(57)【要約】２つ以上の粒子を含む滴を形成することができるフローサイトメーターであって：(a)粒子を液体フロー流(３５)中へと移動せしめるための手段(３８)；(b)前記フロー流において粒子を検出又は分析するために適合せしめられている検出又は分析手段(４６A、４６B)；(c)検出又は分析手段の下流に、廃棄液体を受け取るために配置されている廃棄経路(３９)；(d)検出又は分析手段の下流に、所望の粒子を含む収集液体を受け取るための収集経路(４１)；(e)前記収集経路から２つ以上の粒子を含む滴を分注するための滴形成手段；及び(f)液体流を廃棄経路又は収集経路に対して向けるための制御手段(４２)、を含んで成るフローサイトメーターである。
2005506547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つ以上の粒子を含む滴を形成することができるフローサイトメーターであって：
(a)粒子を液体源から液体フロー流（liquid flow stream）において移動せしめるための手段；
(b)前記フロー流において粒子を検出又は分析するために適合せしめられている検出又は分析手段；
(c)前記検出又は分析手段の下流に配置されている、廃棄液体を受け取るための廃棄経路；
(d)前記検出又は分析手段の下流に配置されている、所望の粒子を含む収集液体を受け取るための収集経路；
(e)前記収集経路から２つ以上の粒子を含む滴を分注するための滴形成手段；
(f)液体流を廃棄経路又は収集経路に対して向けるための制御手段、
を含んで成るフローサイトメーター。
【請求項２】
液体フロー流において粒子を移動せしめるための手段がポンプである、請求項１に記載のサイトメーター。
【請求項３】
前記検出又は分析手段が：
(ｉ)液体フロー流中の粒子を照射するために光線のビームを供するための手段；
(ii)各移動する粒子に関する光線を検出するため及び検出された光線と各粒子の１又は複数の特性を関連付け、そして当該粒子の１又は複数の特性に応じてシグナルを生じさせるための手段；及び
(iii)前記シグナルを受け取るための手段、
を含んで成る、請求項１又は２に記載のサイトメーター。
【請求項４】
前記廃棄経路が、廃棄物収集部位に対して向けられている廃棄用チューブを含んで成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のサイトメーター。
【請求項５】
前記収集経路が、規定の体積を有する捕獲チューブを含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイトメーター。
【請求項６】
前記収集経路が、捕獲チューブ及び当該捕獲チューブを通過する規定の体積を有する収集チューブを含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のサイトメーター。
【請求項７】
前記滴形成手段が、２つ以上の粒子を含む規定の体積の滴を分注することができる規定の出口口径を有する液滴ノズルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のサイトメーター。
【請求項８】
前記液滴ノズルが実質的に前記捕獲チューブの一方の末端に配置されている、請求項７に記載のサイトメーター。
【請求項９】
前記液滴ノズルが実質的に前記収集チューブの一方の末端に配置されている、請求項７に記載のサイトメーター。
【請求項１０】
液体を前記液滴ノズルに対して加えることができる第二の試料源を更に含んで成る、請求項９に記載のサイトメーター。
【請求項１１】
前記第二試料源がポンプ手段によって前記液滴ノズルに対して加えられている、請求項１０に記載のサイトメーター。
【請求項１２】
前記液滴ノズルによって形成された液滴を移動せしめることができる液滴捕獲手段を更に含んで成る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記液滴捕獲手段が、前記液滴ノズルに近接して配置されている真空ポンプである、請求項１２に記載のサイトメーター。
【請求項１４】
約１μl〜５００μlの体積を有する滴を形成することができる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のサイトメーター。
【請求項１５】
前記滴が２０μl〜１００μlの体積を有する、請求項１４に記載のサイトメーター。
【請求項１６】
前記液滴が約３０μlの体積を有する、請求項１５に記載のサイトメーター。
【請求項１７】
２つ以上の粒子を含む滴を形成することができるフローサイトメーターであって：
(a)粒子を含む液体流を生じさせるための液体源；
(b)前記液体流内に含まれている粒子の１又は複数の特性を検出するための検出システム；
(c)所定数の粒子を収集して当該粒子を所定の体積の液体において出口へと向けるために適合せしめられている捕獲チューブであって、当該捕獲チューブは当該液体流から選択的に粒子を受け取るための入口を有し、当該捕獲チューブは：
(ｉ)前記液体流中に含まれている粒子が入口で受け入れられて出口へと向けられる第一の位置、と
(ii)前記粒子が前記入口で受け取られない第二の位置、
の間を移動できる捕獲チューブ；
(d)前記捕獲チューブの位置を、前記検出システムから受け取ったシグナルに従い調節し、それによって所定数の粒子の収集が生じるようにするための制御システム；
(e)前記収集経路から、２つ以上の粒子を含む滴を分注するための滴形成手段；及び
(f)前記検出システムから受け取ったシグナルに従い出口で提示された液体の滴を選択するためのセレクター、
を含んで成るフローサイトメーター。
【請求項１８】
出口からの各滴の出力をセンシングするためのセンサー、当該センサーから受け取ったシグナルに従って選択的に滴を収集するために更に適合せしめられているセレクターを更に含む、請求項１７に記載のサイトメーター。
【請求項１９】
前記検出システム、前記制御システム、前記センサー及び前記セレクターに対して連結されている処理システムを含むかあるいはそれと連動するように適合せしめられているサイトメーターであって、当該処理システムは：
(ｉ)前記センサーを使用することで前記捕獲チューブの出口からの液体の滴の出力について監視し；
(ii)前記制御システムが前記捕獲チューブを第一の位置へと移動させ、それによって選定の特性を有する粒子を当該捕獲チューブ中へと向け；
(iii)所定数の粒子が前記捕獲チューブ中へと向けられる迄(ii)を繰り返し；
(iv)所定数の粒子が液体の滴１つの中に確実に含まれているように(ii)と(iii)のタイミングを調節し；
(ｖ)前記センサーを使用し前記捕獲チューブの出口からの液体の滴の出力について監視し；そして
(vi)前記セレクターが液体の滴を選択するようにする、
ために適合せしめられている、請求項１７又は１８に記載のサイトメーター。
【請求項２０】
前記セレクターが：
(a)キャッチングアーム；
(b)前記キャッチングアームの位置を調節するためのコントローラーを含み、
当該キャッチングアームは：
(ｉ)液体の滴が前記キャッチングアームによって収集される第一の位置；と
(ii) 液体の滴が前記収集器によって収集されない第二の位置、
の間を移動するように適合せしめられている、請求項１８に記載のサイトメーター。
【請求項２１】
前記滴形成手段が、２つ以上の粒子を含む規定の体積の滴を分注することができる規定の出口口経を有する液滴ノズルである、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のサイトメーター。
【請求項２２】
前記液滴ノズルが、実質的に検出器又は分析器より下流の捕獲チューブの一方の末端に配置されている、請求項２０に記載のサイトメーター。
【請求項２３】
前記液滴ノズルによって形成された滴を移動せしめることができる液滴捕獲手段を更に含んで成る、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のサイトメーター。
【請求項２４】
前記液滴捕獲手段が、前記液滴ノズルに対し近接して配置されている真空ポンプである、請求項２３に記載のサイトメーター。
【請求項２５】
１μl〜５００μlの体積を有する滴を形成することができる、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載のサイトメーター。
【請求項２６】
前記滴が２０μl〜１００μlの体積を有する、請求項２５に記載のサイトメーター。
【請求項２７】
