(57)【要約】本発明は、新規ヒトプロトンゲート調節イオンチャンネル（hASIC1B）およびhASIC1Bを同定しかつコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、hASIC1Bをコードする核酸配列を含んでなる遺伝子操作した発現ベクターおよび宿主細胞ならびにhASIC1Bを産生する方法も提供する。本発明はまた、hASIC1Bの発現に関連する疾患の予防および治療における、hASIC1B、およびアゴニスト、hASIC1Bと特異的に結合する抗体またはアンタゴニストの利用も提供する。さらに、本発明は、hASIC1Bの発現に関連する疾患を治療するための、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子の利用を提供する。本発明はまた、hASIC1Bと特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその断片もしくは補体、および抗体を利用する診断アッセイも提供する。
2005505264.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製されかつ単離されたヒトプロトンゲート調節イオンチャンネルタンパク質（hASIC1B）であって、次の群から選択される上記タンパク質：配列番号２に規定したアミノ酸配列と少なくとも80％同一性を有するhASIC1B、配列番号２に規定したアミノ酸配列と少なくとも85％同一性を有するhASIC1B、配列番号２に規定したアミノ酸配列と少なくとも90％同一性を有するhASIC1B、配列番号２に規定したアミノ酸配列と少なくとも95％同一性を有するhASIC1B、配列番号２に規定したアミノ酸配列と少なくとも98％同一性を有するhASIC1B、および配列番号２に規定したアミノ酸配列と少なくとも99％同一性を有するhASIC1B。
【請求項２】
プロトンの活性化（酸、低pH溶液）を特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号２に規定したアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号１とハイブリダイズすることができる、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
配列番号１に規定した配列を有する、請求項４に記載の核酸。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸を含んでなる、組換えベクター。
【請求項８】
発現ベクターである、請求項７に記載の組換えベクター。
【請求項９】
請求項７または８に記載の組換えベクターを含んでなる宿主。
【請求項１０】
請求項８に記載の組換えベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１１】
ヒトプロトンゲート調節イオンチャンネルタンパク質（hASIC1B）を生産する方法であって、請求項１０に記載の宿主細胞を上記タンパク質の産生に対して十分な条件のもとで培養し、培養物から上記タンパク質を回収する上記方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質を産生する細胞を生産する方法。
【請求項１３】
さらに宿主細胞を請求項８の組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることを含んでなる、請求項１２に記載の方法
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のhASIC1Bタンパク質に対して免疫特異的な抗体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のhASIC1Bタンパク質の活性または発現の増強を必要とする被験者の治療方法であって、
(a)被験者に治療上有効な量の、上記hASIC1Bタンパク質に対するアゴニストを投与すること；または
(b)被験者に請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸を、上記hASIC1Bタンパク質活性の有効なin vivo産生を生じる形態で与えることを含んでなる上記方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のhASIC1Bタンパク質の活性および発現を阻害する必要のある被験者を治療する方法であって、
(a)被験者に治療上有効な量の、上記hASIC1Bタンパク質に対するアンタゴニストを投与するか；または
(b)被験者に上記hASIC1Bタンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を阻害する核酸分子を投与するか；または
(c)被験者に治療上有効な量の、そのリガンドに対して上記hASIC1Bタンパク質と競合するタンパク質を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のhASIC1Bタンパク質の発現または活性に関係する被験者の疾患または疾患に対する感受性を診断する方法であって、
(a)上記被験者のゲノム中の上記hASIC1Bタンパク質をコードするヌクレオチド配列における突然変異の存在または不在を決定するステップ；または
(b)上記被験者から誘導されたサンプル中のhASIC1Bタンパク質発現の存在または量を分析するステップを含んでなる上記方法。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか1項に記載のhASIC1Bタンパク質に対するアゴニストを同定する方法であって、
(a)請求項１１に記載の方法により培養した細胞を候補化合物と接触させるステップ；および
(b)候補化合物が生物学的活性またはhASIC1B受容体により伝達されるシグナルを誘導またはモジュレートするかどうかを決定するステップ；または
(c)候補化合物が内向き電流を誘導するかまたはhASIC1B受容体により伝達されるプロトン誘導内向き電流をモジュレートするかどうかを決定することを含んでなる上記方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法により同定したアゴニスト。
【請求項２１】
請求項２０に記載のアゴニストであって、抗うつ薬、除感作薬、抗精神病薬、鎮痛薬、化学療法薬もしくは抗悪性腫瘍薬、抗精神病薬、精神療法薬、呼吸および脳刺激薬、認知刺激薬、記憶刺激薬、神経再生促進薬、細胞成長もしくは増殖刺激薬、殺虫剤、農薬もしくは駆虫剤、またはそれらのいずれかの組合わせであるか、またはそれらに対するアジュバントである上記アゴニスト。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のhASIC1Bタンパク質に対するアンタゴニストを同定する方法であって、
(a)請求項１１の方法により培養した細胞を、低pH溶液（pH＜7.4）または請求項２０に記載のアゴニストを含むいずれかの他のアゴニストと接触させるステップ；および
(b)プロトンまたは上記アゴニストにより作製されたシグナルが候補化合物の存在のもとでモジュレートされるか、減少するかまたは無効化するかどうかを決定することを含んでなる上記方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法により同定したアンタゴニスト。
【請求項２４】
請求項２３に記載のアンタゴニストであって、鎮痛薬、解熱薬、鎮痒薬、抗不安薬、鎮静薬または睡眠薬、精神療法薬、抗痙攣薬、神経保護薬、全身麻酔薬、局所麻酔薬、降圧薬、筋弛緩薬、止瀉薬、制酸薬、またはそれらのいずれかの組合わせであるか、またはそれらに対するアジュバントである上記アンタゴニスト
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
哺乳類動物においては、間質液および血液を含む細胞外区画のpHが厳密に7.4の一定値に調節されかつ維持される。酸感知（acic sensing）は、例えば、痙攣、外傷、炎症または低酸素血症の症状で起こる侵害受容pH不均衡の検出に重要な役割を果たす化学受容（chemoreception）の具体的な一種である（Lindahl, Adv Neurol 1974; 4: 45）。哺乳類動物において、背根神経節（dorsal root ganglia）および三叉神経節（trigeminal ganglia）の小径一次感覚ニューロンの集団は、細胞外プロトン濃度の増加により活性化される特殊なpH感受性表面受容体を発現する（Bevan and Yeats, J Physiol (Lond) 1991; 433: 145）。感覚ならびに中枢神経の酸感受性は、構造的に線虫シーエレガンス（C. elegans）デゲネリン（degenerins）（DEG）および哺乳類上皮ナトリウムチャンネル（ENaC）に関係するプロトンゲート調節（proton-gated）陽イオンチャンネルのファミリーに仲介される。本発明はこれらの酸感知イオンチャンネル（Acid Sensing Ion Channel）（ASIC）に関するものであって、具体的には、このクラスの受容体-チャンネルの新規メンバーの発見、それと他のチャンネルサブユニットとの関連およびそれらの用途を報じる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組織アシドーシスは、複数の、痛みを伴う生理学的（例えば、痙攣）および病理学的（例えば、炎症、間欠性跛行、心筋梗塞）症状と関連する。実験的に、類似の痛みを伴う事象を、皮膚または筋肉中への低pH溶液の輸液により再現することができる。さらに、長期にわたる低pH溶液の皮膚内輸液により、特徴的な慢性痛みの痛覚過敏を模擬することができる。
【０００３】
さらにプロトンの効果およびその痛みとの関係を特徴づけるために、低pH溶液を、パッチクランプした中枢および末梢感覚ニューロンに適用した。pHを酸性値まで低下させると内向き電流（inward current）が誘導され、プロトン活性化イオンチャンネルの存在に確証を与えた。ラットおよびヒト三叉および背根神経節から得た感覚ニューロンにおける数タイプの自然電流：すなわち、急速に失活する電流；非失活電流；および急速に失活する電流の後に非失活電流を示す二相電流を観察した。
【０００４】
イオン選択性に関する他の相違点も報じられた。これらの結果は、複数のプロトンゲート調節イオンチャンネルの存在を示唆した。組織酸性化が誘導する長期にわたる痛みは、ほとんどの場合、非失活プロトンゲート調節イオンチャンネルに関連しているようである。
【０００５】
クローニングされたプロトンゲート調節イオンチャンネル
哺乳類動物プロトンゲート調節（proton-gated）陽イオンチャンネルは最近クローニングされ、酸感知イオンチャンネル（Acid Sensing Ion Channels）としてASICと名付けられている。配列解析は、これらがイオンチャンネルのDEG/ENaCスーパーファミリーのメンバーであると同定した。ASIC受容体の推定膜位相幾何学（putative membmrane topology）は、上皮ナトリウムチャンネルに示されたように、細胞内区画にＮおよびＣ両末端をもつ２つの膜貫通ドメインを予想する。４種のASIC受容体サブクラスが同定されている：
１．ASIC1イオンチャンネルは急速に失活する内向き電流を示し（Waldmannら, Nature 1997; 386: 173）、
２．ASIC2イオンチャンネルは徐々に失活する内向き電流を示し（Brassilanaら, J Biol Chem 1997; 272: 28819）、
３．ASIC3イオンチャンネルは、最初に急速に失活する成分と次いで持続した非失活性内向き電流からなる二相内向き電流を示し（Waldmannら, J Biol Chem 1997; 272: 20975；Babinskiら, J Neurochem 1999; 72: 51）、そして
４．ASIC4イオンチャンネルは特徴的なASIC様配列モチーフを含有するが、ホモ多量体結合（homomultimeric association）はプロトンにより活性化されないと思われる。
【０００６】
mRNAの選択的スプライシングにより作製したASIC受容体のファミリー
これらのイオンチャンネルに共通する特性は、選択的スプライス変異体が存在して重要な機能差を発現することにある。実際、ASIC1の最初の185個のアミノ酸（以後ASIC1Aと呼ぶ）を異なる新しい172個のアミノ酸の配列により置換えると、ASIC1Aと類似の電流動力学を有するが、活性化にはさらに低いpH値を必要とする新しいチャンネル、ASIC1Bを生成する（ASIC1AおよびASIC1Bに対するpH50はそれぞれ6.2および4.5である）。ASIC1Bはまた、ラット背根神経節にも特異的に発現すると思われる。類似の状況はまた、ラットASIC2（以後ASIC2Aと呼ぶ）についても観察され、最初の185個のアミノ酸を異なる新しい236個のアミノ酸の配列により置換えると、他のASICイオンチャンネルサブユニット、ASIC2Bを生成する。ASIC2Bは哺乳類細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞にホモ多量体として単独で発現すると、低pH溶液により活性化されないと思われる。しかし、ASIC2Bが他のASICサブユニット（例えば、ASIC2A、ASIC3）とともに同時発現すると、新規のイオン選択性またはpH50値などの異なる特性をもつヘテロ多量体イオンチャンネルを生じる（Linguegliaら, J Biol Chem 1997: 272: 29778）。ヒトにおいて同定されているASIC3も様々な形態で存在すると思われる。実際、DRASICはラットで同定されたASIC3様チャンネルであって、ヒトASIC3配列と85％同一性を表示しかつ類似の二相電流動力学を有する。しかし、組織分布、イオン選択性およびpH50に重要な相違があって、DRASICはASIC3のヒトのオルソログ（othologue）ではなくむしろ異なるサブタイプでありうることを示唆する。さらに、２種のヒトASIC3の3'スプライス変異体（最近GenBankに受託された、ASIC3Bおよび3C）の存在が報じられているが、機能の差はまだ立証されていない。従って選択的スプライシングはASIC受容体の多様性を増す重要な機構らしく、それは間違いなく神経伝達、痛覚または機械感覚などの神経系において重要な役割を果たすと考えられる（以下参照）。存在するスプライス変異体間には大きな相違があるので、新しいスプライス変異体の実際の機能的特徴は予測できず、いずれの既知ASIC受容体とも完全に異なることもありうる。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、今まで開示されたラットASIC1Bと異なる特性を示すヒトASIC1B受容体（以後、hASIC1Bと呼ぶ）の発見を報じる。またこの新しいサブユニットの、神経伝達および／または痛覚、および／または機械感覚、および／または正常および病態生理学的状態におけるその他のいずれの神経学的および／または代謝プロセスとの潜在的関わりも、本発明の範囲内であると意図する。本発明はまた、限定されるものでないが、薬物スクリーニング技術（すなわち、チャンネルアンタゴニスト、アゴニストおよび／またはモジュレーターのスクリーニング）、診断マーカー、遺伝子治療を含むあらゆる治療標的として、この新しいサブユニットの利用を範囲内に包含することも求める。また、本発明の範囲には、hASIC1Bサブユニットとお互いとのおよび／またはあらゆる種由来のASICファミリーの１以上のサブユニット（限定されるものでないが、ASIC1、ASIC1A、BNaC2、ASIC1B、ASIC2A、ASIC2B、MDEG、MDEG1、MDEG2、BNC1、BNaC1、DRASIC、ASIC3、ASIC4、SPASICまたはそれらのいずれかの変異体を含む）とのヘテロ重合体、ならびにhASIC1Bとあらゆる種由来のデゲネリン（Degenerin）およびEnaCファミリーのあらゆる他メンバーとのヘテロ重合体も包含される。
【０００８】
本発明の目的は、全長hASIC1Bポリペプチド分子（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド分子（配列番号１）の好ましい一次配列を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、受託番号AC025154、AC074032、およびAC025361で寄託された未特性決定配列から推定されるhASIC1Bの部分ゲノムポリヌクレオチド配列、特に、クローンAC025154中の１つの非断続コンティグを含有するhASIC1Bの特徴的かつ特有の第１エキソンの配列を提供することである。
【００１０】
本発明はさらに、hASIC1Bをコードする核酸配列を含んでなるポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）、それらの断片、部分またはアンチセンス分子、および発現ベクターおよび宿主細胞を特徴とする。本発明はまた、hASIC1Bと特異的に結合する抗体および実質的に精製されたhASIC1Bを含有する医薬組成物を特徴とする。本発明はまた、hASIC1Bのアゴニストおよびアンタゴニストの利用も特徴とする。
【００１１】
図面の説明
以下の図（drawings）、図面（figures）および表（tables）は本発明の実施形態の説明であって、請求の範囲に包含される本発明の分野を限定することを意味するものでない。
【００１２】
図面の簡単な説明については以下参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明のヌクレオチド配列、タンパク質および方法を記載する前に断わるが、記載した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、および試薬は変わりうるのであって、本発明はこれらに限定されるものでないと解釈する。また、本明細書に使用される専門用語は特定の実施形態を記載することだけが目的であって本発明の範囲を限定することを意図するのでなく、本発明の範囲は添付した請求の範囲によってのみ限定されうると解釈する。本明細書においておよび添付した請求の範囲において使用した、単数形「或る（a）」、「或る（an）」、および「その（the）」は、その文脈が明らかに別の意味を指定しない限り、複数の意味を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「或る宿主細胞（an host cell）」の意味は複数のそのような宿主細胞を含み；「その抗体（the antibody）」の意味は１以上の抗体および当業者に公知のそれらの同等物の意味であって、以下同様である。
【００１４】
別の定義がされていない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する業界の技術者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載したのと類似のまたは同等のいずれの方法および材料を本発明の実施または試験に利用してもよいが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。本明細書に記述した全ての開示物は、開示物に報じられて本発明に関係して利用しうる細胞系、ベクター、および方法論を記載しかつ開示する目的で、参照により組み入れられる。
【００１５】
別の規定がされていない限り、本明細書において以下および以上使用された用語「hASIC1B」は、hASIC1Bの全ての変異体（以下に定義した）を包含する。
【００１６】
定義
本明細書に使用される「ポリヌクレオチド」は１本鎖または２本鎖分子であって、ヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧを含んでなる「デオキシリボ核酸」（DNA）であっても、または塩基Ａ、Ｕ（Ｔの代わり）、ＣおよびＧを含んでなる「リボ核酸」（RNA）であってもよい上記分子を意味する。ポリヌクレオチドはコード鎖またはその相補体、センスまたはアンチセンス鎖を表しうる。ポリヌクレオチドは、天然の配列と配列が同一であってもよいし、または天然の配列に見出されるのと同じアミノ酸をコードする代わりのコドンを含んでもよい（Lewin：「Genes V（遺伝子V）」、第７章；Oxford University Press、1994）。さらに、ポリヌクレオチドはアミノ酸の保存的置換を表すコドンを含んでもよい。用語「ポリヌクレオチド」はまた、ゲノムDNA（イントロンとエキソンの両方）、相補的DNA（cDNA）、cRNA、メッセンジャーRNA（mRNA）などの、DNAまたはRNAの全ての可能な代替形態、ならびにトリチル化塩基などの修飾された塩基およびイノシンなどの変わった塩基を含む、ヌクレオチド塩基から部分または全化学合成により調製されたDNAまたはRNAを含んでもよい。ポリヌクレオチドはまた化学的、酵素的または代謝的に改変されたDNAまたはRNAの形態、ならびにウイルスの特徴であるDNAおよびRNAの化学的形態を包含してもよい。
【００１７】
用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴ」は典型的には長さが10〜40個の塩基である、短いポリヌクレオチドを意味する。
【００１８】
