(57)【要約】プラスミドＤＮＡの精製方法であって、逆溶解性を有する第一のポリマー及び第一のポリマーと非混和性の第二のポリマーを含む組成物を提供するステップと、この溶液をプラスミドＤＮＡを含む水溶液と接触させるステップと、相分離を行なって水相を単離するステップと、単離した相の温度を、第一のポリマーの曇り点よりも高くプラスミドＤＮＡが劣化する温度よりも低い温度まで上昇させ、続いてこれにより形成される水相を単離するステップとを備える。また、上述のようなプラスミドＤＮＡの精製のためのキットを包含する。
2005537004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性二相系でのプラスミドＤＮＡの精製方法であって、
（ａ）逆溶解性を呈する第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性の第二のポリマー、及び適宜塩を含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）溶液をプラスミドＤＮＡを含む水溶液と接触させるステップと、
（ｃ）相分離を行ない、続いて水相を単離するステップと、
（ｄ）単離した相の温度を、第一のポリマーの曇り点よりも高くプラスミドＤＮＡが劣化する温度よりも低い温度まで上昇させ、続いてこれにより形成される水相を単離するステップと、適宜
（ｅ）単離した上相からプラスミドＤＮＡを回収するクロマトグラフィのステップと、
を含む方法。
【請求項２】
第一のポリマーが、水溶液での曇り点が約６０℃未満である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一のポリマーが、ポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、ポリ（オキシアルキレン）共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシル化界面活性剤、アルコキシル化デンプン、アルコキシル化セルロース、アルキルヒドロキシルアルキルセルロース、シリコーンで改質したポリエーテル、及びポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、並びにこれらの共重合体から成る群から選択される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
第一のポリマーが、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドで構成される共重合体であり、好ましくは約５０％のエチレンオキシド及び約５０％のプロピレンオキシドで構成される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項項記載の方法。
【請求項５】
第二のポリマーが、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン、及びプルランから成る群から選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項項記載の方法。
【請求項６】
第一のポリマーの量と第二のポリマーの量との重量比が約１：１である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項項記載の方法。
【請求項７】
第一のポリマーの量がステップ（ａ）で提供される組成物の約４．５％（ｗ／ｗ）であり、第二のポリマーの量がステップ（ａ）で提供される組成物の約４．５％（ｗ／ｗ）である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
プラスミドＤＮＡを含む水溶液は細胞ライセートであり、ステップ（ｂ）の前に細胞ライセートを脱塩するステップを含む請求項１乃至請求項７のいずれか１項項記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）による接触が室温での混合を含む、請求項１乃至請求項８のいずれか１項項記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）及び／又はステップ（ｄ）による単離が遠心分離による、請求項１乃至請求項９のいずれか１項項記載の方法。
【請求項１１】
水性二相系でのプラスミドＤＮＡの抽出のための組成物であって、約６０℃未満の温度で逆溶解性を呈する第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性の第二のポリマー、及び適宜塩を含む組成物。
【請求項１２】
第一のポリマーの量が４．５％（ｗ／ｗ）であり、第二のポリマーの量が４．５％（ｗ／ｗ）である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項項によるプラスミドＤＮＡの分離のための請求項１１又は請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
水性二相系での細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの精製のためのキットであって、約６０℃未満の温度で逆溶解性を呈する第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性の第二のポリマー、及び適宜塩を一区画に含み、これらの取扱説明書を含むキット。
【請求項１５】
第一のポリマーはエチレンオキシド及びプロピレンオキシドで構成される、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
第二のポリマーは、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン及びプルランから成る群から選択される、請求項１４又は請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
第一のポリマーの量と第二のポリマーの量との重量比が約１：１である、請求項１４乃至請求項１６のいずれか１項項記載のキット。
【請求項１８】
プラスミドＤＮＡを含む水溶液と混合する前に既に脱塩されている細胞ライセートの精製のための請求項１４乃至請求項１７のいずれか１項項記載のキット。
【請求項１９】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項項記載の方法に用いられる請求項１４乃至請求項１８のいずれか１項項記載のキット。
【請求項２０】
細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの精製のための約６０℃未満の温度で逆溶解性を呈するポリマーの水性二相系での用法。
【請求項２１】
前記ポリマーがエチレンオキシドとプロピレンオキシドの共重合体である、請求項２０記載の用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水性二相系でのプラスミドＤＮＡの精製方法に関する。本発明はまた、水性二相系での細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの精製のためのキットを包含する。加えて、本発明は、細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの精製のための幾種類かのポリマーの二相系での用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