前記液滴が約３０μlの体積を有する、請求項２６に記載のサイトメーター。
【請求項２８】
所望の種類の粒子を２つ以上有する液体の滴を獲得するための方法であって、
当該方法は：
（a）請求項１〜１６のいずれか１項に記載のサイトメーターを提供し；
（b）粒子を含む試料を液体流に対して提供し；
（c）前記液体流において粒子を検出又は分析し；
（d）所望の種類の粒子を収集液体において収集経路へと向け；
（e）所望の種類の粒子を含む収集液体に滴形成手段を通過せしめ；そして
（f）滴において所望の種類の２つ以上の粒子を収集すること、
を含んで成る方法。
【請求項２９】
所望の種類の粒子を２つ以上有する液体の滴を収集するための方法であって、当該方法は：
（a）請求項１７〜２７のいずれか１項に記載のサイトメーターを提供し；
（b）粒子を含む試料を液体流に対して提供し；
（c）前記液体流において粒子を検出又は分析し；
（d）所望の種類の粒子を収集液体において捕獲チューブへと向け；
（e）所望の種類の粒子を含む収集液体に滴形成手段を通過せしめ；そして
（f）滴において所望の種類の２つ以上の粒子を収集すること、
を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は改良されたフローサイトメーターに関連し、そして詳細には所定の数の粒子を含む液体の滴が形成され且つ収集すること可能にするサイトメーターに関連する。
【背景技術】
【０００２】
背景
フローサイトメトリーは、液体試料中の粒子の物理的又は化学的特性を、それらが、集束した光線中に存在する場合、定量的に測定するために使用されている。典型的に、このことは、水銀蒸発ランプ又はレーザーによって生じた光線ビームを、シース液として知られている液体(それは狭小層流(narrow laimnar stream)としての当該シース液中へと注入されている試料粒子を含む)の連続流に対して集束させることによって達成されている。前記シース液はフローセル（ここでシース液体は通常、直径５０〜２５０μmの微細流へとチャネル化される）を通過する。前記光線ビームは、前記流体がフローセルの石英領域内にある間、又は当該流体がフローセルを離れた場合にそれ対して集束される。このことは、それぞれ「石英内」分析又は「空中」分析として知られている。光線／レーザーが前記流体にあたる点は相互作用領域として知られている。
【０００３】
粒子がフローセルを通過する場合、それらは光線ビームに入りそして光線を散乱する。集光系は、粒子によって散乱された光線と粒子によって放射された蛍光光線を所定数の検出器へと向ける。これら全ての光散乱及び蛍光測定は同時に単一粒子に対して行うことができる。それぞれのパラメーターに関するデータは通常、フローサイトメーターからコンピューターへとリアルタイムで送られる。
【０００４】
集束されたビームを通過する液体の流速は通常、約１０ms-1であり、それは１秒あたり最大約２，０００〜１０，０００個の細胞又は粒子を分析可能にせしめる。
【０００５】
先に記載のフローサイトメトリー分析に加えて、フローサイトメトリーは、分別器としての様々な検出器からの情報を使用することで、細胞を物理的に選別するためにも使用できる。ソーティングは特定の細胞種を混合物から精製することを可能にする。フローサイトメトリーによって細胞をソートする標準的な方法は液滴偏向ソーティングとして知られている。それは、シース液の液滴を作り出すためにフローセル中で圧電変換器を使用することに依存する。交流が変換器を通過して、当該電流と同じ周波数でフローセルの振動を高めそして下げる。フローセルの振動はシース液が一度フローセル中におかれるとその中で波動を生じさせる。フローセルから更に下流で、シース液の流体中での振動は、当該流体が滴になって離散する迄更に一層明確になる。前記流体が滴へと離散する前、当該流体における最後の振動は、最終的に付与された液滴（last attached droplet）として知られている。
【０００６】
もしある粒子が収集されれば、次いで、所定の時間にて電荷がシース液に対して与えられ、当該粒子は最終付与液滴になる。前記荷電は、変換器中の圧電性結晶が１回振動する時間に渡り生じる。この結果、ソートされる粒子１つを含む、１つの液滴が荷電される。更にフローセルより下流で、液滴の流体は２つのプレート、１つは正に荷電しており１つは負に荷電している、の間を通過する。荷電した液滴が前記プレートの間を通過する場合、それが液滴の主流からそらされることで、それを収集することが可能になる。このソーティング法は、現代のサイトメーターを使用すると数千個／秒の速度で行われうる。
【０００７】
しかしながら、液滴偏向ソーティングを使用するフローサイトメーターは、少なくとも、非常に精通した操作者による日々の調整が要求される精緻な装置である。ソーティングの設定をすることも難しく且つ粒子が相互作用領域を進み最終付着液滴になるのに要する時間の長さの計算など、較正を多く必要とする。この時間の長さは液滴遅延時間として知られている。一度ソーティングの設定が行われれば、それは液滴遅延時間が変化しないことを確認するために綿密に監視されていなければならない。
【０００８】
液滴偏向ソーティングの限界とは、それが、複数の粒子を含む液滴を作り出すことができないことである。液滴偏向ソーティングの更なる問題とは、それがエアロゾルを作り出し、それ故にそれは生物学的に危険な試料を分析するためには適していないことである。液滴遅延ソーティングの使用に伴う問題により、この技術の使用は特定の研究機関に制限されている。
【０００９】
フローサイトメトリーソーティングの代替形態は、米国特許５０３０００２号「Method and apparatus for sorting particles with a moving capture tube」（本明細書中に組み込まれている）に記載されている。このソーティング法は、粒子を捕獲するために試料流内及び外へ機械的に移動せしめられる捕獲チューブを使用することである。このサイトメーターは、上方部分及びノズルを形成するように成形されている下方部分を有するハウジングから形成されている。前記ハウジングの下方部分は、分析される試料液体が入っている容器に対して連結されている。使用に際して、試料液体はポンプを使用することでチューブを介して前記ハウジングへと汲み上げられる。加えて、前記ハウジングは、ポンプを使用することでチューブに沿ってハウジング中へ注入されるシージング液の源へ接続されている。前記ハウジングの上方部分はチューブを介して、廃棄シージング液をキャッチするための廃棄容器へと接続されている。前記ハウジングの上方部分は捕獲チューブに対応するように適合せしめられている。前記捕獲チューブは第一の位置と第二の位置の間を、アクチュエーターの例えばソレノイドなどを使用することで、移動させることができる。前記捕獲チューブはシリコンホースを介して、液体の流体における生産された試料を収集する容器に連結されている。試料化された液体を分析できるようにするために、前記サイトメーターは一般に、レーザーなどの放射源から形成された検出システムと１又は複数の検出器を含む。前記検出システムは相互作用領域を流れて通過する粒子の特性を検出するように適合せしめられている。使用に際して、前記システムは試料液体内に含まれている個々の粒子を分析するためにこのシステムが動作する。このことは、チューブにポンプアップされた試料流体をハウジング中へ入れることによって達成されている。同時に、シージング液は前記チューブを介して前記ハウジング中へと汲み上げられている。前記シージング液は、サンプリング液体を囲む液体の集束流体を作り出すような圧力下でハウジング中へ供給される。シージング液とサンプリング液体がノズルを通じて集束されている場合、このことにより、サンプリング流体が、試料に由来する個々の粒子の層流を含む薄流を形成する。試料粒子が相互作用領域を通過する場合、検出システムは各細胞又は粒子の１又は複数の特性を分析するために動作する。次いで、シグナルが制御システムを介してアクチュエーターに伝達され捕獲チューブの位置が調節される。使用に際して、前記捕獲チューブが第一の位置にある場合、層流中に含まれている粒子は当該捕獲チューブを通じて収集容器へと向けられる。前記捕獲チューブが第二の位置にある場合、粒子を含む層流は廃棄容器中へと向けられる。従って、このことは前記システムが粒子を、当該粒子の所定の特性を検出し、次いで当該粒子を収集容器中へ向けるかあるいは廃棄容器中へと向けることによってソートすることを可能にする。
【００１０】
