(57)【要約】  本発明は、高度に相同性であるＤＮＡコード配列または関連するＤＮＡコード配列のタンパク質産物を並行様式でアッセイするための、タンパク質アレイおよびその使用を記載する。「高度に相同性または関連する」によって、共通の配列を共有し、かつ１つ以上の天然に存在する変異（例えば、単一ヌクレオチド多型、欠失、もしくは挿入）によってのみ異なるＤＮＡコード配列、またはハプロタイプ（ハプロタイプは、通常は特定の遺伝子の文脈における、染色体上の変化もしくは変異の組み合わせである）と考えられるＤＮＡコード配列が、意味される。このような高度に相同性であるＤＮＡコード配列または関連するＤＮＡコード配列は、一般には、同じ遺伝子の天然に存在する改変体である。本発明によるアレイは、表面上に空間的に規定されたパターンで配置された複数（例えば、２つ以上）の個別のタンパク質をある形式で有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面を含むタンパク質アレイであって、該表面上には、空間的に規定された位置に少なくとも２つのタンパク質部分が配置されており、該タンパク質部分は、目的とするＤＮＡ配列の天然に存在する改変体のタンパク質部分である、タンパク質アレイ。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質アレイであって、前記改変体が同じ染色体遺伝子座に位置する、タンパク質アレイ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質アレイであって、前記１つ以上のタンパク質部分が、目的とするＤＮＡ配列の天然に存在する改変体の合成等価物に由来する、タンパク質アレイ。
【請求項４】
請求項１または２に記載のタンパク質アレイであって、前記少なくとも２つのタンパク質部分が、目的とする野生型遺伝子により発現されるタンパク質部分を、その１つ以上の天然に存在する変異を含む１つ以上の遺伝子により発現される少なくとも１つのタンパク質部分とともに含む、タンパク質アレイ。
【請求項５】
請求項４に記載のタンパク質アレイであって、前記変異が、ミスセンス変異、単一ヌクレオチド多型、欠失変異、および挿入変異からなる群より選択される、タンパク質アレイ。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載のタンパク質アレイであって、前記タンパク質部分が、疾患状態に関係するタンパク質、薬物代謝に関係するタンパク質、または特徴付けられていないタンパク質を含む、タンパク質アレイ。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のタンパク質アレイであって、前記タンパク質部分が、野生型ｐ５３およびその対立遺伝子改変体をコードする、タンパク質アレイ。
【請求項８】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載のタンパク質アレイであって、前記タンパク質部分が、薬物代謝酵素をコードする、タンパク質アレイ。
【請求項９】
請求項８に記載のタンパク質アレイであって、前記薬物代謝酵素が、野生型ｐ４５０およびその対立遺伝子改変体である、タンパク質アレイ。
【請求項１０】
タンパク質アレイを作製する方法であって、該方法は、
ａ）目的とするＤＮＡ配列の２つ以上の天然に存在する改変体のＤＮＡコード配列であるＤＮＡコード配列を提供する工程；
ｂ）該コード配列を発現させて、１つ以上の個別のタンパク質部分を提供する工程；
ｃ）該タンパク質部分を精製する工程；
ｄ）該タンパク質部分を、表面上の空間的に規定された位置に配置して、アレイを生じる工程；
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記工程ｃ）およびｄ）が、組み込まれたタグを介して前記アレイ上の前記タンパク質部分を同時に精製および単離することによって１つの工程中に合わされている、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、前記工程ｃ）が省略されており、そして前記個別のタンパク質部分が、発現宿主細胞由来の他のタンパク質とともに存在する、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、前記目的とするＤＮＡ配列が、疾患状態に関係するタンパク質、薬物代謝に関係するタンパク質、または特徴付けられていないタンパク質をコードする、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記目的とするＤＮＡ配列が、ｐ５３をコードする、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、前記目的とするＤＮＡ配列が、薬物代謝酵素をコードする、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記薬物代謝酵素が、野生型ｐ４５０およびその対立遺伝子改変体である、方法。
【請求項１７】
目的とするＤＮＡ配列の天然に存在する改変体の表現型の決定における、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載のアレイの使用であって、該ＤＮＡ配列は、該ＤＮＡ配列に由来する少なくとも１つのタンパク質部分により示され、かつ該ＤＮＡ配列は、該アレイ上に存在する、使用。
【請求項１８】
１つ以上のタンパク質と相互作用する分子について１組のタンパク質部分をスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ）１つ以上の試験部分を、請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載のアレイと接触させる工程であって、該アレイは、該１組のタンパク質部分を保有する、工程；および
ｂ）該アレイ上で１つ以上の試験分子と１つ以上のタンパク質との間の相互作用を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
１組のタンパク質部分のメンバーの相対的特性を同時に決定する方法であって、該方法は、
ａ）該１組のタンパク質部分を保有する請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載のアレイを、１つ以上の試験物質と接触させる工程；および
ｂ）該アレイ上で、該試験物質と該組のメンバーとの相互作用を観察する工程
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記タンパク質部分のうちの１つ以上が薬物代謝酵素であり、該酵素は、補助タンパク質との接触または化学処理により活性化される、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、生物のＤＮＡ間における一塩基の差異である。これは、同一の同胞（ｓｉｂｌｉｎｇ）またはクローンを除く個体間における表現型変動の遺伝子成分の多くの基礎をなす。この変動は、疾患に対する素因、疾患の発症年齢、疾患の重篤度、および処置に対する応答などの特徴を含むので、ＳＮＰの同定および目録作成は、「遺伝子医学」をもたらす［Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０９  ８２２−８２３（２００１）］。薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）のような分野は、治療プログラムを個々の人物に調整するために、ＳＮＰと、薬物処置に対する応答との間の相関関係を確立することを目的とする。より広範には、鎌状赤血球貧血およびアルツハイマー病のような状態およびＨＩＶ抵抗性および移植拒絶のような問題における特定のＳＮＰの役割が、十分に認識されている。しかし、ＳＮＰとその表現型との間の相関関係は、通常は、集団データの統計学的分析から誘導され、観察される表現型変動の分子機構を解明する試みは、ほとんどなされない。高スループット配列決定プロジェクトの出現が、ヒトゲノムの完全配列を決定することを目的とした［Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９  ８６０〜９２１（２００１）；Ｖｅｎｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１  １３０４〜１３５１（２００１）］時まで、２，０００〜３，０００個のＳＮＰしか同定されていなかった。より最近、１４２万個のＳＮＰが、ヒト配列を付随して論文において、研究者のコンソーシアムによって目録作成された［Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＳＮＰ  Ｍａｐ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９  ９２８〜９３３（２００１）］。このうち、６，００００個が、遺伝子中に存在した（「コード」ＳＮＰ）。コードＳＮＰは、それがタンパク質のアミノ酸配列を変化させるか否かによってさらに分類され得、変化が生じる場合には、タンパク質機能が影響されて、表現型変動を生じ得る。従って、この大量の改変体配列の表現型を迅速に決定し得る装置および方法論について、未だ満たされていない必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本発明者らは、本明細書中において、高度に相同性であるＤＮＡコード配列または関連するＤＮＡコード配列のタンパク質産物を、並列様式でアッセイするためのタンパク質アレイおよびその使用を記載する。
【０００３】
「高度に相同性または関連する」によって、共通の配列を共有し、かつ１つ以上の天然に存在する変異（例えば、単一ヌクレオチド多型、欠失、もしくは挿入）によってのみ異なるＤＮＡコード配列、またはハプロタイプ（ハプロタイプは、通常は特定の遺伝子の文脈における、染色体上の変化もしくは変異の組み合わせである）と考えられるＤＮＡコード配列が、意味される。このような高度に相同性であるＤＮＡコード配列または関連するＤＮＡコード配列は、一般には、同じ遺伝子の天然に存在する改変体である。
【０００４】
本発明によるアレイは、表面上に空間的に規定されたパターンで配置された複数（例えば、２つ以上）の個別のタンパク質をある形式で有し、その形式によって、そのタンパク質の特性（例えば、活性または機能）が、そのアレイに問い合わせることによって並列して調査またはアッセイされ得る。
【０００５】
本発明に従うタンパク質アレイ、および変異（例えば、コードＳＮＰ、すなわち、発現タンパク質をなお生じるＳＮＰ変異）から生じるタンパク質機能の表現型変化をアッセイするためのその使用は、ＳＮＰについての既存のＤＮＡベース技術および他の変異分析とは完全に異なり、そしてそれを超える利点を有する［Ｓｈｉ，Ｍ．Ｍ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４７：１６４〜７２（２００１）に概説される］。これらの後者の技術としては、新規なＳＮＰを同定するための高スループット配列決定法および電気泳動法、または診断技術（例えば、高密度オリゴヌクレオチドアレイ）［例えば、Ｌｉｎｄｂｌａｄ−Ｔｏｈ，Ｋ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４  ３８１〜６（２０００）］、または既知のＳＮＰに対する目的とする個別の遺伝子のプロファイリングを可能にする高スループット短読取り（ｓｈｏｒｔ−ｒｅａｄ）配列決定技術［例えば、Ｂｕｅｔｏｗ，Ｋ．Ｈ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８  ５８１〜４（２００１）］が挙げられる。重要なことには、本明細書中に記載される本発明とは対照的に、多型の表現型効果は、ＤＮＡレベルでアッセイされただけである場合には、未知のままである。
【０００６】
実際、コードＳＮＰがコードするタンパク質に対するそのコードＳＮＰの影響は、比較的少数の例外を除いて、特徴付けられていない。これらのＳＮＰの影響に対する目録作成された多くのＳＮＰのほとんど機能的ではないデータを伴うタンパク質の例としては、ｐ５３、ｐ１０（両方とも癌に関連する）、およびシトクロムＰ４５０（薬物代謝）が挙げられる。生成される大量のＳＮＰデータを取り扱うために必要とされるに十分に高スループットに、ＳＮＰがコードするタンパク質の機能性を調査し得る方法は、現在はあったとしてもごくわずかしか存在しない。バイオインフォマティクスまたはコンピューターモデリングが、特に結晶構造が利用可能な場合には可能であるが、生じる仮説は、実験により（すなわち、生化学的アッセイを介して）なお確認される必要がある。しかし頻繁には、その変異の役割は、バイオインフォマティクス分析またはコンピューターベース分析の後でも、不明のままである。従って、本発明により提供されるタンパク質アレイは、ＳＮＰの機能分析への最も強力な経路を提供する。
【０００７】
関連するＤＮＡ分子（例えば、１つ以上の単一ヌクレオチド多型により異なるＤＮＡ分子）由来のタンパク質を、試験管形式で個別のアッセイすることが可能であるが、この作業の連続的性質および関与する大きなサンプル容量により、このアプローチは煩雑かつ魅力のないものになる。関連するタンパク質をマイクロタイタープレート中または顕微鏡スライド上にてアレイ作製することによって、多くの種々のタンパク質（数百個または数千個）が、ほんの小サンプル容量（マイクロアレイにおける場合はわずか数μｌだけで）を使用して同時アッセイされ得、これにより、たとえば、ＳＮＰの機能分析が、経済的に実行可能になる。すべてのタンパク質が、同じ実験において一緒にアッセイされ得、このことは、物質の差次的取扱いに起因する誤差の原因を減少する。さらに、それらのタンパク質を固体支持体に直接つなげると、結合濃度を測定する前に未結合リガンドを洗い流すことを必要とする（これは、溶液ベースアッセイまたは単一液相アッセイにおいて利用可能ではない特徴である）結合アッセイを、容易にする。
