(57)【要約】本発明は、樹状細胞を産出するためのＣＤ１４陽性単球の使用に関する。本発明は、ＣＤ１４陽性単球の分化によって、（調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞、分化した未熟細胞、成熟細胞及び／又は相互連結細胞である）ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の混合集団を少なくとも１種得るための、末梢循環血液から分離したＣＤ１４陽性単球の使用を含む。本発明は、懸濁液、単層及び三次元細胞及び組織モデル中におけるその使用を含む。本発明は、上記細胞及び上記モデルの、免疫毒性／免疫寛容の評価、化粧品や医薬品の有効成分の開発、並びに、細胞治療法や組織治療法の開発と実施のための研究モデルとしての使用を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１４陽性単球の分化によって、ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の混合集団を少なくとも１種得るための、末梢循環血液から分離したＣＤ１４陽性単球の使用であって、
ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞は調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞、分化した未熟細胞、成熟細胞及び／又は相互連結細胞である使用。
【請求項２】
分化の結果、マクロファージ型の細胞及び／又は内皮型の細胞等の、調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞及び／又は分化した細胞の亜集団が更に少なくとも１種得られる
ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
分化は、少なくともＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦβのサイトカイン２種、好ましくはＴＧＦβ１を含む培地中で培養することによって行う
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の集団の配分は、第三のサイトカインが前記培養中所定時間に渉って所定濃度で存在することによって決まり、前記サイトカインは好ましくはサイトカインＩＬ−１３である
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
培養は、ランゲルハンス細胞への分化に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で最長約２日間行う
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
培養は、間質性樹状細胞の形成に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で約６日間行う
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
培養は、ランゲルハンス細胞／間質性樹状細胞の２種からなる集団の形成に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で約４日間行う
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
ランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞を更に分化させるためには、サイトカインＴＮＦαの存在下で培養を行えばよい
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
ＴＮＦαの存在下における培養を、所定濃度で所定時間である約１８時間未満の間行うことにより、活性化した成熟樹状細胞に成熟するのを避けながら、未熟なランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞を分化させる
ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ＴＮＦαの存在下における培養を、所定濃度で所定時間である約２０時間を超えて行うことにより、活性化した成熟樹状細胞に成熟させる
ことを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
サイトカインＧＭ−ＣＳＦの濃度は０．１〜４０００ＩＵ／ｍｌ、有利には約４００ＩＵ／ｍｌであり、サイトカインＴＧＦβ、好ましくはＴＧＦβ１の濃度は０．０１〜４００ｎｇ／ｍｌ、有利には約１０ｎｇ／ｍｌであり、サイトカインＩＬ−１３の濃度は、培地中に存在する場合、０．０１〜４００ｎｇ／ｍｌ、有利には約１０ｎｇ／ｍｌであり、サイトカインＴＮＦαの濃度は、培地中に存在する場合、０．１〜４０００ＩＵ／ｍｌ、有利には約２００ＩＵ／ｍｌである
ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
ＣＤ１４陽性単球の抽出は新鮮な血液から行われ、すなわち、好ましくは個体から血液を採取して２４時間以内に、好ましくは１８時間以内に、好ましくは１２時間以内に、好ましくは６時間以内に開始され実施され、更に好ましくは、前記抽出は血液採取直後に開始され５時間以内に実施される
ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
発生したランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞は生体内で見つかったものと同一の機能の表現型を有する
ことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記ランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞の培養は、特に少なくとも上皮細胞及び間質細胞を含む三次元の培養条件において行う
ことを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
上皮細胞及び間質細胞が明確に分離される場合、ランゲルハンス細胞は主に上皮細胞の領域に位置し、間質性樹状細胞は主に間質細胞の領域に位置する
ことを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
内皮細胞及びマクロファージは、特に三次元の条件に置かれた場合に、培養に由来する特定の細胞からの分化によって得られる
ことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
完全な皮膚モデル又は粘膜モデル、すなわち上皮と結合間質の両方を含むモデルの中に組み込んだ時、細胞の環境、好ましくは繊維芽細胞及び上皮細胞、並びに、間質の環境に基づいて、上皮内に位置してランゲルハンス細胞に分化したり、結合間質中に位置して間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞に分化したりでき、かつ、生体内のランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞と匹敵する機能を獲得できるような細胞、好ましくは調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞が得られる
ことを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
ＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法であって、：
ａ）あらかじめ従来技術によって集めたＣＤ１４陽性単球を末梢循環血液から抽出すること、及び、
ｂ）分離したＣＤ１４陽性単球をサイトカイン数種類を含む培地中で十分な時間培養して、ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の２種からなる集団を取得すること：
を含む方法。
【請求項１９】
培養は、少なくともＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦβのサイトカイン、好ましくはＴＧＦβ１の存在下で行う
ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
培養は、所定濃度の第三のサイトカインの存在下で、前記培養中所定時間行い、前記サイトカインは好ましくはサイトカインＩＬ−１３である
ことを特徴とする請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
培養は、ランゲルハンス細胞へ分化に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で最長約２日間行う
ことを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
培養は、間質性樹状細胞の形成に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で約６日間行う
ことを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
培養は、ランゲルハンス細胞／間質性樹状細胞の混合集団の形成に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で約４日間行う
ことを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
培養はサイトカインＴＮＦαの存在下で行う
ことを特徴とする請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＴＮＦαの存在下での培養を所定濃度で所定時間である約１８時間未満行うことにより、活性化した成熟樹状細胞に成熟するのを避けながら、ランゲルハンス細胞及びまだ未熟な間質性樹状細胞へ細胞を分化させる
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＴＮＦαの存在下での培養を所定濃度で所定時間である約２０時間を超えて行うことにより、活性化した成熟樹状細胞に成熟させる
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ１４陽性単球の抽出は新鮮な血液から行われ、すなわち、好ましくは個体から血液を採取して２４時間以内に、好ましくは１８時間以内に、好ましくは１２時間以内に、好ましくは６時間以内に開始され実施され、更に好ましくは、前記抽出は血液採取直後に開始され５時間以内に実施される
ことを特徴とする請求項１８〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
培養は、三次元の培養条件において、特に少なくとも上皮細胞及び間質細胞の存在下で行う
ことを特徴とする請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞は、特に少なくとも明確に分離された上皮細胞及び間質細胞を含む三次元の培養条件において培養することによって、更に分化させることができる
ことを特徴とする請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
サイトカインと共に培養した後、特に、樹状細胞とＣＤ４０リガンドとを相互作用させたり、サイトカインＴＮＦα又はリポ多糖を添加したりすることにより、成熟を十分な時間相補的に刺激して前記細胞の表現型及び機能を成熟させる
ことを特徴とする請求項１８〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくともランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の混合集団を、割合を変えて三次元培養モデルへ組み込むことを含む
ことを特徴とする請求項１８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
三次元培養モデルは、皮膚モデル、粘膜モデル、真皮モデル、絨毛膜モデル、表皮モデル及び上皮モデルを含む
ことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
三次元培養モデルは、
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲンを基盤とするゲル
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は必要に応じてキトサンを含んでいてよいコラーゲンから作られる多孔性マトリックスであって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる多孔性マトリックス
−ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素のゲル又は膜
−真皮層から構成される真皮等価物
−表皮を剥がした死んだ真皮
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン（Ｒ）膜若しくはテフロン（Ｒ）スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン若しくはポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜、ポリエステル半透膜、ポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体であって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる不活性な担体
から選択されることが好ましい真皮又は絨毛膜のマトリックス担体を含む
ことを特徴とする請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
使用する三次元培養モデルは、上皮細胞、特に角質細胞を表面に播種した前記モデルからなる
ことを特徴とする請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
使用する三次元培養モデルは、例えば、神経細胞、内皮細胞、メラノサイト、リンパ細胞及び／若しくは脂肪細胞等の相補的な細胞種の少なくとも１種、並びに／又は、頭髪等の体毛及び皮脂腺等の皮膚付属器をその中に組み込んだモデルからなる
ことを特徴とする請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
培養に由来する特定の細胞は、特に上皮細胞及び間質細胞を少なくとも含む三次元の条件に置かれた場合に、内皮細胞及びマクロファージに分化する
ことを特徴とする請求項１８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によるＣＤ１４陽性単球の使用を含む
ことを特徴とする培養方法。
【請求項３８】
基本培地と少なくとも２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びサイトカインＴＧＦβ、好ましくはＴＧＦβ１とを併用する
ことを特徴とするＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養のための培地。
【請求項３９】
