(57)【要約】本発明は、シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり０.５、１.０、１.５、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０または４.０を越えるＦＬＩＮＴアイソフォームを提供する。さらに、本発明は該アイソフォームの混合物および該アイソフォームの製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約０.５シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項２】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約０.５シアル酸である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項３】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約１.０シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項４】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約１.５シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項５】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約２.０シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項６】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約２.５シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項７】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約３.０シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項８】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約３.５シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項９】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約４.０シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項１０】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約４.５シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項１１】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約５.０シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項１２】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約５.５シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項１３】
平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約６.０シアル酸未満である、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する組成物。
【請求項１４】
前記アイソフォームがプロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴアナログＲ２１８である、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
製薬的に有効量のＦＬＩＮＴアイソフォームおよび製薬的に許容できる希釈剤、アジュバントまたは担体を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＦＬＩＮＴがＲ２１８Ｑである、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
ＦＬＩＮＴはアポトーシスに関与する糖タンパク質である。ここ数年、多くの強力な生物学的効果を有する数多くの腫瘍壊死因子レセプタータンパク質 (「ＴＮＦＲタンパク質」) が単離されている。これらタンパク質の通常の活性の喪失は、数多くの病的状態に関わっている。
【０００２】
FAS-FASリガンドシグナルトランスダクション経路の活性化の増大は、ランナウェイ（runaway）アポトーシス(Kondo et al., Nature Medicine 3 (4): 409-413 (1997); Galle et al., J. Exp. Med. 182: 1223-1230 (1995))、および好中球の活性化から生じる炎症性疾患 (Miwa et al., Nature Medicine 4: 1287 (1998))を含む多くの病的状態に関与する。「ランナウェイアポトーシス」とは、正常より大きなレベルのアポトーシス、または不適切な時に生じるアポトーシスである。ランナウェイアポトーシスにより生じる病的状態には、例えば肝臓、腎臓、および膵臓の臓器不全が含まれる。好中球の過剰な活性化を伴う炎症性疾患には、敗血症、ARDS、SIRSおよびMODSが含まれる。
【０００３】
本明細書において「Ｆａｓリガンド阻害タンパク質」または「ＦＬＩＮＴ」と称する、１つの具体的なＴＮＦＲホモローグは、Ｆａｓリガンド (ＦａｓＬ)と結合することによってＦａｓＬとＦａｓの相互作用を妨害する。ＦＬＩＮＴはまた、ＬＩＧＨＴとして知られているリガンドと結合して、ＬＩＧＨＴとＬＴＢＲとの相互作用（第２の独立したアポトーシス経路においてステップを開始する）を妨害する。
【０００４】
ＦＬＩＮＴのような化合物は、Ｆａｓ−ＦａｓＬおよびＬＩＧＨＴ−ＬＴＢＲのいずれかまたはその両方が関与する結合相互作用のいずれかまたはその両方と臨床的に関連し得るヒトを含む哺乳動物における疾患または状態を処置または阻止するために使用することができる。
【０００５】
ＦＬＩＮＴを含む多くの真核生物の分泌型タンパク質は１またはそれ以上のオリゴ糖基で修飾されているものが含まれる(ＰＣＴ出願ＷＯ００／５８４６６、ＷＯ００／５８４６５、およびＷＯ９９／５０４１３を参照)。そのようなタンパク質のグリコシレーションの程度は、物理的特性に劇的に影響を及ぼし、安定性、分泌、および細胞内ローカリゼーションにとって重要である。さらに、適切なグリコシレーション生物学的活性に本質的であり得る。実際、真核生物由来のいくつかの遺伝子は、バクテリア（例えば大腸菌）において発現したときにグリコシレーションのためにタンパク質の活性がほとんどまたは全くなかった。
【０００６】
グリコシレーションは、ポリペプチド骨格に沿って特定の位置に存在し、通常２つのタイプに分けられる：コンセンサス配列の一部がＡｓｎ−Ｘ-Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）の場合、Ｏ−結合オリゴ糖はセリンまたはトレオニン残基に結合し、Ｎ−結合オリゴ糖はアスパラギン残基に結合する。
【０００７】
さらに、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の構造および組成は異なる。Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖に通常見られる糖の１つのタイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸(以下、シアル酸と称する)である。シアル酸は、通常、Ｎ−結合およびＯ−結合オリゴ糖の両方に存在する末端残基であり、負に荷電しているために、糖タンパク質において酸性の特性を付与する。
【０００８】
ＦＬＩＮＴは、配列番号３のＡｓｎ１７３(配列番号１のＡｓｎ１４４)でＮ−結合グリコシレーション部位を、および配列番号３のＴｈｒ２０３(あるいは、Ｔｈｒ１７４配列番号１の)；および配列番号３のＴｈｒ２４５(あるいは、配列番号１のＴｈｒ２１６)でＯ−結合グリコシレーションを有する。一般的な組換え法では、配列番号１のＴｈｒ２１６のＯ−結合部位は、配列番号１のＴｈｒ１７４よりも実質的にグリコシレーションが少ない。
【０００９】