【０００８】
本発明のアレイにより提供される、当該分野で現在公知である装置および方法を超える特定の利点は、以下の通りである：
・密接に関連するタンパク質（例えば、コードＳＮＰに由来するタンパク質）を、コードする機能について大量に並列分析すること
・既存の方法よりも良好でない場合には、既存の方法に少なくとも匹敵する分析の感度
・以前には可能ではなかった様式での定量的な比較機能分析が可能であること
・タンパク質：タンパク質相互作用、タンパク質：核酸相互作用、タンパク質：リガンド相互作用、またはタンパク質：低分子相互作用、および翻訳後修飾との、インサイチュ「オンチップ（ｏｎ−ｃｈｉｐ）」での適合性
・本発明に従う並列タンパク質アレイが、スポット密度とは無関係であること
・マイクロアレイ形式は、高価な可能性があるリガンドを小容量使用して分析を実行するのを可能にすること
・本発明に従う並列タンパク質アレイにより提供される情報は、薬物開発分野、薬理ゲノム学の分野、および診断分野にとって極めて価値があること
・他の有用な並列タンパク質アレイが、目的とするＤＮＡ配列の非天然（合成）変異に由来するタンパク質を含み得る。そのようなアレイは、そのようにして生成される改変体タンパク質と他のタンパク質、核酸、および他の分子（例えば、リガンドまたは候補／試験低分子）との間の相互作用を調査するために使用され得る。そのような変異誘発を実行するための適切な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ，ＤＤ，Ｓｉｅｄｍａｎ，ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ  ＪＡおよびＳｔｕｈｌ，Ｋ．により編集された、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、第８章に記載される。
【０００９】
従って、１つの局面において、本発明は、表面を含むタンパク質アレイを提供し、この表面上には、空間的に規定された位置に少なくとも２つのタンパク質部分が配置されており、そのタンパク質部分は、目的とするＤＮＡ配列の天然に存在する改変体のタンパク質部分である。
【００１０】
本明細書中にて規定されるタンパク質アレイは、表面上に一定パターンで存在する、空間的に規定されたタンパク質部分の配置である。好ましくは、このタンパク質部分は、直接的または間接的のいずれかで、この表面に付着されている。この付着は、非特異的（例えば、表面上への物理的吸着によって、または非特異的共有結合相互作用の形成によって）であり得る。好ましい実施形態において、このタンパク質部分は、各タンパク質部分に付着している共通マーカー部分を介して、表面上に付着している。別の好ましい実施形態において、このタンパク質部分は、その表面につながれている小胞またはリポソームに取り込まれ得る。
【００１１】
本明細書中に規定される表面は、平坦領域または等高な（ｃｏｎｔｏｕｒｅｄ）領域であり、その領域は、化学処理によってコート／誘導体化されていても、されていなくてもより。例えば、その領域は、
ガラススライド、
１つ以上のビーズ（例えば、当該分野で公知の磁性ビーズ、誘導体化ビース、および／または標識ビーズ）、
ポリプロピレンスライドまたはポリスチレンスライド、
ポリプロピレンマルチウェルプレートまたはポリスチレンマルチウェルプレート、
金対象物、シリカ対象物、または金属対象物、
ニトロセルロース製膜、ＰＶＤＦ製膜、ナイロン製膜、またはホスホセルロース製膜
であり得る。
【００１２】
ビーズが使用される場合、個々のタンパク質、タンパク質対、または改変体タンパク質のプール（例えば、「ショットガンスクリーニング」用。目的とするタンパク質が存在し得るタンパク質群を個別に同定するため；そのような群は、その後分離されそしてさらに調査される（コンビナトリアル化学の分野で公知のプール方法と同様））が、そのアレイの空間的定義または分離を提供するために、個別のビーズに結合され得る。その後、そのビーズは、区画された様式（例えば、マイクロタイタープレートのウェル中または別個の試験管中）で、別個にではあるが並列して、アッセイされ得る。
【００１３】
従って、本発明に従う表面を含むタンパク質アレイは、種々のタンパク質を保有する一連の別個の固相表面（例えば、ビーズ）として存在し得、そのアレイは、実験において別個の表面の空間的に規定されたパターンまたは配置により形成される。
【００１４】
好ましくは、その表面のコーティングは、非特異的なタンパク質吸収に抵抗し得る。その表面コーティングは、それ自体は、多孔性であっても、非孔性であってもよい。さらに、好ましい実施形態において、その表面コーティングは、各タンパク質部分上のマーカー部分との特異的相互作用を、直接的または間接的（例えば、表面に結合したタンパク質もしくはペプチドもしくは核酸を介して）のいずれかで提供する。以下の実施例に記載される本発明の実施形態は、捕捉表面としてＳＡＭ２ＴＭ膜（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）を使用するが、種々の他の表面、ならびに当該分野で公知のマイクロアレイ形式またはマイクロウェル形式の表面が、使用され得る。
【００１５】
タンパク質部分は、一般的には、遺伝子またはその遺伝子の天然に存在する改変体であるＤＮＡ配列によりコードされる、タンパク質またはポリペプチドである。そのタンパク質部分は、コードされたタンパク質の形態を取り得るか、またはアッセイにおいてそのアレイへの結合または分析を容易にするために、さらなるアミノ酸（そのタンパク質部分が由来するＤＮＡ配列によって元々はコードされてない）を含み得る。その天然に存在する遺伝子によりコードされるアミノ酸配列のみを、さらなる配列なしで有するタンパク質の場合、そのようなタンパク質は、その改変体間の共通特徴によってそのアレイに結合され得る。例えば、１組の改変体タンパク質が、結合タンパク質を介して、またはその組中の個々のタンパク質の不変部分または共通部分に結合し得る抗体を介して、そのアレイに付着され得る。好ましくは、本発明に従うタンパク質部分は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかで、そのアレイへの付着を容易にするためのマーカー部分で（そのタンパク質をコードするＤＮＡ配列と、タグをコードするＤＮＡ配列との組み合わせを介して）タグ化されたタンパク質である。
【００１６】
アレイのパターン中の各位置は、例えば、
・単一タンパク質型のサンプル（モノマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、もしくはより高次のマルチマーの形態）、または
・相互作用分子に結合した単一タンパク質型のサンプル（例えば、核酸分子、抗体、他のタンパク質、もしくは低分子）
のいずれかを含み得る。その相互作用分子は、それ自体が、さらなる分子と相互作用し得る。例えば、ヘテロマータンパク質の１つのサブユニットが、そのアレイに付着され得、そして第２のサブユニットまたはサブユニット複合体が、付着したタンパク質サブユニットとの相互作用を介して、そのアレイに繋がれ得る。次に、その第２のサブユニットまたはサブユニット複合体は、その後、さらなる分子（例えば、候補薬物または抗体）、または
・合成分子に結合した単一タンパク質型のサンプル（例えば、ペプチド、化合物）、または
・２つの異なる改変体タンパク質もしくは「ハプロタイプタンパク質」のサンプル（例えば、各々が、変異または多型の異なる相補体を保有する（例えば、「タンパク質１」は、ＳＮＰ「Ａ」を保有し３塩基対欠失「Ｘ」を保有するＤＮＡ配列に由来し、「タンパク質２」は、ＳＮＰ「Ａ」、ＳＮＰ「Ｂ］および３塩基対挿入「Ｙ」を保有するＤＮＡ配列に由来する）。そのような配置は、個体における２つの異なるタンパク質改変体のヘテロ接合性の存在を模倣し得る。
【００１７】
好ましくは、各位置にあるタンパク質部分は、実質的に純粋であるが、特定の環境において、２個と１００個との間の個数の異なるタンパク質部分の混合物が、少なくとも１つのタンパク質部分がタグ化されているアレイパターンで、各位置に存在し得る。従って、１つより多くの改変体ＤＮＡ配列の発現に由来するタンパク質が、目的とする改変体を含む組を決定するために１組の改変体を大量に初期スクリーニングするために、単一位置に付着され得る。
【００１８】
下記の実施例に記載される本発明の実施形態は、その表面上のタンパク質を精製するためにビオチンタグを使用するが、そのアレイの機能性は、使用されるタグとは無関係である。
【００１９】
「目的とするＤＮＡ配列の天然に存在する改変体」は、共通配列を共有し、かつ天然に存在する（すなわち、集団中に存在し、人工的には導入されていない）１つ以上の単一ヌクレオチド多型、欠失、もしくは挿入、またはハプロタイプであると考えられる配列（ハプロタイプは、通常は特定の遺伝子の文脈における、染色体上の改変体特徴の組み合わせである）によってのみ異なる、タンパク質コードＤＮＡ配列として、本明細書中で定義される。一般には、そのようなＤＮＡ配列は、それが共通する染色体位置に位置し、かつ類似するタンパク質（異なる表現型を有し得る）をコードするという点で、同じ遺伝子に由来する。換言すると、そのような改変体は、一般的には、１つ以上の変異を含む同じ遺伝子の天然に存在するバージョン、またはその合成等価物であって、異なるコドンを有するが同じ「野生型」タンパク質もしくは集団中に存在することが既知であるような改変体タンパク質をコードするものである。
【００２０】
有用なことには、集団中に既知のすべての変異を有するＤＮＡ分子が、本発明のアレイに結合する１組のタンパク質部分を生成するために使用される。必要に応じて、そのアレイは、変異の部分集合（例えば、既知のすべての生殖系列変異もしくは遺伝性変異、または臨床的に関連する変異もしくは臨床的に重要な変異の部分集合）を保有するＤＮＡ分子に由来する改変体タンパク質の部分集合を含み得る。本明細書中で規定される関連するＤＮＡ分子は、生じる発現タンパク質を生成するために導入された単なる共通タグ配列だけよりも多く関連している。それは、そのＤＮＡ分子の関連性と関連するそのようなタグに追加された配列である。その関連する配列は、一般的には、遺伝子の天然コード配列、および変異により生じる改変体形態である。実際には、本発明のアレイは、１つのＤＮＡ分子の配列において、別の（またはよりしばしば、野生型コード配列（もしくは集団中の最も一般的な改変体））ＤＮＡ分子と、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個の別個の位置において異なる（すなわち、変異している）ＤＮＡ分子に由来する、タンパク質部分を保有する。各々の別個の配列位置（例えば、塩基対３４２（この位置は、単一塩基であり得る）もしくは「塩基対５０２〜塩基対５２５」（この位置は、塩基領域であり得る）のような別個の位置）における差異または変異は、塩基変化（例えば、「Ｇ」から「Ａ」への置換）のような点変異であり得る。これは、野生型配列中の１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている「ミスセンス」変異をもたらし得る。「単一ヌクレオチド多型」は、単一のヌクレオチドの変異である。あるいは、この変異は、１〜２００個、１〜１００個、１〜５０個、１〜２０個、または１〜１０個の塩基の、欠失または挿入であり得る。例を与えるために、挿入変異は、ハンティングトン病のような「３つ組（ｔｒｉｐｌｅｔ）反復」障害において見出される−このような挿入変異に対応するタンパク質改変体は、その遺伝子の種々の変異体形態に由来し得、そして、その表現型の調査を可能にするために、このアレイに付着され得る。
【００２１】
従って、関連するＤＮＡ分子に由来するタンパク質は、構造が非常に異なり得ることが、予期される。例えば、そのＤＮＡ分子を短縮する変異を受けた関連するＤＮＡ分子は、フレームシフトを導入するか、または終止コドンを野生型コード配列全体にわたって部分的に導入し、より小さいタンパク質産物またはより短いタンパク質産物を生じ得る。同様に、変異は、その改変体タンパク質が、さらなる構造（例えば、反復ドメインまたは多数のさらなるアミノ酸）をそのタンパク質の末端もしくはそのタンパク質配列内のいずれかに有するようにさせ得る。そのようなタンパク質（関連するＤＮＡ配列に由来する）は、本発明の範囲内に包含される。
【００２２】
上記のように、目的とするＤＮＡ配列の野生型遺伝子（またはその天然に存在する改変体）の合成等価物によりコードされるタンパク質部分を保有するアレイもまた、本発明の範囲内に包含される。
【００２３】
また、改変体（すなわち、変異した）配列を有し、差次的な翻訳前プロセシングを受けている生成物（例えば、選択的スプライス転写物）または差次的翻訳後プロセシングを受けている生成物（例えば、グリコシル化が、１つの発現タンパク質中の特定のアミノ酸にて生じるが、基礎となるＤＮＡ配列中のコドン変化に起因して、別の発現タンパク質においては生じず、グリコシル化アミノ酸を存在させなくする）を生じる関連するＤＮＡ分子に由来するタンパク質部分を保有するアレイも、本発明の範囲内に包含される。
【００２４】
一般に、本発明に従う関連するＤＮＡ分子は、同じ染色体遺伝子座に位置する遺伝子に由来する。すなわち、その関連するＤＮＡ分子は、天然の変異の結果として異なる１つの遺伝子の単一コピーに由来する同じタンパク質コード配列の異なるバージョンである。
【００２５】
そのタンパク質の野生型（または集団中の最も一般的な改変体ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質）が、関連するＤＮＡ分子に由来するタンパク質の相対活性が比較され得る参照物として役立つように、そのアレイ上のタンパク質部分の１つとして、好ましくは含まれる。そのアッセイのアウトプットは、変異した遺伝子を含む関連するＤＮＡ分子が、
（１）野生型タンパク質と匹敵する機能を有するタンパク質
