(57)【要約】ペプチド模倣物として一般式（I）を有するSur-2の小分子阻害剤が提供される。
2005530804.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物およびその製薬上許容される塩。
【化１】
2005530804.tif 000013
（式中、R1はインドール基、インドール誘導体基、アルキル、トリハロアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、スルフィニル、スルホニル、カルボニル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、またはアミノであり、
R2は水素、ヒドロキシ、ナイトレート基、ハロゲン、低級アルキル、またはカルボニルであり、
R3はハロゲン、低級アルキル、カルボニル、アリール、アラルキル、または複素環基であり、かつ
R4はアダマンタン基、アダマンタン誘導体基、アルキル、トリハロアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、スルフィニル、スルホニル、S-スルホンアミド、N-スルホンアミド、トリハロメタン−スルホンアミド、ハロゲン、カルボニル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、またはアミノであり、かつ、
R1がインドール基、R2がヒドロキシル、かつR3がイソプロピルであるとき、R4はアダマンタン基ではない。）
【請求項２】
R1はベンゼン、キシレン、クメン、トルエン、ペンタセン、インデン、ナフタレン、インダセン、ピリミジン、インドリル、プリン、キノリン、またはイソキノリンである、請求項1の化合物。
【請求項３】
R2はメタン、エタン、プロパン、またはヒドロキシルである、請求項1の化合物。
【請求項４】
次式の化合物およびその製薬上許容される塩。
【化２】
2005530804.tif 000014
（式中、R1およびR2は水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、カルボニル、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであり、かつ、
R1およびR2は、同じでも異なっていてもよく、かつ
R1およびR2は、ともに水素であることはない。）
【請求項５】
次式の化合物およびその製薬上許容される塩。
【化３】
2005530804.tif 000015
（式中、R1はプロパノロール（propanolol）、インデノロール（indenolol）、カルピンドロール（carpindolol）、ブプラノロール（bupranolol）、およびメピンドロール（mepindolol）からなるβブロッカーの群より選ばれる。）
【請求項６】
該βブロッカー置換基はプロパノロール（propanolol）である、請求項5の化合物。
【請求項７】
次式の化合物およびその製薬上許容される塩。
【化４】
2005530804.tif 000016
（式中、R1、R2およびR3は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、カルボニル、ハロゲン、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであり、かつ、
R1、R2およびR３は、同じでも少なくとも一つが異なっていてもよく、かつ
R1、R2およびR３は、すべてが水素であることはない。）
【請求項８】
次式の化合物。
【化５】
2005530804.tif 000017
（式中、R1は水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、カルボニル、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルである。）
【請求項９】
式（I）
【化６】
2005530804.tif 000018
式（II）
【化７】
2005530804.tif 000019
式（III）
【化８】
2005530804.tif 000020
および式（IV）
【化９】
2005530804.tif 000021
からなる群より選ばれるものである、請求項8の化合物。
【請求項１０】
次式の化合物およびその製薬上許容される塩。
【化１０】
2005530804.tif 000022
（式中、R1はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、カルボニル、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであり、かつ
R1はイソプロピルではない。）
【請求項１１】
R1はメタン、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、イソペンチル、tert-ペンチル、ネオペンチル、またはイソヘキシルである、請求項10の化合物。
【請求項１２】
式（I）
【化１１】
2005530804.tif 000023
式（II）
【化１２】
2005530804.tif 000024
および式（III）
【化１３】
2005530804.tif 000025
からなる群より選ばれるものである、請求項10の化合物。
【請求項１３】
次式の化合物。
【化１４】
2005530804.tif 000026
【請求項１４】
次式の化合物。
【化１５】
2005530804.tif 000027
【請求項１５】
次式の化合物。
【化１６】
2005530804.tif 000028
【請求項１６】
哺乳動物の癌を治療する方法であって、Her2発現の小分子阻害剤の臨床上有効な量を該哺乳動物に投与することを特徴とする、方法。
【請求項１７】
該癌が乳癌である、請求項16の方法。
【請求項１８】
哺乳動物の乳癌を治療する方法であって、臨床上有効な量のアダマノロール（adamanolol）、官能基化アダマノロール誘導体、またはそれらの製薬上許容される塩を該哺乳動物に投与することを特徴とする、方法。
【請求項１９】
請求項1の化合物またはその製薬上許容される塩を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願の相互参照]
本願は、米国仮特許出願第60/380,481号（2002年5月14日出願）に基づく優先権を主張するものであり、その内容は、この引用によりそっくり本明細書に記載されたものとする。
【０００２】
[研究開発の援助について]
本研究はウェルチ財団（Welch Foundation）（ヒューストン、テキサス州）からの助成金（第Q-1490号）を受けてなされたものである。
【０００３】
本発明の分野は、Her2発現の阻害剤に関する。また本発明の分野は、Sur-2（ヒトメディエーター複合体のRas(ラス)関連サブユニット）のペプチド模倣阻害剤に関し、さらに、哺乳動物における乳癌の治療にそれらを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
プロト癌遺伝子HER2/neu（C-erbB-2）は、トランスメンブラン（膜貫通）チロシンキナーゼ増殖因子受容体をコードする。HER2タンパク質の名称はヒト表皮増殖因子受容体（Human Epidermal growth factor Receptor）に由来する。というのも、それが、表皮増殖因子受容体（EGFR）と実質的に相同であることを特徴とするからである。この膜貫通受容体の過剰発現が、乳癌の約30％において見られ（Slamon他、1987）、それは、米国において年間6万もの症例に達する。現在のところ、15,000以上の患者を含む多様な臨床研究によって、HER2/neuの異常と乳癌の結果との関係が評価されており、その中には、遺伝子および／またはタンパク質異常と予後との関連性について47以上の刊行物が含まれる（Ross他、1999）。これらの研究は、HER2タンパク質の過剰発現が乳癌における不利な結果と関連していることをはっきり示している。
【０００５】
癌遺伝子Her2（neu/ErbB2）の過剰発現は、胸部腫瘍の約30％に見られる（Slamon他、1987; Ross他、1999）。この膜貫通受容体の過剰発現がなぜ乳癌で生じるのか明らかではないが、Her2の過剰な患者は典型的に、より症状が重く、転移が早く、化学療法に対する抵抗性が高い。Her2タンパク質に対するモノクローナル抗体は、これらHer2陽性患者の治療に好結果をもたらした。ヘルセプチン（Herceptin（登録商標））と呼ばれるヒト化抗体は、臨床研究において腫瘍に対し阻害作用および化学的感作作用をはっきり示し、Her2過剰発現性乳癌の治療に対しFDAが認可した唯一の薬剤である（Drebin他、1986; Drebin他、1985）。Her2抗体による治療が臨床上好結果をもたらしたことは、基礎的な癌の生物学が癌の臨床治療に生かされた非常によい例である。しかし、抗体治療単独は、Her2過剰発現性乳癌の治療的介入にとって理想的でない場合もありうる。理論的には、すでに過剰発現された高レベルのHer2タンパク質をねらうよりも、Her2遺伝子の発現を阻害するほうが、効率的にHer2のダウンレギュレーションを達成しうる。AIDS治療から類推すると、薬剤のカクテル（それぞれが異なる作用機序を有する）もまた、乳癌を完治させるのにより効果的でありうる。従って、特に小さな有機分子を介してHer2の発現を外から制御する手段を見出すことは、依然として魅力のあることである。
【０００６】
Her2の過剰発現は、二つの異なるメカニズム、遺伝子の複製および転写の増加の組み合わせ、を介して達成されうる。両方の場合において、過剰なHer2のmRNAが生成され、そして、このプロセスは、遺伝子転写のレベルで制御されうる。乳癌においてHer2遺伝子を活性化する転写因子の研究において、Chang他はEts因子ESX（セリンボックスを有する表皮特異的なもの）を同定した（Chang他、1997）。ESXは、Her2過剰発現性乳癌細胞において過剰に発現され、そして、Her2遺伝子のプロモーターに結合してそれを強くトランス活性化する。ESX結合要素をHer2プロモーターから欠失させると、その活性化が完全になくなるため、細胞でのHer2遺伝子活性化におけるESXの重要性が示唆されている（Scott他、1994）。ESXの発現は、表皮特異的であり、哺乳動物の腺、気管、前立腺、および胃において多い（Andreoli他、1997）。ESXは、これらの組織においてHer2の発現を制御するユニークな転写因子であるかもしれない。
【０００７】
現行の薬物療法は、わずか約500の分子ターゲットを扱っているにすぎない。細胞膜受容体および酵素が、現行すべての薬物ターゲットの約80％を占めており、核受容体（および癌の化学療法の場合DNA）を除いて、核における薬物ターゲットはほとんどない（Drews他、2000）。核における新たな分子ターゲットを見出すことは、薬物ターゲットの範囲を広げることになり得、そして、主要なヒトの病気を治療するため別の治療戦略をもたらしうる。たとえば、癌治療用ターゲットの候補としてヒストンデアセチラーゼが最近発見されたことは、薬物の発見研究に非常に大きな衝撃を与えた（Kwon他、1998; Hassing他、1997; Taunton他、1996; Lin他、1998）。薬物ターゲットとしての転写コアクチベーター（活性化補助因子）の可能性は、予測される治療上の表現形がないために、探究されていない。コアクチベーターのサブセットは、すべてではないとはいえ、医薬による介入のターゲットとして役立ちうる。
