(57)【要約】細胞のナトリウム／水素交換体の阻害剤は、フォンヴィルブランド因子の分泌およびＰ−セレクチンの発現増加における阻害効果を示す。従って前記阻害剤は、血栓性および炎症性疾患の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液中のフォンヴィルブランド因子レベルの上昇および／またはＰ−セレクチンの発現増加によって生じる急性または慢性疾患を予防および治療する医薬を製造するための、ナトリウム／水素交換体の阻害剤の使用。
【請求項２】
下記、
【化１】
2005525336.tif 000011
【化２】
2005525336.tif 000012
【化３】
2005525336.tif 000013
の化合物の少なくとも一つおよび／または上記化合物の立体異性体形態および／またはそれらの形態のあらゆる比率の混合物、および／または上記化合物の薬理学上許容しうる塩をナトリウム／水素交換体の阻害剤として使用する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
カリポリドをナトリウム／水素交換体の阻害剤として使用する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
障害が、後に再灌流を伴う虚血性状態によって誘発される血栓性障害；例えば急性の心筋、腸間膜または脳梗塞における血栓症；外科手術の間もしくは後に生じる血栓性障害；肺塞栓症；特に下肢において長い間血流が制限された後、例えば長い時間横になるかまたは座った後に生じることが多い深部静脈血栓症、ならびに自己免疫疾患もしくは結合組織疾患に伴う脈管炎の際の虚血およびその後の再灌流中に生じる炎症性障害、または初期炎症反応、動脈硬化の予防および治療、癌の予防および治療または関節の炎症および慢性関節リウマチのような関節炎障害の治療である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載された化合物を抗凝血剤、血小板凝集阻害剤またはフィブリン溶解剤と組み合わせて使用する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
追加の薬剤が、第Ｘａ因子阻害剤、標準ヘパリン、低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン、ダルテパリン、セルトロパリン、パルナパリンまたはチンザパリン、直接トロンビン阻害剤、例えばヒルジン、アスピリン、フィブリノーゲン受容体アンタゴニスト、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび／または組織プラスミノーゲンアクチベータの群から選ばれる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
薬剤を、経口、吸入、直腸もしくは経皮的な投与または皮下、関節内、腹腔内もしくは静脈内の注射によって投与する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中のフォンヴィルブランド因子レベルの上昇によって生じる急性または慢性疾患の予防および治療のためのヒトおよび動物用医薬品における細胞のナトリウム／水素交換体の阻害剤の使用に関する。従って、阻害剤は、血栓性および炎症性障害の治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナトリウム／水素交換体（ＮＨＥ）の阻害剤は、多くの臨床前研究において心臓が低灌流である場合に、急激な虚血現象が始まることにより死の危険にさらされる心臓組織を保護するための優れた方法に適した物質として特徴づけられている。ＮＨＥ阻害剤による心臓組織の保護には、心筋の過剰収縮による心臓の不整脈および一時的な機能損失に始まり、心臓組織の死およびそれに伴う永続的な損傷までの、低灌流によって生じる全ての程度の損傷が含まれる。
【０００３】
急性の虚血現象において重要なＮＨＥ阻害剤の作用機構は、細胞内酸性化の結果としてのＮＨＥの活性化による急性的な低灌流組織中で生じるナトリウムイオンの高められた流入を減少させることからなる。これは組織ナトリウムの過負荷状況を遅らせる。心臓組織ではナトリウムおよびカルシウムイオン輸送のカップリングがあるため、これにより心臓細胞の致命的なカルシウム過負荷が予防される。
【０００４】
