(57)【要約】  本発明は、肝臓疾患にカルジオトロフィンを使用することに関するものである。本発明は、肝細胞の最大増殖と一致する肝臓再生過程の間に、カルジオトロフィン（CT-1）の発現が増加すること、並びに肝臓再生刺激物質としてのCT-1の役割を記述する。さらに、本発明は、種々の急性肝臓障害モデルにおけるCT-1の肝臓保護的役割について詳述している。これらは全て、肝疾患患者の治療に使用する組成物の製造にCT-1を使用することの重要性を明らかにした。本発明は、組換えタンパク及びCT-1をコードする遺伝子配列の使用を含む種々の形態及び方法におけるCT-1の使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓再生を促進するために使用できる組成物を製造するための、カルジオトロフィン-1（CT-1）、またはCT-1の活性フラクション、またはCT-1活性を有するポリペプチド誘導体、或いはCT-1、CT-1の活性フラクション、またはCT-1活性を有するポリペプチド誘導体を発現しコードするポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項２】
肝臓保護剤として使用できる組成物を製造するための、カルジオトロフィン-1（CT-1）、またはCT-1の活性フラクション、またはCT-1活性を有するポリペプチド誘導体、或いはCT-1、CT-1の活性フラクション、またはCT-1活性を有するポリペプチド誘導体を発現しコードするポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項３】
外科的肝切除後の肝臓再生を促進するために使用できる組成物を製造するための、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
いずれかの病因による慢性肝臓疾患の治療のために使用できる組成物を製造するための、請求項１及び２の何れか一項に記載の使用。
【請求項５】
ウイルス性、代謝性または毒性の病因による急性、亜急性、劇症または慢性の肝炎の治療のために使用できる組成物を製造するための、請求項１，２および４の何れか一項に記載の使用。
【請求項６】
肝硬変の治療に使用できる組成物を製造するための、請求項１，２および４の何れか一項に記載の使用。
【請求項７】
移植肝の肝機能を治療するために使用できる組成物を製造するための、請求項１及び２の何れか一項に記載の使用。
【請求項８】
肝臓内腫瘍の治療のために使用できる組成物を製造するための、請求項１及び２の何れか一項に記載の使用。
【請求項９】
CT-1、CT-1の活性フラクションまたはCT-1活性を持つポリペプチド誘導体を発現しコードするポリヌクレオチド配列を有するウイルスベクターを含有する組成物を製造するための、請求項１から８の何れか一項に記載の使用。
【請求項１０】
該ウイルスベクターがアデノウイルスであることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
カルジオトロフィン-1（CT-1）、またはCT-1の活性フラクション、またはCT-1活性を有するポリペプチド誘導体、或いはCT-1、CT-1の活性フラクション、またはCT-1活性を有するポリペプチド誘導体を発現しコードするポリヌクレオチド配列を培地に加えることを特徴とする肝細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の属する範囲）
本発明は、肝臓の再生を促進しアポトーシス及び壊死の過程から肝細胞を防護するための、カルジオトロフィン（CT-1）の使用に関する。従って本発明は、急性、亜急性、劇症及び慢性の肝炎の治療及び肝硬変の治療、並びに肝臓切除の後、肝臓移植の後の肝臓再生の促進、及び培養における肝細胞または肝細胞前駆体の増殖及び栄養の促進のための、カルジオトロフィンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（技術の状態）
ヒト及び動物のいずれにおいても、肝臓は、その増殖及び重量を調節する独特の能力を有している。有害物質が肝実質組織の一部を破壊した場合、生存する肝細胞は、複製し、障害された実質組織と置き換わることができる。肝臓の部分切除或いはウイルス性、毒性、免疫性または代謝性の肝細胞障害が、残存する肝臓組織の再生能力を超えるほどの肝実質組織の広い範囲に及ぶならば、致命的と判明することもある肝不全を生じる。現在、急性または慢性肝不全において使用することができる肝臓の保護及び再生促進の効果を有する薬物は存在しない。従って、肝臓治療に使用する一連の薬物にこれらに適応する医薬品を追加することは切迫した重要な問題である。肝保護剤は、肝細胞において毒性及び／または障害を生じる種々の刺激から肝細胞を保護し、究極的には壊死またはアポトーシスから肝細胞を保護することができる製品または活性物質である。従って、肝障害が生じたときには、適正な投与量の肝保護剤を投与すれば、肝臓再生を促進し、肝機能の正常化をもたらし、極端な場合には、患者の生存に寄与する、肝細胞生存率が改善するであろう。肝障害は、毒性物質（アルコールを含む）、ウイルス、自己免疫異常、虚血、虚血／再潅流（肝臓移植の間の移植肝に生じる障害として）及び一般的に炎症過程により生じうる。優れた肝保護剤はこのような状況において肝臓障害及び肝細胞死の発生を防ぎそして減少させるであろう。
【０００３】
肝臓再生についてわれわれは、肝臓総量を回復するまで正常肝細胞を増殖することによりその機能的総量の減少（組織の減少または細胞損失の何れか）を補填する肝臓の反応であると理解している。肝臓再生が重要な役割を演ずる臨床的状況として、手術中（部分肝切除または生体肝移植）の肝臓の切除または前記のような肝臓障害の状況（毒物、ウイルス、虚血、虚血／再潅流など）がある。肝臓再生の促進剤は、機能総量の減少に関連する死亡率を減少させるのに役立つ肝細胞増殖を誘導することができる物質である。
本発明は、肝臓疾患にカルジオトロフィンを使用することを提案する。
【０００４】
カルジオトロフィン（CHFまたは心臓肥大因子とも呼ばれる）は、すでに心臓障害並びに神経変性疾患及び神経学的疾患の治療に（WO 95/29237）、LIFRβ受容体に関連する局所炎症過程の調節剤として（WO 97/30146）、腫瘍の診断及び治療に（WO 00/43790）、並びに筋萎縮脊髄側索硬化症及びパーキンソン病の治療（WO 97/39629）に使用されている。
【０００５】
本発明は、これらの適用のいずれにも関係しておらず、肝細胞の治療に使用することができる医薬組成物において、特にアポトーシス及び壊死の過程に対して肝細胞を保護する薬物、並びに一般的に肝臓再生を促進する薬物として、CT-1を使用することに焦点を絞っている。
【０００６】
