(57)【要約】【課題】本発明は、パン改良組成物等の新規な酵素製剤およびそのような酵素製剤を用いることによる改良されたベーカリー製品を得るための新規な方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属するキシラン分解活性を有する酵素を含むパンまたは生地改良剤を添加することによる、生地および／または焼きあげ製品の性質を改良する方法を記載する。好ましい酵素は、シュードアルテロモナス  ハロプランクティス（Pseudoalteromonas  haloplanktis）からの低温性キシラナーゼおよびバチルス  ハロデュランス（Bacillus  halodurans）Ｃ−１２５からの中温性キシラナーゼである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
焼きあげ製品を製造する方法であって、グリコシド加水分解酵素ファミリー８よりなる群から選択される少なくとも一つのキシラン分解活性を有する酵素を含んでなるパン改良組成物をその焼きあげ製品の生地に添加する工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記酵素が、立体配置の反転を伴って加水分解するものである、請求項１の方法。
【請求項３】
前記酵素が、シュードアルテロモナス  ハロプランクティス株から得られるキシラナーゼである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
前記シュードアルテロモナス  ハロプランクティス株がシュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａである、請求項３の方法。
【請求項５】
前記酵素が、バチルス  ハロデュランス株から得られるキシラナーゼである、請求項１または２の方法。
【請求項６】
前記バチルス  ハロデュランス株がバチルス ハロデュランスＣ−１２５である、請求項５の方法。
【請求項７】
前記パン改良組成物が、生地の混合中に添加される、請求項１−６のいずれかの方法。
【請求項８】
前記パン改良組成物が、他の酵素、乳化剤、酸化剤、ミルク粉末、脂肪、糖類、アミノ酸、塩類、タンパク質（グルテン、セルロース結合部位）またはそれらの混合物よりなるリストから選択される他のパン改良剤をさらに含んでなる、請求項１−７のいずれかの方法。
【請求項９】
前記他の酵素が、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、マルトジェニック、アミラーゼ、他のキシラナーゼ、プロテアーゼ、グルコースオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、トランスグルタミナーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ペクチナーゼまたはそれらの混合物よりなるリストから選択されるものである、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記α−アミラーゼが、アスペルギルス オリザエから得られるα−アミラーゼである、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記キシラン分解活性を有する酵素が、細胞抽出物、無細胞抽出物または精製タンパク質として存在する、請求項１−１０のいずれかの方法。
【請求項１２】
前記キシラン分解活性を有する酵素が、乾燥粉末もしくは粒体、特に粉化しない粒体の形態または液体の形態の他の成分、好ましくはポリオール、糖類、有機酸または糖アルコール等の１以上の安定剤と混合される、請求項１−１１のいずれかの方法。
【請求項１３】
請求項１−１２のいずれかの方法により得られる、焼きあげ製品。
【請求項１４】
カット幅の大きいアルゼンチンパンである、請求項１３の焼きあげ製品。
【請求項１５】
前記焼きあげ製品の生地の混合中に、グリコシド加水分解酵素ファミリー８よりなる群から選択されるキシラン分解活性を有する酵素の十分量を添加する工程を含んでなる、焼きあげ製品の一塊の量を増加させる方法。
【請求項１６】
前記焼きあげ製品の生地の混合中に、グリコシド加水分解酵素ファミリー８、立体配置の反転を伴って加水分解するファミリー８グリコシド加水分解酵素および／またはそれらの組み合わせよりなる群から選択されるキシラン分解活性を有する酵素の十分量を添加する工程を含んでなる、焼きあげ製品の一塊の量を増加させるあるいは焼きあげ製品の表面のカット幅を増加させる方法。
【請求項１７】
グリコシド加水分解酵素ファミリー８よりなる群から選択される少なくとも一つのキシラン分解活性を有する酵素を含むことを特徴とする、焼きあげ製品の一塊の量を増加させるあるいは焼きあげ製品の表面のカット幅を増加させるためのパン改良組成物。
【請求項１８】
前記酵素が立体配置の反転を伴って加水分解するものである、請求項１７のパン改良組成物。
【請求項１９】
前記酵素が、シュードアルテロモナス  ハロプランクティス株から得られるキシラナーゼである、請求項１７または１８のパン改良組成物。
【請求項２０】
前記シュードアルテロモナス ハロプランクティス株がシュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａである、請求項１９のパン改良組成物。
【請求項２１】
前記酵素が、バチルス  ハロデュランス株から得られるキシラナーゼである、請求項１７または１８のパン改良組成物。
【請求項２２】
前記バチルス ハロデュランス株がバチルス  ハロデュランスＣ−１２５である、請求項２１のパン改良組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリコシド加水分解酵素ファミリー８からの少なくとも一つのキシラン分解活性を有する酵素を含んでなるベーカリー製品を改良するための方法および組成物に関する。本発明の一実施態様において、キシラン分解活性を有する酵素は、加水分解中に立体配置の反転があるという事実によりさらに特徴付けられる。本発明の特定の実施態様において、キシラン分解活性を有する酵素は、シュードアルテロモナス  ハロプランクティス（Pseudoalteromonas  haloplanktis）からの低温性キシラナーゼまたはバチルス ハロデュランス（Bacillus  halodurans）からの中温性キシラナーゼである。
【背景技術】
【０００２】
