(57)【要約】本発明は、二官能中間体の自己連結を排除する自然化学連結反応においてオリゴペプチド中間体を構築する方法を提供する。本発明の重要な局面は、化学構築工程において効果的に自己連結を阻止するN末端複素環保護基を有する二官能中間体である。本発明は、特に3つまたはそれ以上のペプチド断片を使用してポリペプチドまたは蛋白質生成物を構築する場合、ポリペプチドおよび蛋白質の収束的合成法において有益であり、自然化学連結反応効率が改善される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)C末端チオエステルのα-炭素と連結前生成物のN末端アミノ酸のα-炭素との間でアミド結合が形成されるような条件下で、C末端チオエステルを有するN末端複素環保護オリゴペプチドを連結前生成物と反応させることにより、複素環保護基を有するN末端アミノ酸を含む連結生成物を形成する工程；
(b)連結生成物を酸性条件下で求核試薬を用いて処理し、複素環保護基を開環させ、遊離N末端システインまたは補助基を有する第二N末端アミンを含む連結前生成物を形成する工程であって、補助基は-D-SH形態(Dはアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、またはシクロアルキル結合部分であり、2〜16個の炭素原子を有し、O、S、およびPからなる群より選択される0〜4のヘテロ原子を有する)である工程；
(c)1つまたは複数の補助基を有するポリペプチドが形成されるまで工程(a)および工程(b)を繰り返す工程；および
(d)1つまたは複数の補助基を除去し所望のポリペプチドを形成する工程；
を含む方法であって、
(e)工程(a)および工程(b)は固体支持体上で選択的に実施される、
3つまたはそれ以上のオリゴペプチド中間体の連結によりポリペプチドを合成する方法。
【請求項２】
C末端チオエステルを有するN末端複素環保護オリゴペプチドが以下の化学式により規定される、請求項1記載の方法：
2005515184.tif 000015
(式中、
Xaa1〜Xaanはそれぞれ独立的に保護または非保護のアミノ酸であり；
nは2〜120までの整数であり；
R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1またはR2は選択的に固体支持体に付着させてもよく；
Dは2〜16個の炭素原子および0〜4個のヘテロ原子から成るアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル結合部分であり；
R6は1〜6個の炭素原子を有するアルキルもしくは6〜8個の炭素原子を有するアルキルアリール、-CH2-、CONH2、-CH2CH2CONH2、または-(CH2)k-CO-Xaa(式中、kは1または2に等しい整数であり、Xaaはアミノ酸である)であり；かつ
R9は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である)
【請求項３】
C末端チオエステルを有するN末端複素環保護オリゴペプチドが以下の化学式により規定される、請求項2記載の方法：
2005515184.tif 000016
または
2005515184.tif 000017
または
2005515184.tif 000018
(式中、
nは2〜70までの整数であり；
R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1またはR2は選択的に固体支持体に付着させてもよく；
R3は単独で、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；
R4およびR5は単独で、それぞれ水素、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリール、または1〜3個の炭素原子を有する電子供与置換アルキルであり；
R4およびR3は、化学式IIの複素環または化学式IIIの複素環のいずれかにおける2-および3-炭素と一緒になる場合、3〜20個の炭素原子を有するアルキル、または0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；
R4およびR5は、化学式IIIの複素環または化学式IVの複素環のいずれかにおける3-および4-炭素と一緒になる場合、3〜20個の炭素原子を有するアルキル、または6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；
ZはO、S、N、およびPからなる群より選択されるヘテロ原子であり；かつ
R9は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である)
【請求項４】
前記形成工程前に、前記連結前生成物を精製する工程をさらに含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
求核試薬が、化学式 H2N-O-R(式中、Rはメチル、エチル、イソプロピル、イソブチルまたは-CH2-COOHである)のO-アルキルヒドロキシルアミンである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
R3が単独で、水素、または1〜8個の炭素原子ならびに窒素、酸素、および硫黄からなる群より選択される0〜2個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；
R4およびR5が単独でそれぞれ水素であり；
ZがOであり；かつ
R9が、グリシン、アラニン、およびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である、
請求項5記載の方法。
【請求項７】
酸性条件がpH2.0〜pH6.0の範囲である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記O-アルコキシヒドロキシルアミンがO-メトキシヒドロキシルアミンである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
以下の化学式により規定されるN末端複素環保護オリゴペプチドチオエステルを含む組成物：
2005515184.tif 000019
(式中、
Xaa1〜Xaanはそれぞれ独立的に保護または非保護のアミノ酸であり；
nは2〜120までの整数であり；
R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1またはR2は選択的に固体支持体に付着させてもよく；
Dは2〜16個の炭素原子および0〜4個のヘテロ原子から成るアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル部分であり；
R6は1〜6個の炭素原子を有するアルキル、6〜8個の炭素原子を有するアルキルアリール、-CH2-、CONH2、-CH2CH2CONH2、または-(CH2)k-CO-Xaa(式中、kは1または2に等しい整数であり、Xaaはアミノ酸である)であり；
R9は、プロリンまたはシステインのアミノ酸側鎖を除いたアミノ酸側鎖である)
【請求項１０】
以下の化学式により規定される化合物の群から選択されるN末端複素環保護オリゴペプチドチオエステルを含む、請求項9記載の組成物：
2005515184.tif 000020
または
2005515184.tif 000021
または
2005515184.tif 000022
(式中、
nは2〜70までの整数であり；
R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1またはR2は選択的に固体支持体に付着させてもよく；
R3は単独で、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；
R4およびR5は単独で、それぞれ水素、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリール、または1〜3個の炭素原子を有する電子供与置換アルキルであり；
R4およびR3は、化学式IIの複素環または化学式IIIの複素環のいずれかにおける2-および3-炭素と一緒になる場合、3〜20個の炭素原子を有するアルキル、または0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；
R4およびR5は、化学式IIIの複素環または化学式IVの複素環のいずれかにおける3-および4-炭素と一緒になる場合、3〜20個の炭素原子を有するアルキル、または6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；
ZはO、S、N、およびPからなる群より選択されるヘテロ原子であり；かつ
R9は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である)
【請求項１１】
R3が単独で、水素、または1〜8個の炭素原子ならびに窒素、酸素、および硫黄からなる群より選択される0〜2個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；
R4およびR5が単独でそれぞれ水素であり；
ZがOであり；かつ
R9が、グリシン、アラニン、およびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である、
請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
以下の化学式により規定される化合物の群より選択されるN末端1,3-チアゾリジン保護オリゴペプチドチオエステルを含む組成物：
2005515184.tif 000023
(式中、
nは2〜70までの整数であり；
R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1またはR2は選択的に固体支持体に付着させてもよく；
R3は単独で、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；
R4は単独で、水素、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、または1〜3個の炭素原子を有する電子供与置換アルキルであり；
R4およびR3は、1,3-チアゾリジン環における2-および3-炭素と一緒になる場合、0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールまたは電子供与置換アリールであり；
R9は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である)
【請求項１３】
R3が単独で、水素、フェニル、電子供与置換フェニル、2-ピコリル、4-ピコリル、電子供与置換2-ピコリル、または電子供与置換4-ピコリルであり；
R4が単独で水素であり；かつ
R9が、グリシン、アラニン、およびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である、
請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
R3が単独で、水素またはメトキシ置換フェニルである、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
以下の化学式の保護アミノ酸を含む組成物：
2005515184.tif 000024
(式中、
R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1またはR2は選択的に固体支持体に付着させてもよく；
Dは2〜16個の炭素原子および0〜4個のヘテロ原子から成るアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、シクロアルキル結合部分であり；
R9は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である)
【請求項１６】
以下の化学式の保護アミノ酸を含む、請求項15記載の組成物：
