(57)【要約】本発明は、ウイルスの複製に必須の遺伝子産物の発現がH19調節配列によって制御される条件複製ウイルスベクターを用いた、腫瘍特異的ウイルス複製および／または発現に関する。本発明は、前記ウイルスベクター、前記ウイルスベクターの作製方法、および前記ベクターの投与方法を提供する。本発明の組成物および方法は癌および過増殖性障害の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における癌または過増殖性障害を治療する方法であって、かかる治療が必要な被験者に、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス核酸の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターを投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項２】
H19調節配列がH19プロモーター、H19エンハンサー、転写調節活性を依然保持するH19プロモーターまたはH19エンハンサーの部分配列、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
H19プロモーターが配列番号1のヌクレオチド1〜830を含んでなる、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
H19プロモーターが配列番号2の配列を含んでなる、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
H19エンハンサーがプラスミドpH19EH19 (ATCC受託番号209322)にクローン化されたH19エンハンサーの配列を含んでなる、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
H19エンハンサーが配列番号3の配列を含んでなる、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
H19エンハンサーが配列番号4の配列を含んでなる、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
H19エンハンサーが配列番号5の配列を含んでなる、請求項2に記載の方法。
【請求項９】
H19エンハンサーがウイルスの複製に必須のウイルス遺伝子の配列の3’側に配置される、請求項2に記載の方法。
【請求項１０】
癌が癌腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、胚芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、ラブドテリオサルコーマ(rhabdotheliosarcoma)、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、胃腸間質性腫瘍、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺の癌、頭部・頸部癌、子宮内膜の癌、および前記癌のいずれかの転移からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
癌が膀胱癌であり、投与が膀胱内である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
条件複製ウイルスがアデノウイルスである、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスの複製に必須の産物をコードする少なくとも1つの核酸が、アデノウイルスのE1a、E1b、E2a、およびE4遺伝子からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス核酸の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている、条件複製ウイルスベクター。
【請求項１５】
H19調節配列がH19プロモーター、H19エンハンサー、転写調節活性を依然保持するH19プロモーターまたはH19エンハンサーの部分配列、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項14に記載のベクター。
【請求項１６】
H19プロモーターが配列番号1のヌクレオチド1〜830を含んでなる、請求項15に記載のベクター。
【請求項１７】
H19プロモーターが配列番号2の配列を含んでなる、請求項15に記載のベクター。
【請求項１８】
H19エンハンサーがプラスミドpH19EH19 (ATCC受託番号209322)にクローン化されたH19エンハンサーの配列を含んでなる、請求項15に記載のベクター。
【請求項１９】
H19エンハンサーが配列番号3の配列を含んでなる、請求項15に記載のベクター。
【請求項２０】
H19エンハンサーが配列番号4の配列を含んでなる、請求項15に記載のベクター。
【請求項２１】
H19エンハンサーが配列番号5の配列を含んでなる、請求項15に記載のベクター。
【請求項２２】
H19エンハンサーがウイルスの複製に必須のウイルス遺伝子の配列の3’側に配置される、請求項15に記載のベクター。
【請求項２３】
条件複製ウイルスがアデノウイルスである、請求項14に記載のベクター。
【請求項２４】
ウイルスの複製に必須の産物をコードする少なくとも1つの核酸が、アデノウイルスのE1a、E1b、E2a、およびE4遺伝子からなる群より選択される、請求項23に記載のベクター。
【請求項２５】
癌細胞または過増殖性細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞に、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス遺伝子の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている有効量の条件複製ウイルスベクターを接触させることを含んでなる、上記方法。
【請求項２６】
H19調節配列がH19プロモーター、H19エンハンサー、転写調節活性を依然保持するH19プロモーターまたはH19エンハンサーの部分配列、およびこれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
H19プロモーターが配列番号1のヌクレオチド1〜830を含んでなる、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
H19プロモーターが配列番号2の配列を含んでなる、請求項26に記載の方法。
【請求項２９】
H19エンハンサーがプラスミドpH19EH19 (ATCC受託番号209322)にクローン化されたH19エンハンサーの配列を含んでなる、請求項26に記載の方法。
【請求項３０】
H19エンハンサーが配列番号3の配列を含んでなる、請求項26に記載の方法。
【請求項３１】
H19エンハンサーが配列番号4の配列を含んでなる、請求項26に記載の方法。
【請求項３２】
H19エンハンサーが配列番号5の配列を含んでなる、請求項26に記載の方法。
【請求項３３】
H19エンハンサーがウイルスの複製に必須のウイルス遺伝子の配列の3’側に配置される、請求項26に記載の方法。
【請求項３４】
癌が癌腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、胚芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、ラブドテリオサルコーマ(rhabdotheliosarcoma)、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、胃腸間質性腫瘍、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺の癌、頭部・頸部癌、子宮内膜の癌、および前記癌のいずれかの転移から選択される、請求項25に記載の方法。
【請求項３５】
条件複製ウイルスがアデノウイルスである、請求項25に記載の方法。
【請求項３６】
ウイルスの複製に必須の産物をコードする少なくとも1つの遺伝子が、アデノウイルスのE1a、E1b、E2a、およびE4遺伝子から選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
癌または過増殖性障害の治療用医薬を製造するための、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス遺伝子の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターの使用。
【請求項３８】
H19調節配列がH19プロモーター、H19エンハンサー、転写調節活性を依然保持するH19プロモーターまたはH19エンハンサーの部分配列、およびこれらの任意の組合せから選択される、請求項37に記載の使用。
【請求項３９】
H19プロモーターが配列番号1のヌクレオチド1〜830を含んでなる、請求項38に記載の使用。
【請求項４０】
H19プロモーターが配列番号2の配列を含んでなる、請求項38に記載の使用。
【請求項４１】
H19エンハンサーがプラスミドpH19EH19 (ATCC受託番号209322)にクローン化されたH19エンハンサーの配列を含んでなる、請求項38に記載の使用。
【請求項４２】
H19エンハンサーが配列番号3の配列を含んでなる、請求項38に記載の使用。
【請求項４３】
H19エンハンサーが配列番号4の配列を含んでなる、請求項38に記載の使用。
【請求項４４】
H19エンハンサーが配列番号5の配列を含んでなる、請求項38に記載の使用。
【請求項４５】
H19エンハンサーがウイルスの複製に必須のウイルス遺伝子の配列の3’側に配置される、請求項38に記載の使用。
【請求項４６】
癌が癌腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、胚芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、ラブドテリオサルコーマ(rhabdotheliosarcoma)、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、胃腸間質性腫瘍、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺の癌、頭部・頸部癌、子宮内膜の癌、および前記癌のいずれかの転移から選択される、請求項37に記載の使用。
【請求項４７】
条件複製ウイルスがアデノウイルスである、請求項37に記載の使用。
【請求項４８】
ウイルスの複製に必須の産物をコードする少なくとも1つの遺伝子が、アデノウイルスのE1a、E1b、E2a、およびE4遺伝子から選択される、請求項47に記載の使用。
【請求項４９】
製薬上許容される担体と、活性成分として、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス遺伝子の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターとを含有する、癌または過増殖性障害を治療するための医薬組成物。
【請求項５０】
H19調節配列がH19プロモーター、H19エンハンサー、転写調節活性を依然保持するH19プロモーターまたはH19エンハンサーの部分配列、およびこれらの任意の組合せから選択される、請求項49に記載の組成物。
【請求項５１】
H19プロモーターが配列番号1のヌクレオチド1〜830を含んでなる、請求項50に記載の組成物。
【請求項５２】
H19プロモーターが配列番号2の配列を含んでなる、請求項50に記載の組成物。
【請求項５３】
H19エンハンサーがプラスミドpH19EH19 (ATCC受託番号209322)にクローン化されたH19エンハンサーの配列を含んでなる、請求項50に記載の組成物。
【請求項５４】
H19エンハンサーが配列番号3の配列を含んでなる、請求項50に記載の組成物。
【請求項５５】
H19エンハンサーが配列番号4の配列を含んでなる、請求項50に記載の組成物。
【請求項５６】
H19エンハンサーが配列番号5の配列を含んでなる、請求項50に記載の組成物。
【請求項５７】
H19エンハンサーがウイルスの複製に必須のウイルス遺伝子の配列の3’側に配置される、請求項50に記載の組成物。
【請求項５８】
癌が癌腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、胚芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、ラブドテリオサルコーマ(rhabdotheliosarcoma)、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、胃腸間質性腫瘍、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺の癌、頭部・頸部癌、子宮内膜の癌、および前記癌のいずれかの転移から選択される、請求項49に記載の組成物。
【請求項５９】
条件複製ウイルスがアデノウイルスである、請求項49に記載の組成物。
【請求項６０】
ウイルスの複製に必須の産物をコードする少なくとも1つの遺伝子が、アデノウイルスのE1a、E1b、E2a、およびE4遺伝子から選択される、請求項49に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.  発明の分野
本発明は、腫瘍細胞生物学および癌治療の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、腫瘍細胞におけるウイルスベクターの選択的特異的発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
2.  発明の背景
2.1  H19遺伝子
H19遺伝子は、ヒトにインプリンティングされていることが知られている数少ない遺伝子の一つである(Hurstら, 1996, Nature Genetics 12:234-237)。H19は、胚形成のごく初期に両染色体の対立遺伝子から発現される(DeGrootら, 1994, Trophoblast 8:285-302)。その後間もなく、父性の対立遺伝子は沈黙(silencing)する一方で、母性遺伝性の対立遺伝子だけは転写される。
【０００３】
H19は胚形成時に豊富に発現され、トランス作用性遺伝子座rafによって、肝のαフェトプロテインにより協調的に調節される遺伝子として最初に同定されたものである(Pachnisら, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5523-5527)。さらにH19は、組織分化の間に発現される遺伝子を分離するためのスクリーニングを用いて、いくつかのグループにより独立にクローニングされてきた。例えば、Davisら（1987, Cell 51:987-1000）は、C3H10T1/2細胞の分化の初期に活動する遺伝子のスクリーニングにおいて、マウスH19ホモログを同定している。Pourierら（1991, Development 113:1105-1114）は、マウスH19が幹細胞の分化中および着床時に発現されることを見出した。ヒトH19の転写もまたヒト胎盤から細胞栄養芽層を分化する際に発見された(Rachmilewitzら, 1992, Molec. Reprod. Dev. 32:196-202)。
【０００４】
