(57)【要約】３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子を同定する方法が提供される。この誘導またはアップレギュレートされた遺伝子は、核酸ワクチンの主成分を形成するか、またはマイコバクテリア感染に対するワクチン用の弱毒化マイコバクテリアの調製を可能にするターゲットを提供する。同様に、この誘導またはアップレギュレートされた遺伝子によってコードされるペプチドは、ワクチンに用いられる。さらなる実施態様では、同定された遺伝子／ペプチドは、核酸プローブまたは抗体検出によって臨床試料におけるマイコバクテリア感染の存在を同定するための手段を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたM. tuberculosisペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含む、マイコバクテリア感染の治療剤であって、該ペプチドが、遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、M. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される、治療剤。
【請求項２】
マイコバクテリア遺伝子を同定する方法であって、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該方法が、以下の工程：
３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、第１のマイコバクテリアを培養する工程；
３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、第２のマイコバクテリアを培養する工程；
該第１および第２のマイコバクテリアから、第１および第２のｍＲＮＡ集団をそれぞれ得る工程；
該第１および第２のｍＲＮＡ集団から、第１および第２のｃＤＮＡ集団をそれぞれ調製する工程であって、該ｃＤＮＡ調製中に、検出可能な標識が、該第１および第２のｃＤＮＡ集団のｃＤＮＡ分子に導入される、工程；
該第１および第２のｃＤＮＡ集団から、対応する第１および第２のｃＤＮＡ分子をそれぞれ単離する工程；
該単離された第１および第２のｃＤＮＡ分子に存在する標識から放出される標識または対応するシグナルの相対量を比較する工程；
該単離された第２のｃＤＮＡ分子によって提供されるよりも多い量の該単離された第１のｃＤＮＡ分子によって提供される標識またはシグナルを同定する工程；および
該第１のｃＤＮＡ、および３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中に誘導またはアップレギュレートされる対応するマイコバクテリア遺伝子を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３】
前記対応する第１および第２のｃＤＮＡ分子が、マイコバクテリアゲノムＤＮＡから生成され、増幅されて固定化されたＤＮＡ配列を含むアレイプレートへのハイブリダイゼーションによって、それぞれ前記第１および第２のｃＤＮＡ集団から単離され、ここで、該固定化された配列が、該マイコバクテリアゲノムの各公知の遺伝子を代表し、そして各代表的な配列が、該プレート上の同定された位置に固定化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のマイコバクテリアが、該第２のマイコバクテリアを実質的にビルレンスに誘導しない連続培養条件下で培養される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記培養条件が、前記マイコバクテリアの増殖のために、酸素以外の利用可能な栄養の点で制限されず、そして増殖因子、温度、およびｐＨの点で制限されていない、請求項２から４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のマイコバクテリアが、前記溶存酸素圧を除いて、実質的に前記第２のマイコバクテリアについての条件と実質的に同一の連続培養条件下で培養される、請求項２から５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
相対誘導またはアップレギュレーションが、前記単離された第１のｃＤＮＡ分子によって提供される標識またはシグナルの量において、前記単離された第２のｃＤＮＡ分子によって提供されるより、相対的に３倍、好ましくは相対的に４倍の増加によって同定される、請求項２から６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
M. tuberculosisペプチドに対するインヒビターであって、該ペプチドが、遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、M. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、そして該インヒビターが、該M. tuberculosisペプチドが本来有する生物学的効果を発揮することを抑制または阻害し得、該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される、インヒビター。
【請求項９】
前記インヒビターが、アシルキャリアタンパク質、モノオキシゲナーゼ、マイコバクチン合成タンパク質、転写レギュレーター、酸化還元酵素、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エステラーゼ／アセチルヒドロラーゼ、シトクロムＤ、メチルトランスフェラーゼ、トランスアミナーゼ、ＰＰＥタンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グアニル酸キナーゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ−結合タンパク質、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、σ因子、ピルビン酸キナーゼ、熱ショックタンパク質、およびアミノトランスフェラーゼからなる群より選択されるタンパク質を阻害し得る、請求項８に記載のインヒビター。
【請求項１０】
前記誘導またはアップレギュレートされたM. tuberculosis遺伝子またはその遺伝子産物をターゲティングし得る抗生物質；および該誘導可能またはアップレギュレート可能な遺伝子の少なくとも一部に相補的であるアンチセンスまたは三重鎖形成核酸配列からなる群より選択される、請求項８に記載のインヒビター。
【請求項１１】
遺伝子によってコードされるペプチド、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体に結合する抗体であって、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのM. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される、抗体。
【請求項１２】
遺伝子が改変されてマイコバクテリアが実質的に非病原性になる弱毒化M. tuberculosisマイコバクテリアであって、該遺伝子が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのM. tuberculosisの培養中に、その発現が誘導またはアップレギュレートされる遺伝子であり、該遺伝子が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８からなる群の１つに対応する野生型コード配列を有する、弱毒化M. tuberculosisマイコバクテリア。
【請求項１３】
遺伝子によってコードされるペプチド、または該ペプチドのフラグメント、改変体、もしくは誘導体を含む、弱毒化微生物キャリアであって、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのM. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される、弱毒化微生物キャリア。
【請求項１４】
前記弱毒化微生物キャリアが、弱毒化サルモネラ、弱毒化ワクシニアウイルス、弱毒化鶏痘ウイルス、または弱毒化M. bovis（例えば、ＢＣＧ株）である、請求項１３に記載の弱毒化微生物キャリア。
【請求項１５】
プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列、または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体含むＤＮＡプラスミドであって、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下での野生型のM. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該プロモーターおよびポリアデニル化シグナルが、該ＤＮＡ配列に作動可能に連結され、該遺伝子のコード配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８からなる群より選択される、ＤＮＡプラスミド。
【請求項１６】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０プロモーターからなる群より選択され、そして前記ポリアデニル化シグナルが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルからなる群より選択される、請求項１５に記載のＤＮＡプラスミド。
【請求項１７】
ＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされる単離されたＲＮＡ配列であって、該ＤＮＡ配列が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのM. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされる遺伝子のコード配列に対応し、該遺伝子のコード配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８からなる群より選択される、単離されたＲＮＡ配列。
【請求項１８】
請求項１７に記載のＲＮＡ配列および宿主細胞の染色体の組込み部位を含む、ＲＮＡベクター。
【請求項１９】
マイコバクテリア感染を治療または予防するための医薬品の製造における、
単離されたM. tuberculosisペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体であって、該ペプチドが、遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、M. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される、ペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体；
請求項８から１０のいずれかの項に記載のインヒビター；
請求項１１に記載の抗体；
請求項１２に記載の弱毒化マイコバクテリア；
請求項１３または１４に記載の弱毒化微生物キャリア；
遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体であって、該遺伝子が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのM. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該遺伝子のコード配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８からなる群より選択される、ＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体；
請求項１５または１６に記載のＤＮＡプラスミド；
請求項１７に記載のＲＮＡ配列；および／または
請求項１８に記載のＲＮＡベクター、
の使用。
【請求項２０】
マイコバクテリア感染を治療または予防する方法であって、
単離されたM. tuberculosisペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体であって、該ペプチドが、遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、M. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される、ペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体；
請求項８から１０のいずれかの項に記載のインヒビター；
請求項１１に記載の抗体；
請求項１２に記載の弱毒化マイコバクテリア；
請求項１３または１４に記載の弱毒化微生物キャリア；
遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体であって、該遺伝子が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのM. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該遺伝子のコード配列が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８からなる群より選択される、ＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体；
請求項１５または１６に記載のＤＮＡプラスミド；
請求項１７に記載のＲＮＡ配列；および／または
請求項１８に記載のＲＮＡベクター、
を患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項２１】
マイコバクテリア感染を同定するための診断試薬の製造における、
単離されたM. tuberculosisペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体であって、該ペプチドが、遺伝子によってコードされ、該遺伝子の発現が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、M. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、該ペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される、ペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体；または
請求項１１に記載の抗体；または
少なくとも８ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドプローブであって、該プローブが、遺伝子の少なくとも一部に結合し、該遺伝子が、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのM. tuberculosisの培養中に誘導またはアップレギュレートされる、プローブ、
の使用。
【請求項２２】
マイコバクテリア感染の治療剤であって、本明細書において実質的に実施例に記載されたインヒビター、抗体、弱毒化M. tuberculosisマイコバクテリア、弱毒化微生物キャリア、単離されたＲＮＡ分子、ＲＮＡベクター、またはＤＮＡプラスミドを含む、治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子の発現が、低い溶存酸素圧によって規定される増殖条件下でマイコバクテリアの連続培養中に誘導またはアップレギュレートされる、マイコバクテリアにおける遺伝子の同定方法；単離されたペプチド産物、その改変体、誘導体、またはフラグメント；該ペプチド、改変体、誘導体、またはフラグメントに結合する抗体；該ペプチド、改変体、誘導体、またはフラグメントを発現するＤＮＡおよびＲＮＡベクター；該誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の少なくとも１つの活性が改変されている弱毒化マイコバクテリア；マイコバクテリア感染に対するワクチン；およびマイコバクテリア感染の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物は、細胞内感染を形成し得る。これらの感染としては、サルモネラ属、 エルシニア属、シゲラ属、カンピロバクター属、クラミジア属、およびマイコバクテリア属の種によって引き起こされる感染が挙げられる。これらの感染のいくつかは、もっぱら細胞内であり、他は細胞内および細胞外成分の両方を含む。しかし、疾患の進行についての主な支援因子と思われるのは、細菌感染の細胞内生存サイクルである。
【０００３】
一般的に、これらの微生物は、体内、例えば血流中で自由に循環せず、そしてしばしば薬物治療法に従順ではない。薬物が利用可能な場合、この問題は、多剤耐性微生物の発生によって悪化している。
【０００４】
多くの因子が、微生物耐性の問題に寄与している、１つは、長期にわたる変異の蓄積およびその後の変異した遺伝子の他の生物への水平および垂直移動である。したがって、所定の病原体について、全クラスの抗生物質が、不活性になっている。さらなる因子は、近年の新しいクラスの抗生物質の不在である。多剤耐性病原性細菌の出現は、公衆衛生に対して重篤な脅威を示し、そして新しい形態の治療が緊急に必要とされる。
【０００５】
同様の理由で、ワクチン療法は、このような細胞内微生物に対して有効性が確認されていない。また、細胞内でのバイオアベイラビリティーを改善するために抗生物質の全身濃度を上昇させることにより、重篤な副作用が生じ得る。
【０００６】
Mycobacterium tuberculosisおよび密接に関連する種は、Mycobacterium tuberculosis複合体（ＭＴＣ）として知られるマイコバクテリアの小さな群を構成する。この群は、全世界中で大部分の結核（ＴＢ）症例の原因因子である４つの種M. tuberculosis、M. microti、M. bovis、およびM. africanumを含む。
【０００７】
M. tuberculosisは、世界的に１年に３００万名以上の死亡の原因である。他のマイコバクテリアもヒトおよび動物において病原性であり、例えば、M. avium subsp. paratuberculosisは、反芻動物においてヨーネ病を引き起こし、M. bovisは、ウシにおいて結核を引き起こし、M. aviumおよびM. intracellulareは、免疫不全患者（例えば、ＡＩＤＳ患者、および骨髄移植患者）において結核を引き起こし、そしてM. lepraeは、ヒトにおいてハンセン病を引き起こす。他の重要なマイコバクテリア種は、M. vaccaeである。
【０００８】
M. tuberculosisは、体内のマクロファージ細胞に感染する。マクロファージ感染後すぐに、ほとんどのM. tuberculosis細菌は、細胞のファゴソーム小胞内に侵入し、存続し、そして複製し、そこで細菌は宿主防御および細胞外因子から隔離される。
【０００９】
細菌感染の細胞内生存および増殖または複製は、マイコバクテリア疾患の進行についての主な支援因子と思われる。
【００１０】
M. tuberculosis感染と戦うための多くの薬物治療法が提案されており、そして現在、薬物イソニアジドを含む組み合わせ治療が最も有効であることが確認されている。しかし、このような治療法の１つの問題は、治療が長期にわたるものであり、そしてこのような治療を完了させなければ、多剤耐性微生物の発生が促進され得ることである。
