(57)【要約】本発明は、脂肪細胞分化を調節することのできる化合物を同定する方法であって、試験すべき化合物とＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞とを接触させ、上記試験すべき化合物の不在下で同一の上記遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞の脂肪細胞分化と比較して上記遺伝的に修飾された細胞の脂肪細胞分化を測定することで構成される方法に関する。本発明はさらに、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞ならびに上記細胞を調製する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）試験化合物をＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸を含む遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞の集団と接触させ、（ii）前記細胞の脂肪細胞分化を測定または決定し、そして（iii）好ましくは、前記分化を前記試験化合物の不在下で前記の同一の前駆脂肪細胞の脂肪細胞分化と比較する、脂肪細胞を調節することのできる化合物を同定するための方法。
【請求項２】
前記試験化合物を脂肪細胞分化プロセスに関与する受容体の少なくとも１つのアクチベータの存在下でＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する細胞と接触させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記脂肪細胞分化プロセスに関与する受容体のアクチベータが、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体のアクチベータである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記脂肪細胞分化プロセスに関与する受容体のアクチベータが、詳細には、ロシグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、またはＫＲＰ−２９７等のチアゾリジンジオン、Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−Ｌ−チロシンおよび１５−デオキシ−δ−１２，１４−プロスタグランジンＪ２からなる群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記試験化合物が、脂肪細胞分化プロセスに関与する遺伝子の少なくとも１つのアクチベータの存在下で遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞と接触する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記脂肪細胞分化プロセスに関与する遺伝子のアクチベータが、ＰＰＡＲγ遺伝子のアクチベータである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＰＡＲγ遺伝子のアクチベータが、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδおよびＡＤＤ１（ＳＲＥＢＰ１ｃ）を含む群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体が配列番号４の配列またはそのフラグメントまたはその機能的変異体を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記組換え核酸が、配列番号３の配列またはそのフラグメントを含む、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記組換え核酸が、配列番号１の配列、または配列番号２の配列を含むそのフラグメントをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記組換え核酸が、プラスミドベクター内に組み込まれている、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記組換え核酸が、ウイルスベクター内に組み込まれている、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記組換え核酸が、細胞ゲノム内に統合されている、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記脂肪細胞分化が、（i）好ましくはオイルレッドＯおよびスーダンブラックからなる群から選択される染色液を用いて分化細胞を染色することによって、（ii）脂肪酸輸送または合成を決定することによって、および／または（iii）好ましくはａＰ２、アジプシンおよびレプチンからなる群から選択されたマーカーである、分化脂肪細胞に特異的な少なくとも１つのマーカーの発現を決定することによって測定される、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
（i）ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の存在下で、試験化合物と配列番号１、好ましくは配列番号２の配列、またはそれらの機能的等価物を含む核酸とを接触させること、（ii）前記核酸へのＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の結合性を検証すること、および場合により（iii）前記結合性を試験化合物の不在下で観察される結合性と比較することを含み、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の前記結合性を調節する試験化合物が脂肪細胞分化を調節する化合物である、脂肪細胞分化を調節することのできる化合物を同定する方法。
【請求項１６】
試験化合物およびＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体を（i）配列番号１の配列、好ましくは配列番号２の配列またはそれらの機能的変異体の１つ以上のコピーを含む転写プロモータ、および（ii）レポーター遺伝子を含むレポーター系と接触させ、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体によって誘導されたレポーター遺伝子発現への試験化合物の作用を測定することによって試験化合物の活性を評価することを含む、脂肪細胞分化を調節することのできる化合物を同定する方法。
【請求項１７】
代謝疾患の予防的または治癒的処置のための薬剤を調製するための、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法によって同定された化合物、またはそのアナログの使用。
【請求項１８】
糖尿病、肥満症、インスリン抵抗性またはＸ症候群の予防的または治癒的処置のための薬剤を調製するための、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法によって同定された化合物、またはそのアナログの使用。
【請求項１９】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸を含み、前記組換え核酸が、配列番号１の配列または配列番号２の配列を含むそのフラグメントをさらに含む、遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞。
【請求項２０】
前記ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体が、配列番号４の配列またはそのフラグメントまたはその機能的変異体を含む、請求項１９記載の細胞。
【請求項２１】
組換え核酸が、配列番号３の配列またはそのフラグメントを含む、請求項１９または２０記載の細胞。
【請求項２２】
前記組換え核酸が、プラスミドベクター内に組み込まれている、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の細胞。
【請求項２３】
前記組換え核酸が、ウイルスベクター内に組み込まれている、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の細胞。
【請求項２４】
前記組換え核酸が、細胞ゲノム内に統合されている、請求項１９〜２３のいずれか一項記載の細胞。
【請求項２５】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸を含み、前記組換え核酸が、ウイルスベクター内に組み込まれている、遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞。
【請求項２６】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸を含み、前記組換え核酸が、細胞ゲノム内に統合されている、遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞。
【請求項２７】
前記ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体が、配列番号４の配列またはそのフラグメントまたはその機能的変異体を含む、請求項２５または２６記載の細胞。
【請求項２８】
前記組換え核酸が、配列番号３の配列またはそのフラグメントを含む、請求項２５〜２７のいずれか一項記載の細胞。
【請求項２９】
前記組換え核酸が、配列番号１の配列、または配列番号２の配列を含むそのフラグメントをさらに含む、請求項２５〜２８のいずれか一項記載の細胞。
【請求項３０】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸が、前駆脂肪細胞内に導入されている、請求項１９〜２９のいずれか一項記載の前駆脂肪細胞を調製するための方法。
【請求項３１】
前記前駆脂肪細胞が、細胞株３Ｔ３−Ｌ１、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、ｏｂ１７およびｏｂ１７７１の中から選択される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸が、プラスミドベクターを用いたトランスフェクションによって導入される、請求項３０または３１のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記組換え核酸を含むプラスミドベクターおよび抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを用いて細胞を同時トランスフェクションすることを含み、前記細胞が、前記抗生物質に対するそれらの耐性および前記組換え核酸のそれらの発現について選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸が、抗生物質耐性遺伝子をさらに含むプラスミドベクターを用いたトランスフェクションによって導入され、前記細胞が、前記抗生物質に対するそれらの耐性および前記組換え核酸のそれらの発現について選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸が、抗生物質耐性遺伝子および真核生物複製起点をさらに含むプラスミドベクターを用いたトランスフェクションによって導入され、細胞が、前記抗生物質に対するそれらの耐性および前記組換え核酸のそれらの発現について選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸が、ウイルスベクターを用いた感染によって導入される、請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３７】
前記感染が、組換えアデノウイルスまたはレトロウイルスによって実現される、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記組換え核酸が、配列番号３の配列またはそのフラグメントを含む、請求項３０〜３７のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
組換え核酸が、１つ以上の転写調節領域、典型的には、転写プロモータおよび／またはターミネータをさらに含む、請求項３０〜３８のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
組換え核酸が、配列番号１の配列、または配列番号２の配列を含むそのフラグメントを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
感染またはトランスフェクション後に、培養中の安定な前駆脂肪細胞株を選択する、請求項３０〜４０のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