しかし、多くの場合、所定の量及び詳細には、所定の濃度の粒子を試料中で生産することができ且つこのことは一般にこのような調整により可能ではないことが望ましい。詳細に、アクチュエーターが第二の位置に置かれていてさえも、シージング液は捕獲チューブ及びホースを通じて収集容器中へと伝達されるだろう。従って、所定数の粒子を収集容器中へと向けて粒子の所望の濃度を維持することは非常に難しい。
【００１１】
例えば、このソーティング方法は、Becton Dickinson FACScalibur（登録商標）フローサイトメーターによって使用されている。このフローサイトメーターは操作が簡単で且つ粒子をソーティングする前に行われる較正又は複雑なセットアップ手順を必要としない。これは試料を分析し且つ注目の粒子をソーティングする装置を比較的大きな収集体積へと切り替える場合簡単である。
【００１２】
前記FACScalibur（登録商標）フローサイトメーターはフローセルの先端で捕獲チューブに対して連結されている、ある長さのシリコンチューブ（tubing）（ソートライン）を有する。前記捕獲チューブによってソートされる粒子は、前記ソートライン中を所望の種類の収集容器へ下流移動する。先に記載されているように、ソートされた粒子を回収容器中へと担持する前記ソートラインを進むシース液の一定の流れがある。シース液のこの一定の流れは、多体積の液体中（典型的に１〜５０ml、収集方法の時間に基づく）に含まれていたソートされる粒子によりもたらされるソートされた粒子に従って収集されなければならない。従って、粒子はそれらが分析されるかあるいは顕微鏡によって視覚化されて良い前により少ない体積に濃縮されなければならない。
【００１３】
更に、ソートされる粒子が小体積の液体である必要があるフローサイトメトリー細胞ソーティングの多くの適用がある。例えば、粒子量コントロール試料を調製することにより小体積の液体中に正確な数の粒子が含まれる。この場合、所定数の粒子が前記ソートライン中へと向けられて良い一方で、当該粒子は当該ラインに沿って様々な速度で進む傾向にあるだろう。何故なら、前記ライン内の流れは層流ではないからだ。前記流れは水分子とラインの壁との間での摩擦によりラインの壁に近い方がより遅い。結果として、シージング液全体に渡り粒子が分散するようになり、それ故に容器にて受け入れられる粒子の濃度を制御することが不可能になる。
【００１４】
米国特許５０３０００２号は、ソートされた粒子の捕獲及び濃縮をするために前記ソートラインに対して連結されているフィルターの使用を記載している。しかしながら、これらの技術を使用してさえも、試料体積中に含まれているある数の粒子を適切に制御することができない。
【００１５】
従って、FACScalibur（登録商標）フローサイトメーターは正確な数の粒子を含む液滴を生み出すために使用することができない。この理由は、ソートされた粒子をそれらが収集されて良い位置へとフローセルから担持するために、シリコンソートラインがフローセルに対して連結されていなければならないからだ。ソートされた粒子がチューブを進む場合、それらは拡散して単一の滴にはならないだろう。
【００１６】
液滴偏向ソーティングを使用するフローサイトメーターは、単一の粒子を含む液滴を生産するために使用されて良い。しかしながら、液滴偏向を使用するフローサイトメーターによって生産される液滴のサイズは典型的に直径４００μm未満に制限されており、それは多くの用途における有意な不都合を有する。例えば、量コントロール用途のための正確な数の粒子を含む凍結乾燥した液滴の調製には、操作が簡単でヒトの目で見ることができるのに十分に大きさである凍結乾燥された液滴が必要である。液滴偏向サイトメーターによる液滴は、この用途のためには大きさが十分ではない。更に、複数の粒子を含む液滴を液滴偏向サイトメーターにより生産することは不可能である。
【００１７】
更に、液滴偏向ソーティングは、粒子をソートするために捕獲チューブを使用するフローサイトメーターよりも生産方法として適していない。何故なら前記液滴偏向フローサイトメーターを較正及びセットアップすることが難しいからだ。詳細には、液滴偏向ソーティングを使用するフローサイトメーターは非常に精通した操作者を必要とし且つソーティングプロセスの間、連続して監視することを必要とする。
【００１８】
本発明者は、規定数の粒子が、様々な小体積の液体において形成されて収集されることを可能にする、フローサイトメーターに対する発展的変更を有する。
【００１９】
発明の概要
第一の観点において、本発明は、２つ以上の粒子を含む滴を形成することができるフローサイトメーターであって：
(a)粒子を液体フロー流（liquid flow stream）において液体源から移動せしめるための手段；
(b)前記液体フロー流において粒子を検出又は分析するために適合せしめられている検出又は分析手段；
(c)前記検出又は分析手段の下流に配置されている、廃棄液体を受け取るための廃棄経路；
(d)前記検出又は分析手段の下流に配置されている、所望の粒子を含む収集液体を受け取るための収集経路；
(e)前記収集経路から２つ以上の粒子を含む滴を分注するための滴形成手段；及び
(f)液体流を廃棄経路又は収集経路に対して向けるための制御手段、
を含んで成るフローサイトメーターを提供する。
【００２０】
好適に、液体フロー流において粒子を移動せしめるための手段はポンプである。
【００２１】
好適に、前記検出又は分析手段は：
(ｉ)液体フロー流中の粒子を照射するために光線のビームを提供するための手段；
(ii)各移動する粒子に関する光線を検出するため及び検出された光線と各粒子の１又は複数の特性を関連付け、そして当該粒子の１又は複数の特性に応じてシグナルを生じさせるための手段；及び
(iii)前記シグナルを受け取るための手段、
を含んで成る。
【００２２】
好適に、前記廃棄経路は廃棄物収集部位に対して向けられている廃棄用チューブを含んで成る。
【００２３】
１つの好適な形態において、前記収集経路は、規定の体積を有する捕獲チューブを含んで成る。
【００２４】
他の好適な実施態様において、前記収集経路は、規定の体積を有する収集チューブ及び前記収集チューブを通る規定の体積を有する収集チューブを含んで成る。
【００２５】
好適に、前記滴形成手段は、規定の出口口径を有し、２つ以上の粒子を含む規定の体積の滴を分注することができる液滴ノズルである。前記液滴ノズルは、検出器又は分析器より下流の捕獲チューブの一方の末端に実質上配置されていて良い。代わりに、前記液滴ノズルは前記捕獲チューブより下流の収集チューブの一方の末端に実質上配置されていて良い。
【００２６】
１つの実施態様において、前記サイトメーターは更に、液体を滴形成手段に対して加えるかあるいはそこにおいて加えることができる第二の試料源を含んで成る。好適に、前記第二の試料源は適切なポンプ手段によって前記滴形成手段に対して加えられている。前記第二試料手段により、他の液体又は物質を、収集液体に対して、滴が形成されるときかあるはその前に加えることが可能になる。フロー流を通過するものではない物質が前記粒子に対して加えられることが要求される状況がある。前記第二試料源によりサイトメーターを通過させることができない物質を加えることが可能になる。例としては、血清、着色された粒子などの粘性の液体又はサイトメーターの正常な機能に対して悪影響を及ぼす不安定な物質が挙げられる。滴形成ノズル内には２つの異なる液体の混合を補助するためにミキサーが伴われていて良い。
【００２７】
前記サイトメーターは更に、液滴ノズルによって形成された滴を移動せしめることができる液滴捕獲手段を含んで成る。１つの好適な形態において、前記液滴捕獲手段は前記液滴ノズルに近接して配置されている真空ポンプである。
【００２８】
第二の観点において、本発明は、２つ以上の粒子を含む滴を形成することができるフローサイトメーターであって：
(a)粒子を含む液体流を生じさせるための液体源；
(b)前記液体流内に含まれている粒子の１又は複数の特性を検出するための検出システム；
(c)所定数の粒子を収集して当該粒子を所定の体積の液体において出口へと向けるために適合せしめらた捕獲チューブであって、当該捕獲チューブは前記液体流から選択的に粒子を受け取るための入口を有し、当該捕獲チューブは：
(ｉ)前記液体流中に含まれている粒子が入口で受け取られて出口へと向けられる第一の位置、と
(ii)前記粒子が前記入口で受け取られない第二の位置、
の間を移動できるチューブ；
(d)前記捕獲チューブの位置を前記検出システムから受け取ったシグナルに従い調節し、それによって所定数の粒子の収集が生じるようにするための制御システム；
(e)前記収集経路から、２つ以上の粒子を含む滴を分注するための滴形成手段；及び
