(57)【要約】本発明は、ＣＸＣＲ４活性または発現の調節により、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）増殖および転移を調節するための新規方法および組成物を提供する。ＣＸＣＲ４活性または発現の調節により、ＳＣＬＣ増殖および転移を調節する化合物を同定する方法も提供される。さらに、ＳＣＬＣ増殖および転移を処置する方法、ならびに対象が、ＣＸＣＲ４活性の調節によりＳＣＬＣの処置の適当な候補であるか、否かを決定する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
小細胞肺癌の細胞集団の細胞の増殖を阻害する方法であって、該集団をＣＸＣＲ４インヒビターと接触させることを含む、方法。
【請求項２】
小細胞肺癌の細胞集団の細胞の運動または移動を阻害する方法であって、該集団をＣＸＣＲ４インヒビターと接触させることを含む、方法。
【請求項３】
小細胞肺癌の細胞集団の細胞の接着を阻害する方法であって、該集団をＣＸＣＲインヒビターと接触させることを含む、方法。
【請求項４】
小細胞肺癌の細胞集団の形態的変化を阻害する方法であって、該集団をＣＸＣＲ４インヒビターと接触させることを含む、方法。
【請求項５】
小細胞肺癌の細胞集団を受容体チロシンキナーゼインヒビターと接触させることをさらに含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
受容体チロシンキナーゼインヒビターがｃ−Ｋｉｔインヒビターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
小細胞肺癌の対象を処置する方法であって、ＣＸＣＲ４インヒビターを該対象に投与することを含む、方法。
【請求項８】
受容体チロシンキナーゼインヒビターを対象に投与することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
受容体チロシンキナーゼインヒビターがｃ−Ｋｉｔインヒビターである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
対象での小細胞肺癌の転移を阻害する方法であって、ＣＸＣＲ４インヒビターを該対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
受容体チロシンキナーゼインヒビターを対象に投与することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
受容体チロシンキナーゼインヒビターがｃ−Ｋｉｔインヒビターである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
小細胞肺癌を処置するために用いられ得る薬物を同定する方法であって、該薬物がＣＸＣＲ４を阻害するか否かを決定することを含む、方法。
【請求項１４】
ＣＸＣＲ４インヒビターが、小細胞肺癌を処置するために用いられ得るか否かを決定する方法であって、
ａ）肺癌細胞試料を採取すること；および
ｂ）細胞がＣＸＣＲ４を発現するか否かを決定すること；
これにより、ＣＸＣＲ４が発現する場合、ＣＸＣＲ４インヒビターが小細胞肺癌を処置するために用いられ得ることが決定されること、
を含む、方法。
【請求項１５】
ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せが、小細胞肺癌を処置するために用いられ得るか否かを決定する方法であって、
ａ）肺癌細胞試料を採取すること；および
ｂ）該細胞が、ＣＸＣＲ４、および該受容体チロシンキナーゼインヒビターで阻害される受容体チロシンキナーゼを発現するか否かを決定すること；
これにより、ＣＸＣＲ４および受容体チロシンキナーゼが発現する場合、ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せが、小細胞肺癌を処置するために用いられ得ることが決定されること、
を含む、方法。
【請求項１６】
受容体チロシンキナーゼインヒビターがｃ−Ｋｉｔインヒビターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＸＣＲ４インヒビターが、小細胞肺癌の増殖または転移を阻害するために用いられ得るか否かを決定する方法であって、
ａ）肺細胞試料を採取すること；および
ｂ）該細胞がＣＸＣＲ４を発現するか否かを決定すること；
これにより、ＣＸＣＲ４が発現する場合、ＣＸＣＲ４インヒビターが、小細胞肺癌の増殖または転移を阻害するために用いられ得ることが決定されること、
を含む、方法。
【請求項１８】
ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せが、小細胞肺癌の増殖または転移を阻害するために用いられ得るか否かを決定する方法であって、
ａ）肺細胞試料を採取すること；および
ｂ）該細胞が、ＣＸＣＲ４、および該受容体チロシンキナーゼインヒビターで阻害される受容体チロシンキナーゼを発現するか否かを決定すること；
これにより、ＣＸＣＲ４および受容体チロシンキナーゼが発現する場合、ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せが、小細胞肺癌の増殖または転移を阻害するために用いられ得ることが決定されること、
を含む、方法。
【請求項１９】
受容体チロシンキナーゼインヒビターがｃ−Ｋｉｔインヒビターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
患者が、ＣＸＣＲ４を阻害する薬物での処置の利益を受けるか否かを決定する方法であって、
ａ）患者から肺試料を採取すること；および
ｂ）ＣＸＣＲ４が該試料中で発現されるか否かを決定すること、
を含む、方法。
【請求項２１】
患者が、ＣＸＣＲ４を阻害する薬物、およびｃ−Ｋｉｔを阻害する薬物での処置の利益を受けるか否かを決定する方法であって、
ａ）患者から肺試料を採取すること；
ｂ）ＣＸＣＲ４が該試料で発現するか否かを決定すること；および
ｃ）ｃ−Ｋｉｔが該試料で発現するか否かを決定すること、
を含む、方法。
【請求項２２】
ＣＸＣＲ４インヒビターでの処置が、小細胞肺癌の患者で続けられるべきか、または中止されるべきかを決定する方法であって、
ａ）処置期間中に、腫瘍細胞を含む２つ以上の試料を患者から採取すること；
ｂ）腫瘍細胞でのＣＸＣＲ４の活性レベルを決定すること；および
ｃ）ＣＸＣＲ４の活性が処置中に増加しない場合、処置を続けること、
を含む方法。
【請求項２３】
ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せでの処置が、小細胞肺癌の患者で続けられるべきか、または中止されるべきかを決定する方法であって、
ａ）処置期間中、腫瘍細胞を含む２つ以上の試料を患者から採取すること；
ｂ）腫瘍細胞でのＣＸＣＲ４の活性レベルを決定すること；
ｃ）腫瘍細胞でのｃ−Ｋｉｔの活性レベルを決定すること；および
ｄ）ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの活性レベルが処置中増加しない場合、処置を続けること、
を含む、方法。
【請求項２４】
対象の処置方法で使用するための、ＣＸＣＲ４インヒビター。
【請求項２５】
小細胞肺癌の細胞集団の細胞の増殖を阻害すること、小細胞肺癌の細胞集団の細胞の移動または運動を阻害すること、小細胞肺癌の細胞集団の細胞の接着を調節すること、小細胞肺癌の細胞集団の形態的変化を阻害すること、小細胞肺癌の対象を処置すること、または対象での小細胞肺癌の転移を阻害すること、の様な方法で使用するための製剤または医薬組成物のための、ＣＸＣＲ４インヒビターの使用。
【請求項２６】
対象の処置方法、好ましくは、小細胞肺癌の細胞集団の細胞の増殖を阻害すること、小細胞肺癌の細胞集団の細胞の移動または運動を阻害すること、小細胞肺癌の細胞集団の細胞の接着を調節すること、小細胞肺癌の細胞集団の形態的変化を阻害すること、小細胞肺癌を処置すること、または小細胞肺癌の転移を阻害すること、の様な方法で同時、併用、別々、または連続使用するための、（ａ）ＣＸＣＲ４インヒビター、および（ｂ）特に、ｃ−Ｋｉｔインヒビターの様な受容体チロシンキナーゼインヒビターを含む組合せ（ここで、有効成分（ａ）および（ｂ）は、それぞれの場合で遊離形または医薬的に許容される塩の形で存在する）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、特徴的な初期転移を伴う侵襲性の癌である。最も有効な治療法でさえ、ＳＣＬＣ患者の全生存率は、初期の疾病で１２％、そして転移性疾病で２％のみである。転移性疾病は通常、ＳＣＬＣ患者の約３分の２で提示される。通常の転移部位は、肝臓、副腎、脳、骨、および骨髄を含む（Chute, J.P. et al. (1999) J. Clin. Oncol. 17:1794-801；Chute, J.P. et al. (1997) Mayo Clin. Proc. 72:901-12；Salgia, R. (1996) Adv. Oncol. 12:8-15）。ＳＣＬＣでのリンパ節および様々な器官への転移機序を理解することは、さらなる治療法を設計する際に重要である。
【０００２】
ＳＣＬＣは、いくつかの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の過剰発現を特徴とする。該ＲＴＫのいくつかは、プロトオンコジーンであり、かつ細胞成長、分化、生存、および運動の鍵となる制御因子である。最近の研究により、該ＲＴＫを標的とするＳＣＬＣの新規治療薬剤が同定され始めた（Gibbs, J.B. and Oliff, A. (1994) Cell 79:193-8； Levitzki, A. and Gazit, A. (1995) Science 267:1782-8）。ｃ−Ｍｅｔおよびｃ−Ｋｉｔ  ＲＴＫが、ＳＣＬＣで重要であると同定された。分子量１４５ｋＤａのプロトオンコジーン産物であるｃ−Ｋｉｔ受容体は、ｃ−Ｆｍｓ、Ｆｌｔ３、および血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）に類似のクラスＩＩＩ  ＲＴＫである。該ｃ−Ｋｉｔタンパク質は、細胞外領域に５つの免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通型ドメイン、およびキナーゼインサートが間に入った２つのキナーゼドメインを有する細胞質ドメインを含有する（Ashman, L.K. (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31:1037-51； Linnekin, D. (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31:1053-74； Matthews, W. et al. (1991) Cell 65:1143-52）。ＳＣＬＣ腫瘍標本の約７０％、および細胞株は、ｃ−Ｋｉｔおよびその天然のリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）を共に発現する。ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ経路は、ＳＣＬＣでのオートクリンまたはパラクリンの機能である（Hibi, K. et al. (1991) Oncogene 6:2291-6； Krystal, G.W. et al. (1996) Cancer Res. 56:370-6； Plummer, H., 3rd et al. (1993) Cancer Res. 53:4337-42； Rygaard, K. et al. 91993) Br. J. Cancer 67:37-46； Sekido, Y. et al. (1991) Cancer Res. 51:2416-9； Sekido, Y. et al. (1993) Cancer Res. 53:1709-14； Yamanishi, Y. et al. (1996) Jpn. J. Cancer Res. 87:534-42）。該ｃ−Ｋｉｔ受容体は、新規チロシンキナーゼインヒビターであるメシル酸イマチニブ（ＳＴＩ５７１またはGleevec［登録商標］としても言及される（Krystal, G.W. et al. (1997) Cancer Res. 57:2203-8； Krystal, G.W. et al. (2001) Cancer Res. 61:3660-8； Krystal, G.W. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:3319-26； Tuveson, D.A. et al. (2001) Oncogene 20:5054-8； Wang, W.L. et al. (2000) Oncogene 3521-8））を含む、様々なインヒビターで阻害され得る。化学名４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドを有するＳＴＩ５７１はさらに、ＥＰ  ０  ５６４  ４０９で記載され、そして、メタンスルホン酸塩の形、特に、好ましいβ結晶形がＷＯ  ９９／０３８５４に記載されている。
【０００３】
造血細胞において、ｃ−Ｋｉｔ受容体は、ケモカイン受容体を含む様々な分子と機能的に相互作用することが示された（Dutt, P. et al. (1998) J. Immunol. 161:3652-8； Kim, C.H. and Broxmeyer, H.E. (1998) Blood 91:100-10； Lataillade, J.J. et al. (2000) Blood 95:756-68； Peled, A. et al. (1999) Science 283:845-8）（１３、２１、２６、３３）。ＳＣＬＣ、特に、転移性ＳＣＬＣを処置するための既存の治療法がないので、新規治療法の同定のため、ＳＣＬＣで用いられるさらなる分子標的を同定する必要がある。
【０００４】
発明の要約
本発明は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の同定、診断、および治療のための方法および組成物を提供する。本発明は、ＳＣＬＣ細胞において、ＣＸＣＲ４が偏在性に発現し、かつｃ−Ｋｉｔが変動して発現するという発見に少なくとも一部基づく。本発明は、ストローマ細胞由来因子１α（ＳＤＦ−１α）、および／または幹細胞因子（ＳＣＦ）（それぞれ、ＣＸＣＲ４、およびｃ−Ｋｉｔのリガンドである）でのＳＣＬＣ細胞の処置が、増殖を誘導し、そしてＳＣＬＣ細胞の接着、運動、および細胞形態を制御するという発見にさらに基づく。本発明は、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）が、ＳＣＬＣ細胞のＳＤＦ−１α誘導性細胞運動を制御すること、ＣＸＣＲ４とｃ−Ｋｉｔが共同して、ＳＣＬＣ細胞の形態的変化を誘導すること、ＳＤＦ−１αおよびＳＣＦが独立して、Ａｋｔおよびｐ７０  Ｓ６キナーゼのリン酸化を制御すること、およびＳＴＩ５７１（メシル酸イマチニブまたはGleevec［登録商標］としても言及されるｃ−Ｋｉｔインヒビター）、およびＬＹ２９４００２（ＰＩ３−Ｋインヒビター）が、ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ経路のシグナル伝達を阻害するという発見になおさらに基づく。
【０００５】
または、１つの実施態様において、本発明は、小細胞肺癌の細胞集団での細胞増殖、細胞移動または運動、および形態的変化を阻害する方法を提供し、これは、該集団をＣＸＣＲ４インヒビターと接触させることを含む。別の実施態様において、本発明は、小細胞肺癌の細胞集団での細胞接着を調節する方法を提供し、これは、該集団をＣＸＣＲ４インヒビターと接触させることを含む。好ましい実施態様において、小細胞肺癌の細胞集団でのＰＩ３−Ｋ活性は、ダウンレギュレートされる。
【０００６】
１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する。別の実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、抗体または抗体フラグメントである。なお別の実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、低分子、例えば、ＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５である。別の実施態様において、本発明の方法は、小細胞肺癌の細胞集団を受容体チロシンキナーゼインヒビター、例えば、メシル酸イマチニブ（Gleevec［登録商標］）の様なｃ−Ｋｉｔインヒビターと接触させることをさらに含む。
【０００７】
別の実施態様において、本発明は小細胞肺癌の対象を処置する方法を提供し、これは、ＣＸＣＲ４インヒビターを該対象に投与することを含む。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する。別の実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、抗体または抗体フラグメントである。なお別の実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、低分子、例えば、ＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５である。別の実施態様において、方法は、受容体チロシンキナーゼインヒビター、例えば、メシル酸イマチニブ（Gleevec［登録商標］）の様なｃ−Ｋｉｔインヒビターを該対象に投与することをさらに含む。好ましい実施態様において、対象の小細胞肺癌の細胞でのＰＩ３−Ｋ活性は、ダウンレギュレートされる。
【０００８】
別の実施態様において、本発明は、対象での小細胞肺癌の転移を阻害する方法を提供し、これは、ＣＸＣＲ４インヒビターを該対象に投与することを含む。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する。別の実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、抗体または抗体フラグメントである。なお別の実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、低分子、例えば、ＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５である。別の実施態様において、方法は、受容体チロシンキナーゼインヒビター、例えば、メシル酸イマチニブ（Gleevec［登録商標］）の様なｃ−Ｋｉｔインヒビターを対象に投与することをさらに含む。好ましい実施態様において、対象の小細胞肺癌の細胞でのＰＩ３−Ｋ活性は、ダウンレギュレートされる。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は、小細胞肺癌を処置するために用いられ得る薬物を同定する方法を提供し、これは、例えば、該薬物が、ＣＸＣＲ４との結合に関してＳＤＦ−１αと競合可能か否か、該薬物が、ＳＤＦ−１α仲介性の細胞増殖、接着、運動、または細胞形態を阻害可能か否か、および／または該薬物が、ＰＩ３−Ｋ活性（例えば、Ａｋｔおよびｐ７０  Ｓ６キナーゼのリン酸化）を阻害するか否かを決定することにより、該薬物がＣＸＣＲ４を阻害するか否かを決定することを含む。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４インヒビターが、小細胞肺癌を処置するために用いられ得るか否かを決定する方法を提供し、これは、肺癌細胞試料を（例えば、細胞株または対象から）採取すること、および該細胞が、ＣＸＣＲ４を発現するか否かを決定すること（例えば、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを測定することによる）（これにより、ＣＸＣＲ４が発現している場合、ＣＸＣＲ４インヒビターが小細胞肺癌を処置するために用いられ得ることが決定される）を含む。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する（例えば、抗体、抗体フラグメント、またはＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５の様な低分子）。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せが、小細胞肺癌を処置するために用いられ得るか否かを決定する方法を提供し、これは、肺癌細胞試料を（例えば、細胞株または対象から）採取すること、および該細胞がＣＸＣＲ４を発現するか否かを決定すること（例えば、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ、および／またはタンパク質レベルを測定することによる）、そしてさらに、該細胞が、該受容体チロシンキナーゼインヒビターにより阻害される受容体チロシンキナーゼも発現するか否かを決定すること（例えば、該受容体チロシンキナーゼのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを測定することによる）（これにより、ＣＸＣＲ４および受容体チロシンキナーゼが発現している場合、ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せが、小細胞肺癌を処置するために用いられ得ることが決定される）を含む。本方法の好ましい実施態様において、該受容体チロシンキナーゼインヒビターは、例えば、メシル酸イマチニブ（Gleevec［登録商標］）の様なｃ−Ｋｉｔインヒビターである。ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する（例えば、抗体、抗体フラグメント、またはＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５の様な低分子）。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４インヒビターが、小細胞肺癌の増殖または転移を阻害するために用いられ得るか否かを決定する方法を提供し、これは、肺細胞試料を（例えば、細胞株または対象から）採取すること、および該細胞が、ＣＸＣＲ４を発現しているか否かを決定すること（例えば、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを測定することによる）（これにより、ＣＸＣＲ４が発現している場合、ＣＸＣＲ４インヒビターが、小細胞肺癌の増殖または転移を阻害するために用いられ得ることが決定される）を含む。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する（例えば、抗体、抗体フラグメント、またはＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５の様な低分子）。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せが、小細胞肺癌の増殖または転移を阻害するか否かを決定する方法を提供し、これは、肺細胞試料を（例えば、細胞株または対象から）採取すること、および該細胞が、ＣＸＣＲ４を発現するか否かを決定すること（例えば、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを測定することによる）、そしてさらに、該細胞が、該受容体チロシンキナーゼインヒビターにより阻害される受容体チロシンキナーゼも発現するか否かを決定すること（例えば、受容体チロシンキナーゼのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを測定することによる）（ここで、ＣＸＣＲ４および受容体チロシンキナーゼが発現する場合、該ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せが、小細胞肺癌の増殖または転移を阻害するために用いられ得ることが決定される）を含む。本方法の好ましい実施態様において、受容体チロシンキナーゼインヒビターは、例えば、メシル酸イマチニブ（Gleevec［登録商標］）の様なｃ−Ｋｉｔインヒビターである。ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する（例えば、抗体、抗体フラグメント、またはＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５の様な低分子）。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は、患者が、ＣＸＣＲ４を阻害する薬物での処置の利益を受けるか否かを決定する方法を提供し、これは、患者から肺試料を採取すること、およびＣＸＣＲ４が、該試料で発現するか否かを決定すること（例えば、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを測定することによる）を含む。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、患者が、ＣＸＣＲ４を阻害する薬物、およびｃ−Ｋｉｔを阻害する薬物での処置の利益を受けるか否かを決定する方法を提供し、これは、患者から肺試料を採取すること、およびＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔが、該試料で発現するか否かを決定すること（例えば、ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルを測定することによる）を含む。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４インヒビターでの処置が、小細胞肺癌の患者で続けられるべきか、または中止されるべきかを決定する方法を提供し、これは、処置期間中に、腫瘍細胞を含む２以上の試料を患者から採取すること、腫瘍細胞でのＣＸＣＲ４の活性レベルを決定すること、およびＣＸＣＲ４の活性が処置中に増加しない場合、処置を続けることを含む。好ましい実施態様において、腫瘍細胞でのＣＸＣＲ４の活性レベルは、増殖、接着、運動、細胞形態、または細胞のＰＩ３−Ｋ活性を調節するためのＳＤＦ−１αの能力を決定することにより、決定される。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せでの処置が、小細胞肺癌の患者で続けられるべきか、または中止されるべきかを決定する方法を提供し、これは、処置期間中に、腫瘍細胞を含む２以上の試料を患者から採取すること、腫瘍細胞でのＣＸＣＲ４の活性レベルを決定すること、腫瘍細胞でのｃ−Ｋｉｔの活性レベルを決定すること、および該ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉの活性レベルが、処置中に増加しない場合、処置を続けられることを含む。好ましい実施態様において、腫瘍細胞でのＣＸＣＲ４の活性レベルは、増殖、接着、運動、細胞形態、または細胞のＰＩ３−Ｋ活性を調節するためのＳＤＦ−１αの能力を決定することにより、決定される。さらに好ましい実施態様において、腫瘍細胞でのｃ−Ｋｉｔの活性レベルは、増殖、接着、運動、細胞形態、または細胞のＰＩ３−Ｋ活性を調節するためのＳＣＦの能力を決定することにより、決定される。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は、対象の処置方法で使用するためのＣＸＣＲ４インヒビターを提供する。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する（例えば、抗体、抗体フラグメント、またはＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５の様な低分子）。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は、小細胞肺癌の細胞集団での細胞増殖を阻害すること、小細胞肺癌の細胞集団での細胞移動または運動を阻害すること、小細胞肺癌の細胞集団での細胞接着を調節すること、小細胞肺癌の細胞集団での形態的変化を阻害すること、小細胞肺癌の対象を処置すること、または対象の小細胞肺癌の転移を阻害することの様な方法で使用するための医薬組成物の製造のための、ＣＸＣＲ４インヒビターの使用を提供する。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する（例えば、抗体、抗体フラグメント、またはＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５の様な低分子）。
【００２０】
別の実施態様において、本発明は、特に、対象の処置方法、好ましくは、小細胞肺癌の細胞集団での細胞増殖を阻害すること、小細胞肺癌の細胞集団での細胞移動または運動を阻害すること、小細胞肺癌の細胞集団での細胞接着を調節すること、小細胞肺癌の細胞集団での形態的変化を阻害すること、小細胞肺癌を処置すること、または小細胞肺癌の転移を阻害することの様な方法で、同時、併用、別々、または連続して使用するため、（ａ）ＣＸＣＲ４インヒビター、および（ｂ）特に、ｃ−Ｋｉｔインヒビターの様な受容体チロシンキナーゼインヒビターを含む組合せ（ここで、有効成分（ａ）および（ｂ）は、それぞれの場合で、遊離形または医薬的に許容される塩の形で存在する）を提供する。本方法の好ましい実施態様において、受容体チロシンキナーゼインヒビターは、例えば、メシル酸イマチニブ（Gleevec［登録商標］）の様なｃ−Ｋｉｔインヒビターである。ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４またはＳＤＦ−１αと結合する（例えば、抗体、抗体フラグメント、またはＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、またはＡＭＤ−３４６５の様な低分子）。
本発明の他の特徴および利点は、次の詳細な説明および請求項から明らかであろう。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の細胞において、ＣＸＣＲ４が偏在性に発現し、かつｃ−Ｋｉｔが変動して発現するという発見に少なくとも一部基づく。本発明は、ＳＤＦ−１αおよび／またはＳＣＦ（それぞれ、ＣＸＣＲ４、およびｃ−Ｋｉｔのリガンドである）でのＳＣＬＣ細胞の処置が、増殖を誘導し、かつＳＣＬＣ細胞の接着、運動、および細胞形態を制御するという発見にさらに基づく。本発明は、ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）が、ＳＣＬＣ細胞のＳＤＦ−１α誘導性の細胞運動を制御すること、ＣＸＣＲ４とｃ−Ｋｉｔが共同して、ＳＣＬＣ細胞の形態的変化を誘導すること、ＳＤＦ−１αおよびＳＣＦが独立して、Ａｋｔ、およびｐ７０  Ｓ６キナーゼのリン酸化を制御すること、およびＳＴＩ５７１（メシル酸イマチニブまたはGleevec［登録商標］としても言及されるｃ−Ｋｉｔインヒビター）、およびＬＹ２９４００２（ＰＩ３−Ｋインヒビター）が、ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ経路のシグナル伝達を阻害するという発見になおさらに基づく。
【００２２】
ケモカインは、造血細胞の様々なサブセットを、そのＧタンパク質共役受容体との相互作用により、ホームスペシフィックな解剖学的部位へ向けるサイトカイン様小ペプチドである（Rossi, D. and Zlotnick, A. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18:217-42； Zlotnick, A. and Yoshie, O. (2000) Immunity 12:121-7）。ＣＸＣＲ４は、７回膜貫通型のＧタンパク質共役受容体であり、かつヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の受容体としても知られている（Bleul, C.C. et al. (1996) Nature 382:829-3； Feng, Y. et al. (1996) Science 272:872-7； Nagasawa, T. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14726-9）。ＣＸＣＲ４の天然のリガンドであるＳＤＦ−１αは、造血前駆細胞に対する走化活性を有するＣＸＣケモカインファミリーのメンバーである（Aiuti, A. et al. (1997) J. Exp. Med. 185:111-20； Jo, D.Y. et al. (2000) J. Clin. Invest. 105:101-11； Nagasawa, T. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2305-9； Nagasawa, T. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14726-9）。現在までのところ、ケモカイン受容体およびサイトカイン受容体との相互作用の役割は、ＳＣＬＣの様な固形腫瘍のためのものであるとは明らかになっていない。
【００２３】
従って、本発明は、ＳＣＬＣの同定、診断、および治療のための方法および組成物を提供する。特に、本発明は、ＳＣＬＣ細胞のＣＸＣＲ４活性を調節することにより、ＳＣＬＣの成長、増殖、運動、移動、接着、形態的変化、および／または転移の調節のための方法および組成物を提供する。ある実施態様においては、ｃ−Ｋｉｔ活性も調節される。従って、本発明の１つの態様は、ある種の保存構造および機能的特徴を有する分子ファミリーを含み、かつ活性と関係するタイプＩ筋形成で働くか、または機能する、本明細書でＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ核酸およびタンパク質分子として言及される、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ分子の使用に関する。本発明のタンパク質および核酸分子に言及する際の用語「ファミリー」は、本明細書で記載の共通構造ドメインを有し、かつ十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する、２つ以上のタンパク質または核酸分子を意味することが意図されている。該ファミリーのメンバーは、天然に存在し得るものであるし、かつ同一または異なる種のいずれか由来のものであり得る。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第１のタンパク質、ならびにヒト起源の他の別のタンパク質を含有可能であるか、または非ヒト起源の相同体を含有可能である。ファミリーのメンバーは、共通機能的特徴も有する。
