(57)【要約】  本発明は、線虫遺伝子に対する２本鎖ＲＮＡ殺線虫剤の同定、および物質、典型的には殺線虫活性を有するｄｓ（２本鎖）ＲＮＡの同定のためのスクリーニング・アッセイである。
2005512543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現カセットを含む核酸分子でトランスフェクションされた遺伝子導入植物細胞であって、該カセットは、少なくとも一部の線虫遺伝子をコード化する核酸配列を含み、該カセットは、センスおよびアンチセンス両方の核酸分子が転写されるように適応され、ここで該センスおよびアンチセンス核酸分子は、ハイブリダイゼーションして抗線虫活性を持つ２本鎖阻害ＲＮＡ分子を形成する、細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞であって、前記核酸分子が：
ｉ）図４、５、６、７、８ａ、８ｂまたは８ｃ中の配列により表される核酸配列；
ｉｉ）該配列（ｉ）へとハイブリダイゼーションし、抗線虫活性を持つ核酸配列；
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）中の配列に対する遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、細胞。
【請求項３】
前記カセットが、該カセットからセンスおよびアンチセンス核酸分子を転写する少なくとも２つのプロモーター配列の準備(provision)により適用される、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記カセットが核酸分子を含み、ここで該分子が第２部分に結合された第１部分を含み、ここで該第１および第２部分は、それらの配列の少なくとも一部に亘って相補的であり、更にここで該核酸分子の転写が、該第１および第２部分の相補的な塩基対形成により、２本鎖領域を形成するＲＮＡ分子を産生する、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項５】
前記第１および第２部分が、少なくとも１ヌクレオチド塩基により結合される、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記第１および第２部分が、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド塩基により結合される、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記リンカー(linker)が、少なくとも１０ヌクレオチド塩基である、請求項４に記載の細胞。
【請求項８】
前記カセットがベクターの一部である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
２本鎖阻害ＲＮＡ分子であって、ここで該ＲＮＡ分子が：
ｉ）図４、５、６、７、８ａ、８ｂまたは８ｃ中の配列により表される核酸配列；
ｉｉ）この（ｉ）中の配列へとハイブリダイゼーションし、抗線虫活性を持つ核酸配列；
ｉｉｉ）これら（ｉ）および（ｉｉ）中の配列に対する遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、ＲＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項９に記載のＲＮＡ分子であって、該分子の長さが１０ヌクレオチド塩基（ｎｂ）〜１０００ｎｂである、ＲＮＡ分子。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載のＲＮＡ分子であって、該分子が長さにおいて、１００ｎｂ；２００ｎｂ；３００ｎｂ；４００ｎｂ；５００ｎｂ；６００ｎｂ；７００ｎｂ；８００ｎｂ；９００ｎｂ；または１０００ｎｂである、ＲＮＡ分子。
【請求項１２】
長さにおいて少なくとも１０００ｎｂである、請求項９に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１３】
長さにおいて、少なくとも１０ｎｂ；２０ｎｂ；３０ｎｂ；４０ｎｂ；５０ｎｂ；６０ｎｂ；７０ｎｂ；８０ｎｂ；または９０ｎｂである、請求項９または１０に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１４】
長さにおいて２１ｎｂである、請求項９に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を含む植物。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を含む種子。
【請求項１７】
請求項９〜１４のいずれか１項に記載の、殺線虫性２本鎖阻害ＲＮＡ分子を少なくとも１つ含む組成物。
【請求項１８】
植物寄生線虫に関する給餌アッセイであって、ここで該アッセイが：
ｉ）処理による第２段階の幼若線虫（Ｊ２ステージ）における給餌を誘導し；
ｉｉ）それらを試験化合物で給餌し；および
ｉｉｉ）該線虫の振る舞いおよび成長に関する該化合物の効果をアッセイする
段階を含むアッセイ。
【請求項１９】
前記線虫がシスト線虫である、請求項１８に記載のアッセイ。
【請求項２０】
前記試験化合物が２本鎖阻害ＲＮＡ分子である、請求項１８または１９に記載のアッセイ。
【請求項２１】
アッセイされる前記効果が、前記線虫が植物に感染することに成功する能力である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２２】
前記効果が前記線虫の性分化である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２３】
前記効果が、植物寄生体としての前記線虫の抑制された成長速度である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２４】
前記効果が、植物寄生線虫の精子の健康度における減少である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２５】
前記線虫がオクトパミンの溶液で処理される、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項２６】
前記オクトパミンの濃度が１ｍＭよりも大きい、請求項２５に記載のアッセイ。
【請求項２７】
前記オクトパミンの濃度が２５ｍＭよりも大きい、請求項２５に記載のアッセイ。
【請求項２８】
前記オクトパミンの濃度が５０ｍＭよりも大きい、請求項２５に記載のアッセイ。
【請求項２９】
前記オクトパミンの濃度が１０〜１００ｍＭである、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項３０】
請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のアッセイにより得られる化合物。
【請求項３１】
２本鎖阻害ＲＮＡ分子であると特徴付けられる、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の２本鎖ＲＮＡをコードすると特徴付けられる、ＤＮＡポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のＤＮＡポリヌクレオチドで形質転換される植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線虫における、特に植物寄生線虫におけるアッセイに関する。より具体的には、本発明は、線虫により摂食され得、殺線虫活性を有する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を包含する線虫毒性化合物の検出のためのアッセイに関する。
【０００２】
本発明は、植物寄生線虫のコントロールのための新たな基盤を提供する。本発明は、作物に被害を与えるそれらの線虫（作物ペスト）のコントロール用の化合物を検出するためのアッセイにも関する。
【背景技術】
【０００３】
作物ペストの攻撃に対して防御するための戦略の大多数は、殺虫剤の適用に関する（ｉｎ  ｃａｓｕ殺線虫剤）。殆どの場合、これらの殺虫剤は有機化学分子であり、これらは、保護される必要のある微生物を該線虫が攻撃する場所にて、局所的に適用されなくてはならない。植物の場合、このことは、この化学物質を該作物上へ噴霧するか、該植物への水やりの間に適用するか、またはそれを土中へ取り込ませることを意味する。好ましい過程は、植物が生物殺虫剤を作ることであろう（すなわち、植物中の（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）殺虫剤）。この延長で、タンパク質性殺虫剤が有利であり、これは、それらが組み換えＤＮＡ技術を通して、特別な酵素または基質に対しての要求性なしに植物中で発現され得、それらが環境中短命であり、これ故にそれに対して遙かにより少ない被害で済むと予期されるからである。
【０００４】
しかしながら、タンパク質性またはペプチド性の僅かな殺虫剤が知られているのみであり、それらは殆ど菌または細菌に関するものである。これらの内の幾つかは毒素であり、これらの内破傷風毒素およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓからの毒素が、最もよく知られ適用される群を形成する。幾つかのＢｔ−毒素は、植物寄生線虫に対して活性であると報告されている（例えば、ＷＯ９９／３４９２６、米国特許第５，８３１，０１１号、ＷＯ９９／０６５６８、および米国特許第５，７５３，４９２号）。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（またはＲＮＡｉ）と呼ばれる代替アプローチが最近示唆され（例えば、Ｆｉｒｅらによる１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：８０６〜８１１）、これは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて、食物中で該線虫に適用される場合（ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３９５：８５４）、または該線虫がこのような溶液中に浸される場合（Ｔａｂａｒａら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：４３０〜４３１）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現をノックアウトさせるために使用され得ることを示している。必須遺伝子がノックアウトされる場合、これは結果的に、該線虫の成長の阻害、または該線虫の死さえもたらすであろう。
【０００６】
特に、これらのタンパク質またはペプチドは、作物ペストである植物寄生線虫に対して活性であるべきである。これらのペストは、植物の内部寄生体、外部寄生体、および外部−内部寄生体へと、一段と細かく分類され得る。幾つかは定着性であり、他はそれらが餌を摂取するに連れて移動し続ける。全て、植物細胞壁に穴を開けるために針状のものを使用し、植物細胞の修飾前または後に、植物細胞の内容物を移動させることにより餌を摂取する（Ｓｙｍｏｎｓ，Ｐ．Ｃ．、Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｊ．、およびＷｙｓｓ，Ｕ．［１９９４］Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３２，２３５〜２５９）。特に重要な属および種についてより詳しくは、それらの宿主の範囲および経済的重大性は、標準的なテキスト中で定義されている（Ｌｕｃら［１９９０］Ｐｌａｎｔ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ  ｉｎ  ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ：Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ  Ｃ．Ａ．Ｂ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｅｖａｎｓら［１９９３］Ｐｌａｎｔ  ｐａｒａｓｉｔｉｃ  ｎｅｍａｔｏｄｅｓ  ｉｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ：ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。ＨｅｔｅｒｏｄｅｒａおよびＧｌｏｂｏｄｅｒａ属シスト（ｃｙｓｔ、嚢）線虫は、重大な作物ペストである。それらは、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ（大豆シスト線虫）、Ｈ．ｓｃｈａｃｈｔｉｉ（ビート・シスト線虫）、Ｈ．ａｖｅｎａｅ（穀物シスト線虫）、ならびにジャガイモ・シスト線虫Ｇ．ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓおよびＧ．ｐａｌｌｉｄａを包含する。根瘤線虫、特にＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ属は、広範な作物に被害を与える。例は、Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ、Ｍ．ｈａｐｌａ、Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ、およびＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ種である。多くの他の経済的に重要な線虫がある。Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ、Ｎａｃｏｂｂｕｓ、およびＴｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓを包含する他の経済的な属がそうするように、前記群両方が、膨らんだ定着性の雌を産生する。他の経済的な線虫は、成虫の雌およびこれらの多くが広範な作物に対して被害を引き起こす場合、移動性のままである。例は、Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、Ｒａｄｏｐｈｏｌｏｕｓ、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、およびＨｉｒｓｃｈｍａｎｎｉｅｌｌａの種を包含する。他は常に植物へ入るわけではないが、それらから外部寄生体として餌を摂取する。例は、Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ、Ａｎｇｕｉｎａ  Ｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ、Ｃｒｉｃｏｎｅｍａ  Ｈｅｍｉｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ、Ｈｅｍｉｃｒｉｃｏｎｅｍｏｉｄｅｓ、Ｐａｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ、およびＢｅｌｏｎｏｌａｉｍｕｓを包含する。これらの外部寄生体の中では、Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ、Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ、Ｐａｒａｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ、およびＰａｒａｔｒｉｃｈｏｄｒｕｓ属が、明らかな重要性を持っている。それらは、それらの餌の摂取により作物への被害を引き起こすが、作物ペストとしてのそれらの経済的ステータスはしばしば、ＮＥＰＯおよびＴＯＢＲＡ植物ウィルスのベクターとしての役割によるものである。
