(57)【要約】本発明は、変異体の少なくとも１つの物理的、化学的または生物学的特性が、野生型タンパク質と比較したときに、特異的および望まれる態様で変化している、機能性チオレドキシンレダクターゼ変異体を生成するための種々の方法の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピューター的突然変異誘発を含むチオレドキシンレダクターゼのコファクター特異性を変化させるための方法。
【請求項２】
チオレドキシンレダクターゼのコファクター特異性を変化させるための請求項1の方法であって、
(a)アミノ酸位置を含むチオレドキシンレダクターゼ(TR)スキャフォルドタンパク質の座標のセットを入力し、
(b)少なくとも1つのタンパク質設計サイクルを適用し、そして
(c)変化したコファクター依存性を有する候補変異体タンパク質のセットを生成させる
ことを含む方法。
【請求項３】
当該TRスキャフォルドタンパク質が、E. coli、Bacillus subtillis、Mycobacterium leprae、Sarccharomyces、Neurospora crassa、Arabidopsos、およびヒトからなる群より選択される、請求項2の方法。
【請求項４】
当該変異体TRの当該コファクター特異性が、NADPHまたはNADHである、請求項1または2の方法。
【請求項５】
当該変異体TRの当該コファクター特異性が、NADHに切り替えられている、請求項1または2の方法。
【請求項６】
当該変異体TRの当該コファクター特異性が変化し、その結果当該変異体がNADHと比較してNADPHに優先的に結合する、請求項1または2の方法。
【請求項７】
当該変異体TRの当該コファクター特異性が変化し、その結果当該変異体が、NADPHと比較して、NADHに優先的に結合する、請求項1または2の方法。
【請求項８】
当該変異体TRの当該コファクター特異性が変化し、その結果当該変異体が、野生型TRタンパク質と比較して、NADPHについての改善された触媒効率を示す、請求項1または2の方法。
【請求項９】
チオレドキシンレダクターゼの基質特異性を変化させるための方法であって、
(a)アミノ酸位置を含むチオレドキシンレダクターゼスキャフォルドタンパク質の座標のセットを入力し、
(b)少なくとも1つのタンパク質設計サイクルを適用し、そして
(c)変化した基質依存性を有する候補変異体タンパク質のセットを生成させる
ことを含む方法。
【請求項１０】
当該変異体TRタンパク質が、E. coli、Bacillus subtillis、Mycobacterium leprae、Sarccharomyces、Neurospora crassa、Arabidopsos、およびヒトからなる群より選択される、生物から取得されるチオレドキシンタンパク質を還元する、変異体チオレドキシンレダクターゼ(TR)タンパク質。
【請求項１１】
当該変異体タンパク質が第2タンパク質に融合されている請求項1または2の変異体TRタンパク質であって、当該第2タンパク質が野生型TRタンパク質、チオレドキシン、または変異体TRタンパク質である、タンパク質。
【請求項１２】
当該変異体タンパク質がリンカーを介して当該第2タンパク質に融合されている請求項11の変異体TRタンパク質。
【請求項１３】
当該変異体TRタンパク質が野生型ArabidopsisTRタンパク質と比較して、1ないし3つのアミノ酸置換を有する、請求項1又は2の変異体TRタンパク質。
【請求項１４】
当該アミノ酸置換が、位置A4、A5およびA6から選択される、請求項13の変異体TRタンパク質。
【請求項１５】
当該アミノ酸置換が、RA4W、RA5L、RA5M、RA5I、RA5F、RA5V、RA5Y、RA6T、RA6S、RA6Q、RA6G、およびRA6Nからなる置換の群より選択される、請求項14の変異体TRタンパク質。
【請求項１６】
アミノ酸置換RA4WおよびRA6Tを含む、請求項15の変異体TRタンパク質。
【請求項１７】
アミノ酸置換がRA4W、RA5L、およびRA6Nを含む、請求項15の変異体TRタンパク質。
【請求項１８】
アミノ酸置換RA5YおよびRA6Nを含む、請求項15の変異体TRタンパク質。
【請求項１９】
アミノ酸置換RA4W、RA5F、およびRA6Qを含む、請求項１５の変異体タンパク質。
【請求項２０】
標的タンパク質のコファクター特異性を変化させるための方法であって、
（ａ）アミノ酸位置を含む、スキャフォルドタンパク質のための座標のセットを入力し、
（ｂ）少なくとも1つのタンパク質設計サイクルを適用しそして
（ｃ）変化したコファクター特異性を有する候補変異体タンパク質のセットを生成する
ことを含む方法。
【請求項２１】
当該タンパク質設計サイクルがタンパク質設計オートメーション（ＰＤＡ（登録商標））を含む、請求項１、２、９または２０の方法。
【請求項２２】
当該タンパク質設計サイクルが、配列予測アルゴリズムを含む、請求項１、２、９、または２０の方法。
【請求項２３】
当該タンパク質設計サイクルが、力場計算を含む、請求項１、２、９、または２０の方法。
【請求項２４】
式Iの単離ポリペプチド分子を含む変異体チオレドキシンレダクターゼ(TR)タンパク質;
(I)S1-A1-A2-S2-A3-A4-A5-S3-A6-S4
[式中
a)S1は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7、またはそれに実質的類似性を有する配列からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む;
b)S2は配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14、またはそれに実質的類似性を有する配列からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む;
c)S3は配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21、またはそれに実質的類似性を有する配列からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む;
d)S4は配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、および配列番号28、またはそれに実質的類似性を有する配列からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む;
e)A1はセリン、バリン、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
f)A2はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
g)A3はヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
h)A4はアルギニン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
i)A5はアルギニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、セリン、トレオニン、およびリジンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
j)A6はアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、システイン、セリン、トレオニン、およびリジンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
ただし少なくとも
A1はセリンでない;
A2はアラニンでない;
A3はヒスチジンでない;
A4はアルギニンでない;
A5はアルギニンでない;または
A6はアルギニンでない。]
【請求項２５】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS1は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7からなる群より選択される配列を有するポリペプチド配列からなる。
【請求項２６】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS2は配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群より選択される配列を有するポリペプチド配列からなる。
【請求項２７】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS3は配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21からなる群より選択される配列を有するポリペプチド配列からなる。
【請求項２８】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS4は配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、および配列番号28からなる群より選択される配列を有するポリペプチド配列からなる。
【請求項２９】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS1は配列番号1に示すポリペプチド配列であり、S2は配列番号8に示すポリペプチド配列であり、S3は配列番号15に示すポリペプチド配列であり、かつS4は配列番号22に示すポリペプチド配列である。
【請求項３０】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS1は配列番号2に示すポリペプチド配列であり、S2は配列番号9に示すポリペプチド配列であり、S3は配列番号16に示すポリペプチド配列であり、かつS4は配列番号23に示すポリペプチド配列である。
【請求項３１】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS1は配列番号3に示すポリペプチド配列であり、S2は配列番号10に示すポリペプチド配列であり、S3は配列番号17に示すポリペプチド配列であり、かつS4は配列番号24に示すポリペプチド配列である。
【請求項３２】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS1は配列番号4に示すポリペプチド配列であり、S2は配列番号11に示すポリペプチド配列であり、S3は配列番号18に示すポリペプチド配列であり、かつS4は配列番号25に示すポリペプチド配列である。
【請求項３３】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS1は配列番号5に示すポリペプチド配列であり、S2は配列番号12に示すポリペプチド配列であり、S3は配列番号19に示すポリペプチド配列であり、かつS4は配列番号26に示すポリペプチド配列である。
【請求項３４】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS1は配列番号6に示すポリペプチド配列であり、S2は配列番号13に示すポリペプチド配列であり、S3は配列番号20に示すポリペプチド配列であり、かつS4は配列番号27に示すポリペプチド配列である。
【請求項３５】
請求項24のポリペプチド分子；ここでS1は配列番号7に示すポリペプチド配列であり、S2は配列番号14に示すポリペプチド配列であり、S3は配列番号21に示すポリペプチド配列であり、かつS4は配列番号28に示すポリペプチド配列である。
【請求項３６】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA1はバリン、アラニン、およびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸部分である。
【請求項３７】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA2はグリシン、バリン、およびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸部分である。
【請求項３８】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA3はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸部分である。
【請求項３９】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA4はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸部分である。
【請求項４０】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA5はアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸部分である。
【請求項４１】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA6はグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、およびアスパラギンからなる群より選択されるアミノ酸部分である。
【請求項４２】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA1はバリンである。
【請求項４３】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA2はグリシンである。
【請求項４４】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA3はアスパラギン酸である。
【請求項４５】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA4はアラニンである。
【請求項４６】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA5はアスパラギンである。
【請求項４７】
請求項24のポリペプチド分子；ここでA6はグルタミン酸である。
【請求項４８】
請求項のポリペプチド分子24；ここで当該分子がE.coli、Bacillus subtillis、Mycobacterium leprae、Sarccharomyces、Neurospora crassa、Arabidopsis、およびヒトからなる群より選択される生物から取得されるチオレドキシンタンパク質を還元する、請求項24のポリペプチド分子。
【請求項４９】
請求項24のポリペプチド分子；ここで当該チオレドキシンの還元がコファクターの存在下で起こる。
【請求項５０】
請求項24のポリペプチド分子；ここで当該コファクターがNADPHまたはNADHである。
【請求項５１】
請求項24のポリペプチド分子；ここで当該コファクターはNADHである。
【請求項５２】
請求項24のポリペプチド分子；ここで当該ポリペプチドがNADHについてよりも、NADPHについて100倍大きいアフィニティを示す。
【請求項５３】
請求項24のポリペプチド分子；ここで当該ポリペプチドがNADHについてよりも、NADPHについて50倍大きいアフィニティを示す。
【請求項５４】
請求項24のポリペプチド分子；ここで当該ポリペプチドがNADHについてよりも、NADPHについて25倍大きいアフィニティを示す。
【請求項５５】
請求項24の単離ポリペプチド分子；ここで当該ポリペプチドが、第2ポリペプチドに融合されている。
【請求項５６】
請求項55のポリペプチド分子；ここで当該ポリペプチド当該ポリペプチドにリンカーを介して融合されている。
【請求項５７】
請求項56のポリペプチド分子；ここで当該リンカーが約5と約50個の間のアミノ酸を有するポリペプチド配列を含む。
【請求項５８】
請求項56のポリペプチド分子；ここで当該リンカーが約10と約40個の間のアミノ酸を有するポリペプチド配列を含む。
【請求項５９】
請求項56のポリペプチド分子；ここで当該リンカーが約15と約25個の間のアミノ酸を有するポリペプチド配列を含む。
【請求項６０】
請求項56のポリペプチド分子；ここで当該第2ポリペプチドがチオレドキシンである。
【請求項６１】
請求項56のポリペプチド分子；ここで当該ポリペプチドが、第3ポリペプチドにさらに融合されている。
【請求項６２】
請求項56のポリペプチド分子；ここで当該ポリペプチドが第3ポリペプチドにリンカーを介して融合されている。
【請求項６３】
請求項56または62のポリペプチド分子；ここで当該リンカーは、約5と約100kDaの間の分子量を有するポリペプチド配列を含む。
【請求項６４】
請求項56または62のポリペプチド分子；ここで当該リンカーが約25と約70kDaの間の分子量を有するポリペプチド配列を含む。
【請求項６５】
請求項56または62のポリペプチド分子；ここで当該リンカーが約25と約45kDaの間の分子量を有するポリペプチド配列を含む。
【請求項６６】
請求項56または62のポリペプチド分子；ここで当該ポリペプチドがオレオシンである。
【請求項６７】
修飾されたTRタンパク質を有する植物を生産する方法であって、
(a)アミノ末端クロロプラスト移行ペプチドを含む、請求項1または22の修飾されたチオレドキシンレダクターゼ(TR)をコードするDNA分子に作動可能に連結された植物細胞中で機能性であるプロモーターを含む発現カセットを、植物細胞内に導入し、形質転換植物細胞を得ること、および
(b)当該形質転換植物細胞を再生し、区別される形質転換植物を提供すること、ここで当該植物での修飾されたTRタンパク質をコードするDNA分子の発現が、非形質転換植物と比較して、コファクター特異性が変化していること
を含む方法。
【請求項６８】
請求項67の方法であって、ここで当該形質転換植物が、当該コファクター特異性がNADPHまたはNADHである修飾されたTRタンパク質を発現する、方法。
【請求項６９】
請求項67の方法であって、ここで当該形質転換植物が、当該コファクター特異性がNADHに切り替えられている修飾されたTRタンパク質を発現する、方法。
【請求項７０】
当該形質転換植物が、修飾されたTRタンパク質を発現し、ここで当該コファクター特異性が変化して、その結果当該修飾されたTRタンパク質が優先的に、NADHと比較してNADPHに結合する、請求項67の方法。
【請求項７１】
当該形質転換植物が、修飾されたTRタンパク質を発現し、ここで当該コファクター特異性が変化して、その結果当該修飾されたTRタンパク質が、非形質転換植物における野生型TRタンパク質と比較して、NADPHについての改善された触媒効率を示す、請求項1または2の方法。
【請求項７２】
請求項67の方法によって調製される形質転換植物。
【請求項７３】
請求項72の当該形質転換植物の形質転換された種子。
【請求項７４】
修飾されたチオレドキシンレダクターゼ(TR)タンパク質を含む油体を作成するための方法であって、
a)請求項1または2の修飾されたTRタンパク質を細胞中で生産し、
b)修飾されたTRタンパク質および当該油体を連関できる油体ターゲティングタンパク質によって当該TRタンパク質と油体を連関させ、および
c)当該修飾されたTRタンパク質と連関された当該油体を取得する
ことを含む方法。
【請求項７５】
さらに
a)該油体を洗浄し、当該修飾されたTRタンパク質を含む、洗浄された油体を取得する、および
b)当該洗浄された油体を、乳化物中に製剤化する
ことを含む、請求項74の方法。
【請求項７６】
当該油体を、非アレルゲン性食品の調製で使用する、請求項74の方法。
【請求項７７】
当該油体を動物飼料の調製で使用し、当該飼料の消化可能性を改良する、請求項74の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この出願は、２００１年３月４日出願の米国出願番号６０／２８９０２９、２００２年４月５日出願の米国出願番号６０／３７０６０９、および２００２年４月２９日出願で出願番号は付与されていないDesjariaisおよびMuchhalによる仮出願、名称「新規核酸およびチオレドキシンレダクターゼ活性を有するタンパク質」の出願日の利益を請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、変異体の少なくとも１つの物理的、化学的または生物学的特性が、野生型タンパク質と比較したときに、特異的および望ましい態様で変化された機能性チオレドキシンレダクターゼ変異体を生成するための種々の方法の使用に関する。
【０００３】
発明の背景
チオレドキシン、小ジチオールタンパク質は、動物および植物源からの、主要な食品タンパク質、アレルギー性タンパク質および特に広く使用される食品中に存在するアレルギー性タンパク質のための特異的還元剤である。ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を有するほとんどのタンパク質は、チオレドキシンによってスルフヒドリル（ＳＨ）レベルへ還元される。これらのタンパク質は、アレルゲン的に活性であり、そして酸化（Ｓ−Ｓ）状態でより消化可能でない。還元されたとき（ＳＨ状態）、これらはそのアレルゲン性を喪失し、および／またはより消化可能になる。多くの種子および禾穀類中に見出されるアルブミン、グロブリン、グリアジン、チオニンおよびグルテニンおよびまたミルク中に見出されるある数のタンパク質のようなタンパク質中のジスルフィド結合のチオレドキシン還元は重要である。例えばKiss, F. et al. (1991), Arch. Biochem. Biophys. 287:337-340; Johnson, T. C. et al. (1987), Plant Physiol. 85:446-451; Kasarda, D. D. et al. (1976), Adv. Cer. Sci. Tech. 1:158-236;およびOsborne, T. B. et al. (1893), Amer. Chem. J. 15:392-471; Shewry, P. R. et al. (1985), Adv. Cer. Sci. Tech. 7:1-83; Dahle, L. K. et al. (1966), Cereal Chem. 43:682-688; Garcia-Olmedo, F. et al. (1987), Oxford Surveys of Plant MolecularおよびCell Biology 4:275-335; Birk, Y. (1976), Meth. Enzymol. 45:695-739,およびLaskowski, M., Jr. et al. (1980), Ann. Reo. Biochem. 49:593-626; Weselake, R. J. et al. (1983), Plant Physiol. 72:809-812; Birk, Y. (1985), Int. J. Peptide タンパク質 Res. 25:113-131,およびBirk, Y. (1976), Meth. Enzymol. 45:695-739; Birk, Y. (1985), Int. J. Peptide タンパク質 Res. 25:113-131参照。
【０００４】
加えて、チオレドキシンは、多くの毒性タンパク質例えば、ヘビ (Yang, C. C. (1967) Biochim. Biophys. Acta. 133:346-355; Howard, B. D. et al. (1977) Biochemistry 16:122-125)、ミツバチ、サソリ(Watt, D. D. et al. (1972) Toxicon 10:173-181), 細菌神経毒素破傷風およびボツリヌス症(Schiavo, G. et al. (1990) InfectionおよびImmunity 58:4136-4141; Kistner, A. et al. (1992) Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 345:227-234)中のジスルフィド結合を還元し、それによってそれらの毒性をいっしょに減少させ、またはある場合には排除する。
【０００５】
チオレドキシンは、ＮＡＤＰ−チオレドキシンレダクターゼ（生理学的条件）を介してニコチンアミドデニンジヌクレオチド燐酸（ＮＡＤＰＨ）によって、またはジチオスレイトール、化学的還元剤によって活性化され（還元され）るとき、この還元を達成する。例えば引用によりここに全体を含める米国特許番号５９５２０３４参照。感作化イヌで実施された皮膚試験および喫食実験は、接種に先立ち還元されたチオレドキシンでの食品の処理は、食品のアレルゲン性を排除または減少することを示した。研究はまた、チオレドキシンによる還元に続いて、ペプシンおよびトリプシンによる食品および食品たんぱく質の増加消化を示した。
【０００６】
こうして、チオレドキシンレダクターゼを使用する、特性タンパク質の毒性を減少させる、食品のアレルゲン性を減少させ得る、そして食品の消化可能性を増加する、効率的、低コスト方法を開発することが望まれる。
【０００７】
発明の要約
前概説目的にしたがって、本発明は、チオレドキシンレダクターゼのコファクター特異性を変化させる方法であって、アミノ酸位置を含む、チオレドキシンレダクターゼスキャフォルドタンパク質のための座標のセットを入力すること；少なくとも１つのタンパク質設計サイクルを適用すること、および変化したコファクター従属性を有する候補タンパク質のセットを生成することを含む方法を提供する。好ましくは、該スキャフォルドタンパク質は、E. coli、Bacillus subtillis、Mycobacterium Leprae、Sarccharomyces、Neurospora crassa、アラビドプシス、およびヒトからなる生物の群より選択される。
【０００８】
追加的側面では、変異体ＴＲタンパク質のコファクター特異性は、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨである。好ましくは、コファクター特異性は、ＮＡＤＨに切り替えられる。加えて、ＮＡＤＨと比較してＮＡＤＰＨに優先的に結合する、ＮＡＤＰＨと比較してＮＡＤＮに優先的に結合する、両方のコファクターに同等に結合する他のＴＲ変異体を生成する。他の実施態様では、１または他のコファクターまたは両方についての触媒効率性を変化させる。
【０００９】
追加的側面では、変異体ＴＲは、RA4W、RA5L、RA5M、RA5I、RA5F、RA5V、RA5Y、RA5A、RA5S、RA5C、RA5T、RA6T、RA6S、RA6Q、RA6G、およびRA6N、RA6D、RA6M、およびRA6Eからなる置換の群より選択されるアミノ酸置換を有する。
【００１０】
追加的側面では、本発明は、ＴＲタンパク質の基質特異性を変化させるための方法であって、アミノ酸位置を含む、チオレドキシンレダクターゼスキャフォルドタンパク質についての座標のセットを入力すること；少なくとも１つのタンパク質設計サイクルを適用すること、および変化した基質特異性を有する候補変異タンパク質ノセットを生成することを含む方法を提供する。
【００１１】
追加的側面では、本発明は、標的タンパク質のコファクター特異性を変化させるための方法であって、アミノ酸位置を含む、チオレドキシンレダクターゼスキャフォルドタンパク質についての座標のセットを入力すること；少なくとも１つのタンパク質設計サイクルを適用すること、および変化したコファクター特異性を有する候補変異タンパク質のセットを生成することを含む方法を提供する。
【００１２】
追加的実施態様では、本発明は、変異体チオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）タンパク質であって、式Ｉ
(I)S1-A1-A2-S2-A3-A4-A5-S3-A6-S4
式中
a)S1は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7からなる群より選択されるポリペプチド配列またはそれに実質的類似性を有する配列を含む、;
【００１３】
b)S2は配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群より選択されるポリペプチド配列またはそれに実質的類似性を有する配列を含む、;
【００１４】
c)S3は配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21からなる群より選択されるポリペプチド配列、またはそれに実質的類似性を有する配列を含む;
【００１５】
d)S4は配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、および配列番号28、からなる群より選択されるポリペプチド配列またはそれに実質的類似性を有する配列を含む;
【００１６】
e)A1はセリン、バリン、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分であり、
【００１７】
f)A2はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分であり;
【００１８】
g)A3はヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸部分であり;
【００１９】
h)A4はアルギニン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分であり;
【００２０】
i)A5はアルギニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、セリン、トレオニン、およびリジンからなる群より選択されるアミノ酸部分であり;
【００２１】
j)A6はアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、システイン、セリン、トレオニン、およびリジンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
【００２２】
ただし少なくとも
A1はセリンではない;
A2はアラニンではない;
A3はヒスチジンではない;
A4はアルギニンではない;
A5はアルギニンではない;または
A6はアルギニンではない。
【００２３】
追加的側面では、本発明は、植物細胞の油含量を変化させる方法であって、アミノ末端クロロプラスト移行ペプチドを含む請求項１または２２の修飾されたチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲ）タンパク質をコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結された植物細胞中で機能性のプロモーターを含む発現カセットを、植物細胞内に導入し、形質転換された植物細胞を得ること；および当該形質転換植物細胞を再生し、区別される形質転換植物を提供することを含む方法を提供し、ここで修飾されたＴＲタンパク質をコードするＤＮＡ分子の、当該植物での発現が、非形質転換植物と比較してコファクター特異性が変化している。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１はチオレドキシンレダクターゼによって触媒される反応である。
【図２Ａ】図２は高度に保存されるある数の種からのレダクターゼの活性部位ポケットを示す。もっとも普通のＴＲ配列の幾つかである。最初のコラムは、GenbankID番号を列挙し、A1ないしA6は式I（以下に記載）に定義のアミノ酸を言及する。S2およびS3はA1ないしA6を文意Rする配列ドメインであり、そしてまた式Iに定義される。
【図２Ｂ】図２は高度に保存されるある数の種からのレダクターゼの活性部位ポケットを示す。普通のグルタチオンレダクターゼ配列のいくつかである。
【図２Ｃ】図２は高度に保存されるある数の種からのレダクターゼの活性部位ポケットを示す。生物によってグループ化される定義された位置のそれぞれの天然配列多様性。
【図２Ｄ】図２は高度に保存されるある数の種からのレダクターゼの活性部位ポケットを示す。生物によってグループ化される定義された位置のそれぞれの天然配列多様性である。
【図２Ｅ】図２は高度に保存されるある数の種からのレダクターゼの活性部位ポケットを示す。既知のコファクター特異性および既知のアミノ酸配置である。
【図３−１】図３は式Iで使用し得る種々の配列である。
【図３−２】図３は式Iで使用し得る種々の配列である。
【図３−３】図３は式Iで使用し得る種々の配列である。
【図３−４】図３は式Iで使用し得る種々の配列である。
【図３−５】図３は式Iで使用し得る種々の配列である。
【図４】図４はハイスループットTRスクリーニング法の概略である。
【図５】図５はタンパク質精製戦略である。
【図６】図６はアラビドプシスNTR野生型レダクターゼと、NAD(P)Hの動力学である。
【図７】図７はNTR-1ライブラリー１から取得された変異体である。
【図８】図８はNTR−1ライブラリ−2から取得された変異体である。
【図９Ａ】図９ＡはNTR−1ライブラリー１およびNTR−2ライブラリ−2から、設計された位置およびドック化されたコファクターである。
【図９Ｂ】図９ＢはNTR−1ライブラリー１およびNTR−2ライブラリ−2から、設計された位置およびドック化されたコファクターである。
【図１０】図１０は４つのコンピューター的ライブラリからの変異体のスクリーニングから得たまとめである。
【図１１Ａ】図１１Ａは２つの変異体対野生型TRについての動力学パラメーターである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは２つの変異体対野生型TRについての動力学パラメーターである。
【図１２】図１２はNTR−1ライブラリ−2設計から取得された最良変異体のまとめである。
【図１３Ａ】図１３Ａは高複雑性ランダムRRRライブラリーから取得した変異体の活性のまとめである。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは高複雑性ランダムRRRライブラリーから取得した変異体の活性のまとめである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃはこのライブラリーから取得した変異体のまとめである。
【図１４】図１４はクローンからの２つについてのコンピュター的モデルである。
【図１５】図１５は変異体のいくつかについての酵素的活性および動力学パラメータのまとめである。
【図１６Ａ−１】図１６ＡはWVR変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｂ−１】図１６ＢはWMG変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｃ−１】図１６ＣはWIS変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｄ−１】図１６ＤはWMS変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｅ−１】図１６ＥはWLS変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｆ−１】図１６ＦはWRT変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｇ−１】図１６ＧはRYN変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｈ−１】図１６ＨはRYN-A変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｉ−１】図１６ＩはRFN変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｊ−１】図１６ＪはRRR-WT核酸配列である。
【図１６Ｋ−１】図１６ＫはWVG変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｌ−１】図１６ＬはWRS変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｍ−１】図１６ＭはWFQ変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｎ−１】図１６ＮはNTR野生型タンパク質についての核酸配列である。
【図１６Ｏ−１】図１６ＯはRYN-M変異体についての核酸配列である。
【図１６Ｐ−１】図１６ＰはRYN-L変異体についての核酸配列である。図１６Q  RYN-I変異体についての核酸配列である。
【図１７Ａ】図１７Ａは変異体のうちのいくつかとの、アラビドプシスNTR野生型タンパク質のアラインメントである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは変異体のうちのいくつかとの、アラビドプシスNTR野生型タンパク質のアラインメントである。
【図１８】図１８は実施例１にキシの重要なRRRないしRNY変化のコンピュータ的提示である。
【図１９】図１９はタンパク質データバンクから抜粋のNADコンホメーションの小サンプルである。ボール-およびスティック−モデルは、NAD  TDFコンホーマーであり、これはその他のほとんどと異なるリブロースパッカーを有する。
【図２０】図２０はPDAシミュレーションで利用されるライブラリー位置およびライブラリー1および2の生成である。
【図２１−１】図２１はいくつかの野生型TRタンパク質の配列アラインメントである。配列は、以下に対応する: 1)｜P09625|TRXB_ECOLI;  2) |P80880|TRXB_BACSU; 3) |P46843|TRXB_MYCLE;  4)  |P51978|TRXB_NEUCR;  5) |P29509|TRB1_YEAST; 6) |P38816|TRB2_YEAST;7) |Q39243|TRB1_ARATH;  8) |Q39242|TRB2_ARATH; および、 9) |Q16881|TRXB_HUMAN。
【図２１−２】図２１はいくつかの野生型TRタンパク質の配列アラインメントである。配列は、以下に対応する: 1)｜P09625|TRXB_ECOLI;  2) |P80880|TRXB_BACSU; 3) |P46843|TRXB_MYCLE;  4)  |P51978|TRXB_NEUCR;  5) |P29509|TRB1_YEAST; 6) |P38816|TRB2_YEAST;7) |Q39243|TRB1_ARATH;  8) |Q39242|TRB2_ARATH; および、 9) |Q16881|TRXB_HUMAN。
【図２１−３】図２１はいくつかの野生型TRタンパク質の配列アラインメントである。配列は、以下に対応する: 1)｜P09625|TRXB_ECOLI;  2) |P80880|TRXB_BACSU; 3) |P46843|TRXB_MYCLE;  4)  |P51978|TRXB_NEUCR;  5) |P29509|TRB1_YEAST; 6) |P38816|TRB2_YEAST;7) |Q39243|TRB1_ARATH;  8) |Q39242|TRB2_ARATH; および、 9) |Q16881|TRXB_HUMAN。
【図２２】図２２はいくつの野生型TRタンパク質ノアミノ酸配列である。配列は以下に対応する： A) |P09625|TRXB_ECOLI;  B) |P80880|TRXB_BACSU; C) |P46843|TRXB_MYCLE;  D)  |P51978|TRXB_NEUCR;  E) |P29509|TRB1_YEAST; F) |P38816|TRB2_YEAST;G) |Q39243|TRB1_ARATH; H) |Q39242|TRB2_ARATH;および,  I) |Q16881|TRXB_HUMAN。
【００２５】
発明の詳細な記載
本発明は、変化したコファクター特異性を呈する変異体タンパク質および核酸の生成を指向する。該変異体タンパク質は、アルすの種々のアプローチを使用して生成し得る。例えば、慣行の突然変異誘発およびコンピューター的加工アプローチである。コンピューター的加工アプローチは、米国特許番号 6,188,965および6,296,312, 米国出願番号 09/419,351, 09/782,004, 09/927,79,および09/877,695であってすべて引用によりここに全体を含めるものに以前記載された。一般に、これらの出願は、種々のコンピューター的モデル化システムを使用し、これは極度に安定なタンパク質の生成を可能とする。このやり方では、野生型タンパク質の変異体であって、野生型タンパク質吐比較して変化したコファクター特異性を呈するものを生成する。
【００２６】
本発明の方法を、その他を超えて１のコファクターについて優先性を呈する任意の酵素に適用し得る。例えば、酵素レダクターゼは、その他に対し１のコファクターについて優先性をしばしば呈する。加えて、本発明の方法を、標的タンパク質の基質特異性を変化させるために適用し得る。
【００２７】
特に、本発明の方法を使用し、NADPHからNADHにコファクター優先性を変化させることができる。NADPHは高価な還元剤である。その費用は、食品アレルゲンおよび毒液処置を減少させることにおけるチオレドキシンシステムの広い使用を禁止してきた。こうして、当分野で、より低いコストで、NADP-チオレドキシンレダクターゼ還元剤の使用として同じ結果を達成する他のシステムを見出す必要性がある。１つのそのようなシステムは、変化したコファクター特異性を有するチオレドキシンレダクターゼの変異体を生成する。
【００２８】
本発明にしたがって、標的タンパク質のコファクター特異性を変化させる方法を提供する。ここに「変化」または文法的均等物によって、ポリペプチドの文脈では、ここで使用するように、天然に存在するタンパク質の対応する特性と比較して選択または検出できるポリペプチドの任意の特徴または属性をさらに言及する。これらのタンパク質は、限定しないが、コファクター特異性、細胞毒性活性、酸化的安定性、基質特異性、基質結合または触媒活性、温度安定性、アルカリ安定性、ｐH活性プロファイル、タンパク質溶解分解への抵抗性、動力学会合（Kon)および解離（Koff)率、分泌のための能力、細胞の表面上のディスプレイ能力、オリゴマー化能力、シグナル化能力、細胞増殖を刺激する能力、細胞増殖を阻害する能力、アポトーシスを誘導する能力、ホスホリル化またはグリコシル化によって修飾される能力、疾患を処置する能力を含む。