(f)前記検出システムから受け取ったシグナルに従い出口で提示されている液体の滴を選択するためのセレクター、
を含んで成る、フローサイトメーターを提供する。
【００２９】
前記サイトメーターは好適に、出口からの各滴の出力をセンシングするためのセンサーを含み、前記セレクターは更に、当該センサーから受け取ったシグナルに従い滴を選択的に収集するために適合せしめられている。
【００３０】
１つの好適な形態において、前記サイトメーターは、前記検出システム、前記制御システム、前記センサー及び前記セレクターに対して連結されている処理システムを含むかあるいはそれと連動するように適合せしめられており、当該処理システムは：
(ｉ)前記センサーを使用することで前記捕獲チューブの出口からの液体の滴の出力について監視し；
(ii)前記制御システムが前記捕獲チューブを第一の位置へと移動させ、それによって選定の特性を有する粒子を当該捕獲チューブ中へと向け；
(iii)所定数の粒子が前記捕獲チューブ中へと向けられる迄(ii)を繰り返し；
(iv)所定数の粒子が液体の滴１つの中に確実に含まれているように(ii)と(iii)のタイミングを調節し；
(ｖ)前記センサーを使用し前記捕獲チューブの出口からの液体の滴の出力について監視し；そして
(vi)前記セレクターが液体の滴を選択するようにする、
ために適合せしめられている。
【００３１】
前記セレクターは通常：
キャッチングアーム；
前記キャッチングアームの位置を調節するためのコントローラーを含み、当該キャッチングアームは：
(ｉ)液体の滴が前記キャッチングアームによって収集される第一の位置；と
(ii) 液体の滴が前記収集器によって収集されない第二の位置、
の間を移動するように適合せしめられている。
【００３２】
前記出口は、液体の滴を重力の作用の下で出口から落とすために典型的に入口より下に配置されている。第一の位置で収集器のアームは、好適に捕獲チューブ出口の真下に位置しており、前記第二の位置は当該第一の位置より空間的に側方にある。
【００３３】
好適に、前記滴形成手段は、２つ以上の粒子を有する規定体積の滴を分注することができる規定の出口口径を有する液滴ノズルである。前記液滴ノズルは検出器又は分析器より下流の捕獲チューブの一方の末端に配置されていて良い。
【００３４】
前記液体の滴は好適に、前記キャッチングアームが第二の位置にある場合に選択されている。
【００３５】
好適に、選択された液体の滴は試料を生成するために処理されている。この場合、この処理は典型的に、液体窒素中に液体の滴を浸し凍結した試料の滴を形成することなどである。しかし、他の形態の処理も使用されて良く、それは所定数の粒子を含む試料を作り出すように滴を試料容器中へと置くことなどである。
【００３６】
前記捕獲チューブは入口から出口への流路（flow path）を含み、当該流路は典型的に規定の長さを有する。典型的に、規定の長さとは約７０mm未満（約２２８μlの体積を与える）、好適には、約５０mm未満（約９０μlの体積を与える）の長さである。一層好適な長さは約３２mm（約１７０μlの体積を与える）である。キャッチャーチューブの流路の正確な長さは他の因子、例えば、流路の直径などに依存して変わりうることが理解されるであるだろう。
【００３７】
他の好適な形態において、前記フローサイトメーターは形成された滴を監視することを含まない。この形態において、滴形成のタイミングは、液体を担持し廃棄する真空ラインの形態においてセレクターを移動せしめることによって調節されている。
【００３８】
本発明のサイトメーターは約１μl〜５００μlの滴を形成するのに適している。通常、前記滴は約２０μl〜１００μlを含み、一層好適に前記滴は約３０μlである。
【００３９】
本発明の改良されたサイトメーターは、規定数の微生物の、例えば細菌、酵母、真菌、ウィルス、植物及び動物細胞を収集するために適している。前記サイトメーターは、規定数の粒子、例えばビーズ、胞子、卵母細胞及びのう胞を収集するためにも適している。前記サイトメーターは規定数の粒子、例えば、規定量のタンパク質、糖、薬物、化学物質及び核酸を被覆されているかあるいはそれらを含むビーズを収集するためにも適している。代わりに、前記粒子は、タンパク質、糖、薬物、化学物質及び核酸など化合物の顆粒状形態であっても良い。
【００４０】
第三の観点において、本発明は所望の種類の粒子を２つ以上有する液体の滴を獲得するための方法を供し、当該方法は：
（a）本発明の第一の観点のフローサイトメーターを提供し；
（b）粒子を含む試料を液体流に対して提供し；
（c）前記流体流において粒子を検出又は分析し；
（d）所望の種類の粒子を収集液体において収集経路へと向け；
（e）所望の種類の粒子を含む収集液体に滴形成手段を通過せしめ；そして
（f）滴において所望の種類の２つ以上の粒子を収集すること、
を含んで成る。
【００４１】
第四の観点において、本発明は所望の種類の粒子を２つ以上有する液体の滴を獲得するための方法を供し、当該方法は：
（a）本発明の第二の観点のサイトメーターを提供し；
（b）粒子を含む試料を液体流に対して提供し；
（c）前記流体流において粒子を検出又は分析し；
（d）所望の種類の粒子を収集液体において捕獲チューブへと向け；
（e）所望の種類の粒子を含む収集液体に滴形成手段を通過せしめ；そして
（f）滴において所望の種類の２つ以上の粒子を収集すること、
を含んで成る。
【００４２】
本明細書全体に渡り、特に断らない限り、用語「comprise」、又は変形「comprise」もしくは「comprising」などは、説明された要素、整数又は段階、又は要素、整数、又は段階の群を含むことを意味するが、他の全ての要素又は段階、又は要素、整数又は段階を排除はしないと解されるであるだろう。
【００４３】
本発明の明細書中に含まれている資料、作用、物質、装置、製品は、本発明の背景を供する目的のためのみである。本発明に関連する分野において、従来技術のこれらの事項のいくつか又は全てが基礎となっているかあるいは通常の一般的な知見と認められているべきではない。何故なら、それは、オーストラリアにおいて本願の各請求項の優占日前に存在するからだ。
【００４４】
本発明が更に明確に理解されるために、好適な形態が以下の図面及び例を参考にして記載されているだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明を実施するための１又は複数の態様
本発明の例は、図１を参照にすることで記載されるであるだろう。示されているように、本発明のフローサイトメーターの１つの例は、当業界で公知のサイトメーターに類似する設計を使用する。しかしながら、従来技術のサイトメーターとは対照的に、そのハウジング及びそれに関連する構成要素は、前記捕獲チューブが装置の底部に位置するように逆にされている。捕獲チューブは、当該捕獲チューブの最末端（distal end）に配置されている液滴ノズルを有し、収集された液体を当該装置から滴において滴下させるかあるいは分注させることを可能にする。
【００４６】
従って、この例では、前記サイトメーターは下方部（３１A）と上方部（３１B）を有するハウジング（３１）を含む。使用に際して、ハウジングの上方部（３１B）は、ホース（３５）を介し、１又は複数の種類の粒子を有する試料液体（３４）をが入っている容器（３３）に対して連結されている。このことにより、ポンプ（３６）を使用することで試料液体（３４）をハウジング（３１B）へと汲み入れることが可能になる。前記ハウジング（３１B）はホース（３７）を介して、シージング液の源を供するために使用されているポンプ（３８）に対しても連結されている。
【００４７】
ハウジングの下方部（３１A）はホース（３９）を介して、廃棄シージング液をキャチするための廃棄容器（４０）に対して連結されている。前記ハウジング（３１A）は、入口（４１A）と出口（４１B）を有する捕獲チューブ（４１）を受け取るために適合せしめられている。前記捕獲チューブ（４１）はアクチュエーター（４２）を使用することで第一の位置と第二の位置との間を移動することができる。
【００４８】
試料液体（３４）中に含まれている粒子の特性を検出できるようにするために、前記サイトメーターには、概して（４６）で示されている検出システムが備えられている。前記検出システム（４６）は、放射線源（４６A）と１又は複数の検出器（４６B）を含む。前記検出システム（４６）は、粒子が概して(４７)に示されている相互作用領域（４７）を通過する場合にそれらを検出するように作動する。
【００４９】
