(57)【要約】本発明は、IRES(内部リボソームエントリー部位)を有するヒトFGF-1遺伝子の単離核酸、ヒトFGF-1遺伝子の5'非翻訳領域(5'NTR)末端から誘導される前記ヌクレオチド配列に関する。本発明はまた、真核細胞における少なくとも1つの前記配列を有する関心対象の少なくとも1つの分子の発現カセットに関する。前記カセットは、直接またはベクターの形態で宿主細胞に挿入でき、それ故、本発明はさらに、組換えベクター類および前記ベクターまたはカセットによってトランスフェクトされた宿主細胞に関する。
2005530512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IRES活性に関して、配列番号1(A)、配列番号30(B)、配列番号36(C)および配列番号42(D)にそれぞれ対応するFGF1の転写物A、B、CおよびDと同一か、または相同的な配列を含有する単離された核酸の使用。
【請求項２】
前記核酸が、配列番号2 (A2)、配列番号3 (A3)、配列番号4 (A4)、配列番号5 (A5)、配列番号6 (A6)、配列番号7 (A7)、配列番号8 (A8)、配列番号9 (A9)、配列番号12 (A12)、配列番号16 (A16)、配列番号17 (A17)、配列番号18 (A18)、配列番号19 (A19)、配列番号20 (A20)、配列番号26 (A26)、配列番号21 (A21)、配列番号27 (A27)、配列番号28 (A28)および配列番号29 (A29)を含む群から選択される配列と同一か、または相同的な配列を含有することを特徴とする請求項1に記載の使用。
【請求項３】
前記核酸が、配列番号31(B2)および配列番号34(B10)を含む群から選択される配列と同一か、または相同的な配列を含有することを特徴とする請求項1に記載の使用。
【請求項４】
前記核酸が、配列番号36(C2)、配列番号40(C10)および配列番号41(C11)を含む群から選択される配列と同一か、または相同的な配列を含有することを特徴とする請求項1に記載の単離された核酸の使用。
【請求項５】
真核細胞において関心対象の少なくとも1つの遺伝子を発現するカセットであって、請求項1から4に定義されている少なくとも1個の核酸を含有することを特徴とするカセット。
【請求項６】
関心対象の少なくとも2つの遺伝子を含有することを特徴とする請求項5に記載の発現カセット。
【請求項７】
請求項5の主題である発現カセットを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項８】
プラスミドベクター、またはレトロウィルス類、レンチウィルス類およびアデノウィルス類を含む群から選択されるウィルスベクターであることを特徴とする請求項7に記載の発現ベクター。
【請求項９】
請求項5の主題である発現カセットまたは請求項7の主題である組換えベクターを含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項5の主題である発現カセットまたは請求項7の主題である組換えベクターを含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項１１】
請求項5の主題である発現カセットまたは請求項7の主題である組換えベクターを含むことを特徴とする形質転換動物。
【請求項１２】
配列番号1 (A)、配列番号30 (B)、配列番号36 (C)、配列番号42 (D)、配列番号2 (A2)、配列番号3 (A3)、配列番号4 (A4)、配列番号5 (A5)、配列番号6 (A6)、配列番号7 (A7)、配列番号8 (A8)、配列番号9 (A9)、配列番号12 (A12)、配列番号16 (A16)、配列番号17 (A17)、配列番号18 (A18)、配列番号19 (A19)、配列番号20 (A20)、配列番号26 (A26)、配列番号21 (A21)、配列番号27 (A27)、配列番号28 (A28)、配列番号29 (A29)、配列番号31 (B2)、配列番号34 (B10)、配列番号36 (C2)、配列番号40 (C10)、配列番号41 (C11)および配列番号42 (D)の群から選択される配列と少なくとも60%の同一性を示す配列からなるIRES活性を有する単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IRES(内部リボソームエントリー部位)活性を有する単離された核酸に関するものであり、前記ヌクレオチド配列は、ヒトFGF-1遺伝子の5'非翻訳領域(5'NTR)末端由来である。本発明はまた、真核細胞において関心対象の少なくとも1つの分子を発現させるためのカセットに関するものであり、前記カセットはFGF-1 IRESを含み、同一のmRNAから数個の分子を共発現することを可能にする。前記カセットは、宿主細胞に直接導入できるか、またはベクターの形態で挿入できるので、組換えベクター類および前記ベクターまたはカセットをトランスフェクトされた宿主細胞もまた、本発明の一部である。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の調節は、転写、成熟、mRNAの安定、および翻訳という幾つかのレベルで起こる。mRNAの翻訳は、厳密な調節を受け、遺伝子発現の調節における重要なステップであることが判る。例えば、c-myc癌原遺伝子の翻訳増大は、ブルーム症候群と関連している(20)。この翻訳制御異常は、これらの患者が癌発症へと進行する危険性を増大させる一因となる可能性がある。
【０００３】
翻訳レベルにおける調節には、多くの蛋白質が関与し、主に5'および3'非翻訳領域(NTR類)によって起こるが、mRNA類のコード部分の特定の構造要素も当然含まれる。翻訳開始ステップ、それ自体もまた調節を受ける。
【０００４】
従来の翻訳開始は、転写物の5'末端に位置しているキャップの認識により起こる。この構造は、翻訳開始因子が結合することを可能にする。このステップにおいて、それは、前記キャップと40Sの小さなリボソームサブユニットとの間のリンカーの役割を担うeIF4F複合体である。この複合体は、eIF4E(キャップ結合蛋白質)、eIF4A(RNAヘリカーゼ)および他の翻訳開始因子であるmRNAと40Sの小さなサブユニットとの間を架橋する役割を担うeIF4Gのそれぞれ3つの因子からなる。後者が一旦補充されると、(正規または非正規な)翻訳開始コドンに遭遇するまでmRNAを「走査する」こととなり、その後、60Sサブユニットは、40Sサブユニットと会合し、リーディングフレームの翻訳が開始され、ステップコドンに到るか、またはリボソームが解離するまで行われる。
【０００５】
ある一定のメッセンジャーmRNA類には、キャップがなく、したがってMarylin Kozakにより記載された機構によっては翻訳できない。これは、ピコルナウィルスRNA類の場合であるが(14)、ここでは翻訳を開始する他のシステムが実証されており、5'非翻訳領域(5'NTR)における内部リボソームエントリー部位またはIRESが関与する。この部位は、リボソームが、まだ十分に理解されていない機構によりmRNA内に直接的に結合することを可能にする。この発見以来、IRES類は、フラビウィルス類、ペスチウィルス類、トバモウィルス類およびレトロウィルス類などのウィルス類の他の群のRNAにおいて同定されている(19)。
【０００６】
これらのウィルスRNA類の翻訳において細胞蛋白質が関与していることにより、細胞起源の転写物における内部エントリーのこの機構に対する研究が促された。1991年に、このような部位は、BIP(イムノグロブリン重鎖結合蛋白質)(8)のmRNAに特徴づけられ、またより最近では、線維芽細胞増殖因子FGF-2(18)、c-myc癌原遺伝子(12)、増殖因子PDGF(血小板誘導増殖因子)(2)およびVEGF(血管内皮増殖因子)(6)のmRNAに特徴づけられた。
【０００７】
FGF-2 mRNAは、代替の翻訳開始が非正規のCUGコドンで実証されている約500個のペプチドの長い5'NTRを有し(1)、FGF-2の5種のイソ体が形成されることになる。内部リボソームエントリー部位もまた、ヌクレオチド154と318との間に位置している(データは公表されていない)。
【０００８】
VEGF mRNA自体もまた、ごく最近、代替の開始の存在が、非正規のCUGコドンで実証された長い非翻訳化配列を有している。この5'NTRにおいて、2つのIRESの存在が実証されており、1つはCUGの上流に位置し、他は従来のAUG開始コドンに位置している(6)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