集団内で遺伝的変異性を維持する方法の一つに、組換えすなわち異なるＤＮＡ分子間で遺伝情報を交換して遺伝子を再編する方法によるものがある。遣伝子工学分野で組換えを行なうためには、通常ベクターが用いられる。最も広く用いられているベクターは、微小な遺伝要素であるＤＮＡプラスミドであり、微生物が付加的遺伝情報を蓄積することを可能にする。
【０００３】
プラスミドは今日、多くのバイオテクノロジー応用で有用な要素となっている。例えば、医療及び診断の分野では、元の細胞に発現していないタンパク質を暗号化した遺伝子を担持したプラスミドを用いて、細胞の遣伝子工学が行なわれている。
【０００４】
ベクターとしてのプラスミドのもう一つの用途は、今後１０年間で最も急速に発展する領域の一つと予想される遺伝子療法分野におけるものである。遺伝子療法は、ヒトの細胞に核酸を導入して、例えば嚢胞性繊維症のような遺伝子欠損を治す治療手法である。体外手法を用いた最初のヒト遺伝子療法試験は１９９０年に開始された。この研究方法では、患者の細胞を採取して実験室で培養し、次いでベクターと共にインキュベートすることにより治療遺伝子を導入する。さらに近年では、生体内遺伝子療法に基づく遺伝子送達方法であって、ウィルスを直接患者に投与する方法が代替として提案されているが、遺伝子療法におけるプラスミドの重要性は不変である。
【０００５】
このように、バイオテクノロジー応用での利用増加によって大量のプラスミドＤＮＡの需要が生じている。この目的のためには、純度及び定量性についての仕様に適合し得る効率的な大規模精製方法が必要とされる。現在、タンパク質のように約１０ｎｍの比較的小さい分子については多くの精製方法がある。しかしながら、１００ｎｍ以上の大きさを有する比較的大きいＤＮＡプラスミドについては、利用可能な精製方法は遥かに少ない。
【０００６】
従来、プラスミドＤＮＡの製造は、発酵、一次精製、及び高分離能での分離を含んでいる。近年、プラスミドＤＮＡの精製方法としてクロマトグラフィを用いた数多くの方法が提案されている。しかしながら、プラスミドＤＮＡの単一の精製手法として単独でクロマトグラフィを用いると、拡散が遅い、マトリクス容量が小さい、大きなプラスミドが剪断される、及びプラスミドが高塩濃度で回収されるといった幾つかの欠点を伴う。従って、クロマトグラフィの前に、一次精製ステップを設ける必要がある。
【０００７】
プラスミドＤＮＡの精製に二相系を用いることが提案されている。水性二相系は極く穏やかで、プラスミド精製の一次回収ステップとして用いられる大きな可能性を示している。プラスミドＤＮＡは現在しばしば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内で生成されているので、細菌細胞からプラスミドＤＮＡを放出するためのアルカリ溶菌のステップを要する。アルカリ溶菌ステップでは、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、タンパク質、細胞及び細胞残渣のような幾種類かの混入物質が放出される。Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓ．Ｃ．Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅｓ  ｂｙ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２００２，Ｗｉｌｅｙ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｓ）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び塩から成る水性二相系でプラスミドＤＮＡを単離し得ることを示している。ＰＥＧはエチレンオキシド基から成る線状ポリマーである。このポリマーは水溶性であり、一定の塩濃度ではＰＥＧ及び塩から成る二相系が得られる。ＰＥＧポリマーは濾過又は透析によって除去することができるが、これによりしばしば収率が低下する。この方法のもう一つの欠点は、ＰＥＧが比較的高価な薬品であることで、大規模工程では重大な問題となる。さらに、この方法で得られるプラスミドＤＮＡは高塩濃度の環境に存在しており、これは遺伝子療法等の応用では不都合である。
【０００８】
代替的な二相系は、温度誘導による相分離によって系が生成されるという点でＰＥＧ／塩系と異なっている。さらに明確に述べると、このことは熱分離性（ｔｈｅｒｍｏｓｅｐａｒａｔｉｎｇ）ポリマーが用いられることを意味し、すなわち温度が曇り点（ＣＰ）を超えた点まで上昇するとポリマー溶液が二つの相に分離する。上述のＰＥＧポリマーは実際に熱分離性ポリマーとして利用することができるが、曇り点が１０％水溶液で１１１．７℃と高いため、ＰＥＧ系は壊れ易い生体物質の分離には極めて不適当である。酵素のような幾種類かのタンパク質の分配及び水溶性ステロイドについての熱分離性二相系が提案されている。
【０００９】
さらに明確に述べると、Ｐ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ：Ｅｎｚｙｍｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ２：２３７?２４６，１９９１は、水性二相系でのパン酵母の細胞ホモジェネートからの酵素３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びヘキソキナーゼの精製を開示している。用いられている系は、ＵＣＯＮ５０−ＨＢ−５１１０として公知であるエチレンオキシド（ＥＯ）及びプロピレンオキシド（ＰＯ）のランダム共重合体と、デキストラン又はヒドロキシプロピルデンプンとを含む。ＥＯ−ＰＯ共重合体の曇り点はＰＥＧよりも遥かに低く、すなわち５０℃である。
【００１０】
さらに、Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ａ．Ａｌｒｅｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｅｃｔｄｙｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，６２８（１９９３）２０５?２１４は、熱分離によって水性二相系でエクジステロイドのα−エクジソン及びβ−エクジソンを分配する研究を開示している。この系は上述と同じ成分すなわちエチレンオキシド−プロピレンオキシドランダム共重合体ＵＣＯＮ５０−ＨＢ−５１１０及びデキストランを含む。回収されたエクジステロイドがそれぞれ７３．６％及び８５．６％と高水準であるため、かかる系はエクジステロイドの分析又は製造手法として提案されている。
【００１１】
最後に、Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７１１（１９９８）９７−１０９は、エチレンオキシド−プロピレンオキシドランダム共重合体及びヒドロキシプロピルデンプンを含む水性二相系での組換えアポリポタンパク質Ａ１の精製方法を記載している。このポリマー系は、臨界点を超えて加熱されると、水に富んだ１相とポリマーに富んだ１相とに分離するという意味で熱分離性である。アポリポタンパク質は上側のＥＯ−ＰＯ共重合体相に分配され、混入タンパク質及びＤＮＡは下相に分配され得ることが示された。
【非特許文献１】Ｓ．Ｃ．Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓａｔｅｓ  ｂｙ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２００２，Ｗｉｌｅｙ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｓ
