(57)【要約】新規なスルファターゼおよびそれに関連するポリペプチド、加えて同一のものをコードする核酸組成物が提供される。本ポリペプチドおよび核酸組成物は、様々な診断的および治療的薬剤のスクリーニングの適用を含む、様々な適用において使用を見出す。特に本スルファターゼの阻害剤を投与することにより、腫瘍誘発血管形成を抑制する方法およびそれに付随する疾患状態を治療する方法もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミン-6-スルファターゼ活性を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
スルファターゼがヒトのスルファターゼである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
スルファターゼが配列番号：03、配列番号：06、配列番号：09、配列番号：12、配列番号：15、および配列番号：18のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項４】
グルコサミン-6-スルファターゼ活性を有するスルファターゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号：03、配列番号：06、配列番号：09、配列番号：12、配列番号：15、および配列番号：18のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項4記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
発現宿主において機能しうる転写開始領域、該転写開始領域の転写制御下において請求項4記載のヌクレオチド配列を有する核酸、および該発現宿主において機能しうる転写終結領域を含む、発現カセット。
【請求項７】
染色体外要素の一部として請求項6記載の発現カセットを含む、もしくは該発現カセットの宿主細胞への導入の結果として宿主細胞のゲノムへと組み込まれた細胞、またはその細胞子孫。
【請求項８】
以下の段階を含む、スルファターゼを生産する方法：
請求項7記載の細胞を増殖させ、それによって該スルファターゼが該細胞により産生される段階；および
該スルファターゼを他のタンパク質を実質的に含まずに単離する段階。
【請求項９】
スルファターゼに特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項１０】
以下の段階を含む、スルファターゼの酵素活性を抑制する薬剤を同定する方法：
請求項1記載のスルファターゼを試験薬剤およびスルファターゼに対する基質に接触させる段階；ならびに
スルファターゼのグルコサミン-6-スルファターゼ活性における効果がある場合、その効果を測定する段階。
【請求項１１】
基質が4-メチルウンベリフェリル硫酸であり、測定が生成される4-メチルウンベリフェロン反応生成物の量を測定することによる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
以下の段階を含む、腫瘍を有する個体において腫瘍誘発血管形成を低下させる方法：
細胞外マトリックスとの結合から血管形成因子を放出するスルファターゼの酵素活性を抑制する薬剤の有効量をその個体に投与し、それにより血管形成を低下させる段階。
【請求項１３】
血管形成における低下が腫瘍増殖における低下を生じる、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
投与が腫瘍の部位においてまたは近くである、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
方法が請求項1記載のスルファターゼポリペプチドの有効量を個体へ投与することを含み、スルファターゼポリペプチドが血管形成を増加させ、それにより虚血性状態を治療する、個体において虚血性状態を治療する方法。
【請求項１６】
以下の段階を含む、組織における癌性細胞の存在を検出する方法：
請求項1記載のスルファターゼをコードする配列を含む宿主組織試料におけるmRNAのレベルを測定する段階；および
該宿主組織試料における該mRNAのレベルを対照値と比較し、対照と比較した該組織試料における細胞でのスルファターゼmRNAレベルの上昇がその組織における癌性細胞の存在を示す段階。
【請求項１７】
特異的なプライマーオリゴヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼを用いてmRNAのcDNAコピーを増幅することによって測定される、請求項16の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、腫瘍を有する個体において腫瘍増殖を低下させる方法：
請求項1記載のスルファターゼの酵素活性を抑制する薬剤の有効量を個体へ投与する段階であって、該スルファターゼが細胞外マトリックスから成長因子を放出する、および該スルファターゼの酵素活性の抑制が腫瘍増殖を低下させる、段階。
【請求項１９】
投与が腫瘍の部位においてまたはその近くである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、個体において癌性細胞の存在を検出する方法：
該個体からの生物学的試料において請求項1記載のスルファターゼポリペプチドのレベルを測定する段階；および
該試料における該ポリペプチドのレベルを対照値と比較し、対照と比較したその生物学的試料における該スルファターゼレベルの上昇が該個体における癌性細胞の存在を示す段階。
【請求項２１】
測定が試料をスルファターゼポリペプチドに特異的な抗体に接触させることによる、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
測定が、スルファターゼの存在下で検出可能な生成物が生成されるように試料をスルファターゼに対する基質に接触させることによる、請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金援助による研究に関する言明
本発明は、国立医療研究所により与えられた助成金番号GM23547号による政府支援でなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、スルファターゼ酵素の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
スルファターゼ酵素は、発生、代謝、および炎症を含む、様々な生理学的過程に関与している。例えば、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)の発生的シグナル伝達機能はそれらの硫酸化状態に依存している。ヒトリソソームのアリールスルファターゼAはスルファターゼファミリーの原型メンバーである。グルコサミン-6-スルファターゼは、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸のリソソーム分解のために必要とされるエキソ加水分解酵素である。これらの酵素は、保存システインの-CH2SH基のアルデヒドへの翻訳後の酸化を必要とし、ホルミルグリシンを生じる。この修飾なしでは、多発性スルファターゼ欠損症として知られるリソソーム蓄積障害により明らかなように、スルファターゼは触媒的に不活性である。例えば、グルコサミン-6-スルファターゼ活性の欠損は、グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸、単糖硫酸および、N-アセチルグルコサミン6-硫酸のリソソーム蓄積ならびに常染色体劣性遺伝病ムコ多糖症IIID型の原因となる。
【０００４】
粘膜の糖タンパク質から硫酸部分を除去するグリコスルファターゼが単離および同定されている。さらに、ヒトグルコサミン-6-スルファターゼが単離および特異的に同定され、それをコードするcDNAが得られている。最終的に、N-アセチルガラクトサミン-6-硫酸/ガラクトース-6-硫酸スルファターゼを単離および特異的に同定された。
【０００５】
血管形成および脈管形成は、血管の増殖に関係する過程である。血管形成は、新しい血管が現存する毛細血管から形成される過程であり、一方、脈管形成は、内皮前駆細胞から派生する脈管の増殖を含む。血管形成および脈管形成、ならびにこれらの過程を調節する因子は、胚発生、炎症、および創傷治癒において重要である。しかしながら、血管形成および脈管形成はまた、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、慢性関節リウマチ、および慢性炎症性疾患のような病的状態の一因となっている(例えば、米国特許第5,318,957号；Yancopoulosら、(1998) Cell 93:661〜664；Folkmanら、(1996) Cell 87:1153〜1155；およびHanahanら、(1996) Cell 86:353〜364)参照。例えば、腫瘍付近での新しい血管の発生は、腫瘍を増殖させ、転移を可能にする。
【０００６】
異なる性質および作用機構を有するいくつかの血管形成剤および/または脈管形成剤は、当技術分野において周知である。例えば、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子(FGF)、トランスフォーミング成長因子アルファ(TGF-α)およびベータ(TGF-β)、腫瘍壊死因子(TNF)、血小板由来成長因子(PDGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、ならびにアンジオゲニンは強力な明確に特徴付けられた血管形成促進剤である。
【０００７】
癌、虚血性状態、および炎症を処置するための治療の有効性にもかかわらず、これらの疾患と闘うためのさらなる手段に対する必要が存在している。本発明は、この要求に取り組む。
【０００８】
文献
Parentiら、(1997) Curr. Opinion Genet. Devel. 7:386〜391; Bergersら、(2000) Nature Cell Biol. 2:737〜744; Lukatelaら、(1998) Biochem. 37:3654; Knaustら、(1998) Biochem. 37:13941; Robertsonら、(1992) Biochem J. 288:539; Robertsonら、(1993) Biochem J. 293:683〜689; Robertsonら、(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun., 157:218〜224; Tomatsuら、(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181:677〜683; Folkmanら、(1992) Seminars in Cancer Biology 3:89〜96; Dhootら、(2001) Science 293:1663〜1666。米国特許第5,925,349号; および第5,695,752号。国際公開公報第98/53071号; 第99/54448号; 第99/63088号; 第00/06086号; 第01/00828号; 第01/02568号; 第01/40269号; 第01/42467号; 第01/59127号; 第01/57058号; 第01/21640号。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
新規のスルファターゼおよびそれらに関連するポリペプチド、加えて、同じものをコードする核酸組成物が提供される。本ポリペプチドおよび核酸組成物は、診断的適用、および治療剤のスクリーニングの適用を含む様々な適用において、加えて、様々な疾患状態の治療において、使用を見出す。また、スルファターゼ酵素活性を調節する方法、およびそれに関連する疾患状態を特にその新規なスルファターゼの阻害剤を投与することにより治療する方法が、提供される。
【００１０】
定義
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、任意の長さのヌクレオチドの重合体の形を指すために本明細書において交換可能に用いられる。ポリヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらの類似体を含みうる。ヌクレオチドは任意の三次元構造をもちうり、既知または未知の任意の機能をなしうる。用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖、二本鎖、および三重らせん状分子を含む。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、一本鎖または二本鎖DNAの約5ヌクレオチドと約100ヌクレオチドの間のポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的に関して、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして知られており、遺伝子から単離される、または当技術分野において公知の方法により化学的に合成されうる。
【００１１】
以下は、ポリヌクレオチドの非限定的態様である：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。核酸分子はまた、メチル化核酸分子および核酸分子類似体のような修飾された核酸分子を含む。プリンおよびピリミジンの類似体は当技術分野において公知である。核酸は、天然に存在する、例えば、DNAもしくはRNAでありうり、または当技術分野において知られているような、合成的な類似体でありうる。そのような類似体は、アッセイ条件下における優れた安定性のため、プローブとしての使用に好ましい場合がある。細胞内安定性および結合親和性を増加させる、骨格、糖、または複素環塩基における変化を含む、天然構造における改変が明らかにされている。骨格化学における有用な変化の中には、ホスホロチオネート；両方の非架橋酸素がイオウで置換されているホスホロジチオネート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートがある。アキラルのホスフェート誘導体は、3'-O'-5'-S-ホスホロチオネート、3'-S-5'-O-ホスホロチオネート、3'-CH2-5'-O-ホスホネートおよび3'-NH-5'-O-ホスホロアミダイトを含む。ペプチド核酸は、リボースホスホジエステルの骨格全体をペプチド結合で置換している。
【００１２】
糖の修飾はまた、安定性および親和性を増強させるために用いられる。デオキシリボースのα-アノマーが用いられることができ、その塩基が天然のβ-アノマーについて転化されている。リボース糖の2'-OHは、親和性を含むことなく、2'-O-メチルまたは2'-O-アリル糖を形成し、改変され、これは分解に対して抵抗性を与える。
【００１３】
複素環塩基の修飾は、正確な塩基対合を維持しなければならない。いくつかの有用な置換は、デオキシチミジンの代わりにデオキシウリジン；デオキシシチジンの代わりに5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-2'-デオキシシチジンを含む。5-プロピニル-2'-デオキシウリジンおよび5-プロピニル-2'-デオキシシチジンは、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンをそれぞれ、置換される場合、親和性および生物学的活性を増加させることが明らかにされている。
【００１４】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に用いられるが、任意の長さのアミノ酸の重合体の形を指し、コード化および非コード化アミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチドバックボーンを有するポリペプチドを含むことができる。その用語は、限定されるものではないが、異種性アミノ酸配列との融合タンパク質、N末端のメチオニン残基の含有または非含有の、異種性および同種性のリーダー配列を有する融合体；免疫学的にタグを付けられたタンパク質などを含む融合タンパク質を含む。
【００１５】
「実質的に単離された」または「単離された」ポリヌクレオチドは、天然においてそれが付随している配列を実質的に含有しないものである。実質的に含有しないとは、天然においてそれが付随している物質の少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、およびさらにより好ましくは少なくとも90％を含有しないことを意味する。本明細書において用いられる場合、「単離された」ポリヌクレオチドはまた、起源または操作によって、(1)天然においてそれが付随するポリヌクレオチドの全部または部分を付随しない、(2)天然においてそれが結合しているもの以外のポリヌクレオチドに結合している、または(3)天然には存在しないという、組換えポリヌクレオチドを指す。
【００１６】
ハイブリダイゼーション反応は、異なる「ストリンジェント性」の条件下で行われうる。当技術分野において広く知られ、かつ発表されているハイブリダイゼーション反応のストリンジェント性を増加させる条件。例えば、Sambrookら、(1989)を参照。関連性のある条件の例(ストリンジェント性を増加させるための)は：25℃、37℃、50℃および68℃のインキュベーション温度；10 x SSC、6 x SSC、1 x SSC、0.1 x SSC(1 x SSCは、0.15 M NaClおよび15 mMクエン酸緩衝液である)の緩衝液濃度および他の緩衝系を用いるそれらの等価物；0％、25％、50％、および75％のホルムアミド濃度；5分から24時間までのインキュベーション時間；1回、2回、またはそれ以上の洗浄段階；1分、2分、または15分の洗浄インキュベーション時間；および6 x SSC、1 x SSC、0.1 x SSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、50℃またはそれより高温かつ0.1 x SSC(15 mM塩化ナトリウム/1.5 mMクエン酸ナトリウム)でのハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもう一つの例は、溶液：50％ホルムアミド、1 x SSC(150 mM NaCl、15 mMクエン酸ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5 x デンハート液、10％デキストラン硫酸、および20 μg/ml変性、剪断されたサケ精子DNAにおいて、42℃で一晩、インキュベーション、続いて、約65℃で0.1 x SSCにおいてそのフィルターを洗浄することである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも上記の典型的な条件と同じくらいストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件である。他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当技術分野において公知であり、同じく、本発明の特定の態様の核酸を同定するために使用されうる。
【００１７】
「Tm」は、ワトソン-クリックの塩基対合により逆平行の方向に水素結合している相補的鎖からなるポリヌクレオチド二重鎖の50％がその実験の条件下において一本鎖へ解離する摂氏度における温度である。Tmは、以下のような標準的式により、予測されうる：
Tm = 81.5 + 16.6 log[X+] + 0.41 (％ G/C) - 0.61 (％ F) - 600/L
【００１８】
[X+]は、モル/Lにおける陽イオン濃度(通常、ナトリウムイオン、Na+)；(％ G/C)は、その二重鎖における全残基のパーセンテージとしてのGおよびC残基の数である；(％ F)は、溶液(重量/容量)におけるホルムアミドのパーセントである；およびLは、その二重鎖の各鎖におけるヌクレオチドの数である。
【００１９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、もう一つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、あるパーセントの「配列同一性」をもち、整列した場合、その2つの配列をを比較すると、塩基またはアミノ酸のそのパーセンテージが同じであることを意味する。配列類似性は、多数の異なる方法において決定されうる。配列同一性を決定するために、配列を、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でのワールドワイドウェブを通じて入手可能なBLASTを含む、方法およびコンピュータープログラムを用いて整列させることができる。もう一つのアラインメントアルゴリズムは、FASTAであり、マディソン、ウィスコンシン、USA、オックスフォードモレキュラーグループ社(Oxford Molecular Group, Inc.)の全額出資の子会社からのジェネティックスコンピューティンググループ(Genetics Computing Group)(GCP)パッケージにおいて入手可能である。アラインメントについての他の技術は、Methods in Enzymology, 266巻: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis, (1996), Doolittle編、Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USAに記載されている。特に関心のある対象としては、配列にギャップを許容しているアラインメントプログラムである。スミス-ウォーターマン(Smith-Waterman)は、配列アラインメントにおいてギャップを許容するアルゴリズムの1つの型である。Meth. Mol. Biol. 70:173〜187 (1997)を参照。また、NeedlemanとWunschのアラインメント法を用いるGAPプログラムは、配列を整列させるために利用されうる。J. Mol. Biol. 48:443〜453 (1970)を参照。
【００２０】
対象となるのは、配列同一性を決定するためのスミスウォーターマンの局所的相同性アルゴリズムを用いるベストフィット(BestFit)プログラムである(Advances in Applied Mathematics 2:482〜489 (1981))。ギャップ生成ペナルティは、一般的に1から5までの範囲、通常2から4までであり、多くの態様においては3である。ギャップ拡張ペナルティは一般的に約0.01から0.20までの範囲であり、多くの例においては0.10である。プログラムは、比較されるために入力された配列により決定されるデフォルトパラメーターをもつ。好ましくは、配列同一性は、プログラムにより決定されるデフォルトパラメーターを用いて決定される。このプログラムは、マディソン、ウィスコンシン、USAからのジェネティックスコンピューティンググループ(Genetics Computing Group)(GCP)パッケージからも入手可能である。
【００２１】
対象となるもう一つのプログラムは、ファストDB(FastDB)アルゴリズムである。ファストDBは、Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc.に記載されている。パーセント配列同一性は、次のパラメーターに基づくファストDBにより計算される：
ミスマッチペナルティ：  1.00；
ギャップペナルティ：  1.00；
ギャップサイズペナルティ：  0.33；および
連結ペナルティ：  30.0
【００２２】
パーセント配列同一性を決定するための1つのパラメーターは、最強のアラインメントが見出される「アラインメント領域の長さのパーセンテージ」である。
【００２３】
アラインメント領域の長さのパーセンテージは、最強のアラインメントの領域に見出される個々の配列の残基の数を数えることにより計算される。この数を標的または質問ポリヌクレオチド配列の全残基の長さで割ると、パーセンテージが見出される。例は、下記に示されている：
2005505237.tif 000002
【００２４】
アラインメントの領域は、残基9で始まり、残基19で終わる。標的配列の全長は、20個の残基である。アラインメント領域の長さのパーゼントは、例えば、11を20で割る、すなわち55％である。
【００２５】
パーセント配列同一性は、標的および質問ポリヌクレオチド配列の間の残基整合の数を数える、そして整合の合計数を最強のアラインメントの領域において見出される標的または質問配列の残基の数で割ることにより計算される。上記の例では、パーセント同一性は、10個の整合を11個の残基で割ることになり、すなわちおよそ90.9％である。
【００２６】
アラインメント領域の長さのパーセントは、典型的には、配列の全長の少なくとも約55％であり、より典型的には少なくとも約58％、およびさらにより典型的には少なくとも配列の全残基の少なくとも約60％である。通常、アラインメント領域のパーセント長は、約62％ほどの大きさ、より通常には約64％ほど、およびさらにより通常には約66％ほどでありうる。
【００２７】
DNA/DNAおよびDNA/RNAの両方のハイブリダイゼーションについてのストリンジェントな条件は、Sambrookら、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989により記載されているとおりであり、参照として本明細書に組み入れられている。例えば、Sambrookのページ7.52を参照。