ＦＬＩＮＴシアル酸含量および分子のＰＩプロファイルに対する効果は、これまで明らかになっていない。本明細書では、ＦＬＩＮＴの血清からのin vivoのクリアランスがシアル酸含量のレベルに依存するという証拠を示す。シアル酸化の程度が低いＦＬＩＮＴは、比較的シアル酸含量が高いＦＬＩＮＴよりも、霊長類の血清から迅速に消失する。これは、ある特定の肝臓のレセプター例えばアシアロ糖タンパク受容体との相互作用による、循環血からのシアル酸化されたＦＬＩＮＴまたはシアル酸化の程度が低いＦＬＩＮＴのクリアランスによって説明し得る(cf. Morrell et al. J. Biol. Chem. 243, 155 (1968)；Briggs, et al. Am. J. Physiol. 227, 1385 (1974)；Ashwell et al. Methods Enzymol. 50, 287 (1978)参照)。シアル酸化のレベルを上げることによってin vivoのクリアランスを遅くし、これによってＦＬＩＮＴの治療上の有用性が改善されると期待される。
【００１０】
本発明の目的は、増大したシアル酸含量を有するＦＬＩＮＴのアイソフォームを提供することである。そのような分子を含有する医薬組成物によって、in vivoでのより遅いクリアランス時間、および増大した治療的価値を有するＦＬＩＮＴ組成物が提供される。
【００１１】
発明の要旨
本発明は、ＦＬＩＮＴシアル酸アイソフォームに関する。さらに、本発明は、ＦＬＩＮＴアイソフォームの製造方法およびＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する製薬的に許容し得る組成物を提供する。本発明は、さらにヒトを含む哺乳動物における疾患または状態を処置および／または阻止するのに治療上有効な量のＦＬＩＮＴ組成物を投与することを含む治療方法に関する。
【００１２】
本発明はさらに、ＦＬＩＮＴを含有する材料を、イオン交換クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、またはクロマトフォーカシングに接触させることを含むＦＬＩＮＴアイソフォームの製造方法、ならびに酵素的方法をの使用を含むＦＬＩＮＴのシアル酸化を増大させる方法に関する。
【００１３】
発明の詳細な記載
配列番号1−成熟ヒトＦＬＩＮＴ、即ちリーダー配列を除いた天然ＦＬＩＮＴ。
配列番号2−成熟ヒトＦＬＩＮＴをコードする核酸／ｃＤＮＡ
配列番号3−天然ヒトＦＬＩＮＴ
配列番号4−ヒトＦＬＩＮＴをコードする核酸
【００１４】
用語「アナログ」または「ＦＬＩＮＴアナログ」は、配列番号１または配列番号３において１またはそれ以上のアミノ酸配列変化、例えば、置換、付加、欠失、を有するＦＬＩＮＴ配列変異体を意味するために特に用いる。該変化によって、配列番号１の第２１８番および２１９番(配列番号３の第２４７番および第２４８番)の間でプロテアーゼ耐性であるアナログを生じる。Ｒ２１８Ｑのようなプロテアーゼ耐性アナログはさらにＮ−結合グリコシレーション部位も有し得る。例えば、アナログＲ３４Ｎ、Ｄ３６Ｔ、Ｒ２１８Ｑは１つの更なる部位を含み；Ｒ３４Ｎ、Ｄ３６Ｔ、Ｄ１９４Ｎ、Ｓ１９６Ｔ、Ｒ２１８Ｑは２つのグリコシレーション部位をさらに含む。これらのアナログは、ＦＬＩＮＴの生物学的活性を保持している。
【００１５】
本明細書において用いられる、「平均シアル酸含量」は、ＦＬＩＮＴサンプル調製物のシアル酸含量の定量的測定値を表し、ＦＬＩＮＴ１モルあたりのシアル酸のモル比率で表示する。この用語は、ＦＬＩＮＴの異なる調製物を比較するのに有用である。ＦＬＩＮＴ調製物は、複数のＦＬＩＮＴアイソフォーム、例えば、ＦＬＩＮＴ一分子あたり０、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のシアル酸を含み得る。
【００１６】
用語「天然ＦＬＩＮＴ」は、配列番号３を意味する。
用語「成熟ＦＬＩＮＴ」は、配列番号１を意味する。
【００１７】
本明細書におけるＦＬＩＮＴアイソフォームの記載は、配列番号１または配列番号３を意味する。ＦＬＩＮＴの成熟および天然のいずれの形態も本発明の範囲内であると意図される。
【００１８】
用語「ＦＬＩＮＴ」には、ＦＬＩＮＴの天然, 成熟,およびプロテアーゼ耐性が含まれる。ＦＬＩＮＴは、in vitroおよびin vivoでＦａｓ−ＦａｓＬによって誘発されるアポトーシスを阻害する能力を有するＴＮＦＲファミリーの１つである。
【００１９】
「ＦＬＩＮＴアイソフォーム」は、ＦＬＩＮＴのシアル酸変異体を意味する。天然ＦＬＩＮＴには、配列番号１のＡｓｎ１４４の１つのＮ−結合部位、および配列番号１のＴｈｒ１７４の１つのＯ−結合部位に基づいて、ＦＬＩＮＴ一分子あたり０、１、２、３、４、５、または６個のシアル酸が存在し得る。配列番号１のＴｈｒ２１６の第２のＯ−結合部位は、Ｔｈｒ１７４部位と比較して実質的にグリコシレーションが少ない。プロテアーゼ耐性アナログＲ２１８Ｑには、配列番号１のＡｓｎ１４４の１つのＮ−結合部位、配列番号１のＴｈｒ１７４の１つのＯ−結合部位およびＴｈｒ２１６の１つのＯ−結合部位に基づいて、タンパク質１分子あたり、０、１、２、３、４、５、６、７、または８個のシアル酸が存在し得る。Ｏ−結合グリコシレーションは、天然ＦＬＩＮＴと比較して第２１６番のＲ２１８Ｑ(配列番号１)で実質的に増大する。シアル酸化は、宿主細胞および増殖条件に依存する。シアル酸化は、本明細書中後述する酵素的方法を用いて試験管内で増大させることができる。
【００２０】
用語「Ｎ−グリコシル化ポリペプチド」は、アスパラギンの側鎖アミド中の窒素原子がグリコシル基と共有結合している１またはそれ以上のＮＸＳ／Ｔモチーフを有するポリペプチドを表す。「Ｘ」は、プロリン以外のあらゆる天然のアミノ酸残基を表す。「天然のアミノ酸」は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、およびトリプトファンである。Ｎ−グリコシル化タンパク質は所望によりＯ−グリコシル化される。
【００２１】
用語「Ｏ−グリコシル化ポリペプチド」は、側鎖中の酸素原子がグリコシル基と共有結合している１またはそれ以上のセリンおよび／またはトレオニンを有するポリペプチドを表す。Ｎ−グリコシル化タンパク質は所望によりＯ−グリコシル化される。
【００２２】
用語「プロテアーゼ耐性」とは、ＦＬＩＮＴと比較した場合に、配列番号１の２１８位および２１９位間の残基のタンパク質加水分解についてより耐性である、ＦＬＩＮＴアナログを意味する（ＰＣＴ出願ＷＯ００／５８４６６参照）。プロテアーゼ耐性のアナログは、天然のＦＬＩＮＴまたは成熟ＦＬＩＮＴと比べたりまたはそれらに対して、１つ以上のアミノ酸の置換、欠損、逆位、付加、および／またはグリコシル部位もしくはパターンの変化によってＦＬＩＮＴとは区別される。これらの変化は、配列番号１のおよそ２１４〜２２２位の位置の領域において起こることが好ましい。
【００２３】
本明細書で用いているヌクレオチドおよびアミノ酸の略号は、当該分野および米国特許商標庁（37 C. F. R. 1.822(b)(2)に記載）で認められたものである。
【００２４】
本発明は、天然ＦＬＩＮＴに対して１またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、または付加によって、プロテアーゼ耐性が生じ、場合によっては、グリコシレーションの部位がさらに追加される、天然ＦＬＩＮＴのアイソフォーム(配列番号１および／または配列番号３)、およびＦＬＩＮＴのプロテアーゼ耐性アナログのアイソフォームを含む、ＦＬＩＮＴのシアル酸アイソフォームに関する。
【００２５】
プロテアーゼ耐性アナログは、配列番号１の第２１４〜２２２によって定義される領域に１またはそれ以上のアミノ酸変化を含む。具体例としては、第２１８のＡｒｇからＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｙｒへの１個のアミノ酸置換が挙げられる。その他の例としては、Ｇｌｙ２１４から任意の天然のアミノ酸、Ｐｒｏ２１５から任意の天然のアミノ酸、ＴｈＲ２１６から任意の天然のアミノ酸、Ｐｒｏ２１７から任意の天然のアミノ酸、Ａｒｇ２１８から任意の天然のアミノ酸、Ａｌａ２１９から任意の天然のアミノ酸、Ｇｌｙ２２０から任意の天然のアミノ酸、Ａｒｇ２２１から任意の天然のアミノ酸、Ａｌａ２２２から任意の天然のアミノ酸を含む、配列番号１の２１４〜２２２番の１またはそれ以上の置換が挙げられる。
【００２６】
その他の置換には、Ｇｌｙ２１４から、Ｈｉｓ、ＡｒｇまたはＬｙｓで定義されるような正に荷電したアミノ酸、Ｐｒｏ２１５から正に荷電したアミノ酸、ＴｈＲ２１６から正に荷電したアミノ酸、Ｐｒｏ２１７から正に荷電したアミノ酸、Ａｒｇ２１８から正に荷電したアミノ酸、Ａｌａ２１９から正に荷電したアミノ酸、Ｇｌｙ２２０から正に荷電したアミノ酸、Ａｒｇ２２１から正に荷電したアミノ酸、Ａｌａ２２２から正に荷電したアミノ酸が挙げられる。
【００２７】
その他の置換には、Ｇｌｙ２１４からＡｓｐまたはＧｌｕで定義されるような負に荷電したアミノ酸、Ｐｒｏ２１５から負に荷電したアミノ酸、ＴｈＲ２１６から負に荷電したアミノ酸、Ｐｒｏ２１７から負に荷電したアミノ酸、Ａｒｇ２１８から負に荷電したアミノ酸、Ａｌａ２１９から負に荷電したアミノ酸、Ｇｌｙ２２０から負に荷電したアミノ酸、Ａｒｇ２２１から負に荷電したアミノ酸、Ａｌａ２２２から負に荷電したアミノ酸が挙げられる。
【００２８】
