(57)【要約】本発明は、患者における再狭窄、新生内膜形成、移植不全、アテローム硬化症、新脈管形成、および／または固形腫瘍増殖を予防又は低減する方法を提供する。本方法は、患者に、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳または核蓄積またはc-Junの活性を低減する、予防的に有効な投与量の核酸を投与することを含む。この核酸はc-Jun ｍＲＮＡをターゲットとするＤＮＡザイムであることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において血管形成および／または新血管新生を妨げるまたは低減する方法であって、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積もしくは活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
患者のアテローム硬化症、再狭窄、移植不全、または新生内膜形成を治療または阻害する方法であって、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積もしくは活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む方法。
【請求項３】
患者の固形腫瘍増殖を治療または阻害する方法であって、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積もしくは活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む方法。
【請求項４】
血管形成が眼球の血管形成である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
固形腫瘍増殖がメラノーマである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が、c-JunをターゲットとするＤＮＡザイム、c-Junアンチセンスオリゴヌクレオチド、c-Junをターゲットとするリボザイム、およびc-Jun dsDNAをターゲットとするssDNAであって、当該ssDNAがc-Jun dsDNAと三本鎖を形成するようなものからなる群から選択される、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、c-Jun mRNAをターゲットとするdsRNA、c-Jun mRNAをターゲットとするdsRNAの製造をもたらす核酸分子、またはc-Jun mRNAをターゲットとする小さな干渉ＲＮＡ分子である、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、配列特異的ＤＮＡザイムによるc-Jun mRNAの切断によって達成される、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡザイムが、
(i)プリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒性ドメイン；
(ii)触媒性ドメインの５’末端に隣接した第一結合ドメイン；および
(iii)触媒性ドメインの３’末端に隣接した第二結合ドメイン
を含み、ここで、ＤＮＡザイムがc-Jun mRNAを切断するように、前記結合ドメインはc-Jun mRNA内のプリン：ピリミジン切断部位の直ぐ隣に隣接した二つの領域に十分に相補的である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記結合ドメインが、少なくとも６ヌクレオチドの長さを有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記両方の結合ドメインが、合わせて少なくとも１４ヌクレオチドの長さを有する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合ドメインの長さが９ヌクレオチドである、請求項９ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記触媒性ドメインが、ヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGAを有する、請求項９ないし１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記切断部位が、c-Jun mRNAの残基A287からA1501の領域内である、請求項９ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記切断部位が、c-Jun mRNAの残基U1296からG1497の領域内である、請求項９ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記切断部位が、ヌクレオチド1311-1312に対応するGU部位である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡザイムが、配列5'-cgggaggaaGGCTAGCTACAACGAgaggcgttg-3'を有する、請求項８ないし１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡザイムが、一以上の末端に3'-3'反転を取り込む、請求項８ないし１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記c-Junアンチセンスオリゴヌクレオチドが、残基U1296からG1497の領域内でc-Junにハイブリダイズする配列を含む、請求項６記載の方法。
【請求項２０】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列CGGGAGGAACGAGGCGTTGを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記リボザイムが、残基A287からA1501の領域内でc-Jun mRNAを切断する、請求項６記載の方法。
【請求項２２】
前記リボザイムが、残基U1296からG1497の領域内でc-Jun mRNAを切断する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記dsRNAが、残基A287からA1501の領域内でc-Jun mRNAをターゲットとする、請求項７記載の方法。
【請求項２４】
前記dsRNAが、残基U1296からG1497の領域内でc-Jun mRNAをターゲットとする、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
残基A287からA1501の領域内でc-Jun mRNAを切断する触媒性核酸。
【請求項２６】
残基U1296からG1497の領域内でc-Jun mRNAを切断する、請求項２５記載の触媒性核酸。
【請求項２７】
前記触媒性核酸が、
(i)プリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒性ドメイン；
(ii)触媒性ドメインの５’末端に隣接した第一結合ドメイン；および
(iii)触媒性ドメインの３’末端に隣接した第二結合ドメイン
を含む配列特異的ＤＮＡザイムであり、ここで、ＤＮＡザイムが残基U1296からG1497の領域内でc-Jun mRNAを切断するように、前記結合ドメインはc-Jun mRNA内のプリン：ピリミジン切断部位の直ぐ隣に隣接した二つの領域に十分に相補的である、請求項２５または２６に記載の触媒性核酸。
【請求項２８】
c-Jun mRNA内の前記切断部位が、ヌクレオチド1311-1312に対応するGU部位である、請求項２５ないし２７のいずれか一項に記載の触媒性核酸。
【請求項２９】
前記結合ドメインが、少なくとも６ヌクレオチドの長さを有する、請求項２５ないし２８のいずれか一項に記載の触媒性核酸。
【請求項３０】
前記結合ドメインの長さが９ヌクレオチドである、請求項２５ないし２９のいずれか一項に記載の触媒性核酸。
【請求項３１】
前記触媒性ドメインが、ヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGAを有する、請求項２５ないし３０のいずれか一項に記載の触媒性核酸。
【請求項３２】
前記触媒性核酸が、配列5'-cgggaggaaGGCTAGCTACAACGAgaggcgttg-3'を有する、請求項２５ないし３１のいずれか一項に記載の触媒性核酸。
【請求項３３】
前記触媒性核酸が、一以上の末端に3'-3'反転を取り込む、請求項２５ないし３２のいずれか一項に記載の触媒性核酸。
【請求項３４】
残基U1296からG1497の領域内でc-Jun mRNAに結合する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列CGGGAGGAACGAGGCGTTGを有する、請求項３４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
請求項２５ないし３３のいずれか一項に記載の触媒性核酸または請求項３４または３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および薬学的に許容できるキャリアーを含む薬学的組成物。
【請求項３７】
c-Jun mRNAレベル、c-Jun mRNA翻訳、またはc-Junの核蓄積もしくは活性を低減する核酸の予防上有効量で操作可能に被覆された血管形成ステントを含む、再狭窄の発生を妨げる血管形成ステント。
【請求項３８】
前記核酸が、請求項２５ないし３３のいずれか一項に記載の触媒性核酸または請求項３４または３５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３７に記載の血管形成ステント。
【請求項３９】
血管形成の時に患者に請求項３７または３８に記載のステントを局所的に適用することを含む、血管形成を受けている患者において再狭窄の発生を阻害する方法。
【請求項４０】
c-Junの誘導を阻害、c-Junの発現を低減、またはc-Junの核蓄積もしくは活性を低減する能力について推定試薬を調べることを含む、再狭窄、新生内膜形成、アテローム硬化症、移植不全、血管形成および／または固形腫瘍増殖を阻害する試薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、c-Jun媒介性の細胞工程を低減または予防するための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、ＤＮＡザイムの使用を含む、新生内膜形成、アテローム硬化症、再狭窄、移植不全、または新脈管形成を低減または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成後のアテローム硬化症および再狭窄の病理における最初の事象は動脈壁の細胞に対する損傷である１。損傷またはストレスが、血管平滑筋細胞におけるシグナル伝達および転写経路に刺激を与え、それらの移動及び増殖、並びに新生内膜の結果的な形成を刺激する。平滑筋細胞増殖は、新生内膜形成、アテローム硬化症、再狭窄、および移植不全の重要な特徴である。
【０００３】
ベース領域-ロイシンジッパータンパク(basic region-leucine zipper)ファミリーの原型メンバーであるc-Junは、動物モデルの動脈損傷後に一時的に誘導される２，３。c-Junは、他のbZIPタンパク質とホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方を形成して、ＡＰ−１転写ファクターを形成する。最近１０年にわたる研究によりＡＰ−１と増殖、腫瘍形成、およびアポトーシスとが関連づけられたが、ＡＰ−１は腫瘍抑制および細胞分化にも関与している４。かくして、c-Jun発現をダウンレギュレートする遺伝子ターゲッティング手法は、必ずしも細胞増殖を阻害するわけではない。
【０００４】