【００２８】
用語「宿主細胞」は、本発明の任意の組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントでありうるまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、かつその子孫は、自然の、偶発的な、または意図的な変異および/または変化のため、最初の親細胞に必ずしも、完全に一致しない可能性がある。宿主細胞は、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドで、インビボまたはインビトロにおいてトランスフェクションされたまたは感染した細胞を含む。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
【００２９】
抗体結合の関連における用語「特異的に結合する」は、特定のポリペプチド、すなわちスルファターゼポリペプチドのエピトープへの抗体の高結合活性および/または高親和性の結合を指す。特定のスルファターゼポリペプチド上のエピトープ(本明細書においては「スルファターゼエピトープ」とも呼ばれる)への抗体の結合は、好ましくは、どの他のエピトープ、特に、関連している分子内において、または対象となるその特定のポリペプチドと同じ試料内において存在しうるエピトープへのその同じ抗体の結合よりも強く、例えば、結合条件を調整することにより、その特定のスルファターゼエピトープに対して、かつどの他のスルファターゼエピトープに対してでもなく、かつそのエピトープを含まないどの他のスルファターゼポリペプチドに対してでもなく、その抗体がほとんど独占的に結合するような、異なるスルファターゼエピトープへよりも特定のスルファターゼエピトープへ強く結合する。本ポリペプチドへ特異的に結合する抗体は、弱いが、まだ検出可能なレベルで(例えば、対象となるポリペプチドに対して示される結合の10％またはそれ未満)、他のポリペプチドに結合する能力がある場合もある。そのような弱い結合、すなわちバックグラウンド結合は、例えば、適当な対照の使用により、その特異的抗体の本ポリペプチドへの結合から容易に識別できる。一般的に、本発明の抗体は、特定のスルファターゼポリペプチドに、10-7 Mまたはそれ以上、好ましくは10-8 Mまたはそれ以上(例えば、10-9 M、10-10 M、10-11 Mなど)の結合親和性をもって結合する。一般的に、10-6 Mまたはそれ未満の結合親和性をもつ抗体は、現今使用される通常の方法体系を用いる検出可能レベルにおいてそれが抗原を結合しないのでは、役に立たない。
【００３０】
「生物学的試料」は、個体から得られる様々な試料タイプを含み、診断的またはモニターするアッセイにおいて使用されうる。定義は、生物学的起源の血液および他の液体試料、組織診検体もしくは組織培養のような固体組織試料、またはそれら由来の細胞およびそれらの子孫を含む。定義はまた、試薬での処理、可溶化、またはポリヌクレオチドのような特定の成分についての濃縮によるような、獲得後に任意の方法において操作されている試料を含む。用語「生物学的試料」は、臨床的試料を含み、ならびにまた、培養された細胞、細胞上清、細胞可溶化物、血清、血漿、生物学的液体、および組織試料を含む。
【００３１】
用語「血管形成」は、新しい脈管の発生を含む組織脈管化の過程を指す。血管形成は、3つの機構：(1)内皮細胞が先に存在する脈管から外へ移動し、新しい脈管の形成を始める、新血管新生；(2)脈管が新たに前駆細胞から発生する、脈管形成；または(3)存在している小さな脈管の直径が大きくなって、より大きな脈管を形成する、管拡大の1つにより、起こる(Bloodら、(1990) Biochem. Biophys. Acta. 1032:89〜118)。
【００３２】
用語「癌(cancer)」、「新生物(neoplasm)」、「腫瘍(tumor)」、および「癌腫(carcinoma)」は、細胞増殖の制御の著しい喪失により特徴付けられる異常型増殖の表現型を現すような、相対的に自律的増殖を示す細胞を指すために、本明細書において交換可能に用いられる。癌の細胞は、良性または悪性でありうる。
【００３３】
本明細書に用いられる場合、用語「処置」、「処置すること」などは、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患またはそれの症状を完全にまたは部分的に防ぐという点から見ると予防的でありうる、ならびに/または疾患および/もしくはその疾患に帰する有害な作用についての部分的または完全な治癒の点から見ると治療的でありうる。本明細書に用いられる場合、「処置」は、哺乳動物、特に人間における疾患のどんな処置も網羅し、かつ(a)その疾患に罹っているとまだ診断されていないがその疾患に罹りやすい可能性がある対象においてその疾患が発生するのを防ぐこと；(b)その疾患を抑制すること、すなわちその発生を阻止すること；および(c)その疾患を軽減すること、すなわちその疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００３４】
用語「個体」、「対象」、「宿主」および「患者」は、本明細書において交換可能に用いられ、限定されるものではないが、マウス、サル、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、哺乳類の農場用動物、哺乳類の競技用動物、および哺乳類のペットを含む、哺乳動物を指す。
【００３５】
本発明をさらに記載する前に、本発明が記載される特定の態様に限定されず、それ自体、もちろん、変わりうることは、理解されるべきである。本明細書において用いられる用語は、特定の態様のみを記載することの目的のためのものであり、かつ本発明の範囲は添付される特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるゆえ、限定しようとするものではないこともまた理解されるべきである。
【００３６】
値の範囲が与えられているところにおいて、その範囲の上限および下限とその定まった範囲での任意の他の定まったまたは間にある値の間において、その文脈が明らかに別なように指図しない限りその下限の単位の10分の1ごとに、それぞれ間にある値が本発明の範囲内に含まれることは、理解されている。これらの小さい方の範囲の上限および下限は、その小さい方の範囲において非依存的に含まれうり、かつまた、その定まった範囲において任意の特に除外された限界を条件として、本発明の範囲内に含まれる。定まった範囲が限界の1つまたは両方を含むところにおいて、それらの含まれる限界の一方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００３７】
特に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の業者に一般に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されるものと類似したまたは等価のどんな方法および材料もまた本発明の実施または試験に用いられうるが、好ましい方法および材料を今、記載している。本明細書に言及されているすべての刊行物は、その刊行物が引用されていることに関連する方法および/または材料を開示および記載するために参照として本明細書に組み入れられている。
【００３８】
本明細書および添付された特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「および(and)」、および「その(the)」は、その文脈が明らかに特に指図しない限り、複数形の指示対象を含む。このように、例えば、「1つのスルファターゼ(a sulfatase)」の指示するものは、そのようなスルファターゼの複数を含み、「その薬剤」の指示するものは、1つまたは複数の薬剤および当業者に公知のそれらの等価物の指示するものを含むなど。
【００３９】
本明細書で論議される刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示としてだけに提供される。本発明が、先発明によるそのような刊行物に先立つことの資格がないことの承認として解釈されるべきことは本明細書にはない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なっている場合があり、自主的に確認される必要があるかもしれない。
【００４０】
発明の詳細な説明
概観
スルファターゼは、糖タンパク質、スルホリピド、およびプロテオグリカンから硫酸基を放出する酵素のファミリーである。本発明は、新規スルファターゼおよびそれらに関連するポリペプチド、加えて、その同じものをコードする核酸組成物を提供する。本ポリペプチドおよび/または核酸組成物は、様々な診断的および治療的薬剤のスクリーニング/発見/調製の適用を含む、様々な異なる適用において使用を見出す。
【００４１】
多くの態様において、本発明の新規スルファターゼは、以下の性質の1つまたは複数を示す：(1)グルコサミン-6-スルファターゼ活性を示す；(2)内部のグルコサミンのC-6位から、加えて多糖の非還元末端でのグルコサミンから硫酸基を除去する、エンドスルファターゼである；(3)糖タンパク質および/またはプロテオグリカンから硫酸基を除去する；(4)真核細胞から分泌される；(5)細胞外マトリックス(ECM)成分に作用して硫酸基を除去し、その結果としてECMからの細胞外分化因子および/または成長因子の放出を生じる；(6)スルファターゼをコードするmRNAは腫瘍において発現の上昇を示す；および(7)同じ細胞および/または組織型の癌ではない細胞と比較して、癌の細胞からより多量に分泌される。
【００４２】
本スルファターゼは、正常の組織と比較して、腫瘍において上昇したレベルで発現される。どんな特定の理論にも結び付けることを求めることもなく、本スルファターゼが腫瘍細胞から分泌され、かつECMの成分に作用して、血管形成因子を含む、1つまたは複数の分化因子または成長因子を放出すると考えられる。血管形成因子は、その後、局在性内皮細胞に作用して、血管形成を促進し、その結果として腫瘍の脈管構造、およびそれゆえの血液供給へのアクセスを生じる。腫瘍の脈管構造へのアクセスを減らすことにより、腫瘍増殖を低下させることができる。
【００４３】
ポリペプチド組成物
新規スルファターゼ、およびそれに関連するポリペプチド組成物が提供される。本発明は、その天然の環境以外において存在するスルファターゼを提供する。本発明の新規スルファターゼは、SULF1およびSULF2を含む。いくつかの態様において、本スルファターゼは、ヒトのスルファターゼである。他の態様において、本スルファターゼは、マウスのスルファターゼである。
【００４４】
特別な態様において、本スルファターゼは、配列番号：03、配列番号：06、配列番号：09、配列番号：12、配列番号：15、および配列番号：18のいずれか1つの配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。他の特別な態様において、本スルファターゼは、図1B、図2B、図3B、図4B、図10B、および図11Bに描かれる配列のいずれか1つに実質的に同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４５】
多くの態様において、本発明の新規スルファターゼは、以下の性質の1つまたは複数を示す：(1)グルコサミン-6-スルファターゼ活性を示す；(2)内部のグルコサミンのC-6位から、加えて多糖の非還元末端でのグルコサミンから硫酸基を除去する、エンドスルファターゼである；(3)糖タンパク質および/またはプロテオグリカンから硫酸基を除去する；(4)真核細胞から分泌される；(5)細胞外マトリックス(ECM)成分に作用して硫酸基を除去し、その結果としてECMからの細胞外分化因子および/または成長因子の放出を生じる；(6)スルファターゼをコードするmRNAは腫瘍において発現の上昇を示す；および(7)同じ細胞および/または組織型の癌ではない細胞と比較して、癌の細胞からより多量に分泌される。
【００４６】
本発明はまた、本スルファターゼの断片を提供する。いくつかの態様において、断片はスルファターゼ活性を示す。断片は、完全長のスルファターゼに対する抗体を作製することにおいて；ならびに結合するおよび/またはスルファターゼ酵素活性を調節する候補薬剤についてのスクリーニング方法において利用を見出せる。本明細書に用いられる場合、用語「スルファターゼポリペプチド組成物」は、完全長のヒトタンパク質、加えてそれの部分または断片の両方を指す。この用語において、天然に存在するヒトタンパク質の変異体で、そのような変異体がその天然に存在するタンパク質と相同的または実質的に類似している変異体、下記により詳細に記載されているが、加えて、他の哺乳類の種のような非ヒトの種由来の対応する相同体も含む。本発明の以下の記載において、用語「SULF1」および「SULF2」は、これらの新規スルファターゼのヒト型だけでなく、非ヒトの種において発現されるそれらの相同体もまた指すのに用いられる。
【００４７】
ヒトSULF1(huSULF1)は、図1Bに示され、かつ配列番号：03として同定されるアミノ酸配列を有する871個のアミノ酸タンパク質である。HuSULF1は、約80 kDa〜約100 kDaのそのアミノ酸に基づく分子量をもつ。
【００４８】
ヒトSULF2(huSULF2)は、図2Bに示され、かつ配列番号：06として同定されるアミノ酸配列を有する870個のアミノ酸タンパク質である。HuSULF2は、約80 kDa〜約100 kDaのそのアミノ酸に基づく分子量をもつ。いくつかの態様において、本スルファターゼは、図10Bに示され、かつ配列番号：15において示されるアミノ酸配列を有する。
【００４９】
マウスSULF1(mSULF1)は、図3Bに示され、かつ配列番号：09において示されるアミノ酸配列を有する870個のアミノ酸タンパク質である。
【００５０】
マウスSULF2(mSULF2)は、図4Bに示され、かつ配列番号：12において示されるアミノ酸配列を有する875個のアミノ酸タンパク質である。いくつかの態様において、本スルファターゼは、図11Bに示され、かつ配列番号：18において示されるアミノ酸配列を有する。
【００５１】
本スルファターゼは、それらのアミノ酸配列に基づき80 kDaと100 kDaの間の分子量をもつ。真核細胞により産生された本スルファターゼはグリコシル化されており、いくつかの態様において、約126 kDaの分子量をもつ。さらに、いくつかの態様において、本スルファターゼは、タンパク質分解的に切断され、約60 kDaから約70 kDaまで(例えば、61 kDa、66 kDa、71 kDa)；約48 kDaから約55 kDaまで(例えば、49 kDa、53 kDa)；または約40 kDaから約55 kDaまで(例えば、40 kDa、49 kDa、53 kDa)の断片を生じる。これらの断片の多数またはこれらの断片の群集は、スルファターゼ活性を有する。
【００５２】
上記の具体的に列挙されたタンパク質に加えて、他種由来のスルファターゼもまた提供され、齧歯動物（例えばマウス、ラット）；家畜（例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ）；およびヒトのような哺乳動物、加えて非哺乳類の種、例えば、トリなどを含む。相同体とは、上記の具体的に列挙されたスルファターゼの1つと、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、もしくは少なくとも約95％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性をもつタンパク質を意味し、「GAP」プログラム(ジェネティックスコンピューターグループ社(the Genetics Computer Group, Inc.)(マディソン、WI)を通して入手可能なウィスコンシンシーケンスアナリシスパッケージ(the Wisconsin Sequence Analysis Package)の一部)を用いることにより測定され、そのパラメーターは、ギャップの重み：12；長さの重み：4である。対象となる多くの態様において、相同性は、少なくとも75％、通常には少なくとも80％、およびより通常には少なくとも85％になり、対象となる特定の態様において、相同性は90％くらいの高さになるものと思われる。
【００５３】
また、上記に列挙されたタンパク質と実質的に同一であるスルファターゼタンパク質も提供され、実質的に同一とは、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも98％の上記に列挙されたタンパク質の配列の1つとのアミノ酸配列同一性をもつことを意味する。
【００５４】
本発明のタンパク質(例えば、SULF1、SULF2、huSULF1、huSULF2、mSULF1、mSULF2など)は、自然発生ではない環境に存在する、例えば、それらの自然発生の環境から隔離されている。特定の態様において、本タンパク質は、その自然発生の環境と比較して、本タンパク質について濃縮されている組成物中に存在する。例えば、精製されたスルファターゼが提供されるが、精製されたとは、そのスルファターゼが非スルファターゼタンパク質を実質的に含まない組成物中に存在することを意味し、実質的に含まないとは、その組成物の90％未満、通常には60％未満、およびより通常には50％未満が非スルファターゼタンパク質から構成されることを意味する。
【００５５】
本発明のタンパク質はまた、単離物として存在しうり、単離物とは、そのタンパク質が他のタンパク質ならびにオリゴ糖、多糖およびそれらの断片などのような他の自然発生の生物学的分子を実質的に含まないことを意味し、この場合の実質的に含まないとは、その単離されたタンパク質を含む組成物の70％未満、通常には60％未満およびより通常には50％未満がいくつかの他の自然発生の生物学的分子であることを意味する。特定の態様において、そのタンパク質は、実質的に純粋な形で存在し、実質的に純粋の形とは、少なくとも95％、通常には少なくとも97％およびより通常には少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００５６】
天然に存在するタンパク質に加えて、天然に存在するタンパク質から変異するポリペプチド(例えば、huSULF1、huSULF2、mSULF1、mSULF2など)もまた提供される。SULF1およびSULF2ポリペプチドは、SULF1およびSULF2遺伝子の読み取り枠(ORF)によりコードされるアミノ酸配列を意味し、下記により詳細に記載されているが、完全長SULF1およびSULF2タンパク質およびそれの断片、特に生物学的活性のある断片および/または機能的ドメインに対応する断片、例えば、スルファターゼ活性部位を含む；および本ポリペプチドの他のタンパク質またはそれらの部分への融合体を含む。融合タンパク質は、本ポリペプチド、またはそれの断片、およびその本SULFポリペプチドのN末端および/またはC末端においてインフレームで融合された非SULFポリペプチド(「融合パートナー」)を含みうる。
【００５７】
融合パートナーは、限定されるものではないが、その融合パートナーに特異的な抗体に結合できるポリペプチド(例えば、エピトープタグ、例えば、赤血球凝集素(HA；例えば、CYPYDVPDYA；配列番号：19)、FLAG(例えば、DYKDDDDK；配列番号：20)、c-myc(例えば、CEQKLISEEDL；配列番号：21)など)；検出可能なシグナルを供給するポリペプチド(例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、花中綱種由来の蛍光タンパク質；β-ガラクトシダーゼ；ルシフェラーゼなど)；触媒機能を供給するまたは細胞応答を誘導するポリペプチド；原核細胞からのその融合タンパク質の分泌のために備えるポリペプチド；金属イオンへの結合のために備えるポリペプチド(例えば、Hisn、n = 3〜10、例えば、6His)などを含む。
【００５８】
いくつかの態様において、本発明のSULFポリペプチドは、配列番号：3、配列番号：6、配列番号：9、配列番号：12、配列番号：15、および配列番号：18のいずれか1つに、ならびに図1B、図2B、図3B、図4B、図10B、および図11Bに示される配列の1つの少なくとも約10個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、少なくとも約50個、少なくとも約75個、少なくとも約100個、少なくとも約150個、少なくとも約200個、少なくとも約250個、少なくとも約300個、少なくとも約350個、少なくとも約400個、少なくとも約450個、少なくとも約500個、少なくとも約550個、少なくとも約600個、少なくとも約650個、少なくとも約700個、少なくとも約750個、少なくとも約800個、少なくとも約850個の近接するアミノ酸の、配列番号：3、配列番号：6、配列番号：9、配列番号：12、配列番号：15、および配列番号：18のいずれか1つに、ならびに図1B、図2B、図3B、図4B、図10B、および図11Bに示される全体のアミノ酸配列までを含む。
【００５９】
本ポリペプチドの断片、加えて、そのような断片を含むポリペプチドもまた提供される。対象となるSULF1およびSULF2の断片は、典型的には、長さが少なくとも約10個のアミノ酸、通常には長さが少なくとも約50個のアミノ酸であり、かつ300個のアミノ酸くらい長いまたはそれ以上である場合もあり、その断片は、長さが少なくとも約10個のアミノ酸、通常では少なくとも約15個のアミノ酸、多くの態様においては少なくとも約50個のアミノ酸の本タンパク質と同一であるアミノ酸のひと続きを有するものである。
【００６０】
対象となる特定の断片は、第1スルファターゼドメイン；親水性ドメイン；および第2スルファターゼドメインを含む。第1スルファターゼドメインは、約アミノ酸42位から約アミノ酸389位までを含む；親水性ドメインは、長さが約370個のアミノ酸であり、約アミノ酸370位から約740位までを含む；および第2スルファターゼドメインは、長さがおよそ70個のアミノ酸であり、約アミノ酸766位から約アミノ酸837位までを含む。第1スルファターゼドメインは、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンおよび関連した複合糖質内のN-アセチルグルコサミン-6-硫酸またはグルコサミン-6-硫酸構造から硫酸部分を切断する。親水性ドメインは、細胞表面に、または酵素についての基質に結合する。第2スルファターゼドメインは、グルコサミンおよびN-アセチルグルコサミン糖の硫酸の認識に関与している。
【００６１】
従って、いくつかの態様において、本スルファターゼ断片は、配列番号：03、配列番号：06、配列番号：09、配列番号：12、配列番号：15、もしくは配列番号：18、またはそれらの変異体、特に保存されたアミノ酸置換を含む変異体のいずれか1つの約アミノ酸40位から約アミノ酸390位まで、約アミノ酸370位から約アミノ酸740位まで、または約アミノ酸760位から約アミノ酸840位である。本発明は、例えば、異種タンパク質にインフレームで(直接的または間接的に)融合された本スルファターゼ断片を含む融合ポリペプチドを含む、そのような断片を含むポリペプチドを提供する。適する異種タンパク質は、限定されるものではないが、検出可能なマーカー(例えば、蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ)としての役割を果たすタンパク質；免疫学的に検出可能なタンパク質(例えば、エピトープタグ)；および構造タンパク質を含む。
【００６２】
第1スルファターゼドメイン内には、フラン/PACEプロテアーゼプロセシング酵素についての切断部位がある。この切断は、hsulf-1の残基408位(アルギニン)と409位(アスパラギン酸)の間および/または576位(アルギニン)と577位(ヒスチジン)の間で起こる。この切断は、hsulf-2の409位(アルギニン)と410位(アスパラギン酸)の間および/または423位(アルギニン)と424位(アスパラギン酸)の間および/または538位(アルギニン)と539位(セリン)の間および/または565位(アルギニン)と566位(ヒスチジン)の間に起こる。切断は、酵素の活性に必要である。従って、多くの態様において、本スルファターゼは、1つまたはそれ以上のフラン/PACE切断部位で切断される。このように、多くの態様において、本スルファターゼは、約1位から約アミノ酸408位または409位まで(例えば、第1フラン/PACE切断部位まで)のアミノ酸を含む。
【００６３】
上記のもののようなスルファターゼ断片は、スクリーニングアッセイにおいて、本スルファターゼの活性を調節する薬剤を同定するのに有用である。スクリーニングアッセイは、より詳細には下に記載されている。例えば、第1スルファターゼドメインを含むポリペプチドは、スクリーニングアッセイにおいて、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンおよび関連した複合糖質内のN-アセチルグルコサミン-6-硫酸またはグルコサミン-6-硫酸構造からの硫酸部分の切断を調節する薬剤を同定するために用いられる。親水性ドメインを含むポリペプチドは、スクリーニングアッセイにおいて、プロテオグリカンのような細胞表面上の陰電荷を帯びている表面構造へのそのドメインの結合を調節する薬剤を同定するために用いられる。第2スルファターゼドメインを含むポリペプチドは、グルコサミンおよびN-アセチルグルコサミン糖の硫酸認識を調節する薬剤を同定するために用いられる。スルファターゼ断片を含むポリペプチドは、スルファターゼ断片のアミノ末端および/またはカルボキシル末端でインフレームで融合された融合パートナーを含むポリペプチドを含む。