その他の置換には、Ｇｌｙ２１４からＣｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒで定義されるような極性非荷電アミノ酸、Ｐｒｏ２１５から極性非荷電アミノ酸、ＴｈＲ２１６から極性非荷電アミノ酸、Ｐｒｏ２１７から極性非荷電アミノ酸、Ａｒｇ２１８から極性非荷電アミノ酸、Ａｌａ２１９から極性非荷電アミノ酸、Ｇｌｙ２２０から極性非荷電アミノ酸、Ａｒｇ２２１から極性非荷電アミノ酸、Ａｌａ２２２から極性非荷電アミノ酸が挙げられる。
【００２９】
その他の置換には、Ｇｌｙ２１４からＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐで定義されるような非極性アミノ酸、Ｐｒｏ２１５から非極性アミノ酸、ＴｈＲ２１６から非極性アミノ酸、Ｐｒｏ２１７から非極性アミノ酸、Ａｒｇ２１８から非極性アミノ酸、Ａｌａ２１９から非極性アミノ酸、Ｇｌｙ２２０から非極性アミノ酸、Ａｒｇ２２１から非極性アミノ酸、Ａｌａ２２２から非極性アミノ酸が挙げられる。
【００３０】
その他の置換には、プロテアーゼ耐性ＦＬＩＮＴに、１またはそれ以上のさらなるＮ−結合グリコシレーション部位を追加しうる複数の変化が含まれる。例えば、Ａｒｇ３４からＡｓｎ、Ａｓｐ３６からＴｈｒ、Ａｒｇ２１８からＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＶａｌまたはＴｙｒ；Ａｒｇ３４からＡｓｎ、Ａｓｐ３６からＴｈｒ、Ａｓｐ１９４からＡｓｎ、ＳｅＲ１９６からＴｈｒ、Ａｒｇ２１８からＧｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｙｒ;またはＡｒｇ３４からＡｓｎ、Ａｓｐ３６からＴｈｒ、Ａｒｇ２１８からＡｒｇでない任意のアミノ酸、Ａｒｇでない任意の正に荷電したアミノ酸、Ａｒｇでない任意の負に荷電したアミノ酸、Ａｒｇでない任意の極性を有する非荷電アミノ酸、Ａｒｇでない任意の非極性アミノ酸、またはＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｙｒであるアミノ酸;
Ａｒｇ３４からＡｓｎ、Ａｓｐ３６からＴｈｒ、Ａｓｐ１９４からＡｓｎ、ＳｅＲ１９６からＴｈｒ、Ａｒｇ２１８からＡｒｇでない任意のアミノ酸、Ａｒｇでない任意の正に荷電したアミノ酸、Ａｒｇでない任意の負に荷電したアミノ酸、Ａｒｇでない任意の極性を有する非荷電アミノ酸、Ａｒｇでない任意の非極性アミノ酸、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｙｒであるアミノ酸;またはＳｅＲ１３２からＡｓｎ、Ａｒｇ２１８からＡｒｇでない任意のアミノ酸、Ａｒｇでない任意の正に荷電したアミノ酸、Ａｒｇでない任意の負に荷電したアミノ酸、Ａｒｇでない任意の極性を有する非荷電アミノ酸、Ａｒｇでない任意の非極性アミノ酸、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、またはＴｙｒであるアミノ酸。
【００３１】
本発明によれば、ＦＬＩＮＴアイソフォームは、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、を含む様々な技術によって分離することができる。ｐＨグラジェントおよび中に置き、電場に付したときに、タンパク質は正味の電荷を有しない点に移動する。これはそのタンパク質の等電点(ｐＩ)である。ＩＥＦで観察される個々のバンドは特定のｐＩを有する分子を表し、同じ重複する電荷はアイソフォームと呼ばれる。本明細書で用いられる用語「ＦＬＩＮＴアイソフォーム」は、適当な方法似よって測定したときにほぼ同じｐＩを有し、そして同じアミノ酸配列を有するＦＬＩＮＴ調製物を意味する。
【００３２】
ＦＬＩＮＴアイソフォームを分離するためのその他の方法としては、イオン交換カラムによる分画が挙げられる。好ましくは、アイソフォームを液体クロマトグラフィーによって分離する。
【００３３】
好ましい態様では、ＦＬＩＮＴを非ヒト真核宿主細胞で組換えにより発現させる（即ち、「組換えＦＬＩＮＴ」）。組換えＦＬＩＮＴは、本明細書の一部を構成する、一般に公開されているＰＣＴ出願ＷＯ００／５８４６６、ＷＯ００／５８４６５、およびＷＯ９９／５０４１３に記載されている方法にしたがって都合よく製造および精製する。例えば、ＦＬＩＮＴｃＤＮＡを、ＦＬＩＮＴ遺伝子発現およびＤＨＦＲ選択を指揮するＣＭＶプロモーターを提供するベクターｐｃＤＮＡ３ＤＨＦＲに組み込む。ＤＧ４４-Ｃ.Ｂ４ＣＨＯ細胞を線状化ベクターでエレクトロポレーションによりトランスフェクトする。非選択的増殖については、細胞をＥｘ-Ｃｅｌｌ３０２培地(JRH BioSciences), 1X HT Supplement (GibcoBRL)、１×デキストラン硫酸塩 (Sigma)および６ｍＭＬ−グルタミン (GibcoBRL) 中で培養する。選択的増殖については、細胞を、Ex-Cell 302培地 (JRH BioSciences), １×Supplement (GibcoBRL)、１×デキストラン硫酸塩 (Sigma)、６ｍＭＬ−グルタミン (GibcoBRL)およびメトトレキセート(20ｍＭstock, USP)中で培養する。
【００３４】
エレクトロポレーションの後、細胞を非選択的培養用培地に７２時間回収する。９６ウェルプレートを用いてプレーティングを行う。種々の細胞密度、および種々のメトトレキセート(ＭＴＸ)選択圧のレベルで細胞をプレーティングする。コロニー形成が認められたら、プレートをＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ウェルを２４ウェルディスに移し、細胞を完全発現試験に十分に増殖させる。
【００３５】
マスターのウェルを種々のレベルのメトトレキセートで増幅させる。すべてのマスターのウェルが、増幅工程の終了時点で増加した発現レベルを示した。２つのマスターウェルをＦＡＣＳクローニングを用いてクローニングした。
【００３６】
別の組換えＦＬＩＮＴのアイソフォーム(配列番号３)は、１〜８シアル酸を有するＦＬＩＮＴ分子に対応した。ＦＬＩＮＴ１分子あたりのシアル酸残基の数が増えると、 in vivoでのＦＬＩＮＴのクリアランスが遅くなる効果がある
【００３７】
本明細書において示されるように、in vivoクリアランスＦＬＩＮＴおよびＲ２１８Ｑ(配列番号１の第２１８番においてＡｒｇからＧｌｎ)等のプロテアーゼ耐性アナログは、シアル酸含量と関連している(実施例３および４参照)。具体的には、シアル酸含量の大きいＦＬＩＮＴ、例えば、より大きい平均シアル酸含量は、霊長類において、対応する低いシアル酸含量を有する対応するＦＬＩＮＴよりもｉｎｖｉｖｏでゆっくりと消失する。天然ＦＬＩＮＴは、１つのＮ−結合部位と１つのＯ−結合部位を有し、Ｒ２１８Ｑアナログは、１つのＮ−結合部位と２つのＯ−結合部位を有し、Ｒ２１８Ｑにおいて天然ＦＬＩＮＴに対するさらなるＯ−結合部位が配列番号１の第２１６番に存在する。
【００３８】
ＦＬＩＮＴアイソフォーム
本発明は、ＦＬＩＮＴアイソフォームの組成物を提供する。ＦＬＩＮＴの特定のアイソフォームのシアル酸化パターンは、特に製造に用いた宿主細胞および増殖条件に依存して変化し得る。好ましい態様では、本発明は、平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ一分子あたり約０.５シアル酸残基；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約１.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約１.５シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約２.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約２.５シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約３.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約３.５シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約４.０シアル酸；ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約４.５シアル酸；ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約５.０シアル酸；ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約５.５シアル酸；ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約６.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり約６.０シアル酸以上のシアル酸含量を有するＦＬＩＮＴアイソフォーム組成物に関する。
【００３９】
