(57)【要約】本発明は、乳製品に由来するモノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドから風味増強エステルを製造する方法である。当該方法は、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドとアルコールとの間の、高いエステル交換活性のために選択されたエステラーゼの存在下でのエステル交換反応である。そのエステルは、様々な食品、特に乳製品、例えばチーズにおける風味付けに使用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
風味増強エステルを製造するための方法であって：
乳製品源由来のモノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドとアルコールとのエステル交換反応を、水性媒体中で、前記モノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドを用いて少なくとも２５：１のエステル交換活性：エステル化活性比を示すエステラーゼの存在下で実施し、前記風味増強エステルを形成すること、を含んで成る方法。
【請求項２】
風味増強エステルを製造する方法であって：
乳製品源由来のモノグリセリド、又はジグリセリドとアルコールとのエステル交換反応を、水性媒体中で、前記モノグリセリド又はジグリセリドを用いて少なくとも２５：１のエステル交換活性：エステル化活性比を示す乳酸菌由来酵素の存在下で実施し、前記風味増強エステルを形成すること、を含んで成る方法。
【請求項３】
風味増強エステルを製造する方法であって：
乳製品源由来のモノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドとアルコールとのエステル交換反応を、水性媒体中で、リパーゼと乳酸菌由来酵素の混合物又はエステラーゼと１若しくは複数の乳酸菌由来酵素の混合物であって、前記モノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドを用いて少なくとも２５：１のエステル交換活性：エステル化活性比を示す混合物の存在下で実施し、前記風味増強エステルを形成すること、を含んで成る方法。
【請求項４】
前記エステラーゼがリパーゼである、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が、前記水性媒体中で前記グリセリド及びアルコールに対して添加される、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素が由来する乳酸菌が、前記水性媒体中で前記グリセリド及びアルコールに対して添加されて、その中で前記酵素を産生する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項７】
乳製品源由来の前記グリセリドが、全乳、クリーム、乳脂肪、チーズ、酵素改良チーズ（ＥＭＣ）、バターミルク、ホエー、ホエークリーム、発酵乳又は他の乳製品に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アルコールがエタノールである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルコールが２−フェニルエタノールである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルコールを産生するための発酵段階を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アルコール産生微生物が当該発酵段階を媒介するために存在する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルコール産生微生物が、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記モノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドがそれぞれ最大１０個の炭素原子を有するアシル基を持ち、且つ前記アルコールがエタノールである、請求項１〜８及び１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記グリセリドが、最大６個の炭素原子を有するアシル基を持つジグリセリドであり、且つ前記アルコールが２−フェニルエタノールである、請求項１〜７及び９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記グリセリドが、最大８個の炭素原子を有するアシル基を持つモノグリセリドであり、且つ前記アルコールが２−フェニルエタノールである、請求項１〜７及び９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記リパーゼがリゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来の１，３−特異的リパーゼである、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵素が、以下の：
ストレプトコッカス(Streptococcus)、
ラクトコッカス(Lactococcus)、
ラクトバチルス(Lactobacillus)、
ロイコノストック(Leuconostoc)、
ペディオコッカス(Pediococcus)、
エンテロコッカス(Enterococcus)
プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、及び
シュードモナス(Pseudomonas)
