(57)【要約】本発明は、動物又はその部分に存在する活性ミオスタチンの量を測定するためのバイオアッセイであって、以下の工程：ａ）ミオスタチンプロモーター、又はその機能性フラグメントもしくは変異体を増幅すること；ｂ）レポーターベクター又は構築物に該プロモーターをクローニングすること；ｃ）筋原性前駆細胞株（筋芽細胞）にベクターをトランスフェクトし、トランスフェクトされた筋芽細胞を選択すること；ｄ）トランスフェクトされた筋芽細胞を、目的の動物から採取したミオスタチン、血清又は筋抽出物とインキュベートすること；ｅ）筋芽細胞を洗浄し、それから蛋白質抽出物を調製すること；ｇ）蛋白質抽出物でレポーター遺伝子アッセイを行うこと；を含むバイオアッセイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物又はその部分に存在する活性ミオスタチンの量を測定するためのバイオアッセイであって、以下の工程：
ａ）ミオスタチンプロモーター、又はその機能性フラグメントもしくは変異体を増幅すること；
ｂ）レポーターベクター又は構築物に該プロモーターをクローニングすること；
ｃ）筋原性前駆細胞株（筋芽細胞）にベクターをトランスフェクトし、トランスフェクトされた筋芽細胞を選択すること；
ｄ）トランスフェクトされた筋芽細胞を、目的の動物から採取したミオスタチン、血清又は筋抽出物とインキュベートすること；
ｅ）筋芽細胞を洗浄し、それから蛋白質抽出物を調製すること；
ｇ）蛋白質抽出物でレポーター遺伝子アッセイを行うこと；
を含む、バイオアッセイ。
【請求項２】
プロモーター領域がミオスタチンプロモーター配列全体を含み、該配列がWO 00/01810に記載のものと同一であるか、又は実質的に相同であり、且つ機能的に等価である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅されるプロモーター領域が、ミオスタチン遺伝子のすぐ上流のミオスタチンプロモーターの１．６ｋｂ領域、又は該領域の機能性フラグメントもしくは変異体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プロモーターが哺乳動物又は脊椎動物由来であり、且つ試験される動物のタイプに基づいて選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物が、ヒト、ヒツジ、ウシ、ヤギ、シカ、ウマ、ラクダ、ポッサム、ブタ、マウス及びラットからなる群から選択されうる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
脊椎動物が、鳥類、ニワトリ、魚類、クロコダイル及びアリゲーターからなる群から選択されうる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
筋芽細胞がＣ２Ｃ１２筋前駆細胞である、請求項に記載の方法。
【請求項８】
本明細書の実施例に関し本明細書で実質的に記載された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオスタチン (myostatin) のバイオアッセイに関する。特に、本発明は、生物活性ミオスタチンのアッセイに広く関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオスタチン（増殖分化因子８）は、マウスからクローニングされ、筋増殖の負の調節因子であると示された[１]。ミオスタチンの発現は、発達中の体節の筋節区域に限定されており、そしてまた、成体動物の種々の骨格筋で発現されている。ミオスタチンノックアウトマウスは、骨格筋量が非常に増加している。骨格筋量の増加は、身体中に散在しているようであり、ミオスタチンヌル (myostatin null) マウスから単離された筋肉は、野生型筋肉の約２−３倍の重量である。しかし、ノックアウトマウスで観察される骨格筋量の増加は、筋繊維数の増加（過形成）のみならず、筋繊維の肥厚（肥大）にも起因する。ミオスタチンノックアウトマウスの筋肉の断面積は、筋肉タイプに依存して約１４−４９％増加している。更に、ミオスタチンヌルマウスは、生存可能、且つ生殖可能であることが示されている。
【０００３】
１９９７年、本発明者らは、筋肉量の増加を特徴とするウシの２品種、即ち、Belgian BlueとPiedmonteseの両方がミオスタチンコーディング配列に変異を有することを発見した[２]。「筋肉の倍増 (double muscling)」というこの現象は、過去１９０年間にウシの多くの品種で観察されており、平均すると、これら動物は筋肉量が２０〜２５％増加している。
【０００４】
ミオスタチン発現は、骨格筋に主に限定されるが、脂肪組織と心筋には低レベルの発現がある。ミオスタチンは骨格筋増殖に特異的な負の調節因子として機能し得ると思われるが、成体の個体におけるミオスタチンの生理的役割は不明である。ミオスタチンは、運動によって誘導される筋肉肥大と筋肉傷害後の再生に関与するかもしれない。ミオスタチンはまた、脂肪組織増殖を抑制するかもしれない。ミオスタチンが動物の生後成長の間、局所的又は全身的に働くかどうかも不明である。
