(57)【要約】多様なサイズおよび任意の所望配列を有する二本鎖DNA分子を直接合成する方法が開示される。合成されるべきDNA分子は、オーバーラップを有するより小さなDNAセグメントに必然的に分解される。無マスクマイクロアレー合成機を用いて基板上にマイクロアレーを作製する。前記には、アレーの各エレメントまたは特徴の集団がオーバーラップをもつDNAセグメントのそれぞれのDNAによって形成される。各セグメントの相補物もまたマイクロアレー上に作製される。前記DNAセグメントを基板から遊離させ、DNAのハイブリダイゼーションを促進する条件下で（前記セグメントがハイブリダイズしてデュープレックスを形成する条件下で）前記セグメントを維持する。続いて、不正確に形成されたDNAらせんと結合するDNA結合物質を用いて前記デュープレックスを分離し、エラーをDNA分子セットから除去する。続いて前記セグメントを互いにハイブリダイズさせてより大きな標的DNA配列をアッセンブリングさせる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、正確な配列を有するDNA分子を不正確な配列を有するDNA分子から分離する方法：
（ａ）デュープレックスDNA分子のデュープレックス鎖間に配列のミスマッチを有するデュープレックスDNA分子と選択的に結合するDNA結合物質に二本鎖DNA分子の溶液を暴露し；さらに
（ｂ）前記DNA結合物質が結合したDNA分子を前記DNA結合物質が結合しなかったDNA分子から分離する。
【請求項２】
前記暴露工程の前に、一本鎖のDNA鎖を他の一本鎖DNA鎖にハイブリダイズさせる工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離が、固定された位置にある前記DNA結合物質にアフィニティー結合させることによって実施される請求項１に記載の方法
【請求項４】
前記分離が電気泳動によって実施される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記DNA結合物質がMutSである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）および（ｂ）が、正確な配列の所望レベルの純度が達成されるまで繰返し実施される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む、その大半が正確な配列を有するデュープレックスDNA分子プール中で配列エラーを有するデュープレックスDNA分子を分離する方法：
（ａ）デュープレックスDNA分子を変性させ；
（ｂ）前記DNA分子をハイブリダイズさせて新しいDNAデュープレックス分子を形成させ；
（ｃ）前記デュープレックスDNA分子をDNAデュープレックスのトポロジーの不規則性を有するDNA分子と選択的に結合するDNA結合物質に暴露し；さらに
（ｄ）前記DNA結合物質が結合したDNA分子から分離することによって前記DNA分子を分離する。
【請求項８】
前記分離が固定された位置にある前記DNA結合物質とのアフィニティー結合によって実施される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分離が電気泳動によって実施される請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記DNA結合物質がMutSである請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）から工程（ｄ）が、正確な配列を有する所望レベルのDNA純度が得られるまで繰り返される請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、特定の配列を有するDNA配列を製造する方法：
（ａ）一本鎖DNAプローブのマイクロアレーを作製し、前記プローブは、各プローブが前記マイクロアレー上の別のプローブと部分的に相補的である相補性部分を有するように構築され、さらに各プローブセットに対して完全な相補性を有するプローブセットが構築されるように構築されてあり；
（ｂ）前記一本鎖DNAプローブを前記マイクロアレーから遊離させ；
（ｃ）DNAデュープレックスが形成されるように前記一本鎖プローブを冷却し、前記DNAデュープレックスは主としてそれらの完全な相補性プローブとハイブリダイズしたプローブで形成され；
（ｄ）前記DNAデュープレックスを、そのトポロジーの形状において不規則性を有するDNAデュープレックスと選択的に結合するDNA結合物質に暴露し；
（ｅ）前記DNA結合物質が結合した前記DNAデュープレックスを分離し；
（ｆ）前記DNAデュープレックスを変性させて、前記DNAデュープレックスから一本鎖DNAプローブを遊離させ；
（ｇ）前記一本鎖DNAプローブの少なくともいくらかがそれらと部分的にのみ相補的であるプローブと結合することを促進する条件下で前記DNAデュープレックスを冷却して、少なくともいくらかの部分で二本鎖であるDNA複合体を形成し；さらに
（ｈ）このようにして生成されたDNA複合体を伸長して、前記DNA複合体の残りの一本鎖部分に第二のDNA鎖を添加する。
【請求項１３】
前記分離が固定された位置にある前記DNA結合物質とのアフィニティー結合によって実施される請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記DNA結合物質がMutSである請求項12に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は米国仮特許出願第60/360,563号（2002年2月28日出願）の権利を主張する。
アメリカ合衆国政府支援研究開発に関する記述
本発明は、以下の団体によりアメリカ合衆国政府の支援を受けて達成された：DOD ARPAグラント#:N39998-01-2-7070。合衆国は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
