(57)【要約】本発明は、抗原PDGFDに対する抗体およびこのような抗体の使用に関する。詳細には、本発明によれば、抗原PDGFDに対する完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。重鎖および軽鎖の免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、ならびにこの免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列であって、特にフレームワーク領域および／または相補性決定領域（CDR's）特にFR1からFR4、またはCDR1からCDR3にまたがる連続する重鎖および軽鎖の配列に相当する配列が提供される。このような免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞株がまた提供される。
2005530684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
PDGFDに結合し、かつ配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、38、40、42、44、46、および48からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を含む、ヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、39、41、43、45、47、および49からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列をさらに含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号13の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号14の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号15の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号16の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体であって。
【請求項５】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号17の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号18の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号19の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号20の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項７】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号21の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号22の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項８】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号23の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号24の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項９】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号25の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号26の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体であって。
【請求項１０】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号27の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号28の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１１】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号29の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号30の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１２】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号31の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号32の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１３】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号33の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号34の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１４】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号35の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号36の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１５】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号37の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１６】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号38の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号39の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１７】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号40の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号41の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１８】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号42の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号43の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１９】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号44の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号45の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項２０】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号46の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号47の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項２１】
前記重鎖アミノ酸配列が配列番号48の配列を含み、かつ前記軽鎖アミノ酸が配列番号49の配列を含む、請求項2に記載のヒトモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の要約
本発明は、抗原PDGFDに対する抗体およびこのような抗体の使用に関する。詳細には、本発明によれば、抗原PDGFDに対する完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。重鎖および軽鎖の免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、ならびにこの免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列であって、特にフレームワーク領域および／または相補性決定領域（CDR's）、特にFR1からFR4、またはCDR1からCDR3にまたがる連続する重鎖および軽鎖の配列に相当する配列が提供される。このような免疫グロブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞株がまた提供される。
【０００２】
２．背景技術
種々の組織において効果を発揮するポリペプチド増殖因子が記載されている。このような増殖因子としては血小板由来増殖因子（PDGF）が挙げられる。
【０００３】
血小板由来増殖因子（PDGF）ファミリーは現在、少なくとも3つの別個の遺伝子であるPDGF  A、PDGF  B、およびPDGF  Cからなり、その遺伝子産物は選択的に2つのPDGFRを通じてシグナル伝達して、多様な細胞機能を調節する。PDGF  A、PDGF  B、およびPDGF  Cは、溶液中で二量体化してホモ二量体、およびヘテロ二量体を形成する。
【０００４】
PDGF  A、およびPDGF  BのサブユニットをコードするRNAの発現は、アテローム性動脈硬化症に関与する脈管組織において報告されている。PDGF  AおよびPDGF  B  mRNAは、動脈硬化性プラーク（アテローム斑）（atherosclerotic plaques）の、間葉に出現する内膜細胞および内皮細胞のそれぞれに存在することが報告されている。さらに、PDGFレセプターのmRNAはまた、プラーク内膜細胞に主に局在している。
【０００５】
PDGF Bは、シミアンサルコーマ（サル肉腫）ウイルスのトランスフォーミング遺伝子（ｖ−ｓｉｓ）に関連する。PDGF  Bはまた、間葉性起源の細胞のマイトジェン（分裂促進因子）であることが報告されている。PDGF  Bは、さらに、グリア芽細胞腫（glioblastomas）で特徴的に見出される内皮細胞の病理的な増殖における自己分泌増殖刺激に関与している。PDGFはまた、細胞増殖を促進して、アポトーシスを阻害することが報告されている。
【０００６】
新規なPDGFであるPDGF−Dは現在クローニングされて特徴付けられている。以下を参照のこと：LaRochelleら、Nature Cell Biology 3：517（2001）、GenBankアクセッション番号AF335584、国際特許出願第WO 01/25433号、米国特許出願第60/158,083号（1997年10月7日出願）；同第60/159,231号（1999年10月13日出願）；同第60/174,485号（2000年1月4日出願）；同第60/186,707号（2000年3月3日出願）；同第60/188,250号（2000年3月10日出願）；同第60/223,879号（2000年8月8日出願）；同第60/234,082号（2000年9月20日出願）；同第09/685,330号（2000年10月5日出願）；PCT出願US00/27671（2000年10月6日出願）；米国特許出願第09/688,312（2000年10月13日出願）および同第09/715,332（2000年11月16日出願）。PDGF-D抗原に対する抗体は、その発現プロフィール、ならびに上で考察した遺伝子および遺伝子産物に対する配列相同性および／または類似性のため、治療上有用であり得る。
【０００７】
発明の概要
本発明の第一の態様によれば、PDGFDに結合し、かつ配列番号13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、38、40、42、44、46、および48からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を有する、ヒトモノクローナル抗体が提供される。1つの実施形態において、この抗体はさらに配列番号14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、39、41、43、45、47、および49からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列を含む。
【０００８】
本発明の第二の態様によれば、VH1−8遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して実質的に対応する重鎖アミノ酸配列、および図50に示される任意のアミノ酸相違を含む、PDGFDに結合するヒト抗体であって、図50に示されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を含む抗体が提供される。
【０００９】
本発明の第三の態様によれば、VH1−18遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して実質的に対応する重鎖アミノ酸配列、および図51に示される任意のアミノ酸相違を含む、PDGFDに結合するヒト抗体であって、図51に示されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を含む抗体が提供される。
【００１０】
本発明の第四の態様によれば、VH3−33遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して実質的に対応する重鎖アミノ酸配列、および図52に示される任意のアミノ酸相違を含む、PDGFDに結合するヒト抗体であって、図52に示されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を含む抗体が提供される。
【００１１】
本発明の第五の態様によれば、HV5−51遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して実質的に対応する重鎖アミノ酸配列、および図53に示される任意のアミノ酸相違を含む、PDGFDに結合するヒト抗体であって、図53に示されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を含む抗体が提供される。
【００１２】
本発明の第六の態様によれば、VK A19遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して実質的に対応する軽鎖アミノ酸配列、および図54に示される任意のアミノ酸相違を含む、PDGFDに結合するヒト抗体であって、図54に示されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を含む抗体が提供される。
【００１３】
本発明の第七の態様によれば、VH  A20遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して実質的に対応する軽鎖アミノ酸配列、および図55に示される任意のアミノ酸相違を含む、PDGFDに結合するヒト抗体であって、図55に示されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を含む抗体が提供される。
【００１４】
本発明の第八の態様によれば、VK A27遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して実質的に対応する軽鎖アミノ酸配列、および図56に示される任意のアミノ酸相違を含む、PDGFDに結合するヒト抗体であって、図56に示されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を含む抗体が提供される。
【００１５】
本発明の第九の態様によれば、VK A30遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対して実質的に対応する軽鎖アミノ酸配列、および図57に示される任意のアミノ酸相違を含む、PDGFDに結合するヒト抗体であって、図57に示されるCDR3配列からなる群より選択されるCDR3配列を含む抗体が提供される。
【００１６】
好ましい具体例の詳細な説明
新規なPDGFであるPDGF−Dは、現在クローニングされて特徴付けられている。以下を参照のこと：LaRochelleら、Nature Cell Biology 3：517（2001）、GenBankアクセッション番号AF335584、国際特許出願第WO 01/25433号、米国特許出願第60/158,083号（1997年10月7日出願）；同第60/159,231号（1999年10月13日出願）；同第60/174,485号（2000年1月4日出願）；同第60/186,707号（2000年3月3日出願）；同第60/188,250号（2000年3月10日出願）；同第60/223,879号（2000年8月8日出願）；同第60/234,082号（2000年9月20日出願）；同第09/685,330号（2000年10月5日出願）；PCT出願US00/27671（2000年10月6日出願）；米国特許出願第09/688,312（2000年10月13日出願）および米国特許出願第09/715,332（2000年11月16日出願）。PDGF−D抗原に対する抗体は、その発現プロフィール、ならびに上で考察した遺伝子および遺伝子産物に対する配列相同性および／または類似性のおかげで、治療上有用であり得る。PDGF−D抗原に対する抗体は、その発現プロフィール、ならびに上で考察した遺伝子および遺伝子産物に対する配列相同性および／または類似性のため、治療上有用であり得る。
【００１７】
PDGF−Dのヌクレオチド配列および翻訳されたアミノ酸配列はそれぞれ、図１および２に示される。
【００１８】
以前に記載されたBMP−1  VEGF−EおよびPDGFというポリペプチドに対するこの開示されたPDGFDポリペプチドの類似性によって、本発明のPDGFD核酸およびポリペプチドによる機能の類似性が示される。これらの有用性は、以下により詳細に記載される。
【００１９】
PDGFDの核酸およびポリペプチドは、軟骨の形成を誘導するために用いることが可能であり、BMP−1と同様に、インビトロで軟骨の形成を誘導することも可能である（Wozneyら、Science 242：1528〜1534（1988））。
【００２０】
PDGFDの核酸およびポリペプチドについてのさらなる用途は、コラーゲン形成のモジュレーションにある。組み換え発現されたBMP１および精製されたプロコラーゲンCプロテイナーゼ（PCP）、分泌されたメタロプロテイナーゼであって、カルシウムを要求しかつ軟骨および骨形成に必要なものは実際同一である。Kesslerら、Science 271：360〜62（1996）を参照のこと。BMP−1は、プロコラーゲンI、IIおよびIIIのC末端プロペプチドを切断し、そしてその活性は、プロコラーゲンCエンドペプチダーゼエンハンサータンパク質によって増大される。PDGFDの核酸およびポリペプチドは、コラーゲンモジュレーション経路において同様の役割を果たし得る。
【００２１】
PDGFD核酸およびポリペプチドはまた、種々の段階の癌に用いることができる。例えば、骨転移はほとんど特定の前立腺癌（prostate cancer）の罹患率および死亡率に普遍的に関連し得る。例えば、骨形態形成タンパク質は、種々の癌において重要な役割を有するとみなされる。骨形態形成タンパク質−４（「BMP−４」）およびMBP−2のmRNAの過剰発現は、分化に乏しい型の胃癌細胞株において報告されている。Katohら、J.Gastroenterol 31（1）：137〜9（1996）を参照のこと。この観察は、胃癌（gastric cancer）の散在性骨転移を有する患者の劣った予後に関して関連を有し得る。さらに、骨形態形成タンパク質（「BMP」）を生成する骨肉腫（osteosarcoma）は、BMPを生成しないものとは臨床特徴が異なった。Yoshikawaら、Cancer 56：1682〜7（1985）を参照のこと。それらは、垂直のスピクラによって放射線学的に、造骨型細胞によって組織学的に、そして血清アルカリホスファターゼレベルの増大、アドリアマイシン（ドキソルビシン）に加えて高用量のメトトレキセートを用いた術前の化学療法に対する相対的な耐性、ならびに他の骨および肺へ転移する傾向によって臨床的に、特徴付けられる。
【００２２】
VEGFに対するPDGFDポリペプチドの関連性によって、脈管形成の調節におけるPDGFDの核酸およびポリペプチドの用途が明らかになる。脈管形成は、新しい血管の発達に寄与するプロセスである。脈管形成の間、新しい毛細血管が既存の血管から出芽する。Risau FASEB J.9（10）：926〜33（1995）；Risauら、Ann.Rev.Cell Dev Biol.11：73〜91（1995）を参照のこと。成体哺乳動物においては、新しい血管が脈管形成を通じて生成される。脈管形成が病理の出現および維持に寄与する病理学的状態としては、腫瘍の発達および増殖が挙げられる。血管内皮増殖因子Fは、脈管形成に関与することが報告されている。
【００２３】
血管内皮増殖因子（「VEGF」）は、非ヒトおよびヒトの両方において、多くの腫瘍細胞によって高レベルで発現されかつ分泌された多機能性サイトカインである。Ferrara、Curr Top Microbiol immunol 237：1〜30（1999）の概説を参照のこと。VEGFは、細胞表面で発現される少なくとも2つのレセプターを介して血管内皮に対してその影響を発揮する。この第一は、キナーゼ挿入ドメイン含有レセプター（「KDR」）／胎児肝臓キナーゼ１（「Flk−1」）であり、２番目は、FLＴ−1である（Warrenら、J Clin invest 95：1789〜97（1995））。これらの2つのレセプターは、VEGFに異なる親和性を有しており、異なる細胞応答を有すると考えられる。Athanassiadesら、PlacentA19（7）：465〜73（1998）；Liら、Cell Res 9：11〜25（1999）を参照のこと。FLＴ−1ヌルマウスは、胚性段階で、約8.5日で死ぬが、KDRヌルマウスは、出生を通じて生存して、内皮細胞および造血性細胞の発達を保持する。KDRの活性化によって、有糸分裂誘発、ならびに血管拡張の調節に寄与する一酸化窒素経路における酵素であって、血管腫瘍発達に役割を果たす酵素である内皮細胞性一酸化窒素シンターゼ（eNOS）および誘導性NOSのアップレギュレーションがもたらされる。
【００２４】
VEGFは、新しく形成された血管の生存因子として作用することも報告されている。例えば、発生中の網膜では、酸素過剰に応答する血管の退縮は、グリア細胞によるVEGF放出の阻害に関連している。Alonら、Nat Med 1：1024〜8（1995）を参照のこと。さらに、抗VEGFモノクローナル抗体の投与によって、異種移植片モデルにおいて、既に樹立された腫瘍関連血管構造の退縮が生じる。Yuanら、Proc Natl Acad Sci USA 93：14765〜70（1996）を参照のこと。従って、PDGFDポリペプチドに対する抗体はまた、新しく形成された血管の退縮を誘導するかまたは促進するためにも用いることができる。
【００２５】