H19 RNAの転写は、胎児生命および胎盤の発達を通していくつかの異なる胚組織において生じるが、H19の発現は出生後にはダウンレギュレーションを受ける。しかしながら、成体マウス筋および肝では、相対的に低いレベルのH19転写が報告されている(Brunkow & Tilghman, 1991, Genes & Dev., 5:1092-1101)。H19はまた、癌細胞では出生後に活性化される。Arielら（1997, Molec. Pathol., 50:34-44）は、H19が出生前に発現される組織から生じるいくつかの腫瘍においてH19発現を実証した。さらに著者らは、H19発現と関連していることが知られていない神経組織由来の腫瘍、特に星状細胞腫および神経節芽細胞腫においてH19 RNAを見つけている。H19 RNAを発現する癌が数多く存在するので、著者らはH19が癌胎児性RNAではないかと考え、H19をヒト新生物の腫瘍マーカーとして研究することを提案した。
【０００５】
ヒトH19遺伝子もマウスH19遺伝子もクローニングされ、配列決定されている(Brannanら, 1990, Mol. Cell. Biol. 10:28-36)。ヒトとマウスのH19遺伝子を比較することによって、全ヌクレオチド配列の77％が同一であると判明した。種間においてこのヌクレオチド相同性が保存されているにも拘わらず、推定されるアミノ酸配列の同一性は、これら2つの遺伝子のオープンリーディングフレームから非常に低いと予想された（Brannan, 前掲）。さらに、H19 RNAはRNAポリメラーゼIIによって転写され、スプライシングされ、ポリアデニル化されるのであるが、H19 RNAが翻訳されている様子はない。その代わり、H19 RNAは、28S細胞質RNAと関連することが分かっており、H19 RNAはリボ核タンパク質のRNA成分として作用しているのではないかとの考えに至る（Brannan, 前掲）。
【０００６】
H19の実際の生理的な役割は十分に理解されているわけではない。H19は優性致死遺伝子として作用する可能性があり、誕生直前のマウスでは、H19トランスジーンが高度に異所性発現されると、死に至らしめる(Brunkowら, 前掲)。この致死期間はH19の転写が抑制されるようになる時期と一致する。他方、H19ノックアウト対立遺伝子をもつヘテロ(異型)接合またはホモ(同型)接合マウスのどちらでも、欠損はなんら観察されていない(Leightonら, 1995, Nature 375:34-39)。母性遺伝性の対立遺伝子のノックアウトは、遺伝的にリンクする逆にインプリンティングされたIGF-2遺伝子のインプリンティングを妨害し、その結果得られるマウスは、出生前のIGF-2発現増加により、誕生時にはその同腹仔よりも大きくなる（Leightonら, 前掲）。これら2つの逆にインプリンティングされた遺伝子はシス作用性の調節配列を共有しているため、Leightonらは、H19がIGF-2遺伝子のインプリンティングに関与しているのではないかと考えた。
【０００７】
H19遺伝子産物について提案されたもう一つの作用は、腫瘍抑制RNAの作用である。Haoら（1993, Nature 365:764-767）は、H19発現構築物による2つの胚芽腫細胞系（RDおよびG401）のトランスフェクションが、ヌードマウスにおいて、細胞増殖遅延、形態変化および腫瘍発生の減少をもたらしたと報告している。そのような腫瘍抑制作用は、マウスにおける異所性発現で見られた致死(Haoら, 前掲)ならびに、母性H19対立遺伝子をノックアウトさせたマウスのサイズが大きくなること(Leightonら, 前掲)と一致するものとして注目されている。しかしながら、H19が腫瘍抑制因子であるとの提案には賛否両論がある。これらの結果のうちあるものは再現性がなかったと報告されており、また、H19と密接に関連する他の腫瘍抑制遺伝子候補が存在するのかもしれない(Arielら, 前掲)。腫瘍抑制因子として提案されたH19の役割はまた、H19が広範な多数の腫瘍細胞において活性化されるという実験データとも抵触する(例えば、Lustig-Yarivら, 1997, Oncogene 23:169-177参照)。
【０００８】
2.2  条件複製ウイルス
一般的に、ウイルスは、ウイルスゲノムの複製、パッケージングおよび放出（すなわち、感染宿主細胞からの子孫ウイルスの産生）に必要な、あらゆる核酸およびペプチド因子をコードしている。条件複製ウイルスとは、ある特定の条件下でのみ複製することが可能なウイルスのことである。
【０００９】
条件複製にすることができるウイルスの一例はアデノウイルスである。アデノウイルスはエンベロープをもたない規則的な正二十面体である。タンパク質コート（キャプシド）は252個のキャプソメアから構成されており、そのうち240個がヘキソンで、12個がペントンである。アデノウイルスのポリペプチドの詳細な構造研究は、そのほとんどがアデノウイルス2型と5型を用いて行われてきた。ウイルスDNAは、アデノウイルス2型が23.85×106ダルトンであり、血清型に応じてサイズが若干変化する。DNAは逆方向末端反復配列を有し、これらの長さも血清型により変化する。
【００１０】
複製サイクルは初期(E)と後期(L)とに大別される。後期がウイルスDNAの複製開始を決定する。アデノウイルスの構造タンパク質は一般的に後期で合成される。アデノウイルス感染後、たいていの血清型に感染した細胞では宿主DNAとタンパク質の合成が阻害される。アデノウイルス2型とアデノウイルス5型の溶解サイクルは非常に効率的で、感染細胞あたりおよそ10,000個のビリオンをもたらし、これと共にビリオンに組み込まれていない過剰のウイルスタンパク質およびDNAも合成される。初期のアデノウイルス転写は相互に関連した生化学的イベントの一連の複雑な過程であるが、それは本質的にウイルスDNAの複製が開始される前のウイルスRNAの合成をもたらす。
【００１１】
アデノウイルスゲノムの構成はアデノウイルスの全てのグループで類似しており、一般に、研究された各血清型について特定の作用が同じ場所に位置づけられている。初期の細胞質メッセンジャーRNAは、ウイルスDNA上の4つの規定された不連続な領域と相補的である。これらの領域はE1からE4と呼ばれている。初期転写産物は、前初期(E1a)、後初期(E1b、E2a、E2b、E3およびE4)、中間(IVa2.1X)領域に分類されている。
【００１２】
E1a領域は、ウイルスおよび細胞の遺伝子の転写トランス活性化、ならびに他の配列の転写抑制に関与している。E1a遺伝子は、他の初期アデノウイルスメッセンジャーRNAの全てに対し重要な制御機能を発揮する。正常な組織では、E1b、E2a、E2b、E3またはE4領域を効率よく転写するために活性E1a産物が必要である。感染の後期に生じるウイルスイベントを正常に進行させるには、E1b領域が必要である。E1b産物は宿主の核内で作用する。E1b配列内に突然変異を生じさせると、後期mRNAの蓄積が減少し、同時にアデノウイルス感染の後期に通常観察される宿主細胞輸送の阻害が損なわれる。E1bは、プロセッシングと輸送がウイルス後期遺伝子産物に有利にシフトされるように、宿主細胞の作用を改変させるのに必要である。これらの産物はその後、ウイルスのパッケージングとウイルス粒子の放出をもたらす。E1bはアポトーシスを妨げる19kDのタンパク質を生成し、また、p53と結合する55kDのタンパク質も生成する。
【００１３】
2.3  腫瘍特異的遺伝子治療
腫瘍関連遺伝子からの調節配列は、腫瘍由来細胞において自殺細胞傷害性遺伝子の発現を選択的にターゲッティングするのに用いられてきた。例えば、αフェトプロテイン発現は肝細胞癌で誘導される。Huberら(1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043)は、アルブミン遺伝子またはαフェトプロテイン遺伝子由来の制御配列を用いて、水痘帯状疱疹チミジンキナーゼ(VZV TK)遺伝子のコード配列の発現を肝癌細胞にターゲッティングした。これらの発現構築物の1つを含むレトロウイルスベクターをin vitro感染させた肝癌細胞はVZV TKを発現し、通常は無毒性のプロドラッグである6-メトキシプリンアラビノヌクレオシド(araM)に対し感受性となった。Kanekoら(1995, Cancer Res. 55:5283-5287)は、αフェトプロテイン制御配列の制御下でHSV TKを発現するアデノウイルスベクターを構築した。このベクターを含有する組換えアデノウイルス粒子を、無胸腺マウスに発生させた肝細胞癌由来の腫瘍に直接注入した。次いでガンシクロビルを腹腔内注射すると、肝細胞癌由来の腫瘍の退縮が起こった。
【００１４】
Osakiら(1994, Cancer Res. 54:5258-5261)は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV TK)のコード配列に連結された肺癌胎児性抗原遺伝子の制御配列を含む発現構築物をA549肺癌細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞はガンシクロビルに対し感受性であった。さらに、皮下注射したトランスフェクト細胞からの腫瘍増殖は、ヌードマウスでは、ガンシクロビルを繰り返し腹腔内注射することにより阻止された。しかしながら、最近、癌胎児性抗原遺伝子は正常な結腸粘膜で発現すると報告されているので、腫瘍特異的調節領域としてのこれら制御配列の有用性には制限がある(Osakaら, 前掲)。
【００１５】
Hochbergらの米国特許第6,087,164号および第6,306,833号は、H19プロモーターを用いて、癌細胞において細胞傷害性および／または細胞増殖抑制性遺伝子産物の選択的な癌細胞特異的発現を誘導する方法を開示している。細胞傷害性遺伝子産物として、典型的には、毒素（ジフテリア毒素など）、アポトーシス誘導物質、薬物代謝酵素（チミジンキナーゼなど）、アンチセンス、リボザイム、および特定遺伝子の発現を阻害する一本鎖RNAがある。
【００１６】
Alemanyら(2000, Nature Biotechnology 18:723-727)は、癌を治療するための複製能のあるウイルスの遺伝子操作の進展について述べている。Hallenbechらの米国特許第5,998,205号は、組織特異的な転写調節エレメントの調節制御下にウイルスの複製に必須の遺伝子(E1a、E1b、E2およびE4など)を含む条件複製アデノウイルスベクターを開示している。このアデノウイルスベクターはそれぞれの組織に対して別のプロモーターを使用する必要があるので、発現させようとする各組織ごとにベクターをde novoで再構築しなければならない。
【００１７】
ウイルスベクターの腫瘍への投与はいくつかの方法で行うことができる。リポソームベクターは肺癌の治療のために全身的に投与されてきた(Rameshら, 2001, Molecular Therapy 3(3):337-350)。膀胱癌の治療には、腫瘍抑制遺伝子を含むアデノウイルスベクターが膀胱内に投与されてきた(Lance C. Pagliaro, 2000, World J. Uncol. 18:148-151)。膀胱癌に関するもう一つの研究はヘルペスベクターの静脈内投与を報告している(Oyamaら, 2000, Human Gene Therapy 11:1683-1693)。米国遺伝子治療学会の第4回ミーティングでは、遺伝子治療のためのいくつかの投与成功例が報じられ、例えば、結腸直腸腫瘍のためのアデノウイルスの動脈内投与(Abstract No. 871)、糖尿病患者での筋肉内送達(Abstract No. 205)、および全身的に送達されるIL-2ベースのプラスミドによる遺伝子治療などである(Molecular Therapy 3(5), 2001, Academic Press)。
【００１８】
このセクションまたは本出願の他のセクションでの文献の引用または確認は、そのような文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることを容認するものとして解釈されるべきでない。
【発明の開示】
【００１９】
3.  発明の概要
本発明は、癌細胞および／または過増殖性細胞において選択的に複製する能力があるが、癌または過増殖性細胞以外では本質的に複製する能力がない条件複製ウイルスベクターを提供する。かかるベクターは、H19転写調節配列、さらに特定すると、H19プロモーター、H19エンハンサー、転写調節活性を依然保持するH19プロモーターまたはH19エンハンサーの部分配列、またはこれらの任意の組合せに機能的に連結された核酸（その遺伝子産物がウイルスの複製にとって必須である）を含有する。この条件複製ウイルスの複製は、癌特異的活性化転写調節因子（これはH19調節配列と結合し、それゆえ、H19発現制御下でのウイルス複製に必須の産物をコードする核酸の発現を可能にする）の存在に依存する。本明細書中で用いるとき、ウイルス複製とは、ウイルスゲノムの複製、子孫ウイルス粒子の産生、および／または子孫ウイルス粒子の感染細胞からの放出を包含するものとして解される。
【００２０】
H19活性化転写因子は癌細胞内に存在するが、非癌細胞には本質的に存在しないため、ウイルス複製に必須の産物をコードする核酸は、癌細胞内で選択的に発現され、ウイルスの選択的複製、それゆえに癌細胞の増殖または成長の選択的阻害を招き、また、癌細胞の溶解をもたらす。ベクターで最初にトランスフェクトされた癌細胞から放出される子孫は、その後近隣の細胞に感染する可能性がある。その近隣細胞が癌性で、H19活性化転写因子を含む場合は、そのウイルスが再び複製して近隣細胞を阻止または死滅させるだろう。ウイルスが近隣癌細胞にさらに広がって、そこで複製すると、腫瘍破壊プロセスの「側方拡散」(lateral diffusion)が生じる。ウイルスで最初にトランスフェクトされていない癌細胞に対する破壊プロセスのこの側方拡散は、治療効率の向上をもたらす。本発明のベクター、ならびに癌細胞の増殖または成長を選択的に破壊または阻止するためのそれらの使用方法は、多種多様な癌および過増殖性状態の治療に有用である。
【００２１】
本発明において有用なH19調節配列としては、限定するものではないが、H19プロモーター、H19エンハンサー配列、これらの配列の転写的に活性な断片、およびこれらの配列の組合せが挙げられる。例えば、H19 (配列番号1〜5) プロモーターおよびエンハンサー配列については図1A〜1C、3、4、5A〜5Bおよび6A〜6Cを参照されたい。H19エンハンサーおよびその活性部分は、H19プロモーターまたは該プロモーターの活性部分と任意に組み合わせて使用することが可能である。また、そのようなベクターを含む宿主細胞も本発明に包含される。本発明のさらに他の態様は、本発明のベクターを投与することによる癌または過増殖性障害の治療である。
【００２２】
本発明によれば、ウイルスの複製に必須の産物をコードする1以上の核酸を使用することが可能である。2以上の必須核酸を使用する場合は、両核酸の発現を単一の異種調節配列の制御下に置いてもよいし、別々の異種調節配列の制御下に置いてもよい。異種調節配列は2つの同一のH19調節配列、2つの異なるH19調節配列、または1つのH19調節配列ともう1つの非H19調節配列であり得る。非H19調節配列は組織特異的プロモーター、または他の癌もしくは腫瘍特異的プロモーター、例えばテロメラーゼプロモーターとすることができる。
【００２３】
したがって、一態様によれば、本発明は、被験者における癌または過増殖性障害を治療する方法であって、かかる治療が必要な被験者に、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス核酸の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターを投与することを含んでなる方法に関する。
【００２４】
もう一つの態様によれば、本発明は、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス核酸の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターに関する。
【００２５】