また、ＮＨＥ阻害剤は、中枢神経系（ＣＮＳ）を保護することが知られており、このような薬剤は、急性の虚血状態に対して心臓に対するのと同様のやり方でＣＮＳを保護する。これらの状態は、急激な低灌流、そしてこれにより栄養素、酸素またはミネラルの供給が欠乏することによって生じる。ＣＮＳに対するこのような虚血性の害は、特に卒中のような中枢神経系の梗塞の場合に現れる。従って、予想通り、これらの急性現象に対するＮＨＥ阻害剤の保護効果は、血流が正常で健康な場合は観察されず、これは心臓の組織またはＣＮＳ組織に対する虚血性の害が急激に開始されないためである。
【０００５】
凝固因子の相互作用に介入し、これにより凝血カスケードを停止させる多くの種類の物質は、先行技術に記載されている。同様に血栓形成を抑制することなく、すでに形成された血栓を分解（溶解）する多くの作用原理が開発されてきた。前記カスケードにおける様々な接合部分で介入するこれらの作用原理のいくつか、例えばビタミンＫ群の誘導体（フィロキノン）、第VIII因子および第IX因子生成物、血小板凝集阻害剤、例えばアセチルサリチル酸、ジピリダモールおよびチクロピジン、抗凝血剤、例えばヘパリンまたはヘパリノイドは、血栓形成を予防するために治療に導入されている。
【０００６】
血液凝固カスケードは、力学的には、以下の図式に示した二つの経路、すなわち内因性および外因性の経路に分けることができ、これらの二つは最終的に合流して第Ｘ因子を活性化し、その結果、トロンビン、続いてフィブリンを生成する。
【化１】
2005525336.tif 000002
【０００７】
このような血液凝固阻害剤の治療上の使用においては、達成される凝血阻害が強すぎないかまたは完全でないことが重要であり、でなければ、生命維持に必要な、頻繁に生じる微小な外傷で起こるべき微小血栓および微小凝血の形成が阻害される。凝血阻害の程度は、特定時間で特定個人の反応における違いの結果として不明確な調節しかできず、そして可能な場合でも程度を注意深くモニターしなければならない。これらの絶えず行われている多くの小さな凝血プロセスを阻害すると、広範囲にわたる出血の危険性が高くなる（血友病）。
【０００８】
従って、凝血現象の阻害剤として介入する、市場で入手可能な知られている治療剤の欠点は、出血合併症の危険性が高いことである。特に高用量の血栓崩壊治療中、例えば急性心筋梗塞症または肺塞栓症の治療中では致命的な出血の危険性がある。従って、過剰投与しても出血傾向が増加する危険性を伴わない治療剤の必要性が切迫している。
【０００９】
知られている抗凝血物質の多くは、血小板、栓球において効果を発揮し、そしてそれらの機能を阻害するかまたはそれらの活性化を阻害することによって作用する。また、内皮が凝血現象における中心的役割を果たしていることは明白である。従って、例えば凝血に必要なフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）は、内皮細胞中のほとんどの部分で産生され、血液中で必要な凝血プロセスを保証するために、内皮細胞によって循環血液中に絶えず（構成的に）分泌されている。産生されたｖＷＦのかなりの部分は、ワイベル−パラーデ小体と称する細胞質の顆粒中に保存され、そして内皮細胞の刺激により必要に応じて放出される。内皮細胞がｖＷＦを産生してそれを血液に供給することができない場合、結果的によく知られている遺伝学的なｖＷＦ依存性疾患、フォンヴィルブランド−ユルゲンス症候群となり；これは出血をほとんど止めることができないことを特徴としている。近年では、血液中のｖＷＦ濃度が上昇し、これによって例えば血液凝固および炎症プロセスの増加傾向が誘発されて生じる疾患が知られるようになった。従って、Kamphuisen等は、多くの研究に基づいて彼らの刊行物“Elevated factor VIII levels and the risk of thrombosis” (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21(5): 731-738 (2001))において血液中のｖＷＦレベルの上昇と血栓障害の増加率との間には優位な関連があることを示している。第VIII因子は、血液凝固に必要な前提条件としてｖＷＦと複合体を形成する。血液中の高レベルのフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）およびｖＷＦと結合した第VIII因子が血栓症の明確な危険因子であると確証することができるようになった。しかし、第VIII因子へのｖＷＦの結合の安定化に拮抗する抗血栓剤は、過剰投与した場合に、血液凝固が実質的に阻害されるため不都合であり、出血傾向の危険性を予想しなければならない。
