(57)【要約】本発明は、送達ベヒクルとしての使用のための陽イオン性ステロイドもしくは陽イオン性薬物分子を作成するための一段階合成技術のための組成物および方法に関する。本発明はさらに、リポフェクションもしくはトランスフェクション、薬物の送達、ならびに炎症ならびに他の疾患および障害の治療のための陽イオン性ステロイド分子の使用方法に関する。本発明はまた、陽イオン性ステロイドプロドラッグおよび陽イオン性プロドラッグ、ならびに薬物の改変方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合することであって、前記結合試薬は、前記ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合し、
前記結合されたステロイド−ポリアミン分子を精製すること、ならびに
前記ステロイド−ポリアミン分子を脂質と混合して、それにより陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを生じさせること
を含んで成る、陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルの作成方法。
【請求項２】
ジメチルスルホキシドが、前記ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体、前記結合試薬および前記ポリアミンと混合される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ステロイドが、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスタゲン、ステロイドアゴニスト活性をもつ類似物、ステロイドアンタゴニスト活性をもつ類似物、不活性構造類似物、およびそれらの改変物もしくは誘導体よりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ステロイドが、陽イオン性ステロイドおよび陽イオン性ステロイドプロドラッグよりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、グリコサミノグリカン、コラーゲン、フィブリン、細胞糖衣、赤血球糖衣、シアル酸、硫酸化糖衣および単離された核酸よりなる群から選択される分子の陰イオン性ドメインと結合する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記グリコサミノグリカンがヒアルロン酸である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ステロイドが、デキサメサゾン、１１−デオキシコルチコステロン−２１−メシレート、コルチコステロン−２１−メシレート、１１−デクソキシコルチゾール−２１−メシレート、コルチゾール−２１−メシレート、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、２１−クロロ−１７ヒドロキシプロゲステロン、トシル酸コレステロール、メシル酸ヒドロコルチゾン、１７α−メシレート−エストラジオール−３−アセテートおよびデキサメソゾン−２１−メシレートよりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ステロイドがデキサメサゾンである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ステロイドがデキサメサゾン−２１−メシレートである、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記ステロイドがメシル酸誘導体である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記結合試薬が２−イミノチオランである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリアミンが、スペルミン、ポリリシン、リシン、リシン含有ペプチド、アルギニン含有ペプチド、陽イオン性ポリマーおよびアミンの豊富なポリマーよりなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記陽イオン性ポリマーがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記脂質が中性脂質である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記脂質がヘルパー脂質である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記中性脂質が、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロールよりなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記脂質が陽イオン性脂質である、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記陽イオン脂質が、３−β−［Ｎ’，Ｎ’ジメチルアミノエタン］−カルバモイル］コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル［Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２’−（１’’，２’’−ジオレオイルオキシプロピルジメチル−アンモニウムブロミド）−Ｎ−エチル−６−アミンドスペルミン四トリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，３−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびＧＬ−６７よりなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
デキサメサゾン−スペルミン分子および脂質を含んで成る陽イオン性非ウイルス送達ベヒクル。
【請求項２０】
請求項１記載の方法により作成された陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクル。
【請求項２１】
請求項１記載の方法により製造された陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルおよび製薬学的に許容できる担体を含んで成る組成物。
【請求項２２】
薬物またはその改変物もしくは誘導体、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合することであって、前記結合試薬は、前記薬物またはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合し、
前記結合された薬物−ポリアミン分子を精製すること、ならびに
前記薬物−ポリアミン分子を脂質と混合して、それにより陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを生じさせること
を含んで成る、陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルの作成方法。
【請求項２３】
ジメチルスルホキシドが前記薬物またはその改変物もしくは誘導体、前記結合試薬および前記ポリアミンと混合される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記薬物が疎水性薬物である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記薬物がメシル酸誘導体である、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記薬物が陽イオン性薬物および陽イオン性プロドラッグよりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
請求項２２記載の方法により作成される陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクル。
【請求項２８】
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合されたステロイド−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記ステロイド−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクル、アプリケーター、およびそれの使用のための説明資料を含んで成る、
前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを投与するためのキット。
【請求項２９】
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、薬物またはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記薬物またはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合された薬物−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記薬物−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクル、アプリケーター、およびそれの使用のための説明資料を含んで成る、
前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを投与するためのキット。
【請求項３０】
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合されたステロイド−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記ステロイド−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、
さらに、前記送達ベヒクルが、細胞への化合物の送達を促進してそれにより前記細胞への前記化合物の送達を促進する、
前記化合物および有効量の前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを含んで成る組成物を前記細胞に投与することを含んで成る、前記細胞への前記化合物の送達の促進方法。
【請求項３１】
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、薬物またはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記薬物またはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合された薬物−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記薬物−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、
さらに、前記送達ベヒクルが、細胞への化合物の送達を促進してそれにより前記細胞への前記化合物の送達を促進する、
前記化合物および有効量の前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを含んで成る組成物を前記細胞に投与することを含んで成る、前記細胞への前記化合物の送達の促進方法。
【請求項３２】
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合されたステロイド−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記ステロイド−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、
さらに、前記送達ベヒクルが、組織への化合物の送達を促進してそれにより前記組織への前記化合物の送達を促進する、
前記化合物および有効量の前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを含んで成る組成物を前記組織に投与することを含んで成る、前記組織への前記化合物の送達の促進方法。
【請求項３３】
前記化合物が前記組織の陰イオン性構成要素に結合し、さらに、前記化合物が送達ベヒクルからゆっくりと放出される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記送達ベヒクルが前記組織の陰イオン性構成要素に結合し、さらに、前記化合物が送達ベヒクルからゆっくりと放出される、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、薬物またはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記薬物またはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合された薬物−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記薬物−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、
さらに、前記送達ベヒクルが、組織への化合物の送達を促進してそれにより前記組織への前記化合物の送達を促進する、
前記化合物および有効量の前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを含んで成る組成物を前記組織に投与することを含んで成る、前記組織への前記化合物の送達の促進方法。
【請求項３６】
前記化合物が前記組織の陰イオン性構成要素に結合し、さらに、前記化合物が送達ベヒクルからゆっくりと放出される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記送達ベヒクルが前記組織の陰イオン性構成要素に結合し、さらに、前記化合物が送達ベヒクルからゆっくりと放出される、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
前記組織が、筋、粘膜、上皮、神経、結合織、血液、間質、心、肝、腎、皮膚、脳、腸管、間質腔、骨、骨髄、関節、軟骨、腱、食道、性腺、脳脊髄液、膵、脾、眼、鼻腔および毛髪よりなる群から選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３０記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が、内皮細胞、間葉細胞、神経細胞、線維芽細胞、ニューロン、平滑筋細胞、腎細胞、肝細胞、筋芽細胞、幹細胞、胚幹細胞、造血幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、単球、好中球、マクロファージ、網膜神経細胞および上皮細胞よりなる群から選択される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記化合物が、核酸、組換えタンパク質、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、腫瘍壊死因子α受容体、オメプラゾール、シンバスタチン、アトロバスタチンカルシウム、ベシル酸アムロジピン、ロラタジン、ランソプラゾール、エポエチンα、セレコキシブ、塩酸フルオキセチン、オランザピン、塩酸パロキセチン、ロフェコキシブ、塩酸セルトラリン、エポエチンα、結合型エストロゲン、アモキシシリンおよびクラブラン酸カリウム、プラバスタチンナトリウム、マレイン酸エナラプリル、塩酸メトホルミン、プラバスタチン、ロサルタンカリウム、塩酸シプロフロキサシン、リスペリドン、パクリタキセル、アジトロマイシン、インターフェロンα−２ｂ、レバビリン、クエン酸シルデナフィル、ギャバペンチン、プロピオン酸フルチカゾン、アレンドロン酸ナトリウム、クラリスロマイシン、フィルグラスチム、シクロスポリン、リシノプリル二水和物、ベンラファキシンＨＣｌ、ヒトインスリン、レボフロキサシン、フェキソフェナジン、塩酸塩、リシノプリル／リシノプリル、コハク酸スマトリプタン、ニフェジピン、フルコナゾール、セフトリアキソンナトリウム、ファモチジン、エノキサパリンナトリウム、酢酸リュープロリド、キシナホ酸サルメテロール、硫酸クロピドグレル、ランソプラゾールおよびラニチジンよりなる群から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸が、プラスミド、発現ベクター、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＣＲ産物、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）および単離された核酸よりなる群から選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記単離された核酸がＤＮＡである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が哺乳動物中にない、請求項３０記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が哺乳動物中のｉｎ  ｖｉｖｏにある、請求項３０記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物が、局所、経口、皮下、鼻内、直腸、膣、筋肉内および静脈内よりなる群から選択される経路を介して投与される、請求項３０記載の方法。
【請求項４８】
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合されたステロイド−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記ステロイド−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、
さらに、化合物が、疾患もしくは障害を治療してそれにより哺乳動物における疾患もしくは障害を治療する、
前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルおよび有効量の前記化合物を含んで成る組成物を前記哺乳動物に投与することを含んで成る、前記哺乳動物における前記疾患もしくは障害の治療方法。
