(57)【要約】改善されたニトロレダクターゼ酵素、特にプロドラッグ転換酵素としての使用のためのニトロレダクターゼ酵素が、提供される。特に、遺伝子治療における使用のためのプロドラッグＣＢ１９５４の活性化について改善された特徴を有する、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼの単一変異体および二重変異体が、開示される。本発明は、プロドラッグ（特に、ＣＢ１９５４）の還元において改善された活性を有するニトロレダクターゼを生成するための努力に基づく。
2005517386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロレダクターゼが、野生型酵素と比較して増加したニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、組換え変異ニトロレダクターゼ。
【請求項２】
前記ニトロレダクターゼが、プロドラッグに対して増加したニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、請求項１に記載のニトロレダクターゼ。
【請求項３】
前記ニトロレダクターゼが、ニトロベンズアミドプロドラッグに対して増加したニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、請求項２に記載のニトロレダクターゼ。
【請求項４】
前記ニトロレダクターゼが、ＣＢ１９５４に対して増加したニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、請求項３に記載のニトロレダクターゼ。
【請求項５】
前記ニトロレダクターゼが、変異したＥ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子によってコードされることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のニトロレダクターゼ。
【請求項６】
前記ニトロレダクターゼが、変異したＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ＮＦＳＢ遺伝子によってコードされることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のニトロレダクターゼ。
【請求項７】
前記ニトロレダクターゼが、変異したＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ＮＦＳＢ遺伝子によってコードされることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のニトロレダクターゼ。
【請求項８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によってコードされる組換え変異ニトロレダクターゼであって、セリン４０、スレオニン４１、チロシン６８、フェニルアラニン７０、アスパラギン７１、グリシン１２０、およびフェニルアラニン１２４からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によってコードされる組換え変異ニトロレダクターゼであって、該ニトロレダクターゼが、アラニン、グリシンおよびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸でのセリン４０の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項１０】
以下：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体であって、セリン４０が、アラニン、グリシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする、変異体；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体であって、セリン４０以外の残基での置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも大きなニトロレダクターゼ活性を有する、改変体、
からなる群より選択されるタンパク質。
【請求項１１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によってコードされる組換え変異体ニトロレダクターゼであって、アスパラギン、グリシン、イソロイシン、ロイシンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸でのスレオニン４１の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項１２】
以下：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体であって、スレオニン４１が、アスパラギン、グリシン、イソロイシン、ロイシンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする、変異体；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体であって、スレオニン４１以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、改変体、
からなる群より選択される、タンパク質。
【請求項１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によってコードされる組換え変異体ニトロレダクターゼであって、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、セリンおよびトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸でのチロシン６８の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項１４】
以下：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体であって、チロシン６８が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、セリン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする、変異体；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体であって、チロシン６８以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、改変体、
からなる群より選択される、タンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載のニトロレダクターゼであって、該ニトロレダクターゼが、チロシン６８のグリシンへの第１の置換（Ｙ６８Ｇ）およびフェニルアラニン１２４のグルタミンへの第２の置換（Ｆ１２４Ｑ）またはトリプトファンへの第２の置換（Ｆ１２４Ｗ）のいずれか１つから選択される置換を含む二重変異体であることを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項１６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によってコードされる組換え変異体ニトロレダクターゼであって、アラニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンからなる群から選択されるアミノ酸でのフェニルアラニン７０の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項１７】
以下：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体であって、フェニルアラニン７０が、アラニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする、変異体；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体であって、フェニルアラニン７０以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、改変体、
からなる群より選択される、タンパク質。
【請求項１８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によってコードされる組換え変異体ニトロレダクターゼであって、アスパラギン酸、グルタミン、およびセリンからなる群から選択されるアミノ酸でのアスパラギン７１の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項１９】
以下：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体であって、アスパラギン７１が、アスパラギン酸、グルタミンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする、変異体；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体であって、アスパラギン７１以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、改変体、
からなる群より選択される、タンパク質。
【請求項２０】
請求項１８に記載のニトロレダクターゼであって、該ニトロレダクターゼが、アスパラギン７１のセリンへの第１の置換（Ｎ７１Ｓ）およびフェニルアラニン１２４のリジンへの第２の置換（Ｆ１２４Ｋ）を含む二重変異体であることを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項２１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によってコードされる組換え変異体ニトロレダクターゼであって、アラニン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸でのグリシン１２０の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項２２】
以下：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体であって、グリシン１２０が、アラニン、セリンおよびスレオニンｌからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする、変異体；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体であって、グリシン１２０以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、改変体、
からなる群より選択される、タンパク質。。
【請求項２３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｆｓＢ遺伝子の変異した等価物によってコードされる組換え変異体ニトロレダクターゼであって、アスパラギン、システイン、グリシン、リジン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸でのフェニルアラニン１２４の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項２４】
以下：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体であって、フェニルアラニン１２４が、アスパラギン、システイン、グリシン、リジン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする、変異体；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体であって、フェニルアラニン１２４以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする、改変体、