ゲノム内にＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする核酸を含む、欠陥組換えウイルス、好ましくは欠陥組換えアデノウイルスまたはレトロウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性分子、詳細には脂肪細胞分化を調節する活性を有する分子をスクリーニングするための方法に関する。本発明はさらに、このようなスクリーニングを実施するために有用な、例えばＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞等の遺伝子構築物、細胞および組成物、ならびに上記細胞を調製する方法に関する。本発明は、代謝障害を管理するための、詳細には糖尿病、肥満症、インスリン抵抗性および／またはＸ症候群を治療するための活性化合物または活性医薬品を開発するための手掛かりとして有用な化合物を同定するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
詳細には、本発明は脂肪細胞分化のメカニズムにおいて特異的核受容体であるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡが果たす役割の実証および特徴付け、ならびに上記受容体が過剰発現したときに脂肪細胞分化因子の作用に対して細胞を感作する上記受容体の能力に基づく。本発明は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の発現を可能にする特異的ベクターの産生、および遺伝的に修飾された細胞系、特には前駆脂肪細胞にもさらに基づく。入手した結果は、そのような細胞系を脂肪細胞分化プロセスに直接的または間接的に関与する受容体のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させるときの、脂肪細胞分化の調節を明らかにする。
【０００３】
白色脂肪組織は、真核生物における主要なエネルギー貯蔵部位である。その役割は、多くの期間中にトリグリセリドを貯蔵し、エネルギー供給が減退したときにそれらを動員することである。脂肪細胞活性の調節不全は、肥満症および非インスリン依存型糖尿病等の結果を引き起こす。白色脂肪組織を構成する脂肪細胞は、それらの分化に特徴的な明確な一組の遺伝子を発現する高度に分化した細胞である（Fajasら, Curr. Opin. Cell Biol. 1998, 10: 165-173; Spiegelman, Diabetes 1998, 47: 507-514; Gregoire F., Phys. Rev. 1998, 78:783-809）。
【０００４】
脂肪細胞分化は複雑なプロセスであり、その分子成分は、より明確に理解されつつある（Fajasら, Curr. Opin. Cell Biol. 1998, 10: 165-173; Spiegelman, Diabetes 1998, 47: 507-514; Gregoire F., Phys. Rev. 1998, 78: 783-809）。脂肪細胞分化は、数種の転写調節因子のネットワークによって協調的に調節される。脂肪細胞分化は、細胞周期からの退出、ならびに脂肪細胞分化の主要コーディネーターであり、以下ではＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡと称するγタイプの「ペルオキシソーム増殖因子」によって活性化される核受容体の発現を誘導する因子Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδおよびＡＤＤ１（ＳＲＥＢＰ１ｃ）の活性化によって開始される。
【０００５】
ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体は、細胞周期からの退出ならびにエネルギーの貯蔵を可能にする脂肪細胞に特異的な遺伝子の発現を刺激する。最後に、Ｃ／ＥＢＰα転写調節因子が脂肪細胞分化の最終段階においてＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体と協調して一組の新規の遺伝子を誘導し、上記ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の発現を維持する。
【０００６】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体は、その天然または人工リガンドが不明のオーファン核受容体である。その配列は、甲状腺ホルモン受容体α型をコードする遺伝子の非コード鎖上でコードされている（Lazar M.A.ら, Mol. Cell. Biol. 1989, 9(3): 1128-1136; Lazar M.A.ら, DNA Cell Biol. 1990, 9(2): 77-83; Laudet V.ら, Nucleic Acid Res. 1991, 19(5): 1105-1012）。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体は、主として転写阻害剤として作用する。その発現は前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化中に増加すると思われ、脂肪細胞分化のマーカーの発現と相関している。（Chawla, J. Biol. Chem. 1993, 266, 12:16265-16269）
【０００７】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体は負の転写調節因子として作用する（Laudet V.ら, Curr. Biol. 1995, 5(2): 124-127）。ヒトＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体が自己の発現を調節することは証明されている（Adelmant G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(8): 3553-3558）。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｍＲＮＡは、脂肪組織、横紋筋、肝臓および脳組織等の組織中では高度に発現するが、他の組織中では余り豊富ではない。
【０００８】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体は脂肪細胞分化中に誘導される（Chawla A.ら, J. Biol. Chem. 1993, 268(22): 16265-16269）。しかし、この調節の分子機構は依然として曖昧である。ヒトＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体が筋肉分化（Downes M.ら, Mol. Endocrinol. 1995, 9(12):1666-1678）、肝臓におけるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の標的遺伝子としてラットａｐｏＡ１遺伝子（アポリポタンパク質Ａ１をコードする遺伝子）が同定されていることから脂質代謝の調節機構（Vu-Dac N., J. Biol. Chem. 1998, 273: 25713-25720）に関与していることもまた観察されている。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体が甲状腺ホルモンシグナリングの調節因子として作用することもさらに提案されている（Lazar M.A., J. Biol. Chem. 1990, 265(22): 12859-12863; Munroe S.H.ら, J. Biol. Chem. 1991, 266(33): 22803-22086）。実際に、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体はＤＲ４ホルモン応答エレメントへ結合し（Spanjaard R.A.ら, Mol. Endocrinol. 1994, 8(3): 286-295）、ＴＲＥのＴＲホモダイマーおよびＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの形成を阻害する（Downes M.ら, Mol. Endocrinol. 1995, 9: 1666-1678）。
【０００９】
これまでのところ、脂肪組織中でのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の生物学的役割およびその作用機序はまだ解明されていない（Chawla A.ら, J. Biol. Chem. 1993, 268(22): 16265-16269）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らが実施した研究は、現在では２種の受容体ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡおよびＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ間の相互作用を解明した。これらの研究は、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体がＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータのＤＲ２応答エレメント（「Ｒｅｖ−ＤＲ２」と称する）を介してＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の転写を活性化させることを証明した。このため本発明者らは、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子がＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の標的であり、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体がＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体によって誘導される脂肪細胞分化のプロモータであり、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体が脂質生成を調節する役割を果たす、と確定することができた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、驚くべき方法で、３Ｔ３−Ｌ１細胞系等の前駆脂肪細胞におけるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の過剰発現が、上記前駆脂肪細胞の分化を増加させ、さらに上記細胞中のＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の発現を増加させることもまた証明した。
【００１２】
この方法で、本発明者らはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体と脂肪細胞分化プログラムに関与する他の受容体との、特にＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体との間の調節機構を同定した。この研究に基づいて、本発明者らはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体または脂肪細胞分化プログラムに関与する上記他の受容体のいずれかと相互作用できる化合物をスクリーニングするための新規方法を提案する。
【００１３】
上記方法は、脂肪細胞分化、糖尿病、肥満症、インスリン抵抗性およびＸ症候群等の上記受容体に関与する代謝異常に関連する病状を処置するための活性化合物を同定するために有用である。
【００１４】
糖尿病または肥満症等の脂肪細胞分化の異常に関連する障害を治療するために使用される一部の化合物がＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体と相互作用することによって作用を及ぼすことが知られている。例えば、インスリン抵抗性を処置するために使用されるグリタゾンとしても知られるチアゾリジンジオンは、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体のリガンドおよび人工アクチベータであると同定されている。同様に、脂肪酸誘導体もＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の天然リガンドとして同定されている。フィブレートもまた、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体のアクチベータとして機能する脂質代謝の強力な調節因子である。
【００１５】
本発明者らが実施して本明細書に記載したin vivoおよびin vitro試験の結果は、ロシグリタゾン（ＢＲＬ  ４９６５３またはＢＲＬとも称される）を用いた処置がＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードするｍＲＮＡの発現を増加させることを証明している。このため２型糖尿病の治療に頻回に使用される抗糖尿病薬であるグリタゾンは、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ核受容体の結合および活性化を通して脂肪細胞分化プログラムを誘導する。
【００１６】
