(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は１つ以上のバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４遺伝子の分析により、結腸細胞増殖性疾患を検出、区別または識別するための方法および核酸を提供する。本発明はさらに、前記遺伝子の細胞増殖性疾患特異的分析に有用な新規な核酸配列ならびにその方法、アッセイおよびキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６〜配列番号２５を含む群から選択される配列およびそれらに相補的な配列の１つである化学的に前処理されたゲノムＤＮＡのセグメントの長さが少なくとも１８塩基である配列を含む核酸。
【請求項２】
オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーであって、配列番号６〜２５に記載される前処理されたゲノムＤＮＡまたはそれらに相補的な配列に相補的であるか、または適度に厳密なまたは厳密な条件下でハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも１つの塩基配列を含むオリゴマー。
【請求項３】
塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む、請求項２に記載されるオリゴマー。
【請求項４】
ＣｐＧのシトシンまたはＴｐＧのチミンまたはＣｐＡジヌクレオチドのアデノシンがオリゴマーのほぼ中３分の１に位置することを特徴とする、請求項３に記載されるオリゴマー。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の少なくとも２つのオリゴマーを含む、オリゴマーのセット。
【請求項６】
配列番号６〜配列番号２５の１つのＤＮＡ配列およびそれらに相補的な配列の増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチドとして使用され得る、請求項２〜５に記載される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項７】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固相に結合されていることを特徴とする、請求項２〜５に記載されるオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項８】
配列番号１〜配列番号５に記載される配列の１つまたはそれらに相補的な配列内のシトシンメチル化状態および／または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出ための請求項５〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも４つを含むオリゴマープローブセットの使用。
【請求項９】
配列番号１〜配列番号５の１つおよびこれらに相補的な配列のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態に関連した結腸細胞増殖疾病を分析するための担体物質に固定化された異なったオリゴマーの配列（アレイ）を製造する方法であって、請求項２〜５および７のいずれか１項に記載される少なくとも１つのオリゴマーが固相に結合されている方法。
【請求項１０】
請求項７で得られうる異なったオリゴマーの配列（アレイ）。
【請求項１１】
四角形または六角形の格子形態の固相上に配列されることを特徴とする、請求項１０に記載される異なったオリゴヌクレオチド−および／またはＰＮＡ−オリゴマー配列のアレイ。
【請求項１２】
固相表面がシリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から構成されることを特徴とする、請求項１０または１１に記載されるアレイ。
【請求項１３】
被験者のバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４を含む群から得た少なくとも１つの遺伝子および／またはその制御領域に関連する結腸細胞増殖性疾患を検出、区別または識別する方法であって、被験者から得た生体試料中の標的核酸を、標的核酸中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを識別する少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させることを含む方法。
【請求項１４】
ａ）被験者のゲノムＤＮＡを有する生体試料を被験者から得て；
ｂ）ゲノムＤＮＡまたはその断片を１つ以上の試薬で処理して、５−位非メチル化シトシン塩基をウラシルあるいはハイブリダイゼーション特性面からシトシンと異なって検出可能な他の塩基に変換し；
ｃ）処理されたゲノムＤＮＡまたは処理されたその断片を、各ケースにおいて配列番号６〜配列番号２５からなる群から選択された配列に相補的であるか、あるいは適度に厳密なまたは厳密な条件下でハイブリダイズする、長さが少なくとも１６ヌクレオチドである近接した配列またはその相補体を含む少なくとも２つのプライマーおよび増幅酵素と接触させ、処理されたＤＮＡまたはその断片は増幅されて１つ以上の増幅産物を生成するか、あるいは増幅されず；そして
ｄ）前記増幅産物の存否に基づくか、あるいは増幅産物の性質に基づいて、配列番号１〜配列番号５の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、あるいは配列番号１〜配列番号５の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態または平均的メチル化状態を反映する値を測定し、結腸細胞増殖性疾患の検出または識別のうちの少なくとも１つを部分的に可能とする
ことを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）被験者のゲノムＤＮＡを有する生体試料を被験者から得て；
ｂ）ゲノムＤＮＡまたはその断片を１つ以上の試薬で処理して、５−位非メチル化シトシン塩基をウラシルあるいはハイブリダイゼーション特性面からシトシンと異なって検出可能な他の塩基に変換し；
ｃ）処理されたＤＮＡの１つ以上の断片を、結腸または結腸細胞増殖性疾患細胞に由来するＤＮＡが唯一または優先的に増幅されるように増幅させ；
ｄ）増幅産物またはその特性を検出し、それにより結腸細胞増殖性疾患の有無を検出する
工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記結腸細胞増殖性疾患は、腺癌、ポリープ、扁平上皮細胞癌、カルチノイド腫瘍、肉腫およびリンパ腫を含む群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載される方法。
【請求項１７】
工程ａ）で、被験者から得た生体試料は組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、糞便、血液、血清、血漿、尿、痰およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載される方法。
【請求項１８】
ゲノムＤＮＡまたはその断片を処理する工程ｂ）は、重亜硫酸塩溶液を使用することを含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載される方法。
【請求項１９】
ｂ）の処理の後、アガロース中にＤＮＡを包埋する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載される方法。
【請求項２０】
ゲノムＤＮＡを処理する工程ｂ）は、ＤＮＡ変性剤または遊離基捕捉剤の少なくとも１つの存在下で処理することを含む、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載される方法。
【請求項２１】
工程ｃ）で接触または増幅することは、
増幅酵素である耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用；
５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼの使用；
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用；
検出可能な標識を有する増幅産物核酸分子の産生；および
これらの組合せを含む、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載される方法。
【請求項２２】
検出可能な増幅産物標識は、
蛍光標識；放射性核種または放射性標識；質量分析計で検出可能な増幅産物質量標識；質量分析計で検出可能な分離できる増幅産物断片質量標識；質量分析計で検出可能な１価正または１価負正味荷電を有する分離できる増幅産物断片質量標識からなる標識群から選択される、請求項２１に記載される方法。
【請求項２３】
工程ｄ）で増幅産物または分離できる増幅産物断片の質量標識を検出するための質量分析計の使用を含む、請求項２２に記載される方法。
【請求項２４】
前記方法の工程ｃ）で、２つ以上の異なった断片が増幅される、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載される方法。
【請求項２５】
１つ以上の前記プライマーが配列番号３４〜配列番号４９、９６、９７、１０１、１０２、１０６および１０７の群から選択される配列を含む、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載される方法。
【請求項２６】
１つ以上の前記プライマーは、１つ以上のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載される方法。
【請求項２７】
前記プライマーが２〜５個のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む、請求項２６に記載される方法。
【請求項２８】
１つ以上の前記ＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドがプライマーの３'半分内に位置する、請求項２６または２７に記載される方法。
【請求項２９】
前記プライマーは請求項１４の工程ｂ）または請求項１５の工程ｃ）の処理で変換された位置にハイブリダイズする１つ以上の塩基を含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載される方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの前記塩基がプライマーの３'半分内に位置する、請求項２９に記載される方法。
【請求項３１】
工程ｄ）で得られた前記増幅産物は、３個以上のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む少なくとも１つの２０塩基対配列を含む、請求項１４〜３０のいずれか１項に記載される方法。
【請求項３２】
さらに、１つ以上のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む長さが少なくとも１８塩基対である、少なくとも１つの核酸分子またはペプチド核酸分子の工程ｃ）における使用を含み、前記分子配列は配列番号６〜配列番号２５からなる群から選択された配列およびその相補体と相補的であるかまたは同一であり、かつ、前記核酸分子またはペプチド核酸分子は、それがハイブリダイズした核酸の増幅を抑制する、請求項１４〜３１のいずれか１項に記載される方法。
【請求項３３】
前記核酸またはペプチド核酸の配列は、配列番号８５〜配列番号８７、９８、１０３および１０８およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される、請求項３２に記載される方法。
【請求項３４】
工程ｂ）の処理前に非メチル化されていたＤＮＡの増幅が抑制される、請求項３２に記載される方法。
【請求項３５】
前記核酸分子またはペプチド核酸分子は、各ケースにおいてその５'−末端で変性されて、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素によって分解を阻止する、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載される方法。
【請求項３６】
前記核酸分子またはペプチド核酸分子は、各ケースにおいて３'ヒドロキシル基を欠く、請求項３２〜３５のいずれか１項に記載される方法。
【請求項３７】
増幅酵素は、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼである、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載される方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーの結合部位は、プライマーの結合部位と同じであるか、あるいは重複し、それによって、その結合部位へのプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載される方法。
【請求項３９】
少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーの結合部位は、少なくとも２つのプライマーの結合部位と同じであるか、あるいは重複し、それによってそれらの結合部位へのプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる、請求項３２〜３８のいずれか１項に記載される方法。
【請求項４０】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸オリゴマーのハイブリダイゼーションは、フォワードプライマーのハイブリダイゼーションを妨げ、かつ、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸オリゴマーのハイブリダイゼーションは前記フォワードプライマーの伸長産物に結合するリバースプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる、請求項３９に記載される方法。
【請求項４１】
前記オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸オリゴマーは、フォワードおよびリバースプライマーの結合部位間でハイブリダイズする、請求項３２〜３８のいずれか１項に記載される方法。
【請求項４２】
工程ｄ）で測定することは、各ケースにおいて１つ以上のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む長さが少なくとも９ヌクレオチドの近接した配列を含む、少なくとも１つの核酸分子またはペプチド核酸分子のハイブリダイゼーションを含み、かつ前記分子の配列は配列番号６〜配列番号２５からなる群から選択された配列と相補的であるか、あるいは同一である、請求項１４または１５に記載される方法。
【請求項４３】
このようにハイブリダイズする少なくとも１つの核酸分子またはペプチド核酸分子は、固相に結合されている、請求項４２に記載される方法。
【請求項４４】
このようにハイブリダイズする複数の核酸分子またはペプチド核酸分子は、線状、六角形、四角形およびこれらの組合せからなるアレイ群から選択された核酸またはペプチド核酸アレイ形態の固相に結合される、請求項４３に記載される方法。
【請求項４５】
工程ｄ）で測定することは、増幅産物の配列決定を含む、請求項１４または１５に記載される方法。
【請求項４６】
工程ｄ）で測定することは、配列番号６〜配列番号２５からなる群から選択された配列およびその相補体に相補的であるか、あるいは適度に厳密なまたは厳密な条件下にハイブリダイズする長さが少なくとも９ヌクレオチドである近接した配列を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズさせることを含む、請求項１４または１５に記載される方法。
【請求項４７】
前記核酸またはペプチド核酸の配列は、配列番号５０〜配列番号８４、配列番号８８〜配列番号９０、９９、１００、１０４、１０５、１０９、１１０およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される、請求項４２に記載される方法。
【請求項４８】
前記オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーは蛍光標識され、その検出は蛍光または蛍光偏光の増加または減少のいずれかによる、請求項４２に記載される方法。
【請求項４９】
オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーションは、蛍光共鳴エネルギー移動により検出され、その検出は蛍光の増加または減少のいずれかによる、請求項４２に記載される方法。
【請求項５０】
バックグランドＤＮＡ濃度は、検証されるＤＮＡの濃度の１００〜１０００倍過剰である、請求項１４または１５に記載される方法。
【請求項５１】
ａ）被験者のゲノムＤＮＡを有する生体試料を被験者から得て；
ｂ）ゲノムＤＮＡを抽出し；
ｃ）配列番号１〜配列番号５または配列番号１〜配列番号５に厳密な条件下にハイブリダイズする配列を含むゲノムＤＮＡまたはその断片を、１つ以上のメチル化感受性制限酵素と接触させ、ゲノムＤＮＡはそれによって分解されて、分解断片を生成するか、あるいは分解されず；そして
ｄ）少なくとも１つのそのような断片の存否またはその性質に基づいて、少なくとも１つの配列番号１〜配列番号５のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、または配列番号１〜配列番号５の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態または平均メチル状態を反映する値を測定し、前立腺細胞増殖性疾患の検出あるいは前立腺細胞増殖性疾患起源の移行性領域と末梢性領域の識別が、少なくとも部分的にできることを含む、
請求項１３に記載される方法。
【請求項５２】
工程ｄ）で測定する前に、さらに分解または未分解ゲノムＤＮＡを増幅することを含む、請求項５１に記載される方法。
【請求項５３】
