(57)【要約】コットンラット細胞株、ＰＲＲＳＶなどの微生物、病原体又はウイルスを成長させ、増殖させ、又は培養するためのコットンラット細胞の使用、及び得られた微生物、病原体又はウイルスの使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コットンラット細胞株ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９３０又はそのすべての同定特性を有する細胞株。
【請求項２】
ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９３０である請求項１に記載の細胞株。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の細胞株の細胞における病原体、微生物又はウイルスを増殖させることを含む病原体、微生物又はウイルスを生産する方法。
【請求項４】
病原体、微生物又はウイルスがウイルスであり、前記ウイルスが乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、感染性気管支炎ウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ブタ流行性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸ウイルス、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、マウス肝炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ラットコロナウイルス、唾液腺涙腺炎ウイルス、鳥類感染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウサギコロナウイルス、ウマトロウイルス、ブタトロウイルス、ヒトトロウイルス、ウシトロウイルス、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）、アデノウイルス、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、ウシロタウイルス（ＢＲＶ）又は３型ウシパラインフルエンザウイルス（ｂＰＩ−３）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ウイルスがＰＲＲＳＶ、２型ＣＰＩ、２型イヌアデノウイルス、３型ブタアデノウイルス、ＢＨＶ−１、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ｂＰＩ−３、ＢＲＶ又はＢＣＶである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ウイルスがＰＲＲＳＶである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５に記載のウイルス又はそれから得られる免疫原、抗原、エピトープを含む免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項８】
ウイルスが不活性化又は弱毒化されている請求項７に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項９】
ウイルスが不活性化されている請求項８に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項１０】
ウイルスがＰＲＲＳＶである請求項９に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項１１】
動物に対する応答を誘導するのに有効な量の請求項７に記載の免疫原性又はワクチン組成物を投与することを含む、ウイルスに対する免疫学的又は防御応答を誘導する方法。
【請求項１２】
ウイルスがＰＲＲＳＶであり、動物がブタである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルス又は抗原、免疫原又はそのエピトープと異なる免疫原、抗原又はエピトープをさらに含む請求項７に記載の免疫原性若しくはワクチン組成物。
【請求項１４】
ウイルス又は抗原若しくはそのエピトープと、ウイルス又は抗原若しくはそのエピトープと異なる免疫原、抗原又はエピトープとを混合することを含む請求項１３に記載の免疫原性又はワクチン組成物を調製する方法。
【請求項１５】
（ａ）ウイルス又は抗原若しくはそのエピトープと、（ｂ）ウイルス又は抗原若しくはそのエピトープと異なる免疫原又は抗原若しくはそのエピトープとを別個の容器中に、場合によって同じ包装中に、また場合によって添加及び／又は投与の指示書とともに含む請求項１３に記載の免疫原性又はワクチン組成物を調製するためのキット。
【請求項１６】
コットンラット肺細胞で病原体、微生物又はウイルスを増殖させることを含む、免疫原性若しくはワクチン組成物用の病原体、微生物若しくはウイルスを生産する、又は免疫原性若しくはワクチン組成物用の抗原、免疫原若しくはエピトープを提供する方法。
【請求項１７】
病原体、微生物又はウイルスがウイルスであり、前記ウイルスが乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、感染性気管支炎ウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ブタ流行性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸器ウイルス、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、マウス肝炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ラットコロナウイルス、唾液腺涙腺炎ウイルス、鳥類感染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウサギコロナウイルス、ウマトロウイルス、ブタトロウイルス、ヒトトロウイルス、ウシトロウイルス、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）、アデノウイルス、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、ウシロタウイルス（ＢＲＶ）又は３型ウシパラインフルエンザウイルス（ｂＰＩ−３）である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスがＰＲＲＳＶ、２型ＣＰＩ、２型イヌアデノウイルス、３型ブタアデノウイルス、ＢＨＶ−１、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ｂＰＩ−３、ＢＲＶ又はＢＣＶである請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ウイルスがＰＲＲＳＶである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載のウイルス又はその免疫原、抗原、エピトープを含む免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項２１】
ウイルスが不活性化又は弱毒化されている請求項２０に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項２２】
ウイルスが不活性化されている請求項２１に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項２３】
ウイルスがＰＲＲＳＶである請求項２２に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項２４】
動物に対する応答を誘導するのに有効な量の請求項２０に記載の免疫原性又はワクチン組成物を投与することを含む、ウイルスに対する免疫学的又は防御応答を誘導する方法。
【請求項２５】
ウイルスがＰＲＲＳＶであり、動物がブタである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ウイルス又はその抗原、免疫原若しくはエピトープと異なる免疫原、抗原又はエピトープをさらに含む請求項２０に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項２７】
ウイルス又はその抗原若しくはエピトープと、ウイルス又はその抗原若しくはエピトープと異なる免疫原、抗原又はエピトープとを混合することを含む請求項２６に記載の免疫原性又はワクチン組成物を調製する方法。
【請求項２８】
（ａ）ウイルス又はその抗原若しくはエピトープと、（ｂ）ウイルス又はその抗原若しくはエピトープと異なる免疫原、抗原又はエピトープとを別個の容器中に、場合によって同じ包装中に、また場合によって混合及び／又は投与の指示書とともに含む請求項２６に記載の免疫原性又はワクチン組成物を調製するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願／参照による組込み）
本出願は、参照により本明細書に組み込まれている、２００２年３月２０日に出願した米国仮出願番号第６０／３６６０１４号の優先権を主張するものである。前記の出願、並びにその願書中又はその手続遂行中に引用したすべての文書（「出願引用文書」）及び出願引用文書に引用又は参照されているすべての文書、並びに本明細書に引用又は参照されているすべての文書（「本明細書引用文書」）、及び本明細書引用文書に引用又は参照されているすべての文書、並びに本明細書に言及する、又は本明細書に参照により組み込まれているあらゆる文書における製品の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書及び製品シートは、参照により本明細書に組み込まれており、本発明の実施に際して用いることができる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規な細胞株、並びにウイルス、例えばブタ生殖及び呼吸症候群（ＰＲＲＳ；porcine reproductive and respiratory syndrome）として知られているブタ疾患を引き起こすウイルスなどの微生物若しくは病原体を生産する新規の方法を含むその使用に関する。
【０００３】
より一般的には、本発明は、微生物若しくは病原体、例えば、通常げっ歯類若しくはラット若しくはコットンラット若しくはコットンラット肺細胞を天然宿主として有さないウイルス、又は、例えば、プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルス、すなわちニドウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）のウイルスなどのＲＮＡウイルス、例えば、アーテウイルス若しくはアーテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）及びＰＲＲＳウイルス（そのベクターが一般的に節足動物である）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス、例えば、感染性気管支炎ウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ブタ流行性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸ウイルス、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、マウス肝炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ラットコロナウイルス、唾液腺涙腺炎ウイルス、鳥類感染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウサギコロナウイルス（また、そのベクターが一般的に節足動物であるウイルス）並びにウマトロウイルス、ブタトロウイルス、ヒトトロウイルス、ウシトロウイルスなどのトロウイルスなどのウイルス、例えば、ビルレント若しくは弱毒化ウイルスなどの微生物若しくは病原体の生産のための本発明によるコットンラット肺細胞又は細胞若しくは細胞株（例えば、寄託された細胞若しくは細胞株又はその同定特性を有する細胞若しくは細胞株）を用いるウイルス、例えば、ビルレント若しくは弱毒化ウイルスなどの微生物若しくは病原体の増殖に関する。