2005515184.tif 000025
(式中、
R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1またはR2は選択的に固体支持体に付着させてもよく；
R3は単独で、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；
R4およびR5は単独で、それぞれ水素、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリール、または1〜3個の炭素原子を有する電子供与置換アルキルであり；
R4およびR3は、化学式IIの複素環または化学式IIIの複素環のいずれかにおける2-および3-炭素と一緒になる場合、3〜20個の炭素原子を有するアルキル、または0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；
R4およびR5は、化学式IIIの複素環または化学式IVの複素環のいずれかにおける3-および4-炭素と一緒になる場合、3〜20個の炭素原子を有するアルキル、または6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；
ZはO、S、N、およびPからなる群より選択されるヘテロ原子であり；かつ
R9は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である)
【請求項１７】
以下の化学式の1,3-チアゾリジン保護アミノ酸を含む、請求項15記載の組成物：
2005515184.tif 000026
(式中、
R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1またはR2は選択的に固体支持体に付着させてもよく；
R3は単独で、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；
R4は単独で、水素、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、または1〜3個の炭素原子を有する電子供与置換アルキルであり；
R4およびR3は、1,3-チアゾリジン環における2-および3-炭素と一緒になる場合、0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；
R9は、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である)
【請求項１８】
R3が単独で、水素、フェニル、電子供与置換フェニル、2-ピコリル、4-ピコリル、電子供与置換2-ピコリル、または電子供与置換4-ピコリルであり；
R4が単独で水素であり；かつ
R9が、グリシン、アラニン、およびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である、
請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
R3が単独で水素またはメトキシ置換フェニルである、請求項18記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的にはポリペプチドおよび蛋白質を合成するための方法に関し、より詳細には、複数のペプチド断片を共有結合により構築し標準の長さのポリペプチドとするための方法および中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒトゲノム配列決定により、ヒトの生物学および疾病に関連する全ての遺伝子および蛋白質の機能を理解するための見込みおよび機会が得られた、PeltonenおよびMcKusick、Science、291:1224-1229(2001)。しかしながら、いくつかの重要なハードルを克服しなければ、この見込みを完全には達成できない。まず、入手可能なヒトゲノム配列を用いても、その発現を制御する遺伝子およびその配列を識別するのは依然として困難である。第2に、転写レベルでの遺伝子発現のモニタリングはマイクロアレイ技術の開発により確固としたものになっているが、機能のかなりの変動性および制御は、選択的スプライシングならびに翻訳後プロセシングおよび修飾などの転写後事象で生じる。最後に、ヒト分子生物学のスケールのために（評価した3〜4万の遺伝子の約3分の1が、複数のスプライシング変異型を生じさせ、ほとんどが過多の翻訳後修飾を受ける蛋白質産物をコードすると考えられる）、おそらく何万という遺伝子およびその発現産物の健康および疾病における役割を理解するためには、それらを単離し、試験しなければならないと考えられる(DawsonおよびKent、Annu.Rev.Biochem.、69:923-960(2000))。
【０００３】
スケールの問題に関して、蛋白質のクローニング、発現、回収、および単離のための従来の組み換え手順は時間および手間がかかり、そのため、機能を決定するために多数の異なる遺伝子産物をスクリーニングする際の適用が制限されていた。最近では、機能スクリーンニングのための高純度研究室スケール量蛋白質を容易に入手する必要性に対処しうる、収束的合成アプローチが開発されている(DawsonおよびKent(上記で引用);Dawsonら、Science、266：776〜779(1994))。最も魅力的な実施において、C末端チオエステルを有する非保護オリゴペプチドは穏やかな水溶液条件下で他のオリゴペプチド中間体のN末端システインと反応し、チオエステル結合が形成され、これは自発的に再配列して天然のペプチド結合となる(Kentら、米国特許第6,184,344号)。このアプローチを使用して、水溶液相(例えば、Kentら、米国特許第6,184,344号)、および固相支持体上で(例えば、Canneら、J.Am.Chem.Soc.、121:8720-8727(1999)および米国特許第6,326,468号)オリゴペプチドを構築し活性蛋白質としている。最近では、技術が拡張され、C末端チオエステル断片を、共反応物のN末端窒素に付着された除去可能なエチルチオ部分を使用することにより広範囲の共反応物のN末端アミノ酸に結合させることができ、これによりN末端システインの機能が模倣される(Lowら、Proc.Natl.Acad.Sci.、98：6554-6559(2001))。
【０００４】
不幸なことに、このアプローチにより合成されるポリペプチドは100〜150アミノ酸を超え、現在のところ、約60残基より長いオリゴペプチド中間体を合成し精製することが困難であるため、通常、3つまたはそれ以上の断片を結合させる必要がある。この場合、内部オリゴペプチド中間体はC末端チオエステル部分だけでなく、N末端システインを含む。構築工程中、そのような内部中間体のシステインまたはシステイン模倣物は、遊離したままだと、同じ中間体分子のC末端チオエステルまたは異なる中間体分子のC末端チオエステルと反応し、このため中間体の望ましくない環状ペプチドまたは鎖状体の形成により望ましい連結反応が阻止される。この問題は、以下の特性を有するN末端アミノ酸に対する保護基を使用することにより回避することができる：i)オリゴペプチドを合成するまたは合成樹脂から開裂させるために使用する条件に対して安定でなければならない、ii)自然の化学連結反応が完了した後除去可能でなければならない、およびiii)好ましくは、除去は同じ連結反応混合物中で精製前に起こり、そのため連結反応およびアミノ酸脱保護はワンポットで実施することができる。
【０００５】
ペプチド反応物のN末端アミノ酸上の補助基を使用することにより化学連結法を拡張させるには、このクラスの試薬に対する有効な保護基、ならびにその合成および使用方法が必要となる。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
上記のことを鑑みると、本発明の目的は、ポリペプチドの収束的合成のための方法を提供すること；自然の化学連結を受け、多成分合成においてポリペプチド生成物を形成することができるが、自己連結および鎖状体化に対し耐性があるオリゴペプチド中間体を提供すること；自然化学連結反応のオリゴペプチド中間体のN末端アミノ酸残基に対する複素環保護基を提供すること；自己連結または鎖状体化からチオエステル修飾オリゴペプチド中間体を保護する方法を提供すること；オリゴペプチドのN末端残基を固体または溶液相のいずれかにおいて一時的にブロックする方法を提供し、これにより同時に精製および保護のツールを提供すること；ならびに単一反応混合物において連続オリゴペプチド中間体の自然化学連結法を提供することを含むが、これらに限定されない。
【０００７】
本発明は、
(a)C末端チオエステルのα-炭素と連結前生成物のN末端アミノ酸のα-炭素との間でアミド結合が形成されるような条件下で、C末端チオエステルを有するN末端複素環保護ポリペプチドを連結前生成物と反応させることにより、複素環保護基を有するN末端アミノ酸を含む連結生成物を形成する工程；
(b)連結生成物を酸性条件下で求核試薬を用いて処理し、複素環保護基を開環させ、遊離N末端システインまたは補助基を有する第二N末端アミンを含む連結前生成物を形成する工程であって、補助基は-D-SH形態(Dはアルキル、アルケニル、アリール、アラルキル、またはシクロアルキル結合部分であり、2〜16個の炭素原子を有し、O、S、およびPからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する)である工程；
(c)1つまたは複数の補助基を有するポリペプチドが形成されるまで工程(a)および工程(b)を繰り返す工程；
(d)1つまたは複数の補助基を除去し所望のポリペプチドを形成する工程；
を含む方法であって、
(e)工程(a)および工程(b)は固体支持体上で選択的に実施される、
3つまたはそれ以上のオリゴペプチド中間体の連結によりポリペプチドを合成する方法を提供する。
【０００８】
本発明は、自然化学連結反応の内部チオエステル修飾オリゴペプチド中間体の修飾N末端アミノ酸に対する複素環保護基を提供することにより、これらおよび他の目的を達成する。本発明の保護基の使用の中には、1つの試薬を過剰に使用し、続いて、例えば未反応過剰試薬を洗浄することによって反応材料を精製することにより連結反応を増強することができる固相ベースの化学連結反応がある。これらの技術は、PCT出願国際公開公報第01/81367号およびPCT/IB02/02949の開示においてシステイン残基に限定される使用分野で可能であったが、本発明はこれらの技術を任意のN末端アミノ酸残基と共に使用する手段を提供する。さらに、そのような固相ベースの化学連結方法は、それ自体では溶解することが困難であるが他の合成断片に連結されると直ちに折り畳まれて溶解性ポリペプチドとなる合成断片を含む、蛋白質の合成に有益である。溶解度の減少したそれらの合成断片を固体支持体に付着させる手段を提供することにより、本発明は自己凝集する傾向のあるそれらの断片を、それらの断片が他の断片と連結して溶解性ポリペプチドを形成するまで空間的に分離することによって一時的な溶解度の問題を解決する。好ましくは、本発明の複素環保護内部チオエステル修飾中間体は以下の化学式Iにより記述される：
2005515184.tif 000002
(式中、
Xaa1〜Xaanはそれぞれ独立的に保護または非保護のアミノ酸であり；
nは2〜120まで、より好ましくは2〜70、およびさらにより好ましくは2〜50の整数であり；
R1およびR2は、下記でより詳細に記述するように、求核試薬の存在下、酸性条件下で、化学式Iの複素環の開環を促進するように選択される)。好ましくは、R1およびR2は別々に、水素、置換もしくは未置換のアルキル、1〜3個の炭素原子を有する電子吸引置換アルキル、2〜3個の炭素原子を有するアルキルカルボニル、または7〜10個の炭素原子を有するアリールカルボニルであり、R1およびR2は選択的に固体支持体に付着させてもよい。
【０００９】