背景技術
本発明は一般に生物学の分野に属し、具体的には特定のまたは所望の配列を有するDNA分子を製造する技術および装置に関する。DNA分子の製造はまた、任意の所望されるペプチド、タンパク質の合成、または所望されるタンパク質および核酸のアッセンブリーを可能にする。
リコンビナントDNA化学に関する技術を用いて、自然界に由来するDNA配列を複製し増幅させ、さらにこれら配列を成分部分に分解し、続いて新規なDNA配列に再組合せまたは再アッセンブリーすることは今や一般的である。個々のヌクレオチドから短いDNA配列（オリゴヌクレオチドと称される）を直接合成することはもはや可能であり一般的でもあるが、約400塩基対より大きいDNA配列の大きなセグメントまたは集合物を直接構築することは原則的には実際的ではないと考えられてきた。結果として、より大きなDNAセグメントは一般的には、購入するか、クローニングするかまたは個々に合成し続いて所望のDNA分子にアッセンブリングすることができる成分部分およびセグメントから構築される。
【０００３】
例えば、新規なタンパク質を選択したホストで発現ベクターによって発現させることを所望する場合、しばしば分子生物学分野の供給会社から一般的な発現ベクターを購入し、続いて発現させようとする遺伝子の領域をコードするタンパク質をクローニングするかまたは合成する。前記コード領域は、前記ベクターが所望のタンパク質のホスト内での発現に有効であるような態様でさらに正しい位置で前記ベクター内に連結させる必要がある。ベクターの購入者はまたベクターの配列を調べて、ベクターの他のDNA成分が、購入者が実施しようとする実験に有害な可能性がある他の特性をもたないことを確認しなければならない。したがって、所望の新規な大型のDNA構築物のいずれかを構築する際の難しさは、類似のどの構築物または構築物のどの成分を公開供給源から購入または入手するか、およびどれほどの情報がそれら成分の配列について入手できるかによって左右される。
【０００４】
無限の長さをもつ新規にデザインされたDNA配列を構築しアッセンブリングさせる新規な方法がDNAマイクロアレーで構築されたDNAの使用を基にして開発された。DNAマイクロアレーは、基板上に配置された一本鎖DNAプローブの複数のセットから構成される。前記プローブセットはヌクレオチド配列が同一であるが、他のプローブセットとはヌクレオチド配列が異なる。注文製作アレーの製造に用いられるDNAマイクロアレーのin situ合成技術が報告された。公開PCT特許出願WO99/42813および米国特許第6,375,903号は、コンピューターからソフトウェアで制御される高密度マイクロミラーにより光が選択的に合成中のアレーに誘導されるアレーの作製方法を記載している。マイクロミラーアレーは完全にソフトウェア制御下で稼動するので、複雑で高価な写真平版マスクの作製は全く不要である。そのような注文製作マイクロアレーを用いて、長さが確定されない二本鎖DNA分子のアッセンブリングに必要で十分な一本鎖DNAセグメントを提供することができる。PCT公開特許出願WO02/095073では前記の方法が説明されている（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。簡単に述べれば、前記アプローチを用いて、一本鎖DNAの短いセグメントがマイクロアレー上で作製され、前記は各プローブの一部分がアレー上の別のセットの他の２つのオリゴヌクレオチドと相補的であるようにデザインされる。したがて理論的には、前記オリゴヌクレオチドがアレーの基板から遊離されるとき各相補性セグメントがその相補物とハイブリダイズするので、前記DNAセグメントはセルフアッセンブリングにより所望の完全なDNA分子を生じる。
合成的プロセスも生化学的プロセスも完全には有効でも正確でもないDNA合成のこの一般的アプローチから複雑な問題が生じる。したがって、前記プロセスによって生成されるDNAセグメントで偶発的欠失および置換エラーが存在するのは避けられないことである。より長くより品質の高い問題のDNAの実際的な合成を促進するために、多様な種類のエラー並びにプローブ合成およびアッセンブリープロセスの非効率から生じるこれらアーティファクトから問題のDNA配列を精製する方法を開発する必要がある。
【０００５】
発明の要旨
本発明は不正確な配列を有するDNA分子から正しい配列を有するDNA分子を分離する方法として要約される。本方法は、二本鎖DNA分子の溶液を、トポロジーの不規則性を有するデュープレックスDNA分子と選択的に結合するDNA結合物質に暴露する工程、および前記DNA結合物質が結合しなかったDNA分子から前記DNA結合物質が結合したDNA分子を分離する工程を含む。
本発明は、エラーが最小限の実質的に任意サイズのDNA構築物の注文品の構築に有用である。これによってDNA発現または遺伝子発現に関する実験の実施を所望する者は、市販のベクターまたは遺伝的エレメントを用いる作業の制限から開放される。その代わりに、本マイクロアレーに基づく技術を用いて、DNA配列をコンピュータで創出し、初めてさらに短時間で組み立てることができる。
本発明はまた、少数集団の配列を含むDNAデュープレックスを多数集団の配列を含むDNAデュープレックスのプールから分離する方法を目的とする。本方法は、デュープレックスDNA分子を変性させる工程、前記DNA分子をハイブリダイズさせて新しいDNAデュープレックス分子を形成させる工程、前記デュープレックスDNA分子をトポロジー的に不規則性を有するDNA分子と選択的に結合するDNA結合物質に暴露する工程、および前記DNA結合物質が結合したDNA分子から分離させることによって前記DNA分子を分離する工程を含む。
本発明の更なる目的、特色および利点は、添付の図面と併用するとき以下の詳細な説明から明白となろう。
【０００６】
発明の詳細な説明