【０００４】
本発明によるコットンラット肺細胞又は細胞若しくは細胞株を用いて有利に増殖されるウイルスとしては、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）、例えば、２型ＣＰＩ（ＣＰＩ−２）、イヌアデノウイルス（ＣＡＶ）、例えば、２型イヌアデノウイルス（ＣＡＶ−２）、ブタアデノウイルス（ＰＡＶ）、例えば、３型及び５型ブタアデノウイルス（ＰＡＶ−３）などのアデノウイルス、ウシヘルペスウイルス、例えば、１型ウシヘルペスウイルス（伝染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）の原因）、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、例えば、１型（ＥＨＶ−１）若しくは４型（ＥＨＶ−４）、ウシロタウイルス（ＢＲＶ）、３型ウシパラインフルエンザウイルス（ＰＩ−３）、腸及び呼吸ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）などがある。
【０００５】
ウイルスはＰＲＲＳウイルスであることがより有利である。
【０００６】
そして、かなり有利な実施形態において、コットンラット肺細胞若しくは細胞株は、ＡＴＣＣにＰＴＡ−３９３０として寄託されたものであるか、又はＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９３０のすべての同定特性を有するコットンラット肺細胞若しくは細胞株であるか、又は少なくとも１０継代まで、例えば、１０継代以上若しくは２１継代以上若しくは７６継代以上などの少なくとも２１若しくは７６若しくは１００継代まで、例えば、少なくとも１０若しくは２１若しくは７６継代まで、及び有利には１００継代（含む）までコットンラット肺細胞を培養し、コットンラット肺細胞が本質的に上皮細胞であり、形態学的特性が各継代にわたって維持されるように細胞株を確立することにより生産されたコットンラット肺細胞若しくは細胞株である。
【０００７】
したがって、本発明は、そのような細胞若しくは細胞株並びにその使用に関する。
【０００８】
本発明によるコットンラット肺細胞又は細胞若しくは細胞株を用いて増殖させたウイルスは、ＰＲＲＳＶなどのウイルスにより引き起こされる疾患に対する免疫原性組成物及びワクチンの調製に有用である。同様に、本発明によるコットンラット肺細胞又は細胞若しくは細胞株を用いて増殖させた微生物又は他の病原体は、そのような他の病原体又は微生物に対する免疫原性又はワクチン組成物の調製に有用である。
【０００９】
本発明はまた、例えば、弱毒化、不活性化及びサブユニット免疫原性組成物及びワクチンを提供するための本発明による細胞における継代により成長させたウイルスの使用に関し、したがって、本発明はそのような弱毒化、不活性化若しくはサブユニット免疫原性組成物及びワクチンに関する。
【背景技術】
【００１０】
ブタ生殖及び呼吸症候群（ＰＲＲＳ）は、１９８７年にノースカロライナ（米国）において最初に記載された。このブタ疾患は、当時「なぞのブタ疾患（Ｍｙｓｔｅｒｙ  Ｓｗｉｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」又はＭＳＤと定義され、後に「ブタ生殖不能及び呼吸症候群（Ｓｗｉｎｅ  Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」又はＳＩＲＳとして知られた。これが次に１９９０年に中央ヨーロッパに出現した。最初はヨーロッパではこの疾患は「ブタ流行性流産及び呼吸症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ａｂｏｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」又はＰＥＡＲＳと命名され、最終的に「ブタ生殖及び呼吸症候群（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」又はＰＲＲＳと命名され、これが世界的に受け入れられた名称となった。
【００１１】
ＰＲＲＳウイルスは、最初にオランダで分離され、レリスタッド（Ｌｅｌｙｓｔａｄ）ウイルスと命名された包膜を有する１本鎖ＲＮＡウイルスである。これは、アーテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科の構成員と分類された。アーテリウイルス科のウイルスは、ニドウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）に属する。ニドウイルス目における他のウイルスは、コロナウイルス及びトロウイルスなどのコロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科に属するウイルスである。
【００１２】
ＰＲＲＳは、国際出願公開第９２／２１３７５号に記載された。分離株がＩｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）によりアクセッション番号Ｉ−１１０２のもとに寄託された。北米型も分離され（国際出願公開第９３／０３７６０号）、そのウイルスはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にアクセッション番号ＶＲ−２３３２のもとに寄託された。
【００１３】
雌ブタでは、疾患ＰＲＲＳは、生殖障害及び呼吸症状によって特徴付けられる。ＰＲＲＳウイルスの標的細胞は、マクロファージ細胞である。
【００１４】
ＰＲＲＳウイルスに対する免疫学的製剤を得る妨げとなっていた問題の１つは、ウイルス複製のための安定な基質が入手し難いことである。
【００１５】
ＰＲＲＳウイルスは、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）培養においてのみ増幅させることができた（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｖｅｔ．Ｑｕａｒｔ．１３、１２１〜１３０頁、１９９１）。これらのマクロファージを得るために特定の年齢の疾患のないブタを使用することが必要であることは、いくつかの欠点を示唆するものであった。さらに、異なる動物から得られる細胞基質は常に可変性であるので、回収されたＰＡＭにおけるウイルス感染に対する感受性は保証されなかった。これは、一定かつ均一な質の抗原バッチの生産における重大な欠点であり、その感受性を判定するために各バッチを評価する必要があった。
【００１６】
他の細胞基質に関する研究がなされた。米国特許第５４７６７７８号において、種々の動物種（例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ヒト、ブタ、サル）及び種々の組織（例えば、腎臓、肺、精巣）から得られた１５細胞株がＰＲＲＳウイルスの培養について試験された。１５細胞株のうちの１つの型（ＭＡ−１０４細胞）のみがＰＲＲＳウイルスの成長を可能にしている。
【００１７】
サル腎臓細胞株（例えば、ＶＥＲＯ、ＭＡ−１０４、ＭＡＲＣ−１４５、それぞれ米国特許第５４７６７７８号及び国際出願公開第９８／００１６５号）がＰＲＲＳウイルスの培養及び弱毒化に用いられている。しかし、これらの細胞におけるＰＲＲＳウイルスの力価は低く、したがって、生産費用は高い。
【特許文献１】米国仮出願番号第６０／３６６０１４号
【特許文献２】国際出願公開第９２／２１３７５号
【特許文献３】国際出願公開第９３／０３７６０号
【特許文献４】米国特許第５４７６７７８号
【特許文献５】国際出願公開第９８／００１６５号
【特許文献６】国際出願公開Ａ３−第９９／５３０４７号
【特許文献７】国際出願公開第９９／５３０４７号
【特許文献８】国際出願公開第９９／０８７０６号
【特許文献９】国際出願公開第０１／８３７３７号
【特許文献１０】国際出願公開第００／４７７５６号
【特許文献１１】米国特許第６０９０３９３号
【特許文献１２】米国特許第６５１７８４３号
【特許文献１３】米国特許第６４９７８８３号
【特許文献１４】米国特許第６３９１３１４号
【特許文献１５】米国特許第６３７９６７６号
【特許文献１６】米国特許第６２１７８８３号
【特許文献１７】米国特許第６２０７１６５号
【特許文献１８】米国特許公告第２００３００３１１２号
【特許文献１９】国際出願公開第９９／５３０４７号
【特許文献２０】国際出願公開第９９／０８７０６号
【特許文献２１】国際出願公開第０１／８３７３７号
【特許文献２２】国際出願公開第００／４７７５６号
【特許文献２３】米国特許第５６１６３２６号
【特許文献２４】米国特許第６０９０３９３号
【特許文献２５】米国特許第６１５９４７７号
【特許文献２６】米国特許第６２２８８４６号
【特許文献２７】米国特許第６４５１７７０号
【特許文献２８】米国特許第６３７６４７３号
【特許文献２９】米国特許第６２２４８７８号
【特許文献３０】米国特許第６２０７１６６号
【特許文献３１】米国特許第６３６８６０３号
【非特許文献１】Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｖｅｔ．Ｑｕａｒｔ．１３、１２１〜１３０頁、１９９１
【非特許文献２】Ｐａｐｐ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９７、７８、２９３３〜２９４３頁
【非特許文献３】Ｂｒｅｋｅｒ−Ｋｌａｓｓｅｎ  Ｍ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９５、６９（７）、４３０８〜４３１５頁
【非特許文献４】Ｈｅｍｍｅｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９９８、１９（４）、１６３〜１６８頁
【非特許文献５】Ｇｅｙｓｅｎ  Ｈ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４、８１（１３）、３９９８〜４００２頁
【非特許文献６】Ｇｅｙｓｅｎ  Ｈ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、８２（１）、１７８〜１８２頁
【非特許文献７】Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８９、１９（１）、４３〜４７頁
【非特許文献８】Ｇｅｙｓｅｎ  Ｈ．Ｍ．、Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９０、２１（４）、５２３〜５３３頁、Ｍｕｌｔｉｐｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ  ｄｅ  Ｃｈｉｒｏｎ
【非特許文献９】（Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１７、５３３〜５６１頁
【非特許文献１０】Ｂｏｖａｒｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９５０、５９、５０９頁
【非特許文献１１】Ｔｓｖｅｔｋｏｖ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８３、２０（３）、３１８〜２３頁
【非特許文献１２】Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９３、３０（５）、５１９〜２３頁
【非特許文献１３】Ｍｉｌｌｓ  ＣＫ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８８、２５（２）、１４８〜５２頁
【非特許文献１４】Ｗｏｌｆｆ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９０、２７（５）、５６９〜７５頁
【非特許文献１５】「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．６、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｋ  Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ、１９９５、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