Kanataniら(1996)５は、c-Junをターゲットとするアンチセンスオリゴヌクレオチドが、投与量依存的に、デキサメタゾンおよびＴＧＦβの増殖阻害効果を低減することを示した。最近のレポートでは、c-Jun ＮＨ２末端キナーゼ／ストレス活性化タンパクキナーゼ（JNK）、すなわちc-Junおよび多くのその他の転写因子の上流アクチベーターが、ヒトおよびウサギのアテローム硬化型プラークのＳＭＣｓにより発現されること６，７、および優性のネガティブJNKがバルーン損傷後の新生内膜形成を阻害すること８が示されている。c-Junは、しかしながら、ヒトのアテローム硬化型傷害には局在化されておらず、また、損傷後の動脈修復に機能的な役割を演じることは示されていない。
【０００５】
しかしながら、c-Junまたは他の所定の遺伝子がバルーン血管形成後に動脈壁に誘導発現されることを見出したことが、必ずしもそれが転写、増殖または新生内膜形成にポジティブな制御的役割を演じると説明するものではないことは明らかである。例えば、３つの転写リプレッサー（NAB2、GCF2、およびYY1）は、in vitro、並びにラットの動脈壁での機械的損傷により血管平滑筋細胞において活性化されることが示されている。NAB2はジンクフィンガー転写因子Egr-1に直接結合して、Egr-1介在性転写を抑制する９。GCF2は、血管平滑筋細胞のよく調べられたマイトジェンであるPDGF-Aの発現の可能性のあるリプレッサーであり、平滑筋細胞増殖を阻害する１０。同様に、YY1過剰発現は、内因性細胞増殖に影響することなく平滑筋細胞増殖をブロックする１１。
【０００６】
c-Junは転写を抑制および活性化できる。c-JunはコレプレッサーであるTG-相互作用因子（TGIF）に結合して、Smad2転写活性を抑制する１２。また、c-Junは、トランスフォーミング成長因子β介在性転写を、Smad3の転写活性を抑制することによりブロックする１３。
【０００７】
c-Junは、増殖を阻害および刺激できる。c-Junに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、Kanataniとその共同研究者らは、TGF-βおよびデキサメタゾンによるヒト単球様細胞白血病細胞増殖の阻害が、c-Jun発現の増大により媒介されることを示した。
【０００８】
しかしながら、c-Junは、固形腫瘍増殖および角膜疾患を含む多くの一般的なヒトの疾患の根底にある血管形成の複雑な工程に直接関連していない。血管形成は、基底膜とその周辺の細胞外マトリックスのタンパク分解による分解、微小血管内皮細胞増殖、移動、管形成、および構造的再編成を含む複雑な多重工程である１４。
【０００９】
ＤＮＡザイム
ヒトの遺伝子治療において、アンチセンス核酸技術は、その発現が疾患を引き起し、そのため望ましくない遺伝子を不活性化するための主なツールの一つである。アンチセンスアプローチは、所望でない遺伝子をコードするｍＲＮＡ分子に相補的であり、そのためハイブリダイズする核酸分子を用いる。係るハイブリダイゼーションは、翻訳機構の核酸分解または立体封鎖を含むメカニズムによる遺伝子発現の阻害をもたらす。
【００１０】
アンチセンス技術には、ある種の欠点がある。アンチセンスハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ／ターゲットｍＲＮＡヘテロ二重鎖の形成をもたらす。このヘテロ二重鎖は、ターゲットｍＲＮＡ成分のＲＮＡｓｅ Ｈ介在性分解の基質を提供する。ここで、このＤＮＡアンチセンス分子は、消極的に作用し、そこで内因性ＲＮＡｓｅ Ｈ酵素による必要な切断を単に容易化するに過ぎない。ＲＮＡｓｅ Ｈへのこのような依存性は、そのターゲットｍＲＮＡとの安定なヘテロ二重鎖を形成する能力と化学に関して、アンチセンス分子の設計を制限してしまう。また、アンチセンスＤＮＡ分子は、非特異的活性、およびより高い濃度では毒性にさえ関わる問題を有する。
【００１１】
アンチセンス分子に代わる手段としては、触媒性核酸分子が遺伝子発現を抑制する治療剤として有望であり、文献において広く議論されている１５−２１。かくして、通常のアンチセンス分子とは違って、触媒性核酸分子は、単にターゲットｍＲＮＡ分子に結合する代わり、そのターゲットｍＲＮＡ分子を実際に切断することにより機能する。触媒性核酸分子は、ターゲット配列がある最小の要求を満たすならば、ターゲット核酸配列を切断することだけが可能である。ターゲット配列は触媒性核酸のハイブリダイズ領域に相補的でなければならず、ターゲットは切断の部位に特異的な配列を含まなければならない。
【００１２】
触媒性ＲＮＡ分子（“リボザイム”）はよく文献に記載されており１５，２２，２３、ＲＮＡ１５およびＤＮＡ２０分子の両方を切断可能であることが示されている。確かに、in vitro選択および進化技術の発達は、出発点として公知のリボザイムのランダムバリアントまたはランダム配列ＲＮＡを用いて１６，２４，２５、公知の基質に対して新規のリボザイムを得ることを可能にした。
【００１３】
しかしながら、リボザイムは、それらの機能を発揮することが意図される細胞内の酵素的加水分解に対して高度に敏感である。これは、翻って、それらの薬理的適用を制限してしまう。
【００１４】
最近、“ＤＮＡザイム(DNAzymes)”と呼ばれる新規のクラスの触媒性分子が製造された２６，２７。ＤＮＡザイムは一本鎖であり、ＲＮＡ１６，２７とＤＮＡ２１との両方を切断する。ＤＮＡザイムの一般的なモデルが提案されており、“１０−２３”モデルとして知られている。単に“１０−２３ＤＮＡザイム”とも称される“１０−２３”モデルに従ったＤＮＡザイムは、種々のデオキシリボヌクレオチドアームの長さの二つの基質認識ドメインが隣接した１５のデオキシリボヌクレオチドの触媒性ドメインを有する。in vitroでの分析は、この種のＤＮＡザイムが、生理学的条件下でプリン：ピリミジン接合部でその基質であるＲＮＡを効果的に切断できることを示している。
【００１５】
ＤＮＡザイムは、治療剤としての見込みがある。しかしながら、公知のｍＲＮＡ分子の存在により引き起こされた疾患に対するＤＮＡザイムの成功は、予測可能なものではない。この予測不能は、部分的に、二つのファクターによるものである。第一には、あるｍＲＮＡの二次構造は、そのターゲットｍＲＮＡに結合して切断するというＤＮＡザイムの能力を妨げ得る。第二には、ターゲットｍＲＮＡを発現する細胞によるＤＮＡザイムの取り込みは、治療上意味のある結果をもたらすのに十分に効率的ではないかも知れない。
【００１６】
損傷した動脈壁、並びに血管形成のような他の疾患背景におけるc-Junの正確な調節的役割の研究は、特異的な薬理学的インヒビターの欠損により妨げられてきた。ＤＮＡザイムは、触媒性コアに隣接した二つのアームにおけるヌクレオチドの配列により与えられる特異性を備えた遺伝子ターゲッティング剤の新規のクラスを意味し２７、また、リボザイムを越える基質特異性及び安定性の利点を有する２７，２８。これまで、c-Junまたはその他のJunファミリーのメンバーのいずれも、触媒性核酸手法を用いてターゲット化されたことがない。
【非特許文献１】Ross,R.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71,1207-1210(1974)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明らは、c-Junをターゲット化するＤＮＡザイムを用いて、c-Junが再狭窄、新生内膜形成、アテローム硬化症、移植不全および血管形成における積極的な役割を演じることを示した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
第一の態様では、本発明は、患者において血管形成および／または新血管新生を妨げるまたは低減する方法であり、当該方法は、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む。
【００１９】
第二の態様では、本発明は、患者の再狭窄、新生内膜形成、移植不全およびアテローム硬化症からなる群から選択される状態を阻害又は治療する方法であり、当該方法は、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む。
【００２０】
第三の態様では、本発明は、患者の固形腫瘍増殖を阻害又は治療する方法であり、当該方法は、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、前記核酸は、c-JunをターゲットとするＤＮＡザイム、c-Junアンチセンスオリゴヌクレオチド、c-Junをターゲットとするリボザイム、およびc-Jun dsDNAをターゲットとするssDNAであって、当該ssDNAがc-Jun dsDNAと三重鎖を形成するようなものからなる群から選択される。別の実施態様では、前記核酸は、c-Jun mRNAをターゲットとするdsRNA、c-Jun mRNAをターゲットとするdsRNAの製造をもたらす核酸分子、またはc-Jun mRNAをターゲットとする小さな干渉ＲＮＡ(small interfering RNA)分子である。
【００２２】
第四の態様では、本発明は、再狭窄、新生内膜形成、移植不全、アテローム硬化症、血管形成および／または固形腫瘍増殖を阻害する試薬のスクリーニング方法を提供するものであり、当該方法は、c-Junの誘導を阻害、c-Junの発現を低減、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する能力について推定試薬を調べることを含む。
【００２３】
第五の態様では、本発明は、残基A287からA1501の領域でc-Jun mRNAを特異的に切断する触媒性核酸である。
【００２４】
第六の態様では、本発明は、残基U1296からG1497の領域でc-Jun mRNAに特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
第七の態様では、本発明は、上記本発明の第五の態様の触媒性核酸または上記本発明の第六の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および薬学的に許容できるキャリアーを含む薬学的組成物である。
【００２６】
第八の態様では、本発明は、再狭窄の発生を妨げる血管形成(angioplastic)ステントであり、c-Jun mRNAレベル、c-Jun mRNA翻訳、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する核酸の予防上有効量で被覆した血管形成ステントを含む。
【００２７】
第九の態様では、本発明は、血管形成を受けている患者の再狭窄、新生内膜形成、移植不全、および／またはアテローム硬化症の開始を阻害する方法であり、血管形成時に患者に本発明の第八の態様に係るステントを局所的に適用することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明者らは、ヒトのアテローム性病変における平滑筋細胞によるc-Junの発現を示した（図１）。c-Junは、正常培地での平滑筋細胞によりほとんど、あるいは全く発現されない。対照的に、ジンクフィンガー転写因子Sp1は、脈管内膜と培地の両方で発現される（図１）。
【００２９】
新生内膜形成は、アテローム硬化症および血管形成後再狭窄のような一般的な血管病理の特徴であり、平滑筋細胞増殖に関与する。
【００３０】
平滑筋細胞によるその発現に加えて、本発明者らはc-Junが血管形成の複雑な工程に関連することを示した。特に、c-Junの発現が、以前には記載されたことのない血管新生化された原発性ヒトメラノーマに見出された。
【００３１】
c-Junをターゲットとする遺伝子特異的ＤＮＡザイム（Dz13と称する）を作成した。Dz13は、その正確な非触媒性のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド等価物を越える効力で、c-Jun ＲＮＡを切断し、血管平滑筋細胞における誘導性のc-Junタンパク発現を阻害する。さらに、Dz13は、in vitroにおいて損傷後の平滑筋細胞修復を抑止し、in vivoにおいてラット頸動脈の新生内膜形成を抑止した。
