(57)【要約】本発明は、少なくとも１つのウイルス性疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造への少なくとも１つの作用物質の使用に関する。それは、ウイルス増殖が抑制されるようにして作用物質が細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼまたは少なくとも１つのＳＥＫキナーゼを抑制することによって特徴付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのウイルス性疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造への少なくとも１つの作用物質の使用において、ウイルス増殖が阻害されるようにして該作用物質が細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼまたは少なくとも１つのＳＥＫキナーゼを阻害することを特徴とする、ウイルス性疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造への少なくとも１つの作用物質の使用。
【請求項２】
細胞間シグナル伝達経路内のキナーゼが直接連続して活性化可能であることを特徴とする、請求項１記載の少なくとも１つの作用物質の使用。
【請求項３】
細胞間シグナル伝達経路の前記複数のキナーゼまたは前記ＳＥＫキナーゼが次の細胞間シグナル伝達経路：ＭＥＫＫ２，−３／ＭＥＫ５／ＥＲＫ５；Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ；
ＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫ；ＪＡＫ１，ＪＡＫ２，ＪＡＫ３，ＴＹＫ２および／またはＪＡＫ１，−２，−３，ＴＹＫ２の異質−および同質二量体；ＡＳＫ／ＭＫＫ３，−６／ｐ３８；ＡＳＫ／ＭＫＫ４，−７／ＪＮＫ；ＭＥＫＫ４／ＭＫＫ４，−７；ＤＬＫ／ＭＫＫ４，−７；
Ｔｐｌ−２／ＭＫＫ４，−７；Ｔｐｌ−２／ＭＥＫ５／ＥＲＫ５；ＭＬＫ−３／ＭＫＫ３，−６；ＭＬＫ−３／
ＭＫＫ４，−７；ＴＡＫ／ＮＩＫ／ＩＫＫ；ＴＡＫ／ＭＫＫ３，−６；ＴＡＫ／ＭＫＫ４，−７；
ＰＡＫ／ＭＫＫ３，−６；ＰＡＫ／ＩＫＫ；Ｃｏｔ，Ｔｐｌ−２／ＩＫＫ；ＰＫＣ／ＩＫＫ；ＰＫＢ／ＩＫＫ；
ＰＫＣ／Ｒａｆ；ＰＡＫ／Ｒａｆ；Ｌｃｋ／Ｒａｆ；ＭＥＫＫｓ／ＩＫＫ；ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ＰＫＢ；
ＪＡＫ／ＴＹＫ／ＰＬＣγ；および／またはＭＡＰキナーゼ／ＭＡＰＫＡＰキナーゼ，例えば：ＥＲＫ／３ｐＫ，ＥＲＫ／Ｒｓｋｐ９０，ｐ３８／ＭＡＰＫＡＰキナーゼおよび／またはｐ３８／３ｐＫ
から選択されていることを特徴とする、請求項１または２記載の少なくとも１つの作用物質の使用。
【請求項４】
前記作用物質が次の作用物質：キナーゼ阻害フラボン誘導体またはベンゾピラン誘導体；４Ｈ−１−ベンゾピランのキナーゼ阻害誘導体；フラボピリドール誘導体；２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−（１）ベンゾピラン；７，１２−ジヒドロ−インドーロ（３，２−ｄ）（１）ベンズアゼピン−６（５Ｈ）−オン；７ＯＨ−スタウロスポリンおよび／または７ＯＨ−スタウロスポリンのホスホキナーゼ阻害誘導体；ブチロラクトン；ロスコビチン；プルバラノールＡ；エモジン；アニリノキン−アゾリン；フェニルアミノ−ピリミジン；トリオイルイミダゾール；パウロン；［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール；［１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス（２アミノフェニルチオ）ブタジエン］；ブタジエンのキナーゼ阻害誘導体；［２−２’−アミノ−３’−メトキシフェニル）−オキサナフタレン−４−オン）；［２−（２−クロロ−４−ヨウ素−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド；ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）ビス−エチルチオメチル；テトラピロールの大環状化合物；ピリミドン誘導体；３−アミノメチレン−インドリン誘導体；ピラゾロ（３，４−ｂ）ピリジン誘導体；ピラゾール誘導体；１，４−置換ピペリジン誘導体；類脂質のアンモニウム塩；細胞間シグナル伝達経路のキナーゼの優性ネガティブの突然変異体；細胞間シグナル伝達経路のキナーゼのためにコーディングするＤＮＡ配列もしくはｍＲＮＡ配列に特異的に付加されて、その転写および／または翻訳を阻害するアンチセンス−オリゴヌクレオチド；ＲＮＡｉ技術によっての、細胞間シグナル伝達経路のキナーゼによるｍＲＮＡの目的とする分解に適当であるｄｓオリゴヌクレオチド；特異的に細胞間シグナル伝達経路のキナーゼのための抗体もしくは抗体フラグメント、
または、キナーゼモジュールのキナーゼ活性を阻害する、少なくとも１つの抗体フラグメント、例えばＦｖ−フラグメント、を含有する融合蛋白質；および／または細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼの相互作用を阻害するペプチド、
から選択されていることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の少なくとも１つの作用物質の使用。
【請求項５】
ウイルス性疾患がＲＮＡ−もしくはＤＮＡウイルス、特にインフルエンザウイルスによって引き起こされることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの作用物質の使用。
【請求項６】
混合物の形でかまたは個々の成分として、同じかもしくは種々の場所における同時もしくは時間的に種々の適用に使用可能である組合せ製剤である、請求項３記載の作用物質から選択された、細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼに、ウイルス増殖が本質的に阻害されるように影響を及ぼすか、またはＳＥＫキナーゼを本質的に阻害する少なくとも２つの作用物質を含有する、少なくとも１つのウイルス性疾患の予防および／または治療のための組合せ製剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの作用物質と、キナーゼ阻害剤ではない少なくとも１つの抗ウィルス性の作用物質を含有する、少なくとも１つのウイルス性疾患の予防および／または治療のための組合せ製剤。
【請求項８】
キナーゼ阻害剤ではない少なくとも１つの抗ウィルス性の作用物質が１−アダマンタンアミン、リマンタジン、ノイラミニダーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似体、例えばリバビリンである、請求項７記載の組合せ製剤。
【請求項９】
マイナス鎖ＲＮＡウイルス、特にインフルエンザウイルスまたはボルナウイルスによる感染の予防および／または治療のための、請求項１から８のいずれか１項に記載の作用物質または組合せ製剤。
【請求項１０】
ウイルス増殖が本質的に阻害されるように細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼまたは細胞間シグナル伝達経路のＳＥＫキナーゼを阻害する作用物質を見いだす為のテストシステムであって、ａ．少なくとも１つのウイルスに感染可能である、細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼまたは少なくとも１つのＳＥＫキナーゼを含む少なくとも１個の細胞と該細胞を感染させる少なくとも１つのウイルスあるいはｂ．少なくとも１つのウイルスに感染している、細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼまたは少なくとも１つのＳＥＫキナーゼを含む少なくとも１個の細胞が含まれているテストシステム。
【請求項１１】
ウイルスがＲＮＡ−もしくはＤＮＡウイルス、特にインフルエンザウイルスであることを特徴とする、請求項１０記載のテストシステム。
【請求項１２】
細胞が少なくとも１つの過発現したキナーゼを含んでいることを特徴とする、請求項１０または１１記載のテストシステム。
【請求項１３】
ａ．少なくとも１つの上位のキナーゼの少なくとも１つの優性ネガティブの突然変異体および／またはｂ．シグナル伝達経路の下位に置かれた少なくとも１つのキナーゼの少なくとも１つの優性ネガティブな突然変異体のためにコーディングする少なくとも１つの遺伝子細胞を含んでいることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか１項に記載のテストシステム。
【請求項１４】
少なくとも１つのキナーゼの発現が阻害されている細胞を含んでいることを特徴とする、請求項１０から１３のいずれか１項に記載のテストシステム。
【請求項１５】
ウイルス性疾患におけるウイルスの増殖を本質的に阻害する、ウイルス性疾患の予防および／または治療のための少なくとも１つの作用物質を見いだすための方法であって、次のステップ；ｃ．少なくとも１つの潜在的な作用物質との、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の少なくとも１つのテストシステムの接触、およびｄ．ウイルス増殖に対する効果の測定を含む方法。
【請求項１６】
ウイルス性疾患におけるウイルスの増殖を本質的に阻害する、少なくとも１つのウイルス性疾患の治療および／または予防のための医薬品の製造のための方法であって、次のステップ：ｃ．請求項１０から１３のいずれか１項に記載のテストシステムの実施およびｄ．見いだした１つもしくは複数の作用物質への少なくとも１つの助剤および／または添加剤の添加を含んでいる方法。
【請求項１７】
ウイルス性疾患の予防または治療のための医薬組成物の製造への次の１つもしくは複数の作用物質：
ａ）キナーゼ阻害剤でない抗ウィルス性の作用物質と組み合わされた、その阻害によりウイルス増殖が阻害されるキナーゼの阻害剤、ｂ）その単独の阻害によりウイルス増殖が阻害される第１のキナーゼの阻害剤、その際、該阻害剤が付加的に第１のキナーゼと異なる、その単独の阻害によりウイルス増殖が阻害される第２のキナーゼを阻害する、ｃ）第１のキナーゼと異なる、その単独の阻害によりウイルス増殖が阻害される第２のキナーゼの、第１の阻害剤と異なる第２の阻害剤と組み合わされた、その単独の阻害によりウイルス増殖が阻害される第１のキナーゼの第１の阻害剤、および／またはｄ）ＳＥＫキナーゼの阻害剤の使用。
【請求項１８】
