(57)【要約】  フロースルー検査過程に使用される方法および装置が開示されている。この方法は、（一般的には、特定のタンパク質の存在の有無に関する）分析対象となるサンプルと、この特定のタンパク質と結合することが分かっている検出用アナライト（一般的には、金コロイドまたは蛍光標識に結合された複数種類の抗体）が必要な期間結合する「プレインキュベーション工程」を特徴とする。このプレインキュベーション工程は、サンプルと検出用アナライトとの混合物がメンブレンに結合された捕捉用アナライトと接触する前に行われる。プレインキュベーション工程を設けることによって、検査感度を向上させるとともに、検査に必要なサンプルの量を低減させる効果がある。この方法を実行する装置として、メンブレンによって形成された底部を有し、サンプルおよび検出用アナライトを受け入れるプレインキュベーション室と、捕捉用アナライトが結合されたもう１つのメンブレンとが形成された装置が開示されている。一形態では、プレインキュベーション室が、ある位置では上記もう１つのメンブレンの上方に支持される一方、捕捉用アナライトを担持したメンブレンと接触するように押圧されることにより、液体をインキュベーション室から捕捉用メンブレンに移動させることができる。別の形態では、インキュベーション室の底部のメンブレンが疎水性であって、その下面が捕捉用メンブレンに接触しており、プレインキュベーション室の内容物に湿潤剤が付与された時に液体の移動が発生する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質メンブレンを設ける工程と、
第２の多孔質メンブレンによって形成された底部を有する小室に、検査対象のサンプルと多重検出用アナライトとを入れる工程と、
上記少なくとも１種類の反応物質が存在する場合に、上記多重検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室の底部を上記第１の多孔質メンブレンと接触させる工程と、
上記サンプルを上記両メンブレンに透過させて、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程を含む方法。
【請求項２】
上記小室を取り外す工程と、上記メンブレンに上記多重検出用アナライトが存在するか否かを検査する前に、上記第１のメンブレンを緩衝液で洗浄する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記小室を取り外して上記第１のメンブレンに上記多重検出用アナライトが存在するか否かを検査する前に、上記小室に緩衝液を加えることによって該緩衝液で上記第１のメンブレンを洗浄する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
検出対象の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質メンブレンからなり、上面と下面を有する第１の部材と、
薄葉紙などの吸収材の集団であって、上記第１の部材の下面の下方に配置され、該第１の部材の下面と接触する第２の部材と、
上記第１の部材の上方に間隔を置いて設けられ、側壁と、第２のメンブレンによって形成された底部とを有する小室と、
上記小室から上記吸収材の集団へ液体を移動させないように上記メンブレンが上記第１の部材から十分な距離を置いて配置される第１の位置と、上記メンブレンが上記第１の部材と接触することにより、上記小室から上記第１および第２のメンブレンを経て上記吸収材の集団へ液体を移動可能にする第２の位置の２つの位置で、上記小室を上記第１の部材の上方に支持する手段とを備えた装置を用いて少なくとも１種類の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記小室を上記第１の位置に配置した状態で、上記小室に検査対象のサンプルと多重検出用アナライトとを入れる工程と、
上記反応物質が存在する場合に、上記多重検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室を上記第２の位置まで降下させて、上記小室の底部と上記第１の多孔質メンブレンとを接触させる工程と、
上記サンプルを上記第１および第２のメンブレンに透過させて、上記反応物質が存在する場合に、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程を含む方法。
【請求項５】
上記小室の底部に形成された上記第２のメンブレンは疎水性であり、上記サンプルを上記第１および第２のメンブレンに透過させる工程は、上記小室を上記第２の位置まで移動させる前に、上記第２のメンブレンの上面に湿潤剤を添加することを含んでいる請求項４記載の方法。
【請求項６】
検出対象の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質のメンブレンからなり、上面と下面を有する第１の部材と、
薄葉紙などの吸収材の集団であって、上記第１の部材の下面の下方に配置され、該第１の部材の下面と接触する第２の部材と、
上記第１の部材の上方に配置されており、側壁と、上面および下面を有する第２の疎水性のメンブレンを備えた底部とを有し、上記疎水性メンブレンの下面が上記第１の部材の上面と接触した状態で上記第１の部材の上方に支持されたプレインキュベーション室とを備えた装置を用いて少なくとも１種類の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記小室に、検査対象のサンプルと多重検出用アナライトとを入れる工程と、
上記反応物質が存在する場合に、上記多重検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室に湿潤剤を添加する工程と、
上記サンプルを上記第１および第２の多孔質メンブレンに透過させて、上記反応物質が存在する場合に、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程を含む方法。
【請求項７】
上記サンプルは全血であり、該全血中の全赤血球がフィルタとして作用する上記第２のメンブレンによって上記小室内で除去され、上記全血中の血漿が上記第１のメンブレンに流される請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
上記サンプルは、穀物抽出物、細胞抽出物、微生物抽出物を含む群から選択された粒状物質を含有しており、該粒状物質は、フィルタとして作用する上記第２のメンブレンによって上記小室内で除去される請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
上記サンプルは、血漿、血清、尿、唾液、痰などの体液からなっており、上記第２のメンブレンは、疎水性メンブレンである請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
上記検査対象サンプルのアナライトと上記第１のメンブレン上の捕捉用アナライトとの結合を妨げる、上記サンプル中の不要なアナライトを上記小室内で除去または中和させる工程を含んでいる請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
上記不要なアナライトと結合する抗体または他のアナライトが、上記小室の側壁または底部に結合される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
上記検査対象サンプルは、スワブなどの吸収材表面に担持されており、上記小室に抽出用溶液を入れて上記スワブをかき混ぜる工程を含んでいる請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
上記多重検出用アナライトは、抗体、リガンドおよび抗原を含む群から選択された検出用化合物を備えている請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
上記抗体は免疫グロブリンである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記多重検出用アナライトは２種類以上の抗体を含んでいる請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
上記多重検出用アナライトは３種類以上の抗体を含んでいる請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種類の抗体は対照用抗体である請求項１５または請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記多重検出用アナライトは、金コロイド粒子、ラテックスビーズ、有色色素および炭素コロイドを含む群から選択された検出可能要素を備えている請求項１ないし請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
上記検出可能要素は金コロイド粒子である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
上記検出可能要素は、有色色素に結合されたラテックスビーズである請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
上記検出可能要素は炭素コロイドである請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