さらに別の態様によれば、本発明は、癌細胞の増殖を抑制する方法であって、該細胞に、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス遺伝子の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている有効量の条件複製ウイルスベクターを接触させることを含んでなる方法に関する。
【００２６】
さらなる態様によれば、本発明は、癌治療用の医薬を製造するための、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス遺伝子の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターの使用に関する。
【００２７】
さらなる態様によれば、本発明は、製薬上許容される担体と、活性成分として、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス遺伝子の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターと、を含有する癌治療用の医薬組成物に関する。
【００２８】
3.1  定義
本明細書中で用いる「条件複製ウイルスまたはウイルスベクター」とは、ウイルスの複製に必須の産物が細胞において発現されるときだけ該細胞内で複製することができるウイルスまたはウイルスベクターをさす。一つの例として、ウイルスを次のような方法で遺伝子操作して条件複製ウイルスとすることが可能である。すなわち、複製に必須の産物をコードする遺伝子の天然の転写調節配列を不活性化する。該不活性化は、例えば、天然調節配列と異種調節配列との完全な置換により、天然調節配列の全体的なまたは部分的な欠失により、天然調節配列を不活性にする塩基の置換、挿入、逆位または欠失のような他の突然変異により達成することができる。複製能を回復させるためには、必須遺伝子産物を異種転写調節配列の発現制御下に置いて、ウイルスの複製がその異種転写調節配列の活性を条件とするようにする。
【００２９】
本明細書中で用いる「治療」とは、疾患や障害からの完全な回復のみを必ずしも意味するのではなく、症状の進行抑制、患者の状態の改善または好転、疾患または障害の症状の軽減のうち少なくとも1つをも意味するものである。癌または過増殖性障害の治療に関して、症状の進行抑制、患者の状態の改善または好転、癌または過増殖性障害の症状の軽減は、以下の少なくとも1つを伴うか、またはそれと関係している。すなわち、腫瘍サイズまたは腫瘍体積の縮小、腫瘍の増殖速度の減少、腫瘍サイズまたは体積の停滞、転移または二次腫瘍の数の減少、癌の侵襲（転移能）の低下、あるステージから次のステージへの腫瘍の進行速度の減少、あるいは癌または過増殖性障害により誘導される血管形成の減少である。
【００３０】
本明細書中で用いる「癌細胞の増殖の抑制」は、以下の少なくとも1つの減少または低下に関係する。すなわち、対照と比較したときの細胞数の減少（ネクローシス、アポトーシスまたは両者の組合せでありうる細胞死による）、細胞の増殖速度の低下（すなわち、細胞の総数は増加しうるが、対照の未処理細胞の増加よりも低いレベルまたは遅い速度で増加する）、たとえ細胞の総数が表現型を変化させていなくとも、対照と比較したときの周囲の環境への細胞の侵襲の低下（例えば、軟寒天アッセイで測定）、ならびに、未分化の癌細胞のより分化した表現型への発達進行である。
【００３１】
本明細書に記載した本発明の目的において、「機能的に連結された」なる語は、ヌクレオチド配列の発現を調節配列により指令させるように、ヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを意味する。
【００３２】
本明細書中で用いる「遺伝子産物」とは、核酸によってコードされ得るあらゆる分子をさし、限定するものではないが、タンパク質または他の核酸、例えば、DNA、RNA、dsRNAi、リボザイム、DNアーゼなどが含まれる。ウイルスの複製に必須の遺伝子産物は、ウイルスゲノムに固有の産物であって、それ無しにはウイルスが複製できない産物である。以下の説明では、そのような遺伝子産物が「必須の遺伝子産物」をさすこともある。
【００３３】
本明細書中で用いる「発現」とは、対象とするヌクレオチドコード配列の転写、ならびに、該転写産物のスプライシング、プロセッシング、安定化、場合により翻訳を意味する。ベクターの構成に応じて、発現は一過性または継続的でありうる。
【００３４】
本明細書中で用いる「ウイルスの複製」とは、ウイルスゲノムの複製、子孫ウイルス粒子の形成、および／または感染細胞からの子孫ウイルス粒子の放出を含むものである。
【００３５】
3.2  発明の目的
本発明の一つの目的は、被験者における癌または過増殖性障害を治療する方法を提供することであり、この方法は、かかる治療が必要な被験者に、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス核酸の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターを投与することを含んでなる。本発明のもう一つの目的は、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス核酸の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターを提供することである。本発明のさらに他の目的は、癌細胞の増殖を抑制する方法を提供することであり、この方法は、該細胞に、ウイルスの複製に必須の産物をコードするウイルス核酸の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている有効量の条件複製ウイルスベクターを接触させることを含んでなる。
【００３６】
本発明の別の目的は、癌または過増殖性障害の治療用の医薬を製造するための、ウイルスの複製に必須な産物をコードするウイルス核酸の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターの使用を提供することである。本発明のさらに別の目的は、製薬上許容される担体と、活性成分として、ウイルスの複製に必須な産物をコードするウイルス遺伝子の少なくとも1つがH19調節配列と機能的に連結されている条件複製ウイルスベクターと、を含有する癌または過増殖性障害の治療用の医薬組成物を提供することである。
【００３７】
本発明は、以下の詳細な説明、具体的な実施形態の実施例、および添付の図面を参照することにより一層理解しやすくなるであろう。
【００３８】
4.  図面の簡単な説明
図1A〜1C：  ヒトH19プロモーター領域のヌクレオチド配列。（転写開始の位置に対して）ヌクレオチド位置-837から-7までのプロモーター領域が示されている（配列番号1)。
【００３９】
図２：  E1遺伝子産物をH19調節配列の制御下で発現させるために用いられる条件複製ウイルスベクターの構築の概略図。H19調節配列と機能的に連結された遺伝子産物（例えば、アデノウイルスE1a）を、まずシャトルベクターにクローニングする。得られたプラスミドを線状化し、続いて細菌細胞（例えば、大腸菌）にウイルス骨格プラスミドと共に同時形質転換する。組換え体を抗生物質耐性により選択し、制限エンドヌクレアーゼ分析で組換えを確認する。線状化した組換えプラスミドを、ウイルスのパッケージングに適した細胞系にトランスフェクトすると、典型的には、7〜12日以内に組換えウイルスが生成される。この特定の図面では、ウイルスベクターがアデノウイルスである。「左アーム」と「右アーム」は、シャトルベクターとウイルス骨格との間の相同的組換えを媒介する領域を表している。Bm: BamHI; RI: EcoRI; LITR: 左手ITRおよびパッケージングシグナル; RITR: 右手ITR; Sp: SpeI。
【００４０】
図３：  ヒトH19プロモーター断片のヌクレオチド配列（配列番号2）。
【００４１】
図４：  0.9kbのH19エンハンサー断片のヌクレオチド配列（配列番号3）。
【００４２】
図5Aおよび5B：  2kbのH19エンハンサー断片のヌクレオチド配列（配列番号4）。
【００４３】
図6A〜6C：  4kbのH19エンハンサー断片のヌクレオチド配列（配列番号5）。
【００４４】
図７：  アデノウイルス5のE1a (配列番号6、7)、E1b (配列番号8)、E2a (配列番号9) および E4 (配列番号10)遺伝子産物のコード化ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列。
【００４５】
図８：  アデノウイルス2のヌクレオチド配列（配列番号11）。
【００４６】
図９：  アデノウイルス2のE1a (配列番号12)、E1b (配列番号13)、E2a (配列番号14) および E4 (配列番号15)遺伝子産物のアミノ酸配列。
【００４７】
図10：  ヒトパピローマウイルス1aのE6 (配列番号16、17) および E7 (配列番号18、19)遺伝子産物のコード化ヌクレオチドおよびアミノ酸配列。
【００４８】
図11：  サイトメガロウイルス前初期領域転写産物のヌクレオチド配列（配列番号20）。
【００４９】
図12：  シミアンウイルス40のラージT抗原のアミノ酸配列（配列番号21）。
【００５０】
5.  発明の詳細な説明
本発明は、一部には、大多数の腫瘍細胞で活性化されるが、非腫瘍細胞では本質的に活性化されないH19プロモーターを用いて、腫瘍細胞における溶解性ウイルスの複製を選択的に引き起こし、したがって、癌細胞を選択的に死滅させたり、その増殖を抑制したりすることが可能である、という認識に基づくものである。特に、H19転写調節エレメントはさまざまな癌腫において活性化されることが見出されており、かかる癌腫としては、限定するものではないが、膀胱癌、肝細胞癌、胚芽腫、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、乳癌、頭部および頸部の扁平上皮細胞癌、食道癌、甲状腺癌、神経膠星状細胞腫、神経節芽細胞腫、および神経芽細胞腫が含まれる。
【００５１】
したがって、本発明の一実施形態においては、癌性細胞（好ましくは、被験者の体内に存在する癌細胞）の増殖を選択的に死滅させるかまたは抑制するための方法および組成物が提供される。この目的は、必須遺伝子産物がH19調節エレメントの発現制御下で発現されるときに複製しうる条件複製ウイルスベクターからなるベクターを、細胞に送達することにより達成される。ウイルスの複製は、必須遺伝子産物が発現されるときに生じて、癌宿主細胞の死を引き起こすか、最低でも、癌宿主細胞の増殖を抑制する。複製されたウイルス（子孫ウイルス）は死滅細胞または感染細胞の近辺に放出され、他の近隣細胞に感染して、そこで再度選択的に複製し、それゆえ、その近隣癌細胞を選択的に死滅させたり、その増殖を抑制したりすることができる。この「拡散」現象は腫瘍の破壊を助けることになる。本発明においては、H19調節配列の腫瘍特異的活性化によりウイルスが複製するようになり、ひいては、少なくとも癌性細胞の増殖抑制をもたらす。
【００５２】
H19調節配列としては、限定するものではないが、H19プロモーターの完全配列、H19エンハンサー、依然として転写調節活性を保持するH19プロモーターまたはH19エンハンサーの部分配列、およびこれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、H19プロモーターおよびエンハンサー配列に関しては、図1、3、4、5A〜5Bおよび6A〜6C(配列番号1〜6)を参照されたい。
【００５３】
ウイルスおよび適当な必須遺伝子産物（その発現がH19調節配列の制御下に置かれる）の具体的な例は以下に与えられる。
【００５４】
本発明に従うと、ウイルス複製に必須の産物をコードする核酸を1つ以上使用することが可能である。2つ以上の必須核酸（例えば、アデノウイルスのE1aとE1b）を使用する場合は、両者の発現を単一の異種調節配列の制御下に置いてもよいし、別々の異種調節配列の制御下に置いてもよい。異種調節配列は2つの同一のH19調節配列、2つの異なるH19調節配列、または1つのH19調節配列ともう1つの非H19調節配列であり得る。非H19調節配列は組織特異的プロモーター、または他の癌もしくは腫瘍特異的プロモーター、例えばテロメラーゼプロモーターとすることができる。
【００５５】
5.1  H19遺伝子の調節配列
本明細書には、条件複製ウイルスの複製に必要とされる産物をコードする核酸の腫瘍細胞特異的発現を指令するために使用できるH19調節配列が記載される。これらのH19調節配列には、上流のH19プロモーター領域および／または下流のH19エンハンサー領域が含まれる。1つのH19プロモーター領域のヌクレオチド配列を図１A〜１C(配列番号１)に示す。この830ヌクレオチド配列は（Brannanら、前掲に記載されるように）キャップ部位から-837〜-7位のヌクレオチドにわたっている。共通TATA配列がヌクレオチド-27〜-35に存在する。2つの共通AP2結合部位(8/9一致)は、転写開始部位から約-500〜-40ヌクレオチド上流に見出される。必須遺伝子産物のコード領域の上流に配置した場合は、内在性H19を発現する癌細胞における機能的に連結された核酸の発現を指令するのに、約830塩基対の該調節領域で十分である。さらに、ヌクレオチド-819〜+14のもう一つのH19プロモーター領域(図3、配列番号2)もまた、癌細胞における機能的に連結された異種核酸（例えば、ウイルスの複製に必要な産物をコードする核酸）の発現を指令するのに十分である。上記において、完全なH19プロモーター配列の部分配列（すなわち、断片）がH19調節活性にとって十分であり、完全なプロモーター配列を使用する必要がないことは明白である。
【００５６】
腫瘍細胞特異的発現のレベルを増加させるために、ヒトH19遺伝子の下流エンハンサー領域をH19プロモーター／必須遺伝子産物構築物に追加してもよい。以下に詳しく説明され、また、セクション6の実施例によって例示されるように、下流エンハンサー領域は転写開始部位からみて+6kb〜+11kbにわたるSacI制限断片に包含される。エンハンサー配列から予想されるように、下流エンハンサーは、H19プロモーターの制御下にある異種核酸のコード領域から下流に(内在性H19遺伝子中のH19エンハンサーの方向に対して)逆方向か直接方向のいずれかに置かれた場合、その効果を発揮することができる。さらに、図4、5A〜5Bおよび6A〜6Cに示す配列(配列番号3〜5)を含むこのエンハンサーの断片を使用して核酸発現を促進させることもできる。
【００５７】
癌細胞において活性なこれらのH19調節配列は、所望の腫瘍特異的発現を得るのに必要な最小調節配列を規定して、特異的転写調節活性を依然保持するH19調節エレメントの最小部分配列を見つけるために、さらに画定することができる。例えば、プロモーター領域を付加、置換または欠失により改変して、腫瘍特異的発現作用の保持についてアッセイする。H19下流エンハンサーの種々の部分を、H19プロモーターからの転写を高める能力について個々に試験してもよい。
【００５８】
調節配列の改変は、当業者に周知のさまざまな化学的および酵素的方法を使用して達成することができる。例えば、制限酵素部位により限定される配列の領域を欠失させることができる。オリゴヌクレオチド指令突然変異誘発を利用して、決められた方式で該配列を改変したり、かつ／または配列内の特定の領域に制限酵素部位を導入したりすることができる。さらに、Bal31またはExoIIIおよびS1ヌクレアーゼなどのDNAヌクレアーゼを用いて欠失突然変異体を作製してもよい。調節配列の次第に大きな欠失体を得るには、期間を延長させて該DNAをヌクレアーゼと共にインキュベートする(突然変異誘発技術については、Ausubelら、1989 Current Protocols for Molecular Biologyを参照されたい)。
【００５９】