【００１１】
さらなる問題は、治療すべき細胞内で薬物の適切なバイオアベイラビリティーを提供することである。薬物の全身濃度を（例えば、より高用量を投与することによって）上昇させることは可能であるが、これは、上昇した薬物濃度によって引き起こされる重篤な福作用を生じ得る。
【００１２】
M. tuberculosisに対するワクチン予防の有効性は、大きく異なっている。現在のM. tuberculosisワクチンであるＢＣＧは、M. bovisの弱毒化株である。小児におけるＴＢの重篤な合併症に対して有効であるが、成人において、特に民族群間で、その有効性は大きく異なる。ＢＣＧワクチン接種は、結核性髄膜炎を予防するために用いられており、そして肺外の部位へのM. tuberculosisの蔓延を予防することを助けるが、感染を予防しない。
【００１３】
ＢＣＧの限られた有効性およびＴＢの全世界的な流行に対して、新しくより有効なワクチンを作り出す国際的な努力が行われている。現在のパラダイムは、その防御がＴｈ１免疫応答の刺激によって媒介されることである。
【００１４】
人間におけるＢＣＧワクチン接種は、最初に導入されたときは経口投与であったが、その経路は、胃腸管通過中の生存ＢＣＧの損失および頻繁な頚部リンパ腺症のため中止された。実験動物種においては、ＢＣＧのエアロゾルまたは気管内送達は、有害な作用なく達成されていたが、その有効性は、霊長類、マウス、およびモルモットにおける非経口接種よりも優れた防御効果から、他の研究における皮下経路を超える明らかな有利性がないことまで、有効性は異なっていた。
【００１５】
遺伝子およびタンパク質発現プロファイルを分析するための従来のマイコバクテリア培養システムは、単純なバッチタイプのシステムに基づいており、例えば、Sherman, D.R.ら (2001) PNAS，98巻，13号，7534-7539頁；Boon, C.ら (2001) J. Bacteriol，183巻，8号，2672-2676頁；Cunningham, A.F.ら (1998) J. Bacteriol、180巻，4号，801-808頁；およびMurugasu-Oei, B.ら (1999) Mol. Gen. Genet、262巻，677-682頁に記載されている。これらのバッチタイプシステムにおいて、マイコバクテリア増殖は、対数増殖期および定常期を含む代表的なシグモイド増殖曲線になる。対数増殖期から定常期への移行は、遺伝子およびタンパク質発現の点で迅速かつ一時的なスイッチを含み、このスイッチは、マイコバクテリアが必須栄養の飢餓になるような、未定義またはあまり定義されていない相互作用的な刺激の完全なセットによって開始される。
【００１６】
したがって、マイコバクテリア感染と戦うための改良されたおよび／または代替のワクチンあるいは治療剤の必要がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の第１の局面によれば、単離されたマイコバクテリアペプチド、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは改変体が提供され、このペプチドは、遺伝子によってコードされ、この遺伝子の発現は、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、マイコバクテリアの培養中に誘導またはアップレギュレートされる。
【００１８】
本発明で用いられる連続培養方法は、バッチ培養方法と比較した場合に特に有利である。これは、連続培養が、ｐＨ、利用可能な栄養、一定の増殖速度、および溶存酸素圧などの、増殖培養パラメータの厳格な制御を可能にするからである。
【００１９】
したがって、本発明の使用において、主要な、好ましくは唯一のマイコバクテリアビルレンス誘導パラメータが、低い溶存酸素圧の使用であることを確実にすることが可能である。これは、低い溶存酸素圧以外の環境スイッチに単に応答性である遺伝子の偶然の誘導またはアップレギュレーションが、実質的に抑制され得ることを意味する。したがって、誘導またはアップレギュレーションが低い溶存酸素圧に関連しない遺伝子の偽陽性同定が、実質的に避けられ得る。
【００２０】
マイコバクテリアバッチ培養システムは、マイコバクテリアが必須栄養の飢餓になるような相互作用的な種々の刺激を含む。結果として、マイコバクテリアは、複雑な範囲の飢餓刺激に曝露され、この刺激は、単離において単一の迅速なまたは一時的な刺激に関連する細胞効果を不明瞭または改変し得る。逆に、本発明は、酸素制限の主な刺激に関する。
【００２１】
本発明の連続培養条件とバッチタイプシステムとのさらなる違いは、本発明が、主な刺激として酸素制限を用い、そして酸素飢餓を含まないことである。酸素制限中、マイコバクテリアは増殖および再生し得、したがって、本発明は、注意深く制御された環境条件下でマイコバクテリア増殖を維持する。逆に、バッチタイプ培養システムで経験するような飢餓刺激に曝露される場合、マイコバクテリアは、実質的に増殖および再生しない。このような飢餓刺激は、代表的には、ストレスタイプ環境条件に関連し、そして栄養制限に関連するのとは異なるマイコバクテリア細胞応答を誘起する。
【００２２】
溶存酸素圧パラメータは、酸素電極および従来の実験室技法によって算出される。したがって、１００％酸素飽和は、空気で飽和される溶液に対応し、一方、０％は、窒素のような不活性ガスで全体的に通気している溶液に対応する。較正は、標準大気圧条件下で、および約２１％酸素を含む従来の空気で行われる。
【００２３】
本発明の低酸素圧誘導条件は、マイコバクテリアの天然のターゲット細胞の感染中にインビボで正常に発現される少なくとも１つの遺伝子を発現するためのマイコバクテリアに伝導性である培養条件であり、本発明の発明者らは、低酸素環境を含むと考える。
【００２４】
用語「単離された」、「実質的に純粋」、および「実質的に均一」は、天然に随伴する成分から分離されているペプチドを記載するために交換可能に使用される。少なくとも約６０〜７５％の試料が単一ペプチド配列を示す場合、ペプチドは実質的に純粋である。実質的に純粋なペプチドは、代表的には約６０〜９０％w/wのタンパク質試料を含み、より通常には約９５％であり、そして好ましくは約９９％以上純粋である。ペプチドの純度または均一性は、例えば、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、次いでゲルの染色での単一のポリペプチドバンドの可視化によって示され得る。あるいは、より高い分解能が、例えば、ＨＰＬＣを用いることによって提供され得る。
【００２５】
ペプチドは、その天然の状態で随伴する夾雑物から分離される場合に、単離されたと考えられる。したがって、化学的に合成されるかまたは天然由来の細胞とは異なる細胞系で合成されるペプチドは、天然に随伴する成分を実質的に含まない。
【００２６】
本発明は、マイコバクテリアから精製され得るペプチド、ならびにこれらのペプチドをコードする組換え核酸で形質転換した他のタイプの細胞から精製され得るペプチドを提供する。
【００２７】
所望であれば、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質配列決定法によって決定され得る。
【００２８】
用語「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、交換可能に使用され、そして特定の長さの産物をいうわけではない。これらの用語は、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などの翻訳後改変を包含する。
【００２９】
用語「フラグメント」とは、問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物であるペプチドの、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、および最も好ましくは少なくとも３５のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントは、好ましくは、問題の遺伝子産物のエピトープを含む。
【００３０】
用語「改変体」とは、問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物であるペプチドと、少なくとも７０、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９０パーセントのアミノ酸配列相同性を有するペプチドまたはペプチド「フラグメント」を意味する。「改変体」の例は、アミノ酸の１以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸）または置換された連結を含む、誘導／アップレギュレートされた遺伝子のペプチドまたはペプチドフラグメントである。用語「相同性」および「同一性」は、本明細書において同義と考えられる。さらなる実施態様では、「改変体」は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの模倣物であり得、この模倣物は、ペプチドまたはペプチドフラグメントの少なくとも１つのエピトープを再生する。この模倣物は、例えば、核酸模倣物、好ましくはＤＮＡ模倣物であり得る。
【００３１】
配列比較について、代表的には、１つの配列は、参照配列として作用し、これに対してテスト配列が比較され得る。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テストおよび参照配列は、コンピュータに入力され、次の座標が指定され、必要であれば、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対するテスト配列についての配列同一性のパーセンテージを算出する。
【００３２】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman［Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)］の局所相同性アラインメントアルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch［J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)］のアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman［Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)］の類似性方法についての検索によって、これらのアルゴリズム（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA - Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）のコンピュータ実行によって、または目視検査によって行われ得る［Current Protocols；Molecular Biology，F.M. Ausbelら編，Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, In. And John Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubelを参照のこと］。
【００３３】
配列類似性のパーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズム［Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410頁；およびthe National Center for Biotechnology Informationの「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/」を参照のこと］。
【００３４】
好ましい相同性比較において、同一性は、少なくとも５０ヌクレオチド長である配列の領域にわたり存在する。
【００３５】
用語「誘導体」とは、問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物であるペプチド（またはそのフラグメントもしくは改変体）を含むペプチドを意味する。したがって、誘導体は、問題のペプチド、および１以上の追加のエピトープを導入し得るさらなるペプチド配列を含み得る。さらなるペプチド配列は、好ましくは、問題のペプチドの基本的なフォールディングおよびこのようなコンホメーション構造を妨害するべきではない。「誘導体」の例は、融合タンパク質、結合体、およびグラフトである。したがって、２以上のペプチド（またはフラグメントもしくは改変体）は、誘導体を形成するために一緒に連結され得る。あるいは、ペプチド（またはフラグメントもしくは改変体）は、関連のない分子（例えば、あるペプチド）に連結され得る。誘導体は、化学的に合成され得るが、代表的には組換え核酸方法によって調製される。脂質、および／または多糖、および／またはポリケチド成分などの追加の成分が含まれ得る。
【００３６】
すべての分子「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」は、共通の抗原性交差反応性、および／またはそれらが由来する問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物と実質的に同じインビボ生物学的活性を有する。例えば、フラグメント、改変体、または誘導体に結合し得る抗体はまた、問題の誘導またはアップレギュレートされた遺伝子の遺伝子産物に結合し得る。フラグメント、改変体、および誘導体がそれぞれ、問題の誘導またはアップレギュレートされたペプチドであるペプチドの活性部位を有することが、好ましい特徴である。あるいは、本発明のペプチドの上記の実施態様のすべては、マイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の「再現応答（recall response）」を誘導する共通の能力を有する。
【００３７】
好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択される。
【００３８】
本発明の第２の局面によれば、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中にその発現が誘導またはアップレギュレートされる、マイコバクテリア遺伝子を同定する方法が提供される。この方法は、以下の工程を包含する：
３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、第１のマイコバクテリアを培養する工程；
３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下で、第２のマイコバクテリアを培養する工程；
該第１および第２のマイコバクテリアから、第１および第２のｍＲＮＡ集団をそれぞれ得る工程；
該第１および第２のｍＲＮＡ集団から、第１および第２のｃＤＮＡ集団をそれぞれ調製する工程であって、該ｃＤＮＡ調製中に、検出可能な標識が、該第１および第２のｃＤＮＡ集団のｃＤＮＡ分子に導入される、工程；
該第１および第２のｃＤＮＡ集団から、対応する第１および第２のｃＤＮＡ分子をそれぞれ単離する工程；
該単離された第１および第２のｃＤＮＡ分子に存在する標識から放出される標識または対応するシグナルの相対量を比較する工程；
該単離された第２のｃＤＮＡ分子によって提供されるよりも多い量の該単離された第１のｃＤＮＡ分子によって提供される標識またはシグナルを同定する工程；および
該第１のｃＤＮＡ、および３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中に誘導またはアップレギュレートされる対応するマイコバクテリア遺伝子を同定する工程。
【００３９】
本明細書全体を通して、遺伝子をいう場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を包含する。
【００４０】
本発明の第１の局面について記載された種々の実施態様は、本発明の第２およびそれに続く局面に等しく適用する。
【００４１】
「第１および第２のｃＤＮＡ集団からの対応する第１および第２のｃＤＮＡ分子」とは、実質的に同じヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡをいう。したがって、各培養条件（すなわち、高酸素、および低酸素）下で所定の遺伝子に関するｃＤＮＡコピーを単離することによって、各培養条件についての遺伝子のｃＤＮＡの相対コピー数を定量することが可能である。各ｃＤＮＡコピーは、ｍＲＮＡ分子から生成されているので、ｃＤＮＡコピー数は各培養条件についての対応するｍＲＮＡコピー数を反映し、したがって、誘導またはアップレギュレートされた遺伝子を同定することが可能である。
【００４２】
マイコバクテリウムは、M. phlei、M. smegmatis、M. africanum、M. caneti、M. fortuitum、M. marinum、M. ulcerans、M. tuberculosis、M. bovis、M. microti、M. avium、M. paratuberculosis、M. leprae、M. lepraemurium、M. intracellulare、M. scrofulaceum、M. xenopi、M. genavense、M. kansasii、M. simiae、M. szulgai、M. haemophilum、M. asiaticum、M. malmoense、M. vaccae、およびM. shimoideiの種から選択される。特に興味深いのは、ＭＴＣのメンバー、好ましくはM. tuberculosisである。同様に、本発明のすべての実施態様は、上記の同定されたマイコバクテリアソースに基づき得る。
【００４３】
マイコバクテリアを培養するために適切な培地は、Wayne, L.G. (1994)［Tuberculosis: Pathogenesis, Protection, and Control、the American Society for Microbiologyによって公表，73-83頁］に記載される。これらは、Middlebrook 7H9 Medium［Barker, L.P.ら (1998) Molec. Microbiol., 29巻(5), 1167-1177頁を参照のこと］、および本発明の出願人のＷＯ００／５２１３９を包含する。
【００４４】
１つの実施態様では、第１および第２のｃＤＮＡ分子は、特定のマイコバクテリア種のゲノム内の各公知の遺伝子（またはＯＲＦ）を代表する固定化ＤＮＡ配列を含むアレイとのハイブリダイゼーションによって、対応するｃＤＮＡ集団から単離される。したがって、第１のｃＤＮＡは、両方のｃＤＮＡが同じ固定化ＤＮＡ配列とハイブリダイズするならば、第２のｃＤＮＡに「対応する」と考えられる。あるいは、特定のマイコバクテリア株または多くの異なる種および／または株由来の代表的なＤＮＡ配列が、アレイで用いられ得る。
【００４５】
他の実施態様では、第１および第２のｃＤＮＡは、蛍光標識の組込みによって調製される。第１および第２のｃＤＮＡは、異なる波長で蛍光を発する標識を組み込み得、それによって２つのＤＮＡ試料の二重蛍光および同時検出を可能にする。
【００４６】
天然に用いられる標識のタイプは、検出方法の出力が読まれる手段によって決定する。蛍光標識を用いる場合、好ましくは、共焦点レーザースキャナーが用いられる。
【００４７】