【０００７】
前記のようなシスト線虫は、真正（ｏｂｌｉｇａｔｅ、特定の環境下でしか生きられない）寄生体であり、それらの生活環（ライフ・サイクル）を完了するのに数週間を要する。両方の特徴が、成長および植物寄生に必須な遺伝子を定めるために、抗線虫物質を検出することを狙いとした研究に対して、またはＲＮＡｉの場合において、それらを耐性にする。このことは、ｍｉｃｒｏｂｏｖｏｒｏｕｓ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓを用いて非常に急激に開発された全範囲の遺伝子的アプローチが、これらのシスト線虫に対して容易には適用され得ないことを意味する。
【０００８】
シスト線虫のみが、餌を摂取後、植物の根の中に線虫摂食部位を樹立し、この段階の前では摂食しない。更に、シスト線虫（自由に生存しているもの）の第２段階「幼若」（Ｊ２）の、小さなサイズでよく形成されたクチクラが、微小注入を難しくし、専門的な設備に依存するようにさせており、一方、ｄｓＲＮＡ調製物中に該線虫を浸すことも、ｄｓＲＮＡの取り込みを見越すものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これ故に、植物寄生線虫、特にシスト線虫に関しての給餌アッセイに対する必要性が未だに存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様によれば、植物寄生線虫に関する給餌アッセイが提供され、これは、該アッセイが以下の段階を含むことにおいて特徴付けられる：ｉ．オクトパミンでの該線虫の処理による第２段階幼若線虫（Ｊ２段階）における給餌の導入；ｉｉ．試験化合物をそれらに給餌すること；ｉｉｉ．該線虫の振る舞いおよび成長に関する、該化合物の効果をアッセイすること。
【００１１】
好ましくは、該線虫は、シスト線虫または根瘤線虫であり、該試験化合物はｄｓＲＮＡである。
【００１２】
該アッセイは、該線虫の、植物に上手く感染する能力を測定することが出来、あるいはアッセイされる効果は、該線虫の引き続いての成長および／または性分化である。該線虫はオクトパミンの溶液中または該溶液と共に処理され、ここでオクトパミンの濃度は、１〜１００ｍＭの値にされる。シスト線虫に関しては、それは好ましくは２５ｍＭより高く、最も好ましくは５０ｍＭより高い。根瘤線虫に関しては、それは好ましくは１ｍＭより高く、最も好ましくは１０ｍＭより高い。本発明の更なる一部は、このようなアッセイにおいて活性であると見出される化合物であり、好ましくはこれらの化合物は、２本鎖ＲＮＡ分子である。
【００１３】
本発明の更なる態様によれば、発現カセットが提供され、該カセットは、遺伝子の少なくとも一部をコード化する核酸配列を含み、ここで該核酸配列は：
図４または図５中の配列により表される核酸配列；ｔ
ｉ）図４または図５中の配列へとハイブリダイゼーションし、酸化酵素（オキシダーゼ）活性を有するポリペプチドをコード化する核酸配列；
ｉｉ）前記（ｉ）および（ｉｉ）中の配列へと、遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択され、該カセットは、センスおよびアンチセンス両方の核酸分子が該カセットから転写されるように適応される。
【００１４】
本発明の好ましい実施形態では、該ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）である。
【００１５】
我々は、ＲＮＡｉに特に関わりやすい相同的な遺伝子を同定した。これらの遺伝子は、前記線虫のクチクラ中の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を架橋することに含まれる２つの酸化酵素をコード化する。該ＥＣＭタンパク質は、ジスルフィドにより、ならびにジ−、トリおよびイソトリチロシン結合により、高度に架橋される。最近、Ｅｄｅｎｓ，Ｗ．Ａ．らは（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５４，８７９〜８９１、２００１年）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ中の２つの２重の酸化酵素（ｄｕｏｘ）遺伝子を同定し、これらは、皮下細胞中で発現され、該ＥＣＭにおけるチロシン架橋の形成における役割を演じる。Ｄｕｏｘは、ＮＡＤＰＨ酸化酵素のＮｏｘ／Ｄｕｏｘファミリーの一員であり、これらは、殺細菌作用に関する活性酸素種の生成に応答性の貪食細胞ｇｐ９１ｐｈｏｘを包含する。これらのＮｏｘタイプのタンパク質は、２つのヘムを含有する６回膜貫通ドメイン、およびＮＡＤＰＨ結合部位を含有する細胞質性フラビン・ドメインを含む。該Ｄｕｏｘタンパク質は加えて、細胞質性の２つのＥＦ−ハンド・カルシウム結合ドメイン、更なる膜貫通に亘るヘリックス、およびＮ−末端細胞外過酸化酵素（ペルオキシダーゼ）ドメインを含有する。
【００１６】
本発明の好ましい実施形態において、該カセットは、該カセットからセンスおよびアンチセンスの核酸分子を転写する少なくとも２つのプロモーター配列の準備により適応される。
【００１７】
本発明の更に好ましい実施形態においては、該カセットは核酸分子を含み、ここで該分子は、第２部分に結合された第１部分を含み、ここで該第１および第２部分は、それらの配列の少なくとも１部に亘って相補的であり、更にここで、該核酸分子の転写が、該第１および第２部分の相補的な塩基対形成により２本鎖領域を形成するＲＮＡ分子を産生する。
【００１８】
本発明は、いわゆる「シュテム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）ＲＮＡ」を取り込む。Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４０７、３１９〜３２０参照。該シュテム−ループＲＮＡをコード化するＤＮＡ分子は、２つの部分で構成され、これらの内の第１部分は、制御が望まれる遺伝子に由来する。その第２部分は、該第１部分の配列に相補的なＤＮＡ配列と共に提供される。該カセットは典型的には、該ＤＮＡをＲＮＡへと転写するプロモーターのコントロール下にある。該ＲＮＡ分子の第１および第２部分の相補的な性質は結果的に、該ＲＮＡ分子の長さの少なくとも１部に亘る塩基対形成を与え、２本鎖ヘアピンＲＮＡ構造またはシュテム−ループを形成する。該第１および第２部分は、リンカー（ｌｉｎｋｅｒ、結合）配列と共に提供され得る。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態において、該第１および第２部分は、少なくとも１つのヌクレオチド塩基により結合される。本発明の更に好ましい実施形態では、該第１および第２部分は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド塩基により結合される。本発明の尚更に好ましい実施形態においては、該リンカーは、少なくとも１０ヌクレオチド塩基である。
【００２０】
本発明の更なる態様によれば、２本鎖ＲＮＡ分子が提供され、ここで該ＲＮＡ分子は：
ｉ）図４または図５中の配列により表される核酸配列；
ｉｉ）図４または図５中の配列へとハイブリダイゼーションし、酸化酵素活性を有するポリペプチドをコード化する核酸配列；
ｉｉｉ）前記（ｉ）および（ｉｉ）中の配列に対する遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、該ｄｓＲＮＡ分子の長さは、１０ヌクレオチド塩基（ｎｂ）〜１０００ｎｂである。好ましくは、該ｄｓＲＮＡ分子は、１００ｎｂ；２００ｎｂ；３００ｎｂ；４００ｎｂ；５００ｎｂ；６００ｎｂ；７００ｎｂ；８００ｎｂ；９００ｎｂ；または１０００ｎｂの長さである。尚より好ましくは、該ｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも１０００ｎｂの長さである。
【００２２】
尚より好ましくは、該ｄｓＲＮＡ分子の長さは少なくとも、１０ｎｂ；２０ｎｂ；３０ｎｂ；４０ｎｂ；５０ｎｂ；６０ｎｂ；７０ｎｂ；８０ｎｂ；または９０ｎｂの長さである。
【００２３】
尚より好ましくは、該ｄｓＲＮＡ分子は、２１ｎｂの長さである。
本発明の更なる態様によれば、本発明による核酸カセットを包含するベクターが提供される。
【００２４】
好ましくは、該ベクター中の該核酸は、宿主植物細胞中での転写に関する適切なプロモーターまたは他の制御要素へと、操作されて結合される。該ベクターは、多数の宿主中で機能する２機能性発現ベクターであってもよい。本発明による核酸の例においては、これは、それの天然のプロモーターまたは他の制御要素を含有してもよい。
【００２５】
「プロモーター」により、転写開始部位から上流のヌクレオチド配列が意味され、これは、転写に要求される全ての制御領域を含有する。適切なプロモーターは、設計に依り、植物中に含まれる植物細胞における発現に関しての、構築性、組織特異的、誘導可能、成長性、または他のプロモーターを包含する。このようなプロモーターは、ウィルス、菌、細菌、動物、および植物由来のプロモーターを包含し、これらは植物細胞中で機能可能である。
【００２６】
構築性プロモーターは、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３、９８１０〜８１２）；コメ・アクチン（ＭｃＥｌｒｏｙら（１９９０年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１６３〜１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら（１９８９年）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８（６７５〜６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔら（１９９１年）Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１〜５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎら（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．３．２７２３〜２７３０）；ＡＬＳプロモーター（米国出願連続番号０８／４０９，２９７）、および同様のものを包含する。他の構築性プロモーターは、米国特許第５，６０８，１４９号；米国特許第５，６０８，１４４号；米国特許第５，６０４，１２１号；米国特許第５，５６９，５９７号；米国特許第５，４６６，７８５号；米国特許第５，３９９，６８０号；米国特許第５，２６８，４６３号；および米国特許第５，６０８，１４２号におけるものを包含する。
【００２７】
化学的に制御されるプロモーターは、外因性化学制御剤の適用を通じて、植物中での遺伝子の発現を調節するのに使用され得る。その目的に依って、該プロモーターは、この化学的に誘導された遺伝子発現の適用の場合、化学的に誘導可能なプロモーターであってもよく、あるいは、化学的に抑制された遺伝子発現の適用の場合、化学的に抑制可能なプロモーターであってもよい。化学的に誘導可能なプロモーターは当業界では既知であり、これらに限定されないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤により活性化されるトウモロコシＩｎ２−２プロモーター、前緊急除草剤として使用される疎水性求電子化合物により活性化されるトウモロコシＧＳＴプロモーター、およびサリチル酸により活性化されるタバコＰＲ−１ａプロモーターを包含する。興味ある他の化学的に制御されるプロモーターは、ステロイド応答性プロモーター（例えば、Ｓｃｈｅｎａら（１９９１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０４２１〜１０４２５、およびＭｃＮｅｌｌｉｅら（１９９８年）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１４（２）：２４７〜２５７中のグルココルチコイド誘導性プロモーター参照）、ならびにテトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性プロモーター（例えば、本明細書中で援用される、Ｇａｔｚら（１９９１年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７、および米国特許第５，８１４，６１８号および米国特許第５，７８９，１５６号参照）を包含する。
【００２８】
