(57)【要約】  本発明は、癌の浸潤および転移に対して阻害活性を示す合成ペプチドに関する。本発明のペプチドは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−２）の８５番目〜９２番目のアミノ酸に相当するＰＲＫＰＫＷＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ：２）ペプチドならびにＳＥＱ  ＩＤ：２の断片、類似体および相同体を含む。また本発明は、ヒト癌の浸潤および転移の阻害剤としての前記ペプチドの用途に関し、さらには、ＭＭＰ類による細胞外マトリックスの分解に関係する癌および他の病理学的状態の予防および治療における治療使用法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の浸潤および転移を阻止するのに有用なメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）配列の特定のオリゴペプチド配列に類似する合成オリゴペプチド配列。
【請求項２】
ＰＲＫＰＫＷＤＫというアミノ酸配列を持つ請求項１記載の合成オリゴペプチド。
【請求項３】
残基数が約６〜約２０である請求項２記載の合成オリゴペプチド。
【請求項４】
残基数が約８〜約１０である請求項２記載の合成オリゴペプチド。
【請求項５】
濃度が１μＭ〜５００μＭの範囲にある請求項２〜４のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチド。
【請求項６】
濃度が５０μＭ〜２００μＭの範囲にある請求項５記載の合成オリゴペプチド。
【請求項７】
ヒトＭＭＰ−２に類似するアミノ酸配列を持つ、請求項１〜６のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチド。
【請求項８】
Ｎ末端にある１つ以上の酸残基が修飾されている請求項１〜７のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチド。
【請求項９】
Ｃ末端にある１つ以上の酸残基が修飾されている上記請求項１〜７のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチド。
【請求項１０】
Ｎ末端およびＣ末端にある１つ以上の酸残基が修飾されている上記請求項１〜７のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチド。
【請求項１１】
所定の配列内にある１つ以上のアミノ酸残基が置換残基の電荷および極性を考慮せずに置換されている請求項１〜６のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチド。
【請求項１２】
所定の配列内にある１つ以上のアミノ酸残基が類似する電荷および／または極性を持つ残基で置換されている請求項１〜６のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチド。
【請求項１３】
２つ以上の上記修飾によって修飾されている請求項７〜１２のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチド。
【請求項１４】
オリゴペプチド配列を１回以上繰り返し、そのそれぞれを１つ以上のオリゴペプチド反復配列に共有結合させることによって修飾されている、請求項１３記載の合成オリゴペプチド。
【請求項１５】
抗体を産生させるための免疫原としての、上記請求項１〜１４のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチドの使用方法。
【請求項１６】
静脈内適用によって、または治療上許容できる方法によって、ＭＭＰ−２の代謝作用または代謝相互作用を直接的および競合的に低減または阻止するための、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチドの使用方法。
【請求項１７】
皮下適用で、またはＭＭＰ−２の代謝相互作用を部分的にもしくは完全に阻止することができる特異的免疫応答を刺激する他の許容できる方法で、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチドをワクチンとして適用することにより、ＭＭＰ類の代謝作用または代謝相互作用を間接的に低減または阻止するための、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチドの使用方法。
【請求項１８】
免疫応答を増強するためにオリゴペプチドをハプテンに結合させる、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチドの使用方法。
【請求項１９】
ＭＭＰ−２タンパク質の合成速度を細胞レベルで特異的に抑制または低下させるためのフィードバック調節因子として機能する、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチドの使用方法。