キシランは、植物バイオマス中に存在するヘミセルロースの主要部分を形成するヘテロ多糖である。これらの多糖の主鎖は、β１−４結合キシロピラノシル残基の鎖である。多くの異なる側鎖基が、アセチル、アラビノシルおよびグルクロノシル残基のようなこれらの残基に結合しうる。フェルラ酸またはヒドロキシケイ皮酸等のフェノール化合物がまた、例えば、キシラン鎖の架橋においてまたはキシランとリグニン鎖の間の結合においてエステル結合を介して含まれる。
【０００３】
エンドキシラナーゼ（またはエンド−β−１，４−キシラナーゼ）は、ヘミセルロースの主鎖を特異的に加水分解する。いくつかの場合には、側鎖基は、立体障害により主鎖をマスクする。様々のキシラナーゼ活性が記載されている。それらの基質に対する特異性は、それぞれで異なっている。あるものは不溶性のアラビノキシランに、より活性である。生成されるオリゴマーの長さもまた、考慮されるキシラナーゼの種類に依存する。
【０００４】
グリコシド加水分解酵素（かつては、セルラーゼファミリーＤとして知られていた）は、配列の相同性、構造的特徴およびメカニズム的な特徴に基づいて、９１ファミリー（http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/）に分類されている。タンパク質の折りたたみ（fold）はそれらの配列よりもより良く保存されているので、ファミリーのいくつかは‘クラン（clans）’にグループ化できる（Henrissat  B.  1991,  Biochem.  J.  Vol.280,  p309）。エンド−β−１，４−キシラナーゼは、一般に、ファミリー１０（かつてのファミリーＦ）と１１（かつてのファミリーＧ）とに分類され、しばしば、それらのＰＩと分子量の間に反対の関係を有することが見出される。ファミリー１０キシラナーゼ（ＥＸｓ１０）はより大きく、より複雑であり、一方、ファミリー１１キシラナーゼ（ＥＸｓ１１）はより小さい。また、双方のファミリーの構造および触媒的特性において有意な差異が存在する。ＥＸｓ１０は（α／β）８バレル折りたたみ（barrel  fold）を示し、約４０％のα−へリックス構造を有し、クランＧＨ−Ｃに属する（Dominguezら、1995,  Nat.  Struct.  Biol.  Vol.2,  p569）が、ＥＸｓ１１はβ−ゼリー折りたたみ立体配座を示し、約３〜５％のα−へリックス構造を有し、クランＧＨ−Ａに属する（T&ouml;rr&ouml;nenら、1994,  EMBO  J.  Vol.13,  p2498）。ＥＸｓ１０は、不飽和キシランに対してより高い親和性を有する、ＥＸｓ１１に比べて、より小さい基質結合部位とより低い基質特異性を有し、しばしばエンドグルカナーゼ活性を有し、より小さいオリゴ糖を生産する（Bielyら、1997,  J.  Biotechnol.  Vol.57,  p151）。これまでに特徴付けられた双方のファミリーのすべてのキシラナーゼは、二つのグルタメートが触媒的残基として機能する加水分解のあと、グリコシド酸素のアノマー立体配置を保持している（Jeffries,  1997,  Curr.  Opin.  Biotechnol.  Vol.7,  p337）。
【０００５】
キシラナーゼは、パルプ、製紙、飼料およびベーカリー産業等の種々の産業分野で使用される。他の応用は、ジュースおよびビール産業部門に存する。キシラナーゼは、小麦分離プロセスにおいても使用されうる。観察された技術的な効果は、とりわけ、パルプの漂白性改良、飼料の粘度減少または生地性質の変化である。
【０００６】
ベーキングにおけるキシラナーゼ（ヘミセルラーゼまたはペントサナーゼとも呼ばれる）の使用は、多年来、周知である。これらの生地調整酵素は、生地の機械加工性および安定性ならびにオーブンスプリング（oven-spring）およびクラム構造（crumb structure）を改良することができる。酵素の他の効果は、より大きな一塊の量およびより柔らかいクラムである。
【０００７】
製パンにおけるキシラナーゼの作用メカニズムは、依然として明確には解明されていない。小麦粉中には約３〜４％のペントサンがある。これらのペントサンは、多量の水（３０％まで）を吸収できる。この水吸収は、生地の性質にそして最終製品の品質に貢献する。ペントサナーゼによるペントサンの水可溶性短鎖オリゴ糖への部分加水分解は、水結合能力を増加させる。ペントサンと小麦粉のグルテン分画との強い相互作用もあり、ネットワークを形成する。ペントサナーゼは、この強く固いネットワークの緩和を助け、そのため、酵母により生成される二酸化炭素が生地をより良く膨張させることを可能にする。
【０００８】
多くの種類のヘミセルラーゼ製剤は、ベーキング活性成分として使用されており、市販されている。それらは、種々の微生物を酵素源として用いて、微生物による発酵により製造される。これらの酵素のいくつかは、遺伝子的に修飾された微生物によっても製造される。特定量の焼きあげ品にプラスの効果を有するキシラナーゼの文献記載の用途のすべては、上記のようなグリコシド加水分解酵素ファミリー１０またはファミリー１１に属するキシラナーゼに関する。
【０００９】
ベーキング用のキシラナーゼの例は、バチルス  ズブチリス（Bacillus  subtilis）およびアスペルギルス  ニガー（Aspergillus  niger）からのキシラナーゼである。
【００１０】
酵素製剤におけるキシラナーゼ活性を評価する多数の方法がある。キシラナーゼ活性を決定するそのような方法の例は、キシランからの還元糖の放出の測定（Miller  G.L.  1959,  Anal.  Chem.  Vol.31,  p426）または修飾基質からの着色化合物の放出の測定（例えば、MegazymeからのAzoWAXまたはXylazyme  AX）である。しかしながら、種々の酵素製剤において見出されるキシラン分解活性とベーキングにおける効果との間に直接的な関係は認められなかった。使用量に関連した結果が、単一の酵素についてある程度観察されたが、異なる起源の２種のキシラナーゼについて同じ量を使用しても、生地やパンにおいて同じ結果を与えない。いくつかの理由がこれを説明しうる。すなわち、基質特異性の相違、温度の差異、および最適ｐＨ、等々。
【００１１】
新規なまたは改良された性質を有する、パン改良剤組成物またはパン改良剤等の酵素製剤を開発することは非常に関心を持たれている。これらの性質の一つは、ベーキングにおいて特定の結果を得るために必要な酵素の重量の観点でキシラナーゼ画分ができるだけ小さいことである。
【００１２】
