(57)【要約】  本発明は、ディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）を実行する方法に関し、該ＤＨＩは、試料のホログラムを復元するために数値手段を適用することによって該試料の画像が得られるということに特徴付けられる。本発明の方法において、試料は、該試料の性質に影響を与え及び／またはホログラム構成に影響を与える制御された特性５を有する媒体３内にある。１つのホログラムの情報内容すなわち複数のホログラムの情報内容は、１つの媒体すなわち複数の媒体における試料と共に記録され、試料の１つの画像すなわち試料の複数の画像を再構成するために使用され、それは、試料の１つの特性すなわち試料の複数の特性を量的に記載している。本発明は、また、上記方法の実行を伴う装置にも関する。
2005512127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）を実行する装置であって、該装置が、
ホログラフィック生成ユニットと、
ホログラフィック復元ユニットと、
処理ユニットと、
試料ユニットとを備え、該試料ユニットは、試料が収容された媒体を収容することに適合した容器を含むことを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置において、前記容器が液体を収容することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の装置において、さらに、前記試料ユニットに接続された媒体制御ユニットを備え、該媒体制御ユニットは、媒体の部分的または完全な媒体交換を含め、媒体特性を修正することに適合した媒体制御ユニットを備えることを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置において、さらに、前記試料ユニットの少なくとも一部を機械的に振動させる振動手段を備えることを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項４に記載の装置において、前記振動手段が前記媒体制御ユニットに組み込まれたことを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置に適合する試料を含む媒体であって、該媒体は、
前記試料に直接影響を及ぼす、すなわち、前記試料の形状及び／またはその誘電特性を修正する条件、および、
得られたホログラフィック・イメージングのコントラスト修正を誘発する条件の少なくとも１つを満足することを特徴とする媒体。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置に使用する方法であって、媒体を使用し、該媒体が実時間観察の間に修正されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記媒体が分散性媒体であり、該媒体の誘電特性が前記試料を照明する放射の波長を変化させることによって変化することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７または８に記載の方法において、前記媒体の誘電特性が修正され、得られた前記対応するホログラフィック情報が前記試料の形状及び／または前記媒体の誘電特性を規定するために使用されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法において、前記試料の方向が複数のホログラムの獲得の間に変化され、該複数のホログラム情報内容が前記試料のコンピュータ処理された三次元断層写真を構築するために使用されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法において、前記試料を照明する放射の波長が複数のホログラムの獲得の間に変化され、該複数のホログラムの情報内容が前記試料のコンピュータ処理された三次元断層写真を構築するために使用されることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法において、前記試料を照明する放射の波長および該試料の方向が複数のホログラムの獲得の間に変化され、該複数のホログラムの情報内容が前記試料のコンピュータ処理された三次元断層写真を構築するために使用されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料のホログラフィック表示を提供するディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）の装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホログラフィーは、参照波（reference wave）と、試料から発出する物体波（object wave）と呼ばれる波動との間の干渉を使用する三次元（３Ｄ）イメージング技術である。この干渉の目的は、試料の３Ｄ特性に関連する物体波の位相を記録することである。ディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）では、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを記録装置として使用しホログラムの数値的復元を行うことによって、実時間観察を達成できる。この概念は、３０年以上前、ジェイ・ダブリュ・グッドマン（J.W. Goodmann）、アール・ダブリュ・ローレンス（R.W. Lawrence）が、「電子的に検出されたホログラムからのディジタル画像形成（“Digital image formation from electronically detected holograms”」、応用物理通信（Appl. Phys. Lett.）、第１１巻、１９６７年で最初に提案した。ディジタル画像の取得及び加工の分野で達成された技術的進歩の結果、ホログラフィーのこうした数値的またはディジタル的アプローチはその可能な適用業務の範囲を大きく拡大しており、近年ＤＨＩに触発された様々な種類のイメージング・システムが開発されている。
【０００３】
ＤＨＩ技術は、参照波と物体波とが同様の伝播方向を有することを特徴とするインライン（in-line）技術と、２つの干渉波が異なった方向に伝播するオフアクシス（off-axis）技術との２つの主なカテゴリーに分類できる。インライン・ディジタル・ホログラフィーでのホログラム形成の手順は、いわゆる位相シフト干渉法技術による位相測定で使用される手順と同様である。インライン技術によるホログラム形成にはいくつか（少なくとも３つ）の画像の取得が必要であり、それらの画像は参照波の変調中に取得しなければならない。オフアクシス技術が必要とするのは１つのホログラムの取得だけであり参照波の位相の変調は必要ないため、実験の観点からはより簡単である。しかし、インライン技術は、復元された画像に二重像とゼロ次回折がないという利点を示す。オフアクシス技術の中では、フーリエ変換ホログラフィーに基づく方法と、いわゆるフレネル・ホログラフィーに基づく方法とを区別できる。フーリエ変換法では、参照波は曲率が精密に管理された球面波でなければならず、イメージの復元は基本的にホログラムのフーリエ変換によって行われる。フレネル・ホログラフィーに基づく技術では、復元手順はより高度であるが、実験設備を構築する上で、より大きな柔軟性が提供される。
【０００４】
ＤＨＩに触発された技術の開発または適用業務を提示する最近の刊行物の中では、以下の論文に言及することができる。インライン技術のいくつかの一般的な動作の研究が「位相シフト・ディジタル・ホログラフィーにおける画像形成と顕微鏡法への応用（“Image formation in phase-shifting digital holography and application to microscopy”）」、アイ・ヤマグチ（I. Yamaguchi）他、応用光学（Applied Optics）、第４０巻、第３４号、２００１年、６１７７−６１８６頁、で提示されている。「フーリエ変換ホログラフィック顕微鏡（“Fourier-transform holographic microscope”）」、応用光学（Applied Optics）、第３１巻、１９９２年、４９７３−４９７８頁では、ダブリュ・エス・ハダッド（W.S. Haddad）他はフーリエ変換ＤＨＩの一般的な原理を記述している。フレネルによるアプローチの応用例は、「ＣＣＤターゲットによるホログラムの直接記録と数値的復元（“Direct recording of holograms by a CCD target and numerical reconstruction”）」、ユー・シュナース（U. Schnars）及びダブリュ・ユプトナー（W. Juptner）、応用光学（Applied Optics）、第３３巻、１９９４年、１７９−１８１頁、及び「“多芯光ファイバによる内視鏡ホログラフィーの動作（“Performances of endoscopic holography with a multicore optical fiber”）」、オー・コクオズ（O. Coquoz）他、応用光学（Applied Optics）、第３４巻、１９９５年、７１８６−７１９３頁に見られる。
【０００５】
