(57)【要約】本発明は、HPV感染症（例えば、皮膚及び粘膜上皮細胞のHPV感染症）及びHPV関連状態（例えば、子宮頚部形成異常、HPV関連子宮頚癌、口部粘膜乳頭腫癌、喉頭乳頭腫癌）を治療することに関連する方法及び材料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HPV複製に関連する発現を阻害する核酸分子の有効量を、治療を必要とする患者に投与する段階を含む、HPV感染症を治療する方法。
【請求項２】
HPVが、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV52、又はHPV58である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
核酸分子がHPVの核酸配列に相補的である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
核酸分子を局所投与する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
核酸分子を患者の生殖器の一部分に局所投与する、請求項4記載の方法。
【請求項６】
核酸分子を患者の子宮頚部組織に局所投与する、請求項4記載の方法。
【請求項７】
核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド又はsiRNA分子である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
核酸分子がリボザイム又はDNAザイムである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
核酸分子を、核酸分子の浸透を増強するのに有効な量で存在する角質溶解剤と一緒に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
角質溶解剤がサリチル酸又は1つ以上のαヒドロキシ酸である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
患者が子宮頚部上皮内異形成症（CIN）に罹患している、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
CINが、CIN I又は軽度の異形成症である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
CINが、CIN II又は中程度〜顕著な異形成症である、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
CINが、CIN III又は重篤な異形成症〜上皮内癌である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
上皮内癌が上皮内組織又は頚部の表面層に位置している、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子をライブラリー選択技術を用いて同定する、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
ライブラリー選択技術がアンチセンスオリゴヌクレオチドライブラリー選択技術である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
ライブラリー選択技術がリボザイムライブラリー選択技術である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
ライブラリー選択技術がDNAザイムライブラリー選択技術である、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
HPV感染細胞の数が減少する条件下で、HPVのヌクレオチド配列に相補的な配列を含む核酸分子を哺乳動物に投与する段階を含む、HPV感染細胞を有する哺乳動物を治療する方法。
【請求項２１】
哺乳動物が非ヒト免疫不全哺乳動物であり、細胞がヒト細胞である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物がヌードマウス又はSCIDマウスである、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物がヒトである、請求項20記載の方法。
【請求項２４】
細胞が皮膚細胞又は上皮細胞である、請求項20記載の方法。
【請求項２５】
HPVが、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV52、又はHPV58である、請求項20記載の方法。
【請求項２６】
核酸分子を哺乳動物に局所投与する、請求項20記載の方法。
【請求項２７】
核酸分子を哺乳動物の生殖器の一部分に局所投与する、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
核酸分子を哺乳動物の子宮頚部組織に局所投与する、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド又はsiRNA分子である、請求項20記載の方法。
【請求項３０】
核酸分子がリボザイム又はDNAザイムである、請求項20記載の方法。
【請求項３１】
HPV感染細胞の数が少なくとも25パーセント減少する、請求項20記載の方法。
【請求項３２】
HPV感染細胞の数が少なくとも50パーセント減少する、請求項20記載の方法。
【請求項３３】
HPV感染細胞の数が少なくとも75パーセント減少する、請求項20記載の方法。
【請求項３４】
ヌクレオチド配列が、ライブラリー選択技術を用いて同定される標的部位を含む、請求項20記載の方法。
【請求項３５】
ライブラリー選択技術がアンチセンスオリゴヌクレオチドライブラリー選択技術である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
ライブラリー選択技術がリボザイムライブラリー選択技術である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
ライブラリー選択技術がDNAザイムライブラリー選択技術である、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
HPV感染細胞が非組み込みHPV核酸を含有する、請求項20記載の方法。
【請求項３９】
HPV感染細胞が複製HPVを含有する、請求項20記載の方法。
【請求項４０】
触媒性コア配列、5'認識配列、及び3'認識配列を含み、かつ、配列番号：4〜48に示される配列からなる群より選択される標的mRNA配列を切断する、単離された触媒性核酸。
【請求項４１】
リボザイムである、請求項40記載の単離された触媒性核酸。
【請求項４２】
触媒性コア配列が、配列番号：51に示される配列を含む、請求項41記載の単離された触媒性核酸。
【請求項４３】
DNAザイムである、請求項40記載の単離された触媒性核酸。
【請求項４４】
触媒性コア配列が、配列番号：68に示される配列を含む、請求項43記載の単離された触媒性核酸。
【請求項４５】
5個〜40個のヌクレオチドを含有し、かつ、配列番号：4〜48からなる群より選択される配列のうちの少なくとも5個連続したヌクレオチドに相補的な配列を含む、単離された一本鎖核酸分子。
【請求項４６】
DNAである、請求項45記載の核酸分子。
【請求項４７】
RNA分子の一方の鎖が、配列番号：4〜48からなる群より選択される配列のうちの少なくとも5個連続したヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む、単離された二本鎖RNA分子。
【請求項４８】
RNA分子が5個〜40個のヌクレオチドからなる、請求項47記載のRNA分子。
【請求項４９】
RNA分子が18個〜25個のヌクレオチドからなる、請求項47記載のRNA分子。
【請求項５０】
以下の段階を含む、一本鎖DNAザイムのライブラリーを作成するための方法：
（a）増幅反応が、鋳型核酸と、少なくとも1つのリボースヌクレオチドを含むプライマーとを含み、該鋳型核酸の一方の鎖が、一本鎖DNAザイムのライブラリーを含み、かつ増幅反応生成物が、該少なくとも1つのリボースヌクレオチドを含む鎖との二本鎖核酸を含む、増幅反応で核酸を増幅して増幅反応生成物を形成する段階、
（b）該少なくとも1つのリボースヌクレオチドを含む鎖が該二本鎖核酸のもう一方の鎖より短くなる条件下で、該増幅反応生成物を塩基加水分解剤と接触させる段階、及び
（c）該一本鎖DNAザイムのライブラリーを含む段階（b）より、サイズに基づいて鎖を得る段階。
【請求項５１】
増幅反応が、リボースヌクレオチドを欠いたプライマーをさらに含む、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
増幅反応が、少なくとも1つのリボースヌクレオチドを含む2つのプライマーを含む、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
段階（b）の二本鎖核酸の短い方の鎖が、一本鎖DNAザイムのライブラリーを含む、請求項50記載の方法。
【請求項５４】
段階（b）の二本鎖核酸の長い方の鎖が、一本鎖DNAザイムのライブラリーを含む、請求項50記載の方法。
【請求項５５】
塩基加水分解剤が水酸化ナトリウムである、請求項50記載の方法。
【請求項５６】
HPV中に存在する核酸配列に相補的な配列を含む核酸分子と、該核酸分子の浸透を増強するのに有効な量で存在する角質溶解剤とを含む、組成物。
【請求項５７】
核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド又はsiRNA分子である、請求項56記載の組成物。
【請求項５８】
核酸分子がリボザイム又はDNAザイムである、請求項56記載の組成物。
【請求項５９】
角質溶解剤がサリチル酸である、請求項56記載の組成物。
【請求項６０】
Nがヌクレオチドであり、かつn1、n2、及びn3が0より大きい整数である、(N)n1、続いて(酸素-炭素-炭素)n2、続いて(N)n3を含む核酸分子。
【請求項６１】
n1が10〜20である、請求項60記載の核酸分子。
【請求項６２】
n2が3〜10である、請求項60記載の核酸分子。
【請求項６３】
n3が10〜20である、請求項60記載の核酸分子。
【請求項６４】
(N)n1が、17個連続したアデノシンのDNA配列である、請求項60記載の核酸分子。
【請求項６５】
(N)n3が、配列
2005537028.tif 000037
である、請求項60記載の核酸分子。
【請求項６６】
核酸分子が、(酸素-炭素-炭素)n2と(N)n3との間にリン酸基を含む、請求項60記載の核酸分子。
【請求項６７】
以下の段階を含む、一本鎖DNAザイムのライブラリーを作成するための方法：
（a）増幅反応が、鋳型核酸と、nが1より大きい整数である(酸素-炭素-炭素)n骨格単位を含むプライマーとを含み、該鋳型核酸の一方の鎖が、一本鎖DNAザイムのライブラリーを含み、かつ増幅反応生成物が、該プライマーから伸長している鎖の方が二本鎖核酸のもう一方の鎖より短い二本鎖核酸を含む、増幅反応で核酸を増幅して増幅反応生成物を形成する段階、及び
（b）該一本鎖DNAザイムのライブラリーを含む段階（a）より、サイズに基づいて鎖を得る段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2002年6月26日に出願された米国仮特許出願第60/391,795号、2002年10月14日に出願された米国仮特許出願第60/417,997号、及び2003年2月21日に出願された米国仮特許出願第60/449,066号の恩典を主張する。
【０００２】
連邦政府が後援する研究に関する陳述
本明細書中に記載された研究の資金は、本発明に一定の権利を有しうる連邦政府により提供されたものである。
【０００３】
背景
1．技術分野
本発明は、ヒト乳頭腫ウイルス感染症及びヒト乳頭腫ウイルス関連症状の治療に関与する方法及び材料に関する。
【背景技術】
【０００４】
2．背景情報
乳頭腫ビリネア（papillomavirinea）ウイルス科の属であるヒト乳頭腫ウイルス（HPV）はヒト病原体として認められている。種々の型のHPVは皮膚及び粘膜上皮細胞に対し向性であり、結果としてそれらは乳頭腫（尋常性いぼ、生殖器いぼ、及び足底のいぼを含む）及び子宮頚癌（cervical carcinomas）（zur Hausen, Curr. Top. Microbiol Immunol, 186: 131-56（1994））の進行に関与している。16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、52型、及び58型はほぼ100パーセント子宮頚癌に関与し（Walboomersら、J. Pathol., 189: 12-9（1999））、16型及び18型は「ハイリスク」型を構成する。
【発明の開示】
【０００５】
概要
本発明は、HPV感染症（例えば、皮膚及び粘膜上皮細胞のHPV感染症）及びHPV関連症状（例えば、子宮頚部形成異常（子宮頚部上皮内癌とも呼ばれる）、HPV関連子宮頚癌、口部粘膜乳頭腫癌、及び喉頭乳頭腫癌）を治療することに関連する方法及び材料を提供する。例えば、本発明は、（1）HPV感染細胞を有する哺乳動物を治療するための方法、（2）HPV配列（例えば、RNA）に相補的な配列を有するアンチセンス分子、小さな干渉RNA（siRNA）分子、DNAザイム（Dz）、及びリボザイム（Rz）（3）HPV配列に相補的な配列を有するアンチセンス分子、siRNA分子、Dz、及びRzを作成するための方法、（4）一本鎖Dzのライブラリーを得るための方法、（5）HPV標的配列を同定するための方法、（6）HPV感染症及びHPV関連症状を治療するための方法、ならびに（7）アンチセンス分子、siRNA分子、Dz、及びRzをHPV感染細胞に送達するための方法及び材料を提供する。
【０００６】
本発明は、一つには、アンチセンス分子、siRNA分子、Dz及びRzなどの核酸分子をうまく用いて哺乳動物におけるHPV感染細胞の数を減らすことができるとの発見に基づく。例えば、HPV E6/E7 RNAと相互作用するように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）及びDzを用いて、哺乳動物内のHPV感染細胞の数を減らすことができる。HPV感染細胞は、非組み込み（non-integrated）HPV核酸細胞を含有する細胞であってもよく、HPV複製を示しうる。本明細書中に記載するように、核酸分子をうまく用いて哺乳動物におけるHPV感染細胞の数を減らすことができた。例えば、ライブラリー選択プロトコルを開発し、それを生殖器いぼの原因に関係するHPV型であるHPV11由来のE6/E7標的RNA中のアクセス可能な部位を同定するのに用いた。ASO、Rz、及びDzは同定部位に相補的な配列を含有するように設計された。さらに、ASO、Rz及びDzを細胞培養中で試験した。さらに、ASO及びDzを局所的に用いて、免疫不全マウスに移植されたHPV11感染ヒト包皮を治療した。ASO及びDzの局所投与により、HPV感染症の進行が低下した。さらに、2つの異なるライブラリー選択プロトコルで同定された部位を標的とするASOは、最大の効力を示した。例えば、ライブラリー選択部位（例えば、ヌクレオチド407位）の1つを取り囲む領域を標的とするアンチセンス分子は、免疫不全マウス上のヒト包皮移植片中でHPV11により誘導される乳頭腫の発達を阻止するのに非常に効果的であることが証明された。本明細書中に提供される結果により、分子治療（例えば、アンチセンス分子、siRNA分子、Rz及びDz）を用いて、インビボにおける真正のHPV感染症を治療できることが実証される。