【０００５】
ミオスタチン蛋白質は、前駆体として合成され、次いで、蛋白質分解によりプロセシングされることで、Ｃ末端がプロセシングされた活性な（成熟）ミオスタチン、及びＮ末端潜在性関連ペプチド (N-terminal Latency Associated Peptide)（ＬＡＰ）が生じる。他のＴＧＦ−βメンバーとの１次構造類似性に基づくと、一旦プロセシングされると、ミトスタチンは循環中に分泌される[３]。循環しているプロセシングを受けたミオスタチン複合体は、恐らく、アクチビンＩＩβ型レセプターと結合し、下流シグナル伝達事象を開始する。従って、循環中の活性ミオスタチン蛋白質複合体のレベルを評価することは、筋肉生理を解析する診断ツールとして有用である。特に、ＨＩＶ感染と関連した筋肉衰弱状態で、ミオスタチンの循環レベルが増加することが最近示された[３]ことを考慮すれば、そうである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
放射能免疫アッセイ（ＲＩＡ）やＥＬＩＳＡなどの、現在までに循環中ミオスタチンを検出するのに使用されている現行の方法は、ミオスタチンの合計レベルのみを検出でき、ミオスタチンの生物活性形態と生物不活性形態を区別しない。
従って、動物でのミオスタチンの生理的役割の発見を支援し得る研究ツールがあれば、有用である。
それ故、本発明は、動物、又はインビトロの細胞培養物もしくはインビトロの組織培養物に存在する生物活性ミオスタチンのレベルを測定する、ミオスタチンプロモーター・レポーター遺伝子バイオアッセイ及びその使用に広く関する。
本発明の目的は、上記問題に取り組む、又は、少なくとも公共に有用な選択を提供することである。
【０００７】
本発明の更なる局面と利点は、例示のみとして与えられた以下の記載から明白である。
本明細書で引用された任意の特許又は特許出願を含む全ての参考文献は、引用により本明細書に含まれるものとする。任意の参考文献が従来技術を構成するということは容認されない。参考文献の考察は、その筆者の主張を述べ、本出願人は、引用文献の正確さと妥当性を検討する権利を留保する。多数の従来技術の刊行物が本明細書で引用されたが、本参考文献は、これらの刊行物のいずれもがニュージーランド又は他の任意の国において当該分野で共通の一般的知識の部分を形成するという容認を構成しない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の開示
本発明の第１局面によれば、動物又はその部分に存在する活性ミオスタチンの量を測定するためのバイオアッセイであって、以下の工程：
ａ）ミオスタチンプロモーター、又はその機能性フラグメントもしくは変異体を増幅すること；
ｂ）レポーターベクター又は構築物に該プロモーターをクローニングすること；
ｃ）筋原性前駆細胞株 (myogenic precursor cell line)（筋芽細胞 (myoblast)）にベクターをトランスフェクトし、トランスフェクトされた筋芽細胞を選択すること；
ｄ）トランスフェクトされた筋芽細胞を、目的の動物から採取したミオスタチン、血清又は筋抽出物とインキュベートすること；
ｅ）筋芽細胞を洗浄し、それから蛋白質抽出物を調製すること；
ｇ）蛋白質抽出物でレポーター遺伝子アッセイを行うこと；
を含むバイオアッセイが提供される。
【０００９】
本明細書の目的より、用語「含む (comprising)」が「含むが、・・・に限定されない」を意味すること、用語「含む (comprises)」が対応する意味を有することが明瞭に理解される。
【００１０】
本発明は、増殖調節因子としてミオスタチンを利用する全ての動物に適用し得ることが意図される。
【００１１】
特に、本発明は、哺乳動物又は他の脊椎動物に適用し得る。
【００１２】
好ましくは、該哺乳動物は、ヒト、ヒツジ、ウシ、ヤギ、シカ、ウマ、ラクダ、ポッサム(possum)、ブタ、マウス及びラットからなる群から選択され得、該脊椎動物は、鳥類、ニワトリ、魚類、クロコダイル及びアリゲーターからなる群から選択され得る。筋肉増殖の制御のためにミオスタチンを利用する商業上重要である他の哺乳動物又は脊椎動物もまた、意図される。
【００１３】
プロモーター領域は、ミオスタチンプロモーター配列全体を含み得、該配列は、ＷＯ00/01810に記載のものと同一であるか、又は実質的に相同であり、且つ機能的に等価である。しかし、好ましくは、増幅されるプロモーター領域は、ミオスタチン遺伝子のすぐ上流のミオスタチンプロモーターの１．６ｋｂ領域、又は該領域の機能性フラグメントもしくは変異体を含み得る。
【００１４】
プロモーターは、哺乳動物又は脊椎動物由来であり得、好ましくは、試験される動物のタイプに基づいて選択される。
【００１５】
