(57)【要約】  本発明は、昆虫Gタンパク質共役型受容体GPCRポリペプチドをコードしている単離された核酸、単離された昆虫GPCRポリペプチド、及びそれらの使用を提供する。更に組換えタンパク質及びこれらのタンパク質のインヒビターを同定する方法が提供される。明らかにされた昆虫GPCR核酸及びポリペプチドをスクリーニングアッセイにおいて用い、化合物の変調を同定することができる。本願明細書において明らかにされた方法において活性があるタンパク質インヒビターは、殺虫剤、殺外部寄生体剤、駆虫剤、葯補助剤(anthenenthicagent)、及びダニ駆除剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)配列番号：1-107の奇数番号配列のいずれかひとつのヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチド；
(b)配列番号：1-107の奇数番号配列のいずれかひとつと実質的と同一の核酸分子によりコードされたポリペプチド；
(c)配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(d)配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつのポリペプチドと生物学的に同等であるポリペプチド；又は
(e)配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつのポリペプチドとの特異的結合性を示す抗体と免疫学的に交差反応性であるポリペプチド；
を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
(a)配列番号：1-107の奇数番号配列のいずれかひとつのヌクレオチド配列；又は
(b)配列番号：1-107の奇数番号配列のいずれかひとつと実質的に同じ核酸分子；
を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
異種プロモーターと機能的に連結された、請求項2記載の核酸分子を含む、キメラ遺伝子。
【請求項４】
請求項3記載のキメラ遺伝子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項3記載のキメラ遺伝子を含む、宿主細胞。
【請求項６】
細胞が、細菌細胞、昆虫細胞、及び植物細胞からなる群より選択される、請求項5記載の宿主細胞。
【請求項７】
Gタンパク質共役型受容体ポリペプチドをコードしている核酸分子の検出法であって：
(a)核酸材料を含有する生物学的試料を入手する工程；
(b)請求項2記載の核酸分子を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、工程(a)の生物学的試料にハイブリダイゼーションし、これにより、請求項2記載の核酸と生物学的試料内の核酸の間に二重鎖構造を形成する工程；及び
(c)工程(b)の二重鎖構造を検出し、これにより核内受容体核酸分子を検出する工程を含む、方法。
【請求項８】
請求項1記載のポリペプチドを特異的に認識する、抗体。
【請求項９】
Gタンパク質共役型受容体ポリペプチドを特異的に認識する抗体の作出法であって：
(a)配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかに示されたような、昆虫の核内受容体ポリペプチド、又はそれらの一部を組換え的又は合成的に作出する工程；
(b)工程(a)のポリペプチドを配合し、これによりこれを有効な免疫原とする工程；
(c)工程(b)の配合物を動物へ投与し、抗体産生を含む動物における免疫応答を生じ、ここで抗体は、動物の血清中に存在する工程；及び
(d)工程(c)の動物から血清を採取し、この血清は、核内受容体ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む；
工程を含む、方法。
【請求項１０】
Gタンパク質共役型受容体ポリペプチドレベルの検出法であって：
(a)ペプチド系物質を含有する生物学的試料を得る工程；及び
(b)工程(a)の生物学的試料中のGタンパク質共役型受容体ポリペプチドを、請求項8記載の抗体との免疫化学的反応により検出し、これにより試料中のGタンパク質共役型受容体ポリペプチドのレベルを決定する；
工程を含む、方法。
【請求項１１】
Gタンパク質共役型受容体機能を変調する物質の同定法であって：
(a)請求項1記載のGタンパク質共役型受容体ポリペプチドを単離する工程；
(b)単離されたGタンパク質共役型受容体ポリペプチドを、複数の候補物質に曝露する工程；
(c)候補物質を、単離された核内受容体ポリペプチドへの結合についてアッセイする工程；及び
(d)単離されたGタンパク質共役型受容体ポリペプチドへの特異的結合性を示す候補物質を選択する；
工程を含む、方法。
【請求項１２】
Gタンパク質共役型受容体機能を変調する殺虫物質の同定法であって：
(a)配列番号：2-108の偶数番号のいずれかひとつのGタンパク質共役型受容体ポリペプチドを単離し、ここで昆虫のGタンパク質共役型受容体ポリペプチドの変調が、幼虫期昆虫の致死性を付与する工程；
(b)単離されたGタンパク質共役型受容体ポリペプチドを、複数の物質に曝露する工程；
(c)物質を、単離されたGタンパク質共役型受容体ポリペプチドへの結合についてアッセイする工程；及び
(d)単離されたGタンパク質共役型受容体ポリペプチドへの特異的結合性を示す物質を選択する；
工程を含む、方法。
【請求項１３】
植物の昆虫加害を予防又は駆除する方法であって：
(a)請求項12記載の方法により同定されたGタンパク質共役型受容体モジュレーターを含有する殺虫組成物を調製する工程；及び
(b)殺虫組成物の有効量を植物と接触し、これにより植物の昆虫加害を予防又は駆除する；
工程を含む、方法。
【請求項１４】
殺虫組成物が、化合物、タンパク質、ペプチド、核酸、又は抗体を含有する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
植物の線虫加害を予防又は駆除する方法であって：
(a)請求項12記載の方法に従い同定されたGタンパク質共役型受容体モジュレーターを含有する殺虫組成物を調製する工程；及び
(b)殺虫組成物の有効量を植物と接触し、これにより植物の線虫加害を予防又は駆除する；
工程を含む、方法。
【請求項１６】
植物の昆虫加害を予防又は駆除する方法であって、請求項1記載のGタンパク質共役型受容体ポリペプチドの活性を変調するGタンパク質共役型受容体モジュレーターを植物内で発現させ、これにより植物の昆虫加害を予防又は駆除する工程を含む、方法。
【請求項１７】
生体活性物質が、タンパク質、ペプチド、核酸、又は抗体を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
植物の線虫加害を予防又は駆除する方法であって、請求項1記載のGタンパク質共役型受容体ポリペプチドの活性を変調する生体活性物質を植物内で発現させ、これにより植物の線虫加害を予防又は駆除する工程を含む、方法。
【請求項１９】
DNA結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、及び活性化もしくは抑制ドメインを含むキメラGタンパク質共役型受容体カセットであって、ここでDNA結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、及び活性化ドメインの1種又は複数は、配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつの一部と同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を含む、カセット。
【請求項２０】
標的ヌクレオチド配列の発現を誘導する方法であって：
(a)請求項19記載のキメラGタンパク質共役型受容体発現カセットを構築する工程；及び
(b)標的ヌクレオチド配列及びキメラGタンパク質共役型受容体発現カセットのDNA-結合ドメインにより認識されるcis調節エレメントを有するタンパク質発現カセットを構築する工程；
(c)異種生物において、キメラGタンパク質共役型受容体発現カセット及び標的発現カセットを発現する工程；及び
(d)キメラGタンパク質共役型受容体発現カセットのリガンド結合ドメインに結合するリガンドを生物と接触させ、これにより標的ヌクレオチド配列が発現される工程を含む、方法。
【請求項２１】
異種生物が植物である、請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が本願明細書に参照として組入れられている、2001年12月18日に出願された米国特許仮出願第60/341,512号の利益を享受するものである。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は概して、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、オオタバコガ(Heliothis virescens)、又はタバコスズメガ(Manduca sexta)由来のGタンパク質共役型受容体(GPCR)遺伝子に関する。より詳細に述べると、本発明は、新規GPCR核酸配列及びポリペプチド配列、明らかにされたGPCR配列を含むキメラ遺伝子、明らかにされたGPCRポリペプチドを特異的に認識する抗体、GPCR核酸及びポリペプチドのモジュレーター、及びそれらの使用に関する。
【０００３】
略号表
ATCC：アメリカンタイプカルチャーコレクション
dsRNA：二本鎖RNA
dsRNAi：二本鎖RNA干渉
FCS：蛍光相関分光法
GPCR：Gタンパク質共役型受容体
GST：グルタチオンSトランスフェラーゼ
HMM：隠れマルコフモデル
IPM：統合的有害生物駆除
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応
PEG：ポリエチレングリコール
RACE：cDNA末端迅速増幅(rapid amplification of cDNA ends)
SELDI-TOF MS：表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析
Sf9細胞：ハスモンヨトウ近似種(Spodoptera frugiperda)細胞：
SPR：表面プラスモン共鳴
【背景技術】
【０００４】
背景
昆虫は、多くのヒト及び動物の疾患に寄与するか又はこれを引き起こし、かつ実質的農業及び地所の損害の原因となる。金銭、時間及び苦痛における害虫に関連した社会的コストは、大変なものである。これらの問題点を克服するために、殺虫化合物が開発され、使用されている。殺虫剤の穀物保護に関する世界的市場規模の合計は、50億ドルを超えており、殺虫剤製品は、農薬の世界的消費のおよそ32％を占めている。
【０００５】
殺虫剤開発は、主に新規化学構造を先がけて見つける努力により導かれている。この戦略に従い、公知の殺虫剤の化学的誘導体化が行われ、合成された化合物が、殺虫活性について分析されている。代わりの方法は、候補化合物と標的分子の間の分子相互作用を検出する方法に頼っている。理想的標的分子は、昆虫の発生期間中正確に調節され、その結果標的分子の活性又は活性レベルの変調が、生物の致死性をもたらす。ハイスループットスクリーニング法は、標的分子と相互作用する能力に関する多様かつ多数の化合物ライブラリーの迅速なスクリーニングを可能にしている。このような方法により発見された新規モジュレーターは、殺虫剤として有用である。
【０００６】
標的分子は、更に幼虫発生期に致死性を生じる標的分子活性の変調を基に選択することができる。昆虫の生活環は、その動物が体積を数千倍も増大することができるような成長に費やされる連続する幼虫期又は若虫期を必要としている。この成長を維持するために、未熟な昆虫は、長期間衰えずに摂食し、その結果この発生期は農作物にとって特に有害である。
【０００７】
多細胞生物の適切な発生及び生理における重要な要因は、細胞のその環境に対する正確な相互作用である。細胞により認識される環境シグナルのひとつの機序は、形質膜局在化した受容体タンパク質によるものである。形質膜上に認められた受容体の多くの範疇の中で、Gタンパク質共役型受容体(GPCR)が、多種多様な細胞外シグナルを、ヘテロ三量体Gタンパク質への可逆的結合により細胞の細胞質へと伝達することが示されている。GPCRタンパク質は、形質膜を7回貫通し、それらのアミノ末端を細胞外側に有し、それに続いて7個の連続する膜貫通ドメインがあり、及びそれらのカルボキシ末端を膜の細胞質側に有するような立体配置である。相互作用する分子又はリガンドは、アミノ末端及び／又は3個の細胞外ループと相互作用し、この受容体の細胞質部分に、その細胞質Gタンパク質への結合を変更させるような立体配置の変化を生じる。本発明のもののようなGタンパク質共役型受容体は、リガンド、受容体、及び細胞内Gタンパク質の間の高-親和性3つ組複合体の形成を促進するリガンドの能力により特徴付けられる。この複合体は、生理的濃度のGTPの存在下で形成され、かつGタンパク質αサブユニットの、Gタンパク質のβ及びγサブユニットからの解離を生じ、このことは更に機能的反応、すなわち、アデニル(adenylyl)シクラーゼ又はホスホリパーゼCのような、下流エフェクターの活性化を生じる。
【０００８】
GPCRの細胞外刺激に対する細胞内反応を生じる能力は、このクラスのタンパク質を、薬物及び化学物質の発見において非常に価値のあるものにしている。市販されている全ての医薬品の60％もの多くが、直接又は間接にGPCRシグナル伝達に関与していると推定されている。これらの薬物のいくつかの例は、H1-ヒスタミン受容体アンタゴニストであるロタラジン(Claritin(登録商標))、及びアデノシン受容体アンタゴニストであるテオフィリン(TheoDur(登録商標))がある。疼痛認知及び食欲調節の変調のようなヒトにおける複雑な生理的反応は、GPCRシグナル伝達の結果として同定されている。
【０００９】
ヒトと同じように、多くの昆虫の発達過程及び生理的過程が、GPCRシグナル伝達により調節されている。例えば、セロトニン受容体5-HT2は、ショウジョウバエにおいて胚の発達に必要である(Colasら、Mech. Dev.、87:67-76 (1999))。「フラミンゴ(flamingo)」と称される別のGPCRは、発達時に、樹状細胞形成及び細胞極性を含む、複数の役割を有する(Gaoら、Neuron、28:91-101 (2000)；及び、Usuiら、Cell、98:585-595 (1999))。同じく、昆虫の腎臓腺であるマルピーギ管内の液体分泌は、複数のGPCRにより指示されることが示されている(Pietrantonioら、Insect Mol Biol、10(4):357-69 (2001))。昆虫の生涯を通じたこれらの複数の機能は、これらのGPCRが、殺虫剤開発のための優れた標的をもたらす理由である。自然界では、クロゴケグモの毒であるラトロキシンが、ラトロフィリン(latrophilin)と称されるGPCRを介して、その作用を開始することが示されている。
【００１０】
改善された効能及び新規作用様式を示す殺虫剤が継続して求められている。この目的のために、本発明は、ショウジョウバエ発生時のGタンパク質共役型受容体の機能的特性を明らかにしている。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、単離された昆虫GPCRポリペプチド及びそれをコードしている単離された核酸分子を明らかにしている。好ましくは、単離された昆虫GPCRポリペプチド、又はそれらの機能部分は、配列番号：1-107の奇数番号配列のいずれかひとつの核酸分子によりコードされたポリペプチド；配列番号：1-107の奇数番号配列のいずれかひとつと実質的に同じ核酸分子によりコードされたポリペプチド；配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつのアミノ酸配列を有するポリペプチド；配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつと生物学的に同等であるポリペプチド；又は、配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつの一部又は全てのアミノ酸を含むポリペプチドに特異的に結合することを示す抗体と免疫学的に交差反応性であるポリペプチドを含む。
【００１２】
ひとつの態様において、本発明は、その相補体が奇数番号の配列番号：1-107からなる群より選択される配列へストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供している。別の態様において、本発明は、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80％、更により好ましくは90％、なお更に好ましくは95％、及び最も好ましくは99〜100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００１３】
本発明は、本発明の核酸分子に機能的に連結されたプロモーターを含むキメラ構築体も提供し、ここでこのプロモーターは、好ましくは真核生物において機能し、ここでこのプロモーターは、好ましくはこの核酸分子に対し異種である。より好ましくは、このプロモーターは、植物において機能する。
【００１４】
本発明は更に、本発明のキメラ構築体を含む、組換えベクターを提供し、ここで該ベクターは、宿主細胞へ安定して形質転換されることが可能である。本発明はより更に本発明の核酸分子を含む宿主細胞を提供し、ここで該核酸分子は、この細胞において発現可能であることが好ましい。宿主細胞は好ましくは、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び原核細胞からなる群より選択される。本発明は加えて、本発明の植物細胞を含む植物体又は種子を提供する。
【００１５】
本発明は、昆虫の成長に必須のタンパク質も提供する。ひとつの態様において、本発明は、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80％、更により好ましくは90％、なお更に好ましくは95％、及び最も好ましくは99〜100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質を提供する。別の態様において、本発明は、本発明のタンパク質の組換え作出、及びこのタンパク質と相互作用する化合物を同定するためのアッセイにおける本発明のタンパク質の使用法にも関する。
【００１６】