【請求項４９】
有効量の前記化合物もしくは有効量の別の化合物もまた、前記陽イオン性送達ベヒクル以外のベヒクルにより送達される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患もしくは障害が、炎症、喘息、関節炎、疼痛、関節の炎症、癌、アレルギー、高血圧、過形成、転移、跛行、血管内膜過形成、血友病、凝固障害、自己免疫障害、潰瘍、びらん性食道炎、心疾患もしくは状態、病理学的分泌亢進状態、鼻炎、慢性特発性蕁麻疹、分泌亢進状態、胸焼け、感染症、家族性腺腫性ポリポージス、うつ、強迫性障害、神経性過食症、月経前不快気分障害、精神病性障害、統合失調症、精神病性障害、双極性障害、強迫性障害、汎発性不安障害、パニック障害、社会不安障害、月経困難症、疼痛、心的外傷後ストレス障害、パニック障害、貧血、閉経期の症状、骨粗鬆症、低エストロゲン症、外陰萎縮症、高コレステロール血症、ＩＩ型糖尿病、カポジ肉腫、疣贅、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、勃起障害、癲癇、パジェット病、好中球減少症、前駆細胞移動、臓器移植拒絶、乾癬、群発性頭痛、偏頭痛、狭心症、高血圧、カンジダ症、胃炎、心虚血の合併症、子宮内膜症、中枢性性早熟症、気管支攣縮、胃食道逆流症、肥満細胞症および増殖性障害よりなる群から選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、薬物またはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記薬物またはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合された薬物−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記薬物−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、
さらに、化合物が、疾患もしくは障害を治療してそれにより哺乳動物における疾患もしくは障害を治療する、
前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルおよび有効量の前記化合物を含んで成る組成物を前記哺乳動物に投与することを含んで成る、前記哺乳動物における前記疾患もしくは障害の治療方法。
【請求項５２】
化合物が疾患もしくは障害を治療し、
さらに、陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、該ステロイド−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記ステロイド−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成される、
前記陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクル、および有効量の前記化合物、アプリケーター、ならびにそれの使用のための説明資料を含んで成る、哺乳動物における前記疾患もしくは障害を治療するためのキット。
【請求項５３】
化合物が疾患もしくは障害を治療し、
さらに、陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、薬物またはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記薬物またはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、該薬物−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記薬物−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成される、
前記陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクル、および有効量の前記化合物、アプリケーター、ならびにそれの使用のための説明資料を含んで成る、哺乳動物における前記疾患もしくは障害を治療するためのキット。
【請求項５４】
細胞に化合物および有効量の陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクルを投与することを含んで成り、前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記ステロイドまたはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、該ステロイド−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記ステロイド−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、さらに、前記送達ベヒクルが前記細胞中への前記化合物の取込みを促進してそれにより前記化合物の前記細胞中への取込みを促進する、前記細胞中への前記化合物の取込みの促進方法。
【請求項５５】
細胞に化合物および有効量の陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクルを投与することを含んで成り、前記陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルが、薬物またはその改変物もしくは誘導体、ジメチルスルホキシド、結合試薬およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記薬物またはその改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合させる］、前記結合された薬物−ポリアミン分子を精製すること、ならびに前記薬物−ポリアミン分子を脂質と混合することにより作成され、さらに、前記送達ベヒクルが前記細胞中への前記化合物の取込みを促進してそれにより前記化合物の前記細胞中への取込みを促進する、前記細胞中への前記化合物の取込みの促進方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
プラスミドＤＮＡ上の非メチル化ＣｐＧモチーフ（非特許文献１）、陽イオン性脂質製剤（非特許文献２）、および脂質／ＤＮＡリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）に対する免疫学的応答は、非ウイルス遺伝子送達に対し大きな障害を与える。導入遺伝子の発現はプラスミド送達後数時間以内に起こる（非特許文献４）とは言え、免疫刺激性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６もまた、全身性（非特許文献２）もしくは鼻内（非特許文献３）投与の１時間後までに検出される。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２のような他の免疫調節性サイトカインは、その後数日間上昇したままである（非特許文献５）。リポプレックスに対するこの迅速な免疫応答は、炎症性サイトカインＩＬ−６により主として媒介される（非特許文献６）局所組織反応および肝による全身反応よりなる感染に対する急性期の応答に似ている。炎症性サイトカインは、内皮細胞の活性化、ならびに遺伝子送達の部位での好中球、リンパ球およびマクロファージの流入につながる（非特許文献２；非特許文献３）。結果として、非ウイルスＤＮＡ送達に対する免疫学的応答は、導入遺伝子発現の規模と持続時間を低下させ、また、頻繁な投与の有効性を低下させる（非特許文献４）。リポプレックスの投与に先立つもしくはそれと同時の薬理学的用量の抗炎症性グルココルチコイドは、プラスミドに対する免疫応答の阻害に対してポジティブな影響を有し、導入遺伝子発現の量および持続時間の増大、プラスミドの寿命の延長、ならびに投与間隔の短縮をもたらす（非特許文献１；非特許文献７；非特許文献８）。
【０００２】
グルココルチコイドはグルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合して古典的核局在化配列の露出を誘導し、それはインポーチンα／β１の結合および核内へのその後のトラフィッキングを可能にする（非特許文献９；非特許文献１０）。グルココルチコイドはまた：（１）ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのような主要なサイトカインの産生もしくは放出を阻害すること；（２）ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦをコードするｍＲＮＡの安定性を低下させること；ならびに（３）ＧＲを介してＡＰ１およびＮＦ−κＢによるサイトカイン誘発性の転写を阻害することにより免疫系を調節する強力な抗炎症分子でもある（非特許文献１１；非特許文献１２：非特許文献１３）。リガンドに結合されたＧＲは二量体を形成し、それが１５塩基対のグルココルチコイド応答配列（ＧＲＥ）を結合して、転写を誘導もしくは抑制する（非特許文献１３；非特許文献１４）。
【０００３】
ウイルスおよび非ウイルスベクターは、遺伝子送達の基礎として、現在の核酸および遺伝子治療方法において使用されている。しかしながら、遺伝子治療のウイルスベクターの製造、再現性、費用および安全性については懸念が存在する。結果として、研究は、目的の遺伝子構築物が合成非ウイルス性物質にパッケージングされる非ウイルス性ベクターの開発に焦点をあててきた。こうした物質の例は、ポリカチオン、デンドリマーおよび多糖、ならびにジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、３−β−［Ｎ’，Ｎ’ジメチルアミノエタン］−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）およびスペルミンコレステロールのような小分子陽イオン性脂質を包含する。例えば、リポフェクションのための陽イオン性脂質はプラスミドを凝縮し、エンドソームの回避（ｅｓｃａｐｅ）を促進し、ＤＮＡの電荷を中和し、かつ／もしくはヌクレアーゼからＤＮＡを守る（非特許文献５）。
【０００４】
高レベルのトランスフェクションを生じる核酸送達、および、細胞中への高レベルの取込みを生じさせかつまた薬物を局所に送達する能力も包含する薬物送達のための新たな組成物および方法の開発に対する、当該技術分野で長い間感じられている必要性が存在する。固有の薬理学的もしくは生物学的活性、ならびに増大した薬物動態半減期および持続的貯蔵（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｄｅｐｏｔ）作用を有するこうした送達プラットフォーム（ｄｅｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）に対する必要性もまた存在する。本発明はこれらの必要性を満たす。
【非特許文献１】Ｔａｎら、１９９９、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０：２１５３−２１６１
【非特許文献２】Ｔｏｕｓｉｇｎａｎｔら、２０００、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：２４９３−２５１３
【非特許文献３】Ｓｃｈｅｕｌｅら、１９９７、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：６８９−７０７１
【非特許文献４】Ｌｉら、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７６：Ｌ７９６−Ｌ８０４
【非特許文献５】Ｌａｓｉｃ、１９９７、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、ＣＲＣ  プレス（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）
【非特許文献６】Ｓｔｒｅｅｔｚら、２００１、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：６６１−６７３
【非特許文献７】Ｂｒａｕｎら、１９９９、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５４：２７７−２８２
【非特許文献８】Ｗｉｓｅｍａｎら、２００１、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１５６２−１５７１
【非特許文献９】Ｇａｌｉｇｎｉａｎａら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１６２２２−１６２２７
【非特許文献１０】Ｓａｖｏｒｙら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２５−１０３７
【非特許文献１１】Ａｓｈｗｅｌｌら、２０００、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２０９−３４５
【非特許文献１２】ＭｃＥｗａｎら、１９９７、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １９：１５３−１６０
【非特許文献１３】Ｓｃｈｉｍｍｅｒら、１９９６、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １４５９−１４８５、マグロウヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）中
【非特許文献１４】ＭｃＮａｌｌｙら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１２６２−１２６５
【発明の開示】
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、全般として、送達ベヒクルとしての使用のための陽イオン性ステロイドもしくは陽イオン性薬物分子を作成するための一段階合成技術のための組成物および方法に関する。本発明はさらに、リポフェクションもしくはトランスフェクション、薬物の送達における陽イオン性ステロイド分子の使用方法、ならびに炎症ならびに他の疾患および障害の治療方法に関する。本発明はまた、陽イオン性ステロイドプロドラッグおよび陽イオン性プロドラッグにも関する。
【０００６】
一態様において、本発明は、ステロイドもしくは薬物、またはそれらの改変物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）もしくは誘導体、結合試薬（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）、およびポリアミンを一緒に混合すること［ここで、前記結合試薬は前記ステロイドもしくは薬物、またはそれらの改変物もしくは誘導体を前記ポリアミンと結合する］、新たに形成される結合されたステロイド−ポリアミン分子もしくは結合された薬物−ポリアミン分子を精製すること、ならびに、結合されたステロイド−ポリアミン分子もしくは薬物−ポリアミン分子を脂質と混合すること、を含んで成る、陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルの作成方法に関する。
【０００７】
本発明の一局面において、ジメチルスルホキシドが、ステロイドもしくは薬物、またはそれらの改変物もしくは誘導体、前記結合試薬および前記ポリアミンと混合される。
【０００８】
本発明の一態様において、本発明はまた、新たな薬物動態／薬動力学特性をもつ新たな薬物実体を創製するための既存の薬物の改変方法にも関する。本発明の一局面において、該新たな薬物実体は脂質とともに使用してもしなくてもよい。本発明の別の局面において、該新たな薬物実体は、それ自身で、もしくは活性薬物を放出するプロドラッグとして機能してよい。
【０００９】
一態様において、ステロイドは、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスタゲン、ステロイドアゴニスト活性をもつ類似物、ステロイドアンタゴニスト活性をもつ類似物、不活性構造類似物、およびそれらの改変物もしくは誘導体よりなる群から選択される。一局面において、ステロイドは陽イオン性ステロイドおよび陽イオン性ステロイドプロドラッグよりなる群から選択される。
【００１０】
一態様において、陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルは、グリコサミノグリカン、コラーゲン、フィブリン、細胞糖衣、赤血球糖衣、シアル酸、硫酸化糖衣および単離された核酸よりなる群から選択される分子の陰イオン性ドメインと結合する。一局面において、グリコサミノグリカンはヒアルロン酸である。
【００１１】
本発明の一局面において、ステロイドは、デキサメサゾン、１１−デオキシコルチコステロン−２１−メシレート、コルチコステロン−２１−メシレート、１１−デクソキシコルチゾール−２１−メシレート、コルチゾール−２１−メシレート、タモキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、２１−クロロ−１７ヒドロキシプロゲステロン、トシル酸コレステロール、メシル酸ヒドロコルチゾン、１７α−メシレート−エストラジオール−３−アセテートおよびデキサメソゾン−２１−メシレートよりなる群から選択される。
【００１２】
本発明の別の局面において、結合試薬は２−イミノチオランである。
【００１３】
本発明の一態様において、ポリアミンは、スペルミン、ポリリシン、リシン、リシン含有ペプチド、アルギニン含有ペプチド、陽イオン性ポリマーおよびアミン豊富なポリマーよりなる群から選択される。本発明の一局面において、ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。
【００１４】
本発明のさらなる一態様において、脂質は中性脂質である。本発明の一局面において、脂質はヘルパー脂質（ｈｅｌｐｅｒ  ｌｉｐｉｄ）である。本発明の別の局面において、中性脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびコレステロールよりなる群から選択される。本発明のなお別の局面において、脂質は陽イオン性脂質である。