からなる群より選択される、タンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２６】
医薬として使用するための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼまたは請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２７】
癌の処置に使用するための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼまたは請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
プロドラッグの細胞傷害性剤への転換に使用するための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼまたは請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２９】
ニトロベンズアミドプロドラッグの細胞傷害性剤への転換に使用するための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼまたは請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３０】
ＣＢ１９５４の細胞傷害性剤への転換に使用するための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼまたは請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３１】
プロドラッグの活性細胞毒性化合物への転換によって癌を処置する医薬の製造のための、請求項１〜２４のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼまたは請求項２５に記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。
【請求項３２】
医薬としての使用のための、変異したＥ．ｃｏｌｉ  ＮｆｓＢ遺伝子によってコードされる組換え変異体ニトロレダクターゼであって、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、セリン、スレオニンまたはバリンからなる群から選択されるアミノ酸でのフェニルアラニン１２４の置換を含むことを特徴とする、ニトロレダクターゼ。
【請求項３３】
以下：
ｉ．組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＮｆｓＢニトロレダクターゼ変異体であって、図９の野生型配列（配列番号１）に対応し、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、セリン、スレオニンまたはバリンからなる群より選択されるアミノ酸でフェニルアラニン１２４が置換されることで特徴付けられる、変異体；
ｉｉ．（ｉ）の改変体であって、フェニルアラニン１２４以外の残基で多くの置換、挿入または欠失を有し、かつ野生型タンパク質のニトロレダクターゼ活性よりも高い活性を有することで特徴付けられる、改変体、
からなる群より選択される、タンパク質。
【請求項３４】
医薬としての使用のための、請求項３２または３３のいずれかに記載のニトロレダクターゼをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３５】
癌の処置において使用するための、請求項３２または３３のいずれかに記載のニトロレダクターゼあるいは請求項３４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３６】
プロドラッグの細胞傷害性剤への転換に使用するための、請求項３２または３３のいずれかに記載のニトロレダクターゼあるいは請求項３４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ニトロベンズアミドプロドラッグの細胞傷害性剤への転換に使用するための、請求項３２または３３のいずれかに記載のニトロレダクターゼあるいは請求項３５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３８】
ＣＢ１９５４の細胞傷害性剤への転換に使用するための、請求項３２または３３のいずれかに記載のニトロレダクターゼあるいは請求項３５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３９】
プロドラッグの活性細胞毒性化合物への転換によって癌を処置する医薬の製造のための、請求項１７または１８のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼあるいは請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチドの使用。
【請求項４０】
プロドラッグの活性細胞毒性化合物への転換によって癌を処置する医薬の製造のためプロセスであって、請求項１〜２４、３２または３３のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼあるいは請求項２５または３４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドの使用によって特徴付けられる、プロセス。
【請求項４１】
請求項１〜２４、３２または３３のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼ、あるいは請求項２５または３４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを、薬学的に受容可能な希釈剤または賦形剤中に含む、薬学的組成物。
【請求項４２】
請求項２５または３４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４３】
コードされたニトロレダクターゼの組織特異的発現を提供することを特徴とする、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
請求項２５または３４のいずれかに記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＴＣＦ反応性エレメントを含むことを特徴とする、請求項４３に記載のベクター。
【請求項４５】
前記ベクターがウイルスであることを特徴とする、請求項４２または請求項４４のいずれかに記載のベクター。
【請求項４６】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスであることを特徴とする、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
請求項４２〜４６のいずれか１項に記載のベクターを調製するための方法。
【請求項４８】
請求項２５または３４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド、あるいは請求項４２〜４６のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４２〜４６のいずれか１項に記載のベクター、あるいは請求項４８に記載の宿主細胞を、薬学的に受容可能な希釈剤または賦形剤中に含む、薬学的組成物。
【請求項５０】
遺伝子治療において使用するための、請求項２５または３４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド、あるいは請求項４２〜４６のいずれか１項に記載のベクター、あるいは請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５１】
改良されたプロドラッグの設計またはそのスクリーニングにおける、請求項１〜２４、３２または３３のいずれか１つに記載のニトロレダクターゼの使用。
【請求項５２】
哺乳動物被験体において癌を処置する方法であって、該方法は、請求項２５または３４のいずれかに記載の単離されたポリヌクレオチド、あるいは請求項４２〜４６のいずれか１項に記載のベクターを投与する工程、コードされるニトロレダクターゼの発現が生じるのに適切な時間放置する工程、および前記発現されたニトロレダクターゼによって活性化され得るプロドラッグを投与する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、変異したニトロレダクターゼ酵素およびこれをコードするＤＮＡ、ならびに癌の処置のためのプロドラックの転換におけるこれらの使用に関する。
【０００２】
癌を処置するための１つのアプローチは、相対的に低い毒性のプロドラッグを、強力な細胞傷害性薬物へと転換し得る酵素をコードする遺伝子を、腫瘍細胞へと導入することである。次いで、このプロドラッグの全身投与は、許容される。なぜならば、これは、プロドラッグ転換酵素を発現する細胞により、腫瘍において、局所的に毒性誘導体へと、単に、転換されるからである。このアプローチは、遺伝子指向型酵素プロドラック治療（ＧＤＥＰＴ）として公知であるか、または、遺伝子が組換えウイルスベクターにより送達される場合、ウイルス指向型プロドラッグ治療（ＶＤＥＰＴ）（ＭｃＮｅｉｓｈら、１９９７）として公知である。
【０００３】
酵素／プロドラッグ系の例は、ニトロレダクターゼおよびアジリジニルプロドラッグＣＢ１９５４（５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド）（Ｋｎｏｘら、１９８８）である。Ｗａｌｋｅｒラット癌腫細胞株は、特に、ＣＢ１９５４に対して感受性であったという観察の後、このことは、ラットニトロレダクターゼＤＴジアフォラーゼの発現に起因していたことが示された。しかし、ＣＢ１９５４は、この酵素のヒト形態についての貧弱な基質であるので、ヒト腫瘍細胞は、ＣＢ１９５４に対する感受性が非常に低い。ＧＤＥＰＴは、適切なニトロレダクターゼ（好ましくは、標的化細胞を感作するために、ＣＢ１９５４に対してより高い活性を有する）を導入する方法として考えられている。ＮＦＳＢ遺伝子（あるいは、ＮＦＮＢ、ＮＦＳＩ、またはＤＰＲＡとして公知）によりコードされる、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉニトロレダクターゼ（Ｅ．Ｃ１．６．９９．７、あるいは、酸素−非感受性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼまたはジヒドロプテリジンレダクターゼとして公知、そして、頻繁に、ＮＴＲと省略される）は、この目的のために広範に用いられている（Ｇｒｏｖｅら、１９９９に総説される）。ＮＦＳＢをコードしたニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）は、２つのフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）コファクター分子を結合するホモダイマーである。電子供与体としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、および還元された中間体として結合ＦＭＮを用いて、ＮＴＲは、ＣＢ１９５４の２つのニトロ基の一方または他方を還元して、高い毒性の４−ヒドロキシルアミン誘導体または相対的に無毒な２−ヒドロキシルアミンのいずれかを与える。細胞内で、５−（アジリジン−１−イル）−４−ヒドロキシアミノ−２−ニトロベンズアミドは、恐らく、さらなる毒性代謝物を介して、非常に遺伝毒性となる（Ｋｎｏｘら、１９９１）。原因となる病巣の正確な性質は、不明であるが、他の因子によりに引き起こされるようではない。著しく高い割合の鎖間架橋が生じ、そして病巣は、十分に修復されないようであり、ＣＢ１９５４が、非常に有効な抗腫瘍剤であるという結果を伴う（Ｆｒｉｅｄｌｏｓら、１９９２）。
【０００４】
