(57)【要約】ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄモノクローナル抗体の重鎖又は軽鎖中の相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる又はその中にある配列（以後「ｈＣＤＲ配列」）、或いはこの配列の１個又は複数のアミノ残基の置換、欠失、及び／又は付加によって得られる配列を含む少なくとも１２個、最大３０個のアミノ酸残基の合成ペプチド、並びにこのペプチドの塩、化学誘導体及びポリマーを、全身性エリテマトーデスに関連する応答の免疫調節に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体の重鎖又は軽鎖中の相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる又はその領域内で見られる配列（以後「ｈＣＤＲ配列」）、或いは（ｉ）ｈＣＤＲ配列の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）該ｈＣＤＲ配列からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）該ｈＣＤＲ配列への１個又は複数のアミノ酸残基の付加、によって得られる配列を含む、少なくとも１２個、最大３０個のアミノ酸残基からなるペプチド、又は該ペプチドの塩若しくは化学誘導体、
（ｂ）直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合した（ａ）の該ペプチドの２個の異なるペプチドを含む合成２本鎖ペプチド、
（ｃ）（ａ）の該ペプチドの複数の配列を含むペプチドポリマー、及び
（ｄ）巨大分子の担体に結合した（ａ）のペプチド又は（ｃ）のペプチドポリマーからなる群から選択される合成ペプチド。
【請求項２】
前記ｈＣＤＲ配列が、ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体の重鎖中のＣＤＲからなる又はその領域内で見られる配列を含む、請求項１に記載の合成ペプチド。
【請求項３】
さらにアミノ酸残基を含む、請求項１又は請求項２に記載の合成ペプチド。
【請求項４】
前記さらなるアミノ酸残基が、ｈＣＤＲ配列に隣接するヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの配列、或いは異なるアミノ酸残基による該ｈＣＤＲ隣接配列の１個又は複数のアミノ酸残基の置換、該ｈＣＤＲ隣接配列からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又はｈＣＤＲ隣接配列への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなるアミノ酸残基である、請求項３に記載の合成ペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号８の配列、或いは（ｉ）該配列番号８の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）該配列番号８からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）該配列番号８への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなる又はそれら配列内に見られる配列を含むペプチド、或いはこのペプチドの塩又は化学誘導体、
（ｂ）直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合した（ａ）の該ペプチドの２個の異なるペプチドを含む合成２本鎖ペプチド、
（ｃ）（ａ）の該ペプチドの複数の配列を含むペプチドポリマー、及び
（ｄ）巨大分子の担体に結合した（ａ）のペプチド又は（ｃ）のペプチドポリマーからなる群から選択される、請求項２から請求項４までのいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項６】
配列番号８の配列、或いは（ｉ）該配列番号８の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）該配列番号８からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）該配列番号８への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなる又はそれら配列内に見られる配列を含む、請求項５に記載の合成ペプチド。
【請求項７】
配列番号１１の配列からなるペプチドから選択される、請求項６に記載の合成ペプチド。
【請求項８】
配列番号１２〜１８の配列からなるペプチドから選択される、請求項７に記載の合成ペプチド。
【請求項９】
配列番号６の配列からなる、請求項７に記載の合成ペプチド。
【請求項１０】
配列番号６の配列からなるペプチド。
【請求項１１】
（ａ）配列番号１０の配列、或いは（ｉ）異なるアミノ酸残基による該配列番号１０の１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）該配列番号１０からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）該配列番号１０への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなる又はそれら配列内に見られる配列を含むペプチド、或いは該ペプチドの塩又は化学誘導体、
（ｂ）直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合した（ａ）の前記ペプチドの２個の異なるペプチドを含む合成２本鎖ペプチド、
（ｃ）（ａ）の前記ペプチドの複数の配列を含むペプチドポリマー、及び
（ｄ）巨大分子の担体に結合した（ａ）のペプチド又は（ｃ）のペプチドポリマーからなる群から選択される、請求項２から請求項４までのいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１２】
配列番号１０の配列、或いは（ｉ）該配列番号１０の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）該配列番号１０からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）前記配列番号１０への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなる又はそれら配列内に見られる配列を含む、請求項１１に記載の合成ペプチド。
【請求項１３】
配列番号１９の配列からなるペプチドから選択される、請求項１２に記載の合成ペプチド。
【請求項１４】
配列番号２０〜２７の配列からなるペプチドから選択される、請求項１３に記載の合成ペプチド。
【請求項１５】
配列番号７の配列からなる、請求項１３に記載の合成ペプチド。
【請求項１６】
配列番号７の配列からなるペプチド。
【請求項１７】
（ａ）配列番号９の配列、或いは（ｉ）該配列番号９の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）該配列番号９からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）該配列番号９への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなる又はそれら配列内に見られる配列を含むペプチド、或いは該ペプチドの塩又は化学誘導体、
（ｂ）直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合した（ａ）の前記ペプチドの２個の異なるペプチドを含む合成２本鎖ペプチド、
（ｃ）（ａ）の前記ペプチドの複数の配列を含むペプチドポリマー、及び
（ｄ）巨大分子の担体に結合した（ａ）のペプチド又は（ｃ）のペプチドポリマーからなる群から選択される、請求項２から請求項４までのいずれか一項に記載の合成ペプチド。
【請求項１８】
配列番号９の配列、或いは（ｉ）該配列番号９の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）該配列番号９からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）該配列番号９への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなる又はそれら配列内に見られる配列を含む、請求項１７に記載の合成ペプチド。
【請求項１９】
それぞれ、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖の異なるＣＤＲからなる又はその領域内に見られる配列を含む２つの異なるペプチドが、直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合している、請求項２に記載の合成２本鎖ペプチド。
【請求項２０】
請求項６に記載のペプチドが請求項１２に記載のペプチドに共有結合している、請求項１９に記載の合成２本鎖ペプチド。
【請求項２１】
配列番号１１に記載のペプチドが配列番号１９に記載のペプチドに共有結合している、請求項２０に記載の合成２本鎖ペプチド。
【請求項２２】
配列番号６に記載のペプチドが配列番号７に記載のペプチドに共有結合している合成２本鎖ペプチド。
【請求項２３】
配列番号６、７及び１１〜２７の各配列から選択される複数の同一配列を含む、請求項１から請求項４までのいずれか一項に記載のペプチドポリマー。
【請求項２４】
請求項１から請求項２３までのいずれか一項に記載の少なくとも１つの合成ペプチド又はペプチドポリマーと、薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２５】
配列番号６の配列のペプチド及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
配列番号７の配列のペプチド及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
全身性エリテマトーデスの治療用の、請求項２４から請求項２６までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
経口、静脈内、皮下、関節内、筋肉内、吸入、鼻腔内、髄腔内、腹腔内、皮内、経皮又は経腸投与に適合する、請求項２４から請求項２７までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１から請求項２３までのいずれか一項に記載のペプチド又はペプチドポリマーの有効量を全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者に投与することを含む、全身性エリテマトーデスの治療方法。
【請求項３０】
配列番号６のペプチドの有効量を前記ＳＬＥ患者に投与することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号７のペプチドの有効量を前記ＳＬＥ患者に投与することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から請求項２３までのいずれか一項に記載のペプチド又はペプチドポリマーの有効量を、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者に投与することを含む、ＳＬＥ患者におけるＳＬＥに伴う応答の免疫調節方法。
【請求項３３】
ＳＬＥ患者のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−３及び／又はＭＭＰ−９の各活性レベルを、ダウンレギュレートすることを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＳＬＥ患者のサイトカイン活性レベルを免疫調節することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
ＳＬＥ患者のＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γ活性レベルを、ダウンレギュレートすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＳＬＥ患者のＴＧＦ−β活性レベルを、アップレギュレートすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
配列番号６のペプチドの有効量を、前記ＳＬＥ患者に投与することを含む、請求項３２から請求項３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
配列番号７のペプチドの有効量を、前記ＳＬＥ患者に投与することを含む、請求項３２から請求項３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＳＬＥ患者の治療における薬物の有効性を評価するための方法であって、前記薬物による治療を受けている前記患者から得た血液試料中のＭＭＰ−３及び／又はＭＭＰ−９のレベルを様々な時間間隔で測定することを含み、ＭＭＰ−３及び／又はＭＭＰ−９のレベルの減少と薬物の有効性との相関性により上記薬物の有効性を評価する方法。
【請求項４０】
ＳＬＥ患者の治療における薬物の有効性を評価するための方法であって、前記薬物による治療を受けている前記患者から得た血液試料中のＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γのレベルを様々な時間間隔で測定することを含み、ＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γのレベルの減少と薬物の有効性との相関性により上記薬物の有効性を評価する方法。
【請求項４１】
ＳＬＥ患者の治療における薬物の有効性を評価するための方法であって、前記薬物による治療を受けている前記患者から得た血液試料中のＴＧＦ−βのレベルを様々な時間間隔で測定することを含み、ＴＧＦ−βのレベルの増加と薬物の有効性との相関性により上記薬物の有効性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成ペプチドに関し、より詳細にはヒトモノクローナル抗ＤＮＡ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に基づく合成ペプチド、それらを含む医薬組成物及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に伴う免疫応答を調節する際のそれらの使用に関する。
【０００２】
略語：１６／６Ｉｄ：ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ；ＣＤＲ：相補性決定領域；ＣＦＡ：完全フロイントアジュバント；ｈＣＤＲペプチド：ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂのＣＤＲ領域に基づくペプチド；ｈＣＤＲ１：配列番号６のヒトペプチド；ｈＣＤＲ３：配列番号７のヒトペプチド；ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ：１６／６Ｉｄを有するヒト病原性抗ＤＮＡ  ｍＡｂ；ＩＣＤ：免疫複合体の沈着物；Ｉｄ：イディオタイプ；ＬＮＣ：リンパ節細胞；ｍＡｂ：モノクローナル抗体；ＭＭＰ：マトリックスメタロプロテイナーゼ；ｍＣＤＲ１：配列番号１のネズミペプチド；ｍＣＤＲ３：配列番号３のネズミペプチド；ＰＢＬ：末梢血リンパ球；ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水；ｒｅｖ：逆ペプチド（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）；ＳＬＥ：全身性エリテマトーデス；ＳＬＥＤＡＩ：ＳＬＥ疾患活動性指数；ＴＧＦ−β：トランスフォーミング成長因子β；ＵＴ：未処置。
【背景技術】
【０００３】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、ＤＮＡに対する抗体、核抗原に対する抗体及びリボ核タンパク質に対する抗体を含む一連の自己抗体の存在によって特徴づけられる自己免疫疾患である。この疾患の進行は、免疫複合体の沈着によって引き起こされる、一般的な臨床症状並びに組織及び器官の損傷と関連する。他の自己免疫的な状態と同様に、ＳＬＥの病因は、遺伝因子、環境因子、ホルモン因子及び免疫学的因子など様々な因子を内含する。ＳＬＥの予防又は治癒を目的とした特異的な治療法はない。
【０００４】
１６／６Ｉｄと命名されたヒトモノクローナル抗ＤＮＡ抗体は、共通のイディオタイプを有する（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ等、１９８３）。このイディオタイプは、ＳＬＥ患者において臨床的に関連があることが見出されている。例えば、１６／６Ｉｄが、疾患活動期にある５４％のＳＬＥ患者における抗ＤＮＡ抗体で発現し（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ等、１９８４）、ＳＬＥ患者の冒された器官内で発現する（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ及びＣｏｌｌｉｎｓ、１９８５）ことが発見された。いかなる自発的な自己免疫疾患も発現しない近交系マウスを、このヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫すると、ヒト及びこの疾患の自発性ネズミモデルにおけるＳＬＥの主な特徴を示した（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ等、１９８８）。すなわち、免疫後、このマウスは１６／６Ｉｄに特異的な抗体、１６／６Ｉｄを有する抗体及び様々な核抗原（ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、Ｓｍ、リボ核タンパク質、Ｒｏ、Ｌａ等）に対する抗体を産生した。血清学的所見は、ＳＬＥの典型的な症状である白血球減少、赤血球沈降速度の上昇、タンパク尿、腎臓内の多量の免疫複合体及び糸球体の硬化（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ等、１９８８）を伴った。
【０００５】
実験的なＳＬＥに罹ったマウスから得たネズミ抗１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ（Ａｂ２）も、１６／６Ｉｄ（Ａｂ１）同様、マウスに実験的疾患を誘発させることができた（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ等、１９８９）。更に、１６／６Ｉｄを発現するネズミ抗ＤＮＡ  ｍＡｂを、実験的なＳＬＥに罹ったマウスから調製した。５Ｇ１２と命名された抗体Ａｂ３は、１６／６Ｉｄに特異的な抗体と反応した。Ａｂ３で免疫すると、ヒト１６／６Ｉｄ（Ａｂ１）ｍＡｂ及びネズミ抗１６／６Ｉｄ（Ａｂ２）ｍＡｂで免疫した後に観察されるのと類似した症状を示す実験的なＳＬＥが誘発された（Ｗａｉｓｍａｎ等、１９９３）。これらの結果は、マウスでのＳＬＥの誘発、進行における１６／６Ｉｄネットワークの重要性を示している。
【０００６】
自己抗体がＳＬＥの発症に関わる機序を理解するために、本発明者は、実験的なＳＬＥを誘発させたＣ３Ｈ．ＳＷマウス由来の様々なモノクローナル自己抗体を作製した。その結果、１６／６Ｉｄを有する又はそれと反応する抗体を誘発できるモノクローナル自己抗体は、病原性であるため、マウスにおいて実験的なＳＬＥを誘発できることが見出された（Ｆｒｉｃｋｅ等、１９９０；Ｓｔｈｏｅｇｅｒ等、１９９３）。
【０００７】
その後、ＤＮＡ又はＨｅＬａ核抽出物（ＮＥ）のいずれかに結合し、実験的なＳＬＥに罹ったＣ３Ｈ．ＳＷマウスから単離された９個の自己抗体の可変（Ｖ）領域配列が決定された（Ｗａｉｓｍａｎ及びＭｏｚｅｓ、１９９３）。種々の自己抗体間の関係を決定するために、異なる特異性を有するモノクローナル抗体を解析した。３種のｍＡｂがＤＮＡに結合することが見出され、病原性抗ＤＮＡ抗体に特徴的な配列を示すことが判明した。これらのｍＡｂの１つは２Ｃ４Ｃ２と称し、別のループスに罹り易いマウス、すなわち（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ1から単離される抗ＤＮＡ  ｍＡｂのＶHと、同一の重（Ｈ）鎖Ｖ領域遺伝子（ＶH）を使用することが判明した。ｍＡｂ  ２Ｃ４Ｃ２の軽（Ｌ）鎖Ｖ領域遺伝子（ＶL）は、やはり（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ1マウスから単離された別の抗ＤＮＡ  ｍＡｂのＶLと９８％相同である。他の２種の抗ＤＮＡ  ｍＡｂは５Ｇ１２−４及び５Ｇ１２−６と称し、それらのＶH配列の９３％をｍＡｂ  ２Ｃ４Ｃ２のＶH配列と共有する。これらのｍＡｂの解析に基づき、実験的なＳＬＥに罹ったマウスで見られる自己抗体は、自発的にループスを起こすマウス系統から単離されたｍＡｂで使用されるのと類似の遺伝因子を使用すると考えられる。
