(57)【要約】本明細書に開示されるものは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染によって引き起こされる疾患を予防するためのワクチンにおいて使用され得る、生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ、ならびに他のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体を生成するための方法である。これらの変異体はまた、他の細菌株、他のウイルス病原体および寄生生物病原体、ならびに腫瘍細胞によって引き起こされる疾患を予防または処置するために使用され得る。
2005504547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性細菌株に由来する生の弱毒化細菌変異体であって、該弱毒化変異体は、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性、および
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性、
のうち２つを有する、弱毒化細菌変異体。
【請求項２】
病原性腸内細菌株に由来する生の弱毒化腸内細菌変異体であって、該弱毒化変異体は、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性、
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性、および
（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対する耐性、
のうち、少なくとも２つを有する、弱毒化変異体。
【請求項３】
病原性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株に由来する生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体であって、該弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体は、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性、
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性、および
（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対する耐性、
のうち、少なくとも２つを有する、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体。
【請求項４】
前記抗生物質がストレプトマイシンである、請求項３に記載の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体。
【請求項５】
前記バクテリオファージが、Ｆｅｌｉｘ  Ｏである、請求項３に記載の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体。
【請求項６】
前記胆汁酸塩が、コール酸およびデオキシコール酸である、請求項３に記載の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体。
【請求項７】
前記バクテリオファージが、細菌毒性因子に結合する、請求項１、２または３に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項８】
前記弱毒化変異体が、前記病原性細菌株に対して感受性の宿主に対して薬学的有効投薬量で投与される場合に、その元の毒性に復帰することが実質的にできない、請求項１、２または３に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項９】
前記弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ変異体、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ変異体、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ変異体またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｃ変異体である、請求項３に記載の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体。
【請求項１０】
前記弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ変異体が、少なくとも以下：Ｔｙ  Ｂ１（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７３３）；Ｔｙ  Ｃ３５；Ｔｙ  Ｃ５６；およびＴｙ  Ｖ２からなる群より選択される、請求項９に記載の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体。
【請求項１１】
前記弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ変異体が、少なくとも以下：ＰＡ  １；ＰＡ  ４１；ＰＡ  ５０（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７３４）；およびＰＡ  ５９からなる群より選択される、請求項９に記載の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体。
【請求項１２】
前記弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ変異体が、少なくとも以下：ＰＢ  ６０（ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３７３５）；およびＰＢ  ２０−２からなる群より選択される、請求項９に記載の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体。
【請求項１３】
前記弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ変異体またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｃ変異体が、Ｖｉ抗原の熱安定性アンカリングを発現する、請求項９に記載の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ変異体またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｃ変異体。
【請求項１４】
前記変異体が、外来抗原をコードし、そして発現する、請求項１、２または３に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項１５】
前記変異体が、外来抗原をコードし、そして真核生物細胞において発現するプラスミドを含む、請求項１、２または３に記載の弱毒化細菌変異体。
【請求項１６】
病原性微生物によって引き起こされる疾患に対するワクチンであって、該ワクチンは、以下：
（ａ）薬学的有効投薬量の、請求項１、２、３、１４または１５のいずれか１項に記載の生の弱毒化細菌変異体の１種以上；および
（ｂ）薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリア、
を含有する、ワクチン。
【請求項１７】
病原性細菌株によって引き起こされる疾患に対するワクチンであって、該ワクチンは、以下：
（ａ）薬学的有効投薬量の、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の殺傷した弱毒化細菌変異体の１種以上；および
（ｂ）薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリア、
を含有する、ワクチン。
【請求項１８】
請求項１に記載の生の弱毒化細菌変異体を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）毒性細菌株を、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性、および
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性、
のうち２つを有する、生の弱毒化細菌変異体を生じる条件に供する工程；
（ｂ）該生の弱毒化細菌変異体について選択する工程；ならびに
（ｃ）該生の弱毒化細菌変異体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項２に記載の生の弱毒化腸内細菌変異体を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）毒性腸内細菌株を、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性、
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性、および
（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対する耐性、
のうち、少なくとも２つを有する、生の弱毒化腸内細菌変異体を生じる条件に供する工程；
（ｂ）該生の弱毒化腸内細菌変異体について選択する工程；ならびに
（ｃ）該生の弱毒化腸内細菌変異体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項３に記載の生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性、
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性、および
（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対する耐性、
のうち、少なくとも２つを有する、生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体を生じる条件に供する工程；
（ｂ）該生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体について選択する工程；ならびに
（ｃ）該生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記抗生物質がストレプトマイシンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記バクテリオファージが、Ｆｅｌｉｘ  Ｏである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記胆汁酸塩が、コール酸およびデオキシコール酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記バクテリオファージが、細菌毒性因子に結合する、請求項１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記弱毒化変異体が、前記病原性細菌株に対して感受性の宿主において、その元の毒性に復帰することが実質的にできない、請求項１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ変異体またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｃ変異体が、Ｖｉ抗原の熱安定性アンカリングを発現する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の生の弱毒化細菌変異体を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）毒性細菌株を、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性を生じる１つ以上の変異、および
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性を生じる１つ以上の変異、
のうち２つに影響を与える変異を有する、生の弱毒化細菌変異体を生じる条件に供する工程；
（ｂ）該生の弱毒化細菌変異体について選択する工程；ならびに
（ｃ）該生の弱毒化細菌変異体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２に記載の生の弱毒化腸内細菌変異体を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）毒性腸内細菌株を、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性を生じる１つ以上の変異、
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性を生じる１つ以上の変異、および
（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対する耐性を生じる１つ以上の変異、
のうち、少なくとも２つに影響を与える変異を有する、生の弱毒化腸内細菌変異体を生じる条件に供する工程；
（ｂ）該生の弱毒化腸内細菌変異体について選択する工程；ならびに
（ｃ）該生の弱毒化腸内細菌変異体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項３に記載の生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体を生成する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）毒性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を、以下の特徴：
（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性を生じる１つ以上の変異、
（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性を生じる１つ以上の変異、および
（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対する耐性を生じる１つ以上の変異、
のうち、少なくとも２つに影響を与える変異を有する、生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体を生じる条件に供する工程；
（ｂ）該生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体について選択する工程；ならびに
（ｃ）該生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体を単離する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記抗生物質がストレプトマイシンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記バクテリオファージが、Ｆｅｌｉｘ  Ｏである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記胆汁酸塩が、コール酸およびデオキシコール酸である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記バクテリオファージが、細菌毒性因子に結合する、請求項２７、２８または２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記弱毒化変異体が、前記病原性細菌株に対して感受性の宿主に対して薬学的有効投薬量で投与される場合に、その元の毒性に復帰することが実質的にできない、請求項２７、２８または２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ変異体またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｃ変異体が、Ｖｉ抗原の熱安定性アンカリングを発現する、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染によって引き起こされる疾患を予防するための方法において使用され得る、生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ、ならびに他の生の弱毒化Ｓａｌｎｏｍｅｌｌａ変異体の調製に関する。これらの変異体はまた、他の細菌株、他のウイルス病原体および寄生生物病原体、ならびに腫瘍細胞によって引き起こされる疾患を予防または処置するために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ細菌によって引き起こされる腸疾患であるサルモネラ症は、特に発展途上国において、重大な世界的健康問題である（Ｉｖａｎｏｆｆら、ＡＮＮ．ＭＥＤ．ＩＮＴ．、１４９：３４０−３５０（１９９８）；Ｐａｎｇら、ＴＲＥＮＤＳ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．６：１３１−１３３（１９９８））。さらに、多剤耐性Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ）によって引き起こされる腸熱の発生率は、世界中で持続的に増大している（Ａｋｉｎｙｅｍｉら、ＺＥＩＴＳＣＨＲＩＦＴ  ＦＵＥＲ  ＮＡＴＵＲＦＯＲＳＣＨＵＮＧ、ＳＥＣＴＩＯＮ  Ｃ、５５：４８９−４９３（２０００）；Ｃｈａｎｄｅｌら、ＥＭＥＲＧ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．、６：４２０−４２１（２０００））。これらの観察は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ関連疾患を制御するための代替的医療経路としてのワクチンの重要性を強調する（Ｈａｍｐｔｏｎら、ＥＭＥＲＧ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．、４：３１７−３２０（１９９８）；Ｍｅｒｍｉｎら、ＡＲＣＨ．ＩＮＴ．ＭＥＤ．、１５８：６３３−６３８（１９９８））。