ＮＦＳＢ  ＮＴＲの構造は、Ｘ線結晶学により分析されている（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら、２０００、Ｌｏｖｅｒｉｎｇら、２００１）。各モノマーは、４本鎖のβシート（５番目の平行鎖は、他のサブユニットにより寄与される）および１０個のαヘリックス（Ａ−Ｋ）を形成する２１７個のアミノ酸からなり、そして大きな疎水性コア（残基２−９１および１３１−２１７）、コア領域から突出する２つのヘリックスドメイン（ＥおよびＦ、残基９２−１３０）、およびヘリックスＡ、ヘリックスＢ、ヘリックスＧ、ヘリックスＪおよびヘリックスＫの部分により形成される広範なダイマー界面を含む。（注意：ドメイン帰属は、Ｌｏｖｅｒｉｎｇらに由来し、そしてＰａｒｋｉｎｓｏｎらにより解析されたより前の構造とはわずかに異なる）。ヘリックスＧと命名されたＰａｒｋｉｎｓｏｎらの残基（残基１１３−１３１）は、活性部位内または活性部位付近にあると同定されており、そして基質特異性を決定するのに重要である。Ｌｏｖｅｒｉｎｇらは、残基１１０−１３１をへリックスＦ、そして残基１３５−１５７をヘリックスＧと帰属する。しかし、両方の文献は、この領域の残基が、基質結合ポケットおよびコファクター結合ポケットに対する開口部の一部を形成し、そしてフェニルアラニン１２４が特に重要であることで一致する。
【０００５】
ＮＦＳＢ  ＮＴＲは、多数の他の酵素（特に、ＦＲａｓｅ  Ｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ由来のフラビンレダクターゼ酵素）に対する配列相同性を有する（Ｚｅｎｎｏら、１９９６）。ランダム変異誘発により、Ｚｅｎｎｏらは、大いに増大したフラビンレダクターゼ活性を有した多数のｎｆｓｂ変異体を作製した。これらの変異体は、フェニルアラニン１２４（Ｆ１２４）（αＧヘリックス中の重大な位置）の置換を有する。セリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニンおよびヒスチジンとの置換を有するＦ１２４変異体が作製され、これらの全ては、実質的に増大したフラビンレダクターゼ活性を有していた。しかし、１つの例外を除いて、これらの変異体のニトロレダクターゼ活性は、基質としてニトロフラゾンおよびニトロフラントインを用いて判断した場合、大まかに同等であるかまたは実質的に減少されるかのいずれかであった。ヒスチジン変異体（Ｆ１２４Ｈ）は、これらの基質についての野生型の活性のほぼ２倍を有していた。しかし、初めに、これらの開示は、他の基質（例えば、ＣＢ１９５４）に対して、どのような影響があり得るかに関する情報を与えない。第２に、開示されるようなデータは、Ｆ１２４位置の変異体が、せいぜい、ニトロレダクターゼ活性に対して予測不可能な効果を有し、そして、一般的には、有害な効果を有することを示唆する。
【０００６】
国際特許出願公開ＷＯ  ００／４７７２５（Ｍｉｎｔｏｎら）は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢをコードした酵素に構造的に無関係であり、そしてＢａｃｉｌｌｕｓ種に由来する、細菌のニトロレダクターゼを開示する。
【０００７】
ＧＤＥＰＴの目的は、標的細胞中のプロドラッグ（例えば、ＣＢ１９５４）の効率的な転換を獲得して、ＮＴＲ−発現細胞のみならず、首尾よくトランスフェクトまたは形質導入されていないかもしれないバイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）腫瘍細胞もまた殺すことである。従って、ＮＴＲ−コードＤＮＡ、可能な限り高い治療指数を有するプロドラッグ、ならびにＣＢ１９５４および他のニトロベースのプロドラッグの、毒性ＤＮＡ架橋プロドラッグへの転換において、可能な限り効率的であるニトロレダクターゼ酵素の効率的な送達を有することが望ましい。後者を扱うために、改変されたニトロレダクターゼ酵素を開発することが望ましい。なぜならば、これらは、より効率的な治療および／またはプロドラッグの低い全身用量を可能にするからである。プロドラッグは、それらの活性化誘導体と比較して比較的低い毒性であるが、それにもかかわらず、必要とされる用量を最小限にすることにより、有害な効果の機会を減らすことが望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の記載）
本明細書の記載および特許請求の範囲を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」ならびにこれらの語のバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）は、「〜を含むが、これらに限定されない」ことを意味し、そして他の部分、置換物、修飾物、添加物、構成要素、整数または工程を排除することを意図しない（そしてこれらを排除しない）。
【０００９】
「癌」および癌の処置に対する言及は、以下を含むが、これらに限定されない新生物障害、過形成障害または他の増殖性障害の範囲に等しく適用されることが理解される：癌腫、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病および他のリンパ増殖性状態または骨髄増殖性状態；ならびに良性の過形成（例えば、良性の前立腺肥大）。
【００１０】
本発明は、プロドラッグ（特に、ＣＢ１９５４）の還元において改善された活性を有するニトロレダクターゼを生成するための努力に基づく。本発明は、ＮＦＳＢ遺伝子（あるいは、ＮＦＮＢ、ＮＦＳＩ、またはＤＰＲＡとして公知）によりコードされる、Ｅ．ｃｏｌｉニトロレダクターゼ酵素（ＥＣ１．６．９９．７、または酸素非感受性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼまたはジヒドロプテリジンレダクターゼとして公知）の変異体を提供し、この変異体は、ＣＢ１９５４を用いてアッセイした場合、野生型酵素よりも、有意により高いニトロレダクターゼ活性を有する。
【００１１】
これらの変異は体の中でも、以下で点変異を有する酵素が存在する：４０位（Ｓ４０）、特に、アラニン（Ｓ４０Ａ）、グリシン（Ｓ４０Ｇ）およびスレオニン（Ｓ４０Ｔ）へのセリンの置換；４１位（Ｔ４１）、特に、アスパラギン（Ｔ４１Ｎ）、グリシン（Ｔ４１Ｇ）、イソロイシン（Ｔ４１Ｉ）、ロイシン（Ｔ４１Ｌ）およびセリン（Ｔ４１Ｓ）へのスレオニンの置換；６８位（Ｙ６８）、特に、アラニン（Ｙ６８Ａ）、アスパラギン（Ｙ６８Ｎ）、アスパラギン酸（Ｙ６８Ｄ）、システイン（Ｙ６８Ｃ）、グルタミン（Ｙ６８Ｑ）、グリシン（Ｙ６８Ｇ）、ヒスチジン（Ｙ６８Ｈ）、セリン（Ｙ６８Ｓ）、およびトリプトファン（Ｙ６８Ｗ）へのチロシンの置換；７０位（Ｆ７０）、特に、アラニン（Ｆ７０Ａ）、システイン（Ｆ７０Ｃ）、グルタミン（Ｆ７０Ｑ）、グルタミン酸（Ｆ７０Ｅ）、グリシン（Ｆ７０Ｇ）、イソロイシン（Ｆ７０Ｉ）、ロイシン（Ｆ７０Ｌ）、プロリン（Ｆ７０Ｐ）、セリン（Ｆ７０Ｓ）、スレオニン（Ｆ７０Ｔ）、およびバリン（Ｆ７０Ｖ）へのフェニルアラニンの置換；７１位（Ｎ７１）、特に、アスパラギン酸（Ｎ７１Ｄ）、グルタミン（Ｎ７１Ｑ）およびセリン（Ｎ７１Ｓ）へのアスパラギンの置換；１２０位（Ｇ１２０）、特に、アラニン（Ｇ１２０Ａ）、セリン（Ｇ１２０Ｓ）およびスレオニン（Ｇ１２０Ｔ）へのグリシン置換。特に興味深いものは、１２４位を中心とする変異の群である。アラニン（Ｆ１２４Ａ）、アスパラギン（Ｆ１２４Ｎ）、システイン（Ｆ１２４Ｃ）、グルタミン（Ｆ１２４Ｑ）、グリシン（Ｆ１２４Ｇ）、ヒスチジン（Ｆ１２４Ｈ）、イソロイシン（Ｆ１２４Ｉ）、ロイシン（Ｆ１２４Ｌ）、リジン（Ｆ１２４Ｋ）、メチオニン（Ｆ１２４Ｍ）、セリン（Ｆ１２４Ｓ）、スレオニン（Ｆ１２４Ｔ）、トリプトファン（Ｆ１２４Ｗ）、チロシン（Ｆ１２４Ｙ）およびバリン（Ｆ１２４Ｖ）へのフェニルアラニン置換は、全て、野生型よりも、実質的により高いＣＢ１９５４による活性を有する変異体酵素を生じることが示されている。
【００１２】
開示する単変異体に加えて、多数の多重変異した組換えＮＴＲが提供される。チロシン６８（Ｙ６８）およびフェニルアラニン１２４（Ｆ１２４）の二重変異体（特に、トリプトファンへのフェニルアラニン１２４の置換と組合わせたグリシンへのチロシン６８置換（変異体Ｙ６８Ｇ／Ｆ１２４Ｗを与える））は、より高い活性を有することが見出された。リジンへのフェニルアラニン１２４置換と組合わせたセリンへのアスパラギン７１置換を含む二重変異体（変異体Ｎ７１Ｓ／Ｆ１２４Ｋを与える）もまた有益である。このような改良された酵素は、特に、方向付けられた酵素プロドラック治療に有用である。特に、改良されたニトロレダクターゼをコードする配列を含むポリヌクレオチドは、プロモーターおよびこのコードされたニトロレダクターゼを発現するために必要とされるその他の調節エレメントと共に、遺伝子治療に適切なベクターに含まれ得る。このようなベクターは、エピソーム的に複製されることが意図されても、一過性に発現されることが意図されても、標的ゲノムへと統合されることが意図されても、プラスミドベクターであり得る。
【００１３】
コードされる酵素に作動可能に連結された調節要素は、組織特異的発現を促進するエレメント（例えば、殆どまたは全ての組織における転写の活性化を促進する遺伝子座領域（本発明で参考として援用される米国特許第５，７３６，３５９号、またはＥＰ  ０  ３３２６６７を参照のこと）エレメント、例えば、遍在性の染色体解放エレメント（本発明中で参考として援用される、ＷＯ  ００／０５３９３、米国特許出願０９／３５８０８２を参照のこと））であり得る。組織特異的プロモーター、そのエンハンサーまたはＬＣＲ、またはそれらの組み合わせは、作動可能に連結された遺伝子（例えば、特定の組織型の細胞におけるプロドラック変換酵素をコードするもの）の標的化発現を可能にし得る。いくつかの場合では、腫瘍細胞は、例えば、胎児組織および特定の腫瘍型においてのみ発現を可能にするプロモーターを用いて、類似の方法で標的化され得る。このような系の使用は、健康な組織における治療的遺伝子（例えば、プロドラック変換酵素）の発現を防止するのに役立ち、そして有害な副作用を最小限にする。
【００１４】
あるいは、このベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはレトロウイルス（レンチウイルス群のウイルスベクターを含む）であり得る。このようなウイルスは、その天然の指向性を変化させるようにか、または特定の器官型、組織型、または細胞型にそれを標的化するように改変され得る。ＶＤＥＰＴのいくつかの形態では、細胞標的化の特異性は、このような操作に由来する。あるいは、抗体、またはその部分（この場合、手順は、時折、抗体指向型酵素−プロドラッグ治療、またはＡＤＥＰＴとして公知である）のような標的化部分、あるいは細胞表面レセプターに結合し得るいくつかの他の特定のリガンドは、活性な酵素またはこのような酵素をコードするポリヌクレオチドのいずれかを、標的細胞に標的化するために用いられ得る。
【００１５】
ベクターは、患者に対して、全身的（非経口または経腸）、局部的（例えば、隔離した四肢（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｌｉｍｂ）の灌流、または腹膜注入）、または例えば、皮内直接注入、筋肉内直接注入、腹膜直接注入、頭蓋内直接注入または腫瘍内直接注入のように局所的に投与される。
【００１６】
改良されたニトロレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドの投与、そして酵素の発現を生じるために適切な時間の配分の後、適切なプロドラックが、局所（例えば、腫瘍の周り）、局所（例えば、隔離した四肢の灌流、または腹膜注入により）あるいは全身に投与される。原則的には、還元、および、特に、ニトロ基の還元により活性化され得る任意のプロドラッグが適切であり得る。このような化合物としては、ニトロベンズアミド（特に、ニトロベンズアミドアジリジンおよびジニトロベンズアミドアジリジン、ならびにニトロベンズアミドマスタードおよびジニトロベンズアミドマスタード）が挙げられる。特に適切なものは、ジニトロベンズアミドアジリジン５−（アジリジン−１−イル）−２，４−ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）およびジニトロベンズアミドマスタード５−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］−２，４−ジニトロベンズアミド（ＳＮ２３８６２）、ならびにそれらの機能的アナログおよび構造的アナログである。
【００１７】