ＤＨＩ法の主要な要素は、ホログラム復元のために使用される数値的方法である。単一のオフアクシス・ホログラム取得に基づく物体波の振幅及び位相の同時復元を可能にする最初の復元手順はクーシュ（Cuche）他によって開発され、米国特許第６，２６２，２１８号及びＷＯ  ００／２０９２９号で提示されている。この技術の様々な応用と実現は、「定量的位相差イメージングのためのディジタル・ホログラフィー（“Digital holography for quantitative phase-contrast imaging”）」、光学通信（Optics Letters）、第２４巻、１９９９年、２９１−２９３頁、「フレネル・オフアクシス・ホログラムの数値的復元による同時振幅差・定量的位相差顕微鏡法（“Simultaneous amplitude-contrast and quantitative phase-contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel off-axis holograms”）」、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、１９９９年、６９９４−７００１頁、「ディジタル・オフアクシス・ホログラフィーにおけるゼロ次及び二重像消去のための空間フィルタリング（“Spatial Filtering for Zero-Order and Twin-Image Elimination in Digital Off-Axis Holography”）」、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、第３４号、１９９９年、「３次スプライン補間を使用する開口アポダイゼーション：ディジタル・ホログラフィック顕微鏡法における応用（“Aperture apodization using cubic spline interpolation:Application in digital holographic microscopy”）」、光通信（Optics Communications）、第１８２巻、２０００年、５９−６９頁、及び「ディジタル・ホログラフィーの使用による偏光イメージング（“Polarization Imaging by Use of Digital Holography”）」、ティー・コロンブ（T. Colomb）他、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、第３４号、１９９９年で提示されている。
【０００６】
ＤＨＩ法は細胞生物学での応用という興味深い可能性を提示している。実際、生細胞は光学的には位相物体、すなわち、それらを横切る光に対して誘発する位相シフトに基づいて成分を光学的に精査できる透明な試料として挙動する。透明な試料の位相シフト挙動は周知であり、長年にわたって位相差（ＰｈＣ）及びノマルスキー（Nomarski）（ＤＩＣ）顕微鏡法における画像形成の機構を構成している。これらの２つの技術は生物顕微鏡法において広く使用されており、対照法としては適切であるが、精密な定量的位相測定に使用することはできない。その代わり、ＤＨＩ法は、位相測定のために最も一般的に使用される技術である古典的な干渉法を思い出させるものである。しかし、干渉法技術は計測学では広く使用されているが、生物学への応用はごくわずかしか報告されておらず、それには、アール・ベラー（R. Barer）及びエス・ジョゼフ（S. Joseph）、「生細胞の屈折率測定法（“Refractometry of living cells”）」、顕微鏡学季刊誌（Quarterly Journal of Microscopical Science）、第９５巻、１９５４年、３９９−４２３頁、アール・ベラー（R. Barer）、「生細胞の屈折率測定法及び干渉法（“Refractometry and interferometry of living cells”）」、米国光学学会雑誌（Journal of the Optical Society of America）、第４７巻、１９５７年、５４５−５５６頁、エー・ジェー・コーブル（A.J. Coble）他、「ネクチュルス胆嚢上皮の顕微鏡干渉法（“Microscope interferometry of necturus gallblader epithelium”）」、ジョサイア・マーシー・ジュニア財団（Josiah Macy Jr. Foundation）、ニューヨーク、１９８２年、２７０−３０３頁、ケー・シー・スヴォボダ（K.C. Svoboda）他、「光トラッピング干渉法によるキネシン・ステッピングの直接観察（“Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry”）、ネイチャー（Nature），第３６５巻、１９９３年、ジェイ・ファリナス（J. Farinas）及びエー・エス・ヴェルクマン（A.S. Verkman）、「干渉法によって測定される上皮細胞層の細胞体積原形質膜浸透的水透過性（“Cell volume plasma membrane osmotic water permeability in epithelial cell layers measured by interferometry”）」、生物物理学雑誌（Biophysical Journal）、第７１巻、１９９６年、３５１１−３５２２頁、ジー・エー・ダン（G.A. Dunn）及びディー・ジチャ（D. Zicha）、「線維芽細胞拡散の動態（“Dynamics of fibroblast spreading”）」、細胞科学雑誌（Journal of Cell Science）、第１０８巻、１９９５年、１２３９−１２４９頁、といったものがある。
【０００７】
材料科学または計測学適用業務の場合と同様、生物学適用業務に対しても、ＤＨＩ法は同様の性能で実験手順が単純化された古典的な干渉法に対する新しい代替案を提案する。主要な利点は、複雑で費用のかかる実験光学装置をディジタル処理法によって取り扱えるという点から生じる。例えば、イー・クーシュ（E. Cuche）他が「フレネル・オフアクシス・ホログラムの数値的復元による同時振幅差・定量的位相差顕微鏡法（“Simultaneous amplitude-contrast and quantitative phase-contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel off-axis holograms”）」、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、１９９９年、６９９４−７００１頁、で説明しているように、顕微鏡対物レンズを物体波の経路に沿って導入する際現れる波面変形は、ディジタル手順を使用して補償できる。特に、この特徴は、顕微鏡法の分野で魅力的な可能性を開くものである。さらに、ＤＨＩ技術は、干渉法技術より高速で動作し、試料についてより多くの情報を提供するが、特に、物体波の振幅と位相とを単一のホログラム取得に基づいて同時に得ることができる。
【０００８】
ケー・ボイヤー他、「可視光線、紫外線及びＸ線波長における生物医学的三次元ホログラフィック・マイクロイメージング（“Biomedical three-dimensional holographic microimaging at visible,ultraviolet and X-ray wavelength”）」、自然医学（Nature Medecine）、第２巻、１９９６年、９３９−９４１頁、及びエフ・デュボア（F. Dubois）他、「部分空間コヒーレンスの発生源を伴うディジタル・ホログラフィー顕微鏡による改良型三次元イメージング（“Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence”）」、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、１９９９年、７０８５−７０９４頁では、ＤＨＩ法は位相復元を伴わない生物細胞の静的イメージングに応用されている。いくつかの画像取得を必要とする位相測定様式を使用した細胞のＤＨＩは、ジー・インデベトウ（G. Indebetouw）及びピー・クリスブン（P. Klysubun）、「空間時間的ディジタル・マイクロホログラフィー（“Saptiotemporal digital microholography”）」、米国光学学会雑誌Ａ（Journal of the Optical Society of America A）、第１８巻、２００１年、３１９−３２５頁、で報告されている。
【０００９】
ＤＨＩによれば、数時間までの実験期間について、画像取得はビデオレートで行うことができ、適当な画像取得システムを使用すればさらに高速に行うことができる。その干渉的性質のため、ＤＨＩは高い軸方向解像度（ナノメートル台）を有しているため、試料形状の微妙・微小な修正の観察を可能にしており、生命及び材料科学の両方で広い分野の用途を開いている。
【００１０】
一般的な干渉法技術、及び特にＤＨＩ法の周知の制限は、測定される量、すなわち電磁放射の位相がいくつかの要因に同時に影響されうるということから生じる。電磁放射が試料と相互作用する時、この相互作用の結果、特に入射放射の位相に発生する変化は、主に次のような３種類のパラメータに依存する。
【００１１】
ａ）試料の幾何学的特性。反射をイメージングする反射性試料の場合の表面トポグラフィーと透過をイメージングする透明試料の場合の試料の厚さ。
ｂ）試料の誘電特性。放射の強度に影響する吸収率と放射の位相を修正する屈折率。吸収率と屈折率とは複素屈折率という概念で結合されることが多い。
