(57)【要約】本発明は、ヒト自己前駆幹細胞を培養して膨張させるために使用することができる、０．１〜９０重量％のヒト自己血清；０．１〜１０，０００ＵＩ／ｍｌのヘパリン；０．１〜１０，０００ＵＩ／ｍｌのプロタミン；並びに１００重量％までの十分量の、グルタミンを含むか又は含まない基本栄養素からなる培養基を含む、ヒト自己前駆幹細胞の自己培養の培地に関する。前記細胞を含有する組成物は、機能不全の心筋組織を創出、再生、及び修復するために、自己細胞心筋形成法を使用して患者に移植することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）０．１〜９０重量％のヒト自己血清；
ｂ）０．１〜１０，０００ＵＩ／ｍｌのヘパリン；
ｃ）０．１〜１０，０００ＵＩ／ｍｌのプロタミン；並びに
ｄ）１００重量％までの十分量の、グルタミンを含むか又は含まない基本栄養素の培養基を含む、ヒト自己前駆幹細胞の自己培養基。
【請求項２】
前記ヒト自己血清が、補体を不活性化する目的の処理を施したものである、請求項１に記載の培養基。
【請求項３】
前記ヒト自己血清が、患者の血液試料より得たものである、請求項１に記載の培養基。
【請求項４】
前記ヒト自己血清が、前記血清の患者ドナーに対するプラズマフェレーシスの実現により得たものである、請求項１に記載の培養基。
【請求項５】
前記プラズマフェレーシスを、抗凝固薬としてのヘパリンと抗凝固を逆転させる硫酸プロタミンを使用して行う、請求項４に記載の培養基。
【請求項６】
さらに抗生物質を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の培養基。
【請求項７】
前記抗生物質が、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、並びにこれらの混合物の間で選択される、請求項６に記載の培養基。
【請求項８】
さらにアンホテリシンＢ、及び／又は線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の培養基。
【請求項９】
８９％のＨＡＭ−Ｆ１２培地；
１０％の患者由来ヒト自己血清
ヘパリン  ０．１〜１００ＵＩ／ｍｌ；
プロタミン  ０．１〜１００ＵＩ／ｍｌ；並びに
１％ペニシリン／ストレプトマイシン、そして随意に
０．２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、及び／又は
０．１〜２５０ｐｇ／ｍｌの組換えｂＦＧＦを含む、請求項１に記載の培養基。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のヒト自己前駆幹細胞の自己培養基の調製方法であって、ヒト自己血清、ヘパリン、プロタミン、グルタミンを含むか又は含まない基本栄養素を、随意に、抗生物質、及び／又はアンホテリシンＢ、及び／又は線維芽細胞増殖因子と一緒に混合することを含む、前記方法。
【請求項１１】
前記ヒト自己血清をプラズマフェレーシスにより得る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のヒト自己前駆幹細胞の自己培養基の、自己前駆幹細胞の in vitro 培養、精製及び膨張における使用。
【請求項１３】
ヒト自己前駆幹細胞の組成物の調製の方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載のヒト自己前駆幹細胞の自己培養基における前記ヒト自己前駆幹細胞のインキュベーションと、得られるヒト自己前駆幹細胞の精製を含む、前記方法。
【請求項１４】
得られるヒト自己前駆幹細胞の精製を、前述のヒト自己前駆幹細胞に特徴的な細胞外抗原の同定を可能にする特異抗体の使用によって行う、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前述のヒト自己前駆幹細胞の前記特異かつ選択抗体を磁気ミクロスフェアへ結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞療法における使用に有用なヒト自己筋肉前駆幹細胞の入手方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載のヒト自己前駆幹細胞の自己培養基において前記ヒト自己筋肉前駆幹細胞をインキュベートすることと、得られるヒト自己前駆幹細胞を精製することを含む、前記方法。
【請求項１７】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製が、随意に磁気ミクロスフェアへ結合したヒト抗ＣＤ５６抗体の使用と、表現型ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−を示す細胞の選択を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製が、細胞培養物を、前記細胞培養物に存在する線維芽細胞の全部又は一部を沈殿させる（settle）目的で予備プレート培養の段階に処すこと、そして引き続き、随意に磁気ミクロスフェアへ結合したヒト抗ＣＤ５６抗体を使用することによってヒト自己筋肉前駆幹細胞を同定して分離すること、そして表現型ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−を示す細胞の選択を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
医薬組成物の調製のために筋肉組織の生検よりヒト自己筋肉前駆幹細胞を入手する方法であって：
ａ）ヒト自己筋肉前駆幹細胞を含む骨格組織の断片を抽出するために、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の後続の移植の対象患者において生検を実施すること；
ｂ）骨格筋からの前記ヒト自己筋肉前駆幹細胞を、請求項１〜９のいずれかに記載の自己前駆幹細胞の自己培養基において、前記培養ヒト自己筋肉前駆幹細胞の膨張を可能にする条件の下で培養すること；
ｃ）前記培養ヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製；並びに
ｄ）前記精製ヒト自己筋肉前駆幹細胞の採取；そして随意に、
ｅ）前記医薬組成物の調製までは、前記精製ヒト自己筋肉前駆幹細胞を凍結することを含む、前記方法。
【請求項２０】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞の増殖を刺激する薬理剤を含む医薬組成物を、生検の部位に、それを行う前に、患者へ局所投与することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記薬理剤がリドカインとブピバカインの間で選択される局所麻酔薬を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製が、細胞培養物を、前記細胞培養物に存在する線維芽細胞の全部又は一部を沈殿させる目的で予備プレート培養の段階に処すこと、随意に磁気ミクロスフェアへ結合したヒト抗ＣＤ５６抗体を使用することによってヒト自己筋肉前駆幹細胞を同定して分離すること、そして表現型ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−を示す細胞の選択を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前述のヒト自己筋肉前駆幹細胞の少なくとも７０％を請求項１〜８のいずれかに記載のヒト自己筋肉前駆幹細胞の自己培養基に含む、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の濃縮組成物。
【請求項２４】
少なくとも５０００万個の細胞／ｍｌの細胞密度がある、少なくとも２０００万個の細胞と、少なくとも４０％の自己前駆幹細胞ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−、請求項１〜９のいずれかに記載の自己前駆幹細胞の自己培養基、並びに、製剤上の観点より許容される少なくとも１つの賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２５】
