(57)【要約】本発明は、単離された網膜の周皮細胞機能または血管機能をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、前記周皮細胞または血管の収縮状態の変化を試験化合物の存在下で検出し、ここで前記変化が、試験化合物が周皮細胞および／または血管の機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された網膜中の血管の機能をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、試験化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出し、ここで前記変化が、試験化合物が血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項２】
単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、単離された網膜を試験化合物と接触させること、および前記血管の収縮状態の変化を検出することを含み、ここで前記変化が、化合物が血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項３】
網膜が全網膜である、請求項1または2に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項４】
単離された網膜が支持体と物理的に接触している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項５】
単離された網膜が支持体に固定されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項６】
単離された網膜が、接着剤の使用または真空により支持体に固定されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項７】
単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(i)支持体に固定されている単離された網膜を提供すること；
(ii)試験化合物を前記の単離された網膜と接触させること；および
(iii)前記血管の歪みを検出すること、
を含み、ここで前記歪みが、前記化合物が単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項８】
単離された網膜が後眼部の内面に配置されているものである、請求項7に記載の化合物を同定する方法。
【請求項９】
後眼部が支持体に固定されている、請求項8に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１０】
単離された網膜が、非天然素材表面または合成素材表面に配置されているものである、請求項7に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１１】
非天然素材表面または合成素材表面が支持体に固定されている、請求項10に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１２】
非天然素材表面または合成素材表面が実質的に凹面である、請求項10に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１３】
非天然素材表面または合成素材表面が実質的に水平または平面である、請求項10に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１４】
単離された網膜が、実質的に水平または平面な表面に平らに取り付けられている、請求項10に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１５】
合成素材表面がガラス製である、請求項10に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１６】
合成素材表面が高分子材料製である、請求項10に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１７】
合成素材表面がガラスと高分子材料の混合物から製造されているものである、請求項10に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１８】
支持体が表面、容器または収納体である、請求項7〜17のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項１９】
支持体が、溶液を含有し得る容器である、請求項18に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２０】
支持体がペトリ皿である、請求項18に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２１】
血管が血液を含んでいるものである、請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２２】
血管が染料を含んでいるものである、請求項1〜20のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２３】
染料がエバンスブルー染料である、請求項22に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２４】
染料を血管へ潅流させる、請求項22または23に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２５】
前記試験化合物が単離された網膜のガラス体側と接触している、請求項2〜24のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２６】
前記試験化合物が単離された網膜の非ガラス体側と接触している、請求項2〜24のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２７】
前記試験化合物を液滴形態で施す、請求項1〜26のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２８】
前記試験化合物を、液滴、蒸気、噴霧化液滴、ナノ粒子、ミクロスフェア、またはこれらの混合物の形態で施す、請求項1〜26のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項２９】
前記試験化合物を溶液の流れの中に施す、請求項1〜26のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３０】
前記試験化合物を潅流により施す、請求項1〜26のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３１】
試験化合物の存在下で、単離された網膜をインキュベートすることを含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３２】
化合物を血管と接触させる前に、血管の収縮状態を検出する、請求項2〜31のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３３】
血管の収縮状態を可視的に検出する、請求項1〜32のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３４】
血管の収縮状態を顕微鏡を用いて検出する、請求項1〜33のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３５】
血管の大きさ、寸法または体積を検出する、請求項1〜34のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３６】
歪みが、前記血管の厚さまたは直径の歪みである、請求項7〜35のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３７】
直径が血管断面の直径である、請求項36に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３８】
血管の直径を画素またはミクロンで測定する、請求項36または37に記載の化合物を同定する方法。
【請求項３９】
血管断面の直径を画素で測定する、請求項38に記載の化合物を同定する方法。
【請求項４０】
単離された網膜を第2試験化合物と接触させることをさらに含む、請求項1〜39のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項４１】
(i)場合により、化合物を除去するのに、または血管収縮に影響を及ぼさないレベルまでその活性を低下させるのに十分な時間および条件下で、網膜の完全性または網膜血管の収縮機能に損傷を与えることのない好適なバッファーまたは水性溶媒を用いて単離された網膜を洗浄すること；
(ii)場合により、網膜血管中の歪みを検出すること；
(iii)網膜血管を第2試験化合物と接触させること；および
(iv)前記網膜血管における歪みを検出すること、
を含み、ここで前記歪みが、前記化合物が網膜血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、請求項7〜39のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項４２】
第2化合物が第1化合物のアンタゴニストである、請求項41に記載の化合物を同定する方法。
【請求項４３】
第2化合物が第1化合物のプロタゴニストである、請求項41に記載の化合物を同定する方法。
【請求項４４】
競合タイプアッセイをさらに含み、候補化合物を網膜血管と接触させる前または後に、拮抗阻害剤化合物を網膜血管と接触させることを含む、請求項1〜41のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項４５】
周皮細胞機能をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、試験化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出し、ここで前記変化が、試験化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項４６】
周皮細胞の収縮状態をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、周皮細胞を試験化合物と接触させること、および前記周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含み、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項４７】
周皮細胞が弾力性のある支持体と物理的に接触している、請求項45または46に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項４８】
周皮細胞が接触している場合に歪みを生じ、かつ、接触している周皮細胞の収縮状態が変化した場合に歪みが生じ得る弾力性または可撓性のある支持体を有する媒体上で周皮細胞を増殖させることによって周皮細胞の収縮状態を検出する、請求項45〜47に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項４９】
周皮細胞の収縮状態をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(i)周皮細胞収縮が弾力性のある支持体を歪ませるのに十分な条件下で、弾力性のある支持体と物理的に接触している周皮細胞を提供すること；
(ii)試験化合物を前記周皮細胞と接触させること；および
(iii)前記弾力性のある支持体における歪みを検出すること、
を含み、ここで前記歪みが、前記化合物が周皮細胞の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項５０】
弾力のある支持体が弾力性のあるシートである、請求項49に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５１】
弾力性のある支持体がガラス製である、請求項49に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５２】
弾力性のある支持体が高分子材料製である、請求項49に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５３】
弾力性のある支持体が架橋ポリマー製である、請求項52に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５４】
高分子材料が弾性ポリマーまたは弾性を有するポリマーフィルムを含む、請求項52に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５５】
高分子材料が粘弾性材料である、請求項52に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５６】
支持体が透明材料から製造されているものである、請求項52に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５７】
支持体がガラス材料と高分子材料の混合物から製造されているものである、請求項52に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５８】
支持体が架橋ポリマー層を有するガラスを含む、請求項52に記載の化合物を同定する方法。
【請求項５９】
支持体が架橋結合シリコーン液層を有している、請求項52に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６０】
支持体が水平または平面である、請求項49に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６１】
周皮細胞の収縮状態を可視的に検出する、請求項45〜60のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６２】
周皮細胞の大きさ、寸法または体積を検出する、請求項45〜61のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６３】
血管の収縮状態を顕微鏡を用いて検出する、請求項45〜62のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６４】
ポリマー層の歪みを支持体の弾性歪みまたはしわとして可視化する、請求項52に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６５】
前記周皮細胞の収縮性を支持体のしわまたは歪みの数を数えることにより検出する、請求項64に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６６】
前記試験化合物を液滴形態で施す、請求項45〜64のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６７】
前記試験化合物を液滴、蒸気、噴霧化液滴、ナノ粒子、ミクロスフェア、またはこれらの混合物で施す、請求項66に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６８】
前記試験化合物を溶液の流れの中に施す、請求項45〜65のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項６９】
前記試験化合物を潅流により施す、請求項45〜65のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項７０】
試験化合物の存在下で、単離された網膜をインキュベートすることを含む、請求項45〜65のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項７１】
