(57)【要約】本発明は、ガストリン及びゴナドトロピン放出ホルモンに対する免疫原を含む比較的高レベルの水溶性物質をカプセル化したリポソーム媒体を提供する。多量の免疫原をカプセル化したリポソームは、有意な拒絶（adverse）組織反応原性を発揮することなく有効な免疫応答を誘導するために非経口的に注射することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性物質の送達用の注射可能なリポソーム組成物であって、高いカプセル化効率を達成するように、カプセル化される水溶性物質に対して高い重量比の脂質を含む複数のリポソーム小胞を含む組成物。
【請求項２】
前記カプセル化効率は５０％より高い請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カプセル化効率は８０％より高い請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記カプセル化物質は複数のリポソーム小胞に分布されている請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記リポソーム小胞は多重膜小胞（ＭＬＶ）である請求項１又は４に記載の組成物。
【請求項６】
前記水溶性物質は２個以上の化合物を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記水溶性物質はタンパク質、プロテオグリカン、及び炭水化物から成る群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記水溶性物質はワクチンを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ワクチンはホルモン又はホルモン同族受容体に対して指向される請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ワクチンは、免疫原性の親水性キャリアタンパク質に共役されている少なくとも１つのホルモン−免疫模擬ペプチド又はホルモン受容体−免疫模擬ペプチドを含む請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記カプセル化物質に対する脂質の重量比は約５０〜約１０００の範囲である請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記カプセル化物質に対する脂質の重量比は約３００である請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記免疫模擬ペプチドはガストリンＧ−１７、ガストリンＧ−３４、ＧｎＲＨ、及びｈＣＧから成る群から選択される合成配列である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記合成ガストリンＧ−１７配列は配列番号１又はそのフラグメント（配列番号３〜８）である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記合成Ｇ−３４ペプチド配列は配列番号１２である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記合成ＧｎＲＨ免疫模擬ペプチド配列は配列番号１５である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記合成ｈＣＧ免疫模擬ペプチド配列は配列番号１６である請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記リポソームはリポソーム形成脂質を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記リポソーム形成脂質は疎水性尾部及び極性部又は化学的反応性部を含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記リポソーム形成脂質は炭化水素鎖又はステロイド尾基及び極性頭基を含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記極性頭基又は化学的反応性部は酸、アルコール、アルデヒド、アミン、又はエステルを含む請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記リポソーム小胞形成脂質はリン脂質を含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記リン脂質はホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びスフィンゴミエリンから成る群から選択される請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記リポソームは少なくとも７０モルパーセントのジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記カプセル化ワクチンは少なくとも約５０μｇの用量を有する請求項８に記載の組成物。
【請求項２６】
前記カプセル化抗ホルモンワクチン又は抗ホルモン受容体ワクチンは約０．３〜５ｍｇの範囲の用量を有する請求項９に記載の組成物。
【請求項２７】
前記免疫模擬ペプチドはスペーサーペプチドを介して免疫模擬キャリアに共役している請求項１０に記載の組成物。
【請求項２８】
前記スペーサーペプチドは配列番号９、１０、及び１１から成る群から選択される請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記リポソームは、水溶性免疫原及び水溶性高分子量免疫調節物質を別々に又は一緒にカプセル化する請求項１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記リポソームは、水溶性低分子量免疫調節物質を別々に又は一緒にカプセル化する請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記高分子量免疫調節物質はサイトカインを含む請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記低分子量物質はノルＭＤＰ、スレオニルＭＤＰ、ムラブチド、Ｎ−アセチルグリコサミル−ＭＤＰ及びムラメチドから成る群から選択される請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
請求項８〜１７のいずれか１項に記載の注射可能な組成物の懸濁水溶液を含む無菌組成物。
【請求項３４】
治療有効量の請求項８〜１７のいずれか１項に記載の組成物及び薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬製剤。
【請求項３５】
治療を必要とする患者に治療有効量の請求項３３又は３４に記載の医薬製剤を投与することを含む障害又は疾患の治療方法。
【請求項３６】
リン脂質多重膜小胞を調製する工程と、水溶性免疫原をカプセル化する工程と、及び／又は物質を免疫調節する工程とを含み、それにより前記リポソームがタンパク質に対する脂質の高い比を有するリポソームワクチンの製造方法。
【請求項３７】
前記比は約５０〜１０００の範囲である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記比は約３００である請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号１７、１８、１９、及び２０から成る群から選択されるペプチドに共役された免疫原性キャリアの免疫模擬構築物を含む、タンパク質に対する脂質の比が高いリポソーム組成物。
【請求項４０】
高用量の免疫原を含有するリポソームワクチンの製造方法であって、凍結乾燥された脂質補体を水又はエタノール水溶液で再水和する工程を含み、該工程では免疫原が脂質補体中又はエタノール水溶液中のいずれかに含有される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、カプセル化された水溶性化合物に対して比較的高い重量比の脂質物質を含有するリポソーム組成物に関する。特に、本発明は、効果的な免疫原性のためであるが無視できる組織反応原性を有する複数のリポソーム小胞中に多量の親水性免疫原が効率的かつ安定的にカプセル化されている注射可能なリポソームのワクチンに関する。本発明はさらにリポソームワクチン組成物の製造方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本発明は、２００２年７月３日に出願された米国仮出願番号６０／３９４，１７９号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）下の利益を請求する。
【０００３】
［発明の背景］
ホルモン及びその生理学的効果の免疫学的中和または阻害は、抗ホルモン又は抗ホルモン受容体ワクチン接種によるホルモン依存性障害及び疾患の治療的処置に有用であることができる。例えば、生殖ホルモン及びその他のホルモンは、乳房、すい臓、肺、胃、及び結腸直腸系の癌を含む腫瘍成長を刺激する成長因子として働くことができることが広く認識されている。健康な器官で通常発現されず機能性でないある種のホルモンは、発達中の悪性疾患での活性な関係物であることが見出されている。
【０００４】
自己抗原としてのこれらのホルモンは生来の免疫原性を発揮しないが、障害又は疾患の治療は、抗ホルモン又は抗ホルモン受容体抗体を産生する免疫応答を誘導するように、自己標的免疫模擬(immunomimic）ペプチドに共役される免疫原性キャリアで対象患者または動物を免疫化することにより達成することができる。例えば、特許文献１；特許文献２；特許文献３；及び特許文献４には、ガストリン又はゴナドトロピン放出ホルモン活性を中和するのに有用な免疫原及び免疫原性組成物が開示されている。
【０００５】
このような共役体の免疫原性を増強して臨床でそれらを有用にすることがさらに必要である。１つのアプローチは、さらにそれらを油性媒体で製剤化して、ゆっくりと放出させるためにエマルジョンを形成することである。水溶性ワクチンは抗ホルモン又は抗ホルモン受容体標的免疫原を含む。注射可能な免疫原は、通常、油中水型エマルジョンの形態で送達される。これらのワクチンエマルジョンは、免疫化後の注射部位で発達する生来の炎症性組織反応原性に起因してどのくらいの用量を投与することができるかに関し制限が加わる。したがって、この局所的に反応する傾向は、場合によっては、免疫原の最適下限レベルの投与となった。
【０００６】
油中水型エマルジョンは、連続油相（ミネラル、スクアレンまたはスクアランまたはそれらの混合物）中で分散される水の小滴から成る。スクアレンまたはスクアランなどの代謝性油は、ヒト治療には許容不可能なフロイントアジュバントよりも患者に受け入れられる点で望ましい安全面を有する。例えばガストリンまたはゴナドトロピン放出ホルモン活性（ＧｎＲＨ）に対する従来技術の免疫原組成物は、免疫応答を有意に増強する油中水型エマルジョンとして製剤化される。しかしながら、ワクチン−エマルジョン製剤での免疫化は、命にかかわる疾患の治療で許容可能であり得る注射部位反応を誘導する可能性があるが、その他の状態で不快であるので望ましくかないまたは許容不可能でさえある。したがって、その他の抗原送達型（modes of delivery）が探求されてきた。例えば、リポソームインフルエンザワクチンは、リポソームを用いてインフルエンザサブユニット抗原をカプセル化し、小胞タイプの送達媒体として働くようにする、Kedarらよる特許文献５に開示されている。
【０００７】
リポソームは良好な標的潜在能（targeting potential）を有し、親水性及び親油性の免疫調節剤を取り込むための基本的な製剤を付与するが、それらを多量の免疫原を十分にカプセル化するように製剤化することは難しく、有効になるにはしばしば可溶性の免疫調節剤の助けが必要である（非特許文献１）。
【０００８】
リポソーム調製物のタンパク質キャリア受容能はある種の制限を有する。例えば、リポソーム画分中でタンパク質部分が大きいほど、リポソーム調製物の粘性が大きくなる。この粘性は、注射可能なワクチンとしての使用に対する障壁を呈するようなレベルまで増加することができる。実際には、これまで達成された注射剤としてのリポソームによる最も高いカプセル化レベルは約３０％である（非特許文献２）。さらに、リポソーム内の親水性分子のカプセル化の効率は特に低いため、リポソーム製剤は一般に両親媒性の免疫原により適している。
【０００９】
免疫原性が低い親水性抗原のワクチン送達媒体としてのリポソームには、比較的多量のワクチン用量が必要であることが見出されている。現在まで、そのようなリポソームによりカプセル化された所望の免疫原性の用量レベルは得られていないが、それは一つには注射体積に設けられた制限にも起因している。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，０２３，０７７号
【特許文献２】米国特許第５，４６８，４９４号
【特許文献３】米国特許第５，６８８，５０６号
【特許文献４】米国特許第６，１３２，７２０号
【特許文献５】米国特許第５，９１９，４８０号
【非特許文献１】J. C. Coxら、「アジュバント−作用型の分類及び総説」（"Adjuvants-a classification and review of their modes of action"）Vaccine,1997, 15巻 (13): 248〜256頁
【非特許文献２】G. Gregoriadis (ed. ), リポソーム技術（Liposome Technology）, 1巻,第２版, CRC Press, Boca Raton, FL. 1993, 527〜616頁
【００１１】
［発明の概要］
