(57)【要約】エレクトロスプレーイオン化マススペクトロメトリー（ＭＳ）にインライン結合した直列電気化学的フローセルは、生物学的に関連のある酸化−還元（レドックス）反応の急速な電気化学的（ＥＣ）研究を提供する。フローインジェクションによって導入された化合物を急速に電気分解し、生成物をＭＳによってモニターする。直列クーロメトリックＥＣ−ＭＳによって、関連する化合物の反応性、結果として得られる「関連物質」の形成、ならびに代謝的および化学的「ソフトスポット」の決定のハイスループット研究が可能となる。こうして、直列クーロメトリックＥＣ−ＭＳは、一定に、再現可能に、大きな化合物ライブラリーに適用され、薬物様特性の予測と評価についての「モデル化に適した」データを生成することができる力学的なプローブを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのレドックス反応のための少なくとも１つの電気化学的フローセルを構成すること、
前記少なくとも１つの電気化学的フローセルに少なくとも１つの溶液を供給すること、
前記少なくとも１つの溶液に関連する化学構造的情報を取得すること、および
前記化学構造的情報および前記少なくとも１つの電気化学的フローセルの構成に基づいて、前記少なくとも１つの溶液の特徴づけを行うこと、
を含む方法。
【請求項２】
特徴づけは、反応生成物のプロファイルを生成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
特徴づけは、前記少なくとも１つの電気化学的フローセルの電圧に基づいて、前記少なくとも１つの電気化学的フローセルの電流を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの電気化学的フローセルの構成は、前記少なくとも１つの電気化学的フローセルを、一定電位および変化する電位の少なくとも１つに設定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの溶液は、少なくとも２つの化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
化学構造的情報の取得は、
前記少なくとも１つの溶液を前記少なくとも１つの電気化学的フローセルに供給する前に化学構造的情報を取得すること、および
前記少なくとも１つの溶液を前記少なくとも１つの電気化学的フローセルに供給した後に化学構造的情報を取得すること、
の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記電気化学的フローセルの少なくとも２つは、直列に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記電気化学的フローセルの少なくとも２つは、並列に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記電気化学的フローセルの少なくとも１つは、前記化学構造的情報を提供する装置に直列に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記電気化学的フローセルの少なくとも１つは、前記化学構造的情報を提供する装置に並列に配置されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの溶液の特徴づけは、前記少なくとも１つの溶液に関連するイオン存在量情報を取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
化学的構造情報の取得は、前記少なくとも１つの溶液をマススペクトロメーターに供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
化学的構造情報の取得は、前記少なくとも１つの溶液をＮＭＲスペクトロメーターに供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
化学的構造情報の取得は、前記少なくとも１つの溶液を赤外線スペクトロメーターに供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
化学的構造情報の取得は、前記少なくとも１つの溶液を紫外線／ＶＩＳスペクトロメーターに供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
化学的構造情報の取得は、前記少なくとも１つの溶液をエバポレイティブ光散乱検出器に供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
化学的構造情報の取得は、前記少なくとも１つの溶液を電気化学的検出器に供給することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの溶液の特徴づけは、前記少なくとも１つの溶液中の少なくとも１つの化合物の化学的同一性の変化をモニターすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記レドックス反応は、酸化反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記レドックス反応は、還元反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記レドックス反応は、脱アルキル化反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記レドックス反応は、水酸化反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記レドックス反応は、キノン形成反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記レドックス反応は、アダクト形成反応を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