予定の作用物質を、場合によっては前もって同定された種々の作用物質または種々の別の予定の作用物質とともに、請求項１０から１４のいずれか１項に記載のテストシステムに接触させ、ウイルス増殖の阻害を定量化し、予定の作用物質がないか、あるいは参照作用物質もしくは参照作用物質の組合わせが用いられた以外は同じ条件下で得られた該阻害の得られた値を阻害の参照値と比較し、そして、阻害の値が阻害の参照値より高い場合に予定の作用物質もしくは予定の作用物質の組合わせが選択される、請求項１７記載の予定の作用物質によるスクリーニングのための方法。
【請求項１９】
患者に請求項１７記載の医薬組成物を定義されかつ生理学に有効な用量で投与する、ウイルス性疾患の治療または予防のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つのウイルス性疾患の予防および／または治療のための医薬組成物の製造への少なくとも１つの作用物質の使用ならびにこれのための組合せ製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ−もしくはＤＮＡウイルスの伝染は、ヒトおよび動物にとっての重大な健康の脅威である。例えばインフルエンザウイルスの伝染は依然として人類の重大な伝染病に属し、年々多くの命を奪っている。このような伝染は、マクロ経済的に、例えば病気が原因で労働能力が失われることにより、莫大なコスト要因である。例えば、とりわけ馬とヒツジを襲うが、しかしながら既にヒトにおいても分離されており、そしてこの場合には神経系疾患に関連づけられるボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）による伝染は同様に重要な経済的な重要性をもつ。
【０００３】
特にＲＮＡウイルスに対する闘いの問題は、ウイルスのポリメラーゼの高い誤り率によって生じるウイルスの多様性であり、この多様性が適当なワクチンの生産および抗ウィルス性物質の開発を著しく困難にする。さらに、そのウイルスの機能に直接向けられる抗ウィルス性の物質の使用が確かに治療の初めには抗ウィルス性の効果を示すが、突然変異が原因で著しく速やかに抵抗性の変異体の選択に導かれる。これについての例は、ウイルスの膜透過蛋白質に向けられた抗インフルエンザ薬のアマンタジンおよびその誘導体である。適用後の短い時間内にウイルスの抵抗性の変異体が形成される。更なる例は、インフルエンザウイルスの表面蛋白質、ノイラミニダーゼ、を阻害するインフルエンザ伝染に対する新しい治療薬である。これには例えばレランザが属する。患者において既にレランザに耐性の変異体が見つけられている（Ｇｕｂａｒｅｖａ他，「Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ」１７８，ｐ１２５７−１２６２，１９９８年）。この治療薬に込められた希望はこうして達成されることができなかった。
【０００４】
その通常著しく小さいゲノムおよびこれに関連しかつ制限された、複製に必要な機能のためのコーディング容量のために全てのウイルスはその宿主細胞の機能に強く依存している。ウイルスの複製に必要であるそのような細胞機能の制御に影響を及ぼすことによって、感染した細胞でウイルスの複製を否定的に損なうことは可能である。この場合にはウイルスにとって、適応によって、特に突然変異によって、選択圧を回避するために欠けている細胞機能を取り替えることは不可能である。これは細胞キナーゼおよびメチルトランスフェラーゼに対する比較的非特異的な阻害剤を持つインフルエンザＡ型ウイルスの例によって既に示されていることができた（ＳｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋおよびＭｕｅｌｌｅｒ，「Ａｒｃｈ  ｖｉｒｏｌ」１１９，ｐ１１１−１１８，１９９１年）。
【０００５】
細胞が多数のシグナル伝達経路を利用できることは知られており、このシグナル伝達経路を用いてこの細胞に影響を与えるシグナルが細胞核に伝達される。従って細胞は外の刺激に反応でき、細胞増殖、細胞の活性化、分化または制御された細胞死をもって反応することができる。これらシグナル伝達経路に共通であるのは、シグナル伝達経路が、リン酸化によって次にシグナルを伝達する少なくとも１つの蛋白質を活性化する少なくとも１つのキナーゼを含んでいることである。ウイルスの伝染の後で引き起こされる細胞プロセスの観察により、多数のＤＮＡ−およびＲＮＡウイルスがその感染した宿主細胞中で好ましくは１つの定義されたシグナル伝達経路、いわゆるＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達経路を活性化することが見いだされる（Ｂｅｎｎ他，「Ｊ  Ｖｉｒｏｌ」７０，ｐ４９７８−４９８５，１９９６年；ＢｒｕｄｅｒおよびＫｏｖｅｓｄｉ，「Ｊ  Ｖｉｒｏｌ」７１，ｐ３９８−４０４，１９９７年；ＰｏｐｉｋおよびＰｉｔｈａ，「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」２５２，ｐ２１０−２１７，１９９８年；ＲｏｄｅｍｓおよびＳｐｅｃｔｏｒ，「Ｊ  Ｖｉｒｏｌ」７２，ｐ９１７３−９１８０，１９９８年）。このシグナル伝達経路は細胞における最も重要なシグナル伝達経路の１つであり、増殖プロセスおよび分化プロセスにおける重要な役割を担う。成長因子により引き起こされたシグナルはその場合にはセリン−トレオニンキナーゼＲａｆの漸進的なリン酸化によって両特異性キナーゼＭＥＫ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ／ＥＲＫキナーゼ）へ、最終的にキナーゼＥＲＫ（細胞外のシグナルによって調整されるキナーゼ）へ伝達する。Ｒａｆのためのキナーゼ基質としてＭＥＫしか知られておらず、かつ、唯一の基質であるＭＥＫについてはＥＲＫ−アイソホームが同定されたのに対して、ＥＲＫは多数の基質をリン酸化することができる。これには例えば、細胞の遺伝子発現に直接影響する転写因子が属する（Ｃｏｈｅｎ，「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」７，ｐ３５３−３６１，１９９７年；ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＣｏｂｂ，「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」９，ｐ１８０−１８６，１９９７年，Ｔｒｅｉｓｍａｎ，「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ」Ｂｉｏｌ  ８，ｐ２０５−２１５，１９９６年）。細胞の意思決定過程に於いてのこのシグナル伝達経路の役割の調査は、数ある中でＭＥＫのレベルのシグナル伝達経路、従って、シグナル伝達経路の比較的初めを阻害する複数の薬理学的な阻害剤の同定をもたらした（Ａｌｅｓｓｉ他，「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７０，ｐ２７４８９−２７４９４，１９９５年；Ｃｏｈｅｎ「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」７，ｐ３５３−３６１，１９９７年；Ｄｕｄｌｅｙ他，「ＰＮＡＳ  ＵＳＡ」９２，ｐ７６８６−７６８９，１９９５年；Ｆａｖａｔａ他，「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７３，ｐ１８６２３−１８６３２，１９９８年）。
【０００６】
より新しいデータは、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ−シグナル伝達経路の阻害が、比較的選択的に、このシグナル伝達経路にかかわるキナーゼの１つ、特にＭＥＫを阻害する作用物質によって、核内で複製するマイナス鎖ウイルス、例えばインフルエンザＡ型ウイルスとボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）、の細胞内の増殖を徹底的に阻害することができることを示している（Ｐｌｅｓｃｈｋａ他，「Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」３，ｐ３０１−３０５，２００１年；Ｐｌａｎｚ他，「Ｊ  Ｖｉｒｏｌ」１０，ｐ４８７１−４８７７，２００１年）。
【０００７】
公知の抗ウィルス性作用物質の欠点は、該作用物質がウイルスの成分に向けられていて、従って速やかに抵抗性が導かれる（アマンタジン参照）か、または細胞因子に対して余りに広くかつ非特異的に作用する（例えばメチルトランスフェラーゼ阻害剤）ことであり、これは重大な副作用に数えることができる。それに応じて細胞因子に対して働く物質のいずれかについて、その物質がこれまでウイルス性疾患のための治療薬へと開発されたということが知られたものは１つもない。一方では他のキナーゼの阻害、例えばＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫシグナル伝達経路のキナーゼＪＮＫの阻害は、ウイルス増殖を増強できる。
【０００８】
またもや他のキナーゼ、例えばプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、の強調された活性化がウイルスの複製を阻害することが更に公知である（ＤｒｉｅｄｇｅｒおよびＱｕｉｃｋ，国際公開第９２／０２４８４号パンフレット）。
【０００９】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスがＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路のみをその増殖のために使用しており、かつ従ってこのシグナル伝達経路についての、特にＭＥＫの阻害による、ウイルス増殖の阻害によってウイルス増殖の完全な阻害が得られるという考えがこれまで存在していた。しかし一細胞内でそのシグナル伝達経路が自己完結的な機能をほとんど有しているのではなく、その１つのシグナル伝達経路の活性化の際に相互ネットワーキングを介してさらに別のシグナル伝達経路が種々の程度に付加的に活性化されるので、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路が細胞ならびにウイルスによって回避されることができ、かつ、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路についてのウイルス増殖を阻害する作用物質の治療効果がそれにより制限されうることは原則的に除かれるべきでない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路におけるウイルス増殖を阻害する物質に対して付加的もしくは補完的に働く抗ウィルス性の作用物質を見いだしかつ使用することに対する大きな需要がある。そのような作用物質を見いだすことは、例えばＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫシグナル伝達経路の外のキナーゼの阻害剤、例えばキナーゼＪＮＫの阻害剤、がウイルス増殖を促進できる、つまり望ましい効果の反対が得られること（Ｌｕｄｗｉｇ他，「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７６，ｐ１−９，２００１年）によって、さらにその一方で、選択されたキナーゼ、例えばＰＫＣ、の活性化が物質によって抗ウィルス的に作用することができることによって困難になる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の対象は、少なくとも１つのウイルス性疾患の予防および／または治療への少なくとも１つの作用物質の使用であり、その際、該作用物質は細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼに、ウイルス増殖が本質的に阻害されるように影響を及ぼすか、またはＳＥＫキナーゼを本質的に阻害する。さらに本発明の対象は、ウイルスの伝染の予防および／または治療のための、少なくとも１つの本発明による作用物質と、好ましくはキナーゼ阻害剤ではない抗ウィルス性作用の少なくとも１つの別の作用物質との組合せ物である。