ある実施態様では、本発明は、二本鎖オリゴヌクレオチドの合成時に生じるエラーの量を減少させる方法を目的とする。我々は本発明を“同時篩い分け（coincidence filtering）”と称する。“同時計数フィルター”という用語は、電子工学および光物理学から借用した。前記分野では、同時計数フィルターは同時に発生する光またはエネルギーシグナルを篩い分けるために用いられる。本明細書では、前記用語は、同時に発生するかまたはペア非形成もしくは間違ったペアを形成したヌクレオチドをもつDNAセグメントのみを選択的に篩い分けるプロセスを指すために用いられる。本プロセスは、核酸集団から内部にミスマッチまたは欠失を有する核酸を取り除く。全体的プロセスはまた、正確でマッチした配列を有するが、生成されたDNA分子集団内の大半のDNA配列の配列とは異なる配列を有する一切の二本鎖DNA分子を選択的に篩い分ける方法も含む。
【０００７】
本発明の方法は、米国特許第6,375,903号（前記文献は参照により本明細書に含まれる）に記載されたタイプの無マスクDNA合成機の並行的大量DNA製造性能を用いて普遍的DNA合成プロセスを創出しようとする努力から達成された。前記の無マスクアレー合成機は、コンピュータ制御下で多くの一本鎖DNAプローブを平行して短時間に製造することを可能にする。前記技術は、アレー中の一本鎖DNAプローブが任意のDNA配列である注文製作DNAマイクロアレーを数時間で製造することを可能にする。前記マイクロアレーは、１つの与えられた特徴を有する全てのプローブが同じDNA配列に由来し、前記プローブは他の任意の特徴のプローブの配列とは異なることができるように編成される。前記技術は、ただ１つのマイクロアレーで数万から数十万の別個の特徴を数時間で合成することを可能にする（各特徴は長さが20から150ヌクレオチドのDNAプローブで構成される）。本マイクロアレー合成機は一本鎖DNAセグメントの並行的大量製造機として用いられ、本明細書に記載するプロセスは、合成プロセスでエラーを排除しながら前記セグメントをアッセンブリングして長いDNA片を得ることに関する。
【０００８】
以前に言及したPCT出願公開WO02/095073に記載された技術は既に、無マスクアレー合成機の並行的大量DNA合成性能を非常に長い対象DNA配列の生成に使用することを考えていた。本発明は、とりわけ以下の問題を解決するためのプロセスを目的とする。マイクロアレーのDNAプローブにヌクレオチドを添加する各工程が99％の効率および正確さを有すると考えてみよう。前記有効性レベルは、添加される100ヌクレオチド毎に１つのヌクレオチドが全く添加されないか、または間違えた場所に添加されることを意味するであろう。このエラー率は、DNAセグメントが全て25量体であるか、または長さが25ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドで構成されている場合、平均して４つのプローブ毎に１つのプローブがその中にエラーを有することを意味するであろう。実際の有効性が99％を越えていたとしても、前記エラー率はゼロになることはない。いくつかのプローブはエラーを有するであろう。前記エラーは以下のいずれかであろう：ヌクレオチド添加の失敗、すなわち欠失；不正確な位置へのヌクレオチドの添加、すなわち付加；あるヌクレオチドの別のヌクレオチドによる完全な置き違え、すなわち置換；またはヌクレオチドの化学的改変。したがって、精製プロセスは、エラーのタイプに関係なくエラーを含む可能な限り多くのプローブを、ハイブリダイゼーションプロセスで生成される配列集団から除去できるように編成されなければならない。本明細書に記載する方法は前記を達成するであろう。本方法は、DNA合成のためにマイクロアレー用いる場合のDNA精製および分離におけるこの固有の問題を形決するために考案されたが、この同じプロセスが、最終的に対象のただ１種のDNA分子のコピーを得ることが所望される他のいずれのDNA合成方法においても有用であることは理解されよう。
【０００９】
図１を参照して、マイクロアレーの基板からプローブが遊離された後、標的DNAのアッセンブリーが一工程で実施されることを先ず考えた（前記はWO02/095073の明細書に記載されている）。前記の概念は図１の左図に示されている。前記基本的アプローチを用いて、各々の特徴をもつプローブのDNA配列は、他の２つの特徴をもつプローブのDNA配列よ部分的にオーバーラップする。さて、前記戦法に付け加えるべきことが意図されている。すなわち、提唱されることは、前記マイクロアレー上で各DNAセグメントのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両鎖が構築されるということである。換言すれば、アレー上に存在する特徴の各々について、アレー上のいずれかの場所にプローブは正確な相補性配列を有する。このことは、前記によってただ１つのマイクロアレーから得られる理論的収量が1/2に減少するのでDNA合成性能について無駄であるように思われるかもしれない。しかしながら、前記方法のDNA合成性能はきわめて高いので、前記の無駄は顕著なものではなく、本戦法の利点は直に明らかとなろう。
いったん相補性配列プローブを有するマイクロアレーが作製されたら、前記プローブを基板から遊離させる。前記のように生成したDNA鎖の溶液を加熱し、前記溶液をゆっくりと冷却すると、各プローブはその正確な相補物を見つけ出し、これとハイブリダイズするであろう。前記は図１の右側に示されている。したがって、多数の二本鎖オリゴヌクレオチドが生成され、各々の長さはマイクロアレー上で生成されたプローブの長さと等しい。この時点で、二本鎖DNAオリゴヌクレオチドは、セルフアッセンブリングしてより大きなDNA分子を形成することはなく、その代わりに単に短い二本鎖DNAセグメントが得られる。
【００１０】