別の本発明の局面において、昆虫GPCRポリペプチドをコードしている核酸分子を検出する方法が提供される。この方法に従い、核酸材料を有する生物学的試料が、本発明の昆虫GPCR核酸分子へ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズされる。このようなハイブリダイゼーションは、生物学的試料の核酸分子及び昆虫GPCR核酸分子が検出可能な二重鎖構造を形成することを可能にする。好ましくは昆虫GPCR核酸分子は、配列番号：1-107の奇数番号配列のいずれかひとつのヌクレオチドの一部又は全てを含む。本発明は更に、昆虫GPCRポリペプチドを特異的に認識する抗体を示している。好ましくはこの抗体は、配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつのアミノ酸の一部又は全てを認識する。昆虫GPCR抗体の産生法も開示されており、この方法は、配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつに示されたような、昆虫GPCRポリペプチド、又はそれらの一部を組換え的又は合成的に作成すること；効果的免疫原となるように、昆虫GPCRポリペプチドを配合すること；この配合されたポリペプチドで動物を免疫処置し、昆虫GPCR抗体の産生を含む免疫応答を形成すること；並びに、昆虫GPCRポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む免疫処置した動物から血清を採取することを含む。抗体-産生細胞は、不死化された細胞株と任意に融合され、これにより昆虫GPCRポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を選択することができる。
【００１７】
配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかの昆虫GPCRポリペプチドを認識する抗体を用い、昆虫GPCRポリペプチドのレベルを検出する方法も提供される。本方法に従い、生物学的試料が、実験対象及び対照対象から得られ、並びに試料中の昆虫GPCRポリペプチドが、昆虫GPCR抗体との免疫化学的反応により検出される。好ましくはこの抗体は、配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつのアミノ酸を認識し；並びに、このような抗体を産生する本発明の方法に従い調製される。
【００１８】
本発明は更に、GPCR機能を変調する化合物を同定する方法を明らかにしている。この方法は以下を含む：(a)配列番号：2-108の偶数番号配列のいずれかひとつの単離された昆虫GPCRポリペプチドを、1種又は複数の化合物へ曝露する工程、及び(b)化合物の単離された昆虫GPCRポリペプチドへの結合をアッセイする工程。単離された昆虫GPCRポリペプチドへの特異的結合を明らかにする化合物が選択される。このモジュレーターは、化合物、タンパク質、ペプチド、核酸、又は抗体であり、及び本願明細書に明らかにされた方法により調製されることが好ましい。
【００１９】
本発明は、GPCR機能を変調する殺虫化合物を同定する方法も提供する。この方法は以下を含む：(a)偶数番号の配列番号：2-108のいずれかひとつの昆虫GPCRポリペプチドを単離し、ここで昆虫GPCRポリペプチドの変調は、昆虫の致死性を付与する工程；(b)単離された昆虫GPCRポリペプチドを、複数の物質に曝露する工程；(c)物質の単離されたGPCRポリペプチドへの結合をアッセイする工程；並びに、(d)単離された昆虫GPCRポリペプチドへの特異的結合を明らかにする物質を選択する工程。モジュレーターは、化合物、タンパク質、ペプチド、核酸、又は抗体であり、及び本願明細書に明らかにされた方法により調製されることが好ましい。
【００２０】
本発明は、昆虫の生存に必須のタンパク質、好ましくはGタンパク質共役型受容体をコードしているヌクレオチド配列を含む、昆虫から単離された核酸分子を提供する。この知識は、新規の殺虫作用様式を提供するために活用されている。本発明の各ヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質の昆虫の成長における重要な役割は、昆虫においてこれらのタンパク質のいずれかひとつの機能を阻害する化学物質は恐らく昆虫に対する有害な作用を有し、及び良好な殺虫剤候補である可能性があることを暗示している。従って必須のヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質は、新規殺虫剤の容易かつ迅速な同定のためにデザインされたアッセイの基礎を提供する。
【００２１】
従って本発明は、それらのインヒビターを同定するために、以下に説明されたヌクレオチド配列のいずれかひとつによりコードされた精製されたタンパク質を用いる方法を提供し、その後これは、望ましくない昆虫の成長を抑制するための殺虫剤として、例えば作物、特に農業的に重要な作物、例えばトウモロコシ並びにコムギ、オート麦、ライ麦、モロコシ、コメ、オオムギ、キビなどの禾穀類、芝及び牧草など、更には綿花、サトウキビ、甜菜、油料種子ナタネ、及びダイズなどが生育する圃場において、使用することができる。
【００２２】
別の局面において、本発明は、殺虫化合物を同定する方法を提供し、これは：(a)偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを、該ポリペプチド結合能について試験される化合物と、結合に役立つ条件下で一緒にする工程；(b)該ポリペプチドに結合する工程(a)において同定された化合物を選択する工程；(c)工程(b)において選択された化合物を、植物へ適用し、殺虫活性について試験する工程；並びに、(d)殺虫活性を有する工程(c)において同定された化合物を選択する工程を含む。好ましくは、このポリペプチドは、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、このポリペプチドは、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、このポリペプチドは、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明は更に、昆虫の成長又は生存を殺傷又は阻害する方法を提供し、これは本方法に従い同定された殺虫化合物を昆虫へ適用するか、又は植物組織へ適用することを含む。
【００２３】
更に別の局面において、本発明は、殺虫性化合物を同定する方法を提供し、これは：(a)偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを、該ポリペプチド活性阻害能について試験される化合物と、阻害に役立つ条件下で一緒にする工程；(b)工程(a)において該ポリペプチドの活性を阻害することが同定された化合物を選択する工程；(c)工程(b)において選択された化合物を昆虫へ適用し、殺虫活性について試験する工程；並びに、(d)工程(c)において殺虫活性を有すると同定された化合物を選択する工程を含む。好ましくは、このポリペプチドは、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも95％同一であるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、このポリペプチドは、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも99％同一であるアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、このポリペプチドは、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明は更に、本方法により同定された殺虫化合物を、昆虫へ適用するか、又は植物組織へ適用することを含む、昆虫の成長又は生存を殺傷又は阻害する方法も提供する。
【００２４】
本発明は更に、偶数番号の配列番号：2-108からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも60％、好ましくは70％、より好ましくは80％、更により好ましくは90％、なお更に好ましくは95％、及び最も好ましくは99〜100％の配列同一性を有するタンパク質の、該昆虫における発現を阻害することを含む、昆虫の成長又は生存を殺傷又は阻害する方法を提供する。
【００２５】
本発明は更に、植物の昆虫加害を予防又は処置する方法を提供し、これは：(a)偶数番号の配列番号：2-108のいずれかひとつとして示された昆虫GPCRのモジュレーターである殺虫組成物を調製する工程；及び、(b)有効量の殺虫組成物を植物と接触し、これにより植物の昆虫加害を予防又は駆除する工程を含む。好ましくは、殺虫組成物は、化合物、タンパク質、ペプチド、核酸、又は抗体を含み、かつ本願明細書に明らかにした方法により調製した。好ましくは、昆虫加害は、昆虫の致死性により駆除される。ひとつの態様において、殺虫組成物は、殺線虫活性も発揮し、その結果有効量の殺虫組成物を植物と接触することは、植物の線虫加害を予防又は駆除する。
【００２６】
本発明は更に、植物の昆虫加害を予防又は駆除する方法を提供し、この方法は：(a)偶数番号の配列番号：2-108のいずれかひとつの昆虫GPCRポリペプチドの活性を変調する昆虫GPCRモジュレーターを植物において発現し、これにより植物の昆虫加害を予防又は駆除する工程を含む。好ましくは、この殺虫組成物は、タンパク質、ペプチド、核酸、又は抗体を含む。ひとつの態様において、殺虫組成物は加えて、殺線虫活性を示し、その結果昆虫GPCRモジュレーターの植物における発現は、植物の線虫加害を予防又は駆除する。本発明は更に、昆虫GPCRモジュレーターを発現し、並びにその結果植物に寄生する線虫加害を阻害することを可能にする、植物、植物組織、植物種子、及び植物細胞を具体化している。
【００２７】
従って本発明の目的は、新規昆虫GPCR核酸及びポリペプチド、並びにそれに関する新規方法を提供することである。本目的は、本発明により全体又は一部が実現される。
本発明の目的は先に説明されており、その他の本発明の目的及び利点は、当業者には、以下の本発明の説明、及び限定のためでない実施例の研究後、明らかとなるであろう。
【００２８】
配列リストの配列の簡単な説明
奇数番号のついた配列番号：1-107は、表1に説明されたGPCRをコードしているヌクレオチド配列である。
偶数番号のついた配列番号：2-108は、直前のヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質配列であり、例えば、配列番号：2は、配列番号：1のヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質であり、配列番号：4は、配列番号：3のヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質であるなどである。
配列番号：109は、オクトパミンフォワード縮重プライマーである。
配列番号：110は、オクトパミンリバース縮重プライマーである。
配列番号：111は、5'RACEプライマーである。
配列番号：112は、3'RACEプライマーである。
【００２９】
表1. 配列リストの要約
【表１】
2005512539.tif 000002
【表２】
2005512539.tif 000003
【００３０】
発明の詳細な説明
I.  定義
下記用語は、当業者には良く理解されていると思われるが、本発明の説明を促進するために、下記の定義を記す。
用語「核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及び一本鎖又は二本鎖型のいずれかのそれらのポリマーを意味する。特に限定しない限りは、この用語は、参照された天然の核酸に類似した特性を有する天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含している。特に別に記さない限りは、特定のヌクレオチド配列は、明白に示された配列に加え、暗にそれらの保存的に修飾された変種(例えば、縮重コドン置換)、相補的配列、部分配列、伸長された配列も包含している。用語「核酸分子」又は「ヌクレオチド配列」は、「遺伝子」、「cDNA」、又は「mRNA」の代わりに使用することもできる。核酸は、あらゆる生物を含む、あらゆる給源に由来することができる。
【００３１】
核酸分子の文脈において使用される用語「単離された」とは、核酸分子が固有の環境から離れて存在し、及び天然の生成物でないことを示す。単離されたDNA分子は、精製された形で存在するか、もしくはトランスジェニック宿主細胞のような固有でない環境で存在することができる。
【００３２】
用語「精製された」は、核酸に適用される場合は、その核酸が、天然の状態ではそれに会合されている他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。好ましくは、精製された核酸分子は、均質な乾燥状態又は水溶液中にある。用語「精製された」は、核酸が、電気泳動ゲルにおいて本質的に1本のバンドを生じることを意味する。特にこれは、核酸が、少なくとも約50％純粋、より好ましくは少なくとも約85％純粋、及び最も好ましくは少なくとも約99％純粋であることを意味する。
【００３３】
用語「実質的に同一」は、ふたつのヌクレオチド配列に関する文脈において、下記の配列比較アルゴリズムのひとつを用いて(見出し「ヌクレオチド及びアミノ酸配列比較」に説明された)又は目視検査により測定するように、比較し及び最大の対応となるように並置する場合に、少なくとも60％、好ましくは約70％、より好ましくは約80％、より好ましくは約90〜95％、及び最も好ましくは約99％のヌクレオチド同一性を有する2種又はそれよりも多い配列又は部分配列を意味する。好ましくは、実質的同一性は、少なくとも50残基のヌクレオチド配列において、より好ましくは少なくとも約100残基のヌクレオチド配列において、より好ましくは少なくとも約150残基のヌクレオチド配列において、及び最も好ましくは完全なコード配列を含むヌクレオチド配列において存在する。ひとつの局面において、多型配列は、実質的に同じ配列であることができる。用語「多型」は、集団における2種又はそれよりも多い遺伝的に決定された代替の配列又はアレルの出現を意味する。アレルの差は、1塩基対と少なくて良い。
【００３４】
ふたつのヌクレオチド配列が実質的に同じであることの別の指標は、これらふたつの分子がストリンジェントな条件下で特異的に又は実質的に互いにハイブリダイズすることである。核酸ハイブリダイゼーションの文脈において、比較されるふたつの核酸配列は、「プローブ」及び「標的」と称することができる。「プローブ」は参照核酸分子であり、及び「標的」は被験核酸分子であり、核酸分子の異種集団において認められることが多い。「標的配列」は、「被験配列」と同義である。
【００３５】
ハイブリダイゼーション試験又はアッセイに使用される好ましいヌクレオチド配列は、本発明の核酸分子の少なくとも約14〜40個のヌクレオチド配列に相補的又は擬態であるプローブ配列を含む。好ましくはプローブは、14〜20個のヌクレオチド、又は望ましいならばそれよりも長い、例えば30、40、50、60、100、200、300、又は500個のヌクレオチド、もしくは配列番号：1-107の奇数番号配列として示されたもののいずれかの完全長までを含む。このような断片は例えば、断片の化学合成による直接合成、核酸増幅技術の適用、又は組換え的産生のための選択された配列の組換えベクターへの導入により、容易に調製することができる。
【００３６】
語句「特異的ハイブリダイズ」は、その配列が複雑な核酸混合物(例えば、総細胞DNA又はRNA)中に存在する場合に、分子の特定のヌクレオチド配列のみへの、ストリンジェントな条件下での結合、二重鎖形成(duplexing)、ハイブリダイゼーションを意味する。
語句「実質的ハイブリダイズ」は、プローブ核酸分子と標的核酸分子の間の相補的ハイブリダイゼーションを意味し、望ましいハイブリダイゼーションを行うためにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低下することにより順応される小さいミスマッチを含んでいる。
【００３７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、サザン及びノーザンブロット分析のような核酸ハイブリダイゼーション実験の文脈においては、配列-及び環境-依存性の両方である。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、Tijssenの著書「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes」(1993)第I部第2章、Elsevier社、ニューヨーク、NYに認められる。一般に、高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件は、規定されたイオン強度及びpHで、具体的配列の融解温度(Tm)よりも約5℃低く選択される。典型的には、「ストリンジェント条件」下で、プローブは、その標的部分配列と特異的にハイブリダイズするが、他の配列とはしないであろう。
【００３８】
Tmは、標的配列の50％が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度(規定されたイオン強度及びpH下で)である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのTmと同じになるよう選択される。約100個よりも多い相補的残基を有する相補的核酸のサザン及びノーザンブロット分析のためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の例は、ヘパリン1mgを含有する50％ホルムアミド中、42℃での一晩のハイブリダイゼーションである。高ストリンジェントな洗浄条件は、0.1xSSC、SM NaCl、65℃で15分間である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、0.2xSSC緩衝液中、65℃で15分間である(SSC緩衝液の説明については、Sambrookら編集、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NYを参照のこと)。高ストリンジェンシー洗浄に先立ち、バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシー洗浄が行われることが多い。約100個よりも多いヌクレオチドの二重鎖形成のための中等度のストリンジェンシー洗浄条件の例は、1xSSC中、45℃で15分間である。約100個よりも多いヌクレオチドの二重鎖形成のための低ストリンジェンシー洗浄の例は、4〜6xSSC中、40℃で15分間である。短いプローブ(例えば、約10〜50個のヌクレオチド)について、ストリンジェント条件は、典型的には、pH7.0〜8.3での、約1M未満のNa+イオン、典型的には約0.01〜1M Na+イオン濃度(又は他の塩)の塩濃度が関与し、並びに温度は典型的には低くとも約30℃である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加により実現することもできる。一般に特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける無関係のプローブについて認められた比よりも2-倍の(又はそれよりも高い)S/N比は、特異的ハイブリダイゼーション検出の指標である。
