(57)【要約】本発明は、標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに優先的に結合するプロテインキナーゼインヒビターを同定する、効率的な高スループット法を提供する。この方法は、標的プロテインキナーゼを不活性型コンホメーションの中にロックすることによりインヒビターを同定する工程、および不活性型キナーゼコンホメーションを特異的に標的するインヒビターを同定するための強力な共有結合繋留アプローチを使用する工程を、包含する。
2005534286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに結合するリガンドを同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）目的の結合部位もしくはその近傍に反応基を含むか、または含むように改変された、該標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションを、該反応基に共有結合し、それによってキナーゼ−リガンド結合体を形成可能な１つ以上のリガンド候補と、接触させる工程；ならびに
（ｂ）該キナーゼ−リガンド結合体の形成を検出する工程、および該キナーゼ−リガンド結合体中に存在する該リガンドを同定する工程；
を、包含する、方法。
【請求項２】
前記反応基が、前記リガンド候補とジスルフィド結合を形成可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応基が、前記リガンド候補上に存在するチオール官能基とジスルフィド結合を形成する、チオール基、マスキングされたチオール基、または活性化チオール基である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記チオール官能基が、可変性結合基（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）の一部分として存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記可変性結合基が、−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２の形態であり、ここで、ｎは１〜５である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標的プロテインキナーゼが、複数の前記リガンド候補と接触する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが、１５００ダルトン未満の大きさである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドが、１０００ダルトン未満の大きさである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドが、７５０ダルトン未満の大きさである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンドが、５００ダルトン未満の大きさである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的プロテインキナーゼが、不活性化部位での少なくとも１つのアミノ酸残基の改変により、不活性型コンホメーションの中にロックされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変が、アミノ酸置換である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アラニン残基が、前記不活性化部位において、野生型アミノ酸残基と置換される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記不活性化部位が、前記標的プロテインキナーゼの触媒ループ中の不変アスパラギン酸残基、該標的プロテインキナーゼの該触媒ループ中のアルギニン残基、該標的プロテインキナーゼのＤＦＧモチーフ中の不変アスパラギン酸残基、および該標的プロテインキナーゼのモチーフＩＩ中に不変リジン残基からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記触媒ループ中の前記不変アスパラギン酸残基における置換により不活性型コンホメーションの中にロックされる前記プロテインキナーゼが、以下：
【数１】
2005534286.tif 000287
からなる群から選択され、ここで、Ｘは、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸残基を意味する、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記触媒ループ中の前記アルギニン残基における置換により不活性型コンホメーションの中にロックされる前記プロテインキナーゼが、以下：
【数２】
2005534286.tif 000288
からなる群から選択され、ここで、Ｘは、アルギニン以外の任意のアミノ酸残基を意味する、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の方法であって、前記ＤＦＧモチーフ中の前記不変アスパラギン酸残基における置換により不活性型コンホメーションの中にロックされる前記プロテインキナーゼが、以下：
【数３】
2005534286.tif 000289
からなる群から選択され、ここで、Ｘは、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸残基を意味する、方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の方法であって、前記モチーフＩＩ中の前記不変リジンにおける置換により不活性型コンホメーションの中にロックされる前記プロテインキナーゼが、以下：
【数４】
2005534286.tif 000290
からなる群から選択され、ここで、Ｘは、リジン以外の任意のアミノ酸残基を意味する、方法。
【請求項１９】
前記標的プロテインキナーゼが、さらなる改変のない前記反応基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記反応基が、システイン残基である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記システイン残基が、ＣＤＫ５のＣ５３；ＥＲＫ１のＣ１８３；ＥＲＫ２のＣ１６６；ＥＲＫ３のＣ２８；ＦＧＦＲ１のＣ４８８；ＦＧＦＲ２のＣ４９１；ＦＧＦＲ３のＣ４８２；ＦＧＦＲ４のＣ４７７；ＮＩＫのＣ５３３；ＰＤＧＦＲ−ａのＣ８３５；ＰＤＧＦＲ−ｂのＣ−８４３；ＳＲＣのＣ２７９；ＳＲＣ２のＣ２７３；ＳＴＫ１のＣ８２８；ＴＧＦＲ２のＣ３９；ＶＥＧＦＲ１のＣ１０３９；ＶＥＧＦＲ２のＣ１０４５；ＶＥＧＦＲ３のＣ１０５４；ＹＥＳのＣ２８７；およびＺＡＰ−７０のＣ３４６からなる群から選択される、方法。
【請求項２２】
前記標的プロテインキナーゼが、前記反応基を含むように改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記反応基が、システイン残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、前記システイン残基が、前記標的プロテインキナーゼ中に導入され、以下：
【数５−１】
2005534286.tif 000291
【数５−２】
2005534286.tif 000292
【数５−３】
2005534286.tif 000293
【数５−４】
2005534286.tif 000294
からなる群から選択される改変体を生じる、方法。
【請求項２５】
前記標的プロテインキナーゼおよび前記リガンド候補が、還元剤の存在下で接触させられる、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記還元剤が、２−メルカプトエタノールまたはシステアミンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記キナーゼ−リガンド結合体の形成が、質量分析によって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記キナーゼ−リガンド結合体が、質量分析を直接受ける、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記キナーゼ−リガンド結合体が、質量分析の前に断片化される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記質量分析法の分析が、前記結合体中の前記リガンドもまた同定する、請求項２８または請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記キナーゼ−リガンド結合体が、ＮＭＲを使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ＮＭＲが、前記結合体中の前記リガンドもまた同定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記キナーゼ−リガンド結合体が、Ｘ線結晶構造解析を使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
Ｘ線結晶構造解析が、前記結合体中の前記リガンドもまた同定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記キナーゼ−リガンド結合体が、キャピラリー電気泳動を使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記キナーゼ−リガンド結合体が、高速液体クロマトグラフィーを使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションの、目的の非重複結合部位に結合するリガンドを、少なくとも２つ同定する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記リガンドを含む分子を合成する工程をさらに包含する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに結合するリガンドを同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）−ＳＨ基、マスキングされた−ＳＨ基、または活性化−ＳＨ基を含む該標的プロテインキナーゼの、不活性型コンホメーションを得る工程；
（ｂ）該標的プロテインキナーゼの該不活性型コンホメーションと、１つ以上のリガンド候補とを結合する工程であって、該リガンド候補は、それぞれジスルフィド結合を含む、工程；
（ｃ）キナーゼ−リガンド結合体を形成する工程であって、ここで、少なくとも１つのリガンド候補が、ジスルフィド交換条件下で、該標的プロテインキナーゼの該不活性型コンホメーションに結合する工程；
（ｄ）該キナーゼ−リガンド結合体の形成を検出し、そして該結合体中に存在するリガンドを同定する工程、
を、包含する、方法。
【請求項４０】
前記標的プロテインキナーゼが、該標的プロテインキナーゼの触媒ループ中の不変アスパラギン酸残基、該標的プロテインキナーゼの該触媒ループ中のアルギニン残基、該標的プロテインキナーゼのＤＦＧモチーフ中の不変アスパラギン酸残基、および該標的プロテインキナーゼのモチーフＩＩ中に不変リジン残基からなる群から選択される、１つ以上の部位におけるアミノ酸置換によって不活性型コンホメーションにロックされる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の方法であって、前記触媒ループ中の前記不変アスパラギン酸残基における置換により不活性型コンホメーションの中にロックされる前記プロテインキナーゼが、以下：
【数６】
2005534286.tif 000295
からなる群から選択され、ここで、Ｘは、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸残基を意味する、方法。
【請求項４２】
請求項４０に記載の方法であって、前記触媒ループ中の前記アルギニン残基における置換により不活性型コンホメーションの中にロックされる前記プロテインキナーゼが、以下：
【数７】
2005534286.tif 000296
からなる群から選択され、ここで、Ｘは、アルギニン以外の任意のアミノ酸残基を意味する、方法。
【請求項４３】
請求項４０に記載の方法であって、前記ＤＦＧモチーフ中の前記不変アスパラギン酸残基における置換により不活性型コンホメーションの中にロックされる前記プロテインキナーゼが、以下：
【数８】
2005534286.tif 000297
からなる群から選択され、ここで、Ｘは、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸残基を意味する、方法。
【請求項４４】
請求項４０に記載の方法であって、前記モチーフＩＩ中の前記不変リジンにおける置換により不活性型コンホメーションの中にロックされる前記プロテインキナーゼが、以下：
【数９】
2005534286.tif 000298
からなる群から選択され、ここで、Ｘは、リジン以外の任意のアミノ酸残基を意味する、方法。
【請求項４５】
前記−ＳＨ基、マスキングされた−ＳＨ基、または活性化−ＳＨ基が、システイン残基によって提供される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、前記システイン残基が、ＣＤＫ５のＣ５３；ＥＲＫ１のＣ１８３；ＥＲＫ２のＣ１６６；ＥＲＫ３のＣ２８；ＦＧＦＲ１のＣ４８８；ＦＧＦＲ２のＣ４９１；ＦＧＦＲ３のＣ４８２；ＦＧＦＲ４のＣ４７７；ＮＩＫのＣ５３３；ＰＤＧＦＲ−ａのＣ８３５；ＰＤＧＦＲ−ｂのＣ−８４３；ＳＲＣのＣ２７９；ＳＲＣ２のＣ２７３；ＳＴＫ１のＣ８２８；ＴＧＦＲ２のＣ３９；ＶＥＧＦＲ１のＣ１０３９；ＶＥＧＦＲ２のＣ１０４５；ＶＥＧＦＲ３のＣ１０５４；ＹＥＳのＣ２８７；およびＺＡＰ−７０のＣ３４６からなる群から選択される、方法。
【請求項４７】
前記標的プロテインキナーゼが、前記反応基を含むように改変される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記システイン残基が、前記標的プロテインキナーゼ中に導入され、以下：
【数１０−１】
2005534286.tif 000299
【数１０−２】
2005534286.tif 000300
【数１０−３】
2005534286.tif 000301
【数１０−４】
2005534286.tif 000302
からなる群から選択される改変体を生じる、方法。
【請求項４９】
前記標的プロテインキナーゼおよび前記リガンド候補が、還元剤の存在下で接触させられる、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記還元剤が、２−メルカプトエタノールまたはシステアミンである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記リガンドが、１５００ダルトン未満の大きさの非ペプチド有機低分子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
前記リガンドが、１０００ダルトン未満の大きさの非ペプチド有機低分子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記リガンドが、７５０ダルトン未満の大きさの非ペプチド有機低分子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記リガンドが、５００ダルトン未満の大きさの非ペプチド有機低分子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記キナーゼ−リガンド結合体の形成が、質量分析によって検出される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
前記キナーゼ−リガンド結合体が、質量分析を直接受ける、請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記キナーゼ−リガンド結合体が、質量分析の前に断片化される、請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記質量分析が、前記結合体中の前記リガンドもまた同定する、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに結合するリガンドを同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）目的の第１結合部位および目的の第２結合部位を有し、そして目的の第１部位もしくはその近傍に求核剤を含むか、または含むように改変された、該プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションを、複数のリガンド候補と接触させて、キナーゼ−第１リガンド複合体を形成する工程であって、ここで、該候補は、該求核剤と該目的の第１部位に対して親和性を有する候補との間に可逆性共有結合が形成される条件下で、該求核剤と反応性の官能基を有する、工程；
（ｂ）（ａ）の該複合体から該第１リガンドを同定する工程；
（ｃ）（ａ）において同定された該第１リガンドの誘導体を設計し、低分子拡張剤（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（ＳＭＥ）を提供する工程であって、該低分子拡張剤（ＳＭＥ）が、該キナーゼ上の求核剤と反応性の第１官能基、および該目的の第２結合部位に対する親和性を有する第２リガンドと反応性の第２官能基を有する、工程；
（ｄ）該ＳＭＥを該キナーゼと接触させ、キナーゼ−ＳＭＥ複合体を形成する工程；ならびに
（ｅ）キナーゼ−ＳＭＥ複合体を、複数の第２リガンド候補と接触させる工程であって、該候補は、該キナーゼ−ＳＭＥ複合体中の該ＳＭＥと反応性の官能基を有し、ここで、該キナーゼ上の該目的の第２結合部位に対する親和性を有する候補が、該キナーゼ−ＳＭＥ複合体と可逆性共有結合を形成し、これによって第２リガンドが同定される、工程、
を、包含する方法。
【請求項６０】
前記求核剤が、−ＳＨ基、−ＯＨ基、−ＮＨ２基および−ＣＯＯＨ基からなる群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記求核剤が、システイン、セリン、トレオニン、リジン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸残基の側鎖によって提供される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記求核剤が、システイン残基の側鎖によって提供される−ＳＨ基である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記キナーゼが、さらなる改変をされない前記システイン残基を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法であって、前記システイン残基が、ＣＤＫ５のＣ５３；ＥＲＫ１のＣ１８３；ＥＲＫ２のＣ１６６；ＥＲＫ３のＣ２８；ＦＧＦＲ１のＣ４８８；ＦＧＦＲ２のＣ４９１；ＦＧＦＲ３のＣ４８２；ＦＧＦＲ４のＣ４７７；ＮＩＫのＣ５３３；ＰＤＧＦＲ−ａのＣ８３５；ＰＤＧＦＲ−ｂのＣ−８４３；ＳＲＣのＣ２７９；ＳＲＣ２のＣ２７３；ＳＴＫ１のＣ８２８；ＴＧＦＲ２のＣ３９；ＶＥＧＦＲ１のＣ１０３９；ＶＥＧＦＲ２のＣ１０４５；ＶＥＧＦＲ３のＣ１０５４；ＹＥＳのＣ２８７；およびＺＡＰ−７０のＣ３４６からなる群から選択される、方法。
【請求項６５】
前記キナーゼが、前記システイン残基を含むように改変される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
請求項６５に記載の方法であって、前記システイン残基が、前記標的プロテインキナーゼ中に導入され、以下：
【数１１】
2005534286.tif 000303
からなる群から選択される改変体を生じる、方法。
【請求項６７】
前記ＳＭＥが、ＳＮ２様の攻撃を受け得る基、または前記システイン残基の−ＳＨ基とＭｉｃｈａｅｌ型付加体を形成し得る基を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記基が、α−ハロ酸、フルオロホスフェート（フルオロホスホネート）（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｐｈ（ｏｎ）ａｔｅ）、エポキシド、アジリジン、チイラン、ハロ−メチルケトン、ならびにハロ−メチルアミドからなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第２官能基が、−ＳＨ基である、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記リガンド候補が、低分子ライブラリーのメンバーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ライブラリーのそれぞれのメンバーが、互いに前記ライブラリーの他のメンバーと、分子量において異なっている、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ライブラリーが、１〜１００個のメンバーを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
