(57)【要約】【課題】  本発明は、日光紫外（ＵＶ）線への暴露に起因する皮膚の光損傷及び／または光老化を治療及び／または評価するための方法を提供する。【解決手段】  本方法は、ＵＶ線への皮膚の暴露後に発現が変調されることが新しく見出された一意のマーカー遺伝子セットを用いる。本発明は、ＵＶ線に暴露されていない皮膚における遺伝子発現レベルに対する、新規提供マーカー遺伝子の少なくとも一つの発現におけるＵＶ線誘発変調または変化を、例えば減弱により、修飾することができる物質を識別し、評定する有利なシステムを提供する。皮膚に塗布すると、ＵＶ線への皮膚の暴露後にマーカー遺伝子セットの少なくとも一つの遺伝子の遺伝子発現を修飾することができ、その結果、光損傷及び光老化に対する防護及び治療効果を生じる、ならびに治療を可能ならしめる材料を含む組成物も提供する。光損傷防止特性及び／または光老化防止特性を有する材料としての、例えば、スキンケア剤、ヘアケア剤、化粧剤及びパーソナルケア剤ならびに栄養補助食品の潜在的な利点を、本方法を用いて評定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；これらの固有フラグメント；及びこれらの組合せから成る群より選択される、紫外線への暴露前の発現レベルに対する紫外線への暴露後の発現レベルの変調によって識別される少なくとも一つの遺伝子を含むことを特徴とするマーカー遺伝子セット。
【請求項２】
紫外線への暴露後の少なくとも一つの遺伝子の発現の変調が、
（ｉ）対照発現レベルと比較して、少なくとも約１．５倍の発現レベル、または
（ｉｉ）対照と比較して、平均値からの標準偏差２以上
を含む、請求項１記載のマーカー遺伝子セット。
【請求項３】
対照が、
（ｉ）紫外線への暴露が存在しない状態での少なくとも一つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベル；または
（ｉｉ）紫外線に対する遮断または減弱が存在する状態での少なくとも一つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベル
の一つ以上を含む、請求項１または請求項２記載のマーカー遺伝子。
【請求項４】
（ａ）皮膚または皮膚代用品と評価を受ける試験化合物または材料とを接触させること；
（ｂ）接触させた皮膚または皮膚代用品を紫外線源に暴露すること；及び
（ｃ）マーカー遺伝子の一つ以上が、ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質及びこれらの組合せから成る群より選択される、マーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の遺伝子発現を、前記試験化合物または材料が、接触させた皮膚または皮膚代用品を紫外線に暴露した後、対照の遺伝子発現と比較して、修飾するかどうか評定することを特徴とする、化合物または材料の紫外線防御、修復及び／または治療効果を評価する方法。
【請求項５】
皮膚代用品が、ヒト及びヒト以外の器官型皮膚モデルまたはヒト及びヒト以外の培養細胞から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
対照が、
（ｉ）紫外線に暴露されていない、同じもしくは異なる皮膚もしくは皮膚代用品；
（ｉｉ）紫外線が遮断または減弱されている、同じもしくは異なる皮膚もしくは皮膚代用品；または
（ｉｉｉ）前記化合物または材料が存在しない状態で紫外線に暴露された、同じもしくは異なる皮膚もしくは皮膚代用品
の一つ以上を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
（ａ）の接触が、皮膚もしくは皮膚代用品またはそれらの一定領域に対する試験化合物または材料の局所適用を含む、請求項４記載の方法。
【請求項８】
紫外線への暴露後の皮膚または皮膚代用品のマーカー遺伝子のセットの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルが、
（ｉ）対照発現レベルと比較して、少なくとも約１．５倍、または
（ｉｉ）対照発現レベルと比較して、平均値からの標準偏差約２
から選択される、請求項４記載の方法。
【請求項９】
皮膚または皮膚代用品が、約５分〜約９６時間、約１時間〜約７２時間、約４時間〜約３２時間、約５分〜約４８時間、または約５分〜約１時間から選択された期間、紫外線に暴露される、請求項４記載の方法。
【請求項１０】
皮膚または皮膚代用品が、最小紅斑量（ＭＥＤ）で紫外線源に暴露される、請求項４記載の方法。
【請求項１１】
皮膚または皮膚代用品が、約１ＭＥＤ〜約４ＭＥＤの最小紅斑量（ＭＥＤ）で紫外線源に暴露される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
評定が、マイクロアレイ、ノーザン・ブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応法、逆ポリメラーゼ連鎖反応法、遺伝子発現連続分析法、及びディフェレンシャルディスプレイ法から成る群より選択されたアッセイによって行われる、請求項４記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）長時間、紫外線源に暴露する段階、または（ｉｉ）異なる回数、紫外線源に暴露する段階が反復される、請求項４記載の方法。
【請求項１４】
請求項４に記載の方法によって判定されるような紫外線防御、修復及び／または治療効果を有する化合物または材料。
【請求項１５】
対照の遺伝子発現との比較での、皮膚または皮膚代用品の紫外線への暴露後のマーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の遺伝子発現の変調を、修飾する化合物または材料であって、
前記マーカー遺伝子の一つ以上が、ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質及びこれらの組合せから成る群より選択され；及びさらに、
前記試験化合物または材料が、対照に対するマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子の遺伝子発現の変調を修飾できるということが、前記化合物または材料が、紫外線防御、修復及び／または治療効果を有することを示すことを特徴とする、
紫外線防御、修復及び／または治療効果を有する化合物または材料。
【請求項１６】
栄養補助食品である、請求項１４または請求項１５記載の化合物または材料。
【請求項１７】
皮膚の紫外線への暴露後にその発現を変調させるマーカー遺伝子のセットの少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾する材料を有効な量含有する組成物を、有効な期間、ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；及びこれらの組合せから成る群より選択されたマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾するために有効な量で、皮膚またはその一定領域に塗布することを特徴とする、
光損傷または光老化した皮膚を改善及び／または治療する方法。
【請求項１８】
皮膚の紫外線への暴露後にその発現が変調されるマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾する材料を有効な量含有する組成物を、有効な期間、ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；及びこれらの組合せから成る群より選択されたマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾するために有効な量で、紫外線暴露後に、皮膚またはその一定領域に塗布することを特徴とする、
光損傷または光老化した皮膚を逆行及び／または修復する方法。
【請求項１９】
前記組成物を毎日塗布する、請求項１７または請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
組成物を２〜４週間塗布する、請求項１７または請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）皮膚または皮膚代用品から選択された試験材料を紫外線源に暴露すること［この場合、前記紫外線暴露の結果、紫外線への暴露後に試験材料が、ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；前記マーカー遺伝子の固有サブフラグメント；及びこれらの組合せから選択されたマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子を発現するレベルは、対照と比較して変調する］；
（ｂ）紫外線に暴露された試験材料と評価を受ける物質を接触させること；及び
（ｃ）前記の評価を受ける物質が、紫外線暴露試験材料による前記マーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを修飾して、対照の遺伝子発現レベルを反映または達成する、紫外線暴露試験材料の遺伝子発現レベルをもたらすかどうかを評定すること（この場合、その物質が、紫外線暴露試験材料によるマーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを修飾できるということは、その物質が、試験材料に対する紫外線の作用を修復するまたは逆行させることができ、その結果、紫外線暴露に関連した皮膚光損傷作用または光老化作用を修復または逆行させることができることを示す）
を特徴とする、物質が、紫外線への暴露に関連した光損傷作用または光老化作用を修復するまたは逆行させることができるかどうかを、評価する方法。
【請求項２２】
皮膚代用品が、ヒト及びヒト以外の器官型皮膚モデルまたはヒト及びヒト以外の培養細胞から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
対照が、
（ｉ）紫外線に暴露されていない、同じもしくは異なる皮膚もしくは皮膚代用品；
（ｉｉ）紫外線が遮断または減弱されている、同じもしくは異なる皮膚もしくは皮膚代用品；または
（ｉｉｉ）前記物質が存在しない状態で紫外線に暴露された、同じもしくは異なる皮膚もしくは皮膚代用品
の一つ以上を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
皮膚または皮膚代用品が、約５分〜約９６時間、約１時間〜約７２時間、約４時間〜約３２時間、約５分〜約４８時間、または約５分〜約１時間から選択された期間、紫外線に暴露される、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
皮膚または皮膚代用品が、最小紅斑量（ＭＥＤ）で紫外線源に暴露される、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
皮膚または皮膚代用品が、約１ＭＥＤ〜約４ＭＥＤの最小紅斑量（ＭＥＤ）で紫外線源に暴露される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
皮膚または皮膚代用品が、約５分〜約４８時間、約１ＭＥＤ〜約４ＭＥＤの最小紅斑量（ＭＥＤ）で紫外線源に暴露される、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
評定が、マイクロアレイ、ノーザン・ブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応法、逆ポリメラーゼ連鎖反応法、遺伝子発現連続分析法、及びディフェレンシャルディスプレイ法によって行われる、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
（ｉ）長時間、紫外線源に暴露する段階、または（ｉｉ）異なる回数、紫外線源に暴露する段階が反復される、請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
請求項２１に記載の方法によって判定されるような皮膚光損傷または光老化修復または逆行効果を有する物質または材料。
【請求項３１】
ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；前記マーカー遺伝子の固有サブフラグメント；及びこれらの組合せから成る群より選択されたマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子の遺伝子発現レベルの紫外線に暴露された皮膚による変調を修飾して、紫外線に暴露されていない、または紫外線が遮断もしくは減弱されている対照の遺伝子発現レベルを反映するまたは達成する紫外線暴露皮膚の遺伝子発現レベルを生じ、その結果、紫外線暴露に関連した皮膚光損傷作用または光老化作用を修復または逆行させることを特徴とする、皮膚の光損傷または光老化修復または逆行効果を有する物質または材料。
【請求項３２】
栄養補助食品である、請求項３０または請求項３１に記載の物質または材料。
【請求項３３】
請求項３０または請求項３１に記載の物質または材料を含む組成物または調合物。
【請求項３４】
請求項４に記載の方法によって判定されるような化合物または材料を含む、光防御用または治療用光損傷防止または光老化防止調合物。
【請求項３５】
（ａ）皮膚または皮膚代用品を紫外線に暴露した後、ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；前記マーカー遺伝子の固有サブフラグメント；及びこれらの組合せから選択されたマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを評定すること；ならびに
（ｂ）（ａ）からの少なくとも一つのマーカー遺伝子の発現レベルを、（ｉ）紫外線に暴露されていない対照の発現レベルまたは（ｉｉ）紫外線が遮断もしくは減弱されている対照の発現レベルと比較して、少なくとも一つのマーカー遺伝子の遺伝子発現レベルにおいて、対照の遺伝子発現レベルとの比較で変調が生じたかどうかを判定すること［この場合、対照対するマーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つのマーカー遺伝子の発現レベルの変調は、（ｉ）対照発現レベルと比較して、少なくとも約１．５倍、または（ｉｉ）対照発現レベルと比較して、平均値からの標準偏差約２以上から選択され、且つ、皮膚または皮膚代用品に対する紫外線誘発損傷と相関する］
を特徴とする、紫外線４暴露後の皮膚または皮膚代用品に対する紫外線誘発損傷を評価する方法。
【請求項３６】
皮膚代用品が、ヒト及びヒト以外の器官型皮膚モデルまたはヒト及びヒト以外の培養細胞から選択される、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
皮膚または皮膚代用品が、約５分〜約９６時間、約１時間〜約７２時間、約４時間〜約３２時間、約５分〜約４８時間、または約５分〜約１時間から選択された期間、紫外線に暴露される、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
皮膚または皮膚代用品が、最小紅斑量（ＭＥＤ）で紫外線源に暴露される、請求項３５記載の方法。
【請求項３９】
皮膚または皮膚代用品が、約１ＭＥＤ〜約４ＭＥＤの最小紅斑量（ＭＥＤ）で紫外線源に暴露される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
皮膚または皮膚代用品が、約５分〜約４８時間、約１ＭＥＤ〜約４ＭＥＤの最小紅斑量（ＭＥＤ）で紫外線源に暴露される、請求項３５記載の方法。
【請求項４１】
マイクロアレイ、ノーザン・ブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応法、逆ポリメラーゼ連鎖反応法、遺伝子発現連続分析法、及びディフェレンシャルディスプレイ法から成る群より選択されたアッセイによって行われる、請求項３５記載の方法。
【請求項４２】
（ｉ）長時間、紫外線源に暴露する段階、または（ｉｉ）異なる回数、紫外線源に暴露する段階が反復される、請求項３５記載の方法。
【請求項４３】
ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質から成る群より選択されたマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルにおける変調を修飾するために有効な濃度の一つ以上の成分を、有効な期間、皮膚に塗布することをを特徴とする、光老化及び／または光損傷する皮膚を予防する方法。
【請求項４４】
期間が、毎日または約１〜４週間から選択される、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
皮膚の光老化を、治療、予防または改善する、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
皮膚の光損傷を、治療、予防または改善する、請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）試験またはスクリーニングを受ける個人からの皮膚サンプルをＵＶ線に暴露すること、ならびに
（ｂ）ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；前記マーカー遺伝子少なくとも一つの固有サブフラグメント；及びこれらの組合せから選択されたマーカー遺伝子のセットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現が、ＵＶ線に暴露された皮膚において、（ｉ）ＵＶ線に暴露されていない対照または（ｉｉ）ＵＶ線への暴露が遮断もしくは減弱されている対照と比較して変調されるかどうかを判定すること［この場合、マーカー遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子発現における変調の判定によって、その個人が、皮膚の光損傷または光老化に対して感受性である、または非常に敏感であると識別される］
を特徴とする、ＵＶ線に暴露された後に皮膚の光損傷または光老化に対して感受性である、または非常に敏感である個人を識別またはスクリーニングする方法。
【請求項４８】
ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；前記マーカー遺伝子少なくとも一つの固有サブフラグメント；及びこれらの組合せから成る群の少なくとも一つから選択されたマーカー遺伝子セットを含む支持材料（この場合、前記マーカー遺伝子の少なくとも一つが、前記支持材料に固定されている）を具備し；ならびに
核酸プローブ、検出標識、バッファ、対照及び使用説明書を場合によっては具備することを特徴とする、
物質の光損傷防止特性または光老化防止特性を評定するためのキット。
【請求項４９】
支持材料が、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、プラスチックフィルムまたはスライドガラスから選択される、請求項４８記載のキット。
【請求項５０】
キットによって行われるアッセイが、マイクロアレイである、請求項４９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの皮膚の光損傷及び光老化の治療及び予防に関する。さらに詳細には、本発明は、新規遺伝子マーカーを用いる、紫外（ＵＶ）線への暴露に起因する皮膚に対する損傷（光損傷）の予防、治療、改善及び修復に関する。さらに、本発明は、その発現が、皮膚のＵＶ線への暴露に関連することが新に見出された、以前に識別されていないマーカー遺伝子セットに影響を及ぼす材料を用いることによって、光老化する／した皮膚を予防、治療、改善及び逆行させるための方法に関する。さらに、本発明は、その発現が皮膚の紫外線への暴露に関連することが新たに見出された、以前に識別されていないマーカー遺伝子のセットを提供することによって、皮膚への紫外線損傷を評価及び評定するための方法に関する。加えて、本発明は、皮膚の光損傷及び光老化、特に、日々発生する、または時間をかけて発生するなど、偶発的及び／または直接的なＵＶ線への急性的または慢性的暴露によって誘発されるような、皮膚の光損傷及び光老化に対して防御する、そうした光損傷及び老化を改善、予防、抑止、阻止、軽減、治療または逆行させるための組成物、好ましくは局所適用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
太陽光線、特に紫外線は、ヒトの皮膚に障害をもたらし、望ましくない作用の中でもとりわけ、光老化、免疫抑制及び皮膚癌の原因となる。
【０００３】
ヒトの皮膚は、表層外面区画（表皮）及び深部区画（真皮）の二つの区画を備えている。最も外側の上皮層は、典型的に、ある程度の保護を身体にもたらすが、上述の有害な光損傷作用の矢面に立つのは、表皮及び真皮である。自然なヒトの表皮は、三つの細胞タイプ、すなわち、表皮細胞（非常に支配的である）、メラノサイト及びランゲルハンス細胞、から主として成る。これらの細胞タイプが機能して、ヒトの身体において欠くことのできない皮膚の保護材的役割が生じる。表皮に充実的及び栄養的援助をもたらす真皮は、主として、線維芽細胞、ならびに線維芽細胞によって合成されるコラーゲン、エラスチン及び基質から主として成る細胞外基質を含む。加えて、真皮は、白血球、肥満細胞、組織マクロファージ、血管及び神経線維を含む。
【０００４】
太陽放射は、紫外（ＵＶ）線（λ＜４００ｎｍ）、可視光線（４００ｎｍ＜λ＜７００ｎｍ）、及び赤外（ＩＲ）線（λ＞７００ｎｍ）を含むことが知られている。ＵＶ線は、一般に、ＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ）、ＵＶＢ（２９０〜３２０ｎｍ）、及びＵＶＣ（＜２９０ｎｍ）に分けられる。ＵＶＣ線は、一般に、成層圏オゾンによって地球表面への到達が阻止される。太陽光線の紫外（ＵＶ）部分特に、ＵＶＡ及びＵＶＢは、光老化及び光損傷における主原因因子であると一般に考えられている。ヒトの身体に関して言えば、皮膚の表皮は、太陽放射、特に、ＵＶ線が到達する最初の標的である。
【０００５】
ヒトの皮膚に光老化及び／または光損傷をもたらすために必要なＵＶ線暴露の程度は、今のところ、充分には規定されていないが、ヒトの皮膚に一般には日焼けとして現われる紅斑（発赤）を生じるために必要な量は、既知であり、所定のＵＶ源からの「最小紅斑量（「ＭＥＤ」）として経験的に定められている。
太陽放射、特にＵＶ線への皮膚の暴露は、皮膚及び皮膚内の一定の化合物の含量を変化させ、その結果、自然な皮膚の老化プロセスを加速させうる。ＵＶ線暴露に起因する皮膚の老化加速または早期老化のプロセスは、一般に、光老化と呼ばれている（光化学線作用性老化（ａｃｔｉｎｉｃ  ａｇｉｎｇ）または皮膚日射病（ｄｅｒｍａｔｏｈｅｌｉｏｓｉｓ）とも呼ばれている）。
【０００６】
光老化は、太陽放射、特にＵＶ線を含む外因性要素の作用及び皮膚への影響によって生じる。皮膚に対する光老化の表現作用は、典型的には、弾力性の喪失、きめの粗さ、まだらな色素沈着、黄ばみ、たるみ、弾力性の喪失に伴う乾燥した荒れた外観、汗孔の変化、及び表在性と深在性、両方のしわ（特に、目の周り）を臨床的特徴とする。多くの場合、前悪性及び悪性新生物は、反復される日光暴露及び光老化と関連する。光老化は、一般に、顔、耳、頭皮の毛の無い領域、首、胴、、腕（例えば、前腕）、下腿、足及び手などの、太陽光線に常習的に暴露される皮膚において発生する。
【０００７】
一般には日焼け止め剤を用いて、太陽光線に暴露される皮膚領域の光損傷及び光老化を予防する。日焼け止め剤は、ＵＶ線を吸収する、反射する、及び／または散乱させる成分を含有する局所製剤である。目に見える防御層を生じる、不透明微粒子材料、例えば、酸化亜鉛、酸化チタン、クレー及び塩化第二鉄を含む無機材料または無機材料と有機材料を組み合わせたものをベースにしている日焼け止め剤もあり、皮膚上に透明または半透明な生成物を生じる成分を含有する日焼け止め剤もある。日焼け止め剤を含む化合物には、オキシベンゾン、スルイソベンゾン、ジオキシベンゾン、アントラニル酸メチル、ｐ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、メトキシケイ皮酸オクチル、オクトクリレン、ドリメトリゾール、トリシロキサン、サリチル酸オクチル、サリチル酸ホモメンチル、ＰＡＢＡオクチルジメチル、サリチル酸ＴＥＡ、二酸化チタン、酸化亜鉛、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、４−メチルベンジリデンカンフル、オクチルトリアゾン、テレフタリジエンジカンフルスルホン酸、ＰＡＢＡエチル、ヒドロキシメチルフェニルベンゾトリアゾール、メチレンビス−ベンゾトリアゾイルテトラメチルブチルフェノール、ビス−エチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェノールトリアジン及び前記のものの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他の適する、有用な日焼け止め活性化合物には、Ｊ．Ｆ．Ｇｒｏｌｌｉｅｒらの［（特許文献１）］に開示されているものが挙げられる。