前記フローサイトメトリーは、特定の波長での吸収、密度、磁性、比重、インピーダンス、光線を散乱する能力、発光又は蛍光など、１又は複数の特定の物理特性に基づき粒子を分析するために使用されて良い。これに加えて、前記サイトメーターは、粒子を分析及びソートするためにCoulterセンシング及びRaman顕微鏡の使用と連結されていても良い。
【００５０】
光検出器（４６）は、各粒子によって前方に散乱した光線を受け取るために配置されている。蛍光も、光源（４６A）からの照射によってエネルギーを得た粒子によって放射されたならば、検出されうる。類似して、前方向に加えて、様々な方向での光の散乱が検出されうる。レーザー励起フローサイトメトリーでは、蛍光と広角散乱光の両方が、典型的に光線ビームの励起軸に対して観察軸（viewing axis）が９０°の角度で収集されている。９０°観察の軸は蛍光と広角散乱の収集にアクセスするための軸である。従って、この軸に沿って移動する光線はその要素として散乱光と蛍光の両方を含む。
【００５１】
入射レーザービームから９０°の角度で蛍光と散乱光を収集するために、当該光散乱及び蛍光は分離されているかあるは分裂されているべきである。かかる分裂を達成するために、二色性フィルター又はビームスプリッタが、分散された光線と蛍光の両方を９０°の角度で受け、そしてかかる要素をそれぞれ様々な方向に向け直すために使用されている。次いで、かかる散乱光及び蛍光の方向転換により、当該散乱光と蛍光が、たとえ、両方が９０°の角度で生じても、別々に収集されるようになる。
【００５２】
例えば、反射された散乱光は光電子倍増管によって検出されうる。もし、蛍光が多くの異なる色領域を含むのならば、様々な色の波長を分離するために二色性ミラーが使用されて良い。従って、例えば、緑色の領域における蛍光が軸に沿って二色性ミラーによって伝達されて適当な光検出器によって収集されて良い。更なる二色性ミラーが米国特許第４６６２７４２号のように、蛍光の色と分析される細胞又は粒子の更なる特性を関連づけるために含まれて良い。当業者は、様々なレンズ、フィルター、バリアなどが、できる限り純粋なシグナルを獲得するために、それぞれの更なる光検出器と共に使用されて良いことを理解するだろう。かかる光学的にきれいなシグナルを獲得することは、蛍光及び散乱光チャネルが使用されている場合に最も望ましい。
【００５３】
光検出器からの電気シグナルは典型的に、離散パルスとして、表示、保存の又は分析されている粒子の１又は複数の特性を特定又はソートするよう更に処理する目的のために装置の電子機器に対して提供されている。電子機器はもし望まれれば、分析コンソール中に含まれていて良い。
【００５４】
このような種類の構成における分析のために、所定の粒子の１つの特異的な選定特性がこの種類の構造における分析のために使用されうる場合、マルチパラメーターフローサイトメトリーを使用することも可能である。「マルチパラメーターフローサイトメトリー」とは、本明細書中で使用されている場合、特定の粒子を他のものから区別するために、その複数の特性を測定することを意味する。
【００５５】
フローサイトメトリーを使用することで粒子を分析するために有効な技術は当業界で周知である。しかし、例示の目的で、当業者が光学的な分析に依存を願う場合、粒子を含む試料は１又は複数の色素、蛍光剤又は発光剤、又はかかる試薬と接合せしめられた抗体と、フローサイトメトリーによる分析前に例えば、特定の粒子が染色又は標識されるよう混合されていて良い。かかる方法の例としては、生細胞を特異的に染色する色素フルオレセインジアシテートの使用が含まれる。フルオレセインジアシテートによる染色後、試料は分析されて、生粒子のライフサイクルの特異的なステージにある１つのそれが同定されて良い。
【００５６】
使用の際の全ての事象において、１又は複数の粒子種類を含む試料液体（３４）がチューブ（３５）に沿ってハウジング（３１B）へと汲み入れられている。この場合、シージング液が、試料液体を取り囲む集束流（focused stream）を提供するために加えられている。この流れは、試料（３４）から、個々の粒子の層流など、直径５０〜２５０μmの微細流を生じるさせるために、ハウジング（３１B）の開口部（３２）を通過せしめられている。
【００５７】
液体が相互作用領域（４７）を通過することで、検出システム（４６）を使用し、個々の粒子の特性が測定されるようになる。次いで、前記検出システム（４６）は、捕獲チューブ（４１）が第一の位置と第二の位置との間を移動することを可能にするアクチュエーター（４２）を作動させるために使用されている。前記捕獲チューブ（４１）が第一の位置にある場合、粒子は当該捕獲チューブ入口（４１A）で収集されて当該捕獲チューブ（４１）を通過するように向けられている。対照的に、前記捕獲チューブが第二の位置にある場合、前記粒子はチューブ（３９）を介して廃棄容器（４０）へと向けられている。どちらの捕獲位置においても、シース液は、加えて、前記捕獲チューブに沿って向けられるだろうことが理解されるだろう。
【００５８】
液滴ノズル（７０）の形態の滴形成手段は、捕獲チューブ（４１）の最末端部（４１B）に配置されている。前記液滴ノズルは、規定の体積の滴を形成するために適合せしめられている。
【００５９】
従って、使用に際して、前記サイトメーターは、従来技術のサイトメーターと類似する方法で、所定の特性を有する粒子のみを含む試料を作り出すために使用されて良い。しかし、加えて、捕獲チューブ（４１）の入口（４１A）と出口（４１B）間の流路は典型的に、小体積を規定するために規定の短い長さに限定されている。典型的に、規定の短い長さは、７０mm（約２２８μlの体積を与える）未満であり、好適には、５０mm（約９０μlの体積を与える）未満の長さ、そして一層好適な長さには、約３２mm（約１７０μlの体積を与える）である。その結果、前記捕獲チューブによって捕獲された全ての粒子は、当該捕獲チューブ流路に含まれているシース液内に分配されることはない。代わりに、同小体積のシース液内で浮上する傾向にある粒子が捕獲される。
【００６０】
従って、このことにより、所定数の粒子を含む個々の粒子を捕獲することが可能になる。この機能を補助するために、サイトメーターには更に又は任意に滴検出器（５０）、試料容器（５１）、及びアクチュエーター（５３）に対して連結されているキャッチャ（５２）が備えられていて良い。
【００６１】
前記滴検出器は、典型的に出口（４１B）で作り出された液体の滴を検出することができる光検出システムである。前記滴検出器は、キャッチャ（５２）と連動するように適合せしめられており、当該キャッチャは、選択的に滴を受け取るように、第一の位置（通常の線で示されている）と第二の位置（点線で示されている）との間を選択的に移動できる。
【００６２】
従って、所定数の粒子を含む試料を収集することが望まれている場合、前記サイトメーターは、液体の滴を生じさせ、そしてそれがキャッチャ（５２）によって選択的に受け取られる動作をするように配置されている。このことを達成するために、前記サイトメーターは最初、第二の位置において捕獲チューブ（４１）が作動しており、従って所望の粒子を含む粒子でさえも収集されることはない。滴検出器（５０）が、出口（４１B）から出てきた直後の滴を検出する場合、前記捕獲チューブ（４１）は、所望の特性を有する粒子を捕獲するために作動する。このプロセスは、所定数の粒子が捕獲される迄繰り返される。従って、一般に、捕獲チューブの１回の動きでは１つの粒子のみを捕まえ、そして、シース液の１つの滴中の複数の粒子を捕まえるために移動が繰り返し迅速（最大３００回／秒）に行われている。これらの粒子は、捕獲チューブ（４１）中で捕まえれられ、そしてその流路に沿って出口（４１B）における滴形成手段（７０）へと向けられている。次いで、粒子及び周囲のシース液は、捕獲チューブ（４１）の出口（４１B）における滴形成手段（７０）にて新たな滴を形成する。この方法は、所定数の粒子が捕獲チューブ（４１）によって捕獲される迄続く。次いで、滴は、最終的に当該滴が十分な体積を有し且つ手段（４１B）にて前記捕獲チューブから落ちる迄シージング液を供給されつづける。前記捕獲チューブの流路長は、狭いのだけなので、ある数の異なる滴を介して粒子が分散及び分配されるようになるための十分な移動長はない。従って、作り出された滴は必要数の粒子を含む。従って、前記捕獲は、所定数の粒子が所定の体積のシージング液内で確実に捕獲されるようにするために適合せしめられている。
【００６３】