プロモーター分子は、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子であり得、一本鎖又は二本鎖であり得る。プロモーター分子はまた、１つ以上の合成、非天然もしくは変更 (altered) ヌクレオチド塩基、又はそれらの組合せを含んでいてもよい。
【００１６】
好適な実施態様では、増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応やリガーゼ連鎖反応などの任意の便利な方法で行い得る。しかし、他の増幅技術もまた、本発明の範囲を逸脱することなく用い得る。
【００１７】
ベクターへのプロモーターのクローニングは、任意の適切なクローニング方法によって達成され得る。好ましくは、クローニング方法は、Sambrookら[６]に開示の任意のものから選択し得る。
【００１８】
「クローニングベクター」とは、適切なサイズである目的の別の外因性（外来性）核酸分子が自己複製のベクター能力を喪失することなく組み込まれ得る高等生物のウイルス、プラスミド又は細胞に起源を発する、又はそれに由来する核酸分子をいう。即ち、ベクターは、少なくとも１つの目的の外来性核酸分子（例えば、目的の遺伝子）を宿主細胞に導入するために使用され得、そこで、遺伝子は大量に複製され得る。
【００１９】
クローニングベクターは、アッセイで用いる筋芽細胞に基づいて選択され得る。有用なベクターは一般的に、以下の特徴を有する。
（ａ）自己複製能；
（ｂ）任意の特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一標的の保有；及び
（ｃ）望ましくは、抗生物質耐性などの容易に選択可能なマーカーの遺伝子を有する。好ましくは、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼである。
【００２０】
これらの特徴を保有するベクターの２つの主要タイプは、プラスミドおよび細菌ウイルス（バクテリオファージ又はファージ）である。現在好適なベクターとしては、以下のもの、即ち、pUC, pBlueScript, pGEM, PGEX, pBK-CMV, ラムダ ZAP, ラムダGEM及び pSPシリーズが挙げられ得る。しかし、このリストは、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００２１】
ミオスタチンプロモーターを介するレポーター遺伝子の発現を更に確実にするために、レポーターベクターはまた、更なる制御配列（例えば、複製起点、エンハンサー、転写ターミネーター、全てがレポーター遺伝子に機能可能に連結されている）を含み得る。レポーターベクターに含まれる更なる制御配列の選択は、アッセイでの使用が意図される筋芽細胞のタイプにより変動し得、そして依存する。
【００２２】
ベクター又は構築物は、標準的技術により筋芽細胞に導入され得る。例えば、Graemeら，1978[７]のリン酸カルシウム沈殿法が好適である。しかし、他の技術もまた、本発明の範囲を逸脱することなく用い得る。
【００２３】
用語「導入」（又はその文脈上の類義語）とは、細胞に核酸分子を挿入する状況下で使用するとき、「トランスフェクション」又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、真核又は原核細胞（核酸分子が細胞のゲノム（例えば、クロモソーム、プラスミド、プラスチド、ミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ得るか、自律レプリコンに変換され得るか、又は一過性に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ））に対する核酸分子の組み込み又は移入についての関連性を含む。
【００２４】
本明細書で使用する用語「トランスフェクション」とは、真核細胞による組換えＤＮＡの取り込み、組み込み及び発現をいう。
【００２５】
本明細書で使用する用語「形質転換」とは、個々の細胞が有する遺伝物質が外因性ＤＮＡのそのゲノムへの組み込みにより変更されるプロセスをいう。
【００２６】
本明細書で使用する用語「形質導入」とは、ウイルスベクターによる所定の細胞から他の細胞への、核酸分子からの遺伝情報の移入のプロセスをいう。
【００２７】
一般的には、任意の筋芽細胞が、ベクターによるトランスフェクションに使用し得る。しかし、最適には、筋芽細胞はＣ２Ｃ１２筋前駆細胞である。同様に、一過性で又は安定にトランスフェクトされた細胞でレポーター遺伝子が利用され得る任意のアッセイが使用され得る。
【００２８】
本発明の更なる局面は、例示としてのみ与えられ、そして、添付の図面と実施例に関連して与えられる以下の非限定的な説明から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明を説明する非限定的な例を、ここで提供する。上記記載は、例示のみとして与えられ、当業者に公知の使用される材料と技術の両方におけるバリエーションが想定されることが理解される。