特定の組織における増強された発現が望まれる場合、組織特異的プロモーターが利用され得る。組織特異的プロモーターは、Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９７年）Ｐｌａｎｔ  J.  １２（２）：２５５〜２６５；Ｋａｗａｍａｔａら（１９９７年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８（７）：７９２〜８０３；Ｈａｎｓｅｎら（１９９７年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５４（３）：３３７〜３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９７年）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．６（２）：１５７〜１６８；Ｒｉｎｅｈａｒｔら（１９９６年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（３）：１３３１〜１３４１；Ｖａｎ  Ｃａｍｐら（１９９６年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５２５〜５３５；Ｃａｎｅｖａｓｃｎｉら（１９９６年）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２（２）：５１３〜５２４；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９４年）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３５（５）：７７３〜７７８；Ｌａｍ（１９９４年）Results Probl. Cell Differ. ２０：１８１〜１９６；Ｏｒｏｚｃｏら（１９９３年）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３（６）：１１２９〜１１３８；Ｍｕｔｓｕｏｋａら（１９９３年）Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ  ９０（２０）：９５８６〜９５９０；およびＧｕｅｖａｒａ−Ｇａｒｃｉａら（１９９３年）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４（３）：４９５〜５０により記載されたものを包含する。
【００２９】
「操作されて結合された（Operably linked）」とは、同じ核酸分子の一部として結合され、適切に位置され、該プロモーターから開始される転写に関する向きとされることを意味する。プロモーターに操作されて結合されたＤＮＡは、該プロモーターの「転写開始制御下に」ある。
【００３０】
好ましい実施形態において、該プロモーターは、誘導可能なプロモーターまたは成長するように制御されるプロモーターである。
【００３１】
特定のベクターは、植物ベクターとして作動する核酸構築物である。植物に関して幅広く成功裏に以前に使用された特定の手順およびベクターが、ＧｕｅｒｉｎｅａｕおよびＭｕｌｌｉｎｅａｕｘ（１９９３年）（Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed)Oxford, BIOS Scientific Publishers、pp 121-148）により記載されている。適切なベクターは、植物のウィルス由来ベクターを包含してもよい（例えば、ＥＰ−Ａ−１９４８０９参照）。
【００３２】
ベクターは、除草剤（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキセート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン、およびグリホセート）に対する耐性のような、選択可能な表現型を与えるもののような、選択可能な遺伝子マーカーを包含してもよい。
【００３３】
本発明の更なる態様によれば、本発明によるカセットまたはベクターでトランスフェクションまたは形質転換された細胞が提供される。
【００３４】
本発明の更なる態様によれば、本発明による細胞を含む植物が提供される。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態において：
トウモロコシ（Zea mays）、カノーラ（Brassica napus、Brassica rapa ssp.）、亜麻（Linum usitatissimum）、アルファルファ（Medicago sativa）、コメ（Oryza sativa）、ライ（Secale cerale）、モロコシ（Sorghum bicolor, Sorghum vulgare）、ヒマワリ（Helianthus annus）、小麦（Tritium aestivum）、大豆（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ピーナッツ（Arachis hypogaea）、ワタ（綿花、Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Iopmoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Cofea spp.）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Anana comosus）、レモンの木（Citrus spp.）、ココア（カカオ、Theobroma cacao）、茶（Camellia senensis）、バナナ（Musa spp.）、アボガド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifer indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイア（Carica papaya）、カシュー（ナッツ）（Anacardium occidentale）、マカダミア（ナッツ）（Macadamia intergrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、サトウキビ（Beta vulgaris）、オート（麦）、大麦、野菜（蔬菜）
からなる群から選択される植物が提供される。
【００３６】
好ましくは、本発明の植物は、作物植物（例えば、穀物および豆類、トウモロコシ、小麦、ジャガイモ、タピオカ、コメ、モロコシ、アワ、キャッサバ、大麦、ピーナッツ、ならびに他の根、塊茎、もしくは種子作物である。重要な種子作物は、グレープ・シード・オイル、サトウキビ、トウモロコシ、ヒマワリ、大豆、モロコシ、および亜麻（亜麻仁）である。
【００３７】
本発明が適用されてもよい園芸植物は、レタス、エンダイブ、ならびに、キャベツ、ブロッコリー、およびカリフラワーを包含するアブラナ属野菜を包含してもよい。本発明は、タバコ、ウリ、ニンジン、イチゴ、ヒマワリ、トマト、ペッパー（胡椒）において適用されてもよい。
【００３８】
特に好ましい種類は、観葉植物のものである。
【００３９】
興味ある種子を提供する穀類植物は、油種子植物および豆科植物を包含する。興味ある種子は、トウモロコシ、小麦、大麦、コメ、モロコシ、ライ麦等のような穀類の種子を包含する。油種子植物は、ワタ（綿花）、大豆、サフラワー、ヒマワリ、アブラナ属植物、トウモロコシ、アルファルファ、パーム（椰子）、ココナッツ等を包含する。豆科植物は、豆およびピーナッツを包含する。豆は、グアー、イナゴ豆、コロハ種子、大豆、エンドウ豆、ササゲ豆、ヤエナリ、アオイ豆、ソラ豆、レンズ豆、ヒナ豆等を包含する。
【００４０】
本発明の尚更なる態様によれば、本発明による細胞を含む種子が提供される。
【００４１】
本発明の尚更なる態様によれば、本発明による少なくとも１つの殺線虫ｄｓＲＮＡ分子を含む組成物が提供される。
【００４２】
本発明の更なる態様によれば、発現カセットが提供され、該発現カセットは、遺伝子の少なくとも一部をコード化する核酸配列を含み、ここで該核酸配列は：
ｉ）図６中の配列により表される核酸配列；
ｉｉ）図６中の配列へとハイブリダイゼーションし、システイン・プロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコード化する核酸配列；
ｉｉｉ）前記（ｉ）および（ｉｉ）中の配列に対する遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択され、該カセットは、センスおよびアンチセンス両方の核酸分子が該カセットから転写されるように適応される。
【００４３】
本発明の更なる態様によれば、発現カセットが提供され、該カセットは、遺伝子の少なくとも一部をコード化する核酸配列を含み、ここで該核酸配列は：
ｉ）図７中の配列により表される核酸配列；
ｉｉ）図７中の配列へとハイブリダイゼーションする核酸配列；
ｉｉｉ）前記（ｉ）および（ｉｉ）中の配列に対する遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択され、該カセットは、センスおよびアンチセンス両方の核酸分子が該カセットから転写されるように適応される。
【００４４】
本発明の更なる態様によれば、発現カセットが提供され、該カセットは、遺伝子の少なくとも一部をコード化する核酸配列を含み、ここで該核酸配列は：
ｉ）図８中の配列により表される核酸配列；
ｉｉ）図８中の配列へとハイブリダイゼーションし、精子関連ポリペプチドであるポリペプチドをコード化する核酸配列；
ｉｉｉ）前記（ｉ）および（ｉｉ）中の配列に対する遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択され、該カセットは、センスおよびアンチセンス両方の核酸分子が該カセットから転写されるように適応される。
【００４５】
図４または５に表される配列に適用可能な本発明の態様および好ましい実施形態が、図６、７、および８に表されるそれらの配列にも等しく適用可能であることは、明らかであろう。
【００４６】
特に、２つ以上のｄｓＲＮＡを組み合わす遺伝子導入植物、ベクター、および組成物も、本発明の範囲内にある。例えば、発現カセットでトランスフェクションされる遺伝子導入植物、あるいは、図６および／または図７および／または図８由来の配列を伴う図４または５由来の配列を包含するベクター。図４または５由来のｄｓＲＮＡの、図６および／または図７および／または図８由来のｄｓＲＮＡとの組み合わせを含む組成物。
【００４７】
本発明の実施形態は今、以下の表および図に言及して、実施例のみにより記載される。
【００４８】
表１は、シスト線虫寄生体の数を例示し、該数は、雌（Ｊ４および成虫）および他の全ての段階の丸みおよび長さに関する平均±ｓｅｍである。線虫は、ＲＮＡｉによる感染後１４または２１日にて植物から、またはコントロール処理されたＪ２から、回収された。比較；剣標、コントロールに対するＲＮＡｉ処理における雄／雌比に関するχ２試験；２重剣標、ＲＮＡｉ処理およびコントロール中の合計寄生体負荷量に関するｔ試験；統計的有意さ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００４９】
表２。Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ  ｄｕｏｘ  ＲＮＡｉ実験の解析。根が、コントロールおよびＲＮＡｉ処理の両方に関してＪ２段階のＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａで感染され、線虫の数が、１４日に数えられた。５５匹の線虫のサブセットがその後、その成長段階を分類するための丸みおよび長さの解析に関して、コントロールおよびＲＮＡｉ処理された線虫で感染された根から切り出された。３５日における解析に関しては、根はＪ２で感染され、線虫は３５ｄｐｉにて数えられた。卵の塊が集められ、卵が数えられた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
植物寄生線虫は、重大な植物ペストであり、地球全体での作物の損失における少なくとも年間＄１００，０００，０００，０００分を引き起こす（Ｊ．Ｎ．Ｓａｓｓｅｒ、Ｗ．Ｎ．Ｆｒｅｃｋｍａｎ、ｉｎ：  Ｖｉｓｔａｓ  ｏｎ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ａ．Ｖｅｅｃｈ，Ｄ．Ｗ．Ｄｉｃｋｓｏｎ、Ｅｄｓ．，Ｓｏｃ．Ｎｅｍａｔｏｌ．，Ｈｙａｔｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ，１９８７，ｐｐ．７〜１４）。これらの化学的殺線虫剤は、環境リスクおよび毒性リスクにかかわる増加する問題点の焦点である。続いて、政府の統制における変化の結果としての、使用からの進行する解離の最近の歴史がある。
【００５１】
本発明のアッセイは、これらの植物寄生線虫による摂食にそれらの毒性効果を発揮する線虫毒性化合物の検出に関して有用である。特に、該アッセイは、これらの線虫において遺伝子発現を阻害出来、これにより、これらの線虫が植物の根における融合体形成を誘導する可能性に影響を及ぼすか、および／またはこれにより、その定着段階において該線虫の成長および発達を干渉する、それらの２本鎖ＲＮＡの検出に関して有用である。
【００５２】
線虫のコントロールのための新規な潜在標的は、予見される機能、およびモデル微生物からの遺伝子に対しての相同性に基づいた比較ゲノム的アプローチを使用して、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏにて（コンピューターにより）同定され得、これらのモデル微生物は、該微生物の生存能力に関して必須であり、またはそれの病理遺伝子の重要な態様に関して決定的であると知られている（Lavorgna, G., Boncinelli, E., Wagner, A., およびWerner, T.(１９９８)Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４（９）、３７５〜３７６）。このような標的はその後、ＲＮＡ干渉を使用する機能の遮断により、または該標的遺伝子のノックアウト突然変異体を研究することにより確認され得る（ＷＯ  ００／０１８４６；Ｂｏｓｈｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＬａｂｏｕｅｓｓｅ，Ｍ．（２０００）ＲＮＡ干渉：ｇｅｎｅｔｉｃ  ｗａｎｄ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｗａｔｃｈｄｏｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２（２），Ｅ３１〜Ｅ３６；Ｂｉｒｄ，Ｄ．Ｍ．，Ｏｐｐｅｒｍａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｊ．Ｍ．，およびＢａｉｌｌｉｅ，Ｄ．Ｌ．（１９９９）Ｔｈｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｇｅｎｏｍｅ：Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｇｅ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３７，２４７〜２６５）。本発明のアッセイは、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ実験により同定される標的が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗線虫アプローチの開発に適しているであろうかどうかを試験するための優れた系であろう。