【非特許文献２】Ｐ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ：Ｅｎｚｙｍｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ２：２３７−２４６，１９９１
【非特許文献３】Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ａ．Ａｌｒｅｄ  ｅｔ  ａｌ：Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｅｃｔｄｙｓｔｅｒｏｉｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，６２８（１９９３）２０５−２１４
【非特許文献４】Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｕｓｉｎｇ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｅｄ  ｂｙ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ，７１１（１９９８）９７−１０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
要約すると、細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの改良された精製方法が依然必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、従来技術の以上に述べた欠点の一つ又は複数を回避したプラスミドＤＮＡの精製方法を提供することにある。この目的は、請求項１記載の方法によって達成することができる。
【００１４】
従って、本発明の一つの目的は、プラスミド精製の一次ステップとして有用な方法を提供することにある。
【００１５】
特定的な目的は、従来技術の方法と比較して塩濃度の低い生成物を得る水性二相系でのプラスミドＤＮＡの精製方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、細胞ライセート内のＲＮＡ、並びにタンパク質及びゲノムＤＮＡのような他の不純物からプラスミドＤＮＡを分離することが可能な方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらにもう一つの目的は、熱分離性ポリマーを含む水性二相系での細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの分離に有用なキットを提供することにある。
【００１８】
本発明の他の観点及び利点は、以下の本発明の詳細な説明及び実験部分から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（定義）
「生物学的溶液」との用語は、通常は細胞残渣、タンパク質、ＲＮＡのような望ましくない混入成分と共にプラスミドＤＮＡを含んだ任意の溶液を包括的に指す。
【００２０】
本発明の第一の観点は、水性二相系でのプラスミドＤＮＡの精製方法であり、この方法は、
（ａ）逆溶解性を呈する第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性の第二のポリマー、及び適宜塩を含む組成物を提供するステップと、
（ｂ）この溶液をプラスミドＤＮＡを含む水溶液と接触させるステップと、
（ｃ）相分離を行ない、続いて水相を単離するステップと、
（ｄ）単離した相の温度を、第一のポリマーの曇り点よりも高くプラスミドＤＮＡが劣化する温度よりも低い温度まで上昇させ、続いてこれにより形成される水相を単離するステップと、適宜
（ｅ）単離された上相からプラスミドＤＮＡを回収するためのクロマトグラフィのステップと、
を備える。
【００２１】
このように、本方法で用いられる第一のポリマーと第二のポリマーと非混和性である。さらに明確に述べると、一方のポリマーは本質的に親水性であり、他方のポリマーは相対的に疎水性であるが依然として水溶性でありすなわち両親媒性であるものとする。当業者であれば理解されるように、第一及び第二のポリマーの濃度は、少なくとも２相への相分離を生ずるのに十分に高いものとする。
【００２２】
このように、第一のポリマーは両親媒性で水溶性であり、プラスミドＤＮＡとの相互作用が可能である。これにより、プラスミドＤＮＡは相対的に疎水性である相に抽出され、これにより、タンパク質、細胞、細胞残渣のような相対的に親水性である混入物質から分離される。「逆溶解性」との用語は、ポリマーの溶解度が溶液温度とは反対に変化することを意味し、さらに明確に述べると、ポリマーの溶解度が溶液温度の上昇と共に低下することを意味する。従って、逆溶解性は、殆どの溶質が呈する温度効果と正反対である。ここでは、第一のポリマーを指すのに「熱分離性（ｔｈｅｒｍｏｓｅｐａｒａｔｉｎｇ）」との用語も用いられる。非常に驚くべきことに、本発明者はまた、本発明による方法を用いてプラスミドＤＮＡをゲノムＤＮＡ及びＲＮＡから分離し得ることを明らかにした。実際に、本発明は、水性二相系での抽出後に、ポリマーを含まない水溶液内でプラスミドＤＮＡを得ることができることを初めて示している。
【００２３】
逆溶解性を呈する第一のポリマーとして有用な適当なポリマーの例は、例えばＩ．Ｙ．Ｇａｌａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．，ｖｏｌ．１５（１９９３），ｐｐ．３５４−３６６にある。さらに明確に述べると、一実施形態では、第一のポリマーは、疎水性に改質したポリアルキレングリコールのようなポリアルキレングリコール、ポリ（オキシアルキレン）ポリマー、疎水性に改質したポリ（オキシアルキレン）共重合体のようなポリ（オキシアルキレン）共重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、アルコキシル化界面活性剤、アルコキシル化デンプン、アルコキシル化セルロース、アルキルヒドロキシルアルキルセルロース、シリコーンで改質したポリエーテル、及びポリＮ−イソプロピルアクリルアミド、並びにこれらの共重合体から成る群から選択される。以上に述べた例の誘導体及び混合物も本発明の範囲内に含まれる。また、国際公開第９８／１１１４０号（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ  ＡＢ）には、本方法に有用な適当な熱分離性ポリマーについてのさらに詳細な記載がある。本方法の有利な実施形態では、第一のポリマーは、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドで構成される共重合体である。好適実施形態では、この共重合体は約５０％のエチレンオキシド及び約５０％のプロピレンオキシドで構成される。この種のポリマーは市販されており、例えばＢｒｅｏｘ  ＰＡＧ５０Ａ１０００（英国サウサンプトン、Ｌａｐｏｒｔｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）等がある。
【００２４】
水溶液での第一のポリマーの濃度は、水溶液の全重量の約０．５重量％から約３０重量％までであってよく、好ましくは約３重量％〜２０重量％の範囲内、さらに好ましくは約４重量％〜１５重量％の範囲内、最も好ましくは約４．５重量％である。
【００２５】