前記２種のサイトカインを併用する培地はまた、サイトカインＩＬ−１３も、培養中に所定の時点で培地に添加できるように、好ましくは物理的に分けて併用する
ことを特徴とする請求項３８に記載の培地。
【請求項４０】
前記２種のサイトカインを併用する培地は、サイトカインＴＮＦαも、培養中に所定の時点で培地に添加できるように、好ましくは物理的に分けて併用する
ことを特徴とする請求項３８又は３９に記載の培地。
【請求項４１】
サイトカインＧＭ−ＣＳＦの濃度は０．１〜４０００ＩＵ／ｍｌ、有利には約４００ＩＵ／ｍｌであり、サイトカインＴＧＦβ、好ましくはＴＧＦβ１の濃度は０．０１〜４００ｎｇ／ｍｌ、有利には約１０ｎｇ／ｍｌであり、サイトカインＩＬ−１３の濃度は、培地中に存在する場合、０．０１〜４００ｎｇ／ｍｌ、有利には約１０ｎｇ／ｍｌであり、サイトカインＴＮＦαの濃度は、培地中に存在する場合、０．１〜４０００ＩＵ／ｍｌ、有利には約２００ＩＵ／ｍｌである
ことを特徴とする請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の培地。
【請求項４２】
ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の混合集団を少なくとも１種含む細胞集団であって、前記ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞は、ＣＤ１４陽性単球から得られる、特に請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＣＤ１４陽性単球から得られる、又は、請求項１８〜３７のいずれか１項に記載の培養方法によって、又は、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の培地の使用によって得られる、調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞、分化した未熟細胞、成熟細胞、及び／又は、相互連結した細胞である
ことを特徴とする細胞集団。
【請求項４３】
少なくとも、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のＣＤ１４陽性単球の使用によって得られる、又は、請求項１８〜３７のいずれか１項に記載の培養方法によって得られる、又は、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の培地の使用によって得られる、又は、請求項４２に記載のランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の混合集団の、懸濁液、単層又は三次元、単細胞又は多細胞の研究モデルを製造するための使用。
【請求項４４】
研究モデルは、
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲンを基盤とするゲル
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は必要に応じてキトサンを含んでいてよいコラーゲンから作られる多孔性マトリックスであって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる多孔性マトリックス
−ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素のゲル又は膜
−真皮層から構成される真皮等価物
−表皮を剥がした死んだ真皮
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン（Ｒ）膜若しくはテフロン（Ｒ）スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン若しくはポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜、ポリエステル半透膜、ポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体であって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる不活性な担体
から選択される担体を含む
ことを特徴とする請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
研究モデルは、主としてランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、ランゲルハンス細胞／間質性樹状細胞の混合物、ランゲルハンス細胞／間質性樹状細胞／内皮細胞／マクロファージの混合物、又は、間質性樹状細胞／内皮細胞／マクロファージの混合物のいずれかを含む
ことを特徴とする請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
請求項１〜３７のいずれか１項によって得られる、又は、請求項４２に記載の混合集団を少なくとも１種含む
ことを特徴とする完全な再生皮膚モデル又は再生粘膜モデル、再生真皮モデル又は再生絨毛膜モデル、再生上皮モデル、特に表皮モデル、その他、任意の懸濁液、単層若しくは三次元、単細胞若しくは多細胞のモデル。
【請求項４７】
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲンを基盤とするゲル
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は必要に応じてキトサンを含んでいてよいコラーゲンから作られる多孔性マトリックスであって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる多孔性マトリックス
−ヒアルロン酸及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素のゲル又は膜
−真皮層から構成される真皮等価物
−表皮を剥がした死んだ真皮
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン（Ｒ）膜若しくはテフロン（Ｒ）スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン若しくはポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜、ポリエステル半透膜、ポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体であって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる不活性な担体
から選択される担体を含む
ことを特徴とする請求項４６に記載のモデル。
【請求項４８】
主としてランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、ランゲルハンス細胞／間質性樹状細胞の混合物、ランゲルハンス細胞／間質性樹状細胞／内皮細胞／マクロファージの混合物、又は、間質性樹状細胞／内皮細胞／マクロファージの混合物のいずれかを含む
ことを特徴とする請求項４６又は４７に記載のモデル。
【請求項４９】
ＬＣは上皮部分に位置し、ＩＤＣ、マクロファージ及び内皮細胞が存在する場合は、これらは結合間質に位置する
ことを特徴とする請求項４６〜４８のいずれか１項に記載のモデル。
【請求項５０】
構造を与える細胞、とりわけ間質細胞、特に繊維芽細胞、及び／又は、上皮細胞、特に角質細胞、及び／又は、その他の細胞種、とりわけＴリンパ球、及び／又は、神経細胞、及び／又は、色素細胞、特にメラノサイト、及び／又は、脂肪細胞、並びに、免疫防御を与える細胞、とりわけランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞及び／又はマクロファージ、並びに、血管新生を与える細胞、とりわけ内皮細胞を中に含む
ことを特徴とする請求項４６〜４９のいずれか１項に記載のモデル。
【請求項５１】
請求項１〜３７及び４２〜５０のいずれか１項で得られるランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の混合集団の少なくとも１種の、有効成分を研究及び／又は選択するためのモデルとしての使用。
【請求項５２】
特に有効成分の免疫刺激活性や免疫抑制活性を研究したり、前記有効成分による免疫寛容を評価したり誘発したりするための請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のモデルの使用。
【請求項５３】
上皮関門の生理病理学；皮膚又は粘膜の刺激；生物種、例えばウィルス、ＨＩＶ等のレトロウィルス、細菌、カビ、微生物及び抗原粒子による攻撃；光毒性；光防御；有効成分、特に化粧品や医薬品の有効成分の効果；及び、最終製品、特に化粧品や医薬品の効果を研究するための、並びに、病原体による感染機構を研究するための請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のモデルの使用。
【請求項５４】
病原体、例えばウィルス、ＨＩＶ等のレトロウィルス、細菌、カビ、微生物及び抗原粒子の存在を検出するための請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のモデルの使用。
【請求項５５】
医療的、生物医学的又は化粧的用途のために、特に予防や治療を目的として、特に、ＵＶ照射等の物理的な、又は、化学的／生物学的な環境因子による攻撃の後に起こる免疫応答や寛容応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて調整するための請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のモデルの使用。
【請求項５６】
組織工学又は細胞工学的の用途への請求項４３〜５０のいずれか１項に記載のモデルの使用。
【請求項５７】
例えば免疫応答を刺激できるＤＣの注入といった抗癌性細胞療法；例えばアネルギーＴ細胞の産生により、免疫寛容状態をつくることによる自己免疫疾患における細胞療法；免疫系に影響を及ぼす疾病の遺伝子治療；並びに、ワクチンの開発及び生産等の医療的又は生物医学的用途のための請求項４２に記載の細胞集団の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は本質的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＤ１４陽性単球の培養法、培地、並びに、免疫毒性／免疫寛容の評価法、有効成分の研究／選択法、皮膚と粘膜に関する生理病理学的研究法、及び、細胞工学及び／又は組織工学及び細胞治療法及び／又は組織治療法における上記方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫系を保護していると考えられる抗原提示細胞である。ＤＣは実際のところほぼ全身で、すなわち胸腺、体循環及び第二次リンパ系器官で、また、単層状又はマルピギー状（すなわち多層状上皮を含む）であってよい皮膚や粘膜等、すなわち膣、子宮頸部の外側（ｏｕｔｅｒ  ｃｅｒｖｉｘ）、陰門、肛門周辺、食道及び口の皮膚や粘膜等の末梢組織でも存在が確認されている。ＤＣは、生体内における数は非常に少ないが、特異的免疫応答を誘発する中枢に存在し、免疫応答の特異性、強度及び性質を制御していて、自然免疫と獲得免疫との中間に位置する。ＤＣには、免疫応答を「起こす」機能に加えて、末梢における寛容を誘導する作用もある。
【０００３】
ＤＣ前駆体は、多くの免疫系細胞や血液細胞と同様、ＣＤ３４陽性造血系前駆体の分化に由来する。ＤＣ前駆体は血液によって皮膚や粘膜に輸送され、そこで分化して、未熟なＤＣの状態で定着する。生体内での位置によって２種類のＤＣがある。
【０００４】
−ランゲルハンス細胞（ＬＣ）はマルピギー状上皮（皮膚及び粘膜）に、様々な密度（１００〜１１００個／ｍｍ２）で存在する。ＬＣの特異的マーカーＬａｎｇｅｒｉｎ（ＣＤ２０７）は、電子顕微鏡で観察される細胞小器官の形成に関与するタンパク質で、Ｂｉｒｂｅｃｋ顆粒と称される。ＬａｎｇｅｒｉｎやＣＤ１ａといったマーカー以外にも、ＬＣは、ＬＣ以外の未熟なＤＣ上に見られる抗原（ＣＤ４、β２−インテグリン、並びに、接着分子ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ−１等）を発現する。ＬＣは、外来抗原（ｅｘｏａｎｔｉｇｅｎ）を捕獲すると、成熟しながら身体の中心に近いリンパ節に向かって遊走するため、接触皮膚炎や移植片拒絶反応等多くの病状の原因となる。
【０００５】
−間質性樹状細胞（ＩＤＣ）は粘膜固有層や真皮で見られる。後者の場合には、皮膚のＤＣ又は皮膚の樹状細胞（ｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ）とも称する。この細胞にはＢｉｒｂｅｃｋ顆粒がなく、単球／マクロファージとの類似点及び共通のマーカーが多い。また、ＩＤＣは特異的マーカー、レクチンＤＣ−ＳＩＧＮを発現し、未熟なＤＣと類似した異種刺激（ａｌｌｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ）能を有する。
【０００６】
ＬＣ及び／又はＩＤＣは抗原を捕獲した後、リンパ節に向かって遊走する。この遊走に関連して、ＬＣ及び／又はＩＤＣが活性化し、ケモカイン受容体の発現が変化し（ＣＣＲ６受容体が発現しなくなってＣＣＲ７が発現するようになり）、接着分子の発現が変化し、その表現型と機能特性が変化する。例えばＬＣの場合、Ｂｉｒｂｅｃｋ顆粒が無秩序な状態になって形態が乱れる。リンパ性神経節では、ＤＣのＣＤ４０受容体とＴリンパ球上のリガンドＣＤ４０−Ｌとが相互に作用してＤＣの「相互連結樹状細胞」への成熟が誘発される。この細胞の特徴は、抗原ＣＤ８３及び副刺激マーカー（ＣＤ８０及びＣＤ８６）が膜上に発現していること、及び、（ＨＬＡ−ＤＲ等の）クラスＩＩの主要組織適合性複合体が膜上で大規模に遊走することである。こうして、これら活性化した成熟ＤＣは、ＴＮＦα及びＩＬ−１２を産生するようになる。
【０００７】
ＬＣを（特に、皮膚又は人間の粘膜のいずれかに由来する上皮細胞と組み合わせて）使用するには、「再生皮膚」又は「再生粘膜」の系又はモデルの中に組み込むのが有用である（非特許文献１〜２及び特許文献１参照）。これは特に、動物実験の代替になるとされる方法を実施する際の生物学的基盤として用いられてきたが、医薬品や化粧品等の製品の耐性及び／又は効能をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて評価するためにもっと使用されるべきである。
【０００８】
しかし実際には、工業規模で確実にＬＣを得られるような合理的で利用可能な方法がなく、記載されているモデルに欠陥があるため、このモデルは現在ほとんど又は全く使用されていない。
【０００９】
特許文献１（Ｌ’ＯＲＥＡＬ）は、皮膚モデル又は皮膚等価物、及び、臍帯血由来のＣＤ３４陽性前駆体の使用に関する。しかし上記皮膚等価物は実際のところ、マトリックス（表皮を剥がした真皮、すなわち生細胞を含まない死んだ真皮）上に細胞を播種したものであるため、表皮と等価であるというだけにすぎない。
【００１０】
いずれにしても、真皮が「生きていない」ため、ＩＤＣは（マクロファージや内皮細胞も同様に）得られない。
【００１１】
一方、ＣＤ３４陽性細胞は臍帯血から得るため、その数も限られる。
【００１２】