化合物を周皮細胞と接触させる前に、周皮細胞の収縮状態を検出する、請求項45〜65のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項７２】
(i)場合により、化合物を除去するのに、または周皮細胞収縮に影響を及ぼさないレベルまでその活性を低下させるのに十分な時間および条件下で、細胞の完全性または収縮機能に損傷を与えることのない好適なバッファーまたは水性溶媒を用いて周皮細胞を洗浄すること；
(ii)場合により、前記の弾力性のある支持体における歪みを検出すること；
(iii)周皮細胞を第2試験化合物と接触させること；および
(iv)前記の弾力性のある支持体における歪みを検出すること、
をさらに含み、ここで前記歪みが、前記化合物が周皮細胞の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、請求項45〜71のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項７３】
第2化合物が第1化合物のアンタゴニストである、請求項72に記載の化合物を同定する方法。
【請求項７４】
第2化合物が第1化合物のプロタゴニストである、請求項72に記載の化合物を同定する方法。
【請求項７５】
競合タイプアッセイをさらに含み、候補化合物を周皮細胞と接触させる前または後に、拮抗阻害剤化合物を周皮細胞と接触させることを含む、請求項45〜74のいずれか1項に記載の化合物を同定する方法。
【請求項７６】
被験体の周皮細胞機能障害を診断する方法であって、周皮細胞の収縮状態を変化させるのに十分な条件下で周皮細胞機能をモジュレートする化合物の薬学上許容可能な量を被験体に投与すること、および被験体の周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含み、前記化合物が、周皮細胞の収縮状態の変化を前記化合物の存在下で検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項７７】
被験体の網膜血管の収縮状態における変化を健常な被験体の網膜血管の収縮状態における変化と比較することによって検出する、請求項76に記載の周皮細胞機能障害を診断する方法。
【請求項７８】
前記化合物が請求項45〜75のいずれか1項に記載の方法によって同定されるものである、請求項76または77に記載の周皮細胞機能障害を診断する方法。
【請求項７９】
被験体の網膜血管機能障害を診断する方法であって、血管の収縮状態を変化させるのに十分な条件下で血管機能をモジュレートする化合物の薬学上許容可能な量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態における変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が血管機能をモジュレートすることを示すものであり、ならびに、被験体の網膜血管の収縮状態の変化を検出することを含む、前記方法。
【請求項８０】
被験体の周皮細胞の収縮状態における変化を、健常な被験体の周皮細胞の収縮状態における変化と比較することによって検出する、請求項79に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項８１】
被験体の網膜血管機能障害を診断する方法であって、
(i)単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする化合物の薬学上許容可能な量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものであり；ならびに
(ii)被験体の網膜中の血管の歪みを検出することを含み、ここで緩慢なまたは微弱な網膜血管の拡張または収縮が網膜血管の損傷を示すものである、
前記方法。
【請求項８２】
前記化合物が請求項1〜44のいずれか1項による方法によって同定されるものである、請求項80または81に記載の被験体の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項８３】
被験体の網膜血管機能障害を診断する方法であって、
(i)周皮細胞の収縮状態をモジュレートする化合物の薬学上許容可能な量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートするものであり；ならびに
(ii)被験体の血管の歪みを検出することを含み、ここで緩慢なまたは微弱な毛細血管の拡張または収縮が網膜血管の損傷を示すものである、
前記方法。
【請求項８４】
血管が毛細血管である、請求項81〜83のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項８５】
被験体の毛細血管の収縮状態における変化が、健常な被験体の網膜毛細血管の収縮状態における変化と比較することにより検出される、請求項79〜84のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項８６】
化合物を侵襲性経路により投与する、請求項79〜85のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項８７】
侵襲性経路が眼球後経路である、請求項86に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項８８】
化合物を非侵襲性経路により投与する、請求項79〜85のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項８９】
非侵襲性経路がイオン導入法を含む、請求項88に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９０】
イオン導入法を眼球の角膜に適用する、請求項88に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９１】
化合物を液滴形態で投与する、請求項88に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９２】
化合物を液滴、蒸気、噴霧化液滴、ナノ粒子、ミクロスフェア、またはこれらの混合物として投与する、請求項91に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９３】
脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、ホスホリパーゼC(PLC)に関する活性を有する化合物、プロテインキナーゼA(PKA)に関する活性を有する化合物、イオンチャネル過分極チャンネルに関する活性を有する化合物、および非ステロイド抗炎症剤(NSAID)、またはこれらの相同体、類似体もしくは誘導体からなる群から選択される少なくとも1種の化合物の有効量と被験体の眼球を接触させることを含む、請求項79〜92のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９４】
NSAIDが、アスピリン、ピラゾロン、フェナメート(fenamate)、ジフルニサル、酢酸誘導体、プロピオン酸誘導体、オキシカム(oxicams)、フェナメート(fenamates)、例えばメフェナム酸、メクロフェナメート(meclofenamate）、フェニルブタゾン、ジフルニサル、ジクロフェナク、ボルタレン、インドメタシン、スリンダク、N-フェニルアントラニル酸、エトドラク、ケトロラク、ナブメトン、トルメチン、イブプロフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、カルプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、インドメタシンおよびフルフェナム酸、またはこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項93に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９５】
NSAIDがN-フェニルアントラニル酸またはフルフェナム酸またはフルルビプロフェンである、請求項93に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９６】
NSAIDがR-異性体形態またはS-異性体形態のフルルビプロフェンである、請求項95に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９７】
血管の大きさ、寸法または体積を検出する、請求項79〜96のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９８】
変化または歪みを可視的に検出する、請求項79〜96のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項９９】
被験体の網膜血管の変化または歪みの検出が顕微鏡、検眼鏡または眼底カメラを使用することを含む、請求項79〜98のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１００】
網膜の画像を記録する、請求項79〜99のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１０１】
歪みが、前記血管の厚さまたは直径の歪みである、請求項81〜100のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１０２】
直径が血管断面の直径である、請求項101に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１０３】
寸法を画素またはミクロンで測定する、請求項97〜102のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１０４】
被験体の網膜血管機能障害の治療用医薬の製造における網膜血管機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮性状態の変化を検出または同定することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用。
【請求項１０５】
前記化合物が請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法によって同定されるものである、請求項104に記載の使用。
【請求項１０６】
被験体の周皮細胞機能障害の治療用医薬の製造における周皮細胞機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮性状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用。
【請求項１０７】
前記化合物が請求項45〜75のいずれか1項に記載の方法によって同定されるものである、請求項106に記載の使用。
【請求項１０８】
周皮細胞機能障害がある被験体を治療する方法であって、周皮細胞機能をモジュレートする化合物と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮性状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項１０９】
前記化合物が請求項45〜75のいずれか1項に記載の方法によって同定されるものである、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
網膜血管機能障害がある被験体を治療する方法であって、周皮細胞機能をモジュレートする化合物と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮性状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項１１１】
前記化合物が請求項45〜75のいずれか1項に記載の方法によって同定されるものである、請求項110に記載の被験体を治療する方法。
【請求項１１２】
網膜血管機能障害がある被験体を治療する方法であって、網膜血管機能をモジュレートする化合物と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜内の血管の収縮性状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項１１３】
前記化合物が請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法によって同定されるものである、請求項112に記載の被験体を治療する方法。
【請求項１１４】
被験体の治療の進行のモニターにおける、請求項76〜103のいずれか1項に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、細胞収縮性または血流をモジュレートする薬剤などの薬剤スクリーニングの分野にある。さらに詳しくは、本発明は、網膜血管機能、例えば、透過性、完全性および収縮性などをモジュレートする薬剤の新規スクリーニングに関する。さらに、本発明は、周皮細胞機能、例えば、周皮細胞の収縮、細胞増殖、分化、イオンチャネル伝導性、神経伝達物質放出、または遺伝子転写などをモジュレートする薬剤の新規スクリーニングに関する。かかるスクリーニングを使用して同定される薬剤は、例えば、ヒトまたは動物の被験体における網膜浮腫、緑内障、網膜症または網膜血管新生などの網膜血管機能障害または周皮細胞機能障害をはじめとする障害の診断または治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
目の網膜は、シグナル伝達に関与する7層構造をなしている。大部分の霊長類では、網膜は約200〜250マイクロメートルの厚さである。網膜血管は比較的薄く、ほとんどの哺乳類の網膜では、大動脈が分岐してちょうど2個または3個の毛細血管床を形成している。網膜中の毛細血管は、毛細血管の長軸の下方ならびに毛細血管の周囲に突起を伸ばしている周皮細胞を含んでいる。周皮細胞は収縮性細胞であり、この細胞の収縮は、網膜の微小血管系を通過する血流を制御している可能性が高い。この血流の制御は、付着板、ギャップ結合、および網膜の周皮細胞と内皮細胞との間を連絡する周皮細胞突起によって仲介されている。周皮細胞突起は、いわゆる「ペグ・アンド・ソケット(peg and socket)」結合を介して種々の内皮細胞に「付着」する。したがって、周皮細胞は、内皮細胞間の結合を機械的に「開」または「閉」状態にさせることにより、あるいは体液シグナル、イオンシグナルまたは他のシグナルを介して内皮細胞収縮要素および／または内皮細胞の経細胞輸送性プロセスに影響を及ぼすことにより、微小血管系にわたる流動に影響を及ぼす特有の位置にある。周皮細胞の収縮能力に関する機能的証拠は、Harrisら（(1980)、Science、Vol 208）の方法の変法を使用し、シリコーンゴム基板上で増殖させた細胞を用いて証明されている。
【０００３】
微小血管の周皮細胞は、微小循環の内皮障壁を通過する液体、栄養素、タンパク質およびホルモンの移動に関する生理学的なレギュレーターであると考えられる。また、周皮細胞機能の変化という点に関して検討した場合、糖尿病をはじめとする様々な疾病症状の病態生理学をより完全に理解することができると考えられる。脈管合併症を含み得る目の疾患としては、緑内障、角膜血管新生、未熟児網膜症および糖尿病性網膜症が挙げられる。例えば、視神経頭部位の血流障害および視神経頭周囲の血流障害は、緑内障に随伴する合併症の主な原因となり得る。
【０００４】
糖尿病性網膜症では、網膜の全体にわたって血管（細動脈および毛細血管）に損傷または閉塞が起こり、その結果、網膜の小領域に血液が供給されなくなる。このため、糖尿病は、網膜血管の透過性における変化の原因となり得る。糖尿病性網膜症のさらなる進行例では、網膜血管新生により網膜内への血液の漏出と網膜剥離が生じ、視力喪失を起こす可能性がある。糖尿病性眼病変を未処置でおいておくと、重い視力障害または失明に至る可能性がある。
【０００５】
