(57)【要約】本開示は、ＤＮＡポリメラーゼ反応の配列特異的な開始を可能にする一本鎖相同ＤＮＡを用いて、二本鎖ＤＮＡに侵入させるために、細菌ＲｅｃＡおよび関連タンパク質の特性を使用する、標的ＤＮＡのリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のための、３つの関連する新規プロセスを記載する。この開示された方法は、熱サイクルも好熱性酵素も必要としないという利点を有する。さらに、開示された方法の改善された処理能力は、数百メガベース長までのＤＮＡの増幅を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖標的配列のＤＮＡ増幅のＲＰＡプロセスであって、該標的配列は、ＤＮＡの第一鎖および第二鎖を含み、該プロセスは、以下の工程：
（ａ）第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーとリコンビナーゼ因子とを接触させて、第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）該第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを、該二本鎖標的配列に接触させ、それによって、該第一鎖の第一の部分において第一の二本鎖構造を形成し、そして該第二鎖の第二の部分にて第二の二本鎖構造を形成し、その結果、該第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーの３’末端は、同じテンプレート核酸分子上で互いに向かい合う、工程；
（ｃ）該第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーの３’末端を、１つ以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて伸長させて、第一の二本鎖核酸および第二の二本鎖核酸、ならびに第一の核酸置換鎖および第二の核酸置換鎖を生成する、工程、
（ｄ）所望の程度の増幅が達成されるまで、（ｂ）および（ｃ）を繰り返して、該反応を継続する工程、
を包含する、プロセス。
【請求項２】
前記工程（Ｃ）において、前記核酸の置換鎖は、同時ＲＰＡ反応によって増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸の置換鎖が、以下：
（ａ）前記第一の核タンパク質プライマーまたは第二の核タンパク質プライマーを、該置換鎖と接触させる工程；および
（ｂ）該第一の核タンパク質プライマーまたは第二の核タンパク質プライマーを、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて伸長させる工程、
によって増幅される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一の置換鎖および第二の置換鎖が、互いに対して少なくとも部分的に相補的であり、かつハイブリダイズして、娘二本鎖核酸を形成し得、該娘二本鎖核酸は、引き続く工程（ｂ）および（ｃ）において、二本鎖テンプレート核酸として作用し得る、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記第一の置換鎖および第二の置換鎖が、前記第一のプライマーまたは第二のプライマーに対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ該第一のプライマーまたは第二のプライマーにハイブリダイズし得る、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記核酸プライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの組み合わせである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記核酸プライマーの各々が、少なくとも１つの一本鎖３’領域を有する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
少なくとも１つのプライマーが、部分的に一本鎖かつ部分的に二本鎖であり、ここで、該プライマーは、特異的３’プライマー配列を有するより長い侵入鎖、および該より長い侵入鎖の５’末端に相補的なより短い非侵入鎖から構成される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記第一の核酸プライマーが、第一の非侵入鎖を含み、そして前記第二の核酸プライマーが、第二の非侵入鎖を含み、そして該第一の非侵入鎖および第二の非侵入鎖が、互いに相補的である、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記侵入鎖、前記非侵入鎖、または該侵入鎖および該非侵入鎖の両方が、検出可能な部分で標識されている、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記検出可能な部分が、蛍光色素、酵素、蛍光クエンチャー、酵素インヒビター、放射性標識およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記侵入鎖および前記非侵入鎖の両方が標識され、該侵入鎖は、第一の蛍光色素または第一の酵素で標識されており、そして該非侵入鎖は、第二の蛍光色素、第二の酵素、蛍光クエンチャーまたは酵素インヒビターで標識されている、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記侵入鎖および前記非侵入鎖の両方が標識され、該非侵入鎖は、第一の蛍光色素または第一の酵素で標識されており、そして該侵入鎖は、第二の蛍光色素、第二の酵素、蛍光クエンチャーまたは酵素インヒビターで標識されている、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記核酸プライマーの一方または両方が、一本鎖プライマーである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記一本鎖プライマーが、蛍光色素、酵素、蛍光クエンチャー、酵素インヒビター、放射性標識およびこれらの組み合わせからなる群より選択される検出可能な部分で標識されている、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
工程（ｄ）が、前記非侵入鎖の置換を引き起こす、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記侵入鎖および前記非侵入鎖が標識され、該侵入鎖と該非侵入鎖との分離が検出される、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１８】
部分的に二本鎖の侵入オリゴヌクレオチドの一方の放出された鎖が、他方の二本鎖侵入オリゴヌクレオチドの放出された鎖に対して相補的な配列である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記放出されたオリゴヌクレオチドが、一本鎖標的テンプレートに対して相補的であり、かつ該一本鎖標的テンプレートにハイブリダイズし、そして該一本鎖標的テンプレートの３’末端からのＤＮＡ合成を開始する、請求項１８に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記リコンビナーゼ因子が、ＲｅｃＡ、ＲａｄＡ、ＲａｄＢ、Ｒａｄ５１、そのホモログ、その機能的アナログおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記ホモログが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡの１９３〜２１２残基である、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記ホモログが、ＲｅｃＡ、ＲａｄＡまたはＲａｄＢの古細菌ホモログである、請求項２０に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記リコンビナーゼ因子が、温度感受性であり、ここで、該温度感受性リコンビナーゼ因子は、許容温度で鎖侵入活性を有し、そして非許容温度で鎖侵入活性を有さない、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記ＲＰＡプロセスが、ＡＴＰまたはＡＴＰアナログの存在下で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項２５】
ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＦの存在下で実施される、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２６】
前記ＡＴＰアナログが、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ＡＴＰγＳおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２５に記載のプロセス。
【請求項２７】
前記１つ以上のポリメラーゼが、原核生物ポリメラーゼまたは真核生物ポリメラーゼである、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項２８】
前記原核生物ポリメラーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  Ｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  ＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  ＩＶ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌ  Ｖまたはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２７に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項２９】
前記真核生物ポリメラーゼが、ｐｏｌ−α、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ、ｐｏｌ−εおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、真核生物の多タンパク質ポリメラーゼ複合体である、請求項２７に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３０】
前記所望の程度の増幅が、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍である、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３１】
前記第一の部分および第二の部分が、間に入る標的ＤＮＡ配列にわたる、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３２】
前記間に入る標的ＤＮＡ配列が、少なくとも１メガベースである、請求項３１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３３】
１つ以上の補助成分の存在下で実施される、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３４】
前記１つ以上の補助成分が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である、請求項３３に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３５】
前記補助成分が、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、レソルバーゼおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３４に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３６】
前記補助成分が、ＲｅｃＦ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲ、一本鎖結合タンパク質、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ  ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ダイマースライディングクランプ、ＤｎａＸクランプローダー、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼである、請求項３４に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３７】
前記補助部分が、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ダイマースライディングクランプ、真核生物ＰＣＮＡスライディングクランプ、Ｔ４スライディングクランプｇｐ４５およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるスライディングクランプである、請求項３４に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項３８】
前記補助成分が、β−クランプ、ＤｎａＸクランプローダーおよびポリメラーゼコア複合体からなる、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体である、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項３９】
前記補助成分が、一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質、スライディングクランプ、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、レソルバーゼおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項４０】
前記一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である、請求項３９に記載のプロセス。
【請求項４１】
前記スライディングクランプが、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ダイマースライディングクランプ、真核生物ＰＣＮＡスライディングクランプまたはＴ４スライディングクランプ（ｇｐ４５）である、請求項４０に記載のプロセス。
【請求項４２】
前記補助部分が、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣおよびＲｅｃＧである、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項４３】
前記プロセスが、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメントを安定化する因子の存在下で実施される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４４】
前記因子が、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＦまたはこれらの組み合わせである、請求項４３に記載のプロセス。
【請求項４５】
前記補助部分が、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣおよびＤｎａＧからなるプライモソーム複合体である、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項４６】
前記プロセスが、２０℃と５０℃との間で実施される、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項４７】
前記プロセスが、２０℃と４０℃との間で実施される、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項４８】
前記プロセスが、２０℃と３０℃との間で実施される、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項４９】
