(57)【要約】本発明は、流体力学の分野に関する。より詳細には、本発明は、実質的に二次元のアレイにおいて、並行して、高密度充填された独立した化学反応を行うための方法および装置に関する。従って、本発明はまた、ＤＮＡ配列決定（最も好ましくは、ピロ配列決定）およびＤＮＡ増幅のような適用のためのこのアレイの使用に焦点を当てる。本発明の技術は、反応部位、マイクロリアクターおよび反応ウェルの高密度な二次元充填を提供するのみならず、拡散単独によってではない対流流動による効率的な試薬の送達および生成物の取り出しを提供する。この後者の特徴によって、先行技術で記載された方法および装置を使用してこれまでに可能であったものよりも、はるかにより迅速な試薬および他の反応補助剤の送達が可能となり、そしてこれにより、反応生成物および副産物のより高速かつより完全な取り出しが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＭＲＡであって、以下：
（ａ）開口マイクロチャネルまたは開口マイクロウェルのアレイを含むマイクロリアクター要素であって、該マイクロチャネルまたは該マイクロウェルの長手方向の軸は実質的に平行様式で配置されている、マイクロリアクター要素；および
（ｂ）該マイクロチャネルまたは該マイクロウェルに対する底部を形成するように、該マイクロリアクター要素と接触し、それにより一連の反応チャンバーを規定する、多孔性フィルター要素であって、ここで該多孔性フィルター要素は、該多孔性フィルター要素を横切る核酸、タンパク質およびビーズの通過をブロックするが、該多孔性フィルター要素を横切る低分子量溶質、有機溶媒および水の通過は許容する選択透過性膜を含む、多孔性フィルター要素、
を備える、ＣＭＲＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＣＭＲＡであって、前記マイクロリアクター要素が、融着延伸型光ファイバー束から形成されるプレートを含み、ここで前記マイクロチャネルは、該プレートの上部表面から該プレートの底部表面まで伸長する、ＣＭＲＡ。
【請求項３】
前記マイクロリアクター要素と前記多孔性フィルター要素との間にさらなる多孔性支持体をさらに含む、請求項１に記載のＣＭＲＡ。
【請求項４】
前記多孔性フィルター要素が限外濾過膜を含む、請求項１に記載のＣＭＲＡ。
【請求項５】
前記マイクロリアクター要素の複数の前記マイクロチャネルの各々に配置された、少なくとも１つの可動性固体支持体をさらに含む、請求項１に記載のＣＭＲＡ。
【請求項６】
前記可動性固体支持体がビーズである、請求項５に記載のＣＭＲＡ。
【請求項７】
前記可動性固体支持体が、該支持体上に固定された酵素および／または核酸を有する、請求項１または請求項６に記載のＣＭＲＡ。
【請求項８】
請求項１に記載のＣＭＲＡを製造する方法であって、該方法は、多孔性フィルター要素にマイクロリアクター要素を装着する工程を包含する、方法。
【請求項９】
多孔性フィルター要素を含むＵＭＲＡであって、該多孔性フィルター要素に対して、濃度分極によって分子が濃縮され、ここで別個の反応チャンバーは、該多孔性フィルター要素の上部または内部の別個の部位に反応物分子を沈着することによって、該多孔性フィルター要素の表面上または内部の別個の位置に形成される、ＵＭＲＡ。
【請求項１０】
請求項９に記載のＵＭＲＡであって、前記反応チャンバーは、可動性固体支持体を前記多孔性要素の表面上または内部に配置することによって形成され、該可動性固体支持体は、該可動性固体支持体上に固定された前記反応物分子を有する、ＵＭＲＡ。
【請求項１１】
前記多孔性フィルター要素が限外濾過膜を含む、請求項９に記載のＵＭＲＡ。
【請求項１２】
前記可動性固体支持体がビーズである、請求項９に記載のＵＭＲＡ。
【請求項１３】
前記可動性固体支持体が、該支持体上に固定された酵素および／または核酸を有する、請求項１０または請求項１２に記載のＵＭＲＡ。
【請求項１４】
ＵＭＲＡであって、以下：
（ａ）多孔性膜であって、該多孔性膜は、可動性固体支持体を該多孔性膜の表面上または内部に沈着することによって形成される別個の反応部位を有し、該可動性固体支持体は、該可動性固体支持体上に前記反応物分子を有する、多孔性膜；
（ｂ）固体支持体に固定された核酸テンプレート；および
（ｃ）必要に応じて存在する、少なくとも１つの固定される酵素、
を備える、ＵＭＲＡ。
【請求項１５】
前記可動性固体支持体がビーズである、請求項１４に記載のＵＭＲＡ。
【請求項１６】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項１４に記載のＵＭＲＡ。
【請求項１７】
前記多孔性膜が織繊維製である、請求項１４に記載のＵＭＲＡ。
【請求項１８】
前記多孔性膜の孔が少なくとも０．０２μｍのサイズを有する、請求項１４に記載のＵＭＲＡ。
【請求項１９】
前記固体支持体が、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される、請求項１に記載のＵＭＲＡ。
【請求項２０】
前記固定される酵素が、ビーズまたは前記多孔性膜に固定される、請求項１４に記載のＵＭＲＡ。
【請求項２１】
前記固定される酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項１４に記載のＵＭＲＡ。
【請求項２２】
アレイであって、以下：
（ａ）第１多孔性膜であって、該第１多孔性膜は、該膜の上部および／または内部に配置された複数の別個の反応部位を有し、ここで各反応部位は、表面に付着された固定されたテンプレートを有する、第１多孔性膜；ならびに
（ｂ）第２多孔性膜であって、該第２多孔性膜は、該膜の表面上および／または内部に位置づけられる少なくとも１つの酵素を有し、ここで該第２多孔性膜は、該第１多孔性膜と直接接触している、第２多孔性膜、
を備える、アレイ。
【請求項２３】
前記第１膜または前記第２膜がナイロン膜である、請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２４】
前記多孔性膜が織繊維製である、請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２５】
前記の各反応部位が、前記多孔性膜の孔によって規定される、請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２６】
前記第１多孔性膜および前記第２多孔性膜が、少なくとも０．２μｍの孔サイズを有する、請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２７】
前記テンプレートが、ビーズまたは前記多孔性膜に固定される、請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２８】
前記酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項２２に記載のアレイ。
【請求項２９】
多孔性フィルターまたは多孔性膜に接続された開口マイクロチャネルまたは開口マイクロウェルのアレイを含む、ＣＭＲＡ。
【請求項３０】
機械的支持体をさらに含む請求項２９に記載のＣＭＲＡであって、ここで該機械的支持体は、前記マイクロチャネルを前記多孔性膜から分離させる、ＣＭＲＡ。
【請求項３１】
前記機械的支持体が、プラスチックメッシュ、ワイヤスクリーン、または成型されたスペーサーもしくは機械加工されたスペーサーからなる群より選択される、請求項３０に記載のＣＭＲＡ。
【請求項３２】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項２９に記載のＣＭＲＡ。
【請求項３３】
前記多孔性膜が織繊維製である、請求項２９に記載のＣＭＲＡ。
【請求項３４】
前記膜の孔サイズが少なくとも０．０２μｍである、請求項２９に記載のＣＭＲＡ。
【請求項３５】
前記マイクロチャネルが、濃度分極によって形成される、請求項２９に記載のＣＭＲＡ。
【請求項３６】
テンプレート核酸ポリマーの核酸配列を決定するための装置であって、以下：
（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；
（ｂ）別個の反応部位にテンプレート核酸ポリマーを導入するための、核酸送達手段；
（ｃ）重合化環境を作製するために該反応部位に試薬を送達するための核酸送達手段であって、該重合化環境において、該核酸ポリマーは、ヌクレオチドを添加した場合に相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして機能する、核酸送達手段；
（ｄ）多孔性膜に試薬を固定するための、対流流動送達手段；
（ｅ）酵素的に無機ピロリン酸の形成を検出するための、検出手段；ならびに
（ｆ）該相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体を決定し、それにより該テンプレートポリマーの配列を決定するための、データ処理手段、
を備える、装置。
【請求項３７】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記ナイロン膜が織繊維製である、請求項３６に記載の装置。
【請求項３９】
前記孔サイズが少なくとも０．０２μｍである、請求項３６に記載の装置。
【請求項４０】
前記別個の反応部位が、濃度分極によって形成される、請求項３６に記載の装置。
【請求項４１】
前記対流流動送達手段がシリンジまたは蠕動ポンプである、請求項３６に記載の装置。
【請求項４２】
前記テンプレート核酸が固体支持体に結合される、請求項３６に記載の装置。
【請求項４３】
前記固体支持体が、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
無機ピロリン酸を検出する前記酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項３６に記載の装置。
【請求項４５】
前記検出手段がＣＣＤカメラである、請求項３６に記載の装置。
【請求項４６】
前記データ処理手段がコンピューターである、請求項３６に記載の装置。
【請求項４７】
複数の分析物を処理するための装置であって、該装置は、以下：
（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；
（ｂ）１つ以上のリザバーからフローチャンバーに処理試薬を送達するための流体手段であって、その結果、該フローチャンバー内に配置された分析物は該試薬に曝露される、流体手段；および
（ｃ）各反応部位からの光学シグナルのシーケンスを検出するための検出手段であって、該シーケンスの各光学シグナルは、該反応部位に配置された処理試薬と該分析物との間における相互作用の指標となり、ここで該検出手段は該反応部位と接続している、検出手段、
を備える、装置。
【請求項４８】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項４７に記載の装置。
【請求項４９】
前記孔サイズが少なくとも０．０２μｍである、請求項４７に記載の装置。
【請求項５０】
テンプレート核酸が固体支持体に結合される、請求項４７に記載の装置。
【請求項５１】
前記固体支持体が、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される、請求項５０に記載の装置。
【請求項５２】
対流流動送達手段が蠕動ポンプである、請求項４７に記載の装置。
【請求項５３】
無機ピロリン酸を検出する酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項４７に記載の装置。
【請求項５４】
前記検出手段がＣＣＤカメラである、請求項４７に記載の装置。
【請求項５５】
前記データ処理手段がコンピューターである、請求項４７に記載の装置。
【請求項５６】
アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置であって、該装置は以下：
（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；
（ｂ）各反応部位に対する反応混合物に１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオチド５’三リン酸前駆体を添加するための試薬送達手段であって、各反応混合物は、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼと一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートとを含み、該一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートは、プライマー鎖の３’末端で各テンプレートにおいて各テンプレート中に少なくとも１つの不対ヌクレオチド残基を形成するように、該プライマー鎖の３’末端への活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下で、該テンプレートよりも少なくとも１ヌクレオチド残基短い相補的なオリゴヌクレオチドプライマー鎖に対してハイブリダイズされ、ただし該活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基は、該テンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素性塩基に対して相補的である、試薬送達手段；
（ｃ）該ヌクレオシド５’三リン酸前駆体が該プライマー鎖に取り込まれたか否かを検出するための検出手段であって、ここで該ヌクレオシド５’三リン酸前駆体が取り込まれたことは、該テンプレートの不対ヌクレオチド残基が、該取り込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基組成と相補的な窒素性塩基組成を有することを示す、検出手段；
（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を連続して繰り返すための手段であって、ここで各々の連続的な繰り返しが、既知の窒素性塩基組成の１つの型の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを付加し、そして該取り込みを検出する、手段；ならびに
（ｅ）各反応チャンバーにおいて、該ヌクレオシド前駆体を取り込んだ配列から該テンプレートの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定するための、データ処理手段、
を備える、装置。
【請求項５７】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項５６に記載の装置。
【請求項５８】
前記孔サイズが少なくとも０．０２μｍである、請求項５３に記載の装置。
【請求項５９】
前記テンプレート核酸が固体支持体に結合される、請求項５３に記載の装置。
【請求項６０】
前記固体支持体が、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される、請求項５９に記載の装置。
【請求項６１】
対流流動送達手段が蠕動ポンプである、請求項５３に記載の装置。
【請求項６２】
無機ピロリン酸を検出する酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項５３に記載の装置。
【請求項６３】
前記検出手段がＣＣＤカメラである、請求項５３に記載の装置。
【請求項６４】
前記データ処理手段がコンピューターである、請求項５３に記載の装置。
【請求項６５】
テンプレート核酸ポリマーの核酸配列を決定するための装置であって、以下：
（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；
（ｂ）反応部位にテンプレート核酸ポリマーを導入するための、核酸送達手段；
（ｃ）重合化環境を作製するために反応チャンバーに試薬を送達するための核酸送達手段であって、該重合化環境において、該核酸ポリマーは、ヌクレオチドを添加した場合に相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして機能する、核酸送達手段；
（ｄ）一連の供給材料を該重合化環境に連続的に提供するための試薬送達手段であって、各供給材料は、該相補的な核酸ポリマーを形成するヌクレオチドのなかから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、該供給材料中のヌクレオチドが、配列決定されるべきテンプレートポリマーにおける次のヌクレオチドに対して相補的な場合に、該ヌクレオチドは該相補的ポリマーに取り込まれ、そして無機ピロリン酸が放出される、試薬送達手段；
（ｅ）酵素的に無機ピロリン酸の形成を検出するための、検出手段；ならびに
（ｆ）該相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体を決定し、それにより該テンプレートポリマーの配列を決定するための、データ処理手段、
を備える、装置。
【請求項６６】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項６５に記載の装置。
【請求項６７】
前記孔サイズが少なくとも０．０２μｍである、請求項６５に記載の装置。
【請求項６８】
前記テンプレート核酸が固体支持体に結合される、請求項６５に記載の装置。
【請求項６９】
前記固体支持体が、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される、請求項６８に記載の装置。
【請求項７０】
対流流動送達手段が蠕動ポンプである、請求項６５に記載の装置。
【請求項７１】
無機ピロリン酸を検出する前記酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項６５に記載の装置。
【請求項７２】
前記検出手段がＣＣＤカメラである、請求項６５に記載の装置。
【請求項７３】
前記データ処理手段がコンピューターである、請求項６５に記載の装置。
【請求項７４】
核酸を配列決定するためのシステムであって、以下の構成要素：
（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；
（ｂ）固体支持体に固定された少なくとも１つの酵素；
（ｃ）多孔性膜に試薬を流動させるための手段；
（ｄ）検出のための手段；および
（ｅ）核酸の配列を決定するための手段、
を備える、システム。
【請求項７５】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７６】
前記多孔性膜が、少なくとも０．０２μｍである孔サイズを有する、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７７】
反応部位が、濃度分極によって形成される、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７８】
前記固定された酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項７４に記載のシステム。
【請求項７９】
前記固体支持体が、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される、請求項７４に記載のシステム。
【請求項８０】
前記検出のための手段がＣＣＤカメラである、請求項７４に記載のシステム。
【請求項８１】
前記配列を決定するための手段が、ピロリン酸配列決定による、請求項７４に記載のシステム。
【請求項８２】
核酸を配列決定するためのシステムであって、以下の構成要素：
（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；
（ｂ）固体支持体に固定された少なくとも１つの酵素；
（ｃ）多孔性膜に試薬を流動させるための手段；
（ｄ）酵素的検出のための手段；および
（ｅ）核酸の配列を決定するための手段、
を備える、システム。
【請求項８３】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８４】
前記多孔性膜が、少なくとも０．０２μｍである孔サイズを有する、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８５】
反応部位が、濃度分極によって形成される、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８６】
前記固定された酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８７】
前記固体支持体が、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８８】
前記検出のための手段がＣＣＤカメラである、請求項８２に記載のシステム。
【請求項８９】
前記配列を決定するための手段が、ピロリン酸配列決定による、請求項８２に記載のシステム。
【請求項９０】
水性環境において別々の並行した独立した反応を実施するための方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のＣＭＲＡまたは請求項９に記載のＵＭＲＡを使用して、少なくとも１つの試薬を含む流体をアレイに送達する工程であって、ここで各反応部位は物質中に埋没されており、その結果、該流体を各反応部位に送達する場合に、該流体は、隣接部位に拡散しない、工程；
（ｂ）出発材料を該試薬と反応させて各反応部位において生成物を形成させた後の時間において、該アレイから該流体を流し去る工程；
（ｃ）連続的に工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項９１】
