(57)【要約】少なくとも２つの制限膜間の第１と第２の間隙容量を生成する分離膜を含有する膜分離系を用いた機能的に活性な第ＶＩＩＩ因子を分離するための方法。１つ以上の安定化剤が試料および／または間隙容量に添加される。第１の間隙容量中の溶剤が、ＦＶＩＩＩを所望の電荷状態に維持する。第１と第２の間隙容量間に電位をかけることにより、分離膜の反対側の望ましくない分子から分離膜の片側にＦＶＩＩＩが分離される。これらの方法は、天然または組換えＦＶＩＩＩの分離用の従来の精製スキームにおける１つ以上のステップの代用としても用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を得るための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量と異なる分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の間隙容量にＦＶＩＩＩを含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を１つ以上の試料、第１の間隙容量、または第２の間隙容量に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するように規定されたｐＨを有する溶剤を選択するステップと；
（ｄ）ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物が分離膜の片側に位置づけられると同時に、望ましくない分子が実質的に分離膜の反対側に位置づけられる、第１と第２の間隙容量間に電位をかけるステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが分離膜の片側に位置づけられるまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと
を含む方法。
【請求項２】
試料から第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を得るための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩを含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を、試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するように規定されたｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと
を含む方法。
【請求項３】
試料から第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を得るための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも少ない分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩを含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を、試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩ以外の試料中の成分の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することが阻止し、第１の間隙容量において最終生成物として保持するステップと；
（ｅ）試料中の所望量の成分を第１の間隙容量から除去され、ＦＶＩＩＩが第１の間隙容量において保持されるまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと
を含む方法。
【請求項４】
試料が血漿またはその画分、寒冷沈降物またはその画分、組換えＦＶＩＩＩの供給源、またはそれらの組合せまたは混合物である、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
安定化剤が、１つ以上の緩衝成分、モル濃度変更成分、タンパク質、アミノ酸、または糖である、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項６】
安定化剤が、ソルビトール、塩、グリセロール、ショ糖、乳糖、およびデキストラン／ブドウ糖などの糖、グリシン、ゲラチン、酢酸カリウム、アジド、およびプロテアーゼ阻害薬からなる群から選択される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項７】
安定化剤が、アルブミン、アミノ酸の混合物、ショ糖、またはそれらの混合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
アルブミンが少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ（２ｇ／Ｌ）の濃度で用いられ、アミノ酸の混合物が少なくとも約０．０１ｇ／ｍＬ（１０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられ、ショ糖が少なくとも約１％（１０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルブミンが少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ（１０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられ、アミノ酸の混合物が少なくとも約０．０５ｇ／ｍＬ（５０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられ、ショ糖が少なくとも約５％（５０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）によりＦＶＩＩＩが正味の負電荷を有するように緩衝剤が利用される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ）により６．５〜７．０のｐＨを有する緩衝剤が利用される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１２】
緩衝剤がｐＨ６．５のＭＥＳ／ヒスチジンであり、分離膜が約１５００ｋＤａの分子量カットオフを有し、制限膜が約５ｋＤａの分子量カットオフを有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
最終生成物ＦＶＩＩＩが少なくとも約４０％の特異的活性を保持する、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１４】
最終生成物ＦＶＩＩＩの特異的活性が少なくとも約６０％である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
最終生成物ＦＶＩＩＩの特異的活性が約７５％より高い、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
試料が組換え体（ｒＦＶＩＩＩ）を含有する細胞上清または細胞溶解物である、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項１７】
ＦＶＩＩＩを含有する試料から毒素、病原体、または感染体汚染物を分離するための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を、試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子および毒素、病原体または感染体汚染物が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
ＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料から毒素、病原体、または感染体汚染物を分離するための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量に、ＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を、試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するように規定されたｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと；
（ｆ）ＦＶＩＩＩのものよりも大きな分子量カットオフを有する明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量にステップ（ｅ）から得られる試料を配置するステップと；
（ｇ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｈ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、毒素、病原体、または感染体汚染物が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｉ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｈ）を維持するステップと
を含む方法。
【請求項１９】
ＦＶＩＩＩを含有する試料から毒素、病原体、または感染体汚染物を分離するための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも少ない分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量に、ＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を、試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量中のＦＶＩＩＩ以外の試料中の成分の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することが阻止され、最終生成物として第１の間隙容量において保持されるステップと；
（ｅ）試料中の所望量の成分が第１の間隙容量から除去され、ＦＶＩＩＩが第１の間隙容量において保持されるまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと；
（ｆ）ＦＶＩＩＩのものよりも大きな分子量カットオフを有する明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量にステップ（ｅ）から得られる試料を配置するステップと；
（ｇ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｈ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、毒素、病原体、または感染体汚染物が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｉ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｈ）を維持するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
