(57)【要約】  種々のエラストマーベースの微小流体デバイス、ならびにそのようなデバイスを使用および製造するための方法が、提供される。このデバイスのあるものは、高スループット分析を容易にするために反応部位のアレイを有する。いくつかのデバイスはまた、製造の間に試薬が以前に配置されたブラインドチャネルの端部に位置する、反応部位を備える。その試薬は、一旦サンプルが反応部位に導入されると懸濁される。このデバイスは、種々の加熱デバイスとともに使用され得、従って、温度コントロールを必要とする種々の分析（核酸増幅反応のような熱サイクリング適用、遺伝子型決定分析、および遺伝子発現分析を包含する）において使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小流体デバイスであって、
（ａ）弾性材料内で形成されたフローチャネル；
（ｂ）該フローチャネルと流体連絡している複数のブラインドフローチャネルであって、各ブラインドフローチャネルの領域は、反応部位を規定する、ブラインドフローチャネル、
を備える、微小流体デバイス。
【請求項２】
請求項１に記載の微小流体デバイスであって、前記ブラインドフローチャネルの各々に重層しかつ交差する１つ以上のコントロールチャネルをさらに備え、弾性膜が、各交差点にて該１つ以上のコントロールチャネルを該ブラインドフローチャネルから隔て、該弾性膜は、衝撃力に応答して該ブラインドフローチャネル中に湾曲するかまたは該ブラインドフローチャネルから引き出されるように配置されている、微小流体デバイス。
【請求項３】
請求項１に記載の微小流体デバイスであって、前記弾性材料内に形成され、かつ前記フローチャネルに重層し、そして／または前記反応部位のうちの１つ以上に重層する、複数のガードチャネルをさらに備える、微小流体デバイス。
【請求項４】
請求項１に記載の微小流体デバイスであって、前記反応部位の各々内に配置された１つ以上の試薬をさらに備える、微小流体デバイス。
【請求項５】
請求項４に記載の微小流体デバイスであって、前記試薬が非共有結合配置されている、微小流体デバイス。
【請求項６】
請求項２に記載の微小流体デバイスであって、
前記弾性材料内に形成され、かつ前記フローチャネルに重層し、そして／または前記反応部位のうちの１つ以上に重層する、複数のガードチャネルと；
前記反応部位の各々内に配置された１つ以上の試薬と；
をさらに備える、微小流体デバイス。
【請求項７】
請求項１に記載の微小流体デバイスであって、前記フローチャネルが、複数のフローチャネルのうちの１つであり、該フローチャネルの各々が、該フローチャネルから枝分かれする複数のブラインドフローチャネルと流体連絡している、微小流体デバイス。
【請求項８】
請求項７に記載の微小流体デバイスであって、
前記複数のフローチャネルは、該フローチャネルが互いに実質的に平行であるように整列されており、そして
隣接するフローチャネルから枝分かれする前記ブラインドフローチャネルは、互いに対して交互配置されている、
微小流体デバイス。
【請求項９】
請求項７に記載の微小流体デバイスであって、前記複数のフローチャネルが、１つの入口を介して前記反応部位の各々へと流体が導入され得るように、互いに相互接続されている、微小流体デバイス。
【請求項１０】
請求項９に記載の微小流体デバイスであって、
前記複数のフローチャネルが、
（ｉ）複数の垂直フローチャネルと；
（ｉｉ）複数の水平フローチャネルと、
を備え、各水平フローチャネルの一端は、該垂直フローチャネルの１つと流体連絡しており、各水平フローチャネルのもう一端は、該垂直フローチャネルの別の１つと流体連絡しており、それにより、流体が、１つの水平フローチャネルから該垂直フローチャネルを介して別の水平フローチャネルへと流動し得、
前記枝分かれフローチャネルが、該水平フローチャネルと実質的に垂直である、
微小流体デバイス。
【請求項１１】
請求項９に記載の微小流体デバイスであって、隣接するフローチャネルから枝分かれする前記ブラインドフローチャネルが、互いに対して交互配置されている、微小流体デバイス。
【請求項１２】
請求項９に記載の微小流体デバイスであって、前記弾性材料内に形成され、かつ前記フローチャネルもしくは枝分かれチャネルのうちの１つ以上に重層し、そして／または前記反応部位のうちの１つ以上に重層する、複数のガードチャネルをさらに備える、微小流体デバイス。
【請求項１３】
請求項９に記載の微小流体デバイスであって、前記反応部位の各々内に配置された１つ以上の試薬をさらに備える、微小流体デバイス。
【請求項１４】
請求項７に記載の微小流体デバイスであって、前記複数のフローチャネルが、１つのフローチャネルに導入された流体が別のフローチャネルへと流動し得ないように互いから隔離されており、そして各フローチャネルが、流体が導入され得る１つの入口を一端に備える、微小流体デバイス。
【請求項１５】
請求項１４に記載の微小流体デバイスであって、前記弾性材料内に形成され、かつ前記フローチャネルもしくは枝分かれチャネルのうちの１つ以上に重層し、そして／または前記反応部位のうちの１つ以上に重層する、複数のガードチャネルをさらに備える、微小流体デバイス。
【請求項１６】
請求項１４に記載の微小流体デバイスであって、前記反応部位の各々内に配置された１つ以上の試薬をさらに含む、微小流体デバイス。
【請求項１７】
請求項７に記載の微小流体デバイスであって、前記複数のフローチャネルの各々が２つの端部を有し、該複数のフローチャネルは、１つのフローチャネルに導入された流体が別のフローチャネルへと流動し得ないように互いから隔離されており、そして各フローチャネルが、各端部に位置する入口を備える、微小流体デバイス。
【請求項１８】
請求項１７に記載の微小流体デバイスであって、前記弾性材料内に形成され、かつ前記フローチャネルもしくは枝分かれチャネルのうちの１つ以上に重層し、そして／または前記反応部位のうちの１つ以上に重層する、複数のガードチャネルをさらに備える、微小流体デバイス。
【請求項１９】
請求項１７に記載の微小流体デバイスであって、前記反応部位の各々内に配置された１つ以上の試薬をさらに含む、微小流体デバイス。
【請求項２０】
１ｃｍ２当たり少なくとも５０部位である密度を有する反応部位のアレイを含む、微小流体デバイス。
【請求項２１】
請求項２０に記載の微小流体デバイスであって、前記反応部位のアレイが、弾性材料内に形成されている、微小流体デバイス。
【請求項２２】
請求項２０に記載の微小流体デバイスであって、前記密度が、１ｃｍ２当たり少なくとも２５０部位である、微小流体デバイス。
【請求項２３】
請求項２２に記載の微小流体デバイスであって、前記密度が、１ｃｍ２当たり少なくとも５００部位である、微小流体デバイス。
【請求項２４】
請求項２３に記載の微小流体デバイスであって、前記密度が、１ｃｍ２当たり少なくとも１０００部位である、微小流体デバイス。
【請求項２５】
弾性基材内に形成された反応部位を含む微小流体デバイスであって、該反応部位において、反応を行うための試薬が固定されている、微小流体デバイス。
【請求項２６】
請求項２５に記載の微小流体デバイスであって、前記試薬が、核酸増幅反応を行うための１種以上の試薬を含む、微小流体デバイス。
【請求項２７】
請求項２６に記載の微小流体デバイスであって、前記試薬が、プライマー、ポリメラーゼ、および／または１種以上のヌクレオチドを含む、微小流体デバイス。
【請求項２８】
請求項２６に記載の微小流体デバイスであって、前記試薬が、核酸テンプレートを含む、微小流体デバイス。
【請求項２９】
微小流体デバイスであって、
（ａ）弾性基材において形成された第１の複数のフローチャネル；
（ｂ）該弾性基材において形成された第２の複数のフローチャネルであって、反応部位のアレイを規定するように該第１の複数のフローチャネルと交差する、第２の複数のフローチャネル；
（ｃ）該第１の複数のフローチャネルおよび該第２の複数のフローチャネル内に配置された複数の隔離バルブであって、該隔離バルブは、該反応部位の各々の中にある溶液を他の反応部位にある溶液から隔離するように作動され得る、隔離バルブ；
を備える、微小流体デバイス。
【請求項３０】
請求項２９に記載の微小流体デバイスであって、１つ以上のコントロールチャネルをさらに備え、該コントロールチャネルは各々、前記フローチャネルのうちの１つ以上に重層しかつ該フローチャネルのうちの１つ以上と交差する、微小流体デバイス。
【請求項３１】
請求項２９に記載の微小流体デバイスであって、
前記第１の複数のフローチャネルが互いに対して実質的に平行であり、
前記第２の複数のフローチャネルが、互いに対して実質的に平行であり、かつ該第１の複数のフローチャネルに対して直交する、
微小流体デバイス。
【請求項３２】
請求項２９に記載の微小流体デバイスであって、前記第１の複数のフローチャネルの各々および前記第２の複数のフローチャネルの各々が、別個の入口を備える、微小流体デバイス。
【請求項３３】
請求項２９に記載の微小流体デバイスであって、前記第１の複数のフローチャネルのうちの少なくともいくつかが、第１の共有された入口と流体連絡しており、そして／または前記第２の複数のフローチャネルのうちの少なくともいくつかが、第２の共有された入口と流体連絡している、微小流体デバイス。
【請求項３４】
分析を行うための方法であって、
（ａ）微小流体デバイスを提供する工程であって、該微小流体デバイスは、
（ｉ）弾性材料内に形成されたフローチャネル；および
（ｉｉ）該フローチャネルと流体連絡している複数のブラインドフローチャネルであって、各ブラインドフローチャネルの端部領域は、反応部位を規定する、ブラインドフローチャネル；
を備える工程；
（ｂ）該反応部位の各々中に少なくとも１種の試薬を導入する工程；ならびに
（ｃ）該反応部位のうちの１つ以上にて反応を検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、前記反応部位内にある少なくとも１種の試薬を加熱する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３６】
請求項３４に記載の方法であって、前記少なくとも１種の試薬が、反応混合物を含む、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、前記反応混合物が、核酸増幅反応のための構成成分を含み、該方法は、該反応混合物を熱サイクリングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、前記反応混合物が、酵素アッセイのための構成成分を含む、方法。
【請求項３９】
請求項３４に記載の方法であって、前記少なくとも１種の試薬が、前記反応部位の各々に配置された試薬と混合して反応混合物を形成する、方法。
【請求項４０】
請求項３９に記載の方法であって、前記少なくとも１種の試薬が核酸テンプレートを含み、前記配置された試薬が、核酸増幅反応の１種以上の構成成分を含み、そして該方法は、前記反応混合物を熱サイクリングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項４１】
請求項３９に記載の方法であって、前記少なくとも１種の試薬が核酸増幅反応の１種以上の構成成分を含み、前記配置された試薬が、核酸テンプレートを含み、そして該方法は、前記反応混合物を熱サイクリングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項４２】
請求項３４に記載の方法であって、
前記フローチャネルが、複数のフローチャネルのうちの１つであり、該フローチャネルの各々は、複数のブラインドフローチャネルと流体連絡しており、
該複数のフローチャネルは、前記反応部位の各々中に単一の入口を介して流体が導入され得るように、互いに交互接続されており、
前記少なくとも１種の試薬が、該単一の入口を介して導入される、
方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、少なくとも１００個の反応部位が存在する、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、少なくとも１，０００個の反応部位が存在する、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、少なくとも１０，０００個の反応部位が存在する、方法。
【請求項４６】
請求項４５に記載の方法であって、少なくとも１００，０００個の反応部位が存在する、方法。
【請求項４７】
請求項４２に記載の方法であって、第１の試薬が、前記反応部位の各々中に前記単一の入口を介して導入され、第２の試薬が、前記反応部位の各々に配置されており、異なる反応部位は異なる第２の試薬を有し、それにより、該異なる反応部位の各々にて該第１の試薬を含む異なる反応が生じる、方法。
【請求項４８】
請求項４７に記載の方法であって、前記異なる第２の試薬が、異なる核酸プライマーを含み、そして前記少なくとも１種の試薬が、核酸テンプレートを含む、方法。
【請求項４９】
請求項３４に記載の方法であって、
前記フローチャネルが、複数のフローチャネルのうちの１つであり、該フローチャネルの各々は、複数のブラインドフローチャネルと流体連絡しており、
前記複数のフローチャネルが、１つのフローチャネル中に導入された流体が別のフローチャネルに流動し得ないように、互いから隔離されており；そして
導入する工程が、該複数のフローチャネルの各々に少なくとも１種の試薬を別個に導入する工程を包含する、
方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、
第１の試薬が各フローチャネルに導入され；
各フローチャネルと流体連絡している反応部位が、第２の試薬を含み、該第２の試薬は、異なるフローチャネルと流体連絡している反応部位間で異なり；
導入する工程が、該フローチャネルの各々に第１の試薬を導入する工程を包含する、
方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、前記異なる第２の試薬が、異なる核酸プライマーを含み、そして前記第１の試薬が、核酸テンプレートを含む、方法。
【請求項５２】
分析を行うための方法であって、
（ａ）１つ以上の反応部位を含む微小流体デバイスを提供する工程であって、各反応部位は、弾性基材上に非共有結合により配置された、分析を行うための第１の試薬を含む、工程；
（ｂ）該１つ以上の反応部位中に第２の試薬を導入することによって、該第１の試薬および第２の試薬が混合して反応混合物を形成する、工程；ならびに
（ｃ）該反応部位のうちの１つ以上における該第１の試薬と第２の試薬との間の反応を検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、前記反応混合物を加熱する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５４】
請求項５２に記載の方法であって、前記第２の試薬の導入が、前記第１の試薬が前記反応部位にて懸濁されることを引き起こす、方法。
【請求項５５】
請求項５２に記載の方法であって、前記１つ以上の反応部位が、反応部位のアレイである、方法。
【請求項５６】
請求項５２に記載の方法であって、前記分析が核酸分析であり、前記第１の試薬が、核酸と相互反応する試薬であり、そして前記第２の試薬が、試験核酸である、方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、前記分析が核酸増幅反応であり、前記第１の試薬が、該核酸増幅反応を行うための１種以上の試薬を含み、そして前記第２の試薬が核酸テンプレートであり、そして該方法は、該第１の試薬および該第２の試薬を熱サイクリングする工程をさらに包含する、方法。
【請求項５８】
請求項５２に記載の方法であって、
前記１種以上の反応部位が、反応部位のアレイであり：
異なる核酸増幅試薬が、異なる反応部位に存在し；そして
同じ核酸テンプレートが、該反応部位の各々に導入される、
方法。
【請求項５９】
請求項５２に記載の方法であって、前記分析がタンパク質分析であり、前記第１の試薬が潜在的タンパク質リガンドであり、そして前記第２の試薬が試験タンパク質である、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法であって、前記潜在的タンパク質リガンドが、タンパク質、抗体、酵素基質、酵素補因子、および酵素インヒビターからなる群より選択される、方法。
【請求項６１】
請求項５２に記載の方法であって、前記分析が細胞分析であり、前記第１の試薬が、該細胞と潜在的に反応する試薬であり、そして前記第２の試薬が試験細胞である、方法。
【請求項６２】
分析を行うための方法であって、
(ａ）反応部位のアレイを含む微小流体デバイスを提供する工程であって、該反応部位のアレイは、基材内に形成されかつ１ｃｍ２当たり少なくとも５０部位である密度を有する、工程；
（ｂ）該反応部位の各々に少なくとも１種の試薬を導入する工程；および
（ｃ）該反応部位のうちの１つ以上で反応を検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項６３】
請求項６２に記載の方法であって、前記アレイが、１ｃｍ２当たり少なくとも２５０部位である密度を有する、方法。
【請求項６４】
請求項６２に記載の方法であって、前記アレイが、１ｃｍ２当たり少なくとも５００部位である密度を有する、方法。
【請求項６５】
請求項６４に記載の方法であって、前記アレイが、１ｃｍ２当たり少なくとも１，０００部位である密度を有する、方法。
【請求項６６】
分析を行うための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの反応部位と、複数のガードチャネルとを含む微小流体デバイスを提供する工程であって、該反応部位は、弾性基材内に形成されており、該ガードチャネルもまた、該弾性基材内に形成されている、工程；
（ｂ）該反応部位の各々に少なくとも１種の試薬を導入する工程；
（ｃ）該反応部位の少なくとも１つの内にある少なくとも１種の試薬を加熱する工程；
（ｄ）該少なくとも１つの反応部位からの蒸発を減少するために、加熱前または加熱の間に、該ガードチャネルに流体を流す工程；および
（ｅ）該少なくとも１つの反応部位内における反応を検出する工程；
を包含する、方法。
【請求項６７】
請求項６６に記載の方法であって、
導入する工程が、前記少なくとも１つの反応部位に核酸テンプレートを導入することによって、該核酸テンプレートが、該少なくとも１つの反応部位にて１種以上の核酸増幅試薬と混合する工程を包含し；
加熱する工程が、該核酸テンプレートおよび増幅試薬を熱サイクリングして増幅産物を形成する工程を包含し；
検出する工程が、該増幅産物を検出する工程を包含する、
方法。
【請求項６８】
請求項６７に記載の方法であって、前記流体が水溶液である、方法。
【請求項６９】
請求項６７に記載の方法であって、前記流体が疎水性化合物である、方法。
【請求項７０】
請求項６９に記載の方法であって、前記疎水性化合物が油である、方法。
【請求項７１】
微小流体デバイスであって、
（ａ）弾性基材中に形成された微量流体ネットワークの一部である、空洞；ならびに
（ｂ）該空洞に重層しかつ該空洞から弾性膜により隔てられている複数のガードチャネルであって、各ガードチャネルは、（ｉ）該ガードチャネルを通る溶液流れを可能にしかつ（ｉｉ）該ガードチャネルへの衝撃力の適用に際して該膜の湾曲に起因する、該空洞中、該空洞外または該空洞を通る溶液流れの実質的減少が存在しないような、大きさである、ガードチャネル；
を備える、デバイス。
【請求項７２】
請求項７１に記載のデバイスであって、前記空洞がフローチャネルである、デバイス。
【請求項７３】
請求項７１に記載のデバイスであって、前記空洞が反応チャンバである、デバイス。
【請求項７４】
請求項７１に記載のデバイスであって、前記ガードチャネルの各々が、５０，０００μｍ２未満の断面積を有する、デバイス。
【請求項７５】
請求項７４に記載のデバイスであって、前記断面積が、１０，０００μｍ２未満である、デバイス。
【請求項７６】
請求項７５に記載のデバイスであって、前記断面積が、１，０００μｍ２未満である、デバイス。
【請求項７７】
請求項７６に記載のデバイスであって、前記断面積が、１００μｍ２未満である、デバイス。
【請求項７８】
微小流体デバイスであって、
（ａ）１つ以上のフローチャネルおよび／または１つ以上の反応部位を含む、微量流体システム；ならびに
（ｂ）該微小流体システムに重層しかつエラストマーにより該微小流体システムから隔てられている、複数のガードチャネルであって、ガードチャネル間の端部間隔は、１μｍ〜１ｍｍの間である、ガードチャネル；
を備える、微小流体デバイス。
【請求項７９】
請求項７８に記載の微小流体デバイスであって、前記間隔が、５μｍと５００μｍとの間である、微小流体デバイス。
【請求項８０】
請求項７９に記載の微小流体デバイスであって、前記間隔が、１０μｍと１００μｍとの間である、微小流体デバイス。
【請求項８１】
請求項８０に記載の微小流体デバイスであって、前記間隔が、４０μｍと７５μｍとの間である、微小流体デバイス。
【請求項８２】
請求項２７に記載の微小流体デバイスであって、前記試薬が、ゼラチン、グリセロールおよび界面活性剤からなる群より選択される１種以上の添加剤をさらに含む、微小流体デバイス。
【請求項８３】
請求項５７に記載の微小流体デバイスであって、前記第１の試薬が、ゼラチン、グリセロールおよび界面活性剤からなる群より選択される１種以上の添加剤を含む、微小流体デバイス。
【請求項８４】
微小流体デバイスにおける増幅反応を増強するための組成物であって、弾性基材上のタンパク質結合部位をブロックする薬剤、核酸中の二次構造を減少する薬剤、プライマーと相補的テンプレートとの間のミスプライミングを減少する薬剤、および界面活性剤
からなる群より選択される１種以上の薬剤を含む、組成物。
【請求項８５】
請求項８４に記載の組成物であって、該組成物は、前記薬剤のうちの少なくとも２種を含む、組成物。
【請求項８６】
請求項２５に記載の微小流体デバイスであって、前記試薬が非共有結合により固定されている、微小流体デバイス。
【請求項８７】
請求項２５に記載の微小流体デバイスであって、前記試薬が、リンカーを介して前記基質に結合されている、微小流体デバイス。
【請求項８８】
請求項８７に記載の微小流体デバイスであって、前記リンカーが、光不安定性リンカーである、微小流体デバイス。
【請求項８９】
請求項８７に記載の微小流体デバイスであって、前記リンカーが、熱不安定性リンカーである、微小流体デバイス。
【請求項９０】
請求項２９に記載の微小流体デバイスであって、前記フローチャネルのうちの１つ以上および／または前記反応部位のうちの１つ以上に重層してそれらからの溶液の蒸発を防ぐ、複数のガードチャネルをさらに含む、微小流体デバイス。
【請求項９１】
