(57)【要約】本発明は、様々な疾患を治療するための治療的に有益で、且つ治療的に効果的な化合物および組成物を提供する。本発明の組成物は著しく減弱した薬物-薬物相互作用(DDI)レベルを示し、主に非酸化的系により代謝される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の特徴または性質のうちの3つまたはそれ以上の組み合わせを有する、加水分解可能な結合を含む化合物：
a)CYP450および非酸化的代謝酵素もしくは酵素系の両方により代謝される；
b)約4時間未満の非酸化的代謝半減期を有する；
c)経口バイオアベイラビリティは親化合物の標準薬学的経口製剤を用いる経口投与と一致する；
d)小規模および大規模化学合成の標準技術を用いて製造される；
e)化合物の一次性代謝産物は化合物の非酸化的代謝に由来する；
f)一次性代謝産物は生理pHで水に溶解し、親化合物に比べ薬理学活性が著しく減弱する；
g)親薬物の電気生理学的特性とは関係なく、一次性代謝産物は、血漿中の親薬物の通常の治療濃度では、IKR（HERG）チャネルでごくわずかな阻害活性しか有さない；
h)化合物およびその代謝産物は、他の薬物と共に投与しても代謝性薬物-薬物相互作用(DDI)を引き起こさない；または
i)化合物およびその代謝産物は、それだけで投与しても肝臓機能検査(LFT)値が上昇しない。
【請求項２】
少なくとも以下の特徴または性質を有する、請求項1記載の化合物：
1a)、1b)および1e)；1a)、1b)および1f)；1a)、1b)および1g)；1a)、1b)および1h)；1a)、1b)および1i)；1a)、1e)および1f)；1a)、1e)および1g)；1a)、1e)および1h)；1a)、1e)および1i)；1a)、1f)および1g)；1a)、1f)および1h)；1a)、1f)および1i)；1a)、1g)および1h)；1a)、1g)および1i)；1a)、1h)および1i)；1b)、1e)および1f)；1b)、1e)および1g)；1b)、1e)および1h)；1b)、1e)および1i)；1b)、1f)および1g)；1b)、1f)および1h)；1b)、1f)および1i)；1b)、1g)および1h)；1b)、1g)および1i)；1b)、1h)および1i)；1e)、1f)および1g)；1e)、1f)および1h)；1e)、1f)および1i)；1e)、1g)および1h)；1e)、1g)および1i)；1e)、1h)および1i)；1f)、1g)および1h)；1f)、1g)および1i)；1f)、1h)および1i)；または1g)、1h)および1i)。
【請求項３】
前記特徴または性質のうちの4つまたはそれ以上を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
前記特徴または性質のうちの5つまたはそれ以上を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
前記特徴または性質のうちの6つまたはそれ以上を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項６】
前記特徴または性質のうちの7つまたはそれ以上を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項７】
前記特徴または性質のうちの8つまたはそれ以上を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項８】
9つの全ての前記特徴または性質を有する、請求項1記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2001年8月24日に出願された米国特許仮出願第60/314,792号について優先権を主張する。この仮出願については、任意の数字、表、核酸配列、アミノ酸配列または図面を含む全体として、本明細書に参照として組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
有害な薬物-薬物相互作用(drug-drug interaction：DDI)、肝機能検査(elevation of liver function test：LFT)値の上昇、およびトルサード・ド・ポワンツ(torsade de pointe：TDP)に至るQT延長が、薬物候補がFDAの承認を得ることができない3つの主な理由である。これらの理由は全て、ある程度代謝に基づくものである。
【０００３】
酸化的代謝は、ほとんどの薬物(生体異物)が排除される主な代謝経路である。酸化的代謝はまた、薬物毒性、すなわち内因毒性または薬物-薬物相互作用(DDI)による毒性のいずれかの主な源である。代謝による有害なDDIならびに内因性毒性は、薬物候補が後期臨床試験で失敗する主な理由である。多くのDDIは代謝を基本とし、すなわち2つまたはそれ以上の薬物がチトクロムP450系(CYP450)における同じ代謝酵素に対し競合する(Guengerich、F.P.、「Role of cytochrome P450 enzymes in drug-drug interactions」Drug-Drug interactions: scientific and regulatory perspectives(1997)7-35、Li AP(編)Academic Press、サンディエゴ；Shen、W.W.、「Cytochrome P450 monooxygenases and interactions of psychotropic drugs: a five-year update」Int. J. Psychiatry M編(1995)25:277-290)。他方、加水分解酵素などの非酸化的代謝系は補助因子に依存せず；誘導性ではなく；高い基質容量を有し；ヒトでは個人間の変動が高くなく；且つ、ほとんどの組織および器官に存在する。そのため、非酸化的代謝系はより信頼できる。
【０００４】
代謝に基づくDDIが、2つまたはそれ以上の薬物が同一の酵素による代謝に対し競合する場合に起こる。これらの代謝相互作用は、代謝系が誘導性であるまたは/および容易に飽和可能である場合にDDIに関連することとなる。そのような代謝相互作用により薬物の薬物動力学の変更および潜在的な毒性にいたる。
【０００５】