ＦＶＩＩＩを含有する試料から毒素、病原体、または感染体汚染物を分離するための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量に、ＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を、試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するように規定されたｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子が第２の間隙容量に侵入することを実質的に阻止するステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと；
（ｆ）毒素、病原体、または感染体よりも大きな分子量カットオフを有する明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量にステップ（ｅ）から得られる試料を配置するステップと；
（ｇ）毒素、病原体、感染体汚染物が所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｈ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量における毒素、病原体、または感染体汚染物の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｉ）所望量のＦＶＩＩＩが第１の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｈ）を維持するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
毒素、病原体、または感染体汚染物を実質的に含まないＦＶＩＩＩを得るための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも少ない分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量に、ＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体、または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を、試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量中のＦＶＩＩＩ以外の試料中の成分の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することを阻止され、第１の間隙容量において最終生成物として保持されるステップと；
（ｅ）試料中の所望量の成分が第１の間隙容量から除去され、ＦＶＩＩＩが第１の間隙容量において保持されるまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと；
（ｆ）毒素、病原体、または感染体よりも大きな分子量カットオフを有する明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量に配置するステップと；
（ｇ）毒素、病原体、感染体汚染物が所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｈ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量における毒素、病原体または感染体汚染物の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｉ）所望量のＦＶＩＩＩが第１の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｈ）を維持するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
毒素、病原体、または感染体が、エンドトキシン、プリオン、ウイルス、細菌、真菌、酵母菌、および原虫からなる群から選択される、請求項１７、１８、１９、２０、または２１に記載の方法。
【請求項２３】
病原体または感染体がウイルスである、請求項１７、１８、１９、２０、または２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、血液または組換え供給源からの凝固因子の分離、特に血漿からの第ＶＩＩＩ因子の分離のための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）に結合される血漿（０．１μｇ／ｍＬ）中に循環する２６５ｋＤａの糖タンパク質である。この糖タンパク質は、その活性化および破壊を誘発するタンパク質分解プロセシングに対してきわめて感受性であり、したがって、凝固カスケード（凝血）中の共同因子としてのその役割を制御する。活性化ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）は、Ｘ因子のＸａ因子への活性化における共同因子である。ＦＶＩＩＩ欠乏症は、出血性疾患であるＡ型血友病をひき起こしうる。
【０００３】
血漿からのＦＶＩＩＩの平均工業産出高は、血漿１リットル当たり１４０〜２７０国際単位（ＩＵ）である（１ＩＵは、プール血漿１ｍＬ中に存在するＦＶＩＩＩ活性の平均量＝０．２μｇ）。ＦＶＩＩＩの従来の精製の第１のステップは、通常、寒冷沈降反応（古典的なコーン（Ｃｏｈｎ）分画法）であり、これにより４０〜５０％のＦＶＩＩＩが得られる。次いで、ＦＶＩＩＩを含有する寒冷沈降物は、クロマトグラフィー、通常、免疫親和性、およびイオン交換を用いて処理される。各プロセシングステップでのＦＶＩＩＩの損失を最小限に抑えることは、適切なＦＶＩＩＩの現行の供給が不十分であるため、産出高を改善するために望ましい。ヘマシュール・デンマーク（Ｈｅｍａｓｕｒｅ  Ｄｅｎｍａｒｋ）Ａ／Ｓは、古典的なコーン（Ｃｏｈｎ）血漿分画法の現在の問題に対抗する試みにおける技術を開発した。ヘマシュール（Ｈｅｍａｓｕｒｅ）は、高容量ゲルろ過ステップを用いて、初期の寒冷沈降反応ステップの代替とし、６０〜７０％のＦＶＩＩＩのステップ産出高が得られ、総工程産出高は血漿１リットル当たり２００ＩＵのＦＶＩＩＩであることが報告されている。Ｊ．ダム（Ｄａｍ）、Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ、第３１巻、ｐ．６５（１９９９年１２月）。この方法により産出高の改善が得られるが、依然として工程におけるＦＶＩＩＩの顕著な損失が認められる。組換え産出物はＦＶＩＩＩの別の供給源であるが、この供給源は天然供給源から得られるＦＶＩＩＩの代替とはなっていない。現行の精製スキームは多大な時間を必要とし、その結果としてＦＶＩＩＩの顕著な損失が生じ、ＦＶＩＩＩの活性または産出高に有害に影響を及ぼすことなく、病原体、特にウイルスを十分に除去することはない。
【０００４】
血漿中には数千種のタンパク質が共存していることが報告されている。このような複雑な混合物から所定のタンパク質を得ることは、特に所定のタンパク質がその単離状態下にその生物活性を保持する必要がある場合は、困難でありうる。現在、血漿から十分な産出高の適切な量でＦＶＩＩＩを精製または分離することは、きわめて困難である。一例として、７０ｍｇ／ｍＬの平均タンパク質濃度を有する血漿では、ＦＶＩＩＩ（約０．１μｇ／ｍＬ）が全血漿タンパク質のおよそ０．０００１４％のみを構成する。血漿または組換え供給源におけるこのような低濃度でのＦＶＩＩＩの存在は、通常、適切な商業的産出高を得るために大量の血漿または他の供給源を必要とする。したがって、製造費用は増大し、一般的に工程ステップの削減を必要とする。
【０００５】
ＦＶＩＩＩは、血漿中で比較的不安定なタンパク質である。その結果、ＦＶＩＩＩ分離に適用される標準の精製技術では、大量の生物活性ＦＶＩＩＩを得るための方法を得るのが困難である。現行の工程は、最も一般的なのがヒトアルブミンである安定化剤による精製スキーム終了時のＦＶＩＩＩ精製の安定化を含む。しかし、精製工程終了時の添加は、分離ＦＶＩＩＩの活性を保護するには遅すぎることがある。ショ糖で調製される組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）治療薬、「コージネイト（Ｋｏｇｅｎａｔｅ）−Ｆ」は、製剤へのヒトアルブミン添加の必要を除去しうる。
【０００６】
ＦＶＩＩＩ製剤のウィルス汚染も潜在的な問題である。通常、溶剤界面活性剤（ＳＤ）、低温殺菌、メチレンブルー（ＭＢ）、およびＵＢ処理、またはそれらの組合せはＦＶＩＩＩ製剤におけるウィルスを不活性化するために用いられる。しかし、従来のウィルス除去ステップは、ＦＶＩＩＩの喪失または不活性化の結果となる場合が多い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
本出願は、膜電気泳動分離系を用いる機能的に活性な第ＶＩＩＩ因子を分離するための種々の方法および装置に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様において、これらの方法では分離膜を含有する電気泳動装置を使用し、少なくとも２つの制限膜間に第１と第２の間隙容量を生成する。１つ以上の安定化剤が試料および／または間隙容量に添加される。第１の間隙容量中の溶剤が、ＦＶＩＩＩを所望の電荷状態下に維持する。第１と第２の間隙容量間に電位をかけることにより、分離膜の反対側の望ましくない分子から分離膜の片側にＦＶＩＩＩを分離する。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、試料から第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を得るための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量と異なる分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の間隙容量にＦＶＩＩＩを含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を１つ以上の試料、第１の間隙容量、または第２の間隙容量に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するように規定されたｐＨを有する溶剤を選択するステップと；
（ｄ）ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物が分離膜の片側に位置づけられると同時に、望ましくない分子が実質的に分離膜の反対側に位置づけられる、第１と第２の間隙容量間に電位をかけるステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが分離膜の片側に位置づけられるまで、ステップ（ｄ）を維持するステップとを含む方法を提供する。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、試料から第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を得るための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩを含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するように規定されたｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｄ）を維持するステップとを含む方法を提供する。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、試料から第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を得るための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも少ない分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩを含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩ以外の試料中の成分の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することを阻止され、第１の間隙容量において最終生成物として保持されるステップと；