【請求項２０】
ＭＭＰ−２が関与する疾患を診断するための特異的抗体またはこの疾患の進行もしくは後退を臨床モニタリングするための特異的抗体を産生させるためのワクチンとしての、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチドの使用方法。
【請求項２１】
当該オリゴペプチドを、注射剤、注入剤、吸入剤、坐剤の形で、または他の薬学的に許容できる担体および／または運搬手段によって、ワクチンとして患者に適用することができる、癌細胞の浸潤および転移を阻止することができる請求項１〜２０のいずれか１つに記載の合成オリゴペプチドの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の浸潤および転移に対して阻害活性を示す合成ペプチドに関する。本発明のペプチドは、マトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）の８５番目〜９２番目のアミノ酸に相当するＰＲＫＰＫＷＤＫ（ＳＥＱ  ＩＤ：２）ペプチドならびにＳＥＱ  ＩＤ：２の断片、類似体および相同体を含む。また本発明は、ヒト癌の浸潤および転移の阻害剤としての前記ペプチドの用途に関し、さらには、ＭＭＰ類による細胞外マトリックスの分解に関係する癌および他の病理学的状態の予防および治療における治療使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生物疾患を含むさまざまな病理学的状態はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）類の活性の上昇と関係している。ＭＭＰ類は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を分解することができる一群のセリンプロテイナーゼである。ＭＭＰ類はそれぞれチモーゲンとして細胞外マトリックスに分泌される。活性化が起こるとＭＭＰ類の酵素活性が活性になり、ＥＣＭを消化する。この過程は癌転移に重要な役割を果たすことが示されている。
【０００３】
ＭＭＰ類は、ＭＭＰファミリーに属する少なくとも数種類のプロテイナーゼであり、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３などがある。癌ではＭＭＰ−２が原発腫瘍成長および腫瘍転移に関係づけられている。このＭＭＰは、癌が浸潤および転移によって広がるための前提条件として、コラーゲンおよび他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を消化する能力を持っている。
【０００４】
抗癌剤の設計と試験には多くの努力が向けられているが、ＭＭＰによるＥＣＭの消化を効果的に阻止することができ、それによって癌および他の疾患の広がりを減じることができる無毒性治療剤は、常に求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は癌細胞浸潤を効果的に阻止することができる合成ペプチドを体現する。これらの薬剤およびそれに対する抗体の利点は、癌の浸潤および転移を阻止するための臨床的応用に有用であることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、癌浸潤および癌転移を阻止するのに有効なマトリックスメタロプロテイナーゼ２配列の特定アミノ酸配列（８５〜９２）に類似するアミノ酸配列を持つ合成オリゴペプチドを提供することである。
【０００７】
本発明の目的は、アミノ酸配列ＰＲＫＰＫＷＥＤＫを持つ、癌の浸潤および転移を阻止するのに有用な合成ペプチドを提供することである。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、癌疾患を予防および治療するために、本願が開示する合成ペプチドを利用する方法である。この実施形態のもう一つの態様は、癌の浸潤および転移の阻止を達成するために、有効量の合成ペプチドを使用することである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、ＰＲＫＰＫＷＤＫ（ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２）という配列を持つオリゴペプチドを提供する。
【００１０】
本オリゴペプチドは、好ましくは、残基数約６〜約２０である。本オリゴペプチドは、最も好ましくは、残基数約８〜約１０である。
【００１１】
