(57)【要約】アポフォールディング状態のα−ラクトアルブミンもしくはα−ラクトアルブミンの変異体、または、これらいずれかの断片、および、生物学的に活性な型で複合体を安定化する補因子を含む、生物学的に活性な複合体であって、本複合体において、α−ラクトアルブミンまたはそれらの変異体の断片はいずれも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界面を形成する領域に対応する領域を含み、さらに、本複合体が天然型α−ラクトアルブミンを含む場合、前記補因子はＣ１８：１：９シス型脂肪酸以外である。これら複合体は、例えばガン処置における治療適用、および、抗菌剤としての治療適用を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポフォールディング状態のα−ラクトアルブミンもしくはα−ラクトアルブミンの変異体、または、これらいずれかの断片、および、複合体を生物学的に活性な型で安定化する補因子を含み、上記α−ラクトアルブミンまたはそれらの変異体の断片はいずれも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界面を形成する領域に対応する領域を含み、さらに、天然型α−ラクトアルブミンを含む場合、上記補因子はＣ１８：１：９シス型脂肪酸以外である、生物学的に活性な複合体。
【請求項２】
補因子は、Ｃ１８：１：９シス型もしくはＣ１８：１：１１シス型脂肪酸、または、構造が類似した異なる脂肪酸である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
（ｉ）Ｃ１８：１：９シス型もしくはＣ１８：１：１１シス型脂肪酸、または、構造が類似した異なる脂肪酸；および、（ｉｉ）カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン、または、カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン変異体もしくは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミン変異体；または、これらいずれかの断片を組み合わせることにより得ることができ、断片はいずれも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界面を形成する領域に対応する領域を含み、さらに、（ｉｉ）がα−ラクトアルブミンの場合、（ｉ）はＣ１８：１：９シス型脂肪酸以外である、請求項１に記載の生物学的に活性な複合体。
【請求項４】
カルシウム結合部位が、カルシウムに対する親和性が減少するように、または、機能しないように改変されたα−ラクトアルブミン変異体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
変異体は、Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７、および、Ｄ８８のいずれか一つにおける変異である、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
改変はＤ８７に存在し、Ｄ８７Ａ変異を有するα−ラクトアルブミン変異体、または、Ｄ８７Ｎ変異を有するα−ラクトアルブミン変異体を含む、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
α−ラクトアルブミンまたはそれらの変異体の断片を含み、該断片は、天然型タンパク質のアミノ酸３４〜８６の全領域を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
α−ラクトアルブミンは、ヒトもしくはウシα−ラクトアルブミン、または、これらいずれかの変異体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
α−ラクトアルブミンは、ヒトα−ラクトアルブミンである、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
α−ラクトアルブミンは、Ｓ７０Ｒ変異を含む変異ウシα−ラクトアルブミンである、請求項８に記載の複合体。
【請求項１１】
カルシウムイオンをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
製薬上許容できるキャリアーと組み合わせて、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の複合体、または、請求項１２に記載の組成物をガン細胞に投与することを含む、ガンの治療方法。
【請求項１４】
上述のような複合体または組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、細菌感染の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に活性な複合体、特に、アルファ−ラクトアルブミン（α−ラクトアルブミン）から誘導された複合体、それらを含む医薬組成物、および、治療における、特に抗ガン剤または抗菌剤としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳汁、特にヒトの乳汁から得られた生物学的に活性な複合体、および、抗菌剤としてのそれらの使用が、例えば欧州特許第０７７６２１４号に説明されている。
【０００３】
ＨＡＭＬＥＴ（以前はＭＡＬとして知られていた）は、健康な分化細胞ではなく腫瘍細胞で選択的にインビトロでのアポトーシスを誘導する分子複合体である。この変異型フォールドのアポトーシス活性は、低いｐＨでの沈殿により得られたヒトのミルクカゼイン分画で偶然発見されたものであり、イオン交換クロマトグラフィーで精製された（１Ｍ  ＮａＣｌの後に単一のピークとして溶離される）。分光分析により、その溶離液には、アポ様コンフォメーションで部分的にアンフォールドしたα−ラクトアルブミンが含まれることが示され（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（１９９９年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４，６３８８〜９６）、このα−ラクトアルブミンは、天然型様の二次構造を有するが、側鎖の特異的な三次的充填を欠く。アポトーシス誘導とフォールディング変化との関連は、天然型α−ラクトアルブミンをアポトーシス誘導型に意図的に変換することにより証明された（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。ＨＡＭＬＥＴは、腫瘍細胞の表面に結合し、細胞質に転移し、細胞核に蓄積され、ＤＮＡ断片化を引き起こすことがわかっている（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。
【０００４】
また、その他の試薬や、特にオレイン酸のような脂質が、ヒトα−ラクトアルブミンからＨＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞に致死的なヒトα−ラクトアルブミン；ｈｕｍａｎ  α−ｌａｃｔアルブミン  ｍａｄｅ  ｌｅｔｈａｌ  ｔｏ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ）への変換に有用であることもわかっている。特に、オレイン酸（Ｃ１８：１：９シス）が、ＨＡＭＬＥＴ産生に必要であることがこれまで報告されている（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。
【０００５】
Ｃａ2+に結合する７個の酸素のうち５個は、８２位、８７位および８８位のＡｓｐ残基の側鎖カルボキシレート、ならびに、Ｌｙｓ７９およびＡｓｐ８４のカルボニルの酸素に起因するものであり、２個の水分子が残りのリガンドを供給している（Ａｃｈａｒｙａ等，１９９１年）。結合したＣａ2+により、αヘリックスの領域とβシートとは極めて近接し、分子のこの部分は、Ｃａ2+結合部位の側にある２個のジスルフィド結合によりほとんど動かないようになっている。
【０００６】
α−ラクトアルブミンは、ヒトの乳汁において主要なタンパク質であり、ヒトの乳汁中、２ｍｇ／ｍｌ（１４０μＭ）の濃度で存在する。成熟タンパク質は、１２３個のアミノ酸残基（１４.２ｋＤａ）からなる。その三次元構造は１.７Åの解像度で決定されており、４個のαヘリックス（残基１〜３４、８６〜１２３）と、４個のジスルフィド結合（６１〜７７；７３〜９１；２８〜１１１、および、６〜１２０）により連結された三本鎖逆平行βシート（残基３８〜８２）を有する球状タンパク質である（Ｋ．Ｒ．Ａｃｈａｒｙａ等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２２１，５７１〜８１）。Ｃａ2+が一つの極めて高い親和性を有するＣａ2+結合部位へ結合するには、タンパク質が天然型のコンフォメーションを維持することが必要である。Ｃａ2+を結合させる７個の酸素のうち５個は、８２位置、８７位置および８８位置のＡｓｐ残基の側鎖カルボキシレート、ならびに、Ｌｙｓ７９およびＡｓｐ８４のカルボニルの酸素に起因するものであり、２個の水分子が残りのリガンドを供給している。結合したＣａ2+により、αヘリックスの領域とβシートとは極めて近接し、分子のこの部分は、Ｃａ2+結合部位の側にある２個のジスルフィド結合によりほとんど動かないようになっている。
【０００７】
このタンパク質は、低いｐＨに晒される場合、または、強く結合したＣａ2+イオンを解離するキレート化剤の存在下で、ＨＡＭＬＥＴで見られるいわゆるアポ状態をとる（Ｄ．Ａ．Ｄｏｌｇｉｋｈ等，（１９８１年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，１３６，３１１〜５；Ｋ．Ｋｕｗａｊｉｍａ，（１９９６年）Ｆａｓｅｂ  Ｊ，１０，１０２〜０９）。
【０００８】
本出願人等は、α−ラクトアルブミンの、アポトーシス活性を有するＨＡＭＬＥＴへの変換は、コンフォメーション変化またはフォールディング変化と、脂質補因子の存在との両方を必要とし、この変換は、α−ラクトアルブミンの変異体を用いて達成されることが好ましいことを見出した。コンフォメーション変化またはフォールディング変化は、カルシウムイオンの除去、または、カルシウムイオンを含まない変異体を用いることによって都合よく達成される。しかしながら、一度変化が達成されれば、カルシウムの存在または機能的なカルシウム結合部位は、活性の損失をほとんど起こさない。
【０００９】
その上、本出願人等は、α−ラクトアルブミンをＨＡＭＬＥＴに変換するのに最適な補因子が、９位または１１位でシスコンフォメーションの二重結合を有するＣ１８：１脂肪酸であることを見出した。トランスコンフォメーションの飽和Ｃ１８脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸、または、より短い炭素鎖を有する脂肪酸は、ＨＡＭＬＥＴを形成しなかったことから、このシステムにおいて脂質をフォールディングパートナーとして機能させるには極めて特異的な分子間の相互作用が必要であることが示される。
【００１０】
本発明によれば、アポフォールディング状態のα−ラクトアルブミンもしくはα−ラクトアルブミンの変異体、または、これらいずれかの断片、および、複合体を生物学的に活性な型で安定化する補因子を含む、生物学的に活性な複合体が提供され、本複合体において、α−ラクトアルブミンまたはそれらの変異体の断片はいずれも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界面を形成する領域に対応する領域を含み、さらに、本複合体が天然型α−ラクトアルブミンを含む場合、前記補因子はＣ１８：１：９シス型脂肪酸以外である。
【００１１】
特に、補因子は、シスＣ１８：１：９もしくはＣ１８：１：１１脂肪酸、または、構造が類似した異なる脂肪酸から選択される。