キャッチャ（５２）は、作り出された滴の収集を可能にするために使用されて良い。このことは、例えば、キャッチャ（５２）が第二の位置へと移動するようにアクチエーター（５３）を作動させ、従って、滴が落下する場合、当該キャッチャが当該滴を捕まえることによって達成されている。しかしながら、この技術に関する１つの問題とは、液体の個々の滴を扱うことが非常に難しいことである。詳細には、前記キャッチャ（５２）が液体の滴を捕まえる場合、液滴を当該キャッチャから引き出すことが非常に難しい。このことは、滴デリバリーにおいて役立つ低摩擦表層を備えたキャッチャを有することによって助けられうる。このような変更においてさえも、滴の断片について、当該滴がその後引き抜かれる場合に、前記キャッチャに残したままになる可能性がある。このことにより、滴中に多くの粒子が含まれ、従って試料が使用不可能になりうる。
【００６４】
この問題を避けるために、試料容器（５１）は、例えば、液体窒素などの低温液体で満たされていて良い。この場合、不要な滴はキャッチャによって収集されて取り除かれている。所望の粒子を含む滴は、試料容器（５１）中へと落下せしめられる。液体窒素は液滴を即座に凍らせ、それによって、所定数の粒子を含む凍結した液滴が生産される。
【００６５】
次いで、前記凍結した粒子は、液体窒素から取り出されて当業界で公知の方法に従い乾燥されて良い。従って、所望の数の粒子を含む凍結した滴を収集されようになる。
【００６６】
一般に、寒剤の温度は、収集される粒子が傷害されないように選択されるべきである。従って、前記寒剤の温度は典型的に、収集される粒子の種類（即ち、細胞、酵素、タンパク質など）、並びに特異的な多様性（即ち、収集される特定の細胞）に依存して選択されるだろう。
【００６７】
凍結乾燥法の例は更に詳細に、「Pruducts Comprising Quantum of Bioparticles and Method For Production Thereof」という表題のPCT／AU０２／０１２１６に記載されている。前記システムは、逆にされているFACScalibur（登録商標）フローサイトメーターを使用することによって試験されている。
【００６８】
図２には、捕獲チューブに対して接続されている収集チューブを有する本発明のフローサイトメーターの第二の好適な実施態様の配置である。この配置は、反対にされている装置ではない点で先に記載されている例とは異なる。使用されている番号は、図１における同じ機能をする要素のための番号と類似している。
【００６９】
従って、この例において、前記サイトメーターは、第一の部分（３１A）と第二の部分（３１B）を有するハウジング（３１）を含む。使用に際して、ハウジングの第一の部分（３１B）は、ホース（３５）を介して、１又は複数の粒子種を有する試料液体（３４）が入っている容器（３３）に対して連結されている。このことにより、試料液体（３４）は、ポンプ（３６）を使用することでハウジング（３１B）中へと汲み入れられる。前記ハウジング（３１B）は、ホース（３７）を介して、シージング液の源を提供するために使用されているポンプ（３８）に対しても連結されている。
【００７０】
ハウジングの第二の部分（３１A）は、ホース（３９）を介して、廃棄シージング液を捕まえるための容器（４０）に対して連結されている。前記ハウジング（３１A）は、入口（４１A）を有する捕獲チューブ（４１）を受けるために適合せしめられている。前記捕獲チューブ（４１）は、アクチュエーター（４２）を使用することで第一の部分と第二の部分との間を移動可能である。
【００７１】
ステンレススチールチューブ（６０）は捕獲チューブ（４１）へと挿入されており、収集経路を形成する。前記ステンレススチールチューブ（６０）は、捕獲チューブ入口（４１A）で始まりそして液滴ノズル（７０）で終わる。このことにより、収集経路の長さが長くなりそして捕獲チューブ（４１）の内径が小さくなる。前記捕獲チューブの出口（４１B）は、液滴ノズル（７０）へと延びている。前記液滴ノズル（７０）は、所定数の粒子を含む滴を規定の体積において形成する。
【００７２】
試料液体（３４）中に含まれている粒子の特性を検出することができるようにするために、前記サイトメーターは、概して（４６）で示されている検出システムを備えている。前記検出システムは、放射線源（４６A）と１又は複数の検出器（４６B）を備えている。前記検出システム（４６）は、概して（４７）で示されている相互作用領域を通じて粒子が伝達されている場合にそれらを検出するために作動する。
【００７３】
前記フローサイトメーターは、特定の物理特性、例えば、特定の波長での吸収、密度、磁性、比重、インピーダンス、光線を散乱する力、発光、又は蛍光に基づいて粒子を分析するために使用されて良い。これに加えて、本発明は、粒子を分析及びソートするためにCoulterセンシング及びRoman顕微鏡検査との連結して提供されて良い。
【００７４】
所定の粒子の１つの特異的な選定の特性がこのような種類の構成の分析のために使用されて良い場合、マルチパラメーターフローサイトメトリーが使用されても良い。「マルチパラメーターフローサイトメトリー」とは、本明細書中で使用されている場合、特定の粒子を、他のものと区別するために、その複数の特性を測定することを意味する。
【００７５】
使用に際して、全ての事象において、試料液体はチューブ（３５）に沿ってハウジング（３１B）へと汲み入れられている。この場合、シージング液は試料液体を取り囲む集束流を担う。この流れは、試料から、個々の粒子の層流など、直径５０μm〜２５０μmの微細流を生じるさせるために、開口部（３２）を通過せしめられている。
【００７６】
液体が相互作用領域（４７）を通過することで、検出システム（４６）を使用し、個々の粒子の特性が測定されるようになる。次いで、前記検出システム（４６）は、捕獲チューブ（４１）が第一の位置と第二の位置との間を移動することを可能にするアクチュエーター（４２）を作動させるために使用されている。前記捕獲チューブ（４１）が第一の位置にある場合、粒子は当該捕獲チューブ入口（４１A）で収集されて捕獲チューブ（４１）を通過するように向けられている。対照的に、前記捕獲チューブが第二の位置にある場合、前記粒子はチューブ（３９）を介して廃棄容器（４０）へと向けられている。どちらのキャッチング位置においても、シース液は、加えて、前記捕獲チューブに沿って向けられるだろうことが理解されるだろう。
【００７７】
更なる液体を滴に対して加えることを可能にするために、第二試料液体（８２）を含む第二試料源（８０）が、第二試料チューブ（８４）を介して液滴ノズル（７０）に対して連結されている。第二試料ポンプ（８６）は、規定量の第二試料液体（８２）を前記滴に対して加えることを可能にする。
【００７８】
形成されて収集される滴の数を調節するために、前記サイトメーターは更に、位置(９０A)において、液滴ノズル（７０）に近接して配置されている真空ポンプの形態の捕獲手段（９０）を含むかあるいは、それを位置(９０B)において、当該液滴ノズルから遠ざけるように動作して良い。前記捕獲手段（９０）は、形成された滴が収集される必要がない場合に動作される。液滴が必要数又は種類の粒子を有する場合、前記捕獲手段（９０）は動作せしめられず、そして滴が形成されて滴は必要な容器（５１）中へと入る。
【００７９】
前記液滴ノズル（７０）は、図３との関係において更に詳細に記載されている。前記ノズルのハウジング（１００）は、３つの皮下注射用チューブ(hypodermics)が取り付けられているプラスチックニップルの形態である。前記皮下注射用チューブの１つは捕獲チューブ（６０）である。第二の皮下注射用チューブ（１０７）は、第二試料チューブ（８４）を介し滴下ノズル（７０）に対して連結されている、第二試料液体（８２）が入っている第二試料源（８０）に対して連結されている。第二試料ポンプ（８６）は、規定量の第二試料液体（８２）を前記滴に対して加えることを可能にする。
【００８０】
中心の皮下注射用チューブ（１０３）は、液滴を混合するために使用されるワイヤ（１０４）のためのハウジングとして働く。このワイヤはそれが中心皮下注射用チューブ（１０４）として存在する場合、下方末端で、適切な角度に曲げられている（１０５）。前記ワイヤ（１０４）は、当該ワイヤを約９００rpmの速度で回転させる電気モーター（１０８）に対して連結されている。
【００８１】
従って、前記サイトメーターは、使用に際して、所定の特定を有する粒子のみを含む試料を作り出すために使用されて良い。しかしながら、更に、前記収集チューブ（６０）の入口（４１A）と出口（４２B）は、典型的に規定の長さ及び規定の内径に限定されている。前記捕獲チューブ（４１）の長さと内径は、チューブ（６０）を当該捕獲チューブ（４１）中へと挿入することによって調節されている。前記チューブ（６０）の長さと内径は、規定数の粒子を含む滴を生産するために重要である。チューブ（６０）の正しい長さと内径を選択することにより、以下の３つの機能が可能になる。それは：