【００１２】
今回意外にも、ＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫ−シグナル伝達経路におけるＳＥＫキナーゼの阻害がウイルス増殖を阻害することが見いだされた。これは、ＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫ−シグナル伝達経路におけるＪＮＫの阻害が反対のこと、増強されたウイルス増殖、をもたらすので意外なことである（Ｌｕｄｗｉｇ他，「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７６，ｐ１−９，２００１年）。ＪＮＫ−ＡＰ−１のシグナル経路がＩＦＮβ、強い抗ウィルス性作用のサイトカイン、のウイルスにより誘発された発現に本質的にかかわっているので、ＪＮＫの阻害の後の欠けたＩＦＮβ発現が、増強されたウイルス増殖を可能にすると思われる。更に意外にも、少なくとも１つの作用物質による細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼの阻害が、１つのみのキナーゼが作用物質によって阻害される場合よりはるかに強くウイルス増殖を阻害することが見いだされた。従って例えばｐ３８とＭＡＰＫＡＰＫ３の阻害あるいはＭＫＫ６とｐ３８の阻害あるいはＲａｆとＭＥＫの阻害は、１つだけの、特に（第２のキナーゼを）活性化する、キナーゼを阻害するよりはっきり強い抗ウィルス性の効果をもたらす。さらに、少なくとも１つの作用物質による細胞間シグナル伝達経路の少なくとも１つのキナーゼの阻害と、キナーゼの阻害剤ではない抗ウィルス性の作用物質の付加的な投与によってウイルス増殖の強い阻害が導かれることが意外にも見いだされた。組合せによるこの阻害は、この組合せの成分の個々の効果の付加により期待されていたであろう場合より強いものであった。従って例えば細胞がインフルエンザＡ型に感染したら、その細胞は、Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路においてＭＥＫキナーゼを阻害することが知られているキナーゼ阻害剤Ｕ０１２６と同時にアマンタジンで治療された。アマンタジンについては、この物質が全てのインフルエンザＡ型ウイルスに作用するわけではなく、そしてインフルエンザＢ型ウイルスには作用しないことが知られており、さらにこの物質が短時間の内に抵抗性のウイルスの変異体の形成を導くことが知られている。Ｕ０１２６とアマンタジンの組合せはインフルエンザＡ型ウイルスの増殖の阻害をもたらしたのであり、この場合、該組合せは２つの個々の成分単独でよりも強く作用することができる。
【００１３】
この細胞間シグナル伝達経路には例えば次のものが属する：ＭＥＫＫ２，−３／ＭＥＫ５／ＥＲＫ５；Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ；
ＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮ；ＪＡＫ１，ＪＡＫ２，ＪＡＫ３，ＴＹＫ２／ＪＡＫ１，−２，−３，ＴＹＫ２の異質−および同質二量体；ＡＳＫ／ＭＫＫ３，−６／ｐ３８；
ＡＳＫ／ＭＫＫ４，−７／ＪＮＫ；ＭＥＫＫ４／ＭＫＫ４，−７；ＤＬＫ／ＭＫＫ４，−７；
Ｔｐｌ−２／ＭＫＫ４，−７；Ｔｐｌ−２／ＭＥＫ５／ＥＲＫ５；ＭＬＫ−３／ＭＫＫ３，−６；ＭＬＫ−３／ＭＫＫ４，−７；ＴＡＫ／ＮＩＫ／ＩＫＫ；ＴＡＫ／ＭＫＫ３，−６；ＴＡＫ／ＭＫＫ４，−７；
ＰＡＫ／ＭＫＫ３，−６；ＰＡＫ／ＩＫＫ；Ｃｏｔ，Ｔｐｌ−２／ＩＫＫ；ＰＫＣ／ＩＫＫ；ＰＫＢ／ＩＫＫ；
ＰＫＣ／Ｒａｆ；ＰＡＫ／Ｒａｆ；Ｌｃｋ／Ｒａｆ；ＭＥＫＫｓ／ＩＫＫ；ＰＩ３Ｋ／ＰＤＫ１／ＰＫＢ；
ＪＡＫ／ＴＹＫ／ＰＬＣγ；ＪＡＫ／Ｔｙｋ／Ｓｔａｔ複合体；ＭＡＰキナーゼ／ＭＡＰＫＡＰキナーゼ，例えば：ＥＲＫ／３ｐＫ，ＥＲＫ／Ｒｓｋｐ９０，ｐ３８／ＭＡＰＫＡＰキナーゼ，ｐ３８／３ｐＫ。
【００１４】
これらシグナル伝達経路についての詳細は、Ｓｅｄｌａｃｅｋ（「Ｄｒｕｇ」５９，ｐ４３５−４７６，２０００年）によって記載されており、かつ他の種々の出版物に記載されている（ＫａｒｉｎおよびＢｅｎ−Ｎｅｒｉａｈ，「Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」１８，ｐ６２１−６６３，２０００年；Ｖｅｒｔｅｇａａｌ他，「Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ」１２，ｐ７５９−７６８，２０００年；ＶａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋおよびＡｌｅｓｓｉ，「Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ」３４６，ｐ５６１−５７６，２０００年；Ｌｕｄｗｉｇ他，「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」１６，ｐ６６８７−６６９７，１９９６年；Ｎｅｗ他，「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７４，ｐ１０２６−１０３２，１９９９年；Ｎｉ他，「Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ」，２４３，ｐ４９２−４９６，１９９８年；ＲｅｂｅｃｃｈｉおよびＰｅｎｔｙａｌａ，「Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ」８０，ｐ１２９１−３３５，２０００年；Ｃｏｈｅｎ，「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」７，ｐ３５３−３６１，１９９７年；ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＣｏｂｂ，「Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」９，ｐ１８０−１８６，１９９７年；ＲａｎｅおよびＲｅｄｄｙ，「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」，１９，ｐ５６６２−５６７９，２０００年；Ｓｕｎ他，「Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．」１０，ｐ２８１−２８４，２０００年；ＧａｒｒｉｎｇｔｏｎおよびＪｏｈｎｓｏｎ，「Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」１１，ｐ２１１−２１８，１９９９年）。
【００１５】
本発明の意味における作用物質は、細胞間シグナル伝達経路の少なくとも１つのキナーゼに、ウイルス増殖が本質的に阻害されるように影響を及ぼすことができるか、または細胞間シグナル伝達経路のＳＥＫキナーゼを本質的に阻害することができる物質である。さらに、例えば酵素的分解によって本発明による有効な作用物質に変換される作用物質の誘導体は、本発明の意味における作用物質であると理解されるべきである。さらに本発明の意味における作用物質は、代謝により本発明による作用物質に変換される作用物質の前駆物質である。本発明の意味における作用物質には例えば次のものが属する；キナーゼ阻害フラベン誘導体またはベンゾピラン誘導体；
例えばＥＰ  ０１３７１９３およびＥＰ  ３６６０６１で開示されている４Ｈ−１−ベンゾピランのキナーゼ阻害誘導体。これらの誘導体についての構造反応関係は例えばＳｅｄｌａｃｅｋ他（「Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ」９，ｐ１１４３−１１６８，１９９６年）によって詳細に記載されており；フラボピリドール誘導体、例えばＫｉｍ他，「Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ」４３（２２），ｐ４１２６−４１３４，２０００年で開示されており、特にチオ−フラボピリドールおよびオキシ−フラボピリドール；２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−（１）ベンゾピラン、例えばＥｂｅｎｄａｌ（国際公開第００／５００３０号パンフレット）により開示されており；７，１２−ジヒドロ−インドーロ（３，２−ｄ）（１）ベンズアゼピン−６（５Ｈ）−オン（ＮＳＣ  ６６４７０４、Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ他「Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．」８２（２−３），ｐ２８５−２９２，１９９９年）；ホスホキナーゼ阻害剤、例えば７０Ｈ−スタウロスポリンおよびそのホスホキナーゼ阻害誘導体、ブチロラクトン、ロスコビチン、プルバラノールＡ、エモジン、アニリノキン−アゾリン（ＰＤ−１６８３９３およびＰＤ  １６９４１４）、ＰＤ  １８４３５２（Ｄｕｅｓｂｅｒｙ他，「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」５（７），ｐ７３６−７３７，１９９９年）およびフェニルアミノ−ピリミジン（ＳＴＩ  ５７１，ＣＧＰ  ７８８５０，ＣＰ  ３５８７７４，ＣＰ５９３２６およびＣＧＰ  ６０４７４）），トリオイルイミダゾール（ｌ−７７９４５０）（Ｍｅｉｊｅｒ他，「Ｐａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．」