【００３９】
以下に、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である相同ヌクレオチド配列をクローニングするために使用することができるハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件の例を示す：プローブヌクレオチド配列は好ましくは、標的ヌクレオチド配列と、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、引き続き2xSSC、0.1％SDS中で50℃で洗浄し；より好ましくは、プローブ及び標的配列は、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、1xSSC、0.1％SDS中で50℃で洗浄し；より好ましくは、プローブ及び標的配列は、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、引き続き0.5xSSC、0.1％SDS中で50℃で洗浄し；より好ましくは、プローブ及び標的配列は、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、引き続き0.1xSSC、0.1％SDS中で50℃で洗浄し；より好ましくは、プローブ及び標的配列は、7％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中、50℃でハイブリダイズし、引き続き0.1xSSC、0.1％SDS中で65℃で洗浄する。
【００４０】
ふたつの核酸配列が実質的に同一であることの更なる指標は、これらの核酸によりコードされたタンパク質が、実質的に同じであること、全体の三次構造を共有すること、生物学的機能が同等であること、又は免疫学的に交差反応性であることである。これらの用語は、更に本願明細書において以下に見出し「ポリペプチド」に定義されている。ストリンジェント条件下では互いにハイブリダイズしない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一である場合には、やはり実質的に同一である。このことは、例えばふたつのヌクレオチド配列が、遺伝暗号により許されるように有意に縮重される場合に生じ得る。
【００４１】
用語「保存的に置換された変種」は、1個又は複数の選択された(又は全ての)コドンの第三の位置が、混合型-塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換されている、縮重コドン置換を有する核酸配列を意味する(Batzerら、Nuc Acids Res、19:5081 (1991)；Ohtsukaら、J Biol Chem、260:2605-2608 (1985)；Rossoliniら、Mol Cell Probes、8:91-98 (1994))。
【００４２】
用語「部分配列」は、比較的長い核酸配列の一部を含む核酸の配列を意味する。部分配列の例は、本願明細書において先に説明されたプローブ、又はプライマーである。本願明細書において使用される用語「プライマー」は、選択された核酸分子の、約8個又はそれよりも多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、好ましくは10〜20個のヌクレオチド、及びより好ましくは20〜30個のヌクレオチドを含む連続配列を意味する。本発明のプライマーは、本発明の核酸分子の重合の開始を提供するために十分な長さ及び適当な配列のオリゴヌクレオチドを包含している。
【００４３】
用語「伸長された配列」は、核酸に組込まれた追加のヌクレオチド(又は他のアナログ分子)を意味する。例えば、ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ)は、核酸分子の3'末端に配列を加えることができる。加えてこのヌクレオチド配列は、他のDNA配列、例えばプロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、及び他のコードセグメントなどと組合せることができる。
【００４４】
本願明細書において使用される用語「相補的配列」は、塩基対間に水素結合形成時に、互いに対形成が可能である逆向き平行のヌクレオチド配列を含むふたつのヌクレオチド配列を示す。本願明細書において使用される用語「相補的配列」は、前述の同じヌクレオチド比較により評価することができるように、実質的に相補的であるか、又は本願明細書に説明されたような比較的ストリンジェントな条件下で問題の核酸セグメントとのハイブリダイゼーションが可能であると定義されるようなヌクレオチド配列を意味する。相補的核酸セグメントの具体例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
用語「遺伝子」は、広範に生物学的機能に関連したDNAセグメントを意味する。遺伝子は、コード配列、プロモーター領域、cis調節配列、調節タンパク質の特異的認識配列である発現されないDNAセグメント、遺伝子発現に寄与する発現されないDNAセグメント、望ましいパラメータを有するようにデザインされたDNAセグメント、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない配列を包含している。遺伝子は、生物学的試料からのクローニング、公知又は予想される配列情報を基にした合成、及び存在する配列の組換え逸脱(deviation)を含む、様々な方法により、得ることができる。
用語「遺伝子発現」は、一般に生物学的活性ポリペプチドが、DNA配列から作成される細胞プロセスを意味する。
【００４６】
本発明は、明らかにされたGPCR配列を含むキメラ遺伝子も包含している。本願明細書において使用される用語「キメラ遺伝子」は、GPCRコード配列、アンチセンスRNA分子、ヘアピン構造のような三次構造を有するRNA分子、又は二本鎖RNA分子を作成するヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーター領域を意味する。
【００４７】
本願明細書において使用される用語「機能的に連結された」とは、そのヌクレオチド配列の転写がそのプロモーター領域により制御及び調節されるような方法で、ヌクレオチド配列に連結されているプロモーター領域を意味する。プロモーター領域をヌクレオチド配列へ機能的に連結する技術は、当該技術分野において公知である。
【００４８】
本願明細書において使用される用語「異種遺伝子」、「異種DNA配列」、「異種ヌクレオチド配列」、「外因性核酸分子」又は「外因性DNAセグメント」は、各々意図された宿主細胞に対して外来の給源を起源とする配列、又は同じ給源に由来する場合は、その当初の形が修飾されることを意味する。従って宿主細胞内の異種遺伝子は、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば突然変異誘発もしくは固有のシス調節配列からの単離により修飾されているような遺伝子を含む。これらの用語は、天然のヌクレオチド配列の天然ではなく生じる複数のコピーも含む。従ってこれらの用語は、その細胞に対して外来又は異種であるか、又は細胞に対して同種であるが、しかしそのエレメントが通常認められない宿主細胞核酸内の位置にある、DNAセグメントを意味する。
【００４９】
用語「転写因子」は、一般に、シス調節エレメント及び転写のための細胞成分との相互作用により、遺伝子発現を変調するタンパク質を意味し、これらは、RNAポリメラーゼ、転写関連因子(TAF)、クロマチン-リモデリングタンパク質、及び遺伝子転写に影響を及ぼすいずれか他の関連タンパク質を含む。
【００５０】
本発明は更に、プラスミド、コスミド、及びウイルスベクターを含む、明らかにされた核配列を含んでいるベクターを含む。本願明細書において使用される用語「ベクター」は、適合性のある宿主細胞におけるその複製を可能にする配列を有するDNA分子を意味する。ベクターは、ベクター内のヌクレオチド配列のライゲーションを可能にするヌクレオチド配列も含み、ここでこのようなヌクレオチド配列も、適合性のある宿主細胞において複製される。ベクターは、GPCRポリペプチドの組換え作出を媒介することもでき、これは本願明細書において以下に更に説明される。好ましい宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳類細胞である。
【００５１】
本発明の核酸は、クローニング、合成、組換え的変更、突然変異誘発、又はそれらの組合せを行うことができる。核酸を単離するために使用される標準の組換えDNA及び分子クローニング技術は、当該技術分野において公知である。例証的だが限定しない方法は、Sambrookら編集の「Molecular Cloning」、(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY；Silhavyら、「Experiments with Gene Fusions」、(1984)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY；Sambrook、「Molecular Cloning: a Laboratory Manual」、(2001)(第3版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY；Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、(1992)、John Wylie and Sons社、ニューヨーク、NY；及び、Glover編集、「DNA Cloning: A Practical Approach」、(1985)、MRL Press社、オックスフォード、英国に説明されている。塩基対の変化、欠失、又は小さい挿入を作成するための位置指定突然変異誘発も、刊行物により例証されているので、当該技術分野において公知である。例えば、Adelmanら、DNA、2:183 (1983)；Sambrookら編集、「Molecular Cloning」、(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NYを参照のこと。
【００５２】
本発明の方法により検出された配列は、ジデオキシ法配列決定、PCR、オリゴマー制限(oligomer restriction)(Saikiら、Bio/Technology、3:1008-1012 (1985))、アレル-特異性オリゴヌクレオチド(ASO)プローブ分析(Connerら、Proc Natl Acad Sci USA、80:278 (1983))、及びオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA) (Landgrenら、Science、241:1007 (1988))を含むが、これらに限定されるものではない、特異的DNA配列の検出に通常適用される方法を用い、当該技術分野において公知の測定により、検出され、サブクローニングされ、配列決定され、更に評価される。同じくLandgrenら、Science、242:229-237 (1988)も参照のこと。
【００５３】
本発明により提供されたポリペプチドは、配列番号：2-108の偶数配列に示された単離されたポリペプチド；配列番号：2-108の偶数番号配列と実質的に同一であるポリペプチド；GPCRポリペプチド断片(好ましくは生物学的機能断片、例えば本願明細書に説明したドメイン)、明らかにされたGPCRアミノ酸配列を含む融合タンパク質、生物学的機能アナログ、及び明らかにされたGPCRポリペプチドを特異的に認識する抗体と交差反応するポリペプチドを含む。
【００５４】
ポリペプチドの文脈で使用される用語「単離された」は、ポリペプチドが、その固有の環境から離れて存在し、及び天然の産物ではないことを意味する。単離されたポリペプチドは、精製された形で存在することができ、又は例えば、トランスジェニック宿主細胞のような固有ではない環境に存在することができる。
【００５５】
用語「精製された」は、ポリペプチドに適用される場合は、そのポリペプチドが、天然の状態では会合されている他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。好ましくはポリペプチドは、均質な固形又は水性溶液である。純度及び均質性は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーのような、分析化学技術を用いて決定される。調製物中に主な種として存在するポリペプチドは、実質的に精製される。用語「精製された」は、ポリペプチドが、電気泳動ゲルにおいて、本質的に1本のバンドを生じることを意味する。特にこれは、ポリペプチドが、少なくとも約50％純粋、より好ましくは少なくとも約85％純粋、及び最も好ましくは少なくとも約99％純粋であることを意味する。
【００５６】
2種又はそれよりも多いポリペプチド配列の文脈において用語「実質的に同一」は、約35％、又は45％、又は好ましくは45〜55％、又はより好ましくは55〜65％同一又は機能的同等であるアミノ酸を有するポリペプチド配列として測定される。更により好ましくは、2種又はそれよりも多い「実質的に同一」のポリペプチド配列は、約70％、又はより好ましくは約80％、更により好ましくは約90％、より更に好ましくは約95％、及び最も好ましくは約99％の同一又は機能的に同等であるアミノ酸を有するであろう。％「同一性」及び同一性を決定する方法は、下記の見出し「ヌクレオチド及びアミノ酸配列比較」に定義されている。
【００５７】
実質的に同一ポリペプチドも、保存された三次構造を共有する2種又はそれよりも多いポリペプチドを包含している。コンピュータを使用する方法を用い、構造の描写を比較し、並びに重要な活性部位又はリガンド結合部位の周囲の類似性を確定するために、構造モデルを作成し、容易に調節することができる。Henikoffら、Electrophoresis、21(9):1700-1706 (2000)；Huangら、Pac Symp Biocomput、230-241 (2000)；Saqiら、Bioinformatics、15(6):521-522 (1999)；及び、Barton、Acta Crystallogr D Biol Grystallogr、54:1139-1146 (1998)を参照のこと。
【００５８】
アミノ酸配列の文脈において用語「機能的に同等である」は、当該技術分野において公知であり、及びアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性を基にしている。Henikoff及びHenikoff、Adv Protein Chem、54:73-97 (2000)を参照のこと。考察のための関連因子は、側鎖の疎水性、親水性、電荷及びサイズを含む。例えば、アルギニン、リシン、及びヒスチジンは全て正帯電した残基であり；アラニン、グリシン、及びセリンは全て、同様のサイズであり；並びに、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは全て、概して同様の形状である。この分析により、以下により詳細に説明されるように、アルギニン、リシン及びヒスチジン；アラニン、グリシン、及びセリン；並びに、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン；は、本願明細書において、生物学的機能が同等であるとして定義されている。
【００５９】
生物学的機能が同等であるアミノ酸置換の作成において、アミノ酸の疎水親水度指数を考慮することができる。各アミノ酸には、それらの疎水性及び帯電特性を基に、疎水親水度指数が割当てられており、これらは：イソロイシン(+4.5)；バリン(+4.2)；ロイシン(+3.8)；フェニルアラニン(+2.8)；システイン(+2.5)；メチオニン(+1.9)；アラニン(+1.8)；グリシン(-0.4)；トレオニン(-0.7)；セリン(-0.8)；トリプトファン(-0.9)；チロシン(-1.3)；プロリン(-1.6)；ヒスチジン(-3.2)；グルタミン酸(-3.5)；グルタミン(-3.5)；アスパラギン酸(-3.5)；アスパラギン(-3.5)；リシン(-3.9)；及び、アルギニン(-4.5)である。
【００６０】
タンパク質に対し双方向型の生物学的機能を付与するアミノ酸疎水親水度指数の重要性は、当該技術分野において一般に理解されている(Kyteら、J Mol Biol、157:105 (1982))。ある種のアミノ酸は、同様の疎水親水度指数又はスコアを有する他のアミノ酸と置換され、かつ依然同様の生物学的活性を維持することはわかっている。疎水性親水性指標を基に変化が生じることにおいて、疎水親水度指数が当初の値の±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、当初の値の±1以内であるものが特に好ましく、及び当初の値の±0.5以内であるものがなお一層特に好ましい。
【００６１】
当該技術分野において、アミノ酸のような置換は、親水性を基に効果的に行うことができることも理解されている。米国特許第4,554,101号は、タンパク質の最大の局所的平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性により支配されるので、これはその免疫原性及び抗原性と、例えば、タンパク質の生物学的特性と、相関していることを開示している。アミノ酸は、同様の親水値を有する別のものと置換することができ、依然生物学的に同等であるタンパク質を得ることが理解されている。
【００６２】
米国特許第4,554,101号に開示されたように、下記の親水値が、アミノ酸残基に割当てられている：アルギニン(+3.0)；リシン(+3.0)；アスパラギン酸(+3.0±1)；グルタミン酸(+3.0±1)；セリン(+0.3)；アスパラギン(+0.2)；グルタミン(+0.2)；グリシン(0)；トレオニン(-0.4)；プロリン(-0.5±1)；アラニン(-0.5)；ヒスチジン(-0.5)；システイン(-1.0)；メチオニン(-1.3)；バリン(-1.5)；ロイシン(-1.8)；イソロイシン(-1.8)；チロシン(-2.3)；フェニルアラニン(-2.5)；トリプトファン(-3.4)。