【非特許文献１６】Ｍａｇａｒ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎ  Ｊ  ｖｅｔ  Ｒｅｓ．、１９９５、５９（３）、２３２〜４頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
不活性化及び弱毒化ＰＲＲＳワクチンは現在市販されているが、例えば、ワクチン又は免疫原性組成物の生産のためのＰＲＲＳウイルスを生産するために別の細胞基質を有することは非常に有用であろう。そして、より一般的には、例えば、ワクチン又は免疫原性組成物の生産のためのウイルス、例えば、プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルス、すなわち、アーテウイルス若しくはアーテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス及び、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスなどのニドウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）のウイルスなどのＲＮＡウイルスなどの病原体を生産するために別の細胞基質を有することは非常に有用であろう。
【００１９】
さらに、新規のコットンラット肺細胞株を提供することは有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、げっ歯類はＰＲＲＳウイルスの天然宿主ではないが、コットンラットの肺細胞は、ＰＲＲＳウイルスの成長又は増殖を可能にするという所見に基づいている。さらに、コットンラット肺組織由来の新規の細胞株を生産し、寄託した。
【００２１】
本発明はまた、コットンラットの肺細胞は、げっ歯類の天然病原体でない他のウイルスの成長又は増殖も可能にするという所見に基づいている。これらのウイルスは、２型イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰＩ−２）、２型イヌアデノウイルス（ＣＡＶ−２）、１型ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ−１）、４型ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ−４）、ウシロタウイルス（ＢＲＶ）及びウシコロナウイルス（ＢＣＶ）などである。
【００２２】
本発明は、より一般的には、通常げっ歯類若しくはラット若しくはコットンラット若しくはコットンラット肺細胞を天然宿主として有さないウイルス、又は、ニドウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）のウイルス、例えば、アーテウイルス若しくはアーテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）及びＰＲＲＳウイルス（そのベクターが一般的に節足動物である）；コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス、例えば、感染性気管支炎ウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ブタ流行性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸ウイルス、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、マウス肝炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ラットコロナウイルス、唾液腺涙腺炎ウイルス、鳥類感染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウサギコロナウイルス（また、そのベクターが一般的に節足動物であるウイルス）などのコロナウイルス、並びにウマトロウイルス、ブタトロウイルス、ヒトトロウイルス、ウシトロウイルスなどのトロウイルスなどのウイルス、例えば、ビルレント若しくは弱毒化ウイルスなどの微生物若しくは病原体を増殖させるための本発明によるコットンラット肺細胞又は細胞若しくは細胞株の使用を含む。
【００２３】
本発明によるコットンラット肺細胞又は細胞若しくは細胞株を用いて有利に増殖されるウイルスは、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）、例えば、２型ＣＰＩ（ＣＰＩ−２）、イヌアデノウイルス（ＣＡＶ）などのアデノウイルス、例えば、２型イヌアデノウイルス（ＣＡＶ−２）、ブタアデノウイルス（ＰＡＶ）、例えば、３型ブタアデノウイルス（ＰＡＶ−３）、ウシヘルペスウイルス、例えば、１型ウシヘルペスウイルス（伝染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）の原因）、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、例えば、１型（ＥＨＶ−１）又は４型（ＥＨＶ−４）、ウシロタウイルス（ＢＲＶ）、３型ウシパラインフルエンザウイルス（ＰＩ−３又はｂＰＩ−３）、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）並びにブタ生殖及び呼吸症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）などである。ウイルスはＰＲＲＳウイルスであることがより有利である。したがって、本発明は、そのようなウイルスの増殖又は培養又は成長に関する。
【００２４】
１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）（Ｐａｐｐ  Ｚ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９７、７８、２９３３〜２９４３頁、例えば、２９３５頁を参照）、３型ウシパラインフルエンザウイルス（ｂＰＩ−３）（Ｂｒｅｋｅｒ−Ｋｌａｓｓｅｎ  Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９５、６９（７）、４３０８〜４３１５頁を参照）及び３型ブタアデノウイルス（ＰＡＶ−３）（ＰＣＴ特許出願国際出願公開Ａ３−第９９／５３０４７号を参照）などのある種のウイルスは、コットンラットの肺細胞において成長することができる。これらの文書は、不活性化、弱毒化若しくはサブユニット免疫原性組成物又はワクチンの調製のためのそのような細胞及びその細胞において生産されたウイルスの使用、並びに動物へのそれらの投与及び免疫化若しくはワクチン接種の方法を記載又は示唆していない。
【００２５】
本発明はまた、ＡＴＣＣにＰＴＡ−３９３０として寄託されたコットンラット肺細胞若しくは細胞株、又はＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９３０のすべての同定特性を有するコットンラット肺細胞若しくは細胞株、又は、１０継代以上若しくは２１継代以上若しくは７６継代以上などの少なくとも１０若しくは２１若しくは７６継代まで、例えば、少なくとも１０若しくは２１若しくは７６継代、及び有利には１００継代まで（１００継代を含む）コットンラット肺細胞を培養し、コットンラット肺細胞が本質的に上皮細胞であり、形態学的特性が各継代にわたって維持されるように細胞株を確立することにより生産されたコットンラット肺細胞若しくは細胞株を含む。
【００２６】
本発明は有利なことにビルレント若しくは弱毒化ＰＲＲＳウイルスの増殖のためのコットンラット肺細胞（ＣＲＬ細胞）、例えば、これらの細胞から造られた細胞株の使用を含む。
【００２７】
本発明はまた、有利なことにウイルスなどの微生物又は病原体、例えば、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ、ＢＣＶなどのビルレント若しくは弱毒化ウイルスの増殖のためのＣＲＬ細胞、例えば、本発明の細胞若しくは細胞株などのこれらの細胞から造られた細胞若しくは細胞株（例えば、寄託された細胞株又はその特性を有する細胞）の使用を含む。
【００２８】
したがって、本発明は、培養又は増殖に適する条件下でウイルスをコットンラット肺細胞と接触させることを含む、ＰＲＲＳＶ、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＰＡＶ−５、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ、ＢＣＶ、ＬＤＶ、ＥＡＶ、ＳＨＦＶ、感染性気管支炎ウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ブタ流行性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸ウイルス、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、マウス肝炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ラットコロナウイルス、唾液腺涙腺炎ウイルス、鳥類感染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウサギコロナウイルス、ウマトロウイルス、ブタトロウイルス、ヒトトロウイルス、ウシトロウイルスなどのウイルスを培養又は増殖させる方法を含む。この方法は、得られるウイルスを収集することをさらに含む。免疫原性若しくは免疫学的若しくはワクチン組成物の調製のために、ウイルスは、場合によって不活性化し、かつ／又はそれから分離されたタンパク質若しくは抗原若しくはエピトープ（不活性化若しくはサブユニット組成物のための）を有することができ、ウイルス若しくはサブユニットを適切な担体又は希釈剤及び／又は佐剤、例えば、獣医学的に許容できる、若しくは製薬上許容できる担体又は希釈剤及び／又は佐剤と混合することができる。
【００２９】
「免疫原性組成物」及び「免疫学的組成物」及び「免疫原性若しくは免疫学的組成物」という用語は、標的とする病原体に対する免疫応答を誘発する、例えば、動物（ブタなどの）への投与又は注射後に標的とする病原体（例えば、ＰＲＲＳ）に対する免疫応答を誘発するあらゆる組成物を含む。「接種（vaccinal）組成物」及び「ワクチン」及び「ワクチン組成物」という用語は、標的とする病原体に対する防御免疫応答を誘発する、又は病原体を効果的に防御する、例えば、動物（例えば、ブタ）への投与又は注射後に標的とする病原体に対する防御免疫応答を誘発する、又は病原体（例えば、ＰＲＲＳ）に対する有効な防御を提供するあらゆる組成物を含む。病原体、例えばウイルスのサブユニット、すなわち病原体、例えばウイルスから分離された抗原若しくは免疫原若しくはエピトープ及びサブユニット組成物は、病原体、例えばウイルスから分離された１つ又は複数の抗原、免疫原若しくはエピトープを含む、又はそれらから本質的になる。
【００３０】
本発明はまた、本発明のコットンラット肺細胞又は細胞若しくは細胞株における培養又は増殖により得られた微生物又は病原体、例えば、通常げっ歯類若しくはラット若しくはコットンラット若しくはコットンラット肺細胞を天然宿主として有さないウイルスなどのウイルス、例えば、ＰＲＲＳＶ、ＬＤＶ、ＥＡＶ、ＳＨＦＶ、感染性気管支炎ウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ブタ流行性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸ウイルス、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、マウス肝炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ラットコロナウイルス、唾液腺涙腺炎ウイルス、鳥類感染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウサギコロナウイルス、ウマトロウイルス、ブタトロウイルス、ヒトトロウイルス、ウシトロウイルス、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＰＡＶ−５、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ又はＢＣＶ、有利なことにＰＲＲＳウイルス、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ又はＢＣＶの培養、例えば、不活性化、弱毒化及びサブユニット培養又は製剤を提供する。