前記レドックス反応は、アミトリプチリン、ノルトリプチリン、イミプラミン、プロプラノロールおよびタモキシフェンからなる群から選択される化合物のＮ-脱アルキル化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記レドックス反応は、２-ヒドロキシエストラジオールおよび２-ヒドロキシエストラジオールからのキノン形成と、アダクト形成の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記反応は、エストラジオールからの、芳香族水酸化、キノン形成およびアダクト形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記レドックス反応は、２および４-メトキシエストラジオールからのＯ−脱アルキル化、キノン形成およびアダクト形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記レドックス反応は、タモキシフェンのＯ−脱アルキル化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記レドックス反応は、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（N-butyldeoxynorjirimycin）のＮ−酸化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記レドックス反応は、メチオニンおよびホモシステインのＮまたはＳ−酸化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記レドックス反応は、２，４−ジヒドロキシ安息香酸からのキノン形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記レドックス反応は、スルホ酸化反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの溶液は、少なくとも１つの求核性プローブを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの溶液の特徴づけは、反応性の相対的な率を決定することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの溶液の特徴づけは、
前記少なくとも１つの溶液を前記少なくとも１つの電気化学的フローセルに供給する前後に前記少なくとも１つの溶液の特徴づけを行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの溶液を少なくとも１つの電気化学的フローセルに再び存在させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
今日の製薬開発プロセスにおける主要な焦点は、後期段階での化合物の破損の発生率を減少させることである。そのような破損(attrition)は通常、吸収、生体内分布、代謝、排泄、毒性（ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ）および安定性を含む好ましくない特性の結果である。この問題に対処するために現在、予測アッセイ（例えば、ＡＤＭＥ／Ｔｏｘ）が薬物の発見および開発の非常に早期の段階で実行されている。
【０００２】
代謝および毒性を研究するためのin vitroでの生物学的方法は、候補化合物の代謝経路および潜在的相互作用を理解する目的のために非常に有用である。しかしながら、生物学的抽出物の使用を含むアッセイによって得られたデータは、時に絶対的および相対的な酵素活性の変化、共因子の損失、非特異的反応およびその他の変数によって損なわれる。これらの問題によって、大きな化合物ライブラリーのハイスループットプロファイルのための、広く適用可能な「モデル化に適した」ＡＤＭＥ／Ｔｏｘデータの生成が制限される。このため代替的および相補的な技法が、薬物様（drug-like）特性のよりタイムリーな予測、およびより高度に集中した発見および開発の努力を目標として模索されている(High-Throughput ADMETOX Estimation: In Vitro & In Silico Approaches、F. Darvas and G. Dorman Eds.(Eaton Publishing、BioTechniques Press、MA、USA、2002)。
【０００３】