CT-1は、IL-6ファミリーに属するいわゆる神経形成サイトカイン（newropoietic cytokines）の一つである（1）。このファミリーのサイトカインの受容体は、異なるサブユニットから形成されているが、すべてgp130サブユニットを共有している（2）。このファミリーの一部のメンバー（IL-6及びIL-11）は、gp130のホモ二量体化を誘導し（3）、他方白血病阻害因子（LIF）、オンコスタチン及び毛様体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor)（CNTF）のような他のメンバーは、gp130サブユニットと190 kDa LIF受容体とのヘテロ二量体化を誘導する（4）。CT-1受容体は、gp130鎖、LIF受容体のβサブユニット（LIFRβ）及びCT-1受容体のαサブユニットとして知られている第3成分を含んでいる（5,6）。後者は、CT-1に対する高い感受性と特異性を付与する3成分複合体の形成に関与している。CT-1受容体の活性化は、JAKファミリー（JAK-1, JAK-2及びTyk2）におけるチロシンキナーゼの早期活性化を含む一連の細胞内信号を誘発する。JAKの主なエフェクターは、サイトソル転写因子であるSTATのグループ（STAT-1及びSTAT-3;転写の信号伝達活性体）である。JAKの活性化は、Ras-MAPキナーゼ経路を介して信号を伝達し、PI3-K（ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ）経路の活性化に関与している（2）。
【０００７】
CT-1は最初、心筋細胞における肥大因子として同定され（7,8）、心筋細胞の胚発生の促進及び低酸素、虚血、及び虚血-再潅流による障害により誘発されるアポトーシスに対する心筋保護作用における役割が示された（8,9,10,11,12）。心筋における保護作用は、心不全の症例においても記述されている（10）。CT-1のそのほかの作用には運動ニューロン及びドパミン作動性ニューロンの生存延長がある（13,14）。
【０００８】
（参考文献）
2005512966.tif 000002
2005512966.tif 000003
2005512966.tif 000004
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の説明）
本発明の目的において：
i)CT-1の活性フラクションは、本発明において請求する完全なタンパクの生理的効果を維持しているCT-1の部分ポリペプチド配列の全てを意味する。
ii)CT-1活性を持つポリペプチド誘導体は、天然CT-1と80％を超える相同性を有し、且つ本発明において請求する完全なタンパクの生理的効果を維持しているポリペプチド配列の全てを意味する。
iii) i)及びii)に記述したCT-1の該活性部分配列またはCT-1のポリペプチド誘導体をコードするポリヌクレオチド配列も本発明に包含されると理解されるべきものである。
iv)カルジオトロフィン-1すなわちCT-1は、そのタンパクの天然型、組換えタンパクの全ての型（単純なまたは徐放製剤中の）、CT-1の完全タンパクをコード若しくは発現するポリヌクレオチド型の全て、またはさらにi),ii)及びiii)に記述された型の何れかを伸長した物を意味する。
【００１０】
本発明は、CT-1遺伝子が肝実質組織の外科的な部分切除に続いて起こる肝臓再生の過程において過剰発現し、その発現が、肝細胞の最大増殖の時期と一致して肝切除後48時間に最大に達する、という発見に基づいている。この知見に基づいて、肝臓再生の過程に対するCT-1の影響を検討し、CT-1をコードする遺伝子配列を肝実質組織に導入することにより、部分肝切除後の肝臓再生を有意に促進し、ほぼ全体的に肝臓を切除した後の動物の死を防ぐことが認められた。同様に、CT-1をコードする配列を肝臓に導入することにより、種々の肝毒性物質に対する著しい肝細胞保護効果を生じ、肝細胞のアポトーシス／壊死の現象を著しく減少することが示された。かくしてこれらの知見は、CT-1が細胞死をもたらす物質に対する強力な肝細胞防御剤であり、さらに肝臓再生の過程を促進する性質を有することを示している。
【００１１】
したがって、本発明は、CT-1、またはCT-1の活性フラクション、またはCT-1活性を持つポリペプチド誘導体、またはCT-1、CT-1の活性フラクション若しくはCT-1活性を持つポリペプチド誘導体をコードし発現するポリヌクレオチド配列を、肝臓の外科的部分切除後または化学物質、生物学的物質、炎症性若しくは免疫性のメディエーターにより生じた肝障害後の肝臓再生の促進のために、さらに毒性、ウイルス性、免疫性または代謝性の病因による種々の型の急性、亜急性、劇症または慢性の肝炎における肝臓保護薬として、そしてアルコール、ウイルス、代謝性または免疫性病因の肝硬変及び移植肝において、再生を促進し、肝細胞を保護し、肝機能を改善するために使用できる組成物の製造において使用することを提案し、請求するものである。
【実施例】
【００１２】
1.  CT-1をコードする遺伝子配列を含むアデノウイルスベクター（AdCT-1）
下記に詳述するように実施して、カルジオトロフィン-1の遺伝子を含む欠損アデノウイルス（E1及びE3に欠失を持つ）（AdCT-1）を構築した。
マウス（ｍｕｒｉｎｅ）CT-1 のcDNAは、マウスcDNA配列（GenBankにおける登録番号U18366）のヌクレオチド20-639に相当するPCRプローブを使用してマウス筋肉cDNAのライブラリーから選別して得た。それをpGEM-T/CT-1ベクター中にクローニングし、配列分析により確認した。次いで、このCT-1のcDNAを、pKSベクター中にクローニングしてpKS-CT-1を形成した。これは、ラウス肉腫ウイルスプロモーターから作られた発現カセット（GenBank M83237のRSVヌクレオチド4526-5108）、神経増殖因子のペプチドシグナル（GenBank V00836のNGFヌクレオチド298-378）、マウスCT-1のcDNA（GenBank U18366のヌクレオチド20-639）及びSV40 ポリアデニル化シグナル（GenBank NC0016691のヌクレオチド2546-2775）を含む。この発現カセットを、BamHI/SalIによりpKS-CT-1プラスミドから除去し、pGY63アデノウイルスシャトルプラスミドにHinfI部位で連結してpGY63-CT-1プラスミドを形成した。このプラスミドpGY63-CT-1は、左手アデノウイルスITR（逆方向末端反復配列）、パッキングシグナル（ps）及びpIX遺伝子の部分を含み、そしてこれらの後の二つの間にCT-1発現カセットが存在する。このプラスミドpGY63-CT-1を、相同組換え用のアデノウイルスゲノムを含むpXL2689と共に、電気適合性E. coli SF800細胞に導入した。正しい組換え体をPacIで消化し、アデノウイルスを作るために細胞293（アデノウイルス5のDNAを導入したヒト胚性腎細胞、ATCC参照番号CRL-1573）に導入した。AdCT-1の構造を図１に示す。E. coliの形質転換株は、2001年9月12日バレンシア大学 (Burjasot, Valencia, Spain) のSpanish Type Culture Collection (CECT)（E. Coli PKSCT1,CECT No. 5980）に寄託した。
