(57)【要約】  防御抗原（ＰＡ）および致死因子（ＬＦ）を含む抗原性薬学的組成物が提供され、このＰＡおよび／またはＬＦは、機能的結合部位を欠き、それによって、このＰＡおよびＬＦがこの結合部位を介して互いに結合することを防ぐか、または、ＰＡがこの結合部位を介して天然のＰＡ細胞レセプターに結合することを防ぎ、そしてこの組成物は、動物細胞に対して実質的に非毒性である。これは、哺乳動物、好ましくはヒトにおける炭疽菌毒性を予防または最小にするための組成物である。この薬学的組成物の抗原性成分をコードするＤＮＡおよびＲＮＡベースのワクチンも提供される。本明細書はまた、ＰＡ、ＬＦ、またはＥＦの少なくとも１つに結合する抗体も記載し、その結合によって、(i)ＰＡがＬＦもしくはＥＦに、または天然のＰＡ細胞レセプターに結合すること；あるいは(ii)ＬＦがＰＡに結合すること；あるいは(iii)ＥＦがＰＡに結合することを防ぐ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
８３ｋＤａの防御抗原（ＰＡ）および致死因子（ＬＦ）を含む抗原性薬学的組成物であって、ＰＡが、天然のＰＡ細胞レセプターに対する機能的結合部位を欠き、それによって該ＰＡが該天然の細胞レセプターに結合することを防ぎ、および／またはＰＡが、機能的フューリン切断部位を欠き、それによって該ＰＡがフューリンによってインビボ切断されて６３ｋＤａのＰＡを形成することを防ぎ、そして該組成物が動物細胞に対して実質的に非毒性である、組成物。
【請求項２】
前記ＰＡが、天然のＰＡ細胞レセプターに対する前記機能的結合部位を欠き、そして該ＰＡが前記機能的フューリン切断部位を欠く、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、致死毒素（ＬＴ）および浮腫毒素（ＥＴ）活性を実質的に有さない、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ＰＡおよびＬＦのそれぞれが機能的結合部位を欠く、請求項１から３のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項５】
ＰＡがＬＦに対する機能的結合部位を欠き、それによって該ＰＡおよびＬＦが該結合部位を介して互いに結合することを防ぐ、請求項１から４のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項６】
ＬＦがＰＡに対する機能的結合部位を欠き、それによって該ＬＦおよびＰＡが該結合部位を介して互いに結合することを防ぐ、請求項１から５のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、浮腫因子（ＥＦ）をさらに含む、請求項１から６のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＥＦがＰＡに対する機能的結合部位を欠き、それによって該ＥＦおよびＰＡが該結合部位を介して互いに結合することを防ぐ、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＬＦが、天然のＬＦと質量対質量で比較した場合に、少なくとも３０％のメタロプロテアーゼ活性を有する、請求項１から８のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＥＦが、天然のＥＦと質量対質量で比較した場合に、少なくとも３０％のアデニリルシクラーゼ活性を有する、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、Ｓａｐ１および／またはＥＡ１をさらに含む、請求項１から１０のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＰＡおよびＬＦが、それぞれ１から６０μｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１から１１のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、ＰＡおよびＬＦを１：３から３：１の質量比で含む、請求項１から１２のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれかの項に記載の抗原性組成物を調製するための組換え方法であって、
ＰＡをコードする核酸構築物をB. anthracis宿主細胞中で発現させ、そして該発現したＰＡを回収する工程；
ＬＦをコードする核酸構築物をB. anthracis宿主細胞中で発現させ、そして該発現したＬＦを回収する工程；
必要に応じて、ＥＦをコードする核酸構築物をB. anthracis宿主細胞中で発現させ、そして該発現したＥＦを回収する工程；および
該ＰＡ、ＬＦ、および必要に応じてＥＦを組み合わせる工程、
を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれかの項で定義されるＰＡおよびＬＦならびに必要に応じてＥＦをコードする１以上のＤＮＡプラスミドであって、該プラスミドが、該ＰＡ、ＬＦ、および必要に応じて該ＥＦに作動可能に連結しそして使用する場合にその発現を駆動する真核生物プロモーターを含む、プラスミド。
【請求項１６】
請求項１から１３のいずれかの項で定義されるＰＡおよびＬＦならびに必要に応じてＥＦをコードする１以上のＲＮＡベクターであって、該ベクターが、哺乳動物宿主細胞の染色体に対する組込み部位を有する、ベクター。
【請求項１７】
哺乳動物における炭疽菌毒性を実質的に予防または最小にするための医薬品の製造のための、請求項１から１３のいずれかの項に記載の組成物の使用、または請求項１５に記載のＤＮＡプラスミドの使用、または請求項１６に記載のＲＮＡベクターの使用。
【請求項１８】
哺乳動物における炭疽菌毒性を実質的に予防または最小にするための医薬品の製造のための、請求項１から１３のいずれかの項で定義されるＰＡの使用。
【請求項１９】
哺乳動物における炭疽菌毒性を予防または最小にする方法であって、請求項１から１３のいずれかの項に記載の組成物、請求項１５に記載のＤＮＡプラスミド、または請求項１６に記載のＲＮＡベクターを被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項２０】
哺乳動物における炭疽菌毒性を予防または最小にする方法であって、請求項１から１３のいずれかの項で定義されるＰＡを被験体に投与する工程を含み、ここで、該ＰＡが、請求項１から１３のいずれかの項で定義されるＬＦの前に、同時に、または後に投与される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炭疽菌関連毒性に対して防御を提供する抗原性組成物、および該組成物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭疽菌ワクチンは、４０年以上も本出願人によって製造されており、そして1979年以来、the Secretary of State for Healthによって所有されるUK Product Licence（PL1511/0037）の主要製品であった。しかし、その期間内で、製品開発またはその製造工程における進歩はほとんどなかった。
【０００３】
上記のワクチンの調製を、ここでより詳細に記載する。毒素産生で非莢膜形成性のB. anthracis 34F2「Sterne」株［Sterne, M. (1939). Onderstepoort J. of Veterinary Science and Animal Industry, 13, 307-312頁を参照のこと］の培養物を、多数のThompson瓶中の一部定義された５００ｍｌ容量の培地中で選択した培養瓶のｐＨがｐＨ７．４以下に低下するまで３７℃にて増殖させる。
【０００４】
増殖期間の最後に（約２４〜２８時間）、培養物を吸引によって採取し、そしてプールした上清液を濾過により滅菌する。硫酸カリウムアルミニウム溶液を添加し、そして得られた溶液を混合する。次いで、ｐＨを５．８〜６．２に調節し、そして得られた凝集物（「ミョウバン沈殿物」）を、５℃にて１週間以内で重力下に静置する。
【０００５】
次いで、沈殿物を、吸引によって２０倍（容量）に濃縮し、そして生理食塩液で１：４に希釈して、炭疽菌ワクチン沈殿物（ＡＶＰ）の「５倍」濃縮物を提供する。これは、ワクチン処方に使用される抗原性組成物である。ワクチンは、ヒトへの使用の前に効力および安全性についての動物テストに供されるが、別々のルーチンの生化学的特徴付けはない。
【０００６】
１つのさらなる無細胞炭疽菌ワクチンが、ヒトに使用されている。このワクチンは、米国で生産され、そして異なるB. anthracis株が使用されそして嫌気的に増殖させること以外は、PL1511/0037下で利用可能であることが広く類似する。このプロセスは、ファーメンターベースであり、そして培養濾液を、水酸化アルミニウム懸濁液上に吸収させる。
【０００７】
他の利用可能なワクチンは、生きた弱毒化された芽胞懸濁液を含む。しかし、弱毒化した病原体に関連する元来の危険性のため、これらのワクチンは、通常、非ヒトの使用に制限される。
【０００８】
炭疽菌毒素は、防御抗原（ＰＡ）、浮腫因子（ＥＦ）、および致死因子（ＬＦ）として知られる３つの異なるポリペプチドからなる。毒素成分は、特定の２つの組み合わせで作用し、ＰＡとＥＦとの組み合わせは浮腫毒素（ＥＴ）を形成して、組織浮腫を引き起こし、そしてＰＡとＬＦとの組み合わせは致死毒素（ＬＴ）を形成して、実験動物に致死的でありそして単球およびマクロファージ細胞の溶解を引き起こす。致死毒素は、末梢マクロファージおよび他の細胞における細胞傷害効果の結果としての炭疽菌関連死の主な原因であると考えられる。
【０００９】
ＰＡは、ターゲット細胞結合部分として作用し、そして細胞に関連するプロテアーゼによる部位特異的なＮ末端活性化の後、オリゴマー化し、そしてＥＦおよびＬＦが競合する高親和性結合成分を提供する。ＥＦまたはＬＦが活性化したＰＡに結合した後、得られるＥＴまたはＬＴ複合体は、酸性エンドソームコンパートメントによってインターナライズし、そして毒素因子ＥＦおよびＬＦは、それによってターゲット細胞のサイトゾル中に送達される。
【００１０】