【００２９】
他に特定しない限り、前列挙特性のいずれかの実質的変化は、本発明の変異体ポリペプチドの特性を、標的タンパク質または野生型タンパク質の特性と比較するとき、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも2倍増加または減少である。
【００３０】
ここで「コファクター特異性」によって、酵素のコファクター優先性を変化させることを意味する。ここで「コファクター」によって、補酵素、例えば酸化／還元反応に関与するNADPH、NADHを意味する。こうして、標的タンパク質は、その他を超える１のコファクターについての優先性を呈する。本発明の方法を使用し、標的酵素のコファクター優先性を変化させ得、その結果より低い優先されたコファクターについての優先性は、２０％、５０％、１００％、３００％、５００％、１０００％、２０００％まで増加する。例えばある数のレダクターゼ酵素は、NADHよりNADPHを優先する(WO 02/22526; WO 02.29019; Mittl, PR., et al., (1994) Protein Sci., 3: 1504-14; Banta, S., et al., (2002) Protein Eng., 15:131-140; すべて引用によりここに含めるのを参照)。NPDPHの利用性は、インビボおよびインビトロの両方でしばしば限定的であるように、標的タンパク質の全体活性は、しばしば限定的である。コファクターとしてNADPHを好む標的タンパク質のために、より容易に利用可能であるコファクター、例えばNADHに標的タンパク質のコファクター特異性を変化させることが望ましい。
【００３１】
好ましい実施態様では、標的タンパク質のコファクター特異性を切りかえる。「切りかえる」によってここに、標的タンパク質のコファクター優先性（例えば親和性）を、その他のコファクターに変化させる。好ましくは、1実施態様では、コファクター特異性を切り替えることによって、野生型酵素によって優先されるコファクターを有する活性を減少させ、一方より低い優先されたコファクターを有する活性を増加させる。例えば、もし標的タンパク質がNADPHを優先するならば、該優先性をNADHに切り替えることは、NADHを使用してネイティブNADPH依存性活性の少なくとも５０％を有する変異体TRを得る。より好ましくは、変異体TRはNADHを使用して天然NADPH依存性活性の少なくとも７５％を有する。より好ましくは変異体TRは、NADHを使用してネイティブNADPH活性の８５％、９５％、１００％までを有する。代替的に、その他の実施態様では、代替的コファクター親和性は、優先されるコファクター親和性の現象を有することなく増加する。なおさらなる実施態様では、両方のファクターについてのコファクター親和性は同時的に変化する。
【００３２】
好ましくは、コファクターについての標的タンパク質の触媒効験は、増強される。ここに「触媒効験」によって、コファクターでの活性が顕著に改善されることを意味する。触媒効験は、いずれかの優先されるコファクターについて改善され、または、コファクター特異性が変化する場合の実施態様では、変化コファクターでの触媒効験は改善し得る。
【００３３】
好ましい実施態様では、コファクターについての標的タンパク質の結合親和性は増強される。結合親和性の変化は、少なくとも５％またはより大きい増加または野生型標的タンパク質と比較したときの結合親和性の減少によって証拠付けられる。ある種の実施態様では、本発明の変異体タンパク質は、その他についてよりも１コファクターについての１００倍より大きい親和性を示し得、一方他の実施態様では、変異体タンパク質は、その他についてよりも１コファクターについて５０倍より大きい親和性を示す。または変異体タンパク質は、その他よりも１コファクターについて25倍より大きい親和性を示し得る。
【００３４】
好ましい実施態様では、標的タンパク質の基質特異性は、変化する。例えば、標的タンパク質が典型的には、同じ種からの基質に作用するならば、標的タンパク質の基質特異性が変化し得、その結果変異体タンパク質は、他の種からの基質に作用し得る。
【００３５】
よって、本発明は、標的タンパク質のコファクター特異性を変化させるための方法を指向する。ここに「標的タンパク質」または「スキャフォルドタンパク質」またはその文法的均等物は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む少なくとも２つの共有結合アミノ酸を意味する。タンパク質は、天然存在アミノ酸およびペプチド結合、または全般に合成の方法に依存して、合成ペプチドミメチック構造すなわち「アナログ」例えばペプトイド[Simon et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 89(20:9367-71(1992)参照]から作成し得る。こうしてここに使用するように「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然存在および合成の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、およびノレロイシンは本発明の目的のアミノ酸と考える。「アミノ酸」はまた、イミノ酸残基例えばプロリンおよびヒドロキシプロリンを含む。加えて、本発明の変異体タンパク質の構成要素を表すアミノ酸は、同じアミノ酸また反対キラリティによって置換し得る。こうしてL配置で天然に存在する任意のアミノ酸（これはまた、化学物質の構造に依存してRまたはSとして言及し得る）は、同じ化学的構造型のアミノ酸また反対キラリティであって一般にD−アミノ酸といわれ、しかし追加的にその組成および化学的配置に依存してRまたはSとして言及されるのと置換し得る。そのような誘導体は、大きく増加した安定性の特性を有し、そしてしたがって、より長いインビボ半減期を有し得る化合物の製剤で、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、局所、経腸、目内、またはその他の経路で投与したときに有利である。好ましい実施態様では、アミノ酸は（S)またはL配置である。もし非天然存在側鎖を使用するならば、非アミノ酸置換を使用し、例えばインビボ分解を防止または阻害し得る。非天然存在アミノ酸を含むタンパク質は合成し得、幾つかの場合は、組換え的に作成し得る。引用によりここに含める、van Hest et al., FEBS Lett 428:(1-2) 68-70 May 22 1998およびTang et al., Abstr. Pap Am. Chem. S218:U138-U138 Part 2 August 22, 1999参照。
【００３６】
芳香族アミノ酸は、DまたはLナフチルアラニン、DまたはLフェニルグリシン、DまたはL-2-チエニルアラニン、DまたはL-1-、-2-、-3-または4-ピレニルアラニン、DまたはL-3-チエニルアラニン、DまたはL-(2-ピリジニル)-アラニン、DまたはL(3-ピリジニル)-アラニン、DまたはL-(2-ピラジニル)-アラニン、DまたはL(4-イソプロピル）-フェニルグリ親、D-(トリフルオロメチル)-フェニルグリシン、D-(トリフルオロメチル)-フェニルアラニン、D-p-フルオロフェニルアラニン、DまたはL-p-ビフェニルフェニルアラニン、DまたはL-p-メトキシビフェニルフェニルアラニン、DまたはL-2-インドール(アルキル）アラニン、およびDまたはL-アルキルアラニンで置換し得る。ここで、アルキルは、置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、sec-ブチル、sec-イソチル、イソ-ペンチル、非酸性アミノ酸であってC1−C20であるものであり得る。酸性アミノ酸は、非カルボキシレートアミノ酸であって、陰性荷電を維持するもの、およびその誘導体またはアナログ、例えば非限定的例は、（フォスフォノ）アラニン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、またはセリン、または硫酸化（例えば-SO置換３H）トレオニン、セリン、チロシンである。他の置換は、非天然ヒドロキシル化アミノ酸は、「アルキル」を任意の天然アミノ酸とあわせることにより作成し得る。用語「アルキル」はここで使用するように、分枝または非分枝飽和炭化水素基で１ないし２４炭素原子のもの、例えばメチル、エチル。n-プロピル、イソプトピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラシシル等である。
【００３７】
アルキルは、窒素、酸素、および硫黄の原子を有するヘテロアルキルを含む。好ましいアルキル基は、ここで、１ないし１２炭素原子を含む。塩基性アミノ酸は、天然存在アミノ酸リジン、アルギニン、オルニチン、シトルリンまたは（グアニジノ）-酢酸、または他の（グアニジノ)アルキル-酢酸の任意の位置でアルキル基で置換されい得る。ここで「アルキル」は、前定義の通りである。ニトリル誘導体（例えばCOOHの代わりにCN-部分を含む）は、またアスパラギンまたはグリタミンで置換し得、そしてメチオニンスルホキシドは、メチオニンで置換し得る。そのようなペプチド誘導体の製造の方法は、当業者に周知である。
【００３８】
加えて、任意の変異体ペプチドの任意のアミド結合は、ケトメチレン部分によって置換できる。そのような誘導体は、酵素による分解に対する増加安定性を有することが予測される。したがって、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、局所、経腸、眼内または他の経路によって投与するように、増加インビボ半減期を有し得る化合物の製剤のために有利性を保有する。本発明の変異体ポリペプチドのアミノ酸の追加的アミノ酸修飾は、異化を含み得る：システイニル残基は、αハロアセテート（および対応アミン）で、例えば2-クロロ酢酸またはクロロアセトアミドで置換し得、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基は、また化合物例えばブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(5-イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルフォスフェート、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル-2-ピリジルジスルフィド、p-クロロメルクリベンゾエート、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応によって誘導体化し得る。ヒスチジル残気を、化合物、例えばジエチルプロカルボネートと、例えばｐH5.5-7.0の反応によって誘導体化し得、というのは、この剤は、明かに、ヒスチジル側鎖に特異的であり、およびパラ-ブロモフェナシルブロミドをまた使用し得る：例えばここで反応は、好ましくは０．１MナトリウムカコジレートでｐH6.0で実施する。リシニルおよびアミノ末端残基は、化合物、例えばコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応し得る。これらの剤での誘導体化は、リシニル残基の変化を逆転する効果を有すると期待される。αアミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬は、化合物例えばイミドエステル/例えばメチルピコリンイミデートとしてピリドキサールフォスフェート、ピリドキサール、ウロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸；O-メチルイソウレア；2,4-ペンタンジオン；およびグリコシレートとのトランスアミナーゼ触媒性反応を含む。アルギニル残基は、１または幾つかの慣行の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって既知方法工程にしたがって修飾し得る。アルギニン残基の誘導体化は、反応がアルカリ条件で実施されるコとを要旨、というのは、グアニジン官能基のpKaが高いからである。さらに、これらの試薬は、リジンの基並びにアルギニンイプシロン-アミノ基と反応し得る。チロシル残基の特異的修飾はそれ自体周知である。例えばスペクトル標識を、チロシル残基に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって導入する。N-アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用し、それぞれO-アセチルチロシル種および3-ニトロ誘導体を形成し得る。カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）を、選択的に、カルボジミイド（R'-N-C-N-R')例えば1-シクロヘキシル-3-2-モルフォリニル-(4-エチル）カルボジミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応によって修飾し得る。
【００３９】
さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基へ変換し得る。グルタミルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミデート化し得る。代替的に、これらの残基を、温和な酸性条件化で脱アミデート化し得る。これらの残基のいずれかの形態は、本発明の範囲内である。
【００４０】
標的またはスキャフォルドタンパク質は、3次元構造すなわち、タンパク質のそれぞれの原子についての3次元座標が既知または生成し得る任意のタンパク質であり得る。一般に、これは、X線結晶学的技法、NMR技法、デノボモデリング、相同性モデリング等を使用して決定できる。一般にｘ線構造を使用するならば、2解像でまたはよりよい構造が好ましいが必要ではない。
【００４１】
本発明の標的またはスキャフォルドタンパク質を原核および真核生物、例えばバクテリア（extremeophiles例えばarchebacteria)を含む、真菌、昆虫、魚、植物、および哺乳動物からのものであり得る。好適な哺乳動物は限定しないがげっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、ギニアブタ等）、霊長類、家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ等を含む）およびもとも好ましい実施態様ではヒトからのものである。
【００４２】
こうして、ここに「標的タンパク質」または「スキャホルドタンパク質」は、変異体タンパク質または変異体タンパク質のライブラリー、好ましくは変化したコファクター特異性を有するものが、望まれるタンパク質を意味する。当業者によって認識されるように、任意の数の標的タンパク質は、本発明の使用を見出す。「タンパク質」の定義内に具体的に含まれるのは、機能性ドメイン、例えば酵素的ドメイン、結合ドメイン等を含む、既知タンパク質のフラグメントおよびドメイン、および小ドメイン例えばターン、ループ等である。すなわち、タンパク質の部分は同様に使用し得る。加えて、ここで使用するような「タンパク質」は、タンパク質、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。加えて、タンパク質変異体すなわち非天然存在タンパク質アナログ構造を使用し得る。
【００４３】
好適なタンパク質は、限定しないが、工業、製薬、および農業的タンパク質を含む。酵素の好適なクラスは、限定しないが、レダクターゼ、ヒロドラーゼ、例えばプロテアーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼイソメラーゼ、例えばラセマーゼ、エピメラーゼ、タウトマラーゼ、またはムターゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、およびフォスファターゼを含む。、好適な酵素は、Seiss-Prot酵素データベ-スに列挙される。好適なタンパク質バックボーンは、限定しないが、Research Collaboratory for Structural Bioinformatics(RCSB, formerly the Brookhaven National Lab)によってコンパイルおよび供されるタンパク質データベースに見出されるものすべてである。
【００４４】
具体的には、好ましい標的タンパク質は、レダクターゼ、例えばチオレドキシンレダクターゼ (US Pub. No. 2002/0037303), 2,5-ジケト-D-グルコン酸レダクターゼ(Banta, S, et al., (2002) タンパク質 Eng., 15: 131-140; WO 02/22527; WO 02/29019),グルタチオンレダクターゼ (Mittl, PR, et al. (1993) J. Mol. Biol., 231: 191-5; Mittl & Schulz, (1994) タンパク質 Sci., 3: 799-809; Mittl, PR, et al., (1994) タンパク質 Sci., 3: 1504-14), アルカリヒドロパーオキシドレダクターゼシステム (Wood, ZA, et al., (2001), Biochemistry, 40: 3900-3911), チオレドキシンレダクターゼ-様タンパク質(Reynolds, CM, et al., (2002) Biochemistry, 41: 1990-2001)を含む。
【００４５】
よって本発明は、標的タンパク質のコファクター特異性を変化させるコンピューター的加工方法を指向する。ひとたび標的タンパク質またはスキャフォルドタンパク質のための座標のセットを入力すると、タンパク質設計サイクルを実行し、望まれるレセプターについての変化した親和性を有する可変タンパク質配列のセットを生成する。ここに「タンパク質設計サイクル」によって限定しないがProtein Design Automation(登録商標）(PDA（登録商標）), 配列予測アルゴリズム (SPA), 種々の力場計算等（米国特許番号 6,188,965および6,296,312, 米国出願番号 09/419,351, 09/782,004, 09/927,79, 09/877,695; Raha, K., et al. (2000) Protein Sci., 9:1106-1119, U.S.S.N. 09/877,695, 2001年６月８日出願, 名称「ApparatusおよびMethod for Designing Proteins and Protein Libraries; 米国出願番号 09/927,790,  60/352,103, および 60/351,937であってすべて引用によりここに全体を含めるものを参照）を含む配列を生産するために使用し得るある数のタンパク質設計アルゴリズムのにいずれかを意味する。
【００４６】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、標的タンパク質で出発し、およびコンピューター的加工を使用し、候補または変異体タンパク質または第１配列のセットを生成することに関係する。代替的に、構造に基づく方法、例えばPDA（登録商標）であって以下に詳細に記載するものを使用する。高正確性配列の相対的エネルギーを評価するための他モデルは、引用によりここに含めるWarshel, Computer Modeling of Chemical Reactions in EnzymesおよびSolutions, Wiley & Sons, New York, (1991)を含む。
【００４７】
同様に、分子力学計算を使用し、突然変異体配列スコアを個々に計算し、およびランク整列リストをコンパイルすることによって配列をコンピューター的にスクリーンすることができる。
【００４８】
好ましい実施態様では、残基対ペンダントを使用し、配列をスコア化することができる(Miyazawa et al., Macromolecules 18(3):534-552 (1985), 引用によりここに含める) during computational screening。
【００４９】
好ましい実施態様では、配列プロファイルスコア(Bowie et al., Science 253(5016):164-70 (1991), 引用によりここに含める) および/または平均力の潜在性 (Hendlich et al., J. Mol. Biol. 216(1):167-180 (1990),また引用によりここに含める)はまた、配列をスコア化するために計算し得る。これらの方法は、配列と３Dタンパク質構造の間のマッチを評価し、ゆえにタンパク質構造への忠実性についてスクリーンするために作用できる。配列をランクするため種々のスコア化機能を使用することによって、配列スペースの種々の領域を、コンピューター的スクリーンにおいてサンプリングできる。
【００５０】
さらに、スコア化機能を使用し、タンパク質の金属またはコファクター結合部位を創出する配列についてスクリーンできる。 (Hellinga, Fold Des. 3(1): R1-8 (1998),引用によりここに含める)。同様に、機能をスコアすることを使用し、タンパク質にジスルフィドを創出する配列についてスクリーンできる。これらの潜在性は新しい構造モチーフを導入得るタンパク質構造を具体的に修飾するのを試みる。
【００５１】
好ましい実施態様では、配列および/または構造アラインメントプログラムを使用し、発明の変異体タンパク質を生成し得る。当業界で知られるように、ある数の配列に基づくアラインメントプログラム、例えば、Smith-Waterman searches, Needleman-Wunsch, Double Affine Smith-Waterman, frame search, Gribskov/GCG profile search, Gribskov/GCG profile scan, profile frame search, Bucher generalized profiles, Hidden Markov models, Hframe, Double Frame, Blast, Psi-Blast, Clustal,およびGeneWiseを含むものがある。
【００５２】
配列の源は広く変化し、そして１または２以上の既知のデータベースであって限定しないがSCOP (Hubbard, et al., Nucleic Acids Res 27(1):254-256. (1999)); PFAM (Bateman, et al., Nucleic Acids Res 27(1):260-262. (1999)); VAST (Gibrat, et al., Curr Opin Struct Biol 6(3):377-385. (1996)); CATH (Orengo, et al., Structure 5(8):1093-1108. (1997)); PhD Predictor (http://www.embl-heidelberg.de/predictタンパク質 /predictタンパク質.html); Prosite (Hofmann, et al., Nucleic Acids Res 27(1):215-219. (1999)); PIR (http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/protseqdb/); GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); PDB (www.rcsb.org)およびBIND (Bader, et al., Nucleic Acids Res 29(1):242-245. (2001))を含むものからの配列をとることを含む。
【００５３】
加えて、これらのデータベースからの配列を、連続分析または遺伝子予測の対象とすることができる; Wheeler, et al., Nucleic Acids Res 28(1):10-14. (2000)およびBurgeおよびKarlin, J Mol Biol 268(1):78-94. (1997)参照。
【００５４】
当業界で知られるように、使用できる配列アラインメント方法論のある数がある。例えば、配列相同性に基づくアラインメント方法を使用し、標的構造に関連するタンパク質の配列アラインメントを創出できる (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410 (1990),  Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997), both 引用によりここに含める).  これらの配列アラインメントを次いで試験し、観察配列変異を決定する。これらの配列変異を集計し、変異体タンパク質のあるセットを定義する。
【００５５】
配列に基づくアラインメントを、種々の方法で使用することができる。例えば関連タンパク質のある数を、当業界で既知のようにアラインメントし、「可変」および「保存」残基を定義する。これらの結果を使用し、以下に概説の確率表を生成することができる。同様に、これらの配列変異を、作表し、そして二次ライブラリーを以下に定義のようにそれらから定義する。代替的に、もたらされた配列変異を使用し、コンピューター的スクリーニング中のそれぞれの位置で考えられるアミノ酸を定義することができる。他の変異は、配列アラインメントで存在するアミノ酸についてのスコアをバイアスさせ、それによってそれらがコンピューター的スクリーニング中に見出される尤度を増加させるが、なお他のアミノ酸の考察を可能とする。このバイアスは変異体タンパク質のフォーカス化ライブラリーという結果となるが、アラインメントで見出されない考察アミノ酸から排除しない。加えて、他の型のある数は、導入し得る。例えば、多様性をフォーカスし得る；すなわち、「保存」残基を選択し、変化させ、タンパク質上の多様性を強化し、こうして配列スペースのより大きい部分をサンプリングする。代替的に、ファミリーメンバー間の高可変性の位置（すなわち低保存）は、アミノ酸のすべてまたはサブセットを使用してランダム化できる。同様に、ポジショナルアウトライアーまたは側鎖アウトライアーを排除し得る。
【００５６】
同様に、構造に基づくタンパク質の構造アラインメントをなし、配列アラインメントを生成し得る。既知の広範囲のそのような構造アラインメントプログラムがある。例えばVAST from the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/Structure/VAST/vast.shtml); SSAP (Orengo and Taylor, Methods Enzymol 266(617-635 (1996)) SARF2 (Alexandrov, Protein Eng 9(9):727-732. (1996)) CE (Shindyalov and Bourne, Protein Eng 11(9):739-747. (1998)); (Orengo et al., Structure 5(8):1093-108 (1997); Dali (Holm et al., Nucleic Acid Res. 26(1):316-9 (1998)であって, すべて引用によりここに含めるもの参照). これらの配列アラインメントを次いで試験し、観察配列変異を決定できる。ライブラリーを、配列柄の二次構造を予測し、次いで予測される二次構造と矛盾しない配列を選択することによって生成できる。ある数の二次構造予測方法、例えばヘリックス-コイル遷移理論(MunozおよびSerrano, Biopolymers 41:495, 1997), 神経ネットワーク,局所構造アラインメントおよびその他 (例えば、Selbig et al., Bioinformatics 15:1039-46, 1999参照)がある。
【００５７】
同様に、前概説の通り、限定しないが配列プロファイリング[Bowie and Eisenberg, Science 253(5016):164-70, (1991)]、ロタマーライブラリー（ rotamer library）selection [Dahiyat and Mayo, Protein Sci. 5(5):895-903 (1996); Dahiyat and Mayo, Science 278(5335):82-7 (1997);  Desjarlais and Handel, Protein Science 4:2006-2018 (1995); Harbury et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(18):8408-8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19:244-255 (1994); Hellinga and Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:5803-5807 (1994)];および残基対ポテンシャル[Jones, Protein Science 3: 567-574, (1994)]; PROSA [Heindlich et al., J. Mol. Biol. 216:167-180 (1990)]; THREADER [Jones et al., Nature 358:86-89 (1992)],および他の逆フォールディング方法例えばSimons et al. [Proteins, 34:535-543, (1999)], LevittおよびGerstein [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:5913-5920, (1998)], Godzik and Skolnick [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:12098-102, (1992)], Godzik et al. [J. Mol. Biol. 227:227-38, (1992)] によって記載されるものおよび２プロファイリング法 [Gribskov et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:4355-4358 (1987)およびFischer and Eisenberg, Protein Sci. 5:947-955 (1996), Rice and Eisenberg J. Mol. Biol. 267:1026-1038(1997)]であってすべて 引用によりここに含めるものを含む他のコンピューター的方法が、既知である。
【００５８】
加えて、他のコンピューター的方法、例えば Koehl and Levitt (J. Mol. Biol. 293:1161-1181 (1999); J. Mol. Biol. 293:1183-1193 (1999); 引用によりここに含める) によって記載されるものを使用し、改善された特性および機能のための実験スクリーニングで使用のためのより小さい二次ライブラリーを生成するため所望により次いで使用することのできる変異体ライブラリーを創出し得る。加えて、力−場計算（force-field calculations）例えばSCMFであってSCMFについてまた使用できるものに基づくコンピューター的方法がある。Delarue et al. Pac. Symp. Biocomput. 109-21 (1997); Koehl et al., J. Mol. Biol. 239:249-75 (1994); Koehl et al., Nat. Struct. Biol. 2:163-70 (1995); Koehl et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6:222-6 (1996); Koehl et al., J. Mol. Biol. 293:1183-93 (1999); Koehl et al., J. Mol. Biol. 293:1161-81 (1999); Lee J., Mol. Biol. 236:918-39 (1994);およびVasquez Biopolymers 36:53-70 (1995)であってすべて引用によりここに含めるもの参照。他の力場計算（forcefield calculations）であってコンピューター的方法内で配列のコンホメーションを最適化するため、または前概説のようにデノボ最適化配列を生成するため使用できるものは、限定しないが、OPLS-AA [Jorgensen et al., J. Am. Chem. Soc. 118:11225-11236 (1996); Jorgensen, W.L.; BOSS, Version 4.1; Yale University: New Haven, CT (1999)]; OPLS [Jorgensen et al., J. Am. Chem. Soc.110:1657ff (1988); Jorgensen et al., J Am. Chem. Soc.112:4768ff (1990)]; UNRES (United Residue Forcefield; Liwo et al., Protein Science 2:1697-1714 (1993); Liwo et al., Protein Science 2:1715-1731 (1993); Liwo et al., J. Comp. Chem. 18:849-873 (1997); Liwo et al., J. Comp. Chem. 18:874-884 (1997); Liwo et al., J. Comp. Chem. 19:259-276 (1998); Forcefield for Protein Structure Prediction (Liwo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . 96:5482-5485 (1999)]; ECEPP/3 [Liwo et al., J Protein Chem. 13(4):375-80 (1994)]; AMBER 1.1 force field (Weiner et al., J. Am. Chem. Soc. 106:765_784); AMBER 3.0 force field [U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 82:755-759 (1985)]; CHARMM and CHARMM22 (Brooks et al., J. Comp. Chem. 4:187-217); cvff3.0 [Dauber-Osguthorpe et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 4:31-47 (1988)]; cff91 (Maple et al., J. Comp. Chem. 15:162-182)を含み; またDISCOVER (cvff and cff91)および AMBER force-fieldsをINSIGHT molecular modeling package (Biosym/MSI, San Diego California)で使用し得、そして HARMMをQUANTA molecular modeling package (Biosym/MSI, San Diego California)で使用し得、すべて引用によりここに含める.実際、以下に概説のようにこれらのforce-field方法を使用し、変異体 TR ライブラリーを直接的に生成し得;これらの方法を使用して、追加的ライブラリーを直接的に生成する確率表を生成できる。
【００５９】
好ましい実施態様では、Protein Design Automation（登録商標） (PDA（登録商標）) を使用し、すべて引用によりここに含める米国特許番号 6,188,965および6,296,312に記載されるようなそれぞれのアミノ酸位置についての定義されたエネルギー状態を含む可変タンパク質配列を生成する。簡単には, PDA（登録商標）を以下のように記載できる。既知のタンパク質構造を出発点として使用する。最適化すべき残基を次いで同定し、これは完全配列またはそのサブセットであり得る。変化すべき任意の位置の側鎖を次いで除去する。得られた構造は、タンパク質バックボーンからなり、そして残りの側鎖はテンプレートと呼ばれる。それぞれの可変残基位置を次いで好ましくは、コア残基、表面残基、または境界残基として分類し；それぞれの分類は、位置についての可能なアミノ酸残基のサブセットを定義する（例えば、コア残基は一般に疎水性残基のセットから選択され、表面残基は一般に、親水性残基から選択され、および境界残基はいずれかから選択される）。それぞれのアミノ酸は、すべての可能な、ロタマーと呼ばれるそれぞれの側鎖コンホマーの明確なセットによって表すことができる。こうして、バックボーンについて最適配列で生存するために、ロタマーのすべての可能な配列を、スクリーンニングしなければならず、ここでそれぞれのバックボーン位置は、すべてのその可能なロタマー性状態のそれぞれのアミノ酸、またはアミノ酸のサブセット、こうしてロタマーのサブセットによって占有されることができる。
【００６０】
相互作用の2セットを次いで、すべての位置のそれぞれのロタマーについて計算する：バックボーンの全部または一部を有する、ロタマー側鎖の相互作用（「シングル」エネルギー、またロタマー／ロタマーエネルギーと呼ばれる）、およびすべての他の位置または他の位置のサブセットの、すべての他の可能なロタマーを有するロタマー側鎖の相互作用（「ダブル」エネルギー、またロタマー／ロタマーエネルギーと呼ばれる）。これらの相互作用のそれぞれのエネルギーを、種々のスコアリング関数の使用によって計算し、これはファンデルワールス力、水素結合のエネルギー、二次構造性向のエネルギー、表面面積溶媒和化および静電気を含む。こうして、それぞれのロタマー相互作用の総エネルギー、バックボーンおよび他のロタマーの両方を計算し、そしてマトリクス形態に貯蔵する。
【００６１】
ロタマーセットの明確な性質は、試験すべきロタマー配列の数の単純な計算を可能とする。位置あたりm個の可能なロタマーを有する長さｎのバックボーンは、ｍｎ可能ロタマー配列を有し、配列長で指数関数的に成長しかつリアルタイムで扱いにくいまたは不可能な計算にさせる。よって、この組み合わせサーチ問題を解決するために、「Dead End Elimination」(DEE)計算を実施する。ＤＥＥ計算は、もし第1のロタマーの最悪の総相互作用がなお第２ロタマーの最良の総相互作用よりもよりよいならば、そのとき第２ロタマーは、グローバル最適ソリューションの一部であることはできないという事実に基づく。すべてのロタマーのエネルギーがすでに計算されたので、ＤＥＥアプローチは、ロタマーを試験および排除するための配列長に渡る和を要するのみであり、これは計算をかなりスピードアップする。ＤＥＥはロタマーの対の比較、またはロタマーの組み合わせに戻ることができ、これは最終的に、グローバル最適エネルギーを表す単一配列の決定という結果となる。
【００６２】
グロバールソリューションが見出されると、Monte Carloサーチをなし得、ＤＥＥソリューションの近所の配列のランク整列リストを生成し得る。ＤＥＥソリューションで出発すると、ランダム位置は、他のロタマーに変化し、そして新しい配列エネルギーを計算する。もし新しい配列が、許容の基準に合致するならば、それを他のジャンプのための出発点として使用する。前決定数のジャンプ後、配列のランク整列リストを生成する。Monte Carloサーチングは、サンプリング技法であり、グローバル最小周辺の配列スペースを探索し、または配列スペース中の新しいローカル最小距離を見出す。より追加的に以下に概説するように、使用できる他のサンプリング技法があり、Bolzmanサンプリング、遺伝的アルゴリズム技法、およびシミュレート性アニーリングを含む。加えて、すべてのサンプリング技法に浮いて、可能であるジャンプの種類は、変化できる（例えば、ランダム残基へのランダムジャンプ、バイアスジャンプ（野生型にまたはそれから、例えば）バイアス残基ヘのジャンプ（類似残基にまたはそれから、例えば）等）。同様に、すべてのサンプリング技法について、サンプリングジャンプが許容されるかの許容される基準は、変化できる。
【００６３】
米国出願番号０９／１２７９２６に概説されるようにタンパク質バックボーン（（天然存在タンパク質のために）窒素、カルボニル炭素、α−炭素、およびα炭素からβ炭素へのベクターの方向と一緒にカルボニル酸素を含む）を、コンピューター的分析に先立ち、超二次構造パラメーターと呼ばれるパラメーターのセットを変化させることによって変化させ得る。
【００６４】
タンパク質バックボーンを生成すると（前概説のような変化）、およびコンピューター入力すると、明示的水素を、もし構造内に含まれないなら追加する（例えばもし構造がｘ腺結晶学によって生成されたならば、水素を追加すべきである）。水素追加後に、構造のエネルギー最小化を稼動し、水素並びに他の原子、結合エネルギーおよび結合長を弛緩する。好ましい実施態様では、これは、原子座標位置のコンジュゲート勾配最小化（Mayo et al., J, Phys. Chem.94:88997(1990)）のある数の工程によってなし、静電気のないDreiding力場を最小化する。約１０ないし約２５０工程が好ましく、約５０が最も好ましい。
【００６５】
少なくとも１可変残基位置でタンパク質バックボーン構造を含む。当業界で知られるように、タンパク質の残基またはアミノ酸は、一般に、タンパク質のN末端で開始し逐次的に数えられる。こうしてそのN末端のメチオニンを有するタンパク質は、アミノ酸または残基位置１のメチオニンを有するといわれ次の残基は２、３、４等という。それぞれの位置で、野生型（すなわち天然存在）タンパク質は、任意の数のロタマーの少なくとも２０アミノ酸の１つを有し得る。「可変残基位置」によって、ここで、設計されるべきタンパク質のアミノ酸位置を意味し、これは特異的残基またはロタマー、一般に野生型残基またはロタマーとして設計方法において固定化されない。