【００１３】
保存アデノウイルスを作るために、細胞293を使用し、組換えアデノウイルスを含む上清で感染させた。細胞293を、最初、6ウエルプレートに約80％の細胞の集合物を播種し、その際にDMEM培地を2％で使用した。数時間後、培地を除去し、3 mlのDEMEMで希釈した組換えアデノウイルスを含む上清の0.5μlで細胞を感染させた。1時間37℃でインキュベーションした後、接種物を除去し、4 mlの寒天を加えた。細胞を5から7日間37℃で培養した。パスツールピペットを使用して、細胞単層中に形成されたウイルスプラークからウイルスの検体を集めた。円筒状の寒天を2％のウシ胎児血清を含むDMEM 500 μlに再懸濁し、-80℃で保存した。組換えアデノウイルスを同定するために、細胞293を12ウエルプレートに播種し、先に単離したウイルスの250μlで感染させた。細胞変性効果が観察され始めたら、各ウエルから別々に細胞を採取した。次いで、細胞を破壊し、ウイルス粒子をできるだけ放出させるために、細胞に凍結及び解凍の操作を3回施した。各一連の操作から生じる細胞分解液を、10分間1500 rpmで遠心分離した。ウイルスを含む上清をもう一度6ウエルプレート中で培養している細胞293に感染させるために使用した。細胞が丸い形を示し始めたら直ちに、上清を採取して該上清中のウイルスDNA及びRNAを検出することによりウイルスの存在を確認した。高レベルのウイルス発現を示した上清を選び、保存組換えアデノウイルスを構築する目的で増幅をした。
【００１４】
細胞293を、150-mmプレート（50〜100のプレート）で培養し、保存したアデノウイルスをM.O.I  10（10プラーク形成単位-pfu-/cell）を使用して感染させた。細胞が細胞変性効果を示したときに、細胞を採取して10分間1500 rpmで遠心分離し、Tris（pH 8）0.1 Mに再懸濁し、その後の精製まで-80℃で凍結した。
【００１５】
組換えアデノウイルスを、塩化セシウム勾配を使用して精製した。このために、-80℃で保存した細胞を、Tris 0.01 Mに再懸濁し、5％デオキシキコール酸ナトリウムと1/10比（v/v）で30分間処理した。次いで、予め冷却したマニュアルガラスホモジナイザーを使用して、半液状になるまで細胞を破壊した。その後、細胞抽出物を飽和塩化セシウム溶液に加え、細胞抽出液10 mlに対して塩化セシウム溶液の比を5.8 mlに維持した。この混合物を、特製ヒートシールポリハロマー（polyhalomer）チューブ（Quick-seal, Beckman Instruments, CA, USA）に調製した。遠心分離を、Beckman 50 Ti 固定角ローター中35,000 rpmで4℃において16-20時間行った。ウイルスに相当するバンドを、滅菌針とシリンジを使用して採取し、同じ条件で2回目の遠心分離を行った。抽出した後に、バンドを各1.5時間2回Tris 0.01 M pH 8 に対して4℃で透析を行った。ウイルス検体の分割液を10％（v/v）滅菌グリセロール（ICN, USA）と共にバイアルにいれ、使用するまで液体窒素中に凍結保存した。
【００１６】
精製組換えアデノウイルスの感染力価を測定するために、限界希釈試験を96-ウエルプレート中で行った。この試験は、ウイルスが細胞293に及ぼす細胞変性効果を調べることに基づいており、細胞293に感染し増殖することができるウイルスの懸濁液の最大10進希釈を測定する。細胞293は、予め96ウエルプレートにウエル当り104細胞で播種した。次いで、ウエルから培地を除去し、細胞を連続希釈したアデノウイルス50μl/ウエルで感染させ、重複試験をした。6時間後、150μlの新鮮DMEM培地を加え、そして最終的に細胞を37℃で最大7日間培養した。この後、細胞に対するウイルスの細胞変性効果の存在を評価した。力価は、細胞変性効果を生じた細胞数に効果が観察された最大希釈倍率を掛けた後、評価した総容量（0.05 ml）でその結果を割ることにより得られ、従ってプラーク形成単位（pfu）/mlの数値が得られる。この測定は各検体について少なくとも3回繰り返した。
【００１７】
2.  CT-1、組換えタンパク
CT-1をコードするcDNAを、pGEM-T/CT-1プラスミドからEcoR1消化により得て、pET28bベクター（Novagen）にクローニングした（pET28b/CT-1）。このベクターは、一連のヒスチジン残基（1 kDa）をコードする配列を供給し、クローニングしたcDNAと同時に翻訳されてそのアミノ末端に1 kDaのヒスチジンテール及びCT-1を含み、この二つの間にトロンビン切断部位を持っている融合タンパクを生産する。
【００１８】
このタンパクを生産するために、このタンパクの継続的生産のために必要条件であるT7 のRNAポリメラーゼにより誘導される遺伝子を含んでいる株BL21(DE3)  (Novagen, Germany, Cat. No. 70235) の適合バクテリアを使用した。適合バクテリアを先に得たベクター、クローン化CT-1のcDNAを有するpET14b（NovagenのpET-14bベクター、Cat. No. 69660-3）で形質転換した。このベクターは、抗生物質（アンピシリン）耐性遺伝子を含んでいるので、形質転換バクテリアをアンピシリン含有LB培地で増殖するために選別した。
【００１９】
組換えCT-1の生産のために、形質転換バクテリアを、アンピシリン含有LB培地上で、600 nmにおける光学密度が0.4になるまで37℃で増殖した。次いで組換えタンパクの発現を、最終濃度0.5 mMのIPTGで誘発した。このようにして、lacプロモーターが誘導され、その結果ベクターを含みそしてクローン化cDNAの発現を調節するT7のRNAポリメラーゼのプロモーターが誘発される。培養は同条件でさらに4時間継続された。
【００２０】
抽出物を得るために、バクテリアが増殖した後、それを4℃で遠心分離した。沈殿したバクテリアをTris/HCl 10 mM, スクロース10％、2-メルカプトエタノール 2 mM及びプロテアーゼ阻害剤を加えた緩衝液中に再懸濁した。細胞破砕は、リゾチームと共に4℃で30分インキュベーションした後、超音波処理して行った。これによりバクテリア細胞壁の破壊が可能になり、抽出操作の収率が改善した。細胞質抽出物は、ホモジネートを100,000 gで90分間遠心分離することにより得た。タンパクの生産を、細胞質フラクションをSDS-PAGEにより分析して評価した。
【００２１】