ＥＦはカルシウムおよびカルモジュリン依存性アデニリルシクラーゼであり、細胞内ＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を触媒する。ＥＦは、種々の細胞内シグナリング経路で活性であり、そしてそれによってある範囲の細胞プロセスを破壊し得る。
【００１１】
ＬＦは、Ｚｎ２＋依存性メタロプロテアーゼであり、２つの特異性、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼＭＡＰＫＫ／１および２、ＭＥＫ−１およびＭＥＫ−２、ならびにおそらく他のタンパク質を切断しそして不活性化する。
【００１２】
ヒトへの使用についての炭疽菌ワクチンのインビトロまたはインビボの公表されたデータの調査は、以下のことを示す。
【００１３】
１．今日まで、すべての有効な炭疽菌ワクチンは、ＰＡ（すなわち、８３ｋＤａのプロ形態、またはその活性化した６３ｋＤａ誘導体のいずれか）を含むまたは産生する。実際、現在の定説は、ＰＡが、単独で有効な炭疽菌ワクチンを産生するために必要かつ十分であることであり、そしてこのようなワクチンを開発するための努力が行われている［例えば、Baillie, L. (2001), 91, 609-613頁を参照のこと］。
【００１４】
２．莢膜形成していない毒素形成性の生きた芽胞ワクチンは、ライセンスした無細胞ワクチンでこれまで行ったよりも、これまでテストしたすべてのB. anthracis株に対してより高度の防御をもたらす［Little, S.F. (1986) Inf. and Imm., 52巻, 2号, 509-512頁を参照のこと］。
【００１５】
３．現在の無細胞ワクチンは、一般的に、ほとんど定義されておらず、そしてバッチ毎の主成分の効果が著しく異なり得る。したがって、各バッチは、ヒトでの使用の前に動物モデルにおける有効性を個々にテストしなければならない。
【００１６】
４．現在の無細胞炭疽菌ワクチン製造プロセスは、生産プロセスの完了および最終生産物のパッケージングについてのみ評価される。したがって、任意の１バッチのワクチン材料が有効性テスト基準に適合しない事象において、寄与している要因は容易に同定され得ない。このような要因は、製造されたバッチ間で異なり得、そして理解の欠如は、製造プロセスにおいて遭遇した何らかの困難性を悪化させる。
【００１７】
５．現在の無細胞ワクチンのほとんど定義されていない性質の結果として、これらのワクチンは、大量のＰＡをＬＦおよび／またはＥＦとともに含み得、これは、６３ｋＤａ形態へのＰＡのインビボ（またはインビトロ）活性化の際に、ＬＴおよびＥＴを形成しそしてワクチンのレシピエントに有害な効果を発揮し得る。このようなワクチンはまた、もちろん、他のB. anthracisタンパク質、分泌および溶解の両方の生産物、ペプチドグリカン、核酸、および炭水化物を含み得、これらは防御有効性に欠陥を生じさせ得る。
【００１８】
６．現在の無細胞ワクチン組成物は、ＬＦ、ＰＡ、およびＥＦ濃度が大きく変動し、そのためＥＦはいくつかの調製物には含まれ得ない。
【００１９】
７．現在の無細胞組成物は、総タンパク質含量が大きく変動する。したがって、所定の組成物中に存在する毒素成分の濃度は著しく変動し得る。これは、次に、ヒトにおける有効性および潜在的な毒性に影響を及ぼし得る。
【００２０】
この２〜３年にわたり、炭疽菌分野の重要な学術的研究が行われており、この研究は、ＰＡの天然の結合部位およびトランスロケーションドメインの同定を可能にした［Bhatnagas, R. (2001) Critical Rev. in Microbiol., 27(3), 167-200頁；およびBatra, S. (2001) Biochem. and Biophys. Res. Comm., 281, 186-192頁を参照のこと］。したがって、ＰＡの構造および結合／トランスロケーションドメインは、十分に記述されている。
【００２１】
同様に、学術的な研究により、ＬＦの結合および酵素機能ドメインの説明が可能になった［Bragg, T.S. (1989) Gene, 81, 45-54頁；Quinn, C.P. (1991) J. Biol. Chem, 266巻, 30号, 20124-20130頁；Gupta, P. (2001) Biochem. and Biophys. Res. Comm., 280, 158-163頁；およびKlimpel, K.R. (1994) Mol. Microbiol., 13(6), 1093-1100頁を参照のこと］。したがって、ＬＦの構造および結合／酵素機能ドメインは、十分に記述されている。
【００２２】
最近、第二世代「組換え」炭疽菌ワクチンが、The Ohio State University Research Foundationによって提案されている［WO 01/45639；およびPrice, B.M. (2001) Inf. and Immun., 69巻, 7号, 4509-4515頁を参照のこと］。記載されたワクチンは、ＰＡおよびＬＦに基づいており、ここではＬＦ分子は、亜鉛メタロプロテアーゼネガティブであるように改変されている。したがって、記載されているＰＡおよびＬＦ成分は、互いに十分に結合して、ＬＴ分子を形成し得るが、得られたＬＴ分子は、ＬＦ成分とともに存在する亜鉛メタロプロテアーゼの活性な機能がないので、細胞傷害性ではない。
【００２３】
バイオテロリズムおよび生物戦の脅威が増している点で、代替の炭疽菌ワクチン、および上記の１以上の確認された問題に対するワクチンの必要性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
したがって、本発明の第１の局面によれば、ワクチンとして使用するための抗原性組成物が提供され、該組成物は、防御抗原（ＰＡ）および致死因子（ＬＦ）を含み、該ＰＡおよび／またはＬＦは、機能的結合部位を欠き、それによって該ＰＡおよびＬＦが該結合部位を介して互いに結合することを防ぐか、または、該ＰＡが該結合部位を介して天然のＰＡ細胞レセプターに結合することを防ぎ、そして該組成物は、動物細胞に対して実質的に非毒性である。
【００２５】
本明細書全体を通してＰＡとは、ＰＡの８３および６３ｋＤａ形態の両方を包含する。
【００２６】
本発明において、ＰＡは、天然のＰＡが結合する天然のターゲット細胞レセプターに、または天然のＬＦのいずれかに結合できないならば、機能的結合部位を欠く。
【００２７】
天然のＰＡに対する天然のターゲット細胞レセプターは、炭疽菌毒素レセプター（ＡＴＲ）である−Bradley, K.A.ら(2001)を参照のこと。したがって、本発明において、ＰＡは、ＡＴＲに実質的に結合できない。あるいは、本発明において、ＰＡは、単球またはマクロファージ細胞に実質的に結合できないならば、天然のＰＡが結合する天然のターゲット細胞レセプターに結合できない。
【００２８】
任意の特定のＰＡがターゲット細胞上の天然のＰＡレセプターについての機能的結合部位を欠くことを確認するために、実施例１０に概説するような簡単なテストが行われ得る。同様に、任意の特定のＰＡが天然のＬＦに対する機能的結合部位を欠くことを確認するために、実施例１１に概説するような簡単なテストが行われ得る。
【００２９】
本発明において、ＬＦは、天然のＰＡに結合できないならば、機能的結合部位を欠く。任意の特定のＬＦが天然のＰＡに対する機能的結合部位を欠くことを確認するために、実施例１２に概説するような簡単なテストが行われ得る。
【００３０】
用語「非毒性」とは、組成物の成分が、活性な致死毒素（ＬＴ）または活性な浮腫毒素（ＥＴ）のいずれかを実質的に形成し得ないことを意味する。これに関して、活性な毒素は、その天然のターゲット細胞に結合し、ターゲット細胞膜を横切ってトランスロケーションを行い、そして酵素的に活性なＬＦまたはＥＦをそのサイトゾル中に送達し得る毒素である。
【００３１】
使用する場合、組成物は、ＬＴおよびＥＴ活性を実質的に有さない。
【００３２】
組成物のＬＴ成分が、多くとも２０％、好ましくは多くとも１０％、より好ましくは多くとも５％の実質的に純粋な天然のＬＴの活性（質量ベースに対する質量で）を有するならば、組成物は、実質的に非毒性でありそしてＬＴ活性を実質的に有さないと見なされ得る。これは、例えば、それぞれのＬＤ５０値を比較することによって、またはそれぞれの細胞溶解（例えば、マクロファージ溶解）活性を比較することによって、決定され得る。後者は、実施例９に記載されるアッセイに基づいて評価され得る。
【００３３】
組成物のＥＴ成分が、多くとも２０％、好ましくは多くとも１０％、より好ましくは多くとも５％の実質的に純粋な天然のＥＴの活性（質量ベースに対する質量で）を有するならば、組成物は、実質的に非毒性でありそしてＥＴ活性を実質的に有さないと見なされ得る。これは、例えば、ＥＴに関連するそれぞれの組織浮腫発生活性を視覚的に比較することによって、決定され得る。
【００３４】
あるいは、それぞれのＥＴ活性は、それぞれの細胞内アデニルシクラーゼ活性を比較することによって評価され得る。これは、実施例８に記載されるアッセイに基づいて評価され得る。
【００３５】
本発明の好適な実施態様によれば、抗原性組成物は、第３の成分である浮腫因子（ＥＦ）を含み得る。本発明のＥＦは、好ましくは、機能的結合部位を欠き、それによってＥＦが天然のＰＡに結合することを防ぐ。任意の特定のＥＦが天然のＰＡに対する機能的結合部位を欠くことを確認するために、実施例１３に概説するような簡単なテストが行われ得る。
【００３６】
機能的結合部位を欠く本発明のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦ成分は、従来の技法によって天然のＰＡ、ＬＦ、またはＥＦを（それぞれ）改変することによってそれぞれ調製され得る。これに関して、機能的結合部位を欠く成分を提供するための改変は、核酸レベルまたはタンパク質レベルのいずれかで行われ得る。天然のＰＡ、ＬＦ、またはＥＦの構造的改変が好ましい。
【００３７】
例えば、１以上の天然のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦは、問題の天然の結合部位を不活性化するように、例えば、トキソイド化することによって、従来の化学的または生物学的改変に供せられ得る。また、タンパク質レベルでは、不可逆的に結合しそれによって問題の結合部位を不活性化する合成ペプチドが用いられ得る。