南極の細菌、シュードアルテロモナス  ハロプランクティス（Pseudoalteromonas  haloplanktis）からのキシラナーゼが最近報告されている（Collins,  T.ら、2002,  A  novel  Family  8  xylanase:  functional  and  physico-chemical  characterisation.  J.  Biol.  Chem.  Vol.277-38,  p35133;  Collins,  Tら、2003,  Activity,  stability  and  flexibility  in  glycosidases  adapted  to  extreme  thermal  environments.  J.  Biol.  Vol.328,  p419;  Van  Petegem  F.ら、2002,  Crystallization  and  preliminary  X-ray  analysis  of  a  xylanase  from  the  psychrophile  Pseudoalteromonas  haloplanktis.  Acta  Crystallogr  D  Biol  Crystallogr.  Vol.58(Pt  9),  p1494-6)。この酵素は、典型的な低温性酵素であり、低温で高い触媒的活性を示す。それはファミリー１０または１１キシラナーゼと相同性ではないが、主にエンドグルカナーゼさらにまたリケナーゼおよびキトサナーゼを含んでなるファミリーである、グリコシド加水分解酵素ファミリー８（かつては、ファミリーＤ）メンバーと２０〜３０％の同一性を有する。さらに、ｉｎｔｅｒＰｒｏ  Ｓｃａｎサーチプログラム（ZdobnovおよびApweiler,  2001,  Bioinformatics  Vol.17,  p847）を用いるＰＲＩＮＴＳに対するＦｉｎｇｅｒＰＲＩＮＴＳｃａｎは、単離された配列が、分析された２０のファミリー８酵素において完全に保存されている、グリコシド加水分解酵素ファミリー８フィンガープリントおよびファミリー８残基を含むことを示した。
【００１３】
ＥＸｓ１０およびＥＸｓ１１とは反対に、このファミリー８キシラナーゼ（ＥＸｓ８）は、高いｐＨと高い分子量の双方を有する。構造的および触媒的性質は、ＥＸｓ１０およびＥＸｓ１１の双方のそれらとは異なっている。ＥＸｓ８は、１３α−へリックスおよび１３β−ストランドを有する（α／α）６バレル折りたたみを示し、クランＧＨ−Ｍに属する（Van  Petegemら、2003,  The structure  of  a  cold-adapted  family  8  xylanase  at  1.3  A  resolution.  Structural  adaptations  to  cold  and  investigation  of  the  active  site.  J.  Biol.  Chem.  Vol.278(9),  p7531-9）。これらの酵素は、エンドグルカナーゼ、キトサナーゼまたはリケニナーゼ活性を持たず、長鎖キシロオリゴ糖に対してより活性であり、ＥＸｓ１１に機能的に類似であると思われる。
【００１４】
立体配置を保持する他の公知のＥＸｓ１０およびＥＸｓ１１とは対照的に、ファミリー８グリコ−加水分解酵素（Fierobeら、1993,  Eur.  J.  Biochem.  Vol.217,  p557;  http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/）は、一つのグルタメートと一つのアスパルテートが触媒的残基として機能する加水分解のあと、グリコシド酸素のアノマー立体配置が反転して基質を加水分解する傾向にある。これは、例えば、シュードアルテロモナス
ハロプランクティスからの低温性キシラナーゼについて示されている（Van  Petegemら、2003,  J.  Biol.  Chem.  Vol.278(9),  p7531-9;  Collins,  T.ら、2002,  A  novel  Family  8  xylanase:  functional  and  physico-chemical  characterisation.  J.  Biol.  Chem.  Vol.277(38),  p35133）。グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属する他のキシラナーゼはすでに報告されている（Yoon,  K-H.,  1998,  Molecular  cloning  of  a  Bacillus  sp.  KK-1  xylanase  gene  and  characterization  of  the  gene product.  Biochem.  Mol.  Biol.  International.  45(2),  p.337;  Bacillus  halodurans  C-125  xylanase  Y  GenBank/GenPeptTM  accession  code  BAB05824）。これらのキシラナーゼは、それらの間および、Collinsら(2002,上記）によって記されたような、シュードアルテロモナス  ハロプランクティスキシラナーゼとの間で配列相同性を示す。
【００１５】
グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属する酵素のリストは、定期的に更新されている（http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、パン改良組成物等の新規な酵素製剤を提供することを目的とする。
【００１７】
本発明は、さらに、そのような酵素製剤を用いることによる、改良されたベーカリー製品を得るための新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
驚くことに、キシラン分解活性を有し、グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属する酵素が、生地の混合中に添加されると、生地の性質または焼きあげ製品の性質にプラスの効果を与えることが見出された。
【００１９】
また、驚くことに、キシラン分解活性を有し、アノマー立体配置の反転で加水分解する酵素が、生地の混合中に添加されると、生地の性質または焼きあげ製品の性質にプラスの効果を与えることが見出された。
【００２０】
さらに、驚くことに、上記の酵素の使用は、一塊の量を増加させることが見出された。
【００２１】
さらにまた、グリコシド加水分解酵素ファミリー８、ＥＸｓ８、からのキシラン分解活性を有するいくつかのそのような酵素の使用は、現在公知のキシラナーゼと比較して、生地またはパンの性質に同じ効果を与える上で、より少ない酵素の使用を可能にする。