【００３１】
そのような培養は、異なる細胞において増殖させた培養からの汚染物質を含んでいない可能性があり、異なる細胞において増殖させた培養と異なる力価を有する可能性があるので、既往の培養と異なっている。例えば、ブタ細胞中で増幅されたＰＲＲＳウイルスを再び考えると、その培養はブタ細胞からの含まれている汚染物質に対して感受性を有し、ＣＲＬ細胞で培養したＰＲＲＳＶはブタ細胞に認められる汚染物質を含まない可能性がある。この分析は、本発明の培養が以前の培養と異なることが明らかなように、本発明におけるようにＣＲＬ細胞で培養したウイルスの培養と比較して、ＰＲＲＳＶ及び他のウイルスを増殖させるために用いられた他の細胞で培養されたＰＲＲＳＶ及び他のウイルスの培養に拡大することができる。
【００３２】
本発明はまた、本発明によるＰＲＲＳウイルス培養から得ることができるＰＲＲＳ疾患又はＰＲＲＳＶに対する免疫原性組成物及びワクチン、有利なことに、生弱毒化免疫原性組成物及びワクチン、不活性化免疫原性組成物及びワクチン並びにサブユニット免疫原性組成物及びワクチンを含む。
【００３３】
本発明はまた、本発明のＣＲＬ細胞又は細胞株若しくは細胞において培養又は増殖させた他の病原体又は微生物に対する免疫原性組成物及びワクチン、例えば、生弱毒化、不活性化若しくはサブユニット組成物又はワクチンを含む。これらの免疫原性組成物又はワクチンは、本発明のＣＲＬ細胞又は細胞株若しくは細胞において成長させ、培養し、増殖等させた微生物又は病原体又はウイルスに対するものであってよく、例えば、そのような免疫原性又はワクチン組成物は、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＢＨＶ−１、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３又はＢＣＶなどの本明細書で言及した任意のウイルス又は微生物又は病原体に対するものである。
【００３４】
本発明は、有利なことに別個の容器中に細胞及びその上で培養するウイルス又は微生物又は病原体を含むキットを含み、さらにより有利なことに、別個の容器が同じ包装中に存在し、場合によって、キットは、細胞及び／又はウイルスを培養し、成長させ、増殖させる指示書を含み、指示書は場合によってウイルスを収集し、かつ／又は不活性化し、かつ／又はサブユニット抗原若しくは免疫原若しくはエピトープを分離する指示を含む。
【００３５】
本発明はさらに、複合組成物、例えば、１つ又は複数の発明によるワクチン若しくは免疫原性組成物を含む組成物、又は他のワクチン若しくは免疫原性組成物若しくは活性成分と組み合わせた発明によるワクチン若しくは免疫原性組成物（例えば、不活性化若しくは弱毒化ウイルス又は病原体又は微生物又はサブユニット抗原若しくはその免疫原若しくはタンパク質若しくはエピトープ）を含む。
【００３６】
したがって、例えば、本発明は、生弱毒化免疫原性組成物及びワクチン、不活性化免疫原性組成物及びワクチン又はサブユニット免疫原性組成物及びワクチンなどの、本発明によるＰＲＲＳ及びＰＡＶ−３ウイルス培養の混合物を含むブタ疾患に対する免疫原性組成物及びワクチンを含む。ＰＡＶ−３は、１つ又は複数の外来又は異種又は外因性免疫原、抗原若しくはエピトープ（該アデノウイルスについて外来、異種又は外因性）をエンコードし、発現する１つ又は複数の核酸配列を含む組換えＰＡＶ−３であってもよい。本発明の実施において用いることができる組換えブタアデノウイルスベクターの例に関しては、国際出願公開第９９／５３０４７号、国際出願公開第９９／０８７０６号、国際出願公開第０１／８３７３７号及び国際出願公開第００／４７７５６号が挙げられる。
【００３７】
他の例は、本発明が、生弱毒化免疫原性組成物及びワクチン、不活性化免疫原性組成物及びワクチン又はサブユニット免疫原性組成物及びワクチンなどの、本発明によるＣＰＩ−２及びＣＡＶ−２ウイルス培養の混合物を含むイヌ疾患に対する免疫原性組成物及びワクチンを含むことである。ＣＡＶ−２は、１つ又は複数の外来又は異種又は外因性免疫原、抗原若しくはエピトープ（該アデノウイルスについて外来、異種又は外因性）をエンコードし、発現する１つ又は複数の核酸配列を含む組換えＣＡＶ−２であってもよい。本発明の実施において用いることができる組換えイヌアデノウイルスの例に関しては、米国特許第６０９０３９３号が挙げられる。
【００３８】
さらなる例は、本発明が、生弱毒化免疫原性組成物及びワクチン、不活性化免疫原性組成物及びワクチン又はサブユニット免疫原性組成物及びワクチンなどの、ＢＨＶ−１、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３及び／又はＢＣＶを含む本発明による少なくとも２つ若しくは少なくとも３つ若しくは４つすべてのウイルス培養の混合物、例えば、ＢＨＶ−１＋ＢＲＶ、ＢＨＶ−１＋ＢＲＶ＋ｂＰＩ−３、ＢＨＶ−１＋ＢＲＶ＋ｂＰＩ−３＋ＢＣＶ、ＢＲＶ＋ｂＰＩ−３、ＢＲＶ＋ｂＰＩ−３＋ＢＣＶ、ｂＰＩ−３＋ＢＣＶ、ＢＨＶ＋ｂＰ−３、ＢＨＶ＋ｂＰＩ−３＋ＢＣＶ、ＢＨＶ−１＋ＢＣＶ、ＢＲＶ＋ＢＣＶを含むウシ疾患に対する免疫原性組成物及びワクチンを含むことである。ＢＨＶ−１及びｂＰＩ−３を含む本発明による少なくとも２つのウイルス培養の混合物を含むウシ呼吸疾患に対する免疫原性組成物及びワクチン、並びにＢＣＶ及びＢＲＶを含む本発明による少なくとも２つのウイルス培養の混合物を含むウシ腸疾患に対する免疫原性組成物及びワクチンが有利であると考えられる。
【００３９】
そして、本発明による複合組成物のさらなる例は、生弱毒化免疫原性組成物及びワクチン、不活性化免疫原性組成物及びワクチン又はサブユニット免疫原性組成物及びワクチンなどの、本発明によるＥＨＶ−１及びＥＨＶ−４ウイルス培養の混合物を含むウマ疾患に対する免疫原性組成物及びワクチンである。
【００４０】
本発明は、例えば、活性成分を有利なことにともに、また担体及び希釈剤及び／又は佐剤と混合することにより、そのような複合組成物を調製することを含む。
【００４１】
本発明はまた、本発明の複合免疫原性又はワクチン組成物を調製するためのキットを含む。例えば、そのようなキットは、（ａ）微生物、病原体又はウイルス又はその抗原若しくはエピトープ（有利なことに本明細書に記載したようなウイルス）及び（ｂ）（ａ）と異なる微生物、病原体又はウイルス又はその免疫原、抗原若しくはエピトープ（有利なことにウイルス又はその免疫原、抗原若しくはエピトープであるが、本明細書に記載したような他の病原体も考えられる）を別個の容器中に、場合によって同じ包装中に、また、場合によって添加及び／又は投与の指示書とともに含む。
【００４２】
本発明はさらに、コットンラット肺細胞若しくは細胞株、例えば、本発明のコットンラット肺細胞若しくは細胞株において増殖した病原体又は微生物又はウイルス、例えば、本明細書に記載したウイルスによって引き起こされる疾患に罹患しやすい宿主などの宿主に、免疫応答を誘発するのに十分な量でそのような不活性化若しくは弱毒化病原体又は微生物又はウイルス又はその抗原若しくは免疫原若しくはエピトープを含む本発明の免疫原性又はワクチン組成物を投与することにより免疫応答を誘発する方法を含む。
【００４３】
したがって、本発明は、発明による免疫原性組成物及び／又はワクチンを用いて、例えば、適切な免疫応答を誘発するのに十分な量で宿主、例えば、ブタに該免疫原性又はワクチン組成物を投与して、ＰＲＲＳ疾患又はウイルスに対する免疫化又はワクチン接種又は免疫応答を誘発する方法を提供する。そして、本発明はさらに、本発明による免疫原性組成物及び／又はワクチンを用いて、すなわち、適切な免疫応答を誘発するのに十分な量で宿主、例えば、ウイルスの天然宿主に該免疫原性又はワクチン組成物を投与して、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＢＨＶ−１、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３又はＢＣＶ疾患又はウイルスに対する免疫化又はワクチン接種又は免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００４４】
本発明は、例えば、カクテル又は複合組成物を用いる場合に、応答を誘発するのに有効な量の本発明の免疫原性組成物（複数）及び／又はワクチン（複数）を投与することを含む、ＰＲＲＳ及びＰＡＶ−３疾患に対するブタにおけるように、２種以上の抗原、エピトープ又は病原体又は微生物又はウイルスに対する宿主動物における免疫化又はワクチン接種又は免疫応答を誘発する方法を含む。（「（複数）」という表示は、この方法は、本発明の組成物又はワクチンを逐次的に投与することによっても実施することができるので用いた。）同様に、さらなる例として、本発明は、有効な量の本発明の免疫原性組成物（複数）及び／又はワクチン（複数）を使用又は投与して、ＣＰＩ−２及びＣＡＶ−２疾患又はウイルスに対するイヌにおける免疫化又はワクチン接種又は免疫応答を誘発する方法を含む。同様に、本発明は、有効な量の本発明の免疫原性組成物（複数）及び／又はワクチン（複数）を使用又は投与して、少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種のウシ疾患又はウイルスに対するウシにおける免疫化又はワクチン接種又は免疫応答を誘発する方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の免疫原性組成物（複数）及び／又はワクチン（複数）を使用又は投与して、ＢＨＶ−１及びｂＰＩ−３疾患又はウイルスに対するウシにおける免疫化又はワクチン接種又は免疫応答を誘発する方法を含む。本発明はまた、本発明の免疫原性組成物（複数）及び／又はワクチン（複数）を使用又は投与して、ＢＣＶ及びＢＲＶ疾患又はウイルスに対するウシにおける免疫化又はワクチン接種又は免疫応答を誘発する方法を含む。また、本発明は、本発明の免疫原性組成物（複数）及び／又はワクチン（複数）を使用又は投与して、ＥＨＶ−１及びＥＨＶ−４疾患又はウイルスに対するウマにおける免疫化又はワクチン接種又は免疫応答を誘発する方法を含む。
【００４５】
本開示において、また特に特許請求の範囲において、「含む（comprises）」、「含まれた（comprised）」、「含んでいる（comprising）」等などの用語は、米国特許法でそれに帰属されている意味をもつことができ、例えば、それらは「含む」「含まれた」、「含んでいる」等を意味することができ、「から本質的になっている」及び「から本質的になる」などの用語は、米国特許法でそれに帰属されている意味をもち、例えば、それらは、明確に列挙されていない要素を受け入れるが、従来技術において認められる、又は本発明の基本若しくは新規特性に影響を及ぼす要素を除外することに留意されたい。
【００４６】
これら及び他の実施形態は、開示されており、或いは、以下の詳細な説明から明らかであり、また、それに含まれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明者等は、コットンラット肺細胞、並びに新しい細胞株を用いるウイルスの生産又は増殖の方法；及びそのような細胞上の微生物又は病原体又はウイルスの増殖又は生産又は培養又は成長の方法を開発した。
【００４８】
肺をコットンラットから採取し、酵素消化（例えば、トリプシン及び／又はコラゲナーゼによる）に供した。分離した細胞を含む上清を収集し、例えば、単層として、又は懸濁液中で培養する。有利なことに、細胞を、例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び／又はラクトアルブミンヒドロシラート（ＬＡＨ）を補足した最少必須培地（ＭＥＭ）中で単層として培養する。有利なことに、培地は、抗生物質、例えば、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン及び／又はペニシリンを含んでいてよい。
【００４９】
ＰＲＲＳウイルスは、そのような肺細胞培養上で培養した。ＰＡＶ−３、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＢＨＶ−１、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３又はＢＣＶウイルスもそのような肺細胞培養上で培養する。
【００５０】