請求項９０に記載の方法であって、任意の１つの反応チャンバーにおいて形成される生成物は、任意の他の反応チャンバーにおいて形成される生成物とは独立しているが、該生成物は、１つ以上の共通の試薬を使用して生成される、方法。
【請求項９２】
前記出発材料が核酸配列であり、そして前記流体中の少なくとも１つの試薬が、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記流体がさらに、前記核酸配列と、前記ヌクレオチドまたは前記ヌクレオチドアナログとを反応させ得るポリメラーゼを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
連続的に工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程をさらに包含する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記物質が鉱油である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
前記反応部位が、濃度分極によって規定される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
アレイ様式でヌクレオチドの塩基配列を決定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡに局在化された複数の反応部位に対して、１つの既知の窒素性塩基組成の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体を添加する工程であって、ここで該反応部位は、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼと一本鎖テンプレートの不均一集団とからなり、該一本鎖テンプレートの不均一集団は、プライマー鎖の３’末端で各テンプレートにおいて少なくとも１つの不対ヌクレオチド残基を形成するように、該プライマー鎖の３’末端への活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下において、該プライマー鎖の３’末端への活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下で、該テンプレートよりも少なくとも１ヌクレオチド残基短い相補的なオリゴヌクレオチドプライマー鎖に対してハイブリダイズされ、ただし該活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基は、該テンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素性塩基に対して相補的である、工程；
（ｂ）該ヌクレオシド５’三リン酸前駆体が該プライマー鎖に取り込まれたか否かを検出する工程であって、ここで該ヌクレオシド５’三リン酸前駆体が取り込まれたことは、該テンプレートの不対ヌクレオチド残基が、該取り込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基組成と相補的な窒素性塩基組成を有することを示す、工程；ならびに
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を連続して繰り返す工程であって、ここで各々の連続的な繰り返しが、既知の窒素性塩基組成の１つの型の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを付加し、そして該取り込みを検出する、工程；
（ｄ）該ヌクレオシド前駆体を取り込んだ配列から該テンプレートの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９８】
前記活性化前駆体の取り込みの検出が、酵素的に達成される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記酵素が、固体支持体に固定されている、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記固体支持体が、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
アレイにおいて複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供する工程であって、各々は、ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ上の複数の反応部位に配置される、工程；
（ｂ）複数の反応部位から発光される光のレベルを、光学的感応性デバイスのそれぞれの比率で検出する工程；
（ｃ）該光学的感応性デバイスの部分の各々に当たる光を、その他のすべての領域に由来するシグナルから識別可能な電気的シグナルへと変換する工程；
（ｄ）対応する電気的シグナルから該別個の領域の各々についての光強度を決定する工程；
（ｅ）経時的に該電気的シグナルの変動を記録する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０３】
前記多孔性膜がナイロン膜である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記孔サイズが少なくとも０．２μｍである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記検出が酵素的に実施される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記酵素が、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項１０５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、多孔性フィルターを含む実質的に二次元のアレイにおいて、並行して、高密度充填された独立した化学反応を行うための方法および装置を記載する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ハイスループットの化学合成および分析は、人類が試みをなす多くの領域について、特に、材料科学、コンビナトリアル化学、薬学（薬物の合成および試験）、およびバイオテクノロジー（ＤＮＡ配列決定、遺伝子型決定）の分野において、急速に成長しつつある技術区分である。
【０００３】
任意のこのようなプロセスにおいてスループットを高めるには、律速工程を加速することに重点を置いて、そのプロセスの個々の工程をより迅速に実施すること、またはより多くの数の独立した工程を並行して実施することのいずれかを必要とする。ハイスループット様式で化学反応を行うためのアプローチの例としては、以下：
・反応または関連した処理工程をより迅速に実施すること：
・触媒を添加すること
・より高い温度で反応を実施すること
・より多くの数の独立した工程を並行して実施すること：
・多重リアクター系を用いて、同時に独立した反応を行うこと
のような技術が挙げられる。
【０００４】
ハイスループットで並行した反応を行うための一般的な形式は、個々のリアクター容器の二次元（２−Ｄ）アレイ（例えば、分子生物学、細胞生物学および他の領域において広範に使用される、９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロタイタープレート）を含む。個々の試薬、溶媒、触媒などは、これらのアレイの適切なウェルに連続的におよび／または並行して添加され、そしてその後、複数の反応が並行して進行する。個々のウェルはさらに、密閉手段（例えば、ぴったりと閉まるカバー、または接着性プラスチックシート）によって、隣接したウェルおよび／または環境から隔離され得るか、あるいは個々のウェルは、開放されたままであり得る。このようなマイクロタイタープレートのウェルの底面は、種々の孔サイズのフィルターを取り付けられていても、取り付けられていなくてもよい。ロボット工学の広範な適用は、試薬の添加、補充の処理工程、ならびに反応のモニタリングの速度および信頼度を著しく高め−従って、スループットを著しく高めている。
【０００５】
このような２−Ｄアレイに組み込まれるマイクロリアクターまたはマイクロリアクターの数をさらに増加させることが、多くの研究の焦点となっており、そしてこれは、小型化によって達成されてきており、そして達成されつつある。例えば、プラスチックマイクロタイタープレートに成型され得るウェルの数は、ここ数年で着実に増加した−−９６個から、３８４個まで、そして現在、１５３６個まで。ウェルの密度をさらに高める試みが進行中である（例えば、ＭａｔｓｕｄａおよびＣｈｕｎｇ，１９９４；Ｍｉｃｈａｅｌら，１９９８；ＴａｙｌｏｒおよびＷａｌｔ，１９９８）。
【０００６】
マイクロリアクターとして使用するためのマイクロウェルおよびマイクロリアクターのアレイを作製する試み（マイクロエレクトロニクス産業のためにもともと開発された、マイクロ製造技術のいくつかを適用および導入（ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ）すること）もまた、マイクロ電気機械的システムおよびマイクロ機械加工システムの領域における開発の焦点となっている（ＭａｔｓｕｄａおよびＣｈｕｎｇ，１９９４；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，１９９７；Ｍａｄｏｕ，１９９７；Ｃｈｅｒｕｋｕｒｉら，１９９９；Ｋａｎｅら，１９９９；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，２０００；Ｄａｎｎｏｕｘら，２０００；Ｄｅｎｇら，２０００；Ｚｈｕら，２０００；Ｅｈｒｆｅｌｄら，２０００を参照のこと）。
【０００７】
小型化されかつ独立している反応を並行して実行するためのなお別の広範に適用されるアプローチは、化学反応に関与する物の少なくともいくつかを、表面上において空間的に局在化させるかまたは固定化し、そのようにして、固定された試薬の大きな２−Ｄアレイを作製することを含む。このような様式で固定される試薬としては、化学反応物、触媒、他の反応補助物質、および相補的な分子に選択的に結合し得る吸着分子が挙げられる（本特許明細書の目的のために、１つの分子が別の分子に選択的に結合することは、それが可逆的であろうと不可逆的であろうと、反応プロセスと呼び、そしてこのような様式で結合し得る分子を反応物という。）。固定化は、かなり多数の基材（平らな表面および／または高い表面積の、そして時には、多孔性の支持媒体（例えば、ビーズまたはゲル）を含む）において生じるように進められ得る。平らな表面における固定化に関するマイクロアレイ技術は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのために（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．により）、および標的薬物のために（例えば、Ｇｒａｆｆｉｎｉｔｙ  ＡＢにより）市販されている。
【０００８】
局所化された反応のための微視的な個別の中心を作製することに対する主な障壁は、単一の所望される反応中心に、独特な反応物および生成物を制限することがしばしば困難である点である。この問題には２つの側面が存在する。第１は、「独特」な試薬（すなわち、１つの反応中心と別の反応中心とで異なることを意味される反応物および他の反応補助物質）は、特定の反応中心に分配またはさもなくば配置されなければならないが、そのすぐ近くの近隣には分配も配置もされてはならないという点である（このような「独特」な試薬は、溶媒のような「共通」の試薬（これはしばしば、同時にかつ並行して実質的に全ての反応中心と接触するようにされることを意味される）とは識別され得る）。この問題の第２の側面は、反応生成物がその反応生成物を作製した反応中心の近傍に制限されながら実行されなければならないということ（すなわち、その反応生成物が、反応の忠実度の付帯的損失を伴って他の反応中心へと移動することを防止すること）である。
【０００９】
指向された試薬の添加に関する問題にまず焦点を当てると、反応中心が、個別のマイクロウェル（隣接するマイクロウェルとの流体接触を防止するように設計されたマイクロリアクター壁（および提供される場合には、カバー））からなる場合、個々のマイクロウェルへの試薬の送達は、特にウェルがとりわけ小さい場合に、困難であり得る。例えば、１００μｍ×１００μｍ×１００μｍの長さを有するリアクターは、わずか１ナノリットルの容量しか有さない−−そしてこれは、多くの型の適用において比較的大きなリアクター容量とみなされ得る。そのような場合でも、この場合における試薬の添加は、ナノリットル以下の容量を、少なくとも±５０μｍの空間的な分解能および精度で分配することを必要する。さらに、複数のウェルへの試薬の添加は、並行して行われるようになされなければならない。なぜなら、１度にせいぜい数個のリアクターに試薬を連続的に添加するのでは、ひどく時間がかかるからである。このような優れた精度で試薬を並行して添加するスキームは存在するが、それらはいくらかの付加的な複雑度と費用とを必要とする。例えば、表面にナノリットル以下のサイズの液滴を送達するためのインクジェットプリント技術の使用は、広範に検討および開発されている（Ｇａｍｂｌｅら，１９９９；Ｈｕｇｈｅｓら，２００１；Ｒｏｓｅｔｔａ，Ｉｎｃ．；Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｉｎｃ．）。しかし、このような少量のサンプルの蒸発は、注意深い湿度の制御を必要とするという重大な問題を残している。
【００１０】
他方、反応中心が、共通の液体と接触するようになる場合、例えば、マイクロウェルがすべて、反応工程または引き続く処理工程の間のいくつかの時点で共通の容量の液体に開かれた状態になる場合、１つの反応マイクロウェルまたは容器に由来する反応生成物（ならびに、過剰および／または未変換の反応物）は、隣接する反応マイクロウェルに移動し得、そして汚染し得る。このような反応中心の相互汚染は、（ｉ）１つのウェルの近傍から別のウェルへの、反応物および生成物を含む溶液のバルク対流を介して、（ｉｉ）反応物種および／または生成物種の拡散（特に、合理的な短い距離にわたって）によって、あるいは（ｉｉｉ）同時に起こる両方のプロセスによって、起こり得る。別個の反応中心で生成される個々の化合物自体が、そのプロセスで所望される目標物である場合（例えば、コンビナトリアル化学における場合のように）、別個の化合物のこの「ライブラリー」の収量および究極的な化学的純度は、起こり得る任意の反応物および／または生成物の相互汚染の結果として影響を受ける。他方、反応プロセスが、いくつかの型の情報（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子の配列または組成に関する情報）を得ることを目的として行われる場合、その情報の整合性、忠実度およびシグナル対ノイズ比は、隣接するマイクロウェルとの間またはさらに遠いマイクロウェルとの間における化学的な「クロストーク」によって損なわれ得る。
【００１１】
バルク液体（例えば、共通の試薬または洗浄溶媒を含む溶液）と接触した二次元の平面的な反応部位のアレイの場合を考慮し、そして特定の反応部位における化学に関与する少なくとも１つの反応物および／または生成物が、そのバルク液体に可溶性であることを仮定する（あるいは、共通の液体にすべて開かれた状態にあるマイクロリアクターのアレイの場合であって；分析物が類似している場合を考慮されたい）。バルク液体の対流流動が無い場合、反応関与物の輸送（および隣接する反応部位またはマイクロリアクターとの間における相互汚染または「クロストーク」）は、拡散によってのみ起こり得る。反応部位を、２−Ｄ表面上の点源とみなす場合、目的の化学種（例えば、反応生成物）は、その生成の部位から放射状に拡散して、その表面上に実質的に半球状の濃度の場を作成する（図１を参照のこと）。
【００１２】
任意の所定時間ｔに化学的実体が拡散し得る距離は、拡散の数理（Ｃｒａｎｋ、１９７５）を考慮することによって、おおまかな様式で推定され得る。任意の所定の方向ｘ（ｃｍ）における拡散輸送の速度は、以下のようなＦｉｃｋの法則によって与えられる：
【００１３】
【数１】
2005520484.tif 000002
式１
ここで、ｊは、拡散係数Ｄ（ｃｍ２／ｓ）を有する種の単位面積あたりのフラックス（ｇ−ｍｏｌ／ｃｍ２−ｓ）であり、そして
【００１４】
【数２】
2005520484.tif 000003
は、その種の濃度勾配である。拡散の数理は、ある実体が拡散単独によって移動し得る特性距離または「平均」距離を、拡散係数と拡散を起こすのを可能にする時間との両方の１／２乗で測るようなものである。実際、大きさの次数（ｏｒｄｅｒ）に対して、この特性拡散距離は、拡散係数と時間との積の平方根として推定され得−システムの幾何学ならびに拡散プロセスに課される初期条件および／または境界条件の詳細を考慮した次数統一の多数の要因によって調整される。
【００１５】
この特性拡散距離を、拡散する実体が時間ｔにおいて移動し得る平方自乗平均距離ｄｒｍｓとして推定すると都合が良い：
【００１６】
【数３】
2005520484.tif 000004
式２。
【００１７】
上述のように、拡散する化学物質が代表的に移動する距離は、それが拡散するために利用可能な時間の平方根に応じて変動し、そして逆に、拡散する化学物質が所定の距離を移動するために必要とされる時間は、拡散によって移動される距離の平方によって測定される。従って、１・１０−５ｃｍ２／ｓの次数の拡散係数Ｄによって特徴付けられる単純な低分子量の生体分子について、０．１ｓ、１．０ｓ、２．０ｓおよび１０ｓの時間間隔において横断され得る平方自乗平均拡散距離ｄｒｍｓは、式２によって、それぞれ、１４μｍ、４５μｍ、６３μｍ、および１４１μｍとして推定される。
【００１８】
このような条件は、１つのマイクロウェルまたは反応部位から隣接するウェルまたは部位への化学物質の拡散（従って、相互汚染）を最小化する場合に、２−Ｄ表面上に配置され得るマイクロウェルまたは反応部位の表面密度または単位面積あたりの数に対して上限を与える。より詳細には、種の拡散率および拡散に利用可能な時間を、ｄｒｍｓが式２で推定されるような特性拡散距離であるようなものとして仮定すると、隣接するマイクロウェルまたは反応部位は、それらの間における反応関与物の拡散を最小限に維持しようとする場合に、この距離ｄｒｍｓの分数以上に互いに離れるように隔てられ得ることが明らかである。次いで、これは、２−Ｄ表面上に配置され得る反応部位の数に制限を与える。隣接するマイクロウェルまたは反応部位における拡散種の実際の濃度のより詳細な算出は、−分析的方法または数的方法のいずれかで−適切な初期条件および境界条件に供された非定常状態拡散を記述する部分的に示差的な方程式を解くことによって実施され得る（Ｃｒａｎｋ、１９７５）。しかし、本明細書中に提供される大きさの分析の次数は、付近の反応中心からの化学的クロストークの危険も汚染の危険もない高密度様式で、複数の並行した反応を独立して行う場合に解決されなければならない問題の大きさを例示するのに十分である。
【００１９】
付近の反応中心またはマイクロウェルで生成された化学的生成物による反応中心またはウェルの汚染の問題は、反応部位が、液体が流動する２−Ｄ表面上に整列される（または、ウェルが、本質的に二次元のマイクロタイタープレートにおいて整列される）場合に、さらにより問題となる（再び、図１を参照のこと）。この場合、表面反応部位またはウェル内で生成された化合物は、その表面からの（または、反応ウェルからの）拡散による輸送的な汲み上げおよび排出を受け、ここでそれらの化合物は引き続いて、アレイの上部表面との流体接続において、フローチャネルを通して通過する流体の対流輸送によって、下流へと流される。
【００２０】
反応部位の間の間隔を減らす（そしてそのようにして、単位面積あたりの数を増加させる）ためのいくつかの選択肢が存在する。例えば、以下の通りである。
【００２１】
（１）別個の反応中心を、例えば、Ｃｈｅｒｕｋｕｒｉら（１９９９）に記載のようにして、「マイクロフルイディクス」アプローチにおいて微視的チューブまたはチャネルと接続し得る。しかし、このアプローチは、複雑なマイクロ製造、マイクロ成分の構築および流体流動の制御を必要とする。
【００２２】
（２）反応中心を、マイクロウェルの底面に配置し得、その結果、ｄｒｍｓを、マイクロウェルの深度＋隣接マイクロウェル間の間隔の合計と比べて、小さくなるように配置する。このようなマイクロウェルは、例えば、マイクロ製造もしくはマイクロプリンティング（例えば、Ａｏｋｉ，１９９２；Ｋａｎｅら，１９９９；Ｄａｎｎｏｕｘら，２０００；Ｄｅｎｇら，２０００；Ｚｈｕら，２０００）によって、または融着延伸型光ファイバー束（ｆｕｓｅｄ  ｆｉｂｅｒ  ｏｐｔｉｃ  ｂｕｎｄｌｅ）の端部をエッチングすること（例えば、ＴａｙｌｏｒおよびＷａｌｔ，２０００；Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．；４５４  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ−−例えば、米国特許第６，２７４，３２０号を参照のこと（全体的に本明細書中で参考として援用される））によって、形成され得る。これらのエッチングされたウェルにおいて、マイクロウェルの上部から底面までの距離は、反応生成物（このエスケープを最小化することが望まれる）によってのみならず、反応物（このアクセスは、妨害されないことが望まれる）によっても同様に横断されなければならない。すなわち、反応がマイクロウェルの底面に制限される場合、反応物は、拡散によってマイクロウェルの上部から底面までの距離を横断しなければならず、このことは潜在的に、反応物の供給速度を低減させ、そしておそらく、反応速度を制限する。