平均シアル酸含量に関して定義される本発明の組成物は、それぞれ異なるシアル酸含量またはプロファイルを有し得る種々のＦＬＩＮＴアイソフォームを含有していてもよい。例えば、Ｎ−結合部位は、理論的には１つの部位に０、１、２、３、または４シアル酸を有し得る；Ｏ−結合部位は、理論的には１つの部位に０、１、または２シアル酸を有し得る。平均シアル酸含量がＦＬＩＮＴ１モルあたり約１シアル酸の天然ＦＬＩＮＴの組成物が考えられる。本発明の範囲内に属する組成物は、Ｎ−結合部位で平均して１回シアル酸化されている、またはＯ−結合部位で１回シアル酸化されているものが含まれ得る。本発明の範囲内に含まれる他の例として、組成物中のＦＬＩＮＴ分子の画分の複数のシアル酸化が挙げられることは当業者によって理解される。本発明の組成物は、アイソフォームのそのような組み合わせのいずれかおよびすべてを意図する。
【００４０】
本発明はさらに、ＦＬＩＮＴアイソフォーム組成物の製造方法を提供する。これらの方法には、調製用等電点電気泳動法またはイオン交換クロマトグラフィー、またはクロマトフォーカシング等の方法によるアイソフォームの単離が含まれる。
【００４１】
一般的に、イオン交換クロマトグラフィーおよびクロマトフォーカシングは、カラム樹脂へ、ＦＬＩＮＴを含む準備した培地または精製した物質を、いくつかまたはすべてのＦＬＩＮＴアイソフォームの樹脂への結合を可能にする条件化でアプライする。
約ｐＨ５でカラムにタンパク質をアプライするのが好ましい。カラムを約ｐＨ５の緩衝液で洗浄した後、イオン交換カラムに結合したＦＬＩＮＴアイソフォームを、増加する塩濃度の緩衝液で溶出する。クロマトフォーカシングについては、ｐＨをグラジェントに下げるか、またはカラムを高濃度の塩で洗浄することにより、カラムから溶出する。
【００４２】
ＦＬＩＮＴ分子は分子のシアル酸含量を限定することができる、Ｎ−結合またはＯ−結合オリゴ糖構造を有する。例えば、テトラ触角型（antennary）(４つに分岐した)Ｎ−結合オリゴ糖は、シアル酸結合のための可能な部位が４つあるが、アスパラギン結合部位の４触角型構造に対して置換することができる２および３触角型オリゴ糖鎖は、結合したシアル酸を通常２または３個有する。Ｏ−結合オリゴ糖は通常シアル酸結合のための部位を２つ持っている。
【００４３】
このように、ＦＬＩＮＴ分子は、１個のＮ−結合オリゴ糖が４触角型であれば、合計８つのシアル酸残基を有する。ＦＬＩＮＴのＮ−結合オリゴ糖は、ガラクトースに対してα-２，３およびα−２，６結合の両方でシアル酸を含む(Takeuchi et al. J. Biol. Chem. 263, 3657(1988))。典型的には、α-２，３結合のシアル酸をマンノースα-１，６分岐鎖でガラクトースに付加し、α-２，６結合のシアル酸をマンノースα-１，３分岐鎖でガラクトースに付加する。これらシアル酸を付加する酵素(β-ガラクトシドα-２，３ シアリルトランスフェラーゼおよびβ-ガラクトシドα-２，６ シアリルトランスフェラーゼ) が、シアル酸をそれぞれマンノースα-１，６およびマンノースα-１，３分岐鎖に付加するのに最も効率的である。
【００４４】
哺乳類培養細胞を、組換えＦＬＩＮＴに４触角型の鎖を優先的に付加する細胞についてスクリーニングし、これによりシアル酸結合のための部位の数を最大限にすることができる。ジヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ(DHFR)欠損Chinese Hamster Ovary (CHO) 細胞が、組換えＦＬＩＮＴを含む組換え糖タンパク質の製造に一般的に用いられる。これらの細胞は、β-ガラクトシドα-２,６シアリルトランスフェラーゼ酵素を発現しないため、シアル酸を、これら細胞によって産生された糖タンパク質のＮ−結合オリゴ糖へα-２,６結合で付加しない (Mutsaers et al. Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986)；Takeuchi et al. J. Chromatogr. 400, 207 (1987))。したがって、CHO 細胞で産生された組換えＦＬＩＮＴは、2,6結合でガラクトースに結合したシアル酸を欠いている (Sasaki et al. (1987), 前掲；Takeuchi et al. (1987), 前掲)。したがって、本発明の１つの態様では、ガラクトースにα-２,６結合での組み込むための機能的なβ-ガラクトシドα-２,６シアリルトランスフェラーゼ遺伝子でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞でＦＬＩＮＴアイソフォームを産生させる。修飾したＣＨＯ細胞,または他の哺乳動物宿主細胞作成するための方法の開示としては、本明細書の一部を構成するLee et al. J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989)を参照。
【００４５】
ＦＬＩＮＴのシアル酸化のin vitroでの増大
さらに本発明は、in vitro での酵素的修飾によるシアル酸化を増大させる方法を意図する。
【００４６】
血中のＦＬＩＮＴ等の糖タンパク質の循環寿命は、Ｎ−結合オリゴ糖の組成と構造に大きく依存する。一般的に、糖タンパク質の血漿半減期を最大にするには、そのＮ−結合炭化水素基がＮｅｕＡｃＧａｌＧｌｃＮＡｃの配列で終わっていることが必要である。末端のシアル酸残基(ＮｅｕＡｃ)がなければ、暴露したＧａｌ残基を認識するレセプターによって糖タンパク質は血液から急速に消失する。このため、ＦＬＩＮＴのような治療タンパク質の高度のシアル酸化を可能にすることは、商業的な開発には重要である。
【００４７】
糖タンパク質における炭化水素構造の複雑さについては多くのことが知られているが、培養細胞において翻訳後グリコシレーションを特定する試みは遺伝子発現の技術と同じように進歩しているわけではなく、ＦＬＩＮＴを含めて、分泌型組換え糖タンパク質のグリコシレーションは不完全であるのが一般的である。この問題に対する１つの解決手段は、炭化水素鎖を完全にするためのｉｎｖｉｔｒｏでの単離されたグリコシルトランスフェラーゼの使用である。
【００４８】
最適なグリコシレーションは、哺乳類細胞培養系を用いて達成することは難しいかもしれない。大規模な増殖条件下では、糖タンパク質のタンパク質骨格の過剰産生は、完全なシアル酸化を達成する宿主細胞の能力を超え得る。
【００４９】
本発明の方法は、シアル酸をＦＬＩＮＴの受容部位に付加するためのシアルトランスフェラーゼの使用を含み、好ましくは、該部位は、ガラクトシル単位を有する。ＦＬＩＮＴのシアル酸化を増大させるための方法は、本明細書の一部を構成する、米国特許第６、０３０、８１５号の開示にしたがう。本質的には、個の方法は、シアルトランスフェラーゼをＦＬＩＮＴのサンプルおよび触媒量のＣＭＰ−シアル酸合成酵素、シアル酸、ＣＴＰおよび可溶性の２価の金属陽イオン（Ｍｎ+2、Ｍｇ+2、Ｃａ+2、Ｃｏ+2、およびＺｎ+2を含む）に添加する工程を含む。好ましくは、２価陽イオン濃度を２ｍＭ〜７５ｍＭに維持する。あるいは、反応物はさらに、米国特許第６、０３０、８１５号に記載のように、ＣＭＰ−シアル酸再生系（recyclilng system）を含み得る。反応を行うための商業的に入手可能な系 (GlycoAdvance（登録商標））はNeose Technologies, Inc. (Horsham, PA)から入手可能である。
【００５０】
本発明の別の態様では、ＦＬＩＮＴは、ＦＬＩＮＴを発現させるための適当なベクターでトランスフェクトすることにより、適当な哺乳類細胞型、例えば CHO 細胞、において組換えにより製造する。ＦＬＩＮＴを含む培養上清を濃縮し、GlycoAdvance（登録商標）系または商業的な非商業的な系を用いてプロセシングする。増大したシアル酸化を有するＦＬＩＮＴを標準的な精製法を用いて回収する。
【００５１】
本発明はさらに、治療的適用に有用な適当な希釈剤、アジュバントおよび／または担体と共に、治療上有効量の、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均シアル酸含量約０.５シアル酸、あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約１.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約１.５シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約２.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約２.５シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約３.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約３.５シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約４.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約４.５シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約５.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約５.５シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約６.０シアル酸；あるいは、ＦＬＩＮＴ一分子あたり平均約６.０以上のシアル酸を有するＦＬＩＮＴアイソフォームを含有する医薬組成物を意図する。本明細書において用いられる「治療上有効な量」とは、与えられた条件および投与レジメに関して治療効果をもたらす量を意味する。ＦＬＩＮＴアイソフォームの投与は、静脈内投与が好ましい。
