(57)【要約】サンプル中の可溶性の分析物の濃度の分析方法が少なくとも１の分析物がそこへ付着した所定の量の形成体、前記分析物に結合する可変の既知の濃度の非標識リガンド、及び検出可能なマーカーで標識された既知の濃度の前記リガンドを用いる競合アッセイを実施することを含む。フローサイトメーターにおける分析の後、テストサンプル及び複数のコントロールサンプルが上記サンプル中の可溶性の分析物の濃度を決定するために使用されるデータを生成する。
2005506523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の可溶性の分析物の濃度又は量の分析方法であって、以下のステップ：
（ａ）テストサンプルであって、未知の濃度の可溶性の分析物、所定の量の形成体であって少なくとも１の分析物がそこへ付着するもの、上記分析物に結合する可変の既知の濃度の非標識リガンド、及び検出可能なマーカーで標識された既知の濃度の上記リガンドを含む前記テストサンプルをインキュベートすること、ここで上記標識リガンド及び前記非標識リガンドが前記形成体に結合した分析物及び前記可溶性の分析物に競合的に結合する；
（ｂ）複数のコントロールサンプルをインキュベートすること、前記コントロールサンプルは前記所定の量の前記形成体、及び非標識リガンドを含まない可変の既知の濃度の前記標識リガンドを結合が平衡状態に達することを許容するように含み、ここで前記形成体が１％と１００％の間の割合で標識リガンドでコートされる；
（ｃ）前記形成体上に結合した分析物に結合した標識リガンドから生じる検出可能なシグナルを測定する機器において、テストサンプルとコントロールサンプルを分析すること；
（ｄ）前記シグナルを前記コントロールサンプル中の前記標識リガンドの上記濃度に対してプロットすることにより作成された曲線と、前記シグナルを前記テストサンプル中の標識及び非標識リガンド全体の上記濃度に対してプロットすることにより作成された第２の曲線との交点を同定すること；
（ｅ）前記交点に対応する上記濃度と前記テストサンプル中の上記不変の標識リガンド濃度との間の差異Ｄを求めることにより、前記テストサンプル中の可溶性の分析物に結合した非標識リガンドの上記濃度を決定すること；そして
（ｆ）Ｄ値の結果及び前記リガンドの可溶性の分析物への結合の化学量論を決定することにより、前記サンプル中の前記可溶性の分析物の上記濃度を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記サンプルが前記分析物以外のいずれかの粒子を精製したものである、請求項１に記載の上記方法。
【請求項３】
前記サンプルが、そこへ前記分析物が結合した形成体及び前記形成体から放出された前記可溶性の分析物を含む、請求項１に記載の上記方法。
【請求項４】
前記形成体が、そこへ分析物が共有結合で結合することができる粒子であり、自然発生的又は合成のいずれかのものである、請求項１に記載の上記方法。
【請求項５】
請求項４に記載の上記方法であって、前記形成体が合成の重合体ビーズ、アミノデキストランでコートされたポリスチレンビーズ、分析物がそれらの表面に結合したコロイド状の粒子、生物学的細胞、バクテリア、ウイルス、及び寄生生物から成る群から選ばれる、前記方法。
【請求項６】
前記形成体が哺乳動物の血液細胞である、請求項５に記載の上記方法。
【請求項７】
前記形成体が白血球細胞である、請求項６に記載の上記方法。
【請求項８】
前記分析物が形成体に自然に又は合成的に共有結合で結合されることのできる、タンパク様組成物又は化学組成物である、請求項１に記載の上記方法。
【請求項９】
前記分析物が細胞表面受容体である、請求項８に記載の上記方法。
【請求項１０】
前記受容体が白血球細胞に固定された抗体の受容体である、請求項９に記載の上記方法。
【請求項１１】
前記受容体がグリコシル−ホスファチジルイノシトール結合を介して前記白血球細胞に結合される、請求項１０に記載の上記方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の上記方法であって、前記リガンドが、以下の：ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥクラスのモノクローナル抗体若しくは組み換え抗体、或いはそれらのＦａｂ，Ｆａｂ′若しくはＦ（ａｂ′）２又はＦｃ抗体フラグメント、一本鎖Ｆｖ抗体フラグメント、抗体の相補的決定領域を含む組み換え構築物、所望の細胞表面受容体に結合する抗体と機能的に同等の結合特性を保持するために十分なＣＤＲｓを共有する合成抗体若しくはキメラ抗体構築物、ファージディスプレイにより作られた結合フラグメント、レクチン、ホルモン、成長因子、及び薬剤並びにそれらのフラグメントから成る群から選ばれる、前記方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の上記方法であって、前記機器が、直流、高周波流、光散乱、蛍光及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれるパラメーターを用いて前記シグナルを測定する、前記方法。
【請求項１４】
前記機器が、形成体の光散乱及び蛍光を測定する、請求項１３に記載の上記方法。
【請求項１５】
前記検出可能なマーカーが蛍光である、請求項１４に記載の上記方法。
【請求項１６】
上記蛍光マーカーがフィコビリプロテイン及びタンデム染料から成る群から選ばれる、請求項１５に記載の上記方法。
【請求項１７】
前記マーカーが、フィコシアニン、アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、フルオレッセインイソチオチアネート、フィコエリトロシアニン、フィコエリトリン−テキサスレッド、ＰＥ−Ｃｙ７、アロフィコシアニン−Ｃｙ５、及びアロフィコシアニン−Ｃｙ７から成る群から選ばれる、請求項１６に記載の上記方法。
【請求項１８】
前記機器がフローサイトメーターである、請求項１３に記載の上記方法。
【請求項１９】
前記ステップがコンピュータープログラムにより実施又は実行される、請求項１に記載の上記方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の上記方法であって、ステップ（ｄ）がさらに以下の：前記平均チャンネル強度値を前記テストサンプル中の前記非標識リガンドのモル濃度に対してプロットすることにより形成された第１の１次−対数グラフの依存性曲線、前記平均チャンネル強度値を前記コントロールサンプル中の前記標識リガンドのモル濃度に対してプロットすることにより形成された第２の１次−対数グラフの依存性曲線、及び前記平均チャンネル強度値を前記テストサンプル中の標識及び非標識リガンド全体のモル濃度に対してプロットすることにより形成された第３の１次−対数グラフの依存性曲線を分析することを含む、前記方法。
【請求項２１】
サンプル中の可溶性の受容体の濃度又は量の分析方法であって、前記サンプルが、前記受容体がそこへ結合した形成体及び前記形成体から放出された前記可溶性の受容体を含み、以下のステップ：
（ａ）テストサンプルをインキュベートすること、前記テストサンプルは未知の濃度の可溶性の受容体、所定の量の前記形成体、前記受容体に結合する可変の既知の濃度のリガンド、及び検出可能なマーカーで標識された既知の濃度の前記リガンドを含み、ここで前記標識リガンド及び前記非標識リガンドが前記結合した受容体及び可溶性の受容体に競合的に結合する；
（ｂ）複数のコントロールサンプルをインキュベートすること、前記コントロールサンプルは前記所定の量の前記形成体、及び非標識リガンドを含まない可変の既知の濃度の前記標識リガンドを結合が平衡状態に達することを許容するように含み、ここで前記形成体が１％と１００％の間の割合で標識リガンドでコートされる；
（ｃ）前記形成体上に結合した受容体へ結合する前記標識リガンドから生じる検出可能なシグナルを測定する機器においてテストサンプル及びコントロールサンプルを分析すること；
（ｄ）前記シグナルを前記コントロールサンプル中の前記標識リガンドの濃度に対してプロットすることにより形成された曲線と、前記シグナルを前記テストサンプル中の標識リガンド及び非標識リガンド全体の濃度に対してプロットすることにより形成された第２の曲線との交点を同定すること；
（ｅ）前記交点に対応する上記濃度と前記テストサンプル中の上記不変の標識リガンドの濃度との間の差Ｄを求めることにより、前記形成体から遊離された可溶性の受容体に結合した非標識リガンドの濃度を決定すること；そして
（ｆ）Ｄ値の結果及び前記リガンドの可溶性の受容体への結合の化学量論を決定することにより、前記サンプル中の前記可溶性の受容体の濃度を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項２２】
ステップ（ｅ）中の可溶性の受容体の前記濃度が以下の式：Ｄ×上記リガンドの結合原子価、によって計算される、請求項２１に記載の上記方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の上記方法を実行することによってサンプル中の可溶性の分析物の量を同定し、分析する、コンピュータプログラム。
【請求項２４】
請求項１に記載の上記方法を実行することによってサンプル中の可溶性の分析物の量を同定し、分析する組み込まれたコンピュータプログラムを含む分析機器。
【請求項２５】
哺乳動物の血液中の可溶性の分析物の変化したレベルに特徴を有する病気の診断方法であって、以下の：
（ａ）請求項１に記載の上記方法の上記ステップを実施することにより、可溶性の分析物の量を分析すること、及び
（ｂ）前記哺乳動物のサンプルからの可溶性の分析物の濃度と、健康な哺乳動物の血液のサンプル中の可溶性の分析物の既知の正常な濃度とを比較すること、
を含み、ここで前記哺乳動物の血液サンプル中の前記可溶性の分析物の上記濃度と前記正常な濃度との間の差が病気の指標となる、前記方法。
【請求項２６】
ターゲット細胞表面へ結合した受容体を有する前記細胞により哺乳動物の血液中へ放出される可溶性の受容体の変化したレベルに特徴を有する病気の診断方法であって、以下の：
（ａ）前記ターゲット細胞の表面から前記哺乳動物の血液サンプル中へ放出される可溶性の受容体の量を分析すること、ここで前記分析が請求項１に記載の上記方法のステップを含む、そして
（ｂ）前記哺乳動物のサンプルからの可溶性の受容体の濃度と、健康な哺乳動物の血液のサンプル中の可溶性の受容体の既知の正常な濃度とを比較すること、
を含み、ここで、前記哺乳動物の血液サンプル中の前記可溶性の受容体と、前記正常な濃度との間の差が病気の指標となる、前記方法。
【請求項２７】
哺乳動物の血液中の可溶性の分析物の変化したレベルに特徴を有する病気の診断を実施するためのキットであって、以下の：リガンド、リガンドを標識するための検出可能なマーカー、形成体、サンプルを入れるための好適な容器、可溶性の分析物の正常値の好適なコントロール又は表、前記方法の実施及びコントロール、好適な希釈剤及びサンプル用の緩衝液の調製のための指示書、シグナル比較のための指示チャート、使い捨て手袋、汚染除去指示書、アプリケータースティック又はコンテナ、サンプル準備用のコップ及びそれらの組み合わせ、を含む前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の可溶性の分析物の同定及び定量のための改良方法に関する。より特別には、本発明は、そのような分析の単純な高速フローサイトメトリーの方法に関する。
