(57)【要約】アポリポタンパク質A-I（アポA-I）、好ましくはアポリポタンパク質A-I Milano（アポA-IM）などの変異型を、単独でまたはより好ましくはリン脂質などの脂質担体もしくは他の薬剤と組み合わせて、病変した冠、末梢および大脳動脈のバイパス手術、移植片もしくは移植器官を移植するための手術、または血管形成術の実施前もしくは実施中に、あるいは不安定プラークを安定化するために、局所投与することができる。代替の実施形態においては、アポリポタンパク質を直接提供するのでなく、アポリポタンパク質をコードする遺伝子を提供する。タンパク質に対して用いる方法と類似の方法で、遺伝子を血管中に導入し、次いでタンパク質を発現させる。本技術はまた、再狭窄または他の心血管疾患を治療もしくは予防するための遺伝子送達に使用することもできる。さらに別の実施形態において、ステントをアポリポタンパク質単独、脂質とともに製剤化したアポリポタンパク質、アポリポタンパク質を発現するように遺伝子操作した細胞、アポリポタンパク質をコードする裸のDNA、または抗増殖薬などの他の薬剤を用いてコーティングして、傷害部位へ局所送達する。好ましい実施形態においては、このシステムを、併合療法として使用し、アポリポタンパク質などの薬剤の局所送達を全身抗高血圧療法、抗炎症療法、脂質調節および／または抗血液凝固療法と組み合わせて使用する。これらの治療は局所送達の前に、同時に、または後に開始することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病変した冠、末梢および大脳動脈のバイパス手術、移植片もしくは移植器官を移植するための手術、または血管形成術の実施前もしくは実施中に治療あるいは予防する方法であって、血管の傷害部位に有効量の脂質調節薬を局所投与し、狭窄もしくは再狭窄を予防または低減するかあるいはプラークを安定化させることを含む、上記方法。
【請求項２】
抗増殖薬がαらせんアポリポタンパク質またはHDL関連タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アポリポタンパク質またはHDL関連タンパク質が、アポリポタンパク質A-I、アポリポタンパク質A-I Milano、アポリポタンパク質A-I Paris、アポリポタンパク質E、プロアポリポタンパク質A-I、アポリポタンパク質A-II、プロアポリポタンパク質A-II、アポリポタンパク質A-IV、１以上のスルフヒドラル基を含むように改変されたアポリポタンパク質、アポリポタンパク質C-I、アポリポタンパク質C-II、およびアポリポタンパク質C-III、これらのアポリポタンパク質内のαらせん配列、パラオキソナーゼ、コレステリルエステル輸送タンパク質、LCATおよびリン脂質輸送タンパク質からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
アポリポタンパク質がアポリポタンパク質A-I Milanoである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
アポリポタンパク質またはHDL関連タンパク質を脂質と組み合わせて投与することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
アポリポタンパク質を脂質およびHDL関連タンパク質と組み合わせて投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アポリポタンパク質対脂質の重量比が約1：0.5〜1:3である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
脂質調節薬を壁内浸潤デバイスにより投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アポリポタンパク質またはHDL関連タンパク質をカテーテルを用いて投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
アポリポタンパク質をゲルで投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アポリポタンパク質がアポリポタンパク質A-I Milanoであり、リン脂質と約1:0.5〜1:3の重量比で組み合わせて、0.05〜0.3mgアポリポタンパク質A-I Milano/kg、または4〜6mgアポリポタンパク質A-I Milano/治療すべき血管セグメント、の用量で投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
アポリポタンパク質またはHDL関連タンパク質を、0.01mgアポリポタンパク質/kgと、粘度またはデバイス容積により限定される用量/冠血管セグメントとの間の用量範囲で投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
アポリポタンパク質を0.3mgアポリポタンパク質/kgと、粘度またはデバイス容積により限定される用量/冠血管セグメントとの間の用量範囲で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
核酸分子を壁内浸潤により送達する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子がαらせんアポリポタンパク質またはHDL関連タンパク質をコードする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子がオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
脂質調節薬を単回有効用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
脂質調節薬を頻回用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
抗増殖化合物、抗炎症化合物、抗高血圧化合物、高血液凝固薬、および脂質調節薬からなる群から選択される薬剤の全身送達をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
全身治療を局所治療の前に開始する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
脂質調節薬がナイアシン、スタチン、およびフィブレートからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
抗増殖薬がパクリタクセル、ラパマイシン、AP-17チロフィバン、およびアブシキシマブからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
血液凝固または血小板凝集を予防または遅延させる薬剤がアスピリン、IIb/IIIaインヒビター、クロピドグレル、ヘパリンおよびヘパリン断片からなる群から選択される、請求項１9に記載の方法。
【請求項２４】
局所送達を、カテーテルから心臓周囲空間中への放出を介して実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
コートしたステントの使用を介して放出を達成する、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
再狭窄を予防または治療するための、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
プラークを安定化するための、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
血栓形成および虚血を含むプラーク破裂に結果として結びつくことを低減させるための、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
病変した冠、末梢および大脳動脈のバイパス手術、移植片もしくは移植器官を移植するための手術、または血管形成術の実施前もしくは実施中に治療または予防するためか、あるいはプラーク安定化のためのキットであって、有効量の脂質調節薬を長期間局所放出して狭窄もしくは再狭窄を予防または低減するかあるいはプラークを安定化するための手段を含む上記キット。
【請求項３０】
壁内浸潤デバイスを含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
カテーテルをアポリポタンパク質および／または脂質のリザーバーと組み合わせて含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
核酸分子を投与する手段を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３３】
コレステロール低下薬が、アポリポタンパク質A-I、アポリポタンパク質A-I Milano、アポリポタンパク質A-I Paris、アポリポタンパク質E、プロアポリポタンパク質 A-I、アポリポタンパク質A-II、プロアポリポタンパク質A-II、アポリポタンパク質A-IV、１以上のスルフヒドラル基を含むように改変されたアポリポタンパク質、アポリポタンパク質C-I、アポリポタンパク質C-II、およびアポリポタンパク質C-III、これらのアポリポタンパク質内のαらせん配列、パラオキソナーゼ、コレステリルエステル輸送タンパク質、LCATおよびリン脂質輸送タンパク質からなる群から選択される、請求項２９に記載のキット。
【請求項３４】
傷害部位への局所送達のために、治療部位において放出される物質でコーティングしたステントであって、該物質が単独かまたは脂質とともに製剤化されたαらせんアポリポタンパク質もしくはHDL関連タンパク質、αらせんアポリポタンパク質もしくはHDL関連タンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞、およびαらせんアポリポタンパク質もしくはHDL関連タンパク質をコードする裸のDNAからなる群から選択される、上記ステント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、2001年９月28日に出願した米国特許出願第60/326,379号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般的に、病変した冠、末梢および大脳動脈の血管再生後の再狭窄、ならびに手術して設けたバイパス移植片または移植器官の狭窄または再狭窄を低減する方法および組成物であって、具体的にはアポリポタンパク質Ａ-Ｉ Milanoなどの薬剤を単独でまたは脂質製剤もしくは他のコレステロール低下薬もしくは脂質調節薬と組み合わせて局所投与することにより達成する上記方法および組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
血管形成術、手術および他の血管介入は、短時間内に細胞が管腔中へ急速に増殖することを特徴とする動脈症の加速を併発する。この増殖はしばしば重篤であって遠位の器官への血流を危うくするのに十分である。
【０００４】
血管バイパス手術（vascular bypass surgery）は、アテローム性動脈硬化症の血管表面にプラークが発生するときなどに、狭窄および閉塞血管を治療するために広く利用されている。バイパス手術においては、１以上の健康な血管を狭窄／閉塞した血管中に狭窄または閉塞部位を越えて移植し、血液を狭窄または閉塞した血管の周りを短絡させて、狭窄または閉塞により血液供給が危機に曝されている組織へ十分な血液供給を再確立する。この手術はしばしば危機に曝された組織の再血管形成に成功している。
【０００５】
血管形成術（angioplasty）は、特に、血管の管腔壁上でのプラークの異常な沈着による血管の狭窄または閉塞発生の初期状態と診断された患者における、バイパス手術に代わる治療法として開発されている。血管形成術は、典型的には、通常、バルーン(すなわち、風船)または伸張可能な金属メッシュを備えたカテーテルを狭窄または閉塞した動脈領域に導き、バルーンまたはワイヤメッシュを、１回以上、少し膨らませて妨害血管内物質またはプラークを血管内皮壁に対して押上げ、それにより、プラークを圧縮および／または破壊してばらばらにし、血流を再確立することに関わる。しかし、血管形成術の処置は、特にバルーンを膨らまし過ぎるかまたはメッシュを拡張し過ぎると血管に傷害を与え、例えば、血管形成術領域の内皮細胞層の剥離（除去）、血管残部の内部血管壁部分の切開とそれに伴う血管の閉塞、または血管の内膜層の破壊、などの種々の望ましくない結果をもたらしうる。
【０００６】