改変された配列は、癌細胞(例えば、H19を発現している癌腫由来の細胞、具体例として膀胱癌)におけるウイルス複製に必須の産物をコードする配列の腫瘍特異的発現を指令するその能力について評価する。腫瘍特異的発現を指令する能力を保持する改変されたH19調節配列はどれも、さらなる使用のために組換えベクターに組み込むことができ、これも本発明の範囲内である。
【００６０】
本明細書中で用いる腫瘍特異的または腫瘍選択的複製とは、癌細胞内でのウイルス複製が対応する非癌性細胞で起こっている該複製の少なくとも2倍であることを意味する。より好ましくは、癌細胞内での複製が対応する非癌性細胞で起こっている複製の少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、少なくとも5000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも50,000倍、または少なくとも100,000倍である。選択的複製のレベルは当業者に周知の方法を用いて測定することができる。一つの例は以下の数式を使用することである：
腫瘍細胞での条件複製ウイルスの放出量  ×  正常細胞での野生型の放出量
正常細胞での条件複製ウイルスの放出量      腫瘍細胞での野生型の放出量
Alemanyら, 2000, Nature Biotechnology 18:723-727。
【００６１】
5.2  条件複製ウイルスベクターおよび必須遺伝子産物
本発明は、癌および／または過増殖性細胞で選択的に複製する能力があるが、癌および／または過増殖性細胞以外では本質的に複製する能力がない条件複製ウイルスベクターを提供する。このベクターはH19転写調節配列と機能的に連結された核酸を含有し、該核酸の産物はウイルス複製に必須のものである。
【００６２】
ウイルスおよび適当な必須遺伝子産物（その発現がH19調節配列の制御下に置かれる）の例としては、DNA腫瘍ウイルスとRNA腫瘍ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。DNA腫瘍ウイルスの例は、一般的に、アデノウイルス、パピローマウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン-バーウイルス、帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス）、パポバウイルス（例えば、ポリオーマおよびSV40）、ならびに肝炎ウイルスであるが、これらに限定されない。他の実施形態では、ウイルスベクターがRNAウイルスベクター、好ましくは、レトロウイルスベクターである。当業者には明らかであろうが、複製能のあるウイルスベクターはどれも、本明細書に開示する方法に従って条件複製とすることができ、本発明に従って使用される。
【００６３】
好ましい実施形態において、条件複製ウイルスはアデノウイルスである。アデノウイルスのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は当技術分野で知られており、例えば、GenBankから入手可能である。例えば、アデノウイルス2の全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、GenBank登録番号J01917で見出せる。また、アデノウイルス2のヌクレオチド配列（配列番号11）を示す図8を参照されたい。アデノウイルス5の全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Chroboczekら, 1992, Virology 186(1):280-285に見出せる。アデノウイルスの必須遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、E1a、E1b、E2aおよびE4が挙げられる。これらの遺伝子産物のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は図7、8および9（配列番号6〜15）に示される。
【００６４】
さらに、条件複製アデノウイルスを遺伝子工学的に作製するための方法は当技術分野で一般的に知られており、周知の分子生物学クローニング技術を使用する。例えば、アデノウイルスベクターは、E1a、E1b、E2aまたはE4のいずれか1つまたはそれ以上の発現を制御している調節配列を、本明細書に記載のH19調節配列と置き換えることにより作製できる。図2は、E1aのヌクレオチドコード配列と機能的に連結されたH19調節配列を含む核酸の挿入を示す概略図である。この特定の実施形態では、アデノウイルスベクターが天然のE1a領域に欠失を有し、その結果、該ベクターを細胞に導入してもウイルスの複製は起こらない。H19調節配列と機能的に連結されたE1aのコード配列を、シャトルベクター（例えば、pAdTrack-CMV）にクローニングする。このシャトルベクターを線状化し、これをアデノウイルス骨格プラスミド（例えば、pAdEasy-1）と共に同時トランスフェクトする。このプラスミドは必須遺伝子産物（この実施形態では、E1a）のコード配列を含まない。組換え体を適当な抗生物質耐性について選択し、制限酵素分析により組換えを確認する。この組換えプラスミドをアデノウイルスパッケージング細胞系にトランスフェクトすると、一般的には7〜12日でウイルス子孫が産生される。ベクターpAdTrack-CMVおよびpAdEasy-1は、カリフォルニア州LaJollaのStratagene社から販売されている。
【００６５】
もう一つの実施形態では、条件複製ウイルスがヒトパピローマウイルスである。パピローマウイルスのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は当技術分野で知られており、例えば、GenBankから入手可能である。例えば、ヒトパピローマウイルス1a型の全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、GenBank登録番号NC_001356のもとに見出せる。パピローマウイルスの必須遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、E6およびE7領域の遺伝子産物が挙げられる。これらの遺伝子産物のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図10（配列番号16〜19）に示してある。
【００６６】
さらに、条件複製パピローマウイルスを遺伝子工学的に作製するための方法は当技術分野で一般的に知られており、周知の分子生物学クローニング技術を使用する。例えば、パピローマウイルスベクターは、E6またはE7のいずれかの発現を制御している調節配列を、本明細書に記載のH19調節配列と置き換えることにより作製できる。図2に示した概略図と同様に、パピローマウイルスベクターが天然のE6領域に欠失を有し、その結果、該ベクターを細胞に導入してもウイルスの複製は起こらない。H19調節配列と機能的に連結されたE6のコード配列を、シャトルベクターにクローニングする。このシャトルベクターを線状化し、これをパピローマウイルス骨格プラスミドと共に同時トランスフェクトする。このプラスミドは必須遺伝子産物（この実施形態では、E6）のコード配列を含まない。組換え体を適当な抗生物質耐性について選択し、制限酵素分析により組換えを確認する。この組換えプラスミドを適当な細胞系（すなわち、H19調節配列が活動する細胞系）にトランスフェクトすると、ウイルス子孫が産生される。
【００６７】
別の実施形態では、条件複製ウイルスがサイトメガロウイルス(CMV)である。サイトメガロウイルスのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は当技術分野で知られており、例えば、GenBankから入手可能である。例えば、サイトメガロウイルスの全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、GenBank登録番号X17403のもとに見出せる。サイトメガロウイルスの必須遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、前初期領域の遺伝子産物が挙げられる。前初期領域のヌクレオチド配列は図11（配列番号20）に示してある。
【００６８】
さらに、条件複製サイトメガロウイルスを遺伝子工学的に作製するための方法は当技術分野で一般的に知られており、周知の分子生物学クローニング技術を使用する。例えば、サイトメガロウイルスベクターは、前初期領域の遺伝子のいずれかの発現を制御している調節配列を、本明細書に記載のH19調節配列と置き換えることにより作製できる。図2に示した概略図と同様に、サイトメガロウイルスベクターが天然の前初期領域に欠失を有しており、その結果、該ベクターを細胞に導入してもウイルスの複製は起こらない。H19調節配列と機能的に連結された前初期コード配列をシャトルベクターにクローニングする。このシャトルベクターを線状化し、サイトメガロウイルス骨格プラスミド（このプラスミドは前初期領域を含まない）と共に同時トランスフェクトする。組換え体を適当な抗生物質耐性について選択し、制限酵素分析により組換えを確認する。この組換えプラスミドを適当な細胞系（すなわち、H19調節配列が活動する細胞系）にトランスフェクトすると、ウイルス子孫が産生される。
【００６９】
条件複製ウイルスの他の例には、限定するものではないが、他のDNA腫瘍ウイルスとRNA腫瘍ウイルスが含まれる。DNA腫瘍ウイルスの例は、一般的に、ヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン-バーウイルス、帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス）、パポバウイルス（例えば、ポリオーマおよびSV40）、ならびに肝炎ウイルスであるが、これらに限定されない。他の実施形態では、ウイルスベクターがRNAウイルスベクター、好ましくは、レトロウイルスベクターである。当業者には明らかであろうが、複製能のあるウイルスベクターはどれも、本明細書に開示する方法に従って条件複製とすることができ、本発明に従って使用される。
【００７０】
これらの例示したウイルスのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、GenBankから入手可能である。例えば、A型、B型およびC型肝炎ウイルスの全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれGenBank登録番号NC_001489、NC_003977およびNC_004102のもとに見出せる。ヒトヘルペスウイルス1、2、3、4、5、6、6Bおよび7の全ゲノムのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれGenBank登録番号NC_001806、NC_001798、NC_001348、NC_001345、NC_001347、NC_001664、NC_000898およびNC_001716で見出せる。エプスタイン-バーウイルスの全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、GenBank登録番号V01555で見出せる。BKポリオーマウイルスの全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、GenBank登録番号NC_001538で見出せる。ポリオーマウイルスの全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、GenBank登録番号NC_001515で見出せる。シミアンウイルス40の全ゲノムからのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、GenBank登録番号NC_001669で見出せる。前述のGenBankエントリーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、参照によりその全体をそのまま本明細書に組み入れるものとする。
【００７１】
適切なウイルス核酸の例は、ウイルスベクターまたはウイルスの複製に必須の産物をコードしているものである。そのような遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、パポバウイルスのT抗原（図12、配列番号21）、レトロウイルスのポリメラーゼなどが挙げられる。本質的に、これらにはウイルスの生活環にとって必要なあらゆる遺伝子が含まれる。
【００７２】
本発明に従うと、ウイルス複製に必須の産物をコードする核酸を1つ以上使用することが可能である。2つ以上の必須核酸を使用する場合は、両者の発現を単一の異種調節配列の制御下に置いてもよいし、別々の異種調節配列の制御下に置いてもよい。異種調節配列は2つの同一のH19調節配列、2つの異なるH19調節配列、または1つのH19調節配列ともう1つの非H19調節配列であり得る。非H19調節配列は組織特異的プロモーター、または他の癌もしくは腫瘍特異的プロモーター、例えばテロメラーゼプロモーターとすることができる。
【００７３】
本発明によれば、ウイルスそれ自体の複製は癌細胞の増殖を選択的に阻害したり癌細胞を破壊するのに十分なものであるが、往々にして、ウイルスベクター中に細胞傷害性または細胞増殖抑制性の産物をコードする核酸を含めることによって破壊プロセスを増強することが望ましい。こうして、別の実施形態では、細胞傷害性または細胞増殖抑制性の産物をコードする核酸を、必須遺伝子産物をコードする核酸と共に、単一のH19調節配列の制御下に置くことができる。別の実施形態によれば、必須遺伝子産物をコードする核酸と細胞傷害性または細胞増殖抑制性産物をコードする核酸とが、別々に異種転写調節配列の発現制御下に置かれる。異種転写調節配列は2つの同一のH19調節配列、2つの異なるH19調節配列であってよく、あるいは、必須遺伝子産物をコードする核酸がH19調節配列の発現制御下に置かれ、細胞傷害性または細胞増殖抑制性の遺伝子産物をコードする核酸が非H19調節配列の発現制御下に置かれてもよい。非H19調節配列は別の組織特異的プロモーターからの異種配列、または、例えばテロメラーゼプロモーターのような他の癌もしくは腫瘍特異的プロモーターからの異種配列とすることができる。あるいは、プロモーターは必須遺伝子産物が発現された後だけ活性となるウイルスプロモーターであってもよい。
【００７４】
細胞傷害性の遺伝子産物は、広義には、毒素とアポトーシス誘導物質の両方を含むと定義される。さらに、本発明においては、プロドラッグを細胞傷害性産物に変換する薬物代謝酵素も細胞傷害性遺伝子産物に含まれる。本発明の方法で使用することのできる細胞傷害性遺伝子産物の例としては、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、リシン、コレラ毒素、PE40、および腫瘍抑制遺伝子産物、例えば網膜芽細胞腫遺伝子産物およびp53が挙げられる。さらには、細胞のアポトーシスを誘発するアポトーシス性ペプチドをコードする配列を使用することもできる。かかるアポトーシス性ペプチドには、アルツハイマーA βペプチド(LaFerlaら、1995, Nat. Genet. 9：21-30参照)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(Wuら、1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866参照)、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(Sakutaら、1996，J. Neuroimmnol. 67:103-109参照)、ならびに既知のまたはこれから発見される他のアポトーシス性ペプチドが含まれる。
【００７５】