多剤療法は、特に幾つかの疾患または状態に罹患した患者において一般的に実施される。2つまたはそれ以上の薬物が同様のまたは重複した時間に投与されると常に、薬物相互作用の可能性が存在する。単一のCYPの複数の基質を代謝することができる能力が、多くの証明されている、CYP阻害と関連する臨床的に重要な薬物相互作用の原因となる(Shen、W.W.、「Cytochrome P450 monooxygenases and interactions of psychotropic drugs: a five-year update」 Int. J. Psychiatry Med.(1995)25:277-290；Riesenman、C.、「Antidepressant drug interactions and cytochrome P450 system：a critical appraisal」 Pharmacotherapy(1995)15：84S-99S；Somogyi、A.ら、「Pharmacokinetic interactions of cimetidine」 Clin Pharmacokinet(1987)12:321-366)。同一の酵素に対する競合による薬物代謝の阻害により、望ましくない血漿薬物濃度の上昇が起こることがある。さらに、薬物相互作用は、長期の薬物治療後の幾つかのCYP誘導の結果、起こることもある。
【０００６】
2005525292.tif 000002
本発明の非酸化的代謝概念は、フルボキサミン(Luvox(登録商標)1)の場合、特定の例により最もよく説明され、上記で図示される。フルボキサミンはヒトにおけるある一定の強迫性疾患の治療において有益なセロトニン再取り込み阻害薬である。フルボキサミンは、代謝性DDIのインビトロ予測モデルが主要な最適化法の絶対必要な部分ではなかった時に開発された。そのため、薬物が承認された後、代謝性DDIの不利益が発見された。
【０００７】
フルボキサミンはCYP450系により段階的に代謝され、累進的に高くなる酸化レベルを有する3つの代謝産物が得られる：O-デスメチル2(アルコール)、アルデヒド3および最後に、ヒトにおいては主な代謝産物であるカルボン酸代謝産物4。主な代謝産物4はさらに代謝を受けることはなく、腎臓濾過により安全に排除される。この一連の酸化的事象がヒトではDDIおよび毒性の原因である。
【０００８】
非酸化的代替代謝経路の概念を提要することにより、加水分解可能な結合をフルボキサミン構造に導入することによりフルボキサミン類似体5を設計することができる。フルボキサミンのように、化合物5はセロトニントランスポーターに結合し、インビトロでフルオキセチンと同様のセロトニン再取り込み阻害特性を有する。フルボキサミンと比較して主な改良点は、化合物5が非酸化的加水分解酵素により1段階で、フルボキサミンと同じ主カルボン酸代謝産物4に代謝されることである。そのため、このフルボキサミン類似体は、CYP450により代謝される他の薬物との代謝性薬物-薬物相互作用を引き起こさないと予測される。
【０００９】
2つまたはそれ以上の薬物が同一の酵素による代謝に対し競合する場合、代謝に基づくDDIが起こる。代謝系が誘導性であり、または/および容易に飽和可能である場合、これらの代謝性相互作用はDDIに関係することとなる。そのような代謝性相互作用により、薬物の薬物動態学の変化および潜在的毒性に至る。
【００１０】
多剤療法は、特に幾つかの疾患または状態に罹患した患者において一般的に実施される。2つまたはそれ以上の薬物が同様のまたは重複した期間に投与されると常に、薬物相互作用の可能性が存在する。単一のCYPの複数の基質を代謝することができる能力が、多くの証明されている、CYP阻害と関連する臨床的に重要な薬物相互作用の原因となる(Shen、W.W.、「Cytochrome P450 monooxygenases and interactions of psychotropic drugs: a five-year update」 Int. J. Psychiatry Med.(1995)25:277-290；Riesenman、C.、「Antidepressant drug interactions and cytochrome P450 system：a critical appraisal」 Pharmacotherapy(1995)15：84S-99S；Somogyi、A.ら、「Pharmacokinetic interactions of cimetidine」Clin Pharmacokinet(1987)12:321-366)。同一の酵素に対する競合による薬物代謝の阻害により、望ましくない血漿薬物濃度の上昇が起こることがある。さらに、薬物相互作用は、長期の薬物治療後の幾つかのCYPの誘導の結果、起こることもある。
【００１１】
CYP450系の酵素は、原核生物および真核生物において見出される偏在性の酸化酵素である。それらの酵素は密接に関連するアイソザイムのスーパーファミリーとして存在し、その基質は広範な構造的に無関係な化合物を含む。酵素は広い基質特異性を示すことができるが、特別な基質はまた幾つかの異なるアイソザイムにより代謝されることもある。CYP450は薬物および生体異物の代謝において主要な役割を果たす。
【００１２】
代謝性薬物-薬物相互作用の臨床的な有意性は、薬理作用部位での活性種(親薬物および/または活性代謝産物)の濃度変化および薬物の治療指数の変化の大きさに依存する。代謝性薬物-薬物相互作用に起因する観察された変化は実質的なものであり(例えば、薬物または代謝産物の血液および組織濃度のある一定の大きさのオーダーのまたはそれ以上の増加または減少)、毒性代謝産物の形成または毒性親化合物への曝露の増大を含むことがある。
【００１３】
他の薬物の投与に関連する実質的に変化した曝露の例としては、(1)ケトコナゾールまたはエリスロマイシンによるテルフェナジン、シサプリド、またはアステミゾールのレベルの増大(CYP3A4の阻害)；(2)ミベフラジルまたはイトラコナゾールによるシンバスタチンまたはその酸代謝産物のレベルの増大(CYP3A4の阻害)；(3)フルオキセチン、パロキセチン、またはキニジンによるデシプラミンレベルの増大(CYP2D6の阻害)；および(4)リファピンによるカルバマゼピンレベルの減少(CYP3A4の誘導)。
【００１４】
曝露のこれらの大きな変化により、重要な様式で、薬物および/またはその活性代謝産物の安全性および効力プロファイルが変化することがある。これは、狭い治療域(NTR)を有する薬物に対し最も明らかであり予測されるが、非NTR薬物に対しても可能である(例えば、HMG CoAリダクターゼ阻害薬)。抗凝血薬、抗うつ薬、または心血管薬を受けた患者は、これらの薬物の治療指数が狭いため、他の患者よりもよりリスクが大きい。これらの作用物質と共に起こることがあるほとんどの代謝性薬物-薬物相互作用は、通常適当な投与調節により対処可能であるが、これらのDDIの多くが潜在的に生命を脅かすものである。
【００１５】