【００６４】
本タンパク質およびポリプチドは、天然に存在する源から得られるまたは合成的に作製されうる。天然に存在する源から入手される場合、選択される源は、一般的に、そのタンパク質が由来するべき種に依存するものである。本タンパク質はまた、合成的方法から、例えば、より詳細には下に記載されているが、適する宿主において対象となるタンパク質をコードする組換え遺伝子を発現することにより、得られる。任意の便利なタンパク質精製工程を使用してもよく、適するタンパク質精製方法論は、「Guide to Protein Purification」(Deuthser編)(Academic Press, 1990)に記載されている。例えば、可溶化物は、最初の源から調製され、かつHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィーなどを用いて精製されうる。
【００６５】
核酸組成物
また、本新規スルファターゼまたはそれらの断片をコードする核酸組成物も提供される。核酸組成物とは、本スルファターゼの1つをコードし、かつ適当な条件下で、上記の本スルファターゼの1つとして発現される能力がある読み取り枠を有するDNAの配列を含む組成物を意味する。このように、その用語は、ゲノムDNA、cDNA、mRNA、および本核酸配列を含むベクターを含む。また、この用語において、本スルファターゼタンパク質をコードする核酸に相同的または実質的に類似のもしくは同一の核酸が含まれる。このように、本発明は、huSULF1、huSULF2、mSULF1、mSULF2、およびそれらの相同体をコードする遺伝子を提供する。
【００６６】
ヒトSULF1 cDNAは、図1Ai〜図1Aiiに示され、かつ配列番号：01として同定される核酸配列を有する。そのコード領域は、図1Ai〜図1Aiiにおいてアッパーケース文字で示されるヌクレオチドにより描かれている。そのコード領域は、配列番号：02に示されている。
【００６７】
ヒトSULF2 cDNAは、図2Ai〜図2Aiiに示され、かつ配列番号：04として同定される核酸配列を有する。そのコード領域は、図2Ai〜図2Aiiにおいてアッパーケース文字で示されるヌクレオチドにより描かれている。そのコード領域は、配列番号：05に示されている。
【００６８】
いくつかの態様において、ヒトSULF2 cDNAは、図11Ai〜図11Aiiに示され、かつ配列番号：14に示される読み取り枠(コード領域)と共に、配列番号：13に示される核酸配列を有する。
【００６９】
マウスSULF1 cDNAは、図3Ai〜図3Aiiに示され、かつ配列番号：07として同定される核酸配列を有する。そのコード領域は、図3Ai〜図3Aiiにおいてアッパーケース文字で示されるヌクレオチドにより描かれている。そのコード領域は、配列番号：08に示されている。
【００７０】
マウスSULF2 cDNAは、図4Ai〜図4Aiiに示され、かつ配列番号：10として同定される核酸配列を有する。そのコード領域は、図4Ai〜図4Aiiにおいてアッパーケース文字で示されるヌクレオチドにより描かれている。そのコード領域は、配列番号：11に示されている。いくつかの態様において、マウスSULF2 cDNAは、図12Ai〜図12Aiiに示され、かつ配列番号：17に示される読み取り枠と共に、配列番号：16に示される核酸配列を有する。
【００７１】
いくつかの態様において、本発明のSULFポリヌクレオチドは、配列番号：1、配列番号：4、配列番号：7、配列番号：10、配列番号：13、もしくは配列番号：16の1つにおいて；または配列番号：2、配列番号：5、配列番号：8、配列番号：11、配列番号：14、もしくは配列番号：17のいずれか1つに示されるような；または図1Ai〜図1Aii、図2Ai〜図2Aii、図3Ai〜図3Aii、図4Ai〜図4Aii、図11Ai〜図11Aii、または図12Ai〜図12Aiiの1つにおいて示される配列の少なくとも約30個、少なくとも約50個、少なくとも約75個、少なくとも約100個、少なくとも約150個、少なくとも約200個、少なくとも約300個、少なくとも約400個、少なくとも約500個、少なくとも約600個、少なくとも約700個、少なくとも約800個、少なくとも約900個、少なくとも約1000個、少なくとも約1100個、少なくとも約1200個、少なくとも約1300個、少なくとも約1400個、少なくとも約1500個、少なくとも約1600個、少なくとも約1700個、少なくとも約1800個、少なくとも約1900個、少なくとも約2000個、少なくとも約2100個、少なくとも約2200個、少なくとも約2300個、少なくとも約2400個、少なくとも約2500個、または少なくとも約2600個の近接するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
いくつかの態様において、本発明のSULFポリヌクレオチドは、配列番号：01、配列番号：02、配列番号：04、配列番号：05、配列番号：13、および配列番号：14の1つまたは複数に示される配列を特に、除外する。
【００７３】
他の態様において、本発明のSULFポリヌクレオチドは、配列番号：3、配列番号：6、配列番号：9、配列番号：12、配列番号：15、または配列番号：18のいずれか1つにおいて示される配列の1つの少なくとも約10個、少なくとも約20個、少なくとも約25個、少なくとも約50個、少なくとも約75個、少なくとも約100個、少なくとも約150個、少なくとも約200個、少なくとも約250個、少なくとも約300個、少なくとも約350個、少なくとも約400個、少なくとも約450個、少なくとも約500個、少なくとも約550個、少なくとも約600個、少なくとも約650個、少なくとも約700個、少なくとも約750個、少なくとも約800個、または少なくとも約850個の近接するアミノ酸の、配列番号：3、配列番号：6、配列番号：9、配列番号：12、配列番号：15、もしくは配列番号：18の1つにおいて示される、または図1B、図2B、図3B、図4B、図10B、および図11Bの1つにおいて描かれる全体のアミノ酸配列までのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
相同遺伝子群の源は、任意の種であってもよく、例えば、霊長類の種、特にヒト；ラットおよびマウスのような齧歯動物、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、線虫などである。哺乳類の種間において、例えば、ヒトとマウスの間において、相同体は、実質的配列類似性、例えば、ヌクレオチド配列間に、少なくとも60％、通常には少なくとも75％、より通常には少なくとも80％の配列同一性をもつ。対象となる多くの態様において、相同性は、少なくとも75％、通常には少なくとも80％、およびより通常には少なくとも85％であるものであり、対象となる特定の態様において、相同性は90％くらい高いものである。配列類似性は、保存モチーフ、コード領域、フランキング領域などのような、大きい方の配列のサブセットでありうる参照配列に基づいて計算される。参照配列は、通常、少なくとも長さが約18ヌクレオチド、より通常には少なくとも長さが約30ヌクレオチドであるものであり、比較されようとしている完全配列まで延長されうる。配列分析のためのアルゴリズムは当技術分野において知られており、例えば、BLASTがあり、Altschulら、(1990)、J. Mol. Biol. 215:403〜410(デフォルト設定を使用)に記載されている。本明細書に提供される配列は、データベース検索において、関連した相同的タンパク質を認識するために必須である。
【００７５】
本発明のタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸は、cDNAもしくはゲノムDNAまたはそれらの断片でありうる。遺伝子という用語は、本発明の特定のタンパク質およびポリペプチドをコードする読み取り枠、ならびにイントロン、加えて発現の制御に関与する隣接する5'および3'の非コードヌクレオチド配列の、そのコード領域を越えて約20 kbまで(あるいはどちらの方向にでもさらに遠くかもしれないが)を意味するものとする。遺伝子は、染色体外の維持のため、または宿主ゲノムへの組込みのために、適当なベクターへ導入されうる。
【００７６】
本明細書に用いられる場合、用語「cDNA」は、配列要素がエキソンならびに3'および5'の非コード領域である、天然の成熟mRNA種において見出される配列要素の配置を共有するすべての核酸を含むものとする。普通には、mRNA種は、近接するエキソンを、存在する場合核RNAスプライシングにより除去されて本発明によるタンパク質をコードする近接する読み取り枠を生成するその介在するイントロンと共に有する。
【００７７】
対象となるゲノム配列は、普通に天然の染色体に存在するすべてのイントロンを含め、列挙された配列において定められているように、開始コドンと停止コドンとの間に存在する核酸を含む。成熟mRNAにおいて見出される3'および5'の非翻訳領域もさらに含みうる。約1 kbの、あるいはより長くあるかもしれないが、転写領域の5'末端または3'末端のいずれかでのフランキングゲノムDNAを含め、プロモーター、エンハンサーなどのような特定の転写および翻訳の制御配列をさらに含みうる。ゲノムDNAは、100 kbpまたはそれ未満の断片として；およびフランキング染色体配列を実質的に含まず、単離されうる。3'もしくは5'のいずれかのコード領域に隣接するゲノムDNA、またはイントロンに時々見出される内部の制御配列は、適切な組織および時期の特異的な発現のために必要とされる配列を含む。
【００７８】
ヒトSULF2のゲノム配列は、配列番号：22に示される。ヒトSULF1のゲノム配列は、配列番号：23に示される。マウスSULF2のゲノム配列は、配列番号：24に示される。特定の態様において、本ゲノム配列は、配列番号：22、配列番号：23、または配列番号：24のいずれか1つに示される配列を有する。
【００７９】
本発明の核酸組成物は、本タンパク質のすべてまたは部分をコードしうる。二本鎖または一本鎖の断片は、通常の方法に従って化学的にオリゴヌクレオチドを合成することによる、制限酵素消化による、PCR増幅によるなどのDNA配列から得られうる。大部分にとっては、DNA断片は、少なくとも15ヌクレオチド、通常には少なくとも18ヌクレオチドまたは25ヌクレオチドからなるものであり、少なくとも約50ヌクレオチドである場合もある。
【００８０】
本発明のSULF核酸分子は、任意の長さの他の、非SULF核酸分子(「異種核酸分子」)を含みうる。例えば、本核酸分子は、長さが約1ヌクレオチドから約10ヌクレオチドまで、約10ヌクレオチドから約20ヌクレオチドまで、約20ヌクレオチドから約50ヌクレオチドまで、約50ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまで、約100ヌクレオチドから約250ヌクレオチドまで、約250ヌクレオチドから約500ヌクレオチドまで、または約500ヌクレオチドから約1000ヌクレオチドまで、またはそれ以上の異種核酸分子により5'末端および/または3'末端上において隣接されうる。例えば、本核酸とハイブリダイズする能力がある核酸分子を検出するためのプローブとして用いられる場合、本核酸分子は、任意の長さの異種配列により隣接されうる。
【００８１】
本核酸分子はまた、ベクターの一部(例えば、SULF構築物)として提供されてよく、その幅広い種類が当技術分野において知られており、本明細書において詳しく述べられる必要はない。ベクターは、限定されるものではないが、プラスミド；コスミド；ウイルスベクター；人工染色体(YAC、BACなど)； ミニ染色体などを含む。ベクターは、例えば、Short Protocols in Molecular Biology, (1999)F. Ausubelら編、Wiley & Sonsを含め、当業者によく知られている多数の刊行物において十分に記載されている。ベクターは、本核酸の発現のために供給されうる、本核酸を遺伝させるために供給されうる、または両方のために供給されうる。
【００８２】
本遺伝子は、単離されかつ実質的に純粋で、一般的には無傷の染色体以外のものとして獲得される。通常、DNAは、本遺伝子の配列またはそれの断片を含まない他の核酸配列を実質的に含まずに獲得されるものであり、一般的に少なくとも約50％、通常には少なくとも90％純粋であり、典型的には「組換え体」であり、すなわち、それが天然に存在する染色体上では普通、付随していない1つまたは複数のヌクレオチドにより隣接されている。
【００８３】
本ポリペプチドの調製
以下のセクションにおいてより詳細に記載される多数の使用に加えて、本核酸組成物は、上記のように、本発明のスルファターゼポリペプチドのすべてまたは部分の調製において使用を見出す。発現のために、発現カセットが使用されうる。発現ベクターは、誘導的または恒常的でありうる、転写および翻訳の開始領域を供給するものであり、そのコード領域は、その転写開始領域、ならびに転写および翻訳の終結領域の転写制御下において利用可能に連結されている。これらの制御領域は、本ペプチドをコードする遺伝子の本来のものでありうる、または外因性の源由来でありうる。
【００８４】
発現ベクターは、一般的に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入のために供給する、プロモーター配列の近くに位置する都合のよい制限部位をもつ。発現宿主において操作的な選択可能マーカーが存在する場合もある。発現ベクターは、融合タンパク質の生成のために用いられうり、外因性融合ペプチドは、付加的な機能性、すなわち、増加したタンパク質合成、安定性、定められた抗血清との反応性、酵素マーカー、例えば、β-ガラクトシダーゼ、などを提供する。
【００８５】
発現カセットは、転写開始領域、遺伝子またはそれの断片、および転写終結領域を含んで調製されうる。機能性エピトープまたはドメインの発現を可能にする配列の使用は特に関心が高く、通常では長さが少なくとも約8個のアミノ酸、より通常では長さが少なくとも約15個のアミノ酸、約25個のアミノ酸まで、または上記の断片のいずれか、かつ遺伝子の完全読み取り枠までである。そのDNAの導入後、その構築物を含む細胞は、選択可能マーカーの手段により選択されてよく、細胞は増加されて、その後発現に使用されうる。
【００８６】
タンパク質およびポリペプチドは、発現の目的に応じて、通常の方法に従い、原核生物または真核生物において発現されうる。タンパク質の大量産生については、大腸菌(E. coli)、枯草菌(B. subtilis)、酵母(S. cerevisiae)のような単細胞生物、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞、または脊椎動物、特に哺乳動物のような高等生物の細胞、例えばCOS 7細胞が、発現宿主細胞として用いられうる。いくつかの状況において、コードされたタンパク質が自然の折り畳みおよび翻訳後の修飾から恩恵を受けるように、真核細胞において遺伝子を発現させることが望ましい。小さなペプチドは、実験室でも合成されうる。本タンパク質の完全配列のサブセットであるポリペプチドは、機能にとって重要なタンパク質の部分を同定かつ調査するために用いられうる。
【００８７】
対象となる特定の発現系は、発現系を導く、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む。これらのカテゴリーのそれぞれからの典型的な系は、以下に提供される：
【００８８】
細菌  細菌における発現系は、Changら、Nature(1978)275:615; Goeddelら、Nature(1979)281:544; Goeddelら、Nucleic Acids Res. (1980)8:4057; 欧州特許第0 036,776号; 米国特許第4,551,433号; DeBoerら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1983)80:21-25; およびSiebenlistら、Cell(1980)20:269に記載されるものを含む。
【００８９】
酵母  酵母における発現系は、Hinnenら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1978)75:1929; Itoら、J. Bacteriol. (1983)153:163; Kurtzら、Mol. Cell. Biol. (1986)6:142; Kunzeら、J. Basic Microbiol. (1985)25:141; Gleesonら、J. Gen. Microbiol. (1986)132:3459; Roggenkampら、Mol. Gen. Genet. (1986)202:302; Dasら、J. Bacteriol. (1984)158:1165; De Louvencourtら、J. Bacteriol. (1983)154:737; Van den Bergら、Bio/Technology(1990)8:135; Kunzeら、J. Basic Microbiol. (1985)25:141; Creggら、Mol. Cell. Biol. (1985)5:3376; 米国特許第4,837,148号および第4,929,555号; BeachおよびNurse, Nature(1981)300:706; Davidowら、Curr. Genet. (1985)10:380; Gaillardinら、Curr. Genet. (1985)10:49; Ballanceら、Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983)112:284-289; Tilburnら、Gene(1983)26:205-221; Yeltonら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1984)81:1470-1474; KellyおよびHynes, EMBO J. (1985)4:475479; 欧州特許第0 244,234号; および国際公開公報第91/00357号に記載されるものを含む。
【００９０】
昆虫細胞  昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第4,745,051号; Friesenら、"The Regulation of Baculovirus Gene Expression", The Molecular Biology Of Baculoviruses (1986)(W. Doerfler編)より; 欧州特許第0 127,839号; 欧州特許第0 155,476号; およびVlakら、J. Gen. Virol. (1988)69:765-776; Millerら、Ann. Rev. Microbiol. (1988)42:177; Carbonellら、Gene(1988)73:409; Maedaら、Nature(1985)315:592-594; Lebacq-Verheydenら、Mol. Cell. Biol. (1988)8:3129; Smithら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1985)82:8844; Miyajimaら、Gene(1987)58:273; およびMartinら、DNA(1988)7:99に記載されるように達成される。多数のバキュロウイルス系統および変種および宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞は、Luckowら、Bio/Technology(1988)6:47-55, Millerら、Generic Engineering(1986)8:277-279, およびMaedaら、Nature(1985)315:592-594に記載される。
【００９１】
哺乳動物細胞  哺乳動物の発現は、Dijkemaら、EMBO J. (1985)4:761, Gormanら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)(1982)79:6777, Boshartら、Cell(1985)41:521および米国特許第4,399,216号に記載されるように達成される。哺乳動物の発現の他の特徴は、HamおよびWallace, Meth. Enz. (1979)58:44, BarnesおよびSato, Anal. Biochem. (1980)102:255, 米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,927,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/00195号、および米国特許第RE 30,985号に記載されるように助長される。
【００９２】
上記宿主細胞、または他の適当な宿主細胞もしくは生物体のいずれかが、本発明のポリヌクレオチドもしくは核酸を複製するおよび/または発現させるために用いられる場合、その結果生じる複製された核酸、RNA、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、その宿主細胞または生物体の産生物として本発明の範囲内である。その産物は、当技術分野において公知の任意の適当な方法により回収される。
【００９３】
いったん、選択されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子が同定されれば、その発現は、その遺伝子が由来する細胞において制御されうる。例えば、細胞の内因性遺伝子は、その細胞においてその遺伝子の発現されるのを少なくとも促進するのに十分な位置に細胞のゲノムへ挿入される外因性制御配列により制御されうる。制御配列は、開示が参照として本明細書に組み入れられている、米国特許第5,641,670号および第5,733,761号において開示されるように、相同的組換えによりゲノムへ組み込むように設計されうる、または、開示が参照として本明細書に組み入れられている、国際公開公報第99/15650号に記載されるように、非相同的組換えによりゲノムへ組み込むように設計されうる。コード化核酸自身の操作なしであるが、その代わりとして、上記の組み入れられている特許文書において記載されるように、所望のタンパク質をコードする遺伝子をすでに含む細胞のゲノムへの制御配列の組み込みによる、本タンパク質の産生もまた、本発明に含まれる。
【００９４】
本タンパク質およびポリペプチドは、天然に存在する源から得られうる、または合成的に作製されうる。例えば、タンパク質は、そのタンパク質を発現する生物学的源から引き出されうる。本タンパク質はまた、合成的方法からも引き出されることができ、例えば、より詳細には以下に記載されているが、適する宿主において対象となるタンパク質をコードする組換え遺伝子を発現させることによる。任意の便利なタンパク質精製工程を使用されることができ、適するタンパク質精製方法論は、Guide to Protein Purification, (Deuthser編)(Academic Press, 1990)に記載される。例えば、可溶化物は、最初の源(例えば、内因性SULF1もしくはSULF2を発現する細胞、または本ポリペプチドを発現する発現ベクターを含む細胞)から調製され、HPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィーなどを用いて精製されうる。
【００９５】
組成物
本発明は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、組換えベクターおよび宿主細胞を含有する薬学的組成物を含む、組成物をさらに提供する。これらの組成物は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、組換えベクターまたは宿主細胞の所望の使用に従って選択される緩衝液を含みうり、かつ意図される使用に適した他の物質もまた含みうる。当技術分野において幅広い種類が知られているが、意図される使用に適した適切な緩衝液を容易に当業者は選択できる。いくつかの例において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、その種類は当技術分野において知られており、本明細書において詳細に論議される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、様々な刊行物において十分に記載されてきており、例えば、A. Gennaro(1995)"Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 第19版、Lippincott, Williams & Wilkinsを含む。
【００９６】
本発明のスルファターゼに特異的な抗体
本発明は、本スルファターゼに特異的な抗体を提供する。適する抗体は、標的タンパク質のすべてまたは部分を含むペプチドで宿主動物を免疫することにより得られる。適する宿主動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなど含む。タンパク質免疫原の起源は、マウス、ヒト、ラット、サルなどでありうる。宿主動物は、一般的に、その免疫原とは異なる種であるものであり、例えば、マウスを免疫するために使用されるヒトタンパク質など。