同様の親水値を基に変化が生じる場合、その親水値が当初の値の±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、当初の値の±1以内であるものが特に好ましく、当初の値の±0.5以内であるものが更により特に好ましい。
【００６３】
本発明は、GPCRポリペプチド断片又はGPCRポリペプチドの機能的部分も包含している。このような機能的部分は、未変性のGPCR遺伝子産物のアミノ酸配列の全て又は実質的に全てを含む必要はない。用語「機能的」は、免疫原性を含むGPCRの生物学的活性又は特徴を含む。
【００６４】
本発明は、GPCRポリペプチドのより長い配列、又はそれらの一部も含む。例えば、1種又は複数のアミノ酸は、GPCRポリペプチドのN-末端又はC-末端に添加することができる。GPCRポリペプチド配列を含む融合タンパク質も、本発明の範囲内で提供される。このようなタンパク質の調製法は当該技術分野において公知である。
【００６５】
本発明は、GPCRポリペプチドの機能的アナログも包含している。機能的アナログは、GPCRポリペプチドと少なくとも1種の生物学的機能を共有している。例証的機能は免疫原性である。本願明細書で使用されるように、アミノ酸配列の文脈において、生物学的に機能性のアナログは、ある種のアミノ酸であるが、しかしほとんど又は全てではないアミノ酸が置換されているペプチドである。機能的アナログは、対応する核酸分子のレベルで、このような配列を望ましいアミノ酸変化をコードするように変更することで、作出することができる。ひとつの態様において、変化は、ポリペプチドの生物学的機能を改善するため、例えばポリペプチドの抗原性を改善するために導入することができる。別の態様において、GPCRポリペプチド配列は、変異体GPCRポリペプチドの活性を評価するために変動される。
【００６６】
本発明は、明らかにされたGPCRポリペプチドの組換え的作出も包含している。簡単に述べると、GPCRポリペプチドをコードしている核酸配列、又はそれらの一部を、発現カセットへクローニングし、このカセットを、宿主生物へ導入し、そこでこれが組換え的に作出される。
【００６７】
本願明細書において使用される用語「発現カセット」は、適当な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することが可能なDNA配列を意味し、終結シグナルに機能的に連結された関心のあるヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む。典型的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も含む。関心のあるヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであることができる。この発現カセットは、天然のものであることができるが、異種発現に有用な組換え型で得ることもできる。
【００６８】
発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された場合にのみ転写を開始する構成的プロモーター又は誘導的プロモーターの制御下であることができる。例証的プロモーターは、シミアンウイルス40初期プロモーター、レトロウイルス由来の長い縦列配列(LTR)(long terminal repeat)プロモーター、actionプロモーター、熱ショックプロモーター、及びメタロチオネインタンパク質である。多細胞生物の場合、プロモーター及びプロモーター領域は、特定の組織もしくは臓器又は発達段階へ発現を指示することができる。使用することができる適当な発現ベクターは、下記のベクター又はそれらの誘導体を含むが、これらに限定されるものではない：ワクシニアウイルス又はアデノウイルス、バキュロウイルスなどの、ウイルスのベクター、酵母ベクター、バクテリオファージベクター(例えばλファージ)、プラスミド及びコスミドDNAベクター、並びにトランスポゾン-媒介型形質転換ベクター。
【００６９】
本願明細書において使用される用語「宿主細胞」は、その中に異種核酸分子が導入される細胞を意味する。形質転換された細胞、組織、又は生物は、形質転換プロセスの最終生成物のみではなく、それらのトランスジェニック後代も包含すると理解される。
【００７０】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を変調するか、又は望ましい特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングするものが選択される。例えば様々な宿主細胞が、翻訳及び翻訳後プロセシング及び修飾に関する特徴的及び特異的機構を有する(例えば、タンパク質のグリコシル化、リン酸化)。適当な細胞株又は宿主システムを、発現された外来タンパク質の望ましい修飾及びプロセシングを確実にするために選択することができる。細菌システムにおける発現を用い、グリコシル化されないコアタンパク質産物を作成することができる。酵母における発現は、グリコシル化された産物を作出するであろう。昆虫細胞における発現を用い、異種タンパク質の「固有の」グリコシル化を確実にすることができる。
【００７１】
発現構築体は、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、DEAEデキストラントランスフェクション、リポソーム-媒介型トランスフェクション、トランスポゾン-媒介型形質転換及びレトロウイルスを用いる感染を含む、いずれか標準の方法で宿主細胞へトランスフェクションされる。発現構築体中に保持されるGPCR-コードしているヌクレオチド配列は、宿主ゲノムへ安定して組込むことができ、又はこれは染色体外分子として存在することができる。
【００７２】
単離されたポリペプチド及び組換えにより作出されたポリペプチドは、当業者に公知の様々な標準技術を用い、精製及び特徴決定することができる。例えば、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」(1992)、John Wylie & Sons社、ニューヨーク、NY；Bodanszkyら、「Peptide Synthesis」(1976)、John Wiley and Sons社、第2版、ニューヨーク、NY；並びに、Zimmerら、「Peptides」(1993)、393-394頁、ESCOM Science Publishers、B. V.社を参照のこと。
【００７３】
I.C.  ヌクレオチド及びアミノ酸配列比較
2種又はそれよりも多いヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」又は％「同一性」は、本願明細書に説明された配列比較アルゴリズムのひとつを用いるか又は目視による検査により測定し、最大の対応となるように比較及び並置した場合に、同じであるか、又は同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定の％で有するような、2種又はそれよりも多い配列又は部分配列を意味する。
【００７４】
ヌクレオチド又はポリペプチド配列に関して用語「実質的に同一」とは、特定の配列が1種又は複数の欠失、置換又は付加により天然の配列のその配列から変動し、その正味の作用は、天然の遺伝子、遺伝子産物、又は配列の生物学的活性の少なくとも一部が維持されることを意味する。このような配列は、「変異体」配列、又は生物学的活性はある程度変更されたが当初の生物学的活性の少なくとも一部は維持されているような配列を含む。本願明細書において使用される用語「天然の」とは、人工的に作出されることと区別して自然状態において認めることができる組成物を説明するために使用される。例えば、自然状態の給源から単離され及び実験室において人工的に意図的に修飾されていないような、生物に存在するタンパク質又はヌクレオチド配列は、天然である。
【００７５】
配列比較に関して、典型的にはひとつの配列が、それと被験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験及び参照配列は、コンピュータプログラムへエントリーされ、部分配列座標(coordinate)が、必要ならば指定され、かつ配列アルゴリズムプログラムのパラメータが選択される。その後配列比較アルゴリズムは、指定された被験配列(複数)について、参照配列に対し、選択されたプログラムパラメータを基に、％配列同一性を計算する。
【００７６】
配列比較のための最適アラインメントを、例えばSmith及びWaterman、Adv Appl Math、2:482 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムにより、Needleman及びWunsch、J Mol Biol 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、Pearson及びLipman、Proc Natl Acad Sci USA、85:2444-2448 (1988)の類似性検索法により、これらのアルゴリズム(GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、これらはWisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、マジソン、WIに含まれる)のコンピュータによる実行により、又は目視による検査により行うことができる。全般的には、Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、(1992)、John Wylie & Sons社、ニューヨーク、NYを参照のこと。
【００７７】
％配列同一性及び配列類似性を決定するための好ましいアルゴリズムは、BLASTアルゴリズムであり、これはAltschulら、J Mol Biol、215:403-410 (1990)に説明されている。BLAST解析のためのソフトウェアは、米国立医学図書館生物工学情報センター(NCBI)から、公に入手可能である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。このアルゴリズムは、最初に問合せ配列において長さWの短いワードを確定することにより高スコア配列対(HSP)を確定することに関与しており、これは、データベース配列中の同じ長さのワードを並置した場合に、いくつかの正値の閾値スコアTを一致するか又は満足する。Tは、隣接ワードスコア閾値と称される。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見つけ出すために検索を開始するための種として作用する。次にワードヒットは、累積(cumulative)アラインメントスコアが増大し得る限りは、各配列に沿い両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM(マッチする残基対に関するリウォードスコア；常に＞0)及びN(ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜0)を用いて算出される。アミノ酸配列について、スコアマトリックスを用い、累積スコアを算出する。各方向のワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Xだけ低下した場合に中断され、この累積スコアは、1個又は複数の負の-スコア化残基アラインメントの蓄積、又はいずれかの配列末端に到達したために、ゼロ以下になる。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとして、ワードレングスW＝11、期待値E＝10、カットオフ100、M＝5、N＝-4、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワードレングス(W)3、期待値(E)10、及びBLOSUM62スコアマトリックスを使用する。Henikoff及びHenikoff、Proc Natl Acad Sci USA、89:10915 (1989)参照のこと。
【００７８】
BLASTアルゴリズムは、％配列同一性の計算に加え、ふたつの配列間の類似性の統計解析も行う。例えばKarlin及びAltschul、Proc Natl Acad Sci USA、90:5873-5887 (1993)参照。BLASTアルゴリズムにより提供された類似性のひとつの測定は、最小和尤度(P(N))であり、これはふたつのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる尤度の指標を提供する。例えば、試験核酸配列の参照核酸配列との比較において最小和尤度が、約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、及び最も好ましくは約0.001未満である場合に、試験核酸配列は参照配列に類似しているとみなされる。
【００７９】
I.D.  抗体
本発明の昆虫GPCRポリペプチドに特異的に結合する抗体も提供される。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、及びFab発現ライブラリーを含む、免疫グロブリンタンパク質、又はそれらの機能的部分を意味する。「機能的部分」は、関心のある分子に結合するタンパク質の一部を意味する。好ましい態様において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。抗体を調製及び特徴決定する技術は、当該技術分野において公知である。例えば、Harlow及びLane、「Antibodies: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY、(1988)参照のこと。本発明のモノクローナル抗体は、米国特許第4,196,265号に開示されたハイブリドーマ技術、及び米国特許第5,260,203号に開示されたファージディスプレイ技術のような、周知の技術を使用することにより容易に調製することができる。
【００８０】
語句「抗体への特異的(又は選択的)結合」もしくは「特異的(又は選択的)免疫反応性」は、タンパク質又はペプチドについて言及される場合、タンパク質及び他の生物学的材料の異種集団内のタンパク質の存在を決定する結合反応を意味する。従って指定されたイムノアッセイ条件下で、指定された抗体は、特定のタンパク質と結合し、かつ試料中に存在する他のタンパク質との有意な結合を示さない。このような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に関するその特異性を基に選択される抗体を必要とすることができる。例えば、本発明の核酸配列のいずれかによりコードされたアミノ酸配列を伴うタンパク質に対し生じた抗体は、そのタンパク質と特異的に免疫反応性であり及び無関係のタンパク質とはそうでない抗体を得るために選択することができる。
【００８１】
抗体、特にモノクローナル抗体、より詳細には単鎖モノクローナル抗体を作出するための分子クローニング法の使用も提供される。単鎖抗体の作成は、当該技術分野において説明されている。例えば、米国特許第5,260,203号を参照のこと。この方法について、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーが、免疫処置した動物の脾臓から単離されたRNAから調製され、並びに適当な抗体を発現しているファージミドは、そのポリペプチドを発現している組織上にパンニングすることにより選択される。この方法の従来のハイブリドーマ技術に勝る利点は、およそ104倍と多くの抗体を、1回のラウンドで作成及びスクリーニングすることができ、並びに新規特異性が、単鎖の重鎖(H)及び軽鎖(L)の組合せにより作成され、これは更に適当な抗体を見つける機会を増加することである。従って、本発明の抗体、又は本発明の抗体の「誘導体」は、本願明細書に説明された抗体の可変領域の軽鎖及び重鎖凝集体の結合特異性及び親和性と実質的に同一の結合特異性及び親和性を有する単独のポリペプチド鎖結合分子に関する。
【００８２】
本願明細書において使用される用語「免疫化学反応」は、特定のタンパク質に特異的に結合した抗体を検出するために使用される様々なイムノアッセイ様式のいずれかを意味し、これはラジオイムノアッセイ、ELISA(固相酵素免疫測定)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(例えば、コロイド状金、酵素又は放射性同位元素標識を使用する)、ウェスタンブロット分析、沈降反応、凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ)、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイなどのような技術を使用する競合的及び非-競合的アッセイシステムを含むが、これらに限定されるものではない。免疫アッセイの様式及び条件の説明については、Harlow及びLane、「Antibodies: A Laboratoryy Manual」、(1988)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NYを参照のこと。
【００８３】
I.E.  変調化合物
用語「アゴニスト」は、本願明細書を通じ、本発明の受容体のいずれかの活性を増大するペプチド又は非-ペプチジル化合物を示すように使用される。用語「アンタゴニスト」は、本願明細書を通じ、本発明の受容体のいずれかの活性を低下するペプチド又は非-ペプチジル化合物を示すように使用される。
【００８４】
I.F.  トランスジェニック生物
本発明の核酸配列を含む導入遺伝子を発現するためにトランスジェニック生物を調製することも本発明の範囲内である。用語「トランスジェニック生物」は、異種核酸の生殖細胞系挿入断片を含む生物を示す。トランスジェニック生物は、動物又は植物であることができる。本発明のトランスジェニック生物は、形質転換法の最終産物のみではなく、それらのトランスジェニック後代も包含することが理解される。
【００８５】
本願明細書において使用される用語「導入遺伝子」は、宿主細胞に形質転換されている異種核酸分子を意味する。トランスジェニック生物の作出における意図された使用について、導入遺伝子は、相同的組換え事象を媒介するために導入遺伝子組込みの選択された遺伝子座又は部位に、宿主生物のゲノム配列を含むことができる。導入遺伝子は更に、例えば、各々本願明細書に先に定義したような、遺伝子座内に存在する遺伝子の標的化された修飾、レポーター遺伝子、又は発現カセットなどの、関心のある核酸配列を含む。
【００８６】
II.  Gタンパク質共役型受容体
II.A.  保存された特徴