請求項３０に記載の微小流体デバイスであって、前記隔離バルブのうちの少なくともいくつかが、該隔離バルブが作動する際に前記コントロールチャネルのうちの１つを前記フローチャネルから隔てる弾性膜を含む、微小流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００２年６月２４日に出願された米国仮出願番号６０／３９１，５２９、および２００１年１１月３０日に出願された米国仮出願番号６０／３３５，２９２の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
近年、調製用途および分析用途の両方について、種々の化学的および生化学的な分析および合成を行うための微小流体システムを開発および製造する協力がなされている。このようなデバイスを製造する目的は、マクロスケールで行われる分析および合成に対して小型化から理解され得る有意な利点に起因して起きる。このような利点としては、分析または合成を行うために使用されるデバイスについての、時間、コストおよび空間要件の実質的な低下が挙げられる。さらに、微小流体デバイスは、自動化システムとの使用に適合される可能性を有しており、それによって、ヒトの介入の減少に起因した、さらなるコスト低下およびオペレータエラーの低減というさらなる利点を提供する。微小流体デバイスは、種々の用途（例えば、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフィーおよび細胞分離が挙げられる）における使用のために提唱されている。
【０００３】
しかし、これらの利点の実現は、今まで製造されてきた微小流体デバイスに関連する種々の複雑性に起因して、しばしば妨げられる。例えば、現在の微小流体デバイスの多くは、シリカベースの物質から製造されており、これらの材料は、機械加工するのが困難かつ複雑であり、このような材料から製造されるデバイスは、もろい。さらに、多くの既存の微小流体デバイスを通した流体の輸送は、制御された様式でこのデバイスを通して流体を輸送するために、複雑な電場の調節を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、既存のデバイスの現在の制限を除く、微小流体デバイスを用いて達成され得る前出の利点の観点から、種々の化学的分析および生化学的分析を行う際の使用のために設計された微小流体デバイスについての必要性が依然として残ったままである。近代生化学におけるこのデバイスの重要性に起因して、種々の核酸増幅反応を行うために利用され得る一方で、同様に他の分析型における使用のために十分な多能性（ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ）を備えたデバイスについての特定の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
核酸増幅を行う性能を備えたデバイスは、多様な用途を有する。例えば、このようなデバイスは、分析用ツールとして使用され、目的の特定の標的核酸がサンプル中に存在するか存在しないかを決定し得る。従って、このデバイスは、特定の病原体（例えば、ウイルス、細菌または真菌）の存在について試験するため、および同定目的（例えば、父系および法医学的用途）のために利用され得る。このようなデバイスはまた、特定の疾患または遺伝子障害と関連することが以前に示されている特定の核酸を検出または特徴付けするために利用され得る。分析用ツールとして使用される場合、このデバイスはまた、遺伝子型分析および遺伝子発現分析（例えば、差次的遺伝子発現研究）を行うために利用され得る。あるいは、このデバイスは、さらなる分析（例えば、増幅産物の配列決定、細胞型別、ＤＮＡフィンガープリントなど）のために十分な核酸を増幅するために、調製様式で使用され得る。増幅産物はまた、種々の遺伝子操作用途（例えば、ベクターへの挿入（次いで、これを使用して、所望のタンパク質産物の産生のために細胞を形質転換する））において使用され得る。
【０００６】
（要旨）
微小流体分析を行うための種々のデバイスおよび方法が、本明細書中で提供される。これらのデバイスとしては、熱サイクリング反応（例えば、核酸増幅反応）を行うために利用され得るデバイスが挙げられる。これらのデバイスは、弾性部品を備えている点で、従来型の微小流体デバイスと異なっている。いくつかの例において、デバイスのほとんどまたは全てが、弾性材料から構成される。
【０００７】
特定のデバイスは、熱サイクリング反応（例えば、ＰＣＲ）を行うように設計される。これらのデバイスは、これらのデバイスを通る溶液の流れを調節するための１個以上の弾性バルブを備えている。従って、この設計のデバイスを用いて増幅反応を行うための方法もまた、提供される。
【０００８】
これらのデバイスのいくつかは、反応部位として機能する領域を含むブラインドフローチャネルを備える。特定のこのようなデバイスは、弾性材料内に形成されるフローチャネル、およびこのフローチャネルと流体連絡した複数のブラインドフローチャネルを備え、各ブラインドフローチャネルの領域が、反応部位を規定している。これらのデバイスはまた、そのブラインドフローチャネルの各々に重層しかつ交差する１個以上のコントロールチャネルを備え得、ここで、弾性膜が、各交差点にて１つ以上のコントロールチャネルをブラインドフローチャネルから隔てている。このようなデバイスにおける弾性膜は、衝撃力に応答してブラインドフローチャネル中に湾曲するかまたはブラインドフローチャネルから引き出されるように配置されている。このデバイスは、弾性材料内に形成され、かつフローチャネルに重層し、そして／または反応部位のうちの１つ以上に重層する、複数のガードチャネルを必要に応じてさらに備え得る。このガードチャネルは、それを通じて流体が流れ、このデバイスのフローチャネルおよび反応部位からのエバポレーションを低減するように設計されている。さらに、このデバイスは、その各反応部位内に配置された１種以上の試薬を必要に応じて備え得る。
【０００９】
特定のデバイスにおいて、そのフローチャネルは、複数のフローチャネルのうちの１つであり、これらのフローチャネルの各々は、そこから枝分かれした複数のブラインドフローチャネルと流体連絡している。この設計のデバイスのうち、いくつかの例において、複数のフローチャネルは、１つの入口を介して反応部位の各々に流体が導入され得るように、互いに相互接続されている。しかし、他のデバイスにおいて、複数のフローチャネルは、１つのフローチャネルに導入される流体が、別のフローチャネルに流れることができないように、互いに隔てられており、各フローチャネルは、流体が導入され得る入口を、一方端または両端に備える。
【００１０】
他のデバイスは、１ｃｍ２当たり少なくとも５０部位の密度を有する反応部位のアレイを備える。この反応部位は、代表的に、弾性材料内に形成される。他のデバイスは、なおより高密度（例えば、１ｃｍ２当たり少なくとも２５０部位、１ｃｍ２当たり５００部位または１ｃｍ２当たり１０００部位）を有する。
【００１１】
なお他のデバイスは、弾性基材内に形成された反応部位を備えており、この反応部位にて、反応を行うための試薬が、非共有的に固定されている。この試薬は、任意の型の反応を本質的に行うための１種以上の試薬であり得る。いくつかのデバイスにおける試薬としては、核酸増幅反応を行うための１種の試薬が挙げられる。従って、いくつかのデバイスにおいて、この試薬は、プライマー、ポリメラーゼおよび１つ以上のヌクレオチドを含む。他のデバイスにおいて、この試薬は、核酸テンプレートである。
【００１２】
種々のマトリクスまたはアレイベースのデバイスもまた、提供される。特定のこれらのデバイスは、以下を備える：（ｉ）弾性基材に形成される第一の複数のフローチャネル、（ｉｉ）反応部位のアレイを規定するためにこの第一の複数のフローチャネルに交差する、弾性基材に形成される第二の複数のフローチャネル、（ｉｉｉ）各反応部位内の溶液を他の部位における溶液から分離するように作動され得る、第一の複数のフローチャネルおよび第二の複数のフローチャネル内に配置される、複数の分離バルブ、ならびに（ｉｖ）１つ以上のフローチャネルおよび／または１つ以上の反応部位に重層し、そこからの溶液のエバポレーションを防止する、複数のガードチャネル。
【００１３】
前出のデバイスは、多くの異なる型の反応（温度調節（例えば、核酸分析の熱サイクリング）を含む反応が挙げられる）を行うために利用され得る。特定のブラインドチャネル型デバイスを用いて行われる方法は、弾性材料内に形成されるフローチャネル；およびこのフローチャネルと流体連絡した複数のブラインドフローチャネル（各ブラインドチャネルの末端領域は、反応部位を規定する）を備える微小流体デバイスを提供する工程を包含する。少なくとも１種の試薬が、これらの反応部位の各々に導入され、次いで、反応が、それらの反応部位のうちの１つ以上にて検出される。この方法は、必要に応じて、これらの反応部位内で少なくとも１種の試薬を加熱する工程を包含し得る。従って、例えば、この方法は、核酸増幅反応のための成分を導入し、次いで、この成分を熱サイクリングして増幅産物を形成する工程を包含し得る。
【００１４】
他の方法は、１つ以上の反応部位を備える微小流体デバイスを提供する工程を包含し、各反応部位は、弾性基材上に必要に応じて非共有的に配置された、分析を行うための第一の試薬を含む。次いで、第二の試薬が、１つ以上の反応部位に導入され、それによって、この第一の試薬と第二の試薬とが混合されて、反応混合物を形成する。これらの反応部位の１つ以上での、この第一の試薬と第二の試薬との間の反応は、連続的に検出される。
【００１５】
なお他の方法は、基材内に形成されかつ１ｃｍ２当たり少なくとも５０部位の密度を有する反応部位のアレイを備える微小流体デバイスを提供する工程を包含する。少なくとも１種の試薬が、これらの反応部位のうちの１つ以上に導入される。次いで、これらの反応部位のうちの１つ以上での反応が、検出される。
【００１６】
なお別の方法は、弾性基材内に形成される少なくとも１つの反応部位、およびこの弾性基材内にまた形成される複数のガードチャネルを備える微小流体デバイスを提供する工程を包含する。少なくとも１種の試薬が、反応部位の各々に導入され、次いで、これらの反応部位内で加熱される。流体は、加熱前または加熱の間、ガードチャネルを通って流れ、少なくとも１つの反応部位からのエバポレーションを減少させる。少なくとも１つの反応部位内の反応は、連続的に検出される。
【００１７】
デバイスからの流体のエバポレーションを減少させるように設計されたさらなるデバイスもまた、提供される。一般に、このようなデバイスは、弾性基材に形成される微小流体ネットワークの一部であるキャビティ；およびこのキャビティに重複しかつ弾性膜によってこのキャビティから隔てられる複数のガードチャネルを備える。このようなデバイスにおけるガードチャネルは、（ｉ）このガードチャネルを通る溶液流れを可能にし、かつ（ｉｉ）このガードチャネルに衝撃力が付与された際の膜の湾曲に起因した、キャビティ内、キャビティ外またはキャビティを通る溶液流れの実質的な減少が存在しないように、サイズ決定される。他のこのようなデバイスは、（ｉ）１つ以上のフローチャネルおよび／または１つ以上の反応部位；ならびに（ｉｉ）微小流体システムに重複しかつエラストマーによってそれから隔てられている複数のガードチャネルを備える。ここで、ガードチャネル間の間隔は、１μｍと１ｍｍとの間である。他のデバイスにおいて、この間隔は、５μｍと５００μｍとの間であり、他のデバイスにおいては、１０μｍと１００μｍとの間であり、そしてなお他のデバイスにおいては、４０μｍと７５μｍとの間である。
【００１８】
特定の微小流体デバイスの反応部位において核酸分析を行うための組成物もまた、提供される。特定のこのような組成物は、以下のうちの１つ以上を含有する：弾性材料上のタンパク質結合部位をブロックする薬剤および界面活性剤。このブロッキング剤は、代表的に、タンパク質（例えば、ゼラチンまたはアルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）））からなる群より選択される。界面活性剤は、例えば、ＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎであり得る。
【００１９】
（詳細な説明）
１．定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版  １９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  （Ｗａｌｋｅｒ編，１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，第５版，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、割り当てられた意味を有する。
【００２０】
「フローチャネル」とは、一般的に、溶液がそこを通って流れ得る流路をいう。
【００２１】
用語「バルブ」は、示されていない限り、フローチャネルおよびコントロールチャネルが交差し、衝撃力に応じてフローチャネルに中に湾曲され得るかまたはフローチャネルから引っ込められ得る弾性膜により隔てられる、構成をいう。
【００２２】
「ブラインドチャネル」または「行き止まりチャネル」とは、入口を有するが、別個の出口を有さないフローチャネルをいう。従って、このブラインドチャネルを出入りする溶液の流れは、同じ位置において起こる。１つ以上のブラインドチャネルを満たすプロセスは、時々、単純に「ブラインドフィル」と呼ばれる。
【００２３】
「隔離された反応部位」とは、一般的に、そのデバイスに存在するほかの反応部位と流体連通していない反応部位をいう。ブラインドチャネルに関して使用される場合、隔離された反応部位は、そのブラインドチャネルに付随したバルブにより遮断され得るブラインドチャネルの末端における領域である。
【００２４】
「を介する（介して）（ｖｉａ）」とは、デバイスの外部ポートと１つ以上のフローチャネルとの間に流体アクセスを提供するための、弾性デバイスに形成されるチャネルをいう。従って、介する（ｖｉａ）は、例えば、サンプル入口またはサンプル出口として作用する。
【００２５】
用語「エラストマー」および「弾性」は、当該分野で使用されるとおりのその一般的な意味を有する。従って、例えば、Ａｌｌｃｏｃｋら（Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版）は、エラストマーを、概して、そのガラス転移温度と液化温度との間の温度で存在するポリマーとして記載する。弾性材料は、弾性特性を示す。なぜなら、ポリマー鎖は、力に応じて容易にねじれ運動を受けて骨格鎖が解けるのを可能にし、この骨格鎖が反動して力の非存在下での以前の形状をとるからである。一般的に、エラストマーは、力が加えられた場合に変形するが、その後、力が除かれるとそれらの元の形状に戻る。弾性材料により示される弾性は、ヤング率により特徴付けられ得る。本明細書中に開示される微小流体デバイスにおいて利用される弾性材料は、代表的に、約１Ｐａ〜１ＴＰａの間、他の例において約１０Ｐａ〜１００ＧＰａの間、なお他の例において約２０Ｐａ〜１ＧＰａの間、さらに他の例において、約５０Ｐａ〜１００ＧＰａの間、そして特定の例において約１００Ｐａ〜１ＭＰａの間のヤング率を有する。これらの範囲外のヤング率を有する弾性材料もまた、特定の適用の必要性に依存して利用され得る。
【００２６】
本明細書中に記載される微小流体デバイスのいくつかは、エラストマーポリマー（例えば、ＧＥ  ＲＴＶ６１５（配合）、ビニル−シラン架橋（型）シリコーンエラストマー（ファミリー））から製造される。しかし、本発明の微小流体システムは、ポリマーのこの１種の配合、型またはこのポリマーのファミリーにさえ限定されず；むしろ、ほとんど任意のエラストマーポリマーが、適切である。ポリマー化学、前駆体、合成方法、反応条件、および可能な添加剤の途方も無い多様性を考慮すると、モノリシックエラストマーミクロバルブおよびポンプを作製するために使用され得る、多数の可能なエラストマー系が存在する。材料の選択は、実施される適用に必要な特定の材料特性（例えば、溶媒耐性、剛性、気体透過性、および／または温度安定性）に代表的に依存する。本明細書中に開示される微小流体デバイスの構成要素の製造において使用され得る弾性材料の型に関するさらなる詳細は、Ｕｎｇｅｒら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６ならびにＰＣＴ公開  ＷＯ０２／４３６１５、および同ＷＯ０１／０１０２５（これらは、全ての目的のために、その全体が参考として本明細書中に援用される）に示される。
【００２７】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書において、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むように使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。これらの用語間で長さにおいて意図された区別はない。さらに、これらの用語は、その分子の一次構造のみを指す。従って、特定の実施形態において、これらの用語は、三本鎖、二本鎖、および一本鎖のＤＮＡ、ならびに三本鎖、二本鎖、および一本鎖のＲＮＡを含み得る。これらはまた、例えば、メチル化および／またはキャッピングによる改変、ならびにポリヌクレオチドの未改変形態を含む。より詳細には、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））、およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎから、Ｎｅｕｇｅｎｅとして市販される）ポリマー）、ならびに他の合成の配列特異的核酸ポリマー（ただし、このポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡで見出される場合のように、塩基対合および塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含む。
【００２８】
「プローブ」は、１つ以上のタイプの化学結合を介して、通常、相補塩基対合を介して、通常、水素結合形成を介して、相補的配列の標的核酸に結合して、二重鎖構造を形成し得る核酸である。プローブは、「プローブ結合部位」に結合またはハイブリダイズする。プローブは、特に、プローブがその相補的標的にハイブリダイズした場合、プローブの容易な検出を可能にするために、検出可能標識で標識され得る。プローブに付着された標識としては、例えば、化学的手段または物理的手段によって検出され得る、当該分野で公知の種々の異なる標識のいずれかが挙げられ得る。プローブに付着され得る適切な標識としては、放射性同位体、発蛍光団、発色団、質量標識、電子稠密粒子（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｅｎｓｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放射する分子、電気化学活性分子、酵素、補因子、および酵素基質が挙げられるが、これらに限定されない。プローブは、その大きさにおいて顕著に変動し得る。いくつかのプローブは比較的短い。一般に、プローブは、少なくとも７〜１５ヌクレオチドの長さである。他のプローブは、少なくとも２０、３０または４０ヌクレオチド長を有する。さらに他のプローブは、幾分長く、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０ヌクレオチド長である。なお他のプローブは、さらに長く、少なくとも１００、１５０、２００またはそれ以上のヌクレオチド長である。プローブは、また前述の範囲内にあるいずれの特定の長さでもあり得る。
【００２９】
「プライマー」は、適切な緩衝液中の適切な条件下で（すなわち、４つの異なるヌクレオシド三リン酸および重合用因子（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡのポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下で）、かつ適切な温度でテンプレート指向ＤＮＡ合成の開始点として作用し得る一本鎖ポリヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図された使用に依存するが、代表的には、少なくとも７ヌクレオチド長であり、より代表的には、１０〜３０ヌクレオチド長の範囲である。他のプライマーは、幾分より長いものであり得、例えば、３０〜５０ヌクレオチド長である。短いプライマー分子は、一般に、テンプレートを用いて十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。プライマーは、テンプレートの正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。用語「プライマー部位」または「プライマー結合部位」は、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡのセグメントをいう。用語「プライマー対」は、５’「上流プライマー」（これは、増幅されるべきＤＮＡ配列の５’末端の相補体とハイブリダイズする）および３’「下流プライマー」（これは、増幅されるべき配列の３’末端とハイブリダイズする）を含むプライマーセットを意味する。
【００３０】
「完全に相補的」であるプライマーは、プライマーの全長にわたって完全に相補的である配列を有し、ミスマッチのない配列を有する。プライマーは、代表的には、標的配列の一部（サブ配列）に完全に相補的である。「ミスマッチ」は、プライマー中のヌクレオチドと、プライマーと整列される標的核酸中のヌクレオチドとが相補的でない部位をいう。プライマーに関して使用される場合、用語「実質的に相補的」は、プライマーがその標的配列に対して完全に相補的ではなく、その代わりにこのプライマーは、所望のプライマー結合部位でそのそれぞれの鎖に選択的にハイブリダイズするのに十分なだけ相補的であることを意味する。
【００３１】
用語「相補的」は、ある核酸が、別の核酸分子に同一であるか、または選択的にハイブリダイズすることを意味する。ハイブリダイゼーションの選択性は、総じて特異性を欠くよりも選択的であるハイブリダイゼーションが生じる場合に存在する。代表的には、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約５５％同一性、好ましくは少なくとも６５％同一性、より好ましくは少なくとも７５％同一性、および最も好ましくは少なくとも９０％同一性がある場合に生じる。好ましくは、ある核酸は、他の核酸に特異的にハイブリダイズする。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照のこと。
【００３２】