本発明は、多量の水溶性物質の送達のための注射可能なリポソーム組成物に関する。該組成物は、複数のリポソーム小胞に分布するカプセル化された水溶性物質に対する脂質の重量比が高い複数のリポソーム小胞を含む。カプセル化物質に対する脂質の重量比は約５０〜１０００の範囲である。この構成により、例えば５０％より多い、いくつかの実施形態によれば８０％より多い、高いカプセル化効率が有利に可能となる。
【００１２】
リポソーム小胞は多重膜小胞（multilamellar vesicles：ＭＬＶ）であることができる。リポソームは、親水性尾部と酸、アルコール、アルデヒド、アミン、またはエステルを含む極性または化学的反応性部とを有するリポソーム形成脂質を含む。リポソームは、炭化水素鎖またはステロイド尾基（tail group）及び極性頭基（head group）によりさらに特徴づけることができる。リポソーム形成脂質はリン脂質を含む。好適なリン脂質の例には、限定するものではないが、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びスフィンゴミエリンが含まれる。
【００１３】
水溶性物質は、タンパク質、プロテオグリカン、及び炭水化物を広範囲に含む。ある実施形態において、水溶性物質には２つ以上の化合物が含まれる。
【００１４】
カプセル化される水溶性物質は、限定するものではないが、ホルモン又はホルモン同族受容体に対するワクチンを含むワクチンであることもできる。本発明の特定の実施形態によれば、ワクチンは、免疫原性親水性キャリアタンパク質に共役された少なくとも１つのホルモン−免疫模擬ペプチド又はホルモン受容体−免疫模擬ペプチドを含む。例えば、免疫模擬ペプチドは、ガストリンＧ−１７、ガストリンＧ−３４、ＧｎＲＨ及びｈｃＧから成る群から選択される合成配列である。具体的には、合成ガストリンＧ−１７配列は、配列番号１またはそのフラグメント（配列番号３〜８）である。合成Ｇ３４ペプチド配列は配列番号１２である。合成ＧｎＲＨ免疫模擬ペプチドは配列番号１５である。合成ｈＣＧ免疫模擬ペプチド配列は配列番号１６である。スペース（space）ペプチドは、配列番号９、１０及び１１から成る群から選択される。
【００１５】
本発明のある種の実施形態によれば、リポソームは、水溶性免疫原及び水溶性高分子量免疫調節物質あるいは低分子量免疫調節物質を別々にまたは一緒にカプセル化する。高分子量免疫調節物質はサイトカインから成ることができる。低分子量免疫調節物質の例には、限定するものではないが、ノル−ＭＤＰ、スレオニルＭＤＰ、ムラブチド（murabutide）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−ＭＤＰ及びムラメチド（murametide）が含まれる。
【００１６】
本発明は、本明細書に開示され特許請求の範囲に記載される低粘性のリポソーム組成物及び薬学的に許容可能なキャリアを含有する医薬製剤にも関する。本発明の医薬製剤は、障害又は疾患の治療における処方計画の一部としてそれを必要とする患者に投与することができる。
【００１７】
そのような医薬製剤の一例は、本明細書に開示され特許請求の範囲に記載される低粘性リポソーム組成物の注射可能な懸濁水溶液を含有する無菌（aseptic）組成物である。多量のタンパク質をリポソーム中に貯蔵しているので、注射に好適な粘性を保ち、かつ、許容可能な用量体積を維持しながら、より免疫原性の用量を付与するために多量のタンパク質が送達される。したがって、本発明は、毒性アジュバントとなり得るもの及び免疫修飾添加物を必要することなしに有効な免疫化を提供する。さらに、組織反応原性に有利な減少がある。
【００１８】
本発明は、リン脂質多重膜小胞を調製する工程と、水溶性免疫原をカプセル化する工程と、及び／又は物質を免疫調節する工程とを含み、それによりリポソームがタンパク質に対する脂質の比が高い、リポソームワクチンの製造方法にも関する。
【００１９】
［発明の詳細な説明］
以下の用語は、本発明の文脈での意味及び使用に関して記載される。
【００２０】
リポソーム形成脂質又は小胞形成脂質とは、水中で二分子層小胞を自発的に形成することができる疎水性及び極性の頭基部分により特徴付けられる両親媒性脂質をいう。具体的には、リポソーム形成脂質は、疎水性部分が小胞膜の内部領域で接触している一方で極性の頭基部分が小胞膜の外部の極性表面に向くように脂質二分子層中に安定的に組み込まれている。
【００２１】
「別々にカプセル化される」との表現は、例えば抗原及びサイトカインが異なるリポソーム調製物中に別々にカプセル化されているリポソームカプセル化成分をいう。
【００２２】
対照的に、「一緒にカプセル化される（co-encapsulated）」成分とは、例えば抗原及び免疫刺激剤のような２つ以上の抗原又は生産物の組み合わせを含有するリポソーム調製物として理解される。
【００２３】
上述した通り、本発明の創意に富んだリポソームは、通常はサイズが０．１〜１０μｍの範囲である非常に多数の脂質小胞に多量の物質を分布させるように、疎水性タンパク質及びさらに低分子量化合物などの水溶性物質をカプセル化するのに好適である。
【００２４】
さらに具体的には、リポソームによりカプセル化された水溶性化合物は、免疫模擬及び免疫原性部分を含むワクチン構築物であることができる。該構築物は、免疫原性キャリアタンパク質及び標的免疫模擬ペプチドの共役体を含むことができる。キャリアタンパク質はキャリアとして免疫原性フラグメントを含むことができる。
【００２５】
「注射可能な組成物」との用語は、例えば皮下注射針による非経口注射を可能とするのに十分に低い粘性を有するリポソーム組成物を定義する。
【００２６】
リポソーム製剤は、一般に、両親媒性物質をカプセル化するのに最も好適なものとみなされている。思いがけなく、タンパク質に対する脂質の重量比条件が高い本発明に従って調製されるリポソームは、例えば、少なくとも５０％の水溶性物質が多数の脂質小胞中に分布するように多量をカプセル化することができる。これは調製物が注射に対して粘性になり過ぎることなく達成できた。さらに、本発明によるリポソーム調製物のタンパク質に対する脂質の比が高いことは、相当に増加した用量のリポソームカプセル化免疫原により臨床的に有効なレベルまで免疫原性を増加させつつ、反応原性を有意に減少することに、又は除去することさえにも役立つ。したがって、本発明のリポソームは、イン・ビボの有効な免疫応答を未だ達成しつつ、従来の油中水型エマルジョンよりも非常に寛容である。
【００２７】
タンパク質に対する脂質の比が高いリポソーム調製物は抗ホルモンワクチンの反応原性を減少する一方、自己ホルモンに対する多重膜リポソームワクチンはリポソームを通常の低用量の乳化免疫原で製剤化したときに十分な抗原力価を誘導しない。実際には、リポソーム中の親水性免疫原含有量を増加させる従来の他者による試みも、親水性分子をカプセル化する効率が一般的に乏しいので、成功しなかった。
【００２８】
本発明のリポソーム小胞は、疎水性尾基部分及び極性頭基部分を配列する脂質から水中で形成された脂質二分子膜を含む。疎水性尾部分は飽和炭化水素鎖及びステロイド基を含む一方、極性頭基は酸、アルコール、アルデヒド、アミン、及びエステル部分などの化学反応性基を含む。例えば、そのような酸性の頭基を有する小胞形成脂質はリン脂質基を含む。本発明によれば、リン脂質には、限定するものではないが、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）が含まれる。
【００２９】
カプセル化された水溶性免疫原は、免疫原性水溶性キャリアタンパク質に結合した標的抗原−免疫模擬ペプチドを含むことが理解される。水溶性免疫原性キャリアタンパク質の親水性部分が優勢であるので、それは免疫原性構築物全体の全水溶性特性に実質的に影響を与える。
【００３０】
本発明の別の実施形態には、ジフテリア毒素（ＤＴ）、破傷風毒素（ＴＴ）、カブトガニヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、又は多糖デキストラン、又はこれら各キャリア部分の免疫原的活性成分を含む、親水性免疫原性キャリアタンパク質が含まれる。
【００３１】
本発明のリポソームワクチン組成物は、各リポソーム粒子が持続的で臨床的に有意な免疫応答を行うように免疫原性である、キャリア水溶液中に懸濁させた多数のリポソーム中に安定的にカプセル化された多量の水溶性ワクチンを含む。
【００３２】
自己抗原に対して標的にされる免疫原及び／又は免疫調節物質を含有するリポソームワクチン懸濁液は、自己標的関連障害又は疾患に対する治療目的での患者への投与に好適である。
【００３３】
リポソーム免疫原を非経口、鼻腔、直腸、又は膣経路によりそのような治療下で患者に投与することができる。非経口投与には、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内注射が含まれる。
【００３４】
例えば、注射可能なリポソームワクチンによる免疫化は受胎を妨げるように生殖ホルモンを対象とすることができる。別の実施例に従って、下記のリポソーム抗ＧｎＲＨ又は抗ｈＣＧワクチンによる免疫化により妊娠を予防するように免疫応答を行うことができる。
【００３５】
タンパク質に対する脂質の重量比が高い小胞（ＨＬＰＲ）の注射可能な懸濁液の有利な実施形態は、自己抗原に対する免疫化のために安全に注射することができる多数の好適なサイズの脂質小胞中のジフテリア毒素タンパク質（ＤＴ）の高用量カプセル化免疫原性共役体を提供する。そのような自己免疫化標的は、種々の胃腸又は生殖系で直接又は間接的に腫瘍成長を刺激すること、又は結腸直腸、乳房、又は前立腺起源の転移癌を促進することに関与する正常ホルモン及び類似因子及びそれらの同族受容体を含む。
【００３６】
したがって、本発明は、抗ガストリン免疫原構築物をカプセル化したリポソーム小胞の注射可能な懸濁水溶液を含む。本発明の別の実施形態は、抗ＧｎＲＨ免疫原性構築物をカプセル化したリポソーム小胞の注射可能な懸濁水溶液を含む。本発明は、ＨＬＰＲリポソーム中にカプセル化されたヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)免疫避妊（immuno-contraceptive）ワクチンも提供する。したがって、一実施形態は、組織反応原性の減少を伴う一方で臨床的に有効量の免疫原を与える避妊薬として好適なリポソーム抗ｈＣＧワクチン接種を提供する。
【００３７】
さらに、ある種のホルモン又は成長因子は癌中で一部分だけ処理されて、腫瘍中でオートクリン及び／又はパラクリン活性を発揮することが見出されている未熟体になる。例えば、双方ともアミド化されたガストリン−１７（Ｇｌ７），ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列リスト中の配列番号１）及び前駆体であるグリシン伸長ガストリン−１７（ＧｌｙＧ１７），ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（配列番号２）であるガストリンホルモンは、胃腸（ＧＩ）腫瘍と甲状腺癌及び肺癌などの非ＧＩ関連の腫瘍との双方とも刺激することができる。
【００３８】
抗ガストリンに関する本発明の実施形態には、６残基ペプチドスペーサー（配列番号９）、７残基ペプチドスペーサー（配列番号１０）、又は８残基ペプチドスペーサー（配列番号１１）のいずれかを介してＣ末端でキャリアタンパク質に結合し、例えば１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９又は１〜１０のアミノ酸（それぞれ配列番号３、４、５、６、７、又は８）の範囲を有する、種々の長さのＧ１７アミノ末端エピトープ免疫模擬ペプチドを含有することができる多量の親水性抗ガストリンＧ１７免疫模擬構築物をカプセル化している、タンパク質に対する脂質の比が高い、多数の小さなリポソーム小胞の注射可能な懸濁水溶液が含まれる。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、ガストリンの免疫原性制御又は阻害及び分泌に有用なガストリンホルモンのＮ末端ペプチド配列１〜２２であるＧ３４(配列番号１２)に対するリポソーム免疫原を提供する。
【００４０】
この文脈において、一実施形態は、Ｃ末端又はＮ末端のいずれかでＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号１１）などのスペーサーペプチドとＧ３４（１〜６のアミノ酸）フラグメントが結合し、それにより免疫模擬ペプチドがＣｙｓ残基で好適な免疫原性キャリアタンパク質に共役している免疫模擬合成ペプチドであるｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ又はＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（それぞれ配列番号１３及び１４）を提供する。
【００４１】
さらに、哺乳動物生殖ホルモンであるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号１５）は、雄及び雌生殖系双方での癌の成長に関与している。
【００４２】
カプセル化された免疫原を有するタンパク質に対する脂質の比が高い小胞タイプのリポソームの注射可能な懸濁液の一実施形態は、ガストリン−１７のペプチドアナログ又はゴナドトロピン放出ホルモン免疫模擬アナログ又はそのフラグメントに共役されている、例えばジフテリア毒素などのホルモン−免疫模擬合成ペプチドに免疫原性キャリアを結合するスペーサーペプチドを提供する。
【００４３】
記載内容（すなわちｈＣＧ構造ＩＩ）全体が参照により本出願に援用される米国特許第４，７６７，８４２号で開示されている方法に従って、ジフテリア毒素又は破傷風毒素と共役させるのに適切した配列を選択する。ｈＣＧ免疫原性構築物では、ｈＣＧ免疫模擬合成ペプチドを免疫原性キャリアであるＤＴに結合することができる。上記で説明したようなその他の免疫原性タンパク質もｈＣＧペプチド構築物の有用なキャリアになるであろう。
【００４４】