【００３０】
最近、本発明者らは、ミオスタチンプロモーターを同定し、クローニングし、これをWO 00/01810に記載した。特に、本発明者らは、レポーター遺伝子発現を駆動し得る、ミオスタチン遺伝子のすぐ上流のこのプロモーターの約１．６ｋｂ領域を発見した。
不活性ミオスタチンを発現する、Belgian Blueウシなどの遺伝モデルが高レベルの変異（非機能性）ミオスタチンｍＲＮＡを有する[４]ことを考慮すると、このことは、ミオスタチンが負のフィードバック機構によりそれ自身の発現を調節することを示唆する。
【００３１】
１．６ｋｂミオスタチンプロモーター領域と適切なレポーター遺伝子を利用して本発明者らがここで確認しようとしたことは、外来性に加えられたミオスタチンが用量依存的な様式でミオスタチンプロモーター活性を実際にダウンレギュレートし得るということである。
【実施例】
【００３２】
実施例１
レポータープラスミドの構築及び安定な細胞株の選択
遺伝的証拠は、ミオスタチンが「フィードバック阻害」ループによってそれ自身のプロモーターを調節することを示唆した。従って、我々は、フィードバック阻害に必要な調節エレメントがミオスタチンプロモーターの1.6 kb内に局在するか否かについての研究を欲した。この目的のために、RK55とRK56プライマーを用い、1.6 kbウシミオスタチンプロモーターをPCR増幅し、TAクローニングベクターであるpGEM-T easyにクローニングした。次いで、プロモーターを、KpnIフラグメントとしてレポータープラスミドpGL3-basicに移した。次いで、ミオスタチンプロモーター−レポーターシステムを有する安定な細胞株を作製するために、ミオスタチンプロモーターとルシフェラーゼレポーター遺伝子を、NotI、XhoIフラグメントとしてpcDNA3中に移し、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine 2000を用いて、DMEM中で培養したC2C12筋芽細胞に12.5 μgをトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたC2C12細胞を、ジェネティシン (40 μg/ml) に対する耐性によって選択した。
【００３３】
ミオスタチン蛋白質に対するミオスタチンプロモーターの用量応答
ミオスタチン蛋白質によるミオスタチンプロモーター阻害の感受性を測定するために、安定にトランスフェクトされたC2C12細胞を、10% FCSを有するDMEM培地中で24時間、漸増濃度 (0.5-4 μg/ml) のミオスタチン蛋白質と共にインキュベートし、細胞抽出物を筋芽細胞から作製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３４】
ルシフェラーゼアッセイ
ルシフェラーゼ活性を解析する細胞を、1×レポーター溶解緩衝液 (Promega) 300 μl中で溶解した。ライセートを集め、10秒間ボルテックスした。急速凍結融解後、ライセートを、12,000 × gで15秒間遠心分離し、Turner Designsルミノメーター (モデルTD-20/20) により、上清10 μlをルシフェラーゼレポーター遺伝子活性 (Promega) について解析した。全蛋白質は、Bradford Bio-Rad蛋白質アッセイ試薬 (Bio-Rad Lab) で評価した。
【００３５】
結果
ミオスタチンプロモーター活性
機能性プロモーター活性を特定し得る、ウシ5’ミオスタチンゲノムDNA内の領域を決定するために、1.6 kbのミオスタチン上流ゲノムDNAを、pGL-basicベクターにサブクローニングし、C2C12細胞にトランスフェクトした。レポーター遺伝子活性をルシフェラーゼアッセイにより測定した。図１に示すように、-1.6 kbの5’末端で開始し、+43で終結するDNAフラグメントは、C2C12細胞中の対照ベクターに対し、有意なレポーター遺伝子活性を示した。
【００３６】
ミオスタチンはフィードバック阻害によりそれ自身のプロモーターを阻害する
正常筋肉動物と筋肉倍増動物（機能性ミオスタチンの欠損）で行われたミオスタチン遺伝子発現解析は、ミオスタチンがネガティブフィードバック機構によりそれ自身の発現を阻害することを示唆するようである。1.6 kbミオスタチンプロモーターがフィードバック阻害に必要なエレメントを有するか否かを研究するために、pGL3-basic中の1.6 kbプロモーター−ルシフェラーゼレポーター部分をpcDNA3にサブクローニングし、C2C12細胞にトランスフェクトし、安定なゲノム組み込みにより選択した。ミオスタチンプロモーター・レポーターシステムを有する細胞を、漸増濃度のプロセシングされた組換えミオスタチンと共にインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を測定した。図２に示すように、漸増濃度のミオスタチンは、ルシフェラーゼ活性を減少させた。0.5 μg/mlの変化によりルシフェラーゼ活性の有意な減少が生じるので、アッセイは感度が良いと思われる。