【０００８】
皮膚に対するＵＶ線暴露の外因性作用の進展は、望ましくない、またはより深刻な病理学的表現の変化、例えば、早期しわ及び／または皮膚癌を一般に生じうる多数の複雑な遺伝子相互作用及びフィードバックメカニズムに依存する。こうした複雑な遺伝子相互作用は、先行法の技術の限界及び労働集約的性質の結果として、以前は確認及び理解が相当困難であった。
【０００９】
ＵＶ誘発皮膚損傷を評価するための幾つかの現行方法論は、紅斑（すなわち、皮膚の赤み）の発生及び測定に頼っている。紅斑反応は、皮膚のタイプ、人種的背景などを含む個人の遺伝的体質に依存するので、個人個人で相当違いがある。さらに、終点は、非常に主観的であり、目に見える紅斑が存在しない状態で細胞損傷などの有意な損傷が発生することもある。
【００１０】
皮膚のＵＶ誘発損傷または老化を判定する他の方法は、本発明が行っているような、新発見の遺伝子セットのＵＶ線誘発発現変調を識別及び評定する分子手順の協力を得ていない。加えて、インビボでのヒトの皮膚におけるＵＶ損傷作用のシグナリングする、新発見の遺伝子は、それら自体が、他の方法によって以前には識別されていない。例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎらの［（特許文献２）］は、エラスチンプロモータのための受容体遺伝子を用いて、ＵＶ線暴露に基づくエラスチンプロモータ受容体遺伝子の活性化を評定する、皮膚光老化のインビボ及びインビトロモデルを開示している。Ｆｉｓｈｅｒらの［（特許文献３）］は、ＵＶ線暴露後の損傷を評定するために、基質メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の酵素活性化を含む方法を開示している。Ｂｅｒｎｅｒｄらの［（特許文献４）］は、Ａ型ＵＶ誘発皮膚損傷に特異的なマーカーへの変異体をインビボ皮膚同等物において測定する、Ａ型紫外線暴露後の皮膚に対する損傷を評価するための方法を開示している。こうしたマーカー変異体には、Ｉ型、すなわち間質性コラーゲナーゼ；細胞、核酸、蛋白質、イオン、細胞器官、脂質及びポリサッカリドにおけるビメンチン分析、非識別変異体が挙げられる。Ｒｅｅｃｅらの米国特許第５，６９１，１５８号は、炎症性媒介物（例えば、インターロイキン−１−α）の導入によって日焼け止め調合薬の有効度を判定するための、または細胞毒アッセイ（例えば、ＭＴＴ）によって生存度を判定するための組織モデル、すなわち、人工皮膚培養物を開示している。
【００１１】
分子生物学のツール、特に、マイクロアレイ分析の出現にともない、複雑な遺伝子変調及び相互作用が解明され始めた。本発明は、多数の便利な分子ツール及びパラメータ、好ましくは核酸アレイ技術によって測定可能な新規遺伝子マーカーを用いて、ＵＶ線暴露に起因する皮膚への光損傷及び／または皮膚の光老化を評価する。本明細書中に記載されているような新規で有利な方法及び組成物を本発明は提供する。
【特許文献１】米国特許第５，０００，９３７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０１８，０９８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，１３０，２５４号明細書
【特許文献４】米国特許第６，０７９，４１５号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、太陽放射／ＵＶ線に起因する皮膚への損傷、すなわち、光損傷を評価する方法及びそれに用いる組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書中で用いられる場合、「ＵＶ線」は、「太陽放射」を包含する。本方法は、ＵＶ線に暴露した後、本明細書において識別され、記載されている一つ以上の遺伝子または遺伝子の組合せの遺伝子発現及び／または活性における変化または変調の評定を含む。本発明によると、一意で予想外の遺伝子セットが、本方法での使用に決定されている。皮膚をＵＶ線に暴露した後、これらの遺伝子の一つ以上の発現が変調されるためである。
【００１４】
本発明の特定の側面は、ＵＶ線に暴露された皮膚源から核酸、例えば、ＲＮＡを得ること、及びＵＶ線暴露後、ＵＶ線に暴露されていない皮膚を基準にして変調された発現を示す、新発見の遺伝子マーカーの一つまたは組合せのＵＶ線誘発発現の変調が存在するかどうかを判定するために前記ＲＮＡを検定することを含む。ＲＮＡのマイクロアレイ分析は、本発明のこの特定の側面に好ましい。
【００１５】
本発明のもう一つの側面は、皮膚のＵＶ線暴露に伴う遺伝子発現を、例えば減弱により修飾する、または皮膚のＵＶ線暴露に伴う遺伝子発現の修飾を行う組成物を評価する方法を提供することである。こうした組成物には、局所適用用日焼け止め剤、酸化防止剤、抗炎症薬、化粧剤（メイクアップ製品、栄養補助食品及び他の全身性経口薬を含む）、老化防止調合薬（例えば、小じわ及び／またはしわ用クリーム）、局所薬、皮膚浸透剤などが挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明に従って、様々な製品形態、例えば、パッチなどの経皮適用形態のこうした組成物に調合される調合成分、成分または化合物を、それらが皮膚のＵＶ線暴露に伴う遺伝子発現を修飾または防止する能力を評定することにより、光防護効果について評価する。こうした組成物、調合成分、成分、化合物及び／または製品は、局所投与及び経口投与の両方のためのものである。本評価法は、本明細書中に記載されているような、皮膚のＵＶ線暴露後に発現の変調があることが発見された一つ以上の新規遺伝子マーカーセットを用いる。
【００１６】
本発明のもう一つの側面は、物質（例えば、日焼け止め調合薬もしくは製品または栄養補助食品などの老化防止または光損傷防止調合薬の成分または調合成分）を試験及び評価して、ＵＶ線誘発皮膚損傷を改善、治療、予防、抑止、阻止、軽減もしくは修復する、ならびに／またはＵＶ線損傷に対する光防護をもたらす、ならびに／または光老化した皮膚を改善、治療及び／もしくは逆行させる物質を識別するための新しい手段を提供する。本発明によると、ＵＶ線誘発皮膚損傷を改善、治療、予防、抑止、阻止、軽減、修復または逆行させることができるこうした物質は、使用者、好ましくは、使用者の皮膚に光防護及び／または老化防止用保護（すなわち、ＵＶ線誘発損傷に対する保護）をもたらす、例えば、化粧剤、日焼け止め剤、老化防止製品または皮膚用栄養補助食品中における調合成分としての使用に適する。
【００１７】
本発明のさらにもう一つの側面は、開発中の製品（例えば、日焼け止め調合薬またはその試作品）が、ＵＶ線暴露に対して望ましい防御レベルを有するかどうか判定するための新規方法を提供する。従って、本発明は、日焼け止め組成物または老化防止組成物のための望ましいサン・プロテクション・ファクター（太陽光線保護指数）またはレベルをスクリーニングする方法であって、ＵＶ線への暴露の結果として発現が変調される新規マーカー遺伝子セットを含む少なくとも一つの遺伝子の発現を、そのファクターまたはレベルが、対照を基準にして修飾するかどうか判定することによる方法を提供する。
【００１８】
本発明のもう一つの側面は、未保護の皮膚における遺伝子発現を修飾することができる、及び／または対照、例えば、その発現が紫外線への皮膚の暴露後に暴露されていない皮膚と比較して変調するマーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを逆行させることができる材料を提供する。ＵＶ線への暴露は、皮膚の光損傷及び／または光老化の原因となる。本発明は、皮膚の光損傷を改善、治療、予防、抑止、阻止、軽減、修復及び／もしくは逆行させることができる、ならびに／または皮膚の光老化を改善、治療、予防、抑止、阻止、軽減、修復もしくは逆行させることができる材料に関する。関連側面において、本発明は、一つ以上の上記材料を、特に、本明細書中に記載されているようなマーカー遺伝子の一つ以上の発現を修飾または逆行させるために有効な量で含む組成物及び調合薬も提供する。こうした組成物及び調合薬、ならびにそれらの中の材料は、未保護の皮膚、皮膚組織、他の皮膚同等物またはケラチン生成細胞を含む皮膚の光損傷及び光老化に対する治療または保護剤に有用である。
【００１９】
もう一つのその側面において、本発明は、皮膚の光損傷または光老化に対する化合物または成分の紫外線防御、治療及び／または処置効果を評価する方法を提供する。この方法は、皮膚または皮膚代用品、例えば、皮膚同等物、皮膚細胞またはケラチン生成細胞から選択された試験材料と評価を受ける化合物または成分を接触させること、及び前記試験化合物を紫外線源に暴露することを含む。その後、その化合物または成分が、対照、例えば、ＵＶに暴露されていない試験材料と比較して、紫外線への暴露後の試験材料によるマーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを修飾するかどうか、当該技術分野において実施されている方法を用いて評価する。
【００２０】
もう一つの側面において、本発明は、光損傷または光老化した皮膚を改善または治療する方法を提供する。詳細には、本発明は、光損傷した皮膚を修復する、または光老化した皮膚を逆行させる方法を提供する。この方法は、皮膚を紫外線に暴露した後、発現が変調されるマーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾する材料を含有する組成物を皮膚またはその一定の領域に塗布することを含む。好ましくは、前記組成物は、紫外線への暴露後に本発明の新規遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾するために有効な量及び期間で局所適用される。
【００２１】
本発明の方法によると、組成物及び／または組成物に調合された活性材料が、皮膚に塗布され、ＵＶ線を適用されと、にマーカー遺伝子のうちの少なくとも一つの発現レベルを修飾することができるということは、前記組成物が、ＵＶ線に暴露され、光損傷または光老化した皮膚を改善、治療、修復または逆行させることができるとうことを示す。典型的には、前記組成物によるマーカー遺伝子の中の少なくとも一つの遺伝子の発現の修飾を、少なくとも一つの対照、例えば、ＵＶ線に暴露されていない皮膚または皮膚代用品における遺伝子の発現、と比較する。
【００２２】
本発明のもう一つの側面は、一つ以上の光防護、光治療及び／または光老化防止用成分、材料または物質を含有する組成物、好ましくは、化粧品組成物を提供する。この場合、前記一つ以上の成分、材料または物質は、ＵＶ線への暴露に関連することが新に見出された一つ以上のマーカー遺伝子の発現の変調を修飾する前記成分、材料または物質の能力によって評定した際に、皮膚へのＵＶ線誘発損傷または皮膚のＵＶ線誘発老化を改善、抑止、阻止、軽減、予防、修復、治療または逆行させることによる、光防護、光治療または光老化防止作用を提供するこが実証されたものである。好ましくは、前記成分、材料または物質による修飾は、ＵＶ線に暴露されていない対照における遺伝子発現のレベルを反映するまたはそれに類似した一つ以上のマーカー遺伝子の発現をもたらす。
【００２３】
本発明のさらにもう一つの側面は、光防護作用を有する、ならびに／または皮膚、皮膚代用品、皮膚細胞もしくはケラチン生成細胞のＵＶ線暴露に起因する光損傷及び／もしくは光老化を改善、修復、予防、抑止、阻止、軽減、治療または逆行させることができる、化合物、材料、試薬、調合成分、薬剤などを、開業医が識別するために適する形態の、皮膚がＵＶ線に暴露すると発現が変調される新規遺伝子セットを含む支持体または支持材料、例えば、膜、より詳細には、ニトロセルロースまたはナイロン膜を備えるキットを提供する。ＵＶ線誘発損傷及び／または老化を克服する、または別様に作用することができる薬剤を判定するためのターゲット識別遺伝子マーカーセットを提供する遺伝子セットに加えて、前記キットは、標識プローブ、バッファ、対照及び使用説明書を含む（しかし、これらに限定されない）、このアッセイ法を実施するために必要な他の材料を具備することができる。
【００２４】