動物の動脈の傷害は血管修復のプロセスを誘導して、究極的に動脈を狭めることになる。平滑筋細胞および炎症細胞の厚い新層、もしくは新内膜は血管内で増殖し、管腔を侵害する。動物におけるこのプロセスは、血管形成術、血管内ステント移植、器官移植、またはバイパス手術後に、臨床上起こるプロセスを代表するものであり、閉塞性動脈疾患を治療するこれらの技術の長期的成功を大きく制限する。動脈傷害および新膜過形成のモデル動物を利用してヒトにおいて再狭窄をもたらす細胞事象が研究され、再狭窄を低下しかつ長期臨床結果を向上する試みで組織増殖を抑制する治療計画が考案されている。ブタはヒトの再狭窄に対するモデル動物として特に有用である。
【０００７】
再血管形成後の血管の狭窄または再狭窄を制限する試みとして薬剤の投与および技術的手法がある。いずれの薬剤も未だヒトにおいて再狭窄を予防する効能を臨床上認められてない。１つの技術手法である血管内ステント留置は、冠動脈介入後のヒトの再狭窄を部分的に低下させることが、Serruysら, N. E. J. Med. 1994; 331:489-495、およびFischmanら, N. E. J. Med. 1994; 331:496-501により報じられている。しかし、ステント自身が20-30％の症例において重大な再狭窄に対して感受性を有する。
【０００８】
血管修復の原因となる機構の知識が増加するに伴い、動脈症の加速を制限する薬剤に対する革新的な提案がなされている。アテローム性動脈硬化症が始まると血管に補充される最初の細胞中に、単球を含む循環白血球があることは公知である。病変した動脈壁内にこれらの細胞が一旦コレステロールおよび他の脂質を巻き込み、かつまた他の細胞を引き付ける物質を産生すると、他の細胞を増殖させるかまたは基質成分を分解する。これらの第２の作用はそれぞれ、その後、より大きな内膜肥厚およびより重篤な動脈管腔の狭小化または閉塞を促進しうる。血管再生後の再狭窄において、白血球の同様な役割は実証されていない。白血球活性化は、例えばグルココルチコイドによるヒトの広範な炎症抑制において再狭窄と関係付けられた（Pietersmaら, Circulation 1995 ; 91:1320-1325；Mickelsonら, 1996 JACC 28 (2):345-353；Inoue,ら, 1996 JACC 28 (5):1127-1133）が、血管再生後にヒトの再狭窄を減少させなかった（Pepineら, Circulation 1990; 81:1753-1761）。この観察は、再狭窄を予防するために広範な効能がある治療と非常に特定した標的を狙う治療の両方を用いる研究を思い起こさせる。例えばヘパリンを用いる広範な治療は、全身毒性および投与制限により限定される。例えば分子計画（molecular strategy）による特定的な治療は、血管修復プロセスを活性化しかつ増強するたくさんの細胞経路および分子経路のすべてを抑制することができない。
【０００９】
Ameliら, Circulation 90(4):1935-41 (1994)は、複数の疫学的研究が高密度リポタンパク質（HDL）コレステロールレベルと冠動脈心疾患との間の逆相関、及び冠動脈バルーン血管形成術後のHDLと再狭窄との間の同様な逆相関を示していることを報じた。彼らは、HDLが新内膜形成に直接影響を与えるかどうかを決定する研究を実施し、そしてコレステロールを与えたウサギにおけるバルーン傷害後の内膜肥厚に対する、組換えアポA-I Milano（アポA-IM；アポA-IのArg-173をCysに置換したヒトアポA-I変異体）の影響を研究した。ウサギは、リン脂質担体と結合したアポA-IM 40mgの静脈注射を、大腿および腸骨動脈のバルーン傷害前５日に開始して同傷害後５日まで連続して１日置きに受けた（全投与量200mg/動物、または約11.4mg/kg/用量）。バルーン傷害後３週間、アポA-IMで処置したウサギでは、２匹の対照群と比較して内膜厚さが有意に低下した。内膜-対-中膜比も、分散分析（ANOVA）によると、２匹の対照と比較して、アポA-IMにより有意に低下した。マクロファージにより覆われた内膜病変の比率は、マクロファージ特異的モノクローナル抗体を用いる免疫組織化学により同定すると、アポA-IM処理したウサギは、担体処理した動物と比較して有意に少なかった（25.3±17％ 対 59.4±12.3％、P＜0.005）。大動脈コレステロール含量は、アポA-IM処理した動物と担体単独処理した対照との間に有意差はなかった。残念ながら、病変がヒトによく似ているブタと異なり、ウサギで得た結果はヒトの結果を予測するものとならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、血管形成術、血管バイパス、器官移植または血管疾患の後に、急速な再閉塞の危険性を最小限にして、血管組織の治癒を促進しかつ血管筋細胞増殖（過形成）を制御して血管の再狭窄を予防する組成物および方法が必要とされている。
【００１１】
それ故に、本発明の目的は、病変した冠、末梢、および大脳動脈の血管再生後の再狭窄、ならびに手術により装着したバイパス移植片または移植した器官の狭窄または再狭窄を減少させる方法および組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、簡単で効果的な手段である遺伝子導入の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
アポリポタンパク質A-I（アポA-I）、好ましくはアポリポタンパク質A-I Milano（アポA-IM）などの変異型を、単独でまたはより好ましくはリン脂質などの脂質担体もしくは他の薬剤と組み合わせて、病変した冠、末梢および大脳動脈のバイパス手術、移植片もしくは移植器官を移植するための手術、または血管形成術の実施前もしくは実施中に、あるいは不安定プラークを安定化するために、局所に投与することができる。好ましい実施形態においては、アポA-IMの投与は、インフィルトレーター（INFILTRATOR）、すなわち壁内送達デバイスおよび／または他のアポA-IMの持続、制御放出手段を用いて投与し、有効用量を傷害部位に投与する。アポA-IMを用いるモデルブタに基づくと、再狭窄の治療または予防のために治療部位へ送達する有効用量は、0.2〜0.4mgアポA-IM/kgの範囲、さらに具体的には4〜6mgアポA-IM／治療すべき血管の範囲である。インフィルトレーターによる壁内投与の上限用量は溶液の粘度により制限される。例えば、本方法は、インフィルトレーターの孔を通過するには粘度が高過ぎるアポA-IMの溶液を使用することはできない。実施例により実証するように、有効量は、アポA-IM 14mg/ml溶液の0.3〜0.4mlの範囲（これは25kgブタの治療するそれぞれの血管に対して、単回用量／血管セグメントで4〜6mg、または約0.2mg/kgのほぼ１用量に等しい）であり、好ましくは1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン（POPC）とほぼ１：１の重量比で組み合わせて投与する。
【００１４】
代替の実施形態においては、アポリポタンパク質を直接提供しないで、アポリポタンパク質をコードする遺伝子を提供する。タンパク質に対して用いる方法と類似の方法で、遺伝子を血管中に導入し、次いでタンパク質を発現させる。この技術はまた、再狭窄または他の心血管疾患を治療または予防するための遺伝子送達にも利用することができる。
【００１５】
さらに他の実施形態においては、ステントを、アポリポタンパク質単独、脂質とともに製剤化したアポリポタンパク質、アポリポタンパク質を発現するように遺伝子操作した細胞、アポリポタンパク質をコードする裸のDNA、または抗増殖薬などの他の薬剤でコーティングして傷害部位に局所送達する。この実施形態はまた、さらに大きい効果を得るために、ステントと組み合わせてコーティングを加える例も含む。好ましい実施形態においては、本システムを、併合療法で、すなわちアポリポタンパク質などの薬剤の局所送達と全身抗高血圧療法、脂質調節および／または抗凝固療法との組み合わせで利用する。使用しうる薬剤の例としては、ナイアシン、スタチン、およびフィブレートなどの脂質調節薬；血糖制御薬；抗高血圧薬；およびアスピリン、IIb／IIIaインヒビター、クロプリゲルまたはヘパリンなどの血液凝固または血小板凝集を予防または遅延する薬剤が挙げられる。最大の利益は、１以上の組み合わせによる局所送達療法、例えば、局所送達＋抗凝固＋脂質調節の治療法を利用しうることである。これらの治療は、局所送達の前、同時、または後に開始してもよい。好ましくは、全身治療を局所送達前に始めうる。
【００１６】
図面の詳細な説明
図１〜４は、10頭の家ブタを100mg/kg ETC-216、すなわちアポA-IM/POPC複合体（重量でほぼ1/1）（n＝5）、または生理食塩水(n＝5)の単回静脈内注入により１回処理した試験に関する。試験薬をほぼ３時間にわたり静脈内に投与するとともに、１動物当たり２つの冠血管に、ステント留置による過拡張経皮経管冠動脈形成術（overstretch percutaneous transluminal coronary angioplasty）を施した。投与量は複合体のタンパク質成分の重量に基づいた。動物を、定量冠血管造影および血管内超音波（IVUS）を実施した後28日目（８動物）または29日目（１動物）に、安楽死させ、冠動脈を潅流しかつ固定して組織形態分析を行った。１頭の対照動物は27日目に死亡し、この動物からは組織形態測定データだけを取って利用した。
【００１７】
図1aおよび1bは定量冠血管造影（QCA）データのグラフであり、３つの時点、すなわち冠傷害前、冠傷害とステント留置直後、および犠牲前に測定し、ステントに対して近位の無ステントセグメント、ステントの近位セクション、ステント長全体の平均領域、ステントの遠位セクション、およびステントに対して遠位の無ステントセグメントにおいて測った直径（mm）測定値に基づいた。これらのデータから、ステント領域の最大直径、最小直径を決定した。管腔増加（傷害後管腔直径−傷害前管腔直径）および管腔減少（傷害後管腔直径−28〜29日フォローアップ時管腔直径）のQCA評価をステントおよび隣接無ステントセグメントにおいて決定した。QCAデータを、全血管（すなわち右冠動脈（RCA）および左前下行冠動脈（LAD）の組み合わせ）については図1aに、血管のタイプ（すなわちRCAまたはLAD）については図1bに示した。
【００１８】
図2aおよび2bは、犠牲前（手術後28〜29日）の各ステント冠血管の遠位、中位および近位領域におけるステントおよび管腔面積を決定するために用いた血管内超音波（IVUS）データのグラフである。これらの測定値の差が新内膜面積である。図2aは全血管（すなわち、RCAおよびLADの組み合わせ）に関するものであり、図2bは血管のタイプ（すなわち、RCAまたはLAD）に関するものである。
【００１９】
図3aおよび3bはステント留置動脈の組織形態分析であり、これを用いて外膜境界層（ABL）、外弾性板（EEL）、内弾性板（IEL）、管腔（L）、外膜（A）、中膜（M）、内膜（I）の平均断面積、内膜対中膜（media）比（I/M）および傷害スコアを決定した。傷害スコアは、ステント留置血管の支柱部位における近位（a）、中位（b）および遠位（c）セグメントのそれぞれにおける12個の測定値からなる36個の傷害測定値の平均である。傷害スコアは、０、１、２または３のいずれかのスコアを付け、無傷のIEL（すなわち無傷害）を０で示し外膜に露出されている破壊されたEEL（すなわち、最も重篤な傷害）を３で示した。図3aは全血管（すなわち、RCAおよびLADの組み合わせ）に対する組織形態測定データであり、図3bは血管のタイプ（すなわち、RCAまたはLAD）に対する組織形態測定データである。
【００２０】
図４は、組織形態測定およびIVUS変数の間の選択した相関を示す。
【００２１】
図5aおよび5bは、4-6mgタンパク質／血管のETC-216すなわちアポA-IM／POPC複合体（重量でほぼ１／１）（n＝6、ブタ）、またはスクロース-マンニトールビヒクル（n＝6、ブタ）を含有する0.3-0.4ml溶液をインフィルトレーター（INFILTRATOR(登録商標)）すなわち内膜送達デバイスを用いて投与し、次いで１動物当たり２つの冠血管にステント留置による過拡張経皮経管冠動脈形成術を行った家ブタから採取した組織形態測定データを示す。用量は、複合体中のタンパク質成分の重量を表す。図に示したのは、外膜境界層（ABL）、外弾性板（EEL）、内弾性板（IEL）、管腔（L）、外膜（A）、中膜（M）、内膜（I）の平均断面積、内膜対中膜（media）比（I/M）および傷害スコアを決定するために用いた、ステント留置動脈の組織形態分析である。傷害スコアは、ステント留置血管の支柱部位の近位（a）、中位（b）および遠位（c）セグメントのそれぞれにおける12個の測定値からなる36個の傷害測定値の平均である。傷害スコアは、０、１、２または３のいずれかのスコアを付け、無傷のIEL（すなわち無傷害）を０としかつ外膜に露出されている破壊されたEEL（すなわち、最も重篤な傷害）を３として示した。全血管（すなわち、RCA、左回旋冠動脈（LCX）およびLADの組み合わせ）を図5aに示し、個々の血管のタイプ（すなわち、RCA、LCXまたはLAD）を図5bに示す。
