘発されたＢ細胞は、Ｔヘルパー細胞を活性化することができ、次いでそれは、ワクチン接種の目標である、Ｂ細胞におけるＩｇＭからＩｇＧ抗体産生へのスイッチおよび長く持続するＢ細胞記憶の形成を誘導する（Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 （1997）））。ウイルス構造は、自己免疫疾患における、そして病原体に対する自然応答の一部として抗抗体の産生と結びついている（Fehr, T., et al., J Exp. Med. 185:1785-1792 （1997）参照）。すなわち、高度に組織されたウイルス表面により提示された抗体は、強い抗抗体応答を誘導することができる。
【００２０】
しかしながら、指摘されたように、免疫系は、通常、自己由来の構造に対して抗体を産生し得ない。低濃度で存在する可溶性抗原の場合、これはＴｈ細胞レベルでの寛容性に起因する。これらの条件下では、Ｔヘルパーを送達し得る担体に自己抗原をカップリングさせると、寛容性は破壊され得る。高濃度で存在する可溶性タンパク質または低濃度での膜タンパク質の場合、ＢおよびＴｈ細胞は寛容性であり得る。しかしながら、Ｂ細胞寛容性は、可逆性（アネルギー）であり得、外来担体に結合されている高度に組織されたやり方での抗原の投与により破壊され得る（Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 （1997））。２００２年１月１８日付けで係属中の米国出願第１０／０５０９０２号で示されている通り、強い免疫応答は、ＶＬＰに結合されたＡβペプチド（Ａβ１−１５、Ａβ１−２７およびＡβ３３−４２、これはマウスにおける自己抗原である）を含む組成物により誘導され得る。特に、ＲＮＡファージＱβのＶＬＰに結合された上記ヒトＡβペプチドは、自己抗原Ａβに対する寛容性が、ＶＬＰに結合させたＡβペプチドによる免疫化により克服され得ることを立証しているヒトＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて高いＡβ特異力価を誘導した（実施例に記載）。
【００２１】
すなわち、特に、副作用を誘発し得るＴ細胞エピトープおよびアジュバントをそれぞれ欠く免疫原を用い、依然として高い抗体力価を誘導し得、抗体がさらにアミロイド斑に結合し得る、アルツハイマー病を処置するための高免疫原性の安全な組成物およびワクチンがそれぞれ要望されている。
【００２２】
発明の簡単な要約
我々は、固有の反復構成をもつ構造を有するコア粒子に、特にウイルス様粒子（ＶＬＰ）およびＶＬＰのサブユニットにそれぞれ結合されており、高度に秩序だった反復性コンジュゲートに至るＡβ１−６ペプチドが、Ａβ１−６に特異的な抗体を誘導する強力な免疫原となることを見出した。したがって、本発明は、秩序正しい反復性Ａβ１−６コア粒子アレイ、および特にＶＬＰ−Ａβ１−６ペプチドコンジュゲートおよびアレイにそれぞれに基づいた、アルツハイマー病を処置するための予防および治療手段を提供する。この予防および治療手段は、可溶性Ａβと交差反応性であり、ヒトＡＰＰトランスジェニックマウスモデルのヒトアミロイド斑およびＡＤアミロイド斑に結合し得る、抗Ａβ１−６ペプチド抗体の高い力価を誘導し得る。さらに、誘発された抗体は、脳薄片におけるＡＰＰには結合しない。
【００２３】
さらに、本発明は、ＡＤ処置の新規組成物、ワクチンおよび方法を提供する。Ａβ１−６ペプチドを含む組成物およびワクチンは、Ｔ細胞エピトープを欠いており、ＡＤ斑および可溶性Ａβと結合する抗体を誘導する。Ａβ１−６ペプチドは、コア粒子、好ましくはＶＬＰ、さらに好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰへのＡβペプチドの結合による高度反復性で秩序だった形で患者の免疫系に呈示される。
【００２４】
好ましい実施態様において、抗原または抗原決定基は、Ａβのフラグメント（DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA；配列番号９１）であるヒトアミロイドベータペプチドＡβ１−６（ＤＡＥＦＲＨ；配列番号７５）であり、ヒトアミロイドベータペプチドＡβ１−６はコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合されている。アミロイドベータタンパクは、配列番号９２で提供されている。アミロイドベータ前駆体タンパク質は、配列番号９３で提供されている。
【００２５】
すなわち本発明は、（ａ）少なくとも１個の第一付着部位を有するコア粒子、および
（ｂ）少なくとも１個の第二付着部位を有する少なくとも１個の抗原または抗原決定基を含む組成物であって、抗原または抗原決定基がＡβ１−６ペプチドであり、そして第二付着部位が、（ｉ）自然の状態では抗原または抗原決定基をもたない付着部位、および（ii）自然の状態で抗原または抗原決定基をもつ付着部位から成る群から選択されるものであり、第二付着部位が第一付着部位と会合し得、そして抗原または抗原決定基およびコア粒子がその会合を通して相互作用することにより、規則正しい反復性抗原アレイを形成する組成物を提供する。本発明での使用に適切なコア粒子の好ましい実施態様は、ウイルス、ウイルス様粒子、バクテリオファージ、ＲＮＡファージのウイルス様粒子、細菌線毛または鞭毛または本発明による規則正しい反復性抗原アレイを形成し得る固有の反復構造を有する他のコア粒子である。
【００２６】
本発明のＡβフラグメントは、可溶性であり、一般的には凝集体を形成しない。さらに、それらはコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合、好ましくは共有結合している。したがって、本発明組成物には、傷害作用、たとえばアミロイド沈着の播種を誘導する危険性が無い。
【００２７】
この発明の予想外の発見は、可溶性ＡβおよびＡＤアミロイド斑と交差反応性を示す高い力価の抗体が、コア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合したＡβ１−６ペプチドを含む組成物により得られるということである。特に、ＶＬＰは、自己抗原に対する抗体の誘導を伝達し、自己寛容性を破壊することが示された（国際公開第０２／０５６９０５号、これについては出典明示で援用する）。さらに、このエピトープのサイズが小さいことから、Ｔ細胞エピトープの存在が除外されるため、Ａβ特異的Ｔ細胞応答を誘導しない新規組成物が提供される。さらに、誘発された抗体は、脳薄片におけるＡＰＰとは結合しない。すなわち、本発明は、ＡＤの予防および処置用の安全なワクチンを提供する。
【００２８】
さらに具体的には、本発明は、規則正しい反復性抗原または抗原決定基アレイ、および特にＡβ１−６ペプチドＶＬＰコンジュゲートを含む組成物を提供する。さらに具体的には、本発明は、ウイルス様粒子およびそれに結合した少なくとも１つのＡβ１−６ペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、コンジュゲートおよび規則正しい反復性アレイの各製造方法を提供する。本発明組成物は、アルツハイマー病処置用ワクチンおよびアルツハイマー病を予防または治療し、免疫応答、特に抗体応答を効果的に誘導するための治療用ワクチンの製造において有用である。さらに、本発明組成物は、示された状況内で自己特異的免疫応答を効果的に誘導するのに特に有用である。
【００２９】
本発明において、Ａβ１−６ペプチドは、典型的には特定方向に指向した形で、コア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合されており、規則正しい反復性Ａβ１−６ペプチド抗原アレイを生成する。さらに、コア粒子およびＶＬＰの各構造は、高度反復性で組織されており、高度に組織された反復性抗原アレイに至る高度に規則正しい反復的な形でＡβペプチドの呈示を伝達する。さらに、コア粒子およびＶＬＰは、コア粒子−Ａβ１−６ペプチドアレイおよびＶＬＰ−Ａβ１−６ペプチドアレイにより個々に免疫化された宿主にとっては異質であるため、コア粒子およびＶＬＰへのＡβ１−６の個々の結合によりＴヘルパー細胞エピトープが提供される。上記アレイは、特にそれらの高度に組織化された構造、寸法およびアレイ表面における抗原の反復性の点で先行技術のコンジュゲートとは異なる。
【００３０】
本発明の一局面では、Ａβ１−６ペプチドは化学的に合成され、コア粒子およびＶＬＰはそれぞれコア粒子およびＶＬＰの個々の折りたたみおよび組立に適切な発現宿主から発現および精製される。次いで、Ａβ１−６ペプチドアレイは、Ａβ１−６ペプチドをコア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合させることにより組立てられる。
【００３１】
別の局面において、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子、および（ｂ）少なくとも１個の抗原または抗原決定基を含む組成物を提供し、その場合抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドであり、少なくとも１個の抗原または抗原決定基はウイルス様粒子に結合されている。
【００３２】
さらなる局面において、本発明は、（ａ）本発明組成物、および（ｂ）許容される医薬用担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
さらに別の局面において、本発明は、（ａ）ウイルス様粒子、および（ｂ）少なくとも１個の抗原または抗原決定基を含む組成物であって、抗原または抗原決定基がＡβ１−６ペプチドであり、少なくとも１個の抗原または抗原決定基はウイルス様粒子に結合されている組成物を含むワクチン組成物を提供する。
【００３４】
別の局面において、本発明は、動物に本発明組成物、本発明医薬組成物または本発明ワクチンを投与することを含む免疫化方法を提供する。
【００３５】
さらに別の局面において、本発明は、本発明組成物の製造方法であって、（ａ）ウイルス様粒子を準備し、（ｂ）少なくとも一抗原または抗原決定基（ただし、抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドである）を準備し、（ｃ）少なくとも一抗原または抗原決定基がウイルス様粒子に結合するようにウイルス様粒子および少なくとも一抗原または抗原決定基を合わせる工程を含む方法を提供する。
【００３６】
同様に、本発明は、（ａ）少なくとも１個の第一付着部位を有するコア粒子を準備し、（ｂ）少なくとも１個の第二付着部位を有する少なくとも１個の抗原または抗原決定基を準備し（ただし、抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドであり、第二付着部位が、（ｉ）自然の状態では抗原または抗原決定基をもたない付着部位、および（ii）自然の状態で抗原または抗原決定基をもつ付着部位から成る群から選択されるものであり、第二付着部位が第一付着部位と会合し得る）、そして（ｃ）コア粒子および少なくとも一抗原または抗原決定基を合わせる（ただし、抗原または抗原決定基およびコア粒子は、その会合を通して相互作用することにより、規則正しい反復性抗原アレイを形成する）工程を含む、請求項１記載の組成物の製造方法を提供する。
【００３７】
さらなる局面において、本発明は、アルツハイマー病処置用医薬の製造についての請求項１記載の組成物の使用に関するものである。
【００３８】
さらに別の局面において、本発明は、アルツハイマー病の治療または予防処置用医薬の製造についての請求項１記載の組成物の使用に関するものである。さらに、さらなる局面において、本発明は、アルツハイマー病を治療または予防し、および／または哺乳類免疫系を刺激するための組成物、医薬組成物、ワクチン、薬剤または医薬の製造を目的とする、単独または他の薬剤と組み合わせた、または特異物質、たとえばアジュバントの明確な非存在下における請求項１記載の組成物の使用に関するものである。
【００３９】
したがって、本発明は、特に、アルツハイマー病またはそれに関連した状態の予防および／または弱毒化に適切なワクチン組成物を提供する。さらに本発明は、ヒトにおけるアルツハイマー病またはそれに関連した状態の予防および／または弱毒化をそれぞれ目的とする、免疫化およびワクチン接種方法を提供する。本発明組成物は、予防的または治療的に使用され得る。
【００４０】
実施態様において、本発明は、「自己」遺伝子産物、すなわち本明細書で使用されている「自己抗原」により誘発または増悪されるアルツハイマー病またはそれに関連した状態の予防および／または弱毒化方法を提供する。関連態様において、本発明は、動物および個体における各免疫学的応答の誘導方法であって、「自己」遺伝子産物により誘発または増悪されるアルツハイマー病またはそれに関連した状態を予防および／または弱毒化する抗体産生を誘導する方法を提供する。
【００４１】
当業者には容易に理解できるように、本発明組成物を動物またはヒトに投与したとき、それらは塩類、緩衝液、アジュバント、または組成物の効力を改良するのに望ましい他の物質を含む組成物中に含まれ得る。医薬組成物製造での使用に適切な材料の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences （Osol, A編、マック・パブリッシング・カンパニー（1990））を含む多数の供給源で提供されている。
【００４２】
本発明組成物は、それらの投与が受容個体による耐容性がある場合、「医薬上許容される」ものであると言われる。さらに、本発明組成物は、「治療有効量」（すなわち、所望の生理学的効果を生じる量）で投与される。
【００４３】
本発明組成物は、当業界で公知の様々な方法により投与され得るが、通常、注射、注入、吸入、経口投与、または他の適切な物理的方法により投与される。別法として、組成物は、筋肉内、静脈内または皮下的に投与され得る。投与用組成物の成分には、滅菌水性（例、生理食塩水）または非水性溶液および懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、たとえばオリーブ油、および注射可能有機エステル、たとえばエチルオレエートである。担体または閉鎖密封法（occlusive dressing）は、皮膚浸透性を増し、抗原吸収を高めるのに使用され得る。
【００４４】
本発明の他の態様は、当業界で公知のこと、以下の図面および発明の記載および請求の範囲に照らし合わせると当業者にとって容易に理解できるものである。
【００４５】
図面の簡単な説明
図１は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰへのＡβ１−６ペプチド（NH2-DAEFRHGGC-CONH2）（配列番号７７）のカップリングの結果を示す、還元条件下で実施された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００４６】
図２は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清中のＡβ１−６に特異的な抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【００４７】
図３は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清中のＡβ１−４０に特異的な抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【００４８】
図４Ａ−Ｂは、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清で染色されたＡＰＰ２３マウスの脳薄片（Ａ）およびＡＤ患者からの内嗅野薄片（Ｂ）を示す。
【００４９】
図５Ａ−Ｅは、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清、またはヒトまたはマウスＡＰＰのＣ−末端に特異的なポリクローナルウサギ抗血清で染色されたＡＰＰ２３マウスの脳薄片を示す。
【００５０】
図６は、ＥＬＩＳＡ検定法において測定されたＱβ ＶＬＰにカップリングされたヒトＡβ１−６によるアカゲザルの免疫化の結果を示す。
【００５１】
図７は、ヒトＡＤおよびトランスジェニックマウス斑に関する組織学により測定された、Ｑβ ＶＬＰにカップリングされたヒトＡβ１−６により免疫化されたサル血清の斑への結合の結果を示す。
【００５２】
図８は、ＡＰ２０５ＶＬＰへのネズミＡβ１−６のカップリングのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【００５３】
図９は、ＥＬＩＳＡ検定法で測定されたＡＰ２０５にカップリングされたネズミＡβ１−６によるマウス免疫化の結果を示す。
【００５４】
図１０は、９.５〜１９ヶ月令のＱβｈＡβ１−６により免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスの血清における抗Ａβ４０および抗Ａβ４２力価のＥＬＩＳＡによる分析を示す。
【００５５】
図１１は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスの脳薄片の免疫組織化学的染色を示す。
【００５６】
図１２は、９.５〜１９ヶ月令のＱβｈＡβ１−６、ＱβまたはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【００５７】
図１３は、１３.５〜１９ヶ月令のＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【００５８】
図１４は、ＱβｈＡβ１−６により免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスの血清における抗Ａβ４０および抗Ａβ４２力価のＥＬＩＳＡによる分析を示す。
【００５９】
図１５は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスからの脳薄片の免疫組織化学的染色を示す。
【００６０】
図１６は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【００６１】
発明の詳細な記載
特に定義しない場合、本明細書で使用されている技術および科学用語は全て、本発明が属する分野における当該業者が通常理解しているのと同じ意味を有するものとする。本明細書記載のものと類似または均等内容の方法および材料であれば使用され得るが、好ましい方法および材料を以後記載する。
【００６２】
１．定義
Ａβ１−６ペプチド：本明細書で使用されているＡβ１−６ペプチドは、ヒトＡβ１−６配列に対応するかまたはヒトＡβ１−６配列と相同的な配列を有するペプチドをいう。ヒトＡβ１−６配列と相同的な配列には、限定はされないが、他種のＡβ１−６配列、たとえば限定されるわけではないが、霊長類、ウサギ、モルモット、アフリカツメガエル、カエル、マウスおよびラットＡβ１−６がある。アフリカツメガエルまたはカエルからのＡβ１−６配列は、ヒトＡβ１−６とは２位置が異なるが、同類突然変異（Ａｌａ−Ｓｅｒ、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ）を有し、この定義によると依然としてＡβ１−６と相同的であると考えられる。しかしながら、本発明によると、Ａβ１−６ペプチドは、典型的には第二付着部位がそこに付着するように修飾されている。好ましくは、第二付着部位は、コア粒子およびＶＬＰにそれぞれ結合するための第二付着部位を含むリンカーまたはアミノ酸リンカーにより修飾されている。ここではＡβ１−６ペプチドについて述べているが、上記で示した修飾Ａβ１−６ペプチド、すなわち第二付着部位がそこに付着しているＡβ１−６ペプチドも包含されるべきである。しかしながら、一般的に、修飾は、本明細書では明確に表示されている。本発明による抗原または抗原決定基であるＡβ１−６ペプチドのさらなる好ましい態様は、この明細書で明確に後述されている。
【００６３】
アジュバント：本明細書で使用されている「アジュバント」の語は、本発明のワクチンおよび医薬組成物とそれぞれ組合わされたとき、さらに高い免疫応答を提供させ得る免疫応答の非特異的刺激因子または宿主においてデポーを生じさせ得る物質をいう。様々なアジュバントが使用され得る。例としては、完全および不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムおよび修飾ムラミルジペプチドがある。さらなるアジュバントは、鉱物ゲル、たとえば水酸化アルミニウム、表面活性物質、たとえばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、たとえばＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌、bacille Calmette−Guerin）およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）である。上記アジュバントもまた当業界ではよく知られている。本発明組成物と共に投与され得るさらなるアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫調節剤、ＡｄｊｕＶａｘ、１００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩類（Ａｌｕｍ）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４、およびウイロソームアジュバント技術があるが、これらに限定されるわけではない。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含み得る。
【００６４】
南アフリカ原産の木キラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮から誘導されたアジュバント活性を有する免疫学的活性サポニンフラクションは、当業界では公知である。たとえば、ＱＡ２１としても知られているＱＳ２１は、キラジャ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の木からのＨｐｌｃ精製フラクションであり、その製造方法は米国特許第５０５７５４０号に（ＱＡ２１として）開示されている。キラジャサポニンはまた、Scott et al, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409によりアジュバントとして開示されている。モノホスホリル脂質Ａおよびその誘導体は当業界では公知である。好ましい誘導体は、３脱−ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａであり、英国特許第２２２０２１１号により知られている。さらなる好ましいアジュバントは、国際公開第００／００４６２号に開示されており、出典明示で援用する。
【００６５】
しかしながら、本発明の有利な特徴は、本発明組成物の高い免疫原性である。既に本明細書で概説されているかまたは本明細書の後記部分で明らかになるように、アジュバントを欠くワクチンおよび医薬組成物が提供されており、さらに別のまたは好ましい態様では、アジュバントを欠き、すなわちアジュバントは副作用を誘発し得ることから優れた安全性プロフィールを有するＡＤ処置用ワクチンおよび医薬組成物が提供されている。ＡＤ処置用ワクチンおよび医薬組成物に関連して本明細書で使用されている「欠く」の語は、アジュバントを用いずに使用されるワクチンおよび医薬組成物を指す。
【００６６】
アミノ酸リンカー：本明細書で使用されている「アミノ酸リンカー」または本明細書内での単なる「リンカー」の語は、抗原または抗原決定基を第二付着部位と会合させるか、またはさらに好ましくは、既に第二付着部位から成るかまたはそれを典型的には−必ずという訳ではないが−一アミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含む。しかしながら、本明細書で使用されている「アミノ酸リンカー」の語は、アミノ酸残基から成るアミノ酸リンカーが本発明の好ましい態様であるにしても、上記アミノ酸リンカーが、アミノ酸残基によってのみ構成されることを意味する訳ではないものとする。アミノ酸リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは、当業界で公知の天然アミノ酸または非天然アミノ酸の全Ｌまたは全Ｄまたは混合物により構成される。しかしながら、スルフヒドリル基またはシステイン残基をもつ分子を含むアミノ酸リンカーもまた本発明の範囲内に包含される。かかる分子は、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル−、シクロアルキル（Ｃ５、Ｃ６）、アリールまたはヘテロアリール部分を含む。しかしながら、アミノ酸リンカーに加えて、好ましくはＣ１−Ｃ６アルキル−、シクロアルキル−（Ｃ５、Ｃ６）、アリール−またはヘテロアリール部分を含み、アミノ酸（複数も可）を欠くリンカーもまた、本発明の範囲内に包含されるべきである。抗原または抗原決定基または所望による第二付着部位およびアミノ酸リンカー間の会合は、好ましくは少なくとも１個の共有結合、さらに好ましくは少なくとも１個のペプチド結合を介するものである。
【００６７】
動物：本明細書で使用されている「動物」の語は、たとえばヒト、ヒツジ、ヘラジカ、シカ、ミュールジカ、ミンク、哺乳類、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、鳥類、ニワトリ、爬虫類、魚類、昆虫および蜘蛛形類を包含するものとする。
【００６８】
抗体：本明細書で使用されている「抗体」の語は、エピトープまたは抗原決定基と結合し得る分子をいう。この語は、１本鎖抗体を含む、全抗体およびその抗原結合性フラグメントを包含するものとする。最も好ましくは、抗体は、ヒト抗原結合性抗体フラグメントであり、Ｆａｂ、Ｆａｂ'およびＦ（ａｂ'）２、Ｆｄ、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインを含むフラグメントを包含するが、これらに限定されるわけではない。抗体は、鳥類および哺乳類を含むあらゆる動物に由来するものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ブタ、ラクダ、ウマまたはニワトリに由来するものである。本明細書で使用されている「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、たとえば、Kucherlapati et alによる米国特許第５９３９５９８号に記載されている通り、ヒト免疫グロブリンライブラリーまたは一またはそれ以上のヒト免疫グロブリンについてのトランスジェニック動物から単離され、内在性免疫グロブリンを発現することのない抗体を包含する。
【００６９】
抗原：本明細書で使用されている「抗原」の語は、ＭＨＣ分子により提示された場合抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）により結合され得る分子をいう。また、本明細書で使用されている「抗原」の語は、Ｔ細胞エピトープを包含する。抗原は、さらに免疫系により認識され得、および／または体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導することにより、Ｂおよび／またはＴリンパ球の活性化をまねき得る。しかしながら、これは、少なくともある種の場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むかまたはそれに結合しており、アジュバント中で与えられることを必要とし得る。抗原は、１個またはそれ以上のエピトープ（ＢおよびＴエピトープ）を有し得る。上記の特異的反応は、好ましくは抗原が、典型的には高度選択的な形で、他の抗原により誘導され得る多数の他の抗体またはＴＣＲではなく、その対応する抗体またはＴＣＲと反応することを意味する。本明細書で使用されている抗原はまた、幾つかの個々の抗原の混合物でもあり得る。
【００７０】
抗原決定基：本明細書で使用されている「抗原決定基」の語は、ＢまたはＴリンパ球により特異的に認識される抗原の部分を指すものとする。抗原決定基に応答しているＢリンパ球は抗体を産生し、Ｔリンパ球は、増殖および細胞性および／または体液性免疫の伝達にとって重大なエフェクター機能の確立により抗原決定基に応答する。
【００７１】
会合：本明細書で使用されている「会合」の語は、それが第一および第二付着部位に適用されているとき、好ましくは少なくとも１個の非ペプチド結合による第一および第二付着部位の結合をいう。会合の性質は、共有結合性、イオン結合性、疎水性、極性またはそれらの組合せであり得、好ましくは会合の性質は共有結合である。
【００７２】
付着部位、第一：本明細書で使用されている「第一付着部位」の語は、抗原または抗原決定基上に位置する第二付着部位が会合し得る非天然または天然由来のエレメントをいう。第一付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）またはそれらの組合せ、またはその化学反応基であり得る。第一付着部位は、典型的には、そして好ましくはコア粒子、たとえば好ましくはウイルス様粒子の表面上に位置する。多重第一付着部位は、コアおよびウイルス様粒子のそれぞれ表面に、典型的には反復立体配座で存在する。
【００７３】
付着部位、第二：本明細書で使用されている「第二付着部位」の語は、コア粒子およびウイルス様粒子のそれぞれ表面上に位置する第一付着部位が会合し得る抗原または抗原決定基に伴うエレメントをいう。抗原または抗原決定基の第二付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然または合成ポリマー、二次代謝物または化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、またはその組合せ、またはその化学反応基であり得る。少なくとも１個の第二付着部位は、抗原または抗原決定基に存在する。したがって、「少なくとも１個の第二付着部位をもつ抗原または抗原決定基」の語は、抗原または少なくとも抗原または抗原決定基および第二付着部位を含む抗原性構築物をいう。しかしながら、特に非天然由来である、すなわち抗原または抗原決定基内に天然には存在しない第二付着部位の場合、これらの抗原または抗原性構築物は「アミノ酸リンカー」を含む。
【００７４】
結合：本明細書で使用されている「結合（された）」の語は、たとえば化学的カップリングによる共有結合、または非共有結合、たとえばイオン相互作用、疎水性相互作用、水素結合などであり得る結合または付着をいう。共有結合は、たとえばエステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素−硫黄結合、炭素−リン結合などであり得る。「結合（された）」の語は、たとえば「カップリング（された）」、「融合（された）」および「付着（した）」の語より広義であり、それらを包含する。
【００７５】
コートタンパク質（複数も可）：本明細書で使用されている「コートタンパク質（複数も可）」の語は、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのキャプシド集合内に組込まれ得るバクテリオファージまたはＲＮＡファージのタンパク質（複数も可）をいう。しかしながら、ＲＮＡ−ファージのコートタンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物をいうとき、「ＣＰ」の語が使用される。たとえば、ＲＮＡ−ファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「Ｑβ ＣＰ」と称され、バクテリオファージＱβの「コートタンパク質」は、「Ｑβ ＣＰ」およびＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのキャプシドは、主としてＱβ ＣＰにより構成され、Ａ１タンパク質の含有量は僅かである。同様に、ＶＬＰ Ｑβコートタンパク質は、主としてＱβ ＣＰを含み、Ａ１タンパク質の含有量は僅かである。
【００７６】
コア粒子：本明細書で使用されている「コア粒子」の語は、固有の反復構成をもつ固定した構造をいう。本明細書で使用されているコア粒子は、合成方法の生成物または生物学的過程の生成物であり得る。
【００７７】
カップリング（された）：本明細書で使用されている「カップリング（された）」の語は、共有結合または強い非共有結合的相互作用による結合、典型的には、そして好ましくは共有結合による結合をいう。生物学的活性材料のカップリングについて当業者により常用される方法であれば全て、本発明で使用され得る。
【００７８】
有効量：本明細書で使用されている「有効量」の語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要または充分な量をいう。組成物の有効量は、この選択された結果を達成する量であり、かかる量は、当業者により慣例的な事柄として決定され得る。たとえば、免疫系欠損症の処置に有効な量は、免疫系の活性化を誘発することにより、抗原への曝露時に抗原特異的免疫応答を発生させるのに必要な量であり得る。この語はまた、「充分量」と同意語である。
【００７９】
特定適用のための有効量は、処置されている病気または状態、投与されている特定組成物、対象の大きさ、および／または病気または状態の重症度といった因子により変化し得る。通常当業者であれば、過度の実験を必要とせずに、本発明の特定組成物の有効量を経験的に決定できるはずである。
【００８０】