【００１５】
本発明はさらに、疎水性薬物である送達ベヒクルの薬物に関する。局面において薬物はメシル酸誘導体である。本発明の別の局面において、薬物は、陽イオン性薬物および陽イオン性プロドラッグよりなる群から選択される。
【００１６】
本発明はまた、本発明の陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを投与するためのキットにも関する。
【００１７】
本発明はさらに、化合物および有効量の本発明の陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルを含んで成る組成物を投与することを含んで成る、細胞、間質腔もしくは組織への化合物の送達の促進方法に関する。本発明の一局面において、送達ベヒクルはステロイドを含んで成り、また、別の局面において、それは薬物を含んで成る。別の局面において、化合物は間質腔もしくは組織の陰イオン性構成要素を結合して、それが送達ベヒクルからゆっくりと放出されることを可能にする。本発明のなお別の局面において、送達ベヒクルは間質腔もしくは組織の陰イオン性構成要素を結合して、化合物が送達ベヒクルからゆっくりと放出されることを可能にする。
【００１８】
本発明の一態様において、該送達ベヒクルにより送達される化合物は、核酸、薬物またはそれらの改変物もしくは誘導体、あるいは別の分子である。
【００１９】
本発明の一態様において、送達ベヒクルは動物の細胞に化合物を送達する。本発明の一局面において、細胞は哺乳動物細胞であり、また、別の局面において、細胞はヒト細胞である。
【００２０】
本発明はまた、陽イオン性非ウイルス送達ベヒクルおよび有効量の化合物を含んで成る組成物を哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物における疾患もしくは障害の治療方法にも関する。本発明の一局面において、送達ベヒクルはステロイドを含んで成り、また、別のものにおいて、それは薬物を含んで成る。本発明はまた、本発明の送達ベヒクルとともに投与されてももしくはされなくてもよい付加的な化合物で治療することによる疾患もしくは障害の治療方法にも関する。本発明はさらに、哺乳動物における疾患もしくは障害を治療するためのキットに関する。
【００２１】
本発明は、本発明の送達ベヒクルを使用する、細胞中への化合物の取込みの促進方法を包含する。本発明の一局面において、送達ベヒクルはステロイドを含んで成り、また、別のものにおいて、それは薬物を含んで成る。
［詳細な記述］
全般的記述
本発明は、全般として、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ双方の細胞に核酸もしくは薬物のような分子を送達するための非ウイルス送達ベヒクルを作成および使用するための組成物および方法に関する。本発明は、とりわけ、陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクルを含んで成る非ウイルス送達ベヒクルに関し、前記ベヒクルは、ポリアミンに結合されかつ脂質とともに使用されるステロイドまたは他の疎水性製薬学的作用物質もしくは薬物を含んで成る。本発明はまた、新たな薬物動態／薬動力学特性をもつ新たな薬物実体を創製するために既存の薬物を改変することにも関する。本発明の方法は送達ベヒクルを作成することおよび送達ベヒクルの使用を包含する。本発明はまた、細胞に核酸をトランスフェクトするための送達ベヒクルの使用にも関する。本発明はさらに、親製薬学的作用物質もしくは化合物と別個の新たな薬物動態もしくは薬動力学特性を提供しかつ単独でもしくは他の作用物質とともに使用することができる、抗炎症活性のような固有の薬理学的もしくは生物学的活性をもつ化学プラットフォームもしくは送達ベヒクルに関する。
定義
別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により普遍的に理解されると同一の意味するところを有する。本明細書に記述されるものに類似もしくは同等のいかなる方法および物質も、本発明の実施もしくは試験で使用することができるとは言え、好ましい方法および物質を記述する。
【００２２】
本明細書で使用されるところの、以下の用語のそれぞれは、この節でそれと関連する意味するところを有する。
【００２３】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１個もしくは１個以上（すなわち最低１個）の該冠詞の文法上の目的語を指すのに本明細書で使用する。例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１個の要素もしくは１個以上の要素を意味する。
【００２４】
本明細書で使用されるところの「疾患もしくは障害の症状を軽減すること」は、症状の重症度を低下させることを意味する。
【００２５】
「陽イオン性脂質」もしくは「陽イオン性ステロイド」もしくは「陽イオン性薬物」は、正の電荷を有するかもしくはポリアミンと結合されたステロイドのような正の電荷を有する複合体の一部である脂質もしくはステロイドもしくは薬物もしくは疎水性部分である。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「化合物」は、薬物と普遍的にみなされるいかなる型の物質もしくは作用物質、または薬物としての使用のための候補、ならびに上の組合せ剤および混合物も指す。
【００２７】
本明細書で使用されるところの「送達ベヒクル」という用語は、核酸もしくは薬物のような別の分子を結合もしくは運搬しかつ細胞のような標的部位にそれを送達するのに有用な分子もしくは組成物を指す。「送達ベヒクル」は、「薬物送達ベヒクル」「核酸送達ベヒクル」もしくは「送達ベクター」のような用語と互換的に使用する。
【００２８】
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、また、該疾患が改善されない場合に動物の健康が悪化し続ける、動物の一健康状態である。
【００２９】
対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することが可能であるが、しかし動物の健康状態が障害の非存在下でそうであろうよりもより少なく好都合である健康状態である。未処置のままで、障害は、動物の健康状態のさらなる悪化を必ずしも引き起こさない。
【００３０】
疾患もしくは障害は、該疾患もしくは障害の症状の重症度、こうした症状が患者により経験される頻度、または双方が低下される場合に「軽減される」。
【００３１】
本明細書で使用されるところの「ドメイン」という用語は、限定されるものでないが疎水性、極性、球状およびらせん状ドメインを挙げることができる共通の物理化学的特徴、もしくはリガンド結合、シグナル伝達、細胞浸透などのような特性を共有する、分子もしくは構造の一部を指す。結合ドメインの特定の例は、限定されるものでないがＤＮＡ結合ドメインおよびＡＴＰ結合ドメインを挙げることができる。
【００３２】
化合物の「有効量」もしくは「治療上有効な量」は、該化合物が投与される被験体に対する有益な影響を提供するのに十分である化合物の量である。送達ベヒクルの「有効量」は、化合物を効果的に結合もしくは送達するのに十分な量である。
【００３３】
「コードすること」は、ヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定義される配列、もしくはアミノ酸の定義された配列およびそれから生じる生物学的特性のいずれかを有する、生物学的過程において他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型としてはたらく遺伝子、ｃＤＮＡもしくはｍＲＮＡのようなポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞もしくは他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合に、該タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列に同一でありかつ通常は配列表に提供されるコーディング鎖、および遺伝子もしくはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コーディング鎖の双方を、その遺伝子もしくはｃＤＮＡのタンパク質もしくは他の産物をコードすると称することができる。別の方法で明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンでありかつ同一のアミノ酸配列をコードする全部のヌクレオチド配列を包含する。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを包含してもよい。
【００３４】
本明細書で使用されるところの、タンパク質もしくはペプチドに適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常、長さが最低約３〜１５アミノ酸、最低約１５〜２５アミノ酸、長さが最低約２５〜５０アミノ酸、長さが最低約５０〜７５アミノ酸、長さが最低約７５〜１００アミノ酸、および長さが１００以上のアミノ酸であることができる。
【００３５】
本明細書で使用されるところの、核酸に適用されるところの「フラグメント」という用語は、通常、長さが最低約２０ヌクレオチド、典型的には最低約５０ヌクレオチド、より典型的には約５０から約１００ヌクレオチドまで、好ましくは最低約１００ないし約２００ヌクレオチド、なおより好ましくは最低約２００ヌクレオチドないし約３００ヌクレオチド、さらになおより好ましくは最低約３００ないし約３５０、なおより好ましくは最低約３５０ヌクレオチドないし約５００ヌクレオチド、さらになおより好ましくは最低約５００ないし約６００、なおより好ましくは最低約６００ヌクレオチドないし約６２０ヌクレオチド、さらになおより好ましくは最低約６２０ないし約６５０であることができ、そして、最も好ましくは、核酸フラグメントは長さが約６５０ヌクレオチド以上であることができる。
【００３６】
本明細書で使用されるところの「説明資料」は、本明細書に列挙される多様な疾患もしくは障害の軽減を遂げるためのキット中の本発明の化合物、組成物、ベクターもしくは送達系の有用性を伝えるために使用することができる、刊行物、録音（画）、図、もしくはいずれかの他の表現媒体を包含する。場合によっては、もしくはあるいは、説明資料は、哺乳動物の細胞もしくは組織における疾患もしくは障害の１種もしくはそれ以上の軽減方法を記述することができる。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の同定される化合物、組成物、ベクターもしくは送達系を含有する容器に添付することができるか、または、同定される化合物、組成物、ベクターもしくは送達系を含有する容器と一緒に発送されることができる。あるいは、説明資料は、説明資料および化合物が受領者により協同して使用されるという意図をもって容器と別個に発送することができる。
【００３７】
「単離された核酸」は、それが天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離されている核酸セグメントもしくはフラグメント、例えば、該フラグメントに通常は隣接する配列、例えばそれが天然に存在するゲノム中の該フラグメントに隣接する配列から取り出されているＤＮＡフラグメントを指す。該用語はまた、該核酸に天然に付随する他の成分、例えば、細胞中でそれに天然に付随するＲＮＡもしくはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製されている核酸にも当てはまる。従って、該用語は、例えば、ベクター、自律複製プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれるか、あるいは他の配列から独立した別個の分子として（例えばＰＣＲもしくは制限酵素消化により生じられるｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換えＤＮＡを包含する。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含する。
【００３８】
「核酸」という用語は典型的には大型のポリヌクレオチドを指す。
【００３９】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的に、一般に約５０ヌクレオチドより大きくない短いポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）により表される場合に、これは「Ｕ」が「Ｔ」に置き換わっているＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）もまた包含することが理解されるであろう。
【００４０】
「ペプチド」という用語は典型的には短いポリペプチドを指す。
【００４１】
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、適切な送達ベヒクルおよび核酸、薬物、もしくは化合物をそれと組合せることができかつ組合せ後に該適切な送達ベヒクルおよび核酸、薬物もしくは化合物を被験体に投与するのに使用することができる化学的組成物を意味する。
【００４２】
本明細書で使用されるところの「生理学的に許容できる」エステルもしくは塩は、製薬学的組成物中のいかなる他の成分とも適合性である有効成分のエステルもしくは塩の形態を意味し、これは、該組成物が投与されるべきである被験体に対し有害でない。
【００４３】
本明細書で使用されるところの「ポリアミン」は、アミンのポリマー、ならびに、アミン豊富なポリマーもしくは他のアミン含有ポリマー、リシン含有ペプチドおよびアルギニン含有ペプチドのような、アミンを含有する他の型の分子を指す。
【００４４】
「ポリペプチド」は、アミノ酸残基から構成されるポリマー、関連する天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合を介して連結される合成の天然に存在しないその類似物、関連する天然に存在する構造変異体、ならびに合成の天然に存在しないその類似物を指す。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」は一本鎖もしくは平行および逆平行鎖の核酸を意味する。従って、ポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖核酸のいずれかであってよい。
【００４６】
「プライマー」は、指定されるポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズしかつ相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供することが可能であるポリヌクレオチドを指す。こうした合成は、合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド、相補的ヌクレオチド鋳型、およびＤＮＡポリメラーゼのような重合のための作用物質の存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれる場合に起こる。プライマーは典型的に一本鎖であるが、しかし二本鎖であることができる。プライマーは典型的にデオキシリボ核酸であるが、しかし、広範な合成および天然に存在するプライマーが多くの応用に有用である。プライマーは、それがハイブリダイズして合成の開始のための部位として働くように設計されている鋳型に対し相補的であるが、しかし鋳型の正確な配列を反映している必要はない。こうした場合、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば色素産生性、放射活性もしくは蛍光の部分で標識しそして検出可能な部分として使用することができる。
【００４７】
「予防的」処置は、疾患に関連する病状を発症する危険を低下させる目的上、該疾患の兆候を表さないかもしくは疾患の初期兆候のみを表す被験体に投与される処置である。
【００４８】
「タンパク質」という用語は、典型的には大型のポリペプチドを指す。
【００４９】
本明細書で使用されるところの「徐放」は、核酸、薬物もしくは分子が、若干が送達ベヒクルもしくは陰イオン分子に結合されたままであるために全部が容易に利用可能でなく、そしてある時間の期間にわたって利用率に関してゆっくりと放出される、細胞、組織もしくは器官への核酸、薬物もしくは分子の送達を指す。該時間の期間は、徐放性でないものの利用率より最低１０％より長く、好ましくは最低２５％より長く、より好ましくは最低３５％より長く、そしてなおより好ましくは最低５０％より長くあるべきである。こうした薬物もしくは分子は、プロドラッグもしくはステロイドプロドラッグを包含することができる。
【００５０】
「合成ペプチドもしくはポリペプチド」は、天然に存在しないペプチドもしくはポリペプチドを意味する。合成ペプチドもしくはポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成機を使用して合成することができる。当業者は多様な固相ペプチド合成法を知っている。
【００５１】
「治療的」処置は、病状の兆候を消失もしくは排除させる目的上、それらの兆候を表す被験体に投与される処置である。
【００５２】
本明細書で使用されるところの「組織」は、類似の細胞の集合物および細胞間物質ならびにそれらを囲む空隙を包含する組織の一般的定義を指し、また、該用語は、組織および器官中の類似の細胞の集合物を包含するのにもまた本明細書で使用する。
【００５３】
本明細書で使用されるところの「局所適用」という用語は、皮膚のような表面への投与を指す。この用語は「皮膚適用」と互換的に使用する。
【００５４】
「経皮」送達により、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（すなわち「経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」および経粘膜投与の双方、すなわち、皮膚もしくは粘膜組織を通りかつ血流中への薬物の通過による送達を意図している。経皮はまた、それへの薬物もしくは化合物の局所適用による薬物もしくは化合物の投与のための入口としての皮膚も指す。
【００５５】