「ポリペプチド」は、お互いにペプチド結合または改変ペプチド結合により接続された２個以上のアミノ酸からなる分子（すなわち、アイソスター（isostere））を意味する。アミノ酸は、自然状態で遺伝子にコードされた全部で20種のアミノ酸ならびに自然状態でまたは化学的に改変されたアミノ酸を含む。ポリペプチドは、通常ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと呼ばれるアミノ酸の短い鎖、および通常タンパク質と呼ばれるさらに長い鎖の両方を意味する。従って、本明細書に使用される「アミノ酸配列」は、天然のまたは合成分子に対応する、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質分子およびそれらの断片または部分を意味する。本明細書において「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子のアミノ酸配列を意味して呼ばれる場合、「アミノ酸配列」および同様の用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、そのアミノ酸配列をその呼ばれたタンパク質分子に関連する完全な、自然のアミノ酸配列に限定することを意味するのではない。さらに、ポリペプチドはまた、翻訳後プロセシングなどの自然プロセスにより、または当技術分野で周知の化学的改変技術により改変されたアミノ酸配列も含みうる。所与のポリペプチドは多数のタイプの改変を含有してもよいしまたは所与の改変は同じかまたは様々な程度で所与のポリペプチド中の複数部位に存在してもよい。改変は、限定されるものでないが、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含むポリペプチド中のいずれの部位に存在してもよい。以上に挙げた改変ならびにそれらの実施は全て、研究文献において、基礎的な教科書および詳細な専攻論文の両方でよく記載されている（「Proteins: Structure and Molecular Properties（タンパク質：構造および分子的特性）」; Creighton TE, Freeman WH, 第２版, New-York, 1993；「Posttranslational Covalent Modification of Proteins（タンパク質の翻訳後共有結合による改変）」, Johnson BC, 編, Academic Press, New-York, 1983；さらに、Seiterら, Meth Enzymol 1990; 182: 626、およびRattanら, Ann NY Acad Sci 1992; 663: 48）。
【００１９】
本明細書に使用される「ペプチド核酸」は、リシンなどのアミノ酸残基およびアミノ基が付加されているオリゴヌクレオチドを含んでなる分子を意味する。抗遺伝子剤とも名づけられたこれらの小分子は、それらの相補的な核酸鎖と結合することにより転写伸長を停止する（Nielsenら, Anticancer Drug Des 1993; 8: 53）。
【００２０】
本明細書に使用されるhASIC1Bは、ヒトから得た、自然、合成、半合成、または組換えのいずれによるにせよ、実質的に精製されたhASIC1Bのアミノ酸配列を意味する。
【００２１】
本明細書に使用される用語「変異体」は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとそれぞれ異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。典型的なポリヌクレオチドの変異体は他の対照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の差は、対照ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドのアミノ酸配列を改変してもしなくてもよい。ヌクレオチド変化は、以下に考察するように、対照配列がコードするポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、挿入、欠失、融合、および末端切断を生じてもよい。典型的なポリペプチドの変異体は他の対照ポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。一般的に、対照ポリペプチドと変異体の配列の差は、全体に密接に類似しかつ多数の領域で同一であるような差である。変異体と対照ポリペプチドは、１以上の置換、付加、挿入、欠失のいずれの組合わせでアミノ酸配列が異なってもよい。置換または挿入されるアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされいていてもいなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、例えば１以上の塩基における多型または突然変異を含む対立遺伝子または擬対立遺伝子変異体のように、天然であってもよいし、または天然では未知の変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然変異体は、突然変異誘発技術によりまたは直接合成により作ってもよい。上記の非天然変異体の定義は用語「突然変異体」を包含する。
【００２２】
本明細書において以下に「スプライス変異体」と呼ぶのは、所与の遺伝子中に存在するエキソンの示差的または代替的スプライシングおよびアセンブリーから生じる変異体である。典型的には、コードされるタンパク質はほとんどの領域で全同一性を提示するが、異なるエキソンによりコードされる特定の領域ではより低い同一性を提示しうる。
【００２３】
本明細書に使用される「欠失」は、対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、１以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基がそれぞれ不在であるアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を意味する。
【００２４】
本明細書に使用される「挿入」または「付加」は、対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、１以上のアミノ酸またはヌクレオチド残基の付加をそれぞれもたらすアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を意味する。
【００２５】
本明細書に使用される「置換」は、対照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと比較して、１以上のアミノ酸またはヌクレオチドのそれぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチドによる置換を意味する。
【００２６】
本明細書に使用される「誘導体」は、hASIC1Bをコードする核酸またはコードされたhASIC1Bの化学的修飾物を意味する。そのような修飾物の例は、水素のアルキル、アシル、またはアミノ基による置換でありうる。核酸誘導体はポリペプチドをコードし、そのポリペプチドは自然分子の本質的な生物学的特徴のいくつかまたは全てを保持しうるかまたはしないであろう。
【００２７】
本明細書に使用される「同一性」は、２以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が共通して有する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の程度の基準を意味する。一般的に、配列を最高度の対合（match）が得られるように整列し、これを「アラインメント（alignment）」と呼ぶ。そのような最適のアラインメントはギャップを利用し、スミス-ウォーターマン・アラインメント（Smith-Waterman alignment）などの局所相同性アルゴリズムを用いて対合数を最大化するようにギャップを挿入する。用語「同一性」、または「類似性」、または「相同性」、または「アラインメント」は当業者には周知であって、アラインメントを実施しかつ同一性を測定する方法は、文献に広く記載されかつ教示されている（Dayhoffら, Meth Enzymol 1983; 91:524；Lipman DJおよびPearson WR, Science 1985; 227: 1435；Altschulら, J Mol Biol 1990; 215:403；Pearson WR, Genomics 1991; 11:635；Gribskov MおよびDevreux J, 編 (1992) 「Sequence Analysis Primer（配列分析プライマー）」, WH Freeman & Cie, New York.；Altschulら, Nature Gen 1994; 6: 119）。さらに、アラインメントを実施しかつ同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムおよびソフトウエアパッケージにコード化されていて、それらのいくつかはウエブ（web）に基づくものでもあり、インターネット上でアクセスしうる。好ましいソフトウエアとしては、限定されるものでないが、Blastn、Blastp、Blastx、tBlastnを含むBLAST（Basic Local Alignment Search Tools）（Altschulら, J Mol Biol 1990; 215: 403）、FastAおよびTfastA（PearsonおよびLipman, PNAS 1988; 85: 2444）、Lasergene99（DNASTAR, Madison WI）、Omiga 2.0またはMacVector（Oxford Molecular Group, Cambridge, UK）、Wisconsin Package（Genetic Computer Group (GCG), Madison, WI）、Vector NTI Suite（InforMaxInc., N. Bethesta, MD）、GeneJockey II（Biosoft, Cambridge, UK）が挙げられる。
【００２８】
具体例として、配列番号１の対照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば95％「同一性」をもつヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列番号１の対照ヌクレオチド配列の100個のヌクレオチド当たり５個までの点突然変異または異なるヌクレオチドを含有しうることを除くと、対照配列と同一であることを意図する。換言すれば、対照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、対照配列中のヌクレオチドの5％までを欠失するかまたは他のヌクレオチドと置換するか、または対照配列中の全ヌクレオチドの5％までの数のヌクレオチドを対照配列中に挿入してもよい。対照配列のこれらの突然変異は、対照ヌクレオチド配列の5'または3'末端位置にもしくはこれらの末端位置間のいずれの場所に、または対照配列のヌクレオチドの間で個々にもしくは対照配列内に１以上の連続グループで点在して、存在してもよい。
【００２９】
同様に、配列番号２の対照アミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、95％「同一性」をもつアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ポリペプチド配列のアミノ酸配列が、配列番号２の対照アミノ酸配列の全部で100個のアミノ酸に対して、５個までのアミノ酸改変を含有しうることを除くと、対照配列と同一であることを意図する。換言すれば、対照アミノ酸配列に対して少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、対照配列のアミノ酸残基の5％までを欠失するかまたは他のアミノ酸と置換するか、または対照配列に全アミノ酸残基の5％までの数のアミノ酸を対照配列中に挿入してもよい。対照配列のこれらの突然変異は、対照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置にもしくはこれらの末端位置間のいずれの場所に、または対照配列の残基の間で個々にまたは対照配列内に１以上の連続グループで点在して、存在してもよい。
【００３０】
本明細書に使用される用語「生物学的活性的に活性な」または「生物学的活性」は、天然分子の構造的、調節的、生化学的、電気生理学的または細胞の機能を有するタンパク質を意味する。同様に、「免疫学的に活性な」は、適当な動物または細胞において特異的免疫応答を誘発して特異的抗体と結合する、天然、組換え、または合成hASIC1B、またはそれらのいずれかのオリゴペプチドの能力を意味する。
【００３１】
本明細書に使用される、「プロトンゲート調節（proton-gated）」および「酸感知（acid-sensing）」は、酸性の増加またはpHの低下とも呼ぶプロトンイオン濃度の増加により誘発されるチャンネル分子の陽イオン透過性増加を意味する。
【００３２】
「機能の利得（gain of function）」は、存在する生物学的活性の増強および／または新規の生物学的活性の取得を示すhASIC1B誘導体を意味する。同様に、「機能の消失（loss of function）」は、１以上の存在する生物学的活性の部分的または完全な消失を示すhASIC1B誘導体を意味する。表現「優性ネガティブ」は、機能の消失したhASIC1B誘導体であって、in vivoで例えばトランスジーンとしてまたはin vitroで例えば特定の生物学的活性（例えば「酸感知」）を試験するために用いるアッセイにおいて完全に機能的なhASIC1Bと同時発現させると、その応答を支配し、それと関連した全ての他のhASIC1Bサブユニットの生物学的活性を消失しうる上記hASIC1B誘導体を意味する。優性ネガティブ効果はまた、優性ネガティブhASIC1B誘導体が他の機能性ASICファミリーメンバー、例えば、限定されるものでないが、ASIC1A、ASIC2AまたはASIC3と同時発現する条件でも現れうるし、かつ優性ネガティブASICサブユニットが機能性hASIC1Bと同時発現される逆のときにも、現れうる。
【００３３】
本明細書に使用される用語「アゴニスト」は、hASIC1Bと結合すると、hASIC1Bに変化を生じてhASIC1Bの活性をモジュレートする分子を意味する。アゴニストは、hASIC1Bと結合するタンパク質、核酸、炭水化物、またはいずれの他の分子であってもよい。
【００３４】
本明細書に使用される用語「アンタゴニスト」または「インヒビター」は、hASIC1Bと結合すると、hASIC1Bの生物学的または免疫活性をモジュレートするかブロックする分子を意味する。アンタゴニストおよびインヒビターは、hASIC1Bと結合するタンパク質、核酸、炭水化物、またはいずれの他の分子であってもよい。
【００３５】
本明細書に使用される「モジュレートする」は、hASIC1Bの生物学的活性における変化または改変を意味する。モジュレーションはタンパク質活性の増加または減少、結合特性の変化、またはhASIC1Bの生物学的、機能的または免疫学的特性における他のいずれの変化であってもよい。
【００３６】
本明細書に使用される「模倣物（mimetic）」は、その構造がhASIC1Bの構造またはその部分の知識から開発され、hASIC1Bとしていくつかのまたは全てのASIC様分子の作用を果たしうる分子を意味する。
【００３７】
本明細書に使用される「実質的に精製された」は、その自然環境から除去され、単離されまたは分離された核酸またはアミノ酸配列であって、その自然状態で随伴する他成分を少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、さらに好ましくは90%含まない、さらになお好ましくは95％、そして最も好ましくは99%含まない上記核酸またはアミノ酸配列を意味する。
【００３８】
本明細書に使用される「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの産生を意味し、一般的に、当技術分野で周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用して実施される（「PCR Primer: a laboratory manual（PCRプライマー：研究室マニュアル）」, Dieffenbach CWおよびDvekslerGS, 編, 1995, CSHL Press, Plainview, N.Y）。
【００３９】
本明細書に使用される「ハイブリダイゼーション」は、核酸鎖が相補鎖と塩基対合を介して結合するあらゆるプロセスを意味する。
【００４０】
本明細書に使用される「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的ＧとＣ塩基の間および相補的ＡとＴ塩基との間の水素結合の形成により２つの核酸配列の間に形成される複合体を意味し；これらの水素結合はさらに塩基スタッキング相互作用により安定化されうる。２つの相補的核酸配列は逆平行のコンフィギュレーションで水素結合する。水素複合体は、溶液中で（例えば、RNアーゼ保護アッセイ分析）または溶液中に存在する１つの核酸配列と固体支持体（例えば、in situハイブリダイゼーションのために細胞が固定されている膜、フィルター、チップ、ピンまたはガラススライド）上に固定された他の核酸配列との間で形成されてもよい。
【００４１】
本明細書に使用される用語「相補的な」または「相補性」は、塩基対合が許容される塩および温度条件のもとでのポリヌクレオチドの自然結合を意味する。例えば、配列「Ａ-Ｇ-Ｔ」は相補的配列「Ｔ-Ｃ-Ａ」と結合する。２つの１本鎖分子間の相補性は「部分的」であって、いくつかの核酸だけが結合してもよいし、または完全であって、１本鎖分子間に全相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補度（degree of complementarity）は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意な影響を与える。これは核酸鎖間の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
【００４２】
本明細書に使用される「相同性」は、配列またはプローブの相補度を意味する。部分相同性または完全相同性（すなわち、同一性）が存在しうる。部分相同性配列は同一配列が標的核酸とハイブリダイズするのを、少なくとも部分的に阻害する配列であり；機能的用語「実質的に相同的な」を用いて呼ぶ。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションアッセイ（サザンまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を利用して試験することができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェンシーの条件下で、完全に相同的な配列またはプローブと標的配列との結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）に対して競合しかつ阻害しうる。ここで、低ストリンジェンシーの条件は非特異的結合を許容するというのではない；低ストリンジェンシー条件は２つの配列のお互いとの結合が特異的（すなわち、選択的）相互作用であることを必要とする。非特異的結合の不在は、部分的相補度すら持たない第２の標的配列（例えば、約30％未満の同一性）を使って試験することができる；非特異的結合が不在の場合、プローブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしないであろう。
【００４３】
当技術分野では公知のように、低または高ストリンジェンシー条件を含む多数の同等な条件を採用することができる。配列（DNA、RNA、塩基組成物）の長さおよび性質、標的（DNA、RNA、塩基組成物、溶液中または固定された存在、その他）の性質、ならびに塩および他成分（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸および／またはポリエチレングリコールの存在または非存在）の濃度などの因子を考慮し、そしてハイブリダイゼーション溶液を変えて以上に掲げた条件と異なるが、同等である低または高ストリンジェンシーの条件を作ってもよい。
【００４４】
本明細書に使用される用語「ストリンジェントな条件」は、約Tm-５℃（プローブの融点（Tm）以下５℃）からTm以下約20〜25℃の範囲にある「ストリンジェンシー」である。当業者であれば理解しうるように、同一または関係するポリヌクレオチド配列を同定しまたは検出するために、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを変更してもよい。
【００４５】
本明細書に使用される「アンチセンス」は、特定のDNAまたはRNA配列に相補的であるヌクレオチドを意味する。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖と相補的である核酸鎖の意味で使用される。アンチセンス分子はいずれの方法により作ってもよく、例えば、目的の遺伝子を逆方向でウイルスプロモーターとライゲートして相補鎖の合成を可能にする方法を含む。いったん細胞中に導入されると、この転写された鎖は細胞が産生する自然配列と複合して２本鎖を形成する。次いでこれらの２本鎖はさらなる転写または翻訳をブロックする。この方法で、突然変異表現型を作製することができる。表現「ネガティブ」はアンチセンス鎖の意味で時々使用され、「ポジティブ」はセンス鎖の意味で時々使用される。
【００４６】
本明細書に使用される、タンパク質の用語「一部分（portion）」（「所与のタンパク質の一部分」のように）はそのタンパク質の断片を意味する。断片のサイズは４個のアミノ酸残基から全アミノ酸配列−１個のアミノ酸までの範囲であってもよい。従って、「配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも１部分を含む」タンパク質は全長ヒトhASIC1Bおよびその断片を包含する。