His-CT-1融合タンパクは、細胞質抽出物から2 mlニッケルカラムクロマトグラフィーにより精製した。カラムを洗った後、タンパクを1 Mイミダゾールで溶出した。精製タンパクをトロンビンで処理して、CT-1を回収した。
【００２２】
3.  インビボにおけるCT-1発現を測定するためのノーザンブロット検定
種々のサイトカイン（肝細胞増殖因子、HGF；LIF;オンコスタチン；CNTF;CT-1）の遺伝子発現を、ラット肝臓からmRNAを抽出した後、ノーザンブロット技術を使用して肝臓再生の間分析した。RNAの抽出は、グアニジウムチオシアナート-フェノール-クロロフォルム法により行った。ノーザンブロットによる分析は、対照として28Sの発現及び分析した遺伝子の各々に特異的なプローブを使用して、われわれが先に記述した方法（15）に従って行った。
【００２３】
4.  肝細胞由来系の細胞培養
インビトロ試験のために、われわれは、ラット肝臓癌由来肝細胞系のH35細胞を使用した。この細胞は、10％ウシ血清、グルタミン2 mM, ストレプトマイシン100 U/ml, ペニシリン100 mg/mlを添加したダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）中で培養した。細胞培養は37℃で5％ ＣＯ2空気中インキュベートした。
【００２４】
5.  細胞サイクル及びアネキシン発現からのアポトーシスの分析技術
細胞サイクルは、ヨー化プロピジウムを用いるDNA染色法を使用して分析した。細胞（0.5ｘ106）を、0.1％ NP40溶液の50μlで透過性とし、次いでヨー化プロピジウムの50μg/ml溶液の0.5μl及び4 KU/ml  RNアーゼ（DNA-Prep Coulter reagents kit, Coulter）で染色した。細胞を、37℃で20分間インキュベートした後、FACScalibur細胞フルオロメーターで調べた。ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）を除外しFL3パラメーターを使用するフローサイトメーター（FACScalibur, Becton-Dickinson, USA）の「二重識別モジュール（ｄｏｕｂｌｅｔ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ）」DDMにおいて、ヨー化プロピジウム陽性の細胞を分析した。二倍体以下の細胞（ｓｕｂｄｉｐｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ）の頻度をアポトーシスの細胞のパーセンテージとした。
【００２５】
細胞の外側に出ているホスファチジルセリンの存在は、細胞がアポトーシスにあることを示すパラメーターの一つである。アネキシンVは、細胞がアポトーシスに進行することを決定した時点において細胞膜の外側に存在するホスファチジルセリンに結合するのでアポトーシス細胞を検出することができる。細胞（0.5ｘ106）を、NaCl 140 mM, KCl 5 mM, MgCl2 1.2 mM, CaCl2,及びHepes 10 mMを含むインキュベーション緩衝液中で一度洗った。細胞を100μlのインキュベーション緩衝液及びアネキシンVに結合したフルオレッセインイソチオニアナートコンジュゲート（アネキシン-FITC）の5μl中15分間室温でインキュベートした。次いでFL1パラメーターを使用して細胞をFACScaliburで調べた。アポトーシスインデックスはアネキシン-FITC陽性細胞のパーセンテージから決定した。
【００２６】
6.  タンパクの分析方法
電気泳動。
タンパク分析のために、細胞を分解用緩衝液（20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% Triton x-100, 2.5 mM ピロリン酸ナトリウム, 1 mM Na3VO4, 1 μg/ml ロイペプチン、ペプスタチン、10 μg/mlのトリプシン阻害剤、1 mM PMSF）中で分解した。0.5ｘ106細胞の分解物を泳動緩衝液（125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% ドデシル硫酸ナトリウム、20％グリセロール、100 mM ジチオトレイトール、0.2％ブルモフェノールブルー）に再懸濁した。タンパク抽出検体を100℃で5分間加熱し、10％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動を行った。
【００２７】
ウエスタンブロットによる免疫検出。
電気泳動の後、タンパクを、300 mAの電流で1時間かけて転移緩衝液（25 mM Tris, 0.2 M グリシン、20％メタノール、pH 8.5）中でニトロセルロース膜に転移した。良好な転移を確認するために、転移したタンパクをポンソウレッドで染色した。次いで膜について特異的タンパクの免疫検出を実施した。このために、膜を2％のBSA（アルブミンフラクションV）を含むTBS-Tインキュベーション緩衝液（20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6及び0.5%のTween 20）中で1時間ブロックした。試験するタンパクに対して特異的な抗体で膜を2時間インキュベートした。次いで、膜をTBS-T緩衝液で1時間洗い、次いでタンパクG-HPRO (BIORAD)と1時間インキュベートした。数回TBS-T緩衝液で洗った後、膜をケミルミネッセンス試薬（NEN Life Science Products）で現像し、直ちに高感度フィルム（Amersham）に予め定めた時間露光した。
【００２８】
免疫沈降法。
特異的タンパクの免疫沈降法のために、106細胞の分解産物を、特異的抗体及び20μlのプロテインG-セファロースの存在下に4℃で18時間インキュベートした。免疫複合体を遠心分離により単離し、分解緩衝液中で2回洗い、泳動緩衝液に溶解した。ついで、検体を100℃に加熱し、10％ゲル上で電気泳動を行った。特異的タンパクの免疫検出はウエスタンブロットにより行った。
【００２９】
7.  DNA合成の測定。増殖の検定。
H-35細胞を、96-ウエルプレートに播種した。血清除去24時間後、細胞を無血清DMENで希釈したCT-1（50 ng/ml）で刺激した。CT-1と24時間インキュベーションした後、10-μCi/ml [メチル-3H]-チミジン（ICN, Amersham）で12時間標識した。放射能培地を除去し、細胞を100μlのトリプシンを用いて37℃で剥離し、25μlのシンチレーションカクテル（Ecolite; ICN）中に収集した。[3H]-チミジンの取り込みはtri Carb 2900TRシンチレーションカウンター（Packard, Meriden, CT）を使用して分析した。
【００３０】
8.  部分肝切除（75％外科的切除）後の肝臓再生のインビボ試験