【０００３】
現在市販されている抗腸チフスワクチン（殺傷した（ｋｉｌｌｅｄ）ワクチン、生の弱毒化Ｔｙ  ２１ａワクチン（Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標））、Ｖｉポリサッカリドワクチン（Ｔｙｐｈｉｍ（登録商標））を含む）および現在臨床試験中の生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株の有意な効力にもかかわらず、改善された特性を有する、他の生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株について、多大な要求が存在する。実際、これらのワクチンの各々は、更なる候補Ｓ．ｔｙｐｈｉワクチン株の開発の目的には、充分に考慮しなければならない少なくとも１つの欠点を伴う。さらに、パラチフス熱に対して利用可能であるワクチンは存在せず、そして有効な抗パラチフスワクチンは、風土病領域を訪れる先進国からの旅行者を保護するため、工業国における疾患の突発を防止するため、および発展途上国において風土病に対処するために、緊急に必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
腸チフスならびにパラチフスＡ熱およびパラチフスＢ熱の両方を予防するための、生の弱毒化株に基づく新規腸チフスならびにパラチフスＡおよびパラチフスＢ（ＴＡＢ）ワクチンの開発は、非常に所望される。実際、このような併用ワクチンは、免疫化の数およびワクチン接種プログラムに関連する費用を減少させる。従って、腸チフスおよびパラチフス熱に対して保護するために、経口経路を介して単一用量で好ましくは投与される、有効で、危険性が低く、かつ費用効率のよいワクチンについての必要性が、当該分野になお存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、病原性株に由来する、生の弱毒化細菌変異体を提供する。これらの変異体は、以下の特徴のうち２つを有する：（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性、または（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性。このバクテリオファージは、病原性株の主要毒性因子の１つである抗原に結合する。
【０００６】
本発明はまた、病原性腸内株由来する、生の弱毒化細菌変異体を提供する。これらの変異体は、以下の特徴のうち少なくとも２つを有する：（ｉ）抗生物質に対する耐性または依存性；（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対する耐性；または（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対する耐性。
【０００７】
本発明の目的は、生ワクチン、ならびに外来抗原および外来ＤＮＡについての生ベクターとして使用され得る、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの弱毒化株を提供する。これらの生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株は、チフスおよびパラチフス熱のみならず、ウイルス、寄生生物および細菌起源の病原体によって引き起こされる疾患に対する、そして腫瘍細胞を選択的に標的化するための、新規ワクチンの調製のための有益なツールを構成する。
【０００８】
本発明の別の目的は、毒性野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの弱毒化、および得られた生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの選択を達成するための方法を提供する。この方法から得られるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体株は、以下である：（ｉ）抗生物質に対して耐性または依存性である；（ｉｉ）毒性バクテリオファージに対して耐性である；（ｉｉｉ）胆汁酸調製物に対して耐性である。特に、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体株は、以下である：（ｉ）ストレプトマイシンに対して耐性または依存性である；（ｉｉ）Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージまたは任意の他の毒性バクテリオファージ（そのレセプターまたはコレセプターは、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）上に位置する）に対して耐性である；（ｉｉｉ）コール酸もしくはデオキシコール酸、またはコール酸およびデオキシコール酸の両方に対して耐性である。
【０００９】
本発明のなお別の目的は、薬学的有効投薬量中に含まれる変異体の量において、完全な毒性に復帰することが実質的にできない、生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを提供する。このＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体株は、少なくとも２つの独立した変異を含み、そしてこれらの変異体の残留毒性は、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方によって評価される。
【００１０】
本発明のなお別の目的は、細菌膜においてＶｉ抗原の熱安定性アンカリングを発現する、生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを提供する。特に、いくつかのＳ．ｔｙｐｈｉ変異体は、１００℃（沸騰水）にて１０分間の加熱後に、細菌膜から放出されないＶｉ抗原を発現する。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによって引き起こされる疾患（例えば、チフスおよびパラチフス熱）に対する粘膜ワクチンを提供する。ワクチンは、１種以上の生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を、薬学的に受容可能な希釈剤またはキャリアと合わせることによって、調製され得る。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、他の病原体からクローニングされた外来遺伝子（これは、タンパク質へと発現される）についての生ベクターとして使用され得、そしてこれらが由来する病原体に対する保護免疫応答を惹起する、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを提供する。
【００１３】
本発明のなおさらなる目的は、ＤＮＡ媒介性ワクチンを送達するための生ベクターとして使用され得る、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を提供する。
【００１４】
本発明のこれらおよび他の目的は、以下に提供される本発明の詳細な説明から明らかである。
【００１５】
本発明は、図面を参照して、以下の記載からさらに理解される。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．腸チフスおよびパラチフス熱に対する従来技術のワクチン）
以下に記載されるように、いくつかのワクチンが、腸チフスおよびパラチフス熱に対して開発されている。しかし、現在利用可能なワクチンは、多数の欠点（例えば、強力な局所的および全身的な反応の誘導、部分的な保護、ワクチン接種の誘導、または複数の用量の必要性）に悩まされる。
【００１７】
（Ａ．腸チフスおよびパラチフス熱に対する、殺傷されたワクチン（ｋｉｌｌｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ））
１００年前に利用可能であり、そして非経口経路を介して投与される、熱殺傷されたした、フェノール保存された全細胞Ｓ．ｔｙｐｈｉワクチンは、中レベルの保護（５１〜６７％の効力）を与え、これが７年間もつことが示された（Ａｓｈｃｒｏｆｔら，ＡＭ．Ｊ．ＨＹＧ．，７９：１９６−２０６（１９６４）；Ａｓｈｃｒｏｆｔら，ＬＡＮＣＥＴ，２：１０５６−１０６０（１９６７））。このワクチンは、本質的に安全であったが、頻繁な局所的および全身的な有害な反応が観察された。しかし、このワクチンは、チフスに対して認可された３つのワクチン（Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標）（Ｔｙ  ２１、生の弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉ株）およびＴｙｐｈｉｍ（登録商標）（Ｖｉ抗原））に依然として含まれる。
【００１８】
殺傷されたＴＡＢワクチン（非経口注射または経口形態のいずれかによって、腸チフスならびにパラチフスＡおよびＢ熱を予防するために投与される）は、成人および小児の両方において、効力が制限されていた。体液性保護免疫応答は、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａに対して良好であり、Ｓ．ｔｙｐｈｉに対して中程度であり、そしてＳ．ｐａｒａｔｈｙｐｈｉ  Ｂに対して乏しかった（Ｄｉｍａｃｈｅら，ＡＲＣＨ．ＲＯＵＭ．ＰＡＴＨ．ＥＸＰ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．，２６：７４７−７５９（１９６７）；Ｖｌａｄｏｉａｎｕら，ＢＵＬＬ．ＷＨＯ，３２：３７−４５（１９６５））。さらに、このワクチンの非経口投与は、強力な局所的および全身的な反応を誘導し、これは、ＴＡＢワクチンの一般的な容認を困難にする。しかし、経口投与される、殺傷されたＴＡＢワクチンは、十分に許容されることが報告された。これらの制限に起因して、ＴＡＢワクチンは、現在、米国および他の多くの国々において使用が認可されていない（ＷＨＯ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．，ＷＨＯ  ＴＥＣＨ．ＲＥＰ．ＳＥＲ．，３６１：６５（１９６７）；Ａｒｙａら，ＶＡＣＣＩＮＥ，１３：１７２７−１７２８（１９９５））。実際に、他のワクチンはいずれも、殺傷されたＴＡＢワクチンの代わりにならない。
【００１９】
（Ｂ．腸チフスおよびパラチフス熱に対する非経口多糖ワクチン）
Ｓ．ｔｙｐｈｉのＶｉ多糖はまた、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｃ、ならびにＳ．ｄｕｂｌｉｎおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのいくつかの株に存在するが、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＢには存在せず、重要なビルレンス因子であり、かつ保護抗原である（Ｆｅｌｉｘら，ＬＡＮＣＥＴ，２２７：１８６−１９１（１９３４）；Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１５０：４３６−４４９（１９８４））。筋肉内または深部皮下注射として１用量で投与された精製されたＶｉ抗原は、十分に許容されること、および少なくとも３年間、ボランティアの６４〜９０％において保護免疫を誘導することが示された（Ａｃｈａｒｙａら，Ｎ．ＥＮＧＬ．Ｊ．ＭＥＤ．，３１７：１１０１−１１０４（１９８７）；Ｋｌｕｇｍａｎら，ＶＡＣＣＩＮＥ，１４：４３５−４３８（１９９６）；Ｔａｃｋｅｔら，ＶＡＣＣＩＮＥ，６：３０７−３０８（１９８８））。これらの試行の効力は、非常に変動性であり、そして試験に登録された乳児の集団および彼らの年齢に依存する。実際に、大部分の多糖ワクチンと同様に、Ｖｉワクチンは、若年の小児における保護レベルの抗原もブースター応答もいずれも誘導しない（Ｌａｎｄｙら，ＡＭ．Ｊ．ＨＹＧ．，６０：５２−６２（１９５４）；Ｋｅｉｔｅｌら，ＶＡＣＣＩＮＥ，１２：１９５−１９９（１９９４））。このワクチンの、年齢に関連する免疫原性およびＴ細胞非依存性免疫原性の制限を克服するために、ＶｉをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）に結合させ、そして有効なワクチンが以前には利用可能ではなかった２〜５歳の小児の大集団において試験した。この試行において、Ｖｉ結合体化ワクチンの効力は、重篤な有害反応なしで９１％であった（Ｌｉｎら，Ｎ．ＥＮＧＬ．Ｊ．ＭＥＤ．，３４４：１２６３−１２６９（２００１））。しかし、ＶｉワクチンとＶｉ−ＥＰＡワクチンとの両方が、Ｖｉ抗原を欠くＳ．ｔｙｐｈｉ株に対して保護しない。
【００２０】
同様に、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ特異的多糖を、破傷風トキソイド（ＳＰＡ−ＴＴ）に結合させ、そして成人、ティーンエイジャーおよび小児に非経口投与した（Ｋｏｎａｄｕら，ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，６８：１５２９−１５３４（２０００））。これらのワクチンのいずれも、有意な副作用を経験せず、そしてこれらの全てにおいて、抗ＬＰＳ抗体（ＩｇＧおよびＩｇＭ）力価の増加が観察された。１８０日目におけるＩｇＧ抗ＬＰＳレベルの次第の減退は、年齢に関連すると観察された。さらに、ＳＰＡ−ＴＴ抗原は、小児集団においてＶｉ−ＥＰＡワクチンによって誘導されたブースター応答と対照的に、同じ年齢におけるブースター応答を誘導しなかった。このストラテジーが、例えば、Ｏ特異的多糖を別のキャリア分子に結合させることによって改善され得るか否かは、現在予測可能ではない。
【００２１】
（Ｃ．腸チフスに対する生の弱毒化ワクチン）
試験された最初の生の弱毒化株は、Ｓ．ｔｙｐｈｉのストレプトマイシン依存性（ＳｍＤ）株であった（Ｒｅｉｔｍａｎ，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１１７：１０１−１０７（１９６７）；Ｃｖｊｅｔａｎｏｖｉｃら，ＢＵＬＬ．ＷＨＯ，４２：４９９−５０７（１９７０））。経口投与される場合、これらの株は、十分に許容されることが示され、そして実験抗原投与に対して８０％の保護を与えた（Ｄｕｐｏｎｔら，ＡＮＴＩＭＩＣＲＯＢ．ＡＧＥＮＴＳ  ＣＨＥＭＯＴＨＥＲ．，１０：２３６−２３９（１９７０））。しかし、凍結乾燥されたワクチンが再構築されそして投与された場合、このワクチンは、その効力を失った（Ｌｅｖｉｎｅら，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１３３：４２４−４２９（１９７６））。この矛盾の理由は未知であるが、ＳｍＤ株を用いるさらなる研究は中断された。
【００２２】