【００２４】
本発明の別の態様は、ＳＣＬＣの対象を処置する方法に関する。該方法は、処置が生じるように、ＣＸＣＲ４モジュレーターおよび／またはｃ−Ｋｉｔモジュレーターを対象に投与する段階を含む。好ましい実施態様において、ＣＸＣＲ４モジュレーターで処置される対象は、ＣＸＣＲ４を発現するＳＣＬＣ細胞を有する。さらに好ましい実施態様において、ＣＸＣＲ４モジュレーターおよびｃ−Ｋｉｔモジュレーターで処置される対象は、ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ共に発現するＳＣＬＣ細胞を有する。本明細書で用いられる用語「処置する」または「処置」は、少なくとも１つの副作用、またはＳＣＬＣの症状（例えば、腫瘍量、腫瘍サイズ、腫瘍細胞の増殖、遊走、運動、接着、および／または形態的変化）の改善または緩和に言及する。
【００２５】
本明細書で用いられるＣＸＣＲ４モジュレーターは、ＣＸＣＲ４核酸発現および／またはＣＸＣＲ４タンパク質活性を調節し得る分子である。例えば、ＣＸＣＲ４モジュレーターは、ＣＸＣＲ４核酸発現を調節、すなわち、アップレギュレート（活性化）またはダウンレギュレート（抑制）し得る。別の例では、ＣＸＣＲ４モジュレーターは、ＣＸＣＲ４タンパク質活性を調節（すなわち、刺激または阻害）し得る。好ましい実施態様において、本発明の方法は、ＣＸＣＲ４インヒビター、すなわち、ＣＸＣＲ４活性を阻害する薬物を用いる。ＣＸＣＲ４インヒビターの非制限的例としては、ＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、およびＡＭＤ−３４６５の様な低分子、または本明細書に記載のスクリーニング方法で同定される低分子または薬物を含む。ＣＸＣＲ４インヒビターは、ＣＸＣＲ４核酸発現も阻害する（例えば、アンチセンス分子、すなわち、本明細書で記載のリボザイム）。ＣＸＣＲ４核酸発現を阻害するために用いられ得るアンチセンス分子の例は、配列番号：１（開始コドンも含む）の５’非翻訳領域の一部に対して相補的なアンチセンス分子、および配列番号：１の３’非翻訳領域の一部に対して相補的なアンチセンス分子を含む。ＣＸＣＲ４核酸発現を阻害するＣＸＣＲ４モジュレーターは、低分子または他の薬物（すなわち、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを用いて同定される低分子または薬物であり、ＣＸＣＲ４核酸発現を阻害する）であり得る。従って、本発明のＣＸＣＲ４分子は、分子（すなわち、ＣＸＣＲ４活性を調節可能）をスクリーニングするための標的としても用いられ得る。ＣＸＣＲ４モジュレーターは、抗体または抗体フラグメントであってもよい。ＣＸＣＲ４モジュレーターは、ＣＸＣＲ４活性を遮断または阻害するＳＤＦ−１α形、例えば、ＳＤＦ−１αのドミナント・ネガティブ形であってもよい。
【００２６】
本明細書で用いられるｃ−Ｋｉｔモジュレーターは、ｃ−Ｋｉｔ核酸発現および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質活性を調節し得る分子である。例えば、ｃ−Ｋｉｔモジュレーターは、ｃ−Ｋｉｔ核酸発現を調節、すなわち、アップレギュレート（活性化）またはダウンレギュレート（抑制）し得る。別の例では、ｃ−Ｋｉｔモジュレーターは、ｃ−Ｋｉｔタンパク質活性を調節（すなわち、刺激または阻害）し得る。好ましい実施態様において、本発明の方法は、ｃ−Ｋｉｔインヒビター、すなわち、ｃ−Ｋｉｔ活性を阻害する薬物を用いる。ＣＸＣＲ４インヒビターの非制限的例としては、本明細書に記載のスクリーニング方法により同定される低分子または薬物を含む。好ましい実施態様において、ｃ−Ｋｉｔインヒビターは、ＳＴＩ５７１またはGleevec［登録商標］（Novartis (Basel, Switzerland)より市販）として互換して本明細書で言及されるメシル酸イマチニブの様な受容体チロシンキナーゼインヒビターである（Savage, D.G. and Antman, K.H. (2002) N. Engl. J. Med. 346(9):683-93； Mauro, M.J. et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):325-34； Schiffer, C.A. (2001) Semin. Oncol. 28(5 Suppl 17):34-9； Demetri, G.D. (2001) Semin. Oncol. 28(5 Suppl 17):19-26； Griffin, J. (2001) Semin. Oncol. 28(5 Suppl 17):3-8； Verweij, J. et al. (2001) Eur. J. Cancer. 37(15):1816-9； Shah, N.P. and Sawyers, C.L. (2001) Curr. Opin. Investig. Drugs. 2(3):422-3）。
【００２７】
ｃ−Ｋｉｔインヒビターは、ｃ−Ｋｉｔ核酸発現も阻害する（例えば、アンチセンス分子、すなわち、本明細書に記載のリボザイム）。ｃ−Ｋｉｔ核酸発現を阻害するために用いられ得るアンチセンス分子の例としては、配列番号：３（開始コドンも含む）の５’非翻訳領域の一部と相補的なアンチセンス分子、および配列番号：３の３’非翻訳領域の一部と相補的なアンチセンス分子を含む。ｃ−Ｋｉｔ核酸発現を阻害するｃ−Ｋｉｔモジュレーターは、低分子または他の薬物（すなわち、本明細書に記載のスクリーニングアッセイを用いて同定される低分子または薬物であり、ｃ−Ｋｉｔ核酸発現を阻害する）でもあり得る。従って、本発明のｃ−Ｋｉｔ分子は、分子（すなわち、ｃ−Ｋｉｔ活性を調節可能）をスクリーニングするための標的として用いられ得る。ｃ−Ｋｉｔモジュレーターは、抗体または抗体フラグメントであってもよい。ｃ−Ｋｉｔモジュレーターは、ｃ−Ｋｉｔ活性を遮断または阻害するＳＣＦ形、例えば、ＳＣＦのドミナント・ネガティブ形であってもよい。
【００２８】
本発明の他の態様は、細胞関連活性を調節する方法に関する。該方法は、細胞を、細胞関連活性が、薬物の非存在下での細胞の細胞関連活性と比較して変化されるように、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質活性、またはＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現を調節する薬物（または、薬物を有効量含む組成物）と接触させることを含む。本明細書で用いられる「細胞関連活性」は、細胞（例えば、ＳＣＬＣ細胞）の正常または異常活性または機能を意味する。細胞関連活性の例は、増殖、成長、移動、運動、接着、および／または形態的変化を含む。好ましい実施態様において、細胞関連活性は、転移である。本明細書で用いられる用語「変化される」は、細胞関連活性の変化、すなわち、増加または減少を意味する。好ましい実施態様において、薬物は、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質活性、またはＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現を阻害する。該阻害性薬物の例は、ドミナント・ネガティブなＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、ドミナント・ネガティブなＳＤＦ−１αおよび／またはＳＣＦタンパク質をコード化する核酸分子、アンチセンスＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ核酸分子、抗ＣＸＣＲ４および／または抗ｃ−Ｋｉｔ抗体または抗体フラグメント、およびＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質活性、またはＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現を阻害し、かつ本明細書に記載の薬物スクリーニングアッセイを用いて同定される調節性の薬物を含む。該調節性の方法は、試験管内（すなわち、細胞を薬物と共に培養することによる）、または生体内（すなわち、薬物を対象に投与することによる）で行われ得る。好ましい実施態様において、調節性の方法は、生体内（すなわち、細胞が対象、すなわち動物、すなわちヒトに存在し、かつ対象がＳＣＬＣを有する）で行われる。
【００２９】
従って、本発明の方法は：１）ＳＣＬＣ細胞の成長を調節し；２）ＳＣＬＣ細胞の増殖を調節し；３）ＳＣＬＣ細胞の移動を調節し；４）ＳＣＬＣ細胞の運動を調節し；５）ＳＣＬＣ細胞の接着を調節し；６）ＳＣＬＣ細胞の細胞形態および／または形態的変化を調節し；７）ＳＣＬＣ細胞の転移を調節し；８）ＣＸＣＲ４活性を調節し；９）ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ活性を調節し；１０）ＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１αとの結合を調節し；１１）ｃ−ＫｉｔのＳＣＦとの結合を調節し；および／または１２)ＰＩ３−Ｋ活性を調節する。
【００３０】
処置方法で用いられる核酸分子、タンパク質、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔモジュレーター、化合物等が、本明細書に記載の適当な医薬組成物に取り込まれ、そして該分子、タンパク質、モジュレーター、または化合物等が、その意図される機能を達成することを可能とする経路を介して、対象に投与され得る。投与経路の例は、本明細書でも記載される。
【００３１】
ヒトＣＸＣＲ４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびヒトＣＸＣＲ４タンパク質の推定アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：１および２に示される。約１６７９ヌクレオチド長の該ヒトＣＸＣＲ４遺伝子は、分子量約３８．７ｋＤａを有し、そして約３５２アミノ酸残基の長さである、全長タンパク質をコード化する。ヒトＣＸＣＲ４核酸およびポリペプチド配列のさらなる記載は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００３４６７、およびＮＰ＿００３４５８；ならびにFedersppiel, B. et al. (1993) Genomics 16(3):707-712； Herzog, H. et al. (1993) DNA Cell Biol. 12(6):465-471； Jazin, E.E. et al. (1993) Regul. Pept. 47(3):247-258； Nomura, H. et al. (1993) Int. Immunol. 5(10):1239-1249； Loetscher, M. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(1):232-237； Moriuchi, M. et al. (1997) J. Immunol. 159(9):4322-4329； Caruz, A. et al. (1998) FEBS Lett. 426(2):271-278； and Wegner, S.A. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(8):4754-4760で見られる。
【００３２】
ヒトｃ−Ｋｉｔ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびヒトｃ−Ｋｉｔタンパク質の推定アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：３および４に示される。約５０８４ヌクレオチド長のヒトｃ−Ｋｉｔ遺伝子は、分子量約１０７．４ｋＤａを有し、そして約９４６アミノ酸残基の長さである全長タンパク質をコード化する。該ヒトｃ−Ｋｉｔ核酸およびポリペプチド配列のさらなる記載は、それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２２２およびＮＰ＿０００２１３で；ならびにYarden, Y. et al. (1987) EMBO J. 6(11):3341-3351； Andre, C. et al. (1992) Oncogene 7(4):685-691； Giebel, L.B. et al. (1992) Oncogene 7(11):2207-2217； Yamamoto, K. et al. (1993) Jpn. J. Cancer Res. 84(11):1136-1144； Toyota, M. et al. (1994) Cancer Res. 54(1):272-275； Zhu W.M. et al. (1994) Leuk. Lymphoma 12(5-6):441-447； and Andre, C. (1997) Genomics 39(2):216-226で見出され得る。
【００３３】
本発明の様々な態様は、次の段落でさらに詳細に記載される。
Ｉ．単離核酸分子
本発明の１つの態様は、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ、またはその生物学的に活性な部分をコード化する単離核酸分子、ならびにＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔコード化核酸（すなわち、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ）を同定するために、ハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸フラグメントを利用する方法に関する。本明細書で用いられる用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（すなわち、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、およびＲＮＡ分子（すなわち、ｍＲＮＡ）、およびヌクレオチド類似体を用いて生成されるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むことが意図されている。該核酸分子は、１本鎖または２本鎖であり得るが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から引き離されているものである。好ましくは、「単離」核酸は、該核酸がもたらされる生物のゲノムＤＮＡにおいて天然で該核酸と隣接する配列（すなわち、該核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施態様において、単離ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ核酸分子は、該核酸分子がもたらされる細胞（すなわち、肺細胞）のゲノムＤＮＡにおいて天然で該核酸と隣接する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子の様な「単離」核酸分子は、他の細胞材料、または組換え技術で産生される際の培養液、または化学的に合成される際の化学前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない。
【００３４】
本発明の核酸分子、すなわち、配列番号：１または３のヌクレオチド、または配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列、またはその一部（例えば、５０、１００、２００、３００、４００、４５０、５００、またはそれ以上のヌクレオチド）と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列を有する核酸分子は、標準的分子生物学的技術、および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。例えば、ヒトＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ  ｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号：１または３の全体または一部、および標準的ハイブリダイゼーション技術（すなわち、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning:  A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載）を用いて、ヒトＳＣＬＣ細胞株（Stratagene, LaJolla, CA、またはClontech, Palo Alto, CAより）から単離され得る。さらに、配列番号：１の全体または一部、または配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列を包含する核酸分子は、配列番号：１または３の配列、またはそれと相同なヌクレオチド配列に基づき設計されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応法により、単離され得る。例えば、ｍＲＮＡは、肺細胞または肺腫瘍細胞から単離され（すなわち、Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299)のグアニジウム・チオシアネート抽出法による）、そしてｃＤＮＡは、逆転写酵素（すなわち、モロニーＭＬＶ逆転写酵素、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ, Bethesda, MDより市販；またはＡＭＶ逆転写酵素、Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FLより市販）を用いて製造され得る。ＰＣＲ増幅用の合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して相同なヌクレオチド配列に基づき設計され得る。本発明の核酸は、標準的ＰＣＲ増幅技術により、鋳型としてｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ、および適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、増幅され得る。増幅された該核酸は、適当なベクターにクローン化され、ＤＮＡ配列解析により特徴付けられ得る。さらに、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術、すなわち、自動ＤＮＡ合成装置を用いて製造され得る。
【００３５】
好ましい実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列、または配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列を含む。配列番号：１の配列は、ヒトＣＸＣＲ４  ｃＤＮＡに対応する。該ｃＤＮＡは、ＣＸＣＲ４タンパク質コード化配列（すなわち、ヌクレオチド８９から１１４４の「コード領域」）、ならびに５’非翻訳配列（ヌクレオチド１から８８）、および３’非翻訳配列（ヌクレオチド１１４５から１６７９）を含む。または、核酸分子は、配列番号：１のコード領域（すなわち、ヌクレオチド８９から１１４４）のみを含み得る。配列番号：３の配列は、ヒトｃ−Ｋｉｔ  ｃＤＮＡに対応する。該ｃＤＮＡは、ｃ−Ｋｉｔタンパク質コード化配列（すなわち、ヌクレオチド２２から２９４９の「コード領域」）、ならびに５’非翻訳配列（ヌクレオチド１から２１）、および３’非翻訳配列（ヌクレオチド２９５０から５０８４）を含む。または、核酸分子は、配列番号：３のコード領域（すなわち、ヌクレオチド２２から２９４９）のみを含み得る。
【００３６】
別の好ましい実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列、または配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列と相補的な核酸分子を含む。配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列、または配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列に対して相補的な核酸分子は、それが、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列、またはそれに対して相同な配列とハイブリダイズし、これにより、安定な２本鎖を形成可能なように、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列、またはそれと相同な配列に対して十分相補的なものである。
【００３７】
なお別の好ましい実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１または３で示されるヌクレオチド配列、または該ヌクレオチド配列の一部と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列を含む。さらに好ましい実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列、または配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列と、ハイブリダイズ、すなわち、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００３８】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号：１または３のコード領域、または配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列のコード領域の一部のみ（例えば、プローブまたはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの生物学的に活性な部分をコード化するフラグメント）を含み得る。マウスまたはヒト由来のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子のクローニングより決定されるヌクレオチド配列は、他のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔファミリーのメンバー、ならびに、他の細胞種類（すなわち、他の組織由来）のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ相同体、ならびにラットまたはサルの様な他の動物由来のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ相同体の同定および／またはクローニングで用いるために設計されるプローブおよびプライマーの生成を可能とする。該プローブ／プライマーは、典型的には、実質上精製されたオリゴヌクレオチドを含む。該オリゴヌクレオチドは、典型的には、配列番号：１または配列番号：３センス、配列番号：１または配列番号：３のアンチセンス配列、またはそれらの天然に存在する変異体の少なくとも約１２、好ましくは、少なくとも約２５、より好ましくは、約４０、５０、または７５の連続ヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含む。配列番号：１または配列番号：３のヌクレオチド配列に基づくプライマーは、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ相同体をクローン化するためのＰＣＲ反応で用いられ得る。
【００３９】
ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、転写物、または同一または相同なタンパク質をコード化するゲノム配列が検出され得る。好ましい実施態様において、該プローブは、それに結合した標識群（すなわち、該標識群は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または補因子酵素であり得る）をさらに含む。該プローブは、例えば、対象由来の細胞（例えば、肺細胞）試料中のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔコード化核酸のレベルを決定すること、すなわち、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡレベルを決定すること、またはゲノムＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子が変異または欠損したか否かを決定することにより、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質を発現または異所発現する細胞または組織（例えば、肺細胞または肺腫瘍細胞）を同定するための診断検査キットの一部として用いられ得る。
【００４０】
１つの実施態様において、本発明の核酸分子は、タンパク質またはその一部が、次の生物学的活性；１）ＳＣＬＣ細胞の成長を調節できるもの；２）ＳＣＬＣ細胞の増殖を調節できるもの；３）ＳＣＬＣ細胞の移動を調節できるもの；４）ＳＣＬＣ細胞の運動を調節できるもの；５）ＳＣＬＣ細胞の接着を調節できるもの；６）ＳＣＬＣ細胞の細胞形態および／または形態的変化を調節できるもの；７）ＳＣＬＣ細胞の転移を調節できるもの；８）ＣＸＣＲ４活性を調節できるもの；９）ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ活性を調節できるもの；１０）ＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１αとの結合を調節できるもの；１１）ｃ−ＫｉｔのＳＣＦとの結合を調節できるもの；および／または１２）ＰＩ３−Ｋ活性を調節できるもののうち１つ以上を維持するように、配列番号：２または４のアミノ酸配列と、十分相同なアミノ酸配列を含む、タンパク質またはその一部をコード化する。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「十分に相同な」は、タンパク質またはその一部が、次の生物学的活性；１）ＳＣＬＣ細胞の成長を調節できるもの；２）ＳＣＬＣ細胞の増殖を調節できるもの；３）ＳＣＬＣ細胞の移動を調節できるもの；４）ＳＣＬＣ細胞の運動を調節できるもの；５）ＳＣＬＣ細胞の接着を調節できるもの；６）ＳＣＬＣ細胞の細胞形態および／または形態的変化を調節できるもの；７）ＳＣＬＣ細胞の転移を調節できるもの；８）ＣＸＣＲ４活性を調節できるもの；９）ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ活性を調節できるもの；１０）ＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１αとの結合を調節できるもの；１１）ｃ−ＫｉｔのＳＣＦとの結合を調節できるもの；および／または１２）ＰＩ３−Ｋ活性を調節できるもののうち１つ以上を維持するように、配列番号：２または４のアミノ酸配列と、最小数の同一または均等（すなわち、配列番号：２または４のアミノ酸残基と同様の側鎖を有するアミノ酸残基）なアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質またはその一部を意味する。
【００４２】
別の実施態様において、タンパク質は、配列番号：２または４の全アミノ酸配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同である。
【００４３】
本発明のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ核酸分子によりコード化されるタンパク質の一部は、好ましくは、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の生物学的に活性な部分である。本明細書で用いられる用語「ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの生物学的に活性な部分」は、次の活性；１）ＳＣＬＣ細胞の成長を調節できるもの；２）ＳＣＬＣ細胞の増殖を調節できるもの；３）ＳＣＬＣ細胞の移動を調節できるもの；４）ＳＣＬＣ細胞の運動を調節できるもの；５）ＳＣＬＣ細胞の接着を調節できるもの；６）ＳＣＬＣ細胞の細胞形態および／または形態的変化を調節できるもの；７）ＳＣＬＣ細胞の転移を調節できるもの；８）ＣＸＣＲ４活性を調節できるもの；９）ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ活性を調節できるもの；１０）ＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１αとの結合を調節できるもの；１１）ｃ−ＫｉｔのＳＣＦとの結合を調節できるもの；および／または１２）ＰＩ３−Ｋ活性を調節できるもののうち１つ以上を有するＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの一部、すなわち、ドメイン／モティーフを含むことが意図されている。
【００４４】
本明細書に記載の標準的結合アッセイ、すなわち、免疫沈降および酵母ツーハイブリッドアッセイを行い、それぞれ、ＳＤＦ−１αまたはＳＣＦと相互作用する（すなわち、結合する）ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性な部分の能力が決定され得る。
【００４５】
１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの生物学的に活性な部分は、少なくとも１個のドメインまたはモティーフを含む。１つの実施態様において、ドメインまたはモティーフを含むタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＳＣＬＣ細胞の増殖または転移を調節できるか、またはＰＩ３−Ｋシグナル伝達を調節できる。該ドメインは、本明細に記載されている。ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの生物学的に活性な部分をコード化するさらなる核酸フラグメントは、配列番号：１または３、または相同なヌクレオチド配列の一部を単離すること、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質またはペプチドのコード化部分を発現させること（すなわち、試験管内での組換え発現による）、およびＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質またはペプチドのコード化部分の活性を評価することにより、製造され得る。
【００４６】
本発明は、遺伝コードの縮重により、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列（および、その一部）と異なるが、配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列によりコード化されるものと同一のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質をコード化する核酸分子をさらに包含する。別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号：２または４のアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を有する。
【００４７】
それぞれ、配列番号：１および３に示されるヒトＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔヌクレオチド配列に加えて、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔのアミノ酸配列での変化を導くＤＮＡ配列多型が、集団内（すなわち、哺乳類集団、すなわち、ヒト集団）に存在することは、当該技術分野の技術者により理解されるだろう。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子の該遺伝子多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションにより、集団内の個体間に存在する。本明細書で用いられる用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、好ましくは、哺乳類、すなわち、ヒトのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質をコード化するオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味する。該天然の対立遺伝子のバリエーションは、典型的には、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子のヌクレオチド配列において、１〜５％の変動を生じ得る。天然の対立遺伝子のバリエーションの結果であり、かつＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの機能活性を変化させないＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔでの任意および全ての該ヌクレオチドバリエーションおよび生じたアミノ酸多型は、本発明の方法の範囲内であることが意図される。さらに、他種由来のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質をコード化し、従って、配列番号：１または３のヒトまたはマウス配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であることが意図されている。天然の対立遺伝子変異体に対応する核酸分子、および本発明のマウスまたはヒトＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ  ｃＤＮＡの相同体は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（本明細書に記載）下での標準的ハイブリダイゼーション技術に従い、ハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡ、またはその一部を用いて、本明細書で記載のヒトＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸配列に対するその相同性に基づき単離され得る。
【００４８】