を含む属の１又は複数の菌株の細菌培養物に由来する、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵素が菌株ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１に由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素が、菌株ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＮＣＩＭＢ７００８２１；ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)Ｂ４０１７；ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)亜種クレモリス(cremoris）Ｅ８及びラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)亜種ラクチス(lactis)ＭＬ３のうちのいずれか１つに由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記の調製された風味増強エステルが、一成分として食品に添加される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記食品が乳製品である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記乳製品がチーズ又はチーズベースの製品である。請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法によって調製される風味増強エステル。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法によって調製される食品。
【請求項２５】
請求項２１に記載の方法によって調製される乳製品。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法によって調製されるチーズ又はチーズベースの製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、風味増強エステルの製造方法に関する。更に具体的には、好ましい態様で、それは乳製品源由来のモノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドを所望の風味増強エステルへと変換するエステル交換反応の触媒における、リパーゼ又は乳酸菌由来の酵素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な風味増強エステルがチーズ内に存在する。脂肪酸（Ｃ２〜Ｃ１０）のエチルエステルが最も豊富である。ブタン酸エチル及びヘキサン酸エチルは、主として生乳及びチーズ中にフルーティーな風味を生じさせるのに重要である(Bills et al, 1965; McGugan et al, 1975; Horwood et al, 1987; Engels et al, 1997; Friedrich and Acree, 1998)。フルーティーな風味は通常、チェダーチーズにおいては短所と見なされるが、消費者によっては評価される(Urbach, 1995; 1997)。フルーティーさは、いくつかのイタリア風チーズの種類、例えばパルメザン及びパルミジアノレジアノの特徴であり、この中には、Ｃ２〜Ｃ１０の脂肪酸のエチルエステルがかなりのレベルで存在する(Dumont et al, 1974; Meinhart and Schreier, 1986 ; Barbieri et al, 1994)。
【０００３】
エステラーゼの作用による遊離脂肪酸とアルコールとのエステル化は、概してチーズ内のエステル形成の機構として認識されており、ここでは、エタノールが重要なアルコールである(Bills et al, 1965; Morgan, 1976; Fox et al., 2000)。乳製品の乳酸菌（ＬＡＢ）及びシュードモナス(pseudomonads)由来のエステラーゼは、エタノールと脂肪酸をエステル化してエステル、例えばブタン酸エチル及びヘキサン酸エチルを形成しうるが(Hosono and Elliott, 1974; Hosono et al, 1974; Liu et al, 1998)、エステル化活性は、水性媒体中では弱い。
【０００４】
このように、添加したアルコールに由来するアルコキシ基でチーズ内に天然に存在するグリセリルエステルのアルコキシ基を置換することによって、チーズ風味の少なくとも１つの側面を制御することが可能であることが知られている。この反応は、２つの段階で起こると考えられた(Bills et al, 1965; Morgan, 1976; Fox et al, 2000)。最初に、天然に存在するグリセリルエステルが加水分解して、グリセリルアルコール、そして更にカルボン酸が形成される。続いて、第二に、生じたカルボン酸が、所望のアルコキシ基を有するアルコール（例えば、エタノール）によってエステル化される。このアルコキシ基の置換を一回の反応で制御することは、加水分解、続くその後のエステル化（エステル化反応）から成る２つの反応工程を介するよりは有利であろう。
【０００５】
明確にするために、当該二段階反応を以下の式１及び２において例示する。エステル交換反応は、式３に例示する。
【０００６】
【化１】
2005517417.tif 000002
【０００７】
本発明の目的は、一段階工程に特に必要とされるものを達成するのにいくらか助けとなること、又は少なくとも公衆に有用な選択肢を提供することである。
【０００８】
本発明の開示
したがって、本発明は広く、風味増強エステルを製造するための方法であって、
乳製品源由来のモノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドとアルコールとのエステル交換反応を、水性媒体中で、前記モノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドを用いて少なくとも２５：１のエステル交換活性：エステル化活性比を示すエステラーゼの存在下で実施し、前記風味増強エステルを形成すること、を含んで成る方法から成ると言うことが出来る。
【０００９】
別の態様において、本発明は広く、風味増強エステルを製造する方法であって、
乳製品源由来のモノグリセリド、又はジグリセリドとアルコールとのエステル交換反応を、水性媒体中で、前記モノグリセリド又はジグリセリドを用いて少なくとも２５：１のエステル交換活性：エステル化活性比を示す乳酸菌由来酵素の存在下で実施し、前記風味増強エステルを形成すること、を含んで成る方法にあると言うことが出来る。
【００１０】
更なる態様において、本発明は広く、風味増強エステルを製造する方法であって、
乳製品源由来のモノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドとアルコールとのエステル交換反応を、水性媒体中で、リパーゼと乳酸菌由来酵素の混合物又はエステラーゼと１若しくは複数の乳酸菌由来酵素の混合物であって、前記モノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドを用いて少なくとも２５：１のエステル交換活性：エステル化活性比を示す混合物の存在下で実施し、前記風味増強エステルを形成すること、を含んで成る方法にあると言うことが出来る。
【００１１】
１つの態様において、前記エステラーゼはリパーゼである。