細胞培養は、有利なことに、これらの細胞の数継代により得ることができる。有利なことに、これらの細胞の継代により、例えば、ＰＲＲＳウイルスの増殖に有用である細胞株を生産することができる。例えば、細胞を少なくとも１０継代、例えば、１０〜１００継代に供することができる。有利なことに、単層の確立にはある程度のＦＢＳ又は他の適切な細胞成長因子を必要とするが、これらの細胞株はウシ胎児血清（ＦＢＳ）の非存在下で耐えることができる。
【００５１】
本発明によるＣＲＬ細胞の培養の他の利点は、使用済み培地の交換又は追加の栄養補給を必要とせずに、細胞の培養が健常な単層又は懸濁液として少なくとも１か月間存続することができることである。この頑健性は、始動時間（培養の確立）及び細胞株の消費を必要とせずに同じ細胞培養から多数のウイルスを収集することができるという利点をもたらした。したがって、同じ細胞培養から多数のウイルスを収集することが可能である。１実施形態において、培養工程は、ウイルス再接種及び／又は新鮮な培地の追加を伴う、又は伴わない、ウイルスの２回以上の収集を含む。有利なことに、毎回の収集の後に、新鮮な培地を細胞培養に追加する。
【００５２】
この手順の後に、コットンラット肺細胞を７６継代まで培養し、細胞株として確立した。これらのコットンラット肺細胞は、本質的に上皮細胞であり、形態学的特性が継代にわたって維持されている。第２１継代が２００１年１２月１８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９）によりブダペスト条約の条件のもとに寄託され、アクセッション番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９３０が割り当てられた。
【００５３】
１実施形態において、本発明は、ビルレント又は弱毒化ＰＲＲＳウイルスの生産のためのコットンラット肺上皮細胞、細胞株ＰＴＡ−３９３０又はその同定特性を有する細胞株などのそれから得られる上皮細胞株の使用を含む。さらなる実施形態において、本発明は、ビルレント又は弱毒化ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ又はＢＣＶウイルスの生産のためのコットンラット肺上皮細胞、細胞株ＰＴＡ−３９３０又はその同定特性を有する細胞株などのそれから得られる上皮細胞株の使用を含む。さらなる実施形態において、本発明は、ビルレント又は弱毒化ＢＨＶ−１又はｂＰＩ−３ウイルスの生産のための細胞株ＰＴＡ−３９３０又はその同定特性を有する細胞株の使用を含む。その細胞株又はその同定特性を有する細胞株は、本明細書に記載した他のウイルスに関しても用いることができる。
【００５４】
したがって、本発明の他の態様は、上皮細胞を含むコットンラット肺細胞培養上、有利なことにコットンラット肺細胞株上でＰＲＲＳウイルスを培養することを含む、ＰＲＲＳウイルスを生産する方法である。例えば、ウイルスの生産を細胞株ＰＴＡ−３９３０又はその同定特性を有する細胞株上で行う。このウイルスを生産する方法は、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＢＨＶ−１、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３又はＢＣＶウイルス並びに本明細書に記載した他のウイルスについても用いることができる。
【００５５】
ウイルスは、ビルレントウイルス又は弱毒化ウイルスであってよい。
【００５６】
ウイルスの生産は、そのような細胞におけるウイルスの接種及び増殖の工程を含む。接種の前に、本発明による細胞は、適切な培地、例えば、ＦＢＳ又は他の適切な細胞成長因子を補足したＭＥＭ培地中で成長させることができる。細胞培養は、有利なことに３５〜３９℃の温度、有利なことに約３７℃で行う。細胞培養は単層であることが有利である。或いは、細胞培養は懸濁液である。一般的に、単層において成長した細胞が集密的であるときに、ウイルスを接種する。細胞外ウイルスは、上清により直接回収することができる。細胞内ウイルスは、例えば、凍結／解凍又は音波処理による細胞の適切な破壊の後に回収することができる。懸濁液中の細胞培養の場合、ウイルスは、例えば、ろ液のろ過の後に回収することができる。ウイルスは、接種してから２〜１５日後、例えば３〜７日後に、より有利なことに５〜７日後に回収することができる。ウイルスの生産は、ウイルス生産に関する分野の技術者の一般的知識に従って行う。ウイルス粗培養は、この段階で得られる。
【００５７】
本発明に用いる培地は、抗生物質を補足することができる。
【００５８】
必要な場合、ウイルス、例えば、ＰＲＲＳウイルスを本発明による細胞上の成長に適応させる。適応は、本発明による細胞及びＭＡ−１０４などのサル腎臓細胞上の共培養により行うことができる。適応は、よく知られているように、本発明による漸増的に増加する量の細胞を用いる共培養による連続継代によって行う。この適応は、ＣＰＩ−２、ＣＡＶ−２、ＢＨＶ−１、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３又はＢＣＶウイルス並びに本明細書に記載した他のウイルスについても行うことができる。
【００５９】
粗培養は、濃縮及び／又は精製することができる。
【００６０】
濃縮は、当業者に知られている従来の方法、例えば、選択的沈殿又は限外ろ過により行うことができる。精製は、当業者に知られている従来の方法、例えば、超遠心分離又はクロマトグラフィー法、例えば、ゲルろ過により行うことができる。ウイルス濃縮培養、精製培養又は濃縮かつ精製培養は、この段階で得られる。
【００６１】
本発明の他の態様において、本発明によるウイルス培養（粗、濃縮、精製又は濃縮かつ精製）は、従来の方法、例えば、熱的及び／又は化学的方法を用いて不活性化することができる。有利な方法は、例えば、ベータプロピオラクトン、ホルマリン、エチレンイミン又は二成分エチレンイミン（ＢＥＩ）などのその誘導体及びこれらの不活性化化合物の組合せを用いる化学的不活性化である。不活性化ＰＲＲＳウイルス培養は、この段階で得られる。
【００６２】
本発明の他の態様において、糖タンパク質又はタンパク質などの免疫原性画分を、本発明によるウイルス培養（粗、濃縮、精製又は濃縮かつ精製、場合によって不活性化）に存在するウイルスから抽出することができる。ウイルスの免疫原性画分の抽出は、当業者の一般的知識に従って行われる。サブユニットウイルス製剤は、この段階で得られる。
【００６３】
したがって、本発明の他の態様は、本明細書に記載したウイルス粗培養、濃縮培養、精製培養、濃縮かつ精製培養、不活性化培養、サブユニット製剤である。
【００６４】
本発明の有利な実施形態において、ビルレントウイルスを本発明による細胞での十分な数の継代により弱毒化することができる。当業者は、ルーチン実験によりウイルスの弱毒化に十分な継代数を決定することができる。弱毒化ウイルス製剤が得られる。
【００６５】
ウイルスによる感染を予防するための免疫原性組成物及びワクチンを提供することも本発明の目的である。これらの免疫原性組成物又はワクチンは、本明細書に記載したような少なくとも１つの培養又は製剤を含む。
【００６６】
「免疫原性組成物」という用語は、それを動物、例えば、ブタに一旦投与したならば、ウイルス又は抗原又は免疫原又はエピトープに対する免疫応答を誘発することができる本明細書におけるあらゆる組成物を対象として含む。「ワクチン」という用語は、それを動物、例えば、ブタに一旦投与したならば、ウイルスに対する防御免疫応答を誘発、又は前記ウイルスから動物を効果的に防護することができる本明細書におけるあらゆる組成物を対象として含む。
【００６７】
本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、ウイルス培養若しくは製剤又はウイルスの抗原若しくは免疫原若しくはエピトープ、並びに他の病原体の少なくとも１つの免疫原、抗原若しくはエピトープ又は他の病原体（例えば、不活性化若しくは弱毒化病原体）を含んでいてよい。そのような免疫原、抗原若しくはエピトープは、例えば、細菌若しくは寄生生物若しくはウイルス起源のもの、又は病原体の不活性化若しくは弱毒化形であってよい。本発明はまた、これらの複合組成物を調製するためのキット、並びにこれらの複合組成物を調製する方法及び複合組成物を調製するためのこれらの複合組成物の成分の使用を含む。したがって、本発明は、本発明の複合免疫原性又はワクチン組成物を調製するためのキットを含む。例えば、そのようなキットは、（ａ）微生物、病原体又はウイルス又はその抗原若しくはエピトープ（有利なことに本明細書に記載したようなウイルス）及び（ｂ）（ａ）と異なる微生物、病原体又はウイルス又はその免疫原、抗原若しくはエピトープ（有利なことにウイルス又はその免疫原、抗原若しくはエピトープであるが、本明細書に記載したような他の病原体も考えられる）を別個の容器中に、場合によって同じ包装中に、また、場合によって添加及び／又は投与の指示書とともに含む。
【００６８】
本発明による免疫原性組成物及び／又はワクチンは、ＰＲＲＳウイルス培養又は製剤（例えば、不活性化若しくは弱毒化ＰＲＲＳＶ又はその免疫原若しくは抗原若しくはエピトープ）及び他のブタ病原体の少なくとも１つの免疫原、抗原若しくはエピトープ（制限なしに、不活性化若しくは弱毒化形の病原体を含む）を含んでいてよい。この病原体は、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス（コロナウイルス）、２型ブタシルコウイルスなどのブタシルコウイルス、ロタウイルス、３型ブタアデノウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エリジペロトリックス・ルシオパチエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンチセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、クロストリジウム亜種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、サルモネラ亜種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）、ヘモフィラス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・マルトサイダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラスマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びアクチノバシラス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を含むが、これらに限定されない群から選択することができる。有利なことに、本発明による免疫原性組成物及びワクチンは、ＰＲＲＳウイルス培養若しくは製剤並びに本発明による細胞若しくは細胞株、例えば、ＰＴＡ−３９３０細胞株又はそのすべての同定特性を有する細胞株上で成長させ、増殖させたＰＡＶ−３ウイルスを含んでいてよい。ブタ病原体の免疫原は、仮性狂犬病ウイルスｇＢ、仮性狂犬病ウイルスｇＣ、仮性狂犬病ウイルスｇＤ、ブタインフルエンザＨＡ、ブタインフルエンザＮＡ、ブタインフルエンザＮＰ、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルスのＯＲＦ４、ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルスのＯＲＦ７、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ３、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ６、ＰＲＲＳＶオープンリーディングフレーム５（ＯＲＦ５）及び６（ＯＲＦ６）、ＰＲＲＳＶオープンリーディングフレーム５（ＯＲＦ５）及び３（ＯＲＦ３）及び６（ＯＲＦ６）、豚コレラウイルスＥ１、豚コレラウイルスＥ２遺伝子、パルボウイルスＶＰ２、２型ブタシルコウイルスＯＲＦ１又は２型ブタシルコウイルスＯＲＦ２を含んでいてよい。ブタ病原体の免疫原、それをコードする核酸分子及びそれを発現する構成体については、米国特許第６５１７８４３号、第６４９７８８３号、第６３９１３１４号、第６３７９６７６号、第６２１７８８３号、第６２０７１６５号及び米国特許公告第２００３００３１１２号並びに国際出願公開第９９／５３０４７号、国際出願公開第９９／０８７０６号、国際出願公開第０１／８３７３７号及び国際出願公開第００／４７７５６号を参照のこと。したがって、本発明は、これらの組成物を調製する方法並びにそのためのキットも含む。