【０００２】
サンプル中の可溶性の分析物であって、特異的にそれに結合するリガンドが存在する前記分析物の分析及び定量のための単純な方法は、広く多様な適用において有用である。生物学的サンプル中の一定の分析物の存在に特徴を有する病気の診断又は分析物を含む商業的又は工業的サンプルの評価は、そのような方法によって達成されることができる。例えば、形成体、特には細胞、の表面上でのそれらの正常な位置から放出される抗原性の受容体のような可溶性の分析物の分析方法は、病気の状態の診断及び多様な病気の治療の有効性のモニタリングに必須の情報を提供することができる。
【背景技術】
【０００３】
そのような分析のための慣用方法は、標識リガンドと細胞懸濁液との平衡化、それに続くリガンドの溶液濃度を得るための結合したリガンドの非結合リガンドからの分離（例えば、洗浄）のようなステップを含むものであった。その後、細胞に結合した標識リガンド、蛍光強度、及び標識リガンドの溶液濃度のセットを用いるグラフによる分析が分析のために必要なデータを作り出した。受容体の分析のための他の既知の方法は、異なるように標識されたリガンド、較正のための外部標準、又は画像分析を採用するものであった。
【０００４】
フローサイトメトリー法は最近、分離ステップ又は外部標準を用いずに非標識及び標識リガンドの両方を未知の量の結合した抗原及び放出された抗原とともに用いる競合結合実験において、溶液中に放出された抗原性の受容体を定量的に分析するために使用された〔Siiman, O. and Burshteyn, A., Cytometry, 40: 316-326 (2000); 及び米国特許第５，８１４，４６８号、両方とも参考文献として本明細書中に援用されている〕。要約すると、この方法は、未知の量の可溶性の（例えば、放出された）抗原性の受容体及び細胞表面に結合した抗原性の受容体を含むサンプル中の可溶性の受容体の量を得た。上記方法は数多くのアッセイステップからのデータを結びつけた。最初のアッセイステップ中で、標識リガンドのみを含むコントロールサンプルが、全血中の固定された数の細胞と混合され、平衡化された。第２のステップ中で、標識リガンド及び非標識リガンドの両方を含む競合テストサンプルが全血中の固定された数の細胞と経時的に混合され、平衡化された。両ステップ中で、上記細胞は、赤血球の溶解及びそれらのクエンチング（Ｑ−ＰＲＥＰｉｎｇ）によって固定された。上記細胞は、慣用のフローサイトメーターで処理された。可変の滴定量の非標識リガンドと固定された滴定量の標準リガンドを用いた競合結合アッセイにおいて、標識リガンドの蛍光強度が非標識リガンドを含まないコントロールの蛍光強度と一致する、非標識リガンド濃度を決定することによって、結果が分析された。この方法は、血漿中の可溶性の抗原性の受容体濃度の予測を可能とした。
【０００５】
そのような結合した又は放出された抗原性の受容体の追加の又は変更された分析方法が、好中球上の一定の抗原性の受容体であって、いくつかの異常な機能を持つものの測定のような他の目的のために必要とされる〔Edwards SW,“Biochemistry and physiology of the neutrophil”, Cambridge, UK: Cambridge, University Press; (1994); Abramson JS, and Wheeler JG, eds,“The neutrophil.”Oxford, UK: IRL Press at Oxford University Press (1993)〕。例えば、全血中の好中球上のＦｃγ受容体IIIの放出の定量は、長く冗長なＥＬＩＳＡ法を用いて今まで長い間行なわれてきた。ＥＬＩＳＡアッセイのためには、コントロールは容易に得られない。
【０００６】
例えば、上記Ｆｃγ受容体IIIＢは、末端のセリン残基を介して、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合によって好中球膜に固定される。この結合は、エラスターゼ及びプロナーゼのような酵素又は走化性のペプチド、Ｎ−ホルミル−ＭＥＴ−ＬＥＵ−ＰＨＥ、及びホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）のような一定の刺激による活性化によって容易に開裂されることができ、それは、ＦｃγＲIIIＢの好中球膜からの放出を誘導するものである〔Huizinga T.W.J. et al. J.Clin Invest., 86: 416-423 (1990); Tosi, M.F. and Zakem, H., J.Clin.Invest., 90: 462-470 (1992)〕。正常なヒト血清中の可溶性のＦｃγＲIIIＢは、モノクローナル抗体、ＣＬＢＦｃＲｇｒａｎ１，ＢＷ２０９／２、及び３Ｇ８又は３Ｇ８Ｆａｂによって、７．３〜７５．９nmol／Ｌの範囲の広く可変な濃度で検出された〔Fleit H.B., et al, Blood, 79: 2721-2728 (1992)〕。
【０００７】
したがって、本分野において、サンプル中の可溶性の分析物のための追加の及び変更されたフローサイトメトリーによる分析方法に対する必要性が残っている。
【発明の開示】
【０００８】
１の側面において、本発明はサンプル中の可溶性の分析物の濃度又は量の分析方法を提供する。上記方法は、未知の濃度の可溶性の分析物を含む一連のテストサンプルに対して、以下の：少なくとも１の分析物が付着した所定の量の形成体、前記分析物に結合する可変の既知の濃度の非標識リガンド、及び検出可能なマーカーで標識された既知の濃度の前記リガンド、を添加するステップを含む。好ましくは、上記分析物は上記形成体に共有結合性に付着され、検出可能なマーカーで標識された不変の既知の濃度の上記リガンドが使用される。上記サンプルはインキュベートされ、標識リガンド及び非標識リガンドが、形成体に結合した分析物及び可溶性の分析物に競合的に結合する。上記コントロールサンプルは、未知の濃度の可溶性の分析物、所定の量の上記形成体、及び非標識リガンドを含まない可変の既知の濃度の標識リガンドを有するサンプルを含む。すべてのコントロールサンプルは、上記形成体に結合した分析物の結合部位の約１％の占有から飽和における１００％の占有、すなわち、標識リガンドが形成体に結合した分析物及び上記可溶性の分析物に結合する、のリガンドの分析物への結合平衡を達成するようにインキュベートされる。
【０００９】
各テストサンプル及びコントロールサンプルは、上記形成体上に結合した分析物に結合した標識リガンドから生じる検出可能なシグナルを測定する機器によって分析される。その後、上記シグナルを上記コントロールサンプル中の上記標識リガンド濃度に対してプロットすることにより形成された曲線と、上記シグナルを上記テストサンプル中の標識リガンドと非標識リガンドの総濃度に対してプロットすることにより形成された第２の曲線との交点が同定される。好ましくは、上記曲線は１次−対数グラフの依存性曲線であり、上記濃度はモル濃度である。テストサンプル中の可溶性の分析物に結合した非標識リガンドの濃度は、上記交点に対応するモル濃度と上記テストサンプル中の標識リガンドの不変の濃度との間の差Ｄを求めることにより決定される。サンプル中の上記可溶性の分析物の濃度は、Ｄ値の結果及び上記リガンドの可溶性の分析物への結合の化学量論を決定することにより得られる。
【００１０】
他の側面においては、本発明はサンプル中の可溶性の受容体の濃度又は量の分析方法を提供し、ここで、上記サンプルは、そこへ上記受容体が結合した形成体及び上記形成体から放出された可溶性の受容体を含む。上記方法は所定の量の上記形成体、上記受容体に結合する可変の既知の濃度のリガンド、及び検出可能なマーカーで標識された既知の濃度の上記リガンドを含む一連のテストサンプルをインキュベートすることを含む。好ましくは、不変の既知の濃度の上記リガンドであって、検出可能なマーカーで標識されたものが使用される。上記標識リガンド及び上記非標識リガンドは、上記結合された受容体及び可溶性の受容体に競合的に結合する。コントロールサンプルは未知の濃度の可溶性の分析物、所定の量の上記形成体、及び非標識リガンドを含まない可変の既知の濃度の上記標識リガンドを含むサンプルを含む。すべてのコントロールサンプルは、形成体上の結合部位の約１％の占有から、飽和における１００％の間の占有、すなわち、標識リガンドが形成体に結合した分析物及び上記可溶性の分析物に結合する、の結合平衡を達成するようにインキュベートされる。各テストサンプル及びコントロールサンプルは、上記形成体上に結合した受容体に結合した上記標識リガンドから生じる検出可能なシグナルを測定する機器において分析される。上記シグナルをコントロールサンプル中の上記標識リガンドの濃度に対してプロットすることにより形成された曲線と、上記シグナルを上記テストサンプル中の標識リガンドと非標識リガンドの総濃度に対してプロットすることにより形成された第２の曲線との交点が同定される。好ましくは、上記曲線は１次−対数グラフの依存線曲線であり、上記濃度はモル濃度である。上記形成体から放出された可溶性の受容体の濃度はその後、上記交点に対応する濃度及び上記テストサンプル中の標識リガンドの不変の濃度との間の差Ｄと上記リガンドの結合の化学量論を求めることにより決定される。
【００１１】
なお他の側面においては、本発明は生物学的サンプル、すなわち、哺乳動物の血液、血清、組織、の中の可溶性の分析物の変化したレベルに特徴を有する病気の診断方法を提供する。上記方法は、上述の方法のステップを実施すること及び上記哺乳動物のサンプルからの可溶性の分析物の濃度と健康な哺乳動物からのサンプル中の可溶性の分析物の既知の正常濃度とを比較することにより可溶性の分析物の量を分析することを含み、ここでテストされる哺乳動物のサンプル中の可溶性の分析物の濃度と上記正常濃度との差が病気の指標となる。
【００１２】
さらに他の側面においては、本発明は哺乳動物の血液中へターゲット細胞により放出された受容体の変化したレベルにより特徴づけられる病気の診断方法であって、上述の方法によって、以下のステップ：上記ターゲット細胞表面から哺乳動物の血液サンプル中へ放出された可溶性の受容体の量を分析すること；及び上記哺乳動物のサンプルからの可溶性の受容体濃度と健康な哺乳動物の血液のサンプル中の可溶性の受容体の既知の正常濃度を比較することを含む前記方法が提供される。上記哺乳動物の血液サンプル中の可溶性の受容体の濃度と正常濃度との顕著な差は病気の指標となる。
【００１３】
他の側面においては、本発明は、サンプル中の可溶性の分析物、すなわち、形成体を含むサンプルの溶液中へ形成体の表面から放出された可溶性の受容体、の量を上述の方法を実施することにより同定し、分析するコンピュータープログラムを提供する。
【００１４】
さらに他の側面においては、本発明はサンプル中の可溶性の分析物、すなわち、形成体を含むサンプル中の溶液中へ形成体の表面から放出された可溶性の受容体、の量を上述の方法を実施することにより同定し分析する組み込まれたコンピュータープログラムを含む分析機器を提供する。