さらに、他のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔファミリーのメンバーをコード化し、従って、配列番号：１または３のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子が、本発明の範囲内であることが意図されている。例えば、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの選択的スプライスアイソフォーム、他のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔファミリーのメンバー、または他種由来のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔメンバー（従って、配列番号：１および３のＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ配列と異なるヌクレオチド配列を有する）の使用は、本発明の範囲内であることが意図されている。例えば、ラットまたはサルＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｃＤＮＡが、それぞれ、ヒトＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔのヌクレオチド配列に基づき同定され得る。
【００４９】
または、別の実施態様において、本発明の単離核酸分子は、少なくとも１５ヌクレオチド長であり、かつ配列番号：１または３のヌクレオチド配列、または配列番号：１または３のヌクレオチド配列と、約６０％、好ましくは、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列を含む核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。他の実施態様において、核酸分子は、少なくとも３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチド長である。本明細書で用いられる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が、典型的には、互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件について記載されることが意図されている。好ましくは、該条件は、互いに少なくとも約６５％、より好ましくは、少なくとも約７０％、そしてなおより好ましくは、少なくとも約７５％、またはそれ以上相同な配列が、典型的には、互いにハイブリダイズしたままであるようなものである。該ストリンジェントな条件は、当該技術分野の技術者に知られており、そしてCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6でも見出される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な例は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５５〜６５℃での１回またはそれ以上の洗浄である。好ましくは、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１または配列番号：３の配列とハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書で用いられる「天然に存在する」核酸分子は、天然で生じるヌクレオチド配列を有する（すなわち、天然タンパク質をコード化する）ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。１つの実施態様において、核酸は、天然ヒトＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔをコード化する。
【００５０】
集団に存在する、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、変化が、配列番号：１または３のヌクレオチド配列への変異により誘導され、これにより、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の機能的能力を変化させることなく、コード化ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質のアミノ酸配列への変化が導かれることを、当該技術分野の技術者はさらに理解するであろう。例えば、「非必須」のアミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換は、配列番号：１または３の配列で行われ得る。「非必須」のアミノ酸残基は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの活性を変化させることなく、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの野生型配列（すなわち、それぞれ、配列番号：２または４の配列）から変化し得る残基であるが、「必須」のアミノ酸残基は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性に必要とされる。例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの結合パートナーまたは標的分子（例えば、それぞれ、ＳＤＦ−１αまたはＳＣＦ）との相互作用で関与するアミノ酸残基は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの最も必須の残基である。しかしながら、他のアミノ酸残基（すなわち、保存されていないか、またはマウスとヒトの間で幾分か保存されているもの）は、活性に必須ではなく、従って、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性を変化させない変化を受けやすいようである。さらに、ＳＣＬＣの増殖または転移と関係するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ機能に必須であるが、ＨＩＶ感染と関係するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ機能には必須でないアミノ酸残基は、変化を受けやすいようである。
【００５１】
または、本発明の別の態様は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含有するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質をコード化する核酸分子に関する。アミノ酸配列が配列番号：２および４と異なる該ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔタンパク質は、本明細書で記載のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性の少なくとも１つを依然保持している。１つの実施態様において、単離核酸分子は、配列番号：２または４のアミノ酸と少なくとも約６０％相同なアミノ酸配列を含み、かつ増殖または転移を調節できるタンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコード化されるタンパク質は、配列番号：２または４のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％相同、好ましくは、少なくとも約８０〜８５％相同、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％相同である。
【００５２】
本明細書で用いられる「配列同一性または相同性」は、２つのポリペプチド分子間、または２つの核酸分子間の配列類似性を意味する。２つの比較した配列の両方の位置が、同一塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットで占められている場合、すなわち、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンで占められていると、分子は、該位置で相同または配列同一性である。２配列間の相同性または配列同一性のパーセントは、２配列で共有される同一位置の一致数または相同数を、比較した位置数で割り、１００倍したものである。例えば、２配列の位置の１０のうち６が同一であると、該２配列は、６０％相同性であるか、または６０％の配列同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ、およびＴＡＴＧＧＣは、５０％相同性、または配列同一性を共有する。一般に、２配列が最大の相同性を生じるようにアラインメントされる場合で比較は行われる。特に記載しない限り、「ループアウト領域」、すなわち、配列の１つから、または配列の１つの欠損または挿入から生じるものは、ミスマッチとしてカウントされる。
【００５３】
２配列間の配列比較、およびパーセント相同性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行われ得る。好ましくは、該アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いて行われ得る。多数のアラインメントパラメーターは、ギャップペナルティー＝１０、ギャップレングスペナルテイー＝１０を含む。ＤＮＡアラインメントのための、対となるアラインメントパラメーターは、Ｈｔｕｐｌｅ＝２、ギャップペナルティー＝５、ウインドウ＝４、および保存対角＝４であり得る。タンパク質アラインメントのための、対となるアラインメントパラメーターは、Ｋｔｕｐｌｅ＝１、ギャップペナルティー＝３、ウインドウ＝５、および保存対角＝５であり得る。
【００５４】
好ましい実施態様において、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（オンラインで入手可能）のギャッププログラムに取り込まれた、Needleman and Wunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス、またはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、およびギャップウエイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４、およびレングスウエイト１、２、３、４、５、または６を用いて、決定される。なお別の好ましい実施態様において、２ヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（オンラインで入手可能）のギャッププログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ  ＣＭＰマトリックス、およびギャップウエイト４０、５０、６０、７０、または８０、およびレングスウエイト１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。別の実施態様において、２アミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バーション２．０）（オンラインで入手可能）に取り込まれた、E. Meyers and W. Miller（CABIOS, 4:11-17 (1989)）のアルゴリズムを用いて、ＰＡＭ１２０  ウエイトの残りの表、ギャップレングスペナルテイー１２、およびギャップペナルティー４を用いて、決定される。
【００５５】
配列番号：２または４のタンパク質と相同なＣＸＣＲ４タンパク質をコード化する単離核酸分子は、配列番号：１または３のヌクレオチド配列に１以上のヌクレオチド置換、付加、または欠損を導入することにより、または、１以上のアミノ酸置換、付加、または欠損が、コード化タンパク質に導入されるような相同なヌクレオチド配列により、生成される。変異は、部位指向性変異誘発、およびＰＣＲ仲介性変異誘発の様な標準的技術により、配列番号：１または３、または相同なヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１以上の推定非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該技術分野で定義された。該ファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝状側鎖を有するアミノ酸（すなわち、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。従って、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの推定非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一の側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置き換えられている。または、別の実施態様において、変異は、例えば、飽和変異誘発により、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード配列の全てまたは一部に沿って、ランダムに導入され、そして生じた変異は、本明細書に記載のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性についてスクリーニングされ、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性を維持する変異体が同定され得る。配列番号：１または３の変異誘発に続いて、コード化タンパク質が、組換え発現され（本明細書に記載）、そして該タンパク質の活性が、例えば、本明細書に記載のアッセイを用いて決定され得る。
【００５６】
上記のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質コード化核酸分子に加えて、本発明の別の態様は、それに対するアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質コード化「センス」核酸に相補的、すなわち、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。または、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合し得る。該アンチセンス核酸は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード鎖全体と、またはその一部のみと相補的であり得る。１つの実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード化ヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味する（すなわち、配列番号：１のコード領域全体が、ヌクレオチド８９〜１１４４を含み、かつ配列番号：４のコード領域全体が、ヌクレオチド２２〜２９４９を含む）。別の実施態様において、アンチセンス核酸分子は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード化ヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する５’および３’配列を意味する（すなわち、５’および３’非翻訳領域としても言及される）。
【００５７】
本明細書に記載のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード化コード鎖配列が与えられると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンとクリックの塩基対形成に従い設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡの全コード領域と相補的であるが、より好ましくは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域と相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の方法を用いる化学合成、および酵素ライゲーション反応を用いて、構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加するため、またはアンチセンスとセンス核酸間で形成される２本鎖の物理的安定性を増加するために設計される様々な修飾ヌクレオチドを用いて、化学的に合成され得る。すなわち、ホスホロチオエート誘導体、およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る。アンチセンス核酸を生成するために用いられ得る修飾ヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオジン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−万のシルクエオジン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、2-メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオジン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを含む。または、アンチセンス核酸は、アンチセンスの向きでクローン化された核酸を含む発現ベクターを用いて、生物学的に生成され得る（すなわち、挿入核酸から転写されるＲＮＡは、対象の標的核酸に対してアンチセンスの向きのものであり、次の段落でさらに記載される）。
【００５８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、対象に投与されるか、またはそれらが、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質コード化細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、または結合し、これにより、該タンパク質の発現を阻害、すなわち、転写および／または翻訳を阻害するように、インサイツで生成される。該ハイブリダイゼーションは、安定な２本鎖を形成するために、通常のヌクレオチド相補性によるものか、または例えば、ＤＮＡの２本鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合、２本鎖へリックスの主溝での特異的相互作用によるものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位での直接注射を含む。または、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように修飾され、そして全身投与される。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それが、選択された細胞表面に発現した受容体または抗原と特異的に結合、すなわち、アンチセンス核酸分子を細胞表面の受容体または抗原と結合するペプチドまたは抗体と結合させるように、修飾され得る。アンチセンス核酸分子は、本明細書で記載のベクターを用いても、細胞へ運ばれ得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度に至るために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下に置かれたベクター構造が、好ましい。
【００５９】
なお別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子形の特定の２本鎖は、相補的なＲＮＡ（通常のβ単位とは対照的に、鎖は互いに平行に走っている）とハイブリダイズする（Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330）も含み得る。
【００６０】
なお別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それが相補性領域を有する、ｍＲＮＡの様な１本鎖核酸を切断できる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（すなわち、ハンマーヘッドリボザイム（Haseloff and Gerlach (1988) Nature 334:585-591に記載））を用いて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ転写物が触媒的に切断され、これにより、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡの翻訳が阻害され得る。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード化核酸に対する特異性を有するリボザイムは、本明細書に記載のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号：１または３）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード化ｍＲＮＡで切断されるヌクレオチド配列に相補的である、Tetrahymena  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体が、構築され得る。すなわち、Cech等の米国特許番号４，９８７，０７１、およびCech等の米国特許番号５，１１６，７４２を参照されたい。または、ＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを用いて、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡが、ＲＮＡプールから選択され得る。すなわち、Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【００６１】
または、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子発現は、標的細胞でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子の転写を妨げる３重らせん体構造を形成するために、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの制御領域（すなわち、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることにより、阻害され得る。概論として、Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84； Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36； and Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15を参照されたい。
【００６２】
ＩＩ．単離ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔタンパク質、および抗ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ抗体
本発明の別の態様は、単離ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、ならびに、抗ＣＸＣＲおよびｃ−Ｋｉｔ抗体を生じる免疫原としての使用に適したペプチドフラグメントの使用に関する。「単離」または「精製」タンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、組換えＤＮＡ技術により産生される場合の細胞物質、または化学的に合成される場合の化学前駆体、また他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞物質を実質的に含まない」は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の調製物を含む（ここで、該タンパク質は、それが天然または組換えで産生される細胞の細胞成分から分離されている）。１つの実施態様において、用語「細胞物質を実質的に含まない」は、非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質（本明細書において、「コンタミしているタンパク質」としても言及される）を約３０％（乾燥重量）未満、より好ましくは、非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質を約２０％未満、さらにより好ましくは、非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは、非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質を５％未満有するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の調製物を含む。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性な部分が、組換えで産生される場合、それはまた、好ましくは、培養液を実質的に含まない、すなわち、培養液は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは、約１０％未満、そして最も好ましくは、約５％未満を示す。用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の調製物（ここで、該タンパク質は、タンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されている）を含む。１つの実施態様において、用語「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学前駆体、または非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ化学物質を約３０％（乾燥重量）未満、より好ましくは、化学前駆体、または非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ化学物質を約２０％未満、さらにより好ましくは、化学前駆体、または非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは、化学前駆体、または非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ化学物質を約５％未満有するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の調製物を含む。好ましい実施態様において、単離タンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質がもたらされる同一動物由来のコンタミタンパク質を含まない。典型的には、該タンパク質は、例えば、非ヒト細胞でのヒトＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の組換え発現により産生される。
【００６３】
本発明の単離ＣＸＣＲ４タンパク質またはその部分は、次の生物学的活性：１）ＳＣＬＣ細胞の成長を調節できるもの；２）ＳＣＬＣ細胞の増殖を調節できるもの；３）ＳＣＬＣ細胞の移動を調節できるもの；４）ＳＣＬＣ細胞の運動を調節できるもの；５）ＳＣＬＣ細胞の接着を調節できるもの；６）ＳＣＬＣ細胞の細胞の形態および／または形態的変化を調節できるもの；７）ＳＣＬＣ細胞の転移を調節できるもの；８）ＣＸＣＲ４活性を調節できるもの；９）ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ活性を調節できるもの；１０）ＣＸＣＲ４のＳＤＦ−１αとの結合を調節できるもの；１１）ｃ−ＫｉｔのＳＣＦとの結合を調節できるもの；および／または１２）ＰＩ３−Ｋ活性を調節できるもののうち１以上を有する。
【００６４】
好ましい実施態様において、タンパク質またはその部分は、該タンパク質またはその部分が、任意の上記のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性を調節する能力を維持するように、配列番号：２または４のアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を含む。タンパク質の部分は、好ましくは、本明細書に記載の生物学的に活性な部分である。別の好ましい実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列、または配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。なお別の好ましい実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、配列番号：１または３のヌクレオチド配列、または配列番号：１または３に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なヌクレオチド配列とハイブリダイズ、すなわち、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコード化されるアミノ酸配列を有する。本発明の方法で用いられる、好ましいＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質はまた、好ましくは、本明細書に記載のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの生物学的活性の少なくとも１つを有する。例えば、本発明の方法で用いられる、好ましいＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、配列番号：１または３のヌクレオチド配列とハイブリダイズ、すなわち、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ任意の上記のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性を調節し得るヌクレオチド配列によりコード化されるアミノ酸を含む。
【００６５】
他の実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、配列番号：２または４のアミノ酸配列と実質的に相同であり、かつ上記の段落Ｉで詳細に記載された天然の対立遺伝子バリエーションまたは変異誘発により、アミノ酸配列は異なるが、配列番号：２または４のタンパク質の機能活性を維持している。または、別の実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、配列番号：２または４のアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約６０％、より好ましくは、少なくとも約７０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％、またはそれ以上相同なアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００６６】
ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の生物学的活性部分は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質のアミンの酸配列、すなわち、配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列、または、全長ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と相同で、かつＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の少なくとも１つの活性を示す全長タンパク質より少ないアミノ酸を含む、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と相同なタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性な部分（ペプチド、すなわち、例えば、５、１０、１５、２０、３０、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、１００、またはそれ以上のアミノ酸長のペプチド）は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモティーフを含む。さらに、他の生物学的に活性な部分（ここで、該タンパク質の他の領域は欠損している）は、組換え技術により生成され、そして本明細書に記載の１以上の活性を増大し得る。好ましくは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の生物学的に活性な部分は、１以上の選択されたドメイン／モティーフ、または生物学的活性を有するその部分を含む。
【００６７】
ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、好ましくは、組換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、該タンパク質コード化核酸分子は、発現ベクター（上記）にクローン化され、該発現ベクターが、宿主細胞（上記）に導入され、そしてＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質が、該宿主細胞で発現される。次に、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、標準的タンパク質精製技術を用いて、適当な精製スキームにより、細胞から単離され得る。組換え発現の代わりに、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、標準的ペプチド合成技術を用いて、化学的に合成され得る。さらに、天然のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、例えば、抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体（以下でさらに記載）を用いて、細胞（すなわち、肺細胞または肺腫瘍細胞）から単離され得る。
【００６８】