（２）野生型よりも低いレベルもしくは高いレベルの機能を有するタンパク質
（３）検出可能な機能を有さないタンパク質
（４）変化した翻訳後修飾パターンを有するタンパク質
（５）余分な成分（例えば、ペプチド、抗体、もしくは低分子薬物候補）の添加により改変され得る活性を有するタンパク質
（６）翻訳後修飾（例えば、チップ上でインサイチュでの、例えば、リン酸化）により改変され得る活性を有するタンパク質
（７）アッセイにおいて種々の環境条件（例えば、イオン強度、温度、もしくはｐＨ）下で変化した機能を有するタンパク質
をコードするか否かを示す。
【００２６】
本発明のアレイのタンパク質部分は、疾患状態に関係するタンパク質、薬物代謝に関係するタンパク質を含み得るか、または特徴付けられていないタンパク質であり得る。１つの好ましい実施形態において、そのタンパク質部分は、野生型ｐ５３およびその対立遺伝子改変体をコードする。別の好ましい実施形態において、そのアレイは、薬物代謝酵素（好ましくは、野生型ｐ４５０およびその対立遺伝子改変体）をコードするタンパク質部分を含む。
【００２７】
本発明のアレイに付着したタンパク質改変体の数は、天然に存在する改変体コード配列の数、または人工的に生成するために十分に実験的、商業的、もしくは臨床的に興味深い改変体コード配列の数によって、決定される。野生型タンパク質および単一改変体を保有するアレイは、調査者にとって有用である。しかし、実際に、高スループットアッセイについてのこのようなアレイの適切性を利用するために、１〜１００００個、１〜１０００個、１〜５００個、１〜４００個、１〜３００個、１〜２００個、１〜１００個、１〜７５個、１〜５０個、１〜２５個、１〜１０個、または１〜５個の関連するＤＡＮ分子が、アレイ上のそのコードタンパク質によって示されることが、予期される。例えば、ｐ５３の遺伝子（本明細書中に記載される実施例のうちの１つの対象物）の場合、約５０個の既知の生殖系列変異または遺伝性変異、および１００個より多くの既知の体細胞変異が、現在存在する。個体は、当然、２つの異なる生殖系列変異を遺伝し得る。従って、ｐ５３改変体タンパク質アレイは、異なる位置において各々単離されている５０個の生殖系列変異に由来するタンパク質、異なる位置において各々単離されている（かまたは、各々の位置に１０個の群の状態で）８００個の体細胞コード変異の臨床的に重要な部分集合（タンパク質が発現され得る場合）に由来するタンパク質、および異なる位置に各々位置する５０個の生殖系列変異の可能なすべての対合組み合わせに由来するタンパク質を、保有し得る。従って、本発明のアレイは、１０００個より多くの異なる天然に存在する変異を含む個別のＤＮＡ分子を有用に示し得、従って、単独で位置するかまたは他の改変体とともに、それに由来するタンパク質改変体のより多くの（例えば、１００００個以上の）別個のサンプルまたは「スポット」を保有し得ることが、観察され得る。
【００２８】
第２の局面において、本発明は、タンパク質アレイを作製する方法を提供し、この方法は、
ａ）目的とするＤＮＡ配列の２つ以上の天然に存在する改変体に由来するＤＮＡコード配列を提供する工程；
ｂ）そのコード配列を発現させて、１つ以上の個別のタンパク質部分を提供する工程；
ｃ）そのタンパク質部分を精製する工程；
ｄ）そのタンパク質部分を、表面上の空間的に規定された位置に配置して、アレイを生じる工程；
を包含する。
【００２９】
上記の工程ｃ）およびｄ）は、好ましくは、１つの工程中に合わされている。これは、「表面捕捉」によってなされ得る。「表面捕捉」によって、下記の実施例において記載されるように、組み込まれたタグを介して上記アレイ上のタンパク質部分を同時に精製および単離することが、意味される。さらに、上記工程ｃ）は省略され得る。なぜなら、このタンパク質調製物が、単離されたタグ化タンパク質の位置において純粋であることは必要ではないからである。このタグ化タンパク質は、そのアレイが部分を構成するアッセイによって純粋性が必要ではない場合には、宿主生成細胞の粗溶解物から分離される必要はない。
【００３０】
そのアレイのタンパク質部分を生成するように発現されるＤＮＡ分子は、当該分野で公知の技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭ，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ，ＤＤ，Ｓｉｅｄｍａｎ，ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ，ＪＡおよびＳｔｒｕｈｌ，Ｋ．により編集された、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１巻、第８章を参照のこと）を使用して、作製され得る。クローン化ＤＮＡのインビトロ操作が容易であると、変異（例えば、ＳＮＰ）を、標準的な分子生物学的技術（例えば、野生型遺伝子をテンプレートとして使用するＰＣＲ変異誘発）によって作製することが、可能である。従って、その変異（例えば、ＳＮＰ）の身元の知見（しばしば、電子データベースにおいて入手可能）のみが、タンパク質アレイ製造において必要とされ、ＤＮＡ分子を含む実際の変異は、必要ではない。目的とするタンパク質をコードする野生型遺伝子が、まず、適切な宿主における発現用のＤＮＡベクター中にクローン化される。発現宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉに限定される必要がないこと−酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞が使用され得ることが、当業者によって理解される。真核生物宿主の使用が、調査中のタンパク質が翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を受けることが公知である場合には、望ましくあり得る。発現およびタンパク質活性を確認した後、野生型遺伝子は、望ましいＳＮＰを導入するように変異される。ＳＮＰの存在は、再クローニング後の配列決定によって、確認される。
【００３１】
そのアレイを作製するために、クローンは、マイクロタイタープレート形式（しかし、包括的ではない）にて増殖され得る。これは、スライドまたはプレート形式へのアレイ作成のための便利でありかつ高スループット形式を提供する形式での、サンプルの並列処理を可能にする。タンパク質発現が誘導され、その後、クローンが、アレイ作製のために処理される。これは、アフィニティクロマトグラフィによるそのタンパク質の精製、または組換えタンパク質に対して選択的である表面（「捕捉表面」）上にアレイ作製する準備ができている溶解物の調製を包含し得る。従って、このＤＮＡ分子は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかにおいてマーカー部分でタグ化されたタンパク質部分を得るために、融合タンパク質として発現され得る。本明細書中に記載されるように、このようなタグは、そのタンパク質を精製するため、またはその表面もしくはそのアレイにタンパク質を付着するために、使用され得る。簡便には、そして好ましくは、そのタンパク質部分は、発現宿主溶解物から同時精製され、そしてマーカー部分によってアレイに付着される。生じたタンパク質アレイは、その後、すべてのタンパク質の機能を並列してアッセイするため、従って、高スループット様式でアッセイするために、使用され得る。
【００３２】
第３の局面において、本発明は、関連するＤＮＡ分子由来の１組のタンパク質部分のメンバーの相対的特性を同時の決定する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載のアレイを提供する工程、そのアレイを試験物質と接触させる工程；およびそのアレイ上で、その試験物質と各組のメンバーとの相互作用を観察する工程、を包含する。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明は、タンパク質の機能を回復もしくは破壊する化合物（例えば、有機低分子）について関連するＤＮＡ分子由来の１組のタンパク質部分をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、特定のＳＮＰまたは他の変異を保有する集団の部分集合について、治療的利点または治療的不利点を有する化合物を明らかにし得る。他の実施形態において、その試験物質は、
・関連するＤＮＡ分子に由来する１組のタンパク質部分における相対的タンパク質：タンパク質相互作用を決定するためのタンパク質
・相対的タンパク質：ＤＮＡ相互作用またはタンパク質：ＲＮＡ相互作用を決定するための核酸分子
・相対的タンパク質：リガンド相互作用を決定するためのリガンド
であり得る。
【００３４】
本発明のアレイの問い合わせから得られた結果は、定量的（例えば、結合定数または触媒定数ＫＤおよびＫＭを測定する）、半定量的（例えば、タンパク質量に対する結合量を規格化する）、または定性的（例えば、機能性  対  非機能性）であり得る。リガンドがいくつか（例えば、二つ以上）の濃度で添加される場合、複製アレイに対するシグナルを定量化することにより、スポットにおけるタンパク質の結合親和性および活性濃度の両方が決定され得る。これは、互いおよび野生型のＳＮＰの比較を可能にする。このレベルの情報は、以前にアレイから得られていない。全く同一の方法論が、アレイされたタンパク質に対する薬物の結合を測定するために、使用され得た。
【００３５】
例えば、定量的の結果は、ＫＤおよびＢｍａｘ（それらは、リガンドとタンパク質との間の相互作用の親和性、およびリガンドそれぞれに対する結合部位の数を記載する）は、タンパク質アレイのデータから誘導され得る。簡潔には、各個々のタンパク質スポットに結合するリガンドの定量化量または相対量のいずれかが、アッセイ溶液における異なる濃度のリガンドで測定され得る。タンパク質の量と結合されたリガンド量との間での直線関係を推定すると、このアッセイで使用されるある範囲のリガンド濃度について、各スポットに結合するリガンド（相対）量は、方程式１、再配列または誘導に一致し得る。
【００３６】
結合したリガンド＝Ｂｍａｘ／（（ＫＤ／［Ｌ］）＋１）  （方程式１）
［Ｌ］＝アッセイで使用されたリガンド濃度。
【００３７】
本発明の各局面の好ましい特徴は、互いの局面について、必要な変更を加えてに規定されるとおりである。
【００３８】
本発明のさらなる特徴および詳細は、以下のタンパク質アレイ、ｐ５３タンパク質ＳＮＰアレイおよびｐ４５０アレイの特定の実施形態のおよび本発明（参考として図を用いた例として示される）に従うその使用記載から明らかである。
【実施例】
【００３９】
（実施例１：ＳＮＰ含有遺伝子によってコードされるタンパク質の機能解析のためのタンパク質アレイの使用−ｐ５３タンパク質ＳＮＰアレイ）
腫瘍サプレッサタンパク質ｐ５３における変異は、約５０％の癌と関連しており、この遺伝子の１０００以上のＳＮＰが認められている。腫瘍細胞中のｐ５３遺伝子の変異（体細胞変異）、または癌に対する疾病素質を有する家族のゲノム（生殖細胞系変異）でのｐ５３の変異は、分子機構との関連性ではなく、状況と遺伝子型との間での関連性を与える。ＳＮＰをコードする機能的な特徴に対して、タンパク質アレイの有用性を示すために、本発明者らは、４６の生殖細胞系変異（ＳＮＰ）を用いて、野生型のヒトｐ５３をアレイにした。次いで、これらのタンパク質の生化学活性を、試薬またはリガンドの少量のサンプルを用いて、即座にそして並行して比較し得る。アレイにされるタンパク質は、ＤＮＡ結合（公知のｐ５３キナーゼにより、翻訳後に「チップ上（ｏｎ−ｃｈｉｐ）」でリン酸化された）に対して、機能的であることを示し、そして公知のｐ５３の相互作用タンパク質（ＭＤＭ２）と相互作用し得る。これらの多くのＳＮＰに対して、これは、ｐ５３機能に対する変異の効果の第一の機能的特徴であり、そして大規模な並行様式において生化学活性分析において、タンパク質マイクロアレイの有用性を説明する。
【００４０】
（ｐ５３  ＳＮＰアレイの構築のための材料および方法）
野生株ｐ５３  ｃＤＮＡを、プライマーＰ５３Ｆ（５’ａｔｇ  ｇａｇ  ｇａｇ  ｃｃｇ  ｃａｇ  ｔｃａ  ｇａｔ  ｃｃｔ  ａｇ３’）およびプライマーＰ５３Ｒ（５’ｇａｔ  ｃｇｃ  ｇｇｃ  ｃｇｃ  ｔｃａ  ｇｔｃ  ａｇｇ  ｃｃｃ  ｔｔｃ  ｔｇ  ３’）を用いて、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅し、そしてポリヒスチジンタグおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＡｃｃＢ遺伝子由来のＢＣＣＰドメインをコードする配列の下流でＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターへ連結した。製造業者の説明書により、この連結混合物を、コンピテントＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へ化学的に形質転換した。このｐ５３  ｃＤＮＡ配列を配列決定によって調べ、そして、ｐ５３に対するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴエントリー（登録番号Ｐ０４６３７）を含まれるような、野生型ｐ５３タンパク質配列に対応することを見出した。
【００４１】
（ｐ５３変異体群の構築）