ｃ）試料を組み込む媒体の誘電特性。電磁相互作用が試料の特性のみに依存するのは、真空中または近似的には空気中だけである。一般的には、試料の誘電特性は試料を組み込む媒体の誘電特性に対して相対的に定義しなければならない。例えば、検討しなければならないのは試料（ｎs）の絶対屈折率ではなく、ｎmが試料を組み込む媒体の屈折率である場合の差（ｎs−ｎm）である。
【００１２】
従って、電磁放射の位相の測定に由来するデータを解釈するのは困難であることが多い。例えば、試料の形状を精密かつ明瞭に決定したい場合、（試料と媒体両方の）誘電特性を知る必要がある。さらに、試料の誘電特性を決定したい場合、試料の形状と媒体の誘電特性を知らなければならない。結果の厳密で明瞭な解釈は、例えば、文献から誘電特性値を得るか、または別の技術によって試料のジオメトリまたは誘電特性を測定することによって得られる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、試料を組み込む媒体を画像形成処理の有効なパラメータとみなすディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）を実行する装置と方法を提供することを目的とする。また、本発明の目的は、このような装置と方法がより正確な測定を提供することによってＤＨＩの性能を改善することである。別の目的は、試料とそれを組み込む媒体との間の相互作用に起因する動的な作用を研究することである。最後に、別の目的は、試料、特にその幾何学的特性及び誘電特性に関するより多くの情報を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、請求項１に記載の装置、請求項６に記載の媒体、及び請求項７に記載の試料のディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）を実行する方法に関する。
【００１５】
装置に関する本発明の一部の実施形態は従属請求項２〜５に記載されている。方法に関する他の実施形態は従属請求項８〜１３に記載されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ  ００／２０９２９号で開示された方法または装置、特に、放射の発生源と、前記放射によって試料ユニットを照明する手段と、試料ユニットとの相互作用の後放射を収集することによって物体波を生成する手段と、前記放射から参照波を生成する手段と、前記参照波と前記物体波との間の干渉によってホログラムを発生させる手段と、前記ホログラムを取得しディジタル化することによってディジタル・ホログラムを発生させる手段と、前記ディジタル・ホログラムを前記ホログラム復元ユニットに伝送する手段とを含むホログラム生成装置を備え、前記ホログラム復元ユニットが前記ディジタル・ホログラムに適用される数値計算によって振幅差画像及び／または定量的位相差画像を提供し、前記処理ユニットが複数の前記振幅差画像及び／または複数の前記定量的位相差画像を処理することによって試料の誘電特性及び／または試料の形状を決定し、前記処理ユニットが複数の前記振幅差画像及び／または複数の前記定量的位相差画像を処理することによって前記試料の変化を記述するためにも使用できる装置と共に使用する場合特に有用である。
【実施例】
【００１７】
本発明の重要な態様は試料を収容する媒体によって代表される。図１に概略を示すように、このことが意味するのは、試料１は、媒体３によって充填された、例えば容器２によって形成されるある容積の内部に位置するということである。試料ユニット４は、試料１と、容器２と、媒体３とによって構成される。媒体３は、気体、液体、ゲル、固体、粉末または液体中に懸濁した固体粒子の混合物でもよい。媒体３が気体の場合、容器２は閉じている。媒体３が液体の場合も容器２は閉じていてよいが、容器２の上面は開いていてもよい。媒体３が固体またはゲルの場合、容器２は必須でない。例えば、試料１は生理溶液中に埋め込まれた生体試料でもよい。
【００１８】
特に、媒体３は媒体３の屈折率を変化させる要素から構成されるか、またはそれを備えてもよい。例えば、媒体３は、様々な濃度のメトリザミド（Ｃ18Ｈ22Ｉ3Ｎ3Ｏ8）のような分子、及び／または様々な濃度のマニトール（manitol）、及び／またはイオヘキソール（iohexol）、及び／またはイオジキサノール（iodixanol）、及び／またはフィコール（ficoll）、及び／またはパーコール（percoll）を備える液体要素でよい。
【００１９】
特に、媒体３は分散性を有する要素から構成されるか、またはそれを備えてもよいが、これが意味するのは、電磁スペクトルの波長が異なれば媒体３の誘電特性も異なるということである。例えば、媒体３は、ある濃度の有機分子、及び／または無機分子、及び／または染料、及び／またはステイン、及び／または発色団、及び／または顔料、及び／またはコロイド、及び／または中性ステイン、及び／またはジアゾ化合物、及び／またはトリフェニルメタン化合物（triphenylmethan compound）、及び／またはキサンテン化合物（xanthen compound）、及び／またはアミノキサンテン化合物（aminoxanthen compound）、及び／またはヒドロキシキサンテン化合物（hydroxyxanthen compound）、及び／またはピロニン（pyronyn）、及び／またはローダミン（rhodamin）、及び／またはフルオレセイン（fluorescein）、及び／またはエオシン（eosin）、及び／またはカルボシアニン（carbocyanin）、及び／またはオキサジカルボシアニン（oxadicarbocyanin）、及び／またはメチレンブルー（methylen blue）、及び／またはフタロシアニン（phthalocyanin）、及び／またはｐｈ指示薬成分、及び／またはスルホロダミン（sulforhodamin）、及び／またはトリパンブルー（trypan blue）、及び／またはチアジン（thiazin）、及び／またはファストグリーンＦＣＦ（fast green FCF）、及び／またはエバンスブルー（evan's blue）でもよい。
【００２０】
特に、媒体３は、特に液体中に懸濁した粒子、マイクロ及び／またはナノ粒子の混合物でもよい。例えば、こうした粒子は金属粒子、及び／または誘電体粒子、及び／または被覆粒子、及び／または金粒子、及び／または銀粒子、及び／または銅粒子、及び／またはシリコン粒子、及び／または結晶粒子、及び／または半導体粒子、及び／またはＣｄＳ粒子、及び／またはＣｄＳｅ粒子、及び／またはラテックス・ベッド（latex beds）、及び／または荷電粒子、及び／またはコロイド金粒子、及び／または銀粒子でもよい。
【００２１】
媒体制御装置５は必要に応じて、さらに詳しく言うと、媒体３が気体または液体である場合使用すればよい。媒体制御装置５の役割は媒体３の交換を可能にすることである。媒体３が複数の成分から構成されている場合、媒体制御装置５を使用してそれらの成分の１つ、または複数の成分の濃度を変化させればよい。また、媒体制御装置５は媒体３の温度及び／または圧力を制御する手段を備えてもよい。また、酸素または二酸化炭素といった気体の分圧を制御する手段を含んでもよい。また、媒体制御装置５は、試料１または試料ユニット４全体の電気または磁気刺激を誘発する手段を備えてもよい。特に、媒体制御装置５は電極または電極アレイを含んでもよい。また、媒体制御装置５は、例えば、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）で行われるように、先端または片持ちといった試料に機械的刺激を誘発する手段を備えてもよい。
【００２２】
特に、媒体３は特に液体中に懸濁した粒子、マイクロ及び／またはナノ粒子の混合物でもよく、媒体制御装置５を使用して、こうした粒子の種類、及び／またはこうした粒子の濃度、及び／またはこうした粒子の大きさを制御してもよい。
【００２３】
ディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）のための装置に導入されると、試料ユニット４は照明波６と呼ばれる入射放射によって照明される。試料ユニットとの相互作用の後、入射放射は物体波７となる。入射放射は放射源８によって提供されるが、これは電磁的な放射を優先的に放出する。試料１と照明波６との間の相互作用を可能にするため、容器２の少なくとも１つの面が入射放射に対して透明な区域を備えていることは明らかである。
【００２４】
媒体制御装置５は、圧電または音響変換器といった、試料ユニット４の機械的振動または媒体３の振動を誘発する手段を備えてもよい。こうした振動は、照明波６と相互作用する容器２の要素によって放出される寄生放射の伝播方向の不規則な変化を誘発することによって本方法の信号対雑音比（ＳＮＲ）によい影響を与えると期待される。
【００２５】
ディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）の標準的な手順は、例えば特許ＷＯ  ００／２０９２９号で説明されている。ここではＤＨＩ処理の最も重要なステップの概要のみを示す。適当な手段９（例えばレンズ、レンズの組立体または顕微鏡対物レンズ）を使用して物体波７を集光し、適当な手段（例えば組立ビーム分割器、ミラー、レンズ及びアパーチャ）を使用して放射源８から参照波１０を発生させる。適当な手段１１（例えば組立ビーム分割器、ミラー、レンズ及びアパーチャ）を使用し、参照波１０と物体波７とを互いに干渉させることによってホログラム１２を形成する。ホログラム１２は画像取得システム１３によって取得され、画像取得システム１３はディジタル・ホログラム１４をホログラム復元ユニット１５に伝送する。復元ユニット１５は数値計算を適用して振幅差画像１６及び／または定量的位相差画像１７を復元する。追加処理ユニット１８を使用して、複数の前記振幅差画像及び／または複数の前記定量的位相差画像を収集及び処理してもよい。処理ユニット１８の主要な機能は本発明の方法固有の結果を提供することである。特に、処理ユニット１８を使用して、試料１の経時変化を記述し、及び／またはその誘電特性の測定及び表示を提供し、及び／またはその厚さの測定及び表示を提供し、及び／またはそのトポグラフィーの測定及び表示を提供してもよい。
