(57)【要約】３−ヒドロキシ−７−ヒドロキシステロイドおよび３−オキソ−７−ヒドロキシステロイド（特に、その７β異性体）ならびにその薬学的に許容可能なエステルは、心臓または腎臓などの周辺器官に対する虚血誘導性障害からの保護ならびに脊髄損傷の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
周辺(peripheral)器官に対する虚血性障害からの保護および脊髄損傷誘導性障害の治療に関する薬物製造のための、３−ヒドロキシ−７−ヒドロキシステロイドもしくは３−オキソ−７−ヒドロキシステロイド、またはその薬学的に許容可能なエステルの使用。
【請求項２】
前記ステロイドは、式（Ｉ）：
【化１】
2005506321.tif 000013
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一であるか互いに異なり、それぞれ、以下に定義するような、水素原子、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基、２〜６個の炭素原子を有するアルキニル基、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基、ホルミル基、２〜７個の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、３〜７個の炭素原子を有するアルケニルカルボニル基、３〜７個の炭素原子を有するアルキニルカルボニル基、７〜１１個の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５個の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、９〜１５個の炭素原子を有するアラルケニルカルボニル基、アミノ酸残基、または複素環カルボニル基を示し、
ＲａおよびＲｂの一方は、好ましくはβ型配座の式−Ｒｃの基を示し、他方は、水素原子を示すか、またはＲａおよびＲｂは共にオキソ基を示し、
Ｒｃは、以下に定義するような、１〜６個の炭素原子を有するアルカノイル基、アリール部分が６〜１０個の環炭素原子を有する芳香族炭素環基であるアリールカルボニル基、複素環カルボニル基、または式−ＯＲ４の基（式中、Ｒ４は、Ｒ１およびＲ２について上記で定義された基および原子の任意の１つを示す）を示し、
環Ａ：
【化２】
2005506321.tif 000014
は、ベンゼン環またはシクロヘキサン環であり、
環Ａがシクロヘキサン環である場合、環Ｂ中の破線は炭素−炭素単結合または炭素−炭素二重結合を示し、ｎは１であり、または環Ａがベンゼン環である場合、環Ｂ中の破線は炭素−炭素単結合を示し、ｎは０であり、
前記複素環カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基（式中、Ｒ３は３〜７個の環原子を含む複素環基を示し、そのうちの１〜３個が窒素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、残りの原子の少なくとも１つが炭素原子である）であり、
前記アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基、ならびに前記アルキルカルボニル基、アルケニルカルボニル基、およびアルキニルカルボニル基のアルキル、アルケニル、およびアルキニル部分は置換されていないか、少なくとも１つの以下の置換基Ψを有し、
置換基Ψは、水酸基、メルカプト基、ハロゲン原子、アミノ基、１〜６個の炭素原子を有するアルキルアミノ基、各アルキル基が１〜６個の炭素原子を有するジアルキルアミノ基、カルバモイル基、ニトロ基、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ基、１〜６個の炭素原子を有するアルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、および６〜１０個の炭素原子を有する非置換アリール基であり、
前記アリール基、前記複素環基、ならびに前記アリールカルボニル基および前記アラルキルカルボニル基のアリール部分は置換されていないか、少なくとも１つの以下の置換基βを有し、
置換基ξは、任意の置換基Ψ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、１〜６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、および１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル基である）の化合物ならびにその薬学的に許容可能な塩およびエステルである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２は同一であるか互いに異なり、それぞれ、以下に定義するような、水素原子、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、任意に置換されたフェニル基、ホルミル基、２〜５個の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、７〜１１個の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５個の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、アミノ酸残基、または複素環カルボニル基を示し、
ＲａおよびＲｂの一方は、１〜６個の炭素原子を有するアルカノイル基またはβ型配座の式−ＯＲ４の基（式中、Ｒ４は、Ｒ１およびＲ２について上記で定義された基および原子の任意の１つを示す）を示し、他方は、水素原子を示すか、またはＲａおよびＲｂは共にオキソ基を示し、
前記複素環カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基（式中、Ｒ３は３〜７個の環原子を有する複素環基を示し、そのうちの１〜３個が窒素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、残りの原子の少なくとも１つが炭素原子である）である、請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記ステロイドは、式（ＩＩ）：
【化３】
2005506321.tif 000015
（式中、Ｒ２は、以下に定義するような、水素原子、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、任意に置換されたフェニル基、ホルミル基、２〜５個の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、７〜１１個の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５個の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、アミノ酸残基、または複素環カルボニル基を示し、
前記複素環カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基（式中、Ｒ３は３〜７個の環原子を含む複素環基を示し、そのうちの１〜３個が窒素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、残りの原子の少なくとも１つが炭素原子である）であり、
ＲａおよびＲｂの一方は、好ましくはβ型配座の式−Ｒｃ基を示し、他方は、水素原子を示すか、またはＲａおよびＲｂは共にオキソ基を示し、Ｒｃは、以下に定義するような、１〜６個の炭素原子を有するアルカノイル基、アリール部分が６〜１０個の環炭素原子を有する芳香族炭素環基であるアリールカルボニル基、複素環カルボニル基、または式−ＯＲ４の基（式中、Ｒ４は、Ｒ２について上記で定義した基および原子の任意の１つを示す）を示す）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステルである、請求項１記載の使用。
【請求項５】
７位の−ＯＲ２基はβ型配座である、請求項２ないし請求項４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ステロイドは、７β−ヒドロキシ−エピアンドロステロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記ステロイドは、７β−ヒドロキシ−デヒドロエピアンドロステロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記ステロイドは、７β−ヒドロキシ−１７β−エストラジオールである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記ステロイドは、７β−ヒドロキシ−プレグネノロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ステロイドは、７β−ヒドロキシ−エストロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記ステロイドは、７α−ヒドロキシ−エストロンである、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記周辺器官は心臓である、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記心臓に対する障害が心筋梗塞に起因する、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記周辺器官は腎臓である、請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
前記腎臓に対する障害は糸球体腎炎または急性腎不全に起因する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
脊髄損傷の治療用である、請求項１ないし請求項１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
有効量の請求項１ないし請求項１１のいずれか１項に記載の３−ヒドロキシ−７−ヒドロキシステロイドもしくは３−オキソ−７−ヒドロキシステロイドまたはその薬学的に許容可能なエステルを投与することによる、周囲器官の虚血誘導性組織障害または脊髄に対する脊髄損傷誘導性障害から哺乳動物を保護する方法。
【請求項１８】
前記周辺器官は心臓である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記周辺器官は腎臓である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物は、脊髄損傷に起因する障害から保護される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３−ヒドロキシ−７−ヒドロキシステロイド化合物およびその一定のケトン誘導体の一定の新規の予防的および治療的使用、詳細には、心臓または腎臓などの周辺(peripheral)器官の虚血性ストレスに起因する障害の予防もしくは治療、ならびに脊髄損傷の治療のためのこれらの化合物の使用に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