上記２種類以上の抗体は、金コロイド粒子に結合される請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断検査方法に関し、特に、検査過程を実行するのに使用される装置と、この装置を用いて検査過程を実行する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
診断検査には、ほぼ２０年間、ラテラルフロー技術とフロースルー技術が使用されている。ラテラルフロー技術は、ラテラルフロー装置の製造が容易であり、検査を全血分離に適応可能な単純な２段階の過程で行うことができるため、現在主流の技術である。その結果、現場での迅速なポイント・オブ・ケアー診断技術として利用可能な簡単な装置を生み出している（コール(Cole)他、１９９６年、チューバキュロシス・アンド・ラング・ディシーズ(Tuberc. Lung. Dis.)７７：３６３−３６８）。しかしながら、ラテラルフロー技術を用いて多種類の病気の診断を行うことは、サンプル間の側方拡散差異や分離用メンブレンのバッチ間の流量変動があるために、非常に困難である。このことは、検査内と検査バッチ間の両方で、抗原または抗体のシグナル強度にばらつきがあり、一貫性のない結果をもたらすことを意味する。
【０００３】
既存のフロースルー診断検査は、ラテラルフロー検査が一般に５分ないし１５分の時間で完了するのに比べて、２分以内で完了することができる。しかしながら、この速度面での利点は、感度を犠牲にしている場合が多い。もう１つ不利な点は、ラテラルフローと同じ感度を得るためには、より多量のサンプルが必要となることである。このことは、状況によっては問題となる可能性がある。例えば、全血中のアナライト（反応物質）の診断には、全血球から血漿を分離する必要がある。そのために必要な全血の量がより多くなると、フロースルーフォーマットのメンブレンを急速に閉塞させることになる。
【０００４】
フロースルー検査の基本原理は十分に確立されている。この検査は、サンプル中の所定のアナライト／反応物質の有無、場合によっては、その量を求めるように構成されている。反応物質は、タンパク質である場合が多いが、他の反応物質も検査対象になり得る。検査が患者の特定の病気の有無を検査することである場合は、患者の体液に、感染症に反応して患者自身が産生した抗体または他のタンパク質が存在するか否か、または、病気を発生させる細菌やウィルス性原因物質が発現させたタンパク質が存在するか否かが検査される。一般的なフロースルー検査では、反応物質を含むと思われる液体サンプルがメンブレンを介して吸収パッドに吸収される。メンブレンには、反応物質と結合することが分かっている捕捉用アナライトが結合されている。その後、メンブレンは、通常、緩衝液で洗浄される一方、メンブレンには、これもまた反応物質と結合し、検出可能なトレーサまたはマーカを備えた検出用アナライトが含有された液体が添加される。検出用アナライトは、メンブレンに結合された固定化反応物質に結合し、目視またはその他の方法で検出することにより、その反応物質の存在を示すことができる。
【０００５】
米国特許第４２４６３３９号は、液体サンプル中の所定の反応物質の存在の有無を検査する検査装置を開示している。この装置は、両者間に液だめを形成し、両者間で伸縮する上下部材と、これら両部材を開放状態に偏倚する弾性手段を備えている。上部材は、それぞれ微孔質のメンブレンによって形成された底部を有する一連の検査ウェルを形成しており、メンブレンは、その表面に捕捉用アナライトを固定化させている。下部材の内部には、吸収材手段が配置されており、開放状態ではメンブレンとの間に間隔が設けられる一方、閉鎖状態ではメンブレンと接触する。米国特許第４２４６３３９号には、緩衝液で希釈された検査用血清を検査ウェルに添加し、装置を室温で１０分間インキュベートした後に、カセットを閉鎖状態まで押圧することによって、サンプルをメンブレンから吸収材に透過させることが開示されている。メンブレンは、乾燥すると、洗浄され、固定化反応物質と結合する検出用アナライトを含んだ溶液で覆われた後、染色剤が添加される次の工程へと続く。
【０００６】
米国特許第４２４６３３９号に記述された方法は、やや長々と時間のかかる単調な方法であり、感度も不足している。
【０００７】
さらに最近のフロースルー装置が米国特許第５１８５１２７号に記載されており、ここには、フィルタ積層体と、底部と蓋を有する筐体とを備えた検査装置が開示されている。フィルタ積層体は、米国特許第５１８５１２７号では結合剤と称される、捕捉用アナライトを付着させた親水性メンブレンを有している。親水性メンブレンの下には、疎水性メンブレンが配置されており、疎水性メンブレンの下には、吸収材パッドが配置されている。蓋は、上方に突出するリブを備えており、このリブは、その内部に挿入口を有する凹部を形成している。使用時には、反応物質（米国特許第５１８５１２７号ではアナライトと称される）を含んだサンプルを検査装置のウェルに入れ、その際に、反応物質／アナライトが捕捉用アナライト／結合剤と結合する。しかしながら、水溶液は、フィルタ積層体の親水性メンブレンの下に位置する疎水性メンブレンを濡らさないため、検査溶液は流動しない。したがって、検出用アナライトと反応物質との結合を完了させるのも同じくらい多くの時間が必要とされる。結合が完了したと判断されると、疎水性メンブレンを濡らす湿潤剤を添加することによって流動が開始される。水溶液は、その後に、吸収材パッドに流入する。その後、メンブレンは、洗浄され、アナライトと特異的に結合する抗体であり、密かに標識を結合させた検出用アナライト／トレーサで処理される。米国特許第５１８５１２７号も感度が不足しており、ラテラルフローフォーマットやELISAフォーマットで得られる感度と同等ではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概要
「に由来する」または「誘導体」という用語は、本明細書中で使用する場合、指定の完全体が特定の源から、必ずしも直接ではないにせよ、得られることを示すとみなされるべきである。
【０００９】
文脈上特に必要のない限り、または、特に指定しない限り、本明細書中で単数の完全体、工程または要素として列挙する本発明の完全体、工程または要素は、列挙された完全体、工程または要素の単数形態と複数形態の両方を明らかに包含するものである。
【００１０】
本明細書中であらゆる単独の実施形態に基づいて、とりわけ検査装置または検査方法に基づいて述べる本発明の実施形態群は、本明細書中で述べる本発明の他のいかなる実施形態に対しても準用されるとみなされるべきである。
【００１１】
本明細書を通じて、文脈上特に必要のない限り、「備える、含む」という言葉または「備えた、含んだ」、「備えている、含んでいる」などの変形は、記載された工程、要素または完全体、あるいは工程、要素または完全体の群を包含することを意味するが、他のいかなる工程、要素または完全体あるいは要素または完全体の群を除外するものではないと解釈される。
【００１２】
当業者であれば、本明細書中に記載する発明が具体的に記載したもの以外の変形および変更を許容することが理解できるであろう。本発明はそのような全ての変形および変更を包含するものと解されるべきである。さらに、本発明は、本明細書中で参照または提示された工程、特徴、組成物および化合物の全てを個別的にまたは集合的に包含し、かつ、上記工程または特徴のありとあらゆる組合せまたは２つ以上の任意の工程または特徴を包含する。
【００１３】
本発明は、本明細書中に記載された具体例によって範囲を限定されるものではない。機能的に等価な生成物、組成物および方法も、本明細書に記載されているように、本発明の範囲に含まれることは明らかである。
【００１４】
本発明は、特に指定しない限り、免疫金標識やプロテオミクスなどの従来の免疫細胞化学の技術を用いて必要以上の実験を伴うことなく実行される。そのような手順は、例えば、参照の形で盛り込まれている以下のテキストに記載されている。すなわち、
「金コロイド−細胞化学的標識の新たな展望(Colloidal Gold ・ A New Perspective For Cytochemical Marking)」ビーズリー(Beesley)Ｊ（１９８９）、ロイヤル・マイクロスコピカル・ソサエティ・ハンドブック(Royal Microscopical Society Handbook)Ｎｏ．１７、オックスフォード・サイエンス・パブリケーションズ(Oxford Science Publications)、オックスフォード大学出版局（ペーパーバック）、
「免疫細胞化学入門：現在の技術と問題点(An Introduction To Immunocytochemistry : Current techniques and problems)」ポラック(Polak)Ｊおよびファン・ノールデン(Van Noorden)５（１９８４）、ロイヤル・マイクロスコピカル・ソサエティ・ハンドブック(Royal Microscopical Society Handbook)Ｎｏ．１１、オックスフォード・サイエンス・パブリケーションズ(Oxford Science Publications)、オックスフォード大学出版局（ペーパーバック）、
「免疫細胞化学−現代の方法と応用(Immunocytochemistry ・ Modern Methods and Applications)」ポラック(Polak)Ｊおよびファン・ノールデン(Van Noorden)５（１９８６）（第２版）、バターワース・ハイネマン(Butterworth Heinemann)、オックスフォード（ハードカバー）、