【００３８】
あるいは、結合部位不活性化は、従来の非特異的突然変異誘発によって、または、天然のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦをコードする核酸の従来の部位特異的突然変異誘発によって、核酸レベルで行われ得る。適切な不活性化は、結合部位配列をコードする核酸配列内で、または、得られるペプチドにおいて問題の結合部位におけるコンホメーション変化を与えそれによってその結合部位が機能不全になる隣接する部位内で、１以上の欠失、挿入、または置換によって行われ得る。
【００３９】
上記のタンパク質レベルおよび核酸レベルの改変は、本明細書において後でより詳細に記載される。
【００４０】
好適な実施態様では、ＰＡ（すなわち、ＬＦまたはＥＦよりもむしろ）は、機能的結合ドメインを欠き、ＰＡがＬＦまたはＥＦのいずれかに、あるいはその天然のターゲット細胞結合部位に結合することを実質的に防ぐ。必要に応じて、ＰＡは、その天然のトランスロケーション機能を減少させるまたは実質的に不活性化するために、さらに改変され得る。あるいは、本発明の別の局面では、ＰＡは、ワクチンに用いられ得、ここでＰＡは、不活性なトランスロケーションドメインを有するが、天然の（すなわち、機能的な）結合ドメインを有し得る。
【００４１】
主な不活性成分としてのＰＡの不活性化に関連する利点は、本発明の抗原性組成物が、天然の（すなわち、活性な）ＬＦを、およびＥＦが存在するならば天然の（すなわち、活性な）ＥＦを含み得ることである。これは、天然のＰＡが活性なＬＴおよび活性なＥＴの両方の形成に必要とされるので、可能である。このような成分が、天然の毒素に関連する同じエピトープを有し、そのため強力な抗原性応答を誘起するので、天然の毒素成分の使用は好ましいことであり得る。
【００４２】
ＬＦ、および（存在するならば）ＥＦは、それぞれ機能的結合部位を欠き、これらは本発明の抗原性組成物に用いられ得る。このような結合部位の欠損したＬＦおよびＥＦは、該結合部位を介して天然のＰＡに結合できない。
【００４３】
１つの実施態様では、ＬＦおよび／またはＥＦの天然の酵素活性機能は、実質的に不活性化され得る。したがって、この実施態様では、本発明のＬＦおよび／またはＥＦは、天然のＬＦおよびＥＦと比較した場合（質量対質量）、それぞれ多くとも５０％、好ましくは多くとも２５％の酵素活性を有する。
【００４４】
しかし、好ましい実施態様では、ＬＦおよび／またはＥＦの天然の酵素活性機能は、実質的に保持される。したがって、本発明のＬＦは、天然のＬＦと比較した場合（質量対質量）、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％のメタロプロテアーゼ活性を保持する。同様に、本発明のＥＦは、天然のＥＦと比較した場合（質量対質量）、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％のアデニリルシクラーゼ活性を保持する。
【００４５】
本発明の種々の成分は、好ましくは組換え手段によって調製され、それによって注意深く規定された組成物の供給が可能になる。これは、現在の無細胞炭疽菌ワクチンシステムでは可能ではない。
【００４６】
上で詳述したように、本発明の１以上のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦ分子は、機能的結合部位を欠く。これは、問題の結合部位へまたはその近くへの構造的改変の導入によって達成され得る。例えば、分子（例えば、アルキル基、または他の立体障害分子）は、結合部位にまたはその近くに導入されて、結合部位が機能不全になり得る。同じ効果は、結合部位内またはその近くで電荷環境を変更する荷電分子の導入によって達成され得る。あるいは、結合部位全体が欠失され得るか、または特定のアミノ酸残基が、問題の結合部位またはその近くで欠失、置換、または挿入され得る。しかし、本発明のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦ分子が、最適な免疫応答を誘起することが好ましく、したがって、結合部位不活性化のプロセスが、結合部位ドメインの外側に（すなわち、結合部位から離れて）最小の３−Ｄコンホメーション変化を導入することが所望される。
【００４７】
結合部位不活性化は、ＤＮＡまたはタンパク質レベルで行われ得る。後者の場合、適切な化学または生物学的改変剤として、アルキル化剤；リン酸化剤；一般的な酸化または還元剤；ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドなどのアルデヒド類；および過酸化水素などの過酸化物発生剤が挙げられ得る。実施例に記載される改変剤のいずれかが、１以上のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦを化学的または生物学的に改変するために使用され得る。
【００４８】
タンパク質レベルで結合部位不活性化を行う場合、結合部位に関連のない位置での所望されない３−Ｄコンホメーション変化を避けることが好ましい。したがって、好適な実施態様では、改変剤（例えば、ホルムアルデヒド）は、一般的に、約２００μｇタンパク質／ｍｌの組成物に対して、約０．１〜５、好ましくは０．２〜１、代表的には０．５％(v/v)の最終濃度で適用される。次いで、改変プロセス（トキソイド化としても知られる）は、例えば、３７℃で５〜２０時間、好ましくは１〜１０時間、より好ましくは１〜５時間、時々振盪しながら行われる。
【００４９】
あるいは、結合部位不活性化は、核酸レベルで行われ得る。例えば、組成物の個々の成分は、組換えによって調製され得、そのプロセス中に、改変が１以上の組換え産物に導入され得る。このような改変は、本発明の成分が活性なＬＴまたはＥＴを形成する能力を実質的に減少させる。
【００５０】
抗原性組成物の１つの成分（特にＰＡ）の結合部位不活性化が好ましい。しかし、組成物の２以上の成分は、機能的結合部位を欠くように不活性化され得る。
【００５１】
したがって、１つの実施態様では、この組成物は、ＬＦまたはＥＦに結合できないＰＡを含む。これは、例えば、天然のＰＡに関連するフューリン切断部位を不活性化し、それによって第１の場所におけるＰＡ上のＬＦまたはＥＦ結合部位の曝露を防ぐことによって、あるいはＰＡ上の曝露されたＬＦまたはＥＦ結合部位を不活性化することによって達成され得る。
【００５２】
したがって、１つの実施態様では、機能的フューリン切断部位（すなわち、アミノ酸残基１６３〜１６８）が不活性化される。フューリンは、インビボで天然のＰＡ（すなわち、８３ｋＤａ形態）をタンパク質分解切断によって６３ｋＤａ形態に活性化する酵素であり、そしてこのようにＬＦおよびＥＦが競合する特異的結合部位を曝露することによってＬＴおよびＥＴをそれぞれ形成する。
【００５３】
フューリン切断部位内またはその近くの単一のアミノ酸残基変化（すなわち、欠失、挿入、または置換）は、フューリン切断の効果を低下させ得、そしてそのためＰＡを実質的に不活性化する。好適な実施態様では、２以上のアミノ酸残基が切断部位内で変化され、そして特に好適な実施態様では、ＰＡはフューリン切断部位全体を欠く（すなわち、天然のＰＡの残基１６３〜１６８のすべてがない）。他の実施態様では、１以上のアミノ酸残基、または短いペプチド配列が、フューリン切断部位に挿入され得る。任意のこのような短いペプチド配列は、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０、最も好ましくは１〜５アミノ酸残基長である。
【００５４】
関連する実施態様では、天然のターゲット細胞に対する機能的結合部位を欠くＰＡが用いられる（例えば、改変は、アミノ酸残基３１５〜７３５内またはその近く、好ましくはドメイン４の残基５９６〜７３５内またはその近くで行われる）。
【００５５】
したがって、ＰＡ結合部位（例えば、アミノ酸残基３１５〜７３５）内またはその近くの変化（すなわち、アミノ酸欠失、置換、または挿入）は、その天然のターゲット細胞レセプターに対するＰＡの結合効率を低下させ得、そのためＰＡを実質的に不活性化する。ＰＡのフューリン切断部位不活性化について上述のように、２以上のアミノ酸残基が、変化（すなわち、欠失、置換、または挿入）され得、これは、天然のターゲット細胞レセプターに対するＰＡ結合部位全体の欠失を含み、あるいは、ペプチド配列は、結合部位に挿入され得る。
【００５６】
さらなる実施態様では、または本発明の別の局面では、機能的トランスロケーションドメインを欠くＰＡが用いられる。
【００５７】
さらに、または不活性なＰＡの代替として、本発明の組成物は、好ましくは不活性なＬＦを含む。
【００５８】
１つの実施態様では、ＰＡに対する機能的結合部位を欠くＬＦが用いられる（例えば、改変は、ＬＦのＮ末端ドメイン内またはその近くで、好ましくはアミノ酸残基１〜２５５内またはその近くで行われる）。
【００５９】
さらなる実施態様では、機能的エンドペプチダーゼ活性または亜鉛結合部位を欠くＬＦが用いられる（例えば、改変は、ＬＦのＣ末端ドメイン内またはその近くで、好ましくは天然の配列「ＨＥＦＧＨＡＶ」に対応する残基６８６〜６９２内またはその近くで行われる）。
【００６０】
ＬＦエンドペプチダーゼ活性のレベルは、本出願人によって開発された簡単なアッセイによって評価され得る（実施例７を参照のこと）。これに関して、好ましい酵素活性不活性化は、エンドペプチダーゼ活性が、多くとも４０％、好ましくは２０％、より好ましくは１０％の天然のＬＦ活性まで低下されている場合に達成される。
【００６１】
本発明の組成物はまた、不活性なＥＦを含み得る。
【００６２】
１つの実施態様では、ＰＡに対する機能的結合部位を欠くＥＦが用いられる（例えば、改変は、ＥＦのＮ末端ドメイン内またはその近くで、好ましくはアミノ酸残基１〜２５０内またはその近くで行われる）。
【００６３】
さらなる実施態様では、または結合部位欠失実施態様の他に、アデニリルシクラーゼ活性がないＥＦが用いられる（例えば、改変は、残基３１４〜３２１によって占められるＡＴＰ結合部位内またはその近くで、および／または残基６１３〜７６７によって占められるカルモジュリン結合部位内またはその近くで行われる）。
【００６４】