使用する場合、高酸素培養条件と比較して低酸素培養条件下で少なくとも１．５倍までアップレギュレートされる遺伝子（すなわち、検出アッセイにおいてｃＤＮＡによって示される場合）が選択されることが好ましい。より好ましい実施態様では、対応するアップレギュレーション選択基準は、少なくとも２倍、より好ましくは３倍、もっとも好ましくは４倍である。さらなる実施態様では、少なくとも１０倍、好ましくは５０倍のアップレギュレーションレベルが用いられ得る。
【００４８】
本発明の好ましい核酸およびペプチド配列は、上で同定したレベルによってアップレギュレートされるものである。
【００４９】
１つの実施態様によれば、低および高酸素培養したシステムからの蛍光標識したｃＤＮＡ配列は、マイコバクテリアゲノムアレイ全体とハイブリダイズすることが可能であった。第１のｃＤＮＡ集団を、蛍光標識Ａで標識し、そして第２のｃＤＮＡ集団を、蛍光標識Ｂで標識した。アレイを、各染料の励起可能な極大に対応する２つの異なる波長でスキャンし、そして発光の強度を記録した。各ｃＤＮＡについて複数のアレイを調製し、そして平均強度値を、各染料での各スポットについての２つのｃＤＮＡ集団にわたって算出し、それに対する相対誘導またはアップレギュレーションを定量した。
【００５０】
上記ｍＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ調製および標識付けの他に、ゲノムＤＮＡは、第１および第２のマイコバクテリアから単離され得る。したがって、好ましい実施態様では、標識されたＤＮＡはまた、単離されたＤＮＡから調製される。標識されたＤＮＡは、次いで、コントロールとして各アレイ上に含まれ得る。
【００５１】
アップレギュレートまたは誘導された遺伝子を同定するための上記の転写に基づく方法の代替として、ｍＲＮＡレベルよりもタンパク質レベルで同定が行われ得る。より詳細には、タンパク質試料が、第１および第２のマイコバクテリアから取り出され得、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは非変性電気泳動のような従来の分離技法、次いでデンシトメーター分析によるような従来の分析にかけられ得る。第１および第２のマイコバクテリアのそれぞれからの特定のタンパク質の相対量を比較することによって、その生成が酸素制限下でアップレギュレートまたは誘導されるこれらのタンパク質が同定され得る。
【００５２】
低酸素培養条件を規定する好ましい最大溶存酸素圧の閾値は、３７℃で測定した５％空気飽和まで、より好ましくは３７℃で測定した２％空気飽和まで、および最も好ましくは３７℃で測定した１％空気飽和までである。対応する最小ＤＯＴは、代表的には３７℃で測定した少なくとも０．５％空気飽和、好ましくは３７℃で測定した少なくとも１％空気飽和である。
【００５３】
同様に、高酸素培養条件を規定する好ましい最小溶存酸素圧閾値は、３７℃で測定した４５％空気飽和、およびより好ましくは３７℃で測定した５０％空気飽和である。
【００５４】
培養培地のｐＨは、好ましくはｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５、最も好ましくは約ｐＨ６．９に維持される。
【００５５】
本発明の好ましい核酸およびペプチド配列は、上で同定されたＤＯＴおよびｐＨ条件下でアップレギュレートされるものである。
【００５６】
本発明の第３の局面によれば、マイコバクテリアペプチドのインヒビターが提供され、該ペプチドは、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中にその発現が誘導またはアップレギュレートされる遺伝子によってコードされ、そして該インヒビターは、該マイコバクテリアペプチドが本来有する生物学的効果を発揮することを抑制または阻害し得る。
【００５７】
マイコバクテリアペプチドの阻害は、核酸レベルで（すなわち、ＤＮＡ、またはＲＮＡ）、またはペプチドレベルで行われ得る。
【００５８】
１つの実施態様では、インヒビターは、１以上のアシルキャリアタンパク質、モノオキシゲナーゼ、マイコバクチン合成タンパク質、転写レギュレーター、酸化還元酵素、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エステラーゼ／アセチルヒドロラーゼ、シトクロムＤ、メチルトランスフェラーゼ、トランスアミナーゼ、ＰＰＥタンパク質、バリル−ｔＲＮＡシンセターゼ、グアニル酸キナーゼ、ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ＡＢＣトランスポーター、ＡＴＰ−結合タンパク質、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ、σ因子、ピルビン酸キナーゼ、熱ショックタンパク質、およびアミノトランスフェラーゼを阻害し得る。
【００５９】
さらなる実施態様では、インヒビターは、本発明によって同定可能な誘導またはアップレギュレートされたマイコバクテリア遺伝子、またはその遺伝子産物をターゲティングし得る抗生物質であり得る。抗生物質は、好ましくは、遺伝子および／または遺伝子産物に特異的である。
【００６０】
本発明のインヒビターは、本明細書で提供される配列情報を利用して調製され得る。例えば、これは、ペプチドを過剰発現させ、ペプチドを精製し、次いで精製されたペプチドにおけるＸ線結晶解析を行うことによって、その分子構造が得られ得る。次に、ポリペプチドのすべてまたは一部あるいはその基質に類似する分子構造を有する化合物が生成される。次いで、この化合物は、ペプチドと組み合わされ、そしてペプチドに付着して、１以上のその生物学的活性をブロックし得る。
【００６１】
低酸素圧下での誘導／アップレギュレーション（すなわち、ビルレンス）に関連する配列を含有するマイコバクテリア染色体の領域に結合する単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドも、本発明の範囲に包含され、アンチセンスおよび三重鎖形成ポリヌクレオチドが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「結合」とは、水素結合または他の分子力によって媒介される、オリゴヌクレオチドとターゲットヌクレオチド配列との間の相互作用または複合体生成をいう。用語「結合」とは、より詳細には、塩基−塩基水素結合によって媒介される２つのタイプのヌクレオチド間結合をいう。第１のタイプの結合は、「ワトソン−クリック−タイプ」結合相互作用であり、これは、アデニン−チミン（またはアデニン−ウラシル）およびグアニン−シトシンの塩基対が、塩基間の水素結合によって形成される。このタイプの結合の例は、ＤＮＡ二重らせんおよびＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに伝統的に関連する結合であり；このタイプの結合は、通常は、ハイブリダイゼーション手順によって検出される。
【００６２】
第２のタイプの結合は、「三重鎖結合」である。一般的に、三重鎖結合とは、第３のポリヌクレオチド鎖と、ワトソン−クリック様式で既に対となっている二重鎖ＤＮＡ（またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）との、任意のタイプの塩基−塩基水素結合をいう。
【００６３】
好ましい実施態様では、インヒビターは、誘導可能またはアップレギュレート可能な遺伝子の少なくとも一部に相補的であるアンチセンス核酸配列であり得る。
【００６４】
使用するインヒビターは、核酸配列の形態である場合、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドを含む。
【００６５】
本発明の第４の局面によれば、遺伝子によってコードされるペプチドに、または該ペプチドのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体に結合する抗体が提供され、該遺伝子の発現は、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中に誘導またはアップレギュレートされる。
【００６６】
抗体は、好ましくは、問題のペプチドに特異性を有し、そしてそこへの結合によって、マイコバクテリアのコーティングを開始し得る。細菌のコーティングは、好ましくは、そのオプソニン化を導く。これは、次には、細菌の破壊に至る。抗体が、ターゲティングされるマイコバクテリア（例えば、種および／または株）に特異的であることが好ましい。
【００６７】
抗体によるオプソニン化は、マクロファージにおけるレセプター媒介侵入および複製を抑制または調節することによって、食細胞および非食細胞におけるマイコバクテリアの細胞侵入および蔓延に影響し得る。
【００６８】
本発明のペプチド、フラグメント、改変体、または誘導体は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む抗体を産生するために使用され得る。ポリクローナル抗体が所望である場合は、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）に、免疫原性ポリペプチドを免疫する。免疫した動物からの血清を収集し、そして公知の手順に従って処理する。所望のマイコバクテリアエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が他の抗原に対する抗体を含む場合は、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。
【００６９】
あるいは、ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成するための一般的方法論（例えば、細胞融合による不死化抗体産生細胞株の調製）、または他の技法（例えば、発癌性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクション）が用いられ得る。
【００７０】
本発明のこの局面に用いられる抗体は、任意の抗体イソタイプファミリーに属し得るか、あるいはその誘導体または模倣物であり得る。本明細書全体を通して抗体というときは、組換え産生抗体、およびマイコバクテリア抗原に結合し得る抗体の任意の部分を包含する。
【００７１】
１つの実施態様では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡイソタイプファミリーに属する。
【００７２】
好ましい実施態様では、抗体は、ＩｇＡイソタイプファミリーに属する。本明細書全体を通してＩｇＡイソタイプというときは、この抗体の分泌形態（すなわち、ｓＩｇＡ）を包含する。ｓＩｇＡの分泌コンポーネント（ＳＣ）は、インビトロまたはインビボで付加され得る。後者の場合、患者の天然のＳＣ標識機構の使用が用いられ得る。
【００７３】
１つの実施態様では、抗体は、ＭＴＣのメンバー由来のペプチド、好ましくはM. tuberculosisに対して惹起され得る。
【００７４】
好ましい実施態様では、抗体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７からなる群より選択されるペプチド（またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体）に結合し得る。
【００７５】
さらなる実施態様では、抗原は、マイコバクテリア病原菌の露出したコンポーネントである。他の実施態様では、抗原は、マイコバクテリア病原菌の細胞表面コンポーネントである。
【００７６】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００７７】
いかなる理論にも縛られることはないが、マイコバクテリアがマクロファージに感染した後、マクロファージは殺され、そして病原菌が放出されることが可能である。この段階では、マイコバクテリアは、抗体攻撃に対して最も脆弱であると考えられる。したがって、本発明の抗体は、マクロファージの死後に放出された病原菌に作用し、そしてそれによって感染後効果を発揮することが可能である。
【００７８】
感染したマクロファージに潜伏しているマイコバクテリア病原菌上の抗原に対して本発明の抗体の接近性が増強されていることによって、本発明の受動防御局面（すなわち、抗体の送達）は、容易になり得る。実際、ａｃｒ発現は対数増殖中は低いが、定常期または酸素制限状態で増加し、特にマクロファージ内で複製する生物において増加する。ａｃｒ発現はマイコバクテリア感染性に必要と考えられ、抗体結合は、そのオリゴマー構造の立体障害または破壊によってマクロファージへの感染をブロックし得ることが可能である。したがって、感染したマクロファージが殺され、放出されたマイコバクテリア病原菌に作用する抗体は、新鮮なマクロファージへの再感染の蔓延を妨害し得る。この仮説は、抗体と、感染後早期に作用する細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、γδおよびＮＫＴ細胞）との間の相乗作用を含むが、後者はＣＤ８およびＣＤ４細胞傷害性Ｔ細胞もまた含み得る。
【００７９】
本発明の第５の局面によれば、遺伝子が改変されてマイコバクテリアが実質的に非病原性になる弱毒化マイコバクテリアが提供される。この遺伝子は、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中に、その発現が誘導またはアップレギュレートされる遺伝子である。
【００８０】
用語「改変された」とは、マイコバクテリアを実質的に非病原性にする核酸または核酸配列の置換、欠失、または挿入などの任意の遺伝子操作をいう。１つの実施態様では、誘導可能またはアップレギュレート可能な遺伝子全体が欠失され得る。
【００８１】
好ましい実施態様では、改変されるべき遺伝子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、および１３８からなる群の１つに対応する野生型コード配列を有する。
【００８２】
野生型配列が、用いられるデータベースに依存してマイナーな改変を含み得ることが理解される。
【００８３】
本発明の第６の局面によれば、弱毒化微生物キャリアが提供され、これは、遺伝子によってコードされるペプチド、または該ペプチドのフラグメント、改変体、もしくは誘導体を含み、この遺伝子の発現は、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中に誘導またはアップレギュレートされる。
【００８４】
使用する場合、ペプチド（またはフラグメント、改変体、もしくは誘導体）は、このキャリアの表面に少なくとも部分的に露出するか、またはキャリアがインビボで分解されてペプチド（またはフラグメント、改変体、もしくは誘導体）の少なくとも一部が宿主の免疫系に曝露されるかのいずれかである。
【００８５】
１つの実施態様では、弱毒化微生物キャリアは、弱毒化サルモネラ、弱毒化ワクシニアウイルス、弱毒化鶏痘ウイルス、または弱毒化M. bovis（例えば、ＢＣＧ株）からなる群より選択される。
【００８６】
好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、および１３７（またはそのフラグメント、改変体、もしくは誘導体）からなる群より選択される。
【００８７】
本発明の第７の局面によれば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および遺伝子または該遺伝子のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドが提供され、この遺伝子の発現は、３７℃で測定した少なくとも４０％空気飽和の溶存酸素圧下で連続培養した場合と比較して、３７℃で測定した１０％空気飽和までの溶存酸素圧によって規定される連続培養条件下でのマイコバクテリアの培養中に誘導またはアップレギュレートされ、ここで、該プロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、該ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。
【００８８】
本発明で使用される用語ＤＮＡ「フラグメント」は、通常、少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド）、より通常には少なくとも約７〜１５コドン、および最も好ましくは少なくとも約３５コドンを含む。このヌクレオチド数は、通常、このような配列と特異的にハイブリダイズする好ましいプローブに必要とされるほぼ最小長である。
【００８９】
好ましい実施態様では、ＤＮＡ「フラグメント」は、対応する誘導／アップレギュレートされた遺伝子のコード配列の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、およびより好ましくは少なくとも８０％であるヌクレオチド長を有する。
【００９０】
用語ＤＮＡ「改変体」とは、誘導／アップレギュレートされた遺伝子のコード配列（またはそのフラグメント）と実質的に相同なまたは実質的に類似するＤＮＡ配列を意味する。核酸またはそのフラグメントは、他の核酸（またはその相補鎖）と（適切なヌクレオチド挿入または欠失とともに）最適にアラインした場合に、少なくとも約６０％のヌクレオチド塩基、通常は少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、およびより好ましくは少なくとも約９５〜９８％のヌクレオチド塩基にヌクレオチド配列同一性があるならば、もう一方に「実質的に相同」（または「実質的に類似」）である。相同性決定は、ペプチドについて上記のように行われる。
【００９１】
あるいは、ＤＮＡ「改変体」は、選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし得る場合、誘導／アップレギュレートされた遺伝子のコード配列（またはそのフラグメント）と、実質的に相同（または実質的に類似）である。ハイブリダイゼーションの選択性は、ハイブリダイゼーションが生じる場合に存在し、全体的に特異性がない場合よりも実質的により選択的である。代表的には、少なくとも約１４ヌクレオチドの長さに渡って少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約７５％、および最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性がある場合に、選択的ハイブリダイゼーションが生じる。Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12: 203-213を参照のこと。上記のように、相同性比較の長さは、より長い長さにわたるものであり得、そしてある実施態様では、しばしば、少なくとも約１７ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、および好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの長さにわたる。
【００９２】
核酸ハイブリダイゼーションが、塩基組成、相補鎖の長さ、およびハイブリダイズしている核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数の他に、塩濃度（例えば、NaCl）、温度、または有機溶媒のような条件によって影響を受けることは、当業者には容易に理解される。好ましくは、ストリンジェントな温度条件が用いられ、そして一般的には３０℃超える、代表的には３７℃を超える、および好ましくは４５℃を超える温度を含む。ストリンジェントな塩条件は、普通には１０００ｍＭ以下、代表的には５００ｍＭ以下、および好ましくは２００ｍＭ以下である。ｐＨは、代表的には７．０〜８．３である。しかし、パラメータの組み合わせは、任意の単一のパラメータの基準よりも非常に重要である。例えば、WetmurおよびDavidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370を参照のこと。