驚くべきことに、これら2つの増殖因子の産生は、血管新生活性を有するIRES類により、翻訳レベルで制御される。これら2つの因子は、発現腫瘍の新血管新生の過程の間に誘導される。第3の主要血管新生因子のFGF-1があるが、そのmRNAの翻訳は、今日まで研究されていなかった。
【００１０】
そこで、本出願人らは、FGF-1 mRNAの翻訳開始が、5'非翻訳領域に位置している内部エントリー部位に関与していることを実証した。さらに、特にFGF-1の転写物Aは、現在までに試験された他の細胞RNA IRES類よりも良好なインビボIRES活性(マウス筋肉)を予想外にも有していることが認められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
FGF-1のゲノム構造(11)は、コード配列を含有する3つのエクソンを有する(図番号1)。後者はスプライシングを受け、単一のリーディングフレームの形成をもたらす。エクソン3は、ポリアデニル化部位を有する3'NTR末端を含有する。
【００１２】
ヒトFGF-1遺伝子に関して4種の異なるプロモーターが存在し、それらは一旦活性化されると、4種の異なる主要な転写物の形成をもたらす。成熟後、これら4種の転写物間の相違は、それぞれの5'NTR(図番号2)にのみ存在する。エクソン1は、非コードの4種のエクソン(A、B、C、D)のうちの1種が、それぞれのプロモーターの活性化に続いて結合するスプライス受容体部位を有する。
【００１３】
転写物AおよびBは、主として脳、腎臓および網膜に発現される主要な転写物である(図番号2)。これら2つの転写物は、それぞれ435個および147個のヌクレオチドの5'NTRを有する。
【００１４】
転写物CおよびDは、インビボで極めて弱く発現される副転写物である(11)。しかしながら、これらは、グリア芽細胞腫由来系に存在し、血清欠乏またはPMA(ホルボール12-ミリステート13-アセテート)処理に供されると、血管起源の線維芽細胞または平滑筋細胞に誘導され得る。これら2つの転写物は、それぞれ149個および92個のヌクレオチドの5'NTRを有する。
【００１５】
FGF-1をコードするこれら4種のmRNA変異体の存在は、ヒト、マウス(9)およびウシ(16)に共通している。これらのヒト5'NTR配列の比較では、ウシおよびマウス(9)のものと良好な相同性が示された。実際、これら種々の生物(9、11、16)由来のFGF-1 5'NTRの配列整列は、5'NTR Aと70%に近い類似性で、これら非コード配列の良好な保存を示した。非翻訳化領域の配列におけるこのような保存は、通常、比較的低選択圧で供され、したがって急速な進化に供される領域であるこれらの5'NTRの重要な機能を推察することを可能にさせる。
【００１６】
ヒトおよびマウスFGF-1の各転写物A、B、CおよびDの5'NTRのIRES活性は、後の記載において実証する(実施例1、B1)。
【００１７】
たいていの場合、IRESの存在は、Cos-7細胞をEGF-1 5'NTR類を含有するCAT-I-NuCATベクター類によりトランスフェクトし、次いでトランスフェクト細胞をウェスタンブロッティングに供することにより求められる。NuCAT蛋白質の発現は、転写物A、B、CおよびDの存在下で見られ、これら4種の転写物IRES活性を反映する(定量分析)。ウシ由来のもの、特にマウス(9)由来のものと、ヒト5'NTR配列との強い相同性により、それからIRES部位が、マウスおよびウシのFGF-1にも存在することが推論される。
【００１８】
ヒトのFGF-1転写物各々の5'NTR類のインビトロIRES活性は、細胞タイプおよび細胞状態の関数としても研究される(定量分析)(実施例1B1)。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
これを行うために、IRES活性は、種々の系においてレポーター遺伝子(実際、LucF/LucR遺伝子)をコードするバイシストロンベクターによって測定される。LucF/LucR比の算出により、5'NTR配列の内部エントリー能力に関する情報を提供し、この配列のIRES活性を規定する。種々の結果の中でも、転写物Aの極めて良好なIRES活性が、Hela細胞およびSk-Hep-1細胞に見られ、FGF-2 IRESの活性よりも大きい。
【００２０】
本出願人らはさらに、インビトロのヒト細胞に対して、ヒト5'NTR類(転写物AおよびB)構造のIRES活性を、マウス5'NTRのIRES活性と比較した(実施例1B2)。ヒト配列との直接的な比較を実施するために、トランスフェクションを、Cos-7細胞、Sk-Hep-1細胞およびSaos-2細胞において実施した。これらの実験により、ヒトおよびマウスAおよびB変異体に関するIRES活性プロフィルは、同様であることを示された。
【００２１】
本発明は、初めてFGF-1の5'NTR類のIRES活性を実証したことのみならず、引き続き実証するように、ヒトFGF-1の種々の転写物A、B、CおよびDにおけるIRES部位を特性決定したことに存する(実施例2)。より具体的には、本出願人は、インビトロおよびインビボ双方でIRES活性を有する各転写物A、B、CおよびDの最小配列を同定することに成功した。これを行うために、FGF-1メッセンジャーRNAから誘導された種々の連続ヌクレオチド配列を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするバイオシストロンベクターにサブクローン化した。種々の哺乳動物細胞系およびヒト細胞系(インビトロ)をトランスフェクトし、またマウス筋肉(インビボ)をこれらのベクター類により形質導入した。
【００２２】
したがって、ヒトFGF-1のIRES活性および相同性によるマウスFGF-1のIRES活性は、本出願において初めて開示されている。この活性は、これらの転写物の5'NTR類のある一定の断片に有するので、この活性は、各転写物A、B、CおよびDに関して実証されている。
【００２３】
残りの記載および請求項において、語句「相同性配列」は、所与の配列と少なくとも60%同一性、有利には80%、好ましくは95%を示す配列を意味し、この場合、1つの種から他の種へ、特にマウスからヒトへの変異性から生じる相同性である。
【００２４】
したがって、本発明はまず第一に、ヒトFGF-1 mRNAの転写物A(以後Aと称される)の5'NTRのヌクレオチド1と435との間に位置する配列番号1と同一か、または相同性の配列を含有する単離された核酸のそのIRES活性に関しての使用に関する。この配列は、転写物Aの5'NTRの全体配列に相当する。
【００２５】
既に記述されたように、本出願人はまた、転写物A上に、配列番号1よりも短く、IRES活性を有するヌクレオチド配列を同定することに成功し、したがって、IRES部位がこれらの配列に含まれることを示唆している。
【００２６】
したがって、本発明の主題はまた、特にそのIRES活性に対しての使用であり:
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド1と390との間に位置している配列番号2(以後A2と称される)と同一の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド39と435との間に位置している配列番号3(以後A3と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド122と435との間に位置している配列番号4(以後A4と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド214と435との間に位置している配列番号5(以後A5と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド122と390との間に位置している配列番号6(以後A6と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド214と390との間に位置している配列番号7(以後A7と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド269と435との間に位置している配列番号8(以後A8と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド269と390との間に位置している配列番号9(以後A9と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド1と366との間に位置している配列番号12(以後A12と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド122と366との間に位置している配列番号16(以後A16と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド214と366との間に位置している配列番号17(以後A17と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド269と366との間に位置している配列番号18(以後A18と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド1と344との間に位置している配列番号19(以後A19と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含み、