本明細書で使用されるところの「治療する」ことという用語は、患者すなわち被験体により症状が経験される頻度を低下させること、または、症状が経験される頻度を低下させるために作用物質もしくは薬物を投与することを意味する。
【００５６】
本明細書で使用されるところの「疾患もしくは障害を治療すること」は、疾患もしくは障害の症状が患者により経験される頻度を低下させることを意味する。疾患および障害は本明細書で互換的に使用する。
【００５７】
本明細書で使用されるところの「ベクター」は、本明細書に記述されるところの送達ベヒクル、もしくは発現ベクターのようなベクターのいずれかを指す。
核酸および薬物の送達ベヒクルとしての使用のための陽イオン性ステロイドもしくは薬物の合成および加水分解
新規方法を使用して、ステロイドもしくは薬物をポリアミンと結合することができること、ならびに、結果として生じる分子が、核酸、薬物および他の分子を結合することができることが、本発明で発見された（実施例１−４を参照されたい）。本発明はさらに、ステロイド、薬物、または他の化合物もしくは分子を陽イオン性にする方法を包含する。さらに、脂質と結合される場合に、本非ウイルス分子が核酸および薬物を細胞に送達させることが可能であることが、本発明で発見された（実施例１および２）。ステロイドは、一旦ポリアミンと結合されれば、その固有の生物学的活性を維持することができることもまた、本発明で発見された。多様なステロイド、ポリアミンおよび脂質が本発明の方法に有用であることが、本発明で発見された。加えて、本発明の送達ベヒクルが、潜在的送達部位としての間質腔の分子を標的とし、局所的な間質部位での化合物の持続放出を可能にする能力を有することが、本明細書で開示される。間質腔もしくは組織は細胞外空隙を包含する。本発明はまた、疾患を治療するための本発明の使用方法および該非ウイルス送達ベヒクルを投与するためのキットも包含する。
【００５８】
本発明はまた、本発明の化学プラットフォームを使用する新たな薬物動態／薬動力学特性をもつ新たな薬物実体を創製するための既存の薬物の改変方法にも関する。該新たな薬物実体は脂質とともに使用してもしなくてもよい。該新たな薬物実体はそれ自身でもしくは活性薬物を放出するプロドラッグとして機能するかもしれない。
【００５９】
本発明は、ＤＮＡを包含する核酸を細胞に送達しかつ前記ＤＮＡの細胞中へのトランスフェクションおよび該ＤＮＡの発現を引き起こす新規方法を開示する。
【００６０】
本発明は、グルココルチコイドを包含する本明細書に記述されるところの多様なステロイドもしくは疎水性薬物を包含すると解釈されるべきであり、そして、本明細書に記述されるステロイドのみを包含すると解釈されるべきでない。こうしたステロイドは、限定されるものでないが、ミネラルコルチコイド、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスタゲン、ステロイドアゴニスト活性をもつ類似物、ステロイドアンタゴニスト活性をもつ類似物、不活性構造類似物、およびそれらの改変物もしくは誘導体を挙げることができる。例えば、本発明で有用である付加的なステロイドは、メシル酸コルテキソロン、メシル酸コルチゾン、プレドニソン２１−メシレート、３β−ヨードコレステロール、１６β−ブロモ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン、２α−ブロモ−５α−コレスタン−３−オン、１６α−ブロモエストラジオール、１６α−ブロモエストロン、１６β−ブロモエストロン、１７α−ブロモプレグネノロン、１７−ブロモプロゲステロン、トシル酸アンドロステロン、トシル酸コレスタノール、トシル酸コレステリル、トシル酸デヒドロエピアンドロステロン、トシル酸ジヒドロテストステロン、トシル酸エピアンドロステロン、トシル酸１１α−ヒドロキシプロゲステロン、トシル酸１９−ノルテストステロン、トシル酸プレグネノロンおよびトシル酸テストステロンを包含する。本発明は、ステロイドおよび薬物の活性および不活性の類似物、改変物および誘導体、ならびにステロイドプロドラッグおよびプロドラッグを包含すると解釈されるべきである。
【００６１】
加えて、本発明はスペルミンを包含する多様なポリアミンを包含すると解釈されるべきである。ポリアミン、スペルミンに加えて、本発明は、限定されるものでないがスペルミジン、ポリリシン、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、他の生物ポリマー、ポリイミン（例えばポリエチレンイミン）のような合成ポリアミン、リシン含有ペプチド、アルギニン含有ペプチド、陽イオン性ポリマー、およびアミン豊富なポリマー、ならびにアミノデンドリマーを挙げることができるいかなるポリアミンも包含すると解釈されるべきである。
【００６２】
本発明の一局面において、脂質は陽イオン性脂質であり、また、別の局面において、脂質は中性脂質である。本発明の中性脂質は、限定されるものでないがＤＯＰＥ、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロールを挙げることができる。本発明の陽イオン性脂質は、限定されるものでないが、３−β−［Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール）（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル［Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２’−（１’’，２’’−ジオレオイルオキシプロピルジメチル−アンモニウムブロミド）−Ｎ−エチル−６−アミノスペルミン四トリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、１，３−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびＧＬ−６７を挙げることができる。本発明の一局面において、脂質は、核酸、薬物もしくは他の化合物の送達において補助するヘルパー脂質である。さらに、本発明は、本明細書に記述されるもの以外の脂質を包含すると解釈されるべきである。
【００６３】
本発明の一態様において、ステロイドもしくは薬物、およびスペルミンのようなポリアミンを、結合試薬（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を使用して結合する。本発明の一局面において、該試薬は２−イミノチオランである。本発明の別の局面において、ステロイドもしくは薬物およびスペルミンは、ジメチルスルホキシドともまた混合される。本発明のなお別の局面において、精製されたステロイド−ポリアミン複合体、もしくは精製された薬物−ポリアミン複合体を脂質と混合して、送達ベヒクルを形成させる。
陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクルを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分子送達
本発明のステロイド−ポリアミン複合体もしくは薬物−ポリアミン複合体の多様な合成方法およびアッセイ、ならびに本発明の陽イオン性脂質非ウイルス送達ベヒクルに到達するための該複合体への脂質の添加方法が本明細書に記述されている。化合物を結合しかつ化合物を細胞に送達する送達ベヒクルの能力を立証するための多様なアッセイもまた本明細書に開示されている。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞であり、そしてより好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【００６４】
本発明は、本発明の非ウイルス送達ベヒクルを使用する、哺乳動物における疾患もしくは障害の治療方法を包含する。本発明の一局面において、該ベヒクルは核酸を送達し、また、別の局面において、該ベヒクルは薬物もしくは別の化合物を送達する。一局面において、哺乳動物はヒトである。本発明の送達ベヒクルを使用して治療されるかもしれない、本発明の疾患もしくは障害は、限定されるものでないが、炎症、喘息、関節炎、疼痛、関節の炎症、癌、アレルギー、高血圧、新生物、過形成、転移、跛行、血管内膜過形成、血友病、貧血、凝固障害、自己免疫障害、十二指腸潰瘍、胃潰瘍、びらん性食道炎、病理学的分泌亢進状態、鼻炎、慢性特発性蕁麻疹、分泌亢進状態、胸焼け、カンジダ症、ヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）感染症、変形性関節症、慢性関節リウマチ、家族性腺腫性ポリポージス、うつ、強迫性障害、神経性過食症、月経前不快気分障害、精神病性障害、双極性障害、強迫性障害、心的外傷後ストレス障害、パニック障害、パニック障害、社会不安障害、統合失調症、精神病性障害、汎発性不安障害、月経困難症、閉経期の症状、骨粗鬆症、前立腺癌、乳癌、低エストロゲン症、外陰萎縮症、高コレステロール血症、うっ血性心不全、心虚血の合併症、心筋梗塞、高血圧、左室不全、２型糖尿病、卵巣癌、非小細胞性肺癌、カポジ肉腫、有毛状細胞性白血病、疣贅、悪性黒色腫、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、非ホジキンリンパ腫、勃起障害、癲癇、パジェット病、好中球減少症、前駆細胞移動、心移植拒絶、腎移植拒絶、肝移植拒絶、乾癬、疼痛、群発性頭痛、偏頭痛、狭心症、胃炎、子宮内膜症、中枢性性早熟症、気管支攣縮、胃食道逆流症、肥満細胞症および増殖性障害を挙げることができる。
【００６５】
本発明の方法により治療されるかもしれない疾患の数例を上述する。本発明は単にこれらの例に制限されると解釈されるべきでない。現在未知である他の疾患もしくは障害は、一旦知られれば本発明の方法を使用してまた治療可能であるかもしれないからである。
【００６６】
本発明の一態様において、送達ベヒクルは、核酸、ステロイド、薬物もしくは化合物を細胞に送達する。本発明の一局面において、細胞は、内皮細胞、間葉細胞、神経細胞、線維芽細胞、ニューロン、平滑筋細胞、腎細胞、肝細胞、筋芽細胞、幹細胞、胚幹細胞、造血幹細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、単球、好中球、マクロファージ、網膜神経細胞および上皮細胞よりなる群から選択される。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞である。より好ましくは、それはヒト細胞である。
【００６７】
本発明の一態様において、送達ベヒクルは核酸、ステロイド、薬物もしくは化合物を組織に送達する。本発明の一局面において、組織は、筋、粘膜、上皮、神経、結合織、血液、間質、心、肺、腎、皮膚、脳、腸管、間質腔、骨、骨髄、関節、軟骨、腱、食道、性腺、脳脊髄液、膵、脾、眼、鼻腔および毛髪組織を含んで成る。
【００６８】
本発明は、単にこれらの例に制限されると解釈されるべきでない。現在未知である、本発明の非ウイルス送達ベヒクルにより治療可能な他の疾患および障害は、一旦知られれば本発明の方法を使用してまた治療可能であるかもしれないからである。
【００６９】
本発明の一態様において、疾患もしくは障害は、経口経路を介して送達ベヒクルおよび核酸もしくは薬物を投与することにより治療する。他の投与経路は、限定されるものでないが鼻内、直腸、膣、筋肉内、局所、真皮下、舌下、腹腔内および静脈内を挙げることができる。
【００７０】
本発明は、本発明の方法を実施するための製薬学的組成物中の非ウイルス送達ベクターおよび送達されるべき同定された核酸、薬物もしくは他の分子の投与に関する。該組成物は、非ウイルス送達ベクターおよび送達されるべき同定された核酸、薬物もしくは他の分子、ならびに製薬学的に許容できる担体を含んで成る。例えば、送達されるべき適切な同定された核酸、薬物もしくは他の分子がそれと組合せられる非ウイルス送達ベヒクルを使用して、送達されるべき同定された核酸、薬物もしくは他の分子を動物を投与する。当業者は、１種以上の核酸もしくは薬物または他の化合物が投与されている場合に、それぞれの付加的なものが本発明の送達ベヒクルとともに送達されてよく、かつ／または、付加的な核酸、薬物もしくは他の分子を本発明の送達ベヒクルと独立に送達してよいことを認識するであろう。
【００７１】
本発明は、本発明の送達ベヒクルにより送達されるかもしれないものとして、単に、本明細書に記述される単離された核酸、薬物もしくは他の分子に制限されると解釈されるべきでない。本発明は、本発明の送達ベヒクルによってもまた送達することができる、本明細書に記述されない他の核酸、薬物もしくは他の分子を包含すると解釈されるべきである。本発明の送達ベヒクルがそれと結合かつ／もしくは送達することができるこれらの他の核酸、薬物もしくは他の分子は、限定されるものでないが、疎水性の化学的実体、脂溶性薬物、陰イオン性の化学的実体、陰イオン性放射ヌクレオチド、化学療法のための陰イオン性もしくは疎水性放射性同位元素、オリゴヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチドまたはそれらのフラグメント、ＰＣＲ産物、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ分子、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸のような陰イオン性酸基を含有するペプチドもしくはタンパク質、ヘパリン、低分子量ヘパリン、陰イオン性グリコサミノグリカン、陰イオン性もしくは疎水性蛍光分子、およびウイルス粒子もしくはウイルス粒子の亜画分を挙げることができる。本発明の送達ベヒクルにより送達することができる化合物に包含される他の分子および薬物は、限定されるものでないが、組換えタンパク質、エリスロポエチン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、腫瘍壊死因子α受容体、オメプラゾール、シンバスタチン、アトロバスタチンカルシウム、ベシル酸アムロジピン、ロラタジン、ランソプラゾール、エポエチンα、セレコキシブ、塩酸フルオキセチン、オランザピン、塩酸パロキセチン、ロフェコキシブ、塩酸セルトラリン、エポエチンα、結合型エストロゲン、アモキシシリンおよびクラブラン酸カリウム、プラバスタチンナトリウム、マレイン酸エナラプリル、塩酸メトホルミン、プラバスタチン、ロサルタンカリウム、塩酸シプロフロキサシン、リスペリドン、パクリタキセル、アジトロマイシン、インターフェロンα−２ｂ、レバビリン、クエン酸シルデナフィル、ギャバペンチン、プロピオン酸フルチカゾン、アレンドロン酸ナトリウム、クラリスロマイシン、フィルグラスチム、シクロスポリン、リシノプリル二水和物、ベンラファキシンＨＣｌ、ヒトインスリン、レボフロキサシン、フェキソフェナジン、塩酸塩、リシノプリル／リシノプリル、コハク酸スマトリプタン、ニフェジピン、フルコナゾール、セフトリアキソンナトリウム、ファモチジン、エノキサパリンナトリウム、酢酸リュープロリド、キシナホ酸サルメテロール、硫酸クロピドグレル、ランソプラゾールおよびラニチジンを挙げることができる。本発明の送達ベヒクルはまた、陰イオン性グリコサミノグリカン、コラーゲン、フィブリン、細胞糖衣、赤血球糖衣、シアル酸、硫酸化糖衣、デオキシリボ核酸およびリボ核酸のようなポリマー中の陰イオン性ドメインとも結合するかもしれない。
【００７２】
本発明はさらに、陽イオン性ステロイドプロドラッグおよび陽イオン性プロドラッグの使用、ならびに徐放治療に関する。本発明の一態様において、送達ベヒクルまたは該送達ベヒクルにより送達されている核酸、薬物、化合物もしくは分子は、前記分子に結合することにより間質腔および細胞外空隙の分子に標的を定めるかもしれない。こうした結合は、その後、該核酸、薬物、化合物もしくは分子の局所部位での徐放を可能にする。
【００７３】
一態様において、本発明を実施するのに有用な製薬学的組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日と１００ｍｇ／ｋｇ／日との間の用量を送達するように投与してよい。別の態様において、本発明を実施するのに有用な製薬学的組成物は、１ｎｇ／ｋｇ日と１００ｇ／ｋｇ／日との間の用量を送達するように投与してよい。
【００７４】
有用である製薬学的に許容できる担体は、限定されるものでないが、グリセロール、水、生理的食塩水、エタノール、ならびにリン酸塩および有機酸の塩のような他の製薬学的に許容できる塩溶液を挙げることができる。これらおよび他の製薬学的に許容できる担体の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９１、マック  パブリッシング  カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｉｎｇ  Ｃｏ．）、ニュージャージー州）に記述される。
【００７５】
製薬学的組成物は、滅菌の注入可能な水性もしくは油性の懸濁剤もしくは溶液の形態で製造、包装もしくは販売してよい。本懸濁剤もしくは溶液は既知技術に従って処方してよく、また、有効成分に加えて、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤もしくは懸濁化剤のような付加的成分を含んでよい。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水もしくは１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤もしくは溶媒を使用して製造してよい。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないが、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、および合成モノもしくはジグリセリドのような不揮発性油を挙げることができる。
【００７６】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬腔、眼もしくは別の投与経路に適する製剤で投与、製造、包装および／もしくは販売してよい。他の企図される製剤は、鋭端ナノ粒子（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球、および免疫学に基づく製剤を包含する。
【００７７】
本発明の組成物は、限定されるものでないが、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬腔もしくは眼の投与経路を挙げることができる多数の経路を介して投与してよい。投与経路（１種もしくは複数）は当業者に容易に明らかであることができ、また、治療されている疾患の型および重症度、治療されている家畜もしくはヒト患者の型および齢などを包含するいずれかの数の因子に依存することができる。