【００２２】
本発明の特定の態様は、グリコシド加水分解酵素ファミリー８からのキシラン分解活性を有する酵素および上記のようなベーキング産業におけるそれらの使用に関する。
【００２３】
本発明の特定の態様は、シュードアルテロモナス  ハロプランクティスからの低温性ファミリー８キシラナーゼおよびバチルス  ハロデュランスからの中温性ファミリー８キシラナーゼＹに関する。これらの酵素は、アノマー立体配置の反転で加水分解するキシラナーゼである。
【００２４】
好ましいキシラナーゼは、シュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａ株およびバチルス  ハロデュランスＣ−１２５から得られるものまたは好適な宿主中で発現される対応する遺伝子から得られるものである。
【００２５】
好ましくは、本発明の少なくとも一つの酵素を含んでなるパン改良組成物は、生地の混合中に添加される。
【００２６】
このパン改良組成物は、他の酵素、乳化剤、酸化剤、ミルク粉末、脂肪、糖類、アミノ酸、塩類、タンパク質（グルテン、セルロース結合部位）またはそれらの混合物よりなるリストから選択される他のパン改良剤をさらに含んでいてもよい。
【００２７】
その他の酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、マルトジェニック（maltogenic）アミラーゼ、他のキシラナーゼ、プロテアーゼ、グルコースオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、トランスグルタミナーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ペクチナーゼまたはそれらの混合物よりなるリストから選択されうる。
【００２８】
α−アミラーゼは、好ましくは、アスペルギルス  オリザエ（Aspergillus  oryzae）である。
【００２９】
本発明に係るキシラン分解活性を有する酵素は、細胞抽出物、無細胞抽出物または精製タンパク質として、上記のパン改良組成物中で使用しうる。
【００３０】
本発明の酵素は、他の成分と混合され、乾燥粉末もしくは粒体、特に粉化しない粒体の形態または液体の形態で使用してもよく、好ましくは、ポリオール、糖類、有機酸または糖アルコール等の１以上の安定剤と使用しうる。
【００３１】
本発明の他の態様は、本発明の酵素を用いて得られたまたは得ることができる、焼きあげ製品に関する。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、本発明の酵素の少なくとも一つを含んでなるパン改良組成物に関する。
【００３３】
本発明のさらに他の態様は、焼きあげ製品の生地の混合中に、グリコシド加水分解酵素ファミリー８キシラナーゼ、できる限り、立体配置の反転を伴って加水分解するキシラン分解活性を有する酵素よりなる群から選択されるキシラン分解活性を有する酵素の十分量を添加する工程を含んでなる、焼きあげ製品の一塊の量を増加させる方法に関する。上記の目的のいずれかのために、生地またはベーカリー製品中で上記の酵素の任意の組合せまたは混合物を使用することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明を、添付の図面を参照して、以下の実施例および実施態様においてさらに詳細に説明する。特定の実施態様および実施例は、クレームされた本発明の範囲を一切限定しようとするものではない。
【００３５】
本発明は、とりわけ、一塊の量を改良するための、ベーキングにおける、キシラン分解活性を有するファミリー８酵素の使用に関する。その酵素は他の活性を有していてもよいが、キシラン分解活性は、本発明の目的に適しているようなものであるべきである。
【００３６】
Ａ．本発明に係るいくつかの好ましい酵素の調製
グリコシド加水分解酵素ファミリー８からのキシラン分解活性を有する酵素は、種々のソースから得ることができる（例えば、概要は、http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/参照）。酵素のいくつかは、学術文献に記載されており、したがって、対応する刊行物中に記載の手法を用いて得られる。以下に、本発明に係るいくつかの好ましい酵素の調製について、より詳細に説明する。
【００３７】
Ａ．１．シュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａからのキシラナーゼ
シュードアルテロモナス ハロプランクティスＴＡＨ３ａからのキシラナーゼは、Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｔ．ら（2002.  A  novel  Family  8 xylanase:  functional  and  physico-chemical  characterisation.  J.  Biol.  Chem.  Vol.277(38),  p35133）に記載されている。Ｃｏｌｌｉｎｓらは、発現プラスミド中にクローニングされたシュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａキシラナーゼ遺伝子を持つ大腸菌の組換え株の液体培養による調製を記載している。
【００３８】
シュードアルテロモナス  ハロプランクティスのキシラナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は利用可能であり、対応するアミノ酸配列も利用可能である（ＥＭＢＬ登録番号 AJ427921、それに参照で添付された配列、図３Ａ〜Ｂ、配列番号：６〜７）。酵素は、４６０００Ｄａの分子量、約９．５の等電点、３５℃の至適温度および５．３〜８の至適ｐＨを有する。それは、延長されたインキュベーションの後のキシラン加水分解の主反応生成物がキシロトリオースおよびキシロテトラオースである、真のキシラナーゼである。
【００３９】
このキシラナーゼの粗製剤および精製製剤は、野生型組換え株のいずれかを、酵素を発現するのに好適な培地中でまず培養し、場合により、その後、遠心分離、細胞破壊、精密濾過、限外濾過、析出、液体クロマトグラフィー、凍結乾燥等々の、ただしこれらに限定されない、１または数段階の精製により得ることができる。
【００４０】
Ａ．２．バチルス  ハロデュランスＣ−１２５株からのキシラナーゼＹ
バチルス ハロデュランスＣ−１２５株からのファミリー８キシラナーゼＹの配列（ATCCCBAA-125）はＧｅｎＢａｎｋ／ＧｅｎＰｅｐｔTM登録コードBAB05824として利用可能である（それに参照で添付された配列、図４、配列番号：８）。対応するＤＮＡ配列は、バチルス  ハロデュランスＣ−１２５株の完全ゲノム配列の一部として利用可能である（登録コード