一実施形態は、ＬＨ（黄体化ホルモン）とは共通せず、したがってＬＨ交差反応抗体を産生しないｈＣＧのベータサブユニットの１１１〜１４５のアミノ酸配列（配列リスト中の配列番号１６）（米国特許第４，７６７，８４２号で引用されている「構造ＩＩ」）の一部分に対応するｈＣＧフラグメントを含む。本発明の別の実施形態は、ＤＴに結合しているｈＣＧのＣ末端の１３８〜１４５位（配列番号１７）の範囲にわたるｈＣＧベータサブユニットのＮ末端の８員ペプチドスペーサー（配列番号１１）を含むｈＣＧ免疫模擬合成ペプチドを提供する。その他のスペーサーペプチド（配列番号８又は９）も抗ｈＣＧ免疫原構築物に有用である。
【００４５】
本発明の薬学的実施形態は、タンパク質に対する脂質の重量比が高い抗ｈＣＧ免疫模擬構築物及び薬学的に許容可能なキャリアをカプセル化したリポソーム小胞体の注射可能な懸濁液を提供する。
【００４６】
本発明の一実施形態は、多数の脂質粒子中に比較的多量のワクチンをカプセル化した多数の注射可能なリポソーム調製物を製造する方法を提供する。該方法は、癌成長促進ホルモン及びその同族受容体に対する免疫原の化学的に安定化されたリポソームカプセル化を含むことができる。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態は、タンパク質に対する脂質の重量比が高い多量の水溶性免疫原をロードするために多数の脂質小胞を製造する方法を提供する。このような方法により、親水性の免疫原性キャリアタンパク質又はそのフラグメントに共役されるＧ１７又はＧｎＲＨなどのホルモン免疫模擬ペプチドをカプセル化し、吸着することができる。
【００４８】
本発明によれば、リポソーム小胞のサイズは０．１μｍ〜約１０μｍの範囲とすることができる。さらに、リポソーム懸濁液により、約５０：１〜約１０００：１の範囲の脂質とタンパク質との比で、適切には０．５ｍｇ〜５ｍｇのタンパク質のカプセル化ワクチンのロードを提供することができる。
【００４９】
本発明のリポソームは、少なくとも１つの高分子量又は低分子量の免疫調節アジュバントを一緒にカプセル化または別々にカプセル化するように調製することができる。高分子量免疫調節アジュバントには、限定するものではないが、単離されたサイトカイン又は非イオン性ブロックコポリマーの微粒子が含まれる。有効量のカプセル化されたサイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、又はＩＦＮ−ガンマなどのインターロイキン、ノル−ＭＤＰ、スレオニルＭＤＰ、ムラブチド、Ｎ−アセチルグルコサミニル−ＭＤＰ、及びムラメチドなどのムラミールジペプチド（ＭＤＰ）又はその水溶性誘導体、さらには脂質Ａ誘導体、４’−モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トリテルペノイド混合物Ｑ５２１又はＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）７０３（サポニンと定義される）、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド及びトマチン（グリコアルカロイドサポニン、Ｃ５０Ｈ３ＮＯ２１；Sigma）を含む。一緒にカプセル化されたまたは別々にカプセル化されたリポソーム調製物の免疫調節物質は、１０ｃ．ｕ．〜１００，０００ｃ．ｕ．の範囲にあるＩＬ−２を含むことができる。リポソーム組成物はさらに、例えばＩＬ−２及び非イオン性ブロックコポリマーの組み合わせなどの免疫原性増強添加物の組み合わせを提供する。
【００５０】
組織反応原性の低い本発明の免疫化方法は、タンパク質に対する脂質の重量比が高い水溶性タンパク質化合物をカプセル化するリポソームの懸濁液を投与することを含む。脂質小胞カプセル化タンパク質は、筋肉内、皮下、鼻腔内、又は直腸経路により投与することができる同じ調製物中に別々にカプセル化又は一緒にカプセル化することができる抗ホルモン免疫原又は抗ホルモン受容体免疫原及び免疫調節化合物を含む。
【００５１】
過度な理論的考察に拘泥することなしに、本発明は２種類の送達型を付与するようにカプセル化タンパク質を脂質小胞中に配置させた輸送媒体を提供すると今のところみなす。具体的には、送達型には、小胞の外面から吸着した抗原を放出することにより行う早い送達、及び各脂質小胞の膜系による完全な囲みから抗原成分を遅くより長期的に放出することの両方が含まれる。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、頻繁な追加抗原による免疫化の必要なしに、リポソームが内在した免疫原の効果的な徐放性の送達を伴う長期免疫避妊の方法を提供する。
【００５３】
本発明は、比較的多量の水溶性抗原をカプセル化することができるタンパク質に対する脂質の比が高いリポソームの製造方法も提供する。
【００５４】
本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，０２３，０７７号；米国特許第５，４６８，４９４号；米国特許第５，６８８，５０６号；米国特許第５，６９８，２０１号及び米国特許第６，３５９，１１４号に記載された方法に従って免疫原構築物を調製する。基本的には、免疫原性キャリアタンパク質又はその免疫原性フラグメントは、ホルモン指向（hormone directed）生理学的効果を中和又は阻害することができる特異的な抗ホルモン又はホルモン受容体抗体を生成するようにペプチドが標的ホルモン又は受容体部分を免疫模擬する好適な長さのペプチドに、好適な免疫学的不活性のスペーサーペプチドを介して直接的又は間接的に共役する。免疫原性キャリアタンパク質に対する免疫模擬ペプチドの通常のモル比は、単位キャリアを１０５ＭＷで位置づけた場合に１〜４０モルの範囲に及ぶ。
【００５５】
以下の実施例は本発明の有利な態様を例示するが、この態様は、免疫化の標的としてのペプチドホルモン又はホルモン受容体を含む、記載されている水溶性化合物に限定されない。本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，０２３，０７７号及び米国特許第５，４６８，４９４号にはガストリンを中和するための免疫原が開示され、米国特許第５，６８８，５０６号にはヒト及びその他の哺乳動物被検体でのＧｎＲＨ活性が開示されている。これら特許の開示すべては本明細書中に援用される。米国特許第５，６９８，２０１号はヒト絨毛性ゴナドトロピンホルモン（ｈＣＧ）免疫原の産生について開示し、その方法全体が参照により本明細書中に援用される。さらに、抗ガストリン免疫原性共役体は胃腸悪性疾患に対する免疫化治療の候補として選択されている（Watsonらによる概説（Exp. Opin. Biol. Ther 2001,1 (2): 309-317）を参照のこと）。
【００５６】
種々のリポソーム免疫原は、ガストリンＧ−１７（配列番号７）又はヒトＧｎＲＨ（配列番号１５）などの合成免疫模擬ホルモンペプチドフラグメントを含む。
【００５７】
ガストリン免疫模擬ペプチドは、Ｃ末端にＳＳＰＰＰＰＣスペーサーが付加された種々のＧ１７（配列番号３、４、５、６、７、又は８）ホルモン免疫原性構築物のＮ末端１〜５、１〜６、１〜７、１〜８又は１〜９のアミノ酸配列などの５個以上の配列長のアミノ酸を含むことができる。
【００５８】
実施例１及び２で記載される方法によりカプセル化されたＧ１７ＤＴ構築物は、Ｃ末端に追加の７個のアミノ酸を含むスペーサー要素により伸長されたヒトＧ１７のアミノ末端部分（１〜９）に由来するＧ１７免疫模擬ノナペプチドから成るガストリン免疫原である。得られたヘキサデカペプチドであるｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ(配列番号18)は、キャリアタンパク質上に存在するリシン残基のε−アミノ基に異種二官能性（heterobifunctional）のリンカー分子と反応することにより、末端システイン残基上のスルフヒドリル基を介してキャリア分子であるジフテリア毒素（ＤＴ）に共有結合する。
【００５９】
ＧｎＲＨのアミノ酸配列１〜１０はＧｎＲＨ免疫原のために選択される。該免疫原は、例えばアミノ酸の国際的用語であるＲＰＰＰＰＣ（配列番号９）やＳＳＰＰＰＰＣ（配列番号１０）などの免疫模擬ペプチドにキャリアを結合するペプチドスペーサーも含むことができるが、これらに限定するものではない。別の好適なスペーサーはＳＰＰＰＰＰＰＣ（配列番号１１）に見られる。ＧｎＲＨ免疫模擬合成ペプチドは、ジスルフィド結合によって末端システイン（Ｃ）を反応させることによりスペーサーペプチドを介してキャリアに共有結合する。
【００６０】
実施例４に記載されるリポソーム中にカプセル化されたＧｎＲＨ共役体は、キャリアタンパク質すなわちＤＴに存在しているリシン残基のε−アミノ基に異種二官能性試薬を介してＣ末端で結合しているスペーサーペプチドを伸長させるアミノ末端のＧｎＲＨ免疫模擬配列を含む、セプタデカペプチドＣｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号１９）である「Ｄ１７ＤＴ」としても同定されている。
【００６１】
Ｇ１７ジフテリア毒素（Ｇ１７ＤＴ）共役免疫原はヒトガストリンＧ１７（ｈＧ１７）を特異的に中和する抗体を誘導するために構築される。該免疫原は、ジフテリア毒素（ＤＴ）などの親水性免疫原性キャリアに共有結合するｈＧ１７エピトープを有するペプチドを含むことができる。Ｇ１７免疫模擬ペプチドは、Ｇ１７のＮ末端からアミノ酸数５〜１２まで伸長するフラグメントを含む。これらのＧ１７ペプチドフラグメントは、ＳＳＰＰＰＰＣペプチドなどのスペーサー及びＤＴなどの免疫原性親水性キャリアに任意選択により結合する。同様に、Ｇ１７又はＧｌｙ伸長Ｇ１７のＣ末端配列部分の免疫模擬物質を伴う免疫原を構築することができる。水相中で溶解することができる免疫原性共役体は、イン・ビボで抗ガストリン抗体産生を誘発するように設計される。それにも関わらず、実際の免疫化処方計画での有効なレベルの抗ｈＧ１７抗体の誘導には、共役体の免疫原性が免疫増強アジュバントを含めることにより増強されることが必要である。
【００６２】
合成ｈＣＧ免疫原は、Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ  （１３８〜１４５アミノ酸Ｃ末端ペプチド配列；配列番号２０）を含むことができる。
【００６３】
本発明は、リポソームの注射部位での組織反応に関して制限がなく、したがって低い又は無視できる反応原性に関して有利な比の高抗体力価を達成する、高い力価の抗血清を誘発する免疫化タンパク質を多量に含む注射可能なリポソームカプセル化ワクチンの製造方法を提供する。以下の詳細な説明及び実施例は、本発明の多重膜リポソーム小胞の組成物、及び特に親水性免疫原をカプセル化するのに好適であるリポソームの組成物の製造を開示する。
【００６４】
以下に説明する実施例に示されるように、多重膜リポソーム中に１．５又は３．０ｍｇの多さの量でカプセル化された用量は、例えば、油中水型エマルジョン製剤中ではるかに低量である１００μｇの免疫原よりも局所組織に対して刺激性が有意に少ないことが見出されている。
【００６５】
当該技術分野で既知である方法に従い、種々のリポソーム小胞形成脂質を用いてリポソーム組成物を形成することができる。米国特許第５，９１９，４８０号に開示されているリポソーム小胞のための関連方法及び材料は参照により本明細書中に援用され、さらに以下に記載する。本発明の脂質又は油性の小胞形成物質により、リポソームカプセル化抗原及びアジュバントの長期貯蔵並びに投与の際におけるこれらの成分の効果的な放出が可能となる。代表的な脂質には、限定するものではないが、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、コレステロール、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、及びＤＭＰＣ／コレステロール、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ／コレステロール、ＤＭＰＣ／ＤＭＴＡＰ、及びＤＭＰＧ／ＤＭＴＡＰ／コレステロールなどのそれらの組み合わせが含まれる。本発明のリポソーム組成物は１０〜１００モルパーセントのＤＭＰＣを含む。特に有用な組成物は９：１（モル／モル）ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ混合物及びＤＭＰＣ単独を提供する。
【００６６】
本発明のリポソームは、平均の直径が約０．２５μｍ〜５．０μｍである以下に記載される大きな脂質小胞を含むこともできる。
【００６７】
本発明は、標的の免疫原リポソームと一緒にカプセル化するか、あるいは免疫原として離れた又はほぼ同じ位置での注射のために適切に構築された多重膜リポソーム中にカプセル化することができる免疫応答増強化合物を提供する。
【００６８】
リポソーム免疫原性組成物はインターロイキンとしても同定されている免疫刺激サイトカインを含むこともできる。サイトカイン添加物には、Ｉｌ−１、Ｉｌ−２、Ｉｌ−４、Ｉｌ−６、Ｉｌ−７、Ｉｌ−１２、Ｉｌ−１５、ＩＦＮ−ガンマなどのインターロイキン及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）又はそれらの組み合わせなどが含まれる。例えば、免疫調節剤Ｉｌ−２及びＧＭ−ＣＳＦはリポソーム送達による免疫化治療のために組み合わせることができる。
【００６９】
サイトカインを約２０ＫＤ（ＫＤ＝キロダルトン）以上の糖タンパク質である高分子量アジュバントとして含むことができる。サイトカインは増強された免疫応答を行うために異なる標的を有し、ＩＬ−１はＴ及びＢ細胞成熟を増強し、ＩＬ−２はＴ及びＢリンパ球及び食細胞のアップレギュレーションを増強し、ＩＬ−４はＢ細胞のアップレギュレーションを増強し、ＩＦＮ−ガンマはＢ細胞及びマクロファージのアップレギュレーション及びＭＨＣ発現を増強し、ＧＭ−ＣＳＦは樹状細胞（ＤＣ）のための共遊走性（co-migratory）シグナルを提示する。
【００７０】