例えば、カルシウムチャネル遮断薬であるミベフラジル(Posicor(登録商標))が高血圧および慢性安定狭心症の管理に使用されている(Bursztyn、M.ら、「Mibefradil, a novel calcium antagonist, in elderly patients with hypertension: favorable hemodynamics and pharmacokinetics」Am. Heart J.(1997)134：238-247)。ミベフラジルはCYP3A4を阻害し、CYP3A4基質の代謝を妨害する。幾つかの臨床試験により、ミベフラジルの全面的な安全性が説明されている。しかしながら、研究した集団は、日常的な臨床治療において見られる場合よりも、おそらく健康であり、より厳密に管理されていた。ミベフラジルとβ-遮断薬、ジゴキシン、ベラパミルおよびジルチアゼムとの間の潜在的に重篤な相互作用が報告された後、ミベフラジルは1998年市場から自発的に撤収された。臨床医はミベフラジルを代替の抗血圧薬に切り換え始め、しばしばニフェジピンなどのジヒドロピリジン型カルシウムチャネル遮断薬(CCB)が選択された。ミベフラジルおよびβ-遮断薬を摂取し、ミベフラジルが市場から撤収された後ジヒドロプリジンCCBに切り換えられた患者において心臓性ショックの4症例が報告されている。1つの症例は死亡し、他の3人の患者は心拍数および血圧の集中的な支援を必要とする心臓性ショックの発現から生き延びた。全ての症例はミベフラジルを中断し、ジヒドロピリジンCCBを開始してから24時間以内に起きた。この重篤な薬物-薬物相互作用はおそらく2つの理由により生じた。第1に、ミベフラジルおよびジヒドロピリジンはどちらもCYP3A4の基質であり、これが、可能性のある機序となる。第2に、ミベフラジルは長い半減期(最長24時間)を有し、中断後24時間以内では治療レベルの作用物質が存在する可能性がある。
【００１６】
CYP450を誘導または阻害せず、その代謝が他の薬物により変化しない新規化学物質(NCE)が開発されることが非常に望まれており、製薬会社により探求されている。
【００１７】
他の非CYP450代謝経路を薬物構造に組み入れると、CYP-450を基本とする薬物-薬物相互作用の可能性を最小に抑えることができる。言い換えると、他の非CYP450代謝経路は、多剤治療によりCYP450相互作用が起きた時に本来備わった回避経路として機能する。例えば、抗高血圧薬であるフェノルドパムはCYP450に基づかない3つの平行な独立代謝経路を介して代謝される：カテコールO-メチルトランスフェラーゼによるメチル化、グルクロン酸抱合、および硫酸化。同様に、ラロキシフェンは肝臓により広範なファーストパス代謝を受け、主代謝産物は6-グルクロニド、4'-グルクロニド、および6,4'-ジグルクロニド複合体であり、これらはCYP450に依存しない。その結果、CYP450の阻害薬との有意の代謝性薬物相互作用はフェナルドパムおよびラロキシフェンに対しては知られていない。
【００１８】
全身麻酔の誘導および維持中に鎮痛薬として使用される超短オピオイドであるレミフェンタニルにより、さらにこの点について説明する。レミフェンタニルはCYP-450に依存しない非酸化酵素であるエステラーゼにより広く代謝される。静注投与後、レミフェンタニルは血液および他の組織内で迅速に代謝される。その結果、レミフェンタニルの除去は腎機能および肝機能には依存せず(Dershwitz、M.ら、「Pharmacokinetics and pharmacodynamics of remifentanil in volunteer subjects with severe liver disease」Anesthesiology(1996)84:812-820)、臨床的に有意な代謝性薬物-薬物相互作用は報告されていない。
【００１９】
LFTの上昇は特有なものであることがあり、すなわち、その源は未知であるが、おそらく患者群の遺伝的変異に関係する。しかしながら、LFT上昇の大部分が特有ではない。それにも関わらず、LFT上昇は肝細胞毒性の直接の指標であり、肝細胞内の毒性化合物の蓄積によるものである。蓄積という用語は、本明細書で、肝細胞内の毒性化合物の濃度が細胞により安全に除去できる濃度より高いことを示す。毒性化合物は薬物自体または代謝産物のいずれかである。
【００２０】
場合によっては、LFT上昇は反応性代謝中間体の形成に至ることがある。身体は反応性中間体を排除する天然の解毒系を有している。解毒系が作用しないと、反応性中間体は内在分子、蛋白質、およびDNAと自由に反応し、発癌性、催奇形、変異などに至る。周知の例は、反応性エポキシド中間体の形成によるベンゼンの発癌性である。このエポキシドは通常グルタチオンおよび/またはエポキシド加水分解酵素により解毒される。しかしながら、ベンゼンの量が高すぎると、エポキシド加水分解酵素およびグルタチオンが飽和され、エポキシドは毒性となり、迅速なLFT上昇および長期発癌性が生じる。
【００２１】
他の場合では、LFT上昇の原因となるのは、薬物自体またはその代謝産物のうちの1つの肝細胞内への蓄積である。この例はトログリタゾン(Rezulin(登録商標))である。初代ヒト肝細胞培養では、肝細胞毒性とトログリタゾンの代謝欠如(すなわち、蓄積と細胞死)との間には強い正相関がある(Kostrubsky、V.E.ら、「The role of conjugation in hepatotoxicity of troglitazone in human and porcine hepatocyte cultures」Drug Metab. Dips.(2000)28:1192-1197)。
【００２２】
トルサード・ド・ポワンツは、心筋中の遅延整流性カリウムチャネル(IKr)の活性化の速い成分の遮断と関係する生命を脅かす可能性のある心不整脈である。このチャネルはエーテル-ア-ゴーゴー(ether-a-go-go)関連遺伝子のヒト相同体から発現され、頭文字によりHERGチャネルとしばしば呼ばれる(Vandernberg、J.I.ら、「HERG K+ channels：friend and foe」TIPS(2001)22:240-6)。この受容体の遮断による不整脈は、体表面心電図のQT間隔の用量依存性の延長により特徴付けられる。本発明により提供される新規化合物および方法は、代謝産物の薬理学および薬力学ならびに薬物自体の薬物動態学を最適化することにより、この望ましくない活性を排除、または著しく減弱する。
【００２３】
致命的なTDFとなるQT延長はまた代謝源に帰着することがある。QT延長およびTDFは心室IKRチャネル(Herg チャネル)を遮断する化合物の存在下で起こり、そのため心室の再分極が遅れ、さらなる刺激に対する心室筋の無反応および脱分極に至る。Hergチャネルに対する遮断活性は通常濃度に依存する。このように、通常の治療用量では阻害濃度に到達しない弱いHergチャネル遮断薬は安全であると考えられる。しかしながら、状況により血液レベルが通常の治療レベルを超えて上昇し、IKR阻害が十分となるレベルに到達すると、遺伝的に病気にかかり易い少数の個体は突然TDPを発症するリスクが高くなる。