請求項５９に記載の方法であって、前記低分子拡張剤が、以下：
【化１】
2005534286.tif 000304
からなる群から選択され、ここで、ＳＭＥ上の少なくとも１つのＲ基がＭｉｃｈａｅｌ受容体であり、別のＲ基が、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；チオール保護基から選択され、ここで、Ｒ’が水素、ジスルフィド、またはチオール保護基であり、そしてｎが１〜５である場合に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミンおよびアリールからなる群から選択される、方法。
【請求項７４】
請求項７３に記載の方法であって、ここで、Ｒ１が、以下：
【化２】
2005534286.tif 000305
からなる群から選択されるＭｉｃｈａｅｌ受容体であり、そして、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうちの１つが、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；およびチオール保護基から選択され、ここで、Ｒ’が水素、ジスルフィド、またはチオール保護基であり、そしてｎが１〜５である場合に、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミン、アリール；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；およびチオール保護基からなる群から選択される、方法。
【請求項７５】
請求項７３に記載の方法であって、ここで、Ｒ３が、以下：
【化３】
2005534286.tif 000306
からなる群から選択されるＭｉｃｈａｅｌ受容体であり、そして、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうちの１つが、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；およびチオール保護基から選択され、ここで、Ｒ’が水素、ジスルフィド、またはチオール保護基であり、そしてｎが１〜５である場合に、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミン、アリール；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；およびチオール保護基からなる群から選択される、方法。
【請求項７６】
標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに結合するリガンドを同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１反応性官能基を含むキナーゼの不活性型コンホメーションと、（１）第２反応性官能基および（２）化学的反応基を含む化合物との共有結合によって形成されるキナーゼ−リガンド結合体によって、リガンド候補のライブラリーをスクリーニングする工程、ここで、該化合物の該第２反応性官能基が、該標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーション第１反応性官能基と反応し、第１共有結合を形成し、その結果、該ライブラリーの少なくとも１つのメンバーが、キナーゼ−リガンド結合体と第２共有結合を形成する条件下で、キナーゼ−リガンド結合体が遊離の化学的反応基を含む、工程；および
（ｂ）該キナーゼ−リガンド結合体の該化学的反応基に共有結合するさらなるリガンドを同定する、工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
真核細胞の成長と分化は、シグナル伝達経路の複雑な網によって調節されている。これらの経路の正確な調節は、細胞外刺激（ホルモン、神経伝達物質、およびストレス）に対して、増殖し特定の組織に分化するように、細胞を応答させる。全ての真核細胞に共通の調節メカニズムであるタンパク質リン酸化は、このシグナル伝達網において、中心的役割を果たしている。５０年近く前に、調節メカニズムとして最初に発見されたタンパク質リン酸化は、哺乳動物細胞におけるシグナル伝達の調節についての、おそらく最も重要なメカニズムである。従って、プロテインキナーゼ（ＡＴＰのγ−ホスファターゼ基の、ペプチドおよびポリペプチド中のセリン残基、トレオニン残基またはチロシン残基のヒドロキシル基の酸素原子への転移を触媒する酵素）が、最も大きいタンパク質スーパーファミリーの１つを構成することは、驚くことではない。実際、ヒトゲノムの完全な配列決定によって、正確に５０８個の、ヒトプロテインキナーゼをコードする遺伝子が存在する（５８個のレセプターチロシンキナーゼおよび３２個の非レセプターチロシンキナーゼを含む）ことが、主張されている。
【背景技術】
【０００２】
（キナーゼおよび癌）
癌は、異常な細胞増殖により特徴付けられる、種々の疾患からなる。癌は、細胞の遺伝物質中に変異を引き起こす、内的要因および外的要因の両方によって引き起こされる。遺伝的変異を引き起こす癌は、２つのカテゴリーに分類される。これらの２つのカテゴリーは、正の様式で作用し、細胞増殖の速度を増加するカテゴリー、および細胞増殖および細胞分化に対する天然の障壁を取り除くことにより負の様式で作用するカテゴリーである。細胞増殖および細胞分化の速度を増加する変異遺伝子は、オンコジーンと呼ばれ、増殖に対する天然の障壁を取り除く変異遺伝子は、腫瘍抑制遺伝子と呼ばれる。
【０００３】
同定された最初のオンコジーンは、Ｓｒｃチロシンキナーゼをコードしていた。Ｓｒｃは、多くの異なった細胞型において、シグナル伝達の主要な調節因子である。Ｓｒｃは、ほぼ全てのヒト細胞内部に不活性状態で存在し、種々の源からの細胞外シグナルに応答する体勢になっている。刺激により一旦引き金が引かれると、Ｓｒｃは、多くのエフェクタータンパク質上で、チロシン残基をリン酸化する、活性状態に変化する。Ｓｒｃのチロシンキナーゼ活性は、正常細胞内では厳重に調節されるが、この酵素を構成的活性状態に変化させる変異が起こり得る。２５年以上前に同定されたこのような変異の１つが、Ｓｒｃを最初のオンコジーンとして知らしめる嫌な栄誉をこれに与えた。現在、約３０の腫瘍抑制遺伝子および１００以上のオンコジーンが公知であり、その２０％が、チロシンキナーゼをコードする。細胞増殖および細胞分化のこのような中心調節因子の調節不能は、細胞にとって悲惨な結果を有する。
【０００４】
（キナーゼインヒビター）
プロテインキナーゼは、シグナル伝達のみでなく、細胞増殖、細胞分化、および種々の調節メカニズムにおいて、重大な役割を果たす。腫瘍形成において、多くのプロテインキナーゼが果たす臨時の役割は、プロテインキナーゼを、新規の抗癌化学療法の開発のためのエキサイティングな標的にしている。ＡＴＰ結合ポケットの保存的かつ非常によく特徴付けられている性質は、ＡＴＰ結合ポケットを、キナーゼ阻害にとって最も一般的かつ最も成功した標的にした。従って、ＡＴＰを打ち負かしそれによってキナーゼ活性を阻害し得る稀なファルマコフォアを発見することを期待して、ＡＴＰ（およびプリン）模倣物を含むライブラリーが産生され、そして大パネルのキナーゼに対してスクリーニングされている。
【０００５】
しかし、このアプローチは、少なくとも２つの主要な弱点を有する。第１に、これらのインヒビターは、その結合部位について、ＡＴＰと直接競合しなくてはならない。幾千の細胞性酵素に使用されるＡＴＰは、細胞内に非常に高密度に存在する。従って、厳密にＡＴＰ競合的様式で作用するキナーゼインヒビターは、非常に高い親和性で、標的キナーゼと結合しなければならない。第２に、ＡＴＰ結合ポケットをとりまく高い構造的保存が、１つのキナーゼについて、別のキナーゼをしのぐ特異性を示すインヒビターを設計することを、困難にする。これらの２つの批評を考慮すれば、２０年の研究の後、１２個の低分子チロシンキナーゼインヒビターしか臨床試験に存在しないとしても、恐らく驚くことではない。これらのインヒビターの全てが、ＡＴＰ結合ポケットについてＡＴＰと直接競合し、その全てがこのポケットと非常に堅く結合し、そしてその全てが、その標的キナーゼについて、様々な程度の特異性を示す。
【０００６】
低分子キナーゼインヒビターの可能性のある例外は、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）（フェニルアミノ−ピリミジン誘導体）であり、これは、Ａｂｌチロシンキナーゼのプリンポケットに結合する。この化合物は、その作用様式が幾分普通でないことを示唆する、独特の特徴を示す。この化合物は、生化学アッセイにおいてアッセイした場合、ほとんどのキナーゼインヒビター臨床候補のおよそ１０００分の１未満の効力であったが、細胞内で試験した場合、ほとんどのインヒビターと同程度に効力を失うことはなかった。このことは、この化合物が、Ａｂｌへの結合について、細胞性ＡＴＰと直接に競合していないことを示唆する。共結晶化（Ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ）研究は、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭは、実際にＡｂｌキナーゼのプリンポケットを占めるが、このキナーゼが不活性型コンホメーションである（アミノ末端突出（ｌｏｂｅ）およびカルボキシル末端突出が捩れていて、リジンと２つのアスパラギン酸との３連構造が適切に並ばず、ＡＴＰを受容できないか、またはリン酸基転移反応を触媒できない）場合にしか、プリンポケットを占めないことを示している。従って、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭは、ＡＴＰに対して直接競合することなく、ずっと低い親和性で不活性型コンホメーションに結合することが証明された、プリンポケットの低分子薬物能力を活用する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
標的プロテインキナーゼのＡＴＰ結合ポケットの、活性型コンホメーションへの結合について、ＡＴＰと直接競合しないプロテインキナーゼインヒビターの開発が、所望される。このようなインヒビターを同定するため、迅速で、信頼のおける、高スループットスクリーニングアッセイの設計が、さらに所望される。プロテインキナーゼのＡＴＰ結合ポケットを不活性型コンホメーションにロックすることにより、このようなスクリーニングアッセイの設計および独特の特徴（例えば、より高い特異性）を有するプロテインキナーゼインヒビターの同定を容易にすることもまた、所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに対するリガンド結合を同定する方法に関する。この方法は、以下：
（ａ）目的の結合部位もしくはその近傍に反応基を含むか、または含むように改変された、上記標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションと、上記反応基に共有結合可能な１つ以上のリガンド候補とを接触させ、それによってキナーゼ−リガンド結合体を形成する工程；ならびに
（ｂ）上記キナーゼ−リガンド結合体の形成を検出する工程、および上記キナーゼ−リガンド結合体中に存在する上記リガンドを同定する工程；
を、包含する。
【０００９】
このキナーゼとリガンド候補とは、好ましくはジスルフィド結合を形成し、キナーゼ−リガンド結合体を生じる。この実施形態において、キナーゼとリガンド候補とは、還元剤（２−メルカプトエタノールまたはシステアミン）の存在下で、接触され得る。
【００１０】
このリガンド候補は、低分子であり得、そして１５００ダルトン未満、好ましくは１０００ダルトン未満、より好ましくは７５０ダルトン未満、さらにより好ましくは５００ダルトン未満、最も好ましくは２５０ダルトン未満の大きさであり得る。
【００１１】
別の局面において、本発明は、標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに結合するリガンドを同定する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）−ＳＨ基、マスキングされた−ＳＨ基、または活性化−ＳＨ基を含む上記標的プロテインキナーゼの、不活性型コンホメーションを得る工程；
（ｂ）上記標的プロテインキナーゼの上記不活性型コンホメーションと、１つ以上のリガンド候補とを結合する工程であって、上記リガンド候補は、それぞれジスルフィド結合を含む、工程；
（ｃ）キナーゼ−リガンド結合体を形成する工程であって、ここで、少なくとも１つのリガンド候補が、ジスルフィド交換条件下で、上記標的プロテインキナーゼの上記不活性型コンホメーションに結合する工程；および
（ｄ）上記キナーゼ−リガンド結合体の形成を検出し、そして上記結合体中に存在するリガンドを同定する工程、
を、包含する。
【００１２】
なお別の局面において、本発明は、標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに結合するリガンドを同定する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）目的の第１結合部位および目的の第２結合部位を有し、そして上記目的の第１部位もしくはその近傍に求核剤を含むか、または含むように改変された、上記プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションを、複数のリガンド候補と、上記求核剤と上記目的の第１部位に対して親和性を有する候補との間に可逆性共有結合が形成される条件下で接触させ、キナーゼ−第１リガンド複合体を形成する工程であって、ここで、上記候補は、上記求核剤に対して反応性の官能基を有する工程；
（ｂ）（ａ）の上記複合体から上記第１リガンドを同定する工程；
（ｃ）低分子拡張剤（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（ＳＭＥ）を提供するように、（ａ）において同定された上記第１リガンドの誘導体を設計する工程であって、上記低分子拡張剤（ＳＭＥ）が、上記キナーゼ上の求核剤に対して反応性の第１官能基、および上記目的の第２結合部位に対する親和性を有する第２リガンドに対して反応性の第２官能基を有する、工程；
（ｄ）上記ＳＭＥを上記キナーゼと接触させ、キナーゼ−ＳＭＥ複合体を形成する工程；および
（ｅ）キナーゼ−ＳＭＥ複合体を、複数の第２リガンド候補と接触させる工程であって、上記候補は、上記キナーゼ−ＳＭＥ複合体中の上記ＳＭＥに対して反応性の官能基を有し、ここで、上記キナーゼ上の上記目的の第２結合部位に対する親和性を有する候補が、上記キナーゼ−ＳＭＥ複合体と可逆性共有結合を形成し、これによって第２リガンドが同定される、工程、
を、包含する。
【００１３】
なおさらに別の局面において、本発明は、標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに結合するリガンドを同定する方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）第１反応性官能基を含むキナーゼの不活性型コンホメーションと、（１）第２反応性官能基および（２）化学的反応基を含む化合物との共有結合によって形成されるキナーゼ−リガンド結合体によって、リガンド候補のライブラリーをスクリーニングする工程であって、ここで、上記化合物の上記第２反応性官能基が、上記標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションの第１反応性官能基に反応し、第１共有結合を形成し、ここで、上記ライブラリーの少なくとも１つのメンバーが、キナーゼ−リガンド結合体と第２共有結合を形成する条件下で、キナーゼ−リガンド結合体が遊離の化学的反応基を含む、工程；および
（ｂ）上記キナーゼ−リガンド結合体の上記化学的反応基に共有結合するさらなるリガンドを同定する工程、
を、包含する。
【００１４】
表１は、各プロテインキナーゼの、型（Ｓｅｒ／ＴｈｒまたはＴｈｒ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＮＣＢＩ登録番号、長さ、および参考文献、ならびにアミノ酸配列の配列番号を含む。
【００１５】
キナーゼ配列のアラインメントは、ＡＰＰＥＮＤＩＸ−Ａとして挙げられる。
【００１６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
別に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって、通常理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４），およびＣｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．（２００２）は、本出願で使用される多くの用語に対する一般的手引きを当業者に提供する。
【００１７】
用語「プロテインキナーゼ」は、ＡＴＰ（ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体）のγ−ホスホリル基の、ペプチドおよびポリペプチド（基質）におけるセリン、トレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシル基の酸素原子への転移を触媒する酵素を言うために、使用される。
【００１８】
用語「チロシンキナーゼ」は、ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体から、別のタンパク質（基質）におけるチロシン残基のヒドロキシル基の酸素原子への、γ−ホスホリル基の転移を触媒する酵素を言うために、使用される。
【００１９】
用語「セリン−トレオニンキナーゼ」は、ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体から、別のタンパク質（基質）におけるセリン残基／トレオニン残基のヒドロキシル基の酸素原子への、γ−ホスホリル基の転移を触媒する酵素を言うために、使用される。
【００２０】
用語「二重特異性キナーゼ（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｋｉｎａｓｅ）」は、標的タンパク質基質の、チロシン残基とセリン残基／トレオニン残基との両方をリン酸化する能力を有するキナーゼを言うために、使用される。
【００２１】
用語「ホスホリルドナー」は、二価のＭｇ２＋イオンがヌクレオチドを正しい位置に置くのを助け、ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体のβホスホリル基およびγホスホリル基における負の電荷を遮蔽し、攻撃する求核剤の静電気的反発を低減するような、ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体を言う。
【００２２】
用語「ホスホアクセプター（ｐｈｏｓｐｈｏａｃｃｅｐｔｏｒ）」は、ＡＴＰ−Ｍｇ２＋を攻撃する求核剤として寄与する遊離の電子対を有する原子（例えば、タンパク質におけるＳｅｒ残基、Ｔｈｒ残基またはＴｙｒ残基の側鎖の、脱プロトン化ヒドロキシル基の酸素原子）を言うために使用される。例えば、チロシンキナーゼの基質において、ホスホアクセプターは、チロシン（Ｔｙｒ）残基の側鎖の脱プロトン化ヒドロキシル基の酸素原子である。
【００２３】
用語「アロステリック」は、この酵素上の別の位置における別の部位（調節部位）での分子の結合により、酵素の一部（例えば活性部位）の活性に影響する効果を言う。
【００２４】
「アロステリック結合部位」は、多くの酵素およびレセプターに含まれる。アロステリック結合部位への結合の結果として、正常なリガンドとの相互作用は、増強されるかまたは低減されるかのどちらかである。
【００２５】
用語「活性化ループ」は、プロテインキナーゼの極めて変わりやすいセグメントであって、ＤＦＧモチーフおよびＡＰＥモチーフの間に位置し、ほぼ全てのプロテインキナーゼにおいて、リン酸化を活性化する部位を含むセグメントに対して使用される。
【００２６】
用語「触媒ループ」および「触媒ドメイン」は、交換可能に使用され、リン酸基転移において触媒性塩基として働く不変アスパラギン酸（Ａｓｐ）残基、および活性化ループにおいてリン酸化残基と静電気的接触を起こし、キナーゼの触媒的活性状態に導くほぼ不変のアルギニン（Ａｒｇ）残基を含む、保存的プロテインキナーゼモチーフＶＩｂ内の残基を言う。
【００２７】
用語「ＡＰＥモチーフ」は、小型ヘリックスにキャップする不変グルタミン酸（Ｇｌｕ）残基、および同ヘリックスを終端させる不変プロリン（Ｐｒｏ）残基を含む、保存的プロテインキナーゼモチーフＶＩＩＩ内の残基を言うために使用される。
【００２８】
用語「ＤＦＧモチーフ」は、モチーフＩＩの不変リジン（Ｌｙｓ）残基と水素結合を形成することにより活性部位を成形する、不変アスパラギン酸（Ａｓｐ）残基、およびＶＩｂモチーフの不変アスパラギン（Ａｓｎ）残基を含み、それによって触媒ループのコンホメーションの安定化を助ける、保存的プロテインキナーゼモチーフＶＩＩ内の残基を言うために使用される。
【００２９】