【００９３】
用語ＤＮＡ「誘導体」とは、誘導／アップレギュレートされた遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列（またはそのフラグメントもしくは改変体）およびコード配列に対応するＤＮＡ配列に天然には随伴しない追加のＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡポリヌクレオチドを意味する。上記のペプチド誘導体についてのコメントがまた、ＤＮＡ「誘導体」に適用される。「誘導体」は、例えば、酸素制限中に誘導されるマイコバクテリアオペロンの２以上のコード配列を含み得る。したがって、コード配列間の非コード領域の存在または不在に依存して、このような「誘導体」の発現産物は、融合タンパク質、または個々のコード領域によってコードされる別々のペプチド産物であり得る。
【００９４】
上記の用語ＤＮＡ「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」は、互いに共通して、得られるペプチド産物が対応する野生型ペプチドと実質的に同じ交差反応性抗原性特性を有する。好ましくは、本発明の上記ＤＮＡ分子実施態様のすべてのペプチド産物は、野生型ペプチドにも結合する抗体と結合する。あるいは、上記のペプチド産物のすべては、マイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の「再現応答」を誘導し得る。
【００９５】
プロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、好ましくは、遺伝子が真核生物細胞中で発現されることを確実にするように選択される。強力なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが好ましい。
【００９６】
関連の局面では、本発明は、本発明のＤＮＡ配列、または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされる単離されたＲＮＡ分子を提供する。
【００９７】
「単離された」ＲＮＡは、目的の配列と天然に随伴する他のマイコバクテリア成分（例えば、リボソーム、ポリメラーゼ、ならびにＤＮＡおよび他の染色体配列のような他のマイコバクテリアポリヌクレオチド）から実質的に分離されるＲＮＡである。
【００９８】
上記ＲＮＡ分子は、例えば、ワクチン成分のような宿主細胞に直接導入され得る。
【００９９】
あるいは、ＲＮＡ分子は、投与前にＲＮＡベクターに組込まれ得る。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチド配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）としては、その天然に存在する環境から取り出されている核酸配列、および組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物、および化学的に合成されたアナログまたは異種系によって生物学的に合成されたアナログが挙げられる。
【０１０１】
本明細書で用いる場合、用語「組換え体」とは、その起源または操作によって、（１）天然に随伴するポリヌクレオチドのすべてまたは一部と随伴しない；または、（２）天然に連結される以外のポリヌクレオチドに連結される；および（３）天然に存在しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意図する。この人工的な組み合わせは、しばしば、化学合成手段、あるいは核酸の単離されたセグメントの人工的な操作（例えば、遺伝子操作技法）のいずれかによって達成される。通常、この操作は、コドンを、同じまたは保存的アミノ酸をコードする重複コドンで置換するために行われるが、代表的には、配列認識部位を導入または除去する。あるいは、機能の所望の組み合わせを生成するために所望の機能の核酸セグメントを一緒に連結するために行われる。
【０１０２】
本発明の実施態様では、ポリヌクレオチドは、低酸素圧下で誘導またはアップレギュレートされるペプチドをコードし得る。核酸は、その天然の状態でまたは操作された場合に、転写および／または翻訳されて、ペプチドまたはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を生成し得るならば、ペプチドを「コードする」という。このような核酸のアンチセンス鎖も、配列をコードするという。
【０１０３】
目的のポリヌクレオチドを含む発現ベクターも、本発明の範囲内に意図される。発現ベクターは、一般的には、適切な転写および翻訳調節エレメントに作動可能に連結されるペプチドをコードする、複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターに通常含まれる調節エレメントの例は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および転写および翻訳開始および終止配列である。これらの調節エレメントは、翻訳される配列に作動可能に連結される。核酸配列は、他の核酸配列と機能的関連に配置される場合、作動可能に連結される。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、作動可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり、そして２つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合、連続的かつリーディングフレーム内であることを意味する。ビルレンス因子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに用いられる調節エレメントは、発現に用いられる宿主細胞において機能的である。
【０１０４】
本発明のポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の任意の手段によって調製され得る。例えば、大量のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞中での複製によって産生され得る。所望のフラグメントをコードする天然または合成ＤＮＡフラグメントは、原核生物または真核生物細胞に導入およびそこで複製し得る、組換え核酸構築物、代表的には、ＤＮＡ構築物に組込まれる。通常は、ＤＮＡ構築物は、単細胞宿主（例えば、酵母または細菌）中での自律複製に適切であるが、培養された昆虫、哺乳動物、植物、または他の真核生物の細胞株のゲノム内への導入および組込みについても意図され得る。
【０１０５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法によって、化学合成によって生成され得、そして市販の自動オリゴヌクレオチド合成機で合成され得る。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成しそして適切な条件下でこの鎖を一緒にアニールすること、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を加えることのいずれかによって、化学合成の一本鎖産物から得られ得る。
【０１０６】
原核生物または真核生物宿主ヘの導入のために調製されるＤＮＡ構築物は、代表的には、宿主によって認識される複製システムを含み、これは、所望のペプチドをコードする目的のＤＮＡフラグメントを含み、そして好ましくは、ポリペプチドコードセグメントに作動可能に連結される転写および翻訳開始調節配列も含む。発現ベクターは、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）および発現調節配列、プロモーター、エンハンサー、ならびに必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終止配列、およびｍＲＮＡ安定化配列を含み得る。選択した宿主細胞から分泌されるポリペプチドからの分泌シグナルも、適切である場合、含まれ得、したがって細胞膜にタンパク質を交差および／または留まらせ、したがって、その機能的トポロジーを獲得しまたは細胞から分泌される。
【０１０７】
適切なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、宿主中で機能的であるように選択され、そして、適切である場合、マイコバクテリア遺伝子と天然に随伴する配列を含み得る。ｔｒｐ、ｌａｃ、およびファージプロモーターのようなプロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、および解糖系酵素プロモーターは、原核生物宿主で使用され得る。有用な酵母プロモーターとしては、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ、または他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、マルトースおよびガラクトース利用に寄与し得る酵素などについてのプロモーター領域が挙げられる。
【０１０８】
適切な非天然哺乳動物プロモーターとしては、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、またはマウスモロニー白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、トリ肉種ウイルス、アデノウイルスII、ウシパピローマウイルス、またはポリオーマ由来のプロモーターが挙げられ得る。さらに、構築物は、増幅可能な遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結され得、そのため遺伝子の複数のコピーが作成され得る。
【０１０９】
このような発現ベクターは自律複製し得るが、これらは宿主細胞のゲノムに挿入されることによってはあまり複製され得ない。
【０１１０】
発現およびクローニングベクターは、好ましくは、選択可能マーカー、すなわち、ベクターで形質転換される宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含む。この遺伝子の存在は、挿入物を発現する宿主細胞のみの増殖を確実にする。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒性物質、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなどに耐性を与える；（ｂ）栄養欠失を補う；または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養を供給するタンパク質をコードする（例えば、バシラス属についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。適切な選択可能マーカーの選択は、宿主細胞に依存する。
【０１１１】
目的の核酸を含むベクターは、インビトロで転写され得、そして得られるＲＮＡは宿主細胞に（例えば、注入によって）導入され得るか、あるいは、ベクターは、細胞宿主のタイプに依存して異なる方法によって宿主細胞に直接導入され得、これらの方法としては、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロインジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；感染（ここではベクターは、レトロウイルスゲノムのような感染性因子である）が挙げられる。上記の核酸が導入されている細胞は、このような細胞の子孫も包含することを意味する。
【０１１２】
本発明の大量の核酸およびペプチドは、適合可能な原核生物または真核生物宿主細胞においてベクターまたは他の発現ベヒクル中で核酸またはその一部を発現させることによって調製され得る。最も一般的に用いられる原核生物宿主は、Escherichia coliの株であるが、Bacillus subtilisまたはシュードモナス属のような他の真核生物も使用され得る。
【０１１３】
哺乳動物または他の真核生物宿主細胞、例えば、酵母、糸状菌、植物、昆虫、両生類、または鳥類の種の細胞もまた、本発明のタンパク質の産生に有用であり得る。培養物中における哺乳動物細胞の増殖は、それ自体周知である。通常用いられる哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株であるが、例えば、より高発現、所望のグリコシル化パターンを提供するために、他の細胞株が適切であり得る。
【０１１４】
クローンは、ベクター構築物の態様に依存してマーカーを使用することによって選択される。マーカーは、同じまたは異なるＤＮＡ分子、好ましくは同じＤＮＡ分子上にあり得る。形質転換体は、スクリーニングされ、あるいは、好ましくは、当業者に周知の任意の手段によって、例えば、アンピシリン、テトラサイクリンのような抗生物質への耐性によって、選択され得る。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、形質転換、形質導入、およびエレクトロポレーションを含む、当該技術分野で公知の任意の手段によって、宿主細胞に挿入され得る。本明細書で使用する場合、「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、および微生物または単細胞体として培養された高等真核生物細胞株を示す他のこのような用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡについてのレシピエントとして使用され得るまたは使用されている細胞をいい、そして形質転換されている元の細胞の子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、天然、偶然、または意図的な変異のため、形態学的にまたはゲノムもしくはＤＮＡ相補物全体において、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよい。本明細書で使用する場合、「形質転換」とは、挿入に使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−接合、またはエレクトロポレーションにかかわらず、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいう。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えば、プラスミドとして維持され得るか、あるいは、宿主細胞ゲノム中に組込まれ得る。
【０１１６】
１つの実施態様では、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡベクターは、ペプチドでのチャレンジ後に免疫応答に特異的である免疫系の成分をコードし得、該ペプチドは、マイコバクテリアの増殖の酸素制限中に誘導またはアップレギュレートされるマイコバクテリア遺伝子によってコードされる。
【０１１７】
このような成分の例は、誘導またはアップレギュレートされる遺伝子のペプチド産物に対する抗体である。したがって、１つの実施態様では、核酸配列（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡベクター）は、問題のペプチドをコードする。
【０１１８】
本発明の第８の局面は、マイコバクテリア感染を治療または予防するための医薬品の製造における、本発明のペプチド、インヒビター、抗体、弱毒化マイコバクテリア、弱毒化微生物キャリア、誘導またはアップレギュレートされた遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含むＤＮＡプラスミド、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされるＲＮＡ配列、および／または該ＲＮＡ配列を含むＲＮＡベクターの使用を提供する。
【０１１９】
用語「予防する」とは、マイコバクテリア感染の重篤度／強度、またはその開始を減少させることを包含する。
【０１２０】
用語「治療する」とは、マイコバクテリア感染の感染後治療および改善を包含する。
【０１２１】
関連の局面では、マイコバクテリア感染の治療または予防方法が提供され、この方法は、本発明のペプチド、インヒビター、抗体、弱毒化マイコバクテリア、弱毒化微生物キャリア、誘導またはアップレギュレートされた遺伝子のコード配列に対応するＤＮＡ配列または該ＤＮＡ配列のフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体を含むＤＮＡプラスミド、該ＤＮＡ配列または該フラグメントもしくは改変体もしくは誘導体によってコードされるＲＮＡ配列、および／または該ＲＮＡ配列を含むＲＮＡベクターからなる群より選択される医薬品の患者への投与を包含する。
【０１２２】
医薬品は、従来の経路、例えば、静脈内、腹腔内、鼻内経路によって投与され得る。
【０１２３】
本発明のペプチドのエピトープの免疫原性は、例えば、Ｂ型肝炎表面抗原と結合されるような粒子形成タンパク質と融合または会合される、哺乳動物または酵母系においてペプチドを調製することによって増強され得る。ワクチンは、本発明の１以上の免疫原性ペプチドから調製され得る。
【０１２４】
代表的には、このようなワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能薬物として調製され；注射前に溶液または懸濁液とするのに適切な固体形態も調製され得る。調製物はまた、乳化され得、あるいはペプチドはリポソーム中にカプセル化される。活性な免疫原性成分は、しばしば、薬学的に受容可能でありそして活性成分と適合可能な賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効果を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含み得る。効果的であり得るアジュバントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰという）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥという）、およびＲＩＢＩ（これは、２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む）。
【０１２５】
ワクチンは、従来どおり、注射によって、例えば、皮下または筋肉内のいずれかに、非経口投与される。他の態様の投与に適切であるさらなる処方物としては、座剤、およびある場合には、経口処方物またはエアロゾルのような分布に適切な処方物が挙げられる。座剤については、伝統的な結合剤およびキャリアとして、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得；このような座剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。経口処方物は、例えば、薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、または粉剤の形態をとり、そして１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。
【０１２６】