【００２２】
発明の説明
開発されたシステムは、病変した冠、末梢および大脳動脈のバイパス手術、移植片または移植器官を移植するための手術、または血管形成術の実施前もしくは実施中に局所的に再狭窄を治療または予防するためか、あるいは不安定プラークを安定化するために有用である物質の局所使用に焦点を当てている。局所投与は、好ましくは、薬剤をある時間にわたって徐放するリザーバーを備えたデバイスを利用して達成される。リザーバーはステントなどのデバイスの一部であってもよいし、あるいは例えば、心膜内またはインフィルトレーター投与経路での特定の組織もしくは器官中への注入によって作製されてもよい。これは、市販のカテーテルを利用して実施しうる。
【００２３】
投与する組成物は、コレステロールおよび酸化脂質を除去する薬剤（例えばリン脂質、スタチン、フィブレートと組み合わせたアポリポタンパク質）、かかる薬剤をコードする（例えば、アポリポタンパク質をコードする）DNA、もしくは一酸化窒素生成に関わる酵素などの他のタンパク質、および／またはラパマイシン、パクリタクセルもしくは（チロフィバンおよびアブシキシマブなどの）抗体のような抗増殖化合物などの薬剤であってもよい。
【００２４】
併合療法はまた、アポA-IMなどの薬剤を局所投与しかつ他の薬剤を全身投与する、例えば全身抗高血圧療法、脂質調節および／または抗凝固療法を行う場合に利用することもできる。利用しうる薬剤の例としては、ナイアシン、スタチンおよびフィブレートなどの脂質調節薬；血糖制御薬；抗高血圧薬；およびアスピリン、IIb/IIIaインヒビター、クロピドグレルまたはヘパリンなどの血液凝固または血小板凝集を予防または遅延する薬剤が挙げられる。
【００２５】
Ｉ  脂質調節薬（Lipid Modulating Agent）
アポリポタンパク質製剤
HDLとして機能する化合物は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンおよび他のリン脂質などの脂質と、アポA-I、またはアポAI-Milanoを含むその変異体、およびそれから誘導された生物学的活性ペプチド、逆脂質輸送（RLT）ペプチド、パラオキソナーゼなどのHDLに関連する酵素、ならびにアポEなどのHDL関連タンパク質とを組み合わせて含有する合成HDLを、単独でまたはリポソームもしくはエマルジョンと組み合わせて製剤化して含むものである。本明細書で使用される用語、HDL関連タンパク質は、HDLに随伴するHDL関連タンパク質中に存在する配列、および等価の結合または機能特性を有する合成ペプチドを含む。HDL機能を増強する化合物は、HDLが細胞からリポソームへのシャトルとして作用するためのリポソームを含む。適切なリポソーム製剤は、ブリティッシュコロンビア大学（the University of British Columbia）による国際公開WO 95/23592に記載されている。
【００２６】
本明細書に記載の製剤は、典型的には、アポA-Iなどのαらせんタンパク質、脂質および担体からなる。
【００２７】
アポA-IおよびアポA-IMは、病変した冠、末梢、および大脳動脈のバイパス手術、移植片もしくは移植器官の移植のための手術、または血管形成術の結果生じる狭窄を治療あるいは予防するために使用しうる代表的な組成物である。
【００２８】
血漿アポA-Iは、243アミノ酸からなる一本鎖のポリペプチドであり、その一次配列は公知である（Brewerら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:623-630 (1978)）。アポA-Iは細胞内で267アミノ酸前駆体として合成される。このプレプロアポリポタンパク質A-Iは最初に細胞内で18アミノ酸のN末端切断を受けてプロアポリポタンパク質A-Iを生じ、次いでさらに、血漿またはリンパ中で特異的プロテアーゼの活性により６アミノ酸の切断を受け、アポリポタンパク質A-Iを生じる。アポA-I分子の主要構造要件は、両親媒性らせんコンフォメーション中に存在すると推定される11または22個のアミノ酸の反復単位の存在であると考えられる（Segrestら, FEBS Lett 38:247-253 (1974)）。この構造は、アポA-Iの主要生物学的活性、すなわち、脂質結合およびレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（LCAT）活性化を可能にする。
【００２９】
ヒトアポリポタンパク質AI-Milano（アポA-IM）はアポA-Iの自然変異体である（Weisgraberら J. Clin. Invest 66:901-907 (1980)）。アポA-IMでは、アミノ酸Arg173がアミノ酸Cys173により置換されている。アポA-IMは１つのポリペプチド鎖当たり１つのCys残基を含有するので、単量体、ホモ二量体、またはへテロ二量体の型で存在しうる。これらの型は化学的に相互交換可能であり、本明細書の文脈において、用語アポA-IMはこれらの２つの型を区別しない。DNAレベルにおいて、遺伝子配列のCからTへの置換から変異型が生じ、すなわちコドンCGCがTGCに変化してアミノ酸位置173においてargの代わりにcysと翻訳される。しかし、このアポA-Iの変異体は最も関心のある変異体の１つであり、その理由は、アポA-IM被験者はHDL-コレステロールレベルの著しい低下によって特徴付けられるが、動脈疾患の、増大する明らかな危険性がない点にある（Franceschiniら J. Clin. Invest 66:892-900 (1980)）。
【００３０】
アポA-Iの他の有用な変異体はParis変異体であり、この場合、アルギニン151はシステインにより置換されている。
【００３１】
実験動物におけるアポA-I単独（MiyazakiらArterioscler Thromb Vasc Biol. 15:1882-1888 (1995)）またはHDL（Badimonら, Lab Invest. 60:455-461 (1989)およびJ Clin Invest. 85:1234-1241 (1990)）の全身注入および初期ヒト臨床研究（Nanjeeら,Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19:979-989 (1999)、およびErikssonら Circulation. 100: 594-598(1999)）は、有意な生化学的変化を与え、ならびにアテローム硬化型病変の程度および重篤度を低減することを示した。そして、今回、以下でさらに詳細に考察して次いで実施例により実証するように、アポA-Iを傷害部位に局所的に投与して、狭窄または再狭窄を有意に低下し得ることを発見した。
【００３２】
αらせん特性をもつ他のHDL関連アポリポタンパク質も使用しうる。例としては、アポE、プロアポA-I、アポA-I Paris、アポA-II、プロアポA-II、アポA-IV、アポC-I、アポC-II、およびアポC-III、これらのタンパク質内のαらせん配列、ならびに、BielickiおよびOda, Biochemistry 41:2089-2096 (2002)に記載の１以上のスルフヒドラル基を含むように改変されたアポリポタンパク質が挙げられる。さらなるHDL関連タンパク質を利用することができる。例としては、パラオキソナーゼ、コレステリルエステル輸送タンパク質、LCATおよびリン脂質輸送タンパク質が挙げられる。上記タンパク質は、単独で、組み合せて、脂質のみと複合体形成して、または脂質と複合体形成したものと組み合わせて、使用することができる。さらに、複合体の混合物が有用でありうる。その一例は、アポA-Iと脂質からなる複合体およびパラオキソナーゼと脂質とからなる複合体を、混合物として投与することである。他の例は、１以上のタンパク質成分からなる複合体が挙げられる。例えば、アポA-I、パラオキソナーゼおよび脂質からなる複合体が有用である。
【００３３】
脂質
脂質はアポA-Iと複合体を形成してその効能を増強する。典型的には、投与前に脂質をアポA-Iと混合する。アポリポタンパク質と脂質を水溶液中で適当な比率で混合し、当技術分野で公知の方法、例えば、凍結乾燥、界面活性剤可溶化とその後の透析、ミクロ流動化（microfluidization）、音波処理、およびホモジナイゼーションにより複合体形成することができる。複合化効率は、例えば、圧力、超音波周波数、または界面活性剤濃度を変化することにより最適化することができる。アポリポタンパク質-脂質複合体を調製するために通常使用される界面活性剤の一例は、コール酸ナトリウムである。
【００３４】
ある場合には、投与前に、脂質とアポリポタンパク質を混合することが望ましい。脂質は、溶液であってもよいし、または音波処理もしくは押出し（extrusion）などの標準技術を利用して作ったリポソームもしくはエマルジョンの形態であってもよい。音波処理は通常、ブランソンチップ音波処理器（Branson tip sonifier）などのチップ音波処理器を用いて氷浴中で実施する。典型的には、懸濁液を複数の音波処理サイクルにかけて処理する。押出しはリペックス生物膜押出機（Lipex Biomembrane Extruder）などの生物膜押出機により実施する。押出しフィルターの規定された孔サイズにより、特定サイズの単層リポソーム小胞を作製することができる。リポソームはまた、Norton社（Worcester Mass.）から市販されるセラフロー（Ceraflow）ミクロフィルターなどの非対称セラミックフィルターを通して押出すことにより作ってもよいし、またはポリカーボネートフィルターもしくは公知の他のタイプのポリマー材料（すなわち、プラスチック）を通して押出すことにより作ってもよい。
【００３５】
ある場合には、アポリポタンパク質を単独で、本質的に脂質を含まずに、投与して傷害した動脈を治療することが好ましい。無菌水溶液をアポリポタンパク質に加える。溶液のアポリポタンパク質を投与して傷害した動脈を治療することができる。あるいは、複合体の凍結乾燥調製物を水溶液により水化した後、投与してもよい。他の場合には、水溶液中の複合体の凍結調製物を解凍して均一な溶液を得た後、傷害した血管に投与する。
【００３６】
好ましい脂質はリン脂質であり、最も好ましくは、少なくとも１つのリン脂質、典型的には、ダイズ・ホスファチジルコリン、卵・ホスファチジルコリン、ダイズ・ホスファチジルグリセロール、卵・ホスファチジルグリセロール、パルミトイル-オレオイル-ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、またはジステアロイルホスファチジルグリセロールを含む。他の有用なリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、N-(2,3-ジ(9-(Z)-オクタデセニルオキシ))-プロプ-1-イル-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、セファリン、カルジオリピン、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ステアロイル-パルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミルストイル-ホスファチジルセリン、およびジオレイル-ホスファチジルコリンが挙げられる。リン非含有脂質も使用しうる。これには、ステアリルアミン、ドセシルアミン、アセチルパルミテート、および脂肪酸アミドが含まれる。
【００３７】
使用に適したさらなる脂質が当業者には周知であり、様々な周知の文献、例えば「McCutcheon's Detergents and Emulsifiers and McCutcheon's Functional Materials（McCutcheonの界面活性剤および乳化剤ならびにMcCutcheonの機能性材料）」, Allured Publishing Co., Ridgewood, N.Jに引用されている。一般的に、脂質は37℃、35℃、または32℃において液晶であることが所望される。液晶状態の脂質は、典型的に、ゲル状態の脂質より効率的にコレステロールを受容する。患者は、典型的に、約37℃の中心部温度を有するので、37℃で液晶である脂質は、治療の間、一般的に液晶状態である。
【００３８】
製剤中の脂質の濃度は変化してもよい。熟練者はこれらの濃度を変化させて、様々な脂質成分によるまたは特定の患者の治療を最適化することができる。アポAIと脂質は１：0.5〜１：３の重量比で組み合わせるが、コレステロールのクリアランスのためにはより多い量の脂質が好ましい。最も均一な集団を作りかつ安定した再生可能なバッチを作るためには、ほぼ１：１の比が好ましい。
【００３９】
他の脂質調節薬
化合物はまた、HDLレベルを特異的に（すなわち、LDLを減少する副産物としてでなく）増加する化合物とともに投与して、それによりHDLコレステロール対全コレステロール比を改善することができ、そしてHDL対全血コレステロールレベルを改善するために有効であるこれらのいずれの組み合わせの投与であってもよい。