【００１５】
他の側面においては、本発明はこれらの方法の実施のため、特別には病気の診断のために有用な診断キットを提供する。
本発明の他の側面及び利点は、その好ましい実施態様についての以下の詳細な説明においてさらに記載される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、分析物がそこへ自然に又は合成的に結合する形成体を利用することによってサンプル中に存在する可溶性の分析物の量を分析するための新規かつ改良された方法、及び標識及び非標識リガンドが可溶性の、及び結合した分析物に対して競合する競合アッセイフォーマットを提供する。この分析は、フローサイトメトリーの使用によって達成される。
【００１７】
Ａ．本発明の方法において有用な構成成分
１．形成体
本明細書中に記載される通り、“形成体”という用語は、分析物がそこへ共有結合で結合、静電気的に結合若しくは水素結合により、又は分子中の原子間のこれら３の相互作用の組み合わせにより結合する粒子である。これらの形成体は自然発生的又は合成的に結合することができる。
【００１８】
例えば、合成の形成体の１のサブセットは直径約０．２〜約５．０ミクロンの間の範囲にわたる大きさ（すなわち、コロイドのサイズ）のポリスチレンビーズのような、安定したコロイド状粒子である。そのようなポリスチレン基質又はビーズは、商業的に入手可能なビーズ、すなわちInterfacial Dynamics Corporation, Portland, Oregonより、のようにアルデヒド及び／又は硫酸官能基を有することができる。代わりに、上記ポリスチレンビーズはその周辺表面上にアミノデキストランコーティング及び／又はコロイド状金属のコーティングを有する。好ましくはアミノデキストランコーティングはアミノデキストランの遊離のアミノ基とポリスチレン基質のアミン反応性の基との間の共有結合によりそしてさらにグルタルアルデヒドのような薬剤との架橋結合により、コア基質に共有結合的に結合する。上記アミノデキストランコーティングは、一般的にはジアミン置換の程度が、最大理論値である１／２．５に比較して１／４０−１／３０の範囲である（１Ｘ−アミノデキストラン）ことに特徴を有することができる。より好ましくは、上記アミノデキストランコーティング中の上記ジアミン置換は、約１／７−１／８（５Ｘ−アミノデキストラン）である。分析物、特別にはタンパク質である分析物、は以下に引用される参考文献中に教示される通り、これらのビーズに容易に付着する。また、O.Siiman et al,“Covalently Bound Antibody on Polystyrene Latex Beads: Formation, Stability and Use in Analyses of White Blood Cell Populations”, J.Colloid Interface Sci., 234: (Feb.2001) も参照のこと。
【００１９】
多様なアミノデキストランでコートされたビーズが米国特許第６，０７４，８８４号；同第５，９４５，２９３号；及び同第５，６５８，７４１号に記載されている。磁性フェライトの〔米国特許第５，２４０，６４０号〕、金属の〔米国特許第５，２４８，７７２号〕、ポリスチレンの〔米国特許第５，４６６，６０９号；同第５，７０７，８７７号；同第５，６３９，６２０号；同第５，７７６，７０６号〕、及びポリスチレン−金属の〔米国特許第５，５５２，０８６号；同第５，５２７，７１３号〕粒子のアミノデキストランでコートされた単分散のコロイド状分散もまた、本発明による形成体として採用されることができる。
【００２０】
他のタイプの形成体は、上記アミノデキストランコーティングを覆うコロイドのサイズの金属固体層を有する上記のコートされた基質を含むことができる。好ましくは、この層は上記アミノデキストラン層の分散された表面上に均一に分散される。上記コートされた基質を形成するために有用なコロイド状金属は、一般的には上記アミノデキストランコーティングによってイオン状態から金属（０）状態へ還元され得る金属、又は約０．７ボルト又はそれより高い還元電位を有する金属イオン又は金属イオン複合体を形成し得る金属として記述される。そのような金属イオンが、以下の：Ａｇ（Ｉ），Ａｕ（III），Ｐｄ（III），Ｐｔ（II），Ｒｈ（III），Ｉｒ（III），Ｒｕ（II），Ｏｓ（II）を含む一方、そのような使用のために好ましい金属イオンはコロイド状の第３金及びコロイド状の第１銀である。特に、金／銀コロイドでコートされたポリスチレン−アミノデキストランビーズ、それらの調製、特徴づけ、及び全血中の白血球の亜集団の分析における使用について記述されてきた。例として、以下の：米国特許第５，２４８，７７２号；同第５，５５２，０８６号；同第５，９４５，２９３号；並びにO.Siiman and A.Burshteyn, J.Phys.Chem., 104: 9795-9810 (2000); 及びO.Siiman et al, Cytometry, 41: 298-307 (2000)を参照のこと。
【００２１】
このコートされた基質の代替物は米国特許第５，６３９，６２０号に記載の通り、ＥＤＡＣカップリングによりアミノデキストンでコートされた、カルボキシ官能基をつけたポリスチレン粒子をコア基質として採用する。
【００２２】
本発明中で有用な自然発生的な形成体はまた、生物学的細胞、特には哺乳動物の血液学的細胞又は血液細胞、並びにまた、すべての脊椎動物及び無脊椎動物の細胞、昆虫細胞、細菌細胞、寄生生物、酵母又は真菌の細胞、藻類の又は他の植物の細胞等を含み得る。この定義には、ウイルス、ウイルス様の粒子、寄生生物、及び基本的にいずれかの生物学的なコロイド状粒子であって、それに対する受容体リガンド又は特異的な結合パートナーの存在する受容体又は抗原（すなわち、分析物）をその表面に有するものもまた、含まれる。上記自然発生的な形成体は、それらの上に結合した分析物を有し、例えば細胞表面の又は他の受容体を含む細胞である。本発明は特に以下において、哺乳動物の血液細胞、特別にはヒト白血球を形成体として使用して、記載される。
【００２３】
２．サンプル
本発明の“オリジナルサンプル”は、可溶性の分析物を含むいかなるサンプルをも含み得る。例えば、上記サンプルは、とりわけ、全血、血漿又は血清を含む生物学的サンプルであることができ、ここで形成体は細胞、特には血液細胞である。上記形成体の性質に依存して、上記サンプルは、形成体のための生理学的に許容可能な媒質、例えば生理食塩水、緩衝液又は植物培地、或いは可溶性の分析物を含むいくつかのタイプの商業的なサンプルであることができる。上記サンプルは、可溶性の分析物と同様に粒子を含む合成のサンプルであることができる。そのようなサンプルは、上述の制限に合うようにそのような粒子を除去するためにそのタイプの他のサンプルを取り扱うための、遠心分離による分離等のような慣用方法によって精製されることができる。“テストサンプル”は、標識されたリガンド及び非標識リガンドを含む上記オリジナルサンプルであって、そこへいずれかの任意の緩衝液が添加され、そして混合されるものを意味する。
【００２４】
３．分析物
“分析物”は選ばれたサンプルに可溶な自然発生的な分子であって、特異的に上記分析物に結合し得る“対抗−リガンド”を有するものを意味する。例えば、生物学的受容体、すなわち抗原又はタンパク或いはそれらの部分、はリガンド、すなわち抗体、に結合することのできる分析物である。受容体は、正常には形成体の表面に位置する。細胞又は形成体の内部の受容体は、転位、透過化処理、エレクトロポーレーション等のような何らかの方法によって到達可能とされるか又は表面に運ばれる。血液学的な細胞上に位置する受容体を含む、広範でよく知られた多様な細胞表面受容体が存在する。いくつかの細胞表面受容体は病気、例えば癌、により又は何らかの有害な出来事、例えば放射線への露出に応答して循環する血流中へ放出される。
【００２５】
１の特別な受容体は“ＧＰＩ−結合受容体”であり、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合を介して白血球膜に固定された抗原性の受容体である。ＧＰＩ−結合抗原性受容体は、白血球細胞の表面上に同定される２００を超える抗原中に同定された〔A.N.Barclay et al, The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd edit., Academic Press, San Diego, California, publ (1997), section II, pp.132-593〕。これらは、制限されることなくＣＤ１６ｂ，ＣＤ１４，ＣＤ２４，ＣＤ４８，ＣＤ５２，ＣＤ５５，ＣＤ５９，ＣＤ６６ｂ，ＣＤ６６ｃ，ＣＤ７３，ＣＤ８７，ＣＤ９０，ｇｐ４２，ＬＹ−６，ＲＴ６、及びＳＣＡ−２を含む。これらの抗原のほとんどは正常血清中において可溶性の形態として生じることが示された。他のＧＰＩ−結合分子の中には最近ＣＤ２３０と分類された〔7th Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Harrogate, June 2000〕正常プリオンタンパク、ＰｒＰc〔N.Stahl et al, Cell, 51: 229-240 (1987)〕及び昆虫により媒介される原虫の寄生生物の表面上の糖タンパクがある〔M.A.J.Ferguson, J.Cell.Sci., 112: 2799-2808 (1999)〕。
【００２６】
さらに他のタイプの分析物は正常に形成体に結合しない可溶性のタンパク又は他の分子を含むことができる。医学の、診断の、工業の及び商業の分野を含む多様な分野において、同定及び定量を必要とする可溶性の分析物が存在する。本発明は、上記分析物と同一であることに限られない。
【００２７】
４．リガンド
“リガンド”は上記分析物に特異的に結合する部分又は結合パートナーを意味する。上記分析物が細胞表面上に正常に表出された受容体である場合、それが細胞に結合しているとき又はそこから溶液中へ遊離又は放出されたときに、上記リガンドは上記受容体に結合する。上記分析物が形成体に正常に結合しない場合、上記リガンドは上記可溶性の受容体に結合することができ、又は上記分析物がビーズのような形成体に合成的に共有結合で結合しているときにそれに結合することができる。本明細書中で定義される通り、リガンドは１又はそれを超える特異的な分析物を検出し、それと反応する多様な作用物質を含む。本発明の意味の内のリガンド及びそれらの分析物の例は、制限されることなく、表１に列挙されたものを含む。
【００２８】
【表１】
2005506523.tif 000003
【００２９】
