(57)【要約】ナノ構造は、抗体アセンブリ単位である、少なくとも１種のアセンブリ単位を含むナノ構造を含む。この抗体アセンブリ単位において、少なくとも２つの連結要素、１つの構造的要素または１つの機能的要素は、抗体または抗体フラグメントである。抗体アセンブリ単位は、１つより多い型の抗体要素を有し得る。この抗体アセンブリ単位はまた、抗体でない構造的要素、機能的要素または連結要素を含み得る。このナノ構造は、段階的アセンブリ法を使用して、適切に調製される。少なくとも１つの未結合連結要素を有するナノ構造中間体が、複数の異なる連結要素を有するアセンブリ単位と接触される。アセンブリ単位の連結要素のうちのいずれも、それら自体とも、同じアセンブリ単位の別の連結要素とも相互作用し得ない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ構造の段階的アセンブリのための方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの未結合連結要素を含むナノ構造中間体を、複数の異なる連結要素を含むアセンブリ単位と接触させる工程であって、ここで：
（ｉ）該複数の異なる連結要素のうちの連結要素のいずれも、それ自体とも、該複数のものの別の連結要素とも相互作用し得ず；そして
（ｉｉ）該複数の単一の連結要素、および該ナノ構造中間体の単一の未結合連結要素が、相補的連結要素であり、
ここで、該アセンブリ単位は、該ナノ構造中間体に非共有結合されて、引き続くサイクルにおいて使用するための新たなナノ構造中間体を形成する、工程；
（ｂ）未結合アセンブリ単位を除去する工程；ならびに
（ｃ）ナノ構造を形成するために十分なサイクル数にわたって、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、
を包含し、ここで、少なくとも１つのサイクルにおいて、該アセンブリ単位は、２つ連結要素、構造的要素または機能的要素を含み、これらの要素が、抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体を含む、方法。
【請求項２】
前記ナノ構造中間体が、表面結合した開始アセンブリ単位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらなる工程：
前記ナノ構造を少なくとも１つのキャップ単位でキャップする工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体アセンブリ単位が、機能的要素および第一の連結要素を含み、これらの要素が、抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記構造的要素が、前記第一の連結要素および第二の連結要素に共有結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第二の連結要素が、抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体アセンブリ単位が、機能的要素をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的要素が、抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体アセンブリ単位が、機能的要素および連結要素を含み、これらの要素が、抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記機能的要素が、抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
相補的連結要素の特異的な非共有結合相互作用の、共有結合へのアセンブリ後転換の工程をさらに包含し、これによって、該結合が安定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体アセンブリ単位が、抗体、抗体結合誘導体またはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤならびにそれらの誘導体およびフラグメントからなる群より選択された抗体結合フラグメントを含む、方法。
【請求項１５】
前記抗体アセンブリ単位が、キメラ抗体、抗体結合誘導体または抗体結合フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体アセンブリ単位が、多重特異性抗体、抗体結合誘導体または抗体結合フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体アセンブリ単位が、Ｆａｂ抗体フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体アセンブリ単位が、Ｆａｂ抗体フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記相補的連結対が、イディオトープ／抗イディオトープの相互作用を示すアセンブリ単位から形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記相補的連結対が、抗原／抗体の相互作用を示すアセンブリ単位から形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
アセンブリ単位の複数の種から形成されるナノ構造であって、該ナノ構造は、該アセンブリ単位間に複数の結合を形成する、複数の異なる連結要素を含み、該アセンブリ単位は、以下：
（ａ）構造的要素または機能的要素を含む第一のアセンブリ単位を備え、これらの要素は、抗体もしくは抗体フラグメント、またはその結合誘導体を含むか、あるいは
（ｂ）２つの連結要素を有する第一のアセンブリ単位を備え、これらの要素は、抗体もしくは抗体フラグメント、またはその結合誘導体を含む、
ナノ構造。
【請求項２２】
前記第一のアセンブリ単位が、抗体もしくは抗体フラグメント、またはその結合誘導体を含む２つの連結要素を有する、請求項２１に記載のナノ構造。
【請求項２３】
前記第一のアセンブリ単位が、機能的要素をさらに含む、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項２４】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶、ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項２３に記載のナノ構造。
【請求項２５】
前記機能的要素が、抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体を含む、請求項２４に記載のナノ構造。
【請求項２６】
前記第一のアセンブリ単位における前記抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体が、機能的要素として存在する、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項２７】
前記第一のアセンブリ単位における前記抗体または抗体フラグメントまたはその結合誘導体が、機能的要素として存在する、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項２８】
請求項２２に記載のナノ構造であって、前記第一のアセンブリ単位が、抗体、抗体結合誘導体またはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤならびにそれらの誘導体およびフラグメントからなる群より選択された抗体結合フラグメントを含む、ナノ構造。
【請求項２９】
前記第一のアセンブリ単位が、キメラ抗体、抗体結合誘導体または抗体結合フラグメントを含む、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項３０】
前記第一のアセンブリ単位が、多重特異性抗体、抗体結合誘導体または抗体結合フラグメントを含む、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項３１】
前記第一のアセンブリ単位が、Ｆａｂ抗体フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントを含む、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項３２】
前記第一のアセンブリ単位が、Ｆａｂ抗体フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントを含む、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項３３】
前記ナノ構造が、イディオトープ／抗イディオトープの相互作用を示すアセンブリ単位から形成される、相補的連結対によって結合された２つのアセンブリ単位を含む、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項３４】
前記ナノ構造が、抗原／抗体の相互作用を示すアセンブリ単位から形成される、相補的連結対によって結合された２つのアセンブリ単位を含む、請求項２２に記載のナノ構造。
【請求項３５】
前記ナノ構造が、二次元または三次元である、請求項２１に記載のナノ構造。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ナノ構造の構築における使用するための抗体または抗体フラグメントアセンブリ単位を含むナノ構造のアセンブリのための方法、および抗体アセンブリ単位を含むナノ構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ナノ構造は、ナノメートル範囲（約１〜１００ｎｍ）の１つ以上の特徴的な寸法を有する個々の成分を有する構造である。成分がナノメートル範囲の物理的寸法を有する構造をアセンブルする利点が、科学者によって４０年以上にわたって考察および熟考されてきた。これらの構造の利点は、Ｆｅｙｎｍａｎ（１９５９，Ｔｈｅｒｅ’ｓ  Ｐｌｅｎｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｏｍ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｏｔｔｏｍ，Ａｎ  Ｉｎｖｉｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｅｎｔｅｒ  ａ  Ｎｅｗ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ（講義）、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２９，１９５９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて再版，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９６０，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）によって最初に指摘され、そしてＤｒｅｘｌｅｒ（１９８６，Ｅｎｇｉｎｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ，Ｇａｒｄｅｎ  Ｃｉｔｙ，Ｎ．Ｙ．：Ａｎｃｈｏｒ  Ｐｒｅｓｓ／Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ）によって大きく展開された。これらの科学者は、非常に小さい特徴的寸法を有する構造の創出において、多大な有用性を想定した。ナノテクノロジーの潜在的な適用は、広がる傾向にあり、そして社会に対する予測された影響は大きい（例えば、２０００，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ：ＩＷＧＮ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  Ｒｅｐｏｒｔ；Ｖｉｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒ＆Ｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｄｅｃａｄｅ；Ｍ．Ｃ．Ｒｏｃｏ，Ｒ．Ｓ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰ．Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ編，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。非常に多数のナノスケールのデバイスおよび構造（電子部品および光部品；医療用センサ；新規材料；生体適合性デバイス；ナノエレクトロニクスおよびナノ回路；ならびにコンピュータ技術を含む）についての潜在的な適用が存在することが予測される。
【０００３】
ナノ構造の物理的性質および化学的性質は、このナノ構造が作製される構築ブロックに依存する。例えば、これらの構築ブロックのサイズおよびこれらが連結する角度、ならびに機能的要素が配置され得る位置は、ナノ構造の特性を決定する際に重要な役割を果たす。当該分野は、ナノ構造において使用され得る異なる型の材料の多数の例を提供しており、これらには、以下が挙げられる：ＤＮＡ（米国特許第５，４６８，８５１号、同第５，９４８，８９７号および同第６，０７２，０４４号；ＷＯ  ０１／００８７６）、バクテリオファージＴ平坦（ｅｖｅｎ）テイル繊維（米国特許第５，８６４，０１３号および同第５，８７７，２７９号ならびにＷＯ  ００／７７１９６）、ヒトエラスチンおよび他の繊維状タンパク質でモデル化された自己整列ペプチド（米国特許第５，９６９，１０６号）、ならびに人工ペプチド認識配列（米国特許第５，７１２，３６６号）。それにもかかわらず、ナノ構造についての全ての潜在的適用を満たすために必要とされ得る多様性を提供するために、さらなる型の構築ブロックが継続して必要とされている。本願は、このクラスのみの構築ブロックを含む均質なナノ構造中、または他のクラスの構築ブロックと組み合わせて不均一ナノ構造中で使用され得る、構築ブロックのさらなるクラスを提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、複数の種のアセンブリ単位から形成されたナノ構造を提供する。いくつかの例外（例えば、キャップ単位）があるものの、これらのアセンブリ単位は、複数の異なる連結要素を含む。本発明のナノ構造において、このナノ構造は、少なくとも１つの連結要素、構造的要素または機能的要素が抗体または抗体フラグメントを含む、少なくとも１種のアセンブリ単位を含む。抗体アセンブリ単位は、１つ以上の抗体または抗体フラグメント要素を有し得る。さらに、抗体アセンブリ要素は、他の要素、非抗体要素、構造的要素、機能的要素および連結要素を含み得る。
【０００５】
本発明のナノ構造は、段階的アセンブリ方法を使用して適切に調製される。この方法において、少なくとも１つの未結合の連結要素を含むナノ構造中間体を、複数の異なる連結要素を含むアセンブリ単位と接触させる。ここで：
（ｉ）この複数の異なる連結要素のなかには、それ自体または別の複数の連結要素と相互作用し得る連結要素はなく、そして
（ｉｉ）複数の連結要素の中の単一の連結要素と、ナノ構造中間体の単一の未結合の連結要素とは、相補的な連結要素である。
結果として、アセンブリ単位は、ナノ構造中間体と非共有結合して、引き続くサイクルにおける使用のための新たなナノ構造中間体を形成する。次いで、未結合のアセンブリ単位が除去され、そしてこのプロセスが、ナノ構造を形成するのに十分な数のサイクルにわたって反復される。本発明の方法において、少なくとも１つのサイクルにおけるアセンブリ単位は、抗体アセンブリ単位を含む。
【０００６】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本願における用語は、当該分野におけるその通常の意味と一致した様式で一般に使用される。しかし、明確さを提供するために、当該分野で一致しない場合においては、以下の定義が支配する。
【０００７】
（抗体アセンブリ単位）：少なくとも１つの連結要素、構造的要素または機能的要素が抗体または抗体フラグメントあるいはその結合誘導体であるアセンブリ単位。抗体、結合誘導体または結合フラグメントは、任意のクラスの免疫グロブリン分子（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの任意のサブクラスを含む）のものであり得る。
【０００８】
（抗体フラグメント）：エピトープに対する特異的な結合親和性を有する抗体の部分。抗体フラグメントの例としては、限定しないが、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２抗体フラグメント、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦＶｓ）、二重特異性ＩｇＧ抗体、キメラＩｇＧ抗体または二重特異性ヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２抗体、ダイアボディーまたは多量体ｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。
【０００９】
（アセンブリ単位）アセンブリ単位は、構造的要素、連結要素および／または機能的要素を含む原子および／または分子の集合である。好ましくは、アセンブリ単位は、特異的非共有結合相互作用の形成を介して、単一の単位としてナノ構造に付加される。アセンブリ単位は、２つ以上のサブアセンブリ単位であり得る。アセンブリ単位は、１つ以上の構造的要素を含み得、そしてさらに、１つ以上の機能的要素および１つ以上の連結要素を含み得る。アセンブリ単位が機能的要素を含む場合、この機能的要素は、連結要素に結合され得るかもしくは連結要素内に組み込まれ得、または特定の実施形態においては構造的要素に結合され得るかもしくは構造的要素内に組み込まれ得る。１つの構造的要素および１つまたは複数の非相互作用連結要素を含み得るこのようなアセンブリ単位は、特定の実施形態において、構造的に剛性であり得、そして十分規定された認識特性および結合特性を有し得る。
【００１０】
（アセンブリ単位、開始剤）開始アセンブリ単位は、本発明の段階的アセンブリ法によって形成されるナノ構造に組み込まれ得る最初のアセンブリ単位である。これは、段階的アセンブリプロセスの第一工程として、共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって、固体基板または他のマトリクスに結合され得る。開始アセンブリ単位はまた、「開始単位」としても公知である。
【００１１】
（結合フラグメント、結合誘導体）抗体または抗体フラグメントの結合誘導体は、抗体、抗体フラグメント、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）など（これらから、結合誘導体が誘導される）の結合特異性を示す誘導体である。抗体または抗体フラグメントは、抗体、抗体フラグメント、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）など（これらから、結合誘導体が誘導される）の結合特異性を示すフラグメントである。
【００１２】
（ボトムアップ（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ））構造（例えば、ナノ構造）のボトムアップアセンブリは、例えば、自己アセンブリまたは段階的アセンブリを使用してサブ構造を一緒に連結することによる、その構造の形成である。
【００１３】
（キャップ単位）キャップ単位は、最大で１つの連結要素を含むアセンブリ単位である。キャップ単位が一旦ナノ構造中に組み込まれると、キャップ単位との相互作用を介してさらなるアセンブリ単位がナノ構造中に組み込まれることはできない。
【００１４】
（誘導体）本発明の方法で使用される目的のタンパク質（例えば、抗体）の誘導体は、機能的に等価な分子を提供する置換、付加または欠失によって配列を変更することによって作製され得る。ヌクレオチドコード配列の縮重に起因して、目的のタンパク質をコードする遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、本発明の実施に使用され得る。これらには、限定しないが、配列内で機能的に等価なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、従ってサイレントな変化を生じる、遺伝子の全てまたは一部を含むヌクレオチド配列が挙げられる。
【００１５】
