(57)【要約】微少量の血液で実施できるホモシステインアッセイについて開示する。このアッセイは、新生児のホモシステイン尿症をスクリーニングすることを初めとする、スクリーニングに好適である。
2005537022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中の全ホモシステインをアッセイする方法であって、
固体の支持体上に乾燥した血液サンプルを準備し；
前記血液を固体の支持体から水性緩衝液中に抽出し；
血液中でのホモシステイン濃度が約5〜15μMかつシステイン濃度が約100〜300μMである場合に前記血液サンプルと接触させたときにホモシステイナーゼの作用により生成する硫化水素の少なくとも約90％がホモシステインに帰因するという十分な特異性を有するホモシステイナーゼで抽出物を処理し；
生成した硫化水素のレベルを測定し；
それにより血液中のホモシステインのレベルを測定することを含んでなる方法。
【請求項２】
抽出物に還元剤を添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
還元剤を抽出中に水性緩衝液に添加する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
水性緩衝液がさらに抗凝血剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗凝血剤がEDTAまたはヘパリンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
酸化剤および発色試薬を添加することにより、生成した硫化水素のレベルを測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
発色試薬がN,N-ジアルキルフェニレンジアミンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生成した色の吸収または蛍光を測定する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
血液サンプルが10μl以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
血液サンプルが5μl以下である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
血液サンプルが2μl以下である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
固体の支持体が濾紙である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
新生児から血液サンプルを得ることおよび請求項１に記載の方法を実施することを含む、新生児のホモシステイン尿症をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
被験者から血液サンプルを得ることおよび請求項１に記載の方法を実施することを含む、被験者のホモシステイン異常を検査する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非常に小さいサンプルを用いて全血液中のホモシステインレベルを評価する方法に関する。より詳しく述べると本発明は、異常症をスクリーニングできるフォーマットにホモシステインアッセイを適応する改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のホモシステイン(または全ホモシステイン、以下tHcy)のレベル（量）は、心血管疾患その他の疾患に対する危険因子として重要である。これは成人についても小児についても当てはまる。新生児の場合、Mudd, S.H.らにより「Scriver, C.R.ら編、遺伝性疾患の代謝および分子的基礎、Vol.II,New York:McGraw-Hill(2002)2007-2043」に記載されているように、tHcy代謝の異常は、ホモシステイン尿症および心血管疾患、知恵遅れその他の疾患を引き起こし得る。tHcyの先天性異常をスクリーニングする方法は、メチオニン測定のように間接的であるか、またはあまりにも複雑である。例えば、Gempel,K.ら、Clinical Chemistry(2001)46:122-123、Chace,D.H.ら、Clinical Chemistry(2001)86:122-123、Probst,R.ら、Clinical Chemistry(1988)44:1567-1569を参照のこと。
【０００３】
より直接的な全ホモシステインアッセイおよび望ましい特異性を有するホモシステイナーゼが、Tan,Y.,ら、Clinical Chemistry(2000)46:1686-1688およびTan,Y.,ら、Clinical Chemistry(2003)49:1029-1030で報告されており、またPCT公開WO 99/05311、PCT出願US 00/17838、ならびに米国特許5985540、米国特許5998191、米国特許6066467、米国特許6140102および米国特許6468762に開示されている。参照によりこれら文献の内容を本明細書に組み込む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の文献に記載されている全ホモシステインのアッセイを、少量の血液および乾燥したサンプルに適応できることが発見された。この適応により該アッセイは新生児のスクリーニングのみならず、高処理能アッセイフォーマットにも適したものになる。