【００１２】
１つの態様において、前記酵素は、前記水性媒体中で前記グリセリド及びアルコールに対して添加される。
【００１３】
別の態様において、前記酵素が由来する乳酸菌は、前記水性媒体中で前記グリセリド及びアルコールに対して添加されて、その中で前記酵素を産生する。
【００１４】
好ましくは、乳製品源由来のグリセリドは、全乳、クリーム、乳脂肪、チーズ、酵素改良チーズ（ＥＭＣ）、バターミルク、ホエー、ホエークリーム、発酵乳又は他の乳製品に由来する。
【００１５】
アルコールは、所望の風味特性を有するエステル（又は複数のエステル）が産生されるように選択される。１つの選択肢として、前記アルコールはエタノールである。別の選択肢として、前記アルコールは２−フェニルエタノールである。しかしながら、本発明は、これらのアルコールに限定されず、そして（限定しないが）天然のチーズ内で発生し得るものを含んだ一連の直鎖、分枝鎖及び芳香族アルコールを含むこともある。
【００１６】
別の選択肢として、上文に規定する方法は、アルコールを産生するための発酵段階を含む。
【００１７】
好ましくは、アルコール産生微生物が当該発酵段階を媒介する。
【００１８】
１つの態様において、アルコール産生微生物は、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)である。
【００１９】
多くの他のアルコール産生菌を使用することができ（ヘテロ発酵型のラクトバチルス属(Lactobacilli)及びロイコノストック属(Leuconostocs)を含む）、そして酵素も使用されうる。
【００２０】
１つの選択肢として、前記モノグリセリド、ジグリセリド又はトリグリセリドのアシル基はそれぞれ最大１０個の炭素原子を有し、且つ前記アルコールはエタノールである。
【００２１】
あるいは、前記グリセリドがジグリセリドである場合、そのアシル基は最大６個の炭素原子を有し、且つ前記アルコールは２−フェニルエタノールである。
【００２２】
追加の選択肢として、前記グリセリドがモノグリセリドである場合、そのアシル基は最大８個の炭素原子を有し、且つ前記アルコールは２−フェニルエタノールである。
【００２３】
好ましくは、前記リパーゼは、リゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来の１，３−特異的リパーゼである。
【００２４】
あるいは、前記酵素は、以下の属：
（限定しないが）：
ストレプトコッカス(Streptococcus)
ラクトコッカス(Lactococcus)
ラクトバチルス(Lactobacillus)
ロイコノストック(Leuconostoc)
ペディオコッカス(Pediococcus)
エンテロコッカス(Enterococcus)
プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、及び
シュードモナス(Pseudomonas)
を含む属の細菌培養物のうちの１又は複数の種に由来する。
【００２５】
１つの態様において、前記酵素は、菌株ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１に由来する
【００２６】
あるいは、前記酵素は、菌株ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＮＣＩＭＢ７００８２１（ＮＣＤＯ８２１として得られ、そして以降８２１と称する）；ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)Ｂ４０１７；ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)亜種クレモリス(cremoris）Ｅ８及びラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)亜種ラクチス(lactis)ＭＬ３のうちのいずれか１つに由来する。
【００２７】
別の態様において、そのようにして調製された風味増強エステルは、一成分として食品に添加される。
【００２８】
好ましくは、前記食品は乳製品である。
【００２９】
好ましくは、前記乳製品はチーズ又はチーズベースの製品である。
【００３０】
本発明はまた、広く、上文に規定した方法によって調製される風味増強エステルにあると言うことが出来る。
【００３１】
本発明はまた、前記風味増強エステルを含む食品にあると言うことが出来る。
【００３２】
好ましくは、前記食品は乳製品である。
【００３３】
好ましくは、前記乳製品はチーズ又はチーズベースの製品である。
【００３４】
本発明はまた、広く、本願明細書において言及され又は示される個々又は集合の部分、因子及び特徴、並びに前記部分、因子又は特徴のうちの任意の２又はそれ以上のあらゆる又は全ての組み合わせにあると言うことができ、そして、具体的な整数は、本発明と関連する分野において知られている既知の等価物を含むものとして本明細書で言及され、そのような既知の等価物は、個々に記載されているかのように本明細書に組み入れられるとみなされる。本発明は前述のものに存し、そして更に以下に示す実施例の構築を予見する。
【００３５】
本発明の実施形態
本発明は、以下の詳細な実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「風味」は、文脈において必要に応じて風味及び／又は芳香を意味することが意図される。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「乳製品由来のグリセリド」は、乳脂肪中に存在する又はそれから生じた１又は複数のトリグリセリド、ジグリセリド及びモノグリセリドを含んで成る組成物を意味することが意図される。これは、好ましくはウシ起源の乳脂肪であるが、ヒツジ（シープ）又はヤギ（ゴート）起源の乳脂肪も含む。トリグリセリドは、乳脂肪において支配的な脂質のクラスであり、全乳脂肪のうち９７〜９８％を占める(Christie, 1995)。少量のジグリセリドとモノグリセリドも存在し、これらの成分のレベルは、リパーゼの加水分解作用によって上昇し得る。乳脂肪のグリセリドは、それらの組成物が非常に多様である。グリセリド分子内でエステル化される広範の異なる脂肪酸が、この多様性を付与する。鎖長が４個の炭素原子から１８個の炭素原子に及ぶ１０個の主要な脂肪酸が存在している。しかしながら、合計４００超の異なる脂肪酸が、ウシの乳脂肪中で同定されている(Jensen and Clark, 1988)。
【００３８】
「エステル交換活性」の計算において、エステル交換活性の単位は、トリブチリン及びエタノールからの、１分当たり１ｎｍｏｌのブタン酸エチルの合成を触媒する酵素量を意味する。エステル交換活性を決定するための標準的なアッセイを、実施例１に記載する。