【００５３】
本発明によるアッセイにおいて陽性なものとして見出された化合物は、合成後、多くのやり方で使用され得る。殺線虫剤として、それらは局所的に、または寄生体の局所にて投与され得、あるいは植物のペストはその土を包含し、他の環境は該植物を取り囲むものである。あるいは、それらは遺伝子導入微生物により産生され得、精製可能な物質または前記の使用のための抽出物を提供する。加えて、それらは生物殺虫剤として産生され得、それの病原、寄生体、もしくはペストから、ｉｎ  ｐｌａｎｔａの該遺伝子導入植物を保護する。これは、該生物殺虫剤の構築性もしくは組織特異的発現を含み得る。発現も、病原、寄生体、もしくはペストの攻撃に応答性であり得、恐らくこの感染の部位へと限定されるであろう。
【００５４】
本発明の更なる実施形態は、前記ペプチドまたはｄｓＲＮＡのいずれかに対してコードするＤＮＡ配列で形質転換された植物を提供する。このようなＤＮＡ配列は、ｄｅ  ｎｏｖｏ合成により、またはそれを天然源から単離することにより得られる。
【００５５】
適切に発現されるためには、該ＤＮＡ配列は、プロモーターに操作されて結合されなければならない。プロモーターの選別は、発現の所望される部位に依存し、ならびに発現の所望されるレベル（水準）、およびそれの制御下の遺伝子の所望される制御方法にも依存している。このことは全て、通常の技術範囲内である。
【００５６】
プロモーターの特異性が特段に好ましいというわけではない場合、強力な構築性プロモーターが使用され得、これは植物全体に亘って機能し、成育パターンに関して最小限可能な制限しか伴わない。高レベルの発現に関する構築性プロモーターの１例は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターである。高レベル、光誘導性のプロモーターの他の例は、他のものの中にあり、リブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット（ｒｂｃＳＳＵ）プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（Ｃａｂ）プロモーター、キメラ・フェレドキシン／Ｒｏ１Ｄプロモーター（ＷＯ  ９９／３１２５８）、および同様のものである。
【００５７】
線虫のような根に特異的な病原と戦うことにおいては、根に特異的なプロモーターが好ましい。このようなプロモーターの例は：Ｒｏ１Ｄ、ＲＰＬ１６Ａ、Ｔｕｂ−１、ＡＲＳＫ１、ＰｓＭＴａ（ＷＯ  ９７／２００５７）、およびＡｔａｏ１プロモーター（Ｍｏｅｌｌｅｒ，Ｓ．Ｇ．およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，１９９８，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１３，７８１〜７９１）である。
【００５８】
一般に、選別に値するＤＮＡ構築物（単数または複数）は、発現カセット中に含有され、これは、少なくともプロモーターおよび転写終結剤を含む。適正に機能するためにこのような要素が如何に結合されるべきかはよく知られており、このことは、実施に当たっての進歩的な技術なしに決定され得る。本発明の小ペプチドの発現の高さを増加させる特異的な方法は、１遺伝子構築物（いわゆるポリタンパク質）において、これらのペプチドに関しての複数のコード配列を包含することであり、ここで転写後、そのｍＲＮＡまたは該タンパク質前駆体（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）は、本発明のペプチドの幾つかの繰り返しが生成されるような方法で加工される。
【００５９】
植物種の形質転換は、非常に（ｉｍｐｒｅｓｓｉｖｅ）多くの植物種に関して今やルーチンであり、これらはＤｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅおよびＭｏｎｏｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅａｅ両方を包含する。原則的に、如何なる形質転換方法も、本発明によるキメラＤＮＡを、適切な元の（先祖の、ａｎｃｅｓｔｏｒ）細胞中へ導入するのに使用されてよい。方法は適切に、原形質に関してのカルシウム／ポリエチレン・グリコール法（Ｋｒｅｎｓ，Ｆ．Ａ．ら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６、７２〜７４；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ  Ｉ．ら、１９８７年６月、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８，３６３〜３７３）、原形質の電気穿孔（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ  Ｒ．Ｄ．ら、１９８５年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．３，１０９９〜１１０２）、植物材料中への微小注入（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  Ａ．ら、１９８６年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２、１７９〜１８５）、（ＤＮＡまたはＲＮＡによりコーティングされている）、種々の植物材料の粒子爆撃（bombardment）（Ｋｌｅｉｎ  Ｔ．Ｍ．ら、１９８７年、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７、７０）、（非統合性）ウィルスを用いた感染、成体植物の浸透、または成熟した花粉もしくは小胞子の形質転換（ＥＰ０３０１３１６）によるｉｎ  ｐｌａｎｔａでのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介遺伝子移入、および同様のものから選択されてもよい。本発明による好ましい方法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介ＤＮＡ移入を含む。特に好ましいのは、ＥＰ  Ａ  １２０  ５１６および米国特許第４，９４０，８３８号に開示されるような、いわゆる２元性ベクター技術の使用である。
【００６０】
遺伝子の形質転換に対してはややより抵抗性であると考えられているが、単子葉植物は形質転換に対して従順であり、稔性の遺伝子導入植物は、形質転換細胞もしくは形質転換胚、または他の植物材料から再生成され得る。現在、単子葉植物の形質転換のための好ましい方法は、胚、移植片もしくは懸濁細胞の微小噴出爆撃（bombardment）、および直接のＤＮＡ取り込みもしくは（組織）電気穿孔（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８，２７４〜２７６）である。遺伝子導入トウモロコシの植物体は、微小噴出爆撃（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２，６０３〜６１８）により、トウモロコシ懸濁培養の胚原性細胞中へ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｂａｒ遺伝子を導入することにより得られており、これは、ホスフィノトリシン・アセチルトランスフェラーゼ（アセチル基転移酵素）（この除草剤ホスフィノトリシンを不活性化する酵素）をコード化する。小麦および大麦のような他の単子葉作物のアリューロン（ａｌｅｕｒｏｎｅ）原形質中への遺伝子材料の導入が、報告されている（Ｌｅｅ，１９８９，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３，２１〜３０）。小麦の植物体は、胚原性懸濁培養物の樹立のために胚原性カルスを選択することにより、該胚原性懸濁培養物から再生成されている（Ｖａｓｉｌ，１９９０  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．８，４２９〜４３４）。これらの作物に関する形質転換系との組み合わせは、本発明の単子葉植物への適用を可能にする。
【００６１】
単子葉植物も、コメ、小麦、およびトウモロコシのような商業的に重要な作物を包含し、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株によりＤＮＡ移入に対して従順でもある（ＷＯ  ９４／００９７７；ＥＰ  ０  １５９  ４１８  Ｂ１；ＥＰ  ０  ８５６  ０６０；Ｇｏｕｌｄ  Ｊ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｄ，Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｏ，Ｕｌｉａｎ  Ｅ．Ｃ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｇ，Ｓｍｉｔｈ  Ｒ．Ｈ．，（１９９１）Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５，４２６〜４３４参照）。
【実施例】
【００６２】
［材料および方法］
［Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける給餌によるＲＮＡｉ］
ＲＮＡｉ研究用のｄｓＲＮＡの分解を防ぐことが出来ないＲＮａｓｅＩＩＩであるバクテリアＨＴ１１５が、前記のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｄｕｏｘ断片（複数）のいずれかを含有するｐＰＤ１２９．３６という２本鎖Ｔ７プロモーター・ベクターで形質転換された。それらは、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１ｍＭのＩＰＴＧを有するＮＧＭ寒天プレート上に植えられ（Ｔｉｍｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ  ２６３，１０３〜１１２，２００１）、５〜６の１日の成体Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｎ２）が加えられ、２０℃にて７２時間インキュベートされた。子孫が表現型に関してスコア化され、更なるプレート上に植えられて、その次の世代をスコア化した。ｐＰＤ１２９．３６中でクローンされたｕｎｃ−２２断片がポジティブ・コントロールとして使用され、縮退する表現型を表示したが、一方で、ＯＰ５０およびＨＴ１１５バクテリアがネガティブ・コントロールとして使用された。
【００６３】
［ｃＤＮＡライブラリー・スクリーニング］
この方法は、植物寄生線虫における同族体を見出すための基盤として、ｄｕｏｘ遺伝子に関してＣ．ｅｌｅｇａｎｓのｃＤＮＡを使用する基盤を提供する。該方法は、このアプローチの例として、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａに適用される。Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａの若い給餌雌のｃＤＮＡライブラリーが、Ｊａｎｅ  Ｓｈｉｎｇｌｅｓ女史（リーズ（Ｌｅｅｄｓ）大学）の好意により提供された。約２００，０００の斑点が、３２Ｐ  ｄＣＴＰにより標識された（Ｐｒｉｍｅ  Ｉｔ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）混合プローブを用いて、２通りスクリーニングされた。これは、過酸化酵素領域およびＮＡＤＰＨ酸化酵素ドメインをコード化するＣ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物（〜６５０塩基対）を含み、それぞれプライマーの対：
ＣｅｄｕｏｘＮｆ５’ＴＣＡＡＧＴＡＧＴＴＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＴＡＡＴＧＣ３’
＋ＣｅｄｕｏｘＮｒ５’ＣＴＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＡＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣ３’、および、
ＣｅｄｕｏｘＣｆ５’ＡＧＴＣＴＣＣＣＡＡＴＴＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧ３’
＋ＣｅｄｕｏｘＣｒ５’ＡＣＡＴＣＴＧＡＧＴＧＡＣＧＡＡＴＡＴＧＴＧＴＧＴＣ３’
と共に生成した。
【００６４】
６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔの溶液、および０．５％ＳＤＳ中５５℃での１６時間のハイブリダイゼーション、１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡ、ならびに０．１％ＳＤＳ含有２ｘＳＳＣ中５５℃での２回の３０分の洗浄後、得られた濾過物を−８０℃にてオートラジオグラフィー・フィルム（Ｆｕｊｉ  Ｓｕｐｅｒ  ＲＸフィルム）に感光させた。第２および第３のスクリーニングが、同一の条件下に行われた。斑点が、製造者らの説明書（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従って、組み換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）に付された。
【００６５】
［Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ  ｄｕｏｘ遺伝子のｄｓＲＮＡの調製］