（ｅ）試料中の所望量の成分が第１の間隙容量から除去され、ＦＶＩＩＩが第１の間隙容量において保持されるまで、ステップ（ｄ）を維持するステップとを含む方法を提供する。
【００１２】
好ましくは、試料は、血漿またはその画分、寒冷沈降物またはその画分、組換えＦＶＩＩＩの供給源、またはその組合せまたは混合物である。
【００１３】
好ましくは、安定化剤は、１つ以上の緩衝成分、モル濃度変更成分、タンパク質、アミノ酸、または糖である。好ましくは、安定化剤は、１つ以上のソルビトール、塩、グリセロール、ショ糖、乳糖、およびデキストラン／ブドウ糖などの糖、グリシン、ゲラチン、酢酸カリウム、アジド、およびプロテアーゼ阻害薬である。好ましくは、安定化剤は、アルブミン、アミノ酸の混合物、ショ糖、またはそれらの混合物である。
【００１４】
好ましくは、アルブミンは少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ（２ｇ／Ｌ）の濃度で使用され、アミノ酸の混合物は少なくとも約０．０１ｇ／ｍＬ（１０ｇ／Ｌ）の濃度で使用され、ショ糖は少なくとも約１％（１０ｇ／Ｌ）の濃度で使用される。より好ましくは、アルブミンは少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ（１０ｇ／Ｌ）の濃度で使用され、アミノ酸の混合物は少なくとも約０．０５ｇ／ｍＬ（５０ｇ／Ｌ）の濃度で使用され、ショ糖は少なくとも約５％（５０ｇ／Ｌ）の濃度で使用される。
【００１５】
好ましい実施形態において、ステップ（ｃ）によりＦＶＩＩＩが正味の負電荷を有するように緩衝剤が利用される。より好ましくは、ステップ（ｃ）により６．５〜７．０のｐＨを有する緩衝剤が利用される。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、緩衝剤はｐＨ６．５のＭＥＳ／ヒスチジンであり、分離膜は約１５００ｋＤａの分子量カットオフを有し、制限膜は約５ｋＤａの分子量カットオフを有する。
【００１７】
最終生成物ＦＶＩＩＩは、少なくとも約４０％の特異的活性を保持することが好ましい。最終生成物ＦＶＩＩＩの特異的活性は、少なくとも約６０％であることが好ましい。より好ましくは、最終生成物ＦＶＩＩＩの特異的活性は、約７５％より高い。
【００１８】
本発明は、組換え体（ｒＦＶＩＩＩ）を含有する細胞上清または細胞溶解物である試料を処理するために特に適している。
【００１９】
第４の態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩを含有する試料から毒素、病原体、または感染体汚染物を分離するための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子および毒素、病原体または感染体汚染物が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと
を含む方法を提供する。
【００２０】
第５の態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料から毒素、病原体、または感染体汚染物を分離するための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するように規定されたｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと；
（ｆ）ＦＶＩＩＩのものよりも大きな分子量カットオフを有する明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量にステップ（ｅ）から得られる試料を配置するステップと；
（ｇ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｈ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、毒素、病原体、または感染体汚染物が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｉ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｈ）を維持するステップと
を含む方法を提供する。
【００２１】
第６の態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩを含有する試料から毒素、病原体、または感染体汚染物を分離するための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも少ない分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量中のＦＶＩＩＩ以外の試料中の成分の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することが阻止され、最終生成物として第１の間隙容量において保持されるステップと；
（ｅ）試料中の所望量の成分が第１の間隙容量から除去され、ＦＶＩＩＩが第１の間隙容量において保持されるまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと；
（ｆ）ＦＶＩＩＩのものよりも大きな分子量カットオフを有する明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量にステップ（ｅ）から得られる試料を配置するステップと；
（ｇ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｈ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、毒素、病原体、または感染体汚染物が第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｉ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｈ）を維持するステップと
を含む方法を提供する。
【００２２】
第７の態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩを含有する試料から毒素、病原体、または感染体汚染物を分離するための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するように規定されたｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子が第２の間隙容量に侵入することを実質的に阻止するステップと；
（ｅ）所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと；
（ｆ）毒素、病原体、または感染体よりも大きな分子量カットオフを有する明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量にステップ（ｅ）から得られる試料を配置するステップと；
（ｇ）毒素、病原体、感染体汚染物が所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｈ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量における毒素、病原体、または感染体汚染物の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｉ）所望量のＦＶＩＩＩが第１の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｈ）を維持するステップと
を含む方法を提供する。
【００２３】
第８の態様において、本発明は、毒素、病原体、または感染体汚染物を実質的に含まないＦＶＩＩＩを得るための方法であって、
（ａ）ＦＶＩＩＩの分子量よりも少ない分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量にＦＶＩＩＩおよび毒素、病原体、または感染体汚染物を含有する試料を配置するステップと；
（ｂ）１つ以上の安定化剤を試料と第２の間隙容量のいずれか一方または両方に供給するステップと；
（ｃ）ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｄ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量中のＦＶＩＩＩ以外の試料中の成分の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することを阻止され、第１の間隙容量において最終生成物として保持されるステップと；
（ｅ）試料中の所望量の成分が第１の間隙容量から除去され、ＦＶＩＩＩが第１の間隙容量において保持されるまで、ステップ（ｄ）を維持するステップと；
（ｆ）毒素、病原体、または感染体よりも大きな分子量カットオフを有する明確な間隙径を有する分離膜と、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量に毒素、病原体、または感染体汚染物とともにＦＶＩＩＩを配置するステップと；
（ｇ）毒素、病原体、感染体汚染物が所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択するステップと；
（ｈ）第１と第２の間隙容量間に電位をかけ、第１の間隙容量における毒素、病原体ｍまたは感染体汚染物の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することを阻止するステップと；
（ｉ）所望量のＦＶＩＩＩが第１の間隙容量に移動するまで、ステップ（ｈ）を維持するステップと
を含む方法を提供する。
【００２４】
好ましくは、毒素、病原体、または感染体汚染物が、エンドトキシン、プリオン、ウイルス、細菌、真菌、酵母菌、原虫、またはそれらの混合物から選択される。
【００２５】
１つの好ましい形態において、病原体または感染体はウイルスである。
【００２６】
請求の範囲のこれらまたは他の特徴は、添付の図面とともに本出願の以下の詳細な説明の検討から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明による膜電気泳動分離系を用いた機能的に活性な第ＶＩＩＩ因子を分離する好ましい実施形態を、以下、非限定的に詳述する。これらの実施形態は、天然のＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩの分離のための従来の精製スキームにおける１つ以上のステップの代替として用いることもできる。
【００２８】
図１は、本発明の一態様による試料からＦＶＩＩＩを得る方法のブロック図を示す。一実施形態において、試料は血漿またはその画分、寒冷沈降物またはその画分、組換えＦＶＩＩＩの供給源、またはその組合せまたは混合物でありうる。別の実施形態において、試料は組換え体（ｒＦＶＩＩＩ）を含有する細胞上清または細胞溶解物でありうる。しかし、膜電気泳動の影響を受けやすいＦＶＩＩＩを含有する他の試料を、本発明の方法に従い用いることもできる。
【００２９】