さらにもう一つの側面において、本発明は、個人の識別、すなわち、本明細書に新しく記載されているようなＵＶ線誘発マーカー遺伝子セットの中の一つ以上のマーカー遺伝子の発現変調があることでＵＶ誘発遺伝子発現に反応する個人の部分集合の識別をもたらす。こうした個人は、ＵＶ線への暴露後に光損傷及び光老化に対して、より感受性であるだろう。本発明の方法を用いてスクリーニングすることによって識別することができるこれらの個人は、本明細書に記載されているようなマーカー遺伝子セットのうちの一つ以上の遺伝子の発現における変調を修飾することができる材料、調合成分、化合物、調合物及び組成物を伴う処置または治療にとりわけ適しているだろう。こうした識別された個人は、ＵＶ線誘発光損傷及び光老化の改善、軽減、治療、予防、修復及び、または逆行に特に適しているだろう。
【００２５】
本発明の前記の各側面によると、ＵＶ線暴露後に発現が変調される少なくとも一つの遺伝子を含むマーカー遺伝子セットには、ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７；コルネオデスモシン；アンフィレグリン；顆粒球遊走性蛋白質；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）；エフリン受容体；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）；ｓｈｂ癌原遺伝子；ＭＡＤ転写抑制因子；カルパイン；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３）；α１−アンチトリプシン前駆体；トリステトラプロリン；増殖因子誘発性核蛋白質４７５；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）；核性因子１；ｈＳＮＦ２転写活性化因子；プロチモシン；ＧＡＴＡ３転写因子；ヒスチジンデカルボキシラーゼ；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白；デコリン；ＣＤ４４抗原；Ｂ９４蛋白質；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）；アポリポ蛋白質Ｅ；上皮ジスコイジン受容体；トロンビン受容体；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１；チオレドキシンペルオキシダーゼ；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）；ＥＢ１微小管付属蛋白質；前記マーカー遺伝子の固有サブフラグメント；及びこれらの組合せが挙げられる。
【００２６】
対照（例えば、ＵＶ線に暴露されていない皮膚、またはＵＶ線への暴露が遮断または減弱された皮膚）を基準にして、上に挙げたマーカー遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の発現レベルを修飾する材料、化合物、成分、調合成分、物質または組成物の能力は、皮膚の光損傷を改善、治療、予防、抑止、阻止、軽減及び／もしくは修復する、ならびに／または皮膚の光老化を改善、治療、予防、抑止、阻止、軽減及び／もしくは逆行させる材料の光防護及び治療能力と相関する。
【００２７】
本発明のさらなる側面、特徴及び利点は、発明の詳細な説明を読み、その際、添付の図／図面に関連して考えると、よりよくご理解いただけることだろう。
皮膚に対するＵＶ線誘発損傷の有害な結果、例えば、免疫抑制、光発癌（例えば、黒色腫）、ならびに光老化に起因するしわ及び弾力性の喪失のために、ＵＶ線への暴露前ならびに暴露後にこれらの結果を予防、抑止、阻止、軽減、治療、改善、修復及び／または逆行させる必要がある。
【００２８】
一般に、本発明は、インビボでの太陽刺激放射（ＳＳＲ：ｓｏｌａｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）、すなわち、ＵＶ線の攻撃を受けているヒトの皮膚または皮膚細胞の一意の遺伝子発現／調節プロフィールを提供する。本発明は、ＵＶ線暴露後に発現が変調される、新規で予想外の遺伝子セット、すなわち、マーカー遺伝子のアレイを識別した。この新発見の遺伝子マーカーセットには、いくつかの異なる種類の蛋白質分子、すなわち、細胞シグナル送信及び細胞外交信蛋白質；細胞表面抗原及び接着受容体蛋白質；増殖因子、サイトカイン、ケモカインよび受容体；細胞内伝達因子、作用因子及び調節因子；発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子；蛋白質阻害因子及び蛋白質修飾分子；異物代謝及び輸送蛋白質；転写活性化因子及び抑制蛋白質；塩基性転写因子；細胞周期調節因子；細胞外交信蛋白質及び輸送体；ならびにキナーゼ活性化因子及び抑制因子を含む遺伝子が含まれている。マーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの発現における変調は、ＵＶ線に暴露されていない、皮膚、皮膚代用品または皮膚同等物などの対照少なくとも一つにおける遺伝子の発現を基準にして判定される。
【００２９】
具体的には、前記遺伝子マーカーセットは、ＵＶ線暴露によって発現に影響を受ける上記タイプの３５の遺伝子（及び市販のＣｌｏｎｔｅｃｈ  マイクロアレイのために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡが供給しているような、ゲンバンクアクセッション番号）を含む。前記３５の遺伝子には、次のものが挙げられる：ｒａｓ関連蛋白質ＲＡＢ−７（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ９３４９９）；コルネオデスモシン（ゲンバンクアクセッション番号Ｌ２０８１４）；アンフィレグリン（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ３０７０４）；顆粒球遊走性蛋白質（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ７８６８６）；遊走阻止因子ＭＲＰ８（カルグラヌリンＡ）（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ０６２３３）；遊走阻止因子ＭＲＰ１４（カルグラヌリンＢ）（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ０６２３４）；エフリン受容体（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ５９３７１）；上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ７４９７９）；ｓｈｂ癌原遺伝子（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ７５３４２）；ＭＡＤ転写抑制因子（ゲンバンクアクセッション番号Ｌ０６８９５）；カルパイン（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ２３２５４）；白血球エラスターゼ抑制因子（単球／好中球エラスターゼ抑制因子）（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ９３０５６）；胎盤プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ１８０８２；Ｊ０２６８５）；β−ディフェンシン（ヒトβディフェンシン２、ＨＢＤ２及びヒトβディフェンシン３、ＨＢＤ３（ゲンバンクアクセッション番号Ｚ７１３８９）、（ＨＢＤ３アクセッション番号Ｍ１８６１１）；α１−アンチトリプシン前駆体（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ０２９２０）；トリステトラプロリン（増殖因子誘発性核蛋白質４７５）、（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ９２８４３）；インターフェロン調節因子（ＩＦＲ系統）（ゲンバンクアクセッション番号Ｕ７３０３６）；核性因子１（ゲンバンクアクセッション番号Ｌ３１８８１）；ｈＳＮＦ２転写活性化因子（ゲンバンクアクセッション番号Ｄ２６１５５）；プロチモシン（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ２６７０８）；ＧＡＴＡ３転写因子（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ５５１２２）；ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ５４２９７）；アシルＣｏ−Ａ結合蛋白（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ１４２００）；デコリン（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ１４２１９）；ＣＤ４４抗原（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ５９０４０）；Ｂ９４蛋白質（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ９２３５７）；トランスサイレチン（ＴＴＲ）、（プレアルブミン）（ゲンバンクアクセッション番号Ｋ０２０９１）；アポリポ蛋白質Ｅ（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ１２５２９）；上皮ジスコイジン受容体（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ７４９７９）；トロンビン受容体（ゲンバンクアクセッション番号Ｍ６２４２４）；セリン／トレオニンプロテインホスファターゼ（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ１２６４６）；白血球抗原関連蛋白質（ＬＡＲ）（ゲンバンクアクセッション番号Ｙ００８１５���；シトクロムｐ４５０  ＩＶＢ１（ゲンバンクアクセッション番号Ｊ０２８７１）；チオレドキシンペルオキシダーゼ（ゲンバンクアクセッション番号Ｕ２５１８２）；ミリスチル化アラニンリッチのＣキナーゼ基質、ＭａｃＭＡＲＣＫＳ（ＭＲＰ）（ゲンバンクアクセッション番号Ｘ７０３２６）；及びＥＢ１微小管付属蛋白質（ゲンバンクアクセッション番号Ｕ２４１６６）。
【００３０】
前記遺伝子マーカーセットを含む遺伝子を表１に呈示し、表中で一般種類によって識別する。本発明によると、これらの遺伝子の一つ、すべて、または組み合わせは、ＵＶ線への暴露後のそれらの遺伝子の発現おける変調または変化のおかげで、ＵＶ線誘発皮膚損傷または光老化のための一意のマーカーまたはマーカーセットとして用いることができる。変調は、ＵＶ線に暴露されていない対照またはその暴露が遮断もしくは減弱された対照を基準にした遺伝子発現における変化を意味し、例えば、ＵＶ線暴露後の遺伝子発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを挙げることができるる。本明細書に呈示されている一つ以上の遺伝子の遺伝子発現における変調は、その変調が、対照を基準にして、少なくとも約１．５倍、好ましくは約２倍、さらに好ましくは約２倍以上、または平均から標準偏差（ＳＤ）約２以上である場合、対照を基準にして有意であると考えられる。
【００３１】
【表１】
2005520483.tif 000002
【００３２】
【表２】
2005520483.tif 000003
【００３３】
【表３】
2005520483.tif 000004
【００３４】
本発明の一つの実施形態は、ＵＶ線による皮膚への損傷を評価する方法を包含する。この方法は、ヒト及びヒト以外の動物の皮膚、皮膚同等物、ヒトもしくはヒト以外の培養細胞、またはケラチン生成細胞（例えば、皮膚、毛髪及び爪からのもの）を含む皮膚、器官型皮膚モデルを紫外線で刺激すること；当該技術分野において既知であり、実施されている方法によって、核酸、好ましくはＲＮＡを単離すること；ならびに単離された核酸、好ましくはＲＮＡを評価して、表１に記載したような遺伝子一つ以上の発現レベルに変化または変調が存在するかを判定することを含む（例えば、実施例１参照）。
【００３５】
本発明の方法によると、皮膚（例えば、皮膚生検材料または皮膚ケラトーム、器官型皮膚モデル、または培養細胞は、所定の期間、ＵＶ線またはＵＶ線源に暴露される。ＵＶ線暴露の時間量は、暴露を受ける個人のＭＥＤ値に従って開業医が決定する。一般に、細胞及び組織同等物に対する典型的なＵＶ暴露は、約６Ｊ／ｃｍ２以下である。この側面の一つにおいて、インビボ皮膚源の使用は、皮膚におけるＵＶ線誘発遺伝子発現に寄与する皮膚の成分（脈管系など）、ならびにインビボで皮膚に移動する皮膚細胞及び炎症性細胞の全成分を含むサンプルの提供に有利である。