【００３２】
Dz13は、その正確な非触媒性のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド等価物を越える効力で、内皮増殖、移動および微小管形成もブロックした。これは、ラットの角膜において新血管新生を阻害し、かつ、マウスにおいてメラノーマ増殖を阻害した。
【００３３】
これらの知見は、損傷を受けた動脈壁の新生内膜形成および血管形成におけるc-Junの重要な制御的役割を示す。
【００３４】
第一の態様では、本発明は、患者において血管形成および／または新血管新生を妨げるまたは低減する方法であり、当該方法は、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む。
【００３５】
第二の態様では、本発明は、患者の再狭窄、新生内膜形成、移植不全およびアテローム硬化症からなる群から選択される状態を阻害又は治療する方法であり、当該方法は、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む。
【００３６】
第三の態様では、本発明は、患者の固形腫瘍増殖を阻害又は治療する方法であり、当該方法は、c-Jun ｍＲＮＡレベル、c-Jun ｍＲＮＡ翻訳、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する予防上有効量の核酸を患者に投与することを含む。
【００３７】
本発明の第一の態様の好ましい実施態様では、血管形成は眼球の血管形成である。
【００３８】
本発明の第三の好ましい実施態様では、固形腫瘍はメラノーマである。
【００３９】
対象はあらゆる動物またはヒトであるが、対象がヒトであることが好ましい。
【００４０】
当業者であれば理解できることであろうが、本発明の方法が達成される多くの手段が存在する。
【００４１】
好ましい実施態様では、当該方法は、配列特異的ＤＮＡザイムによりc-Jun mRNAを切断することにより達成される。さらに好ましい実施態様では、ＤＮＡザイムは以下：
(i)プリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒性ドメイン；
(ii)触媒性ドメインの５’末端に隣接した第一結合ドメイン；および
(iii)触媒性ドメインの３’末端に隣接した第二結合ドメイン
を含む。
ここで、ＤＮＡザイムがc-Jun mRNAを切断するように、前記結合ドメインはc-Jun mRNA内のプリン：ピリミジン切断部位に隣接した二つの領域に十分に相補的である。
【００４２】
ここで、“ＤＮＡザイム”は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい明確なターゲット核酸配列を特異的に認識及び切断するＤＮＡ分子を意味する。
【００４３】
好ましい実施態様では、ＤＮＡザイムの結合ドメインは、切断部位に隣接する領域に対して相補的である。しかしながら、当業者であれば、厳密な相補性は、ＤＮＡザイムがc-Jun mRNAに結合して切断するのに必要ないかもしれないことを理解できるであろう。
【００４４】
結合ドメインの長さ（“アーム長さ”とも称する）は、あらゆる組み合わせとすることができ、同一であっても相違しても良い。好ましい実施態様では、結合ドメインの長さは少なくとも６ヌクレオチドである。好ましくは、両方の結合ドメインが、組み合わせて、少なくとも１４ヌクレオチドの合計の長さを有する。二つの結合ドメインの長さの種々の組み合わせ、例えば７＋７、８＋８、および９＋９を考えることができる。好ましくは二つの結合ドメインの長さは９＋９である。
【００４５】
本発明に係るＤＮＡザイムの触媒性ドメインは、あらゆる適切な触媒性ドメインとすることができる。適切な触媒性ドメインの例は、Santoro and Joyce, 199727および米国特許第5807718号に記載されている。好ましい実施態様では、触媒性ドメインはヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGAを有する。
【００４６】
ＤＮＡザイム切断部位は、c-Jun mRNAの残基A287からA1501、より好ましくはU1296からG1497の領域内であることが好ましい。c-Jun mRNA内の切断部位は、ヌクレオチド1311−1312に対応するGU部位であることが特に好ましい。
【００４７】
さらに好ましい実施態様では、ＤＮＡザイムは配列5'-cgggaggaaGGCTAGCTACAACGAgaggcgttg-3'を有する。
【００４８】
ＤＮＡザイムに基づいた治療を行う際に、細胞内環境における分解に対してできるだけ安定であることが好ましい。これを成し遂げる一つの手段は、ＤＮＡザイムの一以上の末端に3'-3'反転を導入することによる。より詳しくは、3'-3'反転（単に“反転(inversion)”とも称する）とは、末端ヌクレオチドの3'炭素とその隣接ヌクレオチドとの間の共有結合性のリン酸結合を意味する。この種の結合は、隣接するヌクレオチドの3'および5'の炭素間の通常のリン酸結合と異なり、それゆえ“反転”と呼ばれる。従って、好ましい実施態様では、触媒性ドメインの3'末端と隣接した結合ドメインにおいて、3'-末端ヌクレオチド残基が反転される。反転に加えて、即席のＤＮＡザイムは、変性ヌクレオチドを含んでもよい。変性ヌクレオチドは、例えば、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミダート結合、およびペプチド−核酸結合を含む。これらは当該分野で周知である。
【００４９】
特に好ましい実施態様では、ＤＮＡザイムは3'の位置に反転させたＴを含む。
【００５０】
外ヌクレオチド鎖分解性の分解に対する耐性およびヘリックスの熱安定性を増大させるため、ロックされた核酸アナログを製造することができる。これらのアナログに関するさらなる情報はVesterら, J.Am.Chem.Soc.,2002,124,13682-13683に与えられており、その開示を参照としてここに含める。
【００５１】
その他の実施態様では、本発明の方法は、ＲＮアーゼの基質として機能せず、遺伝子発現を立体的にブロックすることにより機能する合成アンチセンスＤＮＡ分子を用いて、c-Jun mRNAの翻訳を阻害することによって達成される。
【００５２】
別の実施態様では、本発明の方法は、アンチセンスＤＮＡとｍＲＮＡとの間に形成されたヘテロ二重鎖に存在するc-Jun mRNAのＲＮase分解を引き起こすことにより作用する合成アンチセンスＤＮＡ分子を用いてｍＲＮＡを不安定化することによりc-Jun mRNAの翻訳を阻害することにより達成される。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様の一つでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、残基U1296からG1497の領域内でc-Junにハイブリダイズする配列を含む。
【００５４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはこの全領域にハイブリダイズする必要はないと理解される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列CGGGAGGAACGAGGCGTTGを有することが好ましい。
【００５５】
別の実施態様では、本発明の方法は、配列特異的ハンマーヘッドリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイムの誘導体、例えばミニザイム(Minizymes)またはミニリボザイム(Mini-ribozymes)により、ｍＲＮＡを切断してc-Jun mRNAの翻訳を阻害することにより達成される。ここでリボザイムは以下から誘導される。
(i)ヘアピンリボザイム、
(ii)テトラヒメナグループIイントロン、
(iii)肝炎デルタウイロイドリボザイム、または
(iv)Neurosperaリボザイム。
【００５６】
リボザイムの組成は、
(i)完全にＲＮＡから成る、
(ii)ＲＮＡおよびＤＮＡ塩基から成る、または
(iii)ＲＮＡまたはＤＮＡ、および修飾塩基、糖および骨格から成る
ことは、当業者であれば理解されよう。
【００５７】
本発明では、リボザイムは、
(i)完全に合成されたものであっても、もしくは
(ii)ウイルスから誘導されたベクター内に供給された遺伝子、発現プラスミド、合成遺伝子であって患者のゲノムに相同的または非相同的に組み込まれたものまたは患者に再導入する前にex vivoで細胞に供給されたものからの転写物内に含まれる。
【００５８】
リボザイムは、残基U1296からG1497の領域でc-Jun mRNAを切断することが好ましい。
【００５９】
別の態様では、本発明の方法は、アンチセンスc-Jun mRNAの発現により、c-Jun遺伝子がそのターゲットＤＮＡに結合する能力を阻害することにより達成される。
【００６０】
さらなる実施態様では、前記核酸はc-Jun mRNAをターゲットとするdsRNA、c-Jun mRNAをターゲットとするdsRNAの産生をもたらす核酸分子、またはc-Jun mRNAをターゲットとする小さな干渉ＲＮＡ分子である。いわゆる“ＲＮＡ干渉”または“ＲＮＡｉ”は周知であり、ＲＮＡｉに関するさらなる情報はHannon, Nature,Vol418,2002,244-251およびMcManusら,Nature Reviews:Genetics,Vol3,2002,737-747に記載されており、これらの開示を参照としてここに含める。
【００６１】
一部の実施態様では、本発明の方法は、ssDNA分子がdsDNAに結合して転写を妨げることができるトリプルヘリックス（トリプレックス）法を用いてc-Jun遺伝子を直接的にターゲッティングすることにより達成される。
【００６２】
別の実施態様では、本発明の方法は、核酸転写性デコイ(nucleic acid transcriptional decoys)を用いてc-Jun遺伝子の転写を阻害することにより達成される。所定の転写因子の結合部位をコードする部分的な分子内二重鎖を形成するリニア配列を設計することができる。
【００６３】
別の実施態様では、本発明の方法は、転写デコイ法を用いて転写因子としてc-Jun活性の阻害により達成される。
【００６４】
別の実施態様では、本発明の方法は、ＧＣリッチ配列に対して選択性を有する薬剤により、ターゲットＤＮＡに結合するc-Jun遺伝子の能力の阻害により達成される。係る薬剤は、ノガラマイシン、ヘダマイシン、およびクロモマイシンＡ３２９を含む。
【００６５】
前記の阻害性核酸の投与は、当業者に周知の種々の方法及びデリバリーシステムのいずれかを用いて実施されうる。投与は、例えば、静脈内、経口、移植(via implant)、経粘膜、経皮、局所、筋肉内、皮下、または体外的に実施できる。さらに、インスタント薬剤組成物は、理想的には、一以上の慣例的に用いられる薬学的に許容できるキャリアを含む。係るキャリアは、当業者に周知である。以下に示すデリバリーシステムは、多くの慣例的に用いられるキャリアーを使用するものであって、インスタント組成物を投与するための多くの実施態様のほんの代表例である。一部の実施態様では、デリバリービヒクルは、Ｍｇ２＋または他のカチオンを、効率的なＤＮＡザイムの生理活性の補因子として機能するように含む。
【００６６】
経皮的デリバリーシステムは、パッチ、ゲル、テープ及びクリームを含み、例えば可溶化剤、浸透増強剤（例えば脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸）、親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）、および粘着剤及び粘着付与剤（例えば、ポリイソブチレン、シリコーンベース粘着剤、アクリラート、及びポリブテン）などの賦形剤を含むことができる。
【００６７】