用語「不活性型コンホメーション」は、本明細書中で使用される場合、触媒的に不活性なタンパク質の状態を言う。例えば、プロテインキナーゼは、活性化ループがリン酸化されない場合、不活性型コンホメーションである。キナーゼが不活性型コンホメーションを呈し、その意図された基質をリン酸化しない場合、このキナーゼは、不活性型コンホメーションにロックされると言う。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、プロテインキナーゼ上の「不活性化部位」は、リガンドに占められた場合、活性型コンホメーションの形成に悪影響を与えるか、さもなければ、その意図する基質をリン酸化する、キナーゼの能力を損なうような、キナーゼ上の任意の部位である。従って、目的の部位としては、活性化ループのリン酸化、ならびに／あるいはＡＴＰ（ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体）のγ−ホスホリル基の提示もしくはプロテインキナーゼの基質へのＡＴＰ（ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体）のγ−ホスホリル基の転移、および／またはプロテインキナーゼとその基質との間の他の任意の相互作用に関与する、アミノ酸残基が挙げられるが、これらに限定されない。プロテインキナーゼ上の目的の部位の一例として、触媒作用に関与する残基（例えば、触媒ループ内の残基（例えば、触媒性３つ組を含むＡＴＰ結合部位）、基質結合チャネル、任意の補因子（例えば、Ｚｎ）結合部位、水素結合ドナー／アクセプター相互作用に関与する残基、およびそのチロシンキナーゼ上の基質の「ドッキング」に関与する残基）が、挙げられ得る。「不活性化部位」としては、特に、プロテインキナーゼ内のアロステリック部位が挙げられる。
【００３１】
キナーゼインヒビターは、不活性型コンホメーションに対するその結合親和性が、活性型コンホメーションに対するその結合親和性より、少なくとも２倍である場合、標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに「優先的に」結合する。
【００３２】
用語「ドッキング部位」は、基質に関して使用される場合、基質（同種のプロテインキナーゼと高い親和性（代表的には、約１μＭ以下のＫｄ）で結合する）におけるホスホアクセプター部位から離れた配列を言う。逆に、プロテインキナーゼにおける「ドッキング部位」は、基質に対して高い親和性で結合する活性部位から離れた表面である。ドッキングの結果、基質の有効局所密度は増加し、ここで、次にリン酸化の効率および特異性が上がる。
【００３３】
本明細書中で定義される「リガンド」は、標的に対する内因性結合親和性を有する存在である。リガンドは、標的に結合する分子または分子の一部であり得る。リガンドは、代表的に、標的分子に対する内因性結合親和性を有する有機低分子であるが、標的に特異的に結合する他の配列特異的結合分子（例えば、ペプチド（Ｄ−ペプチド、Ｌ−ペプチド、もしくはＤ−ペプチドとＬ−ペプチドとの混合）、ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、複合多糖、または独立した単位もしくはモノマーのオリゴマー）でもよい。この用語はまた、標的に対する結合を増強するために導入される、種々の誘導体および改変も含む。標的分子の生物学的活性を阻害するリガンドは、標的の「インヒビター」と呼ばれる。
【００３４】
用語「インヒビター」は、広い意味で使用され、標的プロテインキナーゼによって示される生物学的活性を、部分的または完全にブロックし、阻害するかまたは中和する任意のリガンドを含む。同様に、用語「アゴニスト」は、広い意味で使用され、標的プロテインキナーゼに示される生物学的活性を模倣する任意のリガンドを含む。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、標的プロテインキナーゼ上の「目的の結合部位」は、特定のリガンドが結合にする部位である。代表的には、分子がリガンド間で相互作用し、そして標的上の目的の結合部位は、非共有結合性であり、そして、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および静電性相互作用を含む。標的プロテインキナーゼにおいて、目的の結合部位は、インビボまたはインビトロで、天然の複合体を形成する分子に対する標的の結合に関与する、アミノ酸残基を広く含む。
【００３６】
「低分子」は、通常、約１０ｋＤａ未満の分子量で、そして合成有機化合物または合成無機化合物、ペプチド、（ポリ）ヌクレオチド、（オリゴ）糖類などが挙げられるが、これらに限定されない。低分子は、特別に非重合の（すなわち、ペプチドでもポリペプチドでもない）有機分子または無機分子を含む。多くの製薬会社は、本発明の拡張型繋留（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）アプローチを使用して便利にスクリーニングされ得る分子の大規模なライブラリーを所有する。好ましい低分子は、約１０００Ｄａ未満、より好ましくは約７５０Ｄａ、そして最も好ましくは約５００Ｄａの分子量を有する。
【００３７】
用語「繋留する（ｔｅｔｈｅｒ）」は、本明細書中で使用される場合、目的の結合部位またはその近傍における標的キナーゼとの可逆的共有結合を形成し得る部分を含む構造を言う。
【００３８】
語句「低分子拡張（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ）」（ＳＭＥ）は、本明細書中で使用される場合、約７５ダルトン〜約１，５００ダルトンの分子量を有し、プロテインキナーゼ標的上の求核剤または求電子剤に対して反応性の第１官能基、および第２リガンド候補またはリガンド候補のライブラリーのメンバーに対して反応性の第２官能基を有する。好ましくは、ＳＭＥの片方の端の上の第１官能基は、プロテインキナーゼ上の求核剤に対して反応性（このような求核剤との非可逆的または可逆的共有結合を形成し得る）であり、そしてＳＭＥの他方の端における反応基は、遊離のチオール基もしくは保護チオール基、または遊離のチオール基もしくは保護チオール基の前駆体である基である。１つの実施形態において、低分子拡張剤の少なくとも一部は、標的プロテインキナーゼ上の目的の第１結合部位と非共有結合を形成し得る（すなわち、目的の第１部位に対する固有の親和性を有する）。この定義の範囲内に、求核剤（例えば、標的のＳＨ）と結合を形成し得るＣｄ、ＨｇおよびＡｇなどの金属を含有する有機低分子（非重合を含む）が、含まれる。
【００３９】
語句「可逆的共有結合」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは標的を変性させない条件下で、壊れ得る共有結合を言うために使用される。例としては、非限定で、ジスルフィド、シッフ塩基、チオエステルなどが挙げられる。
【００４０】
語句「反応基」は、リガンドに関する場合、リガンド候補（例えば、ライブラリーのメンバーまたは有機低分子）との共有結合を形成し得る部位を提供する、化学基または部分を言うために使用される。従って、反応基は、スクリーニングされるライブラリーのメンバーと共有結合を形成し得るように選択される。
【００４１】
語句「含むように改変される」および「保有するように改変される」は、相互交換可能に使用され、標的または反応性求核剤もしくは求電子剤の変異体、改変体、または誘導体の作製を言い、化学的変更が挙げられるが、これに限定されない。例えば、タンパク質において、当業者は、野生型残基に対して１つのアミノ酸残基（求核剤または求電子剤を含む側鎖を有する）を置換し得る。別の例は、システイン残基のチオール基をアミン基に変換することである。
【００４２】
用語「反応性求核剤」は、本明細書中で使用される場合、標的を変性させたり傷つけたりしない条件下で、別の分子における互換性の官能基と共有結合を形成し得る求核剤を言う。最もよく該当する求核剤は、チオール、アルコール、およびアミンである。同様に、用語「反応性求電子剤」は、本明細書中で使用される場合、好ましくは標的を変性させたりあるいは損なったりしない条件下で、別の分子における互換性の官能基と共有結合を形成し得る求電子剤を言う。最もよく該当する求電子剤は、ハロゲン化アルキル、イミン、カルボニル、エポキシド、アジリジン、スルホネート、およびヘミアセタールである。
【００４３】
標的プロテインキナーゼ（例えばチロシンキナーゼ）上の「目的の第１結合部位」は、ＳＭＥが反応性の求核剤または反応性の求電子剤に結合する場合、
ＳＭＥの少なくとも一部によって接触し得る。目的の第１結合部位は、ＳＭＥと結合を形成する能力を保有し得るが、保有しなくともよい。
【００４４】
語句「求核剤に反応性の基」、「求核剤反応基」、「求電子剤に反応性の基」および「求電子剤反応基」は、本明細書中で使用される場合、例えば、ＳＭＥ上で、標的を変性させたり、さもなければ損なったりしない条件下で、標的プロテインキナーゼ上の求核剤／求電子剤と共有結合を形成し得る官能基を言う。
【００４５】
用語「保護チオール」は、本明細書中で使用される場合、基または分子と反応して共有結合（保護チオールの反応性をより低くする）を形成しているチオールを言い、そしてこれは、脱保護されて、遊離のチオールを生じ得る。
【００４６】
語句「条件の調整」は、本明細書中で使用される場合、標的プロテインキナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ）を、リガンドと標的（例えば求核剤とＳＭＥ上の求核剤に反応性の基）との間に形成される共有結合を生じるため、または既に形成された共有結合を壊すために必要な、独立した、組み合わせのまたは連続の任意の反応条件または任意の反応試薬に曝すことを言う。
【００４７】
用語「共有結合複合体」は、本明細書中で使用される場合、ＳＭＥと標的との結合（例えば、標的上の求核剤／求電子剤を通して、求核剤／求電子剤に反応性のＳＭＥ上の基と共有結合される標的プロテインキナーゼ、および低分子拡張剤の一部および標的の目的の第１結合部位を通して非共有結合する標的プロテインキナーゼの両方）を言う。
【００４８】
語句「交換可能ジスルフィド結合基」は、本明細書中で使用される場合、チオール含有低分子拡張剤を示す共有結合複合体でスクリーニングされる分子のライブラリーを言い、ここで、このライブラリーのそれぞれのメンバーは、反応条件がチオール交換に有利に調整された場合、共有結合複合体上に表されるチオールまたは保護チオールと反応し、新しいジスルフィド結合を形成し得る、ジスルフィド基を含む。
【００４９】
語句「目的の第２結合部位に対する最高の親和性」は、本明細書中で使用される場合、ジスルフィド含有ライブラリーメンバーのライブラリーから優先的に選択される、標的プロテインキナーゼ上の目的の第２部位に関して、より大きな熱力学的安定性を有する分子を言う。
【００５０】
本明細書中の分子の「機能的改変体」は、参照分子と共通の活性を有する改変体である。
【００５１】
「活性である」または「活性」は、定性的生物学的性質および／または免疫学的性質を言う。
【００５２】
用語アミノ酸「変異」は、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、および／またはアミノ酸挿入を含む。
【００５３】
（Ｂ．詳細な説明）
１つの局面において、本発明は、プロテインキナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ）を、不活性型コンホメーションにロックする方法を提供する。別の局面において、本発明は、標的タンパク質（例えば、チロシン）キナーゼの不活性型コンホメーションに優先的に結合するインヒビターの同定に関する。
【００５４】
（プロテインキナーゼ）
プロテインキナーゼは、ポリペプチド（基質）内のセリン残基、トレオニン残基またはチロシン残基のヒドロキシル基の酸素原子への、ＡＴＰ（ＡＴＰ−Ｍｇ２＋複合体）のγ−ホスホリル基の転移を触媒する酵素である。プロテインキナーゼは、シグナル伝達、細胞増殖、分化、および種々の調節メカニズムにおいて、重大な役割を果たす。ヒトゲノム内の全コード配列の約３％は、プロテインキナーゼをコードする。
【００５５】
プロテインキナーゼの広い分類の中には多くの異なったサブファミリーがあるが、これらは全て共通の特徴を共有する；これらは全て、ＡＴＰホスホトランスフェラーゼとして作用する。従って、プロテインキナーゼが、ＡＴＰが結合する領域（ＡＴＰ結合ポケット）において非常に高い程度の構造的類似性を共有することは、驚くことではない。多くのタンパク質の構造分析は、リン酸基転移活性を担う触媒ドメインが、非常に高度に保存されていることを示す。このドメインは、可変性ヒンジ領域によって連結する、２つの突出部からなる。アミノ末端突出部は、１つのαヘリックスおよび５つのβシートからなり、一方、カルボキシル末端突出部は、４つのαヘリックス塊および活性化ループと呼ばれる可変性ループからなる。ＡＴＰ結合ポケット（プリン結合ポケットとも呼ばれる）は、２つの突出部の界面で形成される。１つのリジンと２つのアスパラギン酸からなる不変触媒性３つ組を含む、幾つかの高度保存残基が存在する。この触媒性３つ組は、第１のアスパラギン酸が、リン酸基転移反応における一般的塩基触媒として作用する場合、基質における転移される残基（ホスホアクセプター残基）のヒドロキシル基を有する、ＡＴＰのγ−ホスフェートの正しい位置決定を担う。顕著に、これらの３つの重大な残基は、触媒ドメインの２つの突出部分にまたがる。その上、触媒性３つ組内の２つのアスパラギン酸は、活性化ループと呼ばれる第２の可変性領域によって、互いに離れている。リン酸基転移反応をさせるために、基質の構造は、幾何学的制約、表面静電性、および関連のプロテインキナーゼの活性部位の他の特徴と一致しなければならない。言い換えれば、基質結合は、その触媒活性を促進するキナーゼにおける構造的変化を含み得る。とりわけ、酵素−基質相互作用のために、活性化ループおよび触媒ループ内の残基は、基質内の側鎖に接触し得るようにされる必要がある。触媒活性に重要な保存的モチーフ（例えば、ＡＴＰ結合部位）の外側に、両ループにおいて、基質認識のために重要な配列の相違が存在する。
【００５６】
（キナーゼの構造的状態およびキナーゼ活性のアロステリック調節）
細胞におけるプロテインキナーゼ活性の適切な調節は、重要であり、そして休止細胞におけるキナーゼは、通常、不活性型コンホメーションで存在する。この不活性型コンホメーションにおいて、触媒性３つ組は、リン酸基転移を触媒しない様式で定位されても、基質結合間隙は、可変性活性化ループによって塞がれても、またはその両方でもよい。活性型コンホメーションと比較して、不活性型コンホメーションにおけるアミノ末端突出部およびカルボキシル末端突出部は、活性部位間隙を広げる合力によって開かれても、活性部位間隙を捻る（ｔｏｒｔｉｏｎｉｎｇ）合力によって歪められても、またはその両方でもよい。細胞は、特異的な刺激に直面した場合にのみ、触媒的に活性なコンホメーションへのこれらのキナーゼ遷移を行う。活性型コンホメーションへの遷移は、ほぼ常に、活性化ループにおける残基のリン酸化、およびその後の触媒アスパラギン酸のすぐ隣に隣接する保存的アルギニンとの塩橋の形成を含む。活性化ループの合力再編成は、新しく形成されたこの塩橋によって安定化され、以下によって特徴付けられる触媒的に活性なコンホメーションを安定化する：正しいアミノ末端とカルボキシル末端との方向性、リン酸基転移を許容するＡＴＰのγ−ホスフェートの正しい方向性、基質結合部位の開口、およびアスパラギン酸媒介塩基性触媒に都合の良い静電気環境。共通の機能は、触媒中心の構造が、活性型コンホメーションにおいてキナーゼ間で高度に保存されるように指示するが、不活性型コンホメーションにおけるキナーゼに関する場合はそうではない。実際、活性型コンホメーションである場合に、高度に保存的な活性部位の構築を有するキナーゼが、不活性型コンホメーションである場合には、同じ領域においてかなりの多様性を示し得る。
【００５７】
代表的なプロテインキナーゼの一覧が、表１に提供される。この表は、各プロテインキナーゼの、型（Ｓｅｒ／ＴｈｒまたはＴｙｒ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＮＣＢＩ登録番号、長さ、および参考文献、ならびにアミノ酸配列の配列番号を含む。表１の全ての参考文献は、本明細書中で明らかに参考として援用される。
【００５８】
薬品開発のための重要なプロテインキナーゼ標的は、ＥＧＦＲ１（Ｕｌｒｉｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９：４１８−４２５（１９８４））である。化学治療のための確認された標的であるＥＧＦＲ１は、細胞外リガンド結合ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインを含む細胞表面レセプターである。これは、上皮細胞における細胞成長、細胞生存、細胞増殖、および細胞分化の主要な調節因子である。多くのリガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、β−セルリン、およびエピレグリンを含む）の結合が、ＥＧＦＲ１を活性化する。リガンド結合は、レセプター重合体化、Ｔｙｒ８４５を含む活性化ループ中の多くのチロシン残基の自己リン酸化、およびその後のｐｆ基質タンパク質の補充、ならびにキナーゼドメインの活性型コンホメーションの安定化を導く。ＥＧＦＲ１は、この活性化状態において、種々の下流標的をリン酸化し、リガンド結合の細胞外刺激を、種々の成長調節遺伝子の最終的な転写アップレギュレーションおよび結果として起こる細胞増殖に伝播する。正常細胞においては、ＥＧＦＲ１は、厳重に調節された様式で、細胞成長を調節する。しかし、ＥＧＦＲ１の過剰発現が、多くの腫瘍型（乳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、頭部扁平上皮細胞癌および頚部扁平上皮細胞癌、卵巣癌、および膵臓癌を含む）で観察されている。種々の癌の始まりおよび進行におけるＥＧＦＲ１アップレギュレーションについての明らかな役割は、ＥＧＦＲ１を介したシグナル伝達を阻害する治療の熱心な探索に導いている。１つの実施形態において、本発明は、二重特異性キナーゼおよび当該分野に公知である他のキナーゼを網羅することを意図する。
【００５９】
プロテインキナーゼの別の重要なファミリーは、Ｓｒｃファミリーである。まず第１に、Ｓｒｃファミリーキナーゼ（特にＬｃｋ）は、種々の癌において、よく確認された日常用の薬剤である。第２に、ヒトにおけるＳｒｃキナーゼを効果的に標的化する現行の低分子治療が存在しない。最後に、Ｓｒｃファミリーキナーゼは、全てのチロシンキナーゼの中でも、最も構造的に特徴付けられる。
【００６０】
このファミリーの代表的なメンバーであるＬｃｋ（Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：１１７−１２６（１９８８））は、細胞質ゾルチロシンキナーゼであり、これは最初にＴ細胞で発現される。ここで、細胞質ゾルチロシンキナーゼは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）からのシグナルの伝達において、中心的に関わる。Ｌｃｋは、内部原形質膜と結合し、この膜で、ＬｃｋはＴＣＲのＣＤ３およびζ鎖を抗原刺激に応答してリン酸化し、最終的に刺激されたＴ細胞のクローン増殖をもたらすシグナル伝達事象のカスケードを開始する。従って、Ｌｃｋは、免疫障害（対宿主性移植片病など）についての治療標的として周知である。しかし、Ｌｃｋはまた、癌治療の標的としても確認されている。ヒトにおいて、幾つかの神経芽腫および非ホジキンリンパ腫は、Ｌｃｋ遺伝子の領域における染色体異常および転座を示す。分子的に特徴付けられている少なくとも１つの場合において、「誘導体Ｉ染色体」転座は、Ｌｃｋのコード配列を有するβＴ細胞レセプター遺伝子の転写調節領域に集中し、Ｔ細胞急性リンパ芽腫白血病の患者においてＬｃｋキナーゼレベルの増大をもたらす（ＣＭＬを引き起こすＡｂｌ発現をアップレギュレートするフィラデルフィア染色体転座（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に酷似している）。
【００６１】
その治療標的としての価値に加えて、Ｓｒｃファミリーキナーゼは、構造的に非常に良く特徴付けられる。結晶配位は、３つのファミリーメンバー（造血細胞キナーゼ（Ｈｃｋ）、Ｓｒｃ、およびＬｃｋ）について公に利用可能であり、活性型コンホメーションおよび不活性型コンホメーションの両方を網羅する。さらに、Ｌｃｋは、バキュロウイルスにおいてよく発現すること、容易に結晶化することが公知である。
【００６２】
（不活性型コンホメーションに優先的に結合するプロテインキナーゼインヒビターの同定）
重要な局面において、本発明は、不活性型コンホメーションのキナーゼを特異的に標的化するプロテインキナーゼインヒビターを同定する方法を提供する。このようなインヒビターをスクリーニングする、以下の少なくとも３つの原則的な動機が存在する：（１）細胞におけるキナーゼの大部分が、このコンホメーションで存在すること；（２）活性型コンホメーションと比較して、不活性型コンホメーションのキナーゼは、より大きな構造的多様性を示すこと；および（３）このコンホメーションにおける活性部位領域の開口およびよじれは、しばしばＡＴＰ（低分子キナーゼインヒビターにとって主要な細胞内競合体）に対する親和性を低下させる。
【００６３】
伝統的な高スループットスクリーニング技術は、活性化キナーゼによる基質分子へのリン酸基転移を検出する。このように、これらのアッセイは、主に、キナーゼの活性型コンホメーションに結合するインヒビターを検出し、不活性型コンホメーションを標的するインヒビターを同定することはほとんどない。対照的に、本発明は、プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに優先的に結合するキナーゼインヒビターを同定する、効率的な、高スループット法を提供する。この方法は、プロテインキナーゼを不活性型コンホメーションにロックする工程、および不活性型キナーゼコンホメーションを特異的に標的するインヒビターを同定するための共有結合繋留の強力な技術を使用する工程を、包含する。