酸化還元（レドックス）反応は、大半の製剤の化学的および生物学的特性にとって重要であることは明らかである。生体異物の化合物の最も一般的なフェーズＩ代謝的生体内変換反応は酸化である（The Pharmaceutical Basis of Therapeutics、Sixth Edition、A. G.Gilman、L. S. Goodman and A. Gilman Eds.(Macmillan Publishing、NY、USA 1980)、pp. 12-20))。実際、化学分解は、酸化性メカニズムを介して進行することが多く（K. C. Waterman、R. C. Adami、K. M. Alsante、I. Hong、M. S. Landis、F. Lombardo、およびC. J. Roberts、Pharmaceutical Development and Technology 7、1-32 (2002)）、また、多くの有機化学物質の毒性は、レドックスベースの代謝的活性化と関連して、反応性親電子種を形成する（Free Radicals in Biology and Medicine、Third Edition、B.Halliwell and J. M. C. Gutteridge、J. M. C. (Oxford University Press、NY、USA、1999)）。治療薬の作用およびそれらが目標とする生理学的条件は、レドックス代謝および酸化性ストレスと関連していることが非常に多い（in Free Radicals in Biology and Medicine, Third Edition, B. Halliwell and J. M. C. Gutteridge、J. M. C. (Oxford University Press、NY、USA、1999)）。興味深いことに、僅かな割合の有機化学物質だけが電気化学（ＥＣ）反応を容易に起こす一方で、認可された製剤化合物の殆どは容易に酸化または還元され得る（I. Jane、A. McKinnonおよびR. J. Flanagan、J., Chromatogr. 323 19 1-225 (1985)）。
【０００４】
クーロメトリックおよびアンペロメトリックＥＣフローセルは、特異性の高い（電位依存性）および再現可能なＥＣ反応を起こす、それらの能力に基づいて、レドックス活性化学物質の研究のためのＨＰＬＣ検出器（ＨＰＬＣ-ＥＣＤ）として広く使用されるようになった。これまで、ＥＣフローセルは主に、抗酸化剤、酸化性ストレスのマーカー、神経伝達物質、薬剤、およびビタミン類の定量的生物学的分析のために使用されてきた（Progress in HPLC-HPCE Vol. 6: Coulometric electrode array detectors for HPLC, I.N. Acworth, M. Naoi, H. Parvez, and S. Parvez Eds. (VSP, Utrecht, The Netherlands 1997)）。ＥＣフローセルの更なる適用は、レドックス反応を生じさせるための単一の手段としてのそれらの使用、その後マススペクトロメトリーによって研究される生成物、および種々の形態のスペクトルスコピーを含む。
【０００５】
Matsonの米国特許第4,511,659号は、サンプル溶液中の選択された物質を制御された条件下で、試験用電極または電極群の下流で測定する前に、連続的に酸化および還元するための、複数の電量的に高効率の電気化学的セルを直列に含む電気化学的検出システムを開示している。より詳細には、米国特許第4,511,659号によれば、サンプル溶液（例えば、体液）を、好適なクロマトグラフィーのカラムを通過させ、その溶離液を、直列の電気化学的に分離したインラインのクーロメトリック電極に、サンプル溶液中の物質の連続的な酸化還元のための直列の「ゲート」を確立し、それによって、サンプル溶液に含有された選択された、緩衝する、および電気化学的不可逆な物質をスクリーニング（除去）する条件下で流して接触させ、一方で選択された電気化学的逆的生成物を下流の電極上に検出および測定するために通過させる。ゲート電極系列は、インラインに１またはそれ以上、好ましくは、６以上のクーロメトリー測定電極のアレイに続いており、それぞれは、電気化学的に可逆性の関連する化合物（例えば、神経伝達物質）を検出および測定するために、それぞれが多孔性電極ベースの物質、例えば、フリット化したグラファイト、フリット化した炭素、もしくはフリット化したその他の導電性物質から形成されている。
【０００６】
米国特許第4,511, 659号に報告されているように、電気化学的分析へのこのアプローチには、いくつかの有利な効果がある。反応における長期浮動（Long-term drift in response）は、実質的に１００％のシグナルを取得することによって効果的に除去される。実質的に１００％の物質を分析することができることから、純度不明の化合物をファラデーの法則において具体化されている電気化学反応の基本原理に関連付けることによって、それらのアッセイが可能となる。実質的に１００％の効率に基づいてクーロメトリック電極は、インラインに連続している検出器において化合物の連続的な酸化および/または還元を可能とすることは、最終的に、およびアレイおよびゲートセルの最終的な開発にとって最も重要である。米国特許第4,511,659号に記載されている検出システムの感度の改良、特に、２以上の活性試験電極がスクリーニング電極に追従するという記載は、血清濾過物の直接的な注入を可能にし、また、多数の溶解性成分の電気化学的挙動のような、カテコールアミンを備えた化合物の再現可能なパターンの生成を可能にする。これによって種々の傷害または疾患状態の診断、またはおそらく、さらには予防的診断のパターン認識も行うことが可能となる。