経粘膜デリバリーシステムは、パッチ、タブレット、坐剤、ペッサリー、ゲル、及びクリームを含み、かつ、例えば可溶化剤及び促進剤（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、及びアミノ酸）およびその他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル及び誘導体、親水性ポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒアルロン酸）等の賦形剤を含むことができる。
【００６８】
経口デリバリーシステムは、タブレット及びカプセルを含む。これらは、バインダー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、他のセルロース材料及びデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトース及びその他の糖類、デンプン、リン酸二カルシウム、およびセルロース材料）、崩壊剤（例えば、デンプンポリマーおよびセルロース材料）および潤滑剤（例えばステアラート及びタルク）のような賦形剤を含むことができる。
【００６９】
再構築可能なデリバリーシステムの溶液、懸濁液および粉体は、懸濁剤（例えばゴム、キサンタン、セルロース誘導体および糖類）、湿潤剤（例えばソルビトール）、可溶化剤（例えばエタノール、水、ＰＥＧおよびプロピレングリコール）、界面活性剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム、Span、Tween、およびセチルピリジン）、防腐剤および酸化防止剤（例えば、パラベン類、ビタミンＥおよびＣ、およびアスコルビン酸）、凝結防止剤、コーティング剤、およびキレート剤（例えばＥＤＴＡ）のようなビヒクルを含む。
【００７０】
典型的なデリバリーシステムは、例えば、ゲルおよび溶液を含み、例えば可溶化剤、浸透増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）のような賦形剤を含むことができる。好ましい実施態様では、薬学的に許容できるキャリアーはリポソームまたは生分解性ポリマーである。本発明で用いることができるキャリアーの例は、以下を含む：（１）Fugene6（登録商標）（Roche）；（２）SUPERFECT（登録商標）(Qiagen)；（３）Lipofectamine 2000（登録商標）(GIBCO BRL)；（４）セルフェクチン(CellFectin),1:1.5(M/M) カチオン性脂質N,NI,NII,NIII-テトラメチル-N,NI,NII,NIII-テトラパルミチルスペルミンおよびジオレオイルホスファチジル-エタノールアミン(DOPE)のリポソーム製剤（GIBCO BRL）；（５）Cytofectin GSV, 2:1(M/M)カチオン性脂質とDOPEのリポソーム製剤（Glen Research）；（６）DOTAP（N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)-N,N,N-トリメチル-アンモニウムメチルスルファート）（Boehringer Mannheim）；および（７）Lipofectamine, 3:1(M/M)ポリカチオン性脂質DOSPAと中性脂質DOPEとのリポソーム製剤（GIBCO BRL）。
【００７１】
記載した核酸のデリバリーは、一以上の以下の非限定的なビヒクルの例の一以上を介して達成することもできる。
（ａ）リポソーム、およびリポソームタンパク複合体、および混合物、
（ｂ）非リポソーム脂質およびカチオン性脂質製剤；
（ｃ）活性化デンドリマー製剤；
（ｄ）ポリエチレンイミン（PEI）またはプルロニックゲルのようなポリマー製剤中、あるいはエチレンビニルアセタートコポリマー（EVAc）中。このポリマーは、好ましくは腔内に輸送される；
（ｅ）センダイウイルスのようなウイルス-リポソーム複合体中；
（ｆ）ペプチド-ＤＮＡ複合体；
（ｇ）カテーテルを利用して、溶液としての、またはリポソームとの複合体としての核酸の腔内製剤を輸送；
（ｈ）溶液として、またはリポソームとの複合体として、外膜組織へのカテーテル輸送；
（ｉ）核酸が、ターゲッティング分子のようなデリバリー剤、またはペプチドや脂肪酸分子のような適切なあらゆるキャリアーに結合されても良い；
（ｊ）核酸が、カテーテルに固定されたダブル血管形成バルーン装置により輸送されても良い；または
（ｋ）核酸が、Schatz-Palmazや誘導型の特に調節されたステント上で輸送されうる。このステントは、血管壁で分子の除法放出を可能にするように、核酸をしみ込ませたポリマーまたは薬剤で被覆することができる。
【００７２】
インスタントの薬学的組成物の予防上の有効量を調べることは、機械的なコンピューターによる方法を用いて、動物データに基づいて行うことができる。一つの実施態様では、予防上の有効量は、約０．１ｍｇから約１ｇのインスタントのＤＮＡザイムを含む。別の実施態様では、予防上の有効量は、約１ｍｇから約１００ｍｇのインスタントのＤＮＡザイムを含む。さらなる実施態様では、予防上の有効量は、約１０ｍｇから約５０ｍｇのインスタントのＤＮＡザイムを含む。さらに好ましい実施態様では、予防上の有効量は、約２５ｍｇのインスタントのＤＮＡザイムを含む。
【００７３】
固形腫瘍増殖の阻害または血管形成の予防または低減の場合、好ましい実施態様では、薬剤が腫瘍の近傍または内部に注入される。注入可能な薬剤輸送システムは、溶液、懸濁液、ゲル、ミクロスフィア、およびポリマー注入物を含み、可溶性変更剤（例えば、エタノール、プロピレングリコールおよびスクロース）およびポリマー（例えば、ポリカプリラクトンおよびＰＬＧＡ）のような賦形剤を含むことができる。移植可能なシステムは、棒状のものおよび皿状のものを含み、ＰＬＧＡおよびポリカプリラクトンのような賦形剤を含むことができる。
【００７４】
c-Junをターゲットとする核酸剤を、細胞懸濁物のex vivoトランスフェクションにより投与し、かくして血管形成を阻害することも考えられる。
【００７５】
第四の態様では、本発明は、再狭窄、新生内膜形成、アテローム硬化症、移植不全、および／または血管形成を阻害する試薬のスクリーニング方法を提供するものであり、当該方法は、c-Junの誘導を阻害、c-Junの発現を低減、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する能力について推定試薬を調べることを含む。
【００７６】
前記推定される薬剤は、あらゆる適切な手段によりc-Junを阻害する能力について試験することができる。例えば、当該試験は、c-Junを発現する細胞を、前記推定される薬剤と接触させて、かつ、c-Jun mRNA（例えば、ノーザンブロット解析により）またはc-Junタンパク質（例えば、免疫組織化学的解析またはウェスタンブロット解析または電気泳動解析により）の産生をモニタリングすることを含むことができる。他の適切な試験は、当業者に周知であろう。
【００７７】
第五の態様では、本発明は、残基A287からA1501、好ましくはU1296からG1497の領域でc-Jun mRNAを特異的に切断する触媒性核酸である。
【００７８】
好ましい実施態様では、前記触媒性核酸は、以下を含む配列特異的ＤＮＡザイム：
(i)プリン：ピリミジン切断部位でmRNAを切断する触媒性ドメイン；
(ii)触媒性ドメインの５’末端に隣接した第一結合ドメイン；および
(iii)触媒性ドメインの３’末端に隣接した第二結合ドメイン
である。
ここで、ＤＮＡザイムがc-Jun mRNAを切断するように、前記結合ドメインは、残基U1296からG1497の領域で、c-Jun mRNA内のプリン：ピリミジン切断部位に隣接した二つの領域に十分に相補的である。
【００７９】
c-Jun mRNA内の前記切断部位がヌクレオチド1311-1312に対応するGU部位であることが特に好ましい。
【００８０】
好ましい実施態様では、ＤＮＡザイムの結合ドメインは、前記切断部位に隣接する領域に相補的である。しかしながら、当業者であれば、厳密な相補性は、ＤＮＡザイムがc-Jun mRNAに結合して切断するのに必要ないかもしれないことを理解できるであろう。
【００８１】
結合ドメインの長さ（“アーム長さ”とも称する）は、あらゆる組み合わせとすることができ、同一であっても相違しても良い。好ましい実施態様では、結合ドメインの長さは少なくとも６ヌクレオチドである。好ましくは、両方の結合ドメインが、組み合わせて、少なくとも１４ヌクレオチドの合計の長さを有する。二つの結合ドメインの長さの種々の組み合わせ、例えば７＋７、８＋８、および９＋９を考えることができる。好ましくは二つの結合ドメインの長さは９＋９である。
【００８２】
本発明に係るＤＮＡザイムの触媒性ドメインは、あらゆる適切な触媒性ドメインとすることができる。適切な触媒性ドメインの例は、Santoro and Joyce, 199727および米国特許第5807718号に記載されている。好ましい実施態様では、触媒性ドメインはヌクレオチド配列GGCTAGCTACAACGAを有する。
【００８３】
さらに好ましい実施態様では、ＤＮＡザイムは配列5'-cgggaggaaGGCTAGCTACAACGAgaggcgttg-3'を有する。
【００８４】
ＤＮＡザイムに基づいた治療を行う際に、細胞内環境における分解に対してできるだけ安定であることが好ましい。これを成し遂げる一つの手段は、ＤＮＡザイムの一以上の末端に3'-3'反転を導入することによる。より詳しくは、3'-3'反転（単に“反転(inversion)”とも称する）とは、末端ヌクレオチドの3'炭素とその隣接ヌクレオチドとの間の共有結合性のリン酸結合を意味する。この種の結合は、隣接するヌクレオチドの3'および5'の炭素間の通常のリン酸結合と異なり、それゆえ“反転”と呼ばれる。従って、好ましい実施態様では、触媒性ドメインの3'末端と隣接した結合ドメインにおいて、3'-末端ヌクレオチド残基が反転される。反転に加えて、即席のＤＮＡザイムは、変性ヌクレオチドを含んでもよい。変性ヌクレオチドは、例えば、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホロアミダート結合、およびペプチド−核酸結合を含む。これらは当該分野で周知である。
【００８５】
特に好ましい実施態様では、ＤＮＡザイムは3'の位置に反転させたＴを含む。
【００８６】
別の実施態様では、前記触媒性核酸は、配列特異的ハンマーヘッドリボザイムおよびハンマーヘッドリボザイムの誘導体、例えばミニザイム(Minizymes)またはミニリボザイム(Mini-ribozymes)であり、ここでリボザイムは以下から誘導される。
(i)ヘアピンリボザイム、
(ii)テトラヒメナグループIイントロン、
(iii)肝炎デルタウイロイドリボザイム、または
(iv)Neurosperaリボザイム。
ここで、リボザイムは、残基U1296からG1497の領域でc-Jun mRNAを切断する。
【００８７】
リボザイムの組成は、
(i)完全にＲＮＡから成る、
(ii)ＲＮＡおよびＤＮＡ塩基から成る、または
(iii)ＲＮＡまたはＤＮＡ、および修飾塩基、糖および骨格から成る
ことは、当業者であれば理解されよう。
【００８８】
本発明では、リボザイムは、
(i)完全に合成されたものであっても、もしくは
(ii)ウイルスから誘導されたベクター内に供給された遺伝子、発現プラスミド、合成遺伝子であって患者のゲノムに相同的または非相同的に組み込まれたものまたは患者に再導入する前にex vivoで細胞に供給されたものからの転写物内に含まれる。
【００８９】
第六の態様では、本発明は、残基U1296からG1497の領域でc-Jun mRNAに特異的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００９０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはこの全領域にハイブリダイズする必要はないと理解される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列CGGGAGGAACGAGGCGTTGを有することが好ましい。