ｃＤＮＡ挿入物がＡＢＩ３７３ＸＬ機器を使用して配列され、そのコード領域（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＸＸＸＸＸＸＸ）が翻訳されて、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ探索を行うのに使用される推定のＤＵＯＸのアミノ酸配列を与えた。タンパク質配列アラインメントが、ＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して行われた。５’末端からのＨｉｎｄＩＩＩ部位９５塩基対、および３’末端におけるＸｈｏＩが使用され、６２９塩基対の断片をｐＰＤ１２９．３６中へクローニングし、ｐＭｉＤｕｏｘ１を与え、これは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ給餌実験における使用のために、ＨＴ１１５細胞へと形質転換された。ｐＭｉＤｕｏｘ１は、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩを使用して直線化され、製造者らの説明書に従って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて（Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ  Ｔ７  ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｆｒｏｍ  Ｃａｍｂｉｏ）転写された。センスおよびアンチセンスの転写物がその後、３７℃にて３０分間アニールされ、アガロース・ゲル電気泳動により分析された。
【００６６】
［Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａのＲＮＡｉ処理］
ＲＮＡｉを浸す方法は、実施例１おいてシスト線虫に関して記載された通りであった。感染後８週にて感染されたトマトの植物体からの球根が、流れ滴る水の下に完全に洗浄された。この洗浄された根が、小片（３〜４ｃｍ）へと切り刻まれ、粗いシーブ（２５０μｍ）上に支持されたティッシュペーパー上に置かれた。該シーブは、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ上の漏斗の内側に置かれた。該漏斗は、噴霧ノズルから連続して噴霧される水（２５℃）の細かい霧の下に保たれた。前記の孵化した線虫は４日間、２４時間毎に５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ中に集められた。約１５０００匹のＪ２線虫が、１．５ｍＬの微駆虫チューブ中で時々震わせながら、室温にて４時間、浸すための緩衝液（Ｍ９塩（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ  ＵＫ）中１０ｍＭのオクトパミン、ＤＭＦ中１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ、ｄｓＲＮＡ２μｇ／μＬ）中に浸された。コントロールは、ｄｓＲＮＡなしか、オクトパミンなしか、または両方共なしの、浸すための緩衝液であった。ＦＩＴＣの取り込みは、その場で画像化するソフトウェア、および５２０ｎｍフィルターを使用する単色光源を用いるＺｉｅｓｓ  ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５−ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して、解析された。ｄｓＲＮＡ処理された線虫およびコントロールの線虫（ｄｓＲＮＡなし）の割合は、半定量的ＰＣＲ解析用に使用された。
【００６７】
［ＲＮＡの単離および半定量的ＰＣＲ］
合計のＲＮＡが、Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ）からのＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、約１２，０００匹の線虫から単離された。合計のＲＮＡを２〜３μｇ分取したものが、製造者らの説明書に従って、Ｓｕｐｅｒ  ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、逆転写された。ｃＤＮＡの反応混合物から３μＬ分取したものが、プライマー５’ＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＧＡＣＧＴＴＴＧＧ３’および５’ＣＣＡＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＣＴＧ３’を用いた各ＰＣＲにおいて使用された。ＰＣＲは、９５℃の３０サイクル４５秒；５５℃３０秒；７２℃２分間、最後に７２℃にて５分間延長して、Ｈｙｂａｉｄ  Ｏｍｎｉｇｅｎｅ中、ＰＣＲ緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ、および１０ｐｍｏｌ／μＬのプライマーを含有する１００μＬの反応中で行われた。該反応は、１％アガロース・ゲル上の電気泳動による解析用に、１５、２０、および２５サイクル後に１０μＬ分取して取り除くことにより、サンプリングされた。
【００６８】
［嚢中の植物の感染］
Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ（小豆）の植物体が、ＣＹＧ種子成長嚢（Ｍｅｇａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）中で育てられ、ＡｔｋｉｎｓｏｎおよびＨａｒｒｉｓ（Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．９８：４７９〜４８７、１９８９年）により記載されたように、Ｊ２の線虫で感染させられた。１つの嚢につき３〜４の感染ポイントが、１５の線虫で各々感染させられた。植物体は、ｄｕｏｘのｄｓＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を含有する浸すための緩衝液で処理されたか、またはｄｓＲＮＡで処理されなかった（コントロール）線虫で感染させられた。これらの嚢は、１５ｍｍ間隔で１トレイにつき１０ずつ、１ｃｍの水に浸されて置かれ、１４または３５日間、３０℃および５６〜６０％の湿度にて、温室中で育てられた。
【００６９】
［植物の根の中の線虫の染色、および画像解析］
これらの感染させられた根は、１４または３５日後にこれらの嚢から集められ、２分間１％の漂白剤に浸されて、きれいにされ浸透可能にされた。水中で濯いだ後、それらは酸フクシン（１Ｌの２５％酢酸中３５０ｍｇの染料）中２分間煮沸され、水中で濯がれ、審査および解剖（切開）用の酸性化されたグリセロール２５（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｊ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２８、２０９〜２１５、１９９６））へと移された。線虫（複数）は、それらを酸性化されたグリセロール中の６０ｍｍのペトリ皿中で分離することにより、感染植物の根から切開された。
【００７０】
それらはランダムに拾われ、０．６ｍｍの針を使用してこの根組織を優しく裂くことにより切り出された。これらの切り出された線虫は、１滴の酸性化グリセロール中、ガラス・スライド上にマウントされ、長さ、面積、および丸みの測定が、カラー・カメラ（Ｋａｐｐａ  Ｆ１５ＭＣＣ）に取り付けられたＬｅｉｔｚ（ＤＭＢＲ）Ｌｅｉｃａの顕微鏡下にＬＥＩＣＡ  ＱＷｉｎからの画像解析ツールのキットを使用して行われた。３５日に、成虫の雌が、平らなブレードを有するピンセットを使用してこれらの根から拾われ、卵の塊に触れないようにしておくことを確実にするように注意が払われた。このゼラチン質の素材は、針を使用してこれらの卵の周りで分離され、ランダムに拾われた成虫の雌からガラス・スライド上で数えられた。各処理からの１０匹の雌からの卵が数えられ、その平均の卵の数が、雌の全体数により掛け算され、感染根からの全卵数をはじき出した。
【００７１】
［シスト線虫］
寄生前のＪ２のＧ．ｐａｌｌｉｄａおよびＨ．ｇｌｙｃｉｎｅｓが、無菌化されたシストから、Ｕｒｗｉｎら、１９９５年、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８，１２１〜１３１に記載されたように集められた。Ｇ．ｐａｌｌｉｄａは２０℃にて孵化し、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓは２５℃にて孵化した。これらの線虫は、ＦＩＴＣアイソマーＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ  Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）１ｍｇ／ｍＬ（ＤＭＦ中２０ｍｇ／ｍＬにて作り上げられたストック（貯蔵品））と一緒に、Ｍ９塩（４３．６ＭのＮａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．１ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＮＨ４Ｃｌ）中で作り上げられた５０ｍＭのオクトパミン中に浸された。これらの線虫は、簡便な微遠心分離により集められ、それから水でたっぷり洗浄されて、外部からの如何なる外因性ｄｓＲＮＡをも除く前に、４時間室温にて置かれた。ＦＩＴＣの取り込みは、適切なフィルターを用いて、Ｌｅｉｃａの顕微鏡（モデルＤＭＲＢ）を使用して蛍光により観察された。画像が、該顕微鏡上に設置されたカラー（Ｋａｐｐａ  ＣＦ１５  ＭＣＣ）または白黒（ＣＯＨＵ）カメラを通して、ソフトウェア・パッケージ（Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ  ５００ｃ；Ｌｅｉｃａ，ＵＫ）を用いて撮られた。処理後、ＦＩＴＣは、針状の口の管中に存在し、これは正常には、植物細胞壁に穴を開けるために使用されるものであり、咀嚼管の後ろへと明確に通される（図１ｂ、ｃ）。この寄生体の排泄／分泌系も、取り込みを示す（図１ｄ）。取り込みは、その針状の口を通して、典型的には個体数の１５〜２０％に限られるが、しばしば該排泄／分泌系を介して＞５０％であった。いずれかの経路による進入は、ｄｓＲＮＡが細胞の境界線を横断出来る能力を持つ場合、ＲＮＡｉを容易にすることがある（Ｆｉｒｅら、１９９８年）。前記の浸すための溶液中３ｍＭのスペルミジンおよび０．０５％のゼラチンの包含は、ｄｓＲＮＡ（Ｍａｅｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１．１７１〜１７６，２００１）およびＦＩＴＣのような分子の浸透性を改善することがある。この今の手順は既に、ｄｓＲＮＡをシスト線虫に適用するための基盤を提供しており、これは、この浸すための溶液に加えられたＦＩＴＣの経口取り込みを示すそれらの線虫が、実験用に選択され得るからである。
【００７２】
［ＲＮＡ合成］
Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ（ｈｇｃｐ−Ｉ）（Ｕｒｗｉｎら、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１１４：６０５〜６１３、１９９７年）およびＧ．ｐａｌｌｉｄａからのそれの同族体（ｇｐｃｐ−Ｉ）（Ｕｒｗｉｎら、未公表であり、ｈｇｃｐ−ＩでのＧ．ｐａｌｌｉｄａのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングすることにより単離された）両方のシステイン・プロテアーゼをコード化する全長ｃＤＮＡクローンが、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおいて使用可能であった。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓシステイン・プロテアーゼ遺伝子ｇｃｐ−１（ＲａｙおよびＭｃＫｅｒｒｏｗ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５１：２３９〜２５０，１９９２）のコード領域も、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおいて使用可能であった（Ｕｒｗｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．８：１２１〜１３１、１９９５年）。ｈｇｃｔｌは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより記載されたように（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）モノクローナル抗体（Ｎ４６Ｃ１０）を用いて、ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Ｌｉｌｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．８９：１９５〜２０７、１９９７；Ｕｒｗｉｎら、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１１４，６０５〜６１３、１９９７年）をスクリーニングすることにより単離された。該抗体は、Ａｔｋｉｎｓｏｎらにより記載されたように（Ａｎｎ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｌ．１１２：４５９〜４６９、１９８８年）給餌雌Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓから抽出された総タンパク質に対してマウス中で生じた数多くの内の１つであった。約４４０塩基対の主要精子タンパク質（ＭＳＰ）のオープン・リーディング・フレーム（Ｎｏｖｉｔｓｋｉら、Ｊ．Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，５４８〜５５４、１９９３年）が、プライマー：
５’ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＴＧＧＣＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＣ３’
５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＧＴＴＧＴＡＣＴＣＣＧＡＴＣＧＧＣＡＡＧ３’
を使用して増幅され、これらは、ＲＮＡプライマー部位Ｔ３およびＴ７（下線部）をそれぞれ取り込んでいるものである。それぞれＴ３およびＴ７プロモーターからの転写を司る場合、ｈｇｃｐ−Ｉおよびｇｐｃｐ−Ｉを宿すベクターは、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで直鎖化され、ｇｃｐ−Ｉを宿すベクターは、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで直鎖化され、ｈｇｃｔｌを宿すベクターは、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩで直鎖化される。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでセンスおよびアンチセンス両方のＲＮＡ鎖を産生させるために、該Ｔ３およびＴ７プロモーターを使用する転写が、製造者（Ｍｅｇａｓｃｒｉｂｅ，Ａｍｂｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により特定されるように行われた。