【０００８】
ヒトゲノムの完全な分析により、空前の数の薬物ターゲット候補ができると考えられる。それらのゲノムによる仮のターゲットのうち、GPCR類や酵素類のような「比較的容易な」ターゲットは、製薬工業において、必ず直ぐに注目されるようになる。しかし、タンパク質−タンパク質相互作用を含むより難しいゲノムによるターゲットを、将来の医薬開発の飛躍のため評価する必要がある。
【０００９】
酵素や細胞核ホルモン受容体よりもタンパク質−タンパク質相互作用は、小さな有機分子によってねらい難いものである。タンパク質−タンパク質結合は、典型的に、比較的広い表面領域にわたって生じ、その二つのタンパク質間の結合表面は、平たくなりやすく、しかも、小さな有機分子に合う結合部位を与えるようなポケット（くぼみ）を持たないことが多い。それにもかかわらず、タンパク質−タンパク質界面は、性質が多種多様であり、あるものは他のものよりより優れた薬物適性を示すことがありうる。そのよい例が、ソマトスタチン受容体とβターンペプチドリガンドとの間の相互作用である。
【００１０】
最近の研究は、タンパク質の短いαらせんセグメントによって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用が、小さな非ペプチド分子による阻害と同様に取り扱いやすいことを示唆する。シグナル伝達および遺伝子転写の分野において、タンパク質のらせんペプチドセグメントは、かなりの生物学的に重要なタンパク質結合を担っている。二つの癌関連核タンパク質、ESX（表皮特異的転写因子）とSur−2/DRIP130（ヒトメディエーター複合体のRas(ラス)関連サブユニット）との間の相互作用が、悪性乳癌細胞におけるHer2癌遺伝子の過剰発現に必要であり、従って、それは、米国において年間60,000にのぼるHer-2陽性乳癌のための治療ターゲット候補として役立つ。その相互作用は、ESXの転写活性化ドメインにおける8つのアミノ酸らせん領域（配列番号1：Ser-Trp-Ile-Ile-Glu-Leu-Leu-Glu）の一つの面によって媒介され、そして、該らせんの疎水性面におけるトリプトファン残基は、相互作用の特異性に対してユニークな貢献をする。その界面が比較的小さいことおよびトリプトファン残基が重要であることは、インドール、ベンゾイミダゾール、およびベンゾジアゼピンの構造ファミリー（生物学的に利用可能な薬物に見られるπ電子に富むインドール模倣ファーマコア（pharmacore））に富む化学品ライブラリーにおいて小分子阻害剤が存在することを示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は小分子のHer2発現阻害剤を提供することである。本発明の一態様において、Her2発現阻害剤はペプチド模倣物（ペプチドミメティック）である。本発明の他の態様において、Her2発現阻害剤はESXのαらせん模倣物（αへリックス模倣物）である。本発明の一態様において、Her2発現阻害剤は配列番号1のαらせん模倣物である。本発明の一態様は、次式の化合物およびその製薬上許容される塩である。
【００１２】
【化１】
2005530804.tif 000003
（式中、R1はインドール基、インドール誘導体基、アルキル、トリハロアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、スルフィニル、スルホニル、カルボニル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、またはアミノであり、R2は水素、ヒドロキシ、ナイトレート（nitrate）基、ハロゲン、低級アルキル、またはカルボニルであり、R3はハロゲン、低級アルキル、カルボニル、アリール、アラルキル、または複素環基であり、かつR4はアダマンタン基、アダマンタン誘導体基、アルキル、トリハロアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、スルフィニル、スルホニル、S-スルホンアミド、N-スルホンアミド、トリハロメタン−スルホンアミド、ハロゲン、カルボニル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、またはアミノであり、かつ、R1がインドール基、R2がヒドロキシル、かつR3がイソプロピルであるとき、R4はアダマンタン基ではない。）特定の態様において、R4はビフェニルである。他の具体的態様において、R2はヒドロキシル基であり、両ラセミ体が意図される。他の具体的態様において、R1はインドール基であり、該インドール基上の窒素は、トシル置換基を有している。
【００１３】
本発明のある特定の態様は、次式の化合物およびその製薬上許容される塩である。その式中、R1およびR2は水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、カルボニル、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであり、かつ、R1およびR2は、同じでも異なっていてもよく、かつともに水素であることはない。
【００１４】
【化２】
2005530804.tif 000004
本発明のさらなる具体的態様は、次式の化合物およびその製薬上許容される塩である。
【００１５】
【化３】
2005530804.tif 000005
（式中、R1はプロパノロール（propanolol）、インデノロール（indenolol）、カルピンドロール（carpindolol）、ブプラノロール（bupranolol）、およびメピンドロール（mepindolol）からなるβブロッカーの群より選ばれる。）本発明のさらなる具体的態様において、R1はプロパナロール（propanalol）である。
【００１６】
本発明の他の具体的態様は、次式の化合物およびその製薬上許容される塩である。
【００１７】
【化４】
2005530804.tif 000006
（式中、R1、R2およびR3は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、カルボニル、ハロゲン、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであり、かつ、R1、R2およびR３は、同じでも少なくとも一つが異なっていてもよく、かつすべてが水素であることはない。）
本発明のさらなる態様は、次式の化合物である。
【００１８】
【化５】
2005530804.tif 000007
（式中、R1は水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、カルボニル、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルである。）本発明のさらなる具体的態様において、R1はメチル基、ベンゼン基、フェニル、トルエン基、ビフェニル、またはナフタレート基である。
【００１９】
次式の化合物およびその製薬上許容される塩もまた意図される。
【００２０】
【化６】
2005530804.tif 000008
（式中、R1はアルキル、アミノアルキル、グアニジノアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、ハロゲン、カルボニル、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであり、かつR1はイソプロピルではない。）本発明のさらなる具体的態様において、R1は2、3、4または5つの炭素を有する炭化水素鎖である。さらなる具体的態様において、該炭化水素鎖は、ヒドロキシル基またはアミン基の末端を有してもよい。
【００２１】
本発明の一態様は、哺乳動物の乳癌を治療する方法であって、臨床上有効な量のHer2発現の小分子阻害剤を該哺乳動物に投与することを特徴とする方法である。本発明の一具体的態様は、哺乳動物の乳癌を治療する方法であって、臨床上有効な量のアダマノロール（adamanolol）、官能基化アダマノロール誘導体、またはそれらの製薬上許容される塩を該哺乳動物に投与することを特徴とする方法である。
【００２２】
本発明の一態様は、請求項1の化合物またはその製薬上許容される塩を含む医薬組成物である。
【００２３】
上記は、以下に述べる本発明の詳細な説明がより良く理解されるように、本発明の特徴および技術上の利点をかなり大まかに概説したものである。本発明のさらなる特徴および利点は、以下に記載され、それらは、本願特許請求の範囲の主題を構成する。当業者に明らかなことであるが、本明細書に開示する概念および特定の態様は、同じ本発明の目的を果たすため、他の構造を変更または設計する際の基礎としてすぐに利用できる。また当業者に明らかなことであるが、そのような等価な構築物は添付の特許請求の範囲に示す本発明の精神および範囲から逸脱しない。その構成と実施法の両方に関して本発明に特有であると考えられる新規な特徴は、さらなる目的および利点と共に、以下の説明を添付の図面と一緒に考慮することにより、より良く理解されるだろう。ただし、当然のことながら、各図面は本発明を例示し説明するためだけにあるのであって、各図面は本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
当業者に明らかなとおり、本発明の範囲および精神を逸脱することなく本願に開示される本発明に対し種々の具体化および改変をなすことができる。
【００２５】
ここで使用する語「a」または「an」は、用語「を含む（comprising）」とともに特許請求の範囲および／または明細書で使用されるとき、「一つの」を意味しうるが、それはまた「一つ以上」、「少なくとも一つ」および「一つまたは複数の」の意味とも一致する。
【００２６】
ここで使用する用語「DRIP-130」は「Sur-2」と交換可能である。「Sur-2」はヒトメディエーター複合体のRas関連サブユニットであり、配列番号2を含む。
【００２７】
ここで使用する用語「Her2発現の阻害」は、Sur-2のESX（Her2発現を調節する）との相互作用の阻害を指す。Sur-2阻害の結果はHer2の転写の減少である。従って、Sur2阻害はHer2発現の阻害をもたらす。
【００２８】
ここで使用する用語「哺乳動物」は、本発明の方法のための適当な対象である。哺乳動物は、ヒトを含む高等脊椎動物である哺乳類を構成する任意の動物とすることができ、生児出生、体毛、および幼体に与えるための乳を分泌する雌の乳腺を特徴とする。さらに哺乳動物の特徴には、気候状態の変化にもかかわらず一定の体温を保持するその能力がある。哺乳動物の具体例には、ヒト、ネコ、イヌ、ウシ、マウス、ラット、およびチンパンジーが含まれる。哺乳動物は「患者」と呼んでもよい。
【００２９】
「ペプチド」は、アミノ酸であるモノマーがアミド結合を介して互いに結合されているポリマーを指し、代わりにポリペプチドと呼ばれることもある。アミノ酸がα−アミノ酸であるとき、L-光学異性体またはD-光学異性体のいずれも使用することができる。さらに、天然でないアミノ酸、たとえばβ−アラニン、フェニルグリシンおよびホモアルギニンもまた含まれる。アミノ酸はD-異性体またはL-異性体のいずれであってもよい。L-異性体が一般に好ましい。総合的な概説については、B. Weinstein編, CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES AND PROTEINS, Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)のSpatola, A. F.の部分を参照されたい。