【００６６】
好ましい実施態様では、タンパク質の残基位置のすべては可変である。すなわち、すべてのアミノ酸側鎖を、本発明の方法において変化し得る。これは特に、より小さいタンパク質について望ましく、しかし本方法は、より大きいタンパク質の設計をまた可能とする。このやり方で設計し得るタンパク質の長さに理論的な制限はないが、実際的なコンピュター的制限がある。
【００６７】
代替的好ましい実施態様では、タンパク質の残基位置のいくつかのみが可変であり、そして残りは「固定化」であり、すなわち、これらはあるセットのコンホメーションであるとして３次元構造で同定される。いくつかの実施態様では、固定化位置は、そのもとのコンフォメーションで残る（これは使用されるロタマーライブラリーの特異的ロタマーと相関し得ない）。代替的に、残基を非野生型残基として固定化し得；例えば、既知部位特異的突然変異誘発技法が、特定残基が望ましいことを示したときに（例えば、タンパク質溶解位置または酵素の基質特異性を変化させる）、残基を特定アミノ酸として固定化し得る。代替的に、本発明の方法を使用し、デノボ突然変異を評価し得る。以下に議論の通りである。代替的好ましい実施態様では、固定化位置は「フロート性」であり得、その位置のアミノ酸を固定化するが、そのアミノ酸の異なるロタマーを試験する。この実施態様では、可変残機は、少なくとも１つであり得、任意のばあいに、残基の総数の０．１％ないし９９．９％である。こうして、例えば、わずか２、３（または１）残基、またはほとんどの残基、その間のすべての可能性がありつつ変化させることが可能であり得る。
【００６８】
好ましい実施態様では、固定化できる残基は、限定しないが、構造的または生物学的機能性残基を含み；代替的に、生物学的機能性残基は、特異的に固定化し得ない。例えば、生物学的活性について重要である、例えば、酵素の活性部位、酵素の基質結合部位、結合パートナーについての結合部位（リガンド／レセプター、抗原／抗体等）、ホスホリル化またはグリコシル化部位であって生物学的機能に重要であるもの、または構造的重要残基、例えばジスルフィド架橋、金属結合部位、重要水素結合残基、バックボーンコンホメーションについて重要な残基、例えばプロリンまたはギリシン、パッキング相互作用に重要な残基、等を形成することが既知である残基は、すべてコンホメーション中に、または単一ロタマーまたは「フロート化」であり得る。
【００６９】
同様に、可変残基として選択され得る残基は、望ましくない生物学的属性、例えばタンパク質溶解性分解、ダイマー化または凝集部位、グリコシル化部位であって免疫応答につながり得るもの、望まれない結合活性、望まれないアロステリー、結合の保存を有するが望まれない酵素活性への感受性、等を付与するものであり得る。
【００７０】
好ましい実施態様では、それぞれの可変位置を、コア、表面または境界残基位置として分類するが、しかし以下に説明のようにある場合には、可変位置をグリシンにセットし得、バックボーン系統を最小化する。加えて、ここに概説のように、残基は分類を要さず、これらを変数として選択肢、そしてアミノ酸の任意のセットを使用し得る。コア、表面および境界位置の任意の組み合わせを利用できる：コア、表面および境界残基；コアおよび表面残基；コアおよび境界残基、および表面および境界残基、並びにコア残基単体、表面残基単体、または境界残基単体。
【００７１】
コア、表面または境界としての残基位置の分類は、いくつかのやり方でなし得、当業者によって認識される通りである。好ましい実施態様では、分類を、側鎖を含むもとのタンパク質バックボーン構造の視覚的スキャンによってなし、そしてタンパク質のモデリングの技術での当業者の主観的評価に基づく分類を割り当てる。代替的に、好ましい実施態様は、テンプレートCα原子のみを使用してコンピューター計算された溶媒接近可能表面に対して、Cα−Cβベクターの配向の評価を利用し、60/061,097、60/043,464、60/054,678、09/127,926およびPCT US98/07254に記載される通りである。代替的に、表面面積計算をなすことができる。
【００７２】
ひとたびそれぞれの可変位置を所望により、コア、表面または境界として分類すると、アミノ酸側鎖のセットおよびこうしてロタマーのセットを、それぞれの位置に割り当てる。すなわち、可能なアミノ酸側鎖のセットであって、任意の特定の位置でプログラムが考えることができるものを、選択する。逐次的に、ひとたび可能なアミノ酸そくさが選択されると、特定の位置で評価させるであろうロタマーのセットを決定できる。こうして、コア残基は一般に、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびメチオニンからなる親水性残基の群から選択される（いくつかの実施態様では、以下に記載のようなファンデルワールススコアリング関数のoscaling factorが低いとき、メチオニンをセットから除去する）、そしてそれぞれのコア位置についてのロタマーセットは潜在的に、これらの８アミノ酸側鎖についてのロタマーを含む（もしバックボーン独立ライブラリーを使用するならば、すべてのロタマーそしてもしロタマー依存性バックボーンを使用するならばサブセット）。同様に、表面位置は一般に、アラニン、セリン、アスパラギン酸、アルパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる親水性残基の群より選択する。それぞれの表面位置についてのロタマーえっとは、こうして、これらの１０残基についてのロタマーを含む。最終的に、境界位置は一般に、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンから選択される。それぞれの境界位置についてのロタマーセットは、こうして潜在的に、これらの１７残基についてのすべてのロタマーを含む（システイン、ギリシン、およびプロリンは使用しないと仮定するが、これらは可能である）。追加的に、いくつかの好ましい実施態様では、１８の天然存在アミノ酸のセット（すべてシステインとプロリンを除き、これらは特に破壊的であると知られる）を使用する。
【００７３】
こうして、当業者に認識されるように、残基位置を分類するコンピューター的利益が存在し、というのは計算の数を減少させるからである。またコア、境界および表面残基が、前記のものから変化されるような状況があってもよいことが注意されるべきであり；例えば幾つかの状況下で、１または2以上のアミノ酸が、もたらされるアミノ酸のセットから付加または差し引きされる。例えば、ダイマー化、またはマルチマー化する、またはリガンド結合部位を有する、いくつかのタンパク質は、親水性表面残基等を含み得る。加えて、ヘリックス「キャッピング」をもたらさない残基、またはヘリックス双極子との優先的相互作用は、もたらされる残基のセットから差し引きされ得る。アミノ酸群のこの修飾は、残基による残基基本に基づいてなす。
【００７４】
好ましい実施態様では、プロリン、システインおよびグリシンは、可能なアミノ酸側鎖のリストに含まれず、そしてこうして、これらの側鎖についてのロタマーは、使用しない。しかし、好ましい実施態様では、可変残基位置が０より大きいφ角を有するとき（すなわち、2平面角が、（１）先行アミノ酸のカルボニル炭素、（２）現在の残基の窒素原子（３）現在の残基のα炭素および（４）現在の残基のカルボニル炭素によって定義される）、位置は、バックボーン緊張を最小化するグリシンにセットされる。
【００７５】
潜在的ロタマーの群がそれぞれの可変位置に割り当てられると、米国出願番号09/127926およびPCTUS98/07254に概説のように、加工は進行する。加工工程は、最適タンパク質配列を生成するために、ロタマーの、互いとおよびタンパク質バックボーンとの相互作用を分析することを必要とする。簡単には加工は理想的には、ロタマーの、バックボーンそれ自体または他のロタマーとの相互作用のエネルギーを計算するためにある数のスコアー化関数の使用を含む。好ましいPDAスコーカ関数は限定しないが、ファンデルワールスポテンシャルスコアー化関数、水素結合ポテンシャルスコアー化関数、原子溶媒和化スコアー化関数、二次構造特性スコアー化関数および静電的スコアー化関数を含む。さらに以下に記載するように、少なくとも１のスコアー化関数を使用し、それぞれの位置をスコアー化するが、スコアー化関数は、位置分類または他の考察、例えばα双極子との優先される相互作用に基づいて異なり得る。以下に概説するように、計算で使用される総エネルギーは、特定の位置で使用されるそれぞれのスコアー化関数のエネルギーの合計であり、等式１で一般的に示すとおりである：
等式１
Etotal = nEvdw + nEas + nEh-bonding + nEss  + nEelec
【００７６】
等式１において、総エネルギーは、ファンデルワールスポテンシャルのエネルギー(Evdw)、原子溶媒和化のエネルギー (Eas)、水素結合のエネルギー(Eh-bonding)、二次構造のエネルギー(Ess)および静電相互作用のエネルギー (Eelec)の合計である。用語nは0または1であり、該用語が特定の残基位置について考察されるべきであるかに依存するものである。
【００７７】
米国出願番号 60/061,097, 60/043,464, 60/054,678, 09/127,926およびPCT US98/07254に概説されるように、単体または組合わせの、これらのスコアー化関数の任意の組み合わせを使用し得る。ひとたび使用すべきスコアー化をそれぞれの可変位置について同定すると、コンピューター的分析における好ましい第1工程は、タンパク質の残りの全部または一部とのかそれぞれの可能なロタマーの相互作用の決定を含む。すなわち、バックボーンまたは他のロタマーとのそれぞれの可変残基位置のそれぞれの可能なロタマーの、１または2以上のスコアー化関数によって測定されるような相互作用のエネルギーを、計算する。好ましい実施態様では、タンパク質の全体の残りとの、それぞれのロタマーの相互作用、すなわち全体のテンプレートおよびすべての他のロタマーの両方がなされる。しかし、前概説のとおり、タンパク質の一部、例えばより大きいタンパク質の１ドメインをモデル化することのみ可能であり、こうして幾つかの場合には、タンパク質のすべては考察する必要はない。ここで使用する用語「一部」は、タンパク質についてそのタンパク質のフラグメントをいう。このフラグメントは、１０アミノ酸残基のサイズから、完全アミノ酸配列マイナス１アミノ酸までの範囲であり得る。よって、ここで使用する用語「一部」は、核酸について、その核酸の１フラグメントを意味する。このフラグメントは、１０ヌクレオチドのサイズから、完全核酸配列マイナス１ヌクレオチドまでの範囲であり得る。
【００７８】
好ましい実施態様では、コンピューター的加工の第一工程は、すべての位置のそれぞれのロタマーについての相互作用の2セットを計算することをによってなす：その位置が変異またはフロートであっても、ロタマー側鎖の、テンプレートまたはバックボーンとの相互作用（「シングル」エネルギー）およびすべての他の位置のすべての他の可能なロタマーとのロタマー側鎖の相互作用（「ダブル」エネルギー）。この場合のバックボーンはタンパク質構造バックボーンの原子並びに任意の固定化された残基の原子の両方を含み、ここで該固定化残基は、アミノ酸の特定のコンホメーションとして定義される。
【００７９】
こうして、「シングル」（ロタマー／テンプレート）エネルギーは、いくつかまたはすべてのスコアー化関数を使用して、バックボーンとの、すべての可変位置の残基位置のすべての可能なロタマーの相互作用について計算する。こうして、水素結合スコアー化関数のために、ロタマーのすべての水素結合原子およびバックボーンのすべての水素結合原子を評価し、そしてEHBをすべての可変位置のそれぞれの可能なロタマーについて計算する。同様に、ファンデルワールススコア化関数について、ロタマーのすべての原子を、テンプレートのすべての原子と比較し（一般に、それ自身の残基のバックボーン原子を除外する）、そしてEvdWを、すべての可変残基位置のそれぞれの可能なロタマーについて計算する。加えて、もし原子が３結合またはより少なく接続されるならば、ファンデルワールスエネルギーは計算されない。原子溶媒和化スコアー化関数のために、ロタマーの表面を、テンプレートの表面に対して測定し、そしてすべての可変残基位置のそれぞれの可能なロタマーについてのEasを計算する。二次構造性向スコア化関数をまた、シングルエネルギーとして考察し、こうして、総シングルエネルギーは、Ess期間を含み得る。当業者によって認識されるように、これらのエネルギー期間の多くは、ロタマーとテンプレート位置の間の物理的距離に依存してゼロに近くなり；すなわち、2部分がさらに離れるにつれ、エネルギーはより低い。
【００８０】
「ダブル」エネルギー（ロタマー／ロタマー）の計算のために、それぞれの可能なロタマーの相互作用エネルギーを、すべての他の可変残基位置のすべての可能なロタマーと比較する。こうして、「ダブル」エネルギーを、幾つかまたはすべてのスコアー化関数を使用して、すべての他の可変残基位置すべての可能なロタマーとの、すべての可変残基位置のすべての可能なロタマーの相互作用のために計算する。こうして、水素結合スコアー化関数のために、第1ロタマーのすべての水素結合原子およびすべての可能な第2ロタマーのすべての水素結合原子はを評価し、そしてEHBを、任意の2可変位置についてのそれぞれの可能なロタマー対について計算する。同様に、ファンデルワールススコア化関数のために、第1ロタマーのすべての原子を、すべての可能な第2ロタマーのすべての原子と比較し、そしてEvdWを、すべての2可変残基位置のそれぞれの可能なロタマー対について計算する。原子溶媒和化スコア化関数のために、第1ロタマーの表面は、すべての可能な第2ロタマーの表面に対して測定し、そしてすべての2可変残基位置のそれぞれの可能なロタマー対についてのEasを計算する。二次構造スコアー化関数は、「ダブル」エネルギーとして稼動する必要はなく、「シングル」エネルギーの構成要素として考察されるとおりである。当業界で認識されるように、これらのダブルエネルギ期間の多くは、第1ロタマーと第2ロタマーの間の物理的距離に依存して、近いないしゼロであり；すなわち2部分がよりさらに離れるにつれ、エネルギーはより低い。
【００８１】
好ましい実施態様では、配列予測アルゴリズム（ＳＰＡ）を使用し、両方引用によりここに含める、Raha, K., et al. (2000) タンパク質 Sci., 9:1106-1119, ２００１年6月8日出願の米国出願09/877,695名称 「Apparatus and Method for Designing Proteins and Protein Libraries」に記載されたようにそれぞれのアミノ酸位置について定義されたエネルギー状態を含む可変タンパク質配列を生成する。
【００８２】
好ましい実施態様では、力場計算例えばＳＣＭＦを使用し、それぞれのアミノ酸位置について定義されるエネルギー状態を含む可変タンパク質配列を生成できる。ＳＣＭＦのために、すべて引用によりここに含める、Delarue et al.,. Pac. Symp. Biocomput. 109-21 (1997), Koehl et al., J. Mol. Biol. 239:249 (1994); Koehl et al., Nat. Struc. Biol. 2:163 (1995); Koehl et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6:222 (1996); Koehl et al., J. Mol. Bio. 293:1183 (1999); Koehl et al., J. Mol. Biol. 293:1161 (1999); Lee J. Mol. Biol. 236:918 (1994);およびVasquez Biopolymers 36:53-70 (1995)参照。コンピューター的方法内で配列のコンホメーションを最適化するために、またはここに概説のようなデノボ最適化配列を生成するため使用できる他の力場計算は、限定しないがすべて引用によりここに含める、OPLS_AA (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, pp 11225_11236; Jorgensen, W.L.; BOSS, Version 4.1; Yale University: New Haven, CT (1999)); OPLS (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1988), v 110, pp 1657ff; Jorgensen, et al., J Am. Chem. Soc. (1990), v 112, pp 4768ff); UNRES (United 残基 Forcefield; Liwo, et al., Protein Science (1993), v 2, pp1697_1714; Liwo, et al., Protein Science (1993), v 2, pp1715_1731; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp849_873; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp874_884; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1998), v 19, pp259_276; Forcefield for Protein Structure Prediction (Liwo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, pp5482_5485); ECEPP/3 (Liwo et al., J Protein Chem 1994 May 13(4):375_80); AMBER 1.1 force field (Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. v106, pp765_784); AMBER 3.0 force field (U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:755_759); CHARMM and CHARMM22 (Brooks, et al., J. Comp. Chem. v4, pp 187_217); cvff3.0 (Dauber_Osguthorpe, et al., (1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v4, pp31_47); cff91 (Maple, et al., J. Comp. Chem. v15, 162_182)を含み;またDISCOVER (cvff and cff91)およびAMBER forcefieldsをINSIGHT molecular modeling package (Biosym/MSI, San Diego California)で使用しそしてHARMMをQUANTA molecular modeling package (Biosym/MSI, San Diego California)で使用する。実際、以下に概説のように、力場方法を使用し、二次的ライブラリーを直接的に生成し；すなわち一次的ライブラリーを生成せず；むしろ、これらの方法を使用し、二次的ライブラリーを直接的に生成する確率表を、例えばＳＣＭＦ計算中にこれあの力場を使用することによって生成できる。
【００８３】
ひとたびシングルおよびダブルエネルギーを計算し、蓄積すると、コンピューター的加工の次の工程が起こり得る。米国出願09/127926およびPCTUS98/07254に概説されるように、好ましい実施態様は、Dead End Elimination (DEE)工程、および好ましくはMonte Carlo工程を利用する。
【００８４】
広く調べられる、PDA（登録商標）は、出力 (例えば一次的ライブラリー)を変異させ変化させ得る３つの構成要素を有する:過程で使用されるスコアー化関数；フィルター化技法、およびサンプリング技法。
【００８５】
好ましい実施態様では、スコアー化関数を、変化させ得る。好ましい実施態様では、前概説スコアー化関数を種々の方法でバイアスまたは秤量し得る。例えば参照配列または配列のファミリーに向かってまたはそれからのバイアスをなし得る；例えば、野生型またはホモログ残基に向かうバイアスを使用し得る。同様に、その完全タンパク質またはフラグメントをバイアスし得る；例えば化性部位を野生型残基に向かって偏らせ、または特定の望まれる物理的特性に向かうドメイン残基をなすことができる。さらに、増加エネルギーに向かうまたはそれに対するバイアスを生成できる。追加的スコアー化関数は、限定しないが静電的ポテンシャル勾配または疎水性勾配を適用すること、基質を付加すること、または計算へのパートナーを結合すること、または望まれる変化または疎水性へむかってバイアスさせることを含む。
【００８６】
加えて、代替的実施態様では、使用し得る種々の追加的スコアー化関数がある。追加的スコアー化関数は、限定しないが、ねじれポテンシャルまたは残基対ポテンシャル、または残基エントロピーポテンシャルを含む。そのような追加的スコアー化関数を単独でまたはそれを当所にスコアー化した後にライブラリーを加工するための関数として使用し得る。例えば、MHC（Major Histocompatibility Complex）へのペプチドの結合についてのデータから由来する種々の関数を使用し、MHCに潜在的に結合できる配列、すなわち潜在的に免疫発生性配列を含むタンパク質をするために再スコアー化できる。
【００８７】
好ましい実施態様では、種々のフィルター化技法をなし得、限定しないがDEEおよびその関連カウンターパートを含む。追加的フィルター化技法は、限定しないが、最適配列を見出すためのbranch-and-bound技法 (Gordon and Majo, Structure Fold. Des. 7:1089-98, 1999)および配列のexhaustive enumerationを含む。しかし、いくつかの技法を任意のフィルター化技法なくしてなし得；例えばサンプリング技法を使用し、フィルター化なくして良好な配列を見出すことができる。
【００８８】
当業者に認識されるように、ひとたび配列または配列のセットを生成すると、Monte Crlo方法に加えて、またはMonte Crloサーチの代わりに種々の配列スペースサンプリング方法をなし得る。すなわち、ひとたび配列または配列のセットを生成すると、好ましい方法は、試験のために追加的、関連配列の生成を可能とするサンプリング技法を利用する。
【００８９】
これらのサンプリング方法は、アミノ酸置換、挿入または欠失、または１または2以上の配列の組換えの使用を含むことができる。ここに概説のように、好ましい実施態様は、Monte Carloサーチを利用し、これは一連のバイアス、システマティックまたはランダムジャンプである。しかし、使用できる他のサンプリング技法があり、Boltzmanサンプリング、遺伝的アルゴリズム技法およびシミュレートされたアニーリングを含む。加えて、すべてのサンプリング技法のために、もたらされるジャンプの種類を変化させることができる（例えば、ランダムジャンプをランダムジャンプ、バイアスジャンプに（例えば野生型にまたはそれから）、バイアス残基へジャンプ（例えば類似残基にまたはそれから、など））。多重残基位置がカップリングされた場合のジャンプ（２つの残基がいつも一緒に変化し、または組換えのない））、前記の全体のセットが他の配列に変化する場合のジャンプ（例えば組換え）。同様に、すべてのサンプリング技法のために、サンプリングジャンプが許容されるかいなかの許容基準を変化させ、高温で広い配列および低温でローカル最適値へ近い狭い配列を可能とすることができる。引用によりここに含めるMetropolis et al., J. Chem Phys v21, pp 1087, 1953参照。
【００９０】
加えて、本発明の好ましい方法は、配列のランク整列リストをもたらすということが注意すべきである；すなわち、配列をいくつかの目的基準に基づいてランク化する。しかし、ここに概説のように、非整列配列のセットを、例えばそれらをランク化することなく配列を列挙する、直接的に確率表を生成することによって（例えばSCMF分析または配列アラインメント技法を使用して）創出することが可能である。ここの概説のサンプリング技法を、いずれかの状況で使用できる。
【００９１】
好ましい実施態様では、Boltzmanサンプリングをなし得る。当業者に認識されるように、Boltzmanサンプリングのための温度基準を変化させ、高温で広いサーチおよび低温でローカル最適値に近い狭いサーチをもたらすことができる（例えばMetropolis et al., J. Chem. Phys. 21:1087,1953参照）。
【００９２】
好ましい実施態様では、サンプリング技法は、遺伝的アルゴリズム、例えばHolland(Adaptation in Natural and Artificial Systems, 1975, Ann Arbor, U. Michigan Press)によって記載されるようなものを利用する。遺伝的アルゴリズム分析は一般に、生成した配列を取り、そして「遺伝子シャッフリング」と類似の態様で、核酸組換え事象と同様に、それらをコンピューター的に組み合わせる。加えて、以下に概説のように、相関多重ジャンプをまたなし得る。そのようなジャンプは、種々の乗り換え位置および１より多い組換え時間で発生でき、そして２または3以上の配列の組換えに関係できる。さらに、欠失または挿入（ランダムまたはバイアス）をなし得る。加えて、以下に概説のように、遺伝的アルゴリズム分析をまた、二次的ライブラリーが生成した後に使用し得る。
【００９３】
好ましい実施態様では、サンプリング技法は、シミュレート化アニーリング、例えばKirkpatrick et al.[Science, 220:671-680(1983)]によって記載のように利用する。シミュレートされたアニーリングは、温度を変化することによって、よいまたは悪いジャンプを許容するためのカットオフを変化させる。すなわち、カットオフのストリンジェンシーは、温度を変化させることによって変化させる。これは、配列スペースの新しい領域への、高温で広いサーチを可能とし、低温での狭いサーチに変化して領域を詳細に探索する。
【００９４】
加えて、すべて引用によりここに含める米国出願09/9277920、60/352103および60/351937に記載の用に使用し得るコンピューター的方法がある。
任意のタンパク質設計サイクルを、個々に、他の方法と組み合わせて、または組み合わせ方法に関連して使用することができる。
【００９５】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、標的タンパク質で出発することに関係し、そして実験的方法を使用し、変異体タンパク質を生成する。すなわち、当業者に既知のような核酸組み合わせ技法を使用し、本発明の変異体タンパク質を実験的に生成する。
【００９６】
こうして、核酸組換え方法の使用またはタンパク質設計サイクルの履行、または核酸組換え方法およびコンピューター的加工の食い合わせは、変化したコファクター特異性を呈する変異体タンパク質の生成という結果となる。「変異体タンパク質」または「可変タンパク質配列」によってここに、少なくとも１アミノ酸残基で、スキャフォルドタンパク質または標的タンパク質と異なるタンパク質を意味する。
【００９７】
好ましい実施態様では、変異体タンパク質のコファクター特異性は変化し、標的タンパク質を比較する。標的タンパク質は限定しないが、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、および2,5-ジケト-D-グルクロン酸レダクターゼを含む。2つの特異的アミノ酸残基は以前、コファクター特異性について報告された（Caugo and Argos, タンパク質s(1997)28,10-28）。グリシンリッチループにすぐに続く第1領域はG-x-G-x-X1-X2モチーフを有し、そしてピリジンヌクレオチド結合に関係する。本来は、NADPHに特異的なンタンパク質では, X1 およびX2 はそれぞれ極性残基(Ser/Thr)およびAlaであり, 一方NADHに特異的なタンパク質では, X1 およびX2 はそれぞれ疎水性残基(Val/Ile) およびGlyである。追加的配列の決定は、しかし、X1およびX2についての顕著な配列可変性を実証し、コファクター特異性についてのこの本来のルールを破壊した。
【００９８】
第２領域は、E.coli チオレドキシンレダクターゼ中の約１７５ないしアミノ酸１８１の領域に一般に対応することが報告されている。NADH依存性細菌性フラボタンパク質レダクターゼCp34およびAhpF (Reynolds et al., Biochemistry (2002) 41, 1990-2001)において、第2モチーフは、それぞれH-Q-F-x-x-x-Q および E-F-A-x-x-x-Kと報告されている。突然変異研究では (Scrutton et al., Nature (1990) 343, 38-43; Mittl et al., タンパク質 Sci. (1994) 3, 1504-1514)、E.coli GRのNADPH特異性は、第2モチーフの、E-M-F-x-x-x-x-P への突然変異によってNADHに切り替えられた(以下の図参照)。
【００９９】
好ましい実施態様では、変異体チオレドキシンレダクターゼを、コファクター特異性が変化するように作成する。チオレドキシン（TR)は、ほとんどの生物に見出される強力なタンパク質ジスルフィドレダクターゼであり、多くのチオール依存性細胞性還元過程に参加する。細胞性タンパク質の還元をもたらすその能力に加えて、チオレドキシンレダクターゼは抗酸化物質として直接的に作用できる（例えば反応性酸素種を掃討することによって酸化可能基質の酸化を防止することによって）または自己酸化によって細胞中の酸化的ストレスを増加できる（例えば自己酸化を介するスーパーオキシドを生成することによって）ことが認識される。
【０１００】
チオレドキシンは、低分子量ジチオールタンパク質であって、典型的な有機化合物中のジスルフィド、例えばEllmanの試薬またはこれらが種々のタンパク質中に天然に存在するようなジスルフィドを還元する能力を有する (Holmgren, A. (1981) Trends in Biochemical Science, 6, 26-39)。通常の生理学的条件下で、ジスルフィド結合の還元に続いて、酸化されたチオレドキシンは、コファクターとしてNADPHの助けを借りて、チオレドキシンレダクターゼによって還元される。種のチオレドキシンは典型的に、同じ種のチオレドキシンレダクターゼによってのみ還元される。
【０１０１】
チオレドキシンレダクターゼの活性部位ポケットは、種間で高度に保存された領域を停止、図１Aのアミノ酸アラインメントに示すとおりである。この領域は、E. coliチオレドキシンレダクターゼの残基１５６と１８１、またはアラビドプシスチオレドキシンレダクターゼの残基２２０と２４５の間のアミノ酸領域に対応する。この高度に保存されたポケットは、コファクター、NADPHの結合のため最大に原因となる。チオレドキシンレダクターゼのアミノ酸配列における種間変異は、CおよびN末端領域すなわちE, coliチオレドキシンレダクターゼの残基1-155と182-C末端およびアラビドプシスチオレドキシンレダクターゼの残基1-219および246-C末端にみえる。
【０１０２】
本発明の変異体チオレドキシンレダクターゼを生成するため使用される標的タンパク質は、限定しないがE. coli、Bacillus subtillis、Mycobacterium leprae、Sarccharomyces、Neurospora crassa、Arabidopsis、Homo sapiens、Methanosarcina acetivorans str. C2A、Ureaplasma parvum、Mycoplasma pulmonis、Rickettsia conorii、Spironucleus barkhanus、Listeria innocua、Fusobacterium nucleatum、Methanococcus jannaschii、Mycoplasma genitalium、Haemophilus influenzae、Vibrio cholera、Listeria monocytogenes、Helicobacter pylori、Methanopyrus kandleri AV19、Schizosaccharomyces pombe、Chlamydophila pneumoniae、Streptococcus pyogenes、Plasmodium falciparum、Mycobacterium tuberculosis、Mycoplasma genitalium、Borrelia burgdorferi、Ralstonia solanacearum、Sinorhizobium meliloti、Caulobacter crescentus CB15]、Encephalitozoon cuniculi、Staphylococcus aureus、Clostridium perfringens、Halobacterium sp. NRC-1、Sulfolobus solfataricus、Rickettsia prowazekii、Mesorhizobium loti、Mus musculus、Thermoplasma acidophilum、Sulfolobus tokodaii、Chlamydophila pneumoniae、Mycoplasma pulmonis、Campylobacter jejuni、Chlamydia trachomatis、Aeropyrum pernix、Neisseria meningitides、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Thermoplasma volcanium、Pyrococcus furiosus、Archaeoglobus fulgidus、Yersinia pestis、Bacillus halodurans、Ureaplasma urealyticum、Methanothermobacter thermautotrophicus、Pyrobaculum aerophilum、Chlamydia muridarum、Treponema pallidum、Streptomyces coelicolor、Brucella melitensis、Agrobacterium tumefaciens、Drosophila melanogaster、Streptococcus pneumoniae、Clostridium acetobutylicum、Xylella fastidiosa、Lactococcus lactis、Thermotoga maritime、Pseudomonas aeruginosa、Salmonella enterica、Nostoc sp、Deinococcus radiodurans、Penicillium chrysogenum、Salmonella typhimurium、Lactobacillus elbrueckii、Clostridium sticklandii、Clostridium litorale、Clostridium acetobutylicum、Thermoplasma volcanium、Rattus norvegicus、Coccidioides immitis、Bos Taurus、Mycobacterium smegmatis、Synechocystis sp、Plasmodium falciparum、Carboxydothermus hydrogenoformans、Sus scrofa Triticum aestivumを含む任意の生物から取得し得る。
【０１０３】
好ましい実施態様では、変異体チオレドキシンレダクターゼを生成するために使用する標的タンパク質は、E. coli、Bacillus subtillis、Mycobacterium leprae、Saccharomyces、Neurospora crassa、Arabidopsis、Homo sapiens、米国特許6380372,名称Barley gene for Thioredoxin and NADP-チオレドキシンレダクターゼ、2002年04月30日発行に見出されるオオムギTR; WO0198509にアミノ酸配列の配列番号27として、およびそこにそのヌクレオチド配列の配列番号25として見出されるイネTR、Archaeoglobusfulgidus (gil2649006) (trxB)由来のタンパク質配列は、WO0198509の配列番号7である熱安定性TR、およびWO0198509の配列番号6のMethanococcus jannaschii (gil 1592167) (trxB)由来TRのタンパク質配列から選択される。
【０１０４】
好ましい実施態様では、変異体TRの触媒効率は、コファクターNADPHについて改善される。好ましくは、変異体TRの触媒効率は、NADPHについての野生型と比較して、少なくとも約5%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADPHについての野生型と比較して少なくとも約15%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADPHについての野生型と比較して少なくとも約15%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADPHについての野生型と比較して少なくとも約25%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADPHについての野生型と比較して少なくとも約50%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADPHについての野生型と比較して少なくとも約100%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADPHについての野生型と比較して少なくとも約300%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADPHについての野生型と比較して少なくとも約500%改善される。
【０１０５】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質の触媒効率は、コファクターNADHについて改善される。好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約5%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約15%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約25%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約50%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約100%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約300%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約500%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約1000%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約1300%改善される。より好ましくは変異体TRの触媒効率は、NADHについての野生型と比較して少なくとも約3000%改善される。
【０１０６】
好ましい実施態様では、変異体チオレドキシンレダクターゼのコファクター特異性を変化させ、その結果NADHを使用する活性増加がある。好ましくは、変異体チオレドキシンレダクターゼ(TR)は、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも50%を有する。より好ましくは、変異体チオレドキシンレダクターゼ(TR)は、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも75%を有する。より好ましくは、変異体チオレドキシンレダクターゼ(TR)は、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも85%を有する。より好ましくは、変異体チオレドキシンレダクターゼ(TR)は、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも95%を有する。より好ましくは、変異体チオレドキシンレダクターゼ(TR)は、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも100%を有する。
【０１０７】
好ましい実施態様では、変異体チオレドキシンレダクターゼのコファクター特異性は変化し、その結果NADPHからNADHへのコファクター切り替えがある。他の言葉では、これらの変異体は、NADH依存性活性の増加および実質的に同時的な、NADPH依存性活性の減少を有する。好ましくは、変異体チオレドキシンレダクターゼ（TR)は、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも50%を有する。より好ましくは変異体チオレドキシンレダクターゼは、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも75%を有する。より好ましくは変異体チオレドキシンレダクターゼは、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも85%を有する。より好ましくは変異体チオレドキシンレダクターゼは、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも95%を有する。より好ましくは変異体チオレドキシンレダクターゼは、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも100%を有する。より好ましくは変異体チオレドキシンレダクターゼは、NADHを使用するもとのNADPH依存性活性の少なくとも75%を有する。