８２（２−３），ｐ２９７−２８４，１９９９年；Ｓｅｄｌａｃｅｋ他，「Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ」９，ｐ１１４３−１１６８，１９９６年；Ｓｅｄｌａｃｅｋ「Ｄｒｕｇ」５９（３），ｐ４３５−４７６，２０００年）；パウロン（Ｚａｈａｒｅｖｉｔｚ他，「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」５９，ｐ２５６６−２５６９，１９９９年）；ＳＢ２０３５８０、［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール、（Ｉｓｈｉｋａｗａ他，「Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ」７５（２），ｐ４９４−５０２，２０００年、ＨａｒａｄａおよびＳｕｇｉｍｏｔｏ，「Ｊｐｎ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ」７９（３），ｐ３６９−３７８，１９９９年）］；キナーゼ阻害ブタジエン誘導体、特にジアミノジシアノ−（Ｒ）−チオブタジエンの誘導体；Ｕ０１２６［１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス（２アミノフェニルチオ）ブタジエン］（Ｆａｖａｔａ他，「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７３（２９），ｐ１８６２３−１８６３２，１９９８年；ＤｅＳｉｌｖａ他，「Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」１６０，ｐ４１７５−４１８１，１９９８年）］；ＰＤ０９８０５９［２−２’−アミノ−３’−メトキシフェニル）−オキサナフタレン−４−オン）］、（Ｄｕｄｌｅｙ他，「ＰＮＡＳ  ＵＳＡ」９２，ｐ７６８６−７６８６，１９９５年）；ＰＤ１８４３５２［２−（２−クロロ−４−ヨウ素−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド］、（Ｓｅｂｏｌｔ−Ｌｅｏｐｏｌｄ他，「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅ��」５，ｐ８１０−８１６，１９９９年）；３−アミノメチレン−インドリン誘導体（Ｈｅｃｋｅｌ他，  ＤＥ  ９２  ４４０１、Ｅｂｅｒｌｅｉｎ他，ＤＥ  ８４  ４００３；国際公開第００／０１８７３４号パンフレット）；ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）ビス−エチルチオメチル（Ｍａｒｏｎｅｙ他，「Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ」７３（５），ｐ１９０１−１９１２，１９９９年）；テトラピロールの大環状化合物、例えば５，１０，１５，２０−テトラアリールポルフィリンおよび５，１０，１５−トリアリールコロール（Ａｖｉｅｚｅｒ他，国際公開第００／２７３７９号パンフレット）；ピリミドン誘導体（Ａｎｄｏ他，国際公開第００／０１８７５８号パンフレット）；３−アミノメチレン−インドリン誘導体（Ｈｅｃｋｅｌ他，ＤＥ  ９２  ４４０１、Ｅｂｅｒｌｅｉｎ他，ＤＥ  ８４  ４００３；国際公開第００／０１８７３４号パンフレット）；ピラゾロ（３，４−ｂ）ピリジン誘導体（Ｂｕｒｓｕｋｅｒ他，国際公開第９９／３０７１０号パンフレット）；ピラゾール誘導体（Ａｎ−ａｎｔａｎａｒａｙａｎ他，国際公開第００／０３１０６３号パンフレット）；１，４−置換ピペリジン誘導体（Ｃａｒａｖａｔｔｉ他，ＥＰ  ３７４０９５）；類脂質のアンモニウム塩（Ｄａｎｉｅｌ他，国際公開第９０／０４９１８号パンフレット）；４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０２１９０）；ＳＬ  ３２７（ブタジエン誘導体）；細胞間シグナル伝達経路のキナーゼの優性ネガティブの突然変異体；細胞間シグナル伝達経路のキナーゼのためにコーディングするＤＮＡ配列もしくはｍＲＮＡ配列に特異的に付加されて、その転写または翻訳を阻害するアンチセンス−オリゴヌクレオチド；例えばＴｕｓｃｈｌ他（「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」１３：ｐ３１９１−３１９７，１９９９年）およびＺａｍｏｒｅ他（「Ｃｅｌｌ」  １０１；ｐ２５−３３，２０００年）によって記載されている方法に相応するＲＮＡｉ技術によっての、細胞間シグナル伝達経路のキナーゼによるｍＲＮＡの目的とする分解に適当であるｄｓオリゴヌクレオチド；特異的に細胞間シグナル伝達経路のキナーゼのための抗体もしくは抗体フラグメントまたは、少なくとも１つのキナーゼのキナーゼ活性を阻害する、少なくとも１つの抗体フラグメント、例えばＦｖ−フラグメント、を含有する融合蛋白質；細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼの相互作用を阻害するペプチド。
【００１６】
有利に、本発明による、少なくとも１つの作用物質の適用は、ＲＮＡ−もしくはＤＮＡウイルス、特にマイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばインフルエンザウイルス、あるいはボルナウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患において行われる。
【００１７】
本発明の更なる実施態様は、好ましくは既に上記の作用物質から選択された、細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼに、ウイルス増殖が本質的に阻害されるように影響を及ぼすか、またはＳＥＫキナーゼを本質的に阻害する少なくとも２つの作用物質を含有する、少なくとも１つのウイルス性疾患の予防および／または治療のための組合せ製剤に関し、その際、該組合せ製剤は、混合物の形でかまたは個々の成分として、同じかもしくは種々の場所における同時もしくは時間的に種々の適用に使用可能である。
【００１８】
少なくとも２つの異なる作用物質を含有する組合せ製剤の投与によって、ウイルス増殖は細胞シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼに対する効果によって阻害される。組合せ製剤の投与は作用物質の混合物として行うことができる。しかしながら、これら作用物質は、一投与につき同じ場所において互いに別に、例えば静脈内で、投与することもできるし、あるいは互いに異なる場所において、同時にかもしくは、最初に投与された物質が依然として効果を示すある一定期間内で、例えば３日間の期間内で、の種々の時点で投与することもできる。
【００１９】
本発明の更なる実施態様は、少なくとも１つの本発明による作用物質と、キナーゼ阻害剤ではない少なくとも１つの抗ウィルス性の作用物質とからの組合せ製剤の投与である。これらの抗ウィルス性の作用物質には例えば次のものが属する；１−アダマンタンアミン（アマンタジン）；リマンタジン；ノイラミニダーゼ阻害剤、例えばレレンザ；合成ヌクレオシド類似体、例えば３−デアザ  アデノシンおよびリバビリン。
【００２０】
本発明の更なる実施態様は、ウイルス増殖が本質的に阻害されるように細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼまたはＳＥＫキナーゼを阻害する作用物質を見いだす為のテストシステムであって、ａ．少なくとも１つのウイルスに感染可能である、細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼまたは少なくとも１つのＳＥＫキナーゼを含む少なくとも１個の細胞と該細胞を感染させる少なくとも１つのウイルスあるいはｂ．少なくとも１つのウイルスに感染している、細胞間シグナル伝達経路の少なくとも２つのキナーゼまたは少なくとも１つのＳＥＫキナーゼを含む少なくとも１個の細胞が含まれているテストシステムに関する。
【００２１】
本発明の意味における細胞は、種々の器官および組織の細胞、例えば血管およびリンパ管の細胞、体腔を内側から覆う細胞である。同様に細胞培養、特に細胞銀行、例えばＡＴＣＣ、から入手できる細胞培養、特に許容真核細胞、例えば：２９３、２９３Ｔおよび２９３Ｔ７（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓからのＢ８２，ＮＩＨ，３Ｔ３，Ｌ９２９；Ｃｒｉｃｅｔｕｓ  ｃｒｉｃｅｔｕｓからのＢＨＫ；Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓからのＣＨＯ；Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ  からのＭＤＣＫ；Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓからのＶｅｒｏ、ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７；ならびにＧａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓからの一次胚−繊維芽細胞（ＣＥＦ細胞）が含まれる。
【００２２】
例えば、作用物質を見いだす為の、本発明によるテストシステムの場合には、好ましくは０．００１μモル〜１００μモルの濃度での、物質と、選択された細胞を感染できる粒子数のウイルスとが添加されることによって、物質が細胞を損傷することなくウイルス増殖を阻害することができるかどうか検査される。
【００２３】
好ましくは本発明によるテストシステムで使用されるウイルスは、ＲＮＡ−もしくはＤＮＡウイルス、好ましくはインフルエンザウイルスである。
【００２４】
有利な実施態様では本発明によるテストシステムの細胞は、過発現させた少なくとも１つのキナーゼを、特に、該キナーゼをコーディングする１つまたは複数の遺伝子の挿入によって含んでいる。この過発現によって、キナーゼを強く阻害し、かつ、過発現させたキナーゼの阻害のために細胞内で高い濃度に達することができる物質が検出される。念のため、本発明によるテストシステムの１つの細胞の場合には少なくとも１つのキナーゼのための発現が、例えば：アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの挿入によって；少なくとも１つの上位のキナーゼの少なくとも１つの優性ネガティブの突然変異体のためにコーディングする少なくとも１つの遺伝子の挿入によって；および／またはシグナル伝達経路の下位に置かれた少なくとも１つのキナーゼの少なくとも１つの優性ネガティブな突然変異体のためにコーディングする少なくとも１つの遺伝子の挿入によって阻害されている。
【００２５】
本発明の更なる実施態様は、ウイルス性疾患におけるウイルスの増殖を本質的に阻害する、ウイルス性疾患の予防および／または治療のための少なくとも１つの作用物質を見いだすための方法であって、次のステップ；ａ．少なくとも１つの潜在的な作用物質との少なくとも１つの本発明によるテストシステムの接触、およびｂ．ウイルス増殖に対する効果の測定を含む方法に関する。