従って、本発明は、このニトロレダクターゼが、野生型酵素に匹敵する増大したニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする組換え変異体ニトロレダクターゼを提供する。好ましくは、このニトロレダクターゼは、プロドラッグ、より好ましくは、ニトロベンズアミドアジリジンプロドラッグおよびジニトロベンズアミドアジリジンプロドラッグ、ならびにニトロベンズアミドマスタードプロドラッグおよびジニトロベンズアミドマスタードプロドラッグについて、そして、最も好ましくは、ジニトロベンズアミドアジリジンプロドラッグＣＢ１９５４についての増大したニトロレダクターゼ活性を有する。
【００１８】
本発明の１つの局面では、組換え変異体ニトロレダクターゼは、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によりコードされる。あるいは、組換え変異体ニトロレダクターゼは、別の属（例えば、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、または別の種（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＮＦＮＢ遺伝子、またはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ＮＦＮＢ遺伝子由来の構造的に相同な遺伝子）によりコードされる。
【００１９】
全ての場合において、開示される有益な変異が、アミノ酸配列の隣接部位またはより遠い部位でのさらなる変異を除外しないことが理解される。
【００２０】
従って、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によりコードされる組換え変異体ニトロレダクターゼが提供され、これは、セリン４０、スレオニン４１、チロシン６８、フェニルアラニン７０、アスパラギン７１、グリシン１２０、およびフェニルアラニン１２４からなる群より選択される１つ上のアミノ酸の置換を含むことを特徴とする。
【００２１】
第１の好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によりコードされるニトロレダクターゼであり、これは、セリン４０の、アラニン、グリシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸との置換を含むことを特徴とする。
【００２２】
あるいは、このニトロレダクターゼは、以下からなる群より選択されるタンパク質である：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体、これは、セリン４０が、アラニン、グリシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体、これは、セリン４０以外の残基での置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも大きなニトロレダクターゼ活性を有する。
【００２３】
第２の好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢ遺伝子の変異した等価物によりコードされるニトロレダクターゼであり、これは、スレオニン４１の、アスパラギン、グリシン、イソロイシン、ロイシンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸との置換を含むことを特徴とする。
【００２４】
あるいは、このニトロレダクターゼは、以下からなる群より選択されるタンパク質である：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体、これは、スレオニン４１が、アスパラギン、グリシン、イソロイシン、ロイシンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体、これは、スレオニン４１以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする。
【００２５】
第３の好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮｆｓＢの変異した等価物によりコードされるニトロレダクターゼであり、これは、チロシン６８の、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、セリン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸との置換を含むことを特徴とする。
【００２６】
あるいは、ニトロレダクターゼは、以下からなる群より選択されるタンパク質である：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体、これは、チロシン６８が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、セリン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体、これは、チロシン６８以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする。
【００２７】
好ましくは、上記（ｉｉ）に記載されるチロシン６８変異改変体は、フェニルアラニン１２４にも変異を含む二重変異体である。より好ましくは、このチロシン６８およびフェニルアラニン１２４の二重変異体は、チロシン６８のグリシン（Ｙ６８Ｇ）への第１の置換およびグルタミン（Ｆ１２４Ｑ）またはトリプトファン（Ｆ１２４Ｗ）のいずれか１つから選択されるアミノ酸による、フェニルアラニン１２４の第２の置換を含む。
【００２８】
第４の好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢの変異した等価物によりコードされるニトロレダクターゼであり、これは、フェニルアラニン７０の、アラニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸との置換を含むことを特徴とする。
【００２９】
あるいは、ニトロレダクターゼは、以下からなる群より選択されるタンパク質である：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体、これは、フェニルアラニン７０が、アラニン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、スレオニンおよびバリンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体、これは、フェニルアラニン７０以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする。
【００３０】
第５の好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢの変異した等価物によりコードされるニトロレダクターゼであり、これは、アスパラギン７１の、アスパラギン酸、グルタミンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸との置換を含むことを特徴とする。
【００３１】
あるいは、ニトロレダクターゼは、以下からなる群より選択されるタンパク質である：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体、これは、アスパラギン７１が、アスパラギン酸、グルタミンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体、これは、アスパラギン７１以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする。
【００３２】
好ましくは、上記（ｉｉ）に記載されるアスパラギン７１変異改変体は、フェニルアラニン１２４にも変異を含む二重変異体である。より好ましくは、このアスパラギン７１およびフェニルアラニン１２４の二重変異体は、アスパラギン７１のセリン（Ｎ７１Ｓ）への第１の置換、およびフェニルアラニン１２４のリジン（Ｆ１２４Ｋ）への第２の置換を含む。
【００３３】
第６の好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢの変異した等価物によりコードされるニトロレダクターゼであり、これは、グリシン１２０の、アラニン、セリンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸との置換をを含むことを特徴とする。
【００３４】
あるいは、ニトロレダクターゼは、以下からなる群より選択されるタンパク質である：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体、これは、グリシン１２０が、アラニン、セリンおよびスレオニンｌからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体、これは、グリシン１２０以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする。
【００３５】
第７の好ましい実施形態は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢの変異した等価物によりコードされるニトロレダクターゼであり、これは、フェニルアラニン１２４の、アスパラギン、システイン、グリシン、リジン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸との置換を含むことを特徴とする。
【００３６】
あるいは、このニトロレダクターゼは、以下からなる群より選択されるタンパク質である：
ｉ．  図９の野生型配列（配列番号１）に対応する組換えＥ  ｃｏｌｉ  ＮＦＳＢニトロレダクターゼ変異体、これは、フェニルアラニン１２４が、アスパラギン、システイン、グリシン、リジン、メチオニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸により置換されることを特徴とする；
ｉｉ．  （ｉ）の改変体、これは、フェニルアラニン１２４以外の残基の置換、挿入または欠失を有し、そして野生型タンパク質の活性よりも高いニトロレダクターゼ活性を有することを特徴とする。
【００３７】
本発明の別の局面では、上記の変異したニトロレダクターゼのいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００３８】
本発明はまた、医薬として使用するための、上に開示されるような組換えの変異したニトロレダクターゼ、またはそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、この医薬は、（より好ましくは、プロドラッグの活性な細胞傷害性化合物への転換による）癌の処置に用いる医薬であり、そしてさらに好ましくは、活性な細胞傷害性化合物へと転換されるプロドラッグは、ニトロベンズアミドアジリジンまたはニトロベンズアミドマスタードであり、そして最も好ましくは、これはＣＢ１９５４である。
【００３９】
本発明の第８の好ましい実施形態は、変異したＥ．ｃｏｌｉ  ＮｆｓＢ遺伝子によってコードされる組換え変異ニトロレダクターゼであり、これは、医薬としての使用のために、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、セリン、スレオニンまたはバリンからなる群より選択されるアミノ酸でのフェニルアラニン１２４の置換を含有することで特徴付けられる。好ましくは、この医薬は、（より好ましくは、活性な細胞傷害性化合物へのプロドラッグの転換によって）癌または他の増殖性障害の処置に有用であり、そしてさらに好ましくは、活性な細胞傷害性化合物へと転換されるプロドラッグがニトロベンズアミドアジリジンまたはニトロベンズアミドマスタードであり、そして最も好ましくは、この化合物がＣＢ１９５４である。
【００４０】
あるいは、ニトロレダクターゼは、医薬としての使用のための、以下からなる群より選択されるタンパク質である：