本発明の第１の態様は、分子標的としてのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の使用に基づく、活性分子、特に脂肪細胞分化を調節することに活性を有する分子をスクリーニングする方法に関する。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、上記スクリーニング法を実施するために有用な、例えば遺伝的に修飾されたＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する前駆脂肪細胞等の遺伝子構築物、細胞および組成物、ならびに上記細胞を調製する方法に関する。
【００１８】
本発明の詳細な態様は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡポリペプチドをコードする組換えウイルス（またはウイルスベクター）に関する。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、ヒトまたは動物の身体を治療またはワクチン処置する方法を実施するための活性化合物の使用に関する。詳細には、これらはＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体のＲｅｖ−ＤＲ２部位への結合を、またはより一般的には脂肪細胞分化におけるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の活性または発現を妨害することのできる化合物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体
本発明は、詳細には脂肪細胞分化におけるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の役割についての同定、上記役割の基礎にある機序の特徴付け、および治療目的でのこの分子の使用に基づく。
【００２１】
本発明の精神において、「ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体」という用語は、配列番号４の一次アミノ酸配列、またはそのフラグメントまたはその機能的変異体を含む核受容体を意味する。
【００２２】
【表１】
2005525099.tif 000002
【００２３】
「フラグメント」という用語は、典型的には５〜２００、好ましくは５〜１５０、いっそうより好ましくは５〜１００の、配列番号４の連続アミノ酸を含むポリペプチドを表す。フラグメントの具体的な例は、５〜８０アミノ酸のポリペプチドである。好ましくは、フラグメントは例えば転写インヒビタードメインおよび／またはＤＮＡ結合ドメインのような配列番号４の配列の機能的ドメインを含んでいる。「機能的変異体」という用語には、特には多形性、スプライシング、種間変化等の結果として生じる変異体である自然変異体が含まれる。上記用語は、合成変異体、詳細にはさらにまた１つ以上の残基の自然変異、欠失、置換および／または付加によって配列番号４の配列から引き出された配列を含むポリペプチドを含んでいる。好ましい方法では、人工変異体は配列番号４の配列との７５％の、いっそうより好ましくは少なくとも８５％の一次配列相同性を示す。フラグメントまたは変異体は、付加された異種領域または化学的、酵素的、免疫学的修飾等をさらに含有していてよい。例えば、上記修飾は受容体の生成または精製を促進したり、その安定性を改善したり、その活性を増加させたりすることができる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、「ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体」という用語は、ヒト起源の受容体、特に、配列番号４の配列またはそのフラグメントを含む受容体を意味する。
【００２５】
「Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子」という用語は、一般に本明細書の上記で定義したＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードするゲノムのいずれかの部分を意味する。
【００２６】
「Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物」または「ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸」という用語は、一般に本明細書の上記で定義したＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードするいずれかの核酸を意味する。それはＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、合成または半合成ＤＮＡであってよい。これらはライブラリーまたはプラスミドからクローン化することによって、または合成によって、または当業者に知られている他のいずれかの方法によって入手できる。
【００２７】
本発明の具体的な実施形態では、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物は配列番号３の配列、そのフラグメント、または中等度のストリンジェンシー条件下で上記とハイブリダイズし、ＲＥＶ  ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードするいずれかの配列を含む核酸である。
【００２８】
【表２】
2005525099.tif 000003
【００２９】
中等度のストリンジェンシー条件は、例えばManiatisらに記載されている。次の条件は一例として提供する：５０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、５×デンハルト溶液、０．１％のＳＤＳを含有する溶剤中における４２℃で１２時間にわたるインキュベーション。
【００３０】
典型的には、組換えのために使用する核酸（組換え核酸）または遺伝子構築物は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする領域に追加して、１つ以上の転写調節領域、典型的には転写プロモータおよび／またはターミネータを含んでいる。上記調節領域は、使用される宿主細胞によって選択される。好ましくは、それらは哺乳類細胞中で機能する調節領域である。例としては、ウイルスプロモータ（例えば；ＣＭＶ、ＬＴＲ、ＳＶ４０）等または細胞遺伝子由来の、誘導性または非誘導性、組織選択的または偏在性、強いまたは弱い、構成的または調節されたプロモータが含まれる。特定な実施形態では、プロモータは、例えば配列ＡＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＡＣＴＧＧＧＧＣＡ（配列番号２）を含むプロモータのような、例えば配列番号１の配列またはその一領域を含むＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子のプロモータである。
【００３１】
本発明の特定の実施形態では、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物は配列番号２および配列番号３の配列、そのフラグメント、または中等度のストリンジェンシーの条件下でそれらにハイブリダイズするいずれかの配列を含む核酸である。より具体的な実施形態では、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物は、配列番号１の配列またはそのフラグメントを含む転写プロモータ、特には配列番号２の配列を含む転写プロモータへ作動的に連結された配列番号４のポリペプチドをコードする配列を含む核酸である。
【００３２】
遺伝的に修飾された細胞
本発明の具体的の目的は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸を含む細胞集団に基づく。
【００３３】
細胞は、好ましくは哺乳類、例えばヒトの培養できるあらゆる細胞であってよい。それらは初代細胞または樹立細胞系であってよい。好ましくは、宿主細胞は前駆脂肪細胞である。上記細胞は、概して線維芽細胞タイプの細胞と定義されており、適切な培養条件下で脂肪細胞へ分化することができる。より詳細には、それらは軟骨芽細胞、骨芽細胞または筋芽細胞へは分化することはできず、問題の細胞に特異的な好ましい条件下では、脂肪細胞へ分化して脂肪細胞に特徴的な数種の分化マーカーを発現する中胚葉細胞である。本発明を実施するために有用な前駆脂肪細胞の例は、特に細胞系３Ｔ３−Ｌ１（ATCC reference：ＣＬ−１７３）、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ（Green H.ら, Cell 1975, 5: 19-27）、ｏｂ１７（Negrel R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75: 6054-6058）またはｏｂ１７７１（Doglio A.ら, Biochem J., 1986, 238: 123-129）である。
【００３４】
このため、本発明の具体的な目的は、遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞に基づいており、その細胞はＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸を含んでいる。
【００３５】
本発明の範囲内で使用できるその他の細胞の例は、原核細胞、酵母細胞または哺乳類細胞、特には胚細胞またはＣＨＯ細胞、線維芽細胞、Ｖｅｒｏ細胞等の細胞である。
【００３６】
細胞中に存在する組換え核酸は、上記細胞がＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を発現する、または細胞中に基礎発現が既に存在する場合は上記受容体を過剰発現することを可能にする。前駆脂肪細胞の場合は、核酸は概して細胞がＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現すること、つまり組換え核酸構築物の不在下で同一細胞中において観察されるより高いレベルで上記受容体を産生することを可能にする。「過剰発現」という用語は、一般的には係数２、より一般的には係数３、理想的には少なくとも係数５増加した発現を意味する。細胞は、好ましくは哺乳類細胞、特にはヒト細胞である。例えばマウス、ラット、サル、ハムスターの細胞等の、他の種からの細胞を使用できると理解されている。
【００３７】
本発明の具体的な目的は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する遺伝的に修飾された細胞、特には前駆脂肪細胞に関する。「遺伝的に修飾された」という用語は、細胞（またはその祖先）が上記受容体をコードする組換え核酸を含有するように修飾されたことを意味する。
【００３８】
典型的には、組換え核酸または遺伝子構築物は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする領域に追加して、上記で定義した１つ以上の転写調節領域、典型的には転写プロモータおよび／またはターミネータを含んでいる。核酸は、プラスミド、ウイルスベクター等中に存在していてよく、または組み込まれていてよい。核酸は細胞ゲノム内に統合されていてよく、または染色体外形態（複製型または非複製型）のままであってもよい。
【００３９】
本発明はさらにまた、その目的としてＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を発現する組換え細胞を、特にはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する遺伝的に修飾された前駆脂肪細胞または上記で定義した組換え核酸を調製する方法を有する。本発明は、一般には上記で定義した宿主細胞中でＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸を導入することを含んでいる。宿主細胞は、上記で記載したような、好ましくは前駆脂肪細胞、特には細胞系３Ｔ３−Ｌ１、３Ｔ３−Ｆ４４２Ａ、ｏｂ１７またはｏｂ１７７１等のいずれかの細胞集団であってよい。
【００４０】
本発明の好ましい第一実施形態によると、組換え細胞はＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物を含むプラスミドベクターを用いて宿主細胞をトランスフェクトすることによって入手される。有益な方法では、トランスフェクションは選択または耐性遺伝子をコードする第二遺伝子構築物の存在下で実施され、細胞は上記選択または耐性遺伝子およびＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡをコードする核酸の発現について選択される。
【００４１】
本発明の精神では、「トランスフェクション」という用語は一般に細胞内への核酸の移動を可能にする、いずれかの方法を意味する。この方法は、化学的、物理的、生物学的方法等であってよい。その例には、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、トランスフェクションを促進する例えば脂質、ポリマー、ペプチド等の物質の使用、あるいは「遺伝子銃」等の物理的技術の使用、発射体の使用、衝撃法等が含まれる。
【００４２】