【０００７】
Matsonの米国特許第4,863,873号は、フェムトグラムレベルで単一のサンプル中に数百もの化合物を溶解し、検出し、それによって個体の小分子インベントリーもしくは代謝経路パターンを提供するシステムを記載している。米国特許第4,863, 873号に教示されているように、小分子インベントリーは、個体のレドックス酵素の経路の基礎となる活性および分布を反映し、したがって、酵素を決定するゲノムの操作的測定を反映するものと考えられる。したがって、個体の小分子インベントリーは、個体の健康状態および/または疾患状態を決定するために使用される。複数の個体からのパターンを相関させることによって、障害または疾患状態または状況のメカニズムを理解でき、ひいては、そのような傷害、疾患の状態または状況の治療、治癒または抑制を導く薬理学的開発への合理的な経路が提供される。
【０００８】
上述の従来技術の記載は主に、ESA, Inc.のPCT/US92/00375号から導かれる。そこには、公知の、またはこれまで診断されたケースのデータベースと、小分子イベントリーの生化学的分析データとの比較に基づいて、個体を診断、分類または識別する方法が記載されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、in vivoでの薬物代謝およびex vivoでの化学的レドックス反応を、電気化学的にモデル化するための反応セルとして、電気化学的セルを採用する。本発明によって採用されるＥＣセルは、さらなる使用または特徴づけのために、酸化または還元生成物の合成のために用いられる。ＥＣ反応の生成物は、時に反応性が高いため、添加化合物（例えば、求核性プローブ）をサンプル溶媒もしくは移動相のいずれかへの組み込むことによって、反応性および反応メカニズムのさらなる特徴づけをすることができる。これによって、薬物活性または代謝、薬物毒性、薬物化学的および生物学的反応性の医学的構成やメカニズムの予測への洞察が可能になり、また、薬剤ライブラリー化合物の薬物様特性を評価することが可能になる。
【００１０】
ＥＣと、マススペクトロメトリ（ＥＣ−ＭＳ）などの質的データ（例えば、化学構造、同一性、化学的性質などに関する情報）を提供することが可能な他の分析装置とを直列に接続することは、生物学的および化学的レドックスプロセスへの洞察を提供するツールとしてこれまでに記載がある。こうしたアプローチの例としては、直接注入、フローインジェクション分析（ＦＩＡ）およびプレおよびポストカラムＨＰＬＣがあげられる。Jurvaらは、Ｎ−脱アルキル化、スルホ酸化、脱硫反応を模倣したクーロメトリックＥＣを使用した(U. Jurva、H. V. WilkstromおよびA. P. Bruins、Rapid Commun. Mass Spectrom. 14,529-533 (2000))。Volkらは、プリン代謝を模倣したクーロメトリックセルを使用した(K. J. Volk, R. A. YostおよびA. Brajter-Toth,Anal. Chem. 61,1709-17 17 (1989))。DengおよびVan Berkelは、ドーパミンの酸化生成物、およびそれに続くベンゼンチオールとそれらとの反応を研究するために薄層ＥＣを用いた（H. DengおよびG. Van Berkel, Electroanalysis 11, 857-865 (1999)）。Getekらは、アセトアミノフェンからの反応中間物質、Ｎ-アセチル-ｐ-ベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ）の酸化的形成および注入された求核物質を用いたフォローアップ化学的付加反応を研究した（TA. Getek, W. A. Korfmacher, T. A. McRae, およびJ. A. Hinson, J Chromatogr. 474, 245-256 (1989)）。
【００１１】
本発明は、化学的および生物学的に関連するレドックス反応をモニターおよび媒介し、in vivoでの薬物代謝の特異的な経路および分解の化学的経路をシミュレーションするための、マススペクトロメトリ（ＭＳ）などの質的分析装置にインライン結合したＥＣフローセルの使用に関する。すなわち、本発明は、生物学的および化学的に関連するレドックス反応または経路を模倣および/またはモニターするためのＥＣフローセルを採用する。本発明によれば、ＥＣフローセルは、分離して、もしくは分離せず（例えば、ＨＰＬＣ、電気泳動法）、質的分析装置の前にインラインで使用され、注入された化合物の前分析電気分解を可能とする。好ましい態様は、電量的に効率的な電気分解（すなわち、１００％反応に近づく）を可能にする多孔性フロースルー（フリット化）ＥＣ作用電極を用いる。本発明に用いられるＥＣセルは、種々の分析装置の交換（例えば、ナノから実験規模まで）および実験条件（例えば、流速、ｐＨ）での使用に互換可能かつ最適であるべきであるので、流通(flow-by)、直交流、ならびに付加的導電物質（例えば、白金、炭素）および化学的に改良された物質を含む付加的フローセル幾何学形状を使用することもできる。例えば、低流速（例えば、＜０．１ｍＬ/分）で、フロースルー（フリット化）作用電極を使用することは、過剰な容積およびメモリー効果ゆえに実用的でないかもしれない。したがって、薄層または低ボリューム構造に好適な他の幾何学形状が好ましいだろう。電極的改良としては、３次元構造および化学的特性（親水性、Ｈ結合等）に基づく化合物の選択的電気分解を可能にする分子インプリンティングを含んでもよい。