本合成ペプチドの濃度は、好ましくは、１μＭ〜５００μＭの範囲にある。合成ペプチドの濃度は、最も好ましくは、５０μＭ〜２００μＭの範囲にある。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、薬学的に許容できる担体と上記オリゴペプチドとを含む医薬組成物に含まれている免疫原オリゴペプチドである。本オリゴペプチドはワクチンとして使用することができる。このオリゴペプチド含有医薬組成物は、上記オリゴペプチドの配列（例えばＳＥＱ．ＩＤ．２）を持つエピトープを含むタンパク質に対する免疫応答を誘発するために使用することができる。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、上記の組成物および方法を生体内と生体外の両方で達成することである。
【００１４】
本発明は、ヒトＭＭＰ−２に類似するアミノ酸配列を持つ合成オリゴペプチドを提供する。
【００１５】
さらに本発明は、Ｎ末端にある１つ以上のアミノ残基を省くことによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００１６】
本発明は、Ｃ末端にある１つ以上のアミノ酸残基を省くことによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００１７】
本発明は、Ｎ末端およびＣ末端にある１つ以上のアミノ酸残基を省くことによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００１８】
本発明は、所定の配列内にある１つ以上のアミノ酸残基を置換残基の電荷および極性を考慮せずに置換することによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００１９】
本発明は、所定の配列内にある１つ以上のアミノ酸残基を類似する電荷および／または極性を持つアミノ酸残基で置換することによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００２０】
本発明は、所定の配列内にある１つ以上のアミノ酸残基を省くことによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００２１】
本発明は、２つ以上の上記修飾による、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００２２】
本発明は、オリゴペプチド配列を１回以上繰り返し、そのそれぞれを１つ以上のオリゴペプチド反復配列に共有結合させることによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、生成した抗体が癌の浸潤および転移を効果的に阻止することができるように、上記合成ペプチドを免疫原として使用して、抗体を産生させることである。
【００２４】
本発明は、静脈内適用によって、または治療的上許容できる他の方法によって、ＭＭＰ−２の代謝作用または代謝相互作用を直接的および競合的に低減または阻止するための、１つ以上の上記オリゴペプチドの予防的または治療使用を提供する。
【００２５】
本発明は、皮下適用で、またはＭＭＰ５の代謝相互作用を部分的にもしくは完全に阻止することができる特異的免疫応答を刺激する他の許容できる方法で、１つ以上の上記オリゴペプチドをワクチンとして適用することにより、ＭＭＰ類の代謝作用または代謝相互作用を間接的に低減または阻止するための、１つ以上の上記オリゴペプチドの予防的または治療使用を提供する。好ましい実施形態にはＭＭＰ−２が含まれる。
【００２６】
本発明は、免疫応答を増強し、よって治療効力を増強するために、オリゴペプチドをハプテンに結合させる、１つ以上の上記オリゴペプチドの予防的または治療使用を提供する。
【００２７】
本発明は、ＭＭＰ−２タンパク質の合成速度を細胞レベルで特異的に抑制または低下させるためのフィードバック調節因子として機能する、１つ以上の上記オリゴペプチドの予防的または治療使用を提供する。
【００２８】
本発明は、ＭＭＰ−２が関与する疾患を診断するための特異的抗体またはこの疾患の進行もしくは後退を臨床モニタリングするための特異的抗体を産生させるためのワクチンとして、癌細胞の浸潤および転移を阻止することができる１つ以上のオリゴペプチドを提供する。
【００２９】
本発明は、癌を予防または治療するための、癌細胞の浸潤および転移を阻止する１つ以上のオリゴペプチドの使用を提供する。
【００３０】
本発明は、当該オリゴペプチドを、注射剤、注入剤、吸入剤、坐剤の形で、または他の薬学的に許容できる担体および／または運搬手段(means of delivery)によって、ワクチンとして患者に適用することができる、癌細胞の浸潤および転移を阻止する１つ以上のオリゴペプチドの使用を提供する。
【００３１】
図面の簡単な説明
図１は、酵素ＭＭＰ２のアミノ酸配列を表す図である。阻害活性研究のために選択したアミノ酸配列を、見つけやすいように、枠で囲んである。他の研究者（Ｌｏｉｔｔａら）によってＭＭＰ２の活性を阻害することが示されているアミノ酸配列ＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮ（やはり枠で囲んである）を参照物質として使用した。
【００３２】