腫瘍細胞は、VEGFを分泌することによって低酸素症にさらに応答する。この応答は、新血管新生を促進し、かつ結果的に腫瘍増殖を可能にする。さらに、造血細胞（Bellamyら、Cancer Res 59（3）：728〜33（1999））、乳癌細胞（Speirsら、Br J Cancer 80（5〜6）：898〜903（1999））、およびカポジ肉腫（Masoodら、Proc Natl Acad Sci USA 94（3）：979〜84（1997））を含むいくつかの腫瘍細胞はKDRレセプターを発現することが見出されている。このような結果によって、これらの腫瘍において、VEGFは脈管形成を刺激するようにパラ分泌様式で作用するだけでなく、同様に自己分泌機構を介しても作用して、内皮細胞の増殖および／または生存を刺激するか、および／または腫瘍細胞の生存を促進することが示唆されている。従って、PDGFD抗体、またはPDGFDの核酸もしくはポリペプチドの機能の他のアンタゴニストによる脈管形成のモジュレーションを、無酸素症関連状態で用いて、内皮細胞の増殖、および／または腫瘍細胞、例えば造血細胞、乳癌細胞、およびカポジ肉腫細胞を阻害することができる。
【００２６】
PDGFDポリペプチドとVEGFポリペプチドとの間の類似性によって、PDGFD核酸およびそれらのコードするポリペプチドは、細胞生存を調節するために用いることができることが示唆される。VEGFシグナル伝達は、細胞生存に重要であることが報告されている。VEGFのレセプターであるVEGFレセプター−2（VEGFR−2/Flk１/KDR）に対する結合は、VE−カドヘリン、βカテニン、ホスホイノシチド−3−OHキナーゼ（PI3−K）、およびKDRの複合体の形成を誘導することが報告されている。この複合体におけるPI3−Kは、リン酸化によってセリン／トレオニンタンパク質キナーゼAkt（タンパク質キナーゼB）を活性化する。Carmelietら、1999 Cell 98（2）：147〜57を参照のこと。従って、活性化されたAktは、VEGF依存性生存シグナルを媒介するのに必要かつ十分であると考えられる。Gerberら、1998 J.Biol.Chem.273（46）：30336〜43を参照のこと。これらの知見によって、VEGFシグナル伝達と細胞生存との間に関連が存在することが示される。
【００２７】
PDGFDポリペプチドとPDGFポリペプチドとの間の類似性によって、PDGFD核酸およびそれらのコードするポリペプチドを、種々の治療適用および診断適用に用いることができることが示唆される。例えば、PDGFD核酸およびそれらのコードするポリペプチドは、癌、心血管疾患（cardiovascular diseases）および線維性疾患（fibrotic diseases）ならびに糖尿病性潰瘍（diabetic ulcers）を処置するために用いることができる。さらに、PDGFD核酸およびそれがコードするポリペプチドは、遺伝子治療を通じた動脈瘤（aneurysms）の予防および創傷閉鎖の加速のために治療上有用である。さらに、PDGFD核酸およびそのコードするポリペプチドを利用して細胞増殖を刺激することができる。
【００２８】
本発明によるPDGFD核酸は、癌性の細胞を含む種々の細胞型を同定するために用いることができる。例えば、PDGFDは、CNS癌、肺癌および卵巣癌において特異的に強力に発現される。PDGFDは、トランスフェクトするHEK  293細胞から生じる馴化培地においてインタクトで存続するか、または処理されて遺伝子産物のフラグメントを提供するかのいずれかである遺伝子産物を生成することが示されている。これらの物質の1つまたは両方のいずれかに起因する活性としては、DNAへのBrdUの取り込みによってモニターされる正味のDNA合成を刺激する能力、細胞数の増殖、培養中の細胞を形質転換する能力、およびインビボにおいて腫瘍形成を誘導する能力が挙げられる。これらの種々の活性は、種々の細胞型で生じる。さらなる活性としては、レセプタータンパク質分子のチロシン残基のリン酸化を誘導することが挙げられる。
【００２９】
PDGFDの核酸または遺伝子産物は、創傷治癒、新血管新生および組織増殖を促進するのにおいて、そして類似の組織再生要件において、治療因子として有用である。より詳細には、PDGFDの核酸またはポリペプチドは、貧血（anemia）および白血球減少症（leukopenia）、腸管感受性および禿頭（baldness）の処置において有用であり得る。このような状態の処置は、例えば、放射線療法または化学療法を受けている患者において指示され得る。このような場合、PDGFDの核酸もしくはポリペプチド、またはこれらのポリペプチドをコードする核酸配列の投与を、過増殖性の副作用が最小化されるような用量で管理することを意図している。
【００３０】
あるいは、CNS癌および卵巣癌のような、PDGFD核酸が高レベルで発現される腫瘍の場合、PDGFD核酸または遺伝子産物の生成の影響を阻害または排除することが所望される。例えば、これは、本明細書において同定されたPDGFDに対する抗体の投与によって達成することができる。別の例は、p85からのp35の形成に関与する推定プロテアーゼを同定する工程を包含する（WO 01/25433 4/12/2001を参照のこと）。このプロテアーゼの活性を特に阻害するが、他のプロテアーゼの活性を阻害しない物質の投与は、PDGFDポリペプチドの活性なp35型の形成を防止するのに効果的である。
【００３１】
本明細書に記載された悪性疾患の進行および遺伝子発現プロフィールにおける、PDGFDポリペプチドおよび核酸に関連する分子（例えば、BMP−1およびVEGF様ポリペプチド、例えば、ファロテイン（fallotein））の役割に基づけば、ヒト神経膠腫（glioma）および卵巣上皮癌腫（ovarian epithelial carcinomas）のサブセットについて、抗体を用いるPDGFDポリペプチドの標的化は、腫瘍増殖、細胞間質浸潤、化学耐性、化学耐性、放射線耐性および転移性の汎発に対して阻害性の効果を有することが予見される。種々の実施形態において、PDGFDポリペプチドは、モノクローナル抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体に連結される。
【００３２】
さらに、染色体位置の解析に基づけば（WO 01/25433 4/12/2001を参照のこと）、PDGFD核酸は、染色体11q23−24に局在する。Dマップに対するこの染色体遺伝子座は、種々の新生物形成（neoplasias）（Ferti-Passantonopoulouら、Cancer Genet.Cytogenet.51、183-188（1991）；Tarkkanenら、Genes Chromosomes Cancer 25、323-331（1999））、および異常な増殖因子発現によって部分的に説明できるヤコブソン症候群（Jacobsen's syndrome）（Pivnickら、J.Med.Genet.33、772−778（1996））において変更されたゲノム不安定性の領域（Kurahashiら、Hum.Mol.Genet.9、1665〜1670（2000））である。ヤコブソン症候群は、頭蓋顔面の異常、心臓の欠陥、腺の異常および脳発達の欠損によって特徴付けられる（Pivnickら、（1996））。従って、本発明によるPDGFDの核酸およびポリペプチドは、これらの疾患状態の種々の診断および治療適用において用いることができる。
【００３３】
さらに、11q23-24遺伝子座についての増幅または欠損を生じる再配置が、乳癌（Ferti-Passantonopoulouら、Cancer Genet.Cytogenet.51、183〜188（1991）；Shenら、J.Surg.Oncol.74、100〜107（2000））、原発性肉腫（sarcoma）、それらの肺転移（Tarkkanenら、（1999））、および骨髄性白血病（myeloid leukemias）（Michauxら、Genes Chromosomes Cancer 29、40〜47（2000）；Crossenら、Cancer Genet.Cytogenet.112、144〜148（1999））において報告されている。従って、本発明によるPDGFDの核酸ポリペプチドおよび抗体はまた、これらの癌の検出および処置において診断適用および治療適用を有し得る。
【００３４】
PDGFDポリペプチドは、腫瘍新血管新生の程度を潜在的にブロックまたは制限し得る。潜在的な抗体治療薬の投与の古典的様式に加えて、投与の新しく開発された様式が有用であり得る。例えば、外科的切除後の原発性脳腫瘍の処置のための１３１Ｉ標識モノクローナル抗体の局所投与が報告されている。さらに、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントの直接の定位脳内注射はまた、臨床および前臨床で研究されている。頸動脈内高浸透圧性灌流は、薬物結合体化ヒトモノクローナル抗体を用いて原発性脳悪性腫瘍を標的する実験的ストラテジーである。
【００３５】
さらに、本発明の核酸、ならびにそのフラグメントおよび変種は、以下の非限定的な例で用いることができる：（a）対応するコードされたタンパク質、ポリペプチド、フラグメントおよび変種の生合成を指向するための、組み換え体または異種遺伝子産物として、（b）本明細書に開示された核酸の検出および数量化のためのプローブとして、（ｃ）アンチセンス分子を調製するための配列テンプレートとして、など。このような用途は、以下の開示にさらに詳細に記載される。
【００３６】
さらに、本発明のタンパク質およびポリペプチド、ならびにそのフラグメントおよび変種は、以下を包含する方法で用いることができる：（a）抗PDGFD抗体の生成を刺激する免疫原としての働き、（b）抗体のような免疫原性アッセイにおける捕獲抗原、（c）本発明のPDGFDポリペプチドに結合する物質についてのスクリーニングのための標的として、および（d）抗体を用いた処置が細胞増殖を阻害するようなPDGFD特異的抗体のための標的。PDGFDの核酸、ポリペプチド、抗体、アゴニスト、アンタゴニストおよび他の関連の化合物の用途についてのこれらの有用性および他の有用性は以下にさらに詳細に開示される。細胞増殖を調節するのにおけるその強力な影響の観点から、PDGFDポリペプチドの発現または活性の増大を用いて、細胞増殖を促進することができる。逆に、PDGFDポリペプチド発現における減少を用いて、細胞死を誘導することができる。
【００３７】
PDGFDアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、PDGFDアゴニスト（模倣物）として、またはPDGFDアンタゴニストとしてのいずれかで機能するPDGFDタンパク質の変種に関連する。PDGFDタンパク質の変種は、突然変異誘発、例えば、離散（discrete）ポイントミューテーション、またはPDGFDタンパク質の末端切断によって生成することができる。PDGFDタンパク質のアゴニストは、PDGFDタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性の実質的に同じものまたはそのサブセットを保持することができる。PDGFDタンパク質のアンタゴニストは、例えば、PDGFDタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーに競合的に結合することによって、PDGFDタンパク質の天然に存在する形態の活性の1つ以上を阻害し得る。従って特定の生物学的な影響は、限定された機能の改変による処置によって誘発され得る。1つの実施形態では、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する変種を用いた対象の処置は、PDGFDタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対して対象における副作用が少ない。
【００３８】
PDGFDアゴニスト（模倣物）またはPDGFDアンタゴニストのいずれかとして機能するPDGFDタンパク質の変種は、PDGFDタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストの活性について、PDGFDタンパク質の変異体、例えば、末端切断変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。1つの実施形態において、PDGFD変種の変化に富んだライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって生成され、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。PDGFD変種の変化に富んだライブラリーは、例えば、遺伝子配列へ合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することによって生成することが可能であり、その結果、潜在的なPDGFD配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、あるいはそこにPDGFD配列のセットを含むさらに大きい融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイのため）のセットとして発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性のあるPDGFD変種のライブラリーを生成するために用いることができる種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動のDNAシンセサイザーで実施し、次いで合成遺伝子を適切な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットの使用によって、可能性のあるPDGFD変種配列の所望のセットをコードする全ての配列の1つの混合物としての供給が可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Narang（1983）Tetrahedron 39：3；Itakuraら、（1984）Annu Rev Biochem 53：323；Itakuraら、（1984）Science 198：1056；Ikeら、（1983）Nucl Acid Res 11：477を参照のこと。
【００３９】
定義
他に規定しない限り、本発明に関して用いた科学的用語および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって他に必要でない限り、単数形の用語は複数を包含し、そして複数形の用語は単数を包含する。一般に、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学および本明細書で記載されるハイブリダイゼーションの技術に関して利用される術語は、当該分野において周知でありかつ一般に用いられるものである。組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクチン）のために、標準的な技術が、用いられる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該分野で一般に達成されるかもしくは本明細書に記載されるように実施される。前述の技術および手順は一般に、当該分野で周知の従来の方法に従って、そして本明細書を通じて引用され考察される種々の一般的およびより専門的な引用文献に記載されるように実施される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual（第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（1989））を参照のこと。本明細書に記載される、解析的化学、合成有機化学、ならびに医学および薬化学に関して、そしてその実験室手順および技術に関して利用される術語は、当該分野で周知でありかつ一般に用いられる術語である。化学的合成、化学的解析、薬学的調製、処方および送達ならびに患者の処置については、標準的な技術が用いられる。
【００４０】
本発明の開示に従って利用されるとおり、以下の用語は、他に示さない限り、以下の意味を有することが理解される：
【００４１】
本明細書において用いる場合、「単離されたポリヌクレオチド（isolated polynucleotide）」という用語は、ゲノム、cDNAもしくはその合成起源のポリヌクレオチドまたはそれらのいくつかの組み合わせを意味しており、その起源のおかげで、「単離されたポリヌクレオチド」は、（1）その「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドの全てまたは一部と関連しないか、（2）それが天然には連結されないポリヌクレオチドと作動可能に連結されるか、または（3）より大きい配列の一部として天然には存在しない。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「単離されたタンパク質（isolated protein）」という用語は、cDNA、組み換えRNAもしくは合成起源のタンパク質またはそれらのいくつかの組み合わせを意味しており、その起源または誘導体の供給源のおかげで、この「単離されたタンパク質」は、（1）天然に見出されるタンパク質と関連しないか、（2）同じ供給源由来の他のタンパク質を含まない、例えばマウスタンパク質を含まないか、（3）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（4）天然には存在しない。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「ポリペプチド（polypeptide）」という用語は、一般名称として、ポリペプチド配列のネイティブなタンパク質、フラグメントまたはアナログをいう。従ってネイティブなタンパク質、フラグメントおよびアナログは、ポリペプチド属の種である。本発明による好ましいポリペプチドは、図1、5、9、13、17、21、25、および29によって提示されたヒト重鎖免疫グロブリン分子、ならびに図3、7、11、15、19、23、27、および31によって提示されたヒトκ軽鎖免疫グロブリン分子、ならびにこの重鎖免疫グロブリン分子と軽鎖免疫グロブリン分子、例えばκ軽鎖免疫グロブリン分子を含む組み合わせによって形成される抗体分子、そして逆も真であって、そしてそれらのフラグメントおよびアナログを含む。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「天然に存在する（naturally-occurring）」という用語は、物体に対して適用する場合、ある物体が天然に見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源から単離可能であり、実験室または他において人によって意図的に改変されている、生物体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列は、天然に存在する。
【００４５】
「作動可能に連結された（operably linked）」という用語は、本明細書において用いる場合、そのように記載された成分が、その意図した様式で機能することを可能にする関係である位置のことをいう。コード配列に対して「作動可能に連結された」制御配列は、このコード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるような方式で連結されている。
【００４６】
「制御配列（control sequence）」という用語は、本明細書において用いる場合、それらが連結されるコード配列の発現および処理を達成するのに必要なポリヌクレオチド配列をいう。このようなコントロール配列の性質は、宿主生物体に依存して異なる；原核生物では、このような制御配列としては一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終止配列が挙げられる；真核生物では、一般に、このような制御配列としては、プロモーターおよび転写終止配列が挙げられる。「制御配列」という用語は、最低限、発現および処理にその存在が必須である全ての成分を含むことを意図しており、そしてまたその存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含んでもよい。
【００４７】
「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」という用語は、本明細書において用いる場合、少なくとも１０塩基長のヌクレオチドのポリマー形態であって、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの型のヌクレオチドの改変型を意味する。この用語は、一本鎖型および二本鎖型のDNAを包含する。
【００４８】
本明細書において言及される「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」という用語は、天然に存在するヌクレオチド、そして改変されたヌクレオチドであって、天然に存在するオリゴヌクレオチド連結および天然には存在しないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、200塩基以下の長さを一般に含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましいオリゴヌクレオチドは、10〜60塩基長であり、そして最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19、または20〜40塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常、例えば、プローブについて、一本鎖である；しかし、例えば、遺伝子変異体の構築における使用について、オリゴヌクレオチドは二本鎖であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００４９】
本明細書において言及される「天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotide）」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される「修飾されたヌクレオチド（modified nucleotides）」という用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される「オリゴヌクレオチド連結（oligonucleotide linkage）」という用語は、オリゴヌクレオチド連鎖、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート、ホスホルアミデートなどが挙げられる。例えば、LaPlancheら、Nucl.Acids Res.14：9081（1986）；Stecら、J.Am.Chem.Soc.106：6077（1984）；Steinら、Nucl.Acids Res.16：3209（1988）；Zonら、Anti-Cancer Drug Design 6：539（1991）；Zonら、Oligonucleotides and Analogues： A Practical Approach、pp.87〜108（F.Eckstein編、Oxford University Press、Oxford England（1991））；Stecら、米国特許第5,151,510号；Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90：543（1990）を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、必要な場合、検出用の標識を含んでもよい。
【００５０】