５０００万〜７０００万個の細胞／ｍｌの細胞密度がある、２００万〜２０００万個の細胞と、少なくとも７０％の自己前駆幹細胞ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−、請求項１〜９のいずれかに記載の自己前駆幹細胞の自己培養基、並びに、全体量に関して０．１％〜２０％量のヒトアルブミンを含む、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞、心臓組織の再生剤を含み、自己培養基において ex vivo 膨張させた医薬組成物の移植によって機能不全の心筋組織を創出、再生、及び修復するための自己細胞心筋形成の治療方法であって、後続の移植の対象患者の身体より、ヒト自己筋肉前駆幹細胞が含まれる材料試料を採取すること、請求項１〜９のいずれかに記載の自己前駆幹細胞の自己培養基における培養によって前述の細胞を膨張させること、並びに、採取したヒト自己前駆幹細胞を、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を含有する材料をすでに抽出した患者に移植することを含んでなる、前記方法。
【請求項２７】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞、心臓組織の再生剤を含み、自己培養基において ex vivo 膨張させた医薬組成物の移植によって機能不全の心筋組織を創出、再生、及び修復するための自己細胞心筋形成の治療方法であって、以下の工程を含む前記方法：
ａ）好ましくは、局所麻酔薬の筋肉内注射により条件付けた、筋肉より取る骨格筋生検を患者より採取すること；
ｂ）該患者の自己血清より、請求項１〜９のいずれかに記載のヒト自己前駆幹細胞の培養基を調製すること；
ｃ）ａ）の生検とｂ）の培養基より、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の濃縮組成物を調製すること；
ｄ）ｃ）の組成物より医薬組成物を調製すること；並びに
ｅ）ｄ）のヒト自己前駆幹細胞の医薬組成物を心筋病巣に移植すること。
【請求項２８】
ヒト自己前駆幹細胞の前記組成物の移植を、末梢領域における梗塞瘢痕への直接注射によるか、又は両心室の冠内空間における注射によって行う、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト自己前駆幹細胞の前記組成物の移植を、皮下静脈アクセスによる全身又は冠内投与によって行う、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ヒト自己前駆幹細胞の前記組成物の移植を、ロボット化及びコンピュータ化されたシステムによって行う、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト自己前駆幹細胞の使用を細胞療法において可能にする条件の下でそれを入手して操作することに概して関する。特に、本発明は、そうした細胞の自己培養用の培地と培養におけるその使用と上記細胞の膨張、並びにそれらを含有する組成物に関する。
【０００２】
背景技術
生物医学研究の最大の課題の１つは、最も破滅させるか又は無能化させる疾患：神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病）、糖尿病、筋肉及び心臓の疾患、肝不全、等において損傷又は破壊された細胞又は組織を置き換えるか又は修復することを可能にする治療戦略の開発にある。
【０００３】
最も有望な治療戦略の１つは、それ自身で分裂して機能的な分化細胞を産生することが可能であり、ある場合は、それ自身で再生することさえできる、多かれ少なかれ未分化の利用可能な細胞をもつことが可能であるというよく知られた事実に立脚した、細胞療法である。この中には、幹細胞と前駆／先駆細胞が含まれ、これらをまとめて前駆幹細胞と呼ぶことにする。これらの細胞は、胚において、そして成体組織にも見出される場合がある。故に、細胞療法とは、十分量の前駆幹細胞の数を患者に移植するか又は埋め込んで、損傷した臓器の機能を修繕して回復させることである。
【０００４】
提起される細胞療法の方法の１つは、動物（異種細胞）より入手される、ドナー（同種細胞）に由来する、又は適切な患者（自己細胞）より入手される、成体からの前駆幹細胞の使用に基づく。自己前駆幹細胞の使用は、ドナーの不足、患者による拒絶を回避するための免疫抑制治療の必要性、並びに、胚性細胞の使用に関連した倫理上の諸条件といった、他の細胞療法の方法の欠点のいくつかを免れることができる。
【０００５】
それでもやはり、この細胞療法が実現するには、個々の場合にどれが好適な細胞であるのか、そしていかにそれらを同定するのかについてより知識を深めること、そしてまた、前駆幹細胞が臨床使用に適するように適切に操作するための手法を開発することが必要である。
【０００６】
自己細胞心筋形成法（ＣＭＰ）は、心疾患（虚血心疾患、心不全、等）の治療のための細胞療法の具体的な例である。最新の概説を Curr. Control. Trials Cardiovasc Med. 2001; 2: 208-210 (D. A. Taylor) に見出すことができる。細胞ＣＭＰに有用な様々な前駆幹細胞の単離、培養、膨張、及び使用の方法とその組成物について、ＵＳ５１３０１４１、ＷＯ／０１０７５６８、ＷＯ／０１９４５５５、ＷＯ７９８５４３０１、ＵＳ２００１／００３８８３７及びＵＳ５５４３３１８に見出すことができる。
【０００７】
発明の要約
本発明は、概して、細胞療法におけるその使用に適したヒト自己前駆幹細胞を提供することの問題、そして特に、その入手、培養、精製及び膨張に特別な方法を含む、前駆幹細胞がその臨床使用に適するように適切に操作するための利用可能な手法を創出することの問題に対処する。
【０００８】
本発明で提供される解決手段は、ヒト自己血清と栄養素を抗凝固薬と一緒に含む自己培養基の使用により、多様な病態の細胞療法による治療のための医薬組成物の加工に使用することができる、ヒト自己前駆幹細胞の in vitro 培養、精製、及び膨張が可能になることを本発明者が観察したという事実に基づいている。
【０００９】
本発明は、栄養素、ヒト自己血清、ヘパリン及びプロタミンを含む自己培養基の入手と、虚血性心筋症、並びに突発性心筋症の自己細胞ＣＭＰによる治療に適した医薬組成物の加工に有用なヒト自己筋肉前駆幹細胞の in vitro 培養、精製及び膨張におけるその使用により例示される。
【００１０】
本発明の１つの側面は、ヒト自己血清及び栄養素を、抗凝固薬と抗凝固を逆転させる薬剤と一緒に含む、ヒト自己前駆幹細胞の培養基に関する。
別の側面によれば、本発明は、ヒト自己前駆幹細胞の前記培養基の調製の方法に関する。特別な実施において、そのような培養基に存在するヒト自己血清は、プラズマフェレーシスにより入手した。
【００１１】
別の側面によれば、本発明は、ヒト自己前駆幹細胞の in vitro 培養、精製及び膨張のための前記培地の使用に関する。
別の側面によれば、本発明は、ヒト自己前駆幹細胞の組成物の入手の方法に関し、該方法は、前記ヒト自己前駆幹細胞の上記培養基におけるインキュベーションと得られるヒト自己前駆幹細胞を精製することを含む。
【００１２】
別の側面によれば、本発明は、細胞療法における使用に有用なヒト自己筋肉前駆幹細胞の組成物の入手の方法に関し、該方法は、前記ヒト自己筋肉前駆幹細胞の上記培養基におけるインキュベーションと得られるヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製を含む。
【００１３】
別の側面によれば、本発明は、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の濃縮組成物に関する。
別の側面によれば、本発明は、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を製剤上の観点より許容される１以上の賦形剤とともに含む医薬組成物に関する。
【００１４】
別の側面によれば、本発明は、ヒト自己筋肉前駆幹細胞、心臓組織の再生剤を含み、自己培養基において ex vivo 膨張させた医薬組成物の移植によって機能不全の心筋組織を創出、再生、及び修復するための自己細胞ＣＭＰの治療方法に関する。
【００１５】
発明の詳細な説明
１．自己培養基
第一の側面において、本発明は、ヒト自己前駆幹細胞の自己培養基（以下、「本発明の自己培養基」と呼ぶ）に関し、これは：
ａ）０．１〜９０重量％のヒト自己血清；
ｂ）０．１〜１０，０００ＵＩ／ｍｌのヘパリン；