【０００７】
一般に、本発明は、HPV複製に関連する発現を阻害する核酸分子の有効量を、治療を必要とする患者に投与する段階を含む、HPV感染症を治療する方法であることを特徴とする。阻害は、任意のレベル（例えば、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95パーセント、又はそれ以上の阻害）でありうる。HPVは、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV52、又はHPV58でありうる。核酸分子はHPVの核酸配列に相補的でありうる。核酸分子を局所投与することができる。核酸分子を患者の生殖器の一部分に局所投与することができる。核酸分子を患者の子宮頚部組織に局所投与することができる。核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はsiRNA分子でありうる。核酸分子はリボザイム又はDNAザイムでありうる。核酸分子を、核酸分子の浸透を増強するのに有効な量で存在することができる角質溶解剤と一緒に投与することができる。角質溶解剤はサリチル酸又は1つ以上のアルファヒドロキシ酸でありうる。患者は子宮頚部上皮内異形成症（CIN）に罹患していてもよい。CINは、CIN I又は軽度の異形成症であってもよい。CINは、CIN II又は中程度〜顕著な異形成症であってもよい。CINは、CIN IIIであるか、重篤な異形成症〜上皮内癌であってもよい。上皮内癌は上皮内組織又は頚部の表面層に位置していてもよい。核酸分子をライブラリー選択技術を用いて同定することができる。ライブラリー選択技術はアンチセンスオリゴヌクレオチドライブラリー選択技術、リボザイムライブラリー選択技術、又はDNAザイムライブラリー選択技術でありうる。
【０００８】
別の実施態様において、本発明は、HPV感染細胞を有する哺乳動物を治療するための方法を特徴とする。方法は、HPV感染細胞の数が減少する条件下で、HPVのヌクレオチド配列に相補的な配列を含有する核酸分子を、哺乳動物に投与する段階を含む。哺乳動物は非ヒト免疫不全哺乳動物であってもよく、細胞はヒト細胞であってもよい。哺乳動物はヌードマウス又はSCIDマウスであってもよい。哺乳動物はヒトであってもよい。細胞は皮膚細胞又は上皮細胞でありうる。HPVは、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV52、又はHPV58でありうる。核酸分子を哺乳動物に局所投与することができる。核酸分子を哺乳動物の生殖器の一部分に局所投与することができる。核酸分子を哺乳動物の子宮頚部組織に局所投与することができる。核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はsiRNA分子でありうる。核酸分子はリボザイム又はDNAザイムでありうる。HPV感染細胞の数は少なくとも25パーセント、少なくとも50パーセント、又は少なくとも75パーセント減少させることができる。ヌクレオチド配列はライブラリー選択技術を用いて同定される標的部位を含有しうる。ライブラリー選択技術はアンチセンスオリゴヌクレオチドライブラリー選択技術、リボザイムライブラリー選択技術、又はDNAザイムライブラリー選択技術でありうる。HPV感染細胞は非組み込みHPV核酸を含有していてもよい。HPV感染細胞は複製HPVを含有していてもよい。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は、触媒性コア配列、5'認識配列、及び3'認識配列を含有し、かつ、配列番号：4〜48に示される配列からなる群より選択される標的mRNA配列を切断する、単離された触媒性核酸を特徴とする。単離された触媒性核酸はリボザイムでありうる。触媒性コア配列は配列番号：51に示された配列を含有しうる。単離された触媒性核酸はDNAザイムでありうる。触媒性コア配列は配列番号：68に示される配列を含有しうる。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、5個〜40個のヌクレオチドを含有し、かつ、配列番号：4〜48からなる群より選択される配列のうちの少なくとも5個連続したヌクレオチドに相補的な配列を含有する、単離された一本鎖核酸分子を特徴とする。核酸分子はDNAでありうる。
【００１１】
本発明の別の実施態様は、単離された二本鎖RNA分子であって、RNA分子の一方の鎖が配列番号：4〜48からなる群より選択される配列のうちの少なくとも5個連続したヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む、単離された二本鎖RNA分子を特徴とする。RNA分子は5個〜40個のヌクレオチドからなりうる。RNA分子は18個〜25個のヌクレオチドからなりうる。
【００１２】
本発明の別の実施態様は、一本鎖DNAザイムのライブラリーの作成方法を特徴とする。方法は、（a）増幅反応で核酸を増幅して増幅反応生成物を形成する段階、ここで、増幅反応は、鋳型核酸と、少なくとも1つのリボースヌクレオチドを含むプライマーとを含み、鋳型核酸の一方の鎖は、一本鎖DNAザイムのライブラリーを含み、かつ増幅反応生成物は、少なくとも1つのリボースヌクレオチドの鎖を含む鎖との二本鎖核酸を含有する、（b）少なくとも1つのリボースヌクレオチドを含む鎖が二本鎖核酸の他方の鎖より短くなる条件下で、増幅反応生成物を塩基加水分解剤と接触させる段階、及び（c）一本鎖DNAザイムのライブラリーを含む段階（b）より、サイズに基づいて鎖を得る段階、を含む。増幅反応はリボースヌクレオチドを欠いたプライマーをさらに含んでいてもよい。増幅反応は少なくとも1つのリボースヌクレオチドを含む2つのプライマーを含有しうる。段階（b）の二本鎖核酸の短い方の鎖は一本鎖DNAザイムのライブラリーを含有することができる。段階（b）の二本鎖核酸の長い方の鎖は一本鎖DNAザイムのライブラリーを含有することができる。塩基加水分解剤は水酸化ナトリウムでありうる。
【００１３】
本発明の別の実施態様は、核酸分子及び角質溶解剤を含有し、核酸分子がHPV中に存在する核酸配列に相補的な配列を含有し、かつ、角質溶解剤が核酸分子の浸透を増強するのに有効な量で存在する、組成物を特徴とする。核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はsiRNA分子でありうる。核酸分子はリボザイム又はDNAザイムでありうる。角質溶解剤はサリチル酸でありうる。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、(N)n1、続いて(酸素-炭素-炭素)n2、続いて(N)n3を含みNがヌクレオチドであり、かつ、n1、n2、及びn3が0より大きい整数である、核酸分子を特徴とする。n1は10〜20でありうる。n2は3〜10でありうる。n3は10〜20でありうる。(N)n1は17個連続したアデノシンのDNA配列でありうる。(N)n3は配列
2005537028.tif 000002
でありうる。核酸分子は(酸素-炭素-炭素)n2と(N)n3との間にリン酸基を含有しうる。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、一本鎖DNAザイムのライブラリーの作成方法を特徴とする。方法は、（a）増幅反応で核酸を増幅して増幅反応生成物を形成する段階、ここで、増幅反応は、鋳型核酸と、nが1より大きい整数である(酸素-炭素-炭素)n骨格単位を含むプライマーとを含み、鋳型核酸の一方の鎖は、一本鎖DNAザイムのライブラリーを含み、かつ増幅反応生成物は、プライマーから伸長している鎖の方が二本鎖核酸のもう一方の鎖より短い二本鎖核酸を含む、及び（b）一本鎖DNAザイムのライブラリーを含む段階（a）より、サイズに基づいて鎖を得る段階を含む。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、細胞をHPV RNAに対して配列特異性を有するアンチセンス分子、siRNA分子、Dz、又はRzと接触させる段階を含む、細胞中のHPV複製を減少させる方法を特徴とする。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）でのHPVの進行を阻害する方法を特徴とする。方法は、（a）ライブラリー選択技術により、アンチセンスオリゴヌクレオチド、DNAザイム、又はリボザイムにアクセス可能であるHPV RNA上の1つ以上の標的部位を同定する段階、（b）段階（a）で同定された標的部位の1つ又は全ての全体又は一部分に少なくとも部分的に相補的である1つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA分子、DNAザイム、又はリボザイムを設計する段階、及び（c）哺乳動物を段階（b）で設計された1つ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA分子、DNAザイム、又はリボザイムと接触させ、その結果、哺乳動物でのHPVの進行を阻害する段階、を含む。
【００１８】
他に定義しない限り、本明細書中で用いるすべての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様の又は等しい方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書中に言及するすべての公開物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照として全体が組み入れられる。相反の場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び具体例は単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
【００１９】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【００２０】
詳細な説明
本発明は、HPV感染症及びHPV関連症状を治療することに関する方法及び材料を提供する。例えば、本発明は、HPV感染細胞（例えば、ヒト細胞）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）を治療する方法を提供する。細胞は、皮膚細胞又は上皮細胞などの任意の種類の細胞であってもよい。さらに、HPV感染細胞は、哺乳動物内のいずれの場所に位置していてもよい。例えば、HPV感染細胞は、哺乳動物の生殖器に位置していてもよい。ある場合には、HPV感染細胞は、生殖器いぼ又は子宮頚部形成異常の一部を形成しうる。HPV感染細胞は、組み込まれた又は非組み込みHPV核酸を含有しうる。例えば、HPV感染細胞は、細胞のゲノム中に組み込まれたHPV核酸配列を含有することができる。ある場合には、HPV感染細胞は、ゲノム中でHPV核酸配列を欠いていてもよい。これらの場合において、HPV核酸配列は、細胞内でエピソーマルに（episomally）維持することができる。HPV感染細胞は、HPV複製を示しうる。例えば、HPV感染細胞はHPV粒子を生成することができる。
【００２１】
任意の種類のHPV感染細胞を有する哺乳動物を、本明細書中に記載されるようにして治療することができる。例えば、HPVの11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、52型、又は58型が感染した細胞を有するヒトを治療することができる。さらに、異なるHPV型の組み合わせに感染した細胞を有する哺乳動物を、本明細書中に記載されるようにして治療することができる。例えば、HPV16及びHPVI8の双方が感染した細胞を有するヒトを治療することができる。
【００２２】
本明細書中に記載されているように、HPV感染細胞を有する哺乳動物を核酸分子を用いて治療することができる。本明細書中で用いられる「核酸」という用語は、cDNA、ゲノムDNA、及び合成（例えば、化学的に合成された）DNAを含むRNA及びDNAの双方を包含する。核酸は二本鎖又は一本鎖であってもよい。さらに、核酸は、円状又は直線状であってもよい。ある実施態様において、核酸はプラスミドでありうる。核酸は1つ以上の制限部位を含有しうる。
【００２３】
典型的には、HPV感染細胞を有する哺乳動物を、HPVの核酸配列に相補的な配列を含有する核酸分子を用いて治療する。例えば、アンチセンス分子、RNA干渉を誘導するRNA分子（例えば、二本鎖RNA分子、ヘアピンループRNA分子、siRNA分子、又はこのような分子を発現するように設計された構築物）、Rz、又はDzを、HPV配列に相補的な配列を有するように設計することができる。このような核酸分子は、非コードHPV核酸配列（例えば、ポリ（A）シグナル配列及び上流調節領域などの調節配列）及びHPVポリペプチドコード核酸配列（例えば、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、LI、及びL2ポリペプチドコード配列）を含むが、これらに限定されない任意のHPV配列に相補的でありうる。ある場合には、核酸分子は、アクセス可能なHPV RNA標的部位に基づいて設計される。そのような標的部位は、本明細書中に記載されるライブラリー選択方法（例えば、LS1、LS2、及びLS3）などの任意の方法を用いて同定することができる。さらに、HPV配列に相補的な配列を有する、アンチセンス分子、RNA干渉を誘導するRNA分子（例えば、二本鎖RNA分子、ヘアピンループRNA分子、siRNA分子、又はこのような分子を発現するように設計された構築物）、Rz、又はDzなどの核酸分子を作成するために任意の方法を用いることができる。例えば、国際特許出願第PCT/US01/46178号及び米国仮特許出願第60/449,066号に記載される方法及び材料を用いることができる。
【００２４】
2つの核酸配列（例えば、Rz又はDz認識配列及びHPV mRNA標的配列；又はアンチセンスオリゴヌクレオチド配列及びHPV mRNA標的配列）に関して本明細書中で用いられる「相補的な」という用語は、2つの核酸配列が100パーセント相補的であることを意味する。相補的な配列は、相補的でない配列を有するより大きな核酸分子の一部であってもよい。相補的な配列の長さは、3ヌクレオチドよりも大きい任意の長さでありうる（例えば、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30ヌクレオチド、又はそれ以上のヌクレオチド）。例えば、60ヌクレオチドDzは、HPV mRNA配列に相補的な10ヌクレオチド配列を有することができる。典型的には、相補的な配列は、約4ヌクレオチド長〜約20ヌクレオチド長（例えば、約5ヌクレオチド長〜約18ヌクレオチド長、又は約6ヌクレオチド長〜約15ヌクレオチド長）の範囲である。
【００２５】