同様に、目的のタンパク質の誘導体としては、限定しないが、一次アミノ酸配列として、機能的に等価なアミノ酸残基が、配列内の残基を置換し、サイレントな変化を生じる変更された配列を含む目的のタンパク質のアミノ酸配列の全てまたは一部を含む誘導体が挙げられる。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸残基は、機能的な等価物として作用する類似の極性の別のアミノ酸によって置換され得、サイレントな変化を生じる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電された（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。負に荷電された（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００１６】
あるいは、抗体の誘導体またはアナログとしては、限定しないが、目的の抗体またはその結合フラグメントに対して実質的に相同である領域（例えば、種々の実施形態において、同じサイズのアミノ酸配列に対してまたはアライメントが当該分野で公知のコンピューターホモロジープログラムによってなされたアライメント配列と比較した場合、少なくとも６０％または７０％または８０％または９０％または９５％の同一性）を含む分子、あるいは、そのコード配列が高いストリンジェントまたは中程度のストリンジェントの条件下で目的のタンパク質をコードする配列にハイブリダイズし得る分子が挙げられる。このような高いストリンジェントまたは中程度のストリンジェントの条件は、当該分野において一般的に公知である。
【００１７】
（第１のアセンブリ単位、第１の要素）明瞭さのために、アセンブリ単位または要素は、時々、「第１」または「第２」のような標識を使用して参照される。これは、単に慣例的な標識であり、ナノ構造内の参照されるアセンブリ単位または要素の位置を示さない。
【００１８】
（機能的要素）機能的要素は、任意の所望の物理的特性、化学的特性または生物学的特性を示す部分であり、ナノ構造中の十分規定された部位において、特異的な共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって構築、結合または配置され得る。あるいは、機能的要素は、所望の物理的特性、化学的特性または生物学的特性を有する部分についての結合部位を提供するために使用され得る。機能的要素の例としては、限定ではなく、ペプチド、タンパク質（例えば、酵素）、タンパク質ドメイン、低分子、無機ナノ粒子、原子、原子クラスター、磁性ナノ粒子、光ナノ粒子もしくは電子ナノ粒子、またはマーカー（例えば、放射性分子、発色団、発蛍光団、化学発光分子もしくは酵素マーカー）が挙げられる。このような機能的要素は、二次元ナノ構造および三次元ナノ構造を形成するために、線状の一次元ナノ構造を架橋するためにも使用され得る。
【００１９】
（連結要素）連結要素は、アセンブリ単位に結合特性を付与する、アセンブリ単位の一部であり、これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結合ドメイン、ハプテン、抗原、ペプチド、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、ポリマーもしくは他の部分、またはこれらの組み合わせ（これらは、特異的な非共有結合相互作用を介して、別の連結要素と相互作用し得る）。
【００２０】
（連結要素、相補的）相補的連結要素は、特異的な非共有結合相互作用を介して、互いに相互作用する２つの連結要素である。
【００２１】
（連結要素、非相補的）非相補的連結要素は、互いに特異的に相互作用せず、そして互いに特異的に相互作用する傾向を全く実証しない、２つの連結要素である。
【００２２】
（連結対）連結対は、２つの相補的連結要素である。
【００２３】
（ナノ材料）ナノ材料は、ナノ粒子の、結晶性集合から作製されるか、部分的に結晶性集合から作製されるか、または非結晶性集合から作製される、材料である。
【００２４】
（ナノ粒子）ナノ粒子は、一緒に結合してナノメートル範囲（１〜１０００ｎｍ）の寸法を有する構造を形成する、原子または分子の集合である。この粒子は、均質であっても不均質であってもよい。単一の結晶ドメインを含むナノ粒子は、ナノ結晶とも呼ばれる。
【００２５】
（ナノ構造またはナノデバイス）ナノ構造またはナノデバイスは、アセンブリ単位（すなわち、構造的要素、機能的要素および／または連結要素）を含む原子および／または分子の集合である。これらの要素は、ナノメートル範囲の少なくとも１つの特徴的長さ（寸法）を有し、ここで、互いに関するアセンブリ単位の位置は、規定された形状で確立される。ナノ構造またはナノデバイスはまた、これに結合した官能性置換基を有して、特定の官能性を提供し得る。
【００２６】
（ナノ構造中間体）ナノ構造中間体は、さらなるアセンブリ単位が付加され得る、ナノ構造のアセンブリ中に形成される中間体サブ構造である。最終工程において、この中間体とナノ構造は同じである。
【００２７】
（非共有結合相互作用、特異的）特異的非共有結合相互作用は、例えば、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間で生じる相互作用である。
【００２８】
（タンパク質）本願において、用語「タンパク質」は、複数のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をいうように一般に使用され、そしてアミノ酸の最小数をいずれも示すことを意図しない。
【００２９】
（除去）非結合のアセンブリ単位の除去は、物理的に除去されるかされないかによらず、これらが、成長中のナノ構造とのさらなる反応に関与することができないようにされる場合に達成される。
【００３０】
（自己アセンブリ）自己アセンブリ（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｙ）は、規則正しい構造への、成分の自発的組織化である。自律的アセンブリ（ａｕｔｏ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）としても知られる。
【００３１】
（ナノ構造の段階的アセンブリ）ナノ構造の段階的アセンブリは、ナノ構造のアセンブリのためのプロセスであり、ここで、一連のアセンブリ単位は、固体マトリクスまたは固体基板上に代表的には固定化された開始単位で始まる、予め指定された順番で付加される。各工程は、中間体サブ構造（ナノ構造中間体という）の形成を生じ、次いでこれに、さらなるアセンブリ単位が付加され得る。アセンブリ工程は、以下の工程を包含する：（ｉ）連結工程（ここで、アセンブリ単位は、付加されるべき次のアセンブリ単位を含む溶液中の結合した開始単位またはナノ構造中間体との、マトリクスまたは基板のインキュベーションによって、開始単位またはナノ構造中間体に連結される）；ならびに（ｉｉ）除去工程（例えば、洗浄工程（ここで、過剰なアセンブリ単位は、中間体構造または完成したナノ構造の近位から除去される））。段階的アセンブリは、ナノ構造の所望の設計に従って全てのアセンブリ単位がナノ構造に組み込まれるまで、工程（ｉ）および工程（ｉｉ）を反復することによって継続される。アセンブリ単位は、特異的な非共有結合の形成を介して、開始単位またはナノ構造中間体に結合する。アセンブリ単位の連結要素は、ナノ構造中間体上の予め指定された部位にのみ結合するように、選択される。アセンブリ単位の形状、構造的要素、ならびに連結要素および機能的要素の相対的配置、そしてアセンブリ単位がナノ構造に付加される順序は、全て、機能的単位がこの構造において互いに対して予め指定された位置に配置され、それによって完全にアセンブリされたナノ構造に所望の機能を付与するように、設計される。
【００３２】
（構造的要素）：構造的要素は、連結要素間に構造的連結または幾何学的連結を提供し、それによって隣接するアセンブリ単位間に幾何学的連結を提供するアセンブリ単位の部分である。構造的要素は、これらが一部分であるナノ構造についての構造的なフレームワークを提供する。
【００３３】
（サブアセンブリ）：サブアセンブリは、一緒に結合される複数のアセンブリ単位からなり、そしてアセンブリ中間体（例えば、ナノ構造中間体）に全体として加えられ得る原子または分子の集合である。本発明の多くの実施形態において、構造的要素はまた、アセンブリ単位の機能的要素を支持する。
【００３４】
（トップダウン）：構造（例えば、ナノ構造）のトップダウンアセンブリは、例えば、リソグラフィー技術を使用する、大きな最初の構造の処理を介する構造の形成である。
【００３５】
（抗体アセンブリ単位）
本発明は、ナノ構造の作製において使用され得るアセンブリ単位の新規なクラスを提供する。これらの「抗体アセンブリ単位」は、抗体または抗体フラグメントである、少なくとも１つの連結構造的要素または連結機能的要素を含む。さらに、アセンブリ単位は、構造的要素および／または他の連結要素および機能的要素を含み得る。
【００３６】
（キメラ抗体および抗体フラグメント）
本発明は、キメラ抗体またはキメラ抗体フラグメントを含むアセンブリ単位を利用するナノ構造の段階的アセンブリを提供する。融合タンパク質産物またはキメラタンパク質産物（（異なるタンパク質の）異種タンパク質配列に結合されたペプチドを介して連結された、所望のタンパク質（例えば、ＩｇＧ）、フラグメント、アナログ、または誘導体を含む）の産生。このようなキメラタンパク質産物は、適切なリーディングフレームにおいて、当該分野において公知の方法によって、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結し、そして当該分野において一般的に公知である方法によってキメラ産物を発現させることによって、作製され得る。あるいは、このようなキメラ産物は、タンパク質合成技術によって（例えば、ペプチド合成機の使用によって）作製され得る。
【００３７】
ＩｇＧおよびその結合誘導体または結合フラグメント（例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、（ｓｃＦｖ）３）の三次元構造は、解析されている（Ｂｒａｄｅｎら，１９９６，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｆｖ−Ｆｖ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  １．９Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４（１）：１３７−５１；Ｂａｎら，１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｄｉｏｔｙｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ｆａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（５）：１６０４−０８；Ｐｅｒｉｓｉｃら，１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｂｏｄｙ，ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２（１２）：１２１７−２６；Ｈａｒｒｉｓら，１９９８，Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ＩｇＧ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５（５）：８６１−７２；Ｐｅｉら，１９９７，Ｔｈｅ  ２．０−Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｃｏｇｎａｔｅ  ＶＨ−ＶＬ  ｄｏｍａｉｎ  ｐａｉｒｓ  ｓｈｏｗｓ  ａ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＶＨ  ＣＤＲ３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１８）：９６３７−４２）。各ＩｇＧ誘導抗体フラグメントは、好ましくは、少なくとも１つの一価一重特異性相補性決定領域（ＣＤＲ）または連結要素を含む。ＣＤＲは、好ましくは、高度に特異的な分子内相互作用がタンパク質成分間に生じ得る各構造に含まれる部位である。
【００３８】
組換え操作された抗体は、ナノ構造の段階的アセンブリのためのアセンブリ単位の構築における使用のための基礎的な基準の多くに適合し、そしてこのようなナノ構造を組み立てるために使用される連結要素の好ましい供給源である。このような組換え抗体結合ドメインが構造的に十分に特徴づけられているだけではなく、これらの組換え抗体結合ドメインはまた、アセンブリ単位付加のために必要な固有の結合特異性（連結要素）を有する。
【００３９】
例えば、多くの組換え操作された成分の既知の三次元構造は、新規な結合特性、構造的特性または機能的特性を抗体フラグメントに与えるペプチドの挿入（例えば、表面ループの部位において）を可能にする抗体フラグメントへの構造的改変の設計のためのガイドとして役立ち得る。さらに、分子内特異性について非常に大きな多様性が存在する（例えば、設計され、そして構築され得るかまたはライブラリーから選択され得るかのいずれかであり得る抗体および特異的エピトープを含む）。組換え抗体技術の進歩は、構造的要素および連結要素の供給源として、本発明の方法に従って使用され得る、多価抗体、多重特異的抗体、および多機能抗体の作製を導いた（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９８９，Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（６２２３）：３９４−９７；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら１９８４，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２（５９９５）：６０４−０８；Ｗａｌｌａｃｅら，２００１，Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ＦｃｇａｍｍａＲＩ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：１８３−９４）。このような多価抗体、多重特異的抗体、および多機能抗体は、本明細書中に記載されるようなナノ構造の作製のために使用されるアセンブリ単位の構築のための機能的基の付加によって改変され得る。
【００４０】
（抗体連結要素）
（抗原−抗体相互作用を示す連結要素）
本発明の特定の実施形態において、連結要素は、抗体あるいはその結合誘導体または結合フラグメント由来であり、そして連結対の形成において使用される抗原−抗体相互作用を示す。構造的情報は、種々の抗体−抗原複合体について容易に入手可能である。このような構造的情報は、本発明の方法に従ってナノ構造の作製のために連結要素を設計するために使用され得る。抗体の可変ドメインは、抗原標的に対する特異性を有して相互作用するように設計される。これらの構造および安定性は、当該分野において十分に特徴づけられており、抗体および抗原結合フラグメントは、当該分野において周知の方法を使用して操作され得る。結果として、抗体の可変ドメインは、ナノ構造アセンブリ単位としての使用のための連結要素として大きな可能性を有する分子のクラスを示す。このような要素は、アセンブリ単位と開始剤またはナノ構造中間体との間の特異的結合相互作用のための基礎を提供し、そして本明細書中において記載される。
【００４１】
抗原に対する抗体の結合が、高い特異性があることが、当該分野において周知である（Ｄａｖｉｅｓら，１９９０，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−７３；Ｍｉａｎら，１９９１，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１７（１）：１３３−５１；Ｗｉｌｓｏｎら，１９９４，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｎｅｗ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４（６）：８５７−６７；Ｄａｖｉｅｓら，１９９６，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１）：７−１２）。この高い特異性は、抗体結合部位と抗原決定基（すなわち、エピトープまたはハプテン）との間の高い相補性と相関することが示されている。この相補性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）として規定される抗体決定表面および抗原性決定表面（これらは、一方の凹部が、他方からの突出部によって充填されるように接触する）によって規定される。相補性はまた、イオン結合を形成する対向した逆電荷側鎖の相互作用のような物理的および化学的特性によって存在する。ＣＤＲと抗原性決定表面との間に生じる特異性は、１つの型のまたは１つの対の非相補性連結要素相互作用を規定し得る。
【００４２】
多くの芳香族側鎖残基（疎水性相互作用を形成する）が、これらの抗体−抗原相互作用に存在する。いくつかの抗原−抗体複合体間の相補性は、水分子でさえ、界面からの接触を排除されるように正確である。この特定の特徴は、ＣＤＲループ内の残基の構造的および化学的多様性（挿入および欠失を含む）とともに、異なる抗体によるリガンド結合の特定および多様性を可能にする（Ｗｉｎｔｅｒら，１９９１，Ｍａｎ−ｍａｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９（６３０７）：２９３−９９；Ｄａｖｉｅｓら，１９９６，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１）：７−１２）；Ｗｅｄｅｍａｙｅｒら，１９９７，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６（５３１９）：１６６５−６９）。種々の抗体によるリガンド結合のこのような公知の特異性および多様性は、本発明の方法に従ってナノ構造を構築する際に使用するための連結要素を設計する際に使用され得る。
【００４３】
本発明の方法において使用される抗体またはその一部は、多重特異的（すなわち、一つより多くのリガンドに対する結合親和性を示す）または一重特異的（すなわち、１つのリガンドのみに対して結合親和性を示す）であり得る。一般的に、抗体は、１０−１〜１０−４ｎＭの範囲またはそれよりも良好な結合親和性を示す（Ｐａｄｌａｎ，１９９４，Ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７）。
【００４４】
免疫グロブリン軽鎖可変領域または免疫グロブリン重鎖可変領域は、３つの超可変領域（ＣＤＲ）によって中断される「フレームワーク」領域からなる。Ｆｖフラグメントは、６個の可変ループ領域（ＶＬ鎖由来の３個およびＶＨ鎖由来の３個）を含む。可変鎖に含まれる各々の可変ポリペプチドループ領域は、残基配列および長さにおいて可変性を示す。この領域内の残基は、超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）または非超可変もしくはフレームワーク領域のいずれかが割り当てられる（Ｗｕら，１９７０，Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １３２（２）：２１１−５０；Ｗｕら，１９７５，Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ａｍｏｎｇ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｈａｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２（１２）：５１０７−１０；Ｗｕら，１９９３，Ｌｅｎｇｔｈ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤＲＨ３  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １６（１）：１−７）。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に規定されている（Ｋａｂａｔら，１９８３，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓを参照のこと）。
【００４５】