【００２６】
また、処理ユニット１８を使用し、複数の前記振幅差画像１６及び／または複数の前記定量的位相差画像１７に統計的手順を適用することによって測定の精度を改善してもよい。
【００２７】
ある期間中に複数の振幅差画像１６及び／または複数の定量的位相差画像１７が提供される場合、処理ユニット１８を使用して、複数の振幅差画像１６及び／または複数の定量的位相差画像から抽出される時間信号を処理してもよい。例えば、処理ユニットを使用して前記時間信号をフーリエ変換してもよく、及び／または帯域通過、及び／または低域通過、及び／または高域通過フィルタリング技術を前記時間信号に適用してもよい。
【００２８】
また、照射波長λを連続して修正した後で、複数の振幅差画像１６及び／または複数の定量的位相差画像１７を収集してもよい。ホログラムが半透明試料による透過ジオメトリ（transmission geometry）で記録されており、屈折率の分散法則が既知であれば、試料の断層画像を得ることができる。
【００２９】
別の代替案では、照射ビームの入射角を変化させて複数の振幅差画像１６及び／または複数の定量的位相差画像１７を収集してもよい。これは、試料を回転させることで達成してもよい。別の実施形態では、試料を固定しておき照射ビームを動かして試料に当たる照射ビームの入射角を変化させてもよい。処理ユニット１８を使用して収集されたデータのラドン変換を行ってもよい。さらに、逆投影法のアルゴリズムを適用して試料の局所的な誘電特性を計算する手段を動作させてもよい。特に、フーリエ・スライスの定理（Fourier slice theorem）を試料の誘電電位の計算に適用してもよい。
【００３０】
別の代替案では、照射波長λを連続して修正し、照射ビームの入射角を連続して修正した後で複数の振幅差画像１６及び／または複数の定量的位相差画像１７を収集してもよい。処理ユニット１８を使用し、アルゴリズムを適用することによって試料の局所的な誘電特性を計算してもよい。回折断層法で一般に適用されるフーリエ・スライスの定理。
【００３１】
また、処理ユニット１８を使用して、例えば獲得した画像の三次元透視表示を発生し、及び／または獲得した画像のいわゆる疑似カラー表示を生成し、及び／または複数の獲得画像から動画またはアニメーションを生成することによって、獲得した結果の表示を生成してもよい。
また、複数の画像が提供される場合、処理制御ユニットを使用してそれらを互いに比較し、例えば信号変化の空間分布を明らかにしてもよい。
【００３２】
本発明の通常の応用を記述する最も重要な物理パラメータは次の通りである。
φは、度数または勾配で表される物体波７の位相である。φは定量的位相差画像１７と呼ばれる画像としてＤＨＩが提供する。
ＯＰＬ＝φλ／２π、但しλは放射の波長。ＯＰＬは光路長と呼ばれる。φが度数で測定される場合、ＯＰＬ＝φλ／３６０である。
【００３３】
ｎmは試料を組み込む媒体の屈折率、さらに正確には媒体３の屈折率である。
ｎｓは試料１の屈折率である。
ｄは試料１の厚さである。
ｈは試料１の高さであり、試料のトポグラフィーを記述する。
【００３４】
上記のリストで記述された全てのパラメータは、特定の空間中のこれらのパラメータの空間分布を記述する二次元（２Ｄ）関数の形式、別言すれば画像の形式で提供される。こうした画像がディジタル形式で提供される場合、対応するパラメータをディジタル画像を構成するピクセルの値から測定できることは明らかである。
【００３５】
透過イメージング・ジオメトリでは、照明波６が試料ユニット７を横切った後で物体波７が収集されこと、前記定量的位相差画像マップの１つのピクセルで測定される量、および、試料１を横切る放射に対して試料１が誘発する位相シフトの２Ｄ分布によって特徴付けられる。対応するＯＰＬは次式のように表すことができる。
【００３６】
ＯＰＬ＝（ｎs−ｎm）ｄ        （１）
数式（１）が明らかに示すところによれば、測定信号は試料の構造特性（厚さｄ）と、試料の誘電特性と試料を組み込む媒体の誘電特性との間の差（屈折率の差ｎs−ｎm）とに依存する。
【００３７】
照明波６が試料によって反射または後方散乱された後で物体波７が収集されることを特徴とする反射イメージング・ジオメトリでは、一定で均質な誘電特性を持つ表面を有する試料だけを考慮するならば、前記定量的位相差画像の１つのピクセルで測定される量は、試料の表面トポグラフィーと、試料を組み込む媒体の屈折率ｎmとに依存する。対応するＯＰＬは次式のように表すことができる。
【００３８】
ＯＰＬ＝２ｎmｄ        （２）
数式（１）及び（２）は標本形状及び誘電特性の関数としてＯＰＬの挙動を記述する数式の例を示したものに過ぎない。本発明を適用し、電磁放射と標本との相互作用を記述するより複雑でより一般的なモデルに基づいて標本形状と標本の誘電特性とを決定してもよい。特に、こうしたモデルは、マクスウェル方程式の枠組、及び／または電磁相互作用のベクトルまたはテンソル理論の枠組、及び／または散乱ポテンシャル方程式の枠組、及び／または標本による電磁放射の回折を記述する理論モデルの枠組で獲得すればよい。また、明らかなように、こうしたモデルは屈折率以外の誘電特性、特に吸収率、及び／または複素屈折率を含んでもよい。特に、こうしたモデルは小さい試料の場合、及び／または試料の誘電特性と媒体の誘電特性とが大きく異なる場合、さらに正確な結果を示すことがある。
【００３９】
本発明の目的は、提案される方法と装置を使用して試料に対する媒体の作用を研究することである。この場合、媒体制御装置５を使用して試料を組み込む媒体中のある媒体の量を制御すればよい。この媒体が試料と相互作用してＯＰＬの変化を誘発するならば、ＤＨＩによってこのＯＰＬの経時変化を測定及び監視すればよい。
【００４０】
本発明の目的は、試料を組み込む媒体を使用してＤＨＩによって測定されるＯＰＬ信号を変調することである。さらに詳しく言うと、数式（１）及び（２）が明らかに示すように、ｎmの変化は測定されたＯＰＬ信号に直接影響する。特に、弱いＯＰＬ信号を発生する小さいかまたは薄い試料の場合、ＯＰＬ信号の増幅は反射中のｎmを増大するかまたは透過中のｎs−ｎmを増大することによって達成すればよい。
【００４１】
試料を組み込む媒体の屈折率ｎmの変化は媒体制御装置５を使用して媒体３を変化させることによって達成すればよい。特に、媒体制御装置５を使用して、媒体の屈折率を変化させる要素を備える媒体３の組成を制御すればよい。例えば、媒体３は様々な濃度の分子またはイオンを備える液体要素でもよい。例えば、媒体３は、メトリザミド（Ｃ18Ｈ22Ｉ3Ｎ3Ｏ8）、及び／またはマニトール、及び／またはイオヘキソール、及び／またはイオジキサノール、及び／またはフィコール、及び／またはパーコールといった要素を備えてもよい。例えば、媒体３は液体中に懸濁した粒子の混合物でもよく、媒体３の屈折率はこうした粒子の大きさの分布を変化させ、及び／またはこうした粒子の大きさの統計的分布を変化させ、及び／またはこうした粒子の濃度を変化させ、及び／またはこうした粒子の材料を変化させることによって変化させればよい。
【００４２】
本発明の目的は、試料１を囲む媒体３が分散性を有する要素から構成されるか、またはそれを備えることであるが、これが意味するのは、放射の波長が異なれば試料を組み込む媒体の屈折率ｎmも異なるということである。従って、試料ユニット４を照明する放射の波長λを変化させることによってｎmを変化させればよい。
【００４３】
例えば、分散性を有する媒体は、吸収線または吸収帯を示す吸収スペクトルによって特徴付けられる。クラマース−クローニングの関係式（Kramers-Kroning relationship）によれば、吸収線または吸収帯に近い波長間隔でのこうした媒体の分散挙動は、小さな波長間隔でも大幅な屈折率の変化が発生しうるということを特徴とする。例えば、図２で説明するように、２つの波長λ1及びλ2は、分散作用がより顕著である吸収帯の下降側に沿って配置されるように選択すればよい。
これによってｎmの高速で大幅な変調が可能になる。
【００４４】
特に透過イメージング・ジオメトリでは、ｎmの値の異なる複数の定量的位相差画像が獲得された場合、異なる値のｎmが既知または前もって測定されていると想定すれば、試料の厚さ（ｄ）、及び試料の屈折率ｎsは個別または同時に獲得することができる。例えば、２つの異なる値のｎm（それぞれｎm1及びｎm2）について行われる２つの異なるＯＰＬの測定値ＯＰＬ１及びＯＰＬ２を定義する。数式（１）から次式が成り立ち、
ＯＰＬ１＝（ｎs−ｎm1）ｄ        （３）
ＯＰＬ２＝（ｎs−ｎm2）ｄ        （４）
【００４５】
また、ｎsとｄは次式のように直接決定できる。
ｄ＝（ＯＰＬ１−ＯＰＬ２）／（ｎm2−ｎm1）        （５）
ｎs＝（ＯＰＬ２ｎm1−ＯＰＬ１ｎm2）／（ＯＰＬ２−ＯＰＬ１）        （６）