本明細書において言及される「選択的にハイブリダイズする（selectively hybridize）」という用語は、検出可能にかつ特異的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそのフラグメントは、非特異的な核酸に対する検出可能な結合の感知可能な量を最小にするハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を用いて、当該分野で公知であり、本明細書において考察されるような選択的ハイブリダイゼーション条件を達成することが可能である。一般には、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびフラグメントと、目的の核酸配列との間の核酸配列の相同性は、少なくとも８０％であり、そしてより代表的には少なくとも85％、90％、95％、99％、および100％の好ましくは増大した相同性を有する。2つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的または完全な同一性が存在する場合、相同である。例えば、85％の相同性とは、2つの配列を最大のマッチングについて整列させたとき、そのアミノ酸の85％が同一であるということを意味する。マッチングを最大にすることにおいて許可されるのが、ギャップ（マッチングされる2つの配列のうちのいずれかにおける）である；5以下のギャップ長が好ましく、2以下がさらに好ましい。あるいは、そして好ましくは、2つのタンパク質配列（または、少なくとも30アミノ酸長のもの由来のポリペプチド配列）は、それらが変位データマトリックスおよびギャップペナルティー6以上を用いるプログラムALIGNを用いて、5より大きいアラインメントスコア（標準偏差単位で）を有する場合、相同（この用語は本明細書において用いられるとおり）である。Dayhoff、M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure、第101〜110頁（第5巻、National Biomedical Research Foundation（1972））およびこの巻に対する補遺2、第1〜10頁を参照のこと。この2つの配列またはその部分は、それらのアミノ酸が、ALIGNプログラムを用いて最適に整列させたとき、50％以上の同一性である場合に、さらに好ましく相同である。「〜に対応する（corresponds to）」という用語は、本明細書において用いる場合、あるポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部に対して相同である（すなわち、同一であり、厳密ではないが進化的に関連する）ということ、またはあるポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列に対して同一であるということを意味する。対照的に、「〜に対して相補的である（complementary to）」という用語は、本明細書において用いる場合、この相補的な配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部に対して相同であることを意味する。例示としては、ヌクレオチド配列「TATAC」は、参照配列「TATAC」に対応して、参照配列「GTATA」に相補的である。
【００５１】
以下の用語を用いて、2つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の配列の関係を記載する：「参照配列（reference sequence）」、「比較ウインドウ（comparison window）」、「配列同一性（sequence identity）」、「配列同一性のパーセンテージ（percetnage of sequence identity）」、および「実質的な同一性（substantial identity）」。「参照配列」は、配列比較のための基礎として用いられる規定された配列である；参照配列は、例えば、全長cDNAのセグメントもしくは配列表における所定の遺伝子配列として、より大きい配列のサブセットであってもよいし、または完全なcDNAもしくは遺伝子配列を含んでもよい。一般に、参照配列は少なくとも18ヌクレオチドまたは6アミノ酸長、頻繁には少なくとも24ヌクレオチドまたは8アミノ酸長、そしてしばしば少なくとも48ヌクレオチドまたは16アミノ酸長である。2つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、各々が（1）この2つの分子の間で同様である配列（すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部）を含み得、そして（2）さらに、この2つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間で多様な配列を含み得るので、2つ（またはそれ以上）の分子の間の配列比較は代表的には、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、「比較ウインドウ（comparison window）」にまたがって2つの分子の配列を比較することによって実施される。「比較ウインドウ」は、本明細書において用いる場合、少なくとも18の連続するヌクレオチド位置または6アミノ酸の概念的なセグメントをいうが、ここでポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、少なくとも18の連続するヌクレオチドまたは6アミノ酸の配列の参照配列に対して比較されてもよい、そしてここでこの比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、この2つの配列の最適のアラインメントについてこの参照配列（付加も欠失も含まない）に比べた場合、20パーセント以下の付加、欠失、置換など（すなわちギャップ）を含んでもよい。比較ウインドウを整列するための配列の最適のアラインメントは、SmithおよびWaterman Adv.Appl.Math.2：482（1981）の局所相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch J.Mol.Biol.48：443（1970）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A.）85：2444（1988）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行によって（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0、（Genetics Computer Group、575 Science Madison博士、Wis.）、Geneworks、またはMacVectorソフトウェアパッケージ）、または検査によって実行することが可能であり、そして種々の方法によって生成された最適のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにまたがって最高のパーセンテージの相同性を生じる）が選択される。
【００５２】
「配列同一性（sequence identity）」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が比較ウインドウにわたって同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチド、または残基対残基に基づいて）ことを意味する。「配列同一性のパーセンテージ（percentage of sequence identity）」という用語は、比較のウインドウにまたがって2つの最適に整列された配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、UまたはＩ）または残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチングした位置の数を求めること、この比較ウインドウ中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）によって、マッチングした位置の数を割ること、およびその結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを求めることによって算出される。「実質的に同一である」という用語は、本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の特徴を意味し、ここでこのポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも18ヌクレオチド（6アミノ酸）位置の比較ウインドウにまたがって、頻繁には少なくとも24〜48ヌクレオチド（8〜16アミノ酸）位置のウインドウにまたがって参照配列に比べた場合、少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセントの配列同一性、さらに通常は少なくとも99パーセントの配列同一性を有する配列を含み、ここでこの配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウにまたがる参照配列の全部で20パーセント以下の欠失または付加を含むかもしれない配列に対して参照配列を比較することによって算出される。この参照配列は、さらに大きい配列のサブセットであってもよい。
【００５３】
本明細書において用いる場合、20個の従来のアミノ酸およびそれらの省略形は従来の用法に従う。Immunology-A Synthesis（第2版、E.S.GolubおよびD.R.Gren、編、Sinauer Associates、Sunderland、Mass.（1991））を参照のこと。20個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Dアミノ酸）、非天然のアミノ酸、例えば、α−、α−二置換アミノ酸、N−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来とは異なるアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適切な成分であり得る。従来とは異なるアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：4−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−N，N，N−トリメチルリジン、ε−N−アセチルリジン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリン、N−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリジン、σ−N−メチルアルギニン、ならびに他の同様のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4−ヒドロキシプロリン）。本明細書において用いられるポリペプチドの表記法においては、標準的な用法および慣習に従って、左手側の方向がアミノ末端方向であり、そして右手側の方向がカルボキシ末端方向である。
【００５４】
同様に、他に特定しない限り、一本鎖ポリヌクレオチドの左手側末端は、5’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手側方向は、5’方向と呼ばれる。生成中のRNA転写物の5’〜3’付加の方向は、転写方向と呼ばれる；RNAと同じ配列を有しており、RNA転写物の5’〜5’末端であるDNA鎖上の配列領域は、「上流配列（upstream sequences）」と呼ばれる；RNAと同じ配列を有しており、RNA転写物の3’〜3’末端であるDNA鎖上の配列領域は、「下流配列（upstream sequences）」と呼ばれる。
【００５５】
ポリペプチドに添加される場合、「実質的な同一性（substantial identity）」という用語は、2つのペプチド配列が、デフォールトギャップウェイトを用いるプログラムであるGAPまたはBESTFITなどによって、至適に整列された場合、少なくとも80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセントの配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも99パーセントの配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性をいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンである；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンである；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンである；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は以下である：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミン。
【００５６】
本明細書において考察される場合、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるわずかなバリエーションは、そのアミノ酸配列におけるバリエーションが少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、90％、95％そして最も好ましくは99％維持されている条件下では、本発明によって包含されると解釈される。詳細には、保存的アミノ酸置換が意図される。保存的置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換である。遺伝子的にコードされたアミノ酸は一般に以下のファミリーに分類される：（1）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（2）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（4）非荷電の極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは以下である：セリンおよびトレオニンは、脂肪族−ヒドロキシファミリーである；アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有ファミリーである；アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンは、芳香族ファミリーである；そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシン単独の置換、グルタミン酸でのアスパラギン酸の置換、セリンでのトレオニンの置換、または構造的に関連するアスパラギン酸でのアミノ酸の同様の置換は、特にその置換がフレームワーク部位内のアミノ酸に関与しない場合、得られた分子の結合または特性に対して大きい影響を有さないことが合理的に予測される。あるアミノ酸変化が機能的ペプチドを生じるか否かは、ポリペプチド誘導体の特異的活性を評価することによって容易に決定できる。アッセイは本明細書において詳細に記載される。抗体または免疫グロブリン分子のフラグメントまたはアナログは、当業者によって容易に調製することができる。フラグメントまたはアナログの好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界の近くで生じる。構造的ドメインおよび機能的ドメインは、公的または私有の配列データベースに対するヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データの比較によって、同定することが可能である。好ましくは、コンピューター化された比較方法を用いて、構造および／または機能が公知である他のタンパク質において存在する配列モチーフまたは予測タンパク質高次構造ドメインを特定する。公知の三次元構造に折り畳むタンパク質配列を同定するための方法は公知である。Bowieら、Science 253：164（1991）。従って、前述の例によって、配列モチーフおよび構造的な高次構造であって、本発明に従って構造および機能的なドメインを規定するために用いることができるものを当業者が認識できることが実証される。
【００５７】
好ましいアミノ酸置換は、以下の置換である：（1）タンパク質分解に対する感受性を低下する、（2）酸化に対する感受性を低下する、（3）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（4）結合親和性を変更する、そして（4）このようなアナログの他の物理化学的特性または機能的特性を付与または改変する。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテイン（突然変異タンパク質）を含んでもよい。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは保存的アミノ酸置換）は、天然に存在する配列において作製することができる（好ましくは、分子間接触を形成するドメイン（単数または複数）の外側のポリペプチドの部分で。保存的アミノ酸置換は、親の配列の構造的特徴を実質的に変化しないはずである（例えば、置換アミノ酸は、親の配列に存在するヘリックスを破壊する傾向でも、親の配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向でもないはずである）。当該分野で認識されるポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、以下に記載される：Proteins、StructuresおよびMolecular Principles（Creighton編、W.H.FreemanおよびCompany、New York（1984））；Introduction to Protein Structure（C.BrandenおよびJ.Tooze編、Garland Publishing、New York、N.Y.（1991））；ならびにThornton et at.Nature 354：105（1991）。
【００５８】
「ポリペプチドフラグメント（polypeptide fragment）」という用語は、本明細書において用いる場合、アミノ末端欠失および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドであって、ただし残りのアミノ酸配列が、例えば、全長cDNA配列から推定される天然に存在する配列における対応する位置に対して同一であるポリペプチドをいう。フラグメントは代表的に、少なくとも5、6、8または10アミノ酸長、好ましくは少なくとも14アミノ酸長、より好ましくは少なくとも20アミノ酸長、通常は少なくとも50アミノ酸長、そしてさらにより好ましくは少なくとも70アミノ酸長である。「アナログ（analog）」という用語は、本明細書において用いる場合、推定のアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有する少なくとも２５アミノ酸のセグメントからなり、かつ以下の特性のうちの少なくとも1つを有するポリペプチドをいう：（1）適切な結合条件下で、PDGFDに対する特異的な結合、（2）適切なPDGFD結合をブロックする能力、または（3）インビトロまたはインビボでPDGFD発現細胞増殖を阻害する能力。代表的には、ポリペプチドアナログは、天然に存在する配列に関して、保存的アミノ酸置換（または付加もしくは欠失）を含む。アナログは代表的に、少なくとも20個のアミノ酸長、好ましくは少なくとも50個以上のアミノ酸長であり、そしてしばしば全長の天然に存在するポリペプチドと同じ程度の長さであってもよい。
【００５９】
ペプチドアナログは一般に、鋳型のペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチドdrusとして製薬産業において用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（peptide mimetics）」または「ペプチド模倣物（peptidemimetics）」と名付けられる。Fauchere、J.Adv.Drug Res.15：29（1986）；VeberおよびFreidinger TINS p.392（1985）；ならびにEvansら、J.Med.Chem.30：1229（1987）。このような化合物はしばしばコンピューターによる分子モデリングの補助によって開発される。治療上有用なペプチドに対して構造的に類似であるペプチド模倣物を用いて、等価な治療効果または予防効果を生じることができる。一般には、ペプチド模倣物は、模範的な（paradigm）ポリペプチド（すなわち、生化学的な特性または生理学的な活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体に対して構造的に類似であるが、当該分野で周知の方法によって、以下からなる群より選択される連結により必要に応じて置換される1つ以上のペプチド連結を有する：--CH2NH--、−CH2S−、−CH2−CH2−、−CH＝CH−（シスおよびトランス）、−COCH2−、−CH（OH）CH2−、および−CH2SO−。同じタイプのDアミノ酸を有するコンセンサス配列の1つ以上のアミノ酸の系統的な置換（例えば、L-リジンの代わりに、D−リジン）を用いて、さらに安定なペプチドを生成することができる。さらにコンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列のバリエーションを含む拘束されたペプチドは、当該分野で公知の方法（RizoおよびGierasch Ann.Rev.Biochem.61：387（1992））によって；例えば、ペプチドを環化する分子間ジスルフィド架橋を形成し得る内部システイン残基を付加することによって、生成することができる。
【００６０】
「抗体（antibody）」または「抗体ペプチド（antibody peptide）」とは、インタクトな抗体、またはその結合フラグメントであって、特定の結合についてそのインタクトな抗体と競合するものをいう。結合フラグメントは、組み換えDNA技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的切断もしくは化学的切断によって、生成される。結合フラグメントとしては、Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、および短鎖抗体が挙げられる。「二重特異性（bispecific）」抗体または「二機能性（bifunctional）」抗体以外の抗体は、その結合部位の各々が同一であることが理解される。過剰の抗体が、少なくとも約20％、40％、60％または80％まで、そしてより通常は約85％より大きくまで（インビトロの競合結合アッセイにおいて測定した場合）カウンターレセプター（counterreceptor）に結合したレセプターの量を減らす場合、この抗体は、このカウンターレセプターに対するレセプターの結合を実質的に阻害する。
【００６１】
「エピトープ（epitope）」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターに特異的に結合し得る任意のタンパク質決定基を包含する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基からなり、そして通常特定の3次元の構造的特徴および特定の荷電特徴を有する。解離定数が1μM以下、好ましくは100mM以下、そして最も好ましくは10nM以下である場合、抗体は、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００６２】
「因子（agent）」という用語は、本明細書において用いる場合、化合物、化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的物質から作製された抽出物を意味する。
【００６３】