【００９７】
免疫原は、完全タンパク質、またはそれの断片および誘導体を含みうる。好ましい免疫原は、本タンパク質の1つのすべてまたは部分を含み、これらの残基は、天然の標的タンパク質上に見出されるグリコシル化のような翻訳後の修飾を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、当技術分野において公知の様々な方法において作製される、例えば、通常の組換え方法を用いるクローニングされた遺伝子の発現、腫瘍細胞培養上清からの単離など。
【００９８】
ポリクローナル抗体の調製について、第一段階は、標的タンパク質での宿主動物の免疫化であり、標的タンパク質は、好ましくは、約1％未満の夾雑物を含む、実質的に純粋な形であるものである。免疫原は、完全標的タンパク質、それの断片または誘導体を含みうる。宿主動物の免疫応答を増加させるため、標的タンパク質はアジュバントと組み合わせうり、適するアジュバントは、ミョウバン、デキストラン、硫酸塩、大きな重合の陰イオン、油と水の乳濁液、例えばフロイントのアジュバント、フロイントの完全アジュバントなどを含む。標的タンパク質はまた、合成担体タンパク質または合成抗原に結合されうる。様々な宿主がポリクローナル抗体を産生するために免疫されうる。そのような宿主は、ウサギ、モルモット、齧歯動物、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含む。通常には皮内に、初回投与量で引き続き1回またはそれ以上、通常には少なくとも2回の追加免疫の投与量で、標的タンパク質は、宿主に投与される。免疫後、宿主からの血液は収集され、その血液細胞からの血清の分離が続くことになる。結果として生じる抗血清に存在するIgは、アンモニウム塩分画、DEAEクロマトグラフィーなどのような公知の方法を用いて、さらに分画されうる。
【００９９】
モノクローナル抗体は、通常の技術により産生される。一般的に、免疫された宿主動物の脾臓および/またはリンパ節が血漿細胞の源を供給する。血漿細胞は、ハイブリドーマ細胞を作製するために骨髄腫細胞との融合により不死化される。個々のハイブリドーマからの培養上清は、所望の特異性をもつ抗体を産生するものを同定するために、標準的技術を用いてスクリーニングされる。ヒトタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生のために適する動物は、マウス、ラット、ハムスターなどを含む。マウスタンパク質に対する抗体を産生させるためには、その動物は、一般的に、ハムスター、モルモット、ウサギなどである。抗体は、通常の技術、例えば、不溶性支持体、プロテインAセファロースなどに結合した本発明によるタンパク質を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、ハイブリドーマ細胞上清または腹水から精製されうる。
【０１００】
通常の多重結合構造の代わりに、単鎖として産生されうる。単鎖抗体は、Jostら、(1994)J.B.C. 269:26267-262673およびその他に記載される。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードするDNA配列は、グリシンおよび/またはセリンを含む小さな中性アミノ酸の少なくとも約4個のアミノ酸をコードするスペーサーに連結されている。この融合によりコード化されたタンパク質は、最初の抗体の特異性および親和性を保持する機能性可変領域の集合を可能にする。
【０１０１】
インビボでの使用、特にヒトへの注入については、抗体の抗原性を減少させることが望ましい。遮断剤に対するレシピエントの免疫応答は、治療が有効である期間を減少させる可能性がある。抗体をヒト化する方法は、当技術分野において知られている。ヒト化抗体は、遺伝子導入のヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の産生物でありうる(例えば、国際公開公報第90/10077号および第90/04036号を参照)。または、対象となる抗体は、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメイン、および/またはフレームワークドメインをその対応するヒト配列で置換するために組換えDNA技術により操作されうる(国際公開公報第92/02190を参照)。
【０１０２】
キメラの免疫グロブリン遺伝子の構築のためのIg cDNAの使用は、当技術分野において知られている(Liuら、(1987)P.N.A.S. 84:3439およびJ.Immunol. 139:3251)。mRNAは、その抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、cDNAを作製するために使用される。対象となるcDNAは、特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応により増幅されうる(米国特許第4,683,195号および第4,683,202号)。または、ライブラリーが作製され、対象となる配列を単離するためにスクリーニングされる。抗体の可変領域をコードするDNA配列は、その後、ヒト定常領域配列に融合される。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabatら、(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242に見出されうる。ヒトC領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手できる。アイソタイプの選択は、補体結合、または抗体依存性細胞障害性における活性のような、所望のエフェクター機能により導かれるものである。好ましいアイソタイプは、IgG1、IgG3およびIgG4である。ヒト軽鎖定常領域、カッパまたはラムダのどちらでも用いられうる。キメラのヒト化抗体は、その後、通常の方法により発現される。
【０１０３】
さらに他の態様において、抗体は、完全にヒト抗体でありうる。例えば、ヒト抗体と同一である異種抗体が使用されうる。異種ヒト抗体とは、ヒト抗体を有する同一のものである抗体を意味する、すなわち、それらがヒト抗体を発現するように遺伝子的に操作されている非ヒト宿主を用いて産生されることを除いては、それらは完全にヒト抗体である。国際公開公報第98/50433号；国際公開公報第98/24893号および国際公開公報第99/53049号を参照、その開示は参照として本明細書に組み入れられている。
【０１０４】
Fv、F(ab')2およびFabのような抗体フラグメントは、無傷のタンパク質の切断、例えば、プロテアーゼまたは化学的切断により、調製されうる。または、切り詰められた遺伝子が設計される。例えば、F(ab')2フラグメントの部分をコードするキメラの遺伝子は、H鎖のCH1ドメインおよびヒンジ領域をコードするDNA配列を含み、次に、切り詰められた分子を生じるために翻訳の停止コドンが続くことになる。
【０１０５】
HとLの共通配列、J領域は、V領域セグメントのヒトC領域セグメントへの引き続く連結のためにそのJ領域へ有用な制限部位を導入するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計するために用いられうる。C領域cDNAは、ヒト配列において類似している位置に制限部位を置くように部位特異的突然変異誘発により改変されうる。
【０１０６】
発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、YAC、EBV由来エピソームなどを含む。便利なベクターは、任意のVHまたはVL配列が容易に挿入されかつ発現されるように操作された適当な制限部位をもつ、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターにおいて、スプライシングは、通常、挿入されたJ領域におけるスプライス供与部位とヒトC領域の前にあるスプライス受容部位の間に起こり、かつまた、ヒトCHエキソンの内に存在するスプライス領域においても起こる。ポリアデニル化および転写終結は、そのコード領域の下流の天然の染色体部位で起こる。その結果生じたキメラの抗体は、レトロウイルスLTR、例えばSV-40初期プロモーター、(Okayamaら、(1983)Mol. Cell. Bio. 3:280)、ラウス肉腫ウイルスLTR(Gormanら、(1982)P. N. A. S. 79:6777)、およびモロニーマウス白血病ウイルスLTR(Grosschedlら、(1985)Cell 41:885)；天然のIgプロモーターなどを含む、任意の強力なプロモーターに連結されうる。
【０１０７】
本ポリペプチドおよび核酸組成物の使用
本ポリペプチドおよび核酸組成物は、研究、診断、および治療の薬剤のスクリーニング/発見/調製の適用、加えて治療的組成物を含む、様々な異なる適用において使用を見出す。
【０１０８】
一般的な適用
本核酸組成物は、様々な異なる適用に使用を見出す。対象となる適用には、本スルファターゼの相同体の同定；新規プロモーター要素の源として；発現制御因子の同定；ハイブリダイゼーションの適用、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)におけるプローブおよびプライマーとして；生物学的検体における発現パターンの同定；本スルファターゼの機能のための細胞または動物モデルの調製；本スルファターゼの機能のためのインビトロのモデルの調製などを含む。
【０１０９】
相同体は、多数の方法のいずれかにより同定される。与えられたcDNAの断片は、対象となる標的生物体由来のcDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用されることができ、低ストリンジェント性条件が用いられる。プローブは、大きな断片、または1つもしくは複数の短い変性プライマーでありうる。配列類似性をもつ核酸は、低ストリンジェント性条件下、例えば、50℃および6 x SSC(0.9 M 塩化ナトリウム/0.09 M クエン酸ナトリウム)で、かつ55℃で1 x SSC(0.15 M 塩化ナトリウム/0.015 M クエン酸ナトリウム)での洗浄にかけられる場合結合したままであることにおいて、ハイブリダイゼーションにより検出される。配列同一性は、ストリンジェントな条件下、例えば、50℃またはそれ以上、および0.1 x SSC(15 mM 塩化ナトリウム/1.5 mM クエン酸ナトリウム)で、ハイブリダイゼーションにより測定されうる。与えられた核酸配列に実質的同一性の領域を有する核酸、例えば、対立遺伝子の変異体、その遺伝子の遺伝子改変型などは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、与えられた配列に結合する。プローブ、特にDNA配列の標識されたプローブを用いることにより、相同的または関連した遺伝子を単離することができる。
【０１１０】
5'フランキング領域の配列は、本遺伝子が発現している組織において発生的調節を与えるエンハンサー結合部位を含む、プロモーター要素について利用されうる。組織特異的発現は、発現のパターンを決定するため、および発現の天然のパターンを模倣するプロモーターを供給するために有用である。プロモーター領域における天然に存在する多型は、発現における自然の変異、特に疾患に関連しうるものを測定するために有用である。
【０１１１】
または、実験的に定められた系において変化する発現の効果を測定するために、プロモーターへ突然変異が導入されうる。転写因子の結合に関与する特定のDNAモチーフの同定のための方法は、当技術分野において知られており、例えば、既知の結合モチーフとの配列類似性、ゲル遅延研究など。例えば、Blackwellら、(1995), Mol. Med. 1:194-205; Mortlockら、(1996), Genome Res. 6:327-333; およびJoulinおよびRichard-Foy(1995), Eur. J. Biochem. 232:620-626を参照。
【０１１２】
制御配列は、発現の転写または翻訳制御のために必要とされるシス作用性配列を、特に発生の異なる組織または時期において、同定するため、ならびにシス作用性配列および発現を制御または仲介するトランス作用性因子を同定するために、用いられうる。そのような転写または翻訳の調節領域は、培養細胞においてまたは胚性、胎児性もしくは成人性組織において、野生型または対象となるタンパク質の発現を促進させるために、かつ遺伝子治療のために、遺伝子に利用可能に連結されうる。
【０１１３】
小さなDNA断片は、PCRのためのプライマー、ハイブリダイゼーションスクリーニングプローブなどとして有用である。大きい方のDNA断片、すなわち、100ヌクレオチドより大きいものは、前のセクションに記載されているように、コード化されたポリペプチドの作製のために有用である。PCRのような増幅反応における使用については、プライマーの対が使用される。プライマー配列の正確な組成は、本発明にとって重要ではないが、たいていの適用について、プライマーは、当技術分野において知られているように、ストリンジェントな条件下で、本配列にハイブリダイズするものである。少なくとも約50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約100ヌクレオチドの増幅産物を生じるプライマー対を選択することが望ましい。プライマー配列の選択に関するアルゴリズムは、一般的に知られており、商業的ソフトウェアパッケージとして入手可能である。増幅プライマーは、DNAの相補鎖にハイブリダイズし、お互いに向かって開始するだろう。
【０１１４】
DNAはまた、生物学的検体において、遺伝子の発現を同定するために使用されうる。ゲノムDNAまたはRNAのような特定のヌクレオチド配列の存在について、細胞を探索する方法は、文献において十分に確立されている。簡単には、DNAまたはmRNAは、細胞試料から単離される。そのmRNAは、相補DNA鎖を形成するために逆転写酵素を用いて、RT-PCRにより増幅され、続いて本DNA配列に特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応増幅を行いうる。または、mRNA試料は、ゲル電気泳動により分離され、適する支持体、例えば、ニトロセルロース、ナイロンなどに移行させ、その後、プローブとして本DNAの断片で探索される。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、インサイチューハイブリダイゼーション、および固体チップ上に配列されたDNAプローブへのハイブリダイゼーションのような他の技術もまた、使用を見出しうる。本配列にハイブリダイズするmRNAの検出は、その試料における遺伝子発現を示している。
【０１１５】
フランキングプロモーター領域およびコード領域を含む、本発明による遺伝子の配列は、プロモーターの強さ、コード化されたタンパク質の配列などにおいて目標とされる変化をを起こすために、当技術分野において公知の様々な方法で突然変異されうる。そのような突然変異のDNA配列またはタンパク質産物は、通常、本明細書に提供される配列と実質的に類似しているものである、すなわち、それぞれ、少なくとも1個のヌクレオチドまたはアミノ酸で異なっているものであり、かつ少なくとも2個であるが、約10個より多くないヌクレオチドまたはアミノ酸で異なりうる。配列変化は、置換、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせでありうる。欠失は、ドメインまたはエキソンの欠失のような大きな変化もさらに含みうる。対象となる他の改変は、例えば、FLAG系、HAなどでのようなエピトープタギングを含む。細胞下局在の研究については、緑色蛍光タンパク質(GFP)をもつ融合タンパク質が使用されうる。
【０１１６】
クローニングされた遺伝子のインビトロでの突然変異誘発のための技術は知られている。部位特異的突然変異誘発についてのプロトコールの例は、Gustinら、(1993), Biotechniques 14:22; Barany(1985), Gene 37:111-123; Colicelliら、(1985), Mol. Gen. Genet. 199:537-539; およびPrentkiら、(1984), Gene 29:303-313に見出されうる。部位特異的突然変異誘発についての方法は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 15,3-15.108; Weinerら、(1993), Gene 126:35-41; Sayersら、(1992), Biotechniques 13:592-596; JonesおよびWinistorfer(1992), Biotechniques 12:528-530; Bartonら、(1990), Nucleic Acids Res. 18:7349-7355; MarottiおよびTomich(1989), Gene Anal. Tech. 6:67-70; およびZhu(1989), Anal. Biochem. 177:120-124に見出されうる。そのような変異された遺伝子は、本タンパク質の構造-機能の関係を研究するため、またはその機能もしくは制御に作用するタンパク質の性質を改変するために使用されうる。
【０１１７】
本核酸は、トランスジェニックの非ヒトの動物または細胞系における部位特異的遺伝子改変を生じるために用いられうる。このように、いくつかの態様において、本発明は、スルファターゼのコード化核酸分子が動物の細胞において発現されるように、プロモーターと利用可能に連結されて本スルファターゼをコードする配列を含む核酸分子を、動物のゲノムへ組み込まれる導入遺伝子として含む、非ヒトトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物は、相同的組換えを通して作製されることができ、その内因的座位は変化する。または、核酸構築物は、ゲノムへランダムに組み込まれる。安定的組み込みのためのベクターは、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス、YACなどを含む。
【０１１８】
改変された細胞または動物は、遺伝子の機能および制御の研究において有用である。例えば、一連の小さな欠失および/または置換は、発癌、シグナル伝達などにおける異なるエキソンの役割を決定するために宿主の天然の遺伝子に行われうる。対象となるのは、本タンパク質の発現が特に低下しているまたは存在しない、癌についてのトランスジェニック動物モデルを構築するための遺伝子の使用である。対象となる特定の構築物は、アンチセンス構築物を含み、発現、顕性不活性の変異の発現、および遺伝子の過剰発現をブロックするものである。配列が導入される場合、その導入される配列は、宿主本来の遺伝子の完全もしくは部分的配列のどちらかでありうる、または宿主動物に対して外因的である、例えば、本発明のヒト配列の、完全もしくは部分的配列でありうる。lac Zのような検出可能なマーカーは、その座へ導入されることができ、上方制御が、その結果として、表現型において容易に検出される変化を生じることになる。
【０１１９】
普通には発現されない細胞または組織において、そのような細胞または組織において普通には存在しないレベルでの、または発生の異常な時期での、遺伝子、例えばSULF1もしくはSULF2遺伝子、またはそれらの変異体の発現もまた提供しうる。内因性SULF1もしくはSULF2プロモーターまたは他の転写制御領域の発現を調節するように機能するポリペプチドをコードする異種核酸分子を含む宿主細胞(トランスジェニック動物における宿主細胞を含む)もまた、作製しうる。
【０１２０】
相同的組換えのためのDNA構築物は、ヒト遺伝子またはその宿主動物の種本来の遺伝子の少なくとも部分を含むものであり、その遺伝子は、所望の遺伝子改変をもち、かつその標的座に相同的な領域を含む。ランダムな組み込みのためのDNA構築物は、組換えを仲介するための相同性の領域を含む必要はない。都合のよいことには、陽性および陰性の選択のためのマーカーが含まれる。相同的組換えを通しての目標とされる遺伝子改変をもつ細胞を作製するための方法は、当技術分野において知られている。哺乳動物細胞をトランスフェクションするための様々な技術については、Keownら、(1990), Meth. Enzymol. 185:527-537を参照。
【０１２１】
胚幹(ES)細胞について、ES細胞系が使用されうる、または胚細胞が、宿主、例えば、マウス、ラット、モルモットなどから新鮮に得られうる。そのような細胞は、適当な線維芽細胞支持細胞層上で増殖するまたは白血病抑制因子(LIF)の存在下で増殖する。ESまたは胚細胞が形質転換されている場合、それらはトランスジェニック動物を作製するために使用されうる。形質転換後、細胞は適当な培地における支持細胞層上へ蒔かれる。その構築物を含む細胞は、選択培地を使用することにより検出されうる。コロニーが増殖するのに十分な時間の後、それらは選び取られ、その構築物の相同的組換えまたは組込みの発生について分析される。陽性であるそれらのコロニーは、その後、胚操作および胚盤胞注入のために使用されうる。胚盤胞は、4週〜6週目の過排卵したメスから得られる。ES細胞はトリプシン処理され、その修飾された細胞は胚盤胞の胞胚腔へ注入される。注入後、胚盤胞は、偽妊娠のメスの各子宮角へ戻される。その後、メスは分娩日まで進行させて、その結果生まれた子はその構築物についてスクリーニングされた。胚盤胞の異なる表現型およびその遺伝子改変の細胞を提供していることにより、キメラの子孫は容易に検出されうる。
【０１２２】
キメラの動物は、改変された遺伝子の存在についてスクリーニングされ、その改変を有するオスおよびメスは、ホモ接合性子孫を産むために交配させる。その遺伝子変化が、発生のいつかの時点に致死を引き起こす場合には、組織または器官は、同種もしくは類遺伝子性移植片として、またはインビトロでの培養において、維持されうる。トランスジェニック動物は、実験動物、家畜などのような任意の非ヒトの哺乳動物でありうる。トランスジェニック動物は、機能性研究、薬物スクリーニングなどにおいて、例えば、SULFまたはSULF活性への候補薬物の効果を測定するために使用されうる。
【０１２３】
診断的適用
また、対象となる生物学的試料における本スルファターゼの観察されるレベルおよび/もしくは活性ならびに/または本スルファターゼポリヌクレオチドのレベルに基づく疾患状態を診断する方法が提供される。本明細書に用いられる場合、試料は、血液、髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液、乳管洗浄液、精液などのような生物学的液体；細胞；器官または組織培養由来液体；腫瘍生検試料；糞便試料；および生理学的組織から抽出された液体を含む。また、その用語に、派生物およびそのような液体の画分も含まれる。固体組織の場合、細胞は分離されうる、または組織切片が分析されうる。または、細胞の可溶化物が調製されうる。
【０１２４】
本発明の検出方法は、定性的または定量的でありうる。このように、本明細書に用いられる場合、用語「検出」、「測定(determination)」などは、定性的および定量的の両方の測定を指し、かつ「測定(measuring)」を含む。
【０１２５】
本発明の検出方法は、生物学的試料においてスルファターゼポリペプチドを検出するための方法、生物学的試料においてスルファターゼmRNAを検出するための方法、および生物学的試料においてスルファターゼ酵素活性を検出するための方法を含む。
【０１２６】
いくつかの態様において、検出方法は、生物学的試料(例えば、組織生検)における癌性の細胞の検出を提供する。実施例に記載されるように、huSULF-1 mRNAレベルが特定の癌、例えば、膵臓癌および前立腺癌において上昇している；およびhuSULF-2 mRNAレベルが乳癌において上昇している。このように、huSFLF-1またはhuSULF-2をコードするmRNAの正常な(非癌性の)組織との比較で上昇しているレベルでの検出は、生物学的試料における癌性組織の検出を与えている。
【０１２７】
検出キット
検出方法は、キットの一部として提供されうる。このように、本発明は、生物学的試料において、スルファターゼポリペプチドもしくはスルファターゼポリヌクレオチドの存在および/またはレベルを検出するためのキットをさらに提供する。これらのキットを使用する工程は、臨床的研究所、実験的研究所、開業医、または私人により行われうる。スルファターゼポリペプチドを検出するための本発明のキットは、限定されるものではないが、スルファターゼ特異的抗体を含む、スルファターゼに特異的に結合する部分を含む。スルファターゼポリヌクレオチドを検出するための本発明のキットは、スルファターゼポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする部分を含む。
【０１２８】