特定の実施形態では、本方法は上記組換え核酸を含むプラスミドベクターおよび抗生物質耐性遺伝子を含むプラスミドベクターを用いて細胞をコトランスフェクトすることを含み、細胞が上記抗生物質に対するそれらの耐性および上記組換え核酸のそれらの発現について選択される。本発明の好ましい実施形態によると、組換え細胞はＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現するＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物および抗生物質耐性遺伝子を過剰発現する遺伝子構築物を用いて宿主細胞をコトランスフェクトすることによって入手される。組換え細胞は、次に抗生物質の存在下で選択され、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の過剰発現について試験される。
【００４３】
本発明の特定の実施形態によると、使用する抗生物質は非限定的例として提供する次の物質：ネオマイシン、ゼオシン、ヒグロマイシン、ブラスチシジン等からなる群から選択される。
【００４４】
本方法の特定の実施形態では、核酸は抗生物質耐性遺伝子もさらに含むプラスミドベクターを用いたトランスフェクションによって導入され、細胞が上記抗生物質に対するそれらの耐性および上記組換え核酸のそれらの発現について選択される。
【００４５】
本発明のこの変形によると、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の過剰発現を可能にするＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物は抗生物質耐性遺伝子の過剰発現を可能にする機能的カセットをさらに含む。組換え細胞は、次に抗生物質の存在下で選択され、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体のそれらの過剰発現について試験される。本発明の特定な実施形態では、使用する抗生物質は非限定的例として提供される次の物質：ネオマイシン、ゼオシン、ヒグロマイシン、ブラスチシジン等からなる群から選択される。
【００４６】
さらに別の実施形態では、核酸は抗生物質耐性遺伝子および真核生物複製起点をさらに含むプラスミドベクターを用いてトランスフェクトすることによって導入され、細胞が上記抗生物質に対するそれらの耐性および組換え核酸のそれらの発現について選択される。より具体的な実施形態では、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の過剰発現を可能にするＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物は抗生物質耐性遺伝子および真核生物複製起源の過剰発現を可能にする機能的カセットをさらに含む。組換え細胞は、次に抗生物質の存在下で選択され、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の過剰発現について試験される。本発明の特定な実施形態によると、使用する抗生物質は非限定的例として提供される次の物質：ネオマイシン、ゼオシン、ヒグロマイシン、ブラスチシジン等からなる群から選択される。
【００４７】
本発明のさらに別の好ましい実施形態によると、核酸は上記核酸を含むウイルスベクターを用いた感染により細胞内へ導入される。本発明の特に好ましい実施形態によると、導入はＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体、および場合によっては、選択または耐性遺伝子（「感染」）をコードする組換え核酸を含む組換えウイルスを使用することによって遂行される。
【００４８】
例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ヘルペスウイルス、組換えバキュロウイルス等の様々なタイプの組換えウイルスを使用できる。好ましい組換えウイルスは、組換えアデノウイルスおよびレトロウイルスである。
【００４９】
好ましい実施形態では、組換え細胞（有益にもＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードするＲＮＡを過剰発現する）は、宿主細胞、特には前駆脂肪細胞をウイルスベクター、好ましくはアデノウイルスまたはレトロウイルスベクターにより感染させることによって入手されるが、上記ベクターはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする核酸を含有する。
【００５０】
この態様では、本発明のさらに別の目的は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする組換え核酸を含むウイルスベクターである。本発明のさらに別の目的は、そのゲノム内にＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする核酸を含む組換えウイルスである。好ましくは、ウイルスベクターは複製欠損の、つまり細胞内で自己複製することのできないベクターである。典型的には、ウイルスベクターは複製のために必須の１個または数個のウイルス遺伝子に対して欠陥がある。レトロウイルスの場合は、主要ウイルス遺伝子はｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子である。アデノウイルスの場合は、主要遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ４およびＥ２領域内に含有される。ＡＡＶでは、ＲｅｐおよびＣａｐゲノム領域が関係する。１個または数個（または全部）のウイルス遺伝子について欠陥があって当該核酸を含むウイルスベクターの構築は、当業者には知られている。例えば、上記方法は、実施例において具体的に示すように、パッケージング細胞系および／またはベクターまたはヘルパーウイルスを利用する。
【００５１】
本発明の具体的な目的は以下に関係する：
−  ゲノム内に、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする核酸を含む欠陥のある組換えアデノウイルス。アデノウイルスは、好ましくはＣ群アデノウイルス、特にはＡｄ５であり、および／または有益にもＥ１Ａおよび／またはＥ１Ｂおよび／またはＥ４領域の全部または一部の欠失を含んでいる；
−  ゲノム内に、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする核酸を含む欠陥のある組換えレトロウイルス。レトロウイルスは、好ましくはＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）に由来するレトロウイルスまたはレンチウイルスであり、／または有益にもｇａｇおよび／またはｐｏｌおよび／またはｅｎｖ領域の全部または一部の欠失を有する。
【００５２】
本発明の特定な実施形態によると、細胞、特に前駆脂肪細胞の調製（例、トランスフェクション、感染）は、例えば配列番号３のようなＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする領域に追加して、１つ以上の転写調節領域、典型的には転写プロモータおよび／またはターミネータを含むＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物を用いて実施される。本発明の好ましい実施形態によると、これらは哺乳類細胞において機能的な調節領域である。非限定的例には、例えばウイルスプロモータ（例えば；ＣＭＶ、ＬＴＲ、ＳＶ４０）等または細胞遺伝子由来の、誘導性または非誘導性、組織選択的または偏在性、強いまたは弱い、構成的または調節されたプロモータが含まれる。
【００５３】
本発明の特定な実施形態によると、細胞（例、前駆脂肪細胞）の調製（例、トランスフェクション）は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする例えば配列番号３のような領域に追加して、例えば配列番号１の配列を含む、または例えば配列番号２のようなその一領域を含むＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子のプロモータを含むＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子構築物を用いて実施される。さらに別の特定な実施形態では、この調製は配列番号１および配列番号３の配列から選択された、またはそれらを含む配列を用いて遂行される。
【００５４】
本発明の組換え細胞を調製するために、宿主細胞はいずれかの適切な条件でＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子または組換え核酸またはベクターもしくはウイルスと接触させることができ、その後に組換え細胞が回収される。接触は、いずれかの適切な支持体上で、細胞タイプに適切ないずれかの培地（例えば：ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ等）中で実施できる。
【００５５】
特定な実施形態では、感染またはトランスフェクション後に、安定性培養細胞系が選択される。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする遺伝子を過剰発現する好ましい遺伝的に修飾された細胞は安定性細胞系である。
【００５６】
スクリーニング方法
本発明はさらに、脂肪細胞分化を調節することのできる化合物を同定し、選択し、特徴付け、または最適化するための方法を目的として有する。上記方法は、細胞検査または、例えば結合試験によってin vitroで実施することができる。上記方法は、分子標的として主としてＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体（または対応する核酸）を使用する。
【００５７】
第一実施形態では、本発明は前駆脂肪細胞を調節することのできる化合物を同定し、選択し、特徴付け、または最適化するための方法を目的として有するが、（i）検査すべき化合物が上記に定義した細胞（好ましくは前駆脂肪細胞）と接触させられ、（ii）上記細胞の脂肪細胞分化が測定または決定され、（iii）好ましくは、上記分化が試験すべき上記化合物の不在下で同一の上記細胞の脂肪細胞分化と比較される。
【００５８】
細胞は、好ましくは上記で定義した前駆脂肪細胞、より好ましくはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を（過剰）発現する前駆脂肪細胞である。
【００５９】
本発明の方法の好ましい実施形態によると、試験すべき化合物は脂肪細胞分化プログラムに関係する受容体の少なくとも１つのアクチベータ、または脂肪細胞分化プログラムに関係する受容体をコードする遺伝子の少なくとも１つのアクチベータの存在下または不在下で、細胞（好ましくはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する遺伝的に修飾された細胞）と接触する。
【００６０】
実際に、実施例に提示した結果は、驚くべき方法で、本発明の組換え細胞におけるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の発現が前駆脂肪細胞分化因子の作用へ前駆脂肪細胞を感作し、分化プログラムを促進することを示した。これらの条件下では、上記分化を調節する化合物の選択が大きく促進される。
【００６１】
本発明の第一変形では、限定するためではなく、例えばＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体のアクチベータ等の脂肪細胞分化プログラムに関与する受容体の少なくとも１つのアクチベータが使用される。例えば、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体アクチベータは、チアゾリジンジオン（ロシグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、ピオグリタゾン、ＫＲＰ−２９７）、Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−Ｌ−チロシン、１５−デオキシ−δ−１２，１４−プロスタグランジンＪ２からなるがそれらに限定されない群から選択される。
【００６２】
さらに別の変形では、脂肪細胞分化プログラムに関与する受容体の遺伝子の少なくとも１つのアクチベータが使用される。非限定的例は、試験すべき化合物をＰＰＡＲγ遺伝子の少なくとも１つのアクチベータの存在下または不在下でＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する遺伝的に修飾された細胞と接触させることである。好ましくは、ＰＰＡＲγ遺伝子のアクチベータはＣ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＡＤＤ１（ＳＲＥＢＰ１ｃ）からなる群から選択される。
【００６３】
化合物およびアクチベータは同時に、または連続的に細胞と接触させることができる。典型的には、アクチベータが最初に、次に試験化合物が添加される。
【００６４】
脂肪細胞分化は、分化した細胞を染色することによって測定できる。例えば染色液は染色液オイルレッドＯおよびスーダンブラックを含む群から選択される。