糖尿病患者の約25％は、糖尿病性網膜症をある程度患っている。糖尿病性網膜症は、Ｉ型糖尿病患者とII型糖尿病患者の両方で発症する。Ｉ型糖尿病患者のほぼ全員が20年後に糖尿病性網膜症の兆候を示し、II型糖尿病患者全員の21％以下が、患者が初めて糖尿病と診断された場合に網膜症を患っているであろう。II型糖尿病は、患者が長期にわたって疾患にかかっていないと診断されない場合が多いため、II型患者は、糖尿病と診断された時点で糖尿病性網膜症に罹患している可能性がある。実際、患者の多くは、患者の眼科医が定期的な眼科検査で糖尿病性網膜症を発見した場合に、自分が糖尿病を患っていることを初めて知る。
【発明の開示】
【０００６】
現在、網膜症の診断では、網膜毛細血管の機能を判断するには検眼鏡および／または蛍光眼底血管撮影法の侵襲的使用が必要とされている。また、その方法によって、糖尿病の予備的診断に関するある程度の確証を得ることができる。しかし残念なことに、透過性障害を発症する網膜血管の罹患性に関して容易に行われる試験は今のところ存在していない。
【０００７】
本発明は、単離された網膜中の血管の機能をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、単離された網膜中の血管の収縮状態における変化を試験化合物の存在下で検出し、ここで前記変化が、試験化合物が血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【０００８】
また、本発明は、周皮細胞機能をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、周皮細胞の収縮状態における変化を試験化合物の存在下で検出し、ここで前記変化が、試験化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【０００９】
本発明のスクリーニングにおいて同定される化合物は、小分子、ペプチド、タンパク質、ホルモン、核酸、有機または無機化学化合物などのものであり、それらは網膜血管機能または周皮細胞機能のアゴニストである。かかる化合物は、単離された網膜または周皮細胞中の血管の収縮を変化させる（すなわち、プロタゴナイズまたはアンタゴナイズする）ことができる。
【００１０】
本明細書では、「アゴニスト」とは、周皮細胞または血管に作用して生理学的応答を起こすことができる化合物、さらに詳しくは血管または周皮細胞の収縮を変化させることができる化合物である。
【００１１】
「収縮をプロタゴナイズする」とは、化合物が血管または周皮細胞の収縮を亢進し、それらをより完全な収縮またはより高度な収縮、あるいはより長期間の収縮またはより速やかな収縮を生じさせることを意味する。
【００１２】
「収縮をアンタゴナイズする」とは、化合物が血管または周皮細胞の収縮程度を低下させ、それによって血管または周皮細胞が弛緩されること、より完全に弛緩されること、あるいは、任意の収縮の時間が短縮されること、または収縮の期間が短くなること、または細胞の弛緩期間が亢進もしくは延長されることを意味する。
【００１３】
血管または周皮細胞の収縮をプロタゴナイズまたはアンタゴナイズすることによって、血管または周皮細胞の収縮状態は変化する。
【００１４】
例えば、アゴニストは、弛緩した周皮細胞を収縮させるか、あるいは収縮した周皮細胞を弛緩させることができる。同様に、部分的に弛緩した周皮細胞または部分的に収縮した周皮細胞をより完全に、または長時間弛緩させるか、あるいはより完全に、または長時間収縮させることができる。
【００１５】
別の例においては、弛緩した網膜血管に収縮を生じさせるか、あるいは収縮した血管に弛緩を生じさせる。部分的に弛緩した血管または部分的に収縮した血管をより完全に、または長時間弛緩させることができるか、あるいはより完全に、または長時間収縮させることができる。
【００１６】
本明細書では、「収縮状態」という用語は、血管または周皮細胞が収縮されている程度を意味するように用いるものとする。従って、周皮細胞に関しては、収縮状態の低下とは、周皮細胞がより膨張または拡大または弛緩されること、あるいは収縮が少ないこと、または収縮までが緩慢であること、または長期間弛緩されていることである。反対に、収縮状態の亢進または向上とは、周皮細胞がより一層収縮もしくは縮小されていること、またはより一層迅速に収縮されること、またはより長時間収縮が維持されていることである。
【００１７】
単離された網膜中の血管に関しては、収縮状態の低下とは、血管がより一層膨張または拡大または伸長または弛緩または拡張していること、あるいは収縮が少ないこと、または収縮までが緩慢であること、または長期間弛緩されていることである。反対に、収縮状態の亢進または向上とは、血管がより一層収縮もしくは縮小していること、またはより一層迅速に収縮すること、あるいはより長時間収縮が維持されていることである。
【００１８】
本発明の新規スクリーニングで同定されたアゴニストは、周皮細胞機能障害または網膜血管機能障害、例えば、緑内障、角膜血管形成、末熟児網膜症または糖尿病性網膜症の症例などの診断に特に有用である。
【００１９】
例示として、本発明者らは、周皮細胞の収縮状態を変化させる数種類のリード化合物を同定した。また、本発明者らは、単離された網膜中の血管の収縮状態を変化させる数種類のリード化合物を同定した。
【００２０】
一実施形態では、かかる化合物は網膜血管を拡大し、それによって網膜への血流を増加させ得る。別の実施形態では、かかる化合物は網膜血管を狭くし、それによって網膜への血流を減少させ得る。さらに、本発明者らは、微小毛細血管をはじめとする網膜血管について、眼球中の血流の調節における機能障害を有する可能性に基づいた診断テストを開発した。これらのアゴニストの効果は、当業者により認められている手段を用いて確認することができる。特に好ましい実施形態では、当業者は、本診断テストによって、緑内障、角膜血管形成、末熟児網膜症または糖尿病性網膜症を発症する被験体のリスクについて評価することができる。
【００２１】
従って、本発明の第2の態様では、被験体の網膜血管機能障害を診断する方法であって、血管の収縮状態を変化させるのに十分な条件下で血管機能をモジュレートする薬学上許容可能な化合物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定されるものであり、ここで前記変化が、化合物が血管機能をモジュレートすることを示すものであり、ならびに、被験体の網膜血管の収縮状態の変化を検出することを含む、前記方法を提供する。被験体の網膜血管の収縮状態の変化は、健常な被験体の網膜血管の収縮状態の変化と比較することにより検出されるのが好ましい。
【００２２】
関連する態様では、本発明は被験体の周皮細胞機能障害を診断する方法であって、被験体の周皮細胞の収縮状態を変化させるのに十分な条件下で周皮細胞機能をモジュレートする薬学上許容可能な化合物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定されるものであり、ここで前記変化が、前記化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものであり、ならびに、被験体の周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含む、前記方法を提供する。
【００２３】
関連する実施形態では、本発明は被験体の網膜血管障害を診断する方法であって、被験体の周皮細胞の収縮状態を変化させるのに十分な条件下で周皮細胞の収縮状態をモジュレートする薬学上許容可能な化合物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定されるものであり、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものであり、ならびに、被験体の網膜中の毛細血管の拡張または収縮を検出することを含み、ここで、網膜血管の緩慢なまたは微弱な拡張または収縮が網膜血管の損傷を示すものである、前記方法を提供する。
【００２４】
「薬学上許容可能な」とは、動物の目へ投与するにあたって安全であると考えられることを意味する。
【００２５】
被験体の網膜血管の収縮状態の変化は、健常な被験体の網膜血管の収縮状態の変化と比較することによって検出されるのが好ましい。
【００２６】
一実施形態では、網膜血管は網膜毛細血管である。
【００２７】
また、本発明の新規スクリーニングで同定されるこれらのアゴニストは、周皮細胞機能障害または網膜血管機能障害、例えば、緑内障、角膜血管形成、末熟児網膜症または糖尿病性網膜症の症例などの治療に特に有用である。
【００２８】
特に、周皮細胞機能のプロタゴニストは、健常な被験体の周皮細胞に比べて、周皮細胞が収縮力または収縮強度の低下または障害を示す場合、あるいは、より緩慢にまたは短時間に収縮する場合の症状の治療に有用である。かかるプロタゴニスト化合物の適用は、網膜への血液の過剰供給がある症例、例えば、糖尿病性網膜症の症例などで必要とされ得る。
【００２９】
同様に、単離された網膜中の血管機能のプロタゴニストとして同定された化合物は、健常な被験体の網膜血管に比べて、網膜血管が収縮力または収縮強度の低下または障害を示す場合、あるいは、より緩慢にまたは短時間に収縮する場合の症状の治療に有用である。また、かかるプロタゴニスト化合物の適用は、網膜への血液の過剰供給、あるいは網膜血管の損傷または漏出がある症例、例えば、糖尿病性網膜症の症例などで必要とされ得る。
【００３０】
反対に、本発明の方法により同定された血管または周皮細胞機能のアンタゴニストは、網膜血管または周皮細胞が収縮に対し過剰に刺激されている場合、または、収縮状態が維持されている場合、または、弛緩する能力、もしくは完全に弛緩する能力の低下を示す場合の症例、あるいは、網膜血管への血液の供給が低下している場合の症例の処置または治療に有用である。
【００３１】
外科的処置もかかる化合物の使用を含み得る。
【００３２】
従って、第3の態様では、本発明は、被験体の網膜血管機能障害の治療用医薬の製造における網膜血管機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出または同定することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用を提供する。
【００３３】
関連の態様では、本発明は、被験体の周皮細胞機能障害の治療用医薬の製造における周皮細胞機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出または同定することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用を提供する。
【００３４】
第4の態様では、本発明は被験体内の網膜血管機能障害を有する被験体を治療する方法であって、網膜血管機能をモジュレートする化合物と薬学上許容可能な担体とを含む医薬組成物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【００３５】
関連の態様では、周皮細胞機能障害を有する被験体を治療する方法であって、周皮細胞機能をモジュレートする化合物と薬学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含む方法により同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【００３６】
本明細書を通じて、「含む(comprise)」という語、または「含む(comprises)」もしくは「含んでいる(comprising）」という語は、説明されている要素、整数またはステップ、あるいは複数の要素、整数またはステップの群の含有を意味するが、他の如何なる要素、整数またはステップ、あるいは複数の要素、整数またはステップの群を排除することを意味するものではないと理解されたい。
【００３７】
周皮細胞スクリーニングアッセイ
本発明は、周皮細胞機能をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、試験化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出し、ここで前記変化が、試験化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。一実施形態では、本発明は、周皮細胞の収縮状態をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、周皮細胞を試験化合物と接触させること、および前記周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含み、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【００３８】
一実施形態では、本方法は、試験化合物の存在下で周皮細胞をインキュベートすることを含んでいる。
【００３９】
化合物を周皮細胞と接触させる前に周皮細胞の収縮状態を検出し、それによって周皮細胞の収縮状態の変化の検出を容易にするのが好ましい。あるいは、ある好ましいアッセイ形態では、周皮細胞は試験化合物の不在下で収縮状態を一般に呈しており、その場合、周皮細胞の弛緩または収縮状態の低下が容易に検出され得る。
【００４０】
いかなる技術認識手段も周皮細胞の収縮状態の検出に用いることができる。例えば、前記手段には、目視検出、cAMPレベルまたはCa2+流出の検出をはじめとする二次伝達物質アッセイ、FACS分析、イオンチャネル活性、細胞透過性の検出、あるいは細胞が接触している表面に細胞が加える力の検出等が挙げられる。
【００４１】
周皮細胞の収縮状態は、目視手段によって、例えば、顕微鏡、またはin vivoもしくはin vitroもしくはin situにおける細胞の大きさもしくは体積、およびそれらの変化を検出することができる同様の分析ツールを用いることによって検出するのが好ましい。本発明の方法は、周皮細胞の可視化、保持または培養の技術を用いるのが好ましく、それによって、それらの収縮または弛緩が容易に検出され、定量化が可能となる。
【００４２】
別の実施形態では、周皮細胞の収縮状態は非可視手段によって検出する。
【００４３】
本発明の方法は、互いにプロタゴニストまたはアンタゴニストであり得る、一連の異なる化合物を周皮細胞と逐次接触させることを明らかに含んでいる。各接触の間に細胞を洗浄し、残留している第1化合物を除去するか、あるいは周皮細胞の収縮に関する効果を及ぼすには低すぎるレベルまで前記化合物の濃度を低下させることができる。
【００４４】
別の実施形態では、本方法は、前記第1試験化合物と第2試験化合物との接触の間に細胞を洗浄することなく、周皮細胞を第2試験化合物と接触させることをさらに含んでいる。この場合、第1化合物に対してアンタゴニストな第2化合物は、十分に高濃度で存在する場合、第1化合物の効果を逆転させる。あるいは、第2化合物が第1化合物のプロタゴニストである場合、周皮細胞の収縮状態は、段階的に亢進（すなわち、収縮の亢進または弛緩の亢進）され得る。
【００４５】
一実施形態では、周皮細胞は弾力性のある支持体と物理的に接触している。別の実施形態では、周皮細胞は弾力性のある支持体と物理的に接触してはいない。一実施形態では、周皮細胞は水溶液中に存在する。
【００４６】
特に好ましい実施形態では、周皮細胞の収縮状態は、弾力性または可撓性のある支持体を有する媒体上における周皮細胞の増殖によって検出するが、前記媒体は、周皮細胞がそれに接している場合に歪ませることができ、かつ、それと接触している周皮細胞の収縮状態が変化した場合に歪ませることができるものである。
【００４７】
本明細書では、「歪ませる」および「歪み」という用語は、細胞または支持体の自然な、以前の、正常の、または本体の形状または状態からの変化を意味する。
【００４８】
一実施形態では、本発明は、周皮細胞の収縮状態をモジュレートする化合物を同定する方法であって、
(i)周皮細胞収縮が弾力性のある支持体を歪ませるのに十分な条件下で、弾力性のある支持体と物理的に接触している周皮細胞を提供すること；
(ii)試験化合物に前記周皮細胞を接触させること；および
(iii)前記弾力性のある支持体における歪みを検出すること、