プロドラッグを細胞傷害性産物に変換する薬物代謝酵素には、チミジンキナーゼ(単純ヘルペスウイルスまたは水痘-帯状疱疹ウイルス由来)、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、シトクロムp-450 2B1、チミジンホスホリラーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、アルカリホスファターゼ、カルボキシペプチダーゼAおよびG2、リナマラーゼ、β-ラクタマーゼおよびキサンチンオキシダーゼが含まれる(背景については、RiggおよびSikora、August 1997, Mol. Med. Today, pp.359-366を参照されたい)。
【００７６】
さらに、アンチセンス、アンチジーン、またはアプタマー(aptameric)オリゴヌクレオチドを本明細書に記載した発現構築物を用いて癌細胞に送達してもよい。また、リボザイムまたは一本鎖RNAを癌細胞で発現させて、対象とする特定の遺伝子の発現を阻止することもできる。これらのアンチセンスまたはリボザイム分子の標的遺伝子は、細胞の維持または癌性細胞表現型の維持に必須の遺伝子産物をコードするものであるべきである。かかる標的遺伝子には、限定するものではないが、cdk2、cdk8、cdk21、cdc25A、サイクリンD1、サイクリンE、サイクリンAおよびcdk4が含まれる。
【００７７】
例えば、癌細胞中でH19調節配列の制御下に、p53、c-fos、c-jun、Kr-rasおよび／またはHer2／neuのオンコジーン形態の転写産物に特異的なアンチセンスRNAまたはリボザイムを発現するベクターを細胞に導入して、内在性遺伝子の発現をダウンレギュレーションする。H19を発現し、かつH19調節配列を活性化しうる腫瘍細胞は、特に、アンチセンスRNAまたはリボザイムRNAの発現のための標的とすることができる。
【００７８】
アンチセンスのアプローチには、標的mRNAに相補的なオリゴヌクレオチド(この場合はmRNA)の設計が必要である。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的mRNA転写産物に結合して、翻訳を妨げる。完全な相補性が好ましいが、必要というわけではない。本明細書中で使用する場合、RNAの一部分に「相補的な」配列とは、そのRNAとハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに十分な相補性を有する配列をさす。ハイブリダイズする能力は相補性の程度とアンチセンス核酸の長さの両方に左右されるだろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長ければ長いほど、その核酸はRNAとの塩基ミスマッチを多く含むことができ、しかもなお、安定な二本鎖(または場合によっては三本鎖)を形成することができる。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融解点を測定するための標準的な手法を用いて、耐えられるミスマッチの程度を確認することができる。
【００７９】
標的メッセージの5'末端に相補的なオリゴヌクレオチド(例えば、AUG開始コドン(該コドンを含む)までの5'非翻訳配列)は、翻訳を阻止するのに最も効果的に作用するはずである。しかしながら、mRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列も同様にmRNAの翻訳を阻止するのに効果的であることが最近示された。概要については、Wagner, 1994, Nature 372:333-335を参照されたい。従って、標的遺伝子転写産物の5'または3'側のいずれかの非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドをアンチセンス法に使用して、内在性遺伝子の翻訳を阻止することができるであろう。mRNAの5'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドはAUG開始コドンの相補体を含むべきである。mRNAのコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、あまり効果的でない翻訳インヒビターであるが、本発明に従って使用することができる。標的mRNAの5'、3'またはコード領域のいずれにハイブリダイズするように設計されていても、アンチセンス核酸は少なくとも6ヌクレオチド長を有し、好ましくは6〜約50ヌクレオチド長にわたるオリゴヌクレオチドである。特定の態様においては、オリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも17ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチドまたは少なくとも50ヌクレオチドからなる。
【００８０】
標的配列の選択にかかわらず、最初に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を阻止する能力について定量するためのin vitro実験を行うことが好ましい。これらの実験は、アンチセンス遺伝子阻止とオリゴヌクレオチドの非特異的な生物学的効果とを区別する対照を利用すべきである。また、これらの実験は標的RNAまたはタンパク質のレベルを内部対照RNAまたはタンパク質のレベルと比較することも好ましい。
【００８１】
また、必須標的遺伝子を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子を使用して、標的mRNAの翻訳を阻止することができる(例えば、PCT国際公開WO90/11364号、1990年10月4日公開；Sarverら、1990, Science 247:1222-1225を参照されたい)。リボザイムが癌細胞の増殖に必須のタンパク質をコードする遺伝子転写産物に特異的である場合は、かかるリボザイムが癌性細胞の表現型を逆転させることがある。mRNAを特定の認識配列部位で切断するリボザイムを使用して標的mRNAを破壊することができるけれども、ハンマーヘッド型のリボザイムを使用することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと相補的な塩基対を形成するフランキング領域により指定された位置でmRNAを切断する。唯一の必要条件は、標的mRNAが次の2個の塩基からなる配列：5'-UG-3'をもつことのみである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築および製造は当業者に周知であり、HaseloffおよびGerlach, 1988, Nature, 334:585-591に詳しく記載されている。好ましくは、リボザイムは、その切断認識部位を標的mRNAの5'末端付近に位置づけるように、すなわち、効率を高めかつ非機能性mRNA転写産物の細胞内蓄積を最少にするように、遺伝子操作される。
【００８２】
また、本発明で使用するリボザイムには、テトラヒメナ(Tetrahymena thermophilia)中に天然に存在するもの(IVSまたはL-19 IVS RNAとして知られる)、ならびにThomas Cechとその共同研究者らにより広範囲に記載されたもの(Zaugら、1984, Science, 224:574-578； ZaugおよびCech, 1986, Science, 231:470-475； Zaugら、1986, Nature, 324:429-433; 国際特許出願WO88／04300号； BeenおよびCech, 1986, Cell, 47:207-216)など、RNAエンドリボヌクレアーゼ(本明細書中では以後「Cech型リボザイム」と称する)が含まれる。このCech型リボザイムは標的RNA配列にハイブリダイズする8塩基対の活性部位を有する（その後そこで標的RNAの切断が起こる）。本発明は、標的遺伝子に存在する8塩基対の活性部位配列を標的とするCech型リボザイムの使用を包含する。
【００８３】
もう一つの別の実施形態において、条件複製ウイルスベクターはまた、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質などのマーカー遺伝子のコード配列を含みうる。こうした構築物は、その構築物の分布、位置確認および安定性を調べるための、かつ／また、最適な投与様式および／またはベクターを用いた治療計画の決定を手助けするための、研究またはin vivo試験において使用することができる。
【００８４】
5.3  腫瘍細胞における遺伝子産物のH19依存的発現
内在性H19遺伝子産物を活発に発現する細胞はまた、必須遺伝子産物の発現を特異的に活性化することができ、それゆえ条件複製ウイルスベクターの複製をもたらすことができる。そのような細胞、特に腫瘍（癌、癌性）および／または過増殖性細胞、は本発明の方法の適切な標的となる。腫瘍細胞系と非腫瘍細胞系の両方におけるH19依存的な特異的発現は、RNA分析、in situハイブリダイゼーション、またはレポーター遺伝子検出を用いて測定することができる。
【００８５】
ほとんどのRNA分析の応用例においては、対象となる核酸の転写産物と特異的にハイブリダイズする標識プローブを、当業者に周知の多数の手法を用いて調製する。標識プローブは、所望のヌクレオチド配列に相補的な少なくとも15〜30塩基を含んでいてよく、より好ましくは転写産物に相補的な少なくとも50〜150塩基を含む。特定の実施形態において、H19発現に対して特に好ましいハイブリダイゼーションプローブは、ポリA部位の約800塩基対上流から該ポリA部位までのH19メッセージの3'末端に相補的なポリヌクレオチドである。
【００８６】
実施例により以下に例示される本発明の特定の実施形態においては、標識アンチセンスRNAプローブを、T7またはT3発現プラスミドを用いてin vitroで作製する。H19プローブは、例えばPrime-Itキット(Stratagene, La Jolla, CA；カタログ番号300392)を用いて、標識ヌクレオチドの存在下でのランダムプライミングによって標識することもできる。あるいはまた、H19コード領域のcDNAクローンおよび該コード領域を増幅するよう設計したプライマーを用いたPCR反応により、または標準的なニックトランスレーション反応により、標識プローブを作製することができる。
【００８７】
ポリヌクレオチドプローブに適した標識としては、1以上の放射性同位体(35S、32Pなど)を組み入れたヌクレオチド、蛍光、発光および着色タグ、および酵素成分が挙げられる。
【００８８】
標識プローブは、実施例により以下で説明されるように、また米国特許第5,955,273号(参照により本明細書に組み入れる)に記載されるような、標準的な手法によりin situで細胞または組織サンプルにハイブリダイズさせる。あるいは、適切な細胞が十分な量で得られる場合は、標準的なRNA分析(ノーザン分析、RNアーゼプロテクション、またはプライマー伸長など)を実施して対象の遺伝子のmRNAの発現レベルを測定することができる。
【００８９】
さらに、そうした遺伝子発現アッセイを「in situ」で、すなわち、生検および切除から得られた患者組織の組織切片(固定および／または凍結されたもの)上で直接、実施することが可能であり、そのため核酸の精製は必要でない。上記したような核酸試薬を、そうしたin situ手法のためのプローブおよび／またはプライマーとして使用することができる(例えば、Nuovo, 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", Raven Press, NYを参照されたい)。
【００９０】
細胞型または腫瘍が条件複製ウイルスベクター（H19調節配列と機能的に連結された、ウイルス複製に必須の産物をコードする核酸を含む）を特異的に活性化することができるかどうかを調べる代替法は、そのような条件複製ベクターを実際に細胞にトランスフェクトすることである。これらの目的のために、該ウイルスベクターにマーカー産物をコードする核酸（例えば、ルシフェラーゼ）を、適当な細胞を同定することを目的として、導入することが可能である。マーカー遺伝子産物に対する陽性のアッセイ結果は、その細胞または細胞系が該調節領域からの発現を活性化する能力があることを明らかにするものである。
【００９１】
5.4  使用方法および医薬組成物
本発明はまた、条件複製ウイルスベクター（H19調節配列と機能的に連結された、ウイルス複製に必須の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む）でトランスフェクトされた宿主細胞に関する。そのような宿主細胞は培養下で維持することができ、また、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト、の一部でありうる。かかるベクターは以下のセクション6で詳述する技法を用いて作製することができる。
【００９２】
5.4.1  培養細胞
条件複製ウイルスベクターでトランスフェクトされる宿主細胞は、どのような原核細胞または真核細胞であってもよい。真核（酵母、鳥類、昆虫、もしくは哺乳動物の細胞）または原核（細菌細胞）のいずれかの宿主細胞への該ベクターのトランスフェクションは、微生物または組織培養技法において広く使用されている標準方法により行うことができる。
【００９３】
5.4.2  条件複製ウイルスベクターおよび組成物の送達
本発明はまた、癌および過増殖性疾患（例えば、制御不能な細胞増殖を特徴とする疾患）を治療するための条件複製ウイルスベクター（H19調節配列と機能的に連結された、ウイルス複製に必須の産物をコードするヌクレオチド配列を含む）の使用を包含する。本発明の方法においては、本発明のベクターを生物学的に有効な担体（例えば、in vivoでベクターを細胞に効果的に送達できる処方物または組成物）で投与することができる。ウイルスベクターは直接細胞にトランスフェクトされるので、例えば、プラスミドによるトランスフェクションの場合に必要となる複雑なトランスフェクション技術を全く必要としない。最近の癌治療のための遺伝子導入および発現系は、Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187および"Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications" Caplitt & Loewy編, Academic Press, San Diego (1995)に載っている。
【００９４】
ウイルス粒子の表面のウイルスパッケージングタンパク質を修飾することによって、ウイルスの感染スペクトル、それゆえにウイルスに基づくベクターの感染スペクトルを制限することが可能であることが示されている（例えば、国際特許公開WO 93/25234およびWO 94/06920参照）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトルを改変するためのストラテジーは、細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスenvタンパク質にカップリングさせること（Rouxら, 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:9079-9083; Julanら, 1992, J. Gen. Virol. 3:3251-3255; およびGoudら, 1983, Virology 163:251-254）；または細胞表面受容体リガンドをウイルスenvタンパク質にカップリングさせること（Nedaら, 1991, J. Biol. Chem 266:14143-14146）を含む。カップリングは、タンパク質またはその他の様々な物質（例えば、envタンパク質をアシアログリコプロテインに変換するラクトース）との化学的架橋の形であってよく、また、融合タンパク質（例えば、一本鎖抗体／env融合タンパク質）を生成させることによるものであってよい。例えば、癌細胞はこの技術を用いて、例えば、組換えウイルスの表面に腫瘍関連分子または癌細胞表面タンパク質に対する抗体をカップリングすることによって、ターゲッティングすることができる。この技術は、感染を特定の組織型に制限するか、さもなくば指向させるのに有用であるが、同種指向性ベクターを両種指向性ベクターに変換するためにも同様に使用することができる。より有利なアプローチは、癌細胞または特定の組織の癌へのウイルスベクターの好適な取込みまたは好適な侵入を引き起こす、ウイルスエンベロープで発現されるタンパク質をコードする遺伝子をウイルスゲノムに挿入することである。