本発明のリポソームワクチンは、個別に又は治療対象との免疫原性共役体と一緒に投与されるリポソームカプセル化アジュバントを含むことができる。例えば、免疫調節アジュバントはノル−ムラミルジペプチド（ノル−ＭＤＰ）などの低分子量化合物を含む。用量は、１用量あたり１〜５０μｇのノル−ＭＤＰの範囲とすることができる任意の有効かつ許容可能な量とすることができる。
【００７１】
ノル−ＭＤＰは、放線菌のペプチドグリカン抽出物のアジュバント活性成分であるＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミンの毒性があまりない親水性誘導体である。その他の親水性誘導体には、スレオニルＭＤＰ、ムラブチド、Ｎ−アセチルグリコサミル−ＭＤＰ及びムラメチドが含まれる。ノル−ＭＤＰはＴｈ２リンパ球を刺激する傾向がある。親油性誘導体ＭＴＰ−ＥはＴｈ−１リンパ球を刺激する傾向がある。
【００７２】
リポソーム製剤は、ＭＰＬ、親油性ＭＤＰ、又は親水性ノル−ＭＤＰ、定義されたサポニンＱ５２１、ＩＳＣＯＰＲＥＰ（商標）７０３、又はＱｕｉｌ  Ａ及びＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドを含む種々の組み合わせの低分子量免疫調節分子を取り入れることができる。ヒトワクチン用のリポソームに好適なアジュバントには、脂質Ａに由来する４’−モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）も含むことができる。トマチン、サポニンは免疫増強活性を有する天然由来のグリコアルカロイドである(Sigma)。
【００７３】
その他の強力な免疫賦活性アジュバントは、許容不可能なレベルの注射部位の局所刺激活性を誘導することなく少なくとも４ヶ月維持される明らかなレベルの免疫を誘発することが観察されている標準の油中水型エマルジョンの水相中にある非イオン性ブロックポリマーを含むことができる。ポリラクタイドコグリコライド（ＰＬＧ）、カルシウム塩、コラーゲン、ヒアルロン酸カルシウム又はヒアルロン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその他のゲル形成物質などの合成ポリマーは、免疫原及び免疫賦活性アジュバントのパルス送達の発生を低下させるミクロスフェアの形態で添加することもできる。そのような放出制御は免疫化の効果を数ヶ月延長させることができる。
【００７４】
［リポソーム及びリポソーム組成物の調製］
本発明による水溶性カプセル化剤を含むリポソーム懸濁液の調製方法及びリポソーム中へ追加成分を取り入れる方法を以下に記載する。
【００７５】
リポソームは種々の技術で調製することができる。多重膜小胞（ＭＬＶ）を形成するために、小胞形成脂質の混合物を好適な有機溶媒（又は溶媒混合物）に溶解し、容器中で蒸発させて薄いフィルムを形成し、次いで水性媒体により水和して、典型的には大きさが約０．１〜１０μｍの範囲に及ぶ脂質小胞を形成する。第３級ブタノール（ＴＢ）は、上記プロセス及びその後の凍結乾燥に特に好適な溶媒である（この溶媒を用いて調製されたＭＬＶはＴＢ−ＭＬＶと称する）。凍結乾燥ＭＬＶ調製物は懸濁水溶液として再溶解することができる。次いで、典型的には０．０５〜１．０ミクロンの選択された均一な孔サイズを有するポリカーボネート膜を通して懸濁水溶液を排出（extusion)することにより、ＭＬＶ懸濁液を１ミクロン以下の所望の小胞サイズ範囲に選択的にダウンサイズすることができる。
【００７６】
本発明による小胞形成脂質は、水中で二分子層の小胞を形成することができるように疎水性鎖及び極性頭基部分を含む。例えば、リン脂質は、水性環境中で小胞を自発的に形成するか、脂質分子の疎水性部分が内部にあり、脂質分子の極性頭基部分が二分子層小胞の水溶性外面にある脂質二分子膜中に安定して組み込まれる。リポソーム小胞の脂質二分子膜は、類脂質膜小胞の囲み内及び該囲み上に親水性免疫原を保持するように設計される。
【００７７】
小胞形成脂質は、炭水化物鎖、ステロイド基、又は酸、アルコール、アルデヒド、アミン、若しくはエステルなどの化学的反応性基を極性頭基として含むことができる。リン脂質には、一般的には、種々の不飽和度で炭素が約１４〜２２個の２つの炭化水素鎖を含む、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、及びスフィンゴミエリン（ＳＭ）の組み合わせを形成する小胞を含むことができる。リポポリマーを加えて小胞の脂質含有量を安定化することができる。さらに、セレブロシド及びガングリオシド並びにステロール（すなわちコレステロール）を含む糖脂質から小胞を形成することができる。ジヘキサデシル基、ジオレオイル基、ジラウリル基、ジミリストイル基、又はジパルミトイル基を含むホスファチジル誘導化合物を形成する合成膜も入手可能であり(Calbiochem)、該合成膜には、脂質膜安定化添加剤の有無に関わらず混合物として用いることができるジミリストイルホスファチジルコリン又はジミリストイルホスファチジルグリセロールが含まれる。
【００７８】
免疫原性リポソーム組成物は少量の抗原性の高いウイルス粒子を慣用的に利用してきた一方、生物自身のすなわち自己のホルモン又はホルモン受容体の非常に低い又は無視できる抗原性には、例えばワクチン接種のためジフテリア毒素又は破傷風毒素などの免疫原性の高いキャリアタンパク質が必要であるだけでなく、ホルモン免疫原リポソームは、化学的安定性及び好ましい送達状態を維持する一方で望ましくない反応原性度を妨げるために多数のカプセル化リポソームに分布されたかなり多量の自己抗原が必要とすることも見出されている。既に言及した免疫原に加えて、本発明のリポソームは、免疫原性の増加のために修飾することができるホルモン、成長因子、補因子、又はアジュバントを含むその他の水溶性物質の送達に好適であろう。
【００７９】
リポソーム中にその他の作用物質又は追加の作用物質をカプセル化するのに種々の方法が利用できる。例えば、逆相蒸発法（Szoka、米国特許第４，２３５，８７１号）では、小胞形成脂質の非水溶液をより小体積の水性媒体で分散させて油中水型エマルジョンを形成する。したがって、カプセル化のため、親油性剤の場合には脂質溶液中又は水溶性剤の場合には水性媒体中に活性成分又は活性剤を含む。脂質溶媒を取り除いた後、得られたゲルをリポソームに換える。これらの逆相蒸発小胞（ＲＥＶ）は、約２〜４ミクロンの典型的な平均サイズを有し、主にオリゴ層状である（oligolamellar）、すなわち、１つ又は少なくともいつくかの（a few）脂質二分子層殻を含んでいる。所望する場合、ＲＥＶを排出によりサイズ分類処理し、例えば約０．０５〜１．５μｍの選択された最大サイズを有するオリゴ層状の小胞を得ることができる。
【００８０】
大きな多重膜小胞（ＬＭＬＶ）又はＲＥＶの調製物を例えば、排出、音波処理、又は高圧均質化によりさらに処理し、０．０３〜０．１ミクロンの範囲のサイズによって特徴づけられる小さな単層の小胞（ＳＵＶ’ｓ）を産生することができる。あるいは、脂質の水性分散剤の均質化によりＳＵＶ’ｓを直接形成することができる。
【００８１】
リポソーム組成物に追加成分を加えるその他の方法は、ＭＬＶを形成するために他の成分及び得られた固体を再分散させた水性リポソーム分散剤を同時に凍結乾燥する方法を含む。別の方法(A. Adler, Cancer Biother. 10: 293, 1995)は、脂質の第３級ブタノール溶液にカプセル化される作用物質の水溶液を添加することを提供する。混合物を音波処理及び凍結乾燥し、得られた粉末を再度水和する。
【００８２】
トラップされた（entrapped）作用物質を含有するリポソーム組成物は、必要な場合、遊離（トラップされていない）作用物質を除去するため、最終のサイズ分類処理後に再度処理することができる。遠心分離、ダイアフィルトレーション、及び限外濾過などの従来の分離技術がこの目的に好適である。組成物を従来の０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過することにより無菌化することもできる。本発明の組成物を形成するため、濾過後、１００％カプセル化において、リポソーム中の免疫原共役体の濃度が約１：１００〜１：１０００のタンパク質／脂質モル比となるように選択することができる。
【００８３】
本発明のリポソーム調製物は長期にわたって安定であることが見出されている。４℃での貯蔵で、リポソームキャリアは１年後もまだ十分に安定であり、トラップされた免疫原性剤は、少なくとも３〜６ヶ月の間、初期活性の７５〜９５％を保持し、ＩＬ−２リポソームが特に安定であった。ＩＬ−２及び抗原をロードしたリポソームは、最長で６ヶ月間、１０％未満の活性損失を示した。
【００８４】
安定剤をリポソーム組成物に加えることもできる。例えば、Ｄｅｓｆｅｒａｌ（商標）又はジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）などの金属キレートを１００μＭの濃度で凍結乾燥媒体中に含むとき、ＩＬ−２生物活性損失はなお一層減少する。貯蔵をより延長するため、組成物を１年よりはるかに長く安定である乾燥した凍結乾燥粉末に換え、使用前に必要なときに水和して懸濁水溶液を形成することができる。
【００８５】
ヒトでは、抗原の有効量は５０μｇ〜５ｍｇの範囲とすることができる。
【００８６】
非経口投与は、例えば腹膜内（ｉ．ｐ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）又は経皮的である注射によって行ってもよい。ワクチンは鼻腔内、直腸、膣、又は経口などの粘膜を介して投与することもできる。
【００８７】
本発明の多重膜小胞は、例えば抗ガストリン共役体、Ｇ１７ＤＴ、又は抗ＧｎＲＨ共役体、ＧｎＲＨＤＴ（Ｄ１７ＤＴとも称する）を含むワクチン製剤用の多量の親水性タンパク質をカプセル化することができることが見出されている。このようなカプセル化の１つの手順が実施例１に記載されているが、この方法は実施例の特定のリポソーム免疫原に限定するものではない。
【００８８】
すべての方法が参照により本明細書中に援用される本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，０２３，０７７号及び第５，４６８，４９４号（Ｇ１７ＤＴ）及び第５，６８８，５０６号（ＧｎＲＨＤＴ）及び第６，１３２，７２０号に記載された方法に従って、共役体を調製した。これらの共役体の配列アナログは上記に記載されている。
【００８９】
さらに、ＣＣＫ−２／ガストリン受容体免疫原（本発明の譲受人に譲渡された係属出願第０９／０７６，３７２号の開示が参照により本明細書中に援用される）及び上記のｈＣＧ免疫原は、上記のリポソーム中にカプセル化するのに好適な物質である。ヒトガストリンアナログ又はフラグメントの例の使用は、本明細書の実施におけるその他の動物種のガストリンホルモンを除外することを意味するものではない。
【実施例１】
【００９０】
リポソームカプセル化
多重膜リポソーム（ＭＬＶ）の製造に用いることができる二分子層形成成分には、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）（Lipoid, Genzyme又はAvanti Polar Lipids)が含まれる。
【００９１】
水溶液及び脂質の第３級ブタノール溶液（中性のＤＭＰＣ単独又は第３級ブタノール中に溶解した重量比が９：１のＤＭＰＣ：ＤＭＰＧ混合物のいずれか）中で、ノル−ＭＤＰアジュバント有り又は無しで、Ｇ１７ＤＴ又はＧｎＲＨＤＴ免疫原の混合物を一晩凍結乾燥することにより、ＭＬＶを調製した。注射用懸濁剤としての凍結乾燥したリポソームを調製するために、水和及び懸濁の方法はリポソームによるタンパク質カプセル化に対して重要な影響を及ぼす。少し増分させて水を加えることにより水和を行うと、最良の結果が得られる。
【００９２】
タンパク質カプセル化での脂質／タンパク質比（ｗ／ｗ）の効果の評価において、１０００：１のＤＭＰＣ／タンパク質比を得るように脂質の量を増加させても、５００：１の比より有利なタンパク質カプセル化にはならないことが見出された。したがって、本発明の有効な実施形態のほとんどは、５００：１の脂質／タンパク質比又はＤＭＰＣ／タンパク質比に焦点を当て、あるいは３００：１の脂質／タンパク質比にも焦点を当てた（表Ｉ’及び実施例６を参照のこと）。
【００９３】
リポソームによるＧｎＲＨＤＴ及びＧ１７ＤＴ（以下では、「タンパク質」としても識別する）のカプセル化の効率は、遠心分離後、リポソームペレット画分中のタンパク質及び上清の水相に存在する遊離の非カプセル化タンパク質の量を定量化することにより計算される。タンパク質は、改変されたローリー法（Peterson G. L. 1983.「全タンパク質の決定」（"Determination of total protein."）Methods Enzymol. 91:95-119）を用いて定量化した。リポソームによる水相の汚染レベルを評価するために、改変したバートレット（Bartlett）法（Bartlett, G. R. 1959;及び「カラムクロマトグラフィーでのリンアッセイ」（"Phosphorus assay in column chromatography"）J. Biol. Chem. 234:446-468;及びY. Barenholz et al.「リポソーム調製及び関連技術」（"Liposome preparation and related techniques"）1993,Lysosome Technology Vol. I, 2nd ed.(Gregoriadis, G. ED.)CRC Press, BOCA RATON, FL, 526-616）を用いて有機ホスフェートを定量化することによりリン脂質量を決定した。
【００９４】
［表Ｉ’］
2005535663.tif 000002
【００９５】
脂質／タンパク比が５００：１で９０％ＤＭＰＣ及び１０％ＤＭＰＧから成る負の電荷を帯びたＤＭＰＣ／ＤＭＰＧリポソーム製剤のタンパク質カプセル化の効力は、１００％ＤＭＰＣで製剤化したリポソームとほぼ同じであった。
【００９６】