用語「標識」は、物理的、化学的、電磁的、および他の関連分析技術によって検出され得る分子または分子の局面をいう。使用され得る検出可能な標識の例としては、放射性同位体、発蛍光団、発色団、質量標識、電子稠密粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を放射する分子、電気化学活性分子、酵素、補因子、核酸プローブに連結された酵素、および酵素基質が挙げられるが、これらに限定されない。用語「検出可能に標識された」は、因子が標識と結合体化されていること、または因子が、別個の標識に結合体化される必要なく検出されることを可能にするいくらかの固有の特徴（例えば、大きさ、形状、または色）を有することを意味する。
【００３３】
「多型マーカー」または「多型部位」は、分岐が生じる遺伝子座である。好ましいマーカーは、少なくとも２つの対立遺伝子を有し、この各々は、選択された集団の１％より多くの、そしてより好ましくは１０％または２０％より多くの頻度で生じる。多型遺伝子座は、１塩基対程度の少なさであり得る。多型マーカーとしては、制限酵素断片長多型、可変数のタンデム反復（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復、および挿入エレメント（例えば、Ａｌｕ）が挙げられる。第一の同定された対立遺伝子形態は、参照形態として任意に指定され、他の対立遺伝子形態は、交互対立遺伝子または改変対立遺伝子と称される。対選択された集団で最も頻繁に生じる対立遺伝子形態は、時に、野生型形態と呼ばれる。二倍体生物は、対立遺伝子形態についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。二対立遺伝子（ｄｉａｌｌｅｌｉｃ）多型は２つの形態を有する。三対立遺伝子（ｔｒｉａｌｌｅｌｉｃ）多型は、３つの形態を有する。
【００３４】
「一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰ）は、一ヌクレオチドで占められる多型部位（これは、対立遺伝子配列間の変化部位である）で生じる。この部位は、通常、対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の１／１００または１／１０００メンバー未満で変動する配列）の前後にある。一ヌクレオチド多型は、通常、多型部位においてヌクレオチドを別のヌクレオチドに対して置換することに起因する。トランジションは、あるプリンを別のプリンに、またはあるピリミジンを別のピリミジンに置換することである。トランスバージョンは、プリンをピリミジンに、またはその逆に置換することである。一ヌクレオチド多型はまた、参照対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。
【００３５】
「試薬」は、広範に、反応において使用される任意の因子をいう。試薬は、それ自体がモニタリングされ得る単一の因子（例えば、それが加熱されるにつれてモニタリングされる物質）または２つ以上の因子の混合物を含み得る。試薬は、生存（例えば、細胞）または非生存であり得る。核酸増幅反応のための例示の試薬としては、緩衝液、金属イオン、ポリメラーゼ、プライマー、テンプレート核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。酵素反応のための試薬としては、例えば、基質、補因子、カップリング酵素、緩衝液、金属イオン、インヒビターおよびアクチベーターが挙げられる。細胞ベースの反応のための試薬としては、細胞、細胞特異的色素、および細胞レセプターに結合するリガンド（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
「リガンド」は、それに対する別の分子（すなわち、「抗リガンド」）が存在する任意の分子であり、この別の分子は、抗リガンドによるリガンドのいくらかの部分の認識によって、リガンドに特異的または非特異的に結合する。
（ＩＩ．概説）
独自のフローチャネルアーキテクチャーを有する多数の異なる微小流体デバイス（時に、チップとも呼ばれる）、ならびに種々の高スループット分析を実施するためにこのようなデバイスを使用する方法が、本明細書中において提供される。このデバイスは、温度制御を必要とする分析、特に、熱サイクリングを必要とする分析（例えば、核酸増幅反応）において使用するために設計される。微小流体デバイスは、以下の特定の設計特徴を組み込む：デバイスに、多くの従来の微小流体デバイスよりも有意に小さいフットプリントを与え、このデバイスが、他の器具と容易に組み込まれるようにし、そして自動分析を提供する。
【００３７】
微小流体デバイスのいくつかは、代表的に、本明細書中で「ブラインドチャネル」または「ブラインドフィル」と呼ばれる設計を使用し、複数のブラインドチャネルを有することにより一部特徴付けられ、これは、定義の節に示されるように、溶液が一方の端部でのみ出入りできるように、デッドエンドまたは隔離された端部を有するフローチャネルである（すなわちブラインドチャネルについて別の入り口および出口が存在しない）。これらのデバイスは、ブラインドチャネルの領域を隔離し、隔離された反応部位を形成するために、各ブラインドチャネルにつき１つのバルブのみを必要とする。このタイプのデバイスの製造の間に、分析を行うための１つ以上の試薬は、反応部位に配置され、それにより、入り口お出口の数において有意な減少を生じる。さらに、ブラインドチャネルは、全ての反応部位が、１つのまたは限定された数のサンプル入り口から充填され得るように、相互に連結したチャネル網に連結される。入り口および出口の複雑度を減少し、そして各反応部位を隔離するためにたった１つのバルブを使用したことにより、反応部位に利用可能な間隙が増大される。従って、これらのデバイスの特徴は、各デバイスが、多数の（例えば、数万までの）反応部位を含み得、そして高い反応部位密度（例えば、１ｃｍ２当たり１，０００〜４，０００反応部位を超える）を達成し得ることを意味する。個々に、そして集合的に、これらの特徴はまた、直接的に、従来の微小流体デバイスに比較して、これらのデバイスのサイズを有意に減少させる。
【００３８】
本明細書中で開示される他の微小流体デバイスは、マトリックス設計を使用する。一般に、このタイプの微小流体デバイスは、交差点での反応部位のアレイを規定するために、複数の交差した水平方向および垂直方向のフローチャネルを使用する。従って、この設計のデバイスはまた、アレイまたは反応部位を有する。しかし、より多くの数のサンプルをこの設計に適応させるために、より多くの数のサンプル入り口および対応する出口が存在する。切り替え可能なフローアレイアーキテクチャと呼ばれるバルブシステムは、溶液が、単に、ちょうど水平チャネルまたはフローチャネルを通って選択的に流れるようにし、従って、マトリックスにおける種々のフローチャネルの切り替え可能な隔離を可能にする。従って、ブラインドチャネルデバイスが、限定された数のサンプルを用いて異なる条件下で多数の分析を実施するために設計される一方、マトリックスデバイスが、限定された数の条件下で多数のサンプルを分析するために構築される。なお他のデバイスは、これらの２つの一般の設計タイプのハイブリッドである。
【００３９】
記載される微小流体デバイスは、さらに、弾性材料製のフローチャネル、コントロールチャネル、バルブおよび／またはポンプのような種々の構成要素を使用することにより、一部特徴付けられる。いくらかの場合、本質的にデバイス全体が、弾性材料で製造されている。結果として、このようなデバイスは、シリコンベースの材料から形成される従来の微小流体デバイスの大部分とは形態および機能が有意に異なる。
【００４０】
デバイスの設計は、それらを、多数の異なる加熱システムと組み合わせて使用されることを可能にする。従って、このデバイスは、温度制御を必要とする種々の分析を実施する際に有用である。さらに、加熱適用において使用するためのそれらの微小流体デバイスは、反応部位からのサンプルのエバポレーションを最小にするために、さらなる設計特徴を取り込み得る。このタイプのデバイスは、一般に、弾性デバイス内で形成される多数のガードチャネルを含む。このチャネルを、水が、デバイスが形成される弾性材料内の水蒸気圧を増大させるように流れ、それにより、反応部位からのサンプルのエバポレーションを減少させる。
【００４１】
特定のデバイスのアレイフォーマットは、デバイスが、高スループットを達成し得ることを意味する。集合的に、高スループットおよび温度制御能は、デバイスを、多数の核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応−ＰＣＲ）を実施するために有用とする。このような反応は、デバイス（特に温度制御を必要とする反応におけるそれらの使用）の有用性の例示として、本明細書中の至るところで議論する。しかし、デバイスは、これらの特定の適用に制限されないことが理解されるべきである。これらのデバイスは、広範な種々の他のタイプの分析または反応において使用され得る。例としては、タンパク質−リガンド相互作用、および細胞と種々の化合物との間の相互作用の分析が挙げられる。さらなる例を以下に提供する。
【００４２】
（ＩＩＩ．微小流体デバイスの一般構造）
（Ａ．ポンプおよびバルブ）
本明細書中で開示される微小流体デバイスは、代表的には、少なくとも一部が弾性材料から構築され、そして単一の多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）技術および／または犠牲層カプセル化法（例えば、Ｕｎｇｅｒら、（２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６、およびＰＣＴ公報ＷＯ０１／０１０２５（これらは共に、あらゆる目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）によって構築される。このような方法を用いて、溶液がデバイスのフローチャネルを流れる微小流体デバイスは、少なくとも一部、弾性膜またはセグメントによってフローチャネルから分離される１つ以上のコントロールチャネルを用いて、制御される。この膜またはセグメントは、コントロールチャネルに衝撃力を適用することにより、コントロールチャネルが関連するフローチャネルに向けたり、フローチャネルから引っ込められたりし得る。膜がフローチャネルに向けられたり、引っ込められたりする程度を制御することにより、溶液の流れは、フローチャネルで遅らせられ得るか、または完全に遮断され得る。このタイプのコントロールチャネルおよびフローチャネルの組み合わせを使用して、Ｕｎｇｅｒら、（２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６、およびＰＣＴ公報ＷＯ／０２／４３６１５およびＷＯ０１／０１０２５において十分詳細に記載されるように、溶液流れを調節するための種々の異なるタイプのバルブおよびポンプを調製し得る。
【００４３】
本明細書中に提供されるデバイスは、試薬が反応させられる反応部位を選択的に隔離するために、このようなポンプおよびバルブを取り込む。反応部位は、デバイス内の多数の異なる位置のいずれかに位置され得る。例えば、いくつかのマトリクスタイプデバイスにおいては、反応部位は、フローチャネルセットの交差に位置する。ブラインドチャネルデバイスにおいては、反応部位は、ブラインドチャネルの端部に位置する。
デバイスが温度制御反応において使用される場合（例えば、熱サイクリング反応）、以下により詳細に記載されるように、弾性デバイスは、代表的には、支持体（例えばスライドガラス）に固定化される。得られた構造は、次いで、例えば、種々の反応部位で温度を制御するために、温度制御プレート上に配置され得る。熱サイクリング反応の場合、デバイスは、多数の熱サイクリングプレートのいずれかの上に配置され得る。
【００４４】
デバイスが比較的光学的に透明な弾性材料で作製されているので、反応は、微小流体デバイス上の本質的に任意の位置の種々の異なる検出システムを用いて、容易にモニタリングされ得る。しかし、最も代表的には、検出は、反応部位それ自体で（例えば、フローチャネルの交差を含む領域内またはフローチャネルのブラインド端部で）生じる。デバイスが実質的に透明な材料から製造されるという事実はまた、特定の検出システムが、この特定のデバイスシステムが、従来のシリコンベース微小流体デバイスと共に使用可能ではない現在のデバイスと共に使用され得ることを意味する。検出は、デバイスに取り込まれたか、またはデバイスとは別個であるが、検出されるべきデバイス領域と整列された検出器を用いて達成され得る。
【００４５】
（Ｂ．ガードチャネル）
本明細書中で提供される弾性微小流体デバイスからのサンプルおよび試薬の蒸発を減らすために、複数のガードチャネルがこのデバイス中に形成され得る。これらのガードチャネルは、これらが、フローチャネルおよび／または反応部位と重層するエラストマーの層中に代表的に形成されるという点で、コントロールチャネルと類似する。それゆえ、コントロールチャネルと同様に、これらのガードチャネルは、弾性材料の膜またはセグメントによって、下層のフローチャネルおよび／または反応部位から隔てられる。しかし、コントロールチャネルとは異なり、これらのガードチャネルは、断面積が相当小さい。一般に、より小さい面積を有する膜は、同じ与圧下で、より大きな面積を有する膜よりもゆがむ。これらのガードチャネルは、溶液（代表的には水）がこれらのガードチャネル中に流動するのを可能にするように加圧されるように設計される。このガードチャネルから生じた水蒸気は、フローチャネルまたは反応部位に隣接したこのエラストマーの孔に拡散し得、従って、このフローチャネルまたは反応部位に隣接した水蒸気濃度を増大させ得、そしてそこからの溶液の蒸発を減少させ得る。
【００４６】
一般に、これらのガードチャネルは、加圧した場合に、このガードチャネルを下層のフローチャネルまたは反応部位から隔てる膜が、ガードチャネルが重層するフローチャネルまたは反応部位の中、外、またはそれらを通しての溶液の流動を実質的に制限しないに充分に小さい。この状況で使用される場合、用語「実質的に制限する」または他の類似の用語は、このガードチャネルがそれを通った溶液の流動を達成するための加圧がされない場合の同じ条件下でのこのフローチャネルまたは反応部位溶液の中、これらへの、またはこれらを通った流動と比較して、このフローチャネルまたは反応部位の中、外またはこれらを通しての溶液の流動が、４０％を超えて、代表的には３０％未満、通常２０％未満、そしていくつかの例では１０％未満、減少しないことを意味する。通常、これは、これらのガードチャネルが、１００μｍ２と５０，０００μｍ２との間の断面積またはそれらの間の任意の積分断面積もしくは非積分断面積を有することを意味する。従って、例えば、いくつかの例では、この断面積は５０，０００μｍ２未満であり、他の例では１０，０００μｍ２未満であり、なお他の例では１０，００μｍ２未満であり、そしてなお他の例では１００μｍ２未満である。これらのガードチャネルは、円形形状、楕円形状、四角形状、矩形形状、六角形形状および八面体形状を含むがこれらに限定されない、種々の形状のうちのいずれかを有し得る。
【００４７】
これらのガードチャネルは、サーモサイクリング反応を行うためにかかる時間の間およびその条件下での、このデバイスからのサンプルおよび試薬の蒸発を、５０％未満に、他の例では４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満まで減少させるように設計される。従って、例えば、４０サイクルを含む代表的なＰＣＲ反応は、１２０分間以内に行われ得る。このガードチャネルシステムは、上記のセットの限界まで、ほぼこの時間枠の間の蒸発を減少させるように設計される。このレベルの蒸発の減少を達成するために、これらのガードチャネルは代表的に、少なくとも１０ライン／ｃｍ２〜１０００ライン／ｃｍ２の密度、またはこれらの間の任意の積分密度レベルで存在する。より詳細には、これらのガードチャネルは一般に、少なくとも２５ライン／ｃｍ２であり、他の例では少なくとも５０ライン／ｃｍ２であり、なお他の例では少なくとも１００ライン／ｃｍ２であり、そしてなお他の例では少なくとも５００ライン／ｃｍ２である。このレベルの蒸発減少を達成するために、これらのガードチャネルは代表的に、１本のラインの外縁から隣のラインの最も近い外縁までで測定した場合に、１ｍｍ〜１μｍの間の間隔で、またはそれらの間の任意の積分密度レベルで存在する。より詳細には、これらのガードチャネルは一般に、５００μｕｍ〜５μｍの間、他の例では１００μｍ〜１０μｍの間、なお他の例では７５μｍ〜４０μｍの間の間隔が空けられている。従って、この間隔は代表的に、少なくとも１μｍであるが、１ｍｍ未満であり、他の例では５００μｍ未満であり、なお他の例では４００μｍ未満であり、なお他の例では３００μｍであり、他の例では２００μｍ未満であり、そしてなお他の例では１００μｍ未満、５０μｍ未満または２５μｍ未満である。
【００４８】
これらのガードチャネルは、チャネルの別個のネットワークとして形成されてもよく、またはコントロールチャネルから枝分かれする、より小さいチャネルであってもよい。これらのガードチャネルは、このデバイスまたはこのデバイスの特定の領域のみを横切って延び得る。代表的に、このガードチャネルは、フローチャネルおよび反応部位に隣接してそれらの上に配置される。なぜなら、ここが、蒸発が主に問題である、主な位置であるからである。特定のマトリクスデバイス上でのガードチャネルの例示的な位置を、図１Ｃに図示し、そして特定のブラインドチャネルデバイス上でのガードチャネルの例示的な位置を、図３Ｂおよび図３Ｃに図示し、そして以下でより詳細に考察する。
【００４９】
このガードチャネルを通って流動した溶液は、水の蒸発を減少させ得る任意の物質を備える。この物質は、フローラインおよび／もしくは反応部位に隣接した水蒸気濃度を増大させる物質、または水蒸気濃度を増大させないが、それにもかかわらず、フローラインおよび／もしくは反応部位からの水の蒸発をブロックする物質（ブロッキング剤）であり得る。従って、１つの選択肢は、本質的に任意の水溶液を利用することであり、この場合、適切な溶液としては、水および緩衝溶液（例えば、ＴａｑＭａｎ緩衝溶液、およびリン酸緩衝化生理食塩水）が挙げられるがこれらに限定されない。適切なブロッキング剤としては、例えば、鉱油が挙げられる。
【００５０】
ガードチャネルは代表的に、上記のＭＳＬ技術および／または犠牲層カプセル化法を利用してエラストマー中に形成される。
【００５１】
以下の節は、温度制御を必要とする分析（例えば、核酸増幅反応）を含め、種々の分析を行うために利用され得る多数の特定の構成をより詳細に記載する。しかし、これらの構成が例示であって、これらの系の改変が当業者に明らかであることが理解されるべきである。
【００５２】
（ＩＶ．マトリクスの設計）
（Ａ．概論）
マトリクスの設計を利用するデバイスは一般に、交差して連結部のアレイを形成する、複数の垂直フローチャネルおよび水平フローチャネルを有する。異なるサンプルおよび試薬（または試薬セット）がこれらのフローチャネルの各々の中に導入され得るので、多数のサンプルが、ハイスループット形式で、比較的多数の反応条件に対して試験され得る。従って、例えば、異なるサンプルが、Ｍ個の異なる垂直フローチャネルの各々の中に導入され、そして異なる試薬（または試薬セット）がＮ個の水平フローチャネルの各々の中に導入される場合、Ｍ×Ｎ個の異なる反応が同時に行われ得る。代表的に、マトリクスデバイスは、垂直フローチャネルと水平フローチャネルとの切り替え可能な隔離を可能にする弁を備える。別の言い方をすると、これらの弁は、垂直フローチャネルをちょうど通るかまたは水平フローチャネルをちょうど通る選択的流動を可能にするように配置される。この種のデバイスは、サンプルの種類および数、ならびに試薬の数および種類の選択に関する融通性を可能にするので、これらのデバイスは、比較的大きな数の反応条件に対して多数のサンプルをスクリーニングしようとする分析を行うためによく適している。これらのマトリクスデバイスは、サンプルおよび反応物の蒸発を予防するために、ガードチャネルを必要に応じて組み込み得る。
【００５３】
（Ｂ．例示的な設計および用途）
図１Ａは、１つの例示的なマトリクスデバイスの図示を提供する。このデバイス１００は、交差して４９個の異なる交差点または反応部位１０６のアレイを形成する、７個の垂直フローチャネル１０２および７個の水平フローチャネル１０４を備える。従って、この特定のデバイスは、７個のサンプルが、７個の異なる試薬または試薬セットと反応することを可能にする。垂直方向における溶液の流動を調節するカラム弁１１０は、コントロールチャネル１１８によって制御され得、コントロールチャネル１１８は、単一の入口１１４にて、全て起動され得る。
【００５４】
同様に、列に並んだ（ｒｏｗ）弁１０８は、水平方向における溶液の流動を調節する；これらは、コントロールチャネル１１６によって制御され、コントロールチャネル１１６は、単一の制御入口１１２によって起動される。図１Ａに示されるように、列に並んだ弁１０８を調節するコントロールチャネル１１６は、位置に依存して幅が変化する。コントロールチャネル１１６が垂直フローチャネル１０２と交差する場合、コントロールチャネル１１６は、起動された場合に、これが垂直フローチャネル１０２に向かってゆがんで、そこを通る溶液の流動を実質的に減少させないに充分に狭い。しかし、コントロールチャネル１１６の幅は、水平フローチャネル１０４のうちの１つと重層する場合、増大する；このことにより、コントロールチャネルの膜は、水平フローチャネル１０４を通る溶液の流動をブロックするに充分に大きくなる。
【００５５】
操作の際に、試薬Ｒ１〜Ｒ７は、それらのそれぞれの水平フローチャネル１０４に導入され、そしてサンプルＳ１〜Ｓ７は、それらのそれぞれの垂直フローチャネル１０２に注射される。従って、各水平フローチャネル１０４中の試薬は、垂直フローチャネル１０２の各々において、交差点１０６にて、サンプルと混合され、これは、この特定のデバイスにおいて、ウェルまたはチャンバの形状である。従って、核酸増幅反応の特定の場合、例えば、増幅反応に必要な試薬は、水平フローチャネル１０４の各々に導入される。異なる核酸テンプレートは、垂直フローチャネル１０２中に導入される。特定の分析では、水平フローチャネル１０４の各々に導入される試薬混合物の一部として導入されたプライマーは、フローチャネル間で異なり得る。これは、各核酸テンプレートが多数の異なるプライマーと反応するのを可能にする。
【００５６】
図１Ｂ〜図１Ｅは、このデバイスが分析の間にどのように作動するかをより詳細に図示するために、図１Ａにおいて示したデバイス中の隣接した反応部位の拡大平面図を示す。明確さの目的のために、交差点１０６は、反応ウェルの形態では示されず、コントロールチャネル１１６および１１８は省略されており、カラムおよび列に並んだ弁１１０、１０８（矩形ボックス）のみが示される。図１Ｂに示されるように、分析は、カラム弁１１０を閉じ、そして列に並んだ弁１０８を開けて、垂直フローチャネル１０２を通る流動をブロックしながら、水平フローチャネル１０４を通る溶液の流動を可能にすることによって開始される。次いで、試薬Ｒ１は、水平フローチャネル１０４中に導入され、そして水平フローチャネル１０４の長さ全体を通って完全に流動され、その結果、全ての反応部位１０６が充填される。水平チャネル１０４を通る溶液の流動は、外部ポンプによって達成され得るが、より代表的には、例えば、Ｕｎｇｅｒら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６およびＰＣＴ公開ＷＯ  ０１／０１０２５に詳細に記載されるように、蠕動ポンプを弾性デバイス自体に組み込むことによって達成される。