【００６５】
脂肪細胞分化もまた、脂肪酸の輸送または合成を決定することによって測定することもできる。
【００６６】
脂肪細胞分化は、分化した脂肪細胞に特異的な少なくとも１つのマーカー、好ましくはａＰ２、アジプシンおよびレプチンからなる群から選択されるマーカーの発現を決定することによって測定することもできる。
【００６７】
本発明の方法は、以下を可能にすることにおいて注目に値する：
−  Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の発現を調節することのできる化合物またはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである化合物等のＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の活性を調節することのできる化合物を同定する。詳細には、本発明の方法は脂肪細胞分化を増加させ、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子発現のアクチベータまたはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体のアゴニストを提示することのできる化合物の同定を可能にする。
−  ＰＰＡＲγ遺伝子アクチベータおよびＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体アクチベータの不在下で、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体アゴニストとして機能する脂肪細胞分化を増加させることのできる化合物を間接的に同定する。
【００６８】
具体的な実施形態によると、本発明の方法は以下を可能にする：
−  脂肪細胞分化を減少させ、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体アンタゴニストを提示することのできる化合物を同定する。
−  脂肪細胞分化を増加させ、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体アゴニストを提示することのできる化合物を同定する。
−  ＰＰＡＲγ遺伝子アクチベータおよび／またはＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体アクチベータの存在下で、脂肪細胞分化を減少させることのできる化合物を同定する。
−  ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体アゴニストである化合物を同定する。
【００６９】
受容体のアゴニストまたはアンタゴニストは、上記受容体に結合してその活性を各々活性化または阻害する化合物として理解されている。
【００７０】
試験化合物は様々な起源、および天然由来のものであってよい。試験化合物は、単離化合物、生物学的抽出物、有機または無機分子、分子ライブラリー（合成、ペプチド、核酸等）または微生物等であってよい。試験化合物は、いずれか適切な支持体上（または中）、および特にプレート上、チューブまたはフラスコ中、膜上等で核酸構築物または細胞と接触させることができる。一般に、接触は多数かつ種々の試験を平行して実施することを可能にするマルチウエルプレート内で実施される。典型的な支持体には、マイクロタイタープレート、および特に９６または３８４ウェル（またはそれ以上）を含有するプレートが含まれる。支持体および試験化合物の性質に依存して、本明細書に記載した方法を実践するためには様々な量の細胞を使用できる。伝統的には、１０3〜１０6cellsが、好ましくは１０4〜１０5cellsが１つのタイプの試験化合物と、適切な培地中で接触する。試験化合物の量（または濃度）は、使用者が化合物のタイプ（その毒性、細胞の内側へ浸透する能力等）、細胞数、インキュベーション時間等によって調整することができる。一般に、細胞は１nM〜１mMの範囲の量の試験化合物へ曝露させられる。当然ながら、本発明から逸脱することなく他の濃度を試験することは可能である。各化合物は、さらにまた相違する濃度で平行して試験することもできる。さらに、様々なアジュバントおよび／またはベクターおよび／または細胞内への化合物の浸透を促進する物質もまた必要であれば使用できる。接触は、例えば数分間から数時間または数日間、詳細には５〜７２時間、一般には１２〜４８時間維持できる。
【００７１】
さらに別の実施形態によると、本発明の方法はＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の発現を調節する、特にＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータ上へのＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の作用を調節することのできる化合物を選択することを含む。事実上、本発明者らは現在では、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体がＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体発現の調節を担っていること、上記調節がＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体とＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータとの、特に配列番号２のＲｅｖ−ＤＲ２領域での相互作用を含んでいることを証明した。
【００７２】
本発明は、脂肪細胞分化を調節することのできる化合物を同定し、選択し、最適化し、または特徴付けるための方法にさらに関するが、この方法は（i）試験化合物とＲｅｖ−ＤＲ２配列またはその機能的等価物を含む核酸とを接触させ、（ii）上記核酸へのＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の結合を検証し、および任意で（iii）上記結合を試験化合物の不在下で観察される結合と比較することを含み、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体結合を調節する試験化合物は脂肪細胞分化を調節する化合物である。
【００７３】
結果として生じる試験化合物、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体またはＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体および上記試験化合物から形成された複合体の応答エレメントへの結合の測定は、例えば上記結合後に応答エレメントによって産生するシグナルによって検出するように、当業者に知られているいずれかの方法によって実施できる。これらは、例えばレポーター遺伝子、結合試験等を使用する方法のような、直接法または間接法であってよい。
【００７４】
従って、本発明の特定な方法は、試験化合物および配列Ｒｅｖ−ＤＲ２（配列番号１または好ましくは配列番号２）またはその機能的等価物を含む核酸を、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の存在下で接触させ、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体から上記核酸への結合を検証することを含んでいる。有益な方法では、結合は試験化合物の不在下で観察される結合と比較される。さらに別の実施形態では、試験化合物およびＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体が、（i）配列番号１の配列、好ましくは配列番号２の配列の１つ以上のコピーまたはその機能的変異体を含む転写プロモータおよび（ii）レポーター遺伝子を含むレポーター系と接触させられ、試験化合物の活性がＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体によって誘導されたレポーター遺伝子発現へのその作用を測定することによって決定される。
【００７５】
従って、本発明の具体的な目的は、脂肪細胞分化を調節することのできる化合物を同定し、選択し、最適化し、または特徴付ける方法に関するが、この方法は試験化合物およびＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体を（i）配列番号１の配列、好ましくは配列番号２の配列の１つ以上のコピーまたはその機能的変異体を含む転写プロモータおよび（ii）レポーター遺伝子を含むレポーター系と接触させ、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体によって誘導されたレポーター遺伝子発現への試験化合物の作用を測定することによって試験化合物の活性を評価することを含んでいる。
【００７６】
レポーター遺伝子は、その配列が配列番号２の配列またはその機能変異体を含むいずれかのプロモータ（例えば、配列番号１）の制御下に置くことができる。上記特定な配列は、プロモータ内に１つ以上（好ましくは１〜１０およびいっそうより好ましくは１〜６）のコピーで、上流または下流または内部に、同一方向または反対方向で存在していてよい。本発明の好ましい実施形態では、レポーター遺伝子は配列番号２の配列の１つ以上のコピーを含むプロモータの制御下に置かれる。好ましくは、そのプロモータは、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体または機能的等価物の不在下および存在下で様々な活性を検出できるプロモータである。
【００７７】
これに関して、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の応答エレメントは転写最小プロモータと結び付けることができる。最小プロモータは、基礎活性が弱い、または基礎活性が存在しない、転写アクチベータ（例えば、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体）の存在下で増加させることのできる転写プロモータである。このため最小プロモータは哺乳類細胞中の自然に弱い、すなわち顕著な生物学的作用を入手するための非毒性および／または不十分な発現を産生するプロモータであってよい。有益な方法では、最小プロモータは転写活性にとって必須ではない領域を欠失することによって、天然プロモータから調製された構築物である。例えば、好ましくは、一般にサイズが１６０ヌクレオチド未満で転写開始コドンを取り囲む中心に位置するＴＡＴＡボックスを主として含んでいるプロモータである。最小プロモータは、例えばヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子プロモータ、ＣＭＶ前初期プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＳＶ４０プロモータ等の、強い、または弱いウイルスプロモータ、細胞プロモータであってよい。
【００７８】
好ましい実施形態では、レポーター遺伝子は配列番号１の非コード配列を含むプロモータのようなＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの制御下に置かれる。
【００７９】
本発明のスクリーニング法ではあらゆるレポーター遺伝子を使用できる。中でも、その例にはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ホタル（Ｌｕｃ）またはウミシイタケ（Ｒｅｎ）のルシフェラーゼ遺伝子、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子が含まれる。上記遺伝子によってコードされたタンパク質の活性は、従来型方法によって容易に測定でき、産生したタンパク質および／またはそれらの酵素活性の量を測定することによって、遺伝子発現への核受容体の作用についての間接的知識を提供する。レポーター系は、有益にも原核生物または真核生物であってよい細胞集団内に導入される。
【００８０】
本発明のさらに別の目的は、ヒトまたは動物の身体の治療またはワクチン処置の方法、特に代謝疾患、特に糖尿病、肥満症、インスリン抵抗性およびＸ症候群の治癒的または予防的治療を実施する目的で薬剤を調製するために、上記に記載した方法により同定された、選択された、特徴付けられた、または最適化された化合物の使用である。
【００８１】
本発明のさらに別の目的は、（i）上記に記載したような脂肪細胞分化を調節することのできる化合物を選択し、および（ii）選択した化合物、またはそのアナログを医薬上許容されるビヒクルと接触させることを含む薬剤を調製する方法に基づく。
【００８２】
本発明のさらに別の目的は、（i）上記に記載した脂肪細胞分化を調節することのできる化合物を選択し、および（ii）選択した化合物、またはそのアナログを合成することを含む脂肪細胞分化に活性な化合物を調製する方法である。
【００８３】
本発明の他の態様および利点は、本発明を限定するためではなく、例示のために提供される下記の添付の図面に記載の実施例において明白になるであろう：
−  図１は、ロシグリタゾン（ＢＲＬ）を用いて治療された、または治療されていないラットの脂肪組織から抽出されたｍＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す：