凍結乾燥試料の水和及び懸濁は、無菌パイロジェンフリー水（ｐＨ５．４）中の有機炭素及び無機イオン合計が低いレベルであるＷａｔｅｒｐｒｏ  Ｐｓ  ＨＰＬＣ／Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄを用いて精製水を加えることにより行った。溶液のｐＨは水和した日に測定した。種々の試験調製物の実際のｐＨは約５．２〜６．７の範囲とすることができたが、該ｐＨは調製物の効力に対してはっきりした影響は与えなかった。リポソーム製剤の、ＤＭＰＣとタンパク質；ＤＭＰＣとタンパク質及びアジュバント；ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧとタンパク質；及びＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ混合物とタンパク質及びアジュバントなどの脂質／タンパク質の重量比を５００：１で保った。
【００９７】
リポソーム分散剤の粒子サイズ分布は、Y.Barenholzら(上記)記載されるコールター（Coulter）モデルＮ４  ＳＤでの動的光散乱（ＤＬＳ）によって、又はコールターカウンタ(Coulter Multisizer Accucomp)によって２５℃で決定した。汚染された又はロードなしのリポソームは０．２〜０．８μｍの範囲であった。
【００９８】
約１．３〜１．８μｍの範囲のリポソームサイズ分布を、粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）８０〜１００％により確認した。
【００９９】
得られたリポソームのサイズをコールターカウンタにより測定し、３．７〜５（±３の標準偏差）の範囲に及ぶ平均体積を一貫して確認した。
【０１００】
ＧｎＲＨＤＴ（すなわちＤ１７ＤＴ）を含有するリポソーム試料は電子顕微鏡検査及により視覚化し、逆染色法を用いて測定した。図１〜図４は、リンタングステン酸ナトリウム中で逆染色した２つの異なるリポソームワクチン（５００：１の脂質／タンパク質重量比）を表した電子顕微鏡写真である。複数の電子顕微鏡写真から得られた粒径は、各リポソーム製剤で約１〜２．５μｍの平均値と測定される平均で約５０個の粒子を示した。
【０１０１】
実験により、例えば上記で同定された共役体のような親水性タンパク質-をトラップするための、タンパク質に対する脂質の比が高いリポソームの調製法の効力も確立された。具体的には、本発明の多重膜小胞は、一部は脂質二分子膜上に位置し、一部は膜の囲み又は殻内に完全に内在した、高濃度又は多量のＤＴの共役体又はその他の水溶液タンパク質を保持することが見出された。
【０１０２】
以下の実施例は組織反応原性に対するワクチン用量の増加の効果を示す。
【実施例２】
【０１０３】
Ｇ１７ＤＴエマルジョン（ｗ／ｏ）よりも低用量のＧ１７ＤＴリポソーム
Ｇ１７ＤＴ共役体を１００μｇ又は２００μｇのタンパク質の共役体用量でリポソーム懸濁水溶液中にカプセル化した。このリポソームＧ１７ＤＴワクチン調製物を（３つの群の）雌ウサギに０日目、２８日目、及び５６日目でそれぞれ注射することにより試験し、従来技術である１００μｇ用量のＧ１７ＤＴエマルジョン対照と比較した。
【０１０４】
血清試料を８４日間の研究の通じて１４日間隔で採取し、ＥＬＩＳＡにより抗ガストリン抗体力価を試験した。リポソーム調製物は、０．２ｍｌ体積あたり１００μｇの用量で、７０日目において、３回の注射後、１０，３７０力価のピーク平均応答を誘導することが見出された。その他のリポソーム試料はすべて５，０００以下の力価を示したが、このことは１０，０００を上回る力価をもたらすのに少なくとも３回の注射が必要であり、これらの力価は長時間維持されないことを示していた。投与用量を２倍にして０．４ｍｌあたり２００μｇにすることにより、注射３の後１４日目において採取した血清中で力価の平均値が１１，１６２となった。９，５５３（又は約１０，０００）の力価の平均値は注射２の１４日後に得られ、このことは１００μｇ用量の処方計画よりも測定できるほどの改善を示しているので、用量の増加は幾分より効果的であった。しかしながら、その他の出血日数（０日目、１４日目、２８日目、５６日目、８４日目）で採取された血清の力価の平均値はすべて５，０００未満であったことから、これらの応答の持続時間は短かった。リポソーム製剤により送達される共役体用量を２倍にすることにより改善が図られたが、応答の持続時間は短かった。したがって、これらのリポソームは、臨床的使用のためのワクチンとして実用的とはみなせかったのに対して、ＩＳＡ  ７０３（第１３群）中の１００μｇのＧ１７ＤＴのエマルジョン用量を用いた同じ処方計画では、４２日目から先には、１０，０００を上回る抗ガストリン抗体の平均ウサギ血清力価が生じた。
【０１０５】
明らかに、リポソーム免疫原でのこの結果は、以下に説明される結果（実施例３）より有意に効果が低い。
【０１０６】
しかしながら、リポソーム製剤は注射部位で非常に寛容で、目に見える組織反応を起こさなかった。これは油中水型エマルジョンによる免疫化よりも改善されたものであるので、抗原のリポソームカプセル化の明らかな保護効果をより高い抗原ロードで試験した。以下に記載されるさらなる実施例により確認される通り、比較的多量（１〜３ｍｇ／用量）の水溶性免疫原の投与により、有意な組織反応なしに臨床的に有効な免疫応答が達成された。
【実施例３】
【０１０７】
Ｇ１７ＤＴ−リポソーム
前述の実施例２に示すように、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３（「ＩＳＡ  ７０３」）改変エマルジョン中で投与されたときに通常は非常に有効である共役体の用量は、リポソーム中にカプセル化したときは十分に有効ではない。しかしながら、（多数の粒子に分布された）１桁大きい用量のリポソームによりカプセル化されたＧ１７ＤＴを投与することにより効力が増加した。下記の通り、用量の大きさに関わらず、非常に低い組織反応原性だけを視覚化することができた。加えて、別の補充注射として投与されるリポソーム調製物中のサイトカインＩＬ−２の免疫調節効果は、抗体応答を明確に増強することが見出された。
【０１０８】
したがって、本実施例は、一連の個別の補充注射でＩＬ−２有り及び無し（すなわち、リポソーム中の０、１，０００、１０，０００、又は１００，０００ｃｕのＩＬ−２の用量）で投与したときの、前述のリポソーム中に製剤化された高用量のｈＧ１７ＤＴ（１．５又は３．０ｍｇのいずれか）の免疫原性及び局所寛容値の評価に有用であった。製剤の効力を、Ｇ１７ＤＴ（１．５又は３．０ｍｇ用量）を含有する緩衝水溶液製剤（ＰＢＳ）及び対照としてのＧ１７ＤＴ共役体（０．２ｍｌのエマルジョン体積中の１００μｇ用量）を含有するＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３エマルジョンと比較した。
【０１０９】
具体的には、１３羽のウサギ群（１群あたりｎ＝４）をリポソーム中にカプセル化されたＧ１７ＤＴ免疫原及びＩＬ−２補充剤で免疫化した。リポソームを１．０ｍｌの用量体積で筋肉内（ｉ．ｍ．）注射するか（第１群〜第１１群）、２．０ｍｌの用量体積で皮下（ｓ．ｃ．）注射した（第１２群）。第１群の動物は、注射１でＩＳＡ  ７０３中の１００μｇのＧ１７ＤＴ、次いで注射２及び３でリポソーム（ＩＬ−２なし）中の１．５ｍｇＧ１７ＤＴを受けた。第１群及び第１３群において、ＩＳＡ  ７０３エマルジョンを０．２ｍｌの用量体積で筋肉内注射した。各ウサギに０．１ｍｌ用量体積のＩＬ−２製剤を筋肉内注射した（第１群、第１０群、第１１群及び第１３群を除くすべての群）。０日目、２８日目及び５６日目で付与する一連の３組の注射で注射剤を投与した。血清試料を８４日間の治療にわたって１４日毎に採取し、その際にすべてのウサギを安楽死させ、注射部位反応についてスコアを取った。１つの群につき２羽の動物から得た生検を顕微鏡検査によって評価した。
【０１１０】
直接的な結合アッセイ法であるＥＬＩＳＡで抗Ｇ１７抗体を測定し、ガストリン標的抗原で被覆されたウェルに結合した抗体を抗抗体酵素複合体及び酵素基質を用いることにより間接的に検出した。
【０１１１】
実験手順
Ｇ１７ＤＴ免疫原製剤
試験物質は以下の成分から調製されるＧ１７ＤＴ免疫原及びＩＬ−２の種々の製剤から成るものであった。
１．ｈＧ１７ＤＴ；免疫原性キャリアにカップリングされたｈＧ１７（１〜９）ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列リスト中の（配列番号１８）；
２．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：［０．０１７ＭのＮａ２ＨＰＯ４＋０．００１ＭのＫＨ２ＰＯ４＋０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２］；
３．Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３:(Seppic;パリ、フランス);
４．ＤＭＰＣ：ｈＧ１７ＤＴリポソーム；
５．ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ：サイトカイン用リポソーム；
６．ＩＬ−２：３×１０６ｃｕ保存溶液；及び
７．無菌食塩水：０．２μｍのシリンジフィルターを通して濾過した蒸留水中の０．９％ＮａＣｌ
【０１１２】
ｈＧ１７ＤＴ免疫原を米国特許第５，４６８，４９４号に開示された方法に従って調製し、該方法は参照により本明細書中に援用される。
【０１１３】
試験製剤
Ｇ１７ＤＴ免疫原及びＩＬ−２補充剤は表Ａに示す組み合わせで無菌的に製剤化した。すべてのリポソーム及びＩＬ−２製剤について、各バイアル中に適当な体積の無菌食塩水を１００μｌずつ添加して、添加毎に激しくボルテックスした。７０：３０（油：水相、ｗｔ：ｗｔ）の比を用い、標準的な手による混合法を用いて、ＩＳＡ  ７０３エマルジョンを調製した。ＰＢＳを希釈剤として用いて水相を調製した。試験物質をシリンジ中に分配し、冷凍下（２〜８℃）で保存した。
【０１１４】
イン・ビボプロトコル
病原無しの成体処女雌ニュージーランド白ウサギを研究に用いた。ウサギをグループ分けし（ｎ＝４）、表Ｂに示すＧ１７ＤＴ免疫原で免疫化した。示される用量体積で０日目、２８日目、及び５６日目に１羽のウサギあたり３組の注射をした。筋肉内（ｉ．ｍ．）又は皮下（ｓ．ｃ．）注射を、第１の注射の組を右足に与え、第２の注射の組を左足に与え、第３の注射の組を第１の注射の組よりも多く右足に与える標準のプロトコルに従って、後足に与えた。注射部位は後の同定のために入れ墨した。
【０１１５】
免疫原性を評価するため、８４日目まで１４日毎にウサギを安楽死させたときに各ウサギから得られた血液試料から血清を調製した。１８ゲージの針を用いて耳周縁の静脈から血液（１出血あたり１５ｍｌ）を採取し、次いで、血塊の収縮（shrinkage）を可能にするために２〜８℃で一晩保存した。次いで、試料を遠心分離し（４００×ｇ）、血清をピペットで取り除き、アッセイするまで個々の試料として−１０℃〜−２５℃で凍結した。
【０１１６】
抗体アッセイ
抗ガストリン抗体力価をＥＬＩＳＡによる血清試料で測定した。抗体用に試験される血清は、０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、７０日目、及び８４日目の試験日に採取した。
【０１１７】
全体症状（Gross Pathology）
８４日目に注射部位の全体症状についてすべて試験動物を検査した。入れ墨により注射部位を位置づけ、筋肉を十分に露出させるように皮膚を反転させ（refected）、各注射部位で完全に筋肉を通って横切開を行った。全体症状について組織を０〜３の尺度で視覚的に評価したが、ここで、スコア０は組織が正常に見えることを表し、スコア３は組織の注射領域の至る所に甚だしい炎症性反応が存在することを表した。スコア１及びスコア２は中間レベルの局所反応を表す。
【０１１８】
顕微鏡病変観察
全体症状について段階付けをした後、１治療群あたり２羽のウサギを顕微鏡病変観察のために無作為に選択した。外科用メスで２〜２．５ｃｍの長さの大腿四頭筋を切除し、直ぐに最小体積のホルマリン緩衝剤０．２５ｍｌ中に組織被検物を沈めることにより、筋肉内注射部位を生検した。各試料を別々のバイアル中に入れ、最短で２４時間ホルマリン中に固定させた。パラフィン包埋、５μｍ厚での薄切、スライド載せ（mounting）、及びＨ及びＥ染色後、顕微鏡検査用の生検領域の組織病理学評価のため、バイアルを処理した。実施例３の各組織学的スコア及びスコアリング方式を表Ｃに示す。
【０１１９】
統計的分析
抗ガストリン力価の平均値及び中央値の双方を個々の抗体力価から計算し（表Ｃ）、選択された出血に対する群の応答をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて比較した。Ｂ群（Ｇ１７ＤＴエマルジョン）の力価の平均値を含む統計的分析の結果を表Ｄに示す。
【０１２０】
注射部位反応スコアの平均値を全体症状観察から計算した。組織学的スコアの平均値を計算し、表Ｄに示す。
【０１２１】
免疫学的結果
８４日間のイン・ビボの免疫原性試験を通じて各群により生じた抗ｈＧ１７抗体応答をＥＬＩＳＡによって測定した。抗体力価の平均値を表Ｅに示す。力価の平均値を図５にプロットし、力価の中央値のプロットを図６に示す。
【０１２２】
図面（図５及び図６）に示す通り、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３中に製剤化され、かつ、１用量あたり１００μｇのＧ１７ＤＴ（第１３群）を送達する対照のＧ１７ＤＴ免疫原エマルジョンは、高ピークの抗ｈＧ１７抗体力価（８４日目）及び研究全体にわたって最も強く持続される抗体の産生により特徴づけられる応答を誘導した。１０，０００を上回る力価には４２日目に達し、その後維持された。リポソーム調製物を筋肉内注射したウサギの応答は力価がより低く、注射２及び３の後、より短く、より非常にはっきりした追加免疫応答を示す傾向にあった。しかしながら、試験ウサギの第２群、第３群、第７群、第９群、及び第１２群に投与されたいくつかのリポソーム製剤は１０，０００を上回る力価を誘導し、持続した。注射３の後における第１群のピーク力価は、第４群及び第６群を除くリポソーム筋肉内注射群（第２群〜第８群）のピーク力価より統計的に有意に高くなかった。第４群（１．５ｍｇのＧ１７ＤＴ、１０，０００ｃｕのＩＬ−２）及び第６群（３．０ｍｇのＧ１７ＤＴ、０のＩＬ−２）の応答はピーク力価の平均値における比較的低い標準偏差により特徴づけられ、したがってこのことは第１群の対照と比較して統計的に優位であることを説明している。