【０００８】
Ｔ細胞は、実験的なＳＬＥの誘導と発生に重要な役割を演じている。例えば、１６／６Ｉｄに特異的なＴ細胞系及びＴ細胞クローンは、１６／６Ｉｄ抗体と同様に、同系の受容個体において実験的なＳＬＥを誘導することが示された。したがって、マウスは、この細胞系の活性化された細胞を接種された後、ＳＬＥに典型的な血清及び腎臓の障害を起こした（Ｆｒｉｃｋｅ等、１９９１）。
【０００９】
上述したように、実験的なＳＬＥに罹ったマウスから単離され、ＤＮＡに結合することが判明し、かつ１６／６Ｉｄを有するｍＡｂ  ５Ｇ１２は、マウスに実験的なＳＬＥを誘発させることができる（Ｗａｉｓｍａｎ等、１９９３）。増殖してｍＡｂと特異的に反応するＴ細胞は、おそらく、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する配列に対応するペプチドと反応する。Ｔ細胞が前記抗体のＶ領域を認識する可能性は極めて高い。というのは、Ｔ細胞は、同じ定常領域を有するが異なる特異性を示す他の抗体とは反応しないからである。可変領域中で認識される可能性が最も高い領域はＣＤＲであり、それはＣＤＲが様々な抗体間で最も異なる領域だからである。マウスにＳＬＥを誘発させる上記９個の病原性ネズミｍＡｂのＶH配列のＣＤＲ領域は、Ｗａｉｓｍａｎ及びＭｏｚｅｓ、１９９３の図１中に枠囲いされ、９個のｍＡｂの可変重鎖（ＶH）に対する完全なヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列が示されている。
【００１０】
本出願人らの国際公開第９６／３００５７号は、実験的なＳＬＥに罹ったマウスから単離した病原性ｍＡｂのＣＤＲ領域に基づくペプチド、特に５Ｇ１２と称するネズミｍＡｂのＶH鎖のそれぞれＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域に基づくペプチドＩａ〜ＩＩＩａ、及び２Ｃ４Ｃ２と称するネズミｍＡｂのＶH鎖のそれぞれＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域に基づくペプチドＩＶａ及びＶａを記載している。これらのペプチドは、実質的に配列番号１〜配列番号５で示す以下の配列を有する。
2005505493.tif 000002
【００１１】
これらのペプチド及び、特に、ペプチドＩａ及びＩＩＩａは、本明細書ではそれぞれｍＣＤＲ１［配列番号１］及びｍＣＤＲ３［配列番号３］と命名し、ＰＢＳで希釈して投与すると、適切なｍＣＤＲペプチド又はネズミ若しくはヒト起源の抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ全体にプライムするＴ細胞を阻害できることを本発明者は示した（Ｗａｉｓｍａｎ等、１９９７）。さらに、本発明者は、ｍＣＤＲ１及びｍＣＤＲ３の各ペプチドが、ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂによって誘発され又はＳＬＥ易罹患性マウス（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１又はＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒで自発的に発生する慢性のＳＬＥを予防又は治療することを示した（Ｅｉｌａｔ等、２０００及び２００１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
（発明の概要）
今回、本発明により、ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体のＣＤＲに基づくペプチドが、ＳＬＥに伴う応答を免疫調節できることを見出した。すなわち、ヒト１６／６ＩｄのＣＤＲ１及びＣＤＲ３に基づくペプチドを試験し、それがネズミペプチドｍＣＤＲ１（配列番号１）及びｍＣＤＲ３（配列番号３）で、又は全ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫したマウスのリンパ節細胞の増殖を阻害し、ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対するＳＬＥ患者の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の増殖性応答を阻害し、自発的又は実験的なＳＬＥに罹ったマウスの疾患症状を寛解させることを示した。
【００１３】
病原性自己抗体のＣＤＲすべてが患者のＴ細胞によって等しく認識されるわけではないので、これらの発見はまったく予想外である。本発明者の研究室においてすでに示したように（Ｄａｙａｎ等、２０００）、抗ＤＮＡ自己抗体２Ｃ４Ｃ２のＣＤＲは、ＳＬＥ患者のＴ細胞によって、抗ＤＮＡ抗体５Ｇ１２のＣＤＲに基づくペプチドほどは認識されない。また、上述の国際公開第９６／３００５７号に記載されたネズミ自己抗体のＣＤＲに基づくペプチドの類似体の多くは、その阻害効果が有効ではないことが示され、したがって、本発明のヒトモノクローナル抗ＤＮＡ抗体のＣＤＲに基づくペプチドの配列に起こる改変が有効であることを予測又は示唆することはできなかった。さらに、ヒトに使用する場合、ヒト抗体に基づくペプチドを使用することは、非ヒト抗体（ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）に基づくペプチドよりも好ましいはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、一の実施形態において、
（ａ）ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体の重鎖又は軽鎖中の相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる又はその領域内に見られる配列（以後「ｈＣＤＲ配列」）、或いは（ｉ）当該ｈＣＤＲ配列の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）当該ｈＣＤＲ配列からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）当該ｈＣＤＲ配列への１個又は複数のアミノ酸残基の付加、によって得られる配列を含む少なくとも１２個、最大３０個のアミノ酸残基のペプチド、又はこのペプチドの塩若しくは化学誘導体、
（ｂ）直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合した（ａ）の前記ペプチドの２個の異なるペプチドを含む合成２本鎖ペプチド、
（ｃ）（ａ）の前記ペプチドの複数の配列を含むペプチドポリマー、及び
（ｄ）巨大分子の担体に結合した（ａ）のペプチド又は（ｃ）のペプチドポリマーからなる群から選択される合成ペプチドに関する。
【００１５】
本明細書で「ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ」と称するヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体は、マウスにＳＬＥ様疾患を誘発することができる病原性ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ抗体である。
【００１６】
先に定義したｈＣＤＲ配列を含む本発明によるペプチドは、本明細書では「ｈＣＤＲペプチド」と称する。
【００１７】
好ましい一の実施形態において、ｈＣＤＲペプチドは、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ配列を含み、より好ましくは、それぞれ実質的に配列番号６及び配列番号７で示す以下の配列を有し、本明細書でｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３と命名するペプチド等（ただしこれだけには限定されない）の、ヒト１６／６ＩｄｍＡｂの重鎖のＣＤＲ１又はＣＤＲ３配列を含む。など、
2005505493.tif 000003
【００１８】
別の態様において、本発明は、少なくとも１種の本発明の合成ペプチド又はペプチドポリマーと、薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、特にＳＬＥに伴う応答を調節し、例えばＭＭＰ−３及び／又はＭＭＰ−９、及び／又はＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γの各活性レベルをダウンレギュレーションし、又はＳＬＥ患者のＴＧＦ−βの活性レベルをアップレギュレーションすることによって、特にＳＬＥの治療及びこの疾患の臨床症状の寛解に有用である。
【００１９】
別の実施形態において、本発明は、ＳＬＥ患者に有効量の本発明のペプチド又はペプチドポリマーを投与することを含むＳＬＥを治療するための方法に関する。また、本発明は、ＳＬＥに伴う応答を、例えば、ＭＭＰ−３及び／又はＭＭＰ−９、並びに／或いはＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γの各活性レベルをダウンレギュレーションしたり、ＳＬＥ患者のＴＧＦ−βの活性レベルをアップレギュレーションして免疫調節する方法にも関し、この方法はＳＬＥ患者に有効量の本発明のペプチド又はペプチドポリマーを投与することを含む。
【００２０】
さらに別の実施の形態において、本発明は、ＳＬＥ患者の治療における薬物の有効性を評価するための方法に関し、この方法は前記薬物による治療を受けている前記患者から得た血液試料中のＭＭＰ−３及び／又はＭＭＰ−９のレベルを様々な時間間隔で測定することを含む。ここで、ＭＭＰ−３及び／又はＭＭＰ−９のレベルの減少は薬物の有効性と相関している。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＳＬＥ患者の治療における薬物の有効性を評価するための方法に関し、この方法は前記薬物による治療を受けている前記患者から得た血液試料中のＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γのレベルを様々な時間間隔で測定することを含む。ここで、ＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γのレベルの減少は薬物の有効性と相関している。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＳＬＥ患者の治療における薬物の有効性を評価するための方法に関し、この方法は前記薬物による治療を受けている前記患者から得た血液試料中のＴＧＦ−βのレベルを様々な時間間隔で測定することを含む。ここで、ＴＧＦ−βのレベルの増加は薬物の有効性と相関している。
【００２３】
上記方法のいずれかに従って有効性を評価すべき薬物は、例えば、本発明によるペプチド又は上述の国際公開第９６／３００５７号に記載のネズミペプチドである（但し、これらに限定されるものではない。）。
（本発明の詳細な説明）
【００２４】
本発明は、一の実施の形態において、マウスでＳＬＥ様疾患を誘発させる病原性ヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体（本明細書では「ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ」又は「ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ」と示す）の重鎖及び軽鎖中にあるＣＤＲからなる、又はそれらの領域内に見られる配列を含む合成ペプチドに関する。
【００２５】
本明細書でｈＣＤＲペプチドと称する、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂのＣＤＲから誘導される本発明の合成ペプチドは、好ましくは、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖中にあるＣＤＲに基づく。
【００２６】
ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂのＶH配列の各ＣＤＲ領域は、Ｗａｉｓｍａｎ等、１９９５の図４Ａの枠内に記載されている。ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖の各ＣＤＲ領域は、実質的に配列番号８〜配列番号１０で示す以下の配列を含む。
2005505493.tif 000004
【００２７】
本発明のｈＣＤＲペプチドは、少なくとも１２個、最大３０個のアミノ酸残基を含有し、好ましくは、配列番号８、９及び１０からなる群から選択される配列と同じ配列、より好ましくは配列番号８、９又は１０の配列内で見られる配列を含み、或いは（ｉ）配列番号８、９及び１０の各配列の１個又は複数のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換して、（ｉｉ）配列番号８、９及び１０の各配列から１個又は複数のアミノ酸残基を欠失させて、又は（ｉｉｉ）１個又は複数のアミノ酸残基を配列番号８、９及び１０の各配列へ付加して得られる配列を含む。
【００２８】
本発明のｈＣＤＲペプチドは、ｈＣＤＲ配列に加え、さらにアミノ酸残基、好ましくは、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂのｈＣＤＲ配列に隣接する配列のアミノ酸残基、或いはｈＣＤＲに隣接する配列の１個又は複数のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換して、ｈＣＤＲに隣接する配列から１個又は複数のアミノ酸残基を欠失させて、又はｈＣＤＲに隣接する配列に１個又は複数のアミノ酸残基を付加して得られる配列を含む。
【００２９】
したがって、一の実施形態において、本発明は、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ１に基づく合成ペプチドを提供する。このＣＤＲ１領域は、実質的に配列番号８で示す配列であり、このペプチドを、
（ａ）配列番号８の配列、或いは（ｉ）当該配列番号８の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）当該配列番号８からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）当該配列番号８への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなる、又はそれらの配列内に見られる配列を含むペプチド、或いはこのペプチドの塩又は化学誘導体、
（ｂ）直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合した（ａ）の前記ペプチドの２個の異なるペプチドを含む合成２本鎖ペプチド、
（ｃ）（ａ）の前記ペプチドの複数の配列を含むペプチドポリマー、及び
（ｄ）巨大分子の担体に結合した（ａ）のペプチド又は（ｃ）のペプチドポリマーからなる群から選択する。
【００３０】
本発明の好ましい一の実施形態において、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ１に基づくペプチドは、配列番号１１に実質的に示される配列のペプチドである。
2005505493.tif 000005
（配列中、Ｘ1はＧ又はＴＧ、Ｘ2はＲ又はＫ、Ｘ3はＰ又はＳ、Ｘ4はＧ又はＥ、Ｘ5はＫ又はＤ、Ｘ6はＥ、Ｌ又はＳである。）
【００３１】
より好ましい実施形態において、配列番号１１のペプチドは、本明細書で「ｈＣＤＲ１ペプチド」又は単に「ｈＣＤＲ１」と称する、実質的に配列番号６で示す配列の１９量体ペプチドである。
2005505493.tif 000006
【００３２】
ｈＣＤＲ１では、配列番号８に含まれる配列ＧＹＹＷＳは、ｍＡｂ配列の天然のロイシン（Ｌ）残基がグルタミン酸残基（Ｅ）（太字）によってペプチドｈＣＤＲ１の位置１５で置換されている以外は、その後にヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ１の天然配列が続く。
【００３３】
別の実施形態において、配列番号１１のペプチドは、ｈＣＤＲ１ペプチド配列に対するアミノ酸残基の置換及び／又は付加によって得られるｈＣＤＲ１ペプチドの類似体であり、その例は実質的に配列番号１２から配列番号１８（配列中、置換され又は付加したアミノ酸を太字で示す）で示す配列のペプチドである。
2005505493.tif 000007
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ３に基づく合成ペプチドを提供する。このＣＤＲ３領域は実質的に配列番号１０で示す配列であり、このペプチドを、
（ａ）配列番号１０の配列、或いは（ｉ）当該配列番号１０の異なるアミノ酸残基による１個又は複数のアミノ酸残基の置換、（ｉｉ）当該配列番号１０からの１個又は複数のアミノ酸残基の欠失、及び／又は（ｉｉｉ）当該配列番号１０への１個又は複数のアミノ酸残基の付加によって得られる配列からなる、又はそれらの配列内に見られる配列を含むペプチド、或いはこのペプチドの塩又は化学誘導体、
（ｂ）直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合した（ａ）の前記ペプチドの２個の異なるペプチドを含む合成２本鎖ペプチド、
（ｃ）（ａ）の前記ペプチドの複数の配列を含むペプチドポリマー、及び
（ｄ）巨大分子の担体に結合した（ａ）のペプチド又は（ｃ）のペプチドポリマーからなる群から選択する。
【００３５】
本発明の好ましい一の実施形態において、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ３に基づくペプチドは、配列番号１９で実質的に示す配列のペプチドである。
2005505493.tif 000008
（配列中、Ｘ1はＧ又はＦ、Ｘ2はＲ又はＡ、Ｘ3はＧ又はＡ、Ｘ4はＧ又はＡ、Ｘ5はＷ又はＡ、Ｘ6はＮ又はＡ、Ｘ7はＹ又はＷ、Ｘ8はＭ又はＱである。）
【００３６】
より好ましい実施形態では、配列番号１９のペプチドは、本明細書で「ｈＣＤＲ３ペプチド」又は単に「ｈＣＤＲ３」と称する配列番号７のペプチドである。
2005505493.tif 000009
【００３７】
ｈＣＤＲ３において、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ３領域の配列ＧＬＬＲＧＧＷＮＤＶＤＹＹＹＧＭＤＶ［配列番号１０］は、チロシン（Ｙ）残基の１個が欠失して改変されており、その先にはこのｍＡｂの天然配列が存在する。
【００３８】
別の実施形態において、配列番号１９のペプチドは、ｈＣＤＲ３ペプチド配列に対するアミノ酸残基の置換及び／又は付加によって得られるｈＣＤＲ３ペプチドの類似体であり、その例は配列番号２０から配列番号２７（配列中、置換され又は付加したアミノ酸を太字で示す）の配列のペプチドである。
2005505493.tif 000010
【００３９】
さらに別の実施形態において、本発明は、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ２に基づく合成ペプチドを提供する。このＣＤＲ２領域は実質的に配列番号９で示す配列であり、このペプチドを、
（ａ）配列番号９の配列、或いは（ｉ）当該配列番号９の１個又は複数のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換して、（ｉｉ）当該配列番号９から１個又は複数のアミノ酸残基を欠失させて、及び／又は（ｉｉｉ）１個又は複数のアミノ酸残基を前記配列番号９に付加して得られる配列からなる、又はそれら配列内に見られる配列を含むペプチド、或いはこのペプチドの塩又は化学誘導体、
（ｂ）直接又は短い結合鎖によって互いに共有結合した（ａ）の前記ペプチドの２個の異なるペプチドを含む合成２本鎖ペプチド、
（ｃ）（ａ）の前記ペプチドの複数の配列を含むペプチドポリマー、及び
（ｄ）巨大分子の担体に結合した（ａ）のペプチド又は（ｃ）のペプチドポリマーからなる群から選択する。
【００４０】
本発明の合成ペプチドは、１２〜３０、好ましくは１７〜２３、最も好ましくは１９〜２２アミノ酸残基を有し、当分野で周知の方法を用いた化学合成又は組換え技術によって製造することができる。
【００４１】
アミノ酸残基を置換して得られる上述の類似体を調製するときには、体積、疎水性−親水性パターン及び非置換の親ペプチドに対応する部分の電荷が、累積的、実質的に変わらない置換から選択することが重要である。したがって、体積、疎水性−親水性パターン及び対応する非置換親ペプチドの電荷の変化が、全体的な効果を実質的に変えない限り、疎水性残基を親水性残基で、又は親水性残基を疎水性残基で置換することができる。
【００４２】