前記プロセスが、前記テンプレート核酸の温度誘導性の溶融なしに実施される、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項５０】
前記２つの核タンパク質プライマーが、各々、少なくとも１０００：１のプライマー：二本鎖核酸標的のモル比で存在する、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項５１】
前記工程（ｂ）および（ｃ）が、少なくとも１回繰り返される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５２】
前記工程（ｂ）および（ｃ）が、少なくとも５回繰り返される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５３】
少なくとも１つのプライマーが、増幅されるべき特異的配列と相補的でない１つ以上のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項５４】
少なくとも１つのプライマーが、その５’末端で前記標的配列と相補的でない１つ以上のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項５５】
前記少なくとも１つのヌクレオチドが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列を含むオリゴヌクレオチドである、請求項５４に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項５６】
前記増幅された核酸が、遺伝病に関連する少なくとも１つの特異的変異を含む、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項５７】
前記増幅された核酸配列が、病原生生物、癌遺伝子、活性化癌遺伝子または抑制された癌遺伝子中に含まれる、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項５８】
少なくとも１つのプライマーが、遺伝病に関連する配列に対して相補的である、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項５９】
少なくとも１つのプライマーが、病原生生物、癌遺伝子、活性化癌遺伝子または抑制された癌遺伝子中の核酸配列に対して相補的である、請求項１に記載のＲＰＡプロセス。
【請求項６０】
ネスティドＲＰＡ増幅のプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
（ａ）第一のプライマーおよび第二のプライマーを用いて請求項１に記載のＲＰＡプロセスを使用してＤＮＡの領域を増幅して、第一の増幅産物を生成する工程；
（ｂ）第三および第四のプライマーを用いて請求項１に記載のＲＰＡプロセスを使用して該増幅産物を増幅して、第二の増幅産物を生成する工程であって、ここで、該第二の増幅産物は、該第一の増幅産物内に含まれる、より小さい配列である、工程、
を包含する、プロセス。
【請求項６１】
前記第一のプライマー、前記第二のプライマー、前記第三のプライマーおよび前記第四のプライマーが、各々異なる、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６２】
前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーの一方が、前記第三のプライマーおよび第四のプライマーの一方と同一である、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６３】
二本鎖標的分子のＤＮＡ増幅のＲＰＡプロセスであって、該プロセスは、以下の工程：
（ａ）リコンビナーゼ因子を、第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーと接触させて、第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）該第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを、該二本鎖標的配列に接触させ、それによって、該標的分子の第一の部分において第一の二本鎖構造を形成し、そして該標的分子の第二の部分にて第二の二本鎖構造を形成し、その結果、該第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーの３’末端は、同じテンプレート核酸分子上で互いに向かい合う、工程；
ｃ）該標的配列を、プライモソーム構築タンパク質およびクランプローダー／ポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体と接触させて、該標的分子の第一の部分にて複製フォークを形成し、そして該標的分子の第二の部分にて第二の複製フォークを形成する、工程；
ｄ）該標的分子を、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩコア、ＤＮＡポリメラーゼＩ、プライマーゼ、ヘリカーゼおよびリガーゼに接触させて、リーディング鎖とラギング鎖のＤＮＡ合成を組み合わせ、そして該複製フォークを互いに対して移動させる、工程；
ｆ）所望の程度の増幅が達成されるまで、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の繰り返しによって該反応を継続する、工程、
を包含する、プロセス。
【請求項６４】
ｄＮＴＰおよびｒＮＴＰの存在下で実施される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の存在下で実施される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記リコンビナーゼ因子が、ＲｅｃＡまたはその機能的ホモログである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記プライモソーム構築タンパク質が、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＣ、ＤｎａＢ、ＤｎａＧ、Ｐｏｌ  ＩＩＩホロ酵素およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記クランプローダーが、ＤｎａＸクランプローダー複合体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩＩＩである、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＤＮＡポリメラーゼＩが、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記プライマーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤｎａＧプライマーゼである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記ヘリカーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤｎａＢヘリカーゼである、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３５８，５６３（２００２年２月２１日出願）に対する優先権の利益を主張する。Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／３５８，５６３は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
本明細書を通して、種々の特許、公開特許出願および科学参考文献が、当該分野の水準および内容を記載するために、引用される。これらの開示は、その全体が、本明細書中で参考として援用される。
【０００３】
ＤＮＡを増幅する能力は、現代の生物学的研究および医学的研究の中心にある。なぜなら、ほとんどの分子生物学的技術は、アッセイの感度を増加させるため、またはさらなる処理のために十分な材料を調製するために、多くの同一の分子を含むサンプルに依存するからである。種々の核酸増幅技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）があり、これは、短い核酸配列を増幅する際のその感度および効率に起因して、最も一般的である。
【０００４】
ＰＣＲは、大いに有用であるが、これはまた、多数の方法で限定されている。ＰＣＲの第一の制限は、高温での熱融解（変性）、その後のハイブリダイゼーションおよび低下した温度での伸長の、複数のサイクルに依存することである。効率を最大化しそしてノイズを最小化するために、複数の反応の複雑な温度制御が必要とされる。このことは、外来物質でできた、サーモサイクラーにより制御可能な迅速な加熱／冷却ブロック（例えば、金メッキした銀ブロック）、または温度制御された領域間でサンプルを移動させるためのロボット機構の使用を必要とする。生理学的塩条件下でＤＮＡを融解するのに必要な高温に起因して、ＰＣＲ技術は、サイクル毎の新たなポリメラーゼの添加または熱安定性ポリメラーゼの使用のいずれかを必要とする。新たなポリメラーゼを添加するアプローチは、自動化されておらず、従って、手間がかかりかつ誤ち（例えば、混入、落ちたチューブ、表示間違い）を導きやすい。さらに、酵素を添加する必要性および各反応を混合する必要性は、個々に、酵素添加ＰＣＲ方法の適用が小規模に限定された、重大な欠点を示す。
【０００５】
新たなポリメラーゼの添加を含む方法と比較して、ＰＣＲにおける熱安定性ポリメラーゼの使用は、最も広く実施されている。このアプローチは、熱安定性ポリメラーゼが限定された数の生物において見出され、そして好熱生物によって使用される複製機構があまり理解されていないという事実に苦しむ。熱安定性ポリメラーゼの利用可能なレパートリーは、ＤＮＡ修復および／またはラギング鎖合成に関与する単一のポリペプチドポリメラーゼ酵素に限定される。ＤＮＡ修復および／またはラギング鎖ポリメラーゼは、乏しい前進性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）（分配型合成（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｖｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ））を示すので、ＤＮＡ増幅についての選択肢が狭い。一部、修復および／またはラギング鎖ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ、Ｐｆｕ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ）を使用することの結果として、そして熱融解後の阻害的な核酸の二次構造または三次構造の形成に起因して、現在のＰＣＲプロトコルは、数千塩基対よりも長い配列を容易に増幅しない。より長いテンプレートの信頼性のある合成（および増幅）は、ポリメラーゼおよび補助酵素複合体（集合的に、かなり高いレベルの前進性、鎖置換、および二次構造分解を示す）、ならびに阻害的な高次核酸構造（熱変性したＤＮＡを冷却する際に形成され得る）の形成の制限に依存する。
【０００６】
ＰＣＲの第二の制限は、これが、水性環境中の、オリゴヌクレオチド（ＰＣＲプライマー）と変性したテンプレートＤＮＡ（すなわち、増幅されるべきＤＮＡ）との間の溶液ハイブリダイゼーションに依存することである。効率的にするために、ＰＣＲ反応は、短時間で実施される。なぜなら、熱安定性ポリメラーゼは、ＰＣＲ温度において活性が迅速に低下するからである。さらに、迅速な転回に重要な特徴である、短時間での効率的なハイブリダイゼーションについて、高濃度のオリゴヌクレオチドを有する環境中でＰＣＲを実施することが必要である。高いオリゴヌクレオチド濃度はまた、溶液中になお存在する熱変性した相補鎖と競合して、オリゴヌクレオチドとの標的配列の迅速な相互作用を確実にする。高いオリゴヌクレオチドプライマー濃度は、標的配列のコピー数が低く、かつＤＮＡ分子の複雑な混合物中に存在する場合に特に、問題を引き起こし得る。例えば、１つの遺伝子座における遺伝子多型を決定するための、ゲノムのＰＣＲの場合がそれである。
【０００７】
高いオリゴヌクレオチド濃度を使用する１つの問題は、このことが、複雑なＤＮＡ混合物中の部分的にのみ一致した配列を誤って開始する程度を増強することである。誤った開始とは、プライマー配列が、テンプレート核酸と完全には相補的でない（これは、核酸の非特異的増幅を生じ得る）場合でさえの、ＰＣＲにおけるテンプレートＤＮＡへのプライマーのハイブリダイゼーションをいう。誤った開始に起因するノイズは、オリゴヌクレオチド濃度および総出発ＤＮＡの複雑さと共に増大する。さらに、誤った開始の可能性は、標的配列のコピー数の減少と共に増大する。誤った開始についての条件が好都合な場合（すなわち、高いオリゴヌクレオチド濃度、高い複雑性、低いコピー数）、誤って増幅された配列が、優勢な反応産物となり得る。結果として、過剰な、誤って開始されたバックグラウンドなしに、サンプルＤＮＡから標的配列を清浄に増幅するための、条件およびオリゴヌクレオチドを同定することは、困難であり得る。従って、ＰＣＲを使用することのさらなる欠点は、複雑な配列混合物から稀な標的ＤＮＡを清浄に増幅する際の成功が限定されることである。
【０００８】
特異性の問題およびＰＣＲが被る温度融解問題の１つの解決は、細菌ＲｅｃＡタンパク質、またはその原核生物および真核生物の関連物の生物学的特性に依存する方法を使用することである。これらのタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を覆ってフィラメントを形成し、次いで、配列相同性の領域について二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を走査する。相同配列が位置づけられると、核タンパク質フィラメント鎖は、ｄｓＤＮＡに侵入して、短いハイブリッドおよびＤループとして公知の置換鎖バブルを生じる。Ｄループ中のフィラメント鎖の遊離３’末端は、新たな相補鎖を合成するために、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る。相補鎖は、伸長するにつれて、元の対合鎖を置換する。ＰＣＲにおいて使用されるのと類似の様式でオリゴヌクレオチドの対を利用することによって、類似の様式ではあるが熱溶解（熱サイクリング）を必要とせずに、標的ＤＮＡ配列を増幅することが可能であるはずである。このことは、ＰＣＲにおいて以前には使用不能であった熱不安定性ポリメラーゼの使用を可能にし、そしてハイブリダイゼーションの代わりにテンプレート走査および鎖侵入によって、信頼性および感度を増大させるという、両方の利点を有する。
【０００９】
核酸のインビトロ増幅のためのＲｅｃＡおよびそのホモログの使用は、以前に記載されているが（米国特許第５，２２３，４１４号（Ｚａｒｌｉｎｇら）（本明細書中で「Ｚａｒｌｉｎｇ」と称する））、これらの方法および結果は、限定されている。Ｚａｒｌｉｎｇの方法は、決定的な欠点を有し、二本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅を達成する能力が限定されている。Ｚａｒｌｉｎｇの方法が指数関数的増幅を達成できないことは、ＡＴＰではなくＡＴＰγＳを使用するその仕様に起因し得る。Ｚａｒｌｉｎｇの方法は、ＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントの構築においてＡＴＰの代わりにＡＴＰγＳの使用を主張する。なぜなら、これは、より安定なＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメント構造を生じるからである。通常、フィラメントは、５’から３’の方向で構築され、そしてＲｅｃＡがＡＴＰを加水分解するのと同時に、同じ５’から３’の方向で解体する。このプロセスは、構築および解体が同時に生じ、そして構築されたフィラメントの量が平衡している点で、動的である。加水分解不能なＡＴＰアナログであるＡＴＰγＳが使用される場合、ＡＴＰγＳの加水分解およびフィラメントの５’から３’への解体は、阻害される。ＲｅｃＡ／ＡＴＰγＳフィラメントの高い安定性は、鎖交換の前および後の両方で、標的化方法（すなわち、Ｚａｒｌｉｎｇ法）において有用である一方で、ＤＮＡ増幅について有害かつ非現実的である。
【００１０】