【０１２３】
第２群（１．５ｍｇ、ＩＬ−２なし）及び第６群（３．０ｍｇ、ＩＬ−２なし）のピーク力価の平均値の間で有意な差はなかったが、このことは１．５ｍｇのＧ１７ＤＴから３．０ｍｇのＧ１７ＤＴへ用量を増加しても免疫原性を測定可能なほど増強しないことを示している。第１群（注射１がエマルジョンであり、その後の注射２及び３が１．５ｍｇのＧ１７ＤＴのリポソーム調製物である）及び第１２群（皮下注射されたリポソーム）を含む残りの２つの試験群は第１３群の対照とほぼ等しい力価を有する応答を誘発したが、応答の動態学（kinetics）は筋肉内リポソーム群により酷似していた。第１２群の注射３の後には力価の測定可能な増大はなかったが、抗体レベルの平均値は５６日目（注射３）から研究終了まで比較的安定しており、このことは第３の用量によって抗体産生が持続することができることを示唆している。予想通り、第９群及び第１０群は、それぞれＰＢＳ中の１．５ｍｇ及び３．０ｍｇのＧ１７ＤＴを有する抗原用量が高い溶液に対し応答が低かった。
【０１２４】
表Ｄに示される通り、ＩＬ−２は１．５ｍｇのＧ１７ＤＴの用量レベルでは抗体レベルに有意に影響を与えなかった。３．０ｍｇの用量で、第８群（１０，０００ｃｕのＩＬ−２）のみが第６群（ＩＬ−２なし）とは有意に異なっていた。しかしながら、共役体のこの用量で、２つのより高用量のＩＬ−２を受けた群（第８群及び第９群）は、低用量ＩＬ−２（第７群）及びＩＬ−２なし（第６群）の群と比較して、高い抗体力価を有していた。これらのデータは、３．０ｍｇのＧ１７ＤＴ用量の免疫原性が１０，０００〜１００，０００ｃｕの刺激性ＩＬ−２の補充投与により増強されたことを示唆している。
【０１２５】
注射部位反応の段階を８４日目においてすべてのウサギで視覚的に評価した。データが示す通り、注射部位反応は第１２群（皮下）及び第１３群（標準のエマルジョン調製物）を除き、すべての群で最小であった。これらの２つの対象群では、第３の免疫原注射の部位で第１２群の４羽の動物のうちの２羽及び第１３群の４羽のうち１羽で１より大きいスコアが示された。第１群〜第１１群では、小さい反応スコアである０．５がＩＬ−２投与の９６部位のうち１４部位（１５％）で観察された。これらの群における免疫原で注射された部位は、ほとんどの部分（６６％）について、０．５のスコアを得（１３２部位のうち８７部位）、３３％はスコアが０であった（１３２部位の４３部位）。したがって、視覚的評価により、リポソーム調製物は筋肉内投与されたときに非常に寛容であることが示された。
【０１２６】
顕微病変観察
８４日目における組織病理学的結果を表Ｄに示す。注射部位生検の顕微鏡病変の解釈(readings)は一般的に全体的な視覚的評価の結果に従い、最も高いスコアはＩＳＡ  ７０３中に製剤化された免疫原を受けた部位又は免疫原を皮下投与した場所のいずれかで生じた。炎症性反応はリポソーム筋肉内注射部位のほぼすべてで最小（minimal）であった。免疫原を注射された部位はＩＬ−２部位よりも若干高いスコアを有する傾向があった。炎症を示すリポソーム注射部位のうち、いつくかは筋肉繊維の中程度から著しい石灰化（calcification）（６部位）及び／又は有意な瘢痕(scarring)（４部位、そのうちの３部位は石灰化もあった）を含むことが認められた。第１３群に見られる筋肉反応スコアは油中水型エマルジョンには典型である。しかしながら、第１群の１２４番のウサギの部位１における２．５のスコアは、投与後の８４日目に段階付けされる第１の注射部位について幾分異常であった。リポソームが皮下で付与された第１２群におけるより高いスコアが認められた。視覚的及び組織学的反応の段階付け方式は互いに独立し、関連がないことに留意すべきである。一般に、組織学的反応スコアは視覚的スコアを上回った。それにも関わらず、リポソームによって油中水型エマルジョンよりも有意に少ない筋肉の炎症が誘導された。
【０１２７】
結論
実施例３の実験結果により、高い脂質とタンパク質との比（５００：１）で製剤化され、多数のＭＬＶ中の１．５ｍｇ及び３．０ｍｇのＧ１７ＤＴを送達するリポソームは、臨床的に有効であるのになお十分に高いＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３エマルジョンを含有する強力な製剤により誘発されるレベルのおよそ２５％の抗ｈＧ１７抗体レベルを筋肉内投与後に誘導することが実証される。同時に、非常に低い組織反応原性がワクチン量の有意な増加に関わらず観察された。１．５及び３．０ｍｇの用量の製剤の免疫原性は同等であった。３．０ｍｇの用量の免疫原性は、１０，０００及び１００，０００ｃｕのＩＬ−２の用量でリポソームと混合されたＩＬ−２の補充的投与により増強された。ＩＬ−２は１．５ｍｇの用量の免疫原性に対し何ら影響を与えなかった。３．０ｍｇの免疫原の皮下（ｓ．ｃ．）投与は、最初のＭｏｎｔａｎｉｄｅエマルジョン製剤で第１群に初回免疫（priming）を行い、続いて１．５ｍｇのリポソームでの追加免疫を行ったときと同様に有意に免疫原性を増強した。免疫原含有量が高いリポソーム製剤の反応原性は筋肉内投与後に有意に減少したが、皮下投与では有意に減少しなかった。これらの結果により、Ｇ１７ＤＴの高タンパク質リポソーム調製物は、反応原性を有意に減少する一方で有効な免疫原性を提供することにより、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３エマルジョンとして製剤化された免疫原の約１０分の１の量と比べても遜色ないことが示される。
【０１２８】
［表Ａ］
2005535663.tif 000003
【０１２９】
［表Ｂ］
2005535663.tif 000004
【０１３０】
［表Ｃ］
2005535663.tif 000005
【０１３１】
［表Ｄ］
2005535663.tif 000006
【０１３２】
［表Ｅ］
2005535663.tif 000007
【実施例４】
【０１３３】
エマルジョンなしのＧｎＲＨよりも少ない用量のＧｎＲＨ
最初の実験では、リポソームＧｎＲＨＤＴワクチン及び油中水型エマルジョンＧｎＲＨワクチンの反応原性及び免疫原性を比較した。ＧｎＲＨＤＴ共役体（すなわちＤ１７ＤＴ）をタンパク質１００μｇ〜１０００μｇの共役体用量を有するリポソーム懸濁水溶液中にカプセル化した。リポソームＧｎＲＨワクチンは、それぞれ０日目、１４日目及び４２日目で筋肉内注射をした雌ウサギで試験し、ほぼ同じ用量のＧｎＲＨＤＴエマルジョンワクチンと比較した。
【０１３４】
０日目から７０日目まで１４日毎にウサギから血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより抗ＧｎＲＨ抗体力価について試験した。０．２ｍｌ体積あたり１００μｇ用量を送達するリポソームの筋肉内注射により、７０日目において、３回の注射後、２，００４の平均ピーク力価が誘導されたことが見出された。その他の血清試料はすべて５８２の平均ピーク力価応答を示したが、このことは２，０００の力価を誘導するには少なくとも３回の注射が必要であったことを示している。さらに、抗体力価は持続しなかったが、ピーク力価が得られた後直ぐに有意に低下した。
【０１３５】
免疫原共役体の用量を２倍にして０．４ｍｌリポソームあたり２００μｇとすることで、５６日目における注射３の１４日後に採取した血清で力価の平均値が２，０６０となり、７０日目で力価の平均値が２，００５で維持された。用量の増加は、０．２ｍｌあたり１００μｇの用量により誘導されたわずか１６６の低い力価と比較して、注射２の１４日後に評価したときに７６８の力価の平均値を誘導することによって既により有効であることが見出された。１．０ｍｌあたり５００μｇ及び１．０ｍｌあたり１０００μｇなどの抗原用量のさらなる増加により、力価の平均値が５６日目にそれぞれ２，９６２及び３，４９４に上昇し、７０日目にそれぞれ２，１３３及び２，８８９へと低下した。したがって、これらの応答の持続期間は短く、リポソーム免疫化に応答する抗体力価は２８日目から４２日目まで及び５６日目から７０日目まで有意に低下した。しかしながら、共役体用量の増加により抗ＧｎＲＨ抗体反応の増加をもたらすようであった。
【０１３６】
ＧｎＲＨＤＴ共役体１ｍｌあたり１ｍｇのリポソーム用量の増加により所望の低い反応原性が示された一方、免疫応答は、ＧｎＲＨ活性免疫学的不妊を中和する（neutralize）のに十分であることが見出されている５０００を上回る力価の誘発に必要な閾値の効力に未だ達していなかった。
【実施例５】
【０１３７】
ＧｎＲＨＤＴ（すなわちＤ１７ＤＴ）
下記の通り、比較的高用量のＤ１７ＤＴ形態のＧｎＲＨＤＴをリポソーム中に取り入れたときの免疫原性及び反応原性に対する効果を評価するための実験を行った。該研究では、別の補充注射としてリポソームとともにＩＬ−２を投与したときの免疫調節効果についても調べた。実施例４に記載される前述の研究より、リポソームワクチン調製物はエマルジョンの用量を増加させて免疫化した動物に見られる反応原性の増加の問題を克服することが実証された（実施例４）。
【０１３８】
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３中に１００μｇ及び２００μｇのＧｎＲＨＤＴの用量を有するエマルジョンはほとんどの場合で臨床的に有効な免疫化に十分である一方、比較的中程度の（moderate）組織反応を一般に引き起こした。しかしながら、時折、０．２〜０．５ｍｌの注射体積のエマルジョン中に５００μｇ又は１０００μｇの高さの用量を要する必要性が生じた。これらの用量の増加は、治療患者のより深刻な組織反応の発生を増加させることが発見された。したがって、反応原性に関する０．２ｍｌあたり２００μｇの用量の制限を考慮すると、その他のより改善された免疫化手段が必要であった。
【０１３９】
タンパク質に対する脂質の比が高いリポソームを用いることにより、多数の小さな小胞中に水溶性タンパク質を分布させることによって多量の免疫原をカプセル化することができることが見出された。本実験では、別の補充注射としてＩＬ−２有り及び無し（０、１，０００、１０，０００、又は１００，０００ｃｕの用量）で投与されるときに、脂質の比が高いリポソーム中に製剤化された多用量（１．５又は３．０ｍｇのいずれか）のＧｎＲＨＤＴ（すなわちＤ１７ＤＴ）を評価した。これらの製剤を実施例１に記載される方法により調製し、ＰＢＳ中のＧｎＲＨＤＴ（０．２ｍＬ用量体積中１．５ｍｇ又は３．０ｍｇの共役体）を含有する水性製剤、及びＧｎＲＨＤＴ（０．２ｍｌ用量体積中１００μｇ）を含有するＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３エマルジョンと比較した（表１にまとめる）。４羽のウサギの１３の群の各々をＧｎＲＨＤＴ免疫原及びＩＬ−２補充物で免疫化した（表２を参照のこと）。第１群〜第９群ではリポソームを１．０ｍＬの用量体積で筋肉内（ｉ．ｍ．）注射し、第１２群では２．０ｍＬの用量体積で皮下（ｓ．ｃ．）注射した。第１群は、注射１でＩＳＡ  ７０３中の１００μｇのＧｎＲＨＤＴを受け、続いて注射２及び注射３でＭＬＶリポソーム中の１．５ｍｇＧｎＲＨＤＴ（ＩＬ−２なし）を受けた。対照の第１群及び第１３群において、ＩＳＡ  ７０３エマルジョンを０．２ｍｌの用量体積で筋肉内注射した。第２群〜第９群及び第１２群には、免疫原を受けた日と同じ研究日に０．１ｍＬの用量体積でＩＬ−２製剤を筋肉内注射した。第１０群及び第１１群にはそれぞれＰＢＳ水溶液中の１．５ｍｇ及び３．０ｍｇのＧｎＲＨＤＴ共役体を注射した。注射物は０日目、２８日目及び５６日目に投与した。血清試料を８４日間にわたって１４日毎に採取し、注射部位の反応について視覚的にスコアを取り、１群あたり２羽の動物から得た生検を顕微鏡検査により評価した。抗ＧｎＲＨ抗体応答をＥＬＩＳＡにより測定した（表３）。
【０１４０】
この実施例の実験により、１．５ｍｇ及び３．０ｍｇのＧｎＲＨＤＴを送達するための小胞としてタンパク質に対して脂質が高い比で製剤化されたリポソームは、ウサギでの筋肉内投与又は皮下投与（わずか３．０ｍｇ）後の抗ＧｎＲＨ抗体の応答を誘導することができることが示された（図７および図８を参照のこと）。用量応答のアッセイにより、１．５ｍｇよりも３．０ｍｇの共役体がより免疫原性であることが示された。さらに、ＩＬ−２を補充しない３．０ｍｇの用量により、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３免疫原エマルジョン対照よりさらに高い抗ＧｎＲＨ抗体力価が誘導された。驚くべきことに、リポソームワクチンの免疫原性はＩＬ−２の補充注射により増強されなかった。実際には、３．０ｍｇの用量でＩＬ−２は応答を減少さえしていた可能性がある。
【０１４１】
筋肉内付与したリポソーム調製物と比較したとき、第１２群において３．０ｍｇの用量の皮下注射により免疫原性が有意に増強されたのに対して、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ製剤でウサギを初回免疫し（第１群）、続いて１．５ｍｇのリポソーム（ＭＬＶ中のＧｕＲＨ）で追加免疫したことによっては若干力価が改善されたことが示されただけであった。注射されたリポソーム製剤の局所筋肉組織の反応原性は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３免疫原エマルジョン対照と比較して相当抑制された。抗体の応答は、ＩＬ−２を加えない３．０ｍｇの筋肉内注射がなされた群及び３．０ｍｇの皮下注射がなされた群を含むエマルジョン対照と同様であった一方、組織学的スコアは一貫して低く、視覚的スコアは顕著に向上した。対照的に、ＰＢＳ中のＧｎＲＨＤＴの高タンパク質溶液による治療では筋肉中で強い組織反応が生じなかった一方、抗ＧｎＲＨ抗体の力価は効力がないほど低かった。