本発明は、本発明のペプチドの化学誘導体も含む。「化学誘導体」は、Ｔ細胞増殖性応答及び自己免疫疾患を予防し抑制することに利用可能な本発明のペプチドの機能の少なくとも一部を保持する限り、通常はこのペプチドの一部ではない追加の化学成分を含み、本発明に包含される。例えば、化学誘導体は、前記ペプチドの選択側鎖又は末端残基と反応し得る有機誘導体化試薬が反応することによって得られ、好ましくは、ＳＬＥを誘発する自己抗体に高度に応答するマウスのＴリンパ球の増殖性応答及びサイトカイン分泌を特異的に阻害するペプチド機能の少なくとも一部を保持する。これらの化学誘導体のなかでも、アミド類、すなわちＣ末端カルボキシル基のアミド類及びアスパラギン酸又はグルタミン酸残基の遊離カルボキシル基のアミド類は特に興味深い。このような多数の化学誘導体及びそれらの生成方法が当分野では周知である。
【００４３】
本発明の範囲には、本発明のペプチド及び類似体の塩も含まれる。本明細書で使用する「塩」という用語は、ペプチド分子のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当分野で既知の手段によって形成することができ、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第二鉄塩又は亜鉛塩などの無機塩、及び例えば、トリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンと形成される塩などの有機塩基を有する塩などが含まれる。酸付加塩は、例えば、塩化水素酸又は硫酸などの鉱酸を有する塩、及び例えば、酢酸又はシュウ酸などの有機酸を有する塩などである。このような化学誘導体及び塩を、ペプチドの薬剤としての安定性、溶解性などの諸特性を改変するのに使用することが好ましい。
【００４４】
本発明によるｈＣＤＲペプチドは、ＳＬＥを誘発する自己抗体に高度に応答するマウスのＴリンパ球の増殖性応答を阻害できるかどうかを評価することによって選択することができる。本発明に従ってペプチドを生成した後、当業者は、ＳＬＥを誘発する自己抗体に高度に応答するマウスのＴリンパ球の増殖性応答を阻害する能力を、本明細書に記載するような試験法を用いて、過度な実験を行なうことなく容易に決定することができる。容易に実施できる一の試験法は、ＳＬＥを誘発する自己抗体に特異的な特定のＴ細胞系及びＴ細胞クローンの増殖性応答をインビトロで阻害するペプチドの能力に関するものである。Ｔ細胞系及びＴ細胞クローンは、例えば、既報の方法（Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｏ．及びＭｏｚｅｓ，Ｅ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、１７２、９９（１９８６））によってマウスの免疫されたリンパ節細胞から樹立された１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに特異的なＴ細胞系及びＴ細胞クローン（Ｆｒｉｃｋｅ等、１９９１）でもよい。強化培地存在下で２週ごとに照射された同系のひ臓細胞上に存在する刺激抗体に細胞を曝す。このＴ細胞系を標準の限界希釈法によってクローン化する。これらのＴ細胞系及びクローンの増殖性応答を、例えば、国際公開第９６／３００５７号の「材料と方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」（ｇ）項に記載の方法によって評価する。
【００４５】
所望の活性を有する類似体を選択するために実施可能な別の試験法は、ペプチドに特異的なＢ細胞を補助するＴ細胞系及びＴ細胞クローンの能力を、合成ペプチドが阻害できるかどうかを親ペプチドの存在下で評価することである。ビオチン標識後、関連する系統の抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ産物に直接結合できるかどうかで合成ペプチドを評価することもできる。この目的のため、水溶液中０℃で過剰のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、関連するペプチドのＮ末端のビオチン標識化を行なう（Ｍｏｚｅｓ等、１９８９）。マウスのひ臓の接着細胞又はＰＢＬ接着細胞（１×１０6／試料）を、ビオチン標識したペプチドとともに０．１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中３７℃で２０時間インキュベートし、その後フィコエリトリン−ストレプトアビジンとともに４℃で３０分間インキュベートする。各インキュベーション後、これらの細胞を上記溶液で２回洗浄する。その後、ＦＡＣＳｃａｎを用いたフローサイトメトリーによりこれらの細胞を分析する。各分析で、最低５０００細胞を検査する（上記手順に関しては、例えば、Ｍｏｚｅｓ等、１９８９を参照されたい）。
【００４６】
実施可能な別の試験方法は、ＳＬＥを誘発する自己抗体に高度に応答するマウスのＴ細胞系による又はＴリンパ球若しくはリンパ節細胞によるサイトカイン分泌をこれらのペプチドが阻害できるかどうかを評価することである。サイトカインを以下のようにして検出する：ＩＬ−１活性を、（ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０に対して以下で説明するように）一対の捕捉抗体及び検出抗体を用いてＥＬＩＳＡにより評価する。ＩＬ−２を、ＩＬ−２に依存するＣＴＬＬ系を用いて又はＥＬＩＳＡによって直接検出する。上清中のＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αの各レベルを、種々のサイトカインに対する種々の抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａ．、ＵＳＡ）を用いたＥＬＩＳＡによって製造者の指示に従って決定する。また、本明細書の実施例に記載したように、これらのペプチドが免疫抑制性サイトカインＴＧＦ−βの分泌レベルを高めることができるかどうかをＥＬＩＳＡにより評価することができる。
【００４７】
これらの１種又は複数のインビトロ試験で陽性であるペプチドは、インビボでの活性が当然期待される。しかし、インビボでの試験も、無理な実験を行なうことなく実施できる。したがって、例えば、候補ペプチドを−３日又は０日に成体マウスに注射してもよい。次いで、疾患を誘発する自己抗体又はこのペプチドでこれらのマウスを免疫する。１０日後、候補ペプチドの阻害能力を見るために、マウスのリンパ節細胞が増殖して免疫原になるかどうかを評価する。
【００４８】
別のこのようなインビボでの動物試験は、上述のＳＬＥの発生に対する治療活性をネズミモデルで直接インビボで測定することからなる。様々な投与量及び様々な時間割で様々な経路によって実験的なＳＬＥが誘発されるマウスにこれらのペプチドを注射することができる。また、ＳＬＥを誘発する自己抗体によって誘発されたマウスの自己抗体応答及び疾患症状に対するこれらのペプチドの効果を測定するために、これらの治療したマウスを定期的に評価することができる。
【００４９】
別のインビボでの操作は、自発的にＳＬＥを発症するマウス、例えば本明細書の実施例に記載した（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスを候補ペプチドが治療できるかどうかを評価することからなる。
【００５０】
したがって、本明細書の実施例中で実施可能であることが判明した好ましい実施形態に加え、当業者は、過度な実験を行なうことなく、本明細書で示した概要に従ってやはり実施可能な別の類似体を決定することができることは明らかである。
【００５１】
別の好ましい実施形態では、本発明は、２本鎖ペプチドなどマルチエピトープの単一ペプチドを提供する。一の実施形態において、２本鎖ペプチドは、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ１配列（配列番号８）又はＣＤＲ３配列（配列番号１０）を含む２つの異なるペプチドなどのように、同じＣＤＲに基づく２つの異なるペプチドからなる。
【００５２】
より好ましい別の実施形態では、２本鎖ペプチドは、１つのペプチドがヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの重鎖のＣＤＲ１配列（配列番号８）を含み、もう１つのペプチドがそのＣＤＲ３配列（配列番号１０）を含むような、それぞれが異なるＣＤＲに基づく２つの異なるペプチドからなる。
【００５３】
本発明による２本鎖ペプチドは、好ましくは２つの異なるペプチドからなり、１つは配列番号１１のペプチド、もう１つは配列番号１９のペプチドであり、より好ましくは１つのペプチドは配列番号６及び１２〜１８からなる群から選択され、もう１つのペプチドは配列番号７及び２０〜２７からなる群から選択され、最も好ましくは１つのペプチドは配列番号６のペプチド、もう１つのペプチドは配列番号７のペプチドであって、これら２つの異なるペプチドは直接、又は一続きのアラニン残基などの短い結合鎖若しくはカテプシンによるタンパク分解推定部位で互いに共有結合している。このような部位に関しては、例えば、米国特許第５，１２６，２４９号及び欧州特許第４９５０４９号を参照されたい。
【００５４】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、例えば、０．１％グルタルアルデヒド（Ａｕｄｉｂｅｒｔ等、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２８９：５９３）などの適切な重合試薬を用いてこれらのペプチドを重合して得られるペプチドポリマーの形の本発明のいくつかの同一又は異なるペプチドを含むマルチエピトープの単一ペプチドを提供する。このポリマーは、好ましくは５〜２０ペプチド残基、好ましくは配列番号６、７及び１１〜２７のペプチドを含む。このようなペプチドポリマーは、これらのペプチドを架橋することによって又は複数のペプチドを巨大分子の担体に結合させることによっても形成することができる。適切な巨大分子担体は、例えば、破傷風トキソイドなどのタンパク質、並びにＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−リジンの線状コポリマー、及びＬ−チロシン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌアラニン及びＬ−リジン（Ｔ，Ｇ）−Ａ−Ｌ−の分枝状コポリマー又は多連鎖ポリＤＬ−アラニンの分枝状コポリマーなどアミノ酸の線状又は分枝状コポリマーである（Ｍ．Ｓｅｌａ等、１９５５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７７：６１７５）。これらの複合物は、例えば、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｇ．Ｍ．等（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：５６９に記載されているように、ペプチドを１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性カルボジイミドとまず結合させ、次いで巨大分子担体と複合させて得られる。各複合物において結合したペプチドの量を、アミノ酸解析により、担体のみの組成物と比較して決定する。
【００５５】
本発明の別の実施形態によれば、１個又は複数の活性ペプチドを適切な巨大分子担体に結合させ、グルタルアルデヒドの存在下で重合することができる。
【００５６】
これらのペプチド、そのポリマー又はそれらの適切な巨大分子担体との複合物を、それらの生物学的利用能を確実にする形で患者に投与することによって、治療に適切なものとなる。本発明の複数のペプチドが有意な阻害活性を有すると判明した場合、これらのペプチドを、それらの混合物を含有する製剤の形で患者に投与することができる。
【００５７】
したがって、本発明は、本発明による少なくとも１種の合成ペプチド又はペプチドポリマーと、場合によっては薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物にも関する。
【００５８】
好ましい一の実施形態において、この医薬組成物は、本発明の少なくとも１種の合成ペプチドを含み、より好ましくは、ｈＣＤＲ１［配列番号６］ペプチド及びｈＣＤＲ３［配列番号７］ペプチド、並びにｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３配列中のアミノ酸残基の置換及び／又は付加によって得られるペプチドからなる群から選択されるペプチドを含み、特に好ましくは、配列番号１２から配列番号１８及び配列番号２０から配列番号２７のペプチドからなる群から選択されるペプチドを含む。
【００５９】
経口、静脈内、皮下、関節内、筋肉内、吸入、鼻腔内、髄腔内、腹腔内、皮内、経皮、又は経腸の経路を含む他の既知の経路を含めて、任意の適切な投与経路が本発明に包含される。好ましい実施形態では、経口、鼻腔内又は皮下の経路で本発明のペプチドを投与する。
【００６０】
本発明による組成物の投与量の範囲は、所望の効果を生じるのに十分な量とすべきである。それによって、例えば、インビトロでのＴ細胞増殖によって測定されるＳＬＥ誘発自己抗体に対する免疫応答を実質的に予防又は抑制し、更に、この疾患の治療が有意なものとなる。この投与量は、有害な交差反応、全身性の免疫抑制、アナフィラキシー性反応などの有害副作用を起こすほど多量とすべきではない。
【００６１】
ＳＬＥの治療に使用する本発明のペプチドの有効投与量は約１μｇ〜１ｍｇ、最大１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００６２】
本発明の合成ヒトペプチドは、他の免疫応答のすべてに影響を及ぼすことなく、ＳＬＥ患者に特異的な抗原応答を阻害又は抑制することを意図するものである。診断を受ける患者は、ほとんどが何年も治療を受けなければならない若い女性であり、しかも現在是認されているＳＬＥの治療法は、るコルチコステロイド及び／又は細胞毒性薬物などの、非特異的で複数の有害な副作用がある免疫抑制剤を投与するものなので、本発明のアプローチは、極めて重要である。
【００６３】
本発明は、ＳＬＥ患者に有効量の本発明のペプチド又はペプチドポリマーを投与することを含む全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療方法にも関する。好ましい一の実施形態では、この方法は、配列番号６のペプチドを投与することを含む。別の好ましい実施形態では、この方法は、配列番号７のペプチドを投与することを含む。
【００６４】
本発明は、有効量の本発明のペプチド又はペプチドポリマーを前記ＳＬＥ患者に投与することを含む、ＳＬＥ患者におけるＳＬＥに伴う応答の免疫調節方法にも関する。一の実施形態において、この方法は、ＳＬＥ患者におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−３及び／又はＭＭＰ−９の各活性レベルをダウンレギュレートすることを含む。別の実施形態において、この方法は、ＳＬＥ患者におけるサイトカイン活性のレベルを免疫調節することを含み、特にＳＬＥ患者におけるＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γ活性レベルをダウンレギュレートしかつ／又はＴＧＦ−β活性レベルをアップレギュレートすることを含む。好ましい一の実施形態において、この方法は、配列番号６のペプチドを投与することを含む。別の好ましい実施形態において、この方法は、配列番号７のペプチドを投与することを含む。
【００６５】
本発明は、ＳＬＥ患者の治療における薬物の有効性を評価するための方法も提供する。この方法は、前記薬物による治療を受けている前記患者から得た血液試料中のＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及び／又はＴＧＦ−βのレベルを様々な時間間隔で測定することを含み、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γのレベルの減少或いはＴＧＦ−βレベルの増加は薬物の有効性と相関する。
【００６６】
本発明は更にまた、医薬組成物の調製のための本発明のペプチド又はペプチドポリマーの使用にも関し、特にＳＬＥ治療用、より具体的にはＳＬＥ患者におけるＭＭＰ−３及び／又はＭＭＰ−９及び／又はＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γレベルのダウンレギュレーション或いはＴＧＦ−βレベルのアップレギュレーションなどＳＬＥ患者におけるＳＬＥに伴う応答の免疫調節用の医薬組成物を調整するための本発明のペプチド又はペプチドポリマーの使用にも関する。
【００６７】
以下の非限定的な実施例及び添付の図において本発明を以下により詳細に説明する。
【実施例】
【００６８】
〔材料及び方法〕
（マウス）
メス（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手した。６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃ近交系マウスをＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｎｉｔ、Ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌから入手した。
【００６９】
（抗ＤＮＡモノクローナル抗体）
１６／６Ｉｄ（ＩｇＧ１／ｋ）を有するヒト抗ＤＮＡ  ｍＡｂの特徴はすでに明らかになっている（Ｓｈｏｅｎｆｅｌｄ等、１９８２；Ｗａｉｓｍａｎ等、１９９５）。このｍＡｂを、培養物中で増殖しＧタンパク質−セファロースカラムで精製したハイブリドーマ細胞により分泌させた（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。
【００７０】
（合成ペプチド）
ｍＣＤＲ１（配列番号１）及びｍＣＤＲ３（配列番号３）の合成ネズミペプチド、並びにｍＣＤＲ１及びｍＣＤＲ３と逆の順序及びヒトペプチドｈＣＤＲ１と逆の順序で合成した逆ペプチドを、既報（国際公開第９６／３００５７号）の通り又は自動合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  モデル４３０Ａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）法の手順によって調製した。逆ペプチドは、本明細書で、それぞれｒｅｖｍＣＤＲ１［配列番号２８］、ｒｅｖｍＣＤＲ３［配列番号２９］及びｒｅｖｈＣＤＲ１［配列番号３０］と記述され、対照として使用した。
【００７１】
これらの逆ペプチドは以下の配列を含む。
2005505493.tif 000011
【００７２】
（実験的なＳＬＥの誘発及び治療）
実験的なＳＬＥを誘発するために、ヒトｍＡｂ  １６／６Ｉｄ１〜２μｇでＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、その３週間後に追加免疫した。実験的なＳＬＥを予防するため、ｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３（実施例１２では対照ペプチドとしてｍＣＤＲ１又はｒｅｖｍＣＤＲ１）をマウスに免疫と同時に静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮下に（ｓ．ｃ．）投与し、その後５週間毎週注射した。１６／６Ｉｄで疾患を誘発してから３．５カ月後、すでに臨床症状が観察されていたとき、確立した疾患の治療を開始した。実施例１２では、ｍＣＤＲ１又はｒｅｖｍＣＤＲ１を１００μｇ／マウスの投与量でマウスに毎週１０回（ｉ．ｖ．又はｓ．ｃ．）注射した。
【００７３】
（（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスにおけるＳＬＥ様疾患のｈＣＤＲ１又はｍＣＤＲ１ペプチドによる予防と治療）
ＳＬＥを予防するため、疾患の症状が観測される前の２カ月齢マウスに、毎週１回１０週間にわたりｈＣＤＲ１（実施例１２ではｍＣＤＲ１、２５０μｇ／マウス）を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。確立した疾患を治療するために、ｈＣＤＲ１（実施例１２ではｍＣＤＲ１をｓ．ｃ．で、２５０μｇ／マウス）を毎週１回１０週間にわたり５〜７カ月齢のマウスに注射した。
【００７４】
（増殖性応答）