最も広範に研究される、Ｓ．ｔｙｐｈｉ由来の生の弱毒化株は、Ｂｅｒｎａ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによるＴｙ  ２１ａ（Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標））経口ワクチンである。Ｔｙ  ２１ａは、化学的変異誘発によって得られた（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒら，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１３１：５５３−５５８（１９７５））。Ｔｙ  ２１ａは、成人および小児によって顕著に十分に許容されることが示されたが、このワクチンの処方および用量の数が、達成され得る保護のレベルに顕著に影響を与える（Ｂｌａｃｋら，ＶＡＣＣＩＮＥ，８：８１−８４（１９９０）；Ｌｅｖｉｎｅら，ＬＡＮＣＥＴ，１：１０４９−１０５２（１９８７））。腸溶酸耐性カプセル内の３用量または４用量の凍結乾燥Ｔｙ  ２１ａワクチンは、臨床研究がなされた国に依存して、６７％〜９６％の範囲の保護効力を与える、市販の製品を構成する（Ｗａｈｄａｎら，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１４５：２９２−２９５（１９８２）；Ｌｅｖｉｎｅら、ＬＡＮＣＥＴ，１：１０４９−１０５２（１９８７））。引き続いて、液体処方物は、腸溶コーティングされたカプセルより優れた保護を提供することが示され、そして３用量の投与が、同じ期間にわたって７７％の保護を誘導した（Ｌｅｖｉｎｅら、ＶＡＣＣＩＮＥ，１７（補遺２）：２２−２７（１９９９））。しかし、Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標）は、いくつかの欠点（その中程度の免疫原性、少なくとも３用量を投与する必要性、ならびにＴｙ  ２１ａがＶ１陰性であり、そして免疫系を刺激して抗Ｖｉ抗体を産生しないという事実）を有する。Ｔｙ  ２１ａ株の免疫原性を増加させるための１つの試みは、Ｖｉ抗原の発現を制限することであった（Ｃｒｙｚら、ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，５７：３８６３−３８６８（１９８９））。ボランティアに投与された、得られたＶｉ陽性Ｔｙ  ２１ａは、十分に許容性であったが、これらはいずれも、抗Ｖｉ抗体を発生させず、一方でこれらの大部分はなお、抗Ｏ（抗ＬＰＳ）抗体を産生し得た（Ｔａｃｋｅｔら，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１６３：９０１−９０４（１９９１））。
【００２３】
他の多くの生の弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉ株が、これらがＴｙ  ２１ａより免疫原性になるような、そして単一用量の投与後に、保護免疫を誘導するような様式で、操作された。このプロセスにおいて、種々の生化学的経路、全体調節因子、熱ショックタンパク質、およびビルレンス因子をコードする遺伝子が、殺傷された（Ｌｅｖｉｎｅら，ＢＥＨＲＩＮＧ  ＩＮＳＴ．ＭＩＴＴ．，９８：１２０−１２３（１９９７））。これらの変異体のいくつかは、臨床治験において試験され、そして５４１Ｔｙ（ａｒｏＡ変異体およびｐｕｒＡ変異体）および５４３  Ｔｙ（ａｒｏＡ変異体、ｐｕｒＡ変異体、Ｖｉ変異体）と同様に免疫原性が乏しいこと（Ｌｅｖｉｎｅら，Ｊ．ＣＬＩＮ．ＩＮＶＥＳＴ．，７９：８８８−９０２（１９８７））、またはＥＸ４６２（ｇａｌＥ変異体Ｖｉ変異体）およびＸ３９２７（ｃｙａ変異体、ｃｒｐ変異体）と同様に、不十分に弱毒化されたこと（Ｈｏｎｅら，ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，５６：１３２６−１３３３（１９８８）；Ｃｕｒｔｉｓｓら，ＤＥＶ．ＢＩＯＬ．ＳＴＡＮＤ．，８２：２３−３３（１９９４））が示された。しかし、他のいくつかの変異体は、大部分の副作用およびチフス様の症状を回避するために十分に弱毒化されたが、可能なワクチン候補としてみなされるほど十分に免疫原性であった。これらの候補のうちでも、Ｔｙ８００（ＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ変異体）（Ｈｏｈｍａｎｎら，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１７３：１４０８−１４１４（１９９６））、Ｘ４０７３（ｃｙａ変異体、ｃｒｐ変異体、ｃｄｔ変異体）（Ｔａｃｋｅｔら，ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，６５：３３８１−３３８５（１９９７））、ＣＶＤ９０８（ａｒｏＣ変異体、ａｒｏＤ変異体）（Ｓｚｔｅｉｎら，Ｊ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１７０：１５０８−１５１７（１９９４））、およびＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ（ａｒｏＣ変異体、ａｒｏＤ変異体、ｈｔｒＡ変異体）（Ｔａｃｋｅｔら，ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，６５：４５２−４５６（１９９７）；Ｔａｃｋｅｔら，ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，６８：１１９６−１２０１（２０００））は、強力な免疫応答および保護を生じたが、各々に、少なくとも１つの欠点が付随した。実際に、これら４つの株は、保護免疫応答において重要な役割を果たすことが公知の抗Ｖｉ抗体を産生せず、そしていくらかのワクチン受容者に、穏やかな下痢またはワクチン症（ｖａｃｃｉｎｅｍｉａ）を引き起こした。
【００２４】
励みとなるが、これらのデータはなお、より適切な特性を有する他の生の弱毒化変異体の選択によって、改善され得ると考えられる。ＣＶＤ９１５（ｇｕａＢ−Ａ変異体）、ＣＶＤ９１５由来のＣＶＤ９ｌ６（ｇｕａＢ−Ａ変異体、Ｖｉ構成的変異体）、およびＣＶＤ９０８−ｈｔｒＡ由来のＣＶＤ９０９（ａｒｏＣ変異体、ａｒｏＤ変異体、ｈｔｒＡ変異体、Ｖｉ構成的変異体）が、より強力な抗Ｖｉ応答を誘導するそれらの能力について、マウスにおいて試験された（Ｐａｓｅｔｔｉら，ＣＬＴＮ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，９２：７６−８９（１９９９）；Ｗａｎｇら，ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，６８：４６４７−４６５２（２０００））。このデータは、Ｖｉ抗原に対する免疫応答が、ＬＰＳ抗原および鞭毛Ｈ抗原に対する免疫応答を妨害せずに増強されることを示した。ＣＶＤ９１６およびＣＶＤ９０９が、ヒトボランティアにおいて、ＣＶＤ９１５と比較して、抗Ｖｉ抗体のより強い産生を引き起こすか否かは、まだ決定されていない。
【００２５】
（ＩＩ．異種病原体に対する従来技術のワクチン）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの弱毒化株は、サルモネラ症に対する保護免疫を誘導する際の効率的な手段であることが示されている。さらに、免疫系に対する異種抗原の発現および送達のためにビヒクルとしてのこれらの可能性は、動物モデルおよびヒトボランティアの両方において、ヒト病原体および動物病原体由来の種々の抗原（細菌、ウイルス、および原生生物由来のビルレンス抗原が挙げられる）を用いて示されている（ＩＮＴＲＡＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ  ＶＡＣＣＩＮＥ  ＶＥＣＴＯＲＳ，Ｐａｔｅｒｓｏｎ編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９９９））。これらの異種抗原の発現は、精製された組換え抗原、およびいくつかの例において、この抗原がクローニングされた生物に対する体液媒介免疫応答および細胞媒介免疫応答の両方の誘導を生じた。実際に、原核生物において発現された、哺乳動物抗原、ウイルス抗原および原生生物抗原は、細菌プロテアーゼに対して感受性であり得、封入体を形成し得るかまたは三次元コンホメーションを失い得、そしてその結果、保護免疫応答を誘導しない。しかし、真核生物細胞において発現される場合、このような抗原は、ネイティブな抗原のコンホメーションを回復し得、そして保護を誘導し得る。このことは、外来抗原をコードする遺伝子が真核生物発現ベクターにクローニングされ、そしてＳａｌｍｏｎｅｌｌａによって哺乳動物細胞に送達される場合に、達成され得る（Ｄａｒｊｉら，ＣＥＬＬ，９１：７６５−７７５（１９９７））。これらの研究は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａベクターが核酸ワクチンを送達する能力を有することを実証した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａベクターが抗腫瘍免疫を誘導する可能性もまた、いくつかの研究によって提唱されている（Ｍｅｄｉｎａら，ＥＵＲ．Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，２９：６９３−６９９（１９９９）；Ｚｈｅｎｇら，ＯＮＣＯＬ．ＲＥＳ．，１２：１２７−１３５（２０００））。
【００２６】
しかし、現在利用可能な、制限された数の生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株（これらは、十分に許容され、そしてボランティアにおいて免疫原性である）は、有望なワクチンの開発を妨げる。１つの例は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｒｏｒｉ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）によって引き起こされる胃炎に対するワクチンの開発であり、これは、生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙ８００において発現されるウレアーゼＡおよびＢに基づき、そしていずれの体液性免疫応答をも誘導しなかった（ＤｉＰｅｔｒｉｌｌｏら，ＶＡＣＣＩＮＥ，１８：４４９−４５９（２０００））。この株は、ヒト免疫系に対する異種抗原の効率的な提示のために、不適切に弱毒化されると考えられた。マウスにおける異なる弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによって誘導される免疫の機構を比較する別の報告はまた、いくつかの株が、ベクターとして他の株より適切であるという仮定を支持した（ＶａｎＣｏｔｔら，ＮＡＴＵＲＥ  ＭＥＤ．，１１：１２４７−１２５２（１９９８））。
【００２７】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａベクターの将来は、非常に有望であるように思われ、そして粘膜ワクチン開発および腫瘍標的化に対する有意な影響を有する。しかし、これらの開発は、新規の生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの利用可能性に非常に依存する。
【００２８】
（ＩＩＩ．本発明の生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体）
本発明は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ関連疾患に対する生ワクチンとしてとりわけ、そして外来抗原または外来ＤＮＡを送達するためのベクターとして使用される場合に他の疾患に対する生ワクチンとして使用するための、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体株を提供する。「変異体株」とは、本明細書中において使用される場合、ＤＮＡ配列において、対応する親株と比較された場合に少なくとも２つの変異を含む株である。変異としては、例えば、塩基の変化、欠失、挿入、復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）、転座または重複が挙げられる。「微生物」とは、本明細書中において使用される場合、細菌、ウイルス、原生生物、または真菌である。本明細書中において使用される場合、「外来抗原」または「外来ＤＮＡ」とは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して外来の抗原またはＤＮＡを意味する。
【００２９】
また、本発明において、「弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」変異体が提供され、ここで、この変異体は、野生型株より低いビルレントであるが、体液性免疫または細胞性免疫、あるいはその両方をなお誘導し得る。
【００３０】
さらに、本発明において、「弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」変異体が提供され、ここで、この変異体は、薬学的有効用量で投与される場合、実質的に、全ビルレンスに復帰し得ない。上述のように、本発明の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体は、ＤＮＡ配列において、対応する親株と比較して少なくとも２つの変異を有する。各変異体が野生型に復帰する割合は非常に低いので、１つの変異体における２つ以上の変異が復帰する可能性は、薬学的有効用量で投与される変異体の数より有意に低い。
【００３１】
なおさらに、本発明において、「弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」変異体が提供され、ここで、この変異体は、（ｉ）ストレプトマイシンに対するこれらの耐性または依存性、（ｉｉ）バクテリオファージ（例えば、Ｆｅｌｉｘ  Ｏ）に対するこれらの耐性、（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対するこれらの耐性によって、獲得および選択される。本発明において使用される特定のバクテリオファージは、それらに対して重要ではない。このようなバクテリオファージの例としては、野生型Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの溶解を誘導するビルレントバクテリオファージ、および細菌ビルレンス因子であるリポ多糖類（ＬＰＳ）におけるそのレセプターまたはコレセプターを有するビルレントバクテリオファージが挙げられる。
【００３２】
さらに、本発明において、Ｖｉ抗原を発現する「弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ」変異体が提供され、ここで、この変異体のいくらかは、Ｖｉ抗原の熱安定性アンカリングを細菌膜内へと発現し、いくらかの変異体は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ由来である。本発明において、生の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体株は、天然に存在する遺伝変異体の選択によって得られたが、変異体も、プラスミドも、トランスポゾンも使用しなかった。
【００３３】
変異体のビルレンスは、単球由来マクロファージアッセイにおける生のによって、および正常ヒト血清の殺菌効果によってインビトロで、ならびに適切な宿主においてインビボで、評価される。
【００３４】
ワクチンとは、本明細書中において使用される場合、所望の生物学的応答（例えば、感受性の宿主において投与される場合の免疫応答）を発生する、適切なキャリアと組み合わせられた材料を含む調製物である。ワクチンは、少なくとも１種の生の生物を含み得、この場合、通常、粘膜投与（経口が挙げられる）され、または少なくとも１種の殺傷された生物もしくはその成分を含み得、この場合、通常、非経口投与される。本発明のワクチンのために使用される細菌細胞は、好ましくは、生存状態で粘膜を介して投与される。
【００３５】
（Ａ．腸チフスおよびパラチフス熱に対するワクチン）
本発明において出発物質として使用される、特定のＳ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂは、これらに対して重要ではない。本明細書中の実施例において、Ｓ．ｔｙｐｈｉ変異体は、ビルレント野生型Ｓ．ｔｙｐｈｉ株Ｔｙ２から構築され、一方でＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ変異体およびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ変異体は、パラチフス熱を罹患する患者由来の血液培養物によって、インドネシアで単離されたビルレント野生型株から構築された。Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２は、種々の供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｆｒａｎｃｅ）およびＩｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ（Ｅｎｇｌａｎｄ））から得られ得る参照株である。