【００３０】
ここで使用する用語「ペプチド模倣物（ペプチドミメティック）」は、ホルモン、サイトカイン、酵素基質、ウイルス、または他の生物分子上にある決定基を生物学的に模倣する化合物であり、そして、それは、天然のリガンドの生理学的活性を拮抗により打ち消す、刺激する、さもなくば調節することができる。タンパク質の二次または三次構造の要素を模倣する所定の模倣物は、Johnson他（1993）に記載されている。ペプチド模倣物を使用する理論的根拠は、タンパク質のペプチド骨格は、抗体および／または抗原のように分子相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を主に配向して存在するということである。従って、ペプチド模倣物は、分子相互作用が天然の分子と類似になるよう設計される。タンパク質の表面においてαへリックスまたはβターンのコンフォメーションにあるアミノ酸残基を認識するよう分子を設計する。疾患に関係するある特定のタンパク質−タンパク質相互作用の阻害にそのような分子を用いることができる。本発明においてSur-2を阻害する新規な化合物を説明する。それらの化合物はSur-2のαへリックス模倣物である。具体的態様において、阻害剤は、Sur-2と相互作用するESXの8アミノ酸（配列番号1）αへリックスドメインを模倣する。当業者に理解されるとおり、ESXの他のαへリックスドメインも、小分子ペプチド模倣物のための適当なターゲットとなりうる。
【００３１】
ここで使用する用語「タンパク質」は、任意のタンパク質を意味し、ペプチド、酵素、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、増殖因子などを含むが、それらに限定されるものではない。目下、好ましいタンパク質は少なくとも25のアミノ酸残基からなるものを含み、より好ましいタンパク質は少なくとも35のアミノ酸残基からなるものを含み、さらに好ましいタンパク質は少なくとも50のアミノ酸残基からなるものを含む。
【００３２】
一つまたは複数の不斉炭素原子を含む本発明のあらゆる化合物は、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一の鏡像異性体（エナンチオマー）、ジアステレオマー混合物、ならびに個々のジアステレオマーとして、生じうる。それらの化合物のそのような異性体の形すべてが本発明に含まれることは明らかである。各立体中心炭素は、R配置またはS配置であるか、あるいは、複数の配置の組み合わせとなりうる。本発明の化合物には、一つより多い互変異性体として存在しうるものもある。本発明は、そのような互変異性体をすべて含む。本発明の化合物は、もっぱら、当業者にとって明らかなように、化学的に安定であると考えられるものである。たとえば、ダングリング原子価を有することになる化合物、あるいはカルボアニオンは、本発明の意図する化合物ではない。任意の芳香環系（炭素環または複素環）は、その一不飽和またはポリ不飽和でありうる非芳香環系、およびその位置異性体またはその類似体を含むと解するものとする。ここに記載されるあらゆる化合物で「窒素」および「硫黄」を有するものは、窒素および硫黄の任意の酸化された形態および任意の塩基性窒素の四級化された形態を含むものとする。ここで特にことわらない限り、すべての命名法は当該技術分野の標準に従う。
【００３３】
1．化学物質の定義および誘導体
A.アダマノロール（adamanolol）
ここで使用する用語「アダマノロール」は、次式からなる化合物であるとして定義される。
【００３４】
【化７】
2005530804.tif 000009
アダマノロールの化学名は1'-(アダマンタン-1-カルボニル)-[4,4']ビピペリジニル-1-カルボン酸[2-ヒドロキシ-3-3-(1H-インドール-4-イルオキシ)-プロピル]-イソプロピル-アミドである。
【００３５】
ここで使用する用語「官能基化アダマノロール誘導体」は、アダマノロールの小分子化合物誘導体であって、該アダマノロール化合物のSur-2阻害活性を保持するものを示し、そして、一般に、次式のものである。
【００３６】
【化８】
2005530804.tif 000010
（式中、R1はインドール基、インドール誘導体基、アルキル、トリハロアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、スルフィニル、スルホニル、カルボニル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、またはアミノであり、
R2は水素、ヒドロキシ、ナイトレート（nitrate）基、ハロゲン、低級アルキル、またはカルボニルであり、
R3はハロゲン、低級アルキル、カルボニル、アリール、アラルキル、または複素環基であり、かつ
R4はアダマンタン基、アダマンタン誘導体基、アルキル、トリハロアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、スルフィニル、スルホニル、S-スルホンアミド、N-スルホンアミド、トリハロメタン−スルホンアミド、ハロゲン、カルボニル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、またはアミノである。
【００３７】
当業者に明らかなように、Her2発現の阻害の強さは、官能基化誘導体の中で変化しうる。本発明のある態様では、官能基化アダマノロール誘導体のHer2発現阻害はアダマノロールのそれより小さく、そして、本発明の別の態様では、官能基化アダマノロール誘導体のHer2発現阻害はアダマノロールのそれより大きくなる。
【００３８】
B.インドール類
インドールは無色の結晶性固体である。その定容燃焼熱は4,268MJ/mol(1020kcal/mol)である。該分子は平面構造で中位の極性を有するにすぎない。インドールは、石油エーテル、ベンゼン、クロロホルム、および熱水を含む広範な溶媒に対し、高い溶解性を有する。インドールは、高濃度の強塩基および強酸のいずれとも塩を形成する。強塩基によって、そのアニオンは、芳香系に広がる電子の非局在化により安定化される。そして、脱プロトン化のpKが16.97であるインドールは、単純なアミンよりも強い酸である。逆に、窒素原子の非共有電子対が芳香系に不可欠の部分であるため、インドールは、強酸と組み合わされるとき、アルキルアミンやピリジンよりもかなり弱い塩基であり、プロトン化に対し-3.5のpK値を与える。プロトン化は、N1またはC3の位置で起こり、インドリウムイオンまたはインドレニニウム（indoleninium）イオンをもたらす。
【００３９】
分光法による証拠は、強い硫酸または過塩素酸中、プロトン化がC3の位置で起こることを明らかにしている。二量体および三量体の形成は状況を複雑にし、2-置換インドール（立体上の理由から二量化しない）の場合を除いて、平衡は、インドール、二量体、三量体、およびそれらの塩の間で成立する。ここで使用する用語「インドール誘導体」または「置換インドール」は、次の一般式の化合物を指す。
【００４０】
【化９】
2005530804.tif 000011
（式中、R1およびR2は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、カルボニル、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであってもよく、かつ、R1およびR2は、同じでも異なっていてもよい。）本発明の他の態様において、意図するところによれば、環の窒素は置換されていてもよく、そして、その置換基は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、カルボニル、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであってもよく、かつ、R1およびR2は、ともに水素であることはない。用語「インドール」または「非置換インドール」は、上記式の化合物でR1およびR2がともに水素であるものを指す。
【００４１】
Xは、アダマノロールまたは官能基化アダマノロール誘導体に対するインドールの結合部位を表す。
【００４２】
C.βブロッカー
βブロッカー類は、心臓血管（循環器系）疾患の治療に使用するため必要とされる薬剤の群を含む。プロプラノロール、オキシプレノロール、ピンドロール、ナドロール、チモロール、およびラベタロールを含む非選択的βブロッカーは、β1−およびβ2−アドレナリン作動性受容体の両方に拮抗する。βブロッカーの化学構造に共通する特徴は、存在する少なくとも一つの芳香環構造が、第二級ヒドロキシルおよびアミン官能基を有するアルキル側鎖に結合していることである。利用可能なβブロッカーのそれぞれが、一つまたは複数のキラル中心をその構造中に有しており、そして、すべての場合、アルキル側鎖に存在するキラル炭素原子の少なくとも一つは、ヒドロキシル基に直接結合している。一つのキラル中心を有するβブロッカーのそれぞれ（たとえば、プロプラノロール、メトプロロール、アテノロール、エスモロール、ピンドロール、およびアセブトロール）は、チモロールを除いて、ラセミ化合物として販売されている。
【００４３】
当業者に明らかなように、所定の態様において、官能基化アダマノロール誘導体はβブロッカーの側基置換基を有するが、それらの小分子誘導体は、機能的にβブロッカーとは別個のものであり、異なる薬理学的活性を示すものである。
【００４４】
D.アダマンタンおよび誘導体
当業者に明らかなとおり、アダマンタンはトリシクロ（3,3,1,13,7）デカンであり、またCAS No.(281-23-2)およびEINECS No.(206-001-4)により解説されている。架構構造を決定するその10の炭素原子は、実質的にひずみのない態様で配置されており、そのため、種々の成分の付加に対し、非常に安定な骨格をもたらしている。これらの炭素原子のうち４つ（橋頭炭素）は、分子の中心に対し、四面体の配置にある。他の６つ（メチレン炭素）は八面体の配置にある。アダマンタンの特異な反応性のため、官能基は、アダマンタン橋頭の1-、3-、5-、7-の位置に容易に導入されている。本発明において、アダマンタン基は、1位においてアダマノロールに結合される。ChapmanおよびWhitehurstの米国特許第5,019,660号ならびにChapmanの米国特許第5,053,434号は、種々のダイヤモンドイド（diamondoid）化合物のメチレン位を介して結合するダイヤモンドイド化合物を開示する。ダイヤモンドイド分子の化学について概略を調べるのであれば、Adamantane, The Chemistry of Diamond Molecules, Raymond C. Fort, Marcel Dekker, New York, 1976を参照されたい。アダマンタン類の合成法については、Paul Schleyer, Cage Hydrocarbons, George A. Olah編, Wiley, New York, 1990を参照されたい。
【００４５】
具体的態様において、次式の化合物が意図される。
【００４６】
【化１０】
2005530804.tif 000012