この二本鎖オリゴヌクレオチド集団は、それらの一本鎖の一方または他方にエラーをもついくつかの二本鎖セグメント含んでいるであろう。繰り返せば、もっとも一般的なエラーは三種類、欠失、付加または置換であろう。エラーは稀であると仮定すれば、その中にエラーを含む一本鎖の各々は、おそらく完全には相補性ではない配列を有する相補性配列とハイブリダイズするであろう。エラーを含んで生成されたプローブのいずれについても、前記プローブの相補鎖が正確に相補的なエラーを含んで生成される確率は極めて低いであろう。したがって、生成されたばかりの二本鎖DNAセグメントの場合、エラーをもつセグメントはミスマッチヌクレオチドを有するであろう。配列内の前記ミスマッチは、それが欠失であれ、付加であれまたは置換であれ、前記二本鎖DNA内にトポロジーの不規則性を生じるであろう。簡単にいえば、前記二本鎖DNA分子は、余分なミスマッチヌクレオチドによってもたらされた隆起部または出っ張りを鎖内に有するであろう。下記実施例で用いられるDNA鎖のあるものを図解した図５で、マッチしていないヌクレオチドがDNAの規則正しい二重らせんから押出されたとき、前記ただ１つのヌクレオチドの欠失が二本鎖DNAのトポロジーの不規則性をひき起こしていることに注目されたい。前記と同じトポロジーの不規則性は、エラーが欠失であれ、挿入または置換であれひき起こされる。これらの事例の各々で、２本のDNA鎖のヌクレオチドは、それらが当然示すアラインメントを示さない。第一の工程として、本明細書に開示するプロセスでは、塩基対のミスマッチを有する二本鎖DNA分子から完全にマッチした二本鎖DNA分子が篩い分けまたは分離される。そのようにして、いずれかの鎖にエラーを有する二本鎖DNAセグメントは前記集団から排除されるであろう。
【００１１】
本プロセスは図２に模式的に示されている。図２の一番上の10と標識された工程では、一本鎖DNAセグメントが形成され、さらにそれらが形成された基板から遊離される。前記一本鎖DNAは二本鎖デュープレックスを形成する。エラーは文字Xで示されている。エラーが存在する場合、鎖は相補的であるが同じエラーをもたない鎖とハイブリダイズする。続いて前記形成されたデュープレックスは、不正確ならせん形状をもつDNAと選択的に結合するDNA結合物質に暴露される。そのような物質の好ましい実施態様はMutS（細胞内DNA修正メカニズムに附随する細菌性タンパク質）である。MutSは、鎖のミスマッチによって生じた不正確な隆起部またはループを鎖内に有するDNAと優先的に結合する。前記DNAデュープレックスと結合した前記結合物質を含むDNAデュープレックスは続いてDNAデュープレックスの総集団またはプールから除去される。前記は、DNA結合物質のアフィニティー分離を用いてDNAデュープレックスの全プールの分離を実施することによって簡単に実施される。図２を参照すれば、20と標識された工程は一本鎖プローブのデュープレックスへのアニーリング工程と称される。30と標識された工程は、結合物質（例えばMutS）の適用および結合物質が結合したデュープレックスの分離工程と称される。工程30は一回実施では完全には有効でなく、工程20および30を適切なように何度でも繰返し実施し、所望の程度までエラー配列が存在しないように前記デュープレックスを精製することが所望されるであろう。
【００１２】
この時点で、短いデュープレックスDNAセグメントを完全な所望の標的DNAにアッセンブリングすることがやはり必要である。前記は多くの方法で実施することができる。図２には、リガーゼ連鎖反応（LCR）またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて特定の配列を完成する考え方が示されている。別のアプローチはデュープレックスを加熱し、それらを変性させ、続いて以前の短いデュープレックス形成工程の場合よりもさらに迅速に前記溶液を冷却する。前記一本鎖DNAは再びハイブリダイズするが、それらの全てが短い相補性プローブと再ハイブリダイズするわけではない。各一本鎖DNAは、その正確な相補物以外に、一本鎖DNAがハイブリダイズすることができる２つのDNA鎖を有することを思い出されたい。これら他の鎖は、第一の鎖の相補物とオーバーラップする配列を有するように構築された本来のDNAプローブである。したがって、前記一本鎖のいくつかはこの半分相補的な鎖とハイブリダイズするであろう。DNAポリメラーゼを用いて、前記のようにして形成された部分的二本鎖/部分的一本鎖複合体を充填し、大きな標的DNA分子がアッセンブリングされるまで前記の工程を必要なだけ何度も繰り返すことができる。
【００１３】
いったん大きなDNA分子がアッセンブリングされたら、同時篩い分け技術を用いてエラーを有する配列を除去することがやはり可能であることに注目されたい（結局配列の大半は正確であると仮定する）。より大きな二本鎖DNA分子プールを考えた場合、その大半は配列が正確で両鎖がマッチしている。最悪の場合を考えるために、相補物とハイブリダイズしないエラー（繰り返せば欠失、挿入または置換である）がたまたま一本鎖の一部分に発生し、さらに前記一本鎖がDNAポリメラーゼを用いて伸長されたと仮定しよう。DNAポリメラーゼは一本鎖上の鋳型を基にしてマッチしたヌクレオチドを付加し、したがって前記エラーに対し相補物を作りあげるであろう。前記分子の２つの鎖は相補的であるので、この時点では前記二本鎖DNAは不適当なDNAらせんのトポロジーを示さないであろう。これらのエラーを篩い分けるために、前記プロセスはこれらのより長いDNA鎖を全てを選び、再びそれらを加熱して変性させ、再度迅速に冷却することができる。前記エラーを含む鎖が再びその同じエラーを有する相補的な鎖とハイブリダイズすることはほとんど起こりえないであろう。それどころか、前記エラーを含む鎖が正しい相補的な鎖（エラーをもたない）と対を形成し、したがって形成されたデュープレックスでエラーを含む箇所に構造の不規則性が導入されることの方がはるかに起こりやすい。同じことが相補的な鎖にも生じるであろう。続いて再び前記デュープレックスを結合物質（例えばMutS）に暴露し、MutSが結合するデュープレックス分子を前記プールから除去することができる。所望の満足な純度レベルが達成されるまで、再度この工程を反復して繰り返すことができる。
【００１４】