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配遠心分離によってヘパリン添加静脈血からＰＢＬを単離した。アッセイはすべて、既報（Ｄａｙａｎ等、２０００）の通り、強化ＲＰＭＩ−１６４０中で２×１０5ＰＢＬを培養した平底マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｍａｒｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で３回実施した。１６／６Ｉｄレベルの少なくとも１０倍過剰の濃度で種々のＣＤＲに基づくペプチドを添加して、又は添加せずに、様々な濃度（０．１〜４０μｇ／ウェル）のヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂにこのＰＢＬを曝した。各実験で、培養条件の対照としてフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ；２μｇ／ウェル）を使用した。この培養物を７．５％ＣＯ2中３７℃で６日間インキュベートした。これらの細胞を収集する１８時間前に、［3Ｈ］−チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌの０．５μＣｉ）（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｇｅｖ、Ｉｓｒａｅｌ）を全培養物に添加した。結果を、培養物（ｎ＝３）の１分当たりのカウント数（ＣＰＭ）±ＳＤで示す平均チミジン取込量、又は刺激指数（Ｓ．Ｉ．；ヒト１６／６Ｉｄの最適濃度での平均ＣＰＭと培地のみの存在下での平均ＣＰＭとの比）として表す。２以上のＳ．Ｉ．を陽性の応答とみなした（Ｄａｙａｎ等、２０００）。５０％を超える阻害（１６／６Ｉｄ及び種々のＣＤＲに基づくペプチドの存在下における平均ＣＰＭと１６／６Ｉｄを含みＣＤＲに基づくペプチドを含まない場合の平均ＣＰＭとの比）を陽性とみなした。
【００７５】
（サイトカイン産生の誘導）
ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫し、ＣＤＲに基づくペプチドで治療したマウス又は治療していないマウスを、ペプチドでの治療中又は治療後の異なる時期に屠殺した。脾臓細胞及びリンパ節細胞（ＬＮＣ）を収集し、１６／６Ｉｄの存在下でインキュベートした（５×１０6／ｍｌ）。４８及び７２時間後に上清を収集した。
【００７６】
（上清中のサイトカインの評価）
培養開始から４８時間後に上清を回収し−７０℃で貯蔵した。関連する標準抗体、捕捉抗体及び検出抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い製造者の指示に従ってＥＬＩＳＡによりＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを測定した。ＴＧＦ−βをＥＬＩＳＡにより測定した。簡潔に述べると、組換えヒトＴＧＦ−β１  ｓＲＩＩ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）をプレートに塗布し、第二抗体にビオチン標識した抗ヒトＴＧＦ−β１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いた。用いた基質溶液は、ＴＭＢ発色試薬（Ｈｅｌｉｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）であり、５７０ｎｍフィルター及び６３０ｎｍフィルターを用いて酵素活性を評価した。
【００７７】
（ＳＬＥに伴う臨床及び病理症状の検出）
Ｃｏｍｂｉｓｔｉｘキット（Ａｍｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｗｂｕｒｙ、Ｕ．Ｋ．）を用いてタンパク尿を半定量的に測定した。１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）酢酸含有蒸留水でヘパリン添加血液を１０倍希釈した後、白血球（ＷＢＣ、白血球減少のために）をカウントした。免疫組織学的解析のために、凍結した腎臓の切片（６μｍ）を固定し、マウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合ヤギ抗体（γ鎖特異的；Ｓｉｇｍａ）で染色した。
【００７８】
（ＥＬＩＳＡ）
抗ＤＮＡ抗体を測定するため、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）にメチル化ＢＳＡ又はポリＬ−リジン（Ｓｉｇｍａ）をコートした。次いで、これらのプレートを洗浄し、１０μｇ／ｍｌの変性子ウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）又はλ−ファージ二本鎖ＤＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、５μｇ／ｍｌ）をコートした。希釈度の異なる血清とともにインキュベートした後、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させた（γ鎖特異的）ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をこのプレートに添加し、次いで基質の２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（Ｓｉｇｍａ）を添加した。結果を、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて読んだ。
【００７９】
（ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９活性の測定）
ＭＭＰ活性をゼラチンザイモグラフィにより試験した。異なる実験グループの個々のマウスのプールした血清を、ゼラチン１ｍｇ／ｍｌと重合した８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。電気泳動後、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間ゲルを１回洗浄してＳＤＳを除去し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ2及び０．０２％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ  ３５（ｐＨ７．５）を含有する反応緩衝液で３０分間１回洗浄した。反応緩衝液を新しいものに変え、ゲルを３７℃で２４時間インキュベートした。０．５％クーマシーブリリアントブルーでゲルを染色して、ゼラチン融解活性（Ｇｅｌａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を可視化した。
【００８０】
（血清中のＭＭＰ−３のウェスタンブロット解析）
各血清の試料５μｌを１２％ＳＤＳ／ＰＡＧＥに乗せ、還元条件下で分離し、ニトロセルロースに写した。抗ＭＭＰ−３抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてこれらのブロットを精査し（０．５μｇ／ｍｌ、１時間、室温）、化学ルミネセンスにより表示させた。
【００８１】
（腎臓切片のＭＭＰ−３又はＭＭＰ−９の免疫染色）
ＭＭＰ−３又はＭＭＰ−９を免疫染色するため、腎臓切片（５μｍ）を冷アセトンで（室温で５分間）固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、（ＰＢＳで希釈した）０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で（室温で１分間）透過化処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ）し、ＰＢＳで２回洗浄した。抗ＭＭＰ染色を特異的に行ない、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスによる免疫複合体沈着物の染色を避けるために、（１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１：１に希釈した）未標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で腎臓切片を（室温で１時間）ブロックし、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳで３回洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈したモノクローナル抗ＭＭＰ−９（１：１００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）又は抗ＭＭＰ−３（１：５０；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）抗体を室温で３０分間にわたり添加した。免疫染色操作のすべてで、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで（室温で３０分間）１：３０に希釈したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。
【００８２】
（統計解析）
結果を平均±ＳＤで示す。カイ二乗、ウィルコクソン、マン−ホイットニー及びｔ検定を統計解析のために使用した。Ｐ≦０．０５を有意とみなした。
【００８３】
（実施例１）
ヒトペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３の合成
ヒトｈＣＤＲ１（配列番号１）及びｈＣＤＲ３（配列番号３）ペプチドを、当分野で周知の方法、例えば、基本的に既報（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂ．Ｇｕｔｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５；Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍ．Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ及びＢ．Ｄｕｎｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ  Ｍ．等、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｏｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｒａｐｉｄ，ｈｉｇｈ  ｙｉｅｌｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４０：１８０〜１９３、１９９２）のｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）又は他のアルファ−アミノ酸保護基を用いた操作に対する製造者の指示に従い、自動合成装置を用いた化学固相又は液相合成によって調製した。
【００８４】
（実施例２）
ｍＣＤＲ１及びｍＣＤＲ３で免疫しｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３で治療したマウスのリンパ節細胞（ＬＮＣ）増殖のインビボでの阻害
ヒトペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３の阻害効力を決定するために、本発明者らは、まず、ネズミペプチドｍＣＤＲ１及びｍＣＤＲ３を用いてマウスのインビボでの初回抗原刺激を阻害できるかどうかを試験した。
【００８５】
このために、ＢＡＬＢ／ｃ及びＳＪＬマウスをそれぞれｍＣＤＲ１及びｍＣＤＲ３で免疫した。ＣＦＡで希釈した免疫用ネズミペプチドを、後脚の足せき皮内に注射した（１０μｇ／マウス）。免疫と同時に、ＢＡＬＢ／ｃマウスグループにＰＢＳで希釈したｈＣＤＲ１  ２００μｇを皮下（ｓ．ｃ．）注射し、ＳＪＬマウスグループに同様にｈＣＤＲ３を注射した。免疫から１０日後に、マウスを屠殺し、そのリンパ節を収集し、その細胞が免疫用ペプチドで誘発された後に増殖できるかどうかを試験した。簡潔に述べると、様々な濃度（１〜２０μｇ／ウェル）のネズミ免疫用ペプチドの存在下、１％正常マウス血清を補充した強化ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、免疫したマウスのＬＮＣ（０．５×１０6／ウェル）を培養した（ｎ＝３）。４日間インキュベーションした後、さらに１６時間3Ｈチミジンを添加した。次いで、細胞を収集し、βカウンタを用いて放射能を計測した。
【００８６】
表１Ａ及び１Ｂの結果は、それぞれｍＣＤＲ１及びｍＣＤＲ３で免疫しｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３で治療したマウスのＬＮＣの増殖の最大阻害％を示している。この阻害値は、阻害ペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３で治療しなかったマウスのＬＮＣの増殖をもとに計算した。ｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３は、免疫ネズミＣＤＲペプチドに対する増殖性応答を阻害できることがわかる。
【００８７】
【表１Ａ】
2005505493.tif 000012
【００８８】
【表１Ｂ】
2005505493.tif 000013
【００８９】
（実施例３）
ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫しｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３で治療したマウスのＬＮＣ増殖のインビボでの阻害
本発明者らの目的はヒト１６／６Ｉｄ自己抗体のＣＤＲに基づくペプチドの阻害能力を試験することであるので、ペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３が、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの分子全体に対する初回抗原刺激を阻害できるかどうかを明らかにすることは重要である。このため、ＢＡＬＢ／ｃ及びＳＪＬマウスの後足の皮内に、ＣＦＡ中のヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ（２μｇ／マウス）で初回抗原刺激を与えた。初回抗原刺激は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのグループには、２００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１を、ＳＪＬマウスのグループには、２００μｇ／マウスのｈＣＤＲ３を、ＰＢＳで希釈して皮下（ｓ．ｃ．）投与するのと同時に行なった。免疫から１０日後にマウスを屠殺し、そのＬＮＣが様々な濃度（０．１〜１０μｇ／ウェル）のヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対して増殖できるかどうかをインビトロで試験した。
【００９０】
これらの実験の代表的な結果を表２Ａ及び２Ｂに示す。１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫しペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３で治療しなかったマウスと比較して、同様に免疫しペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３で治療したマウスのリンパ節細胞の免疫ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対する最大増殖阻害％としてこれらの結果を示す。表に示すように、ｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３の両方のペプチドは、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対する初回抗原刺激を効率的に阻害することができた。
【００９１】
【表２Ａ】
2005505493.tif 000014
【００９２】
【表２Ｂ】
2005505493.tif 000015
【００９３】
わずか１０μｇ／マウス、さらには２μｇ／マウスのペプチドｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３でさえも、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂでの免疫と同時に経鼻投与すると、免疫抗体に対するリンパ節細胞の増殖性応答を最大１００％阻害することがその後の実験で示された。
【００９４】
別の実験では、ＣＦＡ中のヒト１６／６Ｉｄ  １μｇを後足の皮下に投与してＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫し、ＰＢＳで希釈した３００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１を皮下（ｓ．ｃ．）注射するか、あるいはそれ以上治療しなかった。１０日後、マウスを屠殺し、そのＬＮＣがヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対して増殖できるかどうかをインビトロで試験した。すなわち、膝かのＬＮＣ（０．５×１０6）を様々な濃度（０．１〜１０μｇ／ウェル）のヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの存在下でインキュベートした。４日間のインキュベートの最後に3Ｈ−チミジンを培養物に添加し、最後に１８時間インキュベートした。次いで、細胞を回収し放射能を計測した。
【００９５】
図１は、このような実験の結果を示し、治療したマウスのリンパ節細胞の増殖性応答をｈＣＤＲ１が効率的に阻害したことを示している。様々な濃度の１６／６Ｉｄ  ｍＡｂでの増殖阻害％は以下の通りである：０．１μｇ／ウェル−４７％；１μｇ／ウェル−６６％；５μｇ／ウェル−７６％；及び１０μｇ／ウェル−６２％。
【００９６】
上記と同じ実験をＰＢＳ希釈の５０μｇ  ｈＣＤＲ１／マウスで繰り返した。図２は、ｈＣＤＲ１が抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ巨大分子全体によるマウスのインビボでの初回抗原刺激を阻害するのに極めて有効であり、わずか５０μｇのｈＣＤＲ１の皮下（ｓ．ｃ．）注射でも１６／６Ｉｄ自己抗体に対するリンパ節細胞の増殖能力を有意に阻害することを示している。１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの様々な濃度における増殖阻害％は、以下のとおりであった：０．１μｇ／ウェル−９８％；１μｇ／ウェル−７６％；５μｇ／ウェル−７３％；及び１０μｇ／ウェル−６４％。
【００９７】
（実施例４）
ペプチドｈＣＤＲ１は、サイトカインの産生を免疫調節する。
実施例３のｈＣＤＲ１  ５０μｇで治療したＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節細胞を、サイトカインを産生するために、同様にヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで刺激し、その上清をサイトカイン（ＩＮＦ−γ、ＴＧＦ−β及び１Ｌ−１０）分泌に関してＥＬＩＳＡにより評価した。
【００９８】
図３に代表的な実験の結果を示す。ｈＣＤＲ１がＩＮＦ−γの産生をダウンレギュレートし（図３Ａ）、ＴＧＦ−β（図３Ｂ）及びＩＬ−１０（図３Ｃ）の分泌をアップレギュレートすることがわかった。対照として用いたペプチド（無効性（ｍｙａｓｔｈｅｎｏｇｅｎｉｃ）ペプチドであることが判明したｐ２５９−２７１）は、ＩＮＦ−γ及びＩＬ−１０の産生に有意には影響せず、ＴＧＦ−βをアップレギュレートするにはあまり有効でないことに注目されたい。
【００９９】
（実施例５）
ペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３は、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対するＳＬＥ患者のＰＢＬの増殖性応答を阻害する。
ＳＬＥに罹った男性９人（１４．５％）及び女性５３人（８５．５％）の６２人の患者が本発明者らの試験に参加した。診断時の平均年齢は３２．９５±１２．９２（範囲１２〜６１）歳であり、平均経過観察期間は１０．９８±１０．７６（範囲１〜３２）年であった。すべての患者が、アメリカリウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（ＡＣＲ）改訂のＳＬＥの診断基準（Ｔａｎ等、１９８２）のうち少なくとも４つを満たした。患者を３カ所のイスラエル医療センター（Ｉｓｒａｅｌｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒｓ）（Ｋａｐｌａｎ、Ｒｅｈｏｖｏｔ；Ｉｃｈｉｌｏｖ、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ；Ａｓａｆ  Ｈａｒｏｆｅｈ、Ｒｉｓｈｏｎ  Ｌｅｚｉｏｎ）から募集した。ＳＬＥＤＡＩループス活動性指数（ｌｕｐｕｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）（Ｂｏｍｂａｒｄｉｅｒ等、１９９２）に従って疾患活動性を決定した。性及び年齢が同じ３６人の健常な対照ボランティアの対照グループをＳＬＥ患者と同時に試験した。試験は、医療センター倫理委員会（Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって承認されたものであった。