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号1のヌクレオチド1と330との間に位置している配列番号20(以後A20と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含む。
【００２７】
配列番号18(A18)に対応する核酸は、IRES活性を有する最短のヒトFGF-1転写物A断片を構成する。100個のヌクレオチドの位数のより短い配列に関して、有意なIRES活性は、
少なくともヒト腺癌細胞においては得られない。実際、以後の実施例から明らかなように、IRES活性は、以下の断片:
- 配列番号1のヌクレオチド303と435との間に位置している配列番号10(以後A10と称される)と同一の配列か、または相同性の配列、
- 配列番号1のヌクレオチド303と390との間に位置している配列番号11(以後A11と称される)と同一の配列か、または相同性の配列、
- 配列番号1のヌクレオチド282と435との間に位置している配列番号13(以後A13と称される)と同一の配列か、または相同性の配列、
- 配列番号1のヌクレオチド282と390との間に位置している配列番号14(以後A14と称される)と同一の配列か、または相同性の配列、
- 配列番号1のヌクレオチド282と366との間に位置している配列番号15(以後A15と称される)と同一の配列か、または相同性の配列、に関しては有意ではない。
【００２８】
既に記述されたように、本出願人は、ヒトFGF-1転写物Bの5'NTR末端が、特に筋芽細胞において、かなりのIRES活性を有することを実証している。
【００２９】
その結果、本発明はまた、ヒトFGF-1 mRNAの転写物B(以後Bと称される)の5'NTRの配列番号1のヌクレオチド1と147との間に位置している配列番号30(以後A19と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含有することを特徴とするIRES活性を有する単離された核酸に関する。言い換えると、配列番号30は、転写物Bの5'NTRの全配列に相当する。
【００３０】
本出願人はまた、転写物B上に配列番号30よりも短く、IRES活性を有するヌクレオチド配列を同定することに成功し、したがって、IRES部位がこれらの配列に含まれることを示唆している。
【００３１】
したがって、本発明の主題はまた:
-  IRES活性を有する単離された核酸は、配列番号30のヌクレオチド1と93との間に位置している配列番号31(以後B2と称される)と同一の配列を含む、IRES活性を有する単離された核酸である。
【００３２】
配列番号31(B2)に対応する核酸は、IRES活性を有する最短のヒトFGF-1転写物B断片を構成する。最初の39番目が欠失している配列に関して、有意なIRES活性は、少なくともヒト腺癌細胞において得られない。実際、以後の実施例から明らかなように(図8B)、IRES活性は、以下の断片:
- 配列番号30のヌクレオチド39と147との間に位置している配列番号32(以後B3と称される)と同一の配列か、または相同性の配列、
- 配列番号30のヌクレオチド39と93との間に位置している配列番号33(以後B4と称される)と同一の配列か、または相同性の配列、では有意ではない。
【００３３】
本出願人はまた、ヒトFGF-1転写物Cの5'NTR末端および細断片が、かなりのIRES活性を有することを実証した。
【００３４】
その結果、本発明の主題はまた、ヒトFGF-1 mRNAの転写物C(以後Cと称される)の5'NTRのヌクレオチド1と149との間に位置している配列番号36と同一の配列か、または相同性の配列を含有することを特徴とするIRES活性を有する単離された核酸に関する。この配列は、転写物Cの5'NTRの全配列に相当する。
【００３５】
IRES部位が、配列番号36のヌクレオチド1と103との間に本出願人によって同定されたので、本発明はまた、配列番号36のヌクレオチド1と103との間に位置している配列番号37(以後C2と称される)と同一の配列か、または相同性の配列を含有することを特徴とするIRES活性を有する単離された核酸に関する。
【００３６】
最初の59番目が欠失している配列に関して、有意なIRES活性は、少なくともヒト腺癌細胞において得られない。実際、以後の実施例から明らかなように(図8B)、IRES活性は、以下の断片:
- 配列番号36のヌクレオチド59と149との間に位置している配列番号38(以後C3と称される)と同一の配列を含む、IRES活性を示す単離された核酸、
- 配列番号36のヌクレオチド59と103との間に位置している配列番号39(以後C4と称される)と同一の配列を含む、IRES活性を示す単離された核酸、
では有意ではない。
【００３７】
さらに、出願者は、ヒトFGF-1の転写物Dの5'NTR末端が、特に筋芽細胞において、有意なIRES活性を有することを実証している。
【００３８】
その結果、本発明はまた、ヒトFGF-1 mRNAの転写物D(以後Dと称される)の5'NTRのヌクレオチド1と92との間に位置している配列番号42と同一の配列か、または相同性の配列を含有することを特徴とするIRES活性を有する単離または組換え核酸に関する。配列番号42は、転写物Dの5'NTRの全配列に相当する。
【００３９】
さらに、本出願人は、ある一定の断片のIRES活性が、IRESの3'に位置しているある一定の数のヌクレオチド類を加えることにより増大され得ることを実証している。
【００４０】
特に、本発明は、
- 配列番号26(A26)と同一の配列または相同性配列を含有する、IRES活性を有する単離された核酸、
- 配列番号21(A21)と同一の配列または相同性配列を含有する、IRES活性を有する単離された核酸、
- 配列番号34(B10)と同一の配列または相同性配列を含有する、IRES活性を有する単離された核酸、
- 配列番号40(C10)と同一の配列または相同性配列を含有する、IRES活性を有する単離された核酸、
- 配列番号41(C11)と同一の配列または相同性配列を含有する、IRES活性を有する単離された核酸、を包含する。
【００４１】
ヒトFGF-1およびマウスFGF-1にIRES活性があることから、単独のプロモーターの制御下で同一のmRNAから真核細胞における関心対象の1つ以上の遺伝子を発現するカセットの産生に関して、それらは潜在的な候補になる。
【００４２】
残りの説明および請求項において、語句の「関心対象の遺伝子」とは、治療関心対象の蛋白質、抗原性蛋白質、抗抗原性蛋白質、前抗原性蛋白質または腫瘍抑制蛋白質などのポリペプチドをコードする核酸、または突然変異などの遺伝子異常を補うことが意図された他の遺伝子を意味する。
【００４３】
その結果、他の態様によれば、本発明は、真核細胞における関心対象の少なくとも1つの遺伝子を発現するカセットに関するものであり、前記カセットは、少なくとも1個の上記核酸を含有することを特徴とする。
【００４４】
引き続き見られるように、単独遺伝子を含むカセット類が、インビトロ、または遺伝子療法において関心対象の分子を産生するために使用できる。
【００４５】
また、関心対象の2つの遺伝子間の上記核酸配列の1つの挿入から生じるバイシストロンカセットを作製することが可能であり、第2の遺伝子発現は、第1の遺伝子発現と協調させられる。より正確には、第1の遺伝子(第1のシストロン)は、キャップ依存翻訳レベルを提供し、一方、第2の遺伝子(第2のシストロン)は、種々のFGF-1 5'NTR類における内部リボソームエントリーの活性に比例して発現される。