【００７８】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口の固体製剤、眼、坐剤、エアゾル剤、局所、もしくは他の類似の製剤で全身に投与してよい。ヘパラン硫酸もしくはその生物学的同等物のような化合物に加え、こうした製薬学的組成物は、製薬学的に許容できる担体、および薬物投与を高めかつ促進することが既知の他の成分を含有してよい。ナノ粒子、リポソーム、再封止赤血球および免疫学に基づく系のような他の可能な製剤もまた、本発明の方法により化合物を投与するのに使用してよい。
【００７９】
本明細書に記述される方法のいずれかを使用して同定される化合物は、本明細書に記述される多様な疾患、障害もしくは状態の治療のため処方し且つ哺乳動物に投与してよい。
【００８０】
本発明は、本明細書に記述される多様な疾患、障害もしくは状態の治療に有用な化合物を含んで成る製薬学的組成物の製造法および使用を包含する。こうした製薬学的組成物は、被験体への投与に適する形態の有効成分単独からなってよいか、あるいは、製薬学的組成物は、最低１種の有効成分、および１種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体、１種もしくはそれ以上の付加的成分、またはこれらのいくつかの組合せを含んでよい。有効成分は、当該技術分野で公知であるとおり、生理学的に許容できる陽イオンもしくは陰イオンと組合せのような生理学的に許容できるエステルもしくは塩の形態で製薬学的組成物中に存在してもよい。
【００８１】
医薬の局所投与の一障害物は表皮の角質層である。角質は、タンパク質、コレステロール、スフィンゴ脂質、遊離脂肪酸および多様な他の脂質から構成される高度に抵抗性の層であり、そして角質化および生存細胞を包含する。角質を通る化合物の浸透速度（流動）を制限する因子の１つは、皮膚表面上に添加もしくは適用することができる有効成分の量である。皮膚の単位面積あたりに適用される有効成分の量が多くなるほど、皮膚表面と皮膚の下層との間の濃度勾配が大きくなり、そして、順に、皮膚を通る有効成分の拡散力が大きくなる。従って、より大きい濃度の有効成分を含有する製剤は、全部の他のものが等しいより小さい濃度を有する製剤よりも、皮膚、およびそのより多くを通り、かつより一定の速度での有効成分の浸透をもたらすことがよりありそうである。
【００８２】
本明細書に記述される製薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知もしくは今後開発されるいずれの方法により製造してもよい。一般に、こうした準備方法は、有効成分を担体または１種もしくはそれ以上の付属成分との連合にもたらすこと、およびその後、必要もしくは所望の場合は、生成物を所望の単一もしくは複数用量単位に造形もしくは包装することの段階を包含する。
【００８３】
本明細書に提供される製薬学的組成物の記述は、ヒトへの倫理的投与に適する製薬学的組成物に原則として向けられるとは言え、こうした組成物は一般に全部の種類の動物への投与に適することが、当業者により理解されるであろう。
【００８４】
組成物を多様な動物への投与に適するようにするための、ヒトへの投与に適する製薬学的組成物の改変は、十分理解されており、そして、通常の熟練の家畜薬理学者は、もしあれば単なる通常の実験でこうした改変を設計かつ実施することができる。本発明の製薬学的組成物の投与が企図される被験体は、限定されるものでないが、ヒトおよび他の霊長類、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連する哺乳動物を包含する哺乳動物を挙げることができる。
【００８５】
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬腔、眼、クモ膜下もしくは別の投与経路に適する製剤で製造、包装もしくは販売してよい。他の企図される製剤は、鋭端ナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球、および免疫学に基づく製剤を包含する。
【００８６】
本発明の製薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、もしくは複数の単一単位用量として、製造、包装もしくは販売してよい。本明細書で使用されるところの「単位用量」は、予め決められた量の有効成分を含んで成る製薬学的組成物の別個の量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与されるとみられる有効成分の投薬量、または、例えばこうした投薬量の１／２もしくは１／３のようなこうした投薬量の便宜的部分に等しい。
【００８７】
本発明の製薬学的組成物中の有効成分の相対量、製薬学的に許容できる担体およびいずれかの付加的成分は、治療される被験体の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、大きさおよび状態に依存して、ならびに、該組成物が投与されるべきである経路にさらに依存して、変動することができる。例として、組成物は、０．１％と１００％（ｗ／ｗ）との間の有効成分を含んでよい。
【００８８】
有効成分に加え、本発明の製薬学的組成物は、１種もしくはそれ以上の付加的な製薬学的有効成分をさらに含んでよい。とりわけ企図される付加的作用物質は、制吐薬、ならびにシアン化物およびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャーを包含する。
【００８９】
本発明の製薬学的組成物の制御もしくは持続性放出製剤は、慣習的技術を使用して作成してよい。
【００９０】
局所投与に適する製剤は、限定されるものでないが、リニメント剤、ローション剤、クリーム剤、軟膏剤もしくはパスタ剤のような水中油もしくは油中水型乳剤、および溶液もしくは懸濁剤のような、液体もしくは半液体製剤を挙げることができる。局所に投与可能な製剤は、例えば約１％から約１０％（ｗ／ｗ）までの有効成分を含んでよいが、とは言え有効成分の濃度は溶媒中の有効成分の溶解性の限界と同じくらい高くてもよい。局所投与のための製剤は、本明細書に記述される付加的成分の１種もしくはそれ以上をさらに含んでもよい。
【００９１】
浸透の増強剤を使用してもよい。これらの物質は皮膚を横切る薬物の浸透の速度を増大させる。当該技術分野における典型的な増強剤は、エタノール、グリセロールモノラウレート、ＰＧＭＬ（ポリエチレングリコールモノラウレート）、ジメチルスルホキシドなどを哺乳動物する。他の増強剤は、オレイン酸、オレイルアルコール、エトキシジグリコール、ラウロカプラム、アルカンカルボン酸、ジメチルスルホキシド、極性脂質もしくはＮ−メチル−２−ピロリドンを包含する。
【００９２】
処方されるべき有効成分の供給源は、一般に、化合物の特定の形態に依存することができる。小有機分子およびペプチジルもしくはオリゴフラグメントは、化学的に合成しかつ製薬学的／化粧用の用途に適する純粋な形態で提供することができる。天然の抽出物の生成物は、当該技術分野で既知の技術に従って精製することができる。化合物の組換え供給源もまた、当業者に利用可能である。
【００９３】
代替の態様において、局所で活性の製薬学的もしくは化粧用組成物は、場合によっては、モイスチャライザー、化粧用補助物質、抗酸化剤、キレート剤、漂白剤、チロシナーゼ阻害剤および他の既知の脱色素剤、界面活性剤、起泡剤、コンディショナー、湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、湿潤剤（ｗｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、乳化剤、香料、増粘剤（ｖｉｓｃｏｓｉｆｉｅｒ）、緩衝剤、保存剤、太陽遮蔽物などのような他の成分と組合せてよい。別の態様において、浸透（ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ）もしくは浸透（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）増強剤が組成物中に包含され、そして浸透増強剤を欠く組成物に関して角質中におよびそれを通る有効成分の経皮浸透の向上において有効である。オレイン酸、オレイルアルコール、エトキシジグリコール、ラウロカプラム、アルカンカルボン酸、ジメチルスルホキシド、極性脂質もしくはＮ−メチル−２−ピロリドンを包含する多様な浸透増強剤が当業者に既知である。別の局面において、組成物は、角質の構造中の障害を増大させるように機能してそして従って角質を横断する増大された輸送を可能にする屈水性作用物質をさらに含んでもよい。イソプロピルアルコール、プロピレングリコールもしくはキシレンスルホン酸ナトリウムのような多様な屈水性作用物質が当業者に既知である。本発明の組成物は、例えばトレチノイン、レチノール、トレチノインおよび／もしくはレチノールのエステルなどを包含する有効量のレチノイド（すなわちレチノイド受容体のファミリーのいずれかのメンバーに結合する化合物）もまた含有してもよい。
【００９４】
局所で活性の製薬学的もしくは化粧用組成物は、所望の変化をもたらすのに有効な量で適用すべきである。本明細書で使用されるところの「有効な量」は、変化が望ましい皮膚表面の領域を覆うのに十分な量を意味する。有効成分は、組成物の約０．０００１％から約１５重量％までの量で存在すべきである。より好ましくは、それは組成物の約０．０００５％から約５％までの量で存在すべきであり；最も好ましくは、それは組成物の約０．００１％から約１％までの量で存在すべきである。こうした化合物は合成もしくは天然由来であってよい。
【００９５】
生物学的供給源から直接作成される液体の誘導体および天然の抽出物は、約１から約９９％までの濃度（ｗ／ｖ）で本発明の組成物中で使用してよい。天然の抽出物の画分およびプロテアーゼ阻害剤は、組成物の約０．０１％から約２０％まで、およびより好ましくは約１％から約１０％までの異なる好ましい範囲を有してもよい。もちろん、本発明の有効成分の混合物を組合せかつ同一の製剤で、もしくは異なる製剤の連続適用で使用してもよい。
【００９６】
本発明の組成物は組成物の総重量で約０．００５％から２．０％までの保存剤を含んでもよい。保存剤は、例えば空気、または治療用ゲル剤もしくはクリーム剤のような本発明の組成物を適用するために使用される指との接触を包含する患者の皮膚への曝露からの環境中の汚染物質にそれが曝露される場合に、反復される患者使用のための水性ゲル剤の場合の損傷を予防するのに使用する。本発明により有用な保存剤の例は、限定されるものでないが、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミドウレアおよびそれらの組合せよりなる群から選択されるものを挙げることができる。とりわけ好ましい保存剤は、約０．５％ないし２．０％のベンジルアルコールおよび０．０５％ないし０．５％のソルビン酸の組合せ剤である。
【００９７】
該組成物は、好ましくは、水性ゲル製剤中での本発明における使用のための化合物の分解を阻害する抗酸化剤およびキレート剤を包含する。いくつかの化合物について好ましい抗酸化剤は、組成物の総重量で約０．０１％ないし０．３％の好ましい範囲のＢＨＴ、ＢＨＡ、αトコフェロールおよびアスコルビン酸、ならびにより好ましくは０．０３％ないし０．１重量％の範囲のＢＨＴである。好ましくは、キレート剤は、組成物の総重量で０．０１％から０．５重量％までの量で存在する。とりわけ好ましいキレート剤は、組成物の総重量で約０．０１％ないし０．２０％の重量範囲、およびより好ましくは０．０２％ないし０．１０重量％の範囲のエデト酸塩（例えばエデト酸二ナトリウム）およびクエン酸を包含する。キレート剤は、製剤の貯蔵寿命に対し有害であるかもしれない組成物中の金属イオンをキレート化するのに有用である。ＢＨＴおよびエデト酸二ナトリウムはいくつかの化合物についてそれぞれとりわけ好ましい抗酸化剤およびキレート剤である一方、他の適するかつ同等な抗酸化剤およびキレート剤を、当業者に既知であるとみられるとおり、それらの代わりに用いてよい。
【００９８】
制御放出製剤もまた使用してよく、そして、こうした製剤の使用方法は当業者に既知である。
【００９９】
いくつかの場合には、使用されるべき投薬形態を、例えば、所望の放出プロフィルを提供するためにヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、浸透性膜、浸透圧系、多層コーティング、微粒子、リポソームもしくはミクロスフェア、またはそれらの混合物を変動する比率で使用して、その中の１種もしくはそれ以上の有効成分の持続もしくは制御放出として提供することができる。本明細書に記述されるものを包含する当業者に既知の適する制御放出製剤は、本発明の製薬学的組成物を用いる使用のために容易に選択することができる。従って、制御放出に適合されている錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤およびカプレット剤のような経口投与に適する単一の単位投与剤形が、本発明により包含される。
【０１００】
全部の制御放出製薬学的製品は、それらの制御されない対蹠物により達成されるものを上回って薬物療法を改良するという共通の最終目標を有する。理想的には、医学的治療における至適に設計された制御放出製剤の使用は、最少量の時間で状態を治癒もしくは制御するのに使用されている最小限の薬物物質を特徴とする。制御放出製剤の利点は、薬物の延長された活性、低下される投薬頻度、および増大される患者コンプライアンスを包含する。加えて、制御放出製剤は、薬物の血中濃度のような作用もしくは他の特徴の発生の時間に影響を与えるのに使用することができ、そして従って副作用の発生に影響を与える可能性がある。
【０１０１】
大部分の制御放出製剤は、所望の治療効果を即座に生じさせるある量の薬物を最初に放出し、そして徐々にかつ継続的に、延長された時間の期間にわたってこのレベルの治療効果を維持するための他の量の薬物の放出するよう設計されている。体内でのこの一定レベルの薬物を維持するために、薬物は、身体から代謝かつ排泄されている薬物の量を置き換えることができる速度で投薬形態から放出されなければならない。
【０１０２】
有効成分の制御放出は、多様な誘導因子、例えばｐＨ、温度、酵素、水、または他の生理学的条件もしくは化合物により刺激することができる。本発明の情況における「制御放出成分」という用語は、有効成分の制御放出を促進する、限定されるものでないがポリマー、ポリマーマトリックス、ゲル、浸透性膜、リポソームもしくはミクロスフェア、またはそれらの組合せを挙げることができる化合物（１種もしくは複数）と本明細書で定義する。
【０１０３】
液体懸濁剤は、水性もしくは油性ベヒクル中の有効成分の懸濁剤の慣習的達成方法を使用して製造してよい。水性ベヒクルは、例えば水および等張生理的食塩水を包含する。油性ベヒクルは、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油のような植物油、分画植物油、および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。液体懸濁剤は、限定されるものでないが懸濁化剤、分散助剤もしくは湿潤剤、乳化剤、緩和剤、保存剤、緩衝剤、塩、着香料、着色料および甘味料を挙げることができる１種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含んでもよい。油性懸濁剤は増粘剤をさらに含んでもよい。既知の懸濁化剤は、限定されるものでないが、ソルビトールシロップ、硬化可食油、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を挙げることができる。既知の分散助剤もしくは湿潤剤は、限定されるものでないが、レシチンのような天然に存在するホスファチド、脂肪酸、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステル、もしくは脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとのアルキレンオキシドの縮合生成物（例えば、それぞれ、ポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を挙げることができる。既知の乳化剤は限定されるものでないがレシチンおよびアラビアゴムを挙げることができる。既知の保存剤は、限定されるものでないがパラ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチルもしくはｎ−プロピル、アスコルビン酸、およびソルビン酸を挙げることができる。既知の甘味料は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ショ糖およびサッカリンを包含する。油性懸濁剤のための既知の増粘剤は、例えばミツロウ、固形パラフィンおよびセチルアルコールを包含する。
【０１０４】
水性もしくは油性溶媒中の有効成分の液体の溶液は、液体懸濁剤と実質的に同一の様式で製造してよく、主要な差異は有効成分が溶媒に懸濁されるよりむしろ溶解されることである。本発明の製薬学的組成物の液体の溶液は、液体懸濁剤に関して記述される成分のそれぞれを含んでよく、懸濁化剤が溶媒中での有効成分の溶解を必ずしも補助するわけではないことができることが理解される。水性溶媒は、例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性溶媒は、例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナッツ油のような植物油、分画植物油、および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。
【０１０５】
本発明の製薬学的製剤の粉末および顆粒製剤は既知の方法を使用して製造してよい。こうした製剤は、例えば、錠剤を形成するため、カプセルを充填するため、またはそれへの水性もしくは油性ベヒクルの添加により水性もしくは油性の懸濁剤もしくは溶液を製造するのに使用されて、被験体に直接投与してよい。これらの製剤のそれぞれは、分散助剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤および保存剤の１種もしくはそれ以上をさらに含んでもよい。増量剤および甘味料、着香料もしくは着色料のような付加的な賦形剤もまた、これらの製剤中に包含してもよい。