Dは、脱保護(下記でより詳細に記述する)後、化学式Iの複素環の開環により得られる遊離スルフヒドリルと共に、本明細書では「補助基」と呼ばれる。すなわち、「HS-D-」構造は本明細書では補助基と呼ばれる。好ましくはDは2〜16個の炭素原子および0〜4個のヘテロ原子を含むアルキル、アルケニル、アリール(化学式Iの複素環と縮合二環を形成することができるアリール基を含む)、アラルキル(ベンジルを含む)、シクロアルキル(化学式Iの複素環と縮合二環を形成することができるシクロアルキル基を含む)部分であり、(i)自然化学連結の再配列反応を促進するために、脱保護後、化学式Iの複素環窒素に隣接する化学式Iの複素環硫黄が維持され、(ii)化学式Iの複素環窒素に対し開裂可能な結合が提供され、そのため脱保護および断片連結(結合)後、補助基を除去してもよい。好ましくは、「HS-D」の形態では、Dで化学式IのN末端アミノ酸のNαの2〜3炭素-炭素結合長の等しい距離内にスルフヒドリル基が維持され、炭素-炭素結合は線形アルキル基の結合である。好ましくは、Dは化学式IのN末端アミノ酸のNαの1.54〜6.50Åの距離内にスルフヒドリル基を維持する。
【００１０】
R6は1〜6個の炭素原子を有するアルキル、6〜8個の炭素原子を有するアルキルアリール、-CH2-、CONH2、-CH2CH2CONH2-、または-(CH2)k-CO-Xaa(式中、kは1または2に等しい整数であり、Xaaはアミノ酸である)である。
【００１１】
R9は、プロリンまたはシステインの側鎖以外のアミノ酸側鎖であり；より好ましくは、プロリン、システイン、バリン、イソロイシン、またはトレオニン以外の側鎖である。さらに好ましくは、R9は水素、メチル、またはヒスチジンの側鎖であり；最も好ましくは、R9は水素またはメチルである。
【００１２】
R1またはR2のいずれかは、選択的に固体支持体に付着される。付着方法は本明細書内の実施例4および図7に例示される。他の付着方法は、例えば、PCT/GB01/01803(国際公開公報第01/18367号)において記述されている。しかしながら、固体支持体に化学化合物を付着する任意の適した方法を使用してもよい。
【００１３】
より好ましくは、本発明の複素環保護基は1,3-チアゾリジン、1,3-チアジナン、または3個の炭素原子、1個の窒素原子、1個の硫黄原子を含む飽和複素環であり、硫黄原子が窒素原子から1〜3(好ましくは1)個の炭素原子により分離され(複素環を中心に最も直接的な経路において)、ヘテロ原子は窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択され(好ましくは、酸素、硫黄、およびリン)、ヘテロ原子は直接窒素原子に結合される。好ましくは、本発明のそのような複素環保護内部チオエステル修飾中間体は以下の化学式II〜IVにより記述される：
2005515184.tif 000003
(式中、R1、R2、R6、およびR9は上記の通りである)
【００１４】
R3は単独で、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、硫黄、およびリンからなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；好ましくは、R3は単独で、水素、または1〜8個の炭素原子ならびに窒素、酸素、および硫黄からなる群より選択される0〜2個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；さらに好ましくは、R3は単独で、水素、フェニル、電子供与置換フェニル、2-もしくは4-ピコリル、または電子供与置換した2-もしくは4-ピコリルであり、さらに好ましくは、R3は単独で、水素またはメトキシ置換フェニルであり；最も好ましくは、R3は単独で4-メトキシフェニルまたは2,4-ジメトキシフェニルである。
【００１５】
R4およびR5は単独で、それぞれ水素、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリール、または1〜3個の炭素原子を有する電子供与置換アルキルであり；好ましくは、R4およびR5は単独で、それぞれ水素、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、または1〜3個の炭素原子を有する電子供与置換アルキル；より好ましくは、R4およびR5は単独でそれぞれ水素である。
【００１６】
R4およびR3は、化学式IIの複素環または化学式IIIの複素環のいずれかにおける2-および3-炭素と一緒になる場合、3〜20個の炭素原子を有するアルキル、または0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；好ましくは、R4およびR3は、化学式IIの複素環または化学式IIIの複素環のいずれかにおける2-および3-炭素と一緒になる場合、0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；より好ましくは、R4およびR3は、化学式IIの複素環または化学式IIIの複素環のいずれかにおける2-および3-炭素と一緒になる場合、7〜8個の炭素原子を有するメトキシ置換アリールである。
【００１７】
R4およびR5は、化学式IIIの複素環または化学式IVの複素環のいずれかにおける3-および4-炭素と一緒になる場合、3〜20個の炭素原子を有するアルキル、または6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；好ましくは、化学式IIIの複素環または化学式IVの複素環のいずれかにおける3-および4-炭素と一緒になる場合、6〜10個の炭素原子を有するアリールもしくは電子供与置換アリールであり；より好ましくは、R4およびR5は、化学式IIIまたはIVの複素環の3-および4-炭素と一緒になる場合、7〜8個の炭素原子を有するメトキシ置換アリールである。好ましくは、R3およびR4は、R4およびR5と同時には一緒にならない。
【００１８】
ZはO、S、N、およびP、好ましくはO、S、およびPからなる群より選択されるヘテロ原子である。
【００１９】
本発明の化合物、組成物、および方法の好ましい態様では、R1は水素であり、R2は1〜3(好ましくは1)個の炭素原子を有する電子吸引アルキルである。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「電子吸引」は、置換基の付着している分子から価電子を引き付ける傾向を示し、すなわち、電気陰性であり、「電子供与」は置換基の付着している分子へ価電子を供与する傾向を示し、すなわち電子陽性である、例えばSmithおよびMarch、March's Advanced Organic Chemistry:Reactions、 Mechanisms、 Structure、第5版(2001年、ニューヨーク、Wiley-Interscience)。穏やかな電子供与基は、付着している分子への価電子供与の傾向が限られている官能基を示す。そのような効果は、アルケニルまたはアルキル置換基(「電子供与」の特徴が価電子を移動させる有益な能力よりもむしろ、より誘導的な効果である)のような単一の官能基の存在、または2つまたはそれ以上の部分の電子供与および電子吸引の結合された効果(電子供与効果が優勢である)のいずれかによる。穏やかな電子吸引基は、付着している分子から価電子を引き付ける傾向が限られている官能基を示す。そのような効果は、単一の官能基の穏やかな電子吸引効果、または単一の置換基の電子供与特性および電子吸引特性の結合された効果、または2つまたはそれ以上の部分の電子供与特性および電子吸引特性の結合された効果(電子吸引効果が優勢である)のいずれかによる。好ましい電子吸引置換基としては、ハロ-(とりわけ、モノおよびポリ(ジ-およびトリ-を含む)クロロ、ブロモ、およびフルオロ)、シアノ、または1〜3個の炭素原子を有するニトロ置換アルキル、カルボニル、カルボキシ、カルボキシエステル、カルボキシアミド、アミドカルボキシ、アミドカルボニル、スルホキシ、スルホンおよび四級アンモニウム塩、または上記電子吸引部分のいずれかを有する1〜3個の炭素原子のアルキル基、ならびに2つまたはそれ以上の部分の電子供与および電子吸引特性の組み合わせ(電子吸引効果が優勢である)が挙げられるが、これらに限定されない。1つの好ましい態様では、電子吸引置換基は、置換カルボキシアミド、カルボキシエステル、アミドカルボキシ、アミドカルボニル、または上記電子吸引部分のいずれかを有する1炭素原子を含むアルキル基である。他の好ましい態様では、電子吸引置換基として、ハロ-、とりわけクロロおよびブロモ、シアノ、または1〜3個の炭素原子を有するニトロ置換アルキルが挙げられ；より好ましくは、電子吸引置換基はハロ置換メチルである。好ましい電子供与置換基としては、1〜100個の炭素原子を有するアルキル、アルケニル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、メチルチオ、アルキルチオ、アリール、複素環、1〜4ヘテロ原子を有する複素環式芳香族、アリール基に付着された1〜8個のアルキル脂肪族原子を含むアラルキル、ベンジル、ならびに2つまたはそれ以上の構成要素の電子供与特性および電子吸引特性の組み合わせ(電子供与効果が優勢である)が挙げられる。1つの好ましい態様では、電子供与置換基はアルキル、アルケニル、ベンジル、アリール、メトキシ、チオール、メチルチオ、またはヒドロキシルである。他の好ましい態様において、好ましい電子供与置換基は、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、およびメチルチオが挙げられ；より好ましくは、電子供与置換基はメトキシ、チオール、メチルチオ、またはヒドロキシルである。好ましくは、置換基が電子供与基、例えば電子供与置換フェニルまたは電子吸引置換フェニル、により置換される場合、1〜3個のそのような官能基が付着され；より好ましくは、1〜2個のそのような官能基が付着される。
【００２１】
本発明の他の局面は、以下の化学式の複素環保護オリゴペプチドエステルの合成に有益な誘導アミノ酸組成物である：
2005515184.tif 000004
(式中、R1、R2およびR9は上記の通りである)
好ましくは、そのような誘導アミノ酸組成物は以下の化学式からなる群より選択される：
2005515184.tif 000005
(式中、R1、R2、R3、R4、R5、R9およびZは上記の通りである)
好ましくは、そのような誘導アミノ酸組成物は以下の化学式の1,3-チアゾリジン-、1,3-チアジナン-、および1,4,2-オキサチアジナン-保護アミノ酸からなる群より選択される：
2005515184.tif 000006
(式中、R1、R2、R3、R4、R5およびR9は上記の通りである)
より好ましくは、本発明の誘導アミノ酸は以下の化学式の1,3-チアゾリジン-保護アミノ酸である：
2005515184.tif 000007
(式中、
R1およびR2は別々に水素またはメチルであり；R3は単独で、水素、または1〜12個の炭素原子ならびに窒素、酸素、および硫黄からなる群より選択される0〜4個のヘテロ原子を有する電子供与基であり；R4は単独で、水素、1〜3個の炭素原子を有するアルキル、または1〜3個の炭素原子を有する電子供与置換アルキルであり；
また、R4およびR3は、1,3-チアゾリジン環における2-および3-炭素と一緒になる場合、0〜2個のヘテロ原子と共に6〜10個の炭素原子を有するアリールまたは電子供与置換アリールであり；R9はアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である)
さらにより好ましくは、R3は単独で、水素、フェニル、電子供与置換フェニル、2-ピコリル、4-ピコリル、電子供与置換2-ピコリル、または電子供与置換4-ピコリルであり；R4は単独で水素であり；ならびにR9はグリシン、アラニン、およびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖である。最も好ましくは、R3は単独で水素またはメトキシ置換フェニルである。
【００２２】
本発明の方法によれば、ポリペプチドは以下の工程により3つまたはそれ以上のオリゴペプチド中間体から合成される：