【０１００】
ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂのＣＤＲ１及びＣＤＲ３に基づくペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３が、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対するＳＬＥ患者に特異的なＰＢＬの増殖性応答を阻害できるかどうか検討することは重要である。このため、本発明者らは、最初に、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂでＰＢＬが刺激され増殖し得る患者（応答者）を確認しなければならなかった。
【０１０１】
そのため、６２人の続発性ＳＬＥ患者のＰＢＬをヒト１６／６Ｉｄの存在下で培養し、それらの増殖性応答及びＩＬ−２分泌能力を測定した。試験したＳＬＥ患者の全６２人のうち２４人のＰＢＬ（３９％）及び５５人のうち２３人のＰＢＬ（４２％）がそれぞれ増殖（ＳＩ≧２、範囲２〜５．６）及びＩＬ−２分泌（ＳＩ≧２、範囲２〜６０）に応答性であった。ＳＬＥ患者グループにおける応答者の度数は、対照として試験した健常ドナーのグループにおいて観測された度数よりも低かった。すなわち、健常ドナー全３６人のうち２１人のＰＢＬ（５８％）が１６／６Ｉｄに対する増殖に応答性であった。増殖の程度（ＳＩレベル）は１６／６Ｉｄに応答したＳＬＥ患者及び対照健常者でほぼ同じであった。しかし、図４に示すように、対照ドナーのＰＢＬの１６／６Ｉｄに対する最適応答は、ＳＬＥ患者よりも高い１６／６Ｉｄ濃度で観測された。
【０１０２】
１６／６Ｉｄに応答したＳＬＥ患者と応答しなかった患者グループとの性別及び年齢による違いを示すことはできなかった。しかし、１６／６Ｉｄに応答してＰＢＬが増殖した患者の疾患期間はより短かった（応答者及び非応答者それぞれ平均９．７８±８．３６及び１１．７３±１２．０６年；Ｐ≦０．０３６）。表３に、ＳＬＥ患者の１６／６Ｉｄ応答者及び非応答者グループの臨床特性を要約した。この表からわかるように、ＳＬＥに関係する臨床症状のほとんどは、両方のグループでほぼ同じであった。ＳＬＥ疾患活動性スコア（ＳＬＥ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）（ＳＬＥＤＡＩ）及びＳＬＥ診断基準数も、２つのグループでほぼ同じであった。しかし、非応答者グループよりも応答患者グループで、神経関連疾患（発作及び精神病）及び血液的関連疾患の頻度が高く、腎臓関連疾患の頻度が低かったことは注目される。しかし、おそらく関連するサブグループの患者数が少ないことから、上記の相違は統計的有意には至らなかった。また、試験時にステロイド又は細胞毒性薬剤のいずれかで治療を受けた患者の中で応答患者は比較的少なかった。非応答者グループに比べ、ステロイドを服用しなかったかなり多くの患者が１６／６Ｉｄに応答した（５４％対２１％；Ｐ＝０．０２３）ことは注目に値する。
【０１０３】
１６／６Ｉｄに対する健常ドナーのＰＢＬの増殖性応答を阻害するＣＤＲに基づくペプチドの効力は、ＳＬＥ患者のＰＢＬで観測される効力よりも極めて低いことは注目に値する（データ示さず）。
【０１０４】
【表３】
2005505493.tif 000016
【０１０５】
＊ＡＣＲ改訂基準に従って臨床的関連を定義した。抗核抗体（ＡＮＡ）及び抗ｄｓＤＮＡ抗体を、それぞれＨｅｐ２細胞及びクリシジアルシラエ（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ  ｌｕｃｉｌｉａｅ）により測定した。抗リン脂質抗体（ＡＰＬＡ）を、１種又は複数の以下のアッセイにおける反応性で定義した：偽陽性ＶＤＲＬ、ループス抗凝固物質（ＬＡＣ）又は抗カルジオリピン抗体のＥＬＩＳＡ。
†抗マラリア薬のヒドロキシクロロキンを２００〜４００ｍｇ／日の投与量で使用した；１日当たり５ｍｇ以上のプレドニゾンの服用をステロイド治療と定義した；使用した細胞毒性薬剤はシクロホスファミド（０．７５〜１．０ｇ／ｍ2；月）又はアザチオプリン（１００〜１５０ｍｇ／日）であった。
‡応答者及び非応答者の２つのＳＬＥ患者グループ間で差異が観測される傾向にあったパラメータ。
【０１０６】
ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対するＳＬＥ患者のＰＢＬの増殖性応答をペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３が阻害できるかどうかを試験するために、ペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３（５０又は１００μｇ／ウェル）の非存在下又は存在下で、ＳＬＥ患者のＰＢＬ（２×１０5／ウェル）を様々な濃度（０．１〜２０μｇ／ウェル）のヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂでインビトロで刺激した（ｎ＝３）。６日間インキュベーションした後、3Ｈ−チミジン（５Ｃｉ／ｍｍｏｌの０．５μＣｉ）を各ウェルに添加してさらに１８時間インキュベーションした。次いで、細胞を収集し放射能をβカウンタで計測した。結果を、培養物（ｎ＝３）の１分当たりの平均カウント数（ｃｐｍ）で表した。次いで、刺激指数（最適濃度の１６／６Ｉｄにおける平均ｃｐｍと１６／６Ｉｄがない場合の平均ｃｐｍとの比）を計算した。２以上の刺激指数（ＳＩ）を陽性とみなした。
【０１０７】
全６２人のＳＬＥ患者のうち２４人のＰＢＬ（３９％）が、１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対して増殖することが判明した。１６／６Ｉｄ自己抗体の全分子に対するペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３の増殖性応答阻害能力を、１９人のＳＬＥ患者の応答者のＰＢＬについて試験した。
【０１０８】
表４にこれらの実験の結果を示す。５０％を超える増殖能力の阻害を陽性とみなした。この表は各ペプチドの最高陽性阻害能力を示す。ヒトｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３は、試験した１９人の応答者のうちそれぞれ１６／１９（８４．２％）及び１５／１９（７８．９％）のＰＢＬの増殖を阻害することがわかった。両方のペプチドは、試験した応答者の１８／１９（９５％）のＰＢＬの増殖を阻害した。この表から、阻害の程度が両方のペプチドでほぼ同じであることもわかる。したがって、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂのＣＤＲ１及びＣＤＲ３に基づくペプチドは、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対するＳＬＥ患者のＰＢＬ増殖に対して有効な阻害剤であると結論付けることができる。
【０１０９】
【表４】
2005505493.tif 000017
【０１１０】
（実施例６）
ｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３の阻害能力の特異性
ｈＣＤＲに基づくペプチドの阻害効果がＳＬＥに伴う応答に特異的であることを証明することは重要である。このため、分裂促進因子フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、２μｇ／ｍｌ）で刺激したＳＬＥ患者のＰＢＬ培養物に、ペプチドｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３を添加した。１人のＳＬＥ患者のＰＢＬで実施したそのような実験の結果を図５に示す。ペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３は、分裂促進因子ＰＨＡに対するＰＢＬの（ｃｐｍで表される）増殖性応答を阻害できず、増殖性応答は、ｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３の非存在下（黒いカラム）でも存在下でも同様に高かった。
【０１１１】
別の実験では、ＳＬＥ患者のＰＢＬ培養物をヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで刺激し、次いでヒトペプチドｈＣＤＲ１若しくはｈＣＤＲ３又は対照のネズミペプチドｍＣＤＲ３とともにインキュベートした。１人のＳＬＥ患者のＰＢＬで実施したそのような実験の結果を図６に示す。図６に見られるように、ヒト自己抗体に基づくペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３は、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂのＰＢＬの増殖性応答を効率的に阻害したが、ネズミ抗体のＣＤＲ３に基づくペプチドｍＣＤＲ３は増殖を阻害しなかった。
【０１１２】
２つの別の対照ペプチド、すなわちネズミｍＣＤＲ１及びｍＣＤＲ３ペプチドを逆の順序で合成したペプチド（ｒｅｖｍＣＤＲ１及びｒｅｖｍＣＤＲ３）をこれらの実験で使用した。結果を図７に示す。この２つの逆ペプチドは、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対するＳＬＥ患者のＰＢＬの増殖性応答を有意に阻害できず、一方、ペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３は増殖を効率的に阻害したことがわかる。このことは、ヒトｈＣＤＲに基づくペプチドによる増殖阻害が、これらのペプチド及びＳＬＥに伴うＴ細胞応答に特異的であることを示している。
【０１１３】
（実施例７）
ペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３の存在下におけるＳＬＥ患者のＰＢＬによるＩＬ−２分泌のダウンレギュレーション
ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで刺激した後にｈＣＤＲペプチドがＳＬＥ患者のＰＢＬによるＩＬ−２分泌を阻害できるかどうかを明らかにすることは重要である。このような阻害は、ヒトＣＤＲに基づくペプチドがＩＬ−２の分泌をダウンレギュレートすることによって１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対する増殖性応答を少なくとも部分的に阻害することも示唆することができる。このため、ペプチドｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３の非存在下又は存在下、ＳＬＥ患者のＰＢＬをヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂとともにインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、培養物の上清を収集した。上清中のＩＬ−２レベルを測定するアッセイを、ＣＴＬＬ  ＩＬ−２に依存する系を用いて実施した。簡潔に述べると、ＣＴＬＬ系の細胞（２×ｌ０4／ウェル）を種々の上清の存在下で２４時間インキュベートし、その後3Ｈ−チミジンを添加してさらに１８時間インキュベーションした。次いで、細胞を回収しβカウンタで放射能を計測した。基準として用いた組換えヒトＩＬ−２に基づいて結果を計算した。これらのペプチドが、ヒト１６／６Ｉｄで刺激した２３人の応答者のＰＢＬのＩＬ−２分泌を阻害できるかどうか試験した。表５に要約した結果は、ｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３が、それぞれ２１／２３及び１９／２３人の患者で、ＰＢＬによるＩＬ−２の分泌を阻害したことを示している。ＰＢＬの増殖性応答の阻害は、ＣＤＲに基づくペプチドによるＩＬ−２の阻害と直接相関する。したがって、ＩＬ−２分泌の阻害は増殖が阻害されるすべての場合で観測される。
【０１１４】
図８に示す１人のＳＬＥ患者のＰＢＬで得られた結果（ＩＬ−２の分泌をｐｇ／ｍｌで示す）は、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂによって誘発したＳＬＥ患者のＰＢＬによるＩＬ−２分泌を、ｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３共に１００％阻害したことを示している。
【０１１５】
【表５】
2005505493.tif 000018
【０１１６】
（実施例８）
ＣＤＲに基づくペプチドによる免疫抑制サイトカインＴＧＦ−βの分泌のアップレギュレーション
ヒトＣＤＲに基づくペプチドがヒトモノクローナル抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ抗体に対する増殖性応答を阻害する機序を明らかにするために、細胞培養物上清中の免疫抑制サイトカインＴＧＦ−βのレベルを測定した。これらの実験の背後にある論理的根拠は、マウスＣＤＲに基づくペプチドで治療した後に、ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで誘発されてＳＬＥに罹患したマウス又は自発的にＳＬＥに罹患したマウス｛（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス｝では、その細胞培養物中におけるＴＧＦ−βレベルが上昇するという本発明者らの以前の知見（Ｅｉｌａｔ等、２００１）に基づいている。ＴＧＦ−βレベルの上昇は、治療を受けたマウスにおける疾患症状の寛解と相関した。
【０１１７】
このため、ペプチドｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３の非存在下又は存在下でヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂとともに４８時間インキュベーションした後、様々なＳＬＥ患者のＰＢＬ培養物から上清を採取した。ＥＬＩＳＡにより製造者の指示に従ってＴＧＦ−βを測定した。簡潔に述べると、ＰＢＳで希釈した組換えヒトＴＧＦβｓＲＩＩ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１００ｎｇ／ｍｌ）をＭａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ）にコートした。ブロッキング後、細胞上清を添加した。１８時間インキュベーションした後、検出用にビオチン標識した抗ヒトＴＧＦ−β抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。使用した基質溶液はＴＭＢ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｈｅｌｉｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）であり、５７０ｎｍ及び６３０ｎｍフィルターを用いたＭＲＸ  ＥＬＩＳＡリーダーで酵素活性を評価した。結果を表６に要約する。
【０１１８】
図９の結果は、ペプチドｈＣＤＲ１及びｈＣＤＲ３が、病原性ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで刺激した１人の代表的なＳＬＥ患者のＰＢＬにより、ＴＧＦ−β分泌（ｐｇ／ｍｌで表す）において有意なアップレギュレーションを誘発させたことを示す。
【０１１９】
【表６】
2005505493.tif 000019
【０１２０】
（実施例９）
ｈＣＤＲ１によるマウスのＳＬＥ症状の免疫調節：（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスのｈＣＤＲ１による治療後の疾患症状の寛解
上述したように、ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂのＣＤＲに基づく各ペプチドは、同じような有効率で、１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対するリンパ節細胞の初回抗原刺激及び１６／６Ｉｄ  ｍＡｂに対するＳＬＥ患者のＰＢＬの増殖性応答を阻害することができた。したがって、これらのペプチドが、動物モデルにおいてＳＬＥ様疾患を免疫調節できるかどうかを明らかにすることは重要である。
【０１２１】
ヒトペプチドの慢性ＳＬＥ疾患治療能力を明らかにすることを目的とした実験をまずｈＣＤＲ１ペプチドで実施した。このため、ＳＬＥ易罹患性（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスを（抗ｄｓＤＮＡ、タンパク尿などの）ＳＬＥ様疾患の徴候がすでに観察されている５．５カ月齢でｈＣＤＲ１ペプチドにより治療する数通りの実験を組んだ。ＰＢＳで希釈したｈＣＤＲ１ペプチドを１０週間毎週皮下（ｓ．ｃ．）投与した。異なる投与量（５０、１００及び２００μｇ／マウス）でのｈＣＤＲ１ペプチドの効能を試験した。対照グループには分散媒であるＰＢＳを注射した。この治療によって、抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の力価が中程度減少した。すなわち、治療の最後において、ＰＢＳで治療したマウス、５０μｇ／マウス、１００μｇ／マウス及び２００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１で治療したマウスの各血清は、１：１２５０の血清希釈でのＯ．Ｄ．値がそれぞれ０．５８６±０．１、０．２７±０．１、０．３７±０．１及び０．２９±０．１であった。
【０１２２】
本発明者らは、ＰＢＳで希釈した３００μｇのｈＣＤＲ１を７カ月齢の（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスに１０週間毎週皮下（ｓ．ｃ．）注射して治療する別の実験も実施した。ｈＣＤＲ１で治療したマウスの血清では、抗ＤＮＡ抗体の力価について軽度の減少が見られた。それにも拘らず、表７は、ｈＣＤＲ１による治療によって、治療したマウスのタンパク尿が減少し腎臓中の免疫複合体沈着物（ＩＣＤ）が有意に減少したことを示す。この表の結果はＩＣＤの強度で表しており、０＝ＩＣＤ、１＝中程度のＩＣＤ、２＝重度のＩＣＤ、３＝重度かつ極めて激しいＩＣＤである。
【０１２３】
【表７】
2005505493.tif 000020
【０１２４】
次いで、本発明者らは、ペプチドｈＣＤＲ１の投与量を増加させることでより有益な効果が得られるかどうかを明らかにするため、４００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１を用いて追加の実験を実施した。４００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１での治療は、表８に見られるように、抗ＤＮＡ抗体力価に対してより大きな効果をもたらすことはなく、腎臓疾患に対する効果は３００μｇの投与量での治療後に観察される効果とほぼ同じであった。
【０１２５】
【表８】
2005505493.tif 000021
【０１２６】
したがって、本発明者らは、マウスを７カ月齢で３００μｇのｈＣＤＲ１により治療する追加実験を実施し、対照ペプチド、すなわち逆ｈＣＤＲ１を用いた。この実験の目的は、臨床症状の寛解に加えて、ｈＣＤＲ１での治療がサイトカイン産生を免疫調節するかどうかを明らかにすることであった。図１０は、抗ＤＮＡ自己抗体レベルが軽度に減少することを示している。表９に、様々な時間で測定したタンパク尿を示す。
【０１２７】
【表９】
2005505493.tif 000022
【０１２８】
ｈＣＤＲ１の治療効果はすべての測定で見られる。腎臓への損傷は、（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスにおけるＳＬＥ様疾患の主要な症状の一つである。ｈＣＤＲ１ペプチドで１０週間治療すると、腎臓疾患が有意に軽減する。腎臓疾患の治療では、５０μｇの投与量は、１００及び２００μｇの投与量よりも効果が小さい。後者の２つの投与量の効果はほぼ同じである。
【０１２９】
図１１Ａ〜１１Ｄは、投与量１００μｇのｈＣＤＲ１で治療したマウスの代表的な腎臓切片を示す写真である。すなわち、９カ月齢のマウスを屠殺し、それらの腎臓を取り出し、すぐに液体窒素で凍結させた。５μｍの凍結クリオスタット切片を空気乾燥し、アセトン固定した。Ｉｇ沈着物を検出するため、（γ鎖特異的）ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧとともに切片をインキュベートした。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＰＢＳで治療したグループのマウスの腎臓切片（対照）、図１１Ｃ及び１１Ｄは１００μｇのｈＣＤＲ１で治療したマウスの腎臓切片である。図から治療によって免疫複合体の数及び強度が低下したことがわかる（１１Ａ、１１Ｃ×１００；１１Ｂ、１１Ｄ×４００）。