「免疫細胞化学の技術(Techniques in Immunocytochemistry)」ブロック(Bullock)Ｇおよびペトルス(Petrusz)Ｐ（１９８２−１９８９）（４冊）、アカデミック・プレス(Academic Press)（ペーパーバック）、および
「金コロイド−原理、方法および応用(Colloidal Gold ・ Principles, Methods and Applications)」ハヤット(Hayat)Ｍ（１９８９−１９９０）（３冊）、アカデミック・プレス(Academic Press)（ハードカバー）である。
【００１５】
本願に引用された全ての文献は、本明細書に参照の形で具体的に盛り込まれる。
【００１６】
従来技術はその用語法に関して一貫性がないので、不確かさを回避し、明確にするため、以下の明細書で使用する用語を以下のとおりに定義する。「反応物質」または「対象アナライト」という用語は、検査によって検出される高分子（例えば、タンパク質や酵素）やその断片などを指すために使用される。「捕捉用アナライト」という用語は、メンブレンに結合されており、反応物質を結合させる「捕捉用」化合物を指すために使用される。「検出用アナライト」という用語は、これもまた反応物質と結合する「検出用」化合物と、「検出可能」要素とを備えたアナライトを指すために使用される。検出可能要素は、一般的には、可視光によってであれ蛍光によってであれ可視的に検出される。
【００１７】
第１の広い側面では、本発明は、検査過程に使用される装置および方法であって、反応物質と検出用アナライトとを結合させることにより、１種類または複数種類のリガンドが結合された反応メンブレンとサンプル−アナライト複合体とが反応する前に検査感度を向上させるとともに検査に必要なサンプルの量を低減させる効果をもたらす「プレインキュベーション工程」を設けることを特徴とする装置および方法を提供する。
【００１８】
一実施形態では、上記検出用アナライトは、検出可能要素に結合された複数種類の検出用化合物を含んだ多重検出用アナライトである。
【００１９】
したがって、本発明の一側面では、検査過程に使用される装置であって、
検出対象の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質反応メンブレンからなり、上面と下面を有する第１の部材と、
薄葉紙などの吸収材の集団であって、上記第１の部材の下面の下方に配置され、該第１の部材の下面と接触する第２の部材と、
上記第１の部材の上方に間隔を置いて設けられ、側壁と、第２のメンブレンによって形成された底部とを有する小室と、
上記小室から上記吸収材の集団へ液体を移動させないように上記メンブレンが上記第１の部材から十分な距離を置いて配置される第１の位置と、上記メンブレンが上記第１の部材と接触することにより、上記小室から上記第１および第２のメンブレンを経て上記吸収材の集団へ液体を移動可能にする第２の位置の２つの位置で、上記小室を上記第１の部材の上方に支持する手段とを備えた装置が提供される。
【００２０】
それに関連する側面では、本発明は、本発明の装置を用いて所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記小室を上記第１の位置に配置した状態で、上記小室に検査対象のサンプルと検出用アナライトとを入れる工程と、
上記反応物質が存在する場合に、上記検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室を上記第２の位置まで降下させて、上記小室の底部と上記第１の多孔質メンブレンとを接触させる工程と、
上記サンプルを上記第１および第２のメンブレンに透過させて、上記反応物質が存在する場合に、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程とを備え、
好ましくは、上記検出用アナライトが多重検出用アナライトである方法を提供する。
【００２１】
「多重検出用アナライト」とは、本明細書中で使用される場合、検出可能要素に結合された複数種類の検出用化合物を含んだ検出用アナライトを指す。
【００２２】
発明者らは、多重検出用アナライトが以下に挙げるもののいずれかを含む本発明による多数の利点をもたらすことを予期せず発見した。その利点とは、例えば、
複数種類の検出用化合物を最適の結合効率で検出可能要素に結合可能であること、
複数種類の検出用化合物を用いて生成された検出用アナライトが、各検出用化合物について同じサイズと物理的特性を有すること、
検出可能要素に対する各検出用化合物の比率を、検出可能要素の相対的な結合特性に影響を及ぼすことなく変更可能であること、
量的な比較が可能であること、および
検出可能要素の非特異的結合能を低下させることである。
【００２３】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１種類の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記少なくとも１種類の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質メンブレンを設ける工程と、
第２の多孔質メンブレンによって形成された底部を有する小室に、検査対象のサンプルと多重検出用アナライトとを入れる工程と、
上記少なくとも１種類の反応物質が存在する場合に、上記多重検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室の底部を上記第１の多孔質メンブレンと接触させる工程と、
上記サンプルを上記両メンブレンに透過させて、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程とを含む方法を提供する。
【００２４】
上記検出用化合物は、好ましくは、抗原、抗体またはリガンドである。
【００２５】
抗体、抗原およびリガンドは、目的のタンパク質やその断片またはエピトープに対して他の分子よりも優先して特異的に結合可能な結合部位を有する検出用化合物として利用することができる。
【００２６】
抗体は、民間の供給源から入手可能であり、あるいは、従来の手段によって生成される。民間の供給源は、当業者には公知であろう。
【００２７】
抗体などの複合体形成用物質に関連する「特異的に結合」という用語は、本明細書中で使用される場合、その物質が対象アナライト（例えば、目的のタンパク質）と優先的に結合することを指す。特に抗体に関しては、分子と非対象タンパク質との間に、ある程度の非特異的相互作用が生じることが分かっている。それでもなお、特異的結合は、抗原の特異的な認識によって媒介されるものとして区別される。
【００２８】
別の実施形態では、検出用化合物（抗体またはリガンド）は、抗体またはリガンドに、当分野で公知の技術を用いて検出可能な、例えば、放射性標識、蛍光標識または西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素標識により直接的または間接的に標識を付けることによって、サンプル中の対象アナライトを検出させる要素に結合されている。直接的に標識付けされたアナライトは、検出用化合物に標識（検出可能要素）を会合または結合させている。間接的に標識付けされる検出用要素は、標識付き種（例えば、現像主薬に結合可能な標識付き抗体）に結合可能であってもよいし、別の種に作用して検出可能な結果を発生させてもよい。
【００２９】
検出可能要素は、抗体（または他のリガンド）とコンジュゲートを形成することが可能であり、検出可能要素には、高分子コロイド粒子（例えば、金コロイド粒子）や、着色された磁性または常磁性のラテックスビーズなどの粒状物質や、検出可能なシグナルの目視による観察、電子的な検出、またはそれ以外の方法での記録を直接的または間接的に可能にする生物学的または化学的活性物質などが含まれる。この分子は、発色や変色を引き起こす反応や、例えば電気的特性の変化を引き起こす反応を触媒する酵素であってもよい。検出可能要素は、エネルギー状態間の電子遷移によって特徴的な分光吸収や分光放射を生じるように、分子レベルで励起可能であってもよい。検出可能要素は、バイオセンサと併用可能な化学物質を含んでいてもよい。一実施形態では、上記検出用化合物（抗体）は、金コロイド粒子とコンジュゲートを形成する。このコンジュゲート化された抗体をサンプルのタンパク質に結合させることにより、目で検知したり電子的に読み取り可能な可視シグナルが生成され、定量的な結果が得られる。ビオチン−アビジン検出システム、ビオチン−ストレプトアビジン検出システムまたはアルカリフォスファターゼ検出システムが採用されてもよい。
【００３０】
その他の標識も当業者にとって公知である。
【００３１】
上記検出用要素は、好ましくは、金コロイド粒子、ラテックスビーズ、有色色素および炭素コロイドを含む群から選択される。
【００３２】
一実施形態では、上記検出可能要素は金コロイドである。金コロイドは、好ましくは、均質な反射特性を提供する。
【００３３】
別の実施形態では、上記検出可能要素は、有色色素に結合されたラテックスビーズである。
【００３４】
別の実施形態では、上記検出可能要素は炭素コロイドである。
【００３５】
好ましくは、検査時の「検査用」サンプルからのシグナルが対照用サンプルからのサンプルよりも大幅に大きいか小さい場合がよい結果である。
【００３６】