を含み、ここで前記歪みが、前記化合物が周皮細胞の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【００４９】
本明細書では、「物理的に接触」とは、周皮細胞の収縮状態の変化が支持体に歪みをもたらすのに十分に接着させることを意味する。好ましくは、細胞を弾力性のある支持体に固定する。
【００５０】
弾力性のある支持体は、弾力性のあるシートであるのが好ましい。「弾力性のある」という用語は、歪、変形または破裂に永久的に耐え得る特性、あるいは変化または処理から回復可能またはそれらに対し調節可能な特性を意味する。本内容では、弾力性のある支持体は、それに接着されている周皮細胞の収縮中または弛緩中に変形または歪ませるのに十分な弾力性、あるいは周皮細胞の収縮状態が変化した場合のその標準的な外観を想定するのに十分な弾力性がありさえすればよい。必要とされる支持体の変形の程度は小さいので、本目的においては高弾性の材料は必要ではない。
【００５１】
支持体は、ガラス製であるのが好ましい。
【００５２】
別の実施形態では、支持体は非ガラス材料製である。一実施形態では、支持体は、例えば架橋ポリマーなどの高分子材料製である。好ましくは、高分子材料には、弾性特性を有する弾性ポリマーまたはポリマーフィルムが含まれる。一実施形態では、支持体は粘弾性材料である。一実施形態では、支持体は透明材料から製造されているものである。別の実施形態では、支持体は不透明材料または半透明材料から製造されているものである。
【００５３】
特に、ガラス材料と高分子材料が混合されている支持体が好ましい。
【００５４】
好ましくは、支持体は、周皮細胞が付着または固定されているか、あるいは物理的に接触している、架橋ポリマーコーティングを有するガラスを含んでいる。一実施形態では、支持体は架橋結合シリコーン液層を有している。
【００５５】
好ましくは、支持体は、細胞の単分子層または二分子層の支持体への付着または培養が容易になる水平または平面である。平坦でない支持体を使用した場合、ある状況においては、単一の歪みを単一の細胞の収縮状態と互いに関連づけるのが困難になることから、定量の妨げとなる。「水平または平面」というのは、例えば、細胞のほぼ単分子層または細胞のほぼ二分子層など、それらと接触している細胞の平坦な層の増殖または培養または付着を可能にするのに十分に平坦であることを意味する。
【００５６】
別の実施形態では、水平または平面でない支持体を用いることは適当であり得る。
【００５７】
健常な周皮細胞が架橋ポリマーのごく薄いシート上で培養された場合、細胞が薄いシートに及ぼす牽引力によってそのポリマー層に歪みが生じる。従って、試験化合物を前記周皮細胞と接触させると、細胞の収縮を高めることにより、または、細胞の収縮を低下させることにより、ポリマー層にさらに歪みが生じ得る。この場合、前記のさらなる歪みは、前記化合物が周皮細胞の収縮状態をモジュレートしていることを示すものである。
【００５８】
ポリマー層の歪みは、ポリマー層の弾性の歪みまたはしわとして視覚化されるのが好ましい。
【００５９】
一実施形態では、細胞の収縮状態は、in vivoまたはin vitroまたはin situにおける細胞の大きさまたは体積の変化を検出または検出することにより決定される。例えば、細胞の収縮性指数は、支持体のしわまたは歪みの数を数えることにより容易に検出することができる。
【００６０】
本発明の方法は、周皮細胞を一連の異なる化合物（これは、互いにアンタゴニストであってよい）と逐次的にインキュベーションすることを明らかに含んでいる。
【００６１】
一実施形態では、本方法は、
化合物を除去するのに、または周皮細胞収縮に影響を及ぼさないレベルまでその活性を低下させるのに十分な時間および条件下で、細胞の完全性または収縮性機能に損傷を与えることのない好適なバッファーまたは水性溶媒を用いて周皮細胞を洗浄すること；
(ii)場合により、弾力性を有する支持体の歪みを検出すること；
(iii)周皮細胞を第2試験化合物と接触させること；および
(iv)前記弾力性を有する支持体の歪みを検出すること、
を含み、ここで前記歪みが、前記化合物が周皮細胞の収縮状態をモジュレートすることを示すものである。
【００６２】
別の実施形態では、本方法は、化合物を除去するのに、あるいは収縮に影響を及ぼさないレベルまでその活性を低下させるのに十分な時間および条件下で、好適なバッファーまたは水性溶媒を用いて周皮細胞を洗浄することなく、周皮細胞を第2試験化合物と接触させることを含み、ここで前記弾力性を有する支持体のさらなる歪みが、前記化合物が周皮細胞の収縮状態をモジュレートすることを示すものである。
【００６３】
いずれかの実施形態において、第2の歪みが、第1試験化合物で得られた歪みと逆の場合、第2化合物は第1化合物のアンタゴニストである。第2の歪みが第1試験化合物で達成された歪みを増幅する場合、第2化合物は第1化合物のプロタゴニストである。例えば、第1試験化合物は、周皮細胞の弛緩を誘導し、それによって弾力性のある支持体のしわが少なくなるが、第2化合物は周皮細胞の収縮を誘導し、それによって弾力性のある支持体のしわの数を増す。一方、第1および第2の両化合物が同一効果を生じる場合、弾力性のある支持体のしわの数は、（周皮細胞機能のアゴニストに関して）第1化合物と第2化合物の添加の間で段階的に増加し得るか、あるいは、（周皮細胞機能のアンタゴニストに関して）段階的に減少し得る。かかるすべての可能性は本発明に含まれている。
【００６４】
また、本方法は、被験体由来の細胞の視覚化された歪みを、（候補化合物との接触によって）処理されたコントロール細胞あるいは未処理のコントロール細胞と比較することをさらに含んでいるのが好ましい。一実施形態では、コントロール細胞は健常な細胞である。別の実施形態では、コントロール細胞は障害のある細胞、例えば、疾病患者から得た細胞、あるいは機能障害のある細胞が得られるように処理した細胞である。
【００６５】
一実施形態では、本方法は、候補化合物を細胞と接触させる前または後に、拮抗阻害剤化合物を周皮細胞と接触させることを含む、競合タイプアッセイをさらに含んでいる。競合化合物は、収縮状態をモジュレートして、周皮細胞の収縮状態を低下または増強させるものが好ましい。
【００６６】
網膜スクリーニングアッセイ
本発明は、単離された網膜中の血管の機能をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、試験化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出し、ここで前記変化が、試験化合物が血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。本発明のこの実施形態は、単離された血管またはex vivoの毛細血管を試験化合物と接触させることを含まない。一実施形態では、本発明は単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、単離された網膜を試験化合物と接触させること、前記血管の収縮状態の変化を検出することを含み、ここで前記変化が、化合物が血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【００６７】
好ましい実施形態では、網膜は全網膜である。別の実施形態では、網膜は全網膜ではない。一実施形態では、網膜は網膜の一部である。一実施形態では、試験化合物は液滴の形態で施す。一実施形態では、試験化合物は、液滴、蒸気、噴霧化液滴、ナノ粒子、ミクロスフェア、またはこれらの混合物として施される。別の実施形態では、試験化合物は溶液流で施される。一実施形態では、試験化合物は潅流によって施される。
【００６８】
さらなる実施形態では、本方法は、試験化合物の存在下で、単離された網膜をインキュベートすることを含んでいる。
【００６９】
血管の収縮状態は、化合物を単離された網膜と接触させる前に検出し、それによって血管の収縮状態の変化の検出を容易するのが好ましい。あるいは、ある好ましいアッセイ形態では、血管は試験化合物の不在下で収縮状態を一般に呈しており、その場合、血管の弛緩または収縮状態の低下が容易に検出され得る。
【００７０】
いかなる技術認識手段も血管の収縮状態の検出に用いることができる。例えば、前記手段には、目視検出、cAMPレベルまたはCa2+流出の検出をはじめとする二次伝達物質アッセイ、血管透過性の検出等が挙げられる。
【００７１】
血管の収縮状態は、好ましくは目視手段によって、例えば、顕微鏡、またはin vivoもしくはin vitroもしくはin situにおける血管の大きさもしくは体積、およびそれらの変化を検出することができる同様の分析ツールを用いることによって検出するのが好ましい。
【００７２】
本発明の方法は、血管の可視化、単離、処理または維持の技術を用いるのが好ましく、それによって、それらの収縮または弛緩が容易に検出され、定量化が可能となる。
【００７３】
別の実施形態では、血管の収縮状態は非可視手段によって検出する。
【００７４】
本発明の方法は、互いにプロタゴニストまたはアンタゴニストであり得る、一連の異なる化合物を単離された網膜と逐次接触させることを明らかに含んでいる。各接触の間に単離された網膜を洗浄し、残留している第1化合物を除去するか、あるいは血管の収縮に影響を及ぼすには低すぎるレベルまで前記化合物の濃度を低下させることができる。
【００７５】
別の実施形態では、本方法は、前記第1試験化合物と第2試験化合物との接触の間に単離された網膜を洗浄することなく、単離された網膜を第2試験化合物と接触させることをさらに含んでいる。この場合、第1化合物に対してアンタゴニストな第2化合物は、十分に高濃度で存在する場合、第1化合物の効果を逆転させる。あるいは、第2化合物が第1化合物のプロタゴニストである場合、血管の収縮状態は、段階的に亢進（すなわち、収縮の亢進または弛緩の亢進）され得る。
【００７６】
一実施形態では、単離された網膜は水溶液中で遊離して懸濁されており、単離された網膜は、支持体と物理的に接触していない。
【００７７】
別の実施形態では、単離された網膜は支持体と物理的に接触している。
【００７８】
特に好ましい実施形態では、単離された網膜は支持体に固定されている。本明細書において「固定された」という用語は、単離された網膜を十分に安定させるように直接的または間接的に接着されていることを意味する。一実施形態では、接着剤を用いて単離された網膜を支持体に固定する。好ましい実施形態では、接着剤は、シアノクリル酸接着剤(「Super-glue」)、2成分系樹脂(「アラルダイト(Araldite)」)、高粘度真空グリース、またはシリコーン(「Sylgard」)等のいずれかである。別の実施形態では、接着剤は使用しない。一実施形態では、単離された網膜は真空によって支持体に固定される。
【００７９】
特に好ましい実施形態では、本発明は単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする化合物を同定する方法であって、支持体に固定されている単離された網膜を提供すること；試験化合物を前記の単離された網膜と接触させること；および前記血管の歪みを検出することを含み、ここで前記歪みが、前記化合物が単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【００８０】
一実施形態では、単離された網膜は、後眼部の内面に配置されているものである。本明細書で用いられている「配置されている」という用語は、その形状に実質的に合致していることを意味する。
【００８１】
好ましくは、後眼部は、その正常な生理学的な配置で網膜を含有している杯状体を形成している。一実施形態では、後眼部は支持体に固定される。
【００８２】
別の実施形態では、単離された網膜は、後眼部の内面に配置されていないものである。別の実施形態では、単離された網膜は、非天然素材表面または合成素材表面に配置されているものである。一実施形態では、非天然素材表面または合成素材表面は支持体に直接固定されており、それに配置されている網膜は、それによって支持体に間接的に固定されている。別の実施形態では、非天然素材表面または合成素材表面は、支持体に間接的に固定されている。
【００８３】
一実施形態では、非天然素材表面または合成素材表面の一部は、実質的に凹面である。実質的に凹面の表面は、その正常な生理学的な配置で網膜を含有する杯状体を形成するのが好ましい。
【００８４】
別の実施形態では、非天然表面または合成素材表面は凹面ではないものである。一実施形態では、表面の少なくとも一部は、水平または平面である。「水平または平面」とは、その表面が十分に水平であり、その結果、表面が、その正常な生理学的な配置で網膜を維持しないことを意味する。別の好ましい実施形態では、単離された網膜は、水平表面または平面表面上に水平に取り付けられる。
【００８５】
一実施形態では、合成素材表面はガラス製である。
【００８６】
別の実施形態では、合成素材表面は、高分子材料などの非ガラス材料製である。ガラスとポリマーを混合した合成素材表面が好ましい。
【００８７】
好ましくは、支持体は、単離された網膜を固定することができる表面、容器または収納体である。一実施形態では、支持体は、溶液を含有し得る容器である。一実施形態では、支持体は、例えばペトリ皿などの浅い皿である。別の実施形態では、支持体はマイクロピペットである。
【００８８】
好ましくは、試験化合物は単離された網膜の硝子体側と接触させる。かかる接触は、被験体での薬剤の非侵襲的投与経路に関する直接的な相似形と考えられる。別の実施形態では、試験化合物は、単離された網膜の非硝子体側と接触させる。試験化合物の非硝子体との接触は、被験体での薬剤の侵襲的投与経路に関して、薬剤を検出および分析するのに有用であり得る。
【００８９】
本明細書における「歪ませる」および「歪み」とは、網膜血管の自然な、以前の、正常の、または本来の形状または状態からの変化を意味する。
【００９０】
歪みは、血管の生理学的変化を検出することにより判定するのが好ましい。一実施形態では、網膜血管の収縮状態は、in vivoまたはin situにおける網膜血管の大きさ、寸法または体積の変化を検出または判定することにより決定する。
【００９１】
好ましくは、単離された網膜の血管の厚さまたは直径の変化として歪みを可視化する。好ましい実施形態では、歪みは、血管の断面の直径の変化として可視化する。本明細書では「断面の直径」とは、血管の長軸に対して垂直な血管の幅を意味する。
【００９２】
一実施形態では、網膜の画像を記録する。画像は、デジタルカメラまたはビデオカメラを用いて記録することができる。好ましくは、顕微鏡の光学観察経路へデジタルカメラまたはビデオカメラを取り付ける。一実施形態では、血管の断面の直径は、適当なキャリブレーションスケールを用いることにより画素またはミクロンで測定される。
【００９３】
好ましくは、断面直径は、網膜の画像中の血管の断面直径を含む画素数を数えることにより可視的に測定することができる。
【００９４】
一実施形態では、血管の断面直径に対応する画素は、バックグラウンド網膜に対する血管のコントラストの変化によって同定することができる。一実施形態では、画像分析ツールを用いて変化を同定する。特に、特定の画像分析ツールには、(i)バックグラウンド網膜の断面直径および断面を含むように血管を横断して作られた画素光度の断面ラインプロファイル、または(ii)血管の画像中の各画素から最も近位のバックグラウンド画素までの距離を計測する距離マップを作成するのに用いられる網膜のバイナリー画像が含まれる。検出の感度は2画素であるのが好ましい。
【００９５】
画像は、分析前に画像強調には供しないのが好ましい。
【００９６】
一実施形態では、血管は血液を含有しているものである。好ましくは、血管は、(場合によっては顕微鏡を使用して)可視的に検出され得る、または検出される、少なくとも十分量の血液を含有しているものである。別の実施形態では、血管は、染料、例えばエバンスブルー染料などを含有する。染料は血管へ潅流するのが好ましい。血管は、可視的にまたは別の方法で検出され得るような量の染料を含有しているのが好ましい。
【００９７】
一実施形態では、本方法は、
(i)化合物を除去するのに、あるいは血管収縮に影響を及ぼさないレベルまでその活性を低下させるのに十分な時間および条件下で、網膜の完全性または網膜血管の収縮機能に損傷を与えることのない好適なバッファーまたは水性溶媒を用いて単離された網膜を洗浄すること；