【００３６】
本方法での使用に適する培養皮膚細胞の非限定的な例には、ケラチノサイト、皮膚繊維芽細胞、ランゲルハンス細胞、メラニン形成細胞、肥満細胞、内皮細胞、皮脂細胞、毛乳頭及び母基細胞、ならびに爪母基細胞など（しかし、これらに限定されない）の表皮細胞タイプ及び皮膚細胞タイプについての初期単離細胞及び株化細胞系が挙げられる。こうした細胞の供給源には、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ、及び細胞／組織バンクからは、Ｃｌｏｎｔｉｃｓ／ＢｉｏＷｈｉｔｔａｃｋｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＣａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）などが挙げられるが、これらに限定されない。組織同等物は、Ｏｒｆａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ）、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）及びＫｉｎｅｔｈｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｎｉｃｅ，Ｆｒａｎｃｅ）などの組織エンジニアリング会社から入手できる。新鮮な細胞は、ヒトの皮膚または他の哺乳類の生検材料から得ることができる。他の細胞系も、上の供給源からの他の哺乳動物から得ることができる。
【００３７】
遺伝子発現は、例えば、皮膚、皮膚代用品、皮膚同等物、ケラチン生成細胞、または培養細胞から単離された核酸またはポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡを分析するための様々な分子手順を用いて、ＵＶ線暴露後に一回以上評価することができる。一つのガイドとして、一つ以上の遺伝子マーカーに対するＵＶ線の影響の評価は、ＵＶ線暴露後、数分〜数時間〜数日（約５分〜約９６時間、好ましくは約１時間〜約７２時間、及びさらに好ましくは約４時間〜約３２時間が挙げられるが、これらに限定されない）実施することができる。
【００３８】
皮膚、皮膚代用品または培養細胞をＵＶ線に暴露した後の、本明細書中に記載されているような（ＵＶ線に暴露されていない）一つ以上の対照を基準にした、新規提供遺伝子マーカーの一つまたは一つより多く（すなわち、組み合わせたもの）の発現におけるＵＶ線誘発変調は、当業者が通常実施している多数の適する分子技術及び手順によって測定することができる。例えば、遺伝子発現は、当該技術分野において実施されているような、ノーザンブロット法及びＰＣＲ、例えば、「実時間」ＰＣＲ及び逆転写ＰＣＲ、ＲＴ  ＰＣＲなどの技術を用い、ＵＶに暴露された皮膚、皮膚代用品または培養細胞のＲＮＡレベルを判定することによって、測定することができる（例えば、［（非特許文献１）］、［（非特許文献２）］、［（非特許文献３）］、［（非特許文献４）］）、参照）。加えて、皮膚、皮膚代用品または培養細胞における遺伝子発現は、遺伝子（ｃＤＮＡ）アレイ（膜、硝子またはプラスチック支持材料を含むマイクロアレイまたは核酸遺伝子チップ試験アレイ）、遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）（例えば、［（非特許文献５）］、［（非特許文献６）］によって記載されたようなもの）、またはディフェレンシャルディスプレイ法を用いて評価することができる。
【００３９】
好ましいのは、本発明のスクリーニング法及び評価法に、容易に、且つ、信頼性をもって用いることができる遺伝子アレイ方法論である。多数の遺伝子アレイ（マイクロアレイまたは遺伝子チップアレイ）、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／ＮＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）；及びＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）（しかし、これらに限定されない）が、開業医による使用のために市販されている。より具体的には、核酸マイクロアレイ分析は、複数の遺伝子からの遺伝子発現のパタンを確立することを可能ならしめ、本発明によるＵＶ線への暴露のような選択的介入により被験者またはサンプルにおいて惹起される複雑な相互作用の理解を容易にする。マイクロアレイ手法は、遺伝子セットの中での選択的プロフィール修飾の判定、ならびにＵＶ線暴露などのインビボでの介入後の遺伝子発現または活性における新しく、且つ、特異的な変化の判定を可能ならしめる。限定ではなく、さらなるガイダンスとして、マイクロアレイは、(［（特許文献５）］（Ｃｈｅｅら）；［（非特許文献７）］、［（非特許文献８）］)に記載されている方法に従って準備し、用いることができる。マイクロアレイは、さらに、Ｐ．Ｌａｌらの［（特許文献６）］の開示に記載されている。加えて、また、等業者にはご理解いただけるように、高処理能力分析が、マイクロアレイ及び／または遺伝子チップ技術の結果を分析する手段として包含される。
【特許文献５】国際公開公報第９５／１１９９５号明細書
【特許文献６】米国特許第６，０１５，７０２号明細書
【非特許文献１】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ et al，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
【非特許文献２】Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ et al，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：４１３−４１７
【非特許文献３】Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉ et al. １９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１０２６−１０３０
【非特許文献４】Ｅ．Ｓ．Ｋａｗａｓａｋｉ，１９９０，「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏf ＲＮＡ）」，Ｉｎ：ＲＮＡ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ｐｐ２１−２７
【非特許文献５】Ｄ．Ｊ．Ｌｏｃｋｈａｒｔ et al.，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０
【非特許文献６】Ａ．Ｌａｌ et al.，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５９（２１）：５４０３−５４０７
【非特許文献７】Ｄ．Ｊ．Ｌｏｃｋｈａｒｔ et al.，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：１６７５−１６８０
【非特許文献８】Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ et al.，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０６１４−１０６１９
【発明の効果】
【００４０】
皮膚に対する光損傷または光老化の治療、改善、予防、軽減、修復または逆行に用いるために、ＵＶ線暴露を評価及び評定するための、またはＵＶ線への暴露に起因した遺伝子発現を修飾する材料を識別するための遺伝子アレイ技術の使用は、本発明より前には当該技術分野において認知されていなかった。さらに、本発明に従ってＵＶ暴露後に発現が変調されると識別された新規遺伝子（表１参照）が皮膚のＵＶ暴露後の光損傷または光老化に関連付けられたことは、以前にはない。
【００４１】
本発明の方法における遺伝子発現の変調の評価では、対照（例えば、ＵＶ線に暴露されていない、またはＵＶ線暴露を遮断したもの）と試験サンプル（例えば、ＵＶ線に暴露した後のもの）の間の遺伝子発現レベルの差が測定される。上述のように、本発明によると、遺伝子発現における有意な差（すなわち、対照から有意な変調または変化を成す差）とは、少なくとも約１．５倍、好ましくは約２倍、さらに好ましくは約２倍以上の差である。あるいは、本方法において、対照と試験サンプルを比較する際、平均値からの標準偏差２以上の統計学的な差は、有意と考えられる。
【００４２】
本発明に包含されるもう一つの実施形態では、本明細書中に提供されている一つ以上の遺伝子マーカーの遺伝子発現の変調を評価する方法を用いて、皮膚のＵＶ線誘発光損傷または光老化を修飾する、好ましくは減弱する調合成分、成分、薬剤、材料などを識別及び／または評定する。この側面では、スキンケア及び／または化粧品の特定の成分を評定して、ＵＶ線に暴露された／暴露されていない皮膚、皮膚代用品、皮膚細胞またはケラチン生成細胞における、本明細書中に記載されている一つ以上の遺伝子マーカーの発現の変調を修飾する能力を判定することができる。前記調合成分または製品によるこうした修飾によって、光損傷する／した皮膚及び光老化する／した皮膚の保護抑止、阻止、軽減、治療、改善及び／または逆行をもたらすことができる。
【００４３】
さらに具体的には、試験を受ける調合成分、成分、材料もしくは物質、または日焼け止め調合薬または光老化防止調合薬もしくは組成物などの製品は、皮膚もしくは皮膚代用品またはそれらの一定の領域に、有効な濃度で、有効な期間（例えば、毎日、毎週または２週間から４週間ごと）、接触させる、または塗布する。加えて、必要または所望される場合には、これらの期間内で、複数の塗布を行うことができる。非限定的なガイドとして、試験のために皮膚の一定部位に塗布される試験材料の濃度は、約１、２または４週間の間、好ましくは毎日、約０．５〜５ｍｇ／ｍｃ２、好ましくは約１〜２ｍｇ／ｍｃ２である。
【００４４】
本発明の評価法では、試験用皮膚は、例えば、約５分〜約４８時間、好ましくは約５分〜１時間、約０．５ＭＥＤ〜約５ＭＥＤ、好ましくは訳１ＭＥＤ〜約４ＭＥＤの最小紅斑量（ＭＥＤ）のＵＶ線源に暴露される。対照として、ＵＶ線に暴露されていない別の皮膚サンプルからの新規遺伝子マーカーセットの一つ以上の発現レベルを試験する。試験材料を塗布していない皮膚または皮膚代用品をＵＶ線に暴露し、対照として評定することもできる。すなわち、試験材料が存在しない状態での皮膚または皮膚代用品も、対照としてＵＶ線に暴露する。
【００４５】
本発明の好ましいマイクロアレイ系において、ＲＮＡは、試験材料を塗布した、及び塗布していない、ＵＶ線に暴露された皮膚から、ならびにＵＶ線暴露を受けていない皮膚サンプルから調製され、単離される。例えば、このアレイのためのプローブとして役立つように、放射性３２Ｐ標識を組み込みながら、特定の遺伝子アレイプライマーを用いて前記ＲＮＡを逆転写して、相補ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）を生じる。標識されたｃＤＮＡは、その後、本明細書に記載されている３５の遺伝子を包含する数百または数千の遺伝子を含むヒト遺伝子アレイ（例えば、膜基質）とハイブリダイズする（例えば、実施例１）。
【００４６】