ｉ．組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＮｆｓＢニトロレダクターゼ変異体であって、図６の野生型配列に対応し、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、セリン、スレオニンまたはバリンからなる群より選択されるアミノ酸でフェニルアラニン１２４が置換されることで特徴付けられる；
ｉｉ．（ｉ）の改変体であって、これらが、フェニルアラニン１２４以外の残基で多くの置換、挿入または欠失を有し、かつ野生型タンパク質のニトロレダクターゼ活性よりも高い活性を有することで特徴付けられる。好ましくは、この医薬は、（より好ましくは、活性な細胞傷害性化合物へのプロドラッグの転換によって）癌の処置に有用であり、そしてさらに好ましくは、活性な細胞傷害性化合物へと転換されるプロドラッグがニトロベンズアミドアジリジンまたはニトロベンズアミドマスタードであり、そして最も好ましくは、この化合物がＣＢ１９５４である。
【００４１】
別の局面において、医薬製造のための、上記の組換え変異ニトロレダクターゼおよびこれらをコードするポリヌクレオチドにいずれかの使用が、開示される。好ましくは、この医薬は酵素プロドラッグ治療のためである。この医薬は、裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡ、ＤＮＡ−ペプチド、ＤＮＡ−脂質もしくはＤＮＡ−ポリマーの結合体もしくは複合体、またはウイスルベクターの形態を取り得、適切な細胞への投与または形質転換の後に、その細胞内でこのニトロレダクターゼの効率的な組織特異的発現を可能とするように配置された、エンハンサーおよびＬＣＲのようなさらなるエレメントを有するかまたはこれを有さないプロモーターに作動可能に連結された、変異組換えニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。あるいは、この医薬は、標的化部分（例えば、抗体もしくはそのフラグメント）を含む、このようなＤＮＡ−ペプチド、ＤＮＡ−脂質もしくはＤＮＡ−ポリマーの結合体もしくは複合体、またはウイスルベクターを含み得るか、または適切な細胞型への効率的な標的化を可能とするような、適切な細胞表面レセプターもしくは他の構造物に特異的に結合可能な、ペプチドもしくは炭水化物リガンドを、含み得る。
【００４２】
また、上記に開示した組換え変異ニトロレダクターゼ、およびこれらをコードするポリヌクレオチドのいずれかの使用で特徴付けられる医薬を製造するためのプロセスが提供される。
【００４３】
別の実施形態において、上記に開示した組換え変異ニトロレダクターゼまたはこれらをコードするポリヌクレオチド、または受容可能な希釈剤または賦形剤中にこのようなポリヌクレオチドを含むウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターのいずれかを含む薬学的組成物が提供される。
【００４４】
本発明の別の実施形態において、上記に開示された組換え変異ニトロレダクターゼの１つ以上をコードする、単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。以下に詳述されるように、これらのベクターは複製的でも複製的でなくても良く、エピソーム型であっても組み込み型であっても良く、そして原核生物細胞中での使用のために設計されても真核生物細胞中での使用のために設計されてもよい。これらは、コードされるニトロレダクターゼの、遍在的な発現または組織特異的な発現を提供する発現ベクターであり得、このニトロレダクターゼは、適切なプロモーターおよび適切な発現のために必要とされる他のエレメント（例えば、ＬＣＲおよびＵＣＯＥ）に作動可能に連結され得る。より好ましい実施形態において、このベクターは、ニトロレダクターゼの組織特異的な発現を提供する。さらに好ましくは、このニトロレダクターゼは、腫瘍中で優先的に発現される。最も好ましくは、このベクターは、ニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＴＣＦ応答エレメントを含む。
【００４５】
さらに好ましい実施形態において、このベクターはウイルスであり、そして最も好ましくは、これはアデノウイルスである。ニトロレダクターゼ遺伝子に作動可能に連結された、ＴＣＦ応答性腫瘍選択的プロモーターエレメントを含むアデノウイルスベクターの使用は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０１／００８５６に記載されており、この全体が本明細書中で参考として援用される。ＧＢ０１／００８５６のコピーが、本出願と共に提出されており、そしてその内容は本出願中に包含されるが、このコピーは本出願の公開された明細書中には含まれない。
【００４６】
ベクターは、細胞にＤＮＡを輸送し得る任意のベクターであり得る。好ましくは、このベクターは組み込み型ベクターまたはエピソーム型ベクターである。
【００４７】
好ましい組み込み型ベクターとしては、組換えレトロウイルスベクターが挙げられる。組換えレトロウイルスベクターは、標的細胞に感染し得る少なくとも一部のレトロウイルスゲノムのＤＮＡを含む。用語「感染」とは、ウイルスがその宿主または標的細胞に遺伝子物質を輸送するプロセスを意味するために使用される。好ましくは、本発明のベクターの構築物において使用されるレトロウイルスは、また、標的細胞のウイルス複製作用を除去するように複製欠損性にされる。このような場合、この複製欠損性ウイルスゲノムは、従来の技術に従ってヘルパーウイルスによってパッケージされ得る。一般的に、上記の感染性の判定基準および機能性の遺伝子輸送の可能性を満たす任意のウイルスが、本発明の実施において使用され得る。
【００４８】
適切なレトロウイルスベクターとしては、当業者に周知である、ｐＬＪ、ｐＺｉｐ、ｐＷｅおよびｐＥＭが挙げられるが、これらに限定されない。複製欠損性レトロウイルスに適切なパッケージウイルス株としては、例えば、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。
【００４９】
本発明において有用な他のベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＨＳＶベクターおよびポックスウイルスベクターが挙げられる。好ましいベクターは、アデノウイルスである。アデノウイルスベクターは、当業者に周知であり、そして気道上皮細胞、骨格筋、肝臓、脳および皮膚を含む、多くの細胞型に遺伝子を送達するために使用されている（Ｈｉｔｔ，ＭＭ，Ａｄｄｉｓｏｎ  ＣＬおよびＧｒａｈａｍ，ＦＬ（１９９７）Ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４０：１３７−２０６；ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎ  ＷＦ（１９９８）Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔｕｒｅ，３９２：（６６７９追補）：２５−３０）。
【００５０】
さらに好ましいベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、当業者に周知であり、そして遺伝子治療の適用のために、ヒトＴリンパ球、線維芽細胞、鼻ポリープ、骨格筋、脳、赤血球および血球系幹細胞に安定に移入するために使用されている（Ｐｈｉｌｌｉｐら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，２４１１−２４１８；Ｒｕｓｓｅｌｌら，１９９４，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９１、８９１５−８９１９；Ｆｌｏｔｔｅら，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７；Ｗａｌｓｈら，１９９４、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９，７２５７−７２６１；Ｍｉｌｌｅｒら，１９９４、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９１，１０１８３−１０１８７；Ｅｍｅｒｓｏｎ，１９９６１Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２−３０８８）。国際特許出願ＷＯ９１／１８０８８は、特定のＡＡＶベースのベクターを記載する。
【００５１】
好ましいエピソーム型ベクターとしては、一過性の非複製型エピソーム型ベクターおよびＥＢＶ、ヒトパポバウイルス（ＢＫ）およびＢＰＶ−１由来のレプリコンのようなウイルス起源のレプリコンに由来する機能を有する自己複製型のエピソーム型ベクターが、挙げられる。このような組込み型ベクターおよびエピソーム型ベクターは、当業者に周知であり、そして当業者に周知の文献の本文中に詳細に記載されている。特に、適切なエピソーム型ベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載されている。
【００５２】
哺乳動物人工染色体もまた、本発明のベクターとして使用され得る。哺乳動物人工染色体の使用は、Ｃａｌｏｓ（１９９６、ＴＩＧ，１２，４６３−４６６）によって考察されている。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明のベクターはプラスミドである。このプラスミドは、非複製型非組込み型のプラスミドであり得る。
【００５４】
用語「プラスミド」とは、本明細書中で使用される場合、発現可能な遺伝子をコードする任意の核酸をいい、そして直鎖状核酸または環状核酸、および二重鎖核酸または単鎖核酸を含む。この核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして修飾されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得、そしてメチル化または保護基もしくはキャップ構造もしくは尾部（ｔａｉｌ）構造の封入のような手段によって、化学修飾され得る。
【００５５】
非複製型非組込み型のプラスミドは、宿主細胞中にトランスフェクトされた場合に複製せず、そして宿主細胞のゲノム中に特異的に組み込まれない（すなわち、高頻度で組み込まれず、そして特定の部位に組み込まれない）。
【００５６】
複製型プラスミドは、Ｕｓｔａｖら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０、４４９−４５７、１９９１の標準的な複製アッセイを含む、標準的なアッセイを使用して同定され得る。
【００５７】
本発明はまた、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。この宿主細胞は、任意の哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、この宿主細胞はげっ歯類細胞または哺乳動物細胞である。最も好ましくは、これはヒト細胞である。
【００５８】
本明細書中に記載されるベクターを細胞に送達するために、以下の使用を含む多くの技術が公知であり、そして本発明に有用である（核酸濃縮剤、エレクトロポレーション、アスベストとの複合体化、ポリブレン、ＤＥＡＥセルロース、デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ）、リポソーム、カチオン性リポソーム、リポポリアミン、ポリオルニチン、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）および直接的マイクロインジェクション（ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＳｋｏｕｌｔｃｈｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：３４９−３７９（１９８４）；Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：５２７（１９９０）により概説される）。
【００５９】