このように、本発明は、サンプルと多重検出用アナライトとを結合させ、検査感度を向上させるとともに検査に必要なサンプルの量を低減させるプレインキュベーション工程を実行することができるプレインキュベーション室となる小室を設けている。プレインキュベーション工程は、検査の完了までラテラルフローフォーマットでは１０分かかるのに対して、依然として、約２分で検査を完了させることができる一方、一般的な既存のフロースルー装置の検査感度をラテラルフロー技術に匹敵する同等の感度レベルまで約１０倍向上させることが分かった。
【００３７】
一実施形態では、上記サンプルは、農産物、微生物生成物および生体生成物を含む群から選択されるか、あるいはその群に由来する。
【００３８】
一実施形態では、上記農産物は、種子、穀物または植物抽出物を含む群から選択される。
【００３９】
一実施形態では、上記サンプルは、穀物抽出物、細胞抽出物および微生物抽出物を含む群から選択された粒状物質を含んでいる。
【００４０】
別の実施形態では、上記生体サンプルは、血液、血清、痰および肺を含む群から選択された体液または組織サンプルである。
【００４１】
その他のサンプルも除外されない。
【００４２】
本発明に使用されるサンプルを入手、調製および／または保存するために標準的な方法が使用されてもよい。例えば、一実施形態では、綿マトリックスや同様の材料からなる吸着スワブを使用して、対象アナライトを含有する表面または培地を検査することができる。一実施形態では、上記吸着スワブは、対象アナライトを除去するために洗浄される。好ましくは、その後、上記対象アナライトおよび／または上記対象アナライトを含んだ粒状物質が可溶化される。
【００４３】
したがって、一実施形態では、粉末麦穂の懸濁液が、可溶化された後、金コロイド粒子に結合された一次抗αアミラーゼ抗体と、同じく金コロイド粒子に結合された対照用二次抗体とを含んだ多重検出用アナライトと上記小室内で混合され、プレインキュベートされる。その後、小室の内容物が、固定化された抗アミラーゼ抗体または抗対照用抗体の形の捕捉用アナライトを含有する第１のメンブレンに流され、抗体−金複合体が固定化抗体に結合して検出可能なシグナルを形成することになる。このシグナルは、プレインキュベーション部を取り外し、反応メンブレンを緩衝液で洗浄することによって検出可能になる。
【００４４】
別の実施形態では、プレインキュベーション室で全赤血球を除去し、捕捉用アナライトが結合された反応メンブレンに血漿を流すことができるので、本発明を、全血中の反応物質を検出するために使用することができる。このフォーマットでは、プレインキュベーション室の底部に形成された底部メンブレンは、通常、赤血球を残し、第１のメンブレンと接触した際に血漿を透過させる適正な孔径を有するメンブレンである。同様に、プレインキュベーション室で粒状物質を除去して、粒状物質が反応メンブレンの上面の反応領域を閉塞しないようにすることができるので、穀物抽出物、細胞抽出物、微生物抽出物などの粒状サンプルもこのフロースルーフォーマットを用いて分析することができる。
【００４５】
さらに、この装置は、血漿、血清、尿、唾液、痰などの血液以外の体液中のアナライトを検出するために使用することも可能である。この場合、疎水性メンブレンを使用することによって、サンプルをプレインキュベーション室に留めることができる。プレインキュベーション室を降下させたときに第２のメンブレンに対する効率的な透過毛細管作用を得るため、反応メンブレンは、洗浄剤を含有する湿潤剤で予め湿潤されるか、あるいは蔗糖、トレハロース、果糖、またはグリセロールなどの吸湿溶液でブロッキングされる。
【００４６】
これにより、反応メンブレンの特性を非吸湿性メンブレンから吸湿性メンブレンに変化させ、プレインキュベーション室の底部のメンブレンと反応メンブレンとの接触時にサンプルが第２の部材まで透過できるようにする。
【００４７】
さらに別の実施形態では、プレインキュベーション室の底部として疎水性メンブレンが使用される場合に、疎水性メンブレンと反応メンブレンを接触させ、必要に応じて作業者がサンプルに湿潤剤を添加して透過を行わせるようにして、装置を利用してもよい。
【００４８】
したがって、それに関連する側面では、検査過程に使用される装置であって、
検出対象の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質のメンブレンからなり、上面と下面を有する第１の部材と、
薄葉紙などの吸収材の集団であって、上記第１の部材の下面の下方に配置され、該第１の部材の下面と接触する第２の部材と、
上記第１の部材の上方に配置され、側壁と、上面および下面を有する第２の疎水性のメンブレンを備えた底部とを有し、上記疎水性メンブレンの下面が上記第１の部材の上面と接触した状態で上記第１の部材の上方に支持されたプレインキュベーション室とを収容したハウジングを備えた装置が提供される。
【００４９】
また、プレインキュベーション室を利用して、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡＳ）などの検査を妨げるアナライトを、溶解状態で、あるいは抗アナライト抗体をプレインキュベーション室の表面に結合させることによって除去することもできる。さらに、プレインキュベーション室を利用して、患者の咽喉から採取されたスワブなどの吸収材表面の目的のアナライトを、プレインキュベーション室に抽出用溶液を入れてスワブをかき混ぜることによって抽出することも可能である。プレインキュベーション室は、第１の部材の上面と接触する前にサンプルを予め濾過する作用も行う前フィルタ部の一部であってもよい。
【００５０】
２つの反応工程（アナライトを標識付き抗アナライトとともにインキュベートすることと、その後にその複合体を固相抗アナライトと結合させること）を含むこの方法によって実行可能な検査の例は以下のとおりである。
直接抗原検査
１．Ag*(アナライト) ＋ Ab*1(抗Ag)-標識
２．固相-Ab2(抗Ag) ＋ Ag/Ab1(抗Ag)-標識複合体
直接抗体検査（１）
１．Ab1(アナライト＝抗Ag) ＋ Ab2(抗Ab1)-標識
２．固相-Ag ＋ Ab1(抗Ag)/Ab2(抗Ab1)-標識複合体
直接抗体検査（２）
１．Ab1(アナライト＝抗Ag) ＋ Ab2(抗Ab1)-標識
２．固相-Ab3(抗Ag)/Ag ＋ Ab1(抗Ag)/Ab2(抗Ab1)-標識複合体
間接抗原検査
１．Ag(アナライト) ＋ Ab1(抗Ag) ＋ Ab2(抗Ab1)-標識
２．固相-Ab3(抗Ag) ＋ Ag/Ab1(抗Ag)/Ab2(抗Ab1)-標識複合体
間接抗体検査（１）
１．Ab1(アナライト＝抗Ag) ＋ Ab2(抗Ab1) ＋ Ab3(抗Ab2)-標識
２．固相-Ag ＋ Ab1(抗Ag)/Ab2(抗Ab1)/Ab3(抗Ab2)-標識複合体
間接抗体検査（２）
１．Ab1(アナライト＝抗Ag) ＋ Ab2(抗Ab1) ＋ Ab3(抗Ab2)-標識
２．固相-Ab4(抗Ag)/Ag ＋ Ab1(抗Ag)/Ab2(抗Ab1)/Ab3(抗Ab2)-標識複合体
*Agは抗原を示す。
*Abは抗体を示す。
別の種類の検査も除外されない。
【００５１】
本発明の第１の側面にかかる装置に使用される反応メンブレン上に、抗原、抗体などの複数の病気のリガンド、またはアナライトをマイクロアレイの形で正確な量で分注するため、圧電駆動プリンタを使用してもよい。リガンドまたはアナライトは、特定のパターン、例えば、結果を認識しやすくするために文字の形に分注されてもよい。通常、液体反応物質１００ｐｌ（１滴）またはその倍数が分注されるが、この値は用途に応じて変わる。メンブレン上に結果として得られるスポットの径は、メンブレン上で液体が拡散することを条件として、直径約５５ミクロン以上であるが、これもまた用途に応じて変わる。直径５ないし１０ミクロンの液滴を分注することも可能であり、したがって、より少量の液状反応物質（例えば、１ないし１０ｐｌ）を加えることもできる。抗体、抗原または他のアナライトのマイクロアレイを正確な量でプリントすることは、１つのサンプルで複数の病気の診断を行う場合に、これらの反応物質を正確な量で用いた検査をもたらすことができることを意味する。この検査技術は、あらゆる診断分野にわたって薬物やその他のマーカの有無に関する検査に適用することができる。
【００５２】
あるいは、院内患者にカテーテルを通して少量の点滴液を投与するために主として使用される日本のアトムメディカル株式会社製の成人・新生児用シリンジポンプ１２３５を採用して、一列または複数列の捕捉用アナライトを第１のメンブレン、例えば、ニトロセルロースに加えることができる。
【００５３】
好ましい一実施形態では、結核、ＨＩＶ、肝炎、梅毒およびマラリア検出用のリガンドが反応メンブレン上に付着される。これにより、複数のサンプル処理工程を介在させる必要なく、１つの血液サンプルから結核、ＨＩＶ、肝炎、梅毒およびマラリアを一度に診断することが可能になる。
【００５４】
本発明を利用することにより、少量の全血を検査することが可能になり、したがって、本発明により、使いやすく、実験室でもポイント・オブ・ケアー分野の診断現場でも利用可能な超迅速診断検査装置が実現される。例えば、指一刺し分の血液があれば、検査を行うには十分である。また、吸収材（第２の部材）の量を増加させることによって、この装置で大量のサンプルを使用することも可能である。例えば、尿のような希薄な液体１０ｍｌを検査して、低存在量の分子を検出することができる。
【００５５】