ここで、２つの画像取得で十分であっても、例えば測定の精度を向上させるため、異なる値のｎm、または同じ値のｎmについてさらに多くの取得を行ってもよい。
【００４６】
異なる値のｎm（例えば２つの値ｎm1及びｎm2）は媒体を変化させることによって得てもよい。また、異なる値のｎm（例えば２つの値ｎm1及びｎm2）は、標本ユニットを照明する放射の波長を変化させることによって屈折率が変化する分散性を有する媒体を使用して得てもよい。
【００４７】
本発明を使用してｎmを測定してもよい。例えば透過イメージング・ジオメトリでは、ｄとｎsが既知であれば、ｎmは数式：ｎm＝ｎs−ＯＰＬ／ｄによって定義できる。さらに一般的に言うと、本発明は、標本のジオメトリが既知である場合、屈折率測定法のための技術として使用できる。
【００４８】
また、本発明を使用して試料の断層撮影を得てもよい。重大な屈折作用を避けるため、ｎmがｎsの近くで妥当に選択されており、かつ重大な回折作用を避けるためｎmとｎsとが波長λに相当する距離にわたって大きく変化しないならば、次式のような２Ｄジオメトリについての第一次近似が得られるが、
【００４９】
【数１】
2005512127.tif 000003
【００５０】
ここでｎ（ｘ，ｙ）は局所屈折率であり、試料の外側ではｎmに等しく試料の容積の範囲を通じて局所的な変化を伴うがほぼｎsである。δはディラックのデルタ分布である。ＯＰＬ（θ，Ｒ）は、照射ビームの入射角を変化させて収集可能な複数の振幅差画像１６及び／または複数の位相差画像１７を収集することによって獲得すればよい。逆投影法のアルゴリズムを適用することによって、収集されたデータから、試料の屈折率ｎ（ｘ，ｙ）を計算すればよい。
【００５１】
媒体３が試料に対する影響を有さない場合、本発明を使用して媒体３の特性または挙動を測定してもよい。例えば、媒体３が液体であれば、本発明を使用して、ＯＰＬの局所的変化を導入する流体力学現象、特に、例えばフロートレーサーによる流れの分析を研究または観察してもよい。例えば、特に媒体３が固体またはゲルの場合、本発明を使用して材料内の内部応力を分析してもよい。
【００５２】
「ディジタル・ホログラフィーの使用による偏光イメージング（“Polarization Imaging by Use of Digital Holography”）」、ティー・コロンブ（T. Colomb）他、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、第３４号、１９９９年で説明されているように、ＤＨＩを使用して物体波の偏光状態をイメージング及び測定してもよい。本発明の目的は、振幅差画像１６及び定量的位相差画像１７に加えて、物体波の偏光状態を処理ユニット１８に提供することである。この場合、本発明を使用して、放射の偏光に影響する過程、特に偏光の一時的な修正を誘発する動的過程を観察及び分析してもよい。この場合、例えば、媒体３は複屈折性を有してもよい。
【００５３】
ある期間中に複数のホログラムを取得する場合、対応する複数の定量的位相差画像を例えば処理ユニット１８によって処理し、ＯＰＬまたは位相信号の時間変化を補償すればよいが、前記時間変化は試料の挙動以外の起源を有し、例えば、この時間変化はホログラムを生成する装置を構成する要素の機械的振動によって発生することもあり、及び／または空気の乱流によって発生することもあり、及び／または熱影響によって発生することもある。こうした時間変化を補償するため、本発明は、試料がＯＰＬ信号に影響しない定量的位相差画像の領域、すなわち別言すれば、ｄ、またはｈ、またはｎmが測定された信号に影響しない領域で位相信号を測定するコンピュータによる方法を使用する。こうした領域では、ＯＰＬ測定は、信号変化の望ましくない発生源の影響を監視する基準信号を提供する。信号変化のこうした望ましくない発生源の影響の補償は、定量的位相差画像の他の範囲、特に試料が測定信号に影響する範囲で測定された信号から基準信号を減算することによって行えばよい。
【００５４】
イメージング及び顕微鏡法技術の一般的な文脈では、一般にＤＨＩ法、特に本発明は、試料形状の動的な変化、及び／または試料の物理特性の動的な変化を誘発する過程の実時間イメージングのための強力な手段と思われる。こうした動的は変化は自然発生的な過程及び／または誘発された過程に関連して現れうる。例えば、ＤＨＩ法を適用して、例えば、化学的摂動、及び／または生物学的摂動、及び／または電気的摂動、及び／または機械的摂動といった様々な形態の外部摂動に対する試料の応答を監視してもよい。
【００５５】
一般にＤＨＩ法、特に本発明は、ＤＨＩを他の種類の既存のイメージング技術、及び／または他の種類の測定技術と結合する多機能イメージング・アプローチの魅力的な可能性を提示している。例えば、本発明は、蛍光顕微鏡法、またはレーザ走査共焦点顕微鏡法、または二光子顕微鏡法、または二次または三次高調波発生顕微鏡法、または原子間力顕微鏡法と結合してもよい。また、本発明は、電気生理学、及び／または流体力学で使用される実験技術と並行して適用してもよい。
【００５６】
一般にＤＨＩ技術、特に本発明は、造影剤を必要とせず、使用される放射強度が低いため、非侵襲的分析に特に適している。特に、試料平面で測定される照射は、例えば他の顕微鏡法またはイメージング技術によって使用される照射より数桁少ないことが立証されている。従って、本発明の興味深い有望な適用業務は、本方法を適用して繊細な試料、特に生物試料のイメージングを行うことである。例えば、試料は生物細胞、生体生物細胞、生物細胞の培養物、培養された生物細胞の単一層、生物細胞から構成された組織、バイオチップ、蛋白質の組織標本でもよい。
【００５７】
本発明による方法の特定の態様は、試料を組み込む媒体を時間を通じて変化させられること、及び／または試料を組み込む媒体の特性を時間を通じて変化させられることを特徴とする。媒体のこうした変化は試料の形状の修正及び／または試料の誘電特性の修正を誘発するものと予想され、試料の前記修正はＤＨＩによって監視される。
【００５８】
ＤＨＩ法の高い取得頻度の結果、本発明の方法は高速な試料と媒体との反応の動態を研究するのに特に適している。また、ＤＨＩは造影剤を使用せず低い放射強度で機能する非侵襲的イメージング技術であるので、本発明の方法は、最小の外部摂動で、かつ数時間またさらには数日といった長い期間にわたる反応の動態を研究するのに特に適している。これは生命科学での適用業務の場合特に有利である。
【００５９】
図３は、生理溶液３７によって満たされた潅流チャンバ３０内に密閉された培養物中の生細胞のイメージングを行う本発明の適用業務の例である。図３ａに示すように、細胞培養物３１は入射放射３２によって照明され、顕微鏡対物レンズ３３は透過放射を収集し物体波３４を形成する。ＣＣＤカメラ３５はホログラムを記録する。ホログラムの例を図３ｂに示す。ホログラムは参照波３６との干渉によって発生する。次に、数値的手順を適用してホログラムを復元する。定量的位相差画像の例を図３ｃに示す。獲得された位相差画像は、例えば図４ｄに提示されるように３Ｄ透視図で表せばよい。
【００６０】
定量的位相差画像から、細胞形態学に関する定量的データを獲得すればよい。潅流溶液の、波長６３３ｎｍでの屈折率ｎm＝１．３３３６±０．０００２はアッベ屈折計（Abbe refractometer）によって測定済みである。第一次近似で一定で均質な細胞屈折率ｎs＝１．３６５を想定すると、１０度の位相が細胞厚さｄ＝０．６μｍに相当すると推定できる。位相と厚さとの間のこの関係を使用すると、図３ｃで提示された定量的位相差画像の個々のピクセルから抽出される位相測定値から、神経突起の厚さ１〜３μｍ及び細胞体の厚さ約８μｍが得られる。細胞内屈折率の均質な分布（これは細胞成分のある程度の不均質性を想定して論じうる）を想定してさえ、細胞形態学のこうした推定値は、ここで提示されるマウス皮質神経細胞について文献に記載された通常の細胞寸法の実際の値を示している。細胞の屈折率の同じ想定を使用すれば、実験での光機械雑音が規定する０．７度の位相測定精度に基づいて、４０ナノメートルの軸方向（または垂直）解像度が得られる。
【００６１】
本発明の適用業務の例として、本発明を適用して培養マウス皮質神経細胞の形態学に対する興奮性神経伝達物質（グルタミン酸）の作用の研究が行われた。神経細胞形態学に対するグルタミン酸の影響は、高濃度（２０〜５００μＭ）で数分間といった長時間の作用を受けた場合興奮毒性としてすでに説明されていた。その固有の特徴のため、本発明の方法は、生理的濃度（ＥＣ50＝７．５μＭ）で短時間（数秒）の作用に対して発生する可逆的な形態学的変化の観察を可能にした。この作用はＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（N-methyl-D-asparaye：ＮＭＤＡ）受容体の活性化に反応して発生することが立証されている。神経細胞におけるグルタミン酸に媒介された形態学的変化の実時間観察の結果の概要を図４及び図５に示す。図４ａは、生理溶液中に浸漬された生体マウス皮質神経細胞の定量的位相差画像の通常の例を提示する図４ｂの黒い矩形によって画定される領域内でＤＨＩにより実時間測定された位相信号の経時変化を提示する。細胞は制御溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝生理溶液）中で観察され、持続時間２０秒の短期パルスとして薬剤を加えた。この薬剤のパルスを図４ａの黒い三角形で示す。顕著な位相の増大は、黒い三角形４１、４２、４３及び４４で示すグルタミン酸（ＧＬＵＴ）を単独で加えた時に発生している。