【００９１】
第七の態様では、本発明は、上記本発明の第五の態様の触媒性核酸または上記本発明の第六の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および薬学的に許容できるキャリアーを含む薬学的組成物である。
【００９２】
第八の態様では、本発明は、再狭窄の開始を妨げる血管形成(angioplastic)ステントであり、c-Jun mRNAレベル、c-Jun mRNA翻訳、またはc-Junの核蓄積または活性を低減する核酸の予防上有効量で被覆した血管形成ステントを含む。
【００９３】
前記薬剤は、本発明の第五の態様の触媒性核酸であるか、本発明の第六の態様のアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
【００９４】
第九の態様では、本発明は、血管形成を受けている患者の再狭窄の開始を阻害する方法であり、血管形成時に患者に本発明の第八の態様に係るステントを局所的に適用することを含む。
【００９５】
“血管内ステント”または単に“ステント”のような別の用語でも知られる血管形成ステントは、当該技術分野で周知である。これらは、外科的外傷による血管組織の望ましくない内部への増殖のような身体的異常による血管閉鎖を妨げるために機械的に用いられる。これらは、多くの場合、その機能に適した、管状の、膨張するラテックス型構造を有し、任意に生分解性とすることができる。
【００９６】
本発明では、ステントは、当該技術分野で周知のあらゆる適切な手段を用いてインスタントの薬学的組成物で操作可能に被覆することができる。ここで、ステントを“操作可能に被覆”とは、被覆されたステントが適用されたときに、治療されるべき周辺組織に薬学的組成物が折良く放出されるようにステントを被覆することを意味する。係る被覆方法は、例えば、ポリマーポリピロールを用いることができる。
【００９７】
ここで用いるように、“血管新生の時に”適用することは、処置の最中に、または処置の前後に行うことができる。かかる適用は、カテーテルデリバリーのような公知の方法に従って行うことができる。
【００９８】
本願明細書を通じて、用語“含む("comprise"、"comprises"、"comprising")”は、記載した成分、数、または工程、あるいは記載した成分、数、または工程の群を包含することを意味すると解するが、それ以外のあらゆる成分、数、または工程、あるいは成分、数、または工程の群の排除を意図するものではないと理解される。
【００９９】
本明細書に挙げられている全ての刊行物を、参照としてここに含める。
【０１００】
本明細書に含まれている刊行物、作用、物質、装置、物などのあらゆる記載が、本発明の内容を与えるためのものである。これらのいずれかまたは全てが、本願の各請求項の優先日前のオーストラリアに存在した、従来技術の一部をなす、もしくは、本発明に関する分野の一般知識であるとは考えられない。
【０１０１】
本発明の性質がより明確に理解できるように、本発明の好ましい形態を、以下の非限定的な実施例を参照しながら記載する。
【０１０２】
DNAザイム、in vitro転写物及び切断実験
Oligos Etc.又はTrinLinkにより3’−3’結合の反転したTでDNAザイムを合成し、HPLCによって精製した。32P標識した668塩基のc-Jun RNA転写物を、予めXbalで切断した、挿入断片を含むpBluescriptの（T7ポリメラーゼを用いた）in vitro転写により調製した。10mM MgCl2、5mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.5pmolのin vitroで転写された基質、及び、容量依存切断実験を行わないならば、10pmol DNAザイムを含む総容量20μlにおいて、反応を行った。本実験における、ストイキオメトリを図に示す。37℃で様々な時間において反応を進行させ、一定容量をホルムアミド充填バッファーを含むチューブに移すことによってクエンチさせた。サンプルを12％変性ポリアクリルアミドゲルで泳動し、−80℃で一晩オートラジオグラフィー法に供した。
【０１０３】
平滑筋細胞培養、トランスフェクション、増殖及び障害アッセイ
ヒト及びブタの冠状動脈由来の平滑筋細胞をCell Applications, Inc (San Diego, CA)から入手し、10％ウシ胎仔血清、50μg/mlストレプトマイシン及び50IU/mlペニシリンを含むWaymouth’s培地、pH7.4中で、5％CO2の加湿雰囲気下において、37℃で培養した。全てのin vitroでの実験において、7継代を超える平滑筋細胞は使用しなかった。製品の取扱説明書(Roche)に従ってFuGENE6を用いて、血清フリーの培地に変換後6時間に、そして、再び停止開始後24時間の血清刺激時に、平滑筋細胞においてトランスフェクションを行った。増殖アッセイにおいては、96穴プレート（Nunc-InterMed）中の増殖が停止した平滑筋細胞を、DNAザイム又はオリゴヌクレオチドの指示された濃度でトランスフェクトし、その後、37℃で72時間5％FBSに曝した。細胞をトリプシン処理し、懸濁液を自動化されたカルチャーカウンター（Coulter counter）内で定量化した。障害アッセイにおいては、DNAザイムでトランスフェクトした、チャンバースライド（Nunc-InterMed）内の密集した平滑筋細胞を、滅菌した爪楊枝でこすることによって傷をつけた。傷をつける前に、細胞をマイトマイシンC（Sigma）(20μM)で処理し、増殖をブロックした。傷つけた後72時間で、細胞をPBS、pH7.4で洗浄し、ホルムアルデヒドで固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【０１０４】
抗体
基本的に記載されているように11,30、c-Jun及びSp1を標的とするウサギポリクローナル抗ペプチド抗体(Santa Cruz Biotechnology)を用いて、頚動脈血管内膜切除検体のウェスタンイムノブロット、及び免疫組織化学的解析を行った。
【０１０５】
総頚動脈障害及び新生内膜形成の評価
ケタミン（60mg/kg, i.p.）及びキシラジン(8mg/kg, i.p.)を用いて、Sprague Dawleyラット（450mg 雄）を麻酔した。首の正中切開により、左の総頚動脈及び外頚動脈を露出させ、結紮を分岐点に近接する外頚動脈に適用した。結紮前6時間及び結紮時にもう一度、DNAザイム（750μg）、FuGENE6(30μl)、MgCl2(1mM)及びP127 Pluronicゲル(BASF)を含む200μｌ（4℃で）を管の周りにアプライした。37℃で管と接触させた後、溶液がゲル化した。切開部を縫合し、ラットを回復させた。致死量のケタミン/キシラジンの注入により、障害後21日で動物を殺し、120mmHgで10％(v:v)ホルムアルデヒドを用いて血流を固定した。頚動脈を10％ホルムアルデヒド中に置き、3％(w:v)アガロース中で包埋し、パラフィンで固定化して、結び目(tie)から1000μmで切片化した。ヘマトキシリン及びエオシンで染色した5μm切片中の新内膜形成及び内側領域を形態計測学的に求め、6匹のラット群につき平均の割合として表した。
【０１０６】
内皮細胞培養及びトランスフェクション
10％ウシ胎仔血清（FBS）、2mM L-グルタミン、10ng/ml 上皮増殖因子、1μg/mlヒドロコルチゾン、及び5U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含むMCDB131培地（GIBCO BRL）中で、ヒトの微小血管内皮細胞−1（HMEC-1）を増殖させた。10％ウシ胎仔血清、2mM L-グルタミン及び5U/mlペニシリン/ストレプトマイシンを含むDulbecco’s modified Eagles培地（DMEM, GIBCO BRL）中で、マウスの脳微小血管内皮細胞(bEND-3)を培養した。血清フリー培地中での増殖停止の開始後6時間で、subconfluentな状態の細胞（60-70％）を用いて、FuGENE6でDNAザイムのトランスフェクションを行った。最初のトランスフェクション後18時間で、血清を含む倍地中で細胞に二回目のトランスフェクションを行った。
【０１０７】
ウェスタンブロット解析
トータル細胞抽出液の調製に先立つ2時間、150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS、1％トリトンX-100、5mM EDTA、10μg/mlロイペプチン、1％アプロチニン及び2mM PMSF中で、DNAザイムで二回トランスフェクトした増殖停止の内皮細胞を血清中で培養した。これらの抽出液を12％PAGEゲルで分離し、PVDFナイロン膜上に転写し、望ましい抗体（Santa Cruz Biotechnology）をプローブとして用いた。タンパク質は化学発光（NEN）により検出した。
【０１０８】
核抽出液及びEMSAの調製
細胞を氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に入れ、ペレットにし、10mM Hepes、pH7.9、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.5％ NP-40、1mM DTT、0.5mM PMSF、4μg/mlアプロチニン及び10μg/mlロイペプチンを含む溶菌バッファー内で再懸濁した。氷上で5分間反応後、20分間低速で攪拌しながら、20mM Hepes、pH7.9、1.5mM MgCl2、420mM NaCl、0.2mM EDTA、1mM DTT、0.5mM PMSF、4μg/mlアプロチニン及び10μg/mlロイペプチン中で、ペレットを再懸濁した。当量の20mM Hepes、pH7.9、100mM KCl、0.2mM EDTA、20%グリセロール、1mM DTT、0.5mM PMSF、4μg/mlアプロチニン及び10μg/mlロイペプチンと上清を混合した。二本鎖のオリゴヌクレオチドを、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（NEB）を用いて、[γ32P]ATPで5’末端標識した。10mM Tris-HCl、pH7.5、50mM NaCl、0.5mM DTT、0.5mM EDTA、1mM MgCl2、5％グリセロール、2.5μgのポリdI-dI中で、150,000cpmのプローブと20分間室温で反応させた。トリス−ホウ酸−EDTAバッファー系中で、未変性8％PAGEにより、結合した複合物を分離させた。スーパーシフト研究のために、32P標識プローブの添加前10分間に、核抽出液を2μgのc-Jun抗体と反応させた。
【０１０９】
内皮の増殖及び障害アッセイ
血清を含む培地中で、トリプシン処理、IsotonII(Coulter Electronics)中への再懸濁及びカルチャーカウンター(Coulter Z series)を用いた定量の前に2日間、DNAザイムで処理した増殖停止内皮細胞を培養した。DNAザイムでトランスフェクトした内皮細胞を密集になるまで増殖させ、P200チップでこすって傷をつけた。傷をつけた後2日間で、細胞をPBS、pH7.4で洗浄し、4％パラホルムアルデヒド(v/v)で固定し、顕微鏡撮影前に、ヘマトキシリン及びエオシン中で染色した。ブラインドで選んだ3サンプルにおいて、100X拡大率で、各群の剥皮したゾーンの細胞数を求めた。
【０１１０】
細管形成アッセイ
DNAザイムでトランスフェクトした内皮細胞を100mmペトリディッシュで増殖させ、その後、トリプシン処理し、100μlのマトリゲル（BD Biosciences）でコーティングした96穴プレートで再懸濁した（1ウェルあたり30,000細胞）。ブラインドで選んだサンプルにおいて400X拡大率で顕微鏡によって、細管形成を定量した。
【０１１１】
HMEC-1の転移及び浸潤