増幅することは、増幅酵素である耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用、検出可能な標識を有する増幅産物核酸の産生、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法の使用を含む、請求項５２に記載される方法。
【請求項５４】
検出可能な増幅産物標識は、蛍光標識；放射性核種または放射性標識；質量分析計で検出可能な増幅産物質量標識；質量分析計で検出可能な分離可能な増幅産物断片質量標識；質量分析計で検出可能な１価正または１価負正味荷電を有する分離可能な増幅産物断片質量標識；およびこれらの組合せからなる標識群から選択される、請求項５３に記載される方法。
【請求項５５】
増幅産物または分離可能な増幅産物断片質量標識を検出するための質量分析計の使用を含む、請求項５４に記載される方法。
【請求項５６】
質量分析計はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）、電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５５に記載される方法。
【請求項５７】
被験者から得た生体試料は、組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、糞便、血液、血清、血漿、尿、痰またはこれらの組合せからなる群から選択される、請求項５１に記載される方法。
【請求項５８】
ｉ）重亜硫酸塩試薬；およびii）各ケースにおいて配列番号１〜配列番号２５およびその相補体からなる群から選択された配列に相補的であるか、または適度に厳密なまたは厳密な条件下にハイブリダイズする長さ少なくとも９ヌクレオチドである近接した配列を含む少なくとも１つの核酸分子またはペプチド核酸分子
を含む結腸細胞増殖性疾患を検出、区別または識別するために有用なキット。
【請求項５９】
さらに、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＣＯＢＲＡ、核酸配列決定およびこれらの組合せからなる群から選択されたメチル化アッセイを行うための標準試薬を含む、請求項５８に記載されるキット。
【請求項６０】
結腸細胞増殖性疾患または結腸細胞増殖性疾患の素因の分類、区別および／または診断のための請求項１に記載される核酸、請求項２〜７のいずれか１項に記載されるオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマー、請求項５８または５９に記載されるキット、請求項１１または１２に記載されるアレイ、請求項５〜７のいずれか１項に記載されるオリゴヌクレオチドのセット、または請求項１３〜５７のいずれか１項に記載される方法の使用。
【請求項６１】
結腸細胞増殖性疾患の治療のための請求項１に記載される核酸、請求項２〜７のいずれか１項に記載されるオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマー、請求項５８または５９に記載されるキット、請求項１１または１２に記載されるアレイ、請求項５〜７のいずれか１項に記載されるオリゴヌクレオチドのセット、または請求項１３〜５７のいずれか１項に記載される方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
結腸癌は、男性および女性の癌死亡率の主要な原因の第４位にある。５年生存率はステージ全体にわたって６１％であり、早期発見がこの疾患の治癒的療法の必須条件である。全結腸直腸癌の９５％までは、分化の程度が異なる腺癌である。
【０００２】
散発性結腸癌は、正常結腸上皮の病理的形質転換から始まり、浸潤癌に継続的に進行する腺腫に至る多段階プロセスで発生する。結腸腺腫の進行速度は、現在、その組織学的外観、位置、広がりの程度および腸関与の範囲に基づいて予測されている。例えば、管状型良性腺腫は稀に悪性腫瘍に進行するが、絨毛性良性線種は特に直径が２ｃｍより大きいなら、有意に悪性である可能性を有する。
【０００３】
良性増殖性病変から悪性新生物への進行中に、いくつかの遺伝的および後成的変化が生じることが知られている。ＡＰＣ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸腺腫および癌腫の７５〜８０％である最も初期の事象の１つであると思われる。Ｋ−ＲＡＳの活性化は、悪性表現型への進行における臨界的段階であると考えられる。引き続き、他の発癌遺伝子の変異ならびに腫瘍抑制遺伝子の不活性化となる変質が蓄積する。
【０００４】
ＣｐＧアイランド内の異常なＤＮＡメチル化は、広範囲の遺伝子の抑止または過剰発現につながるヒト癌の最も初期および最も一般的な変質の中に共通している。さらに、異常なメチル化はある種の腫瘍における遺伝子のイントロンおよびコード部分のＣｐＧリッチ制御要素に生じることが示されている。腫瘍抑制遺伝子の特異的高メチル化と対照的に、ＤＮＡの全体的低メチル化が腫瘍細胞中に観察され得る。全体的メチル化におけるこの低下は、あからさまな腫瘍形成への発達よりずっと前に、早くから観察され得る。また、低メチル化と大きな遺伝子発現との相関性は、多くの発癌遺伝子について報告されている。結腸癌では、異常なＤＮＡメチル化は最も顕著な変質の１つを構成し、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＴＨＢＳ１、ＭＩＮＴ２およびＭＩＮＴ３１などの多くの腫瘍抑制遺伝子およびｈＭＬＨ１などのＤＮＡミスマッチ修復遺伝子を不活性化する。
【０００５】
結腸直腸癌の分子的進化では、ＤＮＡメチル化異常は２つの異なる役割を果たすと示唆されている。正常な結腸粘膜細胞では、メチル化異常はこれらの細胞の新生物形質転換への素因となる加齢的および経時的事象の機能として蓄積する。例えば、数種の遺伝子座位の高メチル化は、腺腫、特に腺管絨毛および絨毛サブタイプにおいて、既に存在することが示されている。その後の段階で、ＣｐＧアイランドの増加したＤＮＡメチル化は、いわゆるＣｐＧアイランドメチル化誘発表現型（ＣＩＭＰ）により影響される腫瘍のサブセットで重要な役割を果たす。全散発性結腸直腸癌の約１５％を構成するほとんどのＣＩＭＰ＋腫瘍は、ｈＭＬＨ１プロモーターおよび他のＤＮＡミスマッチ修復遺伝子の高メチル化によるマイクロサテライト不安定性（ＭＩＮ）を特徴とする。反対に、ＣＩＭＰ−結腸癌は高率のｐ５３変異および染色体変化をともなう、より古典的な遺伝的不安定経路（ＣＩＮ）に沿って進化する。
【０００６】
しかしながら、分子サブタイプは単に分子変化に関する変動する頻度を示していないだけではない。マイクロサテライト不安定性または染色体異常のいずれかの存在によって、結腸癌は有意な臨床的差異を示す２つのクラスに分類され得る。ほとんど全てのＭＩＮ腫瘍は、近位結腸（上行性および横行性結腸）に由来するが、ＣＩＮ腫瘍の７０％は、遠位結腸および直腸に位置する。これは結腸の異なった部分での異なった発癌性物質の変動する有病率に起因している。近位結腸での一般的な発癌性物質を構成するメチル化発癌性物質は、ＭＩＮ癌の病理学である役割を果たすことが示唆されているが、一方、ＣＩＮ腫瘍は結腸および直腸の遠位部分でより頻繁に生じる付加物生成発癌性物質によってより頻繁に引き起こされると考えられている。さらに、ＭＩＮ腫瘍はＣＩＮ表現型を有する腫瘍よりもより良い予後を示し、補助的化学療法に対してより良く反応する。
結腸癌腫の分化ならびに早期検出のためのマーカーの同定は、現在の研究の大きな目標である。
【０００７】
α−カルシトニン遺伝子は、ペプチド：カルシトニン、カタカルシン、およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の小さなファミリーをコードする。カルシトニンは骨格の完全性に関与し、カルシトニンの分泌は、部分的にはエストロゲン依存性であり、閉経後のカルシトニン分泌の下降は、閉経後骨粗鬆症発生の一要素であるようである。
【０００８】
カルシトニン遺伝子の研究は、該遺伝子のプロモーター領域の高メチル化が、数種の癌タイプ、特に急性白血病の新生細胞中に存在することを明らかにしている。前記研究の大きな部分は、メチル化感受性酵素による方法を使用して実施され、これが複数のタイプの癌における遺伝子のプロモーターおよび第1エクソン領域内の高メチル化の一般的な現象を確認した。しかしながら、前記方法は選択されたＣｐＧ位置の目標とされた分析を不可能とする。高メチル化観察は、領域内のコメチル化の仮定によってのみ実施可能であった。コメチル化は、１つのＣｐＧ位置のメチル化がこの領域内の全ＣｐＧ位置のメチル化の指標となる現象である。制限酵素法を使用して実施された研究例としては、非特許文献１および２が挙げられる。
【０００９】
ＣＳＰＧ２としても公知である遺伝子「バーシカン (Versican)」（NM_004385）は、大きなコンドロイチン硫酸プロテオグリカンをコードする。この遺伝子は異常なメチル化パターンを示すことが知られていて、この問題について対立する意見が発表されている。例えば、アダニイ(Adany)Rおよびイオッゾ(Iozzo)RVは、低メチル化と結腸新生物との相関性を観察した（非特許文献３）。しかし、最近になって、非特許文献４には、非ＵＣ制御粘膜に比べた（５８％対３１％、P=0.01）あるいは隣接した非関与粘膜に比べた（５８％対３５％、P=0.06）形成異常粘膜の高メチル化の観察が記載されている。したがって、この遺伝子の異常メチル化が結腸直腸細胞増殖性疾患に観察されているが、この異常メチル化の特徴付けは、なおも自明ではなく、コメチル化の一般に行われる仮定が、この遺伝子の場合、行えないようである。
【００１０】
遺伝子ＴＰＥＦ（ＴＭＥＦＦ２としても公知である）ＮＭ＿０１６１９２は、ＥＧＦおよびホリスタチンドメインを含む膜貫通タンパクをコードする。これは最初にジョーンズ(Jones)ら、により、そのメチル化特性をもとに同定された（非特許文献５）。そこで、該遺伝子の５'領域はＣｐＧアイランドを含み、その３'領域は腫瘍細胞株中で有意な高メチル化を示すことが明らかにされた。有意であるけれども、前記知見は臨床または診断に応用するには適切でない方法である任意にプライムされたＰＣＲによって実施された。
【００１１】
ＥＹＡ４は、脊椎動物Ｅｙａ(eyes-absent)遺伝子ファミリーのうちで最も近年に同定された一員であり、正常な発生学的発達を確実にする保存制御ヒエラルキー（hierarchy）において他のタンパクと相互作用する4種の転写活性因子のグループである。ＥＹＡ４遺伝子は、６ｑ２２．３に存在し、６４０アミノ酸タンパクをコードする。ＥＹＡ４の構造は、ＥＹＡ１〜３により確定された基本パターンと一致し、ｅｙａ相同領域（ｅｙａＨＲ；または、ｅｙａドメインまたはｅｙａ相同性ドメイン１と呼ばれる）と称する高度に保存された２７１アミノ酸のＣ末端およびＮ末端の多種のプロリン−セリン−スレオニン（ＰＳＴ）リッチな（３４〜４１％）転写促進活性化ドメインを含む。ＥＹＡタンパクは初期胚発達中にＳＩＸおよびＤＡＣＨタンパクファミリーのメンバーと相互作用する。ＥＹＡ４遺伝子の変異は、ＤＦＮＡ１０座で後天性、進行性、常染色体優性難聴の原因である（非特許文献６および他の参考文献）。ＥＹＡ４遺伝子におけるシトシン位置のメチル化と癌の関連は未だ確定されていない。
【００１２】
カドヘリンは、選択的細胞認識および接着の原因である細胞表面糖タンパクの１つのファミリーである。ＣＤＨ１（Ｅ−カドヘリン）およびＣＤＨ１３（Ｈ−カドヘリン、ＮＭ＿００１２５７）を含む数種のファミリーメンバーは、染色体１６の長腕上に位置し、他の遺伝子群は染色体５の短腕上に存在する。カドヘリンのうちのいくつかの染色体位置は、多くの腫瘍型におけるヘテロ接合性の頻繁な消失部位である。１６ｑの欠失は、乳房、肺および他の癌腫でしばしば生じる。カドヘリンの発現消失は、多くの上皮癌で述べられていて、これは腫瘍細胞浸潤および転移である役割を果たすであろう。ＣＤＨ１３発現は、乳房および肺の癌で減少する。卵巣腫瘍で、欠失と異常なメチル化の組合せがＣＤＨ１３を不活性化すると報告されている。ＣＤＨ１３の異常なメチル化はまた、肺癌でも報告されている。
【００１３】
５−メチルシトシンは、真核生物細胞のＤＮＡにおける最も頻度の高い塩基修飾である。これは例えば転写、制御、遺伝子インプリンティングおよび腫瘍形成においてある役割を果たす。したがって、遺伝子情報の１成分として、５−メチルシトシンの同定はかなり興味深いものである。しかしながら、５−メチルシトシンの位置はシトシンとして同じ塩基対形成挙動を有するから、配列決定によって同定することができない。さらに、５−メチルシトシンが行う後成的情報は、ＰＣＲ増幅中に完全に失われる。
【００１４】
５−メチルシトシンのＤＮＡ分析のための相対的に新しく、かつ現在、最も頻繁に使用される方法は、シトシンと重亜硫酸塩との特異的な反応に基づく。これはその後のアルカリ加水分解において、その塩基対形成挙動でチミジンに対応するウラシルに変換される。しかしながら、５−メトルシトシンはこれらの条件下で未変性のまま残存する。その結果、そのハイブリダイゼーション挙動でシトシンと元来、区別され得ないメチルシトシンが、「通常の」分子生物学的技術を使用して、例えば増幅およびハイブリダイゼーションまた配列決定によって、唯一、残存するシトシンとして検出され得るような方法で、元のＤＮＡを変換する。これらの技術の全ては、完全に活用され得る塩基対形成に基づく。感度からみて、先行技術はアガロースマトリックス中で分析されるＤＮＡを囲む方法に限定され、すなわち、ＤＮＡの拡散および再生を阻止し（重亜硫酸塩のみが単一鎖ＤＮＡとの反応する）、そして高速透析により沈殿および精製工程全てを置換する（非特許文献７）。この方法を使用すると、個々の細胞を分析することが可能となり、このことはこの方法の潜在性を示す。しかしながら、現在、長さが約３０００塩基対以下の塩基対の個々の領域のみが分析されているが、数千の可能性あるメチル化事象に関する全体的な細胞分析は可能ではない。しかもこの方法は小さなサンプル量から得た非常に小さな断片を確実に分析することはできない。これらは拡散の保護にもかかわらずマトリックス中で失われる。
５−メチルシトシンを検出する別な公知方法に関する概要は、次の総説文献：非特許文献８から得てもよい。
【００１５】
現在まで、いくつかの例外（例えば、非特許文献９）を除いて、重亜硫酸塩技術が唯一、研究において使用されている。いつも公知遺伝子の短い特定断片が重亜硫酸処理に続いて増幅され、いずれかが完全に配列決定されるか（非特許文献１０）または個々のシトシン位置がプライマー伸長反応（非特許文献１１、特許文献１）または酵素分解（非特許文献１２）よって検出される。さらに、ハイブリダイゼーションによる検出もまた、記述されている（オレク(Olek)ら、特許文献２）。
【００１６】
個々の遺伝子のメチル化検出における重亜硫酸塩技術の使用を扱っている別な刊行物は、非特許文献１３〜１６、特許文献３および４がある。
オリゴマーアレイ製造における先行技術の概要は、１９９９年１月に発行された非特許文献１７およびそこに引用された文献から集めることができる。
【００１７】
蛍光標識されたプローブは、しばしば、固定化ＤＮＡアレイの走査に使用される。特異的プローブの５´−ＯＨへのＣｙ３およびＣｙ５染料の単純な結合は、蛍光標識において特に好適である。ハイブリダイズされたプローブの蛍光検出は、例えば、共焦点顕微鏡によって実施してもよい。とりわけ、Ｃｙ３およびＣｙ５染料が市販されている。
【００１８】
マトリックスアシストレーザー脱離イオン化質量分析計（Matrix  Assisted  Laser  Desorption  Ionisation  Mass  Spectrometry）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生物分子を分析するには非常に効率的な開発である（非特許文献１８）。分析物は光吸収性マトリックス中に包埋される。マトリックスを短いレーザーパルスで蒸発させ、未断片化方法で蒸気相中へ分析物分子を輸送する。分析物はマトリックス分子とともに衝突によってイオン化される。適用された電位がこのイオンをフィールドフリー飛行管中へ加速する。その異なった質量によって、イオンは異なった速度で加速される。より小さなイオンは大きなものよりも早く検出器へ届く。
【００１９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定は、ペプチドおよびタンパクの分析にきわめて適している。核酸の分析はいくぶんより困難である（非特許文献１９）。核酸の感度は、ペプチドよりも約１００倍も悪く、断片サイズが大きくなるにつれて反比例して減少する。多重負電荷バックボーンを有する核酸では、マトリックスによるイオン化方法は、非常に効率が低い。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定では、マトリックスの選択が著しく重要な役割を果たす。ペプチドの脱離には、非常に微細な結晶化を生じるいくつかの効率的なマトリックスが見出されている。ＤＮＡに対するいくつかの反応性マトリックスが現在は存在するが、しかしながら、感度の相違はまだ減少していない。感度の相違は、ペプチドにより類似するような方法にて、ＤＮＡを化学的に変性させることによって減少させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩で置換されたホスホロチオエート核酸は、簡単なアルキル化化学を使用して電荷中性ＤＮＡに変換され得る（非特許文献２０）。変性ＤＮＡへの電荷タグの結合は、ペプチドにおいて見られた感度と同じ程度に感度が増加する。電荷タグの結合のさらなる利点は、未変性基質の検出を非常に困難なものとする不純物に対する分析における大きな安定性である。
ゲノムＤＮＡは標準方法によって細胞、組織または他の試験試料ＤＮＡから得られる。この標準的方法論は、非特許文献２１などの参考文献に見られる。
【特許文献１】ＷＯ９５／００６６９
【特許文献２】ＷＯ９９／２８４９８
【特許文献３】ＷＯ９７／４６７０５
【特許文献４】ＷＯ９５／１５３７３
【非特許文献１】ヒルツネン(Hiltunen) MO、コイスティナホ(Koistinaho)J、アルホネン（Alhonen）Ｌ、ミョハネン(Myohanen)S、マリン(Marin)S、コスマ(Kosma)VM、パッコネン(Paakkonen)M、ジェイン(Janne)J.「ヒト結腸直腸癌の染色体１１ｐのＷＴ１およびカルシトニン遺伝子プロモーター領域の高メチル化」、BrJ Cancer. 1997; 76 (9):1124-30。