Ｇｅｉｓｓｍａｎｎは、循環血液から得られるＣＤ１４陽性単球の使用、及び、それを６日間懸濁液中で（ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ１及びＩＬ−４の存在下において）培養してＬＣを得たことについて記載している（非特許文献３）。
【００１３】
上記出版物に記載されたプロトコールによれば、細胞の培養は懸濁液中であって、三次元モデル上でではない。また、ＩＤＣや他の細胞（マクロファージ、内皮細胞）の存在については記載されていない。
【特許文献１】ヨーロッパ特許０７８９０７４（Ｌ’ＯＲＥＡＬ）
【非特許文献１】Ｒｅｇｎｉｅｒ，ＪＩＤ  １９９７年
【非特許文献２】Ｓｉｖａｒｄ  Ｐ．Ｐｅａｕｘ  ｅｔ  ｍｕｑｕｅｕｓｅｓ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｉｔｅｓ（Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ），Ｎｏｕｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，２００１年，２０，５２０−５２３
【非特許文献３】Ｆ．Ｇｅｉｓｓｍａｎｎ，Ｃ．Ｐｒｏｓｔ，Ｊ−Ｐ．Ｍｏｎｎｅｔ，Ｍ．Ｄｉｙ，Ｎ．Ｂｒｕｃｅ及びＯ．Ｈｅｒｍｉｎｅ；１９９８年；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１８７，Ｎｏ．６，９６１−９６６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の主な目的の１つは、皮膚及び粘膜の樹状細胞（すなわちランゲルハンス細胞（ＬＣ）及び間質性樹状細胞（ＩＤＣ））の２種の生集団を、１種の前駆体からｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００１５】
本発明の別の主な目的は、人間や動物の循環血液中に、特に末梢循環血液中に存在していて容易に入手できる１種の前駆体を提供するという新しい技術的な問題を解決することである。
【００１６】
本発明の別の主な目的は、１種の前駆体を、工業規模で使用できる数の細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができる程十分な量提供するという新しい技術的な問題を解決することである。
【００１７】
本発明の別の主な目的は、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて完全に再現性のある方法で、特にドナーの機能によって変化することなく発生させることができる１種の前駆体を提供するという新しい技術的な問題を解決することである。
【００１８】
本発明の別の主な目的は、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて迅速に発生させることができる１種の前駆体を提供するという新しい技術的な問題を解決することである（ＬＣが得られるまでに７〜８日間培養する必要がある）。
【００１９】
本発明の別の主な目的は、生体内の細胞と表現型及び機能が同じ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができる１種の前駆体を提供するという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２０】
本発明の別の主な目的は、所望の各種分化／成熟段階（すなわち、調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞の段階、分化した未熟細胞の段階、成熟細胞の段階、又は、相互連結細胞の段階）における樹状細胞（すなわちランゲルハンス細胞及び／又は間質性樹状細胞）をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２１】
本発明の別の主な目的は、１種の細胞前駆体から、主にランゲルハンス細胞（ＬＣ）を、又は、主に間質性樹状細胞（ＩＤＣ）を、又は、ランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞の２種からなる集団（ＬＣ／ＩＤＣ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２２】
本発明の別の主な目的は、ＬＣ及び／又はＣＤＩの（それぞれ表現型及び／又は機能特性の異なる）亜集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発生を含む、１種の細胞前駆体からの樹状細胞（すなわちランゲルハンス細胞（ＬＣ）及び間質性樹状細胞（ＩＤＣ））のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発生を可能にするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、これらの細胞を治療に使用できるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２４】
本発明の別の目的は、抗癌性細胞療法（例えば、免疫応答を刺激できるＤＣの注入）；（例えば、アネルギーＴ細胞の産生により）免疫寛容状態をつくることによる自己免疫疾患の細胞療法；免疫系に影響を及ぼす疾病に対する遺伝子治療；並びに、ワクチンの開発及び生産等、医療的又は生物医学的な用途のために、樹状細胞（すなわちランゲルハンス細胞及び／又は間質性樹状細胞）をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２５】
発明の別の主な目的は、樹状細胞（すなわちランゲルハンス細胞及び／又は間質性樹状細胞）をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させて、それを皮膚組織モデル又は粘膜モデル等のモデルの中に組み込めるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２６】
本発明の別の主な目的は、完全な皮膚モデル又は粘膜モデル（すなわち上皮と結合間質（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ）の両方を含むモデル）の中に組み込んだ時、細胞の環境（好ましくは繊維芽細胞及び上皮細胞）及び間質の環境に基づいて、上皮内に位置してランゲルハンス細胞に分化したり、結合間質中に位置して間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞に分化したりでき、かつ、生体内のランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞と匹敵する機能を獲得できるように調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、有効成分等の物質を研究及び／又は選択できるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、内皮細胞及びマクロファージをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、免疫応答性の（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）皮膚又は粘膜等価物を得られるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、本発明が関与する様々な細胞及び組織の生理病理学的研究のためのモデル／ツール、（例えば外部物質の免疫毒性やアレルゲン性を予測するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて試験することを目的とする）薬理毒理学的研究のためのモデル／ツール、並びに、免疫調整特性を有する物質を研究するためのモデル／ツールを提供するという新しい技術的な問題を解決することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、これらの様々なモデルを治療に使用できるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、特に有効成分の免疫刺激活性や免疫抑制活性を研究したり、上記有効成分による免疫寛容を評価したり誘発したりする目的で、モデルを使用できるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００３３】
本発明の別の目的は、上皮関門の生理病理学；皮膚又は粘膜の刺激；生物種（例えばウィルス、ＨＩＶ等のレトロウィルス、細菌、カビ、微生物及び抗原粒子）による攻撃；光毒性；光防御；有効成分（特に化粧品や医薬品の有効成分）の効果；及び、最終製品（特に化粧品や医薬品）の効果を研究するために、並びに、病原体による感染機構を研究するために、モデルを使用できるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００３４】
本発明の別の目的は、病原体（例えばウィルス、ＨＩＶ等のレトロウィルス、細菌、カビ、微生物及び抗原粒子）の存在を検出するためにモデルを使用できるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００３５】
本発明の別の目的は、医療的、生物医学的又は化粧的用途に、特に予防や治療を目的として、特に（とりわけ、ＵＶ照射等の物理的な、又は、化学的／生物学的な）環境因子による攻撃の後に起こる免疫応答や寛容応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて調整するために、モデルを使用できるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【００３６】
本発明の別の目的は、組織工学又は細胞工学的用途；抗癌性細胞療法（例えば、免疫応答を刺激できるＤＣの注入）；（例えば、アネルギーＴ細胞の産生により）免疫寛容状態をつくることによる自己免疫疾患における細胞療法；免疫系に影響を及ぼす疾病に対する遺伝子治療；並びに、ワクチンの開発及び生産等、医療的又は生物医学的な用途にモデルを使用できるようにするという新しい技術的な問題を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【００３７】
本発明により、工業及び商業規模で、特に化粧品、医薬品及び／又は医療において工業規模で使用することができる安全で確実な再現性のある方法で上記技術的な問題の各々を解決することが初めて可能になった。
【００３８】
本発明は主に、生きている１種の前駆体（すなわち末梢循環血液中のＣＤ１４陽性単球）からの、皮膚及び粘膜の樹状細胞（すなわちランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞）の少なくとも２種の集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発生に関する。
【００３９】
本発明の構成において、「細胞」という用語は、特に断りのない限り常に「生細胞」を意味するものとする。
【００４０】
本発明によれば、「末梢循環血液」という用語は、「血液が循環しながら流れる血液系を有する任意の生体、特に動物及び哺乳動物、好ましくは人間から採取した（特に末梢の）血液」を意味するものとする。
【００４１】
本発明によれば、「新鮮な血液」という用語は、ＣＤ１４陽性単球の抽出を、好ましくは個体から血液を採取して２４時間以内に開始し実施する血液を意味するものとする。
【００４２】
従って、最初の特徴によれば、本発明は、ＣＤ１４陽性単球の分化によってランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞（ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞は共に、調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞、分化した未熟細胞、成熟細胞及び／又は相互連結細胞である）の混合集団を少なくとも１種得るための、末梢循環血液から分離したＣＤ１４陽性単球の使用に関する。
【００４３】
ＣＤ１４陽性単球の使用におけるある有利な特徴によれば、ＣＤ１４陽性単球の抽出は新鮮な血液から行う。すなわち、好ましくは個体から血液を採取して２４時間以内に、好ましくは１８時間以内に、好ましくは１２時間以内に、好ましくは６時間以内に開始し実施する。更に好ましくは、上記抽出は血液採取直後に開始し５時間以内に実施する。
【００４４】
ＣＤ１４陽性単球の使用におけるある有利な特徴によれば、分化の結果、ＬＣ及び／又はＩＤＣの様々な亜集団が得られる。
【００４５】
ＣＤ１４陽性単球の使用におけるある有利な特徴によれば、分化の結果、マクロファージ型の細胞及び／又は内皮型の細胞等の、調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞及び／又は分化した細胞の亜集団が更に少なくとも１種得られる。
【００４６】
ＣＤ１４陽性単球の使用におけるある有利な特徴によれば、分化は、少なくともＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦβ１のサイトカイン２種、好ましくはＴＧＦβ１を含む培地中でこれらＣＤ１４陽性単球を培養することによって行う。
【００４７】
これらＣＤ１４陽性単球の使用におけるある有利な特徴によれば、ＬＣとＩＤＣの集団の配分は、第三のサイトカインが上記培養中所定時間に渉って所定濃度で存在することによって決まり、上記サイトカインは好ましくはサイトカインＩＬ−１３である。
【００４８】
別の有利な変形形態において、培養は、ＬＣへの分化に有利であるように、すなわちＬＣが主に形成されるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で最長約２日間行う。
【００４９】
別の有利な変形形態において、培養は、ＩＤＣの形成に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で約６日間行う。
【００５０】
別の有利な変形形態において、培養は、ＬＣ／ＩＤＣの２種からなる集団の形成に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で約４日間行う。
【００５１】
別の有利な特徴によれば、ＬＣ及びＩＤＣを更に分化させるためには、サイトカインＴＮＦαの存在下で培養を行えばよい。
【００５２】
有利には培養を、所定濃度のＴＮＦαの存在下で、所定時間（約１８時間未満）行うことにより、活性化した成熟樹状細胞に成熟するのを避けながら、未熟なランゲルハンス細胞及び未熟な間質性樹状細胞が得られる。
【００５３】
本発明の別の特徴によれば、ＴＮＦαの存在下における培養を、所定濃度で所定時間（約２０時間を超えて）行うことにより、活性化した成熟樹状細胞に成熟させることができる。
【００５４】
別の有利な特徴によれば、サイトカインＧＭ−ＣＳＦの濃度は０．１〜４０００ＩＵ／ｍｌ、有利には１〜２０００ＩＵ／ｍｌ、より正確には約４００ＩＵ／ｍｌ；サイトカインＴＧＦβ（好ましくはＴＧＦβ１）の濃度は０．０１〜４００ｎｇ／ｍｌ、有利には１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より正確には約１０ｎｇ／ｍｌ；サイトカインＩＬ−１３の濃度は（培地中に存在する場合）０．０１〜４００ｎｇ／ｍｌ、有利には１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より正確には約１０ｎｇ／ｍｌ；サイトカインＴＮＦαの濃度は（培地中に存在する場合）０．１〜４０００ＩＵ／ｍｌ、有利には１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、より正確には約２００ＩＵ／ｍｌである。