ペプチドは、中性または塩形態としてワクチン中に処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成される）が挙げられ、そしてこれは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などのような有機酸と形成される。遊離のカルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から誘導され得る。
【０１２７】
ワクチンは、投与処方物と適合可能な様式で、および予防的および／または治療的に効果的な量で投与される。投与されるべき量は、一般的には、用量あたり５μｇから２５０μｇの範囲であるが、治療されるべき被験者、被験者の免疫系が抗体を合成する能力、および所望の防御の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、主治医の判断に依存し、そして各被験者に特有であり得る。
【０１２８】
ワクチンは、単回投与スケジュールで、好ましくは多回投与スケジュールで投与され得る。多回投与スケジュールは、ワクチン接種の初回のコースは１〜１０の別々の投与量であり得、次いで免疫応答を維持およびまたは再強化するために必要なその後の時間間隔で他の投与が行われ、例えば、２回目の投与については１〜４カ月目であり、必要ならば、数カ月後にその後の１または複数回の投与が行われる。投与方法はまた、少なくとも一部は、個体の必要によって決定され、そして主治医の判断に依存する。
【０１２９】
さらに、１または複数の免疫原性マイコバクテリア抗原を含むワクチンは、他の免疫調節剤、例えば、免疫グロブリンおよび抗生物質とともに投与され得る。
【０１３０】
抗体含有組成物を投与する結果は、感染の部位に対する抗体の伝搬の効率に依存し得る。マイコバクテリア呼吸器感染（例えば、M. tuberculosis感染）の場合、これは、肺への抗体の効率的な伝搬によって容易にされ得る。
【０１３１】
１つの実施態様では、医薬品は、鼻内（i.n.）投与され得る。この態様の送達は、M. tuberculosis感染の送達の経路に対応し、そして、抗体送達の場合、抗体が感染部位に存在して、細菌が細胞内に入る前および細胞間に広がる期間中にも、細菌と戦うことを確実にする。
【０１３２】
鼻内組成物は、１００〜５０００μm、好ましくは５００〜４０００μm、より好ましくは１０００〜３０００μmの範囲のおおよその直径を有する液滴形態で投与され得る。あるいは、容量では、液滴は、０．００１〜１００μl、好ましくは０．１〜５０μl、より好ましくは、１．０〜２５μlのおおよその範囲である。
【０１３３】
鼻内投与は、鼻液滴を塗布することによって、または鼻噴霧によって達成され得る。
【０１３４】
鼻液滴の場合、液滴は、代表的には、約１０００〜３０００μmの直径および／または１〜２５μlの容量を有し得る。
【０１３５】
鼻噴霧の場合、液滴は、代表的には、約１００〜１０００μmの直径および／または０．００１〜１μlの容量を有し得る。
【０１３６】
抗体のi.n.送達後、肺への通過は、粘膜分泌の逆流によって容易にされるが、気道における粘膜繊毛作用は、粘液内の粒子を肺から取り除くと考えられる。肺洗浄における比較的長い持続、胆汁からの速いクリアランス、およびいくつかの抗体の唾液ヘの輸送の欠損は、粘膜部位特異的な役割を示唆する。
【０１３７】
異なる実施態様では、医薬品は、エアロゾル処方物で送達され得る。エアロゾル処方物は、粉剤、懸濁剤、または液剤の形態をとり得る。
【０１３８】
エアロゾル粒子のサイズは、エアロゾルの送達能力に関連する１つの因子である。したがって、より小さい粒子は、より大きな粒子よりも、肺胞に向かって気道をさらに下方へ移動し得る。１つの実施態様では、エアロゾル粒子は、気管支、細気管支、および肺胞の全長に沿った送達を容易にするための直径分布を有する。あるいは、粒子サイズ分布は、気道の特定の部分、例えば、肺胞をターゲティングするために選択され得る。
【０１３９】
エアロゾル粒子は、噴霧吸入器または鼻噴霧によって送達され得る。
【０１４０】
医薬品のエアロゾル送達の場合、粒子は、０．１〜５０μm、好ましくは１〜２５μm、より好ましくは１〜５μmのおおよその範囲の直径を有し得る。
【０１４１】
本発明の医薬品のエアロゾル処方物は、必要に応じて、噴射剤および／または界面活性剤を含み得る。
【０１４２】
患者に投与されるべき液滴のサイズを本発明の所定の範囲に制御することによって、肺胞への不用意な抗原送達を回避／最小化し、したがって、肺の炎症および線維形成瘢痕化のような肺胞に関連する病理学的問題を回避できる。
【０１４３】
i.n.ワクチン接種は、鼻および気管支関連粘膜組織におけるＴおよびＢ細胞の両方が媒介するエフェクターメカニズムに適合し、これは、他の粘膜関連リンパ様組織とは異なる。
【０１４４】
鼻内投与経路によって誘起される防御メカニズムとしては、優先的な肺ホーミングを有するＴリンパ球の活性化；共刺激性分子、例えば、Ｂ７．２のアップレギュレーション；および／またはマクロファージまたは分泌性ＩｇＡ抗体の活性化が挙げられ得る。
【０１４５】
抗原の鼻内送達によって、粘膜抗体応答が容易に誘起され得るが、これは、Ｔ細胞応答における抗体産生を助けるＴｈ２表現型へのシフトによる。粘膜応答は、増強されたＩｇＡ産生によって特徴づけられ、そしてＴｈ２応答は、増強されたＩＬ−４産生によって特徴づけられる。
【０１４６】
マイコバクテリア抗原の鼻内送達は、抗原を呼吸器系の粘膜下Ｂ細胞にターゲティングさせ得る。これらのＢ細胞は、哺乳動物において主要な局所ＩｇＡ産生細胞であり、そして鼻内送達は、マイコバクテリア抗原に対するこれらの細胞によるＩｇＡ産生を迅速な増加を容易にする。
【０１４７】
１つの実施態様では、マイコバクテリア抗原を含む医薬品の投与は、ＩｇＡ抗体産生を刺激し、そしてＩｇＡ抗体は、マイコバクテリア抗原に結合する。他の実施態様では、粘膜および／またはＴｈ２免疫応答が刺激される。
【０１４８】
他の実施態様では、モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を惹起するために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、免疫グロブリンであり、防御が所望される感染性因子の抗原の「内部イメージ」を有する。これらの抗イディオタイプ抗体も、マイコバクテリア感染の治療、ワクチン接種、および／または診断に有用であり得る。
【０１４９】
第９の実施態様によれば、本発明のペプチドおよびそれに対する抗体は、マイコバクテリアに対する抗体の存在、または生物学的試料におけるビルレンスに関連する抗原の存在を検出するためのイムノアッセイに有用である。イムノアッセイの設計は、非常に多くのバリエーションがあり、そして多くの形式が当該技術分野で知られている。イムノアッセイは、本発明のペプチドに由来する少なくとも１つのエピトープを利用し得る。１つの実施態様では、イムノアッセイは、このようなエピトープの組み合わせを使用する。これらのエピトープは、同じまたは異なる細菌ペプチドに由来し得、そして別々の組換えまたは天然のペプチド中に、あるいは同じ組換えペプチド中に一緒に存在し得る。
【０１５０】
イムノアッセイは、例えば、１または複数のビルレンス関連ペプチドエピトープに対するモノクローナル抗体、１つのマイコバクテリア抗原の複数のエピトープに対するモノクローナル抗体の組み合わせ、複数の異なるマイコバクテリア抗原のエピトープに対する複数のモノクローナル抗体、同じ抗原に対する複数のポリクローナル抗体、または複数の異なる抗原に対するポリクローナル抗体を使用し得る。プロトコルは、例えば、競合、または直接反応、またはサンドイッチタイプアッセイに基づき得る。プロトコルはまた、例えば、固体支持体を使用し得、あるいは免疫沈降によるものであり得る。ほとんどのアッセイは、標識された抗体またはポリペプチドの使用を包含し；標識は、例えば、酵素、蛍光、化学発光、放射活性、または染料分子であり得る。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも公知であり；その例は、ビオチンおよびアビジン、ならびにＥＬＩＳＡアッセイのような酵素で標識および媒介されるイムノアッセイを利用するアッセイである。
【０１５１】
代表的には、ペプチドに対する１または複数の抗体についてのイムノアッセイは、生物学的試料のような抗体を含むと思われるテスト試料を選択および調製する工程、次いで抗原−抗体複合体を形成することが可能な条件下で１または複数の抗原性（すなわち、エピトープ含有）ペプチドと共に試料をインキュベートする工程、およびこのような複合体の形成を検出する工程を包含する。イムノアッセイは、標準または競合タイプであり得る。
【０１５２】
ペプチドは、代表的には、インキュベーション後の試料からのペプチドの分離を容易にするために固体支持体に結合されている。使用され得る固体支持体の例は、ニトロセルロース（例えば、メンブランまたはマイクロタイターウェル形態で）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェルで）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートで）、ポリフッ化ビニリデン（Immulonとして公知）、ジアゾ化紙、ナイロンメンブラン、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズである。例えば、Dynatech Immulonマイクロタイタープレートまたは６０ｍｍ直径のポリスチレンビーズ（Precision Plastic Ball）が使用され得る。抗原性ペプチドを含む固体支持体は、代表的には、テスト試料からの分離後、および結合した抗体の検出の前に、洗浄される。
【０１５３】
抗体を含む形成された複合体（または、競合アッセイの場合は、競合抗体の量）は、形式に応じて、公知の多くの技法のいずれかによって検出される。例えば、複合体中の非標識抗体は、標識（例えば、酵素標識）と複合体化した抗異種Ｉｇの結合体を用いて検出され得る。
【０１５４】
ペプチドが被分析物であるイムノアッセイでは、テスト試料、代表的には生物学的試料は、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でペプチドに対する抗体と共にインキュベートされる。テスト前に生物学的試料を処理して推定される細菌成分を放出させることが望ましい。種々の形式が用いられ得る。例えば、「サンドイッチアッセイ」が用いられ得、ここでは、固体支持体に結合された抗体は、テスト試料とともにインキュベートされ；洗浄され；被分析物に対する第２の標識された抗体とともにインキュベートされ、そして支持体は再度洗浄される。被分析物は、第２の抗体が支持体に結合されるかどうかを測定することによって検出される。競合形式では、テスト試料は、通常、抗体とともにインキュベートされ、そして標識された競合抗原も、連続的にまたは同時にインキュベートされる。適切な容器にパッケージされた、本発明の１以上のペプチド、該ペプチドに対する１以上の抗体、および緩衝液を含むイムノアッセイキットも、本発明の実施態様として包含される。
【０１５５】
本発明で使用する場合、「生物学的試料」とは、個体から単離された組織または液体の試料をいい、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器管、腸管、および泌尿生殖器管の外切片、涙液、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官、ならびにインビトロ細胞培養構成物の試料（細胞培養培地中の細胞の増殖から得られる馴化培地、推定ウイルス感染細胞、組換え細胞、および細胞構成成分が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
関連の診断アッセイにおいて、本発明は、マイコバクテリア感染を検出するための核酸プローブを提供する。
【０１５７】
主剤として本発明のポリヌクレオチドを使用して、約８ヌクレオチド以上のオリゴマーが、組換えポリヌクレオチドからの切り出しによってまたは合成によってのいずれかで調製され得、これは、マイコバクテリア配列とハイブリダイズし、そしてマイコバクテリアの同定に有用である。プローブは、誘導またはアップレギュレートされた配列のハイブリダイゼーションによる検出を可能にする長さである。６〜８ヌクレオチドは活用可能な長さであり得るが、１０〜１２ヌクレオチドの配列が好ましく、そして少なくとも約２０ヌクレオチドが最適なようである。これらのプローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成方法を含むルーチンの方法を用いて調製され得る。プローブとしての使用には、完全な相補性が望ましいが、フラグメントの長さが増加するにつれて、必ずしも必要であり得ない。
【０１５８】
このようなプローブの診断剤としての使用について、血液または血清のような分析されるべき生物学的試料は、所望であれば、それが含まれる核酸を抽出するために処理され得る。試料から得られる核酸は、ゲル電気泳動または他のサイズ分離技法にかけられ得；あるいは、核酸試料はサイズ分離せずにドットブロットされ得る。プローブは通常標識される。適切な標識、およびプローブを標識するための方法は、当該技術分野で公知であり、そして例えば、ニックトランスレーションまたはキナーゼ操作によって組込まれる放射性標識、ビオチン、蛍光プローブ、および化学発光プローブが挙げられる。次いで、試料から抽出された核酸は、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、標識されたプローブで処理される。
【０１５９】
プローブは、ビルレンスをコードするポリヌクレオチドに完全に相補的になり得る。したがって、通常の高ストリンジェンシーの条件は、偽陽性を防止するために所望される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション中および洗浄手順中の、温度、イオン強度、時間の長さ、およびホルムアミドの濃度を含む多くの因子によって決定される。
【０１６０】
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅技法を使用することが所望であり得る。このような技法は当該技術分野で公知であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法が挙げられる。
【０１６１】
プローブは、診断キット中にパッケージングされ得る。診断キットは、標識され得るプローブＤＮＡを含み；あるいは、プローブＤＮＡは非標識であり得そして標識用の成分が別々の容器でキットに含まれ得る。キットはまた、特定のハイブリダイゼーションプロトコルに必要な他の適切なパッケージされた試薬および材料、例えば、標準薬、ならびにテストを行うための指示書を含み得る。
【０１６２】
好ましい実施態様では、本発明のペプチド（またはフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体）は、患者においてＴリンパ球がマイコバクテリア感染の抗原性成分に既に曝露されているＴリンパ球の存在を検出するための診断アッセイに使用される。
【０１６３】
より詳細には、特定の抗原に既に曝露されているＴリンパ球は、同じ抗原によるその後のチャレンジで活性化される。この活性化は、マイコバクテリア感染の陽性診断を同定するための手段を提供する。逆に、同じ活性化は、特定の抗原にまだ曝露されていないＴリンパ球によっては達成されない。
【０１６４】
Ｔリンパ球の上記の「活性化」は、時々、「再現応答」といい、そして例えば、活性化したＴリンパ球からのインターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）の放出を測定することによって測定され得る。したがって、患者におけるマイコバクテリア感染の存在は、本発明のペプチド（またはフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体）でのＴリンパ球のインビトロチャレンジ後の所定の時間後の、Ｔリンパ球からの最小濃度のインターフェロンの放出によって決定され得る。
【０１６５】
使用する場合、Ｔリンパ球を含む生物学的試料は患者から採取され、次いで本発明のペプチド（またはそのフラグメントもしくは改変体もしくは誘導体）でチャレンジされる。
【０１６６】
上記Ｔリンパ球診断アッセイは、問題の患者によって発現される少なくとも１つの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み得る。ＡＰＣは、生物学的試料中に元から提供され得、または外因的に添加され得る。１つの実施態様では、Ｔリンパ球は、ＣＤ４ Ｔリンパ球である。
【実施例】
【０１６７】
実施例１−マイコバクテリアの連続培養
材料および方法
株
M. tuberculosisの代表的な株である、M. tuberculosis H37Rv株（NCTCカタログ番号7416）を用いて研究を行った。ストック培養物を、37±２℃にて３週間、Middlebrook 7H10＋ＯＡＤＣ中で増殖し、回収し、そして脱イオン水中の高密度懸濁液として−70℃にて保存した。
【０１６８】
培養培地
化学的に定義された培養培地を開発し、そしてCAMRマイコバクテリア培地と命名した（WO00/52139を参照のこと）。Millepore水精製システムで得た高品質水を用いて培地を調製し、そして0.07μm孔サイズの酢酸セルロースメンブランフィルターカプセル（Sartorius Ltd.）を通過させて濾過滅菌した。Middlebrook 7H10＋ＯＡＤＣ寒天を用いて、種菌培養物を調製し、ケモスタット試料中の培養可能な細菌の数を計数し、そして培養純度を評価した。
【０１６９】
培養装置
培養実験を、１リットルのガラス容器中で行い、500mlの使用容量で操作した。容器の下に配置したマグネチックスターラーに連動する培養容器中のマグネチックバーによって、培養物を攪拌した。トッププレート中の密封部分を通して培養液中に挿入したセンサープローブと連結したAnglicon Microlab Fermentation System（Brighton Systems, Newhaven）を用いて、培養条件を連続的にモニターおよび制御した。酸素濃度を、ガルバーニ酸素電極（Uniprobe, Cardiff）によってモニターし、そして攪拌速度のフィードバック制御によって制御した。温度を、Anglicon温度プローブによってモニターし、そして培養容器の下に配置した加熱パッドによって維持した。培養ｐＨを、Ingold ｐＨ電極（Mettler-Toledo, Leicester）を用いて測定し、そして水酸化ナトリウム（0.5M）または硫酸（0.5M）のいずれかの自動添加によって制御した。連続培養のために、培養システムを、培地貯蔵器からの栄養添加を制御することによって操作し、そして定常培養容量を、容器の側面に取り付けたオーバーフローチューブによって維持した。
【０１７０】
接種および培養
容器を350mlの滅菌培養培地で満たし、そしてパラメータを、37℃±２℃、pH6.9±0.2、および約70％空気飽和の溶存酸素圧で安定化させた。37±２℃にて３週間増殖させたMiddlebrook寒天培地培養物を滅菌脱イオン水に再懸濁させることによって、高密度接種懸濁液を調製した。種菌を、培養容器に無菌的に植菌して、540nmで約0.25の初期培養濁度とした。接種後、培養を約50時間継続した。培養が対数増殖に入った時、さらに100mlの培地を添加し、そしてバッチ増殖を、光学密度および可視カウント測定によってモニターした。
【０１７１】