図２は、試験したさまざまなオリゴペプチドの阻害作用を比較した図である。オリゴペプチドＰＲＫＰＫＷＤＫは、ヒトメラノーマ癌細胞Ａ２０５８とマトリゲルアッセイを使った癌細胞浸潤の阻止に著しく有効である。
【００３３】
図３は、ヒトメラノーマ癌細胞Ａ２０５８とマトリゲルアッセイを使った癌細胞浸潤の阻止に関するオリゴペプチドＰＲＫＰＫＷＤＫの阻害作用を表す図である。
【００３４】
図４は、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７とマトリゲルアッセイを使った癌細胞浸潤の阻止に関するオリゴペプチドＰＲＫＰＫＷＤＫの阻害作用を表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
定義
本明細書で使用する用語「ペプチド」は、ペプチド結合によって共有結合された２つ以上のアミノ酸からなる有機化合物を指す。ペプチドとして、ジペプチド（２つのアミノ酸残基を含むもの）やトリペプチド（３つのアミノ酸）などを挙げることができる。
【００３６】
本明細書で使用する用語「オリゴペプチド」は、典型的には長さが３０残基未満のペプチドを指す。オリゴペプチドの長さは、正しいエピトープが維持される限り、本発明にとって重要ではない。大きいオリゴペプチドの生物学的活性をまだ実質上すべて維持していて、癌細胞の浸潤および遊走の阻止に有効である限り、オリゴペプチドは、望ましくは、できるだけ小さくすることができる。
【００３７】
「オリゴペプチド」という用語は、本願では「合成ペプチド」と可換的に用いられる。本発明で使用するオリゴペプチドは「単離されている」が「生物学的に純粋な」合成ペプチドである。
【００３８】
本明細書で使用するアミノ酸残基の１文字記号は以下のとおりである：Ａ（アラニン）、Ｒ（アルギニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｃ（システイン）、Ｑ（グルタミン）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｇ（グリシン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｉ（イソロイシン）、Ｌ（ロイシン）、Ｋ（リジン）、Ｍ（メチオニン）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｐ（プロリン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（スレオニン）、Ｗ（トリプトファン）、およびＹ（チロシン）。
【００３９】
アミノ酸置換は典型的には単一残基の置換である。置換、欠失、挿入またはその任意の組合せを併用して、１つのオリゴペプチドを得ることができる。保存されたアミノ酸置換は、例えばグルタミン酸（Ｅ）からアスパラギン酸（Ｄ）へのアミノ酸置換などにみられるように、１つ以上のアミノ酸を類似する電荷、サイズおよび／または疎水性を持つアミノ酸で置換することからなる。非保存的置換は、例えばグルタミン酸（Ｅ）からバリン（Ｖ）への置換などにみられるように、１つ以上のアミノ酸を電荷、サイズおよび／または疎水性が似ていないアミノ酸で置き換えることからなる。本発明は、置換、欠失、挿入またはその任意の組合せに関して、癌細胞の浸潤および転移を阻止する効果が実質的に変化しない限り、オリゴペプチドの保存的変化を包含するものとする。
【００４０】
Ｒａｔｈら（Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｎｕｔｒ．４４：６２−６９，１９９２、Ｊ  Ｏｒｔｈｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄ．８：１１−２０，１９９３）は、高い親水性極大およびコンフォメーションならびに電荷を持つオリゴペプチド配列が、多くの疾患の発生をもたらすと考えた。この仮説によれば、ＭＭＰ酵素から選択されたアミノ酸配列は、基質中の相補的な配列に自ら結合することによって、その酵素の作用を阻止しうる。この概念は、オリゴペプチドが酵素中の亜鉛分子をブロックするというＬｉｏｔｔａら（米国特許第５，３７２，８０９号）が詳述しているものとは、全く異なっている。細胞中のさまざまなタイプのタンパク質の複合体によって細胞中のタンパク質の活性が修飾されうることを示す実験的証拠（Ｇａｖｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：１４１−１４７頁，２００２年）は、本質的にこの仮説を裏付けている。ここに挙げた文献は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【００４１】
本発明において、我々は、ＭＭＰ−２のアミノ酸配列中にオリゴペプチド配列候補を同定し、癌細胞によるＥＣＭのインビトロ浸潤を試験モデルとして使用することにより、これらのオリゴペプチド配列がＭＭＰ−２の機能的活性を効果的に妨害することを見いだした。
【００４２】