式中、アダマンタン基は、置換されたアダマンタン誘導体、たとえば、1−アダマンタノール、1−アダマンタンカルボン酸、1−アダマンチルメチルケトン、アダマンタノン、アダマンタノール、または1−ブロモアダマンタンであってもよい。R1、R2およびR3は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、カルボニル、ハロゲン、アセチル、カルボキシ、スルホニル、またはトリハロメタン−スルホニルであってもよく、かつ、R1、R2およびR３は、同じでも少なくとも一つが異なっていてもよく、すなわち、すべてが異なっていてもよく、あるいは、一つが異なっていてもよい。R1、R2およびR３がすべて水素である場合、当該基は「アダマンタン」または「非置換アダマンタン」である。R1、R2およびR３すべてが水素であるわけではない場合、当該基は「アダマンタン誘導体」あるいは「置換されたアダマンタン」である。
【００４７】
E.他の側基置換基
意図するところによれば、官能基化アダマノロール誘導体は置換基を有する。具体的態様において、それらの基の定義は以下に示すとおりである。
【００４８】
ここで使用する用語「アルキル」は、約1〜約20の炭素原子、より好ましくは約1〜約10の炭素原子を含む直鎖、分枝鎖、または環式の炭化水素鎖フラグメントまたはラジカル（たとえば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、シクロブチル、アダマンチル、ノルアダマンチルなど）を指す。また、8以下の炭素原子を有する直鎖、分枝鎖、または環式の炭化水素鎖は、ここで「低級アルキル」と呼ぶこととする。炭化水素鎖は、さらに一以上の不飽和度を有してもよく、すなわち、一つ以上の二重結合または三重結合を有してもよい（たとえば、ビニル、プロパルギル、アリル、2-ブテン-1-イル、2-シクロペンテン-1-イル、1,3-シクロヘキサジエン-1-イル、3-シクロヘキセン-1-イルなど）。上述したような二重結合を含むアルキル基は、ここで「アルケン」とも呼ばれる。同様に、三重結合を有するアルキル基は、ここで「アルキン」とも呼ばれる。しかし、環式のアルキル基について述べるとき、二重結合および／または三重結合の組み合わせは、環式炭化水素鎖を芳香族性にするような結合配置を含まない。
【００４９】
用語「オキソ」は二重結合の酸素を意味する。
【００５０】
さらに、ここで使用する用語「アルキル」は、炭化水素フラグメントまたはラジカルの一つ以上の炭素原子における一つ以上の置換基をも含む。そのような置換基には、アリール、複素環、ハロゲン（たとえばトリフルオロメチル、−CF3を形成する）、ニトロ（−NO2）、シアノ（−CN）、ヒドロキシル（ここでは「ヒドロキシ」ともいう）、アルコキシル（ここではアルコキシともいう）もしくはアリールオキシル（ここでは「アリールオキシ」、−ORともいう）、チオもしくはメルカプト、アルキルもしくはアリールチオ（−SR）、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルもしくはジアリールアミノ、またはアリールアルキルアミノ（−NRR'）、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニルもしくはアリールアルキルアミノカルボニル（-C(O)NRR'）、カルボキシル、または、アルキルもしくはアリールオキシカルボニル（-C(O)OR）、カルボキシアルデヒド、またはアリールもしくはアルキルカルボニル（-C(O)R）、イミニル（iminyl）、アリールもしくはアルキルイミニル、スルホ（-SO2OR）、アルキルもしくはアリールスルホニル（-SO2R）、カルバミド、またはチオカルバミド（ここでRおよびR'は、独立してそれぞれ水素、アリールまたはアルキル（上記のような）である）が含まれるが、それらに限定されるものではない。複素環式基を含む置換基（すなわち、複素環、ヘテロアリール、およびヘテロアラルキル）は、上述した用語と同様に定義される。たとえば、用語「複素環オキシ」は、基-OR（Rは以下に規定する複素環）を指す。
【００５１】
用語「メチレン」は基-CH2-を指す。
【００５２】
用語「メチン」は、メチレン基の一つの水素原子が上述したような置換基で置換されたものを指す。また用語「メチン」は、メチレン基の一つの水素原子が混成炭素中心を形成する結合によって置き換わったものも指すことができる。
【００５３】
ここで使用する用語「ハロ」または「ハロゲン」は、置換基であるフルオロ、ブロモ、クロロ、およびヨードを指す。
【００５４】
ここで使用する用語「カルボニル」は、官能基-C(O)-を指す。しかし、当然のことながら、この基は、チオカルボニル（-C(S)-）、スルフィニル（-S(O)-）、スルホニル（-SO2-）、ホスホニル（-PO2-）、およびメチンのような、類似の電子的および／または立体的性質を有する周知の基によって置換することができる。その他のカルボニル等価物は、医薬および有機化学の技術分野における当業者によく知られるものである。
【００５５】
ここで使用する用語「アリール」は、20以下の炭素原子を有する環式の芳香族炭化水素鎖、たとえば、フェニル、ナフチル、ビフェニルおよびアントリルを指す。アリール基の一つまたは複数の炭素原子は、たとえば以下の置換基を有してもよい。アルキル、アリール、複素環基、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシルもしくはアリールオキシル、チオもしくはメルカプト、アルキルもしくはアリールチオ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキル、ジアリールもしくはアリールアルキルアミノ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニルもしくはアリールアルキルアミノカルボニル、カルボキシル、または、アルキルもしくはアリールオキシカルボニル、カルボキシアルデヒド、またはアリールもしくはアルキルカルボニル、イミニル（iminyl）、またはアリールもしくはアルキルイミニル、スルホ、アルキルもしくはアリールスルホニル、ヒドロキシイミニル、またはアリールもしくはアルコキシイミニル、カルバミド、またはチオカルバミド。さらに、アリール基の二つ以上のアルキルまたはヘテロアルキル置換基が組み合わさって、縮合したアリール−アルキルまたはアリール−ヘテロアルキル環系（たとえばテトラヒドロナフチル）を形成してもよい。複素環式基を含む置換基（たとえば複素環オキシ、ヘテロアリールオキシ、およびヘテロアラルキルチオ）は、上述した用語と同様に定義される。
【００５６】
ここで使用する用語「アラルキル」は、上述したようなアルキル基によって親構造に結合されたアリール基、たとえばベンジル、α−メチルベンジル、フェネチルなどを指す。
【００５７】
ここで使用する用語「複素環」は、上で規定したような環式アルキル基またはアリール基において一つ以上の炭素原子が炭素でない原子、特に窒素、酸素または硫黄によって置換されたものを指す。また、ここで非芳香族複素環は「環式へテロアルキル」とも呼ばれる。また、ここで芳香族複素環は「ヘテロアリール」とも呼ばれる。たとえば、そのような基には、フリル、テトラヒドロフリル、ピロリル、ピロリジニル、チエニル、テトラヒドロチエニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピラゾリジニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イミダゾリル、イミダゾリニル、ピリジル、ピリダジニル、トリアジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピラジニル、ピペラジニル、ピリミジニル、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、インドリル、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、キヌクリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、プリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、およびベンゾオキサゾリルが含まれる。
【００５８】
上記複素環式基は、さらに、ヘテロアリール基の一つ以上の炭素および／または非炭素原子において、一つ以上の置換基、たとえば、アルキル、アリール、複素環基、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、アルコキシルもしくはアリールオキシル、チオもしくはメルカプト、アルキルもしくはアリールチオ、アミノ、アルキル、アリール、ジアルキル、ジアリールもしくはアリールアルキルアミノ、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニルもしくはアリールアルキルアミノカルボニル、カルボキシル、または、アルキルもしくはアリールオキシカルボニル、カルボキシアルデヒド、またはアリールもしくはアルキルカルボニル、イミニル（iminyl）、またはアリールもしくはアルキルイミニル、スルホ、アルキルもしくはアリールスルホニル、ヒドロキシイミニル、またはアリールもしくはアルコキシイミニル、カルバミド、またはチオカルバミドを有してもよい。さらに、二つ以上のアルキル置換基が組み合わさって、縮合した複素環−アルキルまたは複素環−アリール環系を形成してもよい。複素環式基を含む置換基（たとえば複素環オキシ、ヘテロアリールオキシ、およびヘテロアラルキルチオ）は、上述した用語と同様に定義される。
【００５９】
用語「複素環アルキル」は、一つ以上の上述したようなアルキル基によって親構造に結合された複素環基、たとえば2-ピペリジルメチルなど、を指す。ここで使用する用語「ヘテロアラルキル」は、一つ以上の上述したようなアルキル基によって親構造に結合されたヘテロアリール基、たとえば2-チエニルメチルなど、を指す。
【００６０】
用語「トシル」または「Ts」は以下に示すp−トルエンスルホネートを指す。それは、強酸であるp−トルエンスルホン酸の共役塩基である。スルホネートエステルは、スルホネート基（-O-S(=O)(=O)）を有する化合物であり、ここで単結合の酸素は炭素に直接結合しており、その炭素は、任意の原子に単結合してもよいし、炭素にのみ多重結合してもよい。用語「メシル」または「Ms」はメシル基を指し、それは式CH3SO2-を有するスルホネートエステルである。
【００６１】
2．医薬用の塩およびエステル
遊離の塩基を適当な有機酸または無機酸と反応させることにより一般的に調製される非毒性の塩およびエステルは、医薬用として適当である。典型的な塩およびエステルには以下のものが含まれる。酢酸塩（エステル）、ラクトビオン酸塩（エステル）、ベンゼンスルホン酸塩（エステル）、ラウリン酸塩（エステル）、安息香酸塩（エステル）、リンゴ酸塩（エステル）、重炭酸マレイン酸塩（エステル）（Bicarbonate Maleate）、重硫酸マンデル酸塩（エステル）（Bicarbonate Mandelate）、酒石酸水素塩（エステル）、メシレート（mesylate）、ホウ酸塩（エステル）、メチル臭化物、臭化物、メチル硝酸塩（エステル）、カルシウムエデト酸塩（エステル）、メチル硫酸塩（エステル）、カンシル酸塩（エステル）、ムケート（mucate）、炭酸塩（エステル）、ナプシル酸塩（エステル）、塩化物、硝酸塩（エステル）、クラブラン酸塩（エステル）、N-メチルグルカミン、クエン酸塩（エステル）、アンモニウム塩、二塩酸塩、オレイン酸塩（エステル）、エデト酸塩（エステル）、シュウ酸塩（エステル）、エディシレート（edisylate）、パモ酸塩（エステル）（エンボネート（embonate））、エストレート（estolate）、パルミチン酸塩（エステル）、エシレート（esylate）、パントテン酸塩（エステル）、フマル酸塩（エステル）、リン酸塩（エステル）／二リン酸塩（エステル）、グルセプテート（gluceptate）、ポリガラクツロン酸塩（エステル）、グルコン酸塩（エステル）、サリチル酸塩（エステル）、グルタミン酸塩（エステル）、ステアリン酸塩（エステル）、グリコリルアルサニレート（glycollylarsanilate）、硫酸塩（エステル）、ヘキシルレゾルシン酸塩（エステル）、スバセテート（subacetate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、コハク酸塩（エステル）、臭化水素酸塩、タンニン酸塩（エステル）、塩酸塩、酒石酸塩（エステル）、ヒドロキシナフトエ酸塩（エステル）、テオクル酸塩（エステル）、ヨウ化物、トシラート、イソチオネート（isothionate）、トリエチオダイド（triethiodide）、乳酸塩（エステル）、吉草酸塩（エステル）。