本発明は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔキメラまたは融合タンパク質の使用も提供する。本明細書で用いられるＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔポリペプチドと作動可能に結合したＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔポリペプチドを含む。「ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔポリペプチド」は、それぞれ、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、一方「非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔポリペプチド」は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と実質的に相同でないタンパク質、すなわち、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と異なり、かつ同一または異なる生物由来のタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。融合タンパク質での用語「作動可能に結合した」は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔポリペプチド、および非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔポリペプチドが、互いにインフレームで融合していることを示すことが意図されている。該非ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔポリペプチドは、ＣＸＣＲ４またはｃ−ＫｉｔポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合し得る。例えば、１つの実施態様において、融合タンパク質は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ配列がＧＳＴ配列のＣ末端と融合している、ＧＳＴ−ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ融合タンパク質である。該融合タンパク質は、組換えＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの精製を促進し得る。別の実施態様において、融合タンパク質は、異種性シグナル配列をそのＮ末端で含有するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質である。ある種の宿主細胞（すなわち、哺乳類宿主細胞）において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの発現および／または分泌は、異種性シグナル配列の使用により増加され得る。
【００６９】
好ましくは、本発明のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔキメラまたは融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは共に、通常の技術に従い、例えば、ライゲーション用に平滑末端化または突出末端化した末端、適当な末端を提供するための制限酵素切断、必要に応じて付着末端の充填、非所望の結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素ライゲーションを用いて、インフレームでライゲーションされる。別の実施態様において、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を含む通常技術により、合成され得る。または、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、キメラ遺伝子配列を生成するために、連続して、アニーリングされ、そして再増幅され得る、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて、行われ得る（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992を参照）。さらに、融合部分（すなわち、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコード化した多くの発現ベクターが、市販されている。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード化核酸は、融合部分が、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質とインフレームで結合するように、発現ベクターにクローン化され得る。
【００７０】
本発明は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔアゴニスト（模倣物）、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔアンタゴニストのいずれかとして機能する、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の相同体の使用にも関する。好ましい実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔアゴニストおよびアンタゴニストは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の天然に存在する形の生物学的活性のサブセットを、それぞれ、刺激または阻害する。従って、特異的な生物学的作用は、機能を制限された相同体での処置により、誘発され得る。１つの実施態様において、該タンパク質の天然に存在する形の生物学的活性のサブセットを有する相同体での対象の処置は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の天然に存在する形での処置と比較して、対象での副作用を減らす。
【００７１】
ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の相同体は、変異誘発により、すなわち、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の別の点変異または切断により、生成され得る。本明細書で用いられる用語「相同体」は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の変異体形を意味する。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質のアゴニストは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の生物学的活性の同じもの、またはサブセットを実質的に維持し得る。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質のアンタゴニストは、例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質を含む、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔカスケードの下流または上流メンバーと競合的に結合することにより、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の天然に存在する形の１以上の活性を阻害し得る。従って、本発明の哺乳類ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、およびその相同体は、例えば、ＳＣＬＣの増殖または転移の正または負のレギュレーターのいずれかであり得る。
【００７２】
代わりの実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の相同体は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の変異体（すなわち、切断変異体）の組換えライブラリーを、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより、同定され得る。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ変異体の変化に富んだライブラリーは、核酸レベルでの変異誘発の組合せにより生成され、かつ変化に富んだ遺伝子ライブラリーによりコード化される。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ変異体の変化に富んだライブラリーは、可能性のあるＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ配列の変性したセットが、個々のポリペプチドとして、または内部にＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ配列のセットを含有しているより大きな融合タンパク質（すなわち、ファージディスプレイ）のセットとして表されるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲーションすることにより、生成され得る。可能性のあるＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ相同体のライブラリーを、変性オリゴヌクレオチドから生成するために用いられ得る、様々な方法が存在する。変性遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成機で行われ、次に、合成遺伝子は適当な発現ベクターにライゲーションされ得る。遺伝子の変性セットの使用により、可能性のあるＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ配列の所望のセットをコード化する配列の全てを、１混合物中で提供することが可能となる。変性オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該技術分野で知られている（すなわち、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3； Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323； Itakura et al. (1984) Science 198:1056； Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477を参照）。
【００７３】
さらに、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質のフラグメントをコードするライブラリーを用いて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の相同体をスクリーニングし、そして続いて選択するための、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔフラグメントの変化に富んだ集団が生成され得る。１つの実施態様において、フラグメントのコード配列のライブラリーは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード配列の２本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニッキングが１分間に約１回だけ生じる条件下で、ヌクレアーゼで処理すること、２本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る２本鎖ＤＮＡを形成するために、ＤＮＡを再生すること、１本鎖部分をＳ１ヌクレアーゼでの処理により、再形成された２本鎖から取り除くこと、および生じたフラグメントライブラリーを発現ベクターにライゲーションすることにより、生成され得る。この方法により、発現ライブラリーは、様々なサイズのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および内部フラグメントをコード化するものからもたらされ得る。
【００７４】
点変異または切断により生じたコンビナトリアル・ライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング、およびｃＤＮＡライブラリーの選択された特性を有する遺伝子産物についてのスクリーニングのためのいくつかの技術が、当該技術分野において知られている。該技術は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ相同体の組換え変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適している。高処理分析を施すことのできる、巨大遺伝子ライブラリー用に最も広範に用いられる技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な遺伝子ベクターにクローニングすること、適当な細胞を、生じたベクターのライブラリーで形質転換すること、および組合せ遺伝子を、所望の活性の検出が、産物が検出された遺伝子をコード化するベクターの単離を促進する条件下で、発現させることを含む。ライブラリーでの機能的変異体の頻度を増大させる新技術である、反復全体的変異誘発（Recursive ensemble mutagenesis）（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイと組み合せて用いて、ＣＸＣＲ４の相同体が同定され得る（Arkin and Youvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815； Delagrave et al. (1993) Protein Eng. 6(3):327-331）。
【００７５】
単離ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその部分またはフラグメントは、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体生成の標準的技術を用いて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと結合する抗体を生成するための、免疫原として用いられ得る。全長ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質が用いられ得るか、または、本発明は、免疫原として使用するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの抗原性ペプチドは、ペプチドに対して生じた抗体が、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと特異的な免疫複合体を形成するように、配列番号：２または４に示されるアミノ酸配列、または本明細書で記載の相同なアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を包含し、かつＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔのエピトープを包含する。好ましくは、該抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは、少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含される好ましいペプチドは、タンパク質の表面、すなわち、親水性領域に位置するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの領域である。
【００７６】
ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ免疫原を典型的に用いて、適当な対象（すなわち、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の動物）を免疫原で免疫することにより、抗体が生成される。適当な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、または化学合成ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔペプチドを含有し得る。調製物は、フロイント完全または不完全アジュバントの様なアジュバント、または類似の免疫刺激性薬物をさらに含み得る。適当な対象の免疫原性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ調製物での免疫は、ポリクローナル抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体応答を含む。
【００７７】
または、本発明の別の態様は、抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体の使用に関する。本明細書で用いられる用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの様な抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含有する分子を意味する。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例は、ペプシンの様な酵素で抗体を処理することにより生成され得る、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。本発明は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位の１種類のみを含有する抗体の調製物を意味する。従って、該モノクローナル抗体組成物は、典型的には、特に、それが免疫反応するＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質に対する１つの結合親和性を示す。
【００７８】
ポリクローナル抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体は、上記の様に、適当な対象をＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ免疫原で免疫することにより、生成され得る。免疫された対象の抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体価は、固定化ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔを用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）での様な、標準的技術で終始モニターされ得る。所望により、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔに対する抗体分子が、哺乳類から（すなわち、血液から）単離され、さらに、ＩｇＧ分画を得るためのタンパク質Ａクロマトグラフィーの様なよく知られた技術により、精製され得る。免疫後適当な時間、すなわち、抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体価が最高となるときに、抗体産生細胞が対象から採取され、そしてKohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497（Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46； Brown et al.  (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83； Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31； and Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照）に最初に記載されたハイブリドーマ技術、最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）、またはトリオーマ技術の様な標準的技術により、モノクローナル抗体を調製するために用いられ得る。モノクローナル抗体のハイブリドーマを生成する技術は、よく知られている（概論として、R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)； E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387 402； M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231 36を参照されたい）。概略、不死細胞株（典型的には、骨髄腫）が、上記のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ免疫原で免疫された哺乳類由来のリンパ球（典型的には、脾細胞）と融合され、生じたハイブリドーマ細胞の培養上清が、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングされる。
【００７９】
リンパ球と不死細胞株の融合に用いられる多くのよく知られたプロトコールのうち任意のものが、抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔモノクローナル抗体を生成する目的で、適用され得る（すなわち、G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052；上記のGefter et al. Somatic Cell Genet.；上記のLerner, Yale J. Biol. Med.；上記のKenneth, Monoclonal Antibodiesを参照）。さらに、通常の技術者は、有用な該方法の多くのバリエーションが存在することを考慮するだろう。典型的には、不死細胞株（すなわち、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同一の哺乳類種由来である。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫されたマウス由来のリンパ球を、不死化マウス細胞株と融合させて作られ得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン含有培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性のあるマウス骨髄腫細胞株である。任意の数の骨髄細胞株が、標準的技術に従い、融合パートナーとして用いられ得る（すなわち、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３、またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞株）。該骨髄腫細胞株は、ＡＴＣＣより入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞株は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いて、マウス脾細胞と融合される。該融合物から生じるハイブリドーマ細胞は、次に、非融合および非産生性の融合骨髄腫細胞を殺す、ＨＡＴ培地を用いて選択される（非融合脾細胞は、形質転換されていないため、数日後に死ぬ）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清のスクリーニング、すなわち、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、検出される。
【００８０】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを生成する代替法として、モノクローナル抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体が、同定され、そして組換え組合せ免疫グロブリンライブラリー（すなわち、抗体ファージディスプレーライブラリー）をＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔでスクリーニングし、これにより、それぞれ、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと結合する免疫グロブリンライブラリーのメンバーを単離することにより、単離され得る。ファージディスプレーライブラリーを生成およびスクリーニングするためのキットは、市販されている（すなわち、Pharmaciaの組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびStratageneのSurfZAP［登録商標］ファージディスプレーキット、カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレーライブラリーを生成およびスクリーニングする際の使用に特に則した方法および試薬の例は、例えば、Ladner et al. 米国特許番号５，２２３，４０９；Kang et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Dower et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／１７２７１；Winter et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／２０７９１；Markland et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１５６７９；Breitling et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９３／０１２８８；McCafferty et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Garrard et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ladner et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1369-1372；Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281；Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734；Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896；Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628；Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377；Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137；Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；およびMcCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554で見出され得る。
【００８１】
さらに、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作られる、ヒトおよび非ヒト特性共に含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体の様な組換え抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体が、本発明の範囲内である。該キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術、例えば、Robinson et al.国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira, et al. 欧州特許出願番号１８４，１８７；Taniguchi, M.,欧州特許出願番号１７１，４９６；Morrison et al.欧州特許出願番号１７３，４９４；Neuberger et al.ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３；Cabilly et al.米国特許番号４，８１６，５６７；Cabilly et al.欧州特許出願番号１２５，０２３；Better et al. (1988) Science 240:1041-1043；Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526；Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218；Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005；Wood et al. (1985) Nature 314:446-449；およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)；Morrison,  S.L. (1985) Science 229:1202-1207；Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214；Winter米国特許番号５，２２５，５３９；Jones et al. (1986) Nature 321:552-525；Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534；およびBeidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060に記載の方法を用いて、産生され得る。
【００８２】
抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体（すなわち、モノクローナル抗体）を用いて、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降の様な標準的技術により、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔが単離され得る。抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体は、天然のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの細胞からの精製、および宿主細胞で発現した、組換え産生ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの精製を促進し得る。さらに、抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体を用いて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の発現の産生量およびパターンを増加させるために、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質（すなわち、細胞溶解物、または細胞上清中）が検出され得る。抗ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ抗体は、臨床検査方法の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターするために、すなわち、例えば、与えられる処置計画の効果を決定するために、診断上用いられ得る。検出は、抗体を検出物質と結合（すなわち、物理的結合）させることにより、促進され得る。検出物質の例は、様々な酵素、接合団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な接合団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、適当な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈを含む。
【００８３】
ＩＩＩ．組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の態様は、ＣＸＣＲ４、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＸＣＲ４モジュレーター、ｃ−Ｋｉｔモジュレーター、またはその部分をコード化する核酸を含有するベクター、好ましくは、発現ベクターの使用に関する。本明細書で用いられる用語「ベクター」は、結合した別の核酸の輸送を可能とする核酸分子を意味する。ある種のベクターは、内部に別のＤＮＡセグメントが結合され得る、環状２本鎖ＤＮＡループを意味する。別の種類のベクターは、別のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合する、ウイルスベクターである。ある種のベクターは、それが挿入された宿主細胞での自己複製が可能である（すなわち、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（すなわち、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入の際に、宿主細胞のゲノムに統合され、そしてこれにより、宿主ゲノムに沿って複製される。さらに、ある種のベクターは、それが作動可能に結合した遺伝子の発現を指揮できる。該ベクターは、「発現ベクター」として本明細書で言及される。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、たいてい、プラスミドの形である。本明細書において、プラスミドがベクターの最も一般的に利用される形であるため、「プラスミド」および「ベクター」は互換使用され得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有する、ウイルスベクター（すなわち、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）の様な他の形の発現ベクターを含むことが意図されている。