特定の神経保護モデルを使用して、本発明者らは、この型の化合物が神経保護活性を有することを証明した。本発明者らは、この度、この神経保護効果が得られるこの作用様式が、心臓および腎臓などの周辺器官の組織でも作用し、それによりこの化合物が、心臓保護効果および虚血性腎障害から保護する能力を有することを発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
それゆえ、本発明は、周辺器官の組織（すなわち、脳および脊髄を除く身体の任意の機能的組織）に対する虚血性障害、特に心臓または腎障害からの保護のため、および脊髄損傷誘導性障害の治療に関する薬物製造のための３−ヒドロキシ−７−ヒドロキシステロイドもしくは３−オキソ−７−ヒドロキシステロイドまたはその薬学的に許容可能なエステルの使用を提供する。
【０００４】
本発明での使用に好ましい化合物の特定のクラス(class)は、７β−ヒドロキシステロイドであり、これらのうち、本発明にとって特に興味深い化合物は、３β、７β−ジヒドロキシステロイドおよびその薬学的に許容可能なエステルである。
【０００５】
好ましいエステルは、カルボン酸エステルおよびアミノ酸エステルである。
【０００６】
本発明で使用することができる任意に置換された３β，７β−ジヒドロキシステロイドならびにその薬学的に許容可能なエステルおよび他の誘導体の例は、式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2005506321.tif 000002
【０００８】
（式中、Ｒ１およびＲ２は同一であるか互いに異なり、それぞれ、以下に定義するような、水素原子、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基、２〜６個の炭素原子を有するアルキニル基、６〜１０個の炭素原子を有するアリール基、ホルミル基、２〜７個の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、３〜７個の炭素原子を有するアルケニルカルボニル基、３〜７個の炭素原子を有するアルキニルカルボニル基、７〜１１個の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５個の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、９〜１５個の炭素原子を有するアラルケニルカルボニル基、アミノ酸残基、または複素環カルボニル基を示し、
ＲａおよびＲｂの一方は、好ましくはβ型配座の式−Ｒｃ基を示し、他方は、水素原子を示すか、またはＲａおよびＲｂは共にオキソ基を示し、
Ｒｃは、以下に定義するような、１〜６個の炭素原子を有するアルカノイル基、アリール部分が６〜１０個の環炭素原子を有する芳香族炭素環基であるアリールカルボニル基、複素環カルボニル基、または式−ＯＲ４（式中、Ｒ４は、Ｒ１およびＲ２について上記で定義された基および原子の任意の１つを示す）を示し、
環Ａ：
【０００９】
【化２】
2005506321.tif 000003
【００１０】
は、ベンゼン環またはシクロヘキサン環であり、
環Ａがシクロヘキサン環である場合、環Ｂ中の破線は炭素−炭素単結合または炭素−炭素二重結合を示し、ｎは１であり、または環Ａがベンゼン環である場合、環Ｂ中の破線は炭素−炭素単結合を示し、ｎは０であり、
上記複素環カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基（式中、Ｒ３は３〜７個の環原子を含む複素環基を示し、そのうちの１〜３個が窒素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、残りの原子の少なくとも１つが炭素原子である）であり、
上記アルキル基、アルケニル基、およびアルキニル基ならびにアルキルカルボニル基、アルケニルカルボニル基、およびアルキニルカルボニル基のアルキル、アルケニル、およびアルキニル部分は置換されていないか、少なくとも１つの以下の置換基Ψを有し、
置換基Ψは、水酸基、メルカプト基、ハロゲン原子、アミノ基、１〜６個の炭素原子を有するアルキルアミノ基、各アルキル基が１〜６個の炭素原子を有するジアルキルアミノ基、カルバモイル基、ニトロ基、１〜６個の炭素原子を有するアルコキシ基、１〜６個の炭素原子を有するアルキルチオ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、および６〜１０個の炭素原子を有する非置換アリール基であり、
上記アリール基、複素環基、ならびに上記アリールカルボニル基および上記アラルキルカルボニル基のアリール部分は置換されていないか、少なくとも１つの以下の置換基ξ他を有し、
置換基ξは、任意の置換基Ψ、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、１〜６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基、および１〜６個の炭素原子を有するハロアルキル基である）の化合物である。
【００１１】
本発明の化合物の活性を、添付の図面によって例示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記の式（Ｉ）の化合物では、７位の基−ＯＲ２は、αまたはβ型配座であってよいが、β型配座が好ましい。
【００１３】
より好ましくは、式（Ｉ）の化合物において、
Ｒ１およびＲ２は同一であるか互いに異なり、それぞれ、以下に定義するような、水素原子、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、任意に置換されたフェニル基、ホルミル基、２〜５個の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、７〜１１個の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５個の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、アミノ酸残基、または複素環カルボニル基を示し、Ｒ１およびＲ２は共に水素原子であることが特に好ましく、
ＲａおよびＲｂの一方は、１〜６個の炭素原子を有するアルカノイル基または好ましくはβ型配座の式−ＯＲ４の基（式中、Ｒ４は、Ｒ１およびＲ２について上記で定義された基および原子の任意の１つを示す）を示し、他方は、水素原子を示すか、またはＲａおよびＲｂは共にオキソ基を示し、特に好ましくは、ＲａおよびＲｂは共にオキソ基を示すか、またはＲａおよびＲｂの一方は、水素基を示し、他方は、水素原子または１〜４個の炭素原子を有する水酸基またはアルカノイル基、特に水酸基またはアセチル基を示し、
上記複素環カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基（式中、Ｒ３は３〜７個の環原子を有する複素環基を示し、そのうちの１〜３個が窒素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、残りの原子の少なくとも１つが炭素原子である）である。
【００１４】
最も好ましい式（Ｉ）の化合物は、
Ｒ１およびＲ２は共に水素原子を示し、かつ
ＲａおよびＲｂは、共にオキソ基を示すか、またはＲａおよびＲｂの一方は水素原子を示し、他方は水酸基または１〜４個の炭素原子を有するアルカノイル基、特に水酸基またはアセチル基を示す化合物およびその薬学的に許容可能なエステルである。
【００１５】
本発明で使用することができる３−オキソ−７β−ヒドロキシステロイドの例は、式（ＩＩ）：
【００１６】
【化３】
2005506321.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｒａ、Ｒｂ、およびＲ２は上記で定義した通りであり、好ましくは、ＲａおよびＲｂは、共にオキソ基を示すか、ＲａおよびＲｂの一方は水素原子を示し、他方は好ましくはβ型配座での水酸基、またはアセチル基を示す）の化合物およびその薬学的に許容可能なエステルである。
【００１８】
上記の式（ＩＩ）の化合物では、７位の基−ＯＲ２は、αまたはβ型配座であってよいが、β型配座が好ましい。
【００１９】
より好ましくは、式（ＩＩ）の化合物において、
Ｒ２は、以下に定義するような、水素原子、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基、任意に置換されたフェニル基、ホルミル基、２〜５個の炭素原子を有するアルキルカルボニル基、７〜１１個の炭素原子を有するアリールカルボニル基、８〜１５個の炭素原子を有するアラルキルカルボニル基、または複素環カルボニル基を示し、特に、Ｒ２が水素原子を示すことを好ましく、
ＲａおよびＲｂの一方は、１〜６個の炭素原子を有するアルカノイル基または好ましくはβ型配座の式−ＯＲ４の基（式中、Ｒ４は、Ｒ２について上記で定義された基および原子の任意の１つを示す）を示し、他方は、水素原子を示すか、ＲａおよびＲｂは共にオキソ基を示し、ＲａおよびＲｂは共にオキソ基を示すか、またはＲａおよびＲｂの一方は水素原子を示し、他方は、水酸基または１〜４個の炭素原子を有するアルカノイル基、特に水酸基またはアセチル基を示すことを好ましく、
上記複素環カルボニル基は、式Ｒ３−ＣＯの基（式中、Ｒ３は３〜７個の環原子を含む複素環基を示し、そのうちの１〜３個が窒素原子、酸素原子、および硫黄原子から選択されるヘテロ原子であり、残りの原子の少なくとも１つが炭素原子であって、またその薬学的に許容可能なエステルである。
【００２０】
最も好ましい式（ＩＩ）の化合物は、
Ｒ２は水素原子を示し、
ＲａおよびＲｂは、共にオキソ基を示すか、あるいはＲａおよびＲｂの一方は水素原子を示し、他方は、水酸基または１〜４個の炭素原子を有するアルカノイル基、特に水酸基またはアセチル基を示す
化合物およびその薬学的に許容可能なエステルである。
【００２１】
本発明の化合物では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、または置換基ξは、アルキル基であり、これは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキル基であってよく、例には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、２−エチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、３−エチルブチル基、ｔ−ヘキシル基、および１，１−ジメチルペンチル基が含まれ、これらの基のうちで１〜４個の炭素原子を含むものが好ましく、メチル基およびエチル基が最も好ましい。
【００２２】
Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４がアルケニル基を示す場合、これは２〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルケニル基であってよく、例には、ビニル基、１−プロペニル基、アリル基、イソプロペニル基、メタリル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、イソブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、および１−ヘキシニル基、２−ヘキシニル基、３−ヘキシニル基、４−ヘキシニル基、５−ヘキシニル基が含まれ、これらの基のうちで２〜４個の炭素原子を有するアルケニル基が好ましく、ビニル基およびアリル基が最も好ましい。
【００２３】
Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４がアルキニル基を示す場合、これは２〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキニル基であってよく、例には、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、１−ブチニル基、２−ブチニル基、３−ブチニル基、イソブチニル基、１−ペンチニル基、２−ペンチニル基、３−ペンチニル基、４−ペンチニル基、および１−ヘキシニル基、２−ヘキシニル基、３−ヘキシニル基、４−ヘキシニル基、５−ヘキシニル基が含まれ、これらの基のうちで２〜４個の炭素原子を有するアルキニル基が好ましい。
【００２４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、または置換基Ψがアリール基を示す場合、これは、６〜１０個の炭素原子を有する芳香族炭素環基である。このような基の例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、およびインデニル基が含まれ、これらの基のうちでフェニル基が好ましい。置換基Ψの場合を除いて、これらの基は置換されていても置換されていなくてもよい。基が置換されている場合、置換基の数は置換可能な位置の数およびおそらくいくつかの場合は立体障害によってのみ制限される。したがって、フェニル基の場合、置換基の最大数は５であり、ナフチル基の場合、置換基の最大数は７であり、以下同様である。しかし、好ましい置換基数は１〜３であり、置換基は本明細書中で後述する通りである。
【００２５】
Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４がアルキルカルボニル基を示す場合、これは２〜７個の炭素原子を有する（すなわち、アルキル部分に１〜６個の炭素原子を含む）直鎖または分岐鎖の基であり得るアルカノイル基であり、例には、アセチル基、プロピニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、およびヘプタノイル基が含まれ、これらの基のうちで２〜５個の炭素原子を有する基が好ましく、アセチル基およびプロピニル基が最も好ましい。この基のアルキル部分は、置換されていても置換されていなくてもよく、置換されている場合、置換基は置換基Ψから選択される。このような置換された基の例には、アラニル基、β−アラニル基、フェニルアラニル基、アスパラギニル基、システイニル基、グリコロイル基、グリシル基、メチオニル基、オルニチル基、グリセロイル基、トロポイル基、グルタミニル基、グルタミル基、ホモシステイニル基、セリル基、ホモセリル基、トレオニル基、ラクトイル基、ロイシル基、イソロイシル基、ノルロイシル基、リシル基、バリル基、ノルバリル基、およびサルコシル基が含まれる。
【００２６】
Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４がアルケニルカルボニル基を示す場合、これは３〜７個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルケニルカルボニル基であってよく、例には、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、３−ブテノイル基、ペンテノイル基、およびヘキセノイル基が含まれ、これらの基のうちで３〜５個の炭素原子を有するアルケニルカルボニル基が好ましく、アクリロイル基およびメタクリロイル基が最も好ましい。
【００２７】
Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４がアルキニルカルボニル基を示す場合、これは３〜７個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルキニルカルボニル基であってよく、例には、プロピオロイル基、３−ブチニルカルボニル基、ペンチニルカルボニル基、およびヘキシニルカルボニル基が含まれ、これらの基のうちで３〜５個の炭素原子を有するアルキニルカルボニル基が好ましい。
【００２８】
Ｒｃ、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４がアリールカルボニル基を示す場合、このアリール部分は上記で定義および例示された任意のアリール基であってよい。好ましいアリールカルボニル基には、ベンゾイル、ｏ−トルオリル基、ｍ−トルオリル基、ｐ−トルオリル基、ｏ−アニソイル基、ｍ−アニソイル基、ｐ−アニソイル基、ｏ−ヒドロキシベンゾイル基、ｍ−ヒドロキシベンゾイル基、ｐ−ヒドロキシベンゾイル基、ピクリル基、ガロイル基、プロトカテクオイル基、バニロイル基、ベラトロイル基、アントラニロイル基、１−ナフトイル基、および２−ナフトイル基が含まれる。
【００２９】
Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４がアラルキルカルボニル基またはアラルケニルカルボニル基を示す場合、アリール基および場合によってはアルキル基またはアルケニル基は、上記で定義および例示された任意の基であってよい。このような基の特定の例には、フェニルアセチル基、３−フェニルプロピオニル基、ベンジロイル基、チロシル基、アトロポイル基、ヒドラトロポイル基、およびシンナモイル基が含まれる。
【００３０】
Ｒｃ、Ｒ１、Ｒ２、またはＲ４が複素環カルボニル基を示す場合、これは、式Ｒ３−ＣＯ−の基（式中、Ｒ３は３〜７個の環原子を有する複素環基を示し、そのうちの１〜３個が窒素原子、酸素原子、および硫黄原子であり、残りが炭素原子である）である。少なくとも１つの環原子は、炭素原子であるべきである。３個のヘテロ原子が存在する場合、少なくとも１つが窒素原子であることが好ましい。このような基の例には、２−フロイル基および３−フロイル基、２−テノイル基および３−テノイル基、２−ピリジンカルボニル基、ニコチノイル基、イソニコチノイル基、プロリル基、ピペリジンカルボニル基、ピペラジンカルボニル基、およびモルホリノカルボニル基が含まれる。
【００３１】
Ｒ１および／またはＲ２がアミノ酸残基を示す場合、これは、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）基から水酸基が除去された任意のアミノ酸であってよい。このようなアミノ酸残基の例には、アラニル基、β−アラニル基、シスタチオニル基、シスチル基、グリシル基、ヒスチジル基、ホモセリル基、イソロイシル基、ランチオニル基、ロイシル基、リシル基、メチオニル基、ノルロイシル基、ノルバリル基、オルニチル基、プロリル基、サルコシル基、セリル基、トレオニル基、チロニル基、チロシル基、バリル基、システイニル基、ホモシステイニル基、トリプトフィル基、α−アスパルチル基、β−アスパルチル基、アスパルトイル基、アスパラギニル基、α−グルタミル基、γ−グルタミル基、およびグルタミニル基が含まれる。
【００３２】
Ｒｃがアルカノイル基を示す場合、これは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の基であってよく、例には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、およびヘプタノイル基が含まれ、これらの基のうちで２〜５個の炭素原子を有する基が好ましく、アセチル基およびプロピオニル基がより好ましく、アセチル基が最も好ましい。
【００３３】
置換基Ψまたは置換基ξが１〜６個の炭素原子を有するアルキルアミノ基である場合、アルキル部分は、上記で定義および例示された任意のアルキル基であってよい。このようなアルキルアミノ基の好ましい例には、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、イソペンチルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、ｔ−ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、およびイソヘキシルアミノ基が含まれ、これらの基のうちで１〜４個の炭素原子を有する基が好ましく、メチルアミノ基およびエチルアミノ基が最も好ましい。
【００３４】
置換基Ψおよび置換基ξがジアルキルアミノ基である場合、各アルキル部分は、１〜６個の炭素原子を有し、２つのアルキル基は同一であっても互いに異なっていてもよい。アルキル基は、上記で定義および例示された任意のアルキル基であってよい。このようなジアルキルアミノ基の好ましい例には、ジメチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基、メチルプロピルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、エチルブチルアミノ基、ジブチルアミノ基、ジ−ｔ−ブチルアミノ基、メチルペンチルアミノ基、ジペンチルアミノ基、ジイソペンチルアミノ基、およびジヘキシルアミノ基が含まれ、これらの基のうちで各アルキル基中に１〜４個の炭素原子を有する基が好ましく、ジメチルアミノ基およびジエチルアミノ基が最も好ましい。
【００３５】
置換基Ψまたは置換基ξがアルコキシ基である場合、これは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルコキシ基であってよく、例には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔ−ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、およびイソヘキシルオキシ基が含まれ、これらの基のうちで１〜４個の炭素原子を有する基が好ましく、メトキシ基およびエトキシ基が最も好ましい。
【００３６】
置換基Ψおよび置換基ξが１〜６個の炭素原子を有するアルキルチオ基である場合、アルキル部分は、上記で定義および例示された任意のアルキル基であってよい。このようなアルキルチオ基の好ましい例には、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ−ブチルチオ基、ｔ−ブチルチオ基、ペンチルチオ基、イソペンチルチオ基、ネオペンチルチオ基、ｔ−ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基、およびイソヘキシルチオ基が含まれ、これらの基のうちで１〜４個の炭素原子を有する基が好ましく、メチルチオ基およびエチルチオ基が最も好ましい。