アナライトおよび／またはリガンド（例えば、抗原や抗体）は、滴定量および／または滴定濃度でプリンティングすることができる。したがって、これは、個々のスクリーニングにおいて、サンプル溶液内のアナライト−リガンド濃度を定量する手段となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
ここで、本発明の具体的な実施形態を例示的に添付の図面に基づいて説明する。
【００５７】
検出用アナライトの調整
金コロイドに結合されて免疫金コンジュゲートを生成する物質（通常は免疫グロブリン）は、抗体の目標活性を維持する安定した複合体を提供するように受動的に結合される。プロテオーム・システムズ・リミテッド（ＰＳＬ）で製造された自然金コロイド懸濁液は、ヒドロキシルアミン還元剤で反応が開始される。オキシムがコロイド内の一部として部分的に残されるという仮定に基づいて、結合工程時にグルタルアルデヒドを添加してコロイド構造中の残留オキシムと免疫グロブリン由来の遊離アミンとの間でシッフ塩基を形成させることにより、免疫金コンジュゲートを安定化させる。
【００５８】
免疫グロブリンの最適の結合特性（濃度およびｐＨ）は、特定ｐＨ値の一定アリコートの金コロイドに対する抗体濃度の滴定と食塩水による混合物の処理によって得られる。コロイドと抗体との間の結合の濃度比が十分であれば、食塩水で処理された場合に、懸濁液からのコロイドの綿状化すなわち凝集が防止される。したがって、タンパク質濃度が低い場合、食塩の添加によって懸濁液からコロイドの凝集が生じるが、抗体の濃度が最適レベルに達すると、コロイドは懸濁液内で安定状態を維持する（コロイド懸濁液の保全性は、分光分析によって４５０ｎｍないし６００ｎｍの波長範囲に計測される）。この抗体濃度値は、安定した免疫金コンジュゲート複合体を形成するのに必要な最小保護濃度を示す。滴定時には、５ｍＭ硼酸塩中に０．１ないし０．２ｍｇ／ｍＬの抗体濃度が使用され、ポリクローナル抗体の場合は、ｐＨ値９が選択される。このｐＨ値は、通常、ポリクローナル血清中の免疫グロブリンの等電点（ｐＩ）域と遭遇する等電点域をはるかに超えている。ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の場合は、免疫グロブリンは特異な等電点を有しており、コロイドのｐＨ値は、通常、抗体のｐＩ値より０．５ないし１単位高く設定される。
【００５９】
コンジュゲート形成に使用される抗体の濃度は、本明細書に記載された滴定手順から求められる最小「保護」濃度の１１０％である。
【００６０】
コンジュゲート形成プロトコル（単一抗体用）
コロイドの必要量を計り分ける（収率９０％とした場合、その量はそのコロイドに関して計測された吸光度での最終コンジュゲートの量とほぼ等しい）。
【００６１】
急速撹拌した上記コロイドに対してある量の５％グルタルアルデヒド溶液を添加し、最終グルタルアルデヒド濃度を０．００２％とする。
【００６２】
グルタルアルデヒド添加から５分後に、急速撹拌した上記懸濁液に対して算出量の抗体溶液を添加する。大量（＞１０ｍＬ）の抗体が添加される場合は、定常な液滴流の形で（好ましくは、滴下漏斗により）添加される。
【００６３】
コロイド量（２００ｍＬないし５Ｌ）に応じて３０分ないし９０分後に、懸濁液のｐＨ値が、０．２Ｍリン酸塩を用いてｐＨ９から（コンジュゲート形成がｐＨ７．５ないし６の間で行われない限り）ｐＨ７まで低下される。上記懸濁液に対して、ある算出量の１０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを添加し、懸濁液中の最終ウシ血清アルブミン濃度を０．５％とする。
【００６４】
上記懸濁液を、３ないし４時間、量が１Ｌを超える場合は一晩中撹拌しつづけた後、（量とコロイドのサイズに応じて）３５分間ないし６０分間１０，０００ｒｐｍの遠心分離にかける。
【００６５】
遠心分離された懸濁液から上澄みを取り除き、濃縮された液体遠心分離物を０．２％ウシ血清アルブミンおよび（防腐剤として）０．１％アジ化ナトリウムを含むｐＨ７．２の２ｍＭ硼酸塩に含ませる。
【００６６】
コンジュゲート形成プロトコル（複数抗体用）
上記コロイドに複数種類の抗体を結合させる場合、各抗体について（凝集用食塩を用いて調べる）保護濃度滴定を実行する。使用される抗体の量は、滴定から個々の抗体について求められる量である（＋１０％）。
【００６７】
それら抗体の結合度がそれぞれ個々に最適な結合度で等しい結合度であることが必要な場合、抗体は、予め混合され、（グルタルアルデヒド添加後の）コロイドに一緒に添加される。その処理は、上述した単一コンジュゲート形成用の手順に従う。抗体が個々に特定の比率である必要がある場合は、一次抗体が最初に添加され、その後、複数種類の副次的抗体がそれぞれ間隔を置いて添加される。コロイドに対する結合度の時間経過をいくつかの抗体の組合せに関して求めた。二次以降の抗体結合度は、一次抗体の添加とその後の各抗体添加との間の時間間隔とともに規則的なパターンで低下する。３０分ないし４０分の時間間隔後では、一定レベルの二次抗体が一次反応物のレベルの約１０％で結合されることが分かっている。場合によっては、必要な濃度比を持つ検査用抗体と手順上の対照用抗体との間に５分間の間隔があることが最適であることが分かっている。
【００６８】
一例を挙げると、一次抗体は、ｐＨ８．３でコンジュゲート化されたマウス抗αアミラーゼであり、二次抗体（対照）は、ヤギ免疫グロブリンＧである。別の例では、２種類の一次抗体（例えば、抗ヒトIgG1と抗ヒトIgG2）を同時に添加し、その後、適切な間隔を置いて対照用抗体を添加してもよい。
【００６９】
捕捉用アナライトを用いたメンブレンの作成
圧電ケミカルプリント技術を用いて、抗原や抗体などのリガンド状の捕捉用アナライト（例えば、結核、HIV-1）を、タンパク質捕捉用メンブレンマトリックス（例えば、ニトロセルロース膜）に、適切なサイズのアレイでプリントする。本発明での使用に適したケミカルプリント装置は、ＤＮＡ診断の際に液体を微量分注する圧電ドロップオンデマンド型インクジェットプリント技術、または、コンビオン・インコーポレーテッド社(Combion Inc.)の”CHEM-JET”と呼ばれる合成方法を使用する必要がある。ＤＮＡ診断用のドロップオンデマンド型液体分注を探求するため、米国基準技術研究所(the Institute of Standards and Technology (USA))が出資したゲノセンサ・テクノロジー・ディヴェロップメント(Genosensor Technology Development(GTD))プロジェクトの一部として、８液プリンタが開発された。現在までの研究は、固体の支持体上にオリゴヌクレオチドの微小スポットをプリントすることに注目が集中している。カリフォルニア工科大学で開発されたCHEM-JET技術の場合、インクジェットプリンタが１ページにインクを噴出する量と同じだけの微量の反応物質含有液が、固体基板の特定のスポット、すなわち、アドレスに噴出される。少数のビルディングブロックのうちの１つか２つ、この場合、そのプロセス用に変更されたヌクレオチドを用いて各アドレスに繰返し戻ることによって、短いＤＮＡ鎖（オリゴヌクレオチド）の巨大な二次元ライブラリーを構築することができる。画像化手段を備えたその種の装置が、その全内容を引用の形で本明細書に盛り込んだ、出願人の同時係属中の国際特許出願PCT/AU98/00265号に記載されている。そこに記載された実施形態では、反応メンブレン上に、１００ｐｌまたはその倍数（例えば、１０ｎｌ）の液滴の抗原が各アリコート間に１ｍｍの間隔を置いてプリントされる。しかしながら、この量と距離は、選択される抗原の滴定量とアレイのサイズに応じて増減させてもよい。例えば、１ないし１０ｐｌといったわずかな量の液滴を分注させることも可能である。
【００７０】
特に好ましい実施形態では、１つのサンプルで複数種類のアナライトを定量分析できるように、抗原または抗体が、点状の行列、線状または文字の形にプリントされる。
【００７１】
分注された抗原が乾燥すると、（ニトロセルロース）メンブレンの非特異的タンパク質結合部位が、０．５％（ｖ／ｖ）カゼインリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液＋０．０５％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム＋０．１％（ｖ／ｖ）Tween-20（すなわち、ＰＢＳＡ洗浄用緩衝液）を用いてブロッキングされる。しかしながら、抗原（または抗体）あるいは他のリガンドをプリントした後に、メンブレンをブロッキングしないままにすることも選択肢の１つである。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、患者の静脈内に液体を流入させるのに利用されるシリンジポンプ技術を採用して、ニトロセルロース膜に１本線または複数本の線を描く。
【００７３】
フロースルーフォーマットでの免疫コンジュゲートの使用
免疫コンジュゲート懸濁液の吸光度は、通常、５２０ｎｍの波長で測定される。この値により、コロイド濃度の相対的な尺度が与えられる。コンジュゲート形成条件の知識からも、吸光度１の場合の抗体のコロイドに対する結合度が分かり、この結合度を利用してフロースルー検査で使用する最適量を求めることができる（コロイドｍＬあたりの抗体濃度ｘコンジュゲート量ｘコンジュゲート吸光度）。
【００７４】