【００３６】
Ｓ．ｔｙｐｈｉ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２）、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  Ｉｎｄｏ）、およびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ（Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ  Ｉｎｄｏ）（それぞれ、Ｔｙ、ＰＡ、およびＰＢと称される（図１））は、トリプシンダイズ寒天（ＴＳＡ，Ｄｉｆｃｏ）またはトリプシンダイズブロス（ＴＳＢ，Ｄｉｆｃｏ）中で増殖され、そして血清学的同定によって（特定の抗原Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒでのスライド凝集反応、図２）、生化学的特性によって（ＩＤ３２Ｅストリップ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）、抗生物質に対する感受性によって（ＡＴＢ  Ｖｅｔストリップ、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）そしてＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージ（ファージＯ：１ともまた称される、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）に対する感受性によって、特徴付けられた。Ｔｙ野生型株および誘導された変異体の特徴付けは、血清抗Ｏ（Ｏ：９）、抗Ｖｉおよび抗Ｈ（Ｈ：ｄ）を用いて実施された。ＰＡ野生型株および誘導された変異体は、血清抗Ｏ（Ｏ：１，２）および抗Ｈ（Ｈ：ａ）を用いて特徴付けられた。ＰＢ野生型株および誘導された変異体は、血清Ｏ（Ｏ：４，５）および抗Ｈ（Ｈ：ｂ）を用いて特徴付けられた。血清は、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ由来である。凝集反応を、ウイルス試験によって評価し、図２、３、４、５、および６において、＋＋＋、＋＋、＋、＋／−または−として報告する。ファージ感受性を、ＴＳＡおよび細菌懸濁物を接種された５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＴＳＡへのファージ（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）の滴下の適用によって、試験した。３７℃で６時間のインキュベーション後に、溶解が観察された。野生型株の同定を実施し、そして腸チフスおよびパラチフス熱を処置するために通常使用される抗体に対する特定の耐性は観察されなかった。
【００３７】
Ｔｙ、ＰＡ、およびＰＢのストレプトマイシン耐性変異体の選択を、野生型株を高濃度の硫酸ストレプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を補充したＴＳＡにプレートすることによって、単一工程で実施した。これらの変異体は、Ｔｙ  ＳｍＲ、ＰＡ  ＳｍＲ、およびＰｂ  ＳｍＲと称され（図１）、そして抗血清でのスライド凝集反応およびＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対する感受性によって、特徴付けた。ＳｍＲ変異体は、通常の表面抗原の発現、Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対するそれらの感受性、および９ｇ／ｌの濃度までの胆汁酸塩Ｎ°３（Ｄｉｆｃｏ）（本明細書中以下で胆汁酸塩と称する）を補充されたＴＳＡでのそれらの増殖が、それらの親株と有意には異ならなかった（図２）。
【００３８】
Ｔｙ  ＳｍＲ、ＰＡ  ＳｍＲ、およびＰＢ  ＳｍＲの変異体のＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージ耐性（ＦＯＲ）変異体の選択は、３７℃で３０分間、１０倍過剰のファージＯとともにＴＢＳ中でＳｍＲ変異体のインキュベーションによって行った。次いで、得られたＦＯＲ変異体を、５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＴＳＡ上で増殖させた。これらの変異体を、Ｔｙ  Ａｎ、Ｔｙ  Ｂｎ、Ｔｙ  Ｃｎ、Ｔｙ  Ｖｎ、ＰＡｎおよびＰＢｎ（ここで、ｎ＝１、２、３など、図１）と呼び、特異的抗血清を用いるスライド凝集によって、そしてＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対する感受性によって特徴付けた（図３、５、および６）。
【００３９】
Ｔｙ由来のＳｍＲ−ＦＯＲ変異体は、２つの明確に異なるクラス（加熱（１００℃にて１０分間）後にＶｉポジティブである変異体、および加熱後にＶｉネガティブである変異体）から構成されることが示された。Ｔｙ  ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体に加えて、数個の変異体が、ストレプトマイシン（ＳｍＤ）に依存し、そして（Ｔｙ  ＳｍＤ−ＦＯＲ変異体であるＴｙ  Ｖ２およびＴｙ  Ｂ６３のような）Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに耐性であるかまたは部分的に耐性であった。ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体株のうちのいくつかは、９ｇ／ｌの胆汁酸塩を含む培地において良好に増殖した。ＳｍＲ−ＦＯＲ  Ｔｙ  Ｖ２変異体およびＴｙ  Ｂ６３変異体を含む他のものは、増殖培地中の胆汁酸塩の存在に対してより感受性であり、そして９ｇ／ｌ未満の胆汁酸塩濃度において増殖を停止した（図３）。胆汁酸塩に対して感受性の変異体が、ワクチン調製にために最適な特徴を示さないかもしれないけれども、腸で生存する能力が乏しいのと同様に、胆汁酸塩耐性表現型へ復帰するそれらの能力は、有利であり得る。第１に、これらの変異体は、Ｔｙ親株よりも病原性ではないことが示され得る。第２に、復帰の頻度は、種々であるが、一般的に小さいと考慮されるので、腸管における復帰変異体の存在は、効率的な免疫を確実にし得る。結果として、このような変異体は、５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび９ｇ／ｌの胆汁酸塩を補充されたＴＳＡでさらに増殖された。細菌コロニーは、変異体から別の変異体に変化している頻度とともに発色する（図３）。これらの胆汁酸塩耐性変異体（ＢＳＲ）は、Ｔｙ  Ｖ２  ＢＳＲおよびＴｙ  Ｂ６３  ＢＳＲと同様に、Ｔｙ  Ａｎ  ＢＳＲ、Ｔｙ  Ｂｎ  ＢＳＲ、Ｔｙ  Ｃｎ  ＢＳＲ、およびＴｙ  Ｖｎ  ＢＳＲ（ここで、ｎ＝１、２，３など）と呼ばれた。ＳｍＤ変異体が、ストレプトマイシンなしで、ＴＳＡ上でさらに増殖した場合、別の型の変異体が得られた。ストレプトマイシン非依存性復帰変異体（Ｓｍ  Ｉ  Ｒｅｖ）コロニーは、Ｔｙ  Ｂ６３  Ｓｍ  Ｉ  Ｒｅｖと同様に、発色した（図３）。
【００４０】
浸透圧モル濃度は、多くの環境因子のうちの１つであり、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｖｉ細菌表面抗原発現に影響する（Ａｒｒｉｃａｕら，ＭＯＬ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．，２９：８３５−８５０（１９９８））。本発明に記載されるＳ．ｔｙｐｈｉ変異体におけるＶｉ細菌表面抗原発現が、浸透圧モル濃度によって調節されたか否かを試験するために、本発明者らは、０．１４〜０．７Ｍの範囲の塩化ナトリウム濃縮物を補充した培地上で培養された、選択されたＴｙ  ＳｍＲ変異体およびＳｍＤ−ＦＯＲ変異体におけるＶｉ抗原、Ｏ抗原、およびＨ抗原の発現を決定した（図４）。図４に示されるように、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体株におけるＶｉ抗原発現は、変化した浸透圧モル濃度に応じて調節される。詳細には、増殖培地において０．３Ｍを超えてＮａＣｌ濃度を上昇させることは、加熱後に、Ｖｉポジティブのままであった変異体についてさえ、Ｖｉ表面抗原免疫反応性の完全な喪失を生じた。研究された変異体の大部分において０．３Ｍよりも高いＮａＣｌ濃度におけるＯ表面抗原免疫反応性の同時の出現は、Ｖｉ抗原が細菌エンベロープのＯ抗原をマスクするという事実と一致する。しかし、加熱後にＶｉポジティブである少数の変異体において、Ｏ表面抗原免疫反応性は、現れなかった。これは、これらの変異体がＴｙ  Ｃ３３５、Ｔｙ  Ｃ３５  Ｐ、およびＴｙＶ２のように、粗面であることを示す（図４）。
【００４１】
ＰＡおよびＰＢ由来のＳｍＲ−ＦＯＲ変異体は、特定の抗Ｏ抗血清および抗Ｈ抗血清を用いる凝集によって、そしてＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対する感受性によって特徴付けられた（図５および６）。Ｔｙ  ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体と同様に、ＰＡ−ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体およびＰＢ−ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体は、異なる濃度の胆汁酸塩に感受性であった。例えば、ＰＡ１、ＰＡ４１、ＰＡ５０、ＰＢ６０、およびＰＢ２０−２  Ｐは、９ｇ／ｌの胆汁酸塩を含む培地上で増殖したが、ＰＡ２８、ＰＡ５７、ＰＡ５９、ＰＡ７２、ＰＢ２６、ＰＢ４１、ＰＢ８およびＰＢ２０−２は、９ｇ／ｌ未満の胆汁酸塩濃度において増殖を停止した（図５および６）。９ｇ／ｌ未満の胆汁酸塩濃度に感受性のＴｙ  ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体を用いて、胆汁酸塩に耐性の復帰変異体が、低い頻度で得られ得ることを示した（図３）。同様に、低濃度の胆汁酸塩に感受性のＰＡ−ＳｍＲ−ＦＯＲおよびＰＢ−ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体を、これらを９ｇ／ｌの胆汁酸塩を補充したＴＳＡ上で増殖させることによって、胆汁酸塩耐性変異体に復帰するのを誘導し得る。これらの復帰変異体が、弱毒化されたビルレンスを有する効率的な免疫原であり得る。
【００４２】
Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージが、溶菌性ファージであることに注目すべきである（Ｋａｌｌｉｎｇｓ，ＡＣＴＡ  ＰＡＴＨ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＳＣＡＮＤ．，７０：  ４４６−４５４（１９６７））。結果として、ＦＯＲ変異体の細菌ゲノムに組み込まれることが予期されない。しかし、本発明者らは、ＦＯＲ変異体を、安定に組み込まれた溶原性ファージを単離するために使用されるマイトマイシンＣに供した（Ｓｉｄｄｉｑｕｉら、ＡＰＰＬ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．，２７：２７８−２８０（１９７４））。さらに、ＦＯＲ変異体およびＦＯＲ変異体培養物の上清を、プライマー５’  ＧＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＧＴＡＧ  ３’（配列番号１）および５  ’ＧＧＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡＧＡＧＴＣＣ  ３’（配列番号２）を使用して、ＰＣＲ増幅によってＦｅｌｉｘ  Ｏファージの存在について試験した。これらの手順の両方によって、どのＦＯＲ変異体株も、組み込まれたＦｅｌｉｘ  Ｏファージを含まないことを確認した。
【００４３】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株と対照的に、Ｓ．ｔｙｐｈｉ変異体株およびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ変異体株のビルレンスを試験するのに適切な実験室動物モデルは、存在しない。あるいは、ヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）内でのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ生存のインビトロアッセイのようなインビトロ方法、および正常なヒト血清の殺菌作用に対するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の感受性を測定する試験は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体の潜在的なビルレンスを評価するために使用された。単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）におけるＳｍＲ−ＦＯＲ変異体およびＳｍＤ−ＦＯＲ変異体の生存を決定するために、本発明者らは、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０中の１０−６Ｍのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ）を用いる、４８時間の処理によって、接着性マクロファージ様細胞に分化するように誘導されたヒト単球白血病細胞株ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ）を使用した。ヒト単球白血病細胞株ＴＨＰ−１の培養を、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）で実施した（各ウェルは、６×１０４細胞を含む）。野生型株および変異体の生存を、５時間のインキュベーション後に決定するために１つのプレートを使用し、そして２４時間のインキュベーション後に他のプレートを使用した。両方のインキュベーション時間についての細菌の各々の生存を決定することは、４ウェルから得られた平均値に基づいた。
【００４４】
４８時間後、培地をドレインし、そしてＴＨＰ−１分化した細胞を、１回ＲＰＭＩ  １６４０で洗浄した。細菌懸濁液（１０％（ｖ／ｖ）ＦＳＣを補充したＲＰＭＩ  １６４０中の６×１０５細菌）を、ウェルの各々に施与し、そしてプレートを２時間、３７℃で、加湿した５％ＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。次いで、細菌懸濁液をドレインし、そして細胞を、１回ＲＰＭＩ  １６４０で洗浄した。細胞をさらに、細胞外細菌を殺傷するために、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび２００μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で３時間インキュベートした。次いで、培地をドレインし、細胞を２回ＲＰＭＩ  １６４０で洗浄し、そして加湿した５％ＣＯ２雰囲気下で２０分間、３７℃で０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて溶解させるか、または２４時間後の生存の決定のために１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０中で１９時間、さらにインキュベートした。次いで、プレートを、室温に移し、ウェルの内容物（氷上で維持した）を、ＴＳＡ（野生型株）および５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＴＳＡ（変異体）においてプレートした。コロニー形成単位（ｃｆｕ）の数を計数し、そして平均値を計算した。５時間のインキュベーション時間の後、野生型株（Ｔｙ、ＰＡ、ＰＢ）の各々の生存を、参照として１００％に設定した。５時間および２４時間のインキュベーション後の変異体の生存、ならびに２４時間のインキュベーション時間後の野生型株の生存を、参照の％として表した。
【００４５】