【００３９】
「エステル化活性」の計算において、エステル化活性の単位は、ブタン酸及びエタノールからの、２４時間当たり１ｎｍｏｌのブタン酸エチルの合成を触媒する酵素量を意味する。エステル化活性を決定するための標準的なアッセイは、実施例２に記載する。
【実施例】
【００４０】
実施例１：ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)によるエステルの合成
微生物及び生育条件
ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１は、Fonterra Research Centre, Palmerston North, New Zealandの培養コレクション由来のものである。培養物は、Ｍ１７−グルコースブロス(Difco, France)中で３７℃で生育した。培養物に、１％（ｖ／ｖ）の前培養物を植菌し、これを静的に最大３６時間インキュベートした。
【００４１】
細胞懸濁液の調製
特に断らない限り、３００ｍＬの細胞（２４時間の培養物）は、７０００ｇ、１０分間、４℃の遠心によって回収した。細胞は、１００ｍＬ（２ｘ）の０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）中で洗浄し、続いて遠心した。洗浄した細胞のペレットは、６０ｍＬの同一の緩衝液中で再懸濁し、そしてユニバーサルボトル内に１０ｍｌのアリコートを分配し、そして使用するまで−２０℃で保存した。
【００４２】
エステル交換反応によるエステル合成
エステル交換活性を決定するための標準的なアッセイは、８０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、２．０ｍＬの細胞懸濁液、５００ｍＭのエタノール及び１０〜３５ｍＭのグリセリドから構成された。トリブチリン基質は、Holland & Coolbear (1996)に記載のように調製し、そして他のグリセリド基質は適宜に調製した。当該反応は、０．５ｍＬの５Ｍエタノールを３０℃で５分間予めインキュベートした上記反応混合物に添加することによって開始した。１．０ｍＬの試料を直ちに取り出し、そしてジエチルエーテルを含む試験管に添加し、そして抽出した。残りの反応物を３０℃で最大６０分インキュベートし、そして試料を一定間隔で採り、そして後述のエステル解析のために抽出した。実験によっては、基質濃度は、指定されるような特定の実験に従い変化した。基質を欠き、又は細胞を欠いたコントロールも含めた。酵素活性（エステル交換）の単位は、トリブチリンとエタノールからの、１分当たり１ｎｍｏｌのブタン酸エチルの合成を触媒する酵素量として定義し、そして比活性は、タンパク質又は細胞乾燥重量（ｃｄｗ）１ｍｇ当たりの単位として定義した。
【００４３】
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によるエステルの定量
反応混合物又は培養液から採取した１ｍＬの試料は、２ｍＬのジエチルエーテル及び１ｍＬの内部標準（１８０ｍｇ／Ｌの酢酸エチル／水）を含む１６ｍＬのＫｉｍａｘスクリューキャップ型試験管に添加した。抽出は、約２．５分間激しく振とうし、続いて遠心機(Heraeus Megafuge 1.0)内で、１２６０ｇで５分間遠心することによって行った。上側の溶媒層を、オーブンで乾燥させた少量の無水硫酸ナトリウムを含むバイアルに移し、そして後述のようにガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によってエステルについて解析した。
【００４４】
試料の抽出後、エステルをＧＣで解析した。解析は、フューズドシリカキャピラリーカラム（液相、ＤＢ−１；長さ３０ｍ；内径０．２５ｍｍ；フィルムの厚さ１．０μｍ）(J&W Scientific, CA, USA)を備えた島津ＧＣ−１５Ａガスクロマトグラフィーを用いて実施した。オーブンは、４５℃で５分間の温度にプログラムし、その後１分当たり５℃ずつ５０℃にまで、続いて１分当たり２０℃ずつ２７０℃にまで上昇させ、そして２７０℃で８分間維持した。分割注入は５：１の比率で行い、そして３μＬの試料を注入した。インジェクター及びＦＩＤ（水素炎イオン化検出器）検出器の温度は、それぞれ２５０℃及び２７５℃とした。他の条件は、キャリヤーガス（Ｈｅ）は０．９ｍＬ／分；Ｈ2及びエアはそれぞれ０．６ｋｇ／ｃｍ2；メーキャップガス（Ｎ2）２ｋｇ／ｃｍ2、とした。ＦＩＤアウトプットシグナルを記録し、そして適切なソフトウェア（島津ＣＬＡＳＳ−ＶＰ(商標)クロマトグラフィーデータシステム、バージョン４．２、島津（ＭＤ，ＵＳＡ））を用いて処理した。試料中のエステルを同定し、そして既知の量の純粋なスタンダードとの比較によって定量した。
【００４５】
図１は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１の非増殖細胞によるエタノール及びトリブチリンからのブタン酸エチルの経時的な形成を示す。合成の初速度は最初の３０分間は線形であった。合成速度及び収率は、細胞の生物量が二倍になるにつれそれに比例して増大した。ブタン酸エチルは、コントロール（細胞のみ及び基質のみ）において検出されなかった。ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１は、示した条件下でブタン酸及びエタノールからブタン酸エチルを合成しなかった。
【００４６】
ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１は、エタノール及びＣ６〜Ｃ１４のトリグリセリド、Ｃ１０及びＣ１４のジグリセリド並びにＣ１４のモノグリセリドからエステルを合成することができなかった（データは示さない）。トリブチリンは、菌株ＳＴ１が活性な唯一のトリグリセリドであった。菌株ＳＴ１はまた、エタノールとＣ６ジグリセリド（ジヘキサノイン(dihexanoin)）及びＣ８モノグリセリド（モノオクタノイン）及びＣ１０モノグリセリド（モノデカノイン）からエチルエステルを合成した（図２ａ、b、ｃ）。エステルの合成速度及びエステルの収率は、脂肪酸放出のものよりはるかに高かった（図２ａ、b、ｃ）。尚、菌株ST1は、２−フェニルエタノールとそれぞれジヘキサノイン、モノオクタノインから２−フェニルエチルヘキサノエート、２−フェニルオクタノエートの合成を触媒したが（図３）、アシルのアクセプターとして２−フェニルエタノールを用いたときトリブチリン及びモノデカノインに対して活性ではなかった（データは示さない）。
【００４７】
実施例２：培養液中で生育した乳酸菌によるエステル合成