【００４０】
薬剤の例としては、ナイアシン、スタチン、およびフィブレートなどの脂質調節薬が挙げられる。
【００４１】
抗増殖薬
インフィルトレーターはまた、パクリタクセルおよびトポテカンのような抗増殖薬などの薬剤の送達に使用することもできる（Biochemical Pharmacology, 2001; 61(1):119-127）。
【００４２】
遺伝子送達
代替の実施形態においては、タンパク質ではなく、送達すべきタンパク質をコードする遺伝子を投与してもよい。遺伝子導入は、プラスミドもしくはウイルスベクター中への遺伝子物質の直接導入、または細胞もしくはカチオン性リポソームなどの担体中への遺伝子物質の導入を介して実施することができる。かかる方法は当技術分野において周知であり、本明細書に記載の、遺伝子が介在する毒素療法での使用に容易に適合させることができる。Francisら Am. J. Pharmacogenomics 1(1):55-66 (2001)に総説されるように、遺伝子治療は、心血管疾患を予防および治療する新規の手法を提供する。ウイルスベクター系の技術的進歩および膜融合性リポソームベクターの開発は、モデル動物の脈管構造および心筋に対する有効な遺伝子治療計画の開発にとって欠かせないものとなっている。遺伝子治療技術は、遺伝性（家族性高コレステロール血症）および後天性閉塞血管疾患（アテローム性動脈硬化症、再狭窄、動脈血栓症）、ならびに心不全、心筋虚血、移植冠動脈硬化症および高血圧を含む心疾患に対する可能性のある代替治療として評価されている。Teigerら, J. Cardiovasc. Pharmacol. 33(5):726-732 (1999)も参照のこと。
【００４３】
Wolffら, Biotechniques 11:474-85 (1991)の研究は、裸のDNAの筋肉中への注射はDNA配列内にコードされたタンパク質の長期かつ低レベルの発現を可能にすることを実証する。裸のDNAの平滑筋層への投与は、インフィルトレーター（INFILTRATOR(登録商標)）などの壁内デバイスの利用により達成することができ、傷害した血管を治療するためのタンパク質またはそのαらせんドメインの発現を可能にする。導入ベクターは、遺伝子を細胞中に送達するために利用する任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）であってもよく、または遺伝子を送達するための一般的戦略の一部、例えば組換えレトロウイルスもしくはアデノウイルスの一部分であってもよい（Ramら Cancer Res. 53:83-88, (1993)）。ウイルスベクター、化学トランスフェクタント、またはエレクトロポレーションおよびDNAの直接拡散などの物理機械的方法を含む適当なトランスフェクション手段は、例えば、Wolff, J. A. ら, Science, 247, 1465-1468, (1990)；およびWolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)に記載されている。本明細書で使用されるプラスミドまたはウイルスベクターは、遺伝子を分解することなく細胞中に輸送する媒介物であり、送達する細胞中で遺伝子を発現させるプロモーターを含むものである。好ましい実施形態においては、ベクターはウイルスもしくはレトロウイルスのいずれかから誘導される。好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、AIDSウイルス、ニューロン向性ウイルス、シンドビス(Sindbis)およびHIV主鎖をもつものを含む他のRNAウイルスである。また、ベクターとして利用するのに好適なウイルスの特性を共有するいずれのウイルスファミリーも好ましい。好ましいレトロウイルスとしては、マウスモロニー白血病ウイルス（MMLV）、およびMMLVのベクターとして所望される特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。
【００４４】
レトロウイルスベクターは他のウイルスベクターより大きい遺伝子搭載物、すなわちトランスジーンまたはマーカー遺伝子を保有することができるので、この理由で通常使用されるベクターである。しかし、それらは非増殖性細胞中では利用することができない。レトロウイルスは、レトロウイルス科（Retroviridae family）に属する動物ウイルスであり、いずれのタイプ、亜科（subfamily）、属（genus）、または向性（tropism）も含む。レトロウイルスベクターは一般的に、Verma, I.M.,「Retroviral vectors for gene transfer（遺伝子導入用のレトロウイルスベクター）」（MICROBIOLOGY-1985, American Society for Microbiology, pp.229-232, Washington, (1985)に収載）に記載されている。遺伝子治療用にレトロウイルスベクターを使用する方法の例は、米国特許第4,868,116号および第4,980,286号；PCT出願WO90/02806およびWO89/07136；ならびにMulligan, Science 260:926-932 (1993)に記載されている。
【００４５】
アデノウイルスベクターは比較的安定かつ取扱い容易であり、高い力価を有し、そしてエーロゾル製剤で送達することができ、そして非分裂細胞にトランスフェクトすることができる。複製欠陥アデノウイルスの構築は記載されている（Berknerら, J. Virology 61:1213-1220 (1987)；Massieら, Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986)；Haj Ahmadら, J. Virology 57:267-274 (1986)；Davidsonら, J. Virology 61:1226-1239 (1987)；Zhang, 「Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome-mediated transfection and PCR analysis（リポソーム媒介トランスフェクションおよびPCR分析による組換えアデノウイルスの作製と同定）」 BioTechniques 15: 868-872 (1993)）。これらのウイルスをベクターとして用いる利点は、それらが最初に感染した細胞内で複製することはできるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することはできないため、他の細胞型へ広がる程度が限定されていることである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質およびいくつかの他の組織部位への直接的、in vivo送達後に高効率遺伝子導入を達成することが示されている（Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993)；Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993)；Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993)；Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993)；La Salle, Science 259:988-990 (1993)；Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992)；Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993)；Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994)；Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993)；Bout, Human GeneTherapy 5:3-10(1994)；Zabner, Cell 75:207-216 (1993)；Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993)；およびRagot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)）。組換えアデノウイルスは、野生型または複製欠陥アデノウイルスと同じ方法で、特定の細胞表面受容体と結合した後、受容体媒介エンドサイトーシスにより内部に取込まれることにより遺伝子形質導入を達成する（ChardonnetおよびDales, Virology 40:462-477 (1970)；BrownおよびBurlingham, J. Virology 12:386-396 (1973)；SvenssonおよびPersson, J. Virology 55:442-449 (1985)；Sethら, J. Virol. 51:650-655 (1984)；Sethら, Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984)；Vargaら, J. Virology 65:6061-6070 (1991)；Wickhamら , Cell 73:309-319 (1993)）。
【００４６】
ポックスウイルスベクターは大きくかつ数個の遺伝子挿入用部位を有し、熱安定性があり、室温で保存することができる。好ましい実施形態は、ウイルス抗原により誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように遺伝子操作したウイルスベクターである。好ましいこのタイプのベクターはインターロイキン８または10のコード領域を保有するものであろう。
【００４７】
ウイルスベクターは、ほとんどの化学的または物理的方法よりも高い、細胞中に遺伝子を導入する処理能力（遺伝子を導入する能力）を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写体、複製およびカプシド形成に必要な逆方向末端反復配列、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして遺伝子操作する場合、典型的にはウイルスから１以上の初期遺伝子を除去して、除去したウイルスDNAの代わりに遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウイルスゲノム中に挿入する。このタイプの構築物は約８kb以下の外来遺伝子物質を運ぶことができる。除去した初期遺伝子の必要な機能は、典型的には、初期遺伝子の遺伝子産物をイントランス（in trans）に発現するように遺伝子操作した細胞系により供給される。
【００４８】
ウイルスおよびレトロウイルスに挿入される遺伝子は通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を助けるプロモーター、および／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは一般的に、転写開始部位に関して比較的固定した位置にあるとき機能するDNAの単一または複数の配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼと転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含有し、そして上流エレメントおよび応答エレメントを含有してもよい。哺乳動物宿主細胞中のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えば、ポリオーマ、サルウイルス40（SV40）、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサイトメガロウイルスなどのウイルスのゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、βアクチンプロモーターから取得することができる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点も含有するSV40制限酵素断片として得るのが好都合である（Fiersら, Nature, 273:113 (1978)）。ヒトサイトメガロウイルスの即時型プロモーターはHindIII E制限酵素断片として得るのが好都合である（Greenway, P. J.ら , Gene 18:355-360 (1982) ）。もちろん宿主細胞または関係種由来のプロモーターも本発明において有用である。
【００４９】