【００５２】
治療的適用
本発明のＦＬＩＮＴアイソフォームの臨床的有用性は実質的なものであると期待される。ＦＬＩＮＴはＦａｓとＦａｓＬおよびＬＩＧＨＴとＬＴＢＲおよびＴＲ２／ＨＶＥＷレセプターの結合を阻害し、そのような結合が関与し得る疾患および／または状態を処置するために用いることができる。
【００５３】
ＦａｓＬ／Ｆａｓが関与する多くの病気および／または病状は、ＦＬＩＮＴ類似体による治療に応じやすい可能性がある。適当な病気および／または病状の例には、以下のものが含まれる。
【００５４】
炎症性／自己免疫疾患−リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、移植片対宿主病、インスリン依存性糖尿病、ＳＩＲＳ／敗血症／ＭＯＤＳ、膵炎、乾癬、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、Ｇｒａｖｅ病、移植拒絶、ＳＬＥ、自己免疫性胃炎、繊維化肺疾患が含まれる。
【００５５】
感染性疾患−ＨＩＶ性リンパ球減少症、劇症ウイルス性Ｂ／Ｃ型肝炎、慢性肝炎／肝硬変、Ｈ.ｐｙｌｏｒｉ関連潰瘍形成。
【００５６】
虚血／再還流病状−急性冠動脈症候群、急性心筋梗塞、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、急性脳虚血／梗塞、脳／脊髄損傷、移植時の臓器保存。
【００５７】
その他の処置としては、癌治療時の細胞保護、化学療法の補助、アルツハイマー性慢性糸球体腎炎、骨粗鬆症、ＴＴＰ／ＨＵＳ、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群が挙げられる。急性肺損傷(ＡＬＩ）／急性呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ)、潰瘍性大腸炎、およびクローン病の治療および予防も興味深い。
【００５８】
ＦＬＩＮＴ類似体が治療的に有用である他の疾患には、リウマチ性関節炎(Elliott et al., Lancet 344: 1105-10 (1994))、繊維増殖性肺疾患、繊維性肺疾患、HIV (Dockrell et al., J. Clin. Invest. 101: 2394-2405 (1998))、虚血 (Sakurai et al. 1998 Brain Res 797: 23-28)、脳外傷／損傷(Ertel et al. 1997 J Neuroimmunol 80: 93-6)、慢性腎不全(Schelling et al. 1998 Lab Invest 78: 813-824)、移植片対宿主疾患(GVHD) (Hattori et al. 1998 Blood 11: 4051-4055)、皮膚炎症 (Orteu at al. 1998 J Immunol 161: 1619-1629)、血管漏出症候群（Vascular leak syndrome）(Rafi et al. 1998 J Immunol 161: 3077-3086)、Helicobacter pylori感染症(Rudi et al. 1998 J Clin Invest 102: 1506-1514)、Goiter (Tamura et al. 1998 Endocrinology 139: 3646-3653)、アテローム性動脈硬化症(Sata and Walsh, 1998 J Clin Invest 102: 1682-1689)、IDDM (Itoh et al. 1997 J Exp Med 186: 613-618)、骨粗鬆症(Jilka et al. 1998 J Bone Min Res 13: 793-802)、クローン病(van Dullemen et al. 1995 Gastroenterology 109: 129-35)、臓器保存および移植（移植片）拒絶(Lau et al. 1996 Science 273: 109-112)、敗血症(Faist and Kim. 1998 New Horizons 6: S97-102)、膵炎(Neoptolemos et al. 1998 Gut 42: 886-91)、癌(メラノーマ、大腸、および食道）(Bennett et al. 1998 J Immunol 160: 5669-5675)、自己免疫病(IBD、乾癬、ダウン症候群 (Seidi et al., Neuroscience Lett. 260: 9 (1999)、および多発性硬化症 (D'Souza et al. 1996 J Exp Med 184: 2361-70)が含まれる。アルツハイマー病、末期腎疾患(ESRD)、単球増加症（mononulceosis）、EBV、ヘルペス、抗体依存性細胞毒性、溶血および凝固過剰症候群、例えば血管出血、DIC (播種性血管間凝固）、子癇、HELLP (血小板減少症、溶血、および肝機能障害に伴う子癇前症）、HITS (ヘパリン性血小板減少症)、HUS (溶血性尿毒症症候群）、および子癇前症、造血障害、例えば再生不良性貧血、血小板減少症(TTP)、および骨髄異形成（myelodysplasia)、ならびに例えばE. bolaによって生じる溶血性発熱（hemolytic fever）が含まれる。
【００５９】
例えば、回収用調製物において臓器を保存する場合は、ＦＬＩＮＴは、臓器提供者から取り出した臓器に対する虚血再還流障害に関連するアポトーシスを防ぐために予防的に有用である。この目的に適した媒質は知られている（例えば、ＥＰ０３５６３６７Ａ２に記載の媒質（この内容は本明細書の一部を構成する））。該方法には移植手術の前および／または後に移植者をＦＬＩＮＴで処置することを含んでいてもよい。
【００６０】
ARDSにヒトの可溶性FasL/Fas相互作用が介在することがあるという証拠がある (Matute-Bello et al., J. Immunol. 163,2217-2225,1999)。ＦＬＩＮＴはFasLと結合することにより肺細胞（pneumocytes）および／または内皮細胞のFasL介在性アポプトーシを阻害することにより、急性炎症性傷害からALIへの、およびALIからARDSへの進行を阻害または予防するかも知れない。
【００６１】
したがって、別の態様において、本発明は治療的有効量のＦＬＩＮＴをそれを必要とするヒトに投与することを含むＡＬＩおよび／またはＡＲＤＳを阻害および／または治療するためのＦＬＩＮＴの使用に関する。
【００６２】
別の態様において、本発明は、治療的有効量のＦＬＩＮＴを投与することにより慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤを治療および／または阻害する必要がある患者のＣＯＰＤを治療および／または阻害するためのＦＬＩＮＴアナログの使用に関する。
【００６３】
別の態様において、本発明は肺繊維症（ＰＦ）を阻害および／または治療するためのＦＬＩＮＴの使用に関する。例えば、ＦＬＩＮＴを肺への炎症性傷害時（例えばブレオマイシン処置時）に急性に投与し、ＰＦの発生を防ぐことができる。
【００６４】
「対象」は治療（処置）を要する哺乳動物、好ましくはヒトであるが、獣医的治療を要する動物、例えば家畜（domestic animals）（例えばイヌ、ネコなど）、家畜（farm animals）（例えば乳牛、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えばラット、マウス、モルモットなど）でもあり得る。
【００６５】
ＦＬＩＮＴアイソフォームの「有効量」は、ＦＡＳとＦＡＳリガンドまたはＬＩＧＨＴとＬＴβＲおよび／またはＴＲ２／ＨＶＥＭとの結合が介在する１またはそれ以上の過程の充分な阻害をもたらし、異常なＦＡＳ／ＦＡＳＬ結合および／またはＬＩＧＨＴ介在結合に関連し得る病気または病状を有する対象において所望の治療もしくは予防効果を達成する量である。そのような過程の１例がランナウェイアポトーシスである。あるいはまた、ＦＬＩＮＴアイソフォームの「有効量」は、ＦＡＳＬ誘導好中球活性化により生じる炎症、または異常なＦＡＳＬ活性に関連するあらゆる他の前記疾患を有する対象において所望の治療および／または予防効果を達成するのに充分な量である。
【００６６】
病気または病状を有する対象における「所望の治療および／または予防効果」には、そのような病気に関連する症状の軽減もしくは症状の発現の遅延が含まれる。あるいはまた、「所望の治療および／または予防効果」には、該病気を有する対象の生存率の増加または寿命の増加が含まれる。
【００６７】