ｃ）０．１〜１０，０００ＵＩ／ｍｌのプロタミン；並びに
ｄ）１００重量％までの十分量の、グルタミンを含むか又は含まない基本栄養素の培養基を含む。
【００１６】
本発明の自己培養基は、ヒト自己前駆幹細胞の後続の移植の同じ対象患者より入手するヒト自己血清より加工処理した完全培養基である。ヒト自己血清は、所望されるならば、補体を不活性化する目的で慣用の処理（例えば、熱処理）に処してよい。
【００１７】
ヒト自己血清は、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の後続の移植の同じ対象患者より、慣用の処理により（例えば、該患者の血液試料より）、又は、好ましくは、上記患者へプラズマフェレーシスを行うことによって入手することができる。本発明の特別な実施において、プラズマフェレーシスは、抗凝固薬としてのヘパリンと抗凝固を逆転させるための硫酸プロタミンを使用して行う。よく知られているように、プラズマフェレーシスは、通常、ＡＣＤ（酸−クエン酸−デキストロースの抗凝固溶液［例えば、１リットルの水に対して、クエン酸一水和物（８ｇ）、クエン酸塩（２２ｇ）、及びグルコース一水和物（２４．５ｇ）を加える］）を抗凝固薬として使用して行う。この抗凝固薬は、カルシウムキレート剤を提供するので、ＡＣＤの効果を逆転させて血清をプラズマフェレーシスより入手するには、カルシウムを加えることが必要であるが、これは後で細胞培養に干渉する。プラズマフェレーシス処理により、患者の血液試料より入手される血清に優る、有意に多い血清供給量を入手することが可能になるが、これは、プラズマフェレーシスでは患者にとって血液の損失がなく、患者にとって重要な利点を示唆するためである。さらに、ヘパリン及びプロタミンを用いたプラズマフェレーシスより入手される血清の使用は、細胞培養における後続の問題を伴わない、培養基におけるその使用を可能にする。
【００１８】
本発明の自己培養基は、基本栄養素と、随意にグルタミンを含有する。細胞培養物に基本栄養素をもたらす市販の培地が存在する。原則として、細胞培養物に十分な栄養素を提供するどの培地も本発明に使用してよい。特別な実現（realization）において、栄養素は、ＨＡＭ  Ｆ１２培地［ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ］により供給される。
【００１９】
特別な実現において、本発明の自己培養基は、上記以外に、抗生物質を含有する。実践的には、どの抗生物質も本発明に使用してよい。特別な実現において、本発明の自己培養基は、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、及びこれらの混合物の間で選択される抗生物質を含む。同様に、本発明の自己培養基は、所望されるならば、抗真菌剤、例えば、アンホテリシンＢ、及び／又は増殖因子、例えばネイティブ又は組換えの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）のような線維芽細胞増殖因子も含有してよい。
【００２０】
特別な実現において、本発明の自己培養基は：
８９重量％のＨＡＭ−Ｆ１２培地；
１０％の患者由来ヒト自己血清
ヘパリン  ０．１〜１０，０００ＵＩ／ｍｌ；
プロタミン  ０．１〜１０，０００ＵＩ／ｍｌ；並びに
１％ペニシリン／ストレプトマイシン、そして随意に
０．２５ｍｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、及び／又は
０．１〜２５０ｐｇ／ｍｌの組換えｂＦＧＦを含む。
【００２１】
２．本発明の自己培養基の調製の方法
別の側面において、本発明は、本発明により提供されるヒト自己前駆幹細胞の培養基の調製の方法に関し、該方法は、その様々な成分を混合して均質化することを含む。
【００２２】
有利なやり方において、前記ヒト自己血清は、すでに述べたように、血清を入手するために抗凝固薬としてヘパリンを、そして抗凝固を逆転させて血清を入手するためにプロタミンを使用する、プラズマフェレーシスにより入手する。
【００２３】
３．本発明の自己培養基の使用
別の側面によれば、本発明は、本発明の自己培養基の、ヒト自己前駆幹細胞の in vitro 培養、精製及び膨張への使用に関する。
【００２４】
ヒト自己前駆幹細胞の膨張用の培養基におけるヒト自己血清の使用は、数多くの利点を提供し、例えば、胎仔ウシ血清を細胞増殖に使用する伝統的な細胞培養の技術に固有のプリオン疾患、ウイルス及び動物原性感染症による汚染のリスクを伴わずに、世界のどこでも細胞膨張を行なうことができる。ヒト細胞培養における、ウシ血清に代わるヒト自己血清の使用は、（ｉ）それにより抗原−抗体反応が回避される、（ｉｉ）それにより、異種タンパク質に起因する炎症応答が回避される；そして（ｉｉｉ）それにより、ウシ血清において培養した細胞ではヒトへの投与前に必要となる繰り返し洗浄の結果としての細胞破壊が回避されるので、大きな利点を提示する。事実、自己細胞ＣＭＰを用いた今回の臨床経験では、ウシ血清で培養した細胞を用いた治療から２週間後の患者に悪性の心室不整脈の存在が示され、この合併症により、４０％の症例で、埋め込み式細動除去器が必要とされた。
【００２５】
４．ヒト自己前駆幹細胞の組成物の調製の方法
別の側面によれば、本発明は、ヒト自己前駆幹細胞の組成物の調製の方法に関し、それには、前記ヒト自己前駆幹細胞を本発明の自己培養基においてインキュベートすることと、入手されるヒト自己前駆幹細胞を精製することが含まれる。
【００２６】
実践的には、どのヒト自己前駆幹細胞も本発明の自己培養基において培養して膨張させることができて、いずれの場合も、培地および培養の諸条件を具体的な細胞型へ適合させる。それでも、次の節において詳しく記載する特別な実現において、そのようなヒト自己前駆幹細胞は、ヒト自己筋肉前駆幹細胞である。
【００２７】
ヒト自己前駆幹細胞は、そのようなヒト自己前駆幹細胞の後続の移植の適切な対象患者における生検により入手することができる。
ヒト自己前駆幹細胞の本発明の自己培養基におけるインキュベーションは、細胞の増殖及び分裂を可能にする条件の下で行う。
【００２８】
入手されたヒト自己前駆幹細胞の精製は、どの慣用法により実現してもよい。特別な実現において、前記ヒト自己前駆幹細胞の精製は免疫精製からなり、それは、上述のヒト自己前駆幹細胞の特徴となる細胞外抗原の同定を可能にする、そのようなヒト自己前駆幹細胞の特異及び選択抗体の使用によって行う。有利にも、そのようなヒト自己前駆幹細胞の前記特異及び選択抗体を磁気ミクロスフェアへ結合して、磁気細胞分離器によりヒト自己前駆幹細胞を精製及び濃縮する。
【００２９】
既述の方法により入手したヒト自己前駆幹細胞は、医薬組成物として提示することができて、遺伝子治療に使用することができる。
５．ヒト自己筋肉前駆幹細胞の入手の方法
すでに述べたように、本発明の特別で好ましい実現において、ヒト自己前駆幹細胞は、ヒト自己筋肉（又は筋原細胞）前駆幹細胞である。
【００３０】
故に、別の側面において、本発明は、細胞療法におけるその使用に適したヒト自己筋肉前駆幹細胞の入手の方法に関し、該方法は、前記ヒト自己筋肉前駆幹細胞を上述の培養基においてインキュベートすることと、入手されるヒト自己前駆幹細胞を精製することを含む。
【００３１】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞は、そのようなヒト自己前駆幹細胞の後続の移植の適切な対象患者における生検、特に、骨格筋の生検を行うことにより入手することができる。
これまでの研究は、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の増殖を刺激する医薬剤が含まれる医薬組成物を、生検に先立って、生検領域において患者へ投与することにより、前記細胞の数を培養の開始時に増加させることが可能になると述べている。特別な実現において、このプレコンディショニングは、骨格筋生検を行う前、通常は生検の実施の２日〜１５分を含む時間の間に、生検が行われる領域において、細胞増殖を刺激する前記医薬剤が含まれる医薬組成物を筋肉内投与により患者へ投与することによってなされる。特別な実現において、前記医薬剤は、筋芽細胞の増殖を刺激する（このことは、後で細胞培養のより高い効率性に反映される）、リドカイン又はブピバカインのような局所鎮痛薬である。
【００３２】