【０１０６】
本発明の製薬学的組成物はまた、水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤の形態で製造、包装もしくは販売してもよい。油相は、オリーブ油もしくはラッカセイ油のような植物油、流動パラフィンのような鉱物油、またはこれらの組合せであってよい。こうした組成物は、アラビアゴムもしくはトラガカントガムのような天然に存在するガム、ダイズもしくはレシチンホスファチドのような天然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレエートのような脂肪酸およびヘキシトール無水物の組合せ由来のエステルもしくは部分エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキシドとのこうした部分エステルの縮合生成物のような、１種もしくはそれ以上の乳化剤をさらに含んでもよい。これらの乳剤は、例えば甘味料もしくは着香料を包含する付加的成分もまた含有してもよい。
【０１０７】
本明細書で使用されるところの「油性」液体は、炭素含有液体分子を含んで成りかつ水より小さい極性の特徴を表すものである。
【０１０８】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の製剤は、それぞれ予め決められた量の有効成分を含有する、限定されるものでないが錠剤、硬もしくは軟カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅ）またはトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）を挙げることができる別個の固体の用量単位の形態で製造、包装もしくは販売してよい。経口投与に適する他の製剤は、限定されるものでないが粉末もしくは顆粒製剤、水性もしくは油性懸濁剤、水性もしくは油性溶液、パスタ剤、ゲル剤、歯磨き剤、含嗽剤、コーティング、口内洗浄剤もしくは乳剤を挙げることができる。口内洗浄剤および含嗽剤という用語は本明細書で互換的に使用する。
【０１０９】
本発明の製薬学的組成物は経口もしくは頬腔投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売してよい。こうした製剤は、限定されるものでないが、ゲル剤、液剤、懸濁剤、パスタ剤、歯磨き剤、含嗽剤もしくは口内洗浄剤およびコーティングを挙げることができる。例えば、本発明の口内洗浄剤は、約１．４％の本発明の化合物、グルコン酸クロルヘキシジン（０．１２％）、エタノール（１１．２％）、サッカリンナトリウム（０．１５％）、ＦＤ＆Ｃ  ブルーＮｏ．１（０．００１％）、ペパーミント油（０．５％）、グリセリン、（１０．０％）、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）６０（０．３％）および１００％までの水を含んでよい。別の態様において、本発明の歯磨き剤は、約５．５％の本発明の化合物、水中７０％ソルビトール（２５．０％）、サッカリンナトリウム（０．１５％）、ラウリル硫酸ナトリウム（１．７５％）、カルボポール９３４、（１５％）中６％分散、スペアミントの油（１．０％）、水中５０％水酸化ナトリウム（０．７６％）、二塩基性リン酸カルシウム二水和物（４５％）および１００％までの水を含んでよい。本明細書に記述される製剤の例は網羅的でなく、そして、本発明は、これら、および本明細書に記述されないがしかし当業者に既知である他の製剤の付加的な改変物を包含することが理解される。
【０１１０】
有効成分を含んで成る錠剤は、例えば、場合によっては１種もしくはそれ以上の付加的成分とともに有効成分を圧縮もしくは成形することにより作成してよい。圧縮錠剤は、場合によっては結合剤、滑沢剤、賦形剤、界面活性剤および分散助剤の１種もしくはそれ以上と混合された、粉末もしくは顆粒製剤のような自由に流動する形態の有効成分を適する装置中で圧縮することにより製造してよい。成形錠剤は、有効成分、製薬学的に許容できる担体、および混合物を湿らせるための少なくとも十分な液体の混合物を適する装置中で成形することにより作成してよい。錠剤の製造で使用される製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないが、不活性の希釈剤、顆粒化剤および崩壊剤、結合剤、ならびに滑沢剤を挙げることができる。既知の分散助剤は、限定されるものでないがバレイショデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムを挙げることができる。既知の界面活性剤は、限定されるものでないがラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。既知の希釈剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを挙げることができる。既知の顆粒化剤および崩壊剤は、限定されるものでないがトウモロコシデンプンおよびアルギン酸を挙げることができる。既知の結合剤は、限定されるものでないが、ゼラチン、アラビアゴム、糊化済トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを挙げることができる。既知の滑沢剤は、限定されるものでないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを挙げることができる。
【０１１１】
錠剤はコーティングしなくてもよいか、もしくは、それらは、被験体の消化管中での遅延された崩壊を達成してそれにより有効成分の持続性の放出および吸収を提供するための既知方法を使用してコーティングしてよい。例として、グリセリルモノステアレートもしくはグリセリルジステアレートのような物質を、錠剤をコーティングするのに使用してよい。さらに、例として、錠剤は、浸透圧制御放出錠剤を形成するための米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号明細書に記述される方法を使用してコーティングしてよい。錠剤は、製薬学的に洗練されかつ味のよい製剤を提供するために、甘味料、着香料、着色料、保存剤もしくはこれらのいくつかの組合せをさらに含んでもよい。
【０１１２】
有効成分を含んで成る硬カプセル剤は、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成してよい。こうした硬カプセル剤は有効成分を含んで成り、また、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンのような不活性の固形希釈剤を包含する付加的成分をさらに含んでもよい。
【０１１３】
有効成分を含んで成る軟ゼラチンカプセルは、ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成してよい。こうした軟カプセル剤は、水、またはラッカセイ油、流動パラフィンもしくはオリーブ油のような油媒体と混合されるかもしれない有効成分を含んで成る。
【０１１４】
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体の形態で、または使用前に水もしくは別の適するベヒクルでの再構成に意図される水分を含まない生成物の形態のいずれかで製造、包装および販売してよい。
【０１１５】
本発明の製薬学的組成物は直腸投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売してよい。こうした組成物は、例えば、坐剤、保持浣腸製剤、および直腸もしくは結腸洗浄のための溶液の形態にあってよい。
【０１１６】
坐剤製剤は、通常の室温（すなわち約２０℃）で固体でありかつ被験体の直腸温度（すなわち健康なヒトで約３７℃）で液体である、非刺激性の製薬学的に許容できる賦形剤と有効成分を組合せることにより作成してよい。適する製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないが、カカオバター、ポリエチレングリコールおよび多様なグリセリドを挙げることができる。坐剤製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含んでもよい。
【０１１７】
直腸もしくは結腸洗浄のための保持浣腸製剤もしくは溶液は、製薬学的に許容できる液体担体と有効成分を組合せることにより作成してよい。当該技術分野で公知であるとおり、浣腸製剤は、被験体の直腸の解剖学に適合された送達装置を使用して投与してよく、また、それ内に包装してよい。浣腸製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含んでもよい。
【０１１８】
本発明の製薬学的組成物は、膣投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売してよい。こうした組成物は、例えば、坐剤、タンポンのような含浸もしくはコーティングされた膣に挿入可能な物質、灌注液製剤、または膣洗浄のためのゲル剤もしくはクリーム剤もしくは溶液の形態にあってよい。
【０１１９】
化学的組成物での物質の含浸もしくはコーティング方法は当該技術分野で既知であり、そして、限定されるものでないが、化学的組成物の表面上への堆積もしくは結合方法、物質（すなわち、生理学的に分解可能な物質を含むような）の合成の間の物質の構造中への化学的組成物の組込み方法、およびその後の乾燥を伴うもしくは伴わない吸収体物質中への水性もしくは油性溶液もしくは懸濁剤の吸収方法を挙げることができる。
【０１２０】
膣洗浄のための灌注液製剤もしくは溶液は、製薬学的に許容できる液体担体と有効成分を組合せることにより作成してよい。当該技術分野で公知であるとおり、灌注液製剤は、被験体の膣の解剖学に適合された送達装置を使用して投与してよく、また、それ内に包装してよい。
【０１２１】
灌注液製剤は、限定されるものでないが抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的成分をさらに含んでもよい。本明細書で使用されるところの製薬学的組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的破壊（ｂｒｅａｃｈｉｎｇ）および組織中の裂け目を通る製薬学的組成物の投与を特徴とするいかなる投与経路も包含する。従って、非経口投与は、限定されるものでないが、組成物の注入、外科的切開を通る組成物の適用、組織を貫通する非外科的創傷を通る組成物の適用などによる製薬学的組成物の投与を挙げることができる。とりわけ、非経口投与は、限定されるものでないが、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎透析注入技術を挙げることができることを企図している。
【０１２２】
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水もしくは滅菌の等張の生理的食塩水のような製薬学的に許容できる担体と組合せられた有効成分を含んで成る。こうした製剤は、ボーラス投与もしくは連続投与に適する形態で製造、包装もしくは販売してよい。注入可能な製剤は、アンプル中もしくは保存剤を含有する複数用量容器中のような単位投与剤形で製造、包装もしくは販売してよい。非経口投与のための製剤は、限定されるものでないが、油性もしくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液、乳剤、パスタ剤、および埋込可能な持続放出もしくは生物分解可能な製剤を挙げることができる。こうした製剤は、限定されるものでないが、懸濁化剤、安定剤もしくは分散助剤を挙げることができる１種もしくはそれ以上の付加的成分をさらに含んでもよい。非経口投与のための製剤の一態様において、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与前に適するベヒクル（例えば滅菌の発熱性物質を含まない水）での再構成のための水分を含まない（すなわち粉末もしくは顆粒の）形態で提供される。
【０１２３】
製薬学的組成物は、滅菌の注入可能な水性もしくは油性懸濁剤もしくは溶液の形態で製造、包装もしくは販売してよい。この懸濁剤もしくは溶液は既知技術に従って処方してよく、そして、有効成分に加えて、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤もしくは懸濁化剤のような付加的成分を含んでよい。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水もしくは１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤もしくは溶媒を使用して製造してよい。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないが、リンゲル液、等張の塩化ナトリウム溶液、および合成モノもしくはジグリセリドのような不揮発性油を挙げることができる。有用である他の非経口で投与可能な製剤は、微晶質の形態の、リポソーム製剤中に、もしくは生物分解可能なポリマー系の一成分として有効成分を含んで成るものを包含する。持続放出もしくは埋込のための組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、ほとんど不溶性のポリマーもしくはほとんど不溶性の塩のような製薬学的に許容できるポリマー性もしくは疎水性物質を含んでよい。
【０１２４】
本発明の製薬学的組成物は頬腔投与に適する製剤で製造、包装もしくは販売してよい。こうした製剤は、例えば、慣習的方法を使用して作成される錠剤もしくはトローチ剤の形態にあってよく、そして、例えば０．１ないし２０％（ｗ／ｗ）の有効成分（残余は経口で溶解可能もしくは分解可能な組成物を含んで成る）、および場合によっては本明細書に記述される付加的成分の１種もしくはそれ以上をよい。あるいは、頬腔投与に適する製剤は、有効成分を含んで成る粉末またはエアゾル化されるもしくは霧化される溶液もしくは懸濁剤を含んでよい。こうした粉末、エアゾル、もしくはエアゾル化製剤は、分散される場合に、好ましくは約０．１から約２００ナノメートルまでの範囲の平均粒子もしくは液滴径を有し、そして、本明細書に記述される付加的成分の１種もしくはそれ以上をさらに含んでもよい。
【０１２５】
本明細書で使用されるところの「付加的成分」は、限定されるものでないが、以下、すなわち賦形剤；界面活性剤；分散助剤；不活性希釈剤；顆粒化剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味料；着香料；着色料；保存剤；ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物；水性ベヒクルおよび溶媒；油性ベヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散助剤もしくは湿潤剤；乳化剤、緩和剤；緩衝剤；塩；増粘剤；増量剤；乳化剤；抗酸化剤；抗菌剤；抗真菌剤；安定剤；ならびに製薬学的に許容できるポリマー性もしくは疎水性物質の１種もしくはそれ以上を挙げることができる。本発明の製薬学的組成物注に包含されてよい他の「付加的成分」は当該技術分野で既知であり、そして、例えばＧｅｎａｒｏ編（１９８５、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、マック  パブリッシング  カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、フィラデルフィア州イーストン）（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述される。
【０１２６】
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与してよい本発明の化合物の投薬量は、限定されるものでないが治療されている動物の型および疾患の型、動物の齢ならびに投与経路を挙げることができるいずれかの数の因子に依存して変動することができる。
【０１２７】
化合物は１日数回くらい頻繁に動物に投与することができるか、あるいは、それは、１日１回、週１回、２週間ごとに１回、月１回のようなより少なく頻繁に、あるいは、数ヶ月ごとに１回、または年１回もしくはより少なくさえのようななおより少なく頻繁に投与してもよい。投与の頻度は当業者に容易に明らかであることができ、そして、限定されるものでないが治療されている疾患の型および重症度、動物の型および齢などのようないずれかの数の因子に依存することができる。
【０１２８】
疾患、障害もしくは状態の治療方法に関して上述されたところの本発明の多様な態様は、本明細書に記述されない他の疾患、障害および状態を包含することが、当業者により認識されるであろう。
【０１２９】
本発明はさらに、動物における疾患もしくは障害を治療するためのキットを包含する。
【０１３０】
本発明により、上述されたとおり、もしくは下の実施例に論考されるとおり、当業者に既知である慣習的な化学的、細胞、組織化学的、生化学的、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。こうした技術は文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド  スプリング  ハーバー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ、（１９８５）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｇａｉｔ、（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｈａｒｌｏｗら、１９８８  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド  スプリング  ハーバー  プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｒｏｅら、１９９６  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ジョン  ワイリー（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン  パブリッシング（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）を参照されたい。