核酸分子をHPV感染細胞を含有する哺乳動物に投与するために任意の方法を用いることができる。例えば、投与は、局所的（例えば、経皮、眼、又は鼻腔内）；肺（例えば、散剤又はエアロゾル剤の吸入又は吹送（insufflation）による）；経口的；又は非経口的（例えば、皮下、鞘内、脳室内、筋肉内、又は腹腔内注射により、あるいは静脈内点滴による）でありうる。投与は、短時間で実施してもよく（例えば、注射による）、あるいは長期にわたって実施してもよい（例えば、緩徐な注入又は徐放製剤の投与による）。
【００２６】
典型的には、HPV感染細胞を有する哺乳動物を治療する場合は、核酸分子を局所投与する。例えば、リポソームで又はリポソームなしで製剤化した核酸分子を、HPV+前癌性子宮頚部形成異常組織又は生殖器いぼなどのHPV病変に直接、局所的に適用することができる。局所投与用に、無菌及び非無菌水溶液、アルコール類などの汎用溶媒中の非水溶液、又は液体又は固体油塩基中の溶液などの組成物中に核酸分子を製剤化することができる。このような溶液は、緩衝剤、希釈剤、及びその他の好適な添加剤を含有することができる。局所投与用の組成物は、経皮貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤、及び散剤の形態で製剤化することができる。被覆したコンドームや手袋などを用いることもできる。慣用的な医用担体、水性、粉末又は油性の塩基、及び増粘剤などを添加することができる。
【００２７】
経口投与用に、散剤もしくは果粒剤、懸濁剤、又は水もしくは非水性媒体中の溶剤、カプセル剤、香粉剤（sachets）、又は錠剤などの組成物中に核酸分子を製剤化することができる。このような組成物には、増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、又は結合剤を取り入れることもできる。
【００２８】
非経口、鞘内、又は脳室内投与用に、緩衝剤、希釈剤、及びその他の好適な添加剤（例えば、透過促進剤、担体化合物、及びその他の薬学的に許容される担体）を含有しうる無菌水溶液などの組成物中に核酸分子を製剤化することができる。
【００２９】
さらに、例えば米国特許第6,271,359号に記載される生物学的又は非生物学的な手段を用いて、HPV感染細胞を含有する哺乳動物に核酸分子を投与することができる。非生物学的な送達は、（1）リポソームを本明細書中に提供される核酸分子で充填すること、及び（2）核酸分子を脂質又はリポソームと複合させて核酸-脂質又は核酸-リポソーム複合体を形成することを含むが、これらに限定されない種々の方法により達成することができる。リポソームは、インビトロで細胞をトランスフェクトするのによく用いられるカチオン性及び中性脂質からなりうる。カチオン性脂質は、負に荷電した核酸と複合体を形成し（例えば、電荷により結合させる）、リポソームを形成することができる。カチオン性リポソームの具体例には、リポフェクチン、リポフェクトアミン、リポフェクテース（lipofectace）、及びDOTAPが含まれるが、これらに限定されない。リポソームを形成するための手順は当技術分野で周知である。リポソーム組成物を、例えば、ホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミンから形成することができる。Lipofectin(登録商標)（Invitrogen/Life Technologies、カールズバッド、カリフォルニア州）及びEffectene(商標)（Qiagen、バレンシア、カリフォルニア州）を含む多数の親油性剤が市販されている。さらに、全身送達方法は、各々がDOPE又はコレステロールなどの中性脂質と混合することができるDDAB又はDOTAPなどの市販のカチオン性脂質を用いて最適化することができる。ある場合には、Templetonら（Nature Biotechnology, 15: 647-652（1997））により記載されたリポソームなどのリポソームを用いることができる。その他の実施態様において、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンを用いて、インビボ及びエキソビボでの送達を達成することができる（Bolettaら、J. Am Soc. Nephrol. 7:1728（1996））。核酸を送達するためのリポソームの使用に関するさらなる情報は、米国特許第6,271,359号に見出すことができる。
【００３０】
生物学的送達は、ウイルスベクターの使用を含むがこれらに限定されない種々の方法により達成することができる。例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス及びヘルペスウイルスベクター）を用いて、皮膚細胞及び頚部細胞に核酸分子を送達することができる。標準の分子生物学的技術を用いて、本明細書中に提供される1つ以上の核酸分子を、核酸を細胞に送達するために従前に開発された多くの異なるウイルスベクターの1つに導入することができる。これらの得られたウイルスベクターを用いて、例えば感染により1つ以上の核酸分子を細胞に送達することができる。
【００３１】
HPV配列に相補的な配列を有する核酸分子を、薬学的に許容される担体又は希釈剤中で製剤化することができる。「薬学的に許容される担体」（本明細書中では「賦形剤（excipient）」とも称する）は、薬学的に許容される溶剤、懸濁剤、又はその他の任意の薬理学的に不活性な媒質である。薬学的に許容される担体は、液体又は固体であることができ、所望のかさ、粘度、及びその他の妥当な輸送及び化学特性を付与するように、意図する投与の計画形式によって選択することができる。典型的な薬学的に許容される担体には、水、生理食塩水、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース及びその他の糖類、ゼラチン、又は硫酸カルシウム）；滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、又は酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；及び湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が含まれるが、例示であって限定されるものではない。
【００３２】
さらに、HPV配列に相補的な配列を有する核酸分子を、その他の分子、分子構造物、又は核酸の混合物と混合、カプセル化、結合させてもよく、又は関連する核酸分子を含有する組成物中に製剤化してもよい。例えば、HPV配列に相補的な配列を有する1つ以上の核酸分子を含有する組成物は、抗炎症薬剤（例えば、非ステロイド性抗炎症薬剤及びコルチコステロイド）及び抗ウイルス薬剤（例えば、リビビリン（ribivirin）、ビダラビン、アシクロビル、及びガンシクロビル）などの他の治療剤を含有することができる。ある実施態様において、組成物は、HPV配列に相補的な配列を有する1つ以上の核酸分子を角質溶解剤と組み合わせて含有することができる。角質溶解剤は、表皮の角質層を分離又は弛緩させる剤である。角質溶解剤の具体例にはサリチル酸が含まれるが、これらに限定されない。その他の具体例は、米国特許第5,543,417号に提供されている。例えば皮膚などの組織への核酸分子の浸透を増強するのに有効な量で角質溶解剤を用いることができる。例えば、生殖器いぼに適用された核酸分子をいぼに浸透させる量で角質溶解剤を用いることができる。
【００３３】
さらに、核酸分子を、哺乳動物の年齢、体重、及び症状、特定のHPV感染症の性質及びその重篤度、哺乳動物の全体的な状態、並びに送達される特定化合物に依存して変動する量及び期間で投与することができる。典型的には、HPVポリペプチド（例えば、E6又はE7ポリペプチド）の発現を阻害する量などの阻害量で核酸分子を投与することができる。阻害は、任意のレベルの阻害でありうる。例えば、HPVポリペプチド発現を、5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95パーセント、又はそれ以上阻害することができる。ある場合には、該阻害により、検出可能なHPVポリペプチドの発現を消失させることができる。投薬は、例えば数日間から数ヶ月続く治療経過を伴ってあるいは治療が行われるか疾患状態の縮小が達成されるまで、治療される疾患状態の重篤度及び応答に基づいて実施することができる。常套の方法を用いて、最適な投与量、投薬方法論、及び反復率を決定することができる。最適な投与量は、個々の核酸分子の相対的な効力に非常に依存し、インビトロ及び/又はインビボモデルで有効であると見出されたEC50値に基づいて一般的に評価することができる。典型的には、投用量は体重1kgあたり約0.01μg〜約100gであり、1日に1回以上、1週間に1回以上、又はそれ以下の頻度で与えることができる。治療成功後、疾患状態の再発を予防するために患者に維持療法を受けさせることが好ましいであろう。
【００３４】
本明細書中に記載されている通り、HPV配列に相補的な配列を有する核酸分子をHPV感染細胞の数を減少させる条件下で哺乳動物に投与することができる。この減少は任意の検出可能な減少レベルであることができる。例えば、HPV感染細胞の数を、5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95パーセント、又はそれ以上減少させることができる。ある場合には、減少により、検出可能なHPV感染細胞が消失する。
【００３５】
任意の方法を用いて、HPV感染細胞の存在又は非存在を決定することができる。例えば、サザンブロット、PCR、ノーザンブロット、RT-PCR、免疫染色法、ELISA、及びラジオイムノアッセイを用いて、細胞試料中のHPV DNA、RNA、又はポリペプチドを検出することができる。さらに、哺乳動物内のHPV感染細胞の数を決定する任意の方法を用いることができる。例えば、インサイチュー・ハイブリダイゼーション及び免疫染色法などの標準の分子生物学技術を用いて、HPV感染細胞の数を決定することができる。同様に、哺乳動物内のHPV感染細胞の数が減少したか否かを決定する任意の方法を用いることができる。例えば、治療前又は治療後に、肉眼により、顕微鏡により、免疫学的に、生物化学的に、又は分子的に組織を検査し、HPV感染細胞の数が減少したかを決定することができる。典型的には、治療後における肉眼で観察可能なサイズの生殖器いぼ（HPV感染細胞を含有することが知られている）の減少又は消失により、HPV感染細胞の数が減少したことが示される。
【００３６】
本発明は、単離された核酸も提供する。核酸に関して本明細書中で用いられる「単離された」という用語は、天然に存在する核酸が由来する生物の天然に存在するゲノム中では核酸が隣接する（一方は5'末端で、他方は3'末端で）配列において、両方に隣接していない、天然に存在する核酸を指す。例えば、単離された核酸は、天然に存在するゲノム中で組換えDNA分子の側面に直ちに位置することが通常見出される核酸配列の1つが除去されているか存在しない、任意の長さの組換えDNA分子でありうるが、これに限定されない。したがって、単離された核酸には、他の配列とは独立した別々の分子（例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ処理により生じたcDNA又はゲノムDNA断片）として存在する組換えDNA、及びベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウィルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）、又は原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNAが含まれるが、これらに限定されない。さらに、単離された核酸は、ハイブリッド又は融合核酸配列の一部である組換えDNA分子を含みうる。
【００３７】
核酸に関して本明細書中で用いられる「単離された」という用語は、天然に存在しない任意の核酸を含むが、その理由は、天然に存在しない核酸配列は、自然界には見出されず、かつ天然に存在するゲノム中に隣接する配列を有しないためである。例えば、操作された核酸などの天然に存在しない核酸は、単離された核酸とみなされる。操作された核酸は、汎用の分子クローニング又は化学核酸合成技術を用いて作成することができる。単離された天然に存在しない核酸は、他の配列から独立していてもよく、あるいはベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウィルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルス）、又は原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込むことができる。
【００３８】
例えば、cDNA又はゲノムライブラリー内の何百から何百万もの他の核酸分子の中に存在する核酸、又はゲノムDNA制限消化物を含有するゲル切片は、単離された核酸とはみなされないことは当業者に明らかである。
【００３９】
本明細書中で提供される単離された核酸はRNA又はDNAであってもよく、1つ以上の触媒性コア配列を含有しうる。本明細書中で用いられる「触媒性コア配列」という用語は、標的認識とは対照的に、Dz又はRz触媒活性の主な原因となる配列をいう。触媒性コア配列の具体例には配列番号：51及び配列番号：68が含まれるが、これらに限定されない。その他の触媒性コア配列は、他で記載されている（Santoro及びJoyce, Proc. Natl. Acad. Sci., 94（9）: 4262-6（1997）; Feldman and Sen, Mol. Biol., 313（2）: 283-94（2001）; ならびに Okumotoら、Biochemistry, 42（7）: 2158-65（2003））。
【００４０】
1つ以上の触媒性コア配列に加えて、本明細書中で提供される単離された核酸は、1つ以上の認識配列を含有しうる。典型的には、認識配列は、標的HPV mRNA配列などの標的配列に相補的な配列である。ある実施態様において、単離された核酸は、5'認識配列、続いて触媒性コア配列、続いて3'認識配列を含有しうる。認識配列は、HPV E6/E7 mRNA配列などの任意のHPV配列に相補的であってもよい。単離された核酸は、該核酸がHPV mRNAの切断部位を切断するように設計することができる。Dz及びRz切断にアクセス可能なHPV mRNA切断部位の具体例は、表1a、表1b、及び表1c中に見出すことができる。
【００４１】
本発明は、単離された一本鎖核酸分子も提供する。そのような核酸分子は、5個〜40個のヌクレオチド（例えば、6個〜35個のヌクレオチド、7個〜30個のヌクレオチド、8個〜25のヌクレオチド、又は8個〜20個のヌクレオチド）からなりうる。さらに、これらの核酸分子は、HPV mRNA配列の少なくとも5個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個、又はそれ以上連続したヌクレオチド）に相補的な配列を有していてもよい。例えば、本明細書中で提供される単離された一本鎖核酸分子は、表1a、表1b、及び表1cに示される配列のうちの少なくとも5個連続したヌクレオチドに相補的な配列を有しうる。
【００４２】
さらに、本発明は、単離された、二本鎖RNA分子を提供する。典型的には、そのようなRNA分子の一方の鎖は、HPV mRNA配列の少なくとも5個連続したヌクレオチド（例えば、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個、又はそれ以上連続したヌクレオチド）に相補的な配列を含有していてもよい。例えば、本明細書中で提供される単離された二本鎖RNA分子は、表1a、表1b、及び表1cに示される配列のうちの少なくとも5個連続したヌクレオチドに相補的な配列を有する鎖を有しうる。