第二のポリマーは上述のように第一のポリマーよりも疎水性が小さく、且つ水溶性である。この第二の親水性ポリマーの分子量は、１０，０００〜５，０００，０００のように約３，０００〜５，０００，０００であってよく、好ましくは４０，０００〜５００，０００である。本方法の有利な実施形態では、第二のポリマーは、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン、プルラン、並びにこれらの誘導体及び混合物から成る群から選択される。この種のポリマーも市販されており、例えばデキストラン５００Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）等がある。水溶液での第二のポリマーの濃度は、水溶液の全重量の約１重量％から約３０重量％までであってよく、好ましくは約３重量％〜２０重量％の範囲内、さらに好ましくは約４重量％〜１５重量％の範囲内、最も好ましくは約４．５重量％である。
【００２６】
本発明はまた、３種以上のポリマーの利用を包含する。このような多相分離は、当業者が、３種以上のポリマーの適当な組み合わせ、及び水溶液と接触するときの十分な高濃度を選択することにより、設計することができる。
【００２７】
当業者には認められるように、水溶液すなわち一次系でのプラスミドＤＮＡ濃度はその起源に依存する。例えば、水溶液が細胞ライセートである場合には、開始材料でのプラスミドＤＮＡ濃度は生成宿主に依存する。一次系でのプラスミドＤＮＡ濃度は典型的には０．１μｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬである。
【００２８】
以上から明らかなように、本発明による方法の一実施形態では、第一のポリマーの量と第二のポリマーの量との重量比は約１：１である。本方法の有利な実施形態では、第一のポリマーの量はステップ（ａ）で提供される組成物の４．５％（ｗ／ｗ）であり、第二のポリマーの量はステップ（ａ）で提供される組成物の４．５％（ｗ／ｗ）である。上相へのさらに徹底した分配が望まれる場合は、この実施形態が特に有利である。
【００２９】
プラスミドＤＮＡの疎水性相への分配は、疎水性陽イオン、又は代替的には親水性陰イオンを有する化合物を水溶液に加えることにより強化することができる。適当な化合物としては、直鎖状又は分岐状のトリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、トリプロピルアンモニウム、トリブチルアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、テトラプロピルアンモニウム及びテトラブチルアンモニウムのような陽イオンと、リン酸塩、硫酸塩、硝酸塩、塩化物及び炭酸水素塩のような陰イオンとを含んだ無機塩がある。特定的な例は硫酸トリエチルアンモニウム及びリン酸ナトリウムである。疎水性陽イオン又は親水性陰イオンを有する化合物の濃度は、高い分配効果が得られるように選択すると同時にプラスミドＤＮＡの沈澱を回避するものとする。
【００３０】
二相系の各相の間での分子の分配は、次式で定義される分配係数Ｋによって記述される。
【００３１】
Ｋ＝ＣＴ／ＣＢ                                      （１）
式中、ＣＴは関心のある分子の上相での濃度、ＣＢは関心のある分子の下相での濃度である。
【００３２】
二相系の各相の間での分子の分配は、相図に示すことができ、ここで第一の相と第二の相との間の境界線はバイノーダル曲線（ｂｉｎｏｄｉａｌ  ｃｕｒｖｅ）と呼ばれる。互いに平衡した二つの相のポリマー濃度は、相図の接続線によって記述される。ポリマー濃度が上昇するすなわち接続線の長さが増すと、二相系での分配がさらに徹底する（Ｇ．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２８（１９９４）ｐｐ．２８−４２）。当業者は、２相間の適当な分配の条件に達するための実験を容易に実行することができる。
【００３３】
本方法の一実施形態では、プラスミドＤＮＡを含む水溶液は細胞ライセートであって、この方法は、ステップ（ｂ）の前に細胞ライセートを脱塩するステップを含む。
【００３４】
ステップ（ｂ）の接触の後に、プラスミドＤＮＡは疎水性相に分配される。上述のように、この分配は、塩のような化合物を加えることにより強化され得る。周知のように、塩を添加すると第一のポリマーの曇り温度も低下するので、この場合にはステップ（ｄ）で行なわれる相分離でさらに低い温度を用いることができる。本方法の最も簡便な実施形態では、ステップ（ｂ）による混合及びステップ（ｃ）による分配は室温で実行される。この１回目の相分離から、第一のポリマーと水内のプラスミドＤＮＡとを含む上相が得られると共に、第二のポリマーと水との中に混入ＲＮＡ及びタンパク質を含む下相が得られる。
【００３５】
ステップ（ｃ）で、プラスミドＤＮＡを含む上相を別の容器に単離する。本方法のこの２回目の相分離では、単離した相を熱分離性ポリマーの曇り点を超える温度まで加熱し、この曇り点は上述のようにサンプル内の塩濃度に依存する。しかしながら、好適実施形態では、温度は好ましくは水浴内で、約５０℃のように約４０℃よりも高温に上昇させる。加熱すると相分離が生じ、上相はプラスミドＤＮＡを含み、下相はポリマーを含む。このようにして、上相のポリマー含有量はポリマー１％未満であることが判明したので、プラスミドＤＮＡは本質的にポリマーを含まない水相で得られる。加えて、プラスミドＤＮＡが得られる溶液の塩濃度を、プラスミドＤＮＡを塩析する従来技術で提案されている方法よりも遥かに低くすることができる。
【００３６】
従って、本発明による方法で得られた製品は、遺伝子療法のように高純度を要件とする応用では、従来技術の製品よりも有利である。水性二相系は、分配が本質的に系の規模と無関係であるため、一連のクロマトグラフィのステップのような他の方法に比べてスケールアップが容易であることが公知である。
【００３７】
この第一の観点の最後の実施形態は、ライセートからのプラスミドＤＮＡの精製方法であり、この方法は、ライセートを脱塩する第一のステップと、上述の方法を含む回収のための第二のステップと、プラスミドＤＮＡの最終精製のための最後のクロマトグラフィのステップとを含んでいる。脱塩は任意の適当な方法で実行することができる。一実施形態では、脱塩は、ゲル濾過、透析濾過及び限外濾過から成る群から選択される方法によって実行される。
【００３８】
本発明の第二の観点は、水性二相系でのプラスミドＤＮＡ抽出のための組成物であり、この組成物は、約６０℃未満の温度で逆溶解性を呈する第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性の第二のポリマー、及び適宜塩を含む。第一及び第二のポリマーは、本発明による方法に関連して上述したものと同様である。
【００３９】
本組成物の一実施形態では、第一のポリマーの量は４．５％（ｗ／ｗ）及び第二のポリマーの量は４．５％（ｗ／ｗ）である。
【００４０】
好適実施形態では、本組成物は、本発明による方法を用いる分離のためのものである。
【００４１】
本発明の第三の観点は、水性二相系での細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの精製のためのキットであり、このキットは、約６０℃未満の温度で逆溶解性を呈する第一のポリマー、第一のポリマーと非混和性の第二のポリマー、及び適宜塩を一区画に含み、またこれらの取扱説明書を含む。
【００４２】