【００９５】
このような技術を採用することによって、二重の安全性を確保することが可能であり、すなわち、条件複製ウイルスが癌細胞内で複製するだけでなく、最初に腫瘍細胞の部位に好ましく送達されることになる。
【００９６】
好ましい実施形態により示されるように、本発明のウイルスベクターはアデノウイルス条件複製ベクターであり、アデノウイルスに関する情報は、Berknerら, 1988, BioTechniques 6:616; Rosenfeldら, 1991, Science 252:431-434; およびRosenfeldら, 1992, Cell 68:143-155に見出すことができる。アデノウイルス株AD型5 d1324またはその他のアデノウイルス株（例えば、Ad2、Ad3、Ad7など）から誘導された適切なアデノウイルスベクターは、当業者に周知である。条件複製ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである場合は、様々な細胞型に感染することができるという追加の利点があることに注目すべきである。例えば、アデノウイルスベクターは、気道上皮（Rosenfeldら, 1992，前掲）、内皮細胞（Lemarchandら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486）、肝細胞（HerzおよびGerard, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816）、および筋細胞（Quantinら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584）に感染しうる。さらに、このウイルス粒子は、比較的安定しており、精製や濃縮を行いやすく、また、感染スペクトルに影響を及ぼすように修飾を施すことができる。さらには、導入されたアデノウイルスDNA（およびそこに含まれる外来DNA）は、宿主細胞のゲノム内に組み込まれず、エピソームのままであり、かくして、導入されたDNAが宿主ゲノム内に組み込まれた場合（例えば、レトロウイルスDNAの場合）に挿入突然変異誘発の結果として起こりうる問題を回避することができる。その上、アデノウイルスゲノムが外来DNAを担持できる能力は、その他の遺伝子送達ベクターと比べて大きいものである（最大8キロベース）（Berknerら, 前掲、Haj-AhmandおよびGraham, 1986, J. Virol. 57:267）。
【００９７】
現在使用されていて、本発明により支持される大方の条件複製アデノウイルスベクターは、ウイルスE1およびE3遺伝子の全部または一部を欠失しているが、80％ものアデノウイルス遺伝物質を保持している（例えば、Jonesら, 1979, Cell 16:683; Berknerら, 前掲; およびGrahamら, Methods in Molecular Biology, E.J. Murray編 (Humana, Clifton NJ, 1991) vol. 7, pp. 109-127を参照されたい）。
【００９８】
臨床的背景においては、条件複製ウイルスベクターを、当技術分野において周知の各種方法のいずれかを用いて患者に導入することができる。種々の送達系が知られており、これらを用いて条件複製ベクターと製薬上許容される担体を含有する医薬組成物を投与することができる。導入方法としては、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられる。ウイルスベクターまたは組成物は、いずれかの都合のよい経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸の粘膜など）からの吸収により投与してもよく、また、他の生理活性物質と一緒に投与してもよい。さらに、本発明のウイルスベクターまたは組成物を中枢神経系に、脳室内およびくも膜下注入をはじめとする適当な経路で導入することも望ましいかもしれない。脳室内注入は、例えば、Ommayaリザーバーのようなリザーバーに取り付けた、脳室内カテーテルを用いて有利に行うことができる。また、肺投与も、例えば、吸入器や噴霧器を使用し、エアゾール化剤で処方することにより、使用することができる。
【００９９】
特定の実施形態において、本発明のウイルスベクターまたは組成物は、治療の必要な領域に局所的に投与することが望ましい。これは、例えば、限定するものではないが、外科手術中の局所注入、注射、カテーテル、またはインプラントにより行うことができる。インプラントは多孔質、非多孔質、または膠様材料のものであり、シアラスティック(sialastic)膜などの膜または繊維が含まれる。ある実施形態では、腫瘍または新生物または前新生物の組織部位（あるいは前方の部位）に直接注入することで投与しうる。
【０１００】
特定の実施形態において、「製薬上許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関により承認されていること、または動物（特にヒト）に使用するために米国薬局方もしくは他の一般的に認められた薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬を投与するときに用いる希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをさす。そのような製薬上の担体は、水や油のような無菌の液体であってよく、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油といった石油、動物、植物由来のものまたは合成されたものが含まれる。医薬組成物を静脈内投与する場合は、水が好ましい担体である。食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液も液状担体として、特に注射用溶液のために、使用することができる。適当な製薬上の賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米粉、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。上記組成物は、所望により、少量の湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤を含んでいてもよい。こうした組成物は溶液剤、懸濁剤、乳濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉剤、持続放出製剤などの剤形をとることができる。経口製剤は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含みうる。適当な製薬上の担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。製剤は投与様式に適合させるべきである。
【０１０１】
別の実施形態では、ウイルスベクターを制御放出系で送達させることができる。ある実施形態においては、ポンプを使用する（Langer, 前掲; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwaldら, Surgery 88:507 (1980); Saudekら, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用する（Medical Applications of Controlled Release, LangerおよびWise (編), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall (編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)を参照されたい; また、Levyら, Science 228:190 (1985); Duringら, Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howardら, J. Neurosurg. 71:105 (1989)も参照されたい）。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療標的（すなわち、脳）の近傍に配置することができ、したがって、全身用量の一部を必要とするにすぎない（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 前掲, vol. 2, pp. 115 138 (1984)を参照されたい）。その他の制御放出系については、Langer (Science 249:1527 1533 (1990))が概説している。ある実施形態では、ウイルスベクターを徐放性マトリックス中に埋め込んでもよい。
【０１０２】
好ましい実施形態においては、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として常法に従って該組成物を製剤化する。典型的には、静脈内投与用の組成物は、無菌の水性等張バッファー中に溶解した溶液である。必要に応じて、該組成物は可溶化剤や、注射部位の痛みを和らげるためのリドカインのような局所麻酔薬を含んでいてもよい。一般的に、諸成分は別々に供給されるか、または一緒に混合して単位剤形で、例えば、活性薬剤の量を表示するアンプルやサシェット（小袋）のような気密容器に入れた凍結乾燥粉末もしくは水不含の濃縮物として供給される。該組成物を輸液により投与しようとする場合は、それを、医薬品等級の無菌の水または食塩水を入れた輸液用ビンと共に分配する。該組成物を注射で投与する場合は、投与に先立って諸成分を混合しうるように無菌の注射用水または食塩水が入ったアンプルを供給する。好ましい実施形態においては、ウイルスベクターの医薬製剤を全身的に、例えば、静脈内注射または動脈内注射により（例えば、肝静脈に）導入すると、標的細胞でのウイルスの特異的複製が、主に、ウイルスの複製に必須の産物をコードする遺伝子の発現の特異性から生じる。別の具体的な実施形態では、ウイルス構築物の初期送達を、動物への局在化された導入によって空間的にさらに限定することが可能である。例えば、遺伝子送達ビヒクルを腫瘍部位に直接注入（腫瘍内注入）するか、または膀胱のようないずれかの管腔へのカテーテル（例えば、米国特許第5,328,470参照）によって、もしくは定位注射（例えば、Chenら, 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3054-3057参照）によって、体腔に導入することができる。あるいはまた、医薬製剤は、条件複製ウイルスベクターを産生しかつ感染性ウイルスを環境に分泌する1以上の細胞を含んでいてもよい。
【０１０３】
5.4.3  治療の終点および投与量
当業者には理解されるように、医師または患者の観点からすると、癌または過増殖状態に伴う望ましくない症状（例えば、痛み、神経過敏、体重減少など）の事実上どのような軽減または防止でも望ましいものであろう。さらに、腫瘍の量または増殖速度の低下が望ましく、同時に腫瘍の組織病理学的像の改善が望ましい。所定のウイルスベクターが癌または過増殖性障害に対して何らかの治療効果を達成する能力は、次のことを測定するための当技術分野で公知のin vitroまたはin vivo方法を用いて評価することができる。すなわち、対照と比較したときの、細胞死（ネクローシス、アポトーシスまたはこれら両者の組合せでありうる）による癌（癌性）細胞数の減少；細胞の増殖速度の低下、例えば、細胞の総数は増えているが、対照の未処置細胞の増加と比べてより低いレベルまたは速度で増えている；たとえ細胞の総数に変化がなかったとしても、対照と比較したときの周囲の環境への細胞の侵襲性の低下（例えば、軟寒天アッセイで測定）；または、より分化した表現型への未分化の癌細胞の進行などを測定する。
【０１０４】
活性化されたH19発現を示す代表的な腫瘍タイプは次のとおりである：癌腫、肉腫、腺腫、肝細胞癌、胚芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、骨膜腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、ラブドテリオサルコーマ(rhabdotheliosarcoma)、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、血腫、胆管癌、黒色腫、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、胃腸間質性腫瘍、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、直腸癌、甲状腺の癌、頭部・頸部癌、子宮内膜の癌、および前記癌のいずれかの転移癌。したがって、本発明は上記のすべての癌の治療方法を包含する。特定の実施形態において、本方法は膀胱癌、肝細胞癌、胚芽腫、横紋筋肉腫、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、乳癌、頭部および頸部の扁平上皮癌、食道癌、甲状腺癌、神経膠星状細胞腫、神経節芽細胞腫、または神経芽細胞腫の治療を包含する。
【０１０５】
有効な投与量および治療プロトコルは、実験動物で低用量から開始し、その後効果をモニタリングしながら用量を増加させ、系統的に用量計画も変化させて、従来の手段を用いて決定することができる。体重1kgあたりの生物活性剤の最大許容量つまりMTDを決定するためには、一般に、動物実験、好ましくは哺乳動物実験が用いられる。当業者は、ヒトを含めたその他の種に対して効力および毒性の回避を目的とした用量を定期的に外挿する。
【０１０６】
効力についてヒトで実験を着手する前に、正常な被験者におけるフェーズIの臨床実験が安全な用量を設定する一助となる。所与の被験者に最適な用量を決定する時点で、医師は数多くの要因を考慮に入れることができる。その中でも主なものは、所定の条件複製ウイルスの毒性および半減期である。さらなる要因としては、患者の体格、年齢、全身状態、治療対象の特定の癌性疾患、疾患の重症度、患者体内のその他の薬物の存在、複製ウイルスのin vivo活性などがある。動物実験の結果を考慮しかつ臨床文献をレビューした後、試験用量が選択されることになる。
【０１０７】
例えば、H19調節配列と機能的に連結されたウイルス複製に必須の産物をコードする核酸を含む条件複製アデノウイルスベクターの標準的なヒト用量は、1日あたり腫瘍塊に直接注入される形で1×107 pfu〜1×1012 pfuである。より好ましくは、腫瘍に直接注入される該アデノウイルスベクターの1日量は、腫瘍の大きさに応じて、1×108 pfu〜1×1010 pfuである。特に、in vivo使用が考慮されている場合、本発明のさまざまな生化学成分は好ましくは高純度のものであり、有害でありうる汚染物質を実質的に含まない（例えば、少なくとも米国食品（NF）等級、一般には少なくとも分析等級、好ましくは少なくとも医薬品等級）。所定の化合物を使用前に合成しなければならない場合には、かかる合成またはその後の精製は、その合成または精製手順の間に使用された可能性のある潜在的に毒性のいかなる物質も実質的に含まない生成物をもたらすことが好ましい。
【０１０８】