【００１０】
ここで、血液中のフォンヴィルブランド因子レベルの上昇によって生じる急性または慢性疾患の治療のための有効な化合物を見出す試みにおいて、本発明で使用する化合物は、内皮細胞からのフォンヴィルブランド因子の放出を阻害することがわかった。本発明の化合物は、虚血中に蓄積されるｖＷＦのｐＨ依存性の大量放出を阻害する。
【００１１】
さて、通常、分泌は正常な血液のｐＨで構成的に行われ、これは約７.４であることが知られており、そしてｖＷＦの一部はワイベル−パラーデ小体中に保存されるが、ｐＨが下がるに従ってｖＷＦ放出における遅延および減少がみられることがわかった。ｖＷＦが入っているワイベル−パラーデ小体のエキソサイトーシスは、ｐＨが下がるにつれ阻害が高まる。従って、アシドーシス条件下では、ワイベル−パラーデ小体において有意な増加があり、このため内皮細胞中にｖＷＦが広範囲で蓄積され、そして構成的なおよび刺激されたｖＷＦの分泌が低下する。これは、染色方法によって視覚化され、上澄液中のｖＷＦの定量的測定によって示すことができる。７より下の著しいｐＨ減少を伴うこのようなアシドーシス状態は、例えば組織虚血の場合に生じる。再アルカリ化されて内皮細胞が刺激された時、これは再灌流状態に相当し、数秒内にエキソサイトーシスが行われ、これによりワイベル−パラーデ小体（ＷＰＢ）が空になり、血栓症前の危険因子が大量放出される。
【００１２】
ワイベル−パラーデ小体は、ｖＷＦの他に、膜貫通タンパク質Ｐ−セレクチンも貯蔵する(Wagner, D.D. 1993, Thromb. Haemost., 70:105-110)。Ｐ−セレクチンは小胞膜中にあり、そして小胞融合（エキソサイトーシス）の後、内皮細胞の形質膜中に取り込まれる。これは、すべてのワイベル−パラーデ小体のエキソサイトーシスが、ｖＷＦ放出を増加させるだけでなく、内皮細胞膜中でＰ−セレクチン発現もまた増加させることを意味する。実施例は、アシドーシス中およびその後の再灌流中のｖＷＦ分泌（ＥＬＩＳＡによる定量的測定）を示している。平行して、これらの定量的測定は、ワイベル−パラーデ小体上の免疫蛍光法のデータによって確認された。従って、測定されたｖＷＦは、（血小板凝集の増加を経た）血栓症傾向の増加（ｖＷＦ分泌における増加）または減少（ｖＷＦ分泌における減少）のマーカーであるだけでなく、内皮細胞膜中のＰ−セレクチン発現の増加または減少の直接マーカーでもある。Ｐ−セレクチンは、白血球そしてだから初期炎症反応のアンカーとして役立つ(Vestweber, D., Blanks, J.E. 1999, Physiol. Rev., 79:181-213; Issekutz, A.C., Issekutz, T.B. 2002, J. Immunol., 168:1934-1939)。病態生理学的な有意性は広範囲にわたり、虚血／再灌流障害、血栓症および動脈硬化について確認されている(Massberg, S., 等, 1998, Blood;. 92:507-515; Kita, T., 等, 2001, Ann. N.Y. Acad. Sci., 947:199- 205)。炎症のマーカーおよび炎症の開始因子としてのＰ−セレクチンの有意性の他に、それは癌転移プロセス(Varki, A., Varki, N.M. 2001, Braz. J. Med. Biol. Res. 34: 711-717)において、そして関節のさまざまな炎症（関節炎）(Veihelmann, A. 等, 1999, Microcirculation, 6: 281-290; Mclnnes, I.B., 等, 2001, J. Immunol., 167:4075-4082)の際に必須の役割を果たす。従って、また、ここに記載された物質の作用様式は、全ての上記Ｐ−セレクチンに関連する障害についての治療剤としての用途を見出すことができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明は、血液中のフォンヴィルブランド因子レベルの上昇によって生じる急性および慢性疾患の予防および治療する医薬を製造するためのナトリウム／水素交換体の
阻害剤の使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