【００６４】
（ａ．不活性型コンホメーションにキナーゼをロックする工程）
本発明に従って、標的キナーゼの不活性型コンホメーションに優先的に結合するキナーゼインヒビターを同定するため、標的プロテインキナーゼは、キナーゼがそのキナーゼ活性を発揮することができないように、不活性化部位における１つ以上のアミノ酸の変更の導入によって、触媒的に不活性なコンホメーションにロックされる。何故なら、多くの場合、変更が活性化ループのリン酸化を阻害するためである。この変更は、キナーゼの触媒的活性状態の形成に（直接または間接に）関わる任意の部位を標的化し得る。例えば、変更は、活性化ループのリン酸化、ならびに／あるいはＡＴＰのγ−ホスホリル基の提示もしくはプロテインキナーゼの基質へのＡＴＰのγ−ホスホリル基の転移、および／またはプロテインキナーゼとその基質との間の他の任意の相互作用に関与する、アミノ酸またはその近傍で生じ得る。触媒ループ内またはその近傍（例えば、触媒３つ組を含むＡＴＰ結合部位、基質結合チャネル、補因子結合部位、もしあれば、水素結合／アクセプター相互作用に関する残基および／またはチロシンキナーゼ上での基質のドッキング）における変更が、特に好ましい。
【００６５】
本明細書中で記載されるプロテインキナーゼ改変体の速記用名称について、代表的野生型プロテインキナーゼのアミノ酸配列に従った、変更されたアミノ酸残基の位置を示す番号を記す。アミノ酸の同定は、以下のアミノ酸の１文字アルファベットを使用する：
【００６６】
【表１】
2005534286.tif 000003
本明細書中の置換改変体の名称は、文字の次の数、その次の文字からなる。最初の（一番左の）文字は、野生型プロテインキナーゼにおけるアミノ酸を表す。特に、表１に列挙したプロテインキナーゼの改変体は、この表中に列挙されるそれぞれの配列番号を参照して表される。数はアミノ酸置換が行われているアミノ酸の位置を示し、そして第２の（右側の）文字は、その位置で野生型のアミノ酸と置き換えるのに使用されたアミノ酸を示す。挿入改変体についての名称は、ｉの文字、続いて挿入が始まる前の野生型のプロテインキナーゼにおける残基の位置を示す数、続いて、１つ以上の大文字からなり、これは、行われた挿入の全体を示す。欠失改変体についての名称は、ｄの文字、次に（野生型プロテインキナーゼに基づく位置で）欠失開始位置の数〜欠失終了位置の数からなる。多数の変更は、読みやすくするために、カンマで分けられる。
【００６７】
１つの実施形態において、このキナーゼは、触媒ループ中の不変アスパラギン酸；触媒ループ中のアルギニン；ＤＦＧモチーフ中の不変アスパラギン酸；およびモチーフＩＩ中の不変リジンからなる群から選択される１つ以上の残基を変異させることによって、不活性型コンホメーションにロックされる。好ましい実施形態において、１つ以上のこれらの残基は、アラニン残基と置換される。
【００６８】
触媒ループ中の不変アスパラギン酸残基がＸ（ここでＸは、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸残基を示す）に変異されるようなキナーゼ変異体の例としては、以下が挙げられる：
【００６９】
【数１２】
2005534286.tif 000004
触媒ループ中のアルギニン残基がＸ（ここでＸは、アルギニン以外の任意のアミノ酸残基を示す）に変異されるようなキナーゼ変異体の例としては、以下が挙げられる：
【００７０】
【数１３】
2005534286.tif 000005
ＤＦＧモチーフ中の不変アスパラギン酸がＸ（ここでＸは、アスパラギン酸以外の任意のアミノ酸残基を示す）に変異されるようなキナーゼ変異体の例としては、以下が挙げられる：
【００７１】
【数１４】
2005534286.tif 000006
モチーフＩＩ中の不変リジン残基がＸ（ここでＸは、リジン以外の任意のアミノ酸残基を示す）に変異されるようなキナーゼ変異体の例としては、以下が挙げられる：
【００７２】
【数１５】
2005534286.tif 000007
上述のまたは類似の変異の２つ以上が、組み合わせられて不活性キナーゼ改変体を産生し得ることが理解される。上に列挙した変異を２つ以上、任意の組み合わせで含む（２重変異、３重変異および４重変異を含む）プロテインキナーゼ改変体が、特に本明細書中の範囲内である。
【００７３】
当業者は、目的の（遊離のチオール基を含むリガンド候補との共有結合に使用可能な所望の数の遊離のチオール基を保有するような）プロテインキナーゼを改変するために慣用的に使用され得る、種々の組換え技術、化学技術、合成技術および／または他の技術をよく知っている。このような技術としては、例えば、標的プロテインキナーゼをコードする核酸配列の部位指定突然変異誘発が挙げられる。部位指定突然変異誘発は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用することが、特に好ましい（例えば、１９８７年７月２８日発行の米国特許第４，６８３，１９５号；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９１）を、参照のこと）。他の部位指定突然変異誘発技術はまた、当該分野に周知であり、例えば、以下：
【００７４】
【数１６】
2005534286.tif 000008
の刊行物に記載され、そして、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６））もまた、使用され得る。
【００７５】
１つより多いアミノ酸置換を有するアミノ酸配列改変体は、いくつかの方法の１つで産生され得る。アミノ酸が、ポリペプチド鎖の中で近接して一緒に位置する場合、これらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて、同時に変異され得る。しかし、アミノ酸が互いにある程度離れて位置する場合（例えば、１０個より多いアミノ酸で隔たっている場合）、全ての所望の変更をコードする１つのオリゴヌクレオチドを産生することは、より困難である。その代わり、２つの代替法のうちの１つが使用され得る。第１の方法において、置換されるべき各アミノ酸について、独立したオリゴヌクレオチドが産生される。次いで、このオリゴヌクレオチドは、１本鎖の鋳型ＤＮＡに同時にアニールされ、そして鋳型から合成されるＤＮＡの第２鎖は、全ての所望のアミノ酸置換をコードする。この代替法は、所望の変異体を産生するため、２回以上の突然変異誘発を含む。
【００７６】
次いで、所望のキナーゼ変異体をコードする核酸は、さらなるクローニングまたはさらなる発現のために、複製可能な発現ベクター内に挿入される。発現ベクターおよびクローニングベクターは、当該分野で周知であり、１つ以上の選択された宿主細胞内においてベクターの複製を可能にする、核酸配列を含む。適切なベクターの選択は、以下の１）〜３）に依存する：１）ＤＮＡ増幅とＤＮＡ発現とのどちらのために使用されるか、２）ベクターに挿入されるＤＮＡの大きさ、および３）このベクターによって形質転換される宿主細胞。各ベクターは、その機能（ＤＮＡ増幅またはＤＮＡ発現）および適合性の宿主細胞に依存して、種々の成分を有する。このベクター成分としては、一般に、以下の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。種々の宿主細胞と組み合わせて使用するための適切な発現ベクターは、当該分野に周知であり、市販されている。
【００７７】
プロテインキナーゼ変異体は、細菌宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、真核微生物（例えば、糸状菌または酵母）および多細胞生物由来の宿主細胞を含む、原核宿主細胞および真核宿主細胞において産生され得る。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）ならびに植物細胞（例えば、ワタ、コーン、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの細胞培養物）が、挙げられる。多数のバキュロウイルス系統および対応する許容性の昆虫宿主細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ由来の細胞）が、同定されている。昆虫宿主細胞のトランスフェクトのための種々のウイルス系統が公に使用可能であり、これらとしては、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＮＰＶおよびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶ系統の改変体が挙げられる。さらなる宿主細胞としては、脊椎動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例としては、限定ではないが、ヒト胚幹性腎細胞株２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、などが挙げられる。  
【００７８】
宿主細胞は、所望のプロテインキナーゼ変異体をコードする、発現ベクターまたはクローニングベクターによって形質転換され、そしてプロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改変された、慣用的な栄養液中で培養されている。
【００７９】
（ｂ．共有結合繋留）
本発明に従って、不活性型コンホメーションにロックされたプロテインキナーゼは、優先的に不活性型コンホメーションに結合するインヒビターを、共有結合繋留アプローチを使用してスクリーニングするために使用される。このアプローチは、大きな有機化合物ライブラリーの合成、およびその後のスクリーニング（通常は、標的プロテインキナーゼの阻害活性についてのスクリーニング）に基づく、慣用的な薬物開発経路とは大きく異なっている。標的キナーゼの低分子インヒビターを同定するための共有結合繋留アプローチに続き、第１のより小さい、繋留鎖（ｔｅｔｈｅｒ）を含むか、または含むように改変された、所望のキナーゼに対する結合活性について、薬物様フラグメント（モノフォア）が試験される。この薬物様フラグメント（モノフォア）は、次いで、フラグメントの結合体を合成するために使用される。この結合体は、非重複部位内に結合して、結合のために繋留鎖を必要としない分子を産生する。多数のフラグメントのこの結合または組み合わせは、一旦第１フラグメントが結合することで代表的医化学の開始点と同レベルの解離定数をもたらすと、個々の結合エネルギー、および第２フラグメントの高い局所密度に起因する都合の良いエントロピー項の組み合わせを、効果的に生じる。定量的項において、このことは、それぞれ約ｍＭの解離定数（Ｋｄ）を有する２つのフラグメントが、結合して約μＭのＫｄを有する分子を形成し得ることを意味する。この「スクリーニングに次ぐ結合」戦略は、伝統的アプローチよりはるかに効果的であり、を、最も大きな化合物ライブラリーのスクリーニングによって達成されるより、はるかに大型の化学的多様性の余地についての調査を可能にする。
【００８０】
好ましい実施形態において、不活性型コンホメーションにロックされた標的プロテインキナーゼに結合する分子は、Ｅｒｌａｎｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：９３６７−９３７２（２０００））によって近年報告された繋留アプローチを使用して同定される。この戦略は、媒介のジスルフィド「繋留」を使用した、低い親和性でタンパク質または他の分子上の特異的な標的部位に結合する低分子可溶性薬物フラグメントの、迅速かつ信頼のおける同定に、適している。このアプローチの好ましい実施形態に従い、ジスルフィド含有分子のライブラリーは、迅速なチオール交換を促進する部分的還元条件下で、システイン含有標的タンパク質に反応させられる。分子が、標的タンパク質に対する弱い親和性を有するとしても、この分子を標的タンパク質に結合するジスルフィド結合（「繋留鎖」）は、エントロピー的に安定である。次いで、このジスルフィド繋留フラグメントは、種々の方法（質量分析法（ＭＳ）が挙げられる）によって同定され得、そしてその親和性は、ジスルフィド繋留鎖の除去の際の伝統的アプローチによって改善され得る。ＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／００８２３号（２０００年１月６日公開）もまた、参照のこと。この開示の全体は、本明細書中で参考として明らかに援用される。
【００８１】
簡潔に言うと、基礎的な共有結合繋留アプローチの好ましい実施形態に従い、ジスルフィド結合が、不活性型コンホメーションにロックされた標的プロテインキナーゼ分子とリガンド候補との間に形成されて、標的タンパク質−リガンド結合体を生じ、そしてこの結合体中に存在するリガンドが、同定される。必要に応じて、この標的タンパク質は、還元剤（例えば、２−メルカプトエタノールまたはシステアミン）存在下で、リガンド候補（好ましくはリガンド候補のライブラリー）と接触される。ライブラリーメンバーの多くは、標的分子に対して、固有の親和性をほとんど有さないか、または全く有さない。従って、質量作用により、平衡は、未結合の標的分子に偏っている。しかし、ライブラリーメンバーが、標的分子に対する固有の親和性を示す場合、平衡は、ジスルフィド繋留鎖を有するライブラリーメンバーに結合している標的分子に向かってシフトする。
【００８２】
この標的は、遊離チオール基または保護チオール基（好ましくは約５個以下のチオール基、より好ましくは約２個以下のチオール基、より好ましくは１個以下の遊離のチオール基）を含むか、または含むように改変される。この目的の標的プロテインキナーゼは、最初に既に所望の数のチオール基を保有するように得られ得るかもしくは選択され得るか、または所望の数のチオール基を保有するように改変され得る。
【００８３】
図１に示される簡略図において、仮定上の標的タンパク質は、リガンド候補（候補インヒビターフラグメント）が結合し得る２つの部位を有する。１０，０００個の中の１個のフラグメントだけがそれぞれの部位に結合される場合、良いリード分子を見出すために、１０，０００×１０，０００＝１０８個の結合フラグメントの試料をスクリーニングする必要がある。これは、低分子ライブラリーにおいて代表的に見出されるよりも、約１００倍のモルの化合物である。しかし、本発明の繋留アプローチの後は、多数のシステイン変異部位に対する約１０，０００個のフラグメント（モノフォア）の単純化ライブラリーをスクリーニングすることにより、このような２つの化合物が見出されることを期待することが妥当である。さらに、それらの結合部位が、システイン繋留部位近傍に存在するという知見を仮定すると、このようなフラグメントが効果的に結合されることが期待される。
【００８４】
上記のように、特定の実施形態において、目的のキナーゼは、基礎的繋留の影響を受けやすい、少なくとも１つの天然に存在するシステインを保有する。基礎的繋留の影響を受けやすい天然に存在するシステインを含むキナーゼの例としては、以下：
【００８５】
【数１７】
2005534286.tif 000009
が、挙げられる。
【００８６】
他の実施形態としては、１つ以上のアミノ酸が、システインに変異する。一般に、システイン変異体は、以下のガイドラインを使用して作製される。
【００８７】
広くは、特定の標的（標的プロテインキナーゼ）上の「目的の結合部位」は、インビボまたはインビトロで天然の複合体を形成する分子に対する標的の結合に関与する残基によって規定される。標的がペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である場合、目的の部位は、標的のリガンドに対する結合（通常は非共有結合である）に関与するアミノ酸残基によって規定される。
【００８８】
標的生物学的分子が酵素である場合、目的の結合部位は、その酵素の約４オングストロームの結合基質、インヒビター、アクチベーター、補因子またはアロステリック修飾因子と接触するかまたはこれらの中に存在する、アミノ酸を含み得る。プロテインキナーゼについて、目的の結合部位は、基質結合チャネルおよびＡＴＰ結合部位を含む。
【００８９】
標的プロテインキナーゼは、目的の結合部位またはその近傍に、反応基を含むか、または含むように改変されるかのどちらかである。好ましくは、標的チロシンキナーゼは、目的の結合部位またはその近傍に、チオール含有アミノ酸残基を、含むかまたは含むように改変される。この場合、プロテインキナーゼが選択された後で、目的の結合部位を計算した。目的の結合部位が分かるとすぐ、改変すべき目的の結合部位の中またはその近傍のアミノ酸残基を決定するプロセスが始められる。例えば、１つの好ましい改変は、目的の結合部位の近傍に位置する別のアミノ酸残基に対するシステイン残基の置換を生じる。
【００９０】
改変する目的の結合部位の中またはその近傍の残基の選択は、以下の章の基準に基づいて決定される。まず、標的のプロテインキナーゼの３次元的な描写は、周知の幾つかの供給源のうちの１つから得られる。例えば、多くのプロテインキナーゼの３次元構造は、Ｘ線結晶学実験を通して決定されている。これらのＸ線構造は、広範な種々の供給源（例えば、インターネット上でｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇにて見出されるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ  （ＰＤＢ））から入手可能である。３次元構造はまた、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＰＳｄｂ）（ｔｈｅ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｃｏｍ）に存在する）においても見出され得る。
【００９１】
さらに、多くのタンパク質およびタンパク質複合体（プロテインキナーゼを含む）の３次元構造が、コンピューターベースのモデリングアプローチをとおして決定されている。従って、タンパク質の３次元コンホメーションのモデルは、現在広く利用可能である。
【００９２】
標的プロテインキナーゼの３次元構造が分かるか、または公知の構造に対する相同性に基づいて形作られるとすぐ、野生型または不活性型立体配置にロックされた改変形態の構造モデルに基づいて、タンパク質表面をおよそ１０オングストロームの距離を横切る、目的の部位内のアミノ酸の任意の原子から、測定が行われる。目標は、標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションに優先的に結合するプロテインキナーゼインヒビターを同定することであるため、好ましくは、目的の部位は、不活性型コンホメーションにロックされるプロテインキナーゼの構造的モデルに基づいて同定される。このような不活性型コンホメーションによって提示される結合部位（ポケット）は、しばしば野生型の構造において存在する結合部位（ポケット）と、かなり異なっている。所望の反応基（例えば、チオール基またはチオール含有残基）を含むように改変されている、繋留された不活性型プロテインキナーゼの改変体は、目的の結合部位（不活性型コンホメーションの安定化をもたらす改変の結果として最初に明らかにされている）から半径およそ１０オングストロームの範囲内に含まれる、１つ以上の標的プロテインキナーゼ上の、野生型アミノ酸の同定に基づく。この測定のために、目的の結合部位内のアミノ酸の任意の原子から約１０オングストロームの範囲内に含まれる、少なくとも１つの原子を有する任意のアミノ酸は、チオール含有残基への改変の可能性の高い残基である。
【００９３】
改変のために好ましい残基は、溶媒可触性の（ｓｏｌｖｅｎｔ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）残基である。溶媒可触性は、標準数値法（Ｌｅｅ，Ｂ．＆Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ５５：３７９−４００（１９７１）；  Ｓｈｒａｋｅ，  Ａ．＆Ｒｕｐｌｅｙ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７９：３５１−３７１（１９７３））または分析的方法（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：７０９−７１３（１９８３）；Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｔ．Ｊ．Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１７８：６３−８９（１９８４））を使用して、構造モデルから計算され得る。例えば、有力なシステイン改変体は、ＬｅｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓ（Ｌｅｅ，Ｂ．＆Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｆ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ５５：３７９−４００（１９７１））の方法によって計算された場合、炭素−β（ＣＢ）または硫黄−γ（ＳＧ）の結合表面領域が、２１平方オングストロームより広い場合、溶媒可触性と考えられる。この値は、Ｃｒｅａｍｅｒら（Ｃｒｅａｍｅｒ，Ｔ．Ｐ，ら  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１６２４５−１６２５０（１９９５））によって記載されるように、理論的な表面領域のおよそ３３％が、システイン側鎖に対して可触性であることを表す。