あるいは、また、好ましくは、標識されたｃＤＮＡは、この一意のマーカー遺伝子パネルのさらに特異的な発現を分析のために、本発明が新規に記載するマーカー遺伝子を特異的にまたは一意に識別する３５の遺伝子またはそれらの核酸部分（例えば、オリゴマー）の少なくとも一つ、組み合わせ、またはすべてを含むアレイ（例えば、ナイロンもしくはニトロセルロース膜、またはプラスチックフィルム、または遺伝子チップ）とハイブリダイズする。従って、本明細書に記載されているような遺伝子マーカーの少なくとも一つ、またはすべて、または組み合わせを用いて、専用マイクロアレイを調製することができる。好ましくは、約３５の遺伝子セットまたはそれらの特定の部分配列の一つ以上またはすべてを含むマーカー遺伝子が、アレイ、例えば、同位体ブロットハイブリダイゼーション用の遺伝子（核酸）チップまたはマイクロアレイにおいて用いられる。製品、調合成分または材料が、光防護的であるかどうか、または好ましくは皮膚の、ＵＶ線暴露に伴う光損傷及び／または光老化を改善、予防、軽減、修復、抑止、阻止、減弱、抑制、治療または逆行させることができるかどうかを判定するための方法に使用するためのアレイ用の支持体の非限定的な例には、ナイロンもしくはニトロセルロース膜、ガラス（例えば、蛍光検出のためのスライドガラス）またはプラスチックフィルム支持体をベースにしたマイクロアレイが挙げられる。すなわち、本方法は、製品、調合成分または材料が、ＵＶ線への暴露後のマーカー遺伝子セットの中の一つ以上の遺伝子の発現、または対照を基準にした発現の変調を修飾するかどうかの判定を可能ならしめる。マイクロアレイ手法において、放射性（例えば、３２Ｐ）材料または非放射性材料、例えば、蛍光標識、化学ルミネッセンス標識、酵素標識、ビオチン−アビジン標識などを用いて、核酸（例えば、皮膚または皮膚代用品から単離及び合成したｃＤＮＡ）に標識付けするこができること、または標識したプローブを適切に使用できることは、熟練した開業医にはご理解いただけよう。様々な標識プローブを遺伝子マイクロアレイに暴露する。発現の量は、マイクロアレイ上のその遺伝子のための特定の位置でその標識プローブから得られるシグナル（例えば、放射性シグナル、蛍光シグナル、化学ルミネッセンスシグナルなど）の量によって判定される。マイクロアレイ上の特定の遺伝子の位置に対するプローブの結合の量が多いほど、その遺伝子の発現は大きい。
【００４７】
適切なハイブリダイゼーション時間（例えば、数時間から一晩またはそれより多少長め）の後、そのアレイ（例えば、膜）を洗浄して、非結合材料を（例えば、膜供給業者のインストラクションに従って）除去し、ホスホ−イメージングスクリーン（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｃｒｅｅｎ）上に配置して、遺伝子発現レベルを視覚化させる。遺伝子誘導は、当該技術分野において実施されているように、密度値として表し、適切なソフトウエア（例えば、実施例１に記載されているようなもの）で分析する。その発現がＵＶ線暴露によって誘発され、対照遺伝子発現レベルに比べ変調されるマーカー遺伝子の一つ以上、例えば、二つ以上、三つ以上、四つ以上、またはすべて、またはそれらの組み合わせの遺伝子発現のレベルにおける変調を、本明細書に記載されているような標識プローブ及びマイクロアレイ分析の検出手順を用いて評定する（例えば、実施例１参照）。
【００４８】
ＵＶ線に暴露されていない対照と比較して、試験材料が、皮膚のＵＶ線暴露後に本発明の新規マーカー遺伝子セットの中の一つ以上の遺伝子の遺伝子発現における変調または変化を修飾することが見出された場合には、その材料は、光損傷及び／または光老化する／した皮膚を改善、予防、軽減、抑止、阻止、抑制、修復、逆行または治療する候補であると判定される。光損傷及び／もしくは光老化の防御剤、または光損傷及び／もしくは光老化の修復剤もしくは治療剤としての試験材料の効果を判定するために、長時間または異なる回数のＵＶ線暴露による経時的実験を行うこともできる。光損傷または光老化が発生した後に、記載の方法を適用することによって、物質が、ＵＶ線暴露により生じた皮膚の光損傷及び／または光老化を逆行させることができるかどうかを評定するための方法も、本発明は考慮している。
【００４９】
試験を受ける調合成分、物質、材料または製品が、ＵＶ線に暴露された皮膚または試験材料において、本明細書中に記載されているマーカー遺伝子セットのうちの一つ以上の遺伝子の遺伝子発現に影響を及ぼす、または前記遺伝子発現を修飾することが見出された場合には、その調合成分は、ＵＶ線暴露に起因する光老化及び／または光老化を予防、抑止、阻止、軽減、治療、改善、修復または逆行させる局所及び／または経口使用用のスキンケア製品または化粧品調合物において使用するための候補と考えることができる。調合成分及び材料を試験し、その後、含めることができるこうしたスキンケア製品及び調合物には、日焼け止め剤、酸化防止調合薬、経皮装置（パッチ及びこれらに類するものなど）、ヘアケア製品、メイクアップ製品及び化粧品（例えば、口紅、顔用クリーム及びハンドクリーム、ファンデーション、体用クリーム、ローション、潤い付与剤、しわ防止調合物など）が挙げられるが、これらに限定されない。熟練した開業医にはご理解いただけるように、好ましくは、こうした材料及び成分は、マーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾するために有効な量、さらに好ましくは、ＵＶ線に暴露されていない少なくとも一つの対照の遺伝子発現を基準にして、マーカー遺伝子セットのうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を修飾するために有効な量で、組成物及び調合物において用いられる。
【００５０】
本発明は、スキンケア、カラー、パーソナルケア及びヘアケア製品の潜在的な利点をスクリーニング及び評価するための有利で有用な方法を提供する。上記に鑑みて、本発明が、光損傷または光老化した皮膚を修復、改善、軽減もしくは治療する光防護（例えば、予防的使用のため）、またはＵＶ線に暴露される皮膚が光損傷する前に逆行させる光防護（例えば、治療的使用のため）をもたらす新規材料を識別するための方法またはアッセイシステムをさらに包含することは、ご理解いただけよう。
【００５１】
本発明に包含される組成物は、化粧品に適するあらゆる形態で、好ましくは、ローションまたはクリームとして、しかし、軟膏または油性基剤、ならびにスプレー可能な液体形（例えば、毛髪に塗布した場合にローションまたは軟膏が有するべとべとした外観を伴わずに化粧品に許容される方法で乾燥する基剤中の、ＵＶ線誘発損傷から毛髪及び頭皮を保護する「ヘア」スプレー）でも提供することができる。加えて、本発明によって考慮されている組成物は、着色剤、芳香剤、皮膚軟化剤、保水剤、保存薬、ビタミン、キレート化剤、増粘剤及びこれらに類するものならびに植物性薬品（アロエ、カモミレ及びこれらに類するものなど）などの、熟練した開業医に通常用いられ、既知である一つ以上の適合可能で化粧品に許容されるアジュバントを含むことができる。レチノイドを含む場合には、好ましくは、約０．００１％〜約５％の間、さらに好ましくは約０．１％〜約１％の間の濃度で局所的に使用される。
【００５２】
もう一つのその側面において、本発明は、経口摂取光防護剤、光治療薬及び光修復剤としての役割を最終的に果たすことができる栄養補助食品を識別及び評価する方法を考慮している。この側面において、栄養補助食品は、ＵＶ線に暴露した後に本発明の遺伝子マーカーの少なくとも一つの遺伝子発現変調を修飾する能力についてその補助食品または潜在的補助食品を評定する本発明の方法によって、識別及び評価される。こうした修飾は、例えば、ＵＶ誘発光損傷または光老化を減弱、予防、抑止、阻止、軽減、改善、修復及び／または逆行させることができる。従って、本発明は、例えば、ＵＶ誘発細胞及び組織損傷に対する内面的な保護もしくは治療、またはＵＶ誘発細胞及び組織損傷を内面的に改善、修復、抑止、軽減または治療することができる栄養補助食品の光防護及び／または治療効果を評価するための新しく、有益な手順をもたらす（例えば、［（非特許文献９）］）。
【非特許文献９】Ｃｈａｋｒａｂａｔｙ et al.，１９９４，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１６：４１７
【００５３】
しかし、一つの例として、レチノイド、例えば、レチノイン酸、レチノール関連材料、酸化防止剤、ならびに本発明の方法によって包含され、識別される光防護及び／または治療用成分も、好ましくは経口投与により、全身性摂取するこがもできる。経口服用される際、レチノイド及び他の摂取される光防護組成物は、好ましくは、約０．１ｍｇ／（体重の）ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ以上までもの量で投与され、この場合、すべての用量は、毒性がありそうな用量より下である。もう一つの例として、酸化防止剤は、多くの場合、「大量投与量」（例えば、少なくとも１ｇ／ｄのビタミンＣ、少なくとも１０００Ｉ．Ｕ．の一つ以上のトコフェロール）で摂取される。
【００５４】
非局所投与、例えば、全身または経口投与のための、本発明よって識別及び包含される成分または材料は、生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、生理学的に許容される組成物、好ましくは医薬適合性の組成物に典型的には調合される。本組成物は、単独で投与することができ、または生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース及び水を含む（しかし、これらに限定されない）あらゆる適する生体適合性の医薬用担体中で投与することができる他の薬剤（安定化化合物など）の少なくとも一つと併用で投与することができる。本組成物は、単独で患者に投与することができ、または他の薬剤、薬物、ホルモンもしくは生体応答調節剤と併用で投与することができる。本組成物は、限定ではなく例として、ゲルキャップ、錠剤、粉末、懸濁液、液体、カプセル、バー、シェイク、ドリンク、及びこれらに類するもの（下にさらに記載するものなど）の形態で、摂取、投与、塗布または導入することができる。
【００５５】
本発明において使用するための医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、経膣または直腸手段を含む（しかし、これらに限定されない）あらゆる数の経路によって、投与することができる。
【００５６】
適する浸透強化剤を用る、または用いない、パッチ及びこれに類するものなどの経皮送達法は、本発明に包含される。本発明によって具体化される方法及び組成物は、一つ以上の光防護、光治療または光修復用薬物及び医薬品を経皮システムで有効に投与することができる手段を提供する。多くの場合、局所吸収が劣る、または高い投薬レベルを要求される化合物は、経皮的に送達される。従って、薬物組成物を（多くの場合、浸透強化組成物を用いて）皮膚に送達する経皮手段は、経皮パッチ、または当該技術分野において知られている及び説明されているような類似の装置である。こうした装置の例は、［（特許文献７）］、［（特許文献８）］、［（特許文献９）］、［（特許文献１０）］、［（特許文献１１）］に開示されている。こうした記載は、限定を意味するものではない。皮膚上に組成物を保存及び送達する、ならびに活性化合物を生成する経皮的方式は、本発明の実施態様のために便利であり、充分に適している。
【特許文献７】米国特許第５，１４６，８４６号明細書
【特許文献８】米国特許第５，２２３，２６２号明細書
【特許文献９】米国特許第４，８２０，７２４号明細書
【特許文献１０】米国特許第第４，３７９，４５４号明細書
【特許文献１１】米国特許第第第４，９５６，１７１号明細書
【００５７】
本明細書中に記載されているようにして識別された光防護、光修復及び／または光治療用化合物または調合成分を含む有効成分に加えて、生理学的に許容される医薬組成物は、適する医薬適合性の担体、希釈剤または賦形剤（医薬に用いることができる製剤への活性化合物の加工を助長する助剤を含む）を含有することができる。調合及び投与のための技術に関するさらなる詳細は、［（非特許文献１０）］の最新版に提供されている。経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適する投薬量で、当該技術分野においてよく知られている医薬適合性の担体を用いて調合することができる。こうした担体によって、医薬組成物を、患者が摂取するための錠剤、ピル、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして、調合することができる。
【非特許文献１０】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．；Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ
【００５８】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物と固体賦形剤とを併せることによって得ることができ、場合によっては、得られた混合物を粉砕し、所望される場合には、適する助剤を添加した後、その顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣丸コアを得ることができる。適する賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯または他の植物からのデンプン；メチルセルロール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチン及びコラーゲンなどの蛋白質などの炭水化物または蛋白質フィラーである。所望される場合には、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその生理学的に許容される塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤または可溶化剤を添加することができる。