(ii)場合により網膜血管中の歪みを検出すること；
(iii)網膜血管を第2試験化合物と接触させること；および
(iv)前記網膜血管における歪みを検出すること、
をさらに含み、ここで前記歪みが、前記化合物が網膜血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである。
【００９８】
別の実施形態では、本方法は、化合物を除去するのに、あるいは網膜血管収縮に影響を及ぼさないレベルまでその活性を低下させるのに十分な条件下で、好適なバッファーまたは水性溶媒を用いて単離された網膜を洗浄することなく、単離された網膜を第2試験化合物と接触させることをさらに含み、ここで網膜血管におけるさらなる歪みが、化合物が網膜血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである。
【００９９】
いずれか実施形態では、第2の歪みが、第1試験化合物で得られた歪みと逆の場合、第2化合物は第1化合物のアンタゴニストである。第2の歪みが、第1試験化合物で達成された歪みを増幅する場合、第2化合物は第1化合物のプロタゴニストである。例えば、第1試験化合物は、網膜血管の弛緩を誘導し、それによって血管の断面直径を大きくするが、第2化合物は網膜血管の収縮を誘導し、それによって網膜血管の断面直径を小さくする。一方、第1および第2の両化合物が同一効果を生じる場合、網膜血管の直径は、（網膜血管機能のアゴニストに関して）第1化合物と第2化合物の添加の間で段階的に増加し得るか、あるいは、（網膜血管機能のアンタゴニストに関して）段階的に減少し得る。かかるすべての可能性は本発明に含まれる。
【０１００】
また、本方法は、被験体由来の網膜血管の歪みを、（候補化合物との接触によって）処理されたコントロール網膜血管、あるいは未処理のコントロール網膜血管と比較することをさらに含んでいるのが好ましい。一実施形態では、コントロール網膜血管は健常な網膜血管である。別の実施形態では、コントロール網膜血管は障害のある網膜血管、例えば、疾病患者から得た網膜血管、あるいは機能障害のある網膜血管が得られるように処理した網膜血管である。
【０１０１】
一実施形態では、本方法は、候補化合物を網膜血管と接触させる前または後に、拮抗阻害剤化合物を網膜血管と接触させることを含む、競合タイプアッセイをさらに含んでいる。競合化合物は、収縮状態をモジュレートして、網膜血管の収縮状態を低下または増強させるものが好ましい。
【０１０２】
網膜血管、特に網膜毛細血管は、身体のすべての器官内の内皮細胞に対して周皮細胞の含有率が最も高い。従って、周皮細胞の収縮状態をモジュレートするアゴニストは網膜血管の収縮状態をモジュレートすることが予想される。また、周皮細胞の収縮を誘導する化合物は、網膜毛細血管中の収縮を誘導することが予想される。逆に、単離された周皮細胞に弛緩するように誘導する化合物は、網膜毛細血管を弛緩するように誘導することが予想される。
【０１０３】
ある状況下で血管が収縮または拡張するかしないかは、場合によっては、周皮細胞または完全な網膜に用いられる化合物の濃度に依存して起こり得ることを当業者は理解するであろう。また、例えば、網膜に比べて周皮細胞内への化合物の取り込みが可変性である結果として、単離された網膜中の血管または周皮細胞の収縮または拡張を誘導するのに用いられる化合物の有効濃度も変わり得る。また明らかに、(例えば、化合物が利用または代謝される場合の)化合物の任意の濃度における経時的な周皮細胞または血管の収縮能または弛緩にも違いがあり得る。しかし、本明細書に記載されている、単離された網膜中の、あるいはin vivoにおける周皮細胞または血管の収縮または拡張を誘導するのに必要とされる任意の化合物の濃度は、過度の試験を行うことなく当業者によって容易に決定され得る。
【０１０４】
好ましくは、本明細書に記載されている化合物は、収縮を誘導するのに必要な化合物の濃度より低い化合物の濃度で、周皮細胞アッセイにおいて周皮細胞の弛緩を誘導するか、あるいは網膜アッセイまたはin vivoにおいて血管の拡張を誘導する。例えば、約3ミクロモルを超える化合物(例えば、NSAID、例えば、アスピリンおよびフルルビプロフェン(特にγ-フルルビプロフェン)からなる群から選択されるもの)の濃度は、本明細書に記載されている周皮細胞アッセイにおいて周皮細胞の収縮能を亢進し、一方、低濃度の化合物は周皮細胞の弛緩(例えば、収縮能の低下)を亢進し得る。同一の化合物について、本明細書に記載されている網膜アッセイにおいて単離された網膜に適用される場合、約10ミクロモル未満の濃度が一般に網膜中の血管の拡張を亢進する。最初の拡張の後、経時的に、一般には化合物の投与後約5〜10分で、あるいはそれより長い時間で、収縮が生じるか、あるいは正常な周皮細胞または血管直径に戻り得る。
【０１０５】
診断および治療上の利用
本発明の新規なスクリーニングで同定される化合物は、被験体の網膜血管機能障害および周皮細胞機能障害の診断に特に有用である。網膜血管機能および周皮細胞機能をモジュレートすることをin vitroでのスクリーニングで示した化合物は、例えば、イヌ、ウサギ、マウスまたはモルモットまたはラットまたは他の小型げっ歯動物、あるいはブタなどの動物モデルで安全性および有効性を試験し、次いで、所望ならば、ヒトにおける臨床試験に移すことができる。もちろん、獣医学上での利用においては、ヒトでの臨床試験は必要ではない。動物またはヒトにおいて安全であって効果のある化合物は、正常または健常な網膜機能に関する試験において、適当な被験体の眼球に適用することができる。網膜血管機能障害または周皮細胞機能障害、例えば、緑内障、角膜血管形成、末熟児網膜症または糖尿病性網膜症などに罹患している被験体では、アゴニスト化合物を眼球の表面に適用した場合、一般に収縮が誘導されないか、あるいは、類似条件または同一条件下で健常な被験体で得られた収縮状態と比較して、収縮の遅延または収縮の不完全を生じる。
【０１０６】
本発明の第2の態様は、被験体の網膜血管機能障害を診断する方法であって、被験体に血管の収縮状態を変化させるのに十分な条件下で血管機能をモジュレートする薬学上許容可能な化合物のある量を投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が血管機能をモジュレートすることを示すものであり、ならびに、被験体の網膜血管の収縮状態の変化を検出することを含む、前記方法を提供する。被験体の網膜血管の収縮状態の変化は、健常な被験体の網膜血管の収縮状態の変化との比較によって検出されるのが好ましい。
【０１０７】
本発明の関連の態様では、被験体の周皮細胞機能障害を診断する方法であって、被験体に周皮細胞の収縮状態を変化させるのに十分な条件下で周皮細胞機能をモジュレートする薬学上許容可能な化合物のある量を投与すること、および被験体の周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。被験体の周皮細胞の収縮状態の変化は、健常な被験体の周皮細胞の収縮状態の変化との比較によって検出されるのが好ましい。
【０１０８】
一実施形態では、本発明は被験体の網膜血管障害を診断する方法であって、
(i)周皮細胞の収縮状態をモジュレートする薬学上許容可能な化合物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものであり；および
(ii)被験体の網膜の毛細血管の拡張または収縮を検出することを含み、ここで緩慢なまたは微弱な網膜血管の拡張または収縮が網膜血管の損傷を示すものである、
、前記方法を提供する。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明は、被験体の網膜血管障害を診断する方法であって、
(i)単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする薬学上許容可能な化合物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の網膜の血管の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜の血管機能をモジュレートすることを示すものであり；および
(ii)被験体の網膜の血管の拡張または収縮を検出することを含み、ここで緩慢なまたは微弱な網膜血管の拡張または収縮が、網膜血管の損傷を示すものである、
前記方法を提供する。
【０１１０】
一実施形態では、網膜の血管は毛細血管である。
【０１１１】
被験体の毛細血管の収縮状態の変化は、健常な被験体の網膜の毛細血管の収縮状態の変化との比較によって検出されるのが好ましい。
【０１１２】
本方法は、獣医学上または医薬上で使用するために適切に処方された化合物の有効量と被験体の眼球とを接触させることを含むのが好ましい。
【０１１３】
一実施形態では、本化合物は、侵襲的方法を用いて投与する。一実施形態では、投与は注射による。一実施形態では、投与は眼球後である。
【０１１４】
特に好ましい投与経路は、非侵襲的なものである。一実施形態では、投与経路にはイオン導入適用法が含まれる。血管作動性化合物の好ましい一非侵襲的投与経路には、眼球の角膜に適用されるイオン導入法の使用が含まれる。一実施形態では、化合物は、例えば、液滴、蒸気、噴霧化液滴、またはナノ粒子などの液滴の形態で投与される、他の送達粒子の形態（例えば、ミクロスフェア等）も化合物の投与のために考えられる。特に好ましいのは、化合物の製剤、またはリポソーム、または目に点眼剤により送達するのに好適な水性溶媒に溶解させた前記化合物を含む他のビヒクルである。
【０１１５】
好適な製剤および薬学上有効なビヒクルの製造に関する指針は、例えば、Rerraington's Pharrnaceutical Sciences、第83〜92章、1519〜1714頁、(Mack Publishing Company 1990) (Remington's)で確認される。なお、この文献は参照により本明細書に組み入れるものとする。薬学上有効なビヒクルについてのさらなる記載は、本明細書の下記に記載されている。
【０１１６】
本発明のスクリーニングで同定される化合物は、単離された網膜または周皮細胞中の血管の収縮をプロタゴナイズまたはアンタゴナイズする、小分子、ペプチド、タンパク質、ホルモン、核酸、有機または無機化合物などである。
【０１１７】
一実施形態では、本化合物は、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、ホスホリパーゼC(PLC)に関する活性を有する化合物、プロテインキナーゼA(PKA)に関する活性を有する化合物、イオンチャネル過分極チャンネルに関する活性を有する化合物、および非ステロイド抗炎症剤(NSAID)、あるいはこれらの相同体、類似体または誘導体からなる群から選択される。
【０１１８】
本明細書に記載されているスクリーニングを用いて同定された化合物の相同体、類似体または誘導体は本明細書で明確に検討されているが、ただ必要であるのは、かかる相同体、類似体および誘導体が、収縮機能に関してそれらが誘導されるベース化合物と同様の活性を保持すること、好ましくは、ベース化合物が網膜血管または周皮細胞の収縮状態をモジュレートする能力を保持することである。
【０１１９】
タンパク性化合物（すなわち、ペプチド、ポリペプチド、酵素等）および機能的に等しい相同体の場合、他の起源、例えばウイルス、細菌、関連の生物から取得する。特に、本明細書では合成ペプチドを検討している。
【０１２０】
特に好ましい改変は、同定されたペプチドの安定性を高めることを意図した改変である。代表的な安定基としては、アミド、アセチル(例えば、N末端のもの)、グリセロール、ベンゾイル、フェニル、トシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、および同様の基の改変が挙げられる。さらなる改変としては、「D」アミノ酸の代わりの「L」アミノ酸の使用、ポリペプチドの環化、およびエキソペプチダーゼ活性を阻害するためのアミノ末端またはカルボキシ末端の代わりのアミドが挙げられる。
【０１２１】
改変する別の手法は、ペプチドまたはタンパク質をポリエチレングリコール(PEG)およびポリプロピレングリコール(PPG)などの種々のポリマーに結合することである。これについては、例えば、米国特許第5091176号、米国特許第5214131号および米国特許第5264209号を参照されたい。
【０１２２】
タンパク性化合物（例えば、PACAPまたはVIPなど）は、当業者に知られている任意の技術、例えば、合成化学技術（例えば、溶液合成の固相法)、および／または組換DNA技術によって合成することができる。合成化学技術(例えば、固相法)は、純度、不要副産物が生じないこと、および産物の精製が容易であることから好ましい。本発明のペプチドを化学的に合成する技術は、BorgiaおよびFields、2000、TibTech 18: 243〜256頁で検討されており、本明細書に含まれている参考文献に詳細に記載されている。
【０１２３】
あるいは、タンパク性化合物（例えば、PACAPまたはVIPなど）は、かかるペプチドをコードする配列を有する核酸で形質転換されている宿主細胞の組換DNA技術によって産生することができる。組換え技術によってペプチドを産生するには、宿主細胞（例えば、細菌細胞（例えば大腸菌）、昆虫細胞、酵母、または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞））を本発明のペプチドを発現するのに好適なベクターで形質転換し、培地で培養して細胞にペプチドを産生させる。そのようにして産生されたペプチドは、限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、またはペプチドに特異的な抗体による免疫精製をはじめとする当技術分野で周知のペプチド精製技術を用いて、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から精製することができる。
【０１２４】
タンパク性化合物は、同種のタンパク質を実質的に含まないように精製されるのが好ましい。
【０１２５】
非ステロイド抗炎症剤(NSAID)は、慢性関節リウマチ、骨関節炎、軽度から中程度の疼痛、月経性痙攣、粘液嚢炎、痛風、片頭痛、ならびに他の症状を治療するのに使用されている薬剤のファミリーである。あるNSAIDの眼用製剤は、眼科手術中または手術後に用いられている。NSAIDは、身体内でのそれらの作用に基づいて、2つのカテゴリー、すなわちCOX-1阻害剤およびCOX-2阻害剤に分類されている。
【０１２６】
NSAIDの例としては、アスピリン、ピラゾロン、フェナメート(fenamate)、ジフルニサル、酢酸誘導体、プロピオン酸誘導体、オキシカム(oxicams)、フェナメート(fenamates)、例えばメフェナム酸、メクロフェナメート(meclofenamate）、フェニルブタゾン、ジフルニサル、ジクロフェナク、ボルタレン、インドメタシン、スリンダク、N-フェニルアントラニル酸、エトドラク、ケトロラク、ナブメトン、トルメチン、イブプロフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、カルプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、インドメタシンおよびフルフェナム酸、またはこれらの類似体もしくは誘導体がある。
【０１２７】
NSAIDの代替事例（商標を含む）に関する指針は、米国、カリフォルニア州、サンフランシスコのeMedicine（eMedicine Clinical Knowledge Base）のウェブサイト、あるいは、米国、ワシントンDC20002のGovernment Computer News in the headquarters for PostNewsweek Tech Mediaのウェブサイトで確認することができる。
【０１２８】
好ましくは、非ステロイド抗炎症剤は、N-フェニルアントラニル酸またはフルフェナム酸またはフルルビプロフェンである。さらに好ましくは、R-アイソマー形態またはS-アイソマー形態のフルルビプロフェンである。
【０１２９】