理論や作用機序はともかくとして、本発明は、癌細胞の浸潤と転移を効果的に阻止することができるオリゴペプチドを提供する。
【００４３】
一つの作用機序として、ＭＭＰ−２は特異的結合部位を介して標的ＥＣＭ分子に結合することが挙げられる。これらの結合部位をブロックすると、ＭＭＰ−２がそのＥＣＭ基質分子に結合できなくなり、ＥＣＭの破壊が阻害され、その結果、癌および他の疾患は体中に広がることができなくなる。
【００４４】
ＭＭＰ−２タンパク質には数ヶ所の潜在的結合部位が同定されている。本発明は、これらのオリゴペプチド配列の合成類似体がＥＣＭ破壊を防止するのに有効であることを示す。治療用オリゴペプチドの一つはＰＲＫＰＫＷＤＫである。このオリゴペプチドは癌細胞の浸潤を約９０％阻害することがわかっている。
【００４５】
また本発明は、他のＭＭＰ関連疾患における上記オリゴペプチドの治療使用も提供する。ＭＭＰ−２はＥＣＭ内に存在するその標的分子に同じ部位を使って結合しうるので、本発明のオリゴペプチドは、他の疾患も同様に妨害することができる。したがって、本発明の合成オリゴペプチドの予防的および治療使用は癌に限定されるわけではなく、ＭＭＰ類によるＥＣＭの破壊に関係する心血管疾患および他の病理学的状態にも使用することができる。これらのオリゴペプチドは、注射剤、注入剤、吸入剤、坐剤の形で、または他の薬学的に許容できる担体および／または運搬手段によって、ワクチンとして患者に適用することができる。
【００４６】
本発明のペプチドおよび製剤を投与する方法には、経口投与、ＩＶ投与、皮下投与、経皮投与および局所投与など、数多くの既知投与経路のいずれかを使用する。好ましい本発明方法では、非経口投与用の医薬組成物を使用する。
【００４７】
本発明は、ＭＭＰ類（特にＭＭＰ−２）が関与する疾患を診断するために用いるアッセイ用の抗体ならびに血液アッセイまたは他の適切な診断アッセイによってこの疾患の進行もしくは後退を臨床モニタリングするための抗体を産生させるためのワクチンとして使用することもできるオリゴペプチドを提供する。
【００４８】
本発明は癌細胞浸潤の阻止に有効な合成ペプチドを体現する。これらの薬剤およびそれに対する抗体の利点は、癌の浸潤および転移を予防および治療するための臨床的応用に有用であることである。好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ．２のアミノ酸を持つ合成オリゴペプチドは、癌の浸潤および転移を阻止するのに有用である。より好ましくは、本合成ペプチドを、癌の浸潤および転移を阻止するための医薬製剤に配合する。
【００４９】
本オリゴペプチドは残基数約６〜約２０でありうる。本オリゴペプチドは、最も好ましくは、残基数約８〜約１０である。本合成オリゴペプチドは、最も好ましくは、長さにして８つのアミノ酸残基を含有する。
【００５０】
合成ペプチドの濃度は、好ましくは、１μＭ〜５００μＭの範囲にある。合成ペプチドの濃度は、最も好ましくは、５０μＭ〜２００μＭの範囲にある。
【００５１】
本発明のもう一つの目的は、生成した抗体が癌の浸潤および転移を効果的に阻止することができるように、上記合成ペプチドを免疫原として使用して、抗体を産生させることである。
【００５２】
本合成オリゴペプチドは、好ましくは、長さにして８つのアミノ酸残基を含有する。本発明のもう一つの目的は、薬学的に許容できる担体と上記オリゴペプチドとを含む医薬組成物に含まれている免疫原オリゴペプチドである。本オリゴペプチドはワクチンとして使用することができる。このオリゴペプチド含有医薬組成物は、上記オリゴペプチドの配列（例えばＳＥＱ．ＩＤ．２）を持つエピトープを含むタンパク質に対する免疫応答を誘発するために使用することができる。
【００５３】
本発明のもう一つの目的は、上記の組成物および方法を生体内と生体外の両方で達成することである。
【００５４】
本発明は、ヒトＭＭＰ−２のタンパク質内のアミノ酸配列と類似するアミノ酸配列を持つ合成オリゴペプチドを提供する。
【００５５】
合成オリゴペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端は、それぞれアミノ基（−ＮＨ２）またはカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を含むことができる。もう一つの選択肢として、オリゴペプチドアミノ末端は、例えば、カルボベンジル、ダンシル、ｔ−ブトキシカルボニル、デカノイル、ナフトイルまたは他の炭水化物基などの疎水性基、アセチル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基、または修飾非天然アミノ酸残基であってもよいが、これらに限られない。もう一つの選択肢として、合成オリゴペプチドカルボキシ末端は、例えば、アミド基、ｔ−ブトキシカルボニル基、または修飾非天然アミノ酸残基であってもよい。もう一つの選択肢として、本発明は、Ｎ末端またはＣ末端にあるアミノ酸残基を省くことによって得られる、癌細胞の浸潤および転移を阻止する合成オリゴペプチドも包含する。また本発明は、所定の配列内にあるアミノ酸残基を置換残基の電荷および極性を考慮せずに置換することによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾も提供する。