【００２６】
本発明の意味における接触は、例えば細胞培養の培地中への作用物質の添加によってか、あるいは生体への作用物質の局所的か全身的な投与によって行われることができる。本発明の意味における接触には、そのままの細胞への物質の挿入を可能にする、従来の技術によれば通常の方法、例えば感染、形質導入、トランスフェクションおよび／または形質転換、ならびに当業者に知られている別の方法も含まれる。これらの方法は、作用物質がウイルス、裸の核酸、例えばアンチセンスＤＮＡおよび／またはアンチセンスＲＮＡ、ウイロイド、ウイロソームおよび／またはリポソームである場合が特に有利であり、その際、ウイロソームおよびリポソームは同様に、核酸分子のほかに別の作用物質を細胞に入れるのに適当である。
【００２７】
ウイルス増殖に対する効果の測定は、例えばプラーク検定によって、感染した、および感染していない細胞のウイルス力価を比較することによって行われる。
【００２８】
本発明の更なる有利な実施態様は、ウイルス性疾患におけるウイルスの増殖を本質的に阻害する、少なくとも１つのウイルス性疾患の治療および／または予防のための医薬品の製造のための方法であって、次のステップ：ａ．本発明によるテストシステムの実施およびｂ．見いだした１つもしくは複数の作用物質への少なくとも１つの助剤および／または添加剤の添加を含んでいる方法に関する。
【００２９】
好ましくは本発明による作用物質は、生体への局所的なもしくは全身的な投与のために、当業者に周知の方法ならびに助剤および／または添加剤を用いて医薬品に調製される。
【００３０】
例えば医薬品または診断試薬の安定もしくは保存に役立つ適当な助剤及び添加剤は、当業者に一般に知られている（例えばＳｕｃｋｅｒ  Ｈ他（１９９１）「Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ」，第２版，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ社，シュトゥットガルト、参照）。このような助剤および／または添加剤の例は、生理的食塩水、リンゲル−デキストロース、デキストロース、乳酸加リンゲル、脱塩水、安定剤、酸化防止剤、錯化剤、抗菌化合物、プロテイナーゼ阻害剤および／または不活性ガスである。
【００３１】
局所的な投与は、例えば皮膚に（例えば経皮システムを用いて）、粘膜に、体腔に、器官に（例えば筋肉内）、関節にまたは結合組織もしくは支持組織で行われることができる。全身的な投与は好ましくは血液循環に、例えば静脈内に、腹膜腔または腹腔に行われる。
【００３２】
本発明による作用物質を含んでいる医薬品調製物は、作用物質の種類及びその投与の種類に順応し、例えば溶液、懸濁液、軟膏、粉末剤、スプレー形態または他の吸入調製物であることができる。好ましくはヌクレオチド配列は、当業者によって知られている方法でウイルスベクターまたはプラスミドに挿入され、かつ細胞トランスフェクションのための助剤が添加される。これらの助剤には、例えばカチオンポリマーかカチオン脂質が属する。アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、これをＤＮアーゼもしくはＲＮアーゼによる酵素的分解に対して保護するために当業者に周知の方法で誘導される。
【００３３】
本発明による作用物質は塩、エステル、アミドの形でかまたは前駆物質として存在することができ、その際、好ましくは、過度の毒性、刺激状態またはアレルギー反応を患者に生じさせない作用物質の修飾のみが用いられる。
【００３４】
作用物質は無菌条件下で生理的に受容可能な賦形剤及び可能な防腐剤、緩衝液または噴霧体と必要に応じて混合される。医薬品の調製のためのこのような賦形剤は当業者に周知である。
【００３５】
本発明による作用物質は、１回の一回量で、特に有利に複数の用量で与えられ、その際、個々の用量は、人間に対するそれぞれの作用物質の最大耐量（ＭＴＤ）を超過しない。好ましくはＭＴＤの半分になる用量が選択される。例えばフラボピリドールの注入については腫瘍患者におけるＭＴＤは５０ｍｇ／ｍ２／ｄｘ３である（Ｓｅｎｄｅｒｏｗｉｃｚ他「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ」１６（９）：ｐ２９８６−２９９９，１９９８年）。従って、本発明の意味における、人間における適用についてはフラボピリドールは、０．１〜５０ｍｇ／ｍ２、特に５〜３０ｍｇ／ｍ２、殊に２５ｍｇ／ｍ２の日用量で与えられることができる。日用量は日に１回でも、あるいは日の全体を複数の区分に分割して、好ましくはほぼ同じ時間間隔で与えられることができる。
【００３６】
本発明によれば、投与は局所的にまたは全身的に、治療上の効果が目に見えるようになるまで、１日でか、あるいは数日にわたって毎日か、あるいは数週にわたり１日おきもしくは２日おきに行われることができる。
【００３７】
本発明の更なる変形形態は請求項１７から１９に示されており、その際、これについては上記及び下記の説明が同様に該当する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
【実施例１】
【００３９】
正の制御Ｉ（インフルエンザＡ型ウイルス）
インフルエンザＡ型ウイルスの増殖のために許容真核細胞培養（Ｍａｄｉｎｅ  ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞）を、同じ細胞数の平行バッチで細胞培養に通常の一般的な方法に従って、生理的食塩水で洗浄し、そして同じ量の感染性のインフルエンザＡ型ウイルス株ＷＳＮ−ＨＫ（インフルエンザ株（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ−Ｓｔａｍｍ）Ａ／ＷＳＮ／３３の７つの遺伝子セグメント及びインフルエンザ株Ａ／ＨＫ／８／６８のＮＡ遺伝子との再集合体）を用いて、１細胞あたり０．００２５個の感染性のウイルス粒子の比で室温で１時間感染させる。この感染の３０分前にＭＤＣＫ細胞を、正の制御のために種々の濃度でキナーゼ阻害剤Ｕ０１２６［１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ１，４−ビス（２アミノフェニルチオ）ブタジエン］が添加されている適当な細胞培地（ＤＳＭＯ中に０μモル、３０μモル、４０μモル、５０μモルで溶解した）で３７℃及び５％のＣＯ２濃度でインキュベートする。溶媒の対照としてＭＤＣＫ細胞を、適切に種々の量のＤＭＳＯが添加されている細胞培地でインキュベートする。感染中に接種材料にキナーゼ阻害剤Ｕ０１２６および／または溶媒としてＤＭＳＯを適切な濃度で添加する。続いて、接種材料は取除き、そして感染させた細胞を、種々の濃度でキナーゼ阻害剤Ｕ０１２６が添加されている適当な細胞培地（ＤＳＭＯ中に０μモル、３０μモル、４０μモル、５０μモルで溶解した）で４８ｈ、３７℃及び５％のＣＯ２濃度でインキュベートする。溶媒の対照として感染したＭＤＣＫ細胞を、適切に種々の量のＤＭＳＯが添加されている細胞培地でインキュベートする。感染の２４時間後に培地の上澄み液２００μｌを取り、そして同じ容量の阻害剤および／またはＤＭＳＯ含有の細胞培地をその培地の上澄み液に再度添加する。４８時間後に試料を再度取る。２４−及び４８時間の値でのそれぞれの試料の細胞培養の上澄み液を通常のウイルス学的な方法に従って、ウイルス粒子の総生産量を表す血球凝集した単位の量（ＨＡ力価）及び新たに形成した感染性なウイルス粒子の量（ＭＤＣＫ細胞についてのプラーク検定）を検査する。結果ではこのような実験バッチで、細胞培地でのキナーゼ阻害剤Ｕ０１２６の増加する濃度の場合に、阻害剤Ｕ０１２６のない対照バッチおよび／または溶媒の対照と比較して、新たに形成される、感染性のウイルス粒子の数の顕著な減少（Ｕ０１２６  ５０μモルで約８０％）が得られることが確認することができる。適切な濃度のＤＭＳＯおよび／または、ＤＭＳＯに溶解された阻害剤Ｕ０１２６で処理されたＭＤＣＫ細胞の肉眼検査ならびに、ヨウ化プロピジウム染色による細胞毒性の検査は、溶媒も阻害剤も細胞に重大な細胞毒素の効果をもたないことを示す。
【実施例２】
【００４０】
正の制御ＩＩ（インフルエンザＢ型ウイルス）
この例は、細胞培地でのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の６０μモルの濃度の場合にまたもや、新たに形成される、感染性のインフルエンザＢ型ウイルス粒子の数がかなり減ることを示す。インフルエンザＢ型ウイルスの増殖のために許容真核細胞培養（Ｍａｄｉｎｅ  ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞）を、同じ細胞数の平行バッチで細胞培養に通常の一般的な方法に従って、生理的食塩水で洗浄し、そして同じ量の感染性のインフルエンザＢ型ウイルス株Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／６／９３を用いて、１細胞あたり０．０１個の感染性のウイルス粒子の比で室温で１時間感染させる。感染の後で接種材料を取除き、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６添加されている（６０μモルでＤＭＳＯに溶解された）適当な細胞培地（トリプシン２μｇ／ｍｌを含んでいる）における感染した細胞を６０ｈ、３７℃と５％のＣＯ２濃度でインキュベートする。溶媒の対照として感染したＭＤＣＫ細胞を、適切な量のＤＭＳＯが添加されている細胞培地でインキュベートする。感染後１２時間ごとに培地の上澄み液の試料を取る。細胞培養の上澄み液のそれぞれの試料を通常のウイルス学的方法に従って、新たに形成する感染性のウイルス粒子の量（ＭＤＣＫ細胞についてのプラーク検定）について検査する。結果ではこのような実験バッチで、細胞培地でのキナーゼ阻害剤Ｕ０１２６の適切な濃度の場合に、対照バッチ（ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６のない溶媒対照）と比較して、新たに形成される、感染性のウイルス粒子の数の顕著な減少（約９０％）が得られることが確認することができる。適切な濃度のＤＭＳＯおよび／または、ＤＭＳＯに溶解されたＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６で処理されたＭＤＣＫ細胞の肉眼検査ならびに、ヨウ化プロピジウム染色による細胞毒性の検査は、溶媒も阻害剤も細胞に重大な細胞毒素の効果をもたないことを示す。
【実施例３】
【００４１】
細胞間ＭＥＫＫ−ＳＥＫ−ＪＮＫ−シグナル伝達経路におけるウイルス増殖の特異的阻害