GPCRは、配列相同性を基に5種の異なるクラスに小分類することができ、かつそれらのリガンドに従い命名される(www.gpcr.org参照)。クラスA GPCRは、時に「ロドプシン様」受容体と称され、これは、特にドパミン及びオクトパミンなどのアミン受容体、ペプチド受容体、ロドプシン、嗅覚受容体及びヌクレオチド-様受容体を含む。クラスB GPCRは、「セクレチン」様として知られており、カルシトニン、利尿ホルモン及びセクレチンの受容体、更にはその他のものを含む。ラトロフィリン及びメトセラも、クラスB受容体である。クラスC受容体又は「代謝共役型グルタミン酸／フェロモン」群は、代謝共役型グルタミン酸受容体、細胞外カルシウム感受性受容体、及びGAGA-B受容体を含む。クラスD及びEは、はるかに小さく、各々、「真菌フェロモン」及び「CAMP受容体」群である。
【００８７】
II.B.  新規昆虫Gタンパク質共役型受容体の同定
本発明は、新規ショウジョウバエ、タバコガ(Heliothis)及びスズメガ(Manduca)のGPCR核酸及びポリペプチド配列を提供する。好ましくは、本発明のショウジョウバエ、タバコガ又はスズメガGPCR核酸分子は、配列番号：1-119の奇数番号配列のいずれかひとつに示された配列；又は、配列番号：1-119の奇数番号配列のいずれかひとつと実質的に同一である核酸分子を含む。同じく好ましくは、本発明のGPCRポリペプチドは、配列番号：2-120の偶数番号配列のいずれかひとつに示されたアミノ酸配列；又は、配列番号：2-120の偶数番号配列のいずれかひとつと実質的に同一であるポリペプチドを含む。
【００８８】
新規ショウジョウバエタンパク質を同定するために、予測タンパク質のデータベース(本願明細書において「GeneMarkデータベース」と称す)は、GeneMarkプログラム(Borodovsky及びMclninch、Computers & Chemistry、17:123-133 (1993))、及びCelera社(ロックビル、MD)が作成した鋳型50キロベースのゲノム配列スカフォールドを用い集成した。別のタンパク質推定プログラムを用いCelera社により作成された第二の予測タンパク質データベースも、使用した(本願明細書において「Celeraデータベース」と称す)。
【００８９】
クラスAの全ての亜-範疇を表わしている脊椎動物(ヒト又はマウスのいずれか)由来の11種のクラスA GPCRを、GeneMarkデータベース及びCeleraデータベースのBLAST検索に使用した。12種のクラスB及び2種のクラスC GPCRも、同じデータベースのBLAST検索に使用した。BLAST検索の結果を検証し、及びGPCRであると推定されたタンパク質を同定した。次に細胞質ループ2(cytoplasmic loop two)の高度に保存された領域を用い、クラスA及びクラスBについて隠れマルコフモデル(HMM)プロファイルを作成し、このプロファイルHMMを用い、GeneMark及びCeleraデータベースに問合わせし、脊椎動物ホモログを有さないショウジョウバエGPCRを同定した。各新規ショウジョウバエGPCRに関するGeneMark及びCeleraタンパク質予測は、GenBankの非-重複(redundant)セットに対してBLASTED検索を行った。より低いE-値スコアによる予測を同定し、クローニングをベースにした予測であると判断した。
【００９０】
引き続き、対応する遺伝子を、実施例2に説明されたようにクローニングした。
新規ショウジョウバエGPCR配列は、表2に示した最も密接に関連したGPCRに従い命名した。
【００９１】
表2：新規ショウジョウバエGタンパク質共役型受容体のBLAST解析
【表３】
2005512539.tif 000004
【表４】
2005512539.tif 000005
【表５】
2005512539.tif 000006
【表６】
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【００９２】
I.C.  タバコガGタンパク質共役型受容体の同定
オオタバコガ(Heliothis virescens)(以後「タバコガ(Heliothis)」と称す)GPCR配列は、実施例3に説明したように、ショウジョウバエGPCR配列に従いデザインされた縮重プライマーを用いるPCRにより得た。この方法に由来したタバコガGPCR断片は、重複する配列の認識により集成した。タバコガGPCRは、最も密接に関連した昆虫GPCRを基に命名した(表3)。
【００９３】
表3：タバコガGPCRのBLAST結果
【表７】
2005512539.tif 000008
【００９４】
II.D.  タバコスズメガ(Manduca Sexta)GPCRの同定
本願明細書に説明された利尿ホルモンGPCRの核酸及びタンパク質を、J.D. Reaganの論文(J. Biol. Chem.、269(1):9-12 (1994))により、同定し及びクローニングした(GenBank寄託番号U03489、以後両方共参照として組込まれる)。BLAST結果は、下記表4に示した。
【００９５】
表4：スズメガGPCRのBLAST解析
【表８】
2005512539.tif 000009
【００９６】
III.  Gタンパク質共役型受容体の機能分析
多くの害虫が、幼虫期の摂食活動により、植物への損傷を加害する。従って、幼虫発生期のGPCR変調に関連した表現型を評価するための機能分析を用い、候補殺虫剤標的を同定することができる。本発明は、その調節が幼虫生存度に関連しているGPCRを明らかにしている。従って、以下に説明された遺伝子操作から生じる変化に類似した方法でGPCR活性を変更するモジュレーターは、殺虫剤組成物として有用であることができる。
【００９７】
III.A.  機能喪失分析
RNA-干渉(RNAi)は、多くの生物の遺伝子機能を決定するために最近発見された方法であり、ここで二本鎖RNA(dsRNA)は、遺伝子-特異的、転写後サイレンシングを示す。例えば、Kuwabara及びOlson、Parasitol Today、16(8):347-349 (2000)；Bass、Cell、101(3):235-238 (2000)；Hunter、Curr Biol、10(4):R137-140 (2000)；Bosher及びLabouesse、Nat Cell Biol、2(2):E31-36 (2000)；Sharp、Genes Dev、13(2):139-141 (1999)参照。二本鎖RNA分子は、in vitro合成することができ、次に注入又は他の方法により生物へ導入される。あるいは、二回転対称を示す遺伝可能な(heritable)導入遺伝子は、ヘアピン構造のように折り畳まれる転写産物を提供する。ショウジョウバエにおいてdsRNAiを用い遺伝子機能を試験する方法は、実施例4に明らかにされており、更に、Kennerdell及びCarthew、 Nat Biotech、18(8):896-898 (2000)；Lam及びThummel、Curr Biol、10(16):957-963 (2000)；Misquitta及びPaterson、Proc Natl Acad Sci USA、96(4):1451-1456 (1999)に記されている。
【００９８】
本発明は、ショウジョウバエGPCRのRNA-干渉を明らかにしている。実施例4に説明されたように、各GPCR配列に相補的である二本鎖RNAは、in vitroにおいて合成され、ショウジョウバエ初期胚へ注入される。注入された胚の発生は、下記表5に示したような、スコア化により評価した：(a)光学顕微鏡を用いる形態学的判定基準(Cameos-Ortega及びHartenstein、「The Embryonic Development of Drosophila melanogaster」(1985)、Springer-Verlag、ベルリン)、(b)幼虫へ孵化している胚、(c)蛹殻形成、及び(d)成虫ハエとしての蛹の羽化。緩衝液-注入胚は、対照として平行して注入し及びモニタリングした。成体期まで生存しているdsRNAが注入された胚の割合(％)を、表5に示した。
【００９９】
表5.：dsRNAi分析の結果
【表９】
2005512539.tif 000010
【０１００】
GPCR機能喪失により生じる致死性は、所定の受容体と特異的に結合するアンタゴニスト物質の供給により模倣されていると推定される。GPCRアンタゴニストは、当該技術分野において公知の方法により同定され、本発明の以下の見出し「昆虫GPCRモジュレーターの同定」に更に説明されている。GPCR、特に本願明細書において最初に説明されているラトロフィリンの不可欠性は、GPCR及びラトロフィリンの殺虫剤としての活性をブロック又は緩和するアンタゴニストの利用性を同定している。
【０１０１】
III.B.  機能獲得分析
古典的機能喪失遺伝が直接的でない場合に、異所性発現システムを用い、遺伝子機能が解明されている。例えば、非筋肉性ミオシンII調節軽鎖をコードしているソウメンウリ(spaghetti squash)の熱で誘導された発現は、ソウメンウリ変異体の初期致死性を効果的に救済することができ、発生後期の表現型の分析を促進する(Edwards及びKiehart、Development、122:1499 (1996))。同様に、関心のある遺伝子の過剰発現により作出されたドミナントな表現型を用い、特に遺伝子変異が胚性致死性を生じる場合に、後胚遺伝子機能に対処する。例えばLamら、Dev Biol、212(1):204-216 (1999)；Woodardら、Cell、79(4):607-615 (1994)を参照のこと。
【０１０２】
ショウジョウバエにおける異所性発現のためのトランスジェニック法は、関心のある遺伝子の構成的又は調節された発現のいずれかを駆動するプロモーターを利用する。異所性発現のためにデザインされた構築体は、形質転換ベクターにおいて調製することができ、及び生殖系列形質転換によりハエゲノムに導入される。トランスジェニック系列が確立され、及び関心のある遺伝子の異所性発現を、野生型又は変異型遺伝子バックグラウンドにおいて分析することができる。
【０１０３】
ひとつの態様において、熱ショックプロモーターを用い、時間的に遺伝子発現を調節する(Lisら、Cell、35:403 (1983)；Struhl、Nature、318:677 (1985)；Schneuwlyら、Nature、325:816 (1987))。この方法を使用し、異所性遺伝子発現のレベルは、熱処理の温度及び／又は期間を変更することにより、容易に変調することができる。別の態様において、遺伝子発現は、本質的にBrand及びPerrimonの論文(Development、118:401 (1993))に記されている、GAL4-UASシステムにより、時間的又は空間的に調節してもよい。
【０１０４】
GPCRの過剰発現は、活性化されたGPCRの役割を明らかにすることができる。リガンド及び／又はアポ-受容体(リガンドに結合されていない受容体)の供給は、リガンド化された受容体の形成にとって好ましい。同様に、過剰なGPCR過剰発現の供給も、活性受容体の過剰につながる。例えば、Tsaiらの著書、Wilsonら編集、「Williams Textbook of Endocrinology」(1998)、55-94頁、W.B. Saunders社、フィラデルフィア、PAを参照し、これは本願明細書に参照として組入れられている。この状況をin vivoにおいて作出するために、GPCRは、異種導入遺伝子を用いて過剰発現される。この戦略は、リガンドは依然同定されていないオーファンGPCRの機能的評価を可能にする。GPCR過剰発現後に認められた表現型は、内因性リガンドの異常に上昇したレベルにより、又はGPCRアゴニストの投与によっても作成されると予想される。
【０１０５】
III.C.  GPCRの発現パターン分析
遺伝子が発現されている特定の細胞の同定は、機能の決定及びその遺伝子の殺虫剤標的としての認識を助ける。幼虫の成虫原基又は成体動物において唯一機能を有する脳視葉のような、幼虫成長又は生存に必要な組織は、必須でない組織よりも、より良い殺虫剤作用部位を示している。
【０１０６】
GPCRの組織特異的発現は、mRNA転写産物の局在化の試験、又はその後のタンパク質それ自身の発現の試験のいずれかにより決定される。どの組織において遺伝子転写産物が発現されているかを決定するために、多くの方法が当該技術分野において利用可能であり、これは以下を含むが、これらに限定されるものではない：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(rtPCR)、ノーザンブロット及びin situハイブリダイゼーション。同様にタンパク質局在化法は、当該技術分野において公知であり、かつこれはウェスタンブロット又は免疫細胞学を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０７】
本発明は、in situハイブリダイゼーションにより、昆虫GPCRの発現パターンを開示している。野生型キイロショウジョウバエ(OreR系)の胚及び移動する(wandering)3齢幼虫が、in situハイブリダイゼーションのためにプロセシングされる。胚は、Berleley Drosophila Genome Projectのウェブサイト(http://www.fruitfly.org/about/methods/RNAinsitu.html)に認められる手法に従いプロセシングされる。幼虫は、切断され、及び胚と同じ方法でプロセシングされる。各遺伝子の標識されたアンチセンス鎖を表わすハイブリダイゼーションプローブが作成され使用される。ハイブリダイゼーション後、結合したプローブは、比色基質により同定される。そのシグナルの位置は更に、化合物顕微鏡試験のための組織の切開及び包埋により特徴決定される。発現パターン分析の結果は、実施例5及び表6に説明されている。
【０１０８】
IV.  昆虫Gタンパク質共役型受容体の組換え発現
宿主生物における本発明のタンパク質の組換え産生に関し、このタンパク質をコードしているヌクレオチド配列は、選択された宿主のためにデザインされた発現カセットに挿入され、及びそこで組換え的に産生される宿主に導入される。選択された宿主にとって適切なプロモーター、シグナル配列、5'及び3'非翻訳配列、並びにエンハンサーのような、特異的調節配列の選択は、当該技術分野の通常の技術レベル以内である。適当なリーディングフレームに連結している個別のエレメントを含む得られる分子は、宿主細胞への形質転換が可能なベクターへ挿入される。
【０１０９】
発現構築体は、選択された宿主にとって適した標準の方法により、宿主細胞へトランスフェクションすることができ、これは電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、DEAE-デキストラントランスフェクション、リポソーム-媒介したトランスフェクション、レトロウイルスを用いる感染、トランスポゾン-媒介した転移、及び遺伝子銃技術を含む。発現構築体内に保持される発現カセット配列は、安定して宿主ゲノムへ組込まれるか、又はこれは染色体外分子として存在することができる。
【０１１０】
タンパク質の組換え産生に関する適当な発現ベクター及び方法は、大腸菌、酵母、及び昆虫細胞などの宿主生物について知られている。例えば、Lucknow及びSummers、Bio/Technol、6:47 (1988)を参照のこと。大腸菌における昆虫GPCR組換え産生の代表的方法は、実施例6に明らかにされている。
【０１１１】
追加の適当な発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクター、例えば、Autographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)のゲノム由来のものがある。好ましいバキュロウイルス/昆虫システムは、PVL1392/PVL1393であり、線状Autographica californicaバキュロウイルスDNA(Pharmingen社、サンディエゴ、CA)の存在下での、Spodoptera frugiperda (SF9)細胞のトランスフェクションのために使用される。得られるウイルスは、HighFive Tricoplusia ni細胞(Invitrogen社、カールスバッド、CA)を感染するために使用される。昆虫細胞における昆虫GPCRの組換え作成の代表的方法は、実施例7に明らかにされている。
【０１１２】
組換え的に産生されたタンパク質は、様々な標準的技術を用い、単離及び精製することができる。使用される実際の技術は、使用される宿主生物、そのタンパク質が分泌されるようにデザインされるかどうか、及びその他のそのような要因によって変動する。このような技術は、当業者に公知である。Ausubelらの、「Current Protocols in Molecular Biology」、(1992)、John Wylie and Sons社、ニューヨーク、NYを参照のこと。
本発明は更に、本願明細書における以下の見出し「トランスジェニック植物」に更に説明されているような、植物における、明らかにされた昆虫GPCR、又はそれらの一部の組換え発現を包含している。
【０１１３】
V.  昆虫Gタンパク質共役型受容体に対する抗体産生
別の局面において、本発明は、昆虫GPCRポリペプチドに対し免疫反応性である抗体を産生する方法を提供し、この方法は、抗原として使用される昆虫GPCRポリペプチド又はその一部を組換え又は合成により作成する工程を含む。昆虫GPCRポリペプチドは、効果的免疫原として使用することができるように、配合される。動物は、配合された昆虫GPCRポリペプチドで免疫処置され、動物における免疫応答を生じる。この免疫応答は、動物の血清から収集することができる抗体の産生により特徴づけられる。任意に、昆虫GPCR抗体を産生する細胞は、メラノーマ細胞と融合することができ、これによりモノクローナル抗体が選択される。昆虫GPCRタンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生する例証的方法は、当業者が入手できる標準の実験プロトコールマニュアルに記載されている。この方法の好ましい態様は、配列番号：2-120の偶数番号配列のいずれかひとつとして示されたポリペプチドを使用する。
【０１１４】
本発明は更に、本願明細書に説明したような抗体及びモノクローナル抗体を産生する細胞株も包含している。
前述の抗体を、本発明の昆虫GPCRポリペプチド配列の局在化及び活性に関連している、当該技術分野において公知の方法、例えば、昆虫GPCR核酸のクローニング、昆虫GPCRポリペプチドの免疫精製、生物学的試料中の昆虫GPCRポリペプチドの作像、及び適当な生物学的試料中のそれらのレベルの測定などにおいて使用することができる。
【０１１５】
VI.  昆虫受容体核酸の検出法