【００４６】
この原理は、3個、4個またはそれ以上の分子が上記に規定されるIRES配列により分離されている限りにおいて、それらの共発現に拡張され得、マルチシストロンカセットの発現をもたらす。もちろん、本発明の複数シストロンカセットは、本出願に特徴づけられているFGF-1 IRES類を含み、例えば、BIP(免疫グロブリン重鎖結合蛋白質)上に同定されたもの、線維芽細胞増殖因子FGF-2、c-myc癌原遺伝子、増殖因子PDGF(血小板由来増殖因子)、およびVEGF(血管内皮増殖因子)などの他のIRES類を伴っても、または伴わなくてもよい。
【００４７】
その結果、特定の実施形態において、発現カセットは、上記の核酸により分離された関心対象の少なくとも2つの遺伝子を含有し、第1の遺伝子(第1のシストロン)は、キャップ依存翻訳レベルを提供し、一方、第2の遺伝子(第2のシストロン)は、前記核酸に存在するIRES部位の活性に比例して発現される。
【００４８】
知られた挙動で、前記カセットはまた、遺伝子(単数または複数)発現を制御するためのプロモーターを含有する。
【００４９】
マルチシストロン発現カセットの主要適用は、このようなカセットが、mRNAから含有するヌクレオチド(単数または複数)または遺伝子産物をインビボで同一の発現をすることを可能にする限り、遺伝子療法から生じる。これらのカセットはまた、受容体、酵素などの産業的関心対象の種々の分子を発現することを可能にし得る。遺伝子療法は、当業者に全体的に知られている2つの異なる技法によって推察され得る。
【００５０】
第1の技法は、二重鎖DNAに含まれた裸のカセットを含有する医薬組成物を、宿主生物(ヒトまたは動物)に直接インビボ導入することに存し、前記医薬組成物は、本発明の一部である。
【００５１】
裸のカセット使用の場合、前記カセットは医薬組成物において、細胞、特にPEIおよびその誘導体、リポソームおよび誘導体などへのカセットの貫通を促進できる任意の化合物に結合させる。
【００５２】
発現カセットが挿入される医薬組成物に含まれた組換えベクターもまた、本発明の一部である。したがって、前記発現カセットは、プラスミドベクターまたはレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルスおよびAAV類などのウィルスベクター類に挿入できる。
【００５３】
第2の遺伝子療法技法は、宿主生物から細胞を除去し、裸のカセットまたはベクターに挿入されたカセットを、インビトロで細胞に導入し、次いで修飾細胞を宿主生物に再度導入することに存する。この方法で、カセット生成物を患者の体内で発現できる。
【００５４】
既述のように、発現カセットが関心対象の1つの分子のみを含有する場合、このカセットは、インビトロで細胞培養から前記分子を産生させるために使用され得る。前記のように、カセットは、裸の形態またはベクターに挿入された形態であり得る。次にカセットまたはベクターは、当業者によく知られたトランスフェクション技法により宿主細胞に導入される。このような技法は、例えば、物理的技法(エレクトロポレーション)、化学的技法、合成ベクター、リン酸カルシウム沈殿、または細胞融合、接合などの他の方法であり得る。
【００５５】
その結果、本発明はまた、上記の発現カセットまたは組換えベクターを含むことを特徴とする組換え宿主細胞に関する。
【００５６】
本発明の組換え宿主細胞は、限定はしないが、特に:
911      ヒト胎児網膜芽細胞、ATCC番号なし              Genethon系
C2/7     マウス筋芽細胞; ATCC番号なし                  Genethon系
CHQ5B    ヒト胎児筋芽細胞
C2C12    マウス筋芽細胞由来系                          91031101
Cos-7    SV-40ウィルスT抗原により形質転換されたCV-1     CRL-1654
Hela     ヒト子宮癌上皮細胞                            CCL-2
L929     免疫抑制マウス結合組織                        CCL-1
NIH-3T3  マウス胎仔線維芽細胞                          CRL1658
Saos-2   ヒト骨肉種上皮細胞(p53-/-)                    HTB-85
SK-Hep-1 ヒト肝腺癌                                    HTB-52
SK-N-AS  ヒト神経芽腫細胞                              94092302
SK-N-BE  ヒト神経芽腫細胞                              95011815
である。
【００５７】
実際、ペプチドの産生は、インビトロで裸のカセットまたはベクターに挿入されたカセットと共に培養液に入れた宿主細胞のトランスフェクションにより得られる。
【００５８】
ペプチド発現の分析は、トランスフェクトされた細胞から調製された細胞抽出物を用いて実施される。関心対象のペプチドの性質によって、その発現レベルは、種々の検出技法(酵素アッセイ、免疫検出など)により分析される。関心対象の分子の産業用使用目的のために、これらは精製され得る。他の使用のために、発現カセットにより遺伝子的に修飾された細胞が、関心対象の分子を生成するために使用される(イクスビボ遺伝子療法、薬理学的スクリーニング)。
【００５９】
本発明の主題であるIRES配列から産生された発現カセットはまた、形質転換動物を創製するために、動物細胞(卵)に挿入できる。
【００６０】
その結果、本発明はまた、その細胞は、上記の裸のカセットまたはベクターに挿入されたカセットを含むことを特徴とする形質転換動物に関する。実際、前記動物は、カセットまたはベクターを胎仔段階で細胞に導入することにより得られる。このタイプの技術は、当業者に全体的に知られている。
【００６１】
本発明は、添付の図面を参照しながら、以後の実施例から明らかになる。
【実施例１】
【００６２】
生体外におけるヒト及びマウスFGF-1の4種類の転写産物A、B、C及びDのIRES活性
A/材料及び方法
mRNA抽出: 全細胞型に関して、細胞の密集したディッシュ(直径10cm)上でRNA抽出を行った。各プレートを滅菌PBSで2回洗浄後、1mlのRNAble溶解バッファ(ユーロバイオ(Eurobio))で処理した。引き続いて、全RNAをクロロホルムで処理後、イソプロパノールで沈殿させ、80%エタノールで洗浄した。乾燥後、水で50μlに調製し260nmで分析した。
逆転写: 全細胞型に関して、superscript IIプロトコル(ジブコビーアールエル(Gibco BRL))に従って逆転写反応を行った。1反応につき2μgの全RNA抽出物を使用した。ヒトFGF-1の cDNA合成には、6量体縮退プライマーを使用した。マウスのcDNA合成には、マウスFGF-1に特異的な3'プライマーを使用した。
オリゴヌクレオチド: プライマーの配列を5'から3'方向に表す。3'プライマー内のSpeIクローン化部位及び5'プライマー内のNcoIクローン化部位を下線で示す。エクソン1のATGでの対合により、3'プライマーは、同種生物の全5'非翻訳領域(5'NTR)で共通である。
ヒトFGF-1プライマー
3'プライマー: CTGCTGAGCCATGGCTGAAGGG 配列番号43;
5'プライマー A: ACAACTAGTGGGCATACCAGTGTCAGCTGCA 配列番号44;
B: CTAACTAGTAGAGAGCCGGGCTACTCTGAGAA 配列番号45;
C: ACAACTAGTCCAGGCAGTGGGGCCGGCTGGCCAGACTCTTGGGGGATTCCTT AG 配列番号46;
D: ACAACTAGTAGAGAGAGAGAAAAAATACTGTTGGCAGCAGCACAATG 配列番号47。
マウスFGF-1プライマー
3' sプライマー: ACCACCGCTGCTTGCTGCCGAGCCATGGCTGAA 配列番号48;
5'sAプライマー: CTCTACTAGTGTCCTTTAGTGCCAGCTAGCCTTACA 配列番号49;
sB: TCTCCAACTAGTAGAGCTGCAGAAATCCTGAGG 配列番号50。