【００２４】
経時的な薬物蓄積のこの現象はいくつかの因子により引き起こされることがある。最も簡単な場合、偶発的な過剰摂取である。他の場合では、薬物の非線形薬物動態学により引き起こされることがある。しかしながら、最も一般的な理由は、DDIにより血液レベルが突然上昇する場合である。このDDIには2つの異なるレベルがある：担体-蛋白質結合部位に対する競合、または代謝酵素に対する競合である。過剰摂取およびDDIが、患者において予測不可能なTDPを引き起こすため2000年春にFDAにより禁止された薬物であるシサプリドの毒性の主原因であった。HERGチャネルの薬理は複雑であるが、分子の親油性を減少させる、および/または分子内の水素結合部位の数を増大させると、チャネル親和性が低くなる傾向があることは明らかである(Guengerich、F.P.、「Role of cytochrome P450 enzymes in drug-drug interactions」Drug-drug interactions: scientific and regulatory perspectives (1997) 7-35, Li AP(編) Academic Press, サンディエゴ)。さらに、本発明の薬物は、水溶性の、極性代謝産物が得られる非酸化的経路により主に代謝される。このように、一次性代謝産物はHERGチャネルに対し減少した親和性を有し、またはそのような親和性を有さない。この特徴は、非鎮痛性抗ヒスタミン薬テルフェナジンのカルボン酸代謝産物であるフェキソフェナジンの発見において実証されている。どちらの化合物も抗ヒスタミン薬として活性であるが、比較的親油性のテルフェナジンが高い血漿レベルで不整脈惹起性であり、その代謝産物はそのような活性を有していない(Selnick、H.G.ら、「Class-III anti-arrhythmic activity in vivo by selective blockade of the slowly activating cardiac delayed rectifier potassium current」J. Med. Chem. (1997) 40:3865-3868)。
【００２５】
化合物の薬物動態学的プロファイルはその物理化学特性により支配される。分子の極性は分布容積に影響し、そのため極性化学物は比較的低い分布容積を有する。これにより化合物は心臓などのより親油性の高い組織から離れて存在し、血漿中の有効濃度が増大する。テルフェナジンとアステミゾールとの間の比較により、分布容積と心臓毒性との間の正相関がされる(DePonti、F.ら、「QT-interval prolongation by non-cardiac drugs: lessons to be learned from recent experience」Eur. J. Clin. Pharmacol. (2000) 56:1-18)。TDPの薬物誘発性症状のかなりの割合が、薬物-薬物相互作用、遺伝形質、または過剰摂取による代謝経路における予測外のシフトの結果である。それぞれの場合において原因は同じである：主代謝経路が遮断され、薬物が毒性レベルまで蓄積する。
【００２６】
本発明は、よく特徴付けられた主に非酸化的である、制圧することが困難な代謝経路を有する新規化合物および組成物を提供する。
【発明の開示】
【００２７】
簡単な概要
本発明は様々な疾患の治療に治療的に有益で治療的に効果的な化合物および組成物を提供する。本発明の化合物は著しく減弱した薬物-薬物相互作用(DDI)レベルを示し、主に非酸化的系を介して代謝される。本発明の化合物および組成物は哺乳類、好ましくはヒトに治療目的で投与される。
【００２８】
詳細な開示
構造内に組み込まれた2つの代謝経路、1つの酸化的なものおよび非酸化的なものを有する薬物は、薬学産業界では非常に望まれている。酸化的代謝経路の1つが飽和しまたは機能しなくなると、治療を受けた被験者には他の非酸化的代謝経路により他の薬物解毒経路(回避経路)が提供される。回避代謝経路を提供するには二重代謝経路が必要であるが、DDI、TDPおよびLFT上昇に関して安全な薬物を得るには他の特徴が必要とされる。
【００２９】
2つの代謝経路を有する他に、薬物は迅速な代謝クリアランス(短い代謝半減期)を有するべきであり、そのため蛋白質レベルではDDIの場合であっても非結合薬物の血液レベルは危険レベルまで上昇しない。また、薬物の代謝半減期が長すぎると、CYP450系が再び主な排除経路となり、このため設計の当初の目的が駄目になる。投与した場合の高いピーク濃度および急速に下降する血液レベルを避けるために、そのような薬物は、経時的に一定であり、制御可能な血液レベルが得られる送達系を用いて投与されるべきである。
【００３０】
本発明は様々な疾患を治療するために治療的に有益かつ効果的な化合物および組成物を提供する。本発明の化合物は以下の特徴または性質のうちの1または複数を有する：
1.本発明の化合物はCYP450および非酸化的代謝酵素もしくは酵素系の両方により代謝される；
2.本発明の化合物は短い(最大4時間)非酸化的代謝半減期を有する；
3.化合物の経口バイオアベイラビリティは標準の薬学的経口製剤を用いる経口投与と一致する；しかし、その化合物および組成物はまた、経時的に一定で、制御可能な血液レベルが得られる任意の送達系を使用して投与することもできる；
4.本発明の化合物は加水分解酵素により非酸化的に開裂させることができる加水分解可能な結合を含む；
5.本発明の化合物は小規模および大規模化学合成の標準技術を用いて製造することができる；
6.本発明の化合物の一次性代謝産物は化合物の非酸化的代謝に由来する；
7.親薬物の溶解特性とは関係なく、化合物の一次性代謝産物は生理pHの水に溶解し、親化合物に比べ著しく減弱した薬理学活性を有する；
8.親薬物の電気生理学的特性とは関係なく、一次性代謝産物は、血漿中の親薬物の通常の治療濃度では、IKR(HERG)チャネルでごくわずかな阻害活性しか有さない(例えば、IKRチャネルでの活性が観察される前に、代謝産物の濃度が親化合物の通常の治療濃度よりも少なくとも5倍高くなければならない)；
9.本発明の化合物、ならびにその代謝産物は、他の薬物と共に投与しても代謝性DDIを引き起こさない；
10.本発明の化合物およびその代謝産物は、それだけで投与してもLFT値が上昇しない；ならびに
11.本発明の化合物は、心血管疾患、代謝疾患、炎症疾患、疼痛疾患、感染症、癌、胃腸疾患、精神障害、肺疾患、泌尿器病、皮膚疾患および眼疾患または状態を含むが、それらに限定されない広範囲の疾患を治療するのに有益である。
【００３１】