肝臓再生の試験は、Fisherラット（雄、体重180 g）において実施した。肝臓の75％を外科的に切除し、ラットを種々の時間（1, 3, 6, 10, 24, 48時間，3，6，及び9日）に殺処理した。肝臓検体を採取し、組織学検査（Formol中で固定）、免疫組織学検査（OCT中で固定）、及びRNA分析（液体窒素中で凍結）のために3部分に分割した。各分析時間ごとに最低4匹のラットを使用した。分析した肝臓再生のパラメーターは、肝臓重量パーセンテージ及び免疫組織学による細胞増殖の核抗体（PCNA）の発現であった。
【００３１】
8.1．肝臓再生中のCT-1遺伝子の発現
肝臓再生におけるその関与を検討する目的で、種々のサイトカイン（HGF, LIF, オンコスタチン、CNTF, CT-1）の遺伝子発現を部分肝切除モデルにおいて分析した。この試験では、部分肝切除後種々の時間（1, 3, 6, 10, 24, 48時間，3，6，及び9日）に採取したラット肝臓検体について分析した。各群は最低4動物であった。さらに、肝切除をしていない健康なラット（対照）の肝臓を分析した。各サイトカインに対応するmRNAのレベルは、ノーザンブロットにより評価した。この実験により、CT-1のmRNAレベルは、肝切除後24及び48時間において有意に増加し（図２及び３）、試験動物の肝臓組織の免疫組織学検査における肝細胞によるPCNAの発現及びブロモデオキシウリジン（BrdU）の取り込みに示されているように肝細胞の最大増殖に一致していることを観察することができた。さらに、肝切除後10時間に生じるHGFの発現におけるピークがCT-1の転写発現における増加に先行することを観察することができた。
【００３２】
8.2.  部分肝切除後の肝臓再生に対するCT-1の効果
肝臓再生におけるCT-1の役割を検討するために、アデノウイルスCT-1（AdCT-1）を108 pfuの用量で、または対照としてLacZレポーター遺伝子を持つアデノウイルス（AdLac-Z）を同用量で静脈内に注射した。48時間後肝臓の75％外科的切除を実施した。ラットを前記と同じ時間に殺処理した。分析した各時間について最小4ラット、最大8ラットを使用した。
【００３３】
AdCT-1投与により、（肝切除後のラットから得られた肝臓検体におけるPCNAに対する免疫染色によって示されるように）肝細胞の最大増殖の時期である48時間において二群の間に有意差をもってAdLac-Zを投与されたラットに比較してAdCT-1を投与されたラットにおける肝臓重量の増加を誘発した。肝切除後3及び6日において、AdCT-1を投与したラットの肝臓重量は対照ラットよりも大きかったが、この時点では群間の差は統計的に有意ではなかった（図４）。この結果は、CT-1で処理された肝臓は肝臓再生の促進を示し、肝切除後の早期には対照よりも多い重量を示すが、最終的には肝臓の最終重量を調節する生体維持機構のために対照と近似した値に達することを示している。
【００３４】
9.  広範囲肝切除（外科的切除＞85％）後の肝臓再生のインビボ検定
ほぼ全体の肝を切除した動物の死をCT-1が防ぐことができるか否か評価する目的で、肝臓の85％以上を外科的に切除したFischerラットについて実験を行った。この実験に30匹のラットの2群を使用した。一群にはAdLac-Zを、他群にはAdCT-1を、前記用量で、静脈内に投与した。この型の外科切除はアデノウイルスの投与48時間後に行った。外科切除に生き残ったラットの数はAdLac-Z群で14ラット、AdCT-1群で13ラットであった。これらのラットについて、広範囲外科切除後の長期生存を監視した。
【００３５】
肝切除後最初の1時間において死亡率はAdLac-Z群において77％であったが、一方AdCT-1群では20％に達しなかった。肝切除後24時間では、AdLac-Zを投与されたラットの7％のみが生存したが、AdCT-1を投与されたラットでは生存率は61％であった。この差は統計的に有意であった。これらのパーセンテージは手術後4日間同じであった（図５）。われわれのデータは、CT-1が広範囲肝切除による死亡を防御することを示している。
【００３６】
10.  インビボにおける肝細胞のアポトーシス/壊死に対するCT-1の防御効果。
劇症肝障害の試験
種々の有害物質により生じる肝臓障害に対するCT-1の役割を評価するために、Balb/cマウスを使用し（雄、体重30 g）、肝臓障害を以下の三つの肝細胞障害モデルで評価した：
i)100 mg/kgのコンカナバリンA, Con-A (Sigma, St. Louis, MO., USA) の静脈内投与により生じる障害；
ii)TNFα（Peprotech）（0.5μg/マウス）の静脈内投与及び25 mgのD-ガラクトサミンの腹腔内投与の併用、TNFα/D-Gal（Sigma）により生じる障害；及び
iii)1.5μg/マウス  抗-Fas（Jo2, Pharmingen）の静脈内投与により生じる障害。
Con-AまたはTNFα/D-Galまたは抗-Fasの投与後6時間にマウスから血液を採取し、殺処理した。
【００３７】
肝障害に対するCT-1の効果を測定するために、「A」群のマウスに生理食塩液を投与し、「B」群にはAdLac-Z（107 pfu）を、「C」群にはAdCT-1（107 pfu）を投与した。48時間後、前項に記述した3モデルの肝障害を各群に誘発した。実験の陰性対照（NC）として、肝炎誘発剤の代わりに食塩液血清を投与したマウスの群も含めた。各群は5匹のマウスで構成した。
6時間後、肝臓障害の程度を2つのパラメーターにより試験した。即ち、自動化分光検定（Technicon RA-1000, Bayer）による血清中のトランスアミナーゼ（GPT）の測定と、「インザイツ死細胞検出キット」（Roche Diagnostics GmbH, Indianapolis, IN, USA）を使用して、OCT中で固定した肝臓検体におけるTUNEL技術によるアポトーシスの測定である。
【００３８】
トランスアミナーゼの測定のために血液検体を各マウスから採取し、その直後に動物を殺処理し、組織学検査のために肝臓を処理し（Formolで固定）、そしてTUNEL技術（OCT中で凍結）によりアポトーシスを検査した。
【００３９】
Con-Aの投与により誘発した急性肝障害の最初のモデルにおいて、対照群のマウス（生理食塩液またはAdLac-Zを投与した動物）は、GPTのかなりの高値を示したが、AdCT-1を投与した動物ではトランスアミナーゼのレベルはほとんど変化せず、この群と対照群との間の差は高度に有意であることが認められた（図６Ａ）。肝臓組織にTUNEL技術を実施した結果、AdCT-1を投与したマウスの肝臓検体にはアポトーシスを認めなかったが、これに対してCon−Aの投与前に食塩液血清またはAdLac-Zを投与した動物においては壊死及びアポトーシスが広範囲の領域で認められた（図７）。
【００４０】