ブロック１００は、ＦＶＩＩＩを含有する試料を電気泳動装置の間隙容量に配置するステップを示す。適切な電気泳動装置は、ＦＶＩＩＩの分子量と異なる分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜を含有する。分離膜は、明確な分子量カットオフを有する電気泳動分離膜でありうる。例えば、分子量カットオフは、ＦＶＩＩＩの分子量またはカットオフよりも大きく、またはＦＶＩＩＩの分子量よりも低くありうる。一実施形態において、電気泳動分離膜は、約１ｋＤａ〜約２０００ｋＤａの分子量カットオフを有する。しかし、当業者は、汚染物、塩、または安定化剤など、試料中の他の分子の分子量によって他の分子量が用いられうることを理解するであろう。一実施形態では、分離膜はポリアクリルアミドから成っている。しかし、他の膜化学または成分が用いられうることは明らかであろう。分離膜は電界領域に位置する。
【００３０】
第１電極ゾーンと分離膜との間に配置された制限膜は、それらの間の第１の間隙容量を規定する。第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜は、それらの間の第２の間隙容量を規定する。ただ便宜上、第１の間隙容量またはストリームはストリーム１（Ｓ１）と呼ばれ、第２の間隙容量またはストリームはストリーム２（Ｓ２）と呼ばれる。
【００３１】
一実施形態では、第１の間隙容量および第２の間隙容量を形成する制限膜は、装置の電極ゾーン間に配置されるカートリッジまたはカセットとして提供される。別の実施形態において、カートリッジの構成は、第１と第２の制限膜間に配置された分離膜を有する筐体であり、必要な間隙容量を形成することが好ましい。一部の実施形態において、カートリッジまたはカセットは、カートリッジを含有または受容に適応した電気泳動装置から取り外し可能である。間隙容量を形成する分離膜および制限膜を含有する他の膜構成も、本請求の範囲によって考慮される。
【００３２】
一実施形態では、第１および第２の制限膜はポリアクリルアミドで形成される。しかし、他の膜化学が適切な制限膜を形成するために用いられ、これらは当業界において周知である。一般的に、制限膜は分離膜よりも少ない分子量カットオフを有する。一部の実施形態において、制限膜は１ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの分子量カットオフを有する。しかし、他の分子量カットオフを用いてもよい。制限膜の分子量カットオフの選択は、加工される試料および除去される高分子のサイズによって決まる。制限膜は、同じ分子量カットオフ、または非対照的な配置を形成する異なるカットオフを有することができる。
【００３３】
一実施形態では、負電極ゾーンに負電極を、正電極ゾーンに正電極を含有する電気泳動装置が使用され、正電極は、負電極と正電極との間に電位をかけると同時にそれらの間の電界に電界を生成するのに適応するように負電極に対して配置され、電界領域に配置された分離膜、それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜、それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜、負電極ゾーン、正電極ゾーン、および第１の間隙容量と第２の間隙容量の少なくとも１つに溶剤を供給する配置、電位をかけると同時に、選択された分離生成物が、少なくとも１つの膜を通じて試料成分から除去され、第１と第２の間隙容量の他方および負電極ゾーンまたは正電極ゾーンに供給される、第１の間隙容量および第２の間隙容量の選択された１つに試料成分を供給する装置、が使用される。負電極ゾーンおよび正電極ゾーンは、適切なポンピング手段によって適切な溶剤または緩衝液で供給される。加工される試料は、適切なポンピング手段によって第１または第２の間隙容量に直接供給される。第１の電極は好ましくは負電極であり、第２の電極は好ましくは正電極である。処理される試料および使用される溶剤または緩衝剤のｐＨによって配置を逆転させ、第１の電極を正電極、第２の電極を負電極とすることができる。
【００３４】
１つの適切な装置では、ゾーンおよび間隙容量は、ストリームを形成するそれぞれの流体／緩衝液および試料溶液の流れを可能にするように構成される。この形態においては、大容量を迅速にかつ効率的に加工することができる。溶液は通常、適切なポンピング手段によってそれぞれのリザーバからゾーンおよび容量を通じて移動または再循環する。例えば、試料、緩衝液、または流体を移動させるためのポンピング手段として蠕動ポンプを用いることができる。
【００３５】
別の適切な装置では、さらに別の配置により電気泳動装置において生成される熱が除去される。例えば、試料および流体は熱交換器を通過して電気泳動中の装置によって生成される熱を除去する。別の例として、電極緩衝液、他の緩衝液、および試料溶液は、適切な処理によって冷却され、分離工程中の化合物の不活性化を制限し、使用中の装置の所望温度を維持する。
【００３６】
適切な電気泳動装置では、電極間の距離は、膜を通じた試料成分の分離または移動に対する影響を有する。電極間の距離が短いほど、成分の電気泳動による移動は迅速になる。約６ｍｍの距離が実験規模装置には適切であることがわかっている。狭い距離も適切であることが理解される。スケールアップの種類では、距離は分離膜の数およびタイプ、試料、緩衝液、および分離生成物用のチャンバーのサイズおよび容量に依存する。好ましい距離はほぼ約６ｍｍ〜約１０ｃｍ程度となる。距離は装置にかけられる電圧にも関係する。
【００３７】
電界の影響は、以下の式に基づく：
ｅ＝Ｖ／ｄ
（ｅ＝電界、Ｖ＝電圧、ｄ＝距離）
したがって、電極間の距離が小さいほど、分離は迅速になる。電極間の距離は、電界強度を増大し、それによってさらに膜を通じた移動速度を改善するために縮小することが好ましい。
【００３８】
試料／緩衝液／流体の流量は、成分の分離に対する影響を有する。分離される装置および試料の配置によって、毎分ミリリットルから毎時リットルまでの流量を用いることができる。例えば、１つの実験規模の器具では、好ましい流量は、約２０±５ｍＬ／分である。しかし、約０ｍＬ／分〜約５０，０００ｍＬ／分の流量も種々の分離方式にわたって用いられている。最大流量は、ポンピング手段および装置のサイズによって一様に高くなる。他の流量も用いてもよい。流量の選択は、移動される生成物、移動の効率、他の処理による前および後位置決めによって決まり、当業者には容易に確認される。
【００３９】
かけられる電圧および／または電流の選択または適用は、分離によって変動する。通常、数千ボルトまでが用いられるが、電圧の選択および変動は、装置、緩衝液、および分離される試料の構成によって決まる。実験規模の器具では、好ましい電圧は約２５０Ｖである。しかし、移動、効率、スケールアップ、および特定の方法によって、約０Ｖ〜５０００Ｖが用いられる。高い電圧も、装置および処理される試料によって考慮される。適切な電圧の選択は、当業者によって容易に確認される。
【００４０】
状況に応じて、電位を周期的に停止して逆転し、膜に侵入した成分の移動をひき起こし、出てきた容量またはストリームに逆行させると同時に、完全に膜を通過した成分が実質的に膜を通じて逆行させることはない。
【００４１】
電位の逆転は任意選択であるが、別の選択肢は静止期である。静止（かけられている電位のない期間）は、任意選択の電位逆転の前後に交換または包含しうる任意選択のステップである。この静止法はしばしば、電位逆転の代替または補助として特異的な分離用途に実施しうる。
【００４２】
別の適切な装置および方法では、分離された化合物または分子を含有する容量またはストリームの少なくとも１つの溶液が収集され、適切な溶剤と交換され、確実に電気泳動が効率的に継続しうるようにする。適切な装置も適応され、大量の処理量および異なる分離構成に適合しうることもできる。上記の種々の電気泳動装置では、本請求の範囲による天然または組換え第ＶＩＩＩ因子が分離されるが、当業界において周知の他の膜電気泳動装置も適している。
【００４３】
図１のブロック１１０を参照すると、本請求の範囲に従い実施される方法により、１つ以上の安定化剤が試料および／または間隙容量に供給される。安定化剤は、分離されたＦＶＩＩＩの生物活性の維持を補助する。例えば、緩衝成分、モル濃度変更成分、タンパク質、アミノ酸、糖、またはそれらの組合せが、安定化剤として添加されうる。他の例として、ソルビトール、塩、グリセロール、ショ糖、乳糖、デキストラン／ブドウ糖、グリシン、ゲラチン、酢酸カリウム、アジド、シンタミン１７（バクスター・コーポレーション（Ｂａｘｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））、およびプロテアーゼ阻害薬も本請求の範囲による安定化剤として用いることができる。ＦＶＩＩＩ用の他の適切な安定化剤は、当業界において周知であり、これらも用いることができる。一実施形態では、アルブミン、アミノ酸の混合物、ショ糖、またはそれらの混合物が安定化剤として用いられる。例えば、一実施形態では、アルブミンは少なくとも約２ｍｇ／ｍＬ（２ｇ／Ｌ）の濃度で用いられ、アミノ酸の混合物は少なくとも約０．０１ｇ／ｍＬ（１０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられ、ショ糖は少なくとも約１％（１０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられる。別の実施形態では、アルブミンは少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ（１０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられ、アミノ酸の混合物は少なくとも約０．０５ｇ／ｍＬ（５０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられ、ショ糖は少なくとも約５％（５０ｇ／Ｌ）の濃度で用いられる。安定剤を出発原料の一部として添加し、または電気泳動分離の前またはその最中に添加することができる。例として、１つ以上の安定化剤を試料に添加し、かつ／またはＦＶＩＩＩを含有する最終生成物ストリームに添加することができる。
【００４４】
ブロック１２０では、ＦＶＩＩＩが所望の電荷状態を有するようにｐＨを有する溶剤が選択される。溶剤によって、ＦＶＩＩＩは、正、負、または中和の電荷状態のいずれかで維持される。例えば、ＦＶＩＩＩのｐｌ値よりも大きいｐＨを有する緩衝剤を選択することにより、ＦＶＩＩＩは負の電荷状態で維持される。ＦＶＩＩＩのｐｌ値よりも低いｐＨを有する緩衝剤を選択することにより、ＦＶＩＩＩは正の電荷状態で維持される。ＦＶＩＩＩのｐｌ値と等しいｐＨを有する緩衝剤により、ＦＶＩＩＩは中和の電荷状態で維持される。一実施形態では、６．５〜７．０のｐＨを有する緩衝剤により、正味の負電荷を有するＦＶＩＩＩが生じる。一実施形態では、ｐＨ６．５（ＭＥＳ／ヒスチジン）、１５００ｋＤａ分離膜、および５ｋＤａ制限膜の組合せを用いることができる。明らかに、他の緩衝剤選択を用いることができる。所望の電荷状態でＦＶＩＩＩを維持する緩衝剤の選択は、当業者には容易に周知される。
【００４５】
ブロック１３０は、ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物が分離膜の片側に位置づけられると同時に、望ましくない分子が実質的に分離膜の反対側に位置づけられる第１と第２の間隙容量間の電位に適用される。一実施形態では、最終生成物ＦＶＩＩＩが少なくとも約４０％の特異的活性を保持する。好ましくは、特異的活性化は少なくとも約６０％であり、より好ましくは、約７５％より高い。特異的活性は、得られるμｇＦＶＩＩＩまたは得られるｍｇ総タンパク質として計算することができる。