本明細書において用いる場合、「標識（label）」または「標識された（labeled）」という用語は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の組み込み、または印されたアビジンによって検出可能であるポリペプチドのビオチニル部分に対する結合による、検出可能なマーカーの組み込みをいう（例えば、光学的または比色定量的な方法によって検出可能である蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）。特定の状況では、この標識またはマーカーは治療剤であってもよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する種々の方法は、当該分野で公知であり、かつ用いることができる。ポリペプチドのための標識の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光物質）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態において、標識は、種々の長さのスペーサーアームによって結合されて、可能性のある立体障害を減らす。
【００６４】
「薬学的因子または薬物（pharmaceutical agent or drug）」という用語は、本明細書において用いる場合、患者に適切に投与される場合、所望の治療効果を誘導し得る化合物または組成物をいう。他の化学的用語は本明細書においては、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms（Parker、S.編、McGraw-Hill、San Francisco（1985）））によって例示されるように、当該分野における従来の用法に従って用いられる。
【００６５】
「抗悪性腫瘍因子（antineoplastic agent）」という用語は、本明細書において用いる場合、ヒトにおける新生物、特に悪性（癌性）病変、例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病（leukemia）の発達または進行を阻害する機能的特性を有する因子をいう。転移の阻害は高い頻度で、抗新生物因子の特性である。
【００６６】
本明細書において用いる場合、「実質的に純粋な」とは、目的の種が存在する優先種であり（すなわち、モル基準では、この組成物における任意の他の個々の種よりもそれが豊富である）、そして好ましくは実質的に精製された画分は、この目的の種が存在する全ての高分子種のうちの少なくとも約50パーセント（モル基準で）を含む組成物であるということを意味する。一般に、実質的に純粋な成分は、その組成物中に存在する全ての高分子種のうち約80％より多く、さらに好ましくは約85％、90％、95％および99％を含む。最も好ましくは、この目的の種は、本質的に均一まで精製され（混入する種は、従来の検出法ではこの組成物中で検出できない）、ここで、この組成物は本質的に、単一の高分子種からなる。
【００６７】
患者という用語は、ヒトおよび獣医学の対象を包含する。
【００６８】
抗体の構造
基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが公知である。各々の四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成され、各々の対が1つの「軽（light）」鎖（約25kDa）および1つの「重（heavy）」鎖（約50〜70kDa）を有する。各々の鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う、約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。各々の鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う、定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κおよびλの軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、そしてそれぞれIgM、IgD、IgA、およびIgEとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内では、可変性領域および定常領域は、約12以上のアミノ酸の「J」領域によって連結され、ここでこの重鎖はまた、約10アミノ酸より多い「D」領域を含む。一般的には、Fundamental Immunology 第7章（Paul、W.編、第2版.Raven Press、N.Y.（1989））を参照のこと。各々の軽鎖／重鎖の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【００６９】
従って、インタクトな抗体は2つの結合部位を有する。二機能性抗体または二重特異性抗体を除けば、この2つの結合部位は同じである。
【００７０】
この鎖は全て、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる、3つの超可変性領域に連結された比較的保存されたフレームワーク領域（FR）の同じ一般的構造を示す。各々の対の2つの鎖由来のCDRは、特定のエピトープに結合し得るフレームワーク領域によって整列される。N末端からC末端へ、軽鎖および重鎖の両方ともドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各々のドメインに対するアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（National institutes of Health、Bethesda、Md.（1987および1991））、またはChothia & Lesk J.Mol.Biol.196：901〜917（1987）；Chothiaら、Nature 342：878〜883（1989）の定義に従う。
【００７１】
二重特異性抗体または二機能性抗体は、2つの異なる重鎖／軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab’フラグメントの連結を含む種々の方法によって生成することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann Clin.Exp.Immunol.79：315〜321（1990）、Kostelnyら、J.Immunol.148：1547〜1553（1992）を参照のこと。二重特異性抗体の産生は、従来の抗体の産生と比較して比較的労働集約的なプロセスであり得、そして収率および純度の程度は一般に、二重特異性抗体については低い。二重特異性抗体は、単一の結合部位を有するフラグメントの形態では存在しない（例えば、Fab、Fab’、およびFv）。
【００７２】
ヒト抗体および抗体のヒト化
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変性領域および／または定常領域を保有する抗体に伴う特定の問題を回避する。このようなマウスまたはラット由来のタンパク質の存在は、抗体の急速なクリアランスをもたらし得るか、または患者による抗体に対する免疫応答の発生をもたらし得る。マウスまたはラット由来の抗体の利用を回避するために、ヒト化抗体を開発してもよいし、またはげっ歯類が完全ヒト抗体を産生するように、げっ歯類へのヒト抗体機能の導入を通じて完全ヒト抗体を生成してもよいということが想定されている。
【００７３】
ヒト抗体
YACにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニングおよび再構築して、それらをマウス生殖細胞系列に導入する能力によって、極めて大型であるかまたはおおまかにマッピングされた遺伝子座の機能的な成分を解明し、ヒトの疾患の有用なモデルを作製する強力なアプローチが得られる。さらに、マウス遺伝子座をそのヒト等価物で置換するためのこのような技術の利用によって、発生の間のヒト遺伝子産物の発現および調節、他の系とのそれらの連絡、ならびに疾患の誘発および進行におけるそれらの遺伝子座の関与への固有の洞察が得られる。
【００７４】
このようなストラテジーの重要な実用化は、マウスホルモン免疫系の「ヒト化（humanization）」である。内因性のIg遺伝子が不活性化されているマウスへのヒト免疫グロブリン（Ig）遺伝子座の導入によって、抗体のプログラムされた発現および組み立ての基礎にある機構、ならびにB細胞発達におけるそれらの役割を研究する機会が得られる。さらに、このようなストラテジーは、ヒトの疾患における抗体治療の展望を満たす方向に向かう重要な里程である−完全ヒトモノクローナル抗体（Mab）の生成のための理想的な供給源を提供することができる。完全ヒト抗体は、マウスまたはマウス誘導体化モノクローナル抗体（Mab）対して固有の免疫原性応答およびアレルギー性応答を最小化すること、従って、投与された抗体の有効性および安全性を増大することが期待されている。完全ヒト抗体の使用は、繰り返しの抗体投与が必要である、慢性および再発性のヒト疾患、例えば、炎症（inflammation）、自己免疫（autoimmunity）および癌の処置において実質的に有利であることが期待できる。
【００７５】
この目的に向かう1つのアプローチは、このようなマウスがマウス抗体の非存在下でヒト抗体の大きいレパートリーを生成すると予測して、ヒトIg遺伝子座の大きいフラグメントを有するマウス抗体の生成を欠損しているマウス系統を操作することであった。大きいヒトIgフラグメントは、大きい可変性の遺伝子多様性、ならびに抗体の産生および発現の適切な調節を保存する。抗体の多様性および選択、ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的耐性の欠失のためにマウスの機構を開発することによって、これらのマウス系統におけるこの再生されたヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対して高い親和性の抗体を生じるはずである。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトMabを容易に生成しかつ選択することができる。
【００７６】
この一般的ストラテジーは、1994年に公開された最初のXenoMouse（商標）系統の本発明者らの生成に関連して実証された。Greenら、Nature Genetics 7：13〜21（1994）を参照のこと。XenoMouse（商標）系統は、コアの可変領域配列および定常領域配列を含んだ、それぞれ、ヒトの重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の245kbおよび190kbのサイズの生殖細胞系列の構成のフラグメントを含む酵母人工染色体（YAC）を用いて操作された。すなわち、YACを含むヒトIgは、抗体の再配列および発現の両方についてマウスの系と適合することが証明されており、かつ不活性化されたマウスIg遺伝子を置換することができた。これは、B細胞発達を誘導する能力、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを生成する能力、および抗原特異的ヒトモノクローナル抗体（Mab）を生成する能力によって実証された。これらの結果によってまた、多数のV遺伝子、さらなる調節エレメントおよびヒトIg定常領域を含有するヒトIg遺伝子座のより大きい部分の導入が、感染および免疫に対するヒトホルモン応答の特徴である実質的に完全なレパートリーを再利用し得ることが示唆された。Greenらの研究は最近、XenoMouse（商標）マウスを作製するために、それぞれヒトの重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖細胞系列の構成のYACフラグメントの導入を通じて、ヒト抗体レパートリーの約80％より多くの導入まで拡大された。Mendezら、Nature Genetics 15：146〜156（1997）および1996年12月3日出願の米国特許出願第08/759,620号を参照のこと。
【００７７】
このようなアプローチはさらに以下において考察されかつ記載されている：米国特許出願第07/466,008号（1990年1月12日出願）、同第07/610,515号（1990年11月8日出願）、同第07/919,297号（1992年7月24日出願）、同第07/922,649号（1992年7月30日出願）、同第08/031,801号（1993年3月15日出願）、同第08/112,848号（1993年8月27日出願）、同第08/234,145号（1994年4月28日出願）、同第08/376,279号（1995年1月20日出願）、同第08/430，938号（1995年4月27日出願）、同第08/464,584号（1995年6月5日出願）、同第08/464,582号（1995年6月5日出願）、同第08/463,191号（1995年6月5日出願）、同第08/462,837号（1995年6月5日出願）、同第08/486,853号（1995年6月5日出願）、同第08/486,857号（1995年6月5日出願）、同第08/486,859号（1995年6月5日出願）、同第08/462,513号（1995年6月5日出願）、同第08/724,752号（1996年10月2日出願）、および同第08/759,620号（1996年12月3日出願）、ならびに米国特許第6,162,963号、同第6,150,584号、同第6,114,598号、同第6,075,181号、および同第5,939,598号、および日本国特許第3 068 180号B2、同第3 068 506号B2、および同第3 068 507号B2。また、Mendezら、Nature Genetics 15：146〜156（1997）、ならびにGreenおよびJakobovits J.Exp.Med.188：483〜495（1998）も参照のこと。また、欧州特許番号EP 0 463 151 B1（1996年6月12日特許公開）、国際特許出願第WO 94/02602号（1994年2月3日公開）、国際特許出願第WO 96/34096号（1996年10月31日公開）、同第WO 98/24893号（1998年6月11日公開）、同第WO 00/76310号（2000年12月21日公開）も参照のこと。
【００７８】
別のアプローチでは、GenPharm international,Inc.，を含む他者は、「ミニ遺伝子座（minilocus）」を利用する。このミニ遺伝子座のアプローチでは、外因性のIg遺伝子座がIg遺伝子座由来の種（個々の遺伝子）の封入を通じて模倣される。従って、1つ以上のVH遺伝子、1つ以上のDH遺伝子、1つ以上のJH遺伝子、μ定常領域、および二次定常領域（好ましくはγ定常領域）は動物への挿入のために構築物中に形成される。このアプローチは、以下に記載される：Suraniらの米国特許第5,545,807号、ならびに各々LonbergおよびKayの米国特許第5,545,806号、同第5,625,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、同第5,770,429号、同第5,789,650号、同第5,814,318号、同第5,877,397号、同第5,874,299号、および同第6,255,458号、KrimpenfortおよびBernsの米国特許第5,591,669号および同第6,023.010号、Bernsらの米国特許第5,612,205号、同第5,721,367号、および同第5,789,215号、ならびにChoiおよびDunnの米国特許第5,643,763号、ならびにGenPharm Internationalの米国特許出願第07/574,748号（1990年8月29日出願）、同第07/575,962号（1990年8月31日出願）、同第07/810,279号（1991年12月17日出願）、同第07/853,408号（1992年3月18日出願）、同第07/904,068号（1992年6月23日出願）、同第07/990,860号（1992年12月16日出願）、同第08/053,131号（1993年4月26日出願）、同第08/096,762号（1993年7月22日出願）、同第08/155,301号（1993年11月18日出願）、同第08/161,739号（1993年12月3日出願）、同第08/165,699号（1993年12月10日出願）、同第08/209,741号（1994年3月9日出願）。また欧州特許第0 546 073号B1、国際特許出願第WO 92/03918号、同第WO 92/22645号、同第WO 92/22647号、同第WO 92/22670号、同第WO 93/12227号、同第WO 94/00569号、同第WO 94/25585号、同第WO 96/14436号、同第WO 97/13852号、および同第WO 98/24884号、ならびに米国特許第5,981,175も参照のこと。さらにTaylorら、1992、Chenら、1993、Tuaillonら、1993、Choiら、1993、Lonbergら、（1994）、Taylorら、（1994）、およびTuaillonら、（1995）、Fishwildら、（1996）を参照のこと。
【００７９】
上記され、かつMedical Research Counsel（the「MRC」）に譲渡されたSuraniらの発明者らは、ミニ遺伝子座アプローチの使用を通じてIg遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスを生成した。本発明者らの先導に従う、上記のGenPharm internationalの研究の発明者であるLonbergおよびKayは、Suraniらの研究の実質的な複製と組み合わせた内因性マウスIg遺伝子座の不活性化を提唱した。
【００８０】
ミリ遺伝子座アプローチの利点は、Ig遺伝子座の一部を含む構築物を生成して動物に導入することができる速さである。しかし、相応して、ミリ遺伝子座アプローチの重要な不利益は理論的には、少数のV、DおよびJ遺伝子の封入によって不十分な多様性しか導入されないということである。実際、公表された研究は、この懸念を支持するようである。ミリ遺伝子座アプローチの使用を通じて生成された動物のB細胞発達および抗体産生は、発達を妨げられるようである。従って、本発明の周辺の研究は一貫して、より大きい多様性を達成するため、そして動物の免疫レパートリーを再構成しようとして、Ig遺伝子座の大部分の導入に向かっていた。
【００８１】
Kirinはまた、マウスからのヒト抗体の生成を実証した。ここでは、微小核体融合を通じて、染色体の大きい小片、または染色体全体が導入されている。欧州特許出願第773288号および843961号を参照のこと。
【００８２】
ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答は、キメラ抗体かさもなければヒト化抗体を調製するための産業をもたらした。キメラ抗体は、ヒト定常領域およびマウス可変領域を有するが、特に抗体の慢性的な利用または多数回用量の利用においては、特定のヒト抗キメラ抗体（HACA）応答が観察されることが期待される。従って、PDGFDに対する完全ヒト抗体を提供して、HAMAまたはHACA応答の懸念および／または影響を無効にすることが望ましい。
【００８３】
ヒト化およびディスプレイ技術
ヒト抗体生成に関して上で考察されたように、免疫原性の低下した抗体を生成することは有利である。これは、ある程度は、ヒト化の技術および適切なライブラリーを用いるディスプレイ技術に関して達成することができる。マウス抗体または他の種由来の抗体を、当該分野で周知の技術を用いてヒト化または霊長類化することができることは理解されている。例えば、WinterおよびHarris Immunol Today 14：43〜46（1993）、ならびにWrightら、Crit、Reviews in Immunol.12125〜168（1992）を参照のこと。目的の抗体は、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを、対応するヒト配列で置換する組み換えDNA技術によって操作することができる（WO 92/02190および米国特許第5,530,101号、同第5,585,089号、同第5,693,761号、同第5,693,792号、同第5,714,350号、および同第5,777,085号を参照のこと）。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのIg cDNAの使用は、当該分野で公知である（Liuら、P.N.A.S.84：3439（1987）およびJ.Immunol.139：3521（1987））。mRNAは、抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞から単離され、そしてcDNAを生成するために用いられる。目的のcDNAは、特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる（米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号）。あるいは、ライブラリーを作製し、スクリーニングして、目的の配列を単離する。次いで、抗体の可変領域をコードするDNA配列を、ヒト定常領域の配列に融合する。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabatら（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest、N.I.H.公開番号91−3242に見出すことができる。ヒトのC領域遺伝子は公知のクローンから容易に利用可能である。アイソタイプの選択は、所望のエフェクター機能、例えば、補体結合、または抗体依存性細胞傷害性における活性によってガイドされる。好ましいアイソタイプは、IgG1、IgG3およびIgG4である。ヒト軽鎖定常領域であるκまたはλのいずれかを用いることができる。次いで、慣用的方法によって、キメラのヒト化抗体を発現する。
【００８４】
抗体フラグメントである、例えば、Fv、F（ab'）.sub.2およびFabは、例えば、プロテアーゼまたは化学的切断による、インタクトなタンパク質の切断によって調製することができる。あるいは、末端切断された遺伝子が設計される。例えば、F（ab'）2フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、CH1ドメインおよびH鎖のヒンジ領域をコードするDNA配列、続いて翻訳終止コドンを含み、末端切断された分子を生じる。
【００８５】
HおよびLのJ領域のコンセンサス配列を用いて、ヒトC領域セグメントへのV領域セグメントの引き続く連結のために、J領域へ有用な制限部位を導入するためのプライマーとして用いるためのオリゴヌクレオチドを、設計することができる。C領域のcDNAを、部位特異的突然変異誘発によって改変して、ヒト配列における同様の位置に制限部位を配置することができる。
【００８６】
発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、YAC、EBV由来エピソームなどが挙げられる。従来のベクターは、任意のVHまたはVL配列を容易に挿入し、かつ発現することができるように、操作された適切な制限部位を有し、機能的に完全なヒトVHまたはCL免疫グロブリン配列をコードするベクターである。このようなベクターでは、スプライシングは通常、挿入されたJ領域におけるスプライスドナー部位と、ヒトC領域に先行するスプライスアクセプター部位と、そしてまたヒトCHエキソン内で生じるスプライス領域との間で生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流のネイティブな染色体部位で生じる。得られたキメラ抗体は、任意の強力なプロモーターに連結されてもよい。このプロモーターとしては、レトロウイルスLTR、例えば、SV−40初期プロモーター（Okayamaら、Mol.Cell.Bio.3：280（1983））、ラウス肉腫ウイルスLTR（Gormanら、P.N.A.S.79：6777（1982））、およびモロニーマウス白血病ウイルスLTR（Grosschedlら、Cell 41：885（1985））が挙げられる。また、理解されるとおり、ネイティブなIgプロモーターなども用いることができる。