骨格筋生検により筋肉組織の試料を採取し、後で詳しく述べるように、これを慣用の処理に処して筋肉線維を消化する。生じた細胞懸濁液を本発明の自己培養基において培養する。一般に、筋肉生検により抽出された試料は、脂肪細胞、線維芽細胞、間葉前駆体、造血細胞、筋肉線維、血管組織（内皮、平滑筋）、さらに、明らかに、筋芽細胞及び衛星細胞のような、様々な種類の組織を含有する。典型的には、ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−と定義される、生検により抽出された骨格筋の試料に存在するヒト自己筋肉前駆幹細胞の初期含量は、１０％より少ない。同様に、自己再生して、抗原ＣＤ５６を発現する筋肉細胞へ分化する、筋肉前駆体となる、きわめて同定が困難な幹細胞（衛星細胞）もわずかな比率で存在する。知られているように、この細胞型の分化プロセスは、衛星細胞から筋芽細胞へ、次いで未熟な筋細胞へ、その後成熟した筋細胞へ、そして最終的には筋線維への工程を含む。筋肉前駆体は、筋芽細胞と筋細胞（成熟及び未熟）であり、これは、抗原ＣＤ５６の存在、デズミンの細胞質内発現、そして抗原ＣＤ４５の非存在によって同定することができる（即ち、それらは、ＣＤ５６＋／デズミン＋／ＣＤ４５−の表現型を提示する）。細胞培養の間に、すでに筋細胞へ変化しつつある、衛星細胞と筋芽細胞の増殖がもたらされる。故に、培養基におけるインキュベーションと細胞膨張の後には、筋芽細胞と筋細胞（成熟及び未熟）が蓄積していて、これらは、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を患者へ注射するための医薬組成物の加工に使用され、いったん注射されたならば、適切な患者において筋肉線維又は筋線維になってその機能を発達させて、その分化プロセスを終了する。
【００３３】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞の本発明の自己培養基におけるインキュベーションは、細胞の膨張（増殖及び分裂）を可能にする条件の下で行う。
入手したヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製は、どの慣用法によって行ってもよい。特別な実現において、前記ヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製は、前記ヒト自己前駆幹細胞の特徴となる細胞外抗原の同定を可能にする、これらヒト自己筋肉前駆幹細胞に特異的で選択的な抗体、例えば、造血細胞の特異抗原ＣＤ４５の非存在下でのヒト抗ＣＤ５６抗体（ＣＤ５６は、骨格筋の特徴となる細胞外抗原である）の使用を含む（即ち、表現型ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−を示す細胞が選択される）。
【００３４】
有利には、そのような抗体を磁気ミクロスフェアへ結合して、磁気細胞分離器によりヒト自己筋肉前駆幹細胞を精製して濃縮する。別の特別な実現において、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を同定して分離することへ進むことの前に線維芽細胞を沈殿させる目的で、細胞培養物を予備プレート培養の前段階に処する。この場合、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製は、前記細胞培養物に存在する線維芽細胞の全部又は一部を沈殿させる目的で細胞培養物を予備プレート培養の段階に処すこと、そしてその後で、随意のやり方で、磁気ミクロスフェアへ結合したヒト抗ＣＤ５６抗体の使用によりヒト自己筋肉前駆幹細胞を同定して分離すること、そして表現型ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−を示す細胞を選択することを含む。
【００３５】
上記の方法に従って入手されるヒト自己筋肉前駆幹細胞を含む組成物は、本発明の追加の側面を構成する。
あるいは、本発明は、医薬組成物の調製のために骨格筋組織の生検より出発して、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を入手する方法を提供し、該方法は：
ａ）ヒト自己筋肉前駆幹細胞を含む骨格筋組織の断片を抽出するために、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の後続の移植の対象患者において生検を実施すること；
ｂ）骨格筋に由来する前記ヒト自己筋肉前駆幹細胞を、本発明の自己培養基において、前記培養ヒト自己筋肉前駆幹細胞の膨張を可能にする条件の下で培養すること；
ｃ）前記培養ヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製；並びに
ｄ）前記精製ヒト自己筋肉前駆幹細胞の採取；そして随意に、
ｅ）そのような医薬組成物の調製までは、前記精製ヒト自己筋肉前駆幹細胞を凍結することを含む。
【００３６】
すでに述べたように、生検の実施前の２日〜１５分の時間の間に、生検が行われる領域において、リドカイン又はブピバカインを患者へ局所投与すると、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の増殖が刺激され、そうした細胞の数を培養の開始時に高めることが可能になる。
【００３７】
骨格筋に由来する前記ヒト自己筋肉前駆幹細胞の、前記培養ヒト自己筋肉前駆幹細胞の膨張を可能にする条件下での、本発明の自己培養基における培養には、一連の事前の慣用的な処理、例えば、洗浄、脂肪組織の除去、筋肉粉砕、酵素解離、濾過、及び、例えば沈降による細胞の採取を行うことが含まれる。一般に、筋肉線維の酵素消化の後では、多量の細胞残滓を含有する細胞懸濁液が生じる。培養段階の後で、細胞及び線維の残滓を除去すると、この懸濁液には、筋肉前駆幹細胞が濃縮される。
【００３８】
培養ヒト自己筋肉前駆幹細胞の精製により、実質的に線維芽細胞を含まない、ヒト自己筋肉前駆幹細胞が濃縮された組成物を入手する目的が、とりわけ追求される。この目的のために、細胞培養物を予備プレート培養の第一段階（これにより、線維芽細胞は筋芽細胞又は衛星細胞より速く沈降する）と、慣用法による（例えば、随意のやり方で磁気ミクロスフェアへ結合した、そのようなヒト自己筋肉前駆幹細胞を特異的に認識する抗体により、表現型ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−を示す上記ヒト自己筋肉前駆幹細胞の特徴となる細胞外抗原の同定を可能にする、そのような細胞の特異及び選択抗体の使用による）前記ヒト自己筋肉前駆幹細胞の同定及び分離の後半プロセスに処すことができる。
【００３９】
別の側面によれば、本発明は、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を、製剤上の観点より許容される少なくとも１つの賦形剤と一緒に含む医薬組成物に関する。特別な実現において、そのような医薬組成物は、非経口的に投与されるのに適している。原則として、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を運ぶことができる、製剤上の観点より許容されるどの賦形剤も、本発明に使用してよい。特別な実現において、そのような医薬組成物には、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を再懸濁させる賦形剤として使用されるアルブミンが含まれる。
【００４０】
本発明において使用されるように、用語「医薬組成物」は、細胞移植における治療使用のために調製されたヒト自己筋肉前駆幹細胞の組成物を意味し、それは、少なくとも５０００万個の細胞／ｍｌの細胞密度がある、少なくとも２０００万個の細胞と、少なくとも４０％の自己前駆幹細胞ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−、本発明の自己培養基、並びに、製剤上の観点より許容される少なくとも１つの賦形剤を含む。特別な実現において、そうした医薬組成物は、５０００万〜７０００万個の細胞／ｍｌの細胞密度がある、２００万〜２０００万個の細胞と、少なくとも７０％の自己前駆幹細胞ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−、本発明の自己培養基、並びに、全体量に関して０．１〜２０重量％のヒトアルブミンを含む。
【００４１】
既述の方法に従って入手するヒト自己筋肉前駆幹細胞、並びにそれらを含有する医薬組成物は：