PCR: GC含有量の多いDNAを増幅可能で高い特異性をもつplatinum TAQポリメラーゼ(ジブコビーアールエル(Gibco BRL))を使用してPCRを行った。各PCRには、前述で合成したcDNAを3μl使用した。5'NTR C及びDの増幅を目的としたPCRには、これらの各種5'NTR(I-M Chiu(11)によって規定)の一部をもつプラスミド断片を50ng添加した。マウス転写産物A及びBを同様の方法で増幅した。「タッチダウンPCR」法に従って増幅した。以下の条件で、5'NTR Aを5'Aプライマー及び3'プライマーで増幅した。94℃5分、94℃30秒76℃2分を3回、94℃30秒74℃2分を3回、94℃30秒72℃2分を25回、最後に72℃5分。
【００６３】
5'NTR Bを以下の条件で増幅した。94℃5分、94℃30秒68℃2分を3回、94℃30秒66℃1分68℃1分を3回、94℃30秒64℃1分68℃1分を25回、最後に68℃5分。3'プライマー及び5'Bプライマーを使用した。同様に5'NTR C及びD、並びにマウスの5'NTR A及びBを対応するプライマーで増幅した。増幅条件は5'NTR Bの条件と同様で、ハイブリダイゼーション温度は、5'NTR Cが70℃、5'NTR Dが70℃、マウス5'NTR Aが68℃及びマウス5'NTR Bが66℃であった。
【００６４】
細胞培養: 細胞株を「アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション(American Type Culture Collection)」(ATCC)又は「ヨーロピアン  コレクション  オブ  セル  カルチャー(European Collection of Cell Culture)」(ECACC)から入手し、入手先の取扱説明書に従って培養した。
【００６５】
【表１】
2005530512.tif 000003
【００６６】
プラスミド構築: SpeI(5'PCRプライマー内に位置する)及びNcoI(3'PCRプライマー内に位置する)を使用して、FGF-1の各種5'NTRをバイシストロンベクター(bicistronic vector)に組み込んだ。各種プラスミドを従来の分子生物学的手法によって得た。すなわち、ライゲーション、形質転換、ポジティブクローンの選択、配列決定、濃縮溶液(1μg/ml)の調製である。
【００６７】
トランスフェクション: ベーリンジャーロッシュ(Boeringher-Roche)規定のプロトコルに従い、比率2.5μl/μgのプラスミドDNAで、FUGENE6試薬を使用して全トランスフェクションを行った。ルシフェラーゼアッセイ用のトランスフェクションを、12ウェルディッシュ(1ウェルにつき80000個の細胞及び1μgのプラスミド)中で行った。
【００６８】
ウェスタンブロッティング用には、200000個のCos-7細胞をまいた直径5cmのディッシュ中で、2μgのプラスミドDNAを使用してトランスフェクションを行った。
【００６９】
ルシフェラーゼアッセイ: 「デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ」システム(プロメガ(Promega))を使用して、LucR及びLucF活性を測定した。12ウェルディッシュに置かれたトランスフェクション後の細胞をPBSで2回洗浄した。トランスフェクションから48時間後に細胞をはがし、キットに付属の溶解バッファ100μl中でホモジナイズした。化学発光性LucF及びLucRのシグナルを自動インジェクター付きルミノメーター(ベルトールド(Berthold))で測定した。
【００７０】
ウェスタンブロッティング: トランスフェクションから48時間後に、Cos-7細胞をPBSで2回洗浄し、1mlのPBS中で回収した。遠心(2000g、2分)後に、沈殿を1% SDS溶液(プロテアーゼインヒビター含有)に再懸濁して超音波で破砕した。BCA試薬(ピアス(Pierce)を使用して595nmでの分光測光法によりタンパク質分析を行った。各細胞抽出液からのタンパク質20μgをウェスタンブロッティング用に使用した。簡単に述べると、細胞溶解物を、1% SDS、0.1M DTT及びローディングバッファ中で、95℃で2分間熱処理後、タンパク質を12.5%ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転写した。CAT及びNuCATタンパク質を、ウサギポリクローナル抗CAT抗体(実験室で1/10000に希釈調製)によって免疫検出した。抗体の結合後、ペルオキダーゼ結合抗ウサギIgG抗体を化学発光試薬(アマシャム(Amersham))により検出した。
【００７１】
B/結果
B1/ヒトFGF-1の各種5'NTR中におけるIRESの存在
ヒトFGF-1の5'NTR cDNAのクローン化: 最初の工程はヒトFGF-1の各種5'NTRのクローン化である。これを実施するために、実験室のヒト細胞株から全RNAを抽出した。逆転写後に、FGF-1の各種5'NTR配列の増幅を目的としたPCRを行った。増幅後に、期待する断片が存在すれば、調べた細胞型に各転写産物が存在することを示す。SK-Hep-1、SK-N-BE及びSK-N-AS細胞由来のcDNAから、ヒトFGF-1の各種5'NTRの増幅が観察された。SK-Hep-1細胞からのcDNA量はより多く、バイシストロンベクターでのクローン化を可能にした。
【００７２】
バイシストロンベクター: 各種細胞型におけるFGF-1の各種5'NTR活性を調べるために、IRESの存在の実証に用いられたバイシストロンベクター法(14)を適用した(図番号3)。これらの構築物は、同じmRNAからの2種類の異なるレポーター遺伝子の発現を可能にする。FGF-1の各種5'NTRをこれらの2種類のレポーター遺伝子間に組み込んだ。最初のシストロンはキャップ依存翻訳レベルを与える。2番目のシストロンは、FGF-1の各種5'NTR内のIRES(internal ribosome entry)活性に比例して発現される。
【００７３】
B1.1 Cos-7細胞におけるFGF-1の5'NTRのIRES活性に関するアッセイ
CAT-1-NuCATバイシストロンベクター: CAT-I-NuCATバイシストロンベクターは、ウェスタンブロッティングによってFGF-1の各種5'NTRのIRES活性を質的に調べるために、まず最初に使用したベクターであった。実際にこれらのベクターは、最初のシストロン内にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(又はCAT)cDNA及び2番目のシストロン内にヌクレオリン-CAT融合タンパク質(NuCAT)cDNAを含む(図番号4)。これらの2種類のタンパク質間の分子量の違いによって、変性条件下で、ポリアクリルアミドゲル上で容易に分離できる。膜への転写後、CATのC末端領域に対する抗体を使用して、CAT及びNuCATタンパク質を容易に視覚化することができる。最初のシストロンに対する2番目のシストロンの比率の評価は、組み込んだ配列のIRES能力に関する情報を与え、IRES活性を定義する。
【００７４】
結果: FGF-1の5'NTRを含む各種CAT-I-NuCATベクターをCos-7細胞にトランスフェクションした。これらのトランスフェクション後のウェスタンブロッティングを図番号4に示す。
【００７５】
トランスフェクション効率の違いによるばらつきは、CATバンド(最初のシストロン)において観察される。然しながら、NuCATタンパク質の発現は、転写産物A、B及びCの存在下で観察される。これらの結果は、FGF-1の変異体Bの強いIRES活性及び変異体Aの十分な活性を示唆する(それがトランスフェクション効率に関係するならば、この場合にはより低くなる)。5'NTR C及びDの活性は、はるかに低い。フィルムの露出過度は、4種類の5'NTR内にFGF-1の代替的開始がないことも示す。FGF-2に関して記述及び観察されたこの現象(1)は、より大きな分子量をもつアイソフォームの形成という結果になる(図番号4、青矢印)。
【００７６】
この結果は、チウら(Chiu et al.)の公表した配列と一致するもので、それによると、エクソン1内に終止コドン(FGF-1のAUGの数塩基前)が存在していた(11)。変異体A、B及びCに関してIRES活性が存在することは、異なる細胞型においてこれらの各種転写産物のIRES活性を定量的に比較することを促す。この研究には、ウェスタンブロッティングは適した方法でないため、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする他のバイシストロンベクターを使用した。
【００７７】