エピトープ：本明細書で使用されている「エピトープ」の語は、動物、好ましくは哺乳類、および最も好ましくはヒトにおける抗原性または免疫原活性を有するポリペプチドの連続または非連続部分をいう。エピトープは、抗体またはＭＨＣ分子の状況ではＴ細胞受容体を通してＴ細胞により認識される。本明細書で使用されている「免疫原性エピトープ」の語は、当業界でよく知られている方法により測定されたところによると、動物において抗体応答を誘発するかまたはＴ細胞応答を誘導するポリペプチドの一部分として定義される。（たとえば、Geysen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８１：３９９８−４００２（１９８３）参照）。本明細書で使用されている「抗原性エピトープ」の語は、当業界でよく知られている方法により測定される、抗体が免疫特異的にその抗原と結合し得るタンパク質の一部分として定義される。免疫特異的結合は、非特異的結合を排除するが、必ずしも他抗原との交差反応性を排除するわけではない。抗原性エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。抗原性エピトープはまた、Ｔ細胞エピトープであり得、その場合、それらはＭＨＣ分子の状況内においてＴ細胞受容体により免疫特異的に結合され得る。
【００８１】
エピトープは、エピトープに特有である空間立体配座で３個のアミノ酸を含み得る。一般的に、エピトープは、少なくとも約５個の上記アミノ酸により構成され、さらに通常は、少なくとも約８〜１０個の上記アミノ酸により構成される。エピトープが有機分子である場合、それはニトロフェニル程度の小ささであり得る。
【００８２】
融合：本明細書で使用されている「融合」の語は、一ポリペプチド鎖における起源が異なるアミノ酸配列の組合せであって、それらのコーディングヌクレオチド配列の枠内組合せによるものをいう。「融合」の語は、明確に、内部融合、すなわち、一ポリペプチド鎖内における起源が異なる配列の挿入を、その末端の一つへの融合に加えて包含する。
【００８３】
免疫応答：本明細書で使用されている「免疫応答」の語は、Ｂおよび／またはＴリンパ球および／または抗原提示細胞の活性化または増殖をまねく体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答をいう。しかしながら、免疫応答が低強度であり得、本発明による少なくとも１種の物質を用いるときしか検出され得ない場合もある。「免疫原性」とは、生きている生物体の免疫系を刺激することにより、免疫系の一つまたはそれ以上の機能を増強させ、免疫原性薬剤に指向させるのに使用される薬剤を指す。「免疫原性ポリペプチド」は、単独であろうと、アジュバントの存在または非存在下で担体に結合されておろうと、いずれにしても細胞性および／または体液性免疫応答を誘発するポリペプチドである。好ましくは、抗原提示細胞は活性化され得る。
【００８４】
免疫応答を「高める」物質とは、物質を加えずに測定される免疫応答と比べたとき、物質の添加により大きいかまたは強化されたかまたは何らかの意味で偏向した同免疫応答が観察される物質をいう。たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶菌活性は、免疫化中に物質を使用し、および使用せずに得られた試料において、たとえば５１Ｃｒ放出検定法を用いることにより測定され得る。物質を加えない場合のＣＴＬ溶菌活性と比べて、ＣＴＬ溶菌活性が高められる物質の量は、抗原に対する動物の免疫応答を高めるのに充分な量であるといわれている。好ましい態様では、免疫応答は、少なくとも約２の係数、さらに好ましくは約３またはそれ以上の係数により高められる。分泌されるサイトカインの量またはタイプも改変され得る。別法として、誘導される抗体またはそれらのサブクラスの量が改変され得る。
【００８５】
免疫化：本明細書で使用されている「免疫化する」または「免疫化」の語またはその関連語は、標的抗原またはエピトープに対する実質的免疫応答（抗体および／または細胞性免疫、たとえばエフェクターＣＴＬを含む）を展開させる能力を付与することをいう。これらの語は、完全な免疫性を生じさせることを要求しているのではなく、実質的に基準より大きい免疫応答を生じさせることを要求している。たとえば、本発明方法の適用後に標的抗原に対する細胞性および／または体液性免疫応答が生じた場合、哺乳類は標的抗原に対して免疫化されていると考えられ得る。
【００８６】
天然由来：本明細書で使用されている「天然由来」の語は、全体またはその一部が合成的ではなく、自然に存在するか生成されることを意味する。
【００８７】
非天然由来の：本明細書で使用されているこの語は、一般的に自然から生じたものではないことを意味し、さらに具体的には、この語は人の手を経ていることをいう。
【００８８】
非天然由来：本明細書で使用されている「非天然由来」の語は、一般的に合成的であるかまたは自然から生じたものではないことを意味し、さらに具体的には、この語は人の手を経ていることを意味する。
【００８９】
規則正しい反復性抗原または抗原決定基アレイ：本明細書で使用されている「規則正しい反復性抗原または抗原決定基アレイ」の語は、一般的に、典型的にそして好ましくはコア粒子およびウイルス様粒子のそれぞれに関して抗原または抗原決定基の均一な空間配置を特徴とする、抗原または抗原決定基の反復パターンをいう。本発明の一態様において、反復パターンは、幾何的パターンであり得る。適切な規則正しい反復性抗原または抗原決定基アレイの典型的で好ましい例は、好ましくは０.５〜３０ナノメートル、さらに好ましくは５〜１５ナノメートルのスペーシングを伴う、厳密に反復的な準結晶性秩序の抗原または抗原決定基を有するものである。
【００９０】
線毛：本明細書で使用されている「線毛」（pili、単数形は「pilus」）の語は、規則正しい反復性パターンへ組織化されているタンパク質モノマー（例、ピリンモノマー）により構成される細菌細胞の細胞外構造をいう。さらに、線毛は、たとえば宿主細胞表面受容体への細菌細胞の付着、細胞間遺伝子交換および細胞−細胞認識といったプロセスに関与する構造である。線毛の例には、１型線毛、Ｐ−線毛、Ｆ１Ｃ線毛、Ｓ−線毛および９８７Ｐ−線毛がある。線毛の追加例は下記に示されている。
【００９１】
線毛様構造：本明細書で使用されている「線毛様構造」の語は、線毛構造と類似した特徴を有し、タンパク質モノマーにより構成される構造をいう。「線毛様構造」の一例は、天然線毛の構造と同一である規則正しい反復性アレイを形成しない修飾ピリンタンパク質を発現する細菌細胞により形成される構造である。
【００９２】
ポリペプチド：本明細書で使用されている「ポリペプチド」の語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）により線状に結合されたモノマー（アミノ酸）から成る分子をいう。それは、アミノ酸の分子鎖を示すもので、生成物の具体的な長さをいうのではない。すなわち、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。この語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、たとえば糖化（glycosolation）、アセチル化、リン酸化などを包含するものとする。組換え体または誘導ポリペプチドは、必ずしも指示された核酸配列から翻訳されるわけではない。それはまた、化学合成を含む何らかの方法で生成され得る。
【００９３】
残基：本明細書で使用されている「残基」の語は、ポリペプチドバックボーンまたは側鎖における特異的アミノ酸を意味するものとする。
【００９４】
自己抗原：本明細書で使用されている「自己抗原」の語は、宿主ＤＮＡによりコード化されるタンパク質をいい、宿主ＤＮＡによりコード化されるタンパク質またはＲＮＡにより産生される生成物は自己として定義される。さらに、２個または幾つかの自己分子の組合せから生じるかまたは自己分子のフラクションを表すタンパク質および上記の２個の自己分子と高い相同性（＞９５％、好ましくは＞９７％、さらに好ましくは＞９９％）を有するタンパク質もまた、自己としてみなされ得る。
【００９５】
処置：本明細書で使用されている「処置」、「処置する」、「処置された」または「処置している」の語は、予防および／または治療をいう。たとえば、感染性疾患に関して使用されているとき、この語は、病原体による感染に対する対象の抵抗力を増強させるか、または言い換えれば、対象が病原体に感染するかまたは感染症に起因する病気の徴候を示す尤度を減らす予防的処置、ならびに対象が感染した後に感染症と闘う、たとえば感染を低減化または排除するかまたはそれが悪化するのを防ぐための処置をいう。
【００９６】
ワクチン：本明細書で使用されている「ワクチン」の語は、本発明組成物を含み、動物に投与され得る形態をしている処方物をいう。典型的には、ワクチンは、本発明組成物が懸濁または溶解される慣用的食塩水または緩衝水溶液媒質を含む。この形態では、本発明組成物は、病状を阻止、軽減または他の方法で処置するのに使用され得る。宿主へ導入されると、ワクチンは、限定するわけではないが、抗体および／またはサイトカインの産生および／または細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、および／または他の細胞性応答を含む免疫応答を誘発することができる。
【００９７】
所望により、本発明ワクチンは、さらに、本発明化合物に対して小さな比率または大きな比率で存在し得るアジュバントを含んでいてもよい。
【００９８】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用されている「ウイルス様粒子」の語は、ウイルス粒子に似た構造をいう。さらに、本発明によるウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの全部または一部、特にウイルスゲノムの複製性および感染性成分を欠くため、非複製性および非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、それらのゲノムとは区別される核酸を含み得る。本発明によるウイルス様粒子の典型的で好ましい態様は、ウイルスキャプシド、たとえば対応するウイルス、バクテリオファージまたはＲＮＡファージのウイルスキャプシドである。本明細書で互換的に使用されている「ウイルスキャプシド」または「キャプシド」の語は、ウイルスタンパク質サブユニットにより構成される巨大分子集合をいう。典型的に、そして好ましくは、ウイルスタンパク質サブユニットは、固有の反復構成をもつ構造を有するウイルスキャプシドおよびキャプシドにそれぞれ集合し、その場合上記構造は典型的には球状または管状である。たとえば、ＲＮＡファージまたはＨＢｃＡｇのキャプシドは、二十面体シンメトリーの球状形態を有する。本明細書で使用されている「キャプシド様構造」の語は、上記定義の意味でキャプシド形態と似ているが、典型的球状集合から偏向しており、充分な程度の秩序および反復性を維持しているウイルスタンパク質サブユニットで構成される巨大分子集合をいう。
【００９９】
バクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で使用されている「バクテリオファージのウイルス様粒子」の語は、バクテリオファージの構造と類似し、非反復性および非感染性であり、バクテリオファージの複製機構についてコード化する少なくとも一遺伝子または複数遺伝子を欠き、典型的には同じく宿主へのウイルス付着または侵入に関与する一タンパク質または複数タンパク質をコード化する一遺伝子または複数遺伝子を欠くウイルス様粒子をいう。しかしながら、この定義はまた、前記一遺伝子または複数遺伝子が依然として存在はするが、不活性であることにより、バクテリオファージの非複製性および非感染性ウイルス様粒子となる、バクテリオファージのウイルス様粒子も包含すべきである。
【０１００】
ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ：ＲＮＡファージコートタンパク質の１８０サブユニットの自己集合から形成され、所望により宿主ＲＮＡを含んでいてもよいキャプシド構造は、「ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ」と称される。具体例はＱβコートタンパク質のＶＬＰである。この特定の場合では、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰは、排他的にＱβ ＣＰサブユニットから構築されるか（たとえば、サプレッションを通して長いＡ１タンパク質の発現を予め排除するＴＡＡ停止コドンを含むＱβ ＣＰ遺伝子の発現により生成される、Kozlovska, T.M., et al., Intervirology 39: 9-15 （1996）参照）、または追加的にキャプシド集合においてＡ１タンパク質サブユニットを含み得る。
【０１０１】
ウイルス粒子：本明細書で使用されている「ウイルス粒子」の語は、ウイルスの形態学的形態をいう。ウイルスのタイプによっては、タンパク質キャプシドにより囲まれたゲノムを含む場合もあれば、追加構造（例、エンベロープ、テイルなど）を有する場合もある。
【０１０２】
Ｏｎｅ、ａまたはａｎ：「ｏｎｅ」、「ａ」または「ａｎ」の語が、この開示の英文テキストにおいて使用されているとき、特に示していない場合、それらは「少なくとも一つ（１個）」または「一つ（１個）またはそれ以上」を意味する。
【０１０３】
当業者には明らかなことであるように、本発明のある種の態様は、組換え核酸技術、たとえばクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡおよびＲＡＮの精製、原核生物および真核生物細胞における組換えタンパク質の発現などの使用を含む。上記方法は当業者には熟知されており、好都合には出版された実験方法のマニュアルから見出され得る（例、Sambrook, J. et al.編, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989）; Ausubel, F. et al.編、Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. （1997））。組織培養セルラインによる作業についての根本的実験技術（Celis, J.編、 Cell Biology、アカデミック・プレス、第２版（１９９８））および抗体に基く技術（Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1988）; Deutscher, M.P., "Guide to Protein Purification," Meth. Enzymol. 128、アカデミック・プレス、サンディエゴ（1990）; Scopes, R.K., Protein Purification Principles and Practice、第３版、スプリンガー−フェルラーク、ニューヨーク （1994））もまた十分に文献に記載されており、これらを全て、出典明示で援用する。
【０１０４】
２．免疫応答を高める組成物および材料
開示されている発明は、動物においてＡβ１−６ペプチドに対する免疫応答を誘導し、Ａβアミロイド斑および可溶性Ａβに結合し得る抗体を誘導する組成物および方法を提供する。本発明組成物は、（ａ）少なくとも１個の第一付着部位を有するコア粒子、および
（ｂ）少なくとも１個の第二付着部位を有する少なくとも１個の抗原または抗原決定基を含むか、またはそれらにより構成され、その場合、抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドであり、そして第二付着部位は、（ｉ）自然の状態では抗原または抗原決定基をもたない付着部位、および（ii）自然の状態で抗原または抗原決定基をもつ付着部位から成る群から選択されるものであり、第二付着部位は第一付着部位と会合し得、そして抗原または抗原決定基およびコア粒子はその会合を通して相互作用することにより、規則正しい反復性抗原アレイを形成する。さらに具体的には、本発明組成物は、ウイルス様粒子および少なくとも１個の抗原または抗原決定基を含むかまたはそれらにより構成され、その場合、抗原または抗原決定基はＡβ１−６ペプチドであり、少なくとも１個の抗原または抗原決定基は、規則正しい反復性抗原−ＶＬＰアレイを形成するようにウイルス様粒子に結合されている。さらに、本発明は、好都合なことに現場の人が、特にアルツハイマー病の処置および／または予防的阻止用の上記組成物を構築することを可能にする。本願明細書におけるウイルス様粒子は、ウイルス粒子と類似してはいるが、病原性ではない構造をいう。一般に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムを欠くため、非感染性である。また、ウイルス様粒子は、異種発現により大量に製造され得、容易に精製され得る。
【０１０５】
一態様において、コア粒子は、ウイルス、細菌線毛、細菌性ピリンから形成された構造、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、ＲＮＡファージのウイルス様粒子、ウイルスキャプシド粒子またはそれらの組換え形態を包含するか、またはそれらから成る群から選択される。規則正しい反復性コートおよび／またはコアタンパク質構造を有する当業界で公知のウイルスであれば、本発明のコア粒子として選択され得る。適切なウイルスの例としては、シンドビスおよび他のアルファウイルス、ラブドウイルス（例、水疱性口内炎ウイルス）、ピコルナウイルス（例、ヒトリノウイルス、愛知ウイルス）、トガウイルス（例、風疹ウイルス）、オルソミクソウイルス（例、トゴトウイルス、バトケンウイルス（Batken virus）、家禽ペストウイルス）、ポリオーマウイルス（例、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、鳥ポリオーマウイルスＢＦＤＶ）、パルボウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、タバコモザイクウイルス、フロックハウスウイルス、およびヒトパピローマウイルス、および好ましくはＲＮＡファージ、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージＭ１１、バクテリオファージＭＸ１、バクテリオファージＮＬ９５、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＭＳ２、バクテリオファージｆ２、バクテリオファージＰＰ７がある（たとえば、Bachmann, M.F. および Zinkernagel, R.M., Immunol. Today 17:553-558 （1996）における表１参照）。
【０１０６】
さらなる態様において、本発明は、ウイルスの遺伝子工学技術を使用することにより、規則正しい反復性ウイルスエンベロープタンパク質および異種タンパク質、ペプチド、抗原決定基または選抜された反応性アミノ酸残基により構成されるか、または択一的にまたは好ましくはそれらである第一付着部位間に融合を形成させる。当業者に公知の他の遺伝子操作も本発明組成物の構築に含まれ得る。たとえば、遺伝子突然変異誘発を通じて組換えウイルスの複製能力を制限することが望ましいことであり得る。さらに、本発明に使用されるウイルスは、化学的または物理的不活化故に、または指摘されている通り、複製適格ゲノムの欠如故に複製不適格である。第一付着部位への融合に選択されるウイルスタンパク質は、組織化された反復構造を有するべきである。かかる組織化された反復性構造は、ウイルス表面上に５〜３０ｎｍ、好ましくは５〜１５ｎｍのスペーシングをもつ準結晶性構成を含む。このタイプの融合タンパク質の作製により、ウイルス表面上に多数の規則正しい反復性第一付着部位がもたらされ、天然ウイルスタンパク質の通常の構成が反映される。当業者には容易に理解できるように、第一付着部位は、抗原または抗原決定基を特異的に付着させる機能を果たし得る適切なタンパク質、ポリペプチド、糖、ポリヌクレオチド、ペプチド（アミノ酸）、天然または合成ポリマー、二次代謝物またはそれらの組合せであるか、またはそれらの一部であることにより、規則正しい反復性抗原アレイを誘導し得る。
【０１０７】
本発明の別の態様において、コア粒子は、組換えアルファウイルス、さらに特定すれば組換えシンドビスウイルスである。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質において、ＤＮＡ中間体を伴わずにそれらのゲノムＲＮＡを完全に複製するプラス鎖ＲＮＡウイルスである（Strauss, J. および Strauss, E., Microbiol. Rev. 58:491-562 （1994））。アルファウイルスファミリーの幾つかの要員、シンドビス（Xiong, C. et al., Science 243:1188-1191 （1989）; Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 （1993））、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）（Liljestrom, P. & Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361 （1991））およびその他（Davis, N.L. et al., Virology 171:189-204 （1989））は、様々な異なるタンパク質についてのウイルスに基く発現ベクターとして（Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 （1997）; Liljestrom, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5:495-500 （1994））、およびワクチン開発用候補としての使用に関してかなりの注目を受けている。最近では、若干の特許が、異種タンパク質の発現についてのアルファウイルスの使用およびワクチン開発に関して出ている（米国特許第 5,766,602; 5,792,462; 5,739,026; 5,789,245 および 5,814,482号参照）。本発明アルファウイルスコア粒子の構築は、上記文献により記載されているように、組換えＤＮＡ技術分野で公知の手段により為され得、それらについては出典明示で援用する。
【０１０８】
様々な異なる組換え宿主細胞が、抗原または抗原決定基付着のためのウイルスに基くコア粒子の製造に使用され得る。たとえば、アルファウイルスは、広い宿主範囲を有することが知られている。シンドビスウイルスは、培養哺乳類、爬虫類、および両生類細胞、ならびに若干の昆虫細胞に感染する（Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51:645 （1973）; Leake, C., J. Gen. Virol. 35:335 （1977）; Stollar, V., The Togaviruses, R.W. Schlesinger編、アカデミック・プレス（1980）, 583−621頁）。すなわち、非常に多くの組換え宿主細胞が本発明の実践に際し使用され得る。ＢＨＫ、ＣＯＳ、ベロ、ヒーラおよびＣＨＯ細胞は、ヒト細胞と類似した方法で異種タンパク質をグリコシル化する可能性を有するため、それらは異種タンパク質の製造に特に適切であり（Watson, E. et al., Glycobiology 4:227, （1994））、血清不含有培地および懸濁液中で増殖させるのに選択されるか（Zang, M. et al., Bio/Technology 13:389 （1995））または遺伝子操作され得る（Renner W. et al., Biotech. Bioeng. 4:476 （1995）; Lee K. et al. Biotech. Bioeng. 50:336 （1996））。
【０１０９】
宿主細胞へのポリヌクレオチドベクターの導入は、標準実験マニュアル（例、Sambrook, J. et al.編、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989）、９章; Ausubel, F. et al.編、 Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. （1997）、１６章参照）記載の方法、たとえば電気穿孔、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、トランスフェクション、顕微注入、カチオン性脂質介在トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング、衝撃導入および感染といった方法により実施され得る。宿主細胞への外生ＤＮＡ配列の導入方法は、Felgner,P.et al., 米国特許第５５８０８５９号で検討されている。
【０１１０】
パッケージされたＲＮＡ配列もまた宿主細胞の感染に使用され得る。これらのパッケージＲＮＡ配列は、それらを培養培地へ加えることにより導入され得る。たとえば、非感染性アルファウイルス粒子の製造は、"Sindbis Expression System", バージョンC （Invitrogen カタログ番号 K750-1）を含む、若干の出典に記載されている。
【０１１１】
哺乳類細胞をウイルスに基くコア粒子製造用の組換え宿主細胞として使用するとき、これらの細胞は、一般的に組織培養で増殖される。培養細胞の増殖方法は、当業界では公知である（たとえば、Celis, J.編、 Cell Biology, アカデミック・プレス、第２版 （1998）; Sambrook, J. et al.編、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989）; Ausubel, F. et al.編、Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. （1997）; Freshney, R., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc. （1983）参照）。
【０１１２】
本発明におけるコア粒子としての使用に適切なＲＮＡウイルスのさらなる例には、限定はされないが、以下のものが含まれる：レオウイルス科、たとえばオルトレオウイルス属（哺乳類および鳥レトロウイルスの両方の多血清型）、オービウイルス属（ブルータングウイルス、エウゲナンギー（Eugenangee）ウイルス、ケメロボ（Kemerovo）ウイルス、アフリカウマ病ウイルス、およびコロラドダニ熱ウイルス）、ロタウイルス属（ヒトロタウイルス、ネブラスカ子牛下痢ウイルス、ネズミロタウイルス、シミアンロタウイルス、ウシまたはヒツジロタウイルス、鳥ロタウイルス）、ピコマウイルス科、たとえばエンテロウイルス属（ポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡおよびＢ、エコー（エンテリック・サイトパシック・ヒューマン・オーファン、ＥＣＨＯ）ウイルス、Ａ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＧ型肝炎ウイルス、シミアンエンテロウイルス、ネズミ脳脊髄炎（ＭＥ）ウイルス、ポリオウイルス・ムリス（muris）、ウシエンテロウイルス、ブタエンテロウイルス）、カーディオウイルス属（脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣ）、メンゴウイルス）、リノウイルス属（少なくとも１１３のサブタイプを含むヒトリノウイルス；他のリノウイルス）、アプトウイルス（Apthovirus）属（口蹄疫ウイルス（ＥＭＤＶ））、カルシウイルス科、たとえばブタ水疱性発疹ウイルス、サンミグエルアザラシウイルス、ネコピコルナウイルスおよびノーウォークウイルス、トガウイルス科、たとえばアルファウイルス属（東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョング−ニョング（O'Nyong-Nyong）ウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス）、フラビウイルス属（カ媒介黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジン（Kunjin）ウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介脳炎ウイルス、極東ダニ媒介脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）、ブンヤウイルス科、たとえばブンヤウイルス属（ブンヤムウェラ（Bunyamwera）および関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱シチリアウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）およびウクウイルス（Uukuvirus）属（ウクニエミ（Uukuniemi）および関連ウイルス）、オルトミクソウイルス科、たとえばインフルエンザウイルス属（インフルエンザＡ型ウイルス、多くのヒトサブタイプ）、ブタインフルエンザウイルスおよび鳥およびウマインフルエンザウイルス、インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（可能な独立属）、パラミクソウイルス科、たとえばパラミクソウイルス属（パラインフルエンザ１型ウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザ（血球吸着）ウイルス、パラインフルエンザ２〜５型ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎���イルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイルス、ジステンバーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（呼吸器性シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）、ウシの呼吸器性シンシチアルウイルスおよびマウス肺炎ウイルス）、森林病ウイルス、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、オニョング−ニョング（O'Nyong-Nyong）ウイルス、ロス川ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス）、フラビウイルス属カ媒介黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、クンジン（Kunjin）ウイルス、中央ヨーロッパダニ媒介脳炎ウイルス、極東ダニ媒介脳炎ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、跳躍病ウイルス、ポーワッサンウイルス、オムスク出血熱ウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルス）、ブンヤウイルス科、たとえばブンヤウイルス属（ブンヤムウェラ（Bunyamwera）および関連ウイルス、カリフォルニア脳炎群ウイルス）、フレボウイルス属（サシチョウバエ熱シチリアウイルス、リフトバレー熱ウイルス）、ナイロウイルス属（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ナイロビヒツジ病ウイルス）およびウクウイルス（Uukuvirus）属（ウクニエミ（Uukuniemi）および関連ウイルス）、オルトミクソウイルス科、たとえばインフルエンザウイルス属（インフルエンザＡ型ウイルス、多くのヒトサブタイプ）、ブタインフルエンザウイルスおよび鳥およびウマインフルエンザウイルス、インフルエンザＢ型（多くのヒトサブタイプ）、およびインフルエンザＣ型（可能な独立属）、パラミクソウイルス科、たとえばパラミクソウイルス属（パラインフルエンザ１型ウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザ（血球吸着）ウイルス、パラインフルエンザ２〜５型ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）、麻疹ウイルス属（麻疹ウイルス、亜急性硬化性汎脳炎ウイルス、ジステンバーウイルス、牛疫ウイルス）、肺炎ウイルス属（呼吸器性シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）、ウシの呼吸器性シンシチアルウイルスおよびマウス肺炎ウイルス）、ラブドウイルス科、たとえばベシクロウイルス（ＶＳＶ）属、チャンディプラ（Chandipura）ウイルス、フランダース−ハートパーク（Flanders-Hart Park）ウイルス）、リッサウイルス属（狂犬病ウイルス）、魚類ラブドウイルスおよび、フィロウイルス（マルブルクウイルスおよびエボラウイルス）、アレナウイルス科、たとえばリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭ）、タカリベウイルス群、およびラッサウイルス、コロナウイルス科、たとえば伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス、ヒトエンテリックコロナウイルス、およびネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ネココロナウイルス）。
【０１１３】