【００７３】
［浸すことによるＲＮＡｉ］
寄生前のＪ２のＧ．ｐａｌｌｉｄａおよびＨ．ｇｌｙｃｉｎｅｓが、Ｕｒｗｉｎら、１９９５年により記載されたように無菌化されたシストから集められた。Ｇ．ｐａｌｌｉｄａは２０℃にて孵化され、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓは２５℃にて孵化された。これらの線虫は、ＦＩＴＣアイソマーＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ  Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）１ｍｇ／ｍＬ（ＤＭＦ中２０ｍｇ／ｍＬにて作り上げられたストック（貯蔵品））および共通して２〜５ｍｇ／ｍＬであるｄｓＲＮＡと一緒に、Ｍ９塩（４３．６ＭのＮａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．１ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＮＨ４Ｃｌ）中で作り上げられた５０ｍＭのオクトパミン中に浸された。これらの線虫は、簡便な微遠心分離により集められ、それから水でたっぷりと洗浄されて、外部からの如何なる外因性ｄｓＲＮＡをも除く前に、４時間室温にて置かれた。ＦＩＴＣの取り込みは、適切なフィルターを用いて、Ｌｅｉｃａの顕微鏡（モデルＤＭＲＢ）を使用して蛍光により観察された。画像が、該顕微鏡上に設置されたカラー（Ｋａｐｐａ  ＣＦ１５  ＭＣＣ）または白黒（ＣＯＨＵ）カメラを通して、ソフトウェア・パッケージ（Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ  ５００ｃ；Ｌｅｉｃａ，ＵＫ）を用いて撮られた。
【００７４】
［転写物の豊富さの解析］
ＦＩＴＣの取り込みによる刺激された摂食を示す寄生前のＪ２の線虫が集められ、転写物の豊富さが解析された。ポリＡ＋ＲＮＡが、QuickPrep Micro mRNA purification kit（Amersham Pharmacia, Bucks, UK）を使用して、Ｊ２の線虫から単離された。転写物の豊富さは、SMART PCR cDNA  合成技術（Clontech, Hampshire, UK）を使用する仮想のノーザン解析により決定された。簡潔には、修飾されたオリゴヌクレオチド（ｄＴ）プライマーが、第１の鎖化反応を開始し、逆転写酵素が、新たなシステイン残基をこの第１のｃＤＮＡ鎖の３’末端にて加える末端転移酵素活性を持っている。それの３’末端にポリＧ配列を有するオリゴヌクレオチド・プライマーは、そのポリＣ配列へとハイブリダイゼーションし、逆転写酵素のための更なるテンプレート（鋳型）として振る舞う。これらの３’および５’末端におけるこれらのオリゴヌクレオチド配列はその後１ｄＰＣＲにより、ｃＤＮＡを増幅させるのに使用される。該ｃＤＮＡはその後、アガロース電気泳動により、大きさにより分画され、不動化された支持体に移され、標準的なプロトコールによって（例えば、Sambrookら、１９９８年）適切に放射能標識されたＤＮＡ配列を用いてプローブされ得る。
【００７５】
［表現型の観察］
Ｊ２の線虫は、AtkinsonおよびHarris（Parasitol.  98：４７９〜４８７、１９８９年）により記載されたように、嚢中で育てられた植物を感染させるのに使用された。線虫は、感染の１４または２１日後に、それらの根から集められ、画像解析（Atkinson, H.J.ら（Journal of Nematology 28, 209-215, 1996））により研究された。雄と推定されるもの（線虫）が、ABgene kit（ABgene、Surry、UK）を使用するｒｔＰＣＲに付された。個々の線虫が、まず根材料から切開され、微小遠心管中で挽かれ、Hybaid  Recovery 増幅試薬が、製造者ら（Hybaid, Middlesex、UK）の説明書により記載されたように使用された。プライマーは、ＭＳＰの公開された配列（Novitskiら、J. Nematol、２５：５４８〜５５４、１９９３年）に対して、配列５’ａｔｇｇｃｇｃａａｃｔｔｃｔｔｃｃ３’および５’ｇｇｃｇａａｔｇｇｇｔｃｇｇｃｇｇａｔｇｇ３’を用いて設計された。同じ標準的なｒｔＰＣＲ反応中で、全てのプライマーを一緒に使用することが可能であった。
【００７６】
［実施例１］
我々は、３つの非常に異なるシスト線虫遺伝子に対して標的とされたｄｓＲＮＡ分子を送達する新たなＲＮＡｉ技術の潜在力を明らかにした。第１に我々は、システイン・プロテアーゼを標的としたが、これは、植物宿主中の導入遺伝子としての特異的なタンパク質阻害剤によるそれらの阻害が、樹立された寄生体の成長に影響を及ぼしたからである。Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｇ．ｐａｌｌｉｄａおよび成虫のＣ．ｅｌｅｇａｎｓのＪ２が、５０μｍのオクトパミンと共に、または無しで、各種（それぞれｈｇｃｐ−Ｉ、ｇｐｃｐ−Ｉ、またはｇｃｐ−Ｉ）からのシステイン・プロテアーゼに対応するｄｓＲＮＡの組み合わせと共に４時間処理され、ＦＩＴＣは取り込みのレポーターとして包含された。処理直後の転写物の相対的な豊富さは、仮想のノーザン解析によって決定された。Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓおよびＧ．ｐａｌｌｉｄａ両方が、システイン・プロテアーゼ転写物の抑制された豊富さを示したが、オクトパミンが該ｄｓＲＮＡと共に存在した場合だけであった（図２ａ）。予期されたように、該線虫はそれが浴される溶媒を容易に飲み込むので、神経液は、その効果を示すにＣ．ｅｌｅｇａｎｓに関しては要求されなかった。該ノーザン・ブロットを分解すること、およびそれをアクチン・プローブで再プローブすることは、サンプルｃＤＮＡの等しい装填を確認した（図２ｂ）。
【００７７】
［実施例２］
選択された第２の遺伝子は、未知の機能を有する新規Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ遺伝子（ｈｇｃｔｌ）であった。我々はそれを選び、未知の機能を有するどの遺伝子が正常な寄生体の発展に関して発現されなければならないかを決定するのを助けるＲＮＡｉの潜在力を明らかにする。この可能性は後に、宿主植物に挑むＲＮＡｉ処理を受けたＪ２を使用して、明らかにされる。ｈｇｃｔｌは、ｃＤＮＡ発現ライブラリーのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）スクリーニング後に、単離された。該ＭＡｂは、均一化されたＪ２の線虫の免疫原を用いたショットガン・アプローチを使用して本来得られた何百の内の１つである。ｈｇｃｔｌは、それらの急速な成長の期間、成虫の雌のシスト線虫により、最も豊富に発現される。それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現された場合機能的である、２つのＣ−型のレクチン（ｃｔｌ）ドメインを有する７７ｋＤａのタンパク質をコード化する。それの２つのレクチン・ドメインは、コブラの毒素凝集因子、マクロファージのマンノース・レセプター（受容体）、およびアグレカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）のようなプロテオグリカンの核となるタンパク質との配列相同性を提供する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、Ｃ−タイプのレクチン・ドメインを含有すると予見される、数多くの遺伝子を持っているが、いずれもｈｇｃｔｌに対する高い相同性は持っていない（Ｌｉｌｌｅｙ、印刷中）。ＲＮＡｉは、Ｊ２におけるそれの転写物の豊富さを抑制した（図２ｄ）。
【００７８】
［実施例３］
我々がＲＮＡｉに関して標的とした転写物のもう１つ別の例は、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａの主要精子タンパク質（ＭＳＰ）の５つの類似の遺伝子からのものである。それらは、数多くの理由により選ばれた。これらの雄特異的転写物に関する如何なるＲＮＡｉの効果も、雌の成長に影響を与えるべきではない。第２に、この遺伝子ファミリーは、寄生体としてのＪ２の樹立の１０日以上後に、雄の精子中でまず発現される。ＭＳＰが弱められる線虫の精子は、機能的ではなさそうである。ＭＳＰは、全精子タンパク質の１０〜１５％を含み、鞭毛を動かさないこれらの精子中の偽鞘形態中に含まれる。それは恐らくアクチンの機能を代替するが、該アクチンは、線虫の精子に、０．０２％の精子タンパク質しか寄与しない（Ｌ．Ｈｅｒｎａｕｌｔ，Ｓ．Ｗ．，１１９７  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＩＩ版、Ｒｉｄｄｌｅ  Ｄ．Ｌ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４８８−２）。最後に、ｄｓＲＮＡによる雄の無菌化は、シスト線虫のような両性植物寄生線虫のコントロールに関する潜在力を持っている。ＭＳＰ（複数）は非常に保存されたタンパク質であり、それでそれは、１つに対するＲＮＡｉの効果の実証が、全てに拡張される例を提供することを伴う。照射による雄の実験室的無菌化は、それらの放出を伴い、幾つかの昆虫のコントロールように使用される（Ｒｈｏｄｅら、１９７１年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ，６４，７０８）。
【００７９】
Ｊ２としてｄｓＲＮＡで処理された、感染後１５日（ｄｐｉ）に回収された雄の線虫の蓄えは、ＭＳＰ転写物の豊富さの抑制を示した（図２ｄ）。これ故に、ＲＮＡｉの効果は、ｄｓＲＮＡ処理数日後にまず発現されるシスト線虫遺伝子に関しては達せられ得る。このことは、Ｊ２を処理し、それから、それらが寄生体を樹立するようになった場合に発現される、それらの遺伝子を研究する潜在力を確立する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいては、ＲＮＡｉの効果は、これらの注入された線虫の子孫の全ライフ・サイクルに亘って、残り得る（ＫｕｗａｂａｒａおよびＣｏｕｌｓｏｎ，Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：３４７〜３４９、２０００年）。
【００８０】
ＲＮＡｉの引き続いての植物寄生に関する共配列が、Ｊ２段階において標的とされた３つの遺伝子それぞれに関して研究された。Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓおよびＧ．ｐａｌｌｉｄａの寄生前の幼若体が再び、刺激されて定着し、ｄｓＲＮＡに晒された。ＦＩＴＣを取り込むもののみが、それらの宿主である大豆またはジャガイモの植物体を感染させるのに使用され、以前の仕事（研究）においてと同様に、それらの成長を測定するのに使用された（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｊ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２８，２０９〜２１５，１９９６年））。シスト線虫、およびＨ．ｇｌｙｃｉｎｅｓのＣ−タイプのレクチン・ドメインタンパク質両方のシステイン・プロテアーゼのＲＮＡｉ処理が、寄生体としての引き続いての成長に関する効果を持っていた。システイン・プロテアーゼのＲＮＡｉ後、１４ｄｐｉにて確立された線虫数においては減少はなく、正常な成長速度が観察された。しかしながら、幾つかの固体の性分化は変化した。雌として成長した線虫の割合は、該システイン・プロテアーゼのＲＮＡｉ後、コントロールにおいて予期された値７５％から、５０％へと有意に（Ｐ＜０．００１）減少した（図３ａ；表１）。Ｇ．ｐａｌｌｉｄａの雌の割合も、コントロール集団における７７％から、それらのシステイン・プロテアーゼがＲＮＡｉにより標的とされた線虫に関しての５６％（Ｐ＜０．０１）へと減少した（表１）。雄は区別可能な外見を持っていたが、これは、視覚による同定を可能にし、画像解析において使用されたフィルター値が正しく線虫の性別を定めることを確かめた（図３ｂ）。加えて、ｒｔＰＣＲが使用され、個々の線虫中の主要精子タンパク質（ＭＳＰ）を検出したが、これらの線虫の内の幾つかは、図３ｂに示された線虫のような成長において進展されたようではなかった（図３ｃ）。表現型を研究するのに使用される方法の組み合わせは、線虫の性別を定めることにおいて信頼性を与えるが、絶対であるとは考えられず、成長において弱められた幾つかの雌または幼若体は、このグループに包含されることがある。システイン・プロテアーゼのＲＮＡｉを含む更なる研究において、植物から２１ｄｐｉにて回収された線虫数は、４０％の抑制（Ｐ＜０．０５）を示した（表１）。このことは、２１日まで該植物を残しておいたＲＮＡｉ処理された集団中の雄のより大きな割合を反映する。１４および２１ｄｐｉ両方にて、幼若体と同様の、システイン・プロテアーゼに対応するｄｓＲＮＡで処理された雌の大きさにおける明白な違い、およびコントロールの雌に関しての違いはなかった。しかしながら、おおよその面積の測定は、この表現型の共配列を持つ他の標的を目指したＲＮＡｉを伴って、検出されるべきこのような効果を可能にするであろう。ｈｇｃｔｌの転写物を目指したｄｓＲＮＡは、これらの線虫の性別の成長に影響を及ぼさなかった。
【００８１】
しかしながら、１４ｄｐｉにて、ＲＮＡｉにより標的とされた４１％未満の線虫（Ｐ＜０．０１）が。コントロールと比べられて、植物から回収された（表１）。このことは、前記Ｃ−タイプ・レクチン・ドメインのＲＮＡｉ処理が、システイン・プロテアーゼに比較して、侵入または樹立の過程においてより早くに上手くいった寄生を弱めることを示唆するであろう。これらの結果は、ＲＮＡｉが、異なる遺伝子の阻害から生じる上手くいった寄生に関して、異なる共配列間で区別可能なことを確立する。ＭＳＰのＲＮＡｉによる標的化は、寄生体の成長または性分化に影響を持たなかった（表１）。予期されたように、ＭＳＰに標的化されたＲＮＡｉが、寄生体の成虫への成長に影響を及ぼす証拠はないが、主要精子タンパク質の消失は、雄の稔性を弱めるであろう。ＭＳＰは、全精子タンパク質の１０〜１５％を含み、これらの鞭毛を動かさない精子中の偽鞘形態中に含まれる。それは恐らくアクチンの機能を代替するが、該アクチンは、線虫精子に、０．０２％の精子タンパク質しか寄与を与えない（Ｌ．Ｈｅｒｎａｕｌｔ，Ｓ．Ｗ．，１１９７  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１  Ｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｉｎ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＩＩ版、Ｒｉｄｄｌｅ  Ｄ．Ｌ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−４８８−２）。