心筋組織を修復及び／又は再構成するため、及び／又は
虚血後心不全の治療のため、及び／又は
拡張性心筋症の治療のため、及び／又は
非虚血性心筋症の治療のための医薬組成物の加工に使用することができる。
【００４２】
６．治療方法
別の側面によれば、本発明は、自己培養基において ex vivo で膨張させて保存されたヒト自己筋肉前駆幹細胞が含まれる医薬組成物インプラントにより、心臓組織を再生するその能力により、機能不全の心筋組織を創出、再生および修復するための自己細胞ＣＭＰの治療方法に関し、前記方法は、後続の移植の対象患者に由来する、ヒト自己筋肉前駆幹細胞を含む材料試料の採取、本発明により提供される自己培養基における培養によるそのような細胞の膨張、並びにヒト自己筋肉前駆幹細胞を含有する前記材料をすでに抽出した患者より採取したヒト自己前駆幹細胞の移植を含んでなる。
【００４３】
具体的な展望によれば、本発明は、ヒト自己筋肉前駆幹細胞、心臓組織の再生剤が含まれ、自己培養基において ex vivo 膨張させた医薬組成物の移植によって機能不全の心筋組織を創出、再生、及び修復するための自己細胞ＣＭＰの治療方法を提供し、ここで前記方法は、以下の工程を含む：
ａ）好ましくは、リドカイン又はブピバカインのような局所麻酔薬の筋肉内注射により条件付けた筋肉より取る、患者に対する骨格筋の生検；
ｂ）該患者の自己血清よりはじめて、ヒト自己前駆幹細胞の培養基を調製すること；
ｃ）ａ）の生検とｂ）の培養基よりはじめて、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の濃縮組成物を調製すること；
ｄ）ｃ）の組成物よりはじめて医薬組成物を調製すること；並びに
ｅ）ｄ）の自己前駆幹細胞の医薬組成物を心筋病巣に移植すること。
【００４４】
ヒト自己筋肉前駆幹細胞は、筋芽細胞と筋細胞（成熟及び未熟）を含み、心筋に移植されたときに、心臓組織を再生させる能力を有する。
本記載に使用されるように、用語「心筋病巣」は、虚血性並びに突発性の心筋症を意味する。特別な適用において、本発明による自己細胞ＣＭＰの方法は、外科的又は経皮的血管再生の可能性がない、心筋梗塞による虚血性心筋症の患者、並びに、代替的な心臓血管再生がある患者へ適用される。この自己細胞ＣＭＰの目的は、梗塞の膨張を制限すること、心臓組織の再構築、そして心筋の再生であろう。虚血性心筋症の定義には、右心室又は左心室の梗塞がある患者が含まれ、後者の症例には、僧帽弁の虚血性逆流の可能性がある。別の特別な適用において、本発明による自己細胞ＣＭＰ法は、突発拡張性心筋症の患者へ適用される。
【００４５】
細胞ＣＭＰの利点の中で、特記することができるのは、線維症の減少、梗塞の瘢痕領域の低下、そして心室壁の弾性及び諸特性の改善（拡張機能を回復するのに必須である）である。
【００４６】
特別の実現において、ｄ）の自己前駆幹細胞の医薬組成物を心筋病巣へ移植することは、直接注射により実施される。本発明に使用される用語「直接注射による移植」は、本発明により提供される医薬組成物を虚血性又は突発性心筋症の患者に心外膜又は脈管内投与することを示唆する。特別な実現において、虚血性心筋症の患者に対する本発明の医薬組成物の心外膜又は脈管内投与は、以下の比率に従う分配で実施される：
梗塞の周辺領域においてほぼ７０％、そして瘢痕の中心部分にほぼ３０％。心外膜投与は、慣用の外科的曝露によるか、又は胸腔鏡検査法によって行なってよい。外科的近似法（規範的又はミニ開胸術／胸骨切開術）において、虚血領域は十分に曝露され、本治療組成物の注射を梗塞領域、そして主にその周囲域にすることを可能にする。本発明に提供されるヒト自己筋肉前駆幹細胞を含有する医薬組成物の注射は、病巣周囲領域に実施してもよい。本発明において裏付けられる移植のこの分配により、残余洗浄による移植細胞の周囲領域における主要な生存と既存の側枝の心筋血管再生が得られ、高線維症の虚血瘢痕中になされる移植に観察される高い細胞死がある程度回避される。
【００４７】
別の特別な実現において、ｄ）の自己前駆幹細胞の医薬組成物の心筋病巣における移植は、経皮的静脈アクセスを介した全身又は冠内投与によりなされる。
別の特別な実現において、本発明による自己細胞ＣＭＰ法は、突発拡張性心筋症の患者へ適用され、本発明により提供される医薬組成物の多数の移植を両心室の心筋中の冠動脈の間で行う。
【００４８】
今日、我々には、心臓外科における使用のためのあらたなコンピュータ化外科システムが提供されている。開胸アクセスによるロボット支援型の冠状ブリッジ又はバイパスの手術が増加しているのは、感染症リスクの低下と優れた美観上の結果を伴う、患者の迅速かつ安全な回復を可能にするからである。特別な実現において、ビデオ制御されたロボットアームにより注射針を心筋中に挿入し、シリンジを胸郭の外側に定位して、小直径の延長チューブにより針と連結する。心不全の患者におけるこの接近法（approximation）の利点は、自己細胞ＣＭＰの治療方法が心臓操作なしに安全になし得て、血行動態の改変や心室細動のリスクを回避することである。
【００４９】
細胞ＣＭＰの有益な効果は、注射される細胞の死亡率によって制限される可能性がある。この問題を解決するために、本発明は、本発明の自己前駆幹細胞の経皮的又は外科的移植の方法による定期的な注射を提案する。この接近法は、梗塞領域を進行的に縮小させるか、又は病理学的な心筋を改善して、ＣＭＰの目的を実現するだろう。この目的のために、本発明には、各個人の細胞培養法の間に単離して凍結した細胞に由来する、各患者の自己前駆幹細胞の特注バンクを創出することが含まれる。この保存した自己前駆幹細胞より、新たな組成物の調製のために新しい細胞培養物を膨張させて、新たな生検や組織除去を回避することができる。
【００５０】
以下の実施例は、本発明を例示することに役立ち、その非限定的な目的のために解釈される。
実施例１
この実施例においては、損傷した機能不全の心筋組織を収縮期圧及び拡張期圧を産生することができる生きた組織学的構造に逆転させることを目的とする自己細胞ＣＭＰ法におけるその使用のためにヒト自己筋肉前駆幹細胞を入手して操作することについて記載する。
【００５１】
１．１  骨格筋生検
外科生検を行う１日前に、筋肉内注射により、２％のリドカイン溶液を前外側大腿筋とその周囲で患者へ注射した。生検は、前外側大腿筋における５ｃｍの切開により、無菌条件において行い、２〜３ｃｍ３の骨格筋の断片を挿入する（１５ｇ）。抽出した筋肉組織をはさみで断片化したらすぐに、完全培養基か又はリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に挿入し、４℃に保つ。細胞の単離及び精製とその培養の方法は、細胞の生存を保証するために可能な限り早く開始すべきである。この試料を好適な容器に入れて低温状態で「細胞生物学」研究室へ運ぶ。
【００５２】
１．２  自己培養基の調製
血液試料より
「輸血サービス」において、患者より静脈血を引き出す。静脈穿刺により、５０本の１０ｍｌ管を血清採取で満たす。層流条件のキャビンでの細胞の沈降とフィブリン沈殿の後で、各試験管より血清を抽出し、空の血液バッグに集める。血清試料を血液学的検査と微生物学的検査（細菌及びウイルス）のために取る。血清入りのバックは−８０℃に凍結し、血液学的検査及び微生物学的検査の結果を待つ。
【００５３】
培養基を調製する前に、血清補体を５６℃で１時間加熱不活性化して、それを濾過する。血清の一部を培養基と一緒にして４℃に保ってから、３７℃まで加熱して濾過した後で、培養基の入ったボトルへ加える。最終の培養基は、１０％の患者のヒト自己血清、８９％のＨＡＭ−Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，カタログ番号２１７６５）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、ヘパリン（採取血清１ｍｌに付き２ＵＩ）、プロタミン（硫酸塩）（採取血清１ｍｌに付き３ＵＩ）、そして随意に、アンホテリシンＢ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）及び／又は０．１〜２５０ｐｇ／ｍｌの組換えｂＦＧＦを含有する。
【００５４】
残るヒト血清は−４０℃に凍結して、新たな培養基の調製を待つ。培養基の調製ごとに補体を５６℃で１時間不活性化して、その後で濾過する。
プラズマフェレーシスより