【実施例】
【０１３１】
実験実施例
本発明は今や、以下の実施例に言及して記述する。これらの実施例は具体的説明のみの目的上提供され、そして、本発明は、これらの実施例に制限されると決して解釈されるべきでないが、しかしむしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかとなるいずれのおよび全部の変形も包含すると解釈されるべきである。
【０１３２】
さらなる記述を伴わずに、当業者は、先行する記述および以下の具体的に説明する実施例を使用して、本発明の化合物を作成かつ利用し、ならびに、特許請求される方法を実施することができると考えられる。以下の作業実施例は、従って、本発明の好ましい態様をとりわけ指摘し、そして、開示の残部をいかなる方法でも制限すると解釈されるべきでない。
実施例１−陽イオン性ステロイドの合成および加水分解
細胞へのおよび細胞中への分子の非ウイルス送達に有用なベクターもしくはベヒクルを容易に合成することが可能であることの当該技術分野における必要性が存在する。この必要性を満たす方法が本発明で開示される。
【０１３３】
本実施例で使用される材料および方法をここに記述する。
陽イオン性ステロイドの合成
メシル酸デキサメサゾンもしくはデキサメサゾン（ステラロイド（Ｓｔｅｒａｌｏｉｄ）、ニューハンプシャー州）、２−イミノチオラン（トラウト試薬）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｓ））、スペルミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））およびＤＭＳＯ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））は受領されたとおり使用した。合計で１０５ｍｇ（２２３μｍｏｌ）のメシル酸デキサメサゾン、８００μｌのＤＭＳＯおよび２８．４ｍｇ（２０６μｍｏｌ）のトラウト試薬を、室温での３１．９μｌ（１４５μｍｏｌ）のスペルミンの添加前に一緒に溶解した。４５分後に反応はＴＬＣにより完了した。ＨＰＬＣ精製（６０／４０  ０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ＰＲＰ−１カラム）および凍結乾燥はＤＳを白色粉末として生じた。収量：１５．３ｍｇ（１４．０％）。
結合のためのステロイドメシル酸塩前駆体の大スケール高収量多グラム（ｍｕｌｔｉ−ｇｒａｍ）合成
磁気攪拌子およびゴム隔壁を装備された２００ｍｌ三角フラスコに、５グラムのデキサメサゾン（１２．７ｍｍｏｌ、１等量）および１６ｍｌの無水ピリジンを充填した。フラスコを氷浴で０℃に冷却し、そして１．２ｍｌの塩化メタンスルホニルを添加した。１時間後に０．８ｍｌの追加の塩化メタンスルホニルを添加した。２時間に、溶液を１００ｍｌの冷１Ｍ  ＨＣｌ中に注いで沈殿物を形成させた。沈殿物を濾過し、そして２５０ｍｌのエタノールに再溶解しかつ２５０ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌ中に沈殿させた。沈殿物を濾過しかつエタノールで再結晶し、濾過しそして真空下に乾燥して、４．９５ｇ（８２．６％）のメシル酸デキサメサゾンを生じた。
Ｎ−［３−（｛４−［（３−アミノプロピル）アミノ］ブチル｝アミノ）プロピル］−４−［（９−フルオロ−１１，１７−ジヒドロキシ−１６−メチル−３，２０−ジオキソプレグナ−１，４−ジエン−２１−イル）スルファニル］ブタンイミダミド−ＴＦＡ塩（１，デキサメサゾン−スペルミン、ＤＳ）の大スケール多グラム高収量合成
磁気攪拌子およびゴム隔壁を装備された１Ｌ丸底フラスコを窒素でパージし、そして６００ｍｌのＵＳＰ等級無水エタノール、６０ｍｌの無水ＴＨＦ、４．９５グラム（１０．５ｍｍｏｌ、１．０５等量）のメシル酸デキサメサゾンおよび１０グラム（１９．５ｍｍｏｌ、４．９５等量）のスペルミンを充填した。３ｍｌの水中の２−イミノチオラン、１．３８グラム（１０ｍｍｏｌ、１．０等量）を、活発な攪拌を伴い５分にわたって溶液に一滴ずつ添加した。溶液は色を澄明から澄明淡黄色に変えた。反応をＴＬＣおよび分析的ＨＰＬＣによりモニターした。室温で３時間後に、Ｒｔ＝０（荷電したＤＳ）（Ｒｔ＝０．７分、分析ＨＰＬＣによるＤＳ）が最大となり、そしてメシル酸デキサメサゾン（Ｒｔ  ０．４７、２．８分  ＨＰＬＣ）のスポットが最少となった。粗反応混合物を１５．２５ｍｌ（１９８ｍｍｏｌ、１９．８等量）のトリフルオロ酢酸で希釈して、白色沈殿物（スペルミン四ＴＦＡ塩）を形成させた。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、そして５０ｍｌのエタノールを添加して白色沈殿物（スペルミン−４ＴＦＡ）を形成させた。ｐＨ３の溶液を２回濾過してスペルミン四トリフルオロ酢酸塩を除去し、また、エタノールをロータリーエバポレーターで除去した。５０ｍｌの水を黄色粘性油状物に添加して沈殿物（デキサメサゾンおよびメシル酸デキサメサゾン）を生じ、そして０．２μｍフィルターを通して溶液を濾過して澄明な黄色液体を生じた。数日にわたって凍結乾燥機で水を除去して、デキサメサゾン−スペルミン四トリフルオロ酢酸塩を生じた。収量：８．２２８グラム（７．１７ｍｍｏｌ、７２％）。
【０１３４】
ＴＬＣ  Ｒｔ＝０、５０／５０  ヘキサン／ＴＨＦ、分析的ＨＰＬＣ  Ｒｔ＝０．１分。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）δ＝６．２３（ｄ，Ｊ＝０．０２３、１Ｈ、Ｃ２）、６．０１（ｓ、１Ｈ、Ｃ４）、５．３３（ｄ、Ｊ＝０．０１、１Ｈ、Ｃ１７−ＯＨ）、５．０４（ｓ、１Ｈ、Ｃ１１−ＯＨ）、４．１４（ｄ、Ｊ＝０．０２、１Ｈ、Ｃ１１−ＯＨ）、３．６３（ｄｄ、Ｊ＝０．３９、０．０３、２Ｈ、Ｃ２１）、３．３７（ｓ、２０Ｈ、スペルミン）、３．２７（ｓ、２Ｈ、スペルミン）、３．９３（ｓ、４Ｈ、スペルミン）、２．６１（ｍ、１Ｈ、Ｃ６ａ）、２．３７（ｍ、１Ｈ、Ｃ６ｂ）、２．３３（ｍ、１Ｈ、Ｃ８）、２．１７（ｄ、Ｊ＝０．０２、１Ｈ、Ｃ１２）、２．１（ｑ、Ｊ＝０．０２、１Ｈ、Ｃ１４）、１．８７（ｍ、４Ｈ、スペルミン）、１．７８（ｍ、Ｊ＝０．０１、１Ｈ、Ｃ７ａ）、１．６３（ｍ、２Ｈ、スペルミン）、１．５８（ｍ、１Ｈ、Ｃ１５ａ）、１．４８（ｓ、３Ｈ、Ｃ１９）、１．４６（ｓ、１Ｈ、Ｃ７）、１．０７（ｍ、１Ｈ、Ｃ１５ｂ）、０．８７（ｓ、３Ｈ、Ｃ１８）、０．７８（ｄ、３Ｈ、Ｃ２２）；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ＋）Ｃ３８Ｈ６３ＦＮ５Ｏ４Ｓ：［Ｍ＋Ｈ］＋計算値６７８．４４２８、実測値６７８．４４２９。
【０１３５】
使用されたがしかし本明細書に記述されない他の方法は、公知、かつ、化学、免疫学、ならびに細胞および分子生物学の当業者の能力内にある。
【０１３６】
本実施例に記述された実験の結果をここに提示する。
陽イオン性デキサメサゾンプロドラッグの合成
デキサメサゾンの２１−ヒドロキシ基は抗炎症活性に必要とされず、そして、従って、ポリカチオンへの結合のための理想的な選択である（図１Ａ）（Ｓｃｈｉｍｍｅｒら、１９９６、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１４５９−１４８５、ＨａｒｄｍａｎとＬｉｍｂｉｒｄ編、マグロウ−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）、ニューヨーク中）。スペルミン、２−イミノチオラン（トラウト試薬）およびメシル酸デキサメサゾンの間のワンポット反応は、主生成物としてデキサメサゾン−スペルミン結合物、（ＤＳ）を生じた（図１Ｂ）。トラウト試薬はスペルミンの一級アミンにより選択的に開環され（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））、スペルミンおよびイミノチオランと、メシル酸デキサメサゾンの２１位のα−ケトメシル酸と反応する（Ｓｉｍｍｏｎｓら、１９８０、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４５：０８４−３０８８）反応性のチオレート陰イオンとの間に、加水分解感受性のアミドイミド結合を形成して（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ））、デキサメサゾンとイミノチオランとの間にα−チオエーテル結合を生じる。該結合反応はＴＬＣにより４５分で完了した。ＤＳの１Ｈ  ＮＭＲは、グルココルチコイド活性に必要とされる３−ビス−エノンならびに１１−および１７−ヒドロキシ基の存在（図１Ａ）、ならびに結合されたスペルミンおよび２１−α−ケトチオエーテル基からの１Ｈシグナルを確認した。１Ｍ  ＮａＯＨ中２０分間のＤＳの加水分解は、スペルミンとイミノチオランとの間のアミドイミド結合の切断をもたらして、デキサメサゾン上に２１−置換ブチルチオエーテルアミド側鎖を有するデキサメサゾン−アミド（ＤＡ）を形成した（図１Ｂ）。ＤＡについて、図１Ｂ：計算値：Ｃ６３．２６；Ｈ：７．３５；Ｎ：２．８４；実測値：Ｃ：６３．４４；Ｈ：７．２７；Ｎ：２．８３。水溶解性：ＤＳ  ＞１００，０００ｍｇ／ｌ；ＤＡ  ６０ｍｇ／ｌ；（デキサメサゾン  １００ｍｇ／ｌ）。
【０１３７】
核酸もしくは薬物のような分子を細胞、間質部位、器官もしくは組織に送達することができる非ウイルス陽イオン性脂質送達ベヒクルに対する、当該技術分野における必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たす。
実施例２−非ウイルス陽イオン性ステロイド送達ベヒクルを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分子送達
本実施例で使用される材料および方法をここに記述する。
細胞培養およびリポフェクション
ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ、４〜１３継代）は１：３分割（ｓｐｌｉｔ）で２４穴培養プレートに継代し、そしてその後、リポフェクション前に密なコンフルエンスまで成長させた。成長培地は、１０％熱不活性化活性炭濾過済（ステロイドホルモンを除去するため）ウシ胎児血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ））、０．３０ｍｇ／ｍｌグルタミン、１５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび０．１５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）であった。２９３細胞は同一条件下で成長させた。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ３およびｐＧＲＥ−ＳＥＡＰ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を、ＣＭＶもしくはＧＲＥプロモーターの調節下でのＥＧＦＰもしくは分泌型アルカリホスファターゼの発現にそれぞれ使用した。多陽イオン性脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）：ＤＯＰＥの２：１（μｇ：μｇ）混合物を含有するリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を、製造元の説明書に従って使用した。
脂質集成体およびリポプレックスの調製および特徴づけ
ＤＳ：ＤＯＰＥ液体溶液を形成させるために、６７μｌのエタノール中ＤＳの１０ｍｇ／ｍｌ溶液および２７μｌのエタノール中ＤＯＰＥの５０ｍｇ／ｍｌ溶液を一緒にボルテックス攪拌した。Ｎ２流での溶媒蒸発後に、１ｍｌの滅菌ミリポア（ＭＩｌｌｉｐｏｒｅ）水を液体薄膜に添加し、そして溶液を１０分間超音波処理した。該溶液（水１μｌあたり２μｇの脂質）を４℃で保存し、そして６ヶ月以上の間リポフェクション活性を保持した（データは示されない）。動的光散乱（ダイナプロ（ＤｙｎａＰｒｏ）９９機器）により得られるＤＳ／ＤＯＰＥ（１μｇ／２μｇ）の流体力学的直径は、ＤＮＡを含まずに７０ないし１５０ｎｍであった一方、１μｇのＤＮＡならびに０ないし２０等量のＤＳおよび０ないし２０等量のＤＯＰＥを含むリポプレックスは、２００から５００ｎｍまでの範囲にわたる大きさを有した。
蛍光ＧＦＰ測定
リポフェクションのために、１２５μｌのオプティＭＥＭ（ＯｐｔｉＭＥＭ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））中のＤＳ／ＤＯＰＥの溶液を、１２５μｌのオプティＭＥＭ（ＯｐｔｉＭＥＭ）Ｉ中のＤＮＡの溶液と混合し、３０ないし６０分間インキュベートし、そしてその後、ＢＡＥＣ細胞上に２時間広げ、次いでＰＢＳですすぎかつ成長培地を添加した。蛍光を４８時間後に測定した。６：１のＤＳ：ＤＮＡの電荷比を越える脂質濃度で、製剤は、変えられた形態により示されるところのＢＡＥＣにおける細胞傷害性を表し始めた。トランスフェクション体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｓ）のＥＧＦＰ発現を、トランスフェクトされないＢＡＥＣの自己蛍光を使用するバックグラウンド減法を用い、蛍光プレートリーダー（ラブシステムズ  フルオロスカン  アセント（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ）；４８５ｎｍ／５３８ｎｍフィルター対）で二重（図２Ａ）もしくは三重（図２Ｂ）でモニターした。ＥＧＦＰ発現は、７５０μｌのＰＢＳ中０ないし２００ｎｇの組換えＧＦＰ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して較正した。ライセート中のＥＧＦＰのアッセイにおいて、リポフェクトされた細胞をトリプシン処理し、ペレットにし（２００×ｇ、８分）、１５０μｌのＰＢＳに再懸濁し、そして−７８℃で３×凍結／融解にかけた。ライセートをエッペンドルフ微小遠心器中１３，５００ＲＰＭ（５分）で遠心分離した。上清を収集し、そしてＰＢＳ洗浄されかつペレットにされた細胞からの上清と合わせ（総容量７５０μｌ）、そしてＥＧＦＰ蛍光を測定した（励起４８３、測定５１５；ＳＬＭ蛍光計）。別個の実験で、ＥＧＦＰを発現する、リポフェクトかつトリプシン処理された細胞のフローサイトメトリーを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を使用し、ペンシルバニア大学フローサイトメトリー中核施設（ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で実施した。
【０１３８】
本実施例に記述された実験の結果をここに提示する。
陽イオン性ステロイドを用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子送達
中性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および１μｇのプラスミド／ウェルを使用して、われわれは、変動する量のＤＳ（０ないし２０μｇ）および変動する量のＤＯＰＥ（０ないし２０μｇ）を用いて得られた遺伝子発現を測定した（図２Ａ）。ＤＳもＤＯＰＥも存在しなかった場合には、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）をベンチマークとして使用した（６μｇ／μｇ−ＤＮＡ）。１：２のＤＳ：ＤＯＰＥ（淡色棒、図２Ａ）の質量比は、ＤＳ結合の使用を最小限にしかつ１０μｇ全脂質／μｇ  ＤＮＡより下の総脂質負荷を最小限にしつつ、高ＥＧＦＰ発現を提供した。ＤＳ：ＤＯＰＥ質量比を１：２で一定に維持する別個の一組の実験において、ＤＮＡに関するＤＳの量は、１から１０の電荷同等物（ＤＮＡ１μｇあたり０．９ないし９μｇのＤＳ）まで系統的に変動され、ＤＳのスペルミンの平均電荷が分子あたり３．８であること（Ｇｅａｌｌら、２０００、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１１：３１４−３２６）およびＤＯＰＥからの正味電荷の寄与がないと想定した。至適のリポフェクションは６  ＤＳ：１  ＤＮＡの電荷比で平坦となり、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）試薬に関して導入遺伝子発現の量の１０倍以上の増大を生じた。６：１のＤＳ：ＤＮＡの電荷比を越える増大は発現の増大を提供しなかった（図２Ｂ）。ＤＳの遺伝子移入活性がスペルミンのＤＮＡ結合能力およびデキサメサゾンの疎水性の特徴とのみ関連したかどうかを試験するために、ＤＮＡを、結合されたＤＳ／ＤＯＰＥトランスフェクションでと同一のモル比および濃度を使用して、スペルミン、デキサメサゾンおよびＤＯＰＥ（全部未結合）と組合せた（図２Ｄ）。デキサメサゾンをスペルミンと結合させた場合にのみＥＧＦＰ発現が検出された（図２Ｅ）。スペルミン単独もしくはデキサメサゾン単独は検出可能な遺伝子移入活性を有しなかった。トランスフェクションのパーセントを規定するために１００  Ｆ．Ｉ．というフローサイトメトリーのカットオフを使用して（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら、１９９９、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：８７３−８７７）、５．９％から２５．５％までの、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を上回るトランスフェクションパーセントの４．３倍の増大が観察された（図３）。コンフルエントに達しない（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）（増殖中の）ＢＥＡＣのＤＳ／ＤＯＰＥでのリポフェクションは、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）での１６．０％からＤＳ／ＤＯＰＥでの７３．８％のリポフェクションまでの、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を上回るトランスフェクションパーセントの４．６倍の増大を生じた（データは示されない）。ＤＳのＤＡへの加水分解は１Ｍ  ＮａＯＨ中で加速されるとは言え、ＤＳ中のアミドイミド結合は、ＤＯＰＥとともに処方された場合に中性のｐＨで比較的安定のようであった。水中４℃で６ヶ月間保存されたＤＳ／ＤＯＰＥ製剤はそれらのリポフェクション活性を保持したためである。