【００２３】
（３）反応中心の間の空間を媒体で充填し得、この媒体中において、拡散する化学物質は低拡散性を有し、そのようにしてその化合物の隣接中心への輸送速度を減少させる。しかしまた、これは複雑度を増し、そして反応部位への反応物のアクセスを妨害（すなわち、緩徐化）し得る。
【００２４】
（４）拡散種が荷電されている場合、例えば、Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．によって例示されるように、拡散に対向するような電場を確立することが可能であり得る。しかし、適切な電極の作製はまた、製造の複雑度を増し、そして電極における電圧の調節は、制御系に複雑度を増す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
（発明の要旨）
実質的に２−Ｄ配置において高密度に充填されたマイクロリアクターについての代替技術を、本明細書に記載する。この技術は、反応部位、マイクロリアクターおよび反応ウェルの高密度な二次元充填を提供するのみならず、拡散単独によってではない対流流動による効率的な試薬の送達および生成物の取り出しを提供する。この後者の特徴によって、先行技術で記載された方法および装置を使用してこれまでに可能であったものよりも、はるかにより迅速な試薬および他の反応補助剤の送達が可能となり、−そしてこれにより、反応生成物および副産物のより高速かつより完全な取り出しが可能となる。
【００２６】
１つの局面では、本発明は、限局型膜リアクターアレイ（ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅａｃｔｏｒ  ａｒｒａｙ）（ＣＭＲＡ）を含む。このＣＭＲＡは、以下を備える：（ａ）開口マイクロチャネルまたは開口マイクロウェルのアレイを含むマイクロリアクター要素であって、このマイクロチャネルまたはマイクロウェルの長手方向の軸は実質的に平行様式で配置される、マイクロリアクター要素、および（ｂ）そのマイクロチャネルまたはマイクロウェルに対する底部を形成するように、そのマイクロリアクター要素と接触し、それにより一連の反応チャンバーを規定する、多孔性フィルター要素であって、ここでこの多孔性フィルター要素は、その多孔性フィルター要素を横切る核酸、タンパク質およびビーズの通過をブロックするが、その多孔性フィルター要素を横切る低分子量溶質、有機溶媒および水の通過は許容する選択透過性膜を含む、多孔性フィルター要素。好ましい実施形態では、このマイクロリアクター要素は、融着延伸型光ファイバー束から形成されるプレートを含み、ここでこのマイクロチャネルは、そのプレートの上部表面からそのプレートの底部表面まで伸長する。別の実施形態では、ＣＭＲＡはさらに、マイクロリアクター要素と多孔性フィルター要素との間にさらなる多孔性支持体を含む。１つの実施形態において、この多孔性フィルター要素は、限外濾過膜を含む。さらなる実施形態において、このＣＭＲＡはさらに、マイクロリアクター要素の複数のマイクロチャネルの各々に配置された、少なくとも１つの可動性固体支持体を含む。この可動性固体支持体はビーズであり得る。好ましい実施形態において、この可動性固体支持体は、その支持体上に固定された酵素および／または核酸を有する。別の局面において、本発明は、ＣＭＲＡを製造する方法を提供し、この方法は、多孔性フィルター要素にマイクロリアクター要素を装着する工程を包含する。
【００２７】
さらなる局面において、本発明は、非限局型膜リアクターアレイ（ｕｎｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅａｃｔｏｒ  ａｒｒａｙ）（ＵＭＲＡ）を含む。このＵＭＲＡは、多孔性フィルター要素を含み、この多孔性フィルター要素に対し、濃度分極によって分子が濃縮され、ここで別個の反応チャンバーは、多孔性フィルター要素の上部またはその内部の別個の部位に反応物分子を沈着することによって、その多孔性フィルター要素の表面上またはその内部の別個の位置に形成される。好ましい実施形態において、反応チャンバーは、可動性固体支持体（この上に固定されたこの反応物分子を有する）を、多孔性要素の表面上または内部に沈着することによって形成される。１つの実施形態において、この多孔性フィルター要素は、限外濾過膜を含む。別の実施形態において、この可動性固体支持体はビーズである。別の実施形態において、この可動性固体支持体は、その支持体上に固定された酵素および／または核酸を有する。
【００２８】
別の局面では、本発明は、以下を備えたＵＭＲＡを含む：（ａ）多孔性膜であって、この多孔性膜は、可動性固体支持体（この可動性固体支持体の上にこの反応物分子を有する）をこの多孔性膜の表面上または内部に沈着することによって形成される別個の反応部位を有する、多孔性膜；（ｂ）固体支持体に固定された核酸テンプレート；および（ｃ）必要に応じて、少なくとも１つの固定される酵素。本明細書中で使用される場合、別個の反応部位との用語は、局在化された反応のための個々の反応中心をいい、これにより、各部位は、隣接した部位の間で相互汚染が存在しないように、独特な反応物および生成物を有する。１つの実施形態において、この可動性固体支持体はビーズである。別の実施形態において、この多孔性膜は、ナイロン膜である。別の実施形態において、この多孔性膜は、織繊維（ｗｏｖｅｎ  ｆｉｂｅｒ）製である。好ましい実施形態において、この多孔性膜は、少なくとも０．０２μｍの孔サイズを有する。別の実施形態において、この固体支持体は、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜からなる群より選択される。別の実施形態において、固定される酵素は、ビーズまたは多孔性膜に固定される。１つの実施形態において、固定される酵素は、ＡＴＰスルフリラーゼ（ＡＴＰ  ｓｕｌｆｕｒｙｌａｓｅ）、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択される。
【００２９】
別の局面において、本発明は、以下を備えたアレイを含む：（ａ）第１多孔性膜であって、この第１多孔性膜は、その上部および／または内部に配置された複数の別個の反応部位を有し、ここで各反応部位は、表面に付着された固定されたテンプレートを有する、第１多孔性膜；ならびに（ｂ）第２多孔性膜であって、この第２多孔性膜は、その膜の表面上および／または内部に位置づけられる少なくとも１つの酵素を有し、ここでこの第２多孔性膜は、上記の第１多孔性膜と直接接触している、第２多孔性膜。
【００３０】
別の局面において、本発明は、多孔性フィルターまたは多孔性膜に接続された開口マイクロチャネルまたは開口マイクロウェルのアレイを含む、ＣＭＲＡを提供する。１つの実施形態において、このＣＭＲＡはさらに機械的支持体を含み、ここでこの機械的支持体は、マイクロチャネルを多孔性膜から分離させる。好ましい実施形態において、この機械的支持体は、プラスチックメッシュ、ワイヤスクリーン（ｗｉｒｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）、または成型もしくは機械加工されたスペーサーからなる群より選択される。
【００３１】
別の局面では、本発明は、テンプレート核酸ポリマーの核酸配列を決定するための装置を包含し、この装置は以下を備える：（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；（ｂ）別個の反応部位にテンプレート核酸ポリマーを導入するための核酸送達手段；（ｃ）重合化環境を作製するために反応部位に試薬を送達するための核酸送達手段であって、この重合化環境において、核酸ポリマーは、ヌクレオチドを添加した場合に相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして機能する、核酸送達手段；（ｄ）多孔性膜に試薬を固定するための対流流動送達手段；（ｅ）酵素的に無機ピロリン酸の形成を検出するための検出手段；ならびに（ｆ）相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体を決定し、それによりテンプレートポリマーの配列を決定するためのデータ処理手段。１つの実施形態において、この検出手段はＣＣＤカメラである。別の実施形態において、このデータ処理手段はコンピューターである。
【００３２】
別の局面において、本発明は、複数の分析物を処理するための装置を提供し、この装置は、以下を備える：（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；（ｂ）１つ以上のリザバーからフローチャンバーに処理試薬を送達するための流体手段であって、その結果、そのフローチャンバー内に配置された分析物はその試薬に曝露される、流体手段；および（ｃ）各反応部位からの光学シグナルのシーケンスを検出するための検出手段であって、このシーケンスの各光学シグナルは、その反応部位に配置された処理試薬と分析物との間における相互作用の指標となり、ここでこの検出手段は反応部位と接続している、検出手段。１つの実施形態において、この対流流動送達手段は、蠕動ポンプである。
【００３３】
別の局面において、本発明は、アレイ上の複数のヌクレオチドの塩基配列を決定するための装置を含み、この装置は以下を備える：（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；（ｂ）各反応部位に対する反応混合物に１つの既知の窒素性塩基の活性化ヌクレオチド５’三リン酸前駆体を添加するための試薬送達手段であって、各反応混合物は、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼと一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートとを含み、この一本鎖ポリヌクレオチドテンプレートは、プライマー鎖の３’末端で各テンプレートにおいて少なくとも１つの不対ヌクレオチド残基を形成するように、そのプライマー鎖の３’末端への活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下で、そのテンプレートよりも少なくとも１ヌクレオチド残基短い相補的なオリゴヌクレオチドプライマー鎖に対してハイブリダイズされ、ただしこの活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基は、そのテンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素性塩基に対して相補的である、試薬送達手段；（ｃ）そのヌクレオシド５’三リン酸前駆体がプライマー鎖に取り込まれたか否かを検出するための検出手段であって、ここでヌクレオシド５’三リン酸前駆体が取り込まれたことは、そのテンプレートの不対ヌクレオチド残基が、その取り込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基組成と相補的な窒素性塩基組成を有することを示す、検出手段；（ｄ）工程（ｂ）および（ｃ）を連続して繰り返すための手段であって、ここで各々の連続的な繰り返しが、既知の窒素性塩基組成の１つの型の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを付加し、そしてそれを検出する、手段；ならびに（ｅ）各反応チャンバーにおいて、上記のヌクレオシド前駆体を取り込んだ配列からテンプレートの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定するためのデータ処理手段。
【００３４】
別の局面において、本発明は、テンプレート核酸ポリマーの核酸配列を決定するための装置を含み、この装置は以下を備える：（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；（ｂ）反応部位にテンプレート核酸ポリマーを導入するための核酸送達手段；（ｃ）重合化環境を作製するために反応チャンバーに試薬を送達するための核酸送達手段であって、この重合化環境において、核酸ポリマーは、ヌクレオチドを添加した場合に相補的核酸ポリマーの合成のためのテンプレートポリマーとして機能する、核酸送達手段；（ｄ）一連の供給材料を重合化環境に連続的に提供するための試薬送達手段であって、各供給材料は、相補的な核酸ポリマーを形成するヌクレオチドのなかから選択されるヌクレオチドを含み、その結果、その供給材料中のヌクレオチドが、配列決定されるべきテンプレートポリマーにおける次のヌクレオチドに対して相補的な場合に、そのヌクレオチドはその相補的ポリマーに取り込まれ、そして無機ピロリン酸が放出される、試薬送達手段；（ｅ）酵素的に無機ピロリン酸の形成を検出するための検出手段；ならびに（ｆ）相補的ポリマー中の各ヌクレオチドの正体を決定し、それによりテンプレートポリマーの配列を決定するためのデータ処理手段。
【００３５】
１つの局面では、本発明は、核酸を配列決定するためのシステムを含み、このシステムは以下の構成要素を備える：（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；（ｂ）固体支持体に固定された少なくとも１つの酵素；（ｃ）上記の多孔性膜に試薬を流動させるための手段；（ｄ）検出のための手段；および（ｅ）核酸の配列を決定するための手段。
【００３６】
さらなる局面において、本発明は、核酸を配列決定するためのシステムを含み、このシステムは、以下の構成要素を備える：（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ；（ｂ）固体支持体に固定された少なくとも１つの酵素；（ｃ）上記の多孔性膜に試薬を流動させるための手段；（ｄ）検出のための手段；および（ｅ）核酸の配列を決定するための手段。
【００３７】
別の局面において、本発明は、水性環境において別々の並行した独立した反応を実施するための方法を提供し、この方法は、以下を包含する：（ａ）特許請求の範囲の請求項１に記載のＣＭＲＡまたは特許請求の範囲の請求項９に記載のＵＭＲＡを使用して、少なくとも１つの試薬を含む流体をアレイに送達する工程であって、ここで各反応部位は物質中に埋没されており、その結果、流体を各反応部位に送達する場合に、その流体は、隣接部位に拡散しない、工程；（ｂ）出発材料を試薬と反応させて各反応部位において生成物を形成させた後の時間において、そのアレイからその流体を流し去る工程；（ｃ）連続的に工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程。１つの実施形態において、任意の１つの反応チャンバーにおいて形成される生成物は、任意の他の反応チャンバーにおいて形成される生成物とは独立しているが、これは、１つ以上の共通の試薬を使用して生成される。別の実施形態において、出発材料は核酸配列であり、そして流体中の少なくとも１つの試薬は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログである。好ましい実施形態において、この流体はさらに、核酸配列とヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログとを反応させ得るポリメラーゼを含む。別の実施形態において、この方法はさらに、連続的に工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程を包含する。１つの実施形態において、上記の物質は、鉱油である。さらなる実施形態において、この反応部位は、濃度分極によって規定される。
【００３８】
１つの局面において、本発明は、アレイ様式でヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を含み、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡに局在化された複数の反応部位に対して、１つの既知の窒素性塩基組成の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体を添加する工程であって、ここでこの反応部位は、テンプレート指向性ヌクレオチドポリメラーゼと一本鎖テンプレートの不均一集団とからなり、該一本鎖テンプレートの不均一集団は、プライマー鎖の３’末端で各テンプレートにおいて少なくとも１つの不対ヌクレオチド残基を形成するように、そのプライマー鎖の３’末端への活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下において、そのプライマー鎖の３’末端への活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを可能にする反応条件下で、そのテンプレートよりも少なくとも１ヌクレオチド残基短い相補的なオリゴヌクレオチドプライマー鎖に対してハイブリダイズされ、ただしこの活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基は、そのテンプレートの不対ヌクレオチド残基の窒素性塩基に対して相補的である、工程；（ｂ）そのヌクレオシド５’三リン酸前駆体がプライマー鎖に取り込まれたか否かを検出する工程であって、ここでヌクレオシド５’三リン酸前駆体が取り込まれたことは、そのテンプレートの不対ヌクレオチド残基が、その取り込まれたヌクレオシド５’三リン酸前駆体の窒素性塩基組成と相補的な窒素性塩基組成を有することを示す、工程；ならびに（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を連続して繰り返す工程であって、ここで各々の連続的な繰り返しが、既知の窒素性塩基組成の１つの型の活性化ヌクレオシド５’三リン酸前駆体の取り込みを付加し、そしてそれを検出する、工程；（ｄ）上記のヌクレオシド前駆体を取り込んだ配列からテンプレートの不対ヌクレオチド残基の塩基配列を決定する工程。
【００３９】
好ましい実施形態において、活性化された前駆体の取り込みの検出は、酵素的に達成される。利用される酵素は、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、この酵素は、固体支持体に固定される。別の実施形態において、この固体支持体は、ビーズ、ガラス表面、光ファイバー、または多孔性膜を含む群より選択される。
【００４０】
さらなる局面において、本発明は、アレイにおいて複数のヌクレオチドの塩基配列を決定する方法を含み、この方法は以下を包含する：（ａ）複数のサンプルＤＮＡを提供する工程であって、各々は、ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ上の複数の反応部位に配置される、工程；（ｂ）複数の反応部位から発光される光のレベルを、光学的感応性デバイスのそれぞれの比率で検出する工程；（ｃ）この光学的感応性デバイスの部分の各々に当たる光を、その他のすべての領域に由来するシグナルから識別可能な電気的シグナルへと変換する工程；（ｄ）対応する電気的シグナルからこの別個の領域の各々についての光強度を決定する工程；（ｅ）経時的にこの電気的シグナルの変動を記録する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
実質的に二次元の配置にある別個の反応部位、マイクロリアクター容器および／またはマイクロウェルの高密度アレイ（図２を参照のこと）を提供するための方法および装置、ならびに、反応部位またはマイクロリアクターのアレイの平面に対して垂直でありかつそのアレイを通過する流体の対流流動をもたらすことによって、このようなマイクロリアクターに反応関与物を充填するための方法および装置が、本明細書中に記載される。本発明の方法によって上記の反応部位またはマイクロリアクター容器に充填され得、その容器内に濃縮され得、そしてその容器内に収容され得る反応関与物としては、高分子量反応物、触媒、ならびに他の試薬および反応補助物質が挙げられる。オリゴヌクレオチドの配列決定およびＤＮＡ／ＲＮＡの分析の状況下における、このような高分子量反応物としては、例えば、オリゴヌクレオチド、より長いＤＮＡ／ＲＮＡフラグメント、およびこれらの構築物が挙げられる。これらの反応物は、遊離で未結合な状態であり得るか（それらの分子量が、それらの反応物を本発明の方法によって収容させることを可能にするに十分なものである場合）、あるいはこれらの反応物は、例えば、高分子量ポリマー、高表面積ビーズもしくはゲル、または当該分野で公知の他の支持体に、共有結合され得るかまたは他の方法で連結され得る。上記の反応部位またはマイクロリアクターに同じようにして送達され得そして局在化され得る反応触媒の例としては、酵素が挙げられ、この酵素は、多孔性ビーズまたは非多孔性ビーズのような固相支持体に連結もしくは結合されていてもよく、またはそのような固相支持体に連結もしくは結合されていなくてもよい。
【００４２】
本発明はまた、上記の別個の反応部位またはマイクロリアクター容器に比較的低分子量の試薬および反応物を効率的に供給するための手段、ならびに、上記の反応部位またはマイクロリアクターから未変換反応物および反応生成物を効率的に取り出すための手段を含む。より詳細には、効率的な試薬の送達および生成物の取り出しは、本発明において、反応部位またはマイクロリアクター容器の実質的に二次元のアレイの平面に対して垂直な方向で、少なくともいくらかの流体の対流流動を起こすように配置することによって、−そしてそのようにして、化学反応を起こす別個の部位またはマイクロリアクターをそれぞれ通過させるかまたは通すように配置することによって、達成される。この場合、反応物および生成物は必ずしも、反応部位または反応マイクロリアクター内もしくはマイクロウェル内において保持または濃縮されるというわけではない；実際、特定の反応生成物が、上記の反応部位またはマイクロリアクターからおよび／またはその外側に迅速に洗い流されることが所望され得る。