【００６９】
本発明による免疫原性組成物及びワクチンは、ＣＰＩ−２及び／又はＣＡＶ−２ウイルス培養又は製剤（例えば、不活性化若しくは弱毒化ＣＰＩ−２及び／又はＣＡＶ−２又はその免疫原若しくは抗原若しくはエピトープ）並びに他のイヌ病原体の少なくとも１つの免疫原若しくは抗原若しくはエピトープ（制限なしに、不活性化若しくは弱毒化形の病原体を含む）を含んでいてよい。この病原体は、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌコロナウイルス、イヌヘルペスウイルス、ライム病病原体、ボルリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）及び狂犬病ウイルスを含むが、これらに限定されない群から選択することができる。有利なことに、本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、本発明によるＣＰＩ−２ウイルス培養又は製剤及び／又はＣＡＶ−２ウイルス培養又は製剤を含む。ＣＰＩ−２免疫原は、ＣＰＩ−２Ｆ及び／又はＨＮであってよい。イヌ病原体の免疫原並びにそれをコードする核酸分子及びそれを発現する構成体については、米国特許第５６１６３２６号、第６０９０３９３号、第６１５９４７７号、第６２２８８４６号も参照のこと。したがって、本発明は、これらの組成物を調製する方法並びにそのためのキットも含む。
【００７０】
本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、ＢＨＶ−１、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３及び／又はＢＣＶウイルス培養又は製剤（例えば、不活性化若しくは弱毒化ＢＨＶ−１、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３及び／又はＢＣＶ又はその免疫原若しくは抗原若しくはエピトープ）並びに他のウシ病原体の少なくとも１つの免疫原若しくは抗原若しくはエピトープ（制限なしに、不活性化若しくは弱毒化形の病原体を含む）を含んでいてよい。この病原体は、ウシ呼吸系発疹ウイルス及びウシウイルス性下痢性ウイルスを含むが、これらに限定されない群から選択することができる。有利なことに、本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、ＢＨＶ−１、ＢＲＶ、ｂＰＩ−３及びＢＣＶを含む本発明による少なくとも２つのウイルス培養又は製剤を含む。ＢＲＳＶ免疫原は、ＢＲＳＶ  Ｆ及び／又はＧ又はＮ及び／又はＧなどのＢＲＳＶ  Ｆ又はＧ又はＮであってよい。ＢＨＶ−１免疫原は、ｇＢ及び／又はｇＣ及び／又はｇＤであってよい。ＢＶＤＶ免疫原は、Ｅ０タンパク質（ｇｐ４８）及び／又はＥ２タンパク質（ｇｐ５３）であってよい。ＢＶＤＶは、１型及び／又は２型であってよい。ｂＰＩ−３免疫原は、ｂＰＩ−３  Ｆ及び／又はＨＮであってよい。ウシ病原体の免疫原並びにそれをコードする核酸分子及びそれを発現する構成体については、米国特許第６４５１７７０号、第６３７６４７３号、第６２２４８７８号も参照のこと。したがって、本発明は、これらの組成物を調製する方法並びにそのためのキットも含む。
【００７１】
本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、ＥＨＶ−１及び／又はＥＨＶ−４ウイルス培養又は製剤（例えば、不活性化若しくは弱毒化ＥＨＶ−１及び／又はＥＨＶ−４又はその免疫原若しくは抗原若しくはエピトープ）並びに他のウマ病原体の少なくとも１つの免疫原若しくは抗原若しくはエピトープ（制限なしに、不活性化若しくは弱毒化形の病原体を含む）を含んでいてよい。この病原体は、ウマインフルエンザウイルス、東部脳脊髄炎ウイルス（ＥＥＶ）、西部脳脊髄炎ウイルス（ＷＥＶ）、ベネズエラ脳脊髄炎ウイルス（ＶＥＶ）、ライム病病原体、ボルリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）及び狂犬病ウイルスを含むが、これらに限定されない群から選択することができる。有利なことに、本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、本発明によるＥＨＶ−１ウイルス培養又は製剤及びＥＨＶ−４ウイルス培養又は製剤を含んでいてよい。ＥＨＶ糖タンパク質は、ｇＢ、ｇＤ、ｇＢ＋ｇＤ、ｇＣ及びｇＥであってよい。ウマ病原体の免疫原並びにそれをコードする核酸分子及びそれを発現する構成体については、米国特許第６２０７１６６号及び第６３６８６０３号を参照のこと。したがって、本発明は、これらの組成物を調製する方法並びにそのためのキットも含む。
【００７２】
そのような追加の免疫原性成分（追加の免疫原、抗原又はエピトープ）も含む本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、それが同時にいくつかの感染若しくは疾患若しくはその原因となる病原体に対する免疫応答又は防御を誘発するという利点を有する。この追加の免疫原性成分は、弱毒化若しくは不活性化微生物、組換え構成体又はサブユニット（例えば、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド又はエピトープ）であってよい。オーバーラップペプチドライブラリーの生成（Ｈｅｍｍｅｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９９８、１９（４）、１６３〜１６８頁）、Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｇｅｙｓｅｎ  Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８４、８１（１３）、３９９８〜４００２頁、Ｇｅｙｓｅｎ  Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、８２（１）、１７８〜１８２頁、Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９８９、１９（１）、４３〜４７頁、Ｇｅｙｓｅｎ  Ｈ．Ｍ．、Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ  Ａｓｉａｎ  Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９０、２１（４）、５２３〜５３３頁、Ｍｕｌｔｉｐｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ  ｄｅ  Ｃｈｉｒｏｎ）及びアルゴリズム（Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９、１７、５３３〜５６１頁）などのエピトープ決定法は、本発明の実施に際して、必要以上の実験なしに免疫原、抗原、ポリペプチド、糖タンパク質などのエピトープを決定するために用いることができる。その情報から、そのようなエピトープをエンコードする核酸分子を構築することができ、また、その知識及び当技術分野における知識から、ベクター又は構成体、例えば、免疫原、エピトープ又は抗原を発現する組換えウイルス又はベクター又はプラスミドをすべて必要以上の実験なしに構築することができる。
【００７３】
免疫原性組成物又はワクチン組成物は、さらに、製薬上又は獣医学的に許容できる添加剤、希釈剤又は賦形剤、並びに場合によって安定化剤及び／又は佐剤を含む。適切な製剤は、当業者には明らかであろう。製剤は、適切な投与経路用のものを開発することができる。
【００７４】
製薬上許容できる賦形剤は、水又は生理食塩水であってよい。
【００７５】
不活性化免疫原性組成物又は不活性化ワクチンは、少なくとも１つの佐剤を含むことが有利である。
【００７６】
生弱毒化ウイルスは、凍結乾燥してもよく、安定化剤を含むことが有利である。凍結乾燥は、よく知られている標準的な凍結乾燥法により行うことができる。製薬上許容できる安定化剤は、ＳＰＧＡ（スクロースリン酸グルタミン酸アルブミン）（Ｂｏｖａｒｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９５０、５９、５０９頁）、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、ラクトース、スクロース、グルコース、デキストラン、トレハロース）、グルタミン酸ナトリウム（Ｔｓｖｅｔｋｏｖ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８３、２０（３）、３１８〜２３頁、Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９３、３０（５）、５１９〜２３頁）、ペプトン、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、スキムミルクなどのタンパク質含有物質（Ｍｉｌｌｓ  ＣＫ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８８、２５（２）、１４８〜５２頁、Ｗｏｌｆｆ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９０、２７（５）、５６９〜７５頁）及び緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、アルカリ金属リン酸塩緩衝液）であってよい。
【００７７】
佐剤は、凍結乾燥製剤を可溶性にするために用いることができる。
【００７８】
佐剤の例は、鉱油及び／又は植物油並びにブロック共重合体、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）などの非イオン界面活性剤に基づく水中油型、水中油中水型乳剤である。他の適切な佐剤は、例えば、ビタミンＥ、サポニン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウムである（「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．６、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｋ  Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ、１９９５、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。佐剤並びに添加剤、希釈剤、担体及び賦形剤に関して、本明細書に引用した文書を参照することもできる。
【００７９】
本発明の他の態様は、本発明による、それぞれ免疫原性組成物又はワクチン組成物を用いた免疫化の方法又はワクチン接種の方法である。
【００８０】
この方法は、有効な量の本発明による免疫原性組成物又はワクチンの動物への少なくとも１回の投与を含む。動物は、雄、雌、妊娠雌及び新生児であってよい。この投与は、特に、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）若しくは皮下（ＳＣ）注射又は鼻腔内若しくは経口投与により行うことができる。本発明による免疫原性組成物又はワクチンは、注射器又はニードルレス器具（例えば、Ｐｉｇｊｅｔ又はＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（Ｂｉｏｊｅｃｔ、Ｏｒｅｇｏｎ、ＵＳＡ））により投与することができる。
【００８１】
弱毒化組成物の場合、新規の細胞培養上で生産されたウイルス又は微生物又は病原体の用量は、約１０３〜約１０７ＣＣＩＤ５０（細胞培養感染量の中央値）であり、有利なことには約１０４〜約１０６ＣＣＩＤ５０であり、より有利なことには約１０５ＣＣＩＤ５０である。容量は、０．２〜２．０ｍｌであり、有利なことには約２．０ｍｌである。例えば、２〜４週間隔で２回の注射、及び有利なことに初回注射の約３週後のブーストによる、１回又は複数回の投与を行うことができる。
【００８２】
新規の細胞培養上で生産されたウイルス又は微生物又は病原体の不活性化組成物の場合、動物に約１０４〜１０９等価ＣＣＩＤ５０（不活性化前の力価）を、有利なことには約１０５〜１０８等価ＣＣＩＤ５０を１回量単位で投与することができる。１回量単位の容量は、０．２ｍｌ〜５．０ｍｌ、有利なことには０．５ｍｌ〜２．０ｍｌ、より有利なことには約２．０ｍｌであってよい。例えば、２〜４週間隔で２回の注射、及び有利なことに初回注射の約３週後のブーストによる、１回又は複数回の投与を行うことができる。