【００１２】
本複合体は、特に、α−ラクトアルブミンまたは変異体からカルシウムイオンを除去することにより、または、カルシウムイオンが解離された変異体、または、機能的なカルシウム結合部位を有さない変異体を用いることにより、従来の方法または分子生物学的方法を用いてタンパク質のアポコンフォメーションを形成することによって、適切に製造される。
【００１３】
しかしながら、本出願人等は、一度複合体が形成されれば、機能的なカルシウム結合部位の存在、および／または、カルシウムの存在により、複合体の安定性または生物学的活性が影響を受けることはないことを見出した。生物学的に活性な複合体は、活性を失うことなくカルシウムに対する親和性を保持し続けることがわかった。
【００１４】
それゆえに、本発明の複合体は、カルシウムイオンをさらに含んでもよく（ただし、本
複合体からのカルシウムの除去は必須ではない）、このような複合体を製造するために適切な手段が提供される。
【００１５】
従って、特定の実施形態において、（ｉ）シスＣ１８：１：９もしくはＣ１８：１：１１脂肪酸、または、構造が類似した異なる脂肪酸；および、（ｉｉ）カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン、または、カルシウムイオンが除去されたα−ラクトアルブミン変異体もしくは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミンの変異体；または、これらいずれかの断片を組み合わせることにより得ることができる生物学的に活性な複合体が提供され、本複合体において、断片はいずれも、α−ラクトアルブミンのαドメインとβドメインとの境界面を形成する領域に対応する領域を含み、さらに、（ｉｉ）がα−ラクトアルブミンの場合、（ｉ）は、Ｃ１８：１：９シス型脂肪酸以外である。
【００１６】
特に、本複合体は、要素（ｉ）と（ｉｉ）とを含み得る。
【００１７】
本発明で使用される表現、「生物学的活性」の「生物学的に活性な」は、本複合体は、ＨＡＭＬＥＴで報告された生物学的活性と類似の生物学的活性を有することを意味する。言い換えれば、ガン細胞でアポトーシスを起こすのに有効である可能性がある、および／または、抗菌特性を有する可能性がある。
【００１８】
本発明で使用される表現「変異体」は、基礎となるタンパク質（適切にはヒトまたはウシα−ラクトアルブミンである）に相同な、しかし、その配列中の１またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された配列が導かれる塩基配列が異なるポリペプチドまたはタンパク質を意味する。アミノ酸置換は、アミノ酸が、概して類似した特性を有する異なるアミノ酸で置換されている「保存的」な置換とみなしてよい。非保存的な置換とは、アミノ酸が、異なるタイプのアミノ酸で置換されていることである。大まかに言えば、ポリペプチドの生物学的活性を変化させることなく非保存的な置換を行う可能性があるとはほとんど考えられない。適切な変異体は、少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは８０％、または、８５％同一であり、特に好ましくは９０％、９５％、または、９８％同一であり、または、それ以上の同一性を有し得る。
【００１９】
同一性の度合いを測定するためにアミノ酸配列を比較するには、ＢＥＳＴＦＩＴやＧＡＰ（いずれもウィスコンシン・ジェネティクス・コンピューター・グループ（ＧＣＧ）のソフトウェアパッケージより）のようなプログラムがある。例えばＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列を比較し、最も類似したセグメントの最適なアライメントを作製する。ＧＡＰは、配列をそれらの全長にそって並べることができ、いずれかの配列に必要に応じてスペースを挿入することにより最適なアライメントを見出す。配列の同一性を考察する際、本発明に関して適切には、全長にそった配列アライメントにより比較を行う。
【００２０】
用語「それらの断片」は、完全なα−ラクトアルブミンのアミノ酸配列を含む複合体と類似の活性を有する複合体を形成し得る所定のアミノ酸配列のあらゆる部分を意味する。断片は、完全長タンパク質からの２以上の部分を一緒に連結させて含んでもよい。このような部分は、適切には、基礎となる配列からの、少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含み得る。
【００２１】
適切な断片は、適切には、長さが少なくとも２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸を含む欠失変異体であり得る。欠失変異体は、上記タンパク質からの小さい領域、または、それらの組み合わせを含む。
【００２２】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法で使用される変異体は、カルシウム結合
部位が、カルシウムに対する親和性が減少するように、または、機能しないように改変された変異体である。ウシα−ラクトアルブミンにおいて、カルシウム結合部位は、残基Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７、および、Ｄ８８が配位していることがわかっている。従って、例えば１またはそれ以上の酸性残基を除去することによりこの部位を改変すれば、この部位のカルシウムに対する親和性を減少させることができ、または、機能を完全に失わせることができ、このタイプの変異体は、本発明の好ましい様相である。
【００２３】
ウシα−ラクトアルブミンのＣａ2+結合部位は、３10ヘリックスとαヘリックスとからなり、２つのヘリックスを分ける短いターン領域を有する（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）。この結合部位には、２個のジスルフィド架橋が側にあり、それにより分子のこの部分がほとんど動かないようにしている。Ｃａ2+を配位させる７個の酸素のうち５個の基は、Ａｓｐ８２、８７および８８の側鎖カルボキシレート、または、Ｌｙｓ７９およびＡｓｐ８４のカルボニルの酸素に起因する。２個の水分子は、残りの２個の酸素を供給する（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）。
【００２４】
これまでに、８７位のアスパラギン酸のアラニンへの部位特異的変異誘発（Ｄ８７Ａ）が、強固なカルシウム結合部位を不活性化することが示されており（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）（図１ａ）、変異タンパク質はアポコンフォメーションをとる。
【００２５】
それゆえに、特定の実施形態において、タンパク質配列中のアミノ酸第８７位のアスパラギン酸残基が、非酸性残基、特に非極性または極性非電荷側鎖に変異する。
【００２６】
非極性側鎖としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、または、システインが挙げられる。特に好ましい例はアラニンである。
【００２７】
極性非電荷側鎖としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、または、チロシンが挙げられる。
【００２８】
変異タンパク質の構造的な歪みを最小限にするために、Ｄ８７はまた、アスパラギン（Ｎ）で置換されており（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）、これは、カルボキシレート基の補われていない負電荷を欠くが、同じ側鎖の容積と配置を有する（図７ａ）。この変異タンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、低い親和性（Ｋ−ca２×１０5Ｍ-1）でカルシウムと結合することが示された（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。
【００２９】
このような変異体は、本発明のさらに好ましい実施形態を形成する。
【００３０】
従って、本発明の複合体において使用するのに特に好ましい変異体は、α−ラクトアルブミンのＤ８７ＡおよびＤ８７Ｎ変異体、または、この変異を含む断片である。
【００３１】
αドメインとβドメインとの境界面を形成する領域は、ヒトα−ラクトアルブミンにおいて、構造中、アミノ酸３４〜３８および８２〜８６に定められる。従って、適切な断片は、これら領域を含む可能性があり、好ましくは天然型タンパク質のアミノ酸３４〜８６の全領域を含む。
【００３２】
本分子のこの領域は、ウシタンパク質とヒトタンパク質とでは異なり、すなわち、ウシ
α−ラクトアルブミンにおいては、３つの塩基性アミノ酸のうち１つが（Ｒ７０）がＳ７０に変わっており、従って１つの配位側鎖が除去されている。それゆえに、本発明の複合体にウシα−ラクトアルブミンを使用する場合、Ｓ７０Ｒ変異体を使用することが好ましいといえる。
【００３３】
α−ラクトアルブミンからＨＡＭＬＥＴを形成するには、３種の分子イベントが必要であると考えられる。第一に、強く結合したＣａ2+イオンが解離される。次に、例えばイオン交換マトリックス上で、アポタンパク質と脂質補因子とを結合させる。第三に、高い塩濃度で活性な複合体を溶離し、透析する。１４種の密接に関連した脂肪酸（以下に示す）を用いてこの手法を繰り返し、その溶離液を特徴付けた。Ｃ１８：１：９シスと、Ｃ１８：１：１１シス複合体のみがアポトーシスを引き起こし、ＮＭＲによれば、これらは単独で他とは異なる新規のシグナルを生じることがわかり、すなわち、これらが新規の分子複合体を形成していることが示された。その他の脂肪酸のいくつかは、イオン交換マトリックス上でタンパク質を保持し、タンパク質を部分的にアンフォールドしたコンフォメーションに安定化することはできたが、生物学的に活性な複合体を形成せず、タンパク質と脂肪酸との混合物から予測されるような明瞭なＮＭＲシグナルしか生じなかった。不飽和Ｃ１８：１シス型脂肪酸は、アポ−α−ラクトアルブミンからのＨＡＭＬＥＴ形成を可能にする独特な構造的特徴を有すると考えられ、このシス型脂肪酸は、正しい立体特異的な適合を示すその他の脂肪酸とは異なることを示す。多数の密接に関連した脂肪酸とＨＡＭＬＥＴを有意に形成しないことは、高い選択性と特異性を有するプロセスを示す。従って、本発明の複合体で使用されるその他の脂肪酸はいずれも、これら不飽和Ｃ１８：１シス型脂肪酸に実質的に類似した立体特異性を有するべきである。
【００３４】
Ｃａ2+結合部位は、様々な種からのα−ラクトアルブミンにおいて１００％保存されており（Ａｃｈａｒｙａ  Ｋ．Ｒ．等，（１９９１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２１，５７１〜５８１）、このタンパク質に関するこの機能の重要性を物語っている。Ｃａ2+結合部位は、５個の異なるアミノ酸と、２個の水分子が配位している。最初に、Ｄ８７の側鎖カルボキシレートが、Ｄ８８と共に、カルシウムイオンをカチオン結合領域にドッキングさせ、内部の水素結合が形成され、構造を安定化する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）。Ｄ８７またはＤ８８のいずれかがないと、Ｃａ2+結合が損なわれ、分子が部分的にアンフォールドした状態で安定化されることが示された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）。
【００３５】