さらに、本発明は、血液中のフォンヴィルブランド因子レベルの上昇および／またはＰ−セレクチンの発現増加によって生じる急性および慢性疾患の予防または治療する医薬を製造するための少なくとも一つの、下記
【化２】
2005525336.tif 000003
【００１５】
【化３】
2005525336.tif 000004
【００１６】
【化４】
2005525336.tif 000005
の化合物および／または上記化合物のすべての立体異性体形態および／またはこれらの形態のあらゆる比率における混合物、および／または上記化合物の生理学上許容しうる塩の使用に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、血液中のフォンヴィルブランド因子レベルの上昇および／またはＰ−セレクチンの発現増加によって生じる急性または慢性疾患の予防および治療する医薬を製造するためのカリポリド
【化５】
2005525336.tif 000006
の使用に関する。
【００１８】
上記化合物は知られており、例えばＥＰ ０４１６ ４９９、ＥＰ ０ ５５６ ６７３、ＥＰ ０ ５８９ ３３６、ＥＰ ０ ６２２ ３５６、ＥＰ ０ ６９９ ６６６、ＥＰ ０ ７０８ ０８８、ＥＰ ０ ７１９ ７６６、ＥＰ ０７２６ ２５４、ＥＰ ０ ７８７ ７２８、ＥＰ ０ ９７２ ７６７、ＤＥ１９５２９６１２、ＤＥ１９６０１３０３、ＷＯ ９９ ００３７９またはT.Kawamoto 等,Potent and selective Inhibition of the human Na+/H+ exchanger isoform NHE1 by a novel aminoguanidine derivative T-162559 Eur.J. Pharmacol. 420 (2001), 1-8に記載された通り製造することができる。
【００１９】
上記化合物がジアステレオ異性体または鏡像異性体の形態をとることができ、そして選ばれた合成においてそれらの混合物として生成した場合、純粋な立体異性体への分離は、場合によりキラル担持物質上でのクロマトグラフィによって、または上記化合物のラセミ体が塩を形成できるならば、助剤として光学活性な塩基または酸を用いて形成したジアステレオマー塩を分別結晶することよって実施する。薄層またはカラムクロマトグラフィによる鏡像異性体の分離に適したキラル固定相の例は、改良されたシリカゲル担体（いわゆるPirkle相）および高分子量炭水化物、例えばトリアセチルセルロースである。また、キラル固定相上のガスクロマトグラフィの方法は、当業者に知られた適当な誘導体化の後に分析目的で使用することができる。ラセミカルボン酸の鏡像異性体を分離するには光学活性な、通常商業的に入手可能な塩基、例えば（−）−ニコチン、（＋）および（−）−フェニルエチルアミン、キニン塩基、Ｌ−リシンまたはＬ−およびＤ−アルギニンを用いて溶解度の異なるジアステレオマー塩を形成し、あまり可溶性でない成分を固形物として単離し、より可溶性のジアステレオマーを母液から析出させ、このようにして得たジアステレオマー塩から純粋な鏡像異性体を得る。原則として、同じやり方で、光学活性酸、例えば（＋）−ショウノウ−１０−スルホン酸、ＤおよびＬ−酒石酸、ＤおよびＬ−乳酸ならびに（＋）および（−）−マンデル酸を用いてアミノ基のような塩基性基を含む式Ｉのラセミ化合物を純粋な鏡像異性体に転化することができる。また、アルコールまたはアミン官能基を含むキラル化合物は、適切に活性化されたもしくは必要に応じてＮ−保護されたエナンチオピュアなアミノ酸を用いて対応するエステルもしくはアミドに転化することができ、または、反対にキラルカルボン酸を、カルボキシル保護されたエナンチオピュアなアミノ酸を用いてアミドに、もしくは乳酸のようなエナンチオピュアなヒドロキシカルボン酸を用いて対応するキラルエステルに転化することができる。次いで、エナンチオピュアな形態で製造されたアミノ酸またはアルコール残基のキラリティは、適切な固定相における結晶化またはクロマトグラフィによって今あるジアステレオマーの分離を実施し、それから含まれるキラル部分を適切な方法によって取り除くことによって異性体の分離に用いることができる。
【００２０】
上記化合物の酸性または塩基性の生成物は、その塩の形態または遊離形態で存在することができる。好ましくは、薬理学的に適切な塩、例えばアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属塩、または塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、半硫酸塩、全ての可能なリン酸塩、およびアミノ酸、天然の塩基もしくはカルボン酸の塩である。