【００８３】
例えば、新規の細胞培養上で生産されたウイルス又は病原体又は微生物からのサブユニット組成物の場合、動物に約５μｇ〜５００μｇを、有利なことには約２０μｇ〜５０μｇを投与することができる。容量は、０．２〜２．０ｍｌであり、有利なことには約２．０ｍｌである。例えば、２〜４週間隔で２回の注射、及び有利なことに初回注射の約３週後のブーストによる、１回又は複数回の投与を行うことができる。
【００８４】
本発明による組成物は、例えば、ポリクローナル抗体を生成させるために、又はモノクローナル抗体用のハイブリドーマを調製するために、他の哺乳動物、例えば、マウス又は実験動物にも投与することができる。
【００８５】
本発明を以下の非限定的実施例によりさらに説明する。
（実施例）
（実施例１：コットンラット肺（ＣＲＬ）細胞を得ること）
【００８６】
安楽死させた動物からの切除後に、肺を最少必須培地Ｆ−１５（ＭＥＭ  Ｆ−１５、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３００２４．０２）及び３０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む細胞培養基中に入れた。この培地に市販の抗生物質（ペニシリン及びストレプトマイシン）及び抗真菌薬（アンホテリシンＢ）を２容積／容積％の濃度で添加した。肺を、３０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＭＥＭ  Ｆ−１５培地中それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び１倍強度（２．５ｍｇ／ｍｌの濃度に相当する）のコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ−０１３０）及びトリプシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ−８００３）の溶液２５ｍｌを含む５０ｍｌコニカル遠心管中で３７℃で消化した。３０分間の消化後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を１０容積／容積％の最終濃度で加えた。ピペットを用いた細胞の分散と清澄化の後に、分離した細胞を含む上清を収集し、３０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含み、１０容積／容積％の最終濃度のＦＢＳを補足したＭＥＭ  Ｆ−１５培地を含む２５ｃｍ２フラスコに入れた。
（実施例２：ＣＲＬ細胞の培養）
【００８７】
トリプシン溶液を用いて、実施例１で得られたＣＲＬ細胞の集密単層から残存ＦＢＳを洗い流した。ブタトリプシンとエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）との０．１％（１×）混合物（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号６２２４４−７９Ｐ）（７５ｃｍ２フラスコで３ｍｌ、１５０ｃｍ２フラスコで５ｍｌ）を重層した細胞を３７℃のインキュベーターに入れ、細胞の脱離が完了するまで厳密にモニターした。細胞をピペットを用いて分散させ、３ｍｌの細胞懸濁液を収集した。その時点に収集した１：４の細胞を、ＭＥＭ  Ｆ−１５、３０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン及び１０容積／容積％の濃度のＦＢＳを含む新鮮な細胞培養基を用いて培養した。
【００８８】
ＣＲＬ細胞を５％ＣＯ２分圧を有するインキュベーター中で３７℃で成長させた。集密的単層の１：４スプリットは、約４日で集密的となり、１：８スプリットは、約７日以内に集密的単層を生成した。これが継代を構成する。
【００８９】
次いで、細胞を継代２から継代７６まで増殖させた。
【００９０】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）凍結保護剤の添加後に、第７６継代までのすべての継代における小バンクを凍結した。バンクは、液体窒素中に保存した。
【００９１】
第２１継代のＣＲＬ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎによりアクセッション番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託された。
（実施例３：ＣＲＬ細胞上のＰＲＲＳウイルスの増殖）
【００９２】
サル腎臓細胞で増殖することが知られている弱毒化ＰＲＲＳウイルスを用いた。
【００９３】
ＰＲＲＳウイルスの増殖は、ＭＥＭ  Ｆ−１５、３０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン及び１０容積／容積％の濃度のＦＢＳを含む５０ｍｌの培地を含む７５ｃｍ２フラスコ（Ｔ７５フラスコ）中のＣＲＬ細胞の単層上で行った。ウイルスの接種の前に、細胞を集密的になるまで３７℃で２４時間インキュベートした。１ｍｌのＰＲＲＳウイルスを接種した後、接種済み細胞を３７℃で５〜７日間インキュベートした。ウイルスの成長を上清物質の間接免疫蛍光抗体試験（ＩＦＡ）及び力価測定により確認した。凍結／解凍の後、上清を収集した。これは、ＰＲＲＳウイルスの粗培養を構成する。
【００９４】
（間接免疫蛍光抗体試験（ＩＦＡ））
ＩＦＡのために、細胞をトリプシン処理し、分散させ、収集し、ゲンタマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含み、１０容積／容積％の濃度のＦＢＳを補足した新鮮なＭＥＭ  Ｆ−１５培地に再懸濁した。細胞を９６ウエル組織培養処理プレートに１００μｌ／ウエルで播種し、集密になるまで一夜成長させる。ＰＲＲＳウイルスの４倍連続希釈物を調製した。次いで、１００μｌ又は２００μｌの希釈ウイルスを９６ウエルプレートの列の各ウエルに入れた。プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに７日間入れた。感染ＣＲＬ細胞を含むウエルを、抗ＰＲＲＳウイルスモノクローナル抗体（ＳＤＯＷ１７、ＵＳＤＡから入手、Ｍａｇａｒ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎ  Ｊ  ｖｅｔ  Ｒｅｓ．、１９９５、５９（３）、２３２〜４頁）を用いて間接免疫蛍光抗体試験により決定した。
【００９５】
（ＣＲＬ培養上で成長したＰＲＲＳウイルスのキャラクタリゼーション）
ＣＲＬ細胞を含む９６ウエルプレートにおいてＰＲＲＳウイルスの力価測定を行った。力価は、５０％終点決定のＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を用いて計算し、１ｍｌ当たりを基準として報告した。結果は、Ｌｏｇ１０（ＦＡＩＤ５０）／ｍｌ単位で表す。力価測定結果は、Ｌｏｇ１０（ＦＡＩＤ５０）／ｍｌ単位で４．３であった。
（実施例４：ＣＲＬ上での成長及び増殖へのＰＲＲＳウイルスの適応）
【００９６】
ＮＡＤＣ８  ＰＲＲＳウイルスをＣＲＬ細胞で成長するように適応させた。ＮＡＤＣ８は、全米動物疾患センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＳＤＡ））から入手した。
【００９７】
ウイルスは、徐々に低下する量のＭＡ−１０４細胞を含む、ＣＲＬ細胞及びＭＡ−１０４細胞（アフリカミドリザル腎臓細胞、ＭＡＲＣ−１４５の親細胞株）の共培養上で連続的に増殖させた。最初に、ＣＲＬ細胞をＭＡ−１０４細胞とともに１：９の比率（２００００細胞／ｍｌ  ＣＲＬ：１８００００細胞／ｍｌ  ＭＡ−１０４）でラクトアルブミンヒドロシラート（ＬＡＨ、０．１容積／容積％の濃度）、３０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン及び１０容積／容積％の濃度のＦＢＳを含むＭＥＭ  Ｆ−１５に３７℃で播種した。これらの共培養が集密的になったとき、培地を補給せずにＰＲＲＳウイルスを接種した（Ｔ７５フラスコ当たり１ｍｌ）。ウイルスの成長は、上清物質の間接免疫蛍光抗体試験（ＩＦＡ、実施例３に記載）及び力価測定により確認した。接種済み細胞を３７℃で５〜７日間インキュベートした。継代は、凍結／解凍、上清の収集及び連続共培養Ｔ７５フラスコのその後の１ｍｌ、すなわち収集した上清の約１０％の接種を含む。これを、それぞれ２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、７：３、８：２及び９：１の比率のＣＲＬ：ＭＡ−１０４の共培養上の接種物の継代培養により繰り返す。
【００９８】
最後にＴ７５フラスコ中でウイルスを、ＭＥＭ  Ｆ−１５、３０μｇ／ｍｌの濃度のゲンタマイシン及び１０容積／容積％の濃度のＦＢＳを含む５０ｍｌの培地を用いてＣＲＬ細胞のみからなる単層上で成長させた（したがってＬＡＨを含まない）。接種済みＣＲＬ細胞を３７℃で５〜７日間インキュベートした。凍結／解凍の後に上清を収集した。これは、ＰＲＲＳウイルスの粗培養を構成する。
【００９９】
ＩＦＡは、ＮＡＤＣ８が感染ＣＲＬ細胞を有していたことを示した。
【０１００】
（ＣＲＬ培養上で成長したＰＲＲＳウイルスのキャラクタリゼーション）
ＰＲＲＳウイルスのＮＡＤＣ８株の力価測定をＣＲＬ細胞を含む９６ウエルプレートで行った。培養は、前述したように行った。力価は、５０％終点測定のＳｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を用いて計算し、１ｍｌ当たりを基準として報告した。結果は、Ｌｏｇ１０（ＦＡＩＤ５０）／ｍｌ単位で表す。
【０１０１】
力価測定結果は、Ｌｏｇ１０（ＦＡＩＤ５０）／ｍｌ単位で４．１２であった。
【０１０２】
ニドウイルス目（Ｏｒｄｅｒ  Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）の他のウイルスなどの他のウイルス、例えば、アーテウイルス若しくはアーテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ）、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、サル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルス、例えば、感染性気管支炎ウイルス、イヌコロナウイルス、ネココロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ブタ流行性下痢ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸ウイルス、ウシコロナウイルス、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、マウス肝炎ウイルス、ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス、ラットコロナウイルス、唾液腺涙腺炎ウイルス、鳥類感染性気管支炎ウイルス、シチメンチョウコロナウイルス、ウサギコロナウイルスなどのコロナウイルス、ウマトロウイルス、ブタトロウイルス、ヒトトロウイルス、ウシトロウイルスなどのトロウイルス、並びに宿主が天然ではげっ歯類又はラット又はコットンラットでない他のウイルスは、本明細書に記載した技術又はＰＲＲＳに関して本明細書に記載したのと同様の技術を用いて、コットンラット肺細胞、有利なことに本発明のコットンラット肺細胞若しくは細胞株（例えば、寄託したもの）上で成長するように適応させることができる。
（実施例５：不活性化の方法）
【０１０３】
ＣＲＬ上で増殖したＰＲＲＳウイルス（実施例３又は４）を収集する。ウイルス懸濁液を約５℃の温度で音波処理する。ウイルス懸濁液を５０〜１００μｍの多孔性の膜を通して約５℃でろ過する。
【０１０４】
ベータプロピオラクトンを１／３０００（容積／容積）の最終濃度でウイルス懸濁液に加える。撹拌して均質化した後、懸濁液を他の滅菌済みフラスコに移す。
【０１０５】
約５℃で２４時間にわたる撹拌のもとで不活性化を行う。１Ｍ  ＮａＯＨを加えてｐＨを約７．２に調節する。
【０１０６】
不活性化ウイルス懸濁液を約５０回の限外ろ過により濃縮する。濃縮ウイルス懸濁液を−４０℃で保存する。