ＧＬＵＴの濃度はそれぞれ１５μＭ、１０μＭ、１５μＭ及び２０μＭである。黒い三角形４５及び４６で示す場合には、広域イオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬であるキヌレン酸（ＫＹＮ）４００μＭをＧＬＵＴに追加した。この場合位相信号の増大は発生せず、観察されたＧＬＵＴの作用はＫＹＮによって阻害されることを示している。また、黒い三角形４７及び４８で示す場合、ＮＭＤＡに固有の受容体拮抗薬であるＭＫ−８０１を５μＭ、生理溶液中のＧＬＵＴに追加した時にもＧＬＵＴの作用は阻害されている。図４ａに見られるように、グルタミン酸のパルスを加えることによって、数分間持続する可逆的なＯＰＬまたは位相の増大が誘発された。このＯＰＬの増大は３時間を越える期間にわたって数回再現しうるものであった。また、図４ａは、こうしたグルタミン酸に媒介された反応が、広域イオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬であるキヌレン酸及びＮＭＤＡに固有の受容体拮抗薬であるＭＫ−８０１によって阻害されたことを示し、作用の受容体固有の性質を強調している。濃度応答曲線（図４ｃ）は、５つの異なる実験に基づいて立証されている。応答振幅は細胞毎に異なっているので、〜１５μＭの濃度で発生する最大振幅について結果を基準化した。ヒルの方程式（Hill equation）を使用した曲線近似は、〜７．５±０．２３μＭのＥＣ50による高度に協調的な挙動（ヒル係数（Hill coefficient）＝３．７５±０．４）を示している。興味深いことに、こうした結果は潅流溶液中にグリシン（３μＭ）が存在するときに得られた。グリシンがない場合、細胞は１５μＭより高いグルタミン酸濃度で反応を開始し、反応したのは細胞の〜２５％だけであった（グリシンが存在する場合〜８０％であるのに対して）。グリシンはＮＭＤＡ受容体コアゴニストであるので、この挙動はグルタミン酸に誘発された反応におけるこうした受容体の役割をさらに強調している。通常の位相増大の���大振幅は〜１０度であるが、これは初期細胞位相の〜５％である。再び一定の細胞屈折率（ｎs＝１．３６５）を想定すると、これは垂直（ｚ）軸方向の〜０．６μｍの増大に相当する。
【００６２】
図４ａは、試料の特定の範囲について平均したＯＰＬの変化の例を示すが、本発明の方法の現実的な可能性の部分的な概念を示したものに過ぎない。ＤＨＩによって、ＯＰＬの空間分布を例えば０．３μｍの横解像度で定義することができ、ＯＰＬの時間経過を、図４ａに提示するように、細胞の異なる微小ドメイン、または定量的位相差画像の各ピクセルについて獲得することができる。従って、例えば処理ユニット１８を使用して、例えば一連のアニメーションを構成し、記録した信号を時間と空間についてたどることができる。
【００６３】
観察された作用を特徴付ける有益な方法は、異なる時間におけるＯＰＬの変化の空間分布をマッピングすることである。図４で提示された実験の場合、この表示が示したところによれば、観察された細胞の形態学的変化は異方性であった。実際に、ＯＰＬ測定値は細胞の境界に沿って著しく減少し、不均質な局所変化に加えて細胞体の中央領域で全体的に増大していることが観察された。細胞体内部の楕円を検討すると、観察された細胞の形状変化は、細胞の偏心を高める半短軸の短縮からなっていた。グルタミン酸パルスを加えるのを終了してから１０分後、細胞全体のＯＰＬが初期のレベルを回復しても、小さい局所的なＯＰＬの変化は一部の範囲で残存していることが観察された。
【００６４】
本発明の高い感度によって、マウス皮質神経細胞の微小ドメインにおいて、グルタミン酸を生理的濃度で数秒間加えることで、ＮＭＤＡ受容体に媒介された可逆的な形態学的変化が誘発されることが示された。この結果が示すように、本発明は細胞レベル以下の空間解像度で実時間３Ｄ機能イメージングを行う独自の可能性を提供する新しい方法である。
【００６５】
（グルタミン酸、ＭＫ８０１等といった薬剤を加えた後の）形態学的な神経細胞の変化は数時間の間監視された。この期間中の光機械的安定性を最適化するため、ホログラフィック顕微鏡全体を容器内に収容してもよい。この容器にもかかわらず、（コヒーレント雑音のような）他の雑音源はやはり光機械的不安定性の影響を極めて受けやすく、復元された画像に摂動を起こさせることがある。こうした残留雑音発生源があると神経細胞の形態学的変化の定量的分析は非常に困難になる。この残留雑音発生源の作用を低減するため、生物試料の範囲で制御されたエネルギーを発生・供給する装置を開発した。この制御されたエネルギーは機械的振動でもよく、潅流管路によってチャンバに伝達してもよい。
【００６６】
本発明の方法は、放射の位相を測定するＤＨＩ技術、特に、特許ＷＯ  ００／２０９２９号で説明された方法を優先して使用している。しかし、本発明で説明された全ての概念、特に試料を媒体中に埋め込むということが位相測定のための他の技術に拡張可能であることは明らかである。特に、本発明は、インライン・ディジタル・ホログラフィー、またはフーリエ変換ディジタル・ホログラフィー、またはディジタル・ヘテロダイン・ホログラフィー、または位相シフト干渉法技術といった位相測定技術を使用する方法にも関連する。ホログラムの概念はインターフェログラムの概念の一般化であり、またホログラムの概念はインターフェログラムの特定の例であることを考慮すると、原則としてあらゆる種類の干渉法技術を本発明の文脈で電磁波の位相を測定する手段として使用してよい。
【００６７】
［参考文献］
［特許］
米国特許６，２６２，２１８号  クーシュ（Cuche）他
ＷＯ  ００／２０９２９号  クーシュ（Cuche）他
【００６８】
［他の刊行物］
ジェイ・ダブリュ・グッドマン（J.W. Goodmann）及びアール・ダブリュ・ローレン（R.W. Lawrence）、「電子的に検出されたホログラムからのディジタル画像形成（“Digital image formation from electronically detected holograms”」、応用物理通信（Appl. Phys. Lett.）、第１１巻、１９６７年、７７−７９頁
アイ・ヤマグチ（I. Yamaguchi）他、「位相シフト・ディジタル・ホログラフィーにおける画像形成と顕微鏡法への応用（“Image formation in phase-shifting digital holography and application to microscopy”）」、応用光学（Applied Optics）、第４０巻、第３４号、２００１年、６１７７−６１８６頁
【００６９】
ダブリュ・エス・ハダッド（W.S. Haddad）他、「フーリエ変換ホログラフィック顕微鏡（“Fourier-transform holographic microscope”）」、応用光学（Applied Optics）、第３１巻、１９９２年、４９７３−４９７８頁
ユー・シュナース（U. Schnars）及びダブリュ・ユプトナー（W. Juptner）、「ＣＣＤターゲットによるホログラムの直接記録と数値的復元（“Direct recording of holograms by a CCD target and numerical reconstruction”）」、応用光学（Applied Optics）、第３３巻、１９９４年、１７９−１８１頁
【００７０】
オー・コクオズ（O. Coquoz）他、「多芯光ファイバによる内視鏡ホログラフィーの動作（“Performances of endoscopic holography with a multicore optical fiber”）」、応用光学（Applied Optics）、第３４巻、１９９５年、７１８６−７１９３頁
イー・クーシュ（Ｃｕｃｈｅ）他、「定量的位相差イメージングのためのディジタル・ホログラフィー（“Digital holography for quantitative phase-contrast imaging”）」、光学通信（Optics Letters）、第２４巻、１９９９年、２９１−２９３頁
【００７１】
イー・クーシュ（Cuche）他、「フレネル・オフアクシス・ホログラムの数値的復元による同時振幅差・定量的位相差顕微鏡法（“Simultaneous amplitude-contrast and quantitative phase-contrast microscopy by numerical reconstruction of Fresnel off-axis holograms”）」、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、１９９９年、６９９４−７００１頁
イー・クーシュ（Cuche）他、「ディジタル・オフアクシス・ホログラフィーにおけるゼロ次及び二重像消去のための空間フィルタリング（“Spatial Filtering for Zero-Order and Twin-Image Elimination in Digital Off-Axis Holography”）」、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、第３４号、１９９９年
【００７２】
イー・クーシュ（Cuche）他、「３次スプライン補間を使用する開口アポダイゼーション：ディジタル・ホログラフィック顕微鏡法における応用（“Aperture apodization using cubic spline interpolation:Application in digital holographic microscopy”）」、光通信（Optics Communications）、第１８２巻、２０００年、５９−６９頁