【０１０８】
好ましくは変異体チオレドキシンレダクターゼ（TR)は、もとのNADPH依存性活性の約0.5%より小さい活性を有する。より好ましくは、TRは、もとのNADPH依存性活性の約5%より小さい活性を有する。より好ましくは、TRは、もとのNADPH依存性活性の約20%より小さい活性を有する。より好ましくは、TRは、もとのNADPH依存性活性の約25%より小さい活性を有する。より好ましくは、TRは、もとのNADPH依存性活性の約30%より小さい活性を有する。より好ましくは、TRは、もとのNADPH依存性活性の約50%より小さい活性を有する。より好ましくは、TRは、もとのNADPH依存性活性の約75%より小さい活性を有する。より好ましくは、TRは、もとのNADPH依存性活性の約95%より小さい活性を有する。
【０１０９】
さらなる実施態様では、変異体TRタンパク質の触媒効率は両方のコファクター、NADHおよびNADPH一緒について、改善される。好ましくはTR変異体の触媒効率は、２つのコファクターのいずれかについての野生型と比較して、少なくとも約5%改善される。より好ましくはTR変異体の触媒効率は、２つのコファクターのいずれかについての野生型と比較して、少なくとも約50%改善される。より好ましくはTR変異体の触媒効率は、２つのコファクターのいずれかについての野生型と比較して、少なくとも約100%改善される。より好ましくはTR変異体の触媒効率は、２つのコファクターのいずれかについての野生型と比較して、少なくとも約300%改善される。より好ましくはTR変異体の触媒効率は、２つのコファクターのいずれかについての野生型と比較して、少なくとも約1000%改善される。より好ましくはTR変異体の触媒効率は、２つのコファクターのいずれかについての野生型と比較して、少なくとも約2000%改善される。
【０１１０】
好ましい実施態様では、変異体チオレドキシンレダクターゼ(TR)のNADPH結合親和性は影響、減少または増強されなくてもよい。例えば、いくつかの実施態様では変異体TRはNADHについてよりもNADPHについて100倍より親和性であり得、一方他の実施態様では、変異体TRは、NADHについてよりもNADPHについて50倍より親和性を示す。または変異体TRはNADHについてよりもNADPHについて25倍より大きい親和性を示し得る。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質の、そのコグネートチオレドキシンを還元する能力は、実質的に影響を受けない。
【０１１１】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質の基質特異性は、影響を受け、その結果TRタンパク質は、他の種からのチオレドキシンタンパク質に作用し得る。
幾つかの実施態様では、タンパク質付加サイクルによって付加された潜在的グリコシル化部位を、第2タンパク質設計サイクルを使用することによって活性に影響することなく除去し得る。
【０１１２】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、野生型ＴＲタンパク質と比較して、コファクター特異性に関与するアミノ酸における1ないし3アミノ酸置換を有する。他の実施態様では、変異体TRタンパク質は、他の部分に追加的アミノ酸置換を有する。こうして、変異体TRタンパク質は他の位置に、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40つの異なる残基を有し得る。当業者に認識されるように、アミノ酸置換を有し得る追加的位置の数は、変異体を生成するために使用される野生型TRタンパク質に依存する。こうして、幾つかの例では、50までの異なる位置は、アミノ酸置換を有し得る。
【０１１３】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アラビドプシスNTRタンパク質(Genbank受託番号Q39242)の位置190、191、および195、およびE.coliTRタンパク質(Genbank 受託番号P09625)の175、Bacillus subtillis TR タンパク質 (Genbank 受託番号P80880)の位置 155、156、および174、Mycobacterium leprae TR タンパク質 (Genbank 受託番号P46843)の位置163、164、および182、Sacchromyces TR タンパク質 (Genbank 受託番号P29509およびP38816)の残基164、165、および183、Neurospora crassa TR タンパク質 (Genbank 受託番号P51978)の位置163、164、および182、アラビドプシスTR タンパク質 (Genbank 受託番号Q39243)の残基170、171、189およびヒトTRタンパク質(Genbank 受託番号Q16881)の残基217、218および249に対応する位置A4、A5およびA6から選択されるアミノ酸置換を含む。
【０１１４】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、RA4W、RA5L、RA5M、RA5I、RA5F、RA5V、RA5Y、RA5A、RA5S、RA5C、RA5T、RA6T、RA6S、RA6Q、RA6G、およびRA6N、RA6D、RA6M、およびRA6Eからなる置換の群より選択されるアミノ酸置換を含む。
【０１１５】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4WおよびRA6Tを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5L、およびRA6Sを含む。
【０１１６】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA5YおよびRA6Nを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5F、およびRA6Qを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5L、およびRA6Tを含む。
【０１１７】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4WおよびRA6Sを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA5YおよびRA6Nを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA5FおよびRA6Nを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4WおよびRA6Tを含む。
【０１１８】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5LおよびRA6Sを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5M、およびRA6Sを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5I、およびRA6Sを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5F、およびRA6Qを含む。
【０１１９】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、およびRA5Vを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5M、およびRA6Gを含む。
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、アミノ酸置換RA4W、RA5V、およびRA6Gを含む。
【０１２０】
好ましい実施態様では、変異体タンパク質は、式Iのポリペプチド分子である。
(I)S1-A1-A2-S2-A3-A4-A5-S3-A6-S4
ここで、
a)S1は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7、またはそれに実質的類似性を有する配列からなる群より選択されるポリペプチドを含む;
b)S2は配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14、またはそれに実質的類似性を有する配列からなる群より選択されるポリペプチドを含む;
【０１２１】
c)S3は配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21、またはそれに実質的類似性を有する配列からなる群より選択されるポリペプチドを含む;
d)S4は配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、および配列番号28、またはそれに実質的類似性を有する配列からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む;
e)A1は、セリン、バリン、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
【０１２２】
f)A2はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
g)A3はヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ロイシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
h)A4はアルギニン、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
i)A5はアルギニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、セリン、トレオニン、およびリジンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
【０１２３】
j)A6はアルギニン、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、システイン、セリン、トレオニン、およびリジンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;
【０１２４】
ただし、少なくとも
A1は、セリンではない;
A2は、アラニンではない;
A3は、ヒスチジンではない;
A4は、アルギニンではない;
A5は、アルギニンではない;または
A6は、アルギニンではない。
【０１２５】
前記式Iでは、配列A1-A2-S2-A3-A4-A5-S3-A6は種々の種から取得されるチオレドキシンレダクターゼタンパク質の配列の高度に保存されたポケットに対応する。A1は、E.coliチオレドキシンレダクターゼ配列の残基156、Bacillus subtillis チオレドキシンレダクターゼ 配列の 残基155、Mycobacterium leprae チオレドキシンレダクターゼ 配列の残基163、Sarccharomycesチオレドキシンレダクターゼ配列の残基164、Neurospora crassaチオレドキシンレダクターゼ配列の残基163、アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ配列の残基170、およびヒトチオレドキシンレダクターゼ配列の残基217に対応する。野生型タンパク質では、この残基はE. coliおよびヒトではトレオニン、および他の前列挙生物ではセリンである。
【０１２６】
A2は、E. coliチオレドキシンレダクターゼ配列の残基157、Bacillus subtillisチオレドキシンレダクターゼ配列の残基156、Mycobacterium lepraeチオレドキシンレダクターゼ配列の残基164、Sarccharomycesチオレドキシンレダクターゼ配列の残基165、Neurospora crassaチオレドキシンレダクターゼ配列の残基164、アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ配列の残基171、ヒトチオレドキシンレダクターゼ配列の残基218に対応する。野生型タンパク質では、この残基は、ヒトではバリンおよび他の列挙種全てではアラニンである。
【０１２７】
A3は、E. coli チオレドキシンレダクターゼ配列の残基175、Bacillus subtillisチオレドキシンレダクターゼ配列の残基174、Mycobacterium lepraeチオレドキシンレダクターゼ配列の残基182、Sarccharomycesチオレドキシンレダクターゼ配列の残基183、Neurospora crassaチオレドキシンレダクターゼ配列の残基182、アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ配列の残基189、ヒトチオレドキシンレダクターゼ配列の残基249に対応する。野生型タンパク質では、この残基は、ヒトではアルギニン、SarccharomycesおよびNeurospora crassaではバリン、および他のすべての列挙生物ではヒスチジンである。
【０１２８】
A4は、E. coliチオレドキシンレダクターゼ配列の残基残基176、Bacillus subtillisチオレドキシンレダクターゼ配列の残基175、Mycobacterium lepraeチオレドキシンレダクターゼ配列の残基183、Sarccharomycesチオレドキシンレダクターゼ配列の残基184、Neurospora crassaチオレドキシンレダクターゼ配列の残基183、アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ配列の残基190、ヒトチオレドキシンレダクターゼ配列の残基250に対応する。野生型タンパク質では、この残基はヒトではグルタミンおよび他のすべての列挙生物ではアルギニンである。
【０１２９】
A5は、E. coli チオレドキシンレダクターゼ配列の残基177、Bacillus subtillisチオレドキシンレダクターゼ配列の残基176、Mycobacterium lepraeチオレドキシンレダクターゼ配列の残基184、Sarccharomycesチオレドキシンレダクターゼ配列の残基185、Neurospora crassaチオレドキシンレダクターゼ配列の残基184、アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ配列の残基191、ヒトチオレドキシンレダクターゼ配列の残基251に対応する。野生型タンパク質では、この残基はSarccharomycesおよびNeurospora crassaではリジン、ヒトではフェニルアラニン、および他のすべての列挙生物ではアルギニンである。
【０１３０】
A6は、E. coli チオレドキシンレダクターゼ配列の残基、Bacillus subtillisチオレドキシンレダクターゼ配列の残基180、Mycobacterium lepraeチオレドキシンレダクターゼ配列の残基188、Sarccharomycesチオレドキシンレダクターゼ配列の残基189、Neurospora crassaチオレドキシンレダクターゼ配列の残基188、アラビドプシスチオレドキシンレダクターゼ配列の残基195、ヒトチオレドキシンレダクターゼ配列の残基255に対応する。野生型タンパク質では、この残基は、ヒトではリジンおよび他のすべての列挙生物ではアルギニンである。
【０１３１】
前記種間で、S2およびS3に対応するアミノ酸配列の部分はまた、高度に保存されていることが観察された。S2は配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む。S3は配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む(図2)。
【０１３２】
したがって、本発明の実施態様は、式Iのポリペプチドに関し、ここでS1は配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7からなる群より選択される配列を有するポリペプチドからなる。
【０１３３】
ある種の実施態様では、S2は配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、および配列番号14からなる群より選択されるポリペプチド配列からなる。一方、S3は配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、および配列番号21からなる群より選択されるポリペプチド配列からなる。本発明の他の実施態様は、S4は、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、および配列番号28からなる群より選択される配列を有するポリペプチド配列からなる。
【０１３４】
１実施態様では、式Iのポリペプチドでは、S1は配列番号1に示すポリペプチド配列であり、S2は、配列番号8に示すポリペプチド配列であり、S3は、配列番号15に示すポリペプチド配列であり、およびS4は、配列番号22に示すポリペプチド配列である。これは、E.coliから取得される、チオレドキシンレダクターゼタンパク質、またはその突然変異体、に対応する。
【０１３５】
べつの実施態様では、式Iのポリペプチドでは、S1は、配列番号2に示すポリペプチド配列であり、S2は、配列番号9に示すポリペプチド配列であり、S3は、配列番号16に示すポリペプチド配列であり、およびS4は、配列番号23に示すポリペプチド配列である。これは、Bacillus subtillisから取得されるチオレドキシンレダクターゼタンパク質、またはその突然変異体に対応する。
【０１３６】
なおさらなる実施態様では、式Iのポリペプチドで、S1は、に示すポリペプチド配列であり 配列番号3、S2はthe は、に示すポリペプチド配列であり 配列番号10、S3はthe は、に示すポリペプチド配列であり 配列番号17、およびS4は、配列番号24に示すポリペプチド配列である。これは、Mycobacterium lepraeから取得されるチオレドキシンレダクターゼタンパク質、またはその突然変異体に対応する。
【０１３７】
本発明の別の実施態様では、式Iのポリペプチドに関し、ここでS1は、配列番号4に示すポリペプチド配列であり、S2は、配列番号11に示すポリペプチド配列であり、S3は、配列番号18に示すポリペプチド配列であり、およびS4は、配列番号25に示すポリペプチド配列であり。これは、Sarccharomycesから取得されるチオレドキシンレダクターゼタンパク質、またはその突然変異体に対応する。
【０１３８】
別の実施態様では、式Iのポリペプチドで、S1は、配列番号5に示すポリペプチド配列であり、S2は、配列番号12に示すポリペプチド配列であり、S3は、配列番号19に示すポリペプチド配列であり、およびS4は、配列番号26に示すポリペプチド配列である。これは、Neurospora crassaから取得されるチオレドキシンレダクターゼタンパク質、またはその突然変異体に対応する。
【０１３９】
１実施態様では、式Iのポリペプチドでは、S1は、配列番号6に示すポリペプチド配列であり、S2は、配列番号13に示すポリペプチド配列であり、S3は、配列番号20に示すポリペプチド配列であり、およびS4は、配列番号27に示すポリペプチド配列である。これは、アラビドプシスから取得されるチオレドキシンレダクターゼタンパク質、またはその突然変異体に対応する。
【０１４０】
本発明はまた、式Iのポリペプチドに関し、ここでS1は、配列番号7に示すポリペプチド配列であり、S2は、配列番号14に示すポリペプチド配列であり、S3は、配列番号21に示すポリペプチド配列であり、およびS4は、配列番号28に示すポリペプチド配列である。これは、、ヒトから取得されるチオレドキシンレダクターゼタンパク質、またはその突然変異体に対応する。
【０１４１】
本発明は天然存在チオレドキシンレダクターゼタンパク質のある種の突然変異体を包含する。これらの突然変異体は、以下のものを含みここでA1はバリン、アラニン、およびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;A2はグリシン、バリン、およびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;A3はアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;A4はアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸部分である;A5はアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸部分である;A6はグルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、およびアスパラギンからなる群より選択されるアミノ酸部分である。
【０１４２】
本発明は前記突然変異体のいずれかの１または2以上を有し得ることが理解される。
ある種の実施態様では、A1がバリンであり、一方他にはA2はグリシンであり、そして他にはA3はアスパラギン酸である;そして他にA4はアラニンであり、一方他にA5はアスパラギンであり、そして他にA6はグルタミン酸である。いくつかの好ましい実施態様では、これら特定のアミノ酸残基の２または3以上が特定の位置に存在する。
【０１４３】
好ましい実施態様では、本発明の変異体タンパク質は、第2タンパク質に融合し得る。例えば、式Iのポリペプチドおよび第2ポリペプチドを含む融合タンパク質を作成し得る。第2ポリペプチドは、野生型TRタンパク質、野生型チオレドキシン、またはタンパク質設計サイクルによって生成される変異体タンパク質であり得る。代替的に、タンパク質設計サイクルによって生成される変異体タンパク質および第2ポリペプチドを含む融合タンパク質を融合し得る。第2ポリペプチドは野生型TRタンパク質、野生型チオレドキシンまたは式Inoポリペプチドであり得る。そのような融合はリンカーを経由し得る。
【０１４４】
ここで「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」またはその文法的均等物によって、２分子を接続しおよび好ましい構成で２分子を配置するようにしばしば供する１分子または分子の群（例えばモノマーまたはポリマー）を意味する。この実施態様の1側面では、リンカーはペプチド結合である。2ポリペプチド鎖が種々のパラメーター、例えば2ポリペプチド鎖（例えばこれらが天然にダイマーを形成し、またはしない）、もし3次元構造決定からしられるならば接続すべきであるNおよびC末端の間の距離および/またはタンパク質溶解および酸化に向かう安定性に依存して接続すべき特異的場合について、好適なリンカーを選択すること。さらに、リンカーはフレキシビリチーを提供する網の酸残基を含み得る。こうして、リンカーペプチドは、以下のアミノ酸残基:Gly、Ser、Ala、またはThrを卓越して含み得る。
【０１４５】
リンカーペプチドは、2モノマーを、これらが互いについて正確なコンホメーションを確保するようなやり方で連結するに十分である長さを有すべきであり、その結果これらは所定のレセプターのアンタゴニストとしての望まれる活性を保持する。この目的のため好適な長さは、数なくとも１および３０アミノ酸残基を超えない。好ましくは、該リンカーは、約１ないし３０アミノ酸長であり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、1819および20アミノ酸長のリンカーが好ましい。また引用によりここに含めるWO01/25277参照。
【０１４６】
加えて、リンカーペプチドに含まれるためのアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性を顕著には妨害しない特性を呈すべきである。こうして、全体のリンカーペプチドは、ポリペプチドの活性と両立しない、またはフォールディングに干渉しない、またはレセプターモノマードメインの結合を重度に抵抗する1または2以上のモノマーのアミノ酸残基の結合または他の相互作用を形成する変化を呈すべきでない。
【０１４７】
有用なリンカーはグリシン-セリンポリマー (例えば(GS)n、(GSGGS)n (GGGGS)nおよび(GGGS)nを含みここでnは少なくとも1の整数である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および他のフレキシブルリンカーたとえばシェーカーカリウムチャンネルのための繋ぎ、および種々の他のフレキシブルリンカーを含み、当業者に認識される通りである。グリシン-セリンポリマーは、これらの両方のアミノ酸が比較的日構造であれう化ら、好ましくあり得、したがって、コンポーネント間の中世繋ぎとして供し得る。第2に、セリンは親水性であり、したがって、グロブラーグリシン鎖であり得るものを可溶化し得る。第3に、類似の鎖は、組換えタンパク質のサブユニット、例えば単一鎖抗体を結合するのに有効であると示された。
【０１４８】
好適なリンカーはまた、既知3次元構造のデータベースを、2ポリペプチド鎖間のギャップを架橋できる天然存在モチーフについてスクリーニングすることによって同定し得る。好適なリンカーを取得する他のやり方は、単純リンカー例えば(Gly4Ser)nをランダム突然変異誘発によって最適化することによる。
【０１４９】
好ましい実施態様では、リンカーは、約5と約50アミノ酸の間、または約10と40アミノ酸の間または約15と25アミノ酸の間を有するポリペプチド配列を含み得る。好ましい実施態様では、リンカーは約22アミノ酸である。
【０１５０】
好ましい実施態様では、本発明の変異体タンパク質は、第3のポリペプチドに融合され、そしてまた、そのような融合はリンカーを介し得る。融合ポリペプチドの間のリンカーは、式Iのポリペプチドを含み、そそてい第3ポリペプチドは、約5と約100kDaの間の分子量、または約20と約70kDaの間の分子量、またはなお約25と約45の間の分子量を有し得る。好ましい実施態様では、リンカーは、約30と約40kDaの間の分子量を有する。ある種の実施態様では、このリンカーは、負に荷電した、アミノ酸残基、例えばグルタメートおよびアスパルテートを含む。
【０１５１】
ある種の実施態様では、第3ポリペプチドはオレオシンである。
こうして、本発明の1実施態様は、式Iのポリペプチドに関し、これはそのC末端の第二ポリペプチドに、多分リンカーを介して、融合され、そしてまた、そのN末端で第3ポリペプチドに融合され、また多分さらなるリンカーを介する。本発明のさらなる実施態様は、式IIの１連の融合ポリペプチドに関する。
(II)オレオシン-リンカー1-チオレドキシンレダクターゼ-リンカー2-チオレドキシン
ここで、「リンカー１」は、前記のように、式Iのポリペプチドと、第3ポリペプチドの間のリンカーをいい、そして「リンカー２」は前記のように、式Iのポリペプチドと第2ポリペプチドの間のリンカーをいう。同様に、本発明の幾つかの実施態様は、そのN末端、C末端または両方で他のタンパク質に融合されているかいなか、式Iのポリペプチドを含む任意の他の融合タンパク質を含む。具体的には、本発明は、式IIまたは式Iのぽりぺぷとどへの2ポリペプチドの任意の他の融合を企図し、ここで該コンポーネントは、任意の順序で存在する。
【０１５２】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質の、NADPHおよびANDHについての結合親和性は、決定される。好適なアッセイは限定しないが、例えば、動力学および平行結合定数を比較する定量的比較を含む。動力学会合率 (Kon)および解離率 (Koff)、および平衡結合定数(Kd)は、文献の標準的手法[Pearce et al.、Biochemistry 38:81-89 (1999)]にしたがってBIAcore装置における表面プラスモン共鳴を使用して、決定できる。
【０１５３】
好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質の宿主動物の抗原性プロファイルは、宿主TRの抗原性プロファイルに類似そして好ましくは同一であり、すなわち、変異体TRタンパク質は有意に、免疫応答ヘの宿主生物（例えば患者）を刺激しない；すなわち、任意の免疫応答は、臨床的に関連せず、そして抗体によるタンパク質のアレルギー応答または中和がない。すなわち好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は、追加的かつTRと異なるエピトープを含まない。「エピトープ」または「決定」によって、ここに、抗体を生成および/または結合するタンパク質の部分を意味する。こうして、ほとんどの例では、抗体の顕著な量は、変異体TRタンパク質を生成しない。一般に、これは表面残基を顕著には変化しないことによって、または任意のアミノ酸残基をグリコシル化されることのできる表面上に追加することによって達成し、新規グリコシル化が免疫応答という結果となる。
【０１５４】
本発明の変異体TRタンパク質および核酸は、天然存在TRと区別可能である。「天然存在」または「野生型」または文法的均等物によってここに、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、そしてアリル変異を含む；すなわち、通常意図的には修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列。よって、「非天然存在」または「合成」または文法的均等物によってここに、天然に見出されないアミノ酸またはヌクレオチド配列を意味する；すなわち通常は意図的には修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列。ひとたび組換え体核酸が作成されそして宿主細胞または生物に再導入されると、それは非組換え的に、すなわちインビトロ操作でなくむしろ宿主細胞の細胞性機構を使用して複製し、しかしそのような核酸はひとたび組換え的に生産されると、逐次的に非組換え的に複製されるが、本発明の目的のためになお組換え体と考えられる。天然存在TRタンパク質の代表的アミノ酸配列は図21に示す。特記しないかぎり、変異体TRタンパク質および変異体TRタンパク質のすべての位置番号は、これらの配列に基づく、すなわち、当業者に認識されるように、TRタンパク質および変異体TRタンパク質のアラインメントは、標準的プログラムを使用して、なし得、以下に概説の通りであり、2タンパク質の間の「均等」位置の同定による。
【０１５５】
こうして、好ましい実施態様では、変異体TRタンパク質は少なくとも1-5%の残基によって、野生型TR配列（図２１）と異なるアミノ酸配列を有する。すなわち、本発明の変異体タンパク質は、野生型TRアミノ酸配列と約97-99%より小さい同一性を有する。よって、もしアミノ酸配列ヘのタンパク質配列の全体相同性が野生型TRタンパク質の、好ましくは約99%より小さい、より好ましくは約98%より小さい、なおより好ましくは約97%より小さい、そしてより好ましくは95%より小さいならば、タンパク質は「変異体TRタンパク質」である。いくつかの実施態様では、相同性は、約75-80%と同じくらい低い。別にいえば、変異体タンパク質は、野生型TR配列（すなわち図21)と異なる少なくとも約1残基を有し、少なくとも約２、３、４、５、５０までの異なる残基である。好ましくは変異体TRタンパク質は、1ないし3この異なる残基を有する。より好ましくは、変異体TRタンパク質は、3ないし5この異なる残基を有する。好ましくは、変異体TRタンパク質は、5ないし10こ異なる残基を有する。好ましくは変異体TRタンパク質は、10ないし15個異なる残基を有する。好ましくは変異体TRタンパク質は、15ないし25個異なる残基を有する。好ましくは変異体TRタンパク質は、25ないし35個異なる残基を有する。
【０１５６】
この文脈では、相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性が好ましい。当業界で知られるように、ある数の異なるプログラムを使用し、タンパク質（または以下議論のように、核酸）が既知配列と配列同一性または類似性を有するか同定できる。配列同一性および/または類似性を、当業界既知標準技法を使用して決定する。限定しないがSmith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)のローカル配列同一性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性方法についてのサーチにより,これらのアルゴリズムのコンピューター化手段により (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WIにおけるGAP, BESTFIT, FASTA,およびTFASTA)、Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984)によって記載されるBest Fit配列プログラム, 好ましくはデフォルトセッティングを使用し、または目視によるものを含む。好ましくはパーセント同一性は、以下のパラメーターに基づいてFastDBによって計算する：1のミスマッチペナルティ；１のギャップペナルティ；０．３３のギャップサイズペナルティ；および30の結合ペナルティ 「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,」 Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.
【０１５７】
有用なアルゴリズムの別の例は、PILEUPである。PILEUPは、進行性、対をなすアラインメントを使用して、関連配列の群から多重配列を創出する。それはまた、アラインメントを創出するために使用されるクラスター化関連性を示すツリーをプロットできる。PILEUPは、Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)の進行性アラインメント方法;の単純化を使用する；該方法はHiggins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989)によって記載されたものと類似する。有用なPILEUPパラメーターは、3.00のデフォルトギャップ重量、0.10のデフォルトギャップ長重量、および秤量された末端ギャップを含む。
【０１５８】
有用なアルゴリズムのさらなる例は、BLASTアルゴリズムであってAltschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997);およびKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787 (1993)に記載される.特に有用なBLASTプログラムは、WU-BLAST-2プログラムであってAltschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html] から取得される。WU-BLAST-2は、いくつかのサーチパラメーターを使用し、ほとんどのそれはデフォルト値にセットされる.調節可能パラメーターは以下の値でセットされる：オーバーアップスパン=1, オーバーラップフラクション = 0.125, ワードスレシュホルド (T) = 11.HSP SおよびHSP S2パラメーターは、力学的値であり、そして特定配列の組成および所望の配列がサーチされる特定のデータベースの組成にそれ自体依存するプログラムによって確立される；しかし、値は、感度を増加するために調節し得る。追加的な有用なアルゴリズムは、ギャップ化BLASTであってAltschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3389-3402によって報告された通りである。ギャップ化BLASTはBLOSUM-62 置換スコアー;9にセットされたスレシュホルドTパラメーター;非ギャップ化伸長をトリガーするための２-ヒット方法； kのギャップ長を負荷するあるコストの10+k;Xu は16にセットし,およびデータベースサーチ段階のためにXg は40にセットし、そしてアルゴリズムの出力段階のために67にセットする。ギャップ化アラインメントは、~22ビットに対応するスコアによってトリガーされる。
【０１５９】
A%アミノ酸配列同一性値は、アラインメントされた領域中の「より長い」配列の残基の総数によって割ったマッチする同一残基の数によって決定される。「より長い」配列は、アラインメントされた領域中のもっとも実際の残基を有するものである（アラインメントスコアを最大化するためにWU-Blast-2によって導入されたギャップは無視する）。
【０１６０】
類似の態様では、ここに同定したポリペプチドのコード配列についての「%核酸配列同一性」は、細胞周期タンパク質のコード配列中のヌクレオチド残企図同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。好ましい方法は、デフォルトパラメーターに対するWU-BLAST-2セットのBLASTNモジュールを利用し、オーバーラップスパンおよびオーバーラップフラクションセットはそれぞれ1および0.125である。
【０１６１】
このアラインメイトは、アラインメントしようとする配列におけるギャップの導入を含むことができる。さらに、野生型TR配列より多いまたは少ないアミノ酸を含む配列については（即ち、図2、図16Nを参照されたい）、或る態様において、アミノ酸総数に対する一致アミノ酸の数に基づき、配列一致のパーセンテージが決定されるという事が理解できる。したがって、例えば、下に論ずるように、野生型TRタンパク質配列より短い配列の配列一致（即ち、図2、図16Nを参照されたい）は、或る態様において、より短いその配列中のアミノ酸の数を用いて決定する。一致パーセントの算出において、相対重量は、挿入、欠失、置換などといった配列変異の諸表示には割り当てられない。
【０１６２】
或る態様では、一致のみが正の得点（+1）を得、ギャップを包含する全ての形式の配列変異は数値「0」が割り当てられるが、これは、配列類似性を算出するための、下記のような加重スケールまたはパラメータの必要性を取り除く。配列一致パーセントは例えば、完全に同一の残基の数を、アラインメントさせている領域内の「より短い」配列の総残基数で除し、100を掛けることによって算出できる。「より長い」配列は、アラインメントさせている領域中の実際の残基を殆ど持っている配列である。
【０１６３】
したがって、本発明に係る変異体TRタンパク質は、野生型TRタンパク質（即ち、図21）のアミノ酸配列より長くても短くてもよい。よって、好ましい態様では、本明細書に記載する配列の一部またはフラグメントが変異体TRタンパク質の定義に包含される。変異体TRタンパク質のフラグメントは、もしa) それらが少なくとも1個の抗原エピトープを共有し；b) 少なくとも指摘された相同性を持ち；c) そして好ましくは本明細書に定義した変異体TRの生物活性を持つならば、変異体TRタンパク質であると考えられる。
【０１６４】
好ましい態様では、後により詳細に記載するように、変異体TRタンパク質は、本明細書に概説したものに加えて、野生型TRと比較してさらなるアミノ酸変異を包含する。加えて、本明細書に概説するように、本明細書に記載の任意の変異は、任意の方法で合してさらなる新規な変異体TRタンパク質を形成することができる。
【０１６５】
さらに、図面に示すものより長い変異体TRタンパク質を、例えば本明細書に概説するようなエピトープまたは精製タグの付加、その他の融合配列の付加などにより製造できる。例えば、本発明に係る変異体TRタンパク質は、薬物動態学的目的のため、他の治療用タンパク質またはFcもしくは血清アルブミンといった他のタンパク質と融合させることができる。例えば米国特許第5766883および5876969号を参照されたく、これらは共に引用によりここに含める。
【０１６６】
好ましい態様では、本発明に係る変異体TRタンパク質はヒトTRコンホマーである。本明細書中「コンホマー」とは、タンパク質バックボーンの3D構造は事実上同じであるがアミノ酸側鎖に著明な相違を持つタンパク質を意味する。即ち、本発明に係る変異体TRタンパク質とは、その集合のタンパク質の全てが１つのバックボーン構造を共有しており、それでいて少なくとも1-3-5%相違する配列を持っている、コンホマー集合を定義するものである。したがって変異体TRタンパク質の三次元的バックボーン構造は実質的にヒトTRの三次元的バックボーン構造に対応する。この文脈中の「バックボーン」とは、非側鎖原子：窒素、カルボニル炭素および酸素、ならびにα炭素、ならびに窒素およびα炭素に結合した水素を意味する。コンホマーであるとみなすためには、タンパク質は、ヒトTR構造から2オングストロームより大きく離れていない、好ましくは1.5オングストロームより大きく離れていない、そして特に好ましくは1オングストロームより大きく離れていないバックボーン原子を持っていなければならない。一般に、これらの距離は二つの方法で測定できる。一つの態様では、可能性ある各々のコンホマーを結晶化し、その三次元構造を決定する。前述の方法はかなり冗長であるため、別法として、可能性ある各コンホマーの配列をPDAプログラムでランし、これがコンホマーであるかどうかを決定する。
【０１６７】
これに代わる態様では、本発明に係る変異体TRタンパク質は、図21に列挙するTRタンパク質のいずれかのコンホマーであってよい。
【０１６８】