【０１３０】
（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスのグループを、疾患の進行がすでに観察された７カ月齢においてｈＣＤＲ１で治療した場合にも同様の結果が得られた。マウスを１００μｇ／マウス又は３００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１で１０週間治療した。両方の投与量による治療は、上述の結果と同様に、抗ＤＮＡ自己抗体力価を中程度減少させた。同様に、タンパク尿もＰＢＳで治療したグループよりも減少した。両方の投与量で治療後に腎臓疾患が寛解したが、３００μｇの投与量で治療したマウスのグループでより有意な効果が見られた。図１２Ａ〜１２Ｆは、各グループの代表的なマウスの腎臓切片であり、Ａ、Ｂは未治療マウス、Ｃ、ＤはｈＣＤＲ１治療マウスの腎臓、Ｅ、Ｆは逆ｈＣＤＲ１治療マウスの腎臓切片である。Ａ、Ｃ、Ｅの倍率は１００倍、Ｂ、Ｄ、Ｆの倍率は４００倍である。
【０１３１】
図１３Ａ〜１３Ｃは、３グループのマウスの（１０週の皮下（ｓ．ｃ．）注射）治療の最後に採取した脾臓細胞のＣｏｎ  Ａ刺激培養物の上清をＥＬＩＳＡで測定したサイトカイン（ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β）のパターンである。治療したマウスのＩＮＦ−γ（図１３Ａ）及びＩＬ−１０（図１３Ｂ、より軽度に）がダウンレギュレートされたことがわかる。刺激していない細胞の上清ではＴＧＦ−βの分泌に増加が見られた（図１３Ｃ、左）。Ｃｏｎ  Ａは、細胞を誘発せず、より多くのＴＧＦ−βを分泌させることはなかった（図１３Ｃ、右）。
【０１３２】
上で要約した結果は、ｈＣＤＲ１による長期治療が疾患症状を寛解させ、サイトカインの分泌を免疫調節することを示している。
【０１３３】
（実施例１０）
実験的なＳＬＥ誘導後のヒトｈＣＤＲ１ペプチドによるＢＡＬＢ／ｃマウスの治療
ｈＣＤＲ１ペプチドが、ヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂによって誘導されたマウスの実験的なＳＬＥを治療できるかどうかを明らかにすることは重要である。そのため、ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１６／６Ｉｄ病原性自己抗体で免疫及び追加免疫した。追加免疫注射から３．５カ月後、マウスが疾患症状をすでに発しているときに、マウスを３つのグループに分けた。第１のグループは未治療のもので、第２のグループは１００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１で治療したもの、第３のグループは１０週間３００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１ペプチドで治療したものであった。これらのマウスの疾患症状を追跡した。
【０１３４】
表１０は、治療の最後に個々のマウスを試験して得られた結果である。測定したすべての臨床症状［抗ｄｓＤＮＡ自己抗体、白血球数（ＷＢＣ）及び尿タンパク］で、治療に使用した両方の投与量による寛解が認められた。実験の最後（追加免疫注射から７カ月後）に屠殺したマウスの腎臓の分析から、１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫し治療しなかったマウスの９／１０の腎臓で免疫複合体沈着物が見られた。これとは対照的に、１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫し１００μｇ／マウス及び３００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１で治療したマウスのそれぞれわずか３／１０及び２／９の腎臓でしか免疫複合体沈着物は観測されなかった。したがって、ヒトペプチドｈＣＤＲ１は、慢性の実験的なＳＬＥを治療できることがわかる。
【０１３５】
【表１０】
2005505493.tif 000023
【０１３６】
別の実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスをヒト１６／６Ｉｄで免疫及び追加免疫して実験的なＳＬＥを誘発させた。追加免疫から２カ月後に、マウスを複数のグループ（１グループ当たり８匹のマウス）に分けた。２００、３００又は４００μｇ／マウスで１０週間マウスを治療した。マウスの抗体産生、白血球減少、タンパク尿を追跡し、治療終了から２カ月後に屠殺し、腎臓の免疫複合体沈着物を分析した。表１１に要約した結果から、１６／６Ｉｄ特異的抗体応答に対して治療効果がないことがわかる。
【０１３７】
【表１１】
2005505493.tif 000024
【０１３８】
しかし、治療は、抗ＤＮＡ抗体力価、白血球減少、タンパク尿レベル、及びより重要なことには腎臓の免疫複合体沈着物に影響を及ぼした。実験の対照グループは、全く免疫又は治療しなかった同年齢のＢＡＬＢ／ｃマウスである。この実験から、ｈＣＤＲ１が実験的なＳＬＥの治療に有効であり、４００μｇ投与に利点のないことが示唆された。
【０１３９】
したがって、２００及び３００μｇ／マウスでマウスを治療する追加の実験を実施した。この実験では、対照ペプチドに逆ｈＣＤＲ１を使用した。この実験の目的は、２００μｇと３００μｇの治療用量の比較に加え、治療したマウスのサイトカイン産生に対する治療効果を検討することであった。６０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを１６／６Ｉｄで免疫及び追加免疫した。追加免疫から３カ月後に、マウスをそれ以上治療しないグループと２００又は３００μｇのｈＣＤＲ１で毎週治療するグループ（１グループ当たり１５匹のマウス）に分けた。別のグループを３００μｇの逆ｈＣＤＲ１で治療した。第５の（対照）グループは免疫もそれ以上の治療もしなかった。マウスの抗体産生及び疾患症状を追跡した。表１２に見られるように、マウス血清中の（１：１００００希釈での）抗１６／６Ｉｄ抗体レベルは各グループの間で違いがなかった。２００及び３００μｇの両方の治療で表１２に見られるように抗ＤＮＡ抗体レベルが減少した（血清を１：１２５０に希釈した）。異なるグループのマウスの臨床症状も表１２に要約する。これら両方の投与量は白血球減少及びタンパク尿を減少させるのに有効であったが、この実験において２００μｇの投与量による効果は有意でなかったことがわかる（治療終了から１カ月後にマウスを屠殺した）。
【０１４０】
【表１２】
2005505493.tif 000025
【０１４１】
図１４Ａ〜Ｆは、各グループの一の腎臓を表し、Ａ、Ｂは未治療マウス、Ｃ、ＤはｈＣＤＲ１治療マウスの腎臓、Ｅ、Ｆは逆ｈＣＤＲ１治療マウスの腎臓切片である。写真Ａ、Ｃ、Ｅの倍率は１００倍、写真Ｂ、Ｄ、Ｆの倍率は４００倍である。
【０１４２】
図１５Ａ〜Ｅに、治療したマウスの１６／６Ｉｄで刺激したリンパ節培養物の上清中にある種々のサイトカインのレベルを示す。治療の最後（１０回の治療の注射後）に後者の試験を実施した。（両方の投与量の）ｈＣＤＲ１での治療によりＩＮＦ−γ（図１５Ａ）、ＩＬ−１０（図１５Ｃ）及びＴＮＦ−α（図１５Ｂ）がダウンレギュレートとされることがわかる。一方、ｈＣＤＲ１はＴＧＦ−βレベルをアップレギュレートした。通常、脾臓細胞はリンパ節細胞よりも多量のＴＧＦ−βを分泌するので（図１５Ｄ）、１６／６Ｉｄで誘発された異なるグループのマウス脾臓細胞の上清中のＴＧＦ−βも測定した（図１５Ｅ）。
【０１４３】
このように、ｈＣＤＲ１は疾患症状を寛解し、誘発された実験的なＳＬＥに罹患したマウスのサイトカイン産生を免疫調節する。
【０１４４】
（実施例１１）
ｈＣＤＲ１で治療したマウスの脾臓細胞を用いた、ループスの症状に対する薬効の導入
疾患症状のダウンレギュレーションによって現れるｈＣＤＲ１の治療上の薬効が、治療したマウスの脾臓細胞を用いて導入することができるかどうかを検討することは重要である。このため、本発明者らは、進行したループス様疾患にすでに罹っている８カ月齢の（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスを２つのグループに分けて実験を行なった。第一のグループは未治療のマウスであり、第二のグループのマウスには、３００μｇ／マウスのｈＣＤＲ１を３回（皮下（ｓ．ｃ．）、１日おきに）注射した３カ月齢（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの２０×１０6個の脾臓細胞を導入した。脾臓細胞をすべて腹腔内に注射した。マウスを抗ｄｓＤＮＡ自己抗体産生及び疾患症状について試験し、細胞導入から４週後に屠殺した。ｈＣＤＲ１で治療したマウスの細胞を導入すると抗ＤＮＡ抗体レベルが軽度の減少を示した。
【０１４５】
表１３は、ｈＣＤＲ１で治療したマウスの脾臓細胞の導入によりタンパク尿が有意に減少し、腎臓の免疫複合体が減少したことを示している。
【０１４６】
【表１３】
2005505493.tif 000026
【０１４７】
ｒｅｖｈＣＤＲ１を対照として用いて実験をさらに数回繰り返した。結果は始めの実験とほぼ同じであり、治療したマウスの細胞を導入すると、抗ＤＮＡ抗体力価がわずかに影響を受け、タンパク尿及び腎臓損傷が有意な影響を受けた。代表的な実験の臨床症状を表１４に示す。
【０１４８】
【表１４】
2005505493.tif 000027
【０１４９】
ｈＣＤＲ１による治療のダウンレギュレート効果は、治療したマウスの脾臓細胞を用いて導入できることがわかる。
【０１５０】
図１６Ａ〜Ｆは、グループ１（Ａ、Ｂ−未治療マウス）、グループ２（Ｃ、Ｄ−ｈＣＤＲ１で治療した２カ月齢マウスの脾臓細胞のレシピエント）及びグループ３（Ｅ、Ｆ−ｒｅｖｈＣＤＲ１で治療した２カ月齢マウスの脾臓細胞のレシピエント）のマウスの腎臓切片である。Ａ、Ｃ、Ｅの倍率は４００倍、Ｂ、Ｄ、Ｆの倍率は１００倍である。
【０１５１】
上記実験結果は、疾患症状に対するｈＣＤＲ１の寛解効果がｈＣＤＲ１で治療した健常マウスの免疫細胞を用いて導入できることを示している。
【０１５２】
（実施例１２）
ネズミｍＣＤＲペプチドによるＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９のダウンレギュレーション
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（Ｓｈｉｎｇｌｅｔｏｎ等、１９９６；Ｇｏｅｔｚｌ等、１９９６；Ｍａｓｓｏｖａ等、１９９８）は、正常組織の細胞外マトリックスのリモデリングに重要な役割を果たす一群の亜鉛含有エンドプロテアーゼを構成し、病状過程にも寄与する。これらは同じ構造領域を共有するが、基質特異性、細胞源及び誘導能が異なる。
【０１５３】
ＭＭＰはチモーゲン様の潜在性前駆体として合成され、続いて活性な形に転化される。ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９は共にゼラチナーゼであり、ＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン、Ｖ型、ＶＩＩ型、Ｘ型及びＸＩＩ型コラーゲン、ビトロネクチン、アグリカン、ガレクチン−３及びエラスチンを分解することができる。ＭＭＰ−２は最も広範に発現されるＭＭＰである。ＭＭＰ−２は様々な細胞によって産生され、悪性腫瘍が転移する際に増加することが多い。
【０１５４】
タンパク質及び領域の構造の点で、ＭＭＰ−９はこれまで同定されている中で最も大きく最も複雑なメンバーである。ＭＭＰ−９の発現は、遺伝子転写及びタンパク質の分泌（サイトカイン、ケモカイン、エイコサノイド）、炎症伝達物質及びメタロプロテイナーゼ組織インヒビター（ＴＩＭＰ）の作用の各レベルで厳密に制御された複雑な調節を特徴としている。また、ＭＭＰ−９活性は、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９の活性化、プラスミノーゲン活性化系の成分又は他のＭＭＰによって調節される（Ｇｕｅｄｅｚ等、１９９６）。
【０１５５】
自己免疫疾患にＭＭＰが関与することは、多発性硬化症（Ｏｚｅｎｃｉ等、１９９９）及びその動物モデルの実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（Ｇｉｊｂｅｌｓ等、１９９４）、リウマチ様関節炎（Ｋｅｙｓｚｅｒ等、１９９９）、ギラン−バレー症候群（Ｃｒｅａｎｇｅ等、１９９９）、実験的な水疱性類天疱瘡（Ｌｉｕ等、１９９８）並びに実験的な自己免疫神経炎（Ｈｕｇｈｅｓ等、１９９８）などの様々な自己免疫疾患で実証されている。ループス腎炎に罹った患者のＭＭＰ−３及びＴＩＭＰ−２の各血清中レベルは、対照健常者のそれらよりもかなり高いことが報告されているが、疾患活動性との相関は述べられていなかった（Ｚｕｃｋｅｒ，１９９９；Ｋｅｙｓｚｅｒ等、１９９９）。
【０１５６】
炎症反応におけるＭＭＰの様々な作用は、いくつかの自己免疫疾患の動物モデルにおけるＭＭＰ阻害剤の阻害効果によって重要となり得ることが示唆されている。インビボでＭＭＰを特異的に阻害すると、浮腫、病理組織の増殖、並びにいくつかの炎症性疾患及び自己免疫疾患における特殊組織構造への損傷が抑制される（Ｇｉｊｂｅｌｓ等、１９９４；Ｗａｌｌａｃｅ等、１９９９；Ｃｏｎｗａｙ等、１９９５）。
【０１５７】
本発明者らは、本発明に従い、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルが、自発的に又は誘導されて実験的なＳＬＥに罹患したマウスの血清及び腎臓の両方で上昇することを示す。本発明者らは、マウスにおいてループスの症状を寛解させるＣＤＲに基づくネズミペプチドによるＳＬＥ罹患マウスの治療が、治療したマウスの血清及び腎臓中のＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルを低下させ、疾患症状の寛解ももたらすことも示す。本発明のヒトｈＣＤＲペプチドによっても同じ効果が得られることが期待される。
【０１５８】
（実施例１２（ｉ））
（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス血清中におけるＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発生の動態
本発明者らは（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスにおける自発的ＳＬＥの発生が、それらの血清中のＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９各レベルの変化を伴うかどうかをまず検討した。すなわち、本発明者らは、疾患症状が観察される前の２カ月齢から、進行した疾患にマウスが罹る８カ月齢までこれらの各レベルを追跡した。結果を図１７に示す。図１７Ａに見られるように、ウェスタンブロット法により検出される、２カ月齢マウスの血清におけるＭＭＰ−３の３４ｋｄ及び４０ｋｄの形態のものは極めて少ない。すべての形態の各レベルは、試験最終点である８カ月齢に向かって徐々に増加する。同様に、図１７Ｂは、ゲルザイモグラフィで評価したＭＭＰ−９活性が２カ月齢では低く、疾患の進行につれ８カ月齢までマウスの血清中で徐々に増加することを示している。ＭＭＰ２のレベルが、疾患の進行にかかわらずさほど変化しないことも図１７Ｂからわかる。
【０１５９】
（実施例１２（ｉｉ））
１６／６Ｉｄで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス血清中におけるＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発生の動態
本発明者らの研究室で得られた以前の結果から、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて１６／６Ｉｄでの免疫後にＳＬＥが誘発され得ることが示された（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ等、１９８８；Ｗａｉｓｍａｎ等、１９９３）。したがって、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の変化に関して、ＳＬＥ誘発モデルが（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１モデルに類似しているかどうかを試験することは重要である。したがって、本発明者らは、このＳＬＥ実験モデルにおけるＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルを観察した。図１８に示す結果は、ＭＭＰ−３（のすべてのアイソフォームの）各レベルが追加免疫（４．５週間の後免疫（ｐｏｓｔｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ））から１０日後に上昇し、免疫していない又はＣＦＡで免疫した同年齢の対照ＢＡＬＢ／ｃマウスのＭＭＰ−３各レベルよりも高かったことを示している（図１８Ａ）。しかし、ＭＭＰ−３各レベルはすべてのグループで加齢につれて増加し、１６／６Ｉｄで免疫したマウスのＭＭＰ−３各レベルは、対照グループのそれらよりも常に高かった。これとは対照的に、追加免疫から２カ月間、ＭＭＰ−９活性において誘発による変化は検出されなかった（図１８Ｂ）。追加免疫から約４カ月で、免疫していないマウスのそれよりも高いＭＭＰ−９活性を１６／６Ｉｄで免疫したマウスで観測した。
【０１６０】
（実施例１２（ｉｉｉ））
１６／６Ｉｄで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓切片中のＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の特異的アップレギュレーション
１６／６ＩｄによるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫は腎臓の損傷を含めてＳＬＥに特徴的な臨床症状をもたらし（Ｍｅｎｄｌｏｖｉｃ等、１９８８；Ｗａｉｓｍａｎ等、１９９３）、（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの腎臓の損傷はＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルの上昇を伴うと報告されているので（Ｎａｋａｍｕｒａ等、１９９３）、本発明者らは１６／６Ｉｄで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓におけるこれらの酵素の発現を観察した。対照として、ＣＦＡで免疫したマウス及び同年齢の免疫していないマウスを本発明者らは使用した。両方の対照グループには追加免疫時にＰＢＳを注射した。１６／６Ｉｄによる追加免疫から２カ月及び５カ月後、マウスの腎臓切片をＭＭＰ−３又はＭＭＰ−９について免疫染色した。図１９は、追加免疫から５カ月後に採取した腎臓の免疫組織である。図からわかるように、ＣＦＡによるマウスの免疫は、腎臓、糸球体及び周囲組織におけるＭＭＰ−３（１９Ａ）及びＭＭＰ−９（１９Ｂ）の両方の発現をアップレギュレートした。それにも拘らず、ＣＦＡ中の１６／６Ｉｄによる免疫は、これら２つのＭＭＰの発現レベルをさらに有意に上昇させた。この上昇は、１６／６Ｉｄによる追加免疫から２カ月後ですでに観察された（データ示さず）。染色の非特異的バックグラウンドレベルも示す（１９Ｃ）。
【０１６１】
（実施例１２（ｉｖ））
ネズミｍＣＤＲ１ペプチドは、（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの血清中のＭＭＰ−３レベル及びＭＭＰ−９活性をダウンレギュレートする。
本発明者らは、両方のＳＬＥ実験モデルでＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルが上昇することを示すことができたので、ｍＣＤＲ１ペプチドによる治療後に観察されるＳＬＥの臨床症状の寛解（Ｅｉｌａｔ等、２０００；Ｅｉｌａｔ等、２００１）が、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルの減少を伴うかどうかを検討することは重要である。そこで、本発明者らは、ＳＬＥ様疾患を自発的に発生する（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスを、２カ月齢で（臨床症状が観察される前に）、ＰＢＳで希釈したｍＣＤＲ１（２５０μｇ／マウス）を１０週間毎週皮下（ｓ．ｃ．）注射して治療した。この予防手順により、臨床症状がすべて寛解した（Ｅｉｌａｔ等、２０００）。図２０からわかるように、血清中のＭＭＰ−３の２本の低い方のバンド（２０Ａ）及びＭＭＰ−９活性（２０Ｂ）が減少する。この減少は臨床症状の緩和と関連している（Ｅｉｌａｔ等、２０００）。図２０Ａに見られるように、ＭＭＰ−３の４５ｋｄ体は影響を受けなかった。