【００２１】
生理学上許容しうる塩は、塩形成可能な立体異性体の形態を含めた上記化合物から、それ自体知られている方法で製造される。カルボン酸およびヒドロキサム酸は、塩基性試薬、例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、アルコラートおよびアンモニア、または有機塩基、例えばトリメチルもしくはトリエチルアミン、エタノールアミンもしくはトリエタノールアミン、または塩基性アミノ酸、例えばリシン、オルニチンまたはアルギニンと共に安定なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩または場合により置換されたアンモニウム塩を形成する。また、上記化合物が塩基性基を有する場合、強酸を用いて安定な酸付加塩を製造することができる。無機酸および有機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、４−ブロモベンゼンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、トリフルオロメチルスルホン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸またはトリフルオロ酢酸は、いずれもこの目的に適している。上記化合物のメタンスルホン酸塩は、特に好ましい。
【００２２】
上記化合物は、薬理学的性質のために、血液中のフォンヴィルブランド因子レベルの上昇および／またはＰ−セレクチンの発現増加によって生じる急性または慢性疾患の予防および治療に適している。
【００２３】
これには、後に再灌流を伴う虚血状態によって誘発された血栓性障害；例えば急性の心筋、腸間膜または脳梗塞における血栓症；外科手術の間または後に生じる血栓性障害；肺塞栓症；特に下肢で長い間血流が制限された後、すなわち例えば長い間横になるかまたは座った後に生じることが多い深部静脈血栓症および脈管炎（例えば自己免疫疾患または結合組織疾患に伴う）の際に、虚血およびその後の再灌流の際に生じる炎症性障害が含まれる。また、これには、Ｐ−セレクチンの発現増加によって生じる障害、例えば初期炎症反応；だけでなく動脈硬化の予防および治療；そして癌の予防および治療；また関節の炎症および関節炎の障害、例えば慢性関節リウマチが含まれる。
【００２４】
本発明の医薬の投与は、経口、吸入、直腸もしくは経皮的な投与によって、または皮下、関節内、腹腔内または静脈内の注射によって行うことができる。経口投与が好ましい。
【００２５】
また、本発明は、上記化合物の少なくとも一つを医薬上適切な生理学上許容しうる担体および必要に応じて別の適切な活性成分、添加剤または賦形剤と共に適切な剤形に転化することからなる医薬の製造方法に関する。
【００２６】
上記化合物をこの目的に適した添加剤、例えば担体、安定剤または不活性希釈剤と混合し、そして慣用の方法によって適切な剤形、例えば錠剤、コーチング錠、ツーピースのカプセル剤、水性アルコール性もしくは油性の懸濁剤または水性もしくは油性の液剤に転化する。使用できる不活性担体の例は、アラビアゴム、マグネシア、炭酸マグネシウム、リン酸カリウム、ラクトース、グルコースまたはデンプン、特にコーンスターチである。さらに製造は乾性および湿性の顆粒剤として実施することができる。適切な油性担体または溶媒の例は、植物油または動物油、例えばヒマワリ油または魚肝油である。
【００２７】
皮下、腹腔内または静脈内投与では、所望により、この目的に適した物質、例えば可溶化剤、乳化剤または別の賦形剤を用いて活性化合物を液剤、懸濁剤または乳濁剤に転化する。適切な溶媒の例は、生理食塩水またはアルコール、例えばエタノール、プロパノール、グリセロールだけでなく、糖溶液、例えばグルコースまたはマンニトール溶液、または上記のさまざまな溶媒の混合物である。
【００２８】
また、慣用の助剤、例えば担体、崩壊剤、結合剤、コーチング剤、膨潤剤、滑剤または潤滑剤、香味剤、甘味剤および可溶化剤も使用する。頻繁に使用され、挙げられる賦形剤は、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび別の糖、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油、例えば魚肝油、ヒマワリ油、ピーナッツ油またはゴマ油、ポリエチレングリコールならびに溶媒、例えば滅菌水および一価および多価アルコール、例えばグリセロールである。