ＥＦアデニルシクラーゼ活性のレベルは、実施例８に記載のようなＥＦアデニルシクラーゼ活性アッセイによって評価され得る。これに関して、好ましい不活性化は、エンドペプチダーゼ活性が、多くとも４０％、好ましくは２０％、より好ましくは１０％の天然のＥＦ活性まで低下されている場合に達成される。
【００６５】
本発明の別の局面によれば、不活性なＥＦは、ワクチン主成分として、必要に応じてＰＡおよび／またはＬＦとともに用いられ得る。ＥＦは、アデニリルシクラーゼ活性に関して不活性であり、および／またはＰＡに対する不活性な結合部位を有する。ＰＡおよび／またはＬＦ成分は、既に詳述したように機能的結合部位を欠き得、そしてＳａｐおよび／またはＥＡ１のような他の抗原を伴い得る。
【００６６】
本発明のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦ成分を結合部位機能に関して機能不全にするためのさらなる手段は、１以上のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦにおける結合部位を不活性化するインヒビターを含むことである。
【００６７】
１つの実施態様では、インヒビターは、天然のターゲット細胞に対する、またはＬＦもしくはＥＦに対する、ＰＡ上の結合部位を模倣する。あるいは、インヒビターは、ＰＡ上のフューリン切断部位に結合し得る。したがって、インヒビターがＰＡに結合した後、天然のターゲット細胞レセプターを結合する、またはＬＦもしくはＥＦに結合する、またはＬＦもしくはＥＦをトランスロケートする、ＰＡの能力は、実質的に低下または阻害され、それによってＰＡは不活性になる。インヒビターは、好ましくは、ＰＡに不可逆的に結合する。１つの実施態様では、インヒビターは、モチーフ「ＹＷＷＬ」を有する短いペプチドである。好ましい実施態様は、「ＨＴＳＴＹＷＷＬＤＧＡＰ」および「ＨＱＬＰＱＹＷＷＬＳＰＧ」を含む。
【００６８】
他の実施態様では、インヒビターは、ＰＡに対するＬＦまたはＥＦのいずれかの結合部位を模倣する。したがって、インヒビターがＬＦまたはＥＦに結合した後、ＰＡに結合するＬＦまたはＥＦの能力は実質的に低下または阻害され、それによってＬＦまたはＥＦは不活性になる。インヒビターは、好ましくはＬＦまたはＥＦに不可逆的に結合する。1つの実施態様では、インヒビターは、ＬＦまたはＥＦ上の活性部位と結合し、あるいはＬＦまたはＥＦへの補因子（例えば、亜鉛、ＡＴＰ、カルシウム、および／またはカルモジュリン）の結合を除去／防止する。
【００６９】
本発明の組成物は、さらなる抗原性成分、好ましくは１以上のＳ−層タンパク質を含み得る。
【００７０】
最も特徴的なB. anthracisの菌体抗原は、Ｓ−層タンパク質であり、Ｓａｐ（例えば、Ｓａｐ１）およびＥＡ１［Farchausら, (1995) J. Bacteriology, 177, 2481-2489頁；およびMesnageら (1997) Molec. Microbiol. 23, 1147-1155頁を参照のこと］がある。
【００７１】
B. anthracisのＳ−層タンパク質に関連する生物学的機能は、現在のところ明らかではない。タンパク質配列レベルでは、それらのＮ末端領域は、６６％までの同一性を示す。逆に、それらのＣ末端領域は、同一性または類似性がほとんどない。
【００７２】
ＳａｐおよびＥＡ１の両方とも細胞と会合するが、ＥＡ１は、主要細胞会合抗原を構成する。
【００７３】
Ｓａｐタンパク質は、インビトロで増殖中にB. anthracis「Sterne」派生株によって高レベルで産生される。B. anthracis「Sterne」派生株を用いて提示される動物からの抗血清は、明らかにＥＡ１を認識するが、Ｓ−層タンパク質を含む細胞抽出物は、ビルレントB. anthracis株でのチャレンジに対して防御を提供しないことが報告されている。
【００７４】
本発明の組成物における抗原の起源およびソースは、好ましくは天然の宿主（すなわち、B. anthracis）である。これは、異なる宿主における抗原の産生は、翻訳適合度および正確な翻訳後改変が変化することによってタンパク質コンホメーションの変動を生じ得るからである。このような変化は、これらの抗原の抗原性または免疫原性の変更を生じ得る。
【００７５】
しかし、ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦが株毎に変動する点で、本発明の好ましい実施態様は、種々のコンホメーションまたはエピトープを有する多価のＰＡ、ＬＦ、および必要に応じてＥＦを用いる。全長の保存された抗原の他に、免疫原性破壊産物の存在が好適であり得る。
【００７６】
本発明の第２の局面によれば、防御抗原（ＰＡ）および致死因子（ＬＦ）を含む組成物が提供され、ここでＰＡおよびＬＦは、それぞれ１〜６０μｇ／ｍｌ、好ましくは２〜４０μｇ／ｍｌ、より好ましくは２〜２０μｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００７７】
好適な実施態様では、ＰＡおよびＬＦのそれぞれの最小濃度は、２μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌ、より好ましくは１０μｇ／ｍｌである。
【００７８】
１つの実施態様では、組成物は、ＰＡおよびＬＦを、１：３〜３：１、好ましくは１：２〜２：１、より好ましくは１：１．５〜１．５：１の質量比で含む。
【００７９】
組成物成分は、天然のB. anthracisの培養物から直接的に、または適切な量の組換え抗原を混合することによって、得られ得る。
【００８０】
存在するならば浮腫因子（ＥＦ）とともに（示した比および／または濃度の）上記の成分は、本発明の第１の局面について上述したように、機能的結合部位をそれぞれ欠き得る。
【００８１】
本発明の第３の局面によれば、組成物の調製方法が提供され、この方法は、
少なくとも１０ｍＭのグルコースを含む培地中でB. anthracis細菌を培養する工程；
グルコース濃度が１ｍＭまで、好ましくは０．５ｍＭまで、より好ましくは０．１ｍＭまでの濃度に低下した時点で細菌を採取する工程；
可溶性または懸濁したタンパク質を沈殿させる化合物を添加して、それによって培養沈殿物を形成する工程；および
防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）、および必要に応じて浮腫因子（ＥＦ）を含む沈殿物を回収する工程、を含む。
【００８２】
可溶性または懸濁したタンパク質を沈殿させる化合物は、好ましくは硫酸カリウムアルミニウムである。
【００８３】
存在するならば浮腫因子（ＥＦ）とともに上記成分は、本発明の第１の局面について上述したように、機能的結合部位をそれぞれ欠き得る。
【００８４】
第３の局面の方法は、本発明の第２の局面で定義したような成分濃度を有する組成物を調製するために用いられ得る。
【００８５】
本発明の第４の局面は、抗原性組成物を調製するための組換え方法を提供し、この方法は、
防御抗原（ＰＡ）をコードする核酸構築物をB. anthracis宿主細胞中で発現させ、そして発現したＰＡを回収する工程；
致死因子（ＬＦ）をコードする核酸構築物をB. anthracis宿主細胞中で発現させ、そして発現したＬＦを回収する工程；
必要に応じて、浮腫因子（ＥＦ）をコードする核酸構築物をB. anthracis宿主細胞中で発現させ、そして発現したＥＦを回収する工程；および
ＰＡ、ＬＦ、および必要に応じてＥＦを組み合わせる工程、
を含み、ここで、ＰＡおよび／またはＬＦは、機能的結合部位を欠く。
【００８６】
Ｓａｐ１および／またはＥＡ１は、同様に調製され、そして抗原性組成物に添加され得る。
【００８７】
好ましくは、ＰＡは、機能的結合部位を欠く。あるいは、ＰＡは、ＬＦ（および必要に応じてＥＦ）とともに、それぞれ機能的結合部位を欠く。
【００８８】
好適な実施態様では、第２の局面で上述した濃度および必要に応じて比で、成分が存在する。
【００８９】
組換え体の性質、および結合部位改変の点で、抗原性組成物の成分のコンホメーションは、感染している株の天然のＰＡ、ＬＦ、およびＥＦとはわずかに異なり得る。これは、ある範囲の感染している株に対して改良された抗原性を提供し得る。
【００９０】
本発明の第５の局面によれば、ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦの少なくとも１つに結合する抗体が提供され、そしてこれが結合した場合、ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦは（それぞれ）機能的結合部位を欠く。本発明の抗体の局面は、好ましくは感染後に用いられる。
【００９１】
抗体は、好ましくは、問題の結合部位に特異性を有する。
【００９２】
１つの実施態様では、２以上のこの抗体を含む組成物が提供され、これらの抗体は、ＰＡ、ＬＦ、またはＥＦから選択される種々の分子に結合する。Ｓａｐ１またはＥＡ１に結合する抗体も含まれ得る。
【００９３】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）に免疫原性ポリペプチドを免疫する。免疫した動物からの血清を収集し、そして公知の手順に従って処理する。所望のエピトープに対するポリクローナル抗体を含む血清が、他の抗原に対する抗体を含む場合、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。
【００９４】
あるいは、例えば、細胞融合による不死化抗体産生細胞株の調製、または癌原性ＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換、もしくはエプスタイン−バーウイルスでのトランスフェクションなどの他の技法を含む、ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作成のための一般的な方法論が用いられ得る。
【００９５】
本発明のこの局面で用いられる抗体は、任意の抗体イソタイプファミリーに属し得、またはその誘導体または模倣物であり得る。本明細書全体を通して抗体というときは、組換え産生された抗体、および問題の炭疽菌抗原に結合し得る抗体の一部を包含する。
【００９６】