ハウジング内で活性メンブレンと接触する前に、フィルタアセンブリ内でプレインキュベートされたサンプルに対して、免疫コンジュゲートが添加される。これにより、サンプル中の最大結合度のアナライトを、コロイドとコンジュゲートを形成した活性抗体に結合させることができる。その後、手順上の対照用抗原がコンジュゲートに結合された二次抗体と結合するのと同時に、混合物がサンプル液にさらされた活性メンブレンから濾過する際に、コンジュゲート−アナライト複合体が、メンブレン上の固定化検査用抗体によって捕捉される。
【００７５】
多重アナライトサンプルの場合、コンジュゲート（検出可能要素）に対する複数種類の抗体は、コンジュゲート化された複数種類の抗体がそれぞれコロイド粒子に対して最適の結合度にありながら、同じ結合度でサンプルアナライトに結合することになる。
【００７６】
−図面の説明−
次に、図面について見ると、図１は、フロースルー検査装置１０を示し、この装置は、上述のニトロセルロース膜を利用している。この装置は、カセット１２と、それに対応する取外し可能なフィルタ枠１４の形をしている。カセット内部には、上述したように、リガンド状の捕捉用アナライトがプリントされたメンブレン（代表的には、ニトロセルロース）１６が存在し、このメンブレンは、吸収材マトリックス１８の上に配置されている。吸収材マトリックスは、吸収性薄葉紙やブロッティング紙など吸収パッドからなる多層構成であることが好ましく、具体的な実施形態では、様々な溶液の最も急速な透過を可能にする理想的な気孔率を有することが分かっている２４層（二重）からなっている。反応特異性が高く、かつ、シグナル分解能が高いほど、バックグラウンドが低くなるので、このような急速な透過は重要である。
【００７７】
図１に示すように、カセットの上部は、その表面の開口と、側面がメンブレン１６の位置まで垂下したほぼ円錐台状の下行ウェルとを形成することによって、傾斜状側面とメンブレン１６によって形成された底面とを有する小室を形成している。
【００７８】
フィルタ部の枠１４は、カセット１２の上面より上方に間隔を置いて配置されている。フィルタ枠１４も、傾斜状側面と５μｍワットマングレード１メンブレンまたはデュラポア０．２２μｍ親水性メンブレンフィルタ（オーストラリア国ノースライドのミリポア(Millipore)社）から形成された底面２２とを有し、「プレインキュベーション室」とも呼ぶ小室２１の形の円錐状下行ウェルを形成している。しかしながら、用途次第では、他の種類のフィルタ／メンブレンや孔径が適する場合もある。メンブレンの機能は、検査対象サンプルを「プレインキュベーション工程」が行われるのに十分な期間だけ、ウェルすなわちプレインキュベーション室２１に留めることである。メンブレン２２がメンブレン１６と接触するまで降下されると、毛細管引力により、サンプルが小室２０からメンブレン２２およびメンブレン１６を介して薄葉紙１８に吸引される。
【００７９】
使いやすくするため、プレインキュベーション工程時にはカセット１２の上方に適切な距離を置いてフィルタ枠１４を支持する一方、図２に示すプロセスの第２段階ではフィルタ枠が押し下げられてメンブレン２２とメンブレン１６を接触状態にする２個のピン２４が設けられている。枠１４は、メンブレン１６を目で観察して検査の結果を判断できるように取外しも可能になっている。
【００８０】
図３ないし図５ｄは、図１および図２の特徴を具現化した市販用検査装置の一構成を示す。
【００８１】
これらの図面において、図１および図２に示す構成要素と同等の構成要素については、同じ参照符号を付している。カセット１２は、上部成形体１２ａと下部成形体１２ｂを備えている。多孔質のメンブレン２２は、フィルタ保持体２３によって所定位置に保持された、型押しされた円錐台状の濾紙２２ａの底部によって形成されている。フィルタ部の枠１４は、２個の窪み１４ａを形成しており、これら窪み１４ａには、フィルタ枠を押し下げて両メンブレン２２および１６を接触させる際に、作業者の親指が押し付けられる。
【００８２】
図５ａないし図５ｄは装置の各操作段階を示す。図５ａは、カセット１２から離れた状態のフィルタ枠を示す。図５ｂは、小室／ウェル２１の底面がメンブレン１６との間に間隔を残した状態のプレインキュベーション工程を示す。図５ｃおよび図５ｄは、フィルタ部がメンブレン２２とメンブレン１６を接触させるまで押し下げられて、サンプルがブロッティング紙１８を透過できるようになった後の装置を示す。
【００８３】
メンブレン２２の代わりに疎水性メンブレンを使用した場合は、メンブレン２２とメンブレン１６とが常に接触状態にある図３および図４に示す位置だけで装置をプレインキュベーション工程で操作することができる。疎水性メンブレン２２は、インキュベーション室２１内のサンプルが反応メンブレン１６に流入することを防止する。小室２１内の検出用アナライトが反応物質と結合するのに十分な時間が経過すると、小室内のサンプルに適切な湿潤剤を添加して、このサンプルが疎水性メンブレンを透過し、反応メンブレン１６を過ぎて吸収材マトリックス２０に流入できるようにする。
【００８４】
−実施例１−
前フィルタ室の適用例
ワットマンメンブレン（紙）またはリーメイ(Reemay)フィルタ（ポリエステル；１ｃｍ2）がフィルタ枠の小室２１に挿入されて、円錐状保持容器（前フィルタ部）が形成される。
【００８５】
サンプル（５０ないし１００μｌ）が、金コロイド（粒径２０ないし５０ｎｍ）に結合された検出用抗体の形の検出用アナライト（５０ないし１００μｌ）とともに、プラスチック製前フィルタ室にピペットで注入される。サンプルは、混合が適切に行われるように静かにピペット注入された後、プレインキュベーション室内で３０秒間金コンジュゲート（吸光度４）とともにプレインキュベートされる。３０秒後、プレインキュベーション室が、検査用カセット１２のウェル２０内に押し込まれる。溶液は、検出領域を含むメンブレン１６に接触すると、下方の吸収材層１８まで濾過される。溶液が濾過されると、前フィルタ１４が廃棄され、その後、反応メンブレンに２滴のＰＢＳＡ洗浄用緩衝液が添加されて、過剰な金コンジュゲートが洗い流され、メンブレン１６上に検査結果が現れる。
【００８６】
サンプルと検出用アナライトとのプレインキュベーションを利用することにより、感度が約１０倍向上する。また、いかなる粒状物質もプレインキュベーション室に保持され、その全体を取り外して明瞭なシグナルを得ることができる。プレインキュベーション工程と前濾過工程を実行する二重の役割を持つプレインキュベーション室を利用することにより、多重アナライトプローブ、例えば、様々な検出用アナライトに結合された金コロイドを用いたプレインキュベーションによって反応メンブレン上での多重アナライト検出が可能になる。さらに、検査中に偽陽性または偽陰性を発生させる恐れのある相互干渉するアナライトまたは物質をプレインキュベーション工程で除去または吸収除去すること、例えば、マウス抗原に対するヒト抗体を抗ＨＡＭＡ抗体によって吸収除去することができる。
【００８７】
上記の実施例は病気関連の抗原に関するものであるが、上記免疫検査装置を、例えば、アレルギー検査キットとして、薬物の乱用や、ヒト以外に由来するサンプルの分析、例えば、ウシ、ブタなど獣医学的検査、および穀物の品質評価などの農業分野での検査などのための検査キットとして使用することができる。
【００８８】
本発明の方法および装置はスワブとともに使用するのに非常に適しており、このスワブは、小室２１内に簡単に入れることができ、前フィルタ部を押し下げてメンブレン２２とメンブレン１６とを接触させる前の３０秒間、金コロイドに結合された検出用抗体（５０ないし１００μｌ）を含有する液体中でかき混ぜることができる。
【００８９】
本発明の装置には、リガンドおよびアナライトのいかなる組合せも適用可能である。リガンドを選択することにより、当該国または当該居住者の間で流行している病気が検出されるように調整することができる。例えば、以下の病気の組合せに基づくアナライトをこのアレイを用いた診断に利用することができる。
１．結核とＨＩＶ
２．Ｂ型およびＣ型肝炎、ＨＩＶ
３．シャーガス病、ＨＩＶ、結核、梅毒、Ｂ型およびＣ型肝炎
４．マラリア、デング熱、結核、シャーガス病
【００９０】
あるいは、様々な種類の小麦や他の農産物に相当する抗原があれば、反応メンブレン上にプリントして、１回の検査で多品種の検出が可能になる。
【００９１】
−実施例２−
上記検査装置は、血漿、血清、尿、唾液、痰など、血液以外の体液中のアナライトの検出にも利用することができる。この場合、サンプルは、上述のワットマングレード１メンブレンまたはデュラポア０．２２μｍ親水性メンブレンフィルタの代わりに、リーメイ(Reemay)フィルタまたはホリングスワース・アンド・ボーズ(Hollingsworth and Vose)社７３０３などの疎水性メンブレンを用いてプレインキュベーション室２２に保持することができる。サンプルは、必要なプレインキュベーション期間の間検出用アナライトと混合される。プレインキュベーション室２２がカセット１２まで押し下げられた時に、吸収材層１８に対して効率的な透過毛細管作用を得るため、２つの手順のうちの一方に従うことができる。
１．捕捉用アナライトを含有したメンブレン１６を、０．０１Ｍのリン酸、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０％アジド、０．５％ツイーン２０(Tween-20)を含んだ洗浄用緩衝剤、または洗浄剤を含有するあらゆる湿潤剤の少なくとも１滴で予め湿潤させる。
２．捕捉用アナライトを含有したメンブレン１６を、蔗糖、トレハロース、果糖、またはグリセロールなどの吸湿溶液でブロッキングする。これにより、メンブレン１６の特性を非吸湿性メンブレンから吸湿性メンブレンに変化させ、プレインキュベーション室２２の底部のメンブレンとメンブレン１６との接触時にサンプルが吸収材層１８まで透過できるようにする。