【００８２】
【表１】
2005512543.tif 000003
【００８３】
［実施例４（もしこれが包含される場合は、後の例はｎ＋１である）］
［レクチンも表面上にあるようだが、該レクチンの更なる特徴付けを加えることに価値はあるか。］
Ｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションが、ｄｅＢｏｅｒら、１９９８年（Ｊ．Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３０，３０９〜３１２）に記載されたように、１本鎖ＤＮＡプローブを使用して行われ、Ｈｇ−ｃｔｌ−１発現の部位を決定した。Ｊ３、Ｊ４、および成虫の雌の段階が、該ｔｇ−ｃｔｌ−１遺伝子の２９１塩基対の領域（図７中の９４２番残基〜１２３３番残基）に特異的なアンチセンス・プローブで処理された場合に、強いハイブリダイゼーションのシグナルが観測された。対照的に、ハイブリダイゼーションは、線虫の体の殆どに亘って明らかであったが、その根および首部分には一貫してなかった。これらの線虫の切開は、染色が体の外側壁層に制限され、その再生系または腸組織中には存在しないことを明らかにした。染色のモザイク様のパターンは、図１４中で分かるように、その体の壁内で、時々見えることがあった。この観察された遺伝子発現のパターンは、Ｈｇ−ｃｔｌ−１が、該線虫の表面コーティングへ分泌されることを示唆する。それは、その体の表面領域において最も豊富に発現され、これは、嚢状の雌における体の輪郭の急速な拡大を示す。それは、このような拡大がより限定されるその首または陰部においては豊富に発現されない。成虫の雌におけるそれのより低い豊富さは、それが、その根の表面に晒された場合に、該雌の保護において、主要な役割を演じていないことを示唆する。
【００８４】
［実施例４］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｄｕｏｘ−１およびｄｕｏｘ−２の２つの２重の酸化酵素遺伝子は、そのヌクレオチド配列のレベルにおいて、８８．８％同一である。領域をコード化するＮ−末端過酸化酵素およびＣ−末端ＮＡＤＰＨ酸化酵素からの保存された領域が、ＲＮＡｉ給餌実験において使用され、Ｅｄｅｎｓ，Ｗ．Ａ．らの結果（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５４，８７９〜８９１，２００１年）を確かめた。線虫の大多数（＞９５％）は１つ以上の大きな膨潤を示し、殆ど（＞８５％）がずんぐりした外見を有していた（図９）。その後方末端はしばしば、産み付けられなかった卵で膨隆され、ずんぐりとした表現型は、卵を全然放出しなかった。放出された卵の内、広範な大多数（＞９５％）が、孵化に失敗した。優先的に、これらの線虫は相対的に動かなかったか、または麻痺を示した。準定量的なＲＴ−ＰＣＲは、コントロール・サンプルに比べて、より低いレベルの処理されたｄｕｏｘ転写物を明らかにする（図９）。世界規模の発現研究が、胚新生の間および３６時間でのｄｕｏｘ遺伝子の環状となった発現を明らかにしているが、これは、新たなクチクラの形成における役割と一致している。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｄｕｏｘに関する高度に分断されたＲＮＡｉ表現型は、我々を植物線虫における同族体を求める探索に導いた。
【００８５】
該Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｄｕｏｘ１からのＮ−およびＣ−末端混合プローブを使用して、我々は、Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、７２３塩基対の挿入物を有するクローンを同定したが、これは、ｄｕｏｘ１のＮ−末端過酸化酵素ドメインの一部に対して、６５％のヌクレオチド配列相同性を示した。該ｃＤＮＡライブラリーからの引き続いてのＰＣＲ増幅は、配列長を１２８５塩基対へと拡張した。この領域が過酸化酵素よりもむしろｄｕｏｘ由来であることは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＤＵＯＸ１および推定のＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａのＤＵＯＸ同族体間のアミノ酸配列相同性により支持され、後者は、他のＣ．ｅｌｅｇａｎｓのヘム過酸化酵素と３０％の同一性しか有さずに６７％比較された（図１０）。サザン・ブロット解析が、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａにおける３つのｄｕｏｘ関連遺伝子の同様の存在を明らかにした。
【００８６】
［実施例５］
我々は、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａの推定のｄｕｏｘ遺伝子の６２９塩基対の領域を使用して、一連のＲＮＡｉ実験を行った。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの給餌により観察されたＲＮＡｉ表現型はなかったが、このことは、６５％のヌクレオチド同一性が、ＲＮＡｉの応答を明確にするに不充分であることを示唆している。実験がその後、ｄｓＲＮＡ、ＦＩＴＣ、および１０ｍＭのオクトパミンの種々の組み合わせを含有する溶液中に置かれたＪ２段階のＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａを用いて行われ、４時間インキュベートされた。ＦＩＴＣの取り込みが、それらの長さに添ってしばしば分布される有意な蛍光を示す線虫の大多数（＞９５％）を用いると、オクトパミンの存在下にのみ観測された（図１１）。この効率的な染料の取り込みは、該染料の存在が更なる研究のために線虫の選択を可能にする場合、〜シスト線虫に関して観測された限られた取り込みと対照をなす。根瘤線虫は、影響を受けた線虫を選択する必要性を取り除くこの効率的な取り込みのために、ＲＮＡｉ研究用のより良い標的を提供することがある。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓとのアナロジーによる、ｄｓＲＮＡの更なる分布は、全身のＲＮＡｉへと至る効率的な増幅応答を明確にすると予期されるであろう。
【００８７】
ｄｓＲＮＡ処理後、準定量的ＲＴ−ＰＣＲが使用され、コントロールおよびｄｓＲＮＡ処理サンプルにおけるｄｕｏｘ転写物の相対レベルを解析した。ｍＲＮＡの該レベルはＣ．ｅｌｅｇａｎｓに関して以前に示されたように、Ｊ２で処理されたコントロールと比較すると、ｄｕｏｘ処理されたものにおいて、有意により低かった（図１１）。線虫は、土を用いない嚢系において小豆（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ａｎｇｕｌａｒｉｓｉｎ）を感染させるためにも使用され、該系は、感染のレベルおよび共時態がコントロールされること、および該感染部位が容易にモニターされ、引き続き解剖されることを可能にした。使用される該系は図１２に示され、実施例３における大豆またはジャガイモの植物体を用いて、嚢線虫に関しても使用された。
【００８８】
１４ｄｐｉにおける解析に関しては、根は、コントロールまたはｄｕｏｘのｄｓＲＮＡ処理されたＪ２のＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａで感染させられた。ゴールの数が数えられ、該感染レベルを決定し、このことは、コントロールおよび試験サンプルに関して同じであり、これらは、ｄｕｏｘがその転移または感染の過程中に含まれることを指し示す。根は酸性フクシンで染色されて、線虫を検出する。１４日までに、樹立された線虫の数は、コントロール処理に関しては有意に４１３異なったが、該ｄｕｏｘ−ｄｓＲＮＡ処理に関しては１６５だけ異なり、６０％の抑制であった。線虫のこの抑えられた数は、成長することの失敗から結果得られた成熟前の死、またはその後その根を残す雄の数における増加よるものであり得るであろうが、嚢線虫に関して観察された用に１２、雄は１４日にまだ存在しているべきである。
【００８９】
画像解析が使用され、各処理からの５５匹のランダムに切開された線虫に関して、丸み（Ｒ）、面積（Ａ）、および長さ（Ｌ）を測定した（表２）。我々は以前に、長さに対する丸みの比が、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａの、３つの形態学的分類、紡錘形（Ｊ２、Ｊ３、Ｊ４、雄）、嚢状の雌、および卵を孕んでいる雌への分類を可能にすることを示した（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２８，２０９〜２１５，１９９６）。このような測定は、前記集団内の線虫の、相対的な成長速度および成長段階に関する情報を提供する。Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａの個体のＲおよびＬに関するフィルター値は、該集団を３つのクラス；紡錘形（Ｊ２、Ｊ３、Ｊ４、および雄）Ｒ＞３．０６およびＬ＜４２２μｍ；嚢状（若い雌）Ｒ＜３．０６およびＬ＜４２２μｍ；大きくなった嚢状（卵を孕んでいる雌）Ｒ＜３．０６μｍおよびＬ＞４２２μｍ２５（Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２８，２０９〜２１５，１９９６）へと分けることに適用され得る。コントロール処理（黒４角）およびｄｕｏｘのｄｓＲＮＡ処理（白丸）線虫両方からの５５の個体に関するデーターが、図１３に示される。紡錘形および嚢状の雌の数は、該コントロールに関してよりも、このｄｕｏｘ−ｄｓＲＮＡ処理された集団に関しての方が、有意により高いが、一方、大きくなった雌の数は、このｄｓＲＮＡ処理された集団よりも、該コントロールにおける方が、有意により大きかった（表２）。Ｃｈｉ平方解析は、これら２つの処理間で、これらの３つのカテゴリーの線虫の集団における、非常に高度に有意な違いを明らかにするものである（Ｐ＜０．００１）。加えて、感染後１４日の線虫の大きさは、抑制された成長速度を確立するＲＮＡｉ処理後、遙かにより小さかった（表２）。
【００９０】
【表２】
2005512543.tif 000004
【００９１】
３５ｄｐｉにおける解析に関しては、根が、コントロールまたはｄｕｏｘのｄｓＲＮＡ処理されたＪ２のＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａで感染させられた。この３５ｄｐｉの解析は、表２に示されるように、酸性フクシンによる染色後の線虫数、およびその卵を数えることを含んでいた。該根中のコントロール処理線虫数（３１２）は、ｄｕｏｘのｄｓＲＮＡ処理線虫に関するものよりも（１２６）２．５倍大きいままであり、このことは、線虫数におけるこの６０％の抑制が、この実験の期間を通して維持されることを指し示した。各処理につき１０匹が解析された場合は、これら２つの処理間で、１匹の雌についての卵の平均数において、実質的な違いがあり、該コントロールに関しては、１匹の雌につき６７６±５０個であり、このｄｕｏｘのＲＮＡｉサンプルに関しては、１匹の雌につき５１４±４８個であった。
【００９２】
［実施例６］
雌の数および１匹の雌についての平均数から決定された卵の数は、再産生の成功についての重要な測定法を提供する。該処理母集団からの６４，７６４個の卵と比較された該コントロール母集団からの２１０，９１２個の卵の値の間での違いは、産生された卵における７０％の抑制を表す。この値は、線虫の給餌を遮るための、植物の根の内でのファイト（フィト）シスタチンの遺伝子導入発現により達成される、７０％のフィールド・レジスタンスのレベル（Ｕｒｗｉｎら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ８，９５〜１０１）と比較され得る。個々で現される該ｄｕｏｘのＲＮＡｉの効果は、それがｄｓＲＮＡでの感染処理の単一の４時間前から生じるに連れ、はるかにより劇的になるが、それは３５日後に測定可能な共配列を持つ応答を明確にする。サブセットの線虫が以下のＲＮＡｉ処理後に成長し続けるが、一般にはより小さくてより少数の卵を持つという観察は、早期の遮られたＲＮＡｉの効果と一貫するものである。このことは、成長を捕捉すること、大多数の線虫が更に成長出来ないこと、または雄の形成に至ることがあるが、その後、該ＲＮＡｉ効果が減少するに連れ、これらの残りの線虫に関しては、捕捉から解放することがある。これらの線虫はその後、該コントロール処理に関して見られるように、大きさにおいて増大する能力があり、および同数の卵を産生することがあるが、それらは、該コントロールの線虫と比較して、有意に遅れるであろう。この仮定は、植物からの、摂食の間の線虫の適切なｄｓＲＮＡ分子への曝露が、線虫の成長に関する、潜在的に充分な抵抗へと至る延長された効果を媒介するはずであることを示唆する。
【００９３】
ＤｕｏｘのＲＮＡｉの分子共配列は、決定されたままであるが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからの証拠は、該効果が正常なクチクラ生合成に関するものであるらしいことを示唆する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに関するＲＮＡｉ効果は、欠陥コラーゲンおよびクチクラ生合成に至る遺伝子の欠損と比較可能な表現型を与える。この仮定は、Ｅｄｅｎｓら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５４，８７９〜８９１，２００１）により実質化されたが、ＥｄｅｎらはＥＭを使用し、その皮層および基底層間に壊れて膨隆した柱状物を包含する該クチクラの異常性を解明し、これらの層の分離およびその液腔の拡大は、膨潤を生じた。加えて、彼らは、野生型およびＲＮＡｉのＣ．ｅｌｅｇａｎｓの酸加水分解物のＨＰＬＣを使用して、野生型にはあるが、該ＲＮＡｉ線虫にはない、ジ−およびトリチロシンの存在を実証した。その過酸化酵素ドメインが、過酸化酵素活性およびチロシンエチルエステルを架橋させる能力を表示するという証拠も表された。これらの観察は、クチクラ生合成におけるＤＵＯＸに関する役割と一貫するものであり、これは、先だっての各脱皮だけでなく、根瘤線虫においても非常に重要な過程であるが、再産生の成功に関して決定的な雌体の急速な拡大も可能にする。