ＳＥＫ／ＭＫＫ４の特異的阻害の影響を最初にキナーゼＳＥＫ  ＫＤの優性ネガティブな突然変異体を用いたＭＤＣＫ細胞の一時的なトランスフェクションによって検査する。これらの突然変異体の場合には、アミノ酸位置１２９におけるリジンのアミノ酸基を目的とする突然変異生成によってＤＮＡレベルでアルギニン−アミノ酸基に変換され（Ｌｕｄｗｉｇ他「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」１６，ｐ６６８７−６６９７  １９９６年）、突然変異はキナーゼのＡＴＰ結合を妨げ、かつ従ってキナーゼは不活性に存在する。この突然変異体は、細胞における過発現において優性ネガティブに内在性野生型により作用する（Ｌｕｄｗｉｇ他「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」１６，ｐ６６８７−６６９７  １９９６年）。実験のために空ベクターｐＥＢＧｍまたは発現構成体ｐＥＢＧ  ＳＥＫ  ＫＤをもつＭＤＣＫ細胞（Ｌｕｄｗｉｇ他「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」１６，ｐ６６８７−６６９７  １９９６年）をトランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて標準方法（Ｌｕｄｗｉｇ他「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７６，ｐ１０９９０−１０９９８，２００１年）に従って形質移入した。トランスフェクション効果は６０％を超えていた。トランスフェクションの２４時間後に感染を感染多重度１（Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝１）を有するインフルエンザＡ型ウイルス株．家禽ペストウイルスＡ／Ｆｐｖ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９を用いて行った。感染のさらに２４時間後に細胞培養上澄み液での最近形成するウイルスの力価をＭＤＣＫ細胞についての標準的なプラーク検定で検査した。空ベクターまたは、ＳＥＫの優性ネガティブの形を発現した構成体で感染していた、インフルエンザＡ型ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞のウイルス力価を比較した。さらにレトロウイルスの形質導入によって、ＳＥＫ  ＫＤあるいはＳＥＫアンチセンスＲＮＡを安定して発現するＭＤＣＫ−細胞系を製造した。優性ネガティブなキナーゼＳＥＫ  ＫＤの過発現は、内在性の野生型を競争的に阻害し、その一方でＳＥＫ／ＭＫＫ４メッセンジャーＲＮＡに対する補足のＲＮＡ種（アンチセンスＲＮＡ）の形成によって内在性のＳＥＫの合成が阻害される。これらの安定したＭＤＣＫ細胞系の生成のためにＳＥＫ  ＫＤのためのｃＤＮＡをセンス配向ならびにアンチセンス配向でそのレトロウイルスな発現ベクターｐＣＦＧ５  ＩＥＧＺ（Ｋｕｓｓ他「Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」２９，ｐ３０７７−３０８８，１９９９年）にクローン化した。ＳＥＫ  ＫＤのためのメッセンジャーＲＮＡおよび／またはアンチセンスＲＮＡの他にベクターＤＮＡは、さらに蛋白質の合成中に内部のリボソーム結合部位から発現する“緑色蛍光タンパク質”（ＧＦＰ）のメッセンジャーＲＮＡのためにコードする。これはフローサイトメトリーでの安定して形質導入された細胞の同定を可能にする。さらにこのベクターは抗生物質ゼオシンに対する抵抗性をもたらす。ＳＥＫ  ＫＤ及びＳＥＫ−アンチセンスＲＮＡための発現構成体ならびに空ベクターを燐酸カルシウム共沈澱法を用いてウイルス産生細胞系φＮＸ（Ｇｒｉｇｎａｎｉ他「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ」５８，ｐ１４−１９，１９９８年）中に形質移入した。トラ���スフェクション効果を２４時間後にＧＦＰ発現に基づいて制御し、７０〜８０％のオーダーであった。細胞をさらに約２週間ゼオシン１ｍｇ／ｍｌを用いて培地中で選択した。組換えレトロウイルスを用いたＭＤＣＫ細胞の感染のためにウイルス産生の細胞系のレトロウイルス含有の培地上澄み液をろ過し、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社，独ミュンヘン近郊、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）５μｇ／ｍｌを添加し、新しいＭＤＣＫ細胞を加えた。感染を連続した２日間における２回の３時間の遠心分離（１０００ｘｇ）の間に行った。安定して形質導入されたＭＤＣＫ細胞を感染の２４時間後にさらに２週間にわたりゼオジン４００〜６００μｇ／ｍｌを用いて培地の上澄み液中で選択した。このようにして行われた安定した細胞系の生成の後に該細胞系ならびに野生型ＭＤＣＫ細胞にインフルエンザＡ型ウイルスで感染させ、そしてＳＥＫ  ＫＤ及びＳＥＫアンチセンス系のウイルス力価を上記と同様にして野生型ＭＤＣＫ細胞の上澄み液からの力価と比較して測定した。次の結果が得られた。あらかじめ空のベクターあるいはＳＥＫの優性ネガティブの形を発現させた構成体で形質移入されていたインフルエンザＡ型ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞のウイルスの力価の比較は、ＳＥＫ  ＫＤを発現する細胞の場合には２４時間後ウイルスの増殖が９０％以上が阻害されていたことを示した。この結果は複数の独立したバッチで再現可能であった。それ以上の検査のために、レトロウイルスによる形質導入によって、安定してＳＥＫ  ＫＤまたはＳＥＫ  アンチセンスＲＮＡを発現させたＭＤＣＫ細胞系を製造した（上記参照）。その一方の場合にはＳＥＫ／ＭＫＫ４活性が競争によって阻害され、もう一方の場合にはキナーゼの発現阻害が行われる。この細胞系の場合にも、２つの異なるインフルエンザＡ型ウイルス株（ＦＰＶ及びＷＳＮ−ＨＫ）による感染の２４時間後のウイルス力価は野生型の細胞に比較して著しく減少しており、このことはＳＥＫのレベルにおけるウイルス活性化されたシグナル伝達経路の遮断がウイルス増殖に重大な効果をもつことを証明している。この調査結果は、細胞間ＭＥＫＫ／ＳＥＫ／ＪＮＫ−シグナル伝達経路内の上位のＳＥＫキナーゼの特異的な阻害がウイルス増殖を阻害する、しかも、ＭＥＫの阻害によってＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫによるシグナル伝達を阻害することが知られているキナーゼ阻害剤Ｕ０１２６と少なくとも同程度に効果的に阻害することを示す。さらに、その形態及び成長挙動に関してベクター細胞または野生型ＭＤＣＫ細胞と区別することができないＳＥＫ  ＫＤ及びＳＥＫアンチセンスＲＮＡを過剰生産する細胞系が得られる可能性によって、このキナーゼの機能または発現の特異的な阻害が宿主細胞にとって有毒でないことが示されている。
【実施例４】
【００４２】
細胞間Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ−シグナル伝達経路におけるウイルス増殖の阻害のための２つの作用物質の組合せ
直接連続して活性化可能である細胞間シグナル伝達経路内の２つのキナーゼの阻害によるインフルエンザウイルス増殖への特異的な効果をＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ−シグナル伝達経路の例で検査した。このために、一時的なトランスフェクションによって一方でキナーゼＲａｆ（ＲａｆＣ４Ｂ）の優性ネガティブな突然変異体、そしてもう一方でキナーゼＥＲＫ２（ＥＲＫ２Ｃ３、ＥＲＫ２Ｂ３）の優性ネガティブな突然変異体をそれぞれの野生型のキナーゼの阻害のためにＭＤＣＫ細胞中に入れ、そして過発現させた。ＲａｆＣ４ＢはＲａｆの、キナーゼドメインのない欠失突然変異体である（Ｂｒｕｄｅｒ他「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」６：ｐ５４５−５５６，１９９２年）。従って活性化シグナルはＲａｆのレベルによって中断される。ＥＲＫ２Ｂ３はキナーゼＥＲＫ２の点突然変異体であり、この点突然変異体では保存リシンが蛋白質のアミノ酸位置５２におけるＡＴＰ結合部位で、ＤＮＡレベルへの目的とする突然変異生成によってアルギニン−アミノ酸基に対して変換されており、キナーゼのＡＴＰ結合を妨げる突然変異であり、かつ従ってキナーゼが不活性に存在する（Ｒｏｂｂｉｎｓ他「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２６８：ｐ５０９７−５１０６，１９９３年）。ＥＲＫ２Ｃ３の場合にはチロシン−アミノ酸基が蛋白質の位置１８５で、キナーゼの活性化の間にリン酸化される配列モチーフトレオニン−グルタミン酸−チロシンで、フェニルアラニンに変換され、このことによりキナーゼはもはや活性化することができなかった（Ｒｏｂｂｉｎｓ他「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２６８：ｐ５０９７−５１０６，１９９３年）。ＥＲＫ２Ｃ３は従って過発現により相応して競争的に阻害しながら内在性の野生型に影響を与える。実験のために空ベクターＫＲＳＰＡまたは発現構成体ＫＲＳＰＡ  ＲａｆＣ４Ｂ、ＫＲＳＰＡ  ＥＲＫ２Ｂ３またはＫＲＳＰＡ  ＥＲＫ２Ｃ３をもつＭＤＣＫ細胞をトランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，独カールスルーエ）を用いて標準方法（Ｌｕｄｗｉｇ他  「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７６，ｐ１０９９０−１０９９８，２００１年）に従って形質移入した。トランスフェクション効果は６０％を超えていた。トランスフェクションの２４時間後にバッチの一部において細胞をシグナル伝達経路でのＭＥＫの付加的な阻害のためにＵ０１２６  ３０μモルで既に先に記載したとおりに処理した（Ｐｌｅｓｃｈｋａ他「Ｎａｔ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」３，ｐ３０１−３０５，２００１年）。その後で全てのバッチにおいて感染を、感染多重度１（Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝１）を有するインフルエンザＡ型ウイルス株．家禽ペストウイルスＡ／Ｆｐｖ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７）を用いて行った。感染のさらに９時間ないしは２４時間後に細胞培養上澄み液での新たに形成するウイルスの力価をＭＤＣＫ細胞についての標準的なプラーク検定で検査した。１．空ベクターで形質移入された感染したＭＤＣＫ細胞、２．ＲａｆＣ４Ｂ、ＥＲＫ２Ｂ３またはＥＲＫ２Ｃ３で形質移入された感染したＭＤＣＫ細胞、３．空ベクターで形質移入されておりかつ付加的にＵ０１２６で処理されている感染したＭＤＣＫ細胞���ならびに４．ＲａｆＣ４Ｂ、ＥＲＫ２Ｂ３またはＥＲＫ２Ｃ３で形質移入されておりかつ付加的にＵ０１２６で処理されている感染したＭＤＣＫ細胞のウイルス力価を比較した。次の結果が得られた。あらかじめ空ベクターあるいはＲａｆＣ４Ｂ、ＥＲＫ２Ｂ３もしくはＥＲＫ２Ｃ３の優性ネガティブの形を発現させた構成体で形質移入されていたインフルエンザＡ型ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞のウイルス力価の比較は、キナーゼ突然変異体を発現していた細胞の場合にはウイルスの増殖が９時間及び２４時間後にかなり阻害されていたことを示していた。同様のことが、Ｕ０１２６で処理されていない細胞との比較で、空ベクターで形質移入されておりかつＵ０１２６で処理された細胞におけるウイルス増殖にあてはまる。ＲａｆもしくはＥＲＫがＲａｆＣ４Ｂおよび／またはＥＲＫ２Ｂ３あるいはＥＲＫ２Ｃ３の過発現により阻害された細胞の場合に、本発明によれば、付加的にキナーゼＭＥＫが第２のキナーゼとしてシグナル伝達経路内で阻害される場合には、Ｕ０１２６によるキナーゼＭＥＫの付加的な阻害を受けなかったバッチと比較してウイルス増殖のより著しい阻害が認められた。これは、シグナル伝達経路内の１つのみのキナーゼの阻害によるウイルス増殖が可能であるよりも、シグナル伝達経路内の２つのキナーゼの阻害によりウイルス増殖がより著しく阻害されることを示す。