【００４３】
反応部位またはマイクロリアクターの実質的に平面のアレイに対して垂直でありかつそのアレイを横切る制御された流体の対流フラックスを提供するための手段を含むことに加えて、本発明はまた、大きな（すなわち、高分子量の）反応関与物と小さな（すなわち、低分子量の）反応関与物との間を識別し得る選択透過性の多孔性フィルター手段を含む。このフィルター手段は、特定の反応関与物を選択的に捕捉または保持し得る一方、他のものはマイクロリアクターアレイの底面を通しておよび／またはその底面から流し出させることを可能にし得る。多孔性フィルターの適切な選択および対流フラックス率の賢明な選択によって、反応関与物の配置、濃度および運命に対するかなりの制御が実現され得る。
【００４４】
（ＣＭＲＡ）
好ましい実施形態において、本発明の装置は、種々の物理的形態または構造的形態をとり得る少なくとも２つの機能的要素（すなわち、（ｉ）マイクロチャネルまたはマイクロウェルのアレイから構成されるマイクロリアクター要素、および（ｉｉ）多孔性フィルター要素（例えば、シートまたは薄層（例えば、図１３を参照のこと）の形態にある多孔性フィルムまたは多孔性膜を含む））から構成されるマイクロリアクター要素のアレイからなる。これらの２つの要素は、互いに隣り合わせで、かつ近接してかまたは接して配置され、マイクロチャネル／マイクロリアクター要素の平面を多孔性フィルター要素の平面と平行にする。定義のために、マイクロチャネルアレイまたはマイクロリアクターアレイを含むこの複合構造物の側を、本明細書中以降では「上部」といい、一方、多孔性フィルターによって規定される側を、この構造物の「底面」という。
【００４５】
マイクロチャネル要素またはマイクロリアクター要素は、多数のマイクロチャネルの集合物からなり、このマイクロチャネルの長手方向の軸は実質的に平行様式で配置され、そしてこのチャネルの下流の端部は、多孔性膜または他のフィルター要素と機能的に接触される。多孔性フィルターまたは多孔性膜は、選択透過性であるように、すなわち、粒子、ビーズまたは高分子（例えば、タンパク質およびＤＮＡ）のような特定の種の通過はブロックしつつ、比較的低分子量の溶質、有機溶媒および水の通過は許容するように、選択される。マイクロチャネルのアスペクト比（すなわち、その直径に対する高さの比または直径に対する長さの比）は、小さくても大きくてもよく、そしてその横断面は、多数の任意の形状（例えば、円形、長方形、六角形など）をとり得る。以下にさらに議論されるように、マイクロチャネルの壁が連続的または規則的なものであることは全く必要でなく；実際、隣接するチャネル間を連絡する相互接続孔を有する高度に多孔性の「スポンジ」マトリクスもまた、それらは必ずしも別個のまたは機能的に制限もしくは隔離されたマイクロチャネルをそれ自体では含まないという事実にもかかわらず、機能的に「マイクロチャネル」要素として役立つ（この実施形態は、以下に続く考察および図８においてより詳細に記載される）。
【００４６】
多くの場合において、アレイアセンブリ全体（すなわち、マイクロチャネル／マイクロリアクター要素および多孔性フィルター要素の組合せ）を、以下にさらに記載されるような、一体物または物理的複合体のいずれかから構成される実質的に二次元の単一の構造物と考えることが適切である。簡略化のために、マイクロチャネル要素またはマイクロリアクター要素と、多孔性フィルター要素または多孔性膜要素とを最小限含む複合構造物からなる本発明のこのようなすべてのシステムを、以後、「限局型膜リアクターアレイ」またはＣＭＲＡという。本発明のＣＭＲＡは、いくつかの一般的な構造的特徴、および生物学の研究室において通常使用される種類の市販されているマイクロタイターフィルタープレートの機能的性質を有することが理解され、ここで多孔性フィルターディスクは、９６ウェルプレートのプラスチックウェルの底面に成型されるかまたは他の方法で組み込まれる。しかし、ＣＭＲＡは、その独特な構成によって、ならびにハイスループット化学を実施するために操作され得るその新規かつ比類ない強力な方法によって、例えば、ＤＮＡの増幅および／または分析に適用される分類を提供するという点で、非平行の高密度の別個の反応部位によるこれらのものとは識別される。
【００４７】
複合マイクロリアクター／フィルター構造物（すなわち、本発明のＣＭＲＡ）は、いくつかの物理的形態をとり得る；上記に示されたように、２つのこのような形態は、それぞれ、物理的複合体および一体型複合体によって表される。前者に関して、この構造物の２つの機能的要素（すなわち、マイクロチャネルアレイおよび多孔性フィルター）は、サンドウィッチまたは積層の様式で、単に並んで重ね合わされるか、共にプレスされるかまたは他の方法で装着された別々の部分または成分として提供される。この構造の実施形態を、本明細書中以降では、「物理的複合体」という。さらなる多孔性支持体（例えば、細いワイヤのメッシュまたは非常に粗いフィルター）および／またはスペーシング（ｓｐａｃｉｎｇ）層もまた提供され得る。ここでは、精巧な多孔性のフィルター要素に対する機械的支持を提供すること、そしてマイクロチャネル要素と多孔性フィルター要素との間の良好な接触を確実にすることが保証される。プラスチックメッシュ、ワイヤスクリーン、成型もしくは機械加工されたスペーサー、または同様の構造物が、ＣＭＲＡの頂部に提供されて、ＣＭＲＡの上部にわたる接線方向の流体流動についての区画を規定するのに役立ち得、そして同様の構造物が、ＣＭＲＡの真下に提供されて、そのＣＭＲＡを通して浸透した流体の排出のための経路を提供し得る。
【００４８】
あるいは、ＣＭＲＡの２つの機能的要素は、単一の一片の複合構造物（より詳細には、「一体型複合体」）の部分および区画であり得る。一体型複合体は、選択透過性である（すなわち、溶媒および低分子量の溶質の透過を許容するが、高分子量の溶質（例えば、タンパク質、ＤＮＡなど）、コロイドおよび粒子を保持または拒絶する）精巧な多孔性の「薄膜」領域から構成される１つの表面を有する。しかし、この構造物の全体的な厚さのバルクは、マイクロチャネルおよび／または大きな空隙もしくはマクロ孔から構成され、これらは、そのマイクロチャネルまたはその中に含まれる空隙の非常に大きなサイズに起因して、選択透過性を示し得ない。
【００４９】
限外濾過プロセスにおいて使用され、そして「限外濾過膜」として一般的に知られる型の多くの合成膜が、当該分野において公知であり、そして本発明の目的のための「一体型複合体」として記載され得る（Ｋｕｌｋａｒｎｉら，１９９２；Ｅｙｋａｍｐ，１９９５）。限外濾過膜は一般的に、最大でも百ナノメートルまでの１ナノメートルかそこらの範囲の有効な孔サイズを有すると考えられる。結果として、限外濾過膜は、数百ダルトンから数十万ダルトンまでおよびそれ以上の範囲の分子量を有する種を保持し得る。多くのＵＦ膜が、名目上の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）に関して記載されている。ＭＷＣＯは、種々の様式で規定され得るが、一般には、膜のＭＷＣＯは、その膜が９０％より高い拒絶を示す最小の種の分子量に対応する。
【００５０】
多くの限外濾過膜は非対称である。すなわち、それらは、ナノメートルサイズの孔を含む薄い（ミクロンの厚さまたはサブミクロンまでもの厚さの）薄膜層を有することによって特徴付けられ、その薄膜層は、１００μｍ厚以上の次数の大きさのはるかにより厚い基材領域によって一体的に支持され、かつその基材領域から分離不可能であり、そしてこの基材領域は、一般的に少なくとも薄膜における孔よりも大きな大きさの次数である孔直径を有する。その選択透過性を生じさせる限外濾過膜の薄層領域の孔が、代表的に、数ナノメートルから数百ナノメートルまでの範囲であるのに対して、その限外濾過膜の基材領域における空隙は、１ミクロンの数割から多ミクロンまでぐらいの大きな直径であり得る。大半のポリマー性限外濾過膜は一般的に、単一の膜鋳造工程で調製され、超多孔薄膜層および基材領域の両方は必然的に、同じ連結の材料から構成される。
【００５１】
一体型複合型の限局型膜リアクターアレイ（ＣＭＲＡ）としての有用性を有する無機膜フィルターは、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  ＰＬＣ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈａｔｍａｎ．ｐｌｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ２．ｈｔｍｌを参照のこと）によって販売される、限外濾過膜のＡｎｏｐｏｒｅＴＭおよびＡｎｏｄｉｓｃＴＭファミリーによって例示される。これらの高純度アルミナ膜は、かなり独特な膜の形態を生じさせる電気化学的な酸化プロセスによって調製される（Ｆｕｒｎｅａｕｘら，１９８９；Ｍａｒｔｉｎ，１９９４；Ｍａｒｄｉｌｏｖｉｃｈら，１９９５；Ａｓｏｈら，２００１）。特に、このような膜は、独立した反応を収容し得る並行的なマイクロチャネルのアレイ、および選択された反応関与物を拒絶し得るより精巧な多孔性の選択透過性表面領域の両方を提供する。市販のアルミナ膜（例えば、Ｗｈａｔｍａｎから）は、隣接するチャネル間において側方でクロスオーバーすることのない、名目上０．２μｍの直径である規則正しいほぼ六角形形状のチャネルの高密度な密集アレイを含む。この膜は、全体的に約６０μｍの厚さを有し、全体の厚さのほとんどが、これらの０．２μｍ直径のチャネルから構成される。しかし、１つの表面には、１μｍ階級の厚さのはるかにより精巧な多孔性の（超多孔性でさえある）表面領域が位置し、この表面領域は、約０．０２μｍまたは２０ｎｍ（すなわち、限外濾過範囲）の孔直径によって特徴付けられる孔を含む。これらの膜は、水溶液で湿らされた場合に、実質的に透明になるというさらに興味深くかつ有用な光学的特性（すなわち、それらの中における化学反応によって生成されたあらゆる光が、容易に検出されることを可能にするという特徴）を有する。
【００５２】
ＡｎｏｐｏｒｅＴＭ膜またはＡｎｏｄｉｓｃＴＭ膜を使用して、限外濾過によりタンパク質を濃縮および／または分離する従来の適用では、通常、より小さな孔によって特徴付けられる膜の側により大きな流体圧力を適用する。すなわち、流体は一般的に、ＵＦ膜の薄い選択透過性の表面領域を最初に通過して流動するようにされ、次に初めて、そのより大きな実質的に並行のマイクロチャネルを有するはるかにより厚い基材領域を通される；この場合、この膜の基材領域は、単に、物理的な支持および機械的な完全性を与えるためのみに役立つ。しかし、以下により詳細に説明するように、ＣＭＲＡにおけるこの型の膜の使用は、それらを通過する対流流動の方向を逆転させることを必要とし、その結果、流体は、並行したマイクロチャネル（この中で反応が起こる）を含む厚い基材領域を通してまず流動し、そして次に初めて、より精巧で多孔性でありかつ選択透過性である表面領域を通される。その結果、ある意味で、これらの限外濾過膜は、ＣＭＲＡとして使用される場合には、少なくとも従来の限外濾過適用におけるそのより一般的な方向と比較して「逆さま」（すなわち、拒絶側を「下方」に、そして高圧側の反対にする）に方向付けられる。
【００５３】
あるいは、限外濾過膜はまた、そのより精巧な多孔性の拒絶側を「上方」に有する（すなわち、より高い流体圧と接触する）ＣＭＲＡ成分として使用され得、その結果、流体は、選択透過性の薄層領域をまず通して流動し、次いで、より全体的に多孔性のスポンジ状の基材領域を通される。しかし、このような場合、ＣＭＲＡは、限外濾過膜の薄層領域の「上」でそしてその薄層領域に密接に接触して配置された、別々の異なるマイクロチャネル含有要素またはマイクロリアクター含有要素を有する、「物理的複合体」型のものである場合が一般的である。この場合、流体流動の順序は、マイクロチャネル含有要素をまず通過し、次いで、一体型複合体ＵＦ膜の選択透過性領域の薄い薄層を横切り、次いで最後に、ＵＦ膜の基材領域を横切る。さらなる支持体層が必要に応じて、この物理的複合体型のＣＭＲＡの下部に提供され得、そしてプラスチックメッシュ、ワイヤスクリーン、または同様の材料が、先のように、ＣＭＲＡの上部にわたる流体の接線方向の流動についての区画を規定するのに役立てるために、複合体の上部に使用され得る。
【００５４】
マイクロリアクターのアレイへの反応物の拡散およびそのアレイから退却する生成物の拡散が、拡散によってのみ起こる従来の多くのマイクロリアクターアレイの操作とは対照的に、本発明の限局型膜リアクターアレイの操作は、ＣＭＲＡを通した適度な対流フラックスの提供を必要とする。特に、構造物の実質的に平面の表面に対して垂直の方向でその構造物を通した流体の制御された対流フラックスを確立するのに十分な、小さな圧力差異を、ＣＭＲＡの上部の表面から底面の表面へと適用する。このようにして流体は、マイクロチャネル要素をまず通過して流動し、次いで引き続いて、多孔性フィルター要素を横切るようにされる。この対流流動は、ＣＭＲＡの多孔性フィルター要素によって保持される種々の高分子量の試薬および反応補助物質を、ＣＭＲＡのマイクロチャネル要素の内部に負荷および捕捉することを可能にする。同じように、この対流流動は、低分子量反応物の反応側への迅速な送達、ならびにその生成側からの低分子量反応生成物の効率的かつ完全な取り出しを可能にする。特に重要なことは、対流流動が、マイクロチャネルの上流端部からの反応生成物の逆拡散を妨害または実質的に防止するのに役立ち、さもなくばそれらは、隣接するマイクロリアクター容器をまたはさらに遠位のマイクロリアクター容器であっても、汚染し得るという事実である。
【００５５】
輸送プロセスにおける対流および拡散の相対的重要度（これは、両方のメカニズムが同時に起こる場合を含む）は、無次元数（すなわち、ペクレ数（Ｐｅ））の助けにより測定され得る。このペクレ数は、２つの速度の比（すなわち、拡散「流動」またはフラックスの速度によって除算された対流流動の速度）として考えられ得る。より詳細には、ペクレ数は、両方とも同じ方向で取られた、特性拡散速度Ｄ／Ｌ（また、ｃｍ／ｓの単位で表される）によって除算された特性流動速度Ｖ（ｃｍ／ｓ）の比である：
【００５６】
【数４】
2005520484.tif 000005
式３
式３において、Ｖは、対流流動の平均または特性速度であり、一般的には、流動のために利用可能な横断面積Ａ（ｃｍ２）によって容量的な流動速度Ｑ（ｃｍ３／ｓ）を除算することによって決定される。特性長さＬは、流動および拡散の方向（すなわち、最も大幅な濃度勾配のある方向）に対して平行な方向で測定され、そしてそのプロセスにおいて拡散が生じる代表的な距離または「平均」距離を表すように選択された、代表的な距離またはシステムの寸法である。そして最後に、Ｄ（ｃｍ２／ｓ）は、問題の拡散種についての拡散係数である（ペクレ数Ｐｅの代替的ではあるが等価な定式は、それを２つの特性時間（すなわち、拡散についての代表的な時間および対流についての代表的な時間）の比として考える。このペクレ数についての式３は、同じように、特性対流時間Ｌ／Ｖによって特性拡散時間Ｌ２／Ｄを除算することによって良好に得られ得る）。
【００５７】
輸送の対流成分は、ペクレ数Ｐｅが一致する場合と比べて大きい状況下で、拡散成分よりも優勢となることが予期され得る。逆に、輸送の拡散成分は、ペクレ数Ｐｅが一致する場合と比べて小さい状況下で、対流成分よりも優勢となることが予期され得る。ペクレ数が一方よりも非常にはるかに大きいかまたは非常にはるかに小さいのいずれかという極端な状況下では、それぞれ、輸送は実際には、対流のみまたは拡散のみのいずれかで起こっていると推定され得る。最後に、概算されたペクレ数が一致した次数のものである状況下では、対流および拡散の両方が、全体的な輸送プロセスにおいて重要な役割を果たしていることが予期され得る。
【００５８】
代表的な低分子量の生体分子の拡散係数は、一般的に、１０−５ｃｍ２／ｓの次数（例えば、スクロースについては０．５２・１０−５ｃｍ／ｓ、およびグリシンについては１．０６・１０−５ｃｍ／ｓ）である。従って、１００μｍ（すなわち、０．０１ｃｍ）の距離によって隔てられた化学反応部位、マイクロチャネルまたはマイクロリアクターについて、これらのような低分子量溶質についてのペクレ数Ｐｅは、約１０μｍ／秒（０．００１ｃｍ／ｓ）より高い流動速度で一致を超える。わずか１０μｍ（すなわち、０．００１ｃｍ）によって隔てられた部位または容器について、低分子量溶質についてのペクレ数Ｐｅは、約１００μｍ／秒（０．０１ｃｍ／ｓ）より高い流動速度で一致を超える。従って、対流輸送は、非常に遅い流動速度および／または非常に短い拡散距離の場合を除いて、拡散輸送よりも優勢であることが理解される。
【００５９】
拡散可能な種の分子量が実質的により大きな場合（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡフラグメント、オリゴヌクレオチド、タンパク質および前者の構築物のような大きな生体分子での場合）、その種の拡散性は対応してより小さくなり、そして対流が、両方のメカニズムを含む輸送プロセスにおいて拡散と比べてさらにより重要な役割を果たす。例えば、タンパク質の水相での拡散係数は、約１０倍の範囲内にある（Ｔａｎｆｏｒｄ、１９６１）。タンパク質の拡散性は、リボヌクレアーゼ（１３，６８３ダルトンの分子量を有する小さなタンパク質）についての１．１９・１０−６ｃｍ２／ｓの値、およびミオシン（４９３，０００ダルトンの分子量を有する大きなタンパク質）についての１．１６・１０−７ｃｍ２／ｓの値によってひとくくりにされる。さらにより大きな実体（例えば、４０６０００００ダルトンのタバコモザイクウイルス（すなわち、ＴＭＶ））は、さらにより小さな拡散性（詳細には、ＴＭＶについて４．６・１０−８ｃｍ２／ｓ）によって特徴付けられる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，１９７５）。対流と拡散とがほぼ等しく輸送に寄与する流体速度（すなわち、一致した次数のＰｅ）は、種の拡散性と正比例して測定される。
【００６０】
ペクレ数の定式の助けにより、マイクロリアクター容器への反応物の供給およびマイクロリアクター容器からの生成物の取り出しに対する対流の影響を測定することが可能である。他方で、たとえ中程度であっても対流流動は、ＣＭＲＡ構造物のマイクロチャネルまたはマイクロウェルの内部に反応物を送達する速度をかなり増加し得ることが明らかである。特に、単純化のために、ほぼ等しい対流流動および拡散流動についての判断基準を、Ｐｅ＝１であるとみなすと想定する。次いで、反応物の拡散性についての推定値を１・１０−５ｃｍ２／ｓと仮定すると、わずか０．００４ｃｍ／ｓの次数の対流流動速度は、拡散のみによって２５μｍの深さのウェルの底面に供給され得るのとほぼ同じ速度でそのウェルに反応物を運ぶのに十分であることが推定され得る。２．５μｍの深さのマイクロウェルの底面から上部までのこのような種の拡散速度と一致するために必要とされる対応の流動速度は、０．０４ｃｍ／ｓの次数であると推定される。明らかに、これよりもはるかに高いＣＭＲＡを通した流動速度が可能であり、従ってこれは、中程度の対流流動が、ＣＭＲＡのマイクロチャネルおよびウェルへの反応物の拡散供給を増強し得る程度を示す。
【００６１】
同じように、ペクレ数の定式は、たとえ中程度であってもトランス−ＣＭＲＡ対流流動成分が、ＣＭＲＡの「上部」または上流の表面上に位置する流動区画への過剰な未変換反応物ならびに／または反応生成物および副産物の逆拡散を妨害または実質的に防止するにおいて如何に有効であり得るかを理解するのに役立つ。このような逆拡散の防止は重要である。なぜなら、一旦化合物がこの妨害流動区画へと漏れ出すと、その化合物は、隣接するマイクロチャネルの開口部の近辺に沿って容易に拡散し得るかおよび／または流され得、このようにして反応部位またはマイクロリアクターの間の相互汚染またはクロストークに寄与するからである。マイクロチャネルまたはマイクロリアクターの上部からの拡散化合物の損失速度を減少するにおいて有意な効力を有することが予期され得るＣＭＲＡのマイクロリアクターまたはマイクロチャネルを通した「上部から底面への」対流流動の大きさはまた、式３において一致に等しいペクレ数を設定することによる大きさの階級に推定され得る−この場合、対流流動および拡散流動は反対方向に生じ、そして互いに対抗という理解による。ＣＭＲＡは、上部表面からの潜在的な汚染化合物の漏れがほとんどまたは全くないという特に臨界的な状況下における一致よりも有意に高い、マイクロチャネルのペクレ数で操作され得る。
【００６２】
ＣＭＲＡの多孔性フィルター要素を横切りそしてＣＭＲＡから外側に浸透する化合物が、理想的にはＣＭＲＡの平面に対して実質的に垂直の方向で、そのデバイスから直線的に流動するようになされることが注目され得る。この流動管理ストラテジーおよび他の流動管理ストラテジー（例えば、ＣＭＲＡの下に敷かれた厚いスポンジ状のパッドを提供すること）によって、この構造物の底面の表面を介した、近辺のＣＭＲＡマイクロチャネルの間における相互汚染のあらゆる可能性が容易に回避され得る。
【００６３】
これまで、直前の段落において議論された自由に拡散し得る反応物および生成物は、ＣＭＲＡの多孔性フィルターまたは多孔性膜によって無意味な保持または拒絶のみを受けると仮定した。ここで議論は、ＣＭＲＡ中における高分子量の反応関与物および補助物質の運命、特に、タンパク質を含む高分子の運命、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド（およびそれらの構築物）の運命、ならびに高分子量のポリマーに結合、ナノ粒子および微粒子に結合またはビーズにも結合した他の低分子量試薬の運命に焦点を当てるように眼を向ける。これらの後者の場合において、この結合は、ＣＭＲＡのマイクロリアクター中またはマイクロチャネル中における試薬の保持を容易にする。
【００６４】