抗-Fasモノクロナール抗体の投与により誘発した急性肝障害の第二のモデルにおいて、AdCT-1の投与によって肝細胞死が防御されることが認められた（図６Ｂ）。AdCT-1を投与した動物におけるトランスアミナーゼ値は、抗-Fasの投与後6時間において、食塩液血清またはAdLac-Zを投与した動物の値よりかなり低い（統計的な有意差あり）ことが認められた。さらに、肝臓組織の検体におけるTUNEL技術及び組織学的検査により、対照動物に比較してAdCT-1投与マウスにおいてアポトーシス体の著しい減少が認められた。
【００４１】
TNFアルファ及びD-ガラクトサミンの併用投与（TNF-α/DGal）による肝障害の第三のモデルにおいて、CT-1の肝臓保護の役割が評価された。肝障害後6時間においてAdCT-1を投与したマウスにおけるトランスアミナーゼレベルの数値及びTUNEL技術によるアポトーシス肝細胞の数は対照群に比較して著しい減少を示した（図６Ｃ）。
【００４２】
これらのデータは全て、CT-1は肝細胞のアポトーシスまたは壊死を生じる種々の刺激から肝臓の細胞を保護できることを示している。
【００４３】
11.  細胞系に由来する肝細胞の細胞サイクル及び生存に対するCT-1の影響の分析
H35ラット肝細胞系を使用して、組換えCT-1が肝細胞のアポトーシスのサイトカイン調節物質として作動する生物学的効果について検討した。CT-1による刺激試験のために、細胞を予め18時間無血清培地に置いた。CT-1による刺激試験は無血清培地中で行った。
【００４４】
最初にこの肝細胞系の細胞サイクルに対するCT-1 の効果を分析した。細胞サイクルは、ヨー化プロピジウムでDNAを染色し次いでサイトフルオロメトリーで分析することにより測定した。アポトーシスは、細胞の培地から血清を4日間除去することにより誘発した。結果は、この条件における4日間の培養により、86％のH35 細胞はアポトーシスを生じた。他の刺激剤が存在せずにCT-1が50 ng/ml存在する場合には、CT-1はH35 細胞のアポトーシスの開始を著しく遅らせ、約52％の細胞にアポトーシスを示す（図７）ことが認められた。
【００４５】
H35細胞培養を3日間無血清とすることにより、同様の実験を行い、次いでFITC（フルオレセインイソチオシアナート）に結合した精製アネキシンに対する細胞表面の結合能力を測定した。H35細胞表面へのアネキシン-FITCの結合は、フローサイトフルオロメトリーによる分析により調べた。CT-1なしで培養された細胞は約21％がアネキシンに対して陽性を示したが、50 ng/mlのCT-1で処理した細胞は約12％が陽性を示した（図８）。したがって、これらの実験から、使用した用量においてCT-1は、抗アポトーシス効果を示しうることが確認された。
【００４６】
12.  細胞増殖に対するCT-1の効果の分析
H35細胞系を使用して、CT-1の肝細胞におけるDNA合成に対する影響を検討した。このために96ウエルプレートに20,000細胞/ウエルを播種した。刺激を明らかにするために、細胞を予め無血清培地に24時間おいた。CT-1による刺激試験は無血清培地中50 ng/mlの用量で24時間行った。CT-1存在下に培養した細胞はCT-1を適用しなかった対照細胞よりも高いDNA合成を示した（図９）。したがってこの実験により、CT-1は使用した用量においてDNA合成を誘導しうることが確認された。
【００４７】
13.  肝細胞由来細胞系においてCT-1により誘発される信号伝達経路の検討及び分析
CT-1がインビボ及びインビトロのいずれにおいても抗アポトーシス効果を示すことが明らかとなったので、肝細胞におけるCT-1受容体の刺激に関与する信号伝達経路について検討した。IL-6/LIFサイトカインファミリーの受容体刺激は、JAK-1ファミリーに帰属する信号伝達物質の迅速なリン酸化をもたらす。CT-1によるH35の刺激の後、種々の時間において、これらの細胞の全分解物について特異抗体（Cell Signaling Technology）によるJAK-1の免疫沈降を行った。リン酸化チロシンに対する特異抗体（4G10, Upstate Biotechnology）及びウエスタンブロットを使用して、CT-1がJAK-1分子のチロシンリン酸化を5分に誘発し、その信号が60分後に消失することを確かめた（図１０Ａ）。
【００４８】
STAT-3のリン酸化は、JAKを介してIL-6ファミリーのサイトカインの信号伝達に関与すると言われている活性化経路の一つである。そのリン酸化による活性化は、ある場合には細胞分化の誘導を伴ない、他の場合には（心筋細胞）肥大を伴なう。ウエスタンブロットを使用して、種々の時間に50 ng/mlのCT-1でインビトロ処理したH35 の分解物を分析した。リン酸化STAT-3に対する特異抗体（Santa Cruz Biotechnology）を使用して、CT-1は刺激後5分から始まり、30分で最大に達するSTAT-3のリン酸化を誘発できることを確認した（図１０Ｂ）。
【００４９】
アポトーシス信号の阻害に明らかに関与する経路の一つは、PI-3/AKT経路（ホスファチジルイノシトール-3キナーゼ/AKTキナーゼ）である。PI-3Kの活性化は、AKTのセリン475及びトレオニン308のリン酸化による活性化を誘発する。AKTの活性化は、今度は、BADのセリン112及び136のリン酸化を引き起こす。BADはBcl-2ファミリーのメンバーであり、生存信号の重要な調節物質である。不活性のBADは、Bcl-xまたはBcl-2タンパクと共に二量化し、それらの抗アポトーシス活性を中和する。BADのリン酸化は、Bcl-2またはBcl-xの放出を生じ、これがアポトーシス経路を抑制すると思われる。したがってBADのリン酸化はアポトーシス経路を抑制すると考えられる。本研究ではCT-1がH35においてこの生存経路を活性化しうるか否かを調べた。50 ng/mlのCT-1を用いて種々の時間で細胞を処理した後、細胞質フラクションを分取し、抗-AKTポリクロナール抗体（Cell Signaling Technology）を使用してAKTの免疫沈降を行った。次いでウエスタンブロットにより、セリン475にリン酸化されたAKTに特異的なポリクロナール抗体（Cell Signaling Technology）を使用してリン酸化AKTの存在を分析した。CT-1は、15分及び30分に、安定AKTのセリン475にリン酸化を誘発し、その後60分には消失することが、確認された。したがってCT-1は肝細胞系において生存信号を誘発する（図１０Ｃ）。
【００５０】
要約すると、CT-1はJAK/STAT信号伝達系並びにPI-3K/AKT生存経路を誘発することができる。したがってCT-1により誘発される信号カスケードにより、どのようにCT-1がPI-3K/AKT経路を介して抗アポトーシス効果を有するサイトカインとして作動するのか、そしてJAK/STAT-3経路を介して増殖と分化の誘発物質として作動するのかが説明される。
【００５１】
14.急性肝臓障害のインビボモデルにおいてAdCT-1により誘発される信号伝達経路の検討及び分析