【００８４】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形の本発明の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現に用いられる宿主細胞に基づき選択される、１以上の制御配列（発現されるべき核酸配列に作動可能に結合している）を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に結合する」は、対象のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能とする方法（すなわち、試験管内での転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞において）で制御配列と結合することを意味することが意図されている。用語「制御配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（すなわち、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図されている。該制御配列は、例えば、Goeddel；Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。制御配列は、多種の宿主細胞でのヌクレオチド配列の恒常的発現を指揮するもの、およびある種の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指揮するもの（すなわち、組織特異的制御配列）を含む。好ましい実施態様において、肺特異的プロモーターを用いて、肺細胞でのヌクレオチド配列の発現が指揮される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当該技術分野の技術者に理解されるだろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、これにより、本明細書に記載の核酸によりコード化される、融合タンパク質またはペプチドを含む、タンパク質またはペプチド（すなわち、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの変異体形、融合タンパク質など）が産生され得る。
【００８５】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの発現のために設計され得る。例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔは、E. coliの様な細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、または哺乳類細胞で発現され得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, Gene Expression Technology:  Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)にさらに記載される。または、組換え発現ベクターは、試験間内で、例えば、Ｔ７プロモーター制御配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、転写および翻訳され得る。
【００８６】
原核生物でのタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指揮する恒常的または誘導可能なプロモーターを含有するベクターを用いて、E. coliで最もよく行われる。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそこでコード化されるタンパク質、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。該融合ベクターは、典型的には、３つの目的：１）組換えタンパク質の発現を増加させること；２）組換えタンパク質の溶解性を増加させること；３）アフィニティー精製でのリガンドとして役立つことにより、組換えタンパク質の精製で手助けとなること、を果たす。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク分解性切断部位は、融合部分の結合部で導入され、そして組換えタンパク質は、組換えタンパク質の融合部分からの分離、続いて融合タンパク質の精製が可能となる。該酵素、およびその同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、それぞれ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを標的組換えタンパク質と融合させる、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc；Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA）、およびｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, NJ）を含む。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔのコード配列が、ｐＧＥＸ発現ベクターにクローン化され、Ｎ末端からＣ末端方向にＧＳＴトロンビン切断部位ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔを含む融合タンパク質をコード化するベクターが作られる。該融合タンパク質は、グルタチオンアガロース樹脂を用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより、精製され得る。ＧＳＴと融合した組換えＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔは、融合タンパク質のトロンビンでの切断により、回収され得る。
【００８７】
適当な誘導可能な非融合E. coli発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Amann et al., (1988) Gene 69:301-315）、およびｐＥＴ  １１ｄ（Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89）を含む。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、結合ｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写による。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現したウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）により仲介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写による。該ウイルスのポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下にＴ７  ｇｎ１遺伝子を宿している、内在性λプロファージ由来の宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により、与えられる。
【００８８】
E. coliでの組換えタンパク質発現を最大とする１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解性に切断する能力の低下した宿主細菌で、タンパク質を発現させることである（Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128）。別のストラテジーは、それぞれのアミノ酸についての個々のコドンが、好ましくはE. coliで利用されるものであるように、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変更させることである（Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118）。本発明の核酸配列の該変更は、標準的ＤＮＡ合成技術により、行われ得る。
【００８９】
別の実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母S. cerivisaeでの発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., (1987) EMBO J. 6:229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123）、およびｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）を含む。
【００９０】
または、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて、昆虫で発現され得る。培養細胞（すなわち、Ｓｆ９細胞）でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）、およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39）を含む。
【００９１】
なお別の実施態様において、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて、哺乳類細胞で発現される。哺乳類発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Seed, B. (1987) Nature 329:840）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195）を含む。哺乳類細胞で用いる場合、発現ベクターの制御機能は、たいてい、ウイルスの制御エレメントにより提供される。例えば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０由来のものである。原核生物および真核生物の細胞両方に適した発現システムについては、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning:  A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989の１６章および１７章を参照されたい。
【００９２】
別の実施態様において、組換え哺乳類発現ベクターは、好ましくは、特定の細胞種類での核酸の発現を指揮できる（すなわち、組織特異的制御エレメントが、核酸を発現させるために用いられる）。組織特異的制御エレメントは、当該技術分野で知られている。適当な組織特異的プロモーターの非制限的な例は、筋肉特異的カゼインキナーゼプロモーター、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277）、リン脂質特異的プロモーター（Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733）、および免疫グロブリン特異的プロモーター（Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740； Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748）、神経特異的プロモーター（すなわち、神経フィラメントのプロモーター；Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund et al. (1985) Science 230:912-916）、および乳房特異的プロモーター（すなわち、乳清のプロモーター；米国特許番号４，８７３，３１６および欧州特許出願公開番号２６４，１６６）を含む。発生性制御プロモーター、例えば、マウスホックスプロモーター（Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379）、およびα胎児タンパク質プロモーター（Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546）も包含される。
【００９３】
本発明は、アンチセンスの向きで発現ベクターにクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクターをさらに提供する。つまり、ＤＮＡ分子は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能とする方法で、制御配列と作動可能に結合する。アンチセンス向きでクローン化された核酸と作動可能に結合する制御配列は、様々な細胞種類でのアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指揮する選択（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）であり得るか、または制御配列が、アンチセンスＲＮＡの恒常的、組織特異的または細胞種特異的発現を指揮する選択であり得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が、高効率制御エレメント（活性は、ベクターが挿入される細胞種により決定され得る）の制御下で産生される、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いる、遺伝子発現の制御の考察のためには、Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【００９４】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが挿入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書で互換使用される。該用語が、特定の対象だけでなく、該細胞の子孫、または可能性のある子孫も意味することが理解される。ある種の変更が、変異または環境の影響のいずれかに起因して、続く世代で生じうるため、該子孫は、実際には親細胞と同一でないが、本明細書で用いられる用語の範囲に依然含まれる。
【００９５】
宿主細胞は、任意の原核生物または真核生物の細胞であり得る。例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、E. coliの様な細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞（例えば、筋肉細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適した宿主細胞は、当該技術分野の技術者に知られいている。
【００９６】
ベクターＤＮＡは、通常の形質転換、またはトランスフェクション技術により、原核生物または真核生物の細胞に導入され得る。本明細書で用いられる用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム、または塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン仲介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、外来核酸（すなわち、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当該技術分野で認められた技術を意味する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする適当な方法は、Sambrook, et al. (Molecular Cloning:  A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、および他の研究室マニュアルで見られる。
【００９７】
哺乳類細胞の安定的トランスフェクションのために、用いられる発現ベクター、およびトランスフェクション技術に依存して、細胞の小分画のみが、外来ＤＮＡをそのゲノムに統合することが知られている。該統合体を同定して選択するために、選択可能なマーカーをコード化する遺伝子（すなわち、抗生物質抵抗性）が、一般に、対象の遺伝子と共に、宿主細胞の導入される。好ましい、選択マーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセートの様な、薬剤に対する抵抗性を確かめるものを含む。選択可能なマーカーをコード化する核酸は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔをコード化する同一ベクターで宿主細胞に導入され得るか、または別々のベクターで導入され得る。導入核酸で安定的にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択により同定され得る（すなわち、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は、生き残るが、他の細胞は死ぬ）。
【００９８】
原核生物または真核生物の培養宿主細胞の様な、本発明の方法で用いられる宿主細胞を用いて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質が産生される（すなわち、発現される）。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質を産生する方法をさらに提供する。１つの実施態様において、方法は、本発明の宿主細胞（ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔをコード化する組換え発現ベクターが、導入されている）を、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔが産生されるまで、適した培地中で培養することを含む。別の実施態様において、方法は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔを培地または宿主細胞から単離することをさらに含む。
【００９９】
本発明の宿主細胞を用いて、非ヒトトランスジェニック動物が作られ得る。非ヒトトランスジェニック動物（すなわち、マウス、ラット、サル、ウマ、イヌ、シチメンチョウ、サカナ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、カエル、またはニワトリ）は、例えば、ＳＣＬＣの増殖および／または転移を調節するために用いられ得る、薬物または化合物、すなわち、薬剤、医薬を同定するために設計されたスクリーニングアッセイで用いられ得る。例えば、１つの実施態様において、本発明の宿主細胞は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード配列が導入された受精卵または胚性幹細胞である。次に、該宿主細胞を用いて、外来性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ配列が、そのゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物、または内在性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ配列が変更された相同組換え動物が作られる。該動物は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの機能および／または活性の研究、およびＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書で用いられる「トランスジェニック動物」は、動物の細胞の１以上が導入遺伝子を含む、非ヒト動物、好ましくは哺乳類、より好ましくは、ラットまたはマウスの様なげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例は、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを含む。導入遺伝子は、トランスジェニック動物がそれから開発され、かつ成熟動物のゲノムに残存し、これにより、トランスジェニック動物の１以上の細胞種または組織でのコード化遺伝子産物の発現を指揮する、細胞のゲノムに統合される外来性ＤＮＡである。本明細書で用いられる「相同組換え動物」は、内在性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子が、内在性遺伝子と、動物の開発に先立ち動物の細胞（すなわち、動物の胚細胞）に導入された外来性ＤＮＡ分子間の同組換えにより変更された、非ヒト動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、マウスである。
【０１００】
本発明のトランスジェニック動物は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード化核酸を受精卵のオス前核に導入することにより、すなわち、マイクロインジェクション、レトロウイルスインフェクション、および卵母細胞が偽妊娠したメスである里親動物で発育するのを可能とすることにより、作られ得る。ヒトＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｃＤＮＡ配列は、導入遺伝子として非ヒト動物のゲノムに導入され得る。または、マウスＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子の様な、ヒトＣＸＣＲ４遺伝子（配列番号：１）またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子（配列番号：３）の非ヒト相同体が、導入遺伝子として用いられ得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも導入遺伝子に含まれ、導入遺伝子の発現の有効性が増大され得る。組織特異的制御配列は、必要に応じて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ導入遺伝子と結合され、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の発現を特定の細胞に対して指揮し得る。胚操作およびマイクロインジェクションにより、トランスジェニック動物、特にマウスの様な動物を作成する方法は、当該技術分野で一般的となり、例えば、米国特許番号４，７３６，８６６および４，８７０，００９（共にLeder et al.,）、米国特許番号４，８７３，１９１（Wagner et al.）、およびHogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)に記載されている。類似の方法が、他のトランスジェニック動物を作るために用いられる。トランスジェニック創始動物は、そのゲノムでのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ導入遺伝子の存在、および／または動物の組織または細胞でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡの発現に基づき同定され得る。次に、該トランスジェニック創始動物を用いて、導入遺伝子を有する動物がさらに繁殖され得る。さらに、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔコード化導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物とさらにかけ合わされ得る。
【０１０１】
相同組換え動物を作るために、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子の少なくとも一部分で、欠損、付加、または置換が導入され、これにより、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子を変更し、すなわち、機能的に崩壊したベクターが調製される。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子は、ヒト遺伝子（すなわち、配列番号：１または３のｃＤＮＡでスクリーニングされるヒトゲノムライブラリーから単離されるヒトゲノムクローン由来）であり得るが、より好ましくは、ヒトＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、マウスＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子を用いて、マウスゲノムの内在性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子を変更させるのに適して相同組換えベクターが構築され得る。好ましい実施態様において、ベクターは、相同組換えの際、内在性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子が機能的に崩壊される（すなわち、もはや、機能的タンパク質をコード化しない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように、設計される。または、ベクターは、相同組換えの際、内在性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子が変異を受けるか、そうでなければ変更されるが、機能的タンパク質を依然コード化する（すなわち、上流の制御領域が変更され、これにより、内在性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の発現が変更される）ように、設計され得る。相同組換えベクターにおいて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子の変更部分は、相同組換えが、ベクターにより運ばれた外来性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子と、胚性幹細胞の内在性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子との間で生じることを可能とするために、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子の付加核酸と、その５’および３’末端で隣接する。付加隣接ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸は、内在性遺伝子との相同組換えを成功させるのに十分な長さのものである。典型的には、隣接ＤＮＡ（５’および３’末端）の数ｋｂｐが、ベクターに含まれる（すなわち、Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 for a description of homologous recombination vectorsを参照）。ベクターが胚性幹細胞株に導入され（すなわち、エレクトロポレーションによる）、導入ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子が、内在性ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ遺伝子と相同組換られた細胞が選択される（すなわち、Li, E. et al. (1992) Cell 69:915を参照）。次に、選択された細胞を、動物（すなわち、マウス）の胚盤胞にインジェクションし、凝集キメラが形成される（すなわち、Bradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152)を参照）。次に、キメラ胚が、適当な偽妊娠メス創始動物に移植され、胚がそれに運ばれ得る。その生殖細胞に相同組換えＤＮＡを有する子孫を用いて、動物の全細胞が、導入遺伝子の生殖系列伝達により、相同組換えＤＮＡを含有する動物が生まれる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829、およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４（Le Mouellec et al.）；ＷＯ９１／０１１４０（Smithies et al.）；ＷＯ９２／０９６８（Zijlstra et al.）；およびＷＯ９３／０４１６９（Berns et al.）にさらに記載される。
【０１０２】
本発明の１つの実施態様において、トランスジェニック動物は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸分子と作動可能に結合した肺特異的プロモーターを含有するベクターを用いて、つくられる。
【０１０３】
別の実施態様において、導入遺伝子の制御発現を可能とする選択システムを含有する、トランスジェニック非ヒト動物が作られ得る。該システムの１例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムの別の例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである（O’Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて、導入遺伝子の発現が制御されると、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質両方をコード化する導入遺伝子を含有する動物が、要求される。該動物は、「共」トランスジェニック動物の構築、すなわち、２匹のトランスジェニック動物（１匹は、選択されたタンパク質をコード化する遺伝子を含有し、もう一方は、リコンビナーゼをコード化する導入遺伝子を含有する）をかけ合わせることにより、提供される。
【０１０４】
本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813、およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載の方法に従っても作られ得る。概略、トランスジェニック動物由来の細胞、すなわち、体細胞が単離され、そして増殖サイクルにあり、かつＧ０期に入るように誘導され得る。次に、休止細胞が、休止細胞が単離された同種の動物由来の脱核卵母細胞と融合（すなわち、電気パルスの使用により）される。次に、再構築された卵母細胞は、それが桑実胚または胚盤胞に発生するように培養され、そして偽妊娠したメス創始動物に移される。該メス創始動物の生まれた子孫は、細胞、すなわち、体細胞が単離された動物のクローンとなる。
【０１０５】
ＩＶ．医薬組成物
本発明のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔモジュレーター（本明細書で「活性化合物」としても言及される）は、対象、すなわち、ヒトへの投与に適した医薬組成物に取り込まれ得る。該組成物は、典型的には、核酸分子、タンパク質、モジュレーター、または抗体、および医薬的に許容される担体を含む。本明細書で用いられる用語「医薬的に許容される担体」は、医薬投与に影響しない、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、被覆原料、抗細菌および抗真菌性薬物、等張性かつ吸収遅延薬物などを含むことが意図されている。医薬的に活性な物質のための該媒体および薬物の使用は、当該技術分野でよく知られている。任意の通常の媒体または薬物が活性化合物と影響する場合を除いて、該媒体は、本発明の組成物で用いられ得る。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、その意図されている投与経路に影響しないように調剤させれる。投与経路の例は、非経腸、すなわち、静脈内、皮内、皮下、経口（すなわち、吸入）、桂皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経腸、皮内、または皮下投与に用いられる液剤または懸濁剤は、次の成分：注射のための水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒の様な滅菌済みの希釈剤；ベンジルアルコール、またはメチルパラベンの様な抗細菌薬；アスコルビン酸、または亜硫酸水素ナトリウムの様な酸化防止剤；エチレンジアミンテトラ酢酸の様なキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩の様なバッファー；および塩化ナトリウムまたはブドウ糖の様な等張性の調整剤を含む。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムの様な、酸または塩基で調整され得る。非経腸製剤は、アンプル、使い捨てのシリンジ、またはガラスまたはプラスチック製の多用量バイアルに封入され得る。
【０１０７】
注射での使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶剤（水溶性の場合）または分散剤、および注射用溶剤または分散剤の使用時調製のための滅菌粉剤を含む。静脈内投与のための、適当な担体は、生理食塩水、殺菌水、Cremophor EL［登録商標］（BASF, Parsippany, NJ）、またはリン酸緩衝食塩水を含む。全ての場合で、組成物は、滅菌済みでなければならず、かつ容易に注射針を通過する程度の流動性でなければならない。それは、製造および保存条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌の様な微生物のコンタミネーション作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性が、例えば、レクチンの様な被覆の使用により、分散の場合に必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の予防は、様々な抗細菌性および抗真菌性薬物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより、達成され得る。多くの場合で、それは、好ましくは、組成物中に等張薬物、例えば、糖、マニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムの様な多価アルコールを含む。注射可能な組成物の長時間作用性吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことで、もたらされ得る。
【０１０８】
滅菌済みの注射可能な溶剤は、活性化合物（すなわち、ＣＸＣＲ４モジュレーターおよび／またはｃ−Ｋｉｔモジュレーター）を必要な量で、適当な溶媒中に、上で列挙された成分の１つまたは組合せと共に取り込み、必要なら、続いて濾過滅菌することにより、製造され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、塩基性分散媒体、および上で列挙されたもの由来の必要な他の成分を含有する滅菌済みのビークル中に、取り込むことにより、製造される。滅菌済みの注射用溶剤の製造のための滅菌済みの粉剤の場合、製造の好ましい方法は、有効成分、および既に濾過滅菌されたその溶剤由来の別の所望の成分の粉剤を生じる吸引乾燥、および凍結乾燥である。