【非特許文献２】シルバーマン(Silverman) AL, パーク(Park）JG, ハミルトン(Hamilton)SR, ガツダー（Gazdar）AF, ルック(Luk)GD,ベイリン(Baylin)SB,「ヒト結腸新生物のカルシトニン遺伝子の異常メチル化」、CancerRes.1989 Jul1; 49 (13): 3468-73。
【非特許文献３】アダニイ(Adany)Rおよびイオッゾ(Iozzo)RV、「ヒト結腸癌腫のバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）プロテオグリカン遺伝子の変化したメチル化」、BiochemBiophysRes Commun 1990 Sep 28; 171 (3): 1402-13）。
【非特許文献４】イッサ(Issa)ら、「潰瘍性結腸炎の加速度的年齢関連ＣｐＧアイランドのメチル化」、CancerResearch61,3573-3577,May1, 2001。
【非特許文献５】ジョーンズ(Jones)ら、「上皮細胞成長因子およびホリスタチンドメインを含む新規な膜貫通タンパクの遺伝子は、ヒト腫瘍細胞中で頻繁に高メチル化される」、CancerResearch60, 4907-4912, September1, 2000。
【非特許文献６】ウェイン(Wyane)S、ロバートソン(Robertson)NG、デクロ（DeClau）F、チェン(Chen)N、ベルホーベン(Verhoeven)K、プラサド(Prasad)S、トランジャグ(Tranebjarg)L、モートン(Morton)CC、リヤン(Ryan)AF、ファンキャンプ（VanCamp）G、スミス（Smith）RJ：「転写活性因子ＥＹＡ４の変異がＤＦＮＡ１０座で遅発性聴覚障害を引き起こす」、HumMolGenet 2001 Feb1; 10(3): 195-200。
【非特許文献７】オレク(Olek)A、オズワルド（Oswald）J、ウォルター(Walter)J、「重亜硫酸塩系シトシンメチル化分析のための修正および改良方法」、NucleicAcidsRes. 1996 Dec15; 24(24): 5064-6。
【非特許文献８】レイン(Rein),T、デパムフィリス(DePamphilis),M.L、ゾルバス(Zorbas),H、Nucleic AcidsRes.1998,26, 2255。
【非特許文献９】ツェシュニック(Zeschnigk)M、リッチ(Lich)C、ビュティング（Buiting）K、ドエルフラー(Doerfler)W、ホルステムケ(Horsthemke)B、「ＳＮＲＰＮ座のアレル変異メチル化相違に基づくアンジェルマンおよびプラダー・ウィリー症候群の診断のための単管ＰＣＲ試験」、EurJHum H Genet. 1997 Mar-Apr; 5 (2): 94-8。
【非特許文献１０】オレク(Olek)A、ウォルター(Walter)J、「Ｈ１９メチル化刷り込みの移植前個体発生」、Nat Genet.1997Nov;17(3): 275-6。
【非特許文献１１】ゴンザルゴ(Gonzalgo)ML、ジョーンズ(Jones)PA、「メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）を使用する特定部位でのメチル化相違の迅速定量」、NucleicAcidsRes. 1997 Jun 15; 25 (12): 2529-31。
【非特許文献１２】ション(Xiong)Z、レアード（Laird）PW、COBRA：「高感度および定量的ＤＮＡメチル化分析」、Nucleic AcidsRes.1997Jun15; 25 (12): 2532-4。
【非特許文献１３】グリッグ(Grigg)G、クラーク(Clark)S、「ゲノムＤＮＡの５−メチルシトシン残基の配列決定」、Bioassays.1994Jun;16(6): 431-6, 431。
【非特許文献１４】ツエシュニク(Zeschnigk)M、シュミッツ(Schmitz)B、ディトリッチ(Dittrich)B、ビューティング(Buiting)K、ホルステムケ(Horsthemke)B、ドエルフラー(Doerfler)W、「ヒトゲノム中の刷り込みされたセグメント：ゲノム配列決定法により測定されたプラダー・ウィリー／アンジェルマン症候群流域中の異なったＤＮＡメチル化パターン」、HumMolGenet. 1997 Mar; 6 (3) 387-95。
【非特許文献１５】フェイル(Feil)R、チャールトン(Charlton)J、バード(Bird)AP、ウォルター(Walter)J、レイク(Reik)W、「個々の染色体上のメチル化分析：重亜硫酸塩ゲノム配列決定の改良プロトコール」、NucleicAcidsRes. 1994 Feb 25; 22 (4): 695-6。
【非特許文献１６】マーチン(Martin)V、リビエラス(Ribieras)S、ソンーウォン(Song-Wang)X、リオ(Rio)MC、ダンテ(Dante)R、「ゲノム配列決定はｐＳ２遺伝子の５'領域中のＤＮＡ低メチル化とヒト乳癌細胞株でのその発現の相関性を示す」、Gene.1995May19; 157(1-2): 261-4。
【非特許文献１７】Nature Geneticsの特別版(Nature Genetics Supplement, Volume21, January  1999。
【非特許文献１８】カラス(Karas)M、ヒレンカムプ（Hillenkamp）F、「１０，０００ダルトンを超える分子量を有するタンパクのレーザー脱離イオン化」、AnalChem.1988Oct 15; 60 (20): 2299-301。
【非特許文献１９】グット(Gut)IG、ベック(Beck)S、「ＤＮＡおよびマトリックスアシストレーザー脱離イオン化質量分光分析」、CurrentInnovationsand Future Trends 1995, 1; 147-57。
【非特許文献２０】グット(Gut)IG、ベック(Beck)S、「選択的ＤＮＡアルキル化のための手法と質量分析による検出」、Nucleic AcidsRes.1995Apr25; 23(8): 1367-73。
【非特許文献２１】サンブルック(Sambrook)、フリッシュ(Fritsch)およびマニアティス(Maniatis)編、Molecular Cloning：「研究室マニュアル」、1989。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４を含む群の少なくとも１つの核酸を、目的のゲノム配列内でメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド間を区別することができる試薬または一連の試薬と接触させることを特徴とする、結腸細胞増殖性疾患の発達に関与する態様の生体試料分析方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の基礎を形成する遺伝子は、「遺伝子パネル」、すなわち、本発明の特別な遺伝子配列および／またはそれぞれの参考となるメチル化部位を含むコレクションを形成するために使用してもよい。遺伝子パネルの形成は、乳癌治療の特異的な面の緊急かつ特異的な分析を可能とする。本発明で記述され、かつ使用される遺伝子パネルは、結腸細胞増殖性疾患の改善された診断、治療およびモニタリングにおいて驚くべき高効率で使用され得る。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、体液試料の結腸直腸癌を検出するために使用されるマーカーが現在、存在しない当該技術分野の状況を超えた有意義な改良を提供する。結腸細胞増殖性疾患を検出および診断するために使用される現在の方法は、結腸鏡検査、Ｓ字結腸鏡検査、および糞便潜血大腸癌を含む。これらの方法に比べて、開示される方法は、結腸鏡検査よりもより侵襲性が低く、かつ、あたかもＳ字結腸鏡検査およびＦＯＢＴよりも感度は高くない。文献中のこれらのマーカーの説明に比べると、記述される発明は、遺伝子パネルを使用することと高感度の分析技術を有利に組み合わせることにより、感度と特異性の面から有意な利点をもたらす。
【００２３】
本発明は、ゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメーターを確認する方法を利用可能とする。この方法は、より具体的には、結腸細胞増殖性疾患のサブクラスおよび該疾患への遺伝的素因の改良された同定および区別を可能とすることによる結腸細胞増殖性疾患の改良された診断、治療およびモニタリングにおける使用に関する。本発明は結腸癌腫の高特異的分類を可能にし、それによって改善され、かつ同意を得た患者の治療を可能とする、当該技術分野の現状を超えた改良をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の１つの態様では、開示された事項は、前記遺伝子内のメチル化の分析に有用な新規な核酸配列を提供し、他の態様は結腸細胞増殖性疾患を検出、分化および区別するための遺伝子および遺伝子産物ならびに方法、アッセイおよびキットの新規な使用を提供する。本発明の方法および核酸は、腺癌、ポリープ、扁平上皮細胞癌、カルチノイド腫瘍、肉腫およびリンパ腫からなる群から選択される結腸細胞増殖性疾患の分析に使用してもよい。
【００２５】
１つの実施態様では、本方法は結腸細胞増殖性疾患の区別、検出および識別のためのマーカーとして、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４からなる群から選択された１つ以上の遺伝子を使用することを開示する。この遺伝子の使用は、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４からなる群から選択された１つ以上の遺伝子およびこれらのプロモーターまたは制御要素のメチル化状態の分析によって行ってもよい。
【００２６】
本発明の目的は、配列番号１〜配列番号５の１つ以上のゲノム配列およびそれらに相補的配列内のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の分析によって達成してもよい。配列番号１〜配列番号５は、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４およびそれらのプロモーターおよび制御要素からなる群から選択された遺伝子の核酸配列を開示し、該断片は疾患特異的メチル化パターンを示すＣｐＧジヌクレオチドを含む。遺伝子コードの縮重によって、配列番号１〜配列番号５として同定された配列は、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４の遺伝子によってコードされたものの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター領域の上流にある実質的に類似および均等である配列を含むと解釈されるべきである。
【００２７】
本方法の好ましい実施態様では、本発明の目的は配列番号６〜配列番号２５の１つおよびその相補的配列の長さ少なくとも１８塩基の配列を含む核酸の分析によって達成される。
配列番号６〜配列番号２５の配列は、配列番号１〜配列番号５の核酸の修飾された変形を提供する。前記配列の変換は、以下の通り特殊であって、かつ配列番号１〜配列番号５と区別される配列を有する核酸の合成となる。（下記表１も参照）：配列番号１〜配列番号５、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４およびそれらのプロモーターおよび制御要素のセンスDNA鎖；配列番号６〜配列番号１５、変換された配列番号１〜配列番号５および相補的配列、ここで、「Ｃ」が「Ｔ」に変換するが、「ＣｐＧ」は「ＣｐＧ」のままである（すなわち、ＣｐＧジヌクレオチド配列の「Ｃ」残基の全てがメチル化され、したがって変換されていない場合に対応する）；配列番号１６〜配列番号２５、変換された配列番号１〜配列番号５および相補的配列、ここで、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものを含めて、「Ｃ」残基の全てにおいて「Ｃ」は「Ｔ」に変換した（すなわち、配列番号１〜配列番号５において、ＣｐＧジヌクレオチド配列の「Ｃ」残基の全てがメチル化されていない場合に対応する）；
【００２８】
【表１】
2005518219.tif 000002
【００２９】
これまで、配列番号６〜配列番号２５の核酸配列および分子は、結腸細胞増殖性疾患の確認法と有意に関係または関連付けされていなかった。
開示される発明は、さらに配列番号６〜配列番号２５の前処理されたＤＮＡ内のシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを記載する。該オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、配列番号６〜配列番号２５の前処理された核酸配列および／またはそれらに相補的な配列に、適度に厳密なまたは厳密な条件下に（上記定義されたように）ハイブリダイズする長さ少なくとも９ヌクレオチドを有する核酸を含む。
【００３０】
すなわち、本発明は配列番号６〜配列番号２５の配列の全てまたは一部に、またはそれらの相補体に、適度に厳密なおよび／または厳密なハイブリダイゼーション条件下にハイブリダイズする核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ＰＮＡ−オリゴマー））を含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、通常、長さ少なくとも９、１５、２０、２５、３０または３５個のヌクレオチドである。しかしながら、より長い分子も本発明の有用性を有し、したがって本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
好ましくは、本発明のハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、配列番号６〜配列番号２５の配列、またはその部分、またはそれらの相補体と少なくとも９５％、または少なくとも９８％、または１００％同一である。
【００３２】
ここに開示されるタイプの核酸ハイブリダイゼーションは、例えばプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、または診断および／または予知用プローブまたはプライマーとして使用され得る。好ましくは、核酸試料へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、厳密な条件下に実施され、プローブは標的配列と１００％同一である。２本鎖核酸またはハイブリッド安定性は、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である融点またはＴｍで表現される。この融点は要求される厳密さの条件を決定するために使用される。
【００３３】
配列番号１〜配列番号５の対応する配列に関連し、かつ、同一よりむしろ実質的に同一である標的配列（アレル変異体およびＳＮＰなど）では、特定濃度の塩（例えば、ＳＳＣまたはＳＳＰＥ）で相同的ハイブリダイゼーションのみが生じる最低温度をまず達成することが有用である。次いで、１％ミスマッチがＴｍにおいて１℃減少となると仮定して、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄温度をそれに応じて低下させる（例えば、もしプローブと９５％以上の同一性を有する配列なら、最終洗浄温度を５℃減少させる）。実際には、Ｔｍの変化は１％ミスマッチ当たり０．５℃から１．５℃である。
【００３４】
例えば、配列番号１〜配列番号５を参照してポリヌクレオチド位置で示される長さＸ（ヌクレオチド）の本発明のオリゴヌクレオチドの例としては、長さＸの連続重複オリゴヌクレオチドのセットに対応するものが挙げられる。ここで、各連続重複セット（所与のＸ値に対応）内のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの位置：ｎ〜（ｎ＋（Ｘ−１））からＺ個のオリゴヌクレオチドの有限セットとして定義される。
ここで、ｎ＝１、２、３、．．．．．（Ｙ−（Ｘ−１））；
ここで、Ｙは配列番号１〜５の長さ（ヌクレオチドまたは塩基対）に等しい；
ここで、Ｘはセットの各オリゴヌクレオチドの共通長さ(ヌクレオチド)に等しい（例えば、連続重複２０マーでは、Ｘ＝２０）；および
ここで、長さＹの配列番号において、長さＸの連続重複オリゴマーの数（Ｚ）は、Ｙ−（Ｘ−１）に等しい；
例えば、配列番号１〜配列番号５のセンスまたはアンチセンスのいずれかのセットにおいて、Ｚ＝２，７８５−１９＝２，７６６、ここで、Ｘ＝２０である。
好ましくは、このセットは少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含むこれらのオリゴマーに限定される。
【００３５】
本発明は配列番号６〜配列番号２５（センスおよびアンチセンス）のそれぞれにおいて、長さＸ（ここでは、例えばＸ＝９、１０、１７、２０、２２、２３、２５、２７、３０または３５ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの多重連続重複セットを包含する。
【００３６】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、配列番号１〜配列番号５に対応するゲノム配列の遺伝的および後成的パラメーターを確認するために有用な効率的ツールを構成する。このような長さＸのオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの好ましいセットは、配列番号１〜配列番号２５（およびそれらの相補体）に対応するオリゴマーのこれらの連続重複セットである。好ましくは、このオリゴマーは少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。配列番号１１〜配列番号１５に対応する好ましいオリゴマーは、これらの好ましいセットに含まれる。
【００３７】
本発明の特に好ましいオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、オリゴヌクレチドの中３分の１に、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシン（またはＴｐＧジヌクレオチドのチミンまたはＣｐＡジヌクレオチドのアデノシン）が存在するものである。すなわち、オリゴヌクレオチドが、例えば長さ１３塩基である場合、ＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドは５'末端から５番目から９番目のヌクレオチド内に位置する。