１つの実施態様では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡイソタイプファミリーに属する。
【００９７】
他の実施態様では、抗体は、ＩｇＡイソタイプファミリーに属する。本明細書全体を通してＩｇＡイソタイプというときは、この抗体の分泌形態（すなわち、ｓＩｇＡ）を包含する。ｓＩｇＡの分泌コンポーネント（ＳＣ）は、インビトロまたはインビボで付加され得る。後者の場合、ヒトの天然のＳＣ標識機構の使用が用いられ得る。
【００９８】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であり得るが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００９９】
本発明の第６の局面によれば、ＰＡまたはＬＦをコードするＤＮＡプラスミドが提供され、このＰＡまたはＬＦは、機能的結合部位を欠き、それによってＰＡおよびＬＦがこの結合部位を介して互いに結合することを防ぎ、またはそれによってＰＡがこの結合部位を介して天然のＰＡ細胞レセプターに結合することを防ぎ、そしてここで、このプラスミドは、ＰＡまたはＬＦに作動可能に連結しそしてそれぞれＰＡまたはＬＦの発現を駆動する真核生物プロモーターを含む。したがって、ＤＮＡプラスミドは、ＤＮＡワクチンとして用いられ得、そしてポリアデニル化シグナルを含み得る。
【０１００】
本発明の代替の局面によれば、ＥＦをコードするＤＮＡプラスミドが提供され、このＥＦは、機能的結合部位を欠き、それによってＥＦがＰＡに結合することを防ぎ、またはこのＥＦはアデニリルシクラーゼ活性が実質的になく、そして、このプラスミドは、ＥＦに作動可能に連結しそしてＥＦの発現を駆動する真核生物プロモーターを含む。
【０１０１】
本発明のＤＮＡプラスミド局面の１つの実施態様では、上記のＰＡ、ＬＦ、またはＥＦの２以上、および必要に応じてＳａｐ１および／またはＥＡ１をコードしそして発現を可能にする１または複数のプラスミドが提供される。
【０１０２】
本発明のＤＮＡプラスミドは、好ましくは、ワクチンとして投与される。
【０１０３】
関連の局面では、本発明は、上記ＰＡ、ＬＦ、またはＥＦ、Ｓａｐ１の少なくとも１つをコードするＲＮＡ分子を提供する。
【０１０４】
本発明のＲＮＡ分子局面の１つの実施態様では、上記のＰＡ、ＬＦ、またはＥＦの２以上、および必要に応じてＳａｐ１および／またはＥＡ１をコードしそして発現を可能にする２以上のＲＮＡ分子が提供される。
【０１０５】
ＲＮＡ分子は、ワクチンとして、動物、好ましくはヒトに直接導入され得るか、または投与前にＲＮＡベクターに組み込まれ得る。
【０１０６】
本発明の第７の局面は、炭疽菌中毒を実質的に予防するための医薬品の製造における、本明細書に定義された抗原性組成物、抗体、および／またはＤＮＡまたはＲＮＡ含有組成物の使用を提供する。
【０１０７】
本明細書に記載される種々の抗原性組成物は、ワクチンとしての使用が意図される。
【０１０８】
ワクチン成分（例えば、ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦ）は、他の成分の前に、または他の成分と同時に、または他の成分の後に投与され得る。
【０１０９】
ワクチンは、従来の経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、および粘膜経路によって投与され得る。
【０１１０】
代表的には、このようなワクチンは、溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能薬物として調製され；注射前に溶液または懸濁液とするのに適切な固体形態も調製され得る。調製物はまた、乳化され得、あるいはペプチドはリポソームまたはマイクロカプセル中にカプセル化される。
【０１１１】
活性な免疫原性成分は、しばしば、薬学的に受容可能でありそして活性成分と適合可能な賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩液、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効果を増強するアジュバントなどの少量の補助物質を含み得る。効果的であり得るアジュバントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰという）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥという）、およびＲＩＢＩ（これは、２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルジョン中に、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含む）。
【０１１２】
ワクチンは、従来どおり、注射によって、例えば、皮下または筋肉内のいずれかに、非経口投与される。
【０１１３】
ワクチンは、投与処方物と適合可能な様式で、および予防的および／または治療的に有効な量で投与される。投与されるべき量は、一般的には、用量あたり５μｇから２５０μｇ抗原の範囲であるが、治療されるべき被験体、被験体の免疫系が抗体を合成する能力、および所望の防御の程度に依存する。投与に必要とされる活性成分の正確な量は、主治医の判断に依存し、そして各被験体に特有であり得る。
【０１１４】
ワクチンは、単回投与スケジュールで、または必要に応じて多回投与スケジュールで投与され得る。多回投与スケジュールは、ワクチン接種の初回のコースが１〜６の別々の投与量であり得、次いで免疫応答を維持およびまたは再強化するために必要なその後の時間間隔で他の投与が行われ、例えば、２回目の投与については１〜４カ月目であり、必要ならば、数カ月後にその後の１または複数回の投与が行われる。投与方法はまた、少なくとも一部は、個体の必要性によって決定され、そして主治医の判断に依存する。
【０１１５】
さらに、１または複数の免疫原性抗原を含むワクチンは、他の免疫調節剤（例えば、免疫グロブリン）および抗生物質とともに投与され得る。
【０１１６】
投与の他の態様に適切なさらなる処方物として、マイクロカプセル、坐剤、およびある場合には、経口処方物、またはエアロゾルとしての分布に適切な処方物が挙げられる。坐剤については、伝統的な結合剤およびキャリアとして、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得；このような坐剤は、０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成され得る。
【０１１７】
経口処方物は、例えば、医薬品用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤を含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、または粉剤の形態をとり、そして１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。
【０１１８】
１つの実施態様では、医薬品は、鼻内（i.n.）に投与され得る。鼻内組成物は、容量では、液滴は、０．００１〜１００μｌのおおよその範囲の液滴のサイズを有する、１００〜５０００μｍの範囲のおおよその直径を有する液滴形態で投与され得る。
【０１１９】
鼻内投与は、鼻液滴を塗布することによって、または鼻噴霧によって達成され得る。鼻液滴の場合、液滴は、代表的には、約１０００〜３０００μｍの直径および／または１〜２５μｌの容量を有し得るが、鼻噴霧の場合、液滴は、代表的には、約１００〜１０００μｍの直径および／または０．００１〜１μｌの容量を有し得る。
【０１２０】
抗体のi.n.送達後、肺への通過は、粘膜分泌の逆流によって容易にし得ることが可能である。
【０１２１】
異なる実施態様では、医薬品は、エアロゾル処方物で送達され得る。エアロゾル処方物は、粉剤、懸濁剤、または液剤の形態をとり得る。
【０１２２】
エアロゾル粒子のサイズは、エアロゾルの送達能力に関連する１つの因子である。したがって、より小さい粒子は、より大きな粒子よりも、肺胞に向かって気道をさらに下方へ移動し得る。１つの実施態様では、エアロゾル粒子は、気管支、細気管支、および肺胞の全長に沿った送達を容易にするための直径分布を有する。あるいは、粒子サイズ分布は、気道の特定の部分、例えば、肺胞をターゲティングするために選択され得る。
【０１２３】
エアロゾル粒子は、噴霧吸入器または鼻噴霧によって送達され得る。
【０１２４】
医薬品のエアロゾル送達の場合、粒子は、０．１〜５０μｍ、好ましくは１〜５μｍのおおよその範囲の直径を有し得る。
【０１２５】
本発明の医薬品のエアロゾル処方物は、必要に応じて、噴射剤および／または界面活性剤を含み得る。
【０１２６】
患者に投与されるべき液滴のサイズを本発明の所定の範囲内に制御することによって、肺胞への不用意な抗原送達を回避／最小化し、したがって、肺の炎症および線維形成瘢痕化のような肺胞に関連する病理学的問題を回避できる。
【０１２７】
i.n.ワクチン接種は、鼻および気管支関連粘膜組織におけるＴおよびＢ細胞の両方が媒介するエフェクターメカニズムに適合し、これは、他の粘膜関連リンパ様組織とは異なる。
【０１２８】
抗原の鼻内送達は、抗原を呼吸器系の粘膜下Ｂ細胞にターゲティングさせる。これらのＢ細胞は、哺乳動物において主要な局所ＩｇＡ産生細胞であり、そして鼻内送達は、炭疽菌抗原に対するこれらの細胞によるＩｇＡ産生の迅速な増加を容易にする。
【０１２９】
１つの実施態様では、炭疽菌抗原を含む医薬品の投与は、ＩｇＡ抗体産生を刺激し、そしてＩｇＡ抗体は、炭疽菌抗原に結合する。他の実施態様では、粘膜および／またはＴｈ２免疫応答が刺激される。
【０１３０】
本明細書全体を通して成分ＰＡ、ＬＦ、ＥＦ、およびＳ−層タンパク質をいうときは、それらのフラグメント、改変体、および誘導体を包含する。
【０１３１】
用語「フラグメント」とは、問題の成分の、少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、および最も好ましくは少なくとも３５のアミノ酸残基を有するペプチドを意味する。フラグメントは、好ましくは、対応する天然の成分の少なくとも１つのエピトープを含む。フラグメントは、対応する天然の成分の酵素的分解から生じ得る。