コア粒子として使用され得るＤＮＡウイルスの実例としては、限定される訳ではないが、以下のものが挙げられる：ポックスウイルス科、たとえばオルトポックスウイルス属（大痘瘡、小痘瘡、サルポックスワクシニア、牛痘、水牛痘、家兎痘、エクトロメリア）、レポリポックスウイルス属（粘液腫、線維腫）、鳥類ポックスウイルス属（鶏痘、他の鳥ポックスウイルス）、カプリポックスウイルス属（ヒツジ痘、ヤギ痘）、スイポックスウイルス属（豚痘）、パラポックスウイルス属（伝染性膿疱性皮膚炎ウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス）、イリドウイルス科（アフリカブタコレラウイルス、カエルウイルス２および３、魚類のリムフォキスティスウイルス）、ヘルペスウイルス科、たとえばアルファ−ヘルペスウイルス（単純疱疹１および２型、水痘−帯状疱疹、ウマ流産ウイルス、ウマヘルペスウイルス２および３、仮性狂犬病ウイルス、ウシ伝染性角結膜炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、伝染性咽頭気管炎ウイルス）、ベータ−ヘルペスウイルス（ヒトサイトメガロウイルスならびにブタ、サルおよびげっ歯動物のサイトメガロウイルス）、ガンマ−ヘルペスウイルス（エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、マレク病ウイルス、ヘルペスサイミリ（Herpes saimiri）、ヘルペスウイルスアテレス（ateles）、ヘルペスウイルスシルビラグス（sylvilagus）、モルモットヘルペスウイルス、リュッケ腫瘍ウイルス）、アデノウイルス科、たとえばマストアデノウイルス属（ヒトサブグループＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥおよびグループ化されていないもの、シミアンアデノウイルス（少なくとも２３血清型）、感染性イヌ肝炎、ならびにウシ、ブタ、ヒツジ、カエルおよび多くの他の種のアデノウイルス）、鳥類アデノウイルス属（鳥アデノウイルス）、および非培養可能アデノウイルス、パポバウイルス科、たとえば乳頭腫ウイルス属（ヒト乳頭腫ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、ショープウサギ乳頭腫ウイルス、および他の種の様々な病原性乳頭腫ウイルス）、ポリオーマウイルス属（ポリオーマウイルス、サル空胞形成ウイルス（ＳＶ−４０）、ウサギ空胞形成ウイルス（ＲＫＶ）、Ｋウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、および他の霊長類ポリオーマウイルス、たとえばリンパ向行乳頭腫ウイルス）、パルボウイルス科、たとえばアデノ関連ウイルス属、パルボウイルス属（ネコ汎白血球減少症ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、アリューシャンミンク病ウイルス等）。最後に、ＤＮＡウイルスには、たとえば慢性感染性ニューロ端―因子（ＣＨＩＮＡウイルス）といったウイルスも含まれ得る。
【０１１４】
他の態様において、細菌性ピリン、細菌性ピリンの小部分（subportion）、または細菌性ピリンまたはその小部分を含む融合タンパク質が、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ製造するのに使用される。ピリンタンパク質の例には、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）、ネイッセリア・メニンギチディス（Neisseria meningitides）、ネイッセリア・ゴノロエアエ（Neisseria gonorrhoeae）、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）、シュードモナス・スツツェリ（Pseudomonas stutzeri）、およびシュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）により産生されるピリンがある。本発明による使用に適切なピリンタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ報告ＡＪ０００６３６、ＡＪ１３２３６４、ＡＦ２２９６４６、ＡＦ０５１８１４、ＡＦ０５１８１５およびＸ００９８１に示されたものを含み、それらについては出典明示で援用する。
【０１１５】
細菌性ピリンタンパク質は、一般に、プロセッシングにより、細菌周辺細胞質へのタンパク質輸送に先行してＮ−末端先導配列が除去される。さらに、当業者が認識しているように、本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ製造するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、一般的に天然に存在する先導配列を有しない。
【０１１６】
本発明での使用に適切なピリンタンパク質の一具体例は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）のＰ−ピリン（ＧｅｎＢａｎｋ報告ＡＦ２３７４８２（配列番号１））である。本発明での使用に適切な１型エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ピリンの一例は、ＧｅｎＢａｎｋ報告Ｐ０４１２８（配列番号２）に示されたアミノ酸配列を有するピリンであり、これはＧｅｎＢａｎｋ報告Ｍ２７６０３（配列番号３）に示されたヌクレオチド配列を有する核酸によりコード化される。これらのＧｅｎＢａｎｋ報告の全開示については、出典明示で援用する。また、上記参照タンパク質の成熟形態は、一般的に本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ製造するのに使用される。
【０１１７】
本発明の実践における使用に適切な細菌性ピリンまたはピリン小部分は、一般に会合することにより規則正しい反復性抗原アレイを形成することができる。
【０１１８】
線毛および線毛様構造のインビトロ製造方法は、当業界では公知である。たとえば、Bullitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12890−12895 （1996）は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）Ｐ−線毛サブユニットのインビトロ再構成について報告している。さらに、Eshdat et al., J. Bacteriol. 148:308−314 （1981）は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）の１型線毛の適切な解離方法および線毛の再構成について記載している。簡単に述べると、これらの方法は以下の通りである：飽和グアニジン塩酸塩中３７℃でインキュベーションすることにより線毛を解離させる。次いで、ピリンタンパク質をクロマトグラフィーにより精製した後、５ｍＭトリス（ヒドロキシルメチル）アミノメタン塩酸塩（ｐＨ８.０）に対する透析によりピリン二量体が形成される。Eshdat et al.はまた、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ｐＨ８.０）に対して透析すると、ピリン二量体が再集合して線毛を形成することを見出した。
【０１１９】
さらに、たとえば、慣用的遺伝子工学およびタンパク質修飾方法を用いることにより、ピリンタンパク質は、抗原または抗原決定基が第二付着部位を介して結合する第一付着部位を含むように修飾され得る。別法として、抗原または抗原決定基は、第二付着部位を通じてこれらのタンパク質に天然に内在するアミノ酸残基に直接結合され得る。次いで、これらの修飾ピリンタンパク質は、本発明のワクチン組成物で使用され得る。
【０１２０】
本発明の組成物およびワクチン組成物をそれぞれ製造するのに使用される細菌性ピリンタンパク質は、ＨＢｃＡｇについて本明細書に記載したのと同様の方法で修飾され得る。たとえば、システインおよびリシン残基は、欠失または他のアミノ酸残基により置換され得、第一付着部位がこれらのタンパク質に付加され得る。さらに、ピリンタンパク質は、修飾形態で発現されるかまたは発現後化学的に修飾され得る。同様に、無傷の線毛は、細菌から採取され、次いで化学的に修飾され得る。
【０１２１】
別の実施態様では、線毛または線毛様構造を細菌（例、エシェリキア・コリ（Escherichia coli））から採取し、本発明の組成物およびワクチン組成物の形成に使用する。組成物およびワクチン組成物の製造に適切な線毛の一例は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）の１型線毛であり、これは配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するピリンモノマーから形成される。
【０１２２】
若干の細菌性線毛の採取方法が当業界では公知である。たとえば、Bullitt および Makowski （Biophys. J. 74:623−632 （1998））は、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）からＰ−線毛を採取するための線毛精製方法について報告している。この方法によると、Ｐ−線毛プラスミドを含む過剰線毛エシェリキア・コリ（Escherichia coli）から線毛をせん断し、可溶化およびＭｇＣｌ２（１.０Ｍ）沈澱のサイクルにより精製する。
【０１２３】
一旦採取されると、線毛または線毛様構造は、様々な方法で修飾され得る。たとえば、第一付着部位は、抗原または抗原決定基が第二付着部位を通じて付着され得る線毛に付加され得る。言い換えれば、細菌性線毛または線毛構造を採取し、修飾することにより、規則正しい反復性抗原アレイが誘導され得る。
【０１２４】
抗原または抗原決定基は、線毛または線毛構造に天然に存するシステイン残基またはリシン残基に結合され得る。かかる場合、天然アミノ酸残基の高度に規則正しい反復性により、線毛または線毛様構造への抗原または抗原決定基のカップリングが誘導される。たとえば、線毛または線毛様構造は、ヘテロ二官能性架橋剤を用いることにより、抗原または抗原決定基の第二付着部位に結合され得る。
【０１２５】
生物体により自然に合成される構造（例、線毛）を用いて本発明の組成物およびワクチン組成物を製造するとき、これらの生物体が望ましい特徴を有する構造を生じるようにそれらに遺伝子操作を加えるのが有利な場合が多い。たとえば、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）の１型線毛を使用するとき、これらの線毛が採取されるエシェリキア・コリ（Escherichia coli）に修飾を加えることにより、特定の特徴をもつ構造が生成され得る。ピリンタンパク質の可能な修飾の例には、１個またはそれ以上のリシン残基の挿入、１個またはそれ以上の天然に存するリシン残基の欠失または置換、および１個またはそれ以上の天然に存するシステイン残基の欠失または置換（例、配列番号２における４４および８４位のシステイン残基）がある。
【０１２６】
さらに、ピリン遺伝子に追加修飾を加えることにより、リシン残基以外の第一付着部位（例、ＦＯＳまたはＪＵＮドメイン）を含む発現産物が生成され得る。勿論、適切な第一付着部位は、一般的に、ピリンタンパク質が、本発明ワクチン組成物での使用に適切な線毛または線毛様構造を形成するのを妨げることのないものに限られている。
【０１２７】
細菌細胞に天然に内在するピリン遺伝子は、インビボで修飾され得る（例、相同的組換えによる）かまたは特定の特徴をもつピリン遺伝子がこれらの細胞に挿入され得る。たとえば、ピリン遺伝子は、複製可能なクローニングベクターまたは細菌染色体へ挿入されるベクターの一成分として細菌細胞へ導入され得る。挿入されたピリン遺伝子はまた、発現調節制御配列（例、ｌａｃオペレーター）に結合され得る。
【０１２８】
たいていの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物においてそれぞれ使用される線毛または線毛様構造は、単一型のピリンサブユニットにより構成される。同一サブユニットにより構成される線毛または線毛様構造は、高度に規則正しい反復性抗原アレイを呈する構造を形成することが予測されることから、一般的に使用される。
【０１２９】
しかしながら、本発明組成物はまた、異種ピリンサブユニットから形成された線毛または線毛様構造を含む組成物およびワクチンを含む。これらの線毛または線毛様構造を形成するピリンサブユニットは、細菌細胞に天然に内在する遺伝子から発現され得るかまたは細胞へ導入され得る。天然に内在するピリン遺伝子および導入された遺伝子が両方とも、線毛または線毛様構造を形成する細胞で発現されるとき、一般的にこれらのピリンタンパク質の混合物から形成される構造となる。さらに、２種またはそれ以上のピリン遺伝子が細菌細胞で発現されるとき、各ピリン遺伝子の相対的発現性が、典型的には線毛または線毛様構造における種々のピリンサブユニットの比率を決定する因子である。
【０１３０】
混合ピリンサブユニットの特定組成を有する線毛または線毛様構造が所望されるとき、ピリン遺伝子の少なくとも１種の発現は、異種誘導性プロモーターにより調節され得る。上記プロモーター、ならびに他の遺伝子エレメントは、細菌細胞で製造される種々のピリンサブユニットの相対量、すなわち線毛または線毛様構造の組成を調節するのに使用され得る。
【０１３１】
さらに、抗原または抗原決定基は、ペプチド結合ではない結合により細菌線毛または線毛様構造に結合され得、本発明組成物で使用される線毛または線毛様構造を生成する細菌細胞は、遺伝子操作を加えられることにより、抗原または抗原決定基に融合されるピリンタンパク質を生成し得る。線毛または線毛様構造を形成する上記融合タンパク質は、本発明のワクチン組成物での使用に適切である。
【０１３２】
好ましい実施態様において、コア粒子は、ウイルス様粒子であり、ウイルス様粒子は組換え体ウイルス様粒子である。当業者であれば、組換えＤＮＡ技術および公的に容易に入手できるウイルスコーディング配列を用いてＶＬＰを製造することは可能である。たとえば、ウイルスエンベロープまたはコアタンパク質のコーディング配列は、市販されているバクロウイルス発現ベクターを用いて、ウイルスプロモーターの調節制御下、コーディング配列を調節配列に機能し得るように結合させ得る適切な修飾を配列に加えることにより、バクロウイルス発現ベクターでの発現用に遺伝子操作され得る。ウイルスエンベロープまたはコアタンパク質のコーディング配列はまた、たとえば細菌発現ベクターでの発現用に遺伝子操作され得る。
【０１３３】
ＶＬＰの例には、Ｂ型肝炎ウイルス（Ulrich, et al., Virus Res. 50:141-182 （1998））、麻疹ウイルス（Warnes, et al., Gene 160:173-178 （1995））、シンドビスウイルス、ロタウイルス（米国特許第５０７１６５１号および米国特許第５３７４４２６号）、口蹄疫ウイルス（Twomey, et al., Vaccine 13:1603−1610, （1995））、ノーウォークウイルス（Jiang, X., et al., Science 250:1580−1583 （1990）; Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456−1461 （1991））のキャプシドタンパク質、レトロウイルスＧＡＧタンパク質（国際公開第９６／３０５２３号）、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１、Ｂ型肝炎ウイルスの表面タンパク質（国際公開第９２／１１２９１号）、ヒト乳頭腫ウイルス（国際公開第９８／１５６３１号）、ＲＮＡファージ、Ｔｙ、ｆｒ−ファージ、ＧＡ−ファージ、ＡＰ２０５−ファージおよびＱβ−ファージがあるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３４】
当業者には容易に理解できることであるが、本発明のＶＬＰが特定形態に限定されることはない。粒子は化学的に、または生物学的過程を通して合成され得、天然の場合も非天然の場合もあり得る。例として、このタイプの具体例にはウイルス様粒子またはその組換え形態がある。
【０１３５】
さらなる実施態様において、ＶＬＰは、組換えポリペプチド、またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成され得、それらはロタウイルスの組換えポリペプチド、ノーウォークウイルスの組換えポリペプチド、アルファルイスの組換えポリペプチド、口蹄疫ウイルスの組換えポリペプチド、麻疹ウイルスの組換えポリペプチド、シンドビスウイルスの組換えポリペプチド、ポリオーマウイルスの組換えポリペプチド、レトロウイルスの組換えポリペプチド、Ｂ型肝炎ウイルスの組換えポリペプチド（例、ＨＢｃＡｇ）、タバコモザイクウイルスの組換えポリペプチド、フロックハウスウイルスの組換えポリペプチド、ヒト乳頭腫ウイルスの組換えポリペプチド、バクテリオファージの組換えポリペプチド、ＲＮＡファージの組換えポリペプチド、Ｔｙの組換えポリペプチド、ｆｒ−ファージの組換えポリペプチド、ＧＡ−ファージの組換えポリペプチドおよびＱβ−ファージの組換えポリペプチドから選択される。さらに、ウイルス様粒子は、上記ポリペプチドおよび上記ポリペプチドの変異型の１個またはそれ以上のフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成され得る。ポリペプチドの変異型は、それらの野生型対応物と、たとえば、アミノ酸レベルで少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の同一性を共有し得る。
【０１３６】
好ましい態様において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、本質的にそれらにより構成されるか、またはそれらにより構成される。好ましくは、ＲＮＡ−ファージは、ａ）バクテリオファージＱβ、ｂ）バクテリオファージＲ１７、ｃ）バクテリオファージｆｒ、ｄ）バクテリオファージＧＡ、ｅ）バクテリオファージＳＰ、ｆ）バクテリオファージＭＳ２、ｇ）バクテリオファージＭ１１、ｈ）バクテリオファージＭＸ１、ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、ｋ）バクテリオファージｆ２、ｌ）バクテリオファージＰＰ７、およびｍ）バクテリオファージＡＰ２０５から成る群から選択される。
【０１３７】
本発明の別の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβまたはＲＮＡ−バクテリオファージｆｒまたはＲＮＡ−バクテリオファージＡＰ２０５の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、それらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される。
【０１３８】
本発明のさらに好ましい実施態様では、組換えタンパク質は、ＲＮＡファージのコートタンパク質を含むか、それらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される。
【０１３９】
したがって、キャプシドまたはＶＬＰを形成するＲＮＡ−ファージコートタンパク質、またはキャプシドまたはＶＬＰへの自己集合と適合し得るバクテリオファージコートタンパク質のフラグメントは、本発明のさらに好ましい実施態様である。たとえば、バクテリオファージＱβコートタンパク質は、エシェリキア・コリ（E.coli）において組換え技法により発現され得る。さらに、上記発現時、これらのタンパク質は自発的にキャプシドを形成する。さらに、これらのキャプシドは、固有の反復構成をもつ構造を形成する。
【０１４０】
本発明組成物の製造に使用され得るバクテリオファージコートタンパク質の特に好ましい例には、ＲＮＡバクテリオファージ、たとえばバクテリオファージＱβ（配列番号４；ＰＩＲデータベース、Ｑβ ＣＰと称される受入番号ＶＣＢＰＱβおよび配列番号５；Ｑβ Ａ１タンパク質と称される受入番号ＡＡＡ１６６６３）、バクテリオファージＲ１７（配列番号６；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＲ７）、バクテリオファージｆｒ（配列番号７；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）、バクテリオファージＧＡ（配列番号８；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ−０４０７５４）、バクテリオファージＳＰ（配列番号９；ＳＰ ＣＰと称されるＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ３０３７４、および配列番号１０；ＳＰ Ａ１タンパク質と称される受入番号ＮＰ６９５０２６）、バクテリオファージＭＳ２（配列番号１１；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＭ２）、バクテリオファージＭ１１（配列番号１２；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ０６２５０）、バクテリオファージＭＸ１（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４６９９）、バクテリオファージＮＬ９５（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＣ１４７０４）、バクテリオファージｆ２（配列番号１５；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ０３６１１）、バクテリオファージＰＰ７（配列番号１６）、およびバクテリオファージＡＰ２０５（配列番号２８）のコートタンパク質がある。さらに、バクテリオファージＱβ（配列番号５）のＡ１タンパク質またはそのＣ−末端から１００、１５０または１８０ものアミノ酸を失ったＣ末端切頭化も、Ｑβコートタンパク質のキャプシド集合に組込まれ得る。一般的に、キャプシド集合におけるＱβ ＣＰに対するＱβ Ａ１タンパク質のパーセントは、キャプシド形成を確実にするために制限される。
【０１４１】
Ｑβコートタンパク質はまた、エシェリキア・コリ（E.coli）で発現されたときキャプシドに自己集合することが見出された（Kozlovska TM. et al., GENE 137: 133-137 （1993））。得られたキャプシドまたはウイルス様粒子は、直径２５ｎｍおよびＴ＝３準対称である二十面体ファージ様キャプシド構造を示した。さらに、ファージＱβの結晶構造が解明された。キャプシドは１８０コピーのコートタンパク質を含み、それらはジスルフィド架橋により共有結合五量体および六量体で結合されており（Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 （1996））、Ｑβコートタンパク質のキャプシドの著しい安定性が導かれる。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から生成されたキャプシドまたはＶＬＰは、キャプシド内の他のサブユニットへジスルフィド結合によって結合されていないかまたは結合が不完全であるサブユニットを含み得る。しかしながら、典型的には、約８０％を越えるサブユニットは、ＶＬＰ内でジスルフィド架橋により互いに結合されている。すなわち、Ｑβキャプシドを非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにローディングすると、モノマーＱβコートタンパク質に対応する帯およびＱβコートタンパク質の六量体または五量体に対応する帯が見られる。不完全ジスルフィド結合サブユニットは、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて二量体、三量体または場合によっては四量体の帯として現われ得る。Ｑβキャプシドタンパク質はまた、有機溶媒および変性剤に対して異常な抵抗性を示す。驚くべきことに、我々は、３０％もの高いＤＭＳＯおよびアセトニトリル濃度ならびに１Ｍもの高いグアニジニウム濃度でもキャプシドの安定性は影響されないことを観察した。Ｑβコートタンパク質のキャプシドの高い安定性は、特に、本発明による哺乳類およびヒトの免疫化およびワクチン接種での使用にとって有利な特徴である。
【０１４２】
我々が、Stoll, E. et al. J. Biol. Chem. 252:990-993 （1977）に記載されたＮ−末端エドマン配列決定法により観察したところによると、エシェリキア・コリ（E.coli）での発現時、Ｑβコートタンパク質のＮ−末端メチオニンは通常除去される。Ｎ−末端メチオニンが除去されていないＱβコートタンパク質から構成されるＶＬＰ、またはＮ−末端メチオニンが開裂されているかまたは存在するＱβコートタンパク質の混合物を含むＶＬＰもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１４３】
本発明による、ＲＮＡ−ファージ、特にＱβのさらに好ましいウイルス様粒子は、国際公開第０２／０５６９０５号に開示しており、それについては出典明示で援用する。
【０１４４】
また、さらなるＲＮＡファージコートタンパク質もまた、細菌宿主での発現時に自己集合することが示された（Kastelein, RA. et al., Gene 23: 245-254 （1983）, Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287: 452-455 （1986）, Adhin, MR. et al., Virology 170: 238-242 （1989）, Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 （1996）, Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 （1995））。Ｑβファージキャプシドは、コートタンパク質に加えて、いわゆるリードスルータンパク質Ａ１および成熟タンパク質Ａ２を含む。Ａ１は、ＵＧＡ停止コドンでのサプレッションにより生成され、３２９ａａの長さを有する。本発明で使用されるファージＱβ組換えコートタンパク質のキャプシドは、Ａ２溶菌タンパク質を欠き、宿主からのＲＮＡを含む。ＲＮＡファージのコートタンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ウイルスのライフサイクルの間翻訳リプレッサーとして作用するレプリカーゼ遺伝子のリボソーム結合部位のステムループと相互作用する。相互作用の配列および構造エレメントは既知である（Witherell, GW. & Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28: 71-76 （1989）; Lim F. et al., J. Biol. Chem. 271: 31839-31845 （1996））。一般にステムループおよびＲＮＡは、ウイルス集合に関与していることが知られている（Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 （1996））。
【０１４５】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−ファージの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されており、それらの組換えタンパク質は、ＲＮＡ−ファージの突然変異コートタンパク質、好ましくは上記ＲＮＡ−ファージの突然変異コートタンパク質を含むか、それらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される。別の好ましい実施態様において、ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質は、置換による少なくとも１個または少なくとも２個のリシン残基の除去により、または置換による少なくとも１個のリシン残基の付加により修飾されている。別法として、ＲＮＡファージの突然変異コートタンパク質は、少なくとも１個または少なくとも２個のリシン残基の欠失により、または挿入による少なくとも１個のリシン残基の付加により修飾されている。少なくとも１個のリシン残基の欠失、置換または付加により、カップリングの度合、すなわちＲＮＡ−ファージのＶＬＰのサブユニットについてのＡβ１−６ペプチドの量が、特にワクチンの必要条件とマッチし、適合するように変えられ得る。
【０１４６】
別の好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−バクテリオファージＱβの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されており、それらの組換えタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有するコートタンパク質、または配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５の突然変異体を有するコートタンパク質の混合物を含むか、それらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されており、Ｎ−末端メチオニンは好ましくは開裂されている。
【０１４７】
本発明のさらに好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、Ｑβの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されており、それらの組換えタンパク質は、突然変異体Ｑβコートタンパク質を含むか、それらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される。別の好ましい実施態様において、これらの突然変異コートタンパク質は、置換による少なくとも１個のリシン残基の除去により、または置換による少なくとも１個のリシン残基の付加により修飾されている。別法として、これらの突然変異コートタンパク質は、少なくとも１個のリシン残基の欠失により、または挿入による少なくとも１個のリシン残基の付加により修飾されている。
【０１４８】
４個のリシン残基がＱβコートタンパク質のキャプシド表面において露出されている。露出されたリシン残基がアルギニンにより置換されているＱβ突然変異体もまた本発明に使用され得る。すなわち、以下のＱβコートタンパク質突然変異体および突然変異体Ｑβ ＶＬＰが本発明の実践に際し使用され得る：「Qβ-240」（Lys13-Arg; 配列番号:17）、「Qβ-243」（Asn 10-Lys; 配列番号:18）、「Qβ-250」（Lys 2-Arg, Lys13-Arg; 配列番号:19）、「Qβ-251」（配列番号:20）および「Qβ-259」（Lys 2-Arg, Lys16-Arg; 配列番号:21）。すなわち、本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、突然変異体Ｑβコートタンパク質の組換えタンパク質を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されており、ａ） 配列番号１７のアミノ酸配列、ｂ） 配列番号１８のアミノ酸配列、ｃ） 配列番号１９のアミノ酸配列、ｄ） 配列番号２０のアミノ酸配列、およびｅ）配列番号２１のアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。上記で示したＱβコートタンパク質、突然変異体Ｑβコートタンパク質ＶＬＰおよびキャプシドのそれぞれの構築、発現および精製は、国際公開第０２／０５６９０５号に記載されている。特にここでは上記出願の実施例１８を引用する。
【０１４９】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、Ｑβの組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されており、それらの組換えタンパク質は、前記Ｑβ突然変異体および対応するＡ１タンパク質にいずれか一方の混合物を含むか、それらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成される。
【０１５０】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換えタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されている。
【０１５１】