プラズマフェレーシス法を開始した直後に、患者に５０ＵＩ／ｋｇ用量の非分画ヘパリンナトリウムを投与する。プラズマフェレーシスの方法は、使用する機器の予期される定型の方法に従って行う。プラズマフェレーシスの間、標準の抗凝固薬は、抗凝固薬としてのヘパリン入り塩化ナトリウム、０．９％の生理溶液を代用する。血漿は、５％アルブミンで代用する。この方法は、自己培養基の調製に必要な量の血漿を入手したらすぐに終了する。採取した血漿中のヘパリンの量を患者の血漿量に従って算出し、ヘパリンの各ユニットについて１．５ＵＩのプロタミンを加える。血漿凝固が生じるまでは、そのままに保つ。次いで、血漿を抽出し、小アリコートへ分配して、凍結する。血液試料より採取した血清と同じように、この場合も、使用する前に血清試料を血液学的かつ微生物学的に分析した。
【００５５】
１．３  衛星細胞の単離と in vitro での膨張
すべての操作は無菌条件において、層流キャビンを使用して行う。外植した骨格筋の断片をＰＢＳにおいて洗浄する。脂肪組織をはさみで除去し、筋肉を慎重に砕く。この筋肉断片をＰＢＳで再び洗浄すると、上清分画が澄明に見える。これを１００ｇで５分間遠心分離する。この組織を２つの連続した酵素処理により解離させる：はじめに、細胞をコラゲナーゼＩＡ（１．５ｍｌ／ｍｇ／ｇ組織）においてインキュベートし、それを１時間インキュベートし続ける。１０分ごとに試験管を振り混ぜて、解離を機械的に促進する。あるいは、相反／軌道振動（ＲＯＳＩ）の付いた３７℃のインキュベーターに試験管を配置する。第二に、これを０．２５トリプシン１ＸＥＤＴＡ（２ｍｌ）で２０分間インキュベートする。直後に細胞を洗浄し（３００ｇで１０分間）、酵素反応を止めて、すでに入手した患者の適切な血清の１ｍｌをこれに加える。４０μｍのネット（細胞染工ナイロン）に通して濾過を実施する。ネットに残ってしまう断片については、先の消化手順を再び繰り返す。最後に、濾過細胞を沈降（３００ｇで２０分）により採取し、上清を捨てる。
【００５６】
細胞を新鮮な完全培養基［１０％の患者のヒト自己血清、８９％のＨＡＭ−Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，カタログ番号２１７６５）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、そして随意にアンホテリシンＢ（０．２５ｍｇ／ｍｌ）を含み、ヘパリン（採取血清１ｍｌに付き２ＵＩ）とプロタミン（硫酸塩）（採取血清１ｍｌに付き３ＵＩ）をさらに含有する］に再懸濁させて、細胞培養用のボトルにまく。次いで、このボトルを加湿雰囲気と５％  Ｈ２Ｏにおいて３７℃で３週間インキュベートする。ボトルは、不規則な細胞増殖を回避するために、インキュベーターにおいて水準勾配のないように配置する。２〜３日のインキュベーション期間の後で、培地を入れ替えて、血球と死細胞を除去する。亜周密状態（５０％の集密）まで増殖したとき、培養物の一部（１：５分画）を取り出して、筋原性の分化が高密度で出現することを回避する。５０％の集密では、単核性の細胞が多核性の筋管へ分化するのを防ぐために、多数の工程が必要となる。
【００５７】
培養の各工程において、細胞をトリプシン処理（各ボトルにおいて２ｍｌの２．５トリプシン／ＥＤＴＡ、インキュベーター中１〜５分間）により採取する。浮遊細胞を顕微鏡により観察して、細胞の完全な剥離を証明する。次いで、完全培養基の添加により反応を止め、生じた細胞の懸濁液を他の５つのボトルに分配する。細胞培養法の各工程において、細菌（好気性細菌及び嫌気性細菌の検査）、ウイルス及び真菌のついての対照試験を実施する。
【００５８】
１．４  線維芽細胞の除去
通常、線維芽細胞が培養物を汚染するので、好適な筋芽細胞の膨張を得るには、それを一掃することが必要である。初回パスの実行において、トリプシンでの中和の後に、培養細胞をインキュベーター中に３０分間保つ。この時間は、線維芽細胞が沈降して、その一方で大部分の筋芽細胞（より小さい）が懸濁状態に保たれるのに十分である。細胞の上清を採取し、これを新たな培養ボトルへ移す。ヒト抗体の抗ＣＤ５６を用いたフローサイトメトリーと細胞内デズミン染色により、筋芽細胞の純度を測定する。筋芽細胞の純度が５０％より低い試料は、細胞濃縮の方法に処する。その目的のために、第二段階において、細胞を採取した後、そしてそれをまく前に、磁気ミクロスフェアへ結合したマウスのヒト抗ＣＤ５６抗体でそれらを染色する。磁気細胞分離器を用いて行うポジティブ選択により、９０％より多い細胞においてＣＤ５６及びデズミンが発現される、筋芽細胞、筋肉前駆細胞が高度に濃縮した細胞集団を得る。
【００５９】
通常、最終の必要量の細胞を入手するには、いくつかのパスを行わなければならない。一般に、ほぼ３週間の最後には、２億個より多い細胞が入手される。この数は、多連鎖培養系におけるパスによってさらに高めてよい。
【００６０】
１．５  特注バンクのための細胞の単離
細胞培養法の間に、凍結される細胞を各患者について単離してよい。これらの保存細胞より出発して、新しい細胞培養物を膨張させ、定期的に反復する心筋内注射物を作製することができる（それにより、新たな生検の反復を回避する）。第二回目のパスのときに、５％  ＤＭＳＯを使用して高濃縮のＣＤ５６陽性細胞の試料を凍結保存して、プログラム化された凍結に処して、最後に、液体窒素にそれを保存する。細胞濃度は、１ｍｌにつき２５００万〜５０００万個になる。必要なとき、細胞を解凍して、筋芽細胞培地で培養し、ex vivo 膨張を実施したらすぐ後で使用（経皮移植）する。
【００６１】
１．６  注射培地
細胞移植の日、細胞を採取して注射培地（０．５％ヒトアルブミン及び完全培養基）において洗浄し、移植の前に氷上に保つ。フローサイトメトリーにより、筋芽細胞の最終純度を評価する。Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計算器（トリパンブルー染色による）を使用して、細胞の濃度及び生存能力を決定する。同様に、その移植前に、細胞培養物の無菌性を評価する（グラム試験）。
【００６２】
１．７  細胞培養法
細胞移植は、心外膜又は脈管内投与により実施することができる。心外膜投与は、慣用の外科的曝露によるか、又は胸腔鏡検査法によって行なってよい。外科的接近法（規範的又はミニ開胸術／胸骨切開術）では、虚血領域を十分に曝露し、細胞懸濁液のほぼ１０回の注射を梗塞領域、そして主にその周囲域に実現することを可能にする。この目的のために、２３〜２６ゲージ、４ｃｍの曲針を使用する。推奨される細胞密度は、５０００万〜７０００万個の細胞／ｍｌを含む。注射は、ほぼ１５分の間、ゆっくりと行う。各注射の後で、針の開口部を押圧（１〜２分）により塞ぎ、細胞懸濁液の逆流を回避する。
【００６３】
筋芽細胞の移植プロトコール：
−少なくとも２０００万個、好ましくは約２億個の細胞の移植
−細胞密度：５０００万〜７０００万個の細胞／ｍｌ
−培養時間：ほぼ２１日
−筋芽細胞濃度：７０％より高い
−２〜８℃での平均細胞寿命：９６時間。
【００６４】
実施例２
本実施例は、心筋梗塞に罹患した患者へ本発明のヒト自己筋肉前駆幹細胞の組成物を心筋内移植することの適格性及び安全性を評価するために行うフェーズＩ／ＩＩの臨床試験である。
【００６５】
材料と方法
２．１  患者の選択
この治験は、プロトコールへの包括に先立つ少なくとも４週間前に心筋梗塞を以前に罹患したことがあり、大動脈・冠状動脈バイパスを受ける予定である、全数１２名の患者に対して行った。患者の選択では、年齢（３０〜８０歳の範囲を含む）、心機能（２５％より高い左心室駆出率）、及び、悪性不整脈も筋ジストロフィーの既往歴もないこと、肝臓又は腎臓の機能不全検査でも、妊娠、ＨＩＶ又は肝炎の検査でも陽性の結果を示さないことを考慮した。
【００６６】
２．２  筋肉生検、ヒト自己筋肉前駆幹細胞の培養及び特性決定
ヒト自己筋肉前駆幹細胞を治療組成物用に調製することは、実施例１に記載のように実施した。
【００６７】
筋肉生検は、無菌条件下に、そして塩酸リドカインのプレコンディショニングの後で前外側大腿筋より採取した。方法全体で、７９％のＨＡＭ  Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）培地を含む本発明のヒト自己培養基を使用した。患者の自己血清は、先の実施例の１．２節に記載のように、筋肉生検の入手の前日にプラズマフェレーシスを行うことによって入手した（患者あたり８００〜２，１３５ｍｌ、平均：１，７３５ｍｌ）。
【００６８】