被験者の癌性状態を治療する上で使用するために、本発明はまた、その態様の一つにおいて、H19調節配列と機能的に連結されたウイルス複製に必須の産物をコードする核酸を含む条件複製ウイルスベクターを含む、無菌充填されたバイアルまたはアンプルの形をしたキットまたはパッケージを提供する。ある実施形態においては、このキットは、上記のウイルスベクターを適当な担体中に、または他の安定した形で含有する。あるいはまた、本発明の別の実施形態によれば、パッケージはそのようなベクターを放出する細胞または細胞系を含む無菌充填されたバイアルまたはアンプルを提供する。貯蔵および輸送のためには、かかるベクター放出細胞または細胞系を凍結すべきである。場合により、パッケージは、ベクター放出細胞または細胞系を培養するための培地と試薬を含んでいてもよい。さらに、パッケージはキットの使用に関する説明が書かれたパッケージ挿入物を含む。
【０１０９】
本発明について説明してきたので、以下の実施例を、制限ではなく例として提供する。
【０１１０】
6.  実施例：条件複製アデノウイルスベクターを作製するための一般的技法
一般に、本明細書に記載のベクターは、標準的な分子生物学的手法を用いて構築することができる。かかるベクターの標準的な構築方法は当業者に周知であり、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1989)、または広く入手可能な無数の実験室マニュアルもしくは組換えDNA技術のいずれかに見出せる。DNA断片同士を連結させるためにいろいろなストラテジー（その選択はDNA断片の末端の性質に依存する）が利用可能であり、当業者は容易にそれを決定することができる。
【０１１１】
アデノウイルスベクターを構築するには、ある実施形態では、まず初めに標準的な技法に従って、下記のようなシャトルプラスミドを作製する。すなわち、5'末端から開始して、アデノウイルス5' ITR、アデノウイルス包膜(encapsidation)シグナル、およびE1aエンハンサー配列を含む「クリティカル左端エレメント」(critical left end elements)；H19プロモーターまたはその部分配列のようなH19調節配列；三部分リーダー配列、マルチクローニング部位（本明細書に記載するとおりでありうる）；ポリAシグナル；およびアデノウイルスゲノムのセグメントに相当するDNAセグメントを含むシャトルプラスミドである。前記DNAセグメントは改変型または突然変異型アデノウイルスとの相同的組換えのための基質として役立つ。このプラスミドはさらに、選択マーカーと複製起点をも含みうる。複製起点は細菌の複製起点であってよい。かかるシャトルプラスミドの代表例としてpAVS6を挙げることができるが、これについては本明細書中で説明する。また、Trapnellら, 1994, Adv. Drug Deliv. Rev 12:185-189を参照されたい。その後、異種遺伝子を含む所望のDNA配列をマルチクローニング部位に挿入すると、プラスミドベクターが得られる。
【０１１２】
次に、この構築物を用いてアデノウイルスベクターを作製する。1以上の天然の転写調節配列が欠失されてH19転写調節配列（例えば、H19プロモーター）で置き換えられている改変型または突然変異型アデノウイルスとの相同的組換えを行う。このような相同的組換えは、上記のプラスミドベクターと改変型アデノウイルスを、リン酸カルシウム沈降によりヘルパー細胞系へ同時トランスフェクトすることにより行うことができる。
【０１１３】
かかる相同的組換えにより、1以上の天然の転写調節配列が除かれたアデノウイルスDNAを含むベクターが形成される。次に、このベクターをウイルス複製用のヘルパー細胞系にトランスフェクトして、、感染性ウイルス粒子を産生させる。トランスフェクションはエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、またはプロテオリポソームにより行うことができる。
【０１１４】
このベクターはH19調節配列を含むDNA配列のクローニングベクターへの挿入を容易にするマルチクローニング部位を含みうる。一般に、マルチクローニング部位には「稀な」制限酵素部位（すなわち、10,000塩基対ごとに約1個から100,000塩基対ごとに約1個までの頻度で真核生物遺伝子中に見出せる部位）が含まれている。したがって、適切なベクターは、該クローニングベクターを標準方法によりマルチクローニング部位中の適当な制限部位で切断し、次いで異種遺伝子を含むDNA配列を該クローニングベクターに連結させることにより形成される。
【０１１５】
一つの実施形態において、上記アデノウイルスは、Ketnerら, 1994, Proc. Nat. Acad. Sci. 91:6186-6190に記載の方法およびそこに含まれる教示に従って、アデノウイルスゲノムを含む酵母人工染色体を用いることにより構築することができる。この実施形態では、アデノウイルスDNAと、アデノウイルス左および右ゲノム末端のセグメントを含有する酵母人工染色体プラスミドベクターと、のin vivo相同的組換えによりアデノウイルス酵母人工染色体を作製する。次に、異種遺伝子を含むDNA配列をアデノウイルスDNAにクローニングする。その後、改変型アデノウイルスゲノムをアデノウイルス酵母人工染色体から切り出して、感染性アデノウイルス粒子を産生させるために使用する。
【０１１６】
6.1  材料および方法
6.1.1  細胞系およびトランスフェクション
膀胱癌細胞系HT-1376、EJ28、T24P、1197およびUM-UC-3をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から入手して、ATCCが推奨する条件下で維持した。
【０１１７】
6.1.2  ウイルス子孫産生アッセイ
アデノウイルス変異体が膀胱癌細胞内で優先的に複製するかどうかを調べるために、放出量についてのウイルス産生アッセイを実施する。ウイルス複製効率を上記の膀胱癌細胞系、ヒト胚性腎細胞系(293)、および通常の膀胱癌細胞において評価する。293細胞系はアデノウイルス5型のE1aおよびE1bタンパク質を構成的に発現しているので、この細胞は複製効率の陽性対照として役立つ。ウイルス子孫の産生を調べるため、1.5×104個の細胞を24ウェルプレートにプレーティングし、2% FBSを含有する増殖培地200μL中にアデノウイルスをMOI 2（2PFU/細胞）で感染させる。翌日、細胞をHBSSで3回洗浄し、10% FBSを含有する増殖培地を加えてさらにインキュベートする。感染後3日目に、細胞と培地を回収し、凍結/融解を3回繰り返し、293細胞上での標準プラークアッセイによりウイルス力価を測定する。
【０１１８】
6.1.3  発現ベクターの構築
最適化されたH19転写調節配列を、必須ウイルス遺伝子（特に、E1a遺伝子）の標的発現を引き出すためにアデノウイルスゲノムに組み込む。アデノウイルスゲノムを次のように構築する。pShuttleの対応する制限部位に、Xho I制限部位を含む断片を導入し、続いてヌクレオチド522から3924位のMfe I制限部位までのAd5ゲノム配列を導入する（ヌクレオチド位置は受託番号AD5001として存在するGenBank配列をさす）。アデノウイルスE1プロモーターを含むAd5ヌクレオチド346〜521を、H19プロモーター（配列番号1中に存在するヌクレオチド-810〜+14）または広く発現されているCMVエンハンサー／プロモーター（対照として役立つ）で置き換える。さらに、これらのプロモーターの上流に合成ポリA部位（Luc-PH19由来）も組み入れる。このエレメントはAd5左ITRでの転写開始に寄与しうる非特異的遺伝子発現を回避することが明らかにされた。次に、これらのシャトルベクターをPmeI消化で線状となし、pADEasy-1との相同的組換えに使用して、組換えアデノウイルスゲノムを含有するそれぞれpAdCMVおよびpAdH19を作製する。これらのプラスミドの正当性をPCRと制限消化により確認する。リポフェクタミン(Life Technologies, Inc)を製造業者のプロトコルに従って用いて、PacIで消化したpAdプラスミドを293細胞にトランスフェクトすることにより、アデノウイルスを産生させる。AdEasy系（下記参照）のプロトコルに記載されるようにウイルスを増幅する。ウイルスゲノムおよび野生型混入の排除を、PCRと制限消化により証明する。
【０１１９】
さまざまなモニタリングを目的として、さらに、レポーター遺伝子（緑色蛍光タンパク質(GFP)またはルシフェラーゼ）もアデノウイルスベクターに組み込む。このアプローチの延長として、HSVtkまたはシトシンデアミナーゼ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターも開発される。これらの構築物では、HSVtk、H19プロモーターにより駆動されるE1a遺伝子を含む発現カセットがシャトルプラスミドに組み込まれる。HSVtk転写産物は内部リボソームエントリー部位(IRES)を介してE1a転写産物に結合される。
【０１２０】
6.1.4  H19プロモーターの作製
H19プロモーターを作製するために、H19プロモーター配列を含むポリヌクレオチドをヒト胎盤DNAからプライマー：
ESPCR21:  CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT (配列番号22) および
ESPCR22:  CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT (配列番号23)
を用いて増幅した。
【０１２１】
PCR産物をクレノウ酵素で平滑化し、pBluescriptIISK+のEcoRV部位にクローニングした。挿入DNAは内部切断酵素PvuII、EcoRIおよびApaIで消化して確認した。プロモーターの向きは該ベクターのlacZコード領域のそれと反対であった。次に、HindIIIおよびPstIで切断してプロモーター領域を切り出した。得られたおよそ0.9kbの断片は上記のように使用することができる。
【０１２２】
6.1.5  AdEasyTM系
AdEasyTM系を用いると、時間のかかるプラーク精製を必要とすることなく、組換えアデノウイルスベクターが迅速に作製される。Heらが開発したAdEasyTM系は、大腸菌の強健で効率的な組換え機構を利用することによって、扱いにくい(36kb)アデノウイルスゲノムがからんでくる制限-連結を回避するものである。この技法に不可欠な細菌細胞と293細胞はどのキットにも含まれており、また、各キットは最大5つの組換えアデノウイルスを産生させるのに十分な試薬類を提供する。非常に詳細なユーザーマニュアルは、初心者だけでなく当研究分野で経験をつんだ者にとっても計り知れないほど貴重なものとなっている。
【０１２３】
一般的スキーム：
ステップ1：  まず初めに、上記のようなH19調節配列と機能的に連結された、配列番号6に示すE1aアデノウイルス必須遺伝子のcDNAをトランスファーベクターにクローニングする。
【０１２４】
ステップ2：  得られたプラスミドをPme Iで線状となし、ウイルスDNAプラスミドであるpAdEasy-1と共に大腸菌BJ5183株に共形質転換する。カナマイシン耐性により組換え体を選択し、制限酵素分析によりスクリーニングする。
【０１２５】
ステップ3：  次に、組換えアデノウイルス構築物をPacIで切断してそのITR（逆方向末端反復配列）を露出させ、QBI-293A細胞にトランスフェクトしてウイルス粒子を産生させる。
【０１２６】
細菌細胞での組換え体の産生：
1.  当分野で公知の方法を用いて、エレクトロコンピテントBJ5183細胞を20μL/チューブのアリコートとして調製する。
【０１２７】
2.  シャトルプラスミドをPme Iで線状化する。通常はミニプレップの1/5（典型的には100〜500 ng）で十分である。消化後、DNAをフェノール-クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、6.0μLのddH2O中に懸濁する。
【０１２８】
3.  Pme I消化シャトルプラスミドを1.0μLのアデノウイルス骨格ベクター(100 ng/μL)と共に同時形質転換する。20μLのエレクトロコンピテント大腸菌BJ5183細胞を加え、2.0 mmキュベット内でBio-Rad Gene Pulserエレクトロポレーターにより2,500V、200オーム、および25マイクロ-FDでエレクトロポレーションを行う。形質転換ミックスを500μLのLブロスに再懸濁させる（37℃で10〜20分のインキュベーションを、バックグラウンドに応じて任意に行う）。このミックスを3〜5個のLB/Kanプレート上にプレーティングして、37℃で一晩（16〜20時間）増殖させる。
【０１２９】
4.  10〜20個の最小コロニーを取り上げ、25μg/mLのカナマイシンを含有するLブロス2 mL中で10〜15時間増殖させる。
【０１３０】
5.  通常のアルカリ溶菌法を用いてミニプレップを行い、超コイルプラスミドのサイズを、0.8％アガロースゲル上でミニプレップの1/5を泳動することによりチェックする。
【０１３１】
6.  クローン由来のDNAをPac Iで制限消化する。候補クローンは大きい断片(約30 kb)と3.0kbまたは4.5kbのより小さい断片をもたらす。
【０１３２】
7.  2μLの正しい組換えミニプレップDNAをDH10B（または任意のプラスミド複製株）に再形質転換する。プラスミドをCsClバンド形成により、または293細胞トランスフェクション用の市販の精製キットを用いて精製する。
【０１３３】
293または911細胞でのウイルスの産生：
1.  トランスフェクションの約24時間前に、1または2個のT-25フラスコに2×106個／フラスコで293細胞（E1a形質転換ヒト胚性腎細胞）または911細胞（E1形質転換ヒト胚性網膜細胞）をプレーティングする。トランスフェクション時の集密度は約50〜70％とする。
【０１３４】
2.  トランスフェクション当日、組換えアデノウイルスプラスミドをPacIで消化する（通常、1個のT-25フラスコをトランスフェクトするのに4μgのDNAが必要である）。プラスミドをエタノールで沈澱させ、20μLの無菌H2Oに懸濁する。
【０１３５】
3.  標準的なLipofectamineトランスフェクションを製造業者のマニュアルに従って行う。各T-25について、4μgのPacI消化プラスミドと20μLのLipofectamine (GIBCO BRL)を500μLのOptiMem I培地中で混合し、室温で15〜30分間インキュベートする。
【０１３６】
4.  待っている間に、増殖培地をレシピエント細胞から除去し、該細胞を4 mlの無血清培地（例えば、普通のDMEMまたはハンクス培地）で1回洗浄する。T-25フラスコあたり2.5 mLのOptiMem Iを加える。37℃ CO2インキュベーターに約10分間もどす。
【０１３７】
5.  Lipofectamine-DNAミックスを該フラスコに加え、このフラスコを37℃ CO2インキュベーターにもどす。
【０１３８】
6.  4時間後、Lipofectamine-DNAミックスを含有する培地を取り出し、6 mLの新鮮な完全DMEM (10% FBS、1% Pen/Strep)を加える。翌朝、培地を交換する。
【０１３９】
7.  pAdTrackに基づくベクターを使用したときは、トランスフェクションとウイルス産生をGFP発現によりモニタリングすることができる。
【０１４０】
8.  トランスフェクション後7〜10日目にゴムポリスマンを使ってフラスコから細胞をこすり取り、50 mLのコニカルチューブに移す。細胞を卓上遠心機で分離し、ペレットを2.0 mLのHBSSまたは無菌PBS中に懸濁する。次に細胞をドライアイス／メタノール浴で凍結させ、37℃の水浴で融解して激しくボルテックス混合する。凍結／融解／ボルテックスをあと3回（合計4回）繰り返す。サンプルを短時間遠心し、上清を-20℃で保管する。
【０１４１】