【００３７】
考察
ミオスタチンは、TGFベータスーパーファミリーのメンバーである。ミオスタチンの変異により、骨格筋の過形成と肥大が生じる。ここで、我々は、ミオスタチン蛋白質により引き起こされるフィードバック阻害に関与するミオスタチンプロモーター領域を用いるバイオアッセイを開発した。ルシフェラーゼレポーターシステムを用いて、我々は、ミオスタチン上流領域の1.6 kbが筋芽細胞でのルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の駆動に十分であることを最初に示した（図１）。レポーター構築物を有するC2C12筋芽細胞を漸増濃度のミオスタチンと共にインキュベートしたとき、プロモーター活性は、用量依存的な様式で有意に減少した。このことは、フィードバック阻害によるミオスタチン転写の阻害に必要な調節エレメントが1.6 kb内に位置することを示す。更に、自己阻害は、非常に感度が良く、ミオスタチン蛋白質レベルに依存するようである。外因性ミオスタチンレベルとルシフェラーゼレポーター活性との間には逆の関係があるので、我々は、ミオスタチンプロモーター・レポーターシステムを用いるバイオアッセイを標準化した。ミオスタチンのフィードバック阻害を制御する可能な機構は、1.6 kb内に存在する1つ以上のシス調節エレメントによってであり得る。ミオスタチンプロモーター領域の1.6 kbは、MyoDやMyf-5などの筋原性調節因子の結合部位である10Eボックスモチーフを少なくとも含む[５]。
【００３８】
本発明の局面は、実施例としてのみ記載されており、添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、それに対して改変、付加がなされ得ることを理解すべきである。
【００３９】
参考文献
1. McPherron, A. C. , A. M. Lawler, 及び S. J. Lee, Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature, 1997. 387 (6628): p. 83-90.
2. Kambadur, R. ら, Mutations in myostatin (GDF8) in double-muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle. Genome Res, 1997. 7 (9): p. 910-6.
3. Gonzalez-Cadavid, N. F. ら, Organization of the human myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95 (25): p. 14938-43. 
4. Oldham, J. M. ら, Molecular expression of myostatin and MyoD is greater in double-muscled than normal-muscled cattle fetuses. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. , 2001. 280 (5): p. 1488-1493. 
5. Rudnicki, M. A. 及び R. Jaenisch, The MyoD family of transcription factors and skeletal myogenesis. Bioessays, 1995. 17 (3): p. 203-9.
6. Sambrook, J, Fritsch, E. F. 及び T. Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989. CSHL press. NY, New York, USA.
7. Graeme 及び Van Der Eb, Virology 52: 546 (1978)
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ミオスタチンプロモーターがルシフェラーゼの発現を駆動し得ることを示すルシフェラーゼ活性のグラフである。
【図２】図２は、ミオスタチンプロモーターの制御下にあるルシフェラーゼ発現筋芽細胞が、ミオスタチン蛋白質の漸増濃度に曝された場合にルシフェラーゼ発現を減少させることを示すルシフェラーゼ活性のグラフである。
【図１】
2005520486.tif 000002
【図２】
2005520486.tif 000003
【国際調査報告】
2005520486.tif 000004
2005520486.tif 000005
2005520486.tif 000006