【００５９】
糖衣丸コアは、濃縮糖溶液などの生理学的に適するコーチングと共に用いることができ、これらは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適する有機溶媒または溶媒混合物を含有することもできる。製品識別のために、または活性化合物の量、すなわち、投薬量を特徴付けるために、染料または色素を、錠剤または糖衣丸のコーチングに添加することができる。
【００６０】
経口使用することができる医薬製剤には、ゼラチン製プッシュ・フィットカプセル、ならびにゼラチン製軟質秤量カプセル及びグリセロールまたはソルビトールなどのコーチングが挙げられる。プッシュ・フィットカプセルは、フィラーまたははバインダー（ラクトースまたはデンプンなど）、潤滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）及び場合によっては安定剤と混合された有効成分を含有することができる。軟質カプセルでは、活性化合物は、安定剤を用いて、または用いずに、脂肪油、液体または液体ポリエチレングリコールなどの適する液体に溶解または懸濁させることができる。
【００６１】
非経口投与に適する医薬調合薬は、水溶液に、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理緩衝食塩水などの生理適合性バッファ中で調合することができる。注射用水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストリンなどの、懸濁液の粘度を上昇させる物質を含有することができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な注射用油性懸濁液として調製することができる。適する親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。場合によっては、懸濁液は、適する安定剤、または化合物の溶解度を上昇させて非常に濃厚な溶液の調製を可能ならしめる薬剤も含有することができる。当業者にはご理解いただけるように、多様な形態での医薬調合物の調製は、その調合物中の活性材料の機能または活性に悪影響を及ぼさない。
【００６２】
局所投与または経鼻投与には、浸透剤、または浸透すべき特定の障壁に適切な浸透物質もしくは強化剤が用いられる。こうした浸透剤は、一般に、当該技術分野において知られている。
【００６３】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野において知られている方法で、例えば、通常の混合法、溶解法、顆粒化法、糖衣丸製造法、研和法、乳化法、カプセル形成法、閉じ込め法または凍結乾燥法によって、製造することができる。
【００６４】
適用可能な場合には、本医薬組成物は、塩として提供することができ、また、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む（しかし、これらに限定されない）多数の酸を用いて生成することができる。塩は、対応する遊離塩基の形態であるより、水性溶媒または他のプロトン性溶媒に溶解する傾向がある。他の場合には、製剤は、使用前にバッファと併せる、ｐＨ範囲４．５〜５．５で、ヒスチジン１〜５０ｍＭ、スクロース０．１〜２％、及びマンニトール２〜７％のうちのいずれかまたはすべてを含有することができる、凍結乾燥粉末であることができる。
【００６５】
光防護、光修復及び／または光治療用医薬組成物を調製した後、それらを適切な容器に入れ、示されている状態の治療のためにラベルを付けることができる。光防護、光修復及び／または光治療用製品の投与のためのこうしたラベルには、投与量、投与頻度及び投与法が含まれているだろう。
【００６６】
本発明における使用に適する医薬組成物には、所期の目的を達成するために有効な量の有効成分または活性材料を含有する組成物が挙げられる。有効な用量または量の決定は、充分、当業者の権限の範囲である。どの化合物についても、その治療に有効な用量または濃度範囲は、例えば腫瘍細胞を用い、細胞培養アッセイで、最初に推定することができる。治療に有効な用量とは、例えば、その症状または状態を予防、改善、軽減、治療、逆行、抑制、修復または除去する有効成分（例えば、本発明に従って識別された光防護、光修復及び／または光治療用化合物または成分）の量を指す。一般に、投薬量は、用いられる剤形、患者の感受性、及び投与経路に依存してこの範囲内で変化する。治療が必要な個人に関連する因子を考慮する開業医が、正確な投薬量を決定するだろう。
【００６７】
投薬量及び投与は、充分なレベルの活性部分が提供されるように、または所望の効果が維持されるように調整される。典型的に考慮される因子には、個人の特定の必要性の深刻さ、患者の全身の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬の組合せ（複数を含む）、反応感度、及び治療に対する耐性／応答が挙げられる。一般的なガイドとして、長時間作用性の医薬組成物は、その特定の調合物の半減期及びクリアランス率に依存して、３〜４日に一度、１週間に一度、または２週間に一度投与することができる。これらの投薬レベルの変化は、当該技術分野においてよく知られているような、最適化のための標準的で経験的な日常の手順を用いて調整することができる。
【００６８】
非限定的なガイドとして、正常な投薬量は、投与経路に依存して、０．１〜１００，０００マイクログラム（μｇ）から全量約１グラム（ｇ）まで変化しうる。特定の投薬量及び送達方法についてのガイダンスは、文献に提供されており、当該技術分野における開業医に一般に利用可能である。当業者は、光防護及び／または光治療用化合物の性質、例えば、構造、組成に依存して、異なる調合物を用いるだろう。
【００６９】
もう一つの実施形態において、本発明は、個人、すなわち、本明細書に新しく記載されているようなＵＶ線誘発マーカー遺伝子セットにおける一つ以上のマーカー遺伝子の発現を変調することによってＵＶ誘発遺伝子発現に応答する個人の部分集合を識別することができるスクリーニング法を提供する。一つ以上のＵＶ線誘発マーカー遺伝子の発現が変調した結果として、ＵＶ線に暴露した後、正常なヒトに比べ、皮膚の光損傷及び光老化に対して感受性である、または非常に美観である可能性が高いこうした個人は、本発明の方法を用いてスクリーニングすることにより識別することができる。例えば、この実施形態のスクリーニング法は、例えば実施例１に記載されているように、皮膚生検材料または皮膚ケラトームサンプルなどの皮膚サンプルを、試験を受ける個人から得ること;そのサンプルをＵＶ線に暴露すること；そのＵＶ線に暴露したサンプルから核酸を単離すること；及びアッセイ法、例えば、マイクロアレイシステム及び記載されているような新規識別マーカー遺伝子を用いて、その個人における少なくとも一つのＵＶ線誘発遺伝子の遺伝子発現が、対照を基準にして変調されるかどうかを評価することを含む。
【００７０】
さらに、本スクリーニング法は、本明細書中に記載されているようなＵＶ線誘発マーカー遺伝子セットのうちの一つ以上の遺伝子の発現における変調を修飾することができる、または前記変調の修飾に影響を及ぼすことができる材料、調合成分、化合物、調合物及び組成物を伴う処置または治療に対して特に敏感に反応する個人の判定を可能ならしめる。識別またはスクリーニングされた個人は、本発明のＵＶ誘発光損傷及び光老化の改善、縮小、治療、予防、修復、軽減及びまたは逆行に特に適するだろう。
【００７１】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、開業医が、皮膚のＵＶ線暴露に起因する光損傷及び／または光老化を改善、予防、抑止、阻止、抑制、軽減、修復、治療するまたは逆行させることができる化合物、試薬、調合成分、物質、薬剤などを識別する際に用いるために適する形態の、本明細書中に記載されているような新規遺伝子セットを含む、ナイロンもしくはニトロセルロース膜、またはプラスチックフィルム、またはガラス、またはマイクロアレイなど（これらに限定されない）の支持体または支持材料を備えるキットに関する。本キットは、適する支持体またはマイクロアレイ上の新規遺伝子マーカーセットまたはこれらの遺伝子の部分集合もしくはこれらの遺伝子の固有の酸部分を備えることができ、これは、皮膚のＵＶ線誘発光損傷及び／または光老化を修飾する（すなわち、減弱する、修飾を行う、または克服する）ことができる薬剤を識別するためのターゲット識別遺伝子マーカーセットを提供する。加えて、本キットは、標識もしくは非標識核酸プローブ、検出標識、バッファ、対照及び使用説明書を含む、そのアッセイ法を実施するために必要な他の材料を場合によっては備えている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するために本発明の特定の側面を記載するものであり、当業者のために本発明の記載を提供する。本実施例は、本発明及びその様々な側面の理解及び実施に有用な特定の方法論を単に提供するものであるので、本実施例が本発明を制限するものと見なさないでいただきたい。
【実施例１】
【００７３】
細胞は、細胞機能におけるゲノム及び非ゲノム変化による刺激に応答する。細胞及び組織が、与えられた刺激にゲノム（ＲＮＡ）レベルで応答する方法の理解は、個々の（単一の）遺伝子ベースで伝統的に行われてきた。遺伝子アレイ技術の利用にともなって、数百、数千までもの遺伝子を１回の実験で研究することができる。
【００７４】
この実施例に記載する実験の目的は、遺伝子アレイ技術及びヒトの皮膚を利用して、紫外線（ＵＶＲ）に起因する光損傷に呼応して生じる変化を識別することである。ＵＶＲは、皮膚の光損傷及び光老化の原因である原因因子であるため、光損傷に伴う急性及び慢性的変化を試験するために、ＵＶの照射を受けた皮膚をモデル系として用いた。ヒトの皮膚サンプルをベースにしたモデル系を、急性ＵＶ暴露及び慢性ＵＶ暴露の両方に起因する光損傷作用を改善ならびに軽減、治療、修復、逆行または予防することができる材料をスクリーニングするための方法として用いた。
【００７５】
この実験を行うために、表皮細胞及び皮膚細胞を含む約２ｃｍ×５ｃｍの皮膚ケラトームを５人の正常なボランティアの臀部領域から採取した。ケラトームは、４ＭＥＤのＵＶＲを暴露（太陽刺激放射、ＳＳＲ）から３２時間後に採取した。対照ケラトームは、ＵＶＲ暴露を受けなかった。組織は、後の全ＲＮＡ単離のために急速冷凍した。
【００７６】
ＲＮＡを単離するために、ポリトロンにより、トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で組織を均質化し、プールして、全ＲＮＡをトリゾール試薬の使用説明書に従って単離した。単離したら、放射性３２Ｐラベルを組み込みながら、特異的遺伝子アレイプライマーセット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて全ＲＮＡを逆転写して、相補ヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）を生じた。標識されたｃＤＮＡを、１１７６のヒト遺伝子を含むヒトＡｔｌａｓ  １．２  Ｉ  Ａｒｒａｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）にハイブリダイズした。一晩のハイブリダイゼーションの後、膜供給業者の使用説明書に従って膜を洗浄し、約１０日間、ホスホ−イメージングスクリーン上に置いておいた。密度値として表される遺伝子誘導を得、ＡｔｌａｓＩｍａｇｅソフトウエア（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用い、ホスホイメージャー（ｐｈｏｐｈｏｉｍａｇｅｒ）分析装置により分析した。ホスホイメージ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅ）分析によって遺伝子発現を定量した後、遺伝子の発現を膜上のすべての遺伝子の平均密度に対して正規化し、ＩｍａｇｅＱｕａＮＴ（商標）ソフトウエアを用いて、バックグラウンドハイブリダイゼーションに対して補正した。