【００４３】
ある実施態様において、単離された二本鎖RNA分子は、siRNA分子であるように設計することができる。典型的には、siRNA分子は、短い二本鎖RNA分子である。さらに、siRNA分子は、任意の長さ（例えば、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40ヌクレオチド長、又はそれ以上のヌクレオチドの長さ）であることができる。例えば、siRNA分子は、15〜30ヌクレオチド長（例えば、18〜25、20〜24、又は20〜21ヌクレオチド長）でありうる。ある実施態様において、HPV RNA由来の選択された標的配列を用いて、siRNA分子を設計することができる。例えば、本明細書中で提供されるアンチセンス分子は、二本鎖RNA分子として合成することができる。さらに、siRNA分子の長さは本明細書中で提供されるアンチセンス分子の長さと同じであってもよく、あるいは長さを増加又は減少させることができる（例えば、siRNA分子が20〜21ヌクレオチド長であるように長さを増加又は減少させることができる）。siRNA分子を細胞中に送達する任意の方法を用いることができる。例えば、アンチセンス分子のために本明細書中に記載される方法を用いて、siRNA分子を細胞に適用することができる。あるいは、siRNA分子が発現されるように細胞に導入しうる発現構築物に、siRNA分子をコードする配列を導入することができる。
【００４４】
本発明は、一本鎖DNA（例えば、Dz）を得る方法及び材料も提供する。このような方法及び材料を用いて、一本鎖Dzのライブラリーを作成することができる。例えば、得られた二本鎖核酸の一方の鎖が標識を含有するように、標識されたプライマー（例えば、ビオチンで標識されたプライマー）を用いて、増幅反応（例えば、PCR反応）を実施することができる。増幅生成物を一度増幅したら、増幅生成物を、標識した鎖を標識されていない鎖から分離することを可能にする標識と相互作用する結合剤（例えば、ストレプトアビジン）とともにインキュベートすることができる。例えば、ストレプトアビジンで被覆した樹脂を用いて、ビオチンを欠いた鎖からビオチンを含有する鎖を除くことができる。典型的には、Dz配列含有鎖（例えば、異なるDz配列のライブラリー）は標識せず、相補鎖を例えばビオチンで標識するようなプライマーを用いて、増幅反応を設計することができる。この場合、結合剤樹脂、例えば、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合しない材料を回収することにより、Dz鎖を得ることができる。
【００４５】
一本鎖DNAは、1つ以上のリボースヌクレオチドを含有する1つ以上のプライマーによる増幅反応を用いて得ることができる。リボースヌクレオチド又はヌクレオチドは、プライマーに添った任意の場所に位置しうる。典型的には、少なくとも1つのリボースヌクレオチドは、プライマーの3'末端に又は3'末端の近くに位置しうる。得られた二本鎖核酸は、一度、増幅すると、1つ以上のリボースヌクレオチドを含有する1つの鎖を有しうる。水酸化ナトリウムなどの塩基加水分解剤でこの得られた生成物を処理することにより、リボースヌクレオチド含有鎖がリボースヌクレオチドで切断される。典型的には、最終NaOH濃度が例えば約0.1M、0.25M、0.5M、又は0.75MのNaOHで増幅生成物を処理する。さらに、一度、水酸化ナトリウムを加えたら、混合物を数分間（例えば、約5分間、10分間、15分間）加熱し（例えば、約80℃、85℃、90℃、又は95℃）、次いで冷却する（例えば、氷上に置く）ことができる。
【００４６】
一度、少なくとも1つのリボースヌクレオチドを含有する鎖を切断したら、例えば、最終HCl濃度が例えば約0.1M、0.25M、0.5M、又は0.75MのHClを添加することにより、混合物を中和することができる。2つの鎖をサイズに基づいて分離することができる。例えば、PAGE（例えば、8パーセント変性ポリアクリルアミドゲル）を用いて、より短い切断された鎖をより長い切断されていない鎖から分離することができる。Dz配列含有鎖に対応するバンドを単離し、一本鎖Dzを溶出する。
【００４７】
一本鎖DNAは、炭素スペーサーを含有する1つ以上のプライマーによる増幅反応を用いて得ることもできる。炭素スペーサーは、プライマーに添った任意の場所に位置させることができる。増幅反応中、ポリメラーゼは、典型的には、炭素スペーサーを超えて伸長することができず、その結果、1つの鎖が他より長くなる。異なるサイズの鎖を分離することができ、Dz配列含有鎖を単離することができる。
【００４８】
本明細書中で用いられる「炭素スペーサー」という用語は、1つ以上の炭素-炭素骨格結合を含有する非五炭糖分子構造をいう。典型的には、ポリメラーゼ（例えば、Taqポリメラーゼ又は逆転写酵素）は、炭素スペーサーを含有する鋳型の炭素スペーサー領域を通しては核酸を重合しない。炭素スペーサーは、酸素-炭素-炭素の反復単位を含有しうる。例えば、炭素スペーサーは、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれ以上の酸素-炭素-炭素単位であることができる。さらに、炭素スペーサーは、リン酸基を含有していてもよい。例えば、6個の酸素-炭素-炭素単位の後にリン酸基が続いていてもよい（図3）。典型的には、プライマーは、5'核酸配列、続いて1つ以上の酸素-炭素-炭素単位、続いてリン酸基、続いて3'核酸配列を含有する。このようなプライマーは、任意の核酸配列を含有していてもよい。
【００４９】
ある実施態様において、本発明は、核酸配列（(N)n1として表され、Nは任意のヌクレオチドであり、n1は0より大きい整数である）、続いて炭素スペーサー（例えば、(酸素-炭素-炭素)n2として表される酸素-炭素-炭素単位であり、n2は0より大きい整数である）、続いて別の核酸配列（(N)n3として表され、Nは任意のヌクレオチドであり、n3は0より大きい整数である）を有する核酸分子を提供する。(N)n1及び(N)n3として表される核酸配列は、任意の配列を有していてもよい。例えば、(N)n1は、5'-ATGG-3'であってもよく、(N)n3は5'-CTGAC-3'であってもよい。
【００５０】
特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない以下の実施例において本発明をさらに記載する。
【００５１】
実施例
実施例1  標的部位のライブラリー選択
全長HPV11E6/E7、HPV16E6/E7、及びHPV18E6/E7RNAを転写し、オリゴヌクレオチド（LS1）のランダムプール、ランダム隣接配列を有する活性なRz（LS2）のプール、又はランダム隣接配列を有する活性なDz（LS3）プールを用いたライブラリー選択にかける。簡単に言えば、LS1ライブラリー選択プロトコルは、Panら（RNA, 7:610-21（2001））に従ってランダムオリゴヌクレオチドライブラリーSELEX手順（5回）を用いることを伴った。LS2ライブラリー選択を活性なRzのランダムライブラリーを用いて実施した（Panら、Mol. Therapy, 7:128-138（2003）及び国際特許出願第PCT/US01/46178号）。簡単に言えば、ライブラリーを不活性条件下で標的RNA（例えば、HPV11E6/E7、HPV16E6/E7、又はHPV18E6/E7RNA）に結合させ、結合種を再増幅した。2回目の結合及び増幅をより低い標的RNA：Rz比で実施し、特異性を増加させた。次いで、選択されたプールを活性なRzに転写し、Rzを全長5'-32P-HPV11E6/E7、HPV16E6/E7、又はBPV18E6/E7標識した標的RNAとともにインキュベートした。分解産物をシークエンシングゲル上で分離し、G-、T-、及び塩基加水分解ラダーとの比較により切断部位を直接同定した。
【００５２】
LS3ライブラリー選択を活性なDzのランダムライブラリーを用いて実施した（図1；国際特許出願第PCT/US01/46178号）。簡単に言えば、一本鎖Dzのライブラリーを調製し、不活性条件下（85℃及びMg++なし）で標的RNA（例えば、HPV11E6/E7、HPV16E6/E7、又はHPV18E6/E7RNA）に結合させて、結合種を非変性PAGEにより得て、再増幅した。2回目の結合及び増幅をより低い標的RNA：Dz比で実施し、特異性を増加させた。一本鎖Dzを選択されたプールから得て、活性条件下で（37℃及び25mMのMgCl）全長5'-32P-HPV11E6/E7、HPV16E6/E7、又はHPV18E6/E7標識した標的RNAとともにインキュベートした。分解産物をシーケンシングゲル上で分離し、G-、T-及び塩基加水分解ラダーとの比較により切断部位を直接同定した。LS3プロトコルを用いた1回目及び2回目の選択の双方で検出可能な切断が生じた。これらの結果は、アクセス可能な切断部位はLS3プロトコルによる1回目の選択を用いて同定することができるが、2回目の選択後に部位がより容易に明らかになることを示している。
【００５３】
LS3プロトコル中に、ビオチン標識したプライマーを用いてDz配列を欠く鎖をプライミングしたPCR反応を用いて、一本鎖Dzを得た。次いで、ストレプトアビジンを含有する樹脂を用いて、Dz含有鎖からビオチン標識した鎖を分離した。あるいは、リボース含有プライマー（例えば、3'末端の塩基がリボースであるDNAプライマー）を用いて増幅反応を行い、RNAヌクレオチドを含有する1つの鎖を得た（図2）。水酸化ナトリウム（0.5M最終濃度）を増幅反応生成物に加えて、リボース及び2-デオキシリボースヌクレオチドの間のリボースヌクレオチドを含有する鎖を切断した。水酸化ナトリウムを加えた後、混合物を95℃で10分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。得られた混合物をHClで中和し、8パーセント変性ポリアクリルアミドゲルを用いて2つの鎖をサイズに基づいて分離した。Dz配列含有鎖に対応するバンドを単離し、一本鎖Dzを溶出した。第3の方法は、炭素スペーサーを含有するプライマーを用いることを伴った。炭素スペーサーは、酸素-炭素-炭素の反復単位、続いてリン酸基を含有した（図3）。増幅反応中、ポリメラーゼは炭素スペーサーを超えて伸長することができず、その結果、1つの鎖が他より長くなった。次いで、異なるサイズの鎖を分離し、Dz配列含有鎖を単離した。
【００５４】
多数の部位を各プロトコルで同定した（表1a及び1b）。さらに、いつくかの部位をLS1及びLS2プロトコルの両方を用いて同定した（例えば、Genbank（登録商標）アクセッション番号M14119中のヌクレオチド505位に対応するHPV11E6/E7RNAのヌクレオチド407位を取り囲む部位；表1b）。HPV標的配列は、ライブラリー選択プロトコルなしで選択することもできる。例えば、大部分のHPV転写に用いられる汎用のポリ（A）シグナルに近接したE5内のいつくかの部位を選択した（表1c）。
【００５５】
（表１ａ）ライブラリー選択プロトコルを用いて同定され、Rzを作成するのに用いられるHPV標的配列
2005537028.tif 000003
下線を引いたヌクレオチドは、Rz切断部位を表す。
【００５６】
（表１ｂ）ライブラリー選択プロトコルを用いて同定され、Dzを作成するのに用いられるHPV標的配列
2005537028.tif 000004
太線のヌクレオチドはDz切断部位を表す。
【００５７】
（表１ｃ）大部分のHPV転写物に用いられる汎用のポリ（A）シグナルに近接したE5内のHPV標的配列
2005537028.tif 000005
太線のヌクレオチドはDz切断部位を表す。
【００５８】
実施例2  ASO、Rz、及びDzの設計
ライブラリー選択プロトコルを用いて同定される部位を標的とするようにASO、Rz、及びDzを設計した。例えば、ASO407(HPV11-E6/E7)を、409位の周辺領域（表1a）に結合し、以下の配列
2005537028.tif 000006
を有するように設計した。ASO407(HPV11-E6/E7)の保護型であるAS0407p(HPV11-E6/E7)を以下の配列
2005537028.tif 000007
を有するように設計した。「T*」は、チミジンが逆向きであることを示している（Santiagoら、Nat. Med., 5（11）: 1264-69（1999））。以下に記載されるように、この修飾により、培地/血清中及び細胞中での分解に対してASO及びDzが有意に保護された。
【００５９】
5つのRz、Rz23(HPV11-E6/E7)、Rz162(HPV11-E6/E7)、Rz244(HPV11-E6/E7)、Rz345(HPV11-E6/E7)、及びRZ409(HPV11-E6/E7)を、標的部位配列に相補的な配列が側面に位置している触媒性コア配列
2005537028.tif 000008
を有するように設計した。例えば、HPV16 E6/E7 RNAの切断部位138位を切断するように設計されたRz59(HPV16-E6/E7)は、以下の配列
2005537028.tif 000009
を有することができる。下線の配列は触媒性コア配列を表す。Rz切断部位を、Rzの特異性（例えば、RzではNUCトリプレット）に従い、アクセス可能な領域内で選択した。
【００６０】
各Rzの鋳型配列を、単一の内部トランス作用Rz（ITRz）としてあるいは2つのITRz（dITRz）として、SNIPAA発現カセット中に置いた（図5A）。簡単に言えば、このカセットは2つのトリプレットRzからなる（Zhangら、Exp. Cell Res., 273: 73-84（2002））。逆に、各トリプレットリボザイムは、ITRz又はdITRzの側面に位置する2つのシス作用リボザイムからなる。2つのシス作用Rzは、一次転写物を切断し、最小の外因性隣接配列を有するITRz又はdITRzを遊離する。このカセットの使用により、遊離したITRz又はdITRzが核（5〜20％）及び細胞質の間に分布する点でさらなる有利性が提供される（Panら、RNA, 7: 610-21（2001）; Benedictら、Carcinogenesis, 19:1223-30（1998）; Renら、Gene rapy and Mol. Biol., 3: 1-13（1998）; 及びCroneら、Hepatology, 29:1114-23（1999））。
【００６１】
SNIPAAカセットのCLIP部分から遊離したITRz又はdITRzは、5'末端で
2005537028.tif 000010
及び3'末端で
2005537028.tif 000011
の隣接配列を含有する。SNIPAAカセットのCHOP部分から遊離したITRz又はdITRzは、5'末端で
2005537028.tif 000012
及び3'末端で
2005537028.tif 000013
の隣接配列を含有する。種々のITRz及びdITRzRzの「触媒性コア」は以下の配列
2005537028.tif 000014
からなるものであった。
隣接配列は、示したITRzでは以下の通りであった。
2005537028.tif 000015
隣接配列は、示したdITRzでは以下の通りであった。
2005537028.tif 000016
さらに、SNIPAAカセットのCLIP部分由来のITRz409は、以下の配列