(i)内部オリゴペプチド中間体のC末端チオエステルアミノ酸のα-炭素と連結前生成物のN末端アミノ酸のα-炭素との間でアミド結合が形成される条件下で、内部オリゴペプチド中間体を連結前生成物と反応させることにより、N末端複素環保護アミノ酸を有する連結生成物を形成する工程；(ii)連結生成物を酸性条件下で求核試薬を用いて処理し、遊離N末端システインを有する連結前生成物または補助基を含む第二N末端アミンを有する連結前生成物を形成する工程；(iii)1つまたは複数の補助基を有するポリペプチドが形成されるまで工程(i)および工程(ii)を繰り返す工程；および(iv)1つまたは複数の補助基を除去し所望のポリペプチドを形成する工程。
【００２３】
本発明の1つの局面は、連結後、同じ反応混合物中で、酸性条件下、求核試薬により連結生成物のN末端複素環を開環させ、補助基を有する第二N末端アミン、またはN末端アミノ酸がシステインである場合はN末端システインを形成させることによりN末端アミノ酸を脱保護することである。そのような試薬としては、O-アルコキシヒドロキシルアミンおよびヒドラジンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、チアゾリジン保護N末端システインは酸性条件下、O-アルコキシヒドロキシルアミン処理することにより脱保護される。より好ましくは、そのようなO-アルコキシヒドロキシルアミン脱保護剤は、化学式：H2N-O-R(式中、Rはメチル、エチル、イソプロピル、イソブチル、または-CH2-COOHである)を有する。好ましくは、Rはメチルである。好ましくは、酸性条件は2.0〜6.0の範囲のpHを含む。より好ましくは、そのようなpHは3.0〜4.0の範囲である。
【００２４】
本発明の他の局面は、反応性の1,2または1,3N末端アミノチオールオリゴペプチドの固体支持体固定により得られる同時保護および精製スキームである。Matteo Villain、Jean VizzavonaおよびKeith Rose、Chem Biol.2001 Jul;8(7):673-9、Keith Rose Matteo Villain、Jean Vizzavona、国際特許出願PCT/GB01/01803(国際公開公報第01/18367号)により明らかにされているように、天然のシステイニルポリペプチドのN末端1,2アミノチオールは、可逆チアゾリジン環形成により、固体支持体に選択的に固定され自己精製可能である。Villainらにより上記で記述されているように共有結合捕獲工程は、N末端の1,2または1,3アミノチオールおよびチオエステル官能基が相互に不活性である酸性媒質条件下で起こるので、同じ分子上に、N末端の1,2または1,3アミノチオールおよびチオエステル官能基を両方とも有する断片に適用することができる。
【００２５】
本発明はポリペプチドおよび蛋白質の収束的合成法において有益であり、好都合なことにこれらの方法における制限に対処する。特に、チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を構築しポリペプチドまたは蛋白質とするために使用される自然化学連結反応の効率(特に2つより多い成分が関係する反応において)を改善するための方法および材料を提供する。
【００２６】
定義
ペプチドに関する「ポリペプチド」、「ペプチド」、「ペプチド断片」、「オリゴペプチド」、または「断片」という用語は、本明細書で使用されるように、ペプチド結合により結合されたアミノ酸残基の単一未分枝鎖で構成された化合物を示す。そのような化合物中のアミノ酸残基の数は広く変動するが；好ましくは、本明細書で示されているペプチドまたはオリゴペプチドは通常2〜70のアミノ酸残基を有し；より好ましくは、2〜50のアミノ酸残基を有する。本明細書で示されるポリペプチドおよびペプチド断片は通常、数十のアミノ酸残基、例えば20から最大数百のアミノ酸残基、例えば200またはそれ以上を有する。
【００２７】
本明細書で使用されるように「蛋白質」という用語は、「ポリペプチド」という用語と同意語として使用してもよく、またはさらに、ペプチド結合以外の結合により結合されてもよい2つまたはそれ以上のポリペプチドの複合体を示してもよく、例えば、蛋白質を構成するそのようなポリペプチドはジスルフィド結合により結合されてもよい。「蛋白質」という用語は、特にそのような蛋白質が真核宿主で発現される場合に付加しうる際、例えばリン酸化、アシル化、グリコシル化などのような同一のアミノ酸配列を有するが異なる翻訳後修飾を有するポリペプチドのファミリーを含んでもよい。
【００２８】
アミノ酸残基は、本明細書では、標準の1文字または3文字表記により示される：A、アラニン；C、システイン；D、アスパラギン酸；E、グルタミン酸；F、フェニルアラニン；G、グリシン；H、ヒスチジン；I、イソロイシン；K、リシン；L、ロイシン；M、メチオニン；N、アスパラギン；P、プロリン；Q、グルタミン；R、アルギニン；S、セリン；T、トレオニン；V、バリン；W、トリプトファン；Y、チロシン。特に本文で記載がなければ、本明細書で述べたアミノ酸配列、例えば「DKLLM」はN末端からC末端までのアミノ酸を左から右への様式で指示している。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「アミノ酸側鎖」という用語はアミノ酸のα-炭素の置換基を示す。
【００３０】
特に規定がなければ本明細書で使用されるように、「ヘテロ原子」という用語はO、N、S、およびPから選択される原子を示す。
【００３１】
特に規定がなければ本明細書で使用されるように、「複素環」という用語は、4〜20個、より好ましくは5〜10個の炭素原子および1〜4個のヘテロ原子を有する、選択的に置換された芳香族または非芳香族炭化水素環を示す。特に規定がなければ本明細書で使用されるように、「複素環式芳香族」という用語は、4〜20個、より好ましくは5〜10個の炭素原子および1〜4個のヘテロ原子を有する、選択的に置換された芳香族炭化水素環を示す。複素環または複素環式芳香族官能基は、ハロ-(特にモノおよびポリ(ジ-およびトリ-を含む)クロロ、ブロモ、およびフルオロ)、シアノ、ニトロ、カルボニル、カルボキシ、カルボキシエステル、カルボキシアミド、アミドカルボキシ、アミドカルボニル、スルホキシ、スルホンおよび四級アンモニウム塩、アルキル、アルケニル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、メチルチオ、アルキルチオ、アリール、複素環、アリール基(例えばベンジル)に付着された1〜8個のアルキル脂肪族原子を含むアラルキル、または上記部分のいずれかを有する1〜3個の炭素原子を含むアルキル基を含むが、これらに限定されない群から選択される0〜3の置換基で置換されてもよい。
【００３２】
特に規定がなければ本明細書で使用されるように、「アルキル」という用語は、1〜100個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜3個、より好ましくは1個の炭素原子を含む分枝または未分枝の、選択的に置換された、飽和または不飽和(すなわち、アルケニルおよびアルキニルを含む)の炭化水素鎖を示す。アルキル基は、ハロ-(特にモノおよびポリ(ジ-およびトリ-を含む)クロロ、ブロモ、およびフルオロ)、シアノ、ニトロ、カルボニル、カルボキシ、カルボキシエステル、カルボキシアミド、アミドカルボキシ、アミドカルボニル、スルホキシ、スルホンおよび四級アンモニウム塩、アルケニル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、メチルチオ、アルキルチオ、アリール、複素環、1〜4個のヘテロ原子を有する複素環式芳香族、アリール基(例えばベンジル)に付着された1〜8個のアルキル脂肪族原子を含むアラルキル、または上記部分のいずれかを有するアリール基を含むが、これらに限定されない群から選択される0〜3の置換基により置換されてもよい。本明細書で使用されるように、「アルキル」という用語は、文脈で要求されるように、一価のアルキル基および二価のアルキルまたはアルキレン基のいずれかまたは両方を示すことは認識されると考えられる。
【００３３】
特に規定がなければ本明細書で使用されるように、「アリール」という用語は、5〜100個、好ましくは5〜20個、より好ましくは5〜10個の炭素原子を有する、選択的に置換された芳香族炭化水素環を示す。好ましいアリール基としてはフェニル基およびナフチル基が挙げられる。アリール基は、ハロ-(特にモノおよびポリ(ジ-およびトリ-を含む)クロロ、ブロモ、およびフルオロ)、シアノ、ニトロ、カルボニル、カルボキシ、カルボキシエステル、カルボキシアミド、アミドカルボキシ、アミドカルボニル、スルホキシ、スルホンおよび四級アンモニウム塩、アルケニル、メトキシ、チオール、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、メチルチオ、アルキルチオ、アリール、複素環、1〜4個のヘテロ原子を有する複素環式芳香族、アリール基(例えばベンジル)に付着された1〜8個のアルキル脂肪族原子を含むアラルキル、または上記部分いずれかを有する1〜3個の炭素原子を含むアルキル基を含むが、これらに限定されない群から選択される0〜3の置換基により置換されてもよい。本明細書で使用されるように、「アリール」という用語は、文脈で要求されるように、一価のアリール基および二価のアリールまたはアリーレン基のいずれかまたは両方を示すことは理解されると考えられる。
【００３４】
特に規定がなければ本明細書で使用されるように、「アラルキル」という用語は、アリール基がアルキル基に結合された官能基を示し、アリールまたはアルキル基を介して分子の残りに結合されてもよい。この用語はベンジル基を含む。
【００３５】
本発明の詳細な説明
本発明は、Lowら、Proc.Natl.Acad.Sci.、98:6554-6559(2001)およびBottiら、Tetrahedron Letters、42:1831-1833(2001)により記述されているように、自然化学連結法による、オリゴペプチドのポリペプチドへの構築に関する。LowらおよびBottiらによる自然化学連結およびその拡張の一般的アプローチを図1に示す。オリジナルの自然化学連結技術では、例えば、DawsonらおよびKentらにより記述されているように(背景で引用されている)、ペプチド断片のカップリングはN末端システインとC末端チオエステルとの間でのみ起こると考えられる。図示されるように、第1のオリゴペプチド(100)は酸化されていないスルフヒドリル側鎖を有するN末端システイン(104)を備え、第2のオリゴペプチド(102)はC末端チオエステル(106)を備える。カップリング反応(108)では、N末端システインの不酸化スルフヒドリル側鎖をC末端チオエステルと縮合させ、第1および第2のオリゴペプチドをβ-アミノチオエステル結合(110)により結合させた中間オリゴペプチドを生成させる。その後、中間オリゴペプチドのβ-アミノチオエステル結合は分子内再配列(112)を起こし、第1および第2のオリゴペプチドをアミド結合(114)により結合させたオリゴペプチド生成物が生成する。
【００３６】