【００６２】
3．医薬製剤
本発明の医薬組成物は、製薬上許容される担体中に溶解または分散された少なくとも一つのSur-2阻害剤またはさらなる薬剤の有効量を含む。「製薬上または薬理学上許容される」という表現は、動物、たとえばヒトに適宜投与したとき、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を引き起こさない分子実体および組成物を指す。少なくとも一つのSur-2阻害剤またはさらなる有効成分を含む医薬組成物の調製は、本開示に照らし、たとえば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第18版、Mack Printing Company, 1990 （この引用により本明細書にその内容が記載されたものとする）に示されるように、当業者に明らかなところである。さらに、動物（たとえばヒト）への投与の場合、明らかなように、製剤は、FDA生物製剤局の基準が要求する滅菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきである。
【００６３】
ここで使用する用語「製薬上許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（たとえば抗菌剤、抗真菌剤）、浸透圧調節剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬剤、医薬安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味・矯臭剤、着色剤などの材料およびそれらの組み合わせを包含する。それらは当業者に明らかなところである（たとえば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第18版、Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329（この引用により本明細書にその内容が記載されたものとする）を参照）。あらゆる通常の担体は、それが有効成分と適合しない場合を除き、本治療用組成物または本医薬組成物への使用が考えられる。
【００６４】
Sur-2阻害剤（Her2発現阻害剤）は、固体、液体またはエアロゾルの形態で投与するかどうか、注射のような投与経路のために滅菌が必要かどうかによって、異なる種類の担体を含みうる。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋内、腹膜内、皮下、結膜下、嚢内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所、局部、吸入（たとえばエアロゾル吸入）、注射、注入（輸注）、連続注入、局部灌流浴、細胞直接攻撃、カテーテル、洗浄、クリーム、脂質組成物（たとえばリポソーム）、またはその他の方法もしくは上記の任意の組み合わせにより、投与することができる。それらは当業者に明らかなところである（たとえば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第18版、Mack Printing Company, 1990（この引用により本明細書にその内容が記載されたものとする）を参照）。
【００６５】
動物の患者に投与される本発明の組成物の実際の用量は、身体的および生理的因子、たとえば、体重、症状の深刻さ、治療する疾患の種類、以前のまたは伴っている治療上の介入、患者の特発疾患、および投与経路によって決定することができる。いずれにせよ、投薬責任者は個々の対象に対し、組成物中の一つ以上の有効成分の濃度および適当な用量を決定することになる。
【００６６】
ある態様において、医薬組成物は、たとえば少なくとも約0.1％の活性化合物を含みうる。他の態様において、活性化合物は、単位（投薬単位）重量の約2％〜約75％、またはたとえば約25％〜約60％からなり得、そして、それらの中で任意の範囲を設定することができる。以下に限定されるものではないが、他の例において、用量は、1回の投与あたり、約1マイクログラム/kg/体重から、約5マイクログラム/kg/体重から、約10マイクログラム/kg/体重から、約50マイクログラム/kg/体重から、約100マイクログラム/kg/体重から、約200マイクログラム/kg/体重から、約350マイクログラム/kg/体重から、約500マイクログラム/kg/体重から、約1ミリグラム/kg/体重から、約5ミリグラム/kg/体重から、約10ミリグラム/kg/体重から、約50ミリグラム/kg/体重から、約100ミリグラム/kg/体重から、約200ミリグラム/kg/体重から、約350ミリグラム/kg/体重から、または約500ミリグラム/kg/体重から、約1000ミリグラム/kg/体重までまたはそれ以上までの範囲とすることができ、そして、それらの中で任意の範囲を設定することができる。以下に限定されるものではないが、ここに挙げる数値からの設定可能な範囲の例において、約5mg/kg/体重〜約100mg/kg/体重の範囲、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重の範囲等を、上記数値に基づいて投与することができる。
【００６７】
いずれの場合においても、組成物は、一つ以上の成分の酸化を遅らせるため種々の酸化防止剤を含むことができる。さらに、微生物の作用の防止を、防腐剤、たとえば種々の抗菌剤および抗真菌剤（パラベン類（たとえばメチルバラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されることはない）により、達成することができる。
【００６８】
Sur-2阻害剤を、遊離の塩基、中性または塩の形態で組成物に製剤することができる。製薬上許容される塩には、酸付加塩（たとえば、タンパク質組成物の遊離のアミノ基を用いて形成されるもの）が含まれ、酸付加塩は、たとえば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を用いて形成される。遊離のカルボキシル基を用いて形成される塩はまた、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【００６９】
組成物が液体の形態である態様において、担体は、たとえば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（たとえばトリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせなどを含む溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティングの使用によって、たとえば液体ポリオールまたは脂質のような担体中での分散による必要な粒径の維持によって、たとえばヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤の使用によって、あるいは、そらの方法の組み合わせによって、維持することができる。多くの場合、浸透圧調節剤、たとえば糖、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせなどを含めることが好ましい。
【００７０】
他の態様において、点眼剤、鼻用溶液もしくは鼻用スプレー、エアロゾルもしくは吸入剤を本発明で用いてもよい。そのような組成物は、一般に、目標とする組織の種類に適合するよう設計される。以下に限定されるものではないが、具体例において鼻用溶液は、通常、滴剤またはスプレーで鼻の通路に投与されるよう設計される水溶液である。鼻用溶液は、多くの点で鼻の分泌物に類似するよう、それにより通常の線毛（睫毛）の作用が維持されるよう、調製される。従って、好ましい態様において、鼻用水溶液は、通常、等張性であるか、または約5.5〜約6.5のpHを維持するよう若干緩衝剤が添加される。さらに、抗微生物用防腐剤（眼用製剤、薬剤に使用されるものと同様のもの）、あるいは、適当な医薬安定剤を、必要に応じて製剤中に含ませることができる。たとえば、種々の市販の鼻用製剤が、知られており、抗生物質や抗ヒスタミン薬を含んでいる。
【００７１】
ある態様において、Sur-2阻害剤は、経口摂取のような経路による投与のため調製される。そのような態様において、固体の組成物は、たとえば、溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤（たとえば硬殻ゼラチンカプセルもしくは軟殻ゼラチンカプセル）、徐放性製剤、バッカル組成物、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハー剤、またはそれらの組み合わせを含むことができる。経口組成物は、食餌療法の食物と直接混合してもよい。経口投与用の好ましい担体は、不活性な希釈剤、同化可能で食可能な担体またはそれらの組み合わせからなる。本発明の他の局面において、経口組成物は、シロップ剤またはエリキシル剤として調製してもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、たとえば、少なくとも一つの活性な薬剤、甘味剤、防腐剤、矯味・矯臭剤、着色剤、保存料、またはそれらの組み合わせを含みうる。
【００７２】
ある好ましい態様において、経口組成物は、一つ以上の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味・矯臭剤、およびそれらの組み合わせを含みうる。ある態様において、組成物は、以下のものの一つ以上を含みうる。結合剤、たとえばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、ゼラチン、またはそれらの組み合わせ、賦形剤、たとえばリン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムまたはそれらの組み合わせ、崩壊剤、たとえばコーンスターチ、ジャガイモでんぷん、アルギン酸、またはそれらの組み合わせ、滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、甘味剤、たとえばスクロース、ラクトース、サッカリンまたはそれらの組み合わせ、矯味・矯臭剤、たとえばハッカ剤、冬緑油、チェリーフレーバー、オレンジフレーバーなど、あるいは、以上のものの組み合わせ。投与単位の形態がカプセル剤である場合、それは、上記種類の材料のほかに、液体担体のような担体を含んでもよい。他の種々の材料を、コーティングとして、さもなくば、投与単位の物理的形態を修飾するために、存在させることができる。たとえば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤を、シェラック、糖、またはその両方でコーティングすることができる。