【０００５】
本発明は、少量の血液中のホモシステイン量を測定する方法を対象とし、血液は都合のよいアッセイを行うことが出来るようになるまで乾燥させて保存することができる。わずか2〜20μlの血液を、このアッセイで直接用いることができ、後の使用のために適切な固体の支持体上で乾燥させることもできる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従ってある態様において本発明が対象とするのは、血液中の全ホモシステインをアッセイする方法であって、固体の支持体上に乾燥した血液サンプルを準備し、前記血液を固体の支持体から水性緩衝液中に抽出し、血液中でのホモシステイン濃度が約5〜15μMかつシステイン濃度が約100〜300μMである場合に、前記血液サンプルと接触したときにホモシステイナーゼの作用により生成する硫化水素の少なくとも約90％がホモシステインに帰因するものであるという十分な特異性を有するホモシステイナーゼで抽出物を処理し、生成する硫化水素のレベルを測定することによって血液中のホモシステインのレベルを測定することを含んでなる方法である。
【０００７】
他の態様で本発明が対象とするのは、上記アッセイを行うことで新生児のホモシステイン尿症をスクリーニングする方法であり、また成人および他の被験者中のホモシステイン代謝異常を検出する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、上記で参照した文献に開示されているもののようなホモシステインアッセイの適応（すなわち改良）を提供する。手短に言うと、本アッセイでは、生物学的な流体を処理したときに生成する硫化水素のほぼ全てがホモシステインに帰因するというような十分な特異性を有するホモシステイナーゼ酵素を利用し、システインによる干渉が最小化される。一般に、このような酵素は、ホモシステインが約5μモル濃度しか存在せずかつシステインが約300μモル濃度存在する場合でさえも、生物学的なサンプルと接触させたときに生成する硫化水素の少なくとも約90％がホモシステインに帰因するという十分な特異性を有する。
【０００９】
乾いた血液サンプルおよび非常に少量のサンプルに対してアッセイを行うことができる可能性は、いくつかの要因の組合せに依存する。１つの要因は、乾いたサンプル中のホモシスチンおよびホモシステインを可溶化させるために、固体の支持体上に保存された乾燥した血液の成分を抽出する能力である。一般には、存在するホモシスチンをホモシステインに変換するために抽出溶液に還元剤を添加する。ヘパリンまたはEDTAのような抗凝血剤を添加してもよい。第２に、本アッセイはホモシステイナーゼでサンプルを処理することにより生成した硫化水素の量を測定するため、血液中に常に存在するメチオニンによるいかなる干渉も排除される。存在するメチオニンの分解で生成するのはアンモニア、α-ケトグルタル酸、およびメチルメルカプタンであって硫化水素ではない。従ってメチオニンによる干渉に対処する複雑な工程は全く必要ない。実際、本発明の方法を用いた検査では、200μMのL-メチオニン存在下でさえも、15μM/lの範囲で存在する全ホモシステインについて決定された濃度のばらつきは1％未満であった。
【００１０】
第３に、アッセイに使用するホモシステイナーゼがシステインと比較してホモシステインに特異的であることから、15μMの範囲の全ホモシステインのアッセイに200μMのシステインを添加しても、結果には2％未満の影響しか与えない。一般に、正常な個体中ではホモシステインの量は5〜15μMの範囲に収まる。
【００１１】
これらの要因の組合せのため、極めて少量の血液でも固体の支持体上に乾燥させ、抽出し、アッセイすることができる。このようなアッセイは多数の工程を行わなければならない場合、不可能である。本発明のアッセイでは多数の工程は必要ない。
【００１２】
従って一般に、アッセイは以下の工程を含み、全てサンプル分離をせずに行う。
【００１３】
1.  存在するホモシスチンをホモシステインに還元する。所望ならばこれは抽出工程中に達成できる。
【００１４】
2.  L-ホモシステインを反応産物であるα-ケト酪酸、アンモニアおよび硫化水素に変換する。
【００１５】
3.  硫化水素を検出する。
【００１６】
硫化水素の量を検出および測定するには様々な方法が使用可能である。例えば、硫化水素は溶液中で鉛イオンと反応して黒い沈殿を形成する。生じた沈殿の不透明度を測定することが可能である。上記に参照した特許出願に記載されているように、一つの非常に便利な方法では、N,N,-ジアルキルフェニレンジアミンなどの発色試薬および第二鉄イオンなどの酸化剤を含む顕色用試薬を添加することによる色または蛍光の発生を利用する。このような顕色用試薬を用いて発色した色を測定することができ、または励起によって発生する蛍光を、生成した硫化水素の尺度として使用することができる。この方法の一例として、H2Sが塩化N,N,-ジブチルフェニレンジアミン（DBPDA)と化合してOD660nmで定量的に検出できる有色のチアジン化合物（以下の例では、3,7-ビス(ジブチルアミノ)フェノチアジン-5-ニウム）を形成する方法の概略を以下に示す。
【化１】
2005537022.tif 000003
【００１７】
これらの検出のための系は上記で参照した文献に開示されている。