第一のポリマーは上述の通りである。本キットの有利な実施形態では、第一のポリマーはエチレンオキシド及びプロピレンオキシドで構成される。有利な実施形態では、この共重合体は約５０％のエチレンオキシド及び約５０％のプロピレンオキシドで構成される。かかる共重合体は上で詳述したものと同様である。
【００４３】
本キットの有利な実施形態では、第二のポリマーは、本発明による方法に関連して上でさらに詳細に述べたように、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン、プルラン、並びにこれらの誘導体及び混合物から成る群から選択される。
【００４４】
本キットの特定的な実施形態では、第一のポリマーの量と第二のポリマーの量との重量比は約１：１である。
【００４５】
本キットの好適実施形態では、第一のポリマーの量は４．５％（ｗ／ｗ）であり、第二のポリマーの量は４．５％（ｗ／ｗ）である。
【００４６】
好適実施形態では、本キットは、プラスミドＤＮＡを含む水溶液と混合する前に既に脱塩されている細胞ライセートの精製のためのものである。
【００４７】
有利な実施形態では、本キットは、本発明による方法に用いられる。
【００４８】
本発明の第四の観点は、細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの精製のための約６０℃未満の温度で逆溶解性を呈するポリマーの水性二相系での用法である。
【００４９】
第一のポリマーは上述の通りである。有利な実施形態では、このポリマーはエチレンオキシド及びプロピレンオキシドの共重合体である。好適実施形態では、この共重合体は約５０％のエチレンオキシド及び約５０％のプロピレンオキシドで構成される。
【００５０】
二相系を得るために、このポリマーは、このポリマーと非混和性の第二のポリマーと共に用いられる。好適実施形態では、第二のポリマーは、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン、プルラン、並びにこれらの誘導体及び混合物から成る群から選択される。最も好適な実施形態では、第二のポリマーはデキストランである。しかしながら、第二のポリマーは、本発明による方法に関連して上述したものと同様であってもよい。
【００５１】
最後に、本発明はまた、細胞ライセートからのプラスミドＤＮＡの精製のためのヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルデンプン、デンプン、デキストラン、プルラン、並びにこれらの誘導体及び混合物から成る群から選択されるポリマーの水性二相系での用法を包含しており、精製は温度誘導による相分離によって達せられる。
〔図面の詳細な説明〕
図１は、本発明による系でのプラスミドＤＮＡ精製の模式図であって、熱分離性ポリマーはＥＯ５０ＰＯ５０であり、第二のポリマーはデキストランＴ５００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）である。第一の系では、様々な形態のプラスミドＤＮＡが上相に分配される。次いで、上相を新たな容器に単離して、曇り点（ＣＰ）よりも高い温度まで加熱する。新たな二相系が得られ、プラスミドＤＮＡはポリマーを含まない水相に回収される。
【００５２】
図２は、本発明による熱分離性ＥＯ５０ＰＯ５０／デキストランＴ５００及び５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４の上相及び下相のアガロースゲル分析を示している。各々のレーンに容積１２μＬの量のサンプルを加えた。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色した。さらに明確に述べると、レーン１はブランク、レーン２は分子量マーカー、レーン３は脱塩後のアルカリ性ライセート、レーン４は熱分離後の系の下相、レーン５は熱分離後の系の下相、レーン６は下相一次系、レーン７は下相一次系、レーン８は熱分離後の上相、レーン９は熱分離後の上相、レーン１０は上相一次系、レーン１１は上相一次系、及びレーン１２は分子量マーカーである。ここで、「一次系」との用語は、本方法のステップ（ｃ）に従って行なわれる１回目の相分離を指し、「熱分離後の系」との用語は、本方法のステップ（ｄ）に従って行なわれる相分離を指す。
【００５３】
図３は、本発明による熱分離性ＥＯ５０ＰＯ５０／デキストランＴ５００及び５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４から得られた上相及び下相のアガロースゲル分析を示している。アガロースゲルはＳＹＢＲグリーンで染色されている。各々のレーンに容積１２μＬを加えた。さらに明確に述べると、レーン１は熱分離後の上相の５倍希釈、レーン２は熱分離後の上相の５倍希釈、レーン３は熱分離後の上相の２倍希釈、レーン４は熱分離後の上相の２倍希釈、レーン５は熱分離後の上相の１倍希釈、レーン６は熱分離後の上相の１倍希釈、レーン７は上相一次系の５倍希釈、レーン８は上相一次系の５倍希釈、レーン９は上相一次系の２倍希釈、レーン１０は上相一次系の２倍希釈、レーン１１は上相一次系の１倍希釈、レーン１２は上相一次系の１倍希釈、レーン１３は熱分離から得られた下相の５倍希釈、レーン１４は熱分離から得られた下相の２倍希釈、レーン１５は熱分離から得られた下相の１倍希釈、レーン１６は下相一次系の５倍希釈、レーン１７は下相一次系５倍希釈、レーン１８は下相一次系の２倍希釈、レーン１９は下相一次系の２倍希釈、レーン２０は下相一次系の１倍希釈、レーン２１は下相一次系の１倍希釈、レーン２２は脱塩後のアルカリ性ライセートの５倍希釈、レーン２３は脱塩後のアルカリ性ライセートの２倍希釈、及びレーン２４は脱塩後のアルカリ性ライセートの１倍希釈である。
【００５４】
図４は、本発明による熱分離性ＥＯ５０ＰＯ５０／デキストランＴ５００及び５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４のアガロースゲル分析を示している。これらの系は異なるポリマー濃度で構成されており、
４／６＝４％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／６％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００、
３／７＝３％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／７％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００、
３／８＝３％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／８％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００、
２．５／９＝２．５％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／９％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００
である。
【００５５】
全ての系は５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含んでいる。各々のレーンに容積１２μＬの量のサンプルを加える。アガロースゲルを臭化エチジウムで染色する。
【００５６】