【００３７】
置換基Ψおよび置換基ξがアルコキシカルボニル基である場合、これは、２〜７個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖のアルコキシカルボニル基であってよく、例には、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、ｔ−ペンチルオキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、およびイソヘキシルオキシカルボニル基が含まれ、これらの基のうちで１〜４個の炭素原子を有する基が好ましく、メトキシカルボニル基およびエトキシカルボニル基が最も好ましい。
【００３８】
置換基ξが１〜６個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基である場合、アルキル部分は、上記で定義および例示された任意のアルキル基であってよい。このようなヒドロキシアルキル基の好ましい例には、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基および２−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシプロピル基、および３−ヒドロキシプロピル基、１，２−ジヒドロキシエチル基、１，２，３−トリヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、および６−ヒドロキシヘキシル基が含まれる。
【００３９】
置換基ξが１〜６個、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するハロアルキル基である場合、アルキル部分は、上記で定義および例示されたアルキル部分であってよく、ハロゲン原子は、好ましくは、塩素、フッ素、臭素、またはヨウ素である。このような基の例には、フルオロメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル基、ヨードメチル基、ジクロロメチル基、ジフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリフルオロメチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、２−クロロエチル基、２−フルオロエチル基、２−ブロモエチル基、２−ヨードエチル基、２，２−ジブロモエチル基、２，２，２−トリブロモエチル基、３−フルオロプロピル基、３−クロロプロピル基、４−ブロモブチル基、４−フルオロブチル基、５−フルオロペンチル基、および６−フルオロヘキシル基が含まれる。
【００４０】
化合物が式−ＯＲの基（式中、ＲはＲ１などに関して上記で定義された任意の基および原子である）を含む場合、活性種は遊離水酸基を含む化合物である可能性が高いことが認識される。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで水酸基に変換することができる任意の基を、水酸基の代わりに使用することができる。
【００４１】
本発明で使用することができる化合物の特定の例には、以下のものが含まれる。
【００４２】
【化４】
2005506321.tif 000005
【００４３】
【化５】
2005506321.tif 000006
【００４４】
上記で列挙した化合物のうち、７β異性体が好ましい。
【００４５】
本発明の化合物が水酸基を含む場合、当該技術分野でよく知られているように、化合物を対応する塩またはエステルに変換することができ、生成された塩またはエステルの性質は特に限定されない。これらの塩またはエステルを患者に投与する場合、これらは薬学的に許容可能でなければならない。しかし、化合物がいくつかの他の目的（例えば、別の合成の中間体として）を意図する場合、この制限でさえ必要ない。このタイプの化合物について当該技術分野でよく知られているものから塩およびエステルを選択することができる。好ましいエステルは、カルボン酸エステルおよびアミノ酸エステル（例えば、アラニン、β−アラニン、シスタチオニン、シスチン、グリシン、ヒスチジン、ホモセリン、イソロイシン、ランチオニン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、プロリン、サルコシン、セリン、トレオニン、チロニン、チロシン、バリン、システイン、ホモシステイン、トリプトファン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、およびグルタミンなど）である。
【００４６】
本発明の化合物を、親(parent)ステロイドから開始するそれ自体が既知の種々のプロセスによって調製することができる。例えば、化合物を、７βおよび対応する７α化合物の混合物が得られる上記文献に記載の方法によって調製し、所望ならばその後既知の技術によって分離することができる。しかし、いくつかの環境では、７α異性体と７β異性体との混合物を分離せずに使用することが望ましいか都合がよい。
【００４７】
例として、従来の方法を使用して３β−ヒドロキシ基および１７−ケトン基の保護の後のアリル酸化によってＤＨＥＡから７α−ヒドロキシＥＰＩＡおよび７β−ヒドロキシＥＰＩＡを得ることができる。次いで、生成物を可溶性金属化合物触媒（水素化ナトリウムなど）で還元し、３β−ヒドロキシ基および１７−ケトン基を脱保護する。次いで、７α−ヒドロキシおよび７β−ヒドロキシエピマーを、従来の手段（例えば、カラムクロマトグラフィ）によって分離し、７α−ヒドロキシＥＰＩＡおよび７β−ヒドロキシＥＰＩＡを晶析させて精製することができる。
【００４８】
以下の反応スキームに別の合成方法を示す。
【００４９】
【化６】
2005506321.tif 000007
【００５０】
上記の式では、ＴＢＤＭＳＯは、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシを示し、Ａｃは、アセチルを示す。これらの省略形は、本明細書中以下で用いる場合、同じ意味を有する。
【００５１】
上記の反応スキームの第１の工程では、式（ＩＩＩ）の化合物（エストロン）を、従来の様式でｔ−ブチルジメチルシリルオキシ基によって保護して、式（ＩＶ）の保護化合物を得る。次いで、これを、酸触媒（ｐ−トルエンスルホン酸など）の存在下でエチレングリコールと反応させて、１７位のケト基を保護して、式（Ｖ）の化合物を得る。次いで、実施例３で後述するように、６位に水酸基を導入して式（ＶＩ）の化合物を得て、その後脱水して式（ＶＩＩ）の化合物を得ることができる。これをエポキシ化して式（ＶＩＩＩ）の化合物を得て、７α水酸基を有する式（ＩＸ）の化合物に還元する。ｔ−ブチルジメチルシリル保護基を除去して式（Ｘ）の化合物を得て、これを触媒量の酸と共に加熱して、本発明で使用することができる７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）を得る。次いで、これを、例えば、クロム酸／硫酸を使用して酸化して７−ケト−エストロン（ＸＩＩ）を得て、これを無水酢酸と反応させて式（ＸＩＩＩ）の化合物を得る。この化合物を、例えば、パラジウム触媒の存在下で水素を使用して水素化して式（ＸＩＶ）の化合物を得て、最後にアセチル基を除去して７β−ヒドロキシ−エストロン（ＸＶ）（本発明の化合物）を得る。所望ならば、これを還元して、７β−ヒドロキシ−エストラジオール（ＸＶＩ）（同様に本発明の化合物）を得ることができる。類似の様式で、７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）から対応する７α化合物を調製することができる。
【００５２】
本発明の他の７α−ヒドロキシ−化合物および７β−ヒドロキシ−化合物を、類似の方法で調製することができ、例えば、７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを、以下の反応スキームによって例示されるように調製することができる。
【００５３】
【化７】
2005506321.tif 000008
【００５４】
この反応スキームでは、ＤＨＥＡ（ＸＶＩＩ）をアセチル化して式（ＸＶＩＩＩ）の対応するアセテートを得て、その後エチレングリコールと反応させて式（ＸＩＸ）のケタールを得る。次いで、実施例１６に記載のようにケタール（ＸＩＸ）を酸化させて、対応する７−ケト化合物（ＸＸ）を得て、その後これを脱アセチル化して式（ＸＸＩ）の化合物を得る。これを還元して式（ＸＸＩＩ）の７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡを得て、次いで、酸で処理してケタール基を除去して７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを得て、最後にこれをクロマトグラフィによって７β異性体と７α異性体とに分離して、７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＶ）および７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＶ）を得る。
【００５５】
上記反応スキームの各工程は、それぞれよく知られていおり、既知の溶媒および触媒（適切な場合）ならびに既知の反応条件（例えば、時間および温度条件）を使用して行うことができる。
【００５６】
上記で定義された化合物は、神経保護効果を有する。本発明によれば、本発明者らは、これらの化合物が心臓保護効果も有するので、虚血性障害（例えば、心筋梗塞）に起因する心疾患の予防または治療に使用することができることを見出した。これらの化合物は虚血性腎障害（例えば、糸球体腎炎または急性腎障害）から保護する能力も有する。一般に、示した活性に基づいて、これらの化合物は他の周辺器官の組織に対して類似の保護効果を有することが予想される。
【００５７】
実際、本発明の化合物を使用して、脊髄損傷を治療することもできる。
【００５８】
虚血事象（特に、心筋梗塞または虚血性腎障害）の危険性を有すると疑われる患者に本発明の化合物を適用することができる。このような予防的適用は、非常に有用であり得る。しかし、本発明の化合物は虚血事象後に適用した場合でさえも有用な活性を有することも証明されたが、心筋または腎臓組織の障害をできるだけ回避するために化合物をできる限り早期に投与することが好ましいと認識される。いくつかの状況では、特に患者が依然として虚血事象の危険性がある場合に、反復して薬を投与することが望ましい。
【００５９】
化合物は、脊髄損傷を予想して予防的に投与してもよく、または化合物を使用してこのような損傷が起こった後に治療することができる。
【００６０】
できるだけ所望の結果を達成するための適切な投与方法は、一般に、注射である。したがって、静脈内注射が特に好ましい。
【００６１】