いくつかの態様では、本発明は上記特徴または性質のうちの任意の2つを有する化合物を提供する。他の態様では、上記性質または特徴のうちの任意の少なくとも3つを有する化合物が提供される。他の態様では、化合物および組成物は上記特徴または性質のうちの少なくとも4つの任意の組み合わせを有する。他の態様では、上記特徴または性質のうちの5〜10個の任意の組み合わせを有する化合物が提供される。好ましい態様では、本発明の化合物は11個の特徴または性質の全てを有する。
【００３２】
様々な態様では、本発明の化合物の一次性代謝産物は、親薬物の電気生理学的特性とは関係なく、血漿中の薬物の通常の治療濃度では、IKR(HERG)チャネルでごくわずかな阻害活性しか有さない。言い換えると、IKRチャネルでの活性が観察される前に、代謝産物濃度が親化合物の通常の治療濃度よりも少なくとも5倍高くなくてはならない。好ましくは、IKRチャネルでの活性が観察される前に、代謝産物の濃度が親化合物の通常の治療濃度よりも少なくとも10倍高くなくてはならない。
【００３３】
本発明による化合物は、主に、その構造内に組み入れられた加水分解可能な結合を介して、内因性加水分解酵素により代謝される。この代謝経路に由来する一次性代謝産物は水溶性であり、他の薬剤(薬物)と共に投与しても、減弱したDDIの発生率を示す。本発明による化合物中に組み入れることができる加水分解可能な結合の例としては、アミド、エステル、炭酸、リン酸、硫酸、尿素、ウレタン、グリコシド、または加水分解酵素により開裂させることができる他の結合が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で開示される化合物の他の改変は、当業者には容易である。このように、例示した化合物の類似体、誘導体、および塩は本発明の範囲内である。本発明の化合物の知識を用いると、熟練した化学者は周知の手順を用い、入手可能な物質からこれらの化合物を合成することができる。本出願において使用されるように、「類似体」および「誘導体」という用語は、実質的に他の化合物と同じであるが、例えば、追加の側基を追加することにより改変されている化合物を示す。本出願において使用される「類似体」および「誘導体」という用語は、他の化合物と実質的に同じであるが、化合物のある一定の位置で原子または分子置換が起きている化合物を示すことができる。
【００３５】
本発明はさらに、長期にわたり徐々に薬物が放出される薬物送達系により投与される新規薬物を提供する。これらの送達系は標的組織または細胞内の薬物レベルを一定に維持する。そのような薬物系は、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン(1995)pp1600-1675(参照により全体として本明細書に組み込まれる)において記述されている。薬物送達系は、経口投与形態、非経口投与形態、経皮系、および標的送達系の形態をとることができる。
【００３６】
経口徐放性投与形態は通常、薬物の放出速度が水に溶解しないポリマーによる拡散により決定される系に基づく。基本的には2つの型の拡散デバイスが存在する。すなわち、薬物コアの周囲をポリマー膜が取り囲むリザーバデバイス、および不活性なポリマーマトリクス中に、溶解または分散された薬物が均一に分配されるマトリクスデバイスである。しかしながら、実際には、放出速度を制御するには、多くの拡散デバイスもある程度溶解に頼っている。
【００３７】
溶解系は、溶解速度が遅い薬物では本質的に血液レベルが持続するという事実に基づく。そのため、水溶性の高い薬物の溶解速度を減少させることにより徐放性製剤を調製することができる。これは、適当な塩または他の誘導体を調製することにより、薬物を徐々に溶解する物質でコートすることにより、または徐々に溶解する担体を有する錠剤中に薬物を組み入れることにより、実施することができる。
【００３８】
実際には、ほとんどの溶解系は2つのカテゴリーに分けられる：カプセル化溶解系およびマトリクス溶解系。カプセル化溶解系は、薬物の粒子もしくは顆粒を様々な厚さの徐々に溶解することができるポリマーでコートすることにより、またはマイクロカプセル化により調製することができ、これは、相分離、界面重合、熱融合、または溶剤蒸発法により達成することができる。コーティング材料は、コートすべき薬物および所望の放出特性により、広範囲にわたる天然および合成ポリマーから選択してもよい。マトリクス溶解デバイスは薬物を徐々に溶解可能なポリマー担体と共に圧縮し錠剤形態とすることにより調製される。
【００３９】
浸透圧制御薬物送達系では、浸透圧を駆動力として使用して、薬物の一定放出が得られる。さらに、イオン交換樹脂を薬物の放出速度を制御するために使用することができる。樹脂と薬物溶液との長期接触により薬物を樹脂に結合させる。この複合体からの薬物放出は、胃腸管内のイオン環境および樹脂の性質に依存する。
【００４０】
最も一般的な非経口持続放出形態には、筋内注射、皮下組織および様々な体腔用のインプラント、および経皮デバイスが挙げられる。筋内注射は薬物および濃化剤の水溶液の形態をとることができ、濃化剤は媒質の粘度を増大させ、分子分散が減少し注入容積の局在化が起こる。このように、吸収面積を減少させ、薬物放出速度を制御する。また、薬物はカフェインまたはプロカインなどの低分子と共に、または巨大分子、例えば抗体および蛋白質などの生体高分子、またはメチルセルロールもしくはポリビニルピロリドンなどの合成ポリマーと共に複合化することができる。後者の場合、これらの製剤はしばしば懸濁水溶液の形態をとる。かなりの親油性の薬物を油溶液または油懸濁液として製剤化することができ、油懸濁液の場合、薬物の放出速度は薬物を周囲の水溶性媒質中への分配により決定される。油懸濁液から得られる作用期間は一般に油溶液から得られるものよりも長い。懸濁された薬物粒子は最初に油相に溶解し、その後に水溶性媒質中に分配されるからである。水-油(W/O)エマルジョンでは、薬物を含む水滴が外側の油相内に均一に分散され、これもまた持続放出のために使用することができる。O/W(反対)および多数のエマルジョンから同様の結果を得ることができる。
【００４１】
生体適合性ポリマーを基本とする移植可能なデバイスは、薬物活性の期間の制御および投与精度の両方共を高くすることができる。これらのデバイスでは、薬物放出は拡散または活性化により制御することができる。拡散型インプラントでは、薬物は速度制御ポリマー膜により囲まれたコンパートメント内に薬物がカプセル化される。薬物リザーバは、薬物粒子または液体もしくは固体型分散媒質中の固体薬物の分散物(または溶液)を含んでもよい。ポリマー膜は同種または異種の非多孔性ポリマー材料またはマイクロポーラスもしくは半透過性膜から作製してもよい。ポリマー膜の内側での薬物リザーバのカプセル化は、鋳造、カプセル化、マイクロカプセル化、または他の技術により達成してもよい。または、親油性または親水性のポリマーマトリクス全体に薬物粒子を均一に分散することにより薬物リザーバを形成する。ポリマーマトリクス中への薬物粒子の分散は薬物を粘性液体ポリマー、または半固体ポリマーと共に室温でブレンドした後、ポリマーを架橋することにより、または薬物粒子を高温の溶融ポリマーと混合することにより、達成してもよい。薬物粒子および/またはポリマーを有機溶媒に溶解し、その後高温または真空下で、鋳型内で混合し溶媒を蒸発させることにより作製することもできる。