【００５７】
一旦Ｒ１が導入されたら、列に並んだ弁１０８が閉じられ、そしてカラム弁１０２が開けられる（図１Ｃを参照のこと）。このことは、サンプルＳ１およびサンプルＳ２が垂直フローチャネル１０２中に導入されて、それらのそれぞれのフローチャネルを通って流動することを可能にする。サンプルが垂直フローチャネル１０２を流動するにつれて、これらはＲ１を反応部位１０６から吐出し、従って、サンプルを反応部位１０６に残す。次いで、図１Ｄに示されるように、列に並んだ弁１０８が開けられて、Ｓ１およびＳ２がＲ１と拡散して混合することを可能にする。従って、サンプルおよび反応物の混合物（Ｒ１Ｓ１およびＲ１Ｓ２）は、各々の交差点または反応部位１０６の領域において得られる。Ｓ１およびＳ２がＲ１と拡散するに充分な時間を可能にした後、全ての列に並んだ弁１０８およびカラム弁１１０は閉じられて、それらのそれぞれの反応部位１０６の領域にＳ１およびＳ２が隔離され、そしてＳ１およびＳ２の混合が防止される（図１Ｅを参照のこと）。次いで、この混合物は反応させられ、そして反応物が、交差点１０６または交差点１０６を含む交差形状の領域をモニタリングすることによって検出される。加熱（例えば、増幅反応の間のサーモサイクリング）を必要とする分析に関して、このデバイスは、ヒーター上に配置され、そしてサンプルが隔離されたままで加熱される。
【００５８】
図１Ａに示される改変版のデバイスを図１Ｆに示す。一般構造は、図１Ａに示される構造と多くの類似性を保有し、そして両方の図において共通の要素は、同じ参照番号を共有する。図１Ｆに図示されるデバイス１５０は、対の水平フローチャネル１０４が、共通の入口１２４に接続されているという点で異なる。このことは、二連のセットの試薬が、入口１２４へのまさに１回の注入によって、２つの隣接したフローチャネルに導入されることを本質的に可能にする。共通の入口の使用は、垂直フローチャネル１０２に関してさらに拡大される。この特定の例では、各サンプルは、サンプル入口１２０への１回の注射によって、５個の垂直フローチャネル１０２中に導入される。従って、この特定のデバイスを用いて、サンプルと試薬との各特定の組み合わせについて本質的に１０個の重複した反応物が存在する。もちろん、重複した反応の数は、共通の入口１２０、１２４に接続される、垂直フローチャネル１０２および／または水平フローチャネル１０４の数を変更することによって、所望により変化させられ得る。
【００５９】
図１Ｆに示されるデバイスはまた、別個のコントロールチャネル入口１２８を備え、このコントロールチャネル入口１２８は、コントロールチャネル１３０を調節し、このコントロールチャネル１３０は、出口１３２および別のコントロールチャネル入口１３２に向かう溶液の流動を支配するために用いられ、このコントロールチャネル入口１３２は、コントロールチャネル１３４を調節し、このコントロールチャネル１３４は、出口１３６への溶液の流動を調節する。さらに、デバイス１５０は、ガードチャネル１３８を組み込む。この特定の設計では、このガードチャネル１３８は、コントロールチャネル１１６の一部として形成される。上記のように、このガードチャネル１３８は、列に並んだ弁１０８よりも小さい；その結果、ガードチャネル１３８の膜は、下層の水平フローチャネル１０４に向かってゆがまず、その結果、溶液の流動が中断される。
【００６０】
最後に、図１Ｆに示される設計は、反応が、水平フローラインと垂直フローラインとの交差点でのウェルにおいて生じないが、それら自体の交差点で生じるという点で異なる。
【００６１】
（Ｖ．ブラインドチャネル設計）
（Ａ．一般）
ブラインドチャネル設計を利用するデバイスは、特定の特徴を有する。第一に、このデバイスは、１つ以上のフローチャネルを備え、このフローチャネルから、１つ以上のブラインドチャネルが枝分かれする。上に示されるように、このようなチャネルの端部領域は、反応部位として働き得る。上に重なるフローチャネルによって形成される弁は、ブラインドチャネルの端部において、この反応部位を隔離するように作動され得る。これらの弁は、反応部位を切り換え可能に隔離するための機構を提供する。
【００６２】
第二に、ブラインドチャネルと連絡するフローチャネルネットワークは、反応部位の全てまたは大部分が、単一または制限された数の入口（例えば、５未満または１０未満）で充填され得るように構成される。ブラインドフローチャネルを充填する能力は、可能にされる。なぜなら、このデバイスは、弾性材料から作製されるからである。この弾性材料は、フローチャネル内およびブラインドチャネル内の空気が、溶液がこれらのチャネルに導入されるにつれて、これらの細孔を通って逃れ得るために十分に多孔性である。他の微小流体デバイスにおいて利用される、材料の孔隙率の欠乏は、ブラインドチャネル設計の使用を妨げる。なぜなら、ブラインドチャネル内の空気が、溶液が注入されるにつれて逃れる通路を有さないからである。
【００６３】
第三の特徴は、１つ以上の試薬が、製造の間（製造プロセスについてのさらなる詳細については、下記を参照のこと）、反応部位内で、エラストマーの基部層に非共有結合的に堆積することである。試薬は、非共有結合する。なぜなら、これらの試薬は、サンプルが反応部位に導入される場合に溶解するように設計されるからである。分析物の数を最大にするために、異なる反応物または反応物のセットが、異なる反応部位の各々に堆積される。
【００６４】
特定のブラインドチャネルデバイスは、反応部位がアレイの形態で配置されるように設計される。
【００６５】
従って、核酸増幅反応を実施するために設計されたブラインドチャネルデバイスにおいて、例えば、伸長反応を実施するために必要とされる１つ以上の試薬が、このデバイスの製造の間に、反応部位の各々に堆積される。このような試薬としては、例えば、以下のうちの全てまたはいくつかが挙げられる：プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子、金属イオン、緩衝剤、インターカレーション色素など。ハイスループット分析を最大にするために、ＤＮＡの異なる領域を増幅するように選択された異なるプライマーが、各反応部位に堆積される。その結果、核酸テンプレートが反応部位に入口を介して導入される場合、多数の伸長反応が、テンプレートの異なるセグメントにおいて実施され得る。増幅反応のために必要な熱サイクリングは、このデバイスを熱サイクリングプレート上に置き、そしてこのデバイスを、種々の必要とされる温度の間でサイクリングすることによって、達成され得る。
【００６６】
試薬は、種々の様式で固定され得る。例えば、いくつかの例において、１つ以上の試薬が、反応部位において非共有結合的に堆積され、一方で他の例においては、１つ以上の試薬が、反応部位において、基材に共有結合される。共有結合される場合、これらの試薬は、リンカーを介して基材に結合され得る。種々のリンカー型（例えば、光化学的リンカー／光不安定リンカー、熱不安定リンカーおよび酵素的に切断され得るリンカー）が使用され得る。いくつかのリンカーは、二官能性（すなわち、このリンカーは、このリンカーが結合するエレメント上に位置する基と反応性の各末端において、官能基を含む）である；各末端にある官能基は、同じであるかまたは異なり得る。いくつかのアッセイにおいて使用され得る適切なリンカーの例としては、直鎖または分枝鎖の炭素リンカー、複素環式リンカーおよびペプチドリンカーが挙げられる。種々の型のリンカーが、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｏｋｆｏｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能であり、そしてＥＰＡ  １８８，２５６；米国特許第４，６７１，９５８号；同第４，６５９，８３９号；同第４，４１４，１４８号；同第４，６６９，７８４号；同第４，６８０，３３８号、同第４，５６９，７８９号および同第４，５８９，０７１号、ならびにＥｇｇｅｎｗｅｉｌｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｇｅｎｔ  Ｄｉｓｃｏｖｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １９９８、３、５５２に記載されている。ＮＶＯＣ（６ニトロベラトリルオキシカルボニル）リンカーおよび他のＮＶＯＣ関連リンカーは、適切な光化学的リンカーの例である（例えば、ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２を参照のこと）。プロテアーゼ切断部位を有するペプチドは、例えば、米国特許第５，３８２，５１３号において議論されている。
【００６７】
（Ｂ．例示的な設計および使用）
図２は、ブラインドチャネル設計を利用する１つの例示的なデバイスの、単純化平面図である。デバイス２００は、フローチャネル２０４およびそこから枝分かれする枝分かれフローチャネル２０６のセットを備え、これらは、弾性基材２０２に形成されている。各枝分かれフローチャネル２０６は、反応部位２０８で終結し、これによって、反応部位のアレイを形成する。制御チャネル２１０が、枝分かれフローチャネル２０６の上に重なり、この制御チャネルは、膜２１２によって、枝分かれフローチャネル２０６から分離される。制御チャネル２１０の作動は、膜２１２を枝分かれフローチャネル２０６内へと偏向させ（すなわち、弁として機能させ）、従って、反応部位２０８の各々が、他の反応部位から隔離され得る。
【００６８】
このようなデバイスの作動は、試験サンプルを、フローチャネル２０４に溶液で注入する工程、引き続いて、各枝分かれチャネル２０６の各々に流し込む工程を包含する。一旦、サンプルが各枝分かれチャネル２０６を満たすと、制御チャネル２１０が作動されて、弁／膜２１２の活性化を引き起こして枝分かれチャネル２０６に偏向し、これによって、各反応部位２０８を密封する。サンプルが反応部位２０８に流入し、そして反応部位２０８に残る場合、このサンプルは、この反応部位２０８の各々で予めスポットした試薬に溶解する。一旦溶解すると、これらの試薬は、サンプルと反応し得る。弁２１２は、各反応部位２０８において溶解した試薬が、拡散によって混合することを防止する。次いで、サンプルと試薬との間の反応が、代表的には反応部位２０８において、検出される。以下の温度制御の節に記載されるように、反応物は、必要に応じて、加熱され得る。
【００６９】
図３Ａは、いくらかより複雑なブラインドフローチャネル設計の例を示す。この特定の設計３００において、水平フローチャネル３０４のセットの各々は、その端部において、２つの垂直フローチャネル３０２に接続される。複数の枝分かれフローチャネル３０６が、水平フローチャネル３０４の各々から延びる。この特定の設計における枝分かれフローチャネル３０４は、任意の所定の水平フローチャネル３０４に接続された枝分かれチャネル３０６が、すぐ隣接する水平フローチャネル３０４に接合された２つの枝分かれチャネル３０６の間に位置するように、またはすぐ隣接するフローチャネル３０４および１つの垂直フローチャネル３０２に接合された枝分かれフローチャネル３０６の間に位置するように、挟まれる。図３Ａに示される設計と同様に、各枝分かれフローチャネル３０６は、反応部位３０８で終結する。図３Ａに示される設計はまた、制御チャネル３１０から構成され、この制御チャネル３１０は、枝分かれチャネルの各々の上に重なり、そして膜３１２によって、下に重なる枝分かれチャネルから隔離される。制御チャネルは、ポート３１６において作動される。垂直フローチャネル３０２および水平フローチャネル３０４は、入口３１４へのサンプルの注入が、水平フローチャネルおよび垂直フローチャネルのネットワーク全体にわたって、そして最終的に、枝分かれフローチャネル３０６を介して反応部位３０８の各々へと、溶液が流れることを可能にするように、相互接続される。
【００７０】
従って、操作の際に、サンプルは、溶液を反応部位の各々に導入するための入口に注入される。一旦、反応部位が充填されると、弁／膜が作動されて、制御チャネルをポートにおいて加圧することによって、溶液を反応部位内にトラップする。反応部位に先に堆積していた試薬が、反応部位において再懸濁され、これによって、堆積された試薬とサンプルとの間の、各反応部位においての反応を可能にする。反応部位における反応は、検出器によってモニタリングされる。再度、反応は、必要に応じて、以下の温度制御の節に記載される方法に従って、制御可能に加熱され得る。
【００７１】
図３Ａに示される一般的な設計の、なおより複雑なバージョンが、図３Ｂに示される。図３Ｂに示されるデバイスは、図３Ａに示される水平フローチャネルおよび枝分かれフローチャネル３０２のユニット組織化が、複数回繰り返されるデバイスである。図３Ｂに示されるデバイスは、加熱が関与する適用（例えば、熱サイクリング）において利用されるように、ガードチャネル３２０を、これらのデバイスに含めることをさらに示す。ガードチャネル３２０の、フローチャネル３０４および枝分かれチャネル３０６に対する例示的な配向は、図３Ｃに示される拡大図において示される。ガードチャネル３２０は、枝分かれフローチャネル３０６および反応部位３０８の上に重なる。上で議論されるように、デバイス３００の加熱の間、水が、ガードチャネル３２０を通して流されて、このデバイスにおける水の局所濃度を増加させ、これによって、フローチャネル３０６および反応部位３０８における溶液からの水の蒸発を減少させる。
【００７２】
この節の最初で議論された、ブラインドチャネルデバイスの特徴は、デバイスのフットプリントを最小にし、そして多数の反応部位がこのデバイス上に形成されること、および高い密度が得られることを可能にする。例えば、２５００個の反応部位を有するこの型のデバイスは、標準的な顕微鏡スライドガラス（２５ｍｍ×７５ｍｍ）上に適合するように、容易に製造され得る。上記特徴はまた、ブラインドチャネル設計を利用するデバイスを用いて、非常に高密度の反応部位が得られることを可能にする。例えば、１ｃｍ２あたり少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００の反応部位、あるいはこれらの間の任意の密度値が、容易に得られ得る。しかし、特定のデバイスは、例えば、１００〜４０００反応部位／ｃｍ２、またはこれらの間の任意の整数の密度値の範囲の、なおより高い密度を有する。例えば、いくつかのデバイスは、１ｃｍ２あたり少なくとも１００部位、１５０部位、２００部位、２５０部位、３００部位、４００部位、５００部位、６００部位、７００部位、８００部位、９００部位または１０００部位の密度を有する。１ｃｍ２あたり少なくとも２０００部位、３０００部位、または４０００部位の非常に高い密度を有するデバイスもまた、得られ得る。このような高い密度は、デバイス上の非常に多数の反応部位に直接変形される。ブラインドチャネル構築物を利用するデバイスは、代表的に、少なくとも１０〜１００の反応部位、またはこの間の任意の整数の部位を有する。より代表的には、このデバイスは、１００〜１，０００の反応部位、またはこの間の任意の整数の部位を有する。より高い密度のデバイスは、なおさらに多くの反応部位（例えば、少なくとも１，０００〜１００，０００の反応部位、またはこれらの間の任意の整数の部位）を有し得る。従って、特定のデバイスは、そのデバイスの全体の大きさに依存して、少なくとも１００；５００；１，０００；２，０００；３，０００；４，０００；５，０００；６，０００；７，０００；８，０００；９，０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；または１００，０００の反応部位を有する。
【００７３】
得られ得る多数の反応部位および密度はまた、非常に小さいウェルまたは空洞を製造する能力の結果であり得る。例えば、空洞またはウェルは、代表的に、５０ｎＬ未満；他の例においては、４０ｎＬ未満、３０ｎＬ未満、２０ｎＬ未満、または１０ｎＬ未満；およびなお他の例においては、５ｎＬ未満または１ｎＬ未満の体積を有する。具体的な例として、特定のデバイスは、３００ミクロン長、３００ミクロン幅、および１０ミクロン深さのウェルを有する。
【００７４】
本明細書中に提供されるブラインドチャネルデバイスは、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４５４９（ＷＯ０２／４３６１５として公開された）およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１０８７５（ＷＯ０２／０８２０４７として公開された）に議論される、特定の設計特徴および方法論を利用し得、これには、例えば、デッドエンドチャネルを充填するため、液体プライミング、加圧外部ガス（ｏｕｔｇａｓ）プライミングのストラテジー、および微小流体チャネルの充填の間にガスを交換するための種々のストラテジーが挙げられる。これらのＰＣＴ公開公報の両方は、すべての目的で、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００７５】
（ＶＩ．ハイブリッド設計)
なお他のデバイスは、マトリックスおよびブラインド充填設計のハイブリッドである。この型のデバイスの設計は、図３Ａに示されるブラインドチャネルデバイスに類似するが、各水平フローチャネルは、その独自のサンプル入口ポートに接続されており、そしてこれらの水平フローチャネルは、垂直フローチャネルを介して相互接続されていない。その結果、任意の所定の水平フローチャネルに導入されるサンプルは、その水平フローチャネルおよびそれに付着した反応部位のみを充填する。一方で、図３Ａに示されるブラインドフローチャネルデバイスにおいて、サンプルは、垂直フローチャネル３０２を介して、水平フローチャネル３０４間で流れ得る。
【００７６】
この一般的なデバイスの例は、図４に示される。デバイス４００は、複数の水平フローチャネル４０４を備え、これらの各々が、そのチャネルから、そしてその独自のサンプル入口４１４から延びる、複数の枝分かれフローチャネル４０６を有する。制御チャネル４１０は、枝分かれフローチャネル４０６の各々の上に重なり、そして膜（弁）４１２が、制御チャネル４１０を、下に重なる枝分かれフローチャネル４０６から隔離する。ブラインドフローチャネルの設計と同様に、入口４１６における制御チャネルの作動は、膜４１２の枝分かれフローチャネル４０６への変形および反応部位４０８の隔離を引き起こす。この設計のバリエーションにおいて、各水平フローチャネル４０４は、各端部において入口４１４を備え得、従って、サンプルが両端から導入されることを可能にする。
【００７７】
いくつかの例において、試薬が、このデバイスの製造の間に、反応部位に堆積される。これは、多数のサンプルが、比較的多数の反応条件下で、短時間で、時間を消費する試薬添加（マトリックスデバイスを用いる場合に必要とされるような）を必要とせずに、試験されることを可能にする。あるいは、反応混合物が、チップ上への注入の前に調製され得る。一旦、この混合物が注入されると、これらは、分析され得るか、またはさらに処理され得る（例えば、加熱され得る）。
【００７８】
異なるサンプルを水平フローチャネルの各々に注入することによって、多数のサンプルが、迅速に分析され得る。試薬が、反応部位において予め堆積されたと仮定すると、任意の所定の水平フローチャネルに付随する各反応部位における同じ試薬の存在は、多数の複製反応を、各サンプルを用いて実施するためのたやすい方法を提供する。そうではなく、反応部位における試薬が任意の所定のフローチャネルについて異なる場合、各サンプルは、種々の異なる反応条件に、本質的に同時に曝露される。
【００７９】
従って、本明細書中で提供されるデバイスは、異なる型の調査のためにあつらえられる。調査が、比較的多数の異なるサンプルの、ユーザに制御された条件下でのスクリーニングを包含する場合（例えば、使用者が選択した１００の試薬に対して１００のサンプル）、マトリックスデバイスは、有用な解決を提供する。しかし、この調査が１つまたは制限された数のサンプルを、広範な種々の反応条件下で分析することを包含する場合（例えば、１０，０００の反応条件に対して１のサンプル）、ブラインドチャネル設計が有用である。最後に、比較的多数のサンプルを、既定された反応条件に対して、試薬を注入する必要なしに試験することを望む場合（例えば、１００の予め規定された試薬に対して１００のサンプル）、ハイブリッドデバイスが有用である。
【００８０】
（ＶＩＩ．温度制御）
（Ａ．デバイスおよび構成要素）
様々な洗練された多数の異なる選択肢が、微小流体デバイスの選択された領域またはデバイス全体において、温度を制御するために利用可能である。従って、本明細書中において使用される場合、用語温度制御器とは、微小流体デバイスの全体または微小流体デバイスの一部（例えば、特定の温度範囲内またはブラインドチャネル型の微小流体デバイスのマトリクスにおける１つ以上の接合部）において、温度を調節し得るデバイスまたは要素をいうように、広く意味される。
【００８１】
一般に、これらのデバイスは、そのデバイスを熱サイクルするための、熱サイクリングプレート上に配置される。種々のこのようなプレートは、商業的供給源（例えば、ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ  Ｐｘ２（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ），ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ），Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐａｒｔ＃  Ｅ５３３１（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ），Ｔｅｃｈｎｅ  Ｐａｒｔ＃  ２０５３３０（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）が挙げられる）から容易に入手可能である。
【００８２】
熱サイクリング工程の精度を確実にするために、特定のデバイスにおいては、このデバイスの種々の領域において温度を検出するセンサを組み込むことが、有用である。温度を検出するための１つの構造体は、熱電対である。このような熱電対は、下に重なる基材材料上にパターン化された薄膜ワイヤとして、または微小作製された弾性材料自体に直接組み込まれたワイヤとして、作製され得る。
【００８３】