ＡＰ２０５ゲノムは、成熟タンパク質、コートタンパク質、レプリカーゼおよび関連ファージには存在しない２つの読み枠により構成され、溶菌遺伝子および読み枠は成熟遺伝子の翻訳においてある一定の役割を演じる（Klovins,J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33  （2002））。ＡＰ２０５コートタンパク質は、ｐＱｂ１０（Kozlovska, T. M.. et al., Gene 137:133-37 （1993））の誘導体であり、ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む、プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号２７）から発現され得る。別法として、ＡＰ２０５コートタンパク質は、ベクターに存在するリボソーム結合部位の下流でｐＱｂ１８５へクローン化され得る。同時係属中の「分子抗原アレイ」と題する２００２年７月１７日付の米国仮特許出願（代理人処理番号１７００.０３１００００）で記載されている通り（これについては出典明示で援用する）、両方法ともタンパク質の発現およびキャプシドの形成を誘導する。ベクターｐＱｂ１０およびｐＱｂ１８５は、ｐＧＥＭベクターから誘導されるベクターであり、これらのベクターでクローン化された遺伝子の発現は、ｔｒｐプロモーターにより制御される（Kozlovska, T. M. et al., Gene 137:133-37 （1993））。プラスミドｐＡＰ２８３−５８（配列番号２７）は、ＡＰ２０５コートタンパク質のＸｂａＩ部位の下流であり、ＡＴＧ開始コドンの上流に近接している以下の配列において推定ＡＰ２０５リボソーム結合部位を含む：tctagaATTTTCTGCGCACCCAT CCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg（配列番号５７）。ベクターｐＱｂ１８５は、ＸｂａＩ部位から下流および開始コドンの上流にシャイン−デラガルノ配列を含む（tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAG TCAGGCCatg（配列番号５８）、シャイン−デラガルノ配列は下線部）。
【０１５２】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されている。
【０１５３】
すなわち、本発明のこの好ましい実施態様は、キャプシドを形成するＡＰ２０５コートタンパク質を含む。上記タンパク質は組換え技法により発現されるか、または天然供給源から製造される。電子顕微鏡（ＥＭ）および免疫拡散法により立証されているところによると、細菌で産生されるＡＰ２０５コートタンパク質は自発的にキャプシドを形成する。ＡＰ２０５コートタンパク質により形成されるキャプシドおよびＡＰ２０５ＲＮＡファージのコートタンパク質により形成されるキャプシドの構造特性は、ＥＭで見たときほとんど区別がつかない。ＡＰ２０５ ＶＬＰは、高免疫原性であり、抗原および／または抗原決定基と結合されることにより、反復的な形で配向された抗原および／抗原決定基を呈示するワクチン構築物を生成させ得る。かくして呈示された抗原に対して高い力価が誘発されることから、結合された抗原／抗原決定基は抗体分子との相互作用に向けて接近し得、免疫原性であることが示されている。
【０１５４】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換え突然変異コートタンパク質またはそのフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されている。
【０１５５】
５位アミノ酸のプロリンからトレオニンへの置換を伴うＡＰ２０５コートタンパク質（配列番号２９）を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合適格性突然変異形態もまた、本発明の実践に際し使用され得、本発明のさらなる好ましい態様を導く。これらのＶＬＰ、天然供給源に由来するＡＰ２０５ ＶＬＰ、またはＡＰ２０５ウイルス粒子は、抗原に結合されることにより、本発明による抗原の規則正しい反復性アレイを生成させ得る。
【０１５６】
ＡＰ２０５ Ｐ５−Ｔ突然変異コートタンパク質は、ｐＱｂ１８５から直接誘導され、Ｑβコートタンパク質遺伝子の代わりに突然変異ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子を含む、プラスミドｐＡＰ２８１−３２（配列番号３０）から発現され得る。ＡＰ２０５コートタンパク質発現用ベクターは、エシェリキア・コリ（E.coli）へトランスフェクションされることにより、ＡＰ２０５コートタンパク質を発現させる。
【０１５７】
ＶＬＰへの自己集合を誘導する、コートタンパク質および突然変異コートタンパク質のそれぞれの発現方法は、実施例１に記載されている。適切なエシェリキア・コリ（E.coli）株には、限定されるわけではないが、エシェリキア・コリ（E.coli）Ｋ８０２、ＪＭ１０９、ＲＲ１がある。適切なベクターおよび株およびそれらの組合せは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりコートタンパク質および突然変異コートタンパク質のそれぞれの発現を、および所望によりまずキャプシドをゲル濾過で精製することによりキャプシド形成および集合を試験し、それに続いてそれらを免疫拡散検定法（オクタロニー試験）または電子顕微鏡で試験することにより同定され得る（Kozlovska, T. M.et al., Gene 137:133-37 （1993））。
【０１５８】
ベクターｐＡＰ２８３−５８およびｐＡＰ２８１−３２から発現されたＡＰ２０５コートタンパク質は、エシェリキア・コリ（E.coli）の細胞質におけるプロセッシング故に、最初のメチオニンアミノ酸を欠き得る。ＡＰ２０５ ＶＬＰの開裂、非開裂形態またはそれらの混合物も、本発明のさらなる好ましい実施態様である。
【０１５９】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質またはそのフラグメントおよびＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換え突然変異コートタンパク質またはそのフラグメントの混合物を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されている。
【０１６０】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、ウイルス様粒子は、ＲＮＡ−ファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質または組換え突然変異コートタンパク質のフラグメントを含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されている。
【０１６１】
ＶＬＰおよびキャプシドへそれぞれ集合し得る組換えＡＰ２０５コートタンパク質フラグメントもまた、本発明の実施において有用である。これらのフラグメントは、コートタンパク質および突然変異コートタンパク質のそれぞれの内部または末端での欠失により生成され得る。コートタンパク質および突然変異コートタンパク質配列における挿入またはコートタンパク質および突然変異コートタンパク質配列への抗原配列の融合、およびＶＬＰへの集合との適合性は、本発明のさらなる実施態様であり、キメラＡＰ２０５コートタンパク質、および粒子をそれぞれ導くものである。挿入、欠失およびコートタンパク質配列への融合の結果およびそれがＶＬＰへの集合と適合しうるか否かは、電子顕微鏡により測定され得る。
【０１６２】
ＡＰ２０５コートタンパク質、コートタンパク質フラグメントおよび上記キメラコートタンパク質により形成される粒子は、沈澱による分画工程およびたとえばセファロースＣＬ−４Ｂ、セファロースＣＬ−２Ｂ、セファロースＣＬ−６Ｂカラムおよびそれらの組合せを用いたゲル濾過による精製工程の組合せにより純粋形態で単離され得る。ウイルス様粒子の他の単離方法も当業界では公知であり、バクテリオファージＡＰ２０５のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離するのに使用され得る。たとえば、超遠心分離の使用による酵母レトロトランスポゾンＴｙのＶＬＰの単離は、米国特許第４９１８１６６号に記載されており、それについては出典明示により援用する。
【０１６３】
幾つかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている（Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 （1996））。上記情報を用いることにより、表面露出残基が同定され得るため、１個またはそれ以上の反応性アミノ酸残基が挿入または置換により挿入され得るようにＲＮＡ−ファージコートタンパク質が修飾され得る。その結果として、バクテリオファージコートタンパク質の上記修飾形態もまた本発明に使用され得る。すなわち、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異型（例、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＲ１７、バクテリオファージｆｒ、バクテリオファージＧＡ、バクテリオファージＳＰ、バクテリオファージＡＰ２０５およびバクテリオファージＭＳ２のコートタンパク質）もまた、本発明組成物の製造に使用され得る。
【０１６４】
上記で検討した変異型タンパク質の配列はそれらの野生型対応配列とは異なるが、これらの変異型タンパク質は、一般的にキャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。すなわち、さらに本発明は、さらにキャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質の変異型を含むそれぞれの組成物およびワクチン組成物、ならびに上記組成物およびワクチン組成物、上記組成物の製造に使用される個々のタンパク質サブユニット、およびこれらのタンパク質サブユニットをコード化する核酸分子のそれぞれの製造方法を包含する。すなわち、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成し、会合してキャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している野生型タンパク質の変異型も本発明の範囲内に含まれる。
【０１６５】
結果として、さらに本発明は、規則正しいアレイを形成し、固有の反復構造を有する野生型タンパク質と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されるタンパク質を含む組成物およびワクチン組成物をそれぞれ包含する。
【０１６６】
さらに、本発明組成物の製造に使用されるタンパク質をコード化する核酸分子も本発明の範囲内に含まれる。
【０１６７】
他の実施態様において、さらに本発明は、配列番号４〜２１に示されたアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されるタンパク質を含む組成物を包含する。
【０１６８】
また、本発明での使用に適切なタンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造、またはＶＬＰを形成するタンパク質のＣ−末端切頭化突然変異体も含まれる。上記切頭化突然変異体の具体例には、配列番号４〜２１のいずれかに示されたアミノ酸配列であって、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸がＣ−末端から除去された配列を有するタンパク質が含まれる。典型的には、これらのＣ−末端切頭化突然変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１６９】
また、本発明での使用に適切なさらなるタンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成するタンパク質のＮ−末端切頭化突然変異体も含まれる。上記切頭化突然変異体の具体例には、配列番号４〜２１のいずれかに示されたアミノ酸配列であって、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸がＮ−末端から除去された配列を有するタンパク質が含まれる。典型的には、これらのＮ−末端切頭化突然変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１７０】
本発明での使用に適切な追加的タンパク質には、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成するＮ−およびＣ−末端切頭化突然変異体も含まれる。適切な切頭化突然変異体には、配列番号４〜２１のいずれかに示されたアミノ酸配列であって、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸がＮ−末端から除去され、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸がＣ−末端から除去された配列を有するタンパク質が含まれる。典型的には、これらのＮ−末端およびＣ−末端切頭化突然変異体は、キャプシドまたはキャプシド様構造を形成する能力を保持している。
【０１７１】
さらに本発明は、上記切頭化突然変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されるタンパク質を含む組成物を包含する。
【０１７２】
すなわち本発明は、キャプシドまたはＶＬＰを形成するタンパク質から製造された組成物およびワクチン組成物、個々のタンパク質サブユニットおよびＶＬＰまたはキャプシドからこれらの組成物を製造する方法、これら個々のタンパク質サブユニットの製造方法、これらのサブユニットをコード化する核酸分子、およびこれらの本発明組成物を用いることによる個体におけるワクチン接種および／または免疫学的応答の誘発方法を包含する。
【０１７３】
前述の通り、本発明は、ウイルス様粒子またはその組換え形態を包含する。さらなる好ましい一実施態様において、本発明組成物で使用される粒子は、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢｃＡｇのフラグメントにより構成される。さらなる実施態様において、本発明組成物で使用される粒子は、遊離システイン残基を除去またはその数を減らすべく修飾された、Ｂ型肝炎コアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）またはＨＢｃＡｇタンパク質のフラグメントにより構成される。Zhou et al. （J. Virol. 66:5393−5398 （1992））は、天然に内在するシステイン残基を除去すべく修飾されたＨＢｃＡｇが集合およびキャプシド形成能力を保持していることを立証した。すなわち、本発明組成物での使用に適切なＶＬＰには、修飾ＨＢｃＡｇまたはそのフラグメントを含むものがあり、その場合天然に内在するシステイン残基の１個またはそれ以上が欠失または別のアミノ酸残基（例、セリン残基）により置換されている。
【０１７４】
ＨＢｃＡｇは、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のプロセッシングにより生成されるタンパク質である。ＨＢｃＡｇの若干のイソ型は既に同定されており、それらのアミノ酸配列は当業者には容易に入手できるものである。たいていの場合、本発明の組成物およびワクチン組成物は、それぞれＨＢｃＡｇのプロセッシングされた形態（すなわち、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ−末端先導配列が除去されたＨＢｃＡｇ）を用いて製造される。
【０１７５】
さらに、プロセッシングが行なわれない条件下で、ＨＢｃＡｇが製造されるとき、ＨＢｃＡｇは、一般的に「プロセッシングされた」形態で発現される。たとえば、細胞質へのタンパク質の発現を指令するエシェリキア・コリ（E.coli）発現系を本発明ＨＢｃＡｇの製造に使用するとき、これらのタンパク質は、一般的に、Ｂ型肝炎コア抗原前駆体タンパク質のＮ−末端先導配列が存在しないように発現される。
【０１７６】
本発明に関して使用され得るＢ型肝炎ウイルス様粒子の製造は、たとえば、国際公開第００／３２２２７号、特に実施例１７〜１９および２１〜２４、ならびに国際公開第０１／８５２０８号、特に実施例１７〜１９、２１〜２４、３１〜４１、および国際公開第０２／０５６９０５号に開示されている。最後に挙げた出願については、特に実施例２３、２４、３１および５１に示されている。３文書については全て明確に出典明示で援用する。
【０１７７】
本発明はまた、１個またはそれ以上の追加システイン残基を欠失または置換すべく修飾されたＨＢｃＡｇ変異型を包含する。遊離システイン残基が若干の化学的副反応に関与し得ることは、当業界では知られている。これらの副反応には、ジスルフィド交換、たとえば他の物質との組合せ治療において注射または形成される化学物質または代謝物との反応、または直接酸化およびＵＶ光線への曝露時におけるヌクレオチドとの反応がある。すなわち、特にＨＢｃＡｇが核酸と結合する強い傾向を有するという事実を考慮に入れると、毒性付加物が生成され得る。すなわち毒性付加物は様々な種の間に分配され、個々には各々低濃度で存在するが、一緒になったとき毒性レベルに達し得る。
【０１７８】
上記を考慮すると、天然に内在するシステイン残基を除去すべく修飾されたワクチン組成物においてＨＢｃＡｇを使用する一つの利点は、抗原または抗原決定基が付着されるとき、毒性種が結合し得る部位が、数の上で低減化されるかまたは全体的に排除されることである。
【０１７９】
本発明の実施における使用に適切な若干の天然ＨＢｃＡｇ変異型は既に同定されている。たとえば、Yuan et al., （J. Virol. 73:10122−10128 （1999））は、配列番号２２における９７位に対応する位置のイソロイシン残基が、ロイシン残基またはフェニルアラニン残基により置換された変異型について報告している。若干のＨＢｃＡｇ変異型および幾つかのＢ型肝炎コア抗原前駆体変異型のアミノ酸配列は、GenBank レポート AAF121240, AF121239, X85297, X02496, X85305, X85303, AF151735, X85259, X85286, X85260, X85317, X85298, AF043593, M20706, X85295, X80925, X85284, X85275, X72702, X85291, X65258, X85302, M32138, X85293, X85315, U95551, X85256, X85316, X85296, AB033559, X59795, X85299, X85307, X65257, X85311, X85301 （配列番号:23）, X85314, X85287, X85272, X85319, AB010289, X85285, AB010289, AF121242, M90520 （配列番号:24）, P03153, AF110999,およびM95589に開示されており、各々出典明示により援用する。上記で挙げたＢ型肝炎コア抗原前駆体変異形の配列は、さらに国際公開第０１／８５２０８号、配列番号８９〜１３８に開示されている。これらのＨＢｃＡｇ変異型は、配列番号２５における12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 および 183位に位置するアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む、若干の位置におけるアミノ酸配列が異なる。本発明組成物での使用に適切であり、本明細書の開示にしたがってさらに修飾され得るさらなるＨＢｃＡｇ変異型は、国際公開第００／１９８３３３号、国際公開第００／１７７１５８号および国際公開第００／２１４４７８号に記載されている。
【０１８０】
上記で示した通り、総じてプロセッシングされたＨＢｃＡｇ（すなわち、先導配列を欠くもの）は、本発明の組成物およびワクチン組成物のそれぞれで使用される。本発明は、上記変異型ＨＢｃＡｇを用いたワクチン組成物およびこれらの組成物の使用方法を包含する。
【０１８１】
ポリペプチドのアミノ酸配列が、上記野生型アミノ酸配列の一つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列またはその小部分を有するか否かは、好都合には公知コンピュータープログラム、たとえばＢｅｓｔｆｉｔプログラムを用いて測定され得る。特定配列が、たとえば、基準アミノ酸配列と９５％同一であるか否かを測定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは他のいずれかの配列アラインメントプログラムを使用するとき、同一性パーセントが基準アミノ酸配列の全長にわたって算出され、そして基準配列におけるアミノ酸残基の総数の５％以下の相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターを設定する。
【０１８２】
上記で挙げたＨＢｃＡｇ変異型および前駆体のアミノ酸配列は、互いに比較的類似している。すなわち、配列番号２５における特定位置に対応する位置に位置するＨＢｃＡｇ変異型のアミノ酸残基にとっての基準は、配列番号２５で示されたアミノ酸配列におけるその位置に存在するアミノ酸残基をいう。これらのＨＢｃＡｇ変異型間における相同性は、たいていの場合哺乳類に感染するＢ型肝炎ウイルス間では充分に高いため、当業者が、配列番号２５に示されたアミノ酸配列および特定ＨＢｃＡｇ変異型のアミノ酸配列の両方を検討し、「対応する」アミノ酸残基を同定する上でほとんど困難は無い。さらに、配列番号２４に示されたＨＢｃＡｇアミノ酸配列は、ウッドチャックに感染するウイルスから誘導されたＨＢｃＡｇのアミノ酸配列を示すもので、配列番号２５に示されたアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇと充分な相同性を有するため、３アミノ酸残基挿入体が、配列番号２５において、配列番号２５のアミノ酸残基１５５および１５６間に存在することは容易に理解できることである。
【０１８３】
本発明はまた、鳥類に感染するＢ型肝炎ウイルスのＨＢｃＡｇ変異型を含むワクチン組成物、ならびにこれらのＨＢｃＡｇ変異型のフラグメントを含むワクチン組成物を包含する。これらのＨＢｃＡｇ変異型については、これらのポリペプチドに天然に存在するシステイン残基の１個、２個、３個またはそれ以上が、本発明ワクチン組成物における含有前に別のアミノ酸残基により置換されるか、または欠失され得る。
【０１８４】
上記で検討した通り、遊離システイン残基の排除により、毒性成分がＨＢｃＡｇに結合し得る部位の数が低減化され、また同一または近隣ＨＢｃＡｇ分子のリシンおよびシステイン残基の架橋が形成され得る部位が排除される。したがって、本発明の別の実施態様では、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシドタンパク質の１個またはそれ以上のシステイン残基が欠失または別のアミノ酸残基により置換されている。
【０１８５】
他の実施態様において、本発明の組成物およびワクチン組成物は、それぞれＣ−末端領域（例、配列番号２５のアミノ酸残基１４５−１８５または１５０−１８５）が除去されたＨＢｃＡｇを含有する。すなわち、本発明の実施における使用に適切な追加的修飾ＨＢｃＡｇには、Ｃ−末端切頭化突然変異体が含まれる。適切な切頭化突然変異体には、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ−末端から除去されたＨＢｃＡｇがある。
【０１８６】
また、本発明の実施における使用に適切なＨＢｃＡｇには、Ｎ−末端切頭化突然変異体が含まれる。適切な切頭化突然変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸がＮ−末端から除去された修飾ＨＢｃＡｇが含まれる。
【０１８７】
本発明の実施における使用に適切なさらなるＨＢｃＡｇには、Ｎ−およびＣ−末端切頭化突然変異体が含まれる。適切な切頭化突然変異体には、１、２、５、７、９、１０、１２、１４、１５または１７アミノ酸がＮ−末端から除去され、そして１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３４、３５アミノ酸がＣ−末端から除去されたＨＢｃＡｇが含まれる。
【０１８８】
さらに本発明は、上記切頭化突然変異体と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれらにより本質的に構成されるか、またはそれらにより構成されるＨＢｃＡｇポリペプチドを含む、組成物およびワクチン組成物をそれぞれ含む。
【０１８９】
本発明のある種の実施態様では、リシン残基をＨＢｃＡｇポリペプチドへ導入することにより、ＨＢｃＡｇのＶＬＰへのＡβ１−６ペプチドの結合に介在させる。好ましい実施態様では、本発明組成物は、配列番号２５のアミノ酸１−１４４、または１−１４９、１−１８５を含むかまたはそれらにより構成されるＨＢｃＡｇにより製造され、このＨＢｃＡｇには、７９および８０位に対応するアミノ酸を、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３３）のアミノ酸配列を有するペプチドにより置換する修飾が加えられており、その結果、配列番号２６に示された配列を有するＨＢｃＡｇポリペプチドが生成される。これらの組成物は、抗原決定基がＨＢｃＡｇのＶＬＰにカップリングされているそれらの実施態様においては特に有用である。さらなる好ましい実施態様では、配列番号２５の４８および１０７位にあるシステイン残基をセリンに突然変異させている。さらに本発明は、上記で示したアミノ酸改変を有する上記で挙げたＢ型肝炎コア抗原前駆体変異型のいずれかで示されたアミノ酸配列を有する対応するポリペプチドを含む組成物を包含する。さらに、会合することにより、キャプシドまたはＶＬＰを形成し得、上記で示したアミノ酸改変を有する追加的ＨＢｃＡｇ変異型も本発明の範囲内に包含される。すなわち、さらに本発明は、野生型アミノ酸配列のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれらにより構成されるＨＢｃＡｇポリペプチド、および適切な場合プロセッシングされることにより、Ｎ−末端先導配列が除去され、上記で示した改変により修飾されたこれらのタンパク質形態を含む組成物およびワクチン組成物をそれぞれ包含する。
【０１９０】
本発明の組成物またはワクチン組成物は、異なるＨＢｃＡｇの混合物を含み得る。すなわち、これらのワクチン組成物は、アミノ酸配列が異なるＨＢｃＡｇにより構成され得る。たとえば、「野生型」ＨＢｃＡｇおよび１個またはそれ以上のアミノ酸残基が改変（例、欠失、挿入または置換）された修飾ＨＢｃＡｇを含むワクチン組成物が製造され得る。さらに、本発明の好ましいワクチン組成物は、高度に規則正しい反復性抗原アレイを提示し、その抗原がＡβ１−６ペプチドであるものである。
【０１９１】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、少なくとも一Ａβ１−６ペプチドが、少なくとも１個の共有結合により上記ウイルス様粒子およびコア粒子にそれぞれ結合されている。好ましくは、少なくとも一Ａβ１−６ペプチドは、少なくとも１個の共有結合によりウイルス様粒子およびコア粒子にそれぞれ結合されており、上記共有結合は、Ａβ１−６ペプチドアレイおよびＡβ１−６ペプチド−ＶＬＰコンジュゲートをそれぞれもたらす非ペプチド結合である。少なくとも一Ａβ１−６ペプチドはＶＬＰおよびコア粒子にそれぞれ一定の配向で結合されているため、このＡβ１−６ペプチドアレイおよびコンジュゲートはそれぞれ、典型的にそして好ましくは反復性の規則正しい構造を有する。以下の記載から明らかなように、反復性の規則正しいＡβ１−６ペプチド−ＶＬＰアレイおよびコンジュゲートのそれぞれの形成は、ＶＬＰおよびコア粒子のそれぞれへ少なくとも一Ａβ１−６ペプチドを一定の配向および指向で限定させた形でそれぞれ結合および付着させることにより確実にされる。さらに、ＶＬＰおよびコア粒子のそれぞれの典型的な固有の高度反復性組織化構造が、高度に規則正しい反復的な形でＡβ１−６ペプチドを提示するのに有利に働いており、それによって高度に組織化された反復性Ａβ１−６ペプチド−ＶＬＰアレイおよびコンジュゲートがそれぞれ導かれる。
【０１９２】
したがって、好ましい本発明コンジュゲートおよびアレイはそれぞれ、それらの高度に組織化された構造、大きさ、およびアレイ表面における抗原の反復性の点で先行技術のコンジュゲートとは異なる。さらに、本発明の好ましい実施態様は、ＶＬＰの正確な折りたたみおよび集合を保証する発現宿主において粒子を発現させ、次いで抗原、すなわちＡβ１−６ペプチドをそこにさらにカップリングさせ得る。
【０１９３】
本発明は、ＶＬＰへのＡβ１−６ペプチドの結合方法を開示している。指摘された通り、本発明の一局面では、Ａβ１−６ペプチドを、化学的架橋により、典型的に、および好ましくはヘテロ二官能架橋剤を用いることによりＶＬＰに結合させる。幾つかのヘテロ−二官能架橋剤が当業界では知られている。好ましい実施態様において、ヘテロ−二官能架橋剤は、好ましい第一付着部位、すなわちＶＬＰのリシン残基の側鎖アミノ基または少なくとも１個のＶＬＰサブユニットと反応し得る官能基、および好ましい第二付着部位、すなわちＡβ１−６ペプチドに融合され、また所望により還元により反応に利用可能にされていてもよいシステイン残基と反応し得るさらなる官能基を含む。典型的には誘導体化と呼ばれるこの手順の第一工程は、ＶＬＰと架橋剤との反応である。この反応の生成物は、活性化ＶＬＰであり、活性化担体とも呼ばれる。第二工程では、常法、たとえばゲル濾過または透析を用いて未反応架橋剤を除去する。第三工程では、Ａβ１−６ペプチドを活性化ＶＬＰと反応させるが、この工程は一般にカップリング工程と呼ばれる。未反応Ａβ１−６ペプチドは、所望によりたとえば透析による第四工程で除去され得る。幾つかのヘテロ−二官能架橋剤が当業界では公知である。これらには、好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（ピアス）、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、スルホ−ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、ＳＩＡおよびたとえばピアス・ケミカル・カンパニー（ロックフォード、イリノイ、米国）から入手でき、アミノ基に向かって反応性を示す一官能基およびシステイン残基に向かって反応性を示す一官能基を有する他の架橋剤が含まれる。上記で挙げた架橋剤は全て、チオエーテル結合の形成を誘導する。本発明の実施において適切な別の種類の架橋剤は、カップリング時におけるＡβ１−６ペプチドおよびＶＬＰ間のジスルフィド結合の導入を特徴とする。この種類に属する好ましい架橋剤には、たとえばＳＰＤＰおよびスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ（ピアス）がある。架橋剤によるＶＬＰの誘導体化の程度は、実験条件、たとえば反応パートナーの各々の濃度、一試薬の他試薬に対する過剰量、ｐＨ、温度およびイオン強度を変えることにより影響され得る。カップリングの度合、すなわちＶＬＰのサブユニットに対するＡβ１−６ペプチドの量については、上記実験条件を変えて調節することにより、ワクチンの必要条件に適合させ得る。
【０１９４】
Ａβ１−６ペプチドをＶＬＰに結合させる特に好適な方法は、ＶＬＰ表面にあるリシン残基とＡβ１−６ペプチド上のシステイン残基の結合である。実施態様によっては、ＶＬＰにカップリングさせるため、システイン残基を含むアミノ酸リンカーを第二付着部位またはその一部としてＡβ１−６に融合させることが要求される場合もあり得る。
【０１９５】
一般に、順応性のあるアミノ酸リンカーが有利である。アミノ酸リンカーの例は、（a） CGG; （b） N-末端 ガンマ 1-リンカー; （c） N-末端 ガンマ 3-リンカー; （d） Ig ヒンジ領域; （e） N-末端グリシンリンカー; （f） （G）kC（G）n ただし ｎ＝０〜１２およびｋ＝０〜５（配列番号３４）; （g） N-末端グリシン-セリンリンカー; （h） （G）kC（G）m（S）l（GGGGS）n ただし n=０〜３, ｋ＝０〜５, ｍ＝０〜１０, １＝０〜２ （配列番号３５）; （i） GGC; （k） GGC-NH2; （l） C-末端 ガンマ 1-リンカー; （m） C-末端 ガンマ ３−リンカー; （n） C-末端グリシンリンカー; （o） （G）nC（G）k ただし ｎ=0-12およびｋ=0-5 （配列番号３６）; （p） C-末端グリシン−セリンリンカーs; （q） （G）m（S）l（GGGGS）n（G）oC（G）k ただし ｎ＝０〜３、 ｋ＝０〜５、 m＝０〜１０、l=０〜２、および ｏ=０〜８（配列番号３７）から成る群から選択される。
【０１９６】
アミノ酸リンカーのさらなる例は、免疫グロブリンのヒンジ領域、グリシンセリンリンカー（GGGGS）n （配列番号３８）、およびグリシンリンカー（Ｇ）ｎ であり、それらは全てさらに第二付着部位としてのシステイン残基および所望によるさらなるグリシン残基を含む。上記アミノ酸リンカーの一般的に好ましい例は、Ｎ−末端ガンマ１：CGDKTHTSPP （配列番号３９）、Ｃ−末端ガンマ１：DKTHTSPPCG（配列番号４０）、Ｎ−末端ガンマ３：CGGPKPSTPPGSSGGAP（配列番号４１）、Ｃ−末端ガンマ３：PKPSTPPGSSGGAPGGCG（配列番号４２）、Ｎ−末端グリシンリンカー：GCGGGG（配列番号４３）およびＣ−末端グリシンリンカー：GGGGCG（配列番号４４）である。
【０１９７】
本発明の実施に特に適切な他のアミノ酸リンカーは、疎水性Ａβ１−６ペプチドがＶＬＰに結合しているとき、ＣＧＫＫＧＧ（配列番号４６）、またはＮ−末端リンカーについてはＣＧＤＥＧＧ（配列番号３１）、またはＣ−末端リンカーについてはＧＧＫＫＧＣ（配列番号４５）およびＧＧＥＤＧＣ（配列番号３２）である。Ｃ−末端リンカーについては、末端システインは、所望によりＣ−末端アミド化されていてもよい。
【０１９８】