本発明の特に有用な特徴は、適切な多孔性フィルター要素を通した単純に圧力によって駆動される濾過による、そのマイクロリアクターまたはマイクロチャネルへの高分子および微粒子の効率的かつ制御された負荷を可能にするというその能力である。上記で考察したように、フィルター要素が、微小溶質を比較的自由に通過させながら、可溶性高分子を実質的に拒絶および収容する能力を有する場合、このフィルターをしばしば、限外濾過膜または限外濾過の膜といい、そしてこのプロセスを限外濾過という。
【００６５】
限外濾過（ＵＦ）は、膜の孔サイズおよび形態に関連して高分子のサイズおよび形状に従って高分子を溶液から分離するために通常使用されるプロセスである。ＵＦは、圧力によって駆動される膜浸透プロセスであり、溶媒（例えば、水）のフラックスは一般的に、浸透液と比較した供給物（ｆｅｅｄ）または保持物の示差的な溶質濃度によって膜にわたって存在するすべての対抗する浸透圧差異Δπ（ａｔｍにおける）よりも小さな適用される水圧差異ΔＰ（例えば、ａｔｍにおける）と等しい有効圧力差異と比例する。膜にわたる容量的なフラックスＪｖ（ｃｍ／ｓの単位で表される）は、時間および膜面積の単位あたりの浸透溶液の容量であり；これは、以下の式：
Ｊｖ＝Ｐ・（ΔＰ−Δπ）／δ          式４
によって与えられ、ここでＰは、膜の浸透係数または浸透率（ｃｍ２／ｓ・ａｔｍ）であり、そしてδ（ｃｍ）は、膜の有効厚である。
【００６６】
ＵＦ膜は、下限で約１ｎｍから上限で約０．０２μｍ〜せいぜい０．１μｍ（すなわち、２０〜１００ｎｍ）の範囲の名目上の孔サイズを有し、そのため、数百以下の分子量を有する溶質は、適用された圧力差異の下で、この孔を通して容易に対流により流動し得；名目上の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）よりも大きな種は、多い程度であれ少ない程度であれ、拒絶されそして保持される。所定のＵＦ膜が、特定の溶質種「ｉ」を保持するにおいて有効である程度は、以下のように規定される拒絶係数Ｒｉに関連して表され得る：
Ｒｉ＝ｌ−（Ｃｐ／Ｃｂ）          式５
ここで、Ｃｐは浸透液中の溶質濃度であり、そしてＣｂは、バルク溶液（すなわち、分離適用における供給物または保持物）中における溶質濃度である（式５は、厳密に言えば、境界層の抵抗が無視できる程度でありかつ濃度分極が大きくない場合においてのみ適用する。これらの考慮事項は、以下においてさらに考察される）。低分子量溶質は、０に近い拒絶係数を示すが、ＭＷＣＯよりも大きな分子量を有する高分子量溶質は、１に近い拒絶係数を示す。高分子溶質の限外濾過分離および濃縮に通常適用されるこれらの概念は、本発明の限局型膜リアクターアレイにおける多孔性膜要素の構造および機能を記述するために、同じように適用され得る。
【００６７】
圧力によって駆動されるフラックスが限外濾過膜を通して生じる場合、拒絶された高分子は、高圧界面（通常は、ＵＦ膜の拒絶薄膜層の高圧側）に蓄積する。溶質が蓄積するにつれて、それらの溶質は、バルク流体においてのみならず、限外濾過の高圧側に通常存在する薄い流体境界層（ｔｈｉｎ  ｆｌｕｉｄ  ｂｏｕｎｄａｒｙ  ｌａｔｅｒ）においてもまた、濃縮される。後者の現象は濃度分極と称され、そして従来の分離適用においていつも厄介である。なぜなら、それらは、膜透過（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）のフラックスを減少させ得るからである（Ｌｏｎｓｄａｌｅ，１９８２；Ｍｕｌｄｅｒ，１９９５；Ｃｕｓｓｌｅｒ，１９９７）。しかし、多孔性の限外濾過要素をマイクロチャネル／マイクロリアクター要素の下部に備え付ける本明細書の目的のＣＭＲＡ適用では、濃度分極は、それらが、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロリアクター内に高分子量試薬を濃縮しそして効率的に固定する手段を提供する限りにおいて、望ましい現象であり得る。事実上、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロリアクターは、滞留被膜または流体境界層（これらは、より一般的には、分離をもたらすために使用される限外濾過膜の拒絶表面上部に存在する）と、構造的および機能的に等価であるとみなされ得る。
【００６８】
溶質が高圧界面（すなわち、限外濾過膜の薄膜領域を構成する選択透過性障壁の上部または機能的に類似の構造物）において濃縮される程度は、濃度分極を生じさせる輸送現象を考慮することによって、数学的に概算され得る。限外濾過において、溶質は、膜の平面に対して垂直な対流流動によって、膜の表面へと継続的に運ばれ、溶媒（代表的には、水）は容易に、その膜を浸透する。さほど拒絶されない（すなわち、小さなＲｉ値を有する）これらの低分子量溶質は、容易にこの膜を浸透し、そして界面でほとんど濃縮を受けない。しかし、高度に拒絶される（すなわち、一致に近いＲｉ値を有する）これらの溶質は、膜によってブロックされ、そしてその表面の方から拡散し、本体または溶液のバルクに向かって戻る傾向が高い。最終的には、定常状態に達し、この定常状態の時点において、対流によって表面へと向かう溶質の流動は、バルクへの溶出の逆拡散によって（そして、拒絶が不完全でありＲｉ＜１である程度まで、膜を通して溶質が漏出することによって）、正確に平衡化される。この平衡は、膜の上の溶質濃度勾配（すなわち、拡散の推進力）が十分に急勾配となった後においてのみ確立される。対流と拡散（そして、いくつかの場合には、浸透）との間におけるこの平衡を記載する示差的な式を記述し、次いで、適切な境界条件に供してそれを解くことによって、膜界面における溶質濃度Ｃｍの、バルクにおけるその濃度Ｃｂに対する比についての式が得られ得る。拡散性Ｄを有する完全に拒絶される溶質の特定の場合（すなわち、Ｒｉ＝１；Ｃｐ＝０）、この式は以下の形をとる：
Ｃｍ／Ｃｂ＝ｅｘｐ［（Ｊｖ・δ）／Ｄ］          式６。
【００６９】
式６の角括弧内のグループ分けは、上記でかなり詳細に考察されたペクレ数Ｐｅ（すなわち、拡散フラックスに対する対流フラックスの比）として認識される。式６の置換により、以下の単純化された式が導かれる
Ｃｍ／Ｃｂ＝ｅｘｐ（Ｐｅ）                    式７。
【００７０】
ＵＦに関する代表的な分離適用において、δは一般的に、膜の表面と接触している停滞フィルムまたは流体境界層の有効厚をいう。しかし、本発明の状況下では、δは、ＣＭＲＡのマイクロチャネル／マイクロリアクター要素の有効厚を表し；すなわち、δは、限局型膜リアクターアレイのマイクロチャネルの高さ、あるいは、限局型膜リアクターアレイのマイクロウェルの深さのいずれかとして考えられ得る。この式に対する適切かつ簡単な改変がなされ得、ここでは、膜表面の上部に存在し得る任意の構造物（例えば、ＣＭＲＡマイクロチャネル）の蛇行性（ｔｏｒｔｕｏｓｉｔｙ）および／または空隙容積を考慮に入れることが必要である。式６の形を調べると、分極したＣＭＲＡ構造のマイクロチャネル内またはマイクロウェル内の溶質濃度は、多孔性膜の表面が近づくにつれて、距離に応じて指数関数的に増加することが示される。
【００７１】
係数Ｃｍ／Ｃｂは、「濃度分極係数」と称され、そしてこれは、競合する対流輸送プロセスと拡散輸送プロセスとの相対的な速度を定量するペクレ数Ｐｅから容易に算出される。濃度分極係数の代表的な値を、完全に拒絶される溶質（すなわち、Ｒｉ＝１）の限定的な場合について、以下の表に提供する：
マイクロチャネルペクレ数Ｐｅ 濃度分極係数（Ｃｍ／Ｃｂ）
０．１０                              １．１１
０．２０                              １．２２
０．５０                              １．６５
１．０                                ２．７２
１．５                                ４．４８
２．０                                ７．３９
３．０                                ２０．１
４．０                                ５４．６
５．０                                １４８．
１０．０                              ２２，０３０。
【００７２】
定義付けのために、０．００４ｃｍ／ｓのマイクロチャネル流動速度（あるいは、ＶまたはＪｖ）において、１０μｍの長さまたは深さδを有するＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロリアクター中に対流によって流される、約１・１０−６ｃｍ２／ｓの拡散係数Ｄを有する小さな完全に拒絶されるタンパク質（例えば、リボヌクレアーゼ）を考える。この状況に対応して算出されるペクレ数Ｐｅは４であり、そして得られる濃度分極係数Ｃｍ／Ｃｂは、５５の次数のものと概算され、すなわち、膜表面（すなわち、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはウェルの底面）における溶質濃度は、マイクロチャネルまたはウェルの上部または開口部のバルク流体における濃度よりも５５倍高くなる。
【００７３】
先に述べたように、溶質濃度は、マイクロチャネルの上部またはマイクロチャネルの開口部から測定される場合に距離に応じて指数関数的に変動し、最も急な勾配は、チャネルまたはウェルの底部において生じる。より詳細には、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェルの長さに沿った任意の点ｘにおける分極した高分子溶質（ｍａｃｒｏｓｏｌｕｔｅ）の濃度Ｃｘは、式６における深さまたは厚さのパラメーターδを位置の値ｘで置換することによって得られ得る：
Ｃｘ／Ｃｂ＝ｅｘｐ［（Ｊｖ・ｘ）／Ｄ］          式８。
【００７４】
直前の段落で考慮した小さなタンパク質の特定の例について、以下の局所的な濃度係数Ｃｘ／Ｃｂは、マイクロチャネルまたはウェルの上部または開口部からの距離ｘの関数として得られる。
【００７５】
深さｘ（μｍ） Ｃｘ／Ｃｂ
０．０                  １．０（マイクロリアクターの上部または開口部）
２．０                  ２．２
４．０                  ５．０
６．０                  １２．２
８．０                  ２４．５
１０．０                ５４．６（ウェルまたはマイクロチャネルの底部）。
【００７６】
ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェルにおける濃度分極溶質の平均濃度は、ｘ＝０からｘ＝δまたはＬまでの間にわたって位置座標ｘに関して式８を積分することによって、容易に算出される。
【００７７】
限外濾過膜によって不完全に拒絶される（すなわち、Ｒｉ＜１）、より低分子量の溶質もまた、より少ない程度ではあるが、濃度分極を受ける。このような溶質の濃度分極係数は、限外濾過膜を横切るそれらの浸透または「漏出」の結果として、より小さい。この状況を記述する数式はより冗長であるが、それらは当該分野で公知であり、そして簡単に解かれ、そして使用される。
【００７８】
従って、膜表面において保持される分子の濃度の増加は、その膜を通した流動に対する抵抗を増加させるので、濃度分極は通常、従来の限外濾過の間における課題と考えられているが、この現象はＣＭＲＡにおいては有益であり、ＣＭＲＡにおいて、これは特に、マイクロチャネルまたはマイクロリアクターの内側で高分子量試薬の濃度上昇を作り出すために使用される。次いで、高分子の濃度の増加は、マイクロチャネル／マイクロリアクターを通し、そして限外濾過膜を横切る継続的な流動によって維持される。
【００７９】
濃度分極または他の手段によって、ＣＭＲＡ中において達成される分子の最大濃度は、その分子についての可溶度限界によって設定される。この限界は一般的に、手元にある分子がより大きくなるにつれて、より低い濃度で満たされる（少なくとも、可溶度がモル濃度基準で表される場合）。可溶度限界を超える場合、分子（そして特に、高分子量の生体分子）は、凝集体またはゲルの形態で溶液から現れる傾向があり、そして濃度分極が、高い局所濃度を得る手段となる場合、分子は、その可溶度限界またはゲル濃度Ｃｇに対応する濃度で限外濾過膜の表面に隣接して沈着する。ゲルの形成は、ＣＭＲＡの操作において決して必要ではないが、このプロセスはとりわけ、特に高い局所的な分子濃度が所望される場合に、有利なように使用され得る。多くの高分子の溶液について、ゲル濃度Ｃｇは、２５重量％付近で平均に達する（約５％〜５０％の範囲を有する）が、コロイド状分散物は、約６５％で平均に達するＣｇ値（５０％〜７５％の範囲を有する）によって特徴付けられる。一旦、ゲル層が限外濾過膜の上部に形成されると、そのゲル層自体の水圧透過性（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）（ＵＦ膜の固有の水圧透過性Ｐではなく）が、膜透過フラックスＪｖを制御し得る。
【００８０】
ＣＭＲＡ内における濃度分極による反応関与物の濃度操作を使用して、このシステムにおける分子の相または物理的状態を有利なように改変し得る。例えば、ゲル状態にある分子が活性なままである場合（例えば、酵素が、ゲルの形態で沈殿された場合に、その生物活性を保持する場合）、ゲルの形成は、ＣＭＲＡのマイクロリアクターまたはマイクロウェル中においてその分子の非常に高い局所濃度を得るための手段を提供する。さらに、ゲルへと沈殿された分子は、拡散運動にさらされることが減り；実際、ゲルの弛緩および再溶解のプロセスは、特定の状況下において、（不可逆的であっても）非常に緩徐であり得る。従って、激しい濃度分極およびゲル化点濃度Ｃｇを超える局所的濃度を引き起こすように十分に大きな対流流動を適用することによって、一旦高分子がゲル層の形態で沈着されると、たとえマイクロチャネルまたはマイクロウェルを通した対流流動速度を実質的に減少または停止さえしたとしても、このような分子は、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェル中に保持される傾向があることが当然に予期される。高分子複合体（例えば、多サブユニットタンパク質および特定のポリマー）を形成する分子が、分子の会合に対して非常に低い濃度でバルク溶液に添加され得ることがさらに注目され得る。しかし、結果として、これらの分子は、ＣＭＲＡマイクロチャネルにおいて、本発明の方法により濃縮され得、その結果、例えば、ポリマーは重合化し、または多サブユニットタンパク質はアセンブルする。
【００８１】
従って、高分子は、マイクロチャネルのウェルまたはいくつかの他の固相支持体にこのような高分子を結合させることを必要とせずに、ＣＭＲＡマイクロチャネルの内側で上昇した濃度で維持され得；すなわち、高分子は、固相支持体に共有結合させることを必要とせずに、溶液相（または、ことによるとゲル相）に局所化されたまま維持される。このことは有益である。なぜなら、多くの酵素は、表面に共有結合または他の方法で結合された場合に、活性を損失するか、または活性の減少を示すからである（Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，１９９７）。さらなる利点は、本発明の高分子の「局所化」（固定化を参照のこと）方法は汎用的であるということ、すなわち、この方法は、多くの共有結合性固定化プロトコールの欠点である高分子特異的なものではなくて、すべての高分子溶質について実質的に同じ様式で機能するということである。
【００８２】
目的とする特定の反応系（例えば、以下でより詳細に考察されるような、ピロ配列決定（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によるＤＮＡ分析）では、全体的に特定の高分子試薬を共有結合により固定することを回避することが必要となり得る。ピロ配列決定において使用されるＤＮＡポリメラーゼは、好適な一例である。ＤＮＡポリメラーゼは、それが最適に機能する場合には、少なくとも特定の程度の可動度を保持するべきであると考えられる。結果として、この特定の酵素は、ピロ配列決定において消耗試薬として通常扱われなければならない。なぜなら、この酵素を共有結合により固定し、そして引き続くピロ配列決定工程においてこの酵素を再利用することは望まれないからである。しかし、本発明は、この高分子試薬を共有結合で固定することを必要とせずに、この高分子試薬を、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロリアクター中に局所化するための手段を提供する。
【００８３】
高分子（例えば、酵素）は、連続的な様式でＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロリアクターに添加され得、それにより、微視的に堆積されたカラムが作製される（図３を参照のこと）。これは、そのチャネルにおける反応物／基質およびその生成物の連続的な処理を可能にし、上流で生成された生成物は、下流の処理工程のための反応物として利用可能となる。
【００８４】
一旦、高分子が、上記に開示された方法によってＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェル中で濃縮および沈着されると、他の反応関与物（例えば、反応物）が添加され得る。この分子が、実質的に妨害を受けない限外濾過膜を通して通過するに十分な小ささである場合、マイクロチャネルまたはマイクロウェル中におけるその分子の局所的濃度は、濾過プロセスによって不変である。Ｒｉ＝１およびＲｉ＝０という２つの限定的な場合の瞬間についてのみ考えると、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェル中に流される分子は、以下の２つの運命のうちのいずれか１つを経験することが考えられる：分子が限外濾過によって濃縮および局所化されるか、または分子がＣＭＲＡを通して通過し、そして浸透液または「限外濾液」中に現れるかのいずれか。以下に続く後者の記述を単純にするために、用語「充填」は、濃度分極によってＣＭＲＡ中に分子を濃縮することを意味し、一方で、用語「流動」は、ＣＭＲＡ中において感知し得る程の濃度を起こさずに、ＣＭＲＡ中に分子を運びそして限外濾液へと運ぶことにより、マイクロチャネルを通してバルク流動を生成することを意味する。
【００８５】
別として、ＣＭＲＡの多孔性フィルターが懸濁物中に粒子を捕捉し得る場合（たとえ、溶液中の高分子を拒絶し得ない場合であっても）には、同様の様式で、このような粒子がフィルターケークの形態で膜に隣接して単純に堆積することに注目すべきである。特定の反応関与物が、ビーズまたは他の粒子状の支持体に固定される適用では、限外濾過膜以外の膜（例えば、当該分野で公知の種々の微細濾過（ＭＦ）膜）が、本発明の実施のために適切であり得る（Ｅｙｋａｍｐ，１９９５）。必要とされる要件は、膜の有効な孔サイズが、保持することを所望する粒子の直径に匹敵するかまたはその直径よりも小さいことである。
【００８６】
明らかに、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェル中に捕捉および濃縮される分子はなお、特定の程度までは拡散運動を受け得る。ゲル層に沈殿された分子は、移動度の減少（おそらく、実質的に減少した移動度）を示すが、その濃度が可溶度またはゲル限界Ｃｇを下回る場合には、それらを溶液に戻し、そしてそれにより自由に拡散させるようにすることが依然として可能である。上記の堆積カラム構成を参照すると、堆積の順序は、負荷された高分子が、引き続いてかなりの速度で拡散し得る場合には、長期間の間に損失し得ることが明らかである。この撹乱を防止するために、分子を、ポリマーと共に繋ぎ得る；例えば、ビオチン化された高分子を、ストレプトアビジンに結合体化された直鎖状デキストラン（例えば、２Ｍダルトン直鎖状デキストラン／ストレプトアビジン結合体、製品番号Ｆ０７１１００−１、Ａｍｄｅｘ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）またはかなり多数の化学的架橋剤のいずれかと共に繋ぎ得る。架橋剤を、タンパク質がＣＭＲＡ中に沈着された後に添加して、負荷工程の間における未熟な架橋および凝集体化を防止し得る。あるいは、ビオチン化された分子およびビオチン化された直鎖状デキストランを同時に添加し得、次いで、引き続くアビジン（分子量約６０ｋＤ）の添加によって共に繋ぎ得る。同様に、光反応性架橋剤を添加し得、次いで、他の高分子種がＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェル中に負荷された後で光により活性化し得る。
【００８７】
上記で述べたように、限外濾過膜によって代表的には保持されない低分子は、より大きな分子（例えば、デキストラン、またはアルブミンのようなタンパク質）に結合されるかまたは粒子（例えば、ポリスチレンビーズまたはコロイド金（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．によって製造される多孔性ビーズのような多孔性ビーズを含む））にさえも結合されて、本発明と関連したその有用性を高め得る。コロイド粒子および微粒子は、微小溶質および高分子溶質と比べて、無視できる程でなくともはるかに低い速度で拡散する。より大きな高分子または粒子に対して低分子（これはさもなくば、ＣＭＲＡを通して通過する）を結合させることによって、これらのより小さな分子は、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェルに保持され得る。
【００８８】