【００９４】
繋留目的のために、システインまたは別のチオール含有アミノ酸残基に変異される残基は、バックボーン原子との水素結合に関わらないか、またはせいぜい、１つの水素結合だけを通してバックボーンと相互作用することが、好ましい。側鎖が、他の側鎖との多数（＞１）の水素結合に関わるような野生型残基もまた、あまり好ましくない。全ての標準的回転異性体（−６０°、６０°または１８０°のχ１角）が、任意の他の残基のＮ、ＣＡ、Ｃ、Ｏ、またはＣＢ原子との好ましくない立体的接触を導入し得るような改変体もまた、あまり好ましくない。好ましくない接触は、関係する原子のファンデルワールス半径の合計の８０％未満の原子間距離として定義される。
【００９５】
さらに、凹表面に隣接する凸面「隆線（ｒｉｄｇｅ）」領域において見出される残基は、システイン残基に改変される残基としてより好ましく、一方、凹領域の範囲内である残基は、システイン残基に改変される残基としてあまり好ましくない。凸性および凹性は、表面ベクターに基づいて計算され得る（Ｄｕｎｃａｎ，Ｂ．Ｓ．＆Ｏｌｓｏｎ．Ａ．Ｊ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ３３：２１９−２２９（１９９３））か、または分子表面に沿って存在する水プローブへの可触性の決定によって予測され得る（Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ａ．ら  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １１：２８１−２９６（１９９１）；Ｂｒａｄｙ，Ｇ．Ｐ．，Ｊｒ．＆Ｓｔｏｕｔｅｎ，Ｐ．Ｆ．Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１４：３８３−４０１（２０００））。普通はＬ−アミノ酸について禁止される（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｇ．Ｎ，ら  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：９５−９９（１９６３）；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｇ．Ｎ．＆Ｓａｓｉｓｅｋｈａｒａｈｎ，Ｖ．Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．２３：２８３−４３７（１９６８））、バックボーンコンホメーションを保有する残基は、システインへの改変のための標的としてあまり好ましくない。禁止されたコンホメーションは、通常、正の数のφ角の特徴を持つ。
【００９６】
他の好ましい改変体は、システインに変異され、そしてジスルフィド結合を解してアルキル繋留鎖に結合される場合、目的の結合部位に向かって繋留する原子を指示するコンホメーションを有する。２つの一般的な手順が、これらの好ましい改変体を同定するために使用され得る。第１の手順において、独特の構造の探索（Ｈｏｂｏｈｍ，Ｕ．ら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １：４０９−４１７（１９９２））が、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（Ｂｅｒｍａｎ．Ｈ．  Ｍ．ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２３５−２４２（２０００））においてなされ、位置ｊにおいてジスルフィド結合されたシステインを含む構造的フラグメントを同定する（ここで、フラグメントの残基ｊ−１、ｊ、およびｊ＋１のバックボーン原子が、０．７５Ａ２未満のＲＭＳＤを有する標的分子の残基ｉ−１、ｉ、ｉ＋１のバックボーン原子の上に重ね合わせられ得る）。システインとジスルフィド結合された残基のＣＢ原子を残基ｉのＣＢ原子よりも目的の部位の任意の原子の近くの位置ｊに配置するフラグメントが、同定された場合（システインに変異された場合）、位置ｉは、好ましいと考えられる。代替の手順において、位置ｉの残基は、システインに計算的に「変異」され、Ｓ−メチル基によって、ジスルフィド結合を介してキャップされる。
【００９７】
本発明のプロテインキナーゼ標的上の繋留のための目的の結合部位の同定のさらなる詳細は、同時継続出願番号第ｌ０／２１４，４１９号（２００２年８月５日出願）において提供され、この出願は、仮特許出願第６０／３１０，７２５号（２００１年８月７日出願）の優先権を主張する。これらの両出願の開示の全体は、本明細書によって明らかに参考として援用される。
【００９８】
表１に列挙されたキナーゼの、繋留に適したシステイン変異体の例は、以下を含む：
ＡＫＴ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【００９９】
【数１８】
2005534286.tif 000010
。
【０１００】
ＡＫＴ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１０１】
【数１９】
2005534286.tif 000011
。
【０１０２】
ＡＫＴ３キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１０３】
【数２０】
2005534286.tif 000012
。
【０１０４】
ＢＬＫキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１０５】
【数２１】
2005534286.tif 000013
。
【０１０６】
ＢＴＫキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１０７】
【数２２】
2005534286.tif 000014
。
【０１０８】
ＣＤＫ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１０９】
【数２３】
2005534286.tif 000015
。
【０１１０】
ＣＤＫ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１１１】
【数２４】
2005534286.tif 000016
。
【０１１２】
ＣＤＫ３キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１１３】
【数２５】
2005534286.tif 000017
。
【０１１４】
ＣＤＫ４キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１１５】
【数２６】
2005534286.tif 000018
。
【０１１６】
ＣＤＫ５キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１１７】
【数２７】
2005534286.tif 000019
。
【０１１８】
ＣＤＫ６キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１１９】
【数２８】
2005534286.tif 000020
。
【０１２０】
ＣＤＫ７キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１２１】
【数２９】
2005534286.tif 000021
。
【０１２２】
ＣＤＫ８キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１２３】
【数３０】
2005534286.tif 000022
。
【０１２４】
ＣＤＫ９キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１２５】
【数３１】
2005534286.tif 000023
。
【０１２６】
ＣＳＫキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１２７】
【数３２】
2005534286.tif 000024
。
【０１２８】
ＥＧＦＲ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１２９】
【数３３】
2005534286.tif 000025
。
【０１３０】
ＥＲＢ２（ＥｒｂＢ２とも呼ばれる）キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１３１】
【数３４】
2005534286.tif 000026
。
【０１３２】
ＥＲＢ４（ＥｒｂＢ４とも呼ばれる）キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１３３】
【数３５】
2005534286.tif 000027
。
【０１３４】
ＥＲＫ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１３５】
【数３６】
2005534286.tif 000028
。
【０１３６】
ＥＲＫ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１３７】
【数３７】
2005534286.tif 000029
。
【０１３８】
ＥＲＫ３キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１３９】
【数３８】
2005534286.tif 000030
。
【０１４０】
ＥＲＫ４キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１４１】
【数３９】
2005534286.tif 000031
。
【０１４２】
ＥＲＫ５キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１４３】
【数４０】
2005534286.tif 000032
。
【０１４４】
ＥＲＫ６キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１４５】
【数４１】
2005534286.tif 000033
。
【０１４６】
ＦＡＫ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１４７】
【数４２】
2005534286.tif 000034
。
【０１４８】
ＦＧＦＲ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１４９】
【数４３】
2005534286.tif 000035
。
【０１５０】
ＦＧＦＲ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１５１】
【数４４】
2005534286.tif 000036
。
【０１５２】
ＦＧＦＲ３キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１５３】
【数４５】
2005534286.tif 000037
。
【０１５４】
ＦＧＦＲ４キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１５５】
【数４６】
2005534286.tif 000038
。
【０１５６】
ＦＹＮキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１５７】
【数４７】
2005534286.tif 000039
。
【０１５８】
ＨＣＫキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１５９】
【数４８】
2005534286.tif 000040
。
【０１６０】
ＩＫＫ−ａキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１６１】
【数４９】
2005534286.tif 000041
。
【０１６２】
ＩＫＫ−ｂキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１６３】
【数５０】
2005534286.tif 000042
。
【０１６４】
ＩＫＫ−ｅキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１６５】
【数５１】
2005534286.tif 000043
。
【０１６６】
ＪＡＫ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１６７】
【数５２】
2005534286.tif 000044
。
【０１６８】
ＪＡＫ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１６９】
【数５３】
2005534286.tif 000045
。
【０１７０】
ＪＡＫ３キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１７１】
【数５４】
2005534286.tif 000046
。
【０１７２】
ＪＮＫ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１７３】
【数５５】
2005534286.tif 000047
。
【０１７４】
ＪＮＫ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１７５】
【数５６】
2005534286.tif 000048
。
【０１７６】
ＪＮＫ３キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１７７】
【数５７】
2005534286.tif 000049
。
【０１７８】
Ｌｃｋキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１７９】
【数５８】
2005534286.tif 000050
。
【０１８０】
ＬＹＮキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１８１】
【数５９】
2005534286.tif 000051
。
【０１８２】
ＭＡＰＫキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１８３】
【数６０】
2005534286.tif 000052
。
【０１８４】
ＮＩＫキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１８５】
【数６１】
2005534286.tif 000053
。
【０１８６】
ＰＡＫ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１８７】
【数６２】
2005534286.tif 000054
。
【０１８８】
ＰＡＫ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１８９】
【数６３】
2005534286.tif 000055
。
【０１９０】
ＰＡＫ３キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１９１】
【数６４】
2005534286.tif 000056
。
【０１９２】
ＰＡＫ４キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１９３】
【数６５】
2005534286.tif 000057
。
【０１９４】
ＰＡＫ５キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１９５】
【数６６】
2005534286.tif 000058
。
【０１９６】
ＰＤＧＦＲ−ａキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１９７】
【数６７】
2005534286.tif 000059
。
【０１９８】
ＰＤＧＦＲ−ｂキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０１９９】
【数６８】
2005534286.tif 000060
。
【０２００】
ＰＩＭ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２０１】
【数６９】
2005534286.tif 000061
。
【０２０２】
Ａ−Ｒａｆキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２０３】
【数７０】
2005534286.tif 000062
。
【０２０４】
Ｂ−Ｒａｆキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２０５】
【数７１】
2005534286.tif 000063
。
【０２０６】
Ｃ−Ｒａｆキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２０７】
【数７２】
2005534286.tif 000064
。
【０２０８】
ＳＲＣキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２０９】
【数７３】
2005534286.tif 000065
。
【０２１０】
ＳＲＣ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２１１】
【数７４】
2005534286.tif 000066
。
【０２１２】
ＳＴＫ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２１３】
【数７５】
2005534286.tif 000067
。
【０２１４】
ＳＹＫキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２１５】
【数７６】
2005534286.tif 000068
。
【０２１６】
ＴＥＣキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２１７】
【数７７】
2005534286.tif 000069
。
【０２１８】
ＴＧＦＲ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２１９】
【数７８】
2005534286.tif 000070
。
【０２２０】
ＴＧＦＲ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２２１】
【数７９】
2005534286.tif 000071
。
【０２２２】
ＴＩＥ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２２３】
【数８０】
2005534286.tif 000072
。
【０２２４】
ＴＩＥ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２２５】
【数８１】
2005534286.tif 000073
。
【０２２６】
ＶＥＧＦＲ１キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２２７】
【数８２】
2005534286.tif 000074
。
【０２２８】
ＶＥＧＦＲ２キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２２９】
【数８３】
2005534286.tif 000075
。
【０２３０】
ＶＥＧＦＲ３キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２３１】
【数８４】
2005534286.tif 000076
。
【０２３２】
ＹＥＳキナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２３３】
【数８５】
2005534286.tif 000077
。
【０２３４】
ＺＡＰ−７０キナーゼについては、以下のシステイン変異体が、繋留に使用される変異体の実例である：
【０２３５】
【数８６】
2005534286.tif 000078
。
【０２３６】
このアプローチは、ジスルフィド含有ライブラリーをスクリーニングするために、チオール官能基を有するプロテインキナーゼ標的に関して代表的に例示されているが、他の化学的性質もまた使用可能であり、そして繋留を達成するために容易に使用され得る。このような化学物質は、以下で議論する拡張型繋留（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）アプローチにおいて使用される化学物質と同様であり、これらは、以下の章でより詳しく議論される。
【０２３７】
（ｃ．拡張型繋留）
このアプローチは、低分子拡張剤（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｅｘｔｅｎｄｅｒ）（ＳＭＥ）の設計に基づく。このＳＭＥは、不活性型コンホメーションにロックされたプロテインキナーゼに、目的の第１の結合部位またはその近傍において、可逆的共有結合または非可逆的共有結合を介して繋留され、そしてプロテインキナーゼ標的上の目的の第２の結合部位に対する親和性についてスクリーニングされるべき有機低分子と反応性の化学的反応基を有する。
【０２３８】