【００４６】
ブロック１４０は、所望量の最終生成物ＦＶＩＩＩが分離膜の片側に位置づけられると同時に、望ましくない分子が分離膜の反対側に位置づけられるまで、ブロック１３０にかけられる電位を維持する。一実施形態では、少なくとも約２８％の回復および少なくとも約４０％の活性を有する商業的量の天然のＦＶＩＩＩまたはｒＦＶＩＩＩが得られる。しかし、他の回復量および活性が、本請求の範囲に記載された本方法を用いて可能である。
【００４７】
例えば、一実施形態では、ＦＶＩＩＩを含有する試料は、電界領域に配置されたＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と；それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と；それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量に配置される。１つ以上の安定化剤が、試料および／または第２の間隙容量に供給される。第１の間隙容量のために規定されたｐＨで溶剤を選択することにより、所望の電荷状態を有するＦＶＩＩＩが生じる。第１と第２の間隙容量間に電位をかけることにより、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、ＦＶＩＩＩを含有する最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子が第２の間隙容量に侵入することが阻止される。電位は、所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動するまでかけられる。
【００４８】
別の実施形態では、ＦＶＩＩＩを含有する試料は、電界領域に配置されたＦＶＩＩＩの分子量よりも少ない分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と；それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と；それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む電気泳動装置の第１の間隙容量に配置される。１つ以上の安定化剤が、試料および／または第２の間隙容量に供給される。第１の間隙容量のために規定されたｐＨで溶剤を選択することにより、所望の電荷状態を有するＦＶＩＩＩが生じる。第１と第２の間隙容量間に電位をかけることにより、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩ以外の試料中の成分の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に侵入することが阻止し、第１の間隙容量において最終生成物として保持される。かけられた電位は、試料中の所望量の成分が第１の間隙容量から除去され、最終生成物ＦＶＩＩＩが第１の間隙容量において保持されるまで維持される。
【００４９】
別の実施形態では、試料が第１の間隙容量に配置され、緩衝剤または溶剤が電極ゾーンおよび第２の間隙容量に供給され、電位が電界領域にかけられ、試料中の少なくとも１つの成分を、負電極ゾーンの緩衝剤／溶剤または第２間隙容量の緩衝剤／溶剤に移動させる。しかし、当業者は、間隙容量の順番が逆転し、試料が第２の間隙容量に配置され、緩衝剤または溶剤が電極ゾーンおよび第１の間隙容量に供給され、電位が電界領域にかけられ、試料中の少なくとも１つの成分を正電極の緩衝剤または第１間隙容量の緩衝剤に移動させうることを理解するであろう。請求の範囲では、試料を電気泳動ゾーンの１つ（または両方）に配置するステップも考慮され、間隙容量の１つ以上への移動が電位をかけている最中に達成される。
【００５０】
毒素、病原体、または感染体汚染物を実質的に含まないＦＶＩＩＩも試料中で得ることができる。例えば、除去しうる一部の毒素、病原体、または感染体としては、エンドトキシン、プリオン、ウイルス、細菌、真菌、酵母菌、または原虫が挙げられる。しかし、他の毒素、病原体、または感染体も、本請求の範囲に従い実施される方法によって除去されうる。
【００５１】
一実施形態では、ＦＶＩＩＩ（および毒素、病原体、または感染体汚染物）を含有する試料が、電界領域に配置されたＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と；それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と；それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量に配置される。１つ以上の安定化剤が、試料および／または第２の間隙容量に供給される。第１の間隙容量のための規定されたｐＨの溶剤を選択することにより、所望の電荷状態を有するＦＶＩＩＩが生じる。第１と第２の間隙容量間に電位をかけることにより、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こし、最終生成物を形成すると同時に、望ましくない分子および毒素、病原体または感染体汚染物が実質的に第２の間隙容量に侵入することが阻止される。かけられた電位は、所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動し、毒素、病原体、または感染体汚染物を比較的含まなくなるまで維持される。
【００５２】
毒素、病原体、または感染体汚染物を除去する別の実施形態では、ブロック１４０からの最終生成物としてＦＶＩＩＩの試料が得られる。この試料は、図１に記載された工程では除去されなかった毒素、病原体、または感染体を含有しうる。ブロック１４０から得られた試料は、電界領域に配置されたＦＶＩＩＩの分子量よりも大きい分子量カットオフの、明確な間隙径を有する分離膜と；それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と；それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量に配置される。規定されたｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択することにより、所望の電荷状態を有するＦＶＩＩＩが生じる。第１と第２の間隙容量間に電位をかけることにより、第１の間隙容量におけるＦＶＩＩＩの、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、毒素、病原体、または感染体汚染物が実質的に第２の間隙容量に侵入することが阻止される。かけられた電位は、所望量のＦＶＩＩＩが第２の間隙容量に移動し、毒素、病原体、または感染体汚染物を比較的含まなくなるまで維持される。
【００５３】
毒素、病原体、または感染体汚染物を除去するさらに別の実施形態では、ブロック１４０からの最終生成物としてＦＶＩＩＩの試料が得られ、電界領域に配置された毒素、病原体、または感染体よりも大きな分子量カットオフの明確な間隙径を有する分離膜と；それらの間に第１の間隙容量を規定するように第１の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第１の制限膜と；それらの間に第２の間隙容量を規定するように第２の電極ゾーンと分離膜との間に配置された第２の制限膜とを含む装置の第１の間隙容量に配置される。規定されたｐＨを有する第１の間隙容量のための溶剤を選択することにより、所望の電荷状態を有する毒素、病原体、感染体が生じる。第１と第２の間隙容量間に電位をかけることにより、第１の間隙容量における毒素、病原体、感染体汚染物の、分離膜を通じての第２の間隙容量への移動をひき起こすと同時に、ＦＶＩＩＩが実質的に第２の間隙容量に侵入することが阻止される。かけられた電位は、第１の間隙容量における所望量のＦＶＩＩＩが、毒素、病原体、または感染体汚染物を比較的含まなくなるまで維持される。
【００５４】
本出願の理解を助けるために、以下の実施例が含まれ、一連の実験結果が記載される。本出願に関する以下の実施例は、本願明細書に記載され、請求された出願の範囲内にある、出願、または現在周知の、あるいは後に開発されるかかる出願の変形を具体的に制限するように構成されるものではない。
【実施例】
【００５５】
定義
「ＦＶＩＩＩ活性」なる用語は、ＩＵ／ｍＬ正常血漿で測定される試料のＦＶＩＩＩ活性を指す。
【００５６】
「ＦＶＩＩＩ特異的活性」なる用語は、それぞれ、ＩＵ／ｍＬまたはｍｇ／ｍＬでのＦＶＩＩＩ抗原または総タンパク質の量の関数として、ＩＵ／ｍＬで測定された試料のＦＶＩＩＩ活性を指す。
【００５７】
「ストリーム１（Ｓ１）」なる用語は、試料がストリーム中で電気泳動装置に供給される第１の間隙容量を指す。
【００５８】
「ストリーム２（Ｓ２）」なる用語は、本明細書では、材料が第１の間隙容量から分離膜を通じて、電気泳動装置のストリームに移動する第２の間隙容量を指すために用いられる。
【００５９】
「順極性」なる用語は、電気泳動装置において第１の電極が負電極であり、第２の電極が正電極であり、それに応じて電流がかけられる場合に用いられる。
【００６０】
「逆極性」なる用語は、第１の電極が正電極となり、第２の電極が負電極となるように電極の極性が逆転する場合に用いられる。
分析方法
ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
ＰＡＧＥを用いて、電気泳動実行中の成分の移動を測定した。標準のＰＡＧＥ法を以下に記載されているように使用した。
【００６１】
試薬：１０倍のＳＤＳグリシンランニングバッファー（グラジポア・リミテッド（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、オーストラリア）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて１倍に希釈して使用；１倍ＳＤＳグリシンランニングバッファー（Ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ  ２９ｇ、グリシン１４４ｇ、ＳＤＳ  １０ｇ、ＲＯウォーター純水中で１．０Ｌに構成）；１０倍ＴＢＥＩＩランニングバッファー（グラジポア（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて１倍に希釈して使用；１倍ＴＢＥＩＩランニングバッファー（Ｔｒｉｚｍａ  ｂａｓｅ  １０．８ｇ、ホウ酸５．５ｇ、ＥＤＴＡ  ０．７５ｇ、ＲＯウォーター純水中で１．０Ｌに構成）；２倍ＳＤＳサンプルバッファー（４．０ｍＬ、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ電気泳動グレード、グリセロール  ２．０ｍＬ、０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー１．０ｍＬ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２．５ｍＬ、ｐＨ６．８、ＲＯウォーター純水中で１０ｍＬまでを構成）；２倍天然サンプルバッファー（１０％（ｖ／ｖ）１０倍ＴＢＥＩＩ、２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ２００、キシレンシアノール  ０．１ｇ／Ｌ、ブロモフェノールブルー  ０．１ｇ／Ｌ、ＲＯウォーター純水中で１００％に構成）；クマシーブルー染色液（Ｇｒａｄｉｐｕｒｅ（商標））、グラジポア・リミテッド（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）。注：脱染色用にメタノール  ６％酢酸溶液を含有。