個体に投与するＦＬＩＮＴアイソフォームの量は、病気の種類と重症度、および個体の特性、例えば一般健康状態、年齢、性別、体重、および薬剤に対するトレランスに依存するであろう。該量は、病気の程度、重症度、および種類にも依存するであろう。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な用量を決定することができよう。
【００６８】
一般的提案として非経口的に投与される、用量あたりの本発明ＦＬＩＮＴアイソフォーム分子の総医薬的有効量は、約１μｇ／ｋｇ（患者体重）／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、詳細には２ｍｇ／ｋｇ／日〜８ｍｇ／ｋｇ／日、より詳細には詳細には２ｍｇ／ｋｇ／日〜４ｍｇ／ｋｇ／日、さらにより詳細には２.２ｍｇ／ｋｇ／日〜３.３ｍｇ／ｋｇ／日、および最終的には２.５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、前述したように、これは治療上の自由裁量に従うであろう。より好ましくは、この用量は少なくとも０.０１ｍｇ／ｋｇ／日である。連続的に与える場合は、典型的には、本発明ＦＬＩＮＴアイソフォームは約１μｇ／ｋｇ／時〜約５０μｇ／ｋｇ／時の投与速度で１日に１〜４回注射するか、または例えばミニポンプを用いて連続的に皮下注入することにより投与される。静脈用バッグ溶液を用いてもよい。変化を観察するのに必要な処置の長さと反応が生じるための治療後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【００６９】
本発明のＦＬＩＮＴアイソフォーム分子を含む医薬組成物は、経口的、経直腸的、頭蓋内、非経口的、槽内（intracisternally）、膣内、腹腔内、局所的（粉末剤、軟膏、滴剤、または経皮パッチによる）、経皮的、鞘内、腔内、または経口もしくは鼻内スプレーとして投与してよい。「医薬的に許容される担体」は、非毒性固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、カプセル化（encapsulating）物質、またはあらゆる種類の製剤助剤を意味する。本明細書で用いている用語「非経口的」には、限定されるものではないが、ＦＬＩＮＴアイソフォームを含む静脈内、筋肉内、腹腔内、イントラスターナル（intrasternal）、皮下、および動脈内注射、注入、およびインプラントが含まれる。
【００７０】
本発明のＦＬＩＮＴアイソフォームは持続放出系によっても適切に投与される。適切な持続放出組成物の例には、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形の半透過性ポリマー物質を含む。持続放出マトリックスには、ポリラクチド（米国特許第3,773.919号、EP 58,481)、L-グルタミン酸およびγ−エチル-L-グルタメートの共重合体(Sidman, U. et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983))、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート）(R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981)、およびR. Langer, Chem. Tech. 12: 98-105 (1982))、エチレンビニルアセテート(R. Langer et al., Id.)、またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)が含まれる。他の持続放出組成物には、リポソームに吸着された（entrapped）ＦＬＩＮＴも含まれる。そのようなリポソームは本質的に知られた方法により製造される：DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EDP 143,949; EP 142,641; 日本特許出願第83-118008号; 米国特許第4,485,045および4,544,545号；ならびにEP 102,324。通常、リポソームは、脂質含有量が約30 mol ％コレステロールより大きい小（約200-800Å）単層型である（選択する割合は最適なTNFRポリペプチド療法に対して調整される）。
【００７１】
非経口投与するには、一般に、本発明のＦＬＩＮＴアイソフォームを所望の純度で医薬的に許容される担体、すなわち、用いる用量および濃度でレシピエントに無毒であり、製剤の他の成分と適合性である担体と混合して注射可能な単位用量剤形（溶液剤、サスペンジョン剤、またはエマルジョン剤）に製剤化される。例えば、該製剤は酸化剤およびポリペプチドに有害であることが知られている他の化合物を含まないことが望ましい。
【００７２】
典型的には本発明ＦＬＩＮＴアイソフォームは、適当なビークルを用いて約０.１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１-１０ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ約３〜８）の濃度に製剤化される。賦形剤、担体、または安定化剤のあるものを用いて本発明ＦＬＩＮＴ分子の塩が形成されると理解されよう。
【００７３】
本発明は、本発明の医薬組成物の１またはそれ以上の成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む医薬パックもしくはキットをも提供する。そのような容器には、医薬品もしくは生物学的生成物の製造、使用もしくは販売を規制する政府機関が規定する様式の、ヒト投与用の製造、使用もしくは販売の該機関による承認を反映した注意書を組み合わせることができる。さらに、本発明ＦＬＩＮＴ類似体は他の治療用化合物と組み合わせて用いてよい。
【００７４】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に記載するが、本発明の範囲の限定するものではない。
【実施例】
【００７５】
実施例１
組換えＦＬＩＮＴアイソフォームの単離
哺乳動物発現ベクターpGTD (Gerlitz, B. et al., 1993, Biochemical Journal 295:131)中に「内在リボソームエントリー（entry）部位」／緑色蛍光増強ポリペプチド(IRES/eGFP)をコードするPCR断片を挿入することにより、ビシストロニック（bicistronic)発現ベクターを構築した。pIG3で表すこの新規ベクターは以下のエレメントを含む：Ela反応性GBMTプロモーター(D.T.Berg et al., 1993 BioTechniques 14:972; D.T.Berg et al., 1992 Nucleic Acids Research 20: 5485)、多クローニング部位(MCS)、脳心筋炎ウイルス(EMCV)由来IRES配列、eGFPコード配列(Cormack, et al., 1996 Gene 173:33, Clontech)、SV40小「t」抗原スプライス部位／ポリアデニル化配列、SV40初期プロモーター、および複製起点、ネズミジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)コード配列、ならびにpBR322由来複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子。
【００７６】
ヒトＦＬＩＮＴ cDNA配列（例えば配列番号３）に基づき、各5'末端にBclI制限部位を有するフォワードおよびリバースPCRプライマーを合成する。これらプライマーを用いてＦＬＩＮＴ類似体cDNAをPCR増幅する。ヒトＦＬＩＮＴ cDNAの方向とヌクレオチド配列を制限消化および挿入物の二本鎖シーケンシングにより確認する。ＦＬＩＮＴ類似体PCR増幅約900塩基対をそれぞれ制限エンドヌクレアーゼNheIおよびXbaIで消化し、NheIおよびXbaI粘着末端を有する断片を生成した。次いで、この断片をpIG3のユニークXbaI部位と結合させ、組換えプラスミドpIG3-ＦＬＩＮＴを得た。
【００７７】
組換えｐＩＧ３−ＦＬＩＮＴプラスミドは、ＦＬＩＮＴ遺伝子を有し、メトトレキセートに対する耐性をコードする。AV12 RGT18細胞を、リン酸カルシウム法を用いて組換えpIG1ベクターでトランスフェクトする。250nMメトトレキセートに耐性な細胞を選んでプールする。耐性クローンのプールを蛍光補助セルソーティング(FACS)にかけ、ポピュレーションの上から5%の蛍光値を有する細胞をソートし単細胞としてプールした。高蛍光プールを２回連続ソーティングにかけた。一回および二回目に得られたプールおよび個々のクローンのＦＬＩＮＴ産生をELISAで分析した。最高レベルにＦＬＩＮＴを発現しているプールまたはクローンを用いてスケールアップさせ、ＦＬＩＮＴを精製した。
【００７８】