【０１６２】
ｍＣＤＲ１ペプチドが、高い、ＭＭＰ−３レベル及びＭＭＰ−９活性をダウンレギュレートすることができるかどうかを明らかにすることも重要である。そこで、本発明者らは、疾患症状がすでに認められる時点でｍＣＤＲ１により治療した（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの血清中のＭＭＰ−３レベル及びＭＭＰ−９活性を観察した。対照ペプチドとして、本発明者らは逆ｍＣＤＲ１を使用した。（図２０、右に）示したように、ｒｅｖｍＣＤＲ１ではなくｍＣＤＲ１による疾患マウスの治療により、血清中のＭＭＰ−３レベル（２０Ａ）及びＭＭＰ−９活性（２０Ｂ）が特異的にダウンレギュレートされた。
【０１６３】
（実施例１２（ｖ））
ｍＣＤＲ１ペプチドは、１６／６Ｉｄで免疫したマウスの血清中のＭＭＰ−３レベル及びＭＭＰ−９活性をダウンレギュレートする。
本発明者らが示したように、ＭＭＰ−９の活性は、両方のＳＬＥ実験モデル［（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１及び１６／６Ｉｄ誘発］で増大した。ｍＣＤＲ１ペプチドは、両方のモデルにおいて疾患を寛解し、治療した（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの血清中のＭＭＰ−３レベル及びＭＭＰ−９活性をダウンレギュレートすることが判明したので、本発明者らは、さらに、１６／６Ｉｄで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のこれらの酵素に対する治療効果を検討した。図２１は、予防及び治療の実験結果である。この図から、ｍＣＤＲ１がこの実験モデルでもＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９をダウンレギュレートできることがわかる。ＭＭＰ−３レベル及びＭＭＰ−９活性のダウンレギュレーションは、予防及び治療の両方の手順で観察された。したがって、疾患が誘発される段階で、又は疾患が進行した段階でｍＣＤＲ１をインビボで投与することによって、ＭＭＰ−３（２１Ａ）及びＭＭＰ−９（２１Ｂ）のレベルを低下させることができた。逆ｍＣＤＲ１による治療はＭＭＰ−３又はＭＭＰ−９活性に影響を及ぼさなかった（図示せず）ことから、この低下は特異的であった。ＭＭＰ−９活性のアッセイシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いた予備的な実験結果から、免疫していないＢＡＬＢ／ｃマウス由来の血清の活性は、７ｎｇ／ｍｌの純粋な活性ＭＭＰ−９に匹敵することがわかる。１６／６Ｉｄで免疫することによって、この活性が１６ｎｇ／ｍｌに増大し、ｍＣＤＲ１ペプチドで治療することによって活性がほとんど正常なレベル（８．５ｎｇ／ｍｌ）にダウンレギュレートされる。
【０１６４】
（実施例１２（ｖｉ））
１６／６Ｉｄで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓切片中のＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルに対するｍＣＤＲ１ペプチドの治療効果
ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９は、誘発した実験的なＳＬＥに罹患したマウスの腎臓中で増加することが判明したため、治療したマウスの腎臓中のＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の発現に対するｍＣＤＲ１ペプチドの治療効果を検討することは重要である。図２２は、予防（図２２Ａ）及び治療（図２２Ｂ）の両方の実験において、ｍＣＤＲ１が、治療したマウスの腎臓中のＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の両方の発現レベルをダウンレギュレートしたことを示している。ＭＭＰレベルの減少は、糸球体及び間質の両方で認められた。観察されたＭＭＰ発現の低下は、抗Ｉｇを用いた免疫複合体沈着物の染色における減少（図２２Ｂ）と相関した。
【０１６５】
ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９がＳＬＥの病因に関与しているように見えるので、本発明者らは、ヒトｈＣＤＲ１ペプチドが、疾患症状の寛解に相関してこれらのレベルをダウンレギュレートできるかどうか試験した。このため、ｈＣＤＲ１  １００μｇ又は３００μｇ／マウスを週に１回、１０週間皮下（ｓ．ｃ．）注射して治療した（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスグループのプールした血清のＭＭＰレベルを、治療中いくつかの時点で評価した。図２３は、すべての臨床症状が認められた７カ月齢でマウスの治療を開始した実験の結果である。この結果は、ｈＣＤＲ１を５回注射した後、治療の中ほどで収集した血清に関するものである。図２３の結果は、３００μｇのｈＣＤＲ１でマウスを治療すると、ＭＭＰ−３レベル及びＭＭＰ−９活性がダウンレギュレートされることを示している。これらの結果は、ｈＣＤＲ１で治療した後に疾患症状が有意に寛解することと一致している。
【０１６６】
（考察）
上記の結果は、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９がＳＬＥのネズミモデルの血清中及び腎臓中で増加することを示している。ネズミｍＣＤＲ１ペプチドは、ＳＬＥに罹患したマウスの血清及び腎臓中のＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルをダウンレギュレートすることができる。自発的なＳＬＥモデルでは、血清中のＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９のアップレギュレーションが、最初の３．５カ月で起こることが示されている。誘発モデルでは、血清中のＭＭＰ−３レベルの上昇は極めて初期（１６／６Ｉｄの追加免疫から１０日後）に起こり、ＭＭＰ−９活性の増大は約３〜４カ月後に起こる。この疾患の第一段階のプロセスを追跡できる１６／６Ｉｄ誘発モデルによる結果から、ＭＭＰ−３が疾患の誘発に関与し、ＭＭＰ−９が疾患の進行に関与すると考えられる。
【０１６７】
ＳＬＥマウスモデルにおけるＭＭＰ−３の上昇を示す本発明者らの結果は、ＭＭＰ−３がＳＬＥ患者の血清中で有意に増加し（Ｋｏｔａｊｉｍａ等、１９９８）、ＭＭＰ−３転写物が（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの腎炎の進行につれ有意に増加する（Ｎａｋａｍｕｒａ等、１９９３）ことを示す結果と一致する。まとめると、これらの結果から、ＭＭＰ−３がループス腎炎における糸球体損傷の発生の一因であることが示唆される。
【０１６８】
本発明者らの結果は、血清中のＭＭＰ−２の活性レベルが、ＳＬＥの誘発及び自発的モデルにおける疾患の進行に伴い有意には増大しないことを示している。これらの結果は、ＭＭＰ−２レベルがＳＬＥで増加しないとする既報の結果（Ｚｕｃｋｅｒ、１９９９）と矛盾しない。すなわち、この酵素はＣＤＲ１に基づくペプチドによる治療によって調節されなかった（データ示さず）。（視神経炎及び多発性硬化症など）他の病理疾患でも、ＭＭＰ−２はあるレベルで恒常的に分泌されて変化せず、一方、ＭＭＰ−９レベルは対照健常者よりも上昇する（Ｇｉｊｂｅｌｓ等、１９９２；Ｐａｅｍｅｎ等、１９９４）。
【０１６９】
興味深いことに、ＳＬＥに伴うＴ細胞応答に特異的かつ直接に影響を及ぼすｍＣＤＲ１ペプチドは、すでにアップレギュレートされているＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルをダウンレギュレートし（治療手順）、並びにそれらの上昇を予防すること（予防手順）ができる。
【０１７０】
血清中のＭＭＰ−９活性は、ＳＬＥ患者でもＳＬＥ動物モデルでも報告されていなかった。本発明が、ＳＬＥとＭＭＰ−９との相関を示し、ＭＭＰ−９がＳＬＥ罹患マウスの血清及び腎臓中で上昇することを示す初めてのものである。血清中のＭＭＰ−９の上昇は比較的遅い（追加免疫から４カ月後）ように見えるが、腎臓中のＭＭＰ−９の上昇は疾患誘発後の初期段階（２カ月）で認められる（データ示さず）。さらに、マウスのＳＬＥ症状を寛解させるペプチド（上述のｍＣＤＲ１及びｈＣＤＲ１）が、血清中でも腎臓中でもＭＭＰ−９をダウンレギュレートすることも初めて本明細書で示される。後者のデータは、ＭＭＰ−９活性アッセイシステムを用いて、１６／６Ｉｄによる免疫がＭＭＰ−９活性を増大させ、一方、ＣＤＲ１に基づくペプチドによる治療が、免疫していないマウスの活性レベルまでＭＭＰ−９活性をダウンレギュレートすることを示す予備的な実験結果によっても支持された。
【０１７１】
ＭＭＰ−３とＭＭＰ−９を誘導する動力学が、特に本明細書で示すＳＬＥのような自己免疫疾患の実験モデルにおいて異なることも初めて本発明で示される。このことは、上記各ＭＭＰがこの疾患の病因において異なる役割を果たすことを示唆している。本発明者らの結果は、ＳＬＥに伴うＴ細胞応答を免疫調節し疾患症状をダウンレギュレートするペプチドが、血清及び腎臓中のこれらのＭＭＰの分泌を（必ずしもＴ細胞自体によってではないが）制御できることを示している。これらの結果は、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９が、ＳＬＥの病因においてある役割を果たし、一方で疾患進行の、もう一方で既定の治療による疾患の寛解の代理マーカーとして働き得ることを示している。
【０１７２】
（実施例１３）
ＭＭＰ−９の活性は、ＳＬＥ患者の血清中で増大する（が、ＭＭＰ−２の活性は増大しない）。
本実施例において、本発明者らは、４０人のＳＬＥ患者の血清中のＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の各レベルを測定し、対照健常者よりもＳＬＥ患者の血清中でＭＭＰ−９活性が有意に増加し、ＭＭＰ−２活性が有意には増加しないことを示す。高いＭＭＰ−９活性は、円板状発疹、レイノー現象、間質性肺炎、粘膜潰ようの有無、及び抗リン脂質抗体（ＡＰＬＡ）の有無と相関があった。また、高レベルのＭＭＰ−９は、男性患者グループにおけるＳＬＥ活動性と相関した。
【０１７３】
〔材料及び方法〕
患者：女性３２人及び男性８人の計４０人のＳＬＥ患者がこの試験に参加した。すべての患者が、アメリカリウマチ学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）（ＡＣＲ）ＳＬＥ診断の改訂診断基準（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、１９９６）のうちの少なくとも４つの基準に合致した。本発明者らの試験では、２５人の性及び年齢が同じ健常ボランティアを対照グループとした。診断時の患者の平均年齢は２９±９．７（範囲１５〜４８）歳であり、平均経過観察期間は１１±１０（範囲１〜３２）年であった。ＳＬＥＤＡＩループス活動性指数（Ｂｏｍｂａｒｄｉｅｒ等、１９９２）及びＢＩＬＡＧ指数（Ｈａｙ等、１９９３）によって疾患の活動性を決定した。試験は、Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、Ｉｓｒａｅｌの倫理委員会によって承認されたものであった。
【０１７４】
〔活性アッセイキットによるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の測定〕
ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の活性を、特定のＢｉｏｔｒａｋ  ＭＭＰ−２又はＭＭＰ−９活性アッセイキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＫ）を用いて製造者の指示に従って測定した。ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の各活性を測定するために血清をそれぞれ１：１００及び１：３２に希釈した。各アッセイで適切な標準物質を添加した。ＭＭＰ全量を測定するために、酢酸ｐ−アミノフェニル第二水銀（ＡＰＭＡ）を用いてＭＭＰの前駆体の活性化を実施した。
【０１７５】
〔ゲルザイモグラフィによるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の各活性の測定〕
ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の各活性をゼラチンザイモグラフィで試験した。ゼラチン１ｍｇ／ｍｌと重合した８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて血清試料５μｌを分離した。ゲルを、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間１回洗浄してＳＤＳを除去し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ５０ｍＭ、ＮａＣｌ２００ｍＭ、ＣａＣｌ2１０ｍＭ及び０．０２％（ｗ／ｖ）Ｂｒｉｊ  ３５（ｐＨ７．５）を含有する反応緩衝液で３０分間１回洗浄した。反応緩衝液を新しいものに変え、ゲルを３７℃で２４時間インキュベートした。０．５％クーマシーブリリアントブルーでゲルを染色してゼラチン融解活性を可視化し、デンシトメトリーで定量した。
【０１７６】
〔統計解析〕
カイ二乗又はフィッシャーの正確確率検定、対応のないｔ検定及び両側Ｐ値を用いてデータを評価した。ピアソン、スピアマン及び多変量解析も使用した。
【０１７７】
（実施例１３（ｉ））
ＳＬＥではＭＭＰ−９の活性が増大し、ＭＭＰ−２の活性は増大しない。
上述のように、ＭＭＰ−９は、いくつかの自己免疫疾患及びＳＬＥ動物モデルに関与することが判明した。したがって、本発明者らは、ＭＭＰ−９がＳＬＥ患者の血清中でも増加するかどうかを興味深く検討した。このため、本発明者らは、ＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の両方の活性を可視化できるゲルザイモグラフィで４０人のＳＬＥ患者及び２５人の対照健常者の各血清を検査した。代表的なゲルを図２４に示す。この図からわかるように、ＭＭＰ−９レベルは、対照健常者よりもＳＬＥ患者の血清中で増加する。４０人のＳＬＥ患者及び２５人の対照健常者の各血清のザイモグラムをデンシトメトリーで分析して、平均ＭＭＰ−９活性がＳＬＥ患者で１０９±５．６デンシトメトリー単位（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ  ｕｎｉｔ）及び対照健常者で７６．５±４．２デンシトメトリー単位であることが示された（Ｐ＝０．０００１）。８５デンシトメトリー単位（対照健常者平均＋２ｓ．ｅ．）を超える活性値を高いとみなした。その結果、６８％のＳＬＥ患者でＭＭＰ−９の活性レベルが高いことが示された。高いＭＭＰ−９活性を示した対照健常者はわずか３％であった（Ｐ＝０．００１）。同じ血清試料中のＭＭＰ−２レベルのデンシトメトリー分析から、ＳＬＥ患者と対照健常者の各血清におけるＭＭＰ−２活性に有意差はないことが判明した。すなわち、対照健常者及びＳＬＥ患者それぞれ１０９±７及び１２３±５（平均活性デンシトメトリー単位±ｓ．ｅ．）と測定された（Ｐ＝０．０５３１）。血清中のＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の活性レベルをさらに定量するために、本発明者らは活性アッセイキットを使用した。
【０１７８】
図２５は、ＳＬＥ患者の血清中のＭＭＰ−９活性が、対照健常者の血清中のそれの３倍に増大することを示しており、この増大は統計的に有意（Ｐ＝０．０３０２）である。これに対し、２つのグループ間のＭＭＰ−２レベルの差は有意差ではない（Ｐ＝０．１２５４）。
【０１７９】
本発明者、その他（Ｅｂｉｈａｒａ等、１９９８及び１９９９）は、非ＳＬＥの慢性腎不全（例えば、糖尿病、高血圧）に罹った患者の血清中において、おそらくこの酵素の滞留のためと思われる、高いＭＭＰ−９レベルを検出したことから、本発明者らは試験したＳＬＥ患者グループにおけるＭＭＰ−９レベルと腎臓機能との相関を解析した。クレアチニンレベルとＭＭＰ−９レベルに相関は認められず（ｒ2＝０．０１）、ＳＬＥ患者におけるＭＭＰ−９レベルの上昇は腎機能障害による酵素の滞留の結果ではないことが示唆された。
【０１８０】
（実施例１３（ｉｉ））
ＭＭＰ−９活性と臨床及び検査パラメータとの相関
ＳＬＥ患者の血清中のＭＭＰ−９活性レベルが上昇したことから、本発明者らは、臨床及び検査パラメータと血清のＭＭＰ−９レベルとに相関があるかどうかを検討した。各臨床症状（表１５）に対して高いＭＭＰ−９レベル及び正常なＭＭＰ−９レベルを有する患者の数を調査し、特定の臨床症状を示す患者や示さない患者の実際の平均ＭＭＰ−９活性レベルを考慮して、統計解析（カイ二乗又はフィッシャーの正確確率検定）を実施した。結果は両方の解析でほぼ同じであった。すべての臨床症状で、高いＭＭＰ−９レベルを有する患者の割合が対照健常者グループよりも極めて高いことは注目に値する。ＭＭＰ−９レベルは、性、疾患期間又はその発症年齢とは相関しなかった（ピアソン、スピアマン）。
【０１８１】
表１５は、（対照健常者と同じかそれよりも低い＝正常）ＭＭＰ−９活性レベルのＳＬＥ患者の臨床及び検査特性を示す。高いＭＭＰ−９レベルは、レイノー現象（Ｐ＝０．０１３８）及びＡＰＬＡ（Ｐ＝０．０４１）の有無と有意な相関があった。間質性肺炎、円板状発疹、神経傷害及び粘膜の潰ようとの強い相関が認められた。しかし、これらの症状を示す患者の数が少なすぎて統計解析を実施できなかった。多変量解析から、レイノー現象及び低補体（Ｃ３、Ｃ４）レベルは、高いＭＭＰ−９レベルと正の相関があることが明らかとなった（それぞれＰ＝０．０００１及び０．０１３７）。これとは対照的に、光感作性、関節炎及び血液疾患は、ＭＭＰ−９活性レベルと負の相関を示す（それぞれ、Ｐ＝０．０３８１、０．００１４及び０．００６５）。
【０１８２】
【表１５】
2005505493.tif 000028
【０１８３】
ＡＣＲ改訂基準（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、１９９６）に従って臨床的関与を定義した。抗核抗体（ＡＮＡ）及び抗ｄｓＤＮＡ抗体を、それぞれＨｅｐ２細胞及びクリシジアルシラエ（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ  ｌｕｃｉｌｉａｅ）により決定した。抗リン脂質抗体（ＡＰＬＡ）を、１種又は複数の以下のアッセイにおける反応性で定義した：偽陽性ＶＤＲ、ループス抗凝固物質（ＬＡＣ）又は抗カルジオリピン抗体のＥＬＩＳＡ。
【０１８４】
本発明者らは、男性患者（図２６Ａ）及び女性患者（図２６Ｂ）におけるＳＬＥＤＡＩとＭＭＰ−９活性に相関があるかどうかも検討した。興味深いことに、相関係数は、男性で有意かつ正（ｒ2＝０．６３３３）であったが、女性では有意でなく負（ｒ2＝０．０５７１）であった。ＢＩＬＡＧスコアシステムでも同様な結果が得られた。すなわち、男性ではＭＭＰ−９活性とＢＩＬＡＧスコアに正の相関係数（ｒ2＝０．６４４２）が認められ、女性では有意ではない相関係数が認められた。
【０１８５】
患者が利用する様々な治療法とＭＭＰ−９活性の間に相関があるかどうかを決定することも重要である。表１６（Ａ）に見られるように、患者の現在の治療法とＭＭＰ−９活性に有意な相関はなかった。しかし、本発明者らが疾患の経過中の如何なる時期で患者の治療法を観察したときでも（表１６（Ｂ））、高いＭＭＰ−９レベルは細胞毒性薬剤の使用と関連があった（８２％）。
【０１８６】
【表１６】
2005505493.tif 000029
【０１８７】
抗マラリア薬のヒドロキシクロロキンを２００〜４００ｍｇ／日の投与量で使用した。１日当たり５ｍｇ以上のプレドニゾンの服用をステロイド治療と定義した。使用した細胞毒性薬剤はシクロホスファミド（毎月０．５〜１ｇ／ｍ2）又はアザチオプリン（１００〜１５０ｍｇ／日）であった。
【０１８８】
（実施例１３（ｉｉｉ））
異なる時点で個々のＳＬＥ患者から採取した血清試料中のＭＭＰ−９活性の変化
疾患の活動性は時間の経過とともに変わるので、本発明者らは、４〜６年の経過観察中に採取した個々の患者の血清におけるＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２の各活性レベルを測定した。異なる時点で採取した９人の患者の血清を分析した。ＭＭＰ−２レベルは、患者と対照健常者で有意差はなかった。試験した９人の患者のうち５人で、個々の患者の血清試料中のＭＭＰ−９活性に時間の経過に伴う変化が認められた。２人の代表的なＳＬＥ患者の結果を図２７に示す。図に示したように、ＭＭＰ−９活性は同一患者で時間の経過とともに変化し、ＭＭＰ−２は変化しなかった。これらの変化は、ＳＬＥＤＡＩシステム又はＢＩＬＡＧシステムで決定される疾患活動性指数と関連がなかった。ＭＭＰ−９活性の変化は、異なる時点で採取した５人の対照健常者の血清では検出されなかった（データ示さず）。他の４人のＳＬＥ患者では、時間の経過に伴うＭＭＰ−９又はＭＭＰ−２の各活性の実質的な変化は観測されず、ＭＭＰ−９活性レベルは個々の患者によって高いままか低いままであった。