【０１０９】
経口用組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用可能な担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、または錠剤中に圧縮され得る。治療上の経口投与の目的のために、活性化合物は、添加剤と共に取り込まれ、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形で用いられ得る。経口用組成物は、口内洗浄剤として用いるための流動担体を用いても、製造され得る。ここで、流動担体中の化合物は、経口投与され、そして、音をたてて、痰をはくかまたは飲み込まれる。医薬的に両立性の結合剤、および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。該錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、任意の次の成分：微結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンの様な結合剤；スターチまたはラクトースの様な添加剤、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチの様な崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesの様な滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素の様な流動化剤；スクロースまたはサッカリンの様な甘味剤；またはペパーミント、メチルサリチル酸塩の様な香味剤、またはオレンジ香味剤、または類似の性質の化合物を含有し得る。
【０１１０】
吸入による投与のため、化合物は、適当な高圧ガス、すなわち、二酸化炭素のようなガスを含有する容器またはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルの形で運ばれる。
【０１１１】
全身投与は、経粘膜または経皮投与によるものでもあり得る。経粘膜または経皮投与のため、浸透するための、バリアに適した浸透剤が、製剤で用いられる。該浸透剤は、一般に当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与のための、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体。経粘膜投与は、鼻用スプレー剤または座剤の使用により、行われ得る。経皮投与のため、活性化合物は、一般に当該技術分野で既知の軟膏、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤される。
【０１１２】
化合物は、座剤（すなわち、カカオバターおよび他のグリセリドの様な通常の座剤基礎と共に）、または直腸送達のための持続性浣腸剤の形でも製造され得る。
【０１１３】
１つの実施態様において、活性化合物は、体液からの迅速排出に対して化合物を保護する担体と共に製造される（例えば、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含む制御遊離製剤）。生分解性、生物学的適合性のポリマー（例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）が用いられ得る。該製剤の製造方法は、当該技術分野の技術者に明らかであろう。材料は、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Incからも購入可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的とするリポソームを含む）は、医薬的に許容される担体として用いられ得る。これは、当該技術分野の技術者に既知の方法に従い製造され得る。例えば、米国特許番号第４，５２２，８１１に記載される。
【０１１４】
経口または非経腸組成物を、投与を容易にするため、および投薬量の均一化のため、単位用量剤形で製剤することは、特に有利である。本明細書で用いられる単位用量剤形は、処置されるべき対象のための単一投与量として適した、物理的に別の単位を意味し、それぞれの単位は、所望の治療効果を、必要な医薬担体と共に生じるように計算された、事前に決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位用量剤形の特定化は、活性化合物のユニークな特徴および達成されるべき特定の治療効果に依存して、および個体の処置のための該化合物を合成する技術での固有の制限により、そして間接的に指示される。
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサーに、投与の指示と共に含まれ得る。
【０１１５】
Ｖ．遺伝子治療
本発明の１つの実施態様において、本発明の方法で用いられる核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして用いられ得る。遺伝子治療のベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許番号５，３２８，４７０を参照）、または定位固定射（すなわち、 Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057を参照）により、対象に送達され得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、遺伝子治療ベクターを適当な希釈剤中に含む得るか、または遺伝子送達ビークルが埋め込まれているゆっくりと遊離するマトリックスを含み得る。または、完全遺伝子送達ベクターが、組換え細胞、すなわち、レトロウイルスベクターから無傷で産生され得る場合、医薬製剤は、遺伝子送達システムを生じる１以上の細胞を含む得る。
【０１１６】
ウイルスベクターは、例えば、組換えレトロウイルスベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス１を含む。レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、一般に、生体内、特にヒトへの外来性遺伝子の送達のために選択された、組換え遺伝子送達システムであると理解される。アデノウイルスは、好ましくは、肝臓でのウイルス受容体の発現、または血管バリアの減少をどうにかしなければならないという理由で、全身投与された場合、肝臓を標的とする（９０％以上；(Antinozzi et al. (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544)）。または、それらは、外来遺伝子を、生体外で培養肝細胞に導入するために用いられ得る。該ベクターは、遺伝子の肝細胞への十分な送達を提供し、送達核酸は、宿主細胞の染色体ＤＮＡ分子に安定的に統合される。
【０１１７】
ウイルスの使用の主な必要条件は、その使用の安全性、特に、細胞集団での野生型ウイルスの拡大の可能性について確かめることである。複製欠陥レトロウイルスのみを産生する、特殊化細胞株（「パッケージング細胞」と呼ばれる）の開発により、遺伝子治療のためのレトロウイルスの有用性が増加し、そして欠陥レトロウイルスは、遺伝子治療の目的上、遺伝子送達での使用に上手く特定化されている（考察のために、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照されたい）。従って、レトロウイルスのコード配列の一部（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）が、レトロウイルス複製欠陥を示す対象遺伝子により置き換えられている、組換えレトロウイルスが構築され得る。次に、該複製欠陥ウイルスは、標準的技術による、ヘルパーウイルスの使用により、標的細胞に感染させるために用いられ得る、ビリオンにパーッケージ化される。組換えレトロウイルス産生、および細胞を、試験管内または生体内で、該ウイルスベクターで感染させるプロトコールは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14、および他の標準的実験室マニュアルに見出され得る。適当なレトロウイルスの例は、当該技術分野の技術者によく知られている、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐＥＭを含む。エコトロピックおよびアンホトロピックなレトロウイルスシステム共に製造するのに適したパッケージングウイルス株の例は、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、およびΨＡｍを含む。
【０１１８】
さらに、レトロウイルス、結果として、レトロウイルスベースのベクターの感染範囲を、ウイルス粒子の表面のウイルスパッケージングタンパク質を変更することにより、制限することが可能であると示された（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２５２３４およびＷＯ９４／０６９２０を参照）。例えば、レトロウイルスベクターの感染範囲の変更ストラテジーは、表面抗原に特異的な抗体をウイルスｅｎｖタンパク質と結合させること（Roux et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9079-9083；Julan et al. (1992) J. Gen. Virol. 73:3251-3255；およびGoud et al. (1983) Virology 163:251-254）；または、細胞表面受容体リガンドをウイルスｅｎｖタンパク質と結合させること（Neda et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:14143-14146）を含む。結合は、タンパク質との化学架橋結合の形、または他の変化（すなわち、ｅｎｖタンパク質をアシアロ糖タンパク質へ変換するためのラクトース）、ならびに、融合タンパク質（すなわち、１本鎖抗体／ｅｎｖ融合タンパク質）を生成することによるものであり得る。従って、本発明の特定の実施態様において、適当な制御エレメントと作動可能に結合した対象の遺伝子を含有する核酸分子を含有するウイルス粒子は、それが肝細胞のサブセットを特異的に標的とし得るように、例えば、上記の方法に従い、変更される。例えば、ウイルス粒子は、ある種の肝細胞に特異的な表面分子に対する抗体で被覆され得る。該方法は、肝細胞の特定のサブセットのみが、トランスフェクションされることが望まれている場合、特に有用である。
【０１１９】
本発明で有用な別のウイルスの遺伝子送達システムは、アデノウイルス由来ベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、それが、対象の遺伝子産物をコード化し、そして発現するが、正常な細胞溶解ウイルスライフサイクルで複製する能力の点で、不活性化されるように、操作され得る。例えば、Berkner et al. (1988) Biotechniques 6:616；Rosenfeld et al. (1991) Science 252:431-434；およびRosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155を参照。アデノウイルス株Ａｄタイプ５  ｄｌ３２４、またはアデノウイルスの他の株（すなわち、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の適当なアデノウイルスベクターが、当該技術分野の技術者によく知られいている。組換えアデノウイルスは、それが非分裂細胞に感染できない、ある種の環境で有利であり得る。さらに、ウイルス粒子は、比較的安定であり、精製および濃縮の影響を受けやすく、そして上記の様に、感染の範囲に影響するように変更され得る。さらに、導入アデノウイルスＤＮＡ（および、そこに含有される外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに統合されないが、エピソームに維持され、これにより、導入ＤＮＡが、宿主ゲノム（すなわち、レトロウイルスＤＮＡ）に統合される状況下での挿入性変異誘発の結果として生じ得る、可能性のある問題を回避する。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡの送達能力は、他の遺伝子送達ベクターと比較して高い（最大、８ｋｂｐ）（Berkner et al. cited supra；Haj-Ahmand and Graham (1986) J. Virol. 57:267）。現在用いられ、それ故本発明に好ましい複製欠陥アデノウイルスベクターのほとんどが、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部を欠損するが、アデノウイルスのゲノム物質のほぼ８０％を維持している（すなわち、Jones et al. (1979) Cell 16:683；Berkner et al., supra；およびGraham et al. in Methods in Molecular Biology, E.J. Murray, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991) vol. 7. pp. 109-127)を参照）。核酸分子に含まれる対象の遺伝子の発現は、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、主な後期プロモーター（ＭＬＰ）および関連リーダー配列、Ｅ３プロモーター、または外来性付加プロモーター配列の制御下にあり得る。
【０１２０】
対象の遺伝子を含む核酸分子の送達に有用な、なお別のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスの様な別のウイルスを、十分な複製および生産性のライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする、天然に存在する欠陥ウイルスである（考察のために、Muzyczka et al. Curr. Topics Microbiol. Immunol. (1992) 158:97-129を参照されたい）。アデノ随伴ウイルスは、高頻度の安定的統合を示す（例えば、Flotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356；Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828；およびMcLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62:1963-1973を参照）。ほぼ３００ｂｐのＡＡＶを含有するベクターは、パッケージ化され、統合され得る。外来性ＤＮＡのためのスペースは、約４．５ｋｂに限られる。Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260に記載される様なＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡがＴ細胞に導入され得る。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを用いて、異なる細胞種に導入されてきた（例えば、Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470；Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081；Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39；Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51:611-619；およびFlotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790を参照）。遺伝子治療に適用される他のウイルスベクターシステムは、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびいくつかのＲＮＡウイルスからもたらされた。
【０１２１】
対象の遺伝子を含む核酸分子の送達に有用な、なお別のウイルスベクターシステムは、遺伝子の筋肉への送達のための、単純ヘルペスウイルスタイプ１（ＨＳＶ−１）アンプリコンベクター（Wang, Y. et al. (2002) Hum. Gene. Ther. 13(2):261-273）を含む。
【０１２２】
遺伝子治療でのウイルスベクターの使用に関連する他の方法は、すなわち、Kay, M.A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S；Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81；Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74；Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86；Thule, P.M. and Liu, J.M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52；Yang, N.S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56；Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58； Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101；Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Invetig. Drugs 8:2159-2172；Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49；およびLee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8に見出され得る。
【０１２３】
ＶＩ．スクリーニングアッセイ
本明細書に記載の核酸分子、ポリペプチド、ポリペプチド相同体、モジュレーター、および抗体は、処置方法、ならびに薬物スクリーニングアッセイで用いられ得る。本発明は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と結合し、例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ発現、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性に阻害性に作用するか、または例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子の発現または活性に阻害性に作用する、モジュレーター、すなわち、候補化合物または試験化合物または薬物（すなわち、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、または他の薬物）を同定する方法（本明細書で「スクリーニングアッセイ」としても言及される）を提供する。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの該モジュレーターは、ＳＣＬＣ細胞の細胞の増殖、移動、運動、接着、形態、形態変化、および／または転移を調節するために、本発明の方法で用いられる。該モジュレーターは、ＳＣＬＣの対象を処置するために、さらに用いられる。
【０１２４】
１つの実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質またはポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分の標的分子である、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質またはポリペプチド、またはその生物学的に活性な部分と結合するか、その活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間上指定可能な平行固相および液相ライブラリー；デコンヴォルーション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる、合成ライブラリー法を含む、当該技術分野で既知のコンビナトリアル・ライブラリー法における任意の多数のアプローチを用いて得られ得る。生物学的ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに限られるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー、または低分子ライブラリーに適用され得る（Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:45）。
【０１２５】
分子ライブラリーの合成方法の例は、当該技術分野において、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909；Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422；Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678；Cho et al. (1993) Science 261:1303；Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059；Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37:1233に見られる。
【０１２６】
化合物のライブラリーは、溶液（すなわち、Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ（Lam (1991) Nature 354:82-84）、チップ（Fodor (1993) Nature 364:555-556）、細菌（Ladner USP 5,223,409）、胞子（Ladner USP ‘409）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869）中、またはファージ上（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390）；(Devlin (1990) Science 249:404-406)；(Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382)；(Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310)；(Ladner supra.)で提示されてもよい。
【０１２７】
１つの実施態様において、アッセイは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞が、試験化合物と接触させられ、そして該試験化合物のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性を調節する能力が決定される、細胞に基づくアッセイである。試験化合物のＣＸＣＲ４活性を調節する能力を決定することは、例えば、ＳＤＦ−１α誘導性ＰＩ３−Ｋ活性（例えば、Ａｋｔおよび／またはｐ７０  Ｓ６キナーゼリン酸化）、またはＣＸＣＲ４を発現する細胞でのＳＤＦ−１α介在性細胞の増殖、接着、運動、または細胞の形態変化をモニターすることにより、達成され得る。細胞は、例えば、ＳＣＬＣ細胞、例えば、原発腫瘍細胞、またはＳＣＬＣ腫瘍細胞株由来の細胞であり得る。
【０１２８】
ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの標的分子との結合を調節する試験化合物の能力も決定され得る。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの標的分子（例えば、それぞれ、ＳＤＦ−１α、またはＳＣＦ）との結合を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子の放射性同位元素または酵素標識との結合により、達成され得る（例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子のそれぞれ、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔとの結合が、複合体中の標識ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子を検出することにより、決定され得る）。または、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔを放射性同位元素または酵素標識と結合させ、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの複合体中のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子との結合を調節する、試験化合物の能力がモニターされる。試験化合物のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと結合する能力の決定は、該化合物を放射性同位元素または酵素標識と結合させることにより、達成され得る（例えば、該化合物のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔとの結合は、複合体中の標識ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ化合物を検出することにより、決定され得る）。例えば、化合物（すなわち、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子）は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的に標識され、そして、放射性同位元素が、放射線放出の直接カウントにより、またはシンチレーションカウントにより、検出される。または、化合物は、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識され、そして酵素標識が、適当な基質の産物への転換の決定により、検出される。
【０１２９】
化合物または標的分子の、任意の相互作用体の標識ではなく、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと相互作用する能力を決定することも、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）を用いて、化合物、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの標識ではなく、化合物のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔとの相互作用が検出され得る。McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912を参照。本明細書で用いられる「マイクロフィジオメーター」（すなわち、Cytosensor）は、光アドレス可能電位計測法（ＬＡＰＳ）を用いて、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析機器である。該酸性化速度の変化は、化合物とＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ間の相互作用の指標として用いられる得る。
【０１３０】
別の実施態様において、アッセイは、細胞に基づくアッセイであり、これは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子を発現する細胞を、試験化合物と接触させること、および該試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子の活性を調節する（すなわち、刺激または阻害する）能力を決定することを含む。試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子と結合、または相互作用する能力を決定することにより、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の、レポーター構造物由来の発現を誘導する能力を決定することにより、成し遂げられ得る。
【０１３１】
ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメントの、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子と結合するか、または相互作用する能力の決定は、直接結合の決定についての上記の方法の１つにより成し遂げられ得る。好ましい実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子と結合するか、または相互作用する能力の決定は、標的分子の活性を決定することにより、成し遂げられ得る。例えば、標的分子の活性は、細胞応答の誘導（すなわち、ＳＤＦ−１αまたはＳＣＦによるＰＩ３−Ｋ活性の誘導）を検出すること、標的分子の、適当な基質への触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー、すなわち、ルシフェラーゼをコード化する核酸と作動可能に結合した、標的応答性制御エレメントを含む）の誘導を検出すること、または、標的制御細胞応答（すなわち、増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０１３２】
なお別の実施態様において、本発明のアッセイは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性な部分が、試験化合物と接触し、該試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、または生物学的に活性な部分と結合する能力が決定される、無細胞アッセイである。本発明のアッセイで用いられるべきＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の好ましい生物学的に活性な部分は、標的分子（例えば、ＳＤＦ−１αまたはＳＣＦ）との相互作用に関与するフラグメントを含む。試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質との結合は、上記の様に直接的または間接的に決定され得る。好ましい実施態様において、アッセイは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと結合し、アッセイ混合物を形成する、既知の化合物と接触させること、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および該試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と相互作用する能力を決定すること（ここで、該試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と相互作用する能力の決定は、試験化合物の、好ましくは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ、またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定することを含む）を含む。
【０１３３】
別の実施態様において、アッセイは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性な部分が、試験化合物と接触し、該試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する（すなわち、刺激または阻害する）能力が決定される、無細胞アッセイである。試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性を調節する能力の決定は、例えば、直接結合の決定について上で記載の方法の１つにより、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子と結合する能力を決定することにより、成し遂げられ得る。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子と結合する能力の決定は、リアルタイム生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）の様な技術を用いても、成し遂げられ得る。Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345およびSzabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705を参照。本明細書で用いられる「ＢＩＡ」は、任意の相互作用体（すなわち、ＢＩＡｃｏｒｅ）を標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用を研究するための技術である。表面プラスモ応答（ＳＰＲ）の光学現象での変化が、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として用いられ得る。
【０１３４】
代わりの実施態様において、試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子の下流エフェクターの活性をさらに調節する能力の決定により、成し遂げられ得る。例えば、適当な標的のエフェクター分子の活性が決定され得るか、またはエフェクターの適当な標的との結合が、上記の様に決定され得る。
【０１３５】
なお別の実施態様において、無細胞アッセイは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と結合する既知の化合物（すなわち、それぞれ、ＳＤＦ−１αまたはＳＣＦ）と接触させ、アッセイ混合物を形成させること、該アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および該試験化合物の、ＣＸＣＲ４タンパク質と相互作用する能力を決定すること（ここで、試験化合物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の、好ましくは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子と結合、またはその活性を調節する能力の決定を含む）を含む。