図８に示されるように、ＳｍＲ−ＦＯＲ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体およびＳｍＤ−ＦＯＲ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体は、ＭＤＭ生存アッセイにおいてビルレント野生型親株ほど良好に生存せず、これは、これらが、あまりビルレントでないことを示す。例えば、Ｔｙ  Ｂ１変異体およびＴｙ  Ｃ５６変異体の生存率は、５時間のインキュベーション後に、親のＴｙ株（１００％）よりも約８５％低かった。さらに、親Ｔｙ株のほとんど５０％がＭＤＭ内で２４時間生存したが、Ｔｙ  Ｂ１変異体およびＴｙ  Ｃ５６変異体がＭＤＭの内側で２４時間生存したものは本質的になかった。図８において分析された他の変異体について同様の観測がなされた。しかし、ＭＤＭアッセイにおけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体の生存率が、固体培地上に細菌をプレートする前に、ＭＤＭを溶解するために使用されるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対する変異体の感受性によって影響され得る（図７）。例えば、Ｔｙ  Ｖ２変異体は、本発明のプロトコルに続くＭＤＭアッセイにおいて評価され得なかった。Ｔｙ、ＰＡ、およびＰＢ由来の変異体のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対する感受性を決定するために、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およびＲＰＭＩ  １６４０＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中の１００μｌの細菌懸濁液（１０４細菌）を、３７℃で加湿した５％ＣＯ２雰囲気下で、２０分間、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において二連でインキュベートした。次いで、プレートを氷上に移し、そいてウェルの内容物を、５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＴＳＡにプレートした。ｃｆｕの数を計数し、そして平均値を計算した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対する感受性を、生存度の％として、図７に表す。
【００４６】
正常なヒト血清の殺菌作用に対するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体株の感受性は、そのビルレンス、およびこれらがワクチン接種を受けた人において菌血症を生成し得るか否かの指標を評価するための別の手段である。変異体の感受性を決定するために、１００μｌの細菌懸濁液（約１０６ｃｆｕ、光学密度によって推定される）を、４００μｌの正常ヒト血清（２５歳男、Ｂ型肝炎、梅毒、ＨＩＶに対して血清学的にネガティブであり、腸チフス−パラチフス熱の病歴がなく、腸チフス−パラチフスに対してワクチン接種されていない）とともに１．５ｍｌチューブ中で混合し、そして１００μｌのこの混合物を、ｃｆｕの数を計数するために使用した。次いで、管を３７℃で２時間３０分間、インキュベートし、次いで、氷上に移した。１００μｌのアリコートを使用して、ＴＳＡまたは５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＴＳＡ上にプレートすることによって、ｃｆｕの数を計数した。ヒト血清に対する感受性を、１０６細菌当たりの生存度として、図８に表す。
【００４７】
これらのデータは、ＰＡ変異体およびＰＢ変異体が、一般的に、Ｔｙ変異体よりヒト血清に対してずっと感受性であることを示した。さらに、Ｔｙ、ＰＡ、およびＰＢ由来の変異体の各群において、いくつかの変異体が、Ｔｙ  Ｂ１、Ｔｙ  Ｖ２  ＢＳＲ、ＰＡ５０、およびＰＢ６０と同様にＭＤＭ中での減少した生存（血清における減少した生存）を有し、そして主要保護表面抗原を発現する。このように、これらの変異体は、潜在的なワクチン候補として考慮され得る。しかし、Ｓ．ｔｙｐｈｉおよびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂの変異体の安全性および免疫原性は、ヒトボランティアに投与された場合にのみ実証され得る。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態において、チフス熱、パラチフスＡ熱、パラチフスＢ熱、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａによって引き起こされる他の疾患に対するワクチンは、以下を含む：
（ａ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体のうちの１つまたは組合せを含む薬学的に有効な調製物；ここで、この変異体は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ由来、または別のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株由来であり、（ｉ）ストレプトマイシンスルフェートに対して耐性または依存性であり；（ｉｉ）Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対して耐性であり；そして（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対して耐性であるように選択によって得られる；ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。
【００４９】
（Ｂ．異種病原体に対するワクチン）
本発明の別の局面において、生きた弱毒化された変異体株を、外来抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達し、そして全身および粘膜区画の両方のレベルで、その外来抗原に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を惹起するための、生きたベクターワクチンとして使用する。
【００５０】
生きた細菌ベクターは、原核細胞プロモータ、好ましくは、Ｐｎｉｒ１５プロモーターのような誘導性プロモーター（Ｃｈａｔｆｉｅｌｄら，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１０：８８８−８９２（１９９２））の制御下に外来遺伝子を有する防御ワクチン抗原、または真核生物プロモーターの制御下に外来遺伝子を有するＤＮＡワクチン（Ｍｅｄｉｎａら，ＶＡＣＣＩＮＥ，１９：１５７３−１５８０（２００１）；Ｄｉｅｔｒｉｃｈら，ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＆  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＶ．，１０：３９１−３９９（２０００））を送達する高度に汎用性の手段を提供する。興味深いことに、組換え株において外来抗原をコードするプラスミドの存在は、生きた細菌ベクターに対する応答を必ずしも損なわず、生きた弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉ  ＣＶＤ９１５において発現される破傷風毒素のフラグメントＣを用いて示されるように、複数の抗原のキャリアとして、弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの使用を促進する（Ｐａｓｅｔｔｉら，ＣＬＩＮ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，９２：７６−８９（１９９９））。
【００５１】
（外来抗原に対する生きたベクターとしての弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）
本発明において開始材料として使用される特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株は、重要ではない。生きた弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を、１８００ボルトおよび４００オームに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、１０〜１５％グリセロール−水中の誘導性または構成性の原核生物プロモーターの制御下に、外来病原体からクローニングされた遺伝子を含むプラスミドでエレクトロポレーションによって形質転換される。外来抗原の発現は、最初にインビトロでチェックされた：５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＴＳＡ上で一晩増殖させた後、細菌コロニーをさらに、５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＴＳＢ中で増殖させ、回転させ、そして滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に、１．０のＯＤ６００まで再懸濁させた。ホールセル細菌溶解物を、２００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中のペレットを遠心分離および溶解させることによって、１ｍｌのアリコートの懸濁液を回収することによって調製した。細菌溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通して電気泳動することによって分離した。タンパク質のバンドを、クーマシーブリリアントブルーまたはイムノブロッティングでの染色によって、視覚化した。イムノブロッティングのために、タンパク質を、ニトロセルロース膜上に電気移動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）し、これを、続いて、ＰＢＳ中の１０％スキムミルクでブロックし、次いで、室温で１〜２時間、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ中の１％ミルク中の外来抗原に対するマウスまたはウサギのポリクローナル抗体とともに、インキュベートした。次いで、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ）に結合した抗マウスまたは抗ウサギ免疫グロブリンとともにインキュベートし、そして反応性ポリペプチドを、ＥＣｌ  Ｐｌｕｓ  Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して、視覚化した。
【００５２】
次いで、外来抗原を発現する、形質転換した生きた弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを、ワクチン調製物において使用し、それらの免疫原性および保護性免疫応答を誘導するそれらの能力についてマウスで試験した。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して外来の病原体に対するワクチン、チフス熱に対するワクチン、パラチフスＡ熱に対するワクチン、パラチフスＢ熱に対するワクチン、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａによって引き起こされる他の疾患に対するワクチンとしては、以下が挙げられる：
（ａ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体の１つまたは組合せを含む薬学的に有効な調製物；ここで、この変異体は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ由来、または別のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株由来であり、（ｉ）ストレプトマイシンスルフェートに対して耐性または依存性であり；（ｉｉ）Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対して耐性であり；そして（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対して耐性であるように選択によって得られ、そして各変異体が、外来抗原をコードし、そして、原核生物プロモーターの制御下に発現する（すなわち、外来抗原の細菌発現）；ならびに
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。
【００５４】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの生きたベクターにおいて使用される特定の外来抗原は、本発明において重要ではない。本発明の弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株は、腸内病原体（細菌、ウイルスなどとして規定される病原体）、性的伝達疾患病原体、急性呼吸管疾患病原体、または疾患（例えば、髄膜炎菌性疾患）の重症の全身性の出現を導く粘膜侵入を有する病原体に対する免疫のための生きたベクターとして使用され得る。異なる型の寄生生物感染（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｅｃｉｅｓ，Ｅｎｔａｍｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）およびＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）に対してもまた保護するために使用され得る。
【００５５】
本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生きたベクターにおいて発現され得る腸の病原体由来の抗原の例としては、以下が挙げられる：
（ａ）エンテロトキシン産生性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のフィンブリアル（ｆｉｍｂｒｉａｌ）コロニー形成因子、および熱不安定性エンテロトキシンまたは変異熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニットのいずれか（腸分泌を引き起こさないが、中和抗毒素を誘発する）；
（ｂ）Ｓｈｉｇａ毒素１または２（あるいは、変異Ｓｉｇａ毒素１または２）のＢサブユニットとともに、腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉのフィンブリアル抗原および／またはインチミン（ｉｎｔｉｍｉｎ）；
（ｃ）ＳｈｉｇｅｌｌａのＯ抗原および侵襲性プラスミド抗原またはＳｈｉｇｅｌｌａのＶｉｒＧ；
（ｄ）ロタウイルス由来の中和抗原；
（ｅ）ウレアーゼ、コロニー形成抗原およびＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来の他の保護性抗原；ならびに
（ｆ）不活化Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素またはそれら由来の抗原。
【００５６】
本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生きたベクターにおいて発現され得る性伝達病原体由来の抗原の例としては、以下が挙げられる：
（ａ）Ｎｅｉｓｅｒｎｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏａｅのピリ線毛および外膜タンパク質；ならびに
（ｂ）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのタンパク質。
【００５７】
本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生きたベクターにおいて発現され得る急性呼吸管病原体由来の抗原の例としては、以下が挙げられる：
（ａ）毒性活性を欠くが、中和抗毒素を誘発するＮＡＤ結合ドメインにおける置換を有する変異ジフテリア毒素；
（ｂ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの抗原（破傷風毒素のフラグメントＣに融合された百日咳毒素の短縮型Ｓ１サブユニット、変異百日咳毒素、糸状血球凝集素およびペルタクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）からなる融合タンパク質を含む）；
（ｃ）ＲＳウイルスのＦ糖タンパク質およびＧ糖タンパク質；
（ｄ）ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの被膜ポリサッカリド；ならびに
（ｅ）グループＡおよびＣのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの被膜ポリサッカリド、およびグループＢのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質。