ポリカーボネートメンブレン膜（12μmポアサイズ）をマトリゲル（1mg/ml）(BD Biosciences)又はコラーゲンタイプI（1mg/ml）(Sigma)で一晩コーティングし、風乾した。予めDNAザイムでトランスフェクトした内皮細胞(4X105/ml)を、改良したBoydenチャンバーの上部チャンバー内に設置した。下部チャンバーの培地には、FGF-2(20ng/ml)を添加した。37℃での24時間培養後、フィルターをメタノール中で固定し、ヘマトキシリンで染色し、膜の下側に転移した細胞を400X拡大率で定量した。
【０１１２】
RT-PCR
停止後6時間で、0.4μMのDz13又はDz13scrで細胞をトランスフェクトした。18時間後、細胞をTGF-beta1(10ng/ml, Promega)で培養し、0.4μMのDz13又はDz13scrで再度トランスフェクトした。24時間後、トータルRNAをトリゾール（Invitrogen）を用いて調製した。200U逆転写酵素（Superscript II）、500μM dNTP、及び0.5μgのoligo(dT)15(Life Technologies)を用いて20μl容量の反応液中で、4μgのトータルRNAから一本鎖cDNAを合成した。1U DNAポリメラーゼ、100μM dNTP、30mM MgCl2(Invitrogen)及び0.1μMプライマーを用いて20μl容量中で、PCRを行った。MMP-2 PCRは、30秒間95℃、30秒間57℃、40秒間72℃を22サイクルにわたって行った。予想されるMMP-2増幅産物は446bpであった。cDNAサンプルをGAPDH（452bp生成物）で標準化した。プライマーを以下に示す：MMP-2:フォワード5’-GGG ACA AGA ACC AGA TCA CAT AC-3’、リバース5’-CTT CTC AAA GTT GTA GGT GGT GG-3’;GAPDH:フォワード5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’、リバース5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。
【０１１３】
MMP-2 ELISA
0.1％FBSを添加した培地中で、2日間、10ng/ml TGF-beta1で、DNAザイムでトランスフェクトした内皮細胞を培養した。条件培地を回収し、遠心し、均等なタンパク質で標準化し、市販のELISA（Amersham Biosciences）を用いてMMP-2のレベルを求めた。
【０１１４】
SDS-PAGE及びゼラチン酵素電気泳動
最終濃度を1mg/mlで、ウシタイプBゼラチン（Sigma）を標準10％PAGE分離ゲル混合液（4％濃縮）へ含浸させた。指示があるならば、DNAザイムでトランスフェクトした内皮細胞を10μgのc-Jun発現ベクターで同時にトランスフェクトした。当量のタンパク質をロードし、4℃で電気泳動を行った。その後、ゲルを2.5% Triton X-100(Sigma)に浸し、基質バッファー（50mM Tris HCl、pH7.6、10mM CaCl2、及び0.02% NaN3）中で、一晩37℃で反応させた。水、メタノール及び氷酢酸（5:4:1）に溶かした0.2％ Coomassie Blue R-250中で1時間染色し、その後、ゲルを最終的に脱色すると、ゼラチン分解活性が明らかになり、写真撮影した。
【０１１５】
免疫組織染色
既に示したように66、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した、パラフィン中のヒト皮膚悪性黒色腫の切片を、c-Jun又はCD31に対するウサギ抗ペプチドポリクローナル抗体、又は、MMP-2に対するヤギ抗ペプチド抗体で染色した。必要に応じて、ビオチン化抗ウサギ又は抗ヤギ二次抗体のいずれかと切片を反応させた後、免疫活性を明らかにした。
【０１１６】
ラットの角膜血管新生モデル
7 w.o. Sprague Dawleyラットの角膜に、予め少なくとも30分間82mM Tris-HCl(pH6.9)で溶かした30μM VEGF165中に浸した直径0.57mmのニトロセルロースフィルターディスクを組み込んだ。その後に、組み込んだ後のディスクに近接する結膜にDNAザイム（100μg）又は単独のベヒクルを投与した。角膜を注意深く除去した後に、(i)血管新生によってふさがった区域（「0.2×π×血管形成の実働時間×最大の管の長さ」として計算される）及び(ii) 組み込み後、角膜5d内において増殖する管の数を定量した。
【０１１７】
腫瘍移植マウスモデル
200μlのマトリゲル中の750μgのDNAザイムを用いて、C57BL/J6(6 w.o.)マウスの中間背部領域へ、B16F10細胞(5X104)を皮下注射した。図で示す時間で、デジタルで体重及び腫瘍容積を測定した。方程式、長さ×幅×高さ×0.52を用いて、腫瘍容積(mm3)を求めた。
【０１１８】
結果
血管平滑筋細胞における、Dz13によるc-Jun RNA切断及び誘導性c-Jun発現のブロック
2つの9ヌクレオチドハイブリダイジングアーム、及び、低い自由エネルギーで様々な領域を標的とするシングル15塩基の活性モチーフを有する、7つのDNAザイム（図２Ａ）について、32P標識したin vitroで転写したc-Jun RNAを切断する能力を評価した。最初に、構造的な完全性を確かめるために、変性電気泳動によって、7つのDNAザイム及びc-Jun転写物を分離した（図２Ｂ）。物理的な条件下1時間37℃において、668塩基のc-Jun転写物は、DNAザイムDz10、Dz12、Dz13、Dz14及びDz15によって切断されたが、Dz9及びDz11によっては切断されなかった（図２Ｂ）。G1311U接合部（ヒトc-Jun mRNAにおける転写開始点はA1261UGに位置する）を標的とする、活性なDNAザイムの1つである、Dz13は、時間依存的（図２Ｃ、上パネル）及び容量依存的（図２Ｃ、下パネル）に、15分以内に転写産物を切断し、474及び194塩基の生成物を産生した。活性ドメインの完全性を妨げないでDz13のハイブリダイジングアームをスクランブルした、DNAザイムDz13scrは、如何なる時間又は化学量論比でも切断しなかった（図２Ｃ）。一次ヒト動脈平滑筋細胞（primary human arterial smooth muscle cells）における内因性のc-JunのDz13阻害を求めるために、我々は、予め0.5μM Dz13又はDz13scrでトランスフェクトし、2時間37℃で血清に曝した増殖停止細胞を用いたウェスタンブロット解析を行った。血清誘導c-Jun免疫活性（39kDa）は、Dz13により強く阻害されたが、スクランブルした対象物は如何なる効果も及ぼさなかった（図２Ｄ）。
【０１１９】
ZukerianのmRNA中の低い自由エネルギーである領域予想（Zukerian prediction of regions of low free energy in the mRNA）に基づき、スクリーニングした全てのc-Jun DNAザイムは、溶液に曝されていると思われるmRNA中の領域を標的とし、翻訳装置が結合し鎖に沿って移動する、mRNAの5’末端の優先性を示した。本研究により、Zuker解析は傷を受けていない細胞における如何なるDNAザイムの効率も保障しない。その理由は、全てではないが唯一いくつかの、in vitroで転写したc-Jun mRNAを切断するDNAザイム配列が、実際に細胞の増殖を阻害することができるからである。このことは、in vitroで転写したc-Jun mRNAと内因性のmRNAの間の部位接触性及び構造の違い、DNAザイムのトランスフェクション効率、末端の細胞環境におけるイオン及び他のDNAザイムの補因子の濃度、及び生物が利用可能なDNAザイムの量を減じさせる、可能性ある特定のヌクレオチド配列に意図しない優先性を有するDNA結合タンパク質の存在（増殖因子、シグナル分子等のような）が原因であろう（限定するものでないが）。
【０１２０】
Zukerの解析によりDNAザイムの効率を正確に予想することができない事は、効率的なDNAザイムをデザインする妨げとならない。いったん特定の標的を選択するならば（例えばc-Jun）、図２に示すように、特定のmRNAを標的とするDNAザイムの範囲をデザインしテストすることは、ルーチンな仕事である。
【０１２１】
Dz13による血管平滑筋細胞増殖のブロック
我々は、次に、ヒト及びブタの血管に由来する一次血管平滑筋細胞における、Dz13及びc-Jun DNAザイム群の影響を求めた。c-Jun mRNA内のDz13標的部位は、ブタ及びラットのc-Jun RNAおいてはAである1319位での1つのC塩基を別として、ヒト、ブタ及びラットの間で保存されている（図３Ａ、上パネル及び真中のパネル）。本基質の場合、DNAザイムの活性効率は、基質中の1つのピリミジン残基をプリンで置換することによって、ほとんど影響を受けなかった32。Dz13（0.5μM）は、両方の細胞タイプの血清誘導増殖を完全にブロックし（図３Ｂ及びＣ）、完全なDNAザイムパネルとして最も有効であった。Dz13阻害は、容量依存的であり、100nMという低い濃度で検出できた。対照的に、Dz13scrは平滑筋細胞増殖を阻害せず（図３Ｂ）、これは血清誘導性c-Junタンパク質に影響を与えないことと一致した（図２Ｄ）。驚くべきことに、いくつかのＤＮＡザイム（Dz9、Dz11、Dz15）は、血清単独の効果を超えて増殖を刺激した（図３Ｂ及びＣ）。加えて、Dz10 （Dz13と同じ効率でc-Jun転写物を切断する（図２Ｂ））は、Dz13と異なり、両方の細胞タイプにおいて平滑筋細胞の増殖を調整しなかった（図３Ｂ及びＣ）。正確なアンチセンスオリゴヌクレオチド対照物と比べてc-Jun DNAザイムがより有効であることを求めるために、我々は、Dz13のようにホスホジエステルのバックボーン及び3’−3’結合の反転したTを含むが、活性部位を有さない、As13を産生した（図３Ａ）。As13は容量依存的な阻害を示したが、Dz13の方が阻害剤としての効果が2倍であった（図３Ｄ）。
【０１２２】
Dz13による、ラット頚動脈における内膜肥厚及びin virto障害後の血管平滑筋細胞修復の阻害
in vitroモデルにおける機械的にこするによって生じた傷ついた縁での平滑筋細胞の再増殖は、0.5μM Dz13の存在により停止するのに対して（図４）、Dz13scrの存在による修復は、オリゴヌクレオチド無しのウェルと異ならなかった（図４）。平滑筋細胞増殖及び修復は、Dz13によってネガティブに調整されている工程であるので、我々は、次に、c-Jun DNAザイムが、ラット頚動脈への結紮後に内膜肥厚に影響を与えるか否かを求めた。ラットにおける障害に対する動脈の反応により、病変形成の基礎を成す細胞及び分子イベントに重要な見識が付与された34。障害及びDz13scrの局所的な投与後3週間での新生内膜形成は、ベヒクル単独の群において観察された結果と顕著な差異は無かった（図５Ａ及びＢ）。しかしながら、内膜肥厚は、60％のオーダーのDz13により抑制された（図５Ａ及びＢ）。免疫組織化学解析により、頚動脈中膜の平滑筋細胞において、Dz13はc-Jun免疫活性の誘導を阻害することが示されたが、Dz13scrは如何なる効果も及ぼさなかった（図５Ｃ）。対照的に、どちらのDNAザイムもSp1のレベルには如何なる影響も及ぼさなかった（図５Ｃ）。総合すると、これらのデータは、平滑筋細胞増殖、障害修復及び新生内膜形成のためのc-Junの重要な役割を明示する。以前から、頚動脈新生内膜形成は、NFκ-Bのp65サブユニット35、c-myb36、c-myc37、及びcdc2キナーゼ/増殖細胞核抗原（PCNA）38を含む、細胞周期調整分子及び特定の転写因子を直接認識するホスホロチオエート結合アンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害されていた。c-Jun mRNAの同じ配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドとホスホジエステル結合DNAザイムを直接比較することによって（それぞれはアーム長が一致し、3’−3’の反転したTを有する）、本研究は、如何なる濃度においても前者の分子による優先的な阻害を明らかした。c-Jun DNAザイムは、幅広い基本的な細胞工程において転写因子の正確な機能を証明するための、新規でより有効な遺伝子特定的なツールとして働き得る。