【００１２】
ある態様において、所与の注入のために、ＥＣセルを一定（ＤＣ）電位に保ち、化合物の酸化または還元の結果生じる電流を測定する。次いで反応生成物を、マススペクトロメトリ；ＮＭＲ、ＵＶ/ＶＩＳ、蛍光発光およびＩＲスペクトロスコピー；電気化学、およびエバポレイティブ光散乱検出（ＥＬＳＤ）を含む質的データを提供することが可能な分析装置によってモニターする。各化合物がＥＣフローセルから溶離した後、電位が変化する。自動化シーケンスは、親化合物のＥＣ反応の急速な生成および親化合物および反応生成物の双方の電位の関数としての質的特徴づけを行うことができる（例えば、ボルタンメトリー−マススペクトロメトリーおよびボルタンメトリー−ＮＭＲスペクトロスコピー）。更なる態様は、環状、線形掃引、およびパルスボルタンメトリーなどの時間−電位の波形の使用を含む。これらの付加的な波形および別の作用電極物質の使用によって、金作用電極上の炭水化物およびＰｔ作用電極上の過酸化物のパルス電気化学的検出によって明らかなように、電気化学的に反応することができる化学物質の範囲を有意に拡大するであろう。
【００１３】
さらに、米国特許第4,863,873号に教示されているように、多数の直列電極を、分析装置として使用することによって、血漿などの複雑なマトリックスおよびin vtroでの反応混合物におけるレドックス活性の定量的および質的パターンが提供される。この装置のスタンドアロンもしくはパラレルな質的装置としての使用も検討される。
【００１４】
本発明の更なる特徴および利点は、添付の図面を参照しながら、以下の詳細な説明から理解できるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明を実施する際、レドックスプロセスをモニターしながら、薬物代謝を模倣するために電気化学（ＥＣ）反応を用いる。ＥＣセルは、インライン反応装置として使用する。低流での自動インジェクションによって、効率的なＥＣ反応および生成物の急速な分析が可能となる。
【００１６】
図１Ａに関して、モデル１１００ ＬＣ／ＭＳＤ単一四重極マススペクトロメータ１０（Agilent Technologies、Palo Alto、CA、USA)を、Coulochem（登録商標）ＩＩＩ ＥＣＤ１２およびモデル５０２１クーロメトリックセル１４(ESA Inc.、Chelmsford、MA、USA)と組み合わせて使用した。
【００１７】
化合物を自動化シーケンスによって特徴付ける。ＥＣ電位を、例えば、０〜１２００ｍＶ（vs. Pd）から、例えば、２００ｍＶの増分を変化させる。ＥＣ電流およびＭＳイオン存在量を特異的な質量対電荷の比率（ｍ／ｚ）でモニターする。本発明によれば、ＥＣ（例えば、クーロメトリックまたはアンペロメトリック）および種々の薬物候補物質の反応生成物のプロファイルを再現可能に取得することができる。親化合物のピーク領域は、反応生成物の同時形成を伴うＥＣ反応に逆比例する。
【００１８】
具体的な例によって、低い電位で、より容易に酸化される化合物の主要な生成物、例えば、アミトリプチリン（ＡＭＩ）およびイミプラミン（ＩＭＩ）は、クロマトグラフ的に、ｍ/ｚによって、それらのそれぞれのＮ−脱メチル化哺乳動物メタボライト、ノルトリプチリン（ＮＯＲ）およびデシプラミン（ＤＥＳ）に対応することが認められた。一方、ＡＭＩおよびＩＭＩの第２の反応生成物は、全て主に高電位で発生するＮＯＲおよびＤＥＳの第１の反応生成物に部分的に対応することが認められた。
【００１９】
移動相（電解質が添加された５０％メタノール水溶液）に希釈された化合物（各２００ｎｇ）をＦＩＡによって、流速０．１ｍｌ／分でシステムに導入した。急速な電気分解を行う化合物および生成物をＭＳによってモニターした。複数の酸化的電位（例えば、−１００、３００、７００、１１００ｍＶ vs. Pd 参照）で各化合物を分析した。基質−生成物の対を用いて、電位の関数として（すなわち、ボルタンメトリーマススペクトロメトリ、ＶＭＳ)フェーズＩタイプ生成物形成の研究における援助を行った。フェーズＩＩタイプ抱合の研究（すなわち、電気化学的に生成された求電子の化学的フォローアップ付加反応)は、求核性化合物（例えば、グルタチオン、ＧＳＨ）を上記ボルタンメトリー実験の結果に基づいて選択された電位において共注入することによって達成した。
【００２０】
これらの研究に用いられるＥＳＡモデル５０２１クーロメトリックＥＣセルは、再現可能かつ高効率（＞９５％)で、最大１ｍｌ／分の流速での電気分解が可能であった。電気分解の効率は、多孔性炭素作用電極（図１Ａ）の３次元表面積によってもたらされる。これらの特性およびセルの高い圧力性能は、エレクトロスコピー（ＥＳＩ）に使用するのに好適な流速、大気圧化学的イオン化およびＬＣ−ＭＳインターフェースでのＦＩＡおよびプレおよびポストカラムＬＣ−ＭＳでの使用のための汎用性を提供する。フェーズＩタイプＥＣトランスフォーメーションの研究のために、ＥＣ電流の変化、および対応する基質の消費（酸化）、関連する生成物形成を、電極電位の関数としてモニターした。これらの研究において、流速０．１ｍｌ／分の溶媒を、ＥＳＩとともに用い、１つの分析を２．５分以内に完了させた。フェーズＩ酸化反応および電位依存性共有結合（フェーズＩＩ）の双方の研究をするために、各化合物の特徴付けのための合計時間は約１５分必要であった（６分析／化合物）。しかしながら、ＥＣセルの効率がよければ、高流速のより高いスループットが可能である。