培養及び生育
培養物は、Fonterra Research Centre, Palmerston North, New Zealandの培養コレクション由来のものを用い、そしてＭ１７−グルコースブロス(Difco, France)中で３０℃で生育した。ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)Ｂ４０１７をＭＲＳブロス(Merk, Germany)中で３０℃で生育した。培養物は、５０ｍＭのエタノール及び３．３ｍのトリブチリン（終濃度）を添加した２００ｍＬの適切なブロス中で生育した。コントロールは、培地を添加していないものあるいはエタノール又はトリブチリンを添加していないものを含めた。培養物は、上述のように、最大３６時間インキュベートした。試料は、中間の対数期(mid-log)と後期の定常期との間の間隔で採取し、そして解析前に−２０℃で保存した。試料は、細胞の乾燥重量、ブタン酸エチル及び他のエステルの決定に使用した。
【００４８】
エステル交換アッセイ
生育している細菌の培養物のエステル交換活性は、実施例１に記載のものと類似のアッセイ系においてブタン酸エチルの蓄積を測定することによって解析した。
【００４９】
エステル化活性
４００ｍＬの適切なブロス中で培養した細菌細胞は、７０００ｇ、１０分間、４℃での遠心によって回収した。細胞は、細胞のペレットを３０ｍＬ（２ｘ）のリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．８）中で再懸濁し、続いて７０００ｇ、１０分間、４℃で遠心することによって洗浄した。洗浄した細胞は、続いて１０ｍＬの同一の緩衝液中で再懸濁し続いてそれぞれ５ｍＬの８ｍＭのエタノール水溶液及び８ｍＭのブタン酸水溶液を、エタノール及びブタン酸がそれぞれ２ｍＭの終濃度を示し、そして約２０ｍＬの合計量の細胞懸濁液中でリン酸カリウムが５０ｍＭの終濃度を示すように添加した。細胞、エタノール及びブタン酸を含む最終的な懸濁液は、２２℃で２４時間静的にインキュベートし、そして次に、その後のガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）によるブタン酸エチルの解析のために−２０℃で保存した。エステル化活性の計算において、エステル化活性の単位は、２４時間当たり１ｎｍｏｌのブタン酸エチルの形成を触媒する量とした。比活性は、細胞の乾燥重量（ｄｗｃ）１００ｍｇ当たりの単位として定量した。
【００５０】
エステルの定量
エステルは、実施例１に記載のようにガスクロマトグラフィーで定量した。
【００５１】
ＧＣ−ＭＳによるエステルの解析
培養液中のエステルは、固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）及びガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって解析した。ＳＰＭＥは、Liu et al (1998)に記載のように実施した。ガスクロマトグラフ（島津ＧＣ−１７Ａ）は、３０ｍｘ０．２５ｍｍの内径のフューズドシリカキャピラリーＣａｒｂｏｗａｘカラム（フィルムの厚さ０．２５μｍ；Altech, IL, USA）を備え、そしてインジェクターの温度は２２０℃とした。キャリヤーガスはヘリウムとした（カラム圧５４ｋＰａ）。オーブンの温度は、５０℃で２分、８０℃まで１分当たり３℃、１２０℃まで１分当たり５℃、２２０℃まで１分当たり２０℃、そして２２０℃で６分となるようにプログラムした。ＧＣカラムは、島津ＱＰ−５０００質量分析計（インターフェース温度２３０℃）のイオン源に直接連結した。ＭＳは、１秒当たり２スキャンの４０〜３５０Ｍ／Ｚのスキャニングモードで作動した。構造は、スペクトルの解釈及び当該スペクトルと書誌データとの比較によって与えられた。
【００５２】
多数の乳酸菌が、トリブチリン及びエタノールからブタン酸エチルを合成するそれらの能力について、当該２つの基質を添加したブロス中での生育によって試験された。得られたエステル交換活性は、続いて、エステル化活性（遊離酸とアルコールとの反応によるエステルの合成）と比較された。これらの活性を表１に記す。エステル化活性及びエステル交換活性の両方ともに、ややおおきな種及び菌株の差異が存在した。エステル交換活性の多様性がエステル化活性の多様性と一致している一方で、前者の活性は後者のものより３４〜７５００倍高い。ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)の菌株は、試験した他の乳酸菌と比較して、最高のエステル交換活性を生み出した（最大２２８倍）。このことは、それらの比較的高いエステラーゼ活性と一致している。特に、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)のエステル交換活性は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)のものに比適する。２つのラクトコッカス属菌株のエステル交換活性は、試験したラクトバチルス(Lactobacillus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、及びペディオコッカス(Pediococcus)の菌株の活性より、最大１８倍高かった。
【００５３】
【表１】
2005517417.tif 000003
【００５４】
実施例３：リゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来リパーゼによるブタン酸エチルの合成
緩衝液中でのブタン酸エチルの合成
ブタン酸エチルは、特に断らない限り、８０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、５０ｍＭのエタノール及び３３ｍＭのトリブチリンを含んで成る５．０ｍＬの反応混合物中で合成した。トリブチリン基質は、いずれかに記載されているように調製した(Holland & Coolbear, 1996)。当該反応は、０．１ｍＬの適切に希釈した酵素調製物（最大１０００倍希釈）を、３０℃で５分間予めインキュベートした上記反応混合物に対し添加することによって開始した。１．０ｍＬの試料が直ちに取り出され、そしてジエチルエーテルを含む試験管に添加され、そして抽出された（下文を参照のこと）。残りの反応物は、３０℃で最大４０分インキュベートし、そして試料を一定間隔で採り、そして後述するブタン酸エチル解析のために抽出された。
【００５５】
チーズベース媒体におけるエステルの合成