図３は、DNA結合物質（例えばMutS）を用いてエラーを除去するDNA鎖プールの“篩い分け”の一般的考え方を示している。DNA鎖を結合させるために利用することができるMutSを結合させたアフィニティーカラムを調製する。デュープレックスDNA鎖のプールを前記アフィニティーカラムに暴露し、DNA鎖のらせん構造内に不規則性を有する鎖は前記カラムに結合するであろう。配列が正しいDNAデュープレックスは不規則性をもたずMutSに結合せず、したがって結合することなくカラムを通過するであろう。不適切に形成されたDNAデュープレックスと前記DNA結合物質との結合によって生成された複合体を選別する他の方法も存在することに留意されたい。例えば、結合物質が付着したデュープレックスDNAはゲルまたは粘稠液の中を結合物質が付着していないDNAよりもゆっくりと移動する。これによって電気泳動または液体クロマトグラフィーは、結合物質が付着したDNAを前記プール中の残余のDNAから分離させることができる。
【００１５】
前記プロセスで使用されるDNA結合物質の主要な要件は、前記物質はその二本の鎖に配列ミスマッチを有する二本鎖DNAと優先的に結合するということである。前記好ましい物質はMutS（細菌性タンパク質）である。テルムス=アクアチクス（Thermus aquaticus）由来のMutSはエピセンターコーポレーション（Epicenter Corporation, Madison, Wiscosin；カタログ番号SP72100およびSp72250）から購入することができる。前記タンパク質の遺伝子配列もまた公知で文献に報告されてあり（Biswas and Hsieh, J. Biol. Chem. 271:5040-5048 (1996)）、遺伝子バンクから入手することができる（GenBank, アクセス番号U33117）。したがって、当業者は培養細菌を通常の遺伝子発現ベクターで形質転換して前記タンパク質を容易に製造することもできる。本プロセスでDNA結合物質として用いることができるまた別の分子はセロリ由来のCEL1エンドヌクレアーゼで、前記は挿入、欠失および塩基置換のミスマッチに高い特異性を有し、互いに５ヌクレオチド離れている２つの多形性現象を検出することができる。特定のヌクレオチドミスマッチと結合する小型の有機分子、例えばダイマーナフチリジン１（G-Gミスマッチと結合する合成リガンド）をデザインし合成することもまた可能である。前記のようなリガンドの混合物（組み合わせて全ての可能なミスマッチを認識する）をMutSの代用とすることができるであろう。マッチデュープレックスとミスマッチデュープレックスとを識別することが可能な他のタンパク性物質もまた用いることができる。例えば、T7エンドヌクレアーゼIはDNA鎖をミスマッチの箇所で特異的に切断し、この酵素をミスマッチ配列の触媒性破壊物質として使用するか、または本プロセスでミスマッチ結合物質として使用するためにこの酵素の切断機能を不活化することができる。T4エンドヌクレアーゼVIIはデュープレックスミスマッチ部でDNAと特異的に結合しこれを切断するであろう。ヌクレアーゼ活性を欠くが、変異デュープレックスDNA分子との結合能力は保持している前記酵素の変異体形も既に作出されている（Golz and Kemper, Nucleic Acids Research, 27:e7 (1999)）。SPヌクレアーゼは、グアニン残基を含むものを除き、全てのミスマッチに切れ目を入れるホウレンソウ由来の高い活性をもつヌクレアーゼである。前記酵素もまたエンジニアリングによって切断活性を除くか、または直接使用することもできるであろう。１つの物質が全ての可能なミスマッチと結合するわけではない場合には、これらの結合物質の２つまたは３つ以上を組み合わせて、さらに厳密な篩い分けを提供するか、または全てのタイプの配列エラーをカバーすることができるであろう。
本発明は、本明細書に例示として記載されている特定の実施態様に限定されず、以下の特許請求の範囲に含まれる全ての改変形もまた包含することは理解されよう。
【００１６】
実施例
１．二本鎖DNA配列合成のための一般的プロトコル
保護ジアミンリンカーおよび光感受性コハク酸ヌクレオチドの合成はWO02/095073に詳細に記載されている。前記文献は参照により本明細書に含まれ、したがって本明細書ではこれ以上考察しない。
スライドの調製およびオリゴヌクレオチド合成（塩基適応性リンカー）
顕微鏡スライドは文献（Singh-Gasson et al., Nature Biotechnology 17:974-978 (1999)）に記載されたように調製し、末端に遊離アルコールを含むリンカーが誘導されたガラス表面を得た。前記スライドを無水ジクロロメタン中の0.6Mカルボニルジイミダゾール溶液に浸漬し（６時間）、無水ジクロロメタンで洗浄し、続いてMePOC-保護ジアミン溶液（0.4M）に12時間浸漬した。続いて前記スライドをジクロロメタンで洗浄して、光感受性保護基MeNPOCのキャップを有する第二アミンをもつ表面を得た。最初の４サイクルの合成で、無マスクアレー合成機は、前記保護ヌクレオチド-3'-スクシネートの各々の結合のために適切なアレーエレメント中で、DMF中のカップリング物質O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロ-ホスフェート（HBTU）により前記第二アミンを光脱保護するであろう。続いて、反応しなかった遊離アミンをピリジン中の無水酢酸によりキャップを施す。3'-ヌクレオチドが前記表面に結合したら、続いて脱保護および伸長サイクルを下記の文献に記載されたように実施する（Singh-Gasson et al., Nature Biotechnology 17:974-978 (1999)およびPCT特許出願WO99/42813公開公報）。
【００１７】
遺伝子合成