【００９２】
−実施例３（比較例）−
上述のフォーマットでαアミラーゼを加えたサンプルに対してプレインキュベーションをかけなかった場合と１分間のプレインキュベーションをかけた場合の比較。
【００９３】
手順
６％ウシ血清アルブミン溶液に、０．１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌのαアミラーゼを加え、以下の手順に従って上記の方法に適用させた。
【００９４】
プレインキュベーションなし
１．プレインキュベーション室を押し下げ、その底部をαアミラーゼに対する捕捉用抗体を含んだ第１のメンバーと接触させた。
２．０．５％ツイーン（tween）食塩溶液６０マイクロリットルをプレインキュベーション室に添加し、第１のメンブレンの真下にある吸収材まで濾過させた。
３．αアミラーゼ添加サンプル１００マイクロリットルをプレインキュベーション室に添加し、第１のメンブレンの真下にある吸収材まで濾過させた。
４．０．５％ツイーン（tween）食塩溶液６０マイクロリットルをプレインキュベーション室に添加し、第１のメンブレンの真下にある吸収材まで濾過させた。
５．金コロイド（粒径２０ないし５０ｎｍ）に結合された抗αアミラーゼ抗体６０マイクロリットルをプレインキュベーション室に添加し、第１のメンブレンの真下にある吸収材まで濾過させた。
６．０．５％ツイーン（tween）食塩溶液６０マイクロリットルをプレインキュベーション室に添加し、第１のメンブレンの真下にある吸収材まで濾過させた。
７．プレインキュベーション室を取り外し、反応メンブレン上の結果を濃度計で走査した。シグナル強度を画素強度の形で測定した。
【００９５】
１分間プレインキュベーション
１．０．５％ツイーン（tween）食塩溶液６０マイクロリットルを第１のメンブレンに添加し、真下にある吸収材まで濾過させた。
２．プレインキュベーション室と第１のメンブレンとの間に空間が存在するように、プレインキュベーション室を第１のメンブレンの上方に懸架した。
３．αアミラーゼ添加サンプル１００マイクロリットルと、金コロイド（粒径２０ないし５０ｎｍ）に結合された抗αアミラーゼ抗体６０マイクロリットルをプレインキュベーション室で１分間インキュベートした。
４．プレインキュベーション室を第１のメンブレンと接触するまで降下させ、サンプルと抗体−金コンジュゲートとの混合物を吸収材まで濾過させた。
５．０．５％ツイーン（tween）食塩溶液６０マイクロリットルをプレインキュベーション室に添加し、吸収材まで濾過させた。
６．プレインキュベーション室を取り外し、反応メンブレン上の結果を濃度計で走査した。シグナル強度を画素強度の形で測定した。
【００９６】
グラフ上の各データ点は、上述の装置を用いた二度の実験の平均値である。この結果から、サンプルと検出用アナライトとのプレインキュベーションによる最小検出限界が画素密度でαアミラーゼ約５００ｐｇ／ｍｌに規定されることが分かる。これをプレインキュベーションを行わない場合の最小検出限界５０ｎｇ／ｍｌと比較すると、プレキュベーションによって感度が約１０倍向上することを示している。
【００９７】
−実施例４（比較例）−
サンプルと検出用アナライトとのプレインキュベーションの増加に伴う感度上昇の実証。
【００９８】
０．５％生理食塩水で４００ｎｇ／ｍＬまで希釈されたアミラーゼのサンプルを抗アミラーゼ免疫金コンジュゲートで処理し、以下に示す様々なプロトコルでフロースルーフォーマット上に等分した。
Ａ．（フィルタのない）フォーマットにサンプルを添加し、コンジュゲートの添加前に濾過させた後、サンプルがメンブレンを透過した直後にコンジュゲートのアリコットを添加した。
Ｂ．サンプルを適正な比率で金コンジュゲートと混合し、直ちにフロースルーフォーマット上に分注した。
Ｃ．サンプルをプロトコルＢと同様に添加するが、６０秒の間隔を置いた後にフロースルーフォーマットに添加した。
【００９９】
画素強度で表現された結果を以下の表に示す（実験二回の場合）。
【表１】
2005512090.tif 000002
【表２】
2005512090.tif 000003
【０１００】
アナライトをコンジュゲートプローブとともにプレインキュベートすると、フロースルーフォーマット上の連続的検出と異なって、明らかにサンプルのシグナルが大幅に増加する。サンプルが捕捉用抗体の検出と切り離してプレインキュベートされた場合、検出レベルの差（４００ｎｇ／ｍＬサンプルの場合）は、フロースルーフォーマットで検出可能なアミラーゼで７．５倍ないし１０倍の増加に等しかった。
【０１０１】
上記具体的な実施形態の形で示した本発明に対して、本発明を大略的に記述した本発明の精神または範囲から逸脱することなく幾多の変形および／または変更を行い得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、これらの実施形態は、あらゆる点で本発明の例示としてみなすべきであり、制限するものとみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、本発明の特徴を具体化した装置の第１の構成を示す概略図である。
【図２】図２は、図１の装置の第２の構成を示す概略図である。
【図３】図３は、本発明の特徴を具現化した検査装置、すなわち、カセットの斜視図である。
【図４】図４は、図３に示すカセットの構成要素の分解図である。
【図５ａ】図５ａは、検査を実行する際に図３の装置を使用した様々な段階を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、検査を実行する際に図３の装置を使用した様々な段階を示す。
【図５ｃ】図５ｃは、検査を実行する際に図３の装置を使用した様々な段階を示す。
【図５ｄ】図５ｄは、検査を実行する際に図３の装置を使用した様々な段階を示す。
【図６】図６は、α−amalyseを加えたサンプルによるプレインキュベーションにかけない検査結果と、１分間のプレインキュベーションにかけた検査結果とを比較したグラフである。
【図１】
2005512090.tif 000004
【図２】
2005512090.tif 000005
【図３】
2005512090.tif 000006
【図４】
2005512090.tif 000007
【図５ａ】
2005512090.tif 000008
【図５ｂ】
2005512090.tif 000009
【図５ｃ】
2005512090.tif 000010
【図５ｄ】
2005512090.tif 000011
【図６】
2005512090.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成16年1月6日(2004.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の少なくとも１種類の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質メンブレンを設ける工程と、
第２の多孔質メンブレンによって形成された底部を有する小室に、検査対象の液体サンプルと多重検出用アナライトとを入れる工程と、
上記少なくとも１種類の反応物質が存在する場合に、上記多重検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室の底部を上記第１の多孔質メンブレンと接触させる工程と、
上記サンプルを上記両メンブレンに透過させて、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程を含む方法。
【請求項２】
上記小室を取り外す工程と、上記メンブレンに上記多重検出用アナライトが存在するか否かを検査する前に、上記第１のメンブレンを緩衝液で洗浄する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記小室を取り外して上記第１のメンブレンに上記多重検出用アナライトが存在するか否かを検査する前に、上記小室に緩衝液を加えることによって該緩衝液で上記第１のメンブレンを洗浄する工程をさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
検出対象の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質メンブレンからなり、上面と下面を有する第１の部材と、
吸収材の集団であって、上記第１の部材の下面の下方に配置され、該第１の部材の下面と接触する第２の部材と、
上記第１の部材の上方に間隔を置いて設けられ、側壁と、第２のメンブレンによって形成された底部とを有しており、所定のインキュベーション期間液体サンプルを貯留可能な、液体サンプルを収容する小室と、
上記小室から上記吸収材の集団へ液体を移動させないように上記メンブレンが上記第１の部材から十分な距離を置いて配置される第１の位置と、上記メンブレンが上記第１の部材と接触することにより、上記小室から上記第１および第２のメンブレンを経て上記吸収材の集団へ液体を移動可能にする第２の位置の２つの位置で、上記小室を上記第１の部材の上方に支持する手段とを備えた装置を用いて少なくとも１種類の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記小室を上記第１の位置に配置した状態で、上記小室に検査対象の液体サンプルと多重検出用アナライトとを入れる工程と、