【００５５】
ＣＤ１４陽性単球の使用における別の有利な特徴によれば、得られたＬＣ及びＩＤＣは生体内で見つかったものと同一の機能の表現型を有する。
【００５６】
別の有利な特徴によれば、上記ＬＣ及びＩＤＣの培養は、（特に、少なくとも上皮細胞及び間質細胞を含む）三次元の培養条件において行う。
【００５７】
有利には、この更なる分化のある特徴によれば、上皮細胞及び間質細胞が明確に分離される場合、ＬＣは主に上皮細胞の領域に位置し、ＩＤＣは主に間質細胞の領域に位置する。
【００５８】
有利には、これらＣＤ１４陽性単球の使用におけるある特徴によれば、内皮細胞及びマクロファージは、特に三次元の条件に置かれた場合に、培養に由来する特定の細胞からの分化によって得られる。
【００５９】
有利には、使用におけるある特徴によれば、完全な皮膚モデル又は粘膜モデル（すなわち上皮と結合間質の両方を含むモデル）の中に組み込んだ時、細胞の環境（好ましくは繊維芽細胞及び上皮細胞）及び間質の環境に基づいて、上皮内に位置してランゲルハンス細胞に分化したり、結合間質中に位置して間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞に分化したりでき、かつ、生体内のランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞と匹敵する機能を獲得できるような細胞（好ましくは調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）細胞）が得られる。
【００６０】
第二の特徴によれば、本発明は更に、ＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法であって、：
ａ）あらかじめ従来技術によって集めたＣＤ１４陽性単球を循環血液から分離すること、及び、
ｂ）分離したＣＤ１４陽性単球をサイトカイン数種類を含む培地中で十分な時間培養して、ＬＣとＩＤＣの２種からなる集団を取得すること：
を含む方法に関する。
【００６１】
ある有利な特徴によれば、このＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法においては、培養は、少なくともＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦβのサイトカイン、好ましくはＴＧＦβ１の存在下で行う。
【００６２】
本発明の別の有利な特徴によれば、ＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法において、培養は、所定濃度の第三のサイトカインの存在下で、上記培養中所定時間行い、上記サイトカインは好ましくはサイトカインＩＬ−１３である。
【００６３】
この有利な特徴のある変形形態において、培養は、ＬＣへ分化に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で最長約２日間行う。
【００６４】
この有利な特徴の別の変形形態において、培養は、ＩＤＣの形成に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で約６日間行う。
【００６５】
この特徴の別の有利な変形形態において、培養は、ＬＣ／ＩＤＣの混合集団の形成に有利であるように、サイトカインＩＬ−１３の存在下で約４日間行う。
【００６６】
本発明のある有利な特徴によれば、ＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法において、培養はサイトカインＴＮＦαの存在下で行う。
【００６７】
この有利な特徴のある変形形態において、ＴＮＦαの存在下での培養を所定濃度で所定時間（約１８時間未満）行うことにより、活性化した成熟樹状細胞に成熟するのを避けながら、まだ未熟なランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞へ細胞を分化させることができる。
【００６８】
別の有利な特徴によれば、ＴＮＦαの存在下での培養を所定濃度で所定時間（約２０時間を超えて）行うことにより、活性化した成熟樹状細胞に成熟させることができる。
【００６９】
本発明の別の有利な特徴によれば、ＣＤ１４陽性単球の抽出は新鮮な血液から行う。すなわち、好ましくは個体から血液を採取して２４時間以内に、好ましくは１８時間以内に、好ましくは１２時間以内に、好ましくは６時間以内に開始し実施する。更に好ましくは、上記抽出は血液採取直後に開始し５時間以内に実施する。
【００７０】
本発明の別の有利な特徴によれば、ＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法において、培養は、三次元の培養条件において、特に少なくとも上皮細胞及び間質細胞の存在下で行う。
【００７１】
本発明の別の有利な特徴によれば、上記ランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞は、（特に少なくとも明確に分離された上皮細胞及び間質細胞を含む）三次元の培養条件において培養することによって、更に分化させることができる。
【００７２】
本発明の別の有利な特徴によれば、ＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法においてサイトカインと共に培養した後、特に、樹状細胞とＣＤ４０リガンドとを相互作用させたり、サイトカインＴＮＦα又はリポ多糖を添加したりすることにより、成熟を十分な時間相補的に刺激して上記細胞の表現型及び機能を成熟させる。
【００７３】
本発明の別の有利な特徴によれば、ＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養方法は、ＬＣとＩＤＣの２種からなる集団を、割合を変えて三次元培養モデルへ組み込むことを含む。
【００７４】
この有利な特徴の別の変形形態において、三次元培養モデルは、皮膚モデル、粘膜モデル、真皮モデル、絨毛膜モデル、表皮モデル及び上皮モデルを含む。
【００７５】
この有利な特徴の別の変形形態において、三次元培養モデルは、
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲンを基盤とするゲル
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は必要に応じてキトサン（ＣＮＲＳのＥＰ０２９６０７８  Ａ１、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社のＷＯ０１／９１１８２１及びＷＯ０１／９２３２２）を含んでいてよいコラーゲンから作られる多孔性マトリックスであって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる多孔性マトリックス
−ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｏｇｒａｆｔ（Ｒ）  ３Ｄ−Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ社）及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素のゲル又は膜（例えば、Ｖｉｔｒｉｘ（Ｒ）（オルガノジェネシス社）等）
−真皮層から構成される真皮等価物（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｍ．ら；１９９９年  ；Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ，ｖｏｌ．３５，３１８−３２６）
−表皮を剥がした死んだ真皮
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン（Ｒ）膜若しくはテフロン（Ｒ）スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン若しくはポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜、ポリエステル半透膜、ポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体（上記群は、Ｓｋｉｎ２ＴＭｍｏｄｅｌ  ＺＫ１１００、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（Ｒ）及びＴｒａｎｓｃｙｔｅ（Ｒ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等の製品を含む）であって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる不活性な担体
から選択されることが好ましい（真皮又は絨毛膜の）マトリックス担体を含む。
【００７６】
この有利な特徴の別の変形形態において、使用する三次元培養モデルは、上皮細胞、特に角質細胞を表面に播種した上述のモデルからなる。
【００７７】
この有利な特徴のある変形形態において、使用する三次元培養モデルは、（例えば、神経細胞、内皮細胞（ＥＣ）、メラノサイト、リンパ細胞及び／又は脂肪細胞等の）相補的な細胞種の少なくとも１種、並びに／又は、頭髪等の体毛及び皮脂腺等の皮膚付属器をその中に組み込んだモデルからなる。
【００７８】
別の変形形態において、培養に由来する特定の細胞は、特に上皮細胞及び間質細胞を少なくとも含む三次元の条件に置かれた場合に、内皮細胞及びマクロファージに分化する。
【００７９】
本発明はその全体において、上述の方法、又は、実施例等の以下の記載全体に起因する方法によるＣＤ１４陽性単球の使用を含む培養方法に関する。
【００８０】
第三の特徴によれば、本発明は、基本培地と少なくとも２種のサイトカイン（すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦ及びサイトカインＴＧＦβ、好ましくはＴＧＦβ１）とを併用する、ＣＤ１４陽性単球のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける培養のための培地に関する。
【００８１】
有利には、上記２種のサイトカインを併用する培地はまた、サイトカインＩＬ−１３も（培養中に所定の時点で培地に添加できるように、好ましくは物理的に分けて）併用する。
【００８２】
この第三の特徴のある有利な特徴によれば、上記２種のサイトカインを併用する培地は、サイトカインＴＮＦαも（培養中に所定の時点で培地に添加できるように、好ましくは物理的に分けて）併用する。
【００８３】
この第三の特徴の別の有利な特徴によれば、培地中のサイトカインＧＭ−ＣＳＦの濃度は０．１〜４０００ＩＵ／ｍｌ、有利には１〜２０００ＩＵ／ｍｌ、より正確には約４００ＩＵ／ｍｌ；サイトカインＴＧＦβ（好ましくはＴＧＦβ１）の濃度は０．０１〜４００ｎｇ／ｍｌ、有利には１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より正確には約１０ｎｇ／ｍｌ；サイトカインＩＬ−１３の濃度は（培地中に存在する場合）０．０１〜４００ｎｇ／ｍｌ、有利には１〜１００ｎｇ／ｍｌ、より正確には約１０ｎｇ／ｍｌ；サイトカインＴＮＦαの濃度は（培地中に存在する場合）０．１〜４０００ＩＵ／ｍｌ、有利には１〜１０００ＩＵ／ｍｌ、より正確には約２００ＩＵ／ｍｌである。
【００８４】
第四の特徴によれば、本発明は、ＣＤ１４陽性単球から（特に、上述の使用を用いて、又は、上記記載の培養方法によって、又は、上記培地の使用によって）得られるランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞（ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞は共に、調整した（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）未分化の細胞、分化した未熟細胞、成熟細胞、及び／又は、相互連結した細胞である）の混合集団を少なくとも１種含む細胞集団に関する。
【００８５】
第五の特徴によれば、本発明は、上記ＣＤ１４陽性単球の使用によって、又は、上記記載の培養方法によって、又は、抗癌性細胞療法（例えば、免疫応答を刺激することができるＤＣの注入）；（例えば、アネルギーＴ細胞の産生により）免疫寛容状態をつくることによる自己免疫疾患における細胞療法；免疫系に影響を及ぼす疾病に対する遺伝子治療；並びに、ワクチンの開発及び生産等、医療的若しくは生物医学的な用途のために、樹状細胞（すなわちランゲルハンス細胞及び／又は間質性樹状細胞）をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させるための上記培地の使用によって得られるＬＣとＩＤＣの混合集団の使用に関する。
【００８６】
また、第六の特徴によれば、本発明は、上記ＣＤ１４陽性単球の使用によって得られる、又は、上記記載の培養方法によって得られる、又は、上記培地の使用によって得られる、又は、上述のＬＣとＩＤＣの混合集団の、懸濁液、単層又は三次元、単細胞又は多細胞の研究モデルを製造するための使用に関する。
【００８７】
この第五の特徴のある有利な特徴によれば、研究モデルは以下から選択される。
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲンを基盤とするゲル
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は必要に応じてキトサン（ＣＮＲＳのＥＰ０２９６０７８  Ａ１、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社のＷＯ０１／９１１８２１及びＷＯ０１／９２３２２）を含んでいてよいコラーゲンから作られる多孔性マトリックスであって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる多孔性マトリックス
−ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｏｇｒａｆｔ（Ｒ）  ３Ｄ−Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ社）及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素のゲル又は膜（例えば、Ｖｉｔｒｉｘ（Ｒ）（オルガノジェネシス社）等）
−真皮層から構成される真皮等価物（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｍ．ら；１９９９年  ；Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ，ｖｏｌ．３５，３１８−３２６）
−表皮を剥がした死んだ真皮