Ｚａｒｌｉｎｇ法において、鎖侵入に関与するＲｅｃＡタンパク質は、鎖交換後に、交換された物質の二本鎖部分と会合したままである。この相互作用は、新たに形成された二重鎖がＲｅｃＡの高親和性部位に結合することに起因して生じる。置換された鎖は、別の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＳＢ）に結合しない限り、異なる低い親和性部位を占める。ＡＴＰが交換構造を生成するために利用される場合、５’から３’への自発的解体が生じ得るが、この交換複合体は、完全に安定であり得、そしてＡＴＰ依存性の解体を刺激するために、さらなる因子を必要とし得る。自発的であるか刺激されるかに関わらず、ＡＴＰγＳの存在下で、ＲｅｃＡフィラメントの５’から３’への解体は阻害される（Ｐａｕｌｕｓ，Ｂ．Ｆ．およびＢｒｙａｎｔ，Ｆ．Ｒ．（１９９７）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，７８３２−８；Ｒｏｓｓｅｌｌｉ，Ｗ．およびＳｔａｓｉａｋ，Ａ．（１９９０）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１６，３３５−５２；Ｓｈａｎ，Ｑ．ら、（１９９７）．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６５，５１９−４０）。これらのＲｅｃＡ／ｄｓＤＮＡ複合体は、正確に、侵入および合成の引き続くラウンドを開始するために使用されるＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡプライマー複合体によって標的化される部位である。ＲｅｃＡの結合の際に、ｄｓＤＮＡは、もはやＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡプライマー複合体によって侵入され得ず、従って、この点からは増幅不能である。これらのテンプレートからのさらなる合成は、テンプレートの他の末端（ＲｅｃＡから離れている）で開始される場合に生じ得、そしてこれは、結合したＲｅｃＡの置換を最終的に導き得る。しかし、多くのポリメラーゼがこの様式でＲｅｃＡを置換し得るか否かは、不明である。さらに、合成ラウンドの開始部位は、ここで、代わりに「ブロック」される。このような状況において、増幅は、時間に関して線形なだけであり、そして一本鎖ＤＮＡ増幅産物を優勢に生じる。従って、記載されたＺａｒｌｉｎｇ法は、せいぜい、各テンプレートから少量のｓｓＤＮＡコピーだけをおそらく生じる。さらに、Ｚａｒｌｉｎｇ法によって提供される線形増幅は、ＳＳＢの存在下でのみ生じる。なぜなら、この置換鎖は、ＲｅｃＡ上の第二の相互作用部位に結合し続け、そして一本鎖ＤＮＡが放出されないからである（Ｍａｚｉｎ，Ａ．Ｖ．およびＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｃ．（１９９８）．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １７，１１６１−８）。このことは、おそらく、Ｚａｒｌｉｎｇ法が、ＳＳＢを含んだ場合に、より速く移動するさらなるフラグメントを観察した理由を説明する。これらのさらなるフラグメントは、置換された一本鎖フラグメントである可能性が最も高かった。従って、Ｚａｒｌｉｎｇ法において、一本鎖ＤＮＡの線形増幅のみが生じる。従って、改善されたリコンビナーゼ依存性のＤＮＡ増幅方法についての必要性が当該分野に存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＤＮＡの熱融解または熱安定性成分についての任意の要件を回避する、２つの新たな増幅ストラテジーを利用する。これらのストラテジーはまた、Ｚａｒｌｉｎｇ法の不十分さを克服する。Ｚａｒｌｉｎｇストラテジーのように、これらの方法は、細菌ＲｅｃＡタンパク質、またはその原核生物および真核生物の関連物の生物学的特性に依存する。しかし、Ｚａｒｌｉｎｇ法とは対照的に、これらの方法は、ｄｓＤＮＡの指数関数的増幅を達成するために設計されている。これらの方法は、動的なＲｅｃＡ／ＤＮＡフィラメントの存在下で、標的核酸中の標的化可能配列の迅速な再生を可能にすることによって、これを達成する。さらに、１つ以上の方法は、リーディング鎖およびラギング鎖の合成を組み合わせて、同時に２つの二本鎖産物を生成することによって、標的核酸の両端からの、同調した複製の開始についての要件を排除する。
【００１２】
（発明の簡単な説明）
本発明は、ＲＰＡと称されるＤＮＡ増幅方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する。第一に、第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーとリコンビナーゼ因子とを接触させて、第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを形成する。第二に、この第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを、二本鎖標的配列に接触させて、第一鎖の第一の部分において第一の二本鎖構造を形成し、そして該二鎖の第二の部分にて第二の二本鎖構造を形成し、その結果、この第一の核酸プライマーおよび第二の核酸プライマーの３’末端は、所定のテンプレートＤＮＡ分子上で互いに向かい合う。第三に、この第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーの３’末端を、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長させて、第一の二本鎖核酸および第二の二本鎖核酸、ならびに第一の核酸置換鎖および第二の核酸置換鎖を生成する。最後に、所望の程度の増幅が達成されるまで、第二の工程および第三の工程を繰り返す。
【００１３】
本発明はまた、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＰＡ方法を提供する。ネスティドＲＰＡにおいて、核酸の第一の領域は、ＲＰＡによって増幅されて、第一の増幅領域を形成する。次いで、完全に第一の増幅領域内にある核酸の第二の領域は、ＲＰＡを使用して増幅されて、第二の増幅領域を形成する。このプロセスは、必要に応じて繰り返され得る。例えば、核酸の第三の領域（これは、完全に第二の領域内にある）は、ＲＰＡによって、第二の増幅領域から増幅され得る。上記で考察したＲＰＡの１回、２回および３回のラウンドに加えて、本発明は、少なくとも４回、そして好ましくは少なくとも５回の、ネスティドＲＰＡのラウンドもまた、企図する。
【００１４】
本発明はまた、ＲＰＡを使用して遺伝子型を検出する方法を提供する。この方法は、遺伝子型決定、正常状態もしくは疾患状態、素因または疾患状態の素因の欠如の検出のために、有用である。さらに、ＲＰＡは、ゲノム（例えば、病原体のゲノム）の存在を検出するために使用され得る。この用途において、この方法は、診断および検出のために有用である。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、標的核酸ポリマーの増幅のための方法である、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を提供する。ＲＰＡの１つの利点は、これが、二本鎖テンプレートの熱融解を必要とせずに実施され得、従って、高価なサーモサイクラーもまた排除するという点である。本発明は、ＲＰＡが標的核酸ポリマーの指数関数的増幅を可能にするように構成され得る、２つの関連するストラテジーを記載する。
【００１６】
（リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ））
リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ）において、一本鎖または部分的に一本鎖の核酸プライマーが、Ｄループ構造を形成するリコンビナーゼ因子を使用して、相同な二本鎖または部分的に二本鎖の配列に標的化される。侵入一本鎖プライマー（これは、Ｄループの一部である）が、ポリメラーゼ合成反応を開始するために使用される。単一のプライマー種が、二本鎖侵入およびその後の合成の、複数のラウンドを通じて、標的核酸配列を増幅する。２つの対向するプライマーが使用される場合、フラグメント（標的配列）の増幅が達成され得る。ｌｓＲＰＡは、図１および２において簡潔に記載される。
【００１７】
本発明の方法のいずれかにおいて増幅されるべき標的配列は、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。しかし、本発明の方法は、二本鎖ＤＮＡ分子に限定されない。なぜなら、他の核酸分子（例えば、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、公知の方法を使用して当業者によって、二本鎖ＤＮＡに転換され得るからである。適切な二本鎖標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。本発明のＲＰＡは、標的核酸を、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１，０００倍、なおより好ましくは少なくとも１０，０００倍、そして最も好ましくは少なくとも１，０００，０００倍、増幅し得る。
【００１８】
標的配列は、リコンビナーゼ因子の助けにより増幅される。リコンビナーゼ因子は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を覆ってフィラメントを形成し得る酵素であり、このフィラメントは、次いで、配列相同性の領域について二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を走査し得る。相同配列が位置づけられると、核タンパク質フィラメント（リコンビナーゼ因子を含む）鎖は、ｄｓＤＮＡに侵入して、短いハイブリッドおよびＤループとして公知の置換鎖バブルを生じる。適切なリコンビナーゼ因子としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質または任意の門由来の任意の相同なタンパク質もしくはタンパク質複合体が挙げられる。これらのＲｅｃＡホモログは、この群の最初のメンバーが同定された後に、Ｒａｄ５１と一般に命名されている。他のリコンビナーゼ因子（例えば、ＲｅｃＴまたはＲｅｃＯ）が、ＲｅｃＡの代わりに利用され得る。リコンビナーゼ因子は、一般に、ＡＴＰ、ＡＴＰγＳまたは他のヌクレオシド三リン酸およびそれらのアナログの存在を必要とする。標的化部位の再生がＤループにより刺激される合成のラウンドの直後に生じ得る反応環境において、リコンビナーゼ因子が使用されることが好ましい。このことは、片側合成を一方の端から他方の端へ振動させることによって引き起こされる、ｓｓＤＮＡの増幅の失速または不十分な線形増幅を回避する。
【００１９】
天然に、上記リコンビナーゼ因子の任意の誘導体および機能的アナログもまた、それ自体、リコンビナーゼ因子として機能し得、そしてこれらの誘導体およびアナログもまた、本発明の実施形態として企図される。例えば、ｒｅｃＡ由来の小ペプチド（これは、ｒｅｃＡのリコンビナーゼ特性のいくつかの局面を保持することが示されている）が使用され得る。このペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｅｃＡの残基１９３〜２１２を含み、そしてｓｓオリゴの対合を媒介し得る（Ｏｌｅｇ  Ｎ．Ｖｏｌｏｓｈｉｎ，Ｌｉｊａｎｇ  Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｄａｎｉｅｌ  Ｃａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ，Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ  ｐａｉｒｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ２０−ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ＲｅｃＡ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２７２  １０  Ｍａｙ  １９９６）。
【００２０】
ＡＴＰγＳの使用は、安定なリコンビナーゼ因子／ｄｓＤＮＡ複合体（これは、効率的な増幅と適合性でない可能性がある）の形成を生じるので、ＡＴＰならびにリコンビナーゼ因子／ｓｓＤＮＡプライマー複合体をロードおよび維持するための補助酵素を使用することが好ましい。あるいは、ＡＴＰγＳの使用の制限は、ＡＴＰγＳに結合したｒｅｃＡを交換複合体から剥ぎ取り得る、さらなる反応成分の使用によって、克服され得る。この役割は、ＲｕｖＡ／ＲｕｖＢ複合体のようなヘリカーゼによって、果たされ得る。
【００２１】
用語「核酸ポリマー」または「核酸」は、本記載において使用される場合、広く解釈され得、そしてＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに他のハイブリダイズする核酸様分子（例えば、置換された骨格を有する分子（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））、モルホリン骨格核酸）または改変された塩基および糖を有する分子）を包含し得る。
【００２２】
好ましい実施形態において、ＲＰＡは、いくつかの補助酵素（これは、ＤＮＡ合成の開始後に、リコンビナーゼ因子／ｄｓＤＮＡ複合体の効率的な解体を促進し得る）を用いて実施される。これらの補助酵素としては、３’から５’への解体を刺激し得るもの、および５’から３’への解体を支持し得るものが挙げられる。
【００２３】
補助酵素としては、３’から５’の方向でＲｅｃＡを置換し得、そしてリコンビナーゼ因子／ｄｓＤＮＡ複合体の３’から５’への解体を刺激し得るいくつかのポリメラーゼ（Ｐｈａｍら、２００１）が挙げられる。これらのＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰｏｌＶおよび他種の相同ポリメラーゼが挙げられる。通常、Ｅ．ｃｏｌｉの生活において、３’から５’の方向でのＲｅｃＡの置換は、ＳＳＢ、スライディングクランプ（ｓｌｉｄｉｎｇ  ｃｌａｍｐ）およびＤＮＡポリメラーゼと協同して、ＳＯＳ傷害標的化合成（ＳＯＳ−ｌｅｓｉｏｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の一部として生じる。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこの活性に必須なポリメラーゼは、ＵｍｕＣ、ＤｉｎＢ、Ｒａｄ３０およびＲｅｖｌを含むポリメラーゼの最近発見されたスーパーファミリーのメンバーであるＰｏｌＶであり、そのインビボでの機能は、ＤＮＡ傷害（ｌｅｓｉｏｎ）テンプレートをコピーすることである。ＲＰＡにとって重要な、インビトロでのＲｅｃＡフィラメントの３’から５’への解体は、ＰｏｌＩ単独、ＰｏｌＩＩＩ単独またはＰｏｌＩＶ単独によっては、触媒され得ない。ＰｏｌＶのみが、ＳＳＢと協同して、測定可能な、ＡＴＰ非依存的な３’から５’へのＲｅｃＡ／ｄｓＤＮＡ解体活性を有する。実際、ＰｏｌＶは、ポリメラーゼの前に、３’から５’の方向で、ＲｅｃＡを推し進め、そしてＤＮＡからＲｅｃＡを除去する（Ｐｈａｍら、２００１；Ｔａｎｇら、２０００）。ＰｏｌＶまたは機能的ホモログを含めることによって、増幅効率を改善し得る。
【００２４】