【０１３２】
用語「改変体」とは、問題の成分と、少なくとも７０、好ましくは少なくとも８０、より好ましくは少なくとも９０パーセントのアミノ酸配列相同性を有するペプチドまたはペプチド「フラグメント」を意味する。「改変体」の例は、アミノ酸の１以上のアナログ（例えば、非天然アミノ酸）または置換された連結を含むペプチドまたはペプチドフラグメントである。用語「相同性」および「同一性」は、本明細書において同義と考えられる。
【０１３３】
配列比較について、代表的には、１つの配列は、参照配列として作用し、これに対してテスト配列が比較され得る。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テストおよび参照配列は、コンピュータに入力され、次の座標が指定され、必要であれば、そして配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する１または複数のテスト配列についての配列同一性のパーセンテージを算出する。
【０１３４】
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman［Adv. Appl. Math. 2: 484 (1981)］の局所相同性アラインメントアルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch［J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)］のアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman［Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)］の類似性方法についての検索によって、これらのアルゴリズム（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA - Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705）のコンピュータ実行によって、または目視検査によって行われ得る［Current Protocols；Molecular Biology，F.M. Ausbelら編，Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley & Sons, Inc. (1995 Supplement) Ausbubelを参照のこと］。
【０１３５】
配列類似性のパーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズム［Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410頁；およびthe National Center for Biotechnology Informationの「http://www.ncbi.nlm.nih.gov/」を参照のこと］。
【０１３６】
好ましい相同性比較において、同一性は、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも３５アミノ酸長である配列の領域にわたり存在する。
【０１３７】
用語「誘導体」とは、問題の成分（またはそのフラグメントもしくは改変体）を含む分子を意味する。したがって、誘導体は、問題の成分、および１以上の追加のエピトープを導入するさらなる配列（例えば、ペプチド）を含み得る。さらなる配列は、好ましくは、問題のペプチドの基本的な折りたたみおよびこのようなコンホメーション構造を妨害すべきではない。
【０１３８】
「誘導体」の例は、融合タンパク質、および結合体である。したがって、２以上の成分（またはフラグメントもしくは改変体）は、誘導体を形成するために一緒に連結され得る。あるいは、成分（またはフラグメントもしくは改変体）は、関連のない分子（例えば、第２の、関連のないペプチド）に連結され得る。誘導体は、化学的に合成され得るが、代表的には組換え核酸方法によって調製される。脂質、および／または多糖、および／またはポリケチド成分などの追加の非ペプチド分子が誘導体に含まれ得る。
【０１３９】
すべての分子「フラグメント」、「改変体」、および「誘導体」は、共通の抗原性交差反応性、および／またはそれらが由来する成分と実質的に同じインビボ生物学的活性を有する。例えば、フラグメント、改変体、または誘導体に結合し得る抗体もまた、問題の成分に結合し得る。
【０１４０】
フラグメント、改変体、または誘導体がそれぞれ、問題の成分の活性部位（例えば、結合部位、または酵素機能活性部位）を有することが、好ましい特徴である。したがって、ＬＦの場合、このようなフラグメント、改変体、または誘導体は、ＬＦのエンドペプチダーゼ活性部位および／または亜鉛結合部位を有する。同様に、ＥＦの場合、このようなフラグメント、改変体、または誘導体は、ＥＦのアデニリルシクラーゼ活性部位を有する。好ましくは、ＬＦのこのフラグメント、改変体、または誘導体は、天然のメタロプロテアーゼの少なくとも３０％の活性を有し、そしてＥＦのこのフラグメント、改変体、または誘導体は、天然のアデニリルシクラーゼの少なくとも３０％の活性を有する。
【０１４１】
本発明を、以下の実施例を参考にして説明する。
【実施例】
【０１４２】
実施例１−組換え抗原の産生
非毒素産生株のBacillus anthracis（UM23C1-1株）を、炭疽菌毒素遺伝子の組換え発現用の宿主としてうまく使用した。天然の宿主の使用により、天然の遺伝子のバックグラウンドにおける遺伝子発現の明らかな利点が得られる。したがって、この宿主を、本研究に必要とされる毒素成分試薬の発現に用いた。
【０１４３】
２つの発現ベクター（ｐＡＥＸ−４およびｐＡＥＸ−ＡＶ４）を構築した。これらは、異なるプロモーターの組み合わせの使用、ならびに精製タグ（ｐＡＥＸ−ＡＶ４）の準備において、互いに異なる。両方のベクターとも、ルーチンのクローニング操作の目的のためのE. coli、および組換えタンパク質の発現のためのB. anthracis UM23C1-1の両方において、複製可能なグラム陰性／グラム陽性シャトルベクターである。２つのベクターの代表として、ｐＡＥＸ−４を図１に図示する。
【０１４４】
実施例２−B. anthracis発現システム：プラスミドｐＡＥＸ−４の開発
発現ベクターｐＡＥＸ−４は、精製用の融合パートナーを含まず、組換え致死因子（ＬＦ）、浮腫因子（ＥＦ）、および防御抗原（ＰＡ）のソースを提供する。
【０１４５】
このシステムにおいて、乳酸球菌Ｐ５９プロモーターおよびB. anthracis Ｐｐａｇ（防御抗原）プロモーターは、タンデムで、発現を駆動する。E. coliにおける複製は、ｐＵＣ９複製起点から開始するが、グラム陽性宿主においては、十分に特徴づけられたｐＵＢ１１０起点から開始する。
【０１４６】
炭疽菌毒素遺伝子をサブクローニングする：
ＥＦ、ＬＦ、およびＰＡをそれぞれコードする毒素遺伝子ｃｙａ、ｌｅｆ、およびｐａｇを、ＣＡＭＲ核酸コレクションから得た適切なクローンからサブクローニングした。遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼ切断によってＮｄｅＩ−ＳａｌＩフラグメントとして取り出した。すべての遺伝子の５’および３’末端を、必要とされる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を組み込むように設計されたオリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成した。すべてのサブクローニング作業を、市販のE. coli K12派生株宿主を用いて行った。ＤＮＡ構築物を、dam-dcm-E. coli宿主ＳＣＳ１１０（Stratagene、Europe）を経由させて、発現分析のためのB. anthracisヘの形質転換に用いた。
【０１４７】
実施例３−抗原シードストックの産生
ｐＡＥＸ−４ｐａｇ、ｐＡＥＸ−４ｌｅｆ、またはｐＡＥＸ−４ｃｙａのいずれかを有するB. anthracis UM23C1-1を、１０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む改変ＰＹＳ５培地中で中程度の通気で３７℃にて１６時間増殖する（２００ｒｐｍ、２０００ｍｌフラスコ中２００ｍｌ容量）。一晩の増殖後、適切な培養物の０．５ｍｌアリコートを、０．５ｍｌの４０％(v/v)滅菌グリセロールと混合し、そして必要になるまで−７０℃にて保存する。
【０１４８】
生存性を、シードストックからの培養物の接種および増殖によって評価し、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）抗原、または浮腫因子（ＥＦ）抗原の発現レベルを、適切な発現構築物で新たに形質転換したB. anthracis UM23C1-1のコロニーから直接接種した培養物と比較する。
【０１４９】
実施例４−B. anthracis UM23C1-1のバッチ培養増殖
適切な発現構築物（図１を参照のこと）を有するB. anthracis UM23C1-1クローンを、１０μｇ／ｍｌのネオマイシンを含む改変ＰＹＳ５培地中で中程度の通気で３７℃にて１６時間増殖する（２００ｒｐｍ、２０００ｍｌフラスコ中５００ｍｌ容量）。一晩の増殖後、B. anthracisの５００ｍｌ培養物を、遠心分離（10,000×ｇ、１０分、４℃、Sorvall RC5B34）によって採取し、上清を氷上で冷却し、そして真空下で濾過滅菌する（Millipore、0.22μｍ PVDFメンブラン）。すべての上清を、分析および抗原精製まで−２０℃にて保存する。
【０１５０】
実施例５−抗原精製
ＰＡを、プラスミドｐＡＥＸ−４ｐａｇを有するB. anthracis UM23C1-1中で発現させる。培養上清を、遠心分離によって澄明にし、そして0.22μｍニトロセルロースフィルター（Millipore）を用いて滅菌濾過した。固体の硫酸アンモニウムを、培養上清に攪拌しながらゆっくり加え、６０％飽和の最終濃度にした。沈殿したタンパク質を、遠心分離によって回収する（10,000×ｇ、４℃、１０分）。
【０１５１】