【００３８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、安定性または検出を増大させるために、１つ以上の分子または共役体にオリゴヌクレオチドを化学的に結合することによって変性され得る。このような分子または共役体としては、発色団、蛍光物質、コレステロールなどの脂質、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル分子、および例えば、米国特許第５，５１４，７５８号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９７，６９６号および第５，９５８，７７３号に記載される他のものが挙げられる。プローブは、特に好ましい対形成特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在していてもよい。したがって、オリゴヌクレオチドはペプチドなどの他の付属基を含んでいてもよく、また、ハイブリダイゼーション誘因切断剤（クロール(Krol)ら、BioTechniques6958-976,1988）または挿入剤（ツオン(Zon)、Pharm. Res. 5: 539-549, 1988）を含んでいてもよい。このために、オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば発色団、蛍光物質、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘因架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘因切断剤などと結合されていてもよい。
オリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野で認められている少なくとも１つの変性糖および／または塩基部分を含んでいてもよく、または変性バックボーンまたは非天然インターヌクレオシド結合を含んでいてもよい。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常、いわゆる「セット」として使用され、１つの実施態様では、配列番号１〜配列番号５を含むゲノム配列およびそれらに相補的な配列のＣｐＧジヌクレオチドまたは配列番号６〜配列番号２５の前処理された核酸およびそれらに相補的な配列内の対応するＣＧ、ＴＧまたはＣＡジヌクレオチドの各分析のための少なくとも１つのオリゴマーを含む。好ましいセットは、配列番号１〜配列番号２５の各遺伝子の前処理されたものおよびゲノムの両者中のバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４およびそれらのプロモーターおよび制御要素からなる群から選択された１つ以上の遺伝子内の各ＣｐＧジヌクレオチドのための少なくとも１つのオリゴマーを含むものである。しかしながら、経済的または他の要因から、該配列内のＣｐＧジヌクレオチドの限定された選択を分析することが好ましいことが予期され、オリゴヌクレオチドのセットの内容はそれゆえ変更されるべきである。しがって、本発明はさらに前処理されたゲノムＤＮＡ（配列番号６〜配列番号２５およびこれらに相補的な配列）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号５およびそれらに相補的な配列）のシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも４つのオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーのセットに関する。これらのプローブは細胞増殖性疾患の遺伝的および後成的パラメーターの診断および／または治療を可能とする。オリゴマーのセットは、前処理されたゲノムＤＮＡ（配列番号６〜配列番号２５およびこれらに相補的な配列）およびゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号５およびこれらに相補的な配列）中の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するために使用してもよい。
【００４０】
さらに、本発明は配列番号６〜配列番号２５およびそれらに相補的な配列、またはそれらの断片の１つのＤＮＡ配列を増幅するためのいわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用することができる少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットを入手可能とする。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチドのセットの場合、オリゴヌクレオチドのセットの少なくとも１つ、より好ましくは全てが固相に結合されることが好ましい。
【００４２】
本発明では、本発明によって入手可能となった異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーの配列（いわゆる「アレイ」）が、固相に結合されるようにして存在することが好ましい。異なったオリゴヌクレオチド−および／またはＰＮＡ−オリゴマー配列のこのアレイは、四角形または六角形格子形態の固相上に配列されることを特徴とする。固相表面は、好ましくはシリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から構成される。しかしながら、ニトロセルロースならびにナイロンなどのプラスチックもペレットの形態で存在することができ、または樹脂マトリックスとして使用してもよい。
【００４３】
したがって、本発明のさらなる主題は、細胞増殖性疾患に関連した分析のための担体物質に固定化されたアレイを製造する方法であり、本発明の少なくとも１つのオリゴマーが固相に結合される方法である。このようなアレイを製造する方法は、例えば固相化学および感光性保護基を用いる米国特許第５，７４４，３０５号から公知である。
本発明の別な主題は、細胞増殖性疾患の分析のためのＤＮＡチップに関する。ＤＮＡチップは、例えば米国特許第５，８３７，８３２号から公知である。
【００４４】
本発明はさらに、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４およびこれらのプロモーターおよび制御要素からなる群から選択された１つ以上の遺伝子の遺伝的および／または後成的パラメーターの分析を実施する方法を提供する。最も好ましくは、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４からなる群から選択された１つ以上の遺伝子のメチル化を検出するために、下記方法による分析を使用する。ここで、メチル化核酸は過剰のバックグランドＤＮＡをさらに含む溶液中に存在し、バックグランドＤＮＡは検出されるべきＤＮＡの濃度の１００〜１０００倍で存在する。前記方法は被験者から得た核酸試料を少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させることを含み、該試薬または一連の試薬は、標的核酸内のメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する。
【００４５】
好ましくは、前記方法は下記工程を含む：第１工程では分析されるべき組織の試料を得る。その原料は好適なものであればよく、好ましくは試料の原料は組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、糞便、血液、血清、血漿、尿、痰およびこれらの組合せからなる群から選択される。好ましくは、原料は生検、体液、尿または血液である。
【００４６】
次いで、ＤＮＡは試料から単離される。抽出は、界面活性剤可溶化液の使用、超音波処理およびガラスビーズによる渦流動を含む当業者にとって標準的な手段による。一度、核酸が抽出されると、ゲノム２本鎖ＤＮＡが分析に使用される。
【００４７】
本方法の第２工程では、ゲノムＤＮＡ試料は５'位でメチル化されないシトシン塩基がウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動の面ではシトシンに類似しない他の塩基に変換されるような方法で処理される。これはここでは「前処理」として理解されるであろう。
【００４８】
ゲノムＤＮＡの上記処理は、好ましくは非メチル化シトシン核酸塩基をウラシルまたは塩基対形成挙動の面からシトシンに類似していない他の塩基に変換することとなる、重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）およびそれに続くアルカリ加水分解でもって実施する。アガロースマトリックス中に分析されるべきＤＮＡを包括し、それによって、ＤＮＡの拡散および再生を阻止し（重亜硫酸塩のみが１本鎖ＤＮＡに作用する）、かつ、全沈殿および精製工程を高速透析に代替する（オレク(Olek)Aら、「重亜硫酸塩によるシトシンメチル化分析のための変性および改良方法」、NucleicAcidsRes.24:5064-6,1996）。さらに、重亜硫酸塩処理は遊離基捕捉剤またはＤＮＡ変性剤の存在下で実施することが好ましい。
【００４９】
本方法の第３工程では、前処理したＤＮＡ断片を増幅する。ＤＮＡ原料が血清であるＤＮＡを含まないか、またはパラフィンから抽出されたＤＮＡを含まない場合には、増幅産物断片の大きさは長さ１００〜２００塩基対であることが特に好ましく、該ＤＮＡ起源が細胞原料（例えば、組織、生検、細胞株）から抽出された場合、増幅産物は長さ１００〜３５０塩基対であることが好ましい。該増幅産物が少なくとも３つのＣｐＧジヌクレオチドを含む２０塩基対配列を少なくとも１つ含むことが特に好ましい。該増幅産物は、本発明のプライマーオリゴヌクレオチドのセット、および好ましくは熱安定性ポリメラーゼを使用して実施する。数種のＤＮＡセグメントの増幅は、１つおよび同じ反応容器中で同時に実施することができ、本方法の１つの実施態様では、好ましくは２つ以上の断片を同時に増幅する。通常、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して実施する。プライマーオリゴヌクレオチドのセットは、その配列が配列番号６〜配列番号２５の塩基配列およびこれらに相補的な配列のうち、少なくとも１８塩基対長のセグメントにそれぞれ逆相補的であるか、同一であるか、または厳密な条件または高度に厳密な条件下にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【００５０】
本方法の別な実施態様では、配列番号６〜配列番号２５を含む核酸配列内の前以て選択されたＣｐＧ位置のメチル化状態をメチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドを使用して検出してもよい。この技術（ＭＳＰ）は米国特許第６，２６５，１７１号、ハーマン(Herman)に記載されている。重亜硫酸塩処理されたＤＮＡの増幅のためのメチル化状態特異的プライマーの使用は、メチル化および非メチル化核酸を区別できる。ＭＳＰプライマー対は、重亜硫酸塩処理されたＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含む。したがって、該プライマーの配列は少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧのＣ位置の３'位に「Ｔ」を含む。好ましくは、それゆえ、該プライマーの塩基配列は配列番号６〜配列番号２５に記載される前処理された核酸配列およびこれらに相補的な配列にハイブリダイズする長さ少なくとも１８ヌクレオチドを有する配列を含むことが必要である。ここで、該オリゴマーの塩基配列は少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。本発明方法のこの実施態様では、ＭＳＰプライマーは２〜５のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含むことが特に好ましい。さらに、該ジヌクレオチドはプライマーの３'半分内に位置することが好ましい。例えば、プライマーが長さ１８塩基である場合、特定ジヌクレオチドは分子の３'末端から最初の９塩基内に位置する。ＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドに加えて、該プライマーはさらに数種の重亜硫酸塩変換塩基（すなわち、チミンに変換されたシトシン、またはハイブリダイズする鎖でアデニンに変換されたグアニン）を含むことが好ましい。さらに好ましい実施態様では、該プライマーは２つ以下のシトシンまたはグアニン塩基を含むように設計される。
本方法の１つの実施態様では、プライマーは配列番号３４〜配列番号４９、９６、９７、１０１、１０２、１０６および１０７からなる群から選択してもよい。
【００５１】
増幅によって得られた断片は、直接または間接に検出可能な標識を保持できる。蛍光標識、放射性核種または質量分析計で検出可能な通常の質量を有する検出可能な分子状断片の形状である標識が好ましい。該標識が質量標識である場合、標識された増幅産物は１価正または負正味荷電を有し、質量分析計でより良い検出能を可能とする。検出は例えば、マトリックスアシストレーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）により、または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して、実施し、可視化してもよい。
【００５２】
マトリックスアシストレーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は生体分子の分析における非常に有効な開発である（カラス(Karas)およびヒレンカップ(Hillenkamp)、AnalChem.,60: 2299-30, 1988）。検体は光吸収性マトリックスに包埋する。マトリックスは短いレーザーパルスによって蒸発し、従って検体分子を未断片化状態で蒸気相中へ移送する。検体はマトリックス分子と衝突してイオン化される。負荷された電圧はイオンをフィールドフリー飛行管中へ加速する。それらの異なる質量により、イオンは異なった速度で加速される。小さなイオンは大きなものよりも早く検出器へ到達する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定は、ペプチドおよびタンパクの分析によく適している。核酸の分析は幾分、より困難である（グット(Gut)およびベック(Beck)、Current  Innovations  and  Future  Trends,1:147-57,1995）。核酸分析の感度は、ペプチドにおけるものよりもおよそ１００倍も低く、断片の大きさが増加するに従い逆比例して減少する。さらに、多重負電荷バッグボーンを有する核酸では、マトリックスを経たイオン化工程はより効率が低いと考えられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光測定では、マトリックスの選択がきわめて重要な役割を果たす。ペプチドの脱離では、非常に微細な結晶化を生じる数種の非常に有効なマトリックスが見出されている。現在、ＤＮＡに対して反応性ある数種のマトリックスが存在するが、ペプチドと核酸の感度の差異は減少していない。しかしながら、この感度の差異はペプチドにより類似するような方法でＤＮＡを化学的に修飾することによって減少され得る。例えば、バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩で置換されているホスホロチオエート核酸は、単純なアルカリ化化学（グット(Gut)およびベック(Beck)、NucleicAcidsRes. 23: 1367-73, 1995）を使用して、電荷中性ＤＮＡに変換され得る。この修飾ＤＮＡへ電荷タグを結合すると、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ感度がペプチドにおいて見られるものと同じ程度に増加する。電荷タグの結合のさらなる利点は、未修飾基質の検出を相当困難とする不純物の検出における大きな安定性である。
【００５３】
本方法の特に好ましい実施態様では、第３工程の増幅は、少なくとも１つのブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で実施する。このようなブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、ユ(Yu)ら、BioTechniques23:714-720,1997に記述されている。ブロッキングオリゴヌクレオチドの使用は、核酸亜集団の増幅において改良された特異性を可能にする。核酸にハイブリダイズしたブロッキングプローブは、該核酸のポリメラーゼを介する増幅を抑制するか、あるいは妨げる。本方法の１つの実施態様では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、バックグランドＤＮＡにハイブリダイズするように設計される。本方法の別な実施態様では、該オリゴヌクレオチドはメチル化核酸とは対照的に、非メチル化核酸の増幅を妨げるか、あるいは抑制するように設計されるか、またはその逆である。
【００５４】
ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーと同時に重亜硫酸塩処理された核酸にハイブリダイズする。核酸のＰＣＲ増幅はブロッキングプローブの５'位で停止し、その結果、核酸の増幅はブロッキングプローブに相補的な配列が存在するところで抑制される。プローブは重亜硫酸塩処理核酸にメチル化状態特異的方法でハイブリダイズするように設計してもよい。例えば、非メチル化核酸の集団内のメチル化核酸の検出において、問題の位置で非メチル化された核酸の増幅抑制は、「ＣｐＧ」ではなく、問題の位置の「ＴｐＧ」を含むブロッキングプローブを使用して実施する。本方法の１つの実施態様では、該ブロッキングオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号６〜配列番号２５からなる、好ましくは１つ以上のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む群から選択された長さ少なくとも１８塩基対の配列に相補的または同一であるべきである。本方法の１つの実施態様では、該オリゴヌクレオチド配列は、配列番号８５〜配列番号８７、９８、１０３および１０８およびこれらに相補的な配列からなる群から選択される。