他の補助酵素としては、ｄｓＤＮＡからのＲｅｃＡの解体を促進するために使用され得る、ヘリカーゼと称される酵素のクラスが挙げられる。これらは、５’から３’の方向および３’から５’の方向の両方での解体を促進する。ヘリカーゼは、インビボの組換えプロセスの必須な構成要素であり、そしてある場所から別の場所へと組換え中間体の分岐点を移動させ、鎖を分離し、そしてＤＮＡに結合した成分を解体およびリサイクルするように、機能する。ＲＰＡにおいて侵入／合成の第一ラウンドが生じた後、２つの新たなＤＮＡ二重鎖が、プライマーが合成のさらなるラウンドのために結合すべき部位上に結合したＲｅｃＡの存在によって「印付け」される。このような状況において、ｄｓＤＮＡは、５’から３’の方向でのＡＴＰ依存性の解離（限定的であり得る）またはいくつかの他の活性プロセスでの３’から５’の方向での解離のいずれかによって、活性に置換されるまで、ＲｅｃＡ中の高親和性部位を占有する傾向がある。中間体からのＲｅｃＡの解体を刺激するための理想的なヘリカーゼ複合体は、Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質のＲｕｖＡおよびＲｕｖＢからなる。ＲｕｖＡＢ複合体は、分枝の移動を促進し、そしてＲｅｃＡタンパク質を解離させて、ＲｅｃＡのリサイクルを可能にする（Ａｄａｍｓら、１９９４）。通常、ＲｕｖＡＢ複合体は、組換え中間体（特にホリデイ接合部様構造）を標的化する。作用の際に、ＲｕｖＡＢ複合体は、ＤＮＡを取り囲み、そしてＡＴＰにより駆動される転座において、ＤＮＡからＲｅｃＡを押しやる（ｆｏｒｃｅ）（ＣｒｏｍｉｅおよびＬｅａｃｈ，２０００；ＥｇｇｌｅｓｔｏｎおよびＷｅｓｔ，２０００）。このＲｅｃＡ解離活性は、ホリデイ接合部さえ有さない、ＲｅｃＡと結合したスーパーコイルｄｓＤＮＡを使用して実証されている（Ａｄａｍｓら、ＰＮＡＳ  １９９４）。ＲｕｖＡＢ複合体は、ＲｅｃＡに覆われたＤＮＡ内の分枝構造を認識し得る。ＲＰＡ混合物へのＲｕｖＡＢの取り込みは、鎖の交換および置換後に、ｄｓＤＮＡからのＲｅｃＡの解離を促進し、同じ部位からの複製されたテンプレートの新たな合成を可能にする。その上、ＲｕｖＡＢ複合体は、ＲｕｖＣ（これは、ホリデイ接合部を最終的に切断および分解する）と協同して作用し得る。ＲＰＡ反応混合物にＲｕｖＣを添加すると、侵入部位において形成される、ホリデイ接合部のような複雑な構造が分解され得る。ＲｕｖＣによって提供されるようなレソルバーゼ活性は、標的化オリゴヌクレオチドが部分的に二本鎖である場合に、特に重要である。このような状況において、逆分枝移動は、ホリデイ接合部（これは、次いで、ＲｕｖＡＢＣ複合体によって分解され得る）を生成して、清浄な分離された増幅産物を生成し得る。
【００２５】
なお他の補助酵素としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＧタンパク質が挙げられる。ＲｅｃＧは、分枝構造の解体を刺激し得る。インビボで、このタンパク質は、リーディング鎖およびラギング鎖の両方を巻き戻して、複製フォークを戻して駆動することによって、ＤＮＡ損傷部位にて複製フォークを逆転させるように機能して、４方向接合部（４−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を生成する（Ｃｏｘら、２０００；ＤｉｌｌｉｎｇｈａｍおよびＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ，２００１；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、２００１）。インビボで、このような接合部は、鎖スイッチングのための基質として機能して、傷害バイパスを可能にする。インビトロで、ＲｅｃＧは、Ｄループに結合し、そして逆分枝移動を駆動することによってＤループ構造の減少を導く。ＲｅｃＧは、いずれかの側での二本鎖エレメントとの接合部を優先し、従って、一本鎖領域および二本鎖領域の両方で標的化部位に相同な、部分的に二本鎖の標的化オリゴヌクレオチドが理想的である。これは、逆分枝移動およびホリデイ接合部（これは、ＲｕｖＡＢＣ複合体によって分解され得る）の形成を刺激する。インビボで、ＲｅｃＧとＲｕｖＡＢとは競合して、異なる組換え結果を生じ得る。なぜなら、分枝移動は、両方向で駆動されるからである（ＭｃＧｌｙｎｎおよびＬｌｏｙｄ，１９９９；ＭｃＧｌｙｎｎら、２０００）。両方の場合において、タンパク質は、ＲｅｃＡで覆われた接合部ＤＮＡを標的化し、そして能動的様式でそれを解体する。
【００２６】
ＲＰＡ反応混合物において有用な他の補助酵素は、ＡＴＰおよびＳＳＢの存在下で、ＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントの連続的な生成を可能にするものである。適切な瞬間でのＲｅｃＡの除去を可能にするために、ＲＰＡ反応において、ＡＴＰγＳではなくＡＴＰを使用することが好ましい。残念ながら、ＡＴＰを用いて形成されたＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントは、５’から３’の方向で自発的に脱重合し、そしてここで必要に応じてＳＳＢの存在下で、再重合は有意な速度で生じない。この問題の解決は、ＲｅｃＯタンパク質、ＲｅｃＲタンパク質、そしておそらくはＲｅｃＦタンパク質の使用である。ＳＳＢおよびＡＴＰの存在下で、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントが解離する（Ｂｏｒｋら、２００１；Ｗｅｂｂら、１９９５；Ｗｅｂｂら、１９９７；Ｗｅｂｂら、１９９９）。ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡがＲｅｃＯタンパク質およびＲｅｃＲタンパク質の存在下でインキュベートされる場合、この解離は生じない。実際、ＲｅｃＲタンパク質は、フィラメントと会合したままであり、そしてその構造を永久的に安定化する。ｓｓＤＮＡがＳＳＢと結合している場合でさえ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＯの存在下で、ＲｅｃＡのフィラメントは、置換ＳＳＢを再構築し得る。従って、必要に応じて、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントの完全性を維持するために、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲの存在下でＡＴＰを使用することによって、ＡＴＰγＳの使用を排除することが可能である。ＲｅｃＦタンパク質は、見かけ上反対の様式で、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲの系と相互作用する。ＲｅｃＦは、インビトロでのフィラメント解体を駆動する傾向があるＲｅｃＲと競合する。ｓｓＤＮＡのＲｅｃＡでの覆いの程度を制限しつつ、３つ全ての成分が、侵入構造の生成を制御するためにインビボで一緒に機能する可能性がある。別の好ましい実施形態において、ＲｅｃＦは、インビボプロセスの動力学を繰り返すのに適切な濃度で、ＲＰＡ反応に含まれる。さらに、ＲｅｃＦは、侵入が生じた後の、ＲｅｃＡで覆われた中間体の解離を促進し得る。
【００２７】
記載されるように、ＡＴＰγＳではなくＡＴＰの使用、ならびに／または置換ポリメラーゼおよびヘリカーゼ（例えば、ＲｕｖＡ／ＲｕｖＢ複合体）、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＦの使用は、標的化部位の連続的な再生を駆動することによって、二本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅を可能にするはずである。しかし、この方法は、２つの対向する標的化部位で生じ得る、開始速度の差異に応答性であるままである。このような差異は、増幅効率の低下およびいくつかの一本鎖ＤＮＡの産生を導き得る。温度サイクリングは、いずれかの部位からの調和した合成を導くので、ＰＣＲ方法は、これらの複雑さをほぼ回避する。別の実施形態において、上記ＰＣＲ条件と類似の状況は、ＲｅｃＡの温度感受性（ｔｓ）変異体（これは、４２℃で非機能的であるが、２５℃〜３７℃の範囲のより低い温度では機能する）を使用することによって、導入され得る（Ａｌｅｘｓｅｙｅｖら、１９９６；  Ｈｉｃｋｓｏｎら、１９８１）。この場合、いずれかの末端からの合成は、許容温度に周期的に低下させ、次いで、変異体ＲｅｃＡタンパク質の機能については非許容性であるが、他の成分については許容性の温度まで反応の温度を上げることによって、同調され得る。反応温度のサイクリングと組み合わせてｔｓＲｅｃＡ変異体を用いてＲＰＡを実施することによって、生成されるＤＮＡ分子数が制御され得る。これは、温度サイクリングを提供するためにいくつかの機構を必要とするが、この温度は、好熱菌由来のタンパク質の使用を必要とする温度よりは十分低い。実際、単純な化学物質ベースまたは携帯型低出力の温度サイクリングデバイスが、このような反応サイクルを制御するために十分である。
【００２８】
他の全ての今日の核酸増幅方法と同様に、ＲＰＡは、テンプレート核酸分子のコピーを生成するために、ポリメラーゼを使用する。組み込みが、新たな合成の部位に隣接する二本鎖核酸の短い鎖の末端糖上の遊離の３’ヒドロキシル部分を必要とすることが、ほとんどの核酸ポリメラーゼに必要である。二本鎖核酸のこの鎖は、代表的には、短い相補鎖（プライマーと呼ぶ）（これは、ポリメラーゼ合成反応の開始部位として作用する）によって、テンプレート上で形成される。いくつかの場合、スルフヒドリルのような３’改変が、合成反応を開始するために利用され得る。テンプレートと塩基対合し、そしてポリメラーゼによって伸長されるプライマー核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。インビボのゲノムＤＮＡ複製の間に、ＲＮＡプライマー配列は、プライマーゼ酵素によって、テンプレートＤＮＡ上に新たに合成される。代表的に、インビトロの反応について、プライマーは、しばしば化学合成された、短い一本鎖ＤＮＡ（または改変ＤＮＡもしくはＲＮＡ）として供給され、そしてオリゴヌクレオチドプライマーと通常いわれる。プライマーは、しばしば、特異的配列のものであるが、ランダムプライマーもまた使用され得る。プライマーは、その特異的塩基対合能によって、相補的配列に対して標的化される。オリゴヌクレオチドプライマーと標的核酸との間のハイブリッドの形成は、代表的に、自発的アニーリングを可能にする塩、ｐＨおよび温度の条件下で、溶液中でこれら２つをインキュベートすることによって、形成される。
【００２９】
ＰＣＲの場合、オリゴヌクレオチドプライマーは、通常、２つの主な理由のために大過剰である。第一に、高濃度は、迅速なアニーリングを駆動する。第二に、融解、アニーリングおよび伸長のラウンドを通じて反応が進行するにつれて、プライマーは消費され、そして限定されてくる。ＰＣＲ標的化核酸は、しばしば、本来最初に二本鎖であり、そうでない場合、最初の合成サイクルの後に二本鎖になる。このような二本鎖分子は、ほとんどの原核生物および真核生物のタンパク質の触媒活性および安定性について適切な温度および溶媒条件では、新たなオリゴヌクレオチドにアニーリングできない。結果として、増幅サイクルを可能にするために、元のテンプレートおよび新たに合成された鎖は、アニーリングが再び生じる前に、最初に分離されなければならない。実際、これは、熱融解によって達成される。ＰＣＲについて、少なくとも８０℃の温度が、１００塩基対より長い長さのほとんどの二本鎖核酸分子の熱融解に必要である。ほとんどのＰＣＲプロトコルにおいて、９０℃〜１００℃の温度が、ＤＮＡを融解するために適用される。このような温度は、まれな熱安定性酵素だけの使用を可能にする。これらのポリメラーゼは、代表的に、好熱原核生物由来である。
【００３０】
ＲＰＡの利点は、熱融解なしでの二本鎖テンプレートからの伸長のために、遊離の３’−ＯＨを有する二本鎖核酸の短い鎖の形成を可能にすることである。これは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲｅｃＡタンパク質（または他の門由来のＲｅｃＡ関連物）を使用することによって達成される。  ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ＵＴＰ、ＡＴＰγＳおよびおそらく他の型のヌクレオシド三リン酸ならびにそれらのアナログの存在下で、ＲｅｃＡは、一本鎖ＤＮＡの周りで核タンパク質フィラメントを形成する。次いで、このフィラメントは、二本鎖ＤＮＡを走査する。相同な配列が位置づけられると、ＲｅｃＡは、鎖侵入反応、および標的ＤＮＡの相同鎖とのオリゴヌクレオチドの対合を触媒する。元の対合鎖は、鎖侵入によって置換されて、この領域中に一本鎖のバブルを残す。
【００３１】
ＲｅｃＡタンパク質は、市販の供給源から獲得され得る。あるいは、これは、標準的な手順（例えば、Ｃｏｘら、１９８１；Ｋｕｒａｍｉｔｓｕら、１９８１）に従って精製され得る。ＲｅｃＡホモログは、以下を含む好熱生物から精製されている：Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（Ｒａｓｈｉｄら、２００１）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｗｅｔｍｕｒら、１９９４）、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ（Ｗｅｔｍｕｒら、１９９４）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｋｏｍｏｒｉら、２０００）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｗｅｔｍｕｒら、１９９４）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ（Ｓｐｉｅｓら、２０００）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＫａｔｏおよびＫｕｒａｍｉｔｓｕ，１９９３）。ＲｅｃＡはまた、他の原核生物（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  （ＰｉｅｒｒｅおよびＰａｏｌｅｔｔｉ，１９８３）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＬｏｖｅｔｔおよびＲｏｂｅｒｔｓ，１９８５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＳｔｅｆｆｅｎおよびＢｒｙａｎｔ，２０００）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｇｏｏｄｍａｎら、１９８７）、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（Ｗｅｓｔら、１９８３）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｂｅｔｔｅｒ  およびＨｅｌｉｎｓｋｉ，１９８３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｋｕｒｕｍｉｚａｋａら、１９９４））、真核生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＨｅｙｅｒおよびＫｏｌｏｄｎｅｒ，１９８９）、Ｕｓｔｉｌａｇｏ  ｍａｙｄｉｓ（ＢｅｎｎｅｔｔおよびＨｏｌｌｏｍａｎ、２００１）、脊椎動物（例えば、ヒトＲａｄ５１  （Ｂａｕｍａｎｎら、１９９７）およびＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ（Ｍａｅｓｈｉｍａら、１９９６）を含む）、ならびにブロッコリーを含む植物（Ｔｉｓｓｉｅｒら、１９９５））から、精製されている。
【００３２】
記載を明確にするため、リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅方法（ｌｓＲＰＡ）は、以下の４つの段階に分割され得る。
【００３３】
１）配列標的化
ＲＰＡは、ＲｅｃＡまたは機能的ホモログで覆われた合成オリゴヌクレオチドを使用して配列を標的化することによって開始される。指数関数的増幅を可能にするために、２つのこのような合成オリゴヌクレオチドを、その遊離３’末端が互いに対して向き合うような様式で、使用した。これらのオリゴヌクレオチドおよびＲｅｃＡタンパク質を含む核タンパク質フィラメントは、複雑なＤＮＡ中の標的を、迅速かつ特異的に同定する。一旦標的化されると、ＲｅｃＡタンパク質が鎖交換を触媒し、その結果、Ｄループ構造が形成される。効率的な増幅のための手順において、ＡＴＰγＳではなくＡＴＰを使用することが必要であり得る。ＡＴＰが使用される場合、ＲｅｃＯ分子、ＲｅｃＲ分子および／またはＲｅｃＦ分子は、効率的な増幅に重要であることを立証し得る。
【００３４】
２）ＤＮＡ合成の開始
ＤＮＡポリメラーゼは、侵入オリゴヌクレオチドとテンプレートＤＮＡとの間のハイブリッドを検出し、そしてこのハイブリッドに結合し、そしてハイブリッド中の露出した遊離３’−ヒドロキシルからＤＮＡ合成を開始する。この３’−ヒドロキシルの露出および引き続くＤＮＡ合成は、鎖交換によって形成された二本鎖ハイブリッドからの、ＲｅｃＡタンパク質の解体を必要とする可能性がある。この解体に達するために、侵入複合体からのＲｅｃＡの自発的な解体を支持し得る、ＡＴＰを使用する必要がおそらくある。さらに、解体は、鎖交換産物からＲｅｃＡを剥ぎ取るように作用し得る、反応混合物中に含まれる他のタンパク質（例えば、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ｒｅｃＧ、他のヘリカーゼ）または他の刺激成分の使用によって、刺激／増強され得る。
【００３５】
３）鎖置換ＤＮＡ合成およびレプリコン分離