ペレットを、１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭピペラジン（ｐＨ９．７）に再懸濁し、そして過剰の同じ緩衝液に対して一晩透析する。透析物を、同じ緩衝液で平衡化したSource 30Q陰イオン交換カラム（AP Biotech）にアプライする。タンパク質を、上記のように１ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭピペラジン（ｐＨ９．７）中で展開させたＮａＣｌグラジエントを用いて溶出させる（図２を参照のこと）。ＰＡを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３を参照のこと）およびウサギ抗ＰＡ抗血清を用いるウエスタンブロッティングによって同定する。
【０１５２】
ＬＦおよびＥＦを、わずかに改変してＰＡについて上述したように発現および精製する。
【０１５３】
上記の増殖条件を用いるこれらのタンパク質の代表的な収量は、ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦについてそれぞれ８０ｍｇ／ｌ、３５ｍｇ／ｌ、および５ｍｇ／ｌである。
【０１５４】
実施例６−炭疽菌ワクチン組成物の処方
ワクチンは、以下のいずれかによって処方され得る：
１．天然の宿主B. anthracis中で産生した適切な量の精製組換え抗原を組み合わせること；または
２．天然のB. anthracis培養物から直接得ること。
【０１５５】
選択肢１をより詳細に説明し、そして適切な量の精製組換え抗原を用いる。
【０１５６】
ワクチンの主成分は、２つの炭疽菌毒素成分、防御抗原（ＰＡ）および致死因子（ＬＦ）である。
【０１５７】
主成分を、ＥＦ、Ｓａｐ、ＥＡ−１などのような他のタンパク質と組み合わせてもよい。Alhydrogelのようなアジュバントを、組み合わせたタンパク質混合物に、あるいは組み合わせる前に個々のタンパク質に添加してもよい。これらの成分（および他のタンパク質）を、１〜２０μｇ／ヒト用量のような好適な濃度で一緒に組み合わせる。
【０１５８】
組み合わせたタンパク質を、好ましくは、ワクチンの安全性（すなわち、非毒性）を確実にする方法で処方する。
【０１５９】
以下の説明においては、これは、ｒＰＡをｒΔＰＡ８３と置き換えることによるＰＡの不活性化によって達成される。
【０１６０】
ＰＡは、８３ｋＤａタンパク質（ＰＡ８３）であり、そのターゲット細胞表面レセプターに結合した後、タンパク質分解により６３ｋＤａ種（ＰＡ６３）に活性化される。ＰＡ６３は、ＬＦまたはＥＦに高い親和性で結合しそしてそれぞれ致死毒素または浮腫毒素を形成する。
【０１６１】
ｒΔＰＡ８３は、アミノ酸残基１６３〜１６８（タンパク質分解切断部位）を欠くＰＡの形態であり、そのためＰＡ６３形態に活性化できない。さらに、ｒΔＰＡ８３は、提案されたワクチン中でＬＦまたはＥＦに結合できず、したがって致死および浮腫毒素が形成され得ない。
【０１６２】
以下の説明においては、これは、その生物学的活性を不活性化するために、ホルムアルデヒドを用いて個々の成分または最終混合物をトキソイド化することによって達成される。
【０１６３】
抗原を０．０５Ｍリン酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）で２００μｇ／ｍｌに希釈する。ビーカー中で攪拌しながら、十分な４０％ホルムアルデヒドを最終濃度０．５％までゆっくり添加する。スクリューキャップボトルに移し、そして時々振盪しながら３７℃にて７〜１４日間インキュベートする。１０〜２０容量のリン酸緩衝化生理食塩液（ＰＢＳ）に対して４℃にて１２時間、材料を３〜５回透析する。ホルムアルデヒドの残りのレベル（０．０１％）が添加され得る。
【０１６４】
選択肢２をより詳細に説明し、そして天然のB. anthracis培養物を用いる。
【０１６５】
ワクチンを、毒素産生性の非莢膜形成のB. anthracis 34F2「Sterne」株培養物から直接処方する。
【０１６６】
培養物を、B. anthracisの増殖および好適なワクチン成分の産生を支持する一部定義された培地または完全な培地のいずれかにおいて増殖し得る。増殖は、最適条件下で行われ、そして培養物採取マーカーをモニターする。これらの採取マーカーを同定して、好適なワクチン成分の適量の産生を得る。マーカーは、例えば、培養物のｐＨ値がｐＨ７．４以下に低下するまたはグルコース濃度が１ｍＭ以下に低下する場合であり得る。
【０１６７】
増殖期間の最後に（約２４〜４８時間）、培養物を採取し、そしてプールした上清を、０．２ミクロンフィルターを通して滅菌濾過する。この上清を、硫酸カリウムアルミニウムを用いて沈殿して、ｐＨを必要な値に調節し得る。
【０１６８】
選択肢１と同様に、組成物は、トキソイド化によって非毒性になり得る。
【０１６９】
実施例７−ＬＦエンドペプチダーゼアッセイ
アッセイは、ヒトＭＥＫ−１のＮ末端６０残基を表す合成ペプチド基質を用いる。天然または組換えＬＴ（すなわち、ＬＦ）を含む試料を、アッセイ緩衝液（０．０５ｍＭのＺｎＳＯ４および０．０５ｍＭのＣａＣｌ２を含む２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で希釈し、そして基質とともにインキュベートする。
【０１７０】
次いで、切断したペプチド（ＬＦによるＭＥＫ−１の切断後に生成したＮ末端アミノ酸残基を表す）に対して産生したウサギ抗血清を用いて、ＬＦの酵素／生物学的活性を測定する。
【０１７１】
実施例８−ＥＦおよびＥＴアデニリルシクラーゼアッセイ
アデニル酸シクラーゼ活性（ＥＦ、およびＥＴに固有）は、浮腫因子（ＥＦ）活性からまたは浮腫毒素（ＥＴ；ＰＡ＋ＥＦ）活性からそれぞれ生じる細胞外および細胞内ｃＡＭＰ産生のいずれかの測定によって決定し得る。
【０１７２】
アデニル酸シクラーゼ活性を、以下のように決定し得る。簡単に言えば、２０μｌの５×アッセイ緩衝液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、２５ｍＭのＭｎＣｌ２、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ｍＭのジチオトレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）、５μｌのウシカルモジュリン（１００μｇ／ｍｌ）、１０μｌの２０ｍＭのＡＴＰ、１０μｌのＥＦ（１ｎｇ／μｌの希釈物）を含み、水で１００μｌにした反応混合物を、３組準備し、そして３０℃にて６０分間インキュベートする。
【０１７３】
市販のキットアッセイ（例えば、Amersham-PharmaciaからのBIOTRAK cAMP酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）システムキット）を用いて、ｃＡＭＰ濃度を測定する。
【０１７４】
実施例９−ＬＦおよびＰＡについてのマクロファージ溶解アッセイ
単球／マクロファージ細胞RAW 264.7を、ECACC（CAMR）から得、そして３％(v/v)Ｌ−グルタミン、１０％(v/v)ウシ胎児血清、およびそれぞれ０．５ＩＵ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質溶液を含むダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。細胞を、７５ｃｍ２フラスコ中で、加湿５％(v/v)二酸化炭素（ＣＯ２）雰囲気中で３７℃にてルーチンで増殖した。
【０１７５】
マクロファージ溶解アッセイは、以下のように確立されている。簡単に言えば、RAW 264.7単球／マクロファージを増殖中の培養物から掻き取って、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４で緩衝化し、予め温めた（３７℃）ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳ）中に採取し、そして細胞密度を５×１０５細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を、９６ウェル培養プレートに２００μｌ／ウェル（１×１０５細胞／ウェル）で播種し、そして細胞を静置し、３７℃、５％ＣＯ２にて１６時間付着させた。
【０１７６】
ＬＦの定量のためのアッセイを始めるために、培地および剥離した細胞を、穏やかな吸引によって除去し、そして０．１μｇ／ｍｌのＰＡを含む温ＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳに置換した（１００μｌ／ウェル）。次いで、０．１μｇ／ｍｌのＰＡを含むＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳに種々の濃度でＬＦを添加した。すべての実験を１００倍濃度範囲にわたって（他に指示がない限り）３組行った。細胞生存性を、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニル-テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）テトラゾリウム染料アッセイを用いて、毒素との３時間のインキュベーション期間後に測定した。
【０１７７】
ＭＴＴ（Sigma、UK）を、１．５ｍｇ／ｍｌでＤＭＥＭ／ＨＥＰＥＳに溶解し、そして３７℃まで温め、細胞培養物（１００μｌ／ウェル）に添加して、最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにした。インキュベーションを３７℃、５％ＣＯ２にて６０分間続けて、生存細胞による染料の取り込みおよび酸化を行った。培地を吸引し、そして０．５％ドデシル硫酸ナトリウム(w/v)および２５ｍＭのＨＣｌを含む１００μｌ／ウェルの９０％イソプロピルアルコールで置換し、そしてプレートを振盪して細胞を破壊し、ＭＴＴを溶解した（１０〜３０分）。
【０１７８】
ＭＴＴ結晶の溶解を可視観察した後に確認するために、５７０ｎｍでのＭＴＴ吸収を、Dynatech MR7000プレートリーダーを用いて測定した。
【０１７９】
固定濃度のＬＦ（０．１μｇ／ｍｌ）を用いること以外は、ＰＡの検出／定量に上記のマクロファージ溶解アッセイを用い得る。
【０１８０】