【００７７】
ＲＮＡ抽出、標識付け、ハイブリダイゼーション、及び遺伝子変化の計算のすべてを４回繰り返し、平均した。対照に対して約２〜２．５倍、または基線（対照）の上または下、いずれかの標準偏差（ＳＤ）２の遺伝子発現変化は、この実施例にいおいて有意とみなした。皮膚組織のＵＶ線暴露後の発現に有意な変化（アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれか）を示した遺伝子を本明細書に記載し、表１に呈示する。
【実施例２】
【００７８】
マイクロアレイ
マイクロアレイにおいて遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを生産するために、ヌクレオチド配列の３’末端で開始するコンピュータアルゴリズムを用いて、特異的遺伝子配列（複数を含む）を試験する。このアルゴリズムは、その遺伝子に固有であり、且つ、ハイブリダイゼーションに適する範囲内のＧＣ含量を有し、且つ、ハイブリダイゼーションに干渉すると予測される二次構造を欠く規定長のオリゴマーを識別する。このアルゴリズムは、特定長、例えば、２０〜１００ヌクレオチド、例えば、２０−ｍｅｒ、３０−ｍｅｒ、５０−ｍｅｒ、８０−ｍｅｒ、１００−ｍｅｒの特定のヌクレオチドを識別する。マッチしたオリゴヌクレオチドのセット（この場合、各配列の中心にある一つのヌクレオチドが変調されている）を作る。この方法をそのマイクロアレイ中の各遺伝子について繰り返し、蛍光または放射性ヌクレオチドの存在下で、倍のオリゴセットを合成し、基体の表面に配列する。その基体がシリコンチップである時、光指向型化学法を蒸着に用いる（例えば、国際公開公報第９５／１１９９５号、Ｍ．Ｃｈｅｅら、参照）。
【００７９】
あるいは、化学結合手順及びインクジェット装置を用いて、基体表面でオリゴマーを合成する（例えば、（特許文献１２）参照）。もう一つの代替法としては、例えば、真空系、または熱、ＵＶ、機械的もしくは化学結合法を用いてｃＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを配列し、基体の表面に連結させるために、ドット（またはスロット）ブロットに類似している「グリッド状（ｇｒｉｄｄｅｄ）」アレイを用いる。
【特許文献１２】国際公開公報第９５／２５１１６号明細書
【００８０】
典型的なアレイは、手作業によって、または利用可能な材料及び装置を用いることによって製造することができ、且つ、複数のドットから成るグリッドを含むことができる。ハイブリダイゼーション後、そのマイクロアレイを洗浄して、ハイブリダイズされていない一切のプローブを除去し、検出装置を用いて、放射能または蛍光のレベル及びパターンを判定する。前記検出装置は、Ｘ線フィルムのごとく簡単なものでであってもよいし、または光走査装置のごとく複雑なものであってもよい。走査された蛍光画像を試験して、好ましくは、対照と試験サンプルまたは材料との比較により、マイクロアレイ中の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の度合い及びその相対存在度／発現レベルまたは発現レベルの変化を判定する。
【実施例３】
【００８１】
インビトロ組織モデルまたは単層培養物に対する二つのタイプの遺伝子アレイ方法論の利用
１００ｍｍの組織培養皿に配置した（集密度７０〜８０％）インビトロのヒト表皮組織（サイズ  ０．６３ｃｍ２）または単層培養物に新鮮な培地を、試験暴露の２４時間前に供給する。試験成分サンプルを、ＵＶ暴露の１時間前に、培地で希釈し、または前記組織については、そのモデルに塗布する。
【００８２】
単層培養物の暴露については、ＵＶ暴露直前（例えば、約５分前）に、すべての利用可能な細胞倍地を前記の皿からデカントする。ＵＶ線との直接的な相互作用を回避するために、組織中の一切の過剰な材料を、（生理）食塩水洗浄によって局所適用から外す。ＵＶ線暴露後、未処理対照（培地のみを含有する）、ＵＶ処理した対照（ＵＶ対照）及び未処理／非ＵＶ対照（基線）を含む三つの組織／単層培養物を各処理に用いる。組織は、ＲＮＡの単離まで、−８０℃で冷凍保存する。
【００８３】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて、細胞培養物または組織（組織モデル）から全ＲＮＡを単離する。前記組織モデルを、市販のホモジナイザーを用いて均質化するか、または液体窒素の存在下で乳鉢及び乳棒を用いて粉砕する。均質化した組織モデルまたは単層細胞培養物を、このキットの供給業者によって供給された溶解バッファで溶解し、得られた溶解材料を、その後、ピペッティングして均質な懸濁液にする。（細胞懸濁液が、多少残存する無傷細胞または粒子のために濁っている、またはゲノムＤＮＡにより非常に粘稠である場合には、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎフィルタユニット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いてサンプルを濾過する）。調製したＤＮアーゼＩ反応混合物をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎのカラムに添加し、１５分間、室温でインキュベートする。供給されているようなバッファで数回洗浄した後、ヌクレアーゼ非含有水を用いてＲＮＡを溶離する時点で、そのＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎフィルタ管を１．５ｍＬの試験管に入れる。ＲＮＡの純度及び収率は、ＵＶ分光法を用いて測定し、２６０ｎｍ／２８０ｎｍの吸光比を判定する。ＲＮＡは、当該技術分野において一般に知られているような変性アガロースゲル電気泳動を用いて、純度及び強度についても検査する。
【００８４】
測定される終点各々について１０〜２０μｇの全ＲＮＡをハイブリダイゼーションのために用いる。全ＲＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｌｔａｓ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ならびにＣｙ３及びＣｙ５ラベル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のいずれかを用いて標識するか、またはＡｌｔａｓ  ｃＤＮＡ発現Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、その供給業者によって提供されたそのキットの使用説明書に従って、３３Ｐまたは３２Ｐ  ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で放射性標識する。
【００８５】
標識ＲＮＡは、ハイブリダイゼーションのために、スライドガラスまたはナイロン膜の被覆に対応する量の供給されているようなハイブリダイゼーション溶液で希釈することにより、スライドガラス（蛍光標識ＲＮＡ）またはナイロン膜（放射性標識ＲＮＡ）に塗布する。インキュベーション（約１６時間）後、そのスライドガラスまたは膜を、様々な濃度のＳＳＣバッファで、その製造業者の使用説明書に従って洗浄する。ＣＹ３／ＣＹ５標識スライドガラスについては、乾燥窒素を用いてスライドを乾燥させ、Ｃｙ３／Ｃｙ５両方の蛍光マーカーを励起する／放射するためのレーザーを具備する蛍光遺伝子アレイ読取機（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  ＣＡ．、Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂ）に入れる。
【００８６】
放射標識ナイロン膜については、Ｐｏｓｐｈｏｉｍｅｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ．、ＳＴＯＲＭ  ８４０）によるハイブリダイゼーションの前に、膜をホスホイメージングスクリーンに約６〜１４日間暴露する。アレイ分析は、蛍光標識スライドガラスに対してはＧｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂスキャナーに装備されたＧｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏ  ３．０ソフトウエア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行い、または放射性標識ナイロン膜についてはＡｔｌａｓｍａｇｅ  １．５（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて行い、その後、Ａｔｌａｓ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  １．０ソフトウエア（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてさらなる分析を行う。例えば、Ｇｅｎｅｐｉｘ  Ｐｒｏ  ３．０は、スライドガラスマイクロアレイからのシグナル強度の定量分析及び比較が可能であり、Ａｔｌａｓｍａｇｅ  １．５は、Ａｌｔａｓナイロンアレイからのシグナル強度の定量分析及び比較が可能であり；Ａｔｌａｓ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒは、遺伝子クラスタ分析、アレイデータの包括的正規化、オンラインでの遺伝子の注釈、線グラフ、棒グラフ、散布図及び定順リストによる遺伝子の呈示に用いられる。
【００８７】
本発明が属する技術分野の状態をさらに充分に説明するために、本明細書中で引用したすべての特許、特許出願、出版物、抄録、本、参照マニュアル及び抄録、ゲンバンク配列アクセッション番号の内容は、全文、本明細書に参照として取り入れる。
【００８８】
本発明の範囲及び精神を逸脱することなく上記の主題に関して様々な変化を成すことができるので、上の記述に含まれているまたは添付の特許請求の範囲において定義されているすべての主題は、本発明の記述及び説明と解釈されるものと考える。上記技術に鑑みて、本発明の多くの変更及び変形が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】正常な対照皮膚における遺伝子発現パタンの代表ｃＤＮＡアレイ画像（図１Ａ）及び４最小紅斑量単位（４ＭＥＤ）のＵＶ線に暴露してから３２時間後の太陽刺激放射（ＳＳＲ）に暴露された皮膚における遺伝子発現パタンの代表ｃＤＮＡアレイ画像（図１Ｂ）を呈示する。
【図２】同じ、プールされた皮膚サンプルでの二つの異なる実験に関するｌｏｇ変換遺伝子発現の散剤プロット分析を示す。各点は、個々の遺伝子の正規化された発現レベルを表す。線は、最適回帰を示す。
【図３】暴露された皮膚  対  正常な（暴露されていない）対照に関するｌｏｇ変換遺伝子発現の散剤プロット分析を呈示する。各点は、４つの実験での個々の遺伝子の正規化された発現レベルの平均を表す。線は、標準偏差約２にほぼ匹敵する（±０．３５）信頼区間を示す。
【図４】本発明が記載しているような遺伝子マーカー、ヒトβディフェンシン２（ＨＢＤ２）及びヒトβディフェンシン３（ＨＢＤ３）のうちの一方のアップレギュレーションを確認するために行った逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す。図４：ヒトの皮膚のＳＳＲ後のＨＢＤ２遺伝子発現（プールされたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ）。図４Ｂ：ヒトの皮膚のＳＳＲ後のＨＢＤ３遺伝子発現（プールされたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ）。
【図５】ヒトの皮膚のＳＳＲ暴露後のＨＢＤ２及びＨＢＤ３のＲＴ−ＰＣＲ経時分析を示す。これらの分析において、未照射の皮膚から、及び３ＭＥＤのＳＳＲから８、２４、３２または４８時間後の皮膚からケラトームを取った。ケラトームサンプルからＲＮＡを抽出し、ＨＢＤ２及びＨＢＤ３についてＲＴ−ＰＣＲを行った（図５Ａ）、（実施例１も参照）。正規化された相対比増加を図５Ｂに示す。
【図１】
2005520483.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2005520483.tif 000009
【国際調査報告】
2005520483.tif 000010
2005520483.tif 000011
2005520483.tif 000012