本発明の化合物の用量は、患者の年齢、体重、および全体的な健康状態ならびに投与の様式、頻度、および経路を含む多数の要因に依存して変化する。しかし、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量が一般に推奨され、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の容量がより好ましい。これを、単回用量または分割用量で投与することができる。
【実施例】
【００６２】
本発明を、以下の制限されない実施例によってさらに例示し、実施例１〜２０は本発明の化合物の調製を例示し、実施例２１〜２３はその活性を例示する。実施例１〜２０では、ローマ数字は上記の反応スキーム中の式を指す。
（実施例１）
【００６３】
３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＶ）
４．２５ｇのｔ−ブチルメチルシリルクロリド（２８．２ｍｍｏｌ、３等量）を、１００ｍｌ三口フラスコ中の２．５４ｇのエストロン（ＩＩＩ）（９．４１ｍｍｏｌ、１当量）および３．８４ｇのイミダゾール（５６．５ｍｍｏｌ、６当量）を含む５０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液に添加した。次いで、混合物を、窒素雰囲気下で室温にて一晩静置した。１０％Ｗ／Ｖ炭酸カリウム水溶液を反応媒体に添加し、その後酢酸エチルで抽出した。有機相を水で洗浄し、その後無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾燥させた。３．７６ｇの３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＶ）（９．４１ｍｍｏｌ、１００％）を得た。
（実施例２）
【００６４】
１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（Ｖ）
３ｇの３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＶ）（７．５０ｍｍｏｌ）、３ｍｌのエチレングリコール、および触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む６０ｍｌのトルエン溶液を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を使用して２４時間水蒸気蒸留しながら加熱還流した。次いで、反応媒体を５０ｍｌの１０％Ｗ／Ｖ炭酸カリウム水溶液に注いだ。有機相を別の容器に移した。水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、蒸発乾燥させた。３．１６ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（Ｖ）（７．１２ｍｍｏｌ、９５％）が得られた。
（実施例３）
【００６５】
６α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＶＩ）
１リットルの三口フラスコ中で、１００ｍｌの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を窒素フラッシング(flushing)によって脱気し、−８０℃に冷却した。ジイソプロピルアミン（２０ｍｌ、１４３．３０ｍｍｏｌ）を、反応媒体に添加した。１５％Ｗ／Ｖブチルリチウムのシクロヘキサン（８９．９ｍｌ、１４３．３０ｍｍｏｌ）溶液を、反応媒体に滴下した。１０分後、１７．５ｇのｔ−酪酸カリウムを含む予め脱気した１００ｍｌの無水ＴＨＦを、反応媒体に滴下した。さらに１５分後、１２．２７ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（Ｖ）（２７．６３ｍｍｏｌ）を含む予め脱気した５０ｍｌの無水ＴＨＦを、反応媒体に滴下した。反応混合物を、−８０℃で２時間静置した。その後、−８０℃で４８ｍｌのホウ酸トリメチル（４２９．９０ｍｍｏｌ）を反応媒体に滴下し、０℃で１時間静置した。次いで、１００ｍｌの３０％Ｖ／Ｖ過酸化水素水溶液を添加した。反応混合物を室温で１時間静置し、その後５００ｍｌの水を添加した。反応媒体を、酢酸エチルで抽出した。有機相を１０％Ｗ／Ｖチオ硫酸ナトリウム水溶液で洗浄し、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９、その後２／８）によって精製した。６．３５ｇの６α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＶＩ）（１３．８１ｍｍｏｌ、５０％）が得られた。
（実施例４）
【００６６】
１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６−デヒドロエストロン（ＶＩＩ）
１．５４ｇの６α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＶＩ）（３．３５ｍｍｏｌ）、４ｍｌのエチレングリコール、および触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む４０ｍｌのトルエン溶液を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を使用して２４時間水蒸気蒸留しながら加熱還流した。次いで、反応媒体を５０ｍｌの１０％Ｗ／Ｖ炭酸カリウム水溶液に注いだ。有機相を別の容器に移した。水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、蒸発乾燥させた。１．４８ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６−デヒドロエストロン（ＶＩＩ）（３．３５ｍｍｏｌ、１００％）が得られた。
（実施例５）
【００６７】
１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６α，７α−エポキシエストロン（ＶＩＩＩ）
１．１６ｇのｍ−クロロ安息香酸（５５％、３．６９ｍｍｏｌ、１．１当量）を含む２０ｍｌのジクロロメタン溶液を、０℃で、１．８５ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６−デヒドロエストロン（ＶＩＩ）（３．３６ｍｍｏｌ、１当量）を含む２０ｍｌのジクロロメタン溶液に滴下した。２時間後、反応媒体を、１０％Ｗ／Ｖ炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９）によって精製した。７６９ｍｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６α，７α−エポキシエストロン（ＶＩＩＩ）（１．６８ｍｍｏｌ、５０％）を得た。
（実施例６）
【００６８】
７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＸ）
２００ｍｇの水素化リチウムアルミニウム（５．４０ｍｍｏｌ、２当量）を、１．１３ｇの１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−６α，７α−エポキシエストロン（ＶＩＩＩ）（２．６０ｍｍｏｌ、１当量）を含む５０ｍｌの無水ＴＨＦに添加した。反応媒体を、２時間加熱還流し、その後冷却し、氷中に注ぎ、Ｃｅｌｉｔｅ（商標）濾過助剤によって濾過し、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９）によって精製した。８３７ｍｇの７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＸ）（１．８２ｍｍｏｌ、７０％）を得た。
（実施例７）
【００６９】
７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−エストロン（Ｘ）
１．５ｇのテトラブチルアンモニウムクロリド（４．７８ｍｍｏｌ、１．１０当量）を含む２０ｍｌのＴＨＦ溶液を、室温で、２ｇの７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−３−ｔ−ブチルジメチルシリル−エストロン（ＩＸ）（４．３５ｍｍｏｌ、１当量）を含む５０ｍｌのＴＨＦ溶液に添加した。反応媒体を、７０ｍｌの１０％Ｗ／Ｖ炭酸ナトリウム水溶液に注いだ。反応媒体を、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後蒸発乾燥させた。１．３９ｇの７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−エストロン（Ｘ）（４．２２ｍｍｏｌ、９７％）を得た。
（実施例８）
【００７０】
７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）
１ｍｌの水、１．０ｇの７α−ヒドロキシ−１７−ケタール−エストロン（Ｘ）（３．０３ｍｍｏｌ）、および触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む５０ｍｌのアセトン溶液を、２時間加熱還流した。次いで、反応媒体を、７０ｍｌの１０％重量／容量炭酸ナトリウム水溶液に注いだ。反応媒体を、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後蒸発乾燥させた。酢酸エチルから再結晶させた８１４ｍｇの７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）（２．８５ｍｍｏｌ、９４％）を得た。
（実施例９）
【００７１】
７−ケトエストロン（ＸＩＩ）
８Ｎクロム酸の硫酸溶液を、３００ｍｇの７α−ヒドロキシ−エストロン（ＸＩ）（１．０５ｍｍｏｌ）を含む０℃に冷却した４０ｍｌのアセトン溶液に黄色になるまで滴下し続けた。反応媒体を、５０ｍｌの水に注ぎ、その後酢酸エチルで抽出した。有機相を炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、その後無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン３／７）によって精製した。２００ｍｇの７−ケトエストロン（ＸＩＩ）（０．７０ｍｍｏｌ、６７％）を得た。
（実施例１０）
【００７２】
７−ヒドロキシ−６−デヒドロエストロン３，７−ジアセテート（ＸＩＩＩ）
５ｇの無水酢酸ナトリウムおよび１ｇの７−ケト−エストロン（ＸＩＩ）（３．５２ｍｍｏｌ）を含む１０ｍｌの無水酢酸溶液を、１時間加熱還流した。次いで、反応媒体を冷却し、その後水を注ぎ、ジエチルエーテルで抽出した。有機相を炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、その後無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン １／９）によって精製した。１．２５ｇの７−ヒドロキシ−６−デヒドロエストロン−３，７−ジアセテート（ＸＩＩＩ）（３．４１ｍｍｏｌ、９７％）を得た。
（実施例１１）
【００７３】