ＤＮＡポリメラーゼが、侵入オリゴヌクレオチドの遊離３’−ヒドロキシルを使用して、テンプレートＤＮＡの相補コピーまたはそれらの部分的伸長産物を合成する場合、このポリメラーゼは、反応中に含まれる一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）で覆われ得る、一本鎖ＤＮＡを置換する。理想的な構成において、標的核酸配列の両方の末端でのオリゴヌクレオチドの侵入は、同じテンプレート核酸上の２つのポリメラーゼが、互いに向かって最初に進行するように、類似の時間枠で生じる。これらの伸長する複合体が互いに遭遇する場合、元のテンプレートは、単純にばらばらにされるはずであり、そしてポリメラーゼは、鎖置換を必要とせずに合成し続けて、ここで、ＳＳＢに結合したｓｓＤＮＡテンプレートをコピーする。立体障害に起因して、ポリメラーゼが遭遇して、２つのテンプレート鎖の分離を可能にする場合、テンプレートから一時的に解離し得る。
【００３６】
４）合成の完了および再侵入
一旦、テンプレート鎖が分離されると、ポリメラーゼは、テンプレートの末端への（または、最初のテンプレートが所望の産物よりも長い場合、第二の対向する標的部位として作用する配列を通過して）伸長を完了し得る。指数関数的増幅を可能にするために、両方の標的化末端からである、元のテンプレートと類似の様式で、新たな産物が標的化および複製されることが必要である。新たに合成された標的化部位は、ＲｅｃＡ／オリゴヌクレオチドフィラメントを標的化するために、自由に利用可能である。合成を開始するために最初に使用される部位はまた、鎖交換産物からのＲｅｃＡの解体に有利な、反応系中の条件の使用の結果として、遊離化されていなければならない。この後者の部位での再侵入が、ポリメラーゼが第二の標的化部位を通過して合成し、その第二の部位で開始され、そして第一の部位に戻るのにかかる時間よりも短い時間で生じる場合、一本鎖ＤＮＡは、初代の産物ではなく、そして指数関数的増幅が生じる。同じテンプレートに対して作用する複数の合成複合体を有することは、非常に短い増幅時間が達成され得る可能性を上昇させる。
【００３７】
（同時のリーディング鎖およびラギング鎖の合成を使用する、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ））
本発明者らの（リーディング鎖ＲＰＡ）ｌｓＲＰＡの記載において、本発明者らは、標的化配列を再生する能力、従って、二本鎖ＤＮＡの指数関数的増幅を可能にする能力を有する多成分系を詳述する。Ｚａｒｌｉｎｇ法とは異なり、ｌｓＲＰＡは、一本鎖ＤＮＡの線形生成を回避する。一本鎖産物の可能性および同時末端開始の要件を完全に回避する、この問題を解決するための別のアプローチが存在する。この方法は、より複雑な反応混合物を必然的に包含する。それにもかかわらず、全ての必要な成分は、ここで十分理解され、そして単一の系への構築に従うはずである。この系は、細胞の正常な複製サイクルの間に生じる事象を繰り返して、リーディング鎖およびラギング鎖の合成を組み合わせることを可能にする。この方法、リーディング鎖／ラギング鎖ＲＰＡは、図１および３に簡単に記載される。
【００３８】
インビボでの正常な複製の間に、二本鎖ＤＮＡは、２つの鎖に同時に分離され、そしてその両方が、複製機構によってコピーされて、２つの新たな二本鎖ＤＮＡ分子を生じる。この「機構」は、従来の５’から３’の方向のリーディング鎖の合成を、ラギング鎖の合成と組み合わせ、ここで、短いＲＮＡプライマーが、プライマーゼ酵素によって、テンプレート核酸上で合成される。ラギング鎖の合成の間、岡崎フラグメントと呼ばれる短いＤＮＡフラグメントが生成され、これらは、一緒に連結されて、連続したラギング鎖を形成する。この同時リーディング鎖／ラギング鎖合成は、原核生物および真核生物の全ゲノムの複製も同様に担う。この系の重要な構成要素は、同定され、そして生化学的に特徴付けられている。これらの構成要素は、リーディング鎖の合成のみを使用して可能なものよりも効率的な増幅を達成するために、インビトロで構築され得る。
【００３９】
複製「機構」の重要な構成要素は、現在、Ｅ．ｃｏｌｉについて十分特徴付けられている。この機構は、ＰｏｌＩＩＩホロ酵素（ＧｌｏｖｅｒおよびＭｃＨｅｎｒｙ，２００１；ＫｅｌｍａｎおよびＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，１９９５）およびプライモソーム（Ｂｅｎｋｏｖｉｃら、２００１；Ｍａｒｉａｎｓ，１９９９）を含む。ＰＯｌＩＩＩホロ酵素は、１０個のポリペプチド要素からなる。各ホロ酵素は、２つの非対称的に配向したコア構造を含み、これらの各々は、ポリメラーゼ（αサブユニット）および２つのさらなるコア要素であるεサブユニット（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する）、およびθサブユニットからなる。このコア複合体に加えて、別のセットのポリペプチドが、前進性をホロ酵素に提供し、そしてリーディング鎖およびラギング鎖の合成を組み合わせる。β−ダイマースライディングクランプは、テンプレートＤＮＡを取り囲んで、非常に高い親和性でこのテンプレートに複合体を取り付ける。スライディングクランプは、τ２γδδ’χψポリペプチドサブユニットを含むＤｎａＸクランプローダー（ｃｌａｍｐ  ｌｏａｄｅｒ）によって、ＤＮＡ上にロードされる。
【００４０】
記載を明確にするため、ＲＰＡ方法は、以下の４つの段階に分割され得る。実際には、全ての段階は、単一の反応で同時に生じる。
【００４１】
１）配列標的化
ＲＰＡは、ＲｅｃＡで覆われた合成オリゴヌクレオチドまたは機能的ホモログを使用して、配列を標的化することによって開始される。このような核タンパク質フィラメントは、複雑なＤＮＡ中の標的を、迅速かつ特異的に同定する。一旦標的化されると、ＲｅｃＡタンパク質は、Ｄループ構造が形成されるように、鎖置換を触媒する。効率的な増幅のための手順において、ＡＴＰγＳではなくＡＴＰを使用することが必要であり得る。しかし、リーディング鎖およびラギング鎖の合成の連結は、合成開始後の非常に迅速なＲｅｃＡ剥ぎ取りの要件を排除し得る。ＡＴＰが使用される場合、ＲｅｃＯ分子、ＲｅｃＲ分子および／またはＲｅｃＦ分子は、効率的な増幅に重要であることを立証し得る。
【００４２】
２）プライモソーム構築
プライモソームは、Ｄループにて構築され得る。通常、Ｄループ構造は、インビボのＤＮＡ損傷をレスキューする機構の一部として、または他の形態の組換えの間に、ＲｅｃＡによって形成される。ＲｅｃＡ媒介性の鎖交換およびプライモソーム構築の合わされた作用の目的は、複製フォークを生成することである。複製フォークは、分離されたテンプレートＤＮＡおよびレプリソーム（ｒｅｐｌｉｓｏｍｅ）を含む核タンパク質構造である。このレプリソームは、ポリメラーゼホロ酵素複合体、プライモソームおよびテンプレートＤＮＡの両方の鎖を同時に複製するために必要とされる他の構成要素からなる。プライモソームは、複製フォークの進行に必要な、ＤＮＡ巻き戻しおよび岡崎フラグメントの開始機能の両方を提供する。
【００４３】
プライモソーム構築は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、遺伝学的分析および生化学的分析を用いて集中的に研究されている。このプロセスに必要な最小セットのポリペプチドは周知であり、そして精製された成分として存在する。プライモソーム構築タンパク質は、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＣ、ＤｎａＢおよびＤｎａＧである。これらのタンパク質は、インビトロで、バクテリオファージΦＸ１７４  ＤＮＡ上にプライモソーム複合体を構築するのに十分であることが示されている（ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，１９９２；Ｍａｒｉａｎｓ，１９９２）。ＰｒｉＡは、ΦＸ１７４染色体上のプライモソーム構築部位（ＰＡＳ）に結合する。次いで、ＰｒｉＢ、ＤｎａＴおよびＰｒｉＣが、このＰｒｉＡ−ＤＮＡ複合体に連続して結合する。ＰｒｉＢは、ＰＡＳにてＰｒｉＡを安定化し、そしてＤｎａＴの結合を容易にするようである（Ｌｉｕら、１９９６）。ＰｒｉＣは、完全な構築反応のために部分的にのみ必要である。この反応からＰｒｉＣを省くと、開始が３〜４分の１に低下する（ＮｇおよびＭａｒｉａｎｓ，１９９６ａ；ＮｇおよびＭａｒｉａｎｓ，１９９６ｂ）。細菌におけるＰｒｉＣの機能は、ＰｒｉＢと遺伝学的に重複する。次いで、ＤｎａＣは、ＡＴＰ依存的な様式で、この複合体にＤｎａＢをロードする。このＰｒｉＡＢＣ−ＤｎａＢＴ複合体は、染色体に沿って転座する能力がある。ＤｎａＧプライマーゼは、この複合体と一過的に相互作用して、ＲＮＡプライマーを合成し得る。
【００４４】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける複製の間に、ＤｎａＢおよびＤｎａＧは、それぞれ、ヘリカーゼおよびプライマーゼとして機能する。これら２つの構成要素は、ＰｏｌＩＩＩホロ酵素に関連して頻繁に必要とされて、岡崎フラグメントについてのプライマーを合成する。従って、ＤｎａＢおよびＤｎａＧは、複製フォークに付随する可動性プライモソームのコア構成要素である。他の記載されたプライモソーム構成要素は、ＤＮＡ上へのプライモソームの構築およびダイマーポリメラーゼの会合に必須である。このプライモソーム構築タンパク質は、ＲｅｃＡおよび鎖交換によって形成される組換え中間体における、複製フォークの再確立に必要である。ＰｒｉＡは、ＤＮＡ合成のための構成要素であるレプリソームの、組換え中間体上での構築を開始し得る。ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢおよびＤｎａＴの混合物を用いてインビトロでＤループを標的化することが可能であり、これらは、次いで、ＤｎａＢおよびＤｎａＣを組み込む能力がある。一旦プライモソームがＤループにおいて形成されると、複製を開始するためにするべき残りのことは、ホロ酵素複合体をこの部位にロードすることである。
【００４５】
３）フォーク構築およびＤＮＡ合成の開始
複製フォークは、プライモソーム構築の部位にて構築する。Ｄループの侵入鎖上の遊離３’末端の存在は、以前に詳述したＤｎａＸクランプローダー複合体を刺激して、スライディングクランプとして作用するように、β−ダイマーをこの部位にて構築させる。ホロ酵素および２つのコアユニットは、足場τサブユニットによって一緒に連結される。τサブユニットはまた、プライモソームの、β−ダイマー要素、クランプローダー要素およびＤｎａＢヘリカーゼ要素についての相互作用表面を有する。これらの複数の相互作用は、２つの非対称的に連結されたコアポリメラーゼ複合体を使用して、リーディング鎖およびラギング鎖の両方の合成を調和させるために必要である。
【００４６】
プライモソームプライマーゼであるＤｎａＧは、巻きがかかっていないラギング鎖ＤＮＡテンプレート上で短いＲＮＡプライマーを合成する。ホロ酵素の存在下で、クランプローダーは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を認識し、そしてこの部位に第二のβ−ダイマークランプをロードする。活性プライモソームの存在およびτサブユニットのＤｎａＢとの相互作用は、同時リーディング鎖／ラギング鎖合成を確実にするために重要である。この相互作用がないと、ポリメラーゼは、連結することなく、プライモソーム部位から離れて異動する。
【００４７】
ここで、複製フォークが構築される。リーディング鎖およびラギング鎖の両方の合成が、ここで同時に生じ、そしてＤｎａＢヘリカーゼが、接近してくるホロ酵素の前に、テンプレート鎖を分離する。ラギング鎖のホロ酵素コアは、１〜２キロベース長の岡崎フラグメントを生成する。一旦ラギング鎖のポリメラーゼが以前のＲＮＡプライマーに遭遇すると、これは、β−クランプから解離し、そして合成が、リーディング鎖前の近傍にロードされた、新たに構築されたクランプから開始される。同じラギング鎖のホロ酵素コアは、リーディング鎖コアへと物理的に係留されるので、再利用される。
【００４８】
β−ダイマークランプとコアサブユニットとクランプローダーとの間には、動的な相互作用が存在する。それらの親和性は、物理的環境に依存して切り替わり得る。岡崎フラグメントの末端で「放棄」されたβ−ダイマーは、クランプローダーまたは存在し得る過剰なδサブユニットによる能動的な除去を介してリサイクルされ得る。
【００４９】
ＲＮＡプライマーは、岡崎フラグメントの末端にて、ＤＮＡポリメラーゼＩの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって除去される。次いで、ＤＮＡリガーゼが、これらの岡崎フラグメントを一緒に連結して、連続したラギング鎖を形成する。
【００５０】
４）フォークの遭遇および終結
ＲＰＡにおいて、複製は、２つの離れた部位にて開始され、そして複製フォークは互いにい向き合っている。複製フォークが集中すると、２つの元のテンプレート鎖は、互いから解離して、各フォークの後ろおよび前の両方で、完全に分離する。次いで、各フォークのリーディング鎖コアが完全に合成され、残りのＲＮＡプライマーがプロセシングされ、そして最終産物は、２つの二本鎖分子である。本発明者らは、このようなアプローチによって、数メガベース（Ｍｂ）規模で、ＤＮＡを増幅することを合理的に予測し得る。本開示において、メガベースはまた、メガ塩基対を包含する。ＰｏｌＩＩＩホロ酵素の既知の合成速度に基づいて、本発明者らは、複製フォークが、約１Ｍｂ／１０００秒、すなわち、１Ｍｂのフラグメントについて、１サイクル当たり約１５〜２０分の速度で進行することを予測し得る。
【００５１】
最後の考慮事項は、ＤＮＡの迅速な指数関数的増幅が達成される機構である。このプロセスについて重要なことは、ヘリカーゼ、レソルバーゼならびにＲｅｃＯタンパク質、ＲｅｃＲタンパク質およびＲｅｃＦタンパク質の混合物の使用によって、標的化部位の効率的な再侵入を可能にすることである。適切な条件下で、再侵入およびプライモソーム構築は、ホロ酵素がフォーク構築部位から離れて移動した直後に、可能であるはずである。ＤＮＡは、多くの点で単に分枝するので、連続的な侵入には、何の問題もないはずである。各分枝は、接近してくるフォークに遭遇する場合に、自然に分解する。これらの条件下で、一回だけのＤＮＡ複製にかかる時間と類似の時間で、多量の増幅を達成することが可能である。しかし、合成の完了前のヌクレオチド枯渇を回避するために、標的化オリゴヌクレオチドの濃度を制限することが重要であり得る。
【００５２】
ホロ酵素複合体に加えて、複製機構は、プライモソームとして公知の別の複合体を使用する。プライモソームは、ラギング鎖を合成し、そして複製フォークを前方に移動させる。プライモソーム複合体は、ＤｎａＢによってコードされるヘリカーゼおよびＤｎａＧによってコードされるプライマーゼを含む。最後に、ホロ酵素およびプライモソームのタンパク質に加えて、複製は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーゼの活性を必要とする。これらの後者の２つの構成要素は、岡崎フラグメントをプロセシングするために必要である。
【００５３】
（ネスティドＲＰＡ）
別の実施形態において、ＲＰＡ複製は、「ネスティドＲＰＡ」と本明細書中で称されるプロセスにおいて実施され得る。
【００５４】
稀な配列を検出することの困難さは、非標的配列対標的配列の高い比率が存在し得ることである。標的ＤＮＡと非標的ＤＮＡとの間を識別し、そして標的配列のみを増幅するＲＰＡの能力は、改善された感度の重要な局面である。非標的と標的との間の識別は、プライマーの特異性および反応条件を反映する。反応の特異性が高くなるほど、生成される特異的標的配列の相対的な量多くなり、そして産物の検出がより容易になる。従って、特異性の増大は、感度も増大させ得る。
【００５５】
改善された感度および特異性についての必要性は、ネスティドＲＰＡを使用して扱われ得る。ネスティドＲＰＡは、ＤＮＡの第一の領域の第一のＲＰＡを含む。次いで、この反応混合物は、第一のプライマー対の濃度を減少させるために、例えば、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍または１００倍以上希釈され、そして第二のプライマー対がこの混合物に導入され、そしてＲＰＡが繰り返される。本発明の１実施形態によれば、この第二のプライマー対は、第一のＲＰＡ産物の部分配列を増幅するために、この第一のプライマー対に対して内部に設計される。この方法は、特異的増幅を増大させる。すなわち、この方法は、非特異的バックグラウンド増幅産物を減少させ、従って、感度を増大させる。このような非特異的増幅産物は、隣接プライマーに対する偶然の部分的相同性によって生じるものの、増幅を継続するのに十分なネスティドプライマーに対する相同性もまた有する可能性は低い。ＲＰＡの検出および特異性は、第二のプライマー対の１つまたは両方で増幅されたプライマーだけが検出されるように、第二のプライマー対の１つまたは両方を標識することによって、さらに改変され得る。