（実施例６：鉱油に基づく乳剤の形態の不活性化ワクチンの調製）
【０１０７】
ワクチンは、実施例５で得られた不活性化ＰＲＲＳウイルス（解凍及び希釈後）を用い、次の処方に従って調製する。
不活性化ＰＲＲＳウイルスの懸濁液：１６７ｍｌ
油相：８３ｍｌ
【０１０８】
油相は、７重量容積％（重量／容積）の無水オレイン酸マンニトール、８重量／容積％のエトキシル化オレイン酸（１１エチレンオキシド）及び８５容積／容積％の軽流動パラフィン油である（欧州薬局方による）。
【０１０９】
水相及び油相は、ろ過により別個に滅菌する。乳剤は、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎタービン乳化機を用いて成分を混合し、均質化して調製する。
【０１１０】
ワクチン１回量は、約１０７．５ＣＣＩＤ５０（不活性化前の力価）を含む。ワクチン１回量の容積は、筋肉内投与経路の場合には２．０ｍｌである。
（実施例７：ＣＲＬ細胞上のウイルスの増殖）
【０１１１】
蛍光抗体（ＦＡ）試薬が利用可能である検定法に対照標準ウイルスとして常用されているウイルス株の力価測定をＣＲＬ細胞を用いて行った。これらの対照標準ウイルスは通常、標準細胞株を用いて力価測定がなされているので、それぞれが種々の変動の程度を有する既知の力価を有する。１０倍又は４倍希釈のこれらの対照標準ウイルスを用いて、各ウイルスごとの標準的力価測定法を用いる９６ウエル検定方式でＣＲＬ細胞に接種した。７日間のインキュベーションの後に、プレートをアセトンで固定し、適切なＦＡ試薬で染色した。蛍光陽性培養の力価を標準細胞培養から得られた力価と比較した。結果を以下に示す。
【０１１２】
【表１】
2005520572.tif 000002
【０１１３】
ウイルス力価は、１ミリリットル当たりの細胞培養感染量５０のｌｏｇ１０（ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）単位で表す。
【０１１４】
各場合にＣＲＬを用いた検定により得られた力価は標準細胞株のそれより低かったが、これらのウイルスは、対照標準ウイルスが標準細胞株を用いて受けた細胞適応工程をＣＲＬ細胞を用いて受けなかったことを強調しなければならない。これは、ウイルス複製を検出する唯一の試験であった。言い換えれば、ある程度の努力により、ＣＲＬ細胞で成長した生ウイルスの濃度を、ウイルスが適応した細胞株上で成長したウイルスの濃度と同等又はそれより良好な程度に改善することができる可能性がある。これは、ＣＲＬ細胞及びＭＡＲＣ−１４５細胞（ＭＡ−１０４細胞の感受性サブクローン）を用いた場合に、ＣＲＬ適応ＰＲＲＳ（実施例４）において同じ連続希釈のウイルスの力価がそれぞれ５．２２及び５．３４（ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）であったことから示されている。この力価の差は無視できる。
【０１１５】
本発明は、以下の番号をつけたパラグラフによりさらに説明される。
【０１１６】
１．コットンラット肺細胞培養を調製し、この細胞培養上でＰＲＲＳウイルスを増殖させるＰＲＲＳウイルスを生産する方法。
【０１１７】
２．細胞培養が上皮細胞を含むパラグラフ１に記載の方法。
【０１１８】
３．コットンラット肺細胞株の細胞の培養を調製し、この培養上でＰＲＲＳウイルスを増殖させるＰＲＲＳウイルスを生産する方法。
【０１１９】
４．培養が上皮細胞を含むパラグラフ３に記載の方法。
【０１２０】
５．コットンラット肺上皮細胞培養を調製し、この細胞培養上でＰＲＲＳウイルスを増殖させるＰＲＲＳウイルスを生産する方法。
【０１２１】
６．コットンラット肺上皮細胞株の細胞の培養を調製し、この細胞株上でＰＲＲＳウイルスを増殖させるＰＲＲＳウイルスを生産する方法。
【０１２２】
７．細胞株がＡＴＣＣにおいてアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託された細胞株であるか、又はＡＴＣＣにおいてアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託された細胞株のすべての同定特性を有するコットンラット肺細胞株であるパラグラフ３又は６に記載の方法。
【０１２３】
８．細胞株がＡＴＣＣにおいてアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託された細胞株であるパラグラフ７に記載の方法。
【０１２４】
９．ＰＲＲＳウイルスがビルレントＰＲＲＳウイルスであるパラグラフ１〜８のいずれか一パラグラフに記載の方法。
【０１２５】
１０．ＰＲＲＳウイルスが弱毒化ＰＲＲＳウイルスであるパラグラフ１〜８のいずれか一パラグラフに記載の方法。
【０１２６】
１１．細胞でＰＲＲＳウイルスを増殖させ、ＰＲＲＳウイルスの粗培養を回収するパラグラフ１〜８のいずれか一パラグラフに記載の方法。
【０１２７】
１２．細胞でＰＲＲＳウイルスを増殖させ、ＰＲＲＳウイルスを回収してＰＲＲＳウイルスの粗培養を生じさせ、この粗培養を精製に供してＰＲＲＳウイルスの精製培養を生じさせるパラグラフ１〜８のいずれか一パラグラフに記載の方法。
【０１２８】
１３．細胞でＰＲＲＳウイルスを増殖させ、ＰＲＲＳウイルスを回収してＰＲＲＳウイルスの粗培養を生じさせ、この粗培養を濃縮に供してＰＲＲＳウイルスの濃縮培養を生じさせるパラグラフ１〜８のいずれか一パラグラフに記載の方法。
【０１２９】
１４．細胞でＰＲＲＳウイルスを増殖させ、ＰＲＲＳウイルスを回収してＰＲＲＳウイルスの粗培養を生じさせ、この粗培養を濃縮及び精製に供してＰＲＲＳウイルスの濃縮かつ精製培養を生じさせるパラグラフ１〜８のいずれか一パラグラフに記載の方法。
【０１３０】
１５．粗培養を不活性化するパラグラフ１１に記載の方法。
【０１３１】
１６．精製培養を不活性化するパラグラフ１２に記載の方法。
【０１３２】
１７．濃縮培養を不活性化するパラグラフ１３に記載の方法。
【０１３３】
１９．濃縮かつ精製培養を不活性化するパラグラフ１４に記載の方法。
【０１３４】
２０．培養を化学物質で不活性化するパラグラフ１５、１６、１７又は１８に記載の方法。
【０１３５】
２１．化学物質がベータプロピオラクトン、ホルマリン、エチレンイミン及び二成分エチレンイミンからなる群から選択されるパラグラフ１９に記載の方法。
【０１３６】
２２．ＰＲＲＳサブユニットを回収するように培養を処理するパラグラフ１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０に記載の方法。
【０１３７】
２３．ＰＲＲＳウイルスを細胞で増殖させ、弱毒化ＰＲＲＳウイルスを回収するパラグラフ９に記載の方法。
【０１３８】
２４．コットンラット肺細胞でのＰＲＲＳウイルスの増殖の後に得られるＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１３９】
２５．コットンラット肺細胞株上でのＰＲＲＳウイルスの増殖の後に得られるＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１４０】
２６．細胞が上皮細胞であるパラグラフ２３又は２４に記載のＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１４１】
２７．細胞が上皮細胞を含むパラグラフ２３又は２４に記載のＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１４２】
２８．細胞株がＡＴＣＣにおいてアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託された細胞株であるか、又はＡＴＣＣにおいてアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託された細胞株のすべての同定特性を有するコットンラット肺細胞株であるパラグラフ２５に記載のＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１４３】
２９．細胞株がＡＴＣＣにおいてアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託された細胞株であるパラグラフ２５に記載のＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１４４】
３０．パラグラフ１〜２０又は２１のいずれか一パラグラフに記載の方法を実施することにより得られるＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１４５】
３１．不活性化されているパラグラフ２３〜２８のいずれか一パラグラフに記載のＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１４６】
３２．弱毒化されているパラグラフ２３〜２８のいずれか一パラグラフに記載のＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養。
【０１４７】
３３．パラグラフ２１に記載の方法を実施することにより得られるサブユニットＰＲＲＳウイルス製剤。
【０１４８】
３４．パラグラフ２３〜３１のいずれか一パラグラフに記載のＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養及び獣医学的に許容できる添加剤、希釈剤又は賦形剤を含む免疫原性組成物。
【０１４９】
３５．パラグラフ３２に記載のサブユニットＰＲＲＳウイルス製剤及び獣医学的に許容できる添加剤、希釈剤又は賦形剤を含む免疫原性組成物。
【０１５０】
３６．さらに安定化剤を含むパラグラフ３３に記載の免疫原性組成物。
【０１５１】
３７．さらに佐剤を含むパラグラフ３３又は３４又は３５に記載の免疫原性組成物。
【０１５２】
３８．パラグラフ１に記載の方法により得られるＰＲＲＳウイルス培養を含む免疫原性組成物。
【０１５３】
３９．パラグラフ３に記載の方法により得られるＰＲＲＳウイルス培養を含む免疫原性組成物。
【０１５４】
４０．パラグラフ１〜２２のいずれか一パラグラフに記載の方法により得られるＰＲＲＳウイルス培養を含む免疫原性組成物。
【０１５５】
４１．パラグラフ１に記載の方法により得られるＰＲＲＳウイルス培養を含むワクチン。
【０１５６】
４２．パラグラフ３に記載の方法により得られるＰＲＲＳウイルス培養を含むワクチン。
【０１５７】
４３．パラグラフ１〜２２のいずれか一パラグラフに記載の方法により得られるＰＲＲＳウイルス培養を含むワクチン。
【０１５８】
４４．パラグラフ２３〜３１のいずれか一パラグラフに記載のＰＲＲＳウイルス又はＰＲＲＳウイルスの培養及び獣医学的に許容できる添加剤、希釈剤又は賦形剤を含むワクチン。
【０１５９】
４５．パラグラフ３２に記載のサブユニットＰＲＲＳウイルス製剤及び獣医学的に許容できる添加剤、希釈剤又は賦形剤を含むワクチン。
【０１６０】
４６．さらに安定化剤を含むパラグラフ４３に記載のワクチン。
【０１６１】
４７．さらに佐剤を含むパラグラフ４３又は４４又は４５に記載のワクチン。
【０１６２】
４８．ブタにパラグラフ３３〜３９のいずれか一パラグラフに記載の免疫原性組成物を投与することを含むブタの免疫化の方法。
【０１６３】
４９．ブタにパラグラフ４０〜４６のいずれか一パラグラフに記載のワクチンを投与することを含むブタへのワクチン接種の方法。
【０１６４】
５０．ＡＴＣＣによりアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託されたコットンラット肺細胞株、又はＡＴＣＣにおいてアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託された細胞株のすべての同定特性を有するコットンラット肺細胞株。
【０１６５】
５１．ＡＴＣＣによりアクセッション番号ＰＴＡ−３９３０のもとに寄託されたコットンラット肺細胞株。
【０１６６】
本発明の好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明の精神又は範囲から逸脱することなくその多数の明らかな変形形態が可能であるので、上のパラグラフにより定義した発明が上の説明に示した特定の詳細に限定されるものでないことを理解すべきである。
【国際調査報告】
2005520572.tif 000003
2005520572.tif 000004
2005520572.tif 000005
2005520572.tif 000006