特定の実施形態に従い、ＳＭＥは、求核剤または求電子剤、好ましくは求核剤を介して、プロテインキナーゼ標的上に「静的」すなわち非可逆的共有結合を形成し、これによって非可逆的プロテインキナーゼ−ＳＭＥ複合体を形成する。必要に応じて、ＳＭＥはまた、プロテインキナーゼ上の目的の第１の結合部位と非共有結合を形成する。さらに、ＳＭＥは、第２の官能基を有する。この第２の官能基は、有機低分子のライブラリーのメンバーと可逆的結合を形成可能であり、この各分子は、ＳＭＥの第２の官能基と可逆的結合を形成可能な官能基を有する。プロテインキナーゼ標的−ＳＭＥ複合体およびライブラリーは、プロテインキナーゼ標的上の目的の第２の結合部位についての親和性（好ましくは最高の親和性）を有するライブラリーのメンバーが、キナーゼ−ＳＭＥ複合体と可逆的結合を形成する条件に、曝される。
【０２３９】
静的拡張型繋留について、非可逆的なキナーゼ−ＳＭＥ複合体を形成するのに適切な標的プロテインキナーゼ上の好ましい求核剤としては、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨ２および−ＣＯＯＨ（通常、それぞれｃｙｓ、ｓｅｒまたはｔｈｒ、ｌｙｓおよびａｓｐまたはｇｌｕの側鎖に起因する）が挙げられる。プロテインキナーゼは、これらの求核剤を含むように改変され得るか（例えば、変異体または誘導体）、またはこれらを天然に含み得る。例えば、ＢＬＫ、ＢＴＫ、ＥＧＦＲ１、ＥＲＢ２、ＥＲＢ４、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４などは、天然に存在するシステインチオール求核剤を含む適切なプロテインキナーゼの例である。静的キナーゼ−ＳＭＥ複合体が生成するための、ＳＭＥを用いたこのようなキナーゼの誘導体化、そしてライブラリーメンバーとのその反応は、以下に図示される。
【０２４０】
【化４】
2005534286.tif 000079
ここで、キナーゼ上の求核剤は、チオール（通常はシステイン）の硫黄であり、これは、非可逆的な共有結合（標的を変性させない条件下で）を形成可能な置換基Ｇを含むＳＭＥ（２）、および遊離のチオール、保護チオールまたは誘導体化されたチオールＳＲ’と反応する。好ましくは、Ｇは、チオールによるＳＮ２様の攻撃を受け得る基であるか、または、チオールとＭｉｃｈａｅｌ型付加体を形成し、この攻撃の不可逆反応生成物（３）（新規の共有結合−ＳＧ’−を有する）を生成する。以下は、ＳＮ２様の付加またはＭｉｃｈａｅｌ型の付加を受け得るＧ基の代表例である。
【０２４１】
１）α−ハロ酸：Ｆ、ＣｌおよびＢｒで、置換された、ＣＯＯＨ、ＰＯ３Ｈ２またはＰ（ＯＲ）Ｏ２Ｈ酸に対するαは、ＳＭＥの一部であり、標的キナーゼのチオールとチオエーテルを形成し得る。一般的なα−ハロ酸の実例を、以下に示す。
【０２４２】
【化５】
2005534286.tif 000080
ここで、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ２０の非置換脂肪族、Ｃ１〜Ｃ２０の置換脂肪族、非置換アリールまたは置換アリールであり、そしてＲ’は、Ｈ、ＳＣＨ３、Ｓ（ＣＨ２）ｎＡであり、ここで、Ａは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ３、ＣＯＮＨ２またはＮＨ２であり、ｎは１〜５であり、好ましくはｎは２〜４である。
【０２４３】
２）フルオロホスフェート（フルオロホスホネート）：これらは、ＳＨ求核剤およびＯＨ求核剤の両方と容易に反応するサリン様の化合物であり得る。一般的なフルオロホスフェート（フルオロホスホネート）の実例を、以下に示す。
【０２４４】
【化６】
2005534286.tif 000081
ここで、ＲおよびＲ’は、上で規定される。
【０２４５】
３）エポキシド、アジリジンおよびチイラン：これらの反応性官能基を含むＳＭＥは、−ＳＨ求核剤、−ＯＨ求核剤および−ＣＯＯＨ求核剤による、ＳＮ２環開口反応（ＳＮ２  ｒｉｎｇ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を受け得る。後者の好ましい例は、β−セクレターゼ（ＢＡＳＥ）のようなアスパルチルプロテアーゼである。エポキシド、アジリジンおよびチイランの好ましい一般的な例は、以下に示される。
【０２４６】
【化７】
2005534286.tif 000082
ここで、Ｒ’は、上で規定され、Ｒは、通常Ｈまたは低級アルキルであり、そしてＲ’’は、低級アルキル、低級アルコキシ、ＯＨ、ＮＨ２またはＳＲ’である。チイランの場合、ＳＲ’の基は、必要に応じて存在する。何故なら、求核剤の攻撃および開環において、遊離のチオールが生成され、その後の拡張繋留反応において使用され得る。
【０２４７】
４）ハロ−メチルケトン／アミド：これらの化合物は、−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ２−Ｘの形態を有する。ここで、Ｘは、多数のよい脱離基であり得る。この脱離基は、ハロゲン、Ｎ２、Ｏ−Ｒ（ここで、Ｒは、置換または非置換のヘテロアリール、アリール、アルキル、−（Ｐ＝Ｏ）Ａｒ２、−Ｎ−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）アリール／アルキル、−（Ｃ＝Ｏ）アリール／アルキル／アルキルアリールなど）、Ｓ−アリール、Ｓ−ヘテロアリールおよびビニルスルホンなどである。
【０２４８】
【化８】
2005534286.tif 000083
フルオロメチルケトンは、このクラスの活性化ケトンの単純な例であり、チオール含有タンパク質と反応した場合、チオエーテルの形成をもたらす。他の周知の例としては、ベンゾイルオキシメチルケトンのようなアシルオキシメチル  ケトン、フェニルメチルアミノメチルケトンのようなアミノメチルケトンおよびスルホニルアミノメチルケトンが挙げられる。これらおよび他の型の適切な化合物は、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３（１８）ｐ３３５１−７１（２０００年９月７日）において概説される。  
【０２４９】
５）求電子芳香族系：これらの例としては、７−ハロ−２，１，３−ベンズオキサジアゾールおよびオルト／パラニトロ置換ハロベンゼンが挙げられる。
【０２５０】
【化９】
2005534286.tif 000084
この型の化合物は、チオール含有のプロテインキナーゼと、アリールアルキルチオエーテルを形成する。
【０２５１】
６）プロテインキナーゼ求核剤との静的共有結合の形成に適切な、他の適切なＳＮ２様反応としては、アルデヒドとＤＮＡ修復タンパク質のような酵素のリジンのアミン基との間のシッフ塩基の形成が挙げられ、例えばＮａＣＮＢＨ４による還元がそれに続く。
【０２５２】
【化１０】
2005534286.tif 000085
７）Ｍｉｃｈａｅｌ型付加：−ＲＣ＝ＣＲ−Ｑ、または−Ｃ＝Ｃ−Ｑの形態の化合物であって、ここで、Ｑは、Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（キニーネを含む）、ＣＯＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＲ、ＣＮ、ＮＯ２、ＳＯＲ、ＳＯ２Ｒであり、ここで、各Ｒは、独立して、置換または非置換のアルキル、アリール、水素、ハロゲンであるか、あるいは別のＱが、標的プロテインキナーゼ上ＳＲ（ここで、Ｒは、Ｈ、グルタチオンまたはＮＨ２もしくはＯＨで置換されたＳ−低級アルキル）、ＯＨおよびＮＨ２と、Ｍｉｃｈａｅｌ付加物を形成し得る。
【０２５３】
８）ボロン酸
これらの化合物は、標的プロテインキナーゼ上の反応性求核剤がヒドロキシルである場合に、使用され得る。例えば、標的キナーゼ上のセリン、トレオニンまたはチロシンが、標識されて、本発明における使用のためのキナーゼ−ＳＭＥ複合体を形成し得る。このようなキナーゼ−ＳＭＥ複合体の形成は、以下に示される。
【０２５４】
【化１１】
2005534286.tif 000086
ここで、Ｒ’は、上で規定される。
【０２５５】
それぞれの上述の例における「静的」すなわち非可逆的共有結合は、標的プロテインキナーゼ上の求核剤を介して形成され、チオールまたは保護チオールを含む非可逆的キナーゼ−ＳＭＥ複合体を生成する。次いで、これらの複合体は、還元剤（例えば、メルカプトエタノール）存在下で、チオール含有有機化合物またはジスルフィド含有有機化合物のライブラリーに曝され、それによって標的プロテインキナーゼ（Ｔ）上の第２の結合部位に結合可能な低分子リガンドを選択する。
【０２５６】
特定の実施形態において、目的のキナーゼは、静的または動的な拡張型繋留を受けやすいシステインを保有する。これらとしては、以下が挙げられる：
【０２５７】
【数８７】
2005534286.tif 000087
。
【０２５８】
拡張型繋留についてのシステイン変異型の例としては、以下が挙げられる：
【０２５９】
【数８８】
2005534286.tif 000088
。
【０２６０】
上記のように、この静的アプローチにおいて、ＳＭＥは、標的キナーゼ上の目的の第１部位に対する結合親和性を有する（すなわち、それに結合し得る）部分を含み得るが、必ずしも含まなくともよい。ＳＭＥがこのような部分を含まない場合でも、ＳＭＥは、リガンド候補が標的上の目的の第２部位に対して自由な接触を有することを確実にするような、適切な長さおよび柔軟性であるべきである。
【０２６１】
別の実施形態において、ＳＭＥは、二重の可逆的共有結合ＳＭＥ（「二重ジスルフィド」拡張剤）であり、すなわち、このＳＭＥは、二官能性であり、そして可逆的共有結合を形成可能な２つの官能基（通常、ジスルフィド）を含む。このＳＭＥは、ＳＭＥ上の第１の官能基によって、不活性型コンホメーションにロックされた標的プロテインキナーゼ上の求核剤と、「動的な」共有結合または第１の可逆的共有結合を形成し、それにより、可逆的キナーゼ−ＳＭＥ複合体を形成する。必要に応じて、ＳＭＥはまた、プロテインキナーゼ標的上の目的の第１の結合部位と非共有結合を形成する（キナーゼ標的と非共有結合を形成するＳＭＥの部分は、本明細書中でＳＭＥと呼ばれる）。さらに、ＳＭＥは、有機低分子の第２ライブラリーのライブラリーメンバーと第二の可逆的結合を形成可能な第２の官能基を含むか、またはこれを含むように改変され、ここで、このライブラリーのそれぞれの分子は、ＳＭＥの第１の官能基または第２の官能基と可逆的結合を形成し得る官能基を有する。プロテインキナーゼ−ＳＭＥ複合体および第２のライブラリーは、標的プロテインキナーゼ上の目的の第２の結合部位に対して最高の親和性を有するライブラリーメンバーが、標的プロテインキナーゼ−ＳＭＥ複合体と可逆的結合を形成する条件に、曝される。好ましくは、この共有結合はジスルフィドであり、これは、還元剤（例えば、ＢＭＥ）の存在下で、可逆的であり得る。
【０２６２】
【化１２】
2005534286.tif 000089
動的拡張型繋留プロセスが、図２に図示される。ここで、チオールまたは保護チオールを含むか、またはこれを含むように改変された標的プロテインキナーゼが、ライブラリーの少なくとも１つのメンバーが、キナーゼを有する選択されたライブラリーメンバーを繋ぐジスルフィド結合を形成するような、還元剤を用いた条件下で、チオールまたは保護チオールを含む有機低分子の第１のライブラリー（ジスルフィド含有モノフォア）とインキュベートされる。必要に応じて、このプロセスは、チオールまたは保護チオールの位置によって互いに異なるキナーゼのライブラリー（すなわち、同じプロテインキナーゼの、異なったシステイン変異体）を用いて繰り返される。好ましくは、低分子ライブラリーのそれぞれのメンバーは、分子量において、ライブラリーの他のメンバーの各々と異なる。好ましくは、低分子ライブラリーは、１〜１００のメンバーを、より好ましくは５〜１５、最も好ましくは約１０のメンバーを有する。必要に応じて、選択された低分子ライブラリーのメンバー（選択されたモノフォア）はまた、標的プロテインキナーゼ上の目的の第１部位と非共有結合を形成する。次いで、選択されたモノフォア、またはその誘導体は、第２のチオールまたは保護チオールを含むように改変され、それによって「二重ジスルフィド」拡張剤を形成する。次いで、この合成二重ジスルフィド拡張剤は、チオールまたは保護チオールを含む有機低分子の第２ライブラリー（このライブラリーは、第１ライブラリーと同じであっても、異なってもよい）の存在下で、第２ライブラリーの少なくとも１つのメンバーが、上の（８）で示されるように、二重ジスルフィド拡張剤によって、標的キナーゼを有する選択されたライブラリーメンバーを繋ぐジスルフィド結合を形成するような、メルカプトエタノール（βメルカプトエタノールすなわちＢＭＥ）などの還元剤を用いた条件下で、標的プロテインキナーゼとインキュベートされる。必要に応じて、その後、２つの選択されたライブラリーメンバー（モノフォア）に基づき、ダイアフォアが合成される。
【０２６３】
２つの基礎的な戦略が、「二重ジスルフィド」拡張剤を合成するために存在する。第１に、動的拡張剤の合成を一般的に進め、これは、キナーゼとの非共有結合を形成するモノフォアの部分を改変しないモノフォアリンカーの改変による。例として、拡張剤は、通常、ジスルフィドモノフォアライブラリーのスクリーニングから生じる。ライブラリーまたはプールから選択された代表的なモノフォアは、キナーゼシステインに対するモノフォアを結合するジスルフィドとキナーゼ上の目的の第１部位に非共有結合するモノフォアの部分の結合との間に、２個または３個のメチレン単位のリンカーを含む。このモノフォアリンカーは、以下で示されるように誘導体化されて、二重ジスルフィド拡張剤を生成し得、ここで、モノフォアの「Ｒ」または可変の基は、不変のままであり、キナーゼ上の目的の第１の結合部位と非共有結合する、拡張剤の一部（ＳＭＥ’）となる。
【０２６４】
【化１３】
2005534286.tif 000090
ここで、モノフォアは、システアミン窒素に最も近いメチレンにおいて誘導体化され、動的二重ジスルフィド拡張剤（１）を生成するか、またはシステアミン窒素それ自体において誘導体化され、左右対称動的二重ジスルフィド拡張剤（２）を生成するかのいずれかである。
【０２６５】
あるいは、モノフォアが、３−メルカプトプロピオン酸誘導体である場合、α炭素は、誘導体化されて、以下の（３）で示される形態の、一般的な動的二重ジスルフィド拡張剤を生成し得る。
【０２６６】
【化１４】
2005534286.tif 000091
必要に応じて、アミド窒素が、アシルまたはスルホニルによって誘導体化され、上の（４）で示される形態の拡張剤を生成し得る。
【０２６７】
第２の戦略は、標的キナーゼ上の目的の第１部位に非共有結合するモノフォアの一部を誘導体化する工程を含む。好ましくは、この誘導体化は、目的の第１部位に対するモノフォアの結合を最小限変化させる部位で行う。このような誘導体化の例が、標的キナーゼに結合する仮定的モノフォアについて、以下に示される。
【０２６８】
【化１５】
2005534286.tif 000092
ここで、動的繋留鎖が、キナーゼチオールに結合し、キナーゼ−ＳＭＥ複合体を形成することが示され、ここで、Ｒ’は、システアミン遊離基である。次いで、この複合体は、ジスルフィドモノフォアまたはジスルフィドモノフォアのライブラリーと接触させられ、キナーゼに対しＳＭＥよりも選択されたモノフォア単独よりも高い親和性を有する結合化合物を得る。
【０２６９】
設計されたＳＭＥの第２の例は、プロテインキナーゼに結合する例示的なジスルフィドモノフォアを形成し、以下に示される。この動的ＳＭＥは、１つ以上のジスルフィドモノフォアの存在下で、標的キナーゼと接触され得、共有結合キナーゼ−ＳＭＥ−モノフォア複合体を形成する。ここで、ＳＭＥは、目的の第１部位に対する親和性を有し、そしてこのモノフォアは、キナーゼ上の目的の第２部位に対する親和性を有する。
【０２７０】
【化１６】
2005534286.tif 000093
キナーゼ−ＳＭＥ−モノフォア複合体の構造の検出および同定は、質量分析または機能アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、酵素アッセイなど）における阻害によって行われ得る。
【０２７１】
キナーゼのための適切なＳＭＥ’としては、以下：
【０２７２】
【化１７】
2005534286.tif 000094
が挙げられ、ここで、ＳＭＥ上の少なくとも１つのＲ基が、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプターであり、そして別のＲ基が、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；およびチオール保護基から選択される場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、それぞれ独立に水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミン、およびアリールからなる群から選択される。１つの実施形態において、Ｒ１は、以下：
【０２７３】
【化１８】
2005534286.tif 000095
からなる群から選択される、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプターであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうちの１つが、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；およびチオール保護基から選択される場合、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６各々独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル；Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミン；アリール；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；およびチオール保護基からなる群から選択される。別の実施形態において、Ｒ３は、以下：
【０２７４】
【化１９】
2005534286.tif 000096
からなる群から選択されるＭｉｃｈａｅｌアクセプターであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうちの１つが、−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；およびチオール保護基から選択される場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、各々独立に、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル；Ｃ１〜Ｃ５アルキルアミン；アリール；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；−（ＣＨ２）ｎ−ＳＲ’；チオール保護基からなる群から選択される。全ての式において、Ｒ’は、水素、ジスルフィド、またはチオール保護基であり、ｎは、１〜５であり、好ましくはｎは、２〜４である。  
【０２７５】
動的拡張剤が、上述のような共有結合繋留によって、第２のフラグメントを選択するために使用される。標的に対して結合され、Ｂ−メルカプトエタノールに対して滴定される場合、ＢＭＥ５０値（平衡状態において、標的由来の化合物の結合の５０％の置換を可能にする、Ｂ−メルカプトエタノール濃度）を決定する。動的拡張剤を使用する場合、動的拡張剤についてＢＭＥ５０を測定し、そして動的拡張剤のＢＭＥ５０以下の総チオール濃度（ＢＭＲ＋ライブラリーチオール）で、共有結合繋留について第２フラグメントをスクリーニングすることが好ましい。例えば、動的拡張剤が、２．５ｍＭのＢＭＥ５０を有する場合、第２のフラグメントスクリーニング工程における総チオール濃度は２．５ｍＭ以下であるべきであり、より好ましくは約１／２以下（例えば、１ｍＭ以下）である。あるいは、動的拡張剤は、静的拡張剤に変換されて、第２フラグメントスクリーニング総チオール濃度の問題を取り除き得る。動的拡張剤を静的拡張剤に変換した場合、同じ原子数を維持し、その結果、標的に対する静的拡張剤の非共有結合が、歪まないことが重要である。同様の理由で、他の大型原子または大型基の導入を最小限にすることが重要である。
【０２７６】