【００２９】
上記化合物は、一つの単位が活性成分として式Ｉの化合物の定義された用量を含む用量単位の医薬品として製造し、投与するのが好ましい。この医薬品は、この目的では、経口的には０.０１mg／kg／日〜２５.０mg／kg／日、好ましくは０.０１mg／kg／日〜５.０mg／kg／日の用量で、または非経口的には０.００１mg／kg／日〜５mg／kg／日、好ましくは０.００１mg／kg／日〜２.５mg／kg／日の用量で投与することができる。また、重度の場合には用量を増やすことができる。しかし、多くの場合、低い用量で十分である。これらのデータは、体重約７５kgの成人に関するものである。
【００３０】
上記化合物は、単独でまたは抗凝血剤、血小板凝集阻害剤もしくはフィブリン溶解剤と組み合わせて使用することができる。併用投与は、例えば第Xa因子阻害剤、標準ヘパリン、低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン、ダルテパリン、セルトロパリン、パルナパリンもしくはチンザパリン、直接トロンビン阻害剤、例えばヒルジン、アスピリン、フィブリノーゲン受容体アンタゴニスト、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび／または組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）と共に行うことができる。
【００３１】
ナトリウム／水素交換体の阻害剤が血小板凝集に影響を及ぼし、接着阻害効果を有することは知られている（Rosskopf, Dieter, J. Thromb. Thrombolysis (1999), 8(1), 15-23; または Nieuwland, Rienk; Akkerman, Jan-Willem Nicolaas, Adv. Mol. Cell Biol. (1997), 18(Platelet), 353-366参照）。
【００３２】
また、血小板の凝集における先に記載した効果とは対照的に、上記化合物はフォンヴィルブランド因子の過剰放出の阻害を示す。この新規な抗血栓性作用原理は、非常に重要な都合の良い方法において以前に開示された抗血栓性作用原理とは異なり、ａ）後の再灌流期に虚血組織にのみ作用し、虚血に影響を受けてない他の細胞（虚血前）は、完全に影響を受けないままであり、そして、ｂ）溶解治療中になんらかの危険な出血性の合併症について心配する必要がない。
本発明を以下の実施例によってより詳細に説明する。
【００３３】
以下の実施例は、細胞外アシドーシス（ｐＨex＝６．４）の効果および細胞内ｐＨ（ｐＨi）およびフォンヴィルブランド因子（ｖＷＦ）放出における本発明の上記化合物の効果を示している。全ての実施例は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で実施した。これは、臍静脈から単離された一次細胞培養物からなる。
【００３４】
以下の実施例では、第１継代後、ゼラチンで覆われたガラスプレート（細胞内プロトン濃度の測定）上または細胞培養プレート（１２穴培養プレート, Falcon, New Jersey, USA；ｖＷＦ放出の測定）上のいずれかで細胞を培養した。
【実施例】
【００３５】
実施例１：
細胞内ｐＨの測定
細胞内プロトン濃度（ｐＨi）を測定するため、ＨＵＶＥＣをｐＨ感受性蛍光染料ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（２',７'−ビス（カルボキシエチル）−５(６)−カルボキシフルオレセイン）と共に装填した。Deltascan蛍光分光光度計(PTI, Hamburg)は、次なる蛍光測定に使用した。この測定システムは、本質的に紫外線供給源、モノクロメータ、光子検出器およびコンピュータによりシステムを制御するためのFelix and Oscarソフトウェアパッケージ(PTI, Hamburg)から構成される。波長４３９.５nm（ｐＨ独立性）および４９０nm（ｐＨ感受性）で交互に励起した後、測定されたＢＣＥＣＦの放出率（比率）を記録し、そして較正後、ｐＨを調べた。細胞測定は、システム中の温度および二酸化炭素分圧のパラメータが連続灌流中に制御されるように設計した。再灌流シミュレーションでは、実験条件を３７℃、そしてシステムおよび灌流液にガスを供給することによって二酸化炭素分圧を５％または１０％に設定した。