2005537028.tif 000017
を含有していた。HPV11に特異的な隣接配列に下線を引いた。SNIPAAカセットのCLIP部分由来のdITRz409/409は以下の配列
2005537028.tif 000018
を含有していた。ここでも、HPV11に特異的な隣接配列に下線を引いた。
【００６２】
LS1プロトコルで同定される切断部位を切断するようにDz27(HPV11-E6/E7)、Dz338(HPV11-E6/E7)、及びDz407(HPV11-E6/E7)を設計したが、その理由は、LS2プロトコルで同定される部位を標的とするDzは劣った活性を示しうるためである。Dz切断部位を、Dzの特異性（例えば、DzではR-Yダブレット）に従い、アクセス可能な領域内で選択した。HPV11 E6/E7 RNAの切断部位125位を標的とするDz27(HPV11-E6/E7)を以下の配列
2005537028.tif 000019
を有するように設計した。HPV11 E6/E7 RNAの切断部位436位を標的とするDz338(HPV11-E6/E7)を以下の配列
2005537028.tif 000020
を有するように設計した。HPV11 E6/E7 RNAの切断部位505位を標的とするDZ407(HPV11-E6/E7)を以下の配列
2005537028.tif 000021
を有するように設計した。各場合において、Dzの触媒性コアに下線を引いた。
2005537028.tif 000022
【００６３】
407位を標的とする触媒不活性Dz（Dz407m(HPV11-E6/E7)）を設計し、対照として用いた。Dz407m(HPV11-E6/E7)は以下の配列
2005537028.tif 000023
を有する。Dz触媒活性を排除するヌクレオチド置換基を太線で示す。DzAR2000及びDzAR2000の触媒不活性型であるDzAR2000mをアンドロゲン受容体RNA配列を標的とするように設計し、対照として用いた。DzAR2000は以下の配列
2005537028.tif 000024
を有する。DzAR2000mは以下の配列
2005537028.tif 000025
を有する。
【００６４】
実施例3  インビトロ切断活性の分析
Rz及びDzを一度設計したら、他で記載される条件下で（Panら、RNA, 7:610-21（2001））E6/E7標的RNAに対する活性についてインビトロで試験した。5' T7プロモーターのITRz配列下流をコードする重複オリゴデオキシヌクレオチドを合成することにより、Rzを得た。次いで、ITRz（SNIPカセットのCHOP部分から遊離したものと同一である）をインビトロで転写し、ゲル精製した。DzをDNagency（Malvern、ペンシルベニア州）から得た。
【００６５】
Rz（Rz23(HPV11-E6/E7)、Rz409(HPV11-E6/E7)、及びRz345(HPV11-E6/E7)）を同定部位に基づいて設計し、インビトロで転写し、ゲル精製した。Rz（50nM）を全長32P標識HPV11 E6標的mRNA（200nM）と混合し、37℃で30分間又は2時間インキュベートし、次いで切断生成物をPAGE及びオートラジオグラフィーにより調べた。Rz409(HPV11-E6/E7)及びRZ23(HPV11-E6/E7)は最も活性なRzであった（図4A）。HPV16を標的とするRz（HPV16 E6/E7中の相同性領域であるヌクレオチド427位を標的とする）は、HPV11 E6標的mRNAに対する活性を示さなかった。このHPV16Rz及びHPV11 E6標的mRNA標的は、切断部位とは2番目、5番目、及び6番目のヌクレオチド下流で異なり、5番目及び6番目のヌクレオチド上流で異なる。HPV16 E6/E7標的mRNAに対するHPV16を標的とするRzの活性は、4×105min-1M-1のkcat/kmを有し、約50nMのKmを有した。詳細な分析を実施しなかったが、HPV11 E6標的mRNAに対するRz409(HPV11-E6/E7)の活性は同様のものであるようであった。
【００６６】
同定部位を標的とするDzは、32P標識HPV11 E6/E7 mRNAに対する活性のスペクトルを示した。例えば、Dz27(HPV11-E6/E7)はインビトロ触媒活性を示さず、Dz338(HPV11-E6/E7)はいくらかインビトロ活性を示し、Dz407(HPV11-E6/E7)は良好なインビトロ活性を示した（図4B）。興味深いことに、LS1及びLS2プロトコルの双方を用いて、407部位を同定した。さらに、LS2プロトコルで同定される12個の部位を標的とする12個のDzの中で、Dz407(HPV11-E6/E7)が良好な活性を示す唯一のDzであった。Dz変異体であるDz407m(HPV11-E6/E7)はいかなる活性も示さなかった。
【００６７】
種々の長さの4つの一本鎖Dzライブラリープールを、リボース含有プライマー：（1）Dz及びTS及びBSプライマー配列（TS＋Dz＋BS；67ヌクレオチド）、（2）Dz及びTSプライマー配列（TS＋Dz；50ヌクレオチド）、（3）Dz及びBSプライマー配列（Dz＋BS；50ヌクレオチド）、及び（4）プライマー配列なしのDz（Dz；33ヌクレオチド）による増幅反応を用いて得た（図2）。プールを一度得たら、標識したHPV16 E6/E7 mRNAに対するインビトロ触媒活性について試験した。4つはすべて、標的部位で検出可能な切断活性を示した。これらの結果は、リボース含有プライマーを用いた増幅反応を用いて活性なDzを得ることができることを示している。これらの結果は、種々のサイズのDzを用いてmRNA標的を切断することができることも示している。
【００６８】
実施例4  ASO、Rz、及びDzの細胞培養分析
以下の細胞培養実験を293Tヒト胚性腎細胞（ATCC, Rockville, MD; #CRL-1573）を用いて実施した。293T細胞をダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）及び10パーセントの熱不活性化ウシ胎児血清中で維持した。
【００６９】
予備の安定性試験において、3'保護（ASOp）又は非保護ASOは、32P-ATPで5'末端を標識した。次いで、5'-32P標識ASOp及び非保護ASOを、培地（DMEM及び10パーセント熱不活性化ウシ胎児血清）中で種々の期間インキュベートした。5'-32P標識ASOp及び非保護ASOも293T細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後1日目、3日目、及び5日目にRNAを単離した。
【００７０】
培地中において、48時間で保護ASOpの分解は観察されなかった。しかしながら、非保護ASOは、48時間で約70〜80パーセントの分解を示した。293T細胞へのトランスフェクション後、ASOpは、5日目に、非保護ASOで観察された安定性の程度より約3〜5倍、より安定性を示した。
【００７１】
HPV11 E6/E7 mRNAを安定して発現する細胞を以下のように生成した。293T細胞をFlp-In系（Invitrogen）を用いて安定にトランスフェクトした。Flp-In293T細胞をゼオシン（400μg/mL）の存在下で増殖し、ゲノム中の特有の部位中の標的とされる組換えに用いられるFRT部位を維持した。HPV11E6/E7配列をpcDNA5ベクター中にクローン化し、次いで、リポフェクトアミンPLUS試薬を用いて、p0G44（Flpリコンビナーゼの発現を可能とするベクター）とともにFlp-In293細胞中に同時トランスフェクトした。トランスフェクション後2日目に、細胞をハイグロマイシンB（30μg/mL）による抗生物質選択に曝した。これにより、組み込まれたpcDNA5/FRT構築物について選択した。30日後、単一のコロニーを拾い、β-ガラクトシダーゼ活性及びHPV11E6/E7発現について試験した。安定的にトランスフェクトされた細胞を293TE6/E7と称した。比較目的のため、HPV11E6/E7の発現を、CaSki細胞中のHPV16E6/E7の発現より約6倍大きいものとした。
【００７２】
293TE6/E7細胞を、種々のASO、SNIPAARz構築物、又はHPV11E6/E7を標的とするDzに続いてトランスフェクトした。トランスフェクション効率は約70〜90パーセントであると評価された。HPV11E6/E7標的RNAレベルを、VIC又は6-カルボキシ-フルオレセイン（FAM）のいずれか及びBlack Hole Quencher 1（BHQ）を有するStratagene（ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）Mx4000機器及びTaqMan 5'リボヌクレアーゼ方法論を用いたリアルタイム定量PCR（QPCR）より測定した。HPV11E6/E7のため、ヌクレオチド827〜803位に逆相補的な最初の3'プライマーを用いた。QPCRのため、ヌクレオチド226〜203位は3'プライマーに逆相補的であり、5'プライマーはヌクレオチド154〜175位と一致した。TaqManプローブは、ヌクレオチド177〜201位と一致する
2005537028.tif 000026
であった。
【００７３】
遍在する転写因子TATAボックス結合タンパク質（TBP、TFIIDの細胞内成分）に対するmRNAを標準化に用いた（Herasseら、Mol. Cell Biol., 19: 4047-55（1999））。TBPのため、最初の3'プライマー
2005537028.tif 000027
はヌクレオチド742〜718位に相補的であった。QPCRのため、同じ3'プライマーを用いた。5'プライマー
2005537028.tif 000028
はヌクレオチド625〜646位と一致した。TaqManプローブ
2005537028.tif 000029
は、ヌクレオチド659〜683位と一致した。ROX（カルボキシ-X-ローダミン、スクシニミジルエステル）を体積対照のために染料として用いた。ある実験において、18SリボソームRNAも定量した。
【００７４】
RT反応では、50ngのRNAを有するSensiscript逆転写酵素（Qiagen）を利用した。標準曲線は、一般に、25〜100ngの全RNAで走査した。QPCR反応では、HotStar Taqポリメラーゼ（Qiagen）を用いた。2μLのRT反応物を20μL反応液中で用いた。増幅を3連で実施し、HPV11E6/E7及びTBPは各々に対し同じRT反応物と一致させた。最初の変性は95℃で15分間であった。各サイクルは、95℃で30秒間、56℃で1分間、及び72℃で30秒間から成った。参照としてTBPを有するRESTプログラム及びペアワイズ固定化再配分ランダム化試験（pair-wise fixed reallocation randomization test）（Pfafflら、Nucleic Acids Res., 30: e36（2002））を用いてデータを分析した。結果は標準化なしで同様であった。
【００７５】
トランスフェクション後1日目に、SNIP dITRZ（409/409）、SNIP dITRZ（409/244）、SNIP dITRZ（409/162）、SNIP ITRZ（409）、SNIP ITRZ（244）、及びSNIP ITRZ（162）をトランスフェクトした細胞において、HPV11 E6/E7 mRNAレベルのわずな減少が観察された。トランスフェクション後3日目及び5日目に、HPV11 E6/E7 mRNAの有意な減少が観察された（図5B）。5日目までに、dITRzを含有するSNIPAARz構築物は、約80〜90パーセントのHPV11 E6/E7 mRNAレベルの減少を生じる単一のTRzを含有するSNIPAARz構築物よりも明らかにより効果的であった。最大活性は、多数の実験においてRz409に因るものであった。空のSNIPカセット（すなわち、ITRzなし）はわずかな効果を有し、すべてのSNIPAARz値は3日目及び5日目に対照とは有意に異なるものであった。種々の繰り返し実験において、同様の結果が得られた
【００７６】
DZ27(HPV11-E6/E7)、Dz338(HPV11-E6/E7)、Dz407(HPV11-E6/E7）、又はDz407m(HPV11-E6/E7)によるトランスフェクション後1日目、2日目、及び3日目に、細胞RNAを293TE6/E7細胞から分離した。1日後、各Dz構築物をトランスフェクトした細胞は、HPV11 E6/E7標的mRNAレベルの実質的な減少を示した（図5B）。2日目では効果は同様であり、すべてのDz構築物は標的RNAレベルを50〜60パーセント減少する結果となった。効果は縮小したが、3日目まで依然として明らかであった。Dz407(HPV11-E6/E7)の触媒不活性変異体（Dz407m(HPV11-E6/E7)）では、DZ407(HPV11-E6/E7)の効果と等しい効果（3日目には優れてさえいる）となった。さらに、触媒活性を欠くDZ27(HPV11-E6/E7)では、3つ時点すべてで標的RNAの大きな減少が生じた。これらの結果は、これらの条件下で観察される活性はアンチセンス効果に因ることを示している。したがって、以下のインビボ研究には、これらの部位に関するASOが含まれた。
【００７７】
実施例4  包皮及び植皮（orthografting）の調製
包皮断片を環状切除部から他で記載されるようにして（Slebosら、PNAS, 91:5320-4（1994））調製した。包皮は検出可能な損傷がなく、中間層（split-thickness）（0.5mm）に切って、次いで5×5mm片に切った。これらの片々をHPV-11ウイルス保存液（Kreiderら、J．Virol., 61:590-3（1987））0.2mLとともに37℃で1時間インキュベートし、次いで、5〜10週齢の雌免疫不全NIH-IIIマウス（#NIHBNX-MMC, Harlan Laboratories、インディアナポリス、インディアナ州）に直ちに移植した。これらのマウスは、T細胞、B細胞、及びNK細胞中での欠失に帰する3つの別々の変異体（bg、nu、及びxid）を保持していた。マウスを麻酔し、移植片と等しい表皮/真皮の切片を胸郭上で除去した。次いで、移植片を該領域におき、1×1cmの非付着性の包帯で覆い、次にマウスの周りをラッピングする多孔性テープで覆った。次いで、10〜14日間、移植片を治癒させたのち、包帯を除去した。「獲得」率は約60パーセントであった。目に見える乳頭腫が移植後約60〜70日で発達した。包皮の感染及び移植後、乳頭腫が肉眼で明確になり（すなわち、直径1〜2mmである）、特有の損傷が各場合で発達していることを確証した場合に、種々のASO又はDzを局所的に適用した。自発的な後退はこのモデルでは観察されない。移植片の治療のため、表面を覆うのに十分な量（例えば、1μg/μLのDNAを有する25μL）で発達中の乳頭腫にASO又はDzを局所的に適用した。1日おきに約20〜30日間治療を続け、その際、実験を終了し、移植片を組織学的に、免疫組織化学的に（E6、E7、又はL1ポリペプチドに対して）、インサイチュー・ハイブリダイゼーションにより（HPV11 DNAに対して）処理した。
【００７８】
実施例5  ASO及びDzの局所的送達