【０１２３】
c-Junは、関節炎39、腫瘍症40、急性肺障害41、瘢痕42、UV誘導角膜損傷43及び骨粗鬆症44のような、他の繊維増殖性の炎症進行の病原に関与すると考えられていることから、c-Jun及び他の重要な調整分子を標的とするDNAザイムは、単独で又は組み合わせて、増殖性の血管疾患及び他の病気の進行を阻害する効果を発揮するであろう。
【０１２４】
血管形成におけるc-Junの関与
血管形成、新規の血管の形成は、腫瘍細胞の増殖及び転移にとって絶対条件であることから、微小血管内皮細胞は、癌治療における重要な標的となっている。血管形成は、また、関節炎及び糖尿病性網膜症のような他の共通なヒトの病気の病原において、重要な工程である。血管形成は、内皮細胞増殖、転移、及び細管形成を含む、複合的な工程である。
【０１２５】
Dz13による、c-Junタンパク質発現、DNA結合活性、転移、増殖及び微小血管内皮細胞による細管形成の阻害
c-Junは、ジンクフィンガー転写因子Sp1と異なり、増殖が停止しているヒトの微小血管内皮細胞においてわずかに発現しているだけであるが、血清に曝して2時間以内に誘導される。Dz13、ヒトc-Jun mRNAのコード領域におけるG1311U接合部を標的とするDNAザイムは、0.4μMの濃度でc-Junタンパク質発現をブロックした。対照的に、c-Jun活性は、同様のDz13scr（スクランブルした9＋9塩基アームによって側面に位置されるDz13のアクティブな触媒ドメインを有するが、安定性を付与する3’−3’結合の反転したTを保持する33）の濃度によっては影響を受けなかった。DNAザイムの触媒ドメインを喪失している、As13（Dz13のアンチセンスオリゴヌクレオチド対照物（3’に反転したTを含む））は、また、誘導性c-Junタンパク質発現を阻害するが、スクランブルしたタイプ、As13scrは、如何なる影響も及ぼさなかった。Sp1レベルは、如何なる分子テストによっても変化しなかった（データを示さず）。
【０１２６】
増殖が停止した微小血管内皮細胞に由来するc-Jun及び核酸出物のためのコンセンサスな結合要素を有する32Pで標識したオリゴヌクレオチドを用いた、電気泳動による移動性シフト解析により、かすかな核タンパク質複合体が生成されていた。誘導性のDNA結合活性は、Dz13（0.4μM）及びc-Jun抗体（2μg）と抽出液とのプレインキュベーションによって見られなくなるが、Dz13scrは影響を及ぼさなかった（データを示さず）。
【０１２７】
前記知見により、c-Jun DNAザイムの有する、c-Junタンパク質発現及び配列特異的にDNA結合活性をブロックする能力が明らかになった。我々は、次に、これらの分子の内皮細管形成、増殖及び転移に及ぼす影響を求めた。
【０１２８】
内皮細胞は、自発的に、マトリゲル上に三次元の細管キャピラリー様ネットワークを形成する。内皮細胞はマトリゲル上に整列し、プレーティング後数時間以内にコード（cord）を形成する。Dz13は、容量依存的に、細管形成をブロックした（図６）。この工程は、Dz13scrの存在によっては変化しなかった（図６）。これらの知見により、c-Junが内皮ネットワークの形成に必要であることが示される。Dz13及び他のDNAザイムの標的部位を図７Ｂに示す。
【０１２９】
血清存在下における内皮細胞増殖は、Dz13によって阻害されるたが（図８Ａ）、Dz13scrによっては阻害されなかった（図８Ａ）。Dz13阻害は配列特異的であり、容量に依存し、0.3μMで最大である（図８Ｂ）。As13もまた、内皮増殖を弱めるが（図８Ａ）、同じ濃度ではc-Jun DNAザイムよりも効率は悪く（図８Ａ）、c-Junの発現に対するこれらの効果に一致する。
【０１３０】
9＋9塩基のアームを有する、Dz13の生物学的活性におけるアーム長の影響を明らかにするために、我々は、10＋10、11＋11及び8＋8塩基アームを有するネスト化した一連のDNAザイムを、スクランブルしたアーム対照物と共に合成した。0.4μMの濃度において、Dz13(11＋11)及びDz13（8＋8）は、ネイティブDz13と同じ効率で、内皮増殖を阻害した（図８Ｃ）。しかしながら、これらのDNAザイムをより低い濃度で（0.2μM）用いた場合、Dz13（11＋11）及びDz13(8＋8)は、Dz13によりも内皮増殖の阻害効率が悪かった（図８Ｃ）。Dz13、Dz13(11＋11)又はDz13(8＋8)に比べて、Dz13(10＋10)は阻害が弱かった。
【０１３１】
ウェスタンブロット解析により、Dz13のように、Dz13(11＋11)及びDz13(8＋8)が、血清誘導c-Jun発現を阻害するが、Dz13(10＋10)、Dz13(11＋11)scr及びDz13(8＋8)scrは、ほとんど影響を及ぼさなかった。ストリップしたブロットをSp1に対する抗体でリプロービングすることによって、この核タンパク質の無関係のレベルを明らかにした。これらのデータの裏づけとして、Dz13のように、Dz13(11＋11)及びDz13(8＋8)は、時間依存的に、40塩基の32P標識した合成RNA基質を切断したが、Dz13(10＋10)、Dz13(11＋11)scr及びDz13(8＋8)scrは切断しなかった（データを示さず）。
【０１３２】
微小血管内皮細胞転移におけるc-Junの役割を明らかにするために、我々は、in vitroの内皮単層をこすり、DNA存在下及び非存在下での、2日後裸出した区域における細胞数を数えた。Dz13は、容量依存的に及び配列依存的に、障害に対する修復反応を阻害した。0.2μM Dz13の存在において、穏やかに再増殖が阻害されることが明らかであり（図９Ａ）、ほぼ完全な阻害が0.4μMで観察された（図９Ａ）。Dz13scrは、この濃度幅では、内皮再増殖を妨げなかった。これらの知見は、再構成した基底膜でコーティングした（マトリゲル）、改良したBoydenチャンバーを用いて確かめられた。マトリゲルを通り抜けて下部に位置する膜への微小血管内皮細胞の浸潤は、Dz13により50％ブロックされたが、Dz13scrによってはブロックされなかった（図９Ｂ）。コラーゲンタイプIでコーティングしたフィルターを通り抜けての細胞転移は、マトリゲルよりも盛んに生じ、同じように、Dz13により50％まで阻害されたが、Dz13scrでは阻害されなかった（図９Ｂ）。
【０１３３】
Dz13による、微小血管内皮細胞MMP-2 mRNA、タンパク質発現及びタンパク質分解活性の阻害
基質メタロプロテイナーゼ(matrix metalloproteinases (MMPs)：基底膜及び細胞外マトリクス分子を切断するプロテアーゼ)は、血管形成に重要である45。例えば、MMP-2（ゲラチナーゼAとしても知られてる）欠損マウスは、腫瘍誘導性の血管形成及び進行を損なう46。我々は、Dz13活性は、MMP-2の発現を阻害する能力によって媒介されると仮定した。半定量的RT-PCR及び酵素免疫測定法によってMMP-2 mRNA及びタンパク質発現をそれぞれ評価することによって、Dz13での処理によりMMP-2発現を減ずるが、Dz13scrを用いても変化が無いことを明らかにした（図１０）。ゼラチン酵素電気泳動による培地へと分泌されるMMP-2活性の解析から、Dz13によってゼラチンのMMP-2タンパク質分解が顕著に減ずることを明らかにした。これは、c-Junの過発現によって救出される。Dz13scr存在下では、MMP-2の如何なる変化も無かった。
【０１３４】
Dz13による、ラット角膜におけるVEGF165誘導血管新生の阻害
角膜血管新生は、炎症又は感染性の疾患に通常関連している、視力低下状態（a sight-threatening condition）である47。角膜の病気における顕著な工程は、血管の通常無血管組織であるものへの浸潤である48。我々は、角膜血管新生のラットモデルにおいて、Dz13の血管形成、MMP-2発現を含む工程49、を阻害する能力を評価した。通常の無血管性のラット角膜中への、血管内皮増殖因子（VEGF）165を浸したディスクの組み込みによって、5日以内に、角膜輪部から組み込み片へと新規の血管増殖を刺激する。本増殖因子は、また、ヒト角膜血管新生の病原と強く関与している50。ウェスタンブロット解析により、VEGF165がc-Jun発現を誘導し得ること、及び、Dz13によってブロックされるがDz13scrによってブロックされないことが明らかになった（データを示さず）。Sp1レベルは変化しなかった。Dz13は、また、in vitroでVEGF165誘導性微小血管形成を阻害した。スリットランプ（slit lamp）生物顕微鏡による可視化によって、配列特異的な方法での結膜投与により、Dz13が角膜血管新生をブロックしていることが明らかになった。血管新生を定量的に求めることにより、血管数が81％阻害されることが示された（図１１Ａ）。Dz13は、これらの新規な血管によって占められる角膜表面積を、74％まで阻害した（図１１Ｂ）。
【０１３５】
Dz13による、マウスにおける固形メラノーマ(solid melanoma)増殖の阻害
活動的なメラノーマ病変は、血管密度の顕著な増大に関与している51。以前の研究により、固形B16メラノーマのin vivo増殖が、抗Flk-1モノクローナル抗体52及びMMP-2阻害剤53、54の投与によってブロックされることが明らかにされ、このことから腫瘍増殖が血管形成及びマトリクス分解に依存することが示された。原発性ヒト皮膚悪性黒色腫(primary human cutaneous malignant melanoma)の免疫組織化学解析により、内皮細胞特異的CD31+血管において、及び、メラノーマ細胞の周りにおいて、c-Junが強く発現していることは明らかである（データを示さず）。両方の細胞タイプにおいて、MMP-2に対する抗体を用いた強烈な細胞質染色によっても明白であった（データを示さず）。原発性メラノーマにおけるc-Jun発現は、今までのところ、記載されていない。
【０１３６】
Dz13は、時間依存的に及び配列特異的に、C57BL/J6マウスにおいて固形B16増殖をブロックした（図１２Ａ）。c-Jun DNAザイムは、14日以内に約70％まで腫瘍増殖を阻害したが、Dz13scrで処理した腫瘍は、ベヒクル群と見分けがつかなかった（図１２Ａ）。Dz13の効率は、他の治療群と比較して、体重の差異とは関連性を有していなかった（図１２Ｂ）。毒性効果の欠如とともに、倦怠感、ruffled fur、皮膚紅斑、及び軟便の証拠は存在しなかった。Dz13はc-Junタンパク質発現をブロックし（データを示さず）、マウスの微小血管内皮細胞の増殖をブロックしたが（図１２Ｃ）、Dz13scrは、いずれの工程も阻害しなかった。
【０１３７】
複合的な生物環境において特異的な遺伝子を標的とするストラテジーは、リボザイム、ミニザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNA干渉及びDNAザイムを含む合成剤を持ってして達成することができる。DNAザイムは、様々な細胞工程において標的とする遺伝子の正確な機能を得る、用途が広いツールとして使用されている55。これらの分子は、また、再狭窄及びステント再狭窄、血管平滑筋細胞の異常増殖を含む工程の阻害剤として用いられている33、56、57。本研究により、c-Junを標的とするDNAザイムは、微小血管内皮細胞の有糸分裂誘導、転移、角膜血管新生及び固形腫瘍増殖の潜在的な阻害剤として働きうることが示された。従って、我々は、本出願において、血管形成におけるc-Junの重要な役割の直接的な最初の証拠を提供する。
【０１３８】
広範に記載された本発明の精神又は範囲から離れることなく、特定の実施態様に示された発明について、多くの変更及び/又は修正をなすことができることは、この業界における当業者ならば当然であろう。本実施態様は、それゆえ、全ての点において、実例であり非制限的であると考えらるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ヒトアテローム病変におけるc-Jun及びSp1発現。ヒト頚動脈アテローマ病変の5μm切片における、c-Jun及びSp1のための免疫組織化学染色。内膜及び中膜を図に示す；Lは内腔を示す。染色は3つの独立したサンプルを代表するものである。