【００５８】
本発明のＳａｌｍｏｎｅｌｌａの生きたベクターにおいて発現され得る寄生生物由来の抗原の例としては、以下が挙げられる：
（ａ）サーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク質（ＣＳＰ）、Ｌｉｖｅｒ  Ｓｔａｇｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−１（ＬＳＡ−１）、ＳＳＰ−２（ＴＲＡＰとしても公知）およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＥｘｐ−１；
（ｂ）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの無性赤血球段階抗原（ＭＳＰ−１、ＭＳＰ−２、ＳＥＲＡ、ＡＭＡ−１を含む）；
（ｃ）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの性段階抗原（Ｐｆｓ２５、およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種のｇｐ６３を含む）；ならびに
（ｄ）セリン富化Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａタンパク質（ＳＲＥＨＰ）。
【００５９】
（外来ＤＮＡに対する生きたベクターとしての弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）
外来抗原の発現を、最初に、インビトロでチェックする：ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞（ＣＨＯ  ＤＵＫ−）に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ９０９６）から得られ、そして外来病原体からクローニングされた遺伝子を含むプラスミドをエレクトロポレーションによってトランスフェクトする。ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞を、１０％透析ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充されたα−最小必須培地（ＭＥＭ−α）中で培養した。増殖の中期対数期および後期対数期において、トリプシン−ＥＤＴＡによって、細胞をプラスチックから遊離させた。細胞（２×１０６）に、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）、０．１０８％グルコース、および０．５％ＦＣＳを補充されたＨａｎｋの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中の３０μｇの線形プラスミドを、エレクトロポレートした（４００Ｖ；２５０μＦ；１ｍｎの間隔で２パルス）。次いで、トランスフェクトされた細胞を、新鮮な増殖培地を含む３５ｍｍ培養ディッシュ中に移し、そして加湿した５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃で、インキュベーションした。細胞を、トランスフェクションの２４〜９６時間後に回収し、そして得られた溶解物または細胞培養物上清を、ＥＬＩＳＡまたはイムノブロッティングによって、標的遺伝子の発現についてアッセイした。
【００６０】
次いで、生きた弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ株を、１８００ボルトおよび４００オームに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、１０％または１５％のグリセロール−水中の誘導性または構成性の真核生物プロモーターの制御下で、外来病原体からクローニングされた遺伝子を含むプラスミドを用いるエレクトロポレーションによって形質転換した。
【００６１】
本発明の開始材料として使用される特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株は、重要ではない。
【００６２】
次いで、外来抗原を発現する形質転換された生きた弱毒化Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを、ワクチン調製物として使用し、そしてそれらの免疫原性および保護性免疫応答を誘導するそれらの能力についてマウスで試験した。
【００６３】
本発明のなお別の実施形態において、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して外来の病原体に対するワクチン、チフス熱に対するワクチン、パラチフスＡ熱に対するワクチン、パラチフスＢ熱に対するワクチン、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａによって引き起こされる他の疾患に対するワクチンとしては、以下が挙げられる：
（ａ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体の１つまたは組合せを含む薬学的に有効な調製物；ここで、この変異体は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ由来、または別のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株由来であり、（ｉ）ストレプトマイシンスルフェートに対して耐性または依存性であり；（ｉｉ）Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対して耐性であり；そして（ｉｉｉ）胆汁酸塩に対して耐性であるように選択によって改変され、そして各変異体が、真核生物細胞において、真核生物プロモーターを使用して、外来抗原の発現をコードし、そして発現するプラスミドを含む；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤。
【００６４】
ＤＮＡ媒介ワクチンにおいて使用される特定の外来抗原は、本発明において重要ではない。このような抗原の例としては、種々の病原体、例えば、インフルエンザ（Ｊｕｓｔｅｗｉｃｚら，Ｊ．ＶＩＲＯＬ．６９：７７１２−７７１７（１９９５）；Ｆｙｎａｎら，ＩＮＴ．Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＰＨＡＲＭＡＣＯＬ．１７：７９−８３（１９９５））、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（Ｚａｒｏｚｉｎｓｋｉら，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５４：４０１０−４０１７（１９９５））、ヒト免疫不全ウイルス（Ｓｈｉｖｅｒら，ＡＮＮ．ＮＹ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．，７７２：１９８−２０８（１９９５））、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｄａｖｉｓら，ＶＡＣＣＩＮＥ，１２：１５０３−１５０９（１９９４））、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｌａｇｇｉｎｇら，Ｊ．ＶＩＲＯＬ．６９：５８５９−５８６３（１９９５））、狂犬病ウイルス（Ｘｉａｎｇら，ＶＩＲＯＬＯＧＹ  ２０９：５６９−５７９（１９９５））、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ（Ｙａｎｇら，ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．２１２：１０２９−１０３９（１９９５））、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（Ｓｅｄｅｇａｈら，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ，ＵＳＡ，９１：９８６６−９８７０（１９９４））；およびマイコプラスマ（Ｂａｒｒｙら，ＮＡＴＵＲＥ  ３７７：６３２−６３５（１９９５））に由来する抗原が挙げられる。
【００６５】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａに対して外来である抗原を発現するかまたはＤＮＡワクチンを送達する弱毒生Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａベクターでのマウスの免疫は、以下のように実施された：
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ抗原および外来抗原に対する血清学的応答および細胞免疫応答を、マウスの鼻（粘膜）免疫の後に測定した。３７℃での一晩培養の後、ワクチン株を、５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＴＳＡプレートから回収し、１０ｍｌの滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。細菌懸濁物を、０．５の６００ｎｍでの光学密度（５×１０８ｃｆｕ／ｍｌに相当する）まで希釈し、そして遠心分離によって１×１０１１ｃｆｕ／ｍｌまで濃縮し、そして適切な容量の滅菌ＰＢＳ中に再懸濁した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、３０μｌ容積中の約２×１０９ｃｆｕの弱毒化組換えＳａｌｍｏｎｅｌｌａで鼻内的（ｉ．ｎ．）に免疫した。マウスを、３５日後に同様の様式で、ブーストした。コントロールマウスは、ＰＢＳをｉ．ｎ．受容した。
【００６６】
体液性免疫応答および細胞性免疫応答を、以下のようにアッセイした：
マウスから採血し、血清を試験するまで−７０℃で保存した。外来抗原およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ抗原に対する、全ＩｇＧ抗体およびＩｇＧサブクラスを、ＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔には、９６ウェルプレートを、３７℃で３時間の間、１００μｌの精製外来抗原（すなわちＳａｌｍｏｎｅｌｌａ抗原）でコートし、ＰＢＳ中の１０％乳汁で一晩ブロックした。プレートを、各インキュベーションの後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで５回洗浄した。各血清の１０％ＰＢＳＴ中の２倍希釈物８個を３７℃で１時間インキュベートした。ペルオキシダーゼ結合体抗ＩｇＧ（抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２ａ、抗ＩｇＧ２ｂ、および抗ＩｇＧ３（Ｒｏｃｈｅ））を、同じ希釈液で１／１０００に希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。使用された基質溶液は、０．１Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５）中の、ｏ−フェニレンジアミン（１ｍｇ／ｍｌ）およびＨ２Ｏ２（０．０３％；Ｓｉｇｍａ）であった。１５分のインキュベーションの後、反応を、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止し、４９２ｎｍの光学密度を、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＭＳ）中で測定した。試験およびコントロールを、二連で実施した。直線回帰曲線を、各血清に対してプロットし、抗体力価を計算した。
【００６７】
頸リンパ節、腸間膜リンパ節、および脾臓を、各群中の５匹の動物から取り出し、そしてプールした。単一細胞懸濁物を、調製し、そして２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン、および１０％  熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０中に再懸濁した。抗原特異的増殖応答を、精製外来抗原（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ抗原またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含有する９６ウェル丸底プレート中で２×１０５細胞／ウェル（三連ウェル）を培養することによって測定した。熱フェノール処理のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ全細胞を、２×１０５粒子／ウェルおよび２×１０４粒子／ウェルで添加した。最終容積は、常に２００μｌであった。細胞を、５％  ＣＯ２下３７℃で６日間培養した。コントロールとして、各細胞集団を、同じ条件下で２μｇ／ｍｌ  ＰＨＡと共に培養し、そして３日後に回収した。培養物を、１μＣｉ／ウェルのトリチウム化チミジンでパルスし、そして１８〜２０時間後に回収した。細胞増殖を、［３Ｈ］チミジンの取り込みによって測定し、Ｗａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンターで測定した。
【００６８】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ中（生ベクターワクチン中の原核生物プロモーターを使用して）またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａに侵入された細胞中（ＤＮＡ媒介性ワクチン中の真核生物プロモーターを使用して）で外来遺伝子が発現するかどうかを決定することは、この特定の抗原に対するワクチン構築物が動物研究または臨床試験における最良の免疫応答を与えること、および／あるいは抗原のグリコシル化がその保護免疫原性に必須であるかどうか、および／あるいは抗原の正しい三次元構造が１つの形態が他よりも発現の１つの形態でよく達成されるかどうかに基づき得る。
【００６９】
（ＩＶ．ワクチン処方物）
本発明のワクチンにおいて、投与される本発明の変異体の薬学的に有効な量は、患者の年齢、体重および性別、ならびに投与の様式に依存して変化し得る。一般的に、使用される用量は、約１０２ｃｆｕ〜１０１０ｃｆｕである。好ましくは、約１０６ｃｆｕ〜１０１０ｃｆｕが、弱毒化された細菌を胃の酸性ｐＨから保護するために、ワクチンがカプセル中に与えられるかまたは緩衝液中に懸濁される、経口投与のために使用されるか；あるいは、約１０２ｃｆｕ〜１０７ｃｆｕが、細菌がドロップまたはエアゾール中に与えられる、鼻内投与のために使用される。
【００７０】
使用される特定の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈物は、本発明にとって重要ではなく、そして当該分野では慣習的である。希釈物の例としては、胃の胃酸に対して緩衝化するための緩衝液（例えば、スクロースを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、炭酸水素緩衝液（ｐＨ７．０）単独（Ｌｅｖｉｎｅら、ＲＥＶ．ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．１１（補遺３）：Ｓ５５２−Ｓ５６７（１９８７）；Ｂｌａｃｋら、ＶＡＣＣＩＮＥ  ８：８１−８４（１９９０））、またはアスコルビン酸、ラクトース、および必要に応じてアスパルテームを含む炭酸水素緩衝液（ｐＨ７．０）（Ｌｅｖｉｎｅら、ＬＡＮＣＥＴ  ＩＩ：４６７−４７０（１９８８）））が挙げられる。キャリアの例としては、タンパク質（例えば、スキムミルク中に見出されるような）；糖（例えば、スクロース）；またはポリビニルピロリドンが挙げられる。本発明の変異体は、１５％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび５００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＴＳＢ（Ｄｉｆｃｏ）中に懸濁され、−８０℃で保存され得る。
【００７１】
（Ｖ．寄託株）
特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の合意の元で、以下の試料が、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．，ＵＳＡのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された。
【００７２】