発現構築物の局所的送達は、カチオン性リポソーム（Templetonら、Nature Biotech., 15:647-52（1997））を含む種々の送達媒質で試験した場合に、非常に劣っていた。より少ないオリゴヌクレオチド（例えば、ASO及びDz）の送達をアッセイした。最初の研究において、蛍光標識したASO又はDzを、リポフェクトアミン：エタノール（70：30、v：v）中において1μg/μL又は2μg/μLの濃度で調製した。リポフェクトアミン：エタノール中のASO又はDzを、ヒト包皮もしくは胸皮膚移植片又は5〜10週齢の雌NIH-IIIマウスの背の皮膚に局所的に適用した。局所的適用後6時間、12時間、又は24時間において、蛍光顕微鏡により送達を評価した。
【００７９】
70：30混合物（v：v）のリポフェクトアミン：エタノール中の1μg又は2μg/μLのDNAを用いた全層異種移植片ヒト表皮及びマウス表皮への蛍光標識したASOの送達は優れていたが、これらの条件下での細胞取り込みを記録することは不可能であった。蛍光標識したDzの送達は一般に同様であったが、同じ条件下でより幾分変動的であった。ある実験で、送達媒質としてPBSを用いたところ、乳頭腫発達後は送達が劣っていたが、送達は遜色なかった。
【００８０】
別の実験において、蛍光標識したASO（1μg/μL溶液の10μL）をマウス頚部に局所的に適用した。2匹のマウスには、ゲル泡沫（gel form）とともに蛍光標識したASOを与え、2匹のマウスには、ゲル泡沫なしで蛍光標識したASOを与えた。ゲル泡沫なしでASOを与えた2匹のマウス、及びゲル泡沫とともにASOを与えた1匹のマウスを、適用4時間後に屠殺した。各々の場合において、蛍光が頚部上皮の全層を通して観察された。ゲル泡沫とともにASOを与えた残りのマウスを、適用12時間後に屠殺した。この場合には蛍光が検出されなかった。さらに、ゲル泡沫が検出されなかったが、このことはゲル泡沫が正確に適用又は保持されなかったであろうことを示している。
【００８１】
実施例6  インサイチュー・ハイブリダイゼーション及び免疫組織化学
クローン化したHPV11（8kbp、Hershey株）を、製造者の指示書に従って、ランダムプライミング（Megaprime DNA Labeling System, Amersham, Piscataway, NJ）によりビオチン-11-dUTPで標識した。50％ホルムアミドハイブリダイゼーションカクテル（50％ホルムアミド中の2.4M NaCl、40mM Tris-HCI、pH7.4、2mM EDTA、4mg/mL BSA、0.08％ポリビニルピロリドン、0.08％フィコール、0.6mg/mL酵母tRNA、及び80mM ジチオスレイトール）中でプローブを希釈して1μg/mLとした。
【００８２】
パラフィン切片を脱ロウし（dewaxed）、エタノールで水和し、次いで、ペプシンで消化した（0.1N HCl中4mg/mL）。次いで、組織を95％エタノールで中和し、その後100％エタノール中で水和し、次いで空気乾燥させた。プローブカクテルを組織に適用し、組織とプローブとの組み合わせを95℃で6分間変性させた。ハイブリダイゼーションを湿室中で37℃において2時間実施した。次いで、試料を2×SSC中で十分に洗浄し、ハイブリダイズしたプローブを、アビジン-アルカリホスファターゼ結合体とともにインキュベートし、続いてMcGady試薬（50％ジメチルホルムアミド中のニトロブルーテトラゾリウム、50mg/mL、及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルホスフェート、p-トルイジン塩、50mg/mL）中の比色の展開により検出した。スライドをヌクレアファーストレッド（nuclear fast red）で対比染色し、永久封入剤（permanent mounting medium）中でカバーをスリップした。
【００８３】
E6及びE7ポリペプチドの免疫組織化学検出用に、ポリクローナル抗体をニワトリ中で3つの17-aaポリペプチドに対して生じさせた。E7ポリペプチドは、
2005537028.tif 000030
であった。2つのE6ポリペプチドは、
2005537028.tif 000031
であった。これらのポリペプチドを合成し、HPLC精製した（Genemed Biotechnologies, South San Francisco, CA）。ポリペプチドは、HPV16中に従前に同定された免疫原性領域と相同である（Staceyら、Oncogene, 9:635-45（1994））HPV11 E6/E7中の領域を標的とした。ポリペプチドをキーホールリンペットヘモシニアンとカップリングし、1日目、21日目、42日目、及び63日目にニワトリを免疫感作することにより抗体を誘導した（Cocalico Biologicals, Reamstown, PA）。試験出血を分析した後、73日目に回収した抗血清を用いて、硫黄親和性（thiophylic）吸着クロマトグラフィー（Tゲル吸着剤、Pierce, Rockford, IL）を用いて製造者の指示書に従い抗体を精製した。さらに卵黄を得て、IgY免疫グロブリンを卵黄から精製した。
【００８４】
免疫組織化学染色のために、パラフィン包埋された組織を用いた。胸腺欠損マウスの腎被膜下に移植されたHPV11感染ヒト包皮から発達した嚢胞のパラフィン切片を陽性対照として用いた。免疫ペルオキシダーゼ染色をアビジン-ビオチン複合体方法（ABC kits, Vector Laboratories, Austin, TX）を用いて実施した。切片を脱パラフィン化し、キシレン及び等級エタノールシリーズにより水和した。内因性ペルオキシダーゼを水中の3％ H2O2を用いて5分間クエンチした。10％正常ヤギ血清でブロッキングを30分間実施し、続いてアビジン-ビオチンブロッキングを実施した。切片を、PBS中の10％正常ヤギ血清とともに、T-ゲル精製した抗体の1：100希釈液中で4℃において一晩インキュベートし、続いてPBS中で2回洗浄した。その後、切片をビオチン化二次ヤギ抗ニワトリIgG（8μg/mL）中で1時間インキュベートした。Nova Red 基質（Vector Laboratories）をペルオキシダーゼ活性の位置づけのための沈殿基質として用い、次いで、赤い反応生成物として視覚化した。ある実験において、HPV11 L1（Signet、デダム、マサチューセッツ州から入手）に対して指向されるウサギポリクローナル抗体をヤギ抗ウサギ二次抗体とともに用いた。
【００８５】
免疫ブロット分析用に、15％アクリルアミドゲルを用いた（Laemmli, Nature, 227: 680-5（1970））。ニッケル精製したヒスチジン標識E6融合タンパク質及びHPV11嚢胞抽出物を陽性対照として用い、HPV40嚢胞抽出物を陰性対照として用いた。PAGE後、分離したタンパク質をニトロセルロースメンブレンにトランファーし、メンブレンをTween-20/Trisで緩衝化した食塩水中でブロックキングし、同じ緩衝液中の抗体調製物の1：50希釈液とともにインキュベートした。対照は、免疫感作に用いられる15μg/mLのポリペプチドを含有する試料を含むものとした。西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したウサギ抗ニワトリIgG（Sigma, St. Louis, MO）を4-クロロ-1-ナプトール及びH2O2（各々0.05％）とともに用い、メタノールを色原体として用い、検出を実施した。
【００８６】
実施例7  HPV感染症の治療
インビボ研究のために、病院/医師の協会から現地で得られたヒト包皮をHPV11に感染させ、NIH-IIIトリプル免疫不全マウスに移植したモデルを用いた（Kreiderら、J.Virol., 61:590-3（1987））。このモデルでは、乳頭腫が発達して、特有の約60日間のインキュベーション期間後に全体的に（grossly）見えるようになる。包皮の感染及び移植後、乳頭腫が肉眼で明確になったときに種々のASO又はDzの局所的適用を開始した。治療を1日おきに約20〜30日間継続し、その際、実験を終了し、組織学的に、免疫組織化学的に（E6、E7、又はLlタンパク質に対して）、インサイチュー・ハイブリダイゼーションにより（HPV11 DNAに対して）、移植片を処理した。種々の対照を除き、合計で21個の包皮移植片をDz407(HPV11-E6/E7)（n＝10）及びASO407(HPV11-E6/E7)（n＝11；6個が非保護で、5個が保護されている）で治療した。
【００８７】
最大かつ最も着実な治療の応答が、保護（3'-逆向きT）又は非保護ASOのいずれかとしてのASO407(HPV11-E6/E7)で観察された（表2）。ASO407(HPV11-E6/E7)で治療した11個の移植片のうち4個において、残存の乳頭腫傷害が残っておらず、かつ、残存のHPV11がインサイチュー・ハイブリダイゼーションにより移植片中に検出できなかったという点で完全な治療の成功が達成された。AS0407(HPV11-E6/E7)で治療した1つの移植片において、治療の最後で乳頭腫の全体の証拠が残っていたが、インサイチュー・ハイブリダイゼーションによって残存のHPV11は検出できなかった。持続性ウイルスを有する移植片（該移植片のすべてで乳頭腫のサイズの増加が一貫して実証されている）とは対照的に、この乳頭腫はサイズが若干減少した（14及び28日目でそれぞれ-4％及び-12％）。したがって、ウイルスDNAの根絶は、6個の対照移植片のうちの0個と比べて、ASO407(HPV11-E6/E7)で治療した11個の移植片のうちの5個で達成された。フィッシャーの正確な確率検定を用いて、ASOで治療した試料及び対照の間にはウイルスの陰性の割合に有意な差はなかったが（p＝0.10）、このことはおそらく試料サイズが小さいことを反映している。完全な応答に加えて、インサイチュー・ハイブリダイゼーションシグナルの局所的な減少からなる部分的な応答が、11個のAS0407(HPV11-E6/E7)治療移植片のうち残りの6個において組織学的に観察された。しかしながら、これは、乳頭腫のサイズの減少を伴わなかった。
【００８８】
（表２）治療された包皮移植片のインサイチュー・ハイブリダイゼーション（ISH）による完全な応答率
2005537028.tif 000032
【００８９】
部分的な応答をしたものにおける治療効果は、乳頭腫内の局所領域内での過錯角化症（hyper-parakeratosis）及び錯角化症の程度と反比例するようであった。これに関連して、著しい残存ウイルス染色は、最も厚い角化を示す領域中で明確であった。この結果は、治療の効力は角質層を透過するASOの能力を反映できることを示している。インビトロで観察される安定性の有意な増加に関わらず、保護されたASOp407(HPV11-E6/E7)による活性の明らかな増強はなかった。HPV11 E7ポリペプチドに対する免疫組織化学により、これらの条件下でE6/E7ポリペプチドを同時に損失することも確認された。
【００９０】
Dz407(HPV11-E6/E7)治療移植片において、10個の移植片のうちの3個は、インサイチュー・ハイブリダイゼーションを用いてもHPV11DNAの証拠を有さなかった（表2）。しかしながら、これらの場合の各々において、残存の乳頭腫が治療後に全体的に観察され、乳頭腫サイズ全体の減少は認められなかった。アポトーシス細胞は、しばしば、核の残骸の蓄積を伴って明確であった。この応答は、Dz407(HPV11-E6/E7)で治療した試料で特に顕著であり、角質化が相対的にわずかである領域でさえDzの部分的な浸透及び/又は取り込みを再度反映することができる。この細胞応答は、しばしば、コイロサイト（koilocyte）の顕著な損失を伴っていた。陽性のインサイチュー・ハイブリダイゼーションが実証された10個の移植片のうちの7個において、顕微鏡による効果が様々に観察されたが、この効果は表皮の上部層に制限された。
【００９１】
移植片を、Dr27(HPV11-E6/E7)、Dz338(HPV11-E6/E7)、及びDz407m(HPV11-E6/E7)によっても治療した。Dz27はインビトロで試験したときには触媒活性を示さなかったが、Dz27(HPV11-E6/E7)による治療では治療効果を若干生じた。この治療効果はアンチセンス効果に因ることができる。Dz338(HPV11-E6/E7)による治療では変動的な結果が生じた。いくつかの移植片において、乳頭腫の発達を完全に阻止したことが観察された。Dz407m(HPV11-E6/E7)で治療した移植片は、部分的な治療効果も示した。
【００９２】
これらの研究は、ライブラリー選択プロトコルを開発及び適用して、HPV標的mRNA、すなわちE6/E7ビスシストロン性RNA中のアクセス可能な部位を同定することを伴った。LS1選択プロトコル及びLS2プロトコルの双方で、アクセス可能な結合領域用のライブラリーを拡充するために繰り返し結合工程を用いた。LS1は、ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリーを用い、結合用のアクセス可能な部位を同定するのに対して、LS2は、ランダムRzのライブラリーを用い、Rz切断部位を直接同定する。
【００９３】
LS1及びLS2プロトコルの双方で、407/409切断部位領域を同定した。この領域は、HPV16E6/E7mRNA中のヌクレオチド427位領域に相同であり、HPV型の1つは子宮頚癌に重要である。HPV16E6/E7mRNAにおいて、部位/領域434位又は437〜447位は他の者により従前に記載された（Alvarez-Salasら、Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 9: 441-50（1999）、及びVenturiniら、Nucleic Acids Res., 27: 1585-92（1999））。異なる番号付けスキームを用いたので、他の者が同定した434位は、本明細書中に記載される358位と対応する（ハンマーヘッドリボザイムとして、Rz358は代わりの番号付けスキームにおけるヌクレオチド436位の後で切断する）。実際に、Rz358をHPV16E6/E7LS1プロトコルで同定した。しかしながら、我々の手法では、Rz358活性はインビトロでRz427の活性より若干小さく、Rz427は細胞培養中で優れた効果を示した。HPV16E6/E7中の427位は、代わりの番号付けスキームにおけるヌクレオチド505位に対応するであろう。
【００９４】
本明細書中に記載されている通り、相対的に高い標的発現レベル（及び＜トランスフェクション効率100％）に関わらず、Dzにより細胞培養中のHPV11E6/E7標的RNAが実質的に減少した。しかしながら、触媒不活性Dzによって等しい結果が生じたため、選択された部位を標的とするASOもその後のインビボでの試験に含ませた。
【００９５】
さらに、ASO及びDz構築物も、保護基としての3'逆向きTにより試験した。3'逆向きT構築物は、培地中及び細胞内での安定性が有意に増加されることを示した。しかしながら、3'逆向きT修飾は、利用される条件下で細胞培養におけるDzの効率を増加せず、より重要なことには、インビボでのASOの効力に対する実証可能な効果を有していなかった。3'逆向きT部分により活性が増強されることが、より低い用量で又は適用間隔の延長で明確になった。
【００９６】
ヒトの乳頭腫は自発的な分解を散在的に実施することが知られている。この現象は免疫学的に仲介されていると考えられる。イミキモド（imiquimod）で処理された生殖器乳頭腫の研究における8週間の観察期間中に、0/57対照の損傷は自発的な後退を受けた（Beutnerら、J. Am. Acad. Dermatol., 38 : 230-239（1998））。ヒト包皮移植片モデルを用いた本明細書中に記載される実験中には、乳頭腫は観察期間中に自発的な後退の証拠を示さなかった。このことは、対照移植片での乳頭腫の持続性及び増殖によりさらに支持される。さらに、乳頭腫の自発的な後退は免疫学的に仲介されるので、この現象が免疫不全マウスで起こることは期待されないであろう。