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン（Ｒ）膜若しくはテフロン（Ｒ）スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン若しくはポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜、ポリエステル半透膜、ポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体（上記群は、Ｓｋｉｎ２ＴＭｍｏｄｅｌ  ＺＫ１１００、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（Ｒ）及びＴｒａｎｓｃｙｔｅ（Ｒ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等の製品を含む）であって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる不活性な担体。
【００８８】
ある有利な特徴によれば、このモデルは、主としてＬＣ、ＩＤＣ、ＬＣ／ＩＤＣの混合物、ＬＣ／ＩＤＣ／内皮細胞／マクロファージの混合物、又は、ＩＤＣ／内皮細胞／マクロファージの混合物のいずれかを含む。
【００８９】
上記組織モデルは、主として角質細胞からなる表皮モデル、主として間質細胞を含む結合間質モデル（皮膚の場合には真皮、粘膜の場合には絨毛膜と称する）、主として上皮細胞からなる上皮モデル、表皮及び真皮からなる皮膚モデル、又は、上皮及び絨毛膜からなる粘膜モデルであってよいとして定義する。
【００９０】
正常で健康な細胞、病的細胞又は細胞系由来の細胞をこれらのモデルにおいて使用できる。これらの細胞は人間又は動物起源であってよい。
【００９１】
本発明によって発生した細胞以外に、上皮細胞、色素細胞及び神経細胞等を上皮部分へ導入できる。
【００９２】
本発明によって発生した細胞以外に、間質細胞（特に繊維芽細胞）、Ｔリンパ球、脂肪細胞及び皮膚付属器（頭髪等の体毛、皮脂腺）を結合間質へ導入できる。
【００９３】
第七の特徴によれば、本発明は、上述のようにＣＤ１４陽性単球から得られるＬＣ／ＩＤＣの混合集団を少なくとも１種含む、完全な再生皮膚モデル又は再生粘膜モデル、再生真皮モデル又は再生絨毛膜モデル、再生上皮モデル、特に表皮モデル、その他、任意の懸濁液、単層若しくは三次元、単細胞若しくは多細胞のモデルに関する。
【００９４】
ある有利な特徴によれば、この再生組織モデル等は以下から選択される。
−間質細胞、特に繊維芽細胞を含む、コラーゲンを基盤とするゲル
−１種以上のグリコサミノグリカン類及び／又は必要に応じてキトサン（ＣＮＲＳのＥＰ０２９６０７８  Ａ１、Ｃｏｌｅｔｉｃａ社のＷＯ０１／９１１８２１及びＷＯ０１／９２３２２）を含んでいてよいコラーゲンから作られる多孔性マトリックスであって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる多孔性マトリックス
−ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｏｇｒａｆｔ（Ｒ）  ３Ｄ−Ｆｉｄｉａ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ社）及び／又はコラーゲン及び／又はフィブロネクチン及び／又は繊維素のゲル又は膜（例えば、Ｖｉｔｒｉｘ（Ｒ）（オルガノジェネシス社）等）
−真皮層から構成される真皮等価物（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｍ．ら；１９９９年  ；Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．−Ａｎｉｍａｌ，ｖｏｌ．３５，３１８−３２６）
−表皮を剥がした死んだ真皮
−合成半透膜、具体的にはニトロセルロース半透膜、ナイロン半透膜、テフロン（Ｒ）膜若しくはテフロン（Ｒ）スポンジ、ポリカーボネート若しくはポリエチレン若しくはポリプロピレン若しくはポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）の半透膜、Ａｎｏｐｏｒｅ無機半透膜、酢酸セルロース若しくはセルロースエステル（ＨＡＴＦ）の膜、Ｂｉｏｐｏｒｅ−ＣＭ半透膜、ポリエステル半透膜、ポリグリコール酸の膜若しくは薄膜からなる群より選択される不活性な担体（上記群は、Ｓｋｉｎ２ＴＭｍｏｄｅｌ  ＺＫ１１００、Ｄｅｒｍａｇｒａｆｔ（Ｒ）及びＴｒａｎｓｃｙｔｅ（Ｒ）（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）等の製品を含む）であって、間質細胞、特に繊維芽細胞を組み込むことができる不活性な担体。
【００９５】
ある有利な特徴によれば、このモデルは、主としてＬＣ、ＩＤＣ、ＬＣ／ＩＤＣの混合物、ＬＣ／ＩＤＣ／内皮細胞／マクロファージの混合物、又は、ＩＤＣ／内皮細胞／マクロファージの混合物のいずれかを含む。
【００９６】
有利には、このモデルのある特徴によれば、ＬＣは上皮部分に位置し、ＩＤＣ、マクロファージ及び内皮細胞が存在する場合は、これらは結合間質に位置する。
【００９７】
有利には、本発明は、構造を与える細胞、とりわけ間質細胞（特に繊維芽細胞）、及び／又は、上皮細胞（特に角質細胞）、及び／又は、その他の細胞種、とりわけＴリンパ球、及び／又は、神経細胞、及び／又は、色素細胞（特にメラノサイト）、並びに、免疫防御を与える細胞（とりわけＬＣ、ＩＤＣ及び／又はマクロファージ）、並びに、血管新生を与える細胞（とりわけ内皮細胞）、並びに、脂肪細胞を中に含む上述のモデルに関する。
【００９８】
第八の特徴によれば、本発明は、上記ＬＣとＩＤＣの混合集団の少なくとも１種の、有効成分を研究及び／又は選択するためのモデルとしての使用に関する。
【００９９】
「有効成分」という用語は、産業、特に化粧品産業、製薬産業、皮膚製薬産業、食品産業、農産食品産業等において有益に作用できるかもしれない任意の物質、製品又は組成物を意味するものとする。
【０１００】
本発明の第九の特徴は、特に有効成分の免疫刺激活性や免疫抑制活性を研究したり、上記有効成分による免疫寛容を評価したり誘発したりするための上記モデルの使用に関する。
【０１０１】
第十の特徴によれば、本発明は、上皮関門の生理病理学；皮膚又は粘膜の刺激；生物種（例えばウィルス、ＨＩＶ等のレトロウィルス、細菌、カビ、微生物及び抗原粒子）による攻撃；光毒性；光防御；有効成分（特に化粧品や医薬品の有効成分）の効果；及び、最終製品（特に化粧品や医薬品）の効果を研究するための、並びに、病原体による感染機構を研究するための上記モデルの使用に関する。特に、本発明によって、ＨＩＶ等のレトロウィルスを含むウィルスの感染、複製及び伝染の現象に関与する機構を研究するための上記モデルの使用、並びに、（ワクチン、薬等を含む）治療法の研究や開発が可能になる。
【０１０２】
第十一の特徴によれば、本発明は、病原体（例えばウィルス、ＨＩＶ等のレトロウィルス、細菌、カビ、微生物及び抗原粒子）の存在を検出するための上記モデルの使用に関する。
【０１０３】
第十二の特徴によれば、本発明は、化粧的、医療的又は生物医学的用途のために、特に予防や治療を目的として、特に（とりわけ、ＵＶ照射等の物理的な、又は、化学的／（免疫学的なものを含む）生物学的な）環境因子による攻撃の後に起こる免疫応答や寛容応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて調整するための、上記研究モデルの使用に関する。
【０１０４】
本発明の第十三の特徴によれば、再生組織、再生皮膚、再生粘膜又は研究モデルは、組織工学又は細胞工学的用途：並びに、抗癌性細胞療法（例えば、免疫応答を刺激できるＤＣの注入）；（例えば、アネルギーＴ細胞の産生により）免疫寛容状態をつくることによる自己免疫疾患における細胞療法；免疫系に影響を及ぼす疾病の遺伝子治療；及び、ワクチンの開発及び生産等の医療的又は生物医学的用途のために使用できる。
【０１０５】
また別の特徴によれば、（とりわけ（特に、研究モデルを利用できるような）上記特徴のいずれかを実施することにより）ＣＤ１４陽性単球から得られた細胞の混合集団を少なくとも使用してその活性が実証されている任意の潜在的な活性物質もまた、本発明の範囲に含まれる。
【０１０６】
本発明に基づいて、もしドナーの血液バッグを各種使用できれば、循環血液中の単球の供給源として容易かつ便利に使用できる。ＣＤ１４陽性前駆体は循環血液中に多く存在するので、ＬＣ及びＩＤＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて高い再現性をもって大量に生産することができる可能性が高くなる。
【０１０７】
また、ＣＤ１４陽性単球を培養するとＬＣとＩＤＣとが得られ、これによって、皮膚や粘膜への適用を特に意図する物質の高速スクリーニングに適した培養モデルが得られる。この培養モデルは、上述のように少なくともＬＣ及び／又はＩＤＣを同時に用いたものなので、満足のいく完全なツールである。その結果、動物実験の代替法となり、とりわけ、このツールを用いれば、化粧品産業における法律によって施行される倫理協定を遵守できる。
【０１０８】
また、本発明によって、培養モデルと再生皮膚モデル又は再生粘膜モデルとの併用が可能になり、正常な人間の皮膚又は正常な人間の粘膜に生理学的に非常に類似する「内皮化した免疫応答性の再生皮膚」又は「内皮化した免疫応答性の再生粘膜」のうち１種のモデルをｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生させることができる。このモデルは、上皮関門の生理病理学；皮膚又は粘膜の刺激；生物種（例えばウィルス、ＨＩＶ等のレトロウィルス、細菌、カビ、抗原粒子）による攻撃；光毒性；光防御；並びに、有効成分（特に医薬品や化粧品の有効成分）及び最終製品（特に化粧品や医薬品）の効果を研究するために使用してもよい。
【０１０９】
本発明によって、ＤＣの様々な集団を発生させることができ、その機能が異なることから、生体の感染／防御プロセスに関与するあらゆる現象を考慮に入れることができる。
【０１１０】
また、注目すべきことに、予想外にも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ１４陽性単球から発生して末梢循環血液から分離された細胞は、再生皮膚モデル又は再生粘膜モデルへ一旦組み込まれると、
−上皮内に位置してＬＣへ分化すること；
−結合間質（真皮又は絨毛膜）中に位置して、ＩＤＣ、内皮細胞及びマクロファージに分化すること；並びに、
−生体内のＬＣ、ＩＤＣ、内皮細胞及びマクロファージと匹敵する機能を獲得すること；
ができる。
【０１１１】
本発明は、（特に化粧品及び／又は医薬品産業における）工業及び商業規模での確実で再現性のある使用が可能になるよう技術的に大いに改善できること、並びに、本発明は臨床分野と密接に関わりを持つ可能性があることが分かる。
【０１１２】
使用した操作プロトコールの要点を見れば、方向の異なるＣＤ１４陽性単球の培養方法についてより理解できるだろう。
【０１１３】
＜末梢循環血液からＣＤ１４陽性単球を抽出した後、以下のプロトコールに基づいて細胞を発生させる＞
プロトコール１：
ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ１及びＩＬ−１３の存在下で２日間、その後ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦβ１の存在下で更に４日間、ＣＤ１４陽性を懸濁液中で培養する→Ｄ６：（未分化で未熟な）ＬＣ前駆体
懸濁液中へのＴＮＦαの添加（＜１８時間）→（分化して未熟な）ＬＣが大部分
【０１１４】
プロトコール２：
ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ１及びＩＬ−１３の存在下で６日間、ＣＤ１４陽性を懸濁液中で培養する→Ｄ６：（未分化で未熟な）ＩＤＣ前駆体
懸濁液中へのＴＮＦαの添加（＜１８時間）→（分化して未熟な）ＩＤＣが大部分
【０１１５】
プロトコール３：
ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ１及びＩＬ−１３の存在下で４日間、その後ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦβ１の存在下で更に２日間、ＣＤ１４陽性を懸濁液中で培養する→Ｄ６：（未分化で未熟な）ＬＣ前駆体及びＩＤＣ前駆体
懸濁液中へのＴＮＦαの添加（＜１８時間）→（分化して未熟な）ＬＣとＩＤＣの均一な混合集団
【０１１６】
プロトコール４：
ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ１及びＩＬ−１３の存在下で６日間、２日間、４日間又は６日間、ＣＤ１４陽性を懸濁液中で培養する→Ｄ６：（未分化で未熟な）ＬＣ前駆体及びＩＤＣ前駆体
懸濁液中へのＴＮＦαの添加（＞２０時間）→（分化し成熟していて、ＬＣ又はＩＤＣのいずれでもない）活性細胞
【０１１７】
プロトコール１、２又は３によって得られた細胞を三次元培養モデル（好ましくは未分化の細胞の段階＝ＬＣ前駆体及び／又はＩＤＣ前駆体）へ組み込むと、：
−ＴＮＦαの添加は、ＬＣ前駆体及びＩＤＣ前駆体がＬＣ及びＩＤＣへ分化するのに必須ではないこと；及び、
−ＬＣ及びＩＤＣに加えて、マクロファージ及び真皮／絨毛膜の内皮細胞が自動的に得られること：
が観察される。
【０１１８】
＜ＣＤ１４陽性単球の分化／成熟の様々な段階＞
・ＣＤ１４陽性単球→Ｄ６：ＬＣ前駆体及び／又はＩＤＣ前駆体（＝未分化で未熟な細胞）
・ＴＮＦαの添加（＜１８時間）→ＬＣ及び／又はＩＤＣ（＝「分化した」未熟な細胞））
・ＴＮＦαの添加（＞２０時間）→ＬＣ又はＩＤＣのいずれでもない成熟した細胞（＝「成熟した活性」細胞）
・ＬＣ及び／又はＩＤＣ又は成熟した細胞への（Ｔリンパ球上に存在する）ＣＤ４０リガンドの添加→「相互連結」細胞（＝「成熟の最終段階」）
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１９】
本発明の他の有利な目的及び特徴は、複数の実施例を参照する以下の記載から当業者にははっきりと明白になるだろう。なお、実施例は説明するための記載であって、本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【０１２０】
実施例において、特に断りのない限り、温度は摂氏又は室温であり、圧力は大気圧である。
【実施例１】
【０１２１】
＜末梢循環血液からのＣＤ１４陽性単球の分離方法＞
１人以上の人間のドナーからの静脈血を、ヘパリンリチウムやクエン酸塩リン酸塩デキストラン（ｃｉｔｒａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｘｔｒａｎ）等の従来の抗凝血薬を入れたヴァキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）又はビニール袋に採取することにより、末梢循環血液を集める。
【０１２２】
有利には、ＣＤ１４陽性単球は、Ｇｅｉｓｓｍａｎｎらの記載するプロトコールによって以下の方法でこの循環血液から分離することができる（Ｇｅｉｓｓｍａｎｎら、Ｊ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．ｖｏｌ．１８７，ｎｏ．６，１６  Ｍａｒｃｈ  １９９８年，ｐ．９６１−９６６，ロックフェラー大学出版）。
−フィコール勾配を用いて遠心分離した後、循環血液の単核細胞を回収し、磁気ビーズを結合した抗体混合物（主として抗ＣＤ３、抗ＣＤ７、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＤ５６、抗ＩｇＥ）により間接的に標識する。
−磁気カラムを通した後、磁気標識されていない単球のみを溶出する。