ティー・コロンブ（T. Colomb）他、「ディジタル・ホログラフィーの使用による偏光イメージング（“Polarization Imaging by Use of Digital Holography”）」、応用光学（Applied Optics）、第３８巻、第３４号、１９９９年
【００７３】
アール・ベラー（R. Barer）及びエス・ジョゼフ（S. Joseph）、「生細胞の屈折率測定法（“Refractometry of living cells”）」、顕微鏡学季刊誌（Quarterly Journal of Microscopical Science）、第９５巻、１９５４年、３９９−４２３頁
アール・ベラー（R. Barer）、「生細胞の屈折率測定法及び干渉法（“Refractometry and interferometry of living cells”）」、米国光学学会雑誌（Journal of the Optical Society of America）、第４７巻、１９５７年、５４５−５５６頁
【００７４】
エージェイ・コーブル（AJ Coble）他、「ネクチュルス胆嚢上皮の顕微鏡干渉法（“Microscope interferometry of necturus gallblader epithelium”）」、ジョサイア・マーシー・ジュニア財団（Josiah Macy Jr.Foundation）、ニューヨーク、１９８２年、２７０−３０３頁
エーシー・スヴォボダ（AC. Svoboda）他、「光トラッピング干渉法によるキネシン・ステッピングの直接観察（“Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry”）、ネイチャー（Nature），第３６５巻、１９９３年
【００７５】
ジェイ・ファリナス（J. Farinas）及びエー・エス・ヴェルクマン（A.S. Verkman）、「干渉法によって測定される上皮細胞層の細胞体積原形質膜浸透的水透過性（“Cell volume plasma membrane osmotic water permeability in epithelial cell layers measured by interferometry”）」、生物物理学雑誌（Biophysical Journal）、第７１巻、１９９６年、３５１１−３５２２頁
ジー・エー・ダン（G.A. Dunn）及びディー・ジチャ（D. Zicha）、「線維芽細胞拡散の動態（“Dynamics of fibroblast spreading”）」、細胞科学雑誌（Journal of Cell Science）、第１０８巻、１９９５年、１２３９−１２４９頁
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明による装置の構成単位を示す概略図である。
【図２】吸収帯付近の屈折率（ｎ）及び吸収係数（ｋ）の挙動を示す図である。
【図３】本発明の方法の応用例を提示する図であり、同図ａは潅流チャンバ内の生物細胞の概略を表し、同図ｂは生物細胞のホログラムの例を示し、同図ｃは生物細胞の定量的位相差画像の例を示し、そして、同図ｄは３Ｄ透視図で表される生物細胞の定量的位相差画像の例を示している。
【図４】本発明の方法の応用例を提示する図であり、同図ａは細胞の特定の範囲内で測定された位相の経時変化の例を示し、同図ｂは細胞の定量的位相差画像の例を示し、そして、同図ｃは本発明のために確立された濃度−応答曲線の例を示している。
【図１】
2005512127.tif 000004
【図２】
2005512127.tif 000005
【図３】
2005512127.tif 000006
【図４】
2005512127.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月5日(2004.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のディジタル・ホログラフィック・イメージングを実行する装置であって、該装置が、
ホログラフィック生成ユニットと、
ホログラフィック復元ユニットと、
処理ユニットと、
試料が収容された媒体を収容することに適合した容器を含む試料ユニットとを備え、
さらに、前記媒体に固有の少なくとも１つのパラメータまたは前記試料に固有の少なくとも１つのパラメータを測定することに適合し、前記媒体が周囲空気と異なる測定手段を備えることを特徴とする装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置において、前記測定手段が前記媒体の誘電特性を測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の装置において、前記測定手段が前記媒体の屈折率を測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置において、前記測定手段が前記試料の誘電特性を測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の装置において、前記測定手段が前記試料の屈折率を測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置において、前記測定手段が前記試料の厚さを測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の装置において、前記測定手段が前記試料の表面トポグラフィーを測定することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置において、さらに、少なくとも前記媒体に固有の１つのパラメータまたは前記試料に固有の１つのパラメータを処理することに適合した処理手段を備えることを特徴とする装置。
【請求項９】
請求項８に記載の装置において、前記処理手段が前記媒体の誘電特性を処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の装置において、前記処理手段が前記媒体の屈折率を処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１項に記載の装置において、前記処理手段が前記試料の誘電特性を処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の装置において、前記処理手段が前記試料の屈折率を処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の装置において、前記処理手段が前記試料の厚さを処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の装置において、前記処理手段が前記試料の表面トポグラフィーを処理することに適合したことを特徴とする装置。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置において、試料が収容された媒体の部分的または完全な媒体交換を含め、媒体特性を修正または調節することに適合した媒体制御ユニットを備えることを特徴とする装置。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置において、前記試料ユニットの少なくとも一部を機械的に振動させる振動手段を備えることを特徴とする装置。
【請求項１７】
請求項１６に記載の装置において、前記振動手段が前記媒体制御ユニットに組み込まれたことを特徴とする装置。
【請求項１８】
媒体中に収容された試料のディジタル・ホログラフィック・イメージングを実行する方法であって、該方法が、
少なくとも１つの参照波と少なくとも１つの物体波との間の干渉によって少なくとも１つのホログラムを発生するステップと、
少なくとも１つのホログラムを取得しディジタル化することによって少なくとも１つのディジタル・ホログラムを発生するステップと、
少なくとも１つのディジタル・ホログラムの数値的復元によって少なくとも１つの振幅差画像及び／または少なくとも１つの定量的位相差画像を復元するステップとを含み、
前記方法が、さらに、