ｐ５３の変異体を、逆ＰＣＲ反応でのテンプレートとして、野生型ｐ５３配列を含むプラスミドを用いて作製した。プライマーを設計し、その結果、正方向プライマーを５’でリン酸化し、そして、５’末端において単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を用いて開始し、その後ｐ５３配列の２０〜２４ヌクレオチドを得た。逆方向プライマーを、ＳＮＰ前の２０〜２４ヌクレオチドに対して相補的であるように設計した。ＰＣＲをＰｗｏポリメラーゼを用いて実施し、これによってｐ５３を含むベクター全体に相当する、平滑末端産物を作製した。ＰＣＲ産物をゲルで精製し、環状プラスミドを形成するために連結し、そして、クローニングの効率を増大させるために、親テンプレートＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。連結産物をＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞へ形質転換し、そして、変異ｐ５３遺伝子を、所望される変異の存在に対する配列決定およびＰＣＲにより導入される二次性変異がないことにより確証した。
【００４２】
（Ｅ．ｃｏｌｉでのｐ５３の発現）
ｐ５３プラスミドを含むＸＬＩＢｌｕｅ細胞のコロニーを、４８ウェルブロック（ＱＩＡＧＥＮ）中で、アンピシリン（７０μｇ／ｍｌ）を含む２ｍｌのＬＢ培地でインキュベートし、振とうインキュベーターにて３７℃で一晩中増殖させた。４０μｌの一晩中培養を、４８ウェルブロックで、別の２ｍｌのＬＢ／アンピシリンを接種するために使用し、約０．４の最適濃度（６００ｎｍ)に到達するまで、３７℃にて増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを５０μＭになるまで添加し、引き続き３０℃で４時間誘導した。次いで、細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットを−８０℃で保管した。タンパク質の調製のために、細胞ペレットを室温で融解し、４０μｌのｐ５３緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０％グリセロール、1ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）および１０μｌの４ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加し、この細胞ペレットを再懸濁するためにボルテックスした。細胞破片を、４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍでの遠心分離により回収する前に、溶解を室温で３０分間、振とう機でのインキュベーションにより促進した。可溶性タンパク質の清澄な上清を取り出し、そしてすぐに使用するか、または−２０℃で保管した。
【００４３】
（ウェスタンブロッティング法）
可溶性タンパク質サンプルを、４〜２０％  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｓｉｎｅゲル（ＮＯＶＥＸ）でロードする前に、５分間、ＳＤＳ含有緩衝液中で煮沸し、４５分間２００Ｖで泳動させた。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）へトランスファーし、標準的な技術を用いて各種のエピトープの存在に対してプローブした。ヒスチジンタグの検出のために、膜を５％  Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳＴでブロックし、１／１０００倍希釈の抗ＲＧＳＨｉｓ抗体（ＱＩＡＧＥＮ）を一次抗体として使用した。ビオチンタグの検出のために、膜をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ／ＴＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）でブロックし、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ／ＴＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０で１／２０００倍に希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてプローブした。ＲＧＳＨｉｓ抗体に対する二次抗体は、Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳＴで１／２０００倍希釈した抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）ＨＲＰ結合（Ｓｉｇｍａ）であった。広範囲にわたる洗浄後、結合されたＨＲＰ結合を、ＥＣＬＰｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ)またはＤＡＢ染色（Ｐｉｅｒｃｅ）のいずれかを用いて検出した。
【００４４】
（ＤＮＡゲルシフトアッセイ）
発現されたｐ５３のＤＮＡ結合機能を、従来のゲルシフトアッセイを用いてアッセイした。オリゴＤＩＧＧＡＤＤ４５Ａ（５’ＤＩＧ−ｇｔａ  ｃａｇａａｃ ａｔｇ ｔｃｔ ａａｇ ｃａｔ ｇｃｔ ｇｇｇ ｇａｃ−３’）およびオリゴＧＡＤＤ４５Ｂ（ｇｔｃ ｃｃｃ ａｇｃ ａｔｇ ｃｔｔ ａｇａ ｃａｔ ｇｇｔｃｔｇ ｔａｃ３’）を最終濃度を２５μＭにして、ｄｓＤＮＡと共にアニールした。１μｌの透明な溶解産物、０．２μｌのアニール化ＤＩＧ標識化ＧＡＤＤ４５オリゴおよび１μｌのポリｄＩ／ｄＣ競合ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）を含む結合反応を、２０μｌのｐ５３緩衝液の中で組み立てた。反応系を室温で３０分間インキュベートし、氷上で冷却し、そして、５μｌを既にプレラン６％ポリアクリルアミド／ＴＢＥゲル（ＮＯＶＥＸ）でロードした。正に荷電したニトロセルロース（Ｒｏｃｈｅ）へトランスファーする前に、ゲルを４℃で９０分間１００Ｖにて泳動した。膜をＢｕｆｆｅｒ  Ｉ（１００ｍＭ  マレイン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中の０．４％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）で３０分間ブロックし、ＨＲＰ（Ｒｏｃｈｅ）結合体化抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメントを用いて、ＤＩＧ標識化ＤＮＡの存在に対してプローブした。結合されたＨＲＰ結合体をＥＣＬＰｌｕｓおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて検出した。
【００４５】
（ｐ５３リン酸化アッセイ）
ｐ５３のリン酸化を、精製カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ、Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した。このキナーゼは、セリン３９２位置で野生型ｐ５３をリン酸化することが以前に示されていた。リン酸化反応は、２０μｌ  ｐ５３緩衝液中に、２μｌのｐ５３溶解産物、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μＭ  ＡＴＰおよび０．１Ｕ  ＣＫＩＩを含有した。反応系を３０℃で３０分間インキュベートし、反応産物を４〜２０％ＮＯＶＥＸゲルを通して分離し、ＰＶＤＦ膜へトランスファーした。ｐ５３のリン酸化を、Ｍａｒｖｅｌ／ＴＢＳＴで１／１０００倍希釈した、セリン３９２位置でのｐ５３リン酸化に対して特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて検出した。二次抗体は、抗ウサギＨＲＰ結合体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であり、1／２０００倍で使用した。
【００４６】
（ＭＤＭ２相互作用アッセイ）
ＭＤＭ２のＮ末端部分（アミノ酸１７〜１２７）のｃＤＮＡを、ｃＤＮＡライブラリーから増幅し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターにおいて、ＨｉｓタグおよびＦＬＡＧタグをコードする配列の下流へクローン化した。プラスミドを、正しいＭＤＭ２配列について配列決定により調べ、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の誘導は、予測されるサイズのＨｉｓタグ化およびＦＬＡＧタグ化の可溶性タンパク質を示した。ＭＤＭ２とｐ５３変異体群との間の相互作用を試験するために、溶解産物を含む１０μｌ  ｐ５３、溶解産物を含む１０μｌ  ＭＤＭ２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０および１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含む５００μｌ  リン酸緩衝生理食塩水中の２０μｌ  抗ＦＬＡＧアガロースを含む結合反応系を組み立てた。反応系を室温で１時間、振とう機でインキュベートし、ＦＬＡＧ結合性複合体を５０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により回収した。ＰＢＳＴでの広範囲にわたり洗浄した後、ＦＬＡＧ結合性複合体をＳＤＳサンプル緩衝液中で変性させ、ウェスタンブロットした。ビオチン化ｐ５３の存在を、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ／ＨＲＰ結合体で検出した。
【００４７】
（ｐ５３マイクロアレイの組み立ておよびｐ５３マイクロアレイアッセイ）
ｐ５３変異体群の清澄溶解物を３８４ウェルプレートへロードし、そして、１６ピンマイクロアレイヘッドと特注ロボット（ｃｕｓｔｏｍ  ｂｕｉｌｔ  ｒｏｂｏｔ）（Ｋ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）を用いて、ＳＡＭ２ＴＭ膜（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）上へプリントした。各溶解産物を各アレイ上に４回スポットし、そして、各スポットを３回上記の膜へプリントした。プリント後、アレイをｐ５３緩衝液で湿らせ、３０分間、５％  Ｍａｒｖｅｌ／ｐ５３緩衝液でブロックした。ｐ５３緩衝液で３回×５分洗浄した後、アレイをアッセイのために準備した。
【００４８】
ＤＮＡ結合アッセイのために、５μｌのアニール化Ｃｙ３標識化ＧＡＤＤ４５オリゴを、５００μｌ  ｐ５３緩衝液へ添加した。プローブ溶液を室温で３０分間アレイ全体を洗浄し、そしてｐ５３緩衝液で３回×５分洗浄した。次いで、アレイを乾燥し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーでスキャンするために、スライドガラス上にのせた。Ｃｙ３スキャンした画像の定量化を、ＩｍａＧｅｎｅソフトウェアを用いて実行した。
【００４９】
リン酸化アッセイのために、１０μｌ  ＣＫＩＩを、３２０μｌ  ｐ５３緩衝液および８０μｌ  Ｍｇ／ＡＴＰ混合物中で、３０℃で３０分間、このアレイとインキュベートした。次いで、アレイをＴＢＳＴで３回×５分洗浄し、Ｍａｒｖｅｌ／ＴＢＳＴで１／１０００倍希釈した抗ホスホセリン３９２抗体を、１時間添加した。ＴＢＳＴで３回×５分洗浄した後、抗ウサギ二次抗体を１時間、１／２０００希釈で添加した。結合した抗体をＥＣＬＰｌｕｓおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍで検出した。
【００５０】
ＭＤＭ２相互作用アッセイのために、１μｌの精製Ｃｙｓ３標識ＭＤＭ２タンパク質を、室温で１時間、５００μｌのＰＢＳ／３００ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／１％  ＢＳＡ中でアレイとインキュベートした。同じ緩衝液中で３回×５分洗浄した後、アレイを乾燥し、スライドガラスにのせ、そしてＤＮＡ結合アッセイに関してＣｙｓ３蛍光を分析した。
【００５１】
（結果）
（Ｅ．ｃｏｌｉでのｐ５３の発現および変異体群の構築）
全長ｐ５３オープンリーディングフレームを、Ｈｅｌａ細胞ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって増幅し、ベクターｐＱＥ８０Ｌ（Ｅ．ｃｏｌｉ遺伝子ＡＣＣＢ由来のＢＣＣＰドメインを、すでにクローンしている）中のｔａｃプロモーターの下流へクローン化した。次いで、結果としてｐ５３は、そのＮ末端でＨｉｓタグ化およびビオチンタグ化され、そして図１は、誘導したＥ．ｃｏｌｉ培養物からの可溶性タンパク質のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ分析を示す。Ｈｉｓタグ化されたビオチンかタンパク質に対するクリアなシグナルが、約６６ｋＤａにあり、そして同じサイズのバンドをｐ５３特異的抗体ｐＡｂ１８０１（データは示さない）によって検出する。このタンパク質をコードするプラスミドを、完全に配列決定し、野生型ｐ５３ｃＤＮＡ配列であることが示された。このプラスミドを、変異体群を構築するためのテンプレートとして使用し、図１はまた、これらの変異体の選択発現の分析を示し、単一ヌクレオチド多型に対して予測されるように全長タンパク質を示し、そしてこの変異が終止コドンをコードするタンパク質を切断した。変異体はまた、所望する変異の存在および二次変異がないことを確認するために、配列決定をした。
【００５２】
本発明者らは、ＳＮＰアレイの本実施例においてＨｉｓタグおよびビオチンタグを使用しているが、他のアフィニティータグ（例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＶＳＶ）もクローン化タンパク質を精製するために、使用され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ以外の発現宿主もまた、所望される場合、使用され得る（例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳細胞）。
【００５３】