【００４７】
本明細書で定義される「形質転換（transformation）」は、外因性DNAが受容体細胞に進入しかつ変化させるプロセスを意味する。それは、自然または人工の条件下で当技術分野で周知の様々な方法を用いて起こりうる。形質転換は、外来核酸配列を原核生物または真核生物宿主細胞中に挿入するためのいずれの公知の方法に頼ってもよい。その方法は、形質転換する宿主細胞に基づいて選択され、限定されるものでないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、および微粒子ボンバードメントを含む。そのような「形質転換された」細胞は、挿入されたDNAを自己複製プラスミドとしてまたは宿主染色体の部分として複製することができる安定に形質転換された細胞を含む。これはまた、挿入されたDNAまたはRNAを限られた時間だけ一過的に発現する細胞も含む。
【００４８】
本明細書に使用される「抗原決定基」は、特定の抗体と接触させる分子の一部分（すなわち、エピトープ）を意味する。タンパク質またはタンパク質の断片を用いて宿主動物を免疫感作すると、タンパク質の多数の領域は、タンパク質上の所与の領域または三次元構造と特異的に結合する抗体の産生を誘導することができる；これらの領域または構造を抗原決定基と呼ぶ。抗原決定基は、抗体との結合について、元のままの抗原（すなわち、免疫応答を誘発するために用いる免疫原）と競合しうる。
【００４９】
抗体とタンパク質またはペプチドとの相互作用を参照して、本明細書において使用される用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、その相互作用が特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味する；換言すれば、抗体は一般的にタンパク質よりむしろ特定のタンパク質構造を認識して結合する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体を含有する反応物中にエピトープＡを含有するタンパク質（または遊離した、無標識のＡ）が存在すると、抗体と結合した標識されたＡの量は減少する。
【００５０】
本明細書に使用される用語「サンプル」はその最も広い意味で使われる。hASIC1Bまたはその断片をコードする核酸を含有すると思われる生物学的サンプルは、細胞、細胞から単離された染色体（例えば、分裂中期染色体の広がり）、ゲノムDNA（溶液中のまたはサザン分析用などの固体支持体と結合した）、RNA（溶液中のまたはノーザン分析用などの固体支持体と結合した）、cDNA（溶液中のまたは固体支持体と結合した）、細胞または組織からの抽出物などを含みうる。
【００５１】
本明細書に使用される用語「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析および／またはRT-PCRによる配列番号１に関係するリボ核酸の存在の検出は、サンプル中のhASIC1BをコードするmRNAの存在を示し、従って、該タンパク質をコードする転写物の発現と相関があることを示す。
【００５２】
本明細書に使用される用語、配列番号１のポリヌクレオチドの「改変」はhASIC1Bをコードするポリヌクレオチドの配列のいずれの改変も含むものであり、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出しうる欠失、挿入、および点突然変異を含む。この定義に含まれるのは、hASIC1BをコードするゲノムDNA配列に対する改変（例えば、配列番号１とハイブリダイズできる制限酵素切断断片長多型のパターンの改変による）の検出、配列番号１の選択した断片がゲノムDNAのサンプルとハイブリダイズしなくなること（例えば、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて）、およびhASIC1Bをコードするポリヌクレオチド配列に対する正常な染色体遺伝子座以外とのハイブリダイゼーションなどの不適当なまたは予想外のハイブリダイゼーション（例えば、分裂中期染色体広がりとの蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を用いて）である。
【００５３】
本明細書に使用される「抗体」は、エピトープ決定基と結合しうるインタクトの分子ならびにFa、F(ab')2、およびFvなどのそのフラグメントを意味する。hASIC1Bポリペプチドと結合する抗体は、元のままのポリペプチドまたは目的の小ペプチドを含有するフラグメントを免疫感作抗原に利用して調製することができる。動物を免疫感作するために利用するポリペプチドまたはペプチドは、翻訳したRNAから誘導するかまたは化学的に合成し、所望であれば、担体タンパク質と結合してもよい。通常利用される化学的にペプチドと結合した担体としては、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリンが挙げられる。次いで、結合したペプチドを利用して動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を免疫感作する。これらの方法は、文献によく記載されている：例えば、「Antobodies : A Laboratory Manual（抗体：研究室マニュアル）」, Harlow EおよびLane D, 編, 1998, CSHL Press, Plainview, N. Y)。
【００５４】
本明細書に使用される用語「ヒト化抗体」は、元来の結合能力を保持したまま、ヒト抗体にさらによく似させるために、非抗原結合領域においてアミノ酸が置き換えられている抗体分子を意味する。
【００５５】
発明の開示
本発明は、新規のヒト酸感知イオンチャンネルタンパク質（human Acid Sensing Ion Channel protein）であるhASIC1B、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチド、およびこれらの組成物の疾患の診断、予防、または治療への利用の発見に基づく。
【００５６】
本発明のhASIC1Bをコードする核酸を、GenBankデータベースのウエブに基づくバーチャルスクリーニング（web-based virtual screening）により、始めて同定した。TblastN検索（search）をラットASIC1Bアミノ酸配列を入力問合せ配列（input query sequence）に用いて実施した。ヒトゲノムクローンAC025154（GenBank）をこのようにして同定した。同定した配列により、続いて特異的オリゴヌクレオチドプライマーの合成が可能になり、そのプライマーにより、ヒト三叉神経節から単離したRNAから逆転写DNAを利用してRT-PCRにより配列番号１の全長hASIC1B核酸分子を単離することができた。
【００５７】
一実施形態において本発明は、新規のヒトプロトンゲート調節イオンチャンネル、すなわち図１に示した配列番号２のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを包含する。hASIC1Bは、長さが562個のアミノ酸であり、２つの潜在的疎水性膜貫通ドメインを有する。図２に示すように、hASIC1BはASIC遺伝子ファミリーの他のメンバーと化学的および構造的相同性を有する。特に、複数のアミノ酸のモチーフまたは伸長部は、今までに同定された全てのASICサブユニット中に完全に保存されている。ヒトhASIC1Bは、開示されたラットASICβサブユニット（GenBank受託番号  ）と最高の同一性を示すが、Ｎ末端側が47個のアミノ酸だけさらに長い。ノーザンブロットおよびRT-PCR分析は、hASIC1Bが中枢および末梢神経系において感覚神経節に強く集中して発現されることを表す。
【００５８】
本発明はまたhASIC1B変異体も包含する。好ましいhASIC1B変異体は、hASIC1Bアミノ酸配列（配列番号２）に対して、少なくとも80％、そしてさらに好ましくは90％アミノ酸配列同一性を有する変異体である。最も好ましいhASIC1B変異体は、配列番号２に対して少なくとも95％アミノ酸配列同一性を有する変異体であるが、97-99％アミノ酸配列同一性を有する変異体は特に最も好ましい。
【００５９】
本発明はまた、hASIC1Bポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも包含する。従って、hASIC1Bのアミノ酸配列をコードするいずれの核酸配列を利用してhASIC1Bを発現する組換え分子を作製してもよい。特定の実施形態においては、本発明は、図１に示した配列番号１の核酸を含んでなるポリペプチドを包含する。
【００６０】
当業者であれば、遺伝子コード縮重の結果として、hASIC1Bをコードする多数のヌクレオチドがあって、いずれの公知および天然遺伝子のヌクレオチド配列とも最小限の相同性しか有しない複数の上記ヌクレオチドを作りうることを理解するであろう。従って、本発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することによって作りうる、それぞれおよび全ての可能なヌクレオチド配列の変異体を意図する。これらの組合わせは、標準トリプレット遺伝子コードを天然のhASIC1Bのヌクレオチド配列に適用して作られ、全てのそのような変異体は特定して開示されたとみなされなければならない。
【００６１】
hASIC1Bおよびその変異体をコードするヌクレオチド配列は、天然のhASIC1Bのヌクレオチド配列と適当に選択したストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズできることが好ましい、しかし実質的に異なるコドン利用を有してhASIC1Bまたはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作るのが有利である場合がある。特定の原核生物または真核生物の発現宿主においては、コドンを選択してペプチドの発現が起こる割合（rate）を、宿主が利用する特定のコドンの頻度に従って増加させることができる。コードされるアミノ酸配列を変えずにhASIC1Bおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に変える他の理由は、天然の配列から産生される転写物より長い半減期などの、さらに望ましい特性を有するRNA転写物の産生にある。
【００６２】
本発明はまた、hASIC1Bおよびその誘導体をコードするDNA、またはその一部分の完全に合成化学による作製も包含する。作製した後に、本特許出願の時点で当技術分野で周知である試薬を用いて、その合成遺伝子を多くの利用しうるいずれのDNAベクターおよび細胞系中に挿入してもよい。さらに、合成化学を用いて、突然変異をhASIC1Bまたはそのいずれかの部分をコードする配列中に導入してもよい。
【００６３】
本発明はまた、請求の範囲に記載のヌクレオチド配列、特に配列番号１に示すヌクレオチド配列と様々なストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列も包含する。ハイブリダイゼーション条件は、BergerおよびKimmel（Meth Enzymol 1987: 152）に教示された核酸結合複合体またはプローブの融点（Tm）に基づくものであり、規定したストリンジェンシーで利用することができる。
【００６４】
本発明に包含される、hASIC1Bをコードする改変された核酸配列は、同じまたは機能的に同等なhASIC1Bをコードするポリヌクレオチドを生じる様々なヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含む。コードされたタンパク質も、機能的に同等なhASIC1Bを生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含有する。本発明に包含されるのはまた、増加したまたは新規の生物学的活性をもつhASIC1Bポリペプチド（「機能の利得」）、または減少したまたは阻害された生物学的活性をもつhASIC1Bポリペプチド（「機能の消失」または「優性ネガティブ」）をコードするポリヌクレオチドを生じる欠失、挿入または置換を含む、改変された核酸配列でもある。コードされたタンパク質も、本明細書に以上記載した、機能的に多様なhASIC1Bを生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を含有する。hASIC1Bの生物学的活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて熟考したアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負荷電アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含んでもよく；正荷電アミノ酸はリシンおよびアルギニンを含んでもよく；そして類似の親水性を有する無荷電の極性ヘッド基をもつアミノ酸はロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；フェニルアラニンおよびチロシンを含んでもよい。
【００６５】
本発明の範囲内にはまた、hASIC1Bをコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれる。本明細書に使用される用語「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から得られる代わりの遺伝子型である。対立遺伝子は、その構造または機能が改変されてもされなくてもよい改変されたmRNAまたはポリペプチドを生じる。いずれの所与の遺伝子もゼロ、１、または多数の対立遺伝子型を有しうる。対立遺伝子を生じる通常の突然変異性変化は、一般的に、ヌクレオチドの自然の欠失、付加、または置換に基づく。これらのタイプの変化はそれぞれ単独でまたは他との組み合わせで、所与の配列中に１以上の回数、起こりうる。
【００６６】
当技術分野で周知でありかつ一般的に利用しうるDNA配列決定の方法を、本発明のいずれの実施形態を実施するために利用してもよい。その方法は、DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片、シーケナーゼII（US Biochemical Corp、Cleveland、Ohio）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham、Chicago、IL）などの酵素、またはGibco BRL（Gaithersburg、Md.）が販売するエロンガーゼ（ELONGASE）増幅系などの組換えポリメラーゼと校正（proofreading）エキソヌクレアーゼの組合わせを採用してもよい。好ましくは、上記方法を、例えば、ハミルトン・マイクロラボ2200（Micro Lab 2000）（Hamilton、Reno、Nev.）、ペルチエ・サーマルサイクラー（Peltier Thermal Cycler）（PTC200; M.J. Research、Watertown、Mass.）およびABI 377 DNAシーケンサー（Perkin Elmer）などの機械を用いて自動化する。
【００６７】
hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドは、部分的なヌクレオチド配列を利用しかつプロモーターおよび調節配列などの上流配列を検出する当技術分野で公知の様々な方法を用いて伸長することができる。例えば、採用しうる１つの方法としての「制限部位（restriction-site）」PCRは、普遍的なプライマーを用いて既知遺伝子座に隣接した未知配列を回収することができる（Sarkarら, PCR Meth Applic 1993; 2:318-322）。特に、ゲノムDNAを、最初に、リンカー配列に対するプライマーと既知領域に特異的なプライマーの存在のもとで増幅する。次に、増幅した配列を、同じリンカープライマーと最初のプライマーに対して内側の他の特異的プライマーを用いて、第２ラウンドのPCRにかける。PCRのそれぞれのラウンドの産物を適当なRNAポリメラーゼを用いて転写し、そして逆転写酵素を用いて配列決定する。
【００６８】
インバースPCR（inverse PCR）も既知領域に基づく多様なプライマーを用いて配列を増幅または伸長するのに利用することができる（Trigliaら, Nuc. Acid Res. 1988 ; 16: 8186）。プライマーは、GeneWorks 2.5.1またはMacVector 6.0.1（Oxford Molecular Group、Cambridge、UK）、またはOLIGO 4.06プライマー解析ソフトウエア（National Biosciences Inc.、Plymouth、Minn.）、またはいずれかの他の適当なプログラムを用いて、長さが22-30個のヌクレオチドであり、ＧＣ含量が50％以上であり、そして標的配列と約68-72℃でアニーリングするように設計することができる。上記方法は複数の制限酵素を用いて遺伝子の既知領域中に適当な断片を作製する。次いでその断片を分子内ライゲーションにより環状化してPCRテンプレートとして利用する。
【００６９】
利用しうる他の方法はキャプチャーPCRであり、この方法はヒトおよび酵母人工染色体DNA中の既知配列に隣接したDNA断片のPCR増幅に関わる（Lagerstromら, PCR Meth Applic 1991; 1:111）。この方法では、PCRを実施する前に、多重制限酵素消化およびライゲーションも利用して、遺伝子操作した２本鎖配列をDNA分子の未知部分中に配置する。
【００７０】
未知配列を検索するために利用しうる他の方法はParkerらの方法（Nuc Acid Res. 1991; 19: 3055）である。さらにPCR、ネスト化プライマー、およびPromoterFinderTMライブラリー（Clontech、Palo Alto、CA）を利用して、ゲノムDNA中を歩行（walk）することができる。この方法は、ライブラリーをスクリーニングする必要をなくし、イントロン／エキソン接続部を見つけるのに有用である。
【００７１】
全長cDNAをスクリーニングするときは、より大きいcDNAを含むようにサイズ選択されているライブラリーを用いるのが好ましい。また、無作為プライミングしたライブラリーも遺伝子の5'領域を含有する配列をより多く含有しうる点で好ましい。無作為プライミングしたライブラリーが特に好ましいのは、オリゴd(Ｔ)ライブラリーが全長cDNAを生じない状況に対してであろう。ゲノムライブラリーは、5'および3'非翻訳調節領域中への配列の伸長に対して有用でありうる。
【００７２】
市販されるキャピラリー電気泳動システムを用いて、サイズを分析するかまたは配列決定のヌクレオチド配列またはPCR産物を確認することができる。特に、キャピラリー配列決定は、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザー活性化される４種（各ヌクレオチドに対して１種）の異なる蛍光染料、および電荷結合素子カメラによる発光波長の検出を採用することができる。出力／光強度は、適当なソフトウエア（例えば、ゲノタイパー（GenotyperTM）および配列ナビゲーター（Sequence NavigatorTM）、Perkin Elmer）を利用して電気信号に変換し、サンプルの供給からコンピューター分析および電子データ表示までの全プロセスをコンピューター制御することができる。キャピラリー電気泳動は、特定サンプル中に限られた量しか存在しえないDNA小片の配列決定用に特に好ましい。
【００７３】
本発明の他の実施形態においては、hASIC1Bまたは融合タンパク質またはそららの機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、組換えDNA分子中に用いてhASIC1Bの発現を指令することができる。遺伝子コードの固有の縮重により、実質的に同じまたは機能的に同等のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を産生し、そしてこれらの配列を用いてhASIC1Bをクローニングしかつ発現してもよい。
【００７４】
当業者であれば理解しうるように、非天然コドンを持ってhASIC1Bをコードするヌクレオチド配列を作ることは有利でありうる。例えば、特定の原核生物または真核生物にとって好ましいコドンを選択して、タンパク質発現の割合を増加するかまたは所望の特性、例えば天然配列から作製される転写物より長い半減期を有する組換えRNA転写物を産生することができる。
【００７５】
本発明のヌクレオチド配列を当技術分野で公知の方法を用いて遺伝子操作し、限定されるものでないが、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変などの様々な理由で、hASIC1Bをコードする配列を改変することができる。無作為断片化によるDNAシャッフリングならびに遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのPCR再アセンブリーを利用してヌクレオチド配列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新しい制限酵素切断部位を挿入し、グリコシル化パターンを改変し、コドン優先度を変え、スプライス変異体または他の突然変異体を作るなどを行うことができる。あるいは、ヌクレオチド配列を遺伝子操作して、hASIC1Bチャンネルの部分を他のASICサブユニット、例えばASIC1AまたはASIC2Aの同等部分によって置換したキメラASICチャンネルを作製することができる。
【００７６】