本発明の別の局面において、昆虫GPCRポリペプチドをコードしている核酸分子を検出する方法が提供される。このような方法を用い、昆虫GPCR遺伝子変種及び関連した耐性遺伝子配列を検出することができる。明らかにされた方法は、遺伝子型タイピング、クローニング、遺伝子マッピング、及び遺伝子発現試験を促進する。
【０１１６】
本発明の核酸を用い、明らかにされた配列を含む遺伝子及びゲノムDNAをクローニングすることができる。あるいは本発明の核酸を用い、関連した配列を含む遺伝子及びゲノムDNAを、好ましくは害虫及び線虫におけるGPCR遺伝子をクローニングすることができる。本願明細書において明らかにされた核酸配列を使用するこのような方法は、当業者に公知である。例えばSambrookら編集の「Molecular Cloning」、(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NYを参照のこと。代表的方法は、実施例2及び3にも明らかにされている。好ましくは、この方法で使用される核酸は、配列番号：1-107の奇数番号配列のいずれかひとつとして示された配列を含む。
【０１１７】
ひとつの態様において、本発明の核酸分子を基にした遺伝アッセイを用い、多くのPCR-ベースの技術により、遺伝的変種をスクリーニングすることができ、これは一本鎖コンホメーション多型(SSCP)分析(Oritaら、Proc Natl Acad Sci USA、86(8):2766-2770 (1989))、SSCP／ヘテロ二重鎖分析、酵素ミスマッチ切断、増幅されたエキソンの直接配列分析(Kestilaら、Mol Cell、1(4):575-582 (1998)；Yuanら、Hum Mutat、14(5):440-446 (1999))、アレル特異的ハイブリダイゼーション(Stonekingら、Am J Hum Genet、48(2):370-82 (1991))、及び特異的変異を含む増幅されたゲノムDNAの制限分析などがある。自動化された方法も、一塩基多型の大規模特徴決定に適用することができる(Brookes、Gene、234(2):177-186 (1999)；Wangら、Science、280(5366):1077-1082 (1998))。好ましい検出法は、非-電気泳動的であり、例えば、TaqMan(商標)対立遺伝子差別アッセイ、PCR-OLA、分子ビーコン、パドロック(padlock)プローブ、及びウェル蛍光がある。Landegrenら、Genome Res、8:769-776 (1998)参照。
【０１１８】
VII.  昆虫Gタンパク質共役型受容体ポリペプチドの検出法
本発明の別の局面において、昆虫GPCRポリペプチドを特異的に認識する抗体又はその一部を使用し、昆虫GPCRポリペプチドのレベルを検出する方法が提供される。好ましい態様において、実験対象及び対照対象由来の生物学的試料を得、並びに各試料において昆虫GPCRポリペプチドが、昆虫GPCR抗体との免疫反応により検出される。より好ましくは、この抗体は、配列番号：2-120の偶数番号配列のいずれかひとつのアミノ酸を認識し；及び、このような抗体を作出する本発明の方法に従い調製される。
【０１１９】
ひとつの態様において、昆虫GPCR抗体を使用し、生物学的試料が、昆虫GPCRポリペプチドの存在についてスクリーニングされる。スクリーニングされる生物学的試料は、細胞外もしくは細胞内液体のような生物学的液体、又は細胞もしくは組織の抽出液もしくはホモジネートであることができる。生物学的試料は、単離された細胞(例えば、培養物中)又はそのような細胞の集合物、例えば組織試料もしくは組織学的試料中などであることもできる。組織試料は、液体培地中に浮遊するか、又は顕微鏡用スライドのような固形支持体上に固定することができる。スクリーニングアッセイ法に従い、生物学的試料は、その存在がアッセイされる昆虫GPCRポリペプチドと免疫反応性である抗体に曝露され、抗体-ポリペプチド複合体の形成が検出される。そのような抗体-抗原接合体又は複合体の検出技術は、当該技術分野において公知であり、遠心、アフィニティークロマトグラフィーなど、並びに標識された二次抗体の抗体-候補受容体複合体への結合を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
昆虫モジュレーターに対し特異的結合を示しているモジュレーターも、昆虫GPCRを検出するために使用することができる。特異的結合をアッセイするための代表的技術は、見出し「昆虫GPCRモジュレーターの同定」で本願明細書において先に説明されている。
明らかにされた昆虫GPCRポリペプチドの検出法は、特定の昆虫GPCRポリペプチドを標的化する殺虫剤に対する増強された耐性のような、特定の条件に関連している遺伝子発現の変更されたレベルを決定するために有用であることもできる。
【０１２１】
VIII.  GPCRモジュレーターの同定
本発明は更に、昆虫GPCRを変調する化合物を同定する方法を明らかにしている。本願明細書において使用される用語「候補物質」及び「候補化合物」は、互換的に使用され、他の部分と相互作用し、そこで生物学的活性が変調されると考えられる物質を意味する。例えば、代表的候補化合物は、昆虫GPCRポリペプチド又はそれらの断片と相互作用すると考えられ、引き続きそのような相互作用について評価することができる。本発明の方法を用いて調べることができる候補化合物の例は、ウイルスエピトープ、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、レクチン、糖質、オリゴヌクレオチド又は核酸、オリゴ糖、タンパク質、化合物、小分子、及び抗体を含むが、これらに限定されるものではない。試験される候補化合物は、精製された分子、均質な試料、又は分子もしくは化合物の混合物であることができる。
【０１２２】
本願明細書において使用される用語「変調」は、野生型昆虫GPCRポリペプチド、好ましくは配列番号：2-108の偶数番号のいずれかひとつの昆虫GPCRポリペプチドの、化学的及び生物学的活性又は特性のいずれか又は全ての増加、減少、又はその他の変化を意味する。好ましくは、昆虫GPCRモジュレーターは、昆虫GPCRタンパク質活性のアゴニストである。
【０１２３】
本発明に従い、前述の方法に頼る迅速及び高処理能のスクリーニング法も提供されている。このスクリーニング法は、各化合物が複数の実質的に同一の標的分子と個別に接触することを含む。このようなスクリーニング法において、複数の標的分子は、好ましくは約104種よりも多い試料を含み、より好ましくは約5x104種よりも多い試料を含む。別の高処理能戦略において、各標的分子は、複数の候補化合物と接触することができる。
【０１２４】
ひとつの態様において、昆虫GPCRのモジュレーターを同定するために明らかにされた方法は、配列番号：2-108の偶数番号のいずれかひとつに示されたGPCR配列を用いて行われる。特に、ラトロフィリン機能が破壊された場合に認められる機能喪失致死性は、ラトロフィリンのアンタゴニストが殺虫剤として有用であり得ることを示唆している。
【０１２５】
昆虫GPCRのモジュレーターを同定するための明らかにされた方法は、有害生物由来の核酸配列を用いて行うことができる。本願明細書において明らかにされたGPCR配列は、有害種において相同配列を同定する方法を提供する。このような技術は、当業者に周知である。例えば、Sambrookら編集「Molecular Cloning」、(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、NY、並びに下記実施例2及び3を参照のこと。
好ましい態様において、モジュレーターを同定するために明らかにされた方法は、Heliothis オクトパミンGPCRポリペプチドを使用する。
【０１２６】
昆虫GPCRに結合し、これにより変調する物質を同定する代表的方法は、本願明細書において以下に明らかにされている。用語「結合」は、ふたつの分子間、例えば、リガンド及び受容体の間の親和性を意味する。本願明細書において使用されるように、「結合」は、分子の混合物中のひとつの分子の他のものへの優先的結合を意味する。分子の結合は、結合親和性が約1x104M-1〜約1x106M-1又はそれよりも大きい場合に、特異的であると考えることができる。ふたつの分子の結合は、ひとつのタンパク質又は化合物の他のタンパク質に対する活性が阻害(アンタゴニストの場合)又は増強(アゴニストの場合)されるような、相互作用の質又は状態も包含している。GPCRリガンド結合ドメインへの、このような方法により同定された候補化合物の飽和可能な結合を明らかにするために、例えば、Makら、J Biol Chem、264:21613:21618 (1989)に記されたようなスキャッチャード解析が実行される。
【０１２７】
VIII.A.  タンパク質結合アッセイ
いくつかの技術を用い、in vivoリガンドを使用することなく、タンパク質及び化学リガンドの間の相互作用を検出することができる。代表的方法は、本願明細書において以下に説明されたような、蛍光相関分光法(FCS)、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間(SELDI-TOF)分光法、及びビアコア法を含むが、これらに限定されるものではない。これらの方法は、自動化された高処理能スクリーニングに適合させやすい。
【０１２８】
蛍光相関分光法(FCS)は、少量の試料中の蛍光分子の平均拡散速度を測定する(Madgeら、Phys Rev Lett、29:705-708 (1972)；Maitiら、Proc Natl Acad Sci USA、94:11753-11757 (1997))。この試料サイズは、103個の蛍光分子と少ないことができ、かつ試料容量は、1個の細菌の細胞質と同じくらい少ないことができる。拡散速度は、この分子の質量の関数であり、質量が増加すると減少する。従ってFCSは、質量の変化を測定し、結果的に結合時の分子の拡散速度を測定することにより、ポリペプチド-リガンド相互作用分析に適用することができる。典型的実験において、分析されるべき標的は、N-末端又はC-末端に挿入された、ポリ-ヒスチジン配列のような、配列タグを伴う組換えポリペプチドとして発現される。この発現は、大腸菌、酵母又は哺乳類細胞において生じる。このポリペプチドは、クロマトグラフィー法を用いて精製される。例えば、ポリ-ヒスチジンタグを用い、発現されたポリペプチドを、イミノ二酢酸アガロース上にNi2+がキレートされたような、金属キレートカラムに結合することができる。その後このポリペプチドは、カルボキシテトラメチルローダミン又はBODIPYT(商標)(Molecular Probes社、ユージーン、OR)のような、蛍光タグにより標識される。次にポリペプチドは、可能性のあるリガンドに溶液中で曝露され、その拡散速度が、Carl Zeiss社(ソーンウッド、NY)から入手できる装置を用い、FCSにより決定される。リガンド結合は、ポリペプチドの拡散速度の変化により決定される。
【０１２９】
表面増強レーザー脱離／イオン化(SELDI)は、Hutchens及びYipにより開発された(Rapid Commun Mass Spectrom、7:576-580 (1993))。SELDIは、飛行時間型質量分析(TOF)と組合せた場合、チップ上に保持された分子を迅速に分析する技術を提供する。これは、チップ上の標的タンパク質又はそれらの一部の共有結合、並びにこのタンパク質に結合している小タンパク質のMSによる分析により、リガンド-タンパク質相互作用分析に適用することができる(Worrallら、Anal Biochem、70:750-756 (1998))。典型的実験において、分析されるべき標的は、FCSについて説明されたように発現される。その後精製されたタンパク質は、更に調製することなくこのアッセイにおいて使用される。これは、ポリヒスチジンタグの利用、又はイオン交換もしくは疎水性相互作用のような他の相互作用のいずれかにより、SELDIチップに結合される。次にこうして調製されたチップは、例えば連続法でリガンドをピペッティングすることができるような送達システム(自動試料採取器)を介して、可能性のあるリガンドに、曝露される。このチップはその後、ストリンジェンシーが増加する溶液、例えば、増大するイオン強度を含む緩衝溶液を伴う一連の洗浄液で洗浄される。各洗浄後、結合した材料は、このチップをSELDI-TOFに提示することにより分析される。この標的に特異的に結合するリガンドは、それらを溶離するのに必要な洗浄のストリンジェンシーにより同定される。
【０１３０】
ビアコアは、リガンドの、層上に固定された標的ポリペプチドへの結合時の表面層の屈折率の変化に頼っている。このシステムにおいて、小さいリガンドの収集は、2〜5μlの細胞中に連続して注入され、ここで標的ポリペプチドは、細胞内に固定される。結合は、表面プラスモン共鳴(SPR)により、表面からのレーザー光屈折を記録することにより、検出される。一般に、表面層での質量濃度の所定の変化による屈折率変化は、実践的に全てのタンパク質及びペプチドについて同じであり、このことは単独の方法を、あらゆるタンパク質に適用可能にしている(Liedbergら、Sensors Actuators、4:299-304 (1983)；Malmquist、Nature、361:186-187 (1993))。典型的実験において、分析されるべき標的は、FCSについて説明されたように発現される。その後精製されたタンパク質が、更に調製せずにこのアッセイにおいて使用される。これは、ポリ-ヒスチジンタグの利用、又はイオン交換もしくは疎水性相互作用のようなその他の相互作用のいずれかにより、ビアコアチップに結合される。こうして調製されたチップは、その後可能性のあるリガンドに、リガンドを連続法でピペッティングするための、Biacore社(ウプスラ、スウェーデン)から販売された装置(自動試料採取装置)に組込まれた送達システムを介して曝露される。チップ上のSPRシグナルは記録され、及び屈折率の変化は、不動化された標的とリガンドの間の相互作用を示す。オンレート及びオフレートの(on rate and off rate)シグナル速度論の分析は、非特異的相互作用と特異的相互作用を識別することができる。
【０１３１】
VIII.B.  ペプチド相互作用アッセイ
多様なペプチドライブラリーを展示する方法は、標的分子に対するリガンドの迅速なライブラリー構築、増幅、及び選択を可能にする。Lowman、Annu Rev Biophys Biomol. Struct、26:401-424 (1997)；Sidhu、Curr Opin Biotech、11(6):610-616 (2000)；及び、米国特許第5,510,240号を参照のこと。GPCRと不可欠な補因子の間の相互作用を破壊することが可能なペプチドを選択するアッセイも使用することができ、これらは、Hallら、Mol Enodcrinol、14(12):2010-2023 (2000)；Northropら、Mol Endocrinol、14(5)605-622 (2000)；国際公開公報第00/37077号に説明されており、これらは本願明細書に参照として組入れられている。
【０１３２】
VIII.C.  転写アッセイ
本発明は、昆虫GPCR転写活性化のモジュレーターを同定する方法も提供する。ひとつの戦略は、以下を含む発現システムを利用する：(1)昆虫GPCRの機能的リガンド結合ドメインを含む、昆虫GPCR、(2)レポーター遺伝子に機能的に連結されたGPCRにより調節された応答要素を含む、標的遺伝子発現カセット、及び(3)被験化合物。GPCR遺伝子及び標的遺伝子発現カセットを構築する方法は、本願明細書において以下に見出し「誘導性遺伝子発現のためのキメラ受容体」に説明されている。同じく、Wentworthら、J Endocrinol、166(3):R11-16 (2000)；Yang及びChen、Cancer Res、59(18):4519-4524 (1999)；及び、米国特許第4,981,784号を参照し、これらは本願明細書に参照として組入れられている。
【０１３３】
用語「レポーター遺伝子」は、容易に観察及び／又は定量される生成物をコードしている異種遺伝子を意味する。レポーター遺伝子は、意図された宿主細胞に対して異物である給源を起源とする点、又は同じ給源に由来する場合には、その当初の形から修飾されている点において異種である。いずれか適当なレポーター及び検出方法を、明らかにされた方法において使用することができる。転写調節領域に機能的に連結され得る検出可能なレポーター遺伝子の限定的でない例は、Alam及びCook、Anal Biochem、188:245-254 (1990)、及び国際公開公報第97/47763号に見ることができる。転写分析にとって好ましいレポーター遺伝子は、lacZ遺伝子(例えば、Rose及びBotstein、Meth Enrymol、101:167-180 (1983))、緑色蛍光タンパク質(GFP)(Cubittら、Trends Biochem Sci、20:448-455 (1995))、ルシフェラーゼ、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)を含む。
【０１３４】
レポーター遺伝子の量は、定性的に、又は好ましくは定量的にレポーター遺伝子産物の存在又は活性を決定することにより、アッセイすることができる。各被験物質により示されたレポーター遺伝子発現の量は、被験物質非存在下でのレポーター遺伝子発現の量と比較される。被験物質は、被験物質非存在下でのレポーター遺伝子発現レベルと比較した場合に、この物質存在下においてレポーター遺伝子発現レベルが有意に増加した場合に、アゴニスト活性を有するとして同定される。本願明細書において使用される用語「有意な増加」は、測定技術に固有の誤差の限界よりも大きい、好ましくは対照測定値に対して約2倍又はそれよりも大きい増加、より好ましくは約5倍又はそれよりも大きい増加、最も好ましくは約10倍又はそれよりも大きい増加である、測定可能な質の定量できる変化を意味する。
【０１３５】
VIII.D.  理論的デザイン
未変性のGPCRポリペプチドの構造に関する知識は、理論的農薬デザインの方法を提供している。例えば、Schapiraら、Proc Natl Acad Sci USA、97(3):1008-1013 (2000)を参照のこと。GPCRポリペプチドの構造は、X-線結晶解析学又は三次元表示を作成するコンピュータアルゴリズムにより決定することができる。Huangら、Pac Symp Biocomput、230-41 (2000)；Saqiら、Bioinformatics、15:521-522 (1999)；国際公開公報第99/26966号を参照し、これらは本願明細書に参照として組入れられている。あるいは、GPCR構造のワーキングモデルは、ホモロジーモデリングに由来することができる(Huangら、Acta Pharmacol Sin.、6月号；21(6):529-35 (2000))。コンピュータモデルは更に、合成し及び試験することができる様々な基質分子に対するタンパク質構造の結合を推定することができる。追加の化合物デザイン技術は、米国特許第5,834,228号及び第5,872,011号に開示されている。