７−ヒドロキシエストロン３，７−ジアセテート（ＸＩＶ）
１．０ｇの７−ヒドロキシ−６−デヒドロエストロン−３，７−ジアセテート（ＸＩＩＩ）（２．７２ｍｍｏｌ）を含む８０ｍｌの氷酢酸溶液を、１ｂａｒの水素圧下で２００ｍｇの１０％パラジウム−炭素触媒で水素化した。２時間後に反応媒体を濾過し、蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン１／９）によって精製した。８５５ｍｇの７−ヒドロキシエストロン３，７−ジアセテート（ＸＩＶ）（２．３１ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
（実施例１２）
【００７４】
７β−ヒドロキシエストロン（ＸＶ）
１％の水酸化カリウムおよび１ｇの７−ヒドロキシエストロン−３，７−ジアセテート（ＸＩＶ）（２．７０ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのメタノール溶液を、２時間加熱還流した。反応媒体を冷却し、中和し、その後酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、続いて蒸発乾燥させた。メタノールから再結晶させた６９５ｍｇの７β−ヒドロキシエストロン（ＸＶ）（２．４３ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
（実施例１３）
【００７５】
７β−ヒドロキシエストラジオール（ＸＶＩ）
２６４ｍｇの水素化ホウ素ナトリウム（７．００ｍｍｏｌ、２当量）を、１．０ｇの７β−ヒドロキシエストロン（ＸＶ）（３．５０ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのメタノール溶液に添加した。反応媒体を水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後蒸発乾燥させた。メタノールから再結晶させた９１７ｍｇの７β−ヒドロキシエストラジオール（ＸＶＩ）（３．１８ｍｍｏｌ、９１％）を得た。
（実施例１４）
【００７６】
ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＶＩＩＩ）
５０ｍｌのピリジンおよび１０ｇのＤＨＥＡ（ＸＶＩＩ）（３４．７２ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌの無水酢酸の溶液を、４時間加熱還流した。反応媒体を冷却し、水に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾燥させた。エタノールから再結晶させた１１．０ｇのＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＶＩＩＩ）（３３．３３ｍｍｏｌ、９６％）を得た。
（実施例１５）
【００７７】
１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＩＸ）
５ｇのＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＶＩＩＩ）（１５．１５ｍｍｏｌ）、５ｍｌのエチレングリコール、および触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を含む１００ｍｌのトルエン溶液を、Ｄｅａｎ−Ｓｔａｒｋ装置を使用して２４時間水蒸気蒸留しながら加熱還流した。反応媒体を、１００ｍｌの１０％Ｗ／Ｖ炭酸カリウム水溶液に注いだ。有機相を別の容器に移した。水相を酢酸エチルで抽出した。有機相を合わせ、蒸発乾燥させた。エタノールから再結晶させた５．１０ｇの１７−ケタール−３−ＤＨＥＡ−アセテート（ＸＩＸ）（１３．６４ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
（実施例１６）
【００７８】
７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＸ）
５ｇの１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＩＸ）（１３．３７ｍｍｏｌ）および触媒量のベンガルローズ（Bengal Rose）を含む７０ｍｌのピリジン溶液を、酸素を注入しながら中圧水銀ランプを使用して照射した。２４時間後、反応液に触媒量の酢酸銅を添加した。２４時間後、反応液を蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル：シクロヘキサン３／７）によって精製した。３．１１ｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＸ）（８．０２ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
（実施例１７）
【００７９】
７−ケト−１７−ケタールＤＨＥＡ（ＸＸＩ）
１％水酸化カリウムおよび１ｇの７−ケト−１７−ケタール−ＤＨＥＡ−３−アセテート（ＸＸ）（２．５８ｍｍｏｌ）を含む５０ｍｌのメタノール溶液を、２時間加熱還流した。次いで、反応媒体を冷却し、中和し、次いで、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後蒸発乾燥させた。メタノールから再結晶させた８０２ｍｇの７−ケト−１７−ケタールＤＨＥＡ（ＸＸＩ）（２．３２ｍｍｏｌ、９０％）を得た。
（実施例１８）
【００８０】
７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩ）
１０ｇの７−ケト−１７−ケタールＤＨＥＡ（ＸＸＩ）（２８．９０ｍｍｏｌ）を、２．６５ｇのナトリウムを含む−３３℃の液体アンモニア溶液に添加した。４時間後、青色が消えるまで塩化アンモニウムを添加した。次いで、２．６５ｇのナトリウムを添加した。４時間後、青色が消えるまで塩化アンモニウムを再度添加した。水を添加し、アンモニアを蒸発させた。反応媒体を、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後蒸発乾燥させた。６．０７ｇの７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩ）（１７．３４ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
（実施例１９）
【００８１】
７−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩＩ）
５ｍｌの水、１０ｇの７−ヒドロキシ−１７−ケタール−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＩ）（２８．５７ｍｍｏｌ、５０％）、および触媒量のパラトルエンスルホン酸を含む１００ｍｌのアセトン溶液を、４時間加熱還流した。反応媒体を冷却し、１００ｍｌの１０％重量／容量炭酸ナトリウム水溶液に注ぎ、次いで、酢酸エチルで抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後蒸発乾燥させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィ（ＳｉＯ２／酢酸エチル）によって精製した。５．２４ｇの７−ヒドロキシーＥＰＩＡ（ＸＸＩＩＩ）（１７．１４ｍｍｏｌ、６０％）を得た。
（実施例２０）
【００８２】
７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＶ）および７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＶ）
６５／３５の比率で７αおよび７βのエピマーを含む７−ヒドロキシーＥＰＩＡ（ＸＸＩＩＩ）（５ｇ）を、フラッシュクロマトグラフィ（Ａｌ２Ｏ３／ＣＨＣｌ３）によって精製した。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＶ）（２．５ｇ）が最初に得られ、その後７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＶ）（１．３４ｇ）が得られた。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＶ）および７α−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＸＸＩＶ）を、酢酸エチルから再結晶した。
（実施例２１）
【００８３】
低酸素性神経障害（Hypoxic Neuronal Damage）の研究プロトコール
海馬器官スライス培養物を、以下のように変更したPringle et al.（1996, 1997）の基本的方法を使用して調製した。
【００８４】
幼Ｗｉｓｔａｒラット（８〜１１日齢）を断頭し、海馬を迅速に４．５ｍｇ／ｍｌのグルコースを補足した氷冷ゲイ平衡塩類溶液に切り出した。スライスを分離し、ＭｉｌｌｉｃｅｌｌＣＭ培養インサート（ウェルあたり４つ）にプレーティングし、３７℃／５％ＣＯ２で１４日間維持した。維持培地は、２５％熱不活化ウマ血清、２５％ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、および１ｍＭグルタミンおよび４．５ｍｇ／ｍｌグルコースを補足したＥａｒｌｅ塩を付加した５０％最少基本培地（ＭＥＭ）からなる。３〜４日毎に培地を交換した。
【００８５】
以前に記載のように（Pringle et al., 1996; 1997）低酸素症実験を行った。簡単に述べれば、培養物を、５μｇ／ｍｌの蛍光排除色素（fluorescent exclusion dye）であるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含む無血清培地（１ｍＭグルタミンおよび４．５ｍｇ／ｍｌグルコースを補足したＳＦＭ−７５％ＭＥＭ、２５％ＨＢＳＳ）に移した。画像化の６０分前に、培養物をＳＦＭにて平衡化した。ローダミンフィルターセットを具備したＬｅｉｃａ倒立顕微鏡を使用して、ＰＩ蛍光を検出した。この段階でＰＩ蛍光が検出された任意の培養物を、さらなる研究から排除した。培養物を９５％Ｎ２／５％ＣＯ２で飽和させたＳＦＭ（＋ＰＩ）に移すことによって、低酸素症を誘導した。次いで、１０リットル／分で１０分間ガスを連続的に吹き込み、その後密封してインキュベーターに１７０分間置くことによって（したがって、全低酸素時間は１８０分間であった）、培養プレート（蓋なし）を、９５％Ｎ２／５％ＣＯ２で飽和させた気密チャンバーに密封した。低酸素期間後、培養物をＰＩを含む酸素正常ＳＦＭに戻し、インキュベーターに２４時間戻した。
【００８６】