AP001514、それに参照で添付された配列）。
【００４１】
バチルス  ハロデュランスＣ−１２５からのキシラナーゼは、その菌株を、キシラナーゼを発現するのに好適な培地中でまず培養し、その後、遠心分離、細胞破壊、精密濾過、限外濾過、析出、液体クロマトグラフィー、凍結乾燥等々の、ただしこれらに限定されない、１または数段階の精製により得ることができる。
【００４２】
あるいは、バチルス  ハロデュランスＣ−１２５からのキシラナーゼは、対応する遺伝子を、ＰＣＲ増幅、ベクターへのライゲーション、および微生物宿主での形質転換等の周知の手法を用いて、まずクローニングすることにより得られる。この工程の後、キシラナーゼは、遺伝子をプロモーターおよびターミネーターのような、ただしこれらに限定されない適当なコントロール配列のコントロール下に置き、遺伝子の発現を許容する細胞にこのＤＮＡ構築物を挿入することにより、好適な宿主中で有利に発現される。
【００４３】
本発明の特定の実施態様において、キシラナーゼ遺伝子はその細胞中で過剰発現される。
【００４４】
しかしながら、本発明は、上記の酵素に限定されるものではなく、グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属するキシラン分解活性を有する他の酵素に広がる。これらの酵素は、植物または動物等の、ただしこれらに限定されない微生物および非微生物の生きた細胞により生産される。酵素は、生きた細胞培養物から直接得てもよく、および／または組換え株または宿主細胞により生産されうる。本酵素をコードする遺伝子は、合成遺伝子であってもよい。
【００４５】
「組換え株」によりあるいは「組換え宿主細胞」によりとは、グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属するキシラン分解活性を有する前記酵素のヌクレオチド配列が組み込まれている株を意味する。
【００４６】
有利には、組換え宿主細胞は、微生物界、好ましくは酵母を含む細菌または糸状菌、より好ましくはバチルスよりなる群から選択される。
【００４７】
好ましくは、前記組換え株は、前記ヌクレオチド配列を過剰発現できるものであり、有利には前記キシラナーゼを高生産できるものである。
【００４８】
本発明により製造されるキシラン分解活性を有する酵素は、本発明の目的のために直接使用することができ、および／または１以上の精製または（さらに）培養工程に付してもよい。本発明の特定の実施態様においては、酵素は純粋な形態で使用しうる。
【００４９】
本発明に係る可能な酵素の調製方法として、振盪フラスコ中もしくは培養器中で組換え体またはそうではない微生物の培養物からの調製もしくは精製、固定化培養物、抽出物からの調製もしくは精製および／または生きた細胞（植物等）からの精製などが挙げられる。
【００５０】
Ｂ．酵素の応用
精製されたまたは精製されていない、本発明に係るキシラン分解活性を有する酵素は、特に、パン改良剤として好適である。パン改良剤は、きめ、香り、劣化防止効果、柔らかさ、保存によるクラムの柔らかさ、新鮮さ、生地の機械加工性、最終製品の容量を改良または増加させうる製品である。好ましくは、キシラン分解活性を有する酵素は、生地の取扱い性を改善し、および／または最終焼きあげ製品の比容量を増加させる。「焼きあげ製品」は、生地から調製されるすべての製品、特に、酵母で膨らませた焼きあげ製品を包含するものである。生地は、あらゆる種類の小麦粉またはミール（例えば、小麦、ライ麦、大麦、オート麦またはトウモロコシベースのもの）から得られる。好ましくは、生地は、小麦または小麦を含むミックスで調製される。
【００５１】
ファミリー８に属するキシラン分解活性を有する酵素が、有利には、パン改良剤調合物に使用されうることを示すことが、本発明の態様の一つである。
【００５２】
本発明のさらなる実施態様において、グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属するキシラン分解活性を有する酵素は、焼きあげ製品の一塊の量を増加させる。
【００５３】
本発明のさらなる実施態様において、ベーキングにおいて特定の結果を得るために必要なキシラン分解活性を有するファミリー８酵素の量は、市販の酵素で実施したときに一般的に使用される量よりも、例外的に低い。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、キシラン分解活性を有する前記酵素に他の酵素、特にα−アミラーゼ、好ましくはアスペルギルス
オリザエ（Aspergillus  oryzae）からのα−アミラーゼを添加した効果に関する。キシラン分解活性を有する前記酵素は、他の酵素、乳化剤、酸化剤、ミルク粉末、脂肪、糖類、アミノ酸、塩類、タンパク質（グルテン、セルロース結合部位）等の、ただしそれらに限定されない、他のパン改良剤と組み合わせて使用してもよく、そのような改良剤は当業者に周知である。酵素の例は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、グルコースオキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、グルカナーゼ、セルラーゼ、トランスグルタミナーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ペクチナーゼ等であるが、ただしそれらに限定されない。
【００５５】
本発明に係るキシラン分解活性を有する酵素は、いくつかの形態で使用しうる。酵素を発現する細胞、例えば酵母、糸状菌、アルケアバクテリア（Archea  bacteria）またはバクテリアはこの方法で直接使用しうる。前記酵素は、細胞抽出物、無細胞抽出物（すなわち、１以上の破壊、遠心分離および／または抽出工程に付された宿主細胞の部分）または精製タンパク質として使用しうる。上記の形態のいずれかを、上記の形態のいずれかである他の酵素と組み合わせて使用しうる。前記細胞、細胞抽出物、無細胞抽出物または酵素は、例えば乾燥粉末もしくは粒体、特に粉化しない粒体の形態または液体の形態の様々な成分、例えばポリオール、糖類、有機酸または糖アルコール等の安定剤と、確立された方法に従って混合しうる。
【実施例１】
【００５６】
実施例１：シュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａのキシラナーゼの調製
シュードアルテロモナス ハロプランクティスからのキシラナーゼは、記載のように（collinsら、2002、上記参照）、対応する遺伝子を含むＤＮＡベクターで形質転換した大腸菌の組換え菌株の液体培養物から得られた。