【実施例５】
【００４３】
細胞間Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ−シグナル伝達経路におけるウイルス増殖の特異的な阻害
インフルエンザウイルスの増殖に対する、細胞間シグナル伝達経路内のキナーゼの阻害の特異的な効果をＲａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の例で検査した。このために、一時的なトランスフェクションによって一方でキナーゼＲａｆ（ＲａｆＣ４Ｂ）の優性ネガティブな突然変異体、そしてもう一方でキナーゼＥＲＫ２（ＥＲＫ２Ｃ３、ＥＲＫ２Ｂ３）（上記参照）の優性ネガティブな突然変異体をそれぞれの野生型のキナーゼの阻害のためにＭＤＣＫ細胞中に入れ、そして過発現させた。実験のために空ベクターＫＲＳＰＡまたは発現構成体ＫＲＳＰＡ  ＲａｆＣ４Ｂ、ＫＲＳＰＡ  ＥＲＫ２Ｂ３またはＫＲＳＰＡ  ＥＲＫ２Ｃ３をもつＭＤＣＫ細胞をトランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，独カールスルーエ）を用いて標準方法（Ｌｕｄｗｉｇ他「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７６，ｐ１０９９０−１０９９８，２００１年）に従って形質移入した。トランスフェクション効果は６０％を超えていた。２４時間後に全てのバッチにおいて感染を、感染多重度１（Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝１）を有するインフルエンザＡ型ウイルス株．家禽ペストウイルスＡ／Ｆｐｖ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７）を用いて行った。感染のさらに９〜２４時間後に細胞培養上澄み液での新たに形成するウイルスの力価をＭＤＣＫ細胞についての標準的なプラーク検定で検査した。５．空ベクターで形質移入された感染したＭＤＣＫ細胞、６．ＲａｆＣ４Ｂ、ＥＲＫ２Ｂ３またはＥＲＫ２Ｃ３で形質移入された感染したＭＤＣＫ細胞のウイルス力価を比較した。次の結果が得られた。あらかじめ空ベクターあるいはＲａｆＣ４Ｂ、ＥＲＫ２Ｂ３もしくはＥＲＫ２Ｃ３の優性ネガティブの形を発現させた構成体で形質移入されていたインフルエンザＡ型ウイルスに感染したＭＤＣＫ細胞のウイルス力価の比較は、キナーゼ突然変異体を発現していた細胞の場合にはウイルスの増殖がにかなり阻害されていたことを示していた。これは、シグナル伝達経路内の種々のキナーゼの阻害がウイルス増殖の阻害のための出発点を表すことができることを示す。
【実施例６】
【００４４】
細胞間ＭＫＫ６／ｐ３８／３ｐＫ−シグナル伝達経路におけるウイルス増殖の阻害のための２つの作用物質の組合せ
直接連続して活性化可能である細胞間シグナル伝達経路内の２つのキナーゼの阻害によるインフルエンザウイルス増殖への特異的な効果をさらに細胞間ＭＫＫ６／ｐ３８／３ｐＫ−シグナル伝達経路の例で検査した。このために、一時的なトランスフェクションによって一方でキナーゼＭＫＫ６（ＭＫＫ６（Ａｌａ））の優性ネガティブな突然変異体、そしてもう一方でキナーゼ３ｐＫ（３ｐＫ  Ｋ＞Ｍ）の優性ネガティブな形、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのキナーゼ基質、をそれぞれの野生型のキナーゼの阻害のためにＭＤＣＫ細胞中に入れ、そして過発現させた。３ｐＫ  Ｋ＞Ｍはキナーゼ３ｐＫの点突然変異体であり、この点突然変異体では保存リシンが蛋白質のアミノ酸位置７３におけるＡＴＰ結合部位で、ＤＮＡレベルへの目的とする突然変異生成によってメチオニンに対して変換されており（Ｓｉｔｈａｎａｎｄａｍ他「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」１６：ｐ８６８−８７６，１９９６）、キナーゼのＡＴＰ結合を妨げる突然変異であり、かつ従ってキナーゼが不活性に存在する。ＭＫＫ６（Ａｌａ）の場合には相応にリシンが蛋白質のアミノ酸位置８２におけるＡＴＰ結合部位で目的とするＤＮＡレベルへの突然変異生成によってアラニンに変換された（Ｒａｉｎｇｅａｕｄ他  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６：ｐ１２４７−１２５５，１９９６年）。この不活性化によってＭＫＫ６（Ａｌａ）は過発現により競争的に阻害しながら内在性の野生型に作用する。実験のために空ベクターＫＲＳＰＡまたは発現構成体ＫＲＳＰＡ  ＭＫＫ６（Ａｌａ）または３ｐＫ  Ｋ＞ＭをもつＭＤＣＫ細胞をトランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて標準方法（Ｌｕｄｗｉｇ他「Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ」２７６，ｐ１０９９０−１０９９８，２００１年）に従って形質移入した。トランスフェクション効果は６０％を超えていた。トランスフェクションの２４時間後にバッチの一部において細胞をシグナル伝達経路でのキナーゼの付加的な阻害のためにＳＢ２０２１９０、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤（Ｃｏｈｅｎ「Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」７：ｐ３５３−３６１，１９９７年）２０μモルで処理した。その後で全てのバッチにおいて感染を、感染多重度１（Ｍ．Ｏ．Ｉ．＝１）を有するインフルエンザＡ型ウイルス株．家禽ペストウイルスＡ／Ｆｐｖ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９を用いて行った。感染のさらに９時間ないしは２４時間後に細胞培養上澄み液での新たに形成するウイルスの力価をＭＤＣＫ細胞についての標準的なプラーク検定で検査した。ｌ．空ベクターで形質移入された感染したＭＤＣＫ細胞、２．ＭＫＫ６（Ａｌａ）または３ｐＫ  Ｋ＞Ｍで形質移入された感染したＭＤＣＫ細胞、３．空ベクターで形質移入されておりかつ付加的にＳＢ２０２１９０で処理されている感染したＭＤＣＫ細胞、ならびに４．ＭＫＫ６（Ａｌａ）または３ｐＫ  Ｋ＞Ｍで形質移入されておりかつ付加的にＳＢ２０２１９０で処理されている感染したＭＤＣＫ細胞のウイルス力価を比較した。次の結果が得られた。あらかじめ空ベクターあるいはＭＫＫ６または３ｐＫの優性ネガティブの形を発現させた構成体で形質移入されていたインフルエンザＡ型���イルスに感染したＭＤＣＫ細胞のウイルス力価の比較は、キナーゼ突然変異体を発現していた細胞の場合にはウイルスの増殖が９時間及び２４時間後にかなり阻害されていたことを示していた。同様のことが、ＳＢ２０２１９０で処理されていない細胞との比較で、空ベクターで形質移入されておりかつＳＢ２０２１９０で処理された細胞におけるウイルス増殖にあてはまる。ＭＫＫ６または３ｐＫがＭＫＫ６（Ａｌａ）または３ｐＫ  Ｋ＞Ｍの過発現により阻害された細胞の場合に、本発明によれば、付加的にキナーゼｐ３８が第２のキナーゼとしてシグナル伝達経路内で阻害される場合には、ＳＢ２０２１９０によるキナーゼｐ３８の付加的な阻害を受けなかったバッチと比較してウイルス増殖のより著しい阻害が認められた。これは、シグナル伝達経路内の１つのみのキナーゼの阻害によるウイルス増殖が可能であるよりも、細胞間シグナル伝達経路内の２つのキナーゼの阻害によりウイルス増殖がより著しく阻害されることを示す。
【実施例７】
【００４５】
インフルエンザウイルスの感染に対するアマンタジンとＵ０１２６の組合せの作用
Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ及びＭｕｅｌｌｅｒ（「Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．」１１９：ｐ１１１−１１８，１９９１年）によれば、インフルエンザに感染した細胞の処置は、メチル化阻害剤（３−デアザ−アデノシン）と幅広く作用する毒性キナーゼ阻害剤（ｌ（５−イソキノ−リン−スルホニル）−２−メチルピペラジン＝Ｈ７）の組合せは、２つの個々の阻害剤の作用を強める。本発明による作用物質と、ウイルス成分を阻害しかつキナーゼ阻害剤ではないウィルス性の物質との組合せが相乗的な抗ウィルス性の効果を有するかどうかを検査した。許容ＭＤＣＫ細胞にインフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ＦＰＶ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ（Ｈ７Ｎ７）Ａ／ＷＳＮ−ＨＫ（Ｈ３Ｎ１））とインフルエンザＢ型ウイルス／Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／６／９２（Ｂ／Ｍａｓｓ）を用いて感染多重度（ＭＯＩ）０．０１で感染させた。この感染した細胞を次の通り処理した：１）（ＦＰＶ、ＷＳＮ−ＨＫ及びＢ／Ｍａｓｓについて）処理せず、２）（ＦＰＶ、ＷＳＮ−ＨＫ及びＢ／Ｍａｓｓについて）最適に抗ウィルス性に作用する濃度でのＵ０１２６（Ｐｌｅｓｃｈｋａ他「Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」３：ｐ３０１−３０５，２００１年）、３）（ＦＰＶについて）最適に抗ウィルス性に作用する濃度でのアマンタジン（Ｈａｙ他「ＥＭＢＯＪ」１１；ｐ３０２１−３０２４，１９８５年），４）（ＦＰＶについて）アマンタジンとＵ０１２６の組合せ。