3つまたはそれ以上の断片からポリペプチドを構築する場合、このスキームに問題が発生する。この状況では、少なくとも1つの断片がN末端システインおよびC末端チオエステルの両方を有し、これにより、従来の反応条件下では、反応性の分子内部分が近接するため、かなり重要な自己連結が起こる可能性が生じる。このことを考えると、内部断片のN末端システインは、Gaertnerら、Proceedings of the 17th American Peptide Symposium、pgs.107-108(サン・ディエゴ、2001年6月9〜14日)により証明されているように、環状チアゾリジン保護基によりそのような反応から保護することができる。本発明まで、LowらおよびBottiらにより開示されているように、同様の保護基は、補助基を使用する化学連結には有効ではなかった。本発明によれば、補助基支援連結において自己連結を阻止することにより、連結効率を著しく増大させる新規クラスの複素環保護基が提供される。本発明の複素環保護基の作用を、3成分連結について図2において示す。複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド(102)はチオエステル基(106)および例示的な複素環保護基(200)を有する。チオエステル(106)は、Dawsonら、Kentら、およびその他(上記で引用)により記述されているように、オリゴペプチド(100)のN末端システイン(104)と反応し、アミド結合(204)により結合されたオリゴペプチド(100)およびオリゴペプチド(102)からなる連結生成物(202)が得られる。この工程での連結生成物を、その後、酸性条件下でO-アルコキシヒドロキシルアミン(206)を用いて処理し、複素環保護基(200)を開環させると、N末端アミノ酸(208)(この図では、グリシンである)の第二アミンに付着された補助基(212)上の遊離末端スルフヒドリル基が得られる。そのような脱保護後、次のチオエステル修飾オリゴペプチド(210)が、LowらおよびBottiら(上記で引用)により教示されているように、N末端アミン(208)と反応し(214)、中間生成物(216)が得られる。補助基(212)は酸処理により除去され(220)、最終生成物(218)が得られる。好ましくは、そのような除去は、HFまたはトリフルオロ酢酸(TFA)による処理により実施される。例示的な除去条件としては、(i)95% HFおよび5% p-クレゾール、(ii)TFA/ブロモトリメチルシラン、ならびに(iii)95% TFA、2.5% トリイソプロピルシラン(TIS)、および2.5% 水が挙げられる。特に記載がなければ、これらの反応および下記の反応は室温で行われる。
【００３７】
本発明の複素環保護基は、最初に補助基を有するオリゴペプチドチオエステルを合成し、続いて補助基の遊離スルフヒドリルを末端アミノ酸の第二α-アミンと環化させることによってオリゴペプチドチオエステルのN末端で形成させてもよい。補助基を有するオリゴペプチドチオエステルは、ハロゲン媒介アミノアルキル化および還元的アミノ化によるなど、いくつかの様式で合成してもよい。また、本発明の複素環保護基は、所望のオリゴペプチドチオエステルの合成において最後の付加サイクルで、定位置に複素環保護基を有する完全保護アミノ酸モノマーを調製することにより形成してもよい。しかしながら、一般に、合成は図3〜5において示されるように、樹脂に付着されたオリゴペプチドチオエステルを用いて開始される。
【００３８】
C末端チオエステルを有するオリゴペプチド(図1のペプチド2(102))は、以下の参考文献において記述されているように製造してもよい(これらの参考文献は参照により本明細書に組み込まれる)：Kentら、米国特許第6,184,344号；Tamら、Proc. Natl. Acad. Sci.、92：12485-12489(1995)；Blake、Int. J. Peptide Protein Res.、17：273(1981)；Canneら、Tetrahedron Letters、36：1217-1220(1995)；Hackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、94：7845-7850(1997)；またはHackengら、Proc. Natl. Acad. Sci.、96：10068-10073(1999)；Ingenitoら、J. Am. Chem. Soc.,121：11369-11374(1999)。好ましくは、Hackengら(1999)により記述されている方法が採用される。簡単に説明すると、オリゴペプチドは、Schnolzerら、Int. J. Peptide Protein Res.、40:180-193(1992)(参照により本明細書に組み入れられる)により開示されているBoc化学のためのインサイチュー中和/HBTU活性化手順を使用することにより、典型的には0.25mmolスケールで、固相支持体(下記で記述)上で合成される。(HBTUは2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、Bocはtert-ブトキシカルボニルである)。各合成サイクルは、純粋TFAを用いた1分または2分の処理によるNα-Boc除去、1分DMF流洗浄、DIEA存在下での予め活性化した1.0mmolのBoc-アミノ酸との10分または20分の結合時間、および第2のDMF流洗浄からなる。(TFAはトリフルオロ酢酸、DMFはN,N-ジメチルホルムアミドであり、DIEAはN,N-ジイソプロピルエチルアミンである)。Nα-Boc-アミノ酸(1.1mol)は過剰のDIEA(3mmol)の存在下、1.0mmolのHBTU(0.5MのDMF溶液)で3分間予め活性化させる。各カップリング工程後、例えば、Sarinら、Anal. Biochem.、117：147-157(1981)において開示されているように、従来の定量的ニンヒドリンアッセイ法により、残存遊離アミンを測定することにより、収率を測定する。Gln残基の結合後、TFAを用いることにより脱保護前後にDCM流洗浄を使用し、起こりうる高温(TFA/DMF)触媒ピロリドン形成を阻止する。選択的に、鎖構築の完了時に、本発明の化合物を合成するための1つの経路として、Zuckermanら、J. Am. Chem. Soc. 114：10646-10647(1992)(参照により本明細書に組み込まれる)により開示されているように、ハロアセチル基、好ましくはブロモアセチル基を添加してもよい。
【００３９】
チオエステルオリゴペプチドは、Fmoc化学またはBoc化学のいずれかを使用して合成してもよい。Fmoc化学を使用する場合、3-カルボキシプロパンスルホンアミドセーフティキャッチリンカーを使用してチオエステルを生成させる。上記チオエステルオリゴペプチドは、Hackengら(1999)、または匹敵するプロトコルにより開示されているように作製されたトリチル関連メルカプトプロピオン酸-ロイシン(TAMPAL)樹脂上で好ましくは合成される。簡単に説明すると、Nα-Boc-Leu(4mmol)を3.6mmolのHBTUを用いて、6mmolのDIEAの存在下で活性化し、16分間2mmolのp-メチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂、または等価物に結合させる。次に、3mmolのS-トリチルメルカプトプロピオン酸を2.7mmolのHBTUを用いて、6mmolのDIEAの存在下で活性化し、16分間Leu-MBHA樹脂に結合させる。得られたTMAPAL樹脂は、TFAに溶解した3.5%のトリイソプロピルシランおよび2.5%のH2Oを用いた2回の1分処理によりトリチル保護基を除去した後、ポリペプチド鎖構築のための開始材料として使用することができる。Shcnolzerら(上記で引用)において開示されているように、1時間の間、標準インサイチュー中和ペプチド結合プロトコルを使用することにより、任意の所望のアミノ酸とチオエステル結合を形成することができる。最終オリゴペプチドを無水HFにより処理すると、C末端活性化メルカプトプロピオン酸-ロイシン(MPAL)チオエステルオリゴペプチドが得られる。
【００４０】
好ましくは、オリゴペプチドチオエステルは、捕捉剤として4%のp-クレゾールと共に無水HFを用いて、0℃で1時間処理することにより、脱保護され、樹脂から開裂される。DNP除去手順はC末端チオエステル基とは適合しないため、イミダゾール側鎖2,4-ジニトロフェニル(DNP)保護基がHis残基上に残る。しかしながら、DNPは連結反応中にチオールにより徐々に除去される。開裂後、オリゴペプチドチオエステルを氷冷ジエチルエーテルにより沈澱させ、アセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥させる。
【００４１】
本発明の複素環保護オリゴペプチドを合成するためのスキーム1を図3に示す。このスキームでは、オリゴペプチドチオエステル(300)の遊離N末端アミンは、標準カップリング反応(304)、例えばSchnolzerら(上記で引用)において補助基(-D-S-R7)を有するアミノ酸(302)と反応し、α-アミンに付着された補助基(308)を有するオリゴペプチドチオエステル(306)が得られる。R7は硫黄保護基(好ましくは、「酸に不安定な」ものであり、より好ましくは「超酸に不安定な」ものである)である。多くの硫黄保護基が周知であり、そのような目的に有益である(Protecting Groups in Organic Synthesis、第3版、T.W.GreeneおよびP.G.M.Wuts、編集、John Wiley & Sons、Inc.、1999、455-493を参照のこと)。硫黄保護基としては、ACM(アセトアミドメチル)など、ピコリル、トリチルなど、キサンチル、フェナシルなど、ベンジル、フルオレニルメチル(FM)など、およびジスルフィド部分が挙げられるが、これらに限定されない。電子供与置換ベンジル、ACM、トリチル、メトキシトリチル、キサンチル、ピコリルが好ましい。オリゴペプチドチオエステル(312)は補助基のα-アミンおよびスルフヒドリルの選択的脱保護(310)により形成され、その後、置換カルボニル(314)と反応し、複素環保護基(316)が形成される。好ましくは、R8がBocまたは同様の保護基であり、R7がトリフェニルメチル(すなわちトリチル)または同様の保護基である場合、選択的脱保護(310)は、トリイソプロピルシラン(TIS)などの捕捉剤の存在下で弱酸処理(例えば従来の反応条件下でのトリフルオロ酢酸(TFA)、例えばGreenおよびWuts(上記で引用))により達成される。選択的脱保護のために適したアミノおよびスルフヒドリル保護基ならびにNα保護基を選択するための手引きは、GreeneおよびWuts、Protecting Groups in Organic Chemistry、第3版(John Wiley & Sons、ニューヨーク、1999)において見出すことができる。例示的なR8保護基としては、t-ブチルカルバメート(Boc)、9-フルオレニルメチルカルバメート(Fmoc)、4-ニトロフェニルエチルスルホニル-エチルオキシカルボニル(NSC)、2,2,2-トリクロロエチルカルバメート(Troc)、ブロモベンジルカルバメート(BrZ)、クロロベンジルカルバメート(ClZ)、2-(4-ビフェニル)-イソプロポキシカルボニル(Bpoc)[Sieberら、Helv. Chim. Acta、57:2617-2621(1968)]、α,α-ジメチル-3,5-ジメチルオキシベンジルオキシカルボニル(Ddz)[Birrら、Justus Liebigs Ann. Chem.、763:162-172(1972)]などが挙げられる。好ましくはR8保護基はBoc、Fmoc、およびBpocである。さらに例示的なR7保護基としては、ベンジル、4-メチルベンジル、4-メトキシベンジル、トリチル、アセトアミドメチル、トリメチルアセトアミドメチル、キサンチルなどが挙げられる。
【００４２】
本発明の複素環保護オリゴペプチドチオエステルを合成するためのスキーム2を図4に示す。このスキームはほぼBottiら(上記で引用)により開示された手順に従う。ブロモアセチル化オリゴペプチドチオエステル(400)はS-保護エチルアミンまたはS-保護アミノチオフェニル(402)、もしくは同様の官能基と反応し、補助基(406)を有するオリゴペプチドチオエステル(404)が得られる。その後、スルフヒドリル保護基、例えばトリフェニルメチル（トリチル）が、TISなどのトリチル捕捉剤の存在下で弱酸(例えばTFA)により除去される(408)。オリゴペプチドチオエステル(410)のα-アミンおよび補助基の遊離スルフヒドリルはカルボニル(414)と反応し(412)、複素環保護オリゴペプチドチオエステル(416)が形成される。好ましくは、カルボニル(414)はホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、アセトンなどである。より好ましくは、R1=R2であり、そのため精製が困難になるキラル形態が生成されない。他方、いくつかの態様では、親和性またはクロマトグラフィー精製支援としてR1およびR2のいずれかまたは両方を採用することが望ましい。例えば、R1またはR2はビオチン、ジゴキシゲニン、または同様の親和性基、（結合部分に結合される）、例えば、ビオチン-(CH2)n-としてもよく；またはR1またはR2は精製を支援するためにクロマトグラフィー保持時間を変更するように設計された疎水性または親水性基としてもよい。複素環保護オリゴペプチドチオエステル(416)は、例えばHF処理により脱保護されて樹脂から開裂され(418)、最終生成物(420)が得られる。