【００５５】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ法において、ポリメラーゼを介する増幅の有効な破壊は、ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによって伸長しないことを要する。好ましくは、これは３'−デオキシオリゴヌクレオチド、または「遊離」ヒドロキシ基以外により３'位で誘導体化されたオリゴヌクレオチドであるブロッカーの使用により達成される。例えば、３'−Ｏ−アセチルオリゴヌクレオチドがブロッカー分子の好ましいものの代表である。
【００５６】
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼによる分解は阻止されるべきである。好ましくは、このような阻止は、５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用するか、あるいはブロッカー分子をヌクレアーゼ抵抗性とする５'−末端に、例えばチオエート架橋を有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用することを含む。特別な用途には、このようなブロッカーの５'修飾を必要としない。例えば、もしもブロッカー結合部位とプライマー結合部位が重複するなら、それによるプライマーの結合阻止（例えば、過剰ブロッカーで）、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解は、実質的に阻止されるであろう。これは、ポリメラーゼがプライマーをブロッカーに向って（５'−３'方向において）進ませる伸長を行わないことによる。これは通常、ハイブリダイズしたブロッカーオリゴヌクレオチドの分解となる方法である。
【００５７】
本発明の目的において、またここに実施されるように、特に好ましいブロッカー／ＰＣＲ実施態様は、ブロッキングオリゴヌクレオチドとしてのペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用を含む。このようなＰＮＡブロッカーオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼによって分解あるいは伸長しないため理想的に適している。
【００５８】
本方法の１つの実施態様では、ブロッキングオリゴヌクレオチドの結合部位はプライマーの結合部位と同じであるか、あるいは重複し、それによって、その結合部位へのプライマーのハイブリダイゼーションを阻止する。本方法のさらに好ましい実施態様では、２つ以上のこのようなブロッキングオリゴヌクレオチドを使用する。特に好ましい実施態様では、ブロッキングオリゴヌクレオチドのうちの１つのハイブリダイゼーションは、フォワードプライマーのハイブリダイゼーションを妨げ、プローブ（ブロッカー）オリゴヌクレオチドの他のもののハイブリダイゼーションは該フォワードプライマーの増幅産物へ結合するリバースプライマーのハイブリダイゼーションを妨げる。
【００５９】
本方法の別な実施態様では、ブロッキングオリゴヌクレオチドが処理されたバックグランドＤＮＡのリバースプライマー位置とフォワードプライマー位置の間にハイブリダイズし、それによって、プライマーオリゴヌクレオチドの伸長を妨げる。
ブロッキングオリゴヌクレオチドはプライマー濃度の少なくとも５倍の濃度で存在することが特に好ましい。
【００６０】
本方法の第４工程で、本方法の第３工程で得られた増幅産物は、処理前のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を確認するために分析される。
【００６１】
増幅産物がＭＳＰ増幅および／またはブロッキングオリゴヌクレオチドによって得られた実施態様では、増幅産物の有無がプライマーおよび／またはブロッキングオリゴヌクレオチドによってカバーされたＣｐＧ位置のメチル化状態そのものをその塩基配列により示す。電気泳動、配列決定、液体クロマトフラフィー、ハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ分析またはこれらの組合せを含むが、これらに限定されない可能性ある公知の分子生物学的方法の全てをこの検出において使用してもよい。本方法のこの工程は、さらに先の工程の定性的コントロールとして作用する。
【００６２】
本方法の第４工程で、標準的ＰＣＲおよびメチル化特異的ＰＣＲの双方によって得られた増幅産物は、さらに本方法の第１工程で単離されたゲノムＤＮＡのＣｐＧメチル化状態を決定するために分析される。これは、アレイ技術およびプローブ使用技術などの塩基利用方法によって、ならびに配列決定および鋳型特異的伸長などの技術によって、実施してもよいが、これらに限定されない。
【００６３】
本方法の１つの実施態様では、第３工程で合成された増幅産物は続いてオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡプローブのアレイまたはセットにハイブリダイズさせる。ここでは、ハイブリダイゼーションは次の方法：ハイブリダイゼーション中に使用されるプローブセットは好ましくは少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーからなり；この方法で生じる増幅産物は固相に先に結合されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして作用し；ハイブリダイズしなかった断片は続いて除去され；該オリゴヌクレオチドは配列番号２〜配列番号５に記載されている塩基配列のセグメントと逆相補的または同一である長さ少なくとも９ヌクレオチドを有する少なくとも１つの塩基配列を含み；そして、このセグメントは少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【００６４】
好ましい実施態様では、該ジヌクレオチドはオリゴマーの１／３の中央に存在する。例えば、オリゴマーが１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む場合、該ジヌクレオチドは好ましくは、１３マーの５'末端から５番目〜９番目のヌクレオチドである。１つのオリゴヌクレオチドは配列番号１〜配列番号５に記載される配列内の各ＣｐＧジヌクレオチドおよび配列番号６〜配列番号２５内の均等な位置の分析のために存在する。該オリゴヌクレオチドはまた、ペプチド核酸の形態であってもよい。次いで、ハイブリダイズされなかった増幅産物を除去する。ハイブリダイズされた増幅産物は検出される。ここで、増幅産物に結合された標識は、オリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位置で確認できることが好ましい。本方法の１つの実施態様では、該オリゴヌクレオチドは配列番号５０〜７７、８８および８９を含む群から選択してもよい。
【００６５】
本方法のなおも別な実施態様では、ＣｐＧ位置のゲノムメチル化状態はＰＣＲ増幅プライマー（該プライマーはメチル化特異的であるか、あるいは標準的である）と同時に重亜硫酸塩処理ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブによって確かめてもよい。
【００６６】
この方法の特に好ましい実施態様は、蛍光利用リアルタイム定量的ＰＣＲ（ハイド(Heid)ら、Genome Res. 6:986-994, 1996；米国特許第６，３３１，３９３号も参照）の使用である。この方法を利用する好ましい２つの実施態様が存在する。ＴａｑＭａｎTM分析として公知である１つの実施態様は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用する。ＴａｑＭａｎTMＰＣＲ反応は、フォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーの間に位置するＣｐＧリッチ配列にハイブリダイズするように設計されたＴａｑＭａｎTMプローブと呼ばれる非伸張性インテロゲイティングオリゴヌクレオチドを使用する。ＴａｑＭａｎTMプローブはさらに、蛍光「レポーター部分」およびＴａｑＭａｎTMオリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合したリンカー部分（例えば、ホスホアミダイト）に共有結合した「消光部分」を含む。ハイブリダイズしたプローブは置換され、増幅反応のポリメラーゼによって分解され、それによって蛍光が増加する。重亜硫酸塩処理に続く核酸内のメチル化分析において、プローブは米国特許第６，３３１，３９３号（ここにその全体が参考として導入される）に記載されるようにメチル化特異的であることが必要である。これは、ＭｅｔｈｙｌＬｉｇｈｔTMアッセイとしても公知である。この技術の第２の好ましい実施態様は、二重プローブ技術（ＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒTM）の使用であり、それぞれのプローブが蛍光分子の供与体または受容体を有し、互いに近接した２つのプローブのハイブリダイゼーションが増加または蛍光増幅プライマーによって示される。これらの両技術が重亜硫酸塩処理ＤＮＡの使用、さらにＣｐＧジヌクレオチド内のメチル化分析に適した方法で適用される。本方法の１つの実施態様では、該プローブオリゴヌクレオチド配列は、配列番号７８〜８４、９０、９９、１００、１０４、１０５、１０９および１１０を含む群から選択してもよい。
【００６７】
本方法のさらに好ましい実施態様では、本方法の第４工程はゴンザルゴ(Gonzalgo)およびジョーンズ(Jones)、Nucleic Acids Res.25:2529-2531, 1997に記載されるＭＳ−ＳＮｕＰＥなどの鋳型特異的オリゴヌクレオチド伸長を使用することを含む。該実施態様では、ＭＳ−ＳＮｕＰＥプライマーは配列番号２〜配列番号５の群から選択される１つ以上の配列のうち、長さ少なくとも９、好ましくは２５ヌクレオチド以下の配列と同一または相補的であることが好ましい。
【００６８】
本方法の別な実施態様では、本方法の第４工程は本方法の第３工程で生じた増幅産物の配列決定およびその後の配列分析を含む（サンガー(Sanger)F.ら、ProcNatlAcad Sci USA 74: 5463-5467, 1977）。
本発明のさらなる実施態様は、本発明のゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号５）のメチル化状態の前処理を必要としない分析方法を提供する。
【００６９】
このようなさらなる実施態様の第１工程では、ゲノムＤＮＡ試料は組織または細胞原料から単離される。好ましくは、このような原料としては細胞株、組織学的スライド、体液、またはパラフィン包埋組織が挙げられる。抽出は界面活性剤可溶化液の使用、超音波処理およびガラスビーズによる渦流動を含む当業者にとって標準的な手段によるが、これらに限定されない。一度、核酸が抽出されると、ゲノム二重鎖ＤＮＡが分析に使用される。
好ましい実施態様では、ＤＮＡは処理前に開裂されてもよく、これは特にメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを使用する当該技術分野で標準的な手段によってもよい。
【００７０】
第２工程では、次いでＤＮＡは１つ以上のメチル化感受性制限酵素により分解される。該分解は、制限部位のＤＮＡの加水分解が特異的ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を知らせるように実施される。
【００７１】
任意であるが、好ましい実施態様である第３工程では、制限酵素断片が増幅される。これは、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応を使用して実施され、該増幅産物は上記したような好適な検出可能な標識、いわゆる蛍光標識、放射性核種および質量標識を有していてもよい。
【００７２】
最終工程では、増幅産物が検出される。検出は当該技術分野で標準的な手段、例えばゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、ＰＣＲ産生物内の検出可能なタグの結合、ＤＮＡアレイ分析、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ分析によってもよいが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明は、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４内の重要な遺伝的および／または後成的パラメーターおよびそれらのプロモーターまたは制御要素がマーカーとして使用される、患者または個人にとって不利益な病気の診断および／または予知を可能とする。本発明の手段によって得られた該パラメーターは、遺伝的および／または後成的パラメーターの他のセットと比較してもよい。その差異が患者または個人にとって不利益である病気の診断および／または予知における基礎となる。
【００７４】
特に、本発明はバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４ＣｐＧジヌクレオチド配列の差別的メチル化の測定に基づく、診断的および／または予知的な癌アッセイを提供する。このような差別的メチル化を測定するのに有用な好ましい遺伝子配列は、配列番号１〜配列番号２５によってここに示されている。通常、このようなアッセイは、試験組織から組織試料を得て、該組織試料から誘導される本発明のバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよびＥＹＡ４特異的ＣｐＧジヌクレオチド配列の少なくとも１つのメチル化状態をコントロール試料と対比して測定するアッセイを行い、それに基づいて診断または予知を行うことを含む。
【００７５】
特に好ましい実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号：全オリゴヌクレオチドに対応する代表的な好ましいオリゴマーを含む配列番号１〜配列番号２５に基づくものなど、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリン、カルシトニンおよび／またはＥＹＡ４特異的ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を評価するために使用され、これらのアレイならびにこれらに基づくキットは癌および／または他の前立腺細胞増殖性疾患の診断および／または予知において有用である。
【００７６】
さらに、本発明は結腸細胞増殖性疾患の診断および／または治療における診断薬および／または治療剤に関し、該診断薬および／または治療剤は、配列番号１〜配列番号２５に基づく少なくとも１つのプライマーまたはプローブができるだけ好適な添加剤および補助剤とともに、該診断薬および／または治療剤を製造するために使用されることを特徴とする。
【００７７】
さらに、本発明のさらなる態様は、例えば：重亜硫酸塩含有試薬ならびに少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含むキットであり、その配列は各ケースにおいて配列番号１〜配列番号５の配列の１８塩基長セグメントに対応するか、相補的であるか、あるいは厳密なまたは高度に厳密な条件下にハイブリダイズする。該キットは、さらに上記した方法を実施し、かつ評価する指示書を含んでもよい。別な好ましい実施態様では、該キットはさらにＣｐＧ位置特異的メチル化分析を行うための標準試薬を含み、該分析は次の技術：ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM、ＣＯＢＲＡおよび核酸配列決定のうちの１つ以上を含む。しかしながら、本発明のキットは、また前記した成分の一部分のみを含むこともできる。
【００７８】
ＣＯＢＲＡ分析のための通常の試薬（例えば、通常のＣＯＢＲＡ系キットに見られるように）は、特異的遺伝子（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）のためのＰＣＲプライマー；制限酵素および適当な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴ；コントロールハイブリダイゼーションオリゴ；オリゴプローブのためのキナーゼ標識キット；および放射活性ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。さらに、重亜硫酸塩変換試薬は、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、親和性カラム）；脱スルホン化緩衝液；およびＤＮＡ回収成分を含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００７９】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイのための通常の試薬（例えば、通常のＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ系キットに見られるように）としては、特異的遺伝子（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）のためのＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎＲプローブ；至適ＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；およびＴａｑポリメラーゼを含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００８０】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ分析のための通常の試薬（例えば、通常のＭｓ−ＳＮｕＰＥ系キットに見られるように）としては、特異的遺伝子（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）のためのＰＣＲプライマー；至適ＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；ポジティブコントロールプライマー；特異的遺伝子のためのＭｓ−ＳＮｕＰＥプライマー；反応緩衝液（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）；および放射活性ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。さらに、重亜硫酸塩変換試薬としては、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、親和性カラム）；脱スルホン化緩衝液；およびＤＮＡ回収成分を含んでいてもよいがこれらに限定されない。