【００９４】
この研究は、植物寄生線虫におけるＲＮＡｉ研究が、遺伝子情報に関する重要な情報を提供することを確実にする。我々の結果は、Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ中のｄｕｏｘの重要性を実証し、これはおそらくＥＣＭの成長に関し、および、遺伝子導入耐性戦略の開発用の潜在的な標的としてこれらの遺伝子を同定するものである。特に我々は、単回の感染前ｄｓＲＮＡ処理が結果的にＲＮＡｉ効果をもたらすことを示し、その線虫の成長に関する共配列は、処理後３５日における卵の数における７０％の抑制として観察される。
【００９５】
外来タンパク質の産生なしに線虫のＥＣＭ過程を標的とする高度に選択的なｄｓＲＮＡ分子の使用は、ペストのコントロールへのＧＭアプローチの批判に対してより許容可能になることがある。植物細胞から給餌線虫へのｄｓＲＮＡ分子の送達に関する潜在力を調査することは、重要であろう。植物は、約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ（複数）へと分解されたｄｓＲＮＡを有する線虫中のＲＮＡｉと同様に操作される、遺伝子の転写後の沈黙化を表示する。このことは、正常な遺伝子制御に関するメカニズムと同様、ウィルスに対する天然の防御戦略を表すように思われる。植物構成は生成されて、植物内の遺伝子機能を発揮する沈黙遺伝子へのｄｓＲＮＡ分子の発現を可能にする。線虫のコントロールは、ＲＮＡｉ応答を明確にする引き続いての加工用の、それが該線虫による取り込み用の、該植物細胞中での長いｄｓＲＮＡの産生を要求することがあるので、更なる挑戦を表す。ｓｉＲＮＡを包含する異なるｄｓＲＮＡ構築物の効率は、線虫を標的としたｄｓＲＮＡの植物細胞加工を克服することが必要かどうかを決定するために発揮されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、ＦＩＴＣの摂食を示す蛍光顕微鏡写真を例示する。１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ中に浸した後の、（ａ）Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのｐｈａｒａｎｇｅａｌ管（ｐｌ）中のＦＩＴＣ。１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣおよび１０ｍＭのオクトパミンに浸した後の、（ｂ）Ｇ．ｐａｌｌｉｄａの針状管中のＦＩＴＣ；ｍ、開口部；ｓｌ、針状管；ｓｋ、該針状物のコブ部分の管、（ｃ）Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓのｐｈａｒａｎｇｅａｌ管（ｐｌ）中のＦＩＴＣ；ｄｐｇ、背面のｐｈａｒａｎｇｅａｌ腺の管。（ｄ）排泄／分泌管（ｅｓｄ）の長さでのＦＩＴＣ；挿絵；該排泄／分泌管の開口部。線虫がＦＩＴＣのみで処理された場合、これらの構造物中に蛍光は現れなかった。バーは２０μｍを表す。
【図２】図２は、転写物の豊富さの仮想ノーザン解析である。浸した直後の、寄生前幼若体中の（ａ）システイン・プロテアーゼ、（ｂ）アクチン、（ｃ）ｈｇｃｔｌ転写物の豊富さ。（ｄ）植物を感染させるのに使用される前の幼若体の場合の、ｄｓＲＮＡでまず処理された雄中のＭＳＰの豊富さ。ｏｃｔは、オクトパミンの存在を指し示す；ＲＮＡは、この浸した溶液中のｄｓＲＮＡの存在を指し示す。
【図３】図３は、Ｈ．ｇｌｙｃｉｎｅｓの成長および性別による二型性を示す。（ａ）丸みに関するフィルター値（Ｒ）は、嚢状であるための条件が達成されるに連れ１へと減少する（視野径２）／（４×π×面積）の形状特徴であり、長さ（Ｌ）は、Ｊ４〜成虫の雌では（Ｒ＜２；Ｌ＞４６９μｍ）および他の段階（Ｒ＞２；Ｌ≦４６９μｍ）にて識別するための基盤を提供する。１４日にて、２群が明らかとなり、（ｉ）拡大された嚢状の線虫、典型的には摂食している大きな雌、（ｉｉ）成長面で弱体化される雌、性分化の段階に到達していないＪ２の線虫、および雄を包含してもよい、紡錘形の線虫。これらの２群の割合は、システイン・プロテアーゼのＲＮＡｉ後に代わる（他のＲＮＡｉ処理の簡潔な比較に関しては、表１参照）。（ｂ）紡錘形のＨ．ｇｌｙｃｉｎｅｓ（Ｒ＞２；Ｌ≦４６９μｍ）の視覚的な同定は、ほぼ全てが、雄を指し示すＪ３クチクラの内側に、虫状形状を持つことを示した。残りの線虫は、成長面でより発達しなかったが、雄であることを示唆する正規のクチクラ形状を持っていた。バー＝２０μＭ。（ｃ）ｒｔＰＣＲを使用した、個々の線虫からのＭＳＰの増幅の例。レーン１、ｐｓｔＩで制限されたλＤＮＡ；レーン２、紡錘形の線虫、視覚的には成虫した雄；レーン３、虫状形状の視覚的な徴候はなかったが。雄のようなクチクラ形状である；レーン４、雄とはより区別出来ないクチクラ形状。ＭＳＰの予見された大きさのバンドが、レーン２および３において現れていたが、レーン４には現れていなかった。アクチン（約２ｋｂ）に対応する正規の大きさの断片の増幅は、全サンプルにおいて増幅され、このＰＣＲ反応が成功であったことを指し示した。より成長していない雄は、ＭＳＰの代表的なＰＣＲ断片を提供しないことがあるであろうということが、述べられるべきである。
【図４】図４は、ｄｕｏｘ１のＤＮＡ配列である。
【図５】図５は、ｄｕｏｘ２のＤＮＡ配列である。
【図６】図６は、システイン・プロテアーゼのＤＮＡ配列である。
【図７】図７は、ｈｇｃｔｌ遺伝子のＤＮＡ配列である。ｉｎ  ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーション用のプローブを生成するのに使用されるプライマーは、太字体で下線を施されている。
【図８】図８ａは、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓの主要精子タンパク質遺伝子ｍｓｐ−１のヌクレオチド配列であり；図８ｂは、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓの主要精子タンパク質遺伝子ｍｓｐ−２のヌクレオチド配列であり；図８ｃは、Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓの主要精子タンパク質遺伝子ｍｓｐ−３のヌクレオチド配列である。
【図９】図９は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｄｕｏｘに関するＲＮＡｉ表現型を例示する。（Ａ）コントロールの線虫；（Ｂ）大きな膨潤を示すごく普通の表現型；（Ｃ）ずんぐりとして膨潤した表現型；（Ｄ）下層の真皮へのクチクラの関係の殆ど完全な欠損を示す、非常に膨潤した表現型。膨潤面積は、矢印により指し示される；（Ｅ）ＲＮＡｉ処理された（Ｔ）およびコントロール（Ｃ）のＣ．ｅｌｅｇａｎｓＬ２’から単離され、適切な溶液中で４時間インキュベートされたｍＲＮＡを使用する、該ｄｕｏｘのＲＴ−ＰＣＲ解析。サンプルは、１５、２０、２５および３０サイクル後に該ＰＣＲから除去された。ＲＮＡｉにより媒介される抑制された遺伝子発現を指し示すｄｓＲＮＡ処理サンプルよりも、該コントロールにおいて、より大きな増幅がある。非処理線虫から単離されたｍＲＮＡからのコントロールの増幅が、（Ｕ）に示される。
【図１０】無脊椎動物の２重の酸化酵素のアミノ酸配列のＮ−末端過酸化酵素ドメインのＣｌｕｓｔａｌＷ配列。Ｃｅ１およびＣｅ２はそれぞれ、C.elegans DUOX1（Genbank AAF71303）およびＤＵＯＸ２（Genbank  ＮＰ＿４９０６８４）、Ｍｉは、Meloidogyne incognita（この仕事）、Ａｇは、Anopheles  gambiae（Genbank EAA13921）、Ｄｍは、Drosophila melanogaster（Genbank AAF51201）。全ての配列中の保存されている残基は、  により示され、類似の残基は：により示され、一方、これら３つの線虫の配列間で保存されている残基は、  により示される。
【図１１】非給餌Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａのＪ２によるＲＮＡｉ取り込み。ＦＩＴＣが、このインキュベート溶液からの材料の取り込みを知らせるのに使用された。（Ａ）ＦＩＴＣの取り込みは、オクトパミンの非存在下では観測されず、（Ｂ）１０ｍＭのオクトパミンの存在下では、ＦＩＴＣの効率的な取り込みが観測され、（Ｃ）幾つかの場合では、非常に増強されたＦＩＴＣの蛍光が、該線虫の消化物および排泄系全般に亘って観測可能である。（Ｄ）ＲＮＡｉ処理された（Ｔ）およびコントロール（Ｃ）のＭ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａのＪ２から単離され、適切な溶液中で４時間インキュベートされたｍＲＮＡを使用する、該ｄｕｏｘ過酸化酵素のＲＴ−ＰＣＲ解析。サンプルは、１５、２０、２５および３０サイクル後に該ＰＣＲから除去された。ＲＮＡｉにより媒介される抑制された遺伝子発現を指し示すｄｓＲＮＡ処理サンプルよりも、該コントロールにおいて、より大きな増幅がある。非処理線虫から単離されたｍＲＮＡからのコントロールの増幅が、（Ｕ）に示される。
【図１２】小豆感染実験用に使用される嚢系の例示。（Ａ）２つの植物を含有する単一の嚢。（Ｂ）濾紙により指し示される感染地点で感染した根の拡大図。（Ｃ）ポリスチレンにより分離され、水を含有するトレイ中にある一連の嚢。
【図１３】Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａの大きさおよび成長段階を示すプロット。該濾紙の長さおよび丸みは、水平および鉛直の線により指し示され、３つのクラス（分類）、紡錘形（右下４分円）、嚢状の雌（左下４分円）、および大きくなった嚢状の雌（左上４分円）内の個々の線虫の帰属を可能にする。該コントロール処理用に、５５匹の個々の線虫が測定されたが、これらはシンボル（  ）により表され、同様に、該ＲＮＡｉ処理からの５５匹の個々の線虫が測定されたが、これらはシンボル（  ）により表される。代表的な線虫は、スケールに対しても示され、これら３つのクラスの形および大きさにおける違いを指し示す。
【図１４】染色パターンを示す、成虫の雌のＨ．ｇｌｙｃｉｎｅｓへのｈｇ−ｃｔｌ−１プローブのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。染色は、「もし前記実施例を包含する場合」、損傷を受けた体壁を通じて突き出す再産生系中には現れない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005512543.tif 000013
【図１０】
2005512543.tif 000014
【図１１】
2005512543.tif 000015
【図１２】
2005512543.tif 000016
【図１３】
2005512543.tif 000017
【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月28日(2003.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現カセットを含む核酸分子でトランスフェクションされた遺伝子導入植物細胞であって、該カセットは、少なくとも一部の線虫遺伝子をコード化する核酸配列を含み、該カセットは、センスおよびアンチセンス両方の核酸分子が転写されるように適応され、ここで該センスおよびアンチセンス核酸分子は、ハイブリダイゼーションして抗線虫活性を持つ２本鎖阻害ＲＮＡ分子を形成する、細胞。
【請求項２】
請求項１に記載の細胞であって、前記核酸分子が：
ｉ）図４、５、６、７、８ａ、８ｂまたは８ｃ中の配列により表される核酸配列；
ｉｉ）該配列（ｉ）へとハイブリダイゼーションし、抗線虫活性を持つ核酸配列；
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）中の配列に対する遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、細胞。
【請求項３】
前記カセットが、該カセットからセンスおよびアンチセンス核酸分子を転写する少なくとも２つのプロモーター配列の準備(provision)により適用される、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
前記カセットが核酸分子を含み、ここで該分子が第２部分に結合された第１部分を含み、ここで該第１および第２部分は、それらの配列の少なくとも一部に亘って相補的であり、更にここで該核酸分子の転写が、該第１および第２部分の相補的な塩基対形成により、２本鎖領域を形成するＲＮＡ分子を産生する、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項５】
前記第１および第２部分が、少なくとも１ヌクレオチド塩基により結合される、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記第１および第２部分が、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド塩基により結合される、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記リンカー(linker)が、少なくとも１０ヌクレオチド塩基である、請求項４に記載の細胞。
【請求項８】
前記カセットがベクターの一部である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
２本鎖阻害ＲＮＡ分子であって、ここで該ＲＮＡ分子が：
ｉ）図４、５、６、７、８ａ、８ｂまたは８ｃ中の配列により表される核酸配列；
ｉｉ）この（ｉ）中の配列へとハイブリダイゼーションし、抗線虫活性を持つ核酸配列；
ｉｉｉ）これら（ｉ）および（ｉｉ）中の配列に対する遺伝子コードの共配列として変性した核酸配列
からなる群から選択される核酸配列を含む、ＲＮＡ分子。
【請求項１０】
請求項９に記載のＲＮＡ分子であって、該分子の長さが１０ヌクレオチド塩基（ｎｂ）〜１０００ｎｂである、ＲＮＡ分子。
【国際調査報告】
2005512543.tif 000019
2005512543.tif 000020
2005512543.tif 000021
2005512543.tif 000022
2005512543.tif 000023
2005512543.tif 000024