そのようなリガンドの構築に有用な方法は当業者に知られている。そのようなすべてのリガンドは、特定の分析物に、それが可溶性であるか又は形成体の集団に結合しているかにかかわらず、結合するのに適した能力に特徴を有する。１の好ましい実施例において、本発明のリガンドは細胞表面受容体のすべて又は一部分に優先的に結合する成分である。したがって、本発明のこの実施例において有用なリガンドは、白血球集団上の細胞表面受容体に結合することのできる抗体又はその機能的フラグメントであることができる。そのような抗体又はフラグメントはいずれかの自然の出所からのポリクローナル抗体、及び天然又は組み換えのＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ、及びＩｇＥクラスのモノクローナル抗体、ハイブリッド誘導体、並びにＦａｂ，Ｆａｂ′及びＦ（ａｂ′）２を含む抗体のフラグメント、ヒト化された、又はヒト抗体、抗体の相補的抗原決定領域を含む組み換え又は合成の構築物、それらのＦｃ抗体フラグメント、一本鎖Ｆｖ抗体フラグメント、目的の細胞表面受容体に結合する抗体と機能的に同等の結合特性を保持するのに十分なＣＤＲｓを共有する合成抗体又はキメラ抗体構築物、そしてファージディスプレイにより生成された結合フラグメントを含む。
【００３０】
本発明の実施例中で使用されたモノクローナル抗体は、一般的には慣用のハイブリドーマ方法により得られ、腹水からの硫酸アンモニウム（４５％）沈澱、遠心分離及びプロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。モノクローナル抗体作製の標準的プロセスは、G.Kohler and C.Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975)に記載されている。もちろん、モノクローナル抗体の上記特別な作製方法及びその型はそのような技術に限定されるものではなく、そのような抗体を作製するためのいずれの技術も本発明の実施に含まれることは、予想される。細胞上の又はそこから放出された受容体をターゲットとすることのできるいずれのリガンドも使用され得る。なぜなら、蛍光強度の増幅は、細胞上の上記特別な受容体の密度に依存しないためである。
【００３１】
他の典型的なリガンドは、制限されることなく、レクチン、ホルモン、成長因子、又は薬剤若しくは合成化合物、或いは上記分析物に結合し得るそれらの部分を含むことができる。本発明において、リガンドの選択は、制限的な因子ではない。
【００３２】
５．マーカー
“マーカー”という用語は、一般的には分子、好ましくはタンパク様の分子を指し、しかしまた小さな化学的分子、好ましくはレーザーによる励起によって特別な波長の検出可能なシグナルを放射することにより、検出を可能とするものを指す。フィコビリプロテイン、タンデム染料、一定の蛍光タンパク、小さな化学的分子、及び他の方法によって検出可能な一定の分子はすべてフローサイトメトリー分析のためのマーカーと考えられる。例えば、Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Ed., R.P.Haugland, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon (1996) 中に列挙されたマーカーを参照のこと。
【００３３】
“フィコビリプロテイン”は、紅藻類及びラン藻類中に見出される高分子群である。上記ビリプロテイン（“ビリプロテイン”という用語は、“フィコビリプロテイン”という用語と同意義である）は、少なくとも約３０，０００ダルトンの分子量、より普通には少なくとも約４０，０００ダルトン、そして６０，０００ダルトン又はそれを超える分子量であることができ、普通には約３００，０００ダルトンを超えない。上記ビリプロテインは、通常は２〜３の異なるサブユニットを含み、上記サブユニットは約１０，０００〜約６０，０００の範囲の分子量である。上記ビリプロテインは、通常は広い種類の藻類とラン藻類から得られる、自然の形態として採用される。
【００３４】
ビリプロテインに含まれるタンパクの存在は、タンパク様の、及び非タンパク様の分子への結合のための広い範囲の官能基を提供する。存在する官能基はアミノ、チオール、そしてカルボキシル基を含む。いくつかの場合には、ビリプロテインが他のタンパクに接合されるとき、官能基、特別にはチオール基、を導入することが望ましい。各フィコビリプロテイン分子は、多数の発色団を含む。典型的なリガンド、例えばフルオレッセインで直接的に標識された抗体分子、は、それに結合した１と３の間の発色団を有する。フィコビリプロテインとの結合により直接的に標識された（例えば）抗体分子は、３４もの結合した発色団を有することができ、それぞれが、おおよそフルオレッセインに匹敵する吸収率及び量子収率を有する。
【００３５】
本発明において有用なフィコビリプロテインの例は、フィコシアニン、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アロフィコシアニンＢ、フィコエリトリン（ＰＥ）及び好ましくはＲ−フィコエリトリンである。ＰＥは、最近入手可能な最も鮮明な蛍光染料の一つである。抗体に接合させられ、ＰＥは、蛍光プレートアッセイ中でインターロイキン−４を検出するために使用されており、M.C.Custer and M.T.Lotze, J.Immunol.Meth., 128, 109-117 (1990)中で、テストされた蛍光発色団のうちで唯一適切なシグナルを発生させることが見出された。
【００３６】
タンデム染料は、フィコビリプロテイン及び他の染料から形成されることのできる非自然発生的な分子である。例えば、米国特許第４，５４２，１０４号及び同第５，２７２，２５７号を参照のこと。本発明において有用なタンデム染料の例はフィコエリトロシアニン又はＰＣ５（ＰＥ−Ｃｙ５、フィコエリトリン−シアニン５．１；励起波長、４８６−５８０nm、発光波長、６６０−６８０nm）〔A.S.Waggoner et al, Ann.N.Y.Acad.Sci., 677: 185-193 (1993) 及び米国特許第５，１７１，８４６号〕及びＥＣＤ（フィコエリトリン−テキサスレッド；励起波長、４８６−５８０nm、発光波長、６１０−６３５nm）〔米国特許第４，５４２，１０４号及び同第５，２７２，２５７号〕である。他の知られたタンデム染料は、ＰＥ−Ｃｙ７，ＡＰＣ−Ｃｙ５、及びＡＰＣ−Ｃｙ７〔M.Roederer et al, Cytometry, 24: 191-197 (1996)〕である。タンデム染料、ＰＣ５及びＥＣＤは、染料のイミノチオラン活性化を含むいくつかの方法によりモノクローナル抗体にうまく直接的に結合させられた。
【００３７】
リガンドに直接接合させられることができ、上記方法に追加の数のマーカー（標識されたリガンド）を加えるために本発明中のフィコビリプロテイン又はタンデム染料とともに用いられるさらに他のマーカーは、励起によって５５０nmより短い波長の発光をする小分子を含む。そのような分子は、フィコビリプロテインの発光とは重複しない。そのようなマーカーの１の例は、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。他のものは上述のハンドブックに列記されている。
【００３８】
追加の色を与えるために本方法において採用されることのできるさらに他のマーカーは、緑色蛍光タンパク及び青色蛍光タンパクであり；また、紫外線による励起によって発光するマーカーも有用であることができる。
【００３９】
上記ビリプロテイン及びタンデム染料は、Coulter International Corporation, Miami, Florida, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon及びProzyme, Inc., San Leandro, Californiaを含む多様な供給源から商業的に入手可能である。以上で検討された他のマーカー又は標識は、既知の供給源より商業的に得られることができる。
【００４０】
Ｂ．可溶性の分析物を同定し、列挙する方法
本発明による方法についての以下の記載は、分析物、形成体、リガンド及びサンプルの１の特別な実施態様を用いる。この実施態様において、上記分析物は、白血球細胞と未知の量の細胞に結合した受容体及び可溶性の受容体の両方を含むサンプル中において、白血球細胞表面から放出された抗原性の受容体である。上記形成体は、結合した受容体を有する自然発生的な細胞である。上記サンプルは、細胞に結合した受容体及び上記細胞から溶液中への放出された受容体の両方を含む全血である。上記典型的なリガンドは抗体である。しかしながら、上記の通り、他の分析物、リガンド及び形成体を本方法のステップ中に採用することができる。
【００４１】
本発明の方法によって、非標識リガンド（例えば、抗体）の可変の濃度及び標識リガンド（例えば、標識抗体）の不変の濃度を用いて競合アッセイを実施する。所定の又は既知の量又は濃度の形成体（例えば、ターゲットとされた細胞）を含むサンプルは上記受容体に結合する標識及び非標識のリガンドとともにインキュベートされる。適切に標識されたリガンドを含むサンプル中の形成体の総数は、例えば、血液アナライザー、好ましくはＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＳＴＫＳ（商標）又はＳ−Ｐｌｕｓ（商標）カウンターで、そして細胞のサブセットのために必要とされる場合には、フローサイトメーターでサンプルを処理することにより、得られることができる。上記形成体の性質に依存して、所定の量又は濃度のサンプルを供給する他の方法が当業者により選択され得る。
【００４２】
競合アッセイの実施において、テストサンプル及びコントロールサンプル中で、上記“標識リガンド”は、検出可能なマーカー（例えば、蛍光マーカー）で標識される。競合アッセイステップのための各テストサンプルは、既知の不変の量又は濃度の標識リガンド及びサンプル中の結合した及び可溶性の受容体へ競合的に結合する増加する既知の量の非標識リガンドを含む。各サンプルはまた、固定された容量又は濃度の形成体を含む。標識リガンドの濃度は好ましくは、飽和より高くなく、しかしそれに近く、各サンプル中で一定に保持される。テストサンプル中の非標識リガンドの可変の濃度は十分な範囲を含む（すなわち、標識リガンド及び受容体間の結合の０から９５−１００％の間までの阻害が得られるように、十分な標識リガンドが置換される範囲）。標識リガンド及び非標識リガンドのいずれか又は両方を含むサンプルのインキュベーション時間は、当業者により選択されることができるが、しかし一般的には約１０分及び約２時間の間である。
【００４３】
コントロールサンプルもまた、処理される。上記コントロールサンプルは、未知の濃度の可溶性の分析物、所定の量の形成体及び非標識リガンドを含まない、可変の既知の濃度の標識リガンドを含むサンプルを含む。サンプルの容量は一定のままである。形成体に結合した分析物上の結合部位の約１％の占有から飽和における１００％の占有、すなわち、標識リガンドが形成体に結合した分析物及び可溶性の分析物へ結合する、で分析物へのリガンドの結合の平衡が達成されるようにすべてのコントロールサンプルはインキュベートされる。ターゲットとされた形成体（例えば、細胞）の蛍光強度は、非標識リガンドの低濃度の変化に対して非常に敏感である。好ましくは、最適の感度のためには、上記コントロール中の標識されたリガンドの濃度は、形成体（例えば、ターゲットされた細胞）上の受容体部位の約８０〜９０％の飽和が得られるように選ばれるべきである。
【００４４】