また、このアレイは、ｐ５３での天然に生じる生殖系ＳＮＰに焦点をあてたが、他の実施形態は、天然に生じるＳＮＰ（「合成性」変異）または一つを超えるＳＮＰを含む野生型タンパク質のバージョンに必ずしも制限されない。他の実施形態は、片方の末端もしくは両方の末端（ネスト化セット）から欠失される、タンパク質のバージョンを包含し得る。このようなアレイは、タンパク質：リガンド相互作用のマッピングおよび未知タンパク質の機能的ドメインの叙述において有用である。
【００５４】
（Ｅ．ｃｏｌｉにより発現されたｐ５３は、ＤＮＡ結合に対して機能的である）
本発明者らのｐ５３の機能性を示すために、本発明者らは、Ｐ５３で結合することが以前に示されているＤＮＡオリゴを用いて、電気泳動移動度シフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）を実施した。図２は、これらのゲルシフトアッセイからの実施結果を示し、野生型ｐ５３および変異体Ｒ７２Ｐ、変異体Ｐ８２Ｌならびに変異体Ｒ１８１ＣによるＤＮＡ結合を示している。これらの変異がｐ５３のＤＮＡ結合性ドメイン外であるので、初めの２つの変異体は、なおもＤＮＡと結合すると予想される。従来のゲルベースアッセイを用いたＤＮＡ結合が示されているので、本発明者らは、次いで、表面上にアレイされたｐ５３に対する同一機能を示したかった。図３Ｃは、ＳＡＭ２ＴＭ膜（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）上にアレイしたｐ５３変異体群に対するＣｙ３標識ＤＮＡの結合の結果を示す。本発明者らは、ＳＮＰアレイの本実施例においてＳＡＭ２ＴＭ膜を使用しているが、タンパク質をアレイするのに使用し得る他の表面には、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、金スライドまたはシリカスライド、ポリプロピレンマルチウェルプレートまたはポリスチレンマルチウェルプレート、あるいはニトロセルロース、ＰＶＤＦおよびナイロン膜のような他の多孔性表面上が挙げられるが、これらに制限されない。特に、ＳＡＭ２ＴＭ膜は、ビオチン化分子をとらえ、そして変異体群細胞溶解物からのビオチン化ｐ５３タンパク質を精製する。アレイから非結合性ＤＮＡを洗浄後、結合性ＤＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＤＮＡアレイスキャナーを用いて視覚化した。図３で見られ得るように、表面上にアレイした場合、ゲルシフトアッセイでＤＮＡを結合した同一変異体はまた、ほとんどのＤＮＡと結合した。実際、ＤＮＡ結合アッセイについては、マイクロアレイアッセイは、従来のゲルシフトアッセイよりもより高い感受性があるようだった。これは、おそらく、ゲルシフトアッセイにおいて、ゲル電気泳動の間、ＤＮＡ：タンパク質複合体は結合を保持しなければならず、そして、弱い複合体はこの工程の間に解離し得るためである。また、使用されたＳＡＭ２ＴＭ膜の３次元マトリックスは、収容効果を有し得る。ｐ５３タンパク質量は、Ｈｉｓタグタンパク質に対してプローブした同一のマイクロアレイによって示されている場合、各スポット上で等量であり、（図３Ｂ）。
【００５５】
（リン酸化試験のためのｐ５３アレイの使用法）
翻訳後修飾に対するＳＮＰ効果の試験を例示するために、本発明者らは、カゼインキナーゼＩＩによるｐ５３アレイのリン酸化へ注目することを選択した。この酵素は、セリン３９２でｐ５３をリン酸化することが以前に示されており，そして、本発明者らは、この事象を試験するために、市販の抗ｐ５３リン酸化セリン３９２特異的抗体の使用法を作製した。図４は、ｐ５３野生株およびＳ３９２Ａクローン由来の、可溶性タンパク質調製物についてのキナーゼ反応のＷｅｓｔｅｒｎブロット分析を示す。レーン１は、ＣＫＩＩによる野生型ｐ５３のリン酸化を示し、バックグラウンドシグナルは、ＣＫＩＩをこの反応（レーン２）から削除した場合である。レーン３およびレーン４は、Ｓ３９２Ａに対する対応結果を示す（予測された通り、ＣＫＩＩによるリン酸化に対するバックグラウンドシグナルのみを示す）。次いで、このアッセイをマイクロアレイ形式（図５に見られ得るように、全ての変異体群に対するリン酸化反応が、Ｓ３９２Ａ変異体および残基３９２前を切断した変異体を除外することを示す）で適用した。
【００５６】
（タンパク質：タンパク質相互作用を試験するためのｐ５３アレイの使用法）
ＳＮＰタンパク質アレイでのタンパク質：タンパク質相互作用の試験を例示するために、ｐ５３タンパク質アレイとＭＤＭ２との相互作用を調査した。図６は、抗ＦＬＡＧアガロースに結合した場合、ＦＬＡＧ標識ＭＤＭ２は、野生型ｐ５３を崩壊することを示す。しかし、Ｗ２３Ａ変異体は、ＦＬＡＧアガロースに結合したＭＤＭ２によって崩壊さず、この残基がｐ５３／ＭＤＭ２相互作用に重要であると以前に示されている（Ｂｏｔｔｇｅｒ、Ａ．、Ｂｏｔｔｇｅｒ、Ｖ．、Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ、Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２６９：７４４−７５６）と考えられる。次いで、このアッセイをマイクロアレイ形式で実施し、そして、図７は、このアレイの結果を示す。Ｃｙ３標識タンパク質は、Ｗ２３Ａ変異体スポットおよびＷ２３Ｇ変異体スポットから離れた全てのスポットにて検出される。
【００５７】
本発明者らは、ヒトｐ５３タンパク質機能に対する４６個の生殖系変異体の効果を特徴付けるために、新規のタンパク質チップ技術を使用した。アレイしたタンパク質を、Ｈｉｓ標識抗体およびｐ５３特異的抗体の双方で検出し得る。このアレイを、ｐ５３状態の診断に対して関係を有し得る変異特異的抗体をスクリーンするために使用し得る。
【００５８】
本発明者らは、従来のゲルベースアッセイによる野生型タンパク質の機能を示し得、そして、マイクロアレイ形成で実施するアッセイと類似の結果を達成している。実際に、ＤＮＡ結合アッセイについては、マイクロアレイアッセイは、従来のゲルシフトアッセイよりもより感受性があることを表した。これらのアレイは、５０％グリセロール中に−２０℃で保管し得、そして、１ヶ月後、ＤＮＡ結合に対する機能がまだあることを示した（データは示していない）。
【００５９】
ＣＫＩＩリン酸化アッセイの結果は、予測される通りであり、残基３９２においてセリンを含む全てのタンパク質についてリン酸化が検出された。この分析は、ｐ５３をリン酸化するキナーゼに対するスクリーン、または、例えば、他の変異体ではなくいくつかの変異体（それ自身、癌において潜在的な標的を表し得る）を差次的にリン酸化するキナーゼに対するスクリーンに拡大され得ることは明らかであ。
【００６０】
ＭＤＭ２相互作用アッセイは、再度、タンパク質アレイ形式の有効性を示し、野生型およびｐ５３変異体に対する結果は、従来の崩壊アッセイを用いて得られた結果を反映している。これらの結果はまた、本発明者らのタンパク質アレイが、タンパク質：タンパク質の相互作用を検出するために使用され得ることを示す。潜在的にはこれらのアレイは、現在の方法を用いては不可能な、高いスループット様式において、タンパク質：タンパク質の相互作用に対する定量的な結合データ（すなわち、ＫＤ値）を得るために使用され得る。ＭＤＭ２タンパク質を、想定されるタンパク質プロフィールの実験のため、アレイボード上の粗Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物を崩壊することは、例えば、細胞抽出物を異なるタンパク質から調製した場合、異なる発蛍光団で標識し、そして、タンパク質の相互作用種量での差異を捜すために同一アレイに双方をハイブリダイズしたということである。
【００６１】
実際に、以下の実施例２において、出願人は、これらのアッセイが定量的なデータを得るために使用され得るということを示す。
【００６２】
（実施例２  ｐ５３タンパク質マイクロアレイでのＤＮＡ結合の定量化）
（方法）
（ＤＮＡ結合アッセイ）ＧＡＤＤ４５プロモーターエレメント配列（５’−ｇｔａ  ｃａｇ  ａａｃ  ａｔｇ  ｔｃｔ  ａａｇ  ｃａｔ  ｇｃｔ  ｇｇｇ  ｇａｃ−３’および５’−ｇｔｃ  ｃｃｃ  ａｇｃ  ａｔｇ  ｃｔｔ  ａｇａ  ｃａｔ  ｇｔｔ  ｃｔｇ  ｔａｃ−３’）を有するオリゴヌクレオチドを、γ３３Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）およびＴ４キナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて放射線標識し、ｐ５３緩衝液中でアニールし、次いで、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて精製した。複合オリゴを、ＵＶ分光測光法によって定量化し、２．５倍の希釈系列をｐ５３緩衝液で作製した。５００μｌの各希釈系列を室温で３０分間、マイクロアレイと共にインキュベートし、次いで、非結合性ＤＮＡを除去するために、ｐ５３緩衝液で３回（５分／回）洗浄した。次いで、マイクロアレイを、スキャニングする前に、一晩、ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）プレート（Ｆｕｊｉ、Ｊａｐａｎ）に曝露した。ＩｍａＧｅｎｅソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｍａｒｉｎａ  ｄｅｌ  Ｒｅｙ、ＣＡ）は、スキャンしたイメージを定量化するために使用した。各ＤＮＡ濃度での全ての変異体に対する複製値を、単純双曲線性濃度−反応曲線  Ｒ＝Ｂｍａｘ／（（ＫＤ／Ｌ）＋１）に適合した（Ｒは相対的計数における反応であり、そしてＬはｎＭのＤＮＡ濃度である）。
【００６３】
（結果）
（ＧＡＤＤ４５プロモーターエレメントＤＮＡに対するｐ５３の結合）複製ｐ５３マイクロアレイ（ＧＡＤＤ４５プロモーターエレメントの配列に相当する）を、様々の濃度で、３３Ｐ標識複合ＤＮＡの存在下でインキュベートした（図８Ａ）。マイクロアレイを、ホスホイメージャーを用いてイメージし、そして個々のスポットを定量化した。この検出方法での非直線性を調節するために、データを検定曲線に対して標準化し、そして、バックグラウンドを減算した。全ての変異体に対する増幅値をプロットし、そして、Ｋｄ値およびＢｍａｘ値双方の計算を与える非直線性回帰分析で分析した。
【００６４】
【表１】
2005512055.tif 000002
図８Ｂは、７ｎＭの野生型アフィニティーと推測する、野生型ｐ５３（高いアフィニティー）、Ｒ２７３Ｈ（低いアフィニティー）およびＬ３４４Ｐ（非結合性）に対するＤＮＡ結合を示す。
【００６５】
（結論）
（ＤＮＡ結合）ＤＮＡ結合データの定量化分析は、野生型および変異体ｐ５３に対するアフィニティー（ＫＤ）および相対的な最大結合値（Ｂｍａｘ）の双方で生じたマイクロアレイから得た。タンパク質機能マイクロアレイは、以前にこの方法で使用されておらず、そのため、このデータは、並列の様式で、データの質および量を獲得することに有用性を示す。スポットにおけるアフィニティータグ化タンパク質の量に対して結合データを標準化するアプローチは、大きなデータセットを分析する手段を速く提供する「Ｚｈｕ、Ｈ．ら、Ｇｌｏｂａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｃｈｉｐｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３、２１０１−２１０５（２００１）」が、マイクロアレイ化タンパク質の種々の特異的活性は考慮にされず、シグナルが飽和状態または非飽和状態の条件下で記録されるかどうかも考慮にされない。定量化分析はここで実施し、ＧＡＤＤ４５  ＤＮＡ結合に従う群へ変異体の機能的分類を与えた：ほぼ野生型アフィニティーを示す；減少した安定化を表す（低いＢｍａｘ）；減少したアフィニティーを示す（高いＫｄ）；および完全な活性消失を示す（表１）。
【００６６】
ＤＮＡに対するほぼ野生型アフィニティーを有するタンパク質は、一般的に、ＤＮＡ結合ドメインの外側に位置する変異を有し、Ｒ７２Ｐ、Ｐ８２Ｌ、Ｒ３０６ＰおよびＧ３２５Ｖを含む。Ｒ３３７Ｃは、ｐ５３のオリゴマー化状態に影響を及ぼすことが知られているが、本明細書中で使用されるアッセイ温度にて、大部分はテトラマーであると考えられる「Ｄａｖｉｓｏｎ、Ｔ．Ｓ．、Ｙｉｎ、Ｐ．、Ｎｉｅ、Ｅ．、Ｋａｙ、Ｃ．＆  Ａｒｒｏｗｓｍｉｔｈ、Ｃ．Ｈ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐ５３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ  ａｎｄ  Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ  ｌｉｋｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７、６５１−６５６（１９９８）」、ここで測定されたアフィニティーと一致する。対照して、結合の全ての消失は、予測された通り、未熟の終止コドン（Ｑ１３６Ｘ、Ｒ１９６Ｘ、Ｒ２０９ＸおよびＲ２１３Ｘ）およびタンパク質をモノマー化する変異（Ｌ３４４Ｐ「Ｌｏｍａｘ、Ｍ．Ｅ．、Ｂａｒｎｅｓ、Ｄ．Ｍ．、Ｈｕｐｐ、Ｔ．Ｒ．、Ｐｉｃｋｓｌｅｙ、Ｓ．Ｍ．＆Ｃａｍｐｌｅｊｏｈｎ、Ｒ．Ｓ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ  ａｎｄ  Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ  ｌｉｋｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７、６４３−６４９（１９９８）．」およびテトラマー化ドメイン欠損性Ｒ３０６Ｘ）を誘導する変異において観察された。
【００６７】