【００９７】
ASO407(HPV11-E6/E7)で治療した移植片は最大の治療効力を示し、11個の試料のうち5個でウイルスDNAの発現を完全に排除し、これらの5個のうち4個で乳頭腫の完全な後退を引き起こした。ウイルス発現の排除は、同時及び経時の（historic）包皮移植片対照との比較に基づいて、統計的に有意であった（p＜0.02）。11個のうちの4個（36％）のこの完全な応答（「治癒」）率は、局所的なイミキモド治療及びその他の治療で達成される率と比しても遜色ない（Beutnerら、J. Am. Acad. Dermatol., 38:230-239（1998））。AS0407(HPV11-E6/E7)で治療した11個の移植片のうち残りの7個（64％）が部分的な応答を示した。
【００９８】
その他のライブラリー選択部位を標的としたDz407(HPV11-E6/E7)及びその他のより活性が少ないDzも、ウイルスの根絶及び細胞効果に関し、少なくとも顕微鏡では治療効力を示した。10個の移植片のうち3個において、ウイルスDNAの発現はなくなったが、乳頭腫の全体の証拠は治療の最後に残っていた。ウイルス根絶及び乳頭腫の後退の間には時間のずれがある可能性がある。移植片を採取するときに動物を屠殺したため、これらの実験でこの仮説には取り組まなかった。
【００９９】
インビボでのDzの治療の効果は、アポトーシス及び核の残骸が観察され、コイロサイト症が存在しないことが観察された、表皮の上部レベルに制限されるようであった。この効果は、関連性のないDz（DzAR2000）による治療後に効果が観察されなかったため、DZ407(HPV11-E6/E7)で最大であり、特異的であるようであった。表皮の上部レベルに制限されることは、ASO（保護されたDzでは32ヌクレオチド、非保護のDzでは31ヌクレオチド、保護されたASOでは18ヌクレオチド、及び非保護のASOでは17ヌクレオチド）の浸透と比較してDzの浸透がより乏しいことを反映しているかもしれないが、このことは蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いた局所的な送達の研究では明確には支持されておらず、あるいは上記制限はDzの細胞取り込みがより低いことを反映しているかもしれない。
【０１００】
ASO及びDzの双方で観察されるHPVウイルスDNAの根絶に対する部分的な応答は、角質層の局所の厚さと明らかに相関する。HPV11DNAに対するインサイチュー・ハイブリダイゼーションにより、残存損傷中の甚だしい角質化を示す領域には強い染色が示され、角質化が少ない領域にはしばしば残存の染色がわずかしか又は全くなかったことが示された。したがって、角質化の程度は、角質化が甚だしい領域における効力の減少に寄与しうる浸透に、影響を与えるようである。角質化の程度がより低い初期の乳頭腫において、改善された結果が得られた。これにより、粘膜表面を治療するときの障害が提示されることはないであろう。あるいは、非粘膜皮膚に対し、これらの試薬は、サリチル酸の局所的使用、皮を削ぐこと（paring）、又は寒冷療法などの角質層の厚さを減少させることを目的とする前処理と組み合わせることができる。
【０１０１】
本明細書中で提供される結果は、HPVにより誘導される損傷の成功的な治療を実証している。これらの結果は、ASO、siRNA分子、Rz、及びDzなどの核酸剤を用いてインビボでHPV感染細胞の数を減少させることができることも実証している。実際に、HPV11E6/E7mRNAの成功的な標的化により、検出可能なHPVの排除をしばしば伴って、ヒト包皮での乳頭腫の発達を阻止することができる。効力は、角質化の程度に反比例するようであり、その結果、非粘膜皮膚上での臨床的な適用は、局所的送達の前（又は中に）表面角質化を減少及び/又は排除するための治療と組み合わせることができる。
【０１０２】
実施例8  HPV16-E6/E7標的部位のライブラリー選択
二本鎖DNAライブラリーを用いて、約1010個の異なるRNA配列の多コピーを有するRzライブラリーを生成した。各々の転写物は、79ヌクレオチド長であり、9Nsのランダム配列及び定義された5'及び3'末端配列に各側面を隣接させた中心のRzコアを有する。国際特許出願第PCT/US01/46178を参照のこと。固定された5'及び3'配列の主な目的は2要素ある：（1）この配列により、結合種の再生のためのPCRに基づく繰り返しプロトコルが可能となる、（2）この配列により、活性なRz種の触媒活性が実質的に（20×だけ）減少し、その後の試験で高い活性であるRzが同定される、及び（3）この配列により、SNIPカセット中へのクローニングが容易になる。
【０１０３】
標的とされるRNAのDNA鋳型を、5'プライマー中のT7プロモーターを用いたRT-PCRで生成した。転写物の該3'末端での微量不均一性の問題を回避するため、正確な3'GUC末端を有する転写物をインビトロでのランオフ転写中に生じるように、自己切断Rzをコードする3'プライマーを用いた。
【０１０４】
標的RNAとともに活性なRzライブラリーをインキュベートすることによっては、ライブラリーへの操作された膨大な多様性ゆえに、分解産物が生じなかった。これを避けるために、まずRzライブラリーは、マグネシウムなしの条件下で選択をかけることで、対応する標的RNAにアニーリングするRNA分子を単離させた。単離されかつアニーリングされたRzライブラリーRNAプールを続いてRT-PCRにより増幅し、次いで、より低い標的-RNA比で2回目の選択をかけて、選択ストリンジェンシーを増大し、バックウランドを減少させた。85℃のアニーリング温度を用いて、これらの結合工程中で標的RNAのすべての領域へのライブラリーRzの結合を最大にした。アニーリングを37℃で実施した場合は、この手順は有効に働かなった。これは、マグネシウムインキュベーションでのマグネシウムの欠如に因るものであろう。
【０１０５】
再増幅された2回目の選択Rz（sRz）ライブラリーRNAプールを用いて、5'又は3'末端を標識した標的RNAを切断した。切断された生成物をシーケンシングゲル上でG-、A-、及び/又は塩基-加水分解生成物との比較で分析し、切断部位を正確に同定した。11個の切断部位がHPV16 E6/E7標的RNA上に位置した。切断された生成物の強度は、一般に（しかし常にではない）sRzの触媒活性を反映していた。おそらく異なるRzの間の相互作用に因る、部位アクセス可能性の変化を反映する時折発生する変則的なバンドが観察された。繰り返し結合工程がないと、標的RNAの切断を同定することができなかった。
【０１０６】
HPV16 E6/E7 RNA内に、部位/領域434位（Alvarez-Salasら、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95: 1189-1194（1998））又は437〜447位（Venturiniら、Nucleic Acids Res., 27:1585-1592（1999））は従前に記載されている。異なる番号付けスキームを考えると、同定された434位は、本明細書中の358位（Rzとして、これは代わりの番号付けスキームにおけるヌクレオチド436位の後で切断する）と対応する。実際に、Rz358をHPV16 E6/E7LS1プロトコルで同定した。さらに、Rz358活性はインビトロでRz427の活性より若干低かったが、Rz427は細胞培養中で優れた効果を示した。
【０１０７】
実施例9  HPV16 E6/E7 mRNAを標的としたsRzのインビトロ切断動力学
sRzの触媒活性を単回のターンオーバー（single turnover）状態を用いて決定した。簡単に言えば、10nMの5'-32P標識した標的RNAを、40nM Rzとともに、MgCl2（1mM、5mM、又は25mM）の異なる濃度を含有する緩衝液中で37℃で30分間インキュベートした。25mMのMgCl2を用いたが、その理由は、細胞基質の存在下で観察される切断率と同様の切断率を生じると報告されていたためである（Nedbal及びSczakiel, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7: 585-9（1997））。次いで、分解産物を変性PAGEにより分析した（図6）。HPV16 E6/E7 mRNAを標的とした11個のsRzのうち8個がRz427よりさらに大きな活性を示し、最も活性なRzはLS1オリゴヌクレオチドライブラリー手順（Panら、RNA, 7:610-621（2001））を用いて同定された。他の2個は、Rz427が示すものとおおよそ遜色のない活性を示した。従前の類別化に従うと（Panら、RNA, 7:610-621（2001））、ほぼすべてのsRzが「高効率」であった。「高い効率」のカテゴリーは、40nMのRz濃度で37℃で30分後に標的RNAの約40〜50％を切断することを表す。より高濃度のマグネシウムでは、sRz触媒活性は増加したが、それらの活性間の差は幾分減少した。例えば、Rz427と比較すると、最良に選択されたsRz（sRz59）は、25mMのMgCl2中で2.4倍より活性であり、5mMのMgCl2中で4.5倍より活性であった。さらに、sRz59及びsRz68だけが1mMのMgCl2で実証可能な活性を示した。sRz59の濃度を減少させて10nMの標的を含有する反応物中で1nMにしたときでさえ、PAGE及びオートラジオグラフィー後、分解産物を依然として可視できた（図6B）。
【０１０８】
HPV16 E6/E7標的RNAに対する効率的な切断部位の分析により、GUU及びGUCが若干低めの普及率を示す他のRzの性向と同様な、GUAトリプレットの性向が明らかになった（表3）。他と区別される特徴は、トリプレットを取り囲んでいる2つの「D」ヌクレオチド（「A」、「G」、又は「U」であるが、「C」ではない）であり、5'-DRUHD-3'のコンセンサスが得られた。他の標的RNAを用いた、より進んだ分析により、ほぼ3分の2の時間で「N」が「G」である同様のコンセンサス5'-DNUHD-3'が得られた。
【０１０９】
（表３）切断部位を取り囲むヌクレオチドの有用性の分析
2005537028.tif 000033
種々の標的RNA中の能率的な切断部位の同定後、NUHトリプレットを取り囲む位置におけるヌクレオチドをまとめた。「位置」は、ヘリックスIII（16×）中のNUHトリプレット上流の相補的な隣接配列中のヌクレオチド3〜10位を示し、NUHトリプレット（1×）の下流の相補的な隣接配列中のヌクレオチド1〜6位を示している。ヌクレオチド位置に以下のように番号をつけ、切断部位は下線を引いたヌクレオチド（17及び1.1の番号をつけたもの）の間に位置する。
2005537028.tif 000034
【０１１０】
HPV16 E6/E7標的RNAをmFoldプログラムを用いてモデル化した（図7；sRz部位の位置は矢印で表されている）。一般に、sRz部位は、一方の隣接領域が二本鎖であると予測される領域中にあり、かつ、他方の隣接領域が一本鎖であると予測される領域中にある、「転移部（transition）」に見出される。驚くべきことに、（種々の標的中の約50個の部位の同定に基づいて）隣接配列が双方とも一本鎖領域中にあることが予測される場合、sRz部位はほとんど（めったに）見いだされない。実際に、mFoldを用いて、HPV16 E6/E7 RNA中のこのような部位を標的とした3つのRz（mRz；図7）を構築し、Rzが不活性であること（mRz406及びmRz565）、あるいは非常に低い活性を示すこと（mRz327）を見出した。
【０１１１】
動力学的分析のため、40nMのRz及び10〜1000nMの標的RNAを種々の期間（40秒間〜60分間の範囲に及ぶ）インキュベートし、単回及び多回のターンオーバー状態双方に対する動力学的データを得た。HPV16 E6/E7に対する結果により、一般に、約20〜80nMのKmが明らかとなった。sRz59は、Rz427のkcat/Km値である2.84×106（M-1min-1）の約5倍大きい値である1.52×107（M-1min-1）のkcat/Kmを示した。Km値が類似しているようであるため、おそらくこれはRz59における触媒活性のより速い化学的過程を表している。
【０１１２】
実施例10  sRz標的HPV16 E6/E7 mRNAの細胞培養分析
HPV16 E6/E7 RNAを標的とするsRzを本明細書中に記載されるようにSNIPAAカセット内に置いた。HPV16-E6/E7標的構築物及びSNIPAAsRz構築物を293T細胞中に同時トランスフェクトし、HPV16-E6/E7 RNA発現に対するsRzの効果について培養物を分析した。sRz（sRz59、sRz68、sRz187、sRz251、及びsRz275）を含有するSNIPAA構築物又はSNIPAA-Rz427（LS1手順を用いて同定される最も活性なRz）によるトランスフェクション後3日目及び5日目に、HPV16 E6/E7 RNAの実質的な減少が観察された（図8A）。3日目に、SNIPAA-sRz59によって最大の減少が生じた。5日目までに、空のSNIPAAカセットとの同時トランスフェクションと比較して、E6/E7 RNA転写物はすべてのsRzトランスフェクションにおいて75％減少した。
【０１１３】
同時トランスフェクション実験を繰り返し、QPCRを用いてHPV16 E6/E7 mRNAレベルを測定した（図8B）。SNIPAAsRz構築物はすべて、HPV16 E6/E7標的RNAレベルを減少することに有効であり、5日目に約60〜80％の減少を達成した。本質的にすべてのHPV16 E6/E7 RNAレベルの減少は、p＜0.001で統計的に有意である。統計的に有意な減少も1日目及び7日目において明らかであり、それぞれ34％及び47％平均で減少した。図8Bに示されるこの減少は、HPV11 E6/E7標的RNA中の選択された部位を標的とするRzを発現するように設計された類似のSNIPAA-Rzカセットで観察される減少より若干より大きかったが、2つのITRzを含有するSNIPAA構築物で観察される90％の減少より小さかった。対照的に、Rz59及びRz427の触媒不活性型（mRz59及びmRz427）を含有するSNIPAA構築物による平行実験では、HPV16 E6/E7 RNA転写物の有意な減少は生じなかった（図8C）。
【０１１４】
増殖実験をSiHa細胞（頚部扁平細胞癌由来のヒト細胞株）を用いて実施した。SiHa細胞はHPV16の組み込まれたコピーを含有し、細胞の増殖はPV16 E6/E7転写物の継続した発現に少なくとも一部分は依存している（Rorke, J. Natl. Can. Inst., 89:1243-1246（1997）; Madrigalら、Gyn. Onc., 64:18-25（1997）；ならびにTan及びTing, Cancer Res., 55:4599-4605（1995））。このプロトコルは、増殖が阻害された細胞の選択を必要とする一方で、それにも関わらずE6/E7発現が維持されたモデル系を提供する。
【０１１５】