B.1.2 各種細胞型におけるFGF-1の5'NTRのIRES活性の比較
LucR-I-LucFバイシストロンベクター: LucR-I-LucFバイシストロンベクター(4)は、2種類のルシフェラーゼを発現し、それらは異なる基質を使用する。ウミシイタケルシフェラーゼ(LucR)は最初のシストロンで、ホタルルシフェラーゼ(LucF)は2番目のシストロンである(図5A)。LucFはIRES活性を伝え、LucRと同様、高感度な分析が可能である。安定性の高い(△G=-40kcal/mol)ステムループ構造がLucR遺伝子のポジション3'に位置し、シストロン間の部位に短い配列が組み込まれる際に観察される非特異的な再開始現象を抑えることを可能にした(図番号5A)。レポーター遺伝子の高い検出感度に基づいたこのようなシステムの使用は、各レポーター活性の迅速で正確かつ付随的な定量化を可能にする。LucF/LucRの比率計算は5'NTR配列のIRES能力を示し、この配列のIRES活性を定義する。
【００７８】
RHLベクターを(4)を使用して、実験室で各種細胞型間のIRES活性を標準化した。このベクターはステムループ構造をもつが、2つのシストロン間にIRESをもたない。このベクター2番目のシストロンの非特異的開始の値を決定するのを可能にし、細胞型間のトランスフェクション効率のばらつきをなくす。
【００７９】
結果: 細胞型に応じたIRES活性の差異を調べるために、4種類のFGF-1転写産物の発現及びFGF-2のIRESに関する既知の結果に従って、各種の細胞株を選択した。Cos-7細胞(CAT-I-NuCATベクターで既に使用)、FGF-1の4種類の5'NTRを増幅できる細胞株(SK-Hep-1細胞)及び増幅しなかった細胞株(Hela細胞)を選択した。p53-/-骨肉腫由来のSaos-2細胞は、そこでのFGF-2のIRES活性が非常に高いことから、この研究用に選択した最後のモデルである(4)。Cos-7、Hela、SK-Hep-1及びSaos-2細胞においてLucR-I-LucFベクターを使用してトランスフェクションを行った結果を図5Bに示す。図番号4に見られるように、5'NTR A、B及びCがIRES活性をもつことは見かけ上明瞭である。一方、5'NTR Dの活性は非常に低く、調べた細胞型において最も低かった。然しながら5'NTR A、B及びCの活性は非常に変動的であった。
【００８０】
通常、最も活性が高いのが5'NTR Aで、その値は5.5〜12.7までの範囲である。Hela細胞及びSK-Hep-1細胞における5'NTR Aの活性はFGF-2のIRES活性よりも高い。一方、変異体AのIRESは、Cos-7細胞及びSaos-2細胞においてFGF-2のIRESほどには機能しない(これらの細胞型において記録された値は最も高いが)。
【００８１】
FGF-1の変異体Bは、Cos-7細胞において変異体Aよりも活性が高い(10ユニット)。Saos-2細胞においてはその活性は中程度である。調べた他の細胞型においては、5'NTR Bは活性をもたない。
【００８２】
変異体Cに関しては、SK-Hep-1細胞及びSaos-2細胞において中程度の活性をもつ(各々順に5.8及び7.5)。それでも5'NTR Cの活性が最も高いのは、後者の細胞型においてである。Cos-7細胞及びHela細胞においてその活性は非常に低い。
【００８３】
Cos-7細胞においてCAT-I-NuCATベクターで得られた情報は、LucR-I-LucFベクターで得られた値と相関関係があると付け加えてもよいであろう。
【００８４】
B2/マウスFGF-1の各種5'NTRにおけるIRES
ヒトのものと同一の遺伝子構造が、マウス(図番号6A)、ウシ、ブタ及びニワトリに見られる。これらの各種生物のFGF-1の5'NTR配列(9、11、16)を並べたものは、これらの非翻訳配列が十分に保存されていることを示した。最も特にマウス・ヒト間でこの保存が確認されており、5'NTR Aに関しては70%近い相同性をもつ(図番号7A)。
【００８５】
マウスからヒトまでIRESメカニズムが保存されているという仮説を想定し、ヒト及びマウスのFGF-1の変異体A及びBの比較研究を行った。
【００８６】
これを実施するために、RT-PCRで増幅し、マウス細胞株cDNAからマウスFGF-1の5'NTR A及びB(図番号6B)をクローン化した。そして同じ研究方法を用いた。LucR-I-LucFバイシストロンベクターの構築、ヒト相同物の研究用に使用した細胞型におけるトランスフェクションである。
【００８７】
マウスFGF-1の5'NTR A及びBのcDNAのクローン化: ヒト5'NTRに関しては、RT-PCRにより同様のクローン化方法を用いた。同じ増幅上の問題が生じ、同一の酵素及びストリンジェンシーを使用することになった。L929細胞のcDNAからマウス5'NTRを増幅し、再クローン化した。
【００８８】
ヒト細胞におけるマウス及びヒトFGF-1の5'NTR A及びBのIRES活性の比較: ヒト配列との直接比較を行うために、Cos-7、Sk-Hep-1及びSaos-2細胞においてトランフェクションを行った。ルシフェラーゼアッセイ後の結果を図番号7Bに示す。
【００８９】
ヒト及びマウスの変異体AのIRES活性の特徴は等しい。Saos-2は例外として、細胞型に応じてどちらも同程度の値をもち、同じように制御されているようである。実際、これらの細胞においてマウス変異体AのIRES活性はより高く、FGF-2のIRESに関して観察される値と等しい。同程度の大きさのIRES値が、ヒト及びマウスの5'NTR Bに関して見られる。さらにまた、ヒトFGF-1の5'NTR Bを含む構築物に関しては、Cos-7細胞において最も高いIRES活性が観察される。このことは又、マウス相同物の場合でも同じである。
【実施例２】
【００９０】
生体外でのヒトFGF-1の4種類の転写産物A、B、C及びDのIRESの特徴付け
実施例2A: ヒト腺癌細胞(SK-Hep-1)における特徴付け
4種類の転写産物のIRES活性の特徴付けは、断片AからDまでのうちでどれが最も、十分なIRES活性(各転写産物のIRES部位を比較的正確に位置定めさせ得るような)をもつ短いヌクレオチド配列であるかを決定することからなる。この実験を、ヒト腺癌細胞(SK-Hep-1)に関して行った。以下のことに関して次のように調べた。
- 転写物A(A)の完全長5'NTR
- 転写産物Aの5'NTRの連続する断片(A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20)に対応する20ヌクレオチド配列
- 転写産物B(B)の完全長5'NTR
- 転写産物Bの5'NTRの連続する断片(B2、B3、B4)に対応する4ヌクレオチド配列
- 転写産物C(C)の完全長5'NTR
- 転写産物Cの5'NTRの連続する断片(C2、C3、C4)に対応する4ヌクレオチド配列
- 転写物A(A)の完全長5'NTR
【００９１】
検証対象のヌクレオチド配列は、mRNA由来の連続する配列で、実施例1に記述したのと同じ手順に従ってバイシストロンベクターにサブクローン化した。バイシストロンベクターは、2種類のルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ(LucR、最初のシストロン)及びホタルルシフェエラーゼ(LucF、2番目のシストロン)をコードする検証対象のヌクレオチド配列を2種類のルシフェラーゼ遺伝子間に組み込んだ。IRESによる翻訳開始を発生させるそれら検証対象のヌクレオチド配列の能力を、LucF活性を測定することによって定量化するためである。LucF活性値は、それ自体mRNA量に比例するLucR活性値に関連している。任意の単位(AUs)におけるIRES活性値を示すために、LucF/LucRの比率は、「漏出」の程度を表すネガティブコントロール(IRESをもたないバイシストロンベクター)の値と関係している。ヒト腺癌(SK-Hep-1)細胞抽出物に関して、LucR及びLucFルシフェラーゼ活性をトランスフェクションから48時間後に測定した。
【００９２】
結果を図8A及び8Bに表す。
【００９３】
IRES FGF-1A: 図8Aに示すように、FGF-1 mRNAの5'NTR A(ヌクレオチド1から435まで)は、約14AUという効率でIRESを可能にする。それ故に、実施例1の結果を確認する。この5'NTRの各部分の解析によって、IRES活性は1から270、387から435までのヌクレオチドを必要としないと結論付けることができるこのマッピングに基づいて、FGF-1Aの最小IRESは269から366までであると結論付けてもよい(構築物A18)。IRES活性は、214から269又は366から435といった、どちらか一方の側に位置するヌクレオチドの存在によって最適化される(構築物A5)。重要ではあるが、必ずしも十分ではない要素は、270から304に位置する。