温度はまた、電気抵抗の変化を介して感知され得る。例えば、従来の技術を利用して、下にある半導体基材上に作製された温度計の抵抗の変化は、所定の温度変化に対して較正され得る。あるいは、温度計は、微小作製された弾性材料に直接挿入され得る。抵抗によって温度を検出するためのなお別のアプローチは、Ｗｕら、「ＭＥＭＳ  Ｆｌｏｗ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏ−ｆｌｕｉｄｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ８９  １５２−１５８（２００１）（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。この論文は、ドープされたポリシリコン構造体の、温度の制御と感知との両方のための使用を記載する。ポリシリコンおよび他の半導体材料について、抵抗の温度係数は、ドーパントの正体および量によって正確に制御され得、これによって、所定の適用についてセンサの性能を最適化する。
【００８４】
熱染色材料は、増幅デバイスの領域において温度を検出するために利用可能な、別の型の構造体である。具体的には、特定の材料は、それらが異なる温度を受ける場合、色を劇的かつ再現性よく変化させる。このような材料は、溶液が異なる温度を受ける場合、その溶液に添加され得る。熱染色材料は、下に重なる基材上に形成され得るか、または弾性材料内に組み込まれ得る。あるいは、熱染色材料は、粒子の形態で、サンプル溶液に添加され得る。
【００８５】
温度を検出するための別のアプローチは、赤外線カメラの使用を介してである。赤外線カメラは、顕微鏡と組み合わさって、増幅構造体全体の温度プロフィールを決定するために使用され得る。弾性材料の、放射線に対する透過性は、この分析を容易にする。
【００８６】
温度検出のためのなお別のアプローチは、焦電センサの使用を介してである。具体的には、いくらかの結晶材料（特に、圧電挙動もまた示す材料）は、焦電効果を示す。この効果は、材料の結晶格子の極性、および従って、この材料にわたる電圧が温度に非常に依存する現象を説明する。このような材料は、基材上またはエラストマー上に組み込まれ得、そして温度を検出するために利用され得る。
【００８７】
他の電気的現象（例えば、キャパシタンスおよびインダクタンス）が、本発明の実施形態に従って、温度を検出するために利用され得る。
【００８８】
（Ｂ．正確な熱サイクリングの確認）
以下の製造の節においてより詳細に記載されるように、ブラインドチャネルデバイスは、基部層を有し、この上に、試薬が配置される。フローチャネルおよび制御チャネルを収容する２つの層を備える構造体は、基部層の上に重ねられ、その結果、このフローチャネルは、堆積された試薬と整列する。次いで、基部層の他方の面は、基材（例えば、ガラス）上に配置される。通常、反応が起こる反応部位は、基材／ガラス界面の約１００〜１５０ミクロン上方である。熱の拡散性についての公知の等式、ならびにこのデバイスにおいて利用されるエラストマーおよびガラスについての適切な値を使用して、反応部位における温度が、制御器が維持しようとする温度に達するために必要とされる時間を計算し得る。表１に示される計算値は、反応部位が約１００〜１５０ミクロン（すなわち、本明細書中に記載されるデバイスについて代表的な距離）であるデバイスにおいて利用されるよりかなり厚いエラストマー層およびガラス層を使用してさえも、温度が迅速に達成され得ることを実証する。
【００８９】
【表１】
2005512031.tif 000002
図５は、ブラインドチャネルデバイスを使用して、所望の温度が達成される迅速性を示す。
【００９０】
（ＶＩＩＩ．検出）
（Ａ．一般）
多数の異なる検出ストラテジーが、本明細書中に提供される微小流体デバイスとともに利用され得る。適切なシステムの選択は、事象の型および／または検出される薬剤について、部分的に特徴付けられる。検出器は、多数の異なる信号型（放射性同位体、発蛍光団、発色団、電子密度粒子、磁気粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子、核酸プローブに結合した酵素、および酵素基質からの信号が挙げられるが、これらに限定されない）を検出するように、設計され得る。
【００９１】
本発明の微小流体デバイスとともに使用するために適した、例示的な検出方法論としては、光散乱、マルチチャネル蛍光検出、ＵＶおよび可視波長の吸収、ルミネッセンス、差示的反射率、および共焦点レーザー走査が挙げられるが、これらに限定されない。特定の適用において使用され得る更なる検出方法としては、シンチレーション近位アッセイ技術、放射線化学検出、蛍光分極、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、時間分解エネルギー移動（ＴＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、および生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）のようなバリエーションが挙げられる。更なる検出の選択肢としては、電気抵抗、抵抗率、インピーダンス、および電圧の感知が挙げられる。
【００９２】
検出は、「検出セクション」または「検出領域」において起こる。これらおよび他の関連する用語は、検出が起こる微小流体デバイスの部分を言う。上に示されたように、ブラインドチャネル設計を利用するデバイスを用いて、検出セクションは、一般に、各反応部位に付随する弁によって隔離されるような、反応部位である。マトリックスに基づくデバイスのための検出セクションは、通常、フローチャネルの、交差点に隣接する領域、交差点自体、または交差点および周囲の領域を含む領域内にある。
【００９３】
検出セクションは、１つ以上の顕微鏡、ダイオード、光刺激デバイス（例えば、レーザー）、光電子増倍管、プロセッサおよび上記のものの組み合わせと通信し得、これらは共同して、特定の事象および／または薬剤に関連する信号を検出する。しばしば、検出される信号は、光学検出器によって検出セクションにおいて検出される、光学信号である。光学検出器は、１つ以上のフォトダイオード（例えば、アバランシェフォトダイオード）、例えば、光電子増倍管に導く、光ファイバー光ガイド、顕微鏡、および／またはビデオカメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）を備え得る。
【００９４】
検出器は、微小流体デバイス内に微小作製され得るか、または別個の要素であり得る。検出器が別個の要素として存在し、そして微小流体デバイスが複数の検出セクションを備える場合、検出は、任意の所定の瞬間において、単一の検出セクションにおいて起こり得る。あるいは、走査システムが使用され得る。例えば、特定の自動化システムは、微小流体デバイスに対して光源を走査する；他のシステムは、検出器にわたって放射された光を走査するか、またはマルチチャネル検出器を備える。具体的に示される例として、微小流体デバイスは、併進可能なステージに取り付けられ得、そして顕微鏡観察下で走査され得る。次いで、このように獲得された信号は、信号の解釈および処理のためのプロセッサに経路付けられる。光電子増倍管のアレイもまた、利用され得る。さらに、すべての異なる検出セクションから同時に信号を収集し、一方で各セクションからの信号を決定する能力を有する光学系が、利用され得る。
【００９５】
外部検出器は、使用可能である。なぜなら、提供されるデバイスは、モニタリングされる波長において光学的に透明な材料から、完全にかまたは大部分が作製されるからである。この特徴は、本明細書中に記載されるデバイスが、従来のシリコンベースの微小流体デバイスを用いては不可能な、多数の光学検出システムを利用することを可能にする。
【００９６】
検出器は、検出可能な信号を発生させるレポーターを刺激するための、光源を備え得る。利用される光源の型は、部分的には、活性化されるレポーターの性質に依存する。適切な光源としては、レーザー、レーザーダイオードおよび高強度ランプが挙げられるが、これらに限定されない。レーザーが利用される場合、このレーザーは、検出セクションのセットまたは単一の検出セクションを走査するために利用され得る。レーザーダイオードは、微小流体デバイス自体に微小作製され得る。あるいは、レーザーダイオードは、別のデバイスに製造され得、このデバイスは、熱サイクリング反応を実施するために利用される微小流体デバイスに隣接して配置され、その結果、このダイオードからのレーザー光は、検出セクションに指向される。
【００９７】
検出は、多数の非光学アプローチを同様に包含し得る。例えば、検出器はまた、例えば、温度センサ、導電性センサ、電位測定センサ（例えば、ｐＨ電極）および／または大気センサ（例えば、酸化反応および還元反応をモニタリングするため）を備え得る。
【００９８】
多数の市販の外部検出器が、利用され得る。これらの多くは、蛍光標識された試薬を調製する際に容易であることに起因して、蛍光検出器である。利用可能な検出器の特定の例としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ａｒｒａｙ  ＷｏＲｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００９９】
（Ｂ．増幅された核酸の検出）
（１．インターカレーション色素）
二本鎖ＤＮＡへの結合の際にのみ蛍光を発する特定のインターカレーション色素が、二本鎖の増幅されたＤＮＡを検出するために使用され得る。適切な色素の例としては、ＳＹＢＲＴＭおよびＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、クロモマイシン、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｔｏｔｏ−１、Ｙｏｙｏ−１およびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール塩酸塩）が挙げられるが、これらに限定されない。インターカレーション色素の使用に関するさらなる考察は、Ｚｈｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：１９４１−１９４８（１９９４）（これは、その全体が参考として援用される）によって提供される。
【０１００】
（２．ＦＲＥＴベースの検出方法）
この型の検出方法は、ドナー／アクセプター発蛍光団対中のドナー（レポーター）および／またはアクセプター（クエンチャー）発蛍光団からの蛍光における変化を検出する工程を包含する。ドナーおよびアクセプター発蛍光団対は、ドナーの発光スペクトルが、放射アクセプターの励起スペクトルと重複するように、選択される。従って、発蛍光団の対が、互いに十分近接すると、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が生じ得る。このエネルギー移動は、検出され得る。
【０１０１】
（ＦＲＥＴおよびテンプレート伸長反応）
これらの方法は、一般に、ドナー／アクセプター対の１つのメンバーで標識されたプライマー、およびドナー／アクセプター対の他方のメンバーで標識されたヌクレオチドを利用する。テンプレート依存的な伸長反応の間の、プライマーへの標識ヌクレオチドの取り込みの前に、ドナーおよびアクセプターは、エネルギー移動が生じ得ないように、互いに十分間隔を空けられる。しかし、標識ヌクレオチドがプライマーに取り込まれ、そしてこの間隔が十分近くなると、エネルギー移動が生じ、そして検出され得る。これらの方法は、単一ヌクレオチド多型の検出において単一塩基対伸長反応を実施する際に特に有用であり（以下を参照のこと）、そして米国特許第５，９４５，２８３号およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９７／２２７１９に記載されている。
【０１０２】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
種々のいわゆる「リアルタイム増幅」方法または「リアルタイム定量的ＰＣＲ」方法もまた、増幅プロセス自体の間またはその後に形成される増幅産物の量を測定することによって、サンプル中に存在する標的核酸の量を決定するために利用され得る。発蛍光ヌクレアーゼアッセイは、本明細書中に記載されるデバイスを用いて首尾よく使用され得る、リアルタイム定量方法の１つの特定の例である。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法は、二重標識発蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用する、ＰＣＲ産物の蓄積の継続的測定（「ＴａｑＭａｎ」方法として文献中で頻繁に言及されるアプローチ）を含む。
【０１０３】
このようなアッセイにおいて使用されるプローブは、代表的に短い（約２０〜２５塩基）のポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは、２種の異なる蛍光色素で標識されている。このプローブの５’末端は、代表的に、レポーター色素に結合され、そして３’末端は、クエンチング色素に結合されているが、これらの色素は、プローブ上の他の位置にも同様に結合され得る。このプローブは、標的核酸上のプローブ結合部位との、少なくとも相当な配列相補性を有するように設計される。プローブ結合部位に隣接する領域に結合するＰＣＲプライマーの上流および下流もまた、この反応混合物中に含まれる。
【０１０４】
プローブがインタクトな場合、２つの発蛍光団間のエネルギー移動が生じ、そしてクエンチャーが、レポーターからの発光をクエンチする。ＰＣＲの伸長期の間、プローブは、核酸ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）の５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによって、ポリヌクレオチド−クエンチャーからレポーターを放出させ、そして適切な検出器によって測定され得るレポーター発光強度の増加を生じる。
【０１０５】
発蛍光アッセイの間に生じる蛍光発光を測定するために特に適合された１つの検出器は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡにより製造されるＡＢＩ  ７７００である。この機器に備えられたコンピュータソフトウェアは、増幅過程全体にわたって、レポーターおよびクエンチャーの蛍光強度を記録し得る。次いで、これらの記録された値は、連続的な基準に対して正規化されたレポーター発光強度の増大を計算し、そして最終的に、増幅されているｍＲＮＡの量を定量するために使用され得る。
【０１０６】
増幅産物の濃度のリアルタイム検出を行うための発蛍光方法の理論および操作に関するさらなる詳細は、例えば、以下に記載される：米国特許第５，２１０，０１５号（Ｇｅｌｆａｎｄ）、同第５，５３８，８４８号（Ｌｉｖａｋら）、および同第５，８６３，７３６号（Ｈａａｌａｎｄ）、ならびにＨｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：９８６−９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｕ．Ｅ．Ｍら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．、ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０，（１９９１）；およびＬｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．、ら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ３５７−３６２（１９９５）（これらの各々は、その全体が参考として援用される）。
【０１０７】
従って、増幅反応が進行すると、漸増量の色素が結合し、そして付随するシグナルの増加がこれに伴う。
【０１０８】
上記のようなインターカレーション色素はまた、定量的ＰＣＲ方法への異なるアプローチにおいて利用され得る。上記のように、これらの色素は、二本鎖ＤＮＡに優先的に結合し（例えば、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ）、そして結合した場合にのみシグナルを生じる。従って、増幅反応が進行すると、漸増量の色素が結合し、そして検出され得る、付随するシグナルの増加がこれに伴う。
【０１０９】
（分子ビーコン）
分子ビーコンを用いて、この分子ビーコンが増幅産物の相補的な領域にハイブリダイズする際のプローブのコンフォメーション変化は、検出可能なシグナルの形成を生じる。プローブ自体は、２つのセクションを含む：５’末端の一方のセクションおよび３’末端の他方のセクション。これらのセクションは、プローブ結合部位にアニールするプローブのセクションに隣接し、そして互いに相補的である。一方の端のセクションは、代表的に、レポーター色素に結合され、そして他方の端のセクションは、通常、クエンチャー色素に結合される。
【０１１０】
溶液中で、２つの端セクションは、互いにハイブリダイズして、ヘアピン構造を形成し得る。このコンフォメーションにおいて、レポーター色素およびクエンチャー色素は、レポーター色素からの蛍光が、クエンチャー色素によって効果的にクエンチされるのに十分接近している。対照的に、ハイブリダイズしたプローブは、クエンチの程度が低減される、直線状のコンフォメーションを生じる。従って、２つの色素についての発光の変化をモニタリングすることによって、増幅産物の形成を間接的にモニタリングすることが可能である。この型のプローブおよびこれらの使用方法は、例えば、以下にさらに記載される：Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：３５９−６３（１９９８）；Ｔｙａｇｉ，Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８（１９９６）；ならびにＴｙａｇｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３（１９９８）（これらの各々は、全ての目的のために、本明細書中でその全体が参考として援用される）。
【０１１１】
（インベーダー）
インベーダーアッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））は、ＳＮＰ遺伝子型決定のために使用され、そしてシグナルプローブ（これは、標的核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）または多型部位に相補的である）と称されるオリゴヌクレオチドを利用する。第二のオリゴヌクレオチド（インベーダーオリゴと称される）は、同じ５’ヌクレオチド配列を含むが、その３’ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド多型を含む。インベーダーオリゴは、標的核酸へのシグナルプローブの結合を妨害し、その結果、このシグナルプローブの５’末端は、多型を含むヌクレオチドにて「フラップ（ｆｌａｐ）」を形成する。この複合体は、構造特異的エンドヌクレアーゼ（切断酵素（Ｃｌｅａｖａｓｅ  ｅｎｚｙｍｅ）と称される）によって認識される。切断酵素（Ｃｌｅａｖａｓｅ）は、ヌクレオチドの５’フラップを切断する。放出されたフラップは、ＦＲＥＴ標識を有する第三のプローブと結合し、それによって、切断酵素によって認識される別の二重鎖構造を形成する。この時点で、切断酵素は、クエンチャーから発蛍光団を切り離し、蛍光シグナルを発生させる。ＳＮＰ遺伝子型決定について、シグナルプローブは、参照（野生型）対立遺伝子または改変体（変異体）対立遺伝子のいずれかとハイブリダイズするように設計される。ＰＣＲとは異なり、核酸の増幅が存在せずに、シグナルの直線的増幅が存在する。当業者を導くのに十分なさらなる詳細は、例えば、Ｎｅｒｉ，Ｂ．Ｐ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３８２６：１１７−１２５、２０００）によって提供される。
【０１１２】
（Ｎａｓｂａ）
核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ））は、テンプレートとしてＲＮＡを使用する検出方法である。ＲＮＡに相補的なプライマーは、Ｔ７プロモーター部位の配列を含む。このプライマーは、テンプレートＲＮＡに結合し、そして逆転写酵素（ＲＴ）が添加されて、３’から５’へと、相補鎖を生成させる。ＲＮａｓｅ  Ｈが、ＲＮＡを消化するために引き続いて添加され、一本鎖ｃＤＮＡを生じる。次いで、プライマーの第二のコピーが、一本鎖ｃＤＮＡに結合し得、そして二本鎖ｃＤＮＡを生成し得る。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが、第一のプライマーによってｃＤＮＡ配列に取り込まれたＴ７プロモーター部位由来の多コピーのＲＮＡを生じるために、添加される。言及される全ての酵素が、４１℃で機能し得る（例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：９１−９１，１９９１を参照のこと）。
【０１１３】
（スコーピオン）
この方法は、例えば、Ｔｈｅｌｗｅｌｌ  Ｎ．、ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８：３７５２−３７６１，２０００によって記載されている。
【０１１４】
（３．容量性ＤＮＡ検出）
ＤＮＡ濃度と、１ｋＨｚの電場を横切る核酸の通過によって引き起こされるキャパシタンスの変化との間に、直線的な関係が存在する。この関係は、種に依存しないことが見出されている（例えば、Ｓｏｈｎら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１０６８７−１０６９０を参照のこと）。従って、特定のデバイスにおいて、フローチャネル（例えば、図１の実質的に環状のフローチャネルまたは図２の反応チャンバ）内の核酸は、増幅産物の濃度を決定するために、このような場に供される。あるいは、増幅産物を含む溶液が引き出され、次いで電場に供される。
【０１１５】
（ＩＸ．反応を実施するための混合物の組成）
本明細書中に開示される微小流体デバイスを用いて実施される反応は、この反応を増強するための特定の添加剤を用いて、代表的に実施される。従って、例えば、試薬が沈着されるデバイスの場合、これらの添加剤は、例えば、１つの反応部位における１つ以上の反応物でスポットされ得る。ある添加剤セットは、弾性基材上のタンパク質結合部位をブロックする、ブロッキング試薬である。多数の異なるタンパク質（例えば、ゼラチンおよび種々のアルブミンタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン））およびグリセロールを含む、広範な種々のこのような化合物が、利用され得る。
【０１１６】