出願人の指定代理人（Ｇａｌｌｉ  Ｖａｌｅｒｉｏ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）は、ＡＴＣＣが、恒久的寄託を提供する寄託所であり、特許が認可された場合、公にそこから入手可能になことを示す。このように寄託された試料の公への入手可能性に対する全ての制限は、特許が認可される際に不可逆的に除去される。試料は、特許出願の係属の間、米国特許法施行規則第１．１４条および米国特許法第１２２条によって、そこに対して資格を与えられた委員によって決定された者は、入手可能である。寄託された試料は、寄託されたプラスミドサンプルを分譲に対する最近の請求後、少なくとも５年間の期間、そして、いかなる場合でも、寄託の日の少なくとも３０年間または特許の有効期間のいずれかのより長い期間、その試料が生存しかつ汚染されないように保管するために必要な全ての注意をもって保管される。出願人の指定代理人は、寄託の条件に起因して請求された場合、寄託所がサンプルの分譲をし得ない場合、再寄託する義務を認識する。
【００７３】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ変異株Ｔｙ  Ｂ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３７３３を受領した。
【００７４】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ変異株ＰＡ５０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３７３４を受領した。
【００７５】
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ変異株ＰＢ６０は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３７３５を受領した。
【００７６】
以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明の範囲をいかなるようにも限定することを決して意図しない。
【実施例】
【００７７】
（実施例１．生存変異体の特徴付け）
（１．ストレプトマイシン耐性変異体）
ストレプトマイシン耐性またはストレプトマイシン依存性の、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの変異体は、１６ＳリボソームＲＮＡおよびいくつかのリボソームタンパク質中に、変異を蓄積することが示された（Ａｌｌｅｎら、ＣＥＬＬ，６６：１４１−１４８（１９９１）；Ｂｊｏｅｒｋｍａｎら、ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＵＳＡ，９５：３９４９−３９５３（１９９８））。
【００７８】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのような他の細菌株に対して実施される同様の研究は、１６ＳリボソームＲＮＡおよびリボソームタンパク質中の変異の蓄積が、ストレプトマイシンに対する体制のレベルに依存することを示した。高度なストレプトマイシン耐性変異体および低濃度のストレプトマイシンに耐性の変異体は、同じ変異を蓄積しない（Ｋａｔｓｕｋａｗａら、Ｊ．ＡＰＰＬ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．，８３：６３４−６４０（１９９７））。
【００７９】
これらの観察に基づいて、ストレプトマイシン耐性（ＳｍＲ）変異体は、高濃度のストレプトマイシン（５００μｇ／ｍｌ）存在下での単一工程の選択において、親株Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂから得られた。単一のＳｍＲ変異体は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂの各々から単離され、これらは、単球誘導マクロファージ（ＭＤＭ）生存アッセイを使用して、野生型よりも毒性が低いことが示された（図８）。これらの変異体（すなわち、Ｔｙ  ＳｍＲ、ＰＡ  ＳｍＲ、およびＰＢ  ＳｍＲ）を、抗Ｏ血清、抗Ｖｉ血清（Ｔｙ  ＳｍＲのみに対する）および抗Ｈ血清を用いて、スライド凝集によってさらに特徴付けた。これらの変異体は、これらの抗原について、そして９ｇ／ｌの濃度までの胆汁酸塩を補充した固体培地上でのこれらの増殖について、野生型と有意に相違しない（図２）。
【００８０】
（２．ストレプトマイシンおよびＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージ耐性変異体）
リポポリサッカリド（ＬＰＳ）分子の異なる領域に付着する異なるバクテリオファージ（Ｏ抗原性側鎖に付着する滑面特異的ファージ（例えば、Ｐ２２およびＰ２７）、核に付着する粗面特異的ファージ（例えば、６ＳＲ、Ｂｒ２、およびＢｒ６０）ならびにＬＰＳの滑面形態および粗面形態の両方に付着するファージ（例えば、Ｆｅｌｉｘ  Ｏ（ＦＯファージともいわれる、Ｆｅｌｉｘ  Ｏ−１）））が記載される（ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＴＯＸＩＮＳ，Ａｊｌら編、ＮＹ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  １９７１；Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，１０５：５７−６４（１９７１））。一般的に、滑面特異的ファージは全て、Ｏ抗原の構造を変更するテンペレート転換ファージである一方、粗面ファージは、例外は存在し得るが、全て毒性である。
【００８１】
Ｆｅｌｉｘ  Ｏ耐性（ＦＯＲ）変異体は、毒性Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに耐性であり、このレセプターは、ＬＰＳコアのＮ−アセチルグルコサミン分枝を含む（Ｆｅｌｉｘら、ＢＲＩＴ．ＭＥＤ．Ｊ．，２：１２７−１３０（１９４３）；Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，９９：５１３−５１９（１９６９）；ＭａｃＬａｃｈｌａｎら、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，１７３：７１５１−７１６３（１９９１）；Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓら、Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．，２７３：８８４９−８８５９（１９９８））。ＬＰＳ核がＯ鎖を保有する滑面株およびＯ鎖を含まない完全なＬＰＳ核を作る粗面株は、ファージＦＯによって溶菌される。従って、完全な核を合成しない変異体は、ファージＦＯに対して耐性であり、ストレプトマイシン耐性ｔｙｐｈｉならびにｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａおよびｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ由来のＦＯＲ変異体の選択は、欠損ＬＰＳ核構造を有するＳｍＲ変異体の単離にある。これらの変異体は、活性な糖転移酵素を発現しないかもしれず、またはこれらの酵素の基質を産生するかもしれない。しかし、いずれの場合においても、他の生合成経路は、広い範囲の異なる表現型を有する変異体を生じるように作用し得る。
【００８２】
Ｔｙ  ＳｍＲ株からのＦＯＲ変異体の独立した４回の選択によって、当初得られた１０００を超える変異体を代表する少なくとも８０の変異体を生じる。これらの変異体は、ＴｙＡｎ、ＴｙＢｎ、ＴｙＣｎおよびＴｙＶｎ（ここで、ｎは、１、２、３などである）と命名された（図１）。これらの変異体の代表的なサンプルを、抗Ｏ血清、抗Ｖｉ血清および抗Ｈ血清を用いて、スライド凝集によってさらに特徴付けた（図３）。凝集を、１００℃（沸騰水）での１０分間のインキュベーションの前および後に実施し、加熱前はＶｉ抗原によってマスクされる、ＬＰＳのＯ抗原を特徴付けた。驚いたことに、２つのクラスの変異体は、抗Ｏ凝集から生じた。第１の変異体は、加熱後Ｏ抗原に対してネガティブまたはわずかにポジティブであり、Ｖｉ抗原に対してポジティブであった変異体からなる（図３）。この特性は、他のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ変異体について報告されていなかった。第２の変異体は、加熱後にＯ抗原に対してポジティブになり、Ｖｉ抗原に対してネガティブである通常の特徴を有する変異体からなる（図３）。
【００８３】
１回のＦＯＲ変異体の選択を、ＰＡ  ＳｍＲ株およびＰＢ  ＳｍＲ株の両方に対して実施した。１７のＰＡ  ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体および１８のＰＢ  ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体は、当初得られた１４０を超えるＰＡ由来変異体および６０のＰＢ由来変異体を代表した。これらの変異体は、ＰＡｎおよびＰＢｎ（ここで、ｎは、１、２、３などである）と命名された（図１）。代表的なＰＡ変異体およびＰＢ変異体を、抗Ｏ血清および抗Ｈ血清を用いて、スライド凝集によってさらに特徴付けた。結果を、図５および図６に報告する。これらのＳｍＲ−ＦＯＲ変異体の胆汁酸塩（０．５〜９．０ｇ／ｌ）を含む培地中での増殖は、これらの変異体が、９．０ｇ／ｌまでの胆汁酸塩まで良好に増殖し、そしていくつかは、０．５、１．５、３．０、５．０または７．０ｇ／ｌの胆汁酸塩で増殖を停止した。この挙動は、Ｔｙ由来変異体、ＰＡ由来変異体、およびＰＢ由来変異体について観察された（図３、５、６）。さらに、加熱後にＶｉポジティブまたはＶｉネガティブのいずれかであるＴｙ  ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体の両方のクラスは、９．０ｇ／ｌの胆汁酸塩またはより低い濃度の胆汁酸塩のいずれかまで良好に増殖し、このことは、膜中のＶｉアンカーおよび胆汁酸塩を含む培地中での増殖の両方が、独立した調節エレメントの制御下に存在することを示唆する。さらに、Ｖｉ発現が、両方のクラスのＴｙ  ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体における容量オスモル濃度によって制御されることを明確に確立した（図４）。さらに、漸増する容量オスモル濃度を含む培地において、加熱後にＶｉポジティブであった変異体の増殖はまた、変異体が、元々Ｏネガティブである（粗面であるＣ３５、Ｃ３５Ｐ、およびＶ２）かＶｉによってマスクされたＯ抗原を有してＯポジティブである（滑面であるＢ１、Ｂ２８、Ｂ６３など）かどうかを決定するための方法であった。この実験はまた、Ｈ抗原（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）が約０．３Ｍ  ＮａＣｌで最大発現と有する容量オスモル濃度によって制御されることを示した（図４）。
【００８４】
（３．ストレプトマイシン依存性変異体およびＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージ耐性変異体）
Ｔｙ  ＳｍＲ株由来のＦＯＲ変異体の選択を実施した場合、いくつかのストレプトマイシン依存性（ＳｍＤ）変異体（例えば、Ｔｙ  Ｖ２およびＴｙ  Ｂ６３（図３））をまた得た。これらの変異体は、ストレプトマイシンの存在下でのみ増殖し、そしてＳｍＲ変異体と異なる、１６ＳリボソームＲＮＡ中の変異および３０Ｓサブユニットのリボソームタンパク質中の変異から生じた。Ｔｙ  Ｖ２およびＴｙ  Ｂ６３は両方、加熱後にＶｉポジティブであり、そして０．５ｇ／ｌの胆汁酸を含む培地中でのみ良好に増殖する。さらに、Ｔｙ  Ｖ２は、ＦＯファージに対して耐性であることが示され、そしてＴｙ  Ｂ６３は、部分的にのみ耐性であることが示された。
【００８５】
（４．ストレプトマイシン非依存性復帰変異体）
ストレプトマイシン非依存性復帰（Ｓｍ  Ｉ  Ｒｅｖ）変異体（例えば、Ｔｙ  Ｂ６３  Ｓｍ  Ｉ  Ｒｅｖ（図３））を、大量のＴｙ  Ｂ６３  ＳｍＤ変異体を、ストレプトマイシンを含まない培地上にプレートする場合、得る。このような変異体は、通常存続し続ける、ＳｍＤ変異体と異なる、１６ＳリボソームＲＮＡ中の変異および３０Ｓサブユニットのリボソームタンパク質中の変異を蓄積する。このようなＳｍ  Ｉ  Ｒｅｖ変異体は、ストレプトマイシンの非存在下または存在下のいずれかで増殖し得る。Ｔｙ  Ｂ６３  Ｓｍ  Ｉ  Ｒｅｖは、ＦＯファージに対するその耐性を喪失し、加熱後にほとんどＯポジティブになり、そして９ｇ／ｌ程度に高い濃度で胆汁酸塩を含む培地上で良好に増殖することが示された。実際、Ｔｙ  Ｂ６３  Ｓｍ  Ｉ  Ｒｅｖは、Ｔｙ  Ｂ６３  ＢＳＲおよび当初のＴｙ  ＳｍＲ変異体と非常に近接した特徴を有する。
【００８６】
（５．ストレプトマイシン耐性変異体および胆汁酸塩耐性変異体）
低濃度の胆汁酸塩に対して全て耐性である、大量のＴｙ  Ｖ２、Ｔｙ  Ｂ６３およびＴｙ  Ｃ３５を、９ｇ／ｌの胆汁酸塩を含む培地中にプレートした場合に、ストレプトマイシン耐性変異体および胆汁酸塩耐性（ＢＳＲ）変異体（例えば、Ｔｙ  Ｖ２  ＢＳＲ、Ｔｙ  Ｂ６３  ＢＳＲおよびＴｙ  Ｃ３５  ＢＳＲ（図３））を、得た。このような変異体は、加熱後にＦＯファージに対して耐性を喪失しそしてＶｉネガティブになることが示され、このことは、細菌の膜上でのＦＯファージレセプター（ＬＰＳ）およびＶｉ抗原のアンカーの合成が、共通の調節エレメント下であることを示唆した。胆汁酸塩耐性への転換の頻度（９ｇ／ｌの胆汁酸塩を含む培地上）は、極めて不定であり、１０，０００のうち１つの復帰突然変異体（Ｔｙ  Ｃ３５）〜１０，０００，０００のうち１つの復帰突然変異体（Ｔｙ  Ｖ２）の範囲にわたる。
【００８７】
（実施例２．変異体の毒性）
（１．ヒト単球誘導マクロファージ生存アッセイおよびヒト血清の殺菌効果を使用するインビトロ評価）
可能な生ワクチンとして新規の減毒されたＳ．ｔｙｐｈｉ変異体、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ変異体およびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ変異体を評価する場合、信頼できかつ代表的なインビトロアッセイが必要とされる。実際に、ヒト腸チフス／パラチフス感染を再現する適切な動物モデルの欠損は、このような減毒されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の意味のある評価を制限する。しかし、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの減毒された株の毒性の評価を、マウスにおいて実施し得る。なぜなら、マウスは、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに対して天然に感受性であり、腸チフスに対する類似点を保有する内蔵型疾病を発現するからである。従って、インビトロでの２つの試験を、このような変異体の毒性を評価するために通常使用する。第１の試験は、単球誘導マクロファージ（ＭＤＭ）生存アッセイであり（Ｖｌａｄｏｉａｎｕら、ＭＩＣＲＯＢ．ＰＡＴＨＯＧ．，８：８３−９０（１９９０）；Ｓｉｚｅｍｏｒｅら、ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，６５：３０９−３１２（１９９７））、第２の試験は、ヒト血清の殺菌効果である（Ｊｏｉｎｅｒ，ＣＵＲＲ．ＴＯＰＩＣＳ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，１２１：９９−１３３（１９８５））。
【００８８】