プロテインキナーゼ上の反応基と標的またはリガンドそれぞれとの間、または２つのリガンド間に、可逆的共有結合または非可逆的共有結合を形成するために利用可能な他の化学的性質が、当該分野で周知であり、基本的な教科書（例えば、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第４版（１９９２））に記載される。アルデヒドおよびケトンとアミンとの間の還元的アミノ化が、例えば、Ｍａｒｃｈら（前出）において、ｐｐ．８９８−９００；アミンを調製する代替的方法が、１２７６頁；ヒドラゾンおよびヒドラゾン誘導体（例えば、セミカルバゾン）を生じるアルデヒドおよびケトンとヒドラジン誘導体との間の反応については、９０４〜９０６頁；アミド結合形成については、１２７５頁；尿素の形成については、ｐ．１２９９頁；チオカルバメートの形成については、８９２頁；カルバメートの形成については、１２８０頁；スルホンアミドの形成については、１２９６頁；チオエーテルの形成については、１２９７頁；ジスルフィドの形成については、１２８４頁；エーテルの形成については、１２８５頁；エステルの形成については、１２８１頁；エポキシドへの付加については、３６８頁；アジリジンへの付加については、３６８頁；アセタールおよびケタールの形成については、１２６９頁；カーボネートの形成については、３９２頁；エナミンの形成については、１２６４頁；アルケンの複分解については、１１４６〜１１４８頁（Ｇｒｕｂｂｓら，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２８：４４６〜４５３［１９９５］もまた、参照のこと）；アルケンおよびアセチレンによる、ハロゲン化アリールおよびスルホネートの遷移金属触媒カップリング（例えば、Ｈｅｃｋ反応）については、７１７〜１７８頁；ハロゲン化アリールおよびスルホネートと有機金属試薬（例えば、有機ボロン試薬）との反応については、６６２頁（Ｍｉｙａｕｒａら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２４５７［１９９５］もまた、参照のこと）；有機スズ試薬および有機亜鉛試薬、オキサゾリジンの形成については、（Ｅｄｅら．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．２８：７１１９〜７１２２［１９９７］）；チアゾリジンの形成については、（Ｐａｔｅｋら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．３６：２２２７〜２２３０［１９９５］）；イミドエステルによるアミンとのカップリングによりアミジン基によって結合するアミンについては、（Ｄａｖｉｅｓら，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｃ５０：４１６〜４２２［１９７２］）などに記載される。特に、ジスルフィド含有低分子ライブラリーは、市販のカルボン酸および保護システアミン（例えば、モノ−ＢＯＣ−システアミン）から、Ｐａｒｌｏｗら，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：２６６〜２６９（１９９５）の方法を採用することにより作製され得、そして反応性システイン含むか、または含むように改変されているポリペプチドへの結合についてスクリーニングし得る。この章に引用された全ての参考文献は、本明細書によって明らかに参考として援用される。
【０２７７】
ＳＭＥの接触は、標的を変性させないことが通常は好まれるが、キナーゼ−ＳＭＥ複合体はまた、変性条件化でも形成され、その後に当該分野で公知の方法による複合体の再折りたたみが続き得る。さらに、ＳＭＥおよび共有結合は、標的プロテインキナーゼの３次元構造を、実質的に変えず、その結果、リガンドが有用な部位特異性を有する標的上の目的の部位を認識し、そして結合するべきではない。最後に、ＳＭＥは、反応条件およびアッセイ条件下で、標的上の他の部位と実質的に反応するべきではない。
【０２７８】
（ｄ．標的に結合するリガンドの検出および同定）
標的に結合するリガンド結合は、質量分析（ＭＳ）によって容易に検出され、容易に同定され得る。ＭＳは、質量−電荷比（ｍ／ｚ）に基づいて分子を検出し、それによって、分子のサイズに基づいて分子を分離し得る  （Ｙａｔｅｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：５−８［２０００］に概説される）。質量分析計は、まず分子をガス相イオンに変換し、次いで、個々のイオンがｍ／ｚ比に基づいて分離され、最後に検出される。質量分析器（これは、質量分析計の不可欠な部分である）は、特定のｍ／ｚ値のイオン（これは、次いで、イオン検出器に入る）を分離するために、物理的特性（例えば、電場もしくは磁場、または飛行時間［ＴＯＦ］）を使用する。質量分析計は、迅速にデータを生成し得、従って、高スループット分析に非常に有力である。ＭＳは、薬物発見のために使用され得る、非常に広い用途のツールを提供する。質量分析法は、単独でも、標的に結合する有機化合物リガンドの検出または同定のための他の手段と組み合わせてもどちらでも使用され得る。質量分析法を使用する技術は、当該分野で周知であり、そして種々の適用のために使用されている（例えば、ＦｉｔｚｇｅｒａｌｄおよびＳｉｕｚｄａｋ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：７０７−７１５［１９９６］；Ｃｈｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：７８２７−７８３５［１９９６］；Ｓｉｕｄｚａｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１２９０−ｌｌ２９７［１９９４］；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：５９９Ｒ−６５１Ｒ［１９９６］；Ｗｕら，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：６５３−６５７［１９９７］；およびＬｏｏら，Ａｍ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３１：３１９−３２５［１９９６］を、参照のこと）。
【０２７９】
しかし、本発明の範囲は、ＭＳの使用に限定されない。実際、プロテインキナーゼ標的分子とライブラリーメンバーとの間に形成される付加体の検出についての任意の他の適切な技術が、使用され得る。例えば、当業者は、種々のクロマトグラフィー技術（例えば、液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーなど）を、反応混合物の成分を分離し、共有結合有機分子を同定する能力を増強するために、使用し得る。このようなクロマトグラフィー技術は、質量分析法との組み合わせでも、質量分析法とは独立しても、使用され得る。当業者は、必要に応じて標識プローブ（蛍光、放射性、他）を遊離された有機化合物と連結し、任意の上述の技術を使用した同定を容易にし得る。なお別の実施形態において、新しい結合の形成は、標識プローブを遊離し、次いで、この標識プローブが、モニターされ得る。標的分子に結合する有機化合物を同定するために使用し得る他の技術としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、キャピラリー電気泳動、Ｘ線結晶解析などが挙げられ、これら全ては、当業者に周知である。
【０２８０】
（キナーゼインヒビター活性の確認）
標的プロテインキナーゼの不活性型コンホメーションを標的として用いる、直接繋留または拡張型繋留を含む初期結合アッセイによって同定された分子（例えば、低分子リガンド）は、生理学的に適した活性アッセイにおいて、チロシンキナーゼインヒビターアッセイとして確認される必要がある。プロテインキナーゼの生理学的重要性を考慮し、キナーゼ活性を測定するための多くの高スループットスクリーニングアッセイが、開発されている。これらのアッセイにとっての共通の課題は、候補キナーゼインヒビター（代表的にはＡＴＰにおける競合におけるキナーゼインヒビター、または他の公知のキナーゼインヒビター）の存在下または非存在下でのキナーゼ活性の測定（代表的には、目的のキナーゼの基質のリン酸化の測定を介して測定する）である。これらのアッセイは、基質の全体またはキナーゼ認識配列を保持するその任意の一部を使用し得る。
【０２８１】
幾つかのアッセイは、キナーゼ活性を定量するために基質内に取り込まれた放射性標識（例えば、３２Ｐまたは３３Ｐ）リン酸の検出を使用する。他のアッセイにおいて、チロシンキナーゼ活性の定量は、リン特異的抗体の使用に基づく。後者の場合、代表的には、蛍光標識が、抗体もしくは基質またはその両方に結合し、ＨＲＰ酵素またはＡＰ酵素が、抗体に結合し、そしてその抗体は、比色定量の読み出し（例えば、時間分解蛍光（ＴＲＦ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、または蛍光極性化（ＦＰ））によって検出される。例えば、セリン−トレオニンキナーゼインヒビターの同定のためのＨｉｔＨｕｎｔｅｒＴＭアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）は、競合的免疫アッセイ形式において、抗ホスホ−ペプチド抗体および化学発光読み出しまたは蛍光読み出しを使用して、基質リン酸化を測定する。抗体非含有蛍光極性化ベースプロテインキナーゼアッセイが、例えば、Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から利用可能である。プロテインキナーゼアッセイ系もまた、利用可能である（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ  ＦＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ））。
【０２８２】
最初の同定と予備的特徴付けの後、候補キナーゼインヒビターは、細胞ベースのアッセイまたは動物モデルアッセイにおいて評価されて、標的プロテインキナーゼのインヒビターとして機能するその能力がさらに確認され得る。細胞ベースのアッセイは、目的のプロテインキナーゼおよびその基質を、機能するように、内因的に発現するか、および／または組換えＤＮＡ技術による個別のコード配列の導入の結果として発現する、任意の細胞を使用し得る。細胞ベースのアッセイの読み出しは、精製されたタンパク質を用いるアッセイにおいて使用されるのと同様である。
【０２８３】
例えば、上記で考案されたような公知のアッセイ形式のうちのいずれかにてパネルのプロテインキナーゼに対して候補インヒビターをアッセイすることにより、プロテインキナーゼインヒビターの選択性が、試験され得る。
【０２８４】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定の実施例において解説される。
【実施例】
【０２８５】
（実施例１）
（ＥＧＦＲ１改変体およびＬｃｋ改変体の構築および同定）
２つの主要な変異を、ＥＧＦＲ１のキナーゼドメインおよびＬｃｋのキナーゼドメインに、それぞれ導入する。第１の変異は、Ｌｃｋのプリン結合ポケットの底（ＡＴＰの２’−ＯＨによって占められる位置に隣接し、ＥＧＦＲ１のＣｙｓ７９７（シグナル配列の切断の後に残る第１の残基から数えるとＣｙｓ７７３）に相当する位置）にシステイン残基を導入する。第２の変異は、触媒３つ組の保存的リジンを、アルギニンで置換する。これは保存的変異であるので、これは、触媒を防ぎ、それにより、キナーゼドメインの自己リン酸化を防ぎ、そしてそれによってキナーゼドメインを不活性型コンホメーションにロックするのに充分である。
【０２８６】
（クローニングおよび変異誘発）
残基３０〜４９５を含むＬｃｋキナーゼドメイン（Ｌｃｋ−ＫＤ）を、標準的ＲＴ−ＰＣＲ技術を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞からクローニングした。残基６９８〜９７０を含むＥＧＦＲ１キナーゼドメイン（ＥＧＦＲ１−ＫＤ）を、同様にＡ４３１細胞からクローニングする。短く述べると、Ｔｒｉ試薬（Ｓｉｇｍａ）を用いてＲＮＡを細胞から単離し、そしてＯｌｉｇｏｔｅｘオリゴｄＴ樹脂（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｍＲＮＡを精製する。ｃＤＮＡの第１鎖を、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ、逆転写酵素、および遺伝子特異的プライマーを用いて合成し、そしてｃＤＮＡを、増幅されるべき領域に隣接する内部プライマー対を用いて増幅する。増幅したｃＤＮＡを、インフレームで、６ＨＩＳエピトープタグ配列の下流に、プラスミドｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴＡ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）内にサブクローニングする。次いで、点変異（ＥＧＦＲ１中のＫ７４５Ｒ；Ｌｃｋ中のＳ３２２ＣおよびＫ２７２Ｒ）を、ロングレンジＰＣＲ（ｌｏｎｇ  ｒａｎｇｅ  ＰＣＲ）および変異領域にわたる相補的プライマー対を用いて、導入する。所望の変異を保有する組換えプラスミドを、重複組換えを介して、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生成する。全ての変異体対立遺伝子を、配列決定法により確認する。
【０２８７】
（ウイルスの構築、キナーゼドメインの発現および精製）
組換えバキュロウイルスを、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ  Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系を製造者の指示に従って使用する標準的重複組換え技術を用いて生成する。短く述べると、プラスミドを、ＤＨ１Ｂａｃ細胞にトランスフェクトし、そして組換えバクミド（ｂａｃｍｉｄ）を含むコロニーを、選択的培地上でのその増殖によって同定する。これらの選択された細胞から単離した組換えバクミドＤＮＡを、Ｓｆ９昆虫細胞にトランスフェクトし、そして剥き出しの（ｓｈｅｄ）組換えビリオンを、必要に応じて、Ｓｆ９細胞内でさらに増幅する。組換えキナーゼドメインを、対応するバキュロウイルス系統での感染の後で、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞内で発現させる。組換えタンパク質発現を、抗５×ＨＩＳ抗体、タンパク質特異的抗体（抗ＥＧＦＲ１または抗Ｌｃｋ）、またはリン光体特異性抗体（抗ＥＧＦＲ１  ｐＹ８７２または抗ＬＣＫ  ｐＹ３９３）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、またはＵｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販される）のいずれかを使用して、細胞溶解産物のウェスタン分析によってモニターする。全細胞抽出物を、種々の組換えキナーゼドメインを発現するＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞から、Ｍ−ＰＥＲ非イオン性界面活性剤溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中での超音波処理により、調製する。抽出物を、製造業者の指示に従い、Ｎｉ−ＮＴＡローディング緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に対して一晩透析して、ＥＤＴＡを除去し、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｕｉａｇｅｎ）上で精製し、そしてイミダゾールを用いて溶出する。
【０２８８】
（酵素学的に活性なキナーゼドメインの特徴付け）
ＥＧＦＲ１−ＫＤ、Ｌｃｋ−ＫＤおよびＬｃｋ−ＫＤ  Ｓ３２２Ｃの酵素学的特徴を、３つの標準的アッセイ形式のうち１つ以上をを使用して、特徴づける。第１の形式においては、γ３３Ｐ標識ＡＴＰを、酵素およびケンプチド（ｋｅｍｐｔｉｄｅ）（ＫＫＫＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＬＤＦ；配列番号７０）（非特異的チロシンキナーゼ基質）と共にインキュベートする。正に荷電された反応産物を、ホスホセルロース膜への結合によって単離し、そしてｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｕｎａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して定量する。第２の形式においては、ＡＴＰを酵素およびビオチン化オリゴＥ４Ｙコポリマー基質（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートする。反応産物を、アビジンコートされた９６ウェルプレート上で捕捉し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ｐＹ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して標準的ＥＬＩＳＡ技術を使用して定量する。第３の形式においては、ＡＴＰを、キナーゼおよび基質と共にインキュベートし、そしてピルビン酸キナーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼとの共役反応において、ＡＤＰ産生をモニターする。これらの３つの形式のそれぞれは、利点を提供する。第１の形式は、例外的に定量が簡単である。第２の形式は、比較的高スループット形式に適合しやすい。第３の形式は、速度論分析に適合しやすい。これらのアッセイ形式を用いて、キナーゼドメイン構築物の機能を確認し、Ｌｃｋ−ＫＤにおけるＳ３２２Ｃ変異に起因するいかなる不利な効果も取り除き、そしてスクリーニングのヒットを特徴づける。
【０２８９】
（キナーゼ特異的繋留拡張剤の開発）
１組のキナーゼ特異的繋留拡張剤を開発するにあたって、２つの主要な目的が存在する。第１は、特異性がほとんどない、種々のキナーゼを非可逆的に標識するために使用され得る最小限の拡張剤の組を開発することであり、第２は、中心足場（ｃｏｒｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）上にチオール基を付加することによって、これらの拡張剤のサブセットを「活性化」することである。一旦これらの２つの目的が達成されてから、これらの一般的な拡張剤は、チオール活性化足場で種々のキナーゼのプリンポケットを標識するために、そしてそのキナーゼの活性型コンホメーションまたは不活性型コンホメーションのどちらかに優先的に結合したチオール活性化低分子のライブラリーをスクリーニングするために、使用され得る。一旦同定されると、多様性エレメントに結合する拡張剤からなるこれらの分子は、標準的医化学方法に使用するために特徴付けおよび最適化され得る。
【０２９０】
広い特異性のキナーゼインヒビターであるキナゾリン（Ｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ）は、無数のプロテインキナーゼのプリンポケットに結合することが公知であり、恐らくは全てのキナーゼ構造モチーフの中で、最も一般的に使用される。さらに、６−アリールアミドキナゾリンベースのインヒビターは、プリン結合ポケットの底に位置するシステイン残基（Ｃｙｓ７７３）との反応性を介して、ＥＧＦＲ１キナーゼを非可逆的に標識することが公知である。驚くべきことに、７−アクリルアミドキナゾリンもまた、ＥＧＦＲ１キナーゼを非可逆的に改変する。このことは、これらの化合物のプリンポケットへの高い親和性にもかかわらず、これらは、結合部以内に限られた可動性を有することを示す。従って、同様に改変されたキアゾリンは、拡張剤内に適合する理想的な化合物であり、適切に操作されたプロテインキナーゼのプリン結合ポケットに対して共有結合するが、緩い特異性を有する。
【０２９１】
従って、６位および７位に、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプターを含む一組の８つの４−フェニルアミノキナゾリンを、合成する。これらの構造を、以下に示す。
【０２９２】
【化２０】
2005534286.tif 000097
これらの化合物は、任意の特定のキナーゼに対し、ほとんど特異性を有さないプロテインキナーゼのプリンポケットに結合するように設計される。これらの化合物の合成および精製は、比較的簡単である。まとめると、このパネル図は、位置、特別な方向性、ならびにＭｉｃｈａｅｌアクセプターの反応性を変えることによる、ＥＧＦＲ１のＣ７７３に相当する残基の位置において可能なわずかな変動に適応する。
【０２９３】
（酵素学的に不活性なキナーゼドメインの特徴付け）
酵素学的に不活性なコンホメーションに抑制された構築物（ＥＧＦＲ１−ＫＤ、Ｋ７４５ＲおよびＬｃｋ−Ｋｄ、Ｓ３２２Ｃ、Ｋ２７２Ｒ）の、機能的完全性および構造の完全性を確認するため、これらがキナゾリンベースのインヒビターに結合する能力を、以下の標準的アッセイ形式の１つ以上を使用して、試験する。最初の２つの形式においては、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプター誘導体化化合物を、まず、３５Ｓシステイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）との反応により、３５Ｓで標識する。あるいは、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプター誘導体化化合物を、まず、１４Ｃ標識した２−メルカプトエタノールで標識し得る。次いで、キナーゼドメインへの結合を、フィルター結合アッセイを通して、またはシンチレーション接近アッセイ（ＳＰＡ）（６×Ｈｉｓタグ化キナーゼドメインを抗ＨＩＳ  ＩｇＧコートされたＳＰＡビーズに固定する）を通して、定量する。第３の形式においては、アクリルアミド誘導体化化合物を、ＢＩＡＣＯＲＥ  ＣＭ５センサーチップ（会社推奨手順に従い、それ自体がシステアミンで誘導体化されている）に共有結合させる。次いで、タンパク質結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００装置を用いる表面プラスモン共鳴を使用して、定量する。フィルター結合アッセイおよびＳＰＡアッセイは、結合親和性および結合特異性の迅速な決定を提供し、高スループット形式に適合しやすい。さらに、ＳＰＡアッセイは、溶液ベースのアッセイであり、競合アッセイをし、結合反応に対する特異性を示し、そしてその親和性を測定するために、より解釈しやすいように設計されたものにし得る。表面プラスモン共鳴は、放射活性を使用しないアッセイであることに加えて、結合親和性に加えて、結合動態学の詳細な特徴付けを許容する。