さらに、以下で述べるように、ウシα−ラクトアルブミンのカルシウム結合部位に２つの異なる点変異を有する変異タンパク質が使用された。８７位のアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ８７Ａ）は、カルシウム結合を完全に消失させ、三次構造を崩壊させる。アスパラギン酸をアスパラギンで置換した場合、そのタンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、カルシウムを結合させたままであり（ただしより低い親和性で）、三次構造の崩壊を示したが、Ｄ８７Ａ変異体でみられるほど著しくはなかった（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。これら変異タンパク質は、充填容積において最小限の変化しか示さなかったが、これは、いずれのアミノ酸も同じ平均容積１２５Å3を有し、アスパラギンの側鎖カルボキシレートがタンパク質にカルシウムを配位させる（ただし非効率的に）ためである（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。いずれの突然変異タンパク質も、生理学的な温度でアポコンフォメーションで安定であったが、このコンフォメーション変化にも関わらず、これらはアポトーシスアッセイにおいて生物学的に不活性であった。従って、アポコンフォメーションへのコンフォメーション変化だけでは、アポトーシスを誘導するには不十分であることがわかる。
【００３６】
α−ラクトアルブミンの構造は、当業界で既知であり、本発明において述べられた残基の正確なアミノ酸のナンバリングは、例えば上述のＡｎｄｅｒｓｏｎ等や上述のＰｅｒｍｙａｋｏｖ等で示された構造を参照することにより確認することができる。
【００３７】
天然型ウシα−ラクトアルブミン、および、Ｃａ2+変異体は、ＢＡＭＬＥＴというＨＡＭＬＥＴ様複合体に変換させることができ、ＢＡＭＬＥＴコンフォメーションにおいて、同じ脂肪酸がウシα−ラクトアルブミンを安定化することが示された。しかしながら、変換の収率は低く、ウシタンパク質への脂質結合は効率的ではないことが示された。この効果の構造的な原理は明らかではない。ウシおよびヒトα−ラクトアルブミンは、７６％のアミノ酸配列同一性を示し、類似の天然型のコンフォメーションを有する（Ｗｉｊｅｓｉｎｈａ−Ｂｅｔｔｏｎｉ  Ｒ．等，（２００１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３１２，２６１〜２７３）。ＢＡＭＬＥＴに関して変換の収率が低かったことにより、配列の差異が、脂肪酸とウシタンパク質との適合に影響を与えることが示された。異なる配列は主に、αヘリックス領域に存在するが（Ａヘリックスは５７％、Ｂヘリックスは５０％、Ｃヘリックスは２３％、３10ヘリックスは２５％異なる）、この領域が脂肪酸結合に関与する可能性は低い（下記の実施例３を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
本出願人は、ヒトα−ラクトアルブミンの脂質結合部位は、αヘリックスドメインとβシートドメインとの間の溝に存在する可能性があり、この部位はアポタンパク質において露出するようになると考える。分子のこの領域は、ウシα−ラクトアルブミンにおいて３つの塩基性アミノ酸のうち１つ（Ｒ７０）がＳ７０に変化しているために１つの可能性のある配位側鎖が除去される点で、ウシタンパク質とヒトタンパク質とで異なる。
【００３９】
本発明で説明した結果により、生物学的な機能の変化は、単にタンパク質のコンフォメーション変化だけでなく、脂質補因子も必要であることが示された。組織特異性を達成するには、タンパク質コンフォメーションの変化と脂質補因子という二重の必要条件が重要といえる。活性な複合体は、改変されたタンパク質フォールドに好都合であり、脂質補因子が利用可能な局所的環境においてのみ形成されるべきである。ＨＡＭＬＥＴの場合、このような条件は、母乳で育てた子供の胃に存在する。低いｐＨにより、カゼインはアポコンフォメーションのα−ラクトアルブミンと共に沈殿し、ｐＨ感受性リパーゼを活性化し、オレイン酸を乳汁のリン脂質から解離させる。興味深いことに、α−ラクトアルブミンとオレイン酸はいずれも、ヒトの乳汁中に最も豊富に含まれるタンパク質と脂肪酸であることが特筆される。従って、脂質は、変わってゆく外部環境にタンパク質を適合させることに関与する「分泌後シャペロン」として機能すると考えられる。一時的な自由なタンパク質フォールディング変異体から組織を守り、新規の機能が必要な部位を標的化するために、フォールディング変化と組織特異的な脂質の両方に関する必要性は重要である。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
本発明の研究の一環として、本出願人は、複合体のカルシウム親和性を試験した。得られたα−ラクトアルブミンのカルシウム親和性は、これまで報告されたものより高かったが（１０ｍＭ以上と比較して約２ｍＭ）、観察された値（０.１５Ｍ  ＮａＣｌ）は、他者により０.１Ｍ  ＮａＣｌで報告された範囲内である（下記の表１）。この違いは、より低いイオン強度で説明することができ、すなわち我々は、α−ラクトアルブミンのＣａ2+親和性が、低いイオン強度と生理学的なイオン強度との間で２００倍減少したことを観察した。これは、静電的相互作用の塩のスクリーニングから予想され、その他の負電荷を有するタンパク質を用いて類似した減少が得られている。
【００４１】
また、Ｎａ+はインビトロでα−ラクトアルブミンに結合し安定化することが報告され
ているので（２０℃でＫa＝１００Ｍ-1）、生理学的な塩濃度でのα−ラクトアルブミンのＫaの減少は、Ｎａ+とＣａ2+とが同じ部位に関して競合することによるものとも考えられる。ＮａＣｌの存在下での、Ｄ８７Ａに関する近ＵＶのＣＤシグナルの欠如は、野生型α−ラクトアルブミンとは著しく異なっていたことから、Ｎａ+が、野生型タンパク質のＣａ2+部位に結合すること、および、この１価イオンの配位にＤ８７側鎖も重要であることが示される。
【００４２】
本発明の複合体およびＨＡＭＬＥＴでは、低い塩濃度および生理学的な塩濃度のいずれにおいてもＣａ2+に対する高い親和性が保持されていたことから、これらは、活性を損なうことなくＣａ2+を結合させることができることが示される。α−ラクトアルブミンの部分的にアンフォールドしたコンフォメーションは通常、Ｃａ2+が存在しない状態と関連するため、これは驚くべきことと考えられる。２つの考えられる解釈を提示することができる。第一の、最も可能性の高いシナリオにおいて、α−ラクトアルブミンは、アンフォールディング、および、αヘリックスドメインの妨害をほとんど伴わずにオレイン酸と結合することにより、ＨＡＭＬＥＴに変換される。それにより、Ｃａ2+結合部位は、オレイン酸の非存在下の場合と類似した親和性を保持することができる。第二の可能性は、Ｃａ2+部位を崩壊させることであり、観察されたＣａ2+結合は、ＨＡＭＬＥＴにおいて新しいＣａ2+部位が生成したことと説明される。オレイン酸の先端の基は、アミノ酸残基と共にカルシウムを配位させる可能性がある。この場合、α−ラクトアルブミンの典型的なＣａ2+結合部位は、ＨＡＭＬＥＴへのＣａ2+結合には必要ないと考えられる。我々は、Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴは、アンフォールドしたタンパク質に結合したオレイン酸を含み、従って新しいＣａ2+部位を形成すべきであるが、Ｃａ2+を結合させないことから、この説明は可能性が低いことを見出した。それゆえに、Ｃａ2+結合部位は、α−ラクトアルブミンをアポトーシス関連のコンフォメーションへ変換させることにはに関与せず、ＨＡＭＬＥＴへのＣａ2+結合に関する構造変化は、生物学的な機能を妨害しない、と考えられる。
【００４３】
ＨＡＭＬＥＴにおいて、α−ラクトアルブミンは、部分的にアンフォールドしたコンフォメーションと、高い親和性のＣａ2+結合部位とを保持する。この明らかなパラドックスは、複合体におけるα−ラクトアルブミンの分子的な特徴に新たな光を当てている。天然型様アポフォームのＸ線構造から、αおよびβ領域の大部分がそのままであるが、同時にそれらの間のクレフトが広がっていることがわかる（Ｃｈｒｙｓｉｎａ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，（２０００年）２７５，３７０２１〜９）。上述したように、本出願人は、オレイン酸のような補因子が、αドメインとβドメインとの境界面に結合し、結合した補因子の酸が分子のこの領域を固定し、その際にαドメインが天然型様コンフォメーションを維持できるようにすると考える。この考察は、ＨＡＭＬＥＴのようなこのタイプの複合体は、Ｃａ2+と結合し、その際に腫瘍細胞に対する活性を保持するという、発見により裏付けられている（以下で説明する）。従って、このようにしてＨＡＭＬＥＴは、低い塩濃度のアポ−α−ラクトアルブミン、または、生理学的な塩濃度での天然型様アポフォームのいずれとも異なる分子状態である、と考えられる。
【００４４】
本発明の複合体は、抗ガン剤や抗菌剤処理などの多種多様な治療用途に有用であり、特に気道の感染を治療するのに有用である。これらの目的のために、本複合体を医薬組成物として配合することが適切であり、これは本発明のさらなる様相を形成する。
【００４５】
本複合体は、口腔粘膜の投与単位、注射可能な組成物、または、局所用組成物の形態で投与することができる。いずれの場合においても、本タンパク質は通常、一般的に知られている製薬上許容できるキャリアー、充填剤、および／または、賦形剤を共に用いて投与される。
【００４６】
局所的な使用のための溶液またはクリームの形態でタンパク質が投与される場合、溶液
は、タンパク質複合体のための乳化剤を、希釈剤またはクリーム基材と共に含む。このような製剤は、腫瘍に直接塗布することもできるし、または、ミストの形態で上気道に吸入させてもよい。
【００４７】
経口的に使用する場合、本タンパク質は通常、キャリアーと共に投与され、キャリアーとしては、固体、半固体もしくは液体希釈剤、または、カプセルが挙げられる。通常、活性化合物の量は、製剤の０.１〜９９質量％、好ましくは注射用製剤の０.５〜２０質量％、経口投与用製剤の２〜５０質量％である。
【００４８】
経口投与用の投与単位の形態で複合体を含む医薬配合物において、上記化合物は、固体、粉末状のキャリアー、例えば、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、例えばポテトスターチ、コーンスターチ、アミロペクチン、セルロース誘導体、または、ゼラチン、同様に、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ポリエチレングリコールワックスなどと共に混合してもよいし、錠剤にプレスしてもよい。複数投与単位の顆粒も同様に製造することができる。上述のコアの錠剤および顆粒は、糖などの濃縮溶液でコーティングしてもよい。コアはまた、消化管での溶解速度を変化させるポリマー（例えばｐｋaが５.５超のアニオン性ポリマー）でコーティングしてもよい。このようなポリマーとしては、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸塩、酢酸セルロースフタル酸塩、および、オイドラギット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）Ｓ１００およびＬ１００の商標で販売されているポリマーが挙げられる。
【００４９】
ゼラチンカプセル製剤において、これらはソフトでもハードでもよい。ソフトの場合、活性化合物は油と混合され、ハードの場合、複数投与単位の顆粒がそこに充填される。
【００５０】
経口投与用の液体製剤は、シロップまたは懸濁液の形態であってもよく、例えば、開示された活性化合物を約０.２質量％〜約２０質量％、ならびに、グリセロールおよびプロピレングリコールを含む溶液である。必要に応じて、このような製剤は、着色剤、矯味矯臭薬剤、甘味料、および、増粘剤としてカルボキシメチルセルロースを含んでもよい。
【００５１】
活性化合物の一日量は様々であり、投与経路のタイプによるが、一般的な慣例としては、ヒトへの投与の際に１〜１００ｍｇ／用量の活性化合物、局所投与では２〜２００ｍｇ／用量の活性化合物である。２４時間あたりの適用回数は、投与経路によるが、様々であってよく、例えば鼻への局所的適用の場合、２４時間あたり３〜８回であり、すなわち、治療的使用において処置される身体で生産される粘液の流れによる。