界面活性添加剤もまた、有用であり得る。多数の異なる界面活性剤のいずれかが、利用され得る。例としては、ＳＤＳおよび種々のＴｒｉｔｏｎ界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
核酸増幅反応の特定の場合において、多数の異なる型の添加剤が含まれ得る。１つのカテゴリーは、増幅反応を促進するエンハンサーである。このような添加剤としては、核酸の二次構造を減じる試薬（例えば、ベタイン）およびミスプライム事象を減じる薬剤（例えば、テトラメチルアンモニウムクロライド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
いくつかのポリメラーゼが増強された結果を生じることがまた、特定の増幅反応を実施する際に見出された。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて良好な結果が得られたが、いくつかの例において、改善された反応が、ＤｙＮＡｚｙｍｅポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して得られた。このポリメラーゼは、好熱細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓに由来する。利用され得る他の例示的ポリメラーゼとしては、ｒＴＨポリメラーゼＸＬ（これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）およびＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）の組み合わせである）、超好熱古細菌Ｐｙｒｏｓｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）ポリメラーゼおよびＴｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本明細書中に開示される特定のデバイスを用いて、核酸増幅反応を含む反応を実施する際に有用な添加剤についてのさらなる詳細は、以下の実施例１に提供される。
【０１２０】
（Ｘ．  例示的適用）
本明細書で提供される微小流体デバイスは、多数の反応部位を備えるように製造され得、このデバイスは、種々の広範なスクリーニングおよび分析方法において有用である。一般的に、このデバイスを利用して、検出可能なシグナル、または別の種との相互作用の際に、検出可能なシグナルを生成する産物を形成するように反応する種間の反応を検出し得る。種々の型の温度制御システムを用いるそれらの使用の観点において、このデバイスはまた、温度制御を必要とする多数の異なる型の分析物または反応において利用され得る。
【０１２１】
（Ａ．  核酸増幅反応）
本明細書に開示されるデバイスを利用して、本質的に任意の型の核酸増幅反応を実施し得る。従って、例えば、増幅反応は、線形増幅、（単一のプライマーを用いる増幅）、ならびに指数関数的増幅（すなわち、順方向プライマーセットおよび逆方向プライマーセットを用いて実施される増幅）であり得る。
【０１２２】
ブラインドチャネル型デバイスを利用して、核酸増幅反応を実施する場合、反応部位に代表的に配置される試薬は、所望の型の増幅反応を実施するのに必要な試薬である。通常、このことは、以下の幾つかまたは全てが、配置されたことを意味する；例えば、プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、金属イオン、緩衝液、および補因子。このような場合に反応部位に導入されるサンプルは、核酸テンプレートである。あるいは、しかし、このテンプレートは、配置され得、そして増幅試薬が、反応部位へ流される。前出での議論のように、マトリックスデバイスを利用して、増幅反応を実施する場合、核酸テンプレートを含むサンプルは、垂直フローチャネルを通って流れ、そして増幅試薬は水平フローチャネルを通って流れ、またその逆もある。
【０１２３】
恐らく、ＰＣＲが、最も知られた増幅技術である。このデバイスは、ＰＣＲ増幅を実施することに限定されない。実施され得る他の型の増幅反応としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９）ならびにＬａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７（１９８８）を参照のこと）；（ｉｉ）転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９）を参照のこと）；（ｉｉｉ）自己持続型配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８７：１８７４（１９９０）を参照のこと）；ならびに（ｉｖ）核酸ベースの配列増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，Ｒ．およびＭａｌｅｋ，Ｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−６５（１９９５）を参照のこと）。前述の参考文献の各々は、全ての目的について、本明細書で参考として援用される。
【０１２４】
得られた増幅産物の検出は、増幅されたＤＮＡの検出について、前出の任意の検出方法を用いて達成され得る。
【０１２５】
（Ｂ．  ＳＮＰ分析および遺伝子型決定）
（１．  全般）
宿主生物または感染性生物のいずれかの、ゲノム改変と関連する多くの疾患は、少数のヌクレオチドの変化の結果であり、頻繁に、単一ヌクレオチドの変化を含む。このような単一ヌクレオチド変化は、単一ヌクレオチド多型または単にＳＮＰといわれ、ＳＮＰが生じる部位は、代表的に、多型部位といわれる。本明細書に記載されるデバイスを利用して、このような多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定し得る。この能力の拡張として、デバイスは、遺伝子型決定分析において利用され得る。遺伝子型決定は、二倍体生物（すなわち、各遺伝子の２つのコピーを有する生物）が、参照対立遺伝子の２つのコピーを含むか（参照型ホモ接合体）、参照対立遺伝子および変異体対立遺伝子の各々の１つのコピーを含むか（すなわち、ヘテロ接合体）、または変異体対立遺伝子の２つのコピーを含むか（すなわち、変異型ホモ接合体）の決定に関与する。遺伝子型決定分析の実施の際に、本発明の方法を利用して、単一変異部位に問合わせ可能である。しかし、多重化についての節において以下にさらに記載されるように、この方法を使用して、同じ遺伝子、異なる遺伝子またはその組み合わせにおける、多くの異なるＤＮＡ座における個々の遺伝子型も決定し得る。
【０１２６】
遺伝子型決定分析の実施に利用されるデバイスは、適切なサイズの反応部位を利用するように設計され、統計学的な観点から、二倍体被験体についての２つの対立遺伝子の各々のコピーが、作動可能なＤＮＡ濃度で反応部位に存在することを保証する。そうでなければ、分析は、ヘテロ接合体が、単にホモ接合体であることを示唆する結果をもたらし得る。なぜなら、第２の対立遺伝子のコピーは、反応部位に存在しないからである。以下の表２は、本明細書に記載のデバイスとともに利用され得る種々の例示的なＤＮＡ濃度での、１ｎｌ反応用量に存在する多数のゲノムのコピーを示す。
【０１２７】
（表２：示されたＤＮＡ濃度での１ｎＬ容量に存在するゲノムコピーの数）
【０１２８】
【表２】
2005512031.tif 000003
一般的な問題として、サンプルの確率的比例に起因して、増幅反応が開始される前に存在するコピー数は、測定における可能な誤差を決定する。特定のデバイスを使用する遺伝子型決定分析は、代表的に、約０．１０ｕｇ／ｕＬのＤＮＡ濃度を有するサンプルを用いて実施されるが、本発明者らは、反応部位１つに対して単一のゲノムが存在する濃度でのＴａｑＭａｎ反応を首尾よく行った。
【０１２９】
（２．  方法）
遺伝子型決定分析は、種々の異なるアプローチを用いて実施され得る。これらの方法において、「はい」または「いいえ」の結果を得ること（すなわち、検出は、所定の対立遺伝子が、存在するか否かについての質問に答え得ることのみが必要である）で、一般的に十分である。従って、分析は、多型部位に潜在的に存在する１つの対立遺伝子を検出するのに必要なプライマーまたはヌクレオチドを用いることでのみ、実施され得る。しかし、より代表的には、多型部位に潜在的に存在する各対立遺伝子の存在を検出するためのプライマーおよびヌクレオチドが、含まれる。適切なアプローチの例は、以下の通りである。
【０１３０】
（単一塩基対伸長（ＳＢＰＥ）反応）
ＳＢＰＥ反応は、遺伝子型決定分析を実施するために特に開発された１つの技術である。多数のＳＰＢＥアッセイが開発されているが、一般的なアプローチは、極めて類似している。代表的に、これらのアッセイは、標的核酸に相補的なプライマーをハイブリダイズさせる工程を包含し、その結果、このプライマーの３’末端は、変異部位のすぐ５’側にあるか、またはそれに隣接する。伸長は、変異部位を占有するヌクレオチドに相補的な１つ以上の標識された伸長不可能なヌクレオチドおよびポリメラーゼの存在下で実施される。伸長不可能なヌクレオチドは、プライマーに一旦組み込まれると、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止するヌクレオチドアナログである。さらなる伸長不可能なヌクレオチドが、変異部位におけるヌクレオチドに相補的である場合、標識された伸長不可能なヌクレオチドは、プライマーの３’末端に組み込まれ、標識された伸長産物を生成する。従って、伸長されたプライマーは、標的核酸の変異部位にどのヌクレオチドが存在するかの指標を提供する。このような方法および関連する方法は、例えば、米国特許第５，８４６，７１０号；同第６，００４，７４４号；同第５，８８８，８１９号；同第５，８５６，０９２号；および同第５，７１０，０２８号；およびＷＯ９２／１６６５７において議論される。
【０１３１】
伸長された産物の検出は、前出の検出節における伸長反応について記載されたＦＲＥＴ検出アプローチを利用して検出され得る。従って、例えば、本明細書に記載されるデバイスを使用して、ドナー／アクセプター発蛍光団のうちの１つのメンバーにより標識されたプライマー、１〜４個の標識された伸長不可能なヌクレオチド（１つより多くの伸長不可能なヌクレオチドが含まれる場合に差次的に標識される）、ならびにポリメラーゼを含む試薬混合物が、反応部位に導入される（または以前では配置される）。テンプレートＤＮＡを含むサンプルは、次いで、反応部位へと導入され、テンプレート伸長の発生を可能にする。形成された任意の伸長産物は、ＦＲＥＴシグナルの形成によって検出される（例えば、米国特許第５，９４５，２８３号およびＰＣＴ公開ＷＯ９７／２２７１９を参照のこと）。この反応は、必要に応じて熱サイクルされ、上記の温度制御方法および装置を用いてシグナルを増大させ得る。
【０１３２】
（定量的ＰＣＲ）
遺伝子型決定分析はまた、先に記載された定量的ＰＣＲ方法を用いて実施され得る。この場合、対立遺伝子形態の各々に相補的な差次的に標識されたプローブは、プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼと一緒に試薬として含まれる。しかし、反応は、単一のプローブのみを用いて実施され得るが、このことは、シグナルの欠損が、特定の対立遺伝子の非存在または単なる反応の失敗のいずれに起因するかについて、あいまいさを生じ得る。２つの対立遺伝子が、多型部位について可能である代表的な二対立遺伝子の場合について、対立遺伝子の１つに各々完全に相補的な２つの差次的に標識されたプローブは、増幅プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼと一緒に試薬混合物に通常含まれる。標的ＤＮＡを含むサンプルは、反応部位に導入される。プローブが相補的である対立遺伝子が、標的ＤＮＡ中に存在する場合、増幅が生じ、それによって、上記の検出において記載されるような検出可能なシグナルを生じる。いずれの差次的シグナルが得られるかに基づいて、多型部位におけるヌクレオチドの同一性は、決定され得る。両方のシグナルが検出される場合、両方の対立遺伝子が、存在する。反応の間の熱サイクルは、前出の温度制御節において記載されるように実施される。
【０１３３】
（Ｂ．  遺伝子発現分析）
（１．全般）
遺伝子発現分析は、特定の細胞中で１つ以上の遺伝子が発現されるレベルを決定する工程を包含する。この決定は、定性的であり得るが、一般的に、定量的である。差次的遺伝子発現分析において、１つの細胞（例えば、試験細胞）における遺伝子のレベルは、別の細胞（コントロール細胞）における同じ遺伝子のレベルと比較される。種々の広範なこのような比較が、なされ得る。例としては、健常細胞と疾患細胞との間の比較、１つの薬物により処置された個体由来の細胞と別の未処置の個体由来の細胞との間の比較、特定の毒物に曝された細胞と曝されていない細胞との間の比較などが挙げられるが、これらに限定されない。発現のレベルが、試験細胞とコントロール細胞との間で変化する遺伝子は、治療についてのマーカーおよび／または標的として機能し得る。例えば、遺伝子の特定のグループが、健常細胞ではなく疾患細胞においてアップレギュレートされていることが見出される場合、このような遺伝子は、疾患のマーカーとして機能し得、そして診断試験についてのベースとして潜在的に利用され得る。これらの遺伝子はまた、標的であり得る。疾患を標的化するストラテジーは、アップレギュレートされた遺伝子の発現の減少を生じる手順を含み得る。
【０１３４】
本明細書に開示されるデバイスの設計は、種々の遺伝子発現分析の容易化において有用である。このデバイスは、多数の反応部位を含むので、多数の遺伝子および／またはサンプルが、同時に試験され得る。ブラインドフローチャネルデバイスを使用して、例えば、数百または数千もの遺伝子の発現レベルが、同時に決定され得る。このデバイスはまた、差次的遺伝子発現分析を容易にする。マトリックス設計に関して、例えば、健常細胞から得られるサンプルは、１つのフローチャネルにおいて試験され得、そして疾患細胞由来のサンプルは、すぐ隣接するチャネルに流される。この特徴は、検出の容易性および結果の正確性を増大する。なぜなら、２つのサンプルは、同時に、同条件下で同じデバイス上に流されるからである。
【０１３５】
（２．サンプルの調製および濃度）
遺伝子の転写レベル（およびこれにより発現レベル）を測定するために、遺伝子または遺伝子フラグメントのｍＲＮＡ転写物を含む核酸サンプル、またはこのｍＲＮＡ転写物由来の核酸を得る。ｍＲＮＡ転写物に由来する核酸とは、その合成のために、ｍＲＮＡ転写物またはその部分配列が、最終的にテンプレートとして供される核酸をいう。従って、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたＲＮＡ、そのｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、その増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡは、全てｍＲＮＡ転写物に由来し、このように得られた産物の検出は、サンプル中の元々の転写物の存在および／または非存在の指標である。従って、適切なサンプルとしては、遺伝子のｍＲＮＡ転写物、このｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、この遺伝子から増幅されたＤＮＡ、この増幅ＤＮＡから転写されたＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
いくつかの方法において、核酸サンプルは、生物学的サンプルから単離された総ｍＲＮＡであり；他の場合においては、その核酸サンプルは、生物学的サンプルからの総ＲＮＡである。用語「生物学的サンプル」とは、本明細書中で使用される場合、生物または生物の成分（例えば、細胞、生物学的組織および流体）から得られるサンプルをいう。いくつかの方法において、このサンプルは、ヒト患者由来である。このようなサンプルとしては、痰、血液、血球（例えば、白血球）、組織または細針生検サンプル、尿、腹水、および胸水（ｆｌｅｕｒａｌ  ｆｌｕｉｄ）、またはこれらに由来する細胞が挙げられる。生物学的サンプルとしてはまた、組織学的目的で採取された凍結切片のような組織切片が挙げられ得る。しばしば、２つのサンプルが、比較目的で提供される。サンプルは、例えば、異なる細胞型もしくは組織型由来、または異なる個体由来、または２つの異なる処理（例えば、薬物処置およびコントロール）に供された同じ起源のサンプル由来であり得る。
【０１３７】
ｍＲＮＡの単離を排除するように選択しない任意のＲＮＡ単離技術は、このようなＲＮＡサンプルの精製に利用され得る。例えば、核酸の単離および精製の方法は、ＷＯ９７／１０３６５、ＷＯ９７／２７３１７、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第３章：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第３章：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  １．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら，編）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７−１９９３）において詳細に記載される。多数の組織サンプルは、当該分野で公知の技術（例えば、米国特許第４，８４３，１５５号に記載されるＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．の１工程ＲＮＡ単離プロセスが挙げられる）を使用して容易に処理され得る。
【０１３８】
記載されるデバイスを利用する遺伝子発現分析において、結果に影響を与える重要な要因は、サンプル中の核酸の濃度である。低コピー数では、ノイズがコピー数の平方根に関連する。従って、許容可能と考えられる誤差のレベルは、必要なコピー数を支配する。特定のサンプル容積中の必要なコピー数は、必要なＤＮＡ濃度を与える。必ずしも最適ではないが、５０％までの誤差レベルで定量的反応が行われ得るが、好ましくは、より低い。容積１ｎｌとすると、特定の誤差レベルを達成するために必要なＤＮＡ濃度は、表３に示される。認められ得るように、特定のデバイスで使用され得るような１ｎｌの容積は、微小流体デバイスで作業可能な濃度で遺伝子発現産物の十分なコピーを有する。
【０１３９】
【表３】
2005512031.tif 000004
さらなる計算により、１ｎｌ反応部位を利用する本明細書中で提供される特定のデバイスが、正確な発現結果を達成するに十分なＤＮＡを含むことが実証される。具体的には、代表的なｍＲＮＡ調製手順により、約１０μｇのｍＲＮＡが得られる。代表的には、１細胞あたり１〜１０，０００コピーの各ｍＲＮＡが存在することが実証された。任意の所定の細胞内で発現されるｍＲＮＡのうち、約４つの最も一般的なメッセージは、約１３％の総ｍＲＮＡレベルを含む。従って、このような高度に発現されたメッセージは、１．３μｇのｍＲＮＡ（各々、４×１０−１２モルまたは約２．４×１０１２コピーである）を含む。前述の発現範囲を考慮すると、稀なメッセージは、約２×１０−８コピーのレベルで存在すると推定される。標準的な分析において、ｍＲＮＡサンプルが１０μｌ中に溶解されると、稀なメッセージの濃度は、約２×１０７コピー／μｌであり；この濃度は、１ｎｌ  ウェルあたり２０，０００コピー（または４×１０１１Ｍ）に対応する。
【０１４０】
（３．方法）
発現分析は、代表的には、定量的分析を含むので、検出は、代表的には、上記の定量的リアルタイムＰＣＲ法の１つを使用して達成される。従って、ＴａｑＭａｎアプローチが利用される場合、反応部位に導入される（または予めスポットされた）試薬は、以下のうちの１つまたは全てを含み得る：プライマー、標識プローブ、ヌクレオチドおよびポリメラーゼ。インターカレーション色素が利用される場合、この試薬混合物は、代表的には、以下のうちの１つまたは全てを含む：プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、およびインターカレーション色素。
【０１４１】
（Ｄ．多重化）
本明細書中で記載されるアレイベースのデバイス（例えば、図１Ａ、１Ｆ、２、３Ａおよび３Ｂ、ならびに付随する本文を参照のこと）は、本質的に、多数の増幅反応を同時に行うように設計されている。しかし、この特徴は、各反応部位内で多重分析（例えば、遺伝子型決定および発現分析）を行うことによって容易に、さらに拡大され得る。
【０１４２】
多重増幅は、サーマルサイクリングプロセスの間に、例えば、複数のプライマー（各々、目的の特定の標的核酸に特異的）を利用することによって、単一の反応部位内でさえ行われ得る。異なる増幅産物の存在は、異なって標識されたプローブを使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を行うか、または異なって標識された分子ビーコン（前出を参照のこと）を使用することによって、検出され得る。このようなアプローチにおいて、各異なって標識されたプローブは、特定の増幅された標的にのみハイブリダイズするように設計される。利用される異なる標識を慎重に選択することによって、異なる標識が単一の反応において異なる波長で励起および／または検出される分析が行われ得る。このようなアプローチにおいて適切な蛍光標識の選択に関するさらなるガイダンスとしては、以下が挙げられる：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｐｅｓｃｅら，編）Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７１）；Ｗｈｉｔｅら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｕｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７６）；Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｂｉｓｈｏｐ，編）．Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２３；およびＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ（１９９２）。
【０１４３】
複数の遺伝子型決定および発現分析は、必要に応じて、各反応部位において行われ得る。定量的ＰＣＲ法（例えば、ＴａｑＭａｎ）が利用される場合、目的の標的ＤＮＡの異なる領域を増幅するためのプライマーは、単一の反応部位内に含まれる。各領域について異なって標識されるプローブは、形成される産物を区別するために利用される。
【０１４４】
（Ｅ．非核酸分析）