ブタン酸エチルはまた、リゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来の１，３−特異的リパーゼ(Novo Nordisk, Denmarkにより、「Palatese 20000L」として販売されている)を用いて、チーズベースの媒体中で合成された。これは、４ｇのヤングチェダーチーズスラリー及び１０ｍＭのエタノールから成る９ｍＬの反応混合物中で実施された。スラリーは、タンパク質分解酵素、乳化塩（クエン酸三ナトリウム及び二ナトリウム）及び水を用いて調製した。当該反応は、４０μＬのリパーゼの添加によって開始し、そしてその混合物を３０℃で４時間インキュベートした。エタノールを添加していないものを含むコントロールも含めた。
【００５６】
ブタン酸エチルの抽出及び解析
反応混合物から採取した１ｍＬの試料は、直ちに２ｍＬのジエチルエーテル及び１ｍＬの内部標準（１８０ｍｇ／Ｌの酢酸エチル／水）を含む１６ｍＬのＫｉｍａｘスクリューキャップ型試験管に添加した。抽出は、約２．５分間激しく振とうし、続いて遠心機(Heraeus Megafuge 1.0)内で、１２６０ｇで５分間遠心することによって行った。上側の溶媒層を、オーブンで乾燥させた少量の無水硫酸ナトリウムを含むＧＬＣバイアルに移し、そして後述のようにガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）によってブタン酸エチルについて解析した。
【００５７】
図４は、リゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来リパーゼがエタノール及びトリブチリンからブタン酸エチルの合成を触媒し、これが最初の１０分間線形であったことを示したが、エタノール及びブタン酸からは同一の条件下で触媒されなかった。また、リパーゼを添加していないコントロール中ではブタン酸エチルは形成しなかった。
【００５８】
図５は、チーズベース媒体中でのリゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来リパーゼによるブタン酸エチルの産生を示す。エタノールが当該媒体に添加された場合、このエステルが一貫して形成された。反対に、エタノール又はリゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来リパーゼのいずれかを当該媒体に添加しなかった場合には、エステルは検出されなかった。ブタン酸エチルに加えて、他のエステル、例えばヘキサン酸エチルが検出されたが、エタノールを添加した媒体中では定量できなかった。
【００５９】
実施例４：チーズ内の風味化合物
新鮮なミルクを分離し、そして再び組み合わせて、タンパク質：脂肪の比率が１：０．８２となった。再び組み合わせた混合物は、当該ミルクを７２℃で１５秒間維持した連続系において低温殺菌した。当該ミルクは３２℃に冷却され、そして３つの温度制御型チーズ製造バット（バット３Ａ、３Ｂ及び４）のそれぞれに３７５Ｌ据えた。
【００６０】
中等温度好性スターター菌株、１．８％のバット体積、１００ｍＬのプロピオニバクテリウムのスターター添加物（チーズ風味を産生するためのもの）及び１０ｍＬのラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)ＨＮ００１（ＷＯ９９／１０４７６に記載のとおり）を含む付属の培養物の培養混合物が各バットに添加され、但し、バット４においては、中等温度好性スターター培養物は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)菌株で置換された。更に１８７５ｍＬのラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)培養物（ＬＦ２）がバット４に添加され、in situでエタノールを産生した。３ｇのHansen Kid lambリパーゼ粉末（８０ＬＦＵ）を各バット内で混合し、続いてレンネットをミルク１００Ｌ当たり１０ｍＬの割合で添加した。当該混合物を続いて４０分間維持し、そしてカードは、１２ｍｍの間隔が空いたブレードを有するカードナイフで切断した。
【００６１】
温度を３８℃に上昇させ、そして１３０分の全処理時間の後にホエーをドレイン排出した。この時点でｐＨは６．２であった。３０％のバット体積が除かれたとき、ホエーは２０％のバット体積の水で置換された。カードがｐＨ５．２に達したとき、それは完全にドレイン排出され、６０分間放置され、続いてミル粉砕された。塩（ＮａＣｌ）を１７ｇ／ｋｇの割合で添加した。チーズの２つの２０ｋｇのブロック、Ａ及びＢが各バットから作られた。バット３のブロックＢのためのカードに対し、１１８ｍＬのエタノールと１１８ｍＬの水とを混合したものを添加した。
【００６２】
カードはプレスされ、続いてブロックが多孔性のバッグ内に据えられ、ＣＯ2が逃がされた。ブロックは２０℃で一ヶ月、続いて試験される前に更に一ヶ月５℃で保存され、そして化学解析のために試料が採取された。
【００６３】
化学解析の結果を以下の表に示す。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
これらの結果は、エタノールが添加された場合、エステル交換反応がエステル、特にブタン酸エチルの産生をもたらすことを証明している。in situで産生したエタノールも、エステル、特にブタン酸エチルの産生をもたらす。
【００６６】
チーズにおけるフルーティーな風味の試験
上述のように製造されたチーズは、専門の感覚評価委員会によって風味の特性について評価された。委員は、チーズを味わい、そしてフルーティーさ及び苦味の特徴並びに存在する他の風味の特徴の記述子を記録することを求められた。以下の表において示す結果は、エタノールの添加が、フルーティーな風味の様子を増大させ、且つ苦味の風味をマスキングするのに有効であったことを示した。達成された果実の風味は、知覚された高レベルのブタン酸エチルとよく相関している。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
実施例５：クリームの発酵に由来する風味の濃縮物
エタノールが、実施例３に記載のリゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来リパーゼでインキュベートされたクリームに添加された。
【００６９】