【０１３６】
IX.  有害生物防除法
本発明の別の局面は、昆虫GPCR生物学的活性の変調による有害生物防除法である。そのような活性を有する物質は、本願明細書に開示された方法により発見することができ、及び化合物、抗体、及び植物導入遺伝子によりコードされた遺伝子産物を含むが、これらに限定されるものではない。
本発明は、植物における有害生物の加害の発生又は進行を防止する方法を提供する。この方法は、配列番号：2-120の偶数番号のいずれかひとつに示されたGPCRのモジュレーターを投与することを含み、ここでGPCRの変調は、生物の致死性を生じる。好ましくは、この致死性は、幼虫発生期に生じる。
【０１３７】
IX.A.  配合物
本発明の昆虫GPCRモジュレーターは、典型的には、許容できるビヒクル、補助剤、及び望ましいならば担体を用いて配合される。代表的配合物は、乳化可能な濃縮物、水混和性液体、湿潤可能な粉末、水溶性粉末、油性溶液、流動可能な粉末、エアロゾル、蒸気、顆粒、マイクロカプセル、燻蒸剤、超低容量濃縮物(ultra-low volume concentrate)、煙霧用濃縮物、蒸気、含浸剤、毒餌、及び種子粉衣を含む。例えば、Perryら、「Insecticides in Agriculture and Environment: Retrospects and Prospects」、(1997)、7-10頁、Springer-Verlag社、ニューヨーク、NYを参照のこと。配合物は更に、貯蔵、取扱い、適用、有効性、散布者及び環境への安全性、並びに経費などの、殺虫剤特性を改善するその能力を基に選択することができる。
【０１３８】
殺虫剤配合物は、更に本発明の昆虫GPCRモジュレーターの活性を増強することができる相乗剤を含むことができる。Yamamoto、「Pyrethrum, The Natural Insecticide」、(1973)、Casida編集、191-170頁、Academic Press社、ニューヨーク、NY；Hodgson及びTate、「Insecticide Biochemistry and Physiology」、(1976)、Wilkinson編集、115-148頁、Plenum Press社、ニューヨーク、NY；Wilkinson、「Proc 2nd Int Congr on Pesticides and Chemistry」、Tahori編集、2:117-159 (1976a)、Gordon & Breach社、ニューヨーク、NY；Wilkinson、「The Future for Insecticides: Needs and Prospects」、Metcalf及びMcKelvey編集、6:191-178 (1976b)、Wiley社、ニューヨーク、NY；Casida及びQuistad、「Pyrethrum Flowers: Production, Chemistry, Toxicology, and Uses」、(1995)、Casida及びQuistad編集、258-276頁、Oxford University Press社、ニューヨーク、NYを参照のこと。あるいは、相乗作用は、昆虫GPCRモジュレーターの適用前の植物の処理によるか、又は昆虫GPCRモジュレーターの適用部位から離れた植物の部位での相乗剤の適用により実現することができる。
【０１３９】
IX.B.  In Vivoアッセイ
昆虫GPCRのモジュレーターの殺虫活性は、当該技術分野において標準の技術を用いて試験することができ、これは局所的適用、噴霧、浸漬、接触又は残留物(residual)曝露、及び摂食／摂水を含む。例えば、Perryら、「Insecticides in Agriculture and Environment : Retrospects and Prospects」、(1997)、12-13頁、Springer-Verlag社、ニューヨーク、NYを参照のこと。一例として、モジュレーターを含有する配合物が、植物に散布され、次に昆虫の幼虫がこの植物に適用され、その後適当な期間にわたり、幼虫による植物破壊の程度が定量化される。
【０１４０】
IX.C.  用量及び投与
殺虫剤の生物に対する毒性は、被験集団の50％を死滅するのに必要な生物の単位重量当りの化合物の量に関して表現することができ、致死量(LD50)とも称される。LD50は、通常体重1kg当りのmg数又は昆虫1匹当りのmg数で表わされる。致死濃度(LC50)は、被験集団の50％を死滅するのに必要である外部媒質中の化合物の濃度であり、媒質中の活性成分(AI)の100万分率(ppm)で表わされる。この値は、昆虫に投与された正確な用量が決定できない場合に使用することができる。候補 殺虫性物質の有効性は、致死的時間LC50に関してアッセイすることもできる。LC50は、特定の用量又は濃度で、被験生物の50％死亡率に必要な時間を表わし、及び圃場試験のための適当な測定値である。
【０１４１】
場合によっては、致死性よりもノックダウン率が、有効性の判定基準として測定される。このような場合、ノックダウン用量(KD50)又はノックダウン時間(KT50)を、殺虫活性を表わすために使用することができる。
本発明は、殺傷又はノックダウンが望ましい判定基準を構成しない場合の、殺虫性物質の同定も構想している。例としての有用なアッセイは、例えば、発生段階の進行、産卵力、卵の生存度、誘引物質又は忌避物質の活性、麻痺、及び摂食障害活性のような、非-致死的測定値を評価することもできる。
【０１４２】
本発明の方法で同定された昆虫GPCRモジュレーターは、植物又は動物における昆虫加害、及び場合によっては線虫加害を予防又は処理するために有用である。予防法及び処理法は、有効量のこのモジュレーターを使用する。本願明細書において使用される用語「有効量」は、加害を予防又は改善するために有効な量を意味する。
有効量は、量の範囲を含むことができる。当業者は、本発明の昆虫GPCRモジュレーターの効能及び効力を容易に評価し、かつこれに従い投与方式を調節することができる。昆虫GPCR生物学的活性のモジュレーターは、様々な技術、例えば、転写アッセイにおける反応性レポーター遺伝子の使用により、昆虫GPCRポリペプチドのモノクローナル抗体との相互作用のアッセイにより、又はモジュレーターが昆虫へ投与された場合の昆虫生存度のアッセイにより、評価することができ、各技術は本願明細書において説明されている。当業者は、特定の適用のために、組成物で使用される特定の配合及び投与法に加え、植物又は動物の種類、植物又は動物の発生段階、及び処理される加害の重症度を考慮し、投与量を調節する(tailor)ことができる。
【０１４３】
IX.D.  トランスジェニック植物
本発明は、昆虫GPCRモジュレーターが植物において発現された場合の有害生物防除の方法も包含している。好ましくは、植物において導入遺伝子によりコードされた核酸、ペプチド又はポリペプチドは、配列番号：1-119のいずれかの活性を変調する。ひとつの態様において、導入遺伝子は、本発明の昆虫GPCRに特異的に結合するペプチドをコードすることができる。別の態様において、本発明の昆虫GPCRに特異的に結合する抗体をコードしている構築体は、昆虫防除を付与するために、植物において発現される。例えば米国特許第5,686,600号を参照し、この内容は本願明細書に参照として完全に組入れられている。トランスジェニック植物の作出法は、当該技術分野において公知であり、以下に更に詳述されている。
【０１４４】
IX.E.  標的生物
本願明細書において明らかにされた方法に従い発見された昆虫GPCRモジュレーターを、有害生物加害の予防又は改善に使用することができる。本願明細書において使用される用語「有害生物」とは、成熟植物、実生、及び貯蔵された穀粒を含む植物を損傷するいずれかの生物を意味する。用語「有害生物」は、動物において疾患を引き起こすいずれかの生物も意味する。本願明細書において明らかにされた組成物及び方法は、アブラムシ、バッタ、クモ、ボールウィービル(boll weevil)、及び貯蔵された穀粒を攻撃する有害生物(例えば、Tribolium及びTenebrio)を含むがこれらに限定されるものではない、有害生物の加害を予防又は処理するために特に有用であることが構想されている。本発明の開示は、Melooidogyneのような土壌線虫及び植物に寄生する線虫の防除法にも関連する。
【０１４５】
XI.  トランスジェニック植物
本発明は、植物における昆虫GPCRのモジュレーター、抗体、dsRNA、アンチセンスRNA又はGPCR成分の発現も企図している。双子葉植物及び単子葉植物の形質転換の代表的技術は、本願明細書において以下に説明されている。
本願明細書において使用される語句「植物体、又はそれらの一部」は、植物全体を意味することとし；並びに、種子、葉、茎及び根に加え、植物組織培養物を含むがこれらに限定されるものではない、それらの一部を意味することとする。本発明のトランスジェニック植物は、形質転換法の最終産物のみではなく、それらのトランスジェニック後代も包含するものと理解される。
【０１４６】
本願明細書において明らかにされたトランスジェニック法において使用することができる代表的植物は、コメ、コムギ、オオムギ、ライムギ、トウモロコシ、ジャガイモ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ、ソラ豆、エンドウ豆、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、スクワッシュ、カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、プラム、サクランボ、モモ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴ、バナナ、タバコ、トマト、サトウモロコシ及びサトウキビを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４７】
XI.A.  プロモーター
植物における昆虫GPCRモジュレーター又はキメラ受容体発現カセットのin vivo作成のために、例証となる構成的プロモーターは、CaMV 35S、コメアクチン、及びトウモロコシユビキチンの遺伝子に由来している。Binetら、Plant Sci、79:87-94 (1991)、Christensenら、Plant Mol Biol、12:619-632 (1989)、Callisら、J Biol Chem、265:12486-12493 (1990)、Norrisら、Plant Mol Biol、21:895-906 (1993)、欧州特許出願第0 342 926号及び第0 392 225号、Taylorら、Plant Cell Rep、12:491-495 (1993)、McElroyら、Plant Cell、2:163-171 (1990)、McEclroyら、Mol Gen Genet、231:150-160 (1991)、Chibbarら、Plant Cell Rep、12:506-509 (1993)を参照のこと。本発明での使用に適した代表的誘導性プロモーターは、化学的に誘導されたPR-1プロモーター、PR-1aプロモーター、エタノール-誘導性プロモーター、糖質コルチコイド誘導性プロモーター、及び創傷-誘導性プロモーターを含む。Uknesら、Plant Cell、4:645-656 (1992)、Lebelら、Plant J、16:223-233 (1998)、Caddikら、Nat Biotechnol、16:177-180 (1998)、Aoyama及びChua、The Plant Journal、11:605-612 (1997)、Xuら、Plant Mol Biol、22:573-588 (1993)；Logemannら、Plant Cell、1:151-158 (1989)、Rohrmeier及びLehle、Plant Mol Biol、22:783-792 (1993)、Firekら、Plant Mol Biol、22:129-142 (1993)、及びWarnerら、Plant J、3:191-201 (1993)を参照のこと。選択されたプロモーターは、特異的細胞型(例えば、葉表層細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)又は特異的組織もしくは器官(例えば根、葉又は花)における発現を指示することができる。植物において細胞又は組織-特異的発現を指示し及び本発明に従い使用することができる代表的プロモーターは、根-特異的プロモーター(de Framond、FEBS、290:103-106 (1991)、米国特許第5,466,785号)、木髄優先(pith-preferred)プロモーター(国際公開公報第93/07278号)、葉-特異的プロモーター(Hudspeth及びGrula、Plant Mol Biol、12:579-589 (1989))、並びに花粉-特異的プロモーター(国際公開公報第93/07278号)を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４８】
XI.B.  ベクター
発現カセットは、形質転換に適当なベクターへ、クローニングされる。使用することができる適当な発現ベクターは、下記のベクター又はそれらの誘導体を含むが、これらに限定されるものではない：植物形質転換ベクター、ワクシニアウイルス又はアデノウイルス、バキュロウイルスなどのウイルスのベクター、酵母ベクター、バクテリオファージベクター(例えば、ラムダファージ)、プラスミド及びコスミドDNAベクター、並びに、トランスポゾン-媒介型形質転換ベクター。
【０１４９】
植物の形質転換に利用可能な多くのベクターは、植物形質転換の技術分野の業者に公知であり、及び本発明に関する遺伝子は、このようなベクターのいずれかと共に使用することができる。例証的ベクターは、pCIB200、pCIB2001、pCIB10、pCIB3064、pSOG19、及びpSOG35を含む。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術及び形質転換のための標的種によって決まる。
【０１５０】
多くのベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用い、形質転換のために利用可能である。これらは典型的には、少なくとも1個のT-DNA境界配列を含み、並びにpBIN19(Bevan、Nuc Acids Res、12:8711-8721 (1984))及びpXYZなどのベクターを含む。欧州特許出願第0 332 104号も参照し、これは本願明細書に参照として組入れられている。
【０１５１】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクターにおけるT-DNA配列の必要要件を回避し、及び結果的にこれらの配列を欠いているベクターを、T-DNA配列を含む前述のもののようなベクターに加え、利用することができる。アグロバクテリウムに頼らない形質転換技術は、微粒子銃、プロトプラスト取込み(例えば、電気穿孔)、及び微量注入による形質転換を含む。ベクターの選択は、形質転換される植物種にとって好ましい選択により大きく左右される。
【０１５２】
ある標的種のために、様々な抗生物質又は除草剤の選択マーカーが好ましい。形質転換において慣習的に使用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連抗生物質に対する耐性を付与するnptll遺伝子(Messing及びVierra、Gene、19:259-268 (1982)；Bevanら、Nature、304:184-187 (1983))、除草剤ホスフィノスリシンに対する耐性を付与するbar遺伝子(Whiteら、Nuc Acids Res、18:1062 (1990)、Spencerら、Theor Appl Genet、79:625-631 (1990))、抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与するhph遺伝子(Blochlinger及びDiggelmann、Mol Cell Biol、4:2929-2931 (1984))、及びメトトレキセートに対する耐性を付与するdhfr遺伝子(Bourouisら、EMBO J、2(7):1099-1104 (1983))、グリホセートに対する耐性を付与するEPSPS遺伝子(米国特許第4,940,935号及び第5,188,642号)、並びにマンノース代謝能を提供するマンノース-6-リン酸異性化酵素遺伝子(米国特許第5,767,378号及び第5,994,629号)を含む。
【０１５３】
XI.C.  双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換技術は、当該技術分野において公知であり、及びアグロバクテリウム-ベースの技術及びアグロバクテリウムを必要としない技術を含む。非-アグロバクテリウム技術は、プロトプラスト又は細胞による外因性遺伝子材料の取込みに関連している。これは、ポリエチレングリコール(PEG)電気穿孔、微粒子銃-媒介した取込み、又は微量注入により実現することができる。これらの技術の例は、Paszkowskiら、EMBO J、3:2717-2722 (1984)；Potrykusら、Mol Gen Genet、199:169-177 (1985)；Reichら、Biotechnology、4:1001-1004 (1986)；Kleinら、Nature、327:70-73 (1987)；並びに、米国特許第4,945,050号、第5,036,006号、及び第5,100,792号に説明されている。前述の方法のいずれかを使用し、形質転換された細胞は、当該技術分野において公知の標準技術を用い、植物全体を再生することができる。
【０１５４】
XI.D.  単子葉植物の形質転換