【０１４２】
この結果により、１桁大きい用量を含有するように製剤化されたＧｎＲＨＤＴの多重膜リポソーム調製物は、免疫原性及び反応原性の双方に関してＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３ ＧｎＲＨＤＴ免疫原エマルジョンと比べて遜色ないことが実証される。
【０１４３】
実験手順
ＧｎＲＨＤＴ免疫原製剤
試験物質は以下の成分から調製されるＧｎＲＨＤＴ免疫原及びＩＬ−２の種々の製剤から成るものであった。
１．ＧｎＲＨＤＴ：Ｄ１７ＤＴとも呼ばれるＧｎＲＨ（１−１０）Ｓｅｒ−ｌ−ＤＴ；
２．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：［０．０１７ＭのＮａ２ＨＰ０４＋０．００１ＭのＫＨ２ＰＯ４＋０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２］；
３．Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３（Seppic；パリ、フランス）；
４．ＤＭＰＣ：ＧｎＲＨＤＴリポソーム；
５．ＩＬ−２又はその他のサイトカイン用のＤＭＰＣ／ＤＭＰＧリポソーム
６．ＩＬ−２：３×１０６ｃｕ；及び
７．無菌食塩水：０．２μｍのシリンジフィルターを通して濾過した蒸留水中の０．９％ＮａＣｌ
【０１４４】
試験製剤
ＧｎＲＨＤＴ免疫原及びＩＬ−２補充剤は清潔な条件下で表１中に示した種々の組み合わせで製剤化した。リポソームを懸濁するために、各バイアル中に適当な体積の無菌食塩水を１００μｌずつ注入して、少しの添加毎に激しくボルテックスした。変性剤（modifying agent）ＩＬ−２を無菌食塩水中に溶解し、次いでＤＭＰＣ／ＤＭＰＧリポソームと混合して適当な濃度のＩＬ−２を得た。７０：３０（油：水相、ｗｔ：ｗｔ）の比を用い、標準的な手による混合法を用いて、ＩＳＡ  ７０３エマルジョンを調製した。ＰＢＳを希釈剤として用いて水相を調製した。試験物質をシリンジ中に分配し、使用前に冷凍下（２〜８℃）で保存した。
【０１４５】
イン・ビボプロトコル
５２羽の特異的な病原無しの成体処女雌ニュージーランド白ウサギを研究に用いた。ウサギをグループ分けし（ｎ＝４）、ＧｎＲＨＤＴ免疫原で免疫化した。表２に示される用量体積で０日目、２８日目、及び５６日目に１羽のウサギあたり３組の注射をした。筋肉内又は皮下注射を、第１の注射の組を右足に与え、第２の注射の組を左足に与え、第３の注射の組を第１の注射の組よりも多く右足に与える標準のプロトコルに従って、後足に与えた。注射部位は後の同定のために入れ墨した。
【０１４６】
免疫原性を評価するために、８４日目まで１４日毎に各ウサギから得られた血液試料から血清を調製した。１８ゲージの針を用いて耳辺縁の静脈から血液（１出血あたり１５ｍｌ）を採取し、次いで、血塊の収縮を可能にするために２〜８℃で一晩保存した。次いで、試料を遠心分離し（４００×ｇ）、血清をピペットで取り除いてアッセイするまで個々の試料として−１０℃〜−２５℃で凍結した。
【０１４７】
抗体アッセイ
抗ＧｎＲＨ抗体力価をＥＬＩＳＡによる血清試料で測定した。抗体用に試験される血清は、０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、７０日目、及び８４日目の試験日に採取した（表３）。
【０１４８】
全体症状
実施例３に記載するように、８４日目に注射部位の全体症状についてすべてのウサギを検査した。
【０１４９】
顕微鏡病変観察
全体症状について段階付けをした後、１群あたり２羽のウサギを顕微鏡病変観察のために無作為に選択した。外科用メスで２〜２．５ｃｍの長さの大腿四頭筋を切除し、直ぐに最小体積のＨｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ（商標）２５ｍｌ中に組織被検物を沈めることにより、筋肉内注射部位を生検した。各試料を別々のバイアル中に置き、最短で２４時間該溶液中に固定し、組織病理学評価を行った。
【０１５０】
結果
統計的分析
抗ＧｎＲＨ力価の平均値及び中央値を各群について計算し（表３）、選択された出血に対する応答をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて比較した。８４日目における注射部位反応スコアの平均値を全体症状観察から計算し、表４に示す。組織学的スコアの平均値を計算し、表５に示す。
【０１５１】
免疫学的結果
８４日間のイン・ビボ試験を通じて各群により生じた抗ＧｎＲＨ抗体応答をＥＬＩＳＡによって測定した。抗体力価の中央値及び平均値を表３に示す。力価の平均値を図７にプロットし、力価の中央値を図８にプロットした。
【０１５２】
図７及び図８に示す通り、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３中に製剤化され、かつ、１用量あたり１００μｇのＧｎＲＨＤＴの用量で送達される対照のＧ１７ＤＴ免疫原（第１３群）は、７０日目でピークを付けた高い抗ＧｎＲＨ抗体力価を誘導した。筋肉内注射されるリポソーム調製物での注射により治療されたウサギ（第２群〜第９群）の応答は一般にエマルジョン対照により誘導される応答よりも力価において低かったが、免疫化された動物のＧｎＲＨの減少又は中和に臨床的に有効であるのに十分な力価であった。この一般的な結果の例外は、第６群（３．０ｍｇのＧｎＲＨＤＴ、ＩＬ−２なし）であり、該第６群では力価の平均値／中央値が対照の第１３群の力価の平均値／中央値を越えた。すべての群の応答は各注射の際に適切に増大した。実際には、注射３の後のピーク力価の平均値の統計的比較により、共役体のいずれかの用量でリポソームの筋肉内注射により誘導される応答は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ／免疫原エマルジョン対照（第１３群）の応答を有意に下回らないことが示された。
【０１５３】
一般的に、３．０ｍｇの用量のＧｎＲＨＤＴを送達するリポソームは１．５ｍｇの用量を有するリポソームよりも免疫原性であった（図２）。このことは、ＧｎＲＨの生物活性を中和し、それにより不妊を仲介するか又は性腺ステロイド合成を抑制するために必要な力価に関する応答を考慮するときに特に関連している。先のAphtonの研究によって、５，０００の力価がウサギの不妊に有効であることが示されている。図２に示した通り、３．０ｍｇのＧｎＲＨＤＴ用量で筋肉内に免疫化したウサギ（第２群〜第９群）は１．５ｍｇ用量で免疫化したウサギより有効な力価をより早く誘導し、該力価をより長く持続するようであった。この差は統計的に有意であった。この観点から、３．０ｍｇのＧｎＲＨＤＴ用量の応答は１．５ｍｇ用量より勝っていた。残りの２つの試験群、第１群及び第１２群は、第６群を除くすべてのその他のリポソーム群の抗ＧｎＲＨ応答を上回る抗ＧｎＲＨ応答を生じた。第１２群（３ｍｇのＧｎＲＨＤＴ、筋肉内）は研究の中で最も高い応答群であったが、このことは皮下注射経路がリポソーム調製物による高い抗体力価の誘導をさらに促進するであろうことを示唆している。予想通り、ＰＢＳ溶液中の１．５ｍｇ及び３．０ｍｇのＧ１７ＤＴそれぞれにより第９群及び第１０群を注射することにより低い応答群だけが減少した。
【０１５４】
サイトカインＩＬ−２は、１．５ｍｇのＧｎＲＨＤＴ用量との組み合わせでは抗体レベルには有意に影響を及ぼさなかった。３．０ｍｇの用量でのＩＬ−２なしの第６群は、第７群、第８群、及び第９群で筋肉内注射された他の３．０ｍｇのリポソーム調製物よりも有意に高い力価を生じた。さらに、第７群〜第９群の応答間に有意な差はなかった。これらのデータにより、ウサギにおけるリポソーム送達された免疫原性はＩＬ−２による補充によって増強されなかったことが示唆される。
【０１５５】
表４に提示したデータが示す通り、注射部位反応はすべての群で最小であり、スコアは１．０未満であった。第１３群の動物（対照エマルジョン調製物）はすべて第３の免疫注射部位で１．０のスコアを提示した一方、リポソーム群である第１群、第７群、第９群及び第１２群の各々では１羽のウサギのみが具体的には（namely）第３の注射の部位で１．０のスコアを有していた。筋肉内リポソーム注射部位の大部分（７４％）が０．５のスコアを得、２３％が０のスコアを得た。さらに、免疫学的アジュバントＩＬ−２は非常に寛容であり、８８％が０のスコアを得た。したがって、視覚的評価により、筋肉内リポソーム調製物が非常に寛容であることが示された。
【０１５６】
顕微病変観察（表５）
注射部位の生検の顕微鏡病変の解釈は一般的に全体的な評価の結果に従い、最も高いスコアはＩＳＡ  ７０３中で製剤化された免疫原を受けた部位で生じた。第１３群で見られる筋肉反応スコアはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３製剤で通常観察されるスコアに従う。免疫原を皮下投与したとき（第１２群）及び筋肉内注射に対する有意な応答を生ずるウサギにおいて（第６群）、エマルジョンにより誘導されるスコアより若干低いスコアが得られた。炎症性反応は、他のリポソーム筋肉内注射部位のほぼすべてで最小であった。免疫原で注射された部位はＩＬ−２部位よりも若干高いスコアを有する傾向があったが、後者は、両方とも部位１における第６群及び第９群を除き、非常にわずかな炎症の証拠を一般に示した。視覚的及び組織学的反応の段階付け方式は互いに独立し、関連がないことに留意すべきである。一般に、数値による組織学的反応スコアは視覚的スコアを上回った。まとめると、該評価により、リポソームは、注射体積の増加に関わらず、油中水型エマルジョンが誘導するよりも有意に少ない筋肉の炎症を誘導するようであることがわかった。
【０１５７】
結論
実施例５の結果により、多数の比較的小さい類脂質粒子に分布された１．５ｍｇ及び３．０ｍｇのＧｎＲＨＤＴを送達するために脂質とタンパク質との重量比が約５００：１で製剤化されたリポソームは、ウサギでの筋肉内又は皮下投与（３．０ｍｇ）後に抗ＧｎＲＨ抗体の応答を誘導することが実証されている。用量の応答は明らかであり、１．５ｍｇより３．０ｍｇの共役体がより免疫原性を誘発した。ＩＬ−２の補充がない３．０ｍｇ用量によってＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３対照よりも高い抗ＧｎＲＨ力価が誘導されたことは驚くべきことであった。したがって、免疫原性はＩＬ−２の補充注射により増強されなかった。実際には、３．０ｍｇの用量でＩＬ−２は応答を減少さえしていた可能性がある。タンパク質に対する脂質の比が高いリポソーム調製物をそれらが筋肉内又は皮下のいずれにより付与されたかに関わらず比較したとき、３．０ｍｇの用量の投与により免疫原性が有意に増強されたのに対して、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ製剤で初回免疫し、続いて１．５ｍｇのリポソームで追加免疫したことではごくわずかに力価が改善した。ワクチン用量の体積の増加に関わらず、はるかに低量のＧｎＲＨＤＴであるＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３エマルジョン対照と比較したとき、リポソーム製剤の反応原性は有意に低下した。したがって、注射部位の組織学的スコアはより低く、それらの視覚的スコアはエマルジョン対照より顕著に改善されたが、抗体の応答はエマルジョン対照に相当した。これらの結果により、タンパク質に対して脂質が高い比で調製された３．０ｍｇのＧｎＲＨＤＴ用量のリポソーム調製物は、反応原性が有意に減少するか又は除かれさえする一方で有効な抗ＧｎＲＨ抗体力価を生ずる点で、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３エマルジョンとして調製された免疫原と比べても遜色ないことが実証される。さらに、この研究により、患者の免疫系のサイトカイン刺激の潜在的な毒性の効果は、サイトカイン又は組成物に完全に由来する類似の作用物質又は治療を省くことにより本発明のリポソームワクチンにより回避するこができることが実証される。
【０１５８】
［表１］
2005535663.tif 000008
【０１５９】
［表２］
2005535663.tif 000009
【０１６０】
［表３］
2005535663.tif 000010
【０１６１】
[表４]
2005535663.tif 000011
【０１６２】
[表５]
2005535663.tif 000012
【実施例６】
【０１６３】
Ｇ１７ＤＴ−リポソームに最適の脂質：タンパク質比及び水和溶液
前述の実施例３に示すように、高用量の共役体はリポソーム中にカプセル化したとき有効である。Ｇ１７ＤＴリポソーム免疫原性をさらに最適にするため、我々は、本実施例に記載される実験を行い、異なる脂質：タンパク質比でＧ１７ＤＴリポソームを製剤化して最適の脂質：タンパク質比を確立した。さらに、我々は、水及び５％エタノール含有水を含む２つの水和溶液を免疫原性及び注射部位反応原性に対するそれらの効果を決定するために試験した。
【０１６４】
したがって、本実施例は、５０：１、１００：１、１５０：１及び３００：１の脂質：タンパク質比で製剤化されたことを除いて前述のＤＭＰＣリポソームとして製剤化された高用量のｈＧｌ７ＤＴ（１．５ｍｇ、３．０ｍｇ又は４．５ｍｇのいずれか）の免疫原性及び局所寛容値を評価した。製剤の効力を、対照としてのＧ１７ＤＴ共役体（０．２ｍｌエマルジョン体積中１００μｇの用量）を含有するＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３エマルジョンと比較した。
【０１６５】