【００２１】
タモキシフェンのＥＣ酸化に関連する生成物イオンを図２Ａに示す。低電位で、最も多量のイオンがプロトン付加されたタモキシフェン（ｍ／ｚ３７２）に対応した。電位が増加するにつれて、タモキシフェンの存在量は、対応するｍ／ｚ ３５８の存在量の増加に対応して指数関数的に減少した。この−１４の質量シフトは、Ｎ−脱メチル化、タモキシフェンの第１のin vivoフェーズＩ反応と一致する。より高い電位、付加、低存在量では、イオンがＮ−脱エチル化（−２８）、０−脱アルキル化（−７３）およびＮまたはＣ酸化（＋１６)に対応する質量シフトを伴って観察された。これらの小生成物の相対的存在量は、対応するマススペクトル（ＥＣ＝１０００ｍＶ）に示されている（図２Ｂ）。これらの質量シフトはまた、酵素的酸化実験において通常認められるものにも対応する。質量シフトのみが、絶対的な構造的同定にとって決定的であるわけではないことを認識しなければならない。しかしながら、これらのＶＭＳデータは、クーロメトリックＥＣ−ＭＳが、薬物候補物質の早期のプロファイリングのための、関連する基質および代謝的および化学的「ソフトスポット」の決定に対応する、相対的な基質反応性の急速な評価をすることが可能であるという有意な証拠を提供する。図２Ｃに示されるマススペクトルは、最も存在量が多く、低い電位の、アミトリプチリンの酸化生成物は、その第１の生物学的メタボライトノルトリプチリンであったことの証拠を提供する。続いて起こる、高い電位でのこの生成物の反応によって、ノルトリプチリン自身に類似する生成物イオンが導かれる。
【００２２】
表１は、付加化合物についてのデータをまとめたものである。予期されたフェーズＩ水酸化、Ｎ−脱アルキル化、Ｏ−脱アルキル化、Ｎ−酸化、脱水素化、キノン形成および/またはスルホ酸化反応に対応する電位依存性質量シフトが、殆どのモデル基質−生成物対において高い存在量の生成物イオンとして観察された。相対的なイオン存在量（すなわち、マススペクトラム）は、６ヶ月間集中的に使用した後でも非常に再現性が高かった（データは示さず）。芳香族水酸化およびＯ-脱アルキル化の証拠は、いくつかの化合物において、更なる反応の最終生成物に基づいて推論される（例えば、２−メトキシエストラジオールのＯ−脱アルキル化は、キノン形成の論理的な前提条件である）。７−エトキシクマリンのＯ−脱アルキル化は、これまでの報告同様、観察されなかった（B. Cavalieri、P. Devanesan、M. Bosland、A. Badawi、およびE. Rogan、Carcinogenesis 23,329-333 (2002))。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
記載されたＥＣアプローチは、酵素レドックス反応の基質特異性も、生物学的酸化酵素系の範囲の広がりも持たないが、一方、in vitroでの生物学的アッセイと比較したとき、それは、多くの利点を有している（下の表２にまとめた）。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
図３は、代表的な化合物の酸化によって得られた最も存在量の多い生成物イオンの結果をまとめたものである。反応の種類および相対的な容易さ（すなわち、電位）を各分子の可能性のある酸化部位とともに示す。研究対象の化合物の殆どにおいて、質量シフトは、予期された酵素フェーズＩ酸化反応に対応した。予期されたように、特定の生物学的反応（例えば、７−エトキシクマリンのＯ−脱アルキル化、脂肪族Ｃ−酸化）は、電気化学的に模倣されなかった。しかしながら、これらのデータは、文献と一致して、生物学的なレドックス代謝の研究との有意な全体的関連性を示している。さらに、このＥＣ-ＭＳアプローチの性質は、化学的酸化性の分解に関連する傾向の評価に非常に当てはまる。したがって、このインラインクーロメトリックＥＣ−ＭＳアプローチは、関連する化合物の反応性、「関連する物質」（メタボライトおよび崩壊剤）の得られる形成および、薬物候補物質の早期プロファイリングのための代謝的および化学的「ソフトスポット」の決定の急速な研究手段を提示する。
【００２７】