ＤＮＡ結合ドメインにおいて、出願人は、一般的に変異は、顕著な除外例Ｒ１８１Ｃ／Ｈ、Ｓ２２７ＴおよびＨ２３３Ｎ／ＤとのＤＮＡの結合性を減少するかまたは排除するかということを見出した；これらは、タンパク質とＤＮＡとの境界からはなれた全ての溶媒暴露位置であり、そして野生型結合を示す。タンパク質とＤＮＡとの境界に存在する変異Ｒ２４８Ｑ／Ｗ、Ｒ２７３Ｃ／ＨおよびＲ２８０Ｋは、野生型（表１）より２〜７倍高いＫｄ値を有す低いアフィニティー（特異的なタンパク質とＤＮＡとの相互作用の消失、あるいは変異化残基の最適以下のパッケージを通じた位置的な妨害、のいずれかを有す）を表した。
【００６８】
多くの残りの変異体は、適切なスポットに存在する、タンパク質の量に従って標準化した場合、相当に減少した特異的な活性（明らかに低いＢｍａｘ値）を表す群へ分かれる。いくつかの変異体に対して、ＤＮＡの結合性は、このような水準に折衷し（しかし、結合は認められる）、それは正確な定量化ではなく、例えば、Ｐ１５１ＳおよびＧ２４５Ｃのバックグラウンド率への低いシグナルに起因する。他の変異体、例えばＬ２５２Ｐに対して、低いシグナル強度は、測定可能なＫｄ値を産出したが、広い信頼限度を有する。
【００６９】
目的のＤＮＡ配列の天然に存在する改変体（例えば、フェーズ１またはフェーズ２からのタンパク質をコードする酵素を代謝する薬剤（ＤＭＥ））のから誘導された、少なくとも二つのタンパク質部分を含む、タンパク質アレイに対する本発明の適応性をさらに示すために、本発明は、ｐ４５０アレイに対する基準を用いてさらに例示される。フェーズ１ＤＭＥは、チトクロムｐ４５０およびフラビンモノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）を含み、そしてフェーズ２ＤＭＥはＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）、薬物結合核受容体およびトランスポータータンパク質薬物を含む。
【００７０】
好ましくは、全ての相補性、またはヒトＤＭＥの重要な比率が本発明のアレイで表される。このようなアレイは、（現在、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースに記載される、括弧内の数）：全てのヒトＰ４５０（１１９）、ＦＭＯ（５）、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）（１８）、ＧＳＴ（２０）、スルホトランスフェラーゼ（ＳＵＬＴ）（６）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）（２）、薬物結合核受容体（３３）およびトランスポータータンパク質薬物（６）を含む。このタンパク質リストは、ヒトゲノム配列決定プロジェクト（基質特異的に転換し得るＰ４５０に対して生じる公知のスプライス改変体、または機能およびｐ４５０ならびにフェーズ２  ＤＭＥの双方に特異的な基質に影響を及ぼす公知の多型）と特徴付けるため、これらを含んでいない。
【００７１】
例えば、異なる人種集団の間で、Ｐ４５０  ２Ｃ９、Ｐ４５０  ２Ｄ６およびＰ４５０  ３Ａ４における各種の対立遺伝子での発生頻度に大きな差異があることが、知られている（表２、３および４を参照のこと）。これらの対立遺伝子は、酵素速度論、基質特異性、部位選択的および産物プロフィール（多数の産物が産出される場合）に影響を及ぼす潜在性を有している。本開示で記載されるタンパク質のアレイは、特定の薬物に対してこれらの差異のさらなる詳細な試験を可能にし、そして潜在的な問題を予測するのに役立ち、また、臨床試験に対して使用される集団を効果的に計画するのに役立つ。
【００７２】
【表２−１】
2005512055.tif 000003
【００７３】
【表２−２】
2005512055.tif 000004
【００７４】
【表３】
2005512055.tif 000005
【００７５】
【表４】
2005512055.tif 000006
【００７６】
【数１】
2005512055.tif 000007
（実施例３：野生型Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓシトクロームＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４のクローニング）
ヒトシトクロームＰ４５０は、Ｎ末端に保存領域を有し、これは、脂質の会合を促進する疎水性領域、酸性領域または「終止転移（ｓｔｏｐ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）」領域（膜へさらに供給されるタンパク質を止める）、および部分的に保存されたプロリンリピートを含む。Ｐ４５０の三つのバージョンを、これらのドメインに対する欠失を伴って生成され、Ｎ末端の欠失は以下に示す。
【００７７】
【化１】
2005512055.tif 000008
ヒトＣＹＰ２Ｄ６を、特定の順方向プライマーおよび逆方向プライマー（Ｔ０１７ＦおよびＴ０１７Ｒ）を用いて、脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、心臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプールからＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物をｐＭＤ００４発現ベクターに、Ｎ末端Ｈｉｓ−ＢＣＣＰタグを用いてインフレームで、逆方向プライマーに存在するＮｏｔ１制限部位を用いて、クローンした。Ｃ末端タグベクターｐＢＪＷ１０２．２（図９ＡおよびＢ）における発現に対してＣＹＰ２Ｄ６を変換するために、５’末端でのＳｆｉ１クローニング部位に取り込みさせたプライマーを使用し、そして、Ｃ末端タグとのインフレームの融合を可能にするために、３’末端での終止コドンを除去した。Ｔ０１７ＣＦ１、Ｔ０１７ＣＦ２またはＴ０１７ＣＦ３のいずれかとプライマーＴ０１７ＣＲとは、ＣＹＰ２Ｄ６のＮ末端から、それぞれ、２９アミノ酸、１８アミノ酸および０アミノ酸の欠失を可能にした。
【００７８】
プライマー配列は、以下の通りである：
【００７９】
【化２】
2005512055.tif 000009
ＰＣＲを０．５μＭの各プライマー、１２５〜２５０μＭ  ｄＮＴＰ、５ｎｇのテンプレートＤＮＡ、１×反応緩衝液、１〜５単位のポリメラーゼ（Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、または「Ｅｘｐａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ」ポリメラーゼ混合物）を含む５０μ量で実施し、ＰＣＲサイクルは、９５℃  ５分、９５℃  ３０秒、５０〜７０℃  ３０秒、７２℃  ４分×３５サイクル、７２℃  １０分、または伸長（Ｅｘｐａｎｄ）の場合は、６８℃を伸長工程に使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって取り除き、正確なサイズのこれらの産物をゲルから切り出し、そしてその後、ゲル抽出キットを用いて精製した。次いで、精製されたＰＣＲ産物をＳｆｉ１またはＮｏｔ１のいずれかを用いて消化し、調製したベクター骨格へ連結した（図９Ｃ）。正確な組換えクローンを、細菌培養物のＰＣＲスクリーニングによって、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング、およびＤＮＡ配列分析によって決定した。
【００８０】
ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９を、ＣＹＰ２Ｄ６に類似の方法によって、ｃＤＮＡライブラリーからクローンした。Ｎ末端ベクターへのクローニングに対し、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９を増幅するためのプライマー配列は、以下の通りである；
【００８１】
【化３】
2005512055.tif 000010
Ｃ末端タグベクターにおける発現に対して、Ｎ末端クローンを変換するためのプライマーは、以下の通りである：
【００８２】
【化４】
2005512055.tif 000011
２Ｃ９の全長または２Ｃ９の疎水性ペプチド（Ｃ３）バージョンを、テンプレートとして２Ｃ９終止転移クローン（Ｃ１）および以下のプライマーを用いて、逆ＰＣＲによって生成した。：
【００８３】
【化５】
2005512055.tif 000012
（実施例４：ＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０還元酵素のクローニング）
ＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０還元酵素を、胎児肝臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅し、ＰＣＲプライマー［ＮＡＤＰＨ還元酵素  Ｆ１  ５’−ＧＧＡＴＣＧＡＣＡＴＡＴＧＧＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡＣＧＴＧＧＡＣＡＣ−３’；ＮＡＤＰＨ還元酵素  Ｒ１  ５’−ＣＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＣＧＴＣＣＡＧＧＧＡＧ−３’］を、遺伝子の５’ＮｄｅＩ部位および３’ＨｉｎｄＩＩＩ部位を取り込み、クローニングを可能にした。このＰＣＲ産物をｐＪＷ４５発現ベクターへクローンし（図１０ＡおよびＢ）、二つの終止コドンを、Ｈｉｓタグが翻訳されないことを確実にするために、逆方向プライマー上に含ませた。正確な組換えクローンを、細菌培養物のＰＣＲスクリーニングによって、および配列決定によって決定した。
【００８４】
（実施例５：Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓシトクロームＰ４５０  ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ３Ａ４の多型改変体のクローニング）
一旦、正確な野生型ＣＹＰ４５０（図１１、１２および１３）をクローンし、そして配列分析によって確証し、表５に示した２Ｃ９、２Ｄ６および３Ａ４の天然に存在する多型を、逆ＰＣＲのアプローチ（実施例３に記載されるＣＹＰ２Ｄ６の開始クローニングと同じ方法で、直線ＰＣＲ産物として増幅し、そしてクローンしたＣＹＰ２Ｄ６＊１０を除く）によって作製した。各場合において、異なる人種集団において観察された場合、順方向逆ＰＣＲプライマーは、多型ヌクレオチドに対して野生型ヌクレオチドを置換するために、５’位置に１ｂｐミスマッチを含んだ。
【００８５】
【表５】
2005512055.tif 000013
以下のＰＣＲプライマーを使用した。
【００８６】
【化６】
2005512055.tif 000014
（実施例６：Ｐ４５０  ３Ａ４の発現および精製）
Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ−１０金（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、Ｐ４５０  ３Ａ４の発現培養のための宿主として使用した。スターター培養物を、１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを補充したＬＢ培地で一晩中培養した。０．５Ｌ  Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地＋１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンおよび１ｍＭチアミン、ならびに極微量のエレメントを、１／１００倍の一晩スターター培養物と共にインキュベートした。フラスコを、細胞密度ＯＤ６００が０．４になるまで、３７℃で振とうし、次いで、δ−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を、３０℃で２０分間、０．５ｍＭで細胞に添加した。この細胞に、５０μＭ  ビオチンを補充し、次いで、ＩＰＴＧの最適濃度（３０〜１００μＭ）と共にインキュベートし、次いで、３０℃で一晩中振とうした。
【００８７】
０．５Ｌの培養物からのＥ．ｃｏｌｉ細胞を、５０ｍｌアリコートへ分割し、細胞を遠心分離によってペレット化し、そしてこの細胞ペレットを−２０℃で保管した。各ペレットからの細胞を、５ｍｌ緩衝液Ａ（１００ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０×プロテアーゼインヒビターカクテルのストック−Ｒｏｃｈｅ  １８３６１７０、０．２ｍｇ／ｍｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅ）中に再懸濁することにより、溶解した。１５分の氷上でのインキュベーション後、４０ｍｌの氷冷却の脱イオン水を、再懸濁した細胞ペレットに各々添加し、混合した。２０ｍＭ  塩化マグネシウムおよび５μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩを添加した。この細胞を、氷上で３０分間、緩やかに振とうしながらインキュベートし、その後、この溶解したＥ．ｃｏｌｉ細胞を３０分間４０００ｒｐｍで遠心分離することによってペレット化した。この細胞ペレットを１０ｍｌの緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、および１０×プロテアーゼインヒビターカクテルのストック−Ｒｏｃｈｅ  １８３６１７０）中での再懸濁によって洗浄し、その後、４０００ｒｐｍで遠心分離した。次いで、膜結合タンパク質を、２ｍｌ緩衝液Ｃ（５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４）、１０×プロテアーゼインヒビターカクテルのストック−Ｒｏｃｈｅ  １８３６１７０、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３％（ｖ／ｖ）Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０）の添加により溶解し、４℃で１５分間、１０，０００ｇでの遠心分離前に、３０分間穏やかに振とうしながら氷上でインキュベートし、次いで、この上清（図１４）をＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に適用した。