エンハンサーは一般的に、転写開始部位から固定されない距離において機能するDNA配列を意味し、転写ユニットに対して5'（Laimins L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:993 (1981)）または3'（Lusky, M.L.ら, Mol. Cell Bio. 3:1108 (1983)）にあってもよい。さらに、エンハンサーはイントロン内（Banerji, J. L.ら , Cell 33:729 (1983)）ならびにそれ自身のコード配列内にあってもよい（Osborne, T. F.ら, Mol. Cell Bio. 4:1293 (1984)）。それらは通常、長さが10〜300bpであり、インシス（in cis）で機能する。エンハンサーは近くのプロモーターからの転写を増加するように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を仲介する応答エレメントも含有する。プロモーターもまた、転写の調節を仲介する応答エレメントを含有しうる。エンハンサーはしばしば、遺伝子発現の調節を決定する。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインスリン）は現在公知であるが、典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。好ましい例は、複製起点の後期側(late side)のSV40エンハンサー（bp 100-270）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【００５０】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能をトリガーする光または特定の化学事象のいずれかにより特異的に活性化することができる。系を、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試薬により調節してもよい。また、ウイルスベクター遺伝子発現を、γ線照射などの照射に曝すことにより、またはアルキル化化学療法薬により増強する方法もある。
【００５１】
プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用し、転写すべき転写ユニット領域の発現を最大化することが好ましい。さらに、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は全ての真核生物細胞型において活性であることが好ましい。このタイプの好ましいプロモーターはCMVプロモーター（650塩基）である。他の好ましいプロモーターはSV40プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターLTFである。全ての特定の調節エレメントはクローニングして、特定の細胞型において選択的に発現する発現ベクターを構築するために利用できることが示されている。
【００５２】
真核生物宿主細胞において利用される発現ベクターはまた、mRNA発現に影響を与えうる転写終結に必要な配列を含有してもよい。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分内に、ポリアデニル化セグメントとして転写される。3'非翻訳領域は転写終結部位も含む。転写ユニットはまた、ポリアデニル化領域も含有することが好ましい。この領域の１つの利点は、それにより、転写ユニットがmRNAのようにプロセシングされて輸送される可能性が増加することにある。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定と使用は十分確立されている。相同的ポリアデニル化シグナルをトランスジーン構築物に利用することが好ましい。転写ユニットの好ましい実施形態においては、ポリアデニル化領域はSV40初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、約400塩基からなる。また、転写されるユニットは他の標準配列を単独でかあるいは、構築物から発現するまたは構築物の安定性を改善する上記配列と組み合わせて含有することも好ましい。
【００５３】
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含んでもよい。このマーカー産物を使用して遺伝子が細胞に送達されたか、および送達されたあとで発現されたかを確認する。哺乳動物細胞用の適当な選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体G418、ヒドロマイシン（hydromycin）、およびピューロマイシンがある。かかる選択可能マーカーが哺乳動物宿主細胞中に成功裏に導入されると、形質転換した哺乳動物宿主細胞はたとえ選択圧下に置かれても生存することができる。
【００５４】
好ましい実施形態においては、アポA-I、アポA-IV、ApoE、パラオキソナーゼ、またはこれらのタンパク質内のαらせん領域をコードするDNAの壁内送達を、脂質とともにまたは脂質なしに動脈に送達して傷害した血管を治療する。
【００５５】
複数の異なるタンパク質をコードするDNAも送達することができる。例えば、Chenら, Jpn. J. Pharmacol. 89(4):327-336 (2002)に記載のように、心血管の遺伝子導入は心血管生物学および病理生物学における特定遺伝子の機能を研究するための強力な技術であるだけではなく、心血管の疾患を治療するための有望な戦術でもある。1990年代中期以後、一酸化窒素シンターゼ（NOS）、すなわちL-アルギニンからの一酸化窒素（NO）生成を触媒する酵素は、心血管遺伝子療法の可能性をもつ候補薬として大きな注目を受けている、その理由は、心血管系においてNOが重要なかつ様々な機能を果たすこと、および大脳血管攣縮、アテローム性動脈硬化症、血管形成術後の再狭窄、移植脈管障害、高血圧症、糖尿病、勃起不能、および創傷治癒の遅延を含む多数の心血管疾患プロセスにおいて、NO生物学上の異常が明らかであることによる。３種のNOSイソ型、すなわち、内皮（eNOS）、ニューロン（nNOS）および誘導性（iNOS）が存在する。３種類全てのNOSイソ型が心血管遺伝子導入研究に利用され、有望な結果が得られている。
【００５６】
Kipshidzeら, J. Am. Coll. Cardio. 39 (10):1686-1691 (2002)は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの壁内送達により、新内膜形成が減少することを記載している。
【００５７】
Turunenら, Mol Ther 6 (3):306 (2002)は、核を標的とするlacZおよびTIMP-1をコードするアデノウイルスによる遺伝子療法を、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)-2およびMMP-9と結合しうるペプチドモチーフ（HWGF）と結び付けたことを記載する。in vivoで局所血管内カテーテルを媒介した、HWGFを標的とするTIMP-1をコードするアデノウイルス（AdTIMP-l（HWGF））の遺伝子導入は、ウサギ大動脈バルーン裸出モデル（rabbit aortic balloon denudation model）での内膜の厚さを対照アデノウイルスと比較して有意に低下させた。
【００５８】
本明細書に開示した方法の利点は、本方法が治療の必要な部位において非常に長い時間にわたり送達および放出を提供することである。
【００５９】
全身治療用の薬剤
様々な異なる薬剤を全身および／または局所に投与することができる。そのような薬剤としては、血糖制御薬；抗高血圧薬；抗炎症薬、例えばステロイド系抗炎症薬、セレブレックス（Celebrex）、VIOXX、およびイブプロフェンのようなシクロオキシゲナーゼインヒビターなどのシクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）インヒビターおよび他の非ステロイド系抗炎症薬、ならびに、血液凝固または血小板凝集を予防または遅延する薬剤、例えば、アスピリン、IIb/IIIaインヒビター、クロピドグレルまたはヘパリンが挙げられる。
【００６０】
ステントコーティング
またステントを、アポリポタンパク質単独、脂質とともに製剤化したアポリポタンパク質、アポリポタンパク質または他のタンパク質を発現する細胞、治療タンパク質をコードするDNA、またはパクリタクセル、ラパマイシンもしくは他の抗増殖性化合物などの局所効果を有する薬剤を用いてコーティングしてもよい。そうすると、コーティングは傷害、プラーク、または治療する領域の部位で薬剤を放出する。
【００６１】
製薬上許容される担体
医薬組成物は典型的には、製薬上許容される担体を含む。多数の製薬上許容される担体を採用することができる。実施例はスクロース-マンニトールを使用する。一般的に、通常の生理食塩水を製薬上許容される担体として使用しうる。他の適当な担体は、グルコース、トレハロース、スクロース、無菌水、緩衝化水、0.4％生理食塩水、および0.3％グリシンを含み、そして、さらに安定性を向上するには、アルブミン、アポリポタンパク質、リポタンパク質、グロブリンなどの糖タンパク質を含むことができる。これらの組成物は通常の、周知の無菌化技術により無菌化することができる。得られる水溶液を包装して使用してもよいし、または無菌条件下で濾過して凍結乾燥し、凍結乾燥した調製物を投与前に無菌水溶液と組み合わせてもよい。組成物は、pH調整剤および緩衝化剤、ならびに等張性（tonicity）調整剤などの生理学的条件に近似させるために必要な製薬上許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウムを含有してもよい。
【００６２】
他の実施形態においては、アポA-Iをゲル、または投与部位においてゲルを形成するポリマー溶液に含ませて投与する。一実施形態においては、展性のある（malleable）イオン性ハイドロゲルを形成しうるアルギン酸カルシウムおよび他のある特定のポリマーを用いる。例えば、ハイドロゲルは、海藻から単離した炭水化物ポリマーであるアルギン酸のアニオン塩をカルシウムカチオンにより架橋して作ることができ、その強度はカルシウムイオンまたはアルギン酸の濃度のいずれかが増加するとともに増加する。アルギン酸溶液をアポA-Iと混合してアルギン酸懸濁液を形成し、その懸濁液を硬化する前に患者に直接注射する。懸濁液は、次いでin vivoで存在する生理学的濃度のカルシウムイオンによって短時間に硬化する。例えば、より速やかに分解しうるかまたは-カプロラクトンのオリゴマーなどの疎水性で水に不安定な鎖を用いて誘導体化した改変アルギン酸誘導体を合成して、ハイドロゲルを形成する能力を改善してもよい。さらに、一価カチオンに曝すとゲル化する多糖類、例えばジェランガムなどの細菌性多糖類、およびカラギーナンなどの植物多糖類を、上記のアルギン酸架橋に利用しうる方法と類似の方法を用いて架橋し、ハイドロゲルを形成してもよい。ハイドロゲルを形成するために利用しうる物質のさらなる例としては、イオン的に架橋されるポリホスファジンおよびポリアクリレート、またはそれぞれ温度またはpHにより架橋されるプルロニック（PluronicsTM）もしくはテトロニクス（TetronicsTM）、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックコポリマーが挙げられる。他の物質としては、ポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸およびコラーゲンなどのポリマーが挙げられる。非常に粘性の液体であるかまたはチキソトロピーであり、かつ構造の進化が遅くて時間をかけてゲルを形成する多糖類などのポリマーも有用である。例えば、ヘアージェルのように粘稠性の注入可能なゲルを形成するヒアルロン酸を利用してもよい。改変したヒアルロン酸誘導体は特に有用である。ポリマー混合物も利用しうる。例えば、混合すると水素結合によりゲル化するポリエチレンオキシドとポリアクリル酸の混合物を利用してもよい。一実施形態においては、ポリアクリル酸の5％w/w溶液と5％w/wポリエチレンオキシド（ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン）100,000との混合物を組み合わせて、時間をかけ、例えば数秒以内の速さで、ゲルを形成することができる。
【００６３】
共有結合により架橋しうるハイドロゲル前駆体も有用である。例えば、キトサンなどの水溶性ポリアミンを、ポリエチレングリコールジイソチオシアネートなどの水溶性ジイソチオシアネートを用いて架橋することができる。イソチオシアネートはアミンと反応して化学的に架橋したゲルを生成しうる。アミンとアルデヒドの反応も、例えばポリエチレングリコールジアルデヒドとの反応も利用することができる。ヒドロキシル化水溶性ポリマーも利用することができる。
【００６４】