衛星細胞の単離のために、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）に続いてコラゲナーゼ（０．５ｍｇ／ｍｌ，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）とのインキュベーションにより酵素消化を行った。細胞膨張の方法と線維芽細胞の除去は、先の実施例に記載のように実施した。筋芽細胞の収穫物における純度は、フローサイトメトリーと、ヒトＮ−ＣＡＭ（ＣＤ５６）、ＣＤ４５及びデズミンに特異的なモノクローナル抗体での染色によって測定した。
【００６９】
入手した筋原細胞の患者あたりの平均は２２１ｘ１０６（通常は、１０５〜３９０ｘ１０６の範囲）であり、筋原細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ４５−）の平均純度は、６５．６±６．４％であった。
【００７０】
２．３  細胞移植
外科的処置の前に、各患者について陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、心エコー図及び心電図（Ｈｏｌｔｅｒ  ＥＧＣ  ２４時間）を介して心筋の機能及び生存能力を判定した。筋肉生検の実施後３〜４週の間に体外循環を伴う大動脈・冠状動脈バイパスを行った。患者は、平均して２（１〜４の間）の移植片を受けた。
【００７１】
すべての移植片を縫合し、自発的な心拍が再確立したならばすぐに、梗塞領域と周囲域（心エコー図の視点から、運動機能減退、無動性、又は異常運動性であると確定された領域）における少なくとも１０回の反復注射による心外膜投与によって細胞移植を行った。注射には、眼科用カニューレ２３Ｇ（Ｍａｅｒｓｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ．Ｒｅｄｄｉｔｃｈ，Ｂ９８  ９ＮＬ  イギリス）を使用した。細胞移植を受けるべき領域を外科的処置の前に心エコー図により確定したのは、細胞移植に対する後のサーベイランスの間に前記領域の収縮性について評価するためである。
【００７２】
外科的処置の後で、患者を連続遠隔測定モニタリングに処した。血液試料を６時間ごとに採取して、心臓壊死酵素の存在について評価した。炎症を防ぐために、手術後にメチルプレドニゾロン（５００ｍｇ）を投与した。心臓不整脈を防ぐには、経口アミオダロンで３ヶ月の治療を報告した。この心筋形成術に対する応答モニタリングのために、ＰＥＴ（移植後３ヶ月）、心エコー図（移植後４０日目と３ヶ月）によりフォローアップを行った。同様に、ホルターＥＣＧ（移植後４０日目と３ヶ月）により不整脈の存在についてモニタリングした。
【００７３】
実施するプロトコールとすべての方法は、法的期待要件に従って、施設及び地域の臨床治験倫理委員会によりすでに承認されたものである。
心エコー図による検討。断層超音波心臓動態診断法（超音波システム、Ｓｏｎｏｓ  ５５００，フィリップスによる）により全体及び局所の心筋収縮性を測定した。局部左心室壁の運動の解析は、アメリカ超音波心臓動態診断学会の標準委員会に記載の方法（Schiller NB et al, J AM Soc Echocardiogr. 1989; 2: 358-367）に従って実施した：左心室を１６の断片に分割し、各セグメントについて壁の運動を１＝正常、２＝運動減退、３＝無運動、４＝異常運動として評価した。各セグメント指数の和を評価セグメントの数で割ったものを局部運動性指数（壁運動スコア指数、ＷＭＳＩ）として決定した。細胞移植で処置したセグメントと無処置のそれについてＷＭＳＩ指数を入手した。左心室駆出率（ＬＶＥＦ）は、心内膜縁の自動検出システム（自動縁検出、ＡＢＤ）（Perez JE et al, J. Am. Coll. Cardiol. 1992; 19: 336-344）により入手した。また、色運動性（colorkinesis）及び組織ドップラーにより、各セグメントの局部収縮性を評価した。この評価は、二重盲検法（事前情報のない２名の独立した観察者）により実施した。左心室における拡張終期容量についての試験の再現性は、２．８±６．４（ＣＶ  ５．５％）で、駆出率（ＬＶＥＦ）については０．３±４．６（ＣＶ  ６．６％）であった。
【００７４】
陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）造影法。ＰＥＴにより、外科的処置の前と細胞移植の３ヵ月後に、心筋の血流とグルコース代謝について評価した。
灌流及び代謝の試験をＰＥＴ断層撮影機（ＥＣＡＴ  ＥＸＡＣＴ  ＨＲ＋，ジーメンス／ＣＴＩ  ノックスヴィル、アメリカ）において行った。これにより平面間に４．５ｍｍの空間解像力がある６２枚の超軸図を得る。グルコース代謝（１８Ｆ−ＦＤＧ）の試験と灌流（１３Ｎ−アンモニウム）の試験のためのトレーサーの産生は、サイクロトロン（サイクロン１８／９，Ｉｏｎ  Ｂｅａｍ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ベルギー）において、そのセンターの放射性薬剤研究室において実施した。
【００７５】
各患者の画像獲得のプロトコールをゲルマニウム−６８の供給源を使用する２分間の伝導試験で開始して、視野に心臓を局在化して、続けて５分間の獲得により光子減弱の補正を実現した。直後に１３Ｎ−アンモニウム（９．２５ＭＢｑ／Ｋｇ，最大７４０ＭＢｑ）を静脈内注射により１０ｍｌ／分の一定流量で灌流した。注射と同時に画像の動的獲得を開始した。動的系列での連続画像を２０分間の可変間隔スキーム（１２ｘ１０秒、４ｘ１０秒、４ｘ３０秒、３ｘ３００秒）で撮影した。ＰＥＴデータ獲得は、引用文献（Muzik O et al. J. Nucl. Med. 1993; 34: 336-344）にすでに記載のプロトコールに従って実施した。灌流評価用の画像が集まったらすぐに、これを５０分間保存して、１３Ｎ−アンモニウム放射活性の物理崩壊を可能にした（崩壊の半減期：９．９分）。引き続き、正常血糖の高インスリン血症鉗子の方法（Knuuti MJ et al, J. Nucl. Med. 1992; 33: 1255-1262）に従って実施する、グルコースの代謝試験のために画像の獲得を開始した。グルコースレベルを８５〜９５ｍｇ／ｄｌの間の範囲に安定化させた後で、１８Ｆ−ＦＤＧ（４．６ＭＢｑ／Ｋｇ，最大３７０ＭＢｑ）を静脈内ボーラスにより注射した。注射と同時に１８Ｆ−ＦＤＧの連続画像獲得を開始し、上記の Knuuti et al に記載のプロトコールに従って、それを６０分間（８ｘ１５秒、２ｘ３０秒、２ｘ１２０秒、１ｘ１８０秒、４ｘ３００秒、３ｘ６００秒）続けた。
【００７６】
画像の獲得を終了し、減弱補正の前に伝導のセグメンテーションを実施し、２つの反復と８つのサブセットを用いるＯＳＥＭ法（期待値最大化法）を使用して、代謝試験の画像を再構築した。すべての試験（灌流並びに代謝に関する）で６ｍｍ  ＦＷＨＭ（半値全幅）のガウスフィルター（正規平準化フィルター）を適用した。通常の解析では、超軸画像を左心室の短軸、垂直長軸、及び水平長軸に従って再配向させた。
【００７７】
最後に、定量分析には、左心室の媒質領域の６つの短軸連続断面を使用した。心筋血流を３−コンパートメントモデル（Musik O et al. J. Nucl. Med. 1993; 83-91）に従って絶対速度で算出し、グルコース利用率（心筋グルコース利用率、ｒＭＧＵ）をＰａｔｌａｋのグラフ解析（Patlak CS et al. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1985; 5: 584-590）により推定した。
【００７８】
結果
２．４  細胞移植と術後の進展
試験の患者の人口統計学、臨床、及び機能上の特徴を以下の表１及び２にまとめる。
【００７９】
【表１】
2005531322.tif 000002
【００８０】
略号：
性別．Ｍ：男性；Ｆ：女性
ＮＹＨＡ分類：「ニューヨーク心臓学会」の分類
ＦＵ：手術及び細胞移植から３ヶ月目に行ったフォローアップの評価
バイパス位置。ＬＡＤ：左前下行動脈；ＲＣ：右冠状動脈；ＯＭ：鈍麻縁動脈；Ｄｇ：対角冠状動脈。
【００８１】
大動脈・冠状動脈バイパスの手術の間、移植が終了して、自発的な心拍が回復したらすぐに、梗塞領域を視覚化して、２０ｘ１０６細胞／ｍｌまでの濃度の筋原細胞を含有する３〜５ｍｌの溶液を注射した。注射部位を心エコー図のフォローアップ用に確定した。移植に進む前、前記移植用の細胞の採取の直後に、汚染を防ぐために微生物学的な培養を行った。このために、患者９では彼の細胞試料がグラム染色で陽性を示したので、移植を行わなかった。それでも、この患者もフォローアップのためにプロトコールの試験を行った。