本発明のベクターは、ウイルス性送達手段または非ウイルス性送達手段を介して、非特異的または特異的に宿主細胞（すなわち、指定された部分集合の宿主細胞）に送達され得る。ウイルス起源の好ましい送達方法としては、本発明のベクターのためのトランスフェクションのレシピエントとして、ウイルス粒子を産生するパッケージ細胞株が挙げられ、この細胞株中にウイルスをパッケージするシグナルが操作されている（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびパポバウイルス（ｐａｐｏｖａｖｉｒｕｓ）のパッケージ細胞株）。好ましい非ウイルスベースの遺伝子送達手段および遺伝子送達方法はまた、本発明において使用され得、そしてこれらとしては、裸のＤＮＡの直接のインジェクション、核酸濃縮性のペプチドおよび非ペプチド、カチオン性リポソームおよびリポソーム内カプセル化が挙げられる。
【００６０】
組織へのベクターの直接の送達が記載されており、そしていくらかの短期間の遺伝子発現が達成されている。筋肉へのベクターの直接送達（Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，１９９０）、胸腺へのベクターの直接送達（Ｓｙｋｅｓら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５，８３７−８４４，１９９４）、黒色腫へのベクターの直接送達（Ｖｉｌｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，９６２−９６７，１９９３）、皮膚へのベクターの直接送達（Ｈｅｎｇｇｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ，１０，１６１−１６６，１９９５）、肝臓へのベクターの直接送達（Ｈｉｃｋｍａｎら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５，１４７７−１４８３，１９９４）、および気道への曝露後のベクターの直接送達（Ｍｅｙｅｒら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２，４５０−４６０，１９９５）が、従来技術において、明確に記載されている。
【００６１】
ウイルスエンベロープタンパク質のアミノ酸配列由来の種々のペプチドは、ポリリジンＤＮＡ複合体と同時投与される場合の遺伝子輸送において使用された（Ｐｌａｎｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２９１８−１２９２４（１９９４））。Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：３２３−３２７（１９９２）；ＷＯ９１／１７７７３；ＷＯ９２／１９２８７；およびＭａｃｋら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３０７：１３８−１４３（１９９４）は、カチオン性脂質とのポリリジン結合体の同時濃縮が、遺伝子送達効率を向上させ得ることを示唆している。国際特許出願公開ＷＯ９５／０２６９８は、カチオン脂質遺伝子送達の効率を増加することを図るための、ウイルス成分の使用を開示する。
【００６２】
本発明において有用な核酸濃縮剤としては、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、カチオン性ペプチド、カチオン性非ペプチド（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）およびポリリジン）が挙げられる。「スペルミン誘導体」とは、スペルミンのアナログおよび誘導体をいい、そして国際特許出願ＷＯ９３／１８７５９（１９９３年９月３０日公開）に記載されるような化合物を含む。
【００６３】
ジスルフィド結合は、送達ビヒクルのペプチド成分を連結するために使用された（Ｃｏｔｔｅｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９２））；Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら（前出）もまた参照のこと。
【００６４】
ＤＮＡ構築物の細胞への送達のための送達ビヒクルは、当該分野で公知であり、そして例えば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；および米国特許第５，１６６，３２０号に記載されるような、細胞表面レセプターに特異的であるＤＮＡ／ポリカチオン複合体を含む。
【００６５】
本発明に従うベクターの送達は、核酸濃縮性ペプチドを使用して企図される。ベクターを濃縮し、そして細胞にベクターを送達するのに特に有用である核酸濃縮性ペプチドは、国際特許出願公開ＷＯ９６／４１６０６に記載されている。ＷＯ９６／４１６０６に記載されるように、官能基は、本発明に従うベクターの送達に有用なペプチドに結合される。これらの官能基は、特定の細胞型を標的化するリガンド（例えば、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアロ糖タンパク質または糖）を含み得る。従って、このリガンドは、非特異的な様式でか、または細胞型で限定される特異的な様式で、細胞を標的化し得る。
【００６６】
これらの官能基はまた、脂質（例えば、パルミトイル、オレイル、ステアロイル）；天然の親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））；融合誘導（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ペプチド（例えば、インフルエンザウイルスのＨＡペプチド）；またはリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含み得る。この官能基はまた、細胞内輸送タンパク質（例えば、核移行配列（ＮＬＳ）、エンドソーム脱出シグナル（例えば、膜崩壊性ペプチド）または直接的に細胞質にタンパク質を指向するシグナルを、含み得る。
【００６７】
また、本発明の組換え変異ニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、またはこのようなポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞が提供される。このようは宿主細胞は、細菌細胞または真核生物細胞であり得、細菌細胞を使用して、前記ベクターを増幅、製造、スクリーニングおよび試験し、そして真核生物細胞（好ましくは哺乳動物細胞であり、そして最も好ましくはヒト細胞）において、コードされるニトロレダクターゼが発現される。
【００６８】
本発明の別の局面において、本発明のニトロレダクターゼをコードする単離されたポリヌクレオチド、またはこのようなポリヌクレオチドを含むベクター、または遺伝子治療における使用のための、前記のポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む宿主細胞が、提供される。好ましくは、このような遺伝子治療は、癌を処置する際に有用である。
【００６９】
本発明の別の局面において、改良されたプロドラッグの設計を支援するため、またはこれについてスクリーニングするための組換えニトロレダクターゼの使用が、提供される。このような使用は、前記ニトロレダクターゼを候補プロドラッグと接触させる工程、および還元された生成物への転換の動態を化学的に測定する工程を包含する。あるいは、開示された組換え変異ニトロレダクターゼが候補プロドラッグを細胞傷害性生成物に変換する能力が、様々な濃度の前記プロドラッグの存在下での細菌宿主細胞の増殖を阻害することによってか、または様々な濃度の前記プロドラッグの存在下で培養した真核生物細胞の殺傷によってアッセイされる、インビトロアッセイが使用され得る。このことは、例えば、組換え変異ニトロレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを投与し、発現が生じるのに適切な時間放置し、次いで種々の用量の候補プロドラッグを投与することによる、実験動物における腫瘍殺傷のインビボアッセイによって、さらに試験され得る。種々の変異体ニトロレダクターゼおよび野生型ニトロレダクターゼを使用した結果の比較によって、向上した効率および治療指標をもたらす、変異体ニトロレダクターゼと新規プロドラッグとの最適な組み合せを、同定し得る。
【００７０】
また、哺乳動物被験体において癌を処置する方法が提供され、この方法は、上記の単離されたポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを投与する工程、コードされるニトロレダクターゼの発現が生じるのに適切な時間放置する工程、および前記発現されたニトロレダクターゼによって活性化され得るプロドラッグを投与する工程を、包含する。
【実施例】
【００７１】
（発明の詳細な説明）
（実施例１  増加したＣＢ１９５４の変換活性に伴うＮＴＲ変異体の作製）
（方法）
（変異誘発）
テンプレートとしてプラスミドｐＪＧ１２Ｂ１を使用するＰＣＲ（図１参照）によって、種々の位置でＮＴＲ配列中に変異を導入した。これは、ｔａｃプロモーターの下流のＳｆｉＩクローニング部位に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α  ＮＴＲを含む、ｐＵＣ１９由来のプラスミドである。
【００７２】
表１を参照して、４０位での変異誘発について、プライマー２はＪＧ１２６Ｂ（配列番号６）であり、そしてプライマー３はＪＧ１２６Ａ（配列番号５）であった；４１位では、プライマー２はＪＧ１２６Ｃ（配列番号７）であり、そしてプライマー３はＪＧ１２６Ａ（配列番号５）であった；６８位では、プライマー２はＪＧ１２７Ｂ（配列番号９）であり、そしてプライマー３はＪＧ１２７Ａ（配列番号８）であった；７１位では、プライマー２はＪＧ１２７Ｃ（配列番号１０）であり、そしてプライマー３はＪＧ１２７Ａ（配列番号８）であった；１２０位では、プライマー２はＪＧ１２８Ｂ（配列番号１２）であり、そしてプライマー３はＪＧ１２８Ａ（配列番号１１）であった；１２４位では、プライマー２はＪＧ１２８Ｃ（配列番号１３）であり、そしてプライマー３はＪＧ１２８Ａ（配列番号１１）であった。プライマー１は、ＪＧ１４Ａ（配列番号２）に対する５’プライマーであり、そして３’プライマーであるプライマー４は、Ｍ１３逆方向配列決定プライマーのＰＳ１１０７ｒｅｖ（配列番号３）であった（表１）。
【００７３】
９４℃で５分の変性後、ＰＣＲを９４℃／４５秒、５５℃／５０秒、７２℃／９０秒を２５サイクル間、その後７２℃／７分間であった。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを製造業者（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＴＭ）の推奨に従って使用し、さらなる変異を最小限に抑えた。プライマー１およびプライマー２を使用したＰＣＲ産物、ならびにプライマー３およびプライマー４を使用したＰＣＲ産物を、ゲルで精製して過剰なプライマーを除去し、そして各々の５ｎｇを、プライマー１およびプライマー２を用いるＰＣＲのテンプレートとして使用して、全長のＮＴＲ遺伝子を再構築した。
【００７４】
（表１  ＮＴＲ変異誘発ＰＣＲプライマー）
【００７５】
【表１】
2005517386.tif 000003
λＪＧ３Ｊ１を、ｐＡＣＹＣ１７７由来のカナマイシン耐性遺伝子をＥｃｏＲＩへ、そしてｐＰＳ１１３３Ｌ１０（最終的にｐＤＲ５４０［Ｐｈａｒｍａｃｉａ］に由来する）由来のｐｔａｃプロモーターをＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローニングすることによってλＮＭ１１４１（図２）から作製した。最終的なＰＣＲ産物を、ＳｆｉＩで消化し、主要な中央のフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント内の２つの適合するＳｆｉＩ部位の間（ｔａｃプロモーターの下流）に挿入した。
【００７６】