連続培養のために、培養物を接種し、そして詳述のように約50時間継続した。次いで、培養が対数増殖期に入って24時間後、培養物を培地添加（約100ml）で48時間流加バッチ様式で操作した。次いで、連続培養を、0.03／時間の希釈率で開始した［24時間の平均生成時間（ＭＧＴ）に等価］。培養パラメータを、「高」溶存酸素培養条件については37±２℃およびpH6.9±0.2にて50％(v/v)空気飽和の溶存酸素圧（ＤＯＴ）で、および「低」溶存酸素培養条件については37±２℃およびpH6.9±0.2にて１％(v/v) 空気飽和のＤＯＴで維持した。増殖を、光学密度、乾燥重量、および可視カウント測定によってモニターした。
【０１７２】
連続培養
24時間のＭＧＴでの定常状態増殖を、正常には、連続培養の開始の10日後に達成した。培養物は、約５×108cfu/mlを含む高密度懸濁液であり、そして約1.2g/lの細胞乾燥重量のバイオマス収量であった。細胞は、２〜３μm長の短い桿菌であり、時々２０細胞までの凝集塊を生じた。主な炭素源であるグリセロールは、定常状態増殖中に枯渇せず、残りの濃度は1.25g/lであった。Tween(登録商標)80は、0.1％の量で存在し、そして実質的に単一細胞から構成される均一懸濁液中でケモスタット培養に役立つ増殖速度でのM. tuberculosisの増殖を可能にした。Tween(登録商標)80の不在下で増殖した培養物は大きな凝集塊および表面菌膜を形成し、そして連続培養はできなかった。
【０１７３】
実施例２−ビルレンスデータ
50％のＤＯＴで増殖した培養物は、モルモット感染モデルにおいてビルレントであったが、それは、エアロゾル送達後感染を引きおこし、肺で増殖し、脾臓に播種し、そして一次肺結核を示す組織変化を引き起こす能力によって決定した。
【０１７４】
播種性感染を引き起こす能力に基づいて培養試料のビルレンスを評価および比較するために、新しいビルレンスアッセイを開発した。このアッセイでは、16日目の脾臓において3.0 log10 ｃｆｕの播種性感染を生じさせるために、０日目に肺で必要とされる投与量を測定した。この値を、感染力インデックスと命名した。
【０１７５】
このアッセイを使用して、好気的ケモスタット培養において増殖した細胞の感染力は、標準Middlebrook寒天上で増殖した細胞の感染力に匹敵した。これは、発明者らの培養システムにおいて増殖した細胞がビルレントであり、そして発明者らの培養システムにおける増殖に関連するビルレンスの損失がないという、発明者らのこれまでの所見を支持する（表１を参照のこと）。
【０１７６】
低酸素圧（１％ＤＯＴ）で増殖した細胞についての感染力インデックスは、好気的細胞よりも著しく低く、これは、高酸素圧での増殖が、M. tuberculosisのビルレンスを増強すること、すなわち、匹敵する感染を生じさせるために非常に低用量を必要とすることを示す。
【０１７７】
【表１】
2005504523.tif 000002
【０１７８】
実施例３−マイクロアレイ分析のためのM. tuberculosisからのＲＮＡ抽出
材料および方法
Trizol（Life Technologies）−これは、フェノールおよびチオシアン酸グアニジンの処方物である。
【０１７９】
ＧＴＣ溶解溶液−これは、５Mのチオシアン酸グアニジン、0.5％のＮ−ラウリルサルコシン、25mMのクエン酸３ナトリウム、0.1Mの２−メルカプトエタノール、および0.5％のTween（登録商標）80を含む。
【０１８０】
クロロホルム
イソプロパノール
３M  酢酸ナトリウム
70％  エタノール
マイクロ遠心機
リボライザー（ribolyser）。
【０１８１】
滅菌プラスチック製品−Falconチューブ、スクリューキャップ付きエッペンドルフ、ギルソンチップ−これらはすべてＲＮａｓｅを含まない。
【０１８２】
ガラス製品−160℃にて少なくとも16時間焼いた。
【０１８３】
方法
封じ込めレベル３で行われる工程；クラスIIIの微生物安全キャビネット内である。
【０１８４】
10または20mlの培養物（109/ml）を取り出し、そしてこれをすぐにプラスチック試料ポット中の４容量のＧＴＣ溶解緩衝液に添加する。ポットを確実に密封する。
【０１８５】
ＧＴＣ溶解緩衝液中の細胞を室温にて１時間インキュベートする。５％のHycolinで５分間プラスチックポットの表面の汚染を除去する。試料をパスボックスに移し、そして密封可能な蓋を有するプラスチックの運搬用容器に入れる。容器を確実に閉じ、そしてこれを非毒性キャビネットであるＣＬ３キャビネットに移す。
【０１８６】
溶解混合物をFalconチューブに等しく分配する。これらのチューブを遠心分離バケットに入れ、そしてバケットを確実に密封する。５％のHycolinで５分間バケットの表面の汚染を除去する。次いで、これらを遠心分離機（Baird and Tatlock Mark IV冷却ベンチトップ遠心分離機）に移す。チューブを3,000rpmにて30分間回転させる。
【０１８７】
未開封のバケットをキャビネットに戻す。遠心チューブを取り出し、そして上清をＧＴＣ溶解緩衝液用の廃棄瓶に注ぐ。
【０１８８】
各ペレットを１mlのTrizol（フェノールおよびＧＴＣの処方物、カタログ番号15596-026）に再懸濁する。製造業者のガイドラインは、繰り返しのピペット操作によって細胞を溶解することを推奨する。この動作のみではM. tuberculosisを溶解しないが、Trizol中にペレットを完全に再懸濁させるためには重要である。
【０１８９】
１mlの細胞をFastRNAチューブに移し、そしてパワーセッティング6.5にて45秒間、細胞をリボライズ（ribolyse）する。
【０１９０】
チューブを室温にて５分間インキュベートする。
【０１９１】
チューブから水層を取り出し、そしてこれをスクリューキャップ付きのエッペンドルフチューブ中の200μlのクロロホルムに添加する。各チューブを約15秒間激しく振盪する。室温にて２〜３分間インキュベートする。
【０１９２】
チューブを13,000rpmにて15分間回転させる。遠心分離後、液体は、赤いフェノール／クロロホルム相、界面、および澄明な水相に分離する。
【０１９３】
水相を注意深く取り出し、そしてこれを500μlのクロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）を含む新鮮なエッペンドルフチューブに移す。このチューブを、13,000rpmにて15分間回転させる。
【０１９４】
水相を、50μlの酢酸ナトリウムおよび500μlのイソプロパノールを含むエッペンドルフチューブに移す。
【０１９５】
エッペンドルフチューブを５％のHycolinで５分間表面の汚染を除去する。チューブをＣＬ３研究室か取り出し、そして研究室157で手順を続ける。
【０１９６】
封じ込めレベル２で行われる工程：
ＲＮＡを−70℃にて少なくとも30分間沈殿させる−この工程は一晩行われ得る。
【０１９７】
沈殿したＲＮＡを13,000rpmにて10分間回転させて落とす。上清を除去し、そしてペレットを70％エタノールで洗浄する。遠心分離を繰り返す。
【０１９８】
70％エタノールを除去し、そしてペレットを空気乾燥させる。ペレットを、ＲＮＡｓｅを含まない水に溶解させる。
【０１９９】
ＲＮＡを−70℃にて凍結させて保存する。
【０２００】
実施例４−ｃＤＮＡ標識付け、ハイブリダイゼーション、および分析
アレイの調製
ＰＣＲ増幅した産物を、ＯＲＦ特異的プライマーを用いてM. tuberculosisゲノムＤＮＡから生成する。ゲノムの各遺伝子が提示される。これらを、標準的な顕微鏡ガラススライド上のグリッドに、BioRobotics microgridロボット（MWG Biotech）を用いて4000スポット／ｃｍ２より高い分解能でスポットする。
【０２０１】
蛍光標識したｃＤＮＡを、異なる環境条件下で増殖した細菌から単離されたＲＮＡから転写する。このｃＤＮＡを、Ｃｙ３またはＣｙ５のいずれかで標識したｄＣＴＰ（染料は、Amersham Pharmacia Biotechによって供給される）の組込みによって標識する。二重蛍光を用い、２つのｃＤＮＡ試料の同時検出を行う。アレイの出力を、共焦点レーザースキャナー（MWG BiotechからのAffimetrix 428スキャナー）を用いて読む。より詳細な情報は、ウェブサイトwww.sghms.ac.uk/depts/medmicro/bugs；Mujumdar, R.B. (1993) Bioconjugate Chemistry, 4(2), 105-111頁；Yu, H. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3226-3232頁；およびZhu, Z. (1994) Nucl. Acids Res. 22, 3418-3422頁に見られ得る。
【０２０２】
ｃＤＮＡの標識付けおよびハイブリダイゼーション
１．Ｃｙ３／Ｃｙ５標識ｃＤＮＡ
マイクロアレイスライド当たり、１つのＣｙ３および１つのＣｙ５で標識したｃＤＮＡ試料を調製する。
【０２０３】
2005504523.tif 000003
【０２０４】
95℃で５分間加熱し、氷上で急激に冷却し、そして短時間遠心分離する。
【０２０５】
2005504523.tif 000004
【０２０６】
25℃にて10分間、次いで42℃にて90分間インキュベートする。
【０２０７】
２．スライドのプレハイブリダイゼーション
コプリンジャー（coplin jar）中でプレハイブリダイゼーション溶液を混合し、そして標識付け反応が平衡化する間、60°にてインキュベートする。
【０２０８】
2005504523.tif 000005
【０２０９】
マイクロアレイスライドを、予め加熱したプレハイブリダイゼーション溶液中で60℃にて20分間インキュベートする。スライドを、水中で１分間リンスし、次いでプロパン−２−オール中で１分間リンスし、そしてスライドを、50mlの遠心チューブ中で1500rpmにて５分間遠心分離して乾燥させる。スライドを、ハイブリダイゼーションまで保存する。
【０２１０】
３．Ｃｙ３／Ｃｙ５標識ｃＤＮＡの精製
Ｃｙ３およびＣｙ５標識したｃＤＮＡ試料を、１つのチューブに一緒に合わせる。
【０２１１】
2005504523.tif 000006
【０２１２】
チューブをホイル中に包み、そして室温にて30分間インキュベートする。13000rpmにて20分間遠心分離し、そして上清を除去する。ペレットを100μlの70％エタノールでリンスし、そして13000rpmにて５分間遠心分離する。上清を除去し、そしてペレットを10分間空気乾燥する。ペレットを10.5μlの水に再懸濁する。
【０２１３】
４．スライドとＣｙ３／Ｃｙ５標識ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション
プレハイブリダイズしたマイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションカセット中に置き、そしてカセット中のウェルに水15μlアリコートを２回添加する。再懸濁したＣｙ３／Ｃｙ５標識したｃＤＮＡ試料を、ハイブリダイゼーション溶液と混合する。
【０２１４】
2005504523.tif 000007
【０２１５】
ハイブリダイゼーション溶液を95℃にて２分間加熱する。氷上で急激に冷却しないが、徐々に冷却し、短時間遠心分離する。気泡形成を避けながらスライド上のアレイした領域の端にハイブリダイゼーション溶液をピペットで載せる。ピンセットを用いて、カバーグラスの端をスライドの表面に沿って、アレイした領域の方へ、およびアレイの端のハイブリダイゼーション溶液中に、注意深くドラッグする。一旦決まった位置に置き、さらなる移動を避けながら、カバーグラスをアレイ上に注意深く下げる。ハイブリダイゼーションカセットを密封し、そして60℃の水浴中に16〜20時間沈める。
【０２１６】
５．スライドの洗浄
ハイブリダイゼーションカセットからマイクロアレイスライドを取り出し、そして最初にWash Aの染色トラフ中でスライドを注意深く洗浄して、カバーグラスを除去する。一旦カバーグラスをスライドラック中のスライドの位置に移動し、そしてWash A中でさらに２分間攪拌を続ける。
【０２１７】
2005504523.tif 000008
【０２１８】
スライドをクリーンなスライドラックに移し、そしてWash Bの第１のトラフ中で２分間攪拌する。Wash Bの第２のトラフ中で２分間攪拌しながら洗浄する。
【０２１９】
2005504523.tif 000009
【０２２０】
スライドを50mlの遠心チューブに入れ、そして1500rpmにて５分間遠心分離して、スライドを乾燥させる。
【０２２１】
６．スライドをスキャンする
ScanArray 3000二重レーザー共焦点スキャナーを用いてスライドをスキャンし、そしてデータを分析する。
【０２２２】
試薬
ランダムプライマー（３μl/μl）［Life Technol., Cat# 48190-011］
dNTP（５mM dATP、dGTP、dTTPおよび２mM dCTP）［Life Technol., Cat# 10297-018］
Cy3 dCTP Fluorolink［Amersham Pharmacia Biotech, Cat# PA53021］
Cy5 dCTP Fluorolink［Amersham Pharmacia Biotech, Cat# PA55021］
SuperScript II逆転写酵素（200U/μl）［Life Technol., Cat# 18064-014］
５×First Strand Buffer [Life Technol., Cat# 18064-014で供給される]
ジチオトレイトール（DTT）（100mM） [Life Technol., Cat# 18064-014で供給される]
ウシ血清アルブミン（BSA）Fraction V 96-99%（100mg/ml）［Sigma, Cat# A9418］。
【０２２３】
2005504523.tif 000010
【０２２４】
器具
マイクロアレイハイブリダイゼーションカセット［Telechem International (Arraylt.com), Cat# AHC-1］
コプリン染色ジャー（Coplin staining jar）［Fisher Scientific, Cat# MNK-820-H］
３×スライド染色トラフ［Fisher Scientific, Cat# MNK-836-K］
２×スライド染色ラック［Fisher Scientific, Cat# MNK-841-K］
カバーグラス  22×22mm［BDH, Cat# 406/0187/33］。
【０２２５】
スキャンニングおよび分析
スライドを、Affymetrix 428スキャナーを用いてスキャンした。スキャナーから供給された生データを、最初にImaGeneとして公知のソフトウエアで分析した。次いで、スキャンしたイメージを、GeneSpringとして公知の他のソフトウエアパッケージに移した。これは非常に強力なツールであり、多くのデータベースから情報を得て、各遺伝子の発現の完全な分析を可能にする。
【０２２６】
結果
上記のプロトコルに従って、定常状態ケモスタット培養物からトータルＲＮＡを抽出した。ＲＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションを、二連で行って、好気（50％ＤＯＴ）および低酸素（１％ＤＯＴ）環境で増殖したM. tuberculosisから抽出したＲＮＡを比較した。
【０２２７】
２つの発現プロファイルを分析および比較した。低酸素条件下で少なくとも1.5倍アップレギュレートされたと思われる遺伝子を、同定のために選択した。
【０２２８】
転写開始部位から終止コドンまでの核酸配列を得る。
【０２２９】
実施例５−免疫原性を保持しながらそのビルレンスを減弱させるためにM. tuberculosisからの１以上の遺伝子を欠失させる
同定されている１以上の遺伝子を、対立遺伝子交換を用いて破壊し得る。簡単に言えば、目的の遺伝子を、どちらかの側に隣接する１〜２kbのＤＮＡでクローニングし、そしてコード領域の一部の欠失およびハイグロマイシンのような抗生物質耐性マーカーの挿入によって不活性化する。
【０２３０】
次いで、操作したフラグメントを、適切な自殺ベクター、例えば、pPR23に移し、そしてM. tuberculosisの野生型の親株を形質転換する。変異体を、抗生物質耐性株について選択することによって回収する。遺伝子型分析（目的の遺伝子に特異的なフラグメントでのサザンブロッティング）を、選択された株について行って、遺伝子が破壊されていることを確認する。
【０２３１】
次いで、変異体株を研究して、表現型に対する遺伝子破壊の影響を決定する。これをワクチン候補物として使用するために、弱毒化ビルレンスを示すことが必要である。これは、モルモットまたはマウスのいずれかの感染モデルを用いて行われ得る。動物を、変異体株で感染させ、そして疾患の進行を、種々の器官、特に肺および脾臓において、感染後の特定の時点で、代表的には16週までに、細菌負荷量を決定することによってモニターする。
【０２３２】
種々の器官において非常に高い細菌負荷量を有する野生型株で感染した動物に対して、比較を行う。長期生存研究および組織病理学も、ビルレンスおよび病原性を評価するために使用され得る。
【０２３３】
一旦減弱化ビルレンスが樹立されると、防御および免疫原性研究を行い、ワクチンとしてのこの株の潜在力を評価し得る。対立遺伝子交換およびＴＢ改変体の調製についての適切な参考文献は、McKinneyら、2000年およびPelicicら、1997年［1,2］である。
【０２３４】
実施例６−免疫原性であるタンパク質をコードする１以上の遺伝子を選択し、そしてこれをＢＣＧまたはM. tuberculosisの弱毒化株中に配置してその全体の免疫原性を増強する
目的の遺伝子を、ＰＣＲによってM. tuberculosisゲノムから増幅する。増幅した産物を精製し、そしてプラスミド（pMV306）にクローニングする。このプラスミドは、マイコバクテリアゲノムのマイコバクテリオファージＬ５の付着部位（attB）に部位特異的に組込まれる［3］。
【０２３５】
高電圧電気パルスで細胞エンベロープを傷つけてＤＮＡの取り込みを生じさせるエレクトロポレーションを用いて、ＢＣＧをプラスミドで形質転換する。プラスミドを、attB部位でＢＣＧ染色体中に組込み、安定な組換え体を生じさせる。組換え体を選択し、そしてＰＣＲまたはサザンブロッティングによってチェックして、遺伝子が組込まれていることを確認する。次いで、組換え株を防御研究に使用する。
【０２３６】
実施例７−弱毒化サルモネラおよびワクシニアウイルスのような組換えキャリアを使用してＴＢ遺伝子を発現および提示する
このタイプのアプローチの最良の例の１つは、改変ワクシニアウイルスAnkara（ＭＶＡ）の使用である［4］。目的の遺伝子を、ワクシニアウイルスシャトルベクター、例えば、pSC11にクローニングする。次いで、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を、野生型ＭＶＡで感染させ、そして組換えシャトルベクターで形質転換する。次いで、組換えウイルスを、適切な選択マーカーを用いて選択し、そしてウイルスプラークを選択および精製した。
【０２３７】
組換えウイルスは、通常、初回ブースト方法の一部として送達され、そこでは動物を、最初に、構成的プロモーターの制御下で目的のＴＢ遺伝子をコードするＤＮＡワクチンでワクチン接種する。少なくとも２週間後に目的の遺伝子を有する組換えＭＶＡを動物に投与することによって、免疫応答をブーストする。
【０２３８】
実施例８−単一ペプチド／タンパク質またはタンパク質の組み合わせを含むサブユニットワクチン
１以上のペプチドまたはタンパク質を有するサブユニットワクチンを調製するために、まず第１に、ワクチンを調製するためのタンパク質またはペプチドを得ることが必要である。現在まで、これは、主として、ＴＢ培養物から目的のタンパク質を精製することによってマイコバクテリア研究を行っている。しかし、目的の遺伝子をクローニングしそして組換えタンパク質を産生することがより一般的になっている。