【００４３】
図5のスキーム3においては、定位置にすでに保護基を有する誘導アミノ酸をカップリングすることにより、複素環保護基がオリゴペプチドチオエステルに添加される。遊離N末端アミンを有するオリゴペプチドチオエステル(500)を、従来の固相ペプチド合成反応において誘導アミノ酸(502)と反応させ、生成物(504)を得る。その後、脱保護し合成カラムから開裂させる(506)と、最終生成物(508)が得られる。誘導アミノ酸(502)はいくつかの経路により調製してもよい。好ましくは、最初に以下の求核性置換反応において補助基-置換Nαを有する中間体を合成することにより調製される：
XNH-CH(R9)-COOR' + R7-S-D-NH2→R7-S-D-NH-CH(R9)-COOH
(式中、
Xはハロゲン、好ましくは臭素であり、R'は従来の保護基または固相支持体である)。また、R7-S-D-NH-CH(R9)-COOHは、下記のスキームによる還元的アミノ化を介して合成することができる：
CO(R9)-COOR' + R7-S-D-NH2→R7-S-D-NH-CH(R9)-COOH
得られたNα-置換アミノ酸のスルフヒドリルは従来のプロトコルにより脱保護され(例えば、トリチル保護スルフヒドリルに対してはTFA/TIS)、その後、置換ホルムアルデヒド、CO(R1)(R2)と反応し、誘導アミノ酸(502)が得られる。また、上記中間体は下記の反応により調製してもよい：
H2N-CH(R9)-COOR' + R7-S-D-X→R7-S-D-NH-CH(R9)-COOH
(式中、Xはハロゲン、好ましくは臭素であり、R'は従来の保護基または固相支持体である)、または、
H2N-CH(R9)-COOR' + R7-S-DI→R7-S-D-NH-CH(R9)-COOH
(式中、DIはD(上記の通り)の前駆体である)。1つの態様では、DIはカルボニル官能基を含み、最終生成物R7-S-D-NH-CH(R9)-COOHは、H2N-CH(R9)-COOR'との反応を介する還元的アミノ化により合成される。好ましくは、この態様では、DIは以下の構造、-(CHn)m-CO-R''(式中、n=0、1、または2であり、m=1〜20であり、かつR''はHまたは置換もしくは未置換のアルキルまたはアリール基である)を有する。より好ましくは、R''はHまたは置換もしくは未置換のフェニルまたは複素環式芳香族環である。
【００４４】
重要なことは、複素環形成を介する1,2または1,3N末端アミノチオールの保護スキームが、非保護オリゴペプチドCα-チオエステル上での開裂後、酸性水溶液媒質中で達成されることである(図7)。そのような場合、R1またはR2が固相の一部である場合、我々はN末端反応性部分の同時共有結合捕捉および保護を得ることができ、多成分合成において自然化学連結を受けポリペプチド生成物が形成されるが、自己連結および鎖状体化には抵抗性があるオリゴペプチド中間体が得られ；自然化学連結反応のオリゴペプチド中間体のN末端アミノ酸残基のための複素環保護基が提供され；自己連結または鎖状体化からチオエステル修飾オリゴペプチド中間体を保護する方法が提供され；および固相支持体上での化学連結を介する連続オリゴペプチド中間体の自然化学連結のための方法が提供される。
【００４５】
好ましくは、複素環保護オリゴペプチドチオエステル中間体は、Hackengら(1999)により記述されている条件、または同様の条件下での自然化学連結において使用される。簡単に説明すると、6Mのグアニジン、2%(vol/vol)のベンジルメルカプタン、および2%(vol/vol)のチオフェノールを含む0.1Mのリン酸緩衝液(pH8.5)を、連結すべき乾燥ペプチドに添加すると、凍結乾燥ペプチドからチオールおよびTFAが添加されるので、最終ペプチド濃度は、約pH7で1〜3mMとなる。好ましくは、連結反応は連続撹拌下で37℃の加熱チャンバで実施し、周期的にボルテックスし、チオール添加物を平衡させる。反応は、MALDI-MSまたはHPLCおよび電子噴霧イオン化MSにより完了の程度についてモニターしてもよい。
【００４６】
自然化学連結が完了または停止した後、酸性条件下で求核性を有する脱保護剤を用いて処理することにより、生成物のN末端複素環を開環する。そのような試薬としては、ある一定のO-アルキルヒドロキシルアミン、ヒドラジン、および同様の試薬が挙げられる。より好ましくは、生成物のN末端複素環の開環は、pH3.5〜4.5で2時間、37℃でO-メチルヒドロキシルアミン(0.5M)で処理することにより実施し、その後、10倍過剰のトリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン(TCEP)を反応混合物に添加し、全ての酸化反応成分を完全に還元し、その後に生成物の精製を、好ましくは従来の調製用HPLCにより実施する。好ましくは、連結生成物を含む画分を電子噴霧MSにより同定し、プールし、凍結乾燥させる。トリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィンの代わりに使用することができる他の還元剤としては、β-メルカプトエタノールアミン、ジチオトレイトールなどが挙げられる。
【００４７】
最終オリゴペプチドチオエステル生成物の脱保護は本発明の重要な特徴であり、上記のように、酸性条件下で求核性の様々な試薬を用いて達成してもよい。複素環保護基がチアゾリジンである場合、酸性条件下での開環はそのC2置換基に依存する(Wohrら、J.Am.Chem.Soc.、118：9218(1994))。以下の化合物をチアゾリジン脱保護剤として使用してもよい：O-メチルヒドロキシルアミンおよび他のヒドロキシルアミン誘導体。ヒドラジンまたは任意のその誘導体、およびチオセミカルバジド(酸性条件下で求核性である)もまた使用してもよいが、この試薬ファミリーは前述のものよりも毒性が高く、縮合生成物(それぞれ、ヒドラゾン、チオセミカルバゾン)はオキシムより安定性が低い。好ましくは、トリス-(2-カルボキシエチル)-ホスフィン(TCEP)または同様の還元剤を脱保護反応において使用して、酸性条件下であっても迅速にかつ化学量論的にほとんどのペプチドおよびスルフヒロリルを還元する(Burnsら、J.Org.Chem.、56：2648-2650、1991)。好ましくは、チアゾリジン脱保護剤としてO-メトキシヒドロキシルアミンを使用する。O-メトキシヒドロキシルアミンは、下記に示すようにチアゾリジン環内のマスクしたアルデヒド官能基と反応し、オキシムを形成する：
2005515184.tif 000008
【００４８】
補助基は各連結工程後に除去してもよく、またはポリペプチド最終生成物が完全に合成された後にすべてを同時に除去してもよい。結合部分「D」の構造により、様々な除去手順が有効である。隣接するアミノ酸のNαに電子を供与するDの好ましい形態では、補助基の除去は、従来のペプチド合成において側鎖脱保護のために使用されるような、酸性条件により容易に実施される。そのような開裂のための例示的な酸としては、HF、TFA、トリフルオロメタンスルホン酸(TFMSA)などが挙げられる。いくつかの態様では、従来の捕捉剤、例えば5%のp-クレゾールなどを使用して、アリール、チオール、または他の反応性部分と結合または反応させてもよく、アミノ酸側鎖との望ましくない2次反応を阻止する。
【００４９】
合成が完了し最終生成物を精製した後、最終ペプチド生成物を従来技術、例えば、Creighton、Meth.Enzymol.、107:305-329(1984)；White、Meth.Enzymol.、11：481-484(1967)；Wetlaufer、Meth.Enzymol.、107:301-304(1984)；Misawaら、Biopolymers、51：297-307(1999)；Anfinsen、Science、181：223-230(1973)；などにより再び折り畳んでもよい。好ましくは、最終生成物は空気酸化、または以下のように再び折り畳まれる：還元した凍結乾燥生成物を、100mMトリス、10mMメチオニンを含む、pH8.6の1Mグアニジン塩酸塩(または、同様のカオトロピック剤)に(約0.1mg/mlで)溶解する。穏やかに一晩中撹拌した後、再び折り畳んだ生成物を従来のプロトコルを用いて逆相HPLCにより単離する。
【００５０】
実施例1
1,3-チアゾリジン-保護オリゴペプチドチオエステルの合成
この実施例では、アミノ酸配列
2005515184.tif 000009
を有するN末端4-置換1,3-チアゾリジン-保護オリゴペプチドチオエステルを、上記で概略を示し、かつ図6に図示したスキーム2に従い合成した。
【００５１】
ブロモアセチル化オリゴペプチドチオエステル(600)を以下のように調製した：
2005515184.tif 000010
を、0.1mmolスケールで上記のように、従来のペプチド化学を使用して合成した。その後、そのα-アミンをTFAで処理することにより脱保護し、続いて10%のジイソプロピルエチルアミン(DIEA)(Aldrich)で中和した。4mmolのBrCH2COOH(MW=133.91(555mg))を、3mLのジメチルホルムアミド(DMF)(6.65Mまたは310μL)に溶解した2mmolのジイソプロピルカルボジイミド(DIC)と結合させ、室温で15〜20分間インキュベートし、その後、溶液を樹脂上の脱保護オリゴペプチドに添加した。脱保護オリゴペプチドおよび樹脂をこの溶液中で少なくとも1時間、室温でインキュベートした。従来のニンヒドリン試験によりブロモアセチル化の完全性を測定した後、ブロモアセチル化オリゴペプチドおよび樹脂をDMFで、その後にDMSOで洗浄した。Bottiら(上記で引用)において記述されているように調製した、保護補助基、1-(4-メトキシフェニル)-2-(トリチルチオ)-エチルアミン(602)(1.5当量または0.15mmol)を2μLのDMSOおよび3当量のDIEA(0.3mmol)に溶解し51μLの溶液を得た。これをブロモアセチル化オリゴペプチドに添加し、一晩中インキュベートすると、
2005515184.tif 000011
が得られた。補助基のトリチル保護スルフヒドリルをその後、2度のTFA/TIS/H2O(95/2.5/2.5)処理により脱保護し(608)、（610）を得た。その後、オリゴペプチドおよび脱保護した補助基をDMFで洗浄した。ホルムアルデヒド(612、式中R1=R2=H)(樹脂上の補助基の100倍過剰、すなわち3mLのDMF、または約10mmolと結合させたH2Oの36%溶液、765μL)および500μLの酢酸で処理することにより、補助基の遊離スルフヒドリルを末端グリシンのNαと環化し、樹脂結合1,3-チアゾリジン保護オリゴペプチドチオエステル(614)を得た。4〜5時間インキュベートした後、HFにより完全に脱保護するため樹脂を洗浄し乾燥させた。乾燥後、HFを用いて複素環保護オリゴペプチドチオエステル(614)を脱保護し、樹脂から開裂させ(616)、最終生成物(618)を得た。
【００５２】
実施例2
Nα-(5-メトキシフェニル-1,3-チアゾリジン)-置換グリシンの合成