まとめると、これらの可変ループ領域は、ほぼ全体的に、抗体の抗原認識部位を規定する。両方のＣＤＲ３（ＣＤＲ３−ＬおよびＣＤＲ３−Ｈ）は、抗体−抗原認識相互作用において最も重要であり、配列およびコンフォメーションにおいて最も可変である。抗原に対する結合に対して、ＶＬ鎖およびＶＨ鎖の両方に由来するＣＤＲループからの寄与は、比較的一定である。抗原と複合体化された抗体の構造解析は、相互作用表面積の約４１〜４４％が、軽鎖によって寄与され、重鎖が、５６〜５９％寄与することを決定している（Ｄａｖｉｅｓら，１９９０，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−７３）。抗原と相互作用する残基の全体的な数は、かなり少ない。抗体−抗原複合体の構造解析は、平均して、１５個のみの抗体残基が抗原と相互作用することが明らかにされた。しかし、ＣＤＲループ内の他の残基は、さらなる抗体−抗原相互作用を提供し得、そして抗体結合部位構造を維持するような構造的役割を提供する（Ｄａｖｉｅｓら，１９９０，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−７３；Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ，１９９４，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｎｅｗ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４（６）：８５７−６７；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９９６，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（１）：７−１２）。
【００４６】
（組換え的に操作された抗体またはその結合誘導体もしくはその結合フラグメントを含む連結要素）
本発明のある実施形態では、連結要素は、組換え的に操作された抗体、またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを含む。多価であり、多重特異性でありおよび／または多機能性であって、ナノ構造の段階的アセンブリのためのアセンブリ単位の設計における使用のための連結要素として適する、当該分野で公知の組換え的に操作された抗体の多くの例が、存在する。そのようなアセンブリ単位を、望まれるナノ構造の製造のための本発明の方法での使用のために、本明細書に記載のように改変されなくても改変されてもよい。
【００４７】
連結要素としての使用のための、組換え的に操作された抗体、またはその結合誘導体もしくはその結合フラグメントのいくつかの例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（ｉ）ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはそれらの任意のサブクラスを含む任意のクラスからの免疫グロブリン（ハイブリッドハイブリドーマに由来する免疫グロブリン、またはクアドローマ（これは、特定の二重特異性抗体、すなわち、二つの異なるＦａｂ結合セグメントを有する抗体分子を産生する細胞株である）からの免疫グロブリンを含む）；
（ｉｉ）Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびＦａｂのような一価の単一特異的な抗体（Ｂａｎら，１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｄｉｏｔｙｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ｆａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（５）：１６０４−０８，Ｆｒｅｕｎｄら，１９９４，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３（１１）：３２９６−３０３；Ｂｏｕｌｏｔら，１９９０，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｆｖ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄ１．３  ａｎｄ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，ｌｙｓｏｚｙｍｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３（４）：６１７−１９；Ｐａｄｌａｎ，１９９４，Ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９−２１７）；
（ｉｉｉ）ハイブリッドハイブリドーマ由来のＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディー（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、異種−Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ融合体またはＦ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ融合体のような、追加された官能基を有するかもしくは追加される官能基を有しない、二価抗体、三価抗体、単一特異的抗体、二重特異的抗体、または三重特異的抗体（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，１９８３，Ｈｙｂｒｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５（５９３４）：５３７−４０；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，１９８４，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２（５９９５）：６０４−０８；Ｗｅｉｎｅｒ，１９９２，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ＩＬ−２  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍｉｃｅ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：６３−６６，ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＷｉｎｔｅｒ，１９９３，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４（４）：４４６−４９；Ｄｏｌｅｚａｌら，１９９５，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆａｂ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ａｎｄ  ＨＩＶ−２，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １（３−４）：１９７−２０９；Ｔｓｏら，１９９５，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆ（ａｂ’）２  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．４（５）：３８９−９４；Ａｔｗｅｌｌら，１９９６，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ｄｉｍｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  ａｎｄ  Ｎ９  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（１７−１８）：１３０１−１２；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら，１９９６，Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１３）：７６３０−３４；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，１９９８，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ３  ｘ  ＣＤ１９  ｄｉａｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７７（５）：７６３−７２；Ｍｕｌｌｅｒら，１９９８，Ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔ���ｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｄｉｔｙ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２（１−２）：４５−４９；Ｃａｒｔｅｒ  ２００１，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：７−１５；Ｆｅｌｌら，１９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｆ（ａｂ’）ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（７）：２４４６−５２；Ｉｌｉａｄｅｓら，１９９７，Ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｌｉｎｋｅｒ  ｆｏｒｍ  ｔｒｉｖａｌｅｎｔ  ｔｒｉｍｅｒｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４０９（３）：４３７−４１；ＨｕｄｓｏｎおよびＫｏｒｔｔ，１９９９，Ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｓｃＦｖ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ；ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１７７−８９；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら，２０００，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉ−  ａｎｄ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ９（３）：１７９−８３；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓら，２０００，Ｆａｂ  ｃｈａｉｎｓ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５（１２）：７０５０−５７）；
（ｉｖ）テトラボディー（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、Ｉｇ−Ｇ結合性誘導体−ｓｃＦｖ融合体またはＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体のような、追加された官能基を有するもしくは追加された官能基を有しない、単一特異的抗体、二重特異的抗体、三重特異的抗体または四重特異的抗体のいずれかである、四価抗体（Ｐａｃｋら，１９９５，Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６（１）：２８−３４，ＣｏｌｏｍａおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（２）：１５９−６３；Ａｌｔら，１９９９，Ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ−ｌｉｋｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇａｍｍａｌ  Ｆｃ  ｏｒ  ＣＨ３  ｒｅｇｉｏｎ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５４（１−２）：９０−４；Ｌｅ  Ｇａｌｌら，１９９９，Ｄｉ−，ｔｒｉ−  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１９：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖａｌｅｎｃｙ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５３（１−２）：１６４−６８；Ｓａｎｔｏｓら，１９９９，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ−ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５（１０補遺）：３１１８ｓ−３１２３ｓ；Ｇｏｅｌら，２０００，Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＣ４９：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０（２４）：６９６４−７１；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら，２００１，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ，ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：４７−６６）；ならびに
（ｖ）ｓｃＦｖおよびＩｇＧの結合性誘導体の融合体（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６−８８を参照のこと）；サイトカインおよびＩｇＧの結合性誘導体の融合体（ここではそのサイトカインは、例えば、ＢＣＤＦ（Ｂ細胞分化因子）、ＢＣＧＦ（Ｂ細胞増殖因子）、分裂促進性サイトカイン、走化性サイトカインもしくはケモカイン、ＣＳＦ（コロニー刺激因子）、血管新生因子、ＴＲＦ（Ｔ細胞交換因子）、ＡＤＦ（成人Ｔ細胞白血病由来因子）、ＰＤ−ＥＣＧＦ（血小板由来内皮細胞増殖因子）、ニューロロイキン（ｎｅｕｒｏｌｅｕｋｉｎ）、インターロイキン、リンフォカイン、モノカイン、インターフェロンなどである）（例えば、ＰｅｎｉｃｈｅｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，２００１，Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：９１−１０１；Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，１９９８，Ａｎ  ＩｇＧ３−ＩＬ−２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１８（８）：５９７−６０７；Ｆｅｌｌら，１９９１，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｆ（ａｂ’）ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６（７）：２４４６−５２を参照のこと）；ｓｃＦｖおよびロイシンジッパーの融合体（ｄｅ  ＫｒｕｉｆおよびＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，１９９６，Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１３）：７６３０−３４；５．５．３章も参照のこと）；ならびにｓｃＦｖおよびＲｏｐタンパク質の融合体（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎａｌｏｇｓ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６−８８を参照のこと；５．５．４章も参照のこと）。
【００４８】
（イディオトープ／抗イディオトープ相互作用を呈示する連結要素）
本発明のある実施形態では、イディオトープ／抗イディオトープ相互作用を、本発明の方法に従うナノ構造の構築のための連結要素を設計するために使用する。抗体は、実質的に任意の抗原を認識し得るので、抗体は、他の抗体上に含まれる他の抗原決定基を認識する能力を有する。抗体上の潜在的抗原決定基から生ずる免疫応答は、「イディオタイプ（ｉｄｉｏｔｏｐｉｃ）」であると呼ばれる（Ｊｅｒｎｅ，１９７４，Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）１２５Ｃ（１−２）：３７３−８９；Ｄａｖｉｅら，１９８６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｉｄｉｏｔｏｐｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１４７−６５）。イディオトープは、特定の抗体または抗体の群にとって独特の抗原決定基である。イディオトープを有する抗体は、そのイディオトープを抗原と認識してそれゆえ「抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｉｃ）」抗体であると称される抗体と反応し得る。大抵の場合、イディオトープは、特異的なｍＡｂのＣＤＲと部分的にまたは全体的に会合することが、免疫学的技術および構造学的技術により示されてきた（図２）。イディオタイプ抗体は、それらの特異的抗原に対する親和性と同じまたはそれ以上の強さの、それらの特異的な抗イディオタイプ抗体に対する親和性を有することが公知である（Ｂｒａｄｅｎら，１９９６，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｆｖ−Ｆｖ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  １．９Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４（１）：１３７−５１）。
【００４９】
いくつかの場合、そのＣＤＲ抗イディオトープは、外側抗原の「内側画像（ｉｎｔｅｒｎａｌ−ｉｍａｇｅ）」の構造的立体配置をとる（Ｂｅｎｔｌｅｙら，１９９０，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８（６２９８）：２５４−５７；Ｂａｎら，１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  Ｆａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（５）：１６０４−０８；Ｐｏｌｊａｋ，１９９４，Ａｎ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（５）：１５９９−１６００；Ｂｒａｄｅｎら，１９９６，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｆｖ−Ｆｖ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  １．９Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４（１）：１３７−５１；Ｉｌｉａｄｅｓら，１９９８，Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ  １１−１Ｇ１０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＮＣ４１  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈｅｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒｅｎｔ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．１７（３）：２４５−５４）。ある実施形態では、抗イディオタイプ抗体に等しいまたはそれより強い、抗原に対する親和性を有するイディオタイプ抗体を、使用する（Ｂｒａｄｅｎら，１９９６，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｆｖ−Ｆｖ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  １．９Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４（１）：１３７−５１，およびその中で引用される参考文献）。
【００５０】