上記競合アッセイは、サンプルの不変の一定分量について、標識リガンドの不変量及び非標識リガンドの可変量を含むテストサンプルのセットを含む。上記コントロールは同一の不変の一定分量の全血サンプルについて、標識リガンドの可変量を含むテストサンプルのセットから成る。
【００４５】
コントロール中における標識抗体の、ターゲットとされた細胞上の及び可溶性の受容体への結合の模式的な図が図１Ａに示される。競合結合サンプル中における非標識及び標識抗体の、ターゲットとされた細胞上の及び可溶性の受容体への結合の模式図が図１Ｂから１Ｄに示される。
【００４６】
本発明の方法の他のステップによれば、非標識リガンドを含まないコントロールサンプルと同様に、競合アッセイステップからの各テストサンプルは、直流、高周波流、光散乱、蛍光、及びそれらの組み合わせから成る群から選ばれるパラメーターを用いてシグナルを測定する機器において分析される。上記機器は、形成体表面上に結合された無処置の受容体を介して結合された標識リガンドのみを検出する。非標識リガンド、可溶性の標識リガンド、及び／又は可溶性の受容体に結合した標識リガンドは測定されない。最も好ましくは、上記機器は、受容体に結合した標識リガンドが付着した形成体の光散乱及び蛍光発光を測定する。例えば、フローサイトメーターからの励起放射は標識リガンド上のマーカーに蛍光の平均チャンネル強度（又は亢進されたラマン強度）又は光散乱として検出可能なシグナルを発生させる。形成体上の受容体に結合した標識リガンドのみがこの方法によって検出される。フローサイトメーターは、サンプル中のいずれの結合していない標識リガンド又は可溶性の受容体に結合したいずれのリガンドも測定しない。したがって、コントロールサンプルとテストサンプルの各セットについて、コントロール中の標識リガンド、並びにテストサンプル中の非標識及び標識リガンドの各濃度の平均チャンネル強度値が得られる。上記平均蛍光強度は、好ましくは約１／１００〜約１００％の飽和の範囲の受容体占有率にわたる（飽和は、標識リガンドによって満たされた、と定義される）。
【００４７】
上記方法の他のステップによれば、１次−対数グラフの依存性曲線が上記競合アッセイ（増加する濃度の非標識リガンド及び不変の濃度の標識リガンドを含むテストサンプル）及びコントロール（サンプルの不変の容量中のみにおける標識リガンドの増加する濃度を含む）から集められたデータからプロットされる。これらの曲線の例については図２及び３を参照のこと。最初の１次−対数グラフの依存性曲線は、テストサンプル中の非標識リガンドの既知のモル濃度に対して、競合アッセイステップから得られた平均チャンネル強度値をプロットすることにより形成される（図３において；及び図２において）。第２の１次−対数グラフの依存性曲線は、コントロールサンプル中の標識リガンドの既知のモル濃度に対して平均チャンネル強度値をプロットすることにより形成される（例えば、図３において；×図２において）。第３の１次−対数グラフの依存性曲線は、テストサンプル中の標識及び非標識リガンド全体の既知の濃度のモル濃度に対して、平均チャンネル強度値をプロットすることにより形成される（図２及び３の両方において）。好ましくは、これらの曲線はさらなる分析のために単一のグラフ上に上書きされる。
【００４８】
本発明の方法は、上記形成体から溶液中へ放出された可溶性の受容体の濃度を決定するためにこれらのグラフによる分析のうちの２を採用する。最初のモル濃度はコントロールのみの中の標識リガンド全体の濃度を用いてプロットされた第２の曲線（例えば、図３において；×図２において）と、テストサンプル中のリガンド全体（標識及び非標識）の濃度を用いてプロットされた第３の曲線（図２及び３の両方において）との交点に対応するものとして同定される。競合結合処理（第３の曲線）中の標識リガンドの不変の濃度がその後上記２の曲線の交点における標識及び非標識リガンドのモル濃度から減算される。上記の差（Ｄ）は可溶性の受容体に結合した非標識リガンド濃度を与える。可溶性の受容体の量はその後、リガンドと可溶性の受容体の間の結合化学量論のために（Ｄ）値を補正することによって計算される。上記の差（Ｄ）に上記リガンドの原子価（例えば、結合部位の数）を乗じて、得られた値は可溶性の受容体の濃度である。実施例５は、この方法の実施及びこれらの計算を詳細に記載する。
【００４９】
そのような原子価は、イムノグロブリン及びそれらの受容体について知られている。例えば、上記リガンドがＩｇＧ抗体である場合、上記原子価は２である。上記リガンドが５量体のＩｇＭ抗体である場合、上記原子価は１０である。上記リガンドが抗体以外、例えばホルモン、薬剤等、である場合、選択された受容体に結合することのできるリガンド上の部位の数は既知の方法によって決定されることができる。例えば、中でも米国特許第５，８１４，４６８号中に記載された方法を参照のこと。
【００５０】
この方法がコンピュータにより実行される場合、コンピュータプログラムは上述の計算のすべてを実行し、上述にしたがって実際に曲線を作り直さなくても交点の値を求めることができる。当業者は、上記曲線及びプロットを実際に物理的に作成することなく実施され得る方法を本発明が含むことを理解するだろう。上記方法に必要とされるそのような計算は、コンピュータプログラムにより実行され得る。
【００５１】
本発明のこの方法は、米国特許第５，８１４，４６８号に記載された方法にそれが著しいさらなる正確さを提供することを含む多くの利点を従来技術の他の方法に対して有する。可溶性の分析物又は可溶性及び結合した分析物の定量のためのこのフローサイトメトリーアッセイ法の他の利点は、いずれの純粋な又は部分的に純粋な抗原（上記分析物が、生物学的細胞のような、先在の形成体上の受容体である場合）の必要もないこと及び上記反応のいずれの成分のための外的な固相支持体の必要もないことを含む。例えば、本発明は既知の抗体競合アッセイ及び抗体捕捉イムノアッセイの変更を許容し、両者とも以前に〔Harlow, E. and Lane, D., Antibodies-A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) chap 14, p iii-ix and 553-569〕に記載されている。本発明によれば、上記分析物が生物学的細胞又は他の自然発生的な形成体であり、上記受容体がまた、これらの形成体から放出される場合、上記アッセイは、反応の成分として純粋な又は部分的に純粋な抗原の存在なしに、そしてマイクロタイタープレート又はビーズなしに行われる。競合アッセイにおいて抗原を定量するために推奨されるこれらの必要物を除くことは先在の形成体及び受容体を含むこれらのサンプルにおいて本発明のフローサイトメトリーアッセイがより容易に実施されることを可能とする。
【００５２】
以下に例証される本発明の実施態様によれば、全血中の細胞が上記アッセイのための固相支持体の役割をはたす。それによって上述の溶液中及び細胞表面上の同一の抗原に対する非標識及び標識抗体の競合結合プロトコールが血漿中の可溶性の抗原の濃度を決定するための鋭敏な技術としてのフローサイトメトリーとともに提供される。この方法はまた、〔Siiman, O. and Burshteyn, A., Cytometry, 40: 316-326 (2000); 米国特許第５，８１４，４６８号〕によって以前に記載された方法のような他の手段によっていったんマークをつけられた抗体の特異的な結合活性定数が決定されると、マークされない抗体の細胞表面上のその抗原への特異的な結合活性定数及びターゲットとされる細胞あたりの抗原性の受容体の数の決定をも可能とする。本発明の方法の結果は、また、細胞表面での抗原−抗体結合定数及び血漿の可溶性成分として上記同一の抗原が存在するための受容体母集団を補正するのに使用されることもできる。
【００５３】
以下に提供される実施例中において、本発明の方法は、可溶性のそして好中球に結合したＣＤ１６ｂ抗原の分析のために採用される。しかしながら、上で述べた通り、この方法は、多くの他の可溶性のそして細胞に結合した受容体、例えば脊髄損傷という情況において放出されたＣＤ１００受容体〔C.Herold et al, Leukocyte Typing V, 288-292 (1995); S.Delaire et al, Cell.Mol.Life Sci., 54: 1265-1276 (1998)〕、の定量に使用されることができる。本発明の上記方法はまた、他の多くの中でも、甲状腺Ｔ４因子又は可溶性の前立腺表面抗原のような可溶性の分析物単独を決定するためにも使用されることができる。同様に、この方法は、プラスミノーゲンでコートされたビーズを用いて、プリオンタンパクの正常及び病気にかかった形態を識別するために採用されることができる。なぜなら、プラスミノーゲンは正常及び病的なプリオンタンパクを識別する最初の因子として発見されたからである〔例えば、M.B.Fisher et al, Nature, 408: 479-483 (2000) を参照のこと〕。
【００５４】
本発明の上記方法はまた、非生物学的分析物、例えば、水又はタンパクが可溶である他の液体中の特定の分析物、の定量のためにも有用である。本発明の上記方法は、精製された非標識リガンド（例えば、抗体）、及び同一の分析物（例えば、抗原性の受容体）に対する好適な蛍光標識されたリガンドのみの供給を必要とする、単純でかつ安価なものであり、上記形成体（例えば、ターゲットとされる細胞）上及び上記サンプル（例えば、血清中の血漿）中の両方で起こるものである。
【００５５】
１の実施態様において、本発明はターゲットとされる細胞によって哺乳動物の血液中へ放出される受容体の変更されたレベルに特徴を有する病気の診断方法を提供する。上記診断方法はあるターゲット細胞（例えば、白血球）の表面から病気、例えば、脊椎損傷、を有する疑いのある哺乳動物、好ましくはヒト、の血液サンプル中へ放出された可溶性の受容体（例えば、ＣＤ１００）の量を分析することによって実施される。上記分析は、検出可能なマーカー（例えば、ＦＩＴＣ）で標識された不変の既知の濃度の抗体（例えば、臍帯血中のＷＢＣ上の既知の受容体ＣＤ１００に結合する抗ＣＤ−１００）、そして可変の既知の濃度の非標識抗体とともに所定の量のターゲットとされたＷＢＣを含むこの哺乳動物からの血液サンプルをインキュベートすることによって競合アッセイを実施するステップを含む。上記標識抗体及び上記非標識抗体は、ＷＢＣに結合したＣＤ１００受容体及び可溶性のＣＤ１００受容体の両方に競合的に結合する。上記最初のステップからの各サンプル及び同一の所定の量のＷＢＣ及び非標識抗体を含まない可変の既知の濃度の標識抗体を含むコントロールサンプルは、励起放射線を照射される。上記放射線は、ＷＢＣに結合したＣＤ１００受容体に結合した標識抗体上のＦＩＴＣマーカーに蛍光又は光散乱の平均チャンネル強度値として検出可能なシグナルを発生させる。
【００５６】
最初の１次−対数グラフの依存性曲線は、上記テストサンプル中の非標識抗体のモル濃度に対して平均チャンネル強度値をプロットすることにより形成される。第２の１次−対数グラフの依存性曲線は、上記コントロールサンプル中の標識抗体のモル濃度に対して平均チャンネル強度値をプロットすることにより、そして第３の１次−対数グラフの依存性曲線は、上記テストサンプル中の標識及び非標識抗体全体のモル濃度に対して平均チャンネル強度値をプロットすることにより形成される。