変異体TRタンパク質はまた、変異体TR核酸によりコードされているものとして同定できる。核酸の場合、核酸配列の全体的相同性はアミノ酸の相同性と同等であるが、遺伝的コードの縮重と、異なる生物のコドン偏倚を考慮する。したがって、核酸配列の相同性はタンパク質配列の相同性より低くても高くてもよいが、より低い相同性が好ましい。
【０１６９】
好ましい態様では、変異体TR核酸は変異体TRタンパク質をコードしている。当業者は理解できるであろうが、遺伝的コードの縮重のため、膨大な数の核酸が製造でき、それらの全てが本発明に係る変異体TRタンパク質をコードしている。したがって、特定のアミノ酸配列を同定したならば当業者は、変異体TRのアミノ酸配列を変化させない方法で単に1またはそれ以上のコドンの配列を修飾することによって、多数の異なる核酸を作製することができる。
【０１７０】
或る態様では、核酸の相同性をハイブリダイゼーション研究によって決定する。したがって、例えば、図21に示す核酸配列またはその相補物と高ストリンジェンシー下でハイブリダイズし、且つ変異体TRタンパク質をコードしている核酸が、変異体TR遺伝子であると考えられる。
【０１７１】
高ストリンジェンシー条件は当分野で既知であり、例えばManiatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989、およびShort Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.を参照されたく、これらの両方を引用によりここに含める。ストリンジェント条件は配列依存的であり、異なる状況では相違する。長い配列は高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針はTijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」 (1993）に見出せる。一般にストリンジェント条件は、一定のイオン強度およびpHにおける特定配列の融点（Tm）より約5-10℃低く選択する。Tmは標的に対し相補的なプローブの50%が平衡時に標的配列とハイブリダイズする温度（一定のイオン強度、pHおよび核酸濃度において）である（標的配列は過剰に存在するため、Tmにおいてはプローブの50%が平衡状態で占有される）。ストリンジェント条件は、pH7.0ないし8.3において塩濃度が約1.0Mナトリウムイオンより低い、典型的には約0.01ないし1.0Mのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、短いプローブ（例えば10ないし50ヌクレオチド）のためには温度が少なくとも約30℃、長いプローブ（例えば50ヌクレオチドより大きい）のためには少なくとも約60℃であるような条件である。ストリンジェント条件はホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成できる。
【０１７２】
別の態様では、よりストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件を使用し、例えば当分野で知られるように中等度または低ストリンジェンシー条件が使用できる。Maniatis and Ausubel（上記）およびTijssen（上記）を参照されたい。
【０１７３】
本発明に係る変異体TRタンパク質および核酸は組換えである。本明細書中使用する「核酸」とは、DNAもしくはRNAのいずれか、またはデオキシおよびリボヌクレオチドの両者を含む分子を指すことができる。この核酸はゲノムDNA、cDNAならびにセンスおよびアンチセンス核酸を包含するオリゴヌクレオチドを包含する。このような核酸は、生理的環境における係る分子の安定性と半減期を増大させるためにリボース-燐酸バックボーンに修飾を含むこともできる。
【０１７４】
この核酸は二本鎖、一本鎖であってよく、または二本鎖もしくは一本鎖配列の一部分を含んでいてよい。当業者には理解できるであろうが、一本鎖（「Watson」）という表現は他の鎖の配列（「Crick」）をも規定し、したがって図6に示す配列はこの配列の相補物をも包含する。本明細書中「組換え核酸」という語は、一般的にエンドヌクレアーゼによる核酸の操作により始めはインビトロで作製された、自然界では通常見出されない形態の核酸を意味する。したがって、直線型の単離された変異体TR核酸、または通常結合しないDNA分子をライゲーションすることによりインビトロで作製された発現ベクターは、いずれも本発明の目的のために組み換えられていると考えられる。いったん組換え核酸を製造し宿主細胞または生物内に再導入したならば、それは非組換え的に複製、即ち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を利用して複製するが、いったん組換え的に作製されたこのような核酸は、その後非組換え的に複製を行っても、依然として本発明の目的のための組換えであると考えられる。
【０１７５】
同様に、「組換えタンパク質」とは、組換え技術を用いて、即ち上述の組換え核酸の発現によって製造したタンパク質である。組換えタンパク質は少なくとも1またはそれ以上の性質により天然に存在するタンパク質と区別できる。例えば、このタンパク質はその野生型宿主に通常付随するタンパク質および化合物の幾らかまたは全てを含まないよう単離または精製でき、よって実質上純粋であり得る。例えば、単離されたタンパク質は、好ましくは与えられた試料中の総タンパク質の少なくとも約0.5重量%、より好ましくは少なくとも約5重量%を構成する、天然状態で通常付随する物質の少なくとも幾らかを含まない。実質上純粋なタンパク質は総タンパク質の少なくとも約75重量%を含み、少なくとも約80%が好ましく、少なくとも約90%が特に好ましい。この定義は、或る生物に由来する変異体TRタンパク質を、異なる生物または宿主細胞において製造することを包含する。これとは別に当該タンパク質は、このタンパク質が増大した濃度レベルで製造されるよう誘導プロモーターまたは高発現プロモーターを使用することにより、通常観察される濃度よりはるかに高い濃度で製造することができる。さらに、本明細書に概説する全ての変異体TRタンパク質は、下に論ずるように、アミノ酸置換、挿入および欠失を含むため（置換が好ましい）、天然に通常見出されない形態である。
【０１７６】
本明細書に概説し図面に示す変異体TR配列のアミノ酸配列変異体もまた本発明に係る変異体TRタンパク質の定義に包含される。即ち、この変異体TRタンパク質はヒトTRに比してさらなる可変位置を含んでいてよい。これらの変異体は3つのクラス：置換、挿入または欠失変異体のうち1またはそれ以上に該当する。これらの変異体は普通、カセットまたはPCR突然変異誘発またはその他の当分野で周知の技術を用いる、該変異体をコードしているDNAを生成するための、変異体TRタンパク質をコードしているDNAにおけるヌクレオチドの位置特異的突然変異誘発によって製造し、その後上に概説するように組換え細胞培養において該DNAを発現させる。しかしながら約100-150までの残基を持つ変異体TRタンパク質フラグメントは、確立した技術を用いるインビトロ合成によって製造できる。アミノ酸配列変異体は、変異体TRタンパク質アミノ酸配列の天然に存在するアリルまたは種間変異とそれらを隔てる特徴である、前もって決定されている変異の性質によって特徴付けられている。この変異は典型的には天然に存在する類似体と同じ質的生物活性を示すが、下記により詳細に述べるように、改変された性質を持つ変異体を選択することもできる。
【０１７７】
アミノ酸配列変異を導入するための部位または領域は前もって決定しておくが、突然変異自体を前もって決定しておく必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の出来を最適なものとするために、標的コドンまたは領域でランダム突然変異誘発を実施し、発現された変異体TRタンパク質を所望の活性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知配列を持つDNAにおいて前もって定められた部位に置換突然変異を作製する技術は周知であり、例えばM13プライマー突然変異誘発およびPCR突然変異誘発がある。突然変異体のスクリーニングは変異体TRタンパク質活性の検定を用いて行う。
【０１７８】
アミノ酸置換は典型的には単一残基の置換であり、挿入は通常約1ないし20アミノ酸であるが、かなり多くの挿入も許容できる。欠失は約1ないし約20残基の範囲であるが、幾つかの場合には欠失はずっと大きくなり得る。
【０１７９】
置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組み合わせを用いて最終誘導体に到達できる。一般にこれらの変化は当該分子の変化を最小とするため少数アミノ酸について行う。しかしながら或る状況では、より大きな変化が許容できる。変異体TRタンパク質の性質に小さな変化を所望する場合、置換は一般に以下の表に従って行う。
【０１８０】
表１
【表１】2005505250.tif 000002
【０１８１】
表1に示したものより同類性の低い置換を選択することにより、機能または免疫学的同一性に実質的な変化を創出する。例えば、変化領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、例えばαヘリックスまたはβシート構造；標的部位の分子の電荷または疎水性；または側鎖の嵩、に、より著しい影響を及ぼす置換を創出できる。当該ポリペプチドの性質に最大の変化を導くことが一般的に予想される置換は、(a) 親水性残基、例えばセリンまたはスレオニンを疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリンまたはアラニンに置換する（またはその逆）；(b) システインまたはプロリンを他の何らかの残基に置換する（またはその逆）；(c) 正電荷を持つ側鎖を有する残基、例えばリジン、アルギニン、またはヒスチジンを、負電荷を持つ残基、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸に置換する（またはその逆）；または(d) 嵩高い側鎖を持つ残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を持たない残基、例えばグリシンに置換する（またはその逆）、置換である。
【０１８２】
変異体は典型的には元の変異体TRタンパク質と同じ質的生物活性を示し、同じ免疫反応を誘起するが、必要に応じて変異体TRタンパク質の性格を修飾するように変異体を選択することもある。これとは別に該変異体は、変異体TRタンパク質の生物活性が変化するように設計できる。例えば、グリコシル化部位を変化させまたは除去することができる。同様に、生物学的機能を変化させることができ、例えば幾つかの例では、より強力なまたはより強力でないTR活性を持つことが望ましいかも知れない。
【０１８３】
本発明に係る変異体TRタンパク質および核酸は幾つかの方法で製造できる。個々の核酸およびタンパク質は、当分野で知られているように、そして下に概説するように製造できる。これとは別に、変異体TRタンパク質のライブラリーを試験のために作製できる。
【０１８４】
好ましい態様では、変異体TRタンパク質の集合またはライブラリーを確率分布表から作製する。本明細書に概説するように、PDA、配列アラインメント、SCMF計算のような力場計算等を包含する、確率分布表を作製する様々な方法がある。加えて、確率分布は、ライブラリー中に観察される突然変異頻度の尺度としての、各位置についての情報エントロピー評点の作製に使用できる。
【０１８５】
この態様では、このリスト中の各々の可変位置にある各アミノ酸残基の頻度を同定する。頻度には限界が設定でき、ここではカットオフより低い変異体頻度を0に設定する。このカットオフは好ましくは1%、2%、5%、10%または20%であり、10%が特に好ましい。次いでこれらの頻度を変異体TRライブラリー中に組み入れる。即ち、上記のように、これらの可変位置を集め、可能な全ての組み合わせを作製するが、但しライブラリーを「満たす」アミノ酸残基は頻度をベースとして利用する。したがって、頻度に基づかないライブラリーでは、5個の可能な残基を持つ可変位置は、第一の可能な残基を持つ可変位置を含むタンパク質20%、第二を持つもの20%、などを有する。しかしながら頻度に基づくライブラリーでは、それぞれ10%、15%、25%、30%および20%の頻度を持つ5個の可能な残基を有する可変位置は、第一の可能な残基を持つ可変位置を含むタンパク質10%、第二の残基を持つタンパク質15%、第三を持つタンパク質25%等を有するであろう。当業者には理解できるであろうが、実際の頻度はそのタンパク質を実際に作製するために利用する方法に依存し、例えば、正確な頻度はそのタンパク質を合成する際に取得可能となり得る。しかしながら、以下に概説する頻度に基づくプライマー系を使用する場合、各位置における実際の頻度は、以下に概説するように、変化するであろう。
【０１８６】
当業者には理解できるであろうが、そして本明細書に概説するように、確率分布表は様々な方法で作製できる。本明細書に概説する方法に加えて、自己無撞着平均場（SCMF）法を、確率表の直接作製に使用できる。SCMFは回転異性体相互作用の平均場の描写を用いてエネルギーを計算する、コンピューターによる決定論的方法である。このようにして作製した確率表を用いて本明細書に記載のライブラリーが作製できる。SCMFは3つのやり方で利用できる。アミノ酸の頻度および各アミノ酸についての回転異性体を各位置において列挙する；確率をSCMFから直接決定する（Delarue et la. Pac. Symp. Biocomput. 109-21 (1997)(引用によりここに含める）を参照されたい）。加えて、非常に可変的な位置および非可変位置が同定できる。これに代わり、別の方法を利用して、配列空間の検索中にどの配列がとばされたかを決定し；SCMFを利用してその配列についての正確なエネルギーを得；次いでこのエネルギーを、等級付けに利用し、配列の等級順リストを作る（Monte Carlo配列リストに類似）。しかる後、各位置のアミノ酸の頻度を示す確率表がこのリストから算出できる(Koehl et al., J. Mol. Biol. 239:249 (1994); Koehl et al., Nat. Struc. Biol. 2:163 (1995); Koehl et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6:222 (1996); Koehl et al., J. Mol. Bio. 293:1183 (1999); Koehl et al., J. Mol. Biol. 293:1161 (1999); Lee J. Mol. Biol. 236:918 (1994); およびVasquez Biopolymers 36:53-70 (1995); これらは全て引用によりここに含める）。同様の方法には、OPLS-AA (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, pp 11225_11236; Jorgensen, W.L.; BOSS, Version 4.1; Yale University: New Haven, CT (1999)); OPLS (Jorgensen, et al., J. Am. Chem. Soc. (1988), v 110, pp 1657ff; Jorgensen, et al., J Am. Chem. Soc. (1990), v 112, pp 4768ff); UNRES (United Residue Forcefield; Liwo, et al., Protein Science (1993), v 2, pp1697-1714; Liwo, et al., Protein Science (1993), v 2, pp1715-1731; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp849_873; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, pp874-884; Liwo, et al., J. Comp. Chem. (1998), v 19, pp259-276; Forcefield for Protein Structure Prediction (Liwo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, pp5482-5485); ECEPP/3 (Liwo et al., J Protein Chem 1994 May;13(4):375-80); AMBER 1.1 force field (Weiner, et al., J. Am. Chem. Soc. v106, pp765-784); AMBER 3.0 force field (U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:755-759); CHARMM and CHARMM22 (Brooks, et al., J. Comp. Chem. v4, pp 187-217); cvff3.0 (Dauber-Osguthorpe, et al.,(1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v4,pp31-47); cff91 (Maple, et al., J. Comp. Chem. v15, 162-182)が包含され（但しこれらに限定される訳ではない）; さらに、the DISCOVER (cvff and cff91) およびAMBER力場がthe INSIGHT molecular modeling package (Biosym/MSI, San Diego California) で使用され、そしてHARMMがthe QUANTA molecular modeling package (Biosym/MSI, San Diego California)で使用されている。
【０１８７】
さらに、本明細書に概説するように、確率分布表を作製する好ましい方法は、配列アラインメントプログラムの使用による。加えて確率表は配列アラインメントとコンピューターアプローチの組み合わせによって得られる。例えば、相同的配列のアラインメントに見出されるアミノ酸をコンピューター計算の結果に加えることができる。好ましくは野生型アミノ酸を、これがコンピューター計算に見出されない場合に確率表に加えることができる。
【０１８８】
理解できるであろうが、可変位置および/または可変位置にある残基を再結合して創出した変異体TRライブラリーは等級順リストに無いかも知れない。幾つかの態様では、このリスト全体を作製し試験できる。これに代わり好ましい態様では、この変異体TRライブラリーもまた等級順リストの形態である。これは、ライブラリーのサイズが実験的に作製するには依然として大きすぎるという事を包含する幾つかの理由のため、または予想目的のために行われる。これは幾つかの方法で行うことができる。
【０１８９】
或る態様では、ライブラリーは、ライブラリーの成員を等級付けるためのPDAの評点機能を用いて等級付ける。別法として統計学的方法が使用できる。例えば、ライブラリーは頻度評点によって等級付けることができる。即ち、殆どの高頻度残基を含むタンパク質を高い等級とするなどである。これは、評点数値を求めるため各可変位置での頻度を加えるまたは掛けることにより行うことができる。同様に、ライブラリーの異なる位置を加重し次いでそのタンパク質の評点を付けることができるが、例えば或る一定の残基を含むものを恣意的に等級付けることができる。
【０１９０】
好ましい態様では、変異体TRライブラリーの異なるタンパク質成員を化学合成できる。この事は、設計したタンパク質が短い、好ましくは150アミノ酸長より短い、さらに好ましくは100アミノ酸長より短い、そして特に好ましくは50アミノ酸長より短い場合にとりわけ有用であるが、当分野で知られるように、長いタンパク質を化学的または酵素的に製造することもできる。例えば、Wilken et al, Curr. Opin. Biotechnol. 9:412-26 (1998）を参照されたく、これは引用によりここに含める。
【０１９１】
好ましい態様では、とりわけ長いタンパク質または大試料が所望であるタンパク質のための好ましい態様では、成員の配列をコードしているDNAのような核酸を創出するためにこのライブラリー配列を使用し、次いでそれを宿主細胞中にクローニングし、発現させ、所望により検定する。したがって、各成員タンパク質配列をコードしている核酸、とりわけDNAを作製することができる。これは既知の方法を利用して行う。コドン、適当な発現ベクターおよび適当な宿主細胞の選択は幾つかの因子に依存して変化し、必要に応じて容易に最適化できる。
【０１９２】
好ましい態様では、U.S.S.N.09/927790（引用によりここに含める）に一般的に記載されているように、プールしたオリゴヌクレオチドによるマルチプルPCR反応を行う。この態様では、完全長遺伝子に対応する部分重複オリゴヌクレオチドを合成する。さらに、これらのオリゴヌクレオチドは各変異体の位置または部分集合にある異なるアミノ酸の全てを表し得る。
【０１９３】
好ましい態様では、これらのオリゴヌクレオチドを等しい比率でプールし、マルチプルPCR反応を行って、該ライブラリーにより定義される突然変異の組み合わせを含む完全長配列を作り出す。加えて、これは誤りがちなPCR法を用いて実施できる。
【０１９４】
好ましい態様では、異なるオリゴヌクレオチドを確率分布表に対応する相対量で加える。こうしてマルチプルPCR反応は、所望の突然変異の組み合わせを所望の比率で有する完全長配列を生成する。
【０１９５】
必要なオリゴヌクレオチドの総数は、突然変異を受ける位置の数およびこれらの位置にあると考えられる突然変異の数の関数である：
(定位置に対するオリゴの数) + M1 + M2 + M3 +・・・Mn = (必要なオリゴの総数)
[式中、Mnはこの配列の位置nにあると考えられる突然変異の数である］。
【０１９６】
好ましい態様では、各々の部分重複するオリゴヌクレオチドは、変化させるべき位置をただ1個含んでおり；別の態様では、そうなるには変異体位置が近すぎるので、オリゴヌクレオチド1個当たり複数の変異体を使用してあらゆる可能性を有する完全な組換えをさせる。即ち、各オリゴは突然変異を受ける1個の位置のためのコドン、または突然変異を受ける1以上の位置のためのコドンを含むことができる。突然変異を受ける複数の位置は、オリゴの長さが非実用的となるのを防ぐため、配列中で近接していなければならない。或るオリゴヌクレオチド上の複数の突然変異位置を目的として、突然変異の特定の組み合わせを、その組み合わせをコードしているオリゴヌクレオチドを包含または除外することによってそのライブラリーに包含またはそこから排除することができる。例えば、本明細書に論ずるように、可変領域の間には相関があり得る。即ち、位置Xが或る残基である場合、位置Yは特定の残基でなければならない（またはそうであってはならない）。これらの可変位置の集合は、本明細書では時に「クラスター」と呼ぶ。クラスターが近接した残基に含まれ、よって1個のオリゴヌクレオチドプライマー上に存在する場合、このクラスターは「良好な」相関関係へと向かい、ライブラリーの有効性を低減させ得る劣悪な相関を排除することができる。しかしながら、クラスターの残基が配列内で遠く離れており、よって合成のための異なるオリゴヌクレオチド上に存在する場合、該残基を「良好な」相関関係に置くか、またはそれらを可変残基として全て排除するのが望ましいであろう。これとは別の態様では、クラスター突然変異が常に一諸に現れるよう、ライブラリーを幾つかの工程で作製できる。この方法、即ち突然変異のクラスターを同定し、それらを同じオリゴヌクレオチド上に位置させるか、またはライブラリーからそれらを排除する方法、またはクラスターを温存する幾つかの工程によるライブラリーの作製は、適正に折り畳まれたタンパク質を有する実験的ライブラリーをかなり高品質なものとし得る。クラスターの同定は幾つかの方法で、例えば既知のパターン認識法、または突然変異の発生頻度の比較を用いて、または実験的に製造しようとする配列のエネルギー解析（例えば、相互作用のエネルギーが高い場合、その位置は相関している）によって、実施できる。これらの相関は、位置相関（例えば、可変位置1と2が常に一諸に変化しまたは決して一諸に変化しない）または配列相関（例えば、1位に残基Aがある場合、2位には常に残基Bがある）であってよい。Pattern discovery in Biomolecular Data: Tools, Techniques, and Applications; edited by Jason T.L. Wang, Bruce A. Shapiro, Dennis Shasha. New York: Oxford University, 1999; Andrews, Harry C. Introduction to mathematical techniques in pattern recognition; New York, Wiley-lnterscience [1972]; Applications of Pattern Recognition; Editor, K.S. Fu. Boca Raton, Fla. CRC Press, 1982; Genetic Algorithms for Pattern Recognition; edited by Sankar K. Pal, Paul P. Wang. Boca Raton: CRC Press, c1996; Pandya, Abhijit S., Pattern recognition with neural networks in C++ / Abhijit S. Pandya, Robert B. Macy. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 1996; Handbook of pattern recognition & computer vision / edited by C.H. Chen, L.F. Pau, P.S.P. Wang. 2nd ed. Singapore; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999; Friedman, Introduction to Pattern Recognition: Statistical, Structural, Neural, and Fuzy Logic Approaches; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999, Series title: Series in machine perception and artificial intelligence; vol. 32（これらは全て引用によりここに含める）を参照されたい。さらに、コンセンサスモチーフの探索に用いられるプログラムもまた使用できる。
【０１９７】
加えて、オリゴヌクレオチドの設計を変えることにより、即ち、そのオリゴヌクレオチド（プライマー）がどこで開始および停止するか（例えばどこでその配列が「切断」されるか）を決定することにより、相関およびシャフリングを固定または最適化できる。オリゴの開始および停止部位は、単一オリゴヌクレオチド中に現れるクラスターの数を最大とするよう設定でき、それにより、高評点の配列でそのライブラリーを質的に向上させることができる。異なるオリゴヌクレオチド開始および停止部位の選択肢は、単一のオリゴ上にあるクラスター数に従って、または予想した配列ライブラリーに一致する得られた配列のパーセンテージに従って、コンピューターにより作製および等級付けできる。
【０１９８】
必要なオリゴヌクレオチドの総数は、複数の突然変異可能な位置が単一オリゴヌクレオチドによってコードされている場合に増加する。アニーリングされた領域は、一定不変の領域、即ちレファランス配列を有する領域である。
【０１９９】
コドンの挿入または欠失を持つオリゴヌクレオチドを使用して異なる長さのタンパク質を発現するライブラリーを創出できる。とりわけ、挿入または欠失を求めるコンピューターによる配列スクリーニングは、異なる長さのタンパク質を規定する二次ライブラリーを産み、このタンパク質はプールされた異なる長さのオリゴヌクレオチドのライブラリーにより発現され得る。
【０２００】
好ましい態様では、変異体TRライブラリーは、ファミリー（例えば変異体の集合）のシャフリングによって行う。即ち、誤りがちなPCRによってまたはこれによらずに上位配列の集合（もし等級順リストを使用するならば）をシャフルすることができる。この文脈中の「シャフリング」とは、一般にランダムなやり方での関連配列の再結合を意味する。これは、米国特許Nos. 5,830,721; 5,811,238; 5,605,793; 5,837,458およびPCT US/19256（これらは全て引用によりその全内容をここに含める）に定義および例示されている「シャフリング」を包含できる。この配列の集合は人工的集合、例えば確率表（例えばSCMFを使用して作製されたもの）またはMonte Carlo集合由来のものとすることもできる。同様に、「ファミリー」とは、上位の10および下位の10配列、上位の100配列などとすることができる。これもまた誤りがちなPCRを用いて実施できる。
【０２０１】
したがって好ましい態様では、本明細書に記載のコンピューター的方法を用いるin silicoシャフリングを行う。即ち、2個のライブラリーまたは2個の配列から始まって、配列のランダムな再結合を作製し評価することができる。
【０２０２】
好ましい態様では、変異体TRライブラリーを作製するために誤りがちなPCRを行う。米国特許Nos. 5,605,793, 5,811,238および5,830,721（これらは全て引用によりここに含める）を参照されたい。これは最適配列について、またはライブラリーもしくは他の何らかの人工的集合もしくはファミリーの上位成員について実施できる。この態様では、一次ライブラリーのコンピュータースクリーニングで見出された最適配列の遺伝子が合成できる。次いで、該ライブラリーの変異体位置に突然変異をコードしているオリゴヌクレオチド（バイアスオリゴヌクレオチド）の存在下で、誤りがちなPCRを最適配列遺伝子上で実施する。このオリゴヌクレオチドの添加は、ライブラリーに突然変異を組み込む傾向のあるバイアスを創出する。別法として、或る突然変異をコードしているオリゴヌクレオチドのみを用いてライブラリーにバイアスをかけることもできる。
【０２０３】
好ましい態様では、誤りがちなPCRによる遺伝子シャフリングを、バイアスオリゴヌクレオチドの存在下に最適配列の遺伝子上で実施し、変異体TRライブラリー中に見出される突然変異の比率を反映するDNA配列ライブラリーを創出することができる。バイアスオリゴヌクレオチドの選択は様々な方法で実施できる。これらはその頻度に基づいて選択できる。即ち、高突然変異頻度の位置をコードしているオリゴヌクレオチドが使用でき；そうではなく、多様性が増大するよう最も変化し易い位置を含むオリゴヌクレオチドが使用でき；二次ライブラリーを等級付ける場合には幾つかの上位評点位置をバイアスオリゴヌクレオチドの作製に使用でき；ランダムな位置を選択でき；数個の上位評点および数個の低評点オリゴヌクレオチドが選択できる、などである。重要な事は、好ましい可変位置および配列に基づいて新しい配列を作製することである。
【０２０４】
好ましい態様では、U.S.S.N. 09/927,790（引用によりここに含める）に一般的に記載されるような野生型遺伝子またはその他の遺伝子を用いるPCRが利用できる。この態様では、開始遺伝子を使用し、一般にこの遺伝子は通常野生型遺伝子である（但しそれが必要であるわけではない）。幾つかの例では、これは全体として最適化された配列またはリスト中の他の何らかの配列または、例えば異なる生物由来の相同的配列をアラインメントすることで得られたコンセンサス配列をコードしている遺伝子とすることができる。この態様では、変異体位置に対応し且つライブラリー中の異なるアミノ酸を含むオリゴヌクレオチドを使用する。当分野で知られるように、末端にPCRプライマーを用いてPCRを行う。これには2つの利点がある。第一は、一般にこれは少ないオリゴヌクレオチドしか必要とせず、誤りがより少なくなる。加えて、野生型遺伝子を使用する場合、それを合成する必要が無いという実験上の有利性がある。
【０２０５】
さらに、図面に例示したような、利用できる他の幾つかの技術がある。好ましい態様では、PCR生成物のライゲーションを実施する。
【０２０６】
好ましい態様では、変異体TRライブラリーに対して多様なさらなる工程を実施することができる。例えばさらなるコンピューター処理を行い、異なる変異体TRライブラリーが再結合でき、または異なるライブラリー由来のカットオフを組み合わせることができる。好ましい態様では、変異体TRライブラリーを再度コンピューター操作して、さらなる変異体TRライブラリーを作ることができる（時にこれを本明細書では「第三のライブラリー」と称する）。例えば、任意の変異体TRライブラリー配列を、第一ライブラリー中の変化した位置の幾つかまたは全てを凍結または固定することにより、二巡目のPDAのために選択できる。別法として、最後の確率分布表に見られる変化のみを許容する。或いは、確率表のストリンジェンシーを、包含についてのカットオフを増大または低下させることにより、変化させることができる。同様に、変異体TRライブラリーは、一巡目の後に実験的に再結合させる事ができる。例えば、第一スクリーニング由来の最良遺伝子/遺伝子群を選択し、再度遺伝子アセンブリーを行うことができる（下に概説する技術、マルチプルPCR、誤りがちなPCR、シャフリングなどを利用）。
【０２０７】
これに代わり、1またはそれ以上の良好遺伝子（群）由来のフラグメントが幾つかの位置で確率を変化させる。これは、コンピューターおよび実験的スクリーニングの一巡目に見出される配列空間の領域に検索を偏倚させる。
【０２０８】
好ましい態様では、組み合わせた異なる変異体TRライブラリーから第三ライブラリーが作製できる。例えば、本明細書に概説するように、第一の変異体TRライブラリー由来の確率分布表を、コンピューターまたは実験で作製し再結合する。PDA変異体TRライブラリーを配列アラインメント変異体TRライブラリーと合し、再結合（やはりコンピューターまたは実験によって）させるか、または各々のカットオフのみを合わせて新しい第三ライブラリーを作製する。幾つかのライブラリーからの上位配列を再結合できる。ライブラリー上位からの配列をライブラリー下位からの配列と合してより広範な試料配列空間を作製し、または、ライブラリー上位から遠い配列のみを合する。タンパク質の異なる部分を解析した変異体TRライブラリーを、そのタンパク質の合した部分を処理する第三ライブラリーと合することができる。
【０２０９】
好ましい態様では、第三ライブラリーを変異体TRライブラリー中の相関を用いて作製できる。即ち、第一の可変位置にある残基は第二可変位置の残基と相関している（またはさらなる位置にある残基と同様に相関している）かも知れない。例えば、第一の残基がXであれば第二の残基はYでなければならないというように、2個の可変位置が立体的または静電的に相互作用しているかも知れない。これは正の相関であっても負の相関であってもよい。
【０２１０】
候補変異体タンパク質または候補変異体ライブラリー成員をコードしている本発明に係る核酸を使用して、様々な発現ベクターを作製する。この発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであっても、また、宿主ゲノム中に統合するベクターであってもよい。一般にこれらの発現ベクターは、ライブラリーのタンパク質をコードしている核酸と機能的に連結した転写および翻訳調節核酸を含む。「調節配列」という語は、特定の宿主生物において機能的に連結したコード配列の発現に必要とされるDNA配列を指す。例えば原核生物のために好適な調節配列は、プロモーター、所望によりオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を包含する。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【０２１１】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置される場合、「機能的に連結」している。例えば、プレ配列のためのDNAまたは分泌リーダーは、或るポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質としてこれが発現されるならば、そのポリペプチドのDNAと機能的に連結しており；プロモーターまたはエンハンサーは、これが配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列と機能的に連結しており；または、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置しているならば、コード配列と機能的に連結している。一般に、「機能的に連結」とは、連結しているDNA配列が隣接しており、そして分泌リーダーの場合は隣接し且つ読み取り相にある。しかしながらエンハンサーは隣接していなくともよい。連結は都合の良い制限部位でのライゲーションにより達成する。そのような部位が無い場合は、常法に従い合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。当業者には理解できるであろうが、転写および翻訳調節核酸は一般に、そのライブラリータンパク質を発現するのに用いられる宿主細胞に適している。例えば、好ましくはBacillus由来の転写および翻訳調節核酸配列を使用してBacillus中でライブラリータンパク質を発現させる。様々な宿主のための、数多くの種類の適当な発現ベクター、および適当な調節配列が当分野で知られている。
【０２１２】
一般に転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を包含するが、これらに限定される訳ではない。好ましい態様では、調節配列はプロモーターならびに転写開始および停止配列を包含する。
【０２１３】
プロモーター配列は構成的および誘導的プロモーター配列を包含する。プロモーターは天然に存在するプロモーター、ハイブリッドまたは合成プロモーターを包含できる。1以上のプロモーターの要素を合しているハイブリッドプロモーターもまた当分野で知られており、本発明において有用である。
さらに、発現ベクターはさらなる要素を含み得る。例えば、発現ベクターは2つの複製系を持つことができ、したがってこれを2つの生物、例えば発現のための哺乳動物または昆虫細胞において、そしてクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において維持することを可能にする。さらに、発現ベクターを統合するため、この発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同的な少なくとも1個の配列、および好ましくは発現構築物に隣接する2個の相同的配列を含む。この統合ベクターは、ベクターに含まれるための適当な相同配列を選択することにより、宿主細胞中の特定の座を目指すことができる。ベクター統合のための構築物ならびに適当な選択およびスクリーニングプロトコルは当分野で周知であり、例えばMansour et al., Cell, 51:503 (1988) およびMurray, Gene Transfer and Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 7 (Clifton: Humana Press, 1991)に記載されている。
【０２１４】
さらに、好ましい態様では、発現ベクターは、発現ベクターを含む形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子を含み、特に哺乳動物細胞の場合には、該ベクターを含まない細胞は一般に死滅することからベクターの安定性を確実とする。選択遺伝子は当分野で周知であり、使用する宿主細胞と共に変わる。本明細書中「選択遺伝子」とは、選択剤に対する耐性を付与する遺伝子産物をコードしている任意の遺伝子を意味する。好適な選択剤は、ネオマイシン（またはその類似体G418）、ブラスティシディンS、ヒスチニドールD、ブレオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンB、およびその他の薬物を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０２１５】
好ましい態様では、遺伝子発現のレベルを増大させるため、発現ベクターはRNAスプライシング配列を、発現させようとする遺伝子の上流または下流に含む。Barret et al., Nucleic Acids Res. 1991; Groos et al., Mol. Cell. Biol. 1987; およびBudiman et al., Mol. Cell. Biol. 1988を参照されたい。
【０２１６】
好ましい発現ベクター系は一般的にMann et al., Cell, 33:153-9 (1993);  Pear et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90(18):8392-6 (1993); Kitamura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:9146-50 (1995); Kinsella et al., Human Gene Therapy, 7:1405-13; Hofmann et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:5185-90; Choate et al., Human Gene Therapy, 7:2247 (1996); PCT/US97/01019およびPCT/US97/01048、ならびにこれらに引用されている文献（これらは全て引用によりここに含める）に記載されているような、レトロウイルスベクター系である。