種々の広範な核酸分析を行うために有用である一方で、このデバイスはまた、多くの他の適用においても利用され得る。先に示されるように、このデバイスは、検出シグナル、または反応産物と相互作用するとシグナルを生成する検出試薬と反応し得る反応産物を生成する２以上の種間の本質的に任意の相互作用を分析するために利用され得る。
【０１４５】
従って、例えば、デバイスは、特定の所望の活性を有する試験薬剤を同定するために多くのスクリーニング適用において利用され得る。特定の例として、このデバイスは、１以上の酵素の基質またはインヒビターとして、活性について化合物をスクリーニングするために利用され得る。このような分析において、（予め入れられていなければ）試験化合物および他の必要な酵素アッセイ試薬（例えば、緩衝液、金属イオン、補因子および基質）が反応部位に導入される。次いで、この酵素サンプルが導入され、反応（試験化合物が基質である場合）または反応の阻害（試験化合物がインヒビターである場合）が検出される。このような反応または阻害は、標準的な技術（例えば、基質の喪失および／または生成物の出現を直接的または間接的にモニタリングすること）によって達成され得る。
【０１４６】
十分に大きなフローチャネルおよび反応部位を有するデバイスはまた、細胞と１以上の試薬との間の相互作用を検出する細胞アッセイを行うために利用され得る。例えば、特定の分析は、サンプル中に特定の細胞型が存在するか否かの決定を含む。これを達成するための１つの例は、特定の細胞型と優先的に反応する細胞特異的色素を利用することである。従って、このような色素が反応部位に導入され得、次いで、細胞が添加され得る。細胞の染色は、標準的な顕微鏡技術を使用して検出され得る。別の例示として、試験化合物は、細胞応答（例えば、シグナル伝達経路）を誘発または阻害する能力についてスクリーニングされ得る。このような分析において、試験化合物が部位に導入され、次いで、細胞が添加される。この反応部位は、次いで、細胞応答の形成を検出するためにチェックされる。
【０１４７】
関連するデバイスおよびこのようなデバイスの適用のさらなる議論は、全ての目的のために、その全体が本明細書中に参考として援用される、同時係属中の共有に係る米国仮出願第６０／３３５，２９２号（２００１年１１月３０日出願）に記載される。
【０１４８】
（ＸＩ．製造）
（Ａ．一般的な局面）
先に示したように、提供される微小流体デバイスは、一般的に、単一の多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）技術および／または犠牲層カプセル化法を使用して構築される。基本的なＭＳＬアプローチは、マイクロマシン鋳型で一連のエラストマー層を成型する工程、鋳型から層を除去する工程、次いで、層をともに融合させる工程を包含する。犠牲層カプセル化アプローチにおいて、フォトレジストのパターンは、チャネルが所望される場所に配置される。これらの技術および微小流体デバイスの製造におけるそれらの使用は、例えば、Ｕｎｇｅｒらによる（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６、Ｃｈｏｕらによる（２０００）「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ−Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｈｅａｄ，Ｓ．Ｃ．；およびＰＣＴ公報ＷＯ  ０１／０１０２５（これらの各々が、全ての目的について、本明細書中においてその全体が参考として援用される）に、詳細に考察される。
【０１４９】
簡単に述べると、上記製造技術法は、最初に、フォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ  ＳＪＲ  ５７４０）を用いるフォトリソグラフィーによって、シリコンウェハ上にトップ層（例えば、コントロールチャネルを有するエラストマー層）およびボトム層（例えば、フローチャネルを有するエラストマー層）のための母鋳型（ｍｏｔｈｅｒ  ｍｏｌｄ）を製造する工程を包含する。チャネル高さは、スピンコーティング速度によって正確に制御され得る。フォトレジストチャネルは、フォトレジストにＵＶ光を曝露し、続いて、現像することによって形成される。熱再流プロセスおよび保護処理は、代表的に、Ｍ．Ａ．Ｕｎｇｅｒ，Ｈ．−Ｐ．Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｔｈｒｏｓｅｎ，Ａ．ＳｃｈｅｒｅｒおよびＳ．Ｒ．Ｑｕａｋｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８：１１３（これは、本明細書中においてその全体が参考として援用される）によって記載されるように、達成される。次いで、混合された２部分シリコーンエラストマー（ＧＥ  ＲＴＶ  ６１５）を、それぞれ、ボトム鋳型内に回転させて入れ、そしてトップ鋳型上に注ぐ。ここで、ボトムポリマー流体層の厚みを制御するためにスピンコーティングを使用し得る。部分的に硬化されたトップ層は、２５分間、８０℃でオーブンにおいて焼いた後、その鋳型から剥がされ、ボトム層と整列され、組み立てられる。８０℃での１．５時間の最終の焼きは、これらの２つの層を不可逆的に結合させるために使用される。一旦、ボトムシリコン母鋳型から剥がされると、このＲＴＶデバイスは、代表的に、ＨＣＬで処理される（０．１Ｎ、８０℃で３０分）。この処理は、いくらかのＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を切断するように作用し、それによって、チャネルをより親水性にするヒドロキシル基を露出する。
【０１５０】
次いで、デバイスは、必要に応じて、支持体に気密的にシールされ得る。支持体は、本質的に任意の材料から製造され得るが、表面は、良好なシールを保証するように平坦であるべきである。なぜなら、形成されるシールが、主に、接着力に起因するからである。適切な支持体の例としては、ガラス、プラスチックなどが挙げられる。
【０１５１】
上記方法に従って形成されるデバイスは、フローチャネルの１つの壁を形成する基材（例えば、ガラススライド）を生じる。あるいは、一旦、母鋳型から取り出されたデバイスは、薄い弾性膜にシールされ、その結果、フローチャネルが、全体的に、弾性材料内に封入される。次いで、得られる弾性デバイスは、必要に応じて、基材支持体に結合され得る。
【０１５２】
（Ｂ．ブラインドチャネル設計を利用するデバイス）
（１．層形成）
製造の間に、試薬が反応部位に配置されるブラインドチャネル設計に基づく微小流体デバイスは、代表的に、３層で形成される。ボトム層は、試薬が配置される層である。ボトム層は、ＭＬＳ法について上で引用される参考文献に記載されるように、種々の弾性材料から形成され得る。代表的に、この材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＭＤＳ）エラストマーである。特定のデバイスについて所望される反応部位の配置および位置に基づいて、適切な試薬がスポットされるべきボトム層上の位置が決定され得る。ＰＭＤＳが疎水性であるので、配置される水性スポットは、縮んで非常に小さなスポットを形成する。配置される試薬は、試薬とエラストマーの表面との間に共有結合が形成されないように配置される。なぜなら、先に記載されるように、試薬は、一旦、反応部位に導入されると、サンプル溶液内に溶解することが意図されるからである。
【０１５３】
デバイスの他の２つの層は、フローチャネルが形成される層、およびコントロールチャネルおよび必要に応じてガードチャネルが形成される層である。これら２つの層は、このセクションにおいて先に記載される一般的な方法に従って、調製される。次いで、得られる２つの層構造は、試薬が配置された第１層の上に配置される。３つの層の組成物の特定の例は、以下の通りである（成分Ａ対成分Ｂの比）：第１層（サンプル層）３０：１（重量による）；第２層（フローチャネル層）３０：１；および第３層（コントロール層）４：１。しかし、弾性成分の他の組成および比が、同様に利用され得ることが理解される。
【０１５４】
このプロセスの間、反応部位は、配置された試薬と整列され、その結果、試薬は、適切な反応部位内に位置付けられる。図６は、デバイスの４つのコーナーから取られた写真のセットである；これらの写真は、配置される試薬が、先のアプローチを利用して、反応部位内に正確に整列され得ることを示す。これらの写真は、枝分かれフローチャネルの端部に配置されるガードチャネルおよび反応部位を示す。白丸は、反応部位に対する、配置された試薬の位置を示す。示されるように、各試薬スポットは、十分に反応部位の範囲の中にある。
【０１５５】
（２．スポッティング）
試薬は、多くの市販の試薬スポッターのいずれかを利用し、そして種々の確立されたスポッティング技術を使用して、配置され得る。デバイスの調製に使用され得る適切なスポッターの例としては、ピンスポッター、音響スポッター、自動マイクロピペッター、電気泳動ポンプ、インクジェットプリンターデバイス、インクドロッププリンター、および特定の浸透圧ポンプが挙げられる。市販のスポッターの例としては、以下が挙げられる：Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｃｒｏＳｙｓ  ５１００（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ），Ｈｉｔａｃｈ  ＳＰＢＩＯ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ），Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｑ−Ａｒｒａｙ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ），Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１７（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）およびＰａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＳｐｏｔＡｒｒａｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）。一般的に、試薬の非常に小さなスポットが、配置される；通常、１０ｎｌ未満のスポットが配置され、他の例において、５ｎｌ、２ｎｌまたは１ｎｌ未満が配置され、なお他の例において、０．５ｎｌ、０．２５ｎｌ、または０．１ｎｌ未満が配置される。
【０１５６】
以下の実施例は、本明細書中に開示されるデバイスおよび方法の特定の局面をさらに示すために提示される。実施例は、本発明を制限するとは解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１５７】
（実施例１）
（シグナル強度評価）
（Ｉ．序論）
このセットの実験の目的は、首尾良いＰＣＲ反応が、本明細書中に記載される設計の微小流体デバイスを用いて、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応の５０％より多くのシグナル強度で、実施され得ることを実証するためであった。
【０１５８】
（ＩＩ．微小流体デバイス）
３層の微小流体デバイス（ＭＳＬプロセスを使用して作製される）は、以下の実施例に記載される実験を実施するために設計および製造された。図７Ａは、デバイスの断面図を示す。示されるように、デバイス７００は、流体チャネルが形成される層７２２を含む。この流体層７２２は、重層層７２０（コントロール層およびガード層を含む）と下にあるシーリング層７２４との間に挟まれる。シーリング層７２４は、フローチャネルの１つの側面を形成する。得られた３層構造は、基材７２６（この実施例において、スライドまたはカバースリップ）に付けられ、この基材は、構造的堅さを提供し、熱伝導性を増加し、そして微小流体デバイス７００の底からのエバポレーションを妨げるのを助ける。
【０１５９】
図７Ｂは、フロー層７２２のフローチャネル、およびコントロール／ガード層７２０のコントロールチャネルおよびガードチャネルの設計の概略図を示す。デバイス７００は、１０個の独立したフローチャネル７２０（各々が、それら独自の入口７０８を備える）および枝分かれブラインドチャネル７０４（各ブラインドチャネル７０４が、１ｎｌの反応部位７０６を有する）から構成される。デバイス７００は、コントロールライン７１２のネットワーク（十分な圧力が適用される場合、反応部位７０６を分離する）を含む。一連のガードチャネル７１６もまた、反応部位７０６から液体がエバポレートすることを妨げるために含まれる；流体は、入口７１８を介して導入される。
【０１６０】
（ＩＩ．実験セットアップ）
ヒト男性ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）由来のβ−アクチン遺伝子のエキソン３を増幅するためにβ−アクチンプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを使用するＰＣＲ反応を、デバイス７００で実施した。ＴａｑＭａｎ反応は、以下の成分からなる：１×ＴａｑＭａｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（５０  ｍＭ  ＫＣｌ，１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ，６０ｎＭ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｌ（ＰＲ１），ｐＨ  ８．３）；３．５〜４．０  ｍＭ  ＭｇＣｌ；２００  ｎＭ  ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，４００  ｎＭ  ｄＵＴＰ；３００  ｎＭ（β−アクチン順方向プライマーおよび逆方向プライマー；２００  ｎＭ  ＦＡＭ−標識β−アクチンプローブ；０．０１Ｕ／ｕｌ  ＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；０．１〜０．２Ｕ／ｕｌ  ＤｙＮＡｚｙｍｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）；０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；０．８ｕｇ／ｕｌゼラチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）；５．０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；脱イオンＨ２Ｏおよび男性ゲノムＤＮＡ。反応成分を添加して、２５μｌの合計反応容量を生じる。ネガティブコントロール（コントロール）を、標的ＤＮＡが各セットのＰＣＲ反応に含まれたことを除いて、ＴａｑＭａｎ反応成分の全てから構成された。
【０１６１】
一旦、ＴａｑＭａｎ反応サンプルおよびコントロールが調製されると、これらを、１ｍｌシリンジに取り付けられたゲル装填ピペットチップを使用することによって、微小流体デバイス７００内に注入した。ピペットチップを、反応サンプルで満たし、次いで、７０８によって流体内に挿入した。フローチャネル７０２を、ブラインドチャネル７０４全体および反応部位７０６の全てが満たされるまで、シリンジに背圧を手動で適用することによって満たした。コントロールライン７１２を、脱イオン水で満たし、そして全てのサンプルがフローライン７０２、７０４内に装填された後に、１５〜２０ｐｓｉに加圧した。加圧されたコントロールライン７１２をバルブに近付くように作動させ、そして１ｎｌウェル７０６中にサンプルを隔離した。次いで、ガードチャネル７１６を脱イオン水で満たし、そして５〜７ｐｓｉに加圧した。鉱油（１５ｕｌ）（Ｓｉｇｍａ）を、熱サイクラーのフラットプレート上に配置し、次いで、微小流体デバイス／カバーガラス７００を、熱サイクラー上に配置した。次いで、微小流体デバイス７００を、開始傾斜（ｒａｍｐ）および３工程または２工程のいずれかの熱サイクルプロフィールを使用して、熱サイクルした。
【０１６２】
１．  ９５℃まで開始傾斜および１分間維持（１．０℃／秒、７５℃まで、０．１℃／秒、９５℃まで）
２．  ４０サイクルの３工程熱サイクル（９２℃３０秒間、５４℃３０秒間、および７２℃１分間）または
３．  ４０サイクルの２工程熱サイクル（９２℃３０秒間、および６０℃６０秒間）。
【０１６３】
残りの反応混合物を含むＭｉｃｒｏＡｍｐチューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）（これらを微小流体デバイスにおいて実施された反応と区別するためにＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応と称した）を、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中に配置し、そして９６００モードで熱サイクルした。Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応は、微小流体デバイスにおいて実施される反応に対する巨視的なコントロールとして役立った。熱サイクルプロトコルを、最初の傾斜速度をＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応について制御しなかったことを除いて、微小流体デバイスの熱サイクルプロトコルと一致するように設定した。
【０１６４】
一旦、熱サイクルが完了すると、コントロールラインおよびガードラインの圧を下げ、チップをガラススライド（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）上に移した。次いで、チップを改変キャリアとともに、Ａｒｒａｙ  ＷｏＲｘ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）内に配置した。蛍光強度を、３つの異なる励起／発光波長について測定した：４７５／５１０  ｎｍ（ＦＡＭ），５１０／５６０  ｎｍ（ＶＩＣ），および５８０／６４０ｎｍ（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｌ（ＰＲ１））。Ａｒｒａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、微小流体デバイスで蛍光を画像化し、そして各１ｎｌウェルのシグナル強度およびバックグラウンド強度を測定した。次いで、β−アクチン  ＴａｑＭａｎ反応について、ＦＡＭ／ＰＲ１比を計算するために、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌファイルを使用して、結果を分析した。通常のＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎについて、標的ＤＮＡに対するポジティブなサンプルを、製造業者によって提供されるプロトコル（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）に記載される計算を使用して決定した。サンプルのＦＡＭ／ＰＲ１比を、コントロールのＦＡＭ／ＰＲ１比によって除算することによって、シグナル強度を、計算した。首尾良い反応を、９９％信頼閾値レベルより上のサンプル比として規定した。
【０１６５】
（ＩＩＩ．結果）
まず、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をＴａｑＭａｎ反応において使用し、１．５〜２．０のＦＡＭ／ＰＲ１／コントロール比を生成し、５．０〜１４．０のＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応比と比較した。結果は、ポジティブであったが、シグナル強度の増加が所望された。従って、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼを、その増加した熱安定性、校正および不純物に対する耐性に起因してＤｙＮＡｚｙｍｅポリメラーゼで置換した。０．０２５Ｕ／μｌの標準的Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ  ＤｙＮＡｚｙｍｅ濃度を、微量流体実験において使用した。ＤｙＮＡｚｙｍｅへのポリメラーゼ交換は、３．５〜５．８のＦＡＭ／ＲＯＸ／コントロール比を生じた。シグナル強度を改善したが、矛盾のない結果に到達することは困難であった。いくらかのタンパク質がＰＤＭＳに固着するは、公知であるので、ポリメラーゼの濃度を増加し、表面改変添加物を含有した。２つの増加した濃度（８×（０．２Ｕ／μｌ）および４×（０．１Ｕ／μｌ）のＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ用の標準濃度（１ｎｌ当たり１００ｐｇまたは１０ｐｇのゲノムＤＮＡ））のＤｙＮＡｚｙｍｅを、微小流体デバイス中で試験した。ゼラチン、グリセロール、および０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ−１００を、添加し、ポリメラーゼがＰＤＭＳに結合することを防止した。微小流体デバイス（チップ）中の反応の結果およびＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎコントロールを、図８に示す。
【０１６６】
微小流体ＴａｑＭａｎ反応比は、４．９〜８．３の範囲である一方、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応は、７．７〜９．７の範囲である。従って、チップ中のＴａｑＭａｎ反応のシグナル強度は、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応の８７％までである。４×ＤｙＮＡｚｙｍｅまたは８×ＤｙＮＡｚｙｍｅの間に有意な差はなかった。この結果は、微小流体デバイス中で、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応と比較した場合、ＰＣＲ反応が、５０％より強いシグナル強度で実施され得ることを示す。結果は、少なくとも４回の試行を通して一致する。
【０１６７】
（実施例２）
（スポットされた試薬）
（Ｉ．導入）
この実験の目的は、微小流体デバイスにおける首尾良いスポットされたＰＣＲ反応を示すことであった。この文脈において用語「スポットされた（ｓｐｏｔｔｅｄ）」は、基材上の試薬の小さな液滴（スポット）の配置をいい、微小流体デバイスの一部となるようにアセンブリされる。スポットされた試薬は、一般的に、ＰＣＲを実施するために必要とされる反応混合物の部分集団である。
【０１６８】
（ＩＩ．手順）
（Ａ．試薬のスポッティング）