本発明が、異なる反応関与物にＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェル中で濃度分極を受けさせる程度を選択的に操作することを可能にする点にさらに注目すべきである。分子が小さくなるにつれてより大きな拡散係数を有し、そのため、それらはより小さなペクレ数によって特徴付けられる；従って、対流成分と比べた、これらのより小さな分子の輸送に関する拡散成分の相対的重要度は、それがより大きなものである場合よりも、小さな分子について高くなる。このことは、これらの系の設計および操作において一定の自由度を与える。
【００８９】
例えば、対流流動速度は、選択的に様々な種のペクレ数を操作するために調節され得る。ＣＭＲＡにわたる任意の流動速度ＶまたはＪｖにおいて、最も小さな種（Ｒｉ＝０）は、多孔性膜フィルターによって全く拒絶されず、そして濃度分極を全く受けない。しかし、所定の流動速度において、中程度の拡散性を有する小さな高分子は、「中程度」の程度の濃度分極を受け得るが、小さな拡散性を有する大きな高分子は、「強度」の分極に遭う。次いで、２つの高分子のうちのより小さな方について、流動速度を増加させ、従ってペクレ数Ｐｅを増加させる場合、この分子の分極の程度は、「中程度」から「強度」へと増加され得る。代わりに、流動速度およびＰｅを減少させる場合、このより小さな高分子の分極の程度は、「中程度」から「低度」へと減少され得る。しかし、３つすべての流動速度条件において、最も小さな拒絶されない溶質は分極を受けないが、２つの高分子のうちのより大きな方は、強度に分極されることに注目すべきである。
【００９０】
一例として、上記の表を参照すると、流動条件は、０．５のペクレ数Ｐｅによって特徴付けられる小さな高分子が、最初の流動速度において１．６５の小さな濃度分極係数Ｃｍ／Ｃｂを示し得るように容易に選択され得ることが示される。しかし、流動速度を１０倍増加させると、ペクレ数Ｐｅは５．０へと１０倍の増加を生じ、そして分極係数Ｃｍ／Ｃｂにおいては、相対的に大きな値１４８へと実質的に９０倍の増加を生じる。しかし、このすべての時間において、より小さな流動速度で開始するように強度に分極された（そしておそらく、ゲルとして沈着さえもされている）はるかにより大きな高分子は、より高い流動速度において強度に分極されたまま残存する。
【００９１】
あるいは、流動は、より大きな拡散係数を有するより小さな分子（しかし、０より大きなＲｉ値を有する）がマイクロリアクターの容積の全体を通して拡散することを可能にするような程度まで、極端な場合には小さな分子が、マイクロリアクターの上流およびその外側に拡散されることさえも可能にされるような程度まで緩徐化され得るが、同時に、より小さな拡散性を有するより大きな分子は、かなりの濃度分極を受ける。次いで、流動速度は、両方の種について濃度分極を回復するように増加され得るが、多孔性フィルターまたは多孔性膜によって拒絶されないかまたは不十分に拒絶されるより小さな分子は、より大きな分子を越えて流れ出した。極端な場合では、対流流動を全体的に停止し得、すべての分子の輸送を拡散によって生じさせる。
【００９２】
従って、この様式におけるペクレ数の操作は、高度に制御された様式および有益な様式で、連続的な処理工程（例えば、高分子の充填、反応物の供給、化学的変換、および限外濾液における生成物の取り出し）が実施されることを可能にする。これらの工程は、一定の流動速度の系において実施され得るか、または各工程が、異なる流動速度および時間により変動する流動速度で実施され得る。
【００９３】
ＣＭＲＡにわたって圧力差異を制御することは、原則的に、流動が、充満を通してＣＭＲＡの上部にある流動区画にその一方の側へと浸入する場合に、いくつかの小さな問題を引き起こし得る。この状況下では、実質的に２−Ｄの限局型膜リアクターアレイに対して平行でありそしてそのアレイを通した流動の両方の粘性の性質に起因して、ＣＭＲＡの上部にありそしてＣＭＲＡに対して平行である流動区画の長さに沿って、圧力の低下が存在する（図４）。このＣＭＲＡに沿った圧力変動は、極端な場合には、距離に応じて幾分変動するようにＣＭＲＡにわたって圧力差異（すなわち、ＣＭＲＡを通した駆動流動の圧力差異）を引き起こし得、最も高いトランスＣＭＲＡ圧力低下は、充満した浸入口付近に存在し、そして最も低い圧力低下は、流動区画の反対側で優勢となる。この影響は、ＣＭＲＡの側面または外周に沿って位置づけられる複数の入口を介して流体を導入することによって減少され得る（例えば、図５を参照のこと。図５では、ＣＭＲＡの中心にある孔を通して過剰な流体を排出することを可能にするための任意の手段が提供され得る）。あるいは、背圧レギュレーター、バルブ、または他の流動制限因子が、ＣＭＲＡの下流の流動ストリームに導入され得、このレギュレーターまたはバルブは、ＣＭＲＡの流動区画における圧力低下と比較して大きくなるように配置された制御された圧力低下を導入する。この様式において、この流動区画内における流動圧力は増加し、そしてＣＭＲＡ自体にわたる圧力低下における端から端への変動は最小化される（図６）。流体の再循環ループが、必要に応じて提供され得る。これらの手段および他の手段によって、ＣＭＲＡの平面に対して平行な圧力低下における潜在的な変動は、ＣＭＲＡに対して垂直でありそしてＣＭＲＡにわたる小さな画分の圧力低下に対してのみ配置され得る。
【００９４】
ＣＭＲＡの好ましい実施形態において、マイクロチャネルまたはマイクロウェルのアレイを含むマイクロリアクター要素は、米国特許第６，２７４，３２０号に記載のものに類似した光ファイバーリアクターアレイプレートとして規定される。この特許において、光ファイバーリアクターアレイは、ウェルを形成するように融着延伸型光ファイバー束の一端をエッチングすることによって形成される。本発明のＣＭＲＡの一実施形態の状況下では、光ファイバーアレイプレートを、そのプレートの幅全体を通して完全にエッチングし、その結果として、そのプレートの上面からそのプレートの底面までを走る、一連の開口チャネルができる。次いで、多孔性フィルター要素を、そのようなエッチングされた光ファイバーの１つの面に接触させて、ＣＭＲＡを形成する。
【００９５】
この実施形態において、マイクロリアクターアレイ成分は、融着延伸型光ファイバー束から構成されるプレートより形成される。このような光ファイバープレートでは代表的に、上部の表面または面と、底部の表面または面との間の距離は、５ｃｍ以下であり、好ましくは、２ｃｍ以下であり、そして最も好ましくは、１ｃｍと１ｍｍとの間の厚さである。
【００９６】
上面から底面へと広がる一連のマイクロチャネルは、例えば、酸によって、光ファイバープレートを処理することによって作製される。各チャネルは、反応チャンバーを形成し得る（例えば、Ｗａｌｔら，１９９６．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１８８８を参照のこと）。
【００９７】
ＣＭＲＡアレイは、代表的に、１，０００より多い反応チャンバーを含み、好ましくは、４００，０００より多い空隙または反応チャンバー、より好ましくは、４００，０００と２０，０００，０００との間の空隙または反応チャンバー、そして最も好ましくは１，０００，０００と１６，０００，０００との間の空隙または反応チャンバーを含む。光ファイバープレートをマイクロリアクター要素として使用する場合、各反応チャンバーの形状（平面図から）は、しばしば、実質的に六角形であるが、この反応チャンバーはまた円柱状でもあり得る。いくつかの実施形態において、各反応チャンバーは、平らな壁面を有するが、本発明者らは、各反応チャンバーが少なくとも１つのでこぼこの壁面をも有し得ることを意図する。アレイは代表的に、５〜２００μｍの間、好ましくは、１０〜１５０μｍの間、最も好ましくは５０〜１００μｍの間の中心−中心間隔を有する反応チャンバーを有するように構築される。１つの実施形態において、本発明者らは、各反応チャンバーが、少なくとも１つの寸法において、０．３μｍと１００μｍとの間、好ましくは、０．３μｍと２０μｍとの間、最も好ましくは、０．３μｍと１０μｍとの間の幅を有することを意図する。別の実施形態において、本発明者らは、より大きな反応チャンバー（好ましくは、少なくとも１つの寸法において２０μｍと７０μｍとの間の幅を有する）を意図する。
【００９８】
（ＵＭＲＡ）
膜ベースのマイクロリアクターアレイを作製するなお別の技術は、別個のマイクロチャネルまたはマイクロウェルについての必要性を全体的に排除する。この膜リアクターアレイは、単純に、多孔性フィルター（ちょうど上記で記載されたように、このフィルターに対して分子が、濃度分極によって濃縮される（または、これにより粒子が、濾過によって充填される））から構成される。しかし、この場合、濃度分極を受けたいくつかの分子は、多孔性膜の拒絶層の上部に連続的な２−Ｄ層を形成するようにされ得、一方、他の反応関与物は、その構造物の内部または上部の別個の独立した部位で、沈着および／または他の方法で固定もしくは局在化される。このような膜リアクターアレイを、本明細書中以降では、「非限局型膜リアクターアレイ」またはＵＭＲＡという。
【００９９】
別個の反応は、反応を開始する個々の分子または粒子をこの膜アレイの表面に「播種」することによって、別個の位置で起こるようになされ得る。例えば、触媒は、その希釈溶液を、表面の小さな領域にピペッティングまたは「スポッティング」することによって添加され得る。あるいは、触媒は、表面での濾過に際して、ＵＭＲＡの平面に沈着される触媒の密度が妥当な程度には高いが非連続である（すなわち、触媒が、２−Ｄ層の表面上にわたって「ドット形成」され得る）ような低い濃度のバルク溶液に添加され得る。さらに別の実施形態では、触媒（例えば、酵素）を、粒子状の支持体またはコロイド状の支持体に（例えば、共有結合性固定化によって）結合し得；次いで、その希釈懸濁液を、ＵＭＲＡに通して濾過して、表面上の別個の部位において、触媒ビーズまたは触媒粒子の沈着を引き起こさせる。
【０１００】
ＵＭＲＡアレイは、代表的に、１，０００より多い反応チャンバーを含み、好ましくは、４００，０００より多い空隙または反応チャンバー、より好ましくは、４００，０００と２０，０００，０００との間の空隙または反応チャンバー、そして最も好ましくは１，０００，０００と１６，０００，０００との間の空隙または反応チャンバーを含む。光ファイバープレートをマイクロリアクター要素として使用する場合、各反応チャンバーの形状（平面図から）は、しばしば、実質的に六角形であるが、この反応チャンバーはまた円柱状でもあり得る。いくつかの実施形態において、各反応チャンバーは、平らな壁面を有するが、本発明者らは、各反応チャンバーが少なくとも１つのでこぼこの壁面をも有し得ることを意図する。アレイは代表的に、５〜２００μｍの間、好ましくは、１０〜１５０μｍの間、最も好ましくは５０〜１００μｍの間の中心−中心間隔を有する反応チャンバーを有するように構築される。１つの実施形態において、本発明者らは、各反応チャンバーが、少なくとも１つの寸法において、０．３μｍと１００μｍとの間、好ましくは、０．３μｍと２０μｍとの間、最も好ましくは、０．３μｍと１０μｍとの間の幅を有することを意図する。別の実施形態において、本発明者らは、より大きな反応チャンバー（好ましくは、少なくとも１つの寸法において２０μｍと７０μｍとの間の幅を有する）を意図する。
【０１０１】
さらに他の例において、ＵＭＲＡ（例えば、ピロ配列決定用の）の表面上の別個の部位に、特定の反応物分子（例えば、オリゴヌクレオチドまたはその構築物）を沈着させることが有益であり得る。同じくまた、これは、ＵＭＲＡの表面上にその溶液をピペッティングすることによってか、ＵＭＲＡを通して反応物の希釈溶液を極度に限外濾過することによってか、または好ましくは、この反応物を粒子状支持体もしくはコロイド状支持体に固定し、次いで、限外濾過によってこのＵＭＲＡ表面に対してそれらを沈着させることによってかのいずれかにより、達成され得る。
【０１０２】
ＣＭＲＡと比較したＵＭＲＡの顕著な特徴は、ＵＭＲＡでは分子の側方拡散が、ＣＭＲＡでの場合のようにマイクロチャネルまたはマイクロリアクターの壁によって制限されないということである。ＵＭＲＡにおいて分子の側方拡散の影響を食い止めるために、その側方輸送が問題となるような程度まで進行し得るよりも前に、分子は、ＵＭＲＡを通してそして濾液中へと流し出される（図７）（単純化のために、図７は、限外濾過膜の拒絶表面または「薄膜層」のみを示し；基材領域（および他の膜支持体）が存在する場合には、それらは、明瞭化のために省略されていることに注意されたい）。同じくまた、流動速度（および種のペクレ数）の操作により、側方輸送の程度およびＵＭＲＡ内における分子の残留時間を制御することが可能である。流動速度を緩徐化させ、そのようにして残留時間および側方輸送の程度を増加させ得るか；または流動速度を増加させ、残留時間および側方輸送を同時に減少させ得る。「一体型複合体」型の非対称性の限外濾過膜は、ＵＭＲＡにおいていずれの方向でも使用され得、すなわち、その拒絶層が「上方」（そしてスポンジ状の基材領域が「下方」）であるかまたはその逆であるかのいずれかであることに注意すべきである。
【０１０３】
ＵＭＲＡは多孔性の限外濾過膜成分を有することに加えて、ＵＭＲＡはまた、より多孔性でありかつ実質的に非拒絶性のフィルター（または機能的に等価なマトリクス）もまた、限外濾過膜の上流または下流のいずれかに、そして限外濾過膜自体に対して配置されるかおよび／または結合されるかのいずれかで、使用され得る（図８）。そのはるかにより大きな孔サイズによって特徴付けられるこの非選択的な第２膜は、選択透過性の限外濾過膜に対して機械的支持を与えるために使用され得る。これはまた、膜表面において濃縮された分子に対していくらかの機械的支持および保護を与えることよりこの分子層を安定化させる、メッシュまたはマトリクスとして使用され得る。特に、このようなメッシュまたはマトリクスを提供することにより、ＵＭＲＡの上部表面に沿って方向付けられ得るあらゆる接線方向の流動の剪断作用から、濃縮された高分子および粒子の表面層が保護され得る。前述の段落において言及された型の非対称性の一体型複合体ＵＦ膜を使用する場合、このスポンジ状でかつ比較的厚い基材領域は、このＵＦ膜が薄膜化された拒絶層を「下方」にして位置づけられる場合に、安定化マトリクスとして都合よく役立ち得る。
【０１０４】
ＵＭＲＡは、実質的にＣＭＲＡの様式で、アセンブルされ得、そして操作され得る。種のペクレ数は、流動速度を制御することによって操作され得、そして異なる高分子および／または粒子は、順に充填されて、堆積されたマイクロリアクターを作製し得る。分子は、そのＫｄ値またはＣｇ値を下回る濃度で添加され得、次いで、フィルター表面で濃度分極によってそのＫｄ値またはＣｇ値を上回るように濃縮され得る。分子は、他の分子、ポリマーまたは粒子に結合され得る。分子はまた、ポリマー内に絡まされ得る。
【０１０５】
多くの異なる型の反応が、ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡにおいて実施され得る。１つの実施形態において、アレイの各空隙または反応チャンバーは、核酸またはタンパク質を分析するための試薬を含む。代表的には、核酸を含むこれらの反応チャンバーは、単一の種の核酸（すなわち、目的の単一の配列）のみを含む（このアレイのすべての反応チャンバーが、そのようであることは必要ではない）。任意の特定の反応チャンバーにおいて、単一コピーのこの種の核酸が存在し得るか、またはそれらは複数のコピーであり得る。一般的には、反応チャンバーは、少なくとも１００コピーの核酸配列、好ましくは少なくとも１００，０００コピーの核酸、そして最も好ましくは、１００，０００〜１，０００，０００コピーの核酸を含むことが好ましい。１つの実施形態において、核酸種は、ＰＣＲ、ＲＣＡ、リガーゼ連鎖反応、他の等温性増幅、または核酸増幅のための他の従来の手段を使用して、所望されるコピー数を提供するように増幅される。１つの実施形態において、核酸は一本鎖である。他の実施形態において、一本鎖ＤＮＡはコンカテマーであり、各コピーは、末端と末端で共有結合により結合されている。
【０１０６】
核酸は、チャンバー自体への結合によってか、またはチャンバーに送達される可動性固体支持体への結合によってのいずれかで、反応チャンバーに固定され得る。生物活性因子は、複数の可動性固体支持体（各可動性固体支持体は、その上に固定された少なくとも１つの試薬を有する）をアレイ上に分散させることによって、アレイに送達され得、ここでこの試薬は、核酸の配列決定反応における使用のために適切である。
【０１０７】
このアレイはまた、反応チャンバーに配置された可動性固体支持体の集団を含み得、各可動性固体支持体は、それに結合された１つ以上の生物活性因子（例えば、核酸または配列決定酵素）を有する。各可動性固体支持体の直径は変動し得、可動性固体支持体の直径は、各空隙の幅の０．０１〜０．１倍であることが好ましい。全ての反応チャンバーが、１つ以上の可動性固体支持体を含むことは必要ではない。３つの意図される実施形態が存在する；少なくとも５％から２０％までの反応チャンバーが、固定された少なくとも１つの試薬を有する可動性固体支持体を有し得る１つの場合；２０％から６０％までの反応チャンバーが、固定された少なくとも１つの試薬を有する可動性固体支持体を有し得る第２の実施形態；および、５０％から１００％までの反応チャンバーが、固定された少なくとも１つの試薬を有する可動性固体支持体を有し得る第３の実施形態。
【０１０８】
可動性固体支持体は、代表的に、その上に固定された少なくとも１つの試薬を有する。ピロ配列決定反応に関連した実施形態、またはより一般的に、ＡＴＰ検出に関連した実施形態について、試薬は、スルフリラーゼ活性もしくはルシフェラーゼ活性またはその両方を有するポリペプチドであり得る。あるいは、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ウリカーゼ、またはペルオキシダーゼのような酵素が利用され得る（例えば、ＪａｎｓｓｏｎおよびＪａｎｓｓｏｎ（２００２）、本明細書中で参考として援用される）。可動性固体支持体は、固定された１つ以上の核酸配列またはタンパク質または酵素を有する複数の可動性固体支持体を、アレイ上に分散させる方法において使用され得る。
【０１０９】
別の局面において、本発明は、特定の部位で反応が起こっていることを示す光生成について、反応チャンバーのアレイを同時にモニタリングする装置に関する。この実施形態において、反応チャンバーは、分析物と、反応チャンバーにおいて光を生成するための酵素的手段または蛍光手段とを含むように適合されたセンサーである。本発明のこの実施形態において、このセンサーは、生化学的アッセイまたは細胞ベースのアッセイにおいて使用するのに適切である。この装置はまた、使用において、特定の反応チャンバーに由来する光が光学的感応性デバイスの特定の予め決定された領域において衝突するように配置された、光学的反応性デバイス、ならびにこの予め決定された領域の各々において衝突した光のレベルを決定するための手段、および各反応チャンバーについて経時的な光レベルの変動を記録するための手段を備える。
【０１１０】
１つの特定の実施形態において、この装置は、光捕捉手段を有する光検出手段、およびこの光検出手段に光を伝送するための第２の光ファイバー束を備える。本発明者らは、１つの光捕捉手段がＣＣＤカメラであることを意図する。第２の光ファイバー束は、代表的に、アレイと光学的に接触し、その結果、個々の反応チャンバーにおいて生成された光は、光捕捉手段に伝送するための第２の光ファイバー束の別々のファイバーまたは別々のファイバーの群によって捕捉される。
【０１１１】
本発明は、特定の部位で反応が起こっていることを示す光について、反応チャンバーのアレイを同時にモニタリングするための装置を提供する。この反応事象（例えば、ルシフェラーゼによって生成される光子）は、種々の検出装置（例えば、光電子増倍管、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、吸光度光度計、ルミノメーター、電荷注入デバイス（ｃｈａｒｇｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ）（ＣＩＤ）、または他の固体検出器）、ならびに本明細書中に記載される装置を使用して、検出および定量され得る。好ましい実施形態において、放出された光子の定量は、融着延伸型光ファイバー束に適合されたＣＣＤカメラの使用によって達成される。別の好ましい実施形態において、放出された光子の定量は、マイクロチャネルプレート増感剤に適合されたＣＣＤカメラの使用によって達成される。背部薄型化ＣＣＤ（ｂａｃｋ−ｔｈｉｎｎｅｄ  ＣＣＤ）を使用して、感度を上昇させ得る。ＣＣＤ検出器は、Ｂｒｏｎｋｓら，１９９５．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６５：２７５０−２７５７において記載されている。
【０１１２】
例示的なＣＣＤシステムは、Ｌｏｃｋｈｅｅｄ−Ｍａｒｔｉｎ  ＬＭ４８５  ＣＣＤチップおよび６〜８μｍの個々のファイバー直径を有する１−１光ファイバーコネクター（束）を備えた、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）Ｓｅｒｉｅｓ  ６００  ４−ｐｏｒｔカメラである。このシステムは、４０９６×４０９６または１６００００００よりも多いピクセルを有し、そして１０％から＞４０％の範囲の量子効率を有する。従って、波長に依存して、ＣＣＤセンサーにおいて画像化される４０％もの多くの光子が、検出可能な電子に変換される。
【０１１３】