あるいは、ラジカル開始剤に接触させるとラジカル反応により架橋される置換基を有するポリマーを利用してもよい。例えば、WO 93/17669に開示された、光化学的に架橋しうるエチレン性不飽和基を有するポリマーを利用することができる。さらに、Matsudaら, ASAID Trans., 38:154-157 (1992)に開示された、光化学的に架橋しうるシンナモイル基を有する水溶性ポリマーを利用することができる。
【００６５】
ゲル物質は、スプレー（開放処置において）またはインフィルトレーター（INFILTRATOR）もしくはカテーテル（閉鎖処置時に）のいずれかの使用により投与（apply）される。典型的には、アポA-I単独、脂質と組み合わせたアポA-I、または脂質と複合化したアポA-Iをこれらのゲルと固化または重合の時点で混合し、次いで治療する血管の表面でゆっくりと拡散させる。
【００６６】
他の実施形態においては、製薬上許容される担体をステント上にコートする。担体を選択して、本発明物を時間に依存する方法で放出させてもよい。当業者であれば、担体を色々と変えて、本発明物のステントからの時間依存性放出を実施するための最適なステントコーティングを達成することができる。
【００６７】
II  治療方法
主な実施形態においては、アポリポタンパク質A-I（アポA-I）などのコレステロール低下薬、好ましくはアポリポタンパク質A-I Milano（アポA-IM）などの変異体を単独で、またはさらに好ましくはリン脂質などの脂質担体もしくは他の薬剤と組み合わせて、インフィルトレーター(登録商標)などのリザーバーデバイス（reservoir device）を用いて、病変した冠、末梢および大脳動脈のバイパス手術、移植片もしくは移植器官を移植するための手術、または血管形成術の実施前もしくは実施中に、あるいは不安定プラークを安定化するために局所投与して、有効用量を傷害部位に投与する。他の実施形態においては、上記の技術と物質を投入/投与して血栓形成および虚血を含むプラーク破裂に結果として結びつくことを低減させる。
【００６８】
他の好ましい実施形態においては、局所療法を全身療法と組み合わせて、例えば、再狭窄を低減する、プラーク破裂を減少または防止する、血中コレステロールを低下する、アテローム性動脈硬化性病変コレステロールを低下する、血液凝固を減少する、１以上の血中脂質を調節する（すなわち、脂質調節薬）、炎症を低減する、あるいは血圧を制御するための薬剤と組み合わせて、開始する。利用しうる薬剤の例としては、ナイアシン、スタチン、およびフィブレートなどの脂質調節薬；血糖制御薬；高血圧薬；およびアスピリン、IIb／IIIaインヒビター、クロプリドグレルまたはヘパリンなどの血液凝固または血小板凝集を予防または遅延する薬剤が挙げられる。これらの追加の薬剤は、典型的にはそれらの通常の治療用量を全身に投与しうる。
【００６９】
１以上の組み合わせ、例えば局所送達＋抗凝固＋脂質調節による局所送達療法を用いて、最大の利益を得てもよい。これらの治療は局所送達の前に、同時に、または後に開始することができる。好ましくは、全身治療法を局所送達処置の前に開始する。
【００７０】
好ましい実施形態においては、アポA-I製剤をIntraventional Technologies社（San Diego、CA；Boston Scientificが現在所有する）から入手しうるインフィルトレーター（INFILTRATOR）などの壁内送達デバイスを使って投与する。他の有用なデバイスは、Pavlidesら, Cathet. Cardiovasc. Diagn. 41(3):287-292 (1997)が記載している。他の送達手段は、血管形成術の前、バルーンの膨張前または後のいずれかに、薬剤をリザーバーから送達するカテーテルを利用することができる。
【００７１】
最も好ましい実施形態においては、アポA-IM製剤を、治療時点前にまたは治療時点に単回用量で投与する。治療としては、血管形成術、病変した冠、末梢または大脳動脈のバイパス手術、血管ステントの移植、移植器官または組織の移植、およびプラークの安定化が挙げられる。
【００７２】
好ましい投与量は、以下の実施例でアポA-IMに対して実施したように、実験研究を通して決定される。他のアポリポタンパク質に対する投与量は、コレステロール除去効率、半減期、およびその他の関連する薬物動態学的パラメーターの差を考慮に入れると、アポA-IMに対する投与量に基づいて容易に計算することができる。あるいは、他のアポリポタンパク質に対する投与量は、調製物の抗酸化剤、抗炎症、および抗血栓特性の効率の差を考慮に入れると、容易に計算することができる。異なる製剤に対する脂質の存在および量は、アポA-IMに対して得た実験データに基づいて、同様に決定することができる。
【００７３】
一般的には、製剤を治療部位に投与する。局所投与するときの実際の全投与量は、同じ局所投与量を達成するために全身投与しなければならなかったであろう投与量より著しく少ないが、局所濃度はアポA-Iを全身投与した従来の研究よりはるかに高い。上に記載したように、アポA-IMの好ましい投与量は４〜６mgアポA-IM／血管（典型的には、約４〜18mgアポA-IMの全投与量を用いて３つ以下のセグメントを治療する）、または70kg哺乳動物において約0.05〜0.3mgのアポA-IM/kg体重である。タンパク質対脂質の好ましい比は、１：0.5〜１：３であり、脂質が多いほどコレステロールのクリアランスにとって好ましいが、規制認可を得るための調製物の安定性および一貫性（consistency）のためには脂質に対してより等しい量のタンパク質が好ましい。アポA-IMを含有するもの以外の調製物に対するタンパク質対脂質の比は、様々なタンパク質対脂質の比において試験し、規制認可のための安定性および一貫性、ならびに特性（複合体サイズ、コレステロール流出能力など）を決定する。
【００７４】
単回投与が有効であることは実証されているが、頻回用量を投与してもよい。例えば、−１、０、１、２および３日における20mgアポA-IM/kg体重の静脈内投与は、全てのバルーン過拡張傷害血管において、処置後４週に、対照と比較して管腔面積の増加を示した。
【００７５】
本発明は次の非限定の実施例を参照することによりさらに理解されるであろう。
【００７６】
経皮冠血管介入は、現在、冠血管虚血を伴う患者の狭まった血管の管腔を増加するための主要処置である。これらの処置は、「バルーニング（ballooning）」として通常知られる、経皮経管冠動脈形成術（percutaneous transluminal coronary angioplasty）（PTCA）により実施される。多くの場合、この処置は、血流を増加しかつ虚血を軽減するため血管直径を増加する目的で、拡張した領域にステントを留置して完了する。大きな欠点は、再狭窄として知られる血管腔の処置後閉鎖である。ステントが存在しないと、処置後の初期反跳（recoil）および血栓症発生の問題があり、従って、現在のほとんどのバルーン処置はステントの留置も含む。ステント留置は成果を改善するが、処置後のステント留置血管の新内膜成長は再狭窄および再発性虚血または心筋梗塞を含む他の冠血管事象を起こしうる。従って、処置成果を改善するために、バルーン処置およびステント留置した血管の新内膜成長を防止する方法が望まれている。これを研究するために、モデルブタを適当な試験系として選択した。文献における証拠は、モデルブタにおける動脈拡張および再狭窄がヒトの再狭窄に類似することを示している。従って、このモデルを用いて、臨床再狭窄の治療に対して可能性のある治療薬を評価することができる。
【００７７】
実施例１：ブタ冠動脈中のステント留置による過拡張経皮経管冠動脈形成術（PTCA）において、ETC-216（すなわち、アポA-IMとパルミトイル-オレオイル-ホスファチジルコリン（POPC）からなる複合体を含有する調製物）の単回高用量静脈内送達が再狭窄に及ぼす影響
この研究の目的は、冠血管PTCAおよびステント留置時において、ETC-216の単回静脈内薬剤送達が血管障害のモデルブタの再狭窄に及ぼす影響を決定することにあった。
【００７８】
材料および方法
実験動物
この研究の目的の適当な試験系としてモデルブタを選択した。文献に記載の証拠は、モデルブタの動脈拡張および再狭窄はヒト再狭窄のそれと類似することを示している。従って、このモデルを用いて再狭窄を治療する可能性のある治療薬を評価することができる。動物を少なくとも７日間実験環境に馴化させ、研究開始前にそれらが健康であることを保証する試験をした。
【００７９】
検疫中および手術前、動物は飼育場で個々に収容した。動物の檻は毎日２回清掃した。動物区の温度と湿度（70-78°F；30-80％RH）を監視して70-80°Fおよび30-80％相対湿度の目標範囲に維持した。室内の空気流は、100％新鮮な濾過空気を１時間当たり数回交換するのに十分な流量であった。自動時間制御装置が12時間周期で交互に明（light）および暗（dark）を提供した。手術後、動物を回復室で回復させ、次いで檻に戻した。動物には、実験期間中、一夜絶食した手術日を除いて、毎日１回、Newco（Rancho Cucamonga、CA）から入手したブタ食物（chow）（Southwest Farms Hog Finisher Diet）を給餌した。新鮮な水を自動給水システムにより自由に与えた。
【００８０】
動物を無作為に選択し、２つの研究グループに割当てた。動物が死亡するかまたは手術処置によりもしくは手術処置から起こったと見られる合併症により安楽死させる必要がある場合、追加の動物を研究用に注文した。
【００８１】
試験物質は、Esperion Therapeutics社より提供されたETC-216（組換えアポリポタンパク質A-I Milano／1-パルミトイル-2-オレオイルホスファチジルコリン（POPC）の複合体）の注射用溶液または生理食塩水のいずれかであった。ETC-216溶液は約14mg/mlのアポA-IMタンパク質を含有し、タンパク質対POPC比が重量で約１対１である。
【００８２】
この研究のために静脈内投与を選択したが、その理由は、これがヒト臨床研究での使用が意図される経路であることによる。用量選択は、動物体重に基づいた。試験物質を100mg/kg体重の用量で投与した。この用量は複合体中のアポリポタンパク質含量に基づいた。従って、本研究の平均ブタは約3000-3500mgの薬剤を受容したことになろう。対照動物は生理食塩水を受容した。
【００８３】
手術は成体家ブタ（体重は約30-35kgで、一動物は50kgであった）において実施した。動物に通常の給餌をして動物施設で飼育した。ブタを一夜絶食し、経口アスピリン325mgによる前処理を手術の３日前に開始し、その後は毎日、安楽死するまで続けた。チクロピジン（250mg）の動物投与を、手術の３日前に開始し、その後は毎日、手術の14日後まで続けた。一夜16時間絶食した後に、動物をアセプロマジン（0.5mg/kg）、ケタミン（20mg/kg）、およびアトロピン（0.05mg/kg）の筋内（IM）注射により固定し；麻酔をチオペンタール（5-8mg/kg）の静脈内(IV)注射を用いて誘導し；そして気管内挿管後、1-2％イソフロランによって維持した。処置中、機械的人工呼吸、動脈血圧（BP）および連続心電図（ECG）監視を実施した。手術後２日間、動物に毎日カルジゼム（cardizem）（120mg）を与えた。
【００８４】
手術処置は、頚動脈の露出と、それに続く8Fシース(sheath)の頚動脈中への挿入からなった。冠血管への器具使用前に、動物にブレチリウムトシレート（250mg IV）、インデラル（inderal）（1mg）およびヘパリン（10,000U IV）を与えた。ETC-216または生理食塩水のIV輸液としての投与を手術処置の90分前に始め、全用量をほぼ３時間にわたって投与した。8F AL-0.75ガイドカテーテルをＸ線透視ガイダンスのもとで冠動脈の小孔（ostia）へ進めた。冠血管内ニトログリセリン（200mcg）の投与後、血管のサイズを評価するために、血管造影を実施した。ステント過拡張傷害を第１の血管で実施し、次いで第２の血管で繰返した。全ての事例において、ステントをLADおよびRCA中に装備した。ステントは平均2.7〜3.0mm直径のセグメントのLADとRCA内に、解剖学的参照として対角枝または中隔枝（diagonal or septal branch）の配置を用いて留置した。全てのステントはバルーンを１〜３回、６-８気圧に30秒間膨張させて装備し、ほぼ1.3：1の最終ステント：動脈比を得た。血管造影は最初にステント部位を狙って実施し、その後繰返して、傷害セグメントの明らかな「ステップアップ（step up）」および「ステップダウン（step down）」により確認されるステント留置部位での傷害を確認した。カテーテルを引抜いて、頚動脈を縫合して皮膚切開を閉じた。感染に対する予防として、処置の終わりに全動物に抗生物質を与えた。動物が麻酔より覚めると、動物施設に帰し、上記の通り、通常の食物と追加の医薬を与えた。
【００８５】
血管造影とIVUS測定