いくつかの態様において、本スルファターゼをコードするmRNAのようなスルファターゼポリヌクレオチドを検出するための本発明のキットは、本スルファターゼのコード化mRNAのcDNAのコピーを特異的に増幅する「フォワード」および「リバース」プライマーとして機能する核酸の対を含む。「フォワード」および「リバース」プライマーは、単離された核酸分子の対としてキット中に供給され、それぞれ、長さが約10ヌクレオチドから200ヌクレオチドまでであり、対の第1核酸分子は、配列番号：02、配列番号：05、または配列番号：14のいずれか1つに示される核酸配列に100％の配列同一性をもつ少なくとも10個の近接するヌクレオチドの配列を含み、かつ対の第2核酸分子は、配列番号：02、配列番号：05、または配列番号：14のいずれか1つに示される核酸配列の逆の相補体に100％の配列同一性をもつ少なくとも10個の近接するヌクレオチドの配列を含み、第2核酸分子の配列は、配列番号：02、配列番号：05、または配列番号：14のいずれか1つにおける第1核酸分子の核酸配列の3'に位置する。プライマー核酸は任意の公知の方法、例えば、自動化合成などを用いて調製される。
【０１２９】
本発明は、上記のように、核酸の対を含むキットを提供する。核酸は、適する保存媒体、例えば、緩衝溶液中に、典型的には適する容器において、存在している。キットは核酸の対を含み、かつ緩衝液；ポリメラーゼ連鎖反応のための試薬(例えば、デオキシヌクレオチド三リン酸(dATP、dTTP、dCTP、およびdGTP)、耐熱性DNAポリメラーゼ、ポリメラーゼ連鎖反応に適した緩衝液、Mg2+イオン(例えば、MgCl2)を含む溶液、およびポリメラーゼ連鎖反応を行うための当業者によく知られている他の成分)をさらに含みうる。キットは、さらに、キットの使用のための使用説明書を含みうり、使用説明書は、様々な形、例えば、印刷された情報として、コンパクトディスク上などで、提供されうる。キットは、さらに、個体由来の生物学的試料(例えば、生検試料、血液など)からのDNAの抽出のために必要な試薬、およびmRNAのcDNAコピーを生成するための試薬を含みうる。キットは、下により詳細に記載されているように、診断的適用において有用である。単離された核酸分子の対は、増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)におけるプライマーとしての役割を果たす。
【０１３０】
いくつかの態様において、第1および/または第2核酸分子は、検出可能な標識を含む。適する標識は、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、放射性標識、例えば、32P、35S、3H、などを含む。標識は、2段階方式でありうり、増幅されたDNAは、高親和性結合パートナー、例えば、アビジン、特異的抗体などをもつビオチン、ハプテンなどに結合しており、その結合パートナーが検出可能な標識に結合している。標識は、プライマーの1つまたは両方に結合しうる。または、標識を増幅産物に組み入れるように、増幅に使用されるヌクレオチドのプールが標識される。
【０１３１】
キットは、限定されるものではないが、緩衝液、展開試薬、標識、反応表面、検出用手段、対照試料、標準、使用説明書、および解説情報を含む、工程に有用である付加的な構成要素を選択的に提供しうる。
【０１３２】
キットが本スルファターゼポリペプチドの検出を提供するにおいては、キットは、本スルファターゼに特異的な1つまたは複数の抗体を含む。いくつかの態様において、本スルファターゼに特異的な抗体は、検出可能に標識されている。他の態様において、本スルファターゼに特異的な抗体は、標識されていない；代わりに、本スルファターゼに特異的なその抗体(「第一」抗体)に結合する、第二の、検出可能に標識された抗体が供給される。キットは、さらに、ブロッキング試薬、緩衝液、ならびに検出可能なマーカーを展開するおよび/または検出するための試薬を含みうる。キットは、さらに、使用のための説明書、対照、および解説情報を含みうる。
【０１３３】
キットが本スルファターゼの酵素活性を検出することを提供するにおいては、キットは、本スルファターゼにより作用された場合、検出可能な生成物を供給する基質を含む。適する基質は、下記に詳細に考察されている。適する基質の1つの非限定的な例は、4-メチルウンベリフェリル硫酸である。キットは、さらに、検出可能なマーカーの展開および検出に必要な試薬を含む。キットは、さらに、使用のための説明書、対照、および解説情報を含む。
【０１３４】
生物学的試料においてスルファターゼポリペプチドを検出する方法
本発明は、さらに、スルファターゼ特異的抗体を用いて、生物学的試料においてスルファターゼポリペプチドの存在を検出するおよび/またはレベルを測定するための方法を提供する。方法は、一般的に、以下の段階を含む：
a)試料をスルファターゼポリペプチドに特異的な抗体に接触させる段階；および
b)その抗体と試料の分子との間の結合を検出する段階。
【０１３５】
適する対照と比較した場合、スルファターゼ特異的抗体の特異的な結合の検出は、スルファターゼポリペプチドが試料中に存在することを示すものである。適する対照は、スルファターゼポリペプチドを含まないことがわかっている試料；およびスルファターゼに特異的ではない抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体と接触させる試料を含む。特異的な抗体-抗原の相互作用を検出するための様々な方法は、当技術分野において知られており、限定されるものではないが、標準的免疫組織学的方法、免疫沈降法、酵素イムノアッセイ法、およびラジオイムノアッセイ法を含む方法において用いられうる。一般的に、スルファターゼ特異的抗体は、直接的または間接的のどちらかで、検出可能に標識されているものである。直接的標識は、放射性同位元素；その生成物が検出可能である酵素(例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼなど)；蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリンなど)；蛍光放射金属、例えば、152Eu、またはランタン系列の他のもので、EDTAのような金属キレート基を通して抗体に付着している；化学発光化合物、例えば、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム塩など；生物発光化合物、例えば、ルシフェリン、エクオリン(緑色蛍光タンパク質)などを含む。
【０１３６】
抗体は、ポリスチレンのプレートまたはビーズのような不溶性支持体に付着(結合)しうる。間接的標識は、スルファターゼ特異的抗体に特異的な第二抗体、その第二抗体は上記のように標識される；および特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン-アビジン、などを含む。生物学的試料は、固体の支持体または担体上に固定化された、細胞、細胞粒子、または可溶性タンパク質を固定化する能力があるニトロセルロースのようなものに接触されうる。支持体はその後、適する緩衝液で洗浄され、続いて、検出可能に標識されたスルファターゼ特異的抗体に接触させうる。検出方法は、当技術分野において知られており、検出可能な標識により放射されるシグナルに適切であるように選択されるものである。検出は、一般的に、適する対照、および適切な標準と比較することで達成される。
【０１３７】
生物学的試料において本スルファターゼの酵素活性を検出する方法
本発明は、さらに、生物学的試料において、本スルファターゼの酵素活性の存在および/またはレベルを検出するための方法を提供する。方法は、一般的に、以下の段階を含む：
a)本スルファターゼにより作用されると検出可能な生成物を生じる基質に試料を接触させる段階；および
b)その酵素的反応の生成物を検出する段階。
【０１３８】
スルファターゼ活性による硫酸基の切断により、検出に基づいて分析可能な吸収、蛍光または他の物理学的性質における変化を生じるどんな硫酸化合物も本アッセイでの使用に適している。適する基質は、限定されるものではないが、4-メチルウンベリフェリル硫酸；p-ニトロフェニル硫酸；4-メチルウンベリフェリル-α-D-N-アセチルグクコサミド-6-硫酸もしくは4-メチルウンベリフェリル-グルコサミン-6-硫酸またはこれらの誘導体を含む複合体；ヘパリンまたはヘパラン硫酸の断片を含む、任意の硫酸化糖またはヘパラン硫酸に関連した糖の集合；および硫酸基が放射性標識されている任意の硫酸化化合物を含む。
【０１３９】
生物学的試料においてスルファターゼmRNAを検出する方法
本発明は、さらに、生物学的試料においてスルファターゼmRNAの存在を検出するための方法を提供する。方法は、例えば、試験化合物が、直接的または間接的に、スルファターゼ遺伝子発現に作用するかどうかを評価するために用いられうる。
【０１４０】
方法は、一般的に、以下の段階を含む：
a)ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、試料を本発明のスルファターゼポリヌクレオチドに接触させる段階；および
b)もしあれば、ハイブリダイゼーションを検出する段階。
【０１４１】
適する対照と比較した場合、ハイブリダイゼーションの検出は、スルファターゼポリヌクレオチドの試料中での存在を示すものである。適切な対照は、例えば、スルファターゼmRNAを含んでいないことがわかっている試料、およびスルファターゼmRNAと同じ「センス」の標識されたポリヌクレオチドの使用を含む。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は、当技術分野において知られており、上により詳細に記載されている。検出は、限定されるものではないが、インサイチューハイブリダイゼーション、PCR、RT-PCR、および「ノーザン」もしくはRNAブロッティング、またはそのような技術の組み合わせを含む任意の公知の方法により、適切に標識されたスルファターゼポリヌクレオチドを用いて、達成されうる。様々な標識およびポリヌクレオチドに対する標識方法は、当技術分野において知られており、本発明のアッセイ方法において用いられうる。特異的なハイブリダイゼーションは、適当な対照との比較により測定されうる。
【０１４２】
いくつかの態様において、方法は、生物学的試料においてmRNA分子のcDNAコピーを生成すること、ならびに増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)においてフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしての役割を果たす単離された核酸分子の対を用いてそのcDNAを増幅することを含む。核酸分子の対における各核酸分子は、長さが約10個から200個までのヌクレオチドであり、対の第1核酸分子は、配列番号：02、配列番号：05、または配列番号：14のいずれか1つに示される核酸配列に100％の配列同一性をもつ少なくとも10個の近接するヌクレオチドの配列を含み、かつ対の第2核酸分子は、配列番号：02、配列番号：05、または配列番号：14のいずれか1つに示される核酸配列の逆の相補体に100％の配列同一性をもつ少なくとも10個の近接するヌクレオチドの配列を含み、第2核酸分子の配列は、配列番号：02、配列番号：05、または配列番号：14のいずれか1つにおける第1核酸分子の核酸配列の3'に位置する。プライマー核酸は任意の公知の方法、例えば、自動化合成などを用いて調製される。プライマー対は、それらが本スルファターゼをコードするmRNAのcDNAコピーを特異的に増幅するように選択される。
【０１４３】
PCR増幅を用いる方法は、少なくとも約105細胞を使用することが都合がよいが、単細胞からのDNA上で行われうる。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、Saikiら、(1985)Science 239:487に記載されており、最近の技術の概説は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 14.2-14.33に見出されうる。検出可能な標識は、増幅反応に含まれうる。適する標識は、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、放射性標識、例えば、32P、35S、3H、などを含む。標識は、2段階方式でありうり、増幅されたDNAは、高親和性結合パートナー、例えば、アビジン、特異的抗体などをもつビオチン、ハプテンなどに結合しており、その結合パートナーが検出可能な標識に結合している。標識は、プライマーの1つまたは両方に結合しうる。または、標識を増幅産物に組み入れるように、増幅に使用されるヌクレオチドのプールが標識される。
【０１４４】
特定の試料において遺伝子の発現レベルまたはタンパク質を測定するために、多数の方法が利用可能である。診断は、患者の試料において、正常なまたは異常なスルファターゼの非存在または存在または変化した量を測定する多数の方法により行われうる。例えば、検出は、通常の方法に従って行われた、細胞の染色または標識化抗体をもつ組織学的切片を利用しうる。細胞は、細胞質分子を染色するために透過処理される。対象となる抗体が細胞試料に添加され、エピトープへの結合を可能にするのに十分な時間、通常には少なくとも約10分間、インキュベートされる。抗体は、直接的検出のために放射性同位元素、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または他の標識で標識されうる。または、第二段階の抗体または試薬がそのシグナルを増幅するために使用される。そのような試薬は、当技術分野においてよく知られている。例えば、一次抗体がビオチンに結合しており、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合型アビジンが第二段階試薬として添加されうる。または、二次抗体が蛍光化合物、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッドなどに結合している。最終の検出は、ペルオキシダーゼの存在下で色の変化を受ける基質を使用する。抗体結合の非存在または存在は、分離された細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡法、X線撮影法、シンチレーションカウンティングなどを含む、様々な方法により測定されうる。
【０１４５】
または、本スルファターゼ遺伝子の発現に焦点を合わす場合もある。生化学的研究は、コード領域または制御領域における配列多型が疾患と関連しているかどうかを決定するために行われうる。疾患関連多型は、タンパク質の活性などに影響を及ぼす発現レベルを変化させる遺伝子の欠失または切り詰め、突然変異を含みうる。
【０１４６】
本遺伝子の発現レベルに影響を及ぼしうるプロモーターまたはエンハンサー配列の変化は、当技術分野において公知の様々な方法により正常な対立遺伝子の発現レベルと比較することができる。プロモーターまたはエンハンサーの強さを測定するための方法は、発現された天然のタンパク質の定量；便利な定量を与える、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどのようなレポーター遺伝子と共にベクターへ様々な調節領域の挿入、などを含む。
【０１４７】
特定の配列、例えば、疾患関連多型の存在について核酸を分析するために、多数の方法が利用可能である。大量のDNAが入手可能である場合には、ゲノムDNAが直接的に使用される。または、対象となる領域を適するベクターへクローニングし、分析のために十分な量に増殖させる。その遺伝子を発現する細胞は、mRNAの源として使用されることができ、分析のために、直接的にアッセイされる、またはcDNAへ逆転写されうる。核酸は、分析のための十分な量を供給するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような通常の技術により増幅されうる。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、Saikiら、(1985)Science 239:487に記載されており、技術の概説は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 14.2-14.33に見出されうる。または、多型を検出する手段としてオリゴヌクレオチドのライゲーションを利用する様々な方法が当技術分野において知られており、例えば、Rileyら、(1990), Nucl. Acids Res. 18:2887-2890; およびDelahuntyら、(1996), Am. J. Hum. Genet. 58:1239-1246を参照。
【０１４８】
検出可能な標識は、増幅反応に含まれうる。適する標識は、蛍光色素、例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、放射性標識、例えば、32P、35S、3H、などを含む。標識は、2段階方式でありうり、増幅されたDNAは、高親和性結合パートナー、例えば、アビジン、特異的抗体などをもつビオチン、ハプテンなどに結合しており、その結合パートナーが検出可能な標識に結合している。標識は、プライマーの1つまたは両方に結合しうる。または、標識を増幅産物に組み入れるように、増幅に使用されるヌクレオチドのプールが標識される。
【０１４９】
試料核酸、例えば、増幅されたまたはクローニングされた断片は、当技術分野において公知の多数の方法の1つにより分析される。核酸は、ジデオキシ法または他の方法によりシーケンシングされ、その塩基の配列は野生型配列と比較されうる。異なる配列とのハイブリダイゼーションはまた、サザンブロット、ドットブロットなどにより、その存在を測定するために使用されうる。米国特許第5,445,934号または国際公開公報第95/35505号に記載されているように、固体の支持体上に固定化されるオリゴヌクレオチドプローブのアレイへの対照および異なる配列のハイブリダイゼーションパターンはまた、異なる配列の存在を検出する手段として使用されうる。一本鎖高次構造的多型(SSCP)分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法(DGGE)、およびゲルマトリックスでのヘテロ二重鎖分析が、DNA配列の変異により創造された高次構造的変化を電気泳動的移動度における変化として検出するために用いられる。または、多型が制限エンドヌクレアーゼについての認識部位を創造するまたは破壊するところにおいては、試料は、そのエンドヌクレアーゼで消化され、その断片が消化されたかどうかを決定するために、その生成物の大きさが分画される。分画は、ゲルまたはキャピラリー電気泳動、特にアクリルアミドまたはアガロースゲルにより行われる。
【０１５０】
遺伝子における突然変異についてのスクリーニングは、そのタンパク質の機能的または抗原性性質に基づきうる。タンパク質切り詰めアッセイ法は、タンパク質の生物学的活性に影響を及ぼしうる欠失を検出するにおいて有用である。タンパク質における多型を検出するように設計された様々なイムノアッセイは、スクリーニングに用いられうる。多くの多様な遺伝子の変異がある特定の疾患表現型へと導くところにおいて、機能的タンパク質アッセイが効果的なスクリーニングの道具であることが証明された。コード化されたタンパク質の活性は、野生型タンパク質との比較により測定されうる。
【０１５１】
発現のレベルが対象となる本発明の診断的方法は、典型的には、何らかの相対的差異を測定するために対象となる試料の核酸量の対照値のそれとの比較を含み、差異は定性的および/または定量的に測定されることができ、その差異は、その後、異常な発現パターンの存在または非存在に関連づけられる。試料において核酸量を測定するための様々に異なる方法は、当業者に知られており、対象となる特定の方法は、以下において記載されるものを含む：Pietuら、Genome Res. (1996年6月)6:492-503; Zhaoら、Gene(1995年4月24日)156:207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (1997年10月)8:542-546; Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods(1994年11月)32:125-127; Chalifourら、Anal. Biochem. (1994年2月1日)216:299-304; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (1996年12月)6:225-230; Hongら、Bioscience Reports(1982)2:907; およびMcGraw, Anal. Biochem. (1984)143:298。同様に、対象となるのは、国際公開公報第97/27317号に開示されている方法であり、その開示は参照として本明細書に組み入れられている。
【０１５２】
スクリーニングアッセイ
本発明は、スルファターゼ酵素活性を調節する薬剤を同定するためのスクリーニング方法、細胞において本スルファターゼポリペプチドのレベルを調節する薬剤を同定するための方法；および細胞において本スルファターゼmRNAのレベルを調節する薬剤を同定するための方法；および真核細胞由来の本スルファターゼの放出を調節する薬剤を同定するための方法を提供する。いくつかの態様において、アッセイは細胞を含まないアッセイである。他の態様において、アッセイは細胞を基盤とするアッセイである。
【０１５３】
本明細書に用いられる場合、用語「調節する」は、「増加させる」および「減少させる」を含む。いくつかの態様において、特に関心のある対象としては、スルファターゼ活性を阻害する、および/または細胞において本スルファターゼポリペプチドのレベルを低下させる、および/または細胞において本スルファターゼmRNAのレベルを低下させるおよび/または真核細胞由来の本スルファターゼの放出を低下させる薬剤である。そのような薬剤は、癌を治療するための候補として対象となる。他の態様において、対象となる薬剤は、スルファターゼ活性を増加させるものである；そのような薬剤は、血管形成を増加させることによる治療を受け入れられる疾患、例えば、虚血性状態を治療するための候補として対象となる。
【０１５４】
用語「候補薬剤」、「薬剤」、「物質」および「化合物」は、本明細書で交換可能に用いられる。候補薬剤は、多数の化学的種類、典型的には、合成の、半合成の、もしくは天然に存在する無機または有機分子を含む。候補薬剤は、50ダルトンより大きくかつ約2,500ダルトン未満の分子量をもつ小さな有機化合物でありうる。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含みうり、かつ少なくともアミン、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基を含みうり、およびその官能化学基の少なくとも2つを含みうる。候補薬剤は、環式炭素もしくは複素環式構造および/または上記の官能基の1つまたは複数で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造を含みうる。候補薬剤はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体またはそれらの組み合わせを含む生体分子の間に見出される。
【０１５５】
候補薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む幅広く様々な源から得られる。例えば、幅広く様々な有機化合物および生体分子のランダム的ならびに定方向的合成のために多数の方法が利用可能であり、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む。または、細菌、菌類、植物および動物の抽出物の形における天然の化合物のライブラリーは、入手可能または容易に作製される。さらに、天然のまたは合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理学的および生化学的方法により容易に修飾され、かつコンビナトリアルライブラリーを作製するために使用されうる。既知の薬理学的薬剤は、構造的類似体を作製するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような定方向的またはランダムな化学的修飾を受けさせうる。
【０１５６】
スクリーニングアッセイが結合アッセイであるところにおいては、1つまたは複数の分子が標識に結合されることができ、その標識は直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供できる。様々な標識は、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁気粒子などを含む。特異的結合分子は、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシンなどのような対を含む。特異的結合メンバーについて、その相補的メンバーは、普通、公知の方法に従って、検出を与える分子で標識されるものである。
【０１５７】
様々な他の試薬が、スクリーニングアッセイに含まれうる。これらは、最適なタンパク質-タンパク質結合を促進するおよび/または非特異的またはバックグラウンドの相互作用を低減させるために使用される塩、天然タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などを含む。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させる試薬が使用されうる。成分の混合物は、必要な結合を与える任意の順序で添加される。インキュベーションは、任意の適する温度、典型的には、4℃と40℃の間で行われる。インキュベーション時間は、最適活性のために選択されるが、迅速な高処理量のスクリーニングを促進するためにも最適化されうる。典型的には、0.1時間と1時間の間が十分であると思われる。