【００８１】
ＭＳＰ分析のための通常の試薬（例えば、通常のＭＳＰ系キットに見られるように）は、特異的遺伝子（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）のためのメチル化および非メチル化ＰＣＲプライマー；至適ＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、および特異的プローブを含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００８２】
定義
「ＣｐＧアイランド」との用語は、ＣｐＧジヌクレオチドの頻度が「観察／予測比率」>０．６に対応する基準（１）および「ＧＣ含量」>０．５である基準（２）を満足するゲノムＤＮＡの隣接領域を呼ぶ。ＣｐＧアイランドは通常、長さ約０．２〜約１ｋｂであるが、これに限定されない。
【００８３】
「メチル化状況」または「メチル化状態」との用語は、ＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の有無をいう。ＤＮＡ配列内の１つ以上の特定の回文構造のＣｐＧメチル化部位（それぞれは２つのＣｐＧＣｐＧジヌクレオチド配列を有する）のメチル化状態は、「非メチル化」、「完全メチル化」および「半メチル化」を含む。
【００８４】
「半−メチル化」または「半メチル化」との用語は、回文構造のＣｐＧメチル化部位の２つのＣｐＧジヌクレオチド配列のうちの１つにおける１つのシトシンのみがメチル化されている（例えば、５'−ＣＣＭＧＧ−３'（トップ鎖）：３'−ＧＧＣＣ−５'（ボトム鎖））回文構造のＣｐＧメチル化部位のメチル化状態をいう。
【００８５】
「高メチル化」との用語は、正常なコントロールＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔ量に対する、試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの増加に対応した平均的メチル化状態をいう。
【００８６】
「低メチル化」との用語は、正常なコントロールＤＮＡ試料内の対応ＣｐＧジヌクレオチドに見られる５−ｍＣｙｔ量に対する、試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの減少に対応した平均的メチル化状態をいう。
【００８７】
「マイクロアレイ」との用語は、当該技術分野で認められるに広く「ＤＮＡマイクロアレイ」および「ＤＮＡチップ」をいい、全技術分野で認められる固体支持体を包含し、かつ、それに核酸分子を固定する方法およびその上で核酸を合成する方法を包含する。
【００８８】
「遺伝的パラメーター」は遺伝子およびその制御にさらに必要である配列の変異および多型である。特に、挿入、欠失、点変異、転化および多型を変異といい、かつ、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）が特に好ましい。
【００８９】
「後成的パラメーター」は、特にシトシンメチル化である。別な後成的パラメーターとしては、上述した方法を使用して直接に分析することができないが、代わって、ＤＮＡメチル化と関連する、例えばヒストンのアセチル化が挙げられる。
【００９０】
「重亜硫酸塩試薬」との用語は、メチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するために、ここに記載される有用な重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩またはこれらの組合せを含む試薬をいう。
【００９１】
「メチル化アッセイ」との用語は、ＤＮＡの配列内の１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するいかなる分析をいう。
【００９２】
「ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ」（メチル化感受性アービトラリリープライムド（Arbitrarily-Primed）ポリメラーゼ連鎖反応）との用語は、ＣｐＧジヌクレオチドを含む可能性が最も高い領域に焦点を当てたＣＧリッチプライマーを使用するゲノムの広範囲のスキャンを可能とする当該技術分野で認められた技術をいい、これは、ゴンザルゴ(Gonzalgo)ら、CancerResearch57: 594-599, 1997に記載される。
【００９３】
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ」との用語は、イーズ(Eads)ら、Cancer Res. 59: 2302-2306, 1999に記載される当該技術分野で認識されている蛍光系リアルタイムＰＣＲ技術をいう。
【００９４】
ここで実施される実施態様の「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ」アッセイとの用語は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTMＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを呼ぶ。これはＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイの変形であり、ここで、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは増幅プライマー間のＣｐＧ位置を包囲するメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わされる。
【００９５】
「Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）との用語は、ゴンザルゴ(Gonzalgo)およびジョーンズ(Jones)、NucleicAcidsRes. 25: 2529-2531, 1997に記載される当該技術分野で認識されているアッセイをいう。
【００９６】
「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）との用語は、ハーマン（Herman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826,1996および米国特許第５７８６１４６号に記載される当該技術分野で認識されているアッセイをいう。
【００９７】
「ＣＯＢＲＡ」（混合型重亜硫酸塩限定分析）との用語は、ション(Xiong)およびレアード(Laird)、Nucleic Acids Res.25:2532-2534,1997に記載される当該技術分野で認識されているメチル化分析をいう。
【００９８】
「ハイブリダイゼーション」との用語は、試料ＤＮＡ中でワトソン−クリック塩基対形成に似た方法で、二重鎖構造を形成する相補的配列へのオリゴヌクレオチドの結合として理解されるべきである。
【００９９】
ここで定義される「厳密なハイブリダイゼーション条件」とは、５×ＳＳＣ／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃でハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中にて室温で洗浄することを含み、当該技術分野で認識されている均等なもの（例えば、ハイブリダイゼーションを２．５×ＳＳＣ緩衝液中、６０℃で実施し、続いて、低緩衝液濃度にて３７℃で数回洗浄工程を行い、そして安定な状態とする）を含む。ここに定義される中程度に厳蜜な条件は、３×ＳＳＣ中、４２℃での洗浄、あるいは当該技術分野で認識されている均等なものを含むことに関する。塩濃度および温度のパラメーターは、プローブと標的核酸間の同一性の至適レベルを達成するために変化し得る。このような条件に関する手引きは、例えば、サンブルック(Sambrook)ら、1989,MolecularCloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；およびオーズベル(Ausubel)ら（編集）、1995,CurrentProtocols in Molecular Biology,(John Wiley & Sons, N.Y.)のユニット2.10により、当該技術分野で容易に入手可能である。
ここで使用される「バックグランドＤＮＡ」は、結腸細胞以外の原料に由来する全ての核酸をいう。
【実施例】
【０１００】
次の実施例は、健康および病的結腸細胞増殖性疾患試料中のＥＹＡ４、カルシトニン、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリンおよびバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）遺伝子のメチル化状態の分析を記載する。該遺伝子と結腸細胞増殖性疾患の初期関連性は、下記実施例１３に記載されたハイブリダイゼーション分析によって初めてもたらされた。次いで、ＴＹＡ４、カルシトニン、ＴＰＥＦ、Ｈ−カドヘリンおよびバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）遺伝子をこれらの実施例で分析されるより大きな遺伝子群から選択し、メチル化状態と結腸細胞増殖性疾患との相関性を他のメチル化分析技術、いわゆるＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔおよびＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用し、試料を分析して確認した。「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ」との用語は、Ｔａｑｍａｎ（単一プローブ）およびＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（二重プローブ）技術の両プローブを使用する重亜硫酸塩処理ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析を記述するために使用されることを注記する。
【０１０１】
実施例１
ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用する結腸癌内のメチル化分析
（ＥＹＡ４）ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ抽出キットを使用して３３個の結腸腺腫試料および４３個の結腸正常隣接組織から抽出した。各試料から得たＤＮＡはアガロースビーズ法（オレク(Olek)ら、1996）による重亜硫酸塩溶液（亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）を使用して処理した。この処理は試料内の非メチル化シトシンの全てがチミジンに変換されるようなものである。逆に、試料内の５―メチル化シトシンは未変性のままである。
【０１０２】
メチル化状態は、問題のＣｐＧアイランド（island）のために設計されたＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイとベータアクチン遺伝子から得たコントロール断片（イーズ(Eads)ら、2001）を使用して測定した。ＣｐＧアイランドアッセイは、プライマーおよびＴａｑｍａｎスタイルプローブに両方にＣｐＧ部位を包含し、一方、コントロール遺伝子は包含しない。コントロール遺伝子は全ＤＮＡ濃度の目安として使用され、ＣｐＧアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）はその部位のメチル化の程度を測定する。
【０１０３】
方法：ＥＹＡ４遺伝子ＣｐＧアイランドアッセイは、下記プライマーおよびプローブを使用して実施した。
フォワードプライマー：CGGAGGGTACGGAGATTACG（配列番号４０）：
リバースプライマー：CGACGACGCGCGAAA（配列番号４１）：および
プローブ：CGAAACCCTAAATATCCCGAATAACGCCG（配列番号８１）
対応するコントロールアッセイは、下記プライマーおよびプローブを使用して実施した。
プライマー：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT（配列番号９１）
プライマー：AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA（配列番号９２）および
プローブ：ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA（配列番号９３）
下記アッセイ条件でもって、各ＤＮＡ試料について反応を３回、実施した。
反応溶液：（９００ｎＭプライマー；３００ｎＭプローブ；３．５ｍＭ塩化マグネシウム；Ｔａｑポリメラーゼ１単位；２００μＭ  ｄＮＴＰ；ＤＮＡ７μｌ；最終反応容量２０μＬ中）；
サイクリング条件：（９５℃、１０分、次いで、９５℃で１５秒、６０℃で１分を５０サイクル）  
【０１０４】
データは既に文献（イーズ(Eads)ら、2001）に記載されているＰＭＲ計算を使用して分析した。
結果；正常な試料の平均ＰＭＲは０．１５であり、標準偏差は０．１８であった。腫瘍試料の平均ＰＭＲは１７．９８であり、標準偏差は１８．１８であった。腫瘍試料と正常試料のメチル化程度の全体的差異は、ｔ−検定で有意であった（ｐ＝０．０００００３１２）。その結果を図１に示す。該アッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）もまた測定した。ＲＯＣは診断試験の異なる可能カットポイントにおける偽ポジティブ割合に対する真のポジティブ割合のプロットである。これは選択カットポイントに依存する感度および特異性間のトレードオフを示す（感度の増加は特異性の減少を伴うであろう）。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は診断試験の精度の基準である（その領域が大きいほど良く、最適は１であり、ランダム試験は領域０．５を有する対角線上に位置するＲＯＣ曲線を有する。J.P.イーガン(Eagan)、「シグナル検出理論とＲＯＣ分析」、AcademicPress, NewYork, 1975）参照。ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは０．９４である（図２）。
【０１０５】
実施例２
結腸癌内のメチル化はＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して分析した。同じＤＮＡ試料をＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイとも呼ばれるＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（またはＨＭ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ）アッセイを用いて、ＣｐＧアイランドのメチル化を分析することにも使用した。メチル化状態は上記したように、問題のＣｐＧアイランドおよび同じコントロール遺伝子分析のために設定されたＨＭ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して測定した。ＣｐＧアイランドアッセイはブロッカーとＴａｑｍａｎスタイルプローブの両方にＣｐＧ部位を包含するが、コントロール遺伝子は包含しない。
【０１０６】
方法：下記プライマーおよびプローブを使用して、ＣｐＧアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）を実施した。
フォワードプライマー：GGTGATTGTTTATTGTTATGGTTTG（配列番号４４）
リバースプライマー：CCCCTCAACCTAAAAACTACAAC（配列番号４５）
フォワードブロッカー：GTTATGGTTTGTGATTTTGTGTGGG（配列番号８７）
リバースブロッカー：AAACTACAACCACTCAAATCAACCCA（配列番号８６）
プローブ：AAAATTACGACGACGCCACCCGAAA（配列番号８４）
【０１０７】
下記アッセイ条件でもって、各ＤＮＡ試料について反応を３回、実施した：
反応溶液：（４００ｎＭプライマー；４００ｎＭプローブ；１０μＭ両ブロッカー；３．５ｍＭ塩化マグネシウム；１×ＡＢＩＴａｑｍａｎ緩衝液；ＡＢＩ ＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼ１単位；２００μＭ  ｄＮＴＰ；およびＤＮＡ７μｌ、最終反応溶液２０μｌ中）；
サイクリング条件：（９５℃で１０分）；（９５℃で１５秒、６４℃で１分（２サイクル））；（９５℃で１５秒、６２℃で１分（２サイクル））；（９５℃で１５秒、６０℃で１分（２サイクル））；および（９５℃で１５秒、５８℃で１分、６０℃で４０秒（４１サイクル））
【０１０８】
結果：正常試料の平均ＰＭＲは１．１２であり、標準偏差は１．４５であった。腫瘍試料の平均ＰＭＲは３８．２３であり、標準偏差は３３．２２であった。腫瘍試料と正常試料のメチル化程度の全体的差異は、ｔ−検定で有意である（ｐ＝００００００３２６）。その結果を図１に示す。
該アッセイのＲＯＣ曲線も測定した。ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは０．９１である（図３）。
該アッセイを結腸試料の別なセット（２５個の腺癌、３３個の正常、および１３個の腺腫瘍）において試験した。その結果は再び有意な差異を示した（図４）。ＲＯＣを図５〜７に示す。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイのＭＳＰおよびＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ変異体が、ＥＹＡ４遺伝子のメチル化分析おいて均等であると決定された。図２２は２つの方法を使用した各試料で検出されたメチル化パーセントの回帰プロットを示す。