さらに明確に述べると、図４で、レーン１はブランク、レーン２は分子量マーカー、レーン３は脱塩後のアルカリ性ライセート、レーン４は３／７系での熱分離から得られた下相、レーン５は３／７系での一次ステップから得られた下相、レーン６は３／７系での熱分離後の上相、レーン７は３／７系での一次系から得られた上相、レーン８は４／６系での熱分離から得られた下相、レーン９は４／６系での一次系から得られた下相、レーン１０は４／６系での熱分離後の上相、レーン１１は４／６系での一次系から得られた上相、レーン１２は分子量マーカー、レーン１３はブランク、レーン１４はブランク、レーン１５は分子量マーカー、レーン１６は２．５／９系での熱分離から得られた下相、レーン１７は２．５／９系での一次系から得られた下相、レーン１７は２．５／９系での一次系から得られた下相、レーン１８は２．５／９系での熱分離後の上相、レーン１９は２．５／９系での一次系から得られた上相、レーン２０は３／８系での熱分離から得られた下相、レーン２１は３／８系での一次系から得られた下相、レーン２２は３／８系での熱分離後の上相、レーン２３は３／８系での一次系から得られた上相、及びレーン２４は分子量マーカーである。
【００５７】
図５は、後述の実施例２に記載されている水性二相系での透析濾過ライセートの抽出から得られた上相及び下相のアガロースゲル電気泳動（０．８％ｗ／ｖ）を示している。さらに明確に述べると、図５で、レーン１は熱分離後の下相、レーン２は熱分離後の上相、レーン４は下相（一次系）、レーン５は上相（一次系）、レーン７は透析濾過後のライセート（出発材料）、及びレーン９はＭｗマーカーである。
【００５８】
図６は、後述の実施例３に記載されている水性二相系での限外濾過ライセートの抽出から得られた上相及び下相のアガロースゲル電気泳動（０．８％ｗ／ｖ）を示している。さらに明確に述べると、図６で、レーン１は限外濾過後のライセート（出発材料）、レーン２は一次系の上相、レーン３は熱分離後の上相、レーン４は熱分離後の下相、レーン５はＭｗマーカーである。
【００５９】
以下の例は説明の目的でのみ掲げられているのであって、特許請求の範囲によって定義されている本発明の範囲を限定していると解釈されるべきではない。以下の記載及び本出願の他の部分に掲げた全ての参考文献を参照によって本明細書に援用する。
〔材料及び方法〕
（薬品）
ポリマーＢｒｅｏｘ  ＰＡＧ５０Ａ１０００（ＥＯ５０ＰＯ５０）（Ｍｒ３９００）は、Ｌａｐｏｒｔｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（英国サウサンプトン）から取得され、分子量５００，０００のデキストランＴ５００はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）から入手可能である。Ｎａ２ＨＰＯ４はＭｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂから取得された。ＪＶ４インサート（３．４３３ｋｂ）を有する高コピー数プラスミドｐＵＣ１９（２．６８６ｋｂ）はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから寄贈された。このプラスミドを本書では以下ｐＪＶ４と呼ぶ（Ｖａｓｉ、１９９９年）。
（培養）
プラスミドｐＪＶ４は、Ｌａｕｒｉａブロス（食塩１０ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ及び酵母エキス５ｇ／Ｌ）５００ｍＬを用いて２．０Ｌのバッフル付き振盪フラスコ内でＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１α株で一晩培養した。培養液でのアンピシリン濃度は１００μｇ／ｍＬであり、３７℃において２５０ｒｐｍで一晩成長させた。
（アルカリ溶菌）
修正アルカリ溶菌法を用いた。一晩培養した細胞培養液５００ｍＬを４℃で１０分間にわたってＳｏｒｖａｌｌ  ＳＬＡ３０００ロータでの９０００ｒｐｍの遠心分離によって採取した。上清を慎重に取り除いて、細菌沈殿物５ｇを、グルコース６１ｍｍ、Ｔｒｉｓ１０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ｐＨ８）５０ｍＭから成る懸濁緩衝液３６ｍＬ内でボルテックスによって再懸濁した。細胞が完全に再懸濁された後に、磁気攪拌機で穏やかにかき混ぜながら溶菌緩衝液Ｐ２（０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）７８ｍＬを加えた。この混合物を攪拌しながら室温で１０分間インキュベートし、完全な混合物（１相）が得られることを確実にした。氷冷した中和緩衝液（５Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．５）の容積５８．６ｍＬをライセートに加えた。溶液を少なくとも２０分間にわたって磁気攪拌機上で氷浴内に保った。ゲノムＤＮＡ、タンパク質及び細胞残渣を含む白色沈殿物が形成された。次いで、４℃で３０分間にわたってＳＳ−３４−ロータで１０，０００ｒｐｍの遠心分離によって沈殿物を除去した。次いで上清を慎重に取り出して未使用の試験管に入れ、冷蔵室で貯蔵する。
【実施例１】
【００６０】
〔Ｅ．ｃｏｌｉライセートからのプラスミドｐＪＶ４の分離、ゲル濾過による脱塩〕
アルカリ性ライセートは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）マトリクス上でのゲル濾過によって脱塩された。さらに明確に述べると、ＳｅｐｈａｄｅｘビーズをＸＫ５０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）に充填し、総ベッド容積を２２５ｍＬとした。カラムをＡＫＴＡ（商標）エクスプローラ１０システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、スウェーデン、ウプサラ）に組み入れて、移動相（５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）と平衡させた。脱塩したいサンプル（５０ｍＬ〜１００ｍＬ）をサンプルポンプＰ−９５０によって５ｍＬ／ｍｉｎの流量でカラムにポンプ供給した。カラムからの溶出液を紫外吸光度及び伝導度によって監視し、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液内の含核酸溶出液の適当な分別を確実にした。
（水性二相系）
４．５％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００及び４．５％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０を含んだ合計重量１０ｇの系を、１０ｍＬ目盛付き試験管に適量のデキストランの２５％原液及び１００％ＥＯ５０ＰＯ５０原液を計量することにより作製した。用いた緩衝液塩は５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４で、１Ｍ原液から系に加えた。透明な脱塩後のアルカリライセートを加えて最終的な重量を１０ｇとした。系を、全てのポリマーが溶解するまで慎重に混合し、次いで室温での遠心分離（１６００ｇ、１０分）によって各相を分離した。上相及び下相の容積を測定した。各相を分離して新たな容器に単離した。上相を３分間にわたって５５℃の水浴内に配置し、次いで、２分間にわたって遠心分離して、水相１相と濃縮ポリマー相１相とを得た。
（アガロースゲル電気泳動）
この相系から得られた上相及び下相をアガロースゲル上で分析した。アガロースゲルは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢのＨｏｅｆｅｒ（商標）ＨＥ３３ミニサブマリン型電気泳動ユニットで泳動させた。１５μｇ／ｍＬの臭化エチジウム（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を含んだ０．８％（ｗ／ｗ）アガロース（Ｄｕｃｈｅｆａ、オランダ）ゲルを、９０Ｖで３０分間にわたって泳動させた。ゲルを紫外線下で分析して撮影した。