他の実施形態では、蛍光部分を標識として使用し得、そして反応事象の検出は、レーザーでアレイ表面を走査するように共焦点走査型顕微鏡を使用して実施され得るか、またはより小さな光学的な解析を可能にする、走査型近距離場光学顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＳＮＯＭ）のような他の技術が利用可能であり、これにより、「より高密度」なアレイの使用が可能となる。例えば、ＳＮＯＭを使用すると、個々のポリヌクレオチドは、１００ｎｍ未満の距離（例えば、１０ｎｍ×１０ｎｍ）で分離されている場合に、識別可能であり得る。さらに、走査トンネル顕微鏡（Ｂｉｎｎｉｎｇら，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，５５：７２６−７３５，１９８２）および原子間力顕微鏡（Ｈａｎｓｗａら，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ，２３：１１５−１３９，１９９４）が使用され得る。
【０１１４】
（ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡの製造、ならびにその使用）
本発明は、ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡを提供する。これらは両方とも、高密度に充填された独立した化学反応を含むアレイである。ＣＭＲＡの反応部位は、マイクロリアクター容器またはマイクロウェルである。本発明はまた、別個の反応部位を有するＣＭＲＡ高密度アレイおよびＵＭＲＡ高密度アレイを作製する方法を包含する。本発明はまた、反応関与物をマイクロリアクターに充填する方法を提供し、この方法は、反応部位のアレイの表面に対して垂直でありかつそのアレイを通した流体の対流流動を引き起こす工程を包含する。ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡの両方の好ましい実施形態において、反応物は、固体支持体に結合されるかまたは結合されないかのいずれかであり得る。結合される反応物は、固体支持体に共有結合される。
【０１１５】
本発明はまた、別個の反応部位に、比較的低分子量の試薬および反応物を効率的に供給するための方法を包含する。ＣＭＲＡはそれ自体、一端に限外濾過膜を備えたマイクロチャネルを含むマイクロリアクターを含む。特に、ＣＭＲＡは、一連のマイクロチャネル；分子の充填されたカラムを作製するための濃度分極；堆積されたカラムを作製するための濃度分極を介した分子の連続的な充填；および充填されたカラムを通した試薬の流動、を含む。ＣＭＲＡの好ましい実施形態において、各アレイは、独立した化学的リアクターである。
【０１１６】
本発明はまた、ＣＭＲＡを生成する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）化学物質の連続的な処理のために、充填カラム／ＣＭＲＡを通して試薬を流動させる工程；（ｂ）ＣＭＲＡに対する混合物の濾過によってＤＮＡの無作為なフラグメントを添加し、１つのマイクロチャネルあたりほぼ１つのフラグメントを得る、工程；および（ｃ）ＣＭＲＡのマイクロチャネルの内側で分子をゲルに濃縮する工程。分子は、マイクロチャネルの内側でＫｄを下回るようにＣＭＲＡに添加され、これにより、そのマイクロチャネルの内側においてのみ分子の重合化およびアセンブリが可能となる。架橋剤が、マイクロチャネル中における分子の拡散移動度を減少させるために添加され得る。さらに、マイクロチャネルの内側で分子を絡ませるポリマー、ならびに、より小さな分子（これは、より小さな分子の拡散移動度を減少させるためにより大きな分子またはより大きな粒子またはビーズに結合されている）もまた添加され得る。ＣＭＲＡのマイクロチャネルにおいてより小さな分子を保持するためにより大きな分子またはより大きな粒子またはビーズに結合されたより小さな分子（これはさもなくば、フィルターを通して通過する）も同様に添加され得る。
【０１１７】
ＣＭＲＡは、Ａｎｏｐｏｒｅ膜を使用することによって生成される。より詳細には、ＣＭＲＡは、マイクロ製造されたマイクロチャネルのアレイに対して限外濾過膜を結合させることによって製造される。次いで、流体入口を、膜にわたる圧力を等しくするように放射状に分散させて、ＣＭＲＡに対する圧力変動を減少させる。次いで、マイクロチャネルを伴わずに、限外濾過膜を使用して化学反応の高密度２−Ｄアレイを作製する（「限局型膜リアクターアレイ」、すなわち、ＵＭＲＡ）。ここで反応は、フィルター表面に触媒または反応物または酵素を濾過することによって播種され、ここで対流流動は、拡散分子が隣接する反応を汚染するよりも前に、その拡散分子を側方へと洗い流す。濃度分極が、ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡのための分子充填カラムを作製するために必要とされ、次いで、濃度分極を介して分子を連続的に充填することにより、堆積カラムが作製される。次いで、化学物質の連続的な処理のために、ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡの充填カラムを通して試薬を流動させる。次いで、限外濾過膜を、第２のより多孔性の膜に結合させ、濃度分極によって濃縮される分子に対して機械的支持を提供する。この膜は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／Ｐｏｒ膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）である。
【０１１８】
ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡは、以下を含む多数の用途を有する：ＰＣＲ、ならびに他のＤＮＡ増幅技術およびＤＮＡ配列決定技術（例えば、ピロ配列決定）。ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡは両方とも、ＤＮＡフラグメントの分離および関連するサンプル調製（ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐ）を伴わずに、高度に並行した配列決定を達成するために利用され得る。ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡはまた、コンビナトリアル化学のために使用され得る。検出目的のために、光検出器のアレイが、ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡにおける光生成反応のモニタリングのために利用される。好ましい実施形態において、光検出器のアレイはＣＣＤカメラである。ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡにおいて別個の反応を検出する別の方法は、光検出器のアレイを使用して、ＣＭＲＡ中における化学反応の指標として光の吸光度における変化をモニターする。
【０１１９】
ＣＭＲＡおよびＵＭＲＡについて特に意図される用途として、以下に２つの例を提供するが、これらは、代表例であることのみが意味され、そして本発明の唯一の適用または実施形態とみなされるべきではない。
【０１２０】
（ピロリン酸検出を介した、ＤＮＡの配列決定）
記載される方法および装置は、一般的に、任意の特定の核酸配列の同定が所望される任意の適用のために有用である。例えば、この方法は、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、単一の染色体において複数のＳＮＰまたは他の多型を含むハプロタイプ、および転写物プロファイリングの同定を可能にする。他の用途としては、人工ＤＮＡ構築物を配列決定をして、その一次配列を確認もしくは導き出すこと、または無作為な変異誘発スクリーニングから特定の変異体クローンを同定すること、ならびに検体から遺伝子発現プロフィールを決定するために、任意の発達段階または環境状況からの単一の細胞、組織全体または生物に由来するｃＤＮＡの配列を得ることが挙げられる。さらに、この方法により、任意の供給源から単離された任意のサイズのＰＣＲ生成物および／またはクローン化ＤＮＡフラグメントの配列決定が可能となる。
【０１２１】
ピロリン酸の検出によるＤＮＡの配列決定（「ピロリン酸配列決定」）は、種々の特許（Ｈｙｍａｎ，１９９０，米国特許第４，９７１，９０３号；Ｎｙｒｅｎら，米国特許第６，２１０，８９１号および同第６，２５８，５６８号およびＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／１３５２３；Ｈａｇｅｒｌｉｄら，１９９９，ＷＯ９９／６６３１３；Ｒｏｔｈｂｅｒｇ，米国特許第６，２７４，３２０号，ＷＯ０１／２００３９）および刊行物（Ｈｙｍａｎ，１９８８；Ｎｙｒｅｎら，１９９３；Ｒｏｎａｇｈｉら，１９９８，Ｊｅｎｓｅｎ，２００２；Ｓｃｈｕｌｌｅｒ，２００２）において記載されている。本明細書中で引用される前述の特許、特許出願、および刊行物の内容は、その全体において、本明細書中で参考として援用される。ピロリン酸配列決定は、テンプレートとして未知の配列（決定されるべき配列）を使用して、相補的な配列を重合化させる技術である。従って、これは、「合成による配列決定」として知られる型の配列決定技術である。成長しつつある相補鎖に新たなヌクレオチドが重合化される各時点で、ピロリン酸（ＰＰｉ）分子が放出される。次いで、このピロリン酸の放出を検出する。ピロリン酸の放出の時点および程度のモニタリングを伴って、４つのヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）またはそのアナログ（例えば、α−チオ−ｄＡＴＰ）を繰り返し付加することによって、成長する相補鎖に取り込まれたヌクレオチドの同定が可能になる。
【０１２２】
ピロリン酸は、カップリング反応を介して検出され得る。この反応において、ピロリン酸は、酵素ＡＴＰスルフリラーゼの作用を通して、アデノシン５’ホスホスルフェート（ＡＰＳ）からＡＴＰを生成するために使用される（図９）。次いで、ＡＴＰは、酵素ルシフェラーゼ（これに対してＡＴＰが基質となる）によって放出される光を介して、光度計測的に検出される（ｄＡＴＰが、合成による配列決定のための４つのヌクレオチドのうちの１つとして添加されていること、そしてルシフェラーゼが基質としてｄＡＴＰを使用し得ることが留意され得る。配列決定のためのｄＡＴＰの添加に対する光の放出を防止するために、ｄＡＴＰアナログ（例えば、α−チオ−ｄＡＴＰ）を、配列決定のためのヌクレオチドとして、ｄＡＴＰに対して置換する。α−チオ−ｄＡＴＰ分子は、成長するＤＮＡ鎖に取り込まれるが、これはルシフェラーゼの基質とはならない。）。
【０１２３】
ピロリン酸配列決定は、いくつかの異なる様式で、ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡにおいて実施され得る。１つのこのようなプロトコールは、以下の通りである：
（１）ルシフェラーゼの充填；
（２）ＡＴＰスルフリラーゼの充填；
（３）配列を決定されるべきＤＮＡ（好ましくは、単一配列の多数コピー）およびＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）の充填；ならびに
（４）ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡを通した、ｄＸＴＰ、ＡＰＳおよびルシフェリンの混合物の流動であって、これは４つのヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、α−チオ−ｄＡＴＰ）を一度に一つづつ通して循環させる。これらはすべて低分子量の分子であり、そのためそれらは、この分子に感知され得る程の濃度分極を受けさせることなく、ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡの限外濾過膜を通して通過することに留意されたい（少なくとも、限外濾過膜のＭＷＣＯが適切に選択されている場合）。
【０１２４】
従って、ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡ中へのそしてそれらを通した、流体の上流から下流への流動は、以下を引き起こす：
（ａ）ポリメラーゼによる適切なｄＸＴＰの付加および配列決定されるＤＮＡの領域におけるＰＰｉの付帯的な生成（受動的に通過するＡＰＳおよびルシフェリンの流動を伴う）；
（ｂ）後者が、スルフリラーゼ酵素と接触するようになった場合（受動的に通過するルシフェリンの流動を伴う）のＡＰＳおよびＰＰｉからのＡＴＰの生成；ならびに
（ｃ）ルシフェラーゼ酵素の近傍におけるＡＴＰおよびルシフェリンからの光の生成。
【０１２５】
次いで、光の生成を光検出器によってモニターする。例えば、レンズまたは他の手段によってＣＭＲＡまたはＵＭＲＡに光学的に連結されているＣＣＤカメラは、多数のマイクロチャネルまたは別個の反応部位から同時に光生成をモニタリングし得る（図１０）。２−Ｄアレイに配置された数百万ピクセルまたは光検出器を有するＣＣＤカメラが利用可能である。ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡの内部または上部において１つのマイクロチャネル、マイクロウェル、または別個の反応部位から発生する光は、ＣＣＤカメラの１つまたは数個のピクセルに当たるようになされ得る。従って、各マイクロチャネル、マイクロウェル、または反応部位が、独立した配列決定反応を含みそして実行するように配置される場合、各反応は、１つの（または多くて数個の）ＣＣＤ要素または光検出器によってモニターされ得る。数百万ピクセルを含むＣＣＤカメラまたは他の画像化手段を使用することによって、数百万の独立した配列決定反応の進行が同時にモニタリングされる。
【０１２６】
さらに、各マイクロリアクター容器、ウェル、または反応部位は、唯一の一本鎖のＤＮＡのみに由来する増幅産物を保持するようになされ得、そして異なるウェルが異なるＤＮＡ鎖の増幅産物を保持する場合には、数百万の異なるＤＮＡ鎖の同時配列決定が可能になる。配列決定されるべきＤＮＡの分配は、多くの方法によって達成され得、このうちの２つを以下に示す：
（ａ）単一のオリゴヌクレオチド鎖の増幅生成物を、ビーズに結合させ、そして多くの独立した増幅反応に由来するビーズを組み合わせ、そしてＣＭＲＡまたはＵＭＲＡに配置する；あるいは、
（ｂ）多くの異なるＤＮＡ鎖を希釈濃縮物に添加し、そしてＣＭＲＡまたはＵＭＲＡに適用し、そうすることにより、大半ではなくとも多くのマイクロチャネル、マイクロリアクターまたは異なる反応部位に、唯一の一本鎖のＤＮＡのみを含ませる。次いで、一連の反応を通してＣＭＲＡまたはＵＭＲＡの内部または上部においてＤＮＡを増幅し、次いで、これを上記試薬の添加を通して直接的に配列決定する。ＣＭＲＡ（またはＵＭＲＡ）のマイクロチャネル内おけるＤＮＡの増幅のための１つのこのような技術（ポリメラーゼ連鎖反応（すなわち、ＰＣＲ））を以下に記載する。
【０１２７】
配列決定されるべきＤＮＡ、ならびにピロリン酸ベースの配列決定のために必要とされる酵素および基質の送達は、多数の方法において達成され得る。
【０１２８】
好ましい実施形態において、１つ以上の試薬は、可動性固体支持体（例えば、ビーズまたはミクロスフェア）の集団に固定または結合されたＣＭＲＡまたはＵＭＲＡに送達される。このビーズまたはミクロスフェアは球状である必要はなく、不規則な形状のビーズが使用され得る。これらは代表的に、多数の材料（例えば、プラスチック、ガラスまたはセラミック）から構築され、そしてビーズは、反応チャンバーの幅に依存して、数ナノメートルから数ミリメートルまでの範囲の寸法をとり得る。好ましくは、各可動性固体支持体の直径は、各反応チャンバーの幅の０．０１倍〜０．１倍であり得る。種々のビーズの化学的性質が使用され得る（例えば、メチルスチレン、ポリスチレン、アクリル酸ポリマー、ラテックス、常磁性体、トリアゾール（ｔｈｏｒｉａｓｏｌ）、黒鉛状炭素、および二酸化チタン）。ビーズの構成または化学的性質は、所望される試薬の結合を容易にするように選択され得る。
【０１２９】
別の実施形態では、生物活性因子をまず合成し、次いで、それをビーズに共有結合させる。当業者に理解されるように、これは、生物活性因子およびビーズの組成に依存して行われる。チオール、アミン、カルボキシルなどのような化学的反応基による、固体支持体表面（例えば、特定のポリマー）の官能化は、当該分野で周知である。従って、使用者によって所望される官能基の結合を容易にする表面の化学的性質を有する「ブランク」ビーズが使用され得る。ブランクビーズに関するこれらの表面の化学的性質のさらなる例としては、アミノ基（脂肪族アミンおよび芳香族アミンを含む）、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネートおよびスルフェートが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
これらの官能基を用いて、一般的に公知の化学を使用することにより、かなり多数の種々の候補因子をビーズに付加し得る。例えば、炭水化物を含有する候補因子は、アミノ官能化された支持体に結合され得る；炭水化物のアルデヒドは、標準的な技術を使用して作製され、次いで、このアルデヒドを、表面のアミノ基と反応させる。代替的な実施形態では、スルフヒドリルリンカーを使用し得る。システインを含有するタンパク質様因子を支持体に結合させるために使用され得る、当該分野で公知の多数のスルフヒドリル反応性リンカーが存在する（例えば、ＳＰＤＰ、マレイミド、α−ハロアセチルおよびピリジルジスルフィド（例えば、１９９４  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ｃａｔａｌｏｇ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒｓ，１５５−２００頁（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと））。あるいは、候補因子上のアミノ基が、表面上のアミノ基への結合のために使用され得る。例えば、多数の安定な二官能の基（ホモ二官能性リンカーおよびヘテロ二官能性リンカーを含む）が当該分野で周知である（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１５５−２００頁を参照のこと）。
【０１３１】
さらなる実施形態では、カルボキシル基（表面または候補因子のいずれかに由来する）を、周知のリンカー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと）を使用して、誘導体化し得る。例えば、カルボジイミドは、アミンのような良好な求核性試薬による攻撃のために、カルボキシル基を活性化する（Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒｅａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７（４）：２７５−３０８（１９９１）を参照のこと）。タンパク質様候補因子はまた、例えば、ポリマーへの抗体の結合についての当該分野で公知の他の技術を使用して、結合され得る；Ｓｌｉｎｋｉｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２：３４２−３４８（１９９１）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら，前出；Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．３：３２３−３２７（１９９２）；Ｋｉｎｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６１７６−６１８５（１９９４）；およびＷｉｌｂｕｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：２２０−２３５（１９９４）を参照のこと。候補因子は、上記に列挙された方法を含む種々の方法で結合され得ることが理解されるべきである。好ましくは、結合の様式は、候補因子の官能性を顕著に変化させない；すなわち、候補因子は、その標的との相互作用を可能にするような柔軟（ｆｌｅｘｉｂｌｅ）な様式で結合されるべきである。
【０１３２】
ビーズに酵素を固定化するための特定の技術が、先行技術において公知である。１つの例では、ＮＨ２表面化学ビーズを使用する。表面の活性化は、ｐＨ６．９を提供するリン酸緩衝化生理食塩水（１０ｍＭ）中の２．５％グルタルアルデヒドによって達成される（１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）。この混合物を、室温で約２時間にわたり撹拌ベッドにおいて撹拌する。次いで、このビーズを、超純水＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０（界面活性剤）−０．０２％でリンスし、そして再度、ｐＨ７．７のＰＢＳ＋０．０１％のＴｗｅｅｎ２０でリンスする。最後に、酵素を、好ましくは、０．４５μｍ  ａｍｉｃｏｎ  ｍｉｃｒｏｐｕｒｅフィルターを使用して予め濾過した後で、この溶液に加える。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、可動性固体支持体に固定される試薬は、スルフリラーゼ活性を有するポリペプチド、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド、またはスルフリラーゼ活性およびルシフェラーゼ活性の両方を有するキメラポリペプチドであり得る。１つの実施形態において、この試薬は、ＡＴＰスルフリラーゼとルシフェラーゼとの融合タンパク質であり得る。スルフリラーゼ反応の生成物は、ルシフェラーゼによって消費されるので、これらの２つの酵素の間を近位にすることは、融合タンパク質の形態でこの２つの酵素を共有結合することによって達成され得る。他の実施形態では、可動性固体支持体に固定される試薬は、配列を決定または分析されるべき核酸であり得る。