【０１２３】
ＣＤ１４＋単球を、当業者には公知の任意の物理的な分離方法によって、特に遠心沈降又は遠心分離によって溶出液から回収し、そのまま次の培養に用いる。
【０１２４】
採取した血液１００ｍｌ当たり約１億５０００万（±２０００万）個の単核細胞を抽出して精製し、ＣＤ１４陽性単球を最大４０００万個得る。用いる培養条件（以下の実施例を参照）に応じて、ランゲルハンス細胞及び／又は間質性樹状細胞が１２００〜１６００万個発生する。
【実施例２】
【０１２５】
＜分離したＣＤ１４陽性単球を培養して、未分化で未熟な樹状細胞を得る＞
実施例１で得られたＣＤ１４陽性単球を、約１００万個／１ｍｌの割合で、非働化（ｄｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００国際単位／ｍｌ（ＩＵ／ｍｌ）及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１２６】
培養は、３７℃においてＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で行う。
【０１２７】
本発明の範囲内において、培地は、第三のサイトカイン、すなわちサイトカインＩＬ−１３を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から添加されているものを用いる。培養４日目に、ＩＬ−１３を加えないこと以外は上記と同じ培地を添加し、更に２日間培養を続ける。培養６日目に、ランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞へ分化できる未分化で未熟な樹状細胞が発生する：
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞の約３０〜５０％は、Ｌａｎｇｅｒｉｎ（ランゲルハンス細胞の特異的マーカー）を細胞内レベルでしか発現しておらず、成熟のマーカーＣＤ８３、ＤＣ−ＬＡＭＰ及びＣＣＲ７を発現しない；
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞の約３０〜５０％は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（間質性樹状細胞の特異的マーカー）を発現し、成熟のマーカーＣＤ８３、ＤＣ−ＬＡＭＰ及びＣＣＲ７を発現しない。
【実施例３】
【０１２８】
＜分離したＣＤ１４陽性単球を培養して、間質性樹状細胞（ＩＤＣ）へ選択的に分化できる未分化で未熟な樹状細胞を得る＞
実施例１で得られたＣＤ１４陽性単球を、約１００万個／１ｍｌの割合で、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１２９】
培養は、３７℃においてＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で行う。
【０１３０】
本発明の範囲内において、培地は、第三のサイトカイン、すなわちサイトカインＩＬ−１３を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から添加されているものを用いる。培養６日後に、ＩＤＣへ選択的に分化できる未分化で未熟な樹状細胞が発生する：
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞の約６０〜８０％は、ＤＣ−ＳＩＧＮ（間質性樹状細胞の特異的マーカー）を発現する；
−ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性細胞の集団は、マーカーＣＤ６８を強く発現するため、未熟である。
【実施例４】
【０１３１】
＜分離したＣＤ１４陽性単球を培養して、ランゲルハンス細胞（ＬＣ）へ選択的に分化できる未分化で未熟な樹状細胞を得る＞
実施例１で得られたＣＤ１４陽性単球を、約１００万個／１ｍｌの割合で、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１３２】
培養は、３７℃においてＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で行う。
【０１３３】
培地は、第三のサイトカイン、すなわちサイトカインＩＬ−１３を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から添加されているものを用いる。遅くとも２日間培養する前から、ＩＬ−１３を加えないこと以外は上記と同じ培地を最長でも培養６日目まで添加する。６日目に、ランゲルハンス細胞へ選択的に分化できる未分化で未熟な樹状細胞が発生する：
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞の約６０〜８０％は、Ｌａｎｇｅｒｉｎを細胞内レベルで発現し、ＣＣＲ６（ＭＩＰ−３αの特異的受容体）を発現する；
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞は、ＭＩＰ−３αによって強く化学誘引されてＣＣＲ６受容体の機能を示す；
−成熟のマーカーＣＤ８３、ＤＣ−ＬＡＭＰ及びＣＣＲ７を発現しないことから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞は未熟である。
【実施例５】
【０１３４】
＜分離したＣＤ１４陽性単球を培養して、主として間質性樹状細胞を得る＞
実施例１で得られたＣＤ１４陽性単球を、約１００万個／１ｍｌの割合で、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１３５】
培養は、３７℃においてＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で行う。
【０１３６】
本発明の範囲内において、培地は、第三のサイトカイン、すなわちサイトカインＩＬ−１３を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から添加されているものを用いる。培養６日間後、サイトカインＴＮＦαを２００ＩＵ／ｍｌの割合で１８時間未満添加し、主として間質性樹状細胞を得る：
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞の約６０〜８０％は、ＤＣ−ＳＩＧＮを膜レベルで発現する；
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞は、間質性樹状細胞に特徴的なマンノース受容体を強く発現する；
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した間質性樹状細胞は、生体内の間質性樹状細胞と同一の機能的特徴を有する。
【実施例６】
【０１３７】
＜分離したＣＤ１４陽性単球を培養して、主としてランゲルハンス細胞を得る＞
実施例１で得られたＣＤ１４陽性単球を、約１００万個／１ｍｌの割合で、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１３８】
培養は、３７℃においてＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で行う。
【０１３９】
本発明の範囲内において、培地は、第三のサイトカイン、すなわちサイトカインＩＬ−１３を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から添加されているものを用いる。遅くとも２日間培養する前から、ＩＬ−１３を加えないこと以外は上記と同じ培地を最長でも培養６日目まで添加する。６日目に、サイトカインＴＮＦαを２００ＩＵ／ｍｌの割合で最長１８時間添加し、主としてランゲルハンス細胞を得る：
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞の約６０〜８０％は、Ｌａｎｇｅｒｉｎ（ランゲルハンス細胞の特異的マーカー）を膜レベルで発現し、ランゲルハンス細胞の超微細構造としての特異的マーカーであるＢｉｒｂｅｃｋ顆粒を示す；
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生したランゲルハンス細胞は、生体内のランゲルハンス細胞と類似した機能を有する；すなわち、ＭＩＰ−３αによって化学誘引されたり、ＩＬ−１βの影響を受けて、又は、ＴＮＰや２、４、６−トリニトロベンゼンスルホン酸等の強いアレルゲンによる感作を受けて遊走したりし得る。
【実施例７】
【０１４０】
＜分離したＣＤ１４陽性単球を培養して、ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の２種からなる均質な集団を得る＞
実施例１で得られたＣＤ１４陽性単球を、約１００万個／１ｍｌの割合で、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１４１】
培養は、３７℃においてＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で行う。
【０１４２】
本発明の範囲内において、培地は、第三のサイトカイン、すなわちサイトカインＩＬ−１３を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から添加されているものを用いる。培養４日後、ＩＬ−１３を加えないこと以外は上記と同じ培地を更に２日間添加する。６日目に、サイトカインＴＮＦαを２００ＩＵ／ｍｌの割合で最長１８時間添加し、ランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞の２種からなる集団を得る：
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞の約３０〜５０％が、Ｌａｎｇｅｒｉｎを膜レベルで発現する；
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞の約３０〜５０％が、ＤＣ−ＳＩＧＮを膜レベルで発現する；
−二重標識実験によって、発生した樹状細胞がＬａｎｇｅｒｉｎ陽性及びＤＣ−ＳＩＧＮ陽性のいずれであるかを確認できる。
【実施例８】
【０１４３】
＜分離したＣＤ１４陽性単球を培養して、主として活性化した成熟樹状細胞を得る＞
実施例１で得られたＣＤ１４陽性単球を、約１００万個／１ｍｌの割合で、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【０１４４】
培養は、３７℃においてＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で行う。
【０１４５】
本発明の範囲内において、培地は、第三のサイトカイン、すなわちサイトカインＩＬ−１３を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から添加されているものを用いる。培養は、サイトカインＩＬ−１３を添加しての培養時間に関わらず最長６日間行う。６日目に、サイトカインＴＮＦαを２００ＩＵ／ｍｌの割合で２０時間を超えて添加し、活性化した成熟樹状細胞を得る：
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞は、成熟のマーカーＣＤ８３、ＤＣ−ＬＡＭＰ及びＣＣＲ７（ＭＩＰ−３βの特異的受容体）を発現する；
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞は、ＭＩＰ−３βによって強く化学誘引されてＣＣＲ７受容体の機能を示す。
【実施例９】
【０１４６】
＜遊走に関する懸濁単細胞モデル中における、主としてランゲルハンス細胞からなる集団の使用＞
細胞の発生：実施例６参照
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生したランゲルハンス細胞の任意の攻撃（例えば微生物（例えば細菌性微生物）等の生物種の攻撃）に向かう走化能を、孔隙率８〜５μｍの膜で分けた２つの区画を有する（基底膜を模倣したマトリックス（ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ型）で覆われていても覆われていなくてもよい）走化チェンバー、又は、ボイデンチェンバーを用いて、以下のプロトコールによって評価する。
【０１４７】
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生したランゲルハンス細胞２．５×１０５個を、濃度１５ｍｇ／ｍｌのマンナン１００μｌで３７℃において１０分間刺激する；
−この細菌性の刺激の後に、ランゲルハンス細胞を、非働化ウシ胎児血清を２％（ｖ／ｖ）添加したＲＰＭＩ１６４０培地０．５ｍｌ中に細胞２．５×１０５個の割合で、走化チェンバーの上室へ播種する；走化チェンバーの下室にはウシ胎児血清を２％添加したＲＰＭＩ１６４０培地０．７５ｍｌをあらかじめ播種してある；
−３７℃において１時間遊走させた後、走化チェンバーの下室へ遊走したランゲルハンス細胞（すなわち、走化チェンバー下室中の培地）を回収する；
−遊走したランゲルハンス細胞を、白色光顕微鏡により細胞を計数して定量する；
−結果を、走化率（すなわち、刺激されて遊走した細胞の割合を自発的に遊走した細胞の割合（ネガティブコントロール）で割ったもの）として示す。
【０１４８】
マンナンによる刺激後の走化率は１．６〜１．９である。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生し、マンナンで刺激したランゲルハンス細胞は、未処理のランゲルハンス細胞よりも１．６〜１．９倍遊走する。
【０１４９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生したランゲルハンス細胞は刺激物の影響を受けて遊走できることから、これらが機能的であること、及び、潜在的な攻撃性／アレルギー性物質の評価のための研究モデルとしてこの試験を使用できることが示される。
【実施例１０】
【０１５０】
＜サイトカイン分泌に関する懸濁単細胞モデル中における、主として間質性樹状細胞からなる集団の使用＞
細胞の発生：実施例５参照
任意の攻撃（例えば化学種（特にＴＮＰや２、４、６−トリニトロベンゼンスルホン酸等のアレルゲン）の攻撃）に対する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した間質性樹状細胞のサイトカインタンパク質（例えばインターロイキン１２（ＩＬ−１２））分泌を、ＥＬＩＳＡ分析（固相酵素免疫測定法）を用いて以下のプロトコールにより定量することができる。
【０１５１】
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した間質性樹状細胞１００万個を、３７℃において１０分間、濃度５ｍＭのＴＮＰ８００μｌで刺激する；
−この刺激の後、間質性樹状細胞を回収し、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌ当たり細胞１００万個の割合で、６ウェルプレートに播種する；
−３７℃においてＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で４８時間培養した後、間質性樹状細胞の培養上清を回収する；