ラット及びマウスにおける急性肝臓障害のインビボモデルにおいて観察されるAdCT-1の保護効果を分析する目的で、インビトロにおいて観察されたように、肝細胞のCT-1受容体の刺激に関与すると思われる信号伝達経路をこれらのインビボモデルにおいて検討した。
【００５２】
すでにインビトロにおいて記述したように、CT-1は生存または抗-アポトーシスに関与する3つの主な経路の活性化を誘発することができる。即ち、STAT-3（転写の信号トランスデューサー及び活性化物質）、PI-3K(ホスファチジルイノシトール3-OHキナーゼ)/AKT及びErkl/2（細胞外調節キナーゼ）である。
【００５３】
a. 広範囲肝切除のラットモデル
実施例9に記述した実験（肝切除＞85％）において認められているように、外科的切除後1時間で高い死亡率が認められた（図５参照）。このため、この実験を、3処置群（AdCT-1, AdLac-Z及び生理食塩液）で繰り返し行ったものの、今回は肝臓検体を採取するために外科的切除後1時間でラットを殺処理した。
【００５４】
採取した肝臓検体を、組織学検査（Formol固定）、免疫組織学検査（OCT固定）及びタンパク分析（液体窒素凍結）のために3部分に分割した。液体窒素凍結検体から、分解緩衝液（20 mM Tris pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM EGTA; 1 mM EDTA; 1% Triton x-100; 2.5 mMピロリン酸ナトリウム; 1 mM Na3VO4及びタンパク分解酵素阻害剤カクテル）中で肝臓ホモジネートを作成した。Cell Signaling Technology (Beverly, Massachussetts)から入手した特異的抗体を使用するウエスタンブロットにより、AdCT-1、AdLac-Z及び生理食塩液（S）で処置した3群のラットにおける信号伝達を検討した。使用した抗体は、抗-Stat-3、抗-リン酸化-Stat-3（Stat-3-Y-705）、抗-AKT、抗-リン酸化AKT（AKT-Ser-473）、抗-Erkl/2、並びにリン酸化型のErkl（Erkl-Thr-202）及びErk2（Erk2-Y-204）を同時に検出する抗-リン酸化Erkl/2であった。このようにして、AdCT-1を投与されたラットの肝臓は、STAT-3, ERKl/2及びAKTのリン酸化を示したが、これに対してAdLac-Z及び生理食塩液を投与したラットでは認められなかった（図１２Ａ）。
【００５５】
他方、Caspasa-3は、広範囲肝切除（＞85％）を含む多くの刺激に応答するアポトーシスの遂行に関与している。この理由から、液体窒素中に採取した検体の一部について、メーカー提供のプロトコールにしたがって、caspasa-3活性の試験を行った（CaspACE, Promega, Madison, Wisconsin）。予めAdCT-1で処置したラットの肝臓は、AdLac-Z及び生理食塩液で処置したラットの肝臓に比較して低いcaspasa-3活性を示し（図１２Ｂ）、したがって前者において低いアポトーシス指数を示すことが観察された。
【００５６】
以上から、ラットの肝障害においてAdCT-1により形成された保護効果は、確認された低caspasa-3活性により示されるように、CT-1により誘発される抗アポトーシス信号のカスケードにより始まり、アポトーシスの減少に至ることが示唆される。
【００５７】
b.  コンカナバリンAにより誘発される急性肝臓障害のマウスモデル
このモデルにおける信号伝達を検討するために、3処置群（AdCT-1, AdLac-Z及び生理食塩液）についてCon-Aによる誘発実験（例10参照）を行ったが、今回はCon-A投与後1時間でマウスを殺処理した。殺処理の時点で得た肝臓検体を上記例14aに記述したように処理した。ウエスタンブロットを同様にして、同じ抗体を使用して行った。
【００５８】
図１３に見られるように、AdCT-1処置は、CT-1により誘発される主たる抗アポトーシス及び生存経路であるAKT及びERK l/2のリン酸化を誘発した。したがってこの結果から、AdCT-1は抗アポトーシスのこれらの主経路を活性化することによりCon-A誘発肝臓障害からマウスを防御することが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】CT-1をコードする配列を含むAdCT-1アデノウイルスベクターの構造の概略図。RSV:ラウス肉腫ウイルスのプロモーター；NGF:神経増殖因子のペプチドシグナル；CT-1:マウスCT-1のcDNA；SV40:SV40ウイルスのポリアデニル化シグナル。抑制されたE1及びE3 領域は黒で示されている。
【図２】部分肝切除後の種々の時間（h=時間;d=日）において得たラット肝臓検体中のCT-1をコードするmRNAのノーザンブロットによる検出。28S:並列対照としてのrRNA。
【図３】図２におけるノーザンブロットにおける経時的（h=時間;d=日）CT-1発現のグラフ。縦軸；光学密度の任意単位（CT-1/28S）。
【図４】予めAdCT-1またはAdLac-Zを投与したラットにおける部分肝切除後の種々の時間（横軸；h=時間;d=日）における肝臓重量（縦軸）。
【図５】AdCT-1またはAdLac-Zで処置し、その処置の48時間後に肝臓切除（＞85％）を行ったラットの生存率（縦軸）。横軸：肝切除後の時間（時間）。
【図６Ａ】コンカナバリンA、Con-Aの投与によりマウスにおいて劇症肝炎を誘導させるモデルでの、トランスアミナーゼであるGPT血清濃度（縦軸、SF単位/ml）を表すグラフ、及び肝臓組織像（アポトーシスを可視化するためのTUNEL技術）である。肝炎誘発の48時間前に動物をアデノウイルスベクター（AdCT-1またはAdLac-Z）または生理食塩液血清（S）で処置した。陰性対照（NC）は、肝炎誘発物質の代わりに生理食塩液血清を投与したマウスである。
【図６Ｂ】抗-Fas抗体の投与によりマウスにおいて劇症肝炎を誘導させるモデルでの、トランスアミナーゼであるGPT血清濃度（縦軸、SF単位/ml）を表すグラフ、及び肝臓組織像（アポトーシスを可視化するためのTUNEL技術）である。肝炎誘発の48時間前に動物をアデノウイルスベクター（AdCT-1またはAdLac-Z）または生理食塩液血清（S）で処置した。陰性対照（NC）は、肝炎誘発物質の代わりに生理食塩液血清を投与したマウスである。
【図６Ｃ】NFα及びD-ガラクトサミンの併用投与、TNFα/D-Galによりマウスにおいて劇症肝炎を誘導させるモデルでの、トランスアミナーゼであるGPT血清濃度（縦軸、SF単位/ml）を表すグラフ、及び肝臓組織像（アポトーシスを可視化するためのTUNEL技術）である。肝炎誘発の48時間前に動物をアデノウイルスベクター（AdCT-1またはAdLac-Z）または生理食塩液血清（S）で処置した。陰性対照（NC）は、肝炎誘発物質の代わりに生理食塩液血清を投与したマウスである。