【００５２】
本発明はさらに、上述のような複合体または組成物をガン細胞に投与することを含む、ガンの治療方法を提供する。
【００５３】
本発明はさらに、上述のような複合体または組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、細菌感染の治療方法を提供する。
【００５４】
説明中、以下の略語が使用される。
ＧＣ／ＭＳ：ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー、
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸、
トリス：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、
ＡＮＳ：８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、
ＣＤ：円二色性、
ＵＶ：紫外線、
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム、
ＮＭＲ：核磁気共鳴、
ｐｐｍ：１００万分の１、
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート、
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー、
ＤＥＡＥ：ジエチルアミノエチル、
ＨＣｌ：塩酸、
ＥＧＴＡ：エチレン−ビス（オキシエチレンニトリオール）四酢酸、
ＦＰＬＣ；タンパク質の高速液体クロマトグラフィー、
ＰＢＳ；リン酸緩衝食塩水。
【００５５】
以下、一例として添付の図面を参照をしながら、本発明を特に説明する。
図１は、ＨＡＭＬＥＴ様分子複合体を産生する能力に関して調査された、簡略化した脂肪酸の構造と、特に不飽和脂肪酸の線画を示す。Ｃ１６：１：９シス＝パルミトレイン酸、Ｃ１８：１：６シス＝ペトロセリン酸、Ｃ１８：１：９シス＝オレイン酸、Ｃ１８：１：１１シス＝バクセン酸、Ｃ２０：１：１１シス＝エイコセン酸、Ｃ１８：１：９トランス＝エライジン酸、Ｃ１８：１：１１トランス＝トランスバクセン酸、Ｃ２０：４：５，８，１１，１５シス＝アラキドン酸、Ｃ１８：３：６，９，１２シス＝γリノレン酸、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス＝リノレン酸、Ｃ１８：２：９，１２シス＝リノール酸。
図２は、それぞれの脂肪酸で調整されたイオン交換マトリックス上でのアポ−α−ラクトアルブミンの保持を示す一連のグラフである。
図３は、脂質−タンパク質複合体により誘導された腫瘍細胞のアポトーシスを説明する。
図４は、脂肪酸−タンパク質複合体の三次構造を決定するためのＣＤ分光分析の結果を示す。
図５は、疎水性のインジケーターとしての、脂肪酸−タンパク質複合体のＡＮＳ分光分析による調査の結果を示す。
図６は、複合体のＮＭＲ分析の結果を示す。
図７は、α−ラクトアルブミンのＤ８７ＡおよびＤ８７Ｎ変異体の特徴付けを説明しており、図中、パネルＡは、カルシウム結合部位の構造を示す。
図８は、変異タンパク質単独を用いて行われた生物学的試験を説明しており、それらがアポトーシスを誘導しないことを示す。
図９は、ウシα−ラクトアルブミンのＢＡＭＬＥＴへの変換を説明しており、パネルＡは、製造中に得られた溶出ピークを示し、パネルＢおよびＣは、ＢＡＭＬＥＴの生物学的試験に関し、パネルＤは、近ＵＶのＣＤ分光分析の結果を示し、パネルＥは、固有の蛍光分光分析の結果を示し、パネルＦは、ＨＡＭＬＥＴおよびＢＡＭＬＥＴのＡＮＳスペクトルを示す。
図１０は、Ｄ８７ＡおよびＤ８７ＮからＤ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴの作成および試験結果を説明しており、パネルＡは、製造中に得られた溶出ピークを示し、パネルＢおよびＣは、これら複合体の生物学的試験に関し、パネルＤは、近ＵＶのＣＤ分光分析の結果を示し、パネルＥは、固有の蛍光分光分析の結果を示し、パネルＦは、ＡＮＳスペクトルを示す。
図１１は、ｑｕｉｎ２の存在下でのＣａ2+滴定の結果を示す。吸光度は、ヒトα−ラクトアルブミン、ＨＡＭＬＥＴ、または、Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴと混合したｑｕｉｎ２、および、ｑｕｉｎ２単独での総Ｃａ2+濃度の関数として示される。実線は、当てはめ曲線である。吸光度は、それぞれ完全Ｃａ2+非含有系およびＣａ2+ローディング系に関する当てはめ値を用いて正規化されている。
【実施例】
【００５６】
実施例１
オレイン酸、ならびに、飽和度、炭素鎖長およびシス／トランスコンフォメーションが異なるその他の脂肪酸の構造変異体（図１）を、アポ−α−ラクトアルブミンからＨＡＭ
ＬＥＴ様複合体を形成する能力に関して比較した。
【００５７】
Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６で説明された方法を用いて、図１に示すそれぞれの脂肪酸で予め調整されたカラムマトリックスにアポ−α−ラクトアルブミンをアプライし、１Ｍ  ＮａＣｌの後の溶出液を回収した。ポジティブコントロール（ａ）としてＣ１８：１：９シスで調整されたカラムを使用した。シスコンフォメーションの不飽和脂肪酸はいずれも、アポ−α−ラクトアルブミンをカラム上に保持したが、効率は様々であった。トランスコンフォメーションの不飽和脂肪酸（Ｃ１８：１：９トランス、Ｃ１６：１：９トランス）または飽和脂肪酸（Ｃ６：０、および、Ｃ１８：０）は、アポ−α−ラクトアルブミンをカラム上に保持できなかった。
【００５８】
図２に、脂肪酸で調整されたマトリックスでのイオン交換クロマトグラフィーの結果を示す。シスコンフォメーションの不飽和Ｃ１８脂肪酸は、アポ−α−ラクトアルブミンと複合体を形成した。Ｃ１８：１：９シス型脂肪酸は、添加されたアポ−α−ラクトアルブミンの９０％超を変換した。Ｃ１８：１：１１シス型脂肪酸は、多少効率が低かった（収率約７０％）、その他の不飽和Ｃ１８シス型脂肪酸（Ｃ１８：１：６シス、Ｃ１８：２：９，１２シス、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、および、γＣ１８：３：６，９，１２シスは、かなり低い収率であった。
【００５９】
しかしながら、Ｃ１８：１と飽和脂肪酸のトランスコンフォーマーは、実質的に不活性であった。Ｃ１８：１：９トランス、Ｃ１８：１：１１トランス、または、飽和Ｃ１８：０脂肪酸で調整されたカラムからは、高い塩濃度で、ほんのわずかなタンパク質しか溶離せず、それらは不活性であった。
【００６０】
炭素鎖が短い不飽和シス型脂肪酸（Ｃ１６：１：９シス）、または、炭素鎖が長い不飽和シス型脂肪酸（Ｃ２０：１：１１シス、および、Ｃ２０：４：５，８，１１，１５シス）は、複合体を形成し、この複合体は、Ｃ１８：１：１１シスに匹敵するが、Ｃ１８：１：９シスよりは低い収率で１Ｍ  ＮａＣｌの後に溶離した。飽和脂肪酸Ｃ６：０、Ｃ１４：０またはＣ１６：０で調整されたカラムは、アポ−α−ラクトアルブミンを保持しなかった。
【００６１】
その結果により、アポ−α−ラクトアルブミンは、立体特異的な様式でＣ１８：１脂肪酸と相互作用し、シス型脂肪酸は、不飽和で、シスコンフォメーションで二重結合を有さなければならないことが実証された。トランスコンフォメーションの不飽和脂肪酸は、飽和脂肪酸の場合と同様に不活性であった。その上、その結果により、α−ラクトアルブミンは、Ｃａ2+結合型で、極めて低い程度でしかＣ１８：１脂肪酸で調整されたカラムに結合しなかったことが確認された。ＨＡＭＬＥＴを定める不飽和シス型脂肪酸に関する結合部位は、アポコンフォメーションでのみ利用可能である。
【００６２】
実施例２
生物学的活性
アポトーシス誘導をＬ１２１０白血病細胞系を用いて試験した。Ｌ１２１０白血病細胞におけるアポトーシスは、ＨＡＭＬＥＴコントロールを含む様々なタンパク質−脂質複合体と接触させることにより誘導された（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等（１９９９年）Ｊ  Ｂｌｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４，６３８８〜９６）。６時間後、ＨＡＭＬＥＴ、および、Ｃ１８：１：１１シス複合体により９９〜１００％の細胞が死滅したが（図３表）、その他の複合体は、細胞生存率に対してわずかな影響しか与えないか、または全く影響を与えなかった。Ｃ１８：１シス型脂肪酸−タンパク質複合体はいずれもＤＮＡ断片化を誘導したが（ｂ）、Ｃ１８：１トランス脂肪酸複合体は不活性であった。Ｃ１６およびＣ２０不飽和脂肪酸複合体は、中程度のＤＮＡ断片化を引き起こしたが、細胞生存率の低下は起こらなかった。
【００６３】
Ｌ１２１０細胞を、ＨＡＭＬＥＴまたはその他の複合体それぞれから得られた脂質抽出物と接触させた。タンパク質１.０ｍｇ中に存在する量に相当する脂質濃度に６時間接触させた後、Ｌ１２１０細胞生存率（図３表）または、ＤＮＡ断片化（ｃ）に対する効果は検出されなかったが、ＨＡＭＬＥＴは０.３ｍｇでアポトーシスにより細胞を死滅させるのに十分であった。極めて高い脂質濃度では、細胞はネクローシスで死滅したが、脂質に応答したアポトーシスであるという証拠はなかった。
【００６４】
従って、Ｃ１８：１：９シス、および、Ｃ１８：１：１１シス型脂肪酸と形成された複合体は、その他のタンパク質−脂質複合体より効率的にアポトーシスを誘導した（図３表）。細胞生存率は、０.３ｍｇ／ｍｌの濃度で、６時間で９９％から０％に減少し、ＤＮＡ断片化が観察された。興味深いことに、この時点で、その他のＣ１８：１：シスタンパク質−脂肪酸複合体は、５０％未満の細胞を死滅させた（図３表）。Ｃ１８：１：トランス脂肪酸複合体は、Ｃ２０脂肪酸複合体と同様に、細胞アッセイで不活性であり、Ｃ１６脂肪酸複合体は、細胞生存率に対して極めて低い効果しか示さなかった。
【００６５】
Ｃ１８：１：シス型脂肪酸複合体は、６時間後に、ＤＮＡ断片化を誘導したが、これは、細胞がアポトーシスにより死滅したことを示す（図３ａ）。驚くべきことに、我々は、その他の脂肪酸複合体と接触したいくつかの細胞においても、６時間で生存し続けていたが、ＤＮＡ断片化の証拠を見出した。
【００６６】
これらの結果により、脂質はアポトーシスのきっかけではないこと、および、ＨＡＭＬＥＴは、タンパク質と脂質との両方により定められることが実証される。さらに、これらの結果により、その他の脂肪酸のいくつかも、イオン交換マトリックス上でアポ−α−ラクトアルブミンと相互作用するようであったが、Ｃ１８：１：９シスとＣ１８：１：１１シスだけが、ＨＡＭＬＥＴ形成における補因子としての基準を満たしていることが実証される。
【００６７】
実施例３
生物学的な活性の構造的な相関
本タンパク質をアポ様コンフォメーションで安定化する能力をＣＤ分光分析とＡＮＳ分光分析で測定し、構造的な統合をＮＭＲ分光分析で調べた。
【００６８】
ＣＤ分光分析で分析されたコンフォメーション
１Ｍ  ＮａＣｌ後に溶離した複合体を、コントロールとして天然型またはアポ−α−ラクトアルブミン、および、ＨＡＭＬＥＴを用いて、近ＵＶのＣＤ分光分析で調べた（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。天然型α−ラクトアルブミンコントロールは、よくフォールドしたタンパク質の特徴（２７０ｎｍでチロシン残基から生じる最小値、および、２９４ｎｍでトリプトファン残基から生じる最大値を示す）を示した。アポ−α−ラクトアルブミンコントロールは、特徴的なシグナルのほとんどが失われており、これは、チロシンおよびトリプトファンがよく固定されていないことを示す。Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、Ｃ１８：３：６，９，１２シス、Ｃ２０：４：５，８，１１，１５シス、および、Ｃ１８：１：６シス複合体は、チロシン領域とトリプトファン領域でシグナルが欠失している点でＨＡＭＬＥＴと類似しており、一方、それ以外の複合体は、アポ−α−ラクトアルブミンコントロールと類似していた。