例えば、目的のペプチドに結合してそのペプチドのレセプターに対する結合を競合的に阻害する抗体を、そのペプチドのレセプターを「模倣」して、それゆえそのペプチドに結合する抗イディオトープ抗体を産生するために使用し得る。抗イディオトープ抗体を、当業者に周知の技術を使用して産生し得る（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ，１９９３，Ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４；ならびにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，１９９１，Ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ：ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−３８を参照のこと）。
【００５１】
本発明の連結要素の組成物および方法において有用なイディオトープ／抗イディオトープ結合対の、例示的な限定されない例は、表１で以下に提供される。
【００５２】
【表１】
2005518454.tif 000002
ある実施形態では、特異的なイディオトープ／抗イディオトープ分子間相互作用を、ナノ構造の段階的アセンブリにおいてアセンブリ単位を一緒に連結するための連結要素として使用する（図１）。各誘導体アセンブリ単位を、交差反応を起こさない二つの特異的イディオトープ／抗イディオトープ結合表面を含むように設計する。これにより、アセンブリ単位の段階的アセンブリについての、多様なおよび多種の機能的要素を含む複雑なナノ構造を形成する系を創出する手段が提供される。複数の連結対を、ファージディスプレイの標準的方法により創出し得る（Ｗｉｎｔｅｒら，１９９４，Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｖｉｔｉら，２０００，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４８０−５０５）。さらに、抗体および抗体誘導体の三次元構造は、十分特徴付けられ（例えば、Ｂｒａｄｅｎら  １９９６，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｆｖ−Ｆｖ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  １．９Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４（１）：１３７−５１；Ｂａｎら，１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｄｉｏｔｙｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ｆａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（５）：１６０４−０８；Ｐｅｒｉｓｉｃら  １９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｂｏｄｙ，ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２（１２）：１２１７−２６；Ｈａｒｒｉｓら，１９９８，Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ＩｇＧｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５（５）：８６１−７２；Ｐｅｉら，１９９７，Ｔｈｅ  ２．０−Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｃｏｇｎａｔｅ  ＶＨ−ＶＬ  ｄｏｍａｉｎ  ｐａｉｒｓ  ｓｈｏｗｓ  ａ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＶＨ  ＣＤＲ３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１８）：９６３７−４２を参照のこと）、さらなる機能的要素を操作するための位置を、利用可能なＸ線座標の可視的調査により同定し得る。
【００５３】
ある実施形態では、抗体由来のアセンブリ単位のＣＤＲドメインの一つ（すなわち、連結要素の一つ）を、イディオトープとして操作し得る。他のＣＤＲを、非相補的な抗イディオトープ連結要素として操作し得る。連結要素は、互いに非同一かつ相互作用しないので、この設計は、タンパク質成分の自己重合を防止する。そのような連結要素を、分子生物学およびファージディスプレイ技術の組み合わせを使用して製造し得る（Ｗｉｎｔｅｒら，１９９４，Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｖｉｔｉら，２０００，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４８０−５０５）。結果として生ずる抗体由来のアセンブリ単位は、イディオタイプＣＤＲもしくは連結要素、および非相補的な抗イディオタイプＣＤＲ連結要素の両方を含む。
【００５４】
本発明のある実施形態では、次の付加サイクルにおいて結合されるべきアセンブリ単位を、イディオトープである連結要素および非相補的な抗イディオトープである連結要素と類似の方式で設計し得る。このアセンブリ単位の一つのＣＤＲは、しかしながら、連結要素として機能する前記のＣＤＲ成分の一つと会合するように操作され得る。それゆえ、ある実施形態では、二つの隣接したアセンブリ単位のＣＤＲを、相補的なイディオトープ／抗イディオトープ相互作用を有する連結要素を有するように設計し得る。この設計のアセンブリ単位の使用は、連結したアセンブリ単位の規定された方向性または配向、および全体としての段階的アセンブリの規定された方向性または配向（すなわち、各構築要素の方向性の付加）を可能にする。ダイアボディーのＣＤＲは、幾何学的に反対の向きであるので、そのアセンブリ単位を、既知の配向および方向性で、開始物またはナノ構造中間体に付加し得る。
【００５５】
（２つの非相補的イディオトープを含む連結要素）
特定の実施形態では、アセンブリ単位は、ダイアボティ単位を含むアセンブリ単位が製作され、ここで、非相補的連結要素は、２つの非相補的イディオトープから構成される。
【００５６】
ダイアボティ、またはその結合性誘導体または結合性フラグメントは、ナノ構造に、２つのＣＤＲの１つのみが用いられるような様式で組み込まれ得る。特定の実施形態では、ＣＤＲそれら自身が、連結要素として供され、そして２つのＣＤＲ間のダイアボティの本体が、構造的要素として供される。
【００５７】
二重特異性ダイアボティは、２つのペアでないｓｃＦｖフラグメントに由来する。ハイブリッドフラグメントの第１の部分は、１つのＦＶ抗体からのＶＨコード領域を含み、そして第２の部分は、別のＦｖ抗体由来のＶＬコード領域を含む。得られるＶＨ−ＶＬハイブリッドフラグメントは、短いＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって一緒に結合される。第２のハイブリッドフラグメントは、これもまた短いＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって一緒に結合される類似ではあるが、反対のコード領域ペアの結合を含む（図２および３）。ハイブリッドｓｃＦＶフラグメントのセットは、ＶＨとＶＬとの間の分子間相互作用によってペアとなる。
【００５８】
図４に示される例示の特定実施形態では、第１のアセンブリ単位（「ダイアボティ単位１」）を作製するために用いられる遺伝子は、リゾチームイディオトープ抗体Ｄ１．３（図４Ａ中、ＶＨＡおよびＶＬＡとして表される）（Ｂｒａｄｅｎら、１９９６、Ｆｖ−Ｆｖイディオトープ−抗−イディオトープ複合体の０．９Å解像度における結晶構造、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４（１）：１３７〜５１）、およびネコの感染性腹膜炎ウイルス中和イディオトープ抗体７３０．１．４．（図４Ａ中、ＶＨＢおよびＶＬＢとして表される）（Ｂａｎら、１９９４、イディオタイプ−抗−イディオタイプＦａｂ複合体の結晶構造、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（５）：１６０４〜０８）に由来する。ハイブリッドＶＨＡおよびＶＬＢ単位、およびハイブリッドＶＨＢおよびＶＬＡ単位を結合するリンカー配列は、Ｈｕｓｔｏｎらによって公開されたもの（１９８８、抗体結合部位のタンパク質操作；Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で産生された、抗ジゴキシン一本鎖Ｆｖアナログ中の特異的活性の回復、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９〜８３）を基に設計される。ダイアボティ単位１の構築物は、図４Ａ中Ａ×Ｂとして表される。プロモーター（ｐ）、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）、ｐｅｌＢリーダー（ｐｅｌＢ）、ＨＳＶおよびヒスチジン（ｈｉｓ）タグおよびストップコドン（Ｓｔｏｐ）の位置がまた、図４中に示される。ダイアボティを操作するための用いられるベクター系は、ｐＥＴ２５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）であり、これは、Ｔ７プロモーター、リボソーム結合部位、ｐｅｌＢリーダー配列、ＨＳＶおよびＨｉｓタグ配列を含む。
【００５９】
図４Ｂは、ダイアボティを含む第２のアセンブリ単位（ダイアボティ単位２）を示し、ここで、非相補的連結要素は、２つの非相補的抗イディオトープを含むように設計されている。この第２のアセンブリ単位を生成するために用いられる遺伝子は、リゾチーム抗イディオトープ抗体Ｅ５．２（図４Ｂ中、ＶＨＡ’およびＶＬＡ’として表される）（Ｂｒａｄｅｎら、１９９６、Ｆｖ−Ｆｖイディオトープ−抗−イディオトープ複合体の０．９Å解像度における結晶構造、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４（１）：１３７〜５１）、およびネコの感染性腹膜炎ウイルス中和イディオトープ抗体４０９．５．３（図４Ｂ中、ＶＨＢ’およびＶＬＢ’として表される）（Ｂａｎら、１９９４、イディオタイプ−抗−イディオタイプＦａｂ複合体の結晶構造、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（５）：１６０４〜０８）に由来する。ダイアボティ単位２の構成は、Ａ’×Ｂ’として表される。これら２つの例示のアセンブリ単位は、本明細書に記載の段階的アセンブリの方法によってナノ構造を製作するために開始単位と組合せて用いられ得る。
【００６０】
（ペプチドエピトープを含む連結要素）
本発明の特定の実施形態では、連結要素は、ペプチドエピトープを含む。ペプチドエピトープは、アセンブリ単位に操作され得、抗体または抗体の結合性フラグメントと相補的ペアを形成する連結要素として作用し、そのＣＤＲは、ペプチドエピトープに特異性で結合する。ペプチドエピトープは、上記のアセンブリ単位内に含まれる複数の規定された領域中にスプライスされ得る。ペプチドエピトープは、ペプチドエピトープが隣接するナノ構造のアセンブリ単位を一緒に架橋するために用いられるような実施形態に加え、多くの実施形態における使用のための連結要素として特に好適である。従って、ペプチドエピトープは、それらが組み込まれるアセンブリ単位に多能を提供する。
【００６１】
例えば、特定の実施形態では、ペプチドエピトープは、予め存在する分枝からナノ構造の新たな分枝のアセンブリのための開始点であり得る結合部の連結要素として供され得る。このような分枝は、一次、二次、または三次構造を生成するために用いられ得る。それは、単一の一次元構造を超えて拡張するためか、または一次元構造に機能的単位を付着するために用いられ得る。あるいは、このような連結要素は、ナノ構造中間体への別に製作されたナノ構造サブアセンブリの付加のための結合部位として供され得る。その他の実施形態では、それらは、連結または結合された機能的要素を有する抗体のための結合部位として供され得る。
【００６２】
特定の実施形態では、アセンブリ単位は、ペプチドエピトープ連結要素を含む抗体フラグメントを含む。Ｆａｂフラグメント内の固有の柔軟性は、段階的アセンブリにあるナノ構造のアセンブリ単位間の種々の架橋幾何学を可能にする連結要素の挿入のために有利に用いられ得る。１つの実施形態では、段階的アセンブリのために必要なＦａｂフラグメント上さらなる分子間結合部位を取り込むために、Ｃ末端遠位端、またはβターン領域が操作されてペプチドエピトープを含む。例示のペプチドエピトープは、表２に提示されている。
【００６３】
特定の例示のアセンブリ単位は、細菌ファージＴ４テールファイバータンパク質ｇｐ３７の改変体であり、そこでは、ポリペプチドのＣ末端ドメインが改変されて、全体の分子上に特異的結合性質を与える配列、例えば、ビオチンを認識するアビジン由来の配列、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ａタンパク質を認識する免疫グロブリン重鎖由来の配列、それらの個々のＦａｂ軽鎖相当物が付着し得る、抗原結合部位を形成するモノクローナル抗体の重鎖のＦａｂ部分由来の配列、特異的抗体を認識する免疫活性配列、または特定金属イオンを結合する配列を含む。これらリガンドは、精製および／またはアセンブリを容易にするために固定化され得る。
【００６４】
【表２】
2005518454.tif 000003
2005518454.tif 000004
１つの実施形態において、ペプチドエピトープは、フラグメントに含まれる規定したβ−ターンモチーフを、直接的に置換し得る。あるいは、ペプチドエピトープは、分子生物学の標準的な方法によって、ＣＨ１の重鎖のＣ末端アミノ酸に連結され得る（Ｗａｌｌａｃｅら、２００１、Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ＦｃｇａｍｍａＲＩ  ｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：１８３−９４）。表３は、連結要素または機能的要素の挿入に適したＩｇＧおよびＩｇＧ誘導体中に含まれる同定されたペプチド領域の例を示す。
【００６５】
（表３：連結要素または機能的要素の挿入のためのＩｇＧおよびＩｇＧ誘導体中に含まれる同定されたペプチド領域）
【００６６】
【表３】
2005518454.tif 000005
2005518454.tif 000006
2005518454.tif 000007
表３  注記：
１残基領域は、原子座標の分析により、インタクトなＩｇＧ１のＦｃフラグメント中に規定し、登録番号１ＩＧＹでＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａ  ｂａｎｋ（ＢＮＬ−ｐｄｂ）（Ｂｅｒｍａｎら、２０００、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３５−４２；１９７７、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ．Ａ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ａｒｃｈｉｖａｌ  ｆｉｌｅ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８０（２）：３１９−２４）に寄託した残基アラインメントに従って、番号付けしている。
【００６７】
２鎖アラインメントは、対応する寄託したｐｄｂ座標に従って標識している。
【００６８】
３残基領域は、原子座標の分析により、Ｆａｂフラグメント中に規定し、登録番号１ＣＩＣでＢＮＬ−ｐｄｂに寄託した残基アラインメントに従って、番号付けしている。
【００６９】
４残基領域は、原子座標の分析により、ｓｃＦｖフラグメント内に規定し、登録番号２ＡＰ２でＢＮＬ−ｐｄｂに寄託した残基アラインメントに従って、番号付けしている。
【００７０】
５残基領域は、原子座標の分析により、ダイアボディフラグメント内に規定し、登録番号１ＬＭＫでＢＮＬ−ｐｄｂに寄託した残基アラインメントに従って、番号付けしている。
【００７１】
別の実施形態では、得られるＦａｂフラグメントは、分子のＮ末近位端に、抗原結合ドメインを含む。このＦａｂフラグメントはまた、規定されたβターンモチーフを置換してＦａｂフラグメント中の位置に挿入されるか、またはＦａｂフラグメントのＣ末遠位端に直接連結される、ペプチドエピトープである連結要素を含む。従って、Ｆａｂフラグメントに融合されるペプチドエピトープは、同族の免疫結合された機能的部分の認識および結合により、付着点として供し得る高度に特異的な連結要素として役に立つ。
【００７２】
（抗体構造的要素）
抗体は、約２２０のアミノ酸の軽（Ｌ）鎖および４５０〜５７５アミノ酸の重（Ｈ）鎖を含むポリペプチド鎖から構成される多価分子である。インタクトなＩｇＧ分子の平均分子量は、１５２〜１９６ｋＤの範囲である。抗体に対して実施された構造研究は、軽鎖および重鎖の両方が、「免疫グロブリン折畳み」と称される特徴的ドメインを含むことを示した。この免疫グロブリン折畳みは、ジスルフィド結合によって一緒に連結された、２層のアンチ平行βシートからなる樽形状のサンドイッチとして規定される。抗体中の優勢な二次構造は、αヘリックスの短いストレッチをもつアンチ平行βシートである（総説には、Ｐａｄｌａｎ、１９９４、抗体分子の解剖、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９〜２１７；Ｐａｄｌａｎ、１９９６、抗体のＸ線結晶学、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．４９：５７〜１３３；およびそれらに引用される参考文献を参照のこと）。
【００７３】
軽鎖は、２つの免疫グロブリンドメインを含み、１つはＮ末端部分にあり、これは、抗体によって異なり（ＶＬ）、そして他方はＣ末端部分にあり、これは相対的に一定（ＣＬ）である。重鎖は、免疫グロブリンのクラスに依存して、４つまたは５つの免疫グロブリンドメインを含む。このＮ末端ドメインは変動し（ＶＨ）、そして他方の遠位ドメインは一定である（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および特定の場合にはＣＨ４）。軽鎖および重鎖の単位は、ジスルフィド結合、およびその他の非共有相互作用によって会合し、２つの軽鎖および２つの重鎖から構成される特徴的なＹ形状の二量体を形成する。ＶＬ鎖およびＶＨ鎖を含む抗体フラグメントは、Ｆｖフラグメントと称される。全軽鎖、および重鎖の可変部分および第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む部分は、Ｆａｂフラグメントと称される。Ｆａｂ中の可変ドメインの定常ドメインとの相互作用は、非常に強くはなく、この分子の全体の構造にある程度の柔軟性と位置変動性を与える。Ｆａｂ可変ドメインとＦａｂ定常ドメインとの間の角度における大きなバリエーション（１２７〜１７６゜）がある。この角度は、Ｆａｂ「エルボー」または「曲がり」として知られる（Ｐａｄｌａｎ、１９９４、抗体分子の解剖学、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９〜２１７）。
【００７４】
２つのＦａｂアームのＮ末端領域は、抗原を結合する（Ｍｉａｎら、１９９１、抗体結合部位の構造、機能および性質、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１７（１）：１３３〜５１；Ｗｉｌｓｏｎら、１９９４、抗ペプチド抗体複合体の構造、Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５（１）：７３〜８；Ｗｉｌｓｏｎら、１９９４、抗体−抗原相互作用：新規構造および新規立体配座変化、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４（６）：８５７〜６７）。Ｆａｂアームは、次に、柔軟性ポリペプチドによって、Ｆｃフラグメントと称される第３のフラグメントに連結され、これは、抗原を遊離しかつ抗原結合部位を二量体化するエフェクター機能の引き金となる原因である。
【００７５】
ＩｇＧ抗体分子のＦｃ部分は、２つの定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３から構成される。ＦａｂおよびＦｃフラグメントを連結するポリペプチドセグメントは、ヒンジとして規定され、そして抗体クラスおよびイソ形に依存して変化する長さおよび柔軟性を有する。この柔軟性ヒンジ領域は、抗体のＦｃとＦａｂフラグメントとの間に天然の境界を提供する。インタクトなＩｇＧ分子中に含まれるヒンジおよびＦａｂエルボーまたは曲がりは、２つの抗原結合部位間の有意な柔軟性を可能にし、そして多くの架橋幾何学を可能にする（図５および６）。