目的の他の化合物としては、例えば、ソプロテレノール、ジブチリルcAMPホルスコリン、アンジオテンシンII、およびエンドセリン-1が挙げられる。
【０１３０】
本化合物は、好ましくは薬学上許容可能な賦形剤または希釈剤、例えば、水性溶媒、非水性溶媒、非毒性賦形剤（例えば、塩）、防腐剤、バッファー等などで製剤化する。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機酸エステルがある。水性溶媒としては、水、アルコール溶液／水溶液、食塩水、塩化ナトリウムなどの非経口ビヒクル、リンガーデキストロース等が挙げられる。防腐剤としては、抗生物質、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスが挙げられる。本医薬組成物の種々の成分のpHおよび正確な濃度は、当技術分野の慣用の技術により調整される。
【０１３１】
場合によっては、本化合物製剤は担体も含むが、例えば、担体が製剤中に低濃度で存在する場合には、化合物の表面変性を低下させる。一般に用いられている担体分子は、ウシ血清アルブミン(BSA)、オボアルブミン、マウス血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン等である。また、合成担体も使用されており、容易に入手することができる。担体は活性化合物に結合していてもよい。担体タンパク質へポリペプチドを結合させる手段もまた当技術分野では周知であり、グルタルアルデヒド、m-マレイミドベンコイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス二窒素化ベンジジンが挙げられる。
【０１３２】
また、本化合物とともに生物学的反応修飾物質(BRM)を同時投与し、本化合物に対するT細胞反応または抗体反応をダウンレギュレートすることも望ましい。
【０１３３】
本化合物の投与に好ましいビヒクルとしてはリポソームが挙げられる。リポソームは、水溶性コンパートメントを包んでいる1種または複数の脂質二重層からなる微小小胞である(Bakker-Woudenbergら、Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. 1)、S61 (1993);およびKim, Drugs 46, 618 (1993))。リポソームは組成物中では細胞膜に類似していて、従って、リポソームは一般に安全に投与され、かつ生物分解性である。
【０１３４】
リポソームの調製に関する技術、およびリポソームを用いた、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドを含有する種々の分子の製剤化（例えば、カプセル化）に関する技術は、当業者に周知である。
【０１３５】
リポソームは製造方法に応じて単一層または多重層であってよく、0.02μm〜10μmを超える範囲の直径の大きさで変えることができる。種々の薬剤はリポソーム中に封入化される。疎水性薬剤は二分子層中へ分配され、親水性薬剤は内部の水溶性の場所の中に分配される(Machyら、Liposonaes in Cell Biology and Pharrnacology (John Libbey 1987)、およびOstroら、American J. Hosp. Pharm. 46, 1576 (1989))。
【０１３６】
また、リポソームは実質的には任意のタイプの細胞へ吸着し、次いで、封入化薬剤を放出することができる。あるいは、リポソームを標的細胞と融合させ、それによって、リポソームの内容物を標的細胞中へ移す。あるいは、吸着されたリポソームは、貪食細胞によってエンドサイトーシスされ得る。エンドサイトーシスの後に、リポソーム脂質のリソソーム内分解と封入薬剤の放出が生じる(Scherphofら、Ann. N. Y. Acad. Sci. 446, 368 (1985))。しかし機序または送達に関係なく、関連の化合物の細胞内配置がもたらされる。
【０１３７】
リポソームベクターはアニオン性またはカチオン性であってよい。アニオン性リポソームベクターにはpH感受性リポソームが含まれ、これは、エンドサイトーシスおよびエンドソーム酸性化後に崩壊するか、またはエンドソームの膜と融合する。カチオン性リポソームは、in vitroにおける哺乳動物細胞トランスフェクション、または核酸の一般的送達を仲介するのに好ましいが、化合物などの他の治療法の送達に用いられる。
【０１３８】
カチオン性リポソーム製剤は、慣用の方法によって調製される(Feignerら、Proc. Nat'l Acad. Sci USA 84、7413 (1987); Schreier、Liposome Res. 2、145 (1992))。リポフェクチン（Lipofectin）(米国、メリーランド州、Gaithersburg、Life Technologies, Inc.)などの市販の製剤は容易に入手できる。投与するリポソームの量は、用量作用曲線に基づいて最適化する（Feignerら、前掲）。
【０１３９】
本発明の方法で用いられる他の好適なリポソームとしては、多重層小胞(MLV)、少数層小胞(OLV)、単一層小胞(UV)、小型単一層小胞(SUV)、中型単一層小胞(MUV)、大型単一層小胞(LUV)、超大型単一層小胞(GUV)、多重小胞の小胞(MW)、逆相蒸発法によって調製された単一層小胞または少数層小胞(REV)、逆相蒸発法によって調製された多重層小胞(MLV-REV)、安定複数層小胞(SPLV)、凍結溶解MLV(FATMLV)、押出成形法によって調製された小胞(VET)、フレンチプレスによって調製された小胞(FPV)、融合によって調製された小胞(FUV)、脱水再水和小胞(DRV)、バブルソーム(bubblesomes）(BSV)が挙げられる。当業者は、これらのリポソームを調製する技術が当技術分野で周知であることは理解するであろう(Colloidal Drug Delivery Systems、vol. 66、J. Kreuter編集、Marcel Dekker, Inc.、1994を参照されたい)。
【０１４０】
被験体の網膜血管の収縮状態における変化の検出は、網膜血管の体積の大きさの変化を測定または検出することを含んでいるのが好ましい。
【０１４１】
一実施形態では、被験体の網膜血管における収縮状態の変化の検出には、顕微鏡、検眼鏡または眼底カメラの使用を含む。別の実施形態では、被験体の網膜血管における収縮状態の変化の検出は、顕微鏡、検眼鏡または眼底カメラを使用せずに実施する。一実施形態では、網膜の画像を記録する。一実施形態では、カメラ、さらに好ましくはデジタルカメラを用いて画像を記録する。
【０１４２】
好ましくは、網膜血管の厚さまたは直径における変化として歪みを視覚化する。好ましい実施形態では、血管断面の直径における変化として歪みを視覚化する。本明細書では、「断面の直径」という用語は、血管の長軸に対して垂直な血管の幅を意味する。
【０１４３】
一実施形態では、網膜の画像はデジタルカメラを用いて記録する。デジタルカメラは、顕微鏡の光学的観察経路に取り付けられるのが好ましい。一実施形態では、血管断面の直径は、適当なキャリブレーションスケールを用いることにより画素またはミクロンで測定する。
【０１４４】
好ましくは、断面直径は、網膜の画像で血管の断面直径を含む画素数を数えることにより測定することができる。
【０１４５】
一実施形態では、血管の断面直径に対応する画素は、バックグラウンド網膜と比較される、血管のコントラストの変化によって同定することができる。一実施形態では、画像分析ツールを用いて変化を同定する。特に、特定の画像分析ツールには、(i)バックグラウンド網膜の断面直径および区画を含むように血管を横断して作られた画素光度の断面ラインプロファイル、または(ii)血管の画像中の各画素から最も近位のバックグラウンド画素までの距離を計測する距離マップを作成するのに用いられる網膜のバイナリー画像が含まれる。検出の感度は2画素であるのが好ましい。
【０１４６】
画像は、分析前に画像強調には供しないのが好ましい。
【０１４７】
被験体は、例えば緑内障、角膜血管形成、または糖尿病性網膜症などの糖尿病に関係している1種または複数の症状を有していてもよい。あるいは、被験体は糖尿病に関連して発症される明らかな症状を有していないか、または、健常であると考えられるものである。健常な被験体は、被験体の年齢、民族性、性別および体重に対して正常な血糖濃度、好ましくは約5ミリモル/Lを有するのが好ましい。
【０１４８】
試験される被験体(健常または非健常)に、健常な被験体の毛細血管を含む網膜血管の拡張を誘導するのに十分な量で本化合物を投与することが好ましい。かかる拡張は、周皮細胞をはじめとする細胞の弛緩の結果であり、この場合、弛緩は網膜の毛細血管の断面直径を拡大する。また、毛細血管の直径の拡大により、毛細血管中の血流速度の変化が誘導されるのが好ましい。
【０１４９】
健常な被験体と比べて血糖濃度が高い被験体の場合には、あるいは、初期段階の糖尿病または進行した糖尿病を患っている被験体の場合には、本発明の化合物は、健常な被験体において確認された拡張と比べて、網膜の毛細血管の拡張の縮小を誘導する。従って、罹患の被験体、すなわち、緑内障、角膜血管形成もしくは網膜症の発症の可能性がある被験体において誘導される周皮細胞弛緩の程度は、正常な被験体と比較して大幅に低減される。
【０１５０】
また、本発明の診断の適用は、これらを必要とする被験体における疾患の進行および／または疾患の治療をモニターするのに有用である。この診断の適用は、罹患の被験体の症状またはその変化、あるいは罹患の被験体における好転または好転がないことを検出するのに有用であり得る。例えば、この診断の適用は、糖尿病の症状が好転するように治療されている被験体、および血液中のグルコース濃度を低下させるように治療されている被験体の症状を検出するのに有用であり得る。患者の症状が好転した場合、血管作動性化合物に対する網膜血管の応答が標準化すること、すなわち、その応答が健常な被験体と同じようになることが予測される。
【０１５１】
本発明は、試験する被験体と健常な被験体における標準的応答または正常応答とを比較し、それにより、診断を得るための直接的な並列比較を不要とすることを明らかに意図している。健常な被験体における標準的応答または正常応答を検出するには、糖尿病、緑内障、角膜血管形成、末熟児網膜症、糖尿病性網膜症または視覚疾患の家系内病歴または症状を有しない健常な被験体のパネルに投与された特定の化合物について網膜の毛細血管が拡張する時間と程度を検出し、パネルの平均応答を決定する。かかる疫学的データは、診断アッセイで用いられている特定の化合物に対する試験被験体の応答に対する比較で特に有用である。
【０１５２】
前述の実施形態は、網膜毛細血管の収縮を誘導する化合物を用いて、in vivoで行われるアッセイにおいて準用する。
【０１５３】
本化合物に対する応答のうち、網膜毛細血管の拡張応答は、約7.5ミリモル/L以下の血糖濃度を有する被験体（スケールのハイエンドで糖尿病性網膜症を有する被験体を含む）における検出感度の閾値を有するのが好ましい。従って、本アッセイは、糖尿病性網膜症を発症している初期段階の被験体を診断するのに特に有用である。
【０１５４】
また、本明細書に記載されている方法を用いて同定される化合物は、網膜血管機能異常の関連疾患、例えば、網膜血管成長異常または網膜血管収縮能異常、網膜症、および他の疾患、または網膜血管機能障害の関連眼病の治療処置または予防処置に有用である。
【０１５５】
また、本明細書に記載されている方法を用いて同定される化合物は、周皮細胞機能異常の関連疾患、例えば、細胞増殖異常または細胞収縮能異常、網膜症、および他の疾患、または周皮細胞機能障害の関連眼病の治療処置または予防処置に有用である。
【０１５６】
従って、第3の態様では、本発明は、被験体の網膜血管機能障害の治療用医薬の製造における網膜血管機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出または同定することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用を提供する。
【０１５７】
関連する態様では、本発明は、被験体の周皮細胞機能障害の治療用医薬の製造における周皮細胞機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出または同定することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用を提供する。
【０１５８】
他の関連する態様では、本発明は周皮細胞機能障害を有する被験体を治療する方法であって、周皮細胞機能をモジュレートする化合物と薬学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法を提供する。
【０１５９】
好ましくは、本化合物は、周皮細胞収縮障害をはじめとする、1種または複数の周皮細胞機能障害を緩和するのに十分な条件下で投与される。その緩和は一時的であってもよく、その場合には、本化合物の繰り返し投与または連続投与が必要であり得る。当業者は、本明細書に記載されている本発明のスクリーニングで同定された有効成分に関し、有効な投薬計画を容易に決定することができる立場にあろう。
【０１６０】
治療の適用（すなわち、被験体に対するin vivoでの適用）については、被験体の眼球に、さらに好ましくは網膜に、周皮細胞の周皮細胞収縮状態をモジュレートするのに十分な量で本化合物を投与するのが好ましい。かかる量は、経験的に、好ましくは動物モデルを用いて決定することができる。本化合物の有効量は、要因、例えば、個体の疾患のタイプ、年齢、性別、および体重、並びに個体の網膜疾患の程度などによって変わる。投与する濃度は、最適な診断応答が得られるように調節することができる。例えば、数種類の分割量を別々に投与することができる。あるいは、化合物の組み合わせによって相乗効果を得ることができ、濃度はそれに従って調節することができる。
【０１６１】
前述の実施形態は、網膜血管機能障害または周皮細胞機能障害を有する被験体を処置する治療の適用において準用する。
【０１６２】
好ましくは、本発明の方法は、好適な薬学上許容可能な担体または希釈剤または賦形剤とともに本発明の方法によって同定された化合物またはその塩を製剤化することを含み、さらに好ましくは、治療を必要とする被験体、例えば、網膜血管機能障害または周皮細胞機能障害を有する被験体、あるいは網膜血管機能障害または周皮細胞機能障害を有する疑いのある被験体に前記化合物を投与することをさらに含む。
【０１６３】
従って別の態様では、本発明は、被験体の網膜血管機能障害の治療用医薬の製造における網膜血管機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出または同定することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用を提供する。
【０１６４】
関連する態様では、本発明は、被験体の周皮細胞機能障害の治療用医薬の製造における周皮細胞機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で周皮細胞の収縮状態の変化を検出または同定することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が周皮細胞機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用を提供する。
【０１６５】
当業者には、広く記載されている本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態で示した本発明について多くの変更および／または改良がなされることが理解されよう。従って、本実施形態はすべての点で例示として考え、これに限定されるものではないことを考慮されたい。
【０１６６】
さらに、本発明を以下の実施例（これに限定されるものではない）に参照して記載する。
【実施例】
【０１６７】
実施例1．シリコーンゴム基板の調製