成体雄性ラットに１４日間にわたりロシグリタゾン（１０mg/kg/日）または賦形剤（１％のカルボキシメチルセルロース）のいずれかを投与した。ラットを致死させて解剖し、全ＲＮＡを精巣上体および腎周囲脂肪組織から抽出した。プローブとしてＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｃＤＮＡ（上方パネル）またはβ−アクチンｃＤＮＡ（下方パネル）を使用するノーザンブロットによって、１０μgのｍＲＮＡを分析した。
【００８４】
−  図２は、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞中でのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｍＲＮＡ発現のロシグリタゾン（ＢＲＬ）誘導を示す。
１０％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ培地中で３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞をコンフルエンスまで増殖させた。細胞がコンフルエンスへ到達したら、細胞は１０％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ培地へ移し、９日間にわたりＩＢＭＸ、デキサメタゾン、インスリンを含有し、ロシグリタゾン（水中で１μM）を含有する、または含有しない混合物を用いて刺激した。ＲＮＡを単離し、ノーザンブロットによって分析した。
【００８５】
−  図３は、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータおよびＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の活性のロシグリタゾン（ＢＲＬ）誘導を示す。
３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の存在下でクローン化されたＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの１．７kbフラグメントを含むプラスミドおよびマウスＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体を発現するプラスミドｐＳＧ５−ＰＰＡＲγまたは対応する空ｐＳＧ５ベクターを用いてトランスフェクトした。細胞はロシグリタゾン（１μM）を用いて処置し、以前に記載したとおりにルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８６】
−  図４は、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体によるＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータ活性の誘導においてＲｅｖ−ＤＲ２部位が果たす役割を示す。
−  図４Ａは、野生型または変異型Ｒｅｖ−ＤＲ２部位を含有するヒトＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ遺伝子のプロモータを含有する構築物の活性にＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体が及ぼす作用を示す。
−  図４Ｂは、ＳＶ４０プロモータの上流にある２つのコピー内でクローン化された野生型または変異型Ｒｅｖ−ＤＲ２部位を含有するヒトＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ遺伝子のプロモータを含有する構築物の活性にＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体が及ぼす作用を示す。
Ｃｏｓ細胞は、指示したレポーター構築物およびｐＳＧ５−ＰＰＡＲ−γまたはｐＳＧ５プラスミドを用いてトランスフェクトした。細胞はロシグリタゾン（ＢＲＬ）を用いて処置し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８７】
−  図５は、ＲＸＲ  ＡＬＰＨＡ核受容体とのヘテロダイマーとしてＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータのＲｅｖ−ＤＲ２部位へ結合するＰＰＡＲγ受容体についての電気泳動ゲルシフト実験を示す。
電気泳動ゲルシフト試験は、マウスＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体、マウスＲＸＲ  ＡＬＰＨＡ受容体、網状赤血球溶解液により産生したヒトＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体、または非プログラム化溶解液（溶解液）の存在下で、指示した末端標識オリゴヌクレオチドを使用することによって実施した。結合競合実験は、０、１０または１００倍過剰の非標識Ｒｅｖ−ＤＲ２部位オリゴヌクレオチドを添加することによって実施した。
【００８８】
−  図６は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現が３Ｔ３−Ｌ１細胞中の脂質蓄積を刺激することを示す。
【００８９】
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、対照レトロウイルス（ＭＦＧ−Ｎｅｏ）またはＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現するレトロウイルス（ＭＦＧ−Ｒｅｖ−ｅｒｖα）を用いて感染させた。結果として生じた細胞は、１μMのロシグリタゾン（ＢＲＬ）を用いて、または用いずに８日間にわたり分化するように誘導した。その後、細胞を固定し、オイルレッドＯを用いて染色した。
−  図６Ａ、ＣおよびＤはオイルレッドＯ染色した細胞の顕微鏡検査の画像を示す。
−  図６Ｂは、オイルレッドＯ染色したプラークの肉眼検査の画像を示す。
−  図６Ｅは、ウエスタンブロットによって試験したＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡタンパク質（Ｅｃｔｏ−ＲｅｖまたはＥｎｄｏ−Ｒｅｖ）の外因性または内因性発現を示す。免疫細胞化学的実験およびウエスタンブロット実験には、合成ペプチドに対して向けられたウサギ抗ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡポリクローナル抗体（ヒト配列のアミノ酸２６３−３６５によって構成される）を使用した。
【００９０】
−  図７は、脂肪細胞分化マーカーとして使用したＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体およびａＰ２遺伝子に対するｍＲＮＡの発現にＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現が及ぼす作用を示す。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、ＭＦＧ−ＮｅｏまたはＭＦＧ−ＲＥＶレトロウイルスのいずれかを用いて感染させ、ＩＢＭＸおよびインスリンを含有する混合物（「Ｍｉｘ」）を用いて、１μMのロシグリタゾンを用いて、または用いずに８日間処置した。次にｍＲＮＡを抽出し、指示したプローブを使用してノーザンブロットによって分析した。
【００９１】
本発明のその他の利点および特徴は、スクリーニング方法の設計および実施を導く本発明者らが実施した試験を記載する下記の実施例において明白になるであろう。
【００９２】
１−材料および方法
材料
Rosiglitiazone（参照番号、ＢＲＬ４９６５３）はA. Bill（ＳＫＢ、フランス国レンヌ）によって提供され、ＧＰ+Ｅ８６細胞はコロンビア大学（米国ニューヨーク州ニューヨーク）から、ｐＭＦＧプラスミドはマサチューセッツ工科大学（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）から提供された。
【００９３】
動物
１０週齢の雄性Sprague-Dawley系ラットに、１４日間にわたり胃管投与により１％のカルボキシメチルセルロース中のrosiglitiazone（１０mg/kg/日）懸濁液を投与した。対照動物には、等価量（５mL/kg/日）のカルボキシメチルセルロース溶液を投与した。実験終了時に、動物はエーテル麻酔下で致死させた。直ちに脂肪組織を切除し、液体窒素中で冷凍した。
【００９４】
ＲＮＡ分析
ＲＮＡ抽出およびノーザンブロット分析は、ラットＲｅｖ−ｅｒｂα、マウスＰＰＡＲγおよびマウスａＰ２、ニワトリβ−アクチンおよびヒト３６Ｂ４  ｃＤＮＡプローブを使用して、以前に記載された方法（Staels B.ら, Arteriosclerosis and Thrombosis 1992, 12(3):286-294）によって実施した。
【００９５】
トランスフェクション実験
プロモータの少ないプラスミドｐＧＬ２またはプラスミドＳＶ４０  ｐＧＬ２中でクローン化されたＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータのフラグメントを含む構築物（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）は、既に記載されている（Adelmant G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(8): 3553-3558）。ヒトＨｅｐＧ２肝臓癌細胞はヨーロッパ培養動物細胞コレクション（英国サリズベリー、ポートン・ダウン）から入手し、３Ｔ３−Ｌ１細胞はアメリカン・タイプ・セル・カルチャー（ＡＴＣＣ）から入手した。細胞は、３７℃の加湿５％ＣＯ2大気中において２mMのグルタミンおよび１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補給したＤＭＥＭ培地中で増殖させた。トランスフェクションはすべて３回ずつ実施した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ試験系（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）を使用して全細胞抽出液について決定した。
【００９６】
In vitro翻訳およびゲルシフトアッセイ
ｐＳＧ５−ｍＰＰＡＲ−γ、ｐＳＧ５−ｍＲＸＲ−αおよびｐＳＧ５−ｈＲｅｖ−ｅｒｂαプラスミドはＴ７ポリメラーゼを用いてin vitroで転写させ、ウサギ網状赤血球溶解液系（Promega、米国ウィスコンシン州マディソン）を用いて翻訳させた。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡおよび／またはＲＸＰ  ＡＬＰＨＡタンパク質を用いたゲルシフト実験は、以前に記載されたように実施した（Gervois P.ら, Molecular Endocrinology 1999, 13(3): 400-409; Vu-Dac N.ら, J. Biol. Chem. 1994, 269(49): 31012-31018）。競合実験のためには、標識したオリゴヌクレオチドを添加する直前に、指示した非標識プローブを、量を増加させながら添加した。複合体は室温で０．２５×ＴＢＥバッファー（９０mMのホウ酸塩、２．５mMのＥＤＴＡ、pH８．３）を使用して５％のポリアクリルアミドゲル中に溶解させた。ゲルを乾燥させ、Rayon-Xフィルム（XOMAT-AR、Eastman Kodak、米国ニューヨーク州ロチェスター）上で、−７０℃で一晩曝露させた。
【００９７】
ウイルスの産生および感染
ＧＰ+Ｅ８６ウイルスパッケージング細胞（Markowitz D.ら, J. Virol. 1988, 62(4):1120-1124）を、３７℃の９５％加湿空気／５％ＣＯ2大気下で、１０％熱不活化ウシ血清（HyClone、米国ユタ州ローガン）、８μg/mLのゲンタマイシン、５０U/mLのペニシリン、５０μg/mLのストレプトマイシンを補給したＤＭＥＭ培地（４．５ｇ/Ｌのグルコース）中において増殖させた。
【００９８】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を構成的に過剰発現する細胞系を発生させるために、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする配列は、ｐＭＦＧ−Ｒｅｖ−ｅｒｂαプラスミドを産生するために、ＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ部位を使用してレトロウイルスプラスミドＭＦＧ（Dranoff G.ら， Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 1993, 90(8):3539-3543）の内部リボソームエントリー部位およびネオマイシン耐性遺伝子ｐＣＩＴＥの上流に挿入した。
【００９９】
試験全体を通して、対照としてＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体配列が欠如した類似の構築物（ｐＭＦＧ−Ｎｅｏ）を使用した。
【０１００】