【００７６】
天然および組換え抗体フラグメントを構成するタンパク質は、段階的アセンブリによってアセンブルされるナノ構造の構造的要素のための候補である。本発明の段階的アセンブリ法で用いられる抗体は、制限されないで、ＩｇＧモノクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体を含む。本発明の段階的アセンブリ法で用いられる抗体の結合誘導体、または抗体の結合性フラグメントはまた、制限されないで、単量体（（ｓｃＦｖ）フラグメント、二量体（（ｓｃＦｖ）２またはダイアボティ）、三量体（（ｓｃＦｖ）３またはトリアボディ）および四量体（（ｓｃＦｖ）４またはテトラボディ）の単鎖抗体を含む単鎖抗体（ｓｃＦｖ）；Ｆａｂフラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；およびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント（Ｈｕｓｅら、１９８９、ファージラムダにおける免疫グロブリンレパートリーの大コンビナトリアルライブラリーの生成、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、１２７５〜８１）。
【００７７】
（モノクローナル抗体を含む構造的要素）
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、またはその結合誘導体もしくはその結合フラグメントを、本発明の方法に従って構造的要素として使用し得る。ｍＡｂは、特定の抗原に対して指向される抗体の均質の集合である。目的の抗原に対するｍＡｂを、抗体分子の産生を提供する当該分野で公知の任意の技術を使用することによって調製し得る。これらとしては、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７；ＶｏｅｔおよびＶｏｅｔ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ３４）によりもともと記載されるハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２−７９；Ｋｏｚｂｏｒら、米国特許第４，６９３，９７５号、表題「Ｈｕｍａｎ  ｈｙｂｒｉｄｒｏｍａ［ｓｉｃ］ｆｕｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」１９８７年９月１５日に発行）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６；Ｒｏｄｅｒら、１９８６，Ｔｈｅ  ＥＢＶ−ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：１４０−６７）が挙げられる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスを含む任意の免疫グログリンクラスであり得る。本発明の方法において使用され得るｍＡｂは、当該分野で一般に公知の任意の技術により合成され得る。例えば、ヒトモノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の多くの技術により作製され得る（例えば、Ｔｅｎｇら、１９８３，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ−−ｈｕｍａｎ  ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８０：７３０８−１２；Ｃｏｌｅら、１９８４，Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２（２）：１０９−２０；Ｏｌｓｓｏｎら、１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３−１６）。
【００７８】
対照的に、ポリクローナル抗体は、本発明の成分として使用され得ない。ポリクローナル抗体は、異なる明確な特異性を有する多くの分子が存在する抗体の集合を表す。これらは特定の抗原に全て結合し得るが、異なる外形、ナノ構造の明確なアセンブリと一致しない特性を有する抗原の異なる部分に結合する。
【００７９】
（多重特異的抗体を含む構造的要素）
多重特異的抗体またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを、本発明の段階的アセンブリ方法における使用のための構造的要素として使用し得る。本明細書中で使用される場合「特異的」または「特異性」は、規定されたエピトープを１つの異なる抗原認識部位に結合させる抗体の能力を言う。従って、二重特異的抗体は、２つの異なる抗原認識部位を含み、各々が異なる抗原と結合し得る。多重特異的抗体は、２つより多い異なるエピトープを結合する能力を有し、各々が、異なる連結要素（すなわち、抗原認識部位）の作用を介する。
【００８０】
特定の実施形態において、均質な二重特異的ｍＡｂまたは多重特異的ｍＡｂは、リンパ球クローンの不死化（ｉｍｍｏｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を介して構造的要素としての使用のために作製され得、一般にモノクローナル抗体の産生のために上記のような目的の抗原に対して惹起されるリンパ球を有する融合ミエローマ細胞によって作製され得る。このような方法によって、多重特異的ｍＡｂは、実質的に限定されない量で産生され得る。当該分野で周知の方法を使用して、選択された生物学的物質を特異的に標的化し、結合する多重特異的ｍＡｂが、作製され得る（例えば、Ｃｏｌｃｈｅｒら、１９９９，Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，  Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８０：２６３−８０；Ｈｕｄｓｏｎ，１９９９，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（５）：５４８−５７；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９９，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｎｄｅｍ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３（１）：４１−５６；Ｓｅｇａｌら、１９９９，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（５）：５５８−６２；Ｔｒａｉｌら、１９９９，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（５）：５８４−８８；Ｈｕｄｓｏｎ，２０００，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ９（６）：１２３１−４２を参照のこと）。
【００８１】
特定の実施形態において、本発明の方法に従う構造的連結として使用のための多重特異的ｍＡｂは、二重特異的および／または二価ｍＡｂであり得る。二重特異的抗体は、２つの異なるエピトープに結合する能力を有し、各々が、異なる抗原認識部位上に含まれる。二価抗体は、２つの異なるエピトープに結合する能力を有する。
【００８２】
二重特異性抗体は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る（例えば、Ｗｅｉｎｅｒら、１９９５、Ｂ細胞悪性腫瘍の二重特異性モノクローナル抗体治療、Ｌｅｕｋ、Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １６（３−４）：１９９〜２０７；Ｈｅｌｆｒｉｃｈら、１９９８、Ｔ細胞を、ヒト癌腫を標的とするようにさせるための二重特異性ダイアボティの構築および特徴付け、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６（２）：２３２〜３９；Ａｒｎｄｔら、１９９９、異物移植ヒトホジキン腫瘍に対する天然のキラー細胞傷害性を媒介する二重特異性ダイアボティ、Ｂｌｏｏｄ  ９４（８）：２５６２〜８；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９９、改善された抗原結合性および薬物動態学をもつ、腫瘍治療のための二重特異性タンデムダイアボティ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３（１）：４１〜５６；Ｓｕｎｄａｒａｐａｎｄｉｙａｎら、２００１、ホジキンリンパ腫細胞の二重特異性抗体媒介破壊、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：１１３〜２３を参照のこと）。
【００８３】
多価および多重特異性抗体の産生のための技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、１９９７、多価および多重特異性抗体フラグメントへの新規タンパク質エンジニアリングアプローチ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３（２）：８３〜１０５；Ｓａｎｔｏｓら、１９９８、医療治療および診断のためのより効目のある抗体の開発、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６０：１６９〜９４；Ａｌｔら、１９９９、単一鎖ダイアボティを免疫グロブリンガンマ１ＦｃまたはＣＨ３領域と結合する新規な三価および二価ＩｇＧ様抗体分子、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５４（１−２）：９０〜９４；Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９、高結合活性ｓｃＦｖマルチマー；ダイアボティおよびトリアボディ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１７７〜８９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０００、多価および二重特異性抗体フラグメントを生成する方法、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１〜７９；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら、２００１、癌を標的にするためのダイアボティ、トリアボディおよびテトラボディの設計および適用、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：４７〜６６を参照のこと。例えば、既知の特異性の抗体をコードする遺伝子は、ハイブリドーマ細胞株から回収され得、そして組換えＤＮＡ技法の採用により再配列されたＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子をクローニングするための出発材料を提供し得る（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから分泌された単一の免疫グロブリン可変領域のレパートリーの結合活性、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１（６２４２）：５４４〜４６：Ｓｈｅｅｔｓら、大非免疫ファージ抗体ライブラリーの効率的構築；タンパク質抗原に対する高親和性ヒト一本鎖抗体の産生、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５（１１）：６１５７〜６２）。ユニバーサルＤＮＡプライマーは、標的Ｖドメイン遺伝子にアニールするために設計され、そしてポリメラーゼ連鎖反応も採用により増幅される。これらプライマー内の制限部位の設計により、得られる増幅されたＤＮＡ産物は、細菌、酵母、植物および昆虫細胞を含む異なる宿主の範囲における発現のために直接クローン化され得る（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０００、多価および二重特異性抗体フラグメントを生成するための方法、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１〜７９）。ハイブリドーマ細胞株よりはむしろ、これらの宿主細胞が、本発明の方法における使用のための組換え操作された抗体の産生のために用いられ得る。
【００８４】
本発明の特定の実施形態では、構造的要素は、ダイアボティフラグメントを含む。ダイアボティは２つのＣＤＲを有し、そして２つの高度に特異的な非共有結合相互作用をし得る。ダイアボティ、またはその結合誘導体または結合フラグメントは、２つのＣＤＲの１つのみが用いられるようにナノ構造中に取り込まれ得る。特定の実施形態では、ＣＤＲそれら自身が連結要素として供され、そして２つのＣＤＲ間のダイアボティの本体は、構造的要素として供される。
【００８５】
当該分野で周知の方法が、Ｅ．ｃｏｌｉからのダイアボティフラグメントの発現、精製および特徴付けのために用いられる（Ｐｏｌｊａｋ、１９９４、イディオトープ−−抗−イディオトープ複合体および分子模倣の構造的基礎、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（５）：１５９９〜６００；Ｚｈｕら、１９９６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのヒト化二重特異性ダイアボティの高レベル分泌、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１４（２）：１９２〜９６；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら、２００１、癌を標的にするためのダイアボティ、トリアボディおよびテトラボディの設計および適用、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：４７〜６６）。ダイアボティフラグメントを含む構造的要素の例は、図４に示されている。図４に表されるダイアボティ発現カセットは、ダイアボティフラグメントをコードするＶＨドメイン遺伝子のＮ末端に、スプライスされるｐｅｌＢシグナル配列が標的にされ、そしてＥ．ｃｏｌｉペリプラズム空間中に分泌されるよう設計され、ここで、酸化的環境が、ダイアボティの適正な折畳みを可能にする。誘導後、過剰発現されたダイアボティフラグメントは、当該分野で周知の確立されたプロトコールに従って、Ｅ．ｃｏｌｉペリプラズムから回収される。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態では（図４）、ダイアボティは操作されて、ＶＬドメインのＣ末端にヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６）が付加され、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー樹脂を用いる精製を容易にする（Ｓｃｏｐｅｓ、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｌｏｎｄｏｎ、１８３〜８５頁；Ｓｃｏｐｅｓ、１９９４  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｐｒｉｎｃｅｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｔｅｘｔｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３版、Ｌｏｎｄｏｎ）。ダイアボティアセンブリ単位１のタンパク質過剰発現（図４Ａ）は、例えば、２（ＶＨＡ×ＶＬＢＨｉｓ６）、２（ＶＨＢ×ＶＬＡ）、および（ＶＨＢ×ＶＬＡ、ＶＨＡ×ＶＬＨｉｓ６）を含む種の混合物を含む。Ｈｉｓ６タグの数は、その時点で混合物中に含まれる各タンパク質単位が溶出するイミダゾールの濃度を決定する（２０〜２５０ｍＭグラジエント）。ヘキサヒスチジンタグのないものは、カラム樹脂に対して親和性がほとんどないか、またはない。１つのヘキサヒスチジンタグをもつものは、ほぼ２０〜４０ｍＭの間のイミダゾールで溶出し（二重特異性ダイアボティ）、そして２つのヘキサヒスチジンタグをもつものは、ほぼ５０〜１００ｍＭの間のイミダゾールで溶出する。溶出ピークは、ＵＶ吸光度によって検出され得、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ネイティブ−ＰＡＧＥまたはＥＬＩＳＡアッセイによって確認される。上記に記載の精製手順がたとえ、所望されない非二重特異性ダイアボティ副産物の単離を防ぐとしても、目的の単離されたダイアボティが本明細書で以下に記載のような機能的二重特異性を有することを確実にする方法が採用される。
【００８７】
図４は、Ａ×Ｂダイアボディを示し、ここで、ＡのＶＨドメインおよびＶＬドメインはリソザイム同位体抗体（Ｄ１．３）を規定し、ＢのＶＨドメインおよびＶＬドメインはウイルス中和イディオトープ抗体（７３０．１．４）を規定する。望ましいダイアボディ産物の精製を容易にするために、ＶＨＡおよびＶＬＢをコードする遺伝子は、ヘキサヒスチジンタグを含み、一方、ＶＨＢおよびＶＬＡをコードする遺伝子は、ヘキサヒスチジンタグを含まない。図４Ｂは、Ｂ’×Ａ’ダイアボディを示し、ここで、Ｂ’のＶＨドメインおよびＶＬドメインはウイルス中和イディオタイプ抗体（４０９．５．３）を規定し、Ａ’のＶＨドメインおよびＶＬドメインはリソザイム同位体抗体（Ｅ５．２）を規定する。望ましいダイアボディ産物の精製を容易にするために、ＶＨＢ’およびＶＬＡ’をコードする遺伝子は、ヘキサヒスチジンタグを含み、一方、ＶＨＡ’およびＶＬＢ’をコードする遺伝子は、ヘキサヒスチジンタグを含まない。
【００８８】
特定の実施形態において、サンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルまたはＢＩＡｃｏｒｅプロトコルが、両方の抗原結合部位の同時かつ二重占拠（二重特異性）ならびに平衡定数を決定するために実施され得る（Ａｂｒａｈａｍら、１９９６、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．９（５−６）：４５６−６１；ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら、１９９６、Ｐｈａｇｅ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（９）：１１４９−５４；ＭｃＣａｌｌら、２００１，Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（１０）：６１１２〜１７）。イディオタイプ／抗イディオタイプ結合定数がＢＩＡｃｏｒｅ技術を使用して決定される特定の実施形態において、それらの抗体のうちの一方は液相中に溶解し、他方は、固相に結合される。この技術を実施することによって、解離定数（Ｋｄ）を決定するための会合速度および解離速度（それぞれＫｏｎおよびＫｏｆｆ）の決定が可能である（Ｇｏｌｄｂａｕｍら、１９９７、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１６）：８６９７〜７０１）。組換え抗原を必要としないが二重特異性を検出し得る他のプロトコルもまた使用され得、そのプロトコルとしては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９７、Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｗｉｔｈ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（７）：６３２−３６）により記載されるような、ロゼッティング（ｒｏｓｅｔｔｉｎｇ）アッセイが挙げられる。
【００８９】
特定の実施形態において、ダイアボディは、連結要素、構造的要素、または機能的要素を挿入するための１つ以上の部位を含み得る。表４は、連結要素、構造的要素、または機能的要素を挿入するために使用され得る、ダイアボディ単位中に含まれるペプチド領域を示す。ペプチド領域は、目的のタンパク質（例えば、抗体またはその結合誘導体もしくは結合フラグメント）の一部である。ペプチド領域は、好ましくは、目的のタンパク質の表面上に露出しており、そしてさらなるペプチドの挿入もしくはその配列の変化またはそれらの両方を介して、再構築され得る。表４は、ＶＨ−ＶＬ改変ドメイン結合（ｐｄｂエントリー１ＬＭＫ）を含むダイアボディの表面上に位置するβ−ターンとして同定されたアミノ酸を要約する。残基領域は、原子座標の分析からダイアボディ内に規定され、そしてエントリー１ＬＭＫｐｄｂの下で寄託された残基割当てに従って番号付けされる。鎖の割当ては、対応する寄託ｐｄｂ座標に従って標識される。