【００１８】
この一般的なアッセイを非常に小さい血液サンプルに適応できることが見いだされた。この血液サンプルは、血漿または血清に分離する必要がなく、また固体の支持体上で血液を乾燥させることによってアッセイのために保存することができる。例えば、サンプルを濾紙またはナイロンもしくは他の布などの好適な他の支持体の上で乾燥させるのが最も都合良い。おそらく濾紙が最も都合が良い。
【００１９】
本発明の方法を用いることにより、非常に小さい血液サンプルを用いることができ、典型的には20マイクロリットル以下、好ましくは5または10マイクロリットル以下、好ましくは1マイクロリットル以下である。いかなる分離も必要ないことから、サンプルの大きさは容易に操作できる。上述のように、サンプルを還元剤で処理してホモシスチンからホモシステインを生成させることが望ましい。便宜上、還元剤を抽出媒体に添加することができる。ヘパリンまたはEDTAなどの抗凝血剤を抽出媒体に添加することもまた望ましい。
【００２０】
サンプルのサイズの小ささと取り扱いの容易性に鑑みて、本発明の方法は大規模スクリーニングに適しており、例えば幼児のホモシステイン尿症の徴候をスクリーニングするのに適する。このアッセイは容易に利用できるので、この症状の望ましくない後遺症を未然に防ぐために、幼児の食事および治療を適時に調節することができる。もちろん、このアッセイはまた、成人および小児に用いることもでき、従ってホモシステインの異常レベルを現場で検出するための便利なアッセイ方法となりうる。それにもかかわらず、本発明のアッセイ方法は新生児のルーチン化されたスクリーニングに適応できることから、本アッセイ方法は早期発見された場合に治療可能な症状を検出するための検査のレパートリーに加えることができる。
【００２１】
本発明のアッセイ方法のさらなる利点は、通常存在する血液成分の量が有為に干渉しないことである。20 mg/ml以下のタンパク質濃度は4％未満の干渉しか示さず； 1 mg/ml以下のヘモグロビン濃度は10％未満の干渉しか示さず； 5 mg/ml以下の脂質濃度は10％未満の干渉しか示さず； 0.4 mg/ml以下のビリルビンCおよびビリルビンF濃度は10％未満の干渉しか示さないことが立証された。このことから、黄疸に関連してビリルビンレベルが上昇した場合でも、本発明のアッセイは正確な結果を提供する。
【００２２】
上述のように、本検査を用いて得られたホモシステインレベルをそれらの正常値(5〜15μM)と比較し、ホモシステインレベルが正常範囲を超えて上昇したレベルの場合は修正が必要であることを意味する。
【実施例】
【００２３】
以下の実施例は本発明を制限することを意図したものでは全くなく、本発明を説明することを意図したものである。
【００２４】
実施例１
全血液中のホモシステインの測定
反復して２回、5μlの全血液を濾紙上にスポット（すなわち、点状に塗布または滴下）し、室温で少なくとも3時間乾燥させた。
【００２５】
全血液スポットサンプルをアッセイ用に調製するために、スポット全体を濾紙から切り出してコニカルマイクロ遠心チューブに移した。
【００２６】
1.0 mM DDT(還元剤); 1.0 mM EDTAおよび0.2％ Tween-X100を含む0.5 mlのリン酸緩衝化食塩水中でスポットを30分間、37℃でインキュベートした。紙から血液が完全に抽出されるまでサンプルをボルテックス(vortex:渦状に撹拌する)した。
【００２７】
サンプル溶液を1.5 ml MSI UltraFuge 遠心フィルター(30KDカットオフ)に移し、次に4000gで10分間遠心分離し、別のチューブに移した。次にpH 8.3 のアッセイ緩衝液0.5 mlを加えた。
【００２８】
20μlの組換えホモシステインα,γ-リアーゼ(ホモシステイナーゼ)(0.145 mg/ml rHCYase)試薬を添加し、37℃で3分間インキュベートしてH2Sを放出させた。
【００２９】
H2S発色団試薬（DBPDA)を添加した。この試薬は2つの部分からなる：試薬1は33.25 mgのフェリシアン酸カリウムを10 mlの1N NaCl、1％(w/V) Triton-x100溶液に溶かして得た10 mMの第二鉄イオンストック溶液である：試薬2は52.5 mgのN,N-ジブチルフェニレンジアミンを２回蒸留した水に溶かし最終濃度を100 mMとした溶液である。2つの試薬を20:1の比率で添加した。蛍光はEX640/EM675で測定した。
【００３０】
濾紙上に10μlのHcyの標準溶液を5μM、20μMおよび50μMの濃度でスポットした。標準曲線はY = 0.231X - 0.0563 (R2 = 0.999)の直線性を有していた(図１)。
【００３１】
乾燥した血液スポットからのtHcyの測定値は血漿からのtHcyの測定値と良好に相関した。Y = 0.335X + 3.6652 (R2 = 0.9548, n=3)。(図２)。サンプルは両方とも同一の実験マウスから得た。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、本発明のアッセイのためのキャリブレーション曲線を示す。
【図２】図２は、血漿中で測定したtHcy量と、本発明の方法で測定したtHcy量の相関を示す。
【図１】
2005537022.tif 000004
【図２】
2005537022.tif 000005
【国際調査報告】
2005537022.tif 000006
2005537022.tif 000007