ＭＤＭ生存アッセイは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの腸粘膜の通過後のマクロファージ内での生存能力を反映することが示された。マクロファージ内で生存する能力は、細菌毒性および宿主依存性因子によって影響される病原における不可欠な段階である。特に、ＭＤＭアッセイを用いての、野生型および弱毒化されたＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株の毒性の評価は、マウスにおけるこれらの毒性の評価と相関するマウスマクロファージを用いて実施される（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒら、ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，５７：１−７（１９８９））。しかし、毒性Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙ２は、マウスマクロファージ中で殺傷されるが、ヒトＭＤＭ内で生存し得る（Ｖｌａｄｏｉａｎｕら、ＭＩＣＲＯＢ．ＰＡＴＨＯＧ．，８：８３−９０（１９９０））。結果として、ＭＤＭ生存アッセイにおける、Ｓ．ｔｙｐｈｉ変異体、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ変異体およびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ変異体の毒性の評価は、ヒトマクロファージ様細胞を必要とする。付着性マクロファージ様細胞への分化の後、健康ボランティア由来の一次単球、ヒト骨髄性単球Ｕ９３７細胞株およびヒト単球白血病細胞株ＴＨＰ−１は、ＭＤＭ生存アッセイにおいて有用であると判明した（Ｓｉｚｅｍｏｒｅら、ＩＮＦＥＣＴ．ＩＭＭＵＮ．，６５：３０９−３１２（１９９７）；Ｄｒａｇｕｎｓｋｙら、ＶＡＣＣＩＮＥ，８：２６３−２６８（１９９０）；Ｈｉｒｏｓｅら、ＦＥＭＳ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＬＥＴＴ．，１４７：２５９−２６５（１９９７））。アッセイをより良好に標準化するために、本発明者らは、１０−６Ｍのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）の存在下で、分化するように４８時間誘導されたＴＨＰ−１細胞株を使用するために選択した（Ｓｃｈｗｅｎｄｅら、Ｊ．ＬＥＵＫ．ＢＩＯＬ．，５９：５５５−５６１（１９９６））。
【００８９】
図８は、Ｔｙ、ＰＡ、およびＰＢに由来するＳｍＲ変異体が、ほんのわずかに減毒されており、このアッセイにおいてＰＢ  ＳｍＲが、ＰＢから有意に異ならないことを示す。しかし、対応するＳｍＲ−ＦＯＲ変異体は、ＳｍＲ変異体と比較される場合、高度に減毒されることが示され、弱毒化の程度は、ほとんど無毒性から中間の毒性およびより高い毒性までの範囲にわたる。５時間後に収集されたデータ（ＴＨＰ−１分化細胞の、細菌懸濁物との２時間のインキュベーション、続く細胞外細菌を殺傷するための高濃度のゲンタマイシンとの３時間のインキュベーション）は、主として、マクロファージを貫通する変異体の能力を反映し、２４時間後に収集されたデータ（ＴＨＰ−１分化細胞の、細菌懸濁物との２時間のインキュベーション、続く細胞外細菌を殺傷するための高濃度のゲンタマイシンとの３時間のインキュベーション、そして低濃度のゲンタマイシンとの１９時間のインキュベーション）は、主として、変異体のマクロファージ内に生存する能力を反映する。
【００９０】
これは、いくつかのＳｍＲ−ＦＯＲ変異体が、マクロファージにより効率的に侵入し（５時間後に最も高い生存％を有する以下の変異体が存在する：Ｔｙ  Ｃ３５  ＢＳＲ、ＰＡ−１、ＰＢ２０−２Ｐ）、そしてその他は、マクロファージ内でより良好に生存する（５時間と２４時間との間に、生存％の減少が最小である以下の変異体が存在する：Ｔｙ  Ｃ５６、ＰＡ１、ＰＢ２０−２）という、図８のデータから得られた。さらに、これらのデータは、ＴＨＰ−１分化細胞を用いて実施されるＭＤＭ生存アッセイが、可能なワクチン候補の選択のために有用であることを示した。
【００９１】
ヒト血清の腸グラム陰性生物に対する殺菌効果は、さらに、これらの毒性の間接的評価である。実際に、これらの細菌由来のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、広いサイズ不均一性を示し、異なる鎖に相補的な代替的経路を活性化する（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．，１６９：８５６−８６３（１９８７））。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの滑面形態は、一般的に、正常血清の殺菌作用に対して比較的毒性でありかつ耐性である一方、粗面形態は、無毒性であり、より感受性である。
【００９２】
細菌膜の別の成分（Ｖｉ抗原）は、Ｓ．ｔｙｐｈｉおよびこれに由来する変異体のヒト血清に対する感受性において役割を果たすが、ＶｉネガティブであるＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂに由来する変異体においては果たさない。Ｖｉの存在は、インビトロで血清、補体活性化および食作用による溶菌における有意な減少と相関する（Ｌｏｏｎｅｙら、Ｊ．ＬＡＢ．ＣＬＩＮ．ＭＥＤ．，１０８：５０６−５１６（１９８６））。従って、Ｖｉ抗原は、免疫系からＳ．ｔｙｐｈｉを保護する保護物として作用し得る。この観察は、血清によって完全に溶解された、いくつかのＶｉネガティブＴｙ  ＳｍＲ−ＦＯＲ変異体によって確認された（データは示さず）。
【００９３】
ヒト血清のＴｙ、ＰＡ、およびＰＢに対する殺菌効果は、Ｔｙ株およびＴｙ由来株が、ＰＡおよびＰＢより、正常ヒト血清に対してさらにより耐性であることを示し、これは、他のＴｙ誘導変異体より耐性の低いＴｙ  Ｂ１の例外を有する（図８）。変異体間の差異は、１０００倍程度に大きくあり得、このことは、いくつかの変異体が、ワクチン株として、他よりさらにより適切であることを示唆する。実際に、予防接種されたヒトにおいて、なお無症状の菌血症は、受容されない。なぜなら、集団の大きな群において見出される免疫無防備状態の個体が、重篤に感染され得るからである。
【００９４】
（２．Ｔｙ  ＳｍＤ−ＦＯＲ変異体のインビボ評価）
Ｔｙ  Ｖ２変異体を、ヒトボランティア（６５歳老人男性であり、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎に対して血清学的にネガティブであり、チフスの病歴を有さない）におけるインビボ試行に対して選択する。実際に、Ｔｙ  Ｖ２は、ヒト血清の殺菌効果に高度に感受性であるが（図８）、菌血症を誘導する可能性がないことが示された。
【００９５】
この変異体は、ストレプトマイシン依存性であり、ＦＯファージに対して耐性であり、Ｏネガティブであり、Ｖｉポジティブであり、そして加熱後にＶｉポジティブのままであり、０．５ｇ／ｌの濃度まで胆汁酸塩中で増殖する（図３および４）。さらに、Ｔｙ  Ｖ２は、１０，０００，０００のうち１（１０−７）の頻度で胆汁酸塩耐性に復帰して、Ｔｙ  Ｖ２  ＢＳＲになり、このＴｙ  Ｖ２  ＢＳＲは、ストレプトマイシン独立性であり、ＦＯファージに対して感受性であり、Ｖｉポジティブであり、Ｏポジティブであり、そして９ｇ／ｌの濃度まで胆汁酸塩中で増殖する。Ｔｙ  Ｖ２と対照的に、Ｔｙ  Ｖ２  ＢＳＲは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対して感受性ではなく（図７）、ＭＤＭ生存アッセイは、この変異体が、ＴｙおよびＴｙ  ＳｍＲよりさらに毒性が低いことを示した（図８）。結果として、Ｔｙ  Ｖ２  ＢＳＲは、消化管に入って生存し、強力な免疫応答を誘導するより良好な能力を潜在的に有する。
【００９６】
Ｔｙ  Ｖ２を、４８時間の間隔で、５．２×１０９、１．７×１０１０、および２．８×１０１０の細菌を含む３つの経口用量において投与した。生バクテリアは、３０ｍｌの乳汁中の懸濁液で存在し、経口摂取の５分前に炭酸水素ナトリウムで胃酸を中和した後、飲み込まれた。完全な絶食を、生細菌の経口投与の９０分前および生細菌の経口投与の９０分後に観察した。１ヶ月間、第１の投与の直後に開始し、ボランティアの腋窩温度を、１日に２回測定し、便培養物を、Ｔｙ  Ｖ２およびＴｙ  Ｖ２  ＢＳＲの存在について規則的に確認した。温度は、約３６℃のままでとどまり、培養物中に変異体は見出されなかった。さらに、消化の問題は生じず、他の特定の副作用は、観察されなかった。結果として、Ｔｙ  Ｖ２は、この試行において、投与された用量で安全であると考えられる。
【００９７】
次いで、Ｔｙ野生型株の生存を、Ｔｙ  Ｖ２変異体での免疫前およびＴｙ  Ｖ２変異体での免疫の３０日後に調製された、ボランティアからの単球誘導マクロファージでのＭＤＭアッセイにおいて試験した（図９）。結果は、Ｔｙの生存が、免疫後大いに減少したことを示し、このことは、免疫応答の効率的な誘導を示唆した。
【００９８】
（等価物）
本発明の特定の実施形態の前述の詳細な説明から、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの生弱毒化変異体株を得そして選択するための特有の手順が、記載され、例示の物質として、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂの、特有の生弱毒化変異体株を得たことが明らかになるはずである。特定の実施形態が、本明細書中で詳細に開示されるが、これは、例示の目的のみのための例として実施され、添付される、添付の特許請求の範囲の範囲に関して制限されることを意図されない。特に、置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって規定される本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることが本発明者らによって、企図される。例えば、弱毒の手順が適用される特定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の選択、あるいは外来抗原または外来ポリヌクレオチド配列に対するベクターとしての、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの特定の生弱毒化株の選択、あるいは病原性生物由来の特定の抗原またはポリヌクレオチド配列の選択は、本明細書中に記載される実施形態の知識を用いて、当業者にとって慣用的な事項であることが考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ、およびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ由来の、生の弱毒化変異体株を獲得および選択するために使用される手順を詳述する、流れ図である。これらの変異体の命名法が含まれる。
【図２】図２は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ、およびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂの、野生型株および生の弱毒化ストレプトマイシン耐性変異体株の、選択特徴を比較する表である。具体的には、この表は、異なる濃度の胆汁酸塩を含有する培地における、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の増殖特性、ストレプトマイシンおよびＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対するこれらの感受性を要約する。１００℃（沸騰水）で１０分間加熱されたかまたは加熱されていないこれらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の、Ｏ抗原、Ｖｉ抗原およびＨ抗原に対する抗体でのスライド凝集反応もまた示される。
【図３】図３は、ストレプトマイシン耐性またはストレプトマイシン依存性、Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対して耐性または感受性の、いくつかの代表的な生の弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉ変異体株の選択特徴を比較する表である。具体的には、この表は、異なる濃度の胆汁酸塩を含有する培地における、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の増殖特性、ストレプトマイシンおよびＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対するこれらの感受性を要約する。１００℃（沸騰水）で１０分間加熱されたかまたは加熱されていないこれらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の、Ｏ抗原、Ｖｉ抗原およびＨ抗原に対する抗体でのスライド凝集反応もまた示される。さらに、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の胆汁酸塩耐性への復帰の頻度が示される。
【図４】図４は、野生型Ｓ．ｔｙｐｈｉおよびストレプトマイシン耐性またはストレプトマイシン依存性、Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対して耐性または感受性の、いくつかの代表的な生の弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉ変異体株の選択特徴を比較する表である。具体的には、Ｏ抗原、Ｖｉ抗原およびＨ抗原の発現に対する容量オスモル濃度の影響が、特定の抗血清でのスライド凝集反応によって評価される。
【図５】図５は、ストレプトマイシン耐性またはストレプトマイシン依存性、Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対して耐性または感受性の、いくつかの代表的な生の弱毒化Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ変異体株の選択特徴を比較する表である。具体的には、この表は、異なる濃度の胆汁酸塩を含有する培地における、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の増殖特性、ストレプトマイシンおよびＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対するこれらの感受性を要約する。これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の、Ｏ抗原およびＨ抗原に対する抗体でのスライド凝集反応もまた示される。さらに、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の胆汁酸塩耐性への復帰の頻度が示される。
【図６】図６は、ストレプトマイシン耐性またはストレプトマイシン依存性、Ｆｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対して耐性または感受性の、いくつかの代表的な生の弱毒化Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ変異体株の選択特徴を比較する表である。具体的には、この表は、異なる濃度の胆汁酸塩を含有する培地における、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の増殖特性、ストレプトマイシンおよびＦｅｌｉｘ  Ｏバクテリオファージに対するこれらの感受性を要約する。これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の、Ｏ抗原およびＨ抗原に対する抗体でのスライド凝集反応もまた示される。さらに、これらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の胆汁酸塩耐性への復帰の頻度が示される。
【図７】図７は、単球由来マクロファージ生存アッセイ（図８）において、ＴＨＰ−１細胞を溶解するために使用される胆汁酸塩およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に対する、いくつかの代表的な生の弱毒化Ｓ．ｔｙｐｈｉ変異体株、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ変異体株およびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂ変異体株の感受性を比較する表である。
【図８】図８は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ、Ｓ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  ＡおよびＳ．ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ｂの野生型株およびいくつかの代表的な生の弱毒化変異体株の、単球由来マクロファージ細胞株ＴＨＰ−１における５時間後および２４時間後の生存を比較する表である。また、ヒト血清の殺菌効果に対するこれらのＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株の耐性が示される。
【図９】図９は、Ｓ．ｔｙｐｈｉ変異体株Ｔｙ  Ｖ２でのワクチン接種の前後のヒトボランティアから調製された単球由来マクロファージにおける、野生型株Ｓ．ｔｙｐｈｉ  Ｔｙの生存を比較する表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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