【実施例２】
【００５７】
実施例２：バチルス  ハロデュランスＣ−１２５からのキシラナーゼの調製
（菌株および培養条件）
バチルス ハロデュランスＣ−１２５（ATCC BAA-125）を、１０ｇ／ｌのバーチウッド（birchwood）キシラン（シグマ社）を補足したアルカリ性バチルス培地（１０ｇ／ｌのグルコース、５ｇ／ｌの酵母エキス（Difco社）、１０ｇ／ｌのバクトトリプトファン（Difco社）、１ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、０．２ｇ／ｌのＭｇＳＯ4、１０ｇ／ｌのＮａ2ＣＯ3）中で、３７℃、７２時間培養した。１８０００ｇ、４℃で１時間遠心分離した後、上清を８０％硫酸アンモニウムで析出させて濃縮し、ｐＨ８．０で２０ｍＭ  ＭＯＰＳ中に再懸濁した。この画分は、ベーキング試験に使用される粗抽出画分に相当する。
【００５８】
（キシラナーゼＹ遺伝子のクローニングと過剰発現）
ゲノムＤＮＡは、上記の改変アルカリ性バチルス培地中、３７℃で培養した１６時間培養物から、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Promega社）で抽出および精製した。刊行された配列（GenBank/GenPeptTM  登録番号AP001514）に基づいて、全体のキシラナーゼＹ遺伝子は、Ｎｄｅ  I部位（下線部）を含むセンスプライマー
5'-GGGCATATGAAGAAAACGACAGAAGG  TG-3'、配列番号１
およびＸｈｏ  Ｉ部位（下線部）と停止コドン（イタリック）を含むアンチセンスプライマー
5'-GGCTCGAGCTAG  TGTTCCTCTTCTTG-3'、配列番号２
と共にＶＥＮＴポリメラーゼ（Biolabs  Inc,  Bervely,  MA,  USA）を用いてＰＣＲ増幅した。
【００５９】
９５℃で３分間の最初の変性の後、プロジーン装置（Techne  Cambridge,  UK）を用いて、２５サイクルの増幅を行った。各々のサイクルは、９５℃で１分間の変性、５２℃で３０秒のハイブリッド形成、および７２℃１．５分間の延長を包含する。
【００６０】
ＰＣＲ生成物は、供給者により推奨された手順を用いて、ＰＣＲＳｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）ベクター（Stratagene）にクローニングし、エピクリアン  コリ(Epicurian  Coli)  ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｋａｎウルトラコンピーテント（ultracompetent）細胞を形質転換するために用いた。ブルー−ホワイト選択により、ＰＣＲフラグメントを有するホワイトコロニーの選択ができた。精製プラスミド製剤（Nucleospin  plasmid、  Macherey-Nagel）は、ＡＬＦ  ＤＮＡシーケンサー（Pharmacia  Biotech）で配列決定した。挿入フラグメントの配列決定は、ユニバーサルプライマーＴ７とＲＰおよび以下のプライマー：
5'-GTGCGGACTGAAGGAATGTC-3'、配列番号３
5'-GTATGGTCCATCAACAGAGG-3'配列番号４
5'-GATGGCACTAAAAACTCCTGG-3'配列番号５
を用いて行った。
【００６１】
得られた配列は、登録番号AP001514のＧｅｎＢａｎｋ／ｇｅｎＰｅｐｔ（登録商標）から読み出すことができた刊行された配列と同一であった。
【００６２】
ＰＣＲＳｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）にクローニングされたキシラナーゼＹ遺伝子は、次いで、Ｎｄｅ  IおよびＸｈｏ  Ｉで切断し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）クローニングベクター（Novagen社）に結合した。得られた組換えプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Stratagene社）に形質変換した。
【００６３】
（バチルス  ハロデュランスＣ−１２５からの組換えファミリー８キシラナーゼＹの製造）
キシラナーゼ遺伝子を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の５時間予備培養物（３７℃）１５ｍｌを１００００ｇで１分間遠心分離し、ペレットを、３リットルの振盪フラスコ中の２００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むテリフィックブロス（terrific  broth）（１２ｇ／ｌのバクトトリプトファン（Difco社）、２４ｇ／ｌの酵母エキス（Difco社）、４ｍｌ／ｌのグリセリン、１２．５４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、２．３１ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4）９００ｍｌに再懸濁した。培養物を、５５０ｎｍでの吸光度が３〜４の間に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートし、次いで酵素の発現を１ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−ガラクトピラノシドで誘起した。３７℃でさらに１５時間インキュベートした後、細胞を４℃、１８０００ｇで３０分間遠心分離することにより収集し、１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＢＩＣＩＮＥ中に再懸濁し、予備冷却した細胞破壊剤（Constant  System社、Warwick,  UK)中で２８Kｐｓｉで破壊し、４０，０００ｇで３０分間遠心分離した。
【００６４】
（組換えバチルス  ハロデュランスＣ−１２５ファミリー８キシラナーゼＹの製造）