【００５６】
ネスティドＲＰＡは、２セットのプライマーの使用に限定されない。通常、より多くのセットのプライマーが、特異性または感度を増大させるために使用され得る。従って、３つ、４つまたは５つのプライマー対が使用され得る。さらに、本発明の別の実施形態として、異なるセットのプライマーが、図４に示されるように、共通のプライマーを共有し得る。
【００５７】
図４において、これらのプライマーセットは、連続して使用されるように設計される。例えば、第一のＲＰＡは、プライマーセット１を用いて実施され、第一のＲＰＡの増幅産物を使用する第二のＲＰＡは、プライマーセット２を用いて実施され、第二のＲＰＡの増幅産物を使用する第三のＲＰＡは、プライマーセット３を用いて実施され、第三のＲＰＡの増幅配列を使用する第四のＲＰＡは、プライマーセット４を用いて実施され、そして最後に、第四のＲＰＡの増幅産物を使用する第五のＲＰＡは、プライマーセット５を用いて実施される。この場合、プライマーセット１、２および３は、共通のプライマー−プライマー（ａ）を共有する。プライマー３、４および５は、共通のプライマー−プライマー（ｂ）を共有する。
【００５８】
ネスティドＲＰＡは、記載した２つのＲＰＡ方法のいずれか、ならびに任意の特定の順序での、これら２つの方法の組み合わせを使用して、実施され得る。すなわち、ＲＰＡは、単にリーディング鎖ＲＰＡによって、単にリーディング鎖およびラギング鎖のＲＰＡによって、または任意の特定の順序でのリーディング鎖ＲＰＡとリーディング鎖およびラギング鎖のＲＰＡとの組み合わせによって、実施され得る。
【００５９】
本発明の任意のＲＰＡ方法の１つの利点は、増幅産物のサイズである。現行の増幅方法（例えば、ＰＣＲ）は、約１０ｋｂの上限までに制限されているが、ＲＰＡ方法は、数百メガベースまでの核酸の領域を増幅し得る。リーディング鎖／ラギング鎖ＲＰＡについて、増幅されるべき標的配列のサイズは、数百メガベース（例えば、５００メガベース未満、３００メガベース未満、１００メガベース未満、７０メガベース未満、５０メガベース未満、２５メガベース未満、１０メガベース未満、５メガベース未満、２メガベース未満、１メガベース未満、５００ｋｂ未満、２００ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、２５ｋｂ未満または１０ｋｂ未満、５ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満）であり得る。ｌｓＲＰＡについて、標的配列のサイズは、メガベース範囲（例えば、５メガベース未満、２メガベース未満、１メガベース未満、５００ｋｂ未満、２００ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、２５ｋｂ未満または１０ｋｂ未満、５ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満）であり得る。
【００６０】
（ＲＰＡ試薬および反応パラメータの選択）
リーディング鎖ＲＰＡ、リーディング鎖およびラギング鎖ＲＰＡ、ならびにネスティドＲＰＡの詳細は、上記に列挙した。この節は、上記で考察した３つの方法のいずれかについての、試薬およびパラメータの選択を記載する。
【００６１】
ＲＰＡの１つの利点は、ＲＰＡの増幅産物が、他の分子生物学的手順について使用され得る二本鎖ＤＮＡである点である。従って、ＲＰＡは、分子生物学における他の方法と組み合わせられ得る。例えば、ＲＰＡの出発物質は、ＰＣＲ増幅フラグメントであり得る。あるいは、ＲＰＡの産物は、ＰＣＲに使用され得る。
【００６２】
必要に応じて、本発明の方法のいずれかにおいて、ＲＰＡ産物は精製され得る。例えば、ネスティドＲＰＡ方法において、増幅産物は、各ＲＰＡ工程の後かつ引き続くＲＰＡ工程の前に、精製され得る。核酸の精製方法は、当該分野で公知であり、そしてこれには、少なくとも以下が挙げられる：フェノール抽出、核酸沈殿（例えば、塩およびエタノールを用いる）、カラムクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除、イオンカラム、アフィニティカラムなど）、またはこれら技術の任意の組み合わせ。
【００６３】
議論されるように、ＲＰＡにおいて使用されるプライマーは、「二本鎖」または「二本鎖構造を形成し得る」ものであり得る。これらの用語は、ＲＰＡ反応溶液またはＰＣＲ反応溶液のような反応溶液において二本鎖状態で存在する、ＤＮＡ分子をいう。ＰＣＲ溶液の組成は、公知である。ＲＰＡ反応の組成は、詳細な説明の節および実施例に列挙される。
【００６４】
プライマーは、リコンビナーゼ因子の存在下で、標的ＤＮＡにハイブリダイズための一本鎖領域を有し得る。この一本鎖領域は、例えば、約１０塩基、約１５塩基、約２０塩基、約２５塩基、約３０塩基、約４０塩基および約５０塩基であり得る。約７５塩基、約１００塩基、約１５０塩基またはそれ以上といった、より長い領域さえも使用され得るが、必須ではない。一本鎖領域の選択は、出発核酸の複雑性に依存する。その結果、例えば、ヒトゲノムは、より長いプライマーを必要とし得るが、プラスミドは、かなりより短いプライマーを必要とし得る。
【００６５】
二本鎖ＤＮＡ中の核酸の２つの鎖は、完全に相補的である必要はない。例えば、二本鎖ＤＮＡの二本鎖領域は、配列が１％まで異なり得る。すなわち、核酸の２つの鎖の配列は、百塩基当たり１塩基まで異なり得、そして溶液中でなお二本鎖状態で存在する。その相補鎖中に１％の差異を有する核酸は、本開示の目的のために、二本鎖ＤＮＡとして企図される。
【００６６】
さらに、標的核酸（すなわち、本発明のＲＰＡ方法によって増幅されるべき核酸）は、部分的に二本鎖かつ部分的に一本鎖であり得る。例えば、図５の構成のいずれかにおける核酸は、本発明の標的核酸として適切である。議論したように、標的核酸は、ＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、公知の方法を使用して、二本鎖ｃＤＮＡに転換され得、そしてこの二本鎖ｃＤＮＡは、標的核酸として使用され得る。図５に示されるような場合、テンプレート核酸は、３’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）、５’オーバーハングまたは平滑末端から選択される末端の任意の組み合わせを有し得る。
【００６７】
本発明のｌｓＲＰＡ方法は、少なくとも以下の工程を包含する。第一に、リコンビナーゼ因子を、２つの核酸プライマー（本明細書中で、第一のプライマーおよび第二のプライマーと称する）に接触させて、２つの核タンパク質プライマー（本明細書中で、第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーと称する）を形成する。
【００６８】
第二に、この第一の核タンパク質プライマーおよび第二の核タンパク質プライマーを、テンプレート核酸に接触させて、第一の鎖の第一の部分での第一の二本鎖構造および第二の鎖の第二の部分での第二の二本鎖構造を形成する。これら２つのプライマーは、ハイブリダイズした場合に、図６Ａに示されるように互いに向かい合う（ｐｏｉｎｔ）ように設計される。あるいは、プライマー１およびプライマー２は、図６Ｂに示されるように、異なる標的核酸にハイブリダイズし得る。
【００６９】
第三に、核タンパク質プライマーは、それらの３’末端で伸長されて、第一の二本鎖核酸および第二の二本鎖核酸を生成する（図７Ａ）。これらのプライマーが異なる標的核酸にハイブリダイズする場合、これらのプライマーの伸長は、置換鎖を生成する（図７Ｂ）。この場合、プライマー伸長から生じる２つの置換鎖は、ハイブリダイズし得、そして新たな二本鎖テンプレート核酸を形成し得る（図７Ｃ）。
【００７０】
工程２および３は、所望の程度の増幅が達成されるまで、繰り返される。このプロセスは、標的核酸へのプライマーハイブリダイゼーションおよび伸長が、連続的に進行される、動的なプロセスである。本発明の１つの利点は、増幅が、熱サイクリングも反応開始後の酵素添加も必要とせずに、連続して実施されることである。
【００７１】
１実施形態において、工程２および３は、少なくとも５回繰り返される。好ましくは、これは、少なくとも１０回繰り返される。より好ましくは、これは、少なくとも２０回、例えば、少なくとも３０回繰り返される。最も好ましくは、これら２つの工程は、少なくとも５０回繰り返される。増幅工程（例えば、工程２および３）の複数回の反復について、本発明のＲＰＡは、好ましくは、プライマー：標的核酸の比が、少なくとも１００：１、好ましくは少なくとも３００：１、そして最も好ましくは少なくとも１０００：１で開始される。すなわち、標的核酸１コピー当たり、少なくとも１００、３００または１０００コピーのプライマーが存在する。
【００７２】
任意の工程において、十分なラウンドの増幅後、さらなる成分が、全体的増幅効率を増強するために、一定時間後に、この反応に添加され得る。１実施形態において、このさらなる成分は、以下の１つ以上であり得る：リコンビナーゼ因子、１つ以上のプライマー、ポリメラーゼおよび１つ以上のさらなる因子（以下の分離の節で考察される）。
【００７３】
好ましい実施形態において、第一のＲＰＡ反応の小さい画分が、引き続くラウンドまたはＲＰＡ増幅のためのテンプレートＤＮＡの補充として使用される。この方法において、第一のＲＰＡ増幅反応は、標的核酸に対して実施される。第一のＲＰＡ反応後、全反応の小さい画分が、ＲＰＡ反応の引き続くラウンドのために、標的核酸の代替物として使用される。この画分は、例えば、最初の反応の約１０％未満であり得る。好ましくは、この画分は、最初の反応の約５％未満であり得る。より好ましくは、この画分は、最初の反応の２％未満であり得る。最も好ましくは、この画分は、最初の反応の１％未満であり得る。
【００７４】
ＲＰＡにおいて使用されるプライマーは、好ましくは、ＤＮＡであるが、ＰＮＡおよびＲＮＡもまた、プライマーとしての使用に適切である。実際、ＤＮＡ複製において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡプライマーからゲノムＤＮＡを伸長するということが留意される。
【００７５】
合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡプライマーとして作用し得、そしてＲｅｃＡまたはそのホモログとの、核タンパク質フィラメントの形成のための基質として、使用され得る。１５ヌクレオチドほどの長さの配列は、二本鎖ＤＮＡを標的化し得る（Ｈｓｉｅｈら、１９９２）。このようなオリゴヌクレオチドは、標準ホスホラミデート化学または他の方法に従って合成され得る。改変された塩基および／またはリンカー骨格化学は、いくつかの場合に所望され得、そして機能的であり得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、その末端（５’または３’のいずれか）において、種々の目的を果たす基（例えば、蛍光基、クエンチャー、保護（ブロック）基（可逆的であってもなくても）、磁性タグ、タンパク質など）によって改変され得る。いくつかの場合、一本鎖オリゴヌクレオチドは、鎖侵入のために使用され得、他の場合には、侵入核酸の配列の５’鎖が、すでにオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしている、部分的に一本鎖の核酸のみが使用され得る。
【００７６】
本発明の別の実施形態において、これらのプライマーは、標的核酸に相同でない５’領域を含み得る。本発明のプロセスは、プライマーが標的核酸に完全に相補的でない場合にさえ、機能的であるはずであることに、留意すべきである。これらのプライマーは、その５’末端にさらなる配列を有することによって、非相補的であり得る。これらのさらなる配列は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列または配列決定プライマーに相補的な配列であり得る。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、増幅配列の引き続く切断のために有用であり得る。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の外側で核酸を切断する制限エンドヌクレアーゼの使用もまた、企図される。配列決定プライマーに相補的な配列は、市販のプライマーまたは市販の配列決定装置を使用して、増幅産物の迅速なＤＮＡ配列決定を可能にし得る。
【００７７】
核タンパク質フィラメントの形成は、プライマー（オリゴヌクレオチド）の、ＲｅｃＡタンパク質またはそのホモログと共に、ＡＴＰおよび補助タンパク質（例えば、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＲおよびＲｅｃＦ）の存在下でのインキュベーションによって、実施され得る。ＲｅｃＡ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＡＴＰ、２ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｕｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン）中で３７℃でインキュベートする場合、ＲｅｃＡは、１つのターン当たり６個のプロモーターで、ｓｓＤＮＡ上にらせん状フィラメントを形成する。このＤＮＡは、タンパク質らせんの内部に位置する。ｄｓＤＮＡの存在下で、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメントは、１時間当たり少なくとも１０７ｂｐの速度で、ＤＮＡを走査し得る。走査の様式は不明であるが、これは、これが、主溝の１つの面に沿って容易に接近され得る、最初のいくつかの塩基対のみを含み得る、ある速度（＞１０３ｂｐ／秒）である。首尾よい結合は、三重らせん中間体への移行を生じ得、次いで、鎖侵入および置換が生じて、Ｄループを形成する。このような連結分子は、らせん状フィラメントの形成について上記した条件と類似の条件下で形成され得、従って、ｓｓＤＮＡ、相同なｄｓＤＮＡ、ＲｅｃＡ、ＡＴＰ、補助タンパク質ならびに適切な緩衝液条件および温度条件の存在下で、連結分子が同時に形成する。ＡＴＰが使用される場合、この構築は、可逆的であり、そして平衡に達するが、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡフィラメントは、補助タンパク質ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲによって、ＳＳＢの存在下でさえ、安定化され得る。熱安定性タンパク質の場合、インキュベーション温度は、より高くできる。ＡＴＰの更新可能な補充が必要とされる場合、標準的なＡＴＰ再生系が、この反応中に含められ得る。
【００７８】
ＤＮＡポリメラーゼは、新たなヌクレオチドを取り込むことによってＤＮＡ合成を触媒するために、侵入鎖の遊離３’−ヒドロキシルを使用し得る。多数のポリメラーゼが、合成を触媒し、そして合成が生じるのと同時に他の鎖を置換するために、侵入鎖の３’−ヒドロキシルを使用し得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのポリメラーゼＩＩまたはポリメラーゼＩＩＩは、侵入したＤループを伸長するために使用され得る（Ｍｏｒｅｌら、１９９７）。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＳＯＳ−傷害標的化変異において通常使用されるＥ．ｃｏｌｉのポリメラーゼＶが、使用され得る（Ｐｈａｍら、２００１）。これらのポリメラーゼの全てが、β−ダイマークランプ、ならびに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）および他の構成要素との、それらの相互作用および協調を介して、高度に進行性にされ得る。原核生物、ウイルスおよび真核生物由来の他のポリメラーゼもまた、侵入鎖を伸長するために使用され得る。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、プライマーは、少なくとも１つの一本鎖３’オーバーハングを有する、部分的に二本鎖で、部分的に一本鎖であり得る。この実施形態において、プライマーは、図８Ａに示されるように、侵入鎖および非侵入鎖を含み得る。この場合、侵入鎖が標的ＤＮＡにハイブリダイズして伸長された後、これは、図８Ｂに示されるように、第二のプライマーについての標的核酸として作用する。第二のプライマーの伸長は、図８Ｃに示されるように、非侵入鎖を置換する。この実施形態において、標的核酸が増幅されるにつれて、プライマー１の非侵入鎖が置換される。プライマー１およびプライマー２の両方が部分的に二本鎖のプライマーである場合、プライマー１およびプライマー２の両方の非侵入鎖は、標的核酸が増幅されるにつれて、溶液中に蓄積する。