神経障害を、以前に記載のように（Pringle et al., 1996; 1997）、Ａｐｐｌｅ  ＩＩｓｉコンピュータで動作するＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ１．６０またはＭａｃｉｎｔｏｓｈＧ４／４００で動作するＯｐｅｎＬａｂ２．１（Improvision）のいずれかを使用して評価した。モノクロカメラを使用して画像を取り込み、オフライン解析用の光学ディスクに保存した。薬物添加前に光透過画像を取り込み、２４時間の低酸素後回復期間の終わりにＰＩ蛍光画像を記録した。透過画像からＣＡ１細胞層領域を同定した。ＣＡ１中のＰＩ蛍光領域を、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅまたはＯｐｅｎＬａｂ内の密度スライス機能を使用して測定し、神経障害を、バックグラウンドを超えるＰＩ蛍光が検出されたＣＡ１の割合として示した。
【００８７】
１ｍｇ／ｍｌのエタノール溶液を作製し、さらにＳＦＭでさらに希釈することによって、ステロイド化合物を調製した。低酸素症前、低酸素エピソード中、および低酸素後回復期間中に４５分間、培養物に化合物を添加した。コントロール実験は、賦形剤のみで処置した培養物からなった。
【００８８】
結果
実験１：
７αＯＨ−ＥＰＩＡおよび７βＯＨ−ＥＰＩＡが１００ｎＭの高濃度で神経保護性を示すかどうかを決定するために、最初の実験を行った。低酸素症により、ＣＡ１の２５．５±６．４％が損傷した。低酸素症前、低酸素症中、および低酸素症後に存在する場合、７αＯＨ−ＥＰＩＡおよび７βＯＨ−ＥＰＩＡの両方によってこの障害は有意に減少した（表Ｉを参照）。
【００８９】
【表１】
2005506321.tif 000009
【００９０】
実験２：
７ＯＨ−ＥＰＩＡのα異性体およびβ異性体が神経保護性を示したので、本発明者らは、この効果の濃度依存性を評価した。コントロール低酸素症により、ＣＡ１の３１．９±４．７％の神経障害が生じた。以下の表ＩＩに示すように、７βＯＨ−ＥＰＩＡは、１０ｎＭおよび１００ｎＭで有意な神経保護性を示したが、濃度が１ｎＭに減少すると失活した。
【００９１】
【表２】
2005506321.tif 000010
【００９２】
実験３：
７βＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護活性が認められたので、本発明者らは、次に、７βＯＨ−ＤＨＥＡが神経保護性を示すかどうかを調査した。低酸素症前、低酸素症中、および低酸素症後に、培養物を、１００ｎＭ  ７βＯＨ−ＤＨＥＡまたは賦形剤のいずれかとインキュベートした。低酸素症により、ＣＡ１の２９．０±６．２％に障害が生じた。以下の表ＩＩＩに示すように、７βＯＨ−ＤＨＥＡで処置した培養物は、大規模で非常に有意な神経障害の減少が認められた。
【００９３】
【表３】
2005506321.tif 000011
（実施例２２）
【００９４】
ラットの全脳虚血（４血管の閉塞）
雄Ｗｉｓｔａｒラット（２５０〜２８０ｇ）において、４血管閉塞（４ＶＯ）によって脳虚血を誘導した。ペントバルビタール麻酔（６０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）下での電気焼灼によって、両椎骨動脈を閉塞した。動物に再び２４時間自由に水を与えたが、飼料は与えなかった。翌日、頚動脈を、２％ハロタンを含む３０％酸素／７０％亜酸化窒素麻酔に曝露し、微小血管クランプを使用して１０分間閉塞した。その後、両クランプを除去し、両動脈を即時（immediate）再灌流について調査した。手術中および３時間後、直腸体温計に接続したサーモスタット制御の加熱ブランケットの使用によって動物の正常体温（３７．５±０．５℃）を維持した。コントロールについて、偽手術動物では、両椎骨動脈を、ペントバルビタール麻酔下で焼灼し、翌日に共通の両総頚動脈を２％ハロタンを含む３０％酸素／７０％亜酸化窒素麻酔に曝露したが、クランプしなかった。創傷をリドカインゲルで処置し、縫合した。動物を、意識が回復するまで加熱ランプ下で３０℃の環境温度に維持した。
【００９５】
以下の７つの動物群を調査した。
１．（ｎ＝８）ステロイド化合物７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ（尾静脈を介した０．１ｍｇ／ｋｇ静脈内で３回注射：虚血誘導１５分前、虚血時、および再灌流から５分後）；
２．（ｎ＝８）ステロイド化合物７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ（１．に記載のように０．３ｍｇ／ｋｇ静脈内で３回注射）；
３．（ｎ＝８）ステロイド化合物７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ（１．に記載のように１ｍｇ／ｋｇ静脈内で３回注射）；
４．（ｎ＝８）基準物質としてＮＢＱＸ（２ナトリウム塩、水溶性がより高くなる）および正のコントロール（ＴＯＣＲＩＳ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１．に記載のように３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内で３回注射）；
５．（ｎ＝８）賦形剤の投与（１．に記載のように１００μｌエタノールを含む０．９％ＮａＣｌで３回注射）；
６．（ｎ＝８）虚血のみ；
７．（ｎ＝８）偽手術コントロール。
【００９６】
ＮＢＱＸは２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ（Ｆ）キノキサリンであり、神経保護活性を有することが既知であった（Gill, R., Nordholm, l., Lodge D.「ラット病巣虚血モデルにおける２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイル−ベンゾ（Ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）の神経保護活性」Brain Res, 580, 35-43, 1992）。
【００９７】
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡは、７β−ヒドロキシエピアンドロステロン（本発明の化合物）であった。
【００９８】
この物質を、１００μｌのエタノールに溶解し、最終的に０．９％ＮａＣｌで希釈した。
【００９９】
虚血後の生存日数が７日で、全動物を、４％パラホルムアルデヒドで心臓から灌流して固定した。次いで、慎重に脳を取り出し、同一の固定液で２時間固定した。３０％スクロース中での凍結防止後、脳をイソペンタン中で急速凍結し、−８０℃で保存した。海馬形成を含む２０μｍの低温保持切片を、トルイジンブルーまたはＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ蛍光でＮｉｓｓｌ染色した。
【０１００】
データ分析：
虚血後の海馬ＣＡ１領域中の神経障害の重症度を、Ｎｉｓｓｌ染色を使用した生存ニューロン数によって評価した。各群のＣＡ１領域中の４００μｍ長あたりの形態学的にインタクト(intact)なニューロンの平均数を計算した。２０倍の対物レンズを具備した光学顕微鏡を使用して、動物あたり３〜５個の連続切片および切片あたり６×４００μｍのＣＡ１領域中の細胞を計数した。ペアドスチューデントｔ(paired Student's t) 検定によって、データを統計分析した。データを、平均±ＳＥＭで示した。
【０１０１】
結果と考察
形態学的にインタクトな海馬ＣＡ１ニューロンを、以下の基準を使用してＮｉｓｓｌ染色（トルイジンブルーおよびＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ）によって特徴付けた：明確な形状の神経細胞形質、陽性標識された核小体を有する巨大な核、陽性Ｎｉｓｓｌ染色された核周辺の小さな細胞質領域（リボゾームを有するインタクトな粗面小胞体を示し、それによりインタクトなタンパク質合成機構を示す）。
【０１０２】
１０分の全脳虚血（軽度の虚血）および７日の生存期間により、海馬ＣＡ１領域中の錐体細胞が選択的に神経保護される（図１Ａ〜図１Ｃ）。偽手術動物のＣＡ１中の錐体細胞の平均数は、１２１．５±４．３（１００％として設定）であった。したがって、全脳虚血の１０分後に、６０％のＣＡ１ニューロンが死滅した（図１Ｂ）。虚血および実験に記載のように適用した賦形剤（ＮａＣｌ＋１００μｌエタノール）の静脈内注射の動物群におけるニューロン数は、虚血群のみの数に匹敵した（図１Ａ、図１Ｂ）。ＮＢＱＸ（実験に記載の３０ｍｇ／ｋｇで３回の静脈内注射）は、虚血群と比較してＣＡ１錐体細胞において有意な（ｐ＝０．０３）神経保護を示した。虚血のみと比較して、ＮＢＱＸにより４７．５％が神経保護され、偽手術動物と比較して保護効果は６８．５％であった。ＮＢＱＸに起因する神経保護は、Gill et al., 1992およびGill, 1994と一致し、本発明者らが実験で使用した全脳虚血モデルの有効性が証明された。７β−ＯＨ  ＥＰＩＡにより、１０分間の全脳虚血および７日間の生存期間後に海馬ＣＡ１錐体細胞の濃度依存性神経保護が認められる（図１Ａ）。ｔ検定分析により、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０１）および０．３ｍｇ／ｋｇ（ｐ＝０．０００８）の濃度で７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの非常に有意な神経保護効果が明らかとなった。偽手術群と比較して、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡは、ＣＡ１錐体細胞に対して７４．８％（０．１ｍｇ／ｋｇ）および８３．９％（０．３ｍｇ／ｋｇ）の神経保護効果を示した（図１Ｃ）。１．０ｍｇ／ｋｇの濃度の７β−ＯＨ  ＥＰＩＡは、神経保護効果を示す傾向を唯一示したが、効果は有意ではなかった。
【０１０３】
虚血前、虚血時、および虚血後に７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを静脈内注射した全実験では、動物のいかなる挙動異常も認められなかった。
【０１０４】
図の説明：
ラットの全脳虚血から７日後および異なる化合物の影響下でのラットの形態学的にインタクトな海馬ＣＡ１錐体細胞数。
【０１０５】
図１Ａ：ＣＡ１領域の４００μｍ長あたりのインタクトなニューロンの平均数±ＳＥＭとしてデータを示した。
【０１０６】
図１Ｂ：１００％と設定した偽手術動物と比較したＣＡ１領域の４００μｍ長あたりのインタクトなニューロンの割合としてデータを示した。
【０１０７】
図１Ｃ：虚血群中の生存ニューロン数を０に設定し、偽手術群の生存ニューロン数を１００％に設定した場合の神経保護の絶対％としてデータを示した。
【０１０８】
上記のデータは神経保護を証明するにもかかわらず、最近、Ｃｙｐ７ｂ１（３−ヒドロキシステロイドを７−水酸化してエストラジオール（ＤＨＥＡおよびＥＰＩＡ）をその神経保護誘導体に変換する酵素）が心臓組織および腎臓組織を含む虚血損傷を受けやすい他の組織に存在することが示された。したがって、上記データから、本発明の化合物が虚血損傷から心臓および腎臓組織を保護することを推定することができる。
（実施例２３）
【０１０９】
心臓保護効果
Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆ灌流雄ラットの心臓における７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの潜在的な抗虚血効果および心臓保護効果を試験するように、研究を計画した。このモデルにおける保護の評価のための終点は、梗塞サイズである（致命的損傷、細胞死からの保護）。使用した梗塞サイズモデルは、標準化した虚血傷害およびその後の再灌流に基づく。本研究では、梗塞前に３０分間、３０分間の局所虚血（梗塞）、および１２０分間の再灌流の間ｅｘ  ｖｉｖｏで（単離した心臓の灌流溶液に）治療薬を加えた。予備的研究の結果に基づいて、１００ｎＭの濃度を使用し、賦形剤処置心臓と比較した。薬物をＤＭＳＯ（賦形剤）に溶解し、灌流溶液中の最終ＤＭＳＯ濃度は１：１０−６であった。研究結果は、濃度１００ｎＭの化合物により、虚血危険領域の梗塞サイズが４６．３＋／−２．４９％から１４．４＋／−１．２２％に有意に減少することを示した（ｐ＜０．００１）。薬物添加と組み合わせた心臓機能も試験し、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ添加のみでは検出可能な心臓機能の変化は得られなかった。７β−ＯＨ  ＥＰＩＡで処置した心臓は、局所虚血時の全左心室収縮期圧パラメーターのわずかな減少が認められ（２５分間の局所虚血でｐ＜０．０５）、再灌流後に消滅した。
【０１１０】
本研究により、単離した灌流雄ラット心臓における１００ｎＭの濃度の化合物の心臓保護（抗虚血特性）が確認される。
【０１１１】
動物の処置
動物を、トロムセ大学の動物局（animal department）に収容し、実験およびその他の目的使用の脊椎動物保護に関する欧州条約によって策定されたガイドラインにしたがって処置した。Ｗｉｓｔａｒラットは、Ｈａｒｌａｎｄ（オランダ）から供給され、実験開始前の１週間ラットを動物局に滞在させた。動物の体重を２４０〜３８０ｇに制限し、雄の心臓のみを使用した。これは、６０〜１２０日齢に相当する。実験日に、ラットを動物局から実験室のフィルターキャビネットに移した。次いで、ラットを、ペントバルビタールの腹腔内注射（５０〜７５ｍｇ／ｋｇ）によって麻酔し、２００ＩＵのヘパリンも腹腔内に添加した。
【０１１２】
灌流
心臓を、灌流溶液としてＫｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔｓ重炭酸緩衝液を使用して準備した灌流に迅速に（１〜２分以内）移した。灌流物および心臓を、３７℃に維持した。
【０１１３】
Ｋｒｅｂｓ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔｓ重炭酸緩衝液は、以下からなる。
ＮａＣｌ          １１８．５ｍＭ／リットル
ＮａＨＣＯ３      ２５．０ｍＭ／リットル
ＫＣｌ            ４．７ｍＭ／リットル
ＫＨ２ＰＯ４        １．２ｍＭ／リットル
ＭｇＳＯ４        １．２ｍＭ／リットル
ＣａＣｌ２        ２．４ｍＭ／リットル
グルコース        １１．１ｍＭ／リットル
【０１１４】
緩衝液を、Ｏ２中に約５％のＣＯ２を含む気体混合物で平衡化した。
【０１１５】
灌流圧は、１００ｍｍＨ２Ｏであった。ラテックスバルーンを、ポリビニルチュービングの先端に配置し、圧力変換器に接続し、左心室圧の測定のために左心室の空洞に挿入した。実験中にバルーンサイズは変化させないので、実験準備は、定積左心室調製であった。心臓の右側由来の静脈流出物（effluate）の定期回収物（肺動脈幹および右心房を介した冠状静脈洞）を、冠血流測定に使用した。圧力記録から心拍数を計算した。
【０１１６】
心臓機能についてコンピュータベースのデータの収集および分析を使用した（Ｌａｂ  Ｖｉｅｗベースのソフトウェア）。
【０１１７】
実験プロトコール
安定化期間は２０〜２５分であり、この期間で安定なパフォーマンスに達しない心臓を廃棄した。安定化期間後のＬＶＤＰ（左心室発生圧）が８０ｍｍＨｇと１７５ｍｍＨｇとの間、拡張期血圧が０〜１０ｍｍＨｇの間、冠血流が９〜１８ｍｌ／分の心臓を使用した。
【０１１８】
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを含む１００ｍｌのＤＭＳＯストック溶液を作製し、エッペンドルフチューブ中に等分して２０℃で保存した。この溶液を、実験直前に活性な薬物が１００ｎＭとなるように灌流液でさらに希釈した。梗塞３０分前に７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ（ｎ＝８）または賦形剤（ｎ＝８）での前処理を行い、実験終了まで維持した。
【０１１９】
左冠状動脈の主枝（ｍａｉｎ  ｂｒａｎｃｈ）周囲の絹縫合によって、局所虚血（梗塞）を達成した。ポリビニルチューブの小片の使用によって、可逆的結紮を行った。標準化局所虚血は３０分間継続され、その後心臓を２時間再灌流した。
【０１２０】
梗塞サイズおよび危険領域サイズ
実験の終局に、以下の手順を行った。
１）左冠状動脈を再結紮した。
２）青色色素の懸濁液を、灌流ラインに添加した。色素を使用しない領域として虚血領域を同定した。
３）心臓を迅速に取り出し、秤量および凍結させた。
４）１日後、心臓を、厚さ２ｍｍのスライスに切断し、テトラゾリウムで染色した。心臓スライスを、１％ＴＴＣ（トリフェニル−テトラゾリウム−クロリド）を含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、３７℃で２０分間インキュベートした。梗塞組織は、いかなる呈色反応も示さないが、生きた組織は組織中のデヒドロゲナーゼおよび補因子の存在により紫色を呈する。
５）染色後、心臓を固定のためのホルマリン（４％）に入れた。
６）ＴＴＣ染色は時間とともに消滅し、全心臓スライスをコンピューターでスキャンし、書類作成のためにデジタル画像として保存した。
７）コンピュータベースの面積測定を使用して心室、虚血危険領域、および梗塞の体積を計算した。結果を、虚血危険領域％における梗塞として示す。
【０１２１】
結果
結果を、以下の表１に示す。
【０１２２】
【表４】
2005506321.tif 000012
【０１２３】
結果を、添付の図面の図２〜６にも例示する。
【０１２４】
梗塞：
２群間で有意差が認められ（ｐ＜０．００１）、薬物処置群において梗塞が著しく減少した。コントロール賦形剤処置心臓における梗塞のサイズは、３０分間の局所虚血に供された未処置心臓において通常得られる標準コントロール梗塞に匹敵した。
【０１２５】
心臓機能：
実験期間を通して心臓機能を試験した。この実験モデルにおいて冠状動脈閉塞とともに冠血流の著しい減少が認められ、意図する冠状動脈閉塞が起こったことが確認される。冠血流は、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの添加の影響を受けなかった。２群間で心拍数は有意に異ならず、実験を通して安定であった。局所虚血時に左心室発生圧（ＬＶＤＰ）も減少する。この減少は、コントロールと比較して薬物処置心臓で大きかった。群間のＬＶＤＰの有意差は、２５分の局所虚血で認められた。２群間で拡張期血圧の有意差は認められなかった。
【０１２６】
賦形剤：
賦形剤ＤＭＳＯを、緩衝液灌流心臓における賦形剤として以前に使用されており、結果は、本研究の環境下でこの化合物は単独で検出可能な影響を与えないことを示す。
【０１２７】
結論
本研究により、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの顕著且つ有意な心臓保護効果が証明された。保護範囲は、その重要性において、いくつかの最も強力且つ十分に特徴付けられた心臓保護薬またはＮＨＥ遮断のような、または同一の実験モデルで使用した場合の虚血前提条件の処置的摂生に匹敵する範囲である。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１Ａ】ＣＡ１領域の４００μｍ長あたりのインタクトなニューロンの平均数±ＳＥＭとして示した、実施例２２に関するデータを示す図である。
【図１Ｂ】１００％と設定した偽手術動物と比較したＣＡ１領域の４００μｍ長あたりのインタクトなニューロンの割合として示した、実施例２２のデータを示す。
【図１Ｃ】虚血群中の生存ニューロン数を０に設定し、偽手術群の生存ニューロン数を１００％に設定した場合の神経保護の絶対的割合として示した、実施例２２のデータを示す図である。
【図２】局所性虚血前、局所性虚血中、および局所性虚血後のコントロール賦形剤処置心臓および７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ処置心臓における実施例２３の梗塞サイズを示す図であり、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを２５分で灌流液に添加し、５５分で局所性虚血が誘導され、８５分で虚血領域を再灌流した。
【図３】局所性虚血前、局所性虚血中、および局所性虚血後のコントロール賦形剤処置心臓および７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ処置心臓における実施例２３の冠状動脈の流れを示す図であり、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを２５分で灌流液に添加し、５５分で局所性虚血が誘導され、８５分で虚血領域を再灌流した。
【図４】局所性虚血前、局所性虚血中、および局所性虚血後のコントロール賦形剤処置心臓および７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ処置心臓における実施例２３の心拍数を示す図であり、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを２５分で灌流液に添加し、５５分で局所性虚血が誘導され、８５分で虚血領域を再灌流した。
【図５】局所性虚血前、局所性虚血中、および局所性虚血後のコントロール賦形剤処置心臓および７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ処置心臓における実施例２３の左心室発生圧を示す図であり、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを２５分で灌流液に添加し、５５分で局所性虚血が誘導され、８５分で虚血領域を再灌流した。
【図６】局所性虚血前、局所性虚血中、および局所性虚血後のコントロール賦形剤処置心臓および７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ処置心臓における実施例２３の拡張末期圧を示す図であり、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを２５分で灌流液に添加し、５５分で局所性虚血が誘導され、８５分で虚血領域を再灌流した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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