ＦＬＩＮＴの大規模製造を、数個１０Ｌスピナー中で、ｐＩＧ３−ＦＬＩＮＴでトランスフェクトしたＡＶ１２ ＲＧＴ１８細胞の安定なクローンを培養することにより行った。コンフルエントに達した後にさらに細胞を２〜３日間インキュベーションし、培地中に最大量のＦＬＩＮＴを分泌させた。ＦＬＩＮＴを含む培地を、０．１％ＣＨＡＰＳに調整し、Amicon ProFlux M12タンジェンシャルろ過システムにて350mLに濃縮した。濃縮した培地をｐＨ６．０に調整し、流速７mL/分でＳＰセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Pharmacia, 500mL)に通した。吸光度(280nm)がベースラインに戻るまでカラムを緩衝液A (２０ｍＭ  ＭＯＰＳ, ０．１％ＣＨＡＰＳ, pH６．０)で洗浄し、結合したポリペプチドを０〜１ＭのＮaＣl (緩衝液A中)の直線勾配で、４カラム体積分展開して溶出した。ＦＬＩＮＴを含む分画をプールし、流速１０mL／分で０.１％ＴＦＡ／Ｈ2Ｏで平衡化したＶｙｄａｃＣ４カラム(１００ml)に通した。この物質をPBS、0.5M NaCl、pH7.4で平衡化した16/60 Superdex200分粒カラム(Pharmacia)に通す。ＦＬＩＮＴ含有分画をSDS-PAGEで分析し、精製ポリペプチドのN末端配列がＦＬＩＮＴであることを確認する。
【００７９】
別の精製法として、濃縮し、透明にした、ＦＬＩＮＴを含有する培地をＢｌｕｅセファロースＤＡＣに通し、７Ｍ尿素、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ８）で溶出する。溶出した物質はさらにＣＧ７１逆相クロマトグラフィーで精製し、３５％アセトニトリル、０.６ＭＮａＣｌ（ｐＨ７.４）で溶出した。溶出した物質を、３０％アセトニトリル（ｐＨ２.５）で溶出するＳＰ６５０Ｍ陽イオン交換でさらに精製した。この工程の後、溶出した物質をＴＦＦを緩衝液に溶媒交換し、大容量の冷凍庫で保存する。
【００８０】
ＦＬＩＮＴは、配列番号１のＡｓｎ１４４で１個のＮ−結合糖タンパク質部位を有している。ＦＬＩＮＴのオリゴ糖構造を特徴付けるために、ＡＶ１２細胞にて産生させ、インタクトなＦＬＩＮＴおよび、のサンプルを、およびノイラミニダーゼおよびＨＥＸｓｅＩＩで処理して、末端のＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ残基を除去したＦＬＩＮＴ(脱シアル酸化ＦＬＩＮＴ)のサンプルをキャピラリーＨＰＬＣ／ＥＳＩ-ＭＳにより分析した。この処理によって遊離したオリゴ糖を２-アミノベンズアミドで標識し、弱陰イオン交換(ＷＡＥ)ＨＰＬＣおよびＬＣ質量分析法(ＬＣ／ＭＳ)により解析した。
【００８１】
実施例２
ＨＰＬＣ／ＥＳＩ-ＭＳおよび蛍光ＨＰＬＣによるフリントのオリゴ糖プロファイル
ＦＬＩＮＴは１個のＮ−グリコシレーション部位を有する。分析に用いた組換えＦＬＩＮＴは、実施例１と同様にＡＶ１２細胞にて発現させ、精製した。インタクトなＦＬＩＮＴをキャピラリーＨＰＬＣ／ＥＳＩ-ＭＳにより直接分析するか、またはノイミラニダーゼまたはＨＥＸａｓｅＩＩ、次いでＨＰＬＣ／ＥＳＩ-ＭＳで処理した。得られた質量および予測されるＦＬＩＮＴペプチド骨格の質量に基づいて、オリゴ糖構造を計算した。蛍光標識したＦＬＩＮＴオリゴ糖を弱陰イオン交換(ＷＡＥ)ＨＰＬＣにより分画した。画分を集め、ＬＣ／ＭＳにより同定した。
【００８２】
ＦＬＩＮＴのノイミラニダーゼ、ＨＥＸａｓｅＩＩ処置
ＦＬＩＮＴ含有溶液１０μＬ(ＰＢＳ中０.４３ｍｇ／ｍＬ、０.５ＭＮａＣｌ)を８μＬの５０ｍＭＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５.２）、および２ｕＬのノイミラニダーゼ溶液(１ｕｎｉｔ／ｍＬ)と混合した。この混合物を３７℃で２時間インキュベーションした。この混合物７μＬをＨＰＬＣ／ＭＳ分析に用い、２μLのHEXaseII酵素溶液 (Glyko, Inc.)を残りの溶液に加え、これを３７℃で３時間インキュベーションしたのち、HPLC／MS分析に付した。
【００８３】
蛍光標識したオリゴ糖の弱陰イオン交換(ＷＡＥ)ＨＰＬＣ
約０.２ｍｇのタンパク質を含有する、融解した、ＦＬＩＮＴ溶液の２００μＬのアリコートを、６０ｍｇの尿素、１７.６μＬの３ＭＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ８.０)および３μＬの５０ｍｇ／ｍＬジチオスレイトールと混合し、この混合物を３７℃で１０分間インキュベーションした。１００ｍｇ／ｍＬのヨード酢酸溶液５μＬを添加してサンプルをアルキル化して、暗室下、室温で１０分間インキュベーションした。サンプルを使い捨てのゲル濾過カラムで脱塩し、１単位のＮ−ガラクトシダーゼＦ溶液で、３７℃にて２時間処理することによってオリゴ糖を遊離させた。脱グリコシル化したタンパク質を１０％(ｖ／ｖ)酢酸溶液でｐＨを調整することによって沈殿させた。オリゴ糖溶液の３００μＬのアリコートを乾燥し、２-アミノベンズアミド染料で標識した。過剰の染料をＰ-２スピンカラムを用いて除去した後、標識されたオリゴ糖溶液を蛍光検出器を用いてＷＡＥ-ＨＰＬＣで分析した。
【００８４】
２-ＡＢ標識したＦＬＩＮＴオリゴ糖のＷＡＥＨＰＬＣ画分の脱シアル酸化
回収したＷＡＥＨＰＬＣ画分をそれぞれ２本のバイアルに移し、遠心吸引システムを用いて乾燥した。１５μＬ(ノイミラニダーゼ２.５ｍｕｎｉｔｓを含む)の１５ｍＭＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５.２）を各画分について１本のバイアルに加えた。この混合物５μＬを室温で１〜１５時間インキュベーションした後、ＬＣ／ＭＳ分析のために用いた。インタクトなオリゴ糖画分については、１５μＬのＨ2Ｏを（９）バイアルに加え、この溶液の５μＬをＬＣ／ＭＳ分析に用いた。
【００８５】
キャピラリーＨＰＬＣ／ＥＳＩ-ＭＳ
126型溶媒デリバリーモジュールを取り付けたBeckman System Goldを使用した。HPLC 緩衝液(Ａ:０.１５％ギ酸（Ｈ2Ｏ中）およびＢ:０.１２％ギ酸（ＡＣＮ中）)をＴスプリットを介してポンプで送り込み、Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢＣ１８、２.１×１５０ｍＭカラムを出口と手動注入バルブにつなぎ、Ｖｙｄａｃキャピラリーカラム(Ｃ１８、０.３×１５０ｍｍ)およびＡＰＩＵＶ検出器(７８５Ａ)を別の出口につないだ。キャピラリーからのＨＰＬＣの流出分を、接合させたシリカ輸送ラインを通じて直接質量分析器に通した。Ｂｅｃｋｍａｎ溶媒デリバリーシステムは、以下のグラジェントで０.２ｍｌ／分にてポンプで送り込んだ。
時間 (分)   0   2  42  43  45  46  57
緩衝液Ｂ％ 10  10  45  90  90  10  10
【００８６】
スプリットの後、約５-６μＬ／分のＨＰＬＣ流出分をキャピラリーカラムへ迂回させた。実施するごとに約２μｇのＦＬＩＮＴをキャピラリーカラムへ注入した。ＡＰＩＵＶ検出器を、λ＝２１４ｎｍにセットし、データをＨＰ１０００に格納した。アーティキュレーテッド・イオンスプレー源を取り付けたＰＥＳｃｉｅｘＡＰＩＩＩＩ質量分析計を、ＣＣ１、ＯＲ５５ＶおよびＩＳＶ４８００Ｖ、Ｑ１ｓｃａｎ９０〜１５００または１００〜１４００、０.３３または０.２０／ステップ、から滞留時間３ｍｓおよび６ｓｅｃ／スキャンの条件下で、これらの試験に用いた。オリゴ糖画分分析については、ショート溶媒グラジェントプログラムを用いた。
【００８７】
ＦＬＩＮＴは、１つのＮ−グリコシレーション部位、Ａｓｎ−１４４を有する。タンパク質単独の理論的な分子量は２９７３６.９Ｄａである。インタクトなＦＬＩＮＴの質量スペクトルおよび再構成した質量スペクトルによって、初発シグナルの分子量３１８３９、３１８８３、３１９１８、３２０９０、３２１３１、３２１６９Ｄａであり、予測されるタンパク質配列の分子量よりも約２ｋＤａ高かった。これらの質量は、二触角型オリゴ糖の予測される分子量である。中性およびアミノ単糖組成の定量分析は、ＦＬＩＮＴがＧｌｃＮＡｃ、ＧｌａＮＡｃ、Ｍａｎ、ＧａｌおよびＦｕｃを含んでいることを示している。インタクトなＦＬＩＮＴの３２１３１Ｄａのシグナルは、(ＮｅｕＡｃ)２(Ｈｅｘ)４(ＨｅｘＮＡｃ)５(ｄＨｅｘ)１(２９７３６.９＋２３９３.２＝３２１３０.１Ｄａ)炭化水素部分を有するＦＬＩＮＴタンパク質１-２９９で構成されている。蒸留後、このシグナルは、３１５４７Ｄａ、ｔｗｏＮｅｕＡｃ残基の分子量(５８２.６Ｄａ)から-５８４Ｄａ、さらにＨＥＸａｓｅＩＩ処置後３１３４６Ｄａ、-２０１Ｄａ(ＨｅｘＮＡｃ)にシフトした。理論的には消失したＨｅｘＮＡｃ残基をＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃに割り当てることができる。しかし、単糖ＧａｌＮＡｃが認められＧａｌＮＡｃがＧｌｃＮＡｃに結合しているので、消失したＨｅｘＮＡｃは、ＧａｌＮＡｃでありＧｌｃＮＡｃではない。したがって３２１３１Ｄａの質量のオリゴ糖は(ＮｅｕＡｃ)２(Ｇａｌ)１(ＧａｌＮＡｃ)１(ＧｌｃＮＡｃ)４(Ｍａｎ)３(Ｆｕｃ)１である。
【００８８】