【００８７】
さらに、ヒト抗体または他の種由来の抗体は、ディスプレイ型の技術を通じて生成することができる。この技術としては、限定はしないが、当該分野で周知の技術を用いるファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、および他の技術が挙げられる。そして得られた分子は、さらなる成熟、例えばアフィニティー成熟、に供することができる。なぜならこのような技術は当該分野で周知であるからである。WrightおよびHarris（前出）、HanesおよびPlucthau PNAS USA 94：4937〜4942（1997）（リボソームディスプレイ）、ParmleyおよびSmith Gene 73：305〜318（1988）（ファージディスプレイ）、Scott TIBS 17：241〜245（1992）、Cwirlaら、PNAS USA 87：6378〜6382（1990）、Russelら、Nucl.Acids Research 21：1081〜1085（1993）、Hoganboomら、Immunol.Reviews 130：43〜68（1992）、ChiswellおよびMcCafferty TIBTECH 10：80〜84（1992）、および米国特許第5,733,743号。ディスプレイ技術を、ヒトでない抗体を生成するために利用する場合、このような抗体は上記のようにヒト化することができる。
【００８８】
これらの技術を用いて、抗体は、PDGFD発現細胞、PDGFD自体、PDGFDの形態、それらのエピトープまたはペプチド、およびそれらに対する発現ライブラリーを生成することが可能であり（例えば、米国特許第5,703,057号を参照のこと）、これはその後に上記の活性について上記されたとおりスクリーニングすることができる。
【００８９】
抗体治療剤についてのさらなる基準
本明細書において考察されるとおり、PDGFD抗体の機能は、その操作の様式の少なくとも一部に重要であると考えられる。機能とは、本発明者らは、例えば、PDGFD操作におけるPDGFD抗体の活性のことを意味する。従って、特定の観点では、PDGFDに対する治療剤候補物として抗体の生成に関して、この抗体は、補体結合しかつCDCに関与し得ることが所望され得る。同じことができる抗体のアイソタイプが多数存在する。この抗体としては、限定はしないが、以下が挙げられる：マウスIgM、マウスIgG2ａ、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1、およびヒトIgG3。生成される抗体は、このようなアイソタイプを最初に保有する必要はなく、むしろ生成された抗体は、任意のアイソタイプを保有してもよく、そしてこの抗体は当該分野で周知の従来の技術を用いてその後に切り換えられたアイソタイプであってもよいということが理解される。このような技術としては、とりわけ、直接組み換え技術の使用（例えば、米国特許第4,816,397号を参照のこと）、細胞間融合技術（例えば、米国特許第5,916,771号および同第6,207,418号を参照のこと）が挙げられる。
【００９０】
細胞間の融合技術において、任意の所望のアイソタイプを有する重鎖を保有するミエローマまたは他の細胞株が調製され、そして軽鎖を保有する別のミエローマまたは他の細胞株が調製される。このような細胞は、その後に、融合することが可能であり、そしてインタクトな抗体を発現する細胞株を単離することが可能である。
【００９１】
例えば、本明細書で考察されたPDGFD抗体は、ヒト抗PDGFD IgG2抗体である。このような抗体がPDGFD分子に対する所望の結合を保有した場合、これを容易にアイソタイプ切り替えして、依然として同じ可変領域（抗体の特異性、およびその親和性のある程度を既定する）を保有したままである、ヒトIgM、ヒトIgG1、またはヒトIgG3アイソタイプを生成することができた。次いで、このような分子は、補体結合し、かつCDCに関与することができる。
【００９２】
従って、上記で考察されるような所望の「構造的（structural）」属性を満たす抗体候補物が生成される場合、それらは一般に、アイソタイプ切り替えを通じて、少なくとも特定の所望の「機能的（functional）」な属性を提供され得る。
【００９３】
他の治療剤の設計および生成
本発明によれば、そしてPDGFDに関して本明細書において生成されかつ特徴付けられる抗体の活性に基づいて、抗体部分を上回る他の治療剤様式の設計が容易になる。このような様式としては、限定はしないが、進歩した抗体治療剤、例えば、二重特異性抗体、免疫毒素、および放射性標識された治療剤、ペプチド治療剤の生成、遺伝子治療、特に体内、アンチセンス治療剤、および低分子が挙げられる。
【００９４】
高度な抗体治療剤の生成に関して、補体固定は、望ましい属性であり、二重特異性、免疫毒素または放射性標識（例えば）の使用を通じて、細胞殺傷のために、補体に対する依存性を回避することが可能であり得る。
【００９５】
例えば、二重特異性抗体に関して、以下を含む二重特異性抗体を生成することができる：（i）2つの抗体であって、1つはPDGFDに対する特異性を有し、もう1つは一緒に結合体化される第二の分子に対する特異性を有する抗体、（ii）PDGFDに特異的な1つの鎖および第二の分子に特異的な第二の鎖を有する単一の抗体、または（iii）PDGFDおよび他の分子に対して特異性を有する単鎖抗体。このような二重特異性抗体は、周知の技術を用いて生成することができる。例えば、（i）および（ii）に関しては、例えば、Fangerら、Immunol Methods 4：72〜81（1994）ならびにWrightおよびHarris（前出）を、そして（iii）に関しては、例えば、Trauneckerら、Int.J.Cancer（捕遺）7：51〜52（1992）を参照のこと。各々の場合、第二の特異性は、重鎖活性化レセプターに対して作製され得る。このレセプターとしては、限定はしないが、CD16またはCD64（例えば、Deoら、18：127（1997）を参照のこと）またはCD89（例えば、Valeriusら、Blood 90：4485〜4492（1997）を参照のこと）が挙げられる。前述に従って調製された二重特異性抗体は、PDGFDを発現する細胞、そして特に本発明のPDGFD抗体が有効である細胞を殺傷する可能性が高い。
【００９６】
免疫毒素に関して、抗体は、当該分野で周知である技術を利用して、免疫毒素として働くように改変することができる。例えば、Vitetta Immunol Today 14：252（1993）を参照のこと。また、米国特許第5,194,594号も参照のこと。放射性標識抗体の調製に関して、このような修飾抗体はまた、当該分野で周知である技術を利用して容易に調製できる。例えば、Junghansら、Cancer ChemotherapyおよびBiotherapy 655〜686（第二版、ChafnerおよびLongo編、Lippincott Raven（1996））を参照のこと。また、米国特許第4,681,581号、同第4,735,210号、同第5,101,827号、同第5,102,990号（RE 35,500）、同第5,648,471号、および同第5,697,902号を参照のこと。各々の免疫毒素および放射性標識された分子は、PDGFDを発現する細胞、そして特に本発明の抗体が有効である細胞を殺傷する可能性が高い。
【００９７】
治療ペプチドの生成に関して、PDGFDおよびその抗体、例えば、本発明の抗体（低分子に関して以下に考察される）に関する構造的情報の利用、またはペプチドライブラリーのスクリーニングを通じて、PDGFDに対する治療用ペプチドが生成できる。ペプチド治療剤の設計およびスクリーニングは、Houghtenら、Biotechniques 13：412〜421（1992）、Houghten PNAS USA 82：5131〜5135（1985）、Pinallaら、Biotechniques 13：901〜905（1992）、BlakeおよびLitzi-Davis BioConjugate Chem.3：510〜513（1992）に考察されている。免疫毒素および放射性標識された分子はまた、抗体に関して上記で考察されたようにペプチド模倣物に関して、同様の方式で調製することができる。
【００９８】
PDGFD分子（または、スプライス変種もしくは選択的な形態のような形態）が、疾患プロセスにおいて機能的に活性であると仮定すれば、従来の技術を通じて遺伝子およびそれに対するアンチセンス治療剤を設計することも可能である。このような様式は、PDGFDの機能を調節するために利用することができる。それに関して、本発明の抗体によって、それに関連する機能的アッセイの設計および使用が容易になる。アンチセンス治療剤についての設計およびストラテジーは、国際特許出願第WO 94/29444号において詳細に考察されている。遺伝子治療のための設計およびストラテジーは周知である。しかし、詳細には、体内に関与する遺伝子治療技術の使用が特に有利であることが証明され得る。例えば、Chenら、Human Gene Therapy 5：595〜601（1994）およびMarasco Gene Therapy 4：11〜15（1997）を参照のこと。遺伝子治療剤の一般的な設計およびそれに関連する考察はまた、国際特許出願第WO 97/38137号において議論されている。
【００９９】
低分子治療剤もまた、本発明に従って構想することができる。本発明に基づいてPDGFDの活性を調節するように薬物を設計することができる。PDGFD分子の構造、および本発明による他の分子、例えば、本発明の抗体とのPDGFD分子の相互作用から収集された知識などを利用して、さらなる治療様式を合理的に設計することができる。これに関して、合理的な薬物設計技術、例えば、Ｘ線結晶学、コンピューター支援（または補助）の分子モデリング、定量的または定性的な構造活性関係（QSAR）および類似の技術を利用して、薬物開発の労力を集中することができる。合理的な設計によって、PDGFDの活性を改変または調節するために用いることができる分子またはその特定の型と相互作用し得る、タンパク質または合成構造の予測をすることができる。このような構造は、化学的に合成されてもよいし、生物学的な系で発現されてもよい。このアプローチは、Capseyら、Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs（Stockton Press、NY（1988））に概説されている。さらに、コンビナトリアルライブラリーを設計し、合成し、スクリーニングプログラム、例えば、高処理能力スクリーニング作業で用いることができる。
【０１００】
治療剤の投与および処方
本発明に従う治療実体の投与は、処方物中に組み込まれる適切なキャリア、賦形剤および他の因子とともに提供されて、移入、送達、耐性などの改善が得られることが理解される。多数の適切な処方物は、全ての薬剤師に公知の処方で見出すことができる：Remington's Pharmaceutical Sciences（第15版、Mack Publishing Company、Easton、PA（1975））、特にそのBlaug、Seymourによる第87章。これらの処方物としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質類、脂質（陽イオンまたは陰イオン）含有ベシクル（例えば、Lipofectin（商標））、DNA結合体、無水吸収ペースト、水中油型エマルジョンおよび油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含有する半固体混合物が挙げられる。任意の前述の混合物は、その処方物中の活性成分が、この処方物によって不活性化されず、かつこの処方物が投与の経路に生理学的に適合しかつ耐容性であるという条件では、本発明による処置および治療に適切であり得る。薬剤師に周知である処方物、賦形剤およびキャリアに関するさらなる情報については、Baldrick P.「Pharmaceutical excipient development：the need for preclinical guidance.」、Regul.Toxicol.Pharmacol.32（2）：210〜8（2000）、Wang W.「Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.」Int.J.Pharm.203（1〜2）：1〜60（2000）、Charman WN 「Lipids、lipophilic drugs、and oral drug delivery-some emerging concepts.」J Pharm Sci.89（8）：967〜78（2000）、Powellら、「Compendium of excipients for parenteral formulations」PDA J Pharm Sci Technol.52：238〜311（1998）、ならびにその引用文献もまた参照のこと。
【０１０１】
抗体の調製
本発明による抗体は好ましくは、挿入されたゲノムを産生するヒト抗体の実質的な部分を有するが、内因性のマウス抗体の産生を欠いているトランスジェニックマウスの利用を通じて調製される。次いで、このようなマウスは、ヒトの免疫グロブリン分子および抗体を産生し得、そしてマウスの免疫グロブリン分子および抗体の産生は欠く。同じことを達成するために利用される技術は、本明細書の発明の背景の項目において開示される特許、出願および引用文献において開示される。しかし、詳細には、マウスのトランスジェニック生成物およびそれに由来する抗体の好ましい実施形態は、1996年12月3日出願の米国特許出願第08/759,620号および1998年6月11日公開の国際特許出願第WO 98/24893号、2000年12月21日公開の国際特許出願第WO 00/76310号に開示されている。また、Mendezら、Nature Genetics 15：146〜156（1997）も参照のこと。
【０１０２】
このような技術の使用を通じて、本発明者らは、種々の抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成した。本質的に、本発明者らは、目的の抗原を用いてマウスのXenoMouse（商標）系統を免疫して、抗体を発現するマウスからリンパ細胞（例えば、B細胞）を回収し、このような回収された細胞を骨髄性タイプの細胞株と融合して、不死のハイブリドーマ細胞株を調製し、このようなハイブリドーマ細胞株をスクリーニングして選択して、目的の抗原に特異的な抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を同定する。本発明者らは、PDGFDに特異的な抗体の調製のために、本発明に従ってこれらの技術を利用した。本明細書において、本発明者らは、PDGFDに特異的な抗体を生成する多数のハイブリドーマ細胞株の生成を記載している。さらに、本発明者らは、このような細胞株によって産生される抗体の特徴づけを提供するが、これには、このような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列解析を含む。
【０１０３】
本明細書において考察されるハイブリドーマ細胞株は、1.6.1、1.11.1、1.17.1、1.18.1、1.19.1、1.23.1、1.24、1.25、1.29、1.33、1.38、1.39、1.40、1.45、1.46、1.48、1.49、1.51、および6.4.1と命名される。前述の細胞株によって生成された各々の抗体は、ヒトκ軽鎖を有する完全ヒトIgG2重鎖を保有する。一般に、本発明に従う抗体は、高い親和性を保有し、固相および液相のいずれかで測定した場合、代表的には、約10-6ないし約10−11MのKdを保有する。
【０１０４】
理解されるとおり、本発明に従う抗体は、ハイブリドーマ細胞以外の細胞株で発現することができる。特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために用いることができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法であって、例えば、ウイルス（またはウイルスベクター中に）ポリヌクレオチドをパッケージングすること、およびウイルス（またはベクター）を用いて宿主細胞を形質導入することを含む方法によるものであっても、または米国特許第4,399,216号、同第4,912,040号、同第4,740,461号、および同第4,959,455号に例示されるような、当該分野で公知のトランスフェクション手順によるものであってもよい。用いられるこれらの形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入のための方法は当該分野で周知であり、そしてこの方法としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、および核へのDNAの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【０１０５】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で周知であり、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ATCC）から入手可能な不死化された多くの細胞株が挙げられ、これらとしては、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、べビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌細胞（hepatocellular carcinoma）（例えば、Hep G2）、および多数の他の細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。どの細胞株が高い発現レベルを有し、構成的なPDGFD結合特製を有する抗体を産生するかを決定することによって、特に好ましい特定の細胞株を選択する。
【０１０６】
本発明に従う抗体は、PDGFDに結合することができる。さらに、本発明の抗体は、患者サンプルにおけるPDGFDの検出に有用であり、従って本明細書において下記されるような診断剤として有用である。さらに、本発明の抗体の使用を通じて観察される線維芽細胞の増殖の強力な阻害に基づいて、このような抗体は、悪性の組織増殖、および／または疾患、例えば、本明細書において下記に考察されるような癌および閉塞性組織増殖の処置に治療的な有効性を有すると考えられる。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例は、実施された実験および得られた結果を含んでいるが、これは、例示の目的のみで提供されているのであって、本発明を制限すると解釈されるべきではない。
【０１０８】
実施例１
PDGFDに対する抗体は、国際特許出願第WO 01/25433号において記載されるように生成されたが、ここでは、HEK293細胞がプラスミドpCEP4/Sec-30664188（実施例17および18を参照のこと）を用いてトランスフェクトされるときに得られた馴化培地中で生じるクローン30664188.0.99由来の遺伝子産物の活性なタンパク質フラグメントを用いている。このベクターは、予測されるN末端シグナルペプチドを除いて、アミノ酸配列全体を包含するクローン30664188.0.99の遺伝子産物のフラグメントを保有する。この活性フラグメントは、本明細書において30664188.0.99のp35形態、すなわち「p35」と名付けられる。
【０１０９】
この活性なフラグメントであるp35は、XenoMouse（登録商標）という動物において免疫応答を刺激する免疫原として使用された。p35に対するモノクローナル抗体は、標準的な形式で、p35で免疫されたXenoMouseという動物からハイブリドーマ技術によって調製された。
【０１１０】
いくつかの完全ヒトモノクローナル抗体クローンをこのような免疫から単離して、それが30664188 p35免疫原の増殖促進効果を中和する能力を、NIH 3T3細胞に対するBrdU取り込みアッセイ（国際特許出願第WO01/25433号に記載される）を用いて解析した。13個のクローンについての結果を表１に示す。さらなる完全ヒトモノクローナル抗体であるCURA2−1.17はまた、p35に免疫特異的に結合することが同定された。さらに、10個の他のクローンが、1000ng/mlを上回るIC50値を示した。重要なことに、この研究で特定されたモノクローナル抗体の全てが、比較のためのBrdU取り込みアッセイに対してPDGF  BBを添加した場合、1000ng/mlにおよぶ阻害活性を有さなかった。従って、特定された完全ヒトモノクローナル抗体を中和することは、p35抗原に特異的であった。
【０１１１】
BrdUアッセイにおいては、マウスNIH 3T3（ATCC No.CRL−1658、Manassas、VA）線維芽細胞を、それぞれ、10％のウシ胎仔血清または10％ウシ血清を補充されたDMEM中で培養した。線維芽細胞を、10％CO２／空気中において37℃でコンフルエンスまで増殖させた。次いで、細胞をDMEM中で24時間、飢餓させた。富化した馴化培地を18時間添加した（培養の10μL/100μL）。次いで、BrdU（10μM）を添加して、細胞とともに5時間インキュベートした。製造業者（Boehringer Mannheim、Indianapolis、IN）の仕様書に従う比色定量イムノアッセイによって、BrdU取り込みをアッセイした。
【０１１２】
図44〜47は、本発明の種々のヒト抗PDGFDモノクローナル抗体の中和を評価した実験からのBrdU取り込みアッセイの結果を示す。図44は、本発明の種々のヒト抗PDGFDモノクローナル抗体に対する曝露の際のNIH 3T3細胞におけるBrdU取り込みのレベルを比較する棒グラフ表示である。図45〜47は、種々の濃度でPDGFBBを利用するコントロール試行に比べた、種々の用量での本発明の種々のヒト抗PDGFDモノクローナル抗体に対する曝露の際のNIH 3T3細胞におけるBrdU取り込みのレベルを比較する棒グラフ表示である。
【０１１３】
【表１】
2005530684.tif 000003
【０１１４】
実施例２
サンプル中におけるPDGFD抗原の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイ（Enzyme-Linked immunosorbent Assay）（ELISA）を開発した。このアッセイでは、96ウェルマイクロタイタープレートまたは384マイクロタイタープレートのようなマイクロタイタープレートのウェルに、この抗原に対する第一の完全ヒトモノクローナル抗体CURA2−1.6（実施例1を参照のこと）を用いて数時間吸着させた。固定されたCURA21.6は、試験サンプルに存在し得る任意の抗原についての捕獲抗体として働く。このウェルを、乳タンパク質またはアルブミンのようなブロッキング剤を用いてリンスして処理して、分析物の非特異的な吸着を防いだ。
【０１１５】
引き続き、このウェルを、抗原を含有することが疑われる試験サンプル、または標準的な量の抗原を含有する溶液を用いて処理した。このようなサンプルは、例えば、病理的診断であるとみなされる、循環中の抗原のレベルを有することが疑われる対象由来の血清サンプルであってもよい。
【０１１６】
試験サンプルまたは標準をリンスして除いた後、そのウェルを、ビオチンとの結合体化によって標識している第二の完全ヒトモノクローナル抗体CURA2−1.17（実施例1を参照のこと）を用いて処置した。この標識されたCURA2−1.17は、検出抗体として働く。過剰な第二の抗体を除いた後、このウェルを、アビジン−結合体化西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）および適切な色素生産性基質を用いて処置した。試験サンプル中の抗原の濃度を、標準的なサンプルから作製された標準曲線との比較によって決定した。このような標準曲線について得られた結果を表2に示す。
【０１１７】
このELISAアッセイによって、試験サンプル中の抗原に極めて特異的でありかつ極めて鋭敏であるアッセイが得られる。
【０１１８】
【表２】