送達ベヒクル中の他の陽イオン性ステロイドの合成および使用
哺乳動物細胞へのＤＮＡ移入に有用な分子を創製するために、ステロイドへのスペルミンの結合を実施した。２１−クロロ−１７ヒドロキシプロゲステロン、トシル酸コレステロール、メシル酸ヒドロコルチゾンもしくは１７α−メシレート−エストラジオール−３−アセテートをＤＭＳＯおよびトラウト試薬と混合し、次いでスペルミンを添加した。生じる陽イオン性ステロイドは、中性脂質ＤＯＰＥとともに使用される場合に、２９３細胞に対する遺伝子移入活性を表した。
【０１３９】
スペルミンと結合しかつウシ大動脈内皮細胞で試験した他の化合物は、１１−デオキシコルチゾン、１１−デオキシコルチゾール、コルチゾールおよびコルチコステロンを包含する。２１種の製剤を試験し、そしてＥＧＦＰ発現に対する変動する影響を有した（図６を参照されたい）。
他の陽イオン性および疎水性化合物の使用
タモキシフェン（エストロゲンアンタゴニスト）および４−ヒドロキシタモキシフェンの、他の陽イオン性ステロイド（例えばデキサメサゾン−スペルミン）もしくは陽イオン性コレステロール誘導体との構造的類似に基づき、タモキシフェンおよび４−ヒドロキシタモキシフェンの遺伝子移入活性を測定した。タモキシフェンもしくは４−ヒドロキシタモキシフェン（より活性の代謝物）が核酸移入試薬として機能することができるかどうかを検査するために、薬物を多様な比でＤＯＰＥとともに処方し、そしてその後ＤＮＡと混合した。ＧＦＰ発現を２９３細胞で測定し、そして、結果は、これらの付加的なステロイドを本発明の送達ベヒクル中で同様に使用することができることを示す。
【０１４０】
多数の薬理学的薬物が親油性および陽イオン性基を有する。これらの化合物は、ＤＯＰＥもしくはコレステロールのような中性脂質の存在もしくは非存在下でＤＮＡを結合しかつ遺伝子移入活性を有することができる分子の一分類にある。陽イオン性および親油性である分子の該分類に存する他の薬物の代表的例は、限定されるものでないが：ラニチジン  ＨＣ、プロポキシフェース（ｐｒｏｐｏｘｙｐｈｅｓｅ）−Ｎ／ＡＰＡＰ、タモキシフェン、ベラパミル  ＳＲ、ＨＣＴＺを含むトリアムテレン、トリモックス、アシクロビル、シクロベンザプリン、メチルフェニデート、アミトリプチリン、トリメトプリム／サルファ、臭化イプラトロピウム、メトトレキセート、ジルタゼム  ＣＤ、ノルバスク、プロザックおよびサラフェム、バソテック、ゼストリル、エフェクソール、プリニビル、イミトレックス、セレベント、ゾロロフトおよびパキシルを挙げることができる。
【０１４１】
これらの結果は、新規陽イオン性プロドラッグもしくは薬物ベヒクルを使用することによる非ウイルス核酸および薬物送達への新たな一アプローチを記述する。ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達を高めることが認識されている強力なグルココルチコイド、デキサメサゾンを、イミノチオラン結合を介してスペルミンと結合させた。この分子は、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＴＭＡおよびＧＬ−６７のような臨床的に関連する陽イオン性脂質の遺伝子送達特性を、加水分解して薬理学的に活性な薬物を放出するという付加される機能性と組合せるよう設計した。この処置は、核酸および薬物のパッケージングおよび送達を促進する薬理学的に活性のプロドラッグを生じさせた。薬理学的に活性の陽イオン性ステロイドの使用は、体内のグリコサミノグリカンのような陰イオン性生物ポリマーの活用が、局所薬物送達のための天然に存在する貯蔵所としてはたらくこともまた可能にする。
実施例３−陽イオン性ステロイドの薬理学的活性
本実施例で使用される材料および方法をここに記述する。
グルココルチコイド受容体の局在化
テトラサイクリンに調節されるプロモーターから緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−グルココルチコイド受容体キメラタンパク質を発現する３Ｔ３細胞系３６７６（Ｗａｌｋｅｒら、１９９９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９：３８６−３９３）を使用して、核中へのＧＲ受容体の局在化を測定した。細胞は１００μｇ／ｍｌのジェネチシンを補充された成長培地中で維持した。細胞を、１０ｎＭから１０００ｎＭまでの濃度の範囲にわたるデキサメサゾン、ＤＳもしくはＤＡとともに３０分間インキュベートし、そして、ＧＦＰ−ＧＲの核転位を、ハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）ＣＣＤカメラおよびライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭ  ＩＲＢＥ蛍光顕微鏡を使用して４０倍で可視化した。
ＧＲＥからの転写の誘導
ＤＳおよびその加水分解産物ＤＡを使用するＧＲＥ誘導のレベルを、ＧＲＥ−ＳＥＡＰプロモーター構築物アッセイ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用してデキサメサゾンと比較した。２９３細胞を、２４穴プレート中でウェルあたり１μｇのプラスミドおよび６μｇのリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を使用して三重でＧＲＥ−ＳＥＡＰプラスミドでリポフェクトした。１２０分後にリポフェクション培地を５００μｌの成長培地で置き換え、そして、細胞を、１ｎＭから１０，０００ｎＭまでの範囲にわたるデキサメサゾン、ＤＳ／ＤＯＰＥもしくはＤＡで処理した。２４時間の誘導後に、成長培地の５０μｌのアリコートを、製造元の説明書に従ってＳＥＡＰ蛍光発生アッセイを使用して、アルカリホスファターゼ活性について分析した。
【０１４２】
本実施例に記述される実験の結果をここに提示する。
陽イオン性ステロイドの薬理学的活性
１０ないし１０００ｎＭのデキサメサゾン、ＤＳ／ＤＯＰＥもしくはＤＡのステロイドファルマコフォアの送達は、３Ｔ３細胞中で安定に発現されるグルココルチコイド成分ＧＦＰ−ＧＲキメラタンパク質（図４Ａ）の迅速な核局在化を生じさせた。ＧＦＰ−ＧＲ蛍光の大部分は、デキサメサゾンにより誘導される局在化と同様、１時間未満で核内に局在化された。１０ｎＭ  ＤＳ／ＤＯＰＥによるＧＦＰ−ＧＲの部分的核輸入、および１００ｎＭでの完全な核輸入は、この化合物の見かけのＫＤが潜在的にはエンドソーム隔離もしくは細胞質中の陰イオン性要素とのＤＳの会合により引き起こされる細胞質のＧＲへの低下された接近により、デキサメサゾンのものよりおよそ１０倍より高かったことを示唆した（ＫＤ〜１ｎＭ；Ａｓｈｗｅｌｌら、２０００、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２０９−３４５）。ＤＡはデキサメサゾンのものに類似の見かけのＫＤを有するようであった。完全な核局在化が１０ｎＭで観察されたからである。ＧＲの核局在化はグルココルチコイド活性の一試験である一方、薬理学的活性の第二の試験、すなわちグルココルチコイド応答性プロモーターからの遺伝子発現を誘導する能力もまた使用した。ＤＳおよびその加水分解産物ＤＡ双方が、ＧＲＥプロモーター構築物（ｐＧＲＥ−ＳＥＡＰ）からの用量依存的な転写を誘導し、２９３細胞におけるデキサメサゾンに関して〜１０ないし１００ｎＭのＥＣ５０を表した。１００ｎＭ濃度でスチューデントのＴ検定（片側および２検体不等分散）を使用したところ、全部の形態のステロイド（デキサメサゾン、ＤＳもしくはＤＡ）がＧＲＥプロモーターから統計学的に有意のレベルのＳＥＡＰ転写を誘導していた。
実施例４−陽イオン性脂質送達ベヒクルのグリコサミノグリカンへの結合
グリコサミノグリカンは、局所的間質部位での薬物、化合物もしくは核酸の徐放を可能にするための潜在的送達部位として標的とされうる陰イオン性の間質分子である。核酸もしくは薬物のような化合物をこうした間質部位に送達してそれらが徐放の様式で放出されることを可能にすることができる非ウイルス送達ベヒクルに対する当該技術分野における必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たす。
【０１４３】
本実施例で使用される材料および方法をここに記述する。
ヒアルロン酸放出アッセイ
ヒアルロン酸ナトリウム塩（ルースター  クーム（Ｒｏｏｓｔｅｒ  Ｃｏｍｂ）ＨＡ；シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、公称間質濃度の陰イオン性グリコサミノグリカンを模倣するように１ｍｇ／ｍｌでＰＢＳで希釈した。ＤＳ、ＤＡもしくはデキサメサゾンの等モル量（１μｍｏｌ）のステロイド部分を別個のＨＡ溶液に添加した（二重で）。生じる混合物を、１ｍｌのスライドアライザー（Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ）透析スライド（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）；ＭＷＣＯ＝１０，０００Ｄａ）に注入し、そして５０ｍｌのＰＢＳに対し室温で透析した。透析膜からのステロイド放出の時間経過を、透析緩衝液からのアリコートの吸光度の増大を２４０ｎｍ（デキサメサゾンのＡｂｓｍａｘ）で測定することにより追跡した。
【０１４４】
本実施例に記述される実験の結果をここに提示する。
【０１４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒアルロン酸への結合
高分子系の埋込物は、（ノルプラント（Ｎｏｒｐｌａｎｔ）技術におけるとおり）ステロイド送達のために十分開発されているが、それでもなお、貯蔵所としての天然に存在する陰イオン性生物ポリマーの活用は、長期の限局性抗炎症療法にとって魅力的な機構である。該結果は、デキサメサゾンが５時間未満に原型的細胞外マトリックス構成要素、ヒアルロン酸（ＨＡ）から迅速に溶出したことを立証した。対照的に、２４時間の期間で陽イオン性ステロイドＤＳの小画分のみがＨＡから溶出した一方、ＤＡの半分以上が溶出した（図５）。ＰＢＳ中のＨＡからの解離の半減期は、デキサメサゾン、ＤＡおよびＤＳについてそれぞれ２、１４および５６時間であると計算された。
【０１４６】
容易に合成され、核酸、遺伝子、薬物もしくは他の化合物を送達させるのに使用される場合に高レベルのトランスフェクションもしくは送達をもたらし、そして送達された生成物の治療的潜在能力に加わるそれら自身の固有の特性を有する、核酸および遺伝子の送達および徐放性プロドラッグ適用のための新たな非ウイルス薬物送達ベヒクルが今や作成され、そして本明細書に記述された。
【０１４７】
本明細書で引用されるそれぞれおよびすべての特許、特許明細および刊行物の開示は、これによりそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。本発明は特定の態様に関して開示された一方、本発明の他の態様および変形物が、本発明の真の技術思想および範囲から離れることなく当業者により考案されるかもしれないことが明らかである。付属として付けられる請求の範囲は、全部のこうした態様および同等の変形物を包含すると解釈されることを意図している。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
前述の要約、ならびに本発明の好ましい態様の以下の詳細な記述は、付属として付けられる図面とともに読まれる場合により良好に理解されるであろう。本発明を具体的に説明する目的上、現在好ましい態様を図面に示す。しかしながら、本発明は、図面に示される態様の正確な配置および装置一式に制限されないことが理解されるべきである。図面において：
【図１】図１Ａおよび１Ｂを含んで成る図１は、核酸もしくは薬物送達および抗炎症活性のための陽イオン性ステロイドの合成を図解で具体的に説明する。デキサメサゾンの２１−ヒドロキシ位を陽イオン基の結合のために選んだ。グルココルチコイド機能の喪失を伴わずにそれを置換することが可能であるためである（図１Ａ）。図１Ｂにおいて、結合試薬としての２−イミノチオラン（トラウト試薬）の使用が、陽イオン性ステロイドデキサメサゾン−スペルミン（ＤＳ；生成物１）の合成の間にスペルミン上の陽イオンを消費しないことをみることができる。基礎的条件下で、プロドラッグＤＳは加水分解を受けてスペルミンおよびデキサメサゾン−アミド（ＤＡ；生成物２）を放出する。
【図２】図２Ａ−２Ｅを含んで成る図２は、コンフルエントなウシ大動脈内皮細胞のトランスフェクションのための陽イオン性ステロイドリポプレックス製剤の至適化を具体的に説明する。図２Ａにおいて、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現のためのウェルあたり１μｇのプラスミド（４×１０５細胞／ウェルで２−ｃｍ２／ウェル）のリポフェクションを、１μｇのＤＮＡあたり増大する量の総脂質（０ないし４０μｇ）、および、１：０  μｇ／μｇ  ＤＳ：ＤＯＰＥ（薄灰色）；２：１  μｇ／μｇ  ＤＳ：ＤＯＰＥ（濃灰色）；１：１  μｇ／μｇ  ＤＳ：ＤＯＰＥ（灰色）；１：２  μｇ／μｇ  ＤＳ：ＤＯＰＥ（灰白色）；０：１  μｇ／μｇ  ＤＳ：ＤＯＰＥ（白色）の多様なＤＳ：ＤＯＰＥ質量比で；ならびにＤＳもＤＯＰＥも存在しなかった場合の６μｇ脂質：１μｇ  ＤＮＡでのリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（黒色）について実施した。図２Ｂは、ＤＮＡに対する電荷比の関数としてＥＧＦＰの発現を至適化することによる、１：２  μｇ／μｇ  ＤＳ：ＤＯＰＥの脂質：ＤＮＡ比の至適化を示し、そしてリポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）に関してのＥＧＦＰ産生の１０倍増強につながった。ＥＧＦＰ発現は、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）で得られた発現に対し正規化した。エピフルオレッセンス顕微鏡検査により画像化したＧＦＰ陽性のＢＡＥＣを、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（図２Ｃ）、未結合デキサメサゾン／スペルミン／ＤＯＰＥ（図２Ｄ）もしくはＤＳ／ＤＯＰＥ（Ｅ）でリポフェクトした。結果は、移入もしくは送達活性を有するためにはデキサメサゾンがスペルミンに結合されなければならないことを示す。
【図３】図３Ａ−３Ｄを含んで成る図３は、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）もしくはＤＳ／ＤＯＰＥを使用するリポフェクションのＦＡＣＳ分析および顕微鏡分析の像を具体的に説明する。コンフルエントなＢＡＥＣ細胞を、６：１  リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）：ＤＮＡ（Ａ、Ｂ）もしくは６：１２：１  ＤＳ：ＤＯＰＥ：ＤＮＡ（Ｃ、Ｄ）でリポフェクトし、そしてフローサイトメトリー（Ａ、Ｃ）もしくはエピフルオレッセンス顕微鏡検査（Ｂ、Ｄ）にかけた。ＦＡＣＳ分析は、接着生存細胞におけるＥＧＦＰの直接可視化により観察される増大されたトランスフェクションと矛盾しない、リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）に対するＤＳ／ＤＯＰＥを使用してのトランスフェクションパーセントにおける４．３倍の増大を示した。
【図４】図４Ａから４Ｍを含んで成る図４は、陽イオン性ステロイドが薬理学的に活性であることを具体的に説明する。図４Ａから４Ｌは、ＧＦＰ−ＧＲタンパク質を発現する３Ｔ３細胞の、デキサメサゾン、ＤＳ／ＤＯＰＥもしくは加水分解産物ＤＡでの３０分処置が、１０００ｎＭ（第一の行）、１００ｎＭ（第二の行）および１０ｎＭ（第三の行）の用量でＧＦＰ−ＧＲの核局在化を引き起こしたことを示す顕微鏡写真の画像である。未処理細胞（第四の行−図４Ｄ、４Ｈおよび４Ｌ）は、蛍光のグルココルチコイド受容体タンパク質の優先的に細胞質の局在化を表した（０ｎＭ）。デキサメサゾン（下図）およびＤＡ（上図）は１０ｎＭ濃度で核局在化を誘発した一方、ＤＳ／ＤＯＰＥ（中央図）はこの用量でわずかにより少ない活性を有した。図４Ｍは、デキサメサゾン、陽イオン性ステロイドＤＳおよびその加水分解産物ＤＡ全部が、分泌型アルカリホスファターゼ活性についての蛍光発生アッセイにより示されるとおり、ＧＲＥ−ＳＥＡＰレポータープラスミドからのＳＥＡＰ転写の用量依存性の誘導を引き起こしたことを示す。プロモーター構築物実験は三重で行い、＊＊ｐ＜０．００１；＊ｐ＜０．００５、＋ｐ＜０．０５。
【図５】図５は、デキサメサゾンスペルミン（ＤＳ）がグルコサミノグリカン、ヒアルロン酸（ＨＡ）を結合することをグラフで具体的に説明する。生理学的塩緩衝液の存在下で、透析膜中に含有されたヒアルロン酸からのデキサメサゾンの放出は極めて迅速であった一方、ＤＳは２４時間以上の間、ＨＡにきつく結合されたままであり、また、ＤＡは中間の放出の動力学を有した。
【図６】図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃを含んで成る図６は、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）におけるＤＮＡパッケージングおよびトランスフェクションに対する一連のステロイド−スペルミン結合物およびリポフェクトアミン（ＬＡ）の構造および活性をグラフで具体的に説明する。動的光散乱（図６Ａ）が、０．５、１および２のＤＯＰＥ：ステロイド比、ならびに２から２４までの範囲にわたるアミン：リン酸比での、ステロイド−スペルミンの変動するＬｏｇ  Ｐｓｔｅｒｏｉｄ（Ｌｏｇ  Ｐｓｔｅｒｏｉｄ＝１．６ないし２．９）について示される。２４時間（図６Ｂ）および４８時間（図６Ｃ）のＥＧＦＰ発現が、図６Ａで試験した各製剤について示される。ＬｏｇＰは、オクタノール／水分配比の対数と定義する。
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｍ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
2005525290.tif 000030
2005525290.tif 000031