【００８０】
本発明の１実施形態において、ＲＰＡ反応中のこれらのプライマーの少なくとも２つは、部分的に二本鎖かつ部分的に一本鎖であり、各々、侵入鎖および非侵入オリゴヌクレオチド鎖のハイブリダイゼーションによって生成され、これらは、二本鎖領域を形成するのに十分相補的な配列を有する。好ましくは、２つのオリゴヌクレオチド鎖は、ＲＰＡ反応条件において二本鎖構造を形成し得る適切な領域にわたって、十分相補的である。
【００８１】
本発明の１実施形態において、一本鎖プライマーおよび部分的に二本鎖のプライマーを含むこれらのプライマーは、検出可能な標識で標識される。蛍光クエンチャーもまた、検出可能な標識とみなされることに、留意すべきである。例えば、蛍光クエンチャーは、蛍光色素に接触され得、そしてクエンチングの量が検出される。検出可能な標識は、伸長反応を妨害しないような標識であるべきである。プライマーが、侵入鎖および非侵入鎖を有して部分的に二本鎖である場合、検出可能な標識は、侵入鎖の伸長反応を妨害しないような方法で結合されるべきである。部分的に二本鎖のプライマーの非侵入鎖は、伸長されないので、非侵入鎖上の標識が、侵入鎖の伸長反応を妨害すべきでないことのみを除いて、非侵入鎖の標識化に対して制限は存在しない。標識されたプライマーは、増幅産物のより迅速な検出の利点を提供する。さらに、組み込まれていない標識、すなわち、伸長されていない標識オリゴヌクレオチドの検出は、反応状態のモニタリングを可能にする。
【００８２】
ＲＰＡ反応のモニタリングは、例えば、ＲＰＡ反応の画分を取り出す工程、組み込まれていない画分を単離する工程、および組み込まれていないプライマーを検出する工程を包含し得る。組み込まれていないプライマーのサイズは、５０ｂｐ未満、４０ｂｐ未満、３０ｂｐ未満または２５ｂｐ未満であり得、そして増幅産物のサイズは、１ｋｂより長いか、２ｋｂより長いか、５ｋｂより長いか、または１０ｋｂより長くあり得るので、組み込まれたプライマーと組み込まれていないプライマーとの間に大きなサイズの差異が存在する。組み込まれていないプライマーの単離は、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、スピンカラム）を使用して、迅速に実施され得る。プライマーが標識される場合、スピンカラムおよび測定（例えば、蛍光または放射性）を含むモニタリング手順は、１分未満で実施され得る。非伸長プライマーから伸長プライマーを分離するための別の代替法は、ＰＡＧＥの使用を含む。例えば、伸長プライマーは、５分未満のゲル電気泳動によって、非伸長プライマーから分離され得る。伸長プライマーを分離するためのなお別の代替法は、固定化オリゴヌクレオチドの使用を含む。例えば、増幅されたＤＮＡ配列内に独自に見出される配列に相同なオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長によって特異的に生成される核酸を捕捉するために使用され得る。これらの捕捉オリゴヌクレオチドは、チップまたは他の基材上に固定化される。捕捉オリゴヌクレオチドによる、伸長オリゴヌクレオチドの捕捉は、ＲｅｃＡタンパク質媒介性の方法または必要に応じて従来の溶液ハイブリダイゼーションによって、実施され得る。
【００８３】
本発明の別の実施形態において、二本鎖プライマーは、プライマーの２つの鎖の分離が検出され得るように、標識され得る。上記考察のように、複数ラウンドの伸長の後、部分的に二本鎖のプライマーの侵入鎖および非侵入鎖が分離される。この分離後、非侵入鎖は、ＲＰＡ反応に関与しない。この特徴は、多数の方法でＲＰＡ反応を検出およびモニタリングするために使用され得る。
【００８４】
本出願において、検出可能な標識は、蛍光標識または酵素であり得、そして標識クエンチャー（標識インヒビターとも称される）は、蛍光クエンチャーまたは酵素インヒビターであり得る。これらの場合、標識は、蛍光または酵素の阻害によって検出される。標識の検出能（ｄｅｌｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）は、蛍光標識が使用される場合には蛍光、または酵素が使用される場合には酵素活性である。
【００８５】
第一の方法において、侵入鎖は、標識で標識され得、そして非侵入鎖は、検出可能な蛍光クエンチャーで標識され得る。部分的に二本鎖のプライマー上の標識クエンチャー（標識インヒビター）の近位にある標識は、高度に検出可能でない。ＲＰＡ後、侵入鎖は、非侵入鎖から分離され、従って、標識および標識クエンチャーは分離される。この分離は、標識をより検出可能にする。従って、ＲＰＡ反応は、検出可能な標識の量の増加を測定することによって、モニタリングされ得る。
【００８６】
第二の方法は、侵入鎖が標識クエンチャーで改変され、一方で非侵入鎖が標識で改変されている点以外は、第一の方法と類似である。その場合、ＲＰＡは、標識クエンチャーから分離された標識の結果（方法１と同じ）を進めることが可能である。従って、標識の全体的な検出能（ｄｅｌｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ）は増大する。
【００８７】
第三の方法は、１つの二本鎖プライマーの非侵入鎖を標識で標識する工程を包含する。さらに、第二の二本鎖プライマーの非侵入鎖は、標識クエンチャーで標識される。２つの非侵入鎖は、互いに相補的であるように設計される。この構成において、ＲＰＡ反応は、最初は蛍光性である。ＲＰＡ反応が進行するにつれて、２つの非侵入鎖は、溶液中に置換され、そしてこれらは相補的であるように設計されているので、互いにハイブリダイズする。これらがハイブリダイズすると、標識および標識クエンチャーは互いに近づき、そして反応の蛍光が減少する。ＲＰＡ反応の進行は、標識検出能の減少をモニタリングすることによって、測定され得る。
【００８８】
第四の方法において、第一および第二の二本鎖プライマーの非侵入鎖は、第一の標識および第二の標識によって標識され得る。２つの非侵入鎖はまた、互いに相補的であるように設計される。第三の方法と同様に、ＲＰＡ後、２つの非侵入鎖は互いにハイブリダイズし、そして２つの標識の接近は、ＲＰＡ反応の進行の反映であり得る。２つの標識の近さは、例えば、直接的観察または非侵入鎖の単離によって、決定され得る。上記で考察したように、プライマーおよび他の小さい核酸の単離は、サイズ排除カラム（スピンカラムを含む）またはゲル電気泳動によって、達成され得る。
【００８９】
本発明の別の実施形態において、プライマーの一方または両方の非侵入鎖は、核酸の第二の領域に対して相同であり、その結果、プライマーは、核酸の第二の領域にハイブリダイズし得、そしてそこでプライマーＤＮＡ合成がなされ得る。この方法を使用して、第一のＲＰＡのプライマー由来の非侵入鎖を使用する第二のＲＰＡ反応が、開始され得る。第二のＲＰＡの産物は、第一のＲＰＡの進行を決定するためにモニタリングされ得る。
【００９０】
本発明のなお別の実施形態において、非侵入鎖は、非侵入鎖の配列に特異的なバイオセンサ（ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）によって検出され得る。例えば、バイオセンサは、非侵入鎖に相補的な核酸配列を有する表面であり得る。このバイオセンサは、非侵入鎖の結合から生じる特徴をモニタリングし得る。この特徴は、検出可能な標識であり得る。
【００９１】
本発明の方法のいずれかに適切な検出可能な標識としては、酵素、酵素基質、補酵素、酵素インヒビター、蛍光マーカー、発色団、発光マーカー、放射性同位体（放射性核種を含む）および結合対の片方のメンバーが挙げられる。より特定の例としては、フルオレセイン、フィコビリンタンパク質、テトラエチルローダミンおよびβ−ｇａｌが挙げられる。結合対は、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、抗原／抗体、リガンド／レセプター、ならびにこれらの結合対のアナログおよび変異体が挙げられ得る
本発明のリコンビナーゼ因子は、ＲｅｃＡ、ＲａｄＡ、ＲａｄＢ、Ｒａｄ５１またはこれらのタンパク質の機能的アナログもしくはホモログであり得る。所望の場合、リコンビナーゼは、温度感受性（本明細書中で「ｔｓ」という）リコンビナーゼ因子であり得る。ｔｓリコンビナーゼが使用される場合、ＲＰＡは、１つの温度（許容温度）で開始され得、そして別の温度（非許容温度）で終結され得る。許容温度の組み合わせは、例えば、２５℃／３０℃、３０℃／３７℃、３７℃／４２℃などであり得る。好ましい実施形態において、ｔｓタンパク質は可逆性である。可逆性ｔｓタンパク質の活性は、非許容温度から許容温度にシフトする場合に、回復される。
【００９２】
好ましい実施形態において、ＲＰＡは、ＡＴＰ、ＡＴＰアナログまたは別のヌクレオシド三リン酸の存在下で実施される。このＡＴＰアナログは、例えば、ＡＴＰγＳ、ｄＡＴＰ、ｄｄＡＴＰまたは別のヌクレオシド三リン酸アナログ（例えば、ＵＴＰ）であり得る。
【００９３】
ＲＰＡ反応に添加され得る他の有用な試薬は、ヌクレオチド三リン酸（すなわち、ｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰならびにその誘導体およびアナログ）およびＤＮＡポリメラーゼを含む。リーディング鎖／ラギング鎖のＲＰＡについて有用な、他の有用な試薬は、ＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰならびにその誘導体およびアナログ）を含む。ＲＰＡ反応の１つの利点は、使用されるポリメラーゼの型を限定しないことである。例えば、真核生物および原核生物両方のポリメラーゼが使用され得る。原核生物のポリメラーゼとしては、少なくとも、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌＩＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌＩＶおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｐｏｌＶが挙げられる。真核生物のポリメラーゼとしては、ｐｏｌ−α、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ、およびｐｏｌ−εからなる群より選択される、多タンパク質ポリメラーゼ複合体が挙げられる。
【００９４】
本発明の別の実施形態において、ＲＰＡプロセスは、ポリメラーゼの前進性または信頼性を改善するために、補助成分の存在下で実施される。原核生物および真核生物の両方の補助成分が使用され得る。好ましくは、この補助成分は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来である。有用な補助タンパク質としては、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼおよびレソルバーゼが挙げられる。他の有用な補助タンパク質としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ダイマースライディングクランプ、真核生物ＰＣＮＡスライディングクランプおよびＴ４スライディングクランプｇｐ４５からなる群より選択されるスライディングクランプが挙げられる。他の補助成分としては、β−クランプ、ＤｎａＸクランプローダーおよびポリメラーゼコア複合体からなるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体が挙げられる。なお他の補助成分としては、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣおよびＲｅｃＧが挙げられる。さらなる成分の使用によって付与される特性は、ＰＣＲのような現行の方法によってはこれまで首尾よく標的化されなかった大きいＤＮＡの増幅を可能にする可能性がある。
【００９５】
別の実施形態において、ＲＰＡは、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメントを安定化するために使用される因子の存在下で実施される。例えば、この因子は、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＦまたはこれらのタンパク質の組み合わせであり得る。他の有用な因子としては、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣおよびＤｎａＧが挙げられる。
【００９６】
本発明の１つの利点は、ＲＰＡ反応が、ＰＣＲ反応と比較して低い温度で実施され得ることである。例えば、ＲＰＡプロセスは、２０℃と５０℃との間の温度で実施され得る。好ましくは、ＲＰＡプロセスは、４５℃未満で実施される。より好ましくは、ＲＰＡ反応は、４０℃未満で実施され得る。なおより好ましくは、ＲＰＡ反応は、３５℃未満で実施され得る。最も好ましくは、ＲＰＡ反応は、３０℃未満で実施され得る。ＲＰＡ反応がこれらの低い温度で実施され得る１つの理由は、ＲＰＡが、テンプレート核酸の温度誘導性の融解なしに実施され得るからである。さらに、ＰＣＲとは異なり、絶対温度制御が必要とされず、そして温度は、ＲＰＡに悪影響を及ぼさずに変動し得るからである。例えば、変動の量は、上記で特定した温度内のどこでもよい。二本鎖ＤＮＡの融解に必要な温度はまた、本発明の方法において存在しない不都合である、未成熟な酵素の不活化に寄与する。
【００９７】
ＲＰＡは、遺伝子型の存在または非存在について試験するために実施され得る。試験される遺伝子型は、疾患または疾患の素因に関連し得る。あるいは、遺伝子型は、正常な表現型または疾患に対する特別な耐性を付与する表現型と関連し得る。上記開示のような遺伝子型は、任意の標準的な遺伝的改変（例えば、点変異、欠失、挿入、逆位、フレームシフト変異、交差事象、または複数コピーの遺伝子配列の存在もしくは非存在（例えば、ミニ染色体の存在））であり得る。
【００９８】
遺伝子型を検出する１つの方法は、ＲＰＡ反応中のプライマー対間の距離を検出することである。プライマー対間の距離は、増幅配列のサイズによって反映される。この方法において、２つのプライマーが、標的領域（例えば、遺伝子）にわたるように、選択される。次いで、このプライマー対を使用してＲＰＡが実施され、そしてＲＰＡ産物が分析される。この分析は、増幅産物のサイズまたは配列を決定する工程を包含する。ＤＮＡ配列のサイズを決定する方法（例えば、少なくともアガロースゲル、ＰＡＧＥゲル、質量分析、パルスフィールドゲル、遺伝子チップ、ショ糖沈殿などの技術を含む）は、公知である。多くのＤＮＡ配列決定方法およびその改変型が存在する：例えば、ジデオキシ終結および変性ゲル電気泳動を使用するＳａｎｇｅｒ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｈｌｅｎ，Ｓ．およびＣｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５，５４６３−５４６７（１９７７））、化学的切断および変性ゲル電気泳動を使用するＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ配列決定（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．およびＧｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４，５６０−５６４（１９７７））、ＤＮＡポリメラーゼ反応の間に放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）を検出するピロ配列決定（ｐｙｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（Ｒｏｎａｇｈｉ，Ｍ．，Ｕｈｌｅｎ，Ｍ．およびＮｙｒｅｎ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，３６３，３６５（１９９８））ならびにオリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイズによる配列決定（ＳＢＨ）（Ｌｙｓｏｖ，Ｉ．，Ｆｌｏｒｅｎｔ’ｅｖ，Ｖ．Ｌ．，Ｋｈｏｒｌｉｎ，Ａ．Ａ．，Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．Ｒ．およびＳｈｉｋ，Ｖ．Ｖ．Ｄｏｋｌ  Ａｋａｄ  Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ  ３０３，１５０８−１５１１（１９８８）；Ｂａｉｎｓ  Ｗ．およびＳｍｉｔｈ  Ｇ．Ｃ．Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ  １３５，３０３−３０７（１９８８）；Ｄｒｎａｎａｃ，Ｒ．，Ｌａｂａｔ，Ｉ．，Ｂｒｕｋｎｅｒ，Ｉ．およびＣｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ，Ｒ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，１１４−１２８（１９８９）；Ｋｈｒａｐｋｏ，Ｋ．Ｒ．，Ｌｙｓｏｖ，Ｙ．，Ｋｈｏｒｌｙｎ，Ａ．Ａ．，Ｓｈｉｃｋ，Ｖ．Ｖ．，Ｆｌｏｒｅｎｔｉｅｖ，Ｖ．Ｌ．およびＭｉｒｚａｂｅｋｏｖ，Ａ．Ｄ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２５６．１１８−１２２（１９８９）；Ｐｅｖｚｎｅｒ  Ｐ．Ａ．Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ  ７，６３−７３（１９８９）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｍａｓｋｏｓ，Ｕ．およびＥｌｄｅｒ，Ｊ．Ｋ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３，１００８−１０１７（１９９２））。