2005530684.tif 000004
【０１１９】
実施例３
癌患者の血清におけるPDGFD抗原の濃度を決定するために、種々のタイプの癌に罹患しているか、または種々の種類の腫瘍を保有すると診断されたヒト対象由来の血清を得た。詳細には、舌の癌（cancer of the tongue）に罹患している5例の患者、ホジキンリンパ腫（Hodkin's lymphoma）に罹患している5例の患者、前立腺癌（prostate cancer）に罹患している5例の患者、肺癌（lung cancer）に罹患している3例の患者、腎臓癌（renal cancer）に罹患している4例の患者、黒色腫（melanoma）に罹患している5例の患者、および骨髄腫（myeloma）に罹患している5例の患者からの血清を検査した。これらの患者の血清における抗原の濃度を、実施例2に記載されたELISA手順を用いて評価した。その結果を表3に示す。この結果によって、5例の舌癌患者のうち5例に由来するサンプルとも高レベルの抗原を含み、5例のホジキン病患者のうち２例に由来するサンプルが検出可能な量の抗原を含み（これらのうち1つは高レベルである）、3例の肺癌患者のうちの2例に由来するサンプルが検出可能なレベルの抗原を含み、前立腺癌を有する5例の患者のうちの1例に由来するサンプルが高レベルの抗原を含み、そして4例の腎臓癌患者のうちの1例に由来するサンプルが検出可能な濃度の抗原を含むということが示される。表3における結果に加えて、強皮症（scleroderma）を有する5例の患者のうち1例が低濃度の抗原を有することが見出された。
【０１２０】
本実施例における結果によって、循環中の抗原に対するイムノアッセイが特定の癌の検出において有用な診断手順であることが示される。このような癌の段階を決め、そして治療的処置に対する応答を評価する場合のアッセイの使用も、これらの結果によって示唆される。
【０１２１】
【表３】
2005530684.tif 000005
【０１２２】
実施例４
本発明の使用を通じて、実施例2および3において示されかつ記載される結果に基づいて、PDGFD抗原の発現レベルに基づいて対象の癌の段階を決めることができる。所定のタイプの癌について、疾患の進行の種々の段階である、および／または癌の治療的処置の種々のポイントであると診断された対象から、血液のサンプルを採取する。存在する抗原の量を特異的に決定する方法を用いて、血液サンプルに存在するPDGFD抗原の濃度を決定する。このような方法としては、実施例2および3に記載される方法のような、ELISA法が挙げられる。進行または治療の各々の段階について実質的に有意な結果が得られるサンプルの集団を用いて、各々の段階の特徴であるとみなすことができる抗原の濃度範囲を指定する。
【０１２３】
研究中の対象における癌の進行の段階を決めるため、または治療の経過に対する対象の応答を特徴付けるため、血液のサンプルをその対象から採取して、そのサンプルに存在するPDGFD抗原の濃度を決定する。そのようにして得た濃度を用いて、どのような範囲の濃度で値が低下するかを特定する。そのようにして特定した範囲は、診断された対象の種々の集団において特定された進行の段階または治療の段階に相関しており、それによって研究下の対象における段階を得る。
【０１２４】
実施例５
ヒト血清におけるPDGFDレベルを定量するためにサンドイッチELISAを開発した。このサンドイッチELISAで用いた2つの完全ヒトモノクローナル抗体（1.6および1.17）は、PDGFD分子上の異なるエピトープを認識した（データ示さず）。ELISAを以下のとおり実施した：50μlの捕獲抗体（モノクローナル抗体1.6）を2μg/mlの濃度で含有するコーティング緩衝液（0.1M NaHCO3、pH 9.6）をELISAプレート（Fisher）にコーティングした。4℃で一晩のインキュベーション後、このプレートを200μlのブロッキング緩衝液（0.5％ BSA、0.1％ Tween 20、0.01％ Thimerosalを含有するPBS）を用いて25℃で1時間、処理した。このプレートを0.05％ Tween 20を含有するPBS（洗浄緩衝液、WB）を用いて洗浄（3回）した。正常な血清または患者の血清（Clinomics、Bioreclaimation）を50％ ヒト血清を含有するブロッキング緩衝液中で希釈した。このプレートを血清サンプルとともに4℃で一晩インキュベートして、WBで洗浄し、次いで100μl／ウェルのビオチン化検出抗体モノクローナル抗体（mAb）1.17とともに25℃で1時間インキュベートした。洗浄後、このプレートをHRP−ストレプトアビジンとともに15分間インキュベートして、前と同様に洗浄し、次いで色の発色のために100μl／ウェルのｏ−フェニレンジアミンを含有するH２O２（Sigma発色溶液）を用いて処理した。この反応を50μl／ウェルのH２SO４（2M）を用いて停止して、492nmでELISAプレートリーダーを用いて解析した。血清サンプル中のPDGF Dの濃度を4パラメーターのカーブフィッティングプログラムを用いて、精製したPDGF Dの希釈に対する比較によって算出した。
【０１２５】
実施例６
ビオチン化した完全ヒトモノクローナル抗体6.4を用いてPDGF D免疫組織化学を実施して、ストレプトアビジン−HRPを検出のために用いた。要するに、従来の技術を用いて組織を脱パラフィン化して、トリプシン（0.15％）を用いて37℃で10分間処理した。切片を10％の正常ヤギ血清とともに10分間インキュベートした。正常なヤギ血清溶液を排出して、拭いて過剰の溶液を除去した。切片をビオチン化した抗PDGF Dモノクローナル抗体を5μg/mlで用いて、25℃で30分間インキュベートして、PBSを用いて徹底的に洗浄した。ストレプトアビジン−HRP結合体とともに10分間インキュベーションした後、ジアミノベンジジン（DAB）の溶液をこの切片上に添加して免疫反応性を可視化した。アイソタイプコントロールのために、切片を、ビオチン化したPDGF Dモノクローナル抗体（mAb）の代わりに、5μg/mlのビオチン化したアイソタイプ適合した陰性コントロールのモノクローナル抗体（mAb）とともに、25℃で30分間、インキュベートした。
【０１２６】
実施例７
以下の考察において、本発明に従って調製された抗体に関連する構造的情報が提供される。
【０１２７】
本発明に従って生成された抗体の構造を解析するため、本発明者らは、特定のハイブリドーマのなかから重鎖および軽鎖フラグメントをコードする遺伝子をクローニングした。遺伝子クローニングおよび配列決定は以下のように行なった：
【０１２８】
Fast−Tractキット（Invitrogen）を用いて、免疫されたXenoMouseマウスに由来する約２×１０5個のハイブリドーマ細胞から、ポリ（A）＋mRNAを単離した。ランダムプライミングされたcDNAの生成の後にPCRを行なった。ヒトVHまたはヒトVκファミリー特異的な可変領域プライマー（Marksら、1991）またはユニバーサルなヒトVHプライマーである（CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG）（配列番号51）を、以下のヒトに特異的なプライマーと組み合わせて用いた：
Cγ2定常領域（MG-40d；5'-GCT GAG GGA GTA GAG TCC TGA GGA-3'（配列番号52））；
Cγ1定常領域（HG1；5' CAC ACC GCG GTC ACA TGG C（配列番号53））；または
Cγ3定常領域（HG3；5' CTA CTC TAG GGC ACC TGT CC（配列番号54））、またはヒトCκ定常領域（ｈκP2；Greenら、1994において以前に記載された）。ハイブリドーマからのヒトモノクローナル抗体（Mab）由来重鎖およびκ鎖転写物の配列を、上記のプライマーを用いてポリ（A＋）RNAから生成したPCR産物の直接配列決定によって得た。PCR産物をまた、ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてpCRII中にクローニングして、両方の鎖をPrismダイ・ターミネーター（dye-terminator）配列決定キットおよびABI配列決定装置を用いて配列決定した。MacVectorおよびGeneworksソフトウェアプログラムを用いて、「V BASE配列ディレクトリ（V BASE sequence directory）」（Tomlinsonら、MRC Centre for Protein Engineering、Cambridge、UK）」に対する整列によって、全ての配列を解析した。
【０１２９】
図3は、本発明のCur2−1.6と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図3Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図3Bは、図3Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図3Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図3Dは、図3Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３０】
図４は、本発明のCur2−1.11と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図4Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図4Bは、図4Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図4Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図4Dは、図4Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３１】
図5は、本発明のCur2−1.17と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図5Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図5Bは、図5Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図5Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図5Dは、図5Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３２】
図6は、本発明のCur2−1.18と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図6Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図6Bは、図6Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図6Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図6Dは、図6Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３３】
図7は、本発明のCur2−1.19と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図7Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図7Bは、図7Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図7Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図7Dは、図7Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３４】
図8は、本発明のCur2−1.23と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図8Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図8Bは、図8Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図8Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図8Dは、図8Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３５】
図9は、本発明のCur2−1.24と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図9Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図9Bは、図9Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図9Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図9Dは、図9Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３６】
図10は、本発明のCur2−1.２５と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図10Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図10Bは、図10Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図10Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図10Dは、図10Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３７】
図11は、本発明のCur2−1.29と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図11Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図11Bは、図11Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図11Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図11Dは、図11Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３８】
図12は、本発明のCur2−1.33と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図12Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図12Bは、図12Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図12Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図12Dは、図12Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１３９】
図13は、本発明のCur2−1.38と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図13Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図13Bは、図13Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図13Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図13Dは、図13Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１４０】
図14は、本発明のCur2−1.39と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図14Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図14Bは、図14Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図14Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図14Dは、図14Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１４１】
図15は、本発明のCur2−1.40と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図15Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図15Bは、図15Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示している。
【０１４２】
図16は、本発明のCur2−1.45と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図16Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図16Bは、図16Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図16Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図16Dは、図16Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１４３】
図17は、本発明のCur2−1.46と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図17Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図17Bは、図17Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図17Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図17Dは、図17Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１４４】
図18は、本発明のCur2−1.48と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図18Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図18Bは、図18Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図18Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図18Dは、図18Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１４５】
図19は、本発明のCur2−1.49と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図19Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図19Bは、図19Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図19Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図19Dは、図19Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１４６】
図20は、本発明のCur2−1.51と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図20Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図20Bは、図20Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図20Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図20Dは、図20Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１４７】
図21は、本発明のCur2−6.4と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図21Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図21Bは、図21Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図21Cは、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図21Dは、図21Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【０１４８】
図22は、本発明の抗体のVDJ遺伝子利用を示す表であって、この表は、この抗体と、この抗体のFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4領域においてそれらが由来するV遺伝子、D遺伝子またはJ遺伝子との間のヌクレオチド変化／アミノ酸変化を示している。
【０１４９】
図22Aにおいて観察されるとおり、以下の抗体は、以下のV重鎖遺伝子利用を有する：
VH 1-8：1.19.1, 6.4.1, 1.18, 1.40.1, 1.45, 1.46.1, 1.49.1
VH 1-18：1.33, 1.48.1
VH 3-21：1.6.1
VH 3-33：1.17.1, 1.24.1, 1.38.1
VH 3-53：1.11.1
VH 5-51：1.23.1, 1.25.1, 1.29, 1.39.1, 1.51.1
【０１５０】
図22Bにおいて観察されるとおり、以下の抗体は、以下のV軽鎖遺伝子利用を有する：
VL L5：1.48
VL A19：1.49, 1.11, 1.29
VL A20：1.45, 1.33, 1.38
VL A27：6.4.1, 1.51
VL A30：1.19, 1.18, 1.6, 1.23, 1.25, 1.29, 1.39, 1.17, 1.24, 1.46
【０１５１】
便利なように、前述のVHおよびVK遺伝子のタンパク質配列の配列を以下に示す：
VH 1-8：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARG （配列番号1）
VH 1-18：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR （配列番号2）
VH 3-21：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR （配列番号3）
VH 3-33：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR （配列番号4）
VH 3-53：
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSSNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR （配列番号5）
VH 5-51：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR （配列番号6）
VK L5：
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP （配列番号7）