【００６２】
分子量マーカー（−２０℃での保存を推奨）；ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（例えば、シグマ・ワイド・レンジ）；天然ＰＡＧＥ（例えば、グラジポア天然マーカー）；ウェスタンブロティング（例えば、カラー／レインボーマーカー）。
非削減試料によるＳＤＳ  ＰＡＧＥ
ランニング用に試料を調製するために、２倍のＳＤＳサンプルバッファーを１：１の比（通常、５０μＬ／５０μＬ）でマイクロタイタープレートウェルまたは１．５ｍＬチューブ中の試料に添加した。試料を５分間、約１００℃でインキュベートした。ゲルカセットをタンクに面し、配置されたウェルを有するゲルサポート上にクリッピングした。サポート上の１つのゲルのランニングだけである場合は、ブランクカセットまたはプラスチックプレートをサポートの反対側にクリッピングした。
【００６３】
十分な１倍のＳＤＳグリシンランニングバッファーをゲルサポートのインナータンクに注ぎ、サンプルウェルを覆った。アウタータンクをゲルカセットのおよそ中間のレベルまで満たした。トランスファーピペットを用いて、サンプルウェルをランニングバッファーで洗浄し、気泡を除去し、貯蔵バッファーおよび残留ポリアクリルアミドと移しかえた。
【００６４】
最小５μＬのマーカーおよび調製試料（最大４０μＬ）をウェルに充填した。タンク上に蓋を配置し、電源にリード線を接続した後、ゲルを１５０Ｖで９０分間ランニングした。ランニング完了後、染色または別の工程（例えば、ウエスタンブロット）の使用前に、できるだけ速やかにゲルをタンクから除去した。
ゲルの染色および脱染色
ゲルカセットを開いて、容器または密閉可能なプラスチックバッグに配置されたゲルを除去した。水道水でゲルを完全に洗浄し、容器から排出した。クーマシーブルー染色液（約１００ｍＬ  Ｇｒａｄｉｐｕｒｅ（商標）、グラジポア・リミテッド（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、オーストラリア）を添加し、容器またはバッグを密閉した。主要バンドは１０分で可視となったが、最大強度のためには、一夜染色した。ゲルを脱染色するために、染色液を容器から排出した。
【００６５】
容器およびゲルを水道水で洗浄し、残留染色液を除去した。６％酢酸（約１００ｍＬ）を容器に注ぎ、密閉した。脱染色液を所望レベルの脱染色が達成される間、放置した（通常１２時間）。所望レベルに達したら、酢酸を排出し、ゲルを水道水で洗浄した。
【００６６】
出発原料および最終生成物の時間的経過は、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥｉｇｅｌｓ（商標）（グラジポア・リミテッド（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、オーストラリア）で実行した。次いで、ゲルをグラジポア（Ｇｒａｄｉｐｕｒｅ（商標）クーマシーブルー染色液（グラジポア・リミテッド（Ｇｒａｄｉｐｏｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、オーストラリア）を用いて染色し、６％酢酸で脱染色した。
等電点電気泳動（ＩＥＦ）
ＩＥＦを用いて、電気泳動分離状態の考察を補助する成分の等電点を測定した。以下の設定のように標準のＩＥＦ法を使用した。
【００６７】
試薬：Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦゲルをｐｌ測定および精製生成物の確認ために用いた。Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦゲルは５％ポリアクリルアミド、非変性であり、尿素を含有しない。ｐＨ３から１０のゲルは３．５〜８．５のｐｌ性能範囲を有する。
【００６８】
推奨緩衝液：ｐＨ３〜１０のＩＥＦゲル（Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦサンプルバッファー、ｐＨ３〜１０（２倍）２５ｍＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ５３１１；Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦ陰極バッファー、ｐＨ３〜１０（１０倍）１２５ｍＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ５３１０；Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦ陽極バッファー、（５０倍）１００ｍＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＣ５３００）；ＩＥＦ陰極バッファー（１倍の使用溶液）を１０分間、真空下に脱気し、または使用直前に不活性ガスで１分間のパージを行った。
【００６９】
混合溶液：スルホサリチル酸１７．３ｇ、ＴＣＡ  ５７．３ｇ、５００ｍＬに満たした脱イオン水、ＩＥＦ、ｐＨ３〜７  カタログ＃ＬＣ５３７１（２倍）、１０倍の陰極バッファー（３〜７）２．０ｍＬ、グリセロール３．０ｍＬ、蒸留水１０．０ｍＬ、陰極バッファー、Ｃａｔ．＃ＬＣ５３７０（１０倍）、リシン（遊離塩基）５．８ｇ、蒸留水１００ｍＬ、陽極バッファー、Ｃａｔ．＃ＬＣ５３００（５０倍）、リン酸（８５％）４．７ｇ、蒸留水１００ｍＬ。１倍陽極バッファーは、約ｐＨ２．４とする。１倍陰極バッファーは、〜１０．１とする。
【００７０】
１部の試料を１部のＮｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦサンプルバッファー（２倍）に添加することによって試料を調製し、十分に混合した。
【００７１】
Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦ陰極バッファー（１０倍）を使用前に脱イオン水で１：９に希釈し、ＩＥＦ陰極バッファー（１倍の使用溶液）を１０分間、真空下に脱気し、または窒素あるいはヘリウムガスで使用直前に１分間のパージを行った。これによりゲル・ラン中に形成する溶解二酸化炭素からの気泡の可能性が減少する。上部緩衝室を適切な量の陰極バッファーで満たした。
【００７２】
Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦ陽極バッファー（５０倍）を使用前に脱イオン水で１：４９に希釈し、適切な量の陽極バッファーを下部緩衝室に注入した。
【００７３】
適切な量の試料をＮｏｖｅｘ（登録商標）ＩＥＦ陰極バッファーで満たしたウェルに添加した。
【００７４】
以下のランニング条件に従いゲルをランした：１００Ｖ定電圧−１時間、２００Ｖ定電圧−１時間、５００Ｖ定電圧−３０分。近似電流は５ｍＡ／ゲルで開始し、６ｍＡ／ゲルで終了した。ラン時間は約２．５時間であった。
【００７５】
ラン後、ゲルをカセットから除去し、固定溶液（配合表は上記参照）中で３０分間固定した。このステップは、タンパク質を固定し、両性電解質を除去するのに重要である。そのほかの点では、高いバックグラウンドが生じうる。
【００７６】
ゲルを染色液（０．１％クーマシーＲ−２５０）に配置し、５分間振盪した。所望の透明度が達成されるまで、１倍の脱染色溶液またはＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｇｅｌ−Ｃｌｅａｒ（商標）でゲルを脱染色した。すべての混合、染色、および脱染色は静かに振盪しながら行った。
【００７７】
精製ＦＶＩＩＩを２種類の希釈下にＩＥＦゲルでランした。マウス抗ヒトＦＶＩＩＩ一次抗体でプロービングしたニトロセルロース上にＩＥＦゲルをブロッティングした。ＨＲＰ抱合型である二次抗体を用いて、一次抗体をプロービングし、４ＣＮを用いて展開した。ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の等電点も以下に設定したようにＩＥＦによって測定した。
シンタミン１７
シンタミン１７は、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）社から入手可能な０．１ｇ／ｍＬでの１４  Ｌ−アミノ酸の静脈内輸液である。この輸液を合成アミノ酸源として用いた。各１０００ｍＬの電解質を含まないシンタミン１７（アミノ酸）（１０％）静脈内輸液は、以下の表に設定された成分を含有する。
【００７８】
【表１】
2005504740.tif 000002
【００７９】
約１．５ｍｍｏｌ／Ｌのメタビスルフィン（Ｍｅｔａｂｉｓｕｌｐｈｉｎｅ）ナトリウムＢＰを安定剤として添加する。
実験プロトコルと結果
精製源からのＦＶＩＩＩの特徴づけ
以下の実験により、電気泳動系におけるＦＶＩＩＩの移動に適したｐＨを確立した。実験バッファー中のＦＶＩＩＩ約１００ＩＵ／ｍＬを出発原料として用いた。ｐＨ範囲５．０〜７．５および大間隙径の分離膜（５００〜１０００ｋＤａ）を調査し、サイズではなく電荷にもとづくＦＶＩＩＩの移動を可能にした。ＦＶＩＩＩの安定性を維持することにより、実験をこのｐＨ範囲に制限した。ＦＶＩＩＩの移動および活性の分析をクロモジェニックアッセイを用いて行ったが、ＦＶＩＩＩ特異的活性は、ＦＶＩＩＩ  １μｇ当たりのＦＶＩＩＩ活性の量（ＩＵ）として表される。仮定は、それらの引用／理論的ｐｌおよびサイズ（ｋＤａ）からの生成物における他のタンパク質の移動にもとづき行った。
【００８０】
ｐＨ７．１およびｐＨ７．３での緩衝液（Ｈｅｐｅｓ／イミジゾール）による分離では５−８００−５ｋＤａ膜構成（第１の制限膜−分離膜−第２の制限膜）を用いた。ｐＨ６．７での緩衝液（Ｈｅｐｅｓ／イミジゾール）による分離では５−１０００−５ｋＤａ膜構成を用いた。ｐＨ６．５（ＭＥＳ／ヒスチジン）およびｐＨ５．０（ＧＡＢＡ／酢酸）での緩衝液による分離では、５−１５００−５ｋＤａ膜構成を用いた。
ｐＨ範囲の大間隙径膜を用いたＦＶＩＩＩ濃縮物からの結果
図２は、さまざまなｐＨでの電気泳動系のＳ１におけるＦＶＩＩＩ抗原（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）の移動を示す。これらの結果は、ＦＶＩＩＩ：Ａｇの大部分が、順極性下に試験した各ｐＨで最初の３０分以内にＳ１から移動したことを示し、試験したｐＨ値、すなわち試験したｐＨ値のすべてのいずれもＦＶＩＩＩのｐｌ値と同等ではなく、ＦＶＩＩＩは荷電状態のままであった。
【００８１】
図３は、さまざまなｐＨでの電気泳動系のＳ２におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す。これらの結果は、ＦＶＩＩＩ：Ａｇが、ｐＨ６．７、７．３および７．５ではＳ２の低レベルで検出され、ｐＨ５．０ではまったく検出されないことを示す。ｐＨ６．５では、ＦＶＩＩＩ：ＡｇはＳ２において有意なレベルで検出された。
【００８２】
したがって、＞ｐＨ６．５では、ＦＶＩＩＩは負の（−ｖｅ）電荷を帯び、順極性下にＳ１を出てＳ２に入り。Ｓ２におけるＦＶＩＩＩの不在は、ＦＶＩＩＩが詰まり、または分離膜に結合しているか、またはＦＶＩＩＩが高度に電荷を帯び、下端または第２の制限膜に結合しているかのいずれかで説明することができる。ｐＨ５．０では、ＦＶＩＩＩはＳ１から移動したが、Ｓ２に現れることはなく、このｐＨでは、ＦＶＩＩＩが正の（＋ｖｅ）電荷を帯び、順極性下に上端または第１の制限膜に移動することを示した。
【００８３】