【０１５８】
スルファターゼ活性を調節する薬剤を同定するための方法
本発明は、本発明のスルファターゼポリペプチドの酵素的活性を調節する薬剤を同定する方法を提供する。用語「調節する」は、適切な対照と比較した場合、測定されるスルファターゼ活性における増加または減少を含む。
【０１５９】
方法は、一般的に以下の段階を含む：
a)試験薬剤をスルファターゼポリペプチドを含む試料と接触させる段階；および
b)その物質の存在下で、スルファターゼポリペプチドのスルファターゼ活性をアッセイする段階。
適切な対照でのスルファターゼ活性との比較において、スルファターゼ活性における増加または減少は、その物質がスルファターゼの酵素活性を調節することを示すものである。
【０１６０】
本明細書で用いられる場合、「スルファターゼポリペプチドのスルファターゼ活性を調節する薬剤」は、本明細書に記載されるように、スルファターゼポリペプチドのスルファターゼ活性を変化させる能力をもつ任意の分子、例えば、合成もしくは天然の有機もしくは無機化合物、タンパク質または薬を示す。一般的に、アッセイ混合物の多数は、様々な濃度に対する示差的応答を得るために異なる薬剤濃度を並行して実行される。典型的には、これらの濃度の1つは、陰性対照としての役割を果たす、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル以下である。スルファターゼ活性は、当技術分野において公知の任意のキナーゼアッセイ法を用いて測定されうる。
【０１６１】
スルファターゼ活性による硫酸基の切断により、検出に基づいて分析可能な吸収、蛍光または他の物理学的性質において変化を生じるどんな硫酸化化合物も、本アッセイでの使用に適している。適する基質は、限定されるものではないが、4-メチルウンベリフェリル硫酸；p-ニトロフェニル硫酸；4-メチルウンベリフェリル-α-D-N-アセチルグクコサミド-6-硫酸もしくは4-メチルウンベリフェリル-グルコサミン-6-硫酸またはこれらの誘導体を含む複合体；ヘパリンまたはヘパラン硫酸の断片を含む、任意の硫酸化糖またはヘパラン硫酸に関連した糖の集合；および硫酸基が放射性標識されている任意の硫酸化化合物を含む。
【０１６２】
特定の態様において、35S標識を含む基質が使用される。35Sの放出は、任意の適当なアッセイ法、例えば、シンチレーションカウンティングなどを用いて測定さえる。
【０１６３】
他の態様において、基質は、いったん硫酸基がスルファターゼの作用により放出されれば、検出可能なシグナルを供給する硫酸化部分を含む。特別な態様において、その基質は、4-メチルウンベリフェリル硫酸である。4-メチルウンベリフェリル硫酸への本スルファターゼの作用の反応生成物は、蛍光化合物である4-メチルウンベリフェロンである。生成物4-メチルウンベリフェロンは、約360 nmの励起波長により検出され、そこにおいて、その生成物は約460 nmで放射する。一般的に、反応は、約10 mMの4-メチルウンベリフェリル硫酸、および10 mM 酢酸鉛を含む。反応は、37℃で行われる。必要に応じて、反応は、0.5 M Na2CO3/NaHCO3、pH 10.7の過剰量の添加により停止される。スルファターゼ活性は、蛍光を測定することにより検出される。このアッセイ法は、特に、高処理量方式に適している。
【０１６４】
本ポリペプチドのスルファターゼ活性を調節する薬剤は、適切な対照と比較した場合、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約100％、または2倍、より好ましくは少なくとも約5倍、より好ましくは少なくとも約10倍もしくはそれ以上、その活性を増加させるまたは減少させる。
【０１６５】
所望の程度まで本ポリペプチドのスルファターゼ活性を増加させるまたは減少させる薬剤は、さらなる研究のために選択されることができ、細胞利用能、細胞障害性、生体適合性などについて評価されうる。
【０１６６】
いくつかの態様において特に関心のある対象としては、本ポリペプチドのスルファターゼ活性を減少させる薬剤である。スルファターゼ活性の最大限の阻害が、治療的効果を達成するあらゆる例において、必ずしも必要ではない、または実のところ望ましいとは限らない。本スルファターゼ活性を減少させる薬剤は、腫瘍細胞により刺激される血管形成を低減させるにおいて使用を見出しうり、このように癌を治療するのに有用でありうる。
【０１６７】
いくつかの態様において特に関心のある対象としては、本ポリペプチドのスルファターゼ活性を増加させる薬剤である。本ポリペプチドのスルファターゼ活性を増加させる薬剤は、血管形成を増加させるにおいて使用を見出しうり、このように虚血性状態を治療するのに有用でありうる。
【０１６８】
細胞を基盤とする方法
細胞を基盤とする方法は、本スルファターゼmRNAおよび/または本スルファターゼポリペプチドのレベルを調節する薬剤を検出する方法、ならびに真核細胞から本スルファターゼの放出を調節する薬剤を検出するための方法を含む。
【０１６９】
候補薬剤は、トリパンブルー色素排除法、MTT([3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド])アッセイ法などのような周知のアッセイ法を用いて、そのアッセイ法において使用される細胞に対してそれが示しうる任意の細胞障害活性について評価される。細胞障害活性を示さない薬剤は、候補薬剤とみなされる。
【０１７０】
アッセイ法に使用される細胞は、通常、限定されるものではないが、齧歯動物細胞およびヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。細胞は、初代細胞培養でありうる、または不死化された細胞系でありうる。
【０１７１】
スルファターゼmRNAおよび/またはスルファターゼポリペプチドのレベルを調節する薬剤を検出する方法
広く様々な細胞を基盤とするアッセイ法は、例えば、cDNAが過剰発現しているようなスルファターゼをコードするcDNAを含む構築物、または、代わりになるべきものとして、レポーター遺伝子に利用可能に連結されたスルファターゼプロモーターを含む構築物で形質転換された哺乳動物細胞を使用して、スルファターゼmRNAのレベルを調節する薬剤を同定するため、および真核細胞からスルファターゼの放出を調節する薬剤を同定するために用いられうる。
【０１７２】
従って、本発明は、細胞において、スルファターゼ発現のレベルを調節する薬剤、特に生物学的活性剤を同定するための方法を提供し、その方法は、スルファターゼポリペプチドをコードする核酸を含む細胞に試験されるべき候補薬剤を結合させる段階；およびスルファターゼ発現における該薬剤の効果を測定する段階を含む。スルファターゼ発現レベルの「調節」は、その薬剤を欠く対照が試験されるのに比較した場合、スルファターゼmRNAおよび/またはそのスルファターゼポリヌクレオチドによりコードされるスルファターゼポリペプチドのレベルを増加させることおよびレベルを減少させることを含む。試験される候補薬剤に細胞を接触させた後のスルファターゼmRNAおよび/またはポリペプチドのレベル(すなわち、量)において、薬剤を添加されない対照と比較して、約1.25倍、通常では少なくとも約1.5倍、通常では少なくとも約2倍、通常では少なくとも約5倍、通常では少なくとも約10倍もしくはそれ以上の増加または減少は、その薬剤がスルファターゼ発現を調節することを示すものである。
【０１７３】
レベルが測定されようとしているスルファターゼmRNAおよび/またはポリペプチドは、内因性スルファターゼポリヌクレオチドによりコードされうる、またはそのスルファターゼポリヌクレオチドは、組換えベクター内に含まれ、かつ細胞へ導入されるものでありうる、すなわち、そのスルファターゼmRNAおよび/またはポリペプチドは外因性スルファターゼポリヌクレオチドによりコードされうる。例えば、組換えベクターは、レポーター遺伝子(例えば、β-ガラクトシダーゼ、CAT、ルシフェラーゼ、または発現を容易にアッセイされうる他の遺伝子)に利用可能に連結された、プロモーター配列のような単離されたスルファターゼ転写制御配列を含みうる。これらの態様において、細胞でのスルファターゼ発現のレベルを調節する薬剤を同定するための方法は、レポーター遺伝子に利用可能に連結されたスルファターゼ遺伝子転写制御要素を含む核酸を含む細胞に試験されるべき候補薬剤を結合させる段階；およびレポーター遺伝子発現における該薬剤の効果を測定する段階を含む。組換えベクターは、スルファターゼポリペプチドについてコードしている配列に利用可能に連結された、プロモーター配列のような単離されたスルファターゼ転写制御配列を含みうる；またはその転写制御配列は、検出を容易にするポリペプチドと融合されたスルファターゼポリペプチドを含むスルファターゼ融合タンパク質についてのコード配列に利用可能に連結されうる。これらの態様において、方法は、スルファターゼポリペプチドのコード配列に利用可能に連結されたスルファターゼ遺伝子転写制御要素を含む核酸を含む細胞に試験されるべき候補薬剤を結合させる段階；および測定が、その細胞により産生されるスルファターゼmRNA、スルファターゼポリペプチド、またはスルファターゼ融合ポリペプチドの量を測定することにより行われうる、スルファターゼ発現における該薬剤の効果を測定する段階を含む。
【０１７４】
細胞を基盤とするアッセイ法は、一般的に、試験試料を形成している試験されるべき薬剤に細胞を接触させる、および、適する時間の後、スルファターゼ発現におけるその薬剤の効果を評価する段階を含む。対照試料は、その候補薬剤の添加なしで、同じ細胞を含む。スルファターゼ発現レベルは、試験試料および対照試料の両方において測定される。試験試料および対照試料におけるスルファターゼ発現レベル間で比較される。スルファターゼ発現は、通常のアッセイ法を用いて評価されうる。例えば、哺乳動物細胞系がスルファターゼの発現を生じる構築物で形質転換されている場合、スルファターゼmRNAレベルが、上記のように、検出かつ測定されうる、またはスルファターゼポリペプチドのレベルが、上記のように検出かつ測定されうる。薬剤の細胞に接触させるための適する時間は、経験的に決定されることができ、一般的に、薬剤の細胞への侵入を可能にし、かつ薬剤がスルファターゼmRNAおよび/またはポリペプチドレベルにおいて測定可能な効果を生じるようにさせるのに十分な時間である。一般的に、適する時間は、10分と24時間の間、より典型的には約1時間〜8時間である。
【０１７５】
いくつかは上に記載されているが、スルファターゼmRNAを測定する方法は、当技術分野において知られており、これらの方法のいずれも、細胞においてスルファターゼmRNAを調節する薬剤を同定するための本発明の方法に用いられうり、限定されるものではないが、検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するPCR法のようなPCR法、および任意の様々なハイブリダイゼーションアッセイ法を含む。同様に、スルファターゼポリペプチドのレベルは、任意の標準的方法を用いて測定されることができ、そのいくつかは本明細書に記載されており、限定されるものではないが、ELISA、例えば、スルファターゼポリペプチドに特異的な検出可能に標識された抗体を使用するELISAを含む。
【０１７６】
様々な他の試薬がスクリーニングアッセイに含まれうる。これらは、最適なタンパク質-タンパク質結合を促進するおよび/または非特異的またはバックグラウンドの相互作用を低減させるために使用される塩、天然タンパク質、例えば、アルブミン、界面活性剤などを含む。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させる試薬が使用されうる。
【０１７７】
スクリーニング方法は、多数の異なる形式を設計され、当技術分野において知られているように、様々なアッセイ形態およびプロトコールが使用されうる。例えば、成分の1つが固体支持体に結合され、その残りの成分が、成分を結合している支持体に接触されうる。方法の上記成分は、実質的に同じ時間に、または異なる時間に結合されうる。インキュベーションは、任意の適する温度、典型的には4℃と40℃の間で行われる。インキュベーション時間は、最適な活性のために選択されるが、迅速な高処理量のスクリーニングを促進するためにも最適化されうる。典型的には、0.1時間と1時間の間が十分であると思われる。接触およびインキュベーション段階の後、本方法は、一般的に、必ずではないが、結合していない成分を除去するために洗浄段階をさらに含み、そのような洗浄段階は、一般的に、放射性または蛍光性に標識された非特異的結合の成分のような、検出の間にバックグラウンドシグナルを起こすであろう標識を除去することが必要とされる場合、用いられる。選択的な洗浄段階後、結合した複合体の存在がその後検出されることになる。
【０１７８】
様々な異なる候補薬剤は、上記方法によりスクリーニングされうる。候補薬剤は、典型的には、それらは有機分子、好ましくは50ダルトンより大きくかつ約2,500ダルトン未満の分子量をもつ小さな有機化合物であるが、多数の化学的種類を含む。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、かつ典型的には、少なくともアミン、カルボニル基、ヒドロキシル基またはカルボキシル基、好ましくはその官能化学基の少なくとも2つを含む。候補薬剤は、しばしば、環式炭素もしくは複素環式構造および/または上記の官能基の1つまたは複数で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的類似体またはそれらの組み合わせを含む生体分子の間に見出される。
【０１７９】
候補薬剤は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む幅広く様々な源から得られる。例えば、幅広く様々な有機化合物および生体分子のランダム的ならびに定方向的合成のために多数の方法が利用可能であり、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む。または、細菌、菌類、植物および動物の抽出物の形における天然の化合物のライブラリーは、入手可能または容易に作製される。さらに、天然のまたは合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理学的および生化学的方法により容易に修飾され、かつコンビナトリアルライブラリーを作製するために使用されうる。既知の薬理学的薬剤は、構造的類似体を作製するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような定方向的またはランダムな化学的修飾を受けさせうる。
【０１８０】
真核細胞からの本スルファターゼの放出を調節する薬剤を検出する方法
真核細胞からのスルファターゼの放出を調節する薬剤を同定するための方法は、一般的に、正常に本スルファターゼを産生する細胞を試験薬剤に接触させること、および本スルファターゼの放出おいて、もしあればその効果を測定することを含む。
【０１８１】
真核細胞からの本スルファターゼの放出の「調節」は、試験される薬剤を欠く対照と比較した場合、真核細胞からの本スルファターゼの放出のレベルを増加させることおよびそのレベルを減少させることを含む。試験される候補薬剤に細胞を接触させた後のスルファターゼmRNAおよび/またはポリペプチドのレベル(すなわち、量)において、薬剤が添加されない対照と比較して、約1.25倍、通常には少なくとも約1.5倍、通常には少なくとも約2倍、通常には少なくとも約5倍、通常には少なくとも約10倍もしくはそれ以上の増加または減少は、その薬剤が真核細胞からの本スルファターゼの放出を調節することを示すものである。
【０１８２】
細胞を基盤とするアッセイ法は、一般的に、試験試料を形成している試験されるべき薬剤に細胞を接触させる、および、適する時間の後、真核細胞からの本スルファターゼの放出におけるその薬剤の効果を評価する段階を含む。対照試料は、その候補薬剤の添加なしの同じ細胞を含む。真核細胞からの本スルファターゼの放出は、試験試料および対照試料の両方において測定される。試験試料および対照試料における真核細胞からの本スルファターゼの放出の間で比較される。真核細胞からの本スルファターゼの放出は、スルファターゼ活性を測定する通常のアッセイ法を用いて評価されうる。例えば、哺乳動物細胞系がスルファターゼの発現を生じる構築物で形質転換されている場合、細胞から放出されるスルファターゼの酵素活性が、上記のように、検出かつ測定されうる、またはスルファターゼポリペプチドのレベルが、上記のように検出かつ測定されうる。薬剤の細胞に接触させるための適する時間は、経験的に決定されることができ、一般的に、薬剤の細胞への侵入(必要な場合には)、または任意の他の、細胞、例えば細胞表面の成分との相互作用を可能にする、かつ薬剤がスルファターゼ放出に測定可能な効果を生じるようにさせるのに十分な時間である。一般的に、適する時間は、10分と24時間の間、より典型的には約1時間〜8時間である。
【０１８３】
薬剤
本発明は、さらに、本発明のスクリーニングアッセイ法を用いて同定された薬剤、および薬学的組成物を含む、その薬剤を含む組成物を提供する。本組成物は、周知の試薬および方法を用いて製剤化されうる。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤との製剤として提供されうる。広く様々な薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において知られており、本明細書で詳細に論議される必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro(2000)"Remington : The Science and Practice of Pharmacy," 第20版、Lippincott, Williams & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H. C. Anselら編、第7版、Lippincott, Williams & Wilkins; およびHandbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A. H. Kibbeら編、第3版、Amer. Pharmaceutical Assoc.を含む、様々な刊行物に十分に記載されている。
【０１８４】
媒体、アジュバント、担体または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、一般に対して容易に入手可能である。さらに、pH調節および緩衝剤、浸透圧調節剤、安定化剤、湿潤剤などのような薬学的に許容される補助物質は、一般に対して容易に入手可能である。
【０１８５】
核酸およびポリペプチドの治療的組成物
本発明の核酸組成物およびポリペプチド組成物はまた、宿主においてスルファターゼ活性、特に本ポリペプチドの活性を増強させること、または特定の解剖学的部位でスルファターゼ活性を供給することが望まれる状況において、治療的薬剤としての使用を見出す。
【０１８６】
いくつかの態様において、本スルファターゼは、薬学的に許容される賦形剤との薬学的組成物として提供される。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro(2000)"Remington : The Science and Practice of Pharmacy," 第20版、Lippincott, Williams & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H. C. Anselら編、第7版、Lippincott, Williams & Wilkins; およびHandbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A. H. Kibbeら編、第3版、Amer. Pharmaceutical Assoc.を含む、様々な刊行物に十分に記載されている。
【０１８７】
媒体、アジュバント、担体または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、一般に対して容易に入手可能である。さらに、pH調節および緩衝剤、浸透圧調節剤、安定化剤、湿潤剤などのような薬学的に許容される補助物質は、一般に対して容易に入手可能である。
【０１８８】
本遺伝子、遺伝子断片、またはコードされたタンパク質もしくはタンパク質断片は、本スルファターゼの活性に関連した疾患を治療するための治療に有用である。発現ベクターは、細胞へ遺伝子を導入するために使用されうる。そのようなベクターは、一般的に、核酸配列の挿入を与えるためにプロモーター配列の近くに位置する都合のよい制限部位をもつ。転写カセットは、転写開始領域、標的遺伝子またはそれの断片、および転写終結領域を含むように調製されうる。転写カセットは、様々なベクター、例えば、プラスミド；レトロウイルス、例えばレンチウイルス；アデノウイルスなどへ導入され、ベクターは、通常では少なくとも約1日の期間、より通常では少なくとも約数日〜数週間の期間、細胞に一過性にまたは安定に維持されることができる。
【０１８９】
遺伝子またはタンパク質は、ウイルス感染、マイクロインジェクション、小胞の融合を含む、かなり多数の経路により組織または宿主細胞へ導入されうる。噴射注入もまた、Furthら、(1992), Anal. Biochem. 205:365-368により記載されるように、筋内投与に使用されうる。DNAは、金の微小粒子上へコーティングされ、粒子砲撃装置、すなわち「遺伝子銃」により皮内へ送達され、文献に記載されているが(例えば、Tangら、(1992), Nature 356:152-154を参照)、そこでは、金の微小発射体がDNAでコーティングされ、その後、皮膚細胞へ砲撃される。
【０１９０】
本発明のさらに他の態様において、活性のある薬剤は、宿主において標的タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する、かつ一般的には減少させるまたは下方制御する薬剤である。例えば、アンチセンス分子は、細胞において、本遺伝子の発現を下方制御するために用いられうる。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ODN)、特に天然の核酸由来の化学的修飾をもつ合成的ODN、またはそのようなアンチセンス分子をRNAとして発現する核酸構築物でありうる。アンチセンス配列は、標的にされる遺伝子のmRNAに相補的であり、標的にされる遺伝子の産物の発現を抑制する。アンチセンス分子は、様々な機構を通して、例えば、RNアーゼHの活性化を通して翻訳のために利用可能なmRNAの量を低下させること、または立体障害により、遺伝子発現を抑制する。アンチセンス分子の1つまたは組み合わせが投与され、組み合わせは、複数の異なる配列を含みうる。
【０１９１】
アンチセンス分子は、適当なベクターにおいて標的遺伝子配列のすべてまたは部分の発現により生成され、その転写開始は、アンチセンス鎖がRNA分子として生成されるように配向される。または、アンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に、長さが少なくとも約7ヌクレオチド、通常では少なくとも約12ヌクレオチド、より通常では少なくとも約20ヌクレオチド、かつ長さが約500ヌクレオチドより多くない、通常では約50ヌクレオチドより多くない、より通常では約35ヌクレオチドより多くなく、長さは、抑制の効率、交差反応性の非存在を含む特異性などにより支配される。長さが7塩基から8塩基までの短いオリゴヌクレオチドが遺伝子発現の強くかつ選択的な阻害剤でありうることが見出された(Wagnerら、(1996), Nature Biotechnol. 14:840-844を参照)。
【０１９２】
内因性センス鎖mRNA配列の特定の領域は、アンチセンス配列により補完されるように選択される。オリゴヌクレオチドに特異的な配列の選択は、数個の候補配列がインビトロまたは動物モデルにおいて標的遺伝子の発現の抑制についてアッセイされる、経験的な方法を使用しうる。配列の組み合わせもまた使用され、mRNA配列の数個の領域がアンチセンス相補性について選択される。
【０１９３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知の方法により化学的に合成されうる(Wagnerら、(1993)、前記、およびMilliganら、前記を参照)。好ましいオリゴヌクレオチドは、それらの細胞内での安定性および結合親和性を増加させるために、天然のリン酸ジエステル構造から化学的に修飾される。多数のそのような修飾は、文献に記載されてきており、修飾は、バックボーン、糖または複素環式塩基の化学を変化させる。
【０１９４】