【０１０９】
実施例３
ＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイもまた、他の組織のパネルに対して試験した（図８）。結腸癌試料のほかに、２つの乳癌組織の１つのみがメチル化されていた。しかしながら、２１個のさらなる乳癌腫瘍（異なった段階）パネルで、たった１つがメチル化されていた（図９）。それゆえ、このマーカーは結腸腫瘍試料に対して特異的である。全てのプライマー、プローブ、ブロッカーおよび反応条件は、結腸癌試料の分析に使用されたもの（実施例２）と同一とした。
【０１１０】
実施例４
リアルタイムＰＣＲで分析した結腸組織のうち、１２個は外科手術前に採取されたペア血清も有していた。我々はＱｕｉａｇｅｎ ＵｌｔｒａＳｅｎｓ ＤＮＡ抽出キットを使用して、該血清１ｍｌからＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ試料を重亜硫酸塩処理し、該試料についてＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを実施した。コントロール遺伝子は癌血清試料のうちの３個および正常血清試料のうちの３個において増幅しなかったことから、これらの事例では試料調製が正常にできなかったと結論を下した。他の事例では、正常試料よりも癌試料で高いメチル化の証拠が存在していた（図１０）。
【０１１１】
実施例５
カルシトニン−ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用する結腸癌内のメチル化分析
実施例１に記載した結腸癌試料は、ＴａｑｍａｎRスタイルプローブを用い、カルシトニン−ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して分析した。試料調製を上記したようにして実施した（実施例１）。アッセイは、下記プライマーおよびプローブを使用して実施した。
プライマー：AGGTTATCGTCGTGCGAGTGT（配列番号３４）；
プライマー：TCACTCAAACGTATCCCAAACCTA（配列番号３５）；および
プローブ：CGAATCTCTCGAACGATCGCATCCA（配列番号７８）
【０１１２】
対応するコントロールアッセイを上記したようにして実施した（実施例１）。
下記アッセイ条件を用い、各ＤＮＡ試料について反応を３回、実施した。
反応溶液：（９００ｎＭプライマー；３００ｎＭプローブ；３．５ｍＭ塩化マグネシウム；ｔａｑポリメラーゼ１単位；２００μＭ  ｄＮＴＰ；ＤＮＡ７μｌ；最終反応容量２０μｌ中）；
サイクリング条件：（９５℃で１０分;９５℃で１５秒；６７℃で１分（３サイクル））；（９５℃で１５秒，６４℃で１分（３サイクル））；（９５℃で１５秒，６２℃で1分(３サイクル））；および（９５℃で１５秒、６０℃で１分（４０サイクル））
【０１１３】
データは文献（イーズ(Eads)ら、2001）に既に記載されるＰＭＲ計算を使用して分析した。
結果：正常試料の平均ＰＭＲは０．１９であり、標準偏差は０．７９であった。正常試料のいずれも正規平均に関する２つの標準偏差よりも大きくなかったが、腫瘍試料３３個のうち１８個がメチル化のこの程度にまで達した。腫瘍試料と正常試料のメチル化程度の全体的差異は、ｔ−検定で有意であった（ｐ＝０．００２）。その結果を図１に示す。有意にも腫瘍試料は正常コントロール組織に比べて大幅に高メチル化されていた。該アッセイのＲＯＣ曲線も測定した。ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは０．８０であった（図１１）。
【０１１４】
実施例６
結腸癌内のメチル化をカルシトニン−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して分析した。ＴａｑｍａｎRスタイルプローブを使用するＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して、カルシトニン−ＣｐＧアイランドのメチル化を分析するために、同じＤＮＡ試料を使用した（実施例２参照）。
ＣｐＧアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）を下記プライマーおよびプローブを使用して実施した：
プライマー：GGATGTGAGAGTTGTTGAGGTTA（配列番号４６）；
プライマー：ACACACCCAAACCCATTACTATCT（配列番号４７）；
プローブ：ACCTCCGAATCTCTCGAACGATCGC（配列番号８３）；および
ブロッカー：TGTTGAGGTTATGTGTAATTGGGTGTGA（配列番号８５）
【０１１５】
下記アッセイ条件を用い、各ＤＮＡ試料について反応をそれぞれ３回、実施した：
反応溶液：（３００ｎＭプライマー；４５０ｎＭプローブ；３．５ｍＭ塩化マグネシウム；ｔａｑポリメラーゼ２単位；４００μＭ  ｄＮＴＰ；５μＭブロッカー；およびＤＮＡ７μｌ；最終反応容量２０μｌ中）
サイクリング条件：（９５℃で１０分）；（９５℃で１５秒、６７℃で１分（３サイクル））；（９５℃で１５秒、６４℃で１分（３サイクル））；（９５℃で１５秒、６２℃で１分（３サイクル））；および（９５℃で１５秒、６０℃で１分（４０サイクル））
【０１１６】
対応するコントロールアッセイを上記したようにして実施した（実施例２）。
結果：正常試料の平均ＰＭＲは０．１３であり、標準偏差は０．５８であった。正常試料のいずれも正規平均について２つの標準偏差よりも大きくなかったが、腫瘍試料３３個のうち、１９個はメチル化のこの程度にまで達した。腫瘍試料と正常試料とのメチル化の程度の全体的差異はｔ−検定で有意である（ｐ＝０．０００４）。その結果を図１に示す。該アッセイのＲＯＣ曲線もまた、測定した。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイは０．８４である（図１２）。
【０１１７】
カルシトニンおよびＥＹＡ４遺伝子を含む遺伝子パネルを分析するリアルタイムアッセイの感度および特異性を評価するために、該アッセイのＲＯＣを、ロジスティックモデルを使用して、２つの遺伝子（上記した）のＲＯＣを組み合わせてインシリコ(insillico)で決定した。該曲線のＡＵＣ（図２１）は０．９７である。
【０１１８】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイのＭＳＰおよびＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ変異体は、カルシトニン遺伝子のメチル化分析において、均等であると判断した。図２３は２つの方法を使用して各試料で検出されたメチル化パーセントの回帰プロットを示す。
【０１１９】
実施例７
カルシトニン−ＨＭ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイ
リアルタイムＰＣＲで分析した結腸組織のうち、１２個は外科手術前に採取したペア血清を有していた。Ｑｕｉａｇｅｎ  ＵｌａｔｒａＳｅｎｓRＤＮＡ抽出キットを使用して、該血清１ｍｌからＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ試料を亜硫酸塩処理し、そして、これらの試料についてＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを実施した（実施例３参照）。カルシトニンは全腫瘍中でメチル化されていなかったが、腫瘍中に最も高い程度のメチル化を示す５人の患者の血清のうち、４つの血清中にメチル化を検出することができた。これに対し、健康な供与者から採取した１１個の血清試料のいずれにもメチル化を検出できなかった。
【０１２０】
実施例８
カルシトニン遺伝子内のＣｐＧ部位のメチル化状態の同定
カルシトニン遺伝子（配列番号１）の上流領域断片をプライマー：
CCTTAGTCCCTACCTCTGCT（配列番号９４）およびCTCATTTACACACACCCAAAC（配列番号９５）を使用するＰＣＲにより増幅した。得られた長さ３７８ｂｐの増幅産物は、１６５位に参考となるＣｐＧを含んでいた。増幅産物ＤＮＡを認識モチーフGGCGCCであるメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＮａｒＩを使用して分解した。該エンドヌクレアーゼによる加水分解は増幅産物の１６５位のＣｐＧをメチル化することによって阻止した。分解物をコントロールとして使用した。
【０１２１】
ＤＮＡ ｗｉｚｚａｒｄRＤＮＡ単離キット（Promega）を使用して、ゲノムＤＮＡを試料から単離した。製造者（NewEnglandBiolabs）の推奨に従い、ＮａｒＩを使用して各試料を分解した。
【０１２２】
次いで、各ゲノム分解物約１０ｎｇをＰＣＲプライマー：CCTTAGTCCCTACCTCTGCT（配列番号９４）およびCTCATTTACACACACCCAAAC（配列番号９５）を使用して増幅した。ＰＣＲ反応は、サーモサイクラー（EppendorfGmbH）を使用し、ＤＮＡ１０ｎｇ、各プライマー６ｐｍｏｌｅ、各ｄＮＴＰを２００μＭ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびＨｏｔｓｔａｒｔRＴａｑ（QuiagenAG）を使用して実施した。他の条件はＴａｑポリメラーゼ製造者が推奨するものであった。
【０１２３】
上記プライマーを使用して、遺伝子断片を変性工程１：９６℃で１４分、続いて（工程２：９６℃で６０秒、工程３：５２℃で４５秒、工程４：７２℃で７５秒）３０〜４５回、そして引き続き７２℃で１０分の最終伸長を実施するＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物の存在はアガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１２４】
サイクルプログラムの工程２から工程４が３４、３７、３９、４２および４５回繰り返されたとき、ＰＣＲ産物は単離されたＮａｒＩ加水分解ＤＮＡで検出可能であり、問題の組織は非メチル化ＤＮＡを含んでいた。対照的に、ＰＣＲ産物はサイクルプログラムの工程２から工程４が４２および４５回繰り返されたとき、下方メチル化組織から単離したＮａｒＩ加水分解ＤＮＡによってのみ検出可能であった。
【０１２５】
実施例９
バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用する結腸癌内のメチル化分析
ＴａｑｍａｎRスタイルプローブを使用するバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して、実施例１に記載された結腸癌試料を分析した。試料調製は上記したようにして実施した（実施例１）。該アッセイは下記プライマーおよびプローブを使用して実施した：
フォワードプライマー：TGGGATTAAGATTTTCGGTTAGTTTC（配列番号３６）
リバースプライマー：CACTACAACGCTACGCGACTAAA（配列番号３７）
プローブ：TCGACGTTACCCAAACGAATCACATAAAAAAC（配列番号７９）
【０１２６】
対応するコントロールアッセイは上記したようにして実施した（実施例１）。下記アッセイ条件にて各ＤＮＡ試料について、反応を３回、実施した。
反応溶液：（９００ｎＭプライマー；３００ｎＭプローブ；３．５ｍＭ塩化マグネシウム；Ｔａｑポリメラーゼ１単位；２００μＭ  ｄＮＴＰ；５μＭブロッカー；およびＤＮＡ７μｌ、最終反応容量２０μｌ中）；
サイクリング条件：９５℃で１０分；（９５℃で１５秒、６０℃で１分）５０サイクル。データは文献（イーズ(Eads)ら、2001）に既に記載されているＰＭＲ計算を使用して分析した。
【０１２７】
結果：その結果を図１に示す。正常試料の平均ＰＭＲは３．９３であり、標準偏差は３．５７であった。腫瘍試料の平均ＰＭＲは２３．０６であり、標準偏差は２０．２３であった。腫瘍試料と正常試料のメチル化程度の全体的差異は、ｔ−検定で有意である（ｐ＝０．０００００３０６３）。該アッセイのＲＯＣ曲線を図１３に示す。ＡＵＣは０．８４である。
これは、さらに二重Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒプローブを使用するバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して確認した。
【０１２８】
方法：ＣｐＧアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）は、下記プライマーおよびプローブを使用して実施した。
フォワードプライマー：TGGATAGGAGTTGGGATTAAGATTTT（配列番号９６）
リバースプライマー：CTTATTACAATTTAAAAAAAAAATTCACTACAA（配列番号９７）
ブロッカー：AAATTCACTACAACACTACACAACTAAATTCAACATTAC（配列番号９８）
プローブ：TTTTCGTATTTTTTTTCGGGTTATTACGTTTT-Fluor （配列番号９９）
プローブ：LC640-ATGTGATTCGTTTGGGTAACGTCGA-Phos（配列番号１００）
【０１２９】
下記アッセイ条件を使用し、各ＤＮＡ試料についてそれぞれ反応を３回、実施した：
反応条件：
５００ｎＭプライマー
１０μＭブロッカー
２５０ｎＭプローブ
【０１３０】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔハイブリダイゼーションプローブ混合物
４ｍＭ塩化マグネシウム
サイクリングプロフィール：
９５℃で１０分間の変性
９５℃で１０秒、５７℃で３０秒、７２℃で２０秒を５０サイクル
【０１３１】
実施例１０
ＴＰＥＦ−ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用する結腸癌内のメチル化分析
ＴａｑＭａｎRスタイルプローブを使用するＴＰＥＦ−ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して、実施例１に記載した結腸癌組織を分析した。試料調製は上記したようにして実施した（実施例１）。該アッセイは下記プライマーおよびプローブを使用して実施した。
フォワードプライマー：TTTTTTTTTCGGACGTCGTTG（配列番号３８）
リバースプライマー：CCTCTACATACGCCGCGAAT（配列番号３９）
プローブ：AATTACCGAAAACATCGACCGA（配列番号８０）
【０１３２】
下記アッセイ条件を使用して、各ＤＮＡ試料について反応を３回、実施した：
反応溶液：（９００ｎＭプライマー；３００ｎＭプローブ；３．５ｍＭ塩化マグネシウム；Ｔａｑポリメラーゼ１単位；２００μＭ  ｄＮＴＰ、５μＭブロッカー；およびＤＮＡ７μｌ、最終反応容量２０μｌ中）；
サイクリング条件：９５℃で１０分；（９５℃で１５秒、６０℃で１分）５０サイクル
【０１３３】
対応するコントロールアッセイを上記したようにして実施した（実施例１）。
データは文献（イーズ(Eads)ら、2001）に既に記載されるＰＭＲ計算を使用して分析した。
結果：その結果を図１に示す。正常試料の平均ＰＭＲは３．０４であり、標準偏差は４．２１であった。腫瘍試料の平均ＰＭＲは２１．３８であり、標準偏差は２４．０８であった。腫瘍試料と正常試料とのメチル化程度の全体的差異はｔ−検定で有意である（ｐ＝０．００００１０１９７３）。該アッセイのＲＯＣ曲線を図１４に示す。ＡＵＣは０．８０である。
【０１３４】
これは、さらにＴＰＥＦ−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイ（二重標識Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒプローブを使用する）を用いて確証した。
方法：ＣｐＧアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）を下記プライマーおよびプローブを使用して実施した：
フォワードプライマー：GTAGGGTTATTGTTTGGGTTAATAAAT（配列番号１０１）
リバースプライマー：TAAAAAAAAAAAAAAAACTCCTCTACATAC（配列番号１０２）
ブロッカー：AACTCCTCTACATACACCACAAATAAATT（配列番号１０３）
プローブ：CGAAAACATCGACCGAACAACG-Fluor（配列番号１０４）
プローブ：LC640-GTCCGAAAAAAAAAAAACGAACTCC-Phos（配列番号１０５）
【０１３５】
下記アッセイ条件を使用して、各ＤＮＡ試料についてそれぞれ反応を３回、実施した：
反応条件：
フォワードプライマー：６００ｎＭ
リバースプライマー：３００ｎＭ
ブロッカー：１０μＭ
プローブ：５００ｎＭ
Ｔａｑポリメラーゼ：０．１単位／μｌ
ｄＮＴＰ：それぞれ０．２ｍＭ
塩化マグネシウム：４ｍＭ
ＢＳＡ：０．２５ｍｇ／ｍｌ
ＭｇＣｌ不含Roche緩衝液：１×
【０１３６】
サイクリング条件：
９５℃で１０分の変性
９５℃で１０秒、５７℃で２５秒、７２℃で１０秒を５０サイクル
【０１３７】
実施例１１
ＴＰＥＦ−ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用する結腸癌内のメチル化分析
ＴＰＥＦの別なアッセイを結腸試料について試験した。該アッセイは２セットの組織、すなわち結腸腺癌１２個および正常隣接組織試料１２個についてそれぞれ試験した。
試料調製は上記したようにして実施した（実施例１）。該アッセイは下記プライマーおよびプローブを使用して実施した。
フォワードプライマー：GGACGTTTTTTATCGAAGGCG（配列番号４８）
リバースプライマー：GCCACCCAACCGCGA（配列番号４９）
プローブ：ACCCGAAATCACGCGCGAAAAA（配列番号９０）
【０１３８】
下記アッセイ条件を使用して、各ＤＮＡ試料について反応を３回、実施した：
反応溶液：（９００ｎＭプライマー；３００ｎＭプローブ；３．５ｍＭ塩化マグネシウム；Ｔａｑポリメラーゼ１単位；２００μＭ  ｄＮＴＰ、５μＭブロッカー；およびＤＮＡ７μｌ、最終反応容量２０μｌ中）；
サイクリング条件：９５℃で１０分；（９５℃で１５秒、６０℃で１分）５０サイクル
【０１３９】
対応するコントロールアッセイは上記したようにして実施した（実施例１）。
データは文献（イーズ(Eads)ら、2001）に既に記載されるＰＭＲ計算を使用して分析した。両事例で、ＴＰＥＦは癌試料で有意によりメチル化されていた。該アッセイのＲＯＣ曲線を図１９〜２０に示す。ＡＵＣは０．９３および１である。