【００９０】
【表４】
2005518454.tif 000008
特定の実施形態において、結合部位が、連結要素としてダイアボディに付加されて、対向するＣＤＲにより形成される２つの連結要素に加えて、可能な構造ブランチ、フォーク、Ｔ結合、または多次元構築結合部位を作製し得る。タンパク質中の表面ループの配列の変化は、タンパク質の全体的フォールディングに対してほとんど影響を有さないようであり、β−ターンの部位での挿入変異体を生成することが、しばしば可能である。この表面ループは、そのタンパク質表面を破壊する最小限の可能性で配列をそのタンパク質に付加し得る、位置である。
【００９１】
このダイアボディ単位内の特定の部位は、挿入のために以前に規定されている。例えば、特定の実施形態において、連結要素が、内部スプライシングされ得るか、または本明細書中の表４に開示されるようなβ−ターン残基を置換し得る。ダイアボディの一般的３次元構造は公知であり、かつ類似の配列のダイアボディの３次元構造をホモロジーモデリング（ＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ，１９９７，ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬならびにＳｗｉｓｓ−ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ：Ａｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８：２７１４〜２３；ＧｕｅｘおよびＰｅｉｔｓｃｈ，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗｓ  ６：１３２〜３４；Ｇｕｅｘら、１９９９、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｌｌ、ＴＩＢＳ  ２４：３６４〜６７）することが可能であるので、既知の構造のダイアボディと類似するアミノ酸配列のダイアボディの表面上に位置するβ−ターンが、（例えば、ＢＬＡＳＴ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２）を使用する）配列比較によって容易に同定され、その後、類似する配列のタンパク質のＸ線座標の視覚的検査される。
【００９２】
１つの実施形態において、ダイアボディの３次元構造の視覚的検査は、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにおいて実施する分子可視化パッケージＱＵＡＮＴＡ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて実施される。ダイアボディ分子の原子の３次元位置を規定する座標は、ＰＤＢエントリー１ＬＭＫ中に含まれる。そのような分析をすると、表４に示される残基を含む表面ループが存在することが、明らかであり、その残基は、ＨＩＶ−１  Ｖ３ループ抗原のようなペプチドの挿入を受容する能力が高い部位を示す。このダイアボディ分子の表面ループ中に含まれるすべてのアミノ酸は、この情報から決定され得、これらの表面ループの相対的空間位置もまた、決定され得る。操作される免疫グロブリンの３次元構造により提供される情報は（Ｘ線結晶学から直接誘導されるようと、または相同構造に基づくホモロジーモデリングから誘導されようと）、表面ループを構成するアミノ酸に対応する目的タンパク質中のアミノ酸すべての同定を可能にする。
【００９３】
特定の実施形態において、Ｈ−ｒａｓタンパク質に由来するペプチドエピトープをコードするＤＮＡが、Ｘ線結晶学により決定される３時限原子座標の視覚的検査によって規定される部位にあるダイアボディアセンブリ単位コード配列中に挿入される。このＨ−ｒａｓエピトープは、いずれかの側にある４つのグリシンに隣接して、同族抗体結合のための可撓性および接近可能性を提供する。
【００９４】
一旦このダイアボディアセンブリ単位／ｒａｓペプチドタンパク質融合物（Ｂｒａｓ×Ａによって示される）が発現されそして精製されると、ダイアボディの価および機能の保持、ならびに適切な抗体によるエピトープ認識について、この融合物は、ＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅ分析のような方法により特徴付けられる。
【００９５】
機能的要素（例えば、酵素、毒素、および抗原性ペプチド）は、ｓｃＦｖフラグメントの末端に首尾良くすでにスプライシングされて、種々の多機能抗体を生じている（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９、Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（６２２３）：３９４〜９７；Ｓｕｚｕｋｉら、１９９７、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｐｔｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２２（２）：３２２〜２９；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００１、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１６（１）：２５〜３５）。タンパク質またはペプチドから構成される機能的要素は、分子生物学的な方法を使用して、アセンブリ単位のタンパク質様部分に直接融合され得、その後、適切な宿主においてタンパク質発現される。
【００９６】
（Ｆａｂ抗体フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２抗体フラグメントを含む、構造的要素）
本発明の特定の実施形態において、ナノ構造の段階的アセンブリのための構造的要素は、抗体フラグメントを含む。そのようなフラグメントとしては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられるがこれらに限定されず、このＦ（ａｂ’）２フラグメントは、ＩｇＧ抗体分子のペプシン消化によりＦｃ部分を放出することによって生成され得る。ペプシン消化の後に、生じたＦ（ａｂ’）２フラグメント間のジスルフィド結合が還元され、それにより単一のＦａｂフラグメントが生成され得る。
【００９７】
Ｆａｂフラグメントは、その分子のＮ末端に一価かつ一重特異性のＣＤＲを含む、細長い操作可能な形状の分子である。特定の実施形態において、アセンブリ単位は、ＦａｂフラグメントのＣ末端部分にペプチドエピトープを挿入することによって、Ｆａｂフラグメントから操作される。結果として、ＦａｂフラグメントのＣ末端に融合されたペプチドは、別の操作されたＦａｂの標的として作用し得、段階的アセンブリにより構築されるナノ構造において隣接するＦａｂ間に、非常に特異的でありかつ緊密な相互作用を提供する。Ｆａｂフラグメントの大きさ、形状および構造（図６）は、そのＦａｂフラグメントを、構造的要素としての使用に好ましくする。なぜなら、Ｆａｂフラグメントはまた、その構造によって、天然に存在する連結要素を含むからである。電子顕微鏡研究およびＸ線構造研究は、Ｆａｂフラグメントの近位部分がしばしば遠位部分と直線的に反対にあることを明らかにした（Ｆｉｓｃｈｍａｎら、１９９１、Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦａｂＤ１．３−ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  ２．５  Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２９１５〜２０；Ｂａｎら、１９９４、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｄｉｏｔｙｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ｆａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（５）：１６０４〜８；Ｐａｄｌａｎ，１９９６、Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．４９：５７〜１３３；Ｈａｒｒｉｓ，Ｓｋａｌｅｔｓｋｙら、１９９８）。可撓性のエルボー屈曲（このフラグメントの中央に位置する）によって、別の幾何構造が可能になる（Ｒｏｕｘら、１９９７、Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９（７）：３３７２〜８２；Ｒｏｕｘら、１９９８、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３  ｈｉｎｇｅ  ｍｕｔａｎｔｓ，ＩｇＭ，ＩｇＥ，ａｎｄ  ＩｇＡ２，ｔｏ  ｆｏｒｍ  ｓｍａｌｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（８）：４０８３〜９０）。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが、構築され（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  ｐｈａｇｅ  ｌａｍｄａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５〜８１）て、望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にし得る。
【００９８】
（単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む構造的要素）
本発明の方法に従って、ナノ構造の段階的アセンブリは、特定の実施形態においては、単鎖ｓｃＦｖフラグメントを含む構造的要素を使用し得る。ｓｃＦｖ抗体は、Ｆｖ可変重鎖（ＶＨ）のカルボキシル末端をＦｖ可変軽鎖（ＶＬ）のアミノ末端に（またはその逆）に連結する融合ペプチドから構成される（Ｆｒｅｕｎｄら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３（１１）：３２９６〜３０３；Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９、Ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｓｃＦｖ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ；ｄｉａｏｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１７７〜８９；Ｌｅ  Ｇａｌｌら、１９９９、Ｄｉ−，ｔｒｉ−  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１９：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖａｌｅｎｃｙ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４５３（１−２）：１６４〜６８；Ｗｏｒｎら、２００１、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５（５）：９８９〜１０１０）。
【００９９】
単鎖抗体はまた、本発明の段階的アセンブリ方法における使用のための構造的要素として使用され得る。単鎖抗体は、例えば、Ｌａｄｎｅｒ（１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７７８号、「Ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｌｙｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｈａｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」）；Ｂｉｒｄ（１９８８、Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２（４８７７）：４２３〜２６））；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ：ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｄｉｇｏｘｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜８３）またはＷａｒｄら（１９８９、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉｂａｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４〜４６）の方法によって、生成され得る。
【０１００】
ｓｃＦｖフラグメントは、Ｆａｂフラグメントとして可視化され得、エルボー屈曲で半分に切断され、末端定常軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインを欠いている、Ｆａｂフラグメントの部分構造である（Ｆｒｅｕｎｄら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｙａｎｍｉｃ  ｐｒｏｐｅｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｎｎｕｃｌｅａｒ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３（１１）：３２９６〜３０３；Ｍａｌｂｙら、１９９８、Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｉｇｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９（４）：９０１〜１０（図２））。Ｆａｂフラグメントのような細長くかつ操作可能な形状ではなく、ｓｃＦｖは、もっと小さくかつもっと球状である。Ｆａｂフラグメントのほぼ半分のサイズであるが、ｓｃＦｖフラグメントは、なお、機能性一価／一重特異性ＣＤＲを、その分子のＮ末端部分に含む。ｓｃＦｖは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現され得る最小の抗原結合モチーフを示す。
【０１０１】
一般に、ｓｃＦｖフラグメントは、一価であり、インタクトな抗体のＦｖ部分において見出されるもの類似する３次構造および４次構造を維持する（図５および２）（Ｂｏｕｌｏｔら、１９９０、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｆｖ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄ１．３  ａｎｄ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，ｌｙｓｏｚｙｍｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１３（４）：６１７〜１９；Ｂｒａｄｅｎら、１９９６、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ｆｖ−Ｆｖ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  １．９  Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４（１）：１３７〜５１；Ｆｕｃｈｓら、１９９７、Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｃＦｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃ−ｍｙｃ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６（３）：２２７〜３３；Ｈｏｅｄｅｍａｅｋｅｒら、１９９７、Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃ２１９．Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｔ  ２．４  Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４７）：２９７８４〜８９；Ｍａｌｂｙら、１９９８、Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９（４）：９０１〜１０）。最適には１５アミノ酸長であるＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーが、２つの可変フラグメントを連結してＶＨドメインとＶＬドメインとの間の好ましい相互作用を維持するのを補助するために、使用され得る（Ｐｅｒｉｓｉｃら、１９９４、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｂｏｄｙ，ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２（１２）：１２１７〜２６；Ｔａｋｅｍｕｒａら、２０００、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｏｂｏｄｙ（ｓｍａｌｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（８）：５８３〜８８；Ｗｏｒｎら、２００１、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５（５）：９８９〜１０１０）。これらのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーは、可撓性およびプロテアーゼ耐性を提供するために使用され得る。さらに、ｓｃＦｖ抗体フラグメントは、抗原認識および抗原結合に関して、インタクトな抗体と同様の機能を有する。
【０１０２】
ｓｃＦｖフラグメントの小さなサイズおよびＣＤＲの相対的位置によって、ｓｃＦｖフラグメントは、ナノ構造の製造のために本発明のアセンブリ単位中に組み込まれるべきタンパク質成分として非常に適合する。Ｆａｂフラグメントを上回るｓｃＦｖの一利点は、ｓｃＦｖの操作および生成のための技術が、より進歩していることである（例えば、Ｗａｒｄ、１９９３、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  ｈｏｓｔ，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１−２０；Ｌｕｏら、１９９６、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｗｉｔｈ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）１２０（２）：２２９〜３２；Ｗｕら、２０００、Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ｇｅｎｅｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ，Ｑ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４（３）：２６８〜８３；Ｗｏｒｎら、２００１、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５（５）：９８９〜１０１０）を参照のこと）。これらの当該分野で公知の方法を使用して、特定のＣＤＲが作製され得、そして機能的要素が、ナノ構造の段階的アセンブリにおいて有用なアセンブリ単位中に組み込まれるべきタンパク質成分としての使用のためにｓｃＦｖ’に付加され得る。
【０１０３】