使用した材料は、フルクリーム（４０％脂肪）、リゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来リパーゼ、及びエタノール（１０Ｍ溶液）であった。これらの成分は、スクリューキャップ型のボトル内で混合された。各ボトルは、５０ｍＬのクリーム、４０ｍＬの水及び１０ｍＬのエタノールを含んだ。１つのボトルはコントロールとして保持された。リゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来リパーゼ（０．１５ｍＬの酵素溶液）が第二のボトルに添加され、これを試験試料とした。これらの混合物を含むボトルは、３０℃の水槽内で維持された。試料（５ｍＬ）は、試験ボトルへの酵素の添加後、１，３，５及び２４時間の間隔で取り出され、そして冷凍庫で保存された。当該試料は、後で、ガス液体クロマトグラフィーによるエチルエステル含量の解析のための標準的な方法（実施例１に記載の通り）を用いて抽出された。
【００７０】
解析結果を図６及び７に示す。図６は、短鎖脂肪酸（Ｃ４〜Ｃ８）のエチルエステルが反応の過程で蓄積することを示す。図７は、５時間後に蓄積した短鎖脂肪酸（Ｃ４〜Ｃ８）のエステル及び中鎖エステル（Ｃ１０〜Ｃ１２）の濃度を示す。
【００７１】
実施例６：酵素改良チーズに対する果実風味の特徴の添加
４０Ｌの水をタンク内で４３℃で維持した。リン酸二ナトリウム（１．２ｋｇを５Ｌの熱水中で溶解した）及び３０ｋｇの粉のヤングチェダーチーズカードを添加した。２０分攪拌した後、４３℃の５Ｌの水に溶解した１２０ｇのプロテアーゼを添加した。混合物は、追加の２０ｋｇの粉のカードが１０分かけて添加されてから更に５分間攪拌された。攪拌した反応混合物の温度は４３℃で維持され、そして混合物は１００ｍＬのアリコート中に添加された４ＭのＮａＯＨの添加によってｐＨ５．６に調節された。続いて酵素が混合物を９３℃に加熱し、そして１５分間その温度を維持することによって不活化された。冷却後、混合物を３２℃で且つｐＨ５．４〜５．６に維持した。続いて、混合物は、４Ｌのエンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)、菌株ＥＦ３の培養物及び２ＬのＬｂプランタラム(Lb plantarum)で植菌して、平衡のとれた成熟チーズ風味をもたらした。
【００７２】
混合物は、３２℃で、且つ５．４〜５．６の範囲に調節されたｐＨで４５時間維持された。試料は、化学解析のために混合物（試料４）から採取した。次に、４４０ｍＬの１００％エタノール及び７５ｍＬのリゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来リパーゼを当該混合物に添加した。５時間後、更に試料を採取した（Ｔ５）。次の日、２０時間の反応後、試料１６を採取した。フルーティーで且つチーズ風の香りが混合物中で明らかであった。続いて、混合物は、商業的な基準に合致するよう更に処理された。
【００７３】
表４に示した化学解析の結果は、リパーゼ及びエタノールの添加後の反応混合物中での揮発性のエステルの形成を確認する。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
実施例７：ヒツジのミルクからのエステル合成
９０ｍＬのヒツジのミルクと１０ｍＬの１０Ｍエタノールの溶液を３７℃に加熱した。パラターゼ２００００Ｌ（０．０３％）を添加し、そして混合物を５時間インキュベートした。試料（１０ｍｌ）を１ｍＬの２．５ＭＨ2ＳＯ4で酸性化し、そしてエステルについて解析する前に−２０℃で保存した。エステルは、実施例１に記載の方法を改変してガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって決定した。１ｍｌの解凍され、酸性化された試料を、５ｍＬのジエチルエーテルを含む１６ｍＬのＫｉｍａｘスクリューキャップ型試験管に添加した。抽出は、約２．５分間激しく振とうし、続いて遠心機(Heraeus Megafuge 1.0)内で、１２６０ｇで５分間遠心することによって行った。１ｍＬの溶媒層を続いて１ｍＬの内部標準（１８０ｍｇ／Ｌの酢酸エチル／水）を含む１６ｍＬのＫｉｍａｘスクリューキャップ型試験管に移した。内部標準を含む全ての溶媒抽出物を、５００ｍｇのアミノプロピル固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジに流し、トリグリセリドを除去した。続いて、素通りするエステル化合物を、オーブンで乾燥させた少量の無水硫酸ナトリウムを含むＧＣバイアル中で回収した。この試料は、後述のようにＧＣによってエステルについて解析した。
【００７６】
試料の抽出後、エステルをＧＣで解析した。解析は、フューズドシリカキャピラリーカラム（液相、ＤＢ−１；長さ３０ｍ；内径０．２５ｍｍ；フィルムの厚さ１．０μｍ）(J&W Scientific, CA, USA)を備えた島津ＧＣ−１５Ａガスクロマトグラフィーを用いて実施した。オーブンは、４５℃で５分間の温度にプログラムし、その後１分当たり５℃ずつ５０℃、続いて１分当たり２０℃ずつ２７０℃にまで上昇させ、そして２７０℃で８分間維持した。分割注入は５：１の比率で行い、そして３μＬの試料を注入した。インジェクター及びＦＩＤ（水素炎イオン化検出器）の温度は、それぞれ２５０℃及び２７５℃とした。他の条件は、キャリヤーガス（Ｈｅ）は０．９ｍＬ／分；Ｈ2及びエアはそれぞれ０．６ｋｇ／ｃｍ2；メーキャップガス（Ｎ2）２ｋｇ／ｃｍ2。ＦＩＤアウトプットシグナルを記録し、そして適切なソフトウェア（島津ＣＬＡＳＳ−ＶＰ(商標)クロマトグラフィーデータシステム、バージョン４．２、島津（ＭＤ，ＵＳＡ））を用いて処理した。試料中のエステルを同定し、そして既知の量の純粋なスタンダードとの比較によって定量した。
【００７７】
この反応で形成したエチルエステルの量を以下の表５に記載する。
【００７８】
【表５】
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【００７９】
実施例８：ヤギのミルクからのエステル合成
９０ｍＬのヤギのミルクと１０ｍＬの１０Ｍエタノールの溶液を３７℃に加熱した。パラターゼ２００００Ｌ（０．０３％）を添加し、そして混合物を７時間インキュベートした。試料（１０ｍｌ）を１ｍＬの０．５ＭＨ2ＳＯ4で酸性化し、そしてエステルについて解析する前に−２０℃で保存した。エステルは、実施例７に記載のようにガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって決定した。
【００８０】
この反応で形成したエチルエステルの量を表６に記載する。
【００８１】
【表６】
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【００８２】
実施例９：クリームからのエステル合成