【０１４０】
実施例１２
Ｈ−カドヘリン−ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用する結腸癌内のメチル化分析
Ｈ−カドヘリン−ＭＳＰ−ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して、実施例１に記載した結腸癌試料を分析した。試料調製は上記したようにして実施した（実施例１）。該アッセイは下記プライマーおよびプローブを使用して実施した。
フォワードプライマー：GACGGATTTTTTTTTAACGTTTTTTC（配列番号４２）
リバースプライマー：AAATAAAATACCACCTCCGCGA（配列番号４３）
プローブ：GCTCCTCGCGAAATACTCACCCCG（配列番号８２）
【０１４１】
下記アッセイ条件を使用して、各ＤＮＡ試料について反応を３回、実施した：
反応溶液：（９００ｎＭプライマー；３００ｎＭプローブ；３．５ｍＭ塩化マグネシウム；Ｔａｑポリメラーゼ１単位；２００μＭ  ｄＮＴＰ、５μＭブロッカー；およびＤＮＡ７μｌ、最終反応容量２０μｌ中）；
サイクリング条件：９５℃で１０分；（９５℃で１５秒、６０℃で１分）５０サイクル
対応するコントロールアッセイは上記したようにして実施した（実施例１）。
データは文献（イーズ(Eads)ら、2001）に既に記載されているＰＭＲ計算を使用して分析した。
【０１４２】
結果：その結果を図１に示す。正常試料の平均ＰＭＲは２．２５であり、標準偏差は２．４２であった。腫瘍試料の平均ＰＭＲは２５．６７であり、標準偏差は１７．５７であった。腫瘍試料と正常試料とのメチル化程度の全体的差異はｔ−検定で有意である（ｐ＝０．００００００００１１８）。該アッセイのＲＯＣ曲線を図１５に示す。ＡＵＣは０．９４である。
このことは、さらにＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ二重プローブ技術を用いる二重Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒプローブを使用し、Ｈ−カドヘリン−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを使用して確認した。
【０１４３】
方法：ＣｐＧアイランドアッセイ（メチル化アッセイ）を下記プライマーを使用して実施した：
フォワードプライマー：GTTAGTTAGTTAATTTTTTAAATAGATTAGTAG（配列番号１０６）
リバースプライマー：CAAAAAAACAAATAAAATACCACCTCC（配列番号１０７）
ブロッカー：CCTCCACAAAACTCACTCCTCACAAAATAC（配列番号１０８）
プローブ：red640 TTTCGTTTTGTATGGTAGATACGGGGTGA- phosphate（配列番号１０９）
プローブ：ATTAATGGTTTTATAAGACGGATTTTTTTTTAACGT- fluorescine（配列番号１１０）
下記アッセイ条件を使用して、各ＤＮＡ試料について反応を３回、実施した：
反応条件：
フォワードプライマー：６００ｎＭ
リバースプライマー：３００ｎＭ
ブロッカー：１０μＭ
プローブ：５００ｎＭ
Ｔａｑポリメラーゼ：０．１単位／μｌ
ｄＮＴＰ：各０．２ｍＭ
塩化マグネシウム：４ｍＭ
ＢＳＡ：０．２５ｍｇ／ｍｌ
ＭｇＣｌ不含Roche緩衝液：１×
サイクリング条件：
９５℃で１０分の変性
９５℃で１０秒、５７℃で２５秒、７２℃で１０秒を５０サイクル
【０１４４】
実施例１３
結腸癌試料のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ−ＰＣＲ
第１工程でＷｉｚｚａｒｄキット（Promega）を使用して、ゲノムＤＮＡを細胞試料から単離した。重亜硫酸塩溶液（亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）を使用して、試料から単離されたゲノムＤＮＡを処理した。該処理は試料内の全非メチル化シトシンをチアミンに変換し、逆に試料内の５−メチル化シトシンを未変性のまま残す。次いで、Ｃｙ５蛍光標識プライマーとの反応当たり８断片を増幅する多重ＰＣＲを使用して、処理された核酸を増幅した。使用したＰＣＲプライマーを表１に記載する。ＰＣＲ条件は以下の通りであった。
【０１４５】
反応溶液：
重亜硫酸塩処理ＤＮＡ１０ｎｇ
３．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
４００μＭ  ｄＮＴＰ
各プライマー２ｐｍｏｌ
Ｈｏｔ Ｓｔａｒ Ｔａｑ（Qiagen）１単位
【０１４６】
以下のようにして増幅を４０サイクル、実施した。９５℃で１５分の変性、続いて５５℃で４５秒のアニーリング、６５℃で２分のプライマー伸長、６５℃での最終伸長は１０分行った。
次いで、各ＣｐＧ位置の１対の固定化オリゴヌクレオチドを有するガラススライドに、各個人試料から得た全てのＰＣＲ産物をハイブリダイズさせた。これらの検出オリゴヌクレオチドのそれぞれは、最初から非メチル化（ＴＧ）またはメチル化（ＣＧ）のいずれかである１つのＣｐＧ部位のまわりの重亜硫酸塩変換配列にハイブリダイズするように設計した。使用した全ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドのさらなる詳細は、表２を参照（参考および非参考の両方）。ハイブリダイゼーション条件は、ＴＧ変異体およびＣＧ変異体の単一ヌクレオチド差異を検出することができるように選択した。
【０１４７】
各多重ＰＣＲ産物の５μｌ容量を１０×Ｓｓａｒｃ緩衝液（１０×Ｓｓａｒｃ：２０×ＳＳＣ２３０ｍｌ、２０％ナトリウムラウロイルサルコシネート溶液１８０ｍｌ、ｄＨ２Ｏで１０００ｍｌに希釈）で希釈した。次いで、反応混合物を以下のように検出オリゴヌクレオチドとハブリダイズさせた。９５℃で変性、１０℃まで冷却、４２℃で一夜、ハイブリダイゼーション、次いで、４２℃で１０×ＳｓａｒｃおよびｄＨ２Ｏで洗浄。
【０１４８】
各ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドからの蛍光シグナルをｇｅｎｅｐｉｘスキャナーとソフトウェアを使用して検出した。２つのシグナル（各ＣｐＧ位置を分析するために使用したＣＧオリゴヌクレオチドとＴＧオリゴヌクレオチドから）の割合は、蛍光シグナルの強度比較に基づいて計算した。
【０１４９】
次いで、アルゴリズムを使用して、２つの組織クラス間のＣｐＧメチル化差異に従い、ランク付けされたマトリックス中へデータを分類した（図１６〜１８に示される）。最も有意なＣｐＧ位置は、上部へ向かって減少する有意性を有するマトリックスの下部にある。黒色は所与のＣｐＧ位置の全メチル化を示し、白色は特定の位置にメチル化を有しないことを示す。メチル化の程度は明るい灰色（低割合のメチル化）から暗い灰色（高割合のメチル化）で示される。各列は１つの遺伝子内の１つの特定ＣｐＧ位置を示し、各カラムは１つの試料の異なるＣｐＧにおけるメチル化プロファイルを示す。左側にＣｐＧと遺伝子認識物が示される。これは問題の遺伝子と使用された検出オリゴヌクレオチドを確認するための表（表１〜６）を相互参照する。右側に、個々のＣｐＧ位置におけるｐ値を示す。ｐ値は観測される分布がデータセットで偶然生じた確率である。
【０１５０】
選択された識別には、我々は学習アルゴリズム（サポートベクターマシン、ＳＶＭ）について訓練した。ＳＶＭ（F.モデル(Model)、P.アドージャン(Adorjan)、A.オレク(Olek)、C.ピーペンブロック(Piepenbrock)、「癌分類に基づくＤＮＡメチル化の特徴選択」、Bioinformatics；2001June17； Suppl1： S157-64）は、２つの所与の訓練試料クラス間の最適弁別手段を構築する。この場合、各試料は検証するＣｐＧ部位のメチル化パターン（ＣＧ／ＴＧ比）によって表される。ＳＶＭは各分類の試料のサブセットについて訓練され、関連する診断とともに示される。その前にＳＶＭに示されなかった独立した試験試料は、もしも診断が訓練ラウンド中に作られた予測変数に正確に基づいて予測できるなら、評価に供された。この方法は試料の異なった区分を使用して数回、繰り返した。これは、交差検証法と呼ばれる方法である。先の実施により得られた知識を全く使用しないで、全てのラウンドを実施することに留意されたい。正しい分類の数は、全ての実施を平均した。これは試験の正確性（全ラウンドに対して正しく分類された試料のパーセント）を有効に評価するものである。
【０１５１】
表
【表１】
2005518219.tif 000003
【０１５２】
【表２】
2005518219.tif 000004
【０１５３】
【表３】
2005518219.tif 000005
【０１５４】
【表４】
2005518219.tif 000006
【０１５５】
【表５】
2005518219.tif 000007
【０１５６】
【表６】
2005518219.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】異なるＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイおよびＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイによって測定されたメチル化の程度を示す。Ｙ軸はメチル化度を示す。腫瘍試料は白点で示され、正常結腸組織試料は黒点で示される。有意に高いメチル化度は健康な組織試料中よりも腫瘍試料中に観察された。
【図２】実施例１の腺癌のＥＹＡ４−ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．９４である。
【図３】実施例２の腺癌のＥＹＡ４−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．９１である。
【図４】結腸試料（腺癌２５、正常３３および腺腫１３）の別なセットを試験する実施例２のＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイによって測定されたメチル化の程度を示す。Ｙ軸は検査するＥＹＡ４遺伝子の領域内のメチル化度を示す。腺癌試料を白四角で、正常結腸組織試料を黒ダイヤで示す。有意に高いメチル化度が健康な組織試料よりも腫瘍試料に見られた。ｔ−検定を使用して測定した有意水準は、０．００４２４であった。
【図５】実施例２（別な試料セット）の腺癌および腺腫におけるＥＹＡ４−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は、診断試験の精度に関する基準である。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．８１である。
【図６】実施例２（別な試料セット）の腺癌におけるＥＹＡ４−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は、診断試験の精度に関する基準である。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．８４４である。
【図７】実施例２（別な試料セット）の腺腫におけるＥＹＡ４−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は、診断試験の精度に関する基準である。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．７４８である。
【図８】実施例３のＥＹＡ４−Ｈｅａｖｙ Ｍｅｔｈｙｌ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイによって測定された、異なる腫瘍および健康な組織のメチル化の程度を示す。Ｙ軸は検査したＥＹＡ４遺伝子の領域内のメチル化度を示す。結腸癌試料に加えて、２つの乳癌組織のうち１つのみがメチル化された。
【図９】実施例３のＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイによって測定された、異なる乳癌組織のメチル化の程度を示す。たった１つがメチル化されていた。
【図１０】実施例４のＥＹＡ４−ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMアッセイによって測定された血清試料のメチル化の程度を示す。Y軸は検査したＥＹＡ４遺伝子の領域内のメチル化度を示す。
【図１１】実施例５のカルシトニン−ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔアッセイの受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）を示す。ＲＯＣ曲線下の領域（ＡＵＣ）は、診断試験の精度に関する基準である。ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＡＵＣは、０．８５である。
【図１２】実施例６のカルシトニン−ＨＭ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８１である。
【図１３】実施例９のバーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８４である。
【図１４】実施例１０のＴＢＥＦ−ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．８０である。
【図１５】実施例１２のカドヘリン−ＭＳＰ−Ｍｅｔｈｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．９４である。
【図１６】健康組織と非健康組織の区別を示す。非健康試料片は結腸腺腫または結腸癌腫のいずれかから得た（実施例１３）。評価は２７個の遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置を使用して実施した。バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、ＥＹＡ４およびＨ−カドヘリンの遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置をさらに表３に記載する。
【図１７】１５個の遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置を使用する健康組織と癌腫組織の区別を示す（実施例１３）。バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、ＥＹＡ４およびＨ−カドヘリンの遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置をさらに表４に記載する。
【図１８】４０個の遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置を使用する健康組織と腺腫組織の区別を示す（実施例１３）。バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）、ＴＰＥＦ、ＥＹＡ４およびＨ−カドヘリンの遺伝子から得た参考となるＣｐＧ位置をさらに表５に記載する。
【図１９】実施例１１のＴＰＥＦ−ＭＳＰ−Ｍｅｈｔｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す（第１試料セット）。ＡＵＣは０．９３である。
【図２０】実施例１１のＴＰＥＦ−ＭＳＰ−Ｍｅｈｔｙｌ−ＬｉｇｈｔアッセイのＲＯＣ曲線を示す（第２試料セット）。ＡＵＣは１である。
【図２１】実施例６のＥＹＡ４−カルシトニン−Ｈｅａｖｙｍｅｔｈｙｌ−Ｍｅｔｈｙｌ−Ｌｉｇｈｔ−併合アッセイのＲＯＣ曲線を示す。ＡＵＣは０．９７である。
【図２２】ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイのＭＳＰおよびＨｅａｖｙｍｅｔｈｙｌ変異体を使用する各試料のＥＹＡ４遺伝子内の算出されたメチル化パーセントの回帰プロットを示す。
【図２３】ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイのＭＳＰおよびＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ変異体を使用する各試料のカルシトニン遺伝子内の算出されたメチル化パーセントの回帰プロットを示す。
【図１】
2005518219.tif 000009
【図２】
2005518219.tif 000010
【図３】
2005518219.tif 000011
【図４】
2005518219.tif 000012
【図５】
2005518219.tif 000013
【図６】
2005518219.tif 000014
【図７】
2005518219.tif 000015
【図８】
2005518219.tif 000016
【図９】
2005518219.tif 000017
【図１０】
2005518219.tif 000018
【図１１】
2005518219.tif 000019
【図１２】
2005518219.tif 000020
【図１３】
2005518219.tif 000021
【図１４】
2005518219.tif 000022
【図１５】
2005518219.tif 000023
【図１６】
2005518219.tif 000024
【図１７】
2005518219.tif 000025
【図１８】
2005518219.tif 000026
【図１９】
2005518219.tif 000027
【図２０】
2005518219.tif 000028
【図２１】
2005518219.tif 000029
【図２２】
2005518219.tif 000030
【図２３】
2005518219.tif 000031
【配列表】
2005518219000001.app
【国際調査報告】
2005518219.tif 000032
2005518219.tif 000033
2005518219.tif 000034
2005518219.tif 000035
2005518219.tif 000036
2005518219.tif 000037
2005518219.tif 000038
2005518219.tif 000039
2005518219.tif 000040
2005518219.tif 000041
2005518219.tif 000042