【００７３】
他の態様での投与に適したさらなる製剤には、座剤が含まれる。座剤は、種々の重量および形状を有する固体の投与形態であり、通常、直腸、膣または尿道に挿入するため適用される。挿入の後、座剤は、腔液において柔らかくなるか、溶融するか、あるいは溶解する。一般に、座剤のため、通常使用される担体には、たとえばポリアルキレングリコール、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせが含まれうる。ある態様において、座剤は、たとえば約0.5％〜約10％、好ましくは約1％〜約2％の範囲の有効成分を含む混合物から形成することができる。
【００７４】
滅菌した注射用溶液は、必要量の活性化合物を、適当な溶媒中で、上に列挙した他のさまざまな成分と必要に応じて混合した後、ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、基礎分散媒および／または他の成分を含む滅菌した媒質にさまざまな滅菌した活性成分を混合することによって調製される。滅菌した注射用溶液、懸濁液または乳剤を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥または凍結乾燥技術であり、これにより、有効成分と先に滅菌ろ過したその液体媒質に由来する所望の追加成分の粉末が得られる。必要な場合、液体媒質に適当な緩衝剤を添加すべきであり、また、液体の希釈剤は、注射の前にまず、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張性にしておくべきである。また、直接注射するための高濃度組成物の調製も意図するところであり、そこにおいて、DMSOを溶媒として使用すれば、非常に速い浸透がもたらされ、小さな領域に活性な薬剤が高濃度で配達されると考えられる。
【００７５】
組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定である必要があり、そして、微生物、たとえば細菌および真菌の汚染作用から保護される必要がある。勿論、内毒素による汚染を、安全なレベルで最小限に抑えるべきであり、たとえば0.5ng/mgタンパク質よりも低く抑えるべきである。
【００７６】
特定の態様において、注射用組成物の長時間にわたる吸収は、吸収遅延剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはそれらの組み合わせを組成物に使用することにより、達成することができる。
【００７７】
4．乳癌の治療
本発明において、Her2発現性乳癌細胞を標的とするSur-2の小分子阻害剤が提供される。「乳癌」は、胸部または乳房の組織の様々な癌腫の任意のものを意味する。ある態様において、意図するところによれば、Sur-2阻害剤は、乳癌治療の化学療法および放射線療法の成分を含むこととなる。乳癌の治療技術は、目下、決まった胸部スクリーニング法による早期診断と積極的な治療の組み合わせによる。そのような治療には、外科手術、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、またはそれらの療法の組み合わせがある。現在、乳癌に利用可能な薬物療法の例には、タモキシフェン、アドリアマイシン、レトロゾール（letrozole）、およびパトリタキセル（patritaxel）が含まれる。
【００７８】
他の態様において、意図するところによれば、Sur-2の小分子阻害剤は、予防の状況において有用でありうる。
【００７９】
また、Her2の過剰発現は、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸結腸癌、および非小細胞肺癌の部分に見出されている。Her2の過剰発現を伴うこれらの他の癌も、Sur-2阻害剤で治療できる可能性がある。
【００８０】
本発明およびその利点を詳細に説明してきたが、勿論、本願特許請求の範囲に規定する本発明の精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更、置換、および改変を施すことができる。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載した特定の態様のプロセス、装置、製品、組成物、手段、方法および工程に限定されるものではない。本発明の開示から当業者には明らかなように、本明細書に記載した対応する態様と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ結果をもたらす、既存のまたは将来開発されるプロセス、装置、製品、組成物、手段、方法または工程を、本発明に従って用いることができる。従って、そのようなプロセス、装置、製品、組成物、手段、方法または工程もまた、本願特許請求の範囲に包含するものとする。
【実施例】
【００８１】
以下は本発明の実施例であるが、これらに本発明が限定されるものではない。
〔実施例１〕
（材料）
HeLa S3およびMCF７細胞はAmerican Type Culture Collectionから購入した。K-BR3、MDA-MB453およびMDA-MB468は、Mien-Chie Hung博士（M. D. Anderson Cancer Center, ヒューストン、テキサス州）のご好意により提供いただいた。MCF7、MCF7-HER18、SK-BR-3、MDA-MB-453およびMDA-MB-468細胞は、10％FBSを含むDMEM/F-12培地において増殖させた。Z. Songyang氏（Baylor College of Medicine）が、ご好意により293Tag細胞を提供くださった。Sur-2のcDNAプラスミド構築物（pcDNA3-FLAG-Sur-2）は、L. P. Freedman氏（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）がご好意によりくださった。ペプチド類は、フルオレニルメトキシカルボニル化学により、Rinkアミドメチルベンンズヒドリルアミン樹脂を用いて合成し、HPLCにより精製し、そして、エレクトロスプレーイオン化質量分析法および／またはNMRによってその特徴を調べた。
〔実施例２〕
（Sur-2の単離およびESXとの相互作用）
HeLa細胞の核抽出物を当該技術において知られているように調製した（Dignam, 1983）。ESX活性化ドメインのGST融合タンパク質またはその活性化欠損変異体を、説明（Choi他、2000）されているように得た。GST融合タンパク質またはGSTのみに結合するグルタチオンビーズを、HeLa細胞核抽出物とインキュベートし、そして、20mMトリスHCl（pH7.5）、150mMのNaClおよび0.1％ノニデット（Nonidet）P-40を含む緩衝液で入念に洗浄した。結合タンパク質をSDS/PAGEで分離し、クマシーブリリアントブルーR-250で染色した。クマシーブリリアントブルーR-250で染色されたタンパク質のバンドをゲルから切り取り、説明されるように質量分析法によりマイクロシークエンスを行った。S35標識DRIP130タンパク質をTNT T7 Quick Coupled 転写/翻訳系（Promega Corporation, マディソン、ウィスコンシン州）により調製した。GST融合タンパク質に結合するグルタチオンビーズまたはGSTのみに結合するグルタチオンビーズを、100mMのNaCl、0.4％ノニデットP-40、10％グリセロール、20mMトリスHCl（pH7.5）、10mMのMgCl2、および2mMのDTTを含む結合緩衝液500μlにおいてインビトロ翻訳タンパク質と1時間4℃でインキュベートした。同じ緩衝液による入念な洗浄の後、結合タンパク質をSDS-PAGEにより分析した。
【００８２】
HeLa核抽出物からのESXの活性化ドメインに結合したヒトタンパク質（図2A）を単離した。単離したタンパク質のSDS-PAGE分析は、130kDaのタンパク質が、しっかりとESX活性化ドメインに結合する一方、その活性化欠損変異タンパク質には結合しないことを明らかにした。トリプティックペプチドのマイクロシークエンスデータは、Sur-2（DRIP130/CRSP130/Sur-2）、DRIP（ビタミンD受容体コアクチベーター複合体）として知られるヒトメディエーター複合体のメタゾア特異的成分、CRSP（Sp1に対するコアクチベーター複合体）およびARC（アクチベーター補充コファクター（activator-recruited cofactor）複合体に合致した。ESX活性化ドメインに結合する他のタンパク質（図2A）は、ATP-クエン酸リアーゼおよび6−ホスホフルクトキナーゼのような豊富にあるハウスキーピングタンパク質であり、そして、より弱いが、ゲルの銀染色により明らかなように、活性化欠損変異体に対しても親和性を有した。インビトロ翻訳Sur-2はESX活性化ドメインに結合したが、その活性化欠損変異体タンパク質には結合しなかった（図2B）。ESX活性化ドメインの17-aaセグメント（ESX129-145）は、Sur-2との相互作用を媒介するのに十分なものであった。Sur-2は、ESXのこの短いセグメントを特異的な態様で認識するようであった。というのも、Sur-2は、NF-kB p65、ALL1、およびC/EBPβの活性化ドメインからの類似する17-aaペプチドに対して検出可能な親和性を有しなかったからである（図2C）。Sur-2は、ESXの活性化ドメインに特異的に結合する核タンパク質である。
〔実施例３〕
（小さなSur-2ドメインの異所性発現はESXを損なう）
ESX活性化ドメインに結合するSur-2の最小ドメインの位置を決めるため、Sur-2の35S標識した一連の欠失変異タンパク質を、ESX活性化ドメインのGST融合物とインキュベートし、そして、結合タンパク質をSDS/PAGEにより分析した。アミノ酸352−625のSur-2断片がESX活性化ドメインと最も選択的に結合し、その親和性は、完全長Sur-2の親和性と同じように高かった（図3A）。こうして、相互作用に重要なドメインは、残基352−625を包含するセグメントに位置する。この274-aa断片または完全長Sur-2の異所性発現（正規の場所外での発現）は、HEK293T細胞において転写を活性化するESX活性化ドメインの能力を損なわせた。これは、おそらくは、ESX活性化ドメインを内生的Sur-2含有メディエーター複合体に結合しないようにしたことによる（図3B）。一方、ESX活性化ドメインへの親和性をほとんど有しない他のSur-2断片（Sur-21-351およびSur-2983-1291）の過剰発現は、転写を活性化するESX活性化ドメインの能力に対して検出可能な影響力をもたなかった。この阻害効果はESX活性化ドメインに特異的である。というのも、Sur-2またはその断片の強制的な発現は、NF-kB p65、ALL1またはC/EBPβの活性化ドメインの活性にほとんど影響を及ぼさなかったからである。Sur-2は、Sur-2/CRSP/ARC複合体により、ESX選択的コアクチベーターとして作用する。
〔実施例４〕
（Sur-2結合性ペプチドは乳癌細胞においてHer2発現を減少させる）