【００５６】
本発明では１つ以上のアミド結合が随意にアミド以外の結合（好ましくは置換アミドまたはアミドの等配電子体）で置き換えられているペプチド類似体も考えられていると理解すべきである。したがって、ペプチド内のアミノ酸残基は一般にアミノ酸として記載され、本発明の好ましい実施形態はペプチドを使って例示されるが、非アミド結合を持つ実施形態では、本明細書で使用する「アミノ酸」または「残基」という用語が、構造がアミノ酸の側鎖と似ている基を持つ他の二官能性部分を指すことは、当業者には理解されるだろう。さらに、そのアミノ酸残基は、阻止されることも、またされないこともある。
【００５７】
本発明は、オリゴペプチド配列を１回以上繰り返し、そのそれぞれを１つ以上のオリゴペプチド反復配列に共有結合させることによる、癌細胞の浸潤および転移を阻止するオリゴペプチドの修飾を提供する。
【００５８】
本発明は、静脈内適用によって、または治療上許容できる他の方法によって、ＭＭＰ−２の代謝作用または代謝相互作用を直接的および競合的に低減または阻止するための、１つ以上の上記オリゴペプチドの予防的または治療使用を提供する。
【００５９】
本発明は、皮下適用で、またはＭＭＰ類の代謝相互作用を部分的にもしくは完全に阻止することができる特異的免疫応答を刺激する他の許容できる方法で、１つ以上の上記オリゴペプチドをワクチンとして適用することにより、ＭＭＰ類の代謝作用または代謝相互作用を間接的に低減または阻止するための、１つ以上の上記オリゴペプチドの予防的または治療使用を提供する。好ましい実施形態にはＭＭＰ−２が含まれる。
【００６０】
本発明は、免疫応答を増強し、よって治療効力を増強するために、オリゴペプチドをハプテンに結合させる、１つ以上の上記オリゴペプチドの予防的または治療使用を提供する。
【００６１】
本発明は、ＭＭＰ−２タンパク質の合成速度を細胞レベルで特異的に抑制または低下させるためのフィードバック調節因子として機能する、１つ以上の上記オリゴペプチドの予防的または治療使用を提供する。
【００６２】
本発明は、ＭＭＰ−２が関与する疾患を診断するための特異的抗体またはこの疾患の進行もしくは後退を臨床モニタリングするための特異的抗体を産生させるためのワクチンとして、癌細胞の浸潤および転移を阻止することができる１つ以上のオリゴペプチドを提供する。
【００６３】
本発明は、ヒト疾患を阻止する１つ以上のオリゴペプチドの使用、例えば、これらに限られないが、癌を予防または治療するための、癌細胞の浸潤および転移を阻止する１つ以上のオリゴペプチドの使用、例えば感染性疾患、心血管疾患および変性疾患を予防または治療するための使用を提供する。
【００６４】
本発明は、ＭＭＰ−２が関与する疾患を予防または治療するための、癌細胞の浸潤および転移を阻止する１つ以上のオリゴペプチドの使用を提供する。
【００６５】
本発明は、当該オリゴペプチドを、注射剤、注入剤、吸入剤、坐剤の形で、または他の薬学的に許容できる担体および／または運搬手段によって、ワクチンとして患者に適用することができる、癌細胞の浸潤および転移を阻止する１つ以上のオリゴペプチドの使用を提供する。
【００６６】
本発明の組成物は、滅菌された生体適合性の医薬用担体（例えば食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、および水などであるが、これらに限らない）に入れて投与することができる、少なくとも１つの他の薬剤、例えば安定化化合物と組み合わされた１つまたは複数のペプチドの形をとりうる。本組成物は、単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、患者に投与することができる。薬学的に許容できる担体は、薬学的に使用することができる製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤も含んでよい。製剤技術および投与技術に関するさらなる詳細は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．））の最新版に記載されており、その内容は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。医薬組成物は塩として提供することもでき、例えば塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸など（ただしこれら限らない）といった多くの酸を使って形成させることができる。塩は、対応する有機塩基型よりも、水性溶媒または他のプロトン性溶媒に溶解しやすい傾向を示す。
【００６７】
本発明は、ＭＭＰ類（特にＭＭＰ−２）が関与する疾患を診断するために用いられるアッセイ用の抗体ならびに血液アッセイまたは他の適切な診断アッセイによってこの疾患の進行もしくは後退を臨床モニタリングするための抗体を産生させるためのワクチンとして使用することもできるオリゴペプチドを提供する。