【０２３９】
目的の遺伝子のコード配列を、ＰＣＲによってＮ末端およびＣ末端に挿入した制限部位とともに増幅して、pET-15bのようなタンパク質発現ベクター中へのインフレームでのクローニングを可能にする。遺伝子を、lacZのような誘導性プロモーターの下流に挿入する。次いで、ベクターを、培養により増殖するE. coliに形質転換する。組換えタンパク質を過剰発現させ、そして精製する。
【０２４０】
普通の精製方法の１つは、Ｎ末端のHisタグを有する組換えタンパク質を産生することである。次いで、タンパク質をNi-NTAカラム上で金属イオンに対するHisタグの親和性に基づいて精製し、その後Hisタグを切断する。次いで、精製したタンパク質を、適切なアジュバント中で動物に投与する［5］。
【０２４１】
実施例９−１以上の同定された遺伝子を有するプラスミドＤＮＡワクチン
特定の遺伝子をコードするＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、精製し、そしてpVAX1のようなワクチン開発のために開発された特殊ベクターに挿入する。これらのベクターは、真核生物細胞において導入されたＤＮＡ（候補抗原をコードする）の強力な発現を指示するプロモーター配列（例えば、CMVまたはSV40プロモーター）、およびｍＲＮＡ転写物を安定化するためのポリアデニル化シグナル（例えば、SV40またはウシ成長ホルモン）を含む。
【０２４２】
ベクターをE. coliに形質転換し、そして形質転換体を、プラスミドによってコードされるカナマイシン耐性のようなマーカーを用いて選択する。次いで、プラスミドを、形質転換したコロニーから回収し、そして配列決定して、目的の遺伝子が存在しそしてＰＣＲで生じた変異なく正確にコードされることをチェックする。
【０２４３】
次いで、大量のプラスミドをE. coliで産生し、そしてプラスミドを回収しそして市販のキット（例えば、Qiagen Endofree-plasmid preparation）を用いて精製する。次いで、ワクチンを、アジュバントの存在または不在下で、例えば、筋肉内注射によって、動物に投与する。
【０２４４】
実施例１０−ＤＮＡ発現ベクターの調製
ＤＮＡワクチンは、細菌プラスミドにクローニングした本発明の核酸配列からなる。ＤＮＡワクチンの調製には、通常、プラスミドベクターpVAX1を使用する。このベクターは、E. coliにおける高コピー数複製、およびほとんどの哺乳動物細胞における目的のペプチドの高レベル一過性発現を容易にするように設計される（詳細については、pVAX1についての製造業者のプロトコルを参照のこと（カタログ番号V260-20、www.invitrogen.com））。
【０２４５】
ベクターは、以下のエレメントを含む：
＊  種々の哺乳動物細胞における高レベル発現のためのヒトサイトメガロウイルス前初期（CMV）プロモーター
＊  センス配向でのインビトロ転写および挿入物全体の配列決定を可能にするT7プロモーター／プライミング部位
＊  有効な転写終止およびｍＲＮＡのポリアデニル化のためのウシ成長ホルモン（BGH）ポリアデニル化シグナル
＊  E. coliにおける選択のためのカナマイシン耐性遺伝子
＊  マルチクローニング部位
＊  E. coliにおける高コピー数複製および増殖のためのpUC起点
＊  挿入物全体の配列決定を可能にするためのBGH逆プライミング部位。
【０２４６】
ベクターは、標準的な組換え技法を用いて調製され得、これは当該技術分野で公知であり、例えば、Sambrookら（1989）である。ワクチンの調製において重要な段階は、以下のとおりである：
＊  目的の遺伝子をマルチクローニング部位の１つによってpVAX1にライゲートする
＊  次いで、ライゲーション混合物をコンピテントE. coli株（例えば、TOP10）に形質転換し、そして50μg/mlのカナマイシンを含むLBプレートを用いて形質転換体を選択する。
＊  クローンを選択し、そして配列決定して目的の遺伝子の存在および配向を確認する。
＊  一旦遺伝子の存在が確認されると、ベクターを用いて、タンパク質発現についてチェックするために哺乳動物細胞株をトランスフェクトし得る。トランスフェクションのための方法は当該技術分野で公知であり、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、およびリポフェクションが挙げられる。
＊  一旦ペプチド発現が確認されると、適切な細胞宿主、例えば、E. coliで大量のベクターを産生し、そして精製し得る。
【０２４７】
pVAX1は、宿主染色体に組込まれない。組込みの可能性を最小にするためにすべての非必須配列が除去されている。特定のベクターを構築する場合、真核生物細胞内で発現される場合にコードされたタンパク質の分泌を指示するために、リーダー配列が含まれ得る。
【０２４８】
使用されている他のベクターの例は、V1Jns.tPAおよびpCMV4である（Lefevreら、2000およびVordermeierら、2000）。
【０２４９】
宿主のゲノムに組込まれる発現ベクターが使用され得るが、組み込まれないベクターを使用することが、より通常でありそしてより好ましい。pVAX1の例は組込まれない。組込みは、他の問題を生じる遺伝学的に改変された宿主を生成する。
【０２５０】
実施例１１−ＲＮＡワクチン
米国特許第5,783,386号の15頁に記載のように、１つのアプローチは、宿主に直接ＲＮＡを導入することである。
【０２５１】
したがって、ベクター構築物（実施例１０）は、インビトロでＲＮＡを生成し、次いで精製されたＲＮＡを宿主に注入するために使用され得る。次いで、ＲＮＡは、宿主細胞における翻訳のテンプレートとして用いる。組込みは起こらない。
【０２５２】
他の選択肢は、目的の遺伝子に対応するＲＮＡを有するレトロウイルスゲノムのような感染性因子を使用することである。ここでは、宿主ゲノムへの組込みが起こる。
【０２５３】
他の選択肢は、シンドビスウイルスまたはセムリキ森林熱ウイルスのようなウイルスベクターに由来し得るＲＮＡレプリコンワクチンの使用である。これらのワクチンは、自己複製および自己制限しており、そしてＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして投与されて、次いでインビボでＲＮＡレプリコンに転写される。ベクターは、最終的には、トランスフェクトされた細胞の溶解を引き起こし、それによって宿主ゲノムへの組込みの可能性を減少させる。ＲＮＡワクチン構築についてのプロトコルは、Chengら（2001）に詳述される。
【０２５４】
実施例１２−Ｔ細胞応答の評価に基づく診断アッセイ
Ｔ細胞応答の評価に基づく診断アッセイのために、患者からの血液の試料を得ることが必要である。単核細胞（単球、ＴおよびＢリンパ球）は、Ficollグラジエントのような密度グラジエントを用いて血液から分離され得る。
【０２５５】
単球とＢリンパ球は両方とも、抗原を提示し得るが、樹状細胞のような専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）よりも効率が劣る。後者は、リンパ様組織により局在する。
【０２５６】
最も単純なアプローチは、分離した単核細胞に抗原を添加し、そして１週間インキュベートし、次いで増殖の量を評価することである。個体が感染によって既に抗原に曝露されているならば、抗原に特異的なＴ細胞クローズは、試料中により広がっているべきであり、そして応答すべきである。
【０２５７】
異なる細胞集団を分離することも可能であり、Ｔ細胞対ＡＰＣの比を制御することが所望される。
【０２５８】
このタイプのアッセイの他のバリエーションは、応答の尺度として応答性リンパ球によるサイトカインの産生を測定することである。以下の実施例１３に記載のELISPOTアッセイは、このバリエーションの適切な例である。
【０２５９】
実施例１３−潜伏性マイコバクテリアの検出
結核の制御についての主な問題は、結核菌に感染した無症候性個体が多く存在することである。停止期桿菌は、第一線の薬物に対してより抵抗性である。
【０２６０】
潜伏性マイコバクテリア関連抗原の存在は、血液試料中の抗原特異的抗体またはＴ細胞のいずれかを検出することによって間接的に検出され得る。
【０２６１】
以下の方法は、Lalvaniら（2001）に記載の方法に基づき、ここでは、分泌された抗原ESAT-6を、M. tuberculosis複合体のメンバーによって発現されると同定したが、M. bovis BCGワクチン株およびほとんどの環境中のマイコバクテリアからは不在である。60〜80％の患者も、EAST-6に対して強力な細胞免疫応答を有する。エクスビボELISPOTアッセイを用いて、ESAT-6特異的Ｔ細胞を検出した。
【０２６２】
本発明に適用した場合：
96ウェルプレートを、サイトカイン（例えば、インターフェロン−γ、IL-2）特異的抗体でコーティングする。次いで、末梢血単球を患者の全血から単離し、そしてウェルに塗布する。
【０２６３】
抗原（すなわち、本発明のペプチド、フラグメント、誘導体、または改変体の１つ）を添加して、存在し得る特異的Ｔ細胞を刺激し、そしてプレートを24時間インキュベートする。抗原は、サイトカイン産生を刺激し、次いで特異的抗体に結合する。
【０２６４】
プレートを洗浄して、抗原特異的Ｔ細胞が存在するプットプリントを残した。
【０２６５】
次いで、適切な検出システム（例えば、酵素）とカップリングさせた第２抗体を添加し、そして適切な基質を添加した後スポットの数を計数する。
【０２６６】
単一の抗原特異的なＴ細胞にそれぞれ対応するスポットの数は、最初に添加された細胞の総数に関連する。
【０２６７】
上記の実施例も、ＴＢ感染した個体をＢＣＧワクチン接種した個体と区別するために使用され得る抗原の使用を記載する。これは、より区別的な診断アッセイで使用され得る。
【０２６８】
実施例１４−トランスクリプトミクス分析のための代替プロトコル
ａ）実験設計
ＲＮＡを好気（50％ＤＯＴ）および低酸素（１％ＤＯＴ）培養物から抽出し、そして蛍光標識したｃＤＮＡを、ＲＮＡの各試料から転写した。蛍光標識したｃＤＮＡもまた、M. tuberculosisから抽出したゲノムＤＮＡから転写した。
【０２６９】
各マイクロアッセイ実験において、全ゲノムアレイを、１つの培養試料からのＲＮＡから生成した標識ｃＤＮＡの試料とハイブリダイズした（テスト試料）。各アレイも、ゲノムＤＮＡから調製したコントロールｃＤＮＡとハイブリダイズした（コントロール試料）。テストおよびコントロールのｃＤＮＡを、それぞれ異なるｃｙ染料で標識した。
【０２７０】
９つの別々のアレイを好気的試料について行い、そして７つの低酸素アレイを行った。各アレイを、Affymetric 428アレイスキャナーを用いて、各染料の励起最大に対応する２つの異なる波長でスキャンした。発光強度を記録し、そしてデータを、GeneSpringソフトウエアを用いて分析した。
【０２７１】
各チップにおけるテスト試料データを、コントロールデータに対して標準化し、次いで、50番目の百分位数を用いたメジアン強度値について、チップ当たりで標準化し、そして最後にアレイすべてにわたって遺伝子当たりで標準化した。この場合、好気的培養物に対して低酸素条件下で少なくとも1.5倍高く発現される遺伝子を、同定のために選択した。
【０２７２】
ｂ）マイクロアレイ分析のためのM. tuberculosisからのＲＮＡ抽出
材料および方法
Trizol（Life Technologies）−これは、フェノールおよびチオシアン酸グアニジンの処方物である。
【０２７３】
ＧＴＣ溶解溶液−これは、５Mのチオシアン酸グアニジン、0.5％のＮ−ラウリルサルコシン、25mMのクエン酸３ナトリウム、0.1Mの２−メルカプトエタノール、および0.5％のTween（登録商標）80を含む。
【０２７４】
クロロホルム、イソプロパノール
３M   酢酸ナトリウム
70％  エタノール
マイクロ遠心機、リボライザー（ribolyser）
滅菌プラスチック製品−Falconチューブ、スクリューキャップ付きエッペンドルフ、ギルソンチップ−これらはすべてＲＮａｓｅを含まない
ガラス製品−160℃にて少なくとも16時間焼いた。
【０２７５】
方法
封じ込めレベル３で行われる工程；クラスIIIの微生物安全キャビネット内である。
【０２７６】
＊  10または20mlの培養物（109/ml）を取り出し、そしてこれをすぐにプラスチック試料ポット中の４容量のＧＴＣ溶解緩衝液に添加する。ポットを確実に密封する。
【０２７７】
＊  ＧＴＣ溶解緩衝液中の細胞を室温にて１時間インキュベートする。５％のHycolinで５分間プラスチックポットの表面の汚染を除去する。試料をパスボックスに移し、そして密封可能な蓋を有するプラスチックの運搬用容器に入れる。容器を確実に閉じ、そしてこれを非毒性キャビネットであるＣＬ３キャビネットに移す。
【０２７８】
＊  溶解混合物をFalconチューブに等しく分配する。これらのチューブを遠心分離バケットに入れ、そしてバケットを堅く密封する。５％のHycolinで５分間バケットの表面の汚染を除去する。次いで、これらを遠心分離機（Baird and Tatlock Mark IV冷却ベンチトップ遠心分離機）に移す。チューブを3,000rpmにて30分間回転させる。
【０２７９】
＊  未開封のバケットをキャビネットに戻す。遠心チューブを取り出し、そして上清をＧＴＣ溶解緩衝液用の廃棄瓶に注ぐ。
【０２８０】
＊  各ペレットを１mlのTrizol（フェノールおよびＧＴＣの処方物、カタログ番号15596-026）に再懸濁する。製造業者のガイドラインは、繰り返しのピペット操作によって細胞を溶解することを推奨する。この動作のみではM. tuberculosisを溶解しないが、Trizol中にペレットを完全に再懸濁させるためには重要である。
【０２８１】
＊  １mlの細胞を各FastRNAチューブに移し、そしてパワーセッティング6.5にて45秒間、細胞をリボライズ（ribolyse）する。
【０２８２】
＊  チューブを室温にて５分間インキュベートさせる。
【０２８３】
＊  各チューブから水層を取り出し、そしてこれをスクリューキャップ付きのエッペンドルフチューブ中の200μlのクロロホルムに添加する。各チューブを約15秒間激しく振盪する。室温にて２〜３分間インキュベートする。
【０２８４】
＊  チューブを13,000rpmにて15分間回転させる。遠心分離後、液体は、赤いフェノール／クロロホルム相、界面、および澄明な水相に分離する。
【０２８５】
＊  水相を注意深く取り出し、そしてこれを500μlのクロロホルム／イソアミルアルコール（24：１）を含む新鮮なエッペンドルフチューブに移す。このチューブを、13,000rpmにて15分間回転させる。
【０２８６】
＊  水相を、50μlの酢酸ナトリウムおよび500μlのイソプロパノールを含むエッペンドルフチューブに移す。
【０２８７】
＊  エッペンドルフチューブを５％のHycolinで５分間表面の汚染を除去する。チューブをＣＬ３研究室から取り出し、そして研究室157で手順を続ける。
【０２８８】
封じ込めレベル２で行われる工程：
＊  ＲＮＡを−70℃にて少なくとも30分間沈殿させる−この工程は一晩行われ得る。
＊  沈殿したＲＮＡを13,000rpmにて10分間回転させて落とす。上清を除去し、そしてペレットを70％エタノールで洗浄する。遠心分離を繰り返す。
【０２８９】
＊  70％エタノールを除去し、そしてペレットを空気乾燥させる。ペレットを、ＲＮＡｓｅを含まない水に溶解させる。
＊  ＲＮＡを−70℃にて凍結させて保存する。
【０２９０】
＊  ＲＮＡをＤＮＡｓｅ１で処理してゲノムＤＮＡを除去し、次いでRNeasyミニカラム（Qiagen）を用いて精製した。両方法とも、製造業者のガイドラインに従って行った。
【０２９１】
ｃ）ケモスタット培養物中で増殖したM. tuberculosisからのゲノムＤＮＡの単離
次いで、ＤＮＡを用いてＣｙ３またはＣｙ５標識したＤＮＡを生成し、マイクロアレイ実験におけるコントロールとして使用する。
【０２９２】
材料および方法
0.5mmの直径のビーズ
ビーズビーター
ベンチトップ遠心分離機
プラットホームロッカー
熱ブロック
Falcon 50ml遠心チューブ
Sorvall RC-5C遠心分離機
250mlポリプロピレン遠心分離ポット
スクリューキャップ付きのエッペンドルフチューブ
１ml、200μl、10ml、５mlのピペット。
【０２９３】
破壊緩衝液
50mM Tris HCL pH8.0
10mM EDTA
100mM NaCl。
【０２９４】
手順
Ｍｔｂ細胞の機械的破壊
＊  150mlのケモスタット細胞（540nmで2.5のO.D.）を、遠心分離機Sorvall RC-5Cを用いて250mlポリプロピレンポット中で15,000rpmにて15分間回転させて落とす。
＊  上清を捨てる。
＊  細胞を、50ml Falconチューブ中の５mlの破壊緩衝液に再懸濁し、そして15,000rpmにてさらに15分間遠心分離する。
＊  上清を除去し、そしてさらなる破壊緩衝液を５mlの容量で添加する。ビーズを用いて細胞を破砕する。これらは、１mlの細胞に対して１mlのビーズ量で使用される。試料を適切なサイズのチャンバー中に置く。ビーズビーター中に置き、そして（氷を含む）外側のユニットを確実にし、そして所望のスピードで30秒間処理する。
＊  ビーズを10分間沈殿させ、そして細胞ライセートを50mlのFalcon遠心チューブに移す。
＊  ビーズ上で洗浄緩衝液をピペットで上下させることによって、２〜５mlの破壊緩衝液でビーズを洗浄する。
＊  この洗浄溶液を、Falconチューブ中のライセートに添加する。
【０２９５】
タンパク質および細胞成分の除去。
＊  0.1容量の10％ＳＤＳおよび0.01容量のプロテイナーゼＫを添加する。
＊  反転によって混合し、そして熱ブロック中で55℃にて２〜３時間加熱する。
＊  得られる混合物は均一かつ粘性であるべきである。そうでないならば、0.2％までの濃度になるようにさらにＳＤＳを添加する。
＊  25/24/1の比のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールの等容量を添加する。
＊  プラットホームロッカー上で均一になるまで穏やかに混合する。
＊  3,000rpmにて20分間回転して落とす。
＊  水相を取り出し、そして新鮮なチューブに入れる。
＊  水相を等容量のクロロホルムで抽出して、ごく少量の細胞破砕物およびフェノールを除去する。クロロホルム抽出物は、すべての破砕物を除去するまで繰り返す必要があり得る。
＊  0.3M酢酸ナトリウムおよび等容量のイソプロパノールでＤＮＡを沈殿させる。
＊  ガラス棒でできるだけ多くのＤＮＡを巻き取る。
＊  巻き取ったＤＮＡを70％エタノール、次いで100％エタノールで洗浄する。
＊  空気乾燥させる。
＊  滅菌脱イオン水（500μl）にＤＮＡを溶解する。
＊  ＤＮＡを４℃にて約16時間溶解させる。
＊  溶解したＤＮＡにＲＮａｓｅ１（500Ｕ）を添加する。
＊  37℃にて１時間インキュベートする。
＊  等容量のフェノール／クロロホルムで再抽出し、次いでクロロホルム抽出物および沈殿物を上記のように処理する。
＊  13,000rpmにてＤＮＡを回転して落とす。
＊  上清を除去し、そして70％エタノールでペレットを洗浄する。
＊  空気乾燥させる。
＊  200〜500μlの滅菌水に溶解する。
【０２９６】
ｄ）ＤＮＡからのＣｙ３またはＣｙ５で標識されたＤＮＡの調製
マイクロアレイスライド当たり１つのＣｙ３または１つのＣｙ５で標識されたＤＮＡ試料を調製する。
各試料について：
ＤＮＡ                            ２〜５μg