この実施例では、無マスクアレー合成機を用いてガラススライド上でオリゴヌクレオチドフラグメントの合成を実施する。スライドからオリゴヌクレオチドフラグメントの遊離後、セルフアッセンブリーおよびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）またはその両者によって、前記フラグメントをアッセンブリングして特定の配列をもつ長い二本鎖DNAを得る。
本実施例の目的のために、任意であるが特定の配列を有する長さが420塩基対の二本鎖DNAフラグメントの合成を考えた。標的配列を40量体で20がオーバーラップするオリゴヌクレオチドに分割する。20個のオリゴヌクレオチドまたはセグメントのうち、10個を前記標的配列の各鎖のために選び、前記セグメントが、それらがいずれかの鎖上の20塩基の3'-オーバーハングにより完全長配列にセルフアッセンブリングできるようにデザインする。ソフトウェアを用いて前記標的配列から仮のオリゴヌクレオチドを選択し、20個のオリゴヌクレオチドフラグメントの合成のために利用可能なアレーエレメントをチップ上で均等に配分する。上記に記載したように合成が完了した後、スライドを最少容量の濃縮水酸化アンモニウムとともにインキュベートし、さらに55℃で4時間加熱してスライド表面から前記オリゴヌクレオチドを切断し、塩基から全ての保護基を除去する。前記溶液をスピードヴァック（Speedvac）で濃縮して乾燥させ、50μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（Promega）に再溶解し、前記オリゴヌクレオチドの5'-ヒドロキシルを20UのT4-ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega）で37℃で2時間リン酸化する。得られたリン酸化オリゴヌクレオチドの混合物を８％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動でサイズにより分離する。完全長の40量体オリゴヌクレオチドに対応するバンドをゲルから切り出し、オリゴヌクレオチドの混合物を凍結/融解および溶出によってゲルから精製する（これら方法の各々についての詳細なプロトコルは下記文献で見出される：Short Protocols in Molecular Biology ,4th ed., Ausubel et al. eds. 1999）。前記精製オリゴヌクレオチドを、８UのPfuDNAリガーゼ（Stratagene）を含むLCR緩衝液（Stratagene）に溶解する。本プロセスの結果によれば、以下の温度サイクルによって個々のオリゴヌクレオチドがアニールされ、一緒に連結されて完全長のDNA配列が生成される（94℃、1分；55℃で90秒、70℃で90秒、95℃で30秒を40サイクル；55℃、2分、72℃2分）。続いて、完全長オリゴヌクレオチドは、2つの20量体オリゴヌクレオチドプライマー（本実施例の3'-オーバーハングに相補的）を用いたLCR反応から標準的プロトコルによるPCRを用いて増幅される。
【００１８】
上記の遺伝子合成プロトコルの詳細な記載は本発明の実施のために例として提供される。LCR、PCRまたはその両方を用いてオリゴヌクレオチドをアニールし増幅してより長い二本鎖DNA配列を得るこのプロトコルに関しては多くの可能な変型が存在する（Kneidinger et al., BioTechniques, 30, 248-249 (2001); Withers-Martinez et al., Protein Eng. 12, 1113-1120 (1999); Casimiro et al., Structure (London), 5:1407-1412 (1997); Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299-302 (1995); Prodromou et al., Protein Eng. 5:827-829 (1992); Engels, Angew. Chem., 101:733-52 (1989)）。当業者は本プロトコルの細部を変更して、種々の明白な方法（例えばリンカーの反応、オリゴヌクレオチドの長さ、各オリゴヌクレオチドのコドンの使用（したがって配列のハイブリダイゼーション特性）、各セグメントの構築に用いられるオリゴヌクレオチドの数、LCRおよび／またはPCRアッセンブリー反応条件）で本プロセスの効率を最適化させることができよう。前記DNAセグメントは全てが同じ長さである必要はなく、特定の反応を示す与えられた装置によって生成することができるセグメントの品質の制限範囲内において任意の所望される長さをもつことができる。
【００１９】
２．同時篩い分けの使用（実施されたもの）
一般的プロトコル
本発明のある態様では、20から200塩基のDNAオリゴヌクレオチドが任意の方法によって合成される。問題の配列を生成するとき、そのアンチセンス相補鎖もまた生成される。センスおよびアンチセンス鎖を先ず初めに95℃に加熱して変性させ、続いてゆっくりと冷却しアニールさせる。続いて、塩基のミスマッチまたは欠失を含むオリゴヌクレオチドと結合またはこれを切断するタンパク質（例えば細菌のMutS）と前記二本鎖オリゴヌクレオチドをインキュベートする。前記タンパク質はエラーを含むオリゴヌクレオチドは保持するかまたは変化させ、一方、エラーをもたないオリゴヌクレオチドは更なる使用について自由である。続いて前記二本鎖オリゴヌクレオチドをさらに酵素で処理して一切の残存するエラーまたは一本鎖を排除する。上記に特記したように、ミスマッチは他の方法によっても位置を決定し排除することができる。
【００２０】
オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチド配列は、プラスミドpGFPuv（GenBankアクセス番号#U62636）に含まれる緑色蛍光タンパク質UV遺伝子から誘導した。この配列は、GFPは後のバイオアッセイでレポーター遺伝子として有用であるために選択した。非変異体または野生型（wt）アンチセンス鎖は蛍光染料Cy5で5'末端を標識した。20位で欠失を含むか、またはCからAへの置換を含む変異体アンチセンス鎖をフルオレセインで5'末端標識した。オリゴヌクレオチドはオペロン社（Operon Inc., Alameda, CA）から入手した。