【００６９】
ＨＡＭＬＥＴは、アポ−α−ラクトアルブミンと類似することが示されたが、三次構造
がさらに失われているようである（図４ａ）。その他の溶離した脂肪酸−タンパク質複合体は、２つの主要なスペクトルパターンを示した。Ｃ１８：１：６シス、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、Ｃ１８：３：６，９，１２シス、および、Ｃ２０：４：５，８，ｌｌ，１５シス型脂肪酸複合体は、ＨＡＭＬＥＴと類似していたが、一方で、Ｃ１８：１：９トランス、Ｃ１８：１：１１：シスまたはトランス、Ｃ１８：２：９，１２シス、および、Ｃ１６：１：９シスまたはトランス複合体は、アポコントロールと同一であった（図４ｂ〜ｈ）。ボイドで溶離した変換されていないアポ−α−ラクトアルブミンは、Ｃａ2+の存在下で天然型状態に逆戻りすることが示された。
【００７０】
これらの結果から、アポ−α−ラクトアルブミンをカラム上に保持する脂肪酸はいずれも、部分的にアンフォールドしたコンフォメーションでタンパク質を安定化することが示される。
【００７１】
ＡＮＳ分光分析で調査された疎水性表面の露出
アポ−α−ラクトアルブミンは、βシートの移動性により疎水性側鎖が露出することがわかっている。１Ｍ  ＮａＣｌ後に溶離した複合体を、コントロールとして天然型またはアポ−α−ラクトアルブミンおよびＨＡＭＬＥＴを用いて、ＡＮＳ分光分析で調べた（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。フラットな曲線と４９０ｎｍでの低いシグナルにより示されたように、天然型α−ラクトアルブミンはＡＮＳと結合しなかったが、アポ−α−ラクトアルブミンは、このフォールドの増加した疎水性から予想されたような、強度の増加と４７０ｎｍでの最大値を示す有意なＡＮＳ結合を示した。全てのα−ラクトアルブミン−脂肪酸複合体（ただしＣ２０：１：１１シスを除く）は、ＡＮＳと結合した。Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、γＣ１８：３：６，９，１２シス、および、Ｃ１８：１：６シス複合体は、ＨＡＭＬＥＴと類似していたが、一方で、その他の脂肪酸複合体は、さらに高いＡＮＳ結合を示した。
【００７２】
アポコントロールは、強度の増加と４７０ｎｍでの最大値を示す予想されたＡＮＳ結合示したが、一方で、天然型タンパク質は、フラットな曲線と４９０ｎｍでの低いシグナルにより示されたように、ＡＮＳと結合できなかった。ＨＡＭＬＥＴは、ＡＮＳと結合し、曲線の青へのシフトを示したが、そのピークは、アポ−α−ラクトアルブミンのピークより低かった（図５ａ）。
【００７３】
Ｃ１８：１：６シス、Ｃ１８：３：９，１２，１５シス、および  Ｃ１８：３：６，９，１２シス型脂肪酸複合体は、ＨＡＭＬＥＴと類似したスペクトル強度でＡＮＳと結合した。その他いくつかの複合体（Ｃ１８：１：９トランス、Ｃ１８：１：１１シスおよびトランス、Ｃ１８：２：９，１２シス、Ｃ１６：１：９シスおよびトランス、Ｃ２０：４：５，８，１１，１５シス）は、アポ−α−ラクトアルブミンコントロールより強いＡＮＳ蛍光を示した。最終的に、Ｃ２０：１：１１シス複合体は、いずれのＡＮＳとも結合しなかった（図５ｂ〜ｈ）。
【００７４】
タンパク質−脂質複合体中の脂肪酸へのＡＮＳの直接的な結合を除外するために、ＡＮＳを脂肪酸へ混合した物を分光分析した。ＡＮＳ−脂肪酸相互作用は観察されなかった（データは示さず）。
【００７５】
これらの結果から、Ｃ１８：１：９シス型脂肪酸複合体は、ＡＮＳと相互作用する能力を保持することがが示されたが、その低い強度から、ＨＡＭＬＥＴにおける脂肪酸がＡＮＳ結合を改変する可能性が示唆される。Ｃ２０：１：１１シス複合体に関する否定的な結果により、より長い脂肪酸は、本タンパク質中の疎水性表面とＡＮＳとの相互作用を妨害することが示唆された。
【００７６】
1Ｈ−ＮＭＲ分光分析
1Ｈ−ＮＭＲを用いて、Ｃ１８：１シスと不活性タンパク質−脂肪酸複合体との活性の差に関する構造的な根拠を解析した（図６）。
【００７７】
天然型α−ラクトアルブミンは、狭いラインと有意なシフトの分散、芳香族領域における多数の鮮明なシグナル（７ｐｐｍ周辺）、および、いくつかのアウトシフトしたメチルシグナル（０.７〜−０.６ｐｐｍ）を示す、フォールドし秩序だったタンパク質の特徴を示した。アポタンパク質は、多数の共鳴のケミカルシフトにおいて天然型状態に比べて有意な偏差を有する、狭いラインと有意なシフトの分散を示した。芳香族領域およびメチル化領域は、左のパネルと右のパネルにそれぞれ示される（Ｍ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９７，４２２１〜６）。
【００７８】
ＨＡＭＬＥＴは、広いラインと、アウトシフトしたメチルシグナルの欠如を示したが、これは、部分的にアンフォールドした状態、および、天然型タンパク質との明らかな違いを示す。Ｃ１８：１：１１シスタンパク質複合体で得られたスペクトルは、実質的にＨＡＭＬＥＴと同一であったが、トランス脂肪酸複合体のスペクトルは、より狭いラインとアウトシフトしたシグナルを示し、これは、Ｃ１８：１：９シス、または、Ｃ１８：１：１１シス複合体のコンフォメーションは独特であること、および、トランス脂肪酸はアポ−α−ラクトアルブミンに結合するにもかかわらず、ＨＡＭＬＥＴが形成されるようにコンフォメーションを変化させないことを示す。
【００７９】
Ｃ１８：１：９シス、および、Ｃ１８：１：１１シス複合体のスペクトルはいずれも、広いラインとわずかなシフトの分散を示した。芳香族領域におけるラインは、クラスターを形成しており、０.７ｐｐｍ未満ではアウトシフトしたメチルシグナルはみられなかった。脂肪酸の広いシグナルは、脂肪酸が本複合体の統合部分を形成することを示唆する。
【００８０】
トランス異性体複合体（Ｃ１８：１：９トランス、および、Ｃ１８：１：１１トランス）は、Ｃ１８：１：９シス、または、Ｃ１８：１：１１シス複合体と著しく異なっていた。結合した脂肪酸からのシグナルが検出されたが、シス複合体のシグナルよりは小さかった。タンパク質のラインは狭く、メチル領域と芳香族領域のいずれにおいてもアウトシフトしていた。これらのデータより、トランス脂肪酸はアポ−α−ラクトアルブミンに結合するが、ＨＡＭＬＥＴが形成されるようにコンフォメーションを変化さないことが示唆された。
【００８１】
これらの結果により、特異的な分子相互作用が、ＨＡＭＬＥＴコンフォメーションでアポ−α−ラクトアルブミンを安定化し、不飽和Ｃ１８：１：９シス、または、Ｃ１８：１：１１シス型脂肪酸のみが、このコンホメーションの切り替えを達成するのに必要な立体特異的な特性を有することが示される。
【００８２】
アポ−α−ラクトアルブミンは、αヘリックスドメインおよびβシートドメインの両方を含む点で、その他の既知の脂質が結合したタンパク質とは異なる。細胞内の脂質結合タンパク質ファミリーは、全体的なβ−バレル構造を有し、このβ−バレル構造は、様々な鎖の長さと飽和度を有する各種の脂肪酸と結合する空孔を形成する（Ｊ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等，（１９９７年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，７１４０〜７１５０）。概して、脂肪酸のカルボキシレートの先端の基は、２〜４個の正電荷を有するアミノ酸（通常はアルギニン）と相互作用し、その炭素鎖に６〜１０個の疎水性アミノ酸が配位する。ヒト血清アルブミンの結晶構造から、タンパク質の繰り返しαヘリックスドメイン構造内に、６個の非対称的に分布した脂肪酸結合部位があることが明らかになった（Ｓ．Ｃｕｒｒｙ等，（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ  Ｂｉｏｌ，５，８２７〜８３５）。それぞれの疎水性ポケットは、一端が塩基性または極性側鎖でキャップされており、脂肪酸の先端の基を配位させている。一方で、脂肪酸がヒト血清アルブミンへ結合することにより、タンパク質の３つのドメインがローテーションし、入ってくる脂肪酸のための道が形成されるように側鎖が調整されて、コンホメーション変化が引き起こされ（Ｓ．Ｃｕｒｒｙ等，（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃ  Ｂｉｏｌ，５，８２７〜８３５）、この分子は、アンフォールドしないか、または、機能を変化させない。それゆえに、我々は、脂質補因子は、α−ラクトアルブミンＨＡＭＬＥＴの変換において機能するのであって、これらのこれまで既知のタンパク質脂質相互作用とは構造的にも機能的にも異なる、と結論付けることができる。
【００８３】
仮の脂肪酸結合部位を、天然型アポ−α−ラクトアルブミンの三次元構造に基づき同定した。天然型α−ラクトアルブミン分子は、親水性の酸性タンパク質であり、主に電荷極性アミノ酸を露出させる。球状構造の内部に２つの疎水性領域がある。第一の領域は、ＣヘリックスおよびＤヘリックスの残基と、２つのドメインの境界面におけるβシートドメインとで形成される。第二の領域は、α−ドメインのＡ、Ｂおよび３０10-ヘリックスの残基で形成される（図９）（Ｌ．Ｃ．Ｗｕ等，（１９９８年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２８０，１７５〜８２；Ｍ．Ｓａｉｔｏ，（１９９９年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １２，１０９７〜１１０４）。ウシアポ−α−ラクトアルブミンの結晶構造およびＮＭＲ構造により、Ｃａ2+が解離する際に２つのドメインの間のクレフトにおいて顕著な構造的変化を有することが解明された（Ｅ．Ｃｈｒｙｓｉｎａ等，（２０００年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５，３７０２１〜３７０２９；Ｒ．Ｂｅｔｔｏｎｉ−Ｗｉｊｅｓｉｎｈａ等，（２００１年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３０７，８８５〜８９８）。Ｃａ2+結合ループの伸長が、３10ヘリックスをＣヘリックスに向けて傾け、それにより、２つのドメイン間の境界面における芳香族クラスターを崩壊させる（Ｔｒｐ６０および１０４、Ｐｈｅ５３およびＴｙｒ１０３）（Ｅ．Ｃｈｒｙｓｉｎａ等，（２０００年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７５，３７０２１〜３７０２９）。その一方で、α−ドメインは、天然型とアポコンフォメーションとのいずれにおいても、ほぼ天然型の側鎖の充填で構造を保つ。それゆえに、Ｃ１８：１脂肪酸は、αドメインとβドメインとの境界面に結合し、従って、モルテン・グロビュール様のコンフォメーションを安定化すると考えられる。
【００８４】