ほとんどの単子葉植物種の形質転換は、現在日常的になってきている。好ましい技術は、PEG又は電気穿孔技術を使用するプロトプラストへの直接の遺伝子導入、及び培養組織への微粒子銃を含む。欧州特許出願第0 292 435号、第0 392 225号、及び第0 332 581号；国際公開公報第93/07278号及び国際公開公報第93/21335号；Gordon-Kammら、Plant Cell、2:603-618 (1990)；Frommら、Biotechnology、8:833-839 (1990)；Kozielら、Biotechnology、11:194-200 (1993)；Zhangら、Plant Cell Rep、7:379-384 (1988)；Shimamotaら、Nature、338:274-277 (1989)；Dattaら、Biotechnology、8:736-740 (1990)；Christouら、Biotechnology、9:957-962 (1991)；Vasilら、Biotechnology、10:667-674 (1992)；Vasilら、Biotechnology、11:1553-1558 (1993)；及び、Weeksら、Plant Physiol、102:1077-1084 (1993)を参照のこと。より最近になって、単子葉植物のアグロバクテリウムを用いる形質転換が説明されている。国際公開公報第94/00977号及び米国特許第5,591,616号を参照し、これらは両方とも本願明細書に参照として組入れられている。
【０１５５】
XII.  誘導性遺伝子発現の方法
本発明は更に、生物における遺伝子発現を制御する方法も提供し、これは以下の工程を含む：(a)生物を、本発明のキメラ受容体ポリペプチドをコードしている受容体カセットへ機能的に連結された発現を促進することが可能である5'調節領域、及び3'終結領域を含む受容体発現カセットで形質転換する工程；(b)生物を、標的ヌクレオチド配列に機能的に連結された 5'調節領域を含む標的発現カセットで形質転換する工程であり、ここで5'調節領域は、Gタンパク質シグナル伝達により調節される1種又は複数の応答要素を含む；(c)このキメラ受容体ポリペプチドを生物において発現する工程；及び、(d)生物を、キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合する化学リガンドと接触し、これによりキメラ受容体ポリペプチドが、Gタンパク質シグナル伝達経路を介して、標的ヌクレオチド配列の発現を活性化する工程。
【０１５６】
好ましい態様において、説明されたGPCR配列を含むGPCRカセットは、適当な化学リガンドの存在下での、標的ポリペプチドの植物における発現の調節に有用である。例えば、米国特許第5,880,333号は、植物を、核内受容体ポリペプチド及び標的配列をコードしている発現カセットで形質転換することを含む、植物における遺伝子発現を制御する方法を開示している。この方法は、作物学的に重要な様々な特徴を制御するために有用である。
【０１５７】
本発明は、GPCRアンタゴニストRNAを含む植物の作成を提供する。これらのアンタゴニストRNAは、典型的には、アンチセンス配向した遺伝子を含む植物導入遺伝子に又はヘアピン構造を形成するために折畳み能を有するmRNAを作成する導入遺伝子に由来している(Patel及びJacobs-Lorena、Proceedings of the National Academy of Science、85:9601 (1988)；Zhao及びPick、Nature、365:448 (1993)；Lam及びThummel、Current Biology、10:957 (2000))。これらのRNAを含む植物材料を消費する昆虫は、必須のGPCR転写産物レベルが低下するために、生存度が低下する。
【０１５８】
実施例
下記実施例は、本発明の態様を例証するために含まれている。下記実施例のある局面は、本共同発明者により本発明の実践においてうまく作業することが認められるか又は企図されている技術及び手法に関して説明されている。これらの実施例は、共同発明者による標準の実験室での実践を説明している。当業者には、本開示及び当該技術分野の技術の一般的レベルを考慮し、下記実施例は、単に例証することが意図されており、及び本発明の範囲を逸脱しない限りは、多くの変化、修飾及び変更を用いることができることが理解されるであろう。
【０１５９】
実施例1：データベース検索
新規ショウジョウバエタンパク質を同定するために、推定タンパク質データベース(本願明細書において「GeneMarkデータベース」と称す)を、GeneMarkプログラム(Borodovsky及びMclninch、Computers & Chemistry、17:123-133 (1993))、及びCelera社(ロックビル、MD)により作成された鋳型50キロベースのゲノム配列スカフォールドを用いて集成した。別のタンパク質推定プログラムを用いCelera社により作成された第二の推定タンパク質データベース(以後「Celeraデータベース」と称す)も、使用した。
【０１６０】
クラスAの全ての亜範疇を表わしている脊椎動物(ヒト又はマウスのいずれか)由来の11種のクラスA GPCRを用い、GeneMarkデータベース及びCeleraデータベースでBLAST検索を行った。12種のクラスB及び2種のクラスC GPCRも、同じデータベースでBLAST検索を行った。BLAST検索の結果を検証し、及び恐らくGPCRであると推定されたタンパク質を同定した。次に細胞質ループ2の高度に保存された領域を用い、HMMER 2.1.1 プログラム(Washington University School of Medicine、セントルイス、MOから入手可能)に従い、クラスA及びクラスBについて隠れマルコフモデル(HMM)プロファイルを作成した。HMMER 2.1.1 hmmbuildパラメータは、最大感度になるよう選択した。プロファイルHMMは更に、このプログラムの指示に従いキャリブレーションした。このプロファイルHMMを用い、GeneMark及びCeleraデータベースを問合せし、脊椎動物ホモログを有さないショウジョウバエGPCRを同定した。各新規ショウジョウバエGPCRに関するGeneMark及びCeleraタンパク質予測は、次に、GenBankの非-重複セットに対して、BLASTED検索を行った。より低いE-値スコアによる予測を同定し、クローニングをベースにした予測であると判断した。
【０１６１】
実施例2：キイロショウジョウバエGPCR cDNAの単離
ショウジョウバエGPCRのcDNAクローンを、鋳型としてショウジョウバエcDNAプールの第一鎖を用い、PCRによりクローニングした。PCRプライマーは、プライマー3適用(Genome ResearchのためにWhitehead/MIT Center(ケンブリッジ、MA)から入手可能)を用い、各受容体の推定された開始コドン及び停止コドンを含むようにデザインした。増幅産物は、pUNI/V5-His-TOPOベクター又はpCR2.1-TOPOベクター(Invitrogen社、カールスバッド、CA)においてクローニングした。クローニングした挿入断片は、ABI PRISM(登録商標) 3700 DNA Analyzer(Applied Biosystems社、フォスターシティ、CA)を用いるプライマーウォーキングにより、両鎖について配列決定し、精度は＜1/10,000ヌクレオチド誤差であった。
【０１６２】
実施例3：PCRによるオオタバコガオクトパミンGPCRのクローニング
ポリA+ RNAを、オオタバコガ幼虫の腸管組織から作成した。cDNAを、ランダムプライマー及びGene Ampキット(Perkin Elmer社、サンノゼ、CA)を用い、逆転写により調製した。逆転写反応は、42℃で15分間進行することが可能であり、その後99℃で5分間反応液をインキュベーションすることにより停止した。オクトパミン受容体の増幅のために、入れ子式の縮重プライマーを、ショウジョウバエOAMB受容体及びフジツボオクトパミン受容体のアミノ酸配列に従いデザインした(フォワード縮重プライマー：5'gcatgtctagaggngaybtntggtgyhsnrtntgg 3' (配列番号：109)及びリバース縮重プライマー：5'gcatgaagcttngtyttngcngcyttngtytccat 3' (配列番号：110))。プライマーは、pBluescript(Stratagene社、ラホヤ、CA)へのクローニングのために、XbaI及びHindIII制限酵素切断部位を含んだ。縮重プライマーを使用する増幅のためのサイクリングパラメータは以下であった：開始増幅は95℃で105秒間；95℃で20秒間、63℃で30秒間、72℃で2分間を30サイクル；最終増幅は72℃で7分間；4℃で維持。各試料を、Qiagen PCR精製カラム／キット上で精製し、及び第一と同じ第二の増幅工程の鋳型として使用した。およそ1.1kbバンドを、オオタバコガオクトパミン受容体として配列決定により同定した。
【０１６３】
cDNA末端の増幅は、MARATHON RACEキット(Clonetech Laboratories社、パロアルト、CA)を用いて行った。遺伝子特異的プライマー(5'RACEプライマー：5'ggatggaagccgtgcacatccayacg 3' (配列番号：111)及び3'RACEプライマー：5' ggcagggaactgacggagagcagg 3' (配列番号：112))は、本願明細書において先に説明したように得たオオタバコガオクトパミン受容体配列に従いデザインした。オオタバコガ幼虫腸管から作成したcDNAライブラリーを、鋳型として用いた。RACE産物は、TOPO-Aベクター(Invitrogen社、カールスバッド、CA)にクローニングした。
ヌクレオチドコード：n=イノシン、Y=C+T、H=A+T+G、B=G+T+C、S=G+C、R=A+G
【０１６４】
実施例4：二本鎖RNA干渉
注入のためのdsRNAの調製。dsRNAとして発現される配列を、Bluescript KS(+)(Stratagene社、ラホヤ、CA)へクローニングし、適当な制限酵素で線状とし、かつin vitroにおいてAmbion T3及びT7 Megascriptキットにより、製造業者の指示に従い転写した(Ambion社、オースチン、TX)。転写産物は、85℃に加熱後注入緩衝液(0.1mM NaPO4(pH7.8)、5mM KCl)中でアニーリングし、1〜24-時間の間室温で冷却した。全てのアニーリングした転写産物を、DNAマーカーと共にアガロースゲル上で分析し、アニーリングしたRNAのサイズを確認し、及び先に説明されたように定量した(Fireら、Nature、391(6669):806-811 (1998))。注入されたRNAは、ゲル精製されなかった。1-kb dsRNAの0.1〜1.0mg/ml溶液の0.1nlの注入は、おおまかに107分子／注入に相当した。
【０１６５】
キイロショウジョウバエ胚の注入。ハエ籠を、2〜4日齢ハエを用いて設定した。寒天-グレープジュースプレートを、1時間毎に交換し、1〜2日間の卵収集に同期させた(synchronize)。卵を、引き続きの注入のために、30〜60分間隔で収集した。これらの卵を、ナイロンメッシュバスケット中に水道水で洗い流した。希漂白液への短時間の浸漬により、漿膜を除去した。卵を、各卵が同じ方向を向くように、スライドガラス上に置いた。二本鎖RNAを、Eppendorf transjector (Eppendorf Scientific社、ウェストベリー、NY)を用い、各卵の中央部に注入した。注入後、スライドを、加湿したチャンバー内に保存し、胚の乾燥を防いだ。胚を、発生についてモニタリングし、1齢幼虫の時に、Drosophila培地を含むバイアルへ移した。ショウジョウバエ段階を育てる方法及び通常の遺伝子技術は、例えば、Roberts、「Drosophila melanogaster, A Practical Approach」、(1986)、IRL Press社、ワシントン、DC；Ashburner、「Drosophila: A Laboratory Handbook」、(1989a)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、ニューヨーク、NY；Ashburner、「Drosophila: A Laboratory Manual」、(1989b)、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、ニューヨーク、NY；Goldstein及びFyrberg編集、「Methods in Cell Biology」、44巻(1994)、Academic Press社、サンディエゴ、CAに見ることができる。
【０１６６】
実施例5：ショウジョウバエGPCRのin situハイブリダイゼーションによる発現パターン分析
野生型キイロショウジョウバエ(Oregon R系)を、公共のStock Center(ブルーミントン、IN)から得た(http://flystocks.bio.indiana.edu)。胚を、グレープジュース／寒天プレート上に、室温で約16時間収集した。移動する3齢期の幼虫を、この動物の全ての内部組織が検出されるように切開した。Berleley Drosophila Genome Projectウェブサイト(http://www.fruitfly.org/about/methods/ RNAinsitu.html)に説明された方法に従い、胚及び幼虫を固定し、プロセシングし、及び検出した。染色後、組織を切り離し、70％グリセロール上に包埋し、複合顕微鏡で調べた。無翅遺伝子のセンス鎖対照は染色を示したのに対し、アンチセンス鎖は無翅について正確な発現パターンを示した。各GPCRの発現パターンは、デジタル写真で記録し、かつ下記表6に説明した。試験したほとんどのGPCRは、胚、幼虫又は両方のいずれかにおいて発現した。表6(GPCR発現)は、GPCRはどの組織において発現を有するかを示している。
【０１６７】
表6：GPCRの発現プロファイル
【表１０】
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【０１６８】
実施例6：大腸菌における組換え作成
本発明のcDNAクローンを、適当な発現ベクターへサブクローニングし、及び製造業者の条件を用い、大腸菌へ形質転換した。具体例は、pBluescript(Stratagene社、ラホヤ、CA)、pFLAG(International Biotechnologies社、ニューヘブン、CT)、及びpTrcHis(Invitrogen社、カールスバッド、CA)などのプラスミドを含む。標準の技術を用い、大腸菌は培養し、組換えタンパク質の発現を確認し、及び組換えタンパク質を単離した。
【０１６９】
実施例7：昆虫細胞におけるGPCRの組換え作出
AcNPVウイルスゲノムに由来するバキュロウイルスベクターは、昆虫細胞のSpodoptera frugiperda (SF9)株(ATCC CRL# 1711)においてcDNAの高レベルの発現を提供するようにデザインされている。本発明のcDNAを発現している組換えバキュロウイルスは、標準の方法に従い作出される(Invitrogen MaxBac Manual、Invitrogen社、カールスバッド、CA)：cDNA構築体は、pAC360及びBleBAcベクター(Invitrogen社、カールスバッド、CA)を含む、様々なバキュロウイルス転移ベクターのいずれかひとつにおいて、ポリヘドリン遺伝子にライゲーションされる。組換えバキュロウイルスは、バキュロウイルス転移ベクター及び線状化されたAcNPVゲノムDNA(Kitts、Nucleic Acid Res、18:5667 (1990))のSF9細胞への同時-トランスフェクション後の相同的組換えにより作成される。組換えpAC360ウイルスは、感染細胞中の封入体の非存在により同定され、及び組換えpBlueBacウイルスは、β-ガラクトシダーゼ発現を基に同定される(Summers及びSmith、Texas Agriculture Exp Station速報第1555号)。
【０１７０】
この遺伝子の全オープンリーディングフレームをコードしているcDNAを、pBlueBacII(Invitrogen社、カールスバッド、CA)のBamHI部位に挿入する。配列分析により同定された正の配向の構築体を用い、線状AcNPV野生型DNAの存在下で、SF9細胞にトランスフェクションする。組換え昆虫GPCRは、感染細胞の形質膜に存在する。この組換え昆虫GPCRを、感染細胞から、低張又は界面活性剤溶解により抽出する。
【０１７１】
実施例8：In vitro結合アッセイ
組換えタンパク質は、例えば、本願明細書において先に実施例6又は7において説明された方法に従い得ることができる。このタンパク質を、リガンド結合アッセイに適したチップ上に不動化する。チップ上に不動化されたタンパク質は、当該技術分野において公知の方法に従い、候補物質に曝される。試料化合物が不動化されたタンパク質と接触される間に、タンパク質-リガンド相互作用を検出することが可能な測定が実行される。測定技術は、先に説明されたような、SEDLI、ビアコア、及びFCSを含むが、これらに限定されるものではない。このタンパク質に結合する物質は、この方法を用い容易に発見され、更なる特徴決定が施される。
【０１７２】
実施例9：細胞-ベースの活性アッセイ
細胞-ベースのアッセイを用い、Gタンパク質共役型受容体活性を検出し、及びEuroscreen(ブリュッセル、ベルギー)により提供されたプロトコールに本質的に説明されたように行う。関心のあるGPCRは、高レベルでアポイクオリン遺伝子を発現している組換え細胞株に安定して形質転換される(AequoScreen(商標))。GPCRがアゴニストにより活性化された場合、ヘテロ三量体Gタンパク質は、酵素ホスホリパーゼCβ(PLCB)を活性化するであろう。次にPLCβは、リン脂質、ホスファチジルイノシトール4, 5ビスリン酸(PIP2)を切断し、ジアシルグリセロール(DAG)及びイノシトール三リン酸(IP3)を生成する。IP3は、IP3受容体へ結合し、及び細胞内貯蔵庫からCa2+を放出する。細胞は、細胞膜を容易に通過しかつアポイクオリンと複合しイクオリンを生成するセレンテラジンと共にインキュベーションする。イクオリン酵素活性はセレンテラジンの酸化時に発光することであるが、これはその周囲のカルシウム濃度に依存している。イクオリンの基本的活性は、GPCR刺激が存在しない場合は、非常に低い。細胞がGPCRアゴニストに曝された場合は、細胞内カルシウム濃度の上昇が、イクオリン酵素を活性化し、閃光ルミネセンスシグナルを生じる。発光強度は、細胞内カルシウム増加に比例する。
【０１７３】
本願明細書に引用した参考文献は、その全体が本願明細書に参照として組入れられている。
本発明の様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱しない限りは、変更することができることは理解されるであろう。更に前述の説明は、単に例証を目的とするものであり、限定を目的とするものではなく、本発明は添付された「特許請求の範囲」によって定義される。
【配列表】
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2005512539.tif 000306
2005512539.tif 000307
【国際調査報告】
2005512539.tif 000308
2005512539.tif 000309
2005512539.tif 000310
2005512539.tif 000311