リポソームの水和は注射可能な製剤の調製における最終工程である。典型的には、水和溶液は、水和媒体の各添加後にボルテックス混合を施して一連のアリコートで凍結乾燥した脂質（タンパク質は凍結乾燥した脂質とともに又は水和溶液中にあることができる）に加える。一般に、注射用水（ＷＦＩ）を用いる。ここで、我々は、リポソームの水和を促進する追加の利点を有する５％エタノール（ＥｔＯＨ）を補充したＷＦＩをも試験した。
【０１６６】
具体的には、８つのウサギ群（１つの群あたりｎ＝６）をリポソーム中にカプセル化したＧ１７ＤＴ免疫原で免疫化した。リポソームを１．０ｍｌの用量体積で筋肉内（ｉ．ｍ．）注射し、各注射日でそれぞれ０．５ｍＬの２回の注射として付与した（第１群〜第７群）。第８群の動物は０．２ｍＬのＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３中の１００μｇのＧ１７ＤＴを筋肉内に受けた。０日目、２８日目及び５６日目で付与する一連の３組の注射で注射剤を投与した。血清試料を８４日間の治療にわたって１４日毎に採取し、その際にすべてのウサギを安楽死させ、注射部位反応についてスコアを取った。１つの群につき２羽の動物から得た生検を顕微鏡検査によって評価した。
【０１６７】
直接的な結合アッセイ法であるＥＬＩＳＡで抗Ｇ１７抗体を測定し、ガストリン標的抗原で被覆されたウェルに結合した抗体を抗抗体酵素複合体及び酵素基質を用いることにより間接的に検出した。
【０１６８】
実験手順
Ｇ１７ＤＴ免疫原製剤
試験物質は以下の成分から調製されるＧ１７ＤＴ免疫原の種々の製剤から成るものであった。
１．ｈＧ１７ＤＴ；免疫原性キャリアにカップリングされたｈＧ１７（１−９）ｐＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列リスト中の（配列番号１８）；
２．リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：［０．０１７ＭのＮａ２ＨＰＯ４＋０．００１ＭのＫＨ２ＰＯ４＋０．１４ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２］；
３．Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３：（Seppic；パリ、フランス）；
４．ＤＭＰＣ：ｈＧ１７ＤＴリポソーム；
７．注射用水（ＷＦＩ）
８．５体積％のエタノールを含有するＷＦＩ（ＷＦＩ／５％ＥｔＯＨ）。
【０１６９】
ｈＧ１７ＤＴ免疫原を米国特許第５，４６８，４９４号に開示された方法に従って調製し、該方法は参照により本明細書中に援用される。
【０１７０】
試験製剤
Ｇ１７ＤＴ免疫原は表Ｉに示す組み合わせで無菌的に製剤化した。すべてのリポソームについて、各バイアル中に適当な体積の無菌ＷＦＩ又はＷＦＩ／５％ＥｔＯＨを１００μｌずつ添加して、添加毎に激しくボルテックスした。７０：３０（油：水相、ｗｔ：ｗｔ）の比を用い、標準的な手による混合法を用いて、ＩＳＡ  ７０３エマルジョンを調製した。ＰＢＳを希釈剤として用いて水相を調製した。試験物質をシリンジ中に分配し、冷凍下（２〜８℃）で保存した。
【０１７１】
イン・ビボプロトコル
病原無しの成体処女雌ニュージーランド白ウサギを研究に用いた。ウサギをグループ分けし（ｎ＝６）、表Ｉに示すＧ１７ＤＴ免疫原で免疫化した。１回の注射につき１．０ｍＬの合計用量体積を３回の注射日の各々でそれぞれ０．５ｍｌの２回の注射に分けた。ウサギは０日目、２８日目、及び５６日目において３回の免疫化を受けた。注射は筋肉内（ｉ．ｍ．）であり、標準のプロトコルに従って後足に与えた（それぞれの足に０．５ｍＬ）。注射部位は後の同定のために入れ墨した。乳化Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３Ｇ１７ＤＴ免疫原で免疫化した対照のウサギは、各注射日で１つの０．２ｍＬ用量の免疫原を受け、０日目、２８日目、及び５６日目において右−左−右と交互に後足に付与された。
【０１７２】
免疫原性を評価するため、８４日目まで１４日毎にウサギを安楽死させたときに各ウサギから得られた血液試料から血清を調製した。１８ゲージの針を用いて耳辺縁の静脈から血液（１出血あたり１５ｍｌ）を採取し、次いで、血塊の収縮を可能にするために２〜８℃で一晩保存した。次いで、試料を遠心分離し（４００×ｇ）、血清をピペットで取り除いてアッセイするまで個々の試料として−１０℃〜−２５℃で凍結した。
【０１７３】
抗体アッセイ
抗ガストリン抗体力価をＥＬＩＳＡによる血清試料で測定した。データを表ＩＩに提示する。抗体用に試験される血清は、０日目、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目、７０日目、及び８４日目の試験日に採取した。
【０１７４】
全体症状
８４日目に注射部位の全体症状についてすべてのウサギを検査した。入れ墨により注射部位を位置づけ、筋肉が十分に露出させるように皮膚を反転させ、各注射部位で完全に筋肉を通して横切開を行った。全体症状について組織を０〜３の尺度で視覚的に評価したが、ここで、スコア０は組織が正常に見えることを表し、スコア３は組織の注射領域の至る所に甚だしい炎症性反応が存在したことを表した。スコア１及びスコア２は中間レベルの局所反応を表す。実施例６の個々の全体症状スコアを表ＩＩＩに示す。
【０１７５】
顕微鏡病変観察
全体症状について段階付けをした後、１治療群あたり２羽のウサギを顕微鏡病変観察のために無作為に選択した。外科用メスで２〜２．５ｃｍの長さの大腿四頭筋を切除し、直ぐに最小体積のホルマリン緩衝液２５ｍｌ中に組織被検物を沈めることにより、筋肉内注射部位を生検した。各試料を別々のバイアル中に入れ、最短で２４時間ホルマリン中に固定した。パラフィン包埋、５μｍ厚での薄切、スライド載せ、及びＨ及びＥ染色後、顕微鏡検査用の生検領域の組織病理学評価のため、バイアルを処理した。実施例６の各組織学的スコア及びスコアリング方式を表ＩＶに示した。
【０１７６】
統計的分析
抗ガストリン力価の平均値及び中央値の双方を個々の抗体力価及び群の応答から計算した（表ＩＩ）。ピーク抗体力価の平均値をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて群の間で比較した（Ｐ＜０．０５）。
【０１７７】
注射部位反応スコアの平均値を全体症状観察から計算した。全組織学的スコアの平均値を計算し、それぞれ表ＩＩＩ及び表ＩＶに示した。
【０１７８】
免疫学的結果
８４日間のイン・ビボの免疫原性試験を通じて各群により生じた抗ｈＧ１７抗体応答をＥＬＩＳＡによって測定した。個々の抗体力価平均値及び中央値を表Ｂに示す。力価の平均値を図９にプロットし、力価の中央値のプロットを図１０に示す。
【０１７９】
図面（図９及び図１０）に示す通り、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ７０３中に製剤化され、かつ、１用量あたり１００μｇのＧ１７ＤＴ（第８群）を送達する対照のＧ１７ＤＴ免疫原エマルジョンは、ＩＳＡ  ７０３応答がリポソームの応答の約２倍にまで高くなった８４日までのリポソーム製剤により誘導された応答と同様の応答を誘導した。比較として、リポソーム調製物を筋肉内注射したウサギの応答は力価がより低く、注射２及び３の後、より短く、より非常にはっきりした追加免疫応答を示す傾向にあった。しかしながら、すべてのリポソーム製剤は１０，０００を上回る力価を誘導し、持続した。第１群（ＷＦＩ／５％ＥｔＯＨ中で水和した１．５ｍｇのＧ１７ＤＴ、４５０ｍｇのＤＭＰＣ）は４２日目から８４日目までの研究を通じて抗体産生の持続という点では特に安定していた。ＷＦＩ／５％ＥｔＯＨ中で水和した１：３００の脂質：タンパク質比（ｗｔ：ｗｔ）におけるこの特定の製剤は、特に有効であった。
【０１８０】
第４群（ｐ＝０．０９６）のピーク応答を除き、リポソーム群のピーク応答と比較して第８群のピーク応答の平均値の間には有意な差がなく、これによりリポソームベースの免疫原が有効であることが示された。ＷＦＩ及びＷＦＩ／５％ＥｔＯＨで水和することにより調製されたリポソームは特に有効であった。ＷＦＩ／５％ＥｔＯＨで水和したリポソームの粘性が高かったことが留意されるが、これにより長時間にわたる安定なレベルの抗体生産が望ましい長期の免疫化に対する該リポソームの有効性を増大させることができる。第１群の抗体応答はそのような応答例を提供する。
【０１８１】
注射部位の反応の段階を８４日目においてすべてのウサギで視覚的に評価した。データが示す通り、注射部位の反応は第８群（標準的なエマルジョン調製物）を除くすべての群で最小であった。この対象群は第３の免疫原注射部位で６羽の動物のうち２羽で１より大きいスコアを示した。第１群〜第７群では、２５２の部位で０．５を上回る反応スコアは観察されなかった。したがって、視覚的評価により、リポソーム調製物は筋肉内投与されたときに非常に寛容であることが示された。
【０１８２】
顕微病変観察
８４日目における組織病理学的結果を表ＩＶに示す。注射部位の生検の顕微鏡病変の解釈は一般的に全体的な視覚的評価の結果に従い、最も高いスコアはＩＳＡ  ７０３中に製剤化された免疫原の第３の注射の部位で生じた。炎症性反応はリポソーム筋肉内注射部位のほぼすべてで最小であった。第８群に見られる筋肉反応スコアは油中水型エマルジョンに典型的なものであった。視覚的及び組織学的反応の段階付け方式は互いに独立し、関連がないことに留意すべきである。一般に、組織学的反応スコアは視覚的スコアを上回った。０．５未満のスコアを得た部位は病変を有しないと考えられる。それにも関わらず、リポソームによって油中水型エマルジョンよりも有意に少ない筋肉の炎症が誘導された。
【０１８３】
結論
実施例６の実験結果により、脂質とタンパク質との比が３００：１で製剤化され、１．５ｍｇのＧ１７ＤＴを送達し、ＷＦＩ中の５％ＥｔＯＨの溶液で水和したリポソームは、許容可能な力価で持続したレベルの抗Ｇ１７抗体を誘導したことが実証される。同様に、本明細書中で試験された他のリポソーム調製物は同等なレベルの抗Ｇ１７抗体を誘導したが、応答レベルは前述の群ほど高くないか（統計的には有意により低いが）、又は安定な状態ではなかった。それにも関わらず、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３エマルジョン対照と比較して非常に低い組織反応原性がリポソーム調製物のすべてにおいて観察された。低レベルの注射部位反応により、注射回数を増加させることは最小の注射部位反応を維持しながら応答レベルを増加させる手段として許容可能である可能性があることが示された。これらの結果により、Ｇ１７ＤＴの高タンパク質リポソーム調製物は、有効な脂質：タンパク質比を選択すること及びリポソーム水和媒体中に５％までのエタノールを入れることにより最適化できることが示される。
【０１８４】
[表I]
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【０１８５】
[表II]
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【０１８６】
[表III]
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【０１８７】
[表IV]
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【０１８８】
結び
前述の実施例はカプセル化された水溶性物質に対する脂質の比が高いこのリポソーム送達系の有利な態様を例示したものであり、何ら限定するものではない。本発明の経験豊富な熟練者が、水溶性因子、補助因子、ホルモン、又はそれらのアナログ若しくは改変体の送達などのヒト疾患又は障害の治療における他の有用な物質をこの系に適用できることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１】脂質とタンパク質との比が５００：１であるリポソームＤＭＰＣとＧ１７ＤＴとの共役体組成物の電子顕微鏡写真である。
【図２】脂質とタンパク質との比が５００：１であるリポソームＤＭＰＣとＧ１７ＤＴとの共役体組成物及びノル−ＭＤＰ添加物の電子顕微鏡写真である。
【図３】脂質／タンパク質比が５００：１であるリポソームＤＭＰＣ／ＤＭＰＧとＧ１７ＤＴとの共役体組成物の電子顕微鏡写真である。
【図４】脂質／タンパク質比が５００：１であるリポソームＤＭＰＣ／ＤＭＰＧとＧ１７ＤＴとノル−ＭＤＰの電子顕微鏡写真である。
【図５】対照である１００μｇのＧ１７ＤＴ共役体単独又は１００μｇのＧ１７ＤＴ注射可能エマルジョン及びリポソーム（０ｃｕのＩＬ−２）中の１．５ｍｇ又は３ｍｇのＧ１７ＤＴ、及びＰＢＳ中の１．５ｍｇ又は３ｍｇのＧ１７ＤＴを、リポソーム中の１．５ｍｇ又は３ｍｇのＧ１７ＤＴ及び１０００ｃｕのＩＬ−２〜１００，０００ｃｕのＩＬ−２と比較した、ワクチン接種により長期にわたって誘導された抗ガストリンＧ１７抗体力価の平均値のグラフである。
【図６】上記同定された組成物でのワクチン接種により長期にわたって誘導された抗ガストリンＧ１７抗体力価の中央値のグラフである。
【図７】対照である１００μｇのＧｎＲＨＤＴ共役体で又はエマルジョンとして、対照である１．５ｍｇ又は３ｍｇのＧｎＲＨ−ＤＴリポソーム（０ｃｕのＩＬ−２）、及びＰＢＳ溶液中の１．５ｍｇ又は３ｍｇのＧｎＲＨＤＴで、並びに１．５ｍｇ又は３ｍｇのＧｎＲＨＤＴリポソーム及び１０００ｃｕのＩＬ−２〜１００，０００ｃｕのＩＬ−２で、ワクチン接種することにより長期にわたって誘導された抗ＧｎＲＨ抗体力価の平均値のグラフである。
【図８】上記の免疫原でのワクチン接種により長期にわたって誘導された抗ＧｎＲＨ抗体力価の中央値のグラフである。
【図９】５％ＥｔＯＨ又は水で復元した高用量のＧ１７ＤＴリポソームに反応する抗Ｇ１７ウサギ抗体力価の平均値のグラフである。
【図１０】５％ＥｔＯＨ又は水で復元した高用量のＧ１７ＤＴリポソームに反応する抗Ｇ１７ＤＴウサギ抗体力価の中央値のグラフである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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