−まず１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞残屑を除去した培養上清を、ＥＬＩＳＡに使用する；ＩＬ−１２に対するＥＬＩＳＡの手順については、製造者（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）提供の使用説明書を参照するとよい；
−結果をＩＬ−１２の濃度（ｎｇ／細胞１００万個／ｍｌ）として示す。
【０１５２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生し、ＴＮＰで刺激した間質性樹状細胞は、ＩＬ−１２ｐ７５を２．１〜２．７ｎｇＩＬ−１２ｐ７５／細胞１００万個／ｍｌの濃度で分泌し、一方、未処理の間質性樹状細胞はＩＬ−１２ｐ７５を０．１ｎｇ未満／細胞１００万個／ｍｌの濃度で分泌する。
【０１５３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した間質性樹状細胞は、刺激物の影響を受けると免疫賦活サイトカインを多く分泌するようになることから、これらが機能的であること、及び、潜在的な攻撃性／アレルギー性物質の効果を評価するための研究モデルとしてこの試験を使用できることが示される。
【実施例１１】
【０１５４】
＜抗原取り込みの懸濁二細胞モデル中における、ＬＣとＩＤＣの２種からなる集団の使用＞
細胞の発生：実施例７参照
ＬＣとＩＤＣの２種からなる本質的に均質な集団の利点は、生体内での場合と同様に互いに相互作用する可能性があるということである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生したランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞の取り込み経路（すなわち抗原捕獲能）を、デキストラン及びフローサイトメトリーを用いて以下のプロトコールにより研究した。
【０１５５】
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生したランゲルハンス細胞と間質性樹状細胞を含む混合集団の２×１０５個の細胞を、以下の条件において連続して培養する：
−濃度２μｇ／ｍｌの抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体５μｌ、３０分間、４℃；
−濃度１μｇ／ｍｌの蛍光色素ＴＲＩ−Ｃｏｌｏｒ標識ヤギ抗マウス抗体１０μｌ、３０分間、４℃；
−１／２０に希釈した正常なマウス血清を用いたブロッキング；
−濃度１μｇ／ｍｌのフィコエリトリン標識抗Ｌａｎｇｅｒｉｎ抗体２μｌ、３０分間、４℃；及び
−非働化ウシ胎児血清を１％添加したＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）からなる取り込みバッファー５００μｌにＦＩＴＣデキストランを１ｍｇ／ｍｌ溶解したもの；試験は３７℃において、ネガティブコントロールは４℃において１５分間反応させる
−ＦＩＴＣデキストランと反応させた後、細胞をフローサイトメトリーによって分析する；
−結果は、（ネガティブコントロールと比較して）陽性のランゲルハンス細胞及び間質性樹状細胞の百分率として、すなわち、デキストランを取り込んだ細胞の百分率として示す；
−ランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｉｎ陽性）の５０〜７０％がＦＩＴＣデキストランを取り込み、間質性樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性）の６０〜８０％がＦＩＴＣデキストランを取り込む。
【０１５６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞が抗原を取り込むことができることから、これらが機能的であること、及び、抗原取り込みの研究モデルとしてこの試験を使用できることが示される。
【実施例１２】
【０１５７】
＜ＬＣ及びＩＤＣの成熟経路を研究するための、懸濁二細胞モデル中におけるＬＣとＩＤＣの２種からなる集団の使用＞
細胞の発生：実施例７参照
６日目に、サイトカインＴＮＦαを２００ＩＵ／ｍｌの割合で４８時間添加する。
【０１５８】
ＬＣとＩＤＣの２種からなる本質的に均質な集団の利点は、生体内での場合と同様に互いに相互作用する可能性があるということである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生したＬＣ及びＩＤＣの成熟経路を研究するために、ＬＣ及びＩＤＣ両方の細胞質内における成熟マーカーＤＣ−ＬＡＭＰの発現を調べた。これにあたり、実験を以下のプロトコールによって行った。
【０１５９】
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生したＬＣとＩＤＣを含む混合集団の２×１０５個の細胞を、以下の条件において連続して培養する：
−抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体（２μｇ／ｍｌ）５μｌ又は抗Ｌａｎｇｅｒｉｎ抗体（２μｇ／ｍｌ）１０μｌのいずれか、３０分間、４℃；
−濃度１μｇ／ｍｌの蛍光色素ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識ヤギ抗マウス抗体１０μｌ、３０分間、４℃；
−１／２０に希釈した正常なマウス血清を用いたブロッキング；
−濃度１μｇ／ｍｌの蛍光色素ＰＥ（フィコエリトリン）標識抗ＤＣ−ＬＡＭＰ抗体１０μｌ、３０分間、４℃；
−結果は、ＤＣ−ＬＡＭＰ陽性のＬＣ及びＤＣ−ＬＡＭＰ陽性のＩＤＣの百分率として示す。
【０１６０】
ＴＮＦαを４８時間培養した後に表現型を調べたところ、ＩＤＣ（ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性）は成熟マーカーＤＣ−ＬＡＭＰを発現しないが、一方、Ｌａｎｇｅｒｉｎ陽性ＬＣの集団の５０％はＤＣ−ＬＡＭＰ陽性である。この結果から、成熟過程は、皮膚の２種のＤＣ（すなわちＬＣ及びＩＤＣ）の亜集団の間で区別でき、異なるということが概ね分かった。従って、皮膚関門を通過して真皮上層部に入ることができる有効物質や有効成分（化粧品又は医薬品）は、皮膚の両ＤＣ（すなわち、表皮中のＬＣ及び真皮上層中のＩＤＣ）の異なった成熟経路を刺激しているのかもしれない。このようなアプローチによって、局所投与において、潜在的な免疫寛容原と、免疫原性の有効物質や有効成分（化粧品又は医薬品）とを区別できるかもしれない。
【実施例１３】
【０１６１】
＜未感作のＴリンパ球に対する同種の刺激に関する懸濁単細胞モデル中における、活性化した成熟樹状細胞の集団の使用＞
細胞の発生：実施例８参照
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した成熟樹状細胞が相互連結樹状細胞の機能を獲得できるかどうか（すなわち、同種の未感作のＴリンパ球の増殖を刺激できるかどうか）を調べるために、以下のプロトコールによって混合リンパ球反応を行った。
【０１６２】
−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した成熟樹状細胞を、ＣＯ２を５％含んだ湿気のある空気中で３７℃において４８時間、ＣＤ４０リガンド分子を感染させた繊維芽細胞と共に、活性化した樹状細胞１０個に対してＣＤ４０リガンドを感染させた繊維芽細胞１個の割合で、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する；
−活性化した樹状細胞を回収し、同種の未感作のＴリンパ球と共に、ヒトＡＢ型血清を１０％添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で３日間培養する；活性化した樹状細胞１２５〜８０００個を準備し、未感作のＴリンパ球１０５個と共に培養する；
−混合リンパ球培養３日目に、活性５ｍＣｉのトリチウム化チミジン２０μｌを１８時間添加する；
−結果を、活性化した樹状細胞の数（１２５〜８０００個の範囲）を横軸、同種の未感作のＴリンパ球へのトリチウム化チミジンの取り込み（ｃｐｍ（カウント／分））を縦軸とするグラフに示す。
【０１６３】
ＣＤ４０リガンドと相互作用させた後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した活性化した樹状細胞は、未感作のＴリンパ球の増殖をあまり誘発しない（３．１０３〜６．１０３ｃｐｍ）活性化した樹状細胞と比較して、未感作のＴリンパ球の増殖を強く刺激する（１２．１０３〜１６．１０３ｃｐｍ）。
【０１６４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞は、相互連結樹状細胞の機能を獲得できること、すなわち高い同種刺激能を獲得できることから、これらが機能的であること、及び、同種刺激の研究モデルとしてこの試験を使用できることが示される。
【実施例１４】
【０１６５】
＜共存培養における角質細胞及びＬＣの単層多細胞モデル＞
細胞の発生：実施例４又は６参照
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓの培地（参照：ＫＧＭ−２）を入れた６ウェルプレート型の培養皿内に角質細胞１×１０５個を播種し、角質細胞がコンフルエントになるまで浸漬培養する。コンフルエントになった時点で、実施例４又は６によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞１〜３×１０５個を添加する。更に３〜４日間、非働化ウシ胎児血清を１０％添加し、２種のサイトカイン、すなわちサイトカインＧＭ−ＣＳＦを４００ＩＵ／ｍｌ及びサイトカインＴＧＦβ１を１０ｎｇ／ｍｌの割合で最初から含んだＲＰＭＩ１６４０培地中で培養する。
【実施例１５】
【０１６６】
＜共存培養における繊維芽細胞及び間質性樹状細胞の単層多細胞モデル＞
細胞の発生：実施例３及び５参照
Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＩＩウシ血清を１０％、ペニシリンを１００ＩＵ／ｍｌ及びゲンタマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍｌ添加したＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ培地を入れた６ウェルプレート型の培養皿内に、繊維芽細胞１×１０５個を播種し、繊維芽細胞がコンフルエントになるまで浸漬培養する。コンフルエントになった時点で、実施例３又は５によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞１〜３×１０５個を添加する。更に３〜４日間培養する。
【実施例１６】
【０１６７】
＜上皮細胞及びランゲルハンス細胞を含む歯肉粘膜の再生表皮又は再生上皮の三次元多細胞モデル＞
モデルは以下のプロトコールによって調製する。
−角質細胞又は上皮細胞１〜２×１０６個をボイデンチェンバー（膜の孔隙率は０．４μｍ）の挿入部に播種する；培養１日後に、実施例４によりｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞１〜３×１０５個を添加し、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＩＩウシ血清を１０％、アスコルビン酸２−リン酸塩を最終濃度１ｍＭ、ＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾンを最終濃度０．４μｇ／ｍｌ、ｕｍｕｌｉｎｅを最終濃度０．１２ＩＵ／ｍｌ、ｉｓｕｐｒｅｌを最終濃度０．４μｇ／ｍｌ、トリヨードサイロニンを最終濃度２．１０−９Ｍ、アデニンを最終濃度２４．３μｇ／ｍｌ、ペニシリンを最終濃度１００ＩＵ／ｍｌ、アンホテリシンＢを最終濃度１μｇ／ｍｌ及びゲンタマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍｌ添加したＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｈａｍ  Ｆ−１２（比率３／１  ｖ／ｖ）培地中で３〜８日間浸漬培養する；
−その後、培養した角質細胞を、ウシ血清、ヒドロコルチゾン、ｉｓｕｐｒｅｌ、トリヨードサイロニン及びｕｍｕｌｉｎｅを加えないこと以外は上記浸漬培養で用いたものと同じ培地中、１２〜１８日間気体界面に置く；
−その後、培養した上皮細胞を、ウシ血清の割合を１０％から１％に減らす以外は上記浸漬培養で用いたものと同じ培地中で、１２〜１８日間浸漬培養を続ける。
【実施例１７】
【０１６８】
＜間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞の集団を含む、再生真皮又は再生歯肉絨毛膜の三次元多細胞モデル＞
細胞の発生：実施例３、４、５、６又は７参照
モデルを以下のプロトコールによって調製する：
−正常な人間の皮膚又は歯肉粘膜の繊維芽細胞２×１０５個を、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＩＩウシ血清を１０％、アスコルビン酸２−リン酸塩を最終濃度１ｍＭ、ＥＧＦ（表皮成長因子）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、ペニシリンを最終濃度１００ＩＵ／ｍｌ、アンホテリシンＢを最終濃度１μｇ／ｍｌ及びゲンタマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍｌ添加したＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ培地中、ジフェニルホスホリルアジドで架橋したコラーゲンを基盤とするマトリックス培養基上に播種する。培養１４日後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した樹状細胞１〜３×１０５個を、結合間質等価物上に播種し、更に１４日間培養する。
【０１６９】
用いたマーカーにより、間質性樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性）、マクロファージ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製マクロファージマーカー：クローン３Ａ５モノクローナル抗体ＮＣＬ−ＭＡＣＲＯ）及び内皮細胞（Ｖ−ＣＡＭ陽性）の存在が明らかになった。
【実施例１８】
【０１７０】
＜ランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞の集団を含む、再生皮膚の三次元多細胞モデル＞
細胞の発生：実施例４又は６参照
モデルを以下のプロトコールによって調製する：
−正常なヒト皮膚繊維芽細胞２×１０５個を、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＩＩウシ血清を１０％、アスコルビン酸２−リン酸塩を最終濃度１ｍＭ、ＥＧＦ（表皮成長因子）を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、ペニシリンを最終濃度１００ＩＵ／ｍｌ、アンホテリシンＢを最終濃度１μｇ／ｍｌ及びゲンタマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍｌ添加したＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ培地中、コラーゲン／グリコサミノグリカン／キトサンを基盤とする真皮培養基上に播種して、１４日間培養する；