【００５７】
患者の血液サンプル中のＷＢＣから遊離（放出）された可溶性の受容体の濃度は、第２の曲線及び第３の曲線の交点に対応するモル濃度と第３の曲線を構築するためにテストサンプル中で用いられた標識抗体の不変の濃度との差を求め、その後抗体及び抗原性受容体の間の結合化学量論を適用することにより決定される。
【００５８】
その後、得られた上記哺乳動物の血液サンプルからの可溶性のＣＤ１００受容体の濃度が健康な哺乳動物からの同一の所定の数のＷＢＣを含む血液サンプル中の可溶性のＣＤ１００受容体の既知の正常な濃度と比較される。上記哺乳動物の血液サンプル中の上記可溶性のＣＤ１００受容体の濃度と正常な濃度との顕著な差は、病気、例えばこの場合、重症の脊髄損傷、を示す。
【００５９】
この開示から、当業者はターゲット細胞、例えば血液細胞、からの結合した受容体の放出に特徴を有する他の病気、又は受容体又は分析物が本来は結合しないが可溶性である、他の病気をモニターするのに上で定義された診断又は治療のための方法を採用することができることが明らかである。後者の場合、結合した分析物を含む形成体は、合成的に調製されるであろう、そしてそれは例えば上記分析物が共有結合で連結されるポリスチレンビーズである。
【００６０】
本発明のさらなる利点は、本発明のフローサイトメトリーを用いた競合抗体結合アッセイを実行するのに必要な時間、必要とされる試薬の価格と、慣用の酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法におけるそれらの点との比較において認められる。まずＥＬＩＳＡ及びＲＩＡは通常、プレート又はビーズのいずれかの固相表面と捕捉抗体とを一夜インキュベートすることを要求する。フローサイトメトリー分析を含む本発明の上記方法は、冗長なインキュベーション時間又は放射性物質の使用及び廃棄に関する注意を必要としない。第２に、ＥＬＩＳＡはＲＩＡと同様にサンプルのインキュベーション、ペルオキシダーゼ第２抗体のインキュベーション、基質のインキュベーション、洗浄、そして連続的に希釈されたサンプル及び標準物質の測定のために３〜４時間の作業時間を必要とする。対照的に、本発明の上記アッセイは、準定量的な結果を得るために、細胞サンプルと標識抗体（標識リガンド）とのインキュベーション時間として約１０分を必要とする。以下に提供される実施例中において、滴定量の異なる非標識リガンドそして、その後標識リガンド（例えば、抗体）を細胞とともに混合するための１時間のインキュベーションが２回、定量的なアッセイ結果のために用いられ、続くフローサイトメーター上での測定で合計の分析時間が約２．５−３時間となる。これは、本フローサイトメトリーアッセイのＥＬＩＳＡ又はＲＩＡに対するかなりの時間の節約を表す。
【００６１】
ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡ法は、本発明のフローサイトメトリーアッセイよりも、より少ない量ではあるが、より多くの異なる型の抗体試薬を必要とする。ＥＬＩＳＡアッセイはまた、既知の量の抗原又は他の分析物を含むコントロールを必要とする。そのようなコントロールは、好適なコントロールを調製し、精製することに関する出費及び努力が莫大であり、最初は、獲得し、特徴づけるのが困難であるかもしれない。
【００６２】
Ｃ．本発明の他の実施態様
１．キット
本発明のなお別の側面において、本発明の方法の実施のためにキットが提供される。好ましくは、そのようなキットは本発明の診断方法を実施するために採用される。しかしながら、工業的又は商業的な分析物、例えは、液体中の汚染物質又はマーカー等、を同定し定量するために本発明の方法が採用される場合、類似するキットが集められることができる。この方法の構成成分は、１又はそれを超える標識及び非標識、両方のリガンド又は好適なリガンドを標識するための１又はそれを超える検出可能なマーカー、合成の形成体、例えばポリスチレンビーズ、ビーズに共有結合で連結した分析物に好適な試薬、サンプルを入れるための好適な容器、及び好適なコントロール又は可溶性の分析物、例えば放出された又は可溶性の受容体、の正常値の表、を含むキットに容易に適合させられることができる。本発明の上記キットは、同一又は異なる検出マーカーのいずれかを含むことができ、それによって複数のサンプルが同一の検出器又は多数の検出器によって検査される。これらのキットは上記サンプルを維持し、保存するために必要な試薬を付加的に含むことができる。さらに重要なことに、上記キットは、競合アッセイを実施し、コントロールを調製するための指示書を含む。キット中にはまた、上記サンプルのための好適な希釈剤及び緩衝液、シグナルの比較のための指示チャート、使い捨て手袋、汚染除去指示書、アプリケータースティック又はコンテナ、及びサンプル準備用のコップが提供される。上記キットは好ましくは、要求に応じて、必要な緩衝物質又は培地をも含む。当業者は情報及びいずれかの特異的な受容体及びターゲット細胞のために上記方法を患者に実施するのに必要な構成成分を含むいかなる数のキットを集めることもでき、その受容体のために規準化するために結果を比較する。
【００６３】
２．コンピュータにより実行される方法
本発明の方法のさらに別の実施態様及び利点において、上述の方法は、１又はそれを超えるコンピュータプログラムにより実行される。上述の分析及び計算を実施するコンピュータプログラムが提供される。このプログラムは、上述の１次−対数グラフの依存性曲線を作成する。さらに特異的には、上記コンピュータプログラムは、平均チャンネル値、リガンドのモル濃度、交点の同定を含む、上で提供された方法のパラメーターを記録し、分類し、及び計算するために、そして必要な分析結果を得るためにデザインされる。好ましい実施態様において、このコンピュータプログラムは、粒子分析の機器、特別には血液学の機器又はフローサイトメーター、中へ組み込まれる。さらに他の実施態様においては、上記プログラムは別のコンピュータ上にあり、それは、分析機器に取り付けるための“プラグ−イン”装置である。本発明のさらに別の実施態様は、そこへ上記機器からのデータが供給される、独立型のコンピュータ上に存在するコンピュータプログラムである。代わりに、本発明の上記方法は、独立型のパーソナルコンピュータ上の慣用の表計算プログラムの使用により行なわれることができる。
【００６４】
このコンピュータプログラムは、平均チャンネル蛍光強度数の連なり及びサンプル中のリガンド集団の濃度又は滴定量として記録された電気的パルスデータを平均蛍光強度対テストサンプル中の非標識リガンド、コントロールサンプル中の標識リガンド及びテストサンプル中の全てのリガンドの濃度の重複したプロットに翻訳するための手段を含む。上記３の重複した曲線のグラフによる分析はこのデータを用いることによって作り出される。このプログラムはまた、交点を得るため、そしてさらに上記サンプル中の可溶性の分析物の濃度を計算するためにこれらの曲線を分析する手段を含む。したがって、上記プログラムは好ましくは、形成体、及び／又は可溶性の分析物、及び結合した分析物を含むテストサンプル又はコントロールサンプルについて上記データを分析することにより、本発明の上記方法を実施するのに必要なすべての計算を実施する。本プログラムのなお別の実施態様においては、異常な結果が確認された場合、電気的シグナル又は警告を与えることができる。
【００６５】
本発明のさらに別の実施態様においては、分析機器、例えばフローサイトメーター、が提供され、それは、上述のプログラム及び方法のステップを実行することにより、例えば形成体を含むサンプル中の溶液中へ形成体の表面から放出された可溶性の分析物である、サンプル中の可溶性の分析物の量を同定し、分析する組み込まれたコンピュータプログラムを含む。
【００６６】
Ｄ．本発明の実施例
以下の実施例は、本発明の上記方法を実証し、正常な血液の提供者中の好中球上のＦｃγＲIIIＢ抗原性受容体である、１Ｄ３又は３Ｇ８の高度に可変な発現を分析し、そして列挙することにおけるその使用を実証する。以下の実施例は本発明の多様な側面を説明する。これらの実施例は、添付された特許請求の範囲により定義された本発明の範囲を制限するものではない。
【００６７】
実施例１：モノクローナル抗体
本明細書で言及されるすべてのモノクローナル抗体は、Coulterにより作成されたモノクローナル抗体のためにBeckman Coulter Inc.により用いられた名称と一致する。“ＣＤ”という語はInternational Workshops on Human Leukocyte Differentiation Antigensにより採用された“クラスター名（Cluster Designation）”を指す。10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209にあるThe American Type Culture Collectionは、略語ＡＴＣＣと同一である。
【００６８】
好中球に特異的な抗体、１Ｄ３（抗−ＣＤ１６ｂ又は抗ＦｃγＲIIIＢ）はＩｇＭモノクローナル抗体である。上記１Ｄ３クローン〔ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９４４５〕は精製されたヒト顆粒球で免疫されたＢａｌｂＣマウス脾臓細胞及びＮＳ−１プラズマ細胞腫マウスミエローマ細胞の融合〔米国特許第４，９３１，３９５号〕に由来する。ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＶＣＳ（商標）（Volume-Conductivity-Scatter）のプロット〔米国特許第５，２６２，３０２号〕から、より正確にいかなる残存する顆粒球（好塩基球及び好酸球）も数え上げられることができるように全血サンプルから好中球を特異的に除去するために１Ｄ３に接合した磁性ビーズ〔米国特許第５，４６６，６０９号及び同第５，７０７，８７７号〕を用いる試みにおいて、発明者は、多くの正常な血液の提供者が好中球の完全な除去を許容しなかったことを発見した。１Ｄ３（ＩｇＭ）及びフルオレッセインイソチオシアネートで標識された１Ｄ３（１Ｄ３−ＦＩＴＣ）の上記試薬はBeckman Coulter, Incから商業的に入手可能である。
【００６９】
３Ｇ８は抗−ＣＤ１６ｂ，ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。上記３Ｇ８受容体は好中球、ほとんどの（９０％）ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、及び末梢血単球の亜集団（１０％）上に発現される。それは、ほとんどの個体の末梢血Ｂ及びＴ細胞上には検出されない。より最近の文献〔Teillaud, J.L., et al, Immunomethods, 4: 48-64 (1994); Galon, J. et al, J, Immunol., 157: 1184-1192 (1996); Kindzelskii, A.L. et al, J.Immunol., 164: 953-958 (2000); Van Eeden, S.F. et al, J.Immunol.Meth., 232: 23-43 (1999); Kuijpers, T.W. et al, J.Immunol.Meth., 232: 211-229 (1999)〕は、可溶性のＦｃγＲIIIＢ並びにそれとＩｇＧ及び補体のような他の血清成分との複合体についての研究がより活発な領域となったことを明らかにした。３Ｇ８（ＩｇＧ１）及びフルオレッセインイソチオシアネートで標識された３Ｇ８（３Ｇ８−ＦＩＴＣ）の上記試薬は、Beckman Coulter, Incから商業的に入手可能である。