ライゲーション混合物を、ＵＴ５６００細胞（ＵＴＲ−）に感染させるために使用されるλバクテリオファージ粒子中にパッケージングした（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。コントロールとして、野生型ＮＴＲもまた、このベクター（ＪＧ１６Ｃ２）へクローニングした。カナマイシン耐性リソゲンを、寒天プレート（３０μｇ／μｌカナマイシン）上で選択し、次いで９６ウェルプレートのウェルにおいて、ＬＢ＋カナマイシン中で一晩個々に増殖させた。これらのクローンを、カナマイシン、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）および０μＭ、２５μＭ、３５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、または４００μＭの濃度のＣＢ１９５４を含むＴｒｉｓ緩衝化（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）ＬＢ寒天を含む一連のプレートに複製プレーティングした（図３を参照のこと）。このプレートを、表２に示されるようにスコアした。その結果を図４および図５に示す。
【００７７】
（表２）
【００７８】
【表２】
2005517386.tif 000004
スコア＞４のクローンからのＤＮＡを、プライマーＪＧ１４ＡおよびＪＧ２Ｂ（表１）を用いたＰＣＲによって増幅し、変異の存在を決定するために配列決定した（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット）。第１スクリーニングからのデータの例を、図４に示し、そしてその結果を図５に要約する。見込みのあるクローンを、それらのＩＣ５０の分析のために選択し、そしてその結果を以下の表３に要約する。
【００７９】
（変異の組合せ）
２つの機能獲得変異を含むＮＴＲクローンを作製するために、図１に示すＰＣＲ方法を、第１ラウンドの変異誘発について使用した。Ｎ７１Ｓ  Ｆ１２４Ｋ変異体を作製するために、１μｌのファージλＪＧ１３１Ｈ４８１ストックをテンプレートとして使用し、プライマー１は、ＪＧ１４Ａ（配列番号２）であり、そしてプライマー２は、ＰＳ１０１３Ａ（配列番号１４）であった（表１）。λＪＧ１３１Ｉ３９９をテンプレートとして使用し、プライマー３は、ＪＧ１２７Ａ（配列番号８）であり、そしてプライマー４は、ＪＧ２Ｂ（配列番号４）であった。次いで、得られた産物を、プライマーＪＧ１４Ａ（配列番号２）およびＪＧ２Ｂ（配列番号４）のためのテンプレートとして使用し、ＳｆｉＩフラグメントとしてλＪＧ３Ｊ１にクローニングするための二重変異型ＮＴＲ配列を作製し、λＪＧ１３９ＣＢ１を得た。同様に、Ｙ６５８Ｇ  Ｆ１２４Ｑ二重変異体を構築するために、プライマーＪＧ１４Ａ（配列番号２）およびＰＳ１０１３Ａ（配列番号１４）を使用してλＪＧ１３１Ｃ１９を増幅し、そしてプライマーＪＧ１２７Ａ（配列番８）およびＪＧ２Ｂ（配列番４）を使用してλＪＧ１３１Ｉ８３を増幅し、続いてこれらの産物を、プライマーＪＧ１４Ａ（配列番号２）およびＪＧ２Ｂ（配列番号４）を用いてＰＣＲ増幅してλＪＧ１３９ＤＣ１を得た。Ｙ６８Ｇ  Ｆ１２４Ｗ二重変異体を、プライマーＪＧ１４Ａ（配列番号２）およびＰＳ１０１３Ａ（配列番号１４）を用いてλＪＧ１３１Ｃ１９４を増幅し、そしてプライマーＪＧ１２７Ａ（配列番号８）およびＪＧ２Ｂ（配列番号４）を用いてλＪＧ１３１Ｉ５０５を増幅し、続いてプライマーＪＧ２Ｂ（配列番号４）およびＪＧ１４Ａ（配列番号２）を用いた増幅のためのテンプレートとしてこれらの産物を使用してＰＣＲすることによって構築し、λＪＧ１３９ＥＣ１２を得た。
【００８０】
（生存曲線データ）
主観性のより低い手段で、これらのクローンにおけるＮＴＲ活性の改善を定量するために、いくつかのクローンを、それらの生存曲線を決定することにより、さらなる研究のために選択した。リソゲンを、ＬＢ＋カナマイシンにおいて、一晩増殖させ、そしてＯＤに基づいて１μｌあたり約１細胞にまで希釈した。１００μｌの希釈した細胞を、カナマイシン、ＩＰＴＧおよび０〜４００μＭのＣＢ１９５４を含むＴｒｉｓ緩衝化ＬＢプレートに二連でプレーティングした。３６時間の増殖後、各プレートのコロニーの数を計数し、そしてＣＢ１９５４を含まないプレート上に存在する数のパーセントとして表した。ＣＢ１９５４の濃度に対する生存％を示す生存曲線をプロットし（図７中の例を参照のこと）、そしてＩＣ５０を、死滅によりコロニー数における５０％の減少を生じるＣＢ１９５４の濃度として決定した（表３および図８）。ＣＢ１９５４に対する増強された感受性を生じる変異を含むいくつかのコロニーを、さらなる研究のために選択した。
【００８１】
（結果）
（酵素活性アッセイ）
第一スクリーニングは、野生型のベースラインレベルよりも増大した、ＣＢ１９５４に対する感受性を示すクローンが、限定数の位置（図４に示すように、特に４０、４１、６８、７０、７１、１２０および１２４）に集積する変異を有することを示した。これらのうちで、Ｐｈｅ１２４の置換は、機能獲得変異体の最も共通した部位である。図５は、同定された機能獲得変異体についての平均スコアを要約する。最高の活性の変異体は、全て１２４位であった。図６は、変異の部位に関連する活性の変化（上昇および低下の両方）を分析する。機能喪失変異体は、６８位、７０位、７１位、および１２０位において最も共通であるが、幾分有意に改善されたいくつかのクローンがまた、特に７０位および７１位において見られた。１２４位では、機能獲得変異体が、より一般的であった。
【００８２】
（ＩＣ５０アッセイ）
図７は、ＣＢ１９５４濃度プロットに対する生存の例を示し、そしてそれらのデータを、表３および図８に要約する。このデータは、酵素活性結果と大まかに一致し、多くの変異体が、両方のアッセイにおいて高いスコアを得る。これらの結果に基づいて、多くのクローンを、さらなる研究のために選択し、そしてＧＤＥＰＴのような適用について、野生型酵素よりも多くの利益を提供するとして同定した。Ｔ４１Ｌ、Ｙ６８Ｇ、Ｎ７１Ｓ、Ｆ１２４Ａ、Ｆ１２４Ｇ、Ｆ１２４Ｎ、Ｆ１２４Ｃ、Ｆ１２４Ｈ、Ｆ１２４Ｌ、Ｆ１２４Ｋ、Ｆ１２４Ｍ、Ｆ１２４Ｓ、Ｆ１２４Ｑ、Ｆ１２４Ｔ、Ｆ１２４ＶおよびＦ１２４Ｗが、これらに含まれた。さらに、より穏やかな改善を生じるが、共通性の低い部位での変異（おそらく異なる様式の作用を意味する）（例えば、Ｓ４０およびＦ７０での変異）が強調された。
【００８３】
（二重変異体）
二重変異体Ｎ７１Ｓ／Ｆ１２４Ｋの活性は、特に顕著であり、Ｙ６８Ｇ／Ｆ１２４Ｗもまた、野生型よりも有意な機能獲得を有した。Ｎ７１Ｓ／Ｆ１２４Ｋは、いずれの変異単独と比較しても減少したＩＣ５０によって測定されるように、増大した酵素活性を示す。このことは、第１ラウンドのスクリーニングにおいて同定された変異が、相加的な効果を有し得ることを示す。しかし、Ｙ６８Ｇ／Ｆ１２４Ｑ変異体は、野生型酵素の活性と同様の活性を有するいずれの変異単独と比較しても減少した酵素活性を有する。このことは、２つの単一の機能獲得変異を組み合わせることはまた、互いを無効にし、野生型レベルの酵素活性のみを生じ得ることを示唆する。第３の二重変異体Ｙ６８Ｇ／Ｆ１２４Ｗは、より良好な単一変異単独のＩＣ５０と同等のＩＣ５０を有した。従って、このことは、変異の組合せがまた中立的効果を有し得ることを示す。
【００８４】
（表３）
【００８５】
【表３】
2005517386.tif 000005
（実施例２：ＮＴＲ変異体Ｆ１２４ＮおよびＦ１２４Ｋ／Ｎ７１Ｓのアデノウイルス媒介性発現は、ＷＴ酵素の発現よりも高い程度まで癌細胞をＣＢ１９５４に対して感作する）
この研究を開始するにあたり、細菌スクリーニング系を使用して同定されたＥ．ｃｏｌｉ  ＮＴＲ酵素の改善されたバージョンがまた、ヒト癌細胞においてＷＴ酵素よりも、「より効率的」にＣＢ１９５４を活性化する（そのようにして、腫瘍内ＣＢ１９５４濃度を減少させ、および／または、細胞を殺傷するために十分な活性化プロドラッグを生成するために必要とされる、薬物への腫瘍細胞の曝露時間を減少させる）という仮説を立てた。
【００８６】
本実施例において、本発明者らは、ＷＴ  ＮＴＲおよび細菌スクリーニングにおいて同定された２つの変異体酵素（Ｆ１２４ＮおよびＦ１２４Ｋ／Ｎ７１Ｓ）が、ヒト癌細胞株（ＨｅＬａ）をＣＢ１９５４に対して感作する効率を比較する実験を記載する。
【００８７】
（方法）
（ウイルスの構築）
ＨｅＬａ細胞におけるＮＴＲ発現を、組換えアデノウイルス媒介性遺伝子転移によって達成した。変異体酵素を発現するＥ１欠損アデノウイルスを、個々のコード変化を除いて、ＷＴ発現ウイルス「ＣＴＬ１０２」（Ｄｊｅｈａら  ２０００）と同一であるように設計した。Ｆ１２４Ｎコード配列および５’隣接配列を、順方向プライマーＪＧ１３８Ａ（５’−ＧＣＡＣＧＣＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＣＧＣＣ−３’）（配列番号１６）および逆方向プライマーＪＧ１３８Ｂ（５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＡＣＡＣＴＴＣＧＧＴＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧ−３’）（配列番号１７）を使用して、個々のλファージからＰＣＲ増幅した。生成物をＮｈｅＩで切断し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｂａＩ部位にクローン化した。Ｆ１２４Ｎを含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、得られたプラスミドから切り出し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで消化されたｐＴＸ０３７４（Ｄｊｅｈａら）中にクローン化した。次いで、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含むＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、得られたベクター中にクローン化した。Ｆ１２４Ｎ中に存在するＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＡＡＧＣＴＴ．ＣＣＡ．ＣＣＡＴＧｇ）（配列番号１８）は、ＷＴ  ＮＴＲ発現ウイルスにおいて存在するＫｏｚａｋコンセンサス配列（ＡＡＧＣＴＴ．ＧＣＣ．ＧＣＣ．ＡＧＣＣＡＴＧｇ）（配列番号１９）とは異なった。従って、これをＮｃｏＩ消化によって取り除き、そしてｐＴＸ０３７４（ＣＴＬ１０２を構築するために使用された野生型ＮＴＲを含むプラスミド）由来の等価なＮｃｏＩフラグメントにより置換した。次いで、ＣＭＶ．Ｆ１２４Ｎフラグメントを、ＳｍａＩおよびＮｈｅＩを使用して切り出し、平滑末端化し、そしてＰｍｅＩ消化ベクターｐＴＸ０３９８（Ｄｊｅｈａら（２０００）に記載された転移ベクターｐＰＳ１１２８であるが、ＰｍｅＩ部位を含む）中にクローン化した。（ｉ）ＮＴＲコード配列の始まりに独特なＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入され、かつ（ｉｉ）ＣＴＬ１０２  Ｋｏｚａｋ配列を組み込まれた、プライマーＳＣ１（５’−ＡＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＣＧＣＣＴＴＡＡＡＧＣＧ−３’）（配列番号２０）およびＳＣ２（５’−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＣＴＴＣＧＧＴＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＣ−３’）（配列番号２１）を使用して、個々のλファージからＦ１２４Ｋ／Ｎ７１Ｓコード配列および５’隣接配列をＰＣＲ増幅した。ＢａｍＨＩ部位をＮＴＲの３’末端に導入して、Ｆ１２４Ｋ／Ｎ７１Ｓが、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで切断されたｐＴＸ０３７４中にクローン化されることを可能にした。次いで、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーを含むＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、このベクター中にクローン化した。次いで、ＣＭＶ．Ｆ１２４ＫＮ７１Ｓフラグメントを、ＳｐｅＩを使用して切り出し、そしてＳｐｅＩで消化されたｐＰＳ１１２８中にクローン化した。ＮＴＲ  Ｆ１２４Ｎ（「ＣＴＬ８０２」）およびＦ１２４Ｋ／Ｎ７１Ｓ（「ＣＴＬ８０５」）をそれぞれ発現する組換えアデノウイルスを、ＰｅｒＣ６細胞において相同組換えによってレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）し、そして精製ストックを調製し、そしてＣＴＬ１０２（Ｄｊｅｈａら  ２０００）について記載されたように、力価決定した。