【０２１７】
本発明に係る候補変異体ライブラリータンパク質は、核酸、好ましくはライブラリータンパク質をコードしている核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、そのライブラリータンパク質の発現を誘導または惹起する適当な条件下で培養することによって生産する。候補変異体ライブラリータンパク質発現にとって適当な条件は発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変わり、日常的な実験を介して当業者が容易に確認できる。例えば、発現ベクター中での構成的プロモーターの使用は宿主細胞の成長と増殖の最適化を必要とし、一方誘導的プロモーターの使用は誘導のために適当な成長条件を必要とする。加えて、幾つかの態様では、収穫のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現に使用するバキュロウイルス系は溶菌ウイルスであり、したがって収穫時期の選択が生成物の収量にとって決定的となり得る。
【０２１８】
当業者には理解できるであろうが、本発明で使用する細胞の種類は広範に変わり得る。基本的には、酵母、細菌、始原細菌、真菌、および昆虫、植物、ならびに哺乳動物細胞を包含する動物細胞を包含する、多岐にわたる適当な宿主細胞が使用できる。Drosophila melanogaster細胞、Saccharomyces cerevisiaeおよびその他の酵母、E.coli、Bacillus subtilis、SF9細胞、C129細胞、293細胞、Neurospora、BHK、CHO、COS、およびHeLa細胞、線維芽細胞、Schwanomaセルライン、不死化した哺乳動物骨髄系およびリンパ系セルライン、Jurkat細胞、肥満細胞およびその他の内分泌および外分泌細胞、ならびに神経細胞は特に興味深い。ATCCセルラインカタログ（これは引用によりここに含める）を参照されたい。加えて、例えば当分野で周知のファージディスプレー系における二次ライブラリーの発現が、とりわけこの二次ライブラリーがランダムなペプチドを含む場合には好ましい。或る態様では、細胞を遺伝子操作でき、これは即ち例えば標的分子を含むよう、外因性核酸を含むという事である。
【０２１９】
好ましい態様では、候補変異体タンパク質または候補変異体ライブラリータンパク質を哺乳動物細胞中で発現させる。任意の哺乳動物細胞が使用でき、マウス、ラット、霊長類およびヒト細胞が特に好ましいが、当業者に理解できるように、シュードタイピングによるこの系の修飾によって、全ての真核生物細胞、好ましくは高等真核生物細胞が使用できるようになる。下により詳細に述べることであるが、細胞がランダムライブラリー成員の存在下で選択可能な表現型を示すよう、スクリーニングを設定する。下により詳細に述べることであるが、好適なスクリーニングを設計して、その細胞内部にライブラリー成員が存在する帰結として変化した表現型を示す細胞を選択できる限り、多彩な疾病状態に関連する細胞型が特に有用である。
【０２２０】
したがって、好適な哺乳動物細胞型は、全ての種類の腫瘍細胞（とりわけ黒色腫、骨髄性白血病、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌および精巣癌）、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（T細胞およびB細胞）、肥満細胞、好酸球、血管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を包含する白血球、幹細胞、例えば造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋細胞幹細胞（分化および非分化因子についてのスクリーニングに使用）、破骨細胞、軟骨細胞およびその他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、肝臓細胞、腎臓細胞、および脂肪細胞を包含するが、これらに限定される訳ではない。好適な細胞はまた、Jurkat T細胞、NIH3T3細胞、CHO、Cos、等を包含する既知の研究用細胞を包含するが、これらに限定されない。引用によりここに含めるATCCセルラインカタログを参照されたい。
【０２２１】
哺乳動物発現系もまた当分野で知られており、レトロウイルス系を包含する。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物RNAポリメラーゼと結合でき、ライブラリータンパク質のコード配列からmRNAへの下流（3'）方向への転写を開始できる任意のDNA配列である。プロモーターは、通常コード配列の5'末端の近位に位置する転写開始領域、および、この転写開始部位の上流に位置する25-30塩基対を用いるTATAボックスを有する。TATAボックスはRNAポリメラーゼIIに指令して正しい部位でRNA合成を開始させると考えられる。哺乳動物プロモーターはさらに、典型的にはTATAボックスの上流100ないし200塩基対以内に位置する上流プロモーター要素（エンハンサー要素）を含む。上流プロモーター要素は転写を開始する速度を決定し、いずれの向きにも作用できる。哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターが哺乳動物プロモーターとして特に有用であり、何故ならこのウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、広範な宿主範囲を有するためである。例には、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびCMVプロモーターがある。
【０２２２】
典型的には、哺乳動物細胞が認識する転写終止およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの3'に位置する調節領域であり、よってプロモーター要素と一諸にコード配列に隣接している。成熟mRNAの3'末端は位置特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例はSV40から誘導したものを包含する。
【０２２３】
哺乳動物宿主およびその他の宿主に外因性核酸を導入する方法は当分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変わる。技術には、デキストラン仲介トランスフェクション、燐酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ウイルス感染、リポソームへのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのDNAの直接的マイクロインジェクションがある。
【０２２４】
好ましい態様では、候補変異体タンパク質または候補変異体ライブラリータンパク質を細菌系で発現させる。細菌発現系は当分野で周知である。
【０２２５】
好適な細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼと結合でき、ライブラリータンパク質のコード配列からmRNAへの下流（3'）方向への転写を開始できる任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、通常コード配列の5'末端の近位に位置する転写開始領域を持っている。この転写開始領域は典型的にはRNAポリメラーゼ結合部位と転写開始部位を包含する。代謝経路の酵素をコードしている配列は特に有用なプロモーター配列を提供する。例には、ガラクトース、乳糖およびマルトースといった糖を代謝する酵素から誘導されるプロモーター配列、ならびにトリプトファンのような生合成酵素から誘導される配列がある。バクテリオファージ由来のプロモーターも使用でき、当分野で知られている。加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用であり、例えばtacプロモーターはtrpおよびlacプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼと結合し転写を開始させる能力を持つ、非細菌由来の天然に存在するプロモーターを包含できる。
機能的プロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合部位が望ましい。E.coliでは、リボソーム結合部位をShine-Delgarno（SD）配列と呼び、開始コドンとこの開始コドンの3-11ヌクレオチド上流に位置する3-9ヌクレオチド長の配列を包含する。
【０２２６】
発現ベクターはさらに、細菌中でライブラリータンパク質の選択を可能にするシグナルペプチド配列を包含できる。当分野で周知のように、シグナル配列は典型的にはその細胞からのタンパク質の分泌を指令する疎水性アミノ酸から成るシグナルペプチドをコードしている。タンパク質は増殖培地中に分泌される（グラム陽性菌）か、または細胞の内膜と外膜の間にある周辺腔に分泌される（グラム陰性菌）。
【０２２７】
細菌発現ベクターはさらに、形質転換された細菌菌株の選択を可能にする選択マーカー遺伝子をも含む。好適な選択遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンといった薬物に対して細菌を耐性とする遺伝子を包含する。選択マーカーはまた、生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成系路の遺伝子をも包含する。
【０２２８】
これらの成分を構築して発現ベクターとする。細菌用の発現ベクターは当分野で周知であり、とりわけBacillus subtilis、E. coli、Streptococcus cremoris、およびStreptococcus lividansのためのベクターを包含する。
【０２２９】
細菌発現ベクターは、当分野で周知の技術、例えば塩化カルシウム処理、電気穿孔などを用いて細菌宿主細胞中に導入する。
【０２３０】
或る態様では、候補変異体タンパク質を昆虫細胞において生成させる。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、特にバキュロウイルス系発現ベクターは当分野でよく知られており、例えばO'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (New York: Oxford University Press, 1994）に記載されている。
【０２３１】
好ましい態様では、候補変異体タンパク質を酵母細胞において生成させる。酵母発現系は当分野で周知であり、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicansおよびC.maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilisおよびK.lactis、Pichia guillerimondiiおよびP.pastoris、Schizosaccharomyces pombe、ならびにYarrowia lipolyticaのための発現ベクターを包含する。酵母での発現のための好ましいプロモーター配列は、GAL1,10誘導プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース-6-燐酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド-3-燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、3-ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、および酸ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターを包含する。酵母選択マーカーは、ツニカマイシンに対する耐性を付与するADE2、HIS4、LEU2、TRP1、およびALG7；G418に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；および、酵母を銅イオン存在下で増殖可能とするCUP1遺伝子を包含する。
【０２３２】
好ましい態様では、候補変異体タンパク質または候補変異体ライブラリータンパク質を植物細胞中で発現させる。トランスジェニック植物での発現を意図した遺伝子配列を、まず、植物中で発現可能な適当なプロモーターに隣接する発現カセットに組み込む。この発現カセットはトランスジーンの発現のために必要なまたは選択されたさらなる配列を含むこともできる。このような配列には、転写ターミネーター、発現を増強するイントロンのような外来配列、エンハンサー配列、および、遺伝子産物が特定の細胞小器官および細胞コンパートメントを標的とすることを意図した配列を包含するが、これらに限定される訳ではない。次いでこれらの発現カセットを下記のような植物形質転換ベクターへと容易に移行させることができる。以下は、典型的な発現カセットの様々な構成成分の記載である。
【０２３３】
発現カセットに使用するプロモーターの選択は、トランスジェニック植物中のトランスジーンの空間的および時間的発現パターンを決定する。選択されたプロモーターはトランスジーンを特定の細胞型（例えば葉の表皮細胞、葉肉細胞、根の皮層細胞）または特定の組織もしくは器官（例えば根、葉または花）で発現させ、故にプロモーターの選択は遺伝子産物の蓄積を望む位置に基づくものである。本発明の好ましい態様では、オレオシン-TR融合タンパク質、オレオシン-TR融合タンパク質またはオレオシン-ハイブリッドTR/TRレダクターゼ融合タンパク質の発現に種子特異的プロモーターを使用する。最も好ましい態様では、この種子特異的プロモーターはファセオリンプロモーターである。
【０２３４】
プロモーターは転写を促進する能力に違いがある。利用する宿主細胞に応じて、当分野で知られる幾つかの適当なプロモーターのいずれかを使用できる。構成的発現のためには、CaMV 35Sプロモーター、米アクチンプロモーター、またはユビキチンプロモーターが使用できる。これに代わり、誘導的プロモーターを選択して様々な誘導条件の下で遺伝子発現をさせることができる。化学誘導的発現のためにはタバコまたはArabidopsis由来の誘導的PR-1プロモーターが使用できる (例えば米国特許No. 5,689,044を参照されたい）。
【０２３５】
様々な転写ターミネーターが、核遺伝子発現カセットでの使用のために利用でき、トランスジーンを超えた転写の停止およびその正しいポリアデニル化を担っている。適当な転写ターミネーターとは、植物中で機能することが分かっているものであり、CaMV 35Sターミネーター、tm/ターミネーター、ノパリンシンターゼ（nos）ターミネーターおよびエンドウ豆rbcS E9ターミネーターを包含する。これらは単子葉植物と双子葉植物の両方に使用できる。好ましい態様ではファセオリン転写ターミネーターを使用する。プラスチドでの発現は停止を必要としないことがあるが、翻訳開始、伸長およびRNA安定性のために正しい5'および3'シグナルを必要とすることがある。
【０２３６】
数多くの配列が、転写ユニット内部からの遺伝子発現を促進することが見出されており、これらの配列を本発明に係る遺伝子と共に使用して、トランスジェニック植物中での発現を増大させることができる。例えば、種々のイントロン配列、例えばトウモロコシAdhl遺伝子のイントロンは、特に単子葉植物細胞で発現を増強することが示されている。加えて、ウイルス由来の幾つかの非翻訳リーダー配列もまた発現を増強することが分かっており、これらは双子葉植物細胞で特に有効である。トランスジェニック植物でそれらを発現させるためには、使用するDNA分子のコード配列は、特にそのDNA分子が原核生物由来である場合、修飾および最適化が必要となるかも知れない。全ての生物はコドンの使用に特定の好みがあることが当分野で知られており、本発明に係るDNA分子のヌクレオチド配列中のコドンは、それによってコードされているアミノ酸を維持しつつ、特定の植物の好みに適合するように変えることができる。少なくとも35%、好ましくは45%以上のGC含有量を持つコード配列から、植物での高発現が最良に達成できる。低GC含有量のヌクレオチド配列は、メッセージを不安定化し得るATTTAモチーフ、そして不適切なポリアデニル化を惹起し得るAATAAAモチーフが存在するためうまく発現しない。好ましい遺伝子配列は単子葉植物と双子葉植物種の両方で充分発現されるが、配列は、特定のコドンの好みならびに単子葉植物または双子葉植物のGC含有量の傾向を考慮して修飾することができる。何故ならこれらの好みは相違することが示されているためである（Murray et al. (1989) Nucl Acids Res 17: 477-498)。加えて、メッセージの末端切除を惹起する異常スプライス部位の存在について、このヌクレオチド配列をスクリーニングする。上記のようなヌクレオチド配列内部でなされることが求められる変化の全ては、位置指定突然変異誘発、PCR、ならびに、例えば公開されている特許出願EP 0 385 962、EP 0 359 472、およびWO 93/07278（これらの開示の全体は引用によりここに含める）に記載の方法を用いた合成遺伝子構築といった周知の技術を用いて実施する。
【０２３７】
翻訳を有効に開始させるため、開始メチオニンに隣接する配列は修飾が必要であるかも知れない。例えば、これらは植物において有効であることが分かっている配列を含めることにより修飾できる。Joshiは植物のための適当なコンセンサスを示唆しており（Nuc Acids Res (1987) 15:6643-6653）、さらなるコンセンサス翻訳イニシエーター(Clontech 1993/1994 catalog, page 210）を含めることができる。これらのコンセンサス配列は本発明に係るヌクレオチド配列と共に使用するのに適している。この配列は、ATGまで（これを含む)(第二のアミノ酸は修飾しないでおく）、或いはATGの後のGTCまで（これを含む)(トランスジーンの第二のアミノ酸を修飾する可能性がある）のヌクレオチド配列を含む構築物中に組み込む。
【０２３８】
遺伝子産物をターゲッティングするための様々なメカニズムが植物に存在することが分かっており、これらのメカニズムの機能を調節する配列が、幾分詳細に特性決定されている。例えば、葉緑体への遺伝子産物ターゲッティングは、葉緑体へと運ばれる間に開裂して成熟タンパク質を生成する、種々のタンパク質のアミノ末端に見出される一時的配列によって調節される（Comai et al. (1988) J Biol Chem 263: 15104-15109)。別の遺伝子産物は、ミトコンドリアやペルオキシソームのような他の細胞小器官に局在する（ Unger et al. (1989) Plant Mol Biol 13:411-418)。これらの生成物をコードしているcDNAを操作して、ヘテロローガス遺伝子産物をこれらの細胞小器官へとターゲッティングすることができる。加えて、遺伝子産物を他の細胞コンパートメントにターゲッティングする配列が特性決定されている。
【０２３９】
アミノ末端配列は、ER、アポプラストへのターゲッティング、およびアリューロン細胞からの細胞外分泌を担っている（Koehler & Ho (1990) Plant Cell 2:769-783)。さらに、カルボキシ末端配列と共にアミノ末端配列は、遺伝子産物の液胞ターゲッティングを担っている（Shinshi et al., (1990) Plant Mol Biol 14:357-368)。上に述べた適当なターゲッティング配列を目的のトランスジーン配列と融合させることにより、トランスジーン生成物を所望の細胞小器官または細胞コンパートメントへと向かわせることが可能である。
【０２４０】
別の好ましい態様では、本発明に係るDNA分子を直接プラスチドゲノム中に導入する。プラスチド形質転換技術は米国特許Nos. 5,451,513、5,545,817、5,545,818および5,576,198; PCT出願nos. WO 95/16783およびWO 97/32977；ならびにMcBride et. al., Proc Natl Acad Sci USA 91: 7301-7305 (1994)(これらの全開示は引用によりここに含める）に詳細に記載されている。或る態様では、プラスチド形質転換は、バイオリスティクスで達成し；まず単細胞緑藻類Chlamydomonas reinhardtiiで実施し (Boynton et al. (1988) Science 240:1534-1537)) 次にNicotiana tabacumに拡大し (Svab et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:8526-8530)、シス作動性抗生物質耐性遺伝子座についての選択（スペクチノマイシンまたはストレプトマイシン耐性）または非光合成突然変異表現型の補完についての選択と組み合わせる。
【０２４１】
別の態様では、抗生物質耐性選択マーカーに隣接するクローンプラスチドDNAを用いて、葉もしくはカルス組織の粒子衝突、またはプロトプラストによるプラスミドDNAのポリエチレングリコール（PEG）仲介取り込みによって、タバコプラスチド形質転換を実施する。ターゲッティング配列と命名された1ないし1.5kbフランキング領域は、プラスチドゲノムとの相同的組換えを促進し、156kbタバコプラスチドゲノムの特異的領域の置換または修飾を可能にする。最初に、スペクチノマイシンおよび/またはストレプトマイシンに対する耐性を付与するプラスチド16S rDNAおよびrps12遺伝子における点突然変異を、形質転換のための選択マーカーとして利用し（Svab et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:8526-8530; Staub et al. (1992) Plant Cell 4:39-45、これらの開示全体を引用によりここに含める）、およそ100回の標的葉の衝突につき1回の頻度で安定なホモプラスミック形質転換体を得た。これらのマーカー間のクローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のためのプラスチドターゲッティングベクターの創出を可能にする (Staub et al. (1993) EMBO J 12:601-606、この開示全体を引用によりここに含める）。劣性rRNAまたはrタンパク質抗生物質耐性遺伝子を優性選択マーカー、スペクチノマイシン無毒化酵素アミノグリコシド-3'-アデニルトランスフェラーゼをコードしている細菌aadA遺伝子で置換することにより、形質転換頻度の実質的増大を達成した(Svab et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 913-917、この開示全体を引用によりここに含める）。かつてこのマーカーは、緑藻Chlamydomonas reinhardtiiのプラスチドゲノムの高頻度形質転換に成功裏に用いられていた(Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl Acids Res 19, 4083-4089、この開示全体を引用によりここに含める）。近年、タバコおよびコケ類Physcomitrella由来のプロトプラストのプラスチド形質転換が、PEG仲介DNA取り込みを用いて達成されている(O'Neill et al. (1993) Plant J 3:729-738; Koop et al. (1996) Planta 199:193-201、これらの開示全体を引用によりここに含める)。
【０２４２】
粒子衝突とプロトプラスト形質転換は共に本発明の状況において適当である。油料種子植物のプラスチド形質転換がArabidopsisおよびBrassica属で成功裏に実施された(Sikdar et al. (1998) Plant Cell Rep 18:20-24; PCT出願WO 00/39313、これらの全開示を引用によりここに含める)。
【０２４３】
本発明に係るDNA分子を、植物プラスチド中でこのDNA分子を発現できるプロモーターを含むプラスチド発現カセット中に挿入する。植物プラスチド中での発現が可能な好ましいプロモーターは、例えばプラスチド遺伝子のコード領域の上流の5'フランキング領域から単離したプロモーターであり、これは同じまたは異なる種から誘導したものであってよく、その天然の産物は、非緑色組織に存在するものを包含する大多数の種類のプラスチドに典型的に見出される。プラスチドにおける遺伝子発現は核遺伝子発現とは異なり、原核生物における遺伝子発現に関連している(Stern et al. (1997) Trends in Plant Sci 2:308-315、この全開示を引用によりここに含める)。
【０２４４】
プラスチドプロモーターは一般に、原核生物プロモーターに典型的な-35および-10要素を含み、PEP（プラスチドコード化RNAポリメラーゼ）プロモーターと呼ばれる幾つかのプラスチドプロモーターは、大抵プラスチドゲノム中でコードされているE.coli様RNAポリメラーゼによって認識され、一方、NEPプロモーターと呼ばれる別のプラスチドプロモーターは核コード化RNAポリメラーゼによって認識される。いずれのタイプのプラスチドプロモーターも本発明にとって好適である。プラスチドプロモーターの例は、clpP遺伝子のプロモーター、例えばタバコclpP遺伝子プロモーター (WO 97/06250、この全開示を引用によりここに含める) およびArabidopsis clpP遺伝子プロモーター (米国出願No. 09/038,878、この全開示を引用によりここに含める）を包含する。植物プラスチドにおいてDNA分子の発現を可能にする別のプロモーターは、プラスチド16SリボソームRNAオペロンの調節領域由来のものである（Harris et al., (1994) Microbiol Rev 58:700-754; Shinozaki et al. (1986) EMBO J 5:2043-2049、これらの全開示を引用によりここに含める）。植物プラスチドにおいてDNA分子の発現を可能にするプロモーターの別の例は、psbAプロモーターまたはam rbcLプロモーターを包含する。プラスチド発現カセットは、好ましくは、本発明に係るDNA分子と機能的に連結したプラスチド遺伝子3'非翻訳配列（3' UTR）をさらに含む。非翻訳配列の役割は、好ましくは転写の終止ではなく転写されたRNAの3'プロセシングを指令することである。好ましくは、この3' UTRはプラスチドrps16遺伝子3'非翻訳配列、またはArabidopsisプラスチドpsbA遺伝子3'非翻訳配列である。さらなる好ましい態様では、プラスチド発現カセットは、3'非翻訳配列の代わりにポリG列を含む。プラスチド発現カセットはまた、好ましくは、本発明に係るDNA分子に機能的に連結した、植物プラスチド中で機能的な5'非翻訳配列（5' UTR）をさらに含む。
【０２４５】
プラスチド発現カセットはプラスチド形質転換ベクター中に含まれるが、これは好ましくは、相同的組換えによるプラスチドゲノム中への組み込みのためのフランキング領域をさらに含む。プラスチド形質転換ベクターは所望により少なくとも1個のプラスチド複製起点を含む。本発明はさらに、該DNA分子が該植物プラスチド中で発現され得る、係るプラスチド形質転換ベクターによって形質転換された植物プラスチドを包含する。本発明はさらに、この植物プラスチドを含む植物または植物細胞（その子孫を包含する）を包含する。好ましい態様では、その子孫を包含する該植物または植物細胞は、トランスジェニックプラスチドについてホモプラスミックである。
【０２４６】
植物プラスチドにおいてDNA分子の発現をさせることができるその他のプロモーターには、好ましくは該植物または発現が行われる植物細胞の細胞下小器官または構成成分に関してヘテロローガスである、トランスアクチベーターの調節を受けるプロモーターがある。これらの場合、トランスアクチベーターをコードしているDNA分子を適当な核発現カセット中に挿入し、これを植物核DNAに導入する。このトランスアクチベーターはプラスチド一過性ペプチドを用いてプラスチドにターゲッティングする。トランスアクチベーターとトランスアクチベーターにより駆動するDNA分子は、選択したプラスチド形質転換された系統を、プラスチドターゲッティング配列が補完された核プロモーターに機能的に連結しているトランスアクチベーターをコードしているDNA分子を含むトランスジェニック系統と交雑することによって、または、所望DNA分子を含むプラスチド形質転換ベクターを、核プロモーターに機能的に連結したプラスチドターゲッティング配列を補完したトランスアクチベーターをコードしているDNA分子を含むトランスジェニック系統中に導入することによって、一諸にする。核プロモーターが誘導的プロモーター、とりわけ化学誘導的プロモーターである場合、植物プラスチド中でのDNA分子の発現は化学的インデューサーを葉に適用することで活性化される。このような誘導的トランスアクチベーター仲介プラスチド発現系は、しっかりと調節ができ、誘導前には検出可能な発現が無く、誘導後には極めて高いタンパク質の発現と蓄積のあることが好ましい。好ましいトランスアクチベーターは、例えばウイルスRNAポリメラーゼである。このタイプの好ましいプロモーターは、単一サブユニットRNAポリメラーゼにより認識されるプロモーター、例えばバクテリオファージT7 DNA依存RNAポリメラーゼにより認識されるT7遺伝子10プロモーターである。T7ポリメラーゼをコードしている遺伝子を好ましくは核ゲノム中に導入し、このT7ポリメラーゼをプラスチド一過性ペプチドを用いてプラスチドにターゲッティングする。遺伝子、例えばT7ポリメラーゼのようなウイルスRNAポリメラーゼをコードしている遺伝子の核発現に好適なプロモーターは上記および本出願の他所に記載がある。プラスチドにおけるDNA分子の発現は構成的であっても誘導的であってもよく、係るプラスチド発現もまた器官または組織特異的であってよい。種々の発現系の例はWO 98/11235に詳細に記載されており、この全開示を引用によりここに含める。したがって或る側面では、本発明は、例えば米国特許No. 5,614,395（この全開示を引用によりここに含める）に記載のように、T7遺伝子10プロモーター/ターミネーター配列により調節される葉緑体リポータートランスジーンと機能的に連結した、化学誘導的PR-1aプロモーター、例えばタバコのPR-1プロモーターの調節下に、葉緑体ターゲッティングファージt7 RNAポリメラーゼの核ゲノムにおける共役発現を利用した。別の態様では、母系遺伝したTR遺伝子についてホモプラスミックなプラスチド形質転換体を、核でT7ポリメラーゼを発現する系統により授粉させる時、両方のトランスジーン構築物を持つが、PR-1aインデューサー化合物であるベンゾ(1,2,3)チアジアゾール-7-カルボチオ酸S-メチルエステル（BTH）の葉への適用により、プラスチドにおける酵素的に活性なタンパク質の大量合成が誘発されるまではそれが発現されないF1植物が得られる。
【０２４７】
好ましい態様では、2またはそれ以上の遺伝子、例えばTR遺伝子をオペロン様ポリシストロン遺伝子中の1個のプロモーター由来のプラスチドゲノムから転写する。好ましい態様では、このオペロン様ポリシストロン遺伝子は、オペロン様ポリシストロン遺伝子中の2個の遺伝子の間に介在DNA配列を含んでいる。好ましい態様では、このDNA配列は、プラスチド配列との相同的組換えを回避するため、プラスチドゲノムには存在しない。別の好ましい態様では、このDNA配列を、非真核生物遺伝子の5'非翻訳（UTR）領域から、好ましくはウイルス5'UTRから、好ましくはバクテリオファージ、例えばT7、T3またはSP6ファージから誘導した5'UTRから誘導する。好ましい態様では、オペロン様ポリシストロン遺伝子のRNA転写物において、例えば該DNA配列と下流遺伝子のRBSの間にRNA二次構造の形成を妨げるために、このDNA配列の一部を修飾できる。このような二次構造は下流遺伝子の発現、とりわけ翻訳の開始を阻害または抑制できる。このようなRNA二次構造は、「mfold」プログラムバージョン3（Zuker and Turner, Washington University School of Medicine, St-Louis, MOより入手できる) のようなコンピューターモデルおよびプログラムならびに当業者の知悉するその他の方法を用いて融点を測定することにより予想する。
【０２４８】
オペロン様ポリシストロン遺伝子中の介在DNA配列の存在は下流遺伝子のRBSの利用可能性を増大させ、したがって高い発現速度をもたらす。このような戦略は、オペロン様キメラ遺伝子中の単一プロモーター由来のプラスチドゲノムから転写される任意の2またはそれ以上の遺伝子に適用できる。
【０２４９】
植物の形質転換に利用できる形質転換ベクターが当業者に多数知られており、本発明に関連する遺伝子をこのような任意のベクターと共に使用することができる。ベクターの選択は好ましい形質転換技術および形質転換される標的の種に依存する。或る標的の種については異なる抗生物質または除草剤選択マーカーが好ましいかも知れない。
【０２５０】
形質転換で常套的に用いられる選択マーカーは、カナマイシンおよび関連抗生物質に対する耐性を付与するnptll遺伝子（Messing & Vieirra. (1982) Gene 19:259-268; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187)、除草剤ホスフィノスリシンに対する耐性を付与するbar遺伝子 (White et al. (1990) Nucl Acids Res 18: 1062; Spencer et al. (1990)Theor Appl Genet 79:625-631)、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子 （Yanofsky, et al. (1992) Gene 117:161-167)、メソトレキサートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子 (Bourouis et al., EMBO J. 7:1099-1104 (1983))、グリホサートに対する耐性を付与するEPSPS遺伝子 (米国特許Nos. 4,940,935および5,188,642)、および通常は植物毒性である糖マンノースに対する耐性を付与するマンノースホスファートイソメラーゼ遺伝子pmi (Negrotto, et al. (2000) Plant Cell Rep 19:798-803）を包含する。
【０２５１】
Agrobacterium tumefaciensを使用する形質転換には多くのベクターが適している。これらは典型的には少なくとも1個のT-DNA境界配列を持ち、pBIN19（Bevan, (1984) Nucl Acids Res)およびpXYZのようなベクターを包含する。Agrobacteriumの形質転換に好適な典型的ベクターは、バイナリーベクターpCIB200およびpCIB2001、ならびにバイナリーベクターpCIB10およびそのハイグロマイシン選択誘導体である（米国特許No. 5,639,949)。
【０２５２】
Agrobacterium tumefaciensを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクターにおけるT-DNA配列の必要性を回避する。その結果、これらの配列を欠くベクターを、上記のT-DNA含有ベクターのようなベクターの代替として使用できる。Agrobacteriumに依拠しない形質転換技術には、粒子衝突、プロトプラスト取り込み、例えばPEGおよび/または電気穿孔、ならびにマイクロインジェクションがある。ベクターの選択は、形質転換を受ける好ましい種の選択にほぼ依存する。非Agrobacterium形質転換に好適な典型的ベクターはpCIB3064、pSOG1 9、およびpSOG35を包含する (米国特許No. 5,639,949)。
【０２５３】
目的のコード配列を発現系にクローニングしたならば、これを植物細胞に導入する。植物の形質転換と再生の方法は当分野で周知である。例えばTiプラスミドベクターが外来DNAのデリバリーに利用されており、DNAの直接取り込み、リポソーム、電気穿孔、マイクロインジェクション、およびマイクロプロジェクタイルもまた利用されている。さらに、Agrobacterium属由来の細菌を植物細胞の形質転換に利用することもできる。
【０２５４】
双子葉植物の形質転換技術は当分野で周知であり、Agrobacteriumに基づく技術とAgrobacteriumを必要としない技術を包含する。非Agrobacterium技術は、プロトプラストまたは細胞による外因性遺伝物質の直接的取り込みを含む。これはPEGまたは電気穿孔仲介取り込み、粒子衝突仲介デリバリー、またはマイクロインジェクションによって達成する。いずれの場合にも、形質転換を受けた細胞を当分野で既知の標準技術を用いて全植物体に再生する。
【０２５５】
多くの双子葉植物および単子葉植物種を形質転換する方法が当分野でよく知られている。好ましい技術は、PEGまたは電気穿孔技術を用いるプロトプラスト中への直接的遺伝子移動、カルス組織中への粒子衝突、ならびにAgrobacterium仲介形質転換を包含する。
【０２５６】
さらに、当分野で周知の技術を用いて候補変異体ライブラリータンパク質を融合タンパク質として製造することもできる。例えば、変異体タンパク質を該タンパク質の発現を増大させまたは安定化する他のタンパク質に融合させることができる。同様に、他の融合相手、例えば抗体、ライブラリー成員を細胞の細胞下または細胞外コンパートメントに局在させるターゲッティング配列、ライブラリータンパク質またはそれをコードしている核酸のいずれかを精製または単離可能とする救出配列もしくは精製タグ、安定性または分解からの防御を付与する安定性配列、リポーター、検出および選択遺伝子もしくはタンパク質を包含する融合タンパク質、またはこれらの組み合わせ、ならびに必要に応じてリンカー配列が使用できる。
【０２５７】
好ましい態様では、候補変異体タンパク質または候補変異体ライブラリータンパク質を発現後に精製または単離する。試料中にどのような他の成分が存在するかに応じて、当業者の知悉する様々な方法で変異体タンパク質を単離精製できる。標準的精製法は、電気泳動、分子、免疫およびクロマトグラフィー技術（イオン交換、疎水性、アフィニティー、および逆相HPLCクロマトグラフィーを包含する）、ならびにクロマトフォーカシングを包含する。タンパク質濃度に関連した限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もまた有用である。適当な精製技術の一般的指針については、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlan, NY (1982）を参照されたい。必要な精製の程度はその変異体タンパク質の用途に依存する。幾つかの例では精製は必要ない。
【０２５８】
製造したならば、この変異体TRタンパク質は実験的に試験しインビボおよびインビトロ検定で評価できる。適当な検定は、一次および二次スクリーニング検定ならびに精製タンパク質動態パラメータ、即ちKcatおよびKmの特性決定を包含する。(図11および12を参照されたい）。
【０２５９】
製造したならば、この本発明に係る変異体TRタンパク質および核酸は幾つかの適用に用途が見出せる。好ましい態様では、この変異体TRを使用して、小麦、ライ麦および大麦中のグルテンの抗原性を低下させる。
【０２６０】
別の態様では、変異体TRを使用して、蛇毒、ミツバチ、サソリおよび細菌神経毒破傷風およびボツリヌス中毒に見られる毒性タンパク質のジスルフィド結合を還元する。
【０２６１】
好ましい態様では、変異体TRを使用して代替基質を還元する。チオレドキシンレダクターゼのための有用な代替基質は、チオレドキシンドメインを含むことが判明した幾つかの植物および哺乳動物タンパク質を包含する。例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）はチオレドキシンに相同的な内部配列を示す2個の領域を含んでいる。PDIはチオレドキシンレダクターゼの基質である。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼは、ウシ（Yamauchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:1485-1492, 1987)、ニワトリ（Parkkonen et al., Biochem. Zn 256:1005-1011, 1988)、ヒト (Rapilajaniemi et al. EMBO J. 6:643-649 1987)、マウス (Gong, et al., Nucleic Acids Res. 16:1203, 1988)、ウサギ (Fliegel et al., J. Biol. Chem. 265:15496-15502, 1990)、およびラット (Edman et al., Nature 317:267-270, 1985）といった哺乳動物供給源から同定されている。PDIは酵母から単離された (Tachikawa et al., J. Biochem. 110:306-313)。適当なPDIはWO9501425公開19950112およびWO9500636公開19950105、ならびにヒトおよび植物型を包含する当分野で既知のその他のPDIに見出すことができる。
【０２６２】