【００４２】
マイクロリザーバ溶解制御薬物送達では、水に混和可能なポリマーの水溶液中に溶解した薬物粒子の懸濁液である薬物リザーバは、ポリマーマトリクス中の、複数の別個の濾過できない微視的薬物リザーバの均一分散物を形成する。マイクロ分散物は、高エネルギー分散技術により作製してもよい。この型の薬物送達デバイスからの薬物の放出は、界面分配またはマトリクス拡散制御過程のいずれかに続いて起こる。
【００４３】
活性化型インプラントでは、薬物は浸透圧勾配下、制御された速度で溶液形態の半透過型リザーバから放出される。移植可能な薬物送達デバイスはまた蒸気圧、磁力、超音波、または加水分解によっても活性化することができる。
【００４４】
薬物の制御された全身送達のための経皮系は、いくつかの技術に基づく。膜制御系では、薬物リザーバは、薬物が浸透できない裏材および、速度を制御するマイクロポーラスなまたは非多孔性ポリマー膜(薬物粒子はここを通して放出される)で形づくられた浅いコンパートメント内に、完全にカプセル化される。膜の外面には、薬物と化学反応を起こさず、低アレルギー誘発性の接着ポリマーが塗布されてもよく、経皮系と皮膚との親密な接触が達成される。この型の送達系からの薬物放出速度は速度制御膜および接着剤のポリマー組成、透過率または厚さを変化させることにより調整することができる。
【００４５】
接着剤拡散制御系では、薬物リザーバは、接着ポリマー中に薬物を直接分散させ、その後、溶媒キャスティングにより、薬物添加接着剤を薬物不透過性裏材膜の平らなシート上に広げ薄い薬物リザーバ相を形成させることにより構築される。薬物リザーバ層の上面には、一定の厚さの薬物が混入されていない速度制御接着ポリマーの層が塗布され、接着剤拡散制御薬物送達系が形成される。
【００４６】
マトリクス分散系では、薬物リザーバは薬物を親水性または親油性ポリマーマトリクス中に均一に分散させることにより形成される。その後、薬物混入ポリマーを成形し、ある規定された表面積および制御された厚さを有するディスクとする。その後、ディスクを、薬物不透過性裏材から作製されたコンパートメント内の閉塞性ベースプレートに接着させる。接着ポリマーを周囲に沿って広げ、薬物混入ディスクの周囲に接着剤リムのストリップを形成させる。マイクロリザーバ系では、薬物リザーバは、最初に水溶性ポリマーの水溶液中に薬物粒子を懸濁させ、その後、高せん断機械力により親油性ポリマー中に均一に分散させ、多数の濾過不能な薬物リザーバの微小球を形成させることにより作製される。この熱力学的に不安定な系はポリマーをインサイチューで架橋することにより安定化される。この架橋により、一定の表面積および厚さを有する薬物混入ポリマーディスクが作製される。
【００４７】
標的送達系としては、ナノ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、巨大分子複合体、ポリマービーズ、ミクロスフェア、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定されるものではない。標的送達系はまた、封じ直された赤血球および他の免疫学的系を含む。後者には、薬物/抗体複合体、酵素により活性化される抗体標的プロドラッグ系、および抗体に共有結合された薬物が含まれる。
【００４８】
本発明はまたこれらの化合物を製造する方法を提供する。
【００４９】
本発明の他の局面は、これらの条件を試験することができるプロトコルを提供することである。これらのプロトコルは、1)新規化合物はCYP450および加水分解酵素の両方により代謝される；2)親薬物の非酸化的半減期は内標準に比べると一定値にすぎない(好ましい態様では、約4時間未満)；3)親薬物の一次性代謝産物は非酸化的代謝の結果である；4)親薬物の一次性代謝産物は水溶性である(親薬物の溶解特性に関係なく)；5)親薬物の一次性代謝産物は、親薬物の治療濃度と同様の濃度ではIKRチャネルに対しわずかな阻害特性を有する(親薬物の電気生理学特性に関係なく)；6)新規化合物(その特性に関わらず)は他の薬物と共に投与しても代謝性DDIを引き起こさない；ならびに7)新規化合物はヒトの一次肝細胞内で肝毒性を引き起こさないことを確保するように設計されたインビトロおよびインビボ試験を含む。
【００５０】
実施例1：CYPアッセイ法
5つの主な薬物代謝酵素、CYP1A4、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、およびCYP3A4、ならびに他のCYP450サブファミリーの活性ついて試験する一連のアッセイ法が設計され、現在では、すぐに使用できるキットまたは請負仕事のいずれかとして市販されている。これらのアッセイ法の販売元には、例えばGentestおよびMDS Panlabsが含まれる。これらのアッセイ法は試験化合物の代謝に対する酵素の活性、ならびに基質による酵素の動力学的改変(阻害または活性化)について試験することができる。これらのインビトロプロトコルは簡単で迅速なコストの低い方法を使用して、薬物代謝の側面を特徴づけ、典型的に必要とされる試験物質は1mg未満である。
【００５１】
実施例2：ハイスループットのチトクロムP450阻害スクリーニング
大部分の薬物-薬物相互作用は代謝に基づき、このうちほとんどにおいてCYP450が関係する。例えば、新規化学物質が強力なCYP450阻害薬である場合、共に投与された薬剤の代謝を阻害することがあり、有害な臨床徴候に至る可能性がある。ヒトCYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4および他のアイソフォームの阻害を、酵素源としてミクロソーム調製物および文献において記述されている蛍光検出法を用いて評価する(Crespi、C.L.ら、「Microtiter plate assays for inhibition of human, drug-metabolizing cytochromes P450」Anal.Biochem.(1997)248:188-190；Crespi、C.L.ら、「Novel High throughput fluorescent cytochrome P450 assays」Toxicol.Sci(1999)48、abstr.No.323；Favreau、L.V.