キシラナーゼ遺伝子を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の５時間予備培養物（３７℃）の細胞を１０，０００ｇで１分間遠心分離することにより収集し、２００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むテリフィックブロス（１２ｇ／ｌのバクトトリプトファン（Difco社）、２４ｇ／ｌの酵母エキス（Difco社）、４ｍｌ／ｌのグリセリン、１２．５４ｇ／ｌのＫ2ＨＰＯ4、２．３１ｇ／ｌのＫＨ2ＰＯ4）５リットル（培養１リットルあたり、１５ｍｌ予備培養物）を接種するために使用した。培養物を、５５０ｎｍでの吸光度が３〜４の間に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍでインキュベートし、次いで酵素の発現を１ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−ガラクトピラノシドで誘起した。３７℃でさらに４時間インキュベートした後、細胞を４℃、１８０００ｇで２０分間遠心分離することにより収集し、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ（Sigma社）中に再懸濁し、予備冷却した細胞破壊剤（Constant  System社)中で２８Kｐｓｉで破壊し４０，０００ｇで３０分間遠心分離した。染色体ＤＮＡは、０．２％硫酸プロタミン（Calbiochem社）で処理し、４０，０００ｇで３０分間遠心分離することにより除去した。その後、２５単位のベンゾナーゼ（Merck,
Darmstadt,  ドイツ）を添加し、溶液をベーキング試験で使用した。
【実施例３】
【００６５】
実施例３：ベルギーハードロールのベーキングにおけるシュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａのキシラナーゼの効果
ベーキング試験は、ベーキングにおけるシュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａキシラナーゼのプラス効果を実証するために行われた。プラス効果は、この酵素を含まない対照物と比較して、パンの体積の増加により評価した。
【００６６】
キシラナーゼは、ベルギーで毎日大規模に製造されるベルギーハードロールにおいて試験した。記載の手順は熟練パン職人に周知であり、同じ結果が他の供給者からの装置を用いることによっても得られるであろうことは当業者に明らかである。
【００６７】
使用される成分は、下記の表１に列挙する。
【表１】
2005537806.tif 000002
(1)：シュードアルテロモナス  ハロプランクティスキシラナーゼの1単位は、３０℃、ｐH４．５でバーチウッドキシランから１マイクロモルの還元糖(キシロースで表される)を放出するのに必要な酵素の量として定義される（Nelson-Somogyi法）。
【００６８】
成分を、Ｄｉｏｓｎａ  ＳＰ２４ミキサー中、低速で２分間、高速で８分間混合した。最終生地温度ならびに休止時間および品質テスト（proofing）温度は２５℃であった。２５℃で１５分間休止後、生地を手作業で再加工し、さらに１０分間休止した。その後、２ｋｇの生地ピースを作製し、１０分間品質テストした（proofed）。２ｋｇの生地ピースを分割し、Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ  Ｏｐｔｉｍａｔを用いて仕上げた。６６ｇの丸い生地ピースが得られた。さらに５分間の休止時間の後、生地ピースをプレスによりカットし、７０分間最終品質テスト段階に付した。生地ピースは、スチームでのＭＩＷＥ
ＣｏｎｄｏTMオーブン（Michael  Wenz-Arnstein-Germany）中、２３０℃で焼きあげた。６ロールの体積は、一般に使用される菜種押しのけ容積法を用いて測定した。
【００６９】
結果を以下の表２に示す。
【表２】
2005537806.tif 000003
【００７０】
キシラナーゼの効果のグラフ表示を図１に示す。
【００７１】
これらの結果は、シュードアルテロモナス  ハロプランクティスのキシラナーゼがパンの体積へのプラス効果を有することを示す。
【実施例４】
【００７２】
実施例４：ベーキングに使用されたキシラナーゼ量の比較
実施例３に記載されたベルギーハードロール分析における体積への同じ効果を得るために必要なキシラナーゼの相対量は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により比較される。
【００７３】
試験されたキシラナーゼおよびベーキングにおけるそれらの各々の使用量は以下のとおりである。
・シュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａからのキシラナーゼ（３０Ｐ．ハロプランクティス単位／１００ｋｇ小麦粉）
・バチルス  ズブチリスからのキシラナーゼ（Belase  B210  (BELDEM  S.A.,  ベルギー）−３ｇ／１００ｋｇ小麦粉)
【００７４】
小麦粉０．３３３ｋｇおよび０．１６６ｋｇを処理するのに必要な量に対応し、同じ体積増加をもたらす酵素の量を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動用の１２％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌプレキャストゲル「レディゲル」（BIO-RAD,  Hercules,  CA,  USA）上に載せ、製造者の手順に従って、「Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ」（BIO-RAD）装置で運転した。タンパク質は、標準的な手順を用いてクーマシー（Coomassie）ブルーで染色した。
【００７５】
染色されたゲルの図を図２に示す。
【００７６】
この図から、ベーキングに必要なシュードアルテロモナス
ハロプランクティスＴＡＨ３ａからのキシラナーゼの量は、他のものに比べて、有意に少ないことを結論付けることができる。
【実施例５】
【００７７】
実施例５：アルゼンチンパンにおけるシュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａのキシラナーゼの効果
ベーキング試験は、例えばアルゼンチンパンのような、実施例３で使用されたものとは違うレシピでのベーキングにおけるファミリー８キシラナーゼのプラス効果を実証するために行われた。プラス効果は、本発明の酵素を含まない対照物と比較して、パンの体積の増加によりおよびパンの表面のカット幅により評価した。
【００７８】
本発明の酵素を、長時間の品質テスト（２０℃で１７時間)を必要とする典型的な長いパンである、アルゼンチンパンにおいて試験した。記載の手順は熟練パン職人に周知であり、同じ結果が他の供給者からの装置を用いることによっても得られるであろうことは当業者に明らかである。
【００７９】
使用される成分は、下記の表３に列挙する。
【表３】
2005537806.tif 000004