本発明の好ましい実施態様では、ペプチドのＣ−末端におけるＧＧＣＧ（配列番号４７）、ＧＧＣまたはＧＧＣ−ＮＨ２（「ＮＨ２」はアミド化を表す）リンカーまたはそのＮ−末端におけるＣＧＧが、アミノ酸リンカーとしては好ましい。一般に、グリシン残基を、巨大アミノ酸および第二付着部位として使用されるシステイン間に挿入することにより、カップリング反応におけるより巨大なアミノ酸の立体障害の可能性を回避する。本発明の最も好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーＧＧＣ−ＮＨ２を、Ａβ１−６のＣ−末端に融合させる。
【０１９９】
Ａβ１−６ペプチドに存在するシステイン残基は、その還元状態で活性化ＶＬＰ上のヘテロ−二官能架橋剤と反応しなければならず、すなわち、遊離システインまたは遊離スルフヒドリル基をもつシステイン残基が利用可能でなくてはならない。結合部位として機能すべきシステイン残基が酸化形である場合、たとえばそれがジスルフィド結合を形成している場合、たとえばＤＴＴ、ＴＣＥＰまたはβ−メルカプトエタノールによるこのジスルフィド架橋の還元が必要とされる。国際公開第０２／０５６９０５号に記載されたところによると、低濃度の還元剤がカップリングと適合し得、当業者が知るところでは高い濃度はカップリング反応を阻害し、その場合、還元剤を除去するか、またはたとえば透析、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣにより、その濃度をカップリング前に減少させなければならない。
【０２００】
上記の好ましい方法にしたがってヘテロ−二官能架橋剤を用いてＶＬＰへＡβ１−６ペプチドを結合させることにより、一定の配向でＡβ１−６ペプチドをＶＬＰにカップリングさせ得る。ＶＬＰへのＡβ１−６ペプチドの他の結合方法には、カルボジイミドＥＤＣおよびＮＨＳを用いてＡβ１−６ペプチドをＶＬＰに架橋させる方法がある。さらなる方法では、ホモ−二官能架橋剤、たとえばグルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（ピアス・ケミカル・カンパニー、ロックフォード、イリノイ、米国）またはＶＬＰのアミン基またはカルボキシル基に向かって反応性を示す官能基をもつ他の公知ホモ−二官能架橋剤を用いてＡβ１−６ペプチドをＶＬＰに付着させる。
【０２０１】
Ａβ１−６ペプチドへＶＬＰを結合させる他の方法には、ＶＬＰをビオチニル化し、Ａβ１−６ペプチドをストレプトアビジン融合タンパク質として発現させる方法、またはたとえば国際公開第００／２３９５５号に記載された要領でＡβ１−６ペプチドおよびＶＬＰの両方をビオチニル化する方法がある。この場合、まず遊離結合部位が依然として次工程で加えられるＶＬＰの結合に利用可能であるようにＡβ１−６ペプチド対ストレプトアビジンの比率を調節することにより、Ａβ１−６ペプチドを、ストレプトアビジンまたはアビジンに結合させ得る。別法として、全成分を「一ポット」反応で混合させ得る。レセプターおよびリガンドの可溶性形態が利用可能であり、ＶＬＰまたはＡβ１−６ペプチドと架橋し得る他のリガンド−レセプター対も、Ａβ１−６ペプチドをＶＬＰへ結合させるための結合剤として使用され得る。別法として、リガンドまたはレセプターをＡβ１−６ペプチドへ融合させ、レセプターまたはリガンドへそれぞれ化学的に結合または融合されたＶＬＰへの結合について介在させ得る。融合はまた、挿入または置換により実施され得る。
【０２０２】
既に指摘した通り、本発明の好ましい実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡ―ファージのＶＬＰであり、さらに好ましい実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰである。
【０２０３】
１個または幾つかの抗原分子、すなわちＡβ１−６ペプチドは、立体的に許容される場合、好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰの露出されたリシン残基を通じてＲＮＡファージコートタンパク質のキャプシドまたはＶＬＰの一サブユニットに付着され得る。すなわち、ＲＮＡファージのコートタンパク質のＶＬＰおよび特にＱβコートタンパク質ＶＬＰの具体的特徴は、一サブユニットについて幾つかの抗原とカップリングする可能性である。これによって、高密度の抗原アレイが作製され得る。
【０２０４】
本発明の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子への少なくとも一Ａβ１−６ペプチドの結合および付着は各々、ウイルス様粒子の少なくとも１個の第一付着部位および抗原または抗原決定基の少なくとも１個の第二付着部位間におけるそれぞれの相互作用および会合によるものである
【０２０５】
Ｑβコートタンパク質のＶＬＰまたはキャプシドは、それらの表面上に特定数のリシン残基を有しており、キャプシド内部に向かい、ＲＮＡと相互作用する３個のリシン残基、およびキャプシド外部へ露出された４個の他のリシン残基による特定トポロジーを有する。これらの特性は、リシン残基がＲＮＡと相互作用する粒子内部よりも粒子外部への抗原の付着に有利である。他のＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰもまた、それらの表面上における特定数のリシン残基およびこれらのリシン残基の特定トポロジーを有する。
【０２０６】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、第一付着部位はリシン残基であり、および／または第二付着部位は、スルフヒドリル基またはシステイン残基を含む。本発明の非常に好ましい実施態様では、第一付着部位はリシン残基であり、第二付着部位はシステイン残基である。
【０２０７】
本発明の非常に好ましい実施態様では、Ａβ１−６ペプチドは、システイン残基を介してＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、および特にＱβコートタンパク質のＶＬＰのリシン残基に結合される。
【０２０８】
ＲＮＡファージから誘導されたＶＬＰの別の利点は、手頃なコストでの材料の大量生産を可能にする、細菌におけるそれらの高い発現収率である。
【０２０９】
指摘した通り、本発明コンジュゲートおよびアレイはそれぞれ、高度に組織化された構造、大きさ、およびアレイ表面上における抗原の反復性の点で先行技術コンジュゲートとは異なる。さらに、担体としてＶＬＰを使用することにより、可変抗原密度をもつ、強固な抗原アレイおよびコンジュゲートがそれぞれ形成され得る。特に、ＲＮＡファージのＶＬＰの使用、および特にＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰの使用により、非常に高いエピトープ密度が達成され得る。特に、一サブユニット当たり１.５エピトープを越える密度は、ヒトＡβ１−６ペプチドをＱβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングさせることにより達成され得る。エピトープ密度が高いＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰの組成物の製造は、本明細書における指示にしたがって実施され得る。本発明の好ましい実施態様では、Ａβ１−６ペプチドがＱβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされているとき、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.１、１.２、１.３、１.４、１.５、１.６、１.７、１.８、１.９、２.０、２.１、２.２、２.３、２.４、２.５、２.６、２.７、２.８、２.９またはそれより高い一サブユニット当たりのＡβ１−６ペプチドの平均数が好ましい。
【０２１０】
本明細書で定義されている第二付着部位は、抗原または抗原決定基に伴い天然または非天然で存在し得る。抗原または抗原決定基に適切な天然第二付着部位が存在しない場合、非天然第二付着部位について抗原に対し遺伝子操作を加えなければならない。
【０２１１】
上記の通り、４個のリシン残基は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰの表面で露出されている。典型的には、これらの残基は、架橋剤分子との反応時に誘導体化される。露出されたリシン残基が必ずしも全て抗原に結合され得るわけではない場合、架橋剤と反応したリシン残基は、誘導体化工程後にε−アミノ基に付着した架橋剤分子と残される。これによって、ＶＬＰの溶解性および安定性にとって有害であり得る１個または幾つかの正電荷が消失する。下記で開示されているＱβコートタンパク質突然変異体の場合と同様、リシン残基の幾つかをアルギニンと置換することにより、アルギニン残基は架橋剤と反応しないことから、我々は正電荷の過度の消失を阻止し得る。さらに、アルギニンによるリシン残基の置換により、抗原への反応に利用可能な部位が少なくなるため、さらに特定された抗原アレイが誘導され得る。
【０２１２】
したがって、露出されたリシン残基は、本出願で開示されている以下のＱβコートタンパク質突然変異体および突然変異体Ｑβ ＶＬＰにおけるアルギニンにより置換された：Qβ-240 （Lys13-Arg; 配列番号１７）, Qβ-250 （Lys 2-Arg, Lys13-Arg; 配列番号１９）および Qβ-259 （Lys 2-Arg, Lys16-Arg；配列番号２１）。構築物をクローン化し、タンパク質を発現させ、ＶＬＰを精製し、ペプチドおよびタンパク質抗原へのカップリングに使用した。またＱβ−２５１（配列番号２０）を構築し、如何にＱβ−２５１のＶＬＰについて発現、精製およびカップリングするかに関する指針は、本明細書全体から見出され得る。
【０２１３】
さらなる実施態様において、我々は、密度がさらに高い抗原アレイを得るのに適切な、１個の追加的リシン残基をもつＱβ突然変異コートタンパク質を開示している。この突然変異体Ｑβコートタンパク質、Ｑβ−２４３（Ａｓｎ１０−Ｌｙｓ；配列番号１８）をクローン化し、タンパク質を発現させ、そしてキャプシドおよびＶＬＰを単離および精製したところ、追加リシン残基の導入は、キャプシドまたはＶＬＰへのサブユニットの自己集合と両立し得ることが示された。すなわち、Ａβ１−６ペプチドアレイおよびコンジュゲートは、それぞれＱβコートタンパク質突然変異体のＶＬＰを用いて製造され得る。ＶＬＰ、特にＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰへの特に有利な抗原付着方法は、抗原、すなわちＡβ１−６ペプチドに付加されたシステイン残基とＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰの表面に存在するリシン残基の結合である。システイン残基が第二付着部位として有効であるためには、スルフヒドリル基がカップリングに利用可能でなくてはならない。すなわち、システイン残基はその還元状態であらねばならず、すなわち、遊離システインまたは遊離スルフヒドリル基をもつシステイン残基が利用可能でなくてはならない。第二付着部位として機能すべきシステイン残基が酸化形態である場合、たとえば、それがジスルフィド架橋を形成している場合、たとえばＤＴＴ、ＴＣＥＰまたはβ−メルカプトエタノールによるこのジスルフィド架橋の還元が必要とされる。還元剤（reductand）の濃度、および抗原に対する還元剤のモル過剰量は、各抗原について調節されなければならない。１０μＭ程度またはそれ未満の低濃度から出発し、１０〜２０ｍＭまたはそれより高い還元剤濃度に及ぶ滴定範囲を必要ならば試験し、担体への抗原のカップリングを評価する。国際公開第０２／０５６９０５号に記載されている通り、低濃度の還元剤はカップリング反応と両立し得るが、当業者の知るところによると、高濃度ではカップリング反応が阻止され、その場合、たとえば透析、ゲル濾過または逆相ＨＰＬＣにより、還元剤を除去するかまたはその濃度を減少させなければならない。有利には、透析または平衡緩衝液のｐＨは７未満、好ましくは６である。抗原活性または安定性と低ｐＨ緩衝液の両立性について試験しなければならない。
【０２１４】
ＲＮＡファージコートタンパク質おＶＬＰにおけるエピトープ密度は、架橋剤および他の反応条件の選択により調節され得る。たとえば、架橋剤スルホ−ＧＭＢＳおよびＳＭＰＨは、一般に高いエピトープ密度に到達させ得る。誘導体化は高濃度の還元剤により明確に影響され、反応条件の操作を用いることにより、ＲＮＡファージコートタンパク質のＶＬＰ、特にＱβコートタンパク質のＶＬＰへカップリングされる抗原の数を制御し得る。
【０２１５】
非天然第二付着部位の設計前に、それを融合、挿入または遺伝子操作すべき場所を選択しなければならない。第二付着部位の位置の選択は、たとえば抗原の結晶構造に基き得る。抗原の上記結晶構造は、分子のＣ−またはＮ−末端の利用能（たとえば溶媒へのそれらの接近可能性により決定される）について、または第二付着部位としての使用に適切な残基、たとえばシステイン残基の溶媒への露出に関する情報を提供する。露出されたジスルフィド架橋もまた、Ｆａｂフラグメントに関する場合と同様、それらが一般的にたとえば２−メルカプトエチルアミン、ＴＣＥＰ、β−メルカプトエタノールまたはＤＴＴによる緩やかな還元条件を通して単一システイン残基に変換され得ることから、同じく第二付着部位の供給源であり得る。抗原の免疫原性に影響を及ぼさない緩やかな還元条件が選択される。一般に、自己抗原による免疫化が、この自己抗原とその天然リガンドとの相互作用の阻止を目指す場合、第二付着部位は、天然リガンドとの相互作用部位に対して抗体を産生させ得るように付加される。すなわち、第二結合部位の位置は、第二付着部位または同部位を含むアミノ酸リンカーからの立体障害を回避するように選択される。さらなる実施態様において、自己抗原とその天然リガンドとの相互作用部位とは異なる部位で指向された抗体応答が望ましい。上記実施態様において、第二付着部位は、自己抗原とその天然リガンドの相互作用部位に対する抗体の産生を阻止するように選択され得る。
【０２１６】
第二付着部位の位置選択における他の基準には、抗原のオリゴマー化状態、オリゴマー化部位、補因子の存在、および抗原の修飾が、自己抗原の機能、または自己抗原を認識する抗体の産生と両立し得る場合の抗原構造および配列における部位を示す実験的証拠の利用可能性がある。
【０２１７】
ほとんどの好ましい実施態様において、Ａβ１−６ペプチドは、単一第二付着部位またはコア粒子上の第一付着部位およびＶＬＰまたはＶＬＰサブユニットとそれぞれ会合し得る単一反応性付着部位を含む。これにより、コア粒子およびＶＬＰのそれぞれへの少なくとも１個、ただし典型的には１個より多く、好ましくは１０、２０、４０、８０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３６０、４００、４５０個より多くの抗原の限定された均一な結合および会合がそれぞれ確実なものとなる。すなわち、抗原において単一の第二付着部位または単一の反応性付着部位を与えることにより、単一および均一タイプの結合および会合がそれぞれ確実にされ、非常に高度に規則正しい反復性アレイがもたらされる。たとえば、結合および会合がそれぞれリシン−（第一付着部位として）およびシステイン−（第二付着部位として）相互作用により実施される場合、本発明のこの好ましい実施態様によると、このシステイン残基が抗原上に天然に存在するのか、または非天然で存在するのかとは関係無く、１抗原当たり唯一のシステイン残基がＶＬＰおよびコア粒子の第一付着部位とそれぞれ結合および会合し得ることが確実となる。
【０２１８】
実施態様の中には、抗原上への第二付着部位の遺伝子操作が、本発明の開示による第二付着部位として適切なアミノ酸を含むアミノ酸リンカーの融合を必要とする場合もある。したがって、本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１個の共有結合を介してアミノ酸リンカーを抗原または抗原決定基に結合させる。好ましくは、アミノ酸リンカーは、第二付着部位を含むか、またはそれにより構成される。さらなる好ましい実施態様において、アミノ酸リンカーは、スルフヒドリル基またはシステイン残基を含む。別の好ましい実施態様では、アミノ酸リンカーはシステインである。アミノ酸リンカーの若干の選択基準および本発明によるアミノ酸リンカーのさらなる好ましい実施態様は、既に上記で述べられている。
【０２１９】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、少なくとも一抗原または抗原決定基、すなわちＡβ１−６ペプチドをウイルス様粒子と融合させる。上記で概説されている通り、ＶＬＰは、典型的にはＶＬＰへ集合する少なくとも１個のサブユニットにより構成される。すなわち、本発明のさらなる好ましい実施態様でも、抗原または抗原決定基、好ましくは少なくとも１個のＡβ１−６ペプチドを、ウイルス様粒子またはＶＬＰへ組込まれ得るタンパク質の少なくとも１個のサブユニットに融合させることにより、キメラＶＬＰ−サブユニット−Ａβ１−６ペプチドタンパク質融合が形成される。
【０２２０】
Ａβ１−６ペプチドの融合は、ＶＬＰサブユニット配列への挿入により、またはＶＬＰ−サブユニットまたはＶＬＰへ組込まれ得るタンパク質のＮ−またはＣ−末端への融合により実施され得る。以後、ＶＬＰサブユニットへのペプチドの融合タンパク質をいう場合、サブユニット配列のいずれかの末端への融合またはサブユニット配列内におけるペプチドの内部挿入も包含されるものとする。
【０２２１】
融合はまた、サブユニット配列の一部が欠失されたＶＬＰサブユニットの変異型へＡβ１−６ペプチド配列を挿入することにより実施され得、さらにそれらは切頭化突然変異体と称される。切頭化突然変異体は、ＶＬＰサブユニットの配列のＮ−またはＣ−末端、またはその一部の内部欠失を有し得る。たとえば、アミノ酸残基７９〜８１の欠失を伴うたとえば特異的ＶＬＰ ＢＨｃＡｇは、内部欠失をもつ切頭化突然変異体である。また、切頭化突然変異体ＶＬＰ−サブユニットのＮ−またはＣ−末端へのＡβ１−６ペプチドの融合により、本発明の実施態様がもたらされる。同様に、ＶＬＰサブユニットの配列へのエピトープの融合はまた置換により実施され得、その場合、たとえば特異的ＶＬＰ ＨＢｃＡｇについては、アミノ酸７９〜８１が外来エピトープにより置換される。すなわち、以後称するように、融合は、ＶＬＰサブユニットの配列におけるＡβ１−６ペプチド配列の挿入により、Ａβ１−６ペプチドによるＶＬＰサブユニットの配列の一部の置換により、または欠失、置換または挿入の組合せにより実施され得る。
【０２２２】
キメラＡβ１−６ペプチド−ＶＬＰサブユニットは、一般にＶＬＰへ自己集合し得る。それらのサブユニットに融合されたエピトープを提示するＶＬＰはまた、キメラＶＬＰと本明細書では称する。指摘した通り、ウイルス様粒子は、少なくとも１個のＶＬＰサブユニットを含むか、またはそれにより構成される。本発明のさらなる実施態様では、ウイルス様粒子は、キメラＶＬＰサブユニットおよび非キメラＶＬＰサブユニット、すなわち抗原と融合していないＶＬＰサブユニットの混合物を含むかまたはそれにより構成され、いわゆるモザイク粒子をもたらす。これは、ＶＬＰの形成およびそれへの集合を確実にするのに有利であり得る。それらの実施態様において、キメラＶＬＰ−サブユニットの比率は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５％またはそれより高いものであり得る。
【０２２３】
フランキングアミノ酸残基をペプチドまたはエピトープの配列のいずれかの端に付加することにより、ＶＬＰのサブユニットの配列のいずれかの端に融合させるかまたはＶＬＰのサブユニットの配列へ上記ペプチド配列を内部挿入させ得る。グリシンおよびセリン残基は、融合されるペプチドに付加されるフランキング配列で使用されるのに特に有利なアミノ酸である。グリシン残基は追加的順応性を付与し、ＶＬＰサブユニットの配列への外来配列の融合を潜在的に不安定にする効果を減少させ得る。
【０２２４】
本発明の実施態様において、ＶＬＰは、Ｂ型肝炎コア抗原ＶＬＰである。ＨＢｃＡｇのＮ−末端へのＡβ１−６ペプチドの融合タンパク質（Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5:1157-1163 （1999））またはいわゆる主要免疫優性領域（ＭＩＲ）における挿入体については既に報告されており（Pumpens, P. および Grens, E., Intervirology 44:98-114 （2001）、国際公開第０１／９８３３３号）、本発明の好ましい実施態様である。ＭＩＲにおいて欠失を伴うＨＢｃＡｇの天然に存する変異型についても報告されており（Pumpens, P. および Grens, E., Intervirology 44:98-114 （2001）、出典明示で援用する）、そしてＮ−またはＣ−末端への融合、ならびに野生型ＨＢｃＡｇと比べた場合に欠失部位に対応するＭＩＲの位置における挿入は、本発明のさらなる実施態様である。Ｃ−末端への融合についても報告されている（Pumpens, P. および Grens, E., Intervirology 44:98-114 （2001））。当業者であれば、古典的分子生物学技術を用いることにより（Sambrook, J.et al.編、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第二版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（1989）, Ho et al., Gene 77:51 （1989））融合タンパク質を如何にして構築するかについての指針を容易に見出せるはずである。ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質をコード化し、ＨＢｃＡｇおよびＨＢｃＡｇ融合タンパク質の発現に有用であるベクターおよびプラスミドについては報告されており（Pumpens, P. & Grens, E. Intervirology 44: 98-114 （2001）, Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5:1157-1163 （1999））、本発明の実施において使用され得る。我々はまた、例を挙げて（実施例６）ＨＢｃＡｇのＭＩＲへのエピトープの挿入による、キメラ自己集合性ＨＢｃＡｇの生成について記載している。ＨＢｃＡｇの自己集合効率およびそのＭＩＲにおいて挿入されるエピトープの提示の最適化にとって重要な因子は、挿入部位の選択、および挿入時にＭＩＲ内のＨＢｃＡｇ配列から欠失されるアミノ酸の数（Pumpens, P. & Grens, E. Intervirology 44: 98-114 （2001）；欧州特許第０４２１６３５号；米国特許第６２３１８６４号）、または言い換えれば、ＨＢｃＡｇからのどのアミノ酸を新たなエピトープにより置換すべきかということである。たとえば、外来エピトープによるＨＢｃＡｇアミノ酸７６〜８０、７９〜８１、７９〜８０、７５〜８５または８０〜８１の置換については、既に報告されている（Pumpens, P. & Grens, E. Intervirology 44: 98-114 （2001）；欧州特許第０４２１６３５号；米国特許第６２３１８６４号）。ＨＢｃＡｇは、キャプシド集合にとって重要ではなく、核酸と結合し得る長いアルギニンテイル（Pumpens, P. & Grens, E. Intervirology 44: 98-114 （2001））を含む（Pumpens, P. & Grens, E. Intervirology 44: 98-114 （2001））。このアルギニンテイルを含むかまたは欠くＨＢｃＡｇは、両方とも本発明の実施態様である。
【０２２５】
本発明のさらなる好ましい実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡファージのＶＬＰである。ＲＮＡファージの主要コートタンパク質は、細菌での、特にエシェリキア・コリ（E.coli）での発現時、ＶＬＰに自発的に集合する。本発明組成物の製造に使用され得るバクテリオファージコートタンパク質の具体例には、ＲＮＡバクテリオファージ、たとえばバクテリオファージＱβ（配列番号４；ＰＩＲデータベース、受入番号ＶＣＢＰＱＢ、すなわちＱβ ＣＰおよび配列番号５；受入番号ＡＡＡ１６６６３、すなわちＱβ Ａ１タンパク質）およびバクテリオファージｆｒ（配列番号７；ＰＩＲ受入番号ＶＣＢＰＦＲ）のコートタンパク質がある。
【０２２６】
さらに好ましい実施態様では、少なくとも１個のＡβ１−６ペプチドをＱβコートタンパク質に融合させる。エピトープがＱβのＡ１タンパク質の切頭化形態のＣ−末端に融合されているか、またはＡ１タンパク質内に挿入されている融合タンパク質構築物については既に報告されている（Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39:9-15 （1996））。Ａ１タンパク質は、ＵＧＡ停止コドンでのサプレッションにより生成され、Ｎ−末端メチオニンの開裂を考慮に入れる場合３２９または３２８アミノ酸長を有する。アラニン（Ｑβ ＣＰ遺伝子によりコード化される第二アミノ酸）の前のＮ−末端メチオニンの開裂は、通常エシェリキア・コリ（E.coli）で行なわれ、それはＱβコートタンパク質のＮ−末端の場合にも当てはまる。Ａ１遺伝子の一部、ＵＧＡアンバーコドンの３'は、１９５アミノ酸長を有するＣＰ伸長部分をコード化する。ＣＰ伸長部分の７２および７３位間における少なくとも一Ａβ１−６ペプチドの挿入により、本発明のさらなる実施態様が導かれる（Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39:9-15 （1996））。Ｃ−末端切頭化Ｑβ Ａ１タンパク質のＣ−末端におけるＡβ１−６ペプチドの融合により、本発明のさらなる好ましい実施態様が導かれる。たとえば、Kozlovska ら（Intervirology, 39:9-15 （1996））は、エピトープが、１９位で先端切除されたＱβ ＣＰ伸長部のＣ−末端で融合されているＱβ Ａ１タンパク質融合体について報告している。
【０２２７】
Kozlovska ら（Intervirology, 39:9-15 （1996））が報告しているところによると、融合エピトープを提示する粒子の集合は、モザイク粒子を形成するのに一般的にはＡ１タンパク質−Ａβ１−６ペプチド融合体および野生型ＣＰの両方の存在を必要とする。しかしながら、ウイルス様粒子およびここでは特に、少なくとも１個のＡβ１−６ペプチドが融合しているＶＬＰサブユニットにより排他的に構成されている、ＲＮＡファージＱβコートタンパク質のＶＬＰを含む実施態様もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０２２８】
モザイク粒子の製造は若干の方法で実施され得る。Kozlovska ら、Intervirology, 39:9-15 （1996）は、３つの方法を記載しており、それらは全て本発明の実施において使用され得る。第一の方法では、ＶＬＰにおける融合エピトープの有効な提示を、ＴｒｐへのＵＧＡコドンの翻訳を誘導するクローン化ＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡをコード化するプラスミド（ｐＩＳＭ３００１プラスミド（Smiley B.K., et al., Gene 134:33-40 （1993））））を含むエシェリキア・コリ（E.coli）株において、ＣＰおよびＣＰ伸長部間にＵＧＡ停止コドンを有するＱβ Ａ１タンパク質融合体をコード化するプラスミドを発現させることにより伝達させる。別の方法では、ＣＰ遺伝子停止コドンをＵＡＡへ修飾し、Ａ１タンパク質−Ａβ１−６ペプチド融合体を発現する第二プラスミドを同時形質転換させる。第二プラスミドは、異なる抗生物質耐性をコード化し、複製起点は、第一プラスミドと適合し得る（Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39:9-15 （1996））。第三の方法では、Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 （1996）の図１における記載にしたがって、ＣＰおよびＡ１タンパク質−Ａβ１−６ペプチド融合体を、プロモーター、たとえばＴｒｐプロモーターへ機能し得るように結合させたバイシストロン方法でコード化する。
【０２２９】
さらなる実施態様では、Ａβ１−６ペプチドを、ｆｒＣＰのアミノ酸２および３（開裂ＣＰのナンバリング、すなわち、Ｎ−末端メチオニンが開裂されている）間に挿入することにより、Ａβ１−６ペプチド−ｆｒＣＰ融合タンパク質が形成される。ＶＬＰへ自己集合するｆｒＣＰ融合タンパク質を構築および発現させるための、本発明の実施において有用なベクターおよび発現系については、既に報告されている（Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 （1993））。ある実施態様では、Ａβ１−６ペプチド配列をアミノ酸２の後におけるｆｒＣＰの欠失変異型（ｆｒＣＰの残基３および４は欠失されている）へ挿入する（Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 （1993））。
【０２３０】
ＲＮＡファージＭＳ−２のコートタンパク質のＮ−末端突出β−ヘアピンにおけるエピトープの融合およびそれに続くＲＮＡファージＭＳ−２の自己集合ＶＬＰにおける融合エピトープの提示についても報告されており（国際公開第９２／１３０８１号）、ＭＳ−２ＲＮＡファージのコートタンパク質への挿入または置換によるＡβ１−６ペプチドの融合体もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０２３１】
本発明の別の実施態様では、Ａβ１−６ペプチドを、乳頭腫ウイルスのキャプシドタンパク質に融合させる。さらなる実施態様では、Ａβ１−６ペプチドを、ウシ乳頭腫ウイルス１型（ＢＰＶ−１）の主要キャプシドタンパク質Ｌ１に融合させる。バクロウイルス／昆虫細胞系においてＢＰＶ−１融合タンパク質を構築および発現させるためのベクターおよび発現系については既に報告されている（Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 （1999）、国際公開第００／２３９５５号）。Ａβ１−６ペプチドによるＢＰＶ−１ Ｌ１のアミノ酸１３０〜１３６の置換により、ＢＰＶ−１ Ｌ１−Ａβ１−６ペプチド融合タンパク質が形成され、これも本発明の好ましい実施態様に含まれる。バクロウイルスベクターにおけるクローニングおよびバクロウイルス感染Ｓｆ９細胞における発現についても報告されており、本発明の実施において使用され得る（Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 （1999）、国際公開第００／２３９５５号）。融合Ａβ１−６ペプチドを呈示する集合粒子の精製は、若干の方法で、たとえばゲル濾過またはスクロース勾配超遠心分離により実施され得る（Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 （1999）、国際公開第００／２３９５５号）。
【０２３２】
本発明のさらなる実施態様では、Ａβ１−６ペプチドを、Ｔｙ ＶＬＰへ組込まれ得るＴｙタンパク質に融合させる。さらなる実施態様では、Ａβ１−６ペプチドを、ＴＹＡ遺伝子によりコード化されるｐ１またはキャプシドタンパク質に融合させる（Roth, J.F., Yeast 16:785-795 （2000））。酵母レトロトランスポゾンＴｙ１、２、３および４は、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Saccharomyces Serevisiae）から単離され、レトロトランスポゾンＴｆ１は、シゾサッカロマイシス・ポンバエ（Schizosaccharomyces Pombae）から単離されている（Boeke, J.D.および Sandmeyer, S.B., 添east Transposable elements  、 The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics中、p.193, コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス（1991））。レトロトランスポゾンＴｙ１および２は、植物および動物因子のコピア型と関連しており、Ｔｙ３はレトロトランスポゾンのジプシーファミリーに属しており、それは植物および動物レトロウイルスと関連している。Ｔｙ１レトロトランスポゾンにおいて、Ｇａｇまたはキャプシドタンパク質とも称されるｐ１タンパク質は、４４０アミノ酸長を有する。Ｐ１は、４０８位におけるＶＬＰの成熟中に開裂され、それによってＶＬＰの必須成分であるｐ２タンパク質をもたらす。
【０２３３】
ｐ１への融合タンパク質および酵母における上記融合タンパク質の発現用ベクターについては既に報告されている（Adams, S.E., et al., Nature 329:68-70 （1987））。そこで、たとえば、Ａβ１−６ペプチドは、Ａβ１−６ペプチドについてのコーディング配列をｐＭＡ５６２０プラスミドのＢａｍＨ１部位へ挿入することによりｐ１へ融合され得る（Adams, S.E., et al., Nature 329:68-70 （1987））。外来エピトープについてのコーディング配列をｐＭＡ５６２０ベクターへクローン化することにより、外来エピトープのＮ−末端へＣ−末端融合された、Ｔｙ１−１５のｐ１のアミノ酸１〜３８１を含む融合タンパク質が発現される。同様に、Ａβ１−６ペプチドのＮ−末端融合、またはｐ１配列への内部挿入、またはｐ１配列の一部の置換もまた、本発明の範囲内に含まれるものとする。特に、Ｔｙタンパク質ｐ１のアミノ酸３０〜３１、６７〜６８、１１３〜１１４および１３２〜１３３間におけるＴｙ配列へのＡβ１−６ペプチドの挿入（欧州特許第０６７７１１１号）により、本発明の好ましい実施態様が導かれる。