この系おいてＦＶＩＩＩ：Ａｇを保持することは重要でありうるが、存在する抗体なしには活性レベルを検出することはできなかった。実験条件はｐＨ６．５での緩衝液（ＭＥＳ／ヒスチジン）、５−１５００−５ｋＤａ膜構成、２時間の休止および逆転（２分）による３０分の収穫を含む場合、各アッセイ（３０分間隔）は、合計９０．３％のＦＶＩＩＩ抗原が２時間の時点で回復し（ＵＳ＝４．７８％、Ｓ２＝８５．５２％）、機能的活性が分離の全体を通じて維持されたことを示した。各Ｓ２画分の特異的活性が表１に示されている。
【００８４】
【表２】
2005504740.tif 000003
【００８５】
ｐＨ６．５では、５９．１９％のＦＶＩＩＩがＳ２３０収穫に移動した。製剤中の安定化アルブミンの大部分もＳ２に移動した。Ｓ２３０試料におけるＦＶＩＩＩは、おそらくこれもこの時点で収穫されたアルブミンの結果としてきわめて安定（８７．２％）であった。残りのＳ２画分はＦＶＩＩＩを収集したが、第１の画分（Ｓ２３０）において収集された安定化アルブミンの大部分の結果として活性レベルは相当に減少した。
ＦＶＩＩＩ濃縮物ｐｌの計算
ヒトＦＶＩＩＩの理論的ｐｌは、６．９７であることがそのアミノ酸配列から計算された。しばしば、これらの理論的ｐｌ計算は、上記のＦＶＩＩＩの結果によって示されているように生物学的存在と相関することはない。ＦＶＩＩＩのｐｌが実際に６．９７であった場合、順極性下にｐＨ６．５でＳ２への移動は認められなかった。上記の結果は、実験製剤からのＦＶＩＩＩのｐｌが５．０＜６．５の間であったことを示す。
【００８６】
電気泳動分離実験を補完するために、等電点電気泳動（ＩＥＦ）を用いて、ＦＶＩＩＩのｐｌ値を計算した。図４は、マウス抗ヒトＦＶＩＩＩでプロービングしたＦＶＩＩＩの等電点電気泳動ウエスタンブロットを示す。結果は、ＦＶＩＩＩについて６．２のｐｌを示し、これは上記のさまざまなｐＨ値での電気泳動の移動結果を裏づける。
ＦＶＩＩＩ濃縮物用の安定化剤
これらの実験は、ＦＶＩＩＩ分子の不安定性、およびＦＶＩＩＩの移動および活性に対して有する安定化剤の好ましい効果を際立たせている。
タンパク質
以下の実験は、一定のアルブミン濃度が、本発明の方法を用いた分離の経過中にＦＶＩＩＩ分子に供給されうることを示している。
実験１
分離条件：ｐＨ６．５（ＭＥＳ／ヒスチジン）緩衝液、５−１５００−５ｋＤａカートリッジ構成、２時間の休止および逆転による３０分の収穫。ＦＶＩＩＩの電気泳動収穫後のＳ２緩衝液の補充には、最終濃度１０ｍｇ／ｍＬでヒトアルブミンが含まれた。
【００８７】
図５は、Ｓ２補充緩衝液（最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）中の安定化剤としてヒトアルブミンを用いた装置のＳ１およびＳ２におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す。
【００８８】
【表３】
2005504740.tif 000004
【００８９】
Ｓ２緩衝液へのヒトアルブミンの添加は、電気泳動装置における保持ＦＶＩＩＩ活性に対する好ましい効果を有した。追加アルブミンの安定化効果は、Ｓ２に移動した出発原料からのアルブミンを含んだため、最初のＳ２収穫（Ｓ２３０）におけるＦＶＩＩＩ特異的活性に対しては明らかでなかった。残りのＳ２収穫は、安定化アルブミンを含まない平行実験に比べて安定化アルブミンの添加により特異的活性の増大を示した（結果は表２に示されている）。
【００９０】
したがって、Ｓ２ランニングバッファーへのアルブミンの添加は、安定化剤を精製／単離工程中の系に添加することができ、ＦＶＩＩＩの特異的活性の保持に対する好ましい効果を有しうることの証拠であった。
アミノ酸
以下の実験は、アミノ酸が安定化剤として有効に使用しうることを示している。プロトコルには、大きな制限膜によるカートリッジ構成（３５−１５００−３５ｋＤａ）が含まれた。この構成により、Ｓ１、Ｓ２、およびバッファーストリームを通じて、ランニングバッファーに含まれるアミノ酸の適度に一定の循環を可能にする。
実験２
分離条件：ｐＨ６．５（ＭＥＳ／ヒスチジン）緩衝液とシンタミン１７（比１：１、シンタミン１７の最終濃度は０．０５ｇ／ｍＬであった）、３５−１５００−３５ｋＤａカートリッジ構成、２時間の休止および逆転による３０分の収穫を用いた。緩衝液の最終ｐＨは、シンタミン１７の影響により６．２であった。
【００９１】
図６は、ランニングバッファー（最終濃度０．０５ｇ／ｍＬ）中の安定化剤としてシンタミン１７を用いた電気泳動装置のＳ１およびＳ２におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す。シンタミン１７は緩衝液の最終ｐＨに影響を及ぼしただけではなく、５００ｍＡでの限定要因であった電流にも影響した。これらの条件により、実験の持続時間にわたり約４０Ｖの低電圧が生じた（表３）。１２０分の時点で、合計２０．１６％のＦＶＩＩＩがＳ１に保持され、初期活性が８３．３９％であった。３０分および６０分の収穫のＦＶＩＩＩ活性の保持は、シンタミン１７が保持ＦＶＩＩＩ活性に対して好ましい効果を有することの証拠であった。低電圧条件下に、製剤中のアルブミンはきわめてゆっくりＳ２に移動するため、ＦＶＩＩＩの安定剤としてＳ１に存在しうることが予想された。
【００９２】
【表４】
2005504740.tif 000005
【００９３】
実験３
分離条件：ｐＨ６．５（ＭＥＳ／ヒスチジン）緩衝液とシンタミン１７（比３：１、シンタミン１７の最終濃度は０．０２５ｇ／ｍＬであった）、３５−１５００−３５ｋＤａカートリッジ構成、２時間の休止および逆転による３０分の収穫。緩衝液の最終ｐＨは、シンタミン１７の影響により６．４２であった。
【００９４】
図７は、ランニングバッファー（最終濃度０．０２５ｇ／ｍＬ）中の安定化剤としてシンタミン１７を用いた電気泳動装置のＳ１およびＳ２におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す。
【００９５】
【表５】
2005504740.tif 000006
【００９６】
低濃度のシンタミン１７（０．０２５ｇ／ｍＬ）を用いることも、５００ｍＡでの限定要因であった電流に対して劇的な影響を有した。これらの条件により、実験の持続時間にわたり約７０Ｖの低電圧が生じた。実験１（上記）と比較したこの実験における高いｐＨにより、ＦＶＩＩＩに多くの電荷が生じ、Ｓ２への多くの移動を可能にした（それぞれ、１０．２６％および３２．６％）。この濃度でのＦＶＩＩＩ活性に対するシンタミン１７の影響は、Ｓ１６０の結果は不規則ではあるが、好ましい影響であった。
糖
以下の実験で確認されるように、糖もＦＶＩＩＩの安定化剤の代替源でありうる。
血漿からのＦＶＩＩＩの特徴づけ
純血漿をＦＶＩＩＩ源として用いた。ＦＶＩＩＩ分子は血漿出発原料中のｖＷｆに結合し、大きな複合体を形成することが予想された。ｖＷｆ−ＦＶＩＩＩ複合体はＳ１に残ると同時に、Ｓ２に移動する血漿タンパク質を汚染することが予想されたのは、このためであった。５．５〜７．３のｐＨ範囲が、１０００ｋＤａ分離膜といっしょに調査された。ＦＶＩＩＩの安定性を維持することは、実験をこのｐＨ範囲に限定した。ＦＶＩＩＩの移動および活性の分析は、クロモジェニックアッセイを用いて行い、特異的活性は当該試料におけるＦＶＩＩＩのμｇ当たりのＦＶＩＩＩ活性（ＩＵ）の量で表される。
ｐＨ範囲におけるＦＶＩＩＩ純血漿からの結果
図８は、出発原料として純血漿を用いたさまざまなｐＨ値での電気泳動装置のＳ１におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す。分析したすべてのｐＨ値について、Ｓ２に移動したＦＶＩＩＩ：Ａｇは確認されなかった。
【００９７】
【表６】
2005504740.tif 000007
【００９８】
表５の上記の結果は、系における純ヒト血漿からのＦＶＩＩＩの移動およびｐＨ６．９がこの段階で適切なランニング条件であることを示し、６０分の時点で出発ＦＶＩＩＩの６５．１５％を保持した。最初の３０分における２５％の喪失および次の３０分におけるさらに１０％の喪失が、これらの条件下に確認された。ＦＶＩＩＩは非特異的に膜に結合しうる。この結合は、ＰＢＳ洗浄液を組込み、休止し、緩衝液中にＴｗｅｅｎ２０の添加および／または出発原料を希釈することによって低下しうる。
【００９９】
【表７】
2005504740.tif 000008
【０１００】
図８は、ｐＨ６．９での純血漿からのＦＶＩＩＩの特異的活性の回復を示す。ＦＶＩＩＩは血漿中でｖＷｆに結合するため、活性の喪失は、血漿が分離装置内で循環している間のその活性化およびその結果としての非活性化によるとみられる。
【０１０１】
ＦＶＩＩＩを含有するＳ１試料の総タンパク質量は計算されなかったが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、これらの条件下に血漿タンパク質の大部分がＳ１に残っていることを示した。
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）によるＦＶＩＩＩの特徴づけ
ＰＰＶを用いて、本発明の方法を用いることによるＦＶＩＩＩからのウイルス汚染物の除去を示した。
ＰＰＶｐｌの計算
電荷ベースのクリアランスまたは除去におけるウイルスｐｌ値を利用するために、ＰＰＶのｐｌ値を確立することが必要であった。等電点電気泳動（ＩＥＦ）を最初に用いて、ＰＰＶのｐｌを計算した。
【０１０２】
図９は、ＰＰＶのＩＥＦブロットであり、レーン１はポンソーＳ染色液で染色したｐｌマーカーであり、レーン２はポンソーＳ染色液で染色したＰＰＶ製剤であり、レーン３はマウス抗ブタパルボウイルスでプロービングしたＰＰＶ製剤である。これらの結果は、ＰＰＶについて５．１〜６．０のｐｌ範囲を示す。レーン３の他の３つの帯は、マウス抗パルボウイルス抗体との反応ではなく、したがってＰＰＶのいかなるｐｌ指標も示さない。
【０１０３】
図１０は、本請求の範囲による方法によるＦＶＩＩＩからのＰＰＶの除去の結果を示す。ＦＶＩＩＩ源として血漿を用いると、Ｓ１におけるＦＶＩＩＩを保持し、ウィルスを膜を通じてＳ２に移動させることによってウイルス負荷は減少した。分離中、ＦＶＩＩＩ特異的活性はｖＷｆに結合される要因の結果として保持されると同時に、ＰＰＶは出発賦課の１％未満に減少した。
組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）の精製
上記の実験は、膜電気泳動法を利用して、濃縮凍結乾燥源および通常プール血漿の両方からＦＶＩＩＩを分離しうることを示している。以下の実験は、組換え源からのＦＶＩＩＩの精製を示す。ｒＦＶＩＩＩタンパク質は混入細胞培地タンパク質から精製した。
【０１０４】
ｒＦＶＩＩＩは電気泳動装置のＳ１にスパイクされ、溶液の１ミリリットル当たり約１０ＩＵのｒＦＶＩＩＩを得た。最初の実験では、１５００Ｋを超える大間隙径（ＬＰＳ）膜およびｐＨ６．５のＭＥＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液を用いた。これらの条件は、ｒＦＶＩＩＩを膜上に移動させると同時に、ｒＦＶＩＩＩを活性形態で保持し続ける。
【０１０５】
ｒＦＶＩＩＩを、安定化剤を含まない標準のＭＥＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液に配置し、電気泳動装置内で循環させると、ｒＦＶＩＩＩ活性のレベルは急速に減少した。分離装置上に動力がかけられなかったにもかかわらず、ｒＦＶＩＩＩ活性の１５％のみが循環の１時間後に残った（図１１）。この低い活性は、ｒＦＶＩＩＩ分子が機能を保持するために最適ではない緩衝液によるとみられる。
【０１０６】
動力を分離装置上にかけると、Ｓ１の活性のレベルも劇的に低下し、一過性のｒＦＶＩＩＩ活性がＳ２において確認された。すべてのｒＦＶＩＩＩ活性が、電位をかけた２時間以内にＳ１とＳ２の両方から検出しえなかった。Ｓ２において確認された一過性の活性レベルにより、移動した後に活性ｒＦＶＩＩＩを捕捉するために収穫が有用であることが判定された。