ら、「Improved Reliability of the Rapid Microtiter Plate Assay Using Recombinant Enzyme in Predicting CYP2D6 Inhibition in Human Liver Microsomes」Drug Metab. Dispos.(1999)27:436-439)。試験は96-ウエルマイクロタイタプレートで実施し、以下の蛍光CYP450基質を使用してもよい：レゾルフィンベンジルエーテル(BzRes)、3-シアノ-7-エトキシクマリン(CEC)、エトキシレゾルフィン(ER)、7-メトキシ-4-トリフルオロメチルクマリン(MFC)、3-[2-(N,N-ジエチル-N-メチルアミノ)エチル]-7-メトキシ-4-メチルクマリン(AMMC)、7-ベンジルオキシキノリン(BQ)、ジベンジフルオレセイン(DBF)、または7-ベンジルオキシ-4-トリフルオロメチルクマリン(BFC)。複数のCYP3A4基質は、IC50値の基質依存性、活性化、およびこの酵素と関連する複合体阻害動力学を評価するのに有効である(Korzekwa、K.R.ら、「Evaluation of atypical cytochrome P450 kinetics with two-substrate models: evidence that multiple substrates can simultaneously bind to the cytochrome P450 active sites」Biochemistry(1998) 37:4137-47；Crespi、C.L.、「Higher-throughput screening with human cytochromes P450」Curr. Op. Drug Discuv. Dev.(1999)2:15-19)。データは、1つまたは2つの濃度の試験化合物のみを使用した場合の、IC50値または阻害％として報告される。
【００５２】
実施例3：代謝安定性
代謝安定性は経口バイオアベイラビリティおよび半減期の両方に影響する；代謝安定性が高い化合物ほど薬物動態学パラメータが制御しにくい。この特徴または性質の組み合わせにより潜在的なDDIおよび肝臓毒性に至る。この試験では、CYP450の存在下、加水分解酵素の存在下、CYP450および加水分解酵素の両方の存在下での化合物の代謝安定性が測定される。
【００５３】
CYP450の存在下での安定性
低いおよび中程度のインビボクリアランスを有するCYP450基質を用いると、インビトロ代謝安定性とインビボクリアランスとの間で良好な相関が見られる(Houston、J.B.、「Utility of in vitro drug metabolism data in predicting in vivo metabolic clearance」 Biochem Pharmacol. (1994)47(9):1469-7)。この試験では、プールした肝臓ミクロソーム、S9(ヒトおよび/または前臨床種)、または適当な陽性対照および陰性対照を有するミクロソーム調製物を使用する。I相およびII相酵素代謝の両方の評価が可能であり、標準セットの基質濃度およびインキュベーションを使用してもよい。代謝は親化合物の損失により測定される。吸光度、蛍光、放射、または質量スペクトル検出を備えたHPLC分析を使用することができる。
【００５４】
加水分解酵素の存在下での安定性
肝臓サイトゾル、血漿中の加水分解酵素、または販売元からの酵素混合物(ヒトおよび/または前臨床種)を使用して、本発明の新規化合物の代謝安定性を評価する。適当な陽性対照および陰性対照ならびに標準セットの基質濃度を添加し、インビトロ観察をインビボ代謝半減期と相関させる。代謝は親化合物の損失により測定される。吸光度、蛍光、放射、または質量スペクトル検出を備えたHPLC分析を使用することができる。
【００５５】
CYP450および加水分解酵素の両方の存在下での安定性
この試験では、肝臓ミクロソーム、S9(ヒトおよび/または前臨床種)、または適当な陽性対照および陰性対照を有するミクロソーム調製物を、販売元からの、血漿由来の、またはサイトゾル由来の加水分解酵素と組み合わせて使用し、代謝安定性を評価する。試験はまた、一次肝細胞(ヒトおよび/または前臨床種)または潅流肝臓(前臨床種)において実施することができる。陽性対照および陰性対照、ならびに標準セットの基質を使用すると、インビトロ観察とインビボ代謝半減期との間の相関が得られる。
【００５６】
実施例4：CYP1A1誘導スクリーニング
CYP1A1の誘導は、様々なI相およびII相酵素の誘導と関連する過程であるアリール炭化水素(Ah)受容体のリガンド活性化を示す(Swanson、H.I.、「The AH-receptor: genetics, structure and function」Pharmacogenetics(1993)3:213-30)。多くの製薬会社が、Ah受容体リガンドとして疑われる化合物の開発を避けることを選択している。この試験は、Ah受容体リガンドに曝露することにより上昇する天然のCYP1A1活性を含むヒトリンパ芽球状細胞株を使用する。アッセイ法は96ウエルマイクロタイタプレートで実施し、試験物質と共に一晩中インキュベートした後、7-エトキシ-4-トリフルオロメチルクマリンを基質として添加する。ジベンズ(a,h)アントラセンを陽性対照誘導物質として使用する。毒性またはCYP1A1阻害に対する同時対照試験は、CYP1A1を本質的に発現する他の細胞株を使用すると利用可能である。
【００５７】
実施例5：チトクロムP450反応表現型
薬物の代謝の原因となるCYP450酵素の数および特性は、代謝における群変動に影響する。反応表現型は選択的阻害剤を有する肝臓ミクロソームまたはcDNA発現酵素のパネルのいずれかを使用して、基質の代謝に関係する酵素の数および特性を予備的に示す。各cDNA発現酵素の量はプールしたヒト肝臓ミクロソーム中の同一の酵素の活性に比例するように選択される。蛋白質濃度は対照ミクロソーム(CYP450酵素無し)を添加することにより標準化される。標準セットの基質濃度およびインキュベーションを使用し、薬物の代謝は親化合物の損失により測定する。また、吸光度、蛍光、放射、または質量スペクトル検出を備えたHPLC分析を使用することができる。
【００５８】
実施例6：Caco-2、LLC-PK1、またはMDCK細胞単層における薬物透過性測定