【００８８】
Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）の０．５ｍｌ  カラムを、使い捨ての重力カラムに注入し、５カラム容量の緩衝液Ｃを用いて平衡化させた。上清をこのカラムに適用し、その後、このカラムを、４カラム容量の緩衝液Ｄ＋２００ｍＭ  イミダゾール溶出前に、４カラム容量の緩衝液Ｃ、４カラム容量の緩衝液Ｄ（５０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４）、１０×プロテアーゼインヒビターカクテルのストック−Ｒｏｃｈｅ  １８３６１７０、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２０％（ｖ／ｖ）グリセロール）および４カラム容量の緩衝液Ｄ＋５０ｍＭイミダゾールを用いて連続的に洗浄した（図１５）。０．５ｍｌ分画を回収し、そして、タンパク質を含む分画をプールし、等分し、そして−８０℃で保管した。
【００８９】
（実施例７：Ｐ４５０へのヘム取り込みの決定）
精製Ｐ４５０を、１０ｍＭ  ＫＣＮの存在下および１０ｍＭ  ＫＣＮの非存在下において、２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４）で０．２ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈し、吸光度スキャンを６００〜２６０ｎｍで測定した。結合ヘムの百分率を、吸光係数ε４２０  １００ｍＭ−１ｃｍ−１に基づいて計算した。
【００９０】
（実施例８：ＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０還元酵素を用いたリポソームへのシトクロームＰ４５０酵素の再形成およびアッセイ）
クロロホルム中に、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリンの１：１：１の混合物を、溶解し、乾固するまで蒸発させ、そしてその後、２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４）に１０ｍｇ／ｍｌとなるように再懸濁することによって、リポソームを調製する。精製Ｐ４５０  ２Ｄ６（２０ｐｍｏｌ)、ＮＡＤＰＨ  Ｐ４５０還元酵素（４０ｐｍｏｌ)、シトクロームｂ５（２０ｐｍｏｌ)の混合物に、最終用量が１０μｌになるよう、４μｇのリポソームを添加し、３７℃で１０分間プレインキュベートする。
【００９１】
リポソーム中へのシトクロームＰ４５０酵素の再形成後、リポソームを、黒色９６ウェルプレート（ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．４、５０ｍＭ）、ＮＡＤＰ＋（２．６ｍＭ）、グルコース−６−リン酸（６．６ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（６．６ｍＭ）およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（０．４単位／ｍｌ）を含む）中で、アッセイ緩衝液で１００μｌまで希釈する。アッセイ緩衝液はまた、アッセイされるシトクロームＰ４５０アイソフォームに対する適切な蛍光基質を含む：Ｐ４５０  ２Ｄ６に対してＡＭＭＣ、Ｐ４５０  ３Ａ４に対してジベンジルフルオレセイン（ＤＢＦ）またはレソルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ)ベンジルエーテル（ＢｚＲｅｓ）、および２Ｃ９に対してジベンジルフルオレセイン（ＤＢＦ）が使用され得る。この反応を、「終止溶液（ｓｔｏｐｐｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」（Ｔｒｉｓで緩衝化した８０％アセトニトリル）の添加により終了し、そして、生成物を蛍光プレートリーダーで、適切な波長フィルターセットを用いて読みとる（図１６）。
【００９２】
Ｐ４５０はまた、例えば、補酵素および再生溶液の両方の代わりに、２００μＭ  クメンヒドロペルオキシドの添加により、化学的に活性化され得る（図１７）。
【００９３】
さらに、蛍光で測定されるターンオーバー率は、インヒビターの存在下において測定され得る。
【００９４】
（実施例９：固定化Ｐ４５０  ＣＹＰ３Ａ４に結合する薬物の検出）
精製ＣＹＰ３Ａ４（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．０１％  ＣＨＡＰＳ中の１０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）を、ストレプトアビジン固定化プレート（Ｅｘｉｑｏｎ）（１００μｌ／ウェル）に置き、氷上で１時間振とうした。このウェルを吸引し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／０．０１％  ＣＨＡＰＳで２回洗浄した。固定化タンパク質に結合した［３Ｈ］−ケトコナゾールを、シンチレーションカウンターによって直接に決定した。飽和実験を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％  ＣＨＡＰＳおよび１０％  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ）中において、［３Ｈ］ケトコナゾール（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を用いて実施した（図１８）。１００μｌの最終アッセイ容量において、リガンドの６つの濃度を、結合アッセイ（２５〜１０００ｎＭ）で使用した。１００μＭ  ケトコナゾールにより置換される場合、特異的な結合を規定した。各測定を二重で実施した。室温で１時間のインキュベーション後、ウェルの内容物を吸引し、このウェルを１５０μｌ氷冷却アッセイ緩衝液を用いて３回洗浄した。１００μｌ  ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ２０（Ｐａｃｋａｒｄ）を、各ウェルに添加し、そして、このプレートをＰａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンターで計数した（図１８）。
【００９５】
（実施例１０：タグ化し、固定化したＣＹＰ３Ａ４の化学的な活性化）
ＣＹＰ３Ａ４を、実施例９に記載するように、ストレプトアビジン固定化プレートに固定化し、次いで、ジベンジルフルオレセインおよび種々の濃度（０〜３００μＭ）のクメン過酸化水素と共にインキュベートした。エンドポイントアッセイは、タグ化し固定化したＣＹＰ３Ａ４が化学的な活性化を用いたターンオーバーアッセイにおいて、機能的であるということを示した（図１９）。
【００９６】
（実施例１１：リポソームまたはミクロソームのゲルカプセル化によるＰ４５０の固定化）
リポソームまたはミクロソーム中のＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０還元酵素との、シトクロームＰ４５０酵素の再形成後、次いで、これらは、例えば、アガロース、ポリウレタンまたはポリアクリルアミドのようなゲルマトリックス内のカプセル化により、表面上に固定化され得る。
【００９７】
例えば、低い融解温度（ＬＭＴ）（１％  ｗ／ｖ）のアガロースを、２００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ７．４）に溶解した。次いで、これを加熱ブロック（ｈｅａｔｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ)上で３７℃まで冷却した。次いで、シトクロームＰ４５０  ３Ａ４、シトクローム  ｂ５およびＮＡＤＰＨシトクロームｐ４５０還元酵素を含むミクロソームを、ＬＭＴアガロースへ希釈し、その結果、５０μｌのアガロースは、２０ｐｍｏｌ  Ｐ４５０  ３Ａ４、４０ｐｍｏｌ  ＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０還元酵素および２０ｐｍｏｌ  シトクロームｂ５を含んだ。次いで、５０μｌのアガロースミクロソームを黒色９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加し、室温で、凝固させた。
【００９８】
各ウェルにおいて、１００μｌのアッセイ緩衝液を添加し、このアッセイを、従来の再形成アッセイについて、上記（例えば、実施例８）に記載されるようにして行った。作製されたデータから、ＢｚＲｅｓ酸化の基本動態とケトコナゾール阻害の基本動態との比較を行い（図６）、これは、ＣＹＰ３Ａ４の活性はゲルカプセル化後も残存したことを示した。
【００９９】
【表６】
2005512055.tif 000015
ＢｚＲｅｓに対するＫＭおよびＶmaxの推定のために、３２０μＭまでの種々の濃度のＢｚＲｅｓの存在下で、アッセイを実施した。ケトコナゾール阻害を、５μＭから３倍希釈を７回行ったケトコナゾールを用いて、５０μＭ  ＢｚＲｅｓで実施した。括弧内の値は、曲線フィッティングから得られた標準誤差を示す。
【０１００】
固定化Ｐ４５０の活性を、７日間にわたって評価した（図２０）。同一条件下で保管された同一のタンパク質調製物のアリコート（ゲルでカプセル化される場合を除く）をまた、同一期間にわたってアッセイし、このことは、ゲルカプセル化が、Ｐ４５０活性に対して有意な安定性を与えることを示した。
【０１０１】
（実施例１２：活性に対する３Ａ４多型の影響の定量的決定）
精製シトクロームＰ４５０  ３Ａ４アイソフォーム＊１、＊２、＊３、＊４、＊５および＊１５（約１μｇ）を、ケトコナゾールの非存在下および存在下において、ＢｚＲｅｓおよびクメン過酸化水素（２００μＭ）存在下で、９６ウェル黒色マイクロタイタープレート中で、２００ｍＭ  ＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）で最終容量を１００μｌにし、室温にて、インキュベートした。各濃度のＢｚＲｅｓまたは各濃度のケトコナゾールについて、最低２回行った。
【０１０２】
レソルフィン形成を、蛍光の増加（各々５２０ｎｍの励起および発光フィルターならびに５８０ｎｍの励起ならびに発光フィルター）で長期にわたり測定し、初期率を進行曲線から計測した（図２１）。
【０１０３】
ＢｚＲｅｓのＫＭａｐｐおよびＶｍａｘａｐｐの推定のために、バックグラウンド率を、初期率から始めに減算し、次いで、ＢｚＲｅｓ濃度に対してプロットし、そして曲線を従来のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ動態に記載するように適合した：
Ｖ＝Ｖｍａｘ／（１＋（ＫＭ／Ｓ）
ここでＶおよびＳは、それぞれ、初期率および基質濃度である。次いで、Ｖｍａｘ値をシトクロームＰ４５０濃度に対して標準化し、そして野生型酵素に調整した（表７）。
【０１０４】
ケトコナゾールのＩＣ５０の推定のために、バックグラウンド率を、初期率から始めに減算し、次いで、％非阻害率に変換し、ケトコナゾール濃度に対してプロットした（図２２）。ＩＣ５０阻害曲線を以下の方程式を用いて適合した：
Ｖ＝１００／（１＋（Ｉ／ＩＣ５０））
ここでＶおよびＩは、それぞれ、初期率および阻害剤濃度である。得られたデータは、表７に示す：
【０１０５】
【表７】
2005512055.tif 000016
パラメーターを、図２１および２２でのデータに対するＭｉｃｈａｅｌｉｓ−ＭｅｎｔｏｎおよびＩＣ５０阻害曲線の適合から得た。括弧内の値は、曲線適合から得た標準誤差である。
【０１０６】
（実施例１３：固定化ＣＹＰ３Ａ４多型のアレイベースのアッセイ）
シトクロームＰ４５０多型は、特定の低分子を用いた活性において、微妙な差異を同定するために、アレイフォーマットを用いて並列でアッセイされ得る。例えば、精製シトクロームＰ４５０  ３Ａ４イソ型＊１、＊２、＊３、＊４、＊５および＊１５は、実施例１１に記載されるように、ＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０還元酵素を用いたリポソームに対して、個々に再形成され得る。次いで、結果として生じたリポソーム調製物を、ＬＭＰアガロースへ希釈し得、実施例１１に記載されるように、黒色９６ウェルマイクロタイタープレートの個々のウェルへ固定化し得る。
【０１０７】
次いで、固定化タンパク質を、各ウェルに、ＢｚＲｅｓ＋／−ケトコナゾールを含む１００μｌのアッセイ緩衝液を添加することによって、実施例１１に記載されるようにアッセイし得る。
【０１０８】
化学的な活性化（実施例１２に記載されるように）もまた、アレイ形式で使用し得る。例えば、精製シトクロームＰ４５０  ３Ａ４アイソフォーム＊１、＊２、＊３、＊４、＊５および＊１５を、ＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０還元酵素なしで、リポソームに、個々に再形成し得、そして、その結果として生じたリポソームを、実施例１１に記載されるように、アガロースでのカプセル化を通して固定化し得る。次いで、各ウェルでのシトクロームＰ４５０活性を、各ウェルに、ＢｚＲｅｓおよびクメン過酸化水素（２００μＭ）、＋／−ケトコナゾールを含む１００μｌの２００ｍＭ  ＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）を添加することにより、実施例１２に記載されるように測定し得る。