−その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した正常なヒト角質細胞２×１０５個及び樹状細胞１〜３×１０５個を、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＩＩウシ血清を１０％、アスコルビン酸２−リン酸塩を最終濃度１ｍＭ、ＥＧＦを最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ、ヒドロコルチゾンを最終濃度０．４μｇ／ｍｌ、ｕｍｕｌｉｎｅを最終濃度０．１２ＩＵ／ｍｌ、ｉｓｕｐｒｅｌを最終濃度０．４μｇ／ｍｌ、トリヨードサイロニンを最終濃度２．１０−９Ｍ、アデニンを最終濃度２４．３μｇ／ｍｌ、ペニシリンを最終濃度１００ＩＵ／ｍｌ、アンホテリシンＢを最終濃度１μｇ／ｍｌ及びゲンタマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍｌ添加したＤＭＥＭ−Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｈａｍ  Ｆ−１２（比率３／１  ｖ／ｖ）培地中、真皮等価物上に播種し、７日間浸漬培養する；
−その後、培養した細胞を、ウシ血清、ヒドロコルチゾン、ｉｓｕｐｒｅｌ、トリヨードサイロニン及びｕｍｕｌｉｎｅを加えないこと以外は上記浸漬培養で用いたものと同じ培地中、１４日間気体界面に置く；
−その後、培養した細胞をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｃｋ（Ｒ）等の無定形の樹脂で覆い、液体窒素中で凍結する；
−厚さ６μｍの凍結切片について、抗Ｌａｎｇｅｒｉｎ、抗ＤＣ−ＳＩＧＮ及び抗Ｖ−ＣＡＭモノクローナル抗体、並びに、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製マクロファージマーカー（クローン３Ａ５モノクローナル抗体ＮＣＬ−ＭＡＣＲＯ）を用いて免疫組織化学的に調べ、存在する様々な細胞の種類を特定する；
−用いたマーカーにより、表皮中におけるランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｉｎ陽性）の存在、並びに、真皮中における間質性樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性）、マクロファージ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製マクロファージマーカー：クローン３Ａ５モノクローナル抗体ＮＣＬ−ＭＡＣＲＯ）及び内皮細胞（Ｖ−ＣＡＭ陽性）の存在が明らかになった。
【実施例１９】
【０１７１】
＜ランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞の集団を含む、色素細胞を有する再生皮膚の三次元多細胞モデル＞
モデルを、実施例１８に記載のプロトコールにより調製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発生した角質細胞及び樹状細胞と共にメラノサイト１００００個を播種する。
【０１７２】
実施例１８に記載のマーカーを用いる以外に、メラノサイトを免疫標識（ＭＥＬＡＮ−Ａ）して、免疫組織化学的に調べる（ＤＯＰＡ反応）。
【実施例２０】
【０１７３】
＜間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞の集団を含む、再生皮膚の三次元多細胞モデル＞
細胞の発生：実施例３、５又は７参照
モデルを、実施例１８に記載のプロトコールに従って調製する。
【０１７４】
用いたマーカーにより、真皮中における間質性樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性）、マクロファージ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製マクロファージマーカー：クローン３Ａ５モノクローナル抗体ＮＣＬ−ＭＡＣＲＯ）及び内皮細胞（Ｖ−ＣＡＭ陽性）の存在が明らかになった。
【実施例２１】
【０１７５】
＜ランゲルハンス細胞、間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞の集団を含む、再生膣粘膜の三次元多細胞モデル＞
細胞の発生：実施例４又は６参照
モデルを、以下の変化を加えた実施例１８に記載のプロトコールに従って調製する：角質細胞を膣上皮細胞に置き換え、繊維芽細胞は膣粘膜から採取し、全ての培養は浸漬培養として培地中で行う。
【０１７６】
その後、培養した上皮細胞を、ウシ血清の割合を１０％から１％に減らす以外は上記と同じ培地中で、１２〜１８日間浸漬培養を続ける。
【０１７７】
用いたマーカーにより、上皮中におけるランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｉｎ陽性）の存在、並びに、絨毛膜中における間質性樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性）、マクロファージ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製マクロファージマーカー：クローン３Ａ５モノクローナル抗体ＮＣＬ−ＭＡＣＲＯ）及び内皮細胞（Ｖ−ＣＡＭ陽性）の存在が明らかになった。
【実施例２２】
【０１７８】
＜間質性樹状細胞、マクロファージ及び内皮細胞の集団を含む、再生膣粘膜の三次元多細胞モデル＞
細胞の発生：実施例３、５又は７参照
モデルを、以下の変化を加えた実施例１８に記載のプロトコールに従って調製する：角質細胞を膣上皮細胞に置き換え、繊維芽細胞は膣粘膜から採取し、全ての培養は浸漬培養として培地中で行う。その後、培養した上皮細胞を、ウシ血清の割合を１０％から１％に減らす以外は上記浸漬培養で用いたものと同じ培地中で、１２〜１８日間浸漬培養を続ける。
【０１７９】
用いたマーカーにより、絨毛膜中における間質性樹状細胞（ＤＣ−ＳＩＧＮ陽性）、マクロファージ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社製マクロファージマーカー：クローン３Ａ５モノクローナル抗体ＮＣＬ−ＭＡＣＲＯ）及び内皮細胞（Ｖ−ＣＡＭ陽性）の存在が明らかになった。
【実施例２３】
【０１８０】
＜実施例１６、１８、１９又は２０に記載するモデルのいずれかを使用して、ＬＣ／上皮環境の相互作用を調べる＞
モデルを調製した後、Ｅ−カドヘリンを標識する。
接着分子Ｅ−カドヘリンの発現がランゲルハンス細胞及び上皮細胞上に見られることから、このタンパク質を介してランゲルハンス細胞と近隣の上皮細胞が好中球性の相互作用をしている可能性が示される。
【実施例２４】
【０１８１】
＜実施例１６に記載する再生表皮モデルを使用して、ＵＶＢ照射の影響を調べる＞  
様々な環境因子、特にＵＶ照射、より正確には（大抵の場合表皮まで届く）ＵＶＢ照射の影響を調べるため、以下のプロトコールに従って免疫組織化学に調べることにより、ＵＶＢ照射後の再生表皮モデル中におけるランゲルハンス細胞の走化性及び表現型を評価した。
【０１８２】
−培養１１日後に、再生表皮に０．５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＢを照射し、３日間培養する；
−表皮におけるランゲルハンス細胞の減少を視覚化するため、抗Ｌａｎｇｅｒｉｎモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学に調べる；
−再生表皮の表皮部中に残存するランゲルハンス細胞の表現型が変化していることが、抗ＣＤ１ａ、抗ＣＣＲ６、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ８６、抗ＣＣＲ７及び抗ＤＣ−ＬＡＭＰモノクローナル抗体を用いることにより分かる。
【０１８３】
ＵＶＢ照射後、予測通り、表皮部中のランゲルハンス細胞の数が５０％を超えて減少し、また、例えば、表皮中に残存するランゲルハンス細胞上の副刺激分子ＣＤ８６の標識強度も減少していることが分かる。
【実施例２５】
【０１８４】
＜実施例２０に記載する再生皮膚モデルを使用して、ＵＶＡ照射の影響を調べる＞
様々な環境因子、特にＵＶ照射、より正確にはＵＶＡ照射が皮膚の真皮に及ぼす影響を調べるため、以下のプロトコールに従って免疫組織化学に調べることにより、ＵＶＡ照射後の再生皮膚モデル中における間質性樹状細胞の表現型を評価した。
【０１８５】
−培養３２日後に、再生皮膚試料に１０Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡを照射し、更に３日間培養する；
−抗ＤＣ−ＳＩＧＮ、抗凝固因子ＸＩＩＩａ、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ８６、抗ＣＣＲ７及び抗ＤＣ−ＬＡＭＰモノクローナル抗体を用いて免疫組織化学に調べることにより、再生皮膚試料の真皮部中に存在する間質性樹状細胞の表現型の変化が分かる。
【０１８６】
ＵＶＡ照射後、例えば、真皮中に存在する間質性樹状細胞上のＨＬＡ−ＤＲ分子及びＣＤ８６分子の標識強度の減少が見られる。
【実施例２６】
【０１８７】
＜実施例１８、１９及び２０のいずれかに記載する再生皮膚モデルを使用して、有効成分の影響を受けて分泌されたサイトカインの性質を調べる＞
潜在的な感作性又はアレルギー性を評価し、人間の皮膚を対象とする有効成分の炎症性又は抗炎症性活性を評価するため、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＮＦγ等の炎症性サイトカイン、及び、ＩＬ−２、ＩＬ−１０等の免疫抑制サイトカインの分泌量を、以下のプロトコールによるＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１８８】
−培養３２日後、培地中にレチノール１０Ｓを最終濃度０．０５％となるように７日間添加する；
−サイトカインを２〜３日毎に１４日間定量する。
【０１８９】
レチノール１０Ｓが炎症性サイトカインの刺激を誘発していることが分かる。
【実施例２７】
【０１９０】
＜実施例１６に記載する再生表皮モデルを使用して、アレルギー反応を調節できる有効成分をスクリーニングする＞
アレルギー性ストレス誘導後の有効成分の免疫調整効果を、以下のプロトコールによって調べる：
−培養１２日目に、濃度５ｍＭのＴＮＰ（２、４、６−トリニトロベンゼンスルホン酸）３００μｌを、３７℃において３０分間、ボイデンチェンバーの上室へ添加する；
−この刺激の後、培地を、試験する有効成分を様々な濃度で含んでいてよい新しい培地で置き換え、更に２日間培養を続ける；
−培養１４日後、ボイデンチェンバー（孔隙率８〜５μｍの膜（ＭＡＴＲＩＧＥＬＴＭで覆われていても覆われていなくてもよい））の下室へ遊走したランゲルハンス細胞の数を、光学顕微鏡で計数して定量する；培地を回収して遠心分離し、上清をＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）についてのＥＬＩＳＡ及びタンパク質の分析（ＢＣＡ）に使用する；結果は、タンパク質１μｇ当たりのＩＬ−１２の量（ｎｇ）で示す。
【０１９１】
走化試験とＩＬ−１２合成の結果を合わせると、試験した有効成分の免疫調整作用を明らかにできる。
【実施例２８】
【０１９２】
＜実施例１８、１９及び２１のいずれかによって得られる再生皮膚モデル又は再生粘膜モデルを使用して、有効成分の免疫刺激活性や免疫抑制活性を調べ、免疫寛容を評価及び／又は誘発する＞
ランゲルハンス細胞及び／又は間質性樹状細胞が有効成分に対して免疫応答及び／又は寛容応答を誘発するか又は誘発しないかを、ランゲルハンス細胞及び／又は間質性樹状細胞の表現型を以下のプロトコールによる三次元培養モデルにおいて免疫組織化学的に調べることによって評価した。
【０１９３】
−培養３２日目に有効成分を濃度を変えて培地中に添加し、７日間培養する；
−細胞の表現型を、様々な抗体を用いて免疫組織化学的に調べる（実施例１８及び２４参照）。
【実施例２９】
【０１９４】
＜実施例１０によって得られる主として間質性樹状細胞を含む懸濁モデルを使用して、有効成分の免疫刺激活性や免疫抑制活性を調べ、免疫寛容を評価及び／又は誘発する＞
以下のプロトコールによって調べる：
−ＴＮＰで刺激した後、試験する有効成分を様々な濃度で含んでいてよい培地中で細胞を４８時間培養する；培養終了後、間質性樹状細胞の表現型を、抗ＣＤ１ａ、抗ＣＣＲ６、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８３、抗ＣＤ８６、抗ＣＣＲ７及び抗ＤＣ−ＬＡＭＰモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより調べる。
【０１９５】
細胞の表現型によって、試験した有効成分の免疫調整効果を調べることができる。
【実施例３０】
【０１９６】
＜実施例２１又は２２に記載する再生粘膜モデルのいずれかを使用して、ＨＩＶによる感染を調べる＞
以下のプロトコールによって調べる：
針を用いて３５日間培養した再生粘膜中に、ウィルス懸濁液（濃度５５ｎｇ（ｐ２４）／１０６の単細胞栄養（ｍｏｎｏｃｙｔｏｔｒｏｐｈｉｃ）株ＨＩＶ−１ＢａＬ）を直接注射したり置いたりすることによって感染させる。３７℃において１晩培養後、培地で４回洗浄する。１週間培養を続けて、以下のように調べる：
−感染した再生粘膜の培養上清中のタンパク質ｐ２４の産生をＥＬＩＳＡで測定することにより、ウィルスの複製を定量する（コールター／Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）；
−ＤＣの感染を、感染した再生粘膜の組織切片についてのｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲによって監視する。ｇａｇ遺伝子の特異的プライマーとしてＳＫ３８とＳＫ３９を用い、ジゴキシゲニン標識又は非標識ｄＮＴＰの存在下で行う。ＰＣＲ条件は、９４℃において変性させ、９５℃、５５℃、７２℃のサイクルを２０回行う。ＰＣＲを行った後、アルカリフォスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体と共に切片をインキュベートする。その後、その切片をメチルグリーンで染色する。
−ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの結果、感染した細胞が表皮中（ランゲルハンス細胞）及び真皮中（間質性樹状細胞）に存在することが分かる。
−このモデルは、ウィルスの感染、複製及び伝染の機構を調べ、（ワクチン、薬等を含む）治療法を研究し開発するためのツールとして使用することができる。
【実施例３１】
【０１９７】
＜無血清培地を用いた樹状細胞の懸濁液の調製−治療への適用＞
ＣＤ１４陽性培養は実施例２、３、４、５、６、７及び８と同様に行うが、ウシ胎児血清を１０％添加したＲＰＭＩ１６４０培地は、ＳＴＥＭＢＩＯ社製の特定の無血清培地に置き換える（ＳｔｅｍｂｉｏＡ：Ｓｂ  Ａ  １００参照）。
【０１９８】
その後、樹状細胞は、感作の標的として、かつ、細胞免疫療法における治療ツール（抗原提示細胞）として用いることができる。
【国際調査報告】
2005518787.tif 000002
2005518787.tif 000003
2005518787.tif 000004
2005518787.tif 000005
2005518787.tif 000006