アマンタジンに関して、ｉ）薬理学的に有利な（マイクロモルの）濃度でインフルエンザＡ型感染の場合のみに作用するが、しかしながらインフルエンザＢ型感染の場合には作用しないこと（Ｄａｖｉｅｓ他「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１４４：ｐ８６２−８６３，１９６４年），ｉｉ）Ａ亜型の全てのインフルエンザウイルスの場合に作用しない、例えばＡ／ＷＳＮ／３３（Ｔｈｏｍａｓ他「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」２５２，ｐ５４−６４，１９９８年）の場合にも、あるいはＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｃａｓｔｒｕｃｃｉ他「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ」６９：ｐ２７２５−８，１９９５年）の場合にも作用しないこと、ｉｉｉ）感受性インフルエンザＡ型ウイルスを最初に強く阻害し、続いて抵抗性のウイルス変異体の形成をもたらすこと（Ｈａｙ他「ＥＭＢＯ  Ｊ．」１１：ｐ３０２１−３０２４，１９８５年）が知られている。感染の４８時間後に細胞培養上澄み液における感染性ウイルス粒子の力価を測定した。未処理の細胞と、アマンタジンおよび／またはＵ０１２６で処理された細胞の上澄み液をｌ：１０００で希釈し（Ｕ０１２６で処理されていた、インフルエンザＡ型／ＷＳＮ−ＨＫとインフルエンザＢ型ウイルスに感染した細胞の上澄み液１：１００で希釈し）、そして再度新しい細胞感染に使用した。この感染のラウンドを二度繰り返した。次の結果が得られた：ｉ）既に第２の感染ラウンドの後にＵ０１２６の最適の濃度での処理の場合にインフルエンザウイルス粒子の顕著な減少が認められ、この減少は実験によれば、第３の感染ラウンドを可能にするに十分には感染性のインフルエンザＡ型／ＷＳＮ−ＨＫまたはインフルエンザＢ型ウイルス粒子はもはや存在していなかった程度であったこと、ｉｉ）このウイルスの亜型が細胞培養で例えばインフ��エンザＡ型／ＷＳＮ−ＨＫより大幅に著しく増加するにもかかわらず、インフルエンザＡ型／ＦＰＶのウイルス力価はＵ０１２６の最適の濃度で処理された場合には一様に低いままであったこと、ｉｉｉ）アマンタジン感受性のインフルエンザＡ型／ＦＰＶウイルスの力価がアマンタジンの添加後に下降し、そして続いて上昇し、このことのは、抵抗性のウイルス変異体の生成を示していること、ｉｖ）アマンタジン非抵抗性のインフルエンザＡ型／ＷＳＮ＿ＨＫのウイルスの力価は、アマンタジンによる処理にもかかわらず上昇し、これにより、全てのインフルエンザＡ型ウイルスがアマンタジンに反応するのではないことが確認されること、ｖ）ＦＰＶの場合の、アマンタジン及びＵ０１２６の最適に抗ウィルス性に作用する濃度による処置によってウイルス増殖のより強化された阻害が得られること。従って結果は、抵抗性の形成がインフルエンザＡ型ウイルスとインフルエンザＢ型ウイルスと観察されなかった、種々のインフルエンザＡ型ウイルス（部分的にアマンタジン抵抗性である）に対して、及びインフルエンザＢ型ウイルス（アマンタジン抵抗性である）に対して作用し、その際、抵抗性の形成がインフルエンザＡ型ウイルスの場合にも、インフルエンザＢ型ウイルスの場合にも観察されなかった、本発明による作用物質の優秀な抗ウィルス性の効果を示し、そして、インフルエンザＡ型ウイルスに対する、キナーゼ阻害剤でない、抗ウィルス性に働く作用物質との本発明による作用物質の組合せの場合の相乗的な効果を示している。
【実施例８】
【００４６】
抵抗形成
この例は、繰り返しの継代培養でのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の作用下において、インフルエンザＡ型とＢ型のウイルスの抵抗性変異体が形成されないことを示している。インフルエンザＡ型とＢ型のウイルスの増殖のために許容真核細胞培養（Ｍａｄｉｎｅ  ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞）を、同じ細胞数の平行バッチで細胞培養に通常の一般的な方法に従って、生理的食塩水で洗浄し、そしてある一定の量の感染性のインフルエンザＡ型ウイルス株家禽ペストウイルスＡ／Ｆｐｖ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７）および／または感染性のインフルエンザＢ型ウイルス株Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ／６／９３を用いて、１細胞あたり０．０１個の感染性のウイルス粒子の比で室温で１時間感染させる。感染後に接種材料は取除き、そして感染させた細胞を、キナーゼ阻害剤Ｕ０１２６が添加されている適当な細胞培地（ＤＳＭＯ中に５０μモルで溶解した）で４８ｈ、３７℃及び５％のＣＯ２濃度でインキュベートする。溶媒の対照として感染したＭＤＣＫ細胞を、適切な量のＤＭＳＯが添加されている細胞培地でインキュベートする。インフルエンザＢ型ウイルス感染については細胞培養培地はトリプシン２μｇ／ｍｌを含有する。インフルエンザＡ型ウイルス感染については細胞上澄み液を４８時間後に得た。インフルエンザＢ型ウイルス感染については感染の４８時間後に同量の阻害剤および／または溶媒をあらためて添加した。細胞上澄み液をさらに２４時間後に得た。細胞上澄みの１０−２希釈（インフルエンザＢ型ウイルス）および／または１０−３希釈（インフルエンザＡ型ウイルス）０，１ｍｌを新しいＭＤＣＫ細胞の感染に使用した（継代）。この実験手順を４回繰り返し、そして各回ごとにウイルスの力価を測定した。それぞれの細胞培養の上澄み液の試料を通常のウイルス学的な方法に従って、新たに形成する感染性のウイルス粒子の量について検査する（ＭＤＣＫ細胞についてのプラーク検定）。付加的な対照の場合にはＦＰＶ感染したＭＤＣＫ細胞を、Ｍ２蛋白質のイオンチャネルの活性を阻害するため、いくつかのインフルエンザＡ型ウイルスの増殖を著しく阻害するアマンタジン（５μモル、細胞の上澄み液を感染の４８時間後に得て、１０−３希釈０．１ｍｌを継代培養に使用した）で処理した。アマンタジンについては例７が参照される。結果ではこのような実験バッチで、細胞培地でのＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６の適切な濃度の場合に、アマンタジンによる処理の場合にはっきり確認することができるように、ウイルス力価の上昇をもたらすことになる抵抗性のウイルス変異体が形成されることなく、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６のない溶媒対照と比較して、新たに形成される、感染性のインフルエンザＡ型ウイルスの粒子の数の顕著かつ一定の減少（約８０％）が得られることが確認することができる。さらに同様に、アマンタジンによる処理の場合にはっきり確認することができるように、ウイルス力価の上昇をもたらすことになる抵抗性のウイルス変異体が形成されることなく、ＭＥＫ阻害剤Ｕ０１２６のない溶媒対照と比較して、新たに形成される、感染性のインフルエンザＢ型ウイルスの粒子の数の顕著かつ一定の減少（約９０％）が得られることが確認される。
【実施例９】
【００４７】
負の制御
この例は、ＭＤＣＫ細胞において、キナーゼＲａｆの構成性活性な形（Ｒａｆ  ＢＸＢ、キナーゼドメインしか含んでいない欠失突然変異体：Ｆｌｏｒｙ，Ｅ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｃ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｐ．，Ｈｏｆｆｍｅｙｅｒ，Ａ．，Ｊａｓｓｏｙ，Ｃ．＆Ｒａｐｐ，Ｕ．Ｒ．（１９９８）「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」７２，ｐ２７８８−２７９４に記載）及びＭＥＫの構成性活性な形（阻害性α螺旋のＳｔｕによる媒介によって得られたｄｅｌｔａ  Ｓｔｕ  ＭＥＫ：Ｇｉｓｅ  Ａ，Ｌｏｒｅｎｚ  Ｐ，Ｗｅｌｌｂｒｏｃｋ  Ｃ，Ｈｅｍｍｉｎｇｓ  Ｂ，Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈ−Ｓｉｅｂｅｌｔ  Ｆ，Ｒａｐｐ  ＵＲ，Ｔｒｏｐｐｍａｉｒ  Ｊ．による『Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｒａｆ−１  ａｎｄ  ＭＥＫ１  ｏｆ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍｅｋ−  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３−ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｓ．』、「Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ」  ２００１年４月：２１（７）：ｐ２３２４−３６に記載）の一時的な発現の作用下にインフルエンザＡ型ウイルスの増殖が著しく高められることを示している。インフルエンザＡ型ウイルスの増殖のために許容真核細胞培養ＭＤＣＫ細胞を、同じ細胞数の平行バッチで細胞培養に通常の一般的な方法に従って、相応の発現プラスミドのプラスミドＤＮＡおよび／またはベクターの対照により形質移入する（上記参照）。トランスフェクション効果はこの場合には８０％を超えていた。トランスフェクションの２４時間後に細胞を細胞培養に通常の一般的な方法に従って、生理的食塩水で洗浄し、そしてある一定量の感染性のインフルエンザＡ型ウイルス株．家禽ペストウイルスＡ／Ｆｐｖ／Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ／７９（Ｈ７Ｎ７）を用いて、１細胞あたり１〜１０個の感染性のウイルス粒子の比で室温で１時間感染させる。引き続き、接種材料を適当な細胞培養培地で交換する。さらに２４時間後に、新たに形成した感染性のウイルス粒子の数をプラーク検定によって検査する（上記参照）。結果ではこのような実験バッチにおいて、インフルエンザＡ型ウイルスに関して、ウイルスの感染前に相応の発現プラスミドで形質移入されていたＭＤＣＫ細胞の新しく形成する感染性のウイルス粒子の数が、ウイルスの感染前にベクターの対照でのみ形質移入されていたＭＤＣＫ細胞と比較して、著しく上昇することが確認することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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