VK A19：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP （配列番号8）
VK A20：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAP （配列番号9）
VK A27：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP （配列番号10）
VK A30：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYP （配列番号11）
【０１５２】
図23は、本発明のCur2−1.6と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図23Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図23Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１５３】
図24は、本発明のCur2−1.11と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図24Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図24Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１５４】
図25は、本発明のCur2−1.17と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図25Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図25Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１５５】
図26は、本発明のCur2−1.18と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図26Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図26Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１５６】
図27は、本発明のCur2−1.19と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図27Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図27Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１５７】
図28は、本発明のCur2−1.23と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図28Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図28Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１５８】
図29は、本発明のCur2−1.24と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図29Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図29Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１５９】
図30は、本発明のCur2−1.25と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図30Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図30Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６０】
図31は、本発明のCur2−1.29と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図31Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図31Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６１】
図32は、本発明のCur2−1.33と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図32Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図32Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６２】
図33は、本発明のCur2−1.38と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図33Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図33Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６３】
図34は、本発明のCur2−1.39と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図34Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図34Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６４】
図35は、本発明のCur2−1.45と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図35Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図35Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６５】
図36は、本発明のCur2−1.46と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図36Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図36Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６６】
図37は、本発明のCur2−1.48と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図37Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図37Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６７】
図38は、本発明のCur2−1.49と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図38Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図38Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６８】
図39は、本発明のCur2−1.51と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図39Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図39Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１６９】
図40は、本発明のCur2−6.4と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントであって、ここで図40Aは、この重鎖アミノ酸配列アラインメントのアラインメントを提示しており、図40Bは、この軽鎖アミノ酸配列のアラインメントを提示している。
【０１７０】
図41は、本発明の1.19.1および6.4.1の抗体のVDJ遺伝子利用を示す表であって、この表は、この抗体とそれらが由来するVH、DHおよびJHならびにVKおよびJKの遺伝子との間のヌクレオチド変化を示している。
【０１７１】
図42は、本発明の1.6.1，1.11.1および1.23.1の抗体のVDJ遺伝子利用を示す表であって、この表は、この抗体とそれらが由来するVH、DHおよびJHならびにVKおよびJKの遺伝子との間のヌクレオチド変化を示している。
【０１７２】
図43は、本発明の1.19.1、6.4.1、1.6.1、1.11.1、1.23.1、1.17.1、1.18、1.24.1、1.25.1、1.29、1.33、1.38.1、1.39.1、1.40.1、1.45.1、1.46.1、1.46.2、1.48.1、1.49.1および1.51.1の抗体のVDJ遺伝子利用を示す表であって、この表は、この抗体とそれらが由来するVH、DHおよびJHならびにVKおよびJKの遺伝子との間のヌクレオチド変化を示している。
【０１７３】
図48は、本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、抗体のCDRの位置を示している。
【０１７４】
図49は、本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、抗体のCDRの位置を示している。
【０１７５】
図50は、VH1−8遺伝子由来の重鎖を保有する本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。
【０１７６】
図51は、VH1−18遺伝子由来の重鎖を保有する本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。
【０１７７】
図52は、VH3−33遺伝子由来の重鎖を保有する本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。
【０１７８】
図53は、VH5−51遺伝子由来の重鎖を保有する本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。
【０１７９】
図54は、VK A19遺伝子由来の軽鎖を保有する本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。
【０１８０】
図55は、VK A20遺伝子由来の軽鎖を保有する本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。
【０１８１】
図56は、VK A27遺伝子由来の軽鎖を保有する本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。
【０１８２】
図57は、VK A30遺伝子由来の軽鎖を保有する本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。
【０１８３】
図48〜57の各々において、CDRドメインは、Kａbａtの番号付けシステムに従って決定した。KabatのSequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health、Bethesda、Md.（1987および1991））を参照のこと。
【０１８４】
実施例８
以下の考察において、本発明に従って調製された抗体が結合する関連のエピトープに関連する構造的情報が提供される。
【０１８５】
本発明による特定の抗体は、それらが結合する関連のエピトープに従って「ビンニングされる（binned）」。このようなビンニング（binning）を実施するために、本発明者らは、結合特徴に基づく抗体特徴づけ（Antibody Categorization Based On Binding Characteristics）と題された2001年12月3日出願の米国特許出願第60/337,245号に記載のプロトコールに従った。以下の表に示されるとおり、本発明者らは、PDGFD抗原上で少なくとも3つの別個のエピトープに結合する抗体を検出した。結果は、2つの異なる実験について示されるが、この実験では、前述の特許出願で記載されたビンニング手順、およびBiaCoreアフィニティー交差競合研究を用いた競合研究に由来する結果を利用している。
【０１８６】
【表４】
2005530684.tif 000006
【０１８７】
均等物
前述の詳細な説明および実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳述しており、そして本発明者らによって意図される最良の形態を記載している。しかし、前述の内容がどんなに詳細に本文中に存在しようとも、本発明は多くの方法で実施することが可能であり、そして本発明は、添付の特許請求の範囲およびその任意の等価物に従って解釈されるべきであることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図1は、ヒトPDGFD遺伝子（配列番号50）のヌクレオチド配列の提示である。
【図２】図2は、ヒトPDGF D遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号50）および推定アミノ酸配列（配列番号12）の提示である。
【図３】図3は、本発明のCur2−1.6と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図3Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号55）を提示しており、図3B（配列番号13）は、図3Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図3C（配列番号56）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図3D（配列番号14）は、図3Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図４】図4は、本発明のCur2−1.11と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図4Aは、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号57）を提示しており、図4B（配列番号15）は、図4Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図4C（配列番号58）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図4D（配列番号16）は、図4Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図５】図5は、本発明のCur2−1.17と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図5A（配列番号59）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図5B（配列番号17）は、図5Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図5C（配列番号60）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図5D（配列番号18）は、図5Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図６】図6は、本発明のCur2−1.18と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図6A（配列番号61）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図6B（配列番号19）は、図6Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図6C（配列番号62）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図6D（配列番号20）は、図6Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図７】図7は、本発明のCur2−1.19と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図7A（配列番号63）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図7B（配列番号21）は、図7Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図7C（配列番号64）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図7D（配列番号22）は、図7Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図８】図8は、本発明のCur2−1.23と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図8A（配列番号65）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図8B（配列番号23）は、図8Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図8C（配列番号66）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図8D（配列番号24）は、図8Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図９】図9は、本発明のCur2−1.24と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図9A（配列番号67）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図9B（配列番号25）は、図9Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図9C（配列番号68）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図9D（配列番号26）は、図9Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１０】図10は、本発明のCur2−1.２５と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図10A（配列番号69）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図10B（配列番号27）は、図10Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図10C（配列番号70）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図10D（配列番号28）は、図10Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１１】図11は、本発明のCur2−1.29と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図11A（配列番号71）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図11B（配列番号29）は、図11Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図11C（配列番号72）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図11D（配列番号30）は、図11Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１２】図12は、本発明のCur2−1.33と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図12A（配列番号73）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図12B（配列番号31）は、図12Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図12C（配列番号74）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図12D（配列番号32）は、図12Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１３】図13は、本発明のCur2−1.38と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図13A（配列番号75）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図13B（配列番号33）は、図13Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図13C（配列番号76）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図13D（配列番号34）は、図13Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１４】図14は、本発明のCur2−1.39と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図14A（配列番号77）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図14B（配列番号35）は、図14Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図14C（配列番号78）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図14D（配列番号36）は、図14Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１５】図15は、本発明のCur2−1.40と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図15A（配列番号79）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図15B（配列番号37）は、図15Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示している。