試料の少なくとも１つのパラメータを決定するため、及び／または媒体の少なくとも１つのパラメータを決定するために、少なくとも１つの振幅差画像を処理、及び／または少なくとも１つの定量的位相差画像を処理するステップを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、媒体の少なくとも１つのパラメータが時間を通じて修正され、複数の振幅差画像及び／または複数の定量的位相を獲得するため複数のホログラムが発生され、試料の少なくとも１つのパラメータの経時変化を記述するため前記複数の振幅差画像及び／または前記複数の定量的位相差画像が処理されることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法において、媒体の少なくとも１つのパラメータが時間を通じて修正され、複数の振幅差画像及び／または複数の定量的位相を獲得するため複数のホログラムが発生及び処理され、媒体の少なくとも１つのパラメータの経時変化を記述するため前記複数の振幅差画像及び／または前記複数の定量的位相差画像が処理されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法において、媒体と試料とが互いに相互作用する結果、試料の少なくとも１つのパラメータの修正及び／または媒体の少なくとも１つのパラメータの修正が生じることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法において、媒体が分散性媒体であり、媒体の誘電特性の値が試料を照明する放射の波長を変化させることによって変化し、試料を照明する放射の波長の変化の結果、試料の少なくとも１つのパラメータの修正及び／または媒体の少なくとも１つのパラメータの修正が生じることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の方法において、試料の前記パラメータが試料の厚さであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法において、試料の前記パラメータが試料の表面トポグラフィーであることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法において、試料の前記パラメータが試料の誘電特性であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１８〜２５のいずれか１項に記載の方法において、試料の前記パラメータが試料の屈折率であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法において、媒体の前記パラメータが媒体の誘電特性であることを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法において、媒体の前記パラメータが試料の屈折率であることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の方法において、振幅差画像のコントラストを増大または減少させるため、及び／または定量的位相差画像のコントラストを増大または減少させるために、媒体の誘電特性が調整されることを特徴とする方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の第１の形態によれば、試料のディジタル・ホログラフィック・イメージング（ＤＨＩ）を実行する装置であって、該装置が、ホログラフィック生成ユニットと、
ホログラフィック復元ユニットと、処理ユニットと、試料が収容された媒体を収容することに適合した容器を含む試料ユニットとを備え、さらに、前記媒体に固有の少なくとも１つのパラメータまたは前記試料に固有の少なくとも１つのパラメータを測定することに適合し、前記媒体が周囲空気と異なる測定手段を備えることを特徴とする装置が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の第２の形態によれば、媒体中に収容された試料のディジタル・ホログラフィック・イメージングを実行する方法であって、該方法が、少なくとも１つの参照波と少なくとも１つの物体波との間の干渉によって少なくとも１つのホログラムを発生するステップと、少なくとも１つのホログラムを取得しディジタル化することによって少なくとも１つのディジタル・ホログラムを発生するステップと、少なくとも１つのディジタル・ホログラムの数値的復元によって少なくとも１つの振幅差画像及び／または少なくとも１つの定量的位相差画像を復元するステップとを含み、前記方法が、さらに、試料の少なくとも１つのパラメータを決定するため、及び／または媒体の少なくとも１つのパラメータを決定するために、少なくとも１つの振幅差画像を処理、及び／または少なくとも１つの定量的位相差画像を処理するステップを特徴とする方法が提供される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
別の代替案では、照射波長λを連続して修正し、照射ビームの入射角を連続して修正した後で複数の振幅差画像１６及び／または複数の定量的位相差画像１７を収集してもよい。処理ユニット１８を使用し、アルゴリズムを適用することによって試料の局所的な誘電特性を計算してもよい。フーリエ・スライスの定理は、回折断層法で一般に適用される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
図３は、生理溶液３７によって満たされた潅流チャンバ３０内に密閉された培養物中の生細胞のイメージングを行う本発明の適用業務の例である。図３ａに示すように、細胞培養物３１は入射放射３２によって照明され、顕微鏡対物レンズ３３は透過放射を収集し物体波３４を形成する。ＣＣＤカメラ３５はホログラムを記録する。ホログラムの例を図３ｂに示す。ホログラムは参照波３６との干渉によって発生する。次に、数値的手順を適用してホログラムを復元する。定量的位相差画像の例を図３ｃに示す。獲得された位相差画像は、例えば図３ｄに提示されるように３Ｄ透視図で表せばよい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本発明の適用業務の例として、本発明を適用して培養マウス皮質神経細胞の形態学に対する興奮性神経伝達物質（グルタミン酸）の作用の研究が行われた。神経細胞形態学に対するグルタミン酸の影響は、高濃度（２０〜５００μＭ）で数分間といった長時間の作用を受けた場合興奮毒性としてすでに説明されていた。その固有の特徴のため、本発明の方法は、生理的濃度（ＥＣ50＝７．５μＭ）で短時間（数秒）の作用に対して発生する可逆的な形態学的変化の観察を可能にした。この作用はＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（N-methyl-D-asparaye：ＮＭＤＡ）受容体の活性化に反応して発生することが立証されている。神経細胞におけるグルタミン酸に媒介された形態学的変化の実時間観察の結果の概要を図４に示す。図４ａは、生理溶液中に浸漬された生体マウス皮質神経細胞の定量的位相差画像の通常の例を提示する図４ｂの黒い矩形によって画定される領域内でＤＨＩにより実時間測定された位相信号の経時変化を提示する。細胞は制御溶液（ＨＥＰＥＳ緩衝生理溶液）中で観察され、持続時間２０秒の短期パルスとして薬剤を加えた。この薬剤のパルスを図４ａの黒い三角形で示す。顕著な位相の増大は、黒い三角形４１、４２、４３及び４４で示すグルタミン酸（ＧＬＵＴ）を単独で加えた時に発生している。ＧＬＵＴの濃度はそれぞれ１５μＭ、１０μＭ、１５μＭ及び２０μＭである。黒い三角形４５及び４６で示す場合には、広域イオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬であるキヌレン酸（ＫＹＮ）４００μＭをＧＬＵＴに追加した。この場合位相信号の増大は発生せず、観察されたＧＬＵＴの作用はＫＹＮによって阻害されることを示している。また、黒い三角形４７及び４８で示す場合、ＮＭＤＡに固有の受容体拮抗薬であるＭＫ−８０１を５μＭ、生理溶液中のＧＬＵＴに追加した時にもＧＬＵＴの作用は阻害されている。図４ａに見られるように、グルタミン酸のパルスを加えることによって、数分間持続する可逆的なＯＰＬまたは位相の増大が誘発された。このＯＰＬの増大は３時間を越える期間にわたって数回再現しうるものであった。また、図４ａは、こうしたグルタミン酸に媒介された反応が、広域イオンチャネル型グルタミン酸受容体拮抗薬であるキヌレン酸及びＮＭＤＡに固有の受容体拮抗薬であるＭＫ−８０１によって阻害されたことを示し、作用の受容体固有の性質を強調している。濃度応答曲線（図４ｃ）は、５つの異なる実験に基づいて立証されている。応答振幅は細胞毎に異なっているので、〜１５μＭの濃度で発生する最大振幅について結果を基準化した。ヒルの方程式（Hill equation）を使用した曲線近似は、〜７．５±０．２３μＭのＥＣ50による高度に協調的な挙動（ヒル係数（Hill coefficient）＝３．７５±０．４）を示している。興味深いことに、こうした結果は潅流溶液中にグリシン（３μＭ）が存在するときに得られた。グリシンがない場合、細胞は１５μＭより高いグルタミン酸濃度で反応を開始し、反応したのは細胞の〜２５％だけであった（グリシンが存在する場合〜８０％であるのに対して）。グリシンはＮＭＤＡ受容体コアゴニストであるので、この挙動はグルタミン酸に誘発された反応におけるこうした受容体の役割をさらに強調している。通常の位相増大の最大振幅���〜１０度であるが、これは初期細胞位相の〜５％である。再び一定の細胞屈折率（ｎs＝１．３６５）を想定すると、これは垂直（ｚ）軸方向の〜０．６μｍの増大に相当する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
エー・ジェイ・コーブル（A.J. Coble）他、「ネクチュルス胆嚢上皮の顕微鏡干渉法（“Microscope interferometry of necturus gallblader epithelium”）」、ジョサイア・マーシー・ジュニア財団（Josiah Macy Jr.Foundation）、ニューヨーク、１９８２年、２７０−３０３頁
ケー・シー・スヴォボダ（K.C. Svoboda）他、「光トラッピング干渉法によるキネシン・ステッピングの直接観察（“Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry”）、ネイチャー（Nature），第３６５巻、１９９３年
【国際調査報告】
2005512127.tif 000008
2005512127.tif 000009
2005512127.tif 000010