粘度が60,000cps(DMPS-60M)または12,500cps(DMPS-12M)である少量のジメチルポリシロキサン(Sigma Chemical Co.)を12mm直径のガラスカバーガラスに施した。場合によっては、12,500cpsのジメチルポリシロキサン46重量％と、60,000cpsのジメチルポリシロキサン54重量％とを混合することにより、中間粘度のジメチルポリシロキサン(30,000cps)を調製した。ブンゼンバーナーを用いて、被覆したカバーグラスを2秒間加熱し、ジメチルポリシロキサンの表面の架橋と、カバーガラスに結合した薄いシリコーンゴムシートの形成を行った。調製後、24穴の組織培養皿にそれらのカバーガラスを置き、一晩UV照射して殺菌した。
【０１６８】
実施例2．シリコーンゴム基板上での周皮細胞の増殖
初代培養(第1継代)から得た周皮細胞を10％FCSを補充したDMEM中のカバーガラス上に置いた。細胞の大部分が自然発生的に収縮状態（細胞の下にあるゴムシートのしわによって明示される）にあった場合（図１）、実験は48時間後に実施された。
【０１６９】
すべての実験では、延長培養で起こり得る周皮細胞の生理機能におけるいかなる変化をも最小限にするため、周皮細胞の第1継代培養物のみを用いて行った。
【０１７０】
実施例3．周皮細胞の収縮能の評価
アンタゴニストに対する細胞の応答は、室温で位相差顕微鏡法を用いて評価した。周皮細胞の自発的収縮傾向により、24時間後に観察可能な張力性のしわが誘導された(図1)。図1から明らかなように、周皮細胞と関連する場合のみ、しわが検出された。細胞と関連する張力性のしわの大きさが縮小された場合には、細胞は弛緩されたものとして同定され、しわが消失した場合には、完全に弛緩されたものとして同定される。逆に、周皮細胞と関連するしわの数と長さに増加がみられた場合、周皮細胞は収縮したと同定される。各実験において、周皮細胞の画像は、毎分コンピューターに保存した(ビデオカメラおよびフレームグラッバー)。しわは、実験後、保存した画像から分析した。
【０１７１】
各実験において、はっきりと認められる細胞に関連する各々のしわの長さを3回測定し、その長さの平均を表にした。しわの両末端は、写真のバックグラウンドからコントラスト差により決定した。コンピューター、ビデオカメラまたはフレームグラッバーのコントラストのセッティングは実験の開始時に設定し、実験の間は変更しなかった。同様に、顕微鏡の焦点は実験の開始時に設定し、実験の間は変更しなかった。また、バス中の溶液の深さ(レベル)も同じ速度で新しい各溶液を吸引および注入することによって一定に保った。従って、しわの画像における変化のみ(コントラスト、長さ)が、周皮細胞によりシリコーン基板に誘導された張力によるものであった。各実験条件でのしわは、Zeiss videoplanにより写真からカウントした。
【０１７２】
周皮細胞の収縮状態は、シリコーンの薄い頸骨(shin)シートのしわの数(N)と各しわの長さ(l)をカウントすることにより定量化した。これらの観察により、収縮能指数(Ci)はN×ｌから求めた。血管作動薬の効果を検出する実験は、まず、生理学的バッファー（「コントロール」）中の周皮細胞を用いてCiを計測することによって行なった。Ciは、周皮細胞を血管作動薬に暴露し、周皮細胞を定常レベルの収縮能に到達させた（通常10分必要）後に計測した。血管作動薬の効果は、コントロール条件におけるCiで除算し、次いで100を乗じ、100未満(コントロールに比べて周皮細胞が弛緩している)、または100を超過する(コントロールに比べて周皮細胞が収縮している)効果の指数(Ie、％)を得た。さらにコントロールとして、各血管作動薬へ暴露する全時間につき、バッファー単独とのインキュベーションを各実験と共に実施した。
【０１７３】
実施例4．単細胞収縮能アッセイの機能性の試験
血管作動薬は、シリコーン基板上に付着している細胞の収縮活性をモジュレートし得る。網膜毛細血管の周皮細胞が収縮性細胞であり、ノルエピネフリン(生物起源の血管収縮剤のうち最も効力のあるものの1つ)が収縮応答を起こしたことを観察することによって、シリコーン基板系により収縮能の定量化が提供されることを確認した。
【０１７４】
この目的では、細胞はシリコーンゴム上で増殖させた。実験の日、細胞を室温にて20分間HEPESバッファー溶液ですすいだ。次いで、全溶液の速やかな交換によって、周皮細胞を異なる濃度(10-6M、10-5M、10-4M)のノルエピネフリン(米国、Sigma、N5785)に暴露した。これらの周皮細胞は、トータルとして10分間、新しい各薬剤の濃度に暴露し、1分毎に周皮細胞の画像を得た。周皮細胞に関連しているしわの数の変化を、1分毎に記録されたそれらの画像から分析した。
【０１７５】
効果指数の算出後、この収縮能アッセイによって周皮細胞の収縮能における変化を測定することが可能であり、かつ周皮細胞が用量依存的にノルエピネフリンに対して収縮し得ることがこの実験から証明された(図3)。
【０１７６】
実施例5：周皮細胞収縮能に対する血管作動性ペプチドの効果
本発明者らは、網膜毛細血管に影響を及ぼし得る数種類の有望な血管作動薬を同定した。本実験に供した血管作動性のペプチドは、VIP(血管作動性腸管ペプチド)、およびPACAP(脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド)である。本発明者らは、これらのペプチドは、網膜の周皮細胞の収縮状態に影響を及ぼし得ること、すなわち、毛細血管の血行動態に影響を及ぼす効果を同定した。
【０１７７】
下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)は、視床下部のペプチドであって、下垂体前葉細胞中の環状アデノシン3'-モノホスフェート(cAMP)の産生を刺激する際の有効な作用を有する。PACAP受容体およびVIP受容体は広く分布しており、中枢神経系および末梢の器官（眼球など）で産生されている。
【０１７８】
本発明者らは、PACAPおよびVIPがどのように毛細血管の状態に影響を及ぼし、それによって、周皮細胞の収縮と弛緩の効果によって血管の制御における機能を果たすのかについて調査した。実験では、周皮細胞がPACAPおよびVIPの刺激に応答可能であり、in vivoにおいて微小血管の管腔直径をモジュレートし、それにより局部の血流量を制御することができることが確認された。
【０１７９】
この目的では、細胞をシリコーン基板上で増殖させた。実験の日、細胞をHEPESバッファー溶液ですすぎ、室温にて20分間、この溶液中で放置した。PACAPまたはVIPは、シリコーン基板上で増殖した周皮細胞上に輸液交換よって濃度を上昇させながら添加した。周皮細胞をPACAPまたはVIPの新しい各々の濃度に対して10分間暴露した。周皮細胞に対するPACAPの効果を調べ、VIPの効果と比較した。PACAPの濃度は10-9M、10-8Mおよび10-7Mであった。VIPの濃度は10-9M、10-8Mおよび10-7Mであった。
【０１８０】
PACAP 10-8Mを20分間適用した場合のPACAPの単回投与の経時的効果を調査した。20分後、薬剤を含有する溶液を除去し、細胞を薬剤非含有のバッファーで洗浄した。VIPおよびPACAPは、AUSPEP(オーストラリア)から購入した。
【０１８１】
本発明者らは、一実施形態において、PACAPまたはVIPの結合後のcAMPの上昇が、cAMP依存性プロテインキナーゼ活性の上昇をもたらし得ることを確認した。環状アデノシン3',5'一リン酸(cAMP)は、多くの組織において細胞内の重要な二次伝達物質であり、複数の薬剤およびホルモンの作用を仲介する。cAMPは異なる多くの細胞工程、例えば、細胞増殖および分化、イオンチャネル伝導性、神経伝達物質のシナプス放出、および遺伝子転写などを調節する。可逆的なタンパク質リン酸化は、真核細胞において重要な制御機構である。
【０１８２】
本発明者らは、PACAPまたはVIPの結合後のcAMPの上昇によって影響を受けるプロテインキナーゼA(PKA)をさらに同定した。この目的では、細胞をシリコーン基板上で増殖させ、10-8M濃度のPACAPに接触させた。薬剤の環状アデノシン3',5'一リン酸、Rp-アイソマー(Rp-cAMPS、米国、Sigma、A7850)はPKA活性の特異的阻害剤であるが、これを最低濃度をはじめとして3種類の個別の濃度(10μM、30μMおよび100μM)で、PACAP 108M溶液に連続して添加した。周皮細胞は、各Rp-cAMPS濃度を用いて変化した収縮応答の定常状態に到達させ(10分間)、その後、次の濃度に対して過冷却溶液を交換した。本発明者らは、用量依存的に、EC50値26μMで、Rp-cAMPが10-8MのPACAPの弛緩効果を阻害したことを確認した。0.3μM濃度の薬剤N-(2-[p-ブロモシンナミルアミノ]-エチル)-5-イソキノリンスルホンアミド(米国、Sigma、B1427、H-89)(PKA活性の別の特異的阻害剤である)も10-8MのPACAPの弛緩効果を阻害することを示した。図6を参照されたい。
【０１８３】
また、本発明者らは、周皮細胞収縮に対するPACAPの弛緩効果は、ある程度、細胞内貯蔵からCa2+を移動させる細胞内経路によって仲介されていることを明らかにした。10μMの薬剤1-[6-([(17β)-3-メトキシエストラ-1,3,5(10)-トリエン-17-イル]アミノ)ヘキシル]-1H-ピロール-2,2-ジオン(U73122、米国、Sigma、U6756)は、ホスホリパーゼC(PLC)に結合される細胞内経路の特異的アンタゴニストであり、かつ周皮細胞のPACAP誘導型弛緩のアンタゴニストである。
【０１８４】
実施例6：周皮細胞収縮能に対する非ステロイド抗炎症剤の効果
本発明者らは、網膜毛細血管に影響を及ぼし得る数種類の有望な非ステロイド抗炎症剤(NSAID)を同定した。本実験に供するNSAIDは、N-フェニルアントラニル酸、フルフェナム酸、およびフルルビプロフェンである。フルルビプロフェンのR-アイソマー形態をこれらの実験で用い、R-フルルビプロフェンと称する。本発明者らは、これらのNSAIDが、網膜の周皮細胞の収縮状態に影響を及ぼし得ること、すなわち、毛細血管の血行動態に影響を及ぼす効果を明らかにした。
【０１８５】
本発明者は、N-フェニルアントラニル酸、フルフェナム酸、およびR-フルルビプロフェンがどのように毛細血管状況に影響を及ぼし、それによって、周皮細胞の収縮と弛緩の効果を介して血管制御における機能を果たすかを調べた。実験から、周皮細胞は、N-フェニルアントラニル酸、フルフェナム酸、およびR-フルルビプロフェン刺激に応答可能であり、in vivoにおいて微小血管の管腔直径をモジュレートし、それによって局部の血流量を制御することができることが明らかになった。
【０１８６】
この目的では、細胞はシリコーン基板上で増殖させた。実験の日、細胞をHEPESバッファー生理学的溶液ですすぎ、室温にて20分間この溶液中で放置した。N-フェニルアントラニル酸、フルフェナム酸、またはR-フルルビプロフェンは、シリコーン基板上で増殖させた周皮細胞上に輸液交換よって濃度を上昇させながら添加した。周皮細胞をN-フェニルアントラニル酸、フルフェナム酸、またはR-フルルビプロフェンの新しい各々の濃度に対して10分間暴露した。N-フェニルアントラニル酸の濃度は、100マイクロモル/L、300マイクロモル/L、および1000マイクロモル/Lであった。フルフェナム酸の濃度は、30マイクロモル/L、50マイクロモル/L、100マイクロモル/L、および300マイクロモル/Lであった。R-フルルビプロフェンの濃度は、0.1マイクロモル/L、0.3マイクロモル/L、1マイクロモル/L、および3マイクロモル/Lであった。図8、9および10を参照されたい。
【０１８７】
実施例7：大動脈の平滑筋細胞に対する非ステロイド抗炎症剤の効果
フェナメート(fenamate)ファミリーのNSAID(メフェナム酸、ニフルム酸およびフルフェナム酸が含まれる)は、Ca2+活性化カリウムチャンネルを活性化することが報告されている[13、14]。本発明者らは、パッチクランプ電気生理学を用いて、すべてのNSAIDが血圧の有意な上昇をもたらすことを示すとは限らなかったので、他のNSAIDもまた大動脈平滑筋細胞でCa2+活性化カリウムチャンネルを活性化し得る可能性を検討した。さらに、本発明者らはフルルビプロフェンのエナンチオマーを用いて、器官のバス実験でカリウムチャンネル活性化に関連している効果からシクロオキシゲナーゼが仲介する作用を分離した。ここでは、本発明者らは、フェニレフリンに対する大動脈の収縮筋応答を記録した。大腿動脈を用いた本発明者らによるさらなる試験では、Ca+とATPの両方によって活性化される平滑筋細胞中のK+チャンネルのクラスは、血管壁の張力の制御において重大な機能を有するという、大動脈に関する本発明者らの知見が確認された。
【０１８８】
実施例8：単離された網膜の調製
スクリーニングアッセイを実施するために、下記方法を用いて、眼球から全網膜を得る：動物を犠牲にした後、直ちに両眼を摘出し、次いで、生理学的バッファー溶液を入れた小型試験管内にその両眼を入れ、直ちに氷上に保管した。もし、ドナーの動物が診断化合物のスクリーニングを実施する研究所から若干の距離にいる場合、両眼はこの方法によって長距離を移送することができる。
【０１８９】
摘出した眼球を浅い皿(例えばペトリ皿)に置き、網膜を取り出す解剖を実施するために、双眼解剖顕微鏡のステージに眼球を入れた皿を置く。
【０１９０】
切開が眼球の周囲にそって連続的となるように、眼球の外側の鋸状縁の位置で切開し、前眼部を後眼部から注意深く単離させた。そのようにして取り出された前眼部には、角膜、虹彩、毛様体および水晶体が含まれている。虹彩および毛様体(毛様体筋を含む)は、後眼部に残存する硝子体液から剥離される。水晶体は、眼球の後眼部に残存している硝子体から丁寧に分離する。
【０１９１】
硝子体液は、後極部から丁寧に単離し、後眼部から取り除く。この解剖では、後眼部の内面に配置されているその通常の位置に網膜を置いておく。後眼部は、その正常な生理学的な位置に配置されている網膜を含む後部眼杯を形成している。次いで、この後部眼杯と網膜を生理学的バッファーで丁寧にすすぐ。
【０１９２】
接着剤を用いて、この後部眼杯と網膜を浅い皿(例えばペトリ皿)に固定する。この接着剤は、シアノクリル酸接着剤(「Super-glue」)または2成分系樹脂(「Araldite」)または高粘度真空グリースもしくはシリコーン(「Sylgard」)であってよい。接着剤により、後部眼杯と網膜を浅い皿の底部にしっかりと安定させることができる。この立体配置は、生きている眼球内の硝子体液によって通常占められている位置にある網膜上に、液体の小さな貯蔵部を作る。
【０１９３】
浅い皿にそのように固定された後部眼杯と網膜は、生理学的溶液で潤うように保たれている。後部眼杯および網膜を含んでいるこの皿を後部眼杯調製物中の網膜の高倍率画像を記録するデジタルカメラが取り付けられている顕微鏡のステージに置く。本発明者らが使用した顕微鏡は、解剖顕微鏡または手術用顕微鏡であった。
【０１９４】
実施例9：単離された網膜に対する血管作動性化合物の効果
後部眼杯内に含まれている小さな貯蔵部に血管作動性化合物を入れることにより、血管作動性化合物の活性について試験する。このように、血管作動性化合物は、硝子体側から網膜に接触する。種々の血管作動性化合物と生理学的バッファーの洗浄溶液を後部眼杯と網膜の調製物に連続して用いる。
【０１９５】
網膜の画像は、顕微鏡の光学観察経路に取り付けられたデジタルカメラを用いて記録する。網膜の画像は、網膜血管（毛細血管および大型の細動脈を含む）の寸法の変化を測定することにより分析する。好ましくは、測定する寸法は血管断面の直径である。
【０１９６】
眼球を摘出、解剖して後部眼杯および網膜の調製物を得た後には、通常、血管に少量の血液が残存している。この少量の血液により、デジタルカメラによって記録される画像において血管が可視化される。
【０１９７】
血管を可視化するための別法は、後部眼杯および網膜の調製物を顕微鏡により目視し画像化するための浅い皿に固定した後、網膜血管を滅菌したエバンスブルー溶液で潅流する方法である。エバンスブルーを潅流する方法は、まず、微小電極プリング装置を利用してガラス製マイクロキャピラリー管に先の尖った端部を作ることである。この先の尖った端部の外径は5〜30ミクロンである。このガラスマイクロキャピラリー管にエバンスブルー溶液を充填する。ガラス製マイクロキャピラリー管の未処理の端部(前記位置の反対)は、通気口を有する市販の微小電極ホルダーに挿入する。この通気口は、可撓性チューブを用いてシリンジポンプに接続されている。視神経頭の近位の太い網膜血管に、ガラス製マイクロキャピラリー管の先の尖った端部を用いてカニューレ挿入する。次いで、シリンジポンプを用いて、このカニューレ挿入した網膜血管へエバンスブルー溶液を潅流する。数分後、エバンスブルー溶液は太い網膜血管と細い分岐状血管を満たす。当初カニューレが挿入された太い網膜血管から出ている多数の網膜血管の多数の管枝をエバンスブルー溶液が満たした後、網膜血管からガラス製マイクロキャピラリー管を取り除く。