【００９４】
IRES FGF-B: 図8Bは、FGF-1 mRNAの5'NTR B(ヌクレオチド1から147)が、3AUという比較的低い活性をもつことを示す。それ故に、実施例1の結果を確認する。ヌクレオチド0から39の欠失は、IRESを完全に失活させる(図8B、構築物B3及びB4)。
【００９５】
他例は、FGF-1BのIRESが他の細胞型においてより高い活性をもつことを示す。
【００９６】
IRES FGF-1C: 図8Bは、FGF-1のmRNAの5'NTRC(149ヌクレオチド)が、6AUという効率の強い活性をもつことを示す。面白いことに、ヌクレオチド103から149(FGF-1のmRNAの4種類のNTRに共通の領域に対応する)の欠失は、IRES活性の増大を引き起こす(4AU)。それ故に、FGF-1Cの最小IRESはヌクレオチド1から103から成ると結論付けることができる。さらに又、最初の59ヌクレオチドの欠失はIRES活性を失活させる。
【００９７】
IRES FGF-ID: 図8Bは、FGF-1 mRNAの5'NTR DがSK-Hep-1細胞においてIRES活性をもたないことを示す。然しながら、他例は、この断片が、他の細胞型、特にはC2/7筋芽細胞においてIRES活性をもつことを示す。
【００９８】
実施例2B: 911細胞(ヒト胚網膜芽細胞)及びC2/7細胞(マウス筋芽細胞)における特徴付け
実施例2Aは、断片A2、A6、A7及びA9で繰り返す。
【００９９】
胚網膜芽細胞及び筋芽細胞をトランスフェクションの1〜2日前に24ウェルプレートにまいた。ライフテクノロジーズ(life technologies)のプロトコルに従いリポフェクタミン試薬を使用して、1ウェルに3μl/μlのプラスミドDNA濃度で、網膜芽細胞及び神経芽細胞の全トランスフェクションを行った。トランスフェクションから48時間後に、100μlの溶解バッファ(デュアルルシフェラーゼ、プロメガ(Promega))で細胞を溶解した。50μlの試薬(デュアルルシフェラーゼ、プロメガ(Promega))を添加後、20μlの細胞溶解物で10分間ルシフェラーゼ活性(ウミシイタケ及びホタル)を測定した(mediator PhL、ルミノメーター)。
【０１００】
結果を図9A及び9Bに表す。ヘアピンはステムループ構造をもつ参照配列で、IRESをもたない。
【０１０１】
図9Aが示すように、翻訳産物Aの5'NTR並びに断片A2、A6、A7及びA9は十分なIRES活性をもつ。筋芽細胞における翻訳産物B、C、及びDの5'NTRに関しても同じことがいえるが、ヒト腺癌細胞(SK-Hep-1)においては、これらの同じ配列はより低い活性を示した(実施例2A参照)。
【０１０２】
実施例2C: 後に筋管に分化するC2/7筋芽細胞における特徴付け
転写産物A、A9、B、C及びDを使用して実施例2Aを繰り返し、この活性をEMCVのものと比較する。
【０１０３】
筋芽細胞をトランスフェクションの1〜2日前に12ウェルプレートにまく。ヘアピン、EMCV、A、A9、B、C又はDを含む断片に関して、2組ずつで前述のようにトランスフェクションを行った。トランスフェクションから24時間後(図9C、斜線)、又は9日間後(図9C、点描)に細胞を溶解した。9日間のインキュベーション中に、筋芽細胞は、5%ウシ血清を加えたDMEM培地中で筋管に分化する。
【０１０４】
図9Cが示すように、FGF-1転写産物A、断片A9及びFGF-1転写産物BのIRES活性は、筋芽細胞より筋管においてより高い。FGF-1の転写産物C及びDは、筋芽細胞及び筋管において同程度の活性をもつ。
【０１０５】
非常に興味深いことに、筋芽細胞に対する筋管におけるFGF-1の転写産物A(比率=8.47)、断片A9(比率=11.63)及びFGF-1の転写産物B(比率=18.27)のIRES活性は、EMCV(比率=6.44)のそれよりもはるかに高い。
【０１０６】
実施例2D: 911細胞(ヒト胚網膜芽細胞)における突然変異型転写産物の特徴付け
IRESとホタルルシフェラーゼ遺伝子のAUGコドン間に特定の配列を加えた各種転写産物を使用して実施例2Aを繰り返す。
【０１０７】
得た断片は、以下の通りである。
A26: 配列番号26 (配列番号8の配列の269から435番目のヌクレオチド+20ヌクレオチド)
A21: 配列番号21 (配列番号8の配列の269から435番目のヌクレオチド+40ヌクレオチド)
A22: 配列番号22 (配列番号8の配列の269から435番目のヌクレオチド+70ヌクレオチド)
A25: 配列番号25 (配列番号8の配列の269から435番目のヌクレオチド+135ヌクレオチド)
A23: 配列番号23 (配列番号9の配列の269から390番目のヌクレオチド+70ヌクレオチド)
A24: 配列番号24 (配列番号9の配列の269から390番目のヌクレオチド+135ヌクレオチド)
B10: 配列番号34 (配列番号30の配列の1から147番目のヌクレオチド+40ヌクレオチド)
B11: 配列番号35 (配列番号30の配列の1から147番目のヌクレオチド+70ヌクレオチド)
C10: 配列番号40 (配列番号36の配列の1から149番目のヌクレオチド+40ヌクレオチド)
C11: 配列番号41 (配列番号36の配列の1から149番目のヌクレオチド+70ヌクレオチド)
【０１０８】
結果を図8C及び図8Dに表す。
【０１０９】
FGF1AのIRES効率(図8C)は、A26及びA21に関して増加し、A22及びA25に関して減少する。然しながら、ヌクレオチド390から435の間に含まれる部分がIRES効率をもつのに必要である(変異体A23及びA24)。FGF1B及びFGF1CのIRES効率は、野生型IRESと比較して4〜6AUほど増加する(図8D)。さらに又、断片A、B及びCの可逆性が十分に観察される。
【０１１０】
実施例2E: 911細胞(ヒト胚網膜芽細胞)における突然変異型転写産物の特徴付け
IRESとホタルルシフェラーゼ遺伝子のAUGコドン間にそれぞれに異なる40ヌクレオチド配列を加えた断片A8の各種転写産物を使用して実施例2Aを繰り返す。
【０１１１】
得た断片は、以下の通りである。
A27: 配列番号27 (配列番号8の配列の269から435番目のヌクレオチド+40ヌクレオチド)
A28: 配列番号28 (配列番号8の配列の269から435番目のヌクレオチド+40ヌクレオチド)
A29: 配列番号29 (配列番号8の配列の269から435番目のヌクレオチド+40ヌクレオチド)。
【０１１２】
3つのケースにおいて十分なIRES活性が得られ、それは再度、断片Aの十分な可逆性を示す。約100株を試したところ、それらのうちの少なくとも80%が、転写産物Aと同じかそれよりも高い効率をもつことが観察される。
【実施例３】
【０１１３】
インビボにおけるヒトFGF-1の転写産物A、B、C及びDの5'NTRの活性
以下のプトロコルに従って実験を行う。
【０１１４】
使用動物は約6週齢の乳離れした雌マウスで、系統はBalb/C(IFFA CREDO)である。ケタミン(100mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)の混合物でマウスに麻酔する。麻酔は20分もつ。
【０１１５】
DNAを増幅し、エンドトキシンフリーのマキシプレパレーション(Endofree、キアゲン(Qiagen))で精製した。沈殿後、150mM NaCl溶液(Sigma)でDNAを約50μg及び30μlの濃度に調製した。
【０１１６】
ハミルトン注射器を使用してDNAを左前脛骨に注射する。事前に脱毛した肢を導電性ゲルでコートする。エレクトロトランスファーを誘起するために片側の肢に2本の電極をあてる。通常では、20ミリ秒の8電気パルスを周波数2Hzで送る。電圧は200V/cm。動物3匹/プラスミドのグループでこれらの実験を行った。
【０１１７】
一週間後、0.1mlの6%ペントバルビタールの腹腔内注射及び頚部脱臼で殺生する。前脛骨を取り出し、液体窒素で凍結する。プロテインインヒビターカクテールを16.7μl/mlの濃度になるように添加した溶解バッファ500μl中に筋肉を置く。筋肉溶解物を37℃で5分間溶解してボルテックスし、15000Gにて4℃で5分間遠心する。20μlの筋肉溶解物について、50μlの試薬(デュアルルシフェラーゼ、プロメガ(Promega))を添加した10秒後、ルシフェラーゼ活性(ウミシイタケ及びホタル)を測定した(mediators PhL、ルミノメーター)