(1)：使用された標準的改良剤は以下を含む：真菌性αアミラーゼ（Fungamyl  75.000,  Novozymes）１ｇ／１００ｋｇ小麦粉、ビタミンＣ  １０ｇ、アゾジカルボンアミド  ２ｇ／１００ｋｇ小麦粉。これは、標準的改良剤の一例である。添加物の絶対的なおよび相対的な量は、小麦粉への局所的適合および方法に応じて変わりうる。
(2)：キシラナーゼの1単位は、３０℃、ｐH４．５でバーチウッドキシランから１マイクロモルの還元糖（キシロースで表される）を放出するのに必要な酵素の量として定義される（Nelson-Somogyi法）。
【００８０】
成分を、Ｄｉｏｓｎａ  ＳＰ２４ミキサー中、低速で２分間、高速で７分間混合した。休止中の最終生地温度は２５℃であり、品質テスト中のそれは２０℃であった。２５℃で２０分間休止後、生地を手作業で再加工し、品質テスト中に２０℃で１７時間休止した。その後、２ｋｇの生地ピースを作製し、１０分間品質テストした。０．３５ｋｇの生地ピースを分割し、Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｒ８／Ｌ８を用いて仕上げ、１７時間最終品質テスト段階に付した。生地ピースは、スチームでのＭＩＷＥ  ＣｏｎｄｏTMオーブン（Michael  Wenz-Arnstein-Germany）中、２１０℃で３０分間焼きあげた。アルゼンチンパンの体積は、一般に使用される菜種押しのけ容積法を用いて測定した。
【００８１】
結果を以下の表４に示す。
【表４】
2005537806.tif 000005
【００８２】
これらの結果は、ファミリー８キシラナーゼが低温（つまり２０℃）での長時間の品質テストでの製パンにプラス効果を有することを示す。ここで使用した市販の酵素（Bel'ase  B210、上記参照）の量は、ベルギーハードロールについて実施例３で記載したような必要とされる最適使用量より３倍多く、一方、必要とされるファミリー８キシラナーゼの量は変わらなかった。また、カット幅を最適化するのに必要な酵素の量と最高の体積増加に必要とされる量との間に差が存在する。
【実施例６】
【００８３】
実施例６：ベーキングにおける他の酵素と比較した本発明の種々の酵素の効果
ベーキング試験は、グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属し、キシラン分解活性を有する種々の酵素のベーキングにおけるプラス効果を実証するために行われた。プラス効果は、これらの酵素を含まない対照物および市販の酵素製剤（Bel'ase  B210、上記参照）と比較して、パン体積の増加により評価した。
【００８４】
シュードアルテロモナス ハロプランクティスＴＡＨ３ａからのキシラナーゼは、実施例１に記載のように調製し、精製した。バチルス  ハロデュランスＣ−１２５からのキシラナーゼＹは、実施例２に記載のように、組換え大腸菌株から調製した。
【００８５】
二つの酵素の性能を評価するために使用された方法は、１００ｇの小麦粉で生地を調製することからなるミニベーキング試験である。
【００８６】
記載の手順は当業者に周知であり、同じ結果が他の供給者からの装置を用いることによっても得られるであろうことは明らかである。
【００８７】
使用される成分は、下記の表５に列挙する。
【表５】
2005537806.tif 000006
(1）：キシラナーゼの1単位は、３０℃、ｐH４．５でバーチウッドキシランから１マイクロモルの還元糖(キシロースで表される)を放出するのに必要な酵素の量として定義される（Nelson-Somogyi法）。
【００８８】
成分を、Ｎａｔｉｏｎａｌミキサー中で４．５分間混合した。生地ピース１５０ｇを秤量し、プラスチックボックス中で２５℃、２０分間休止させた。生地を再加工し、さらに２５℃で２０分間休止した。最終品質テスト時間は３６℃で５０分間であった。次いで、生地ピースを、２２５℃で２０分間焼きあげた。パンの体積は、一般に使用される菜種押しのけ容積法を用いて測定した。
【００８９】
結果を以下の表６に示す。
【表６】
2005537806.tif 000007
【００９０】
これらの結果は、本発明の酵素のプラスの効果は、シュードアルテロモナス  ハロプランクティスＴＡＨ３ａキシラナーゼに限定されないことを示す。グリコシド加水分解酵素ファミリー８に属し、キシラン分解活性を持つ他の酵素製剤も、パンの性質を改良しうる（ここでは、バチルス  ハロデュランスＣ−１２５キシラナーゼについて実証、他の結果は示していない）。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】シュードアルテロモナス  ハロプランクティスキシラーゼＴＡＨ３ａの量を増加させたときのベルギーハードロールに対する効果を表す。
【図２】種々のキシラナーゼ試料のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す（ロードされた酵素の量はベーキングに使用された量に比例し、すべての酵素について同じ比例関係である）。  レーン１：分子量マーカー  レーン２〜５：各々小麦粉０．３３３（２、４）および０．１６６ｋｇ（３、５）を処理するのに必要な、シュードアルテロモナス  ハロプランクティス  キシラーゼ（２〜３）およびバチルス  ズブチリス  キシラナーゼ（４〜５）の量
【図３】シュードアルテロモナス  ハロプランクティス（Ａ）および対応するキシラナーゼ（Ｂ）のキシラナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を表す。
【図４】バチルス  ハロデュランスＣ−１２５株からのキシラナーゼＹを表す。
【配列表】
2005537806.tif 000008
2005537806.tif 000009
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2005537806.tif 000012
2005537806.tif 000013
【図１】
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【図２】
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【図３】
2005537806.tif 000016
【図４】
2005537806.tif 000017
【国際調査報告】
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2005537806.tif 000019
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