Ｉ．捕獲チューブ（４１）を通る流速は、液体が、捕獲チューブ（４１）へと入る代わりに廃棄タンク（５１）へとそらされるような程度に制限されるべきではない；
II．前記チューブの長さは、前記フローサイトメーターを整然(clear)とするのに十分であるべきである；
III ．前記内径は、適切な滴を形成するには大きすぎる体積の液体へと粒子が希釈されてしまうほど大きすぎるべきではない。
【００８２】
前記チューブ（６０）の好適な長さは、内径２４１μmで１７０mmである。この長さは、前記チューブを慎重にU字に曲げることによって前記サイトメーターを整然とするのには十分である。従って、前記サイトメーターは、通常の方向で操作されて良い。前記チューブは鋭角に捩られるかあるいは曲げられるべきではない。何故なら、このことは前記チューブ内の液流に乱流を導入して、ソートされる粒子を、当該チューブ内を移動する場合に分散させる結果になりうるからである。このチューブにより、ソートされた粒子に、液滴形成ノズル（７０）にて、液滴を形成させることが可能になる。
【００８３】
チューブの長さがより短いことで機能は正確になるだろうが、当該チューブ内に捩れを導入することなくサイトメーターを整然とすることは難しくなる。
【００８４】
もし前記チューブの内径が約１１２μm未満であるなら、前記捕獲チューブは所望の粒子を捕獲することができない可能性がある。前記チューブの直径が非常に小さいことは、液体が捕獲チューブ中へと入る流れを、当該液体が廃棄容器へとそれるような程度で制限する。この結果、所望の粒子が廃棄容器へと入り、そして失われることになる。
【００８５】
前記チューブの内径が約３５０μmより大きいならば、次いで、ソートされた粒子は、そして単一の滴を形成するには大きすぎる体積の液体内へ分散するようになる。
【００８６】
ソーティングのタイミング及び滴を形成するタイミングを正確に調節することは、滴が規定数の粒子を確実に含むするために重要である。シグナルは、規定数の粒子のソーティングを開始するために、サイトメーターへと送られる。ソーティングを開始するためにサイトメーターが整う間約５０msの遅延がある。次いで、サイトメーターは粒子のソーティングを約２５０／秒の速度で開始する。このソートされた粒子は捕獲チューブを滴形成ノズルへと下流に移動する。キャッチャ手段が前記ノズルから移動し、そしてソートされた粒子が液滴形成ノズルに到達する直前に、滴を形成開始可能にすることは重要である。もし前記キャッチャ手段が移動するのが遅すぎれば、次いで、ソートされた粒子は廃棄になり、そして液滴にはならない。もし前記キャッチャ手段が移動するのが早すぎ、そしてソートされた粒子が前記ノズルに到達するかなり前に液滴形成を開始すれば、滴の形成は、ソートされた粒子の全てがノズルに対して到達する前に完了してしまう。このことは、ソートされた粒子が滴内に入る前に滴が破壊することにつながる。滴を形成して破壊するためには約０．６６秒かかる。
【００８７】
前記ソーティングプロセスは、約５０msの遅延及び約４ms／粒子のソーティング時間を伴う。それ故に、３０個の粒子をソートするのに必要な時間の長さは、約１７０msである。ソートされた粒子が、回収経路を形成する捕獲チューブを滴形成ノズルへと移動するにつれて、当該粒子は当該チューブ中の乱流によって分散するようになる。分散の量は前記捕獲チューブの内径及び当該捕獲チューブの長さに依存して変わる。粒子が滴形成ノズルへと到達するのにかかる時間の長さも前記捕獲チューブの内径及び当該捕獲チューブの長さに依存する。
【００８８】
長さ１７０mmで内径２４１μmの好適な捕獲チューブを使用する場合、粒子は滴形成ノズルへと約２５０msで分散された最初と最後の粒子と共に到達する。ソートされた粒子がこの捕獲チューブ中を移動するのにかかる時間の長さは約５０msである。
【００８９】
好適な捕獲チューブを使用し、３０個のソートされた粒子を含む滴を生産するために、前記捕獲手段は、１００msより前に滴形成ノズルから移動して離れなければならない。典型的には、５０msの遅延が使用されている。
【００９０】
本発明の代わりの実施態様は、複数の粒子を含む滴を形成するために、静電ソーターを使用する。Becton Dickenson Facstarplus(登録商標)、Becton Dickenson Advantage又はCoulter Eliteなどの静電ソーターは、粒子を液体の小さな滴中へとソートすることを可能にする。しかし、複数の粒子を含む滴を生産することが可能ではない。本発明者によって開発された滴形成装置は、静電ソーターから複数の滴を収集してそれらを単一の滴中へと入れるために使用できうる。
【００９１】
本発明の２つのサイトメーターを使用する例は、以下に記載されている。
【００９２】
実施例１
器具
前記サイトメーターは、図１に示した改良されたFACScalibur(登録商標)フローサイトメーターであった。この器具を、FACScalibur(登録商標)フローサイトメーターを覆っているアルミニウムフレームを使用することによって逆にした。前記フローサイトメーターのフタを取り除き、そして当該サイトメーターの低部を前記フレームに対してネジ止めして、次いで、当該フレームとサイトメーターを逆転させた。この装置は２つ以上の粒子を含む滴を形成することができた。
【００９３】
光センサー(Festo、Sydney)を前記捕獲チューブの出口の直下に配置して当該捕獲チューブの末端で滴が形成された場合にそれらを検出できるよう調節した。液滴の形成により、前記センサーが作動し、Programmable Logic Controller (PLC) model FC−３０(Festo)を介してパルスシグナルをキャッチャ遅延へと送り、そしてまたそれを有効にし、そしてパルスシグナルを、変更が加えられたMacintoshマウス(WO ０１／６８９０２に記載されている)へと送り、ソートデータを獲得する。ソートされた粒子がフローセルの検査領域からキャッチャの出口先端へと移動する時間を、キャッチャ遅延として示している。一度前記キャッチャ遅延が始まれば(timed down)、キャッチャアームが滴路(drop path)から離れ、そして当該キャッチャアーム遅延が有効になる。前記キャッチャアームを、不要な滴を放出するための真空廃棄システムとして設計した。１つの液滴が前記キャッチャアームを通過するためにかかる時間をキャッチャアーム遅延として示した。一度、前記キャッチャアーム遅延が始まれば、前記サイクルがリセットされて前記光センサーが再度使用可能になる。
【００９４】
試料容器であって、シース液が入っている容器及び廃棄容器を廃棄タンクが直立するように逆にした。光学カバーとソートラインを取り除いた。シースタンクをMilliQ水で満たした。
【００９５】
大腸菌(Eschericia coli)の分析
大腸菌の株(ATCC １１７７５)を栄養ブロスのフラスコ中３７℃で５時間に渡り激しく振とうすることによって増殖させた。この試料をろ過(０．２２μｍ)したリン酸緩衝塩類溶液(PBS)中で１／１０００に希釈した。大腸菌の試料２００μlを、試料挿入棒に対し長さ４mmのシリコンチューブを介して接続したピペットチップで採取した。内径１０mmを有する長さ１５０mmのシリコンチューブの一方の末端を封止して試料及び試料挿入棒より上に配置した。このことにより、サイトメーターによって試料に圧力を加えることが可能になった。
【００９６】
前記サイトメーターを以下のような：
前方散乱  E００２
側方散乱  ５００
の感度レベルに設定した検出器と共に使用した。側方散乱を３５０の値での閾値として使用した。
【００９７】
領域を、大腸菌が含んだ前方散乱に対する側方散乱の散乱プロットにより規定した。
次いで、大腸菌をソートするためにこの領域を使用した。
【００９８】
大腸菌のソーティング
前記サイトメーターを３０個の大腸菌細胞をソートするために設定した。大腸菌の流速及び濃度を、ソート速度が１５０〜２００ソート／秒であるように正確に調節した。
【００９９】
ソーティングが完了した直後に形成された液滴を栄養寒天プレート上で回収して、無菌のプラスチック製L字棒で広げて３７℃で一晩インキュベートした。３０個の大腸菌コロニーを前記寒天プレート上で検出した。
【０１００】
実施例２
器具