ランダムプライマー                （３μg/μl）１μl
水                                41.5μlにする。
【０２９７】
95℃にて５分間加熱し、氷上で急激に冷却し、そして短時間遠心分離する。
【０２９８】
それぞれに以下のものを加える：
10×REact 2緩衝液                                        ５μl
ｄＮＴＰ（５mM dA/G/TTP、２mM dCTP）                     １μl
Ｃｙ３またはＣｙ５ ｄＣＴＰ                              1.5μl
クレノウ（５U/l）                                        １μl
暗所で37℃にて90分間インキュベートする。
【０２９９】
スライドをプレハイブリダイズする
コプリンジャー（Coplin jar）中でプレハイブリダイゼーション溶液を混合し、そして標識付け反応が平衡化する間、65℃にてインキュベートする。
【０３００】
プレハイブリダイゼーション：20×ＳＳＣ        8.75ml（3.5×ＳＳＣ)
20％ＳＤＳ                                    250μl（0.1％ＳＤＳ）
ＢＳＡ（100mg/ml）                            ５ml（10mg/ml）
水                                             50mlにする。
【０３０１】
マイクロアレイスライドを、予め加熱したプレハイブリダイゼーション溶液中で65℃にて20分間インキュベートする。スライドを、400mlの水中で１分間全体的にリンスし、次いで400mlのプロパン−２−オール中で１分間リンスし、そしてスライドを、50mlの遠心チューブ中で1,500rpmにて５分間遠心分離して乾燥させる。スライドを暗所の無塵ボックスでハイブリダイゼーションまで保存する（１時間未満）。
【０３０２】
Ｃｙ３／Ｃｙ５標識したＤＮＡを精製する−Qiagen MinElute Purification
＊  Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したＤＮＡ試料を１つのチューブに合わせ、そして500μlの緩衝液ＰＢを添加する。
＊  コレクションチューブ中でMinEluteカラムにかけ、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに500μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに250μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  13,000rpmにてさらに１分間遠心分離して、残りのエタノールを取り出す。
＊  新鮮な1.5mlチューブ中にMinEluteカラムを配置する。
＊  メンブランの中心に10.5μlの水を添加し、そして１分間放置する。
＊  13,000rpmにて１分間遠心分離する。
【０３０３】
ｅ）ＲＮＡからのＣｙ３またはＣｙ５で標識されたｃＤＮＡの調製
マイクロアレイスライド当たり１つのＣｙ３または１つのＣｙ５で標識されたｃＤＮＡ試料を調製する。
各試料について：
ＤＮＡ                             ２〜10μg
ランダムプライマー（３μg/μl）    １μl
水                                 11μlにする。
【０３０４】
95℃にて５分間加熱し、氷上で急激に冷却し、そして短時間遠心分離する。
それぞれに以下のものを加える：
５×First Strand Buffer                                  ５μl
ＤＴＴ（100mM）                                          2.5μl
ｄＮＴＰ（５mM ｄＡ／Ｇ／ＴＴＰ、２mM  ｄＣＴＰ）        2.3μl
Ｃｙ３またはＣｙ５ ｄＣＴＰ                              1.7μl
SuperScript II（200U/μl）                               2.5μl。
【０３０５】
暗所で25℃にて10分間、次いで暗所で42℃にて90分間インキュベートする。
【０３０６】
スライドをプレハイブリダイズする
コプリンジャー（Coplin jar）中でプレハイブリダイゼーション溶液を混合し、そして標識付け反応が平衡化する間、65℃にてインキュベートする。
プレハイブリダイゼーション：20×ＳＳＣ        8.75ml（3.5×ＳＳＣ)
20％ＳＤＳ                                    250μl（0.1％ＳＤＳ）
ＢＳＡ（100mg/ml）                            ５ml（10mg/ml）
水                                             50mlにする。
【０３０７】
マイクロアレイスライドを、予め加熱したプレハイブリダイゼーション溶液中で65℃にて20分間インキュベートする。スライドを、400mlの水中で１分間全体的にリンスし、次いで400mlのプロパン−２−オール中で１分間リンスし、そしてスライドを、50mlの遠心チューブ中で1500rpmにて５分間遠心分離して乾燥させる。スライドを暗所の無塵ボックスでハイブリダイゼーションまで保存する（１時間未満）。
【０３０８】
Ｃｙ３／Ｃｙ５標識したｃＤＮＡを精製する−Qiagen MinElute Purification
＊  Ｃｙ３およびＣｙ５で標識したＤＮＡ試料を１つのチューブに合わせ、そして250μlの緩衝液ＰＢを添加する。
＊  コレクションチューブ中でMinEluteカラムにかけ、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに500μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  MinEluteカラムに250μlの緩衝液ＰＥを添加し、そして13,000rpmにて１分間遠心分離する。
＊  フロースルーを捨て、そして同じコレクションチューブ中にMinEluteカラムを戻して配置する。
＊  13,000rpmにてさらに１分間遠心分離して、残りのエタノールを取り出す。
＊  新鮮な1.5mlチューブ中にMinEluteカラムを配置する。
＊  メンブランの中心に10.5μlの水を添加し、そして１分間放置する。
＊  13,000rpmにて１分間遠心分離する。
【０３０９】
ｆ）スライドをＣｙ３／Ｃｙ５で標識されたｃＤＮＡ／ＤＮＡとハイブリダイズする
プレハイブリダイズしたマイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションカセット中に置き、そしてカセット中のウェルに水の15μlアリコートを２回添加する。再懸濁したＣｙ３／Ｃｙ５標識したｃＤＮＡ試料を、ハイブリダイゼーション溶液と混合する。
【０３１０】
ハイブリダイゼーション：
Ｃｙ３／Ｃｙ５標識したｃＤＮＡ試料        10.5μl
20×ＳＳＣ                                3.2μl（４×ＳＳＣ）
２％ＳＤＳ                                2.3μl（0.3％ＳＤＳ）。
【０３１１】
ハイブリダイゼーション溶液を95℃にて２分間加熱する。氷上で急激に冷却しないが、徐々に冷却し、短時間遠心分離する。気泡形成を避けながらスライド上のアレイした領域の端にハイブリダイゼーション溶液をピペットで載せる。ピンセットを用いて、カバーグラスの端をスライドの表面に沿って、アレイした領域の方へ、およびアレイの端のハイブリダイゼーション溶液中に、注意深くドラッグする。一旦決まった位置に置くとさらなる移動を避けながら、カバーグラスをアレイ上に注意深く下げる。ハイブリダイゼーションカセットを密封し、そして60℃の水浴中に16〜20時間沈める。
【０３１２】
スライドを洗浄する
ハイブリダイゼーションカセットからマイクロアレイスライドを取り出し、そして最初に、予め65℃まで加熱したWash Aの染色トラフ中でスライドを注意深く洗浄して、カバーグラスを除去する。一旦カバーグラスをスライドラック中のスライドの位置に移動し、そしてWash A中でさらに２分間攪拌を続ける。
【０３１３】
Wash A：
20×ＳＳＣ                20ml（１×ＳＳＣ）
20％ＳＤＳ                １ml（0.05％ＳＤＳ）
水                        400mlにする。
【０３１４】
スライドをクリーンなスライドラックに移し、そしてWash Bの第１のトラフ中で２分間攪拌する。Wash Bの第２のトラフ中で２分間攪拌しながら洗浄する。
【０３１５】
Wash B（×２）：
20×ＳＳＣ               1.2ml（0.06×ＳＳＣ）
水                       400mlにする。
【０３１６】
スライドを50mlの遠心チューブに入れ、そして1500rpmにて５分間遠心分離して、スライドを乾燥させ、次いでマイクロアレイスライドスキャナーを用いて蛍光をスキャンする。スライドを、Affymetrix 428スキャナーを用いてスキャンした。生データを、ImaGeneおよびGeneSpringソフトウエアの組み合わせを用いて分析した。
【０３１７】
ｇ）アレイの調製
M. tuberculosisゲノム全体のアレイを、ＯＲＦ特異的プライマーを用いて、M. tuberculosisゲノムＤＮＡから調製した。各ＯＲＦに対応するＰＣＲ産物を、標準的な顕微鏡ガラススライド上のグリッドに、BioRobotics microgridロボット（MWG Biotech）を用いて4000スポット／ｃｍ２より高い分解能でスポットした。
【０３１８】
結果
低ＤＯＴ連続培養条件下でアップレギュレートされるM. tuberculosisのＤＮＡをコードする配列のトランスクリプトミクス分析は、以下の配列番号を同定した（表２を参照のこと）。配列番号のカラムを参照すると、第１の同定した数字はアミノ酸配列であり、そして第２の同定した数字は対応するＤＮＡ配列である。
【０３１９】
【表２Ａ】
2005504523.tif 000011
【０３２０】
【表２Ｂ】
2005504523.tif 000012
【０３２１】
【表２Ｃ】
2005504523.tif 000013
【０３２２】
【表２Ｄ】
2005504523.tif 000014
【０３２３】
実施例１５−タンパク質抽出および特徴付けのためのプロトコル
M. tuberculosis H37Rvを、好気（50％ＤＯＴ）および低酸素（１％ＤＯＴ）条件下で連続培養で増殖し、そして試料を定常期中に収集した（実施例１を参照のこと）。
【０３２４】
培養細胞ペレットの採集
＊  300〜350mlの培養物を、氷上で一晩収集する。
＊  培養物を、Sorvall RC5B遠心分離機を用いてドライスピンチューブ中で４℃で15,000rpmにて10分間遠心分離する。
＊  上清をデカントし、そして細胞ペレットをチューブ中に収集し、そして−40℃にて凍結保存する。
【０３２５】
細胞ペレットからのタンパク質抽出物の調製
＊  ３つの好気および２つの低酸素のケモスタット培養物のそれぞれからの定常期細胞ペレットの１つの試料を、フリーザーから取り出し、そして室温で１時間解凍した。
＊  各ペレットを、40mlのTris-HCL緩衝液［40ml当たり、40mM Tris、１mM EDTA（pH6.9）、および200μlのプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma、P8645）］に再懸濁し、そして12,000rpmにて４℃での遠心分離により再ペレット化する。
＊  次いで、各細胞ペレットを、約１mlの緩衝液と再懸濁する。
＊  細菌懸濁液の0.5mlアリコートを、別々のリボライザー（ribolyser）チューブ（Anachem）中に分散する。
＊  各チューブを、３×90秒サイクル（最大出力−セッティング6.5）で、各サイクル間は氷上で５分間でリボライズする。
＊  リボライズ後、各試料のタンパク質調製物をプールし、そして以下の化学物質を添加した：
3.2ｇ                 尿素
64.8mg                ＤＴＴ
300μl                両性電解質（servalyte 2-4 serva 電気泳動）
0.24ｇ                ＣＨＡＰＳ。
【０３２６】
＊  各化学物質を、次の添加前に溶解する。
＊  試料を、室温にて30分間インキュベートする。
＊  試料を、エッペンドルフチューブ中に分散し、そして12,000rpmにて５分間遠心分離する。
＊  次いで、澄明な可溶性タンパク質調製物を取り出し、そして0.2μmの酢酸セルロースフィルターメンブランを通して二重濾過する。
＊  Bioradアッセイを用いる試料のタンパク質定量を、ウシ血清アルブミン標準曲線を用いて行い、そして試料が６〜8.5mg/mlのタンパク質を含むことを見出した。
【０３２７】
２Ｄ電気泳動を用いるプロテオミクス分析
低酸素および好気ケモスタット培養物の代表的なタンパク質試料を、２Ｄ電気泳動分析のために、the Wittman Institute of Technology and Analysis of Biomolecules (WITA), Berlinに送付した。
【０３２８】
＊  ２Ｄ電気泳動による各試料のタンパク質分離（Jungblutら、Infect Immun 2001年9月; 69(9):5905-7）を、それぞれ70μlおよび25μlのタンパク質試料を用いて生成したクーマシーブリリアントブルーおよび銀染色ゲルの両方で行った。
【０３２９】
タンパク質同定
＊  クーマシーの低酸素ゲル上の最も多いタンパク質スポットを切り出し、そしてタンパク質同定のためにRobin Wait（Jungblutら、Infect Immun 2001年9月; 69(9):5905-7）による質量分析決定に送付した。
【０３３０】
以下のタンパク質を同定し、そして表３に（それらの対応するＤＮＡコード配列と一緒に）挙げる。
【０３３１】
【表３】
2005504523.tif 000015
【０３３２】
参考文献：
１．McKinney, J.D.,ら、Persistence of Mycobacterium tuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase [コメントを参照のこと]. Nature, 2000. 406(6797): 735-8頁。
２．Pelicic, V.ら、Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1997. 94(20): 10955-60頁。
３．Lee, M.H.ら、Site-specific integration of mycobacteriophage L5: integration- proficient vectors for Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, and bacille Calmette-Guerin. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(8): 3111-5頁。
４．McShane, H.ら、Enhanced immunogenicity of CD4(+) t-cell responses and protective efficacy of a DNA-modified vaccinia virus Ankara prime-boost vaccination regimen for murine tuberculosis. Infect Immun, 2001. 69(2): 681-6頁。
５．Movahedzadeh, F., M.J. Colston, およびE.O. Davis, Characterization of Mycobacterium tuberculosis LexA: recognition of a Cheo (Bacillus-type SOS) box. Microbiology, 1997. 143(Pt 3): 929-36頁。
【０３３３】
その他の参考文献：
Sambrook, J., E. F. Fritsch, およびT. Maniatis、1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 第2版. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, N. Y.。
Lefever, P., O. Denis, L. De Wit, A. Tanghe, P. Vandenbussche, J. Content, およびK. Huygen、2000. Cloning of the gene encoding a 22-kilodalton cell surface antigen of Mycobacterium bovis BCG and analysis of its potential for DNA vaccination against tuberculosis. Infection and Immunity. 68:1040-1047。
Vordermeire, H. M., P. J. Cockle, A. O. Whelan, S. Rhodes, M. A. Chambers, D. Clifford, K. Huygen, R. Tascon, D. Lowrie, M. J. Colston, およびR. G. Hewinson、2000. Effective DNA vaccination of cattle with the mycobacterial antigens MPB83 and MPB70 does not compromise the specificity of the comparative intradermal tuberculin skin test. Vaccine. 19:1246-1255。
Cheng, W., C. Hung, C. Chai, K. Hsu, L. He, C. Rice, M. Ling, およびT. Wu、2001. Enhancement of Sindbis virus self-replicating RNA vaccine potency by linkage of Mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70 gene to an antigen. J. Immunol. 166:6218-6226。
Lalvani, A.ら、2001. Enhanced contact tracing and spatial tracking of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. The Lancet 357:2017-2021。
【国際公開パンフレット】
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2005504523.tif 000018
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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