その他の薬物を研究した。例えば、アセトアミノフェンは、非常に頻繁に投与される薬物であり、反応性ＮＡＰＱＩを形成するための、その酸化的代謝活性化は広く、ヒトにおける肝毒性効果に必須の成分であるとみなされている(P. Eyer、Environ Health Perspect. 102,123-132 (1994))。反応性求電子は、広範囲の化学的構造からレドックス代謝を介して生じ、典型的に共有結合もしくは小分子および大分子（例えば、ＤＮＡ、蛋白質、ペプチド、脂質）への他の改良を含む毒性プロセス、レドックス循環、酸化防止剤/スカベンジャーの枯渇および酸化的ストレスの他のエレメントの種々のアレイにおいて作用すると考えられていることが、多くの遡及的研究によって示唆されている。したがって、ライブラリー候補化合物が同様にレドックスベースの代謝的活性を起こし、反応的求電子性種を形成する傾向は、薬学的開発において考慮すべき主な事項である。図３に示されているように、アセトアミノフェンおよび複数の他の化合物のＥＣ酸化の結果、求電子性キノイド種の形成を示唆する質量シフトを引き起こす。これらの製造物をさらに調べるために、求核性化合物を各溶液に添加し、試験化合物と共注入し、ＥＣ−ＭＳが代謝的活性化およびその結果得られる求核物質との反応をモデル化することができるかどうかを調べた。図４におけるマススペクトルは、アセトアミノフェンのＮＡＰＱＩ（ｍ／ｚ １５０）への酸化によって得られるモノ（ｍ／ｚ ４５７）およびジグルタチオニル（ｍ／ｚ ７６２）添加物を示すイオンの明確な証拠である。図５は、アセトアミノフェンと研究対象の付加化合物の可能性のあるＥＣ反応生成物をまとめたものである。構造的アナログ、４−アミノフェノールの酸化の結果、反応性キノンイミン（ｍ／ｚ １０８）、モノグルタチオニル（ｍ／ｚ ４１５）およびジグルタチオニル（ｍ／ｚ ７２０）添加物を示す生成物イオンが生じる。ＢＨＴ酸化の結果、キノンメチド（ｍ／ｚ ２１９）およびモノグルタチオニル添加物（ｍ／ｚ ５２６）を示すイオンが生成する。エストラジオールおよびメタボライトについては、プロトン化され、脱プロトン化されたカテコールエストロゲン−グルタチオン（ＣＥ-ＳＧ）抱合体の形成に対応する陽イオン（ｍ／ｚ ＋５９４）および陰イオン（ｍ／ｚ −５９２）は、ＣＥでは３００ｍＶ、メチルエーテルメタボライトでは７００ｍＶ、およびエストラジオールでは９００ｍＶのＥＣ電位で最大の存在量に達する（図６）。これらの反応は、エストラジオール（Ｅ２）、２−メトキシエストラジオール（２ＭＥ）、４−メトキシエストラジオール（４ＭＥ）、２-ヒドロキシエストラジオール（２ＨＥ）および４-ヒドロキシエストラジオール（４ＨＥ）について証明された。これらの結果は、本発明の技法が、生物学的に関連のある化学反応、例えば、アセトアミノフェン（P. Eyer、Environ HealthPerspect. 102、123-132 (1994))、４-アミノフェノール（ＲＥＦ １１）およびＢＨＴ(K. Yamamoto、K. Sachiko、K. TajimaおよびT. Mizutani、Biol.Pharm. Bull. 20 571-573 (1997)）、サイトトキシンおよびエストロゲン依存性発癌性(B. Cavalieri、P. Devanesan、M. Bosland、A. BadawiおよびE. Rogan、Carcinogenesis 23、329-333 (2002))に関連する生体内変換を生じさせることができることを証明している。
【００２８】
プレカラムＥＣ酸化を用いたＨＰＬＣを用いて、マルチプルイオンクロマトグラム（図７Ａ、７Ｂ）によって求電子性キノンおよびＣＥ-ＳＧ抱合体の電位依存形成を確認する。これらの結果から、この技法は、エストロゲン依存性発癌性に関連する提案された生体内変換反応を非常に緊密にシミュレーションすることが可能であることがさらに示される（B. Cavalieri、P. Devanesan、M. Bosland、A. BadawiおよびE. Rogan、Carcinogenesis 23、329-333 (2002)）。電気化学的酸化のための該提案された反応経路を図９に示す。
【００２９】
以下の生物学的代謝的反応を、特異的な電気化学電位での本発明のＭＳ測定と併せて、ＥＣ反応セルを用いて模倣した：
１）アミトリプチリン、ノルトリプチリン、イミプラミン、プロプラノロールおよびタモキシフェンのＮ−脱アルキル化; 
２）２および４-ヒドロキシエストラジオールからのキノン形成と、アダクト形成の組み合わせ; 
３）エストラジオールからの芳香族水酸化と＃２反応の組み合わせ; 
４）２および４−エストラジオールからのＯ−脱アルキル化と＃２反応の組み合わせ; 
５）タモキシフェンのＯ-脱アルキル化; 
６）Ｎ-ブチルデオキシノジリマイシンのＮ−酸化;
７）メチオニンおよびホモシステインのＮまたはＳ酸化；
８）２，４−ジヒドロキシ安息香酸からのキノン形成；および
９）スルホ酸化反応。
【００３０】
こうして、本発明は、化合物の薬物様特性をモデル化または予測するために用いることができる技法を提供することが理解される。
【００３１】
ＭＳに結合したＥＣ反応セルもまた、製剤のミクロ合成に有利に用いることができる。例えば、製剤として「望ましい」とみなされる分子を、電気化学セル内で改良および/または精製して、密接に関連する化合物を作製し、その化合物を毒性についてスクリーニングし、および/または上記のように生体外物質として試験する。化合物を生体外物質として試験することによって、該薬物の活性の増加または減少をシミュレーションし、体内での在留時間を増加または減少させ、「用量」の増加および減少をシミュレーションし、２もしくはそれ以上の薬物の相互作用をシミュレーションすることができる。例えば、アミトリプチリンは、生体内ではＡＭＩの活性形態であると考えられている電気化学に比較的純粋なノルトリプチリンに変換され得る。カロチノイドおよびレチノイドについても類似のアプローチがなされる。
【００３２】