【０２３４】
Ａβ１−６ペプチドの融合に適切なさらなるＶＬＰは、たとえばレトロウイルス様粒子（国際公開第９６／３０５２３号）、ＨＩＶ２ Ｇａｇ（Kang, Y.C., et al, Biol. Chem. 380:353-364 （1999））、ササゲモザイクウイルス（Taylor, K.M.et al., Biol. Chem. 380:387-392 （1999））、パルボウイルスＶＰ２ ＶＬＰ（Rueda, P. et al., Virology 263:89-99 （1999））、ＨＢｓＡｇ（米国特許第４７２２８４０号、欧州特許第００２０４１６Ｂ１号）である。
【０２３５】
また、本発明の実施に適切なキメラＶＬＰの例は、Intervirology ３９：１（１９９６）に記載されているものである。本発明での使用が考えられるＶＬＰのさらなる例は、ＨＰＶ−１、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−４５、ＣＲＰＶ、ＣＯＰＶ、ＨＩＶ、ＧＡＧ、タバコモザイクウイルスである。ＳＶ−４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、ロタウイルスおよびノーウォークウイルスのウイルス様粒子もまた製造されており、Ａβ１−６ペプチドを含むそれらのＶＬＰのキメラＶＬＰもまた本発明の範囲内に含まれる。
【０２３６】
本発明の好ましい実施態様では、本発明ワクチンの製造に適切なＡβ１−６ペプチドは、ＶＬＰへ結合させるためアミノ酸リンカーにより修飾されている。それらのＡβ１−６ペプチドには、リンカーＧＧＣにＣ−末端融合されたＡβ１−６があるが、限定はされない。Ａβ１−６フラグメントのＮ−末端への融合に適切なアミノ酸リンカーには、配列ＣＧＧおよびＣＧＨＧＮＫＳがあるが、限定はされない。Ａβ１−６のＣ−末端への融合に適切なリンカーには、配列ＧＧＣがあるが、限定はされない。好ましい実施態様において、リンカーがＡβまたはＡβフラグメントのＣ−末端に融合されているとき、Ｃ−末端システインはアミド化されている。好ましい実施態様において、Ａβ１−６は、アミノ酸リンカーに融合されており、配列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2を有し、この配列では、Ｃ−末端「−ＣＯＮＨ２」により示されている、Ｃ−末端システインがアミド化され、さらに「ＮＨ２」により示されている、ペプチドのＮ−末端が遊離状態である。アミノ酸リンカーは、上記リンカーのアミノ酸に対する免疫応答の誘導を回避するために、好ましくは短いが、可溶性ＡβおよびＡＤ斑と交差反応性を示す抗体を誘導させ得るべきであり、抗体とＡβ１−６ペプチドの相互作用を容易に行わせ得る。アミノ酸リンカーの他の適切な特性は、順応性であり、好ましくはカップリングを妨げ、および／またはリンカー自体に対する免疫応答を生じさせ得る巨大アミノ酸を欠いている。さらに好ましい実施態様では、第二付着部位としてシステイン残基を含むアミノ酸リンカーを、Ａβ１−６ペプチドのＣ−末端に融合させる。
【０２３７】
本発明の実施に適切な追加的Ａβフラグメントには、他の動物種に由来する、同じく上記要領で修飾された、前述のフラグメントに対応し、ヒトアミロイド斑および可溶性ヒトＡβと交差反応性を示す抗体を誘発するＡβフラグメントが含まれる。上記フラグメントの例は、霊長類（ＤＡＥＦＲＨ；配列番号８４）、ウサギ（ＤＡＥＦＲＨ；配列番号８５）、モルモット（ＤＡＥＦＲＨ；配列番号８８）、マウス（ＤＡＥＦＧＨ；配列番号７６）、ラット（ＤＡＥＦＧＨ；配列番号８７）およびアフリカツメガエル（ＤＳＥＹＲＨ；同８６）からのＡβ１−６である。
【０２３８】
ヒトＡＰＰの突然変異形態を過剰発現するトランスジェニックマウスに基づいた若干の動物ＡＤモデルが報告されている（Games, D. et al., Nature 373: 523-527 （1995a）; Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292 （1997）; Hsiao, K., et al., Science 274: 99-102 （1996）; Chen, G. et al., Nature 408： 975- 979 （2000）; Janus, C. et al., Nature 408: 979-982 （2000）; Morgan, D. et al., Nature 408: 982-985 （2000））。それらのマウスモデルは、導入遺伝子の過剰発現レベル、導入遺伝子に存在するＡＤ突然変異および導入遺伝子の過剰発現が指令されるプロモーターの点が互いに異なる。これらの動物モデルは、特に年齢に関連した行動の変化、不溶性斑へのβ−アミロイドの沈着、ニューロン内における神経細線維もつれ、および前脳全体に及ぶニューロン消失である、ＡＤの病理学的徴候の全てを必ずしも示すことはできない（Chapman, P.F. Nature 408: 915-916 （2000））。しかしながら、記憶欠損およびそれらの鑑定方法は、それらのモデルにおいて確認され得、動物モデルにおける本発明組成物の効果の試験で使用され得る（Chen, G. et al., Nature 408: 975- 979 （2000）; Janus, C. et al., Nature 408: 979-982 （2000）; Morgan, D. et al., Nature 408: 982-985 （2000））。さらに、年齢に関連したアミロイド斑へのＡβ沈着は、星状細胞増加症および小膠細胞症をも発現する、それらのモデルで試験され得る。
【０２３９】
本明細書記載の方法および適用例に対する他の適切な修飾および適応が容易に認められ、本発明の範囲またはその実施態様から逸脱することなく為され得ることは当業者であれば容易に理解できることである。本発明について詳細に記載したが、説明を目的として載せているに過ぎず、本発明を限定するものではない以下の実施例を参考にすると本発明に対する理解はさらに深められるはずである。
【実施例】
【０２４０】
実施例１
ＲＮＡファージの好ましいコア粒子およびＶＬＰのクローニングおよび構築、発現および精製
Ａ．突然変異Ｑβコートタンパク質の構築および発現、ならびに突然変異Ｑβコートタンパク質ＶＬＰまたはキャプシドの精製
プラスミド構築および突然変異コートタンパク質のクローニング
ｐＱβ−２４０の構築：
プラスミドｐＱβ１０（Kozlovska, TM, et al., Gene 137:133-137）を、ｐＱβ−２４０の構築用初期プラスミドとして使用した。Ｌｙｓ１３からＡｒｇへの突然変異を逆ＰＣＲにより誘発した。逆プライマーを逆テイル−テイル方向で設計した：
5’-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3’（配列番号４８）および
5’-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3’（配列番号４９）。
【０２４１】
初回ＰＣＲの生成物を第二ＰＣＲ反応用鋳型として使用し、その場合、上流プライマー5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’（配列番号５０）
および下流プライマー
5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’（配列番号５１）
を使用した。第二ＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３１により消化し、ｐＱβ１０発現ベクターへクローン化し、これを同制限酵素により開裂した。ＰＣＲキット試薬により製作者プロトコール（ＭＢＩファーメンタス、ビルニウス、リトアニア）にしたがってＰＣＲ反応を実施した。
【０２４２】
直接標識組込方法を用いた配列決定により、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２４０を含むエシェリキア・コリ（E.coli）細胞は、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質とのＳＤＳ−ＰＡＧＥ時に共移動する１４ｋＤタンパク質の有効な合成を維持した。
【０２４３】
生成されたアミノ酸配列：（配列番号１７）：
AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
【０２４４】
ｐＱβ−２４３の構築
プラスミドｐＱβ１０を、ｐＱβ−２４３の構築用初期プラスミドとして使用した。Ａｓｎ１０からＬｙｓへの突然変異を逆ＰＣＲにより誘発した。逆プライマーを逆テイル−テイル方向で設計した：
5’-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG -3’（配列番号５２）
および
5’-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC -3’（配列番号５３）。
【０２４５】
初回ＰＣＲの生成物を第二ＰＣＲ反応用鋳型として使用し、その場合、上流プライマー5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’（配列番号５０）
および下流プライマー
5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’（配列番号５１）
を使用した。第二ＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３１により消化し、ｐＱβ１０発現ベクターへクローン化し、これを同制限酵素により開裂した。ＰＣＲキット試薬により製作者プロトコール（ＭＢＩファーメンタス、ビルニウス、リトアニア）にしたがってＰＣＲ反応を実施した。
【０２４６】
直接標識組込方法を用いた配列決定により、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２４３を含むエシェリキア・コリ（E.coli）細胞は、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質とのＳＤＳＤ−ＰＡＧＥ時に共移動する１４ｋＤタンパク質の有効な合成を維持した。
【０２４７】
生成されたアミノ酸配列：（配列番号１８）：
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
【０２４８】
ｐＱβ−２５０の構築
プラスミドｐＱβ−２４０を、ｐＱβ−２５０の構築用初期プラスミドとして使用した。Ｌｙｓ２からＡｒｇへの突然変異を位置指定突然変異導入法により誘発した。上流プライマー
5’-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3’（配列番号５４）
および下流プライマー
5’-GATTTAGGTGACACTATAG-3’（配列番号５５）
を、突然変異ＰＣＲフラグメントの合成に使用し、特有の制限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIにおいてｐＱβ−１８５発現ベクターへ導入した。ＰＣＲキット試薬により製作者プロトコール（ＭＢＩファーメンタス、ビルニウス、リトアニア）にしたがってＰＣＲ反応を実施した。
【０２４９】
直接標識組込方法を用いた配列決定により、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２５０を含むエシェリキア・コリ（E.coli）細胞は、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質とのＰＡＧＥ時に共移動する１４ｋＤタンパク質の有効な合成を維持した。
【０２５０】
生成されたアミノ酸配列：（配列番号１９）：
ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
【０２５１】
ｐＱβ−２５１の構築
プラスミドｐＱβ１０を、ｐＱβ−２５１の構築用初期プラスミドとして使用した。Ｌｙｓ１６からＡｒｇへの突然変異を逆ＰＣＲにより誘発した。逆プライマーを逆テイル−テイル方向で設計した：
5’-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG -3’（配列番号５６）
および
5’-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC -3’（配列番号５７）。
【０２５２】
初回ＰＣＲの生成物を第二ＰＣＲ反応用鋳型として使用し、その場合、上流プライマー    5’-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3’（配列番号５０）
および下流プライマー
5’-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3’（配列番号５１）
を使用した。第二ＰＣＲの生成物を、ＸｂａＩおよびＭｐｈ１１０３１により消化し、ｐＱβ１０発現ベクターへクローン化し、これを同制限酵素により開裂した。ＰＣＲキット試薬により製作者プロトコール（ＭＢＩファーメンタス、ビルニウス、リトアニア）にしたがってＰＣＲ反応を実施した。
【０２５３】
直接標識組込方法を用いた配列決定により、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２５１を含むエシェリキア・コリ（E.coli）細胞は、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質とのＳＤＳ−ＰＡＧＥ時に共移動する１４ｋＤタンパク質の有効な合成を維持した。この構築物により生成されたアミノ酸配列は配列番号２０に示されている。
【０２５４】
ｐＱβ−２５９の構築
プラスミドｐＱβ−２５１を、ｐＱβ−２５９の構築用初期プラスミドとして使用した。Ｌｙｓ２からＡｒｇへの突然変異を位置指定突然変異導入法により誘発した。上流プライマー
5’-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3’（配列番号５４）
および下流プライマー
5’GATTTAGGTGACACTATAG-3’（配列番号５５）
を、突然変異ＰＣＲフラグメントの合成に使用し、特有の制限部位ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIにおいてｐＱβ−１８５発現ベクターへ導入した。ＰＣＲキット試薬により製作者プロトコール（ＭＢＩファーメンタス、ビルニウス、リトアニア）にしたがってＰＣＲ反応を実施した。
【０２５５】
直接標識組込方法を用いた配列決定により、所望の突然変異を証明した。ｐＱβ−２５９を含むエシェリキア・コリ（E.coli）細胞は、Ｑβファージ粒子から単離された対照Ｑβコートタンパク質とのＳＤＳ−ＰＡＧＥ時に共移動する１４ｋＤタンパク質の有効な合成を維持した。
【０２５６】
生成されたアミノ酸配列：（配列番号２１）：
AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
【０２５７】
ＱβおよびＱβ突然変異体の一般的発現および精製手順
発現
エシェリキア・コリ（E.coli）ＪＭ１０９を、Ｑβコートタンパク質発現プラスミドにより形質転換した。２０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地５ｍｌに、Ｑβコートタンパク質発現プラスミドにより形質転換されたクローンを接種した。接種された培地を振とうせずに１６〜２４時間３７℃でインキュベーションした。調製されたイノキュラムを、２０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む新鮮なＬＢ培地１００〜３００ｍｌ中で１：１００に連続希釈し、３７℃で一晩振とうせずにインキュベーションした。生成した第二イノキュラムを、フラスコにおいて１％カサミノ酸および０.２％グルコースを含むＭ９培地中で１：５０に希釈し、振とうしながら３７℃で一晩インキュベーションした。
【０２５８】
精製
精製手順用溶液および緩衝液
１．溶菌緩衝液ＬＢ
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％トリトンＸ１００および新たに調製されたＰＭＳＦ、１ｍｌ当たり５マイクログラムの濃度。リゾチームおよびデオキシリボヌクレアーゼ不含有。
２．ＳＡＳ
飽和硫酸アンモニウム水溶液
３．緩衝液ＮＥＴ
２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、５ｍＭのＥＤＴＡおよび
１５０ｍＭのＮａＣｌ。
４．ＰＥＧ
ＮＥＴ中４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００
【０２５９】
崩壊および溶菌
冷凍細胞を細胞１ｇにつき２ｍｌでＬＢに再懸濁した。混合物を２２ｋＨで５回１５秒間超音波処理し、１分間隔で溶液を氷上で冷却した。次いで、ジャネッキ（Janecki） Ｋ６０ローターを用いて、ライゼートを１時間１４０００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。特記しない場合、同ローターを用いて、下記遠心分離工程を全て実施した。上清を４℃で貯蔵し、細胞屑をＬＢで２回洗浄した。遠心分離後、ライゼートおよび洗浄画分の上清をプールした。
【０２６０】
分画
飽和硫酸アンモニウム溶液を、攪拌しながらプールした上記ライゼートへ滴下した。ＳＡＳの量を全量の５分の１に調節して、飽和の２０％とした。溶液を一晩放置し、翌日１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけた。ペレットを少量の２０％硫酸アンモニウムで洗浄し、再び遠心分離にかけた。生じた上清をプールし、ＳＡＳを滴下して、飽和の４０％とした。溶液を一晩放置し、そして翌日１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。生じたペレットをＮＥＴ緩衝液中で可溶化した。
【０２６１】
クロマトグラフィー
ＮＥＴ緩衝液中で可溶化されたキャプシドまたはＶＬＰタンパク質を、セファロースＣＬ−４Ｂカラムにローディングした。クロマトグラフィー中３つのピークが溶離した。第一ピークは主に膜および膜フラグメントを含んでおり、集められなかった。キャプシドは第二ピークに含まれ、第三ピークは他のエシェリキア・コリ（E.coli）タンパク質を含んでいた。
【０２６２】
ピーク画分をプールし、ＮａＣｌ濃度を、０.６５Ｍの最終濃度に調節した。プールされたピーク画分の半分に相当するＰＥＧ溶液の量を、攪拌しながら滴下した。溶液を攪拌せずに一晩放置した。２０分間１４０００ｒｐｍでの遠心分離により、キャプシドタンパク質を沈降させた。次いで、それを最少量のＮＥＴ中で可溶化し、再びセファロースＣＬ−４Ｂカラムにローディングした。ピーク画分をプールし、飽和の６０％（ｗ／ｖ）での硫酸アンモニウムにより沈澱させた。遠心分離およびＮＥＴ緩衝液中での再可溶化後、キャプシドタンパク質を再クロマトグラフィー用にセファロースＣＬ−６Ｂカラムへローディングした。
【０２６３】
透析および乾燥
上記で得られたピーク画分をプールし、滅菌水に対して充分に透析し、貯蔵用に凍結乾燥した。
【０２６４】
Ｑβ−２４０の発現および精製
細胞（エシェリキア・コリ（E.coli）ＪＭ１０９、プラスミドｐＱβ−２４０により形質転換された）を、ＬＢに再懸濁死、１５秒間５回超音波処理（水氷ジャケット）し、１３０００ｒｐｍで１時間遠心分離にかけた。さらなる処理工程まで上清を４℃で貯蔵し、細胞屑を、９ｍｌのＬＢ、および最後にＬＢ中の０.７Ｍ尿素９ｍｌで２回洗浄した。全上清をプールし、セファロースＣＬ−４Ｂカラムにローディングした。プールされたピーク画分を硫酸アンモニウムで沈澱させ、遠心分離にかけた。次いで、再可溶化タンパク質をセファロース２Ｂカラムおよび最後にセファロース６Ｂカラムでさらに精製した。最後に、キャプシドピークを水に対して充分透析し、上記要領で凍結乾燥した。コートタンパク質のキャプシドへの集合を電子顕微鏡により確認した。
【０２６５】
Ｑβ−２４３の発現および精製
細胞（エシェリキア・コリ（E.coli）ＲＰＩ）を、ＬＢに再懸濁し、一般的手順記載の要領で処理した。セファロースＣＬ−４Ｂカラムおよび最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムでの２連続ゲル濾過工程によりタンパク質を精製した。ピーク画分をプールし、上記要領で凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質の集合を電子顕微鏡により確認した。
【０２６６】
Ｑβ−２５０の発現および精製
細胞（エシェリキア・コリ（E.coli）ＪＭ１０９、ｐＱβ−２５０により形質転換）を、ＬＢに再懸濁し、上記要領で処理した。セファロースＣＬ−４Ｂおよび最後にセファロースＣＬ−２Ｂカラムでのゲル濾過によりタンパク質を精製し、上記要領で凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質の集合を電子顕微鏡により確認した。
【０２６７】
Ｑβ−２５９の発現および精製
細胞（エシェリキア・コリ（E.coli）ＪＭ１０９、ｐＱβ−２５９により形質転換）を、ＬＢに再懸濁し、超音波処理した。細胞屑を、１０ｍｌのＬＢで１回および２回目はＬＢ中０.７Ｍの尿素１０ｍｌで洗浄した。セファロースＣＬ−４Ｂでの２ゲル濾過クロマトグラフィー工程によりタンパク質を精製した。上記要領でタンパク質を透析および凍結乾燥した。キャプシドへのコートタンパク質の集合を電子顕微鏡により確認した。
【０２６８】
Ｂ．組換えＡＰ２０５ＶＬＰのクローニング、発現および精製
ＡＰ２０５コートタンパク質遺伝子のクローニング
ＡＰ２０５コートタンパク質（ＣＰ）のｃＤＮＡ（配列番号２８）を、ファージＡＰ２０５ ＲＮＡから生成された２つのｃＤＮＡフラグメントから、逆転写−ＰＣＲ技術を用い、市販の配列決定用プラスミドｐＣＲ ４−ＴＯＰＯでクローニングすることにより構築した。逆転写技術は当業界ではよく知られている。プラスミドｐ２０５−２４６に含まれる第一フラグメントは、ＣＰ配列の上流２６９ヌクレオチドおよびＣＰの最初の２４Ｎ−末端アミノ酸をコードする７４ヌクレオチドを含んでいた。プラスミドｐ２０５−２６２に含まれる第二フラグメントは、ＣＰのアミノ酸１２〜１３１をコードする３６４ヌクレオチドおよびＣＰ配列の下流の追加１６２ヌクレオチドを含んでいた。ｐ２０５−２４６およびｐ２０５−２６２は両方ともJ.Klovinsから寛大にも寄贈されたものであった。
【０２６９】
プラスミド２８３.−５８を２段階ＰＣＲにより設計することにより、一完全長ＣＰ配列におけるプラスミドｐ２０５−２４６およびｐ２０５−２６２からの両ＣＰフラグメントを融合させた。
【０２７０】
プラスミドｐＱｂ１８５へクローニングするためのＮｃｏＩ部位を含む上流プライマーｐ１.４４、またはプラスミドｐＱｂ１０へクローニングするためのＸｂａＩ部位を含むｐ１.４５、およびＨｉｎｄIII制限部位を含む下流プライマーｐ１.４６を使用した（制限酵素の認識配列は下線部）：
p1.44  5’-AACC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3’  （配列番号７９）
p1.45  5’-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3’ （配列番号８０）
p1.46  5’-AAAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3’（配列番号８１）
【０２７１】
２つの追加的プライマー、ｐ２０５−２６２に含まれているフラグメントの５'末端でアニーリングしているｐ１.４７、およびプラスミドｐ２０５−２４６に含まれるフラグメントの３'末端でアニーリングしているｐ１.４８を用いることにより、初回ＰＣＲにおいてフラグメントを増幅した。プライマーｐ１.４７およびｐ１.４８は互いに相補的である。
p1.47: 5’-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGCAAGTCTG-3’ （配列番号８２）
p1.48: 5’-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGA-GTTGGATCACTC-3’（配列番号８３）
【０２７２】
最初の２ＰＣＲ反応で、２つのフラグメントが生成された。第一フラグメントは、プライマーｐ１.４５およびｐ１.４８および鋳型ｐ２０５−２４６により生成された。第二フラグメントは、プライマーｐ１.４７およびｐ１.４６および鋳型ｐ２０５−２６２により生成された。両フラグメントを、プライマー組合せｐ１.４５およびｐ１.４６またはｐ１.４４およびｐ１.４６による、第二ＰＣＲ反応、スプライス−オーバーラップ伸長についての鋳型として使用した。２つの２段階ＰＣＲ反応の生成物を、ＸｂａＩまたはＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIIIにより消化し、エシェリキア・コリ（E.coli）トリプトファンオペロンプロモーターの制御下にある２つのｐＧＥＭ誘導発現ベクター、ｐＱｂ１０またはｐＱｂ１８５へ同制限部位によりクローン化した。
【０２７３】
２種のプラスミド、ｐＱｂ１０における野生型ＡＰ２０５ ＣＰ（配列番号２８）についてのコーディング遺伝子を含むｐＡＰ２８３−５８（配列番号２７）、およびｐＱｂ１８５における、Ｐｒｏ５からＴｈｒへの突然変異（配列番号２９）を伴うｐＡＰ２８１−３２（配列番号３０）が得られた。ＤＮＡ配列決定法によりコートタンパク質配列が証明された。ＰＡＰ２８３−５８は、ＸｂａＩ部位の下流、ＣＰのＡＴＧコドンの上流４９ヌクレオチドを含み、そしてコートタンパク質ｍＲＮＡの推定的原リボソーム結合部位を含む。
【０２７４】
組換えＡＰ２０５ ＶＬＰの発現および精製
Ａ．組換えＡＰ２０５ ＶＬＰの発現
エシェリキア・コリ（E.coli）ＪＭ１０９を、プラスミドｐＡＰ２８３−５８により形質転換した。２０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ液体培地５ｍｌに単一コロニーを接種し、３７℃で１６〜２４時間振とうせずにインキュベーションした。
【０２７５】
調製されたイノキュラムを、１００〜３００ｍｌの１０μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地中で１：１００に希釈し、振とうせずに３７℃で一晩インキュベーションした。生成された第二イノキュラムを、０.２％グルコースおよびリン酸緩衝液を含む２ＴＹ培地中で１：５０に希釈し、振とう器中３７℃で一晩インキュベーションした。細胞を遠心分離により採取し、−８０℃で冷凍した。
【０２７６】
Ｂ．組換えＡＰ２０５ ＶＬＰの精製
溶液および緩衝液：
溶菌緩衝液
５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、５ｍＭのＥＤＴＡ、０.１％トリトンＸ１００およびＰＭＳＦ、１ｍｌ当たり５マイクログラム。
ＳＡＳ
飽和硫酸アンモニウム水溶液
緩衝液ＮＥＴ
２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.８、５ｍＭのＥＤＴＡおよび
１５０ｍＭのＮａＣｌ。
ＰＥＧ
ＮＥＴ中４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００
【０２７７】
溶菌：
冷凍細胞を細胞１ｇにつき２ｍｌで溶菌緩衝液に再懸濁した。混合物を２２ｋＨで５回１５秒間超音波処理し、１分間隔で溶液を氷上で冷却した。次いで、Ｆ３４−６−３８ローター（エッペンドルフ）を用いて、ライゼートを２０分間１２０００ｒｐｍでの遠心分離にかけた。特記しない場合、同ローターを用いて、下記遠心分離工程を全て実施した。上清を４℃で貯蔵し、細胞屑を溶菌緩衝液で２回洗浄した。遠心分離後、ライゼートおよび洗浄画分の上清をプールした。
【０２７８】
さらに硫酸アンモニウム沈澱を用いることにより、ＡＰ２０５ ＶＬＰが精製され得る。第一工程では、ＡＰ２０５ ＣＬＰが沈澱しない硫酸アンモニウム濃度を選択する。生じたペレットを廃棄する。次工程では、ＡＰ２０５ ＶＬＰが大量沈澱する硫酸アンモニウム濃度を選択し、ＡＰ２０５ ＶＬＰをこの沈澱工程のペレットから遠心分離（１４０００ｒｐｍ、２０分間）により単離する。得られたペレットをＮＥＴ緩衝液中で可溶化する。
【０２７９】
クロマトグラフィー
プールした上清からのキャプシドタンパク質を、セファロース４Ｂカラム（２.８×７０ｃｍ）にローディングし、４ｍｌ／時／画分でＮＥＴ緩衝液により溶離した。画分２８〜４０を集め、飽和の６０％の硫酸アンモニウムにより沈澱させた。画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＡＰ２０５に特異的な抗血清によるウエスタン・ブロットにより沈澱前に分析した。遠心分離により単離されたペレットを、ＮＥＴ緩衝液中で再可溶化し、セファロース２Ｂカラム（２.３×６５ｃｍ）にローディングし、３ｍｌ／時／画分で溶離した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、画分４４〜５０を集め、プールし、６０％飽和の硫酸アンモニウムにより沈澱させた。遠心分離により単離されたペレットをＮＥＴ緩衝液に再可溶化し、セファロース６Ｂカラム（２.５×４７ｃｍ）で精製し、３ｍｌ／時／画分で溶離した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。画分２３〜２７を集め、塩濃度を０.５Ｍに調節し、ＰＥＧ６０００により沈澱させ、水中４０％のストックから加えて最終濃度１３.３％にした。遠心分離により単離されたペレットをＮＥＴ緩衝液中で再可溶化し、上記と同様セファロース２Ｂカラムにローディングし、同様に溶離した。画分４３〜５３を集め、６０％飽和の硫酸アンモニウムにより沈澱させた。遠心分離により単離されたペレットを水で再可溶化し、生成されたタンパク質溶液を水に対して充分透析した。細胞１グラム当たり精製タンパク質約１０ｍｇが分離され得る。
【０２８０】
電子顕微鏡におけるウイルス様粒子の検査は、それらがファージ粒子と同一であることを示した。
【０２８１】
実施例２
ＨＢｃＡｇ（１−１４９）のｃ／ｅ１エピトープへのリシン残基含有ペプチドの挿入
ＨＢｃＡｇのｃ／ｅ１エピトープ（残基７２〜８８）を、Ｂ型肝炎ウイルスキャプシド（ＨＢｃＡｇ）の表面における先端領域に位置させる。この領域の一部（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドGly-Gly-Lys-Gly-Gly（配列番号３３）により遺伝学的に置換することにより、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ構築物（配列番号２６）が生成した。導入されたリシン残基は、遊離システイン基を含む抗原とＨＢｃＡｇ粒子の分子間化学的架橋に使用され得る反応性アミノ基をその側鎖に含む。
【０２８２】
配列番号７８に示されたアミノ酸配列を有するＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ ＤＮＡを、ＰＣＲにより生成した。ＨＢｃＡｇフラグメントをコード化する２つのフラグメント（アミノ酸残基１〜７８および８１〜１４９）を、ＰＣＲにより別々に増幅した。これらのＰＣＲに使用したプライマーはまた、Gly-Gly-Lys-Gly-Glyペプチド（配列番号３３）をコード化するＤＮＡ配列を導入した。プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）を用いて、ＨＢｃＡｇ（１〜７８）フラグメントをｐＥｃｏ６３から増幅した。プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ（１−１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いて、ＨＢｃＡｇ（８１〜１４９）フラグメントをｐＥｃｏ６３から増幅した。プライマーＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）およびＬｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）は、２つのＰＣＲ産物の末端に相補的ＤＮＡ配列を導入することにより、後続のアセンブリーＰＣＲにおいて２つのＰＣＲ産物を融合させた。プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨｂｃＡｇ（１−１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を用いるＰＣＲにより、構築されたフラグメントを増幅した。
【０２８３】
ＰＣＲについては、１００ｐｍｏｌの各オリゴおよび５０ｎｇの鋳型ＤＮＡを、２単位のＰｗｏポリメラーゼ、０.１ｍＭのｄＮＴＰおよび２ｍＭのＭｇＳＯ４との５０ｍｌ反応混合物中で使用した。両反応について、以下の要領で温度サイクリングを実施した：９４℃で２分間；３０サイクルの９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）。
【０２８４】
プライマー配列：
EcoRIHBcAg（s）:
（5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3'） （配列番号58）;
Lys-HBcAg（as）:
（5'-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAG-TACCCACCCAGGTAGC-3'） （配列番号59）;
Lys-HBcAg（s）:
（5'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACC-TAGTAGTCAGTTATGTC -3'） （配列番号60）;
HBcAg（1-149）Hind（as）:
（5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3'）（配列番号６１）
【０２８５】
ＰＣＲによる２種のＰＣＲフラグメントの融合については、１００ｐｍｏｌのプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨｂｃＡｇ（１−１４９）Ｈｉｎｄ（ａｓ）を、２単位のＰｗｏポリメラーゼ、０.１ｍＭのｄＮＴＰおよび２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む５０ｍｌ反応混合物中２つの精製ＰＣＲフラグメント１００ｎｇと共に使用した。ＰＣＲサイクリング条件は次の通りであった：９４℃で２分間；３０サイクルの９４℃（１分）、５０℃（１分）、７２℃（２分）。構築されたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII制限酵素により適切な緩衝液中で１９時間消化した。消化されたＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII−消化ｐＫＫベクターへライゲーションすることにより、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現ベクターを生成した。ベクターへのＰＣＲ産物の挿入を、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII制限分析および挿入体のＤＮＡ配列決定法により分析した。
【０２８６】
実施例３
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの発現および精製
エシェリキア・コリ（E.coli）株Ｋ８０２またはＪＭ１０９を、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓにより形質転換した。細菌の一晩培養物１ｍｌを用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１００ｍｌに接種した。この培養物を、６００ｎｍでのＯＤが約０.８に達するまで３７℃で４時間増殖させた。ＩＰＴＧを加えて１ｍＭの最終濃度にすることにより、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの合成の誘導を実施した。誘導後、細菌をさらに３７℃で４時間振とうした。５０００×ｇで１５分間遠心分離にかけることにより、細菌を採取した。ペレットを−８０℃で冷凍した。ペレットを解凍し、２００μｇ／ｍｌのリゾチームおよび１０μｌのベンゾナーゼ（メルク）を補った溶菌緩衝液（１０ｍＭのＮａＨＰＯ４、ｐＨ７.０、３０ｍＭのＮａＣｌ、０.２５％のトウィーン−２０、１０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した。細胞を室温で３０分間インキュベーションし、超音波処理により崩壊させた。ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現プラスミドまたは対照プラスミドを含むエシェリキア・コリ（E.coli）細胞を、ＩＰＴＧによるＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ発現の誘導に使用した。ＩＰＴＧの添加前、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓプラスミドを伴う細菌培養物および対照プラスミドを伴う培養物から試料を採取した。ＩＰＴＧ添加の４時間後、ｐＫＫ−ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを含む培養物および対照培養物から再び試料を採取した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクーマシー染色によりタンパク質発現をモニターした。
【０２８７】
次いで、ライゼートを１２０００×ｇで３０分間遠心分離にかけることにより、不溶性細胞屑を除去した。ＨＢｃＡｇに対するモノクローナル抗体（ＹＶＳ１８４１、米国ニューヨーク、ウエストベリー、Accurate Chemical and Scientific Corp.から購入）を用いたウエスタン・ブロッティングにより上清およびペレットを分析したところ、顕著な量のＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質が可溶性であることが示された。簡単に述べると、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを発現するエシェリキア・コリ（E.coli）細胞および対照細胞からのライゼートを、３０分間１４０００×ｇでの遠心分離にかけた。上清（＝可溶性画分）およびペレット（＝不溶性画分）を分離し、ＳＤＳ試料緩衝液で等量に希釈した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで抗ＨＢｃＡｇモノクローナル抗体ＹＶＳ１８４１によるウエスタン・ブロッティングにより試料を分析した。
【０２８８】
清澄化細胞ライゼートを、４ｍｌの６５％しょ糖溶液に３ｍｌの１５％しょ糖溶液、次いで４ｍｌの細菌ライゼートを載せたものから成るしょ糖密度段階勾配を用いる段階−密度勾配遠心分離に使用した。試料を、４℃、１０００００×ｇで３時間の遠心分離にかけた。遠心分離後、勾配の上部からの１ｍｌ画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクーマシー染色により分析した。ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質は、クーマシー染色により検出された。
【０２８９】
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓタンパク質は、１５〜６５％しょ糖間の界面で濃厚化しており、それがキャプシド粒子を形成したことを示していた。細菌タンパク質の大部分は勾配のしょ糖不含有上層に残存していたため、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ粒子の段階−勾配密度遠心分離により、粒子が濃厚化され、かつ部分的に精製された。
【０２９０】
ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓの大規模発現および精製を以下の要領で実施した。１００ｍｌのＬＢ、１００μｇ／ｍｌアンピシリンに単一コロニーを接種し、３７℃で一晩培養物を増殖させることにより、一晩培養物を調製した。前培養物２５ｍｌを、翌日８００ｍｌのＬＢアンピシリン培地中で希釈し、そして培養物を０.６〜０.８の光学密度ＯＤ６００に増殖させた。次いで、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導し、さらに４時間増殖させた。細胞を採取し、本質的に上記要領で溶解した。
【０２９１】
次いで、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓを、まず清澄化細胞ライゼートから硫酸アンモニウム（３０％飽和）によりタンパク質を沈澱させ、次いでゲル濾過カラム（セファクリルＳ−４００、ファルマシア）に再可溶化ペレットをローディングすることにより精製した。プールした画分を硫酸アンモニウムにより再沈澱させ、ペレットを再可溶化し、再度同ゲル濾過カラムにローディングした。最後に画分をプールし、濃縮し、ブラッドフォード試験（バイオラッド）を用いて濃度を評価した。
【０２９２】
実施例４
遊離システイン残基を欠き、挿入リシン残基を含むＨＢｃＡｇの構築
本明細書ではＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔとも称される、配列番号２５における４８および１０７位に相当する位置のシステイン残基を欠き、挿入されたリシン残基を含む肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を、以下の方法を用いて構築した。
【０２９３】
まず、以下のＰＣＲプライマーの組合せにより、上記実施例２の要領で調製されたＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ遺伝子の３フラグメントを別々に増幅することにより、２種の突然変異体を導入した。ＰＣＲ方法および慣用的クローニング技術を用いて、ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ遺伝子を調製した。
【０２９４】
簡単に述べると、以下のプライマーを用いてフラグメント１を調製した：
プライマー１：EcoRIHBcAg（s）
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG（配列番号５８）
プライマー２：４８ａｓ
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC（配列番号６２）
【０２９５】
以下のプライマーを用いてフラグメント２を調製した：
プライマー３：４８ｓ
GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC（配列番号６３）
プライマー４：１０７ａｓ
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC（配列番号６４）
【０２９６】
以下のプライマーを用いてフラグメント３を調製した：
プライマー５：ＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓ
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG（配列番号６５）
プライマー６：１０７ｓ
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG（配列番号６６）
【０２９７】
次いで、フラグメント１および２を、ＰＣＲプライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）および１０７ａｓと組合せることにより、フラグメント４を得た。次いで、フラグメント４およびフラグメント３を、プライマーＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）およびＨＢｃＡｇ１４９ｈｉｎｄ−ａｓと合わせることにより、完全長遺伝子を製造した。次いで、完全長遺伝子をＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＨｉｎｄIII（ＡＡＧＣＴＴ）酵素により消化し、同じ制限部位で切断したｐＫＫベクター（ファルマシア）へクローン化した。ＨＢｃＡｇ−ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔの発現および精製を実施例３に示した要領で実施した。
【０２９８】
実施例５
ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓの構築
肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）１−１８５を、実施例２記載の要領で修飾した。ｃ／ｅ１エピトープの一部（残基７２〜８８）領域（プロリン７９およびアラニン８０）を、ペプチドＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号３３）により遺伝学的に置換することにより、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ構築物（配列番号２６）を生成した。導入されたリシン残基は、遊離システイン基を含む抗原とＨＢｃＡｇ粒子の分子間化学的架橋に使用され得る反応性アミノ基をその側鎖に含む。ＰＣＲ方法および慣用的クローニング技術を用いて、ＨＢｃＡｇ１−１８５−Ｌｙｓ遺伝子を調製した。
【０２９９】
上記実施例２の要領で、ｐＥｃｏ６３からのＨＢｃＡｇ遺伝子の２つの別々のフラグメントを増幅し、それに続いて２つのフラグメントをＰＣＲにより融合することにより、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列（配列番号３３）を挿入し、完全長遺伝子を組立てた。以下のＰＣＲプライマーの組合せを使用した：
フラグメント１：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（配列番号５８）（実施例２参照）
プライマー２：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ａｓ）（配列番号５９）（実施例２参照）
フラグメント２：
プライマー３：Ｌｙｓ−ＨＢｃＡｇ（ｓ）（配列番号６０）（実施例２参照）
プライマー４：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG（配列番号６７）
組立：
プライマー１：ＥｃｏＲＩＨＢｃＡｇ（ｓ）（配列番号５８）（実施例２参照）
プライマー２：ＨＢｃＡｇｗｔＨｉｎｄIII（配列番号６７）
【０３００】
次いで、組立てられた完全長遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）およびＨｉｎｄIII（ＡＡＧＣＴＴ）酵素により消化し、同じ制限部位で切断したｐＫＫベクター（ファルマシア）へクローン化した。
【０３０１】
実施例６
ＨＢｃＡｇのＭＩＲ領域におけるペプチドエピトープの融合
ＨＢｃＡｇ１−１８５の残基７９および８０を、配列VNLTWSRASG（配列番号６８）のエピトープＣεＨ３により置換した。ＣεＨ３配列は、ヒトＩｇＥ重鎖の第三定常ドメインの配列に由来する。アセンブリーＰＣＲ方法を用いて、エピトープをＨＢｃＡｇ１−１８５配列に挿入した。第一ＰＣＲ段階において、ＡＴＣＣクローンｐＥｃｏ６３から生じ、プライマーＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄおよびＨＢｃＡｇ−ｗｔ ＨｉｎｄIIIｒｅｖにより増幅されたＨＢｃＡｇ１−１８５遺伝子を、２つの別々の反応における鋳型として用いることにより、ＣεＨ３配列をコードする配列エレメントを含む２つのフラグメントを増幅した。次いで、これら２フラグメントを、第二ＰＣＲ段階、アセンブリーＰＣＲ反応で組立てた。
【０３０２】
第一ＰＣＲ段階におけるプライマー組合せ：ＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄIIIｒｅｖとＣεＨ３ｆｗｄ、およびＣεＨ３ｒｅｖとＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄ。アセンブリーＰＣＲ反応において、第一ＰＣＲ段階で分離された２つのフラグメントを、外側プライマーを用いずに３ＰＣＲサイクル中に組立て、その後外側プライマーを次の２５サイクルの間反応混合物に加えた。外側プライマー：ＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄおよびＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄIIIｒｅｖ。
【０３０３】
ＰＣＲ産物を、エシェリキア・コリ（E.coli）で発現させるため、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII部位を用いてｐＫＫ２２３.３でクローン化した（実施例２参照）。実施例２記載の要領で、キメラＶＬＰをエシェリキア・コリ（E.coli）で発現させ、精製した。ＨＢｃＡｇ１−１８５−ＣεＨ３がゲル濾過から溶離するときの溶離体積は、キメラＶＬＰとの融合タンパク質の組立を示した。
【０３０４】
プライマー配列：
【表１】
2005539025.tif 000002
【表２】
2005539025.tif 000003
ＨＢｃＡｇ−ｗｔＥｃｏＲＩｆｗｄ：
5' ccggaattcatggacattgacccttataaag（配列番号７３）
ＨＢｃＡｇ−ｗｔＨｉｎｄIIIｒｅｖ：
5' cgcgtcccaagcttctaacattgagattcccgagattg（配列番号７４）
【０３０５】
実施例７
ＨＢｃＡｇのＭＩＲ領域におけるＡβ１−６ペプチドの融合
ＨＢｃＡｇ１−１８５の残基７９および８０を、ＤＡＥＦＲＨ（配列番号７５）またはＤＡＥＦＧＨ（配列番号７６）の配列のＡβ１−６ペプチドにより置換する。実施例６の記載と同じ戦略を用いて、２種のオーバーラッププライマーを設計し、アセンブリーＰＣＲにより融合タンパク質を構築する。ＰＣＲ産物をｐＫＫ２２３.３ベクターでクローン化し、エシェリキア・コリ（E.coli）Ｋ８０２で発現させる。実施例３の記載と同様にしてキメラＶＬＰを発現させ、精製する。
【０３０６】
実施例８
ＣＰ伸長部の１９位が切頭化されたＱβ Ａ１タンパク質のＣ−末端へのＡβ１−６ペプチドの融合
配列ＤＡＥＦＲＨ（配列番号７５）またはＤＡＥＦＧＨ（配列番号７６）を有する、Ｑβ Ａ１遺伝子の５'末端にアニーリングしているプライマーおよびＡ１遺伝子の３'末端にアニーリングし、さらにＡβ１−６ペプチドをコードする配列エレメントを含むプライマーを、鋳型としてｐＱβ１０を用いるＰＣＲ反応で使用する。ＰＣＲ産物をｐＱβ１０（Kozlovska T.M. et al., Gene 137: 133-37 （1993））でクローン化し、実施例１の記載と同様にしてキメラＶＬＰを発現させ、精製する。
【０３０７】
実施例９
ｆｒコートタンパク質の２および３位間におけるＡβ１−６ペプチドの挿入
配列ＤＡＥＦＲＨ（配列番号７５）またはＤＡＥＦＧＨ（配列番号７６）を有する、Ａβ１−６ペプチドの配列についてコードし、Ｂｓｐ１１９Ｉ適合末端および枠内挿入を可能にする追加ヌクレオチドを含む相補的プライマーを、標準分子生物学技術によりｐＦｒｄ８ベクター（Pushko, P. et al., Prot. Eng. 6: 883-91 （1993））のＢｓｐ１１９Ｉ部位に挿入する。別法として、ｐＦｒｄ８ベクターのオーバーハングを、Ｂｓｐ１１９Ｉで消化後、クレノウ断片で満たし、Ａβ１−６ペプチドの配列をコードするオリゴヌクレオチドおよび枠内クローニング用の追加ヌクレオチドを、クレノウ処理後にｐＦｒｄ８でライゲーションする。正しい配向で挿入体を含むクローンを、配列決定法により解析する。エシェリキア・コリ（E.coli）ＪＭ１０９またはエシェリキア・コリ（E.coli）Ｋ８０２におけるキメラ融合タンパク質の発現および精製を、Pushko, P. et al, Prot. Eng. 6:883-91 （1993）の記載にしたがって実施するが、ただしクロマトグラフィー工程については、セファロースＣＬ−４ＢまたはセファクリルＳ−４００（ファルマシア）カラムを用いて実施する。実施例１でＱβについて記載した手順と同様にして、細胞ライゼートを硫酸アンモニウムにより沈澱させ、２連続ゲル濾過精製工程により精製する。
【０３０８】
実施例１０
ベクターｐＯＧＳ８１１１におけるＴｙ１タンパク質ｐ１の６７位および６８位間へのＡβ１−６ペプチドの挿入
配列ＤＡＥＦＲＨ（配列番号７５）またはＤＡＥＦＧＨ（配列番号７６）を有し、ｐＯＧＳ８１１１のＮｈｅＩ部位と適合し得る末端をもつ、Ａβ１−６ペプチドをコードする２つの相補的オリゴヌクレオチドを合成する。欧州特許第６７７１１１号の記載にしたがって、追加ヌクレオチドを付加することにより、Ａβ１−６ペプチドをコードする配列を枠内挿入させる。挿入されたエピトープの両端に隣接するアミノ酸ＡＳおよびＳＳは、ｐＯＧＳ８１１１のＴｙＡ（ｄ）遺伝子におけるオリゴヌクレオチドの挿入から生じる改変されたＮｈｅＩ部位によりコード化される。
【０３０９】
欧州特許第０６７７１１１号およびその引用文献の記載にしたがって、ＰＯＧＳ８１１１を、サッカロマイシス・セレヴィシエ（S.cervisiae）株ＭＣ２へ形質転換し、キメラＴｙ ＶＬＰを発現させる。キメラＴｙ ＶＬＰを、欧州特許第６７７１１１号の記載にしたがってしょ糖密度勾配超遠心分離により精製する。
【０３１０】
実施例１１
乳頭腫ウイルス１型（ＢＰＶ−１）の主要キャプシドタンパク質Ｌ１へのＡβ１−６ペプチドの挿入
配列ＤＡＥＦＲＨ（配列番号７５）またはＤＡＥＦＧＨ（配列番号７６）を有するＡβ１−６ペプチドをコードする配列を、記載された要領（Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. USA 96: 2373-2378 （1999））でｐＦａｓｔＢａｃ１（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）ベクターにおいてクローン化されたＢＰＶ−１ Ｌ１遺伝子のアミノ酸１３０〜１３６をコードする配列へ置換する。構築物の配列を、ヌクレオチド配列解析により証明する。製造業者による記載にしたがってＧＩＢＣＯ／ＢＲＬバクロウイルス系を用いて、組換えバクロウイルスを生成させる。Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:12180-84 （1992）および Greenstone, H.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1800-05 （1998）による記載にしたがって、キメラＶＬＰをバクロウイルス感染Ｓｆ９細胞から精製する。
【０３１１】
実施例１２
ＶＬＰに融合させたＡβ１−６ペプチドによるマウスの免疫化
実施例７〜１１で生成された配列ＤＡＥＦＲＨ（配列番号７５）またはＤＡＥＦＧＨ（配列番号７６）のＡβ１−６ペプチドを呈示するキメラＶＬＰを、実施例１３および１４の記載にしたがってヒトトランスジェニックＡＰＰマウスまたはＣ５７／ＢＬ６マウスの免疫化に使用する。免疫化マウスから採取した血清を、実施例１３の記載にしたがってＡβ１−６ペプチドまたはＡβ１−４０またはＡβ１−４２特異的ＥＬＩＳＡで分析する。
【０３１２】
実施例１４記載の要領で、大群のヒトＡＰＰトランスジェニックマウスを免疫化することにより、ワクチンの防御効果を調べる。
【０３１３】
実施例１３
Ｑβ ＶＬＰへのＡβ１−６ペプチドのカップリング（ＱβＡβ１−６）、およびＱβＡβ１−６によるマウスの免疫化
Ａ．Ａβ１−６ペプチド Ｑβ ＶＬＰのカップリング
Ａβ１−６ペプチド（配列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2）（配列番号７７）を化学的に合成した。最初のＮＨ２基は、ペプチドが遊離Ｎ−末端を有することを示し、最後のＮＨ２基は、ペプチドがアミド化されたカルボキシ末端を有することを示す。実施例１の記載と同様にして、Ｑβ ＶＬＰを発現および精製した。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.２（ＨＢＳ、ｐＨ８.２）中においてＱβ ＶＬＰを、２ｍｇ／ｍｌの濃度（ブラッドフォード検定法で測定）で、ＤＭＳＯ中のストックから希釈した１.４３ｍＭのＳＭＰＨ（ピアス、ロックフォード、イリノイ）と室温（ＲＴ）で３０分間反応させた。次いで、反応混合物を４℃でＨＢＳ、ｐＨ８.２緩衝液に対して透析し、ＤＭＳＯ中の５０ｍＭストックからの反応混合物中で希釈した、０.３６ｍＭのＡβ１−６ペプチドと反応させた。カップリング反応を１５℃で２時間進行させ、反応混合物を１０００倍容量のＨＢＳ、ｐＨ８.２に対して２×２時間透析し、アリコートに分けて液体窒素中で瞬間冷凍し、さらなる使用時まで−８０℃で貯蔵した。
【０３１４】
アリコートを解凍し、Ｑβ ＶＬＰサブユニットへのＡβ１−６ペプチドのカップリングをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、ブラッドフォード検定法でタンパク質濃度を測定した。カップリング反応の結果を図１に示す。
【０３１５】
図１は、Ａβ１−６ペプチドおよびＱβ ＶＬＰのカップリング反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。試料を還元的条件下１６％トリス−グリシンゲルでの電気泳動にかけ、クーマシーブリリアントブルーで染色する。レーン１はタンパク質マーカーであり、対応する分子量はゲルの左境界線上に示されている。レーン２は誘導体化されたＱβ ＶＬＰタンパク質であり、レーン３は、Ａβ１−６ペプチドへのＱβ ＶＬＰタンパク質のカップリング反応の上清であり、レーン４は、Ａβ１−６ペプチドへのＱβ ＶＬＰタンパク質のカップリング反応のペレットである。一モノマー当たりの１、２および３ペプチドのカップリングに対応するカップリング生成物を、図面の矢印で示す。一サブユニット当たり１.５を越えるペプチドが平均してカップリングされた。カップリングされずに残されたサブユニットはほぼ無かった。
【０３１６】
Ｂ．Ｑβ ＶＬＰにカップリングさせたＡβ１−６ペプチドによるマウスの免疫化および免疫応答の分析
Ａβ１−６ペプチドにカップリングされたＱβ ＶＬＰ（ここではＱｂ−Ａｂ−１−６と称す）を、０日目および１４日目にマウス（３マウス）に皮下注射した。Ａβ１−６ペプチドを上記要領でＱβ ＶＬＰタンパク質にカップリングした。各マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を、ＰＢＳ中で２００μｌに希釈したワクチン１０μｇで免疫化した。２１日目にマウスの眼窩後方から採血し、Ａβ１−６ペプチドに特異的な抗体の力価をＡβ１−６に対するＥＬＩＳＡで測定した。化学架橋物質スルホ−ＳＰＤＰを用いてＡβ１−６ペプチドを牛リボヌクレアーゼＡにカップリングした。１０μｇ／ｍｌ濃度のカップリングしたリボヌクレアーゼ調製物で、ＥＬＩＳＡプレートを被覆した。プレートを遮断し、次いで系列希釈マウス血清とインキュベーションした。結合抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。対照として、同マウスの免疫前血清についても試験した。結果を図２に示す。
【０３１７】
図２は、Ｑβ ＶＬＰにカップリングさせたＡβ１−６ペプチドに対して免疫化したマウスの血清中のＡβ１−６ペプチドに特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。免疫化した３マウス（Ａ１〜Ａ３）についての結果を示す。免疫前血清を図面では「ｐｒｅ」として示す。一免疫前血清についての結果を示す。免疫前血清と「Ｑｂ−Ａｂ−１−６」により免疫化したマウスの血清の比較結果は、ペプチドＡβ１−６に対する強い特異的抗体応答がアジュバントの不存在下で得られることを示している。
【０３１８】
Ｃ．Ａβ１−４０ペプチドに対するＥＬＩＳＡ
ヒトＡβ１−４０またはＡβ１−４２ペプチドストックをＤＭＳＯ中で調製し、使用前にコーティング緩衝液で希釈した。ＥＬＩＳＡプレートを０.１μｇ／ウェルのＡβ１−４０ペプチドで被覆した。プレートを遮断し、次いで上記で得られた系列希釈マウス血清とインキュベーションした。結合抗体を、酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。対照として、ワクチン接種前に得た血清も含ませた。基準より上の平均３標準偏差を示す血清希釈度を計算し、「ＥＬＩＳＡ力価」と定義した。特異抗体は免疫前血清からは全く検出されなかった。３マウスについて得られた力価は１：１０００００であり、Ａβ１−４０に対する強い特異的免疫応答を示した。すなわち、Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたＡβ１−６による免疫化は、Ａβ１−４０との交差反応性を示す強い抗体力価を誘発する。
【０３１９】
図３は、ＥＬＩＳＡの結果を示す。上記要領でＱβ ＶＬＰにカップリングしたＡβ１−６ペプチドで免疫化した３マウス（Ａ１〜Ａ３）の血清について得た、４０５ｎｍでの光学密度としてのＥＬＩＳＡシグナルを、ｘ軸で示した希釈度の各々についてプロットする。２１日目に採血した３マウスについての結果を示す。また、免疫前血清も含まれている。血清中における抗体の力価を、上記要領で測定したところ、３マウス全てについて１：１０００００であった。
【０３２０】
実施例１４
ヒトＡＰＰトランスジェニックマウスの免疫化
ヒトＡＰＰ導入遺伝子（Sturchler-Pierrat et al.,  Proc.Natl. Acad.Sci. USA 94: 13287-13292 （1997））をもつ８ヶ月令雌ＡＰＰ２３マウスをワクチン接種に使用する。滅菌ＰＢＳで希釈した２５μｇのワクチンをマウスに皮下注射し、１４日後同量のワクチンで追加抗原を投与する。免疫化開始前およびブースター注射の７日後にマウスの尾部静脈から採血する。実施例１３記載の要領でＡβ１−６、Ａβ１−４０およびＡβ１−４２に特異的な抗体の存在について血清を分析する。
【０３２１】
実施例１５
Ｑβ ＶＬＰへのネズミＡβ１−６ペプチドのカップリング、マウスにおけるワクチン注射、および免疫応答の分析
ネズミＡβ１−６ペプチド（配列：NH2-DAEFGHGGC-CONH2）（配列番号７８）を化学合成し、実施例１３記載の要領でＱβ ＶＬＰへのカップリングに使用する。ワクチンをＣ５７ＢＬ／６マウスに注射し、ネズミＡβ１−６、ネズミＡβ１−４０およびネズミＡβ１−４２に対して誘発された抗体の力価を測定する。免疫化およびＥＬＩＳＡ測定を実施例１３と同様にして実施する。
【０３２２】
実施例１６
Ａβ１−６に対して誘導された血清のヒトＡＰＰトランスジェニックマウス斑およびＡＤ斑への結合
脳薄片における免疫組織化学
１８ヶ月令異型接合ＡＰＰ２３マウスの連続的パラフィン脳薄片およびＡＤ患者ブラークIII段階（インスティテュート・オブ・パソロジー、ユニバーシティー・バーゼル）からの内嗅野薄片を、染色に使用した。濃蟻酸で５分間ヒト脳薄片を処理し、マウス脳薄片を３分間９０℃で電子レンジ加熱することにより抗原性を高めた。ヒトＡβ１−６（実施例１３記載の要領で得た）に対して誘導されたマウス血清を、３％ヤギ血清を含むＰＢＳ中で１：１０００に希釈し、一晩インキュベーションした。すすいだ後、薄片を、ＰＢＳ中で１：２００に希釈したビオチニル化抗マウス二次抗体と１時間インキュベーションした。すすいだ後、薄片をさらにアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術（ＡＢＣ−エリートキットＰＫ６１００；ベクター・ラボラトリーズ）により処理した。最後に、薄片をジアミノベンジジン（ＤＡＢ）金属高感度基質（ベーリンガー、コード１７１８０９６）と反応させ、ヘマルムで対比染色し、脱水し、キシレン中で清澄化し、カバーグラスで覆った。
【０３２３】
組織学的染色の結果を図４ＡおよびＢに示す。Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたヒトＡβ１−６に対して免疫化した３マウスの血清により薄片を染色した。各血清は、トランスジェニックマウスおよびＡＤからのアミロイド斑を明確に染色した。３血清の一つについての結果を示す。ヒトＡβ１−６に対して誘導された血清は、トランスジェニックヒトＡＰＰ２３マウスのアミロイド斑、およびＡＤ患者からのアミロイド斑を明確に染色する。免疫前血清は陰性であった。細胞外アミロイド斑および摘出された血管は、抗体により染色される。
【０３２４】
実施例１７
マウス斑の組織学評価による、ヒトＡβ１−６に対して誘導された血清の特異性
脳剥片における免疫組織化学
ヒトＡＰＰを過剰発現する３ヶ月および１８ヶ月令異型接合ＡＰＰ２３マウスの連続的パラフィン脳薄片を、実施例１６の記載と同様にして、実施例１３に記載されたヒトＡβ１−６に対して誘導された代表的マウス血清、またはネズミまたはヒトＡＰＰの最後の２０アミノ酸に特異的であるため、Ａβを認識しないウサギポリクローナル抗体により染色した。ウサギポリクローナル抗体とインキュベーションした薄片を実施例１６記載の要領で処理するが、ただし、ビオチニル化抗ウサギ二次抗体（ＢＡ１０００、ベクター・ラボラトリーズ）を使用した。
【０３２５】
組織染色の結果を図５Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥに示す。薄片の下方左に印されたＡβ１−６は、Ａβ１−６に対して誘導された血清が染色に使用されたことを示しており、「Ｐａｂ」は、薄片が、ＡＰＰ６９５における６７６〜６９５位に相当する、ネズミまたはヒトＡＰＰの最後の２０アミノ酸に特異的なポリクローナル抗体により染色されたことを示している。
【０３２６】
１８ヶ月令マウスからの薄片の染色（図５ＡおよびＣ）比較結果は、Ａβ１−６に対して誘導された血清は脳で発現されたＡＰＰとは交差反応しないが、薄片は対照ポリクローナル抗体により染色されることを示している。図５Ｂは、アミロイド沈着がまだ見られない時点である、３ヶ月令マウスからの脳薄片を示し、ＡＰＰに特異的なポリクローナル抗体により染色される。図５Ｄおよび５Ｅは、それぞれ図５Ａおよび図５Ｂからの海馬のＣＡ１錐体層の拡大写真を示す。
【０３２７】
実施例１８
Ａ．ｆｒキャプシドタンパク質へのＡβ１−６ペプチドのカップリング