【００９９】
遺伝子型を検出する１つの方法は、特定の遺伝子型に特異的なプライマーを使用することである。例えば、プライマーは、１つの遺伝子型を効率的に増幅するか、または別の遺伝子型を全く増幅しないように、設計され得る。１実施形態において、このプライマーは、１つの遺伝子型（例えば、遺伝病の遺伝子型）に相補的であるが、別の遺伝子型（例えば、正常な遺伝子型）とは相補的でない３’配列を含み得る。
【０１００】
決定されるべき遺伝子型は、疾患の指標（例えば、活性化した癌遺伝子の存在；ハンティングトン病の遺伝子の存在または腫瘍抑制遺伝子の非存在）であり得る。
【０１０１】
プライマーの３’塩基は、ＲＰＡ反応の特異性および効率を決定する際に、特に重要である。プライマーは、３’塩基が、１つの遺伝子型に特異的であるが別の遺伝子型には相補的でないように、設計され得る。このことは、１つの遺伝子型の効率的なＲＰＡおよび第二の遺伝子型（存在する場合）の非効率的なＲＰＡを可能にする。この方法は、プライマー対の１つのプライマーが、（異なる増幅効率を有することによって）異なる遺伝子型間を識別し得る場合にのみ有効であることに留意する。好ましい実施形態において、ＲＰＡ反応中の両方のプライマーが、異なる遺伝子型間を識別し得る。この上記の例において、これらのプライマーは、１つの遺伝子型に対して相補的であるが、第二の遺伝子型に対しては、その３’末端にて１塩基分、相補的ではない。好ましい実施形態において、このプライマーは、その３’末端にて少なくとも１塩基分、第二の遺伝子型に対して相補的でない。好ましくは、このプライマーは、その３’末端にて、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０塩基分、第二の遺伝子型に対して相補的でない。最も好ましくは、このプライマーは、完全に非相補的であるか、または第二の遺伝子型にハイブリダイズできないが、第一の遺伝子型にはハイブリダイズし得る。
【０１０２】
考察した方法のいくつかにおいて、増幅産物の存在または非存在は、遺伝子型の存在または非存在の指標を提供する。これらの場合、ＲＰＡ反応は、本明細書を通じて、これらの考察した方法によって、モニタリングされ得る。
【０１０３】
好ましい実施形態において、遺伝子型決定のためのＲＰＡ反応は、患者の遺伝子型に関わらず、配列を増幅する。しかし、患者の遺伝子型は、増幅配列の特徴を変更する。例えば、１つの遺伝子型についての増幅配列は、別の遺伝子型についての増幅配列よりも、異なるサイズまたは配列であり得る。この方法において、ＲＰＡ反応は、増幅反応が首尾よく実施されたことを示す、内部コントロールを含む。もちろん、ＲＰＡ反応の性能についてのコントロールとして、１つ以上のさらなる対のプライマーを含むＲＰＡ方法もまた、想定される。
【０１０４】
別の実施形態において、ＲＰＡ反応は、核酸分子の存在または非存在を決定するために使用され得る。この核酸分子は、任意の生物由来であり得る。例えば、サンプルの微生物組成は、異なる微生物の核酸に対するＲＰＡ反応の組を使用することによって、決定され得る。ＲＰＡは、微生物の検出に特に有用である。１実施形態において、病原体は、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌から選択される。さらなる実施形態において、この病原体は、インフルエンザウイルス、風疹ウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、他の肝炎ウイルス、単純疱疹ウイルス、ポリオウイルス、痘瘡ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ワクシニアウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、レトロウイルスおよびライノウイルスから選択される。別の実施形態において、この病原体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＣｈｌａｍｙｄｉａおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓから選択される細菌である。なおさらなる実施形態において、この病原体は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉおよびＯｎｃｈｏｃｅｒｃａから選択される寄生生物である。しかし、本発明が、上記列挙した特定の属および／または種に限定されることは意図しない。
【０１０５】
（参考文献）
【０１０６】
【数１】
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【実施例】
【０１０７】
（実施例１：リーディング鎖リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ））
ＤＮＡ配列を、図１に示されるリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）方法に従うリーディング鎖合成を使用して増幅し得る。
【０１０８】
反応は、以下の組成で構築される：
【０１０９】
【表１】
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この反応を、最終濃度が、Ｄループ形成／分解成分、ポリメラーゼ／ヘリカーゼ／レソルバーゼ混合物および反応緩衝液を満たすように構築し、ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはテンプレートは、必要に応じて最後に添加される。例えば、Ｄループ形成／分解成分の２×濃度の溶液およびポリメラーゼ／ヘリカーゼ／レソルバーゼ混合物の２×濃度の溶液を、１×の反応緩衝液に調製し得る。この反応を、２つの成分の各々の等量（各々１×反応緩衝液中）を混合することによって開始し得る。必要に応じて、そして上記のように、ＤＮＡポリメラーゼまたはテンプレート（標的ＤＮＡ）は、最後に添加され得る。この反応を、反応物が使い果たされるまでの十分な時間にわたってインキュベートする。代表的なインキュベーション時間は、１時間、２時間、３時間、５時間、１０時間または一晩（約１６時間）の範囲である。迅速な温度変化のために小さい容量を必要とするＰＣＲとは異なり、ＲＰＡの反応容量には制限がない。２５μｌ、５０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌおよび１００ｍｌまたはそれより大きい反応容量が、１つの容器中で実施され得る。インキュベーション温度は、代表的な実験室温度（例えば、２５℃、３０℃または３７℃）であり得る。
【０１１０】
テンプレートＤＮＡおよび／またはポリメラーゼの添加前に、ＲｅｃＡおよびＳＳＢは、一本鎖オリゴヌクレオチドプライマーへの結合について競合する。ＲｅｃＲおよびＲｅｃＯの存在下で、ＲｅｃＡは、一本鎖プライマー上に選択的に安定化されて、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲとの複合体中のＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントを形成する。この複合体は、二本鎖ＤＮＡに侵入して、オリゴヌクレオチドプライマーに相同な部位においてＤループを形成する能力がある。あるいは、ＲｅｃＡ、ＲｅｃＯおよびＲｅｃＲを、反応混合物へのＳＳＢの導入前に、オリゴヌクレオチドプライマー上に予めロードし得る（図１）。侵入鎖を、５’から３’の方向でポリメラーゼによって伸長させる。Ｄループが形成され、そして合成が進むにつれ、置換された一本鎖ＤＮＡは、ＳＳＢで覆われるようになる。二本鎖ＤＮＡからのＲｅｃＡ放出は、５’から３’方向でのＡＴＰ加水分解を介して生じ得るか、またはヘリカーゼ／レソルバーゼもしくはポリメラーゼの活性の結果として生じ得る（図２Ａ、Ｂ）。侵入／合成の新たなラウンドは、連続的に生じる。第三ラウンドの鎖侵入／合成は、その末端が２つの対向するプライマー部位に対応する、放出された分離産物を放出する。これらのフラグメントは、直ぐに優勢な反応産物になり、そして高レベルまで蓄積する。各合成複合体がテンプレートの末端へと進行するにつれて、ＲｅｃＡタンパク質は、ポリメラーゼ活性、またはヘリカーゼ（例えば、ＲｕｖＡＢ）もしくはレソルバーゼ（例えば、ＲｕｖＣ）の活性のいずれかによって、置換される。一旦、プライマー、ＡＴＰ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸または任意の他の制限的成分が使い果たされると、反応は停止する。
【０１１１】
温度感受性ＲｅｃＡ変異体を含めると、ＤＮＤ合成の制御された開始が可能になる。このような状況において、開始反応を、２５℃〜３７℃で実施して、Ｄループの形成を可能にする。伸長反応を、４２℃で実施する。この温度は、ＲｅｃＡ媒介性の二本鎖侵入について非許容性である。サイクル数が、反応産物の量を決定する。延長された伸長期間は、再侵入を妨害せずに、非常に長いＤＮＡの増幅を可能にする。
【０１１２】
（実施例２：ネスティドＲＰＡ）
ＲＰＡ反応を、実施例１において記載されるように実施する。反応の１／１０の画分および１／１００の画分を取り出し、そして第二ラウンドのＲＰＡにおいてＤＮＡテンプレートの代わりに使用する。ｌｓＲＰＡ、リーディング／ラギングＲＰＡおよびこれらの組み合わせを、ネスティドＲＰＡのために使用し得る。
【０１１３】
（実施例３：リーディング鎖およびラギング鎖の同時リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅）
ＤＮＡ配列を、図２に示されるリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）方法に従うリーディング鎖およびラギング鎖の合成を使用して増幅し得る。
【０１１４】
反応を、以下の組成を用いて構築する：
【０１１５】
【表２】
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この反応を、全ての試薬の最終濃度が上記で列挙したようになるように、構築する。従って、例えば、５倍濃度の各成分の溶液（Ｄループ形成／分解成分、ヘリカーゼ／レソルバーゼ混合物、プライモソーム複合体、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体、ラギング鎖混合物）を、１×緩衝液中に作製する。次いで、５つの溶液を等量で一緒に混合して、反応を開始する。この反応を、反応物が使い果たされるまでの十分な時間にわたって、インキュベートする。代表的なインキュベーション時間は、１時間、２時間、３時間、５時間、１０時間または一晩（約１６時間）の範囲である。上記のように、ＲＰＡの反応容量には制限がない。２５μｌ、５０μｌ、１００μｌ、１ｍｌ、１０ｍｌおよび１００ｍｌまたはそれより大きい反応容量が、１つの容器中で実施され得る。インキュベーション温度は、代表的な実験室温度（例えば、２５℃、３０℃または３７℃）であり得る。
【０１１６】
まず、プライモソームは、ＲｅｃＡ核タンパク質フィラメントの侵入によって形成されるＤループ上にロードする。このプライモソームは、ＲＮＡプライマーの鎖を合成する。最後に、プライモソームは、クランプローダーをリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔ）し、このクランプローダーは、スライディングクランプダイマーおよび非対称的ＤＮＡポリメラーゼコアの両方をリクルートする（図３Ａ）。
【０１１７】
合成は、リーディング方向およびラギング方向の両方で同時に生じる。最終的に、ラギング鎖合成は停止し、そしてラギング鎖クランプが外れる。リーディング鎖の合成は、ラギング鎖の合成の新たな部位が形成されるまで、継続する（図３Ｂ）。
【０１１８】
リーディング鎖合成は継続したままで、ラギング鎖合成の新たな部位が形成される。ラギング鎖合成は、ラギング鎖クランプが外れた、以前の岡崎フラグメントに戻って継続する（図３Ｃ）。
【０１１９】
ＤＮＡポリメラーゼＩは、ＲＮＡプライマーを除去し、そしてギャップを満たし、一方でＤＮＡリガーゼは、２つの岡崎フラグメントを接続して、連続したラギング鎖を形成する（図３Ｄ）。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、ＲｅｃＡ／プライマーローディングの模式的図を示す。
【図２Ａ】図２は、パネル（ａ）および（ｂ）で示される、リーディング鎖リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ）の連続工程の模式図を示す。
【図２Ｂ】図２は、パネル（ａ）および（ｂ）で示される、リーディング鎖リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ｌｓＲＰＡ）の連続工程の模式図を示す。
【図３Ａ】図３は、パネル（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）で示される、リーディング鎖およびラギング鎖のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅の連続工程の模式図を示す。
【図３Ｂ】図３は、パネル（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）で示される、リーディング鎖およびラギング鎖のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅の連続工程の模式図を示す。
【図３Ｃ】図３は、パネル（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）で示される、リーディング鎖およびラギング鎖のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅の連続工程の模式図を示す。
【図３Ｄ】図３は、パネル（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）で示される、リーディング鎖およびラギング鎖のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅の連続工程の模式図を示す。
【図４】図４は、ネスティドＲＰＡのために選択されたネスティドプライマーの例を示す。
【図５】図５は、適切な二本鎖テンプレート核酸の例を示す。
【図６】図６は、パネル（ａ）および（ｂ）において、標的核酸とのハイブリダイゼーションにおける、ＲＰＡプライマー対の種々の配向を示す。
【図７】図７パネル（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、進行中のＲＰＡ反応の模式的描写を示す。
【図８】図８は、（ａ）二本鎖プライマーの例（ｂ）伸長後の二本鎖プライマーおよびプライマー対の第二のメンバーアニーリング後、（ｃ）非侵入鎖が置換された、プライマー対の第二のメンバーの伸長後、を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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