同様に、移動相中に化合物を含むこと、または該物質ポストＥＣセルを再び混合することによって、毒性（例えば、ＤＮＡまたはチオアダクト形成）、抗酸化特性（フラボノイドなど）または代謝の他のいくつかの局面の発生を引き起こすことができる。１つの例は、酸化の前後のグルタチオンの移動相への挿入および分析物-グルタチオン抱合体の検出である。
【００３３】
このように、クーロメトリック（または、アンペロメトリック)ＥＣ−ＭＳは、一定に、再現可能に大きな化合物ライブラリーに適用され、薬物様特性の予測と評価のための「モデル化に適した」データを生成することができる力学的なプローブを提供する。ライブラリー成分の電気化学的活性および反応生成物の急速な評価は、その「薬物様」特性に高度な関連する。これらのデータは、直列クーロメトリックＥＣ−ＭＳが関連する化合物の迅速な研究、その結果得られる「関連する物質」の形成、および代謝的および化学的「ソフトスポット」の決定を可能にするということの更なる有意な証拠を提供する。この技法は、より容易に標準化され、生物学的アッセイより高いスループット電位を有し、ＦＩＡ、プレカラムおよびポストカラム技法を含むＬＣ−ＭＳベースのシステムと容易に一体化することができる。クーロメトリック(またはアンペロメトリック)ＥＣ−ＭＳはまた、酸化的分解、選択的生成および続く関連物質（メタボライトおよび崩壊剤）の同定に対する化学的安定性を予測および評価するために使用することもできる。
【００３４】
本発明は、ＭＳ検出器の使用と関連付けて記載されているが、蛍光検出器および電気伝導率検出器などの他の種々の検出器も有利に使用することができる。また、クーロメトリックまたはアンペロメトリックＥＣセルが好ましいが、他のＥＣ操作モード、例えば、ＤＣ、パルスまたは他の波長を用いることもできる。
【００３５】
本発明は、改良の余地がある。例えば、２以上のＥＣセルを、例えば、図１Ａに示したようにパラレルに走らせてもよい。
【００３６】
本発明は、製剤開発の時間とコストを有意に減少させる電位を提供することが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明によって形成されたＥＣ-ＭＳシステムの模式的フローチャートである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、図１Ａと同様、本発明による別の形態のＥＣ-ＭＳシステムの模式的フローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明のタモキシフェンのボルタンメトリーマススペクトルである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の、1000mV vs. Pdで酸化された、タモキシフェンの正スキャンマススペクトルである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明のアミトリプチンおよびノルトリプチリンのマススペクトルである。
【図３】図３は、本発明のＥＣ酸化の一連の典型的な基質、質量シフトおよび可能性のある部位（ソフトスポット）である。
【図４】図４は、本発明による、アセトアミノフェンおよびグルタチオンを含有する混合物のフルスキャンマススペクトルである。
【図５】図５は、本発明による、提案されたＥＣ生成反応中間物質および結果として得られるグルタチオニル添加物をまとめて示した。
【図６】図６は、本発明のグルタチオンといくつかのエストロゲン化合物との抱合体を示すボルタンメトリーマススペクトルである。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明による、１ｍＭのグルタチオンの存在下でのカテコールエストロゲンの酸化の前後におけるＭＳイオンクロマトグラムのオーバーレイである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明による、１ｍＭのグルタチオンの存在下でのカテコールエストロゲンの酸化の前後におけるＭＳイオンクロマトグラムのオーバーレイである。
【図８Ａ】図８Ａは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図８Ｄ】図８Ｄは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図８Ｅ】図８Ｅは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図８Ｆ】図８Ｆは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図８Ｇ】図８Ｇは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図８Ｈ】図８Ｈは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図８Ｉ】図８Ｉは、図２Ａと同様、本発明による、異なるｐＨ条件で測定されたいくつかの生物活性化合物のプロットである。
【図９】図９は、本発明における、エストラジオールおよびメタボライトのＥＣ酸化およびフォローアップ抱合のための典型的な経路である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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