本発明の他の実施形態においては、hASIC1Bをコードする天然、修飾、または組換えポリヌクレオチドを異種配列とライゲートして融合タンパク質をコードさせることができる。例えば、hASIC1B活性のインヒビターのペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体が認識しうるキメラhASIC1Bタンパク質をコードすることは有用である。融合タンパク質はまた、hASIC1Bをコードする配列と異種タンパク質配列の間に位置する切断部位を含有するように遺伝子操作して、hASIC1Bを切断し異種部分から精製して取出すこともできる。
【００７７】
他の実施形態においては、hASIC1Bのコード配列を、当技術分野で周知の化学的方法を用いて、全体または部分で合成することができる（Caruthersら, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 1980; 215-23；Hornら, Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 1980; 225-232を参照）。あるいは、タンパク質自身を、化学的方法を用いて作って、hASIC1Bアミノ酸配列またはその部分を合成することができ（Robergeら, Science 1995; 269: 202）、そして例えば、ABI 431A ペプチド合成機（Perkin Elmer）を利用して自動合成を実施してもよい。
【００７８】
新しく合成したペプチドは、分取高速液クロマトグラフィにより実質的に精製してもよい（例えば、Creighton T.(1983) 「Proteins, Structures and Molecular Principles（タンパク質、構造および分子的原理）」, W. H. Freeman & Co. , New York, N. Y.）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定により確認することができる（例えば、「the Edman degradation procedure（エドマン分解法）」；Creighton T. (1983)、前掲）。さらに、hASIC1Bのアミノ酸配列またはそのいずれかの部分を、直接合成中におよび／または化学的方法を用いて他のタンパク質からの配列もしくはその部分を組合わせて改変し、変異体ポリペプチドを作ることができる。
【００７９】
生物学的活性のあるhASIC1Bを発現する目的で、hASIC1Bまたは機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を適当な発現ベクター、すなわち、挿入したコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクター中に挿入してもよい。
【００８０】
当業者が周知する方法を利用して、コード配列ならびに適当な転写および翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技術、合成技術およびin vivo遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、「Molecular Cloning : A Laboratory Manual（分子クローニング：研究室マニュアル）」, Sambrook J, 編, CSHL Press, 1989, Cold Spring Harbor, N.Y.、および「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の現行プロトコル）」, Ausubelら, John Wiley & Sons, 1989, New York, N. Y.に記載されている。
【００８１】
hASIC1Bコード配列を含有しかつ発現するために、様々な発現ベクター／宿主系を利用することができる。これらとしては、限定されるものでないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV）もしくは細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。
【００８２】
「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を実施するベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、5'および3'非翻訳領域）である。そのようなエレメントの強度および特異性は様々である。利用するベクター系および宿主に依存して、構成および誘導プロモーターを含む適当な転写および翻訳エレメントをいくつ利用してもよい。例えば、細菌系のクローニングでは、Bluescrip(登録商標)ファージミドのハイブリッドlacZプロモーター（Stratagene、La Jolla、CA）またはpSport1TMプラスミド（Gibco BRL）およびptrp-lacハイブリッドなどの誘導プロモーターを用いてもよい。他の好ましい原核生物ベクターとしては、限定されるものでないが、pQE-9、pQE60、pQE70（Quiagen）、pNH8A、pNH16a、pNH18a、pNH46A（Stratagene）、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmacia）が挙げられる。バキュロウイルスの多角体プロモーターを昆虫細胞に利用してもよい。植物細胞のゲノム由来（例えば、熱ショック、RUBISCO；および貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルス由来（ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）のプロモーターまたはエンハンサーをベクター中にクローニングしてもよい。哺乳類細胞系においては、哺乳類遺伝子由来または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが好ましい。もしhASIC1Bをコードする配列の多コピーを含有する細胞系を作製する必要があれば、SV40またはEBVに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に用いてもよい。
【００８３】
細菌系では、複数の発現ベクターを、hASIC1Bの意図する用途に依って選択することができる。例えば、抗体を誘導するために大量のhASIC1Bが必要である場合、容易に精製しうる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターを利用することができる。そのようなベクターとしては、限定されるものでないが、Bluescript(登録商標)（Stratagene、La Jolla、CA）のような多機能大腸菌（E. coli）クローニングおよび発現ベクター（この場合、hASIC1Bをコードする配列をβ-ガラクトシダーゼのアミノ末端メチオニンおよび続く７個の残基に対する配列と同じフレーム内でベクター中にライゲートして、ハイブリッドタンパク質を産生させることができる）；pINベクター（Van HeekeおよびSchuster, J.Biol. Chem. 1989; 264: 5503）；その他が挙げられる；pGEXベクター（Promega、Madison、WI）も外来ポリペプチドをグルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現するために利用することができる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞から、グルタチオンアガロースビーズへの吸着と続いて遊離グルタチオンの存在のもとでの溶出により、容易に精製することができる。このような系で作ったタンパク質を、ヘパリン、トロンビン、またはXA因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計して、思うままにクローニングした目的のポリペプチドをGST部分から遊離してもよい。
【００８４】
細菌に加えて、酵母などの真核微生物も宿主として利用することができる。酵母（Saccharomyces cerevisiae）の実験室株、パン酵母（Baker's yeast）は最もよく利用されているが、他の複数の株または種も通常、利用できる。例えば、Broachら（Meth Enzymol 1983; 101: 307）の２μ複製起点、または他の酵母と共存しうる複製起点（例えば、Stinchcombら, Nature 1979; 282: 39；Tschumperら, Gene 1980; 10: 157；Clarkeら, Meth Enzymol 1983; 101: 300を参照）を採用するベクターを利用してもよい。酵母ベクターの制御配列としては、解糖酵素の合成に対するプロモーターが挙げられる（Hessら J Adv Enzyme Reg 1968; 7: 149；Hollandら, Biochemistry 1978; 17: 4900）。当技術分野で公知のさらなるプロモーターとしては、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzemanら, J Biol Chem 1980; 255: 2073）、アルコールオキシダーゼ、およびPGHに対するプロモーターが挙げられる。増殖条件および／または遺伝的背景により制御された転写を行う、さらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、α因子系、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関わる酵素に対するプロモーター領域である。また、ターミネーター配列はコード配列の3'末端にあることが望ましいと考えられる。そのようなターミネーターは、酵母由来の遺伝子のコード配列に続く3'非翻訳領域に見出される。総説は、「Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の現行プロトコル）」, Ausubelら, John Wiley & Sons, 1989, New York, N. Y、およびGrantら, Meth Enzymol. 1987; 153: 516を参照すること。
【００８５】
植物発現ベクターを利用する場合、hASIC1Bをコードする配列の発現は、プロモーターをいくつ使って駆動してもよい。例えば、CaMVの35Sおよび19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独でまたはTMV由来のω（omega）リーダー配列と組合わせて利用することができる（Takamatsuら, EMBO J. 1987; 6: 307；Brissonら, Nature 1984; 310: 511）。あるいは、RUBISCOの小サブユニットまたは熱ショックプロモーターなどの植物プロモーターを利用してもよい（Coruzziら, EMBO J 1984; 3: 1671；Broglieら, Science 1984; 224: 838；Winterら, Results Probl. Cell Differ 1991; 17: 85）。これらの構築物は、直接DNA形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞中に導入することができる。そのような技術は、複数の一般的に利用しうる総説に記載されている（例えば、Hobbs SまたはMurry LE in 「McGraw Hill Yearbook of Science and Technology（McGraw Hill科学技術年鑑）」, McGraw Hill, 1992, New York, N. Y.; pp.191-196、またはWeissbachおよびWeissbach in 「Methods for Plant Molecular Biology（植物分子生物学）」, Academic Press, 1988, New York, N. Y.; pp.421-463を参照）。
【００８６】
昆虫系も、hASIC1Bを発現するために利用することができる。例えば、そのような１つの系においては、オートグラファ核多角体病ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus）(AcNPV)をベクターとして利用してスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）幼生中に外来遺伝子を発現させる。hASIC1Bをコードする配列を、多角体遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングし、多角体プロモーターの制御下に置く。hASIC1Bの挿入に成功すると、多角体遺伝子は不活性化してコートタンパク質の欠如する組換えウイルスを産生する。次いでその組換えウイルスを用いて、例えば、Ｓ．フルギペルダ（S. frugiperda）細胞またはトリコプルシア（Trichoplusia）幼生に感染させ、そこでhASIC1Bを発現させることができる（Smithら, J Virol 1983; 46: 584；Engelhardら, Proc Natl Acad Sci 1994; 91: 3224）。
【００８７】
哺乳類宿主細胞においては、ウイルスに基づく複数の発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして利用する場合、hASIC1Bをコードする配列を、後期プロモーターおよび３部リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲートしてもよい。ウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域における挿入を利用して、感染宿主細胞でhASIC1Bを発現することができる生ウイルスを得てもよい（LoganおよびShenk, Proc Natl Acad Sci 1984; 81: 3655）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサーなどの転写エンハンサーを利用して、哺乳類宿主細胞における発現を増加させてもよい。
【００８８】
特定の開始シグナルを、hASIC1Bをコードする配列のさらに効率的翻訳を達成するために利用することもできる。そのようなシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。hASIC1Bをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入する場合は、さらなる転写または翻訳制御シグナルを必要としないであろう。しかし、コード配列、またはその部分だけを挿入する場合は、ATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、開始コドンは、全インサートの正しい翻訳を保証するために、正しいリーディングフレーム内にあることが必要である。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは自然および合成両方の、様々な起源であってよい。発現の効率は、文献に記載のように、使用する特定の細胞系に適当であるエンハンサーの封入により増強することができる（Scharfら, Results Probl Cell Differ 1994; 20: 125；Bittnerら, Meth Enzymol 1987; 153: 516）。
【００８９】
さらに、宿主細胞株は、挿入される配列の発現をモジュレートするまたは発現したタンパク質を所望の様式でプロセシングするその能力について選択してもよい。ポリペプチドのそのような修飾としては、限定されるものでないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられる。タンパク質の「プレプロ（prepro）」型を切断する転写後プロセシングを利用して、正しい挿入、フォールディングおよび／または機能を促進してもよい。そのような翻訳後活性に対して特定の細胞機構および特徴的な機構を有するCHO、HeLa、MDCK、HEK293、W138、およびCOSのような様々な宿主細胞を選択して、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証することができる。
【００９０】
好ましい発現系においては、cDNA種を直接アフリカツメガエル卵母細胞核中に挿入してそれによりin vitro翻訳させて機能的プロトンゲート調節チャンネルを形成し、そして上記チャンネルにより、in vivo特性を模擬するモデルアッセイに対して、イオン選択性、ゲート調節動力学、リガンド優先度、およびアミロライドなどの薬剤に対する感受性を含む、自然のプロトンゲート調節チャンネルの機能的特性を実証することができる。
【００９１】
組換えタンパク質の長期、高収率産生のためには、安定した発現が好ましい。例えば、安定してhASIC1Bを発現する細胞系を、ウイルスの複製起点および／または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を同じまたは別のベクター上に含有する発現ベクターを用いて形質転換してもよい。ベクターの導入後、細胞を１-２日間濃縮培地中で増殖し、その後、それらを選択培地に切換える。選択マーカーの目的は選択耐性を与えることであり、その存在は導入した配列を成功裏に発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定して形質転換された細胞の耐性クローンを、その細胞型に適当な組織培養技術を用いて増殖することができる。
【００９２】
選択系をいくつ使って形質転換細胞系を回収してもよい。それらとしては、限定されるものでないが、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, Cell 1977; 11: 223）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, Cell 1980; 22: 817）遺伝子が挙げられ、それぞれtk+-またはaprt+-cellsにおいて採用することができる。また、抗代謝物、抗生物質、または除草剤耐性を選択のベースとして利用することができる；例えば、メトトレキセート耐性を与えるdhfr（Wiglerら, Proc Natl Acad Sci 1980; 77: 3567）；アミノグリコシドネオマイシンおよびG-418耐性を与えるnpt（Colbere-Garapinら, J Mol Biol 1981; 150: 1）、そしてそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ耐性を与えるalsまたはpat（Murry LE、前掲）が挙げられる。さらなる選択遺伝子が記載されていて、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB、または細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするhisD（HartmanおよびMulligan, Proc Natl Acad Sci 1988 ; 85: 8047）が挙げられる。最近、可視マーカーの利用がアントシアニン、β-グルクロニダーゼおよびその基質GUSなどのマーカーによって普及し、かつルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンは形質転換体を同定するためだけでなく特定のベクター系に帰属する一過性または安定したタンパク質発現の量を定量するためにも使われている（Rhodesら, Methods Mol Biol 1995; 55: 121）。
【００９３】
マーカー遺伝子発現の存在／不在は目的の遺伝子も存在することを示唆するが、その存在および発現を確認する必要がありうる。例えば、もしhASIC1Bをコードする配列をあるマーカー遺伝子配列中に挿入すれば、hASIC1Bをコードする配列を含有する組換え細胞はマーカー遺伝子機能の不在により同定することができる。あるいは、マーカー遺伝子を、単一プロモーターの制御下でhASIC1Bをコードする配列と直列に配置してもよい。誘導または選択に応答するマーカー遺伝子の発現は通常、直列配置遺伝子の発現も示す。
【００９４】
あるいは、hASIC1Bのコード配列を含有しかつhASIC1Bを発現する宿主細胞は、当業者に公知の様々な方法により同定することができる。これらの方法としては、限定されるものでないが、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術が挙げられ、核酸またはタンパク質を検出および／または定量するための膜、溶液、またはチップに基づく技術を含むものである。
【００９５】
hASIC1Bをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは部分または断片を用いるDNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションまたは増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイは、hASIC1Bをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを利用してhASIC1BをコードするRNAまたはDNAを含有する形質転換を検出することに関わる。本明細書に使用される「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、プローブまたはアンプライマー（amplimer）として利用することができる、少なくとも約10個のヌクレオチドおよび約60個の数のヌクレオチド、好ましくは約15〜30個のヌクレオチド、そしてさらに好ましくは約20〜25個のヌクレオチドの核酸配列を意味する。
【００９６】
タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を利用して、hASIC1Bの発現を検出しかつ測定する様々なプロトコルが当技術分野で知られている。例としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、および蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）が挙げられる。hASIC1B上の２つの非妨害エピトープと反応性のあるモノクローナル抗体を利用する２部位、モノクローナルに基づくイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを採用してもよい。これらのおよび他のアッセイは、他の場所のなかでも、「Serological Methods: A Laboratory Manual（血清学的方法：研究室マニュアル）」, Hamptonら, APS Press, 1990, St-Paul, MI、およびMaddoxら, J Exp Med 1983; 158: 1211）に記載されている。
【００９７】
多様な標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られていて、様々な核酸技術およびアミノ酸アッセイに利用することができる。hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドに関係した配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはPCRプローブを作る方法としては、標識したヌクレオチドを用いる、オリゴラベリング、ニック翻訳、末端ラベリングまたはPCR増幅が挙げられる。あるいは、hASIC1Bまたはそのいずれかの部分をコードする配列を、mRNAプローブを産生するベクター中にクローニングしてもよい。そのようなベクターは当技術分野では知られており市販されていて、これらを利用してT7、T3またはSP6などの適当なRNAポリメラーゼおよび標識したヌクレオチドを加えることによりRNAプローブをin vitro合成することができる。これらの方法は、様々な市販キット：例えば、Pharmacia & Upjohn,（Kalamazoo、MI）；Promega（Madison、WI）；およびU. S. Biochemical Corp.（Cleveland、Ohio）、またはAmbion（Austin、TX）を用いて実施してもよい。利用しうる適当なレポーター分子または標識としては、放射核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素生産剤ならびに基質、補因子、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【００９８】
hASIC1Bをコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞を、細胞培養物からタンパク質を発現しかつ回収するのに適当な条件のもとで培養してもよい。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用する配列および／またはベクターに依存して、分泌されるか細胞内に含有される。当業者であれば理解しうるように、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを、原核生物または真核生物細胞膜を通してhASIC1Bの分泌を指令するシグナル配列を含有するように、設計することができる。他の組換え構築物を利用して、hASIC1Bをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にしうるポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列と接続してもよい。そのような精製を容易にするドメインとしては、限定されるものでないが、固定した金属上の精製を可能にするヒスチジン-トリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定した免疫グロブリン上の精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびFLAGS伸長／アフィニティ精製系で利用されるドメイン（Immunex Corp.、Seattle、WA）が挙げられる。精製ドメインとhASIC1Bの間に因子XAまたはエンテロキナーゼ（Invitrogen、San Diego、CA）に特異的なリンカー配列を封入すると、これを利用して精製を容易にすることができる。そのような発現ベクターの１つは、hASIC1B、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位、および続いて６個のヒスチジン残基を含有する融合タンパク質を発現する。ヒスチジン残基はIMIAC（固定金属イオンアフィニティクロマトグラフィ、Porathら, Prot Exp Purif 1992; 3: 263に記載）による精製を容易にする一方、エンテロキナーゼ切断部位は融合タンパク質からhASIC1Bを精製する方法を与える。融合タンパク質を含有するベクターの考察は、Krollら（DNA Cell Biol 1993; 12: 441）に記載されている。
【００９９】
組換え産生のほかに、hASIC1Bの断片を、固相技術を利用して直接ペプチド合成により作ることができる（Stewartら, 「Solid-Phase Peptide Synthesis（固相ペプチド合成）」, WH Freeman & Co., 1969, San Francisco, CA.；Merrifieldら, J Am Chem Soc 1963; 85: 2149を参照）。化学合成は手作業技術でまたは自動化を利用して実施してもよい。自動化合成は、例えば、アプライド・バイオシステム431A（Applied Biosystems 431A）ペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて実施できる。hASIC1Bの様々な断片を別々に化学合成し、化学的方法を用いて組合わせて全長分子を作ってもよい。
【０１００】
従って、本明細書に述べたように、本発明はプロトンゲート調節チャンネルタンパク質の新規サブファミリーであって、図１（配列番号）に記述した新規DNA配列、ならびに本発明のcDNAの最初の単離で採用したストリンジェンシーの条件と等しいかそれより高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件のもとでそれとハイブリダイズするDNA配列、および少なくとも部分的に縮重コドンの利用を介して上記対立遺伝子変異または類似のプロトンゲート調節チャンネルタンパク質をコードするDNA配列で例示される上記新規サブファミリーを提供する。本配列はまた、Cannessaら（Nature 1994; 367: 463）に記載の、他の密接に関係したこのサブファミリーのメンバーを位置付けしかつ同定するためにも利用することができる。
【０１０１】
本発明の新規タンパク質産物は、図１および配列番号２で記述したプロトンゲート調節チャンネルタンパク質の一次構造コンフォメーション（すなわち、アミノ酸配列）をもつポリペプチド、ならびにそのペプチド断片およびそのアミノ酸配列の複製である組み立てた合成ペプチドを含む。本発明のタンパク質、タンパク質断片および合成タンパク質もしくはペプチドは、診療、診断、および予後アッセイおよびプロトコルを含む、先に記載した用途を有することを計画し、チャンネルタンパク質と特異的に反応性のあるモノクローナルおよびポリクローナル抗体の基礎を提供しうる。
【０１０２】
治療薬
本発明の他の実施形態においては、hASIC1Bまたはその断片を治療目的に使用することができる。hASIC1B（配列番号2）および他のASIC受容体（図２）の間の化学的および構造的相同性、ならびにhASIC1B転写物は独占的でないが主に末梢および中枢神経系の細胞に関連することを示すRT-PCRおよびノーザンブロット分析に基づいて、hASIC1Bは神経伝達物質放出、神経興奮性、興奮毒性または機械感覚の調節に或る役割を果たすと考えられる。実際、分泌顆粒およびシナプス小胞は高濃度のプロトン（低い小胞内pH）を含有することが知られていて、このプロトンは調節されたかつ構成的な開口分泌中に他の神経伝達物質と同時放出される。こうして、放出されたプロトンは前および／または後シナプス、またはシナプス外のhASIC1B受容体を活性化しうる。実際、ある特定の条件下では、低pHまたは細胞外アシドーシスはシナプス伝達ならびに長期増強の誘導に影響を与えることが示されている（Igelmundら, Brain Res 1995; 689: 9；Velisekら, Hippocampus 1998; 8: 24）。また、ある特定の動物発作モデルにおいて、低pHの神経保護効果も観察されている（Velisekら, Exp Brain Res 1994; 101: 44）。ASIC2Aはノックアウト動物を用いる機械検出に直接関係づけられている。さらに、hASIC1Bの第１エキソン中の特定の反復構造は、細胞骨格との相互作用またはアンカリングなどの複数の特定機能を示しうる。従って、hASIC1Bは機械ゲート調節イオンチャンネル（mechanogated ion channel）の重要な要素を構成しうる。従って、hASIC1Bの重要な用途は、神経伝達物質放出、シナプス効力、神経興奮性、または神経毒性を調節する化合物のスクリーニングである。このような化合物は、例えば、認知、知覚、学習、記憶、痛みおよびその他多くの関係する複数の生理学的および病理学的状況において有用でありうる。
【０１０３】
一実施形態においては、該タンパク質のアンタゴニストもしくはインヒビターまたはアンチセンス配列を発現するベクターを用いて、改変されたイオン輸送、シグナル伝達、およびアポトーシスから生じる神経系の障害および疾患を治療することができる。そのような疾患としては、限定されるものでないが、慢性痛み、炎症性痛み、糖尿病、癌およびAIDSに関係する神経障害性痛み、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト‐ヤーコプ病、および筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、およびAIDSに関係するものを含む痴呆、ならびに、痙攣、癲癇、卒中、および不安と鬱病が挙げられる。
【０１０４】
他の実施形態においては、該タンパク質のアンタゴニストもしくはインヒビターまたはアンチセンス配列を発現するベクターを用いて、アンギナ、鬱血性心疾患、血管狭窄、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、および出血などの循環器病を治療することができる。
【０１０５】
他の実施形態においては、該タンパク質のアンタゴニストもしくはインヒビターまたはアンチセンス配列を発現するベクターを用いて、生殖系、特に雄性不妊症の障害および疾患を治療することができるし、あるいはこれらを雄性避妊剤として用いることもできる。
【０１０６】
活性を増強するアゴニストおよびhASIC1Bの効果をブロックまたはモジュレートするアンタゴニストを、そのような増強または阻害が治療上所望である状況のもとで用いることができる。そのようなアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターは、当技術分野で一般的に知られる方法を利用して作ることができ、特に精製hASIC1Bを用いて抗体を産生させるかまたは医薬のライブラリーをhASIC1Bと特異的に結合する医薬についてスクリーニングすることに関わる。例えば、一態様においては、hASIC1Bに対して特異的である抗体を、アンタゴニストとして直接利用するか、またはhASIC1Bを発現する細胞もしくは組織へ医薬を運ぶためのターゲティングまたは送達機構として間接的に利用することができる。
【０１０７】
抗体は当技術分野で周知の方法を利用して作製することができる。そのような抗体としては、限定されるものでないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーにより産生したフラグメントが挙げられる。中和化抗体（すなわち、二量体形成を阻害する抗体）は治療用途に特に好ましい。
【０１０８】
抗体を生産するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、その他を含む様々な宿主を、hASIC1Bまたは免疫原性を有するそのいずれかの断片またはオリゴペプチドを用いる注射により免疫感作してもよい。宿主種に依存して、様々なアジュバントを用いて免疫応答を増加することができる。そのようなアジュバントとしては、限定されるものでないが、水酸化アルミニウムなどのフロイントのミネラルゲル、およびリゾレシチンなどの表面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化液、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールが挙げられる。ヒトに用いるアジュバントの中では、BCG（bacilli Calmette-Guerin）およびコリネバクテリウム・パルヴム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０１０９】
hASIC1Bに対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片、またはオリゴヌクレオチドは少なくとも５個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも10個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい。それらが自然タンパク質のアミノ酸配列の部分と同一であり、そして小さい天然分子の全アミノ酸配列を含有しうることも好ましい。hASIC1Bアミノ酸の短い伸長部をキーホールリンペットヘモシアニンおよびキメラ分子に対して産生した抗体などの他のタンパク質の伸長部と融合してもよい。
【０１１０】
hASIC1Bに対するモノクローナル抗体は、連続培養細胞系により抗体分子を産生するいずれの技術を利用して調製してもよい。これらとしては、限定されるものでないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイドーマ技術が挙げられる（Koehlerら Nature 1975; 256: 495；Kosborら, Immunol Today 1983; 4: 72；Coteら, Proc Natl Acad Sci 1983; 80: 2026；Coleら, 「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy（モノクローナル抗体と癌治療）」, Alan R. Liss Inc., 1985, New York, NY, pp.77-96）。
【０１１１】
さらに、「キメラ抗体」を産生するために開発された技術であって、マウス抗体遺伝子をスプライシングしてヒト抗体遺伝子とし、適当な抗原特異性および生物学的活性をもつ分子を得る上記技術を利用することができる（Morrisonら (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-6855；Neubergerら (1984) Nature 312: 604-608；Takedaら (1985) Nature 314: 452-454）。あるいは、１本鎖抗体を産生するための記載された技術を、当技術分野で知られる方法を用いて、hASIC1B特異的１本鎖抗体を産生するのに適応させることができる。関係する特異性をもつが、異なるイディオタイプ組成の抗体を無作為コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからチェーンシャッフリング（chain shuffling）を利用して作製してもよい（Burton, D. R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 11120-3）。
【０１１２】
抗体はまた、リンパ球集団でin vivo産生を誘導することにより、または免疫グロブリンライブラリーもしくは高度に特異的結合をする試薬のパネルをスクリーニングすることにより産生することができ、これらは文献に開示されている（Orlandiら (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 3833-3837；Winter, G.ら (1991) Nature 349: 293-299）。
【０１１３】
hASIC1Bとの特異的結合部位を含有する抗体フラグメントを作製することもできる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定されるものでないが、抗体分子のペプシン消化により作ることができるF(ab')2フラグメントおよびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作製することができるFabフラグメントが挙げられる。あるいは、Fab発現ライブラリーを構築して、所望の特異性をもつモノクローナルFabフラグメントを迅速かつ容易に同定できるようにしてもよい（Huseら (1989) Science 256: 1275-1281）
様々なイムノアッセイを利用してスクリーニングを行い、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性をもつポリクローナルまたはモノクローナル抗体を利用する競合結合または免疫放射線測定アッセイ用の多数のプロトコルが、当技術分野では周知である。そのようなイムノアッセイは、典型的には、hASIC1Bとその特異的抗体との複合体形成の測定に関わる。２つの非干渉性hASIC1Bエピトープと反応性のあるモノクローナル抗体を利用する２部位、モノクローナルに基づくイムノアッセイが好ましい、しかし競合アッセイを採用してもよい（Maddox、前掲）。
【０１１４】
本発明の他の実施形態においては、hASIC1B、またはそのいずれかの断片をコードするポリヌクレオチド、またはアンチセンス配列を治療目的に使用することができる。一態様においては、タンパク質の合成をブロックするのが所望である状況において、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスを利用してもよい。特に、細胞を、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドと相補的な配列を用いて形質転換してもよい。従って、アンチセンス配列を利用してhASIC1B活性をモジュレートするか、または遺伝子機能の調節を達成することができる。そのような技術は現在、当技術分野で周知であり、hASIC1Bをコードする配列のコード領域または制御領域に沿った様々な位置からなる、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたはさらに大きな断片を設計することができる。
【０１１５】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスもしくはワクシニアウイルスから、または様々な細菌プラスミドから誘導された発現ベクターを、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達するために利用することができる。当技術分野で周知の方法を利用して、hASIC1Bをコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチドを発現しうる組換えベクターを構築してもよい。これらの技術は、Sambrookら（前掲）とAusubelら（前掲）の両方に記載されている。
【０１１６】
hASIC1Bをコードする遺伝子を、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現する発現ベクターによって細胞または組織を形質転換することにより、消す（turn off）ことができる。そのような構築物を用いて翻訳不能なセンスまたはアンチセンス配列を細胞中に導入することができる。DNA中に組込まれなくてもそのようなベクターは、最後に全コピーは内因性ヌクレアーゼにより無能化されるまでRNA分子を転写し続ける。
【０１１７】
非複製ベクターによる一過性発現は１ヶ月以上、もし適当な複製エレメントがベクター系の部分であればもっと長く持続しうる。
【０１１８】
以上述べたように、遺伝子発現の改変は、hASIC1Bをコードする遺伝子の制御領域、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンに対するアンチセンス分子、DNA、RNAまたはPNAを設計することにより達成することができる。転写開始部位、例えば、転写物の5'末端からの位置-10および+10の間、から誘導したオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、阻害は、「３重らせん体（triple helix）」に基づく対合手法によって達成することができる。３重らせん体対合が有用であるのは、それが２重らせん体のポリメラーゼ、転写因子、もしくは調節分子と結合するために十分に開く能力を阻害するからである。最近の３本鎖DNAを用いる治療の進歩は文献に記載されている（Gee, J. E.ら (1994) In : Huber, B. E.およびCarr, B. I. 「Molecular and Immunologic Approaches（分子および免疫学的手法）」, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y.）。アンチセンス分子も、転写物のリボソームとの結合を阻止することにより、mRNAの翻訳をブロックするように設計することができる。