【０１３６】
本発明の上記のアッセイ法の１以上の実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ、またはその標的分子のいずれかを固定化し、複合体形の、１つまたは２つのタンパク質の非複合体形からの分離を促進すること、ならびに、アッセイの自動化に適応させることも望まれる。候補化合物の存在下または非存在下での、試験化合物のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質との結合、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の標的分子との相互作用は、反応体を含有するのに適した任意の容器で成され得る。該容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを含む。１つの実施態様において、１つまたは２つのタンパク質がマトリックスと結合することを可能とするドメインを付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ融合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質が、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着され、そして次に、試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と結合し、そして混合物が、複合体形成を助ける条件（すなわち、塩およびｐＨの生理的条件）下でインキュベートされ得る。インキュベーションの次に、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルが、任意の非結合成分を除去するために洗浄され、ビーズの場合、マトリックスが固定化され、複合体が、例えば、上記の様に直接的または間接的に決定され得る。または、複合体は、マトリックスから解離され、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの結合または活性レベルが、標準的技術を用いて決定される。
【０１３７】
マトリックスにタンパク質を固定化する他の技術も、本発明のスクリーニングアッセイで用いられ得る。例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して固定化され得る。ビオチン化ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、または標的分子は、当該技術分野で既知の技術（すなわち、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）を用いて、ビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製され、そしてストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化され得る。または、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の、その標的分子との結合には干渉しないが、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、または標的分子との抗体反応は、プレートのウェルに誘導体化され、非結合標的またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質が、抗体結合によりウェルにトラップされ得る。ＧＳＴ固定化複合体についての上の記載に加えて、該複合体を検出する方法は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、または標的分子との抗体反応を用いての複合体の免疫検出、ならびに、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、または標的分子と関係する酵素活性を検出することによる酵素結合アッセイを含む。
【０１３８】
別の実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ発現のモジュレーターは、細胞が候補化合物と接触され、細胞でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質の発現が決定される方法で同定される。候補化合物の存在下でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質の発現レベルが、候補化合物の非存在下でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質の発現レベルと比較される。次に、該候補化合物が、該比較に基づき、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、その非存在下より高い（統計学的に十分に高い）場合、候補化合物が、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質発現の刺激物質として同定される。または、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下で、その非存在下より低い（統計学上有意に低い）場合、候補化合物が、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質発現のインヒビターとして同定される。細胞でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質発現のレベルは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡ、またはタンパク質を検出するための本明細書で記載の方法により、決定され得る。
【０１３９】
本発明のなお別の態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔと結合するか、または相互作用する他のタンパク質（「ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ結合タンパク質」または「ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ−ｂｐ」）、かつＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ活性に関与する他のタンパク質を同定するための、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイでの「ベイトタンパク質」として用いられ得る（すなわち、米国特許番号５，２８３，３１７；Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232；Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054；Bartel et al. (1993)  Biotechniques 14:920-924；Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696；およびBrentＷＯ９４／１０３００)。該ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ結合タンパク質は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的によるシグナルの伝搬、例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ仲介性シグナル伝達経路の下流エレメントに関与され得るようである。または、該ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ結合タンパク質は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔインヒビターであり得る。
【０１４０】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインからなる、ほとんどの転写因子のモジュレーターの性質に基づく。概略、該アッセイは、２つの異なるＤＮＡ構造物を利用する。一方の構造物において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質をコードする遺伝子は、既知の転写因子（すなわち、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコード化する遺伝子と融合される。もう一方の構造物において、未同定のタンパク質（「プレイ」または「試料」）をコード化するＤＮＡ配列のライブラリー由来のＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質が、生体内で相互作用され、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ依存性複合体を形成することが可能であると、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは、近接部に運ばれる。該近接は、転写因子応答性の転写制御部位に作動可能に結合する、レポーター遺伝子（すなわち、ＬａｃＺ）の転写を可能とする。レポーター遺伝子の発現が検出され、機能的転写因子を含有する細胞コロニーが単離され、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質と相互作用するタンパク質をコード化するクローン化遺伝子を得るために用いられ得る。
【０１４１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載のアッセイの２つまたはそれ以上の組合せに関する。例えば、調節性の薬物は、細胞ベースまたは無細胞アッセイを用いて、同定され、該薬物のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性を調節する能力が、生体内、すなわち、ＳＣＬＣのマウスモデルの様な動物で確かめられ得る。
【０１４２】
本発明は、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規薬物に関する。従って、本明細書に記載の同定された薬物の適当な動物モデルでの使用も、さらに本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載の同定された薬物（すなわち、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔモジュレーター、アンチセンスＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸分子、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ特異的抗体、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ結合パートナー）は、該薬物での処置の、有効性、毒性、または副作用を決定するための動物モデルで用いられ得る。または、本明細書に記載の同定された薬物は、該薬物の作用機序を決定するための動物モデルで用いられ得る。さらに、本発明は、本明細書に記載の処置のための、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規薬物の使用に関する。
【０１４３】
なお別の実施態様において、本発明は、ＳＣＬＣの処置で使用可能な化合物を同定する方法（すなわち、スクリーニングアッセイ）を提供する。該方法は、典型的には、化合物または薬物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸の発現、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性を調節する能力をアッセイすること、これにより、ＳＣＬＣを処置するための化合物を同定する段階を含む。化合物または薬物の、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸の発現、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性を調節する能力をアッセイする方法は、典型的には、細胞ベースのアッセイである。例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔを含む経路によりシグナルを誘導するリガンドに感受性のある細胞が、誘導され、候補化合物の存在下、または非存在下でＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質を過剰発現させる。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ依存性応答（刺激または阻害のいずれか）での統計上有意な変化を生じる候補化合物が、同定され得る。１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸の発現、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質の活性は、細胞で調節され、候補化合物の対象の読み出しへの作用（例えば、細胞の増殖または分化の速度）が、測定される。例えば、ＣＸＣＲ４タンパク質依存性シグナルカスケードに応答して、アップレギュレート、またはダウンレギュレートされる遺伝子の発現または活性がアッセイされ得る（例えば、Ａｋｔおよび／またはｐ７０  Ｓ６キナーゼのリン酸化）。好ましい実施態様において、該遺伝子の制御領域、すなわち、５’フランキングプロモーターおよびエンハンサー領域は、容易に検出され得る遺伝子産物をコード化する、検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）と作動可能に結合する。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ、またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ標的分子のリン酸化も例えば、免疫ブロットにより、測定され得る。
【０１４４】
または、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現のモジュレーター（すなわち、ＳＣＬＣを処置するために用いられ得る化合物）は、細胞が、候補化合物と接触させられ、該細胞でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が決定される方法で同定される。候補化合物の存在下でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次に、候補化合物は、該比較に基づきＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現のモジュレーターとして同定され、そして、異常ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現により特徴付けられる、疾患を処置するために用いられ得る。例えば、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、候補化合物の存在下でその非存在下より高い（統計上有意に高い）場合、該候補化合物が、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現の刺激物質として同定される。または、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現が、候補化合物の存在下でその非存在下より低い（統計上有意に低い）場合、該候補化合物が、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現のインヒビターとして同定される。細胞でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現のレベルは、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための、本明細書に記載の方法により決定され得る。
【０１４５】
該薬物スクリーニングアッセイに従い、同定されたＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質活性および／またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現のモジュレーターは、ＳＣＬＣを処置するために用いられ得る。ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質活性、および／またはＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ核酸発現のモジュレーターを用いて、ＳＣＬＣと無関係のＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの他の機能と関係する疾病（例えば、ＡＩＤＳ）も処置され得る。該処置方法は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔタンパク質活性および／または核酸発現のモジュレーターを、すなわち、上記の段落ＩＶに記載した医薬組成物中で、該処置の必要な対象、すなわち、本明細書に記載の疾患の対象に投与することを含む。
【０１４６】
ＶＩＩ．抗ＳＣＬＣ薬物の有効性のモニタリング
ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの活性レベルの存在は、１）ＳＣＬＣが、薬物または薬物の組合せにより十分に処置され得るか、またはされそうか否かを決定するため；２）ＳＣＬＣが、薬物または薬物の組合せでの処置に応答するか否かを決定するため；３）ＳＣＬＣ処置のための適当な薬物、または薬物の組合せを選択するため；４）行われる処置の有効性をモニターするため；および／または５）新規の処置（１つの薬物または薬物の組合せ）を同定するために用いられてもよい。具体的には、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔは、マーカーとして利用され（代替的および／または直接的）、適当な治療が決定され、有効性について試験される薬物の臨床治療およびヒトトライアルがモニターされ、そして新規薬物および治療上の組合せが開発される。
【０１４７】
または、本発明は、薬物、例えば、化学療法剤を用いて、ＳＣＬＣの増殖または転移が阻害され得るか、否かを決定する方法を提供し、これは、次の段階
ａ）肺癌細胞試料を採取すること；
ｂ）該細胞がＣＸＣＲ４を発現するか否かを決定すること；
これにより、該薬物を用いて、ＣＸＣＲ４が発現する小細胞肺癌の増殖または転移が阻害され得ることが決定されること、
を含む。さらなる実施態様において、方法は、細胞がｃ−Ｋｉｔを発現するか否かを決定すること、これにより、薬物を用いて、ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔが発現する小細胞肺癌の増殖または転移が阻害され得るかが決定されること、を含む。
【０１４８】
別の実施態様において、本発明は、患者が、ＣＸＣＲ４を阻害する薬物での処置の利益を受けるか否かを決定する方法を提供し、これは、
ａ）該患者から肺試料を採取すること；および
ｂ）ＣＸＣＲ４が、該試料中で発現するか否かを決定すること、
を含む。別の実施態様において、本発明は、患者が、ＣＸＣＲ４を阻害する薬物、およびｃ−Ｋｉｔを阻害する薬物での処置の利益を受けるか否かを決定する方法を提供し、これは、
ａ）該患者から肺試料を採取すること；
ｂ）ＣＸＣＲ４が、該試料中で発現するか否かを決定すること；および
ｃ）ｃ−Ｋｉｔが、該試料中で発現するか否かを決定すること、
を含む。
【０１４９】
ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの活性レベルを用いて、ＳＣＬＣが、行われている処置（例えば、化学療法処置）に対して抵抗性となるか否かが評価され得る。ＳＣＬＣは、もはや処置に応答して、細胞の活性特性が変化しない場合、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの活性レベルが、増加されるだろう。または、別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４インヒビターでの処置が、ＳＣＬＣ患者で続けられるべきか、または中止されるべきかを決定する方法を提供し、これは、
ａ）処置期間中に、細胞を含む２以上の試料を患者から採取すること；
ｂ）該細胞のＣＸＣＲの活性レベルを決定すること；および
ｃ）ＣＸＣＲ４の活性が、治療中増加しない場合、処置を続けること、
を含む。別の実施態様において、本発明は、ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せでの処置が、小細胞肺癌の患者で続けられるべきか、または中止されるべきかを決定する方法を提供し、これは、
ａ）処置期間中に、細胞を含む２以上の試料を患者から採取すること；
ｂ）該細胞のＣＸＣＲ４の活性レベルを決定すること；
ｃ）該細胞のｃ−Ｋｉｔの活性レベルを決定すること；および
ｄ）処置中、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの活性レベルが増加しない場合、処置を続けること、
を含む。
【０１５０】
本発明の該実施態様は、抗ＳＣＬＣ処置を受けている患者から採取された２以上の試料を比較することによる。該試料は、標準的方法を用いて採取された、患者の肺（すなわち、ＳＣＬＣ細胞、腫瘍細胞など）である。一般に、処置を始める前に、第１の試料を、そして処置中に１以上の試料を患者から採取することが好ましい。このような使用では、治療に先立ち、活性のベースラインが決定され、次に、発現のベースライン状態の変化が、治療期間中モニターされる。または、処置中採取された２以上の試料が、処置前のベースライン試料を必要としないで、用いられ得る。かかる使用において、対象から採取された第１の試料は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの活性が、増加または減少しているかを決定するためのベースラインとして、用いられる。
【０１５１】
一般に、治療上の処置の有効性をモニターする場合、患者由来の２以上の試料が調べられる。好ましくは、少なくとも１つの処置前の試料を含む、３以上の継続的に採取された試料が用いられる。
【０１５２】
本発明の１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの発現は、それぞれ、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡレベルを測定することにより、決定される。本発明のなお別の実施態様において、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの発現は、それぞれ、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔタンパク質レベルを測定することにより、検出される。
【０１５３】
本明細書で用いられる用語「薬物」は、ＳＣＬＣ細胞が、治療上のプロトコールにおいて、曝露されるもの、好ましくは、例えば、本明細書に記載の方法を用いてのＳＣＬＣの処置に有効であるとして定義された薬物として、広範に定義される。本発明において、該薬物は、化学療法剤、放射線、および紫外線を含むが、これらに制限されない。好ましい実施態様において、薬物は、ＣＸＣＲ４インヒビター（例えば、ＡＭＤ−３１００、ＡＬＸ４０−４Ｃ、Ｔ２２、Ｔ１４０、Ｍｅｔ−ＳＤＦ−１β、Ｔ１３４、ＡＭＤ−３４６５、または本明細書に記載のスクリーニング法で同定された薬物）である。別の実施態様において、薬物は、受容体チロシンキナーゼインヒビター、例えば、ｃ−Ｋｉｔインヒビターである。好ましい実施態様において、ｃ−Ｋｉｔインヒビターは、メシル酸イマチニブ（ＳＴＩ５７１またはGleevec［登録商標］）である。さらなる好ましい実施態様において、該薬物は、ＣＸＣＲ４インヒビターと受容体チロシンキナーゼインヒビターの組合せである。
【０１５４】
上記に加えて、用語「化学療法剤」は、増殖中の細胞または組織の成長（該細胞または組織の成長は望まれていない）を阻害する化学試薬を含むことが意図されている。化学療法剤は、当該技術分野でよく知られており（例えば、Gilman A.G., et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Ed., Sec 12:1202-1263 (1990)を参照）、そして典型的には、新生物疾病を処置するために用いられる。好ましい実施態様において、本発明の方法で用いられる化学療法剤は、ＳＣＬＣを処置するために用いられる化学療法剤である。
【０１５５】
本発明の方法を用いて、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔを発現する、任意の種類の癌または腫瘍細胞（例えば、ＳＣＬＣ細胞）の増殖、成長、移動、運動、接着、形態、および／または転移も調節され得る。本明細書で用いられる、癌細胞（腫瘍細胞を含む）は、異常な（増加）速度で分裂する細胞を意味する。
【０１５６】
本方法で用いられる肺またはＳＣＬＣ細胞の供給源は、本発明の方法がどのように用いられるかによるであろう。例えば、方法が、患者のＳＣＬＣが、薬物、または薬物の組合せで処置され得るか否かを決定するために用いられる場合、好ましい細胞供給源は、患者の肺生検（例えば、腫瘍生検）から採取された肺癌細胞となる。方法が、治療プロトコールの有効性をモニターするために用いられる場合、処置される患者の肺組織試料は、好ましくは、供給源のものである。方法が、新規治療薬物または組合せを同定するために用いられる場合、任意のＳＣＬＣ細胞、例えば、原発ＳＣＬＣ細胞、またはＳＣＬＣ細胞株が用いられ得る。
【０１５７】
当該技術分野の技術者は、本発明の方法で用いられるのに適当な細胞を容易に選択し、得ることができる。癌細胞株（例えば、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞）については、National Cancer Instituteの様な供給源が好ましい。患者から採取される癌細胞については、標準的な生検方法が利用され得る。
【０１５８】
本発明の方法において、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの発現または活性レベルが測定される。本明細書で用いられるＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔの発現は、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡが、細胞（例えば、ＳＣＬＣ細胞）で発現するか否かを意味する。本明細書で用いられるＣＸＣＲ４の活性レベルは、例えば、ＳＤＦ−１αの、細胞の増殖、接着、運動、細胞の形態、またはＰＩ３−Ｋ活性を調節する能力を意味する。本明細書で用いられるｃ−Ｋｉｔの活性レベルは、例えば、ＳＣＦの細胞での増殖、接着、運動、細胞の形態、またはＰＩ３−Ｋ活性を調節する能力を意味する。
【０１５９】
本明細書で用いられる患者は、肺癌（例えば、ＳＣＬＣ）の処置を受けている任意の対象を意味する。好ましい対象は、化学療法処置を受けているヒト患者であろう。
【０１６０】
生物学的試料でのＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔに対応するポリペプチドまたは核酸の存在、または非存在を検出する典型的な方法は、生物学的試料（例えば、肺試料または肺腫瘍試料）を試験対象から採取すること、および該生物学的試料を、ポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡ）を検出できる化合物または薬物と接触させることを含む。従って、本発明の検出方法を用いて、例えば、試験管内ならびに生体内で生物学的試料中でのｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡが検出され得る。例えば、試験管内で、ｍＲＮＡを検出する技術は、ノーザンハイブリダイゼーション法、およびインサイツハイブリダイゼーション法を含む。試験管内で、ＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔに対応するポリペプチドを検出する技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、および免疫蛍光法を含む。生体内でゲノムＤＮＡを検出する技術は、サザンハイブリダイゼーション法を含む。さらに、生体内でＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔに対応するポリペプチドを検出する技術は、対象を該ポリペプチドに対する標識抗体に導入することを含む。例えば、対象での存在および位置が、標準的画像技術により検出され得る放射性マーカーで、抗体は標識され得る。
【０１６１】
該診断および予後アッセイの一般的な原則は、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ、およびプローブを含有する試料または反応混合物を適当な条件下で、かつＣＸＣＲ４またはｃ−Ｋｉｔとプローブが相互作用および結合するのに十分な時間調製し、これにより、反応混合物で除去および／または検出され得る複合体を形成することを含む。該アッセイは、様々な方法で構築され得る。
【０１６２】
例えば、該アッセイを構築するための１つの方法は、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ、またはプローブを固相支持体（基質としても言及される）に固定すること、および固体支持体に結合した標的ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ／プローブ複合体を反応後に検出することを含む。該方法の１つの実施態様において、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔの存在についてアッセイされるべき対象由来の試料が、担体または固相支持体に結合され得る。別の実施態様において、プローブが、固相支持体に結合され得る逆の状況が可能であり、対象由来の試料は、アッセイの非結合成分として反応することが可能である。
【０１６３】
アッセイ成分を固相に結合させる、確立された方法は多く存在する。これらは、ビオチンとストレプトアビジンの結合により固定される、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ、またはプローブ分子を含むが、これに限らない。該ビオチン化アッセイ成分は、当該技術分野で既知の技術（ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, IL）を用いて、ビオチンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製され、ストレプトアビジンコート９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定される。ある種の実施態様において、固定化アッセイ成分の表面は、前もって調製され、貯蔵可能である。
【０１６４】
該アッセイに適当な他の担体または固相支持体は、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ、またはプローブが属する分子種と結合可能な任意の物質を含む。よく知られた支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、デキストラン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱を含むが、これらに限らない。
【０１６５】
上記の方法でのアッセイを構築するために、非固定成分が、第２の成分が固定される固相に添加される。反応終結後、形成された任意の複合体が、固相に固定されたままであるように、非複合体形成成分が除去（例えば、洗浄により）される。固相に結合したＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ／プローブ複合体の検出は、本明細書で概説した多くの方法で成し遂げられ得る。
【０１６６】
好ましい実施態様において、プローブが非固定アッセイ成分である場合、検出およびアッセイの読み出しの目的のために、それは、本明細書に記載の検出可能な標識（これは、当該技術分野の技術者によく知られている）で直接的または間接的に標識され得る。
【０１６７】
ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ／プローブ複合体形成を、さらなる操作またはいずれかの成分（マーカーまたはプローブ）を標識することなく、例えば、蛍光エネルギー転位技術（例えば、Lakowicz et al.,米国特許番号５，６３１，１６９；Stavrianopoulos, et al.,米国特許番号４，８６８，１０３を参照）を利用して、直接的に検出することも可能である。第１のフルオロフォア標識である「ドナー」分子は、適当な波長の入射光での励起の際、その放出された蛍光エネルギーが、第２の「受容」分子（吸収エネルギーにより、代わりに蛍光を発することができる）の蛍光標識により、吸収される。または、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然の蛍光エネルギーを単純に利用する。「受容」分子標識が、「ドナー」のものと区別されるように、異なる波長の光を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー転位の有効性は、分子を隔てる距離と関係するので、分子間の空間的関係が調べられる。結合が分子間で生じる状況下で、アッセイでの「受容」分子標識の蛍光放出が最大であるべきである。ＦＥＴ結合現象は、通常、当該技術分野でよく知られた標準的蛍光定量的検出方法（例えば、蛍光光度計を用いて）により、測定され得る。
【０１６８】
別の実施態様において、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔを認識するプローブの能力の決定は、リアルタイム生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）の様な技術を利用して、アッセイ成分（プローブまたはマーカー）を標識することなく、成され得る。