チオレドキシンレダクターゼの基質である酸化還元剤、例えばチオレドキシンおよびPDIの組成物および用途は当分野で既知であり、本明細書に記載してある。ジスルフィド結合は、酵素、構造タンパク質などといった多くの種類のタンパク質に存在している。酵素とはプロテアーゼ、アミラーゼなどといった触媒タンパク質であり、一方構造タンパク質とはケラチンなどのような硬タンパク質であってよい。体毛、羊毛、皮膚、皮革、獣皮、食品、飼料中のタンパク質物質は染料であり、ヒト組織はジスルフィド結合を含む。PDIおよびチオレドキシン、および酸化還元相手による、これらの物質のうち幾つかの処理が過去に記載されている。例として、人間および動物の体毛にウェーブを付け、まっすぐにし、除去しそして柔らかにするためのチオレドキシンの使用がEP183506およびWO8906122に記載されている。米国特許4771036はまた、白内障の防止および逆転のためのチオレドキシンの使用を記載している。生体反応において金属で触媒される酸化的損傷を防止するためのチオレドキシンの使用がPigiet et al. EP 237189に記載されている。EP272781およびEP276547はそれぞれ人間の体毛の配置変更、および羊毛の処理のためのPDIの使用を記載している。このような酵素の使用は全て、遊離のタンパク質スルヒドリル基へのタンパク質ジスルフィド結合の還元および/または同一ポリペプチド内でのまたは異なるポリペプチド間でのジスルフィド結合の再配置と関連している。したがって、本発明に係るチオレドキシンレダクターゼを、所望によりその補助因子NADHまたはNADPHと共に酸化還元相手としての係る組成物に添加し、その酸化還元剤を再生し、そのようにしてその組成物の有用性を向上させることができる。これに代わる態様では、本発明に係るチオレドキシン変異体を、本明細書に教示する酸化還元剤とのタンパク質融合物として提供する。例えばこの組成物は、硬タンパク質、特に体毛、皮膚および羊毛の処理または分解のために、獣皮の除毛および軟化のために、洗剤添加物として織物の処理およびクリーニングのために、食品および飼料の濃厚化およびゲル化のために、パンまたはペストリー製品中のグルテンの強化のために、そして眼の苦痛を軽減する医薬として使用できる。本発明に係る組成物、特にPDIとの組成物を、分子間タンパク質ジスルフィド架橋を生成する物質を含有する他のタンパク質と共に使用して、高分子量またはゲル化した組成物を得ることができる。したがって本発明は、生魚肉ペースト、蒲鉾（フィッシュケーキ）、魚肉/畜肉ソーセージ、豆腐（大豆カード）、麺類、菓子類、パン、練り生地、食品接着剤、シート様肉食品、ヨーグルト、ゼリーおよびチーズといった食品加工の分野で使用できる。加えてこれらは、化粧品、マイクロカプセルの素材および固定化酵素の担体を包含する広範囲の工業における新規なタンパク質由来材料として使用できる。
【０２６３】
好ましい態様では、変異体TR-オレオシン-チオレドキシンおよびオレオシン-変異体チオレドキシンレダクターゼ融合タンパク質は、油体と共に蓄積する。別の態様では、オレオシン-チオレドキシン/変異体チオレドキシンレダクターゼハイブリッド融合タンパク質は、油体と共に蓄積する。この油体を分画して融合タンパク質の部分精製を達成できる。融合タンパク質の付随する精製された油体は、チオレドキシンおよびチオレドキシン-レダクターゼ活性ならびに皮膚（化粧品）または食品用途の適用における機能的利益を試験するための成分として使用できる。油体は化粧品および食品成分にとって極めて好適な加工および調合性質を持っている。故に、油体と結びついたオレオシン融合物としてチオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼをデリバリーすることは、加工を単純にし、そして製品の安定性を増大させる。
【０２６４】
別の態様では、油体からチオレドキシンまたはチオレドキシンレダクターゼを精製するため、第二の精製工程を実施できる。この事は、チオレドキシンおよびチオレドキシンレダクターゼの活性を試験するための、そして化粧品または食品用途における機能的利益を提供するための成分として使用できる、該タンパク質の高度精製調製品を導く。米国特許公開No. 2002/0037303をも参照されたい（引用によりここに含める）。
【０２６５】
本明細書に論ずるその他の調合物および組成物、例えば油体の態様に加えて、本発明に係る組成物は可溶性チオレドキシンレダクターゼおよび/または酸化還元剤、ならびに当分野で既知のその他の成分、例えば賦形剤、安定剤、増量剤、洗浄剤などを含有できる。この組成物は任意の簡便な形態、例えば粉末、ペースト、液体または顆粒形態として調合できる。この酵素は酵素安定剤を含有させることによって液体で安定化させることができる。通常、この組成物の溶液のpHは5-10、幾つかの例では7.0-8.5である。用途に応じてしばしば無菌組成物が好ましい。
【０２６６】
さらに、家畜飼料中の穀物および穀物由来製品の品質もまた、分子間および分子内ジスルフィド結合による影響を受ける。穀物の消化性、栄養利用性、および抗栄養因子（例えばプロテアーゼ、アルニラーゼインヒビターなど）の中和は、ジスルフィド結合の程度を低下させることによって増大するであろう。(1999年12月15日出願のWO 00/36126を参照されたい)。トウモロコシおよび大豆における、所望によりチオレドキシンを伴うトランスジェニックチオレドキシンレダクターゼ変異体の発現ならびに穀物加工、例えば湿潤製粉の際のチオレドキシンレダクターゼの使用は、工業的加工中またはこれに先立って種子タンパク質中のジスルフィド結合を還元する代替法を提供する。故に本発明は、貯蔵タンパク質の品質が変化した穀物、および、工業的加工の際または動物が消化する際（いずれも以降「加工」と称する）通常穀物とは質的に異なる挙動をする穀物を提供する。所望によりチオレドキシンを伴うこのチオレドキシンレダクターゼのデリバリー法は、加工中に添加するための外因性チオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼ供給源を創出する必要性を排除する。穀物を介してチオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼを供給する第二の利点は、加工前にまたは余分な加工工程として、当該種子の貯蔵またはマトリックスタンパク質と該酵素を接触させるために種子の完全性を物理的に破壊する必要がないことである。本明細書に記載する発明は、全ての穀物収穫物、特にトウモロコシ、大豆、小麦、および大麦、最も具体的にはトウモロコシおよび大豆、とりわけトウモロコシに適用できる。所望によりチオレドキシンを伴うトランスジェニックチオレドキシンレダクターゼの穀物における発現は、穀物加工に移行する材料（種子）の品質を変え、穀物加工から誘導される材料の品質を変え、加工中の特定種子成分の収量を最大化し（効率を増大させ）、加工方法を変え、そして製粉の流れから種子由来部分または成分の新たな用途を作り出す手段である。したがって本発明は、好ましくは誘導性プロモーターの調節下に、例えば誘導性プロモーターと機能的に連結した、またはトランスアクチベーターにより調節されるプロモーターの調節下に（ここで、対応するトランスアクチベーターは該誘導性プロモーターの調節下にあるか、または第二の植物中で発現され該プロモーターがこの第二植物とのハイブリダイゼーションにより活性化される）、所望によりチオレドキシンを伴うチオレドキシンレダクターゼ変異体を発現する植物（ここでTRは好ましくは熱安定性でありまたは真核生物レダクターゼであり；係る植物はその種子をも包含し、この種子は所望により処理（例えば下処理または被覆されている）および/または包装され、例えば使用説明書と共に袋に入れられている）、および、そこから収穫した、例えば上記の製粉工程で使用するための種子を提供するものである。本発明に係るトランスジェニック植物は所望によりNADPHまたはNADHの生産を増強する遺伝子をさらに含む。
【０２６７】
さらに本発明は、上記の植物から収穫した種子から澱粉またはタンパク質を抽出することを含む、澱粉および/またはタンパク質を生成するための方法；および上記のチオレドキシンレダクターゼ発現植物由来の種子を浸漬し、澱粉および/またはタンパク質をそこから抽出することを含む、湿潤製粉のための方法を提供する。例えば好熱性生物、例えばarchea由来の、例えばMethanococcus jannaschiiまたは本明細書に記載のArchaeglobusfulgidus由来の熱安定性酵素が好ましい。穀物における、所望によりチオレドキシンを伴うトランスジェニックチオレドキシンレダクターゼ変異体の発現はまた、特に動物飼料における消化性に関連する穀物の性質の改善に有用である。プロテアーゼに対する飼料タンパク質の感受性は時間とタンパク質コンホメーションの関数である。飼料調合物にはしばしば穀粒の挽き割りが用いられ、蒸気による薄片化もまた使用される。これらのプロセスはいずれも穀粒の消化性を助ける事を目的としている。その完全性が動物の胃内でより容易に破壊され得る軟穀粒が望ましい。コンホメーション制約およびタンパク質間の架橋がプロテアーゼ感受性の主たる決定要因である。増大させたチオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼ発現によりこれらの結合を修飾改変することは消化を助ける。タンパク質の含有量と質は薄片化粗粉の生産とmasaの生産の重要な決定要因である。ジスルフィド結合の還元は、小麦代用品、特に高タンパク質白色トウモロコシ変種から製造した粉としての使用に好適なようにトウモロコシ粉の性質を変化させる。米国の大豆収穫量の半分以上が粉砕または製粉されており、得られる低脂肪大豆粉または脱脂大豆粉（または大豆ミール）中のタンパク質の質はその後の加工にとって重要である。大豆加工の流れからのタンパク質の収量と質は経済的に重要であり、主としてタンパク質のコンホメーションに依存している。トランスジェニックチオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼの発現によるチオレドキシン活性の増大はタンパク質の溶解度を増大させ、よって水溶性タンパク質画分で収量を増加させる。回収は塩基性条件下での脱脂大豆ミールの水性抽出によって促進する。トランスジェニックチオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼの発現によるチオレドキシン活性の増強はまた、効率的抽出に必要なpHを低下させ、それにより水酸化カルシウムまたは水酸化ナトリウム投入量を減らし、後の酸沈殿化のための酸投入量をも低下させ、アルカリ損傷のない効率的なタンパク質回収を可能にし、水消費とプラント廃水（これは実質的な生物学的酸素要求量の負荷を含む）処理を減らす。タンパク質の酸化還元状態は、大豆タンパク質が供給する重要な機能的性質、例えば溶解度、吸水性、粘度、粘着/接着、ゲル化および弾性に影響を及ぼす。大豆タンパク質濃縮液の生産と、大豆タンパク質単離物のプロテアーゼによる加水分解の間の繊維除去は、本明細書に記載のチオレドキシン活性の増大によって向上する。同様に、トウモロコシについて上に述べたように、トランスジェニックチオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼの発現によるチオレドキシン活性の増大は、酵素活性大豆粉の機能性と、動物飼料中の大豆ミール画分および蒸気薄片化画分の消化性を向上させる。種子の発生の間の、そして加工の間のタンパク質品質の修飾もまた提供されるが、種子発生中のチオレドキシン活性の結果遭遇する可能性のある貯蔵タンパク質蓄積に及ぼす著しい副作用を回避するため、このトランスジェニックチオレドキシンおよび/またはチオレドキシンレダクターゼは細胞コンパートメントにターゲッティングされ、且つ上記のように熱安定性であることが好ましい。これとは別にこのチオレドキシンレダクターゼ変異体、および所望によりチオレドキシンは、加工用酵素として（または本明細書で教示する融合物として）添加することができるが、それは、（トウモロコシ湿潤製粉とは対照的に）ジスルフィド結合の破壊は穀粒の完全性破壊（粉砕および油抽出）後まで必要ないためである。上に述べたようにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）もまたチオレドキシンにとって有用である。
【０２６８】
TRと共に油体を使用することに関して、「Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products」なる標題のUS20020037303（公開20020328）を引用してここに含める。
【０２６９】
種子と増加のための本発明に係る酵素のさらなる用途をWO0058453（公開20001005）に見出すことができる。チオレドキシンレダクターゼ変異体は、種子と穀物の品質向上のための本明細書に記載の用途のため、所望によりチオレドキシンと共に発現され、または外部から添加することができる。興味深いトランスジェニック植物は、大麦、小麦、Arabidopsis、タバコ、米、Brassica、Picea、または大豆、トウモロコシ、カラス麦、ライ麦、モロコシ、キビ、ライコムギ、ならびにまぐさおよび芝を包含する。本発明に係るトランスジェニック植物は、同種の非トランスジェニック植物の同部分に比して低下したアレルゲン性を持ち得る。このアレルゲン性は過敏性であってよく、この過敏性が少なくとも5%低下している。さらに、本発明に係るトランスジェニック植物は、同種の非トランスジェニック植物の同部分に比して増大した消化性を持ち得る。この消化性は少なくとも5%増大している。トランスジェニック植物は、同種の非トランスジェニック植物の同部分に比してジベレリン酸誘導酵素の早期発現開始および/または増大した発現のある、該植物の少なくとも一部を持ち得る。好ましくは該酵素は、プルラナーゼ、α-アミラーゼである。この植物の一部分は好ましくは可食部分、より好ましくは穀物または種子である。好ましいプロモーターは種子または穀物の成熟に特異的なプロモーターであり、例えば米グルテリン、米オリジン、米プロラミン、大麦ホルデイン、小麦グリアジン、小麦グルテリン、トウモロコシゼイン、トウモロコシグルテリン、カラス麦グルテリン、モロコシカシリン、キビペニセチン、ライ麦セカリン、およびトウモロコシ胚特異的グロブリンより成る群から選ばれる。その他の態様には、本発明に係るトランスジェニック種子または穀物から製造した食品、飼料または飲料製品がある。この食品、飼料、または飲料は、小麦粉、練り生地、パン、パスタ、クッキー、ケーキ、シックナー、ビール、麦芽飲料、または食品添加物であってよい。この食品、飼料、またはビール製品は、低下したアレルゲン性および/または増大した消化性を持ち得る。さらに、練り生地製品は、同種の非トランスジェニック種子または穀物から製造した練り生地に比して、増大した強度および体積を持ち得る。この食品、飼料、または飲料は超消化性タンパク質および/または超消化性澱粉を持ち得る。この食品、飼料、または飲料は低アレルゲン性となり得る。上記の態様は当分野で知られるように、本発明に係る酵素を外部から添加することによっても達成できる。チオレドキシンによる小麦および乳中のジスルフィドタンパク質アレルゲンの還元がこれらのアレルゲン性を減少させることが示されている。さらにチオレドキシン処理は、他のジスルフィドタンパク質と同様、乳の主要アレルゲン（β-ラクトグロブリン）の消化性を増大させる。食品に外部からチオレドキシンを添加することの利点についてのより詳細な議論は米国特許No. 5,792,506に示されており、これを引用により特にここに含める。この組成物および方法は本発明に係るTR変異体を用いて増強することができる。
【０２７０】
本明細書で論ずるように、本発明に係るタンパク質を使用して食品および飼料中のタンパク質のアレルゲン性を低下させることができる。例えば、チオレドキシンとチオレドキシンレダクターゼならびに外部から加える処理としてのNADPHの使用に関するUS6190723およびその中の参考文献を参照されたい（これは引用により特にここに含める）。感作したイヌを用いて実施した皮膚試験および給餌実験は、摂取前にそれらの食物を処理するとアレルゲン性が取り除かれまたは減少することを示した。したがって、アレルゲン性食品または飼料タンパク質のアレルゲン性を減少させる組成物および方法が本明細書に提供される。食品もしくは飼料タンパク質または該タンパク質もしくはタンパク質群を含有する食品もしくは飼料を、該タンパク質のアレルゲン性の減少にとって有効な、或る量のチオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ、および補助因子、即ちNADPH、NADHまたはそれらの組み合わせと接触させる。その後、接触させたタンパク質を動物または人間に投与でき、ここで、該動物または人間の示したアレルギー性症状が対照に比して減少する。このアレルギー性食品/飼料タンパク質は好ましくは牛肉、牛乳、卵、大豆、米および小麦タンパク質である。チオレドキシンおよびTR変異体を含有し、さらに補助因子を含有する可食食品/飼料製品もまた具体化できる。酵素は外部から添加することができ、または1もしくはそれ以上が単独でもしくは融合物としてトランスジェニックの形でまたは本来存在していてよい。可食食品は、当該処理が原因で好ましくは低アレルゲン性である。この食物製品はペットフードまたはベビーフードまたは調合乳であってよい。この食物製品は牛肉、卵、大豆、小麦または乳タンパク質を含むことができる。これは可食食肉製品であってよい。米国特許5792506およびその参考文献を引用によりここに含める。
【０２７１】
同様に、US6114504では、シスチンを含有する動物および植物タンパク質を還元し練り生地およびベーカリー製品の性質を改善するための組成物および方法を提供しているが、これは、練り生地の成分をチオール酸化還元タンパク質と混合して練り生地を作り、この練り生地を焼いてベーカリー製品を作る工程を含む。本発明方法は好ましくは還元されたチオレドキシンを小麦粉と共に使用するが、これはより強い練り生地とより大きなパンの体積を与える。この方法および組成物は本発明に係るタンパク質を使用して増強される。グルテニンまたはグリアジンタンパク質を還元する方法は、該グルテニンまたはグリアジンタンパク質を含有する液体または物質にチオレドキシンを添加し；チオレドキシンレダクターゼ変異体および補助因子、即ちNADPH、NADHもしくはそれらの組み合わせによってチオレドキシンを還元し、そしてこの還元されたチオレドキシンによってグルテニンまたはグリアジンタンパク質を還元することによる。組成物は、グルテニンまたはグリアジンタンパク質、添加されたもしくは内因性チオレドキシン、添加されたもしくは内因性（トランスジェニック植物由来の場合）チオレドキシンレダクターゼ変異体、および添加された補助因子、即ちNADPH、NADHもしくはそれらの組み合わせを含有する。この方法は、水不溶性または水溶性の種子由来タンパク質の含有を減らすのに有用である。チオレドキシンをこのタンパク質を含有する液体または物質に添加し；チオレドキシンレダクターゼ変異体およびその補助因子、即ちNADPH、NADHまたはそれらの組み合わせによってチオレドキシンを還元することができる。
【０２７２】
本発明はさらに、食品および飼料タンパク質の超消化性を増大させるのに有用である。チオレドキシン還元によって食物タンパク質の消化性を増大させる組成物および方法を提供している米国特許5952034を参照されたい。この方法は本発明に係る酵素を使用することにより増強される。食品の消化性を増大させる組成物および方法は、食品を、その食品の消化性を増大させるのに有効な、或る量のチオレドキシン、チオレドキシンレダクターゼ変異体、およびその補助因子、即ちNADPH、NADHまたはそれらの組み合わせで処理し；所望によりこの処理した食品を動物または人間に投与し、それにより、対照と比較した該動物または人間の示す症状によって測定される該食品の消化性を増大させることを含む。この食品は、好ましくは乳または小麦または卵を含む。上の態様では、チオレドキシンレダクターゼ変異体をチオレドキシンとのタンパク質融合物として提供できる。
【０２７３】
本発明に係る組成物はさらなる用途が見出せる。チオレドキシンおよびその他の酸化還元剤、例えばPDIはストレスと損傷に対する防御に有用であることが知られている。したがって、本発明に係る組成物は係る治療のための酸化還元剤組成物を増強するために使用できる。或る態様では、TR変異体を、ニトロソ化ストレスの操作に使用して、ニトロソ化ストレス防御をアップレギュレートする。US6359004を参照されたい。チオレドキシンはラジカル捕捉剤として働き、よってフリーラジカルに関連する疾病および状態は、好ましくはチオレドキシンと組み合わせた、TR変異体で治療され得る。したがって或る側面では、本発明は、眼疾患、例えば白内障の予防または治療のための組成物および方法を提供する。別の側面では本発明は、酸化的ストレスにより惹起されるまたは構成要素として酸化的ストレスを有する疾病の予防または治療に関するものである。例えば米国特許6379664を参照されたい。或る態様では、TR変異体を好ましくはチオレドキシンと組み合わせて含有する本発明に係る組成物の白内障阻害有効量に眼を接触させることにより、眼の白内障の形成を阻害または逆転させるための組成物および方法が提供される。別の態様では、TR変異体および補助因子と組み合わせたチオレドキシンの眼内注射が網膜の光酸化ストレスを抑制し、そして治療的戦略として網膜の光損傷を防止する。別の態様では、チオレドキシン活性を含む本発明組成物は、急性肺損傷で誘発される虚血-再潅流と酸化的ストレスを治療または最小化するのに有用である。その結果、特に末期肺疾患、例えば嚢胞性線維症、気腫、肺線維症、および肺高血圧症患者の肺移植に用途が見出せる。本発明に係る組成物は移植用臓器の完全性を維持するための保存用組成物としての用途が見出せる。別の態様では、TR変異体と組み合わせたチオレドキシンは一次培養ニューロンのインビトロ生存を促進する。さらに該組成物は、周縁部に神経防御効果を提供して、限局性脳虚血の際の神経損傷を緩和する。該組成物はさらに、神経損傷後またはこれに由来する運動ニューロンの防御および改善を提供する。別の態様では、本発明に係る組成物は虚血-再潅流損傷から網膜を防御する。熱傷もまた本発明に係る組成物で治療できる。チオレドキシンおよびTR変異体は、迅速な抗酸化剤防御を提供し、凝固プロセス、細胞増殖、ならびに細胞防御と密接に結びついた細胞外過酸化物の状態の制御および熱傷の際の創傷治癒を改善する。最後に、本発明に係る組成物は、エプスタイン-バーウイルス（EBV）感染を制圧する良好な候補物質であるチオール-抗酸化物質を提供する。
【０２７４】
TR変異体は、チオレドキシンレダクターゼによりアスコルビン酸へと還元される有害なアスコルビンフリーラジカルおよびデヒドロアスコルビン酸塩を除去することによって直接的な利益が提供できる。したがってTRは直接的抗酸化効果および治療を提供する。該組成物は所望により補助因子を含有できる。
【０２７５】
本明細書に記載の疾病および状態において、TR変異体を単独でまたはチオレドキシンもしくは他の酸化還元剤および補助因子と組み合わせて供給できる。TR変異体は宿主の酸化還元剤と共に、または外部から添加した酸化還元剤と共に作用することができる。
【０２７６】
上記の発明を使用する方法をより詳細に描写するため、そして本発明の様々な態様の実施にとって考え得る最良の形態を開示するため、以下の実施例を供する。これらの実施例は本発明の真の範囲を限定するものでは決してなく、例示目的のために供するものである事が理解できるであろう。U.S.S.N. 60/289,029（2001年5月4日出願）、U.S.SN. 60/370,609（2002年4月5日出願）、およびDesjarlaisおよびMuchhalによる「Novel Nucleic Acids and Proteins with Thioredoxin Reductase Activity」なる標題の仮出願（2002年4月29日出願、出願番号未定）を包含する本明細書に引用した全ての参考文献を、引用によりここに含める。
【実施例】
【０２７７】
実施例1
コンピューターによる変異体タンパク質の設計
概観
改良されたNADH-依存TR活性を持つ変異体を創出するための最初のPDA(登録商標)設計戦略を下に詳説する。一言で言えば、E coliおよびArabidopsis酵素由来の構造情報、ならびに補助因子のコンホメーション多様性を用いて、それぞれ〜2000の組み合わせ成員を有する2つの異なるライブラリー（以後TR-1およびTR-2と称する）を設計した。
【０２７８】
スカホールドタンパク質として使用する野生型TR遺伝子：
1) pET29aにクローニングされたArbidopsis NTR1遺伝子。コードされているタンパク質はN末端Sタグを持つ。このタンパク質はBL21-S1細胞 (塩誘導）またはBL21-Star (IPTG誘導）を用いて発現させ、BugBuster HTを用いて溶菌できる。
2) チオレドキシンj。pDEST-14で合成およびクローニングされ、BL21-S1-Starで発現されたコドン最適化遺伝子。Nおよび/またはC末端Hisタグを付けたものを作製した。C末端Hisタグを付けたTRxを動態決定に使用するためアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【０２７９】
検定：412nmにおけるDTNBの還元生成物形成の連続検出に基づく動態検定。
【０２８０】
「ヒット」の同定および動態特性決定に使用したスクリーニング戦略のさらに詳細な概観を図4に示す。
【０２８１】
全ての動態特性決定ならびに第二および第三階層のスクリーニングのため、精製タンパク質を使用した。必要量の精製タンパク質を産む高スループット法を個別に開発するか、または現存する商業的プロトコルから改変した。これらの方法の片鱗を図5に示す。高スループット培養、誘導、発現、タンパク質精製および酵素特性決定に使用した詳細なプロトコルを下に記載する。
【０２８２】
PDA（登録商標）設計された変異体についての基準点を規定するための、NADHおよびNADPH両基質に関する、精製WT NTR-1酵素（非修飾）の動態パラメータ（KmおよびKcat)。WT酵素は、天然（NADPH）補助因子についてNADHよりも〜4倍高いKcatを持つ（TRタンパク質1μgを使用するVmaxに相当）。さらにNADHのKmはNADPHに比して〜50倍高い。WT酵素についてのデータを図6に示す。
【０２８３】
位置指定突然変異誘発および反復PCRの標準的分子生物学的方法を用いてTRライブラリーを構築した。特異的に突然変異を受けた遺伝子セグメントを表す組み合わせ断片を特異的制限酵素を用いて合した。これらのライブラリーの品質をランダムに選んだクローンの配列および発現分析から評価した。TR-1とTR-2についてのこれらの詳細をそれぞれ図7および8に示す。これらの組み合わせライブラリーに加え、これら2つのライブラリー各々のための個別的C領域の組み合わせ（TR-1について24、TR-2について48）をWTバックボーンで合成し、PDA（登録商標）により同定したこの重要領域の効果を評価し、以降これらのクローンを、TR-3およびTR-4の個別的成員と共に「規定クローン」と称する（下記参照）。
【０２８４】
この2つのライブラリーのコンピューターに関連する記載を図9AおよびBに示す。設計された位置（橙色）および適当なコンホメーションを持つ結合させた補助因子（青または黄色）を明らかにしている。
【０２８５】
これら2つのライブラリーに加えて、さらなる戦略を探求するため幾つかの極めて小さなライブラリーを作製した。TR-3は18の成員を持ち、TR-2スクリーニング由来の最良クローンの結果に基づく細かな調整アプローチとして設計した。TR-4は16の成員を持ち、TRおよびAhpF配列の配列アラインメントに基づくものであった。AhpFは、TRと類似の活性であるNADH依存ペルオキシレドキシンレダクターゼをコードしている。
【０２８６】
これら4つのライブラリーのスクリーニングから得られた結果の要約を図10に示す。
【０２８７】
TR-1ライブラリーのスクリーニングは、WT NTR-1と比較して、NADHを補助因子とする著しく改善されたTR活性を持つクローンを何ら同定しなかった。これは「正しくない」補助因子のコンホメーションを用いた結果であろう。
【０２８８】
TR-2ライブラリーは著しく改善されたNADH依存活性を有する幾つかのクローンを持っていた。異なるC領域配列を持つ2つの最良変異体は「RYN」および「RFN」であった。設計された他の位置での突然変異はTR酵素の全体的性質に著しい影響を及ぼさなかった。以下のスライドはこれらの変異体の多くについての詳細な動態データを示すものである。
【０２８９】
異なる補助因子濃度におけるM-RYN、L-RYNおよびWTの動態パラメータおよび活性をそれぞれ図11AおよびBに示す。これらの変異体はいずれもWTと比較して著しく高いNADH依存活性を有する。さらにこれらは著しく低下したNADPH依存活性を有する。これを「補助因子スイッチ」と称する。2.5mMおよびそれ以上の補助因子濃度では、これらPDA（登録商標）設計されたNTRの両者は、NADHが補助因子であるWT NADPH活性の＞50%を有する。
【０２９０】
これらのクローンの配列アラインメントおよび設計観点からの相対的コンピューター等級付けを図17Aに示す。
【０２９１】
RYNおよびRFNクローン中のNの存在が、可能性あるグルコシル化部位を作り出した。この部位はこれらのクローンの活性プロフィールに著しい影響を及ぼすことなくPDA（登録商標）を用いて「設計された（designed out)」。このためのデータと戦略を下に記載する。
【０２９２】
重大なRRRからRYNへの変化のコンピューターによる表示を図18に示す。
【０２９３】
C領域におけるRYNおよびRFNの組み合わせに加えて、REN、RLN、RRNの組み合わせもまたNADH依存活性を著しく改善した。RRN変異体はまた、そのWTレベルのNADPH依存活性を維持した。このデータを図12にまとめる。さらに、RRT、RYT、RLR、KYN、MYN、QYN C領域変異体もまた改善されたNADH依存活性を示した。
【０２９４】
これらのライブラリーのスクリーニング結果は、補助因子の特異性プロフィールを決定するための、C領域に存在する3個のRRR残基の重要性を強く示している。これらの位置各々における20のアミノ酸の可能な全組み合わせの重要性を扱うため、高複雑性ランダムRRRライブラリーを設計およびスクリーニングして、NADHを伴うそれらの活性について最良の変異体を同定した。3個のR位置の各々においてNNK縮重を有するオリゴヌクレオチドを使用して、32768の成員の理論的組み合わせの可能性を有するこのライブラリーを構築した。
【０２９５】
このライブラリーの小部分のみをスクリーニングしたところ、最良クローンの配列および活性分析は、最初のR位置でのRからWへの突然変異が最も興味深い活性プロフィールを持つことを示した。これは、芳香族アミノ酸の存在を示唆する天然に存在する殆どのNAD(P)H依存性酵素配列のバイオインフォーマティクス分析からも実証される。これは本発明者等を、PDA（登録商標）シミュレーションの間、最初のRが芳香族アミノ酸であらざるを得ないPDA（登録商標）ライブラリーの設計へと導いた。これにより、R1-WおよびWXXと呼ばれる、より小さなさらなる2つのPDA（登録商標）ライブラリーの設計が導かれた。これらの設計のためのコンピューター戦略を下に述べる。
【０２９６】
これら全ての新ライブラリーデザインからの最良のヒットを、2つの補助因子がそれぞれ0.6および1.2mMの時の相対活性について分析した（精製酵素を使用）。それらのKmとKcatも決定し、データをそれぞれ図13AとBに示す。これらのクローンは「高度に改善された」NADH依存TR活性を持つ。それらの改善されたNADH活性に加え、変異体の幾つかは改善されたNADPH依存活性をも有する。これは本質的に、両補助因子についてより良い触媒効率を有するTR変異体の創出を示す。これはさらに、全変異体について数倍高いNADH Kcat値に反映している。NADHについてのKmは、WRTがこの補助因子について2倍低下したKmを持っていることを除けば、改善された変異体の殆どについて不変であった。R1-WおよびWXXライブラリーのいずれかに由来するこのリストの成員を図13Cに示す。R1-Wライブラリー由来の2つの最良クローンのコンピューターモデルを、活性に関して構造上の見通しを得るために図14に示す。
【０２９７】
TRのためのPDA（登録商標）設計プロセスをこのように確認した：
・1.2mMのNADHでWT NADPH活性の50%に等しいまたはこれ以上の活性を有する、5またはそれ以上の変異体。
・少なくとも1個の変異体が、0.6mM NADHにおいてもこの活性の重要条件に適合する。
・これらの変異体の多数が、NADPH活性についても良好な触媒効率を有する。
・最良の変異体はWTに比してNADHについて13倍良好なKcat/Kmおよび2倍低いKmを持つ。
【０２９８】
チオレドキシンレダクターゼR1-Wライブラリー
新たな組のPDA（登録商標）シミュレーションを実施して、Xencorの発見した三つ組み残基の最初の位置に芳香族アミノ酸（F、Y、またはW）を使用することが、NADHおよびNADPHで活性レベルを調節する際に極めて重要であることを評価した（RYN変異体中Rの位置に対応する）。この新たなシミュレーションは、少数のNAD(P)H利用酵素がこの位置に芳香族を含むという知見、および、芳香族とNAD(P)H上のアデニン環の間の積層相互作用の可能性によって誘導された。
【０２９９】
インビトロスクリーニング用の1296の変異体を規定する2010 (1013) の配列のシミュレーションを下に示したライブラリーから得た。補助因子結合にとって重大な残基の構造分析により、10個の位置を選択した。このシミュレーション結果の分析は、10個のうち6個の位置におけるアミノ酸の相違をサンプリングすることにより、適度なサイズの高品質ライブラリーが得られることを明らかにした。
【０３００】
１つの位置はW対Rの状況で、6個の位置に相違がある第4のPDA（登録商標）ライブラリーを以下のように規定する：
2005505250.tif 000003
【０３０１】
このライブラリーの高スループットスクリーニングは以下の高活性WXXクローンを生成した。これらのクローンを、第4のPDA（登録商標）組み合わせライブラリーを示すPDA（登録商標）シミュレーションを行うことによりコンピューターで等級付けた。
【０３０２】
このライブラリー中の1296の可能な配列から、非常に活性なWXXクローンが以下のようにコンピューターで等級付けられる：
LIWRTVI  13/1296            (等級/ライブラリーサイズ)
LIWLSVI  51/1296
LIWMSVI  26/1296
LIWRSVI  46/1296
【０３０３】
これらの等級付けは相対活性を予想しようとするものではないという事に留意されたい。この計算は、構造的に共存可能な補助因子結合ポケット多様性の最も大きな集合を、最も少ない数の配列で定義すべく設計された。このライブラリー成員の全ては、第4ライブラリー中に含まれる6個の位置にある理論上可能な206の配列組み合わせの上位0.001%にあり、104以上の集束効果を証明している。それはさらに、元のシミュレーションに含まれる2010の配列組み合わせに比して少なくとも109の集束効果を構成する。
【０３０４】
これらの等級付けは純粋にNADHとのシミュレーションされた相互作用に基づくものであることにも留意されたい。これらはNADPHのためのまたはこれに対立する酵素の特異性を考慮していない。このプロジェクトの目的はNADPH/NADH特異性を包含しなかったため、2つの補助因子-タンパク質複合体の比較モデル作製は実施しなかった。
【０３０５】
さらなる変異体
R1-Wライブラリーの成功、ならびにシミュレーションおよび研究室でのスクリーニングの両方で第二および第三のR位置にかなりの多様性が観察された事に基づき、Xencorは、全ての可能なWXX組み合わせをサンプリングするための小複雑性（400）ライブラリーを構築した。このライブラリーの高スループットスクリーニングにより、NADHを使用する高活性の変異体、およびNADPHを使用する種々の活性の変異体をさらに幾つか発見するに至った。
【０３０６】
3個のRRR位置にのみ多様性を含む、このライブラリー由来の最良クローン5個を下に列挙する。このライブラリーの設計は先のPDA（登録商標）シミュレーションおよび実験結果の全てに直接影響を受けたが、このライブラリーはPDA（登録商標）シミュレーション自体に基づくものではなかった。したがってこれらの変異体についてのコンピューターによる等級付けは無い。
WIS
WFQ
WVR
WMG
WVG
【０３０７】
RYNチオレドキシンレダクターゼ変異体のコンピューター等級付け
Xencorによって構築されスクリーニングされた第二PDA（登録商標）組み合わせライブラリーを表すPDA（登録商標）シミュレーションを実施することにより、個々の「RYN」クローンをコンピューターで等級付けた。208 (2.5 x 1010) 配列のシミュレーションによって下のライブラリーを得たが、これはインビトロスクリーニング用の2304の変異体を規定する。補助因子結合のための重要残基の構造分析により、8個の位置を選択した。
【０３０８】
8個の位置に多様性を持つ第二PDA（登録商標）ライブラリーを下のように規定する：
2005505250.tif 000004
【０３０９】
このライブラリー中の2304個の考え得る配列から、野生型および高度活性RYNクローンを以下のように等級付ける：
LIGDRRRS (wt)    329
LIGDRYNS              339
LLGDRYNS              698
LMGDRYNS              920
【０３１０】
これらの等級付けは相対活性を予想しようとするものではないという事に留意されたい。この計算は、構造的に共存可能な補助因子結合ポケット多様性の最も大きな集合を、最も少ない数の配列において定義すべく設計された。このライブラリー成員の全ては、第2ライブラリー中に含まれる8個の位置にある理論上可能な208の配列組み合わせの上位0.00001%にあり、107以上の集束効果を証明している。
【０３１１】
これらの等級付けは純粋にNADHとのシミュレーションされた相互作用に基づくものであることにも留意されたい。これらはNADPHのためのまたはこれに対立する酵素の特異性を考慮していない。このプロジェクトの目的はNADPH/NADH特異性を包含しなかったため、2つの補助因子-タンパク質複合体の比較モデル作製は実施しなかった。
【０３１２】
新規なチオレドキシンレダクターゼ変異体
低複雑性ライブラリー。RYN変異体での最初の成功は、このRYN変異体中のアミノ酸を洗練することによりこの変異体のさらなる最適化をXencorに遂行させる動機となり、下に示す極めて小さな18成員ライブラリーを導いた。
2005505250.tif 000005
【０３１３】
このライブラリーのスクリーニングは、RFNの組み合わせが、過去に発見されたRYN変異体と同様の活性を持つことを明らかにした。PDA（登録商標）シミュレーションによれば、このクローンはこのライブラリーの7番目に等級付けられる（RYNは3番目に等級付けられる）。
【０３１４】
非グリコシル化変異体。RYNおよび関連変異体（RYDAFNASKIMQQ）に可能性あるN結合グリコシル化部位（コンセンサスN-X-[T/S]）が偶然に導入されたため、PDA（登録商標）シミュレーションを実行して、RYN変異体においてAsn（N）の2位下流にあるセリン（S）の置換によってこの可能性ある部位を消去できる可能性を評価した。このシミュレーションは、SerからAlaへの置換を包含する幾つかのアミノ酸置換が好ましいことを示し、その後Xencorはこれを実験的に作製および特性決定した。この1位置シミュレーション（NAX）においては、Alaは6番目に、そしてThrおよびSerはそれぞれ1番目および2番目に等級付けられた。実験データは、Ala置換はRYN変異体の活性に検出可能な効果を持たないことを示している。
【０３１５】
RYN-A (339/2304,6/20)  (等級/元のライブラリーサイズ、等級/NAXライブラリーサイズ)
RFN-A (7/18,6/20)
【０３１６】
コンピューターによる戦略
一次目標：NADH対NADPHを効率的に利用するようarabidopsisチオレドキシンレダクターゼの活性を変換。
【０３１７】
戦略の基本的概略
I. 開始モデルを作製
E coli構造 (1TDF) を使用して、NADP補助因子の座標を補助因子座標を包含しないarabidopsis構造 (1VDC）の座標枠に「融合」させる。
【０３１８】
II. 作業用補助因子コンホメーションを規定。
a. NADPからPを除去することにより直接誘導。
b. 種々のNAD利用酵素からのNAD座標の重ね合わせにより間接誘導
【０３１９】
III. 組み合わせライブラリーの可能性を作製するためのPDAシミュレーションを実行。
a. ライブラリー位置を規定。
b. シミュレーションを実行。
c. ライブラリーを作製。
【０３２０】
戦略の詳細な概略
I. 開始モデルの作製
A. 1VDC構造ファイルをプロセシングして、この構造のためのより妥当な番号付け系を創出した（元のバージョンは、その番号がE coli構造に合致するよう非定型的番号付けフォーマットを含んでいた）。
【０３２１】
B. NADP座標を1TDFから1VDCに融合するための構造アラインメント
以下の残基由来のC-アルファを用いてアラインメントを得た：117、119、151-156、174-181、および242-244。これは19の合致した原子について0.48AのRMSDを与える（最大偏差0.89A）。
【０３２２】
C. 最終モデルに関して最小化を行わなかったことに留意されたい。
【０３２３】
II. 作業用補助因子コンホメーションを規定。
A. 1TDFファイル内にあるNADP補助因子から単に燐酸基を除去することによって最初の補助因子コンホメーションを規定した。本発明者等はこのコンホメーションをNAD_TDFと称する。
【０３２４】
B. これに代わるNADコンホメーション
Adam Thomasonは、NAD補助因子を含む構造についてPDBをスキャンするPerlスクリプトを開発した。次いでこのスクリプトは、抽出されたPDBファイル由来のNADをレファランスNAD_TDF上に完全または部分的に重ね合わせる。このようにして多数のNADコンホメーションを収集し（図19を参照されたい）、PDAシミュレーションにおける使用準備が整った。
【０３２５】