【００７０】
ＣＤ４５抗体は、マウスＳｐ２／０−ＡＧ１４ミエローマ細胞とＣＥＭ細胞株の誘導体で免疫化したＢＡＬＢ／Ｃマウスからの脾臓細胞とのハイブリダイゼーションに由来する。
【００７１】
本明細書中で使用される他の試薬であって、Beckman Coulter, Incから商業的に入手可能なものは以下の：ＭｓＩｇＧ１−ＲＤ１／ＭｓＩｇＧ１−ＦＩＴＣ：Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１−フィコエリトリン（ＲＤ１）／Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ；及びＣＤ４５−ＲＤ１である。
【００７２】
実施例２：ビーズの調製
磁性ビーズ除去において使用した１Ｄ３−ＤＡＰ−ＰＳ磁性鉱ビーズは、１Ｄ３−アミノデキストラン−ＰＳ磁性鉱ビーズの調製のために記載された方法〔例えば、本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第５，４６６，６０９号；同第５，７０７，８７７号；同第５，６３９，６２０号及び同第５，７７６，７０６号を参照のこと〕に従って調製した。しかしながら、アミノデキストランのかわりに１，３−ジアミノプロパン（ＤＡＰ）が最初に上記ビーズ表面に結合した。上記１Ｄ３モノクローナル抗体のフィコエリトリン（ＲＤ１）への接合は、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホサクシニミジル４−〔Ｎ−マレイミドメチル〕シクロヘキサン−１−カルボキシレート）で活性化された１Ｄ３抗体とＩＴ（２−イミノチオラン）で活性化されたＲＤ１とを反応させることにより達成した。
【００７３】
実施例３：フローサイトメトリーによる測定
ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＰｒｏｆｉｌｅII（商標）又はＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＥＰＩＣＳ（登録商標）ＸＬ−ＭＣＬ（商標）フローサイトメーターを、本明細書中に参考文献として援用されているSiiman, O. and Burshteyn, A., Cytometry, 40: 316-326 (2000) に記載されている通りに使用した。ＣＤ１６ｂ＋細胞を前方対側方光散乱ヒストグラム中の顆粒球集団上にゲーティングすることにより、適切な蛍光マーカーによって分析する。
【００７４】
実施例４．１Ｄ３−磁性ビーズを用いた全血からの好中球の除去特性
１Ｄ３−ＦＩＴＣのようなマーカーで標識し、フローサイトメトリーで分析した場合に明るい平均チャンネル蛍光強度（ＭＦＩ＞１２）を示す、正常な提供者の全血中の好中球が、１Ｄ３抗体を接合した磁性ビーズにより容易に除去されることが以前示された〔米国特許第５，４６６，６０９号及び同第５，７０７，８７７号〕。しかしながら、１Ｄ３−ＦＩＴＣ又は１Ｄ３−ＲＤ１で標識された好中球が暗い（ＭＦＩ＜６）又は中程度（６＜ＭＦＩ＜１２）の明るさの平均チャンネル蛍光強度を示した多くの正常な血液の提供者は、除去不可能であった。彼らは、１Ｄ３を接合した磁性ビーズによる除去後に１〜２％の残存好中球を示した。１〜２％の未成熟の好中球の存在によって％好中球についてフローサイトメトリーのデータとＣＯＵＬＴＥＲ  ＳＴＫＳ血液学機器のデータとの間に典型的に１〜２％の相異を観察した。これらの未成熟の好中球は１Ｄ３（ＣＤ１６ｂ）のような一定の抗原の細胞表面上における発現を欠く。以下の、明るい、中程度、そして暗い提供者の実施例は典型的であった。
【００７５】
以下に記載する実験において、１０×７５mm2のガラス試験管中で２００μＬの全血を可変の滴定量の標識リガンド、すなわち、４０〜２．５μＬの容量中２．５％ｗ／ｖ１Ｄ３−ＤＡＰ−ＰＳ磁性鉱ビーズ（４１％磁性鉱、直径０．７μｍ）、と混合することにより、テストサンプルを調製した。連続する各サンプル中で、標識リガンドの滴定量を１／２倍で減少させた。コントロールサンプルはビーズを含まなかった。各テストサンプルとコントロールサンプルとの全体の容量を、混合する前に１×ＰＢＳ緩衝溶液で２４０μＬに調節する。多管ボルテクサー（Multitube Vortexer）における混合時間は２分、続いて磁力による分離が少なくとも２分であった。その後、各テストサンプルについて上清サンプルを、分離した残渣をかき乱さないように注意深く試験管からピペットによって取った。除去されないコントロールサンプル及び多様な除去されたテストサンプルをその後、２０μＬの２重標識リガンド、０．４μｇ／μＬ１Ｄ３−ＦＩＴＣ／０．５μｇ／μＬＣＤ４５−ＲＤ１と混合し、そして赤血球を溶血させ、反応を止めるためにＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）ＴＱ−Ｐｒｅｐ（商標）機器で処理した。これらのサンプルをその後、上記顆粒球にゲーティングした標識抗体１Ｄ３−ＦＩＴＣの平均チャンネル蛍光強度（ＭＦＩｓ）及び白血球母集団中の好中球のパーセンテージを決定するために、フローサイトメーターで処理した。
【００７６】
正常な血液提供者要員からの任意の５人の提供者からのサンプルを用いて一連の実験を実施した。上記サンプルは未除去及び４０μＬのビーズで除去された。上記ＭＦＩｓ（括弧中は標準偏差）及び白血球細胞母集団中の好中球のパーセンテージを表に報告した。
【００７７】
【表２】
2005506523.tif 000004
【００７８】
最も明るかった提供者＃４は、１：１，１：２，１：４，１：８及び１：１６の希釈率のビーズで除去されたサンプル中の％好中球のデータが以下の：１．１，４．２，４．６，５．１及び５．４の通りであった。１：１６の希釈率（２．５μＬの２．５％ｗ／ｖ固体ビーズ＋３７．５μＬの１×ＰＢＳ緩衝溶液＋２００μＬの全血）のビーズにおける上記除去レベルでさえ、＃５及び＃３の提供者は１：１の希釈率のビーズで達成できず、それは、上記血液サンプルの血清中の大量の可溶性のＣＤ１６ｂ抗原の存在によるものであった。
【００７９】
別の一連の実験については、ＥＤＴＡ−抗−凝固全血に関する処理１においては、０〜４０μＬのビーズ滴定量に対するＭＦＩｓと％好中球を表３に報告した。処理２についての同様のデータが表３中の以下のデータを与え、ここで処理２では同一の提供者からの全血サンプルを５００ｇで５分間遠心分離して、上清の血清を除き等容量の１×ＰＢＳ緩衝溶液で置換して、その後混合した。上記洗浄されたサンプルは４０μＬの２．５％ｗ／ｖ磁性ビーズで９５％の好中球を除去されたが、一方未洗浄サンプルは同一の滴定量において５３％の好中球を除去されたのみであった。
【００８０】
【表３】
2005506523.tif 000005
【００８１】
上述の磁性ビーズ（１．５６９ｇ／cm3の密度及び０．７０μｍの直径）及び全血サンプル（ＣＯＵＬＴＥＲ（登録商標）Ｓ−Ｐｌｕｓ（商標）カウンターで決定された９．０×１０5ＷＢＣ／血液１００μｌ）の特性により磁性的な分離による好中球の除去を可能とするために磁性ビーズによって占有される必要のある細胞あたりの最小限の受容体の数の推定をすることができる。
【００８２】
したがって、上記の２．５％ｗ／ｖ固体ビーズの４０μＬは、総容積で６．４１０×１０-4cm3の固体ビーズを含む。球状ビーズあたりの容積は１．７９６×１０-13cm3と計算され、ビーズの滴定量中全体で３．５６９×１０9のビーズとなる。仮に各ビーズが上記細胞上の１の占有された受容体部位に対応する場合、除去された全血サンプル中の１Ｄ３受容体部位は最低でも３．５６９×１０9個である。
【００８３】
提供者の白血球母集団中の５９．１％が好中球であって、除去のために２００μＬの全血サンプルを採取し、そして血液１００μＬあたり５．３×１０5個の好中球を含むことから、除去されたサンプル中には全体で１．０６×１０6個の好中球があった。したがって、好中球の磁性的な除去を可能とする最小の平均受容体／好中球比は３．３×１０3であった。
【００８４】
また、０．４６×１０6個の好中球が除去されずに未洗浄のサンプル中に残ったことは、１．４８５×１０9個のビーズが放出された抗原に付着したことをあらわす。磁性ビーズ（直径７００nm）表面上のＩｇＭ分子あたりの面積、約２５６nm2（ＩｇＧ抗体の４倍）によって、ビーズあたりのＩｇＭの最大数は６０１０個である。この後者の値と表面に結合したＩｇＭの減少した結合価、２によって、最大で全血１Ｌあたり８．９×１０16個の受容体又は全血２００μＬあたり１５０nMの放出された受容体がある。
【００８５】
この実施例は、ターゲットとされた好中球を含む未洗浄の全血ではなく、洗浄された血液を磁性的に除去する可能性を示す。これらのデータは、いくつかの結論を支持する。最初に、好中球上の１Ｄ３受容体は、例えば循環中の抗体によってブロックされなかった。第２に、好中球上の抗原部位への蛍光で標識されたリガンドの結合は、受容体を好中球表面上で孤立させるように覆うものではないため、マーカーの蛍光のクエンチングが観察された。しかしながら、血漿中の放出された（すなわち、可溶性の）受容体は、好ましくはそれらの平均直径１０〜１５μｍの好中球の表面上の受容体に比較して非常に高い運動エネルギーそして従って、より高い拡散定数によって、磁性ビーズ上の１Ｄ３抗体部位を占有する。
【００８６】
さらには、ターゲットとされた好中球は、磁性ビーズによる分離で除去可能であるように細胞内の貯蔵所に存在するすでに形成された亜細胞性の受容体のプールからの転位〔Huizinga T.W.J. et al, J.Clin.Invest., 86: 416-423 (1990)〕のような何らかのメカニズムによって、血漿中へ放出された細胞表面上の１Ｄ３抗原を補充することができた。
【００８７】
実施例５：フローサイトメトリーによる可溶性の抗原及び生物学的細胞上の抗原に対する競合的抗体結合…サイトイムノアッセイ（ＣＹＩＡ）
非標識リガンド（抗体）の濃度が可変であり、標識リガンド（標識抗体）の濃度が一定に保たれる場合、以下のプロトコールが適用できる。コントロール中の標識抗体の濃度を、ターゲットとされた細胞上の受容体部位の約８０〜９０％飽和が得られるように選択する。例えば、図１Ａを参照のこと。ターゲットとされた細胞上の受容体への非標識及び標識抗体の結合及び競合結合サンプル中の可溶性の受容体を図１Ｂから１Ｄに示す。
【００８８】
Ａ．実験１
１０μＬの可変量の（標準量である４μｇの１／１００〜１００倍）の非標識１Ｄ３抗体を最初に全血サンプル（１００μＬ）と１時間インキュベートした。その後、すべてのサンプルを標準の１０μＬの２重蛍光標識抗体（リガンド）１Ｄ３−ＦＩＴＣ／ＣＤ４５−ＲＤ１と、追加の１時間インキュベートした。各サンプル中の標識リガンド１Ｄ３−ＦＩＴＣの総濃度は、ＴＱ−Ｐｒｅｐ（商標）前に３．９２×１０-8Ｍであった。すべてのサンプルをその後、ＴＱ−Ｐｒｅｐ（商標）上で処理し、フローサイトメーターで分析した。