定量冠血管造影（QCA）を利用して、様々な時点、すなわち傷害前、傷害直後および安楽死前28-29日フォローアップにおける平均および最小管腔直径を評価した。
【００８６】
定量冠血管造影（QCA）の際に使用した用語の定義
MLD＝平均管腔直径
R1＝近位セグメントに対する参照セグメント（ステント留置なし）
Prox.＝ステント留置動脈の近位セグメント
Mid.＝ステント留置動脈の中位セグメント
Dist.＝ステント留置動脈の遠位セグメント
R2＝遠位セグメントに対する参照セグメント（ステント留置なし）
Max＝ステント留置セグメント全体の最大管腔直径
Min＝ステント留置セグメント全体の最小管腔直径
管腔増加＝傷害後管腔直径−障害前管腔直径
管腔減少＝傷害後管腔直径−28日フォローアップ時管腔直径
傷害セグメントの％狭窄は、無傷害セグメントを参照として用いて評価した。ステント面積、管腔面積、新内膜面積、％面積狭窄パラメーターを、血管内超音波（IVUS）により測定した。
【００８７】
後期管腔減少(late luminal loss)はバルーン処置直後の傷害と28-29日フォローアップ時のMLDの差として計算し、再構築指数（remodeling index）は後期管腔減少を傷害後MLDで割算して計算した。
【００８８】
フォローアップにおける冠動脈の分析
28日後（n＝8）または29日後（n＝1）に動物を一夜絶食し、上記の手術、すなわちフォローアップ血管造影に備えた。（27日目に死亡した生理食塩水処理した１頭の対照動物は組織学的分析のみを実施した）。さらにフォローアップ時に、それぞれのステント留置動脈をIVUS研究するために、IVUSカテーテルをステント留置冠動脈に留置した。次いで動物をペントバルビタール90mg/kg静注（IV）による麻酔下で安楽死させ、開胸術後に心臓を切除した。冠動脈を生理食塩水により潅流して血液を洗い流し、次いで2％パラホルムアルデヒドを用いて15分間潅流固定し、その後、4％パラホルムアルデヒドを含むリン酸バッファー（pH 7.4）に４時間浸漬し、そして最後に70％エタノール中で保存した。外膜および血管周囲組織の完全性を保持するために、冠動脈を隣接組織（脂肪組織および心筋）とともに注意深く取り除いた。ステント留置セグメントについては特殊な組織学的加工を実施して、血管構造を金属支柱とともにin situで維持した。組織ブロックをメタクリル酸メチルに埋めこんでダイアモンドウエハー刃を用いて切断した。12個の支柱を含有する３つの半径方向断面を切断した。すなわち、近位から、中位から、さらに遠位から、それぞれステントの３分の１づつである。切片を研磨して厚みを約50μmとし、光学的に磨いて、トルイジンブルー（パラゴン染色（paragon stain））を用いて染色した。
【００８９】
組織形態分析
コンピューター画像処理システム（Image Pro Plus 4.0）を用いて、次の組織形態測定を実施した。
【００９０】
１．平均断面積および管腔厚さ（内膜／新内膜-管腔境界により囲まれた面積）；新内膜（管腔と内弾性板（IEL）との間の面積で、IELが無い場合は管腔と中膜の残遺物または外弾性板（EEL）との間の面積）；中膜（IELとEELの間の面積）；血管サイズ（EELにより囲まれた面積であるが外膜面積を除外したもの）；および外膜（外膜周囲組織、脂肪組織および心筋と、EELとの間の面積）
２．傷害スコア。血管障害度を定量化するために、様々な壁構造の裂け目の量と長さに基づくスコアを使用した。傷害度は次のように計算した：
０＝無傷のIEL
１＝表面中間層に露出した破裂IEL
２＝さらに深い中膜層に露出した破裂IEL（中膜切開）
３＝外膜に露出した破裂EEL
結果
27-29日後に、生理食塩水により処理した家ブタ５頭またはETC-216により処理したブタ５頭（雄４頭および雌１頭／グループ）を処理後再狭窄について評価した。
【００９１】
白血球数、赤血球数、血液ヘモグロビン含量、％ヘマトクリット、血小板数を測定する研究の過程において、全動物ではないが複数の動物から血液を採取した。これらの血液変数を測定した全ての事例において、処理後の値は基線値から大きな変化は認められなかった。すなわち、それらは全て正常な範囲内にあった。
【００９２】
本研究に入った全動物の心拍数および血圧を基線で測定した。心拍数および血圧はまた、ほとんどの動物について手術処置中に定期的に、および犠牲前に測定した。研究に入った動物についてのこれらの変数は、手術処置または処理のいずれによっても基線値から大きな変化は認められなかった。
【００９３】
定量冠血管造影(QCA)は、冠傷害前、冠傷害およびステント留置直後、ならびに犠牲前の３時点において測定した（図1aおよび図1b）。直径測定（mm）は、ステントに対し近位の無ステントセグメント（Rl）、ステントの近位セクション（Prox）、ステント長全体の平均領域（Aver）、ステントの遠位セクション（Dist）、およびステントに遠位の無ステントセグメント（R2）において行った。さらに、ステント留置領域の最大直径（Max）、最小直径（Min）を決定した。管腔増加および管腔減少のQCA評価をステント留置セグメントおよび隣接無ステントセグメントにおいて決定した。ステント留置血管の最大（管腔減少最大指数）および最小（管腔減少最小指数）に対する指数を決定した。全血管（すなわちRCAおよびLADの組み合わせ）に対するまたは血管のタイプ（すなわちRCAまたはLAD）に対する定量冠血管造影データを図1aおよび図1bにそれぞれ示した。
【００９４】
血管内超音波（IVUS）を用いて、犠牲前のそれぞれのステント留置冠血管の遠位、中位および近位領域におけるステントおよび管腔面積を決定した。これらの測定値間の差が新内膜面積である。それぞれの動物およびセグメントに対するステント、管腔および新内膜面積の平均値を決定し、これを用いてプールした冠血管（LAD＋RCA）または個々の冠血管（LADまたはRCA）の処理グループに対する平均値を決定した。１頭の対照処理ブタはその予定処置前に（すなわち、27日目に）死亡し、従ってそのステント留置冠血管は組織形態測定のみを行った。全血管（すなわち、RCAおよびLADの組み合わせ）および血管タイプ（すなわち、RCAまたはLAD）に関する血管内超音波データを図2aおよび2bに、それぞれ示した。
【００９５】
ステント留置動脈の組織形態分析を用いて、外膜境界層（ABL）、外弾性板（EEL）、内弾性板（IEL）、管腔（L）、外膜（A）、中膜（M）、内膜（I）の平均断面積、内膜対中膜（media）比（I/M）および傷害スコアを決定した。傷害スコアは、ステント留置血管の支柱部位における近位（a）、中位（b）および遠位（c）セグメントのそれぞれにおける12個の測定値からなる36個の傷害測定値の平均である。傷害は、０、１、２または３のいずれかのスコアを付け、無傷のIEL（すなわち無傷害）を０で示し外膜に曝されている破壊されたEEL（すなわち、最も重篤な傷害）を３で示した。
【００９６】
ETC-216処理は、冠血管の内膜対中膜(I/M)比を32%だけ（RCAおよびLADの組み合わせ）有意に低下させる。この効果はほとんどがLADのI/M比の有意な38％低下によるものであり、RCAにおける低下はそれより低い程度の22％（有意でない）であった。注目すべきは、RCA（傷害スコア＝1.87±0.54）は傷害に対してLAD（傷害スコア＝2.57±0.34）より有意な回復力を有したことである。全血管（すなわちRCAとLADの組み合わせ）および血管タイプ（すなわち、RCAまたはLAD）に関する組織形態測定データを図3aおよび3bにそれぞれグラフで示した。組織形態とIVUS変数の間の選択相関を図４に示した。
【００９７】
実施例２：ブタ冠動脈中のステント留置による過拡張経皮経管冠動脈形成術（PTCA）において、ETC-216（すなわち、アポA-IMとパルミトイル-オレオイル-ホスファチジルコリン（POPC）からなる複合体を含む調製物）のインフィルトレーター壁内送達が再狭窄に与える影響
材料と方法
実験は体重25-30kgの成体家ブタについて実施した。動物に通常の食物を与えて動物施設で飼育した。ブタを一夜絶食し、経口アスピリン（325mg）による前処理を、手術の３日前に開始し、その後は毎日、安楽死するまで続けた。チクロピジン（250mg）の動物への投与を、手術の３日前に開始し、その後は毎日、手術の14日後まで続けた。手術後２日間、動物に毎日カルジゼム（cardizem）（120mg）を与えた。
【００９８】
一夜16時間絶食した後に、動物をアセプロマジン（0.5mg/kg）、ケタミン（20mg/kg）、およびアトロピン（0.05mg/kg）の筋内（IM）注射により固定し；麻酔をチオペンタール（5-8mg/kg）の静脈内(IV)注射を用いて誘導し；そして気管内挿管後、1-2％イソフロランによって維持した。処置中、機械的人工呼吸、動脈血圧（BP）および連続心電図（ECG）監視を実施した。
【００９９】
手術処置は、頚動脈の露出および8Fシースの頚動脈中への挿入からなった。冠血管への器具使用前に、動物にブレチリウムトシレート（250mg IV）、インデラル（inderal）（1mg IV）およびヘパリン（8,000U IV）を与えた。8F AL-0.75ガイドカテーテルをＸ線透視ガイダンスのもとで冠動脈の小孔（ostia）に進めた。冠血管内ニトログリセリン（200mcg）の投与後、血管のサイズを評価するために、定量冠動脈血管造影を全ての３つの冠動脈に対して実施した。２つの最大血管を選択して処置を行った。手術処置中、ステント留置によるPTCAの前に、ETC-216またはスクロース-マンニトールビヒクルをインフィルトレーターを介して壁内に投与した。インフィルトレーターカテーテルを導入したのは、ETC-216またはスクロース-マンニトールビヒクルを非常に低い用量で冠血管壁に送達して循環中への薬剤の損失を最小限にするためである。各動物の２つの動脈に、4-6mg ETC-216またはスクロース-マンニトールビヒクルをそれぞれ0.3-0.4mlの投与容積で浸潤させた。従って、各動物は、２つの動脈セグメントに局在した全用量約8-12mgのETC-216を受けた。それぞれの動脈は、ステント留置とバルーン過膨張の前、ETC-216またはスクロース-マンニトールビヒクルの送達中に、結合したバルーンを１回、1.5-2気圧の圧力まで膨張することにより浸潤処置（infiltration procedure）を受けた。浸潤処置の後、ステントを解剖学的参照として対角枝または中隔枝の配置を用いて、LAD、RCA、およびLCXの浸潤セグメントに正確に留置した。全てのステントはバルーンを１〜３回、６-８気圧に30秒間膨張させて留置され、ほぼ1.3：1の最終ステント：動脈比を得た。血管造影は最初にステント部位を狙って実施し、その後繰返して、傷害セグメントの明らかな「ステップアップ（step up）」および「ステップダウン（step down）」により確認されるステント留置部位での傷害を確認した。カテーテルを引抜いて、頚動脈を縫合して皮膚切開を閉じた。感染に対する予防として、処置の終わりに全動物に抗生物質を与えた。動物が麻酔より覚めると、動物施設に帰し、上記の通り、通常の食物と追加の医薬を与えた。
【０１００】
血管造影とIVUS測定
定量冠血管造影（QCA）を使用して、様々な時点、すなわち傷害前、傷害直後および安楽死前28日フォローアップ時の平均および最小管腔直径を評価した。後期管腔減少をバルーン直後傷害と28日フォローアップとのMLDの差として計算し、再構築指数は後期管腔減少を傷害後MLDで割算して計算した。
【０１０１】
定量冠血管造影の際に使用した用語の定義
R1＝近位セグメントに対する参照セグメント（ステント留置なし）
P＝ステント留置動脈の近位セグメント
M＝ステント留置動脈の中位セグメント
D＝ステント留置動脈の遠位セグメント
R2＝遠位セグメントに対する参照セグメント（ステント留置なし）
Max＝ステント留置セグメント全体の最大管腔直径
Min＝ステント留置セグメント全体の最小管腔直径
管腔増加＝傷害後管腔直径−障害前管腔直径
管腔減少＝傷害後管腔直径−28日フォローアップ時管腔直径
傷害セグメントの％狭窄は、無傷害セグメントを参照として用いて評価した。ステント面積、管腔面積、新内膜面積、％面積狭窄（全てIVUS）パラメーターを測定した。
【０１０２】
フォローアップ時の冠動脈の分析
28日後、動物を一夜絶食し、上記の手術、フォローアップ血管造影に備えた。さらにフォローアップ時に、それぞれのステント留置動脈をIVUSについて研究するために、IVUSカテーテルをステント留置冠動脈に配置した。次いで動物をペントバルビタール90mg/kg静注（IV）による麻酔下で安楽死させ、開胸術後に心臓を切除した。冠動脈を生理食塩水を用いて潅流して血液を洗い流し、次いで2％パラホルムアルデヒドを用いて15分間潅流固定し、その後、4％パラホルムアルデヒドを含むリン酸バッファー（pH 7.4）に４時間浸漬し、そして最後に70％エタノール中で保持した。外膜および血管周囲組織の完全性を保存するために、冠動脈を隣接組織（脂肪組織および心筋）とともに注意深く取り除いた。ステント留置セグメントについては特殊な組織学的加工を実施して、血管構造を金属支柱とともにin situで維持した。組織ブロックをメタクリル酸メチルに埋めこんでダイアモンドウエハー刃を用いて切断した。12個の支柱を含有する３つの半径方向断面を切断した。すなわち、近位から、中位から、さらに遠位から、それぞれステントの３分の１づつである。切片を研磨して厚さを約50μmとし、光学的に磨いて、トルイジンブルー（パラゴン染色（paragon stain））を用いて染色した。