〔実施例１の結果〕
（ポリマー濃度及び塩の影響）
水性二相系でのプラスミドＤＮＡを含んだ脱塩後のアルカリ細胞ライセートの分配は、ポリマー濃度及び塩組成のような様々な要因の影響を受ける可能性がある。目的は、一次水性二相系で、ＥＯ５０ＰＯ５０相へのプラスミドの一方的分配を得ることにあった。二相系でのポリマー濃度を変化させることにより、プラスミドＤＮＡをさらに徹底して上相へ分配することができる。ＥＯ５０ＰＯ５０及びデキストランＴ５００の異なる濃度で構成される二相系での脱塩後のアルカリライセート中のプラスミドＤＮＡの分配について検討した。両相とも、ポリマー濃度を低下させると上相へのさらに徹底した分配が得られた（図２）。アガロースゲル電気泳動による定性分析によれば、ポリマー濃度を、７％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００／７％ＥＯ５０ＰＯ５０（ｗ／ｗ）から４．５％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００／４．５％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０に低下させることにより、プラスミドＤＮＡを上相に分配し得ることが分かる。文献には（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ、１９８６年）、適当な塩の添加によって、ＤＮＡを各相の間で実効的に移動させることが記載されている。二相系で塩の支配的効果を得るためには、塩濃度を緩衝液の少なくとも１０倍にしなければならない。二相系への塩の添加によって、陰イオン及び陽イオンが２相の異なるポリマー相の間で強制的に分配され、これにより相の間に電位が発生する。ＨＰＯ４２−陰イオンはデキストラン相に親和性を有する。これにより系に電気化学的推進力が発生する。例えばプラスミドＤＮＡのような負に帯電した物質がこの系に添加されると、ＤＮＡは上相に分配される（図２）。
（熱分離性系でのプラスミドＤＮＡの分配）
ライセートを４．５％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００、４．５％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０及び５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４を含んだ系で分配した。この系は「材料及び方法」の項に従って製造された。系を混合して、相分離の後に、各相を分離して別々の容器に単離した。上相は５５℃の水浴に配置した。この系の相は、水相１相と、濃厚なポリマー相１相との新たな二つの相に分離した。熱分離ステップを用いて、ＥＯ５０ＰＯ５０ポリマーから目的のプラスミドを分離して低ポリマー溶液（＜１％）の水相にプラスミドを単離した。相を臭化エチジウムで染色したアガロースゲル電気泳動で分析した（図２）。アガロースゲル電気泳動から、第一のステップで全ての形態のプラスミドＤＮＡが上相に分配され、熱分離ステップでプラスミドＤＮＡが専ら上側の水相に分配されていることが分かる（図２）。また、アガロースゲル電気泳動（図２）から、一次系で混入ＲＮＡが下相へ高い度合いまで分配されることが分かる。アガロースゲルをＳＹＢＲグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色することにより、臭化エチジウムでのＤＮＡの染色に比較して２５倍高いＤＮＡ検出感度を達成することができる（図２）。さらに高感度の染色法を用いることにより、プラスミドＤＮＡを一次系の上相及び熱分離性系の水相に分配し得たことが決定的に示される。一次ステップでも熱分離ステップでもプラスミドＤＮＡは下相には分配されない。
（全タンパク質の分配）
プラスミド単離工程での一次精製ステップでは、主な目的はプラスミドＤＮＡを含む溶液内の優位の混入物を除去することにある。アルカリ溶菌ステップで細菌を溶解させる際に、タンパク質、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、細胞及び細胞残渣が放出される。アルカリ溶菌の中和ステップの後に、ライセートを遠心分離するとこれら混入物の殆どは除去されるが、サンプルにはかなりの混入物が依然存在する。第一のステップでの全タンパク質の分配を分析したところ、Ｋ値は１．４であった。これにより上相の全タンパク質の収率は６５％となる。この系では第一のステップでタンパク質の３５％を廃棄することができる。熱分離ステップではタンパク質の収率は１００％である。このように、この系ではタンパク質を３５％まで廃棄することができる。
（プラスミドＤＮＡの濃度）
一次精製ステップを設計する際の課題の一つは、対象溶液の作業容積を減少させることである。二相系では、上相の容積を減少させることによりこのことを達成することができる。相図の接続線に沿って移動することにより、物質の分配を変えずに二つの相の容積比を変化させることができる。下相のデキストラン濃度を上昇させるとより大きい容積の下相が生成され、従って上相の容積が減少する。以下のように構成された４種の異なる系について検討した。４．５％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／４．５％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００、４％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／６％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００、３％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／７％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００、３％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／８％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００、２．５％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／９％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００。アガロースゲルでの系分析（図４）によれば、上相の容積が減少してもプラスミドＤＮＡの徹底した分配が依然得られることが判明している。２．５％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０／９％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００を含む系では、上相及び下相の容積比（ＶＴ／ＶＢ）は０．２４であった。これにより単離されたプラスミドの上相での濃度は、アルカリライセートに比較して３倍になる。これらの系の全てで、ＲＮＡは下相に部分的に廃棄される。
（群分離クロマトグラフィによるプラスミドＤＮＡの分析）