２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.２中の１２０μＭのｆｒキャプシドタンパク質の溶液を、ロッキングシェーカーにおいて２５℃で、ＤＭＳＯ中のストック溶液から希釈した、１０倍モル過剰のＳＭＰＨ（ピアス）と３０分間反応させる。それに続いて、反応溶液を、４℃の１Ｌの２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.２に対して２時間２回透析する。次いで、透析したｆｒ反応混合物を、ロッキングシェーカーにおいて１６℃で２時間５倍モル過剰のＡβ１−６ペプチド（配列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2）（配列番号７７）と反応させる。カップリング生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０３２８】
Ｂ．ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−ＭｕｔへのＡβ１−６ペプチドのカップリング
２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.２中の１２０μＭのＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔの溶液１ｍｌを、ロッキングシェーカーにおいて２５℃で、ＤＭＳＯ中のストック溶液から希釈した、１０倍モル過剰のＳＭＰＨ（ピアス）と３０分間反応させる。それに続いて、反応溶液を、４℃の１Ｌの２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７.２に対して２時間２回透析する。次いで、透析したＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔ反応混合物を、ロッキングシェーカーにおいて１６℃で２時間５倍モル過剰のＡβ１−６ペプチド（配列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2）（配列番号７７）と反応させる。カップリング生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０３２９】
Ｃ．線毛へのＡβ１−６ペプチドのカップリング
２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７.４中のエシェリキア・コリ（E.coli）の１型線毛１２５μＭの溶液を、ロッキングシェーカーにおいてＲＴで、ＤＭＳＯ中のストック溶液から希釈した、５０倍モル過剰の架橋物質ＳＭＰＨ（ピアス）と６０分間反応させる。反応混合物をＰＤ−１０カラム（アマシャム−ファルマシア・バイオテック）で脱塩する。カラムから溶離するタンパク質含有画分をプールし、脱塩誘導体化線毛タンパク質を、ロッキングシェーカーにおいて１６℃で２時間５倍モル過剰のＡβ１−６ペプチド（配列：NH2-DAEFRHGGC-CONH2）（配列番号７７）と反応させる。カップリング生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。
【０３３０】
Ｄ．ｆｒ−キャプシドタンパク質、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔまたは線毛にカップリングしたＡβ１−６ペプチドによるマウスの免疫化
上記要領でｆｒ−キャプシドタンパク質、ＨＢｃＡｇ−Ｌｙｓ−２ｃｙｓ−Ｍｕｔまたは線毛にカップリングしたＡβ１−６ペプチドを、０日目および１４日目にマウス（３マウス）に皮下注射する。各マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を、ＰＢＳ中で２００μｌに希釈したワクチン１０μｇにより免疫化する。２１日目にマウスの眼窩後方から採血し、Ａβ１−６ペプチドまたはＡβ１−４０またはＡβ１−４２に特異的な抗体の力価を、実施例１３記載の容量でＥＬＩＳＡにより測定する。
【０３３１】
実施例１９
ＱβｈＡβ１−６によるアカゲザルの免疫化
Ａβ１−６が自己抗原である場合において、ヒトＡβ１−６ペプチドに基くワクチンを用いてヒトＡβに対する抗体の誘導を試験するため、Ａβ配列がヒトとアカゲザルの間では同一であることから、アカゲザルをＱβｈＡβ１−６で免疫化した。ＱβｈＡβ１−６ワクチンを実施例１３記載の要領で製造した。年齢１０〜１５歳のアカゲザル４匹を、０日目に５０μｇのワクチンで免疫化し、２８および５６日目に２５μｇのワクチンにより２回ブースター投与をした。アカゲザルの背中に皮下注射で免疫化した。０（採血前）、４２および７０日目に動物から採血した。４ｍｌの血液を前腕橈側皮静脈から集めた。サルＩｇＧに特異的な二次抗体を用いて、Ａβ１−４０に特異的な抗体の力価を、本質的に実施例１３記載の要領でＥＬＩＳＡにより測定した。
【０３３２】
ヒトおよびアカゲザルは、同じＡβ配列を共有しているため、Ａβ１−４０に特異的なアカゲザルにおいて高い抗体力価が得られたことは、ＱβにカップリングしたｈＡβ１−６による免疫化が自己抗原Ａβに対する寛容性を破壊することを示している。さらに、完全長Ａβを認識する抗体は、霊長類においてカップリングしたＡβ１−６フラグメントにより産生される。
【０３３３】
ＥＬＩＳＡの結果を図６に示す。図表でプロットされているのは、ＱβｈＡβ１−６により免疫化した４匹のサル（１〜４）の血清中で測定されたＡβ１−４０特異抗体の力価およびサル４匹力価の平均である。力価をＯＤ５０力価として表す。ＯＤ５０は、シグナルがその最大値の半分に達する抗体の希釈度である。最大値（ＯＤｍａｘ）は、ＱβｈＡβ１−２７で免疫化したサルに由来し、Ａβ１−４０についても認識する基準血清から得られ、同じＥＬＩＳＡプレートで測定された。
【０３３４】
９７、１１０、１１７、１２４、１３８、１４３、１５２、１５９、１６６日目に２匹のサル（上記）から採血し、１１０日目に２５μｇのワクチンで３回目のブーストを投与した。血清をプールし（９９ｍｌ）、Ａβ１−６−特異抗体のアフィニティー精製に使用した。これらの抗体を、１.５μｇ／ｍｌの濃度で免疫組織化学的染色に使用し、ビオチニル化二次抗サル抗体を検出に使用した。１８ヶ月令の異型接合ＡＰＰ２３マウスおよびＡＤ患者（ブラークIII段階）のパラフィン脳薄片を染色に使用した。ＡＰＰ２３マウス脳薄片およびＡＤ患者脳薄片の両方において斑特異的染色が観察された（図７）。
【０３３５】
組織学的分析結果を図７ＡおよびＢに示す。Ａβ１−６に特異的な上記アフィニティー精製抗血清によるヒトＡＰＰトランスジェニックマウス斑（ＡＰＰ２３株）の染色は、図７Ａに描かれている。図７Ｂは、同じ精製抗血清によるヒトＡＤ斑の染色を示す。精製抗血清を両場合とも１.５μｇ／ｍｌの濃度で使用した。典型的斑は、両図面において矢印で示されている。
【０３３６】
実施例２０
ＡＰ２０５ ＶＬＰへのネズミＡβ１−６のカップリング、マウスの免疫化および免疫応答の分析
Ａ．ＡＰ２０５ ＶＬＰへのネズミＡβ１−６ペプチドのカップリング
ペプチドネズミＡβ１−６（ｍＡβ１−６、配列：NH2-DAEFGHGGC-CONH2）（配列番号７８）を化学的に合成した。最初のＮＨ２基は、ペプチドが遊離Ｎ−末端を有することを示し、最後のＮＨ２基は、ペプチドがアミド化されたカルボキシ末端を有することを示す。２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８.０（ＨＢＳ、ｐＨ８.０）中のＡＰ２０５ ＶＬＰ（実施例１記載の要領で発現および精製された）を、２ｍｇ／ｍｌの濃度（ブラッドフォード検定法で測定）で、室温（ＲＴ）で３０分間、ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストックから希釈した、２.８６ｍＭのＳＭＰＨ（ピアス、ロックフォード、イリノイ）と反応させた。次いで、反応混合物を、４℃で２時間、１０００倍容量のＨＢＳ、ｐＨ７.４に対して２回透析した。生成した透析および誘導体化ＡＰ２０５ ＶＬＰを液体窒素中で瞬間冷凍し、一晩−２０℃で貯蔵した。誘導体化ＡＰ２０５ ＶＬＰを、１体積の２０ｍＭのＨＢＳ、ｐＨ７.４で希釈し、ＤＭＳＯ中５０ｍＭのストックから反応混合物中で希釈した７１９μＭのｍＡβ１−６ペプチドと振とうしながら１５℃で２時間反応させた。カップリング反応物を、２時間および一晩、１０００倍体積のＨＢＳ、ｐＨ７.４に対して２回透析した。透析反応混合物をアリコートに分けて液体窒素中で瞬間冷凍し、さらなる使用時まで−８０℃で貯蔵した。
【０３３７】
アリコートを解凍し、ＡＰ２０５ ＶＬＰサブユニットへのｍＡβ１−６ペプチドのカップリングをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、タンパク質濃度をブラッドフォード検定法で測定した。カップリング反応の結果を図８に示す。
【０３３８】
図８は、ｍＡβ１−６ペプチドとＡＰ２０５ ＶＬＰのカップリング反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。試料を還元的条件下１６％トリス−グリシンゲルでの電気泳動にかけ、クーマシーブリリアントブルーで染色する。レーン１はタンパク質マーカーであり、対応する分子量はゲルの左境界線上に示されている。レーン２はＡＰ２０５ ＶＬＰタンパク質であり、レーン３は、誘導体化されたＡＰ２０５ ＶＬＰであり、レーン４は、ｍＡβ１−６ペプチドとＡＰ２０５ ＶＬＰのカップリング反応の上清であり、レーン５は、ｍＡβ１−６ペプチドへのＡＰ２０５ ＶＬＰのカップリング反応のペレットである。カップリングされずに残されたＡＰ２０５ ＶＬＰサブユニットは、ゲルからは全く検出され得ず、一サブユニットにつき幾つかのペプチドに対応するバンドが見られたことから、非常に高いカップリング効率が立証された。特に、１個のＡＰ２０５ ＶＬＰサブユニットにつき１個よりかなり多いＡβ１−６ペプチドが存在する。
【０３３９】
Ｂ．ＡＰ２０５ ＶＬＰにカップリングしたｍＡβ１−６ペプチドによるマウスの免疫化および免疫応答の分析
ｍＡβ１−６ペプチドにカップリングされたＡＰ２０５ ＶＬＰを、０日目および１４日目にマウス（３マウス）に皮下注射した。ｍＡβ１−６ペプチドを上記要領でＡＰ２０５ ＶＬＰにカップリングした。各マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を、ＰＢＳ中で２００μｌに希釈したワクチン２５μｇで免疫化した。２１日目にマウスの眼窩後方から採血し、ｍＡβ１−６ペプチドに特異的な抗体の力価を、ｍＡβ１−６に対するＥＬＩＳＡで測定した。化学架橋物質スルホ−ＳＰＤＰを用いてｍＡβ１−６ペプチドを牛リボヌクレアーゼＡにカップリングした。１０μｇ／ｍｌ濃度のリボヌクレアーゼ−ｍＡβ１−６調製物で、ＥＬＩＳＡプレートを被覆した。プレートを遮断し、次いで系列希釈マウス血清とインキュベーションした。結合抗体を酵素標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。対照として、同マウスの免疫前血清についても試験した。結果を図９に示す。
【０３４０】
図９は、ＡＰ２０５ ＶＬＰにカップリングさせたｍＡβ１−６ペプチドで免疫化したマウスの血清中のｍＡβ１−６ペプチドに特異的なＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。２１日目に集めた免疫化した３マウス（Ａ１ ｄ２１〜Ａ３ ｄ２１）の血清についての結果を示す。免疫前血清を図面では「ｐｒｅ ｉｍｍ」として示す。一免疫前血清についての結果を示す。免疫前血清とＡＰ２０５ ＶＬＰにカップリングしたｍＡβ１−６により免疫化したマウスの血清の比較結果は、自己抗原である、ペプチドｍＡβ１−６に対する強い特異的抗体応答がアジュバントの不存在下で得られたことを示している。さらに、ＡＰ２０５ ＶＬＰへ自己ペプチドをカップリングすることにより、このペプチドに対する寛容性が破壊され、非常に高い特異的免疫応答が誘導される。すなわち、ＡＰ２０５ ＶＬＰは、アジュバントの不存在下でＡβに対して高い抗体力価を生じさせるのに適切である。
【０３４１】
実施例２１
ＱβｈＡβ１−６による免疫化により、「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおけるアミロイド斑は低減化される
この実施例は、アルツハイマー病様拡散性（コンゴ−レッド陰性）アミロイド斑を発現するマウスモデルにおけるＱβｈＡβ１−６での免疫化により、新皮質および皮質下部脳領域における斑密度は大きく低減化されることを立証している。拡散性アミロイド斑の組織学的発生は、ＡＤ脳病理学の目立つ特徴であり（Selkoe、１９９４、Annu.Rev.Neurosci.１７：４８９−５１７）、したがって、この実施例は、ＱβｈＡβ１−６による免疫化が、アルツハイマー病の有効な処置方法を提供することを立証している。
【０３４２】
ＱβｈＡβ１−６による免疫化の治療効力を評価するため、マウスＴｈｙ−１プロモーターの制御下で「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス（ＡＰＰ２４；Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ；Ｖ７１７Ｉ、特許番号ＷＯ９８０−３６−４４２３）を使用した。このマウス系統は、１８ヶ月令で新皮質、海馬、尾状被殻および視床における多数のアミロイド斑を特徴とする。斑は、９ヶ月令で初めて観察され得る。組織学的に、ＡＰＰ２４マウスにおけるアミロイド斑は主として拡散型に属し、すなわちそれらはコンゴ−レッド染色において陰性である。程度は劣るが、密集したアミロイド斑（コンゴ−レッド陽性）も見出され得る。
【０３４３】
Ｑβ ＶＬＰにカップリングしたヒトＡβ１−６ペプチド（ＱβｈＡβ１−６）を実施例１３記載の要領で製造した。本発明を記載または実施可能にするのに必ずしも必要ではないが、用いた実験手順に関して言えば、０日目に、ＡＰＰ２４トランスジェニックマウス（９.５ヶ月令）に対し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）中の２５μｇのＱβｈＡβ１−６（ｎ＝１６）または陰性対照としてＰＢＳ（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）（ｎ＝９）またはカップリングさせた抗原を欠くＱβウイルス様粒子（ｎ＝１１）を皮下注射した。その後、１５、４９、７６、１０６、１４０、１６９、２００、２３０、２５９および２９１日目に、マウスに２５μｇのＱβｈＡβ１−６ワクチン、ＱβまたはＰＢＳを注射した。動物に対し、初回免疫（０日目）の１〜２日前および５６、９０、１１８、１８８、２１４、２４６および２７２日目に尾部静脈から採血した。血清もまた３０５日目に集め、その時点で組織病理学用に脳も採取した（この時点でのマウスの年齢：１９.５ヶ月）。
【０３４４】
Ａβ１−４０に特異的な抗体の力価を、本質的に実施例１３の記載にしたがってＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡの結果を図１０に示す。図表でプロットされているのは、ＱβｈＡβ１−６により免疫化したマウスの血清で測定されたＡβ１−４０またはＡβ１−４２特異抗体の力価である。力価をＯＤ５０％力価として表す。ＯＤ５０％は、シグナルがその最大値の半分に達する抗体の希釈度である。最大値（ＯＤｍａｘ）は、Ａβ１−４０およびＡｂ４２を認識する基準血清から得られ、同じＥＬＩＳＡプレートで測定された。全ＱβｈＡβ１−６免疫化マウスは、１：８０００より上のＯＤ５０％（免疫前血清力価は１：１００未満であった）を示したことから、高齢ＡＰＰ２４マウスにおいてさえもＱβｈＡβ１−６に対する一定の抗体応答が立証された（図１０）。免疫化群における半ＯＤ５０％力価は、免疫化期間全体を通して１：２００００〜１：５００００の範囲であった。
【０３４５】
アミロイド斑の定量については、４℃の０.１ＭのＰＢＳ中４％のホルムアルデヒドに浸漬することにより脳を固定した。エタノールで脱水後、脳をパラフィンに埋封し、ミクロトームにより４μｍ厚さで矢状方向に切断した。薄片を凍結（super frost）載物グラス上に載せ、３７℃で乾燥した。薄片をＰＢＳ中で洗浄し、０.１Ｍクエン酸緩衝液中、９０℃で３分間電子レンジ加熱することにより抗原性を高めた。ＮＴ１１抗血清（抗Ａβ１−４０、Sturchler−Pierrat et al., １９９７、Proc.Natl.Acad.Sci.９４：１３２８７−１３２９２）を、３％ヤギ血清を含むＰＢＳで１：１０００に希釈し、４℃で一晩インキュベーションした。すすいだ後、薄片を１時間、ＰＢＳで１：２００に希釈したビオチニル化抗ウサギＩｇＧ二次抗体（ＢＡ１０００、ベクター・ラボラトリーズ）とインキュベーションした。すすいだ後、薄片をさらにアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ技術（ＡＢＣ−エリート・キット ＰＫ６１００：ベクター・ラボラトリーズ）により処理した。最後に、薄片をジアミノベンジジン（ＤＡＢ）金属高感度基質（ベーリンガー、コード１７１８０９６）と反応させ、ヘマルムで対比染色し、脱水し、キシレン中で清澄化し、カバーグラスで覆った。一動物当たり異なる３解剖面での脳薄片の系統的ランダム系列を、分析に使用した。ＭＣＩＤ画像分析装置（イメージング・リサーチ、ブロック・ユニバーシティー、オンタリオ−カナダ国、プログラムバージョンＭ５エリート）を用いてアミロイド斑を定量した。顕微鏡画像を、Ｘｉｌｌｉｘ白黒ＣＣＤ ＴＶカメラの使用によりディジタル化し、２５６グレイレベルでの６４０×４８０画素解像度で記憶させた。５×倍率のマイクロメーター（ライカ・ネオプラン・オブジェクティブ）を用いて画素サイズを測定した。隣接する対象視野を正しい場所に位置させるためモーター駆動式顕微鏡載物台を用いて、各薄片の全新皮質および嗅覚核を分析した。各対象視野について、解剖（大脳皮質）野をマニュアルアウトラインにより画定した。個々の各薄片について、免疫陽性アミロイド斑および組織バックグラウンド間におけるマニュアル閾値設定（グレイレベル）によりサンプル野を画定した。摘出組織アーチファクトをマニュアルアウトラインにより除外した。未処理データを、個々のカウント（アミロイド沈着）および比例面積値（免疫陽性アミロイド／皮質または嗅覚核）として測定する。
【０３４６】
各マウスのデータを、１ｍｍ２当たりの沈着（斑）の数および新皮質全体における全斑面積（％）に対して正規化した。ＱβｈＡβ１−６免疫化マウスは、ＰＢＳまたはＱβ注射対照群と比べて皮質および皮質下野におけるアミロイド沈着の劇的な低減化を示した（図１１）。沈着数の中央値および斑合計は両方とも、皮質、尾状被殻、海馬および視床においてＰＢＳ群と比べると非常に顕著に８０〜９８％低減化された（ｐ＜０.００１対ＰＢＳ群、マン−ホイットニー検定、図１２）。
【０３４７】
第二の試験では、ＡＰＰ２４トランスジェニックマウス（１３.５ヶ月令）に対し、０日目、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）中の２５μｇのＱβｈＡβ１−６（ｎ＝１５）、または陰性対照としてＰＢＳ（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）（ｎ＝１５）の皮下注射をした。その後、１６、４６、７６、１０９、１４０および１７０日目に、マウスに２５μｇのＱβｈＡβ１−６ワクチンまたはＰＢＳを注射した。動物に対し、初回免疫（０日目）の１〜２日前および３１、５９、１２８および１５４日目に尾部静脈から採血した。血清もまた１８４日目に集め、その時点で組織病理学用に脳も採取した（この時点でのマウスの年齢：１９.５ヶ月）。Ａβ１−４０に特異的な抗体の力価を、上記と同様にして測定および表現したところ、同じく免疫化マウスは全て、少なくとも１：２０００より上の血清ＯＤ５０％力価でＱβｈＡβ１−６免疫化に応答することが見出された（示さず）。半ＯＤ５０％力価は、免疫化期間全体と通して１：１００００〜１：５００００の範囲であった。アミロイド沈着の定量を上記と同様にして行った。免疫化を早く（すなわち９.５ヶ月令で）開始した実験と比較すると、斑沈着数（−５５％）および面積（−３２％）の低減化は、新皮質ではそれほど劇的なものではなかったが、それでも非常に明白で（図１３）非常に有意であった（ｐ＞０.００１対ＰＢＳ、マン−ホイットニー検定）。皮質下領域では、斑沈着数および面積は、ＱβｈＡβ１−６免疫化群において６０〜９０％低減化されていた。皮質と比べた場合のこれらの領域におけるより明白な効果は、これらの領域における斑形成の延長された時間経過と関連していると思われる。
【０３４８】
これらを考え合わせると、両実験とも、「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいてＱβｈＡβ１−６で免疫化すると、これらのマウスにおけるアミロイド沈着の発生が劇的に低減化されることを立証している。
【０３４９】
図１０：「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおける血清抗Ａβ４０／４２抗体力価（Ｄ５０％）。９.５〜１９ヶ月令のマウスをＱβｈＡβ１−６により免疫化した。個々の値（黒点）および四角が示されており、四角の端部は１００分順位の２５番目および７５番目を画定し、中央の線および誤差バーは１００分順位の１０番目および９０番目を画定している（特定範囲外のものはドットとして示されている）。
【０３５０】
図１１：矢状方向脳薄片におけるアミロイド斑の免疫組織化学染色。Ｑβ（Ａ）およびＱβｈＡβ１−６（Ｂ）ワクチンで免疫化した「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスの矢状方向脳薄片が図に示されている。
【０３５１】
図１２：免疫化後の「スウェーデン／ロンドン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス（９.５〜１９ヶ月令）における斑沈着の定量。（Ａ）皮質斑密度。（Ｂ）皮質斑領域。（Ｃ）尾状被殻における斑密度。（Ｄ）尾状被殻における斑領域。（Ｅ）海馬における斑密度。（Ｆ）海馬における斑領域。（Ｇ）視床における斑密度。（Ｈ）視床における斑領域。斑密度を斑／ｍｍ２で表しており、斑領域を、アミロイド・ベータにより覆われた組織面積のパーセントで表している。個々の値（黒点）および四角としてデータを示している。四角の端部は１００分順位の２５番目および７５番目を画定し、中央の線および誤差バーは１００分順位の１０番目および９０番目を画定している。＊＊ｐ＜０.００１（マン−ホイットニー検定）。ＰＢＳ、ｎ＝９、Ｑβ，ｎ＝１１、ＱβｈＡβ１−６、ｎ＝１６。
【０３５２】
実施例２２
ＱβｈＡβ１−６での免疫化により、「スウェーデン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおけるアミロイド斑は低減化される。
この実施例は、ＱβｈＡβ１−６による免疫化が、アミロイド斑病状の非常に進行した段階で免疫化を開始した場合でも、アルツハイマー病の有効な処置方法となることを立証している。この実施例で使用したＡＤマウスモデルにおけるアミロイド斑沈着過程は、約６ヶ月令で既に始まっている（Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292）。本明細書記載の試験では、ＱβｈＡβ１−６による免疫化は、１８ヶ月令で開始されており、既に多数の小型斑が皮質で形成されていた。この実施例はまた、かなりの高齢動物におけるＱβｈＡβ１−６のＡβ４０／４２抗体誘導能力を立証している（１９免疫化マウスにおいて非応答者は無し）。
【０３５３】
ＱβｈＡβ１−６による免疫化の治療効果を評価するため、「スウェーデン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス（ＡＰＰ２３; Ｋ６７０Ｎ/Ｍ６７１Ｌ、Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292）を使用した。これらのマウスにおけるアルツハイマー病様病状は、既に充分に特性確認されている（Calhoun et al., 1998, Nature 395: 755-756; Phinney et al., 1999, J. Neurosci. 19: 8552-8559; Bondolfi et al., 2002, J. Neurosci. 22: 515-522）。
【０３５４】
Ｑβ ＶＬＰにカップリングさせたヒトＡβ１−６ペプチド（ＱβｈＡβ１−６）を、実施例１３記載の要領で製造した。本発明を記載または実施可能にするのに必ずしも必要ではないが、用いた実験手順に関して言えば、０日目に、ＡＰＰ２３トランスジェニックマウス（１８ヶ月令）に対し、リン酸緩衝食塩水（１マウスにつき２×１００μｌとして投与）に溶かした２５μｇのＱβｈＡβ１−６（ｎ＝１９）または陰性対照としてリン酸緩衝食塩水（ｎ＝１７）を皮下注射し、１３、２７〜３４、６１〜６３、９０〜９６、および１２３〜１３０日目に、２５μｇのワクチンをブースター注射した。動物に対し、初回免疫（０日目）の１〜２日前および４１〜４５、および６８日目に尾部静脈から採血した。血清もまた１５２〜１５４日目に集め、その時点で組織病理学用に脳も採取した（この時点でのマウスの年齢：２３ヶ月）。
【０３５５】
Ａβ１−４０に特異的な抗体の力価を、本質的に実施例１３の記載にしたがってＥＬＩＳＡにより測定し、結果を実施例２１の記載と同様に表す。ＥＬＩＳＡの結果を図１４に示す。全ＱβｈＡβ１−６免疫化マウスは、１：２０００より上のＯＤ５０％力価（免疫前血清力価は１：１００未満であった）を示したことから、非常に高齢のマウスにおいてさえもＱβｈＡβ１−６に対する一定の抗体応答が立証された（図１４）。半ＯＤ５０％力価は、免疫化期間全体を通して１：９０００〜１：２００００の範囲であった。
【０３５６】
アミロイド斑の定量を実施例２１記載の要領で実施した。各マウスのデータを、１ｍｍ２当たりの沈着（斑）の数および新皮質全体における全斑面積（％）に対して正規化した。ＱβｈＡβ１−６免疫化マウスでは、ほぼ小型斑の減少故に、皮質に現われた沈着はさらに少数であった（図１５、図１６）。非免疫化群と比べると、中央の斑数は、ＱβｈＡβ１−６免疫化群では３３％減少していた（ｐ＜０.０１対ＰＢＳ群、マン−ホイットニー検定）。主として小型斑状をとるため、全斑領域の低減化は緩やかであり、１０％に達した（ｐ＜０.０１対ＰＢＳ群、マン−ホイットニー検定）。
【０３５７】
図１４：「スウェーデン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスにおける血清抗Ａβ４０／４２抗体力価（Ｄ５０％）。１８〜２３ヶ月令のマウスをＱβｈＡβ１−６により免疫化した。個々の値（黒点）および四角が示されており、四角の端部は１００分順位の２５番目および７５番目を画定し、中央の線および誤差バーは１００分順位の１０番目および９０番目を画定している（特定範囲外のものはドットとして示されている）。
【０３５８】
図１５：矢状方向脳薄片におけるアミロイド斑の免疫組織化学染色。矢印は小型沈着を指す。ＰＢＳ（Ａ）またはＱβ−Ａβ１−６（Ｂ）で免疫化した「スウェーデン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウスからの矢状方向脳薄片が図に示されている。
【０３５９】
図１６：免疫化後の「スウェーデン」突然変異アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニックマウス（１８〜２３ヶ月令）における斑沈着の定量。（Ａ）皮質斑密度。（Ｂ）皮質斑領域。斑密度を斑／ｍｍ２で表しており、斑領域を、アミロイド・ベータにより覆われた組織面積のパーセントで表している。個々の値（黒点）および四角としてデータを示している。四角の端部は１００分順位の２５番目および７５番目を画定し、中央の線および誤差バーは１００分順位の１０番目および９０番目を画定している。＊＊ｐ＜０.００１（マン−ホイットニー順位和検定）。ＰＢＳ、ｎ＝１７、ＱβｈＡβ１−６、ｎ＝１９。
【０３６０】
理解を深めるために図を引用し、例を挙げて本発明を詳細に説明したが、当業者であれば、本発明の範囲またはその実施態様に影響を及ぼすことなく、条件、処方物および他のパラメーターの広範かつ均等な範囲内で本発明を修飾または変更することにより同じことが実施され得ること、および上記修飾または変更も添付の請求の範囲内に包含されるものであることは容易に理解できるはずである。
【０３６１】
本明細書で挙げた出版物、特許および特許出願は全て、本発明が属する分野での当業者のレベルを示すものであり、各出版物、特許および特許出願が本明細書において具体的で個々に引用されているのと同じ扱いで出典明示により援用されているものとする。
【図面の簡単な説明】
【０３６２】
【図１】図１は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰへのＡβ１−６ペプチド（NH2-DAEFRHGGC-CONH2）（配列番号７７）のカップリングの結果を示す、還元条件下で実施された、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２】図２は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清中のＡβ１−６に特異的な抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【図３】図３は、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清中のＡβ１−４０に特異的な抗体のＥＬＩＳＡ分析を示す。
【図４】図４Ａ−Ｂは、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清で染色されたＡＰＰ２３マウスの脳薄片（Ａ）およびＡＤ患者からの内嗅野薄片（Ｂ）を示す。
【図５】図５Ａ−Ｅは、Ｑβコートタンパク質のＶＬＰにカップリングされたＡβ１−６ペプチドにより免疫化されたマウスの血清、またはヒトまたはマウスＡＰＰのＣ−末端に特異的なポリクローナルウサギ抗血清で染色されたＡＰＰ２３マウスの脳薄片を示す。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡ検定法において測定されたＱβ ＶＬＰにカップリングされたヒトＡβ１−６によるアカゲザルの免疫化の結果を示す。
【図７】図７は、ヒトＡＤおよびトランスジェニックマウス斑に関する組織学により測定された、Ｑβ ＶＬＰにカップリングされたヒトＡβ１−６により免疫化されたサル血清の斑への結合の結果を示す。
【図８】図８は、ＡＰ２０５ＶＬＰへのネズミＡβ１−６のカップリングのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡ検定法で測定されたＡＰ２０５にカップリングされたネズミＡβ１−６によるマウス免疫化の結果を示す。
【図１０】図１０は、９.５〜１９ヶ月令のＱβｈＡβ１−６により免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスの血清における抗Ａβ４０および抗Ａβ４２力価のＥＬＩＳＡによる分析を示す。
【図１１】図１１は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスの脳薄片の免疫組織化学的染色を示す。
【図１２】図１２は、９.５〜１９ヶ月令のＱβｈＡβ１−６、ＱβまたはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【図１３】図１３は、１３.５〜１９ヶ月令のＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン／ロンドン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【図１４】図１４は、ＱβｈＡβ１−６により免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスの血清における抗Ａβ４０および抗Ａβ４２力価のＥＬＩＳＡによる分析を示す。
【図１５】図１５は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスからの脳薄片の免疫組織化学的染色を示す。
【図１６】図１６は、ＱβｈＡβ１−６またはＰＢＳにより免疫化された「スウェーデン」トランスジェニックマウスにおける斑沈着の定量化を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
2005539025.tif 000064
【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４】
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2005539025.tif 000076
【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2005539025.tif 000078
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月26日(2005.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005539025000001.app
【国際調査報告】
2005539025.tif 000079
2005539025.tif 000080
2005539025.tif 000081