上記反応物質が存在する場合に、上記多重検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室を上記第２の位置まで降下させて、上記小室の底部と上記第１の多孔質メンブレンとを接触させる工程と、
上記サンプルを上記第１および第２のメンブレンに透過させて、上記反応物質が存在する場合に、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程を含む方法。
【請求項５】
上記小室の底部に形成された上記第２のメンブレンは疎水性であり、上記サンプルを上記第１および第２のメンブレンに透過させる工程は、上記小室を上記第２の位置まで移動させる前に、上記第２のメンブレンの上面に湿潤剤を添加することを含んでいる請求項４記載の方法。
【請求項６】
検出対象の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質のメンブレンからなり、上面と下面を有する第１の部材と、
吸収材の集団であって、上記第１の部材の下面の下方に配置され、該第１の部材の下面と接触する第２の部材と、
上記第１の部材の上方に間隔を置いて設けられており、側壁と、上面および下面を有する第２の疎水性のメンブレンによって形成された底部とを有し、上記疎水性メンブレンの下面が上記第１の部材の上面と接触した状態で上記第１の部材の上方に支持されており、上記底部が内部の液体サンプルを所定のインキュベーション期間貯留可能な、液体サンプルを収容する小室を備えた装置を用いて少なくとも１種類の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記小室に、検査対象のサンプルと多重検出用アナライトとを入れる工程と、
上記反応物質が存在する場合に、上記多重検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室に湿潤剤を添加する工程と、
上記サンプルを上記第１および第２の多孔質メンブレンに透過させて、上記反応物質が存在する場合に、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程を含む方法。
【請求項７】
上記サンプルは全血であり、該全血中の全赤血球がフィルタとして作用する上記第２のメンブレンによって上記小室内で除去され、上記全血中の血漿が上記第１のメンブレンに流される請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
上記サンプルは、穀物抽出物、細胞抽出物、微生物抽出物を含む群から選択された粒状物質を含有しており、該粒状物質は、フィルタとして作用する上記第２のメンブレンによって上記小室内で除去される請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
上記サンプルは、血漿、血清、尿、唾液、痰などの体液からなっており、上記第２のメンブレンは、疎水性メンブレンである請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
上記検査対象サンプルのアナライトと上記第１のメンブレン上の捕捉用アナライトとの結合を妨げる、上記サンプル中の不要なアナライトを上記小室内で除去または中和させる工程を含んでいる請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
上記不要なアナライトと結合する抗体または他のアナライトが、上記小室の側壁または底部に結合される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
上記検査対象サンプルは、スワブなどの吸収材表面に担持されており、上記小室に抽出用溶液を入れて上記スワブをかき混ぜる工程を含んでいる請求項１ないし請求項１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
上記多重検出用アナライトは、抗体、リガンドおよび抗原を含む群から選択された検出用化合物を備えている請求項１ないし請求項１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
上記抗体は免疫グロブリンである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上記多重検出用アナライトは２種類以上の抗体を含んでいる請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
上記多重検出用アナライトは３種類以上の抗体を含んでいる請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種類の抗体は対照用抗体である請求項１５または請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記多重検出用アナライトは、金コロイド粒子、ラテックスビーズ、有色色素および炭素コロイドを含む群から選択された検出可能要素を備えている請求項１ないし請求項１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
上記検出可能要素は金コロイド粒子である請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
上記検出可能要素は、有色色素に結合されたラテックスビーズである請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
上記検出可能要素は炭素コロイドである請求項１８記載の方法。
【請求項２２】
上記２種類以上の抗体は、金コロイド粒子に結合される請求項１５記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
第１の広い側面では、本発明は、検査過程に使用される装置および方法であって、反応物質と多重検出用アナライトとを結合させることにより、１種類または複数種類のリガンドが結合された反応メンブレンとサンプル−アナライト複合体とが反応する前に検査感度を向上させるとともに検査に必要なサンプルの量を低減させる効果をもたらす「プレインキュベーション工程」を設けることを特徴とする装置および方法を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
したがって、本発明の一側面では、検査過程に使用される装置であって、
検出対象の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質反応メンブレンからなり、上面と下面を有する第１の部材と、
薄葉紙などの吸収材の集団であって、上記第１の部材の下面の下方に配置され、該第１の部材の下面と接触する第２の部材と、
上記第１の部材の上方に間隔を置いて設けられ、側壁と、第２のメンブレンによって形成された底部とを有しており、所定のインキュベーション期間液体サンプルを貯留可能な、液体サンプルを収容する小室と、
上記小室から上記吸収材の集団へ液体を移動させないように上記メンブレンが上記第１の部材から十分な距離を置いて配置される第１の位置と、上記メンブレンが上記第１の部材と接触することにより、上記小室から上記第１および第２のメンブレンを経て上記吸収材の集団へ液体を移動可能にする第２の位置の２つの位置で、上記小室を上記第１の部材の上方に支持する手段とを備えた装置が提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
それに関連する側面では、本発明は、本発明の装置を用いて液体サンプル中の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記小室を上記第１の位置に配置した状態で、上記小室に検査対象の液体サンプルと検出用アナライトとを入れる工程と、
上記反応物質が存在する場合に、上記検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室を上記第２の位置まで降下させて、上記小室の底部と上記第１の多孔質メンブレンとを接触させる工程と、
上記サンプルを上記第１および第２のメンブレンに透過させて、上記反応物質が存在する場合に、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程を含み、
好ましくは、上記検出用アナライトが多重検出用アナライトである方法を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１種類の所定の反応物質の存在の有無を検査する方法であって、
上記少なくとも１種類の反応物質と結合する捕捉用アナライトが結合された第１の多孔質メンブレンを設ける工程と、
第２の多孔質メンブレンによって形成された底部を有する小室に、検査対象の液体サンプルと多重検出用アナライトとを入れる工程と、
上記少なくとも１種類の反応物質が存在する場合に、上記多重検出用アナライトが上記反応物質と結合するのに十分な時間を経過させる工程と、
上記小室の底部を上記第１の多孔質メンブレンと接触させる工程と、
上記サンプルを上記両メンブレンに透過させて、上記第１のメンブレン上に担持された捕捉用アナライトに上記反応物質を結合させる工程を含む方法を提供する。


【国際調査報告】
2005512090.tif 000013
2005512090.tif 000014
2005512090.tif 000015