慣用的な試薬のスポッティングを、接触プリンティングプロセスによって実施した。試薬を、金属ピン上に１セットの供給源ウェルから選び取り、このピンを標的基材と接触させることによって配置した。このプリンティングプロセスを、図９にさらに概説する。示されるように、試薬を、供給源（例えば、マイクロタイタープレート）から選び取り、次いで、この装填されたピンを基材と接触させることによってプリントした。洗浄工程は、脱イオン水中で攪拌した後、真空乾燥する工程からなる。試薬スポットをプリントするために使用されるシステムは、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｃｒｏＳｙｓ５１００（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）であり、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  「ＣｈｉｐＭａｋｅｒ」ブランドのピンを使用するが、他のシステムを、上記されるように使用し得る。
【０１６９】
使用されるピンは、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  ＣｈｉｐＭａｋｅｒ  ４ピンであり、これは、電気ミルスロットを組込み（図９を参照のこと）、取り込み体積を増加する（従って、プリント可能なスポットの数が増える）。使用される操作条件（代表的には、７５％の相対湿度および約２５℃の温度）下で、１００を越えるスポットが、１つのピン当たり、１回の装填サイクル当たり、プリントされた。上記条件下で、ＰＤＭＳ基材上にスポットされる試薬の体積は、０．１ｎＬのオーダーにある。
【０１７０】
ピンチップの大きさは、１２５×１２５μｍである。乾燥試薬の最終スポットは、実質的にこれより小さく（直径が７μｍ程度に小さい）、さらに、ピンの大きさは、下限を容易に達成可能なスポット間隔に規定する。達成可能な間隔は、最終デバイスにおいて最小のウェル間ピッチを決定する。このようなデバイスおよび前述の方法を使用して、１８０μｍの間隔を有するアレイが、達成される。作動チップに組み入れられるアレイは、６００〜１３００ミクロンの間隔を有する傾向がある。
【０１７１】
スポッティングを、同時に１つのピンのみを使用して実施した。しかし、使用中のシステムは、３２ピンまでに適応され得るピンヘッドを有する。標準的サイズのチップ（２０×２５ｍｍのオーダーのアレイの大きさ）をプリントすることは、５分未満かかる。
【０１７２】
（Ｂ．スポッティッドチップのアセンブリ）
ＰＣＲデバイスの流れ層およびコントロール層は、上記される正常なＭＳＬプロセスに従って、アセンブリされる。微小流動デバイス設計は、実施例１に記載される設計と同一である。同時に、基質層は、１５０μｍ厚のＰＤＭＳから構成され、Ａ：Ｂの３０：１の成分比が、ブランクシリコンウェハーをスピンコーティングすることによって形成され、次いで、８０℃で９０分間硬化する。
【０１７３】
ＰＤＭＳの硬化されたブランク基質層（図７Ａの密封層／基材層７２４）は、試薬スポッティングのための標的として働く。スポットのパターンを、ブランクウェハー上にさらに存在する基材上にプリントする。ＰＣＲ反応のためにスポットされた試薬は、プライマーおよびプローブであり、増幅される特定の遺伝子に対して特異的である。スポットされた試薬は、１：１：１の体積比の３００ｎＭ  β−アクチン順方向プライマー（ＦＰ）、３００ｎＭ  β−アクチン逆方向プライマー（ＲＰ）、および２００ｎＭ  β−アクチンプローブ（Ｐｒｂ）を含んだ。いくつかの場合において、スポットされた混合物を濃縮することによって化学的性質をさらに調整することが有用である。プライマー濃度およびプローブ濃度が、正常な巨視的配合値と等しいかまたはその値よりわずかにより高くなるような濃度を調整することが、一貫して良好な結果を生じることが見出された。従って、スポットされた試薬は、大量反応の３倍濃度および４倍濃度まで濃縮される。試薬の濃縮を、Ｃｅｎｔｒｉｖａｐ（加熱され真空にされたそして相対的ＦＰ：ＲＰ：Ｐｒｂ比を変更しない遠心分離器）中で実施する。スポット濃度の増加は、試薬を１ｎＬの反応容量中に再懸濁する場合、正しい最終濃度を生じる。スポットされた試薬は、プライマーおよびプローブに限定される必要はなく；３つ全て（ＦＰ、ＲＰおよびＰｒｂ）がスポットされなければならない。プローブのみまたはプライマーの１つですらスポットされる適用を、実施し得る。スポットされたサンプルプライマー／プローブセットが、ＴａｑＭａｎ  β−アクチンおよびＴａｑＭａｎ  ＲＮＡｓｅ−Ｐである実験が、実施された。
【０１７４】
基材上へのスポッティングプロセスの後、合わせた流れ層およびコントロール層（すなわち、図７Ａの層７２０および７２２）を、スポットパターンを用いて配列し、接触させた。８０℃で６０〜９０分間のさらなるベイクを、基質をチップの残りに結合するために使用した。チップがアセンブリされた後、ＰＣＲ反応の残りの成分（実施例１に記載される）を、チップのフローチャネルに注入し、このチップを、実施例１に記載のように熱サイクルする。
【０１７５】
（ＩＩＩ．結果）
ＰＣＲ反応は、プライマー（順方向プライマーおよび逆方向プライマー）およびプローブ分子をスポットしたデバイスを使用して、首尾よくそして繰り返し実施した。反応が首尾よく実施されたチップからのデータの例を、図１０に示す。スポットされた試薬は、実施例１に規定されるような首尾よいＰＣＲ反応を生じる。首尾良い反応は、２段階熱サイクリングプロトコルおよび３段階熱サイクリングプロトコルを使用して実施する。
【０１７６】
（実施例３）
（遺伝子型決定）
（Ｉ．導入）
以下の実施例の目的は、遺伝子型決定実験が、本明細書中に記載されるような微小流体デバイスまたはチップを使用して実施され得ることを示すことであった。具体的には、これらの実験は、デバイス中で実施される反応が、十分な感度を有するかどうかを決定するように、そしてβーアクチン以外の他のプライマー／プローブセットを、微小流体デバイス中で実施し得ることを保証するように設計された。
【０１７７】
（ＩＩ．方法／結果）
（Ａ．ＲＮａｓｅ  Ｐ実験）
ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、実施例１に記載されるように微小流体デバイスにおいて実施し、他のプライマー／プローブセットが、検出可能な結果を生じることを示した。ＲＮａｓｅＰ反応はまた、より高いレベルの感度を必要とする。なぜなら、ＲＮａｓｅＰプライマー／プローブセットは、β−アクチンプライマー／プローブセットと対照的に単一コピーの遺伝子（２コピー／ゲノム）を検出するからである。β−アクチンセットは、単一コピーのβ−アクチン遺伝子およびいくつかの偽遺伝子を検出し、１ゲノム当たり約１７コピーを集合的に合計する。ＲＮａｓｅ  Ｐ反応を、β−アクチンプライマー／プローブセットを、ＲＮａｓｅ  Ｐプライマー／プローブセットと置換したことを除いて、実施例１に記載される同じ成分を用いて実施した。さらに、ＲＮａｓｅ  Ｐプライマー／プローブセットを、４×製造業者推奨値で使用して、蛍光シグナルを増強した。ＶＩＣ色素を、ＲＮａｓｅ  Ｐに対するプローブに結合し、分析は、ＶＩＣ／ＰＲ１比に対して集中した。４つの実験のうち１つの結果を、図１１に示す。
【０１７８】
Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応についてのＶＩＣ／ＰＲｌ／コントロール比は、１．２３である。微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応について対応する比は、１．１１および１．２１である。微小流体デバイスにおけるゲノムＤＮＡサンプルの比は、約９９％以上の確かな閾値レベルである。さらに、微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応のシグナル強度は、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応の５０％および９３．７％である。微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応のコントロールは、０．００６および０．０１２の標準偏差を有し、これは、微小流体デバイスを横切る反応における一貫性を証明する。従って、チップにおけるＴａｑＭａｎ反応は、１ゲノムあたり２コピーを検出するのに十分な感度である。
【０１７９】
（Ｂ．ＤＮＡ希釈実験）
微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応の感度をさらに測定するために、ゲノムＤＮＡの希釈を、β−アクチンプライマー／プローブセットを使用して試験した。反応組成物を、一般的に、４×ＤｙＮＡｚｙｍｅおよびゲノムＤＮＡの希釈を使用して、実施例１に記載される通りに作製した。ゲノムＤＮＡを、０．２５ｐｇ／ｎｌ以下まで希釈した（これは、１ｎｌあたり約１コピーに一致する）。１回希釈シリーズの結果を、図１２に示す。
【０１８０】
ポアソン分布に従って、平均標的数が１である場合、ウェルの全数の３７％が、ネガティブであるはずである。ウェル番号５、６および７は、計算された闘値以下であり、従ってネガティブである。これは、微小流体チップ中のβ−アクチンＴａｑＭａｎ反応が、１ｎｌあたり１コピーの平均を検出し得ることを示唆する。従って、微小流体デバイスにおける反応の感度は、遺伝子型実験を行うのに十分である。
【０１８１】
（Ｃ．遺伝子型実験）
微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎは、低い標的数を決定し得るので、ＳＮＰ（単一塩基多型）遺伝子型の予備的な試験を、Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、ＣＹＰ２Ｄ６  Ｐ４５０シトクロム遺伝子に対して実施した。キットは、１つのプライマーセットおよび２つのプローブ；野生型または参照対立遺伝子、ＣＹＰ２Ｄ６＊１に対して標識されたＦＡＭおよびＣＹＰ２Ｄ６＊３変異体対立遺伝子または改変体対立遺伝子に対して標的されたＶＩＣを備える。ゲノムＤＮＡと共に各対立遺伝子についてのポジティブコントロール、ＰＣＲ産物を、実施例１に記載されるのと同じ条件を使用して、デバイスで試験した。１つの実験からの結果を、図１３および図１４に示す。この実験は、少なくとも３回繰り返し、結果を確認し、そして信頼性を証明した。
【０１８２】
図１３に示されるように、Ａｌ−１（対立遺伝子１、ＣＹＰ２Ｄ６＊１野生型対立遺伝子）およびゲノムＤＮＡ（１００ｐｇ／ｎｌ）が、それぞれ、３．５および２．２の平均ＶＩＣ／ＰＲｌ／コントロール比を生じ、このことは、ゲノムＤＮＡがＣＹＰ２Ｄ６＊１、野生型対立遺伝子についてポジティブであったことを示した。これらの値は、反応の闘値限界を上回る。微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応のシグナル強度は、それぞれ、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎコントロールの５９％および４０％である。Ａｌ−２（対立遺伝子２、ＣＹＰ２Ｄ６＊３変異体対立遺伝子または改変体対立遺伝子）（これは、ＶＩＣチャネルにおいてネガティブであるはずである）は、おそらく検出器のＶＩＣチャネルへのＦＡＭ蛍光の漏出に起因して、コントロール（１．５）を超えるいくつかのシグナルを示した。この漏出は、改善された検出プロセスで最小化され得る。
【０１８３】
Ａｌ−２ポジティブコントロールは、３．０の平均ＦＡＭ／ＰＲｌ／コントロール比を与え、これはＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎシグナルの３７％であり、そして計算された闘値限界を上回った（図１４を参照のこと）。ゲノムサンプルは、ＣＹＰ２Ｄ６＊３変異体対立遺伝子についてネガティブであった（ＣＹＰ２Ｄ６＊３対立遺伝子の周波数の予測された結果は低い）。さらに、検出器のＦＡＭチャネルへのＡｌ−１、ＶＩＣプローブのいくらかの漏出が存在することが明らかである。全体として、ＳＮＰ検出反応は、微小流体デバイスにおいて成功であった。
【０１８４】
（実施例４）
（ゲル電気泳動によるＰＣＲの検証）
（Ｉ．導入）
ＤＮＡの増幅を改善するための代替の方法を、微小流体デバイスにおいて行うのに、ゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を検出するための実験を実施した。ＴａｑＭａｎプローブを除外し、そしてβ−アクチン順方向プライマーを、ＦＡＭに結合体化したことを除いて、ＰＣＲ反応組成は、実施例１に記載される通りであった。
【０１８５】
（ＩＩ．手順）
（Ａ．微小流体デバイス）
３層の微小流体デバイス（ＭＳＬプロセスを使用して製造した）を設計し、そして本実施例に記載される実験を実施するために製造した；図１５は、設計の概略図を示す。デバイス１５００は、一般的に、サンプル領域１５０２およびコントロール領域１５０４からなる。サンプル領域１５０２は、フローチャネル１５０６に沿って整列された長方形によって示される３４１個の１ｎｌの反応部位１５０８備え、入口１５１０および出口１５１２を備える。コントロール領域１５０４は、３つのコントロールフローチャネル１５１４を備え、各コントロールチャネルは、また長方形によって示される１０個の１ｎｌの反応部位１５１８および入口１５１６を備える。十分な圧力が入口１５２４に適用される場合、コントロールライン１５２２のネットワークは、各反応部位１５０８、１５１８を分離する。一連のガードチャネル１５２０は、液体が反応部位１５０８、１５１８からエバポレートするのを防ぐように備えられる。このデバイスは、実施例１に記載されるような３層デバイスである（図７Ａを参照のこと）。全体のチップは、カバースリップ上に配置される。
【０１８６】
（Ｂ．実験設定）
微小流体デバイス１５００を、実施例１に記載される３つの温度プロフィールを使用して、ロードし、そして熱サイクルした。残りの反応サンプルを、流体微小デバイス１５００についてと同じ熱サイクルで、ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００中で熱サイクルした。熱サイクルが完了した後、反応産物を回収した。増幅したＤＮＡの回収のために、３μｌの水を、サンプル入口１５０６へと注入し、そして３〜４μｌの産物を、出口１５１２から取り除いた。デバイス１５００からの反応産物およびＭａｃｒｏ反応物を、２μｌのＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）（これは、ＤＮＡエクソヌクレアーゼＩおよびＳｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅからなる）で処理し、過剰のヌクレオチドおよびプライマーを除去した。Ｍａｃｒｏ産物を、１：１０〜１：１０６まで希釈した。このデバイス１５００からの産物を、脱水し、そして４μｌのホルムアミドに再懸濁した。
【０１８７】
（ＩＩＩ．結果）
ネガティブコントロールと共に両方の産物を、ポリアクリルアミドゲルで分析した。図１５は、ゲル電気泳動の結果を示す。２９４塩基対長の適切なサイズのＤＮＡバンドが、図１６において観察される。
【０１８８】
Ｍａｃｒｏ反応からの産物をゲルの左側に示し、そしてこれは、約２９４塩基対（β−アクチンＰＣＲ産物の予測されたサイズ）に対応する。ネガティブコントロールは、ＰＣＲ産物を欠損する。同様に、デバイス由来の産物は、予測されたβーアクチンＰＣＲ産物を与えた。従って、標的ＤＮＡは、微小流体デバイス中で増幅された。
【０１８９】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみであり、それを考慮した種々の改変または変更が、当業者に示唆され、そして本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中に引用される全ての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物、特許または特許出願の各々が、そのように参考として援用されることが特にかつ独立して意図されるのと、同じ程度まで全ての目的のためにその内容が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１Ａ】図１Ａは、交差する垂直フローチャネルおよび水平フローチャネルのマトリックス設計を有する例示的なデバイスの模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂ〜１Ｅは、図１Ａに示されるデバイスの一部の拡大図を示し、その操作を示す。
【図１Ｃ】図１Ｂ〜１Ｅは、図１Ａに示されるデバイスの一部の拡大図を示し、その操作を示す。
【図１Ｄ】図１Ｂ〜１Ｅは、図１Ａに示されるデバイスの一部の拡大図を示し、その操作を示す。
【図１Ｅ】図１Ｂ〜１Ｅは、図１Ａに示されるデバイスの一部の拡大図を示し、その操作を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、サンプル蒸発を低減するためのガードチャネルを利用する、別の例示的なマトリックス設計のデバイスの概略図である。
【図２】図２は、例示的なブラインドチャネルデバイスの平面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、別の例示的なブラインドチャネルデバイスの平面図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに示される全体的な設計単位に基づいたより複雑なブラインドチャネルデバイスの概略図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、図３Ｂに示されるデバイスの領域の拡大図であり、この特定の設計におけるガードフローチャネルの方向を示す。
【図４】図４は、ハイブリッド設計を利用するデバイスの平面図である。
【図５】図５は、熱サイクル反応を行うための急上昇（ｒａｍｐ  ｕｐ）および急降下（ｒａｍｐ  ｄｏｗｎ）の時間を示すチャートである。
【図６】図６は、ブラインドチャネル型デバイスにおける反応部位内にスポッティングされた試薬の位置を示し、デバイスの角における反応部位内の試薬の適切なアラインメントを図示する。
【図７Ａ】図７Ａは、別のハイブリッド型微小流体デバイスの断面図および概略図であり、実施例１〜４に記載される実験を実施するために使用される型のデバイスを表す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、別のハイブリッド型微小流体デバイスの模式図であり、実施例１〜４に記載される実験を実施するために使用される型のデバイスを表す。
【図８】図８は、６つの異なるβ−アクチンＴａｑＭａｎ反応について、平均ＦＡＭ／ＰＲ１／コントロール比をプロットした棒グラフである。反応を、図７Ｂで示される微小流体デバイス（チップ）（ベタの棒）およびＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応（斜線の棒）において熱サイクルした。コントロールは、第１の棒セットと第４の棒セットであり、これらはＤＮＡを有さない。誤差棒は、比の標準偏差である。
【図９】図９は、例示的なピンスポッティングプロセスを示す図である。試薬を、供給源（例えば、マイクロタイタープレート）からピックアップし、次いでこの負荷したピンを基材に接触させることによりプリントする。洗浄工程は、脱イオン水中での攪拌、次いで真空乾燥からなる。
【図１０】図１０は、実施例２に記載される実験に基づいた、実施例１に記載される微小流体デバイス（チップ）（図７Ｂを参照のこと）についてのＦＡＭシグナル強度を示す棒グラフである。データは、参照レーンについてＦＡＭ／ＰＲ１比により拡大された（ＦＡＭシグナル／ＰＲ１シグナル）の形態である。誤差棒は、レーンに沿った標準偏差である。「１．３×」および「１×」の表示は、その正規化値に対する、スポッティングされたプライマーおよびプローブの濃度を指す。
【図１１】図１１は、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ（斜線の棒）、および微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応（ベタの棒）についての９〜１０ウェルの平均ＶＩＣ／ＰＦ１／コントロール比を示す棒グラフである。２つのネガティブコントロール（コントロール）および１００ｐｇ／ｎｌのゲノムＤＮＡを含む２つのサンプルを、４×標準量のプライマー／プローブと共に上記のような反応成分を用いて熱サイクルした。誤差棒は、平均比の標準偏差を示す。
【図１２】図１２は、微小流体デバイス（図７Ｂを参照のこと）の単一フローチャネルから分岐する１０〜１ｎｌのウェルの各々についてのＦＡＭ／ＰＲ１／コントロール比を示す棒グラフである。ゲノムＤＮＡの量は、０．２５ｐｇ／ｎｌであった。これは、ウェルあたり１標的コピーという平均を生じる。
【図１３】図１３は、図７Ｂにおいて示される微小流体デバイスを使用する、ＣＹＰ２Ｄ６  ＳＮＰ反応についての平均ＶＩＣ／ＰＲ１／コントロール比を示す棒グラフである。対立遺伝子１（Ａｌ−１）は、参照または野生型の対立遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６＊１に対するＶＩＣプローブについてのポジティブコントロールである。対立遺伝子２（Ａｌ−２）は、改変体または変異対立遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６＊３に対するＦＡＭプローブについてのポジティブコントロールである。このコントロールは、ＤＮＡテンプレートを有さない。ゲノムＤＮＡを、１００ｐｇ／ｎｌまたは２０ｐｇ／ｎｌのいずれかで使用した。誤差棒は、比の標準偏差である。
【図１４】図１４は、図７Ｂに示される微小流体デバイスにおけるＣＹＰ２Ｄ６  ＳＮＰ反応についての平均ＦＡＭ／ＰＲ１／コントロール比を示す房グラフである。サンプルは、図１３および実施例３に関して記載されるサンプルと同じである。
【図１５】図１５は、実施例４における実験に使用される微小流体デバイスの概略図である。
【図１６】図１６は、Ｍａｃｒｏ  ＰＣＲおよび図７Ｂに示される微小流体デバイスにおけるＰＣＲ反応由来のＰＣＲ産物を含有するポリアクリルアミドゲルである。左側の結果は、異なるＤＮＡ塩基対長のおよその移動を示す。散在したバンドを含むレーンは、分子量マーカーである。「Ｍａｃｒｏ」と標識されたレーンは、異なる希釈でのＭａｃｒｏ反応由来のＰＣＲ産物である。「Ｉｎ  ｃｈｉｐ」と標識されたレーンは、チップ中で生成されたＰＣＲ産物である。ゲル全体にわたって多くのバンドを含むレーンは、非特異的バックグラウンドシグナルである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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