バイシストロン性構築物は、感染細胞中でのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体およびネオマイシン耐性遺伝子産物の類似の発現を可能にするように設計された。組換えウイルスを産生するために、ＧＰ+Ｅ８６細胞（１５，０００/ cm2）はリポフェクタミン（Life Technologies-Invitrogen、オランダ国フローニンヘン）を使用し、ゲネチシンアナログＧ４１８（０．８mg/mL、Life Technologies-Invitrogen、オランダ国フローニンヘン）を用いて耐性クローンを選択することによりＭＦＧプラスミド構築物（２μg）を用いてトランスフェクトした。３Ｔ３−Ｌ１細胞は記載されたようにＧＰ+Ｅ８６細胞により産生したＭＦＧ−ＮｅｏまたはＭＦＧ−Ｒｅｖ−ｅｒｂαウイルスを用いて感染させ（Mattot V.ら， Oncogene 2000, 19(6): 762-772）、安定性細胞系が確立するまで（約１０日間）ゲネチシンに対する耐性について選択した。
【０１０１】
細胞培養および分化
３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣから入手した）は、１０％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ増殖培地中で増殖させた。細胞はBernlohrらの方法によって分化させた（Bernlohr D.A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81(17): 5468-5472）。
【０１０２】
培養２日後（Ｄ０日と称する）のコンフルエント後の細胞は２日間にわたり分化培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ、１μMのデキサメタゾン、１０μg/mLのインスリンおよび０．５mMの３−メチル−１−イソブチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Sigma、米国ミズーリ州セントルイス））へ移した。細胞は次に、ロシグリタゾンを含む、または含まない分化後培地（ＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳ、インスリン）中で増殖させた。培地は毎日取り換えた。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を発現する安定性３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞は、デキサメタゾンを使用せずに分化させる以外は同一条件で増殖させた。処置後、細胞はＰＢＳ中の１０％のホルムアルデヒドを用いて固定し、オイルレッドＯ（Sigma、米国ミズーリ州セントルイス）を用いて染色した。あるいはまた、全ＲＮＡを以前に記載されたように抽出した。
【０１０３】
結果
ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の活性化は、ラット脂肪組織中のＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の発現を増加させる。
ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の活性化がin vivoでのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の発現に作用を及ぼすかどうかを決定するために、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の高度に特異的な活性リガンドであるロシグリタゾン（ＢＲＬと称する）を用いてラットを１４日間にわたり処置した。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の発現は、副睾丸および腎周囲脂肪組織中でノーザンブロット法により分析した。対照と比較すると、ロシグリタゾンを用いた処置は試験した脂肪組織中のＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｍＲＮＡのレベルを急激に増加させた（図１）。対照として使用したβ−アクチンｍＲＮＡのレベルは処置によって影響を受けなかった。これらの実験は、ロシグリタゾンによるＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の活性化が脂肪組織中のＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の発現を増加させることを証明している。
【０１０４】
ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の活性化は３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞中でのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｍＲＮＡを誘導する。
この誘導の分子機序を調査するために、本発明者らは３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞中でのロシグリタゾンによるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｍＲＮＡ発現の調節を試験した（図２）。３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞は、１０％ウシ胎児血清を補給した培地中でコンフルエンスまで増殖させた。コンフルエントな細胞は脂質を欠失している血清を含有する培地へ移し、デキサメタゾン、ＩＢＭＸ、インスリンを含有し、ロシグリタゾン（１μM）を含む、または含まない混合物を用いて細胞を分化させた。
【０１０５】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体のレベルは、前駆脂肪細胞が脂肪細胞へ分化するにつれて増加した。しかし、標準分化処置と比較すると、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｍＲＮＡのレベルはロシグリタゾンが存在した場合より速く誘導された。上記レベルは、十分に分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞中の９日後より有意に高かった。
【０１０６】
対照として使用したβ−アクチンｍＲＮＡのレベルは脂質生成中には実際的に変化せず、ロシグリタゾンを用いた処置による影響を受けなかった。
【０１０７】
ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体は、転写レベルでのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体発現を誘導する。
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｍＲＮＡの誘導が転写レベルで発生するかどうかを解明するために、本発明者らはＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの１．７kbフラグメントの制御下で、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の過剰発現およびロシグリタゾンによる刺激がルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む構築物の転写活性に及ぼす作用を試験した。
【０１０８】
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、マウスＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体、または対応する空ベクターｐＳＧ５の発現を可能にするｐＳＧ５−ＰＰＡＲ−γ発現の存在下で、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの１．７kbフラグメントの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む構築物を用いてトランスフェクトし、ロシグリタゾンまたは賦形剤を用いて処置した。
【０１０９】
Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの活性化はＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の過剰発現により誘導され、その作用はロシグリタゾンの存在下ではさらに増幅された（図３）。他方、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの１．７kbフラグメントの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む構築物が単独でトランスフェクトされた場合は、作用は全く観察されなかった。これらの観察所見は、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の転写がＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の活性化を通してロシグリタゾンによって誘導されることを示している。
【０１１０】
核受容体の「ＤＲ２」応答エレメントとの強度の相同性を示すＲｅｖ−ＤＲ２と称するエレメントがＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータ内で同定された。上記ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体がこの部位に結合し、その部位を介して自己の転写を抑制することが証明された（Adelmant G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(8): 3553-3558）。このエレメントは、それにＰＰＡＲα／ＲＸＲ  ＡＬＰＨＡヘテロダイマーが結合して肝臓中のＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子へのフィブラート応答を付与する応答エレメントとしても同定された（Gervoisら, Mol. Endocrinol. 1999, 13: 400-409）。
【０１１１】
Ｒｅｖ−ＤＲ２部位が脂肪組織中のＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の応答エレメントとしても機能できることを確証するために、本発明者らは以前に記載されたｐＧＬ２−ｈＲｅｖ−ｅｒｂαδおよびｐＧＬ２−ｈＲｅｖ−ｅｒｂαΔと称するＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの野生型および短縮形バージョンを含む構築物を使用して一過性トランスフェクション実験を実施した（Adelmant G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(8): 3553-3558）（図４）。Ｒｅｖ−ＤＲ２部位が脂肪組織中のＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の応答エレメントとしても機能できることを確証するために、本発明者らはＳＶ４０プロモータの上流でクローン化されたＲｅｖ−ＤＲ２部位の野生型および突然変異型を含む以前に記載された構築物（Ｒｅｖ−ＤＲ２、Ｒｅｖ−ＤＲ２Ｍ５’およびＲｅｖ−ＤＲ２Ｍ３’）を使用して一過性トランスフェクション実験もさらに実施した（Adelmant G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(8): 3553-3558）（図４）。ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体発現ベクターならびにＳＶ４０プロモータおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流でクローン化された野生型Ｒｅｖ−ＤＲ２部位の２つのコピーを含むレポーターベクターを用いたＨｅｐＧ２細胞のコトランスフェクションは、空ｐＳＧ５ベクターを用いて観察されたレベルと比較して２．５倍大きな転写活性の誘導を導いた。他方、レポーターベクターが３’または５’位置のいずれかで変異型Ｒｅｖ−ＤＲ２部位の２つのコピーを含むときは影響が所見されなかった。ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の過剰発現の作用は、ロシグリタゾンの存在下では増幅された。これらの結果は、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの活性化がＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体によって調節されること、この誘導がＲｅｖ−ＤＲ２部位を通して実行されることを明確に証明している（図４）。
【０１１２】
ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体はＲＸＲ  ＡＬＰＨＡ受容体を備えるヘテロダイマーとしてＲｅｖ−ＤＲ２部位へ結合する。