【０１６９】
または、別の実施態様において、類似の診断および予後診断アッセイは、液相の溶質であるＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ、およびプローブで行われ得る。該アッセイにおいて、複合体形成ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔおよびプローブは、分画遠心分離法、クロマトグラフィー、電気泳動法、および免疫沈降法を含む（これらに制限されない）多数の標準的技術の任意のものにより、非複合体形成成分から分離される。分画遠心分離法において、マーカー／プローブ複合体は、異なる大きさおよび密度に基づく複合体の異なる沈殿平衡により、一連の遠心段階で非複合体形成アッセイ成分から分離される（例えば、Rivas, G. and Minton, A.P. (1993) Trends Biochem Sci. 18(8):284-7を参照）。標準的なクロマトグラフィー技術は、複合体形成分子を非複合体形成のものから分離するためにも利用される。例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーは、大きさに基づき、そしてカラム態様の適当なゲル濾過樹脂の利用により、分離される。例えば、比較的大きな複合体が、比較的小さな非複合体形成成分から分離される。同様に、非複合体形成成分と比較して、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ／プローブ複合体の比較的異なる荷電特性は、例えば、イオン交換クロマトグラフィー樹脂の利用により、該複合体を非複合体形成成分から分離するために活用される。該樹脂およびクロマトグラフィー技術は、当該技術分野の技術者によく知られている（例えば、Heegaard, N.H., 1998, J. Mol. Recognit. Winter 11(1-6):141-8；Hage, D.S., and Tweed, S.A.  J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1997 Oct 10；699(1-2):499-525を参照）。ゲル電気泳動法も、複合体形成アッセイ成分を非結合成分から分離するために利用される（例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987-1999を参照）。該技術において、タンパク質または核酸複合体は、例えば、大きさまたは電荷に基づき分離される。電気泳動中、結合相互作用を維持するために、非変性ゲルマトリックス材料、および還元薬物の存在しない条件が、典型的には好ましい。特定のアッセイに適当な条件、およびその成分は、当該技術分野の技術者によく知られている。
【０１７０】
特定の実施態様において、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔに対応するｍＲＮＡのレベルは、当該技術分野で既知の方法を用いて、生物学的試料において、インサイツおよび試験管内での態様により、決定され得る。用語「生物学的試料」は、組織、細胞、生物学的体液、およびその単離物を含むことが意図され、対象、ならびに対象に存在する組織、細胞、および体液から単離される。好ましい実施態様において、生物学的試料は、好ましくは、肺試料または肺腫瘍試料である。多くの発現検出方法は、単離ＲＮＡを用いる。試験管内での方法のため、ｍＲＮＡの単離に対して選択されない任意のＲＮＡ単離技術が、卵巣細胞からＲＮＡを精製するのに利用され得る（例えば、Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 1987-1999を参照）。さらに、多数の組織試料は、例えば、Chomczynski（1989, 米国特許番号４，８４３，１５５）のシングルステップＲＮＡ単離方法の様な、当該技術分野の技術者によく知られた技術を用いて、容易に処理され得る。
【０１７１】
単離ｍＲＮＡは、サザンまたはノーザン分析法、ポリメラーゼ連鎖反応分析法、およびプローブアッセイ法を含む（これらに限定されない）ハイブリダイゼーション法または増幅アッセイ法で用いられ得る。ｍＲＮＡレベルの検出に好ましい診断方法は、単離ｍＲＮＡを、検出される遺伝子によりコード化されるｍＲＮＡとハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチド長、および本発明のマーカーをコード化するｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの様な全長ｃＤＮＡ、またはそのタンパク質であり得る。本発明の診断アッセイでの使用に適した他のプローブが、本明細書で記載される。ｍＲＮＡのプローブとのハイブリダイゼーションは、問題のマーカー（例えば、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ）が発現していることを示す。
【０１７２】
１つの態様において、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲルを泳動させ、該ｍＲＮＡを該ゲルから膜（例えば、ニトロセルロース）に移すことにより、ｍＲＮＡは、固体表面に固定され、プローブと接触させられる。代わりの態様において、プローブは、固体表面に固定され、ｍＲＮＡは、例えば、Affymetrixの遺伝子チップ解析において、プローブと接触させられる。当該技術分野の技術者は、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ  ｍＲＮＡのレベルを検出するのに使用するための、既知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適用できる。
【０１７３】
試料中のＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔに対応するｍＲＮＡのレベルを決定する代わりの方法は、核酸増幅過程、例えば、ｒｔＰＣＲ法（Mullis, 1987, 米国特許番号４，６８３，２０２で記載の例示的実施態様）、リガーゼ連鎖反応法（Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193）、自己持続性配列複製法（self sustained sequence replication）（Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム法（Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−βリプリカーゼ法（Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197）、ローリングサイクル複製法（Lizardi et al.,米国特許番号５，８５４，０３３）、または任意の他の核酸増幅方法を含み、続いて、当該技術分野の技術者によく知られた技術を用いて、増幅分子が検出される。該検出スキームは、分子が非常に少量存在する場合の核酸分子の検出に特に有用である。本明細書で用いられる増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれ、プラスおよびマイナス鎖、または逆または正）とアニーリングでき、かつ間に短い領域を含有し得る核酸分子ペアであるものとして定義される。一般に、増幅プライマーは、約１０から３０ヌクレオチド長、および約５０から２００ヌクレオチド長の領域に隣接する。適当な条件下、および適当な試薬で、該プライマーは、プライマーと隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能とする。
【０１７４】
インサイツ方法のため、ｍＲＮＡは、検出に先立ち肺細胞から単離される必要はない。該方法において、肺腫瘍または組織試料は、既知の組織学的方法を用いて、調製または処理される。次に、該試料は、支持体、典型的にはガラススライドに固定され、次に、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔをコード化するｍＲＮＡとハイブリダイズできるプローブと接触させられる。
【０１７５】
本発明の別の実施態様において、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔに対応するポリペプチドが検出される。本発明のポリペプチドを検出するのに好ましい物質は、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔと結合可能な抗体または抗体フラグメント、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が用いられ得る。プローブまたは抗体に関しての用語「標識された」は、検出可能な分子をプローブまたは抗体と結合（すなわち、物理的結合）させること、プローブまたは抗体の直接的標識、ならびに、直接的に標識される別の試薬との免疫反応、プローブまたは抗体の間接的標識を包含することが意図されている。間接的標識の例は、蛍光標識２次抗体の使用による１次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンで検出され得るように、ビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識を含む。
【０１７６】
様々な態様が、試料が与えられた抗体と結合するタンパク質（例えば、ＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔ）を含有するか否かを決定するために、利用され得る。該態様の例は、酵素免疫アッセイ法（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）、ウエスタンブロット分析法、および酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含むが、これらに限定されない。当該技術分野の技術者は、肺細胞がＣＸＣＲ４および／またはｃ−Ｋｉｔを発現するか否かを決定するのに使用するための既知のタンパク質／抗体検出方法を容易に適用し得る。
【０１７７】
１つの態様において、抗体または抗体フラグメントは、発現タンパク質を検出するためのウェスタンブロット法、または免疫蛍光技術の様な方法で用いられ得る。該使用においては、一般的には、抗体またはタンパク質のいずれかを固体支持体に固定されることが好ましい。適当な固相支持体または担体は、抗原または抗体を結合できる任意の支持体を含む。よく知られた支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアシルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱を含む。
【０１７８】
当該技術分野の技術者は、多くの他の、抗体または抗原を結合するのに適した担体を知っているであろうし、該支持体を本発明での使用に適用できるであろう。例えば、肺細胞から単離されたタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で泳動され、ニトロセルロースの様な固相支持体に固定され得る。次に、該支持体は、適当なバッファーで洗浄され、次に、検出可能に標識された抗体で処置され得る。次に、該固相支持体は、バッファーで２回洗浄され、非結合抗体が除去される。次に、該固体支持体の結合標識の量が、通常の方法により検出され得る。
【０１７９】
本発明は、次の実施例（制限するものではない）により、さらに説明される。
実施例
材料および方法
細胞株および細胞培養
１０種類の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）細胞株（ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ１２８、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ２０９、ＮＣＩ−Ｈ２４９、ＮＣＩ−Ｈ３４５、ＮＣＩ−Ｈ４４６、ＮＣＩ−Ｈ５１０、およびＮＣＩ−Ｈ５２６）を、American Type Culture Collection（Rockville, MD）から購入し、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地（Cellgro）で維持した。ＭＯ７ｅ細胞を、Sattler, M. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10248-53に記載のように、維持した。全細胞株を、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気下でインキュベートし、対数増殖期に回収した。０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma, St. Louis, MO）含有ＲＰＭＩ  １６４０培地での１８時間のインキュベーションにより、細胞の成長因子を枯渇させた。ある実験では、細胞を、５μＭ  ＳＴＩ５７１（Gleevec［登録商標］、Novartis Pharmaceuticals, Basel, Switzerland）、または２５μＭ  ＬＹ２９４００２（Sigma）で処理した。組換えヒトＳＤＦ−１αおよびＳＣＦ（BioSource International, Inc., Camarillo, CA）を、それぞれの実験で示す条件下で用いた。
【０１８０】
細胞生存アッセイ
ＮＣＩ−Ｈ６９細胞（１×１０６／ｍｌ）を、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦおよび／またはＳＤＦ−１αを含む、または含まない、無血清（０．５％  ＢＳＡ）、または血清含有（０．５、１、５、または１０％  ＦＣＳ）培地中で培養した。生存細胞を、２４時間毎、最大７２時間、トリパンブルー色素排除試験により、カウントした。データを、３回の独立実験から、平均±ＳＤとしてプロットした。スチューデントのｔ検定を、個々の条件下での生存細胞の統計解析に用いた。ｐ＜０．０５の差を、統計上有意であると考慮した。
【０１８１】
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）
ケモカイン受容体ｍＲＮＡを、製造元のプロトコールに従い、ｈＣＲ−６多プローブ鋳型セット（RiboQuant, PharMingen, San Diego, CA）を用いて、検出した。該セットは、ＣＸＣＲ−１、−２、−３、−４に対するＤＮＡ鋳型、バーキットリンパ腫受容体（ＢＬＲ）−１／ＣＸＣＲ５、ＢＬＲ−２／ＣＣＲ７、Ｖ２８／ＣＸ３ＣＲ１、ならびに、対象としてリボソームタンパク質Ｌ３２およびＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素）を含有している。概略、アンチセンスＲＮＡプローブを、ＤＮＡ鋳型から、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより、［α−３２Ｐ］ＵＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Life Science Products, Inc., Boston, MA）の存在下で生成した。標識プローブを、ＲＮｅａｓｙキット（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて単離した全ＲＮＡ２０μｇと、５６℃で一晩ハイブリダイズした。負および正の対照として、酵母ｔＲＮＡおよびヒト対照ＲＮＡ−２  ２μｇをそれぞれ用いた。非ハイブリダイズＲＮＡを、ＲＮａｓｅ  ＡおよびＴ１で切断した。ＲＮａｓｅプロテクトプローブを、変性５％  アシルアミド尿素シークエンスゲルで分離し、オートラジオグラフィーで同定した。
【０１８２】
ＦＡＣＳ解析
細胞（１×１０５）を、０．５％  ＢＳＡ含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄し、次に、１０μｇ／ｍｌ  フィコエリトリン（ＰＥ）結合マウス抗ヒトＣＸＣＲ４モノクローナル抗体、またはＰＥ標識マウス対照ＩｇＧ２Ｂ（R&D Systems Inc., Minneapolis, MN）と、４℃で３０分間インキュベーションした。非結合抗体を除去するために、細胞をＰＢＳバッファーで洗浄後、染色細胞を、ＰＢＳ３００μｌに再懸濁し、Cell Questソフトウエア（Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ）を用いて、ＦＡＣＳｃａｎにより解析した。
【０１８３】
接着アッセイ
４℃で一晩、１０μｇ／ｍｌ  ヒト血漿フィブロネクチン（ＦＮ）、またはヒトコラーゲンタイプＩＶ（ｃｏｌ．ＩＶ）（Gibco BRL, Rockville, MD）で事前にコートした、９６ウェル組織培養プレート（Corning-Costar, Cambridge, MA）のウェルを、ＰＢＳで２回洗浄し、０．２％  ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ  １６４０培地（接着培地）で３７℃で１時間ブロッキングし、細胞をまいた。ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞（３×１０５）を２回洗浄し、ＳＤＦ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）を含む、または含まない接着培地に再懸濁し、非コート、ＦＮ、またはコラーゲンＩＶでコートしたウェルにまいた。３７℃で２時間インキュベーションし、接着培地でかるく洗浄し非接着細胞を除去した。接着生存細胞の総対数を、製造元のマニュアルに従い、ＭＴＴ比色分析アッセイ（Sigma）により決定した。スチューデントｔ検定を、接着細胞数の統計解析に用い、ｐ＜０．０５の差を有意であるとした。
【０１８４】
位相差顕微鏡での細胞形態
血清枯渇ＮＣＩ−Ｈ６９細胞（１×１０６）を、６ウェル組織培養プレート（Becton Dickinson Labware）にまき、無血清培地中、ＳＴＩ５７１（５μＭ）、ＳＤＦ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）および／またはＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の非存在下、または存在下でインキュベーションした。位相差顕微鏡写真を、様々な時間点（０、１、２、４、８、および２４時間）で撮った。ＬＹ２９４００２研究のために、血清枯渇ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞（１×１０６）を、無血清培地に再懸濁し、３５ｍｍ組織培養ディッシュ（Becton Dickinson Labware）にまいた。ＬＹ２９４００２（２５μＭ）および／またはＳＤＦ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）の非存在下、または存在下で２４時間インキュベーションした後、位相差写真を撮った。
【０１８５】
低速度撮影ビデオ顕微鏡（ＴＬＶＭ）による細胞移動の解析
ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞を上記のようにまき、ディッシュを、３７℃に温度制御したチャンバー、５％  ＣＯ２雰囲気下においた。Olympus IX70倒立顕微鏡、Omega温度制御装置、DVC1310デジタルビデオカメラ、およびStandalone 145ソフトウエアを有するQEDカメラを用いて、細胞をＴＬＶＭにより調べた。ＳＤＦ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）を、６時間後に培地に加え、画像を次ぎの１０時間記録した。デジタルビデオ画像を、９０秒毎に保存し、細胞の移動、または形態的変化を、ＮＩＨ画像解析プログラムで解析した。移動解析のため、細胞の中心位置を１５分毎に測定し、中心の移動の跡を示すためにプロットした。細胞の中心が９０秒で横に移動した距離を、移動速度を決定するために計算した。形態的解析のために、細胞表面範囲および周辺を、でこぼこの形の程度を示すために、測定した。糸状仮足および腹肢の形成、および退縮の頻度および期間も解析した。
【０１８６】
免疫ブロット
プロテアーゼインヒビター（１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、５μｇ／ｍｌ  アプロチニン、５μｇ／ｍｌ  ロイペプチン）含有ライシスバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、１％  ＮＰ−４０、０．４２％  ＮａＦ）に、細胞を溶解した。細胞ライセートを、還元条件下で７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（Schleicher & Schuell, Dassel, Germany）に移した。タンパク質を、増強化学発光技術（NEN Life Science Products, MA）を用いて免疫ブロットにより検出した。ｃ−Ｋｉｔに対するウサギポリクローナル抗体（Ｃ−１９；Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）、Ａｋｔ、Ａｋｔ（ｐＳｅｒ  ４７３）、Ａｋｔ（ｐＴｈｒ  ３０８）、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、およびｐ７０  Ｓ６キナーゼ（ｐＴｈｒ  ３８９）（Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA）、およびβアクチン（ＡＣ−１５； Sigma, St. Louis, MO)、およびホスホチロシン（4G10, UBI, Lake Placid, NY）に対するモノクローナル抗体を用いた。
【０１８７】
実施例１：ＳＣＬＣ細胞株において、ＣＸＣＲ４は偏在性に発現し、ｃ−Ｋｉｔは変動して発現する
ＳＣＬＣ細胞でのケモカイン受容体ｍＲＮＡの発現は、ＲＰＡにより決定された。酵母ｔＲＮＡおよびヒト対照ＲＮＡ−２を、それぞれ、ＣＸＣＲ４に対する負および正の対照として用いた。全ＳＣＬＣ細胞株（合計１０）を、他のケモカイン受容体の検出可能なｍＲＮＡのないレベルで、発現したＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡを試験した。対照であるヒトマクロファージ細胞株ＭＯ７ｅは、ＣＸＣＲ３ならびにＣＸＣＲ４を発現した。ＣＸＣＲ４タンパク質の発現を、該ＳＣＬＣ細胞株およびＭＯ７ｅでのフローサイトメトリー解析により確認した。ＣＸＣＲ４の発現は、ＮＣＩ−Ｈ２０９およびＮＣＩ−Ｈ４４６細胞で最も高かった。該細胞株でのｃ−Ｋｉｔの発現を免疫ブロットで評価した。調べた１０種類のうち６種類のＳＣＬＣ細胞株が、変動可能なレベルのｃ−Ｋｉｔを発現した（レーンＨ６９、Ｈ１２８、Ｈ２０９、Ｈ３４５、Ｈ５１０、およびＨ５２６）（ＭＯ７ｅ対照細胞で最も高発現）。ブロットをはぎとり、βアクチンに対する抗体でプローブ結合させた。
【０１８８】
実施例２：ＳＣＦおよびＳＤＦ−１αはＮＣＩ−Ｈ６９細胞の増殖を誘導する
ＳＣＦおよびＳＤＦ−１αのＮＣＩ−Ｈ６９細胞の生存力への作用を解析した。実施例１に記載の様に、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞はｃ−ＫｉｔおよびＣＸＣＲ４共に発現する。従って、該細胞を多くの実験に用いた。無血清で、ＳＣＦおよびＳＤＦ−１αのどちらも細胞生存への作用を示さなかった。一方、１０％  ＦＣＳ含有培地において、４８時間での細胞増殖は、無処理の対照と比較して、ＳＣＦ（２１．５％、ｐ＝０．０３７３）およびＳＤＦ−１α（２６．６％、ｐ＝０．０１３３）別々、または組合せ（２６．６％、ｐ＝０．０１３３）で誘導された。ＳＣＦおよびＳＤＦ−１αも、７２時間での生存細胞数を増加させた（それぞれ、１６．５％、ｐ＝０．０１６４、および１５．５％、ｐ＝０．０１８４、組合せで２０．０％、ｐ＝０．０３２２）。ＳＣＦおよびＳＤＦ−１αは個々に、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞の増殖を誘導したが、サイトカインおよびケモカインの組合せで観察した相加または相乗作用はなかった。類似の結果を、異なる濃度のＦＣＳ（０．５、１、および５％  ＦＣＳ）処置で観察した。これは、ＳＣＦおよびＳＤＦ−１αがＮＣＩ−Ｈ６９  ＳＣＬＣ細胞の増殖で重要であることを示している。
【０１８９】
実施例３：ＳＤＦ−１αは、ＮＣＩ−Ｈ４４６  ＳＣＬＣ細胞の接着、運動、および細胞の形態を制御する
細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質への細胞の運動、接着、形態的変化、および移動の増加の様な細胞骨格機能は、癌細胞が転移するのに重要である。ＳＤＦ−１αの細胞運動および接着への作用を決定するために、ＣＸＣＲ４を大量に発現し、かつ機能に依存して固定して成長するＮＩＣ−Ｈ４４６細胞を用いた。接着アッセイにおいて、ＦＮ（３．８４倍、ｐ＝０．０００２）、およびコラーゲンＩＶ（２．９８倍、ｐ＝０．０１２４）は、非コート表面と比較して、ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞の接着を増加させることが分かった。結合でのＳＤＦ−１α刺激は、非コート表面との接着を３．１４倍（ｐ＜０．０００１）さらに増加させたが、ＦＮおよびコラーゲンＩＶ仲介性接着を有意に増強しなかった。細胞接着に加えて、ＳＤＦ−１αは、ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞の運動および速度も顕著に増加させた。細胞移動の速さを、９０秒毎に、それぞれの細胞中心が横に移動する距離を用いて測定した。神経突起様の突起の形成を含む、円形から多型形への形態的変化は、膜の波打ち運動を増加させた。そして、ＳＤＦ−１αに応答して、糸状仮足および腹肢の形成を高頻度で観察した。ＳＤＦ−１αの存在下での糸状仮足形成は、非常に高頻度（１３．１４対２．８６回／時間／細胞）、かつ長時間（６．０９対３．７５回／糸状仮足）生じた。足形成を、６個のうち４個のＳＤＦ−１α処理細胞で観察した（５７．１％）。しかしながら、７個のうち１個の無処理細胞で腹肢を観察した（１４．３％）。それぞれの腹肢の持続時間は、ＳＤＦ−１α刺激により誘導された場合、非常に長くなった（１２．２対５．０分／腹肢）。
【０１９０】
実施例４：ＰＩ３−Ｋは、ＮＣＩ−Ｈ４６６  ＳＣＬＣ細胞のＳＤＦ−１α誘導性細胞移動を制御する
ＰＩ３−ＫインヒビターＬＹ２９４００２が、ＮＣＩ−Ｈ４６６  ＳＣＬＣ細胞でのＳＤＦ−１α誘導性細胞運動を阻害できるか否かを決定するために、この実施例を行う。ＮＣＩ−Ｈ４４６細胞を、無処理、またはＬＹ２９４００２（２５μＭ）の非存在下または存在下でＳＤＦ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。位相差顕微鏡写真を２４時間後に撮影した。ほとんどの無処理細胞は円形のままであり、そして群れを形成した。そして、ほぼ半分がディッシュの底に弱く接着した。ＳＤＦ−１α処理のほとんどすべての細胞は、ディッシュの底に強固に接着し、神経突起様の突起が多くの細胞で誘導された。ＬＹ２９４００２の存在下で、９０％より多くの細胞は、群れを形成できるのに、浮遊し、ＳＤＦ−１α処理にも関わらず円形であった。
【０１９１】
実施例５：ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔは協力して、ＮＣＩ−Ｈ６９  ＳＣＬＣ細胞の形態的変化を誘導する。
ＳＣＬＣでのＣＸＣＲ４とｃ−Ｋｉｔ間の機能的相互作用が存在することは、既に示されてはいない。ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ発現共に陽性のＮＣＩ−Ｈ６９細胞を、無処理、またはＳＴＩ５７１（５μＭ）の非存在下または存在下でＳＤＦ−１α（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。次に、位相差顕微鏡写真を８時間後に撮った。形態的変化は４時間で明らかとなり始め、変化は、８から２４時間でプラトーに達した。神経突起様のアクチン形成を、ＳＣＦに応答して観察し、形態的変化は、細胞をＳＤＦ−１αで処理した場合、突起として、より明らかとなった。ＳＤＦ−１αで誘導される神経突起様の突起のみが、ＳＴＩ５７１の存在下でも依然形成された。ＳＤＦ−１αおよびＳＣＦ両方で刺激したＳＴＩ５７１処理ＮＣＩ−Ｈ６９細胞は、神経突起様構造を形成できなかった。ＳＴＩ５７１は、ＳＣＦの存在下でのみ形態的変化を阻害した。該結果は、細胞運動に影響するＳＣＬＣでのＣＸＣＲ４とｃ−Ｋｉｔ間の重要な相互作用が存在することを示す。ＳＴＩ５７１による活性化ｃ−Ｋｉｔ受容体の阻害は、ＣＸＣＲ４の様な他の活性化受容体の阻害を導く。
【０１９２】
実施例６：ＳＤＦ−１αおよびＳＣＦは独立して、Ａｋｔおよびｐ７０  Ｓ６キナーゼのリン酸化を制御する。
ＰＩ３−Ｋは、ＳＤＦ−１αおよびＳＣＦシグナル伝達における細胞骨格機能の制御で重要である（Ganju, R.K. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:23169-75；Linnekin, D. et al. (1999) Int. J. Biochem. Cell Biol. 31:1053-74；Vicente-Manzanares, M. et al. (1999) J. Immunol. 163:4001-12；Wang, J.F. et al. (2000) Blood 95:2505-13；Zhang, X.F. et al. (2001) Blood 97:3342-8）。Ａｋｔおよびｐ７０  Ｓ６キナーゼを標的とするＰＩ３−Ｋ下流の活性は、重要なセリン／スレオニン（Ｓｅｒ／Ｔｈｅ）残基により制御される（Franke, T.F. et al. (1997) Cell 88:435-7；Pullen, N. and Thomas, G. (1997) FEBS Lett. 410:78-82）。
【０１９３】
血清枯渇ＮＣＩ−Ｈ６９細胞を、ＳＤＦ−１α（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で、０〜６０分間刺激し、ライシスした。細胞ライセートを７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライし、ニトロセルロース膜に移した。該膜を、ホスホチロシン（４Ｇ１０）およびβアクチンに対するモノクローナル抗体、およびＡｋｔ（ｐＳｅｒ４７３）およびｐ７０  Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）（ｐＴｈｒ３８９）に対するポリクローナル抗体でプローブ処理した。ＳＤＦ−１αおよびＳＣＦ共に、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞での時間依存性、細胞タンパク質のチロシンリン酸化、およびＡｋｔおよびｐ７０  Ｓ６キナーゼのＳｅｒ／Ｔｈｒリン酸化を誘導した。いくつかのチロシンリン酸化バンドを、ＳＤＦ−１α刺激１５分以内で７０から１２０ｋＤａの間で同定した。一方、６０〜９０ｋＤａおよび１１０〜１４５ｋＤａでのタンパク質の最大チロシンリン酸化が、ＳＣＦに応答して２．５〜７．５分以内に生じた。用量依存性研究は、細胞タンパク質の最適なリン酸化を、少なくとも２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１α、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦで得られることを示した。Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）およびｐ７０  Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）のリン酸化は、ＳＤＦ−１αに応答して５分以内、およびＳＣＦに応答して２．５分以内に生じた。
【０１９４】
実施例７：ＳＴＩ５７１およびＬＹ２９４００２は、ＣＸＣＲ４およびｃ−Ｋｉｔ経路のシグナル伝達を阻害する
低分子インヒビターＳＴＩ５７１（ｃ−Ｋｉｔを標的とする）、およびＬＹ２９４００２（ＰＩ３−Ｋを標的とする）を利用して、ＮＣＩ−Ｈ６９細胞でのＳＤＦ−１αおよびＳＣＦによる下流シグナル伝達への作用を決定した。細胞を、無処理、またはＳＴＩ５７１（５μＭ）またはＬＹ２９４００２（２５μＭ）で事前処理し、血清枯渇培地で一晩おき、続いて５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦおよび／または５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１αで１５分間刺激し、ライシスした。ライセートを上の実施例６に記載の様に処理し、膜を、Ａｋｔおよびｐ７０  Ｓ６キナーゼに対するリン酸特異的または通常抗体、ならびに抗ｃ−Ｋｉｔ抗体でプローブ処理した。Ｓｅｒ４７３／Ｔｈｒ３０８でのＡｋｔ、およびＴｈｒ３８９でのｐ７０  Ｓ６キナーゼの共リン酸化を、ＳＣＦおよびＳＤＦ−１αにより誘導した。ＳＴＩ５７１での事前処理はＳＣＦを阻害したが、ＳＤＦ−１αはリン酸化を誘導した。Ａｋｔ、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、およびｃ−Ｋｉｔの発現レベルは、該処理のいずれでも影響されなかった。対照的に、ＬＹ２９４００２での事前処理は、ＳＤＦ−１αを遮断し、ならびにＳＣＦはＡｋｔおよびｐ７０  Ｓ６キナーゼを誘導した。
【０１９５】
均等発明
当該技術分野の技術者は、単なる日常的な実験を用いて、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様と均等な多くのものを認識、または確かめることができる。該均等発明は、請求の範囲により包含されることが意図されている。
【配列表】
2005520834.tif 000002
2005520834.tif 000003
2005520834.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月9日(2005.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005520834000001.app
【国際調査報告】
2005520834.tif 000005
2005520834.tif 000006
2005520834.tif 000007
2005520834.tif 000008