【０１０３】
組織形態分析
コンピューター画像処理システム（Image Pro Plus 4.0）を用いて、次の組織形態測定を実施した。
【０１０４】
１．平均断面積および管腔厚さ（内膜／新内膜-管腔境界により囲まれた面積）；新内膜（管腔と内弾性板（IEL）との間の面積で、IELが無い場合は管腔と中膜の残遺物または外弾性板（EEL）との間の面積）；中膜（IELとEELの間の面積）；血管サイズ（EELにより囲まれた面積であるが外膜面積を除外したもの）；および外膜（外膜周囲組織、脂肪組織および心筋と、EELとの間の面積）
２．傷害スコア。血管傷害度を定量化するために、様々な壁構造の裂け目の量と長さに基づくスコアを使用した。傷害度は次のように計算した：
０＝無傷のIEL
１＝表面中間層に露出した破裂IEL
２＝さらに深い中膜層に露出した破裂IEL（中膜切開）
３＝外膜に露出した破裂EEL
結果
14頭の家ブタからのそれぞれ２つの冠動脈をスクロース-マンニトールビヒクル（対照）または4-6mgのETC-216（n＝7/グループ）を用いて処理した。それぞれの血管サイズを評価するために、左前下行冠動脈（LAD）、左回旋冠動脈（LCX）および右冠動脈（RCA）の定量冠動脈血管造影(QCA)を実施した。この処置には２つの最大の動脈を選択した。それぞれの動脈において、薬剤をインフィルトレーターにより壁内送達し、次いで薬剤送達部位にステント留置による過拡張経皮経管冠動脈形成術（PTCA）を行った。この手術処置は血管傷害を誘発し、炎症、新内膜過形成および再狭窄を発生した。全ての動物からのステント留置動脈に対して、冠傷害前、ステント留置直後、および28日目の犠牲前にQCAを実施した。さらに、IVUSを用いてステントおよび管腔面積を決定し、犠牲直前の新内膜面積を評価した。犠牲後に、ステント留置動脈のセグメントを得て、組織形態測定を行い、過拡張傷害、新内膜過形成の量、および再狭窄の程度を評価した。予定したQCAおよびIVUS処置の９日前に死亡した1頭のビヒクル処理ブタから得た冠血管は、組織学的方法だけを分析した。1頭のETC-216処理ブタは、設備スケジュールの誤りにより予定した28日処置後の６日に安楽死させた。公正な比較を実施しようとするために、これらの２頭のブタから採取したデータは分析から除外した。
【０１０５】
さらに２動物は、ほぼ３倍濃度のETC-216の調製物をインフィルトレーターを通して送達して処理した。調製物の粘度はデバイスを通して試験薬を効果的に送達するには高過ぎることを見出し、そしてデバイスバルーンの破損、従って動脈の傷害量が増加するので、粘性溶液に対するデバイスの使用が制限されることを見出した。
【０１０６】
白血球数、赤血球数、血液ヘモグロビン含量、％ヘマトクリット、血小板数を測定する研究の過程において、全動物から血液を採取した。これらの血液変数を測定した全ての事例において、処理後の値は基線値から大きな変化が認められなかった。すなわち、それらは全て正常な範囲内にあった。本研究に入った全動物の心拍数および血圧を基線で測定した。心拍数および血圧はまた、ほとんどの動物について手術処置中に定期的に、および犠牲前に測定した。研究に入った動物についてのこれらの変数は、手術処置または処理のいずれによっても基線値から大きな変化が認められなかった。
【０１０７】
定量冠血管造影(QCA)は、冠傷害前、冠傷害およびステント留置直後、ならびに犠牲前の３時点において測定した。直径測定（mm）は、ステントに対し近位の無ステントセグメント（R1）、ステントの近位セクション（Prox）、ステント長全体の平均領域（Aver）、ステントの遠位セクション（Dist）、およびステントに対し遠位の無ステントセグメント（R2）において行った。血管内超音波（IVUS）を用いて、犠牲前のそれぞれのステント留置冠血管の遠位、中位および近位領域におけるステントおよび管腔面積を測定した。これらの測定値間の差が新内膜面積である。
【０１０８】
ステント留置動脈の組織形態分析を用いて、外膜境界層（ABL）、外弾性板（EEL）、内弾性板（IEL）、管腔（L）、外膜（A）、中膜（M）、内膜（I）の平均断面積、内膜対中膜（media）比（I/M）および傷害スコアを決定した。傷害スコアは、ステント留置血管の支柱部位における近位（a）、中位（b）および遠位（c）セグメントのそれぞれにおける12個の測定値からなる36個の傷害測定値の平均である。傷害は、０、１、２または３のいずれかのスコアを付け、無傷のIEL（すなわち無傷害）を０で示し外膜に曝されている破壊されたEEL（すなわち、最も重篤な傷害）を３で示した。
【０１０９】
壁内にインフィルトレーター送達したETC-216処理は、冠血管の内膜対中膜比を35％だけ（LAD、LCX、およびRCAの組み合わせ）有意に低下させた。この効果はほとんどRCA（-42％、p＝0.002）、LCX（-38％）、およびLAD（-29％）のI/M比の有意な低下によるものであった。全血管（すなわち、RCA、LCX、およびLADの組み合わせ）および血管タイプ（すなわち、RCAまたはLAD）に関する組織形態測定データを、図5aおよび5bにそれぞれグラフで示した。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１ａ】図1aは定量冠血管造影（QCA）データのグラフであり、３つの時点、すなわち冠傷害前、冠傷害とステント留置直後、および犠牲前に測定し、ステントに対して近位の無ステントセグメント、ステントの近位セクション、ステント長全体の平均領域、ステントの遠位セクション、およびステントに対して遠位の無ステントセグメントにおいて測った直径（mm）測定値に基づいた。これらのデータから、ステント領域の最大直径、最小直径を決定した。管腔増加（傷害後管腔直径−傷害前管腔直径）および管腔減少（傷害後管腔直径−28〜29日フォローアップ時管腔直径）のQCA評価をステントおよび隣接無ステントセグメントにおいて決定した。QCAデータを、全血管（すなわち右冠動脈（RCA）および左前下行冠動脈（LAD）の組み合わせ）について示した。
【図１ｂ】図1bは定量冠血管造影（QCA）データのグラフであり、３つの時点、すなわち冠傷害前、冠傷害とステント留置直後、および犠牲前に測定し、ステントに対して近位の無ステントセグメント、ステントの近位セクション、ステント長全体の平均領域、ステントの遠位セクション、およびステントに対して遠位の無ステントセグメントにおいて測った直径（mm）測定値に基づいた。これらのデータから、ステント領域の最大直径、最小直径を決定した。管腔増加（傷害後管腔直径−傷害前管腔直径）および管腔減少（傷害後管腔直径−28〜29日フォローアップ時管腔直径）のQCA評価をステントおよび隣接無ステントセグメントにおいて決定した。QCAデータを、血管タイプ（すなわちRCAまたはLAD）について示した。
【図２ａ】図2aは、犠牲前（手術後28〜29日）の各ステント冠血管の遠位、中位および近位領域におけるステントおよび管腔面積を決定するために用いた血管内超音波（IVUS）データのグラフである。これらの測定値の差が新内膜面積である。この図は全血管（すなわち、RCAおよびLADの組み合わせ）に関するデータである。
【図２ｂ】図2bは、犠牲前（手術後28〜29日）の各ステント冠血管の遠位、中位および近位領域におけるステントおよび管腔面積を決定するために用いた血管内超音波（IVUS）データのグラフである。これらの測定値の差が新内膜面積である。この図は血管のタイプ（すなわち、RCAまたはLAD）に関するデータである。
【図３ａ】図3aはステント留置動脈の組織形態分析であり、これを用いて外膜境界層（ABL）、外弾性板（EEL）、内弾性板（IEL）、管腔（L）、外膜（A）、中膜（M）、内膜（I）の平均断面積、内膜対中膜（media）比（I/M）および傷害スコアを決定した。傷害スコアは、ステント留置血管の支柱部位における近位（a）、中位（b）および遠位（c）セグメントのそれぞれにおける12個の測定値からなる36個の傷害測定値の平均である。傷害スコアは、０、１、２または３のいずれかのスコアを付け、無傷のIEL（すなわち無傷害）を０で示し外膜に露出されている破壊されたEEL（すなわち、最も重篤な傷害）を３で示した。この図は全血管（すなわち、RCAおよびLADの組み合わせ）に対する組織形態測定データである。
【図３ｂ】図3bはステント留置動脈の組織形態分析であり、これを用いて外膜境界層（ABL）、外弾性板（EEL）、内弾性板（IEL）、管腔（L）、外膜（A）、中膜（M）、内膜（I）の平均断面積、内膜対中膜（media）比（I/M）および傷害スコアを決定した。傷害スコアは、ステント留置血管の支柱部位における近位（a）、中位（b）および遠位（c）セグメントのそれぞれにおける12個の測定値からなる36個の傷害測定値の平均である。傷害スコアは、０、１、２または３のいずれかのスコアを付け、無傷のIEL（すなわち無傷害）を０で示し外膜に露出されている破壊されたEEL（すなわち、最も重篤な傷害）を３で示した。この図は血管のタイプ（すなわち、RCAまたはLAD）に対する組織形態測定データである。
【図４】図４は、組織形態測定およびIVUS変数の間の選択した相関を示す。
【図５ａ】図5aは、4-6mgタンパク質／血管のETC-216すなわちアポA-IM／POPC複合体（重量でほぼ１／１）（n＝6、ブタ）、またはスクロース-マンニトールビヒクル（n＝6、ブタ）を含有する0.3-0.4ml溶液をインフィルトレーター（INFILTRATOR(登録商標)）すなわち内膜送達デバイスを用いて投与し、次いで１動物当たり２つの冠血管にステント留置による過拡張経皮経管冠動脈形成術を行った家ブタから採取した組織形態測定データを示す。用量は、複合体中のタンパク質成分の重量を表す。図に示したのは、外膜境界層（ABL）、外弾性板（EEL）、内弾性板（IEL）、管腔（L）、外膜（A）、中膜（M）、内膜（I）の平均断面積、内膜対中膜（media）比（I/M）および傷害スコアを決定するために用いた、ステント留置動脈の組織形態分析である。傷害スコアは、ステント留置血管の支柱部位の近位（a）、中位（b）および遠位（c）セグメントのそれぞれにおける12個の測定値からなる36個の傷害測定値の平均である。傷害スコアは、０、１、２または３のいずれかのスコアを付け、無傷のIEL（すなわち無傷害）を０としかつ外膜に露出されている破壊されたEEL（すなわち、最も重篤な傷害）を３として示した。この図は、全血管（すなわち、RCA、左回旋冠動脈（LCX）およびLADの組み合わせ）に関するデータを示す。
【図５ｂ】図5bは、4-6mgタンパク質／血管のETC-216すなわちアポA-IM／POPC複合体（重量でほぼ１／１）（n＝6、ブタ）、またはスクロース-マンニトールビヒクル（n＝6、ブタ）を含有する0.3-0.4ml溶液をインフィルトレーター（INFILTRATOR(登録商標)）すなわち内膜送達デバイスを用いて投与し、次いで１動物当たり２つの冠血管にステント留置による過拡張経皮経管冠動脈形成術を行った家ブタから採取した組織形態測定データを示す。用量は、複合体中のタンパク質成分の重量を表す。図に示したのは、外膜境界層（ABL）、外弾性板（EEL）、内弾性板（IEL）、管腔（L）、外膜（A）、中膜（M）、内膜（I）の平均断面積、内膜対中膜（media）比（I/M）および傷害スコアを決定するために用いた、ステント留置動脈の組織形態分析である。傷害スコアは、ステント留置血管の支柱部位の近位（a）、中位（b）および遠位（c）セグメントのそれぞれにおける12個の測定値からなる36個の傷害測定値の平均である。傷害スコアは、０、１、２または３のいずれかのスコアを付け、無傷のIEL（すなわち無傷害）を０としかつ外膜に露出されている破壊されたEEL（すなわち、最も重篤な傷害）を３として示した。この図は、個々の血管タイプ（すなわち、RCA、LCXまたはLAD）に関するデータを示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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2005504085.tif 000072
2005504085.tif 000073
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504085.tif 000074
【国際調査報告】
2005504085.tif 000075
2005504085.tif 000076