プラスミドＤＮＡの分析は、群分離クロマトグラフィで行なった。プラスミドＤＮＡの全ての形態とＲＮＡとの間の分離を達成することができる。結果は、熱分離後の上側水相でのプラスミドの全収率は、出発材料に比較して１０３．３％であることを示す。クロマトグラフィの結果によると同じサンプルのＲＮＡの収率は２７％である。これは、水性二相系は混入ＲＮＡの６３％を除去し得ることを意味している。
【実施例２】
【００６１】
〔Ｅ．ｃｏｌｉライセートからのプラスミドｐＪＶ４の分離、透析濾過による脱塩〕
ＴＧ１／ｐＪＶ４細胞の細胞ペースト合計量７５ｇを溶解して、さらに実施例１に記載されているようにして処理した。最終的な準備の後の最終ライセート容積は２Ｌであった。
（透析濾過）
透析濾過では、１００，０００Ｄａ遮断のポリスルホン中空ファイバーカートリッジ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州Ｎｅｅｄｈａｍ）を用いた（ロット番号９６９９２０５７０６１、管腔ｉｄ０．５ｍｍ、表面積６５０平方メートル）。用いる前に、カートリッジをＭｉｌｌｉＱ水で洗浄してグリセロール汚染を除去した。系をＭｉｌｌｉＱ水５Ｌで１０分間にわたって再循環させ、次いで、新しい５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で１０分間にわたって再循環させた。容積３５０ｍＬの透明なライセートを５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０に対して透析濾過した。完全な緩衝液交換のために、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の４種のサンプル容積を用いた。透析濾過後の最終保持液容積は３００ｍＬであり、３５０ｍＬから３００ｍＬへの容積減少があった。透析濾過後に、カラムを５ｍＭ緩衝液１００ｍＬで洗浄してカラムから付着したプラスミドＤＮＡを除去した。
【００６２】
４種の緩衝液容積の緩衝液が完全な緩衝液交換に不十分であったため、２回目の透析濾過を行なった。透析濾過したライセートを再度ｐＨ７．０の５ｍＭ  ＮａＰ緩衝液に対して透析濾過した。完全な緩衝液交換を達成するために他の８種の緩衝液容量を用いた。最終的な透析濾過後のサンプルをさらに水性二相系で抽出した。
（水性二相系）
系を実施例１に記載されているようにして製造した。
〔実施例２の結果〕
（透析濾過後のプラスミドＤＮＡの熱分離性系での分配）
透析濾過後のライセートを、４．５％（ｗ／ｗ）ＥＯ５０ＰＯ５０、４．５％（ｗ／ｗ）デキストランＴ５００及び５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４で構成される水性二相系で分配した。全ての薬品及び透析濾過されたライセートをガラス製試験管に加えて最終的な重量を１０ｇとした。次いで、系を室温での遠心分離（１６００ｇ、１０分間）によって分離した。相は上相１相及び下相１相に分離し、これらの各相を新たな容器に単離した。上相を５５℃の水浴に配置した。この系の相は、水相１相と、濃厚なポリマー相１相との新たな２相に分離した。熱分離ステップは、ＥＯ５０ＰＯ５０ポリマーから目的のプラスミドを分離して、低ポリマー溶液（＜１％）の水相にプラスミドを単離するために利用された（図１）。水性二相系抽出で得られた相をアガロースゲル電気泳動及びサイズ排除クロマトグラフィ（群分離）で分析した。群分離からの結果は、プラスミドの上相への一方的分配を示した（表１）。プラスミドＤＮＡの濃度の計算は標準曲線から行なわれる。アガロースゲル電気泳動（図５）から、レーン４において、第一の抽出ステップでは下相にプラスミドは分配されないが多量のＲＮＡが廃棄されていることが分かる。このように、透析濾過によるアルカリライセートの脱塩が達せられ、続いて水性二相系での抽出を行なうことができる。熱分離後の上相に１００％の収率を達成することができる。
【００６３】
【表１】
2005537004.tif 000003
【実施例３】
【００６４】
〔Ｅ．ｃｏｌｉライセートからのプラスミドｐＪＶ４の分離、限外濾過による脱塩〕
ＴＧ１／ｐＪＶ４細胞の細胞ペースト合計量７５ｇを溶解して、さらに実施例１に記載されているようにして処理した。最終的な準備の後の最終ライセート容積は２Ｌであった。
（限外濾過）
透析濾過について上に記載したものと同じ遮断の同じカートリッジを限外濾過でも用いた。容積１０００ｍＬの透明なライセートについて、容積２２５ｍＬに達するまで限外濾過を行なった。次いで、限外濾過後のライセートを５ｍＭ  ＮａＰ緩衝液８００ｍＬに対して透析した。緩衝液がなくなるまで溶液を透析した。次いで、ライセートを７２ｍＬの最終的な容積まで再度限外濾過し、さらに水性二相系で抽出した。
〔実施例３の結果〕
（限外濾過後のプラスミドＤＮＡの熱分離性系での分配）
限外濾過後のライセートを、上述のような水性二相系で分配した。アガロースゲル電気泳動（図６）から、プラスミドについて殆ど一方的な分離が達成されたことが分かる。この系では下相にプラスミドの少量の損失が出た。この原因はおそらく、系でのプラスミド濃度が例えば２ｍｇ／ｍＬと高かったためか、又はもう一つの可能性としては緩衝液交換が不十分だったためであろう。限外濾過及び二相系抽出で得られたサンプルの結果を表２に掲げる。限外濾過後のライセートは、出発材料から１３．９倍に濃縮されている。限外濾過されたライセートにＲＮＡ及びＤＮＡの沈澱は見られなかった。限外濾過によって緩衝液交換及びライセート濃縮の両方を達成することができる。限外濾過後のライセートは、水性二相系と相溶であったが、水性二相系の容量限度又は不完全な緩衝液交換のいずれかによって下相に幾分かのプラスミドＤＮＡ損失が出た。熱分離後の上相でのプラスミドＤＮＡの収率は８５％であった。
【００６５】
【表２】
2005537004.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】本発明による第一及び第二のポリマーを含む熱分離性系におけるプラスミドＤＮＡ精製の模式図である。プラスミドＤＮＡは第一の系では上相に分配され、次いで上相を単離して加熱する。新たな二相系が得られ、ここではプラスミドＤＮＡは水相に回収される。
【図２】本発明による第一及び第二のポリマー、並びに５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液系を含む熱分離性系で得られた上相及び下相のアガロースゲル分析を示す図である。
【図３】本発明による第一及び第二のポリマー、並びに５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液系を含む熱分離性系で得られた上相及び下相のアガロースゲル分析であって、熱分離後の上相の希釈率を変化させた場合を示す図である。
【図４】本発明による第一及び第二のポリマー、並びに５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液系を含む熱分離性系のアガロースゲル分析であって、一次系において第一のポリマー／第二のポリマーの濃度を変化させた場合を示す図である。
【図５】実施例２に記載するような水性二相系での透析濾過後のライセートの抽出から得られた上相及び下相のアガロースゲル電気泳動（０．８％ｗ／ｖ）を示す図である。
【図６】実施例３に記載するような水性二相系での限外濾過後のライセートの抽出から得られた上相及び下相のアガロースゲル電気泳動（０．８％ｗ／ｖ）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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