【図７】CT-1の非存在下（C=対照）及び存在下（CT-1）において、血清を除去した後1日（上段）及び4日（下段）でのH35 細胞の細胞サイクルの分析。左から右にかけて次の区分で選別した：2n未満のDNAを持つ細胞（アポトーシス細胞、Apo）;G0-G1にある細胞（静止細胞）及びS及びMにある細胞（分裂期細胞）。縦軸：細胞数。横軸：DNA含量。
【図８】CT-1の非存在下（C=対照）及び存在下（CT-1）において、3日間無血清に置いた後でのフローサイトメトリーによるH35細胞におけるアネキシンV発現の分析。CT-1と培養した細胞は12％のアポトーシス細胞が見られた。これに対してCT-1なしで培養した細胞では21％のアポトーシス細胞が確認された。
【図９】[3H]チミジンの取り込みにより測定した細胞増殖に対するCT-1の効果の分析。結果は、処理しない対照細胞（C=対照）に比較してCT-1処理細胞（CT-1）において増殖のパーセンテージ増加（縦軸）を示した。
【図１０】細胞をCT-1とインキュベートした後種々の時間に採取したH35細胞の分解物中におけるリン酸化信号伝達タンパク（Jak-1-Y, Stat-3-Y-705,及びAKT-Ser-475）の免疫検出。A.)Jak-1に特異的な抗体と細胞分解物との免疫沈降。次いでリン酸化チロシンに特異的な抗体によるウエスタンブロットにより、5分においてJak-1分子のリン酸化が観察された。B.)リン酸化Stat-3（Stat-3-Y-705）に特異的な抗体によるウエスタンブロットであり、処理5分で陽性が観察された。C.)抗―AKT抗体による細胞質フラクションの免疫沈降、その後のセリン475のリン酸化AKT（AKT-Ser-475）に特異的な抗体によるウエスタンブロットにより、15分及び30分に誘発が認められた。
【図１１】pET-14bベクターの構造。
【図１２Ａ】AdCT-1, AdLac-Zまたは生理食塩液（S）を投与し、次いで85％以上の肝切除を行い、切除の1時間後に殺処理したラットの肝臓における信号伝達タンパクのウエスタンブロット。1a)Stat-リン酸化3（Stat-3-Y-705）に特異的な抗体によるウエスタンブロット。 1b)総Stat-3を定量するためのStat-3に特異的な抗体によるウエスタンブロット。    Stat-3のリン酸化はAdCT-1で処置したラットにおいて観察された。 2a)リン酸化Erkl及びErk2（Erkl-Thr-202及びErk2-Tyr-204）に特異的な抗体によるウエスタンブロット。 2b)総Erkl及びErk2を定量するためのErkl及びErk2に特異的な抗体によるウエスタンブロット。    ERKl/2のリン酸化はAdCT-1で処置したラットにおいて観察された。3a)リン酸化Akt（Akt-Ser-473）に特異的抗体によるウエスタンブロット。3b)総Aktを定量するためのAktに特異的な抗体によるウエスタンブロット。    Aktのリン酸化はAdCT-1で処置したラットにおいて観察された。
【図１２Ｂ】広範囲肝臓切除（＞85％）を行ったラットの肝臓におけるCaspasa-3活性。検体は図１２Ａに記述した実験に使用した肝切除の同じ群から得た。図は健康肝臓に対するcaspasa-3の活性増加倍率を示す。
【図１３】肝障害を誘発するためのCon-Aを投与する前に、AdCT-1, AdLac-Zまたは生理食塩液（S）でそれぞれ処置したマウスの肝臓における信号伝達タンパクのウエスタンブロット。検体はCon-Aによる誘発後1時間に殺処理したときに採取した。1a)リン酸化Akt（Akt-Ser-473）に特異的な抗体によるウエスタンブロット。1b)総Aktを定量するためのAktに特異的な抗体によるウエスタンブロット。    Aktのリン酸化はAdCT-1で処置したラットにおいて観察された。2a)リン酸化Erkl及びErk2（Erkl-Thr-202及びErk2-Tyr-204）に特異的な抗体によるウエスタンブロット。2b)総Erkl及びErk2を定量するためのErkl及びErk2に特異的な抗体によるウエスタンブロット。    ERKl/2のリン酸化はAdCT-1で処置したラットにおいて観察された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月15日(2003.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓再生を促進するために使用できる組成物の製造における、カルジオトロフィン-1（CT-1）またはCT-1を発現しコードするポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項２】
肝臓保護剤として使用できる組成物の製造における、カルジオトロフィン-1（CT-1）またはCT-1を発現しコードするポリヌクレオチド配列の使用。
【請求項３】
外科的肝切除の後の肝臓再生を促進するために使用できる組成物の製造における、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
いずれかの病因による慢性肝臓疾患の治療のために使用できる組成物の製造における、請求項１及び２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ウイルス性、代謝性または毒性の病因による急性、亜急性、劇症または慢性の肝炎の治療のために使用できる組成物の製造における、請求項１，２及び４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
肝硬変の治療に使用できる組成物の製造における、請求項１，２及び４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
移植肝の肝機能の治療のために使用できる組成物の製造における、請求項１及び２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
肝臓内腫瘍の治療のために使用できる組成物の製造における、請求項１及び２のいずれか一つに記載の使用。
【請求項９】
CT-1を発現しコードするポリヌクレオチドを有するウイルスベクターを含有する組成物の製造における、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
該ウイルスベクターがアデノウイルスであることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
CT-1またはCT-1を発現しコードするポリヌクレオチドを有するウイルスベクターを培地に加えることを特徴とする、肝細胞の培養方法。
【国際調査報告】
2005512966.tif 000023
2005512966.tif 000024
2005512966.tif 000025
2005512966.tif 000026