NAD_TDFコンホマーまたはNAD_GRBコンホマー（1GRB  ヒトグルタチオンレダクターゼより）のいずれかを用いてシミュレーションを実施したが、これはNAD_TDFに対して最も低い全原子r.m.s.dを持っていた。100以上のNADコンホマーの目視検査は、NAD_GRB中に見出されるリボースパッカーはNAD_TDF中のそれよりも著しく多く、このコンホマーが低いエネルギーを持つことを示唆している。NAD_TDF中にコンホマーが稀であるという事は、このコンホマーがNADP座標から誘導されたという事実に由来するのかも知れない。
【０３２６】
C. ヒドロキシ回転異性体の状態
ヒドロキシ基の水素の向きは側鎖-補助因子相互作用、特に水素結合相互作用に関して著しい影響を及ぼし得る。ライブラリー1について、ヒドロキシ回転異性体の静止対を利用した。何故なら、シミュレーション当たり1つのリガンドの状態だけがXencorのPDA（登録商標）の実行の中に含まれるためである。続いて、リガンド状態の組み合わせ集合がこのシミュレーションに包含されるようSPAパッケージを開発した。ヒドロキシ回転異性体の向きの組み合わせ集合を作製するため、「makeligands」(makeligands.f90より) なる名称の支援プログラムも開発した。
【０３２７】
III. 組み合わせライブラリーを作製するためのPDAシミュレーション
A  ライブラリー位置を規定
この戦略は、TRRタンパク質と、特にアデニンリボース上にジオール基（これは燐酸が除去される際そのまま残される）を有するNADHのアデニン部分との相互作用を増強することである（図20を参照されたい）。
【０３２８】
B. ライブラリー1の計算  PDA（登録商標）により実施
PDA（登録商標）シミュレーションパッケージを用いて最初の組み合わせライブラリーを作製した。このパッケージでは、リガンドが「テンプレート」の一部として取り込まれ、それはシミュレーション当たりのリガンド状態の数を1に制限する。故に、アデニンジオール上のヒドロキシ回転異性体はこの計算の集合について随意であった。さらに、NADについて電荷は創出されなかった。計算の第一の集合は、189位における幾つかのアミノ酸の可能性を含んでいた。続く全ての計算について、この位置における実体はヒスチジンに限定された。
【０３２９】
C. ライブラリー1の定義
ライブラリー1の原理は、(i) ORBITによって予想された残基の質（ORBITモンテカルロシミュレーションにより作製した確率表に基づく）； (ii) 構造に対する直感；および（iii) 多様なアミノ酸性質をサンプリングすることの重要性、の組み合わせに基づいていた。このライブラリーの最も興味深い側面は、127位に残基EDTを、195位にQEを、217位にEQを、そして255位にEを生ずる、側鎖と補助因子の間の可能性ある様々な水素結合相互作用である。殆どのNADH利用酵素がカルボキシ側鎖とアデニンジオールの間の相互作用を含んでいることから、195位におけるQとEの予想は有望である。
【０３３０】
TRRライブラリー1:
127    LEDTA
165    IML
166    G
167    G
189    H
190    RYM
191    RQ
195    RYQE
217    SEQ
255    IE
【０３３１】
D. ライブラリー2の計算  SPAにより実施
種々の補助因子コンホメーションおよびサンプリング戦略を用いた幾つかのシミュレーションをライブラリー2の開発のために実施した。
【０３３２】
(i) シミュレーションの第一の集合を、重原子座標のためのNAD_TDF補助因子コンホメーションを用いて実施した。このコンホメーションと、アデニンジオール上の36（6x6）のヒドロキシ回転異性体の組み合わせを使用して、バックボーン集団またはsub-回転異性体サンプリング戦略のいずれかによるシミュレーションを実施した。
【０３３３】
(ii) シミュレーションの第二の集合は、重原子座標のためのNAD_GRB補助因子コンホメーションを用いて実施した。このコンホメーションと、アデニンジオール上の36（6x6）のヒドロキシ回転異性体の組み合わせを使用して、バックボーン集団またはsub-回転異性体サンプリング戦略のいずれかによるシミュレーションを実施した。
【０３３４】
E. ライブラリー2の定義
ライブラリー2の原理は、(i) SPAによって予想された残基の質（出力自由エネルギーマトリックスおよび異なるシミュレーション由来のマトリックスの比較に基づく）； (ii) 構造に対する直感；（iii) 多様なアミノ酸性質をサンプリングすることの重要性；および（iv) ライブラリー1のスクリーニングからのフィードバック、の組み合わせに基づいていた。全ての位置においてこのライブラリーには野生型残基が含まれていた。前と同様、このライブラリーの最も興味深い側面は、側鎖と補助因子の間の可能性ある様々な水素結合相互作用である。しかしながら、これらの計算には別の補助因子コンホマーを使用したため、127位に残基Qを、167位にSを、195位にTNを（図3A、B)、217位にDを、そして255位にEを生ずる、新たな相互作用の集合がSPAによって予想された。アデニンジオールのAO2* 酸素との水素結合に対する予想された能力と、小さな動きがファンデルワールス衝突を軽減するであろうという推測に基づき、S167（図3C）が、高い自由エネルギー値にも拘わらず選択された。169位にある負の電荷の中和が補助因子の結合親和性の改善を助けるであろうという可能性に基づき、169位にさらなる残基Nを加えた（NはE coli TRRに見出されるため、これは保存的突然変異であることに留意されたい）。
【０３３５】
ライブラリー2中の殆どの残基をNAD_GRBによるシミュレーションに基づいて選択した。しかしながら、NAD_TDF補助因子コンホメーションを用いるSPA計算においてI195の傾向が高い事に基づき、I195を加えた。
【０３３６】
TRRライブラリー2：
【表２】2005505250.tif 000006
【０３３７】
検定
発現
1. pET29でクローニングされたNTRコード領域をBL21 Star（Invitrogen) 細胞で発現させる。本明細書に記載の体積は精製タンパク質＞50ugを取得するために典型的な体積であるが、必要に応じてスケールアップまたはダウンすることができる。
2. 1.5ml CG + カナマイシン (100ug/ml)を入れた96深ウェルプレートにコロニーを接種し、適当な対照を接種する。37℃、250rpmで培養を一夜増殖させる。
3. 翌日、96深ウェルプレートの各々から5ml CG + カナマイシン (100ug/ml）を入れた4x24ウェルに一夜培養200μlを接種する。30℃、250rpmで3時間増殖させる。
4. 残りの一夜培養からグリセロール保存菌を作製し、-80℃で凍結する。
5. 5ml培養を1M IPTGで誘導し最終濃度1mMとする。30℃、250rpmで一夜増殖させる。
6. 翌日、最大速度（Avanti J-20、5300rpm) で10分間遠心沈降させる。上清を廃棄し、ペレットを-80℃で凍結またはS.tag精製法へと進めることができる。
【０３３８】
96ウェルプレートのためのS.Tag精製
(96試料 (細胞ペレットより; Novagen、cat# 69232-3)
S.Tagトロンビン精製キットはビオチニル化トロンビンを用いる特異な戦略を利用するものであり、ストレプトアビジンアガロースによる消化後にこの酵素を単純且つ特異的に除去することができる。標準プロトコルは、Sタンパク質アガロースとのバッチ型結合、洗浄、ビオチニル化トロンビンによる処理、およびストレプトアビジンアガロースによる捕捉を必要とし、溶液中に精製タンパク質が残る。
【０３３９】
キット構成要素
【表３】2005505250.tif 000007
【０３４０】
さらなる材料：
Whatman Unifilter、96ウェル、800μl (Fisher、cat# PF7700-2804)
Bug Busterタンパク質抽出試薬 (VWR、cat# 80500-208)
【０３４１】
プロトコル (発現培養5ml)
1. 凍結ペレット (5ml）を室温で〜30分間融解させる。
2. Bug Buster HT 500μlを加え、攪拌してペレットを再懸濁し、室温で20分間振盪する。
3. 最大速度または3000xgで20分間遠心分離する。可溶性タンパク質を含有する上清（細胞溶解液）を新たなプレートに移す。
4. 細胞溶解液150μlを精製用に使用し、残りを後の使用のために保存する。
150μlについて
Tris-HClおよびNaCl濃度を20mM Trisおよび150mM NaCl（pH7.5）に調節する。
150μl Bug Buster                    x100
10μl  1M Tris-HCl (最終濃度20mM)    1ml
15μl  5M NaCl (最終濃度0.15M)  1.5ml
325μl H2O                            32.5ml
500μl 合計                          アリコート350μlミックス
【０３４２】
5. フィルタープレートの底にアルミニウムテープで封をする。
6. 広口チップを用いてSタンパク質アガロースミックス167μlを加える。
7. 溶解液（調節済み）をフィルタープレートに加え、アルミニウムテープでプレートに封をする。
8. 楕円振盪機上、室温で30分-1時間結合させる（プレートを側方に位置させる。タンパク質が変性する傾向があるため激しく攪拌してはならない）
9. 底からアルミニウムテープをはずし、減圧に付す。
10. 500μlの1X結合/洗浄緩衝液で2回洗浄し、減圧に付す。
11. 〜1Xスラリー体積=200μlで1Xトロンビン開裂緩衝液により2回平衡化し、ごく低い減圧に付す。
12. フィルタープレートの底にアルミホイルで再度封をする。
13. 1Xトロンビン開裂緩衝液およびビオチニル化トロンビンのミックスを作製する。
【０３４３】
マスターミックス
【表４】2005505250.tif 000008
14. 管を、設定=5、振幅=4のマイクロミキサー上、室温で1-2時間穏やかに振盪する。
15. ストレプトアビジンアガロースのスラリー60μlを加える。
16. 楕円振盪機上、室温で10分間インキュベートする。
17. フィルタープレートの底からホイルの封を取り除く。
18. 500xgで2分間遠心分離する。
19. より多くのタンパク質を溶離するため1X開裂緩衝液80μlを添加し、500xgで2分間遠心分離する。
20. 同体積の50%グリセロールを加え、充分に混合し、一時的には4℃で保存し、長期保存用には-80℃で凍結する。
【０３４４】
BCA検定
BCAタンパク質検定試薬キット（Pierce、cat# 23227)
1. 標準および作業用試薬の調製
a. 標準 (作業範囲は0.125  2μg/μl)
【表５】2005505250.tif 000009
検定のために：各標準5μl + ddH2O 20μl = 計25μl
【０３４５】
b. 作業用試薬
試薬A 50mlを試薬B 1mlと混合。
* この作業用試薬は密閉容器中、室温で保存すると数日間安定である。
【０３４６】
2. 96ウェルプレートにおける試料の調製。
精製タンパク質5μl (精製法の工程20より)
ddH2O 20μl
よく混合する
【０３４７】
3. 検定法
a. 25μlの標準および試料を入れた各ウェルに作業用試薬200μlを加える。
b. プレート振盪機上で30秒間プレートを完全に混合する。
c. アルミホイルテープでプレートを覆う。
d. 37℃で30分間インキュベートする。
e. プレートを室温に冷却する。
f. プレート読み取り機で562nmの吸光度を測定する。
【０３４８】
4. 標準曲線のプロッティングにExcelを使用し、試料のタンパク質濃度を決定する。
【０３４９】
5. 検定のためにタンパク質濃度を正規化する。
a. 濃度を確認するため正規化したタンパク質のタンパク質ゲルをランする。
b. SYPRO Orangeで30分間-1時間染色する (および/またはCoomassie blueで一夜）
c. Apha Innotech Corporation Imager上でゲルを視覚化する。
d. Kodak 1D 3.5 Networkソフトウェアを用いてデンシトメトリーを実施する。
【０３５０】
チオレドキシンレダクターゼ検定
1. 検定/ウェル当たり50μｌの最終体積を用いる384微量定量プレートで検定を開始する：4x96ウェルプレートまでを1枚の384プレートに入れ、移し換える時に個々のパターンを記録しておく。
2. 正規化したタンパク質試料5μlを384微量定量プレートのウェルに移す。1.2mM（またはその他の適当な濃度）のNADPHまたはNADH、および精製チオレドキシン基質2μMを検定に使用する。
3. 検定ミックスを調製する：
【表６】2005505250.tif 000010
* 試験しようとする上清に検定ミックスを添加する直前にNADHまたはNADPHおよびチオレドキシン基質を加える。
4. Titertek Multidrop 384を用いて検定ミックス45μlを加える。
5. 直ちにプレートをSpectramaxプレート読み取り機にかけ、データの収集を開始する。
6. 動態パラメータ（KcatおよびKm）の測定のために一般的に以下の基質濃度範囲を使用した：
NADPH : 0.00、0.01、0.02、0.04、0.08、0.15、0.3、0.6、1.2、2.5、5.0および10.0 mM
NADH: 0.02、0.04、0.08、0.15、0.3、0.6、1.2、2.5、5.0、10.0および20.0 mM。
各濃度について直線範囲の初期反応速度を決定した。このデータをGraphPad Prismソフトウェアを用いて解析し、標準ミカエリス-メンテンの式に適合させた。
【０３５１】
検定用途のためのチオレドキシンh（N末端Hisタグ）の調製
培養の調製
1. 2リットルの発現培養に、BL21 Star（DE3）発現細胞中のチオレドキシンコドンopt.e-coli/pET28bの一夜培養を接種する。これは＞100mgの精製タンパク質を生成する。
2. 増殖期間の後、1M IPTGで1mM IPTGの最終濃度に細胞を誘導する。30℃、250rpmで一夜増殖させる。
3. 翌日、2Lの培養を20本の50ml Falcon管に遠心沈降させ、培養100mlからのペレットのみを残して上清を廃棄する。ペレットを-80℃で凍結した後、上清の調製およびHisタグ精製を継続する。
【０３５２】
上清の調製:
1. 20のペレットを各々1mlのBugbusterに再懸濁し、250rpm、室温で20分間振盪する。
2. 細胞を遠心沈降させ、上清を50ml Falcon管内に合する。2-メルカプトエタノールを加えた同体積の2Xローディング緩衝液を加える。精製を進める。
【０３５３】
Hisタグタンパク質の精製:
1. Clontech TALON Superflow樹脂懸濁液6mlを4本の50ml Falcon管に加える。
2. 1Xローディング緩衝液30mlで樹脂を2回洗浄する。
3. 室温で穏やかに20分間攪拌することによりタンパク質を樹脂に結合させる。
4. 1Xローディング緩衝液30ml中、室温で10分間樹脂を洗浄する。
5. 1Xローディング緩衝液3mlに樹脂を再懸濁する。
6. 4本の管全てから得た懸濁液を、1本のClontech 10ml重力流カラム中に合する。
7. 1Xローディング緩衝液15mlで樹脂を洗浄する。
8. 250mMイミダゾール溶離緩衝液20mlに樹脂を再懸濁する。タンパク質を50ml管に2回溶出する。
9. 濾過によるイミダゾール除去および試料濃縮を継続し、または後の使用のために-20℃で凍結する。
【０３５４】
精製チオレドキシンの濾過および濃縮
1. 精製タンパク質試料をMillipore Ultrafree-4 Biomax 5Kフィルター管でランする。
2. 濾過洗浄緩衝液で試料を3回洗浄する。
3. 濃縮したタンパク質試料を合する。BCA検定を行って濃度を決定し、次いで50%グリセロール、20mM Tris-HCl pH8.0で100uMに希釈する。
【０３５５】
2Xローディング緩衝液
100mM NaPO4 pH 8.0
10mM Tris、pH 8.0
600mM NaCl
20mMイミダゾール
10% エチレングリコール
2mM 2-メルカプトエタノールを加えた2Xローディング緩衝液のために0.156ul/mlを添加する。
【０３５６】
250mMイミダゾール溶離緩衝液
50mM NaPO4 pH 8.0
5mM Tris、pH 8.0
200mM NaCl
250mMイミダゾール
10% エチレングリコール
【０３５７】
濾過緩衝液 (イミダゾール除去のため)
50mM NaPO4
10mM Tris、pH 8.0
200mM NaCl
10% エチレングリコール
ddH20
【０３５８】
実施例2
変異体TRタンパク質による植物の形質転換
概観
オレオシン-TR融合タンパク質、オレオシン-TRレダクターゼ融合タンパク質またはオレオシン-ハイブリッドTRレダクターゼ/TRレダクターゼ融合タンパク質をコードしている遺伝子を、常套的組換えDNA技術を用いて植物細胞中に組み込むことができる。一般にこれは、オレオシン-TRレダクターゼ融合タンパク質、オレオシン-TRレダクターゼ融合タンパク質またはオレオシン-ハイブリッドTR/TRレダクターゼ融合タンパク質をコードしているDNA分子を上記のように発現系に挿入することを含む。
【０３５９】
育種
生産および品質にとって重要な他の性質と共にオレオシン-TR融合タンパク質、オレオシン-TRレダクターゼ融合タンパク質またはオレオシン-ハイブリッドTR/TRレダクターゼ融合タンパク質を発現する植物は、育種アプローチおよび当分野で既知の技術によって植物系統に組み入れることができる。オレオシン-TR融合タンパク質、オレオシン-TRレダクターゼ融合タンパク質またはオレオシン-ハイブリッドTR/TRレダクターゼ融合タンパク質を発現する植物が得られたならば、該アリルを遺伝学的に作り換えたりこれを植物中に導入する必要なく、伝統的な育種技術を用いてこのトランスジーンを商業的な変種に移す。
【０３６０】
母系組織が子孫を生ずる、アポミクシス的生殖能を有する植物は、オレオシン-R融合タンパク質、オレオシン-TRレダクターゼ融合タンパク質またはオレオシン-ハイブリッドTR/TRレダクターゼ融合タンパク質を発現するよう形質転換し、導入したアリルをアポミクシス的育種によって所望のバックグラウンドに維持することができる。
【０３６１】
TRおよびTRレダクターゼ遺伝子の単離ならびにインビトロ検定
或る態様では、Arabidopsis、小麦、仔牛のような哺乳動物起源およびE.coli由来のTR遺伝子を単離し、細菌発現ベクターを用いてE.coliで発現させ、得られたタンパク質生成物を精製することができる。別の態様では、ArabidopsisおよびE.coli由来のTRレダクターゼ遺伝子を単離し、E.coliで発現させ、そして精製することができる。さらに、TR/TRレダクターゼ遺伝子をMycobacterium lepraeから単離/取得し、E.coliで発現させ、精製できる。好ましい態様では、M.lepraeコドンを、任意の与えられた宿主、例えばE.coli宿主細胞または植物種における最適化のために改変できる。多くの生物のためのコドン使用法の表が知られており利用可能であって、特定宿主のために作り変えられたコード配列のコドン最適化を可能にしている。
【０３６２】
別の態様では、改変された補助因子特異性を持つTRレダクターゼを、標的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発を用いて製造し、補助因子結合部位における特異的突然変異について試験する（Shiraishi, et al. (1998) Arch Biochem Biophys 358 (1): 104-115; Galkin et al. (1997) Protein Eng 10(6): 687-690); Carugo et al. (1997) Proteins 28(1):10-28; Hurley et al. (1996) Biochemistry 35(18):5670-8; および/または有機溶媒の添加による (Holmberg et al. (1999) Protein Eng 12 (10): 851-856)。突然変異の決定は例えばMayoおよびDahiyatが開発したもの (Chem & Eng News October 6, 1997, pages 9-10）のようなコンピュータープログラムによって支援することができる。前記の参考文献は引用によりその全体をここに含める。
【０３６３】
異なるTRおよびTRレダクターゼの組み合わせをマトリックスで使用して、どのTRおよびTRレダクターゼの組み合わせがインビトロでの小麦貯蔵タンパク質および乳貯蔵タンパク質β-ラクトグロブリンの還元に最も有効であるかを決定する。好ましくは、TRとTRレダクターゼの組み合わせを試験する。これらの実験はDel Val et al. ((1999) Jnl Allerg Clin Immunol 103:690-697）の記載に従って実施する。同系交配の高IgE応答アトピー犬を取得し、乳および小麦を含有する食物調製物の市販抽出物で感作することによってさらに準備する。I型過敏性反応を用いて皮膚試験を実施する。皮膚試験の直前にエバンスブルー色素を静脈内注射する。小麦粥、全牛乳抽出物および純粋なβ-ラクトグロブリンのアリコートを皮内注射する。各々の青色スポットの2つの垂直直径を評点付けることにより、皮膚試験を盲検により読み取る。オレオシン-TR、オレオシン-TRレダクターゼおよびこれらの組み合わせがアレルギー反応に影響を及ぼす能力を、外因性NADPHまたはNADHの存在下または不在下で測定する。
【０３６４】
植物発現ベクターの構築
Arabidopsis TRおよびTRレダクターゼ遺伝子の配列が公表されており（Rivera-Madrid et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:5620-5624; Jacquot et al. (1994) J Mol Biol 235:1357-1363)、これらの遺伝子をPCRで単離できる。
或る態様では、Arabidopsis TRおよびTRレダクターゼ遺伝子の両者を、オレオシンのNおよびC末端の両方に翻訳により融合させる。このオープンリーディングフレームは、植物中での発現のための適当なプロモーターおよびターミネーター配列の転写調節下にある。好ましい態様では、ファセオリンプロモーターおよびターミネーター配列を用いてArabidopsis TR (ATR）およびArabidopsis TRレダクターゼ（ATRR）構築物を創出する。
【０３６５】
Arabidopsis中での発現
或る態様では、オレオシン-ATRおよびオレオシン-ATRR発現構築物の初回試験のためのモデル系としてArabidopsisを使用する。Arabidopsisの種子は、収穫種、特にTRの商業生産に利用できる油料種子収穫種に極めてよく似たオレオシン被覆油体を含有している。Arabidopsis中でのオレオシン-TRおよびオレオシンTRレダクターゼの発現を利用して、油体中のオレオシンTRおよびオレオシンTRレダクターゼ融合物を得、これらの融合タンパク質が生物活性であるかどうかを決定する。オレオシンに対するTRおよびTRレダクターゼ両方のNおよびC両末端融合物を作製し試験する。さらなる態様では、M.leprae由来の天然TR/TRレダクターゼ融合遺伝子に対するオレオシン融合物を試験する。これらの融合タンパク質の蓄積を、オレオシンおよび/またはTRおよびTRレダクターゼに特異的な抗体を利用するウェスタンブロッティングを用いて定量する。形質転換されたArabidopsis植物が再生および生育するのに要する時間、およびトランスジーンの発現と種子中に発現された生成物の蓄積を測定するのに要する時間が、殆どの収穫種よりはるかに短いため、Arabidopsisがこの目的にとって有用である。
【０３６６】
植物発現ベクターの構築
植物発現ベクターは、小麦由来のTR遺伝子、仔牛のような哺乳動物起源のTR遺伝子、E.coli由来のTR遺伝子；E.coli由来のTRレダクターゼ遺伝子； M.leprae由来のTR/TRレダクターゼ遺伝子を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）、TRおよびTRレダクターゼをコードしているその他の遺伝子を用いて構築する。これらの遺伝子のいずれかまたは両方をオレオシンのNおよびC両末端と翻訳により融合させる。このようないかなる構築物のオープンリーディングフレームも、適当なプロモーターおよびターミネーター配列の転写調節下にある。好ましい態様では、ファセオリンプロモーターおよびターミネーター配列を用いてTR'およびTRレダクターゼを目的とする植物発現ベクターを構築する。さらに好ましくは、ファセオリンプロモーターおよびターミネーター配列を用いてTR'およびTRレダクターゼ'を目的とする植物発現ベクターを構築する。
【０３６７】
ベニバナにおける発現
当業者に既知の方法を使用してベニバナを形質転換するために上記の植物形質転換ベクターを使用する。好ましい態様では、BakerおよびDyer (Plant Cell Rep (1996) 16:106-110）の開示した方法から適合させた方法によってベニバナを形質転換する。発現はノーザンおよびウェスタンブロッティングを用いて検定する。小麦貯蔵タンパク質および乳貯蔵タンパク質β-ラクトグロブリンを還元するTR'およびTRレダクターゼ'構築物の能力を試験する。各構築物当たり最低25の個別に形質転換させたトランスジェニックベニバナ植物を作製する。全てのトランスジェニック標的収穫植物をオレオシン-TR'およびオレオシン-TRレダクターゼ'の発現について試験する。この分析結果は、どの形質転換事象が最も高いそして/または最適なTR'またはTRレダクターゼ'活性をもたらすかを示す。この構築物で形質転換したトランスジェニック系統をさらなる分析に付す。TR'およびTRレダクターゼ'の量を定量的ウェスタンブロッティング分析を用いて決定する。オレオシン融合物の比活性を、E.coliで生産された「遊離の」TR'およびTRレダクターゼ'の比活性と比較する。
【０３６８】
最も高い発現を行った植物系統を繁殖させる。安定な遺伝子型を有する同型接合体および二倍体植物を作製して、後続世代における安定なトランスジーン遺伝形質を確実とする。
【０３６９】
ビオチニル化TRの製造
或る態様では、ビオチニル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルのような化学物質を用いてリジン残基を化学修飾することにより、TRをインビトロでビオチニル化することができる。これに代わる態様では、E.coliアセチル-CoAカルボキシラーゼのビオチンカルボキシ担体タンパク質由来のビオチンドメインペプチドを利用して、インビボの位置特異的ビオチニル化を、Smith et al. ((1998) Nuc Acid Res 26:1414-1420）の記載に従って利用できる。E.coli宿主内因性ビオチニル化機構（BIOTRX）によりインビボビオチニル化が可能な組換えチオレドキシンを、E.coli trxAの5'末端に23アミノ酸ビオチニル化認識ペプチドをコードしているオリゴヌクレオチドをフレーム内挿入することによって構築し、構築物pBIOTRXを創出する。pBIOTRXプラスミドを含む細胞を外因性ビオチンの不在下に増殖させ、BIOTRXタンパク質の量および溶解度を決定する。総細胞タンパク質の10%までがBIOTRXタンパク質であることが判明し、一方少量のトリチル化ビオチンがBIOTRXタンパク質中に取り込まれ、固定化アビジンまたは固定化アビジン-アルカリホスファターゼに対するBIOTRXの結合は低い。pBIOTRXで形質転換された細胞の誘導前培地へのビオチン10μg/mlの添加は、全体的なビオチン取り込みの程度の改善をもたらす。
【０３７０】
ビオチニル化油体-TR混合物の製造
アビジンまたはストレプトアビジンを用いてビオチニル化TRをビオチニル化油体に結合させる。精製したビオチニル化TRを異なる比率でビオチニル化油体と混合する。小麦のアレルゲン性を低下させ練り生地の品質を改善するこれら混合物の有効性を、乳製品のアレルゲン性を低下させるこれら混合物の有効性と共に試験する。対照は、野生型ベニバナ油体およびTRと混合した（但し結合していない）野生型ベニバナ油体を包含する。
【図１】
2005505250.tif 000011
【図２Ａ】
2005505250.tif 000012
【図２Ｂ】
2005505250.tif 000013
【図２Ｃ】
2005505250.tif 000014
【図２Ｄ】
2005505250.tif 000015
【図２Ｅ】
2005505250.tif 000016
【図３−１】
2005505250.tif 000017
【図３−２】
2005505250.tif 000018
【図３−３】
2005505250.tif 000019
【図３−４】
2005505250.tif 000020
【図３−５】
2005505250.tif 000021
【図４】
2005505250.tif 000022
【図５】
2005505250.tif 000023
【図６】
2005505250.tif 000024
【図７】
2005505250.tif 000025
【図８】
2005505250.tif 000026
【図９Ａ】
2005505250.tif 000027
【図９Ｂ】
2005505250.tif 000028
【図１０】
2005505250.tif 000029
【図１１Ａ】
2005505250.tif 000030
【図１１Ｂ】
2005505250.tif 000031
【図１２】
2005505250.tif 000032
【図１３Ａ】
2005505250.tif 000033
【図１３Ｂ】
2005505250.tif 000034
【図１３Ｃ】
2005505250.tif 000035
【図１４】
2005505250.tif 000036
【図１５】
2005505250.tif 000037
【図１６Ａ−１】
2005505250.tif 000038
【図１６Ｂ−１】
2005505250.tif 000039
【図１６Ｃ−１】
2005505250.tif 000040
【図１６Ｄ−１】
2005505250.tif 000041
【図１６Ｅ−１】
2005505250.tif 000042
【図１６Ｆ−１】
2005505250.tif 000043
【図１６Ｇ−１】
2005505250.tif 000044
【図１６Ｈ−１】
2005505250.tif 000045
【図１６Ｉ−１】
2005505250.tif 000046
【図１６Ｊ−１】
2005505250.tif 000047
【図１６Ｋ−１】
2005505250.tif 000048
【図１６Ｌ−１】
2005505250.tif 000049
【図１６Ｍ−１】
2005505250.tif 000050
【図１６Ｎ−１】
2005505250.tif 000051
【図１６Ｏ−１】
2005505250.tif 000052
【図１６Ｐ−１】
2005505250.tif 000053
【図１７Ａ】
2005505250.tif 000054
【図１７Ｂ】
2005505250.tif 000055
【図１８】
2005505250.tif 000056
【図２１−１】
2005505250.tif 000057
【図２１−２】
2005505250.tif 000058
【図２１−３】
2005505250.tif 000059
【国際公開パンフレット】
2005505250.tif 000060
2005505250.tif 000061
2005505250.tif 000062
2005505250.tif 000063
2005505250.tif 000064
2005505250.tif 000065
2005505250.tif 000066
2005505250.tif 000067
2005505250.tif 000068
2005505250.tif 000069
2005505250.tif 000070
2005505250.tif 000071
2005505250.tif 000072
2005505250.tif 000073
2005505250.tif 000074
2005505250.tif 000075
2005505250.tif 000076
2005505250.tif 000077
2005505250.tif 000078
2005505250.tif 000079
2005505250.tif 000080
2005505250.tif 000081
2005505250.tif 000082
2005505250.tif 000083
2005505250.tif 000084
2005505250.tif 000085
2005505250.tif 000086
2005505250.tif 000087
2005505250.tif 000088
2005505250.tif 000089
2005505250.tif 000090
2005505250.tif 000091
2005505250.tif 000092
2005505250.tif 000093
2005505250.tif 000094
2005505250.tif 000095
2005505250.tif 000096
2005505250.tif 000097
2005505250.tif 000098
2005505250.tif 000099
2005505250.tif 000100
2005505250.tif 000101
2005505250.tif 000102
2005505250.tif 000103
2005505250.tif 000104
2005505250.tif 000105
2005505250.tif 000106
2005505250.tif 000107
2005505250.tif 000108
2005505250.tif 000109
2005505250.tif 000110
2005505250.tif 000111
2005505250.tif 000112
2005505250.tif 000113
2005505250.tif 000114
2005505250.tif 000115
2005505250.tif 000116
2005505250.tif 000117
2005505250.tif 000118
2005505250.tif 000119
2005505250.tif 000120
2005505250.tif 000121
2005505250.tif 000122
2005505250.tif 000123
2005505250.tif 000124
2005505250.tif 000125
2005505250.tif 000126
2005505250.tif 000127
2005505250.tif 000128
2005505250.tif 000129
2005505250.tif 000130
2005505250.tif 000131
2005505250.tif 000132
2005505250.tif 000133
2005505250.tif 000134
2005505250.tif 000135
2005505250.tif 000136
2005505250.tif 000137
2005505250.tif 000138
2005505250.tif 000139
2005505250.tif 000140
2005505250.tif 000141
2005505250.tif 000142
2005505250.tif 000143
2005505250.tif 000144
2005505250.tif 000145
2005505250.tif 000146
2005505250.tif 000147
2005505250.tif 000148
2005505250.tif 000149
2005505250.tif 000150
2005505250.tif 000151
2005505250.tif 000152
2005505250.tif 000153
2005505250.tif 000154
2005505250.tif 000155
2005505250.tif 000156
2005505250.tif 000157
2005505250.tif 000158
2005505250.tif 000159
2005505250.tif 000160
2005505250.tif 000161
2005505250.tif 000162
2005505250.tif 000163
2005505250.tif 000164
2005505250.tif 000165
2005505250.tif 000166
2005505250.tif 000167
2005505250.tif 000168
2005505250.tif 000169
2005505250.tif 000170
2005505250.tif 000171
2005505250.tif 000172
2005505250.tif 000173
2005505250.tif 000174
2005505250.tif 000175
2005505250.tif 000176
2005505250.tif 000177
2005505250.tif 000178
2005505250.tif 000179
2005505250.tif 000180
2005505250.tif 000181
2005505250.tif 000182
2005505250.tif 000183
2005505250.tif 000184
2005505250.tif 000185
2005505250.tif 000186
2005505250.tif 000187
2005505250.tif 000188
2005505250.tif 000189
2005505250.tif 000190
2005505250.tif 000191
2005505250.tif 000192
2005505250.tif 000193
2005505250.tif 000194
2005505250.tif 000195
2005505250.tif 000196
2005505250.tif 000197
2005505250.tif 000198
2005505250.tif 000199
2005505250.tif 000200
2005505250.tif 000201
2005505250.tif 000202
2005505250.tif 000203
2005505250.tif 000204
2005505250.tif 000205
2005505250.tif 000206
2005505250.tif 000207
2005505250.tif 000208
2005505250.tif 000209
2005505250.tif 000210
2005505250.tif 000211
2005505250.tif 000212
2005505250.tif 000213
2005505250.tif 000214
2005505250.tif 000215
2005505250.tif 000216
2005505250.tif 000217
2005505250.tif 000218
2005505250.tif 000219
2005505250.tif 000220
2005505250.tif 000221
2005505250.tif 000222
2005505250.tif 000223
2005505250.tif 000224
2005505250.tif 000225
2005505250.tif 000226
2005505250.tif 000227
2005505250.tif 000228
2005505250.tif 000229
2005505250.tif 000230
2005505250.tif 000231
2005505250.tif 000232
2005505250.tif 000233
2005505250.tif 000234
2005505250.tif 000235
2005505250.tif 000236
2005505250.tif 000237
2005505250.tif 000238
2005505250.tif 000239
2005505250.tif 000240
2005505250.tif 000241
2005505250.tif 000242
2005505250.tif 000243
2005505250.tif 000244
2005505250.tif 000245
2005505250.tif 000246
2005505250.tif 000247
2005505250.tif 000248
2005505250.tif 000249
2005505250.tif 000250
2005505250.tif 000251
2005505250.tif 000252
2005505250.tif 000253
2005505250.tif 000254
2005505250.tif 000255
2005505250.tif 000256
2005505250.tif 000257
2005505250.tif 000258
2005505250.tif 000259
2005505250.tif 000260
2005505250.tif 000261
2005505250.tif 000262
2005505250.tif 000263
2005505250.tif 000264
2005505250.tif 000265
2005505250.tif 000266
2005505250.tif 000267
2005505250.tif 000268
2005505250.tif 000269
2005505250.tif 000270
2005505250.tif 000271
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505250.tif 000272