GFPuv 351-390    MP 81.7℃
センス：GTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAG
アンチセンス：CTTCACCCTCTCCACTGACAGAAAATTTGTGCCCATTAAC
アンチ-del20：CTTCACCCTCTCCACTGACGAAAATTTGTGCCCATTAAC
アンチC＞A：CTTCACCCTCTCCACTGAAAGAAAATTTGTGCCCATTAAC
【００２１】
アニーリング
典型的な反応では、80pmolの無標識センス鎖を40pmolのCy5標識アンチセンス鎖および40pmolのフルオレセイン標識変異鎖（del20またはC＞A）と１XのMuts緩衝液（10mMトリス塩酸（pH8.8）、５mMのMgCl2、0.1％トリトンX-100）中で混合した。前記混合物を95℃で5分先ず変性させてからサーモサイクラーでアニーリングさせた。続いて前記混合物を0.2℃/秒で温度が25℃に達するまで冷却した。このようにして生成したデュープレックスDNAは図5に示されている。
結合反応
2または6μgのMutStタンパク質（Epicenter Technologies, Madison, WI）を前記アニーリングさせたオリゴヌクレオチドに添加した。続いて混合物を37℃で30分インキュベートした。
ローディング染料（Promega 6X）を反応に添加した。全反応物を６％のTBE-PAGEゲル（5mMのMgCl2に修正）にロードした（泳動緩衝液（１XのTBE）は5mMのMgCl2に修正）。電気泳動を120vで3時間実施した。分析は、青色（フルオレセイン）および赤色（Cy5）レーザーによりモレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics）STORM860で実施した。モレキュラーダイナミクスイメージクォント（ImageQuant）ソフトウェアを用いて結果を定量した。
【００２２】
結果
野生型（wt）センス鎖をCy5標識wtアンチセンス鎖およびフルオレセイン標識アンチセンス鎖（20位に欠失を含む）の50/50混合物とアニーリングさせた。MutSタンパク質は、シフトをもたらすDNAタンパク質複合体を形成する。MutSタンパク質は優先的にフルオレセイン標識二本鎖オリゴヌクレオチド（20位に欠失を含む（del20））と結合する。この結果は、得られたゲルのフルオレセインチャネルのはるかに強い暗色のMutS/DNA複合体バンドによって示された。プロテアーゼKを前記レーンに添加し、MutSタンパク質を消化した。この消化によって、前記シフトしたバンドが除去され、シフトはタンパク質の結合によるものであることが証明された。
MutSによるDNAへの結合はエラーを含む二本鎖オリゴヌクレオチドに特異的であることを証明するために、MutSタンパク質について前記DNAを10倍モル過剰の非標識二本鎖野生型オリゴヌクレオチド（wt）または20位に欠失をもつ非標識二本鎖オリゴヌクレオチド（del20）のどちらかと競合させた。結果は以下を示した：MutSタンパク質の非存在下では（No MutS）、10倍過剰はいずれのタイプのバンドシフトももたらさず、6μgのMutSタンパク質では10倍過剰のwtオリゴヌクレオチドはDNA/MutS複合体と競合しない。同じ時に、10倍過剰のdel20オリゴヌクレオチドはDNA/MutS複合体と競合した。このことは、MutSの結合はエラーを含むオリゴヌクレオチドについて特異的であることを示している。
オリゴヌクレオチド合成機を用いてオリゴヌクレオチドを生成するとき、もっとも一般的なエラーは、封鎖基の除去の失敗または塩基の結合の失敗によって生じる欠失である。本実験によって、MutSタンパク質は、中央にA対Gのミスマッチをもつオリゴヌクレオチドよりも欠失変異をもつオリゴヌクレオチド（del20）とより効率的に結合することが示された。前記は、泳動ゲルでdel20レーンのより強い暗色のシフトバンドによって示唆された。本実験では、センス鎖もまたCy5で標識されているので、DNA複合体はCy5およびフルオレセインの両レーンに出現する。
【００２３】
結論
二本鎖オリゴヌクレオチドを生成することによって、ミスマッチ特異的タンパク質（例えばMutS）を使用してエラーの検出および除去が可能になる。MutSの結合は、エラーを含む二本鎖オリゴヌクレオチドに特異的である。エラー含有オリゴヌクレオチドは、エラーをもたないオリゴヌクレオチドが極めて過剰に存在している場合でさえ検出することができる。もっとも一般的なエラータイプ（欠失）が優先的に検出される。
正しい配列プールから変異オリゴヌクレオチドデュープレックスを除去するMutSの能力を証明するために実験を実施した。オリゴヌクレオチドはふたたび天然の緑色蛍光タンパク質配列から選択した。前記事例ではGFPuvｎの塩基番号は649から717で、68量体である。変異体型68量体はまた塩基33（T）の欠失を含むように作製した。第一回の試験では、正しい配列のそれぞれ2.5nmolのセンスおよびアンチセンスを含む22.2μLを１XのTaq緩衝液および1.5ｍMのMgCl2を含む反応物に加えた。前記反応物を95℃で5分加熱して変性させ、続いて反応物が25℃に達するまで0.1℃／秒で温度を下げてアニーリングさせた。平行して、野生型および変異体オリゴヌクレオチドの両方を組み合わせた同様な反応を実施し、変異体オリゴヌクレオチドは合計0.25nmolのアンチセンスDNAに0.25nmolが加えられた。前記２つの反応混合物をそれぞれ半分に分け、MutS存在下または非存在下でインキュベートした。この反応には以下を用いた：総反応容積30μLに対して、1.25nmolのDNAデュープレックスを含む11.1μLのデュープレックスDNA溶液、2μLの75ｍMMgCl2、13.9μLの水および（ａ）3μLのMutSタンパク質（2μg/μLまたは0.067nmol）または代替として（ｂ）3μgの水。