実施例１０−改変ＰＡがその細胞ターゲットに結合しないことを示すこと
炭疽菌毒素レセプター（ＰＡが結合する細胞ターゲット）は遍在し、そして致死毒素の効果に非感受性細胞株上にさえも、細胞表面上にある程度高レベルで発現する（Bradleyら、2001）。
【０１８１】
放射標識したＰＡを用いるレセプター結合アッセイを用いて、本発明の任意の特定の改変ＰＡが、所定の細胞株、例えば、マウスマクロファージJ774A.1（致死毒素感受性）またはマクロファージA/J（耐性）（Freidlanderら、1993）においてこれらのレセプターに結合しないことを確認する。
【０１８２】
より詳細には、細胞を、約３×１０５細胞／ｍｌで９６ウェル組織培養プレートに播種し、そして放射ヨウ素化ＰＡ８３（コントロール）または改変ＰＡに４℃にて１時間曝露して、結合を生じさせる。低いインキュベーション温度は、結合したＰＡのインターナリゼーションを防ぐ。次いで、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄して、非結合の標識ＰＡを除去し、細胞を可溶化し、そして得られる試料中の放射活性を、ガンマカウンターを用いて定量する。
【０１８３】
実施例１１−改変ＰＡがＬＦまたはＥＦに結合しないことを示すこと
ＰＡ８３が、細胞表面でフューリンによって天然に、またはトリプシンもしくはキモトリプシンによって人工的にいずれかで切断され得るのと同様に、改変ＰＡはプロテアーゼ切断を受けやすく、ＰＡ６３に類似する誘導体を形成し得るが、この誘導体はＬＦまたはＥＦに結合しない。あるいは、改変ＰＡは、単にプロテアーゼ切断を受けにくい。
【０１８４】
これは、１〜５ｍｇの改変ＰＡが、１．５ｍｌの適切な緩衝液（例えば、ｐＨ９の２０ｍＭのエタノールアミン）中で、例えば、トリプシン（２０μｇ）との、３７℃にて３０分間のインキュベートによって切断されるかどうかがテストされ得る。次いで、トリプシンインヒビター（１０μｌの緩衝液中４０μｇ）を添加することによって、反応を停止する。
【０１８５】
次いで、フラグメントを、従来の低圧液体クロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過または陰イオン交換クロマトグラフィー）によって精製し、そしてＰＡ６３に対応するフラグメントを、実施例１２に記載のようにマイクロタイタープレート上にコーティングする。
【０１８６】
プレートをブロッキングした後、ＬＦまたはＥＦの希釈物を改変ＰＡに結合させ、そして結合した抗原を、実施例１２に記載のように定量する。
【０１８７】
実施例１２−改変ＬＦがＰＡに結合しないことを示すこと
これは、マイクロタイタープレート上に１μｇ／ｍｌの濃度でＰＡ６３をコーティングすることによって確認する。抗原（ＰＡ６３）を、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌで２〜８℃にて一晩コーティングする。コーティングしたプレートを洗浄し、すべてのウェルに希釈物（０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）および５％ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝化生理食塩液）を添加してブロックする。
【０１８８】
ＬＦ（コントロール）または改変ＬＦの希釈物を、ブロッキング緩衝液に添加する。３７℃にて６０分間結合を行わせる。プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そしてＨＲＰ結合した抗ＬＦ抗体を用いて結合したＬＦを検出する。過剰の抗体を、上記のように洗浄して除去し、そしてプレートを各ウェルへの１００μｌ基質の添加によって発色させる。
【０１８９】
発色反応を、５０μｌのＮａＯＨ（３Ｍ）の添加によって停止し、そして吸光度を４０５および６９０ｎｍで読み取る。
【０１９０】
実施例１３−改変ＥＦがＰＡに結合しないことを示すこと
これは、マイクロタイタープレート上に１μｇ／ｍｌの濃度でＰＡ６３をコーティングすることによって確認する。抗原（ＰＡ６３）を、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中１μｇ／ｍｌで２〜８℃にて一晩コーティングする。コーティングしたプレートを洗浄し、すべてのウェルに５０μｌ希釈物（０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）および５％ウシ胎児血清を含むリン酸緩衝化生理食塩液）を添加してブロックする。
【０１９１】
ＥＦ（コントロール）または改変ＥＦの希釈物を、ブロッキング緩衝液に添加する。３７℃にて６０分間結合を行わせる。プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そしてＨＲＰ結合した抗ＥＦ抗体を用いて結合したＥＦを検出する。過剰の抗体を、上記のように洗浄して除去し、そしてプレートを各ウェルへの１００μｌ基質の添加によって発色させる。
【０１９２】
発色反応を、５０μｌのＮａＯＨ（３Ｍ）の添加によって停止し、そして吸光度を４０５および６９０ｎｍで読み取る。
【０１９３】
実施例１４−ＰＡ、ＬＦ、および／またはＥＦの化学的改変
任意のアミノ酸残基におけるシステイン残基またはアミン基のアミノ酸特異的改変は、好ましくは、本発明の改変ＰＡ、ＬＦ、および／またはＥＦ成分においてターゲティングされる。
【０１９４】
例えば、種々の濃度のスルフヒドリル基試薬ＤＴＮＢ（5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）でのＥＦの滴定は、ＥＦのアデニル酸シクラーゼ活性を不可逆的に阻害する。
【０１９５】
同様に、アミン特異的試薬ＭＬＭＳ（モノ(ラクトシルアミド)モノ(スクシンイミジル)スベリン酸）でのＰＡおよび／またはＬＦの処理は、これらの２つのタンパク質の結合活性を不可逆的に調節する。種々の濃度のＭＬＭＳでの滴定は、これらのタンパク質のその後の活性（すなわち、結合または酵素活性）にある範囲の影響を発揮し得る。
【０１９６】
実施例１５−ＰＡ、ＬＦ、および／またはＥＦの遺伝子改変
成分（すなわち、ＰＡ、ＬＦ、またはＥＦ）の結合に重要なアミノ酸残基をコードするヌクレオチド残基の部位特異的変異誘発を用いて、これらの３つのタンパク質の活性を改変し得る。
【０１９７】
例えば、ＰＡは、酵素フューリンによって細胞表面で切断される、細胞結合タンパク質である。フューリン切断事象についての認識部位は、ＲＫＫＲである。これらのアミノ酸の部位特異的変異誘発は、フューリンによるＰＡ切断を不可能にし、したがってＬＦまたはＥＦに結合またはこれらをインターナリゼーションできない。
【０１９８】
同様に、ＥＦおよびＬＦの残基１３６〜１４２および１４７〜１５３（ＶＹＹＥＩＧＫ）の部位特異的変異誘発は、それぞれ、これらのタンパク質をＰＡに結合不可能にする。詳細には、チロシン残基、イソロイシンまたはリジン残基の変異誘発が、ＰＡへの結合、およびその後の活性な毒素の形成を防ぐために好ましい。
【０１９９】
部位特異的変異誘発を、変異原性オリゴヌクレオチドプライマー、次いでポリメラーゼ連鎖反応を用いる所望の領域の増幅を用いて行う。次いで、変異誘発した領域を配列決定して、コード遺伝子を再構築する。
【０２００】
あるいは、毒素成分についての遺伝子内のランダム変異を、エラー−プロンＰＣＲによって構築し得る。異なるヌクレオチドについて枯渇したヌクレオチドミックスを用いて、４つの反応をそれぞれ行う。各ヌクレオチドミックスは、高濃度のデオキシイノシン３リン酸（ｄＩＴＰ）を含み、枯渇したヌクレオチドを必要とする部位に組み込まれる。４つのすべての天然塩基がイノシンと対形成し得るので、次のＰＣＲサイクル中に変異が生じる確率は、７５％である。
【０２０１】
参考文献
KA Bradley, J Mogridge, M Mourez, RJ Collier, JAT Young, Nature, 414, 225-229 (2001)；
AM Friedlander, R Bhatnagar, SH Leppla, L Johnson, Y Singh, Infect Immun, 61, 245-52 (1993)。
【図面の簡単な説明】
【０２０２】
【図１】E. coliならびにB. anthracisなどの種々のグラム陽性菌の両方で複製可能なシャトルベクターである、ｐＡＥＸ−４のプラスミドマップを示す。この構築物は、約６．５ｋｂのサイズであり、そしてｐＵＣ９（E. coliにおける複製用）およびｐＵＢ１１０（B. anthracisにおける複製用）の複製機能を含む。さらに、ネオマイシン／カナマイシン（Bacillusで）およびエリスロマイシン（E. coliで）への耐性をコードする選択可能マーカーが存在する。ターゲット遺伝子の発現は、乳酸球菌Ｐ５９プロモーターおよび防御抗原ＰａｇＡ（Ｐｐａｇ）プロモーターのタンデム組み合わせによって駆動する。転写ターミネーターｔｐａｇは、B. anthracisのｐａｇＡ遺伝子に由来する。翻訳は、プロテインＡシグナル配列より上流に位置するブドウ球菌プロテインＡリボソーム結合部位から開始される。マルチクローニング部位（ＭＣＳ）は、毒素成分遺伝子のクローニング用のＮｄｅ１部位を有する。組換えタンパク質は、融合パートナーを含まないこのベクターから産生される。
【図２】XK26/20 Source 30Qカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーによる組換えＰＡの溶出プロファイルを示す。
【図３】組換えＬＦの調製に用いた精製工程のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１は、Invitrogen Seeblue（登録商標）＋マーカーを示し；レーン２は、粗製の培養上清を示し；そしてレーン３〜５は、ＬＦピーク（Source 30Q陰イオン交換カラム）を横断する画分を示す。トラック４のピーク画分は、デンシトメトリーのスキャンによって決定した場合、９６％より高い純度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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