【００３６】
実験では、最初に呼吸の代謝性アシドーシスをシミュレーションするため炭酸水素ナトリウム緩衝液ｐＨex６.４を用いて６０分間プレインキュベーションした。次いで再灌流シミュレーションとして開始灌流を１０μＭヒスタミン入りのｐＨ７.４の炭酸水素ナトリウム緩衝液に変えた。これらの対照実験を、ＮＨＥ阻害剤カリポリドを再灌流緩衝液に対して１０μＭの濃度で加えた実験と比較した。
【００３７】
数回の実験結果を表１および２にまとめた。
表１：少なくとも１５分間の細胞外アシドーシス（ｐＨi（アシドーシス））中のおよび
対照状態（Ｃｏ）下での細胞内ｐＨ。
【表１】
2005525336.tif 000007
【００３８】
細胞外アシドーシスは細胞内酸性化に至り、これはアシドーシスの間持続する。細胞内アシドーシスのｐＨは、細胞外のｐＨに実質的に同じである（適用された細胞外アシドーシスｐＨex＝６.４）。
【００３９】
表２：カリポリドを含んでなる実験緩衝液（ＨＯＥ）および対照緩衝液（Ｃｏ）を用いた再灌流。アシドーシスの６０分後に、ｐＨi値における最初の増加率を、再灌流後の最初の３０秒の間の測定から調べた。
【表２】
2005525336.tif 000008
【００４０】
細胞外ｐＨが６.４〜７.４に変化した時に、対照と比べて細胞内ｐＨの増加率は３.６倍減少した。従って、再灌流中にカリポリドを用いることによって再アルカリ化速度を著しく低下させることができる。
【００４１】
実施例２
再灌流後のｖＷＦ放出の測定
Heraeus Heracellインキュベータ中で測定を実施した。これにより制御された生理学的条件下（温度３７℃、相対湿度１００％、ｐＣＯ2定数５％）で臍静脈内皮細胞を算出し、そして異なる細胞培養基の急速な変化を保障することが可能となる。
【００４２】
前記細胞を、最初に、アシドーシス培地（ｐＨ６.４，成分：培地Ｍ１９９ｗ／Earle's
＆アミノ酸，ｗ／Ｌ−グルタミン，ｗ／ｏ ＮａＨＣＯ3，ｗ／ｏ Hepes＋ＮａＨＣＯ3 ０.０８４ｇ／ｌから構成される）またはｐＨ標準培地（ｐＨ７.４，成分：培地Ｍ１９９
ｗ／Earle's ＆アミノ酸，ｗ／Ｌ−グルタミン，ｗ／ｏ ＮａＨＣＯ3，ｗ／ｏ Hepes＋ＮａＨＣＯ3 ２.２００ｇ／ｌから構成される）を用いて１、３または４８時間インキュ
ーベートした。再灌流を始める前に上澄液の試料を採取し、アシドーシス条件（ｖＷＦアシドーシス）および対照条件（ｖＷＦco）下でｖＷＦ濃度を測定した。再灌流をシミュレ
ーションするため、培地をｐＨ７.４のもの（成分：培地Ｍ１９９ｗ／Earle's及びアミノ酸、ｗ／Ｌ−グルタミン，ｗ／ｏ ＮａＨＣＯ3，ｗ／ｏ Hepes＋ＮａＨＣＯ3 ２.２００ｇ／ｌ＋１０μＭヒスタミン）に変え、これに上記ＮＨＥ阻害剤カリポリドを１０μＭの濃度で加えた。対応する阻害剤を添加してない同様の培地に対する変化は、対照として役立つ。上澄液から採取した試料を用いてｖＷＦ濃度を測定した。これは、特定の抗体を用いてＥＬＩＳＡ方法（酵素結合抗体免疫吸着アッセイ）によって行った。標準ヒト血漿のｖＷＦ含量(Behring, Marburg)は、国際標準を用いて算出した(2nd International Standard 87/718; National Institute for Biological Standards and Control, London)。
【００４３】
表３：１５分間インキュベーションした後に測定したアシドーシス（ｖＷＦアシドーシス）下および対照条件（ｖＷＦco）下での細胞上澄液中のｖＷＦ濃度。対照条件下のｖＷＦ濃度を１００％に設定した。
【表３】
2005525336.tif 000009
【００４４】
アシドーシスでは、構成的分泌および刺激したワイベル−パラーデ小体分泌の両方のｖＷＦ分泌において減少が異なった。ｖＷＦ分泌は、アシドーシス中の対照細胞（ｐＨex＝６.４）と比較すると２倍減少した。
【００４５】
表４：１０分間の再灌流時間中に刺激してｖＷＦ分泌を測定した。対照細胞（ｖＷＦco）のｖＷＦ分泌を１００％に設定した。プレアシドーシス細胞の再灌流中のｖＷＦ濃度（ｖＷＦアシト゛ーシス）および１０μＭのカリポリドの存在下でのプレアシドーシス細胞の再灌流中のｖＷＦ濃度（ｖＷＦHOE）を対照値と比較した値として示した。対照細胞は、カリポリドと共にインキュベートした（ｖＷＦCO+HOE）。