【００８９】
このように記録した平均チャンネル１Ｄ３−ＦＩＴＣ蛍光強度を、サンプルごとに使用した非標識１Ｄ３抗体のmol／Ｌ濃度に対して図２にプロットした。非標識抗体を含まないコントロールに比較して、競合アッセイ処理１（ＭＦＩ＝２．８）及び処理２（ＭＦＩ＝４．９）においてＭＦＩのわずかな増加が観察された。その後、プロット中の最も低い滴定量において、蛍光強度の減少を示した。ＭＦＩのこのわずかな増加は、細胞に結合した抗原上の蛍光標識された抗体の強度を増加させた、可溶性の抗体と非標識抗体との反応を示唆する。可溶性の抗原上の非標識抗体との競合なしには、標識抗体は、可溶性の抗原に結合し、フローサイトメトリーで検出されなかったであろう。このターゲットとされた細胞上の標識抗体の蛍光強度の最初の増加そして減少を得るための段階的な進行を、図１Ａから１Ｄに模式的に示す。
【００９０】
可溶性の抗原の存在によるターゲットとされた細胞上の蛍光強度のこの感受性は逆の競合抗体モード、すなわち可変の濃度の標識抗体と不変濃度の非標識抗体、では達成できなかった、それは、可溶性の抗原に対して結合が起こる、低い可変の滴定量における非常に低い蛍光強度による。グラフ（図２）中の遅い相には、非標識抗体がターゲットされた細胞表面上の結合した抗原部位を標識抗体と競合して占めるのにつれて強度がなめらかに減少する、シグモイド状曲線が続く。この減少は、１Ｄ３抗体濃度の１０〜２０倍にわたって対数−１次的である。
【００９１】
最終的には、すべての部位が非標識抗体で満たされ、強度が細胞の内発的な蛍光に相当する、より低いレベルにおいて平坦部に達する。非標識抗体１Ｄ３の低濃度のコントロールの強度より下を上記曲線が通過するポイントは、血液サンプル中の遊離の可溶性抗原の滴定の終点を推定するのに使用されることができる。可溶性の抗原と反応するのに十分な非標識抗体１Ｄ３を添加した場合、ターゲットとされた細胞に結合できる標識抗体、１Ｄ３−ＦＩＴＣの濃度がコントロール中と同じになるようにコントロールの強度を合わせる。
【００９２】
終点を見出すためのより正確な分析方法は、競合結合処理（テストサンプル）及び標識抗体のみの処理（コントロールサンプル）においてターゲットとされた細胞中の標識抗体の蛍光が同一である点の抗体全体の濃度（非標識＋標識）を決定することである。これは各処理において行う。
【００９３】
表４は、処理１中の暗い提供者（滴定点あたり単一の全血−１Ｄ３抗体−２重標識抗体サンプル）及び処理２中の第２の暗い提供者（滴定点あたり３連のサンプル）のデータを示す。処理１及び２のための１００μＬの全血に添加した一定量の非標識抗体１Ｄ３あたりの平均チャンネル１Ｄ３−ＦＩＴＣ蛍光強度もまた示す。処理１のための１００μＬの全血に添加した一定量の１Ｄ３−ＦＩＴＣあたりの平均チャンネル１Ｄ３−ＦＩＴＣ蛍光強度もまた表４中に示す。括弧中の値は標準偏差である。
【００９４】
【表４】
2005506523.tif 000006
【００９５】
図２のグラフから読み取れる処理１及び２中の可溶性の１Ｄ３抗原（ＦｃγＲIIIＢ）の滴定の終点は、どちらも１Ｄ３抗体の約４nM（８５０，０００ダルトン）である。同一の終点を、図２中の競合結合における１Ｄ３−ＦＩＴＣ結合曲線と総抗体濃度（１Ｄ３＋１Ｄ３−ＦＩＴＣ）の曲線との交点からも得て、４．３×１０-8Ｍの総抗体濃度又は０．４×１０-8Ｍの非標識抗体濃度であった。
【００９６】
抗原の結合価を１、及び抗原：抗原過剰の領域におけるＩｇＭ抗体の化学量論を１０：１と仮定することは、それぞれの暗い提供者の血清中の可溶性の１Ｄ３抗原の４nM×１０×１２０μＬ／１００μＬ＝４８nMという濃度に対応する。この数は、ＥＬＩＳＡにより７．３〜７５．９nmol／Ｌと決定された〔Fleit H.B., et al, Blood, 79: 2721-2728 (1992)〕、正常血清中の可溶性の３Ｇ８抗原（ＦｃγＲIIIＢもまた）の範囲の中間にあたる。
Ｂ．実験２
さらには、また、１００μＬの全血を３Ｇ８非標識抗体の１０μＬの滴定量（１／１００〜２８０×標準量の０．７５μｇ）及び３０μＬの１×ＰＢＳ緩衝溶液と１時間混合することにより、競合結合実験を行った。その後、１０μＬの滴定量中の固定した量の２重標識リガンド、０．７５μｇ３Ｇ８−ＦＩＴＣ／５．０μｇＣＤ４５−ＲＤ１を上記サンプルに加えた。上記サンプルをその後さらに１時間インキュベートし、ＴＱ−Ｐｒｅｐ（商標）上で処理し、フローサイトメーターで分析した。ＴＱ−Ｐｒｅｐ（商標）前の各サンプル中の標識リガンド３Ｇ８−ＦＩＴＣの総濃度は３．０８×１０-8Ｍであった。標識リガンド３Ｇ８−ＦＩＴＣの平均チャンネル蛍光強度対非標識３Ｇ８抗体の総濃度の図３中の対数−１次プロットとして示された結果は、その中で標識抗体３Ｇ８−ＦＩＴＣの強度（ＭＦＩ＝３７−３２）が非標識３Ｇ８抗体を含まないコントロール中（ＭＦＩ＝３２）においてよりも高かった、非標識３Ｇ８抗体の３．０８×１０-10〜５．４×１０-8Ｍの広い範囲を示した。
【００９７】
最初に、可溶性の３Ｇ８抗原の滴定の終点を、上記曲線がコントロールの平均チャンネル強度まで落ちる点、すなわち、５．４×１０-8Ｍの非標識３Ｇ８抗体であると推定した。図３に示すように３Ｇ８／３Ｇ８−ＦＩＴＣ競合結合（テストサンプル）における以下の３Ｇ８−ＦＩＴＣ：（ａ）標識抗体３Ｇ８−ＦＴＩＣ単独；（ｂ）非標識及び標識抗体全体、３Ｇ８＋３Ｇ８−ＦＩＴＣ、の濃度対平均チャンネル蛍光強度の２の結合曲線の交点を求めることにより、さらに正確な定量を達成した。上記交点は、３．８×１０-8Ｍという総抗体濃度又は０．７×１０-8Ｍという非標識３Ｇ８濃度における同一の３Ｇ８−ＦＩＴＣ蛍光強度を表す。
【００９８】
抗体の結合価を１、及び抗原過剰の領域における３Ｇ８（ＩｇＧ１）抗体と可溶性のＣＤ１６抗原の間の結合化学量論を１：２、と仮定すると、この血液提供者においての可溶性の３Ｇ８抗原濃度は約７nM×２×１５０μＬ／１００μＬ＝２１nMと決定される。
【００９９】
Ｃ．結論
提供者は好中球上の部位の飽和状態において、中程度の１Ｄ３マーカーの蛍光強度を示すことができるが、標識リガンドによる全血サンプルの滴定の最初における低い蛍光強度によって示唆される大量の可溶性の１Ｄ３受容体を示す。競合結合処理中の滴定の初めにおいて、非標識抗体を含まないコントロールの蛍光強度よりも高い蛍光強度を認めた。
【０１００】
可溶性の抗原の高濃度をもたらす好中球からのＦｃγＲIIIＢ受容体の放出は作用を受けた細胞から必ずしもすべての受容体を除去するものではない。むしろ、亜細胞プールから細胞表面への受容体の転位が、放出された受容体が高濃度であるにもかかわらず高い表面受容体濃度が観察されたことを説明するメカニズムとしてひきおこされた〔例えば、Huizinga T.W.J. et al, J.Clin.Invest., 86: 416-423 (1990) を参照のこと〕。
【０１０１】
ＫＣ４８（抗−ＣＤ１５）の他の非標識及び標識抗体であって好中球を含むすべての顆粒球を標識するものを、以前は非標識１Ｄ３及び標識１Ｄ３−ＦＩＴＣ並びに非標識３Ｇ８及び標識３Ｇ８−ＦＩＴＣと全血中のＣＤ１６ｂ抗原との結合平衡を比較するために用いた。これは、全血中に正常に放出されない抗原に結合するモノクローナル抗体の競合結合特性を検証するために行った。米国特許第５，８１４，４６８号に記載された通り、全血中の抗原への非標識ＫＣ４８及び標識ＫＣ４８−ＦＩＴＣの競合結合の結果は、低い滴定量の非標識ＫＣ４８抗体におけるコントロールの強度を上回る最大値への強度の最初の増加を示さなかった。標準的なシグモイド状曲線をＫＣ４８−ＦＩＴＣ蛍光強度対非標識ＫＣ４８抗体の総濃度のプロットにおいて得た。
【０１０２】
非標識抗体１Ｄ３又は３Ｇ８の、ターゲットとされた好中球上のそれらの抗原性部位への結合の平衡定数は［米国特許第５，８１４，４６８号］、標識抗体、１Ｄ３−ＦＩＴＣ又は３Ｇ８−ＦＩＴＣの同一の抗原性部位への結合の平衡定数と非常に近似している。したがって、可溶性のＣＤ１６ｂ抗原の細胞数測定のイムノアッセイにおいて用いた上記方法は定量的に有用である。
【０１０３】
残りの細胞懸濁液のフローサイトメトリーによる分析で測定したように、ＣＤ１６ｂ抗体を接合したビーズによる全血中の好中球の磁性ビーズ除去は、正常の提供者の血漿中の可溶性のＣＤ１６ｂ抗原の存在によって阻害される。フローサイトメトリーによる競合結合アッセイによって決定したように、正常な血液提供者は、１〜５０nMの範囲の放出されたＣＤ１６ｂ抗原の血清濃度を示した。放出されたＣＤ１６ｂ抗原の濃度を求めるために洗浄された及び未洗浄の全血サンプルについて、これらの数字は、ターゲットされた好中球の磁性ビーズ除去を用いた平行測定と比較して優れていた。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１Ａ】本発明の方法のコントロールを示す模式図であり、細胞上に存在する受容体（抗原）及び可溶性の（放出された）受容体を含む全血又は血漿サンプルから成る。標識抗体の存在下、ターゲットとされた細胞上の受容体及び可溶性の受容体の両方が標識される。
【図１Ｂ】細胞に結合した受容体及び可溶性の受容体を含む血液サンプルが可溶性の受容体を標識する傾向にある低い滴定量の非標識抗体、及び結合された受容体を標識する標準的な（既知の）滴定量の標識抗体と接触させられる場合に起こる競合結合を示す摸式図である。
【図１Ｃ】細胞に結合した受容体及び可溶性の受容体を含む血液サンプルが、低度から中程度の滴定量の非標識抗体及び標準的な滴定量の標識抗体に接触させられた場合に起こる競合結合を示す模式図である。〔図１Ｂ〕とは対照的に、非標識抗体のうちのいくらかは結合していない受容体と同様に結合した受容体に結合する。
【図１Ｄ】細胞に結合した受容体及び可溶性の受容体を含む血液サンプルが中程度の滴定量の非標識抗体及び標準的な滴定量の標識抗体に接触させられた場合に起こる競合結合を示す模式図である。
【図２】標識抗体（１Ｄ３−ＦＩＴＣ）の平均チャンネル蛍光強度対以下の：  （◇）競合結合処理１（テストサンプル）中の非標識抗体（１Ｄ３）のモル濃度；  （□）競合結合処理２（テストサンプル）中の非標識抗体（１Ｄ３）のモル濃度；  （×）非競合結合処理１（コントロール）中の標識抗体（１Ｄ３−ＦＩＴＣ）のモル濃度；及び  （黒三角）競合結合処理１（テストサンプル）中のすべての抗体（１Ｄ３＋１Ｄ３−ＦＩＴＣ）のモル濃度；の１次−対数グラフによる依存性である。
【図３】標識抗体（３Ｇ８−ＦＩＴＣ）の平均チャンネル蛍光強度対以下の：  （◇）競合結合処理（テストサンプル）中の非標識抗体（３Ｇ８）のモル濃度；  （□）非競合結合処理（コントロール）中の標識抗体（３Ｇ８−ＦＩＴＣ）のモル濃度；  （黒三角）競合結合処理（テストサンプル）中のすべての抗体（３Ｇ８＋３Ｇ８−ＦＩＴＣ）のモル濃度；の１次−対数グラフによる依存性である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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