バックボーンの化学における有用な変化の間では、ホスホロチオネート；非架橋の酸素の両方がイオウで置換されている、ホスホロジチオネート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートがある。非キラルのリン酸誘導体は、3'-O'-5'-S-ホスホロチオネート、3'-S-5'-O-ホスホロチオネート、3'-CH2-5'-O-ホスホネートおよび3'-NH-5'-O-ホスホロアミダイトを含む。ペプチド核酸は、リボースリン酸ジエステルバックボーン全体をペプチド結合で置換している。糖修飾はまた、安定性および親和性を高めるために用いられる。天然のα-アノマーについて塩基が転化されている、デオキシリボースのβ-アノマーが使用されうる。リボース糖の2'-OHは、2'-O-メチルまたは2'-O-アリル糖を形成するように変化されることができ、親和性を含めることなく、分解に対する抵抗性を与える。複素環式塩基の修飾は、正確な塩基対形成を維持しなければならない。いくつかの有用な置換は、デオキシチミジンの代わりにデオキシウリジン；デオキシシチジンの代わりに5-メチル-2'-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-2'-デオキシシチジンを含む。5-プロピニル-2'-デオキシウリジンおよび5-プロピニル-2'-デオキシシチジンは、それぞれ、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンの代わりに置換される場合、親和性および生物学的活性を増加させることが示された。
【０１９５】
アンチセンス阻害剤に代わるものとして、触媒的核酸化合物、例えば、リボザイム、アンチセンス複合体などが遺伝子発現を抑制するために用いられうる。リボザイムは、インビトロで合成されて患者へ投与されうる、または発現ベクター上にコード化されることができ、そこからリボザイムが標的にされる細胞中で合成される(例えば、国際公開公報第9523225号、およびBeigelmanら、(1995), Nucl. Acids Res. 23:4434-4442を参照)。触媒活性をもつオリゴヌクレオチドの例は、国際公開公報第9506764号に記載されている。mRNAの加水分解を仲介する能力がある、金属錯体をもつアンチセンスODNの複合体、例えば、テルピリジル銅(II)は、Bashkinら、(1995), Appl. Biochem. Biotechnol. 54:43-56に記載されている。
【０１９６】
治療方法
本発明は、様々な治療方法を提供する。いくつかの態様において、本タンパク質の酵素活性を、調節することおよび抑制することを含めて、制御する方法が提供される。本方法は、限定されるものではないが、癌、炎症；虚血性疾患のような血管形成を増加させることによる治療を受け入れられる疾患；および血栓症を含む、様々な異なる疾患状態の治療に使用を見出す。
【０１９７】
宿主、すなわち患者は、任意の哺乳類の種、例えば、霊長類の種、特に、ヒト；マウス、ラットおよびハムスターを含む齧歯動物；ウサギ；ウマ、ウシ、イヌ、ネコなどからである。動物モデルは、ヒトの疾患の治療についてのモデルを提供する、実験的研究のための対象となる。
【０１９８】
本明細書に用いられる場合、用語「薬剤」は、酵素的に活性のある本スルファターゼのレベルを調節する物質を指す。いくつかの態様において、薬剤は、本発明のスクリーニングアッセイ法により同定されるものである。「酵素的に活性のある本スルファターゼのレベルを調節すること」は、本スルファターゼの酵素活性を増加させるまたは減少させること；酵素的に活性のあるスルファターゼタンパク質のレベルを増加させるまたは減少させること；および酵素的に活性のある本スルファターゼをコードするmRNAのレベルを増加させるまたは減少させることを含む。いくつかの態様において、薬剤は本スルファターゼであり、その本スルファターゼ自身が個体へ投与される。いくつかの態様において、薬剤は、本スルファターゼに特異的な抗体である。
【０１９９】
腫瘍増殖を低下させる方法
本スルファターゼの活性を低下させることおよび/または本スルファターゼのポリペプチドもしくはmRNAのレベルを低下させることによる治療を受け入れられる疾患状態は、腫瘍による血管形成の促進に関連するまたは起因する疾患状態を含む。このように、本方法は、腫瘍誘発血管形成を低下させるために有用である。いくつかの態様において、方法は、癌を治療するために提供される。これらの態様のいくつかにおいて、方法は、腫瘍増殖を低下させるために提供される。他の態様において、方法は、ECMからの分化因子の放出を低下させるために提供される。
【０２００】
腫瘍増殖を低下させる方法、腫瘍誘発血管形成を低下させる方法、および本スルファターゼ活性を低下させる方法は、一般的に、酵素的に活性のある本スルファターゼのレベル低下させる薬剤を個体へ投与することを含む。薬剤の有効量は、酵素的に活性のあるスルファターゼのレベルを適切な対照と比較した場合、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、またはそれ以上、低下させる。薬剤の有効量は、腫瘍増殖を適切な対照と比較した場合、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、またはそれ以上、低下させる。
【０２０１】
成長因子および分化因子のような因子のECMからの放出を低下させる方法が提供される。方法は、一般的に、酵素的に活性のある本スルファターゼのレベルを低下させる薬剤の有効量を個体へ投与することを含み、酵素的に活性のあるスルファターゼのレベルにおける低下は、結果として、腫瘍に近接したまたは周囲のECMからの因子の放出の低下を生じる。
【０２０２】
分化因子および成長因子は、限定されるものではないが、線維芽細胞成長因子(FGF)、ヘパリン結合EGF様成長因子、肝細胞成長因子、分泌性糖タンパク質のWntファミリーのメンバー、血管内皮成長因子(VEGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、トランスフォーミング成長因子(TGF)、例えばTGF-β、骨形成タンパク質、GM-CSF、および肝細胞成長因子を含む。いくつかの態様において、本スルファターゼによりECMから放出される因子は、ヘパラン硫酸を結合する因子である。いくつかの態様において、本スルファターゼによりECMから放出される因子は、血管形成因子である。
【０２０３】
本発明の方法を用いて治療されうる腫瘍は、癌腫、例えば、大腸癌、前立腺癌、乳癌、黒色種、腺管癌、子宮体癌、胃癌、膵癌、中皮腫、形成異常口腔粘膜癌、浸潤口腔癌、非小細胞肺癌、移行および扁平上皮細胞泌尿器癌など；神経学的悪性疾患、例えば、神経芽細胞腫、神経グリア芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠腫など；血液学的悪性疾患、例えば、小児期急性白血病、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、悪性皮膚T細胞、菌状息肉腫、非MF皮膚T細胞リンパ腫、リンパ腫様丘疹症、T細胞豊富皮膚リンパ球系増殖症、水泡性類天疱瘡、円板状エリテマトーデス、扁平苔癬など；その他同種類のものを含む。
【０２０４】
腫瘍細胞増殖が抑制されているまたは低下しているかどうかは、限定されるものではないが、腫瘍の大きさを測定すること；腫瘍細胞が増殖しているかどうかを、例えば、3H取り込みアッセイ法を用いること；および/または腫瘍細胞を数えることにより、測定することを含む、当技術分野において公知の任意の方法により評価されうる。
【０２０５】
炎症を低減させるための方法
いくつかの態様において、本発明は、酵素的に活性のある本スルファターゼのレベルを増加させることを含む、炎症を低減させる方法を提供する。スルファターゼは、セレクチンリガンドの炭水化物部分から硫酸基を除去するように作用する。いったん硫酸基がセレクチンリガンドから(例えば、N-アセチルグクコサミン-6-硫酸から)除去されれば、セレクチンのリガンドへの結合は弱まり、かつセレクチンがその表面上にある免疫細胞と、例えば内皮細胞の表面上のセレクチンリガンドとの結合は弱まる。従って、セレクチンリガンドからの硫酸基の除去は炎症を低減させる。いくつかの態様において、方法は、本スルファターゼを個体へ投与することを含む。他の態様において、方法は、薬剤(例えば、上記のスクリーニング方法により同定された薬剤)を個体へ投与することを含み、該薬剤は、個体において酵素的に活性のある本スルファターゼのレベルを増加させるものである。薬剤の治療的有効量は、炎症が止められうるまたは改善されうるかのどちらかであるように、実質的に比例した数のリガンドから硫酸部分を除去するために十分な量である。このように、炎症に関連して本明細書で用いられる「治療すること」は、炎症および/もしくは炎症に関連する症状を止めることもしくは改善することを意味するものである。
【０２０６】
投与されるべきスルファターゼまたは薬剤の用量を決定するにおいて、すべての硫酸基を完全に除去することを望まないことに留意しなければならない。正常な治癒過程が進行するために、白血球または好中球の少なくともいくらかが、創傷、感染または疾患状態が生じている領域において組織へと運び込まれなければならない。投与されるスルファターゼまたは薬剤の量は、治療されようとしている疾患の型のような様々な因子を考慮すると同時に、患者の個々の要求に基づいて調整される。
【０２０７】
本スルファターゼおよび/または薬剤は、広い範囲の疾患を治療するのに有用であり、慢性関節リウマチ、喘息、成人性呼吸窮迫症候群、類肉腫症、過敏性肺臓炎多発性硬化症、同種移植片拒絶、および皮膚部位へのリンパ腫の蔓延のような疾患を含む。本発明の組成物は、免疫系が身体に敵対し、組織損傷、腫脹、炎症および/または痛みを引き起こす程度にまで白血球を組織に集積させているどんな疾患状態をも治療するために適用できるものと思われる。例えば、慢性関節リウマチの炎症は、大量の白血球が疾患領域の関節に急速に侵入し、その周囲の組織を攻撃する場合に引き起こされる。
【０２０８】
スルファターゼおよび/または薬剤の処方は、心臓発作に起因する組織損傷の望ましくない後遺症を予防するために投与される。心臓発作が発生し、抗凝血薬または血栓溶解剤(例えば、tPA)の投与によるなどで患者が蘇生した場合、血塊が形成された内皮の内側は、しばしば、損傷を受けている。抗血栓薬が血塊を除去した場合、血塊の下の傷ついた組織および酸素を奪われた内皮の内側における他の傷ついた組織は活性化する。白血球はL-セレクチンを所有している。その受容体が活性化された内皮細胞の表面上のリガンド分子に付着している。リガンド分子は、活性化により内皮細胞の表面へ誘導されうる。大量の白血球が迅速に捕獲され、かつ作用を受けた領域の周囲の組織へと運び込まれ、その結果として、炎症、腫脹、およびそれにより患者の生存の見込みを減少させる壊死を生じる。
【０２０９】
心臓発作に起因する外傷を患っている患者を治療することに加えて、事実上の肉体的外傷を患っている患者は、身体の領域が重篤な外傷を受けた後に普通、生じる炎症および腫脹の量を軽減するために、本発明の処方で治療されうる。最も好ましくは、これは、外傷を受けている領域へのスルファターゼおよび/または薬剤の局所的注入により行われる。また、出血性ショックを起こしている患者は、回復血流に付随した炎症を緩和するために治療されうる。本発明の処方を用いて治療可能と思われる他の疾患状態は、様々な型の関節炎、様々な皮膚の慢性炎症状態、インスリン依存性糖尿病、および成人性呼吸窮迫症候群を含む。本開示を読んだ後、当業者は、本発明の処方の投与により治療されるおよび/または緩和されるであろう他の疾患状態および/または症状を認識するものと思われる。
【０２１０】
血管形成を増加させる方法
いくつかの態様において、本発明は、血管形成を増加させるための方法を提供する。方法は、一般的に、本スルファターゼの有効量による血管形成を増加させることによる治療を受け入れられる状態をもつ哺乳動物へ投与することを含む。多くの態様において、本スルファターゼは、解剖学的部位へ局所的に投与されるものである。
【０２１１】
本発明の方法による治療の影響を受けやすい状態および疾患の例は、血管の閉塞、例えば、動脈、静脈の閉塞、または毛細血管系の閉塞に関連するどんな状態も含む。そのような状態または疾患の特定の例には、必ずしも限定されるものではないが、冠動脈閉塞性疾患、頸動脈閉塞性疾患、動脈閉塞性疾患、末梢動脈性疾患、アテローム性動脈硬化症、筋肉脈管内膜肥厚(例えば、血管手術またはバルーン血管形成または血管ステント術による)、閉塞性血栓性脈管炎、血栓性疾患、脈管炎などを含む。本発明の方法を用いて防ぎうる状態または疾患の例は、必ずしも限定されるものではないが、様々な虚血性状態のいずれも(例えば、心筋虚血、肢虚血、発作に付随する虚血)、心臓発作(心筋梗塞)または他の血管死、脳卒中、減少した血流に付随する肢の死または損失などを含む。
【０２１２】
このように、本発明は、虚血性状態を治療する方法を提供する。本スルファターゼの有効量の投与は、血管形成における増加、および、結果として、虚血性組織への血液供給の増加を生じる。本スルファターゼの投与後、虚血性組織への血液供給(血流)は、適切な対照と比較した場合、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約100％またはそれ以上、増加する。虚血性組織への血液供給が増加しているかどうかは、当技術分野において公知の任意の方法により測定されることができ、限定されるものではないが、サーモグラフィー；赤外線記録計；経皮的PO2、経皮的PCO2、レーザードップラー、ドップラー波形、足首上腕インデックス、脈拍容量記録、足指圧力、二重波形、磁気共鳴映像法特性、同位元素ウォッシュアウトおよびNAD/NADH蛍光測定法を含む。そのような方法は当技術分野においてよく知られており、多数の刊行物に記載されてきており、例えば、Lazarusら((1994)Arch. Dermatol. 130:491)およびそこに引用されている参照文献を含む。
【０２１３】
血管形成が増加しているかどうかは、任意の公知のアッセイ法を用いて測定されうる。血管形成が増加しているかどうかは、任意の公知のアッセイ法を用いて測定されることができ、例えば、リラキシンに浸漬された移植片への新血管新生の刺激；角膜または前眼房における血管増殖の刺激；インビトロでの内皮細胞の増殖、遊走または管形成の刺激；およびニワトリ漿尿膜アッセイ法；ハムスター頬嚢アッセイ法；ポリビニルアルコールのスポンジディスクアッセイ法を含む。そのようなアッセイ法は、当技術分野においてよく知られており、多数の刊行物に記載されてきており、例えば、Auerbachら((1991)Pharmac. Ther. 51:1-11)およびそこに引用されている参照文献を含む。
【０２１４】
血栓症を低減させる方法
本発明は、さらに、個体における血栓症を低減させる方法を提供し、その方法は、一般的に、本スルファターゼの阻害剤の有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、阻害剤は、本スルファターゼのスルファターゼ活性の小分子阻害剤である。他の態様において、阻害剤は、本スルファターゼに特異的な抗体であり、抗体は、直接的に、またはスルファターゼの除去を実施することによるかのいずれかで、スルファターゼ活性を阻害する。
【０２１５】
製剤、投与量、および投与経路
上で言及されているように、活性のある薬剤(例えば、小分子、抗スルファターゼ抗体、または本スルファターゼ)が宿主に投与され、「有効量」とは、所望の結果を生じるのに十分な用量を意味する。いくつかの態様において、所望の結果は、少なくとも、対照と比較して、本スルファターゼの酵素活性における低下である。他の態様において、所望の結果は、対照と比較して、酵素的に活性のあるスルファターゼのレベル(個体において、または個体の局在化された解剖学的部位において)における増加である。
【０２１６】
典型的には、本発明の組成物は、活性のある成分の1％未満から約95％まで、好ましくは約10％から約50％まで含むものである。一般的に、約100 mgと500 mgの間が小児へ投与され、かつ約500 mgと5グラムの間が成人へ投与されるものである。投与は、一般的に、注射による、およびしばしば局在化された領域への注射による。投与の頻度は、患者の反応性に基づいて与えられる治療により決定されるものである。他の有効用量は、当業者により、用量反応曲線を確立する日常的な試行を通して容易に決定されうる。
【０２１７】
スルファターゼ酵素の量を計算するために、当業者は、スルファターゼの所定の量を除去するのに必要な酵素の量についての入手可能な情報を容易に使用できるものと思われる。例えば、所定の酵素が、その酵素の1ユニットが生理学的pHにおいて基質からSO4の1マイクロモル/分を除去するような活性をもつ場合には、治療的目的のために、70 kgのヒトへ1ユニットから10ユニットを静脈内に投与することになる。酵素的に活性のある本スルファターゼのレベルを増加させるために必要な薬剤の量は、インビトロでの実験から計算されうる。例えば、所定の量の基質からの硫酸基の除去を増加させるために必要な薬剤の量を計算すること、および治療されるべき領域内でのそのような基質(またはそれのインビボでの等価物)の量を推定することにより、投与されるべき薬剤の量が決定されうる。薬剤の量は、もちろん、使用される個々の薬剤に依存して変化するものである。
【０２１８】
本方法において、活性のある薬剤は、所望のスルファターゼ活性の阻害を生じることが可能な任意の通常の方法を用いて、宿主へ投与されうる。このように、薬剤は、治療的投与として、様々な製剤形態へと組み入れられうる。さらに特に、本発明の薬剤は、適当な、薬学的に許容される担体または希釈剤との組み合わせによる薬学的組成物へと製剤化されることができ、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射薬、吸入薬およびエアゾールのような、固体、半固体、液体またはガス状の形での調合薬へと製剤化されうる。
【０２１９】
それとして、薬剤の投与は、様々な方法において行われることができ、経口、頬、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内などの投与を含む。
【０２２０】
薬学的調剤形態において、薬剤は、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与されうる、またはそれらは、単独で、もしくは他の薬学的に活性のある化合物との適当な会合、および組み合わせとしても使用されうる。以下の方法および賦形剤は、単に例示的なものであり、決して限定するものではない。
【０２２１】
経口の調合薬について、薬剤は、単独で、または錠剤、粉末、顆粒もしくはカプセルを作製するために適当な添加剤、例えば、乳糖、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモの澱粉のような通常の添加剤；結晶性セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモの澱粉またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；および、必要に応じて、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤およびフレーバー剤と組み合わせて使用されうる。
【０２２２】
適する賦形剤媒介物は、例えば、水、塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要なら、媒介物は、湿潤もしくは乳化剤またはpH緩衝剤のような補助物質を微量含んでもよい。そのような調剤形態を調製する実際の方法は、当業者に知られている、または明らかであると思われる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 第17版、1985を参照されたい。投与されるべき製剤の組成物は、とにかく、治療されようとしている対象において所望の状態に達するために十分な量の塩素酸塩/セレン酸塩および/またはスルファターゼを含むものである。
【０２２３】
薬剤は、植物油もしくは他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸もしくはプロピレングリコールのエステルのような、水性または非水性溶媒に；ならびに、必要に応じて、可溶化剤、等張性剤、沈澱防止剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような通常の添加剤と共に、それらを溶解、懸濁または乳化することにより注射のための調合薬へと製剤化されてよい。
【０２２４】
薬剤は、吸入により投与されるためにエアゾールの製剤形態で利用されうる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような加圧された許容される噴霧剤へと製剤化されうる。
【０２２５】
さらになお、薬剤は、乳化基剤または水溶性基剤のような様々な基剤と混合することにより坐剤へと作製されうる。本発明の化合物は、坐剤を通して直腸へ投与されうる。坐剤は、体温で溶解するが、室温ではまだ凝固する、カカオバター、カーボワックスおよびポリエチレングルコールのような媒介物を含むことができる。
【０２２６】
シロップ、エリシキル剤および懸濁液のような経口または直腸投与のための単位用量形式は、各用量単位、例えば、ティースプーン1杯、テーブルスプーン1杯、錠剤または坐剤は、1つまたは複数の阻害剤を含む組成物のあらかじめ決められた量を含む。同様に、注射または静脈内投与のための単位用量形式は、滅菌水、普通の塩水または別の薬学的に許容される担体における溶液としての組成物中にその阻害剤を含みうる。
【０２２７】
本明細書で用いられる場合、用語「単位用量形式」は、ヒトおよび動物の対象に対する単位の用量として適切な物理学的に別々の単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、担体または媒介物と会合して、所望の効果を生じるために十分な量として計算された本発明の化合物のあらかじめ決められた量を含む。本発明の新規な単位用量形式についての仕様は、使用される個々の化合物および達成されるべき効果、および宿主における各化合物に関連する薬力学に依存する。
【０２２８】
媒介物、アジュバント、担体または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、一般に容易に入手可能である。さらに、pH調整および緩衝剤、張性調整剤、安定化剤、湿潤剤などのような薬学的に許容される補助物質は一般に容易に入手可能である。
【０２２９】
薬剤がポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらの類似体または模倣体、例えば、アンチセンス組成物であるところにおいて、それは、ウイルス感染、マイクロインジェクション、または小胞の融合を含む、かなり多数の経路により組織または宿主細胞へと導入されうる。噴射注入もまた、Furthら、(1992), Anal. Biochem. 205:365-368により記載されるように、筋内投与に使用されうる。DNAは、金の微小粒子上へコーティングされ、粒子砲撃装置、すなわち「遺伝子銃」により皮内へ送達されることができ、文献に記載されているが(例えば、Tangら、(1992), Nature 356:152-154を参照)、そこでは、金の微小発射体が治療用DNAでコーティングされ、その後、皮膚細胞へ砲撃される。
【０２３０】
用量レベルがその特定の化合物の機能、症状の重症度および副作用に対する対象の感受性に伴って変化しうることを当業者は容易に理解するものと思われる。所定の化合物に対する好ましい用量は、様々な方法により当業者に容易に決定可能である。
【０２３１】
治療とは、宿主を苦しめている病理学的状態に関連する症状の少なくとも改善を意味し、改善は、広い意味に用いられ、パラメーター、例えば、炎症およびそれに付随する痛みのような、治療されようとしている病理学的状態に関連する症状の重大さにおける、少なくとも低減を指す。それとして、治療はまた、病理学的状態または少なくともそれに関連する症状が、完全に抑制される、例えば起こるのを阻止される、または終わる、例えば、宿主がその病理学的状態もしくはその病理学的状態を特徴付ける症状にもはや悩まされないように終わる状態を含む。
【０２３２】
様々な宿主が本方法に従って治療可能である。一般的に、そのような宿主は、「哺乳動物」または「哺乳類の動物」であり、これらの用語は、哺乳類綱内である生物体を記載するために広く用いられ、食肉類目(例えば、イヌおよびネコ)、齧歯類目(例えば、マウス、モルモット、およびラット)、および霊長類目(例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル)を含む。多くの態様において、宿主は、ヒトである。
【０２３３】
本発明の様々なスルファターゼおよび薬剤は、単独で、お互いいっしょに、または上記のような薬学的に許容される賦形剤材料との組み合わせで、使用されうる。
【０２３４】
活性のある薬剤の単位用量をもつキットは、通常には経口または注射可能な用量で、提供される。そのようなキットには、単位用量を含む容器に加えて、対象となる病理学的状態を治療するにおけるその薬の使用および付随の利点を記載する情報パッケージ挿入物がある。好ましい化合物および単位用量は、本明細書の上に記載されるものである。
【０２３５】
実施例
以下の実施例は、本発明を作製しかつ使用する方法の完全な開示および記載を当業者に供給するために提出されており、本発明者が彼らの発明としてみなすところの範囲を限定するものではなく、また下記の実施例が行われる実験のすべてまたは唯一であることを示すものでもない。使用される数(例えば、量、温度など)について正確さを保証するために努力したが、いくらかの実験的エラーおよびずれは計上されるものと思われる。別なように指示されない限り、部分は重量での部分であり、分子量は分子の重量を平均する重量であり、温度は摂氏の度で示され、および圧力は大気圧においてまたは大気圧近くにおいてである。