【０１８９】
（考察）
本研究は、ヒトＳＬＥにおけるＭＭＰ−９の関与を初めて実証したものである。本発明者らは、ＭＭＰ−９活性が６８％のＳＬＥ患者の血清で対照健常者よりも有意に増大し、ＭＭＰ−２活性が増大しないことを示した。高いＭＭＰ−９レベルは、レイノー現象、間質性肺炎、神経障害、円板状発疹及びＡＰＬＡの存在と相関があった。ＭＭＰ−９活性の変化は、同一患者の血清において疾患の異なる時点で観察された。ＭＭＰ−９活性レベルは、女性患者の疾患活動性指数（ＳＬＥＤＡＩ、ＢＩＬＡＧ）とは相関しなかったが、男性患者グループのＳＬＥ活動性とは相関があった。
【０１９０】
本研究は、ＭＭＰ−２活性レベルがＳＬＥ患者の血清では有意に増大しないことを示した。これらの結果は、ＭＭＰ−２レベルがＳＬＥで増加しないとした既報の結果（Ｚｕｃｋｅｒ、１９９９）と矛盾しない。（視神経炎及び多発性硬化症など）他の病理疾患でも、ＭＭＰ−２レベルは恒常的で変化せず、ＭＭＰ−９レベルは対照健常者よりも増大する（Ｇｉｊｂｅｌｓ等、１９９２；Ｐａｅｍｅｎ等、１９９４）。
【０１９１】
別のＭＭＰ、すなわちＭＭＰ−３は、ＳＬＥ患者の血清中で有意に増加することから（Ｋｏｔａｊｉｍａ等、１９９８）、ＳＬＥの病因に関与することが示唆された。本発明の実施例で見られる高いＭＭＰ−９活性を有するＳＬＥ患者の割合（６８％）は、高いＭＭＰ−３レベルのＳＬＥ（７６％）及びＲＡ（８２％）患者に対して報告されている割合（Ｋｏｔａｊｉｍａ等、１９９８）と類似している。また、ＭＭＰ−３転写物が（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの腎炎の進行につれ有意に増加することが示された（Ｎａｋａｍｕｒａ等、１９９３）。
【０１９２】
ＳＬＥ患者の血清中でＭＭＰが増加する原因は不明である。ＭＭＰ−９は、Ｔ細胞、好中球及びマクロファージなどの末梢血細胞によって分泌されることが示されている（総説としてＧｏｅｔｚｌ等、１９９６を参照されたい）。患者のＭＭＰ−９活性レベルと末梢血細胞数に相関が見られないという事実は、ＭＭＰ−９が末梢血免疫細胞ではなく、ＳＬＥに冒された腎臓又は肺／胸膜などの器官によって分泌されることを示唆している可能性がある。間質性肺炎に罹ったすべてのＳＬＥ患者が高いＭＭＰ−９活性レベルを示すという観察結果は、患部の肺が高いＭＭＰ−９レベルの原因となっていることを示唆している可能性がある。また、ＳＬＥに関連した器官の障害の重篤度を示す細胞毒による治療と血清中の高レベルのＭＭＰ−９との関連も、患部の器官がＳＬＥ患者のＭＭＰ−９活性の原因であるという考えを支持している可能性がある。しかし、末梢血リンパ球が少ないほどより高い活性レベルのＭＭＰ−９が分泌される可能性が依然として存在する。
【０１９３】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−１は、ヒトの疾患（Ｄｅａｎ等、２０００）及びネズミモデル（Ｓｅｇａｌ等、１９９７；Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ等、１９９９；Ｅｉｌａｔ等、２００１）の両方でＳＬＥの病因に重要な役割を果たしていることが示された。これらのサイトカインがＭＭＰ−９の産生を誘導することがいくつかの系で示され（Ｇｕｅｄｅｚ等、１９９６）、したがって、これらのＭＭＰの誘導が、ＳＬＥにおけるこれらのサイトカインの病原性効果の一部である可能性がある。健常者の末梢血単球によって自発的に分泌されるＭＭＰ−９のレベルは、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βに曝すとアップレギュレートされることが報告されている（Ｓａｒｅｎ等、１９９６）。また、Ｔ細胞及びマクロファージのＭＭＰは、膜結合の形が切断されることによってＴＮＦ−αの分泌を促進する（Ｇｅａｒｉｎｇ等、１９９４）。したがって、これらの例は、炎症誘発性サイトカインに対するＭＭＰの相互調節の効果及びＭＭＰの相互調節に対する炎症誘発性サイトカインの効果を示している。しかし、ほとんどの患者の血清で高い活性レベルのＭＭＰ−９が測定された一方で、何人かの患者の血清でＭＭＰ−９活性レベルが経過観察期間中正常な範囲内にあったということは、ＭＭＰ−９活性レベルの調節における遺伝因子の関与を示唆している可能性がある。
【０１９４】
本明細書の結果は、ＭＭＰ−９がＳＬＥの病因にある役割を果たすことができ、このメタロプロテイナーゼの血しょう／血清活性レベルを測定することによって、ＭＭＰ−９活性と干渉する薬物による治療を受けている患者をモニターするときに重要な情報を提供し得ることを示している。
【０１９５】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】３００μｇのｈＣＤＲ１を用いた治療による、様々な濃度の１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ（０．１〜１０μｇ／ウェル）に対する、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫したマウスリンパ節細胞の増殖性応答の阻害を示すグラフである。
【図２】５０μｇのｈＣＤＲ１を用いた治療による、様々な濃度の１６／６Ｉｄ  ｍＡｂ（０．１〜１０μｇ／ウェル）に対する、ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫したマウスリンパ節細胞の増殖性応答の阻害を示すグラフである。
【図３】ヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで免疫し、ｈＣＤＲ１又は無関係なペプチドｐ２５９−２７１で治療したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるサイトカインのパターンを示すグラフである。図３ＡはＩＦＮ−γのパターン、図３ＢはＴＧＦ−βのパターン、図３ＣはＩＬ−１０のパターンである。
【図４】ＳＬＥ患者及び対照健常者のＰＢＬを最適に刺激するのに必要なヒト抗ＤＮＡ１６／６Ｉｄ  ｍＡｂの濃度を示すグラフである。様々な濃度（０．１〜４０μｇ／ウェル）の１６／６Ｉｄ  ｍＡｂでＰＢＬを刺激した。最も高い刺激指数を生じる濃度を、増殖性応答を誘発するのに最適なレベルと定義した。
【図５】ｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３の非存在下又は存在下において分裂促進因子フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で刺激した１人のＳＬＥ患者由来のＰＢＬの増殖を示すグラフである。
【図６】ヒトペプチドｈＣＤＲ１若しくはｈＣＤＲ３又はネズミペプチドｍＣＤＲ３の非存在下又は存在下においてヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで刺激した１人のＳＬＥ患者由来のＰＢＬの増殖を示すグラフである。
【図７】ヒトペプチドｈＣＤＲ１若しくはｈＣＤＲ３又はネズミ逆ペプチドｒｅｖｍＣＤＲ１及びｒｅｖｍＣＤＲ３の非存在下又は存在下においてヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで刺激した１人のＳＬＥ患者由来のＰＢＬの増殖を示すグラフである。
【図８】ｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３の非存在下又は存在下においてヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで誘発したＳＬＥ患者のＰＢＬにおけるＩＬ−２分泌の阻害を示すグラフである。
【図９】ｈＣＤＲ１又はｈＣＤＲ３の非存在下又は存在下においてヒト１６／６Ｉｄ  ｍＡｂで刺激した１人の代表的なＳＬＥ患者のＰＢＬにおけるＴＧＦ−β分泌のアップレギュレーションを示すグラフである。
【図１０】無治療の（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス又は３００μｇのｈＣＤＲ１で若しくは（対照として使用した）逆ペプチドｒｅｖｈＣＤＲ１で治療した（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスにおける抗ＤＮＡ自己抗体レベルを示すグラフである。
【図１１】５．５カ月でＰＢＳ（図１１Ａ、図１１Ｂ）又は１００μｇのｈＣＤＲ１（図１１Ｃ、図１１Ｄ）による治療を開始したＳＬＥ易罹患性（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの代表的な腎臓の切片を示す写真である。これらの切片は９カ月で屠殺したマウスのものである。Ｉｇ沈着物を検出するため、切片を（γ鎖特異的）ＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした（１１Ａ、１１Ｃ×１００；１１Ｂ、１１Ｄ×４００）。
【図１２】ＰＢＳ（図１２Ａ、図１２Ｂ）又は３００μｇのｈＣＤＲ１（図１２Ｃ、図１２Ｄ）又は逆ペプチドｒｅｖｈＣＤＲ１（図１２Ｅ、図１２Ｆ）で治療したＳＬＥ易罹患性（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの代表的な腎臓の切片を示す写真である。これらの切片は９カ月で屠殺したマウスのものである。免疫複合体Ｉｇの沈着物を検出するため、切片を（γ鎖特異的）ＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした（図１２Ａ、図１２Ｃ、図１２Ｅ×１００；図１２Ｂ、図１２Ｄ、図１２Ｆ×４００）。
【図１３】未治療又はｈＣＤＲ１若しくは逆ペプチドｒｅｖｈＣＤＲ１で治療したＳＬＥ易罹患性（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスにおける脾臓細胞のＣｏｎ  Ａ刺激培養物の上清をＥＬＩＳＡにより測定したサイトカインのパターンを示すグラフである。図１３ＡはＩＦＮ−γのパターン、図１３ＢはＩＬ−１０のパターン、図１３ＣはＴＧＦ−βのパターンである。
【図１４】ＰＢＳ（１４Ａ、１４Ｂ）又は２００μｇのｈＣＤＲ１（１４Ｃ、１４Ｄ）又は逆ペプチドｒｅｖｈＣＤＲ１（１４Ｅ、１４Ｆ）で治療した、１６／６Ｉｄで誘発した実験的なＳＬＥに罹ったＢＡＬＢ／ｃマウスの代表的な腎臓の切片を示す写真である。これらの切片は９カ月で屠殺したマウスのものである。免疫複合体Ｉｇの沈着物を検出するため、切片を（γ鎖特異的）ＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした（１４Ａ、１４Ｃ、１４Ｅ×１００；１４Ｂ、１４Ｄ、１４Ｆ×４００）。
【図１５Ａ−Ｂ】未治療又はｈＣＤＲ１（２００又は３００μｇ）若しくは逆ペプチドｒｅｖｈＣＤＲ１で治療した、１６／６Ｉｄで誘発した実験的なＳＬＥに罹ったＢＡＬＢ／ｃマウスの１６／６Ｉｄで刺激したリンパ節培養物の上清中のＥＬＩＳＡにより測定したサイトカインのパターンを示すグラフである。１６／６Ｉｄで誘発した脾臓細胞の上清を測定した、図１５ＡはＩＦＮ−γのパターン、図１５ＢはＴＮＦ−αのパターンである。
【図１５Ｃ−Ｄ】未治療又はｈＣＤＲ１（２００又は３００μｇ）若しくは逆ペプチドｒｅｖｈＣＤＲ１で治療した、１６／６Ｉｄで誘発した実験的なＳＬＥに罹ったＢＡＬＢ／ｃマウスの１６／６Ｉｄで刺激したリンパ節培養物の上清中のＥＬＩＳＡにより測定したサイトカインのパターンを示すグラフである。１６／６Ｉｄで誘発した脾臓細胞の上清を測定した、図１５ＣはＩＬ−１０のパターン、図１５ＤはＴＧＦ−βのパターンである。である。
【図１５Ｅ】未治療又はｈＣＤＲ１（２００又は３００μｇ）若しくは逆ペプチドｒｅｖｈＣＤＲ１で治療した、１６／６Ｉｄで誘発した実験的なＳＬＥに罹ったＢＡＬＢ／ｃマウスの１６／６Ｉｄで刺激したリンパ節培養物の上清中のＥＬＩＳＡにより測定したサイトカインのパターンを示すグラフである。１６／６Ｉｄで誘発した脾臓細胞の上清を測定した、ＴＧＦ−βのパターンである。
【図１６】未治療のＳＬＥ易罹患性（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス（１６Ａ、１６Ｂ）又は３００μｇのｈＣＤＲ１（図１６Ｃ、図１６Ｄ）若しくは逆ペプチドｒｅｖｈＣＤＲ１（図１６Ｅ、図１６Ｆ）で治療したマウスの脾臓細胞のＳＬＥ易罹患性（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスレシピエントの代表的な腎臓の切片を示す写真である。免疫複合体Ｉｇの沈着物を検出するため、切片を（γ鎖特異的）ＦＩＴＣ複合ヤギ抗マウスＩｇＧとともにインキュベートした（図１６Ａ、図１６Ｃ、図１６Ｅ×４００；図１６Ｂ、図１６Ｄ、図１６Ｆ×１００）。
【図１７】（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの血清におけるＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発生動態を示す図である。表示した時に（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウス（１０マウス／グループ）から採血した。各グループのマウスからプールした各血清（４μｌ）のＭＭＰ−３発現レベルをウェスタンブロット法により（図１７Ａ）、或いはそのＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２活性をゲルザイモグラフィにより（図１７Ｂ）評価した。これらの結果は、４つの同様の実験を代表するものである。
【図１８】ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清におけるＭＭＰ−３、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の発生動態を示す図である。表示した時に免疫性がないＢＡＬＢ／ｃマウス（１０マウス／グループ）又はＰＢＳ／ＣＦＡで免疫したマウス（１０マウス／グループ）又は（ＣＦＡで希釈した）１６／６Ｉｄで免疫したマウス（１０マウス／グループ）から採血した。各グループのマウスからプールした各血清（４μｌ）のＭＭＰ−３発現レベルをウェスタンブロット法により（図１８Ａ）、或いはそのＭＭＰ−９及びＭＭＰ−２活性をゲルザイモグラフィにより（図１８Ｂ）テストした。これらの結果は、３つの同様の実験を代表するものである。
【図１９】免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓切片をＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９について免疫染色した写真である。免疫性がないＢＡＬＢ／ｃマウス又はＰＢＳ／ＣＦＡ若しくは（ＣＦＡで希釈した）１６／６Ｉｄで免疫したマウスの各３マウス／グループを１６／６Ｉｄで追加免疫後５．５カ月で屠殺した。腎臓を取り出し、そのクリオスタット切片５μｍをＭＭＰ−３（１９Ａ）及びＭＭＰ−９（１９Ｂ）について免疫染色した。ブロッキング効率を見るために対照となる染色を実施した（１９Ｃ）。（×２００）。これらの結果は、３つの同様の実験を代表するものである。
【図２０】ｍＣＤＲ１で治療した（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの血清におけるＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルを示す図である。予防実験では、マウス（１０／グループ）に、２カ月齢から１０週間毎週ｍＣＤＲ１を皮下注射した。これらの結果は、治療終了から４カ月後に採取した血清のものである。治療実験では、マウス（１０／グループ）に、５カ月齢からＰＢＳ又は２５０μｇ／マウスのｍＣＤＲ１を皮下注射した。これらの結果は、治療終了から３週後に採取した血清のものである。各実験グループからプールした各血清のＭＭＰ−３レベルをウェスタンブロット分析により（図２０Ａ）、及びそのＭＭＰ−９活性をゲルザイモグラフィにより（図２０Ｂ）評価した。ＵＴは未治療を示す。これらの結果は、２つの同様の実験を代表するものである。
【図２１】ｍＣＤＲ１で治療した１６／６Ｉｄ免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスのＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルを示す図である。予防実験では、ｍＣＤＲ１（１００μｇ／マウス）をマウス（８／グループ）に静脈注射した。示した結果は、治療終了から４．５カ月後に採取した血清のものである。治療実験では、１００μｇ／マウスのｍＣＤＲ１をマウス（８／グループ）に皮下注射した。これらの結果は、治療終了時に得た血清のものである。各実験グループからプールした各血清のＭＭＰ−３をウェスタンブロット分析により（２１Ａ）、及びそのＭＭＰ−９活性をゲルザイモグラフィにより（２１Ｂ）評価した。ＵＴは未治療を示す。これらの結果は、２つの同様の実験を代表するものである。
【図２２】ｍＣＤＲ１で実験的なＳＬＥの予防（２２Ａ）又は治療（２２Ｂ）処置を受けた１６／６Ｉｄ免疫ＢＡＬＢ／ｃマウスの腎臓切片をＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９について免疫染色した写真である。疾患の誘発から８カ月後にマウスを屠殺し、それらの腎臓を取り出した。クリオスタット切片（５μｍ）を調製し、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９、及び免疫複合体の沈着物が存在するかどうか免疫染色した（×２００）。（Ｗ／Ｏ）は、ブロッキング効率を見るための対照となる染色を示し、第１抗体が存在しない。これらの結果は、２つの同様の実験を代表するものである。
【図２３】ｈＣＤＲ１で治療した（ＮＺＢ×ＮＺＷ）Ｆ１マウスの血清中のＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の各レベルを示す図である。治療実験では、マウス（１０／グループ）に、ＰＢＳ又は１００μｇ若しくは３０μｇ／マウスのｈＣＤＲ１を、７カ月齢から１０週間毎週１回皮下注射した。これらの結果は、治療の中程で収集した血清のものである。各実験グループからプールした各血清のＭＭＰ−３レベルをウェスタンブロット分析により（２３Ａ）、及びそのＭＭＰ−９活性をゲルザイモグラフィにより（２３Ｂ）評価した。これらの結果は、２つの同様の実験を代表するものである。
【図２４】ＳＬＥ患者及び対照健常者の血清中のＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の活性を示す代表的なゲルの図である。４０人の個々のＳＬＥ患者及び２５人の対照健常者の各血清（５μｌ）のＭＭＰ−２又はＭＭＰ−９の各活性をゲルザイモグラフィにより分析した。この図は、２つのグループの各血清試料を用いた代表的な結果を示している。
【図２５】ＳＬＥ患者（黒のカラム）及び対照健常者（白のカラム）の各血清中のＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の各活性の定量分析を示すグラフである。ＳＬＥ患者の３６個の血清試料及び対照健常者の１５個の血清試料を、比活性アッセイキットを用いてＭＭＰ−２又はＭＭＰ−９の活性について評価した。結果を平均値±標準誤差で示す。＊Ｐ＝０．０３０２。
【図２６】ＳＬＥ患者のＭＭＰ−９活性レベルと疾患活動性指数（ＳＬＥＤＡＩ）を示すグラフである。８人の男性ＳＬＥ患者（図２６Ａ）及び２７人の女性ＳＬＥ患者（図２６Ｂ）からの３５個の血清試料のＭＭＰ−９活性を比活性アッセイキットを用いて評価した。これらの患者のＳＬＥＤＡＩに対するＭＭＰ−９活性の分布を示す。破線は対照健常者のＭＭＰ−９活性を示す。
【図２７】４〜６年の疾患中に採取した２人のＳＬＥ患者の血清におけるＭＭＰ−２（白丸）及びＭＭＰ−９（黒丸）の各活性のパターンを示すグラフである。これらの血清のＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の各活性を比活性アッセイキットにより評価した。アッセイを２回実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１３】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ−Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505493.tif 000180
【国際調査報告】
2005505493.tif 000181
2005505493.tif 000182
2005505493.tif 000183