【０１１９】
リボザイム、すなわち酵素RNA分子も、RNAの特異的切断を触媒するのに利用することができる。リボザイムの作用機構は、リボザイム分子の相補的な標的RNAとの配列特異的ハイブリダイゼーションとそれに続くヌクレオチド鎖分解による切断に関わる。利用しうる例としては遺伝子操作したハンマーヘッドモチーフリボザイム分子が挙げられ、hASIC1Bをコードする配列のヌクレオチド鎖分解切断を特異的かつ効率的に触媒することができる。
【０１２０】
最初に標的分子をGUA、GUU、およびGUCの配列を含むリボザイム切断部位について走査することによって、あらゆる潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位を同定する。いったん同定されれば、切断部位を含有する標的遺伝子の領域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの短いRNA配列を、オリゴヌクレオチドを機能しないようにする二次構造的特徴について評価することができる。候補標的の適性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するアクセシビリティを試験することによって評価することもできる。
【０１２１】
本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、RNA分子の合成に対する当技術分野で知られるいずれの方法により調製してもよい。これらは、固相ホスホロアミダイト化学合成などのオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術を含む。あるいは、RNA分子をhASIC1BをコードするDNA配列のin vitroおよびin vivo転写により作製してもよい。そのようなDNA配列を様々なベクター中に、T7またはSP6などの適当なRNAポリメラーゼプロモーターとともに組込むことができる。あるいは、アンチセンスRNAを構成的にまたは誘導的に合成するこれらのcDNA構築物を、細胞系、細胞、または組織中に導入してもよい。
【０１２２】
RNA分子を改変して細胞内安定性および半減期を増加することができる。可能な改変としては、限定されるものでないが、分子の5'および／または3'末端におけるフランキング配列の付加、または分子の主鎖内でのホスホジエステル結合よりむしろホスホロチオエートまたは2'O-メチルの使用が挙げられる。この概念はPNAの産生に固有のものであって、内因性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないイノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル-、メチル-、チオ-、および類似の改変型などの非伝統的塩基を含むこれらの分子の全てに拡張することができる。
【０１２３】
ベクターを細胞または組織中に導入するための多くの方法が、in vivo、in vitro、およびex vivoの使用に利用しうるしかつ等しく適当である。ex vivo治療のため、ベクターを患者から採取した幹細胞中に導入し、クローニングにより増殖して自家移植体として同じ患者に戻すことができる。トランスフェクションによるおよびリポソーム注入による送達は当技術分野で周知の方法を利用して実施することができる。
【０１２４】
上記のあらゆる治療法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトなどの哺乳類動物を含むいずれの適当な被験体にも適用することができる。
【０１２５】
本発明のさらなる実施形態は、以上考察したいずれかの治療効果をあげるために、医薬組成物を製薬上許容される担体と一緒に投与することに関する。そのような医薬組成物は、hASIC1B、hASIC1Bに対する抗体、hASIC1Bの模倣物（mimetic）、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターでありうる。該組成物は単独で、またはいずれかの安定化化合物などの少なくとも１つの他の薬剤と組合わせて投与してもよく、限定されるものでないが、塩類、緩衝化塩類、デキストロース、および水を含む無菌で生体適合性の製薬担体に入れて投与してもよい。組成物を単独でまたは他の薬剤、薬物またはホルモンと一緒に患者に投与してもよい。
【０１２６】
本発明において利用する医薬組成物は、限定されるものでないが、経口、静脈内、筋内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸による方法を含むいずれの数の径路により投与してもよい。これらの医薬組成物は、活性成分のほかに、活性化合物の医薬上使用しうる調製物への加工を容易にする賦形剤および助剤を含む適当な製薬上許容される担体を含有してもよい。製剤および投与のための技術のさらなる詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントンの製薬科学）」（Maack Publishing Co., Easton, Pa.）の最新版に見出しうる。
【０１２７】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野で周知の製薬上許容される担体を用いて経口投与に適した投与量で製剤することができる。そのような担体により、医薬組成物を患者による摂取のための錠剤、ピル、糖剤、カプセル、液剤、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤することができる。
【０１２８】
経口用の医薬調製物は、活性化合物と固体賦形剤とを組合わせ、場合によっては得られる混合物を粉砕しかつ、もし所望であれば、錠剤または糖衣コアを得るための適当な助剤を加えた後に顆粒の混合物を加工することを通して、得ることができる。適当な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質フィラー、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物からのデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース；アラビックおよびトラガカントを含むガム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。もし所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を加えてもよい。
【０１２９】
糖剤コアを、アラビックゴム、ポリビニルピロリドン、カルボポルジェル（carbopol gel）、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および有機溶媒または溶媒混合液も含有する高濃度糖溶液のような、適当なコーティングと一緒に使ってもよい。製品同定のためにまたは活性化合物の量すなわち、投与量を特徴付けるために、染料または含量を錠剤または糖剤コーティングに加えてもよい。
【０１３０】
経口用に使用しうる医薬調製物としては、ゼラチンで作ったプッシュ-フィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングで作ったシールしたソフトカプセルが挙げられる。プッシュ-フィットカプセルは、ラクトースまたはデンプンなどのフィラーまたは結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合によっては、安定剤と混合した活性成分を含有してもよい。ソフトカプセルでは、活性化合物を、脂肪油液、または液状ポリエチレングリコールなどの適当な液中に安定剤とともにまたはなしで溶解または懸濁してもよい。
【０１３１】
非経口投与用に適当である医薬製剤は、水溶液、好ましくはハンク（Hank）溶液、リンゲル（Ringer）溶液、または緩衝化生理食塩水などの生理学的に適合しうるバッファーに入れて製剤することができる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加する物質を含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製することもできる。適当な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。場合によっては、懸濁液はまた、適当な安定剤または化合物の溶解度を増加して高濃度溶液の調製を可能にする薬剤を含有してもよい。
【０１３２】
局所または経鼻投与に対しては、透過すべき特定のバリヤーにとって適当な貫入剤を製剤に用いる。そのような貫入剤は、当技術分野で公知である。
【０１３３】
本発明の医薬組成物は、当技術分野で知られる方法、例えば、通常の混合、溶解、造粒、糖衣、磨砕、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥の方法により製造することができる。
【０１３４】
医薬組成物は、塩として与えてもよく、かつ、限定されるものでないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などの多数の酸を用いて作ることができる。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水溶液または他のプロトン性溶媒中によく溶解する傾向がある。他の事例では、好ましい調製物は凍結乾燥粉末であって、1-50mM ヒスチジン、0.1％-2％スクロース、および2-7％マンニトールのいずれかまたは全てを含有してもよく、pH範囲は4.5から5.5であり、使用前にバッファーと組合わせる。
【０１３５】
医薬組成物を調製した後に、それらを適当な容器に収納して治療の適応症に対するラベルを付ける。そのようなラベルは、hASIC1Bの投与についての量、頻度、および治療方法を含みうる。本発明における使用に適当な医薬組成物は、活性成分を意図する目的を達成するために有効な量だけ含有する組成物を含む。有効な用量は当業者の能力により十分決定できる。
【０１３６】
いずれの化合物についても、治療上有効な用量は、最初に、例えば新生物細胞の細胞培養アッセイ、または、通常、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタである動物モデルにおいて評価することができる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与径路を決定するために利用してもよい。次いで、そのような情報を用いてヒトにおける投与に対する有効な用量および径路を決定する。治療上有効な用量は、症候群または症状を改善する活性成分、例えばhASIC1Bまたはその断片、hASIC1Bの抗体、hASIC1Bのアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターの量を意味する。治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物において標準の製薬上の方法により決定することができ、例えば、ED50（集団の50％において治療上有効な用量）およびLD50（集団の50％に対する致死用量）である。治療と毒性効果の間の用量比が治療指数であり、比LD50/ED50として表すことができる。
【０１３７】
大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータをヒトに用いる用量範囲を製剤するのに利用する。そのような組成物に含有される投与量は、好ましくはED50を含みかつ毒性が少ししかないかまたは全く無い循環濃度の範囲内にある。投与量はこの範囲内で、利用する投与剤形、患者の感受性、および投与径路に依存して変化する。
【０１３８】
正確な投与量は、開業医が、治療を必要とする被験者に関する諸因子を照合して決定しうる。投与量および投与は、十分なレベルの活性部分を与えるかまたは所望の効果を維持するように調節する。考慮すべき因子としては、病状の重篤度、被験者の一般的健康状態、年齢、体重、および被験者の性別、食事、投与の時間および頻度、薬物組合わせ、反応感受性、ならびに治療に対する耐性／応答性が挙げられる。長期作用医薬組成物を、特定の製剤の半減期およびクリアランス率に依存して、３または４日毎、毎週、または隔週投与してもよい。
【０１３９】
通常の投与量は、投与径路に依存して、0.1〜100,000μg、全用量約１ｇまで変化しうる。特定の投与量および送達の方法に関する手引きは文献に与えられていて、一般的に当技術分野の開業医は利用しうる。当業者であれば、ヌクレオチドに対しては、タンパク質またはそのインヒビターに対するのと異なる製剤を採用するであろう。同様にポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、条件、部位などに対して特異的であろう。
【０１４０】
診断
他の実施形態においては、hASIC1Bと特異的に結合する抗体を、hASIC1Bの発現が特徴である症状または疾患の診断に、またはhASIC1B、アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターを用いて治療する患者をモニターするアッセイに利用することができる。診断の目的に有用な抗体は、上記の治療用抗体と同じ要領で調製することができる。hASIC1Bの診断アッセイは、ヒトの体液または細胞もしくは組織の抽出物中のhASIC1Bを検出するために抗体および標識を利用する方法を含む。抗体は、改変してまたは改変しないで利用してもよく、かつそれらを共有結合もしくは非共有結合によりレポーター分子と接続することにより標識してもよい。当技術分野で知られる広範囲のレポーター遺伝子を利用することができるのであって、それらの数例を上に記載した。
【０１４１】
hASIC1Bを測定するための、ELISA、RIA、およびFACSを含む様々なプロトコルが当技術分野では知られていて、改変されたまたは異常なhASIC1B発現のレベルを診断する基準を提供する。hASIC1B発現の正常または標準値は、正常な哺乳類被験者、好ましくはヒトから採取した体液または細胞抽出物をhASIC1Bに対する抗体と、複合体形成に適当な条件のもとで組合わせることにより確立する。標準複合体形成の量は、様々な方法により、好ましくは測光手段により定量することができる。対照および罹患被験者において生検組織からのサンプルに発現したhASIC1Bの量を標準値と比較する。標準値と被験者値の間の偏差が、疾患を診断するためのパラメーターとなる。
【０１４２】
本発明の他の実施形態においては、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドを診断の目的に利用することができる。利用しうるポリヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNAおよびDNA分子、およびPNAが挙げられる。ポリヌクレオチドは、hASIC1Bの発現が疾患と相関のある生検組織中の遺伝子発現を検出しかつ定量するのに利用することができる。診断アッセイを利用して、hASIC1Bの不在、存在、および過剰発現を識別し、かつ治療介入中のhASIC1Bレベルの調節をモニターすることができる。
【０１４３】
一態様においては、hASIC1Bもしくは密接に関係した分子をコードする、ゲノム配列を含む、ポリヌクレオチドを検出できるPCRプローブとのハイブリダイゼーションを利用して、hASIC1Bをコードする核酸配列を同定することができる。プローブの特異性、すなわち、それが高度に特異的領域、例えば、5'調節領域における10個のユニークなヌクレオチド、または例えば、特に3'コード領域における低度に特異的領域からなるかどうか、およびハイブリダイゼーションまたは増幅のストリンジェンシー（最大、高、中、または低）が、そのプローブがhASIC1Bをコードする天然配列だけ、対立遺伝子、または関係する配列を同定するかどうかを決定しうる。
【０１４４】
プローブはまた、関係配列を検出するために利用することもでき、その場合、好ましくはhASIC1Bをコードする配列のいずれか由来のヌクレオチドを少なくとも50％を含有しなければならない。本発明のハイブリダイゼーションプローブはDNAまたはRNAであってもよく、かつ配列番号１のヌクレオチド配列からまたは天然hASIC1Bのプロモーター、エンハンサーエレメント、およびイントロンを含むゲノム配列から誘導してもよい。
【０１４５】
hASIC1BをコードするDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを産生する方法は、hASIC1BまたはhASIC1B誘導体をコードする核酸配列を、mRNAプローブを産生するベクター中にクローニングするステップを含む。そのようなベクターは当技術分野で知られかつ市販されているので、それを用いて、適当なRNAポリメラーゼと適当な標識したヌクレオチドを加える方法により、RNAプローブをin vitro合成することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、様々なレポーターグループ、例えば、32Pまたは35Sなどの放射性核種、またはアビジン／ビオチン結合系を経由してプローブと結合したアルカリホスファターゼなどの酵素標識などにより標識することができる。hASIC1Bをコードするポリヌクレオチド配列は、hASIC1Bの発現に関連する症状または疾患の診断に利用することができる。症状または疾患の例としては、慢性痛み、糖尿病、癌、およびAIDSに関係する神経障害性痛み、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチンソン病、クロイツフェルト‐ヤーコプ病、および筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患、およびAIDSに関係するものなどの痴呆、ならびに、痙攣、癲癇、卒中、および不安と鬱病、アンギナ、鬱血性心疾患、血管狭窄、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、および出血などの循環器病が挙げられる。患者生検から得た体液または組織を用いるサザンまたはノーザン分析、ドットブロット、または他の膜に基づく技術；PCR技術；またはディップスティック（dip stick）、ピン、ELISAまたはチップアッセイにおいて、hASIC1Bをコードするポリヌクレオチド配列を利用して、hASIC1Bの改変された発現を検出することができる。そのような定性または定量的方法は当技術分野において周知である。
【０１４６】
特定の態様においては、hASIC1Bをコードするヌクレオチド配列は様々な神経学的または他の非神経学的障害、特に以上記載した障害を検出するアッセイに有用である。hASIC1Bをコードするヌクレオチド配列を標準の方法により標識し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適当である条件下で、患者から採取した液または組織サンプルに加えてもよい。適当なインキュベーション時間の後、サンプルを洗浄してシグナルを定量して標準値と比較する。もし生検もしくは抽出サンプル中のシグナルの量が比較しうる対照サンプルのそれから有意に変化していれば、上記ヌクレオチド配列はサンプル中のヌクレオチド配列とハイブリダイズしていて、サンプル中のhASIC1Bをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化が関連疾患の存在を示す。またそのようなアッセイを利用して、動物研究、臨床研究、または個々の患者の治療モニタリングにおける特定の治療処置体制の有効性を評価することもできる。
【０１４７】
hASIC1Bの発現に関連する疾患の診断に対する基準を与えるために、発現の正常または標準プロフィールを確立した。これは、動物またはヒトの正常な被験者から採取した体液または細胞抽出物を、hASIC1Bをコードする配列もしくはその断片と、ハイブリダイゼーションまたは増幅に適当な条件下で組合わせることにより実施することができる。標準ハイブリダイゼーションは、正常な被験者から得た値と実質的に精製したポリヌクレオチドの既知量を用いた実験から得た値とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得た標準値を疾患の徴候がある患者由来のサンプルから得た値と比較してもよい。標準と被験者値との間の偏差を用いて疾患の存在を確立する。
【０１４８】
いったん疾患を確立して処置プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的基準で繰返し、患者における発現のレベルが通常の患者で観察されるレベルに近づき始めるかどうかを評価する。逐次アッセイから得た結果を用いて、数日から数ヶ月の範囲の期間にわたる治療の有効性を示すことができる。
【０１４９】
神経学的疾患に関して、個人からの生検組織中の転写物の比較的高い量は、その疾患の発生に対する素因を示すかまたは実際の臨床症候群出現に先立って疾患を検出する手段を提供しうる。このタイプのより明確な診断により、保健専門家は予防的対策または攻撃的治療を早い段階で採用し、それにより疾患の発生またはさらなる進行を防止することができる。
【０１５０】
hASIC1Bをコードするオリゴヌクレオチドのさらなる診断上の用途は、PCRの用途に関わりうる。そのようなオリゴマーは、化学的に合成し、酵素によって作製し、または組換え供給源から産生することができる。オリゴマーは好ましくは２つのヌクレオチド配列、１つはセンス方向そして他の１つはアンチセンスからなり、特定の遺伝子または症状を同定するための最適な条件のもとで使用する。同じ２つのオリゴマー、すなわちオリゴマーのネスト化セットまたはオリゴマーの縮重プールでも、より低いストリンジェンシーの条件下で、密接に関連したDNAまたはRNA配列の検出および／または定量に利用することができる。