この実施例では、最初にNα-(補助基)-置換グリシンを形成し、続いて脱保護し、その後ホルムアルデヒドと反応させ環化することにより、複素環保護グリシンを合成する。トリフェニルメチルメルカプタン(Aldrich)、4mmolおよび4'-メトキシ-2-ブロモアセトフェノン(Aldrich)、4mmolを2mLのDMFに溶解し、その後4mmolのDIEAを添加する。混合物を室温で1時間撹拌し、その後、希塩酸に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。得られた油を酢酸エチルに溶解し、石油エーテルを添加することにより沈澱させ、その後、蒸発させると、白色固体の4'メトキシ-2-(トリフェニルメチルチオ)-アセトフェノンが得られる。この化合物1.44mmolおよびアミノキシ酢酸4.3mmolを20mLのオルトギ酸トリメチル(TMOF)に溶解し、その後、0.047mLのメタンスルホン酸を触媒として添加する。室温で48時間インキュベートした後、溶剤を蒸発させ、残渣を酢酸エチル中に入れ、1Mの硫酸水素カリウムで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、その後、粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、オキシム複合体を単離する。0.556mmolのオキシム複合体を2mLのテトラヒドロフラン(THF)に溶解し、1.67ｍLの1M BH3/THF複合体を添加する。24時間後、3mLの水および1.5mLの10N水酸化ナトリウムを添加し、混合物を1時間還流させ、その後、混合物を酢酸エチル(4x)で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。1-アミノ-1-(4-メトキシフェニル)-2-(トリフェニルメチルチオ)-エタンの最終生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。その後、1-アミノ-1-(4-メトキシフェニル)-2-(トリフェニルメチルチオ)-エタンを、塩基の存在下、BrNα-グリシンと反応させると、好ましくは固相支持体に付着された、Nα-(補助基)-置換グリシンが得られる。上記のようにTFA/TISで処理することによってこの化合物のスルフヒドリルを脱保護した後、ホルムアルデヒドを用いて処理することによって環化反応を実施する。最終生成物を従来の手段により固相支持体から開裂させる。
【００５３】
また、Boc保護Nα-1-(4'-メトキシフェニル)-2-(トリフェニルメチルチオ)-エチルグリシンを以下のように調製してもよい。4'-メトキシ-2-(トリフェニルメチルチオ)アセトフェノン2mmolおよびグリシンエチルエステルHCl塩2mmolを15mLのジクロロメタン中に懸濁させ、その後、1mLの四塩化チタン(1M溶液)およびDIEA6mmolを添加する。後者は窒素下で徐々に行う。室温で48時間インキュベートした後、2.5mLの無水メタノールに溶解したシアノ水素化ホウ素ナトリウム6mmolを添加すると、Nα-1-(4'-メトキシフェニル)-2-(トリフェニルメチルチオ)-エチルBoc-グリシンエチルエステルの最終生成物が得られる。この生成物1mmolを2mLのTHFに溶解した後、2mmolのLiOH水和物を添加する。一晩中撹拌し完全にエステルを加水分解した後、真空によりTHFを除去し、残りの材料を2mLのDMF、5mmolの二炭酸ジブチル(dibutyl dicarbonate)、および3mmolのDIEAと混合する。一晩中反応させた後、希HCl水溶液を添加し、最終生成物を酢酸エチルで3度抽出する。
【００５４】
実施例3
Nα-(1-メチル-5-メトキシフェニル-1,3-チアゾリジン)-保護オリゴペプチドチオエステルの連結
この実施例では、Nα-(1-メチル-5-メトキシフェニル-1,3-チアゾリジン)保護オリゴペプチドチオエステル(断片2)を溶液中で、N末端システインを有するオリゴペプチド(断片1)に連結させた。反応物の質量を電子噴霧質量分析(モデルEsquire、Brucker、ブレーメン、ドイツ)により決定すると、断片1では958、断片2では4008であった。
2005515184.tif 000012
【００５５】
チオエステルの形成
断片2をチオエステル生成樹脂上で合成した。このため、S-アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステルを、本質的にはHackengら(上記で引用)により記述されているような条件下でLeu-PAM樹脂に結合させた。得られた樹脂を、DMFに溶解した2Mのメルカプトエタノール、2Mのピペリジンを用いて30分処理することによりアセチル保護基を除去した後、0.2mmolのスケールでペプチド鎖伸長のための開始樹脂として使用した。断片2の合成のために、スルフヒドリル基に対し4倍モル過剰のアミノ酸を使用し、標準インサイチュー中和カップリングプロトコルを1時間使用して(Schnolzerら(上記で引用))、Boc-Leu-OHを用いてチオエステルを合成した。
【００５６】
ペプチド合成
Schnolzerら、Int.J.Peptide Protein Res.,40:180-193(1992)により記述されているように、段階Boc化学鎖伸長のためのインサイチュー中和/2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HBTU)活性化プロトコルを使用して、Applied Biosystemsからの特別仕様の433Aペプチドシンセサイザー上で、断片1および2の固相合成を実施した。各合成サイクルは、純粋TFAを用いた1〜2分処理によるNα-Boc-除去、1分DMF流洗浄、過剰DIEAの存在下における2.0mmolの予め活性化したBoc-アミノ酸との10分カップリング時間、および第2のDMF流洗浄から構成した。Nα-アミノ酸(2mmol)を3分間、過剰DIEA(6mmol)の存在下、1.8mmolのHBTU(DMFに溶解した0.5M)を用いて予め活性化した。Gln残基のカップリング後、TFAを用いた脱保護前後に、ジクロロメタン流洗浄を用い、起こりうる高温(TFA/DMF)触媒ピロリドンカルボン酸形成を阻止した。適用可能であれば、側鎖保護アミノ酸は、Boc-Arg(p-トリエンスルホニル)-OH、Boc-Asn(キサンチル)-OH、Boc-Asp(O-シクロヘキシル)-OH、Boc-Cys(4-メチルベンジル)-OH、Boc-Glu(O-シクロヘキシル)-OH、Boc-His(ジニトロフェニルベンジル)-OH、Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH、Boc-Ser(ベンジル)-OH、Boc-Thr(ベンジル)-OH、Boc-Trp(ホルミル)-OH、およびBoc-Tyr(2-Br-Z)-OH(Orpegen Pharma、ハイデルベルグ、ドイツ)とした。他のアミノ酸は側鎖保護せずに使用した。
【００５７】
補助基の遊離スルフヒドリルを、メチル置換ホルムアルデヒドで処理することにより末端グリシンのNαと環化させることを除き、実施例1で記述したように、N末端Nα-(1-メチル-5-メトキシフェニル-1,3-チアゾリジン)-保護グリシンを断片2上で形成した。
【００５８】
鎖構築が完了した後、捕捉剤として5%のp-クレゾールを用い、1時間フッ化水素無水物で処理することによってペプチドを脱保護し、樹脂から開裂させた。開裂後、両方のペプチドを氷冷ジエチルエーテルを用いて沈澱させ、0.1%のTFAを含むアセトニトリル水溶液に溶解し、凍結乾燥させた。WatersからのC18カラムを備えたRP-HPLCにより、緩衝液A(H2O/0.1%のトリフルオロ酢酸)に溶解した緩衝液B(アセトニトリル/0.1%のトリフルオロ酢酸)の直線勾配を使用し、214nmでUV検出することによりってペプチドを精製した。回収した画分を、Esquire機器(Brucker、ブレーメン、ドイツ)を用いる電子噴霧質量分析(ESMS)により、および分析用HPLCにより分析した。正しい生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥させた。
【００５９】
自然化学連結
非保護断片の連結を以下のように実施した：乾燥ペプチドを等モル量で(1.0mgの断片1および4.4mgの断片2)、6Mのグアニジン塩酸塩(GuHCl)、0.2Mのホスフェート、pH7.5に溶解し、pH約7の1〜5mMの最終ペプチド濃度を得、2%のチオフェノールを添加した。反応を一晩中実施し、HPLCおよび電子噴霧質量分析によりモニターした。その後、連結生成物を処理し、残存チオエステルを全て加水分解し、依然として存在する保護基を除去した。この目的のために、20%の2-メルカプトエタノールを添加し、ヒドラジンを添加することによりpHを9.0にシフトさせ、溶液を1時間、37℃でインキュベートした。チアゾリジン環を開環させるために、その後反応混合物を6MのHClを用いて酸性化しpH3.5とし、6Mのグアニジン塩酸塩、pH3.5に溶解した2MのO-メチルヒドロキシアミンを添加し、0.5Mの最終濃度を得た。N末端チアゾリジン環を完全に開環するには37℃で2時間インキュベートする必要がある。断片に対し10倍過剰のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンを添加し、15分インキュベートした後、調製用HPLCにより材料を精製した。ポリペプチド鎖を含む画分をESMSにより同定し、プールし、凍結乾燥した。
【００６０】
連結および開環反応の結果を図8A〜8Cのクロマトグラムにおいて示す。図8Aのピーク1は断片1であり、ピーク2は末端システイン間のジスルフィド架橋により形成される断片1の2量体である。ピーク3は複素環保護断片2である。ピーク3の複数のピークは複素環保護基中にキラル中心が存在するためである。図8Bのピーク4は断片1および2の連結生成物である。ピーク5はチオフェニル触媒である。図8Cのピーク6は脱保護連結生成物、すなわち、複素環保護基が開環したものである。図8Cのピーク7は再び、チオフェニル触媒である。
【００６１】
実施例4
拡張化学連結(非システイン残基での自然化学連結)のために適したN末端修飾アミノ酸ペプチド断片[N末端AA(Aux)-ペプチド]への共有結合捕獲戦略の適用
捕獲工程
文献：Villainら、Chem Biol.2001 Jul;8(7):673-9；Roseら、国際特許出願PCT/GB01/01803(国際公開公報第01/18367号)に記述されるように、配列Gly(Aux)YAKYAKAL(配列番号：4)(Aux=Nα-(1-(4-メトキシフェニル)-2-メルカプトエチル)のモデルペプチドを、室温で、最終pHが4.4の50%酢酸塩緩衝液0.1N 50%MeCN中に溶解し、その後、CHO機能化PEGA樹脂に添加する(図11)。パネルA〜Dは時間経過に伴う機能化支持体によるペプチドの捕獲を示す。パネルAのクロマトグラムのピーク1は捕獲反応の開始時の遊離ペプチド濃度を示す。パネルBおよびCのピーク1はそれぞれ、1h30mおよび3h30mの遊離ペプチドの濃度を示す。パネルDのクロマトグラムは、モデルペプチドに対応するピークが本質的に消失したことを示す。
【００６２】
溶離工程
その後、ペプチドの溶離を文献に報告されているように実施する：0.5M O-カルボキシメチルヒドロキシアミン(図12)または0.5M O-メチルヒドロキシルアミン(図13)を有する、酢酸塩緩衝液0.1N 10mM Tcep。図12では、0h0m時の溶離剤のクロマトグラム(パネルA)はモデルペプチドに対応するピーク(1)が存在しないことを示す。すなわち、時間0では、溶液中に放出された物質は存在しない。パネルB、CおよびDにおいてそれぞれ示されているピーク1は、それぞれ時間1h30m、3h30m、および24h0mであり、放出されたモデルペプチド濃度の累進的な増加を示す。図13では、放出の本質的に同じパターンが、パネルAのピーク(1)が存在しないこと、およびパネルB〜Dのモデルペプチド濃度の累進的な増加により証明される。図14は溶離された物質の質量スペクトログラムであり、主ピーク(1)に対応する質量がモデルペプチドの計算重量と等価であることを示す。
【００６３】
本発明の前記態様の記述は例示および説明目的のものである。これらの態様の記述が、包括的なものであり、開示したまさにその形態に本発明を限定するものであると考えるべきではなく、明らかに上記教示に鑑みれば多くの改変および変更が可能である。態様は本発明の原理を最もよく説明するために選択され記述されたものであり、そのため、当業者であれば、様々な態様で、熟考された特別な使用に適するように様々な改変を実施して本発明を最もよく利用することができる。本発明は添付の請求の範囲により規定されると考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】チオエステル修飾オリゴペプチドの共反応物がN末端システインを有するオリゴペプチドである、自然化学連結を示した図である。