【０１９８】
網膜血管を可視化するための別法は、先の尖ったガラス製マイクロキャピラリー管を用いて、解剖前に眼球の外側から血管にカニューレ挿入することである。この別法では、眼球に入っている太い血管へエバンスブルーを潅流する。灌流の数分後に、血管からガラス製マイクロキャピラリー管を取り除き、眼球を摘出し、上記の方法に従って解剖を行い、後部眼杯と網膜を調製する。
【０１９９】
血管を可視化するための別法は、動物に麻酔をかけて、大腿動脈へ標準の血管カニューレを導入することである。カニューレは、大腿動脈へ滅菌エバンスブルーを潅流するために用いられるシリンジポンプに取り付ける。大腿動脈へ導入されたエバンスブルーは、麻酔をかけた動物の心臓の鼓動によって網膜循環を介して送られる。エバンスブルーは、数分間大腿動脈へ潅流する。その時間の後に、カニューレは大腿動脈から取り出され、動物を犠牲にし、上記の方法に従って眼球を摘出、解剖し、後部眼杯および網膜を調製する。
【０２００】
当業者は、広く記載されている本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態で示した本発明について多くの改変および／または変更を行ってもよいことを理解されよう。従って、本実施形態はすべての点において例示であり、これらに限定されるものではないと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】図1は、倒立顕微鏡(NIKON TE200)に取り付けられたフレームグラッバー(DT3100)とビデオカメラ(SONY SSC-DC30P)を用いて得られた、シリコーン基板と接触している周皮細胞(24時間増殖後)の位相コントラスト画像を表す。周皮細胞の収縮は、シリコーン基質中に生じたしわとして認められた。しわは矢印によって示している。しわは、(i)その長さに沿った厚みの変化によって、また(ii)その長さに沿った相中でみられる著しい変化によって、細胞膜と容易に区別された。この領域内の周皮細胞のすべてがシリコーン基板のしわ寄せを示している。
【図２】図2は、倒立顕微鏡(NIKON TE200)に取り付けられたフレームグラッバー(DT3100)とビデオカメラ(SONY SSC-DC30P)を用いて得られた、シリコーン基板と接触している周皮細胞(24時間増殖後)の位相コントラスト画像を表す。周皮細胞の収縮は、シリコーン基質中に生じたしわとして認められた。しわは矢印によって示している。しわは、(i)その長さに沿った厚さの変化によって、また(ii)その長さに沿った相中でみられる著しい変化によって、細胞膜と容易に区別された。この領域内の周皮細胞のすべてがシリコーン基板のしわ寄せを示している。
【図３】図3は、網膜の周皮細胞の収縮におけるノルエピネフリン(NE)の用量依存的効果を示すグラフ表示である。X軸上にNEの濃度を示す。周皮細胞培養物に対するシリコーンしわの数から検出した収縮能指数を横座標上に示す。NEは、収縮依存的に、周皮細胞の収縮状態の増強を誘発し、シリコーンしわの数を増加させている。10-6Mより高い濃度のNEは収縮を引き起こし、10-4MのNEにおいて周皮細胞の収縮状態に最高の増大があった。NEは、用量依存的にシリコーン基板の周皮細胞収縮を誘導した(EC50=8μM)。
【図４】図4は、周皮細胞の収縮能に対する脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド(PACAP)の効果を示すグラフである。EC50の濃度は3nMであり、これらのデータについては6種類の細胞から平均したものである。100未満の収縮能指数は、周皮細胞が薬剤に対して緩和応答を有していたことを示している。
【図５】図5は、周皮細胞の収縮能に対する血管活性腸管ペプチド(VIP)の効果を示すグラフである。EC50の濃度は48nMであり、これらのデータは3種類の細胞から平均したものである。100未満の収縮能指数は、周皮細胞が薬剤に対して緩和応答を有していたことを示している。
【図６】図6は、PACAP(10-8M)によって刺激された周皮細胞の弛緩に対する異なる濃度のRp-cAMPの効果を示すグラフである。各濃度におけるサンプルサイズに含まれている周皮細胞の数は、各棒の中に記載されている。
【図７】図7は、PACAPによって誘導された周皮細胞の弛緩に対するホスホリパーゼCの阻害効果に関するグラフである。棒によって表された条件は以下のとおりである:UはU73122単独であり、UPはPACAPの存在下におけるU73122であり、UPRはPACAPおよびRp-cAMPの両方の存在下におけるU73122である。
【図８】図8は、周皮細胞の弛緩に対する異なる濃度のN-フェニルアントラニル酸の効果を示すグラフである。データは、7種類の周皮細胞のサンプルから平均されている。100未満の収縮能指数は、周皮細胞が薬剤への応答で弛緩したことを示す。
【図９】図9は、周皮細胞の弛緩に対する異なる濃度のフルフェナム酸の効果を示すグラフである。データは、4種の周皮細胞のサンプルから平均されている。100未満の収縮能指数は、周皮細胞が薬剤への応答で弛緩したことを示す。
【図１０】図10は、周皮細胞の弛緩に対する異なる濃度のR-フルルビプロフェンの効果を示すグラフである。データは、8種の周皮細胞のサンプルから平均されている。100未満の収縮能指数は、周皮細胞が薬剤への応答で弛緩したことを示す。
【図１１】図11は、周皮細胞に対する異なる濃度(μM)のアスピリンの効果を示すグラフである。
【図１２】図12は、単離された網膜中の血管に対する0.3μMアスピリンの経時的な効果を示すグラフである。
【図１３】図13は、単離された網膜中の血管に対する1μMアスピリンの経時的な効果を示すグラフである。
【図１４】図14は、単離された網膜中の血管に対する3μMアスピリンの経時的な効果を示すグラフである。
【図１５】図15は、様々な時間における周皮細胞に対する種々の濃度のフルルビプロフェンの効果を示すグラフである。
【図１６】図16は、単離された網膜中の血管に対する0.3μMのR-フルルビプロフェンの経時的な効果を示すグラフである。
【図１７】図17は、単離された網膜中の血管に対する0.3μMのR-フルルビプロフェンの経時的な効果を示すグラフである。
【図１８】図18は、単離された網膜中の血管に対する1μMのR-フルルビプロフェンの経時的な効果を示すグラフである。
【図１９】図19は、周皮細胞に対する異なる濃度のR-フルルビプロフェンの効果を示すグラフである。
【図２０】図20は、単離された網膜中の血管に対する1μMのS-フルルビプロフェンの経時的な効果を示すグラフである。
【図２１】図21は、単離された網膜中の血管に対する3μMのS-フルルビプロフェンの経時的な効果を示すグラフである。
【図２２】図22は、単離された網膜中の血管に対する10μMのS-フルルビプロフェンの経時的な効果を示すグラフである。
【図２３】図23は、周皮細胞に対する0.3μMアスピリンの経時的な効果を示すグラフである。
【図２４】図24は、周皮細胞に対する10μMアスピリンの経時的な効果を示すグラフである。
【図２５】図25は、周皮細胞に対する1μMアスピリンの経時的な効果を示すグラフである。
【図２６】図26は、周皮細胞に対する3μMアスピリンの経時的な効果を示すグラフである。
【図２７】図27は、単離された網膜中の血管に対する種々の濃度のアスピリンの10分後の効果を示すグラフである。
【図２８】図28は、単離された網膜中の血管に対する0.1μMのR-フルルビプロフェンの経時的な効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月8日(2005.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、単離された網膜を試験化合物と接触させることと、前記血管の収縮状態の変化を検出することとを含み、ここで前記変化が、化合物が血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項２】
単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする化合物を検出または同定する方法であって、
(i)単離された網膜を提供すること；
(ii)試験化合物を前記の単離された網膜と接触させること；および
(iii)前記血管の歪みを検出すること、
を含み、ここで前記歪みが、前記化合物が単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項３】
単離された網膜が支持体に固定されている、請求項１に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項４】
網膜が全網膜である、請求項１に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項５】
血管の収縮状態を可視的に検出する、請求項１〜４のいずれか1項に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項６】
血管の大きさ、寸法または体積を検出する、請求項１に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項７】
(i)場合により、化合物を除去するのに、または血管収縮に影響を及ぼさないレベルまでその活性を低下させるのに十分な時間および条件下で、網膜の完全性または網膜血管の収縮機能に損傷を与えることのない好適なバッファーまたは水性溶媒を用いて単離された網膜を洗浄すること；
(ii)場合により、網膜血管中の歪みを検出すること；
(iii)網膜血管を第2試験化合物と接触させること；および
(iv)前記網膜血管における歪みを検出すること、
をさらに含み、ここで前記歪みが、前記化合物が網膜血管の収縮状態をモジュレートすることを示すものである、請求項２に記載の化合物を検出または同定する方法。
【請求項８】
被験体の網膜血管機能障害を診断する方法であって、血管の収縮状態を変化させるのに十分な条件下で血管機能をモジュレートする化合物の薬学上許容可能な量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態における変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が血管機能をモジュレートすることを示すものであり、ならびに、被験体の網膜血管の収縮状態の変化を検出することを含む、前記方法。
【請求項９】
被験体の網膜血管機能障害を診断する方法であって、
(i)単離された網膜中の血管の収縮状態をモジュレートする化合物の薬学上許容可能な量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものであり；ならびに
(ii)被験体の網膜中の血管の歪みを検出することを含み、ここで緩慢なまたは微弱な網膜血管の拡張または収縮が網膜血管の損傷を示すものである、
前記方法。
【請求項１０】
血管の大きさ、寸法または体積を検出する、請求項８に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１１】
脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、ホスホリパーゼC(PLC)に関する活性を有する化合物、プロテインキナーゼA(PKA)に関する活性を有する化合物、イオンチャネル過分極チャンネルに関する活性を有する化合物、および非ステロイド抗炎症剤(NSAID)、またはこれらの相同体、類似体もしくは誘導体からなる群から選択される少なくとも1種の化合物の有効量と被験体の眼球を接触させることを含む、請求項８に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１２】
NSAIDが、アスピリン、ピラゾロン、フェナメート(fenamate)、ジフルニサル、酢酸誘導体、プロピオン酸誘導体、オキシカム(oxicams)、フェナメート(fenamates)、例えばメフェナム酸、メクロフェナメート(meclofenamate）、フェニルブタゾン、ジフルニサル、ジクロフェナク、ボルタレン、インドメタシン、スリンダク、N-フェニルアントラニル酸、エトドラク、ケトロラク、ナブメトン、トルメチン、イブプロフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、カルプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、インドメタシンおよびフルフェナム酸、またはこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１３】
NSAIDがN-フェニルアントラニル酸またはフルフェナム酸またはフルルビプロフェンである、請求項１１に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１４】
NSAIDがR-異性体形態またはS-異性体形態のフルルビプロフェンである、請求項１１に記載の網膜血管機能障害を診断する方法。
【請求項１５】
被験体の網膜血管機能障害の診断用または治療用医薬の製造における網膜血管機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜中の血管の収縮状態の変化を検出または同定することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記使用。
【請求項１６】
前記化合物が請求項２に記載の方法によって同定されるものである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
被験体の網膜血管機能障害の診断用または治療用医薬の製造における網膜血管機能をモジュレートする化合物の使用であって、前記化合物が、
脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、ホスホリパーゼC(PLC)に関する活性を有する化合物、プロテインキナーゼA(PKA)に関する活性を有する化合物、イオンチャネル過分極チャンネルに関する活性を有する化合物、および非ステロイド抗炎症剤(NSAID)、またはこれらの相同体、類似体もしくは誘導体からなる群から選択される、前記使用。
【請求項１８】
網膜血管機能障害がある被験体を治療する方法であって、網膜血管機能をモジュレートする化合物と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、前記化合物の存在下で、単離された網膜内の血管の収縮状態の変化を検出することを含む方法によって同定され、ここで前記変化が、化合物が網膜血管機能をモジュレートすることを示すものである、前記方法。
【請求項１９】
前記化合物が請求項２に記載の方法によって同定されるものである、請求項１８に記載の被験体を治療する方法。
【請求項２０】
網膜血管機能障害がある被験体を治療する方法であって、網膜血管機能をモジュレートする化合物と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物のある量を被験体に投与することを含み、前記化合物が、
脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)、血管作動性腸管ペプチド(VIP)、ホスホリパーゼC(PLC)に関する活性を有する化合物、プロテインキナーゼA(PKA)に関する活性を有する化合物、イオンチャネル過分極チャンネルに関する活性を有する化合物、および非ステロイド抗炎症剤(NSAID)、またはこれらの相同体、類似体もしくは誘導体からなる群から選択される、前記方法。
【国際調査報告】
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