疎水性ポケットの形状は、湾曲した分子との相互作用に好都合であるべきであることを示していた（図１）。このことより、実際に、Ｃ１８：１トランスコンフォーマーがＨＡＭＬＥＴを形成できないことを説明することができる。このシスコンフォメーションの脂肪酸は、双方の炭素鎖が一方に突き出ており、二重結合の周辺でｕ型であるが、トランス脂肪酸は、二重結合の逆側の炭素鎖により、二重結合の周辺でロッド型である。飽和脂肪酸は、二重結合が欠如しているために構造的な制限がなく、最もフレキシブルである。従って、その結果から、シスコンフォメーションだけが脂肪酸に近接した立体特異的な適合を可能にすること、および、脂肪酸のさらなる決定的な特徴は、炭素鎖長であることが示される。加えて、ポケットは塩基性残基でキャップされており、それにより脂肪酸の極性の先端の基を配位させることができ、従って脂質を方向づけることができる。しかしながら、この相互作用は、活性な複合体を形成しそこなった同じ電荷を有する先端の基を有するトランスおよび飽和脂肪酸として活性化するには不十分である。立体特異的な適合は、脂質テールとの疎水性相互作用、および、負電荷を有する先端の基と塩基性側鎖との静電的相互作用の両方に関与する可能性が極めて高い。その他の脂肪酸結合タンパク質との類似に基づき、脂肪酸は、負電荷を有する先端の基とタンパク質中の塩基性側鎖との間の静電的相互作用により、同様に、好ましい立体特異的な適合（Ｃ１８：１：９シス）で最適化されたテールとのファン・デル・ワールス接触および疎水性効果により、ＨＡＭＬＥＴに結合しているのかもしれない。
【００８５】
実施例４
α−ラクトアルブミン変異体の分析
α−ラクトアルブミンのアポコンフォメーションは不安定であり、このタンパク質は、中性ｐＨで、および、アポトーシス分析において存在していたＣａ2+濃度で天然型状態に戻る。しかしながら、ＨＡＭＬＥＴ複合体において、このタンパク質は、アポ様コンフォメーションを維持する。脂質単独ではアポトーシスを引き起こさないことから、単にアポコンフォメーションを安定化することによって作用するものと考えられる。次に、このタンパク質のコンフォメーション変化は、アポトーシスを誘導するのに十分であるかもしれないが、アポコンフォメーションの不安定な性質は、タンパク質そのものを試験する実験を不可能にしていた。
【００８６】
この問題は、Ｃａ2+結合部位への部位特異的変異導入により処理した。結合したＣａ2+イオンは、７個の酸素基の群に配位し、ねじれた五角形の両錐を形成するが、８７位のアスパラギン酸残基の変異は、Ｃａ2+結合部位を完全または部分的に不活性化し、アポコンフォメーションに固定された変異タンパク質を生じさせるのに十分である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４；Ｖｅｐｒｉｎｔｓｅｖ  Ｄ．Ｂ．等，（１９９９年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３７，６５〜７２；Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。この研究において、天然型からアポ状態へのコンフォメーション変化によりアポトーシスを単独で引き起こすことができるかどうかを試験した。さらに、ＨＡＭＬＥＴへの変換のためのＣａ2+結合部位の重要性も調査した。
【００８７】
天然型ヒトα−ラクトアルブミンを、ヒトの乳汁から、記載通りに硫酸アンモニウム沈殿とフェニルセファロースクロマトグラフィーにより精製した（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｍ．等，（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，４２２１〜４２２６）。アポ−α−ラクトアルブミンは、１.８ｍＭトリス１（１０Ｍトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８.５）に溶解させた天然型α−ラクトアルブミン（２５ｍｇ）から、５ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて結合したＣａ2+を除去することによって作成された。コンホメーション変化が、近ＵＶのＣＤおよびＡＮＳスペクトロスのコピーにより確認された。ウシα−ラクトアルブミンは、シグマ社（セントルイス，ミズーリ州，米国）から購入し、さらに精製することなく使用した。
【００８８】
加えて、変異ウシタンパク質（Ｄ８７ＡおよびＤ８７Ｎ）を、記載通りにＥ．ｃｏｌｉで発現させ、精製し、フォールドさせ、凍結乾燥した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４；Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）。
【００８９】
ＤＥＡＥ−トリスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）Ｍ（バイオセプラ（ＢｉｏＳｅｐｒａ），フランス）を充填したカラム（１４ｃｍ×１.６ｃｍ）を、バイオ・ロジック・クロマトグラフィーシステム（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社，ハーキュリーズ，カリフォルニア州）に取り付け、ＮａＣｌ濃度勾配で溶離した（緩衝液Ａ：１０ｍＭトリス／ＨＣｌ，ｐＨ８.５；緩衝液Ｂ：１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ａ）。マトリックスをオレイン酸で調整した（ラロダン・バイオケミカルズ社（Ｌａｒｏｄａｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ），マルモ，スウェーデン）。１０ｍｇを、超音破砕により（ブランソン２２００バス・ソニケーター（ブランソン社，ダンベリー，米国）を用いて３分間）、９９.５％エタノール５００μｌ溶解させた。１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.５）を１０ｍｌ加えた後、脂質溶液を、新たに充填したＤＥＡＥ−トリスアクリルＭマトリックスにアプライし、ＮａＣｌ濃度勾配を用いてマトリックスに分散させた。
【００９０】
ヒト、および、組換え、および、天然型ウシα−ラクトアルブミンそれぞれ１０ｍｇを
、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８.５）１０ｍｌに溶解させ、カラムに加えた。高い塩濃度の後で溶離したタンパク質分画を、蒸留水に対する透析で、水（１００倍超の容積）を少なくとも４回交換して脱塩し（スペクトラ／ポア，（スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社（Ｓｐｅｃｔｏｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ），ラグナヒルズ，カリフォルニア州），メンブレンを３.５ｋＤａで切り出した）、次に、凍結乾燥した。
【００９１】
次に、生成物を分光分析した。タンパク質またはタンパク質分画を２倍量の蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）に溶解させてストック溶液を製造し、その濃度を、２８０ｎｍで吸光度として測定した（Ａ／１＝Ｃ（ｍｇ／ｍｌ）、ここで、１ｍｇ／ｍｌのα−ラクトアルブミンは７０μＭである）。適切な希釈でスペクトルを記録した。
【００９２】
円二色性（ＣＤ）スペクトルを、ＪＡＳＣＯ  ＰＴＣ−３４３ペルチエタイプのサーモスタットセルホルダーを備えたＪＡＳＣＯ  Ｊ−７２０分光旋光計で得た。石英キュベットをパス長１ｃｍで使用し、２５℃で、２４０〜３２０ｎｍの間のスペクトルを記録した。波長ステップは１ｎｍであり、応答時間は８秒であり、スキャン速度１０ｎｍ／分であった。６回のスキャンを記録し、各スペクトルを平均した。基準スペクトルをキュベット中に純粋な緩衝液を用いて記録し、タンパク質のスペクトルから差引いた。
【００９３】
平均残基楕円率ｑm（ｍｄｅｇ×ｃｍ2×ｄｍｏｌ-1）を、以下のように記録された楕円率（ｑ）から計算した。
ｑm＝ｑ／（ｃ・ｎ・ｌ）
式中、ｃは、タンパク質濃度（Ｍ）、ｎは、タンパク質中の残基数（この場合１２３）、ｌは、パス長（ｎｍ）、ｑは、楕円率（度）である。
【００９４】
蛍光スペクトルを、２５℃で、パーキンエルマーＬＳ−５０Ｂスペクトロメーターで、１ｃｍ励起パス長の石英キュベットを用いて記録した。固有の（トリプトファン）蛍光発光スペクトルを、２９５ｎｍでの励起で３０５〜５３０ｎｍ（１ｎｍごと）記録した。励起帯域は３ｎｍであり、発光帯域は５ｎｍであった。ＡＮＳ蛍光発光スペクトルを、２５℃で、パーキンエルマーＬＳ−５０Ｂスペクトロメーターで、１ｃｍの励起パス長で石英キュベットを用いて、４００〜６００ｎｍ（１ｎｍごと）で、３８５ｎｍでの励起で記録した。励起帯域と発光帯域はいずれも５ｎｍに設定された。ＡＮＳアンモニウム塩（フルカ（Ｆｌｕｋａ）社，ブーフス，スイス）を段階的に加え、１.５モル当量でのスペクトルを示す。
【００９５】
その結果を図７で説明する。パネルＡは、黒く影をつけたラインで示す配位側鎖を有するカルシウム結合ループのリボン図を示す。野生型タンパク質において、カルシウムは、Ｋ７９、Ｄ８２、８４、８７（矢印）、および、Ｄ８８により配位される。Ｄ８７がＡに変化している場合（矢印）、このタンパク質は、カルシウムと結合する能力を失う。Ｄ８７がＮに変化している場合（矢印）、このタンパク質は、まだカルシウムと結合することができる（ただし低い親和性で）。
【００９６】
２種の変異体の三次構造に対する調査の結果をパネルＢに示す。スペクトルをＥＤＴＡを含まないリン酸ナトリウム緩衝液中で記録した。天然型ウシα−ラクトアルブミンは、２７０ｎｍでチロシン残基から生じる最小値、および、２９４ｎｍでトリプトファン残基から生じる最大値を示した。アポ−α−ラクトアルブミンはシグナルの特徴的な消失を示し、これは、チロシンおよびトリプトファンがよく固定されていないことを示す。Ｄ８７Ａ変異体は、ほとんど完全な楕円率の消失を示し、これは、部分的にアンフォールドしたコンフォメーションと一致している。Ｄ８７Ｎ変異体のスペクトルは、チロシン領域およ
びトリプトファン領域で減少した楕円率を示したが、Ｄ８７Ａ変異体と同程度ではなかった。
【００９７】
固有の蛍光分光分析の結果をパネルＣに示す。天然型ウシα−ラクトアルブミンにおいては、強度の３３５ｎｍでの最大値、３２０ｎｍでのショルダーを示し、これは、フォールドした疎水性コアにトリプトファン残基があることを示すが、アポ−α−ラクトアルブミンにおいて３５０にシフトしており、これは、トリプトファンが溶媒により近接していることを示す。Ｄ８７Ａ変異体とＤ８７Ｎ変異体とはいずれも、アポ−α−ラクトアルブミンと類似して、強度が３５０ｎｍで最大値を示した。
【００９８】
１.５当量のＡＮＳでの蛍光スペクトルを図７のパネルＤに示す。天然型ウシα−ラクトアルブミンは、ＡＮＳと結合しなかったが、純粋な緩衝液に加えたＡＮＳに類似していた。アポα−ラクトアルブミンは、４７５ｎｍでの最大値、および、顕著な強度の増加を示し、ＡＮＳと結合した。Ｄ８７Ｎ変異体およびＤ８７Ａ変異体は、ＡＮＳと結合し（強度が４７５ｎｍで最大値）、アポコントロールのスペクトルと極めて類似していた。
【００９９】
従って、近ＵＶのＣＤ分光分析をまとめると、ほぼ完全な楕円率の消失が観察され、これは、三次構造の崩壊（図７ｂ）、および、固有のトリプトファンスペクトルにおける強度の最大値がより高い波長にシフトしたこと（図７ｃ）を示す。曲線の高さと、強度の最大値がより短い波長へシフトしたこと（図７ｄ）により示されるように、Ｄ８７Ａ変異体は、ＡＮＳと結合した。過量のカルシウム（１ｍＭ）を添加した後、スペクトル変化は観察されなかったが、これは、これら条件下でＤ８７Ａ変異体がカルシウムと結合しなかったことを示す（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｐ．Ｊ．等，（１９９７年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６，１１６４８〜１１６５４）。
【０１００】
近ＵＶのＣＤスペクトルは、天然型のスペクトルとＤ８７Ａのスペクトルとの中間であるが、楕円率は天然型α−ラクトアルブミンと比べて顕著に減少し（図７ｂ）、固有の蛍光スペクトルは、天然型タンパク質と比べて赤にシフトし、これは、露出したトリプトファンと、三次構造の崩壊を示す（図７ｃ）。Ｄ８７Ｎ変異体はＡＮＳと結合したが、これは、露出した疎水性表面を示す（図７ｄ）。ＥＤＴＡ（１ｍＭ）の添加は、近ＵＶのＣＤ楕円率に対してわずかな効果しか示さず（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ  Ｓ．Ｅ．等，（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ  １４，７８５〜７８９）、これは、Ｄ８７Ｎ変異体が、カルシウムの存在下でもモルテン・グロビュール様状態であることを示す。