【００６８】
以下の実施例は本発明の実施を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６９】
オリゴペプチド配列
荷電アミノ酸が豊富な高親水性極大領域に関して、ＭＭＰ−２のアミノ酸配列を、ソフトウェアプログラムで同定した。本発明のオリゴペプチドは、当技術分野で周知の技術によって、合成または製造することができる（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３年，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）などを参照されたい。この文献は、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる）。本発明で製造し使用したオリゴペプチドを表１に挙げる。
【００７０】
さまざまな癌細胞によるマトリゲル膜を通したマトリゲル浸潤・遊走にこれらのオリゴペプチドが及ぼす阻害作用を、「改良型マトリゲル浸潤チャンバー（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ）」（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国（ＵＳＡ））を使って評価した。Ｌｉｏｔｔａらによって抗ＭＭＰ−２活性を持つことが示されたオリゴペプチドＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮを、オリゴペプチドの標準参照物質として使用した。
本研究で同定し使用したさまざまなオリゴペプチド配列
【００７１】
【表１】
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【００７２】
一般実験条件
同定したオリゴペプチドをカスタム合成した。次にそれらをマトリゲル浸潤研究に使用した。
【００７３】
（ａ）マトリゲル浸潤研究
この研究は「改良型マトリゲル浸潤チャンバー」（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国（ＵＳＡ））を使って行った。
【００７４】
ヒトメラノーマ細胞を使った研究では、ヒト線維芽細胞ＮＨＤＦ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を「マトリゲル」インサート上に播種し、コンフルエントにした。これは、体内の癌細胞を取り巻く生体内条件を綿密にシミュレートするために行った。次に、ヒトメラノーマ細胞Ａ２０５８をインサート上に播種した。選択したオリゴペプチドを線維芽細胞の条件培地にさまざまなレベルで添加したものをチャンバーに加えた。その系を約２４時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最後にインサート上面の細胞を拭き取った。マトリゲル膜に侵入してインサートの下面まで遊走した細胞を「クイック・ステイン（ｑｕｉｃｋ  ｓｔａｉｎ）」で染色し、顕微鏡下で計数した。対照（オリゴペプチドレベル０）と比較して、膜越しに遊走することができなかった細胞の数により、阻害百分率を計算した。対照の阻害活性を「０」とみなした。浸潤アッセイで得た培地をザイモグラム研究のためにとっておいた。
【００７５】
ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７を使った研究では、ＮＨＤＦの代わりにＭＲＣ５（ＡＴＣＣ）線維芽細胞を使った点以外は、メラノーマ細胞の場合と基本的に同様の手順を使用した。
【００７６】
ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１を使った研究では、線維芽細胞ＭＲＣ５（ＡＴＣＣ）細胞をウェルに播種した。残りの手順はＭＣＦ７細胞を使った研究の場合と同じにした。
【００７７】
（ｂ）ザイモグラム研究
浸潤実験でさまざまなウェルから得た培地（２５〜３０μｌ）を「ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）」ザイモグラムゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にのせた。製造者が推奨するとおりにゲルを展開し、染色した。マトリックスメタロプロテイナーゼ類（ＭＭＰ類）は、それぞれの既知分子量に基づいて同定した。
【実施例１】
【００７８】
さまざまなオリゴペプチド配列がメラノーマ細胞Ａ２０５８によるマトリゲル浸潤・遊走に及ぼす阻害作用
７つのオリゴペプチド（それぞれのアミノ酸配列については表１を参照）を、ヒトメラノーマ癌細胞浸潤の阻害について試験した。ＰＲＫＰＫＷＤＫというアミノ酸配列を持つオリゴペプチドは阻止活性を示した。ＰＲＫＰＫＷＤＫが７３％の阻害を示したのに対して、ＴＭＲＫＰＲＣＧＮＰＤＶＡＮという配列のオリゴペプチドは約１１％の阻害を示した（図１）。