【０１５１】
hASIC1Bの発現を定量するために利用しうる方法としてはまた、放射標識またはビオチン化ヌクレオチド、対照核酸の同時増幅、および実験結果を内挿した標準曲線も挙げられる（Melby, P. C.ら (1993) J. Immunol. Methods, 159: 235-244；Duplaa, C.ら (1993) Anal. Biochem. 229-236）。多サンプルの定量速度は、アッセイを、目的のオリゴマーを様々な希釈度で提示しかつ分光光度または比色応答が高速の定量値を与えるELISAフォーマットで実施することにより加速することができる。
【０１５２】
本発明の他の実施形態においては、hASIC1Bをコードする核酸配列を利用して、天然ゲノム配列をマッピングするのに有用であるハイブリダイゼーションプローブを作製することもできる。周知の技術を用いて、配列を特定の染色体に、または染色体の特定領域にマッピングすることができる。そのような技術としては、FISH、FACS、または酵母人工染色体などの人工染色体構築物、細菌人工染色体、細菌P1構築物または単一染色体cDNAライブラリーが挙げられ、Price, C. M.（1993; Blood Rev. 7: 127-134）およびTrask, B. J.（1991; Trends Genet. 7: 149-154）の総説に記載されている。
【０１５３】
FISH（Vermaら (1988) 「Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques（ヒト染色体：基礎技術のマニュアル）」, Pergamon Press, New York, N.Y.に記載）は他の物理的染色体マッピング技術および遺伝子マップデータと相関がありうる。遺伝マップデータの例は、1994年「Genome Issue of Science（Scienceのゲノム特集号）」（265:1981f）に見ることができる。hASIC1Bをコードする遺伝子の物理的染色体マップ上の位置と特定疾患または特定疾患に対する素因との相関は、遺伝病に関連するDNAの領域を限定するのに役立ちうる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者、保有者、または罹患者の間の遺伝子配列の差を検出することができる。
【０１５４】
染色体調製物のin situハイブリダイゼーションおよび確立した染色体マーカーを用いる連鎖解析などの物理的マッピング技術は、遺伝地図を広げるために利用することができる。特定のヒト染色体の番号またはアームが未知であっても、しばしば、マウスなどの他の哺乳類動物種の染色体上の遺伝子の配置が関連するマーカーを示しうる。物理的マッピングにより、新しい配列を、染色体アームまたはその部分に割当てることができる。これは、研究者が位置クローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探すための貴重な情報を与える。いったん疾患または症候群が、遺伝連鎖により、大雑把に特定のゲノム領域、例えばAT〜11q22-23に局在化されると（Gattiら (1988) Nature 336: 577-580）、その領域にマッピングするいずれの配列もさらなる研究のための関連または調節遺伝子となりうる。本発明のヌクレオチド配列はまた、正常者、保有者、または罹患者の間の転座（translocation）、逆位（inversion）などによる染色体位置の差を検出するのに利用することもできる。
【０１５５】
スクリーニングアッセイ
本発明の他の実施形態においては、hASIC1B、その触媒または免疫原性断片またはそのオリゴマーを利用して、様々な薬物スクリーニング技術のいずれかにおいて、化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。そのようなスクリーニングに採用する断片は、溶液中に遊離していても、固体支持体に付着していても、細胞表面上に保持されていても、または細胞内に位置してもよい。hASIC1Bと試験する薬剤との間の結合複合体の形成を測定してもよい。このようにして、本発明のポリペプチドはまた、小分子基質と、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、および自然産物混合物中のリガンドとの結合を評価するために利用してもよい。これらの基質とリガンドは自然の基質とリガンドであってもよいしまたは構造的もしくは機能的模倣物であってもよい。一般的に、そのようなスクリーニング方法は、その表面上に本発明の受容体ポリペプチドを発現する適当な細胞を作ることに関わる。そのような細胞としては、哺乳類動物、酵母、昆虫（例えば、ショウジョウバエ）または細菌（例えば、大腸菌（E. coli））が挙げられる。次に、受容体を発現する細胞（または、発現した受容体を含有する細胞膜）を試験化合物と接触させて、結合、または機能的応答の刺激もしくは抑制（例えば、プロトン活性化電流の抑制）を観察する。
【０１５６】
アッセイは候補化合物の結合を単純に試験してもよく、その場合、受容体を担う細胞に対する接着を、直接または間接に候補化合物に関連する標識を使うことによるか、または標識した競合物との競合に関わるアッセイで検出する。さらに、これらのアッセイは、受容体の活性化により発生するシグナルを候補化合物が生じるかどうかを、その表面に受容体を担う細胞に適当な検出系（例えば、パッチクランプによるか、または好ましくはイオンイメージングにより測定したイオン透過の増加）を用いて試験してもよい。活性化のインヒビターは一般的に既知のアゴニスト（agonist）（例えば、プロトン）の存在のもとでアッセイし、アゴニストによる活性化に対する候補化合物の効果を観察する。そのようなスクリーニングアッセイを実施する標準的方法は当技術分野では十分理解されている。典型的には、その応答を細胞の電圧固定（voltage clamping）のような測定方法を伴うマイクロ電極技術を利用して測定し、その場合、イオンチャンネルの活性化はマイクロ電極を用いて検出した内向きまたは外向き電流により確認することができる。22Na、86Rb、45Ca放射標識陽イオンまたは14Cもしくは3Hグアニジンを用いてそのようなイオン流束を評価してもよい；ナトリウム、カルシウムまたはカリウムイオン感受性染料（例えば、フラ-２（Fura-2）、またはインド（Indo））を用いて受容体イオンチャンネルを通してのイオン通過をモニターしてもよいし、または電位感受性染料を用いて脱分極などの電位変化をモニターしてもよい。
【０１５７】
あるいは、構成的活性hASIC1Bチャンネルを作る目的で、hASIC1B cDNAを突然変異することも可能であり、これは他のDEG/EnaCファミリーメンバーで示されている（Huangら, Nature 367: 467；Waldmanら, J Biol Chem 1997: 271; 10433）。そして、構成的活性hASIC1Bチャンネルを宿主細胞に発現させて、チャンネル活性が不変であるスクリーニングアッセイを作ることができる。チャンネル活性の記録は、直接的に（例えば、パッチクランプ）もしくは間接的に（例えば、蛍光プローブ）膜電圧分析によりまたはナトリウム進入測定（放射性ナトリウム流入流束、蛍光プローブ、またはレポーター遺伝子）により実施することができる。
【０１５８】
利用しうる他の薬物スクリーニングの技術は、目的のタンパク質と適当な結合アフィニティを有する化合物のハイスループット・スクリーニングを提供し、公開PCT出願特許W084/03564に記載の通りである。この方法においては、hASIC1Bに適用する場合、多数の様々な小分子試験化合物を固相基質、例えば、プラスチックピンまたはその他の表面上に合成する。該試験化合物をhASIC1Bまたはその断片と反応させ、そして洗浄する。結合したhASIC1Bを次いで当技術分野で周知の方法により検出する。精製したhASIC1Bを直接プレート上にコートして上記の薬物スクリーニング技術に利用してもよい。あるいは、非中和化抗体を利用してペプチドを捕獲してそれを固体支持体上に固定してもよい。
【０１５９】
他の実施形態においては、hASIC1Bと結合しうる中和化抗体がhASIC1Bとの結合について試験化合物と特異的に競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを利用してもよい。この方式においては、抗体を用いて、１以上の抗原決定基をhASIC1Bと共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。
【０１６０】
さらなる実施形態においては、hASIC1Bをコードするヌクレオチド配列を今後開発されるいずれの分子生物学技術に使用してもよい、ただし、上記新技術は、限定されるものでないが、トリプレット遺伝子コードおよび特定の塩基対相互作用のような特性を含む、現在公知のヌクレオチド配列の特性に依ることを条件とする。
【実施例】
【０１６１】
実施例
以下の実施例は本発明をさらに説明することを意図するものであり、本発明の範囲をいずれの方法でも限定することを意図するものではない。今までまたは以下の実施例においてのいずれであれ、本明細書に引用した全ての参考文献は、その全文が参照により明白に組み入れられる。
【０１６２】
実施例１：hASIC1Bタンパク質をコードする全長cDNAのクローニング
ラットASIC1B Ｎ末端ポリペプチドの特徴をもつ選択したポリペプチドモチーフを用いる全GenBankデータベースのblastサーチにより、ヒトゲノムポリヌクレオチド分子（GenBank受託：AC025154、AC074032、AC025361）を検索した。次いで、上に引用したゲノムcDNA配列の、クローニングしたASICファミリーメンバーとの配列比較およびアラインメントならびにコンセンサスイントロン／エキソンスプライシング部位に基づく方法論的解析により、新規ヒトASICサブユニット（本明細書でhASIC1Bと名づけた）を同定することができた。開示されたラットASIC1Bとのアラインメントは、両方の受容体が5-プライム末端で異なることおよびヒト受容体の開始メチオニンが明らかでないことを直接、示した。同定したヒト配列は３つの潜在的開始部位を含有するので（図１参照）、３つの推定hASIC1B構築物を調製した。機能分析はhASIC1B受容体の最長バージョンだけが機能的であったことを表したので、これが実際のヒト受容体を構成するものであり、それをRT-PCRにより確認した。ASIC受容体のコード領域のアラインメントは、hASIC1B開始セグメントがhASIC4領域と類似性を示すことを表す。hASIC1Bの実際の構築は、配列番号３および配列番号４の特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、逆転写ヒト三叉神経節cDNAからhASIC1Bの5-プライム末端のRT-PCR増幅により達成した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、TaqおよびPwoポリメラーゼ（Roche Diagnostics、以前はBoehringer Mannheimから）の両方を含有するEXPANDロングテンプレートポリメラーゼミックス（long-template polymerase mix）を用いて実施した。反応条件は製造業者の指示書に従った。簡単に説明すると、反応混合物は：dNTPs 0.5mM、フォワードおよびリバースプライマーそれぞれ1μM、RT-cDNAテンプレート5μL、10x PCRバッファー5μLおよびポリメラーゼ酵素ミックス0.75μLを含み、全部で最終容積50μLとした。サンプルを４℃に保って、酵素ミックスを最後に加えた。次いでチューブをサーマルサイクラーに直接移して94℃に予熱し、その後、サイクリングを始動した。典型的なサイクリング条件は次の通りであった：最初の変性ステップ：94℃にて２分間、次いで94℃にて45秒、58℃にて45秒および72℃にて２分間の40サイクル、その後に72℃にて10分間の最終伸長ステップ。ヒト三叉神経節由来のRT-cDNAは、RNAまたはmRNAからスーパースクリプト（Superscript）またはサーモスクリプト（Thermoscript）酵素ミックスを用いて製造業者（Gibco Life Sciences）指示に従って調製した。RNAおよびmRNAは、Maniatisら（上記参照）に記載のような標準分子生物学プロトコルを用いて、または、例えばS.N.A.P.全RNA単離キット、Fast Track 2.0、およびマイクロFast Track 2.0 mRNA単離キット（InVitrogen）などの市販キットを用いて調製した。増幅断片を次いで精製し、HindIIIおよびNotlで制限酵素により消化し、そして両方のスプライス変異体の共通領域であるhASIC1Aの3-プライム断片とライゲートした。
【０１６３】
実施例２：ハイブリダイゼーションプローブの標識付けと利用
配列番号１から誘導したハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、ゲノムcDNAまたはmRNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識付けを具体的に記載するが、さらに長いcDNA断片についても本質的に同じ方法を用いる。オリゴヌクレオチドをGene Works2.5.1（Oxford Molecular）のような業界最新技術のソフトウエアを用いて設計し、それぞれのオリゴマーの50pmolおよびγ32Ｐアデノシン三リン酸（Amersham）の250μCiおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston、Mass.）を組合わせることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドを、セファデックス（Sephadex）G-25スーパーファイン樹脂カラム（Pharmacia & Upjohn）を用いて実質的に精製する。次いで標識したセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、次のエンドヌクレアーゼ（Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba 1またはPvu II；DuPont NEN）の１つを用いて消化したヒトゲノムDNAの、典型的な膜に基づくハイブリダイゼーション解析において利用する。
【０１６４】
それぞれの消化物から得たDNAを0.7％アガロースゲル上で分画し、ナイロン膜に移す（Nytran Plus, Schleicher & Schuell,Durham, N. H.）。ハイブリダイゼーションは40℃にて16時間実施する。非特異的シグナルを除去するために、ブロットを、室温にて、0.1 xクエン酸ナトリウム生理食塩水および0.5％ドデシル硫酸ナトリウムまで増加するストリンジェンシーの条件のもとで洗浄する。XOMAT ARフィルム（Kodak、Rochester、N.Y.）をホスホイメージャーカセット（Molecular Dynamics、Sunnyvale、CA）のブロットに数時間露光させた後に、ハイブリダイゼーションパターンを視覚で比較する。
【０１６５】
実施例３：ノーザンブロットブロット分析
ノーザンブロット分析は、遺伝子転写物の存在を検出するために利用する実験室技術であり、標識したヌクレオチド配列と、特定の細胞型または組織由来のRNAを結合した膜とのハイブリダイゼーションに関わる（Sambrookら、前掲）。
【０１６６】
特定の成人ヒト組織からまたは脳の切片から単離したポリ(A)＋RNAの２μgを含有するノーザンブロットを販売元（Clontech）から入手する。プローブを、無作為プライムラベリング（Pharmacia Biotech Inc.）により、または上記のように、調製する。hASIC1Bの第１エキソンのタンパク質コード配列の5'および3'末端に特異的なPCRプライマー（配列番号５および配列番号６）をPCR反応に利用して、全hASIC1B特異的配列を含有する断片を作製した。この断片をpBluescriptベクター中にクローニングして利用し、複数の組織ブロットをプローブした。フィルターを、50％ホルムアミド、5 X SSPE、２％ SDS、10 X デンハルト（Denhardt's）溶液、および100μg/mlサケ精子DNAを含有するバッファー中で一夜42℃にてハイブリダイズした。フィルターを、0.1 X SSC、0.1％ SDSを用いて55℃にて洗浄し、そしてKodak X-Omat ARフィルムに４日間、70℃にて露光した。結果は、hASIC1Bが末梢組織中に検出されず、主に神経細胞組織中に発現することを示した。脳においては、hASIC1Bは主に視床、尾側核（caudal nucleus）、皮質のp.g.、小脳、黒質、延髄、被殻に発現し、脳梁に低レベルで発現した。
【０１６７】
実施例４：アフリカツメガエル（Xenopus laevis）卵母細胞におけるhASIC1Bの発現
hASIC1Bを、pCDNA3中にサブクローニングしたhASIC1B cDNA（1-5ng）の核注射により、アフリカツメガエル卵母細胞に発現させた。対照卵母細胞はH2Oを注射した。卵母細胞を改変バース（Barth）溶液中で18℃に維持した。注射後1-3日に、電流を２電極電圧固定法により測定した。電圧固定（-60 mV/-100 mV）中、卵母細胞を116 mM NaCl、2mM KCl、1.8mM CaCl2、10mM 酢酸および5mM Hepes（NaOHを用いてpH 7.4）の浴中に保った。プロトンゲート調節（proton-gating）を確認するために、浴液を速やかにpH 5の溶液に10秒間切替え、次いで浴液を戻して洗い流した。刺激溶液は、元の浴液のpHを塩酸で低下することにより調製した。溶液の浸透圧を浸透圧計を用いて確認し、マンニトールまたは塩化コリンを用いて補正した。イオン選択性を実証するために、NaClをLiClまたはKClと置換えた。電流-電圧関係を、低pH溶液による刺激前および中の10秒間、-60mVの保持電位から-100および+60 mVの間の電位へステップを踏むことにより決定した。類似の機能特性決定を、hASIC1Bを含有するpcDNAベクターを用いてトランスフェクトしたCOS細胞を用いてパッチクランプ（patch-clamp）でも実施した。pH５に応答する典型的な電流を、COS細胞および卵母細胞をそれぞれ用いて図５および図６に示した。hASIC1Bチャンネルに対するpHを変化させた用量-応答曲線（図７）ならびにＩ／Ｖ曲線（図８）を同様な方法で得た。
【０１６８】
実施例５：位置指定突然変異により作製した非機能的優性ネガティブhASIC1Bサブユニット
DEG/EnaCイオンチャンネルサブユニットは結合してホモおよび／またはへテロ多量体複合体になって実チャンネルを形成する。従って、所与の配列中の特定のアミノ酸を人工的に改変して、特定のサブユニットを、例えば、チャンネル活性について無機能であるがそれでも他のサブユニットと相互作用する能力を保持させることができる。得られる、そのような無機能の突然変異を有する複合体はアゴニストが存在しても不活性である。標的とするアミノ酸は、好ましくは所与のイオンチャンネルサブユニットのファミリー全体に高度に保存されるものである。本発明者らはASICファミリーのある特定のアミノ酸を標的としたが、或る保存されたGly残基（すなわち、ヒトASIC3の位置439、またはhASIC1Bの位置469）が、Arg残基により置換されると、優性ネガティブ突然変異体を作製することを見出した。hASIC3-G439Rを卵母細胞で単独に発現させると、電圧固定条件下で低pHに応答する電流が観察されない。さらに、この突然変異体を野生型ASIC3サブユニットとともに同時注射すると、G439R突然変異体の優性ネガティブ効果のために、無機能のチャンネルが発現した。hASIC1B由来のGly-469のArg残基の置換は、市販の突然変異誘発キット「クイックチェンジ（QuickChange）」（Stragene）を用いて、キットの指示に従って行った。簡単に説明すると、同じ領域においてそれぞれ反対の鎖に相補的である２つの反平行オリゴヌクレオチドプライマーであって、単一ミスマッチ（Gly-469をコードするコドンの最初の位置の「Ｃ」を「Ｇ」に置換わり、ヌクレオチドの残部は同一である）の所望の突然変異を運ぶ上記プライマーを合成した。次いでオリゴヌクレオチドプライマーを、PfuTurbo DNAポリメラーゼにより、全長hASIC1BをコードするcDNAを含有するテンプレートとしてpCDNA3プラスミドを用いて、温度サイクリング処理をして伸長した。オリゴヌクレオチドプライマーを組み込むと、ねじれたニック（staggered nick）を含有する突然変異プラスミドが作製された。温度サイクリングの後、産物をDpn Iを用いて処理した。Dpn Iを用いて親DNAテンプレートを消化し、突然変異を含有する合成されたDNAを選択する。ほとんどの大腸菌（E. coli）株から単離されるDNAはdamメチル化されているので、メチル化およびヘミメチル化DNAに特異的であるDpn I消化に感受性がある。次いで、所望の突然変異を組込んでいるニックのあるベクターDNAを大腸菌（E. coli）中に形質転換する。いったん正しい突然変異が配列決定により確認されれば、突然変異hASIC1Bを卵母細胞または哺乳類動物発現系において、本明細書に記載のように試験する。
【０１６９】
優性ネガティブ突然変異を運ぶトランスジェニック動物を育種することにより、そのような優性ネガティブ突然変異体をツールに利用して、サブユニット相互作用の様々な組合わせを研究し、かつhASIC1Bの生理学的役割およびその病態生理学的症状との関わりを学ぶことができる。これらの突然変異体はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドの代わりに、例えば遺伝子治療に利用することもできる。