【０１０９】
要約すると、本発明者らは、コードされたタンパク質の生物学的活性についてＳＮＰを大量に平行して、ハイスループットスクリーニングするための新規のタンパク質アレイ技術を開発している。その適応性を、野生型ｐ５３の各種の機能の分析およびｐ５３の４６のＳＮＰバージョンの各種の機能の分析、ならびにｐ４５０の対立遺伝子改変体の機能の分析を通じて示した。同一表面検出法およびアッセイ検出法は、現在開発中の他のさらなる種々のアレイに適用し得る。本明細書中で試験している小さいサイズのタンパク質の回収に起因して、本発明者のアレイのスポット密度は、比較的小さく、そして各タンパク質を４重でスポットした。現在、ロボットのスポット能力を用いて、１０，０００タンパク質／アレイ以上を含むスポット密度に増加することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、ｐ５３変異体群の発現を示す。ヒト野生型ｐ５３をコードするプラスミドまたは示された変異体をコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、３０℃で４時間、誘導した。細胞を、リゾチームおよびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の添加により溶解し、清澄な溶解産物をウェスタンブロットによって分析した。Ｈｉｓでタグ化された全長、ビオチン化ｐ５３に相当するバンドは、約７０ｋＤａで電気泳動する。
【図２】図２は、ｐ５３を発現したＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡ結合機能を示すための、ゲルシフトアッセイを示す。野生型ｐ５３（ｗｔ）または示した変異体を含む１μｌの清澄なＥ．ｃｏｌｉ溶解産物を、２５０ｎＭ  ＤＩＧ標識ＤＮＡおよび０．０５ｍｇ／ｍｌ  ポリｄＩ／ｄＣ競争物（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ)ＤＮＡと合わせた。−ｖｅコントロールは、ＤＮＡのみを含んだ。結合ＤＮＡおよび遊離ＤＮＡを６％ゲル（ＮＯＶＥＸ）に通して分離し、正に荷電させた膜（Ｒｏｃｈｅ）に移し、そして抗ＤＩＧ  ＨＲＰ結合抗体（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＤＩＧ標識ＤＮＡを検出した。ＤＮＡ：ｐ５３複合体を矢印で示す。
【図３】図３は、ｐ５３ＤＮＡ結合アッセイに対するマイクロアレイデータを示す。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーでスキャンする前に、溶解産物を、Ａ）に詳細されるようにストレプトアビジン捕捉膜上に、４×４パターンでアレイし、Ｂ）Ｃｙ３標識抗ヒスチジン抗体またはＣ）Ｃｙ３標識ＧＡＤＤ４５  ＤＮＡを用いてプローブした。
【図４】図４は、ｐ５３のＣＫＩＩリン酸化を示す。ｐ５３野生型（ｗｔ）または示した変異体タンパク質を含む２μｌのＥ．ｃｏｌｉ溶解産物を、３０℃で３０分間、ＡＴＰを含む緩衝液中においてカゼインキナーゼＩＩと共にまたはカゼインキナーゼＩＩなしでインキュベートした。反応物をウェスタンブロットし、セリン３９２でのリン酸化をリン酸化特異的抗体を用いて検出した。
【図５】図５は、ＣＫＩＩリン酸化アッセイに対するマイクロアレイデータを示す。ｐ５３アレイを３０℃で１時間、ＣＫＩＩおよびＡＴＰと共にインキュベートし、セリン３９２でのリン酸化に対して分析した。短縮型変異体Ｑ１３６Ｘ、Ｒ１９６Ｘ、Ｒ２０９Ｘ、Ｒ２１３Ｘ、Ｒ３０６Ｘおよびアミノ酸変異体Ｌ３４４ＰならびにＳ３９２Ａを除き、アレイ上の全てのタンパク質に対して、リン酸化を検出した。
【図６】図６は、溶液相ＭＤＭ２相互作用アッセイを示す。溶解産物を含む１０μｌのｐ５３を、合計容量５００μｌにおいて、溶解産物および２０μｌ  抗ＦＬＡＧアガロースを含む１０μｌのＭＤＭ２と共にインキュベートした。室温で１時間インキュベーションした後、抗ＦＬＡＧアガロースを遠心分離によって回収し、広範囲にわたり洗浄し、そしてウェスタンブロッティングによって結合されたタンパク質を分析した。ｐ５３タンパク質をＳｔｒｅｐ／ＨＲＰ結合体によって検出した。
【図７】図７は、ＭＤＭ２相互作用に対するマイクロアレイのデータを示す。ｐ５３アレイを、室温で１時間、精製Ｃｙ３標識ＭＤＭ２タンパク質とともにインキュベーションし、ＤＮＡアレイスキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いて、結合性ＭＤＭ２タンパク質を検出した。ＭＤＭ２タンパク質は、Ｗ２３Ａ変異体およびＷ２３Ｇ変異体とは別の、全てのメンバーのアレイに結合した。
【図８】図８Ａは、複製Ｐ５３マイクロアレイが様々の濃度で、３３Ｐ標識二重鎖ＤＮＡ（ＧＡＤＤ４５プロモーターエレメントの配列に相当する）の存在下において、インキュベートされ、そして、リン酸イメージャーを用いて画像化し、その結果、個々のスポットが定量化され得たことを示す。図８Ｂは、野生型ｐ５３（高い親和性）、Ｒ２７３Ｈ（低い親和性）およびＬ３４４Ｐ（非結合剤）と結合するＤＮＡを示し、野生型は７ｎＭの親和性と予測する。
【図９Ａ】図９Ａは、Ｃ末端ＢＣＣＰヘキサヒスチジン構築物の発現に対するｐＢＪＷ１０２．２のプラスミドマップを示す。
【図９Ｂ−１】図９Ｂは、ｐＢＪＷ１０２．２のＤＮＡ配列を示す。
【図９Ｂ−２】図９Ｂは、ｐＢＪＷ１０２．２のＤＮＡ配列を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、開始コドンからのｐＢＪＷ１０２．２のクローニング部位を示す。ヒトＰ４５０、ＮＡＤＰＨシトクロムＰ４５０還元酵素、ならびにシトクロムｂ５  ＯＲＦ、およびその短縮型を、ＤｒａＩＩＩ／ＳｍａＩで消化したｐＢＪＷ１０２．２ベクターに連結した。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ｐＪＷ４５のベクターマップを示す。
【図１０Ｂ−１】図１０Ｂは、ベクターｐＪＷ４５の配列を示す。
【図１０Ｂ−２】図１０Ｂは、ベクターｐＪＷ４５の配列を示す。
【図１１】図１１Ａは、ヒトＰ４５０  ３Ａ４オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列を示す。図１１Ｂは、全長ヒトＰ４５０  ３Ａ４のアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２Ａは、ヒトＰ４５０  ２Ｃ９オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列を示す。図１２Ｂは、全長ヒトＰ４５０  ２Ｃ９のアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３Ａは、ヒトＰ４５０  ２Ｄ６オープンリーディングフレームのＤＮＡ配列を示す。図１３Ｂは、全長ヒトＰ４５０  ２Ｄ６のアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４は、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製シトクロームＰ４５０  ３Ａ４のウェスタンブロットおよびクマシー染色ゲルを示す。精製シトクロームＰ４５０  ３Ａ４からのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、クマシーを用いてタンパク質を染色したか、またはニトロセルロース膜上にウェスタンブロットし、ストレプトアビジンＨＲＰ結合体を用いてプローブし、そしてＤＡＢ染色を用いて視覚化した：レーン１：全細胞レーン２：溶解産物レーン３：溶解させたＥ．ｃｏｌｉ細胞レーン４：Ｅ．ｃｏｌｉ細胞洗浄液からの上清レーン５：Ｅ．ｃｏｌｉ細胞洗浄液からのペレットレーン６；膜可溶後の上清レーン７：膜可溶後のペレットレーン８：分子量マーカー：１７５、８３、６２、４８、３２、２５、１６．５、６．５Ｋｄａ
【図１５】図１５は、シトクロームＰ４５０  ３Ａ４のＮｉ−ＮＴＡカラム精製のクマシー染色ゲルを示す。カラム精製の全てのステージからのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。レーン１：マーカー１７５、８３、６２、４８、３２、２５、１６．５、６．５Ｋｄａレーン２：膜可溶物からの上清レーン３：カラムフロースルー（Ｆｌｏｗ−Ｔｈｒｏｕｇｈ）レーン４：緩衝液Ｃの洗浄液レーン５：緩衝液Ｄの洗浄液レーン６および７：緩衝液Ｄの洗浄液＋５０ｍＭ  イミダゾールレーン８〜１２：緩衝液Ｄの溶出液＋２００ｍＭ  イミダゾール
【図１６】図１６は、基質ＡＭＭＣを用いた再構築アッセイにおいて、シトクロームＰ４５０  ２Ｄ６に対する活性のアッセイを示す。組換え型のタグ化ＣＹＰ２Ｄ６を、ＮＡＤＰＨ−シトクロームＰ４５０還元酵素を用いたリポソーム中で再構築後に、ＡＭＭＣをターンオーバーする能力により、市販のＣＹＰ２Ｄ６と比較した。
【図１７】図１７は、クメン過酸化水素活性化シトクロームＰ４５０  ３Ａ４による、ＢｚＲｅｓからのレソルフィン（ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ)形成速度を示す。シトクロームＰ４５０  ３Ａ４を、１６０μＭまでの漸増ＢｚＲｅｓ濃度の存在下で、クメン過酸化水素活性化と共に溶液中でアッセイした。
【図１８】図１８は、固定化されたＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ９に対する［３Ｈ］ケトコナゾールの結合平衡を示す。ＣＹＰ３Ａ４の場合において、データポイントは、４つの実験における、平均±標準偏差である。非特異的な結合を、１００μＭ  ケトコナゾールの存在下で決定した（データは示していない）。
【図１９】図１９は、ストレプトアビジン表面上に固定化させたＣＨＰ活性化Ｐ４５０  ３Ａ４による、ＤＢＦの蛍光への変換を包含する、タグ化された固定化Ｐ４５０の化学的な活性化を示す。
【図２０】図２０は、アガロースカプセル化ミクロソームの安定性を示す。シトクロームＰ４５０  ２Ｄ６＋ＮＡＤＰＨシトクロームＰ４５０還元酵素を含むミクロソーム、およびシトクロームｂ５を、アガロースで希釈し、９６ウェルプレートに配置した。ＡＭＭＣターンオーバーを、４℃で、すぐに、２日後、および７日後に計測した。
【図２１】図２１は、シトクロームＰ４５０  ３Ａ４アイソフォームによるＢｚＲｅｓのターンオーバーを示す。シトクロームＰ４５０  ３Ａ４アイソフォームＷＴ、＊１、＊２、＊３、＊４、＊５および＊１５（約１μｇ）を、ＢｚＲｅｓ（０〜１６０μＭ）およびクメン過酸化水素（２００μＭ）存在下で、２００ｍＭ  ＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）中で、室温にてインキュベートした。レソルフィンの形成を経時的に測定し、速度を進行曲線から計測した。従来のミカエリス−メンテン動態に記載する曲線をデータに適合した。
【図２２】図２２は、ケトコナゾールによるシトクロームＰ４５０  ３Ａ４アイソフォームの阻害を示す。シトクロームＰ４５０  ３Ａ４アイソフォームＷＴ、＊１、＊２、＊３、＊４、＊５および＊１５（約１μｇ）を、ＢｚＲｅｓ（５０μＭ）、クメン過酸化水素（２００μＭ）およびケトコナゾール（０、０．００８、０．００４、０．２、１、５μＭ）の存在下において、２００ｍＭ  ＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．４）中で、室温にてインキュベートした。レソルフィンの形成を経時的に測定し、速度を進行曲線から計測した。ＩＣ５０阻害曲線をデータに適合した。
【図１】
2005512055.tif 000017
【図２】
2005512055.tif 000018
【図３Ａ】
2005512055.tif 000019
【図３Ｂ】
2005512055.tif 000020
【図３Ｃ】
2005512055.tif 000021
【図４】
2005512055.tif 000022
【図５】
2005512055.tif 000023
【図６】
2005512055.tif 000024
【図７】
2005512055.tif 000025
【図８】
2005512055.tif 000026
【図９Ａ】
2005512055.tif 000027
【図９Ｂ−１】
2005512055.tif 000028
【図９Ｂ−２】
2005512055.tif 000029
【図９Ｃ】
2005512055.tif 000030
【図１０Ａ】
2005512055.tif 000031
【図１０Ｂ−１】
2005512055.tif 000032
【図１０Ｂ−２】
2005512055.tif 000033
【図１１Ａ】
2005512055.tif 000034
【図１１Ｂ】
2005512055.tif 000035
【図１２Ａ】
2005512055.tif 000036
【図１２Ｂ】
2005512055.tif 000037
【図１３Ａ】
2005512055.tif 000038
【図１３Ｂ】
2005512055.tif 000039
【図１４】
2005512055.tif 000040
【図１５】
2005512055.tif 000041
【図１６】
2005512055.tif 000042
【図１７】
2005512055.tif 000043
【図１８】
2005512055.tif 000044
【図１９】
2005512055.tif 000045
【図２０】
2005512055.tif 000046
【図２１】
2005512055.tif 000047
【図２２】
2005512055.tif 000048
【国際調査報告】
2005512055.tif 000049
2005512055.tif 000050
2005512055.tif 000051
2005512055.tif 000052
2005512055.tif 000053