【０１０１】
Ｄ８７Ｎタンパク質はアポ様コンフォメーションであるが、Ｄ８７Ａより明確な三次構造を有する、と考えられる。
【０１０２】
これらの結果から、カルシウム結合部位における変異により、タンパク質が、カルシウム条件に非感受性なモルテン・グロビュール様コンフォメーションに固定されることが確認された。
【０１０３】
実施例５
アポトーシスのバイオアッセイ
Ｌ１２１０（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ２１９）細胞系を、記載通りに懸濁液中で培養した（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  Ｍ．等，（１９９９年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，６３８８〜６３９６）。この細胞を遠心分離で回収し（２００ｇで１０分間）、細胞培地（１０％ウシ胎仔血清、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、および、ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌを添加したＲＰＭＩ１６４０，ライフテクノロジーズ社，ギブコ・ビー・アール・エル（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ），ペーズリー，英国）に再懸濁し、２４ウェルプレート（ファルコン，ベクトンディッキンソン社，ニュージャージー州，米国）に２×１０6／ウェルの濃度で撒いた。様々なアゴニストを、ウシ胎仔血清を含まない細胞培地に溶解させ、細胞に加えた（最終容量１ｍｌ／ウェル）。プレートを、３７℃で、５％ＣＯ2雰囲気でインキュベートし、３０分後、ウシ胎仔血清１００μｌを各ウェルに加えた。細胞培地をコントロールとして使用した。
細胞生存率を、インキュベート６時間後にトリパンブルー排除法で測定した。分析のために、細胞懸濁液３０μｌを０.２％トリパンブルー溶液３０μｌと混合し、干渉位相差顕微鏡（オルトルックス（Ｏｒｔｏｌｕｘ）ＩＩ，ライツ・ヴェツラー（Ｌｅｉｔｚ  Ｗｅｔｚｌａｒ），ドイツ）で、１００個の細胞あたりの染色された細胞（死んだ細胞）数を測定した。
【０１０４】
ＤＮＡ断片化
オリゴヌクレオソーム長のＤＮＡ断片がアガロースゲル電気泳動で検出された。トリパンブルーの後に残った細胞懸濁液（９７０μｌ，２×１０6／ｍｌ）を、５ｍＭトリス、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.５％トリトンＸ−１００（ｐＨ８.０）中で、４℃で１時間溶解させ、１３,０００×ｇで１５分間遠心分離した。ＤＮＡを一晩−２０℃でエタノール沈殿させ、プロテイナーゼＫとＲＮＡアーゼで処理し、１.８％アガロースゲルにローディングし、定電圧を５０Ｖに設定して一晩電気泳動した。
ＤＮＡ断片をエチジウムブロマイドで３０５ｎｍのＵＶ光源を用いて可視化し、ポラロイドタイプの５５のポジ−ネガフィルムを用いて撮影した。
【０１０５】
変異タンパク質
変異タンパク質のアポトーシスを誘導する能力をＬ１２１０細胞系を用いて試験した。ＤＮＡ断片化の場合と同様に、本タンパク質を細胞培地に２ｍｇ／ｍｌで懸濁し、インキュベートの６時間後に細胞生存率を測定した。ＨＡＭＬＥＴコントロールは、０.３ｍｇ／ｍｌでアポトーシスを誘導したが、変異タンパク質は効果を示さなかった（図８）。
図８のパネルＡの表１は、変異タンパク質へ接触させてから６時間後のＬ１２１０細胞の生存率を示す。変異体は、１.０ｍｇ／ｍｌの濃度でも細胞を死滅させることができなかった（ＢＡＭＬＥＴに関する結果を参照（図９を参照）、生存率が９８％から４％に減少した）。
変異タンパク質は、ＤＮＡ断片化を誘導しなかったが、ＢＡＭＬＥＴは、パネルＢで示されるような特徴的なＤＮＡラダー形成を導いた。
これらの結果により、オレイン酸と結合していないタンパク質は、腫瘍細胞でアポトーシスを誘導するには不十分であることが示される。
【０１０６】
実施例６
ＢＡＭＬＥＴの製造（腫瘍細胞に致死的なウシα−ラクトアルブミン）
ヒトタンパク質とウシタンパク質との構造的な相同性を考慮すると、ウシα−ラクトアルブミンを、アポトーシス誘導特性を有するＨＡＭＬＥＴ様分子へ変換することが可能なはずである。従って、ウシα−ラクトアルブミンを、ヒトα−ラクトアルブミンでこれまで使用されてきた変換条件で処理した。ウシα−ラクトアルブミンをＥＤＴＡで処理して、Ｃａ2+を除去し、Ｃ１８：１で調整されたカラムでのイオン交換クロマトグラフィーで処理し、ＮａＣｌ濃度勾配で溶離させた。大部分のアプライされた材料がボイドで溶離したが、約４０％が１Ｍ  ＮａＣｌの後に鮮明なピークを形成した（図９ａの矢印）。高い塩濃度後の溶出液を分析のために保存した。ヒトα−ラクトアルブミンが、高い効率で変換された。
【０１０７】
大部分のアプライされた材料が、ボイドで溶離したが（約６０％）、少量が１Ｍ  ＮａＣｌ後に鮮明なピークで溶離した（図９ａ）。
【０１０８】
高い塩濃度ピーク、すなわちＢＡＭＬＥＴのアポトーシス誘導活性を、上述のようなＬ
１２１０マウス白血病細胞系を用いて調べた。細胞生存率の消失とＤＮＡ断片化を、エンドポイントとした。Ｌ１２１０細胞は、ＨＡＭＬＥＴ（０.３ｍｇ／ｍｌ）に接触させると急速に死滅し、ＤＮＡ断片化が誘導された。Ｌ１２１０細胞は、ＢＡＭＬＥＴに対しても同様に感受性を有していた。
【０１０９】
ＢＡＭＬＥＴは、０.３ｍｇ／ｍｌで、６時間のインキュベート後に、細胞生存率を９９％から１２％に減少させ、ＤＮＡ断片化を誘導した（図９ｂ）。ＨＡＭＬＥＴとウシの相当物との間に、アポトーシス誘導の効率における明らかな差はなかった（図９ｂ）。
【０１１０】
ＢＡＭＬＥＴの三次構造を近ＵＶのＣＤ分光分析で分析した。天然型ウシα−ラクトアルブミンは、チロシンのくぼみとトリプトファンピークを有するよくフォールドされたタンパク質の特徴的なスペクトルを共通して有し、天然型ウシα−ラクトアルブミンはＡＮＳと結合しなかった。ウシアポタンパク質は、チロシン領域とトリプトファン領域の両方のシグナルを減少させ、これは、フレキシブルな側鎖を含む部分的にフォールドしたタンパク質、４７０ｎｍでの最大値、および強度の増加を示す有意なＡＮＳ結合を示す。ウシ複合体は、ＨＡＭＬＥＴとアポ−コントロールとの両方に極めて類似していた（図９ｃ）。天然型およびアポコントロールを図７に示す。ＨＡＭＬＥＴは、部分的にアンフォールドしたタンパク質に特徴的なチロシン領域およびトリプトファン領域で楕円率の減少を示した。ＢＡＭＬＥＴは、アポコントロールとＨＡＭＬＥＴに類似したスペクトルを有しており、これは、フレキシブルな芳香族部分（ａｒｏｍａｔｅｓ）を示す。
【０１１１】
天然型ウシα−ラクトアルブミンの固有の蛍光スペクトルは、フォールドしたタンパク質中のトリプトファン残基から予想されたように、強度の３２０ｎｍでの最大値を示した。アポタンパク質は、強度の３４５ｎｍでの最大値、および、３６０ｎｍでのショルダーを示し、これは、トリプトファンがより露出していることを示す（図９ｅ）。ＨＡＭＬＥＴは、固有の蛍光強度の３４５ｎｍでの最大値、および、３６０ｎｍでの傾斜を示し、これは、トリプトファンが溶媒に露出していることを示す。ＢＡＭＬＥＴのスペクトルもＨＡＭＬＥＴのスペクトルと類似していたが、ただしショルダーは示さなかった。この結果から、天然型タンパク質ではトリプトファン残基が溶媒から保護されているが、アポコントロールのＨＡＭＬＥＴおよびＢＡＭＬＥＴではより溶媒に露出していることが示される。
【０１１２】
ＨＡＭＬＥＴのＡＮＳスペクトルは、青色にシフトし、強度の４７５ｎｍでの最大値を示し、量子効率が増加したが、これは、ＡＮＳ結合を示す。ＢＡＭＬＥＴのスペクトルは、実質的に、ＨＡＭＬＥＴのスペクトルと同一であった。この結果から、天然型タンパク質ではなく、アポコントロールのＨＡＭＬＥＴおよびＢＡＭＬＥＴにおいて露出した疎水性表面があることが示される。ウシ複合体およびＨＡＭＬＥＴは、実質的に同一のスペクトルを有し、アポコントロールと同様にＡＮＳと結合した（図９ｆ）。
【０１１３】
ウシアポ−ラクトアルブミンは、Ｃ１８：１の存在下で、アポトーシスを誘導する分子複合体に変換することができると結論付けることができ、この複合体をＢＡＭＬＥＴ（腫瘍細胞に対して致死性にしたウシα−ラクトアルブミン）という。
【０１１４】
実施例７
Ｄ８７ＡおよびＤ８７Ｎ変異体のＢＡＭＬＥＴへの変換
上述のＤ８７Ａ変異体を、Ｃ１８：１で調整されたイオン交換カラム（ＥＤＴＡを含まない）にアプライし、アプライしたタンパク質のほとんどが高い塩濃度の後に鮮明なピークで溶離した（矢印）（図１０ａ）。最初に、Ｄ８７Ｎ変異体をＥＤＴＡで処理して、残留したカルシウムを除去し、カラムにアプライした。少量のアプライされたタンパク質がボイドボリュームで溶離したが、大部分が高い塩濃度の後に鮮明なピークとして溶離した
（矢印）。溶離したタンパク質−脂質複合体は、アプライしたＤ８７Ａタンパク質の９０％超、および、Ｄ８７Ｎタンパク質の９５％超に達し、Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴ、および、Ｄ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴと名付けた。
【０１１５】
これら複合体を上述のアポトーシスおよびＤＮＡ断片化分析で試験した。表ＩＩＩ（図１０ｂ）に、Ｌ１２１０細胞をＤ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴに接触させて６時間後の、生存率の低下を示す。０.５ｍｇ／ｍｌで、Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴは、生存率を９８％からそれぞれ１３％、１７％に減少させた。Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴは、ＢＡＭＬＥＴコントロールと同様に、ＤＮＡ断片化を誘導した（図１０ｃ）。変異体複合体のＬＤ50（０.４ｍｇ／ｍｌ）は、ＢＡＭＬＥＴおよびＨＡＭＬＥＴのＬＤ50よりわずかに高かった（０.２ｍｇ／ｍｌ）。
【０１１６】
Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴおよびＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴの分光学的な特徴付け
Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴのコンフォメーションを、天然型およびアポ−ウシα−ラクトアルブミン、および、ＢＡＭＬＥＴと比較した。この複合体と、天然型アポ、および、ＢＡＭＬＥＴコントロールとを用いて近ＵＶのＣＤ分光分析を行った（図７および９に示す）。Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴスペクトルは、変換されていないＤ８７Ａタンパク質と極めて類似しており、Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴがアポ構成であることを示す楕円率は実質的にはみられなかった。Ｄ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴのスペクトルは、実質的に、ＢＡＭＬＥＴのスペクトルと同一であり、チロシン領域とトリプトファン領域の両方において楕円率が減少していた（図１０ｄ）。
【０１１７】