細胞単層を通過する薬物透過性は、腸透過性および経口バイオアベイラビリティと相関する。この測定にはいくつかの哺乳類細胞株が適している(Stewart、B.H.ら「Comparison of intestinal permeabilities determined in multiple in vitro and in situ models: relationship to absorption in humans」Pharm. Res. (1995)12：693-9；Irvine、J.D.、ら「MDCK（Madin-Darby Canine Kidney）cells: A tool for membrane permeability screening」J. Pharm. Sci.(1999)88:28-33)。先端から基底外側への拡散は、標準セットの時間点および薬物濃度を用いて測定する。これらの系はハイスループットモードに適合させることができる。液体クロマトグラフィ/質量分析(LC/MS)分析もまた、代謝産物の分析に使用できる。膜完全性に対する対照および比較化合物が含まれ、データは一定条件下での見かけの透過性(Papp)またはフラックス％として報告される。
【００５９】
実施例7：ヒトP-糖蛋白質(PGP)スクリーニング
ATPアーゼアッセイ法を使用して、化合物が生体異物トランスポーターMDR1(PGP)と相互作用するかどうかを決定する。PGPによる薬物排出にはATP加水分解が必要であり、ATPアーゼアッセイ法はヒトPGP膜における薬物により刺激されたATP加水分解により遊離したリン酸塩を測定する。アッセイ法は、周知のPGP基質のATPアーゼ活性と比較して単一濃度決定値を使用するハイスループットモードで化合物をスクリーニングする。薬物により刺激されたATPアーゼ活性の濃度依存性および見かけの動力学的パラメータ、またはPGPとの阻害相互作用を決定することによるより詳細な方法もまた使用できる。
【００６０】
実施例8：分極細胞単層でのPGPに媒介された薬物輸送
P-糖タンパク質(PGP)はABCトランスポータースーパーファミリーのメンバーであり、ヒト腸、肝臓および他の組織中で発現される。細胞膜に局在し、PGPはATP依存性排出ポンプとして機能し、多くの構造的に関連しない生体異物を細胞外に輸送することができる。PGPの腸発現はこのトランスポーターのための基質である薬物分子の経口バイオアベイラビリティに影響することがある。PGP基質である化合物は、分極細胞単層を横切る輸送を直接測定することにより同定することができる。2方向薬物輸送(先端から基底外側への透過性、および基底外側から先端へのPGPに促進される排出)は、LLC-PK1細胞(ヒトPGP cDNAを発現する)および対応する対照細胞において測定することができる。Caco-2細胞もまた使用できる。濃度依存性は、PGPにより媒介される輸送の飽和に対し分析され、見かけの動力学的パラメータが計算される。試験化合物はまた、このモデルを使用してハイスループットモードでスクリーニングすることができる。LC/MS分析を使用することができる。膜完全性に対する対照および比較化合物はアッセイ系に含まれる。
【００６１】
実施例9：蛋白質結合
LC/MS分析を使用して、試験化合物の固定ヒト血清アルブミンに対する親和性を評価することができる(Tiller、P.R.ら、「Immobilized human serum albumin: Liquid chromatography/mass spectrometry as a method of determining drug-protein binding」Rapid comm. mass spectrom. (1995)9:261-3)。適当な低、中および高結合陽性対照比較は試験に含まれる。
【００６２】
実施例10：代謝産物産生
ミクロソーム調製物または細胞株を使用して、mg量の代謝産物を産生させることができる。これらの代謝産物は分析標準、構造の特徴付けにおける補助、または毒性および効力試験に対する材料として使用することができる。
【００６３】
実施例11：Hergチャネルに対する効果
このアッセイ法は、安定ヒト胚腎臓細胞(HEK)において発現させたクローンHergチャネル、またはHerg/MiRP-1コードカリウムチャネルを一過的に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)のいずれかを用いて、親薬物および代謝産物のHergチャネルに対する効果を試験する。全ての細胞実験は、パッチ-クランプ技術を用い、電圧固定モードで実施される。
【００６４】
HEK細胞を使用する試験では、細胞は-80mVの電位から-80mVと+60mVの間の電圧を保持するように、4秒間で10mVのインクリメントで脱分極され、チャネルが完全に開き、または不活性化される。その後、電圧は6秒間で-50mVまで段階的に戻され、テール電流が記録される。電流は試験化合物の存在下でも記録され、Hergチャネルを阻害する試験化合物の能力の用量-応答曲線が評価される。
【００６５】
CHO細胞が関係する試験では、細胞は-60mVの電位を保持するように固定され、全細胞構造が確立される。その後、細胞は1秒間で+40mVに脱分極され、その後、-120mVと+20mVとの間の電位に、300ミリ秒で20mVのインクリメントで過分極/脱分極され、テール電流が分析される。試験化合物の影響を調べるために、細胞を300ミリ秒で+40mVに脱分極し、その後0.5mV/ミリ秒の速度で-60mVに再分極され、続いて200ミリ秒で試験電位-120mVとされる。6制御刺激後、細胞外溶液を、試験化合物を含む溶液に変え、44の追加の刺激を実施する。外向き電流および内向きテール電流のピークを分析する。
【００６６】
HERGチャネルに対する活性はまた、潅流心臓調製物、通常モルモットの心臓または他の小動物を用いて評価することもできる。このアッセイ法では、心臓は一定速度とされ、周知の濃度の薬物を含む溶液で潅流させる。QT間隔に対する薬物の効果の濃度-応答曲線を記録し、潅流液に薬物が含まれないブランク調製物と比較する。
【００６７】
実施例12：肝細胞培養における毒性
この試験は初代ヒトおよびブタ肝細胞培養物中で実施される。毒性は、[14C]ロイシンでパルス標識することにより(Kostrubsky、V.E.ら、「Effect of toxol on cytochrome P450 3A and acetaminophen toxicity in cultured rat hepatocytes: Comparison to dexamethasone」Toxicol. Appl. Pharmacol. (1997)142:79-86)、および製造業者(Sigma Chemical Co.、ミズーリ州セントルイス)により記述されているプロトコルを使用する3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドの還元により、総蛋白質合成を測定することにより決定される。肝細胞は、全臓器移植のために使用されない肝臓から、または雄のHanfordミニブタから単離することができる。
【国際調査報告】
2005525292.tif 000003
2005525292.tif 000004
2005525292.tif 000005