【０１１８】
コントロール筋肉は、30μlの150mM NaClを注射しエレクトロポレーションを行った筋肉、又は何も行っていない筋肉である。
【０１１９】
実施例3A: 既知のIRESに関してヒトFGF-1の転写産物AのIRES活性との比較
この実施例は、インビボ、つまりマウス筋肉におけるヒトFGF-1の転写産物AのIRES活性をEMCV、VEGF、FGF2、Bip及びPDGFのIRESといった他のIRESと比較することを目的とする。
【０１２０】
図10が示すように、FGF-1AのIRES活性は、EMCVのそれと同程度であり、VEGF、FGF-2、Bip及びPDGFのIRESよりも高い。
【０１２１】
実施例3B: EMCVのIRESに関して、インビボでのヒトFGF-1の転写産物AのIRES並びにそのサブ断片A、A2、A6、A7及びA9のIRES活性との比較
図11が示すように、FGF-1A並びにそれに変更を加えたA2、A6及びA7のIRESは、EMCVのIRESと同程度の活性をもつが、FGF-1Aの最小IRES(構築物A9)は、わずかながらより高い活性をもつ。
【０１２２】
実施例3C: EMCVのIRESに関して、ヒトFGF-1の転写産物AのIRES、そのサブ断片A及びA11のIRES、ヒトFGF-1の転写産物BのIRES、そのサブ断片B2及びB3のIRES、ヒトFGF-1の転写産物CのIRES並びにその断片C2及びC3のIRES活性との比較
【０１２３】
図12が示すように、FGF-1B及びFGF-1CのIRESは、EMCVのIRESと同程度の活性をもつ。FGF-1Bの最小IRES(断片B3)及びFGF-1Cの最小IRES(断片C2)は、EMCVのIRESよりはるかに高い活性をもつ。
【０１２４】
断片A11は活性をもたない。このことは、FGF-1Aの最小IRESがA9であることを確認する(実施例3B)。
【０１２５】
[参考文献]
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2005530512.tif 000005
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【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】線維芽増殖因子1遺伝子: ヒトFGF-1遺伝子の構成を示す図であって、エクソン1、2および3は、3つのコードエクソンを構成する: エクソン1における非コードエクソン類1A、1B、1Cおよび1Dのスプライシングは、それぞれA、B、CおよびD mRNA類を生成する。転写物Aの転写に関する出発点は、正規の配列CCAATおよびTATAにより前にある。
【図２】FGF-1をコードする4つの転写物A、B、CおよびDを示す図であって: 転写物AおよびBは、主要な転写物であり、腎臓、脳および網膜に発現される。転写物CおよびDは、副転写物であり、血清またはPMAによる誘導後、線維芽細胞および血管平滑筋細胞(VSMC類)に発現される。これらはまた、前立腺癌(PC3)または肺癌由来の細胞、またはグリア芽細胞腫由来の細胞に発現される。
【図３】IRES試験法: バイシストロンベクター類の原理を示す図であり: バイシストロンmRNAの第1のシストロンは、キャップ依存翻訳レベルを提供し、第2のシストロンは、FGF-1 5'NTR類における内部エントリーの活性に比例して発現される。蛋白質Y/蛋白質X比の算出は、2つのシストロン間に位置する配列のIRES活性を規定する。
【図４】ベクターCAT-I- NuCATによるCos-7細胞のトランスフェクション後のウェスタンブロッティングを示す図であり: CATに対応するバンドの強度は、キャップ依存翻訳レベルを提供する。NuCATバンドの強度は、検討中の5'NTRのIRES活性に対応する。N. T.: 非トランスフェクト細胞から抽出;  FGF-2 5'NTRを含有するベクターを示す図である。A、B、C、D: ヒトFGF-1のA、B、C、D 5'NTR類を、それぞれ含有するベクター類; 矢印1: FGF-2 5'NTRにおいて、代わりの翻訳開始から開始コドンCUGで誘導される高分子量イソ体。
【図５】バイシストロンLucR-I-LucF mRNA類および種々の細胞タイプにおけるヒトFGF-1の5'NTR類のIRES活性比較を示す図である。
【図５Ａ】LucR -I- LucFバイシストロンmRNAを示す図である。ステム-ループ構造は、LucF第2のストロンにおける非特異的翻訳の再開始の現象を制限するために、LucRの3'位に配置された。
【図５Ｂ】種々の細胞タイプにおけるヒトFGF-1の5'NTR類のIRES活性を示す図である。Y軸上の値は、LucF /LucRの活性比を算出することにより得られ、任意の単位で表される。
【図６】マウスFGF-1遺伝子および転写物を示す図である。
【図６Ａ】マウスFGF-1遺伝子構造を示す図である。エクソン1、2および3は、3つのコードエクソンを構成し; エクソン1における非コードエクソン-1Aおよび-1Bのスプライシングにより、FGF-1のAおよびB mRNA類を生成する。
【図６Ｂ】マウスFGF-1転写物AおよびBを示す図である。前記転写物は、通常リーディングフレームおよび3'NTR領域を有しており、それらの5'NTR末端効力に関して異なっている。
【図７】FGF-1のヒト5'NTRとマウス5'NTR間の比較を示す図である。
【図７Ａ】マウスFGF-1(m FGF-1)およびヒトFGF-1(h FGF-1)の5'NTR類Aの配列整列を示す図である。
【図７Ｂ】種々の細胞タイプにおけるヒトFGF-1(h FGF-1)およびマウスFGF-1(m FGF-1)の5'NTR類AおよびBのIRES活性を示す図である。Y軸上の値は、LucF /LucRの活性比を算出することにより得られ、任意の単位で表される。
【図８】SK-Hep-1ヒト腺癌細胞における種々のヒトFGF-1 5'NTR細断片のIRES活性を示す図である。Y軸上の値は、LucF /LucRの活性比を算出することにより得られ、任意の単位で表される。
【図８Ａ】断片Aの20個のヌクレオチド配列(A、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20)のIRES活性を示す図である。
【図８Ｂ】断片BおよびCのそれぞれ4つのヌクレオチド配列(B、B2、B3、B4)および(C、C2、C3、C4)、および断片Dのヌクレオチド配列のIRES活性を示す図である。
【図８Ｃ】911系(胎仔網膜芽細胞)における6つの変異断片A(A26、A21、A22、A23、A24、A25)のIRES活性を示す図である。
【図８Ｄ】911系(胎仔網膜芽細胞)における2つの変異断片B(B10、B11)および2つの変異断片C(C10、C11)のIRES活性を示す図である。
【図８Ｅ】911系(胎仔網膜芽細胞)における3つの変異断片A27、A28、A29のIRES活性を示す図である。
【図９】911系(胎仔網膜芽細胞(図9A))、筋芽細胞(図9B)および筋管に分化された筋芽細胞(図9C)における種々のヒトFGF-1 5'NTR細断片のIRES活性を示す図である。Y軸上の値は、LucF /LucRの活性比を算出することにより得られ、任意の単位で表される。断片A の5つのヌクレオチド配列(A、A2、A6、A7、A9)、図9Aに関する断片B2のヌクレオチド配列を含む断片Bのヌクレオチド配列、図9Aに関する断片C2のヌクレオチド配列を含む断片Cのヌクレオチド配列、および断片Dのヌクレオチド配列もまた試験した。
【図１０】EMCV、VEGF、FGF2、BipおよびPDGFに関するインビボでのヒトFGF-1(マウスの筋肉内注射)転写物AのIRES活性の比較を示す図である。
【図１１】EMCVのIRESに関するインビボでのヒトFGF-1の転写物Aおよび細断片A2、A6、A7およびA9のIRES活性の比較を示す図である。
【図１２】EMCVのIRESに関するヒトFGF-1の転写物Aおよびその全ての細断片、ヒトFGF-1の転写物Bおよびその細断片B2およびB3、ヒトFGF-1の転写物Cおよびその断片C2およびC3のIRES活性の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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