【００８８】
（ＣＢ１９５４感作実験）
ＣＢ１９５４に対するＨｅＬａ細胞の感作を、以下のプロトコールを使用してアッセイした。細胞を、マイクロタイタープレートにプレーティング（１０４細胞／ウェル）する前に、一定範囲のＭＯＩで、懸濁液中のＮＴＲ発現ウイルスに感染させた（２時間）。２４時間の発現期間の後、ＣＢ１９５４を一定の濃度範囲（０〜５０μＭ）で適用し、そしてプロドラッグへの５時間の曝露後、細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＭＴＳ細胞基質殺傷アッセイ（ＯＤ４５０ｎｍでのプレート読出しの前に、２〜３時間インキュベーション）を使用して評価した。所定のＭＯＩおよび［ＣＢ１９５４］について、これらの条件下で、Ｆ１２４ＮおよびＦ１２４ＫＮ７１Ｓの両方の発現は一貫して、ＷＴ酵素の発現によって引き起こされる細胞殺傷よりも大量の細胞殺傷を生じさせることが見出された。しかし、ヘルパー細胞におけるプラーク形成によるアデノウイルスの力価決定は、誤りがちなプロセスである。これを補正するために、実験を、各ウイルスに関して複数の独立した力価決定調製物で行った。
【００８９】
（結果）
図１０Ａ、ＢおよびＣは、使用したウイルスが、各ＮＴＲ発現ウイルスの３つの調製物の混合物（１：１：１）を含んだ実験の結果を示す。これらの混合物の力価を、個々に実験により決定された力価の平均であると仮定した。正規化目的のためのＮＴＲ発現のウェスタンブロット分析のために、全細胞抽出物を、１１％分離ゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、そしてニトロセルロース膜にブロットした。ＮＴＲを、ヒツジ抗ＮＴＲ血清（１：１０００希釈）、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）により標識されたロバ抗ヒツジＩｇＧ、およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して検出し、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍｏｄｅｌ＃２．３．１を用いて分析した。各ウェルの相対的な負荷を、転写後のゲルのクマシーブルー染色によって決定した。
【００９０】
示されるように、使用されたほぼすべてのＭＯＩおよびＣＢ１９５４濃度において、ＣＴＬ８０２は、ＣＢ１９５４殺傷に対して、ＣＴＬ１０２よりも高い感作を媒介した。ＣＴＬ８０５もなお、高い効果を媒介した。この実験において、Ｆ１２４Ｎで達成された殺傷の改善は中程度であったが、図１１Ａにおけるウェスタンブロットは、Ｆ１２４Ｎの発現レベルがＷＴ  ＮＴＲ発現細胞におけるよりも低かったことを示している。これは、Ｆ１２４Ｎが癌細胞においてＣＢ１９５４を活性化する改善された能力を保有することについての支持を与えるが、これはあるいは、ＷＴと比較して安定性の減少を指摘するものである。Ｆ１２４ＫＮ７１Ｓの発現に起因する殺傷は、より顕著であった。しかし、この場合、酵素発現のレベルは、ＷＴの発現レベルにより類似していた。まとめると、これらのデータは、二重変異体酵素が、ＷＴ酵素よりも大きなＣＢ１９５４活性化活性を保有することと一致する。
【００９１】
結論として、この実験は、細菌スクリーニングを使用して単離されたＦ１２４ＮおよびＦ１２４Ｋ／Ｎ７１Ｓ  ＮＴＲ変異体が、ＷＴ  Ｅ．ｃｏｌｉ酵素よりも効率的に、ヒト癌細胞株をＣＢ１９５４に対して感作し得るという証拠を与える。
【００９２】
（実施例３：変異体ＮＴＲの動態特性）
特定のＮＴＲ変異体の発現が、ＣＢ１９５４に対するＥ．ｃｏｌｉの感作を、ＷＴ酵素で観察される感作よりも増加させたという観察は、この変異体酵素が、増加された触媒活性を保有するということと一致した。これを、選択された変異体のインビトロにおける動態分析によって試験した。野生型ＮＴＲおよび選択された変異体を、Ｌｏｖｅｒｉｎｇら（２００１）によって記載されたようにして精製した。定常状態の動態研究を、４２０ｎｍでのニトロフラゾン
【００９３】
【数１】
2005517386.tif 000006
およびニトロフラントイン
【００９４】
【数２】
2005517386.tif 000007
の消失、または３００ｎｍでの還元型ベンゾキノン
【００９５】
【数３】
2005517386.tif 000008
、２−ニトロフラン
【００９６】
【数４】
2005517386.tif 000009
、２−ニトロベンズアミド
【００９７】
【数５】
2005517386.tif 000010
および４ニトロベンズアミド
【００９８】
【数６】
2005517386.tif 000011
の消失をモニターすることによって実施した。ＣＢ１９５４還元の４ヒドロキシルアミン生成物の形成を、４２０ｎｍ
【００９９】
【数７】
2005517386.tif 000012
でモニターした。すべての反応を、０．１ｃｍ、０．５ｃｍまたは１ｃｍのいずれかのパス長を有する石英キュベットにおいて実施した。すべての場合において、反応を、反応混合物に少量の冷酵素溶液を添加することによって開始した。アッセイを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ（ｐＨ７．０）において実施した。各反応の温度を、循環水浴によって、２５℃に維持した。試験された全ての基質を、最終の有機溶媒濃度が４％（容量／容量）を超えないように、ＤＭＳＯ中に溶解した（５％（容量／容量）を超える濃度は、明確な酵素阻害を与える）。すべてのアッセイにおいて、最終ＤＭＳＯ濃度は、４％であった。すべての定常状態データを、有酸素環境下で収集した。動態データを、Ｋｍが０．１から、基質溶解度または光学的吸光度によって許容される最大の可能な濃度までに及ぶ濃度範囲で収集した。すべての場合において、最大基質濃度は、５×Ｋｍを超えた。すべてのデータを、市販のパッケージＳｉｇｍａ  ＰｌｏｔＴＭを使用して分析し、そして以下の形：
ｙ＝ａｘ／ｂ＋ｘ
の直角双曲線に非線形回帰で当てはめた。図１２Ａ、ＢおよびＣならびに表４に示される結果は、分析されたすべての変異体が、ＣＢ１９５４についてのＫｍまたはｋｃａｔのいずれかにおいて改善を示したことを示している。両方のパラメーターで改善を示すものはなかった。第２基質に対して最良の生体分子速度定数を示す変異体は、Ｔ４１Ｌであった。Ｆ１２４ＨおよびＨ１２４Ｋは両方とも、ヌクレオチドおよび第２基質の両方について、ｋｃａｔ／Ｋｍにおいて有意な改善を示した。Ｙ６８Ｇは、第２基質に対する触媒活性において大きな改善を示したが、ｋｃａｔ／Ｋｍにおいては示さなかった。なぜなら、これは、ＣＢ１９５４についてのＫｍの増加により相殺されたからである。まとめると、これらのデータは、ＣＢ１９５４に対するＥ．ｃｏｌｉの感作効率の改善が、ＷＴ  ＮＴＲ酵素に対する、改善された触媒活性に基づくものであるという証拠を与える。
【０１００】
（表４  一連の選択されたＮＴＲ変異体の動態パラメーター）
【０１０１】
【表４】
2005517386.tif 000013
【０１０２】
【表５】
2005517386.tif 000014
2005517386.tif 000015
本明細書中に引用されたすべての参考文献は、それらの全体において、本明細書中で参考として援用される。
【０１０３】
（他の実施形態）
他の実施形態は、当業者に明らかである。前述の詳細な説明が、明瞭化のためのみに提供され、そして単なる例示にすぎないことが理解されるべきである。本発明の意図および範囲は、上記の実施例に限定されず、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
本発明は、添付の表および図を参照しながら、実施例を通して記載される。ここで：
【図１】図１は、ＰＣＲを使用してＮＴＲ変異体を作製するために使用される、部位特異的変異誘発の方法を図示する；
【図２】図２は、溶原化したＥ．ｃｏｌｉ細胞における変異体ＮＴＲを発現するために使用される、ファージ（λＮＭ１１５１ＫａｎＲｐｔａｃ−ＮＴＲ）の構築物を示す；
【図３】図３は、ＣＢ１９５４の漸増濃度に対する増殖によって、変異体ＮＴＲを発現する溶原体をスクリーニングすることの１例を示す。より効率的なＮＴＲは、より高い遺伝毒性を導き、これによってより低い増殖を導く；
【図４】図４は、図３に図示する方法によって、変異体クローンの第１回目のスクリーニングの結果を示す；
【図５】図５は、ＮＴＲの活性部位付近の重要なアミノ酸の変異によって作製された変異体の数の分析、およびこれによってＮＴＲ活性が増加したかまたは減少したかを示す（野生型酵素のスコアが４）；
【図６ａ】図６は、野生型ＮＴＲと比較して、増加した活性を示す変異体の酵素活性スコアをまとめる。図６ａはＳ４０変異体、Ｔ４１変異体、Ｙ６８変異体、Ｆ７０変異体、Ｎ７１変異体およびＧ１２０変異体についての結果を示す。
【図６ｂ】図６は、野生型ＮＴＲと比較して、増加した活性を示す変異体の酵素活性スコアをまとめる。図６ｂはＦ１２４変異体についての結果を示す。
【図７】図７は、多くの変異体クローンについて得られた生存曲線の例を示す。パーセント生存率をＣＢ１９５４濃度に対してプロットして、ＩＣ５０値を算出し得る；
【図８】図８は、野生型酵素と比較した実験によって作成したＩＣ５０のデータを示す。
【図９】図９は、野生型ＮＴＲのアミノ酸配列（配列番号１）−Ｅ  ｃｏｌｉ  ＮｆｓＢ遺伝子によってコードされるタンパク質を示す。Ｓ４０、Ｔ４１、Ｙ６８、Ｆ７０、Ｎ７１、Ｇ１２０およびＦ１２４での重要な変異を、下線および太字で示す。
【図１０】図１０は、野生型ＮＴＲ（Ａ）、Ｆ１２４ＮのＮＴＲ（Ｂ）または二重変異体Ｆ１２４／Ｎ７１ＳのＮＴＲ（Ｃ）を哺乳動物細胞中に発現し、その結果ＣＢ１９５４に対する増感およびＣＢ１９５４による殺傷を生じる、３つの異なるアデノウイルスベクターを用いた実験の結果を示す。ＭＯＩおよびＣＢ１９５４の濃度の範囲で生存する、％細胞を示す。
【図１１】図１１は、野生型ＮＴＲ、ならびにＦ１２４ＮのＮＴＲ変異体およびＦ１２４／Ｎ７１ＳのＮＴＲ変異体の発現レベルを、クマシー染色したローディングコントロール（Ｂ）と共に、ウエスタンブロッティング（Ａ）によって示す。
【図１２】図１２は、野生型、Ｆ１２４Ｋ変異体、Ｎ７１Ｓ変異体およびＦ１２４／Ｎ７１Ｓ変異体についての酵素動態のデータ（ｋｃａｔ、Ｋｍ、およびｋｃａｔ／Ｋｍ比）を示す。
【配列表】
2005517386.tif 000016
2005517386.tif 000017
2005517386.tif 000018
2005517386.tif 000019
2005517386.tif 000020
2005517386.tif 000021
2005517386.tif 000022
2005517386.tif 000023
【図１】
2005517386.tif 000024
【図２】
2005517386.tif 000025
【図３】
2005517386.tif 000026
【図４】
2005517386.tif 000027
【図５】
2005517386.tif 000028
【図６ａ】
2005517386.tif 000029
【図６ｂ】
2005517386.tif 000030
【図７】
2005517386.tif 000031
【図８】
2005517386.tif 000032
【図９】
2005517386.tif 000033
【図１０】
2005517386.tif 000034
【図１１】
2005517386.tif 000035
【図１２】
2005517386.tif 000036
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月17日(2004.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005517386000001.app
【国際調査報告】
2005517386.tif 000037
2005517386.tif 000038
2005517386.tif 000039
2005517386.tif 000040
2005517386.tif 000041
2005517386.tif 000042
2005517386.tif 000043