【０２３６】
実施例1：  新規ヒトスルファターゼをコードする核酸分子HuSULF-1およびhuSULF-2配列の同定は、部分的タンパク質配列(15個のアミノ酸)に基づいて引き出され、かつNCBI公開データベースのBLAST(すなわち、tblastn)検索を用いてそのタンパク質配列について重複されている発現遺伝子配列断片を見出した。その新しいESTsは、その後、公開データベースから追加的な対応するESTsおよびゲノム配列を見出すために使用された。コンティグは集められて完全長cDNAを生じた。本発明者らはまた、ヒトESTsおよびゲノム配列から、ヒトsulf-1に高い関連性のあるヒトsulf2に対応する完全長cDNA配列を同定することができた。その2つの遺伝子についてのcDNAsから、本発明者らは推定のタンパク質配列を引き出した。huSULF-1 cDNAのヌクレオチド配列は、図1Aiおよび図1Aiiに提供されている；huSULF-1のアミノ酸配列は、図1Bに提供されている。huSULF-2 cDNAのヌクレオチド配列は、図2Aiおよび図2Aiiに提供されている；huSULF-2のアミノ酸配列は、図2Bに提供されている。
【０２３７】
同様の方法を用いて、本発明者らは、マウスSULF-1およびマウスSULF-2の完全長配列を引き出した。マウスSULF-1 cDNAのヌクレオチド配列は、図3Aiおよび図3Aiiに提供されている；マウスSULF-1のアミノ酸配列は、図3Bに提供されている。マウスSULF-2 cDNAのヌクレオチド配列は、図4Aiおよび図4Aiiに提供されている；マウスSULF-2のアミノ酸配列は、図4Bに提供されている。
【０２３８】
実施例2：  正常な組織および癌性組織におけるhuSULF-1およびhuSULF-2の発現の頻度を測定すること
【０２３９】
発現遺伝子配列断片(EST)
電気的ノーザン法は以下のように行われた。Genbank huESTデータベースは、ヒトsulf-1およびヒトhulf-2の完全長cDNAsのそれぞれについて、BLAST検索(blastn)にかけられた。p<1E-100(完全整合)でヒットするもののみが収集された(どちらかのhuSULFについて98の総数)。このストリンジェント性で、両方のアイソザイムに位置づけられる重複性ESTsはなかった。各ESTの源は、どれもこれもことごとく関係のあるGenBank登録を調べ、その結果を表にまとめることにより決定された。グリア芽細胞腫および脳腫瘍のような類似した源がプールされた。その結果は、図5、図6および図7に示されている。その結果より、huSULF1およびhuSULF2が、正常な、非癌性組織と比較した場合、癌性組織において上昇したレベルで発現していることが示されている。
【０２４０】
SAGE
遺伝子発現の直列的分析(Serial analysis of gene expression)、すなわちSAGEは、細胞の遺伝子発現の定量的特性を得るために高処理量のシーケンシングテクノロジーを利用するように設計された技術である。本質的に、SAGE技術は、遺伝子の発現レベルを測定するのではなく、遺伝子の転写産物を代表する「タグ」を定量する。SAGEの目的のためのタグは、特定の制限酵素に対する最も3'側の制限部位に直接的に3'側に隣接する、定められた長さのヌクレオチド配列である。最初に記載されているように、タグの長さは9塩基であり、制限酵素はNlaIIIであった。最新のSAGEプロトコールは10塩基〜11塩基のタグを作製しており、NlaIIIは最も幅広く使用される制限酵素のままであるが、酵素の代用は可能である。SAGE技術のデータ作成は、対応するカウント値をもつタグの一覧表であり、かつこのように、細胞の遺伝子発現のデジタル表示である。Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. Serial analysis of gene expression. Science. 1995年10月20日; 270(5235):484-487; およびZhang L, Zhou W, Velculescu VE, Kern SE, Hruban RH, Hamilton SR, Vogelstein B, Kinzler KW. Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science. 1997年5月23日; 276(5316):1268-1272。目下、約80個のライブラリーからおよそ3 x 106個のSAGEタグがある。
【０２４１】
SAGEライブラリーをhuSULF2配列の存在について調査した。正常および癌性の組織(細胞系および組織の両方の試料)に対応するライブラリーを分析した。結果は表1に示されている。全有効SAGEタグの数、加えてhuSULF2配列を含む有効タグの数が提供されている。
【０２４２】
【表１】
2005505237.tif 000003
【０２４３】
表1に提供されるデータより、huSULF1およびhuSULF2の両方が癌性細胞において高く発現していることが示されている。
【０２４４】
実施例3：  huSULF-1およびhuSULF-2のSAGE分析
SAGE分析をヒトsulf-1およびsulf-2に適用した時、特筆すべき発見があった。hsulf-1の場合、膵臓および前立腺の両方について正常な組織と比較して、癌組織において有意により多いタグが見出された(全タグの100万あたりの特異的なタグに標準化されている)。結果は図8に示されている。
【０２４５】
sulf-2の場合、発見はいっそうより劇的であった。4つの異なる癌(膵臓、乳房、中枢神経系および大腸)について、標準化されたタグ表示(全タグの100万あたりの特異的タグに基づく)が、正常の相当する組織と比較して、癌組織において有意により高かった。その結果は乳癌について最も劇的であった。ここにおいて、その癌組織においての発現は、極めて高く、他の癌組織のいずれにおいてよりも約6倍高く、かつさらになお、乳癌組織においてのレベルは、正常な乳房組織においてよりも17倍高かった。その結果は、図9に示されている。
【０２４６】
これらの結果は、1つのまたはより重要な他のsulf遺伝子が癌の性質に依存しての、ヒト癌におけるsulf遺伝子発現の上方制御を示している。このように、そのsulf遺伝子産物−細胞外スルファターゼ酵素−が癌治療のための適切な標的である。これらの酵素の阻害が成長因子の放出を阻止することにより腫瘍の増殖をブロックする、または腫瘍増殖に付随する新しい血管の形成(血管形成)をブロックし、そのために腫瘍の増殖および転移を阻止する。
【０２４７】
実施例4：  cDNAのクローニング
ヒトSULF2
4286 bp cDNAが同定され、かつヒト肺cDNAライブラリーから単離されて、両方の鎖にそってシーケンシングされた。このcDNAは、ヒトSULF2と名付けられた870個のアミノ酸のポリペプチドをコードする2613 bpの読み取り枠(ORF)を含む。ヒトSULF2遺伝子は、ヒト染色体20p12-13.2に位置するが、この遺伝子のエキソン11からエキソン20までを含むゲノムクローンが以前にこの領域に限局化されていたことからである(GenBankアクセッション番号：AL034418)。huSULF-2 cDNAのヌクレオチド配列は、図10Aiおよび図10Aiiに提供されている；huSULF-2のアミノ酸配列は、図10Bに提供されている。
【０２４８】
マウスSULF2
ヒトSULF2のマウス相同体をコードするcDNAは、マウス乳腺癌由来のIMAGEクローン3155559(GenBankアクセッション番号：AW763993)において同定された。このクローンが回収され、DNAが調製されて、両方の鎖にそってシーケンシングされた。それは、アミノ酸レベルにおいてヒトSULF2と94.6％同一であるマウスSULF2と名付けられた875個のアミノ酸のタンパク質をコードする2628 bp ORFを含む3613 bp cDNAを含むことを見出された(GCG-BESTFIT)。マウスSULF-2 cDNAのヌクレオチド配列は図11Aiおよび図11Aiiに提供されている；マウスSULF-2のアミノ酸配列は、図11Bに提供されている。
【０２４９】
実施例5：  ヒトSULF2遺伝子のゲノム組成
ヒトSULF2 cDNAの断片は、整合しているゲノム断片についてGenbank nrおよびhtgsデータベースをスクリーニングするために使用された。回収された整合物は、その後、シーケンサーコンティグアラインメントソフトウェアを用いて組み立てられた。このように、21個のエキソンとしてhuSULF2 cDNA全体を含む4つのコンティグ(I、II、IIIおよびIV)が組み立てられた。ひとつながりにされた配列は配列番号：22に提供されている。その4つのコンティグを分けている3つのギャップは、Nの列(NNNNNNNNNNN)により示されている。これらの3つのギャップの長さは、現在、未知である。遺伝子のゲノム組成が決定された。すべての21個のエキソンの長さ、相対的位置、および分けているギャップは、図12に示されている。コンティグIは、エキソン1の上流に制御的要素(プロモーターおよびエンハンサー配列)を含むことが予想される。
【０２５０】
実施例6：  タンパク質構造の分析
図13は、huSULF-1およびhuSULF-2タンパク質の構造を示す。ヒトsulf-1は長さが871個のアミノ酸であり、ヒトsulf-2は長さが870個のアミノ酸である。hu-SULF1およびhu-SULF-2は、アミノ酸レベルで65％同一である。両方ともそのタンパク質のアミノ末端に切断可能なシグナル配列を有する：sulf-1については1位〜22位のアミノ酸、およびsulf-2については1位〜24位のアミノ酸。この性質は、これらの酵素が起源の細胞から分泌され(リソソームのグルコサミン-6-スルファターゼ酵素と対照的に)、かつ細胞外のヘパラン硫酸プロテオグリカンおよび関連する複合糖質に作用することができる細胞外間隙に存在していることを示す。そのシグナル配列に続いて、約アミノ酸400位まで伸びる「スルファターゼ」ドメインがある。この「スルファターゼ」命名は、そのタンパク質のブロック分析に基づいている。この領域において、最も近い相同体はリソソームのグルコサミン-6-スルファターゼであり、この領域(24位〜400位のアミノ酸)にわたるsulfタンパク質に対してアミノ酸レベルで約49％の同一性を示す。このように、sulfタンパク質は、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンおよび関連複合糖質に対する活性をもつグルコサミン-6-スルファターゼ酵素である。
【０２５１】
第1のスルファターゼドメイン内には、酵素を処理するフラン/PACEプロテアーゼについての切断部位がある。この切断は、hsulf-1の残基408位(アルギニン)と409位(アスパラギン酸)の間および/または576位(アルギニン)と577位(ヒスチジン)の間で起こる。切断は、hsulf-2の409位(アルギニン)と410位(アスパラギン酸)の間および/または423位(アルギニン)と424位(アスパラギン酸)の間および/または538位(アルギニン)と539位(セリン)の間および/または565位(アルギニン)と566位(ヒスチジン)の間で起こる。切断はその酵素の活性にとって必要である。
【０２５２】
第1の「スルファターゼドメイン」に続いて、天然で大部分は塩基性である荷電アミノ酸の高濃度を含む親水性ドメインがある。これらのドメインは、約370個のアミノ酸から構成されている。そのタンパク質のカルボキシ末端まで伸びている最後のドメイン(第2の「スルファターゼ」ドメイン)(長さが70個のアミノ酸)もまた、リソソームのグルコサミン-6-スルファターゼ酵素のC末端に相同的である。第2のスルファターゼドメインにおいてO-GlcNAcトランスフェラーゼ(アラビドプシス(Arabidopsis))とも有意な相同性がある。このように、第1のスルファターゼドメインは、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカンおよび他の関連複合糖質内でのグルコサミン-6-硫酸構造から硫酸部分の切断に関与し、一方、第2のスルファターゼドメインは、グルコサミンおよびN-アセチルグルコサミン糖の基質認識に関与している。
【０２５３】
図14は、本スルファターゼの活性のモデルを提示している。本スルファターゼは、細胞表面上のヘパラン硫酸プロテオグリカン内のグルコサミン(GlcN)またはN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)のC-6位から硫酸基を除去する細胞外酵素である。スルファターゼは、成長因子/分化因子/血管形成因子を放出する。そのような因子の例は、血管内皮成長因子(VEGF)である。VEGFの放出により内皮細胞に対して有効になり、静止状態(例えば、非血管形成性)のECを増殖性(例えば、血管形成性)のECへ転化させる。
【０２５４】
実施例7：  CHO細胞におけるhsulf-1およびhsulf-2の発現
方法
ヒトsulf-1(hsulf-1) cDNA、hsulf-2 cDNA、マウスsulf-1(msulf-1) cDNA、およびmsulf-2 cDNAは、XhoIおよびBamHI、HindIIIおよびXhoI、NheIおよびHindIII、またはHindIIIおよびXhoIの制限酵素で、それぞれ、消化され、pcDNA3.1/Myc-His(-)(インビトロジェン社(Invitrogen Inc.))の対応する部位へサブクローニングされた。この5.5 kbベクターは、ポリヒスチジン金属結合タグおよびmycエピトープからなるC末端タグをもち、組換えタンパク質の過剰生産用に設計されている。チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)は、10 cmの皿で増殖され、製造会社の使用説明書に従って、リポフェクタミン(Lipofectamine)およびプラス試薬(Plus reagent)(インビトロジェン社(Invitrogen Inc.))を用いて、pcDNA3.1/Myc-His(-)-hsulf-1、pcDNA3.1/Myc-His(-)-hsulf-2、pcDNA3.1/Myc-His(-)-msulf-1、またはpcDNA3.1/Myc-His(-)-msulf-2の5 μgでトランスフェクションされた。DNAはプラス試薬と混合され、室温で15分間インキュベートされた。
【０２５５】
複合化DNAは、リポフェクタミン試薬(OptiMEM(ギブコBRL(GIBCO BRL)))と結合し、室温で15分間インキュベートされた。その複合体は、培養皿の細胞へ添加され、37℃、5％ CO2で5時間、インキュベートされた。インキュベーション後、培地をOptiMEMに取り換えた。細胞をさらに48時間、増殖させ、そしてその馴化培地を回収した。試料は、セントリコン30(Centricon30)マイクロ濃縮機(アミコン(Amicon))上で濃縮され、還元SDS-8％ ポリアクリルアミドゲル(ISCバイオエクスプレス(ISC BioExpress))上での電気泳動により分離され、プロブロット(商標)(ProBlott)(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))へブロットされた。膜は5％ 脱脂乳で1時間ブロックされ、その後、5％ 脱脂乳において、抗Myc抗体(インビトロジェン(Invitrogen))の0.22 μg/ml希釈液と一晩インキュベートされた。膜は洗浄され、増強化学発光(enhanced chemiluminescence)(ECL)検出試薬(アマーシャムファルマシア(Aersham Pharmacia))の前に、西洋ワサビペルオキシダーゼヤギ抗マウスIgG1(0.4 μg/ml希釈液)(カルタグ(Caltag))と1時間、インキュベートされた。
【０２５６】
結果
4つのスルファターゼ融合タンパク質は、次のような一連のバンドとして検出された(hsulf-1: 126 kDa, 61 kDa, 53 kDa)、(hsulf-2: 126 kDa, 61 kDa)、(msulf-1: 126 kDa, 61 kDa, 49 kDa, 40 kDa)および(msulf-2: 126 kDa, 71 kDa, 66 kDa)。
【０２５７】
実施例8：  sulfタンパク質のスルファターゼ活性の検証
方法
CHO細胞の各トランスフェクション由来の100倍に濃縮された馴化培地を50 mM HEPES、pH 8.0へ透析した。his-タグのついたタンパク質は、4℃で一晩の回転によりNi-NTA樹脂(キアゲン(QIAGEN))に結合し、その後、50 mM HEPES(pH 8.0)で3回、洗浄された。これらの樹脂は、10 mM 4-メチルウンベリフェリル-硫酸(スルファターゼの基質)、および10 mM 酢酸鉛と混合され、総容量は100 μlである。反応混合物は、0.5 M Na2CO3/NaHCO3、pH 10.7の100 μlの反応混合物の20 μlへの添加による反応の終結でもって、様々な時間の間、37℃でインキュベートされた。4-メチルウンベリフェロンの蛍光は、マルチウェルプレートリーダーサイトフルオルII(Multi-Well Plate Reader CytoFluorII)(パーセプティブバイオシステムズ(PerSeptive Biosystems))上で測定された。蛍光は、360 nmの励起波長および460 nmの発光波長で測定された。
【０２５８】
結果
時間依存性スルファターゼ活性は、hsulf-1およびhsulf-2融合タンパク質の両方について検出された。hsulf-1について実証されているように、活性は、添加される酵素の濃度で異なった。これらの結果は、本タンパク質がスルファターゼ活性をもつことを明確に実証した。
【０２５９】
実施例9：  ヒト乳癌組織におけるsulf遺伝子の発現
方法
ラピッドスキャンジーンエクスプレションパネル(Rapid-Scan Gene Expression Panel)(オリジーン社(Origene Inc.))は、12個の独立した正常な乳房組織(ヒト)および12個の独立した乳癌患者から調製されたcDNAsのセットである。314-bp hsulf-2 cDNA産物は次のPCRプライマーを用いて増幅された：
センス
2005505237.tif 000004
アンチセンス
2005505237.tif 000005
。鋳型cDNAの変性、アニーリングおよび伸長はそれぞれ、次のとおりである：94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で1分間を40サイクル。cDNAの各源について、PCRをチタニウム(商標)(TITANIUM)Taq DNAポリメラーゼ(クロンテック(Clontech))を用いて4つの異なるcDNA濃度(1X、10X、100Xおよび1000X)で行った。PCR産物は、その後、2％アガロースゲル上で電気泳動され、臭化エチジウムで可視化された。
【０２６０】
結果
いずれのcDNA濃度においても正常な乳房組織試料の一つも陽性でなかった(12個のうち0個が陽性であった)のに対して、12個の乳癌検体のうちの9個は、hsulf-2発現について陽性であった。その結果は、以下の表2に示されている。乳癌組織におけるエストロゲン受容体(ER)およびプロゲステロン受容体(PR)の発現レベルもまた、示されている。
【０２６１】
【表２】
2005505237.tif 000006
【０２６２】
本発明がヘパラン硫酸グリコサミノグリカンおよび関連複合糖質に対する活性をもつグルコサミン-6-スルファターゼであるスルファターゼを提供していることは、上記に提示されているデータから明らかである。本スルファターゼは、真核細胞から分泌され、かつ正常組織と比較して、癌性組織において正常なレベルより高く発現している。本発明はまた、スルファターゼ活性についてアッセイする方法を提供し、アッセイ法は高処理量形式に容易に適応する。
【０２６３】
本発明は、それの特定の態様に関して記載されてきたが、本発明の真の意図および範囲から逸脱することなく、様々な変化がなされてもよく、かつ等価物が置換されうることを当業者に理解されるものと思われる。さらに、本発明の目的の意図および範囲に、特定の状況、材料、物質組成、手順、工程段階を適応させるために多くの改変がなされうる。すべてのそのような改変は、本明細書に添付された特許請求の範囲の範囲内であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】図1A(1Aiおよび1Aii)および図1Bは、ヒトSULF1のcDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、提供している。完全長cDNA配列は、配列番号：01であり、読み取り枠は、配列番号：02に示されており、その読み取り枠によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：03である。
【図２】図2A(2Aiおよび2Aii)および図2Bは、ヒトSULF2のcDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、提供している。完全長cDNA配列は、配列番号：04であり、読み取り枠は、配列番号：05に示されており、その読み取り枠によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：06である。
【図３】図3A(3Aiおよび3Aii)および図3Bは、マウスSULF-1のcDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、提供している。完全長cDNA配列は、配列番号：07であり、読み取り枠は、配列番号：08に示されており、その読み取り枠によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：09である。
【図４】図4A(4Aiおよび4Aii)および図4Bは、マウスSULF-2のcDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、提供している。完全長cDNA配列は、配列番号：10であり、読み取り枠は、配列番号：11に示されており、その読み取り枠によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：12である。
【図５】正常な組織および腫瘍組織のライブラリーにおけるヒトSULF1発現遺伝子配列断片(ESTs)の数を示すグラフである。
【図６】様々な組織におけるhuSULF1 ESTsの数を示すグラフである。
【図７】正常な組織および腫瘍組織のライブラリーにおけるヒトSULF2発現遺伝子配列断片(ESTs)の数を示すグラフである。
【図８】正常な組織および癌組織におけるhuSULF-1のSAGE分析の結果を示す。
【図９】正常な組織および癌組織におけるhuSULF-2のSAGE分析の結果を示す。
【図１０】図10A(10Aiおよび10Aii)および図10Bは、ヒトSULF-2のcDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、提供している。完全長cDNA配列は、配列番号：13であり、読み取り枠は、配列番号：14に示されており、その読み取り枠によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：15である。
【図１１】図11A(11Aiおよび11Aii)および図11Bは、マウスSULF-2のcDNA配列およびアミノ酸配列をそれぞれ、提供している。完全長cDNA配列は、配列番号：16であり、読み取り枠は、配列番号：17に示されており、その読み取り枠によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：18である。
【図１２】ヒトSULF2遺伝子のエキソンについてのエキソンの開始部位および終結部位、ならびにエキソンの長さを示す。
【図１３】ヒトsulf-1およびsulf-2のタンパク質ドメインの模式的表示である。
【図１４】本スルファターゼの活性の模式的表示である。
【図１Ａｉ】
2005505237.tif 000007
【図１Ａｉｉ】
2005505237.tif 000008
【図１Ｂ】
2005505237.tif 000009
【図２Ａｉ】
2005505237.tif 000010
【図２Ａｉｉ】
2005505237.tif 000011
【図２Ｂ】
2005505237.tif 000012
【図３Ａｉ】
2005505237.tif 000013
【図３Ａｉｉ】
2005505237.tif 000014
【図３Ｂ】
2005505237.tif 000015
【図４Ａｉ】
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【図４Ａｉｉ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａｉ】
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【図１０Ａｉｉ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａｉ】
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【図１１Ａｉｉ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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