Becton Dickison FACScalibur(登録商標)フローサイトメーターを図２及び図３に示したサイトメーターに従って改良した。このサイトメーターを較正し３０個のバチルス・セレウス(Bacilus cereus)胞子が単一の液滴内に分配されることを可能にした。血清を、この液滴中へとそれが形成されている間に注入し、凍結乾燥され実質的に球状のボールになる液滴の生産を可能にした。
【０１０１】
前記変更は、フローセル内の捕獲チューブに、内径１６５μm且つ外経２９６μm、長さ４０mmの皮下注射用チューブ(A-M systems、Calsborg、USA)を挿入することを伴った。内径１６５μmを有する長さ２６５mmのシリコンチューブを皮下注射針(A-M systems、Calsborg、USA)に対して連結した。内径１６５μm、長さ３０mmの皮下注射用チューブ(A-M systems、Calsborg、USA)を前記シリコンチューブの他の末端に対して連結した。この改良により約２７μlを有する滴を捕獲することが可能になる。前記滴を、５mmのポリプロピレンバーベッドフィッティング(berbed fitting)からなる液滴ノズルにおいて形成した。このフィッティング中にサイトメーターからの皮下注射用チューブが挿入されている。前記サイトメーターをオンにした場合、液が前記ノズルから皮下注射用チューブの末端で形成された。
【０１０２】
蠕動ポンプ(Cole Parmer Instruments、Ilinois、 USA)を使用し、ウマの血清を、内径１６５μm、長さ３００mmの皮下注射用チューブ(A-M systems、Calsborg、USA)に注入した。このチューブは、前記血清がフローサイトメーターの出口で混合されて滴を形成するように液滴ノズル(図３に描かれている)にも挿入されている。前記ポンプの流速を、前記サイトメーターソートラインを出る流体の流速に合うように調整した。ミキサーを前記ノズルへと組み込んだ。それは、第三の皮下注射用チューブ(内径３０５μm、Small Parts Inc)を前記ノズルへと組み込み、そしてより微細な皮下注射用チューブ(外経２５４μm、Small Parts Inc.)を前記皮下注射用チューブ中へと組み込むことによる。長さ１mmの微細皮下注射用チューブを適切な角度に曲げ、外側の皮下注射用チューブの出口でフックを形成した。前記微細皮下注射用チューブを電気モニターに接続して約９００rpmで回転させた。
【０１０３】
前記蠕動ポンプは、液滴形成の開始を調節するために大まかな速度ダイアルを有し、６psiのミクロボア複動式空気シリンダー(Asco、Frenchs Forest、NSW、Australia)を付属のポリプロピレン真空ノズル共に使用した独立型の単位であった。前記シリンダーのシャフト末端に対して接続した真空ノズルを液滴ノズル出口先端付近で維持していた。前記真空ノズルにより、前記液滴ノズルから受け取った全ての液体を、液滴形成が始まる前に廃棄へと送ることが確実になった。複動式シリンダーが作動すると、前記真空ノズルが離れ、従って、離れた直後即座に、液滴を形成することが可能になる。
【０１０４】
空気シリンダーをProgrammable Logic Controller(PLC)model FC−３０(Festo)によって制御した。前記PLCは、改良したMacintoschマウス（WO０１／６８９０２に記載されている）を介して前記サイトメーターのソーティングプロセスをも制御した。サイトメーターソーティングプロセスの通常の操作は、マウスをクリックすることによって行った。基本的に、前記マウスには、マウスのクリックを模倣してサイトメーターのソーティングプロセスを開始するPLCから長さ０．１ｓの２４Vパルスシグナルを受け取るように改良した。
【０１０５】
押しボタンスイッチをPLCに対して接続した。プログラムを、PLCが、前記ボタンが押されるのを待ち、そして以下のような段階を伴うプロセス開始するために書いた。
【０１０６】
ソートのため及び試料が滴形態で調製されるようにするために、以下の段階を行った。その段階とは：
Ｉ．マウスを通じてソートプロセスを作動せしめ；
II．最初にソートされた粒子が液滴形成先端部へと到達するために十分である規定の遅延を待ち；
III ．空気シリンダーを作動せしめ、真空ノズルを液体フローから離し；
IV．単一の滴が形成されて破壊されることを可能にするために十分である規定の遅延を待ち；
Ｖ．空気シリンダーを動作せしめ、前記真空ノズルを前記液体フロー中へと移動せしめる、
段階である。
【０１０７】
３０個の大腸菌の単一の滴へのソーティング
大腸菌の調製
大腸菌の株(NCTC ９００１)を３７℃で２４時間に渡り１．６％(w/v)トリプトン及び１％(w/v)イーストエクストラクト中pH７．２中で増殖させた。この細胞をろ過(０．２２μｍ)したPBS中で１／１０００に希釈してすぐに分析した。
【０１０８】
大腸菌の分析
領域を、大腸菌が含んだ前方散乱に対する側方散乱の散乱プロットにより規定した。
次いで、大腸菌をソートするためにこの領域を使用した。
【０１０９】
所望の大腸菌の選択
前記サイトメーターを製造説明書に従い３０個の大腸菌細胞の試料をソートするために設定した。大腸菌の流速と濃度を、ソート速度が２２０〜２５０ソート／秒であるように正確に調整した。液滴を栄養寒天プレート（Oxoid Ltd.）上で回収して、室温で３０分に渡り乾燥せしめ、そして３７℃で１２時間に渡りインキュベートした。次いで、前記寒天プレートを調べ、そして２７〜３０個の大腸菌コロニーを含んでいることを確認した。
【０１１０】
液滴の凍結及び凍結乾燥
サイトメーターから液滴を集収して液体窒素が入っている試験管に入れた。前記液滴は球体又はボールとして凍結した。液滴を収集した後、前記試験管をDynavac FD１２凍結乾燥機中に置いて、２×１０-1Torrの真空及びコンデンサ温度−７０℃で一晩乾燥させた。
【０１１１】
翌日、真空下でバイアルにフタをして前記凍結乾燥機から取り出した。このバイアルを開けてボールを個々に栄養寒天プレート（Oxoid、Australia）上に置き、そして２００μlの無菌０．９％塩類溶液を慎重に各ボール上へ分注した。このボールを５分に渡り再水和せしめて無菌のプラスチックスプレッダーで広げた。前記寒天プレートを３７℃で１２時間に渡るインキュベーションの後調べ、そして２５〜３０個の大腸菌コロニーを含んでいることを確認した。
【０１１２】
実施例３
大腸菌を培養し、分析して実施例２に記載のように３０個の大腸菌を含んでいる液滴を生産した。
液滴の凍結及び凍結乾燥
サイトメーターから液滴を集収して液体窒素が入っている試験管に入れた。液滴を収集した後、前記試験管をDynavac FD１２凍結乾燥機中に置いて、２×１０-1Torrの真空及びコンデンサ温度−７０℃で一晩乾燥させた。翌日、バイアルに真空下でフタをして前記凍結乾燥機から取り出した。このバイアルを開けてボールを個々に栄養寒天プレート（Oxoid、Australia）上に置き、そして２００μlの無菌０．９％塩類溶液を慎重に各ボール上へ分注した。このボールを５分に渡り再水和せしめて無菌のプラスチックスプレッダーで広げた。前記寒天プレートを３７℃で１２時間に渡るインキュベーションの後調べ、そして２５〜３０個の大腸菌コロニーを含んでいることを確認した。
【０１１３】
当業者は、多くの変形及び変更が明らかであるだろうことを理解するだろう。当業者に明らかになるかかる変形及び変更の全ては、大まかに先に記載されたような本発明の精神と範囲内に落ち着くと考えられるべきである。
【０１１４】
当業者によって、多くの変形及び／又は変更は、大まかに記載されたような本発明の精神又は範囲から出発せずとも特定の実施態様に示されているように本発明を較正しうることは明らかであるだろう。従って、本発明は、全てに関して例示として且つ限定しないと考えられるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】捕獲チューブの一方の末端に配置されている滴形成手段を有する本発明の１つのサイトメーターの概略図である。
【図２】捕獲チューブに対して連結されている収集チューブの一方の末端に配置されている滴形成手段を有する本発明の更なるサイトメーターの概略図である。このサイトメーターは、更なる液体を滴形成手段に対して加えるための手段をも含む。
【図３】液体を滴形成手段に対してかあるいはそこで加えることができる第二試料源を、２つの異なる液体の混合を補助をするミキサーと一緒に有する液滴ノズルの概略図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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