【０１７０】
実施例６：hASIC1Bをコードするポリヌクレオチドの全長への伸長または調節配列の回収
全長hASIC1Bをコードする核酸配列（配列番号１）を利用して、部分ヌクレオチド配列を全長へ広げるための、またはゲノムライブラリーから5'もしくは3'、イントロンまたは他の制御配列を取得するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。１つのプライマーをアンチセンス方向（Ｒ）の伸長を開始するように合成しかつ他のプライマーをセンス方向（Ｆ）に伸長するように合成する。プライマーを用いて、既知配列の伸長を促進しかつ目的の領域に対する新しい未知ヌクレオチド配列を含有するアンプリコンを「外側」に作製する。最初のプライマーは、cDNAから、GeneWorks 5.0.1（Oxford Molecular, Cambridge, UK）または他の適当なプログラムを用いて設計し、長さが22-30個のヌクレオチドであって、50％以上のＧＣ含量を有し、かつ標的配列と温度約68-72℃にてアニーリングすることにする。ヘアピン構造およびプライマー-プライマー２量体化を生じうるヌクレオチドの伸長部はいずれも避ける。
【０１７１】
元の、選択したcDNAライブラリー、またはヒトゲノムライブラリーを用いて、配列を伸長する；5'上流領域を得るためには後者が最も好ましい。もしさらなる伸長が必要であるかまたは所望であれば、さらなるプライマーのセットを設計して既知領域をさらに伸長する。
【０１７２】
EXPANDロングテンプレートPCRキット（Roche Diagnostics）の指示書に従いかつ酵素と反応ミックスとを十分混合することにより、高忠実度の増幅が得られる。それぞれのプライマーの40pmolおよびキットの全ての他成分の推奨濃度を用いて開始し、PCRをPeltierサーマルサイクラー（PTC200；M.J. Research、Watertown, Mass.）および次のパラメーターを用いて実施する：
ステップ１  94℃、１分間（最初の変性）
ステップ２  65℃、１分間
ステップ３  68℃、６分間
ステップ４  94℃、15秒間
ステップ５  65℃、１分間
ステップ６  68℃、７分間
ステップ７  ステップ４-６をさらに15サイクル繰り返す
ステップ８  94℃、15秒間
ステップ９  65℃、１分間
ステップ10  68℃、７分15秒間
ステップ11  ステップ８-10を12サイクル繰り返す
ステップ12  72℃、８分間
ステップ13  4℃（および保持）
反応混合物の5-10uLアリコートを、低濃度（約0.6-0.8％）アガロースミニゲル上の電気泳動により分析して、どの反応物が配列を伸長するのに成功したかを決定する。最大産物を含有すると考えられるバンドを選択してゲルから除去する。さらなる精製は、QIAQuick.TM.（QIAGEN Inc., Chatsworth, CA）のような商業用ゲル抽出法を利用する。DNAの回収後、クレノウ酵素を用いて１本鎖、ヌクレオチドオーバーハングをトリミングして、再ライゲーションおよびクローニングを容易にする平滑末端を作製する。
【０１７３】
エタノール沈降の後、生成物を13uLのライゲーションバッファーに再溶解し、１μL T4-DNAリガーゼ（15単位）および１μL T4ポリヌクレオチドキナーゼを加え、そして混合物を室温にて２-３時間または16℃にて一夜インキュベートする。コンピテントな大腸菌（E. coli）細胞（40μl中の適当な培地に入った）を３μlのライゲーション混合物を用いて形質転換し、80μlのSOC培地中で培養する（Sambrookら、前掲）。１時間、37℃でのインキュベーション後に、全形質転換混合物を、２倍のCarb.を含有するルリア・ベルターニ（Luria Bertani）（LB）-寒天上にプレーティングする（Sambrookら、前掲）。翌日、複数のコロニーをそれぞれのプレートから無作為に拾い、適当な市販の無菌96ウエルマイクロタイタープレートの個々のウエル中に配置した150μlの液LB/２倍Carb培地中で培養する。翌日、それぞれの一夜培養物の５μlを非無菌96ウエルプレート中に移し、水により１：10に希釈後、それぞれのサンプルの５μlをPCRアレイに移す。
【０１７４】
PCR増幅については、４単位のrTth DNAポリメラーゼ、ベクタープライマー、および伸長反応に用いる遺伝子特異的プライマーの１つまたは両方を含有する18μlの濃縮PCR反応混合物（3.3倍）を、それぞれのウエルに加える。増幅は次の条件を用いて実施する：
ステップ１  94℃、60秒間
ステップ２  94℃、20秒間
ステップ３  55℃、30秒間
ステップ４  72℃、90秒間
ステップ５  ステップ２-４をさらに29サイクル繰り返す
ステップ６  72℃、180秒間
ステップ７  4℃（および保持）
PCR反応のアリコートを分子量マーカーと一緒にアガロースゲル上で泳動させる。PCR産物のサイズを元の部分cDNAと比較し、適当なクローンを選択し、プラスミド中にライゲートし、そして配列決定する。
【０１７５】
実施例７：アンチセンス分子
hASIC1Bをコードするまたはその部分に対するアンチセンス分子を用いて、天然のhASIC1Bのin vivoまたはin vitro発現を阻害することができる。約20塩基対を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を具体的に記載するが、さらに大きいcDNA断片についても本質的に同じ方法を使用する。図１に示すようなhASIC1Bのコード配列に基づくオリゴヌクレオチドを使用して天然のhASIC1Bの発現を阻害する。相補的オリゴヌクレオチドを図１に示したような最もユニークな5'配列から設計し、上流の未転写配列との結合を阻害することにより転写を、またはリボソームとの結合を防止することによりhASIC1Bをコードする転写物の翻訳を阻害する。配列番号１の5'配列の適当な一部分を用いる、有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、図１に示したポリペプチドの5'コード配列中に翻訳される領域にまたがるあらゆる15-20個のヌクレオチドを含む。
【０１７６】
実施例８：hASIC1Bの発現
hASIC1Bの発現を、そのcDNAを適当なベクター中にサブクローニングしかつそのベクターを宿主細胞中に形質転換することにより実施する。本実施例の場合、クローニングベクター、pSportを用いて大腸菌（E. coli）にhASIC1Bを発現する。このベクターは、クローニング部位の上流に、β-ガラクトシダーゼ用のプロモーター、続いてアミノ末端Metを含有する配列および次いで７個のβ-ガラクトシダーゼを含有する。これらの８個の残基の直後に、転写に有用なバクテリオファージプロモーターおよび複数のユニークな制限酵素切断部位を含有するリンカーが存在する。
【０１７７】
単離し、標準方法を用いてIPTGにより形質転換した細菌株を誘導すると、最初に８個のβ-ガラクトシダーゼの残基、約５〜15個のリンカーの残基、および全長タンパク質からなる融合タンパク質を産生する。シグナル残基が細菌増殖培地中へのhASIC1Bの分泌を指令し、これを次の活性に対するアッセイに直接利用することができる。
【０１７８】
実施例９：hASIC1B特異的抗体の産生
PAGE電気泳動（Sambrook、前掲）または他の精製技術を利用して実質的に精製したhASIC1Bを用いてウサギを免疫感作し、標準プロトコルを利用して抗体を産生させる。配列番号２から推定されるアミノ酸配列をMacVector 6.0.1（Oxford Molecular）を用いて解析し、高免疫原性の領域を決定し、そして対応するオリゴペプチドを合成し、これを使って当業者に知られる方法により抗体を産生させる。Ｃ末端に近いまたは親水性領域にあるなどの適当なエピトープの選択は、Ausubelら（前掲）その他に記載されている。
【０１７９】
典型的には、オリゴペプチドは長さが約15残基であり、fmoc化学を利用するアプライド・バイオシステムモデル431A（Applied Biosystems Model 431A）ペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によりキーホールリンペットヘモシアニン（KLH, Sigma, St. Louis, Mo.）とカップリングさせる（MBS；「Antobodies: A Laboratory Manual（抗体：研究室マニュアル）」", Harlow EおよびLane D, 編, 1998, CSHL Press, Plainview, N. Yを参照）。ウサギを、完全フロイントアジュバント中のオリゴペプチド-KLH複合体を用いて免疫感作する。得られる抗血清を抗ペプチド活性について試験する、例えば、ペプチドをプラスチックと結合し、1％BSAを用いてブロッキングし、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、そして放射性ヨードで標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０１８０】
実施例１０：特異的抗体を用いる天然hASIC1Bの精製
天然または組換えhASIC1Bを、hASIC1Bに特異的な抗体を用いて免疫アフィニティクロマトグラフィにより実質的に精製することができる。免疫アフィニティカラムは、hASIC1B抗体をCnBr活性化セファロース（Pharmacia & Upjohn）などの活性化クロマトグラフィ樹脂に共有結合でカップリングすることにより構築する。カップリングの後、樹脂をブロックし、製造業者の指示書に従って洗浄する。
【０１８１】
hASIC1Bを含有する培地を免疫アフィニティカラムに通して、カラムをhASIC1Bが優先的に吸収される条件（例えば、界面活性剤が存在する高イオン強度バッファー）のもとで洗浄する。そのカラムを抗体／hASIC1B結合を破壊する条件（例えば、pH 2-3、または高濃度の尿素またはチオシアネートイオンなどのカオトロープ）のもとで溶出して、hASIC1Bを回収する。
【０１８２】
実施例１１：hASIC1Bと相互作用する分子の同定
マルチウエルプレート中の永続的にまたは一過的にトランスフェクトされてhASIC1Bを発現するCOS細胞系に、電位感受性染料を供給し、低pHバッファー（pH 5.0）を適用した後に蛍光放出を測定する。候補化合物の存在および不在のもとでの応答を比較して、hASIC1Bを刺激し、抑制しまたはモジュレートする化合物を同定する。
【０１８３】
あるいは、hASIC1Bまたはその生物学的活性断片を125I-ボルトン・ハンター（Bolton-Hunter）試薬（Boltonら, (1973) Biochem. J. 133: 529）によって標識する。マルチウエルプレートのウエル中に予めアレイしておいた候補分子を標識したhASIC1Bとともにインキュベートし、洗浄し、全てのウエルを、標識したhASIC1B複合体についてアッセイする。様々な濃度のhASIC1Bを用いて得たデータを利用して、番号、アフィニティ、およびhASIC1Bの候補分子との結合に対する値を求める。
【０１８４】
以上の明細書で記述した全ての開示は本明細書に参照により組み入れられる。本発明の範囲と精神から逸脱することなく、記載した本発明の方法および系の様々な修飾および改変が当業者には明白であろう。本発明は特定の好ましい実施形態と関連づけて記載しているが、請求した本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるものでないことは理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【０１８５】
【図１−Ａ】全長hASIC1Bのヌクレオチド配列である配列番号１、および推定アミノ酸配列である配列番号２を示す。矢印はイントロン／エキソンスプライス部位を示す。
【図１−Ｂ】全長hASIC1Bのヌクレオチド配列である配列番号１、および推定アミノ酸配列である配列番号２を示す。矢印はイントロン／エキソンスプライス部位を示す。
【図１−Ｃ】全長hASIC1Bのヌクレオチド配列である配列番号１、および推定アミノ酸配列である配列番号２を示す。矢印はイントロン／エキソンスプライス部位を示す。
【図２−Ａ】hASIC1Bのアミノ酸配列（配列番号２）とクローニングしたASICファミリーメンバー（ヒトASIC1A、ヒトASIC2A、ヒトASIC2B、ヒトASIC3、ヒトASIC4およびラットASIC1Bを含む）のアミノ酸配列との構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図２−Ｂ】hASIC1Bのアミノ酸配列（配列番号２）とクローニングしたASICファミリーメンバー（ヒトASIC1A、ヒトASIC2A、ヒトASIC2B、ヒトASIC3、ヒトASIC4およびラットASIC1Bを含む）のアミノ酸配列との構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図２−Ｃ】hASIC1Bのアミノ酸配列（配列番号２）とクローニングしたASICファミリーメンバー（ヒトASIC1A、ヒトASIC2A、ヒトASIC2B、ヒトASIC3、ヒトASIC4およびラットASIC1Bを含む）のアミノ酸配列との構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図２−Ｄ】hASIC1Bのアミノ酸配列（配列番号２）とクローニングしたASICファミリーメンバー（ヒトASIC1A、ヒトASIC2A、ヒトASIC2B、ヒトASIC3、ヒトASIC4およびラットASIC1Bを含む）のアミノ酸配列との構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図２−Ｅ】hASIC1Bのアミノ酸配列（配列番号２）とクローニングしたASICファミリーメンバー（ヒトASIC1A、ヒトASIC2A、ヒトASIC2B、ヒトASIC3、ヒトASIC4およびラットASIC1Bを含む）のアミノ酸配列との構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図３−Ａ】hASIC1B（配列番号2）のアミノ酸配列とラットASIC1Bのアミノ酸配列との具体的な構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図３−Ｂ】hASIC1B（配列番号2）のアミノ酸配列とラットASIC1Bのアミノ酸配列との具体的な構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図４−Ａ】hASIC1B（配列番号2）のアミノ酸配列とヒトASIC4のアミノ酸配列との具体的な構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図４−Ｂ】hASIC1B（配列番号2）のアミノ酸配列とヒトASIC4のアミノ酸配列との具体的な構造比較を図解する。保存アミノ酸をグレーの箱で囲み、最良のアラインメントスコアを得るための挿入ギャップをダッシュ（-）で表す。
【図５】hASIC1B、ラットASIC1BまたはヒトASIC1Aを発現する電圧固定したCOS細胞を用いて記録した、pH活性化内向き電流を図解する。
【図６】電圧固定したhASIC1Bを発現するアフリカツメガエル卵母細胞を用いて記録した、pH活性化内向き電流を図解する。
【図７】COS細胞に発現したhASIC1BおよびヒトASIC1Aのプロトン用量応答曲線を図解する。
【図８】COS細胞に発現したhASIC1BおよびヒトASIC1AのＩ／Ｖ曲線を図解する。
【図１−Ａ】
2005505264.tif 000003
【図１−Ｂ】
2005505264.tif 000004
【図１−Ｃ】
2005505264.tif 000005
【図２−Ａ】
2005505264.tif 000006
【図２−Ｂ】
2005505264.tif 000007
【図２−Ｃ】
2005505264.tif 000008
【図２−Ｄ】
2005505264.tif 000009
【図２−Ｅ】
2005505264.tif 000010
【図３−Ａ】
2005505264.tif 000011
【図３−Ｂ】
2005505264.tif 000012
【図４−Ａ】
2005505264.tif 000013
【図４−Ｂ】
2005505264.tif 000014
【図５】
2005505264.tif 000015
【図６】
2005505264.tif 000016
【図７】
2005505264.tif 000017
【図８】
2005505264.tif 000018
【国際公開パンフレット】
2005505264.tif 000019
2005505264.tif 000020
2005505264.tif 000021
2005505264.tif 000022
2005505264.tif 000023
2005505264.tif 000024
2005505264.tif 000025
2005505264.tif 000026
2005505264.tif 000027
2005505264.tif 000028
2005505264.tif 000029
2005505264.tif 000030
2005505264.tif 000031
2005505264.tif 000032
2005505264.tif 000033
2005505264.tif 000034
2005505264.tif 000035
2005505264.tif 000036
2005505264.tif 000037
2005505264.tif 000038
2005505264.tif 000039
2005505264.tif 000040
2005505264.tif 000041
2005505264.tif 000042
2005505264.tif 000043
2005505264.tif 000044
2005505264.tif 000045
2005505264.tif 000046
2005505264.tif 000047
2005505264.tif 000048
2005505264.tif 000049
2005505264.tif 000050
2005505264.tif 000051
2005505264.tif 000052
2005505264.tif 000053
2005505264.tif 000054
2005505264.tif 000055
2005505264.tif 000056
2005505264.tif 000057
2005505264.tif 000058
2005505264.tif 000059
2005505264.tif 000060
2005505264.tif 000061
2005505264.tif 000062
2005505264.tif 000063
2005505264.tif 000064
2005505264.tif 000065
2005505264.tif 000066
2005505264.tif 000067
2005505264.tif 000068
2005505264.tif 000069
2005505264.tif 000070
2005505264.tif 000071
2005505264.tif 000072
2005505264.tif 000073
2005505264.tif 000074
2005505264.tif 000075
2005505264.tif 000076
2005505264.tif 000077
2005505264.tif 000078
2005505264.tif 000079
2005505264.tif 000080
2005505264.tif 000081
2005505264.tif 000082
2005505264.tif 000083
2005505264.tif 000084
2005505264.tif 000085
2005505264.tif 000086
2005505264.tif 000087
2005505264.tif 000088
2005505264.tif 000089
2005505264.tif 000090
2005505264.tif 000091
2005505264.tif 000092
2005505264.tif 000093
2005505264.tif 000094
2005505264.tif 000095
2005505264.tif 000096
2005505264.tif 000097
2005505264.tif 000098
2005505264.tif 000099
2005505264.tif 000100
2005505264.tif 000101
2005505264.tif 000102
2005505264.tif 000103
2005505264.tif 000104
2005505264.tif 000105
2005505264.tif 000106
2005505264.tif 000107
2005505264.tif 000108
2005505264.tif 000109
2005505264.tif 000110
2005505264.tif 000111
2005505264.tif 000112
2005505264.tif 000113
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505264.tif 000114
2005505264.tif 000115
【国際調査報告】
2005505264.tif 000116
2005505264.tif 000117
2005505264.tif 000118
2005505264.tif 000119
2005505264.tif 000120