Sur-2は、クロストリジウム・エレガンス（Clostridium elegans）Sur-2（機能不明のタンパク質であって、その変異体は活性化ras変異体の表現型を抑制する）のヒト相同体である（Singh他、1995）。そして、それは、アデノウイルスE1Aタンパク質およびElk-1転写因子の転写活性化機能と関連づけられてきた。Rasにより媒介される腫瘍増殖とHer2過剰発現の両方にSur-2が機能的に関連することは、Sur-2-ESX相互作用が乳癌治療のためのターゲットとなることを示している。このことを確かめるため、本発明らは、Sur-2に結合する細胞透過性ペプチド（TAT-ESX129-145と呼ぶ）を設計した。この設計は、ESX129-145の結合親和性およびHIV TATタンパク質から誘導される11-aaペプチドの細胞インターナリゼーション特性を利用している。まず本発明らは、三種のHer2過剰発現性乳癌細胞株SK-BR-3、MDA-MB-453、およびMCF7において、TAT ESX129-145がHer2遺伝子の内生的発現を減少させるかどうか調べた（図4）。TAT-ESX129-145の存在下または不在下において細胞をインキュベートし、そして、Her2のタンパク質レベルを正規化量の細胞溶解物のウェスタンブロット解析により調べた。繰り返し実験した結果、試験した三種のHer2過剰発現性細胞株すべてにおいてTAT-ESX129-145がHer2のタンパク質レベルを減少させるのに対し、TAT配列単独またはTAT-VP16469-485は検出可能な効果を及ぼさないことがわかった。アクチンの発現レベルはTAT-ESX129-145によって変化しなかった。これは、選択的なHer2発現の阻害を示している。
【００８３】
SK-BR-3、MDA-MB-453およびMCF7細胞の増殖はTAT-ESX129-145の存在下において完全に阻止されたのに対し、TAT単独またはTAT-VP16469-485は増殖にほとんど影響を及ぼさなかった（図5A）。Her2過剰発現性細胞MDA-MB-468とは対照的に、検出可能なレベルでHer2をもたない乳癌細胞株は、TAT-ESX129-145に対し耐性であった（図5Aおよび5B）。TAT-ESX129-145に対するMDA-MB-468の限られた応答により、TAT-ESX129-145が特異的にHer2発現性乳癌細胞の増殖および生存能力をダウンレギュレーションすることが明らかになった。安定的にHer2遺伝子でトランスフェクトしたMCF7細胞株に対するTAT-ESX129-145の効果を調べた。異種プロモーター上でのHer2の異所性発現により、MCF7細胞は、TAT-ESX129-145によって引き起こされる細胞死から免れた。これらの結果はすべて、ESXとDRIP130との間の相互作用を破壊すれば、Her2発現が減少し、Her2発現性癌細胞において細胞死が引き起こされることを示している。
〔実施例５〕
（ESXのSur-2との相互作用の特徴評価）
ESX129-145は、かなりの数の相互残基核オーバーハウザー効果（NOE）（主鎖における連続したアミドプロトン間の効果およびdaN(i,i 1 3)から生じる効果を含む）を示した（図6Aおよび6B）。NOE連結度のパターンは、αらせん二次構造に対して見られるパターンに特有のものである（特にSer-137からLys-145までの領域において）（図6A）。従って、Ser-137からLys-145までの残基は、強いらせんの性質を有している。ESX129-145の欠失および点変異タンパク質を構築し、インビトロでSur-2に結合するその能力について調べた（図7A）。欠失変異の結果は、Ser-137からGlu-144までの残基がSur-2との相互作用に必要であることを示している。この8-aaセグメントは、NMRによってらせんであることが明らかにされた領域に、ほぼぴったり相当する。この短いペプチドにおいてかさばった疎水性残基を置換すると、Sur-2との相互作用が消失した一方、親水性残基の変異は、検出可能な効果を及ぼさなかった（図7B）。Ser-137からGlu-144までの残基をヘリカルホイールに投影すると、これら疎水性残基のすべてがこの短いらせんの一表面にそって存在することが明らかである。それら疎水性残基は、おそらく、Sur-2における化学的に相補的な表面と直接接触する（図7C）。
〔実施例６〕
（アダマノロールのSur-2阻害活性の確認）
インドール、ベンゾイミダゾールまたはベンゾジアゼピンのいずれかをその構造に含むTripos Inc.（セントルイス、ミズーリ州）から購入した2,422の薬らしい化合物の化学品ライブラリーからアダマノロールを特定した。Tripos Inc.の化合物コレクション全体からライブラリーのメンバーを注意深く選択した。インドール様構造の存在に加えて、それらは、タンパク質−タンパク質相互作用の阻害に適した分子量を有する一方、６つより少ない窒素原子をもち、そして、そのclogP値が-1と6の間にあるものである。
【００８４】
2,422の化合物を、個々に複数の濃度において、Her2過剰発現性SK-BR3細胞およびHer2陰性MDAMB468細胞の生存能を損なわせる能力についてアッセイした。SK-BR3細胞の生存能および細胞増殖を選択的に損なわせた化合物を選択し、次いで、転写レポーター遺伝子アッセイにより検定した。ESX活性化ドメインのレポーター遺伝子発現を活性化する能力を阻害する一方、VP16活性化ドメインのその能力を阻害しない化合物を選択した。選択した化合物の中にアダマノロールがあった（図3B）。薬らしいピンドロール（pindolol）誘導体は、ESX活性化ドメインの細胞において転写を刺激する能力を損なわせた一方、VP16活性化ドメイン（プロトタイプの活性化因子）の能力にほとんど影響を及ぼさなかった（図3A）。アダマノロールは、Her2陽性乳癌細胞株（SK-BR-3、MDA-MB453、およびMCF7）の生存能力を損なわせた一方、検出可能なレベルのHer2をもたないMDA-MB468に対するアダマノロールの影響はよりゆるやかなものであった（図3B）。薬物で処理した細胞のウェスタンブロット解析の結果、Her2陽性SK-BR3細胞において、Her2タンパク質の発現は、アダマノロールによって顕著に減少させられた一方、αチューブリンの発現はそうでなかったことがわかった。
〔実施例７〕
（転写レポーター遺伝子アッセイ）
GAL4 DNA結合ドメインと融合されたNFκBp65、VP16またはESXの活性化ドメインをそれぞれコードする哺乳動物の発現ベクターを用いた。分泌されるアルカリ性ホスファターゼ（SEAP）の生産が5つのGAL4結合部位を保有するIL-2プロモーターの制御下にあるレポータープラスミドとともに、各発現コンストラクトを、HEK293Tagヒト腎臓細胞に同時形質導入した。アダマノロールの存在下または不在下において24時間インキュベーションした後、培養物のアリコートをSEAP活性についてアッセイした。形質導入したDNAの総量を正規化した。
〔実施例８〕
（細胞生存能アッセイ）
乳癌細胞を96ウェルプレートに5×103細胞／ウェルの密度で置き、24時間保持した。アダマノロールを種々の濃度で培地に添加し、さらに24時間インキュベートした。Premix WST-1溶液（Takara）を各ウェルに添加し、2時間インキュベートした。細胞の生存能力を、SPECTRAmaxマイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定することにより評価した。
〔実施例９〕
（SK-BR3細胞におけるHer2の発現レベルに対するアダマノロールの効果）
Her2過剰発現性SK-BR3細胞を、7.3μMのアダマノロールで24時間処理し、そして、全細胞溶解物をウェスタンブロットで分析した。ウェスタンブロット分析に用いた一次抗体は、Her2に対するモノクローナル抗体（c-neu-Ab-3、Oncogene Science）と、＜−チューブリンに対するモノクローナル抗体（T5168、Sigma）であった。次いでブロットされた膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス免疫グロブリンとインキュベートし、ECL化学ルミネセンス検出試薬（Amersham Bioscience）で可視化した。
〔実施例１０〕
（蛍光摂動実験）
ESX-DRIP130相互作用をモニターするため、本発明らはESX129-145をLys144の位置においてイソチオシアン酸フルオレセイン（FITC、Pierce）で標識し、DRIP130352-625のグルタチオン−S'−トランスフェラーゼ（GST）融合物を添加した際のその蛍光スペクトルを測定した。ESX129-145は、標準的なFmoc化学（合成の間NH2末端をアセチル基でキャップした）により合成し、HPLCにより精製した。次いで、暗所において結合緩衝液（100mMの炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、pH9）中、ペプチドをLys144の位置でFITCと結合させ、NAP-5脱塩カラム（Amersham）により精製した。標識されたペプチドを、UVおよび可視の吸光度により定量した。
【００８５】
GST-Sur-2352-625を発現させ、精製した。種々の濃度の該融合タンパク質を、2％（v/v）エタノールを含むリン酸塩緩衝生理食塩水中のFITC-ESX129-145（10nM）に添加した。そして、FITC-ESX129-145の蛍光スペクトルを、ABILS-50B蛍光分光計（Ex：490nm）により測定した。522nmでの発光摂動法により、相互作用の解離定数を12μMであると見積もった。
【００８６】
インビトロでの相互作用に対するアダマノロールの効果を調べるため、結合緩衝液のエタノール成分を、アダマノロールのエタノール溶液に置き換えた。50μMのGST-Sur-2352-625に結合したFITC-ESX129-145（10nM）のフラクションを、522nmでの蛍光発光を測定することにより評価した。ESX129-145およびピンドロールを、それぞれ陽性および陰性の対照として用いた（図3A）。
〔実施例１１〕
（アダマノロールのNMR研究）
0.05％(v/v)TMSを含む99.8％クロロホルム-dにアダマノロール（0.5mg）を溶解し、その試料のNMRデータを、Bruker AMX600分光計により収集した。TOCSY、DQF-COSY、およびNOESYデータセットの組み合わせを用いることにより、プロトンシグナルの帰属を行った。NOESYスペクトルでは、512の自由誘導減衰を298Kにおいて300msおよび500msのミキシング時間で記録した。適当なアポディゼーションおよびゼロフィリングを用いたFelix98.0ソフトウェア（Biosym Technologies）によりデータを解析し、縮小の後、真の2D 2K×2Kマトリクスを得た。アダマノロールのNMR解析により、室温における尿素リンカー周囲のプロトンシグナルの広がりが明らかになるとともに、500ミリ秒のNOESYミキシング時間においてさえイソプロピルプロトンとピペリジンとの間にNOEが存在しないことが明らかになった。NMRのこれらの特徴は、かさばったイソプロピル基によって強要されるZ型を優先する尿素リンカーの周りの剛直なコンフォメーションによって合理的に説明できる。図6参照。
〔実施例１２〕
（アダマノロールおよび官能基化アダマノロール誘導体の調製のための合成スキーム）