続いて全溶液を2.5％アガロースゲル（5mMのMgCl2に修正）にロードし、１XのTBE緩衝液（5mMのMgCl2）で泳動した。電気泳動後、ゲルを臭化エチジウムで染色した。ゲルのバンドを分析し、シフトしたもの、していないものが認められた。シフトしていないバンドをゲルから切り出し、キアゲン（Qiagen）ゲル精製キットを用いて前記DNAをゲル精製した。前記回収したDNAの一部をTopo-TAプラスミドでクローニングし、大腸菌HB101細胞を形質転換し、前記大腸菌細胞を平板培養した。ミニプレップ（Miniprep）を前記コロニーから調製してDNAを回収し、前記DNAの配列を決定した。配列分析の結果は、MutSを添加されなかった反応では、クローンの30％が野生型または正しい配列であり、一方、MutSが添加された反応では、クローンの58％が野生型または正しい配列であることを示した。前記の結果は、集団内で正しい野生型クローンの数は93％増加することを示している。インプットDNAのわずか10％が意図的に変異体であったときに、変異体クローンのパーセンテージがそのように高い理由は、購入したオリゴヌクレオチドの純度が低かったからかもしれない。しかしながら、前記の精製効果はそれでもなおデータで明白である。
【００２４】
エラーを含む配列のアッセンブリー
本実験は、エラーの篩い分けを評価するために緑色蛍光タンパク質の発現を調べる機能アッセイを実施するため、およびエラー配列が存在する中でより小さなプローブを大きなDNA集合体にアッセンブリーさせるために実施した。前記概念は、PCRプロセスが残留する変異体デュープレックスを選別できるか否かを観察することであった。
本実験で使用したDNAはGFPuv配列の塩基445から585の間のリン酸化オリゴヌクレオチドであった。上部および下部（相補）鎖を３つの40量体および１つの20量体から生成した。アッセンブリングされたフラグメント内にNcoIおよびBsrGI酵素の固有の制限部位が存在する。用いたプロトコルでは、総容積15μLに0.47nmolの各プライマーが含まれ、さらに以下も含む反応物中で組み合わせて（4μLの10XのPfuDNAリガーゼ緩衝液、2μLのPfuDNAリガーゼ（4μg/μL）および19μLの水）、総容積を40μLとした。リガーゼ連鎖反応は以下の温度プロフィールで実施した：95℃で1分、続いて55℃で90秒、70℃で90秒および95℃で30秒の40サイクル、続いて55℃で2分および70℃で2分。
【００２５】
実験を実施するために、前記反応混合物を半分（総容積20μL）に分け、それに5μLの75ｍMのMgCl2、5μLの10Xリガーゼ緩衝液、22.5μLのMutSタンパク質（2μg/μL）または22.5μLの水を加え、さらに22.5μLの水を加えて75μLの総容積を得た。組み合わせた反応物はしたがって各々0.0235nmolのアッセンブリングされたDNAデュープレックスおよび45μgのMutSタンパク質（DNAミスマッチを認識し、これと結合する際にダイマーとして機能する）を含んでいた。前記反応物を50℃に30分置いた。続いて、１XのTBEプラス5mMMgCl2の泳動緩衝液を含む2.5％アガロースゲル（5mMのMgCl2に修正）に全容積をロードし泳動した。電気泳動の後、ゲルを臭化エチジウム染色し、シフトしていないバンドをゲルから切り出した。キアゲン（Qiagen）ゲル精製キットを用いて前記DNAを精製した。続いて前記DNAを一番外のプライマーを用いて増幅した。DNAをNcoIおよびBsrGIで消化しゲル精製した。前記DNAを連結してpGVPuv-NcoI-BsrGIを作製しHB101細胞を形質転換させた。本プロセスは図4に示されている。
【００２６】
本実施例の結果は、UV照明下でMutS含有およびMutS陰性複製物の両方から750を越えるコロニーを調べた後95％を超えるコロニーが光を放った。GFPを含まないプラスミドを有するコントロールは光らず、無傷のpGFPuvカセットを有する陽性コントロールはまた全て光を放っていた。挿入物を含まないpGVPuv-NcoI-BsrGIプラスミドを用いたまた別の陰性コントロールもまた光を示さなかった。この結果は、（１）多数の欠失または挿入がフレームシフトの創出を無効するか、または（２）PCRは変異を含むデュープレックスの増幅に対して偏りを示すということがない限り幾分驚くべきことであった。クローンに存在する可能なサイレント変異の数を決定および定量するために、サブセットを増殖させ、それらのDNAを抽出し、配列を決定した。前記配列決定反応によって、MutS陰性プールに由来するコロニーの81％が野生型配列を有し、一方、19％が変異配列を含み、さらに全ての変異が置換であることが明らかになった。MutS含有反応物から得られたコロニーのうち、テストした全てが野生型または正しい配列を示した。前記の配列は各コロニーのデュープリケートシークェンシングによって確認された。
前記の結果は、DNA結合物質を用いて、LCR反応で精製されるDNAデュープレックスプールから小数のエラー配列を首尾よく分離することができることを示している。GFP機能アッセイは分析に役立たなかったが、MutSによるDNAの結合は所望の配列についてDNAプールの精製に有用なツールであった。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のアプローチを模式的に示す。
【図２】本発明のアプローチの他の工程を模式的に示す。
【図３】DNAプールから不正確な配列をもつDNAの除去のための概念を模式的に示す。
【図４】実施例の１つで用いられる方法を示す。
【図５】実施例の１つでオリゴヌクレオチドからアッセンブリングされたデュープレックスを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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