２５ｋｇのクリーム（４０％脂肪）を、０．０７５ｋｇのパラターゼ２００００Ｌ、２．３１ｋｇのエタノール（ホエー発酵由来の９９．８％の食品用）及び２２．６３ｋｇの水と循環ポンプを備えた攪拌タンク内で攪拌しながら混合した。酵素を添加した後、混合物を攪拌し、そして３７℃で４８時間ポンプを使用した。３時間終了時のｐＨは５．５であった。４８時間終了時のｐＨは４．６であった。当該反応は、安定な風味成分を作るためにこの段階で処理されうる。しかしながら、この実施例においては、５０ｋｇの粉チェダーチーズがエステル風味成分に添加され、そしてこの混合物は８５℃で１５分間加熱された。エステル／クリーム／チーズの大半を２０Ｌのプラスチックバケツ中に注いだ。エステル及びクリームとチーズとの配合は、相分離を停止させた。加熱段階は、パラターゼを不活化し、そして生成物を無菌化した。
【００８３】
第二のバッチの風味成分を、上文で概説したようにクリームから調製したが、これは７０ｋｇのクリーム、パラターゼ２００００Ｌ、エタノール（ホエー発酵由来の９９．８％の食品用）と水を、最初に調製したバッチについて上述したのと同一の比率で添加した最初の混合物から作成した。６０ｋｇの生じた生成物を６０ｋｇのチェダーチーズと混合し、そして８５℃に１５分間加熱し、そしてパラターゼを不活化して生成物を無菌化した。
【００８４】
第二のバッチから生じた生成物のエステル解析を以下の表７に記す。
【００８５】
【表７】
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【００８６】
実施例１０：風味の評価
ａ）ホワイトソース
実施例９の第二のバッチに従い調製されたエステル風味成分の試料は、ホワイトソース調製物中で１％で混合された。当該ホワイトソースは、１２５ｇのソース粉末（５ｇの塩、１２０ｇの標準的な白小麦粉及び５００ｇのクリーム粉末）を混合、加熱し、そして４５０ｇの水を配合することにより作られた。
【００８７】
生じた味は、専門の感覚評価委員会によって（実施例４を参照のこと）、せっけん風の特徴を伴う、フルーティーさ、甘味（パイナップルの塊）の風味であることが決定された。
【００８８】
ｂ）チェダーチーズ
チェダー調製物は、以下の通りに調製した。実施例９の第二バッチに従い調製した０．５％のエステル風味成分を、５８．８％のチェダーチーズ、１．７５％のクエン酸三ナトリウム及び３９．４％の水と混合した。パーセンテージは、重量／重量をベースとしている。
【００８９】
生じた生成物は、平衡のとれたフルーティーな風味を有しており、これは後になって生じた。
【００９０】
ｃ）パルメザン−スタイルチーズ
パルメザンスタイルチーズ混合物は、以下のように調製した。実施例９の第二バッチに従い調製した０．５％のエステル風味成分を、５６．２％のパルメザンチーズ、１．７５％のクエン酸三ナトリウム及び４２％の水と混合した。
【００９１】
これは、専門家委員会によって、好ましい甘味の、フルーティーな風味を有することが記載され、これはパルメザンスタイルチーズの良い風味の特徴に対し良好なバランスをもたらした。
【００９２】
ｄ）ゴーダチーズ
ゴーダチーズ調製物は、実施例９に記載の第二バッチについて記載したように調製した０．５％のエステル風味成分と、６３．７％のゴーダチーズ、１．７５％のクエン酸三ナトリウム及び３４．５％の水とを混合することによって作られた。
【００９３】
これは、味見の後化学物質臭のないフルーティーな風味を有すると専門家委員によって記載された。
【００９４】
ｅ）フォンデュチーズ
フォンデュレシピは、１４％のチェダーチーズ、２３％のクリーム、４７％のミルク、９％のバター、４％の小麦粉、１％の他の風味及び実施例６に記載の方法に従い調製した、２％のエステル風味成分を用いて調製した。
【００９５】
専門家委員会は、生じたフォンデュ調製物が向上した味の良さ／フルーティーさ及びチーズ風の味を有していたと述べた。
【００９６】
【表８】
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【表９】
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【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１の非増殖細胞による、１００ｍＭのエタノール及び３３ｍＭのトリブチリンを含むリン酸緩衝液中でのブタン酸エチルの合成の、時間に対するプロットである。黒丸、細胞のみ（４２ｍｇ  ｃｄｗ）；白丸、基質のみ；黒三角、２４ｍｇの細胞（ｃｄｗ）；白三角、４８ｍｇの細胞（ｃｄｗ）[（ｃｄｗ）細胞乾燥重量]。
【図２】図２ａ、２ｂ及び２ｃは、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１の非増殖細胞による、リン酸緩衝液中でのエチルエステルの合成の、時間に対するプロットである。（ａ）１００ｍＭエタノール由来のヘキサン酸エチル；（ｂ）５００ｍＭエタノール及び１０ｍＭデカノイン由来のデカン酸エチル；並びに（ｃ）５００ｍＭエタノール及び１０ｍＭモノデカノイン由来のデカノン酸エチル。黒丸、エステル；白丸、脂肪酸。
【図３】図３は、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)ＳＴ１の非増殖細胞による、リン酸緩衝液中での２−フェニルエチルエステルの合成の、時間に対するプロットである。黒丸、１７ｍＭ２−フェニルエタノール及び１７ｍＭジヘキサノイン由来の２−フェニルエチルヘキサノエート；白丸、１７ｍＭ２−フェニルエタノール及び２３ｍＭモノオクタノイン由来２−フェニルエチルオクタノエート。
【図４】図４は、リゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来１，３−特異的リパーゼによる、５０ｍＭエタノール及び６６ｍＭトリブチリンを含む（白丸）又は５０ｍＭのエタノール及びブタン酸を含む（黒丸）リン酸緩衝液中でのブタン酸エチルの合成のプロットである。
【図５】図５は、リゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)由来１，３−特異的リパーゼによる、過剰のエタノールを含むチーズベースの媒体中でのブタン酸エチルの合成のプロットである。コントロール（黒丸）は、エタノールが添加されなかった。
【図６】図６は、クリーム中でリゾムコール・ミエーイ(Rhizomucor miehei)（０．１５％）を用いる、時間に対する脂肪酸のエチルエステルの産生のプロットである。黒三角、脂肪酸Ｃ４〜Ｃ８のエチルエステル；黒丸、脂肪酸Ｃ１０〜Ｃ１８のエチルエステル。
【図７】図７は、実施例６に記載の、５時間発酵後の炭素鎖長の増大の遊離脂肪酸のエチルエステル濃度を例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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