反応に用いる溶媒は、使用の前に乾燥させた。他のすべての試薬は、精製することなく受けいれたままで使用した。すべての水分に敏感な反応は、特にことわらない限り、火炎乾燥および／またはオーブン乾燥したガラス製品において、陽圧の窒素下で行った。薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル60F254でプレコートしたガラスTLCプレートを用いて行った。フラッシュカラムクロマトグラフィーは、シリカゲルBW820MHを用いて行った。プロトン核磁気共鳴スペクトルは、重水素化溶媒中、270MHzまたは600MHzで記録した。4−ヒドロキシインドール（1）（0.50g、3.8mmol）のジメチルスルホキシド（10mL）溶液に、45℃において、水酸化カリウム（0.4g、7.6mmol）を添加し、次いで、エピクロロヒドリン（1.4g、15.2mmol）を添加した。反応混合物を45℃で4時間撹拌した。この反応をNH4Clの飽和溶液で停止させ、ジエチルエーテル（3×50mL）で抽出を行った。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、濃縮した。生成物をベンゼン／アセトン混合物を用いたシリカゲルカラムからの溶出により精製し、グリシジル4-インドリルエーテル（２）（0.75g、3.8mmol、99％）を透明な油として得た。グリシジル4-インドリルエーテル（２）（215mg、1.14mmol）のメタノール（2mL）溶液にイソブチルアミン（160mg、2.28mmol）を添加した。この溶液を100℃に加熱し、32時間撹拌した。生成物をベンゼン／アセトン混合物を用いたシリカゲルカラムからの溶出により精製し、対応するアミン（3）（120mg、0.46mmol、40％）を透明な油として得た。4,4'-ビピペリジン（420mg、5.0mmol）およびトリエチルアミン（2mL）のCHCl3（150mL）溶液に1-アダマンタンカルボニルクロリド（4）（500mg、2.5mmol）のCHCl3（50mL）溶液を添加した。得られた混合物を0.5時間還流し、塩水で希釈し、MgSO4で乾燥した。次に溶液を真空中で濃縮し、CHCl3／メタノール混合物を用いたシリカゲルカラムからの溶出により精製し、対応するアミド（5）（750mg、2.3mmol、90％）を透明な油として得た。図11および図13参照。
〔実施例１３〕
（アダマノロールおよびそのイソブチル誘導体の合成）
アミド（120mg、0.36mmol）のTHF（10mL）溶液に1,1'-カルボニルジイミダゾール（236mg、1.44mmol）のTHF（5mL）溶液を添加した。得られた混合物を4時間還流した。反応混合物にジエチルエーテル（20mL）を添加し、塩水（3×20mL）で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、濃縮した。カルバモイルイミダゾールは、その後の工程に使用するためさらなる精製を必要としなかった。カルバモイルイミダゾールをMeCN（2mL）中のMeI（0.5mL）とともに18時間室温で撹拌した。溶媒および過剰のMeIを真空において蒸発させることにより、対応するイミダゾリウム塩が定量的に得られた。それは、やはり、そのアダマノロールへの変換のため、さらなる精製を必要としなかった。イミダゾリウム塩のCH2Cl2（2mL）溶液にピンドロール（pindolol）（268mg、1.08mmol）またはN-[3-(4-インドリルオキシ)-2-ヒドロキシプロピル]-イソブチルアミン（283mg、1.08mmol）のCH2Cl2（1mL）溶液およびEt3N（0.5mL）を添加した。得られた混合物を室温で30時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、CHCl3／メタノール混合物を用いたシリカゲルカラムからの溶出により精製し、アダマノロール（145mg、0.24mmol、67％）またはそのイソブチル誘導体（42mg、0.07mmol、19％）を透明な油として得た。アダマノロール：1H NMR(CDCl3,270MHz)δH 7.10(br,1H), 7.08-7.04(m,2H), 6.58(d,1H), 6.51(d,1H), 5.33(br,1H), 4.52(br,2H), 4.39(m,1H), 4.37(br,1H), 4.15(br,2H), 3.69(d,1H), 3.43(m,1H), 3.30(br,1H), 2.65(br,4H), 2.02(s,3H), 1.98(s,6H), 1.71(s,6H), 1.34(dd,6H), 1.45-0.86(m,10H); MS(FAB)(M+H+)605。図11参照。
〔実施例１４〕
（N-トシルアダマノロールの調製）
アダマノロール（8）（30.1mg、0.05mmol）のTHF（1mL）溶液を0℃に冷却し、その後、鉱油中60％の水素化ナトリウム（12mg、0.50mmol）およびトシルクロリド（10.4mg、0.05mmol）をそれに添加した。この温度で0.5時間撹拌した後、反応混合物を室温に暖め、2時間撹拌した。反応を塩水で停止させ、CH2Cl2（3×20mL）で抽出を行った。合わせた有機層をMgSO4で乾燥し、濃縮した。生成物をCHCl3／メタノール混合物を用いたシリカゲルカラムからの溶出により精製し、N-トシルアダマノロール（10）（21.5mg、0.03mmol、57％）を透明な油として得た。図11参照。
〔実施例１５〕
（動物実験）
BT474に由来する1ラウンド（BT474M1）または2ラウンド（BT474M2）の腫瘍形成選択後の乳癌細胞株を用いた。5×106の細胞をヌードマウス乳房の脂肪パッド中にマトリゲル（Matrigel）とともに注入した。二種の腫瘍を各動物に接種した。各処理群は5匹の動物を含んだ。接種の5週間後、腫瘍がよく定着した（約100mm3平均）ところで、処置を開始した（図の0日目）。各マウスは、アダマノロール（7QH2）を、20mg/kgの1日あたりの用量で腹腔内注射により各週連続5日で2週間、摂取した。腫瘍の体積を3日ごとに測定した。0日目の最初の体積に対する腫瘍体積の百分位数を各時点に対してプロットした。結果を図15に示す。アダマノロールは、HER-2/neu過剰発現性癌細胞のインビボでの強い腫瘍増殖阻害剤である。これらの結果は、処置によるBT474細胞の顕著な増殖抑制を示している。
【００８７】
参照文献
本明細書に記載するすべての特許および刊行物は、本発明に関し、当業者の技術水準を示すものである。すべての特許および刊行物は、引用することによって、その内容が具体的かつ個々に本明細書に記載されたものとする。
【００８８】
米国特許第5,019,660号
米国特許第5,053,434号
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
本発明のより完全な理解のため、添付の図面を参照しつつ、以下の説明を行っていく。
【図１】Sur-2とESXとの間の相互作用およびHer-2発現の調節におけるその役割を示す。
【図２】Sur-2の精製を示す。図2Aは、精製されたSur-2のSDS-PAGEゲルを示す。図2Bは、インビトロで翻訳されたSur-2がESX活性化ドメインに結合する一方、その活性化欠損変異体には結合しないことを示す。図2Cは、Sur-2がESX活性化ドメインに特異的に結合することを示す。
【図３】ESX活性化ドメインに結合する小さなSur-2ドメインの特定を明らかにする。図3Aは、Sur-2の欠損変異体がESX活性化ドメインに結合する能力を維持したことを示す。図3Bは、一連のSur-2タンパク質断片をESX活性化ドメインのGST融合物（GST-ESX129-159）に結合する能力についてアッセイした結果を示す。アミノ酸352-625が、ESX活性化ドメインとの相互作用に十分なものである。図3Cは、小さなSur-2ドメインの過剰発現がESX活性化ドメインによる転写活性化を特異的に阻害するモデルを示すものである。
【図４】Her-2発現性乳癌株におけるHer2のタンパク質レベルに対するTAT-ESX129-145の効果を示す。試験した三種の乳癌株すべてにおいて、TAT-ESX129-145はHer2発現の量を顕著に減少させた。
【図５】乳癌細胞の増殖に対するTAT-ESX129-145の効果を示す。図5Aは、四種の乳癌細胞株をTAT-ESX129-145とともにインキュベートした結果を示す。図5Bは、TAT-ESX129-145によって引き起こされた核凝縮を示す。図5Cは、試験した三種の乳癌株におけるHer2過剰発現を示す。図5Dは、MCF-7 Her18（Her2過剰発現性細胞株の一つ）がESX129-145に対し抵抗性であったことを示す。
【図６】アダマノロールとESX129-145についてのNMRデータを示す。図6Aは、ESX129-145のNOESY（核オーバーハウザー効果分光法）スペクトルのNH-αH領域を拡大して示す。図6Bは、ESX129-145のNOESYスペクトルのNH-NH領域を拡大して示す。図6Cは、αらせん構造の特徴として残基間NOE（核オーバーハウザー効果）データをまとめて示す。図6Dは、アダマノロールについてのNMR研究の結果を示す。
【図７】Sur-2と相互作用するESXの8アミノ酸セグメントを示す。図7Aは、インビトロでSur-2に結合する最小ESXペプチドを特定する。図7Bは、突然変異研究のまとめである。ESX129-145の点変異体を、Sur-2に結合するその能力について試験した。Trp138のインドール構造をAla、Phe、またはLeuと置換すると、Sur-2との相互作用が消滅した。図7Cは、最小結合ペプチドESX137-144をヘリカルホイールに投影した図である。
【図８】アダマノロール（7QH2）の活性を示す。図8Aは、アダマノロールが選択的にESX活性化ドメインを阻害することを示す。図8Bは、アダマノロールがHer2発現性乳癌細胞の細胞増殖および生存能力を選択的に減じることを示す。図8Cは、アダマノロールによるHer2の阻害を示すウェスタンブロットである。図8Dは、アダマノロールがインビトロでESX-Sur-2相互作用を阻害することを示す。図8Eは、Sur-2とESXの相互作用の解離定数の見積もりを示す。
【図９】GAL4-ESXの活性を阻害する能力についてアッセイされる化合物を同定または識別するスクリーニング法を示す。
【図１０】アダマノロールの立体異性体を示す。尿素基の制限された回転のため、アダマノロールは二種の配座異性体（EおよびZ）を有する。
【図１１】アダマノロールおよびN-トシルアダマノロールのための合成プロトコルを示す。
【図１２】典型的なピンドロール（pindolol）類似体の化学構造を示す。
【図１３】アダマノロールにおける側基置換基の具体例を示す。
【図１４】合成された官能基化アダマノロール誘導体を示すとともに、Her2発現性乳癌細胞株におけるインビトロ試験の後のそれらの活性（IC50として表現される）を示す。五つの化合物がアダマノロールと同様に活性であり、二つがより活性であり、三つがほぼ半分の活性である。
【図１５】マウスにおける腫瘍のサイズに対するアダマノロール（7QH2）の効果についてインビボで検討した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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2005530804.tif 000035
【図７】
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【図８ＡＢ】
2005530804.tif 000037
【図８ＣＤ】
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【図８Ｅ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
2005530804.tif 000047