9.   集密度50〜70％の911または293細胞のT-25フラスコ2個に、各フラスコにつき30〜50％の上記ウイルス上清を用いて感染させる。感染後2〜3日でCPEまたは細胞溶解が明らかになるはずである。増殖性感染はAdTrackベクターを用いて容易に観察される。
【０１４２】
10.  細胞の1/3〜1/2が脱離したときウイルスを集める（通常は感染の3〜5日後）。組換えアデノウイルスの存在はウェスタンブロットおよび／またはPCRにより確認することができる（PCRのためには、5μLのウイルス上清と10μLのPCRグレードのプロテアーゼKを55℃で1時間一緒にし、次にこのサンプルを5分間沸騰させ、短時間遠心して、1〜2μLをPCRに使用する）。
【０１４３】
11.  細胞をこすり取り、上記ステップ8に記載したようにウイルス上清を調製する。この段階で少なくとも107個の感染性粒子／mLが得られ、もっと多いこともしばしばである。各ラウンドの増幅は、前のラウンドで存在していたウイルスより少なくとも10倍多いウイルスを与えるだろう。
【０１４４】
12.  さらに増幅するために、細胞の感染ステップを繰り返すが、T25フラスコの代わりにT75フラスコを使用し、ステップ11から得られたウイルス上清の30〜50％を用いて感染させる。力価はいつでも測定することができ、AD-Trackベクターを用いると特に簡単である。様々な希釈率のウイルス上清を用いて293細胞に感染させ、18時間後に緑色がどのくらいかを測定する。
【０１４５】
高力価ウイルスストックの調製：
1.  911または293細胞をT-75フラスコにプレーティングして、感染時の集密度を90％とする（約1×107細胞／T-75）。通常、高力価ウイルスストックを調製するには15〜20個のT-75フラスコで十分である。
【０１４６】
2.  細胞に、細胞あたり5〜10 PFUの感染多重度(MOI)でウイルス上清を感染させる。全細胞が一巡して、細胞の約半分が脱離したとき（通常、感染後3〜4日目）、全フラスコから回収して合わせる。次にこの内容物を卓上遠心機で5分間分離し（約500 g）、上清を除く。
【０１４７】
3.  ペレットを8.0 mLの無菌PBSに懸濁する。凍結／融解／ボルテックスを4回繰り返す。溶解液をSorvall HS4ローターにより6000 rpm (7000 g)、4℃で5分間遠心する。
【０１４８】
4.  50 mLのコニカルチューブに4.4 gのCsClを量り入れ、このチューブに8.0 mLの透明なウイルス上清を移して、ボルテックスにより十分混合する。このCsCl溶液（約10 mL、密度1.35 g/mL）をSW41ローター用の12 mLポリアロマーチューブに移し、2 mLのミネラルオイルを重層する。バランスチューブを調製し、このグラジエントをSW41ローターにて32,000 rpm、10℃で18〜24時間遠心する。
【０１４９】
5.  3cc注射器と18ゲージ針を使ってウイルス画分（約0.5〜1.0 mL）を集め、等量の2X貯蔵バッファー（2X貯蔵バッファー = 10 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1% BSAおよび50% グリセロール、濾過滅菌済み）と混合する。ウイルスストックを-20℃で保管する。
【０１５０】
6.  ウイルス力価はGFP（好ましい）により、またはプラークアッセイもしくは免疫組織化学的染色により調べるか、あるいは単に260 nmでODを読み取る。ODを読み取るためには、15μLのウイルスを15μLのブランク溶液（ブランク溶液 = 1.35g/mL CsClを等量の2X貯蔵バッファーと混合したもの）および100μLのTE/0.1% SDSに加え、30秒間ボルテックス混合し、5分間遠心してA260を測定する。1 A260単位はおよそ1012個のウイルス粒子（粒子：感染性粒子 = およそ20:1）を含有する。
【０１５１】
7.  実施例：膀胱癌細胞に対する条件複製ウイルスの効果−in vitro研究
H19調節性アデノウイルスの細胞傷害性をin vitroで評価する。異なるレベルのH19 RNAを発現している1.5×104個の腫瘍細胞（例えば、HT-1376、EJ28、T24P、1197およびUM-UC-3）、ならびに一次細胞を24ウェルプレートにプレーティングし、2% FBSを含有する増殖培地200μL中で種々のMOI(0.1〜10)にてアデノウイルスを感染させるか、あるいは偽感染させる。E1欠失AdCMVLuc構築物を陰性対照として用いる。翌日、感染培地を増殖培地と置き換える。細胞の溶解後、細胞を固定して1％クリスタルバイオレットで染色する。プレートを乾燥させ、オリンパスデジタルカメラで画像をとらえ、本発明のベクターが原因で生じた細胞溶解の程度／レベルを測定する。
【０１５２】
8.  実施例：膀胱癌細胞に対する条件複製ウイルスの効果−異種移植モデルでのin vivo研究
上記セクション6で調製したベクターの効力を、SCIDマウスの皮下で増殖するヒト膀胱癌細胞系において研究する。アデノウイルスによる腫瘍崩壊を研究するためには、この比較的複雑な動物モデルが必要である。なんとなれば、一般的に条件複製アデノウイルスはマウスやラットの細胞内では増殖しないからである。これらの実験のために用いたヒト膀胱腫瘍株(UM-UC-3)は、ルシフェラーゼ発現ベクターで安定にトランスフェクトされるため、腫瘍退縮のin vivoイメージングが可能である。もう一つの代案として、切除した腫瘍内での発現のイメージングを可能にするために、上記の条件複製ベクターにGFPレポーターが組み込まれる。
【０１５３】
より詳しくは、SCIDマウスに、ルシフェラーゼを安定に発現している5×106個のヒトUM-UC-3膀胱腫瘍細胞を皮下注射する。約100〜120 mm3の腫瘍体積を有するマウスの群(n=8)に、媒体200μL中の、107〜109 pfuの範囲の、上記セクション6に記載のように調製した条件複製H19-アデノウイルスベクターを、様々な用量で腫瘍内注射する。対照の動物群は媒体(PBS)のみを受け取る。
【０１５４】
皮下注射した腫瘍の増殖速度はカリパスで測るか、またはin vivoルシフェラーゼ検出により測定する（腫瘍細胞それ自体が蛍光を発するため）。動物を犠牲にした後、切除した腫瘍の重さを測って本発明の条件複製ウイルスベクターの治療効力を判定する。ウイルスの広がりを時間の関数として測定するための実験は、次のように行う。すなわち、接種後1、3、5、7、および14日目に腫瘍組織を回収して、アデノウイルスの複製を評価する。ただし、検出のために、抗アデノウイルス抗血清またはβガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはルシフェラーゼのようなマーカー遺伝子を含むアデノウイルスを使用するように改変する。H19プロモーターを担う各腫瘍崩壊性アデノウイルスの治療効力、ならびに腫瘍内にウイルスが広がる度合は、該プロモーターの内在活性（腫瘍細胞内の対応RNAレベルにより評価）と相関している。また、腫瘍選択的な腫瘍崩壊性ウイルスが表現型陰性（例えば、H19陰性）腫瘍細胞を死滅させる能力も測定して、条件複製ウイルスベクターがH19調節配列を活性化する転写因子を発現している腫瘍細胞においてのみ活動することを明らかにする。
【０１５５】
9.  実施例：膀胱癌の同所移植モデルにおけるH19条件複製ウイルス系の使用
この動物モデルは、ヒト膀胱癌細胞系UM-UC-3、RT-112および5637を重症複合型免疫不全症（「SCID」）マウスの膀胱に移植したものである。同所移植ヒト膀胱癌を雌CD-1無胸腺ヌードマウスの膀胱内で（腫瘍へと）発生させる。上記セクション6に記載のように調製した本発明のベクターを、移植後4および7日目にカテーテルで膀胱に投与する。動物をアデノウイルスベクター(100μL PBS中の1 x 107 pfu)の1回または複数回の点滴注入により処置する。増殖速度は次の2つの方法のいずれかで測定する。すなわち、in vivoルシフェラーゼ検出（セクション8に記載したとおり、腫瘍細胞それ自体が蛍光を発する）によるか、または、治療開始後のいろいろな時点で動物を犠牲にした後、切除した腫瘍の重さを測って、本発明の条件複製ウイルスベクターの治療効力を判定する。
【０１５６】
10.  クローンの寄託
特許手続上の微生物の寄託の国際的認知に関するブダペスト条約の条項に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）(Manassas, VA)に以下のプラスミドを寄託した：
2005506386.tif 000002
【０１５７】
本発明はここに記載の特定の実施形態によってその範囲が限定されるものではない。実際、本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な改変が上記の説明および添付の図面から当業者には明らかであろう。そのような改変も添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０１５８】
各種の特許、刊行物およびGenBankエントリーが本明細書に引用されているが、これらの開示内容はその全体を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１Ａ】ヒトH19プロモーター領域のヌクレオチド配列（配列番号1）を示す。
【図１Ｂ】図1Aの続き。
【図１Ｃ】図1Bの続き。
【図２】E1遺伝子産物をH19調節配列の制御下で発現させるために用いられる条件複製ウイルスベクターの構築の概略図を示す。
【図３】ヒトH19プロモーター断片のヌクレオチド配列（配列番号2）を示す。
【図４】0.9kbのH19エンハンサー断片のヌクレオチド配列（配列番号3）を示す。
【図５Ａ】2kbのH19エンハンサー断片のヌクレオチド配列（配列番号4）を示す。
【図５Ｂ】図5Aの続き。
【図６Ａ】4kbのH19エンハンサー断片のヌクレオチド配列（配列番号5）を示す。
【図６Ｂ】図6Aの続き。
【図６Ｃ】図6Bの続き。
【図７−１】アデノウイルス5のE1a遺伝子産物のコード化ヌクレオチドおよびアミノ酸配列(配列番号6、7)を示す。
【図７−２】図7-1の続き。
【図７−３】図7-2の続き。
【図７−４】図7-3の続き。
【図７−５】図7-4の続き。
【図７−６】アデノウイルス5のE1b(配列番号8)およびE2a(配列番号9)遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−７】アデノウイルス5のE4遺伝子産物のアミノ酸配列(配列番号10)を示す。
【図８−１】アデノウイルス2のヌクレオチド配列（配列番号11）を示す。
【図８−２】図8-1の続き。
【図８−３】図8-2の続き。
【図８−４】図8-3の続き。
【図８−５】図8-4の続き。
【図８−６】図8-5の続き。
【図８−７】図8-6の続き。
【図８−８】図8-7の続き。
【図８−９】図8-8の続き。
【図８−１０】図8-9の続き。
【図８−１１】図8-10の続き。
【図８−１２】図8-11の続き。
【図８−１３】図8-12の続き。
【図８−１４】図8-13の続き。
【図８−１５】図8-14の続き。
【図８−１６】図8-15の続き。
【図８−１７】図8-16の続き。
【図８−１８】図8-17の続き。
【図８−１９】図8-18の続き。
【図８−２０】図8-19の続き。
【図８−２１】図8-20の続き。
【図８−２２】図8-21の続き。
【図８−２３】図8-22の続き。
【図８−２４】図8-23の続き。
【図８−２５】図8-24の続き。
【図８−２６】図8-25の続き。
【図８−２７】図8-26の続き。
【図８−２８】図8-27の続き。
【図８−２９】図8-28の続き。
【図９−１】アデノウイルス2のE1a(配列番号12)およびE1b(配列番号13)遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図９−２】アデノウイルス2のE2a(配列番号14)およびE4(配列番号15)遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図１０】ヒトパピローマウイルス1aのE6(配列番号16、17)およびE7(配列番号18、19)遺伝子産物のコード化ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図１１−１】サイトメガロウイルス前初期領域転写産物のヌクレオチド配列（配列番号20）を示す。
【図１１−２】図11-1の続き。
【図１１−３】図11-2の続き。
【図１１−４】図11-3の続き。
【図１１−５】図11-4の続き。
【図１２】シミアンウイルス40のラージT抗原のアミノ酸配列（配列番号21）を示す。
【図１Ａ】
2005506386.tif 000003
【図１Ｂ】
2005506386.tif 000004
【図１Ｃ】
2005506386.tif 000005
【図２】
2005506386.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2005506386.tif 000009
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図８−１２】
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【図８−１３】
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【図８−１４】
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【図８−１５】
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【図８−１６】
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【図８−１７】
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【図８−１８】
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【図８−１９】
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【図８−２０】
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【図８−２１】
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【図８−２２】
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【図８−２３】
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【図８−２４】
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【図８−２５】
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【図８−２６】
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【図８−２７】
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【図８−２８】
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【図８−２９】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005506386.tif 000182
2005506386.tif 000183
2005506386.tif 000184
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