【００７９】
ＬＰＰＤＶＱＲＶＤというアミノ酸配列を持つオリゴペプチドＶＩも多少の阻止活性（すなわち約２０％）を持っていた。ＧＤＶＡＰＫＴＤＫＥというアミノ酸配列を持つオリゴペプチド「Ｉ」は１００μＭ濃度まで活性を全く示さなかった（図２には示していない）。これに対して、ＰＲＫＰＫＶＶＤＫは同じ濃度で６３％の阻害を示した。
【実施例２】
【００８０】
オリゴペプチドＰＲＫＰＫＷＤＫがメラノーマ細胞Ａ２０５８によるマトリゲル浸潤・遊走に及ぼす阻害作用
これらの研究では、培地中のＰＲＫＰＫＷＤＫ濃度を０〜１５０μＭの間で変化させた。このオリゴペプチドは、濃度５０μＭでの約３７％から１５０μＭでの７３％まで、メラノーマ細胞による浸潤を漸進的に阻害することがわかった（図３）。
【００８１】
マトリゲル膜はＥＣＭと類似していて、この膜を突破して膜の反対側まで遊走する癌細胞の能力は、その癌細胞の体内での転移能力を表す。本オリゴペプチドは、３種類の癌細胞の浸潤を有意に減少させることができた。この試験系では活性がＥＣＭに向けられた。したがって、本オリゴペプチドは体内でＥＣＭの分解を妨害することができ、そうすることによって、ＥＣＭの破壊が基本病変である疾患の進行に不利な影響を及ぼすことができるということを、我々の研究は明確に示していると結論する。
【実施例３】
【００８２】
これらの研究では、ＰＲＫＰＫＷＤＫがヒト乳癌細胞ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ）によるマトリゲル浸潤・遊走に及ぼす阻害作用を決定した。メラノーマ細胞の場合と同様に、このオリゴペプチドは癌細胞浸潤を阻害した。濃度１５０μＭでの阻害は約７０％だった。濃度２００μＭでは約９０％まで増加した（図４）。
【実施例４】
【００８３】
これらの研究では、別のヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ２３１を使って、ＰＲＫＰＫＷＤＫの阻害活性を調べた。濃度１５０μＭでの阻害は約９４％だった。
【実施例５】
【００８４】
次に我々は、分泌された後の酵素の作用を上記オリゴペプチドが妨害できることを検討した。ザイモグラム研究から、ＰＲＫＰＫＷＤＫは、さまざまな癌細胞によって分泌されるＭＭＰ−２の量に対して、阻害作用を全く示さないことがわかった（非掲載データ）。
【００８５】
以上、本発明の実施形態をいくつか説明した。しかし、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を加えうることはわかるだろう。したがって他の実施形態も本願発明の範囲に包含される。
【００８６】
以上、かなり詳細に説明したが、上記の配列は説明のために記載したものであって、限定を意図するものではない。当業者の知識と能力の範囲内で行うことができる上記技術の修飾および改良は、等価物を含めて、本願特許請求の範囲に包含される。上記の説明の詳細に関して、本明細書に記載した発明の概念から逸脱することなく、数多くの修飾、変更および改変を加えうることは、当業者には自明だろう。例えば、本明細書に記載した基本的配列の修飾（化学的修飾または酵素的修飾）も、本発明の範囲に包含される。例えば、本明細書に記載した配列はジペプチドまたはトリペプチドであることができる。また、本明細書に記載した配列は、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に、この残基を含むように修飾することができる。上記の配列の活性を増加させるために、上記の配列を化学的に修飾することもできる（例えば、ある配列のカルボキシル末端部分のアミド化）。ペプチドの活性を増加させるために、ペプチドを化学修飾すること（例えば、ある配列のカルボキシ末端部分のアミド化や、どちらかの末端にグリシン残基またはアラニン残基を含めることなど）もできる。したがって、本発明の精神と範囲から逸脱することなくさまざま修飾を加えうること、そしてそのような相違は本願請求項に記載する本発明の範囲に包含されると見なすべきであることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、酵素ＭＭＰ２のアミノ酸配列を表す。
【図２】図２は、試験したさまざまなオリゴペプチドの阻害作用の比較を示す。
【図３】図３は、ヒトメラノーマ癌細胞Ａ２０５８とマトリゲルアッセイを使った癌細胞浸潤の阻止に関するオリゴペプチドＰＲＫＰＫＷＤＫの阻害作用を表す。
【図４】図４は、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７とマトリゲルアッセイを使った癌細胞浸潤の阻止に関するオリゴペプチドＰＲＫＰＫＷＤＫの阻害作用を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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