天然型アポ−α−ラクトアルブミン、および、ＢＡＭＬＥＴコントロールを用いて、固有のトリプトファン蛍光分光分析を行った（図１および３に示す）。Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴを用いた結果により（図１０ｅ）、ＢＡＭＬＥＴおよびヒトアポ−α−ラクトアルブミンコントロールと極めて類似した、強度の３４５ｎｍでの最大値、および、３５５ｎｍでのショルダーを示し、これは、トリプトファンが溶媒に近づきやすいことを示唆する。
【０１１８】
天然型アポコントロールおよびＢＡＭＬＥＴコントロールを用いてＡＮＳ分光分析を行った（図７および９に示す）。Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴはいずれもＡＮＳと結合し、スペクトルは、ＢＡＭＬＥＴおよびアポ−α−ラクトアルブミンコントロールと類似していた。Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴは、ＡＮＳと結合し、強度の最大値は４７０ｎｍにシフトし、天然型コントロールと比較して量子効率は増加しており、これは、いずれのタンパク質においても疎水性表面が露出していることを示す（図１０ｆ）。
【０１１９】
これらの結果により、Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴは、ＨＡＭＬＥＴとＢＡＭＬＥＴに類似した構造的および機能的特性を有する部分的にフォールドした状態を維持することが示された。オレイン酸処理の前のカルシウムの除去は、Ｄ８７Ａ突然変異体には必要なく、なぜなら、このタンパク質は、最も結合カルシウムが存在しない可能性が高く、大部分がアポフォームで存在するためである。
【０１２０】
生物学的な活性を維持する複合体のように、機能的なカルシウム結合部位は、この複合体のアポトーシス機能には必要がないと考えられる。
【０１２１】
実施例８
α−ラクトアルブミンおよびＨＡＭＬＥＴ複合体へのカルシウム結合
発色性キレート化剤ｑｕｉｎ２を、フルカ・ケミ社（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ
）（ブーフス，スイス）から購入した。その他の化学物質は、入手できる最高の実験用クオリティのものとした。Ｃａ2+非含有緩衝液を製造するために、膜チュービング（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｕｂｉｎｇ）（分子量カットオフ：３５００，スペクトラム・メディカル・インダストリーズ社（ロサンゼルス，カリフォルニア州，米国），使用前に２倍量の蒸留水で４回煮沸）を、キレックス１００（１０ｍｌ）（バイオラッド社，リッチモンド，カリフォルニア州，米国）で充填し、密封し、溶液中で保存してＣａ2+を吸収させた。
【０１２２】
天然型ヒトα−ラクトアルブミンを、ヒトの乳汁から、記載通りに硫酸アンモニウム沈殿とフェニルセファロースクロマトグラフィーで精製した（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ等，ＰＮＡＳ．２０００年，９７，４２２１〜６）。ウシα−ラクトアルブミンは、シグマ社（セントルイス，ミズーリ州，米国）から購入し、さらに、硫酸アンモニウム沈殿とフェニルセファロースクロマトグラフィーを用いてウシ乳汁から精製した（上述のＳｖｅｎｓｓｏｎ等）。変異タンパク質（Ｄ８７ＡおよびＤ８７Ｎ）を、記載通りにＥ．ｃｏｉｌで発現させ、精製し、フォールディングさせ、凍結乾燥した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ等，１９９７年）、（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ等，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎｇ．２００１年，１４：７８５〜９）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびアガロースゲル電気泳動、および、ＮＭＲ分光分析で、このタンパク質の純度を分析した。
【０１２３】
１０倍の過量のモル濃度のＥＧＴＡを含む二回蒸留した蒸留水（ｐＨ８.０）にα−ラクトアルブミンを溶解させることによって、Ｃａ2+結合研究のためのアポヒトまたはウシα−ラクトアルブミンを調製した。Ｇ−２５ゲルろ過カラムに、飽和ＮａＣｌのアリコート（カルシウム非含有）の後でサンプルをアプライし、二回蒸留した蒸留水で溶離させた。サンプルを飽和ＮａＣｌに通過させてＥＧＴＡと本タンパク質との結合を減少させ、Ｃａ2+もＥＧＴＡも含まないタンパク質が水中に溶離した。残留したカルシウム量は、以下で説明するようにｑｕｉｎ２の存在下での滴定で推定したところ、０.１当量未満であった。
【０１２４】
カルシウム非含有およびＥＤＴＡ非含有ＨＡＭＬＥＴを、以下の適応を加えて、以前で記載したようにして調製した。全ての緩衝液を、使用前に、転倒したボード上で最小限５日間、キレックス（上述で製造したもの）と共に保存した。プラスチックバイアルのみを使用した。イオン交換カラム２０ｍｌおよび全てのチュービングを含むＦＰＬＣシステム（バイオラッド・バイオロジック社（Ｂｉｏｒａｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃ），リッチモンド，カリフォルニア州，米国）を２倍量の１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８.５）で洗浄し、次に、少なくとも１０倍量のミリポア水でリンスした。オレイン酸をアプライする前にこれを２倍量の緩衝液で処理した。カルシウム非含有緩衝液（８０ｍｌ）中のＥＧＴＡ非含有アポα−ラクトアルブミン（２０ｍｇ）を、４回の連続したランでカラムにアプライした（各ランあたり２０ｍｌ）。回収された分画をプールし、透析し、凍結乾燥し、上述のように腫瘍細胞に対する活性を調べた。原子吸光分光分析法、または、ｑｕｉｎ２の存在下での滴定でカルシウム含量を分析した（以下に説明する）。また、生成物をアガロース電気泳動および1Ｈ−ＮＭＲで特徴付けた。
【０１２５】
Ｃａ2+結合平衡を研究するために、表１に列挙したタンパク質、例えば実施例７で説明されたようにして得られたＤ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴやＨＡＭＬＥＴなどを、Ｃａ2+が結合すると２６３ｎｍでの吸光度が減少する（約８５％）発色性キレート化剤ｑｕｉｎ２の存在下でカルシウムで滴定したところ、この方法は、ｑｕｉｎ２がキレート化剤の場合、本タンパク質とキレート化剤とでカルシウムに対して競合することにより、高い親和性部位を定量するのに使用することができる（低い塩濃度で約１０7〜５×１０9Ｍ-1、および、０.１５  ＮａＣｌで約５×１０5〜１×１０8Ｍ-1）。キレート化剤溶液の正確な濃度（２５〜３０μＭの範囲）を、過量のカルシウムの存在下での２３９.５ｎｍでの吸光度から計算した（ｑｕｉｎ２に関しては、ε239.5＝４.２×１０4Ｌ／モル・ｃｍを用いる）
。凍結乾燥したタンパク質を、２５〜３０μＭの濃度で、カルシウム非含有（１μＭ未満のＣａ2+）キレート化剤溶液に溶解させた。２６３ｎｍでの吸光度（Ａ263）を、本タンパク質／キレート化剤溶液に関して、ＵＶ／Ｖｉｓ９２０分光光度計（ＧＢＣサイエンティフィック・イクイップメントＰｔｙ社（ＧＢＣ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ），ビクトリア，オーストラリア）を用いて記録した。カルシウム溶液（３ｍＭ  ＣａＣｌ2，２ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７.５）中，０.１５Ｍ  ＮａＣｌ含有または非含有）を４μｌずつ加えた。カルシウムを添加する度に、Ａ263を記録した。最後の５回の添加で吸光度変化がみられなくなるまで滴定を継続した。０.１５Ｍ
ＮａＣｌでのタンパク質滴定を停止させるために、より高濃度のＣａ2+ストック（１０ｍＭ）を用いた。測定された量、吸光度対総カルシウム濃度に対して直接最小二乗フィッティングを用いて、ＣａＬｉｇａｔｏｒソフトウェアを用いてデータを分析した（ＡｎｄｒｅおよびＬｉｎｓｅ，２００２年）。
【０１２６】
α−ラクトアルブミンのＣａ2+親和性は、主にウシタンパク質に関して広範囲にわたり研究されている。報告された値（表１）は、２.５×１０6〜５.７×１０8Ｍ-1の範囲で様々であり、これは恐らく、温度、緩衝液、イオン強度、塩、および、タンパク質調製物に関する実験条件を反映している。
【０１２７】
滴定曲線は、キレート化剤とタンパク質との親和性の違いに対して極めて高い感受性を示したため、この割合は、高い精度でデータから得ることができる。低い塩濃度での正規化データ（吸光度対総Ｃａ2+濃度）を図１１に示し、生理学的（０.１５Ｍ  ＮａＣｌ）および低い塩濃度（添加なし）で得られた本タンパク質のＣａ2+結合定数を表１に列挙する。我々は、低い塩濃度で、Ｋaが１.８×１０9Ｍ-1（ＫD＝０.５６×１０-9Ｍ）であることを見出した。Ｃａ2+イオンは、生理学的な塩濃度（０.１５Ｍ  ＮａＣｌ）ではより弱く結合した：Ｋa＝８.３×１０6Ｍ-1（ＫD＝１.２×１０-7Ｍ）。
【０１２８】
ＨＡＭＬＥＴおよびＢＡＭＬＥＴは、Ｃａ2+と結合することが示された（図１１）。ＨＡＭＬＥＴのカルシウム結合定数は、低い塩濃度でＫa＝５.９×１０8Ｍ-1（ＫD＝１.７×１０-9Ｍ）であり、生理学的な塩濃度でＫa＝５.３×１０6Ｍ-1（ＫD＝１.９×１０-7Ｍ）であった。Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴのＣａ2+滴定データは、ｑｕｉｎ２単独での滴定と比較して差がないことが示され（図１１）、これは、Ｄ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴが機能的なＣａ2+結合部位を失っていることを証明している。
【０１２９】
ＨＡＭＬＥＴは、低い塩濃度環境と生理学的な塩濃度環境とのいずれにおいても高いカルシウム親和性を維持すると考えられる。従って、ＨＡＭＬＥＴのカルシウム親和性は、塩が添加されない場合、α−ラクトアルブミンのカルシウム親和性より３倍低いだけであり、生理学的な塩濃度では１.６倍低い。
【０１３０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】ＨＡＭＬＥＴ様分子複合体を産生する能力に関して調査された、簡略化した脂肪酸の構造と、特に不飽和脂肪酸の線画を示す。
【図２】それぞれの脂肪酸で調整されたイオン交換マトリックス上でのアポ−α−ラクトアルブミンの保持を示す一連のグラフである。
【図３】脂質−タンパク質複合体により誘導された腫瘍細胞のアポトーシスを説明する。
【図４】脂肪酸−タンパク質複合体の三次構造を決定するためのＣＤ分光分析の結果を示す。
【図５】疎水性のインジケーターとしての、脂肪酸−タンパク質複合体のＡＮＳ分光分析による調査の結果を示す。
【図６】複合体のＮＭＲ分析の結果を示す。
【図７】α−ラクトアルブミンのＤ８７ＡおよびＤ８７Ｎ変異体の特徴付けを説明しており、図中、パネルＡは、カルシウム結合部位の構造を示す。
【図８】変異タンパク質単独を用いて行われた生物学的試験を説明しており、それらがアポトーシスを誘導しないことを示す。
【図９Ａ】ウシα−ラクトアルブミンのＢＡＭＬＥＴへの変換を説明する。
【図９Ｂ】図９Ａの続きである。
【図１０Ａ】Ｄ８７ＡおよびＤ８７ＮからＤ８７Ａ−ＢＡＭＬＥＴとＤ８７Ｎ−ＢＡＭＬＥＴの作成および試験結果を説明する。
【図１０Ｂ】図１０Ａの続きである。
【図１１】ｑｕｉｎ２の存在下でのＣａ2+滴定の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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