【図１６】図16は、本発明のCur2−1.45と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図16A（配列番号80）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図16B（配列番号38）は、図16Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図16C（配列番号81）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図16D（配列番号39）は、図16Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１７】図17は、本発明のCur2−1.46と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図17A（配列番号82）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図17B（配列番号40）は、図17Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図17C（配列番号83）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図17D（配列番号41）は、図17Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１８】図18は、本発明のCur2−1.48と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図18A（配列番号84）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図18B（配列番号42）は、図18Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図18C（配列番号85）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図18D（配列番号43）は、図18Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図１９】図19は、本発明のCur2−1.49と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図19A（配列番号86）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図19B（配列番号44）は、図19Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図19C（配列番号87）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図19D（配列番号45）は、図19Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図２０】図20は、本発明のCur2−1.51と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図20A（配列番号88）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図20B（配列番号46）は、図20Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図20C（配列番号89）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図20D（配列番号47）は、図20Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図２１】図21は、本発明のCur2−6.4と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一連の提示であって、ここで図21A（配列番号90）は、重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、図21B（配列番号48）は、図21Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を提示しており、図21C（配列番号91）は、軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を提示しており、そして図21D（配列番号49）は、図21Cに示されるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を提示している。
【図２２】図22は、本発明の抗体のVDJ遺伝子利用を示す表であって、この表は、この抗体と、この抗体のFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4領域においてそれらが由来するV遺伝子、D遺伝子またはJ遺伝子との間のヌクレオチド変化／アミノ酸変化を示している。
【図２３】図23は、本発明のCur2−1.6と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図23Aは、重鎖アミノ酸配列CUR2.1.6.1HC（配列番号270）およびVH2−21（配列番号271）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号272）。図23Bは、軽鎖アミノ酸配列Cur2.1.6.1LC（配列番号273）およびA30（配列番号274）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号275）。
【図２４】図24は、本発明のCur2−1.11と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図24Aは、重鎖アミノ酸配列Cur2.1.11.1.1HC（配列番号276）およびVH3−53（配列番号277）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号278）。図24Bは、軽鎖アミノ酸配列CUR2.1.11.1LC（配列番号279）およびA19（配列番号280）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号281）。
【図２５】図25は、本発明のCur2−1.17.1と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図25Aは、重鎖アミノ酸配列CR2.1.17.1HC（配列番号282）およびVH3−53（配列番号283）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号284）。図25Bは、軽鎖アミノ酸配列CR2.1.17.1LC（配列番号285）およびA30（配列番号286）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号287）。
【図２６】図26は、本発明のCur2−1.18と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図26Aは、重鎖アミノ酸配列CR2-1.18HC（配列番号288）およびVH1−8（配列番号289）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号290）。図26Bは、軽鎖アミノ酸配列CR2-1.18LC（配列番号291）およびA30（配列番号292）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号293）。
【図２７】図27は、本発明のCur2−1.19と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図27Aは、重鎖アミノ酸配列CUR2.1.19.1HC（配列番号294）およびVH1−8（配列番号295）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号296）。図27Bは、軽鎖アミノ酸配列CUR2.1.19.1LC（配列番号297）およびA30（配列番号298）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号299）。
【図２８】図28は、本発明のCur2−1.23と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図28Aは、重鎖アミノ酸配列CUR2.1.23.1HC（配列番号300）およびVH5−51（配列番号301）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号302）。図28Bは、軽鎖アミノ酸配列CUR2.1.23.1LC（配列番号303）およびA30（配列番号304）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号305）。
【図２９】図29は、本発明のCur2−1.24と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図29Aは、重鎖アミノ酸配列CUR2.1.24.1HC（配列番号306）およびVH3−53（配列番号307）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号308）。図29Bは、軽鎖アミノ酸配列CUR2.1.24.1LC（配列番号309）およびA30（配列番号310）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号311）。
【図３０】図30は、本発明のCur2−1.25と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図30Aは、重鎖アミノ酸配列VH5−51（配列番号312）およびCUR2.1.25.1HC（配列番号313）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号314）。図30Bは、軽鎖アミノ酸配列A30（配列番号315）およびCUR2.1.25.1LC（配列番号316）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号317）。
【図３１】図31は、本発明のCur2−1.29と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図31Aは、重鎖アミノ酸配列VH5−51（配列番号318）およびCUR2.1.29HC（配列番号319）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号320）。図31Bは、軽鎖アミノ酸配列A19（配列番号321）およびCUR2.1.25.1LC（配列番号322）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号323）。
【図３２】図32は、本発明のCur2−1.33と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図32Aは、重鎖アミノ酸配列VH1−18（配列番号324）およびCR2.1.33HC（配列番号325）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号326）。図32Bは、軽鎖アミノ酸配列A20（配列番号327）およびCR2.1.33LC（配列番号328）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号329）。
【図３３】図33は、本発明のCur2−1.38と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図33Aは、重鎖アミノ酸配列VH3−33（配列番号330）およびCUR2.1.38.1HC（配列番号331）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号332）。図33Bは、軽鎖アミノ酸配列A20（配列番号334）およびCUR2.1.38.1LC（配列番号335）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号336）。
【図３４】図34は、本発明のCur2−1.39と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図34Aは、重鎖アミノ酸配列VH5−51（配列番号336）およびCUR2.1.39.1HC（配列番号337）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号338）。図34Bは、軽鎖アミノ酸配列A30（配列番号339）およびCur2.1.25.1LC（配列番号340）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号341）。
【図３５】図35は、本発明のCur2−1.45と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図35Aは、重鎖アミノ酸配列VH1−8（配列番号342）およびCR2.1.45.1HC（配列番号343）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号344）。図35Bは、軽鎖アミノ酸配列A20（配列番号345）およびCUR2.1.45.1LC（配列番号346）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号347）。
【図３６】図36は、本発明のCur2−1.46と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図36Aは、重鎖アミノ酸配列VH1−18（配列番号348）およびCR2.1.46.1HC（配列番号349）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号350）。図36Bは、軽鎖アミノ酸配列A30（配列番号351）およびCR2.1.46.1LC（配列番号352）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号353）。
【図３７】図37は、本発明のCur2−1.48と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図37Aは、重鎖アミノ酸配列CR2.1.4.8.1HC（配列番号354）およびVH1−8（配列番号355）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号356）。図37Bは、軽鎖アミノ酸配列CR2.1.48.1（配列番号357）およびL５（配列番号358）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号359）。
【図３８】図38は、本発明のCur2−1.49と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図38Aは、重鎖アミノ酸配列CR2.1.49.1HC（配列番号360）およびVH1−18（配列番号361）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号362）。図38Bは、軽鎖アミノ酸配列CUR2.1.49.1LC（配列番号363）およびA19（配列番号364）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号365）。
【図３９】図39は、本発明のCur2−1.51と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図39Aは、重鎖アミノ酸配列CR2.1.51.1HC（配列番号366）およびVH5−51（配列番号367）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号368）。図39Bは、軽鎖アミノ酸配列CR2.1.51.1LC（配列番号369）およびA27（配列番号370）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号371）。
【図４０】図40は、本発明のCur2−6.4と命名されたハイブリドーマ細胞株によって発現されたヒト抗PDGFD抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列、ならびにそれが由来するV遺伝子のアミノ酸配列の一連のアラインメントである。図40Aは、重鎖アミノ酸配列CUR2.6.4.1HC（配列番号372）およびVH1−8（配列番号373）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサスは下に示す（配列番号374）。図40Bは、軽鎖アミノ酸配列CUR2.6.4.1LC（配列番号375）およびA27（配列番号376）のアラインメントを提示しており、そのコンセンサス配列は下に示す（配列番号377）。
【図４１】図41は、本発明の1.19.1および6.4.1の抗体のVDJ遺伝子利用を示す表であって、この表は、この抗体とそれらが由来するVH、DHおよびJHならびにVKおよびJKの遺伝子との間のヌクレオチド変化を示している。
【図４２】図42は、本発明の1.6.1、1.11.1および1.23.1の抗体のVDJ遺伝子利用を示す表であって、この表は、この抗体とそれらが由来するVH、DHおよびJHならびにVKおよびJKの遺伝子との間のヌクレオチド変化を示している。
【図４３】図４３は、本発明の1.19.1、6.4.1、1.6.1、1.11.1、1.23.1、1.17.1、1.18、1.24.1、1.25.1、1.29、1.33、1.38.1、1.39.1、1.40.1、1.45.1、1.46.1、1.46.2、1.48.1、1.49.1および1.51.1の抗体のVDJ遺伝子利用を示す表であって、この表は、この抗体とそれらが由来するVH、DHおよびJHならびにVKおよびJKの遺伝子との間のヌクレオチド変化を示している。
【図４４】図44は、本発明の種々のヒト抗PDGFDモノクローナル抗体に対する曝露の際のNIH  3T3細胞におけるBrdU取り込みのレベルを比較する棒グラフ表示である。
【図４５】図45は、種々の濃度でPDGFBBを利用するコントロール試行に比べた場合の、種々の用量での、本発明の種々のヒト抗PDGFDモノクローナル抗体に対する曝露の際のNIH  3T3細胞におけるBrdU取り込みのレベルを比較する棒グラフ表示である。
【図４６】図46は、種々の濃度でPDGFBBを利用するコントロール試行に比べた場合の、種々の用量での、本発明の種々のヒト抗PDGFDモノクローナル抗体に対する曝露の際のNIH  3T3細胞におけるBrdU取り込みのレベルを比較する棒グラフ表示である。
【図４７】図47は、種々の濃度でPDGFBBを利用するコントロール試行に比べた場合の、種々の用量での、本発明の種々のヒト抗PDGFDモノクローナル抗体に対する曝露の際のNIH  3T3細胞におけるBrdU取り込みのレベルを比較する棒グラフ表示である。
【図４８】図48は、本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、抗体のCDRの位置を示している。示される重鎖配列は以下である：1.19H（配列番号199）；6.4H（配列番号200）；1.18H（配列番号201）；1.40H（配列番号202）；１４５H（配列番号203）；1.46H（配列番号204）；1.49H（配列番号205）；1.33H（配列番号206）；1.48H（配列番号207）；1.6H（配列番号208）；1.17H（配列番号209）；1.24H（配列番号210）；1.38H（配列番号211）；1.11H（配列番号212）；1.23H（配列番号213）；1.25H（配列番号214）；1.29H（配列番号215）；1.39H（配列番号216）；および1.51H（配列番号217）。
【図４９】図49は、本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、抗体のCDRの位置を示している。示される軽鎖配列は以下である：1.48L（配列番号218）；1.49L（配列番号219）；1.11L（配列番号220）；1.29L（配列番号221）；1.45L（配列番号222）；1.33L（配列番号223）；1.38L（配列番号224）；6.4L（配列番号225）；1.51L（配列番号226）；1.19L（配列番号227）；1.18L（配列番号228）；1.1６L（配列番号229）；1.23L（配列番号230）；1.25L（配列番号231）；1.39L（配列番号232）；1.17L（配列番号233）；1.24L（配列番号234）；および1.46L（配列番号235）。
【図５０】図50は、VH1−8遺伝子由来の重鎖を保有する本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。示される重鎖配列は以下である：1.19H（配列番号236）；6.4H（配列番号237）；1.18H（配列番号238）；1.40H（配列番号239）；1.45H（配列番号240）；1.46H（配列番号241）；および1.49H（配列番号242）。
【図５１】図51は、VH1−18遺伝子由来の重鎖を保有する本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。示される重鎖配列は以下である：1.33H（配列番号243）および1.48H（配列番号244）。
【図５２】図52は、VH3−33遺伝子由来の重鎖を保有する本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。示される重鎖配列は以下である：1.17H（配列番号245）；1.24H（配列番号246）；および1.38H（配列番号247）。
【図５３】図53は、VH5−51遺伝子由来の重鎖を保有する本発明の抗体の重鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。示される重鎖配列は以下である：1.23H（配列番号248）；1.25H（配列番号249）；1.29H（配列番号250）；1.39H（配列番号251）；および1.51H（配列番号252）。
【図５４】図54は、VK A19遺伝子由来の軽鎖を保有する本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。示される軽鎖配列は以下である：1.49L（配列番号253）；1.11L（配列番号254）；および1.29L（配列番号255）。
【図５５】図55は、VK A20遺伝子由来の軽鎖を保有する本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。示される重鎖配列は以下である：1.45L（配列番号256）；1.33L（配列番号257）；および1.38L（配列番号258）.
【図５６】図56は、VK A27遺伝子由来の軽鎖を保有する本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。示される軽鎖配列は以下である：6.4L（配列番号259）および1.51L（配列番号260）。
【図５７】図57は、VK A30遺伝子由来の軽鎖を保有する本発明の抗体の軽鎖アミノ酸配列の間のClustalW配列アラインメントの提示であって、ここにはCDRを示している。示される軽鎖配列は以下である：1.19L（配列番号261）；1.18L（配列番号262）；1.16L（配列番号263）；1.23L（配列番号264）；1.25L（配列番号265）；1.39L（配列番号266）；1.17L（配列番号267）；1.24L（配列番号268）；および1.46L（配列番号269）。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４３Ｆ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
2005530684.tif 000192
【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０】
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【図５１】
2005530684.tif 000199
【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月7日(2004.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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