別の実施形態において、Ｆａｂフラグメントについて上記されたのと類似するストラテジーが、ｓｃＦｖ上にさらなる分子間結合部位を組み込むために使用される。Ｃ末端遠位部分またはβ−ターン領域が、規定されたペプチドエピトープ（例えば、下記表２に提供されるものであるが、これらに限定されない）によって置換され得る。これらのペプチドエピトープは、当該分野で周知の組換えＤＮＡ手順を使用して適切なコードＤＮＡ配列を操作することによって、規定されたβ−ターンモチーフを置換し得るか、またはＶＨ重鎖またはＶＬ重鎖のＣ末端アミノ酸に（結合した重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの順序に依存する）（表３）に直接結合され得る。生じたｓｃＦｖフラグメントは、そのｓｃＦｖフラグメントの一部に抗原結合認識部位を含み、そして規定されたβ−ターンモチーフを置換するかまたはそのｓｃＦｖフラグメントのＣ末端部分で連結されているかのいずれかである、ペプチドエピトープである連結要素を含む。従って、融合ペプチドエピトープは、段階的アセンブリにおいてｓｃＦｖを含む隣接アセンブリ単位間での結合対の形成における、非常に特異的な連結要素として役立る。
【０１０４】
（二重特異性ＩｇＧ抗体、キメラＩｇＧ抗体、または二重特異性ヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２抗体を含む、構造的要素）
本発明の特定の実施形態において、構造的要素は、抗体フラグメント（例えば、二重特異性ＩｇＧフラグメント、キメラＩｇＧフラグメント、または二重特異性ヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメント）を含む。天然に存在するＩｇＧ分子は、設計によって二価であるが、そのＣＤＲは同一であるので一重特異性であるが、二価または二重特異性のいずれかであるＩｇＧ分子（例えば、ハイブリドーマ技術によって作製される分子）が、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら（１９８６．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：２１０〜２８）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４（４）：４４６〜４９）；Ｈａｙｄｅｎら（１９９７、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（２）：２０１〜１２）；Ｃａｒｔｅｒ（２００１、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：７〜１５）の方法を使用して、生成され得る。
【０１０５】
二重特異性ＩｇＧは、当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、化学的カップリング方法によってか、またはハイブリドーマ細胞株の開発（ハイブリッドハイブリドーマ技術とも呼ばれる）（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｈｙｂｒｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５（５９３４）：５３７〜４０）（図７）を介して、作製され得る。
【０１０６】
二重特異性抗体を得るために使用される別のアプローチは、ＩｇＧを限定的タンパク質分解消化に曝露する工程を包含し、その２つの同一のＦａｂフラグメントが、ヒンジポリペプチドの切断の際にＦｃフラグメントから放出される（図８）。これらの一価Ｆａｂフラグメントは、単独で使用され得るか、または二重特異性ヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２を形成するために別の起源のＦａｂフラグメントと一緒に（ヒンジシステインにて）化学結合され得る。化学結合二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、研究されており、そしていくつかの小規模臨床試験において評価されている（Ｈｕｄｓｏｎ、１９９９、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（５）：５４８〜５７；Ｓｅｇａｌら、１９９９、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（５）：５５８〜６２）。いくつかの他の合理的設計ストラテジーが、重鎖のＦｃ部分を操作して二重特異性抗体のヘテロ二量体化を促進するために開発されてきた。これらのストラテジーはとしては、例えば、立体相補性設計変異（ファージディスプレイ技術を使用する「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」））、ならびにさらなる鎖間ジスルフィド結合および／またはＦｃフラグメントの重鎖間の塩架橋相互作用の設計（Ｃａｒｔｅｒ  ２００１．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１〜２）：７〜１５）が挙げられる。望ましい二重特異性抗体の重鎖間の相補性の増強は、二重特異性抗体を、本明細書中に開示されるナノ構造の段階的アセンブリにおける使用のための構造的要素の好ましい供給源にする。
【０１０７】
１つの実施形態において、二重特異性抗体は、Ｆｃ二量体形成モチーフを、別の二量体化モチーフで置換することによって生成される。１つの非限定的例において、ヘテロ二量体を形成し得るロイシンジッパー（例えば、Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質において見出されるもの）が、遺伝子融合によってＩｇＧ分子の２つの異なるＦａｂ部分に結合される。適切な細胞株において個別に発現された場合、その融合物ＩｇＧ’は、Ｆａｂ−（ジッパー）２ホモ二量体として単離され得る。その後、ヘテロ二量体形成は、そのホモ二量体のヒンジ領域内にあるジスルフィド結合を還元して、単量体サブユニットを放出することによって、達成される。
【０１０８】
生じた単量体は、一緒に混合され、そして酸化条件下に配置されて、Ｆｏｓ−Ｊｕｎ対合ロイシンジッパーモチーフを最終産物の大部分として含む、二重特異性ヘテロ二量体を生じる。この技術の変化形は、二重特異性ＦａｂおよびＦｖ融合タンパク質を生成するために使用され得る（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７〜５３；Ｔｓｏら、１９９５、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆ（ａｂ’）２  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．４（５）：３８９〜９４；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、１９９６、Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ，ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１３）：７６３０〜３４）。二重特異性二量体形成を促進するために使用されるさらなる多価モチーフとしては、転写因子ｐ５３（Ｒｈｅｉｎｎｅｃｋｅｒら、１９９６、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（７）：２９８９〜９７）、ストレプトアビジン（Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８．Ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｎｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｄｉｔｙ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２（１〜２）：４５〜４９）、またはヘリックス−バンドルモチーフ（例えば、Ｒｏｐ（Ｐａｃｋら、１９９３．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ａｖｉｄｉｔｙ  ａｓ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ  １１：１２７１〜７７；Ｄｕｂｅｌら、１９９５．Ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ｓｃＦｖ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７８：２０１〜０９）（図９））が挙げられるが、これらに限定されない。そのような抗体は、本発明において、同一ではなくかつ互いに相互作用しない複数の連結要素の供給源として、有用である。
【０１０９】
上記の方法によって、二重特異性抗体の生成および単離が可能になるが、これらの方法はまた、低収量のＩｇＧ生成物の混合物、またはそれらの組合せを生じる。多量、高品質かつ高純度の多価多機能性抗体は、組換え抗体技術（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８９、Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５〜９２；Ｓｈｉｎら、１９９３、Ｈｙｂｒｉｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２−３）：１７７〜８６；Ｓｅｎｓｅｌら、１９９７、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６５：１２９〜５８；Ｈｕｄｓｏｎら、１９９８，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（４）：３９５〜４０２を参照のこと）によって、生成され得る。
【０１１０】
本発明の他の実施形態において、ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、またはキメラ（例えば、ヒト−マウスもしくはヒト−他の種の）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、あるいはそれらの結合誘導体または結合フラグメントが、本発明の段階的アセンブリ方法における使用のための構造的要素として使用され得る。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する、非ヒト種由来の抗体分子である。ヒト化抗体はまた、「キメラ抗体」：とも呼ばれる。ヒト化抗体またはキメラ抗体は、当該分野で周知の方法によって生成され得る（例えば、１９９６年１２月１７日発行のＱｕｅｅｎ、米国特許第５，５８５，０８９号、「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ」（これは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。
【０１１１】
キメラ抗体は、本発明の方法に従って構造的要素として使用され得る。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えば、マウスｍＡｂ由来の可変領域と、ヒト免疫グロブリンエフェクター領域もしくは定常領域とを有する、分子）である。キメラ抗体の生成のための技術は、開発されており（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１〜５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｏｓｅｓｓｉｎｇ  ｎｏｖｅｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６０４〜０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍａｅｒｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｕｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２〜５４）、それは、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物学的活性またはエフェクター活性のヒト抗対分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる。
【０１１２】
（ダイアボディまたは多価ｓｃＦｖフラグメントを含む、構造的要素）
本発明の特定の実施形態において、構造的要素は、ダイアボディまたは多価ｓｃＦｖフラグメントを含む。ｓｃＦｖフラグメント（特に、短縮ペプチドリンカー（例えば、３アミノ酸残基長、４アミノ酸残基長、もしくは５アミノ酸残基長を有する）を含むもの）は、溶液中で単量体ではなく二量体（ｓｃ（Ｆｖ）２もしくはダイアボディ）を形成する（Ｄｏｌｅｚａｌら、２０００、ＳｃＦｖ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＮＣ１０：ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｎｋｅｒ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｉｎ  Ｖ（Ｌ）ｔｏ  Ｖ（Ｈ）  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｓ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｓ，ｔｒｉｍｅｒｓ,ｔｅｔｒａｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（８）：５６５〜７４）。鎖内ドメイン相互作用ではなく鎖間ドメイン相互作用が、安定な二量体ダイアボディフラグメントを形成するために生じる（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、１９９３、Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（１４）：６４４４〜４８）。短縮ペプチドリンカーは、鎖内ドメイン対合を防ぎ得、従って、ダイアボディフラグメント形成を生じる鎖間相互作用の形成を可能にする（Ｐｅｒｉｓｉｃら、１９９４、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｂｏｄｙ，ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２（１２）：１２１７〜２６）。
【０１１３】
特定の実施形態において、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）は、１次元、２次元、および３次元のナノ構造の段階的組立てのための構造的要素として使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「ダイアボディ」とは、二量体の一本鎖可変抗体フラグメント（ｓｃＦＶ）をいう。上記のようなｓｃＦＶフラグメントは、Ｆｖ可変領域の重鎖のＣ末端を、Ｆｖ可変領域の軽鎖のアミノ末端に連結する融合ペプチド（ＶＨ−ＶＬ）またはその逆の融合ペプチド（すなわち、ＶＬ−ＶＨ）から構成される（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、１９９７、Ｎｅｗ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３（２）：８３−１０５；Ｈｕｄｓｏｎ、１９９８、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（４）：３９５−４０２；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９９、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（２）：１７３−２０１）。
【０１１４】
特定の実施形態において、ダイアボディまたはマルチマーのフラグメントは、熱安定性（例えば、Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、２００１、Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８（１）：７５−８０；Ｗｏｒｎら、２００１、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０５（５）：９８９−１０１０を参照のこと）である。熱安定性は、１次元、２次元、および３次元のナノ構造の段階的組立てにおいて利用される構造的要素にとって、有用な特徴である。
【０１１５】
一価のｓｃＦＶフラグメントとは異なり、ダイアボディは、互いに反対向きであり、かつ擬似的な二つ折り対称軸（インターフェイスに対して、平行である）の周りで約１７０度で関連して、２つの別々の抗体結合部位を含む「２つのボディ」を含む二価の分子である（Ｐｅｒｉｓｉｃら、１９９４、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｂｏｄｙ、ａ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２（１２）：１２１７−２６；Ｐｏｌｊａｋ、１９９４、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−２３；Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９、Ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｓｃＦＶ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ；ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１７７−８９）（図２）。
【０１１６】
単一特異性の（ｍｏｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）ダイアボディは、両方とも同じリガンド／ハプテンに対する特異性を有する２つの同一の抗原結合部位を含む。二重特異性の（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）ダイアボディは、それぞれが異なるリガンド／ハプテンに対して特異的である２つの抗原結合部位を含む；すなわち、二重特異性ダイアボディは、２つの異なる非対ｓｃＦＶフラグメントに由来する。第一ハイブリッドフラグメントは、第１ＦＶ抗体のＶＨコード領域および第２ＦＶ抗体に由来するＶＬコード領域を含む。その結果生じるＶＨ−ＶＬハイブリッドフラグメントは、短いＧｌｙ/Ｓｅｒリンカーによって、一緒に結合される。第二ハイブリッドフラグメントは、第１ＦＶ抗体のＶＬコード領域および第２ＦＶ抗体に由来するＶＨコード領域を含む。
【０１１７】
二重特異的連結の使用によって、それぞれのリガンドに対する二重特異的親和性を示す二重特異的抗体フラグメントを作製することが可能である（Ｐｏｌｊａｋ、１９９４、Ａｎ  ｉｄｉｏｔｏｐｅ−ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｏｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（５）：１５９９−１６００；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、１９９８、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ３  ｘ  ＣＤ１９  ｄｉａｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７７（５）：７６３−７２；Ａｒｎｄｔら、１９９９、Ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ  ｔｕｍｏｒｓ、Ｂｌｏｏｄ  ９４（８）：２５６２−６８；Ｔａｋｅｍｕｒａら、２０００、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｍａｌｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（８）：５８３−８８）。特定の二重特異的ダイアボディは、ＩｇＧ全体によって示される親和性に類似するリガンド／ヘプテンに対する親和性を示す（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４（４）：４４６−４９；Ｙａｇｉら、１９９４、Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｖ  ｂｅｔａ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（８）：３８３３−４１）。
【０１１８】