【図２Ａ】in vitro転写したc-Jun RNAの切断及びc-Jun DNAザイムによるc-Jun誘導の阻害。c-Jun RNAにおけるDNAザイムの切断部位（矢印）及び予想される生成物のサイズを表す。3’切断を司る特定のプリンをそれぞれのDNAザイム候補のために示す。番号付けは、ヒトc-Jun完全コード領域に基づく（Accession J04111, NID g186624）。T7RNAポリメラーゼに依存したc-Jun RNAの産生のために使用する発現ベクターを示す。
【図２Ｂ】in vitro転写したc-Jun RNAの切断及びc-Jun DNAザイムによるc-Jun誘導の阻害。DNAザイム（34塩基）の完全性解析（上パネル）及び668塩基c-Jun RNAの完全性解析（真中パネル）及び37℃で1時間後における候補DNAザイムのヌクレオチド分解活性のためのパニング（panning）（下パネル）。DNAザイムの完全性は、γ32P-dATP及びT4 RNAポリメラーゼで5’末端標識し、12％変性ポリアクリルアミドゲル上での分離することによって求めた。転写物の完全性は、α32P-dUTP及びT7ポリヌクレオチドキナーゼでランダム標識し、12％変性ポリアクリルアミドゲル上での分離することによって求めた。図は、指示された時間において反応を進めた後の、668塩基の転写物を示す。次の実験においては、30分ランオフ(30 min run-off)を用いた。
【図２Ｃ】in vitro転写したc-Jun RNAの切断及びc-Jun DNAザイムによるc-Jun誘導の阻害。c-Jun RNAのDz13切断の時間及び容量依存性。474及び194塩基生成物を示す。
【図２Ｄ】in vitro転写したc-Jun RNAの切断及びc-Jun DNAザイムによるc-Jun誘導の阻害。c-Junタンパク質のウェスタンブロット解析。0.5μMのDNAザイム（Dz13又はDz13scr）でトランスフェクトした平滑筋細胞の抽出物（10μg）について、ウサギポリクローナル抗ペプチド抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いて、c-Jun免疫活性の評価を行った。クマシーブルー染色ゲルは、無作為のローディング(unbiased loading)を示す。
【図３Ａ】平滑筋細胞増殖のc-Jun DNAザイム阻害。c-Jun DNAザイムDz13及びヒトc-Jun mRNA中の標識部位(G1311T)の概略図（上パネル）、ヒト、ブタ及びラットc-Jun mRNA中のDz13標的部位の比較（真中パネル）、及び、As13及びDz13の比較（下パネル）。ヒトc-Jun mRNAの転写開始部位は、A1261TGに位置する。
【図３Ｂ】平滑筋細胞増殖のc-Jun DNAザイム阻害。Dz13によって阻害された血清誘導性の一次ヒト平滑筋（HASMC）増殖におけるc-Jun DNAザイム（0.5μM）の効果。Dz13scrの配列は、5’-GCG ACG TGA GGC TAG CTA CAA CGA  GTG GAG GAG X-3’であり、Xは3’−3’結合の反転したTである。
【図３Ｃ】平滑筋細胞増殖のc-Jun DNAザイム阻害。0.5μMのDz13によって阻害された血清誘導性のブタ平滑筋（PASMC）増殖。
【図３Ｄ】平滑筋細胞増殖のc-Jun DNAザイム阻害。容量依存的に、ヒト平滑筋細胞増殖は、Dz13及びAs13によって阻害される。DNAザイムの濃度（0.1−0.4μM）を図で示す。As13scrの配列は、5’-GCG ACG TGA C GTG GAG GAG X-3’であり、Xは3’−3’結合の反転したTである。
【図４】平滑筋細胞修復のc-Jun DNAザイム阻害。こすって、0.5μMのDz13又はDz13scrでのトランスフェクト後3日での、裸出した区域での平滑筋細胞増殖。細胞を固定し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色後に、顕微鏡観察を行った。
【図５Ａ】ラットの総頚動脈中の新生内膜肥厚の遮断。障害後21日における、各群についての新生内膜/中膜比（ベヒクル単独、Dz13を含むベヒクル、Dz13scrを含むベヒクル）。*は、Student’sテストを用いた、ベヒクル群及びDz13scrを含むベヒクル群と比較した場合のP<0.05を示す。ベヒクル群及びDz13scrを含むベヒクル群は、統計的な有意差は無かった。
【図５Ｂ】ラットの総頚動脈中の新生内膜肥厚の遮断。ヘマトキシリン及びエオシンで染色した代表的な横断切片。N及び一本の線は新生内膜(neointima)を表し、M及び三本線は中膜(media)を表し、矢印は障害後の内膜(preinjured intima)を表す。血栓症が時々見られ、これは特定の群に制限されなかった。
【図５Ｃ】ラットの総頚動脈中の新生内膜肥厚の遮断。動脈障害後6時間後の、c-Junタンパク質の免疫ペルオキシダーゼ染色。
【図５Ｄ】ラットの総頚動脈中の新生内膜肥厚の遮断。動脈障害後6時間後の、Sp1の免疫ペルオキシダーゼ染色。ベヒクル（FuGENE6, MgCl2, PBS, pH7.4）中のDNAザイムを、障害時に、Pluronicゲル（BASF）中で頚動脈に適用した。3週間後、動脈を潅流固定し、5μm切片を免疫組織化学及び形態計測解析に供した。
【図６】Dz13による、再構築した基底膜上の微小血管内皮細管形成阻害。予めDz13及びDz13scrの指示された濃度でトランスフェクトされた、HMEC-1細胞を、マトリゲルを含む96穴プレートに入れ、8時間後に細管形成を定量した。アスタリスクは、コントロールと比較した、Student’sテストによるp<0.05を示す。ウェスタン及びEMSAにより、Dz13が、微小血管内皮細胞中でc-Jun発現及びDNA結合活性を阻害することが明らかになった（データを示さず）。（FBSはウシ仔児血清を表す）。
【図７Ａ】c-Jun cDNA配列（Accession J04111, NID g186624）。
【図７Ｂ】c-Jun mRNA中のDNAザイム標的部位の位置。
【図８Ａ】Dz13による、微小血管内皮細胞増殖の阻害。DNAザイム（0.2μM）で前処理した増殖停止HMEC-1細胞を血清に曝し、カルチャーカウンターを用いて、総細胞数を3日後に求めた。
【図８Ｂ】Dz13による、微小血管内皮細胞増殖の阻害。微小血管内皮細胞増殖のDz13による阻害は容量依存的である。
【図８Ｃ】Dz13による、微小血管内皮細胞増殖の阻害。Dz13バリアント（短いアーム長及び長いアーム長）の増殖における効果。Dz13(11＋11)、Dz13(10＋10)及びDz13(8＋8)の配列は、それぞれ、5’-GA CGG GAG GAA ggc tag cta caa cga GAG GCG TTG AG-Ti-3’、5’-A CGG GAG GAA ggc tag cta caa cga GAG GCG TTG A-Ti-3’及び5’-GG GAG GAA ggc tag cta caa cga GAG GCG TT-Ti-3’である。 Dz13(11＋11)scr、Dz13(10＋10)scr及びDz13(8＋8)scrの配列は、それぞれ、5’-GA GCG ACG TGA ggc tag cta caa cga GTG GAG GAG AG-Ti-3’、5’-A GCG ACG TGA ggc tag cta caa cga GTG GAG GAG A-Ti-3’及び5’-CG ACG TGA ggc tag cta caa cga GTG GAG GA-Ti-3’である。アスタリスクは、コントロールと比較した、Student’sテストによるp<0.05を示す。
【図９Ａ】Dz13による、in vitroでこすった後の微小血管内皮細胞の再増殖阻害及び改良したBoydenチャンバー内での転移阻害。DNAザイム（0.2、0.3又は0.4μM）で前処理した増殖停止HMEC-1細胞をこすり、裸出した区域における細胞の数を、顕微鏡下で定量した。
【図９Ｂ】Dz13による、in vitroでこすった後の微小血管内皮細胞の再増殖阻害及び改良したBoydenチャンバー内での転移阻害。HMEC-1をマトリゲル又はコラーゲンタイプIでコーティングした、改良したBoydenチャンバーにプレーティングし、24時間後に膜の下側における細胞数を定量した。アスタリスクは、コントロールと比較した、Student’sテストによるp<0.05を示す。
【図１０】Dz13による、MMP-2発現及びタンパク質分解のブロック。MMP-2タンパク質発現を、酵素免疫測定アッセイによって定量した。ゼラチン電気泳動により、MMP-2タンパク質分解のDz13阻害及びc-Jun cDNAの過発現による救出を明らかにした。RT-PCRにより、Dz13はc-Jun mRNA発現をブロックすることを明らかにした（データを示さず）。
【図１１Ａ】Dz13による、ラット角膜におけるVEGF165誘導血管新生の阻害。HMEC-1細胞（0.4μM DNAザイムで前処理し、200ng/mlのVEGF165を含む培地に存在する）をマトリゲルを含む96穴プレートに入れ、8時間後に細管形成を顕微鏡下で定量した。
【図１１Ｂ】Dz13による、ラット角膜におけるVEGF165誘導血管新生の阻害。ラット角膜中の血管の数の定量。アスタリスクは、コントロールと比較した、Student’sテストによるp<0.05を示す。ポリクローナルc-Jun抗体、及び、VEGF165(100μg/ml)に曝した後2時間におけるDNAザイム(0.4μM)で前処理した増殖停止HMEC-1細胞の抽出液を用いたウェスタンブロット解析により、Sp1発現に変化をもたらさずにc-Jun発現を阻害することが示された（データーを示さず）。
【図１１Ｃ】Dz13による、ラット角膜におけるVEGF165誘導血管新生の阻害。新しい血管が占める角膜表面積の定量。アスタリスクは、コントロールと比較した、Student’sテストによるp<0.05を示す。ポリクローナルc-Jun抗体、及び、VEGF165(100μg/ml)に曝した後2時間におけるDNAザイム(0.4μM)で前処理した増殖停止HMEC-1細胞の抽出液を用いたウェスタンブロット解析により、Sp1発現に変化をもたらさずにc-Jun発現を阻害することが示された（データを示さず）。
【図１２Ａ】Dz13による、マウス中の固形メラノーマ増殖のブロック。配列特異的な、Dz13による固形悪性B16腫瘍増殖の阻害。腫瘍容積をｘ軸上で示される時に評価した。
【図１２Ｂ】Dz13による、マウス中の固形メラノーマ増殖のブロック。DNAザイム及びベヒクル処理したコーホートにおける平均の総重量。
【図１２Ｃ】Dz13による、マウス中の固形メラノーマ増殖のブロック。DNAザイム(0.4μM)で前処理した増殖停止培養微小血管内皮細胞を血清に曝した後2日における増殖。ヒトc-Jun mRNA中のDz13標的部位における18ヌクレオチド(5’-CAA CGC CUC G1311| UUC CUC CcG-3’)のうち17は、マウスc-Jun Mrna(5’-CAA CGC CUC G| UUC CUC CaG-3’)中で保存されている。アスタリスクは、コントロールと比較した、Student’sテストによるp<0.05を示す。血管が新生したヒト皮膚悪性黒色腫組織における免疫組織化学解析により、c-Jun及びMMP-2がCD31+内皮及び周辺のメラノーマ細胞において発現していることを明らかにした（データを示さず）。ウェスタンブロット解析により、血清に細胞を曝した後2時間においてc-Junタンパク質がDz13により阻害されることを明らかにした（データを示さず）。
【０１４０】
「参考文献」
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【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ａ−１】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【国際調査報告】
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