【表４】
2005525336.tif 000010
【００４６】
再灌流中にｖＷＦ分泌が２倍となる大きな増加があった。カリポリドによりＮＨＥを遮断するとｖＷＦ分泌増加は、ほとんど６０％まで低下し、これにより対照値に近付いた。カリポリド（１０μＭ）とインキュベートした対照細胞は、ｖＷＦ分泌における増加も減少も示さなかった。
【００４７】
実施例からは、例えば虚血中に存在する細胞外アシドーシスは細胞内アシドーシスに至り、結果的に（構成的および刺激された）ｖＷＦ分泌が減少し、Ｐ−セレクチン発現が減少することがわかる。その後の再灌流および内皮細胞の刺激により急速に細胞内の再アルカリ化が生じた。ｖＷＦ分泌の増加およびｐ−セレクチン発現の増加が同時に大きく増大した。カリポリドを用いて再アルカリ化を遅らせると、増加したｖＷＦ分泌およびＰ−セレクチン発現は減少し、これにより起こりうる血栓症および炎症性反応が緩和された。実施例は、細胞内ｐＨが細胞外ｐＨによって決まることを示している。次に、内皮細胞による分泌は、細胞内ｐＨによって決まる。従って、再アルカリ化を阻害することによって、再灌流期中の知られている内皮細胞活性化を大きく低下させ、そして再血栓症（ｖＷＦ分泌）および炎症に関する心配を大きく減らすことができる。健康な非アシドーシス対照細胞をカリポリドとインキュベーションすると効果がみられなかった。これは、副作用の可能性が低く、過剰な出血傾向が予防されることを示している。薬剤は、虚血が存在すると
ころにしか作用しない。
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月22日(2003.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性の心筋、腸間膜または脳の梗塞における血栓症；外科手術の間もしくは後に生じる血栓性障害；肺塞栓症；特に下肢において長い間血流が制限された後、例えば長い時間横になるかまたは座った後に生じることが多い深部静脈血栓症、ならびに自己免疫疾患もしくは結合組織疾患に伴う脈管炎の際の虚血およびその後の再灌流中に生じる炎症性障害、または初期炎症反応の群から選ばれる、血液中のフォンヴィルブランド因子レベルの上昇および／またはＰ−セレクチンの発現増加によって生じる急性または慢性疾患の予防および治療、動脈硬化の予防および治療、癌の予防および治療または関節の炎症および慢性関節リウマチのような関節炎障害の治療用医薬を製造するための、
ａ）
【化１】
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【化２】
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【化３】
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および／またはそれらの立体異性体形態および／またはそれらの形態のあらゆる比率の混合物および／または上記化合物の薬理学上許容しうる塩の群から選ばれるナトリウム／水素交換体の阻害剤と、
ｂ）抗凝血剤、血小板凝集阻害剤またはフィブリン溶解剤
とを組み合わせた使用。
【請求項２】
カリポリドをナトリウム／水素交換体の阻害剤として使用する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
抗凝血剤、血小板凝集阻害剤またはフィブリン溶解剤が、第Ｘａ因子阻害剤、標準ヘパリン、低分子量ヘパリン、例えばエノキサパリン、ダルテパリン、セルトロパリン、パルナパリンまたはチンザパリン、直接トロンビン阻害剤、例えばヒルジン、アスピリン、フィブリノーゲン受容体アンタゴニスト、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび／または組織プラスミノーゲンアクチベータの群から選ばれる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
薬剤を、経口、吸入、直腸もしくは経皮的な投与または皮下、関節内、腹腔内もしくは静脈内の注射によって投与する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【国際調査報告】
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