【０１３４】
ＤＮＡの配列決定および他の適用に適用される場合の本発明の多くの改変および代替的な実施形態は、容易に明らかであり、そしてそれらは、本発明の範囲内にあるとみなされる。
【０１３５】
（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））
ＰＣＲもまた、ＣＭＲＡ（またはＵＭＲＡ）において実施され得る。ＰＣＲ反応における関与物としては、テンプレートＤＮＡ、プライマー、ポリメラーゼ、およびデオキシヌクレオチドが挙げられる。これらの分子のいくつかについての拡散係数は以下の通りである：
分子 Ｄ（１０−５ｃｍ２／ｓ）
Ｔａｑポリメラーゼ                ０．０６＊
ＤＮＡ（１１００マー、二重鎖）    ０．００７＊＊
＊より小さな分子量を有するオボアルブミン（Ｔａｑポリメラーゼについての９０ｋＤと比較すると、オボアルブミンについては４５ｋＤ）よりもわずかに低いと考えられる；オボアルブミンについてのＤは、０．０８・１０−５（Ｃｕｓｓｌｅｒ、１９９７）
＊＊Ｌｉｕら、２０００。
【０１３６】
増幅されるべきＤＮＡ配列を、１つのマイクロチャネルまたはマイクロウェルあたり１コピー程度の少数コピーの配列として、ＣＭＲＡ中に充填する。次に、ポリメラーゼおよびプライマーを充填し、そして流動を介してヌクレオチドを添加する。次いで、サーマルサイクリングを、ＩＲまたは熱制御の他の手段によって、ＣＭＲＡを加熱することによって進行させる。ＣＭＲＡを通したｄＸＴＰ溶液（そしていくつかの場合ではプライマー）の連続的な流動は、ＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェル中における増幅生成物の保持を確実にする。なぜなら、ｄＸＴＰ（そしておそらく、プライマー）の溶液が連続的に添加されるからである。この結果として、独立したＣＭＲＡのマイクロチャネルまたはマイクロウェルにおいて実行される独立したＰＣＲ反応のアレイ（各々が、異なるＤＮＡ配列を増幅する）が得られる。
【０１３７】
他のＤＮＡ増幅技術が同様の様式で実施され得ることが留意され得る。このような代替的な技術としては、ビーズ上におけるブリッジ増幅（ｂｒｉｄｇｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、直鎖状オリゴヌクレオチドコンカテマーを形成するためのローリングサイクル増幅（ＲＣＡ）およびハイパーブランチング増幅（ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。
【実施例】
【０１３８】
（実施例）
（実施例１：ＵＭＲＡにおけるピロリン酸ベースの配列決定）
（材料）
（試薬）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズは、３０±１０μｍであり、そして１ビーズあたり１×１０９個のビオチン分子を結合し得る（非常に高い結合能）。膜におけるＰＣＲにおいて使用されたオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りである；Ｃｙ３−標識化プローブＦ（５’−［Ｃｙ３］ＡＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＣＴＡＡＣＣＡＴＧＡＡＧ−３’）（配列番号１）、ビオチン化プローブ（５’−ＲＢｉｏｔ（ｄＴ１８）ＧＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡ−３’）（配列番号２）、ＳｓＤＮＡテンプレート（５’−ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＴＴＡ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＴＡＴ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＧＴＣ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＣＴＡ  ＧＧＴ  ＣＧＧ  ＴＧＡ  ＧＡＧ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  Ｃ−３’）（配列番号３）、および非チオビン化プローブ（５’−ＧＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡ−３’）（配列番号４）、Ｓｅｑ１  ５’−ＡＣＧ  ＴＡＡ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＣＣＣ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＧＴＡ  ＣＧＴ  ＡＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＴＣＧ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ−３’（配列番号５）、ＰＲＢ  １  ５’−ＢＳ−ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ−３’（配列番号６）。
【０１３９】
（ビーズの調製）ストレプトアビジンを結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）へのビオチン化一本鎖ＤＮＡプローブの結合体化を、以下のプロトコールを使用して実施した：１００μｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（１×１０８ビーズ／ｍｌ）および３００μｌの結合洗浄緩衝液（製造業者によって推奨されるようなもの）を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  １００（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）膜に適用した。このチューブを、微小遠心分離器において６分間にわたり５０００ｒｐｍでスピンした。ビーズを、３００μｌの結合洗浄緩衝液で２回洗浄した。このチューブを新しいチューブへと反転させて配置し、そしてビーズを膜からスピンさせて離した（６０００ｒｐｍで１分間）。ビーズを沈殿させ、そして上清を取り除いた。１００μｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）のビオチン化プローブ溶液をこのビーズに添加した。最終的なサンプル容量は、約１００μｌであった。チューブを、ロータリー上に室温で１時間にわたって配置して、ビオチン化プローブとビーズとを結合体化させた。結合体化の後に、ビーズを、上記のようにＴＥ緩衝液で３回洗浄した。最終的なビーズ容量は約１００μｌであり、これを−２０℃で保存した。
【０１４０】
（方法）
（第１膜に対する酵素の負荷）基質は、３００μｌのＤ−ルシフェリン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、４μＭのＡＰＳ（アデノシン５’ホスホ硫酸ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ）、４ｍｇ／ｍｌのＰＶＰ（ポリビニルピロリドン、Ｓｉｇｍａ）、および１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール、Ｓｉｇｍａ）からなる。１０μｌの組換えルシフェラーゼ（１４．７ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａから）および７５μｌのＡＴＰスルフリラーゼ（１．３ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａから）を、１ｍｌの基質中において混合した。この酵素混合物を、基質で湿らせた限外濾過膜（ＭＷＣＯ  ３０，０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上にピペッティングした。吸引を適用して、膜の微細構造中に酵素混合物を捕捉した。膜に吸着された酵素は、室温で１８時間にわたり安定であることが見出された。
【０１４１】
（第２膜に対するＤＮＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズの負荷）結合したＤＮＡ（１ビーズあたり３×１０６コピー）を有する１００μｌのＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（１ｍｌあたり１×１０８ビーズ）を基質中に希釈し、そして第２のナイロン膜（Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）に適用した。このビーズは、３０±１０μｍであり、そしてこのナイロン膜は、孔直径３０μｍを有する。真空吸引を適用して、膜のメッシュにビーズを固定した。次いで、このナイロン膜を、酵素の膜の上に置いた。８０μｌのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素（８０００Ｕ／μｌ）を、ナイロン膜にピペッティングし、そしてこの膜を、室温で３０分間にわたりインキュベートした。インキュベートの後で、図１１に示すように、ガラスウィンドウをこの膜の上に置いた。膜のホルダーを、マルチポジションバルブ（Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）から）と２つの蠕動ポンプ（Ｉｎｓｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）とから構成されるＦｌｕｉｄｉｃ  １．１に接続した。基質の流動の間、上部のポンプを、２分間にわたり０．５ｍｌ／分間の流動速度で運転し、そして下部のポンプを、５０μｌ／分間の流動速度で一定に運転した。ピロリン酸（ｐｐｉ）またはヌクレオチドの流動の間、上部のポンプの流動速度は、２分間にわたり０．１ｍｌ／分間であった。
【０１４２】
（画像化システム）
画像化システムは、ＣＣＤカメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ２ｋ×２ｋ（２４μｍのピクセルサイズを有する））と２つのレンズ（５０ｍｍ、ｆ  １／１．２）とから構成される。一方のレンズは、酵素混合物とｐｐｉの相互作用の結果において生じる光を収集し、そして他方のレンズは、ＣＣＤカメラにその光の焦点を合わせる。すべての実験について収集時間は１秒間であった。ｄＮＴＰ（２分間にわたり、６．５μＭのｄＧＴＰ、６．５μＭのｄＣＴＰ、６．５μＭのｄＴＴＰ、および５０μＭのｄＡＴＰ−αｓ）をＤＮＡビーズに添加する流出（ｒｕｎ−ｏｆｆ）により、バックグラウンドを超える５０００カウントが得られた。バックグラウンドは、通常、１６０カウントであった。
【０１４３】
（結果）
（対流配列決定の感度）図１２は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに固定されたオリゴｓｅｑ１についてのピログラム（生成されるピロリン酸の結果として生成される光子の測定値）を示す。１ビーズあたりのオリゴのコピー数は、約１０００であった。実験条件は、図１３に記載される条件と同じであった。図１４から、０．１μＭ（ｐｐｉ）についてのシグナルは約３００カウントであったことが概算される。１塩基（ヌクレオチドＡ）についてのシグナルは、１ビーズあたり１０００ＤＮＡのコピー数で約３８カウントであった。対流配列決定についてのこの高い感度は、可溶性酵素の活性の保持に一部起因する；なぜなら、この酵素混合物はビーズに固定されないが、限外濾過膜の微細構造に物理的に捕捉されるからである。また、膜上における酵素の濃縮が増加され得ることにより、感度の増強がもたらされる。
【０１４４】
この実施形態では２つの膜（互いに接触する）を使用したが、単一の膜でも同様に十分であり、そして配列決定されるべき核酸、ならびに必要な配列決定の酵素および基質を単一の膜上に捕捉することが当業者にとって慣用的であることに留意のこと。
【０１４５】
（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ上にルシフェラーゼおよびＡＴＰスルフリラーゼを固定することの効果）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズは、３０±１０μｍであり、そして１ビーズあたり１×１０９のビオチンの結合能を有する。従って、１つのビーズは、そのビーズが１０４〜１０６コピーの核酸テンプレートを負荷した後で、ルシフェラーゼおよびＡＴＰスルフリラーゼの固定化に適合し得る。ＤＮＡ分子を有するＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズ上におけるルシフェラーゼおよびスルフリラーゼの固定化の効果を研究した。０．５μｌのオリゴｓｅｑ１を、ｐｒｂ１プライマーを有する１００μｌのｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに添加した。この混合物を、ＰＣＲサーモサイクラー内に配置し、そして９５℃まで加熱し、そして０．１℃／ｓの速度で４℃まで冷却させた。過剰なオリゴを、アニーリング緩衝液でビーズを２回洗浄することによって取り除いた。ルシフェラーゼおよびスルフリラーゼの混合物１００μｌを、５μｌのビーズに添加し、そして回転させながら４℃で１時間にわたりインキュベートした。酵素混合物を有するＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズのピログラムは、固定された酵素を有さないビーズよりも、約３．５倍優れた感度を示した。
【０１４６】
（実施例２：ＵＭＲＡの生成）
限外濾過膜を使用して、化学反応の高密度２−Ｄアレイ（「限局型膜リアクターアレイ」、すなわち、ＵＭＲＡ）を作製する。このＵＭＲＡにおいて、反応は、フィルター表面に触媒または反応物または酵素を濾過することによって播種され、ここで対流流動は、拡散分子が隣接する反応を汚染するよりも前に、その拡散分子を側方へと洗い流す。濃度分極が、ＵＭＲＡのための分子充填カラムを作製するために必要とされ、次いで、濃度分極を介して分子を連続的に充填することにより、堆積カラムが作製される。次いで、化学物質の連続的な処理のために、ＵＭＲＡの充填カラムを通して試薬を流動させる。次いで、限外濾過膜を、第２のより多孔性の膜に結合させ、濃度分極によって濃縮される分子に対して機械的支持を提供し得る。この膜は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／Ｐｏｒ膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）、または、例えば、Ｗｈａｔｍａｎ  ＰＬＣによって販売される、限外濾過膜のＡｎｏｐｏｒｅＴＭおよびＡｎｏｄｉｓｃＴＭファミリーである。
【０１４７】
基材材料は、好ましくは、反応事象の検出を容易にする材料から作製される。例えば、代表的な配列決定反応では、配列決定されるべきサンプル核酸に対するｄＮＴＰの結合は、配列決定反応において遊離されるリン酸に対する酵素作用により生成される光子の検出によってモニターされ得る。従って、透明な材料または光を伝える材料から作製された基材材料を有することは、光子の検出を容易にする。試薬（例えば、酵素およびテンプレート）は、可動性固体支持体（例えば、ビーズ）によって、反応部位に送達される。
【０１４８】
ＵＭＲＡは、ナイロン膜と同様の取り扱い特性を有する。反応チャンバーは、直接的に膜上に形成され、その結果、各反応部位は、その膜自体の織繊維によって形成される。あるいは、光ファイバー束が、ＵＭＲＡの表面のために利用される。例えば、酸によって、ファイバー束の端部を処理して、光ファイバー材料において窪みを形成することによって、表面はそれ自体が空隙形成される。従って、空隙は、光ファイバー束から形成され、好ましくは、空隙は、光ファイバー束の一端をエッチングすることによって形成される。空隙形成された表面の各々は、反応チャンバー（すなわち、光ファイバーリアクターアレイ（ＦＯＲＡ））を形成し得る。窪みは、個々の光ファイバーの直径の約半分からファイバーの直径の２〜３倍までの範囲の深さである。空隙は、種々の時間量にわたって酸浴中に光ファイバーウェーハの一方の側を配置することによって、ファイバーの端部に導入される。時間量は、所望される反応空隙の全体的な深さに依存して変動する（Ｗａｌｔら，１９９６．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：１８８８）。光ファイバーウェーハの反対側（すなわち、エッチングされていない側）は、代表的に、高度に研磨され、第２の光ファイバー束への光学的なカップリング（例えば、オイルまたは他の光学的カップリング流体に浸漬することによって）を可能にする。この第２の光ファイバー束は、反応チャンバーを含む光学ウェーハの直径と正確に一致し、そして取り付けられた検出デバイス（例えば、ＣＣＤ画像化システムまたはカメラ）への光生成物の伝送のためのコンジットとして機能する。次いで、光ファイバーウェーハを、例えば、水溶液中の１５％Ｈ２Ｏ２／１５％ＮＨ４ＯＨ（容量／容量）で連続的に洗浄し、次いで、６回脱イオン水でリンスし、次いで、０．５Ｍ  ＥＤＴＡで洗浄し、６回脱イオン水で洗浄し、１５％Ｈ２Ｏ２／１５％ＮＨ４ＯＨで洗浄し、そして６回脱イオン水で洗浄する（各洗浄において３０分間のインキュベーション）ことによって、徹底的に洗浄する。
【０１４９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】マイクロウェルの２−Ｄアレイを横切る流動の影響。左側において、流動は存在せず、そして化合物（灰色）の拡散が、その反応物を含むマイクロウェルから広がる半球状の化学物質濃度勾配を作製する。右側において、流動は化合物を下流に運び、濃度の柱状噴流（ｐｌｕｍｅ）を作り出す。付近のウェルおよび／または遠位のウェルへの化合物の拡散および／または対流による輸送から生じるマイクロウェルの相互汚染は、本発明によって最小化または回避される。
【図２】限局型膜リアクターアレイ（ＣＭＲＡ）を形成する、マイクロチャネルアレイおよび多孔性膜障壁の一体物または物理的複合体。ＣＭＲＡを通る流体の流動は、そのＣＭＲＡに沿って反応関与物を運ぶ。拒絶された高分子は濃度分極を受け、そしてそのようにして、それらは支持体上に固定されることなく、マイクロチャネル内において濃縮および局在化される。
【図３】異なる高分子を含む溶液の連続的な添加は、マイクロチャネルまたはマイクロウェル内におけるそれらの層状化を可能にし、そのようにして、堆積カラムの微視的な等価物を形成する。
【図４】ＣＭＲＡ表面に対して上部および接線方向にある流体流動は、流動区画に沿って圧力の低下を生じさせ得、次いで、この圧力の低下は、ＣＭＲＡに沿って距離に応じて減少するようなＣＭＲＡにわたる圧力の差異を生じさせ得る。この変動が大きな場合、ＣＭＲＡを通る流動速度もまた入口からの距離に応じて変動し、不均一であるようなマイクロチャネルへの分子の送達の原因となる。
【図５】放射状または環状面状の流体入口は、ＣＭＲＡに対する圧力の変動を減少させ、マイクロチャネルを通した流動速度をよりほぼ等価なものとする。
【図６】ＣＭＲＡの下流にある流体流動制限因子（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｒ）、バルブ、または背圧レギュレーターは、ＣＭＲＡ流動区画に関連した流動抵抗と比較して優勢な流動抵抗性（すなわち、大きな圧力の低下）を提供し−従って、ＣＭＲＡにわたって比較的均一な圧力差異（そしてそれを通した均一な流体流動）を維持する。ここでは、必要に応じた流体再循環と共に示される。
【図７】非限局型膜リアクターアレイ（ＵＭＲＡ）。特定の分子は、濃度分極によって、多孔性フィルターに隣接して濃縮され得る。他の分子または粒子は、ＵＭＲＡの上部または内部において別個の反応部位に、分散された２−Ｄアレイを形成するような様式で添加される。別個の反応部位で形成された生成物は、多孔性フィルター（例えば、ＵＦ膜）を通した流動によって運ばれ、下流に広がる反応生成物の柱状噴流を作り出す。生成物は、別々の柱状噴流が融合する前にＵＭＲＡから洗い流され、それにより、異なる反応部位で起こらなければならない独立した反応の相互汚染を効率的に最小化または回避する。
【図８】限外濾過膜および粗いフィルター、メッシュまたは他の大まかに（ｇｒｏｓｓｌｙ）多孔性のマトリクスからなる、非限局型膜リアクターアレイ（ＵＭＲＡ）。２つのフィルターを互いに層重ねし、より粗いフィルターを上流にする。後者は、限外濾過膜に隣接して形成された濃度分極された分子の層を安定化するにおいて補助し得、そしてこれは、反応生成物の側方拡散に対していくらかの抵抗性を提供し得る。より粗いフィルター、メッシュまたはマトリクスはまた、機械的な支持を提供し得る。
【図９】光子の検出を伴う、ピロリン酸ベースの配列決定方法の概略図である。
【図１０】ＣＭＲＡにおいてマイクロチャネルまたはマイクロウェルからの光生成を検出するための光検出器アレイとしてのＣＣＤの使用。
【図１１】実施例１に記載される対流流動実施形態についての実験設定。
【図１２】オリゴ配列１を有するセファロースビーズにおけるルシフェラーゼおよびＡＴＰスルフリラーゼの固定化の効果。（Ａ）酵素はビーズに固定されなかった。（Ｂ）酵素はビーズに固定され、そしてシグナルは、３．５倍の倍率で改善された。
【図１３】ＣＭＲＡまたはＵＭＲＡのために利用され得るナイロン織物フィルターの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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