最後に、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体のＲｅｖ−ＤＲ２部位への結合について試験した。電気泳動移動度を測定する試験（ゲルシフトまたは電気泳動移動度シフトアッセイ）をin vitroで合成したＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡおよびＲＸＲ  ＡＬＰＨＡタンパク質を使用して実施した。対照として、in vitro産生ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体はモノマーおよびホモダイマーの両方として野生型Ｒｅｖ−ＤＲ２部位へ結合することが証明された（図５）。これとは対照的に、Ｒｅｖ−ＤＲ２オリゴヌクレオチドが以前に記載されたようにＡＧＧＴＣＡ半部位に位置する５’（Ｍ５’）上で突然変異を有する場合には結合は観察されなかった（Adelmant G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(8): 3553-3558）。最終的に、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体は以前に記載されたようにＡＧＧＴＣＡ半部位に位置する３’（Ｍ３’）上で突然変異を有するＲｅｖ−ＤＲ２部位へモノマーとして結合した（Adelmant G.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(8): 3553-3558）。ＲＸＲ  ＡＬＰＨＡまたはＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体は単独ではオリゴヌクレオチドのいずれにも結合せず、これはＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡおよびＲＸＲ  ＡＬＰＨＡがモノマー形では結合できないことを指示している。Ｒｅｖ−ＤＲ２部位への結合は、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体がＲＸＲ  ＡＬＰＨＡ受容体とともにインキュベートしたときに所見された。結合は、それが過剰な非標識オリゴヌクレオチドと競合できたので特異的であった。これとは対照的に、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ／ＲＸＲ  ＡＬＰＨＡ複合体は変異型Ｒｅｖ−ＤＲ２部位（Ｍ５’またはＭ３’）へ結合しなかった。これらの結合試験は、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡはＲＸＲ  ＡＬＰＨＡを備えるヘテロダイマーとしてＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータの無傷Ｒｅｖ−ＤＲ２部位へ結合することを証明している。
【０１１３】
ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体はＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の脂肪生成性活性を増加させる。
脂肪生成におけるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の関与を直接的に確証するために、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体をコードする全ｃＤＮＡをレトロウイルスベクター内にクローン化した。３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞は、その後結果として生じたウイルスを用いて感染させた。ＭＦＧ−Ｎｅｏウイルス（陰性対照）またはＭＦＧ−Ｒｅｖ−ｅｒｂαウイルスのいずれかを用いた感染後にＧ４１８（ネオマイシン）を用いての抗生物質選択により確立された安定性細胞系をコンフルエンスまで増殖させ、その後ＩＢＭＸ、インスリンを含有し、ロシグリタゾン（ＢＲＬ）（１μM）を含む、または含まない分化培地（Ｍｉｘと称した）を用いて処置した。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡの内因性またはウイルス誘導性発現は、免疫細胞化学的分析またはウエスタンブロットによって試験した（図６Ｅ）。ＭＦＧ−Ｎｅｏを用いて感染させた細胞は、ＭＦＧ−Ｎｅｏ感染対照細胞と比較して高レベルのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を発現した。
【０１１４】
ロシグリタゾンの不在下では、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現は前駆脂肪細胞の極めて弱い形態的分化しか誘導しなかった。ロシグリタゾン（１μM）の存在下では、対照細胞と比較してＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を発現する細胞中で前駆脂肪細胞分化および脂質蓄積の増加が生じた。事実上、固定およびオイルレッドＯを用いた染色後に、ロシグリタゾンの不在下では脂質の弱い蓄積が観察されたが、８日間にわたるロシグリタゾンを用いて処置したＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を発現する細胞中では高脂質蓄積が所見された。ホルモン刺激を使用せずにロシグリタゾン単独で同一の結果を入手するためには、細胞は１６日間分化させなければならなかった（データは示していない）。
【０１１５】
これらの形態的変化は、脂肪細胞特異的マーカーのｍＲＮＡレベルにおける類似変動と平行して発生した。ノーザンブロット分析は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を発現する細胞中でＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体およびａＰ２の弱いが有意な発現を証明した（図７）。ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の内因性レベルは、驚くべき方法でＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する細胞中では乱された。ａＰ２およびＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体ｍＲＮＡレベルは４日間だけの分化後にロシグリタゾン混合物を用いて（図７）、またはロシグリタゾン単独を用いて（図７）処置されたＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を発現する細胞中で高かった。この現象は対照細胞中では８〜１２日間までは観察されなかった。これらの所見は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現はホルモン刺激なしで弱い作用を有し、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡリガンド活性化によって脂肪生成の誘導を増幅することを証明している。
【０１１６】
この方法で、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体を過剰発現する本発明の前駆脂肪細胞系の使用は、脂肪生成転写因子カスケードにおけるＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体にとっての新規標的遺伝子としてのＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子の同定を可能にした。脂肪細胞分化プロセスにおけるＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の有効な役割についてのこの観察によって、本発明者らは脂肪細胞調節に関与する活性化合物を同定する新規スクリーニング方法を開発することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、ロシグリタゾン（ＢＲＬ）を用いて治療された、または治療されていないラットの脂肪組織から抽出されたｍＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。
【図２】図２は、３Ｔ３−Ｌ１前駆脂肪細胞中でのＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体ｍＲＮＡ発現のロシグリタゾン（ＢＲＬ）誘導を示す。
【図３】図３は、Ｒｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータおよびＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体の活性のロシグリタゾン（ＢＲＬ）誘導を示す。
【図４Ａ】図４は、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体によるＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータ活性の誘導においてＲｅｖ−ＤＲ２部位が果たす役割を示す。  図４Ａは、野生型または変異型Ｒｅｖ−ＤＲ２部位を含有するヒトＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ遺伝子のプロモータを含有する構築物の活性にＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体が及ぼす作用を示す。
【図４Ｂ】図４は、ＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体によるＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータ活性の誘導においてＲｅｖ−ＤＲ２部位が果たす役割を示す。  図４Ｂは、ＳＶ４０プロモータの上流にある２つのコピー内でクローン化された野生型または変異型Ｒｅｖ−ＤＲ２部位を含有するヒトＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ遺伝子のプロモータを含有する構築物の活性にＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体が及ぼす作用を示す。
【図５】図５は、ＲＸＲ  ＡＬＰＨＡ核受容体とのヘテロダイマーとしてＲｅｖ−ｅｒｂα遺伝子プロモータのＲｅｖ−ＤＲ２部位へ結合するＰＰＡＲγ受容体についての電気泳動ゲルシフト実験を示す。
【図６Ａ】図６は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現が３Ｔ３−Ｌ１細胞中の脂質蓄積を刺激することを示す。  図６Ａは、オイルレッドＯ染色した細胞の顕微鏡検査の画像を示す。
【図６Ｂ】図６は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現が３Ｔ３−Ｌ１細胞中の脂質蓄積を刺激することを示す。  図６Ｂは、オイルレッドＯ染色したプラークの肉眼検査の画像を示す。
【図６Ｃ】図６は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現が３Ｔ３−Ｌ１細胞中の脂質蓄積を刺激することを示す。  図６Ｃは、オイルレッドＯ染色した細胞の顕微鏡検査の画像を示す。
【図６Ｄ】図６は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現が３Ｔ３−Ｌ１細胞中の脂質蓄積を刺激することを示す。  図６Ｄは、オイルレッドＯ染色した細胞の顕微鏡検査の画像を示す。
【図６Ｅ】図６は、ＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現が３Ｔ３−Ｌ１細胞中の脂質蓄積を刺激することを示す。  図６Ｅは、ウエスタンブロットによって試験したＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡタンパク質（Ｅｃｔｏ−ＲｅｖまたはＥｎｄｏ−Ｒｅｖ）の外因性または内因性発現を示す。
【図７】−  図７は、脂肪細胞分化マーカーとして使用したＰＰＡＲ  ＧＡＭＭＡ受容体およびａＰ２遺伝子に対するｍＲＮＡの発現にＲＥＶ−ＥＲＢ  ＡＬＰＨＡ受容体の外因性発現が及ぼす作用を示す。
【図３】
2005525099.tif 000004
【図４Ａ】
2005525099.tif 000005
【図４Ｂ】
2005525099.tif 000006
【図６】
2005525099.tif 000007
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【配列表】
2005525099000001.app
【国際調査報告】
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2005525099.tif 000014
2005525099.tif 000015
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