これらの実験結果に基づき、ＦＬＩＮＴの初発の糖構造は、ガラクトース残基を通常二触覚型の構造に置換する０〜２のＮ−アセチルガラクトサミン残基を有するモノ−およびジ−シアル酸化された二触角型のオリゴ糖であることが明らかになった。見つかったオリゴ糖の大部分は、五糖類の骨格構造にＦｕｃ残基を含んでいる。少量の三触覚型、シアロ二触覚型および硫酸化オリゴ糖もまた見つかった。
【００８９】
標識されたＦＬＩＮＴオリゴ糖は、それらの負電荷の数にしたがってＷＡＥＨＰＬＣにより複数のピークに分画された。各画分中の同定されたオリゴ糖初発構造は、モノおよびジ−シアル酸化された二触覚型オリゴ糖であり、総オリゴ糖の７０％以上である。三および／または四触覚型オリゴ糖は、炭化水素合計の１０％未満であった。
【００９０】
タンパク質が完全にグリコシル化されている場合、タンパク質中のシアル酸のモル比率をＷＥＡＨＰＬＣクロマトグラムにおける蛍光標識されたオリゴ糖の標準化されたピーク面積を用いて推定した。
【００９１】
ＦＬＩＮＴは、完全にグリコシル化されたグリコシレーション部位を１個のみ有するので(非グリコシル化タンパク質はＬＣ／ＭＳによって検出されなかった)、シアル酸含量を以下のＷＥＡＨＰＬＣの結果に基づいて計算することができる：
シアル酸含量＝画分のΣシアル酸化の程度×画分の百分率／１００。
【００９２】
ＦＬＩＮＴのこの調製物の平均シアル酸含量は、この蛍光標識法を用いて、タンパク質１モルあたり約１.５モルであると見積もられる。同様に、タンパク質に対するシアル酸の比率はＨＰＬＣ／ＭＳのデータによって決定することができる。この同じ方法を適用して、タンパク質に対するシアル酸の比率が、ＬＣ／ＭＳ分析について１.４であると決定された。ＷＥＡＨＰＬＣクロマトグラムの標準化されたピーク面積を用いることの利点は、ＦＬＩＮＴの正確な質量を正確に決定する必要がないということである。
【００９３】
シアル酸含量をJourdian et al. J. Biol. Chem. 246, 430 (1971)の方法の修飾によって決定することもできる。シアル酸残基を、０.３５Ｍ硫酸を用いて８０℃にて３０分間加水分解すること糖タンパク質から切断し、この溶液を水酸化ナトリウムで中和した後分析した。存在するタンパク質の量を見積もるために、組換えＦＬＩＮＴを標準として用い、Bio-Radによって供給される分析試薬およびマイクロ法を用いて、Bradfordタンパク質分析(Bradford Anal. Biochem. 72, 248 (1976))を行った。
【００９４】
実施例３
Ｒ２１８ＱＦＬＩＮＴのクリアランスに対する高度シアル酸化の効果
ＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)の２つのロット(Ｃ７Ｔ-６３Ａ-１およびＣ７Ｚ-ＰＢＳ-３２)の薬動力学を、雄性Cynomolgusサルにおけるクリアランスに対するシアル酸含量の影響について試験した。ＬＣ／ＭＳおよびオリゴ糖プロファイリングに基づいて、ｌｏｔ#Ｃ７Ｔ-６３Ａ-１のシアル酸比率は１.７、ｌｏｔ#Ｃ７Ｚ-ＰＢＳ-３２のシアル酸比率は０.４であった。
【００９５】
ＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)のロットを１回の静脈内ボーラス投与(０.５ｍｇ／ｋｇ)および血液サンプルを投与後４８時間の間に採取した。アフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗ＦＬＩＮＴ抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用い、処置した動物から得た血漿サンプルをＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)の濃度について分析した。捕捉抗体は、ＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)のＮ末端部分を認識する。サンドウィッチ抗体は、ＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)のＣ末端部分を認識するビオチン化ポリクローナル抗体であった。記載したように、ＥＬＩＳＡにおける測定は、全長ＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)、またはＮ−またはＣ-末端領域の分解が最小限である分子の存在に依存する。
【００９６】
静脈内投与後、二相法によって両ロットのＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)を血漿から除去した。化合物の両ロットのクリアランスは、早い（ｒａｐｉｄ）分配相で特徴的であった。全体として、Ｃ７Ｚ-ＰＢＳ-３２(シアル酸比率:０.４)のＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)の全身クリアランスは、ｌｏｔＣ７Ｔ-６３Ａ-１(シアル酸ｒａｔｉｏ:１.７)よりも約２.５倍速かった。
【００９７】
ロットＣ７Ｚ-ＰＢＳ-３２のＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)の初発分布は、より完全にシアル酸化された形態(ｌｏｔＣ７Ｔ-６３Ａ-１)で観察されたものより広範に広がっていた。５分のレベルの約１２％および２３％がそれぞれ、ロットＣ７Ｚ-ＰＢＳ-３２およびＣ７Ｔ-６３Ａ-１由来のＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)を投与してから１時間後に血漿に残存していた。さらに、最初の時点（５分）の濃度は、ロットＣ７Ｚ-ＰＢＳ-３２(５.４８μｇ／ｍｌ)の投与後の方が、ロットＣ７Ｔ-６３Ａ-１(８.４７μｇ／ｍｌ)の投与後よりも低かった。末期のｔ１／２は、より低いシアル酸含量を有するＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)についてさらに短かくなった。(８.３対１２.７時間；表１)。このデータは、ＦＬＩＮＴ(Ｒ２１８Ｑ)上に存在する炭化水素部分における末端のシアル酸化の程度が、静脈内経路での投与後の化合物のクリアランス動力学に影響を及ぼすことを示している。シアル酸化の程度が低い分子の循環血からのクリアランス速度の増大は、暴露された末端のガラクトシダーゼ残基によって肝臓のアシアロ糖タンパク受容体を介して媒介されている可能性が最も高い。
【００９８】
実施例４
天然ＦＬＩＮＴのクリアランスに対する高度なシアル酸化に対する効果
ＦＬＩＮＴの複数のロットの薬動力学を、哺乳類、例えば雄性CynomolgusサルにおけるＦＬＩＮＴのクリアランスに対するシアル酸含量の影響について試験した。ＬＣ／ＭＳを用いたオリゴ糖およびシアル酸プロファイリングを用いて、ロット間のシアル酸化の違いを調べた。
【００９９】
ＦＬＩＮＴのロットをCynomolgusサルに１回の静脈内ボーラス投与(０.５ｍｇ／ｋｇ)で投与し、血液サンプルを投与後４８時間の間に採取した。
【０１００】
アフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗ＦＬＩＮＴ抗体を用いたサンドウィッチＥＬＩＳＡ法を用い、処置した動物から得た血漿サンプルをＦＬＩＮＴの濃度について分析した。捕捉抗体は、ＦＬＩＮＴのＮ末端部分を認識する。サンドウィッチ抗体は、ＦＬＩＮＴのＣ末端部分を認識するビオチン化ポリクローナル抗体であった。記載したように、ＥＬＩＳＡにおける測定は、全長ＦＬＩＮＴ、またはＮ−またはＣ-末端領域の分解が最小限である分子の存在に依存する。
【０１０１】
ＦＬＩＮＴのクリアランス動力学に対するシアル酸化のレベルの効果を実施例３に記載したように測定する。
【０１０２】
実施例５
ＳＰセファロースに対する低ｐＨグラジェントを用いた組換えＦＬＩＮＴアイソフォームの精製
ｐＨを減少させ、イオン強度を増加させるグラジェントを用いてＦＬＩＮＴアイソフォームを分離する。濃縮し、濾過したＦＬＩＮＴ含有培地を、約２０ｍｇ総タンパク質／ｍＬゲルの割合でＳＰ−セファロースのカラムに加える。次いで、カラムを約３体積カラム体積の２０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ５．５）で洗浄する。ＦＬＩＮＴアイソフォームを、２０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ５．５）で開始し、２０ｍＭＭＯＰＳ、６００ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ５.５）を用いるグラジェントでカラムから溶出させる。
【０１０３】
本発明を好ましい態様について記載したが、開示した態様に限定されず、むしろ添付したクレームのの精神と範囲に様々な修飾および等価物が含まれることを意図するものであり、そのクレームの範囲はそのような修飾および等価物のすべてが含まれるようなもっとも広い解釈が認められるべきである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005506282.tif 000047
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