SiHa細胞を、SNIPAAカセット中に種々のsRzを含有するpCMV/BSDプラスミドでトランスフェクトし、トランスフェクトされた集団を抗生物質抵抗性（10μg/mLのブラストシジンによる）について選択した。6日後に選択を完了した。8日後、細胞を3連の試料中で計数した。59、68、又は251SNIPAAsRz構築物でトランスフェクトされた集団は、空のSNIPAAカセット又はレポーター発現構築物でトランスフェクトされた細胞と比較して、細胞増殖中で40〜45％の減少を示した（p＜0.05）。これらの減少は、他の研究（Madrigalら、Gyn. Onc., 64:18-25（1997）、ならびにTan及びTing, Cancer Res., 55:4599-4605（1995））で観察された「最大の減少」に対応している。E6/E7RNA発現レベルが80％減少することにより、50％の比率の増殖を維持するために十分なE6/E7ポリペプチドが依然として提供される可能性がある。しかしながら、SiHa細胞の増殖は、目下、E6/E7の発現に部分的にのみ依存している可能性もある。従来同定されたSNIPAA-Rz427でトランスフェクションされた細胞及び187又は275SNIPAAsRz構築物でトランスフェクトされた細胞は、増殖率のより穏当な減少（15％まで）を示した。繰り返し実験において、QPCRによるRNAの分析により、5日目におけるHPV16 E6/E7標的RNAの等しい減少が明らかになった。2つのITRzを含有するSNIPAA構築物による他の実験において、7日目及び12日目に約60〜75％の減少が観察された。
【０１１６】
概説すると、LS2ライブラリースクリーニング手順は、長い構造的な標的RNA中の効率的な切断部位を決定する比較的端的な早い方法を提供する。繰り返し手順を能率化して2回の選択とし、全手順を数日間で終えることができる。有意な数の効果的な切断部位が一般に同定される。同定されるほとんどのsRzは、インビトロで「高い効率」であった。これは、ライブラリープール内でのそれらの活性が、固定された5'及び3'配列の存在により著しく減少し、それらが外因性隣接配列なしで構築・試験された場合には、活性は主に増加することが確実である、という事実を一部反映している。より重要なことは、HPV16 E6/E7 RNAを標的とするこれらの選択されたRzは、細胞培養モデルで高い効率であり、インビボモデルで用いることができることである。これらの結果は、LS2方法が、ハンマーヘッドリボザイムを設計するのに用いることができる比較的単純な繰り返しRzライブラリースクリーニング方法であることを実証している。
【０１１７】
実施例11  B型肝炎ウイルス（HBV）RNAを標的としたRz及びDz特異性の分析
種々のRz及びDz変異体（Dz885(HBV)及びDz879(HBV)の変異体；Panら、RNA, 7:610-621（2001）及び国際特許出願第PCT/US01/46178号）を、標的RNAと相互作用してこれを切断するRz又はDzの能力に対する変異の影響について評価するために試験した。Dz885(HBV)及びDz879(HBV)の変異体を合成し、HBVRNA転写物（Panら、RNA, 7:610-621（2001））とともにインキュベートした。変異体をRz又はDzのN又はQ領域に導入した（図9A）。ヌクレオチドの番号付けを図9Aに示した。
変異体を生成するために、「G」を「A」で置き換え、「A」を「G」で置き換え、「C」を「T」又は「U」で置き換え；「T」又は「U」を「C」で置き換えた。多くの変異体がRz及びDzの活性を減少させた（表4及び図9B）。いつくかの変異体はRz及びDzの触媒活性を増加した（表4及び図9B）。
【０１１８】
（表４）変異体Rz及びDzの相対活性
2005537028.tif 000035
【０１１９】
実施例12  HPV16 E6/E7 mRNAを標的とするsiRNAの細胞培養分析
HPV16mRNAに対するRNA干渉を誘導するように設計されたRNA分子を発現するカセットを含有する構築物を作成し、他で記載されるようにして（米国仮特許出願第60/449,066号）Flip293細胞において試験した。具体的には、以下のカセットを、トランスフェクション後1日目に、CMVプロモーター配列により作動した場合に細胞内のHPV16mRNAレベルを減少させる能力について試験した：p1CLIPS/HPV16C+50-68+GUU；p1CLIPAS/VPV16C+68-50+GUU；pSIR/HPV16siC+50-68+GUU；p1CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；pSIRHP/HPV16C+50-68+GUU；p2CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；p2CHOPHP/HPV16C+50-68+GUU；pSNIPHP/HPV16C+50-68+GUU；p2CLIRHR/HPV16C+50-68+GUU；p2CHOPHR/HPV16C+50-68+GUU；pSNIPHR/HPV16C+50-68+GUU；及びpSNIP（空のカセット）。さらに、以下のカセットを、トランスフェクション後2日目に、U6プロモーター配列により作動した場合に細胞内のHPV16mRNAレベルを減少させる能力について試験した：p1CLIPS/HPV16C+50-68+GUU；p1CLIPAS/HPV16C+68-50+GUU；pSIR/HPV16siC+50-68+GUU；p1CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；pSIRHP/HPV16C+50-68+GUU；p2CLIPHR/HPV16C+50-68+GUU；p2CHOPHR/HPV16C+50-68+GUU；pSNIPHR/HPV16C+50-68+GUU；sRz59を含有するpSNIPカセット；及びpSNIP（空のカセット）。
【０１２０】
標的mRNAの有意な減少が、pSIR/HPV16siC+50-68+GUUカセット又はpSIRHP/HPV16C+50-68+GUUカセットを含有する細胞で、カセットがCMVプロモーター配列から発現されたときに検出された（図10A）。標的mRNAの有意な減少も、pSIR/HPV16siC+50-68+GUUカセット、pSIRHP/HPV16C+50-68+GUUセット、又はpSNIPHR/HPV16C+50-68+GUUカセットを含有する細胞で、カセットがU6プロモーター配列から発現されたときに検出された（図10B）。
【０１２１】
これらの結果は、RNA干渉を誘導し、かつ、細胞内のHPV16mRNAレベルを減少させるRNA配列を発現するようにカセットを設計することができることを実証している。
【０１２２】
実施例13  Rz及びDzの動力学的分析
Rz59(HPV16E6/E7)、Dz57(HPV16E6/E7)、及びDz589(HPV16E6/E7)の動力学をHPV16 E6/E7 RNAを標的として用いて決定した（表5）。Rz59(HPV16E6/E7)及びDz57(HPV16E6/E7)はLS2プロトコルを用いて同定された切断部位を標的とする一方、Dz589(HPV16E6/E7)はLS3プロトコルを用いて同定された切断部位を標的とする。これらの結果は、高い触媒活性レベルを有するようにRz及びDzを設計することができることを実証している。さらに、測定されたkm値は、これらのRz及びDzが細胞内で高いレベルで機能できることを示している。
【０１２３】
（表５）標的RNAのRz及びDz切断の動力学的分析
2005537028.tif 000036
【０１２４】
他の実施態様
本発明は発明の詳細な説明との組み合わせで記載されている一方、先の記載は例示であって付記の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことを意図していると理解される。その他の実施態様、利点、及び変更は特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】LS3（Dz選択ライブラリー）法の図式による概観である。
【図２】LS3法に関する3つのパネルを含む。パネルAは、1つの鎖がDzのライブラリーを含有する二本鎖DNAを生成するのに用いるPCR反応の図式である。TS-17（配列番号：1）及びBS-17（配列番号：2）プライマーを標識する。増幅された鋳型（配列番号：3）は、プライマー配列及び触媒性コア配列（下線を引いてある）の側面に位置するランダムヌクレオチド伸長部を含有する。パネルBは、DzライブラリーのPCR産物のシークエンシングゲルの写真である。パネルCは、リボースヌクレオチド（TSR及びBSR）を含有するプライマー及び2-デオキシリボース（TSD及びBSD）プライマーを用いたいくつかの増幅反応の図である。右向きの太線は、活性なDz配列を含有する鎖を表している。
【図３】炭素スペーサーを含有する核酸分子の図である。
【図４】示されたRz（A）及びDz（B）を用いて、インビトロアッセイ中で生成された分解産物を分離しているゲルの写真を含む。
【図５】図5Aは、示したCLIP及びCHOP部分を有するSNIPAA発現カセットを図表により表したものである。S1及びS2は、CLIP中のシス作用Rzに対する自己触媒切断部位を同定する一方、S3及びS4は、CHOP中のシス作用Rzに対する自己触媒切断部位を同定する。dITRzは遊離のトランス作用Rzについて表されるが、単一のITRzをdITRzの代わりに用いることができる。ポリ（A）領域は、SNIPAAカセット中の遊離のdITRz又はITRzの3'末端の近くにある。CHOP部分は、それらの自己触媒活性を増強するシス作用Rzのためのより長い相補的な隣接配列を含む。図5Bは、（1）HPV11 E6/E7標的mRNAを発現するように設計された構築物、及び（2）示した標的部位を標的とするITRz又はdITRzを発現するように設計された構築物で同時トランスフェクションされた細胞中のHPVl1 E6/E7 mRNAの相対量をプロットした棒グラフである。図5Cは、安定的にHPV11 E6/E7標的mRNAを発現し、かつ、示した部位を標的にするように設計されたDzをトランスフェクトした細胞中のHPV11 E6/E7 mRNAの相対量をプロットした棒グラフである。
【図６】ライブラリーにより選択された部位を標的するRzによるHPV16 E6/E7 RNAのインビトロ切断を実証するゲルの2つの写真を含む。パネルA：40nMの個々のRz及び10nMの5'末端32P標識HPV16標的RNA（782ヌクレオチド）を、25mMのMgCl2を含有する20mMのTris-HCl（pH7.4）中、37℃で30分間インキュベートした。パネルB：1、2.6、6.4、16、40、及び100nMのRz59及び10nMの5'末端32P標識HPV16 E6/E7 RNA（782ヌクレオチド）を、25mMのMgCl2を含有する20mMのTris-HCl（pH7.4）中、37℃で30分間インキュベートした。
【図７】mFoldプロットを用いて決定されたHPV16 E6/E7 mRNAの予測構造の図である。ライブラリー選択により同定されたRz部位の位置をsRz部位として標識し、mFoldモデリングに基づいて選択されたRz部位の位置をmRzとして標識する。
【図８】図8Aは、示したRzを発現するSNIPAAsRz構築物でトランスフェクトされた細胞中のHPV16 E6/E7 RNAのレベルを定量化するのに用いたゲルの写真である。「AA」は、空のSNIPAAカセット（すなわち、E6/E7を標的とするトランス作用Rzを含まない）を表す。図8Bは、示したRzを発現するSNIPAAsRz構築物でトランスフェクトされた細胞中の相対HPV16 E6/E7 mRNAレベルをプロットした棒グラフである。空のSNIPAAカセットを対照として用いた。図8Cは、示したRzを発現するSNIPAAsRz構築物でトランスフェクトされた細胞中の相対HPV16 E6/E7 mRNAレベルをプロットした棒グラフである。空のSNIPAAカセットを対照として用いた。mRz59及びmRz427は、それぞれRz59及びRz427の触媒不活性型を含有するSNIPAA構築物を表す。IRzは、B型肝炎ウイルスを標的とするトランス作用Rzを含有する、関連性のないSNIPAA構築物を表し（Panら、RNA, 7:610-621（2001））、pVAX1はベクター対照を表す。
【図９】図9Aは、標的RNAと相互作用するRz及びDzの図である。Rz及びDz切断部位を矢印により示す。切断部位の側面に位置する標的RNAと相互作用するRz及びDzヌクレオチドの数をN1〜5及びQ1〜5として標識する。図9Bは、種々のRz及びDz変異体に対する標的RNA切断の量を測定するのに用いたゲルの写真である。特定の変異体を表4に記載する。
【図１０】図10Aは、トランスフェクション（CMVプロモーター）後1日目に以下の核酸を含有する細胞中のHPV16mRNAの相対レベルをプロットした棒グラフである：カラム1：p1CLIPS/HPV16C+50-68+GUU；カラム2:p1CLIPAS/HPV16C+68-50+GUU；カラム3：pSIR/HPVI6siC+50-68+GUU；カラム4：p1CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム5：pSIRHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム6：p2CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム7：p2CHOPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム8：pSNIPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム9：p2CLIPHR/HPV16C+50-68+GUU；カラム10：p2CHOPHR/HPV16C+50-68+GUU；列11：pSNIPHR/HPV16C+50-68+GUU；及び列12：pSNIP（空のカセット）。図10Bは、トランスフェクション（U6プロモーター）後2日目に以下の核酸を含有する細胞中のHPV16mRNAの相対レベルをプロットした棒グラフである：カラム1：p1CLIPS/HPV16C+50-68+GUU；カラム2：p1CLIPAS/HPV16C+68-50+GUU；カラム3：pSIR/HPV16siC+50-68+GUU；カラム4：p1CLIPHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム5：pSIRHP/HPV16C+50-68+GUU；カラム6：p2CLIPHR/HPV16C+50-68+GUU；カラム7：p2CHOPHR/HPV16C+50-68+GUU；カラム8：pSNIPHR/HPV16C+50-68+GUU；カラム9：sRz59を含有するpSNIPカセット；及びカラム10：pSNIP（空のカセット）。
【図１】
2005537028.tif 000038
【図２】
2005537028.tif 000039
【図３】
2005537028.tif 000040
【図４】
2005537028.tif 000041
【図５】
2005537028.tif 000042
【図６】
2005537028.tif 000043
【図７】
2005537028.tif 000044
【図８】
2005537028.tif 000045
【図９】
2005537028.tif 000046
【図１０】
2005537028.tif 000047
【国際調査報告】
2005537028.tif 000048
2005537028.tif 000049