【０２９４】
（実施例２）
（不活性型コンホメーションにロックされるキナーゼドメインによる低分子ライブラリーのスクリーニング）
本実施例は、不活性型コンホメーションにロックされ、かつ低分子ライブラリーにおけるスルフヒドリル含有フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための繋留拡張剤を含む、キナーゼドメインの使用を示す。結合条件（例えば、タンパク質、還元剤、および拡張剤の終濃度）を、実験的に決定する。種々の拡張剤によるタンパク質の改変を、質量分析法（ＭＳ）により、評価し、定量する。ＬｃｋおよびＥＧＦＲ１の両方が表面露出システイン残基を含むので、ＥＧＦＲ１  Ｃ７７３およびＬｃｋ  Ｓ３２２Ｃの改変は、ＡＤＰ、またはプリンポケットにてＥＧＦＲ１およびＬｃｋに結合することが公知の他のインヒビターのいずれかと競合することにより、確認される。必要であれば、ＥＧＦＲ１  Ｃ７７３およびＬｃｋ  Ｓ３２２Ｃ以外の溶媒可触システイン残基を、セリンで置換する。
【０２９５】
（拡張剤の設計）
使用する正しい拡張剤は、実施例１で議論された４−フェニルアミノキナゾリンのうちのどれがＥＧＲＲ１−ＫＤ、Ｋ７４５ＲおよびＬｃｋ−ＫＤ、Ｓ３２２Ｃ、Ｋ２７２Ｒに最も効率的に結合するかに依存する。チオールを、最良のキナゾリンの５位、６位、７位、または８位に付加し、１原子スペーサー、２原子スペーサー、または３原子スペーサーによって離す。Ｌｃｋの結晶構造およびＥＧＦＲ１の構造モデルに基づき、これらの拡張剤が、基質結合領域、活性化ループ、およびリボソームポケット（この全てが、不活性型コンホメーションから活性型コンホメーションへの遷移の間にかなりの構造的再編成を受ける）に、接近することが期待される。これらのチオール含有拡張剤の結合条件を、実験的に決定し、改変の部位を、非チオール含有バージョンについて記載されたように確認する。ＥＧＦＲ１についての９個の繋留拡張剤候補の１組を、以下に示す。
【０２９６】
【化２１】
2005534286.tif 000098
（スルフヒドリル含有フラグメントのライブラリー）
マスクされたスルフヒフドリル基を示す薬物様フラグメントすなわち「モノフォア」の収集物のアセンブリは、繋留スクリーニングアプローチの重要な構成要素である。このスルフヒドリルを、このフラグメントが、酵素またはレセプター（例えば、プロテインキナーゼ標的）における、システインとのジスルフィド交換反応に関わり得るように、組み込まねばならない。モノフォアフラグメントはまた、認識され、かつ独特の薬物様のファルマコフォアおよびそのフラグメントを広く代表するべきである。最低でも、候補フラグメントは、２つの主要な基準を満たす必要がある。第１に、候補フラグメントは、ジスルフィドリンカーの導入を許容する官能基を含まねばならない。適切な官能基としては、遊離のアミン、カルボキシレート、スルホニルクロリド、イソシアネート、アルデヒド、ケトンなどが挙げられる。第２に、これらは、このような２つの実体の組み合わせが薬物様の物理的特徴を有する産物を生じるように、選択されるべきである。この物理的特徴としては、分子量（およそ５００Ｄａ以下）および疎水性（−１〜５のｃＬｏｇＰ）が挙げられる。
【０２９７】
異なったリンカーの組み合わせを、繋留フラグメントを調製するために使用する。２つの代表的リンカーを以下に示す。アミノリンカーは、求電子性官能基を有する構築ブロック（ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋ）（カルボキシレート、スルホニルクロリド、イソシアネート、など）と反応するために使用され得、一方、カルボキシレートリンカーが、求核剤（例えばアミン）と反応するために使用され得る。これらの繋留基は、ライブラリー内のジスルフィド含有化合物として保持される。
【０２９８】
モノフォアライブラリーは、上記の基準を満たす市販の化合物に由来し得る。しかし、生物学的に活性な化合物に共通な多くのモチーフは、市販の化学物質供給源にあまり存在しないか、または存在しない。従って、フラグメント収集物を、好ましくはこれらのギャップを埋めるのを手伝うモノフォアフラグメントを合成することにより補充する。代表的なライブラリーは、１０，０００以上の化合物を含み得る。
【０２９９】
次いで、フラグメントライブラリーを、チオール拡張剤改変ＥＧＦＲ１触媒ドメインおよびチオール拡張剤改変Ｌｃｋ触媒ドメイン）に対してスクリーニングする。繋留実験を、ＢＭＥ（β−メルカプトエタノール）存在下で行う。ＢＭＥは、親和性の熱力学に基づき、ジスルフィドの競合的交換を容易にする。この実験溶液内の酸化還元電位を、ジスルフィド結合単独よりも、モノフォアと周囲の酵素表面における間隙との間の疎水性相互作用および極性相互作用からの結合エネルギーを利用する、化合物をストリンジェントにスクリーニングするレベルに合わせる。
【０３００】
（ヒットの同定および特徴づけ）
キナーゼ−拡張剤共有結合複合体の最初のスクリーニング条件を、実験的に決定する。拡張剤を共有結合的に改変する化合物を含むプールを、質量分析法（ＭＳ）分析によって同定する。逆重畳積分したＭＳプロフィールから、結合化合物の分子量を正確に計算し得、そしてそれにより、プールにおけるその同一性を決定する。次いで、別個の化合物を単独で試験し、これが、キナーゼ−拡張剤複合体を共有結合的に改変し得るか否かを決定する。それぞれのスクリーニングは、多数のヒットを同定しやすい。ヒットを、その相対結合親和性に従って優先順位を付け、そして不活性型酵素コンホメーションに対するその相対的優先度に従って優先順位を付ける。次いで、相対的酵素結合親和性（ＢＭＥ５０によって表す）を、ＢＭＥ滴定曲線を使用して、一定の化合物濃度を使用した場合に、５０％の改変を許容する濃度を決定する。このことから、その結合親和性に基づいて、当業者は容易に化合物をランク分けし得る。不活性型コンホメーションに対する相対的優先度を、拡張剤改変活性型構築物（ＥＧＦＲ１−ＫＤおよびＬｃｋ−Ｋｄ  Ｓ３２２Ｃ）に対する化合物を導く再スクリーニングによって決定される。
【０３０１】
確認したモノフォアヒットの編集において、ヒット化合物とモノフォアライブラリーにおけるその関連化合物との間の構造活性関係（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）（ＳＡＲ）の分析から、さらに価値のある情報を得ることができる。例えば、特定のチロシンキナーゼ拡張剤対についての幾つかのヒット分子が、近縁のファミリー内にふくまれる場合、次に、モノフォアライブラリーに戻され、最初のスクリーニングで選択されなかった、構造的に類似の化合物が見出され得る。これらの関連化合物を、別個の化合物として再スクリーニングし、その活性（または不活性）を確認して、その後活性型酵素コンホメーションおよび不活性型酵素コンホメーションの両方に対する親和性の面から、ファミリー全体のランク付けを行う。このデータセットにより、活性にとって受容な特性および改変の潜在的部位（これらの部位の変更により、親和性の改善が予想される）が同定され得る。
【０３０２】
ＳＡＲ研究と平行して、繋留化合物を、Ｌｃｋキナーゼドメインと共に共結晶化する。これは、目的の化合物によって、タンパク質拡張剤複合体の完全な改変を生じ、その後、結晶成長が起こる。あるいは、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプターを欠く拡張剤−化合物ダイアフォアを、合成し、そしてＬｃｋ−ＫＤの結晶に浸すか、またはＬｃｋ−ＫＤと共結晶化させる。Ｘ線データを収集し、そして市販の設備またはソフトウェアを用いてプログラムする。
【０３０３】
上述の実施例は、本発明の理解を補助するためだけに示され、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【０３０４】
当業者は、本発明が、目的を実行しそして述べられた結果および利点ならびに本発明に本来備わる結果および利点を得るためによく適合されることを、容易に理解する。本明細書中で記載される方法および手順は、現在、好ましい実施形態の代表例であり、模範例であり、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。方法および手順における変更および他の用途が、当業者に想起され、本発明の精神の範囲内に包括される。
【０３０５】
本明細書中で開示される本発明に対し、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の置換または改変が行われ得ることが、当業者に容易に明らかになる。
【０３０６】
本明細書中で言及された全ての特許および刊行物は、本発明が属する分野の当業者の水準を示す。全ての特許および刊行物は、各々の刊行物が具体的かつ個別に参考として援用されることを示されるのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【０３０７】
本発明は、本明細書中で例証的に記載され、本明細書中で具体的に開示されない任意の要素、限定が存在しなくとも、適切に実行され得る。使用されている用語および表現は、記載の用語として使用され、限定的ではなく、このような用語および表現の使用において示されかつ記載される特徴またはその一部の等価物の排除を示すことを意図しない。本発明の範囲内で、種々の改変が可能であることが、理解される。従って、本発明は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されるが、本明細書中に開示される概念の変更および改変が、当業者によってなされ、そしてそのような変更および改変は、本発明の範囲（特許請求の範囲によってのみ限定される）内に含まれることが、理解されるべきである。
【０３０８】
【表２】
2005534286.tif 000099
【０３０９】
【表３】
2005534286.tif 000100
【０３１０】
【表４】
2005534286.tif 000101
【０３１１】
【表５】
2005534286.tif 000102
【０３１２】
【表６】
2005534286.tif 000103
【０３１３】
【表７】
2005534286.tif 000104
【０３１４】
【表８】
2005534286.tif 000105
【０３１５】
【表９】
2005534286.tif 000106
【０３１６】
【表１０】
2005534286.tif 000107
【０３１７】
【表１１】
2005534286.tif 000108
【０３１８】
【表１２】
2005534286.tif 000109
【０３１９】
【表１３】
2005534286.tif 000110
【０３２０】
【表１４】
2005534286.tif 000111
【０３２１】
【表１５】
2005534286.tif 000112
【０３２２】
【表１６】
2005534286.tif 000113
【０３２３】
【表１７】
2005534286.tif 000114
【０３２４】
【表１８】
2005534286.tif 000115
【０３２５】
【表１９】
2005534286.tif 000116
【０３２６】
【表２０】
2005534286.tif 000117
【０３２７】
【表２１】
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【０３２８】
【表２２】
2005534286.tif 000119
【０３２９】
【表２３】
2005534286.tif 000120
【０３３０】
【表２４】
2005534286.tif 000121
【０３３１】
【表２５】
2005534286.tif 000122
【０３３２】
【表２６】
2005534286.tif 000123
【０３３３】
【表２７】
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【０３３４】
【表２８】
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【０３３５】
【表２９】
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【０３３６】
【表３０】
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【０３３７】
【表３１】
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【０３３８】
【表３２】
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【０３３９】
【表３３】
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【０３４０】
【表３４】
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【０３４１】
【表３５】
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【０３４２】
【表３６】
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【０３４３】
【表３７】
2005534286.tif 000134
【０３４４】
【表３８】
2005534286.tif 000135
【０３４５】
【表３９】
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【０３４６】
【表４０】
2005534286.tif 000137
【０３４７】
【表４１】
2005534286.tif 000138
【０３４８】
【表４２】
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【０３４９】
【表４３】
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【０３５０】
【表４４】
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【０３５１】
【表４５】
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【０３５２】
【表４６】
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【０３５３】
【表４７】
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【０３５４】
【表４８】
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【０３５５】
【表４９】
2005534286.tif 000146
【０３５６】
【表５０】
2005534286.tif 000147
【０３５７】
【表５１】
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【０３５８】
【表５２】
2005534286.tif 000149
【０３５９】
【表５３】
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【０３６０】
【表５４】
2005534286.tif 000151
【０３６１】
【表５５】
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【０３６２】
【表５６】
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【０３６３】
【表５７】
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【０３６４】
【表５８】
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【０３６５】
【表５９】
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【０３６６】
【表６０】
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【０３６７】
【表６１】
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【０３６８】
【表６２】
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【０３６９】
【表６３】
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【０３７０】
【表６４】
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【０３７１】
【表６５】
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【０３７２】
【表６６】
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【０３７３】
【表６７】
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【０３７４】
【表６８】
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【０３７５】
【表６９】
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【０３７６】
【表７０】
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【０３７７】
【表７１】
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【０３７８】
【表７２】
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【０３７９】
【表７３】
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【０３８０】
【表７４】
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【０３８１】
【表７５】
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【０３８２】
【表７６】
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【０３８３】
【表７７】
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【０３８４】
【表７８】
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【０３８５】
【表７９】
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【０３８６】
【表８０】
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【０３８７】
【表８１】
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【０３８８】
【表８２】
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【０３８９】
【表８３】
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【０３９０】
【表８４】
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【０３９１】
【表８５】
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【０３９２】
【表８６】
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【０３９３】
【表８７】
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【０３９４】
【表８８】
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【０３９５】
【表８９】
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【０３９６】
【表９０】
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【０３９７】
【表９１】
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【０３９８】
【表９２】
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【０３９９】
【表９３】
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【図面の簡単な説明】
【０４００】
【図１】図１は、プロテインキナーゼインヒビター候補の同定のための、基礎的な繋留アプローチの略図である。
【図２】図２は、プロテインキナーゼインヒビター候補の同定のための、静的拡張型繋留アプローチの略図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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