【００８２】
【表２】
2005531322.tif 000003
【００８３】
略号：
ＬＶＥＦ：左心室駆出率
ＦＵ：手術及び細胞移植から３ヶ月目に行ったフォローアップの評価
２Ｄ：二次元；ＡＢＤ：心内膜縁の自動検出
移植した患者の術後の進展は、合併症を示さなかった。これまでの臨床試験では骨格筋原細胞の移植に関連した心臓不整脈が観察されているので、入院の間（連続遠隔測定）と移植から４０日及び３ヶ月目に患者をモニタリングした（ホルターＥＣＧにより、２４時間）。いずれの場合も不整脈の有意な増加を観察しなかった。さらによいことに、移植後に心室性期外収縮の数が低下した。しかしながら、患者６は術後４０日目に非持続性の心室性頻拍を発症した。この患者は外科的処置の間に動脈瘤切除術を受けていて、それによりこのイベントを説明することができた。
【００８４】
心臓及び肝臓の酵素の血清学的分析は移植後に有意な変化を示さず、その正常値に速やかに復帰した。炎症の間接的な測定として、プロテインＣを定量したが、移植後からフォローアップ期間の間に劇的な変化を観察しなかった。
【００８５】
いずれの患者も退院して、今も存命している。
２．５  左心室の機能
断層超音波心臓動態診断法により測定した左心室駆出率の平均増加は、術前の３５．５±２．３％（平均値±標準誤差）から移植後３ヶ月で５３．５±４．９８％まで増加した。心内膜縁検出（ＡＢＤ）の自動超音波心臓動態診断法により評価した心臓の全体収縮性は、３９．８±３．２６％から５６．３±３．１％へ増加した（ｐ＜０．０５）（図１）。
【００８６】
無運動性／運動減退／異常運動の平均数の７（術前、５〜１０）から３（移植後３ヶ月、０〜５）への減少により示されるように、局所収縮性にも改善があった。
局部運動性指数（ＷＭＳＩ）の平均値、１．７２±０．１４は、移植から３ヶ月目に１．２５±０．０７へ低下した（ｐ＜０．０５）（表３）。筋原細胞の移植から派生する心臓機能に対する潜在利益を血管再生から派生するそれより差別化するために、細胞移植を受けたセグメントのＷＭＳＩ指数と細胞を受けなかったセグメントのそれの改善について比較した。ＷＭＳＩは、（術前の）基準指標に比較して３ヶ月で劇的に低下し、細胞移植を受けたセグメントにより大きな減少があった（表３）。
【００８７】
２．２±０．２（基準値）から１．５±０．２６（３ヶ月）というＷＭＳＩの減少（ｐ＜０．０１）は、ＮＹＨＡ分類における改善に相当する。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
２．６  心筋の灌流及び活動可能性（feasibility）試験
７名の患者で術前（１〜５日前）と移植後３ヶ月に行った検査により、灌流（ＰＥＴ−アンモニウム）及び代謝（ＦＤＧ−グルコース）の試験を行った。各部位について定量的な数値率を割り当てて、トレーサーの保持を評価した。すべての心筋でグルコースの平均保持は、術前が０．１５８±０．０２６ｍｇ／分で、３ヶ月では０．２７０±０．００８ｍｇ／分であった（ｐ＜０．０５）。梗塞領域（心筋梗塞による壊死組織）の差別解析では、アンモニウムとグルコースの保持の有意な増加が証明され、このことは梗塞領域における心筋活動可能性の改善を示唆する（表４）。図２も参照のこと。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
考察
本研究の主たる結論は：１．心筋梗塞の既往歴があり、大動脈・冠状動脈バイパスの手術を受けた患者の心筋への自己骨格筋原細胞の直接移植は、実施可能であり安全である。２．細胞移植からの派生効果よりバイパスの派生効果を明瞭に差別化することはできないものの、機能性及び活動可能性の試験は、自己筋原細胞の移植が左心室の収縮性を改善することと組織の修復に貢献することを示唆する。３．骨格筋芽細胞は、少なくとも術後３ヶ月まで移植することができる、ということである。
【００９２】
骨格筋芽細胞が十分に移植可能であるかどうかを証明するには、心筋を直接試験することが必要であろうが、ＰＥＴによるグルコース保持の増加は、生存可能組織が検出されなかった梗塞領域において、移植の実施後すぐに生存可能組織が検出されはじめることを明らかに示している。一方、この試験には対照患者を含めなかったものの、細胞培養物の微生物学的汚染により大動脈・冠状動脈バイパスだけを行った患者９の１８Ｆ−ＦＤＰ−ＰＥＴの結果は、３ヶ月のフォローアップでグルコース利用能の有意な変化を示さず（図２Ｂ）、このことは決定的ではないものの、有望である。
【００９３】
上記の結果は、自己骨格筋原細胞の移植を伴う大動脈・冠状動脈バイパスにより、駆出率の増加と、特にＷＭＳＩ指数の減少により明白なように、心臓収縮性が顕著に改善されることを示す。これらの結果から、心臓機能の改善がバイパスだけによると結論付けることはできない。細胞移植を受けた心筋セグメントがこれらの同じセグメントにおけるグルコース保持の増加を伴うより高い改善を示したという事実は、心臓機能の改善がバイパスだけによるものではあり得ないことを示している。自己細胞移植が心臓機能の改善の原因であることの裏付けのある証明には、他の療法との協同を伴わない移植を行うことが必要であろうが、そのことは、細胞を皮下注射により移植するのでなければ、今日では倫理に反するだろう。
【００９４】
他の臨床治験に関する最近の研究は、自己骨格筋芽細胞の移植が心臓不整脈に関連することを示唆している（Menasche P et al. Lancet 2001; 357: 279-280. Menasche P et al. J. Am. Coll. Cardiol. 2003; 41: 1078-1083. Hagege AA et al. Lancet 2003; 361: 491-492. Pagani FD et al. J Am. Coll. Cardiol. 2003; 41: 879-888）。事実、これまでに心臓内細動除去器の移植を必要とした患者もいる。今のところ、これら不整脈の確たる原因は知られていないが、それらは、電気的再入回路の形成（おそらくは、移植される骨格筋芽細胞では細隙結合が確立していないため）、移植細胞の数及び容量、又は自己筋原細胞の使用に関連している可能性がある。上記のプロトコールでは、自己筋原細胞の in vitro 培養及び膨張に、異種タンパク質の供給源となる、胎仔ウシ血清を使用したことを指摘することは重要である。ヒト細胞をウシ血清と３週間接触させると、細胞表面に前記動物タンパク質の固定化をもたらす。これらの細胞を移植すると、炎症反応と、続いて線維症を引き起こすだろう。実施した臨床病理学的検査は、この方法に従って移植した細胞が血管新生の存在しない線維症のパターンに埋め込まれることを示している。この組織学的配置は、重篤な心室性不整脈の異所発生を引き起こす可能性がある、再入回路のリスクとなる。上記の研究とは異なり、今回の臨床治験では、完全自己培養基において膨張させた自己骨格筋原細胞を使用して、免疫反応を回避した。このことにより、今回の臨床試験において上記不整脈を観察しなかった理由を説明することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１は、外科手術前（基準）、細胞移植後４０日目のフォローアップ来診時（４０日）、及び３ヶ月でのフォローアップ来診時（３ヶ月）の、断層超音波心エコー図（２Ｄ）及び自動縁検出法（ＡＢＤ）により算出した、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）の解析による左心室機能の評価を表す棒チャートである。
【図２】図２は、外科手術前（基準）、細胞移植の３ヶ月（ＦＵ３ヶ月）での、１３Ｎ−アンモニウムを用いたＰＥＴ造影による灌流とＰＥＴ  １８Ｆ−ＦＤＧによるグルコースの代謝の評価を示す。図２Ａ：細胞移植を受けた患者の代表例としての患者番号５に対応する画像。図２Ｂ：細胞移植を受けていない（骨格筋原細胞培養物の汚染により）患者番号９の心臓に対応する画像。矢印は、外科手術の前と後での梗塞組織を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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