【図２】本発明の複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を用いた、補助基の使用による自然化学連結(「拡張自然化学連結」)を示した図である。
【図３】本発明の複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を合成するためのスキーム1を示した図である。
【図４】本発明の複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を合成するためのスキーム2を示した図である。
【図５】本発明の複素環保護チオエステル修飾オリゴペプチド中間体を合成するためのスキーム3を示した図である。
【図６】4-置換1,3-チアゾリジン-保護オリゴペプチドチオエステルを合成するためのスキーム2の使用を示した図である。
【図７】N末端1,2アミノチオール部分の同時共有結合捕獲および保護を示した図である。
【図８Ａ】複素環保護オリゴペプチドチオエステルおよびモデルオリゴペプチドの連結の開始材料のクロマトグラムである(T=0)。
【図８Ｂ】12時間後の連結生成物のクロマトグラムである(T=12h)。
【図８Ｃ】脱保護後の連結生成物のクロマトグラムである(NOC添加後T=3h)。
【図９】共有結合捕獲精製手順のスキームである。
【図１０】非システイン部位での自然化学連結に適用される共有結合捕獲精製手順のスキームである。
【図１１】固体支持体上での捕獲工程を示した図である。11A：ELCペプチド共有結合捕獲T=0、ALIFS 1.0 220nm 20μlの反応物+30μl A inj=20μl。11B：T=1h30。11C：T=3h30。11D：T=24h。
【図１２】固体支持体からの溶離工程を示した図である。12A：ELCペプチド放出O-カルボキシメチルヒドロキシルアミン。HCl T=0。12B：T=1h30。12C：T=3h30。12D：T=24h。
【図１３】固体支持体からの溶離工程を示した図である。13A：ELCペプチド放出O-メチルヒドロキシルアミン。HCl T=0。13B：T=1h30。13C：T=3h30。13D：T=24h。
【図１４】図12および13の溶離物質の質量スペクトルである。
【配列表】
2005515184.tif 000013
2005515184.tif 000014
【図１】
2005515184.tif 000027
【図２】
2005515184.tif 000028
【図３】
2005515184.tif 000029
【図４】
2005515184.tif 000030
【図５】
2005515184.tif 000031
【図６】
2005515184.tif 000032
【図７】
2005515184.tif 000033
【図８Ａ】
2005515184.tif 000034
【図８Ｂ】
2005515184.tif 000035
【図８Ｃ】
2005515184.tif 000036
【図９】
2005515184.tif 000037
【図１０】
2005515184.tif 000038
【図１１】
2005515184.tif 000039
【図１２】
2005515184.tif 000040
【図１３】
2005515184.tif 000041
【図１４】
2005515184.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月15日(2004.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
本発明の前記態様の記述は例示および説明目的のものである。これらの態様の記述が、包括的なものであり、開示したまさにその形態に本発明を限定するものであると考えるべきではなく、明らかに上記教示に鑑みれば多くの改変および変更が可能である。態様は本発明の原理を最もよく説明するために選択され記述されたものであり、そのため、当業者であれば、様々な態様で、熟考された特別な使用に適するように様々な改変を実施して本発明を最もよく利用することができる。本発明は添付の請求の範囲により規定されると考えるべきである。
【配列表】
SEQUENCE LISTING                               
<110> GeneProt, Inc.
<120> Chemical Prptide Ligation with Three or More
Components
<130> TO-A0419
<140> JP   2003-544070
<141> 2002-11-14
<150> US   60/336,459
<151> 2001-11-14
<150> US    60/334,268
<151> 2001-11-29
<150> US   60/353,823
<151> 2002-01-31
<160> 7                             
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic
oligopeptide (fragment 1) reactant having
N-terminal cysteine, artificial model peptide
<400> 1
Cys Tyr Ala Lys Tyr Ala Lys Leu                                  
1               5            
<210> 2
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic
N-terminal 4-substituted 1,3-thiazolidine-protected
oligopeptide thioester, artificial model peptide
<400> 2
Gly Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Ser Ala Asn  
1               5                  10                  15    
Pro Glu Lys Lys Ala Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Leu Leu  
20                  25                  30        
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:synthetic
bromoacetylated oligopeptide thioester, artificial
model peptide
<400> 3
Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Ser Ala Asn Pro  
1               5                  10                  15    
Glu Lys Lys Ala Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Leu Leu      
20                  25                  30    
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:N-terminal
modified amino acid peptide fragment [N-terminalAA
(Aux)-Peptide], artificial model peptide
<220> 
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa = alpha-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2-mercaptoethyl
Gly
<400> 4
Xaa Tyr Ala Lys Tyr Ala Lys Ala Leu                              
1               5                
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial Sequence:amino acid
sequence orders amino acids from the N-terminus to
the C-terminus
<400> 5
Asp Lys Leu Leu Met 
1               5
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial
Sequence:resin-boundoligopeptide thioester with
trityl-protected sulfhydryl of auxiliary group
<220> 
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa =
alpha-N-(1-(4-methoxyphenyl)-2-(tritylthio)-ethyl-
Gly
<220> 
<221> MOD_RES
<222> (32)
<223> Xaa = Leu coupled to resin by -(CO)-S- (thioester)
group
<400> 6
Xaa Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Ser Ala Asn 
1               5                  10                  15    
Pro Glu Lys Lys Ala Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Leu Xaa 
20                  25                  30        
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220> 
<223> Description of Artificial
Sequence:alpha-N-(1-methyl-5-methoxyphenyl-
1,3-thiazolidine)-protected oligopeptide thioester
(fragment 2) synthetic oligopeptide reactant,
artificial model peptide
<220> 
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Xaa =
alpha-N-(1-methyl-5-methoxyphenyl-1,3-thiazolidine)-
Gly
<220> 
<221> MOD_RES
<222> (32)
<223> Xaa = Leu coupled via thioester to PAM resin
<400> 7
Xaa Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Ser Ala Asn 
1               5                  10                  15    
Pro Glu Lys Lys Ala Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Leu Xaa 
20                  25                  30        
【国際調査報告】
2005515184.tif 000043
2005515184.tif 000044
2005515184.tif 000045