【０１０７】
図１１は、機械内の緩衝液および／または条件がｒＦＶＩＩＩ分子に有害であることを示す。ｒＦＶＩＩＩ活性のほぼすべてが、２時間分離の終了によって喪失した。機能的活性の喪失をひき起こしたのが緩衝液または装置であったかを試験するために、２種類の安定剤として、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびショ糖を利用した。ＨＳＡはしばしばＦＶＩＩＩを安定化するために用いられている。このようなタンパク質からの可能な病原体汚染の問題により、人工的な安定剤が好ましい形態である。ショ糖は代替の安定化剤として用いられている。
【０１０８】
安定化剤として１０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ（１％ｗ／ｖ）を用いたところ、ｒＦＶＩＩＩ活性は電気泳動装置内で維持され、Ｓ１からＳ２に移動し、活性の喪失はきわめてわずかであった。Ｓ２に移動したｒＦＶＩＩＩ生成物は、３０分、６０分、および１２０分の時点で収穫され、このストリームにおけるｒＦＶＩＩＩは電気泳動装置を連続的に通過する過酷さにほとんどさらされなかった。出発活性の平均９２％がＳ１から移動し、Ｓ２において収集しえた（図１２）。
【０１０９】
安定化剤としてショ糖を使用したところ、０．１１％ショ糖が安定剤なしよりも十分にｒＦＶＩＩＩ活性を維持した。しかし、大量の活性が依然として喪失した。次いで、このレベルが１．１％に上昇した場合は、より大きな活性の回復が可能である。１．１％のショ糖濃度は、ｒＦＶＩＩＩおよびアルブミンを安定化することはなかった。０．１％および１．１％のショ糖濃度で確認された用量反応により、５％濃度のショ糖を利用した（図１３）。安定化剤として５％ショ糖を用いると、活性の保持はアルブミンで確認されたものよりも優れていた。高濃度のショ糖を用いることにより、ｒＦＶＩＩＩ活性の９６％が６０分でＳ１からＳ２に移動することが可能であった。
【０１１０】
瓶詰めのショ糖安定化ｒＦＶＩＩＩ生成物は、高レベルでは患者に有害である可能性が高いため、１．１％ショ糖のみが含まれていた。１．１％でのショ糖は、電気泳動装置を用いた分離中にｒＦＶＩＩＩを十分に安定化することが確認されず、高濃度が必要であった。ＦＶＩＩＩの分離中に用いられたこの高濃度のショ糖は、精製スキームの終了時に削減しうる。
【０１１１】
細胞培養上清からのｒＦＶＩＩＩの精製スキームを展開し、擬態ｒＦＶＩＩＩを培養中のＣＨＯ細胞から発現させた。同等部の細胞培養上清および１０％ショ糖を混合して適切な出発原料を得、ｒＦＶＩＩＩをこの上清にスパイクし、約１０ＩＵ／ｍＬの濃度を得た。
【０１１２】
精製スキームでは、５％ショ糖とともにｐＨ６．５のＭＥＳ／ヒスチジンを用いた。約５００ｋＤａ分離膜を用いて分粒を可能にし、ここで大きなｒＦＶＩＩＩ分子（２６５ｋＤａ）がＳ１に保持されると同時に、アルブミンやトランスフェリンなど小さなタンパク質のすべてがＳ２に移動した。高レベルのショ糖（５％）は、ｒＦＶＩＩＩ活性を維持する助けになると同時に、汚染タンパク質のほぼすべてが除去された（図１４）。汚染物の大部分が除去されていた３０分の時点で、７９％の活性が残っていた。６０分の時点では、少なくとも６５％の生物活性を保持したより純粋な生成物が得られた（図１５）。
【０１１３】
図１５に示したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル分離は、汚染物のほぼすべてが、ランの開始時点でＳ１に存在するタンパク質を豊富に含む培地からＳ２に移動したが、活性アッセイはｒＦＶＩＩＩがＳ１に残ったことを示している（図１４）。ポリアクリルアミドゲル上のレーン５として確認しうる最終生成物は、ゲルの最上部にある、タンパク質帯のみを含有した。
【０１１４】
ｒＦＶＩＩＩスパイク細胞培養上清は、ブラッドフォード総タンパク質アッセイによって、３９０μｇ／ｍＬのタンパク質を含むことが測定され、本発明による電気泳動法を用いた精製後、最終生成物の含有量をわずか１６μｇ／ｍＬであった。生成物がより精製された状態になると、総タンパク質のＩＵ／μｇで測定される特異的活性は劇的に上昇した（図１５）。９６％を超える不純物がＳ２に除去され、Ｓ１に精製された組換えＦＶＩＩＩが残った。これはクーマシー染色ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて分析された。
【０１１５】
精製工程はさらに多くの方法で改良される。１つのステップでの精製およびウイルスクリアランスを達成するために、バイオバーデンからの分割を得る分離膜上のｒＦＶＩＩＩの移動が、分離膜として大間隙径膜を用い、第２の制限膜として約５００ｋＤａの膜を用いることによって達成される。これによりｒＦＶＩＩＩ分子が、すべての大分子量タンパク質汚染物のほかウイルスおよびプリオンから離れることが可能になると同時に、ｒＦＶＩＩＩとともに移動する低分子量タンパク質のすべてがさらに、約５００ｋＤａ制限膜によってバッファーストリームに移動する。緩衝液のｐＨおよび組成物の最適化におけるさらなる努力は、当業界で容易に周知であり、精製される間にｒＦＶＩＩＩ分子の安定性をも改善する。
【０１１６】
ショ糖は、本発明の方法によるｒＦＶＩＩＩのための優れた非タンパク性安定剤である。ショ糖により、使用される濃度が高いほど、十分な活性保持が得られるという点で用量反応が生じた。０．１、１．１、および５％の濃度のショ糖を試験し、濃度５％のショ糖がｒＦＶＩＩＩに対する最良の安定化効果を示した。
【０１１７】
さらに、本請求の範囲による電気泳動法は、細胞培養上清からｒＦＶＩＩＩを精製する優れた手段であることがわかった。９６％を超える不純物が細胞培養上清から除去され、ＦＶＩＩＩ活性の十分な保持を示した。ｒＦＶＩＩＩ生成物の特異的活性は、精製中に大幅に増大することが確認され、ＳＤＳ  ＰＡＧＥは単一帯の純度であることを示した。全体の分離は６０分で生成される最終生成物で固定され、きわめて不安定なｒＦＶＩＩＩ分子が大幅な機能性を喪失するのを未然に防いだ。
【０１１８】
この明細書全体を通じて、文脈からその他が必要でない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」なる語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素、完全体、またはステップ、あるいは要素、官全体、またはステップの群の包含を意味するが、他の要素、完全体、またはステップ、あるいは要素、完全体、またはステップの群の除外を意味しないと理解されよう。
【０１１９】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品などの考察は、単に本発明の文脈を提供するのが目的である。これら諸件のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成し、または本出願の各請求項の優先日前にオーストリアに存在した本発明に関連した分野における一般常識であったことを是認と取るべきではない。
【０１２０】
大まかに述べられた発明の精神または範囲から逸脱することなく特定の実施形態で示された本発明に多くの変形および／または変更がなされうることが、当業者によって理解されよう。しかし、本実施形態は、すべての点で例示的であり、制限的ではないと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】膜電気泳動分離系を用いた機能的に活性な第ＶＩＩＩ因子を分離するための方法を示すブロック図である。
【図２】経時の種々のｐＨ値での電気泳動系のＳ１におけるＦＶＩＩＩ抗原（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）の移動を示す図である。
【図３】経時の種々のｐＨ値での電気泳動系のＳ２におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す図である。
【図４】マウス抗ヒトＦＶＩＩＩでプロービングされた高精製生成物からのＦＶＩＩＩの等電点電気泳動ウエスタンブロットを示す図である。結果は、種々のｐＨ値での移動結果を示すこの供給源からのＦＶＩＩＩに対する６．２の真のｐｌを示す。
【図５】ランニングバッファー中の安定化剤としてアルブミンを用いた電気泳動装置のＳ１およびＳ２におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す図である（アルブミンの最終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）。
【図６】ランニングバッファー中の安定化剤としてシンタミン１７を用いた電気泳動装置のＳ１およびＳ２におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す図である（シンタミン１７の最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ）。
【図７】ランニングバッファー中の安定化剤としてシンタミン１７を用いた電気泳動装置のＳ１およびＳ２におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す図である（シンタミン１７の最終濃度０．０２５ｍｇ／ｍＬ）。
【図８】出発原料として純血漿を用いた種々のｐＨ値での電気泳動装置のＳ１におけるＦＶＩＩＩ：Ａｇの移動を示す図である。
【図９】ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ブロットを示す図であり、レーン１はポンソーＳ染色液で染色されたｐｌマーカーを示し、レーン２はポンソーＳ染色液で染色したＰＰＶ製剤を示し、レーン３はマウス抗ブタパルボウイルスでプロービングされたＰＰＶ製剤を示す図である。
【図１０】電気泳動実行中の経時のＰＰＶ汚染物からのＦＶＩＩＩの分離を示すグラフである。
【図１１】ｒＦＶＩＩＩがｐＨ６．５のＭＥＳ／Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファーにスパイクされた場合の膜電気泳動装置のＳ１およびＳ２において確認されたｒＦＶＩＩＩ活性を示すグラフである。分離装置上に動力はかけられなかった。
【図１２】膜電気泳動分離の全体を通じてＳ１からＳ２へのｒＦＶＩＩＩ活性の移動レベルを示すグラフである。安定化剤として、３種類の濃度のショ糖および１つの濃度のアルブミンを試験した。最適な安定剤は５％ショ糖であったが、これにより２つの低濃度のショ糖よりもはるかに大きな活性が保持された。
【図１３】上記されている安定剤の３つの組合せが用いられた場合の膜電気泳動装置のＳ２からのｒＦＶＩＩＩ活性の最終回復を示すグラフである。５％ショ糖安定剤は、低濃度ショ糖よりもはるかに良好であることがわかった。
【図１４】膜電気泳動装置を用いたｒＦＶＩＩＩ精製法における出発原料および最終生成物を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを示す図である。レーン５は精製ｒＦＶＩＩＩ生成物を含有し、これはアルブミンおよびトランスフェリンのほか、他の低分子量の汚染物を完全に含まない。レーン７および８は、Ｓ１から除去された汚染物を含有する。
【図１５】膜電気泳動分離におけるタンパク質濃度対時間を示すグラフである。不純物のレベルが分離中に低下すると、ＦＶＩＩＩ特異的活性の実質的な増大が確認される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005504740.tif 000087
2005504740.tif 000088
2005504740.tif 000089