ダイアボディは、本発明の段階的組立て方法において使用する上で、それらのダイアボディを特に魅力的にする、以下のいくつかの特性を示す：（ｉ）それらは、反対向きにされた抗原結合部位を含む構造物である；（ｉｉ）２つの抗原結合部位の幾何学的対置によって、直鎖状のナノ構造またはナノ構造の直鎖状の伸長部を構築する能力が、最適化される；（ｉｉｉ）それらは、よく規定されたサイズ、形状、構造および化学量論を有する；（ｉｖ）それらは、構造的剛性およびよく規定された認識特性および結合特性を有する；（ｖ）非常に広い範囲の有機部分および無機的部分に対する特異性を示す結合モチーフが、同定され得、ダイアボディ構造中に取り込まれ得る；（ｖｉ）それらのＸ線構造は、解明されており（図２）、そのＸ線構造は、官能基または結合部位を加え得る位置を同定するための青写真として役立ち得る；（ｖｉｉ）ダイアボディは、互いに対して強い分子間結合を形成する；（ｖｉｉｉ）この分子間結合は、高い特異性を有する；（ｉｘ）免疫グロブリンの折りたたみによって、構造化されたタンパク質コア（構造的要素）およびそのタンパク質の異なる面の間で、安定的な空間的関係を提供する；（ｘ）さらなる結合部位が挿入され得るループが、ダイアボディの３次元構造の実験を通して、容易に同定される（Ｚｈｕら、１９９６、Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１４（２）：１９２−９６；Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９、Ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｓｃＦＶ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ；ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２３１（１−２）：１７７−８９）。総合すると、これらの特徴は、ダイアボディを、複雑な多次元ナノ構造を構築するための構造的要素として使用する上で有利である。
【０１１９】
ｓｃＦＶフラグメントはまた、結合して多価のマルチマーとなり得る（Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９、Ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ｓｃＦＶ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ；ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１（１−２）：１７７−８９；Ｐｏｗｅｒら、２０００、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ｓｃＦＶ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ）ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２（１−２）：１９３−２０４；Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら、２００１、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ、ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：４７−６６）（図３）。マルチマーの形成は、可変ドメイン（Ｖ−ドメイン）を１つに結合させるために使用されるリンカーの長さ、ならびにＶ−ドメイン組成およびＶ−ドメインの方向（ＶＨ−ＶＬ対ＶＬ−ＶＨ）に依存的である。リンカーの長さを３残基未満に減少させることは、普通はトリマーまたはトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）（例えば、（ｓｃＦＶ）３）の形成を支持する。テトラボディの形成（例えば、（ｓｃＦＶ）４）もまた、リンカーの長さが、０残基長であり、かつＶ−ドメインの方向が、ＶＬ−ＶＨである、少なくとも２つの例において、報告されている（Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａら、２００１、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ、ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８（１−２）：４７−６６）。
【０１２０】
抗体の可変ドメインは、段階的組立てのためのアセンブリ単位において、構造的要素および連結要素の両方を機能的に含み得る。構造的要素と同様に、連結要素の範囲は、常に完全に定義されるわけではない。例えば、抗体可変ドメインのβ−シート構造は、ＣＤＲとその分子の他の部分との間の幾何学的関係性を保持する。しかし、そのβ−シート構造はまた、結合対の相補的パートナーの結合親和性および結合特異性を提供する、ＣＤＲのループ間の構造的関係性を維持するためにも、重要である。結果的に、抗体の可変ドメインは、アセンブリ単位において、構造的要素および連結要素の両方を機能的に含み得る。従って、抗体分子および抗体の結合フラグメントは、連結要素の好ましい要素であるが、それらはまた、多くの実施形態のため、および上記のようにアセンブリ単位のために、構造的枠組を提供し得る。
【０１２１】
（抗体機能的要素）
抗体アセンブリ単位は、抗体を機能的要素として含み得る。連結要素としても構成要素としても含まれない、上記の抗体、結合フラグメントおよび結合誘導体は、他の部分の部位特異的な結合のための機能的要素として機能し得る。従って、特定の実施形態において、２つより多くの連結要素を有するアセンブリ単位は、ナノ構造を構築するために使用される。さらなる連結要素が、例えば、（ｉ）機能的要素または機能性部分（上記の表４を参照のこと）の付加または挿入のための結合点として；（ｉｉ）固体基板へのイニシエーターの結合点として；あるいは（ｉｉｉ）部分アセンブリのための結合点として使用され得る。
【０１２２】
（他の要素）
本発明の特定の実施形態において、アセンブリ単位は、構造的要素を含む。一般的に、構造的要素は概して、剛性構造を有する（しかし、以下で示す特定の実施形態において、構造的要素は、非剛性的であり得る）。構造的要素は、好ましくは、少なくとも５０アミノ酸、かつ一般的には２０００アミノ酸未満を含む、既知のサイズおよび構造を有する規定されたペプチド、タンパク質またはタンパク質フラグメントである。天然に存在するペプチド、タンパク質およびタンパク質フラグメントは、タンパク質の異なる表面間に安定な空間的関係性を提供する構造化コアを有する、よく定義された構造を有するので、ペプチド、タンパク質およびタンパク質フラグメントが好ましい。この特性により、構造的要素が、アセンブリ単位の連結要素と機能的要素との間のあらかじめ設計された幾何学的関係性ならびに、それが結合するアセンブリ単位の相対位置および化学量論を維持することが可能となる。
【０１２３】
構造的要素としてのタンパク質の使用は、他の選択肢（例えば、無機ナノ粒子）を越える特定の利点を有する。無機ナノ粒子の大部分の集団は不均質であり、それにより、それらは、ナノ構造のアセンブリにとって魅力のない足場となっている。大部分の集団において、各無機ナノ粒子は、異なる数の原子で構成され、切子面と結晶面との間の異なる幾何学的関係性、ならびに欠損および不純物を有する。対照的に、同等のサイズのタンパク質の集団は、非常に均質であり、各タンパク質は、同じ数のアミノ酸で構成され、各アミノ酸は、ほぼ同様に配置され、そのほとんどの部分は、熱変動効果を介してのみ配置が異なる。結果的に、互いに相互作用するように設計された２つのタンパク質は、常に同じ幾何学的配置で相互作用し、予測可能な幾何学的配置および化学量論を有する複合体の形成が、生じる。この特性は、ナノ構造の大規模な並列的「ボトムアップ」アセンブリのために必須である。
【０１２４】
構造的要素は、ナノ構造の連結要素と機能的要素の間の幾何学的関係性を維持するために使用され得る。これらのために、本明細書中に記載する段階的アセンブリ方法を使用するナノ構造の構築において、剛性の構造的要素が、一般的には好まれる。この剛性は、多くのタンパク質に典型的であり、これは、タンパク質を構成する２次構造的要素（例えば、α−へリックスおよびβ−シート）の特性を介して、タンパク質に与えられ得る。
【０１２５】
構造的要素は、その３次元構造が公知であるか、タンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチドの構造に基づき得るか、または最初から設計され得る。アセンブリ単位において構造的要素として利用され得る、タンパク質またはタンパク質フラグメントの例としては、抗体ドメイン、ダイアボディ、単鎖抗体可変ドメイン、および細菌ピリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、構造的要素、連結要素および機能的要素は、よく規定された程度で、（例えば、グリシンリンカーによって）分離され得る。別の実施形態では、連結要素は、構造的要素の統合部分であるペプチドまたはタンパク質セグメントを含み得るか、または、例えば、抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の場合のように、構造的要素の１つの末端に多数のループを含み得る（Ｋａｂａｔら、１９８３、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。ＣＤＲは、抗体可変ドメインの統合部分である連結要素である。この可変ドメインは、構造的要素を表し、構造的要素と連結要素を構成するＣＤＲとの間の境界は、（多くの抗体配列の比較に基づく文献において、よく規定されているが）常に完全に、構造的に一義的であるわけではないかもしれない。構造的要素と連結要素との間には、常に、よく規定された境界があるわけではないかもしれないし、これらのドメイン間の境界は、それぞれの有用性に基づいてよく規定されているが、空間的に曖昧であり得る。
【０１２７】
本発明の構造的要素は、例えば、天然に存在するタンパク質のコア構造的要素を含み、この構造的要素は、次いで連結要素、機能的要素、および／または可撓性ドメイン（例えば、トリグリシン、テトラグリシン、またはペンタグリシン）を取り込むように改変され、それによって、有用なアセンブリ単位が提供される。結果として、特定の実施形態において、既存のタンパク質の構造が、分析され、タンパク質またはタンパク質の一部の剛性構造に実質的に影響することなしに改変され得る、タンパク質またはタンパク質の一部のそのような部分が同定される。
【０１２８】
例えば、特定の実施形態において、タンパク質または構造的要素の表面ループ領域のアミノ酸配列は、そのタンパク質の全体的フォールディングにほとんど影響することなく、改変される。タンパク質の表面ループ領域のアミノ酸配列は、一般的に、連結要素、機能的要素、および／または可撓性ドメインのさらなるアミノ酸配列が、タンパク質構造を破壊する可能性が最小であるように挿入され得る、アミノ酸位置が好まれる。タンパク質中の表面ループの位置の決定は、３次元原子座標が利用可能である場合、例えば、一般ドメインタンパク質可視化コンピュータープログラム（例えば、ＲＡＳＭＯＬ（Ｓａｙｌｅら、１９９５、ＲａｓＭｏｌ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  ａｌｌ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（ＴＩＢＳ）２０（９）：３７４−３７６；Ｓａｑｉら、１９９４、ＰｄｂＭｏｔｉｆ−−Ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０（５）：５４５−４６））を使用してそのタンパク質またはそのホモログの３次元構造を試験することで、実行される。この様式において、表面ループに含まれるアミノ酸および、これらの表面ループの相対空間位置が、決定され得る。
【０１２９】
操作されるタンパク質の３次元構造が公知ではないが、近いホモログの３次元構造が公知である場合（例えば、本質的に全ての抗体分子にとって）、目的の分子のアミノ酸配列またはその一部は、その３次元構造が公知である分子のアミノ酸配列と整列され得る。この比較（例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）またはＬＡＬＩＧＮ（ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ、１９９１、Ａ  ｔｉｍｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｎｅａｒ−ｓｐａｃｅ  ｌｏｃａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１２：３３７−３５７）を使用して行われる）により、公知の３次元構造を有するタンパク質中の表面ループ（β−ターン）を構成するアミノ酸に対応する、目的のタンパク質の全アミノ酸の同定が可能となる。この２つのタンパク質間で高い配列類似性がある領域において、この同定は、高レベルの確実性で実行される。一旦、推定ループが同定され、本明細書で開示する方法に従って改変されると、生じた構築物が試験され、それが予測された特性を有するか否かが決定される。この分析は、ループの同定が、高い信頼性を有する場合（例えば、その決定が、既知の３次元タンパク質構造に基づいている場合）においてでさえ、実施される。
【０１３０】
抗体由来ドメインに加えて、ロイシンジッパー型のコイルドコイルを含む構造的要素もまた、本発明のナノ構造中のアセンブリ単位において使用され得る。特定の実施形態において、本発明は、本発明の段階的アセンブリ方法を使用するナノ構造の構築における使用のために、ロイシンジッパー型のコイルドコイルを含む構造的要素を包含する。ロイシンジッパーは、周知のα−へリックスのタンパク質構造であり（Ｏａｓら、１９９４、Ｓｐｒｉｎｇｓおよびｈｉｎｇｅｓ：ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｉｔｉｅｓ、ＴＩＢＳ  １９：５１−５４；Ｂｒａｎｄｅｎら、１９９９、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第２版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ロイシンジッパードメインの実際の配列に依存して、タンパク質またはタンパク質単量体の二量体構造、トリマー構造、およびテトラマー構造へのオリゴマー化に関与する（Ｈａｒｂｕｒｙら、１９９３、Ａ  ｓｗｉｔｃｈ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ−、ｔｈｒｅｅ−、ａｎｄ  ｆｏｕｒ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌｓ  ｉｎ  ＧＣＮ４  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ  ｍｕｔａｎｔｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−０７）。簡単のために、本明細書では二量体のみを開示するが、トリマー単位およびテトラマー単位もまた、本明細書で開示する方法に従うナノ構造の段階的アセンブリにおける使用のためのアセンブリ単位の構築のために使用され得ることが、当業者には明らかである。特定の実施形態において、トリマー単位およびテトラマー単位は、例えば、２つ以上の化学的部分を適切な活性のために必要とする、機能的要素の取り込み（例えば、金粒子の結合のための２つのシステイン部分の取り込み）において、特に有用であり得る。
【０１３１】
例えば、抗体由来ドメインに連結された、４ヘリックスバンドルを含む構造的要素もまた、本発明のナノ構造のアセンブリ単位中に使用され得る。ロイシンジッパーの設計と構築は、アセンブリ単位の構造的要素の構築において有用であるコイルドコイルオリゴマー化ペプチドの１つの種類を表す。別の種類は、４ヘリックスバンドルであり、その非限定的な例を図１０に示す。へリックスを結合してアセンブリ単位を形成する１つ以上のループセグメント（すなわち、非へリックスセグメント）が存在するので、この構造はまた、「ヘリックス―ループ―へリックス」とも呼ばれる。ループセクションは、ヘリックスを互いに近くに、従って機能的に高い密度に保つことによって、全体的構造の安定性に寄与する。ヘリックス―ループ―へリックスタンパク質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細菌のＲｏｐタンパク質（２つのヘリックス―ループ―へリックス分子を含むホモ二量体）（Ｌａｓｓａｌｌｅら、１９９８、Ｄｉｍｅｒ−ｔｏ−ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ｌｏｏｐ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｄｒａｍａｔｉｃａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＯＰ  ｆｏｕｒ  ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９（４）：９８７−１０００）；真核生物のシトクロムｂ５６２（１つのヘリックス―ループ―へリックス―ループ―へリックス―ループ―へリックス構造から構成される単量体タンパク質）（Ｌｅｄｅｒｅｒら、１９８１、Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２．５Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５６２  ｂｙ  ｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４８（４）：４２７−４８）；Ｍａｘ（Ｌａｖｉｇｎｅら、１９９８、Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  １Ｈ−ＮＭＲ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ−Ｍｙｃ−Ｍａｘ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８１（１）：１６５−８１）；ＭｙｏＤ  ＤＮＡ結合ドメイン（Ｍａら、１９９４、Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＭｙｏＤ  ｂＨＬＨ  ｄｏｍａｉｎ−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ  ７７（３）：４５１−５９）；ＵＳＦ１ＤＮＡ結合ドメインおよびＵＳＦ２  ＤＮＡ結合ドメイン（Ｆｅｒｒｅ−Ｄ'Ａｍａｒｅら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂ/ＨＬＨ/Ｚ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ＵＳＦ、ＥＭＢＯＪ．１３（１）：１８０−９；Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒら、１９９７、ＵＳＦ２／ＦＩＰ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｂ−Ｚｉｐ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ｃ−Ｍａｆ，ｖｉａ  ｉｔｓ  ｂＨＬＨ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃ−Ｍａｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３１（２）：３３３−３９）；ならびにＭｉｔ−ｆ転写因子ＤＮＡ結合ドメイン（Ｒｅｈｌｉら、１９９９、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｂＨＬＨ−ＺＩＰ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ＴＦＥＣ  ａｎｄ  ＴＦＥＢ  ｒｅｖｅａｌ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇｅｎｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｌｌ  ＭｉＴ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５６（１）：１１１−２０）。
【０１３２】
Ｒｏｐタンパク質のへリックス領域およびループ領域は両方とも、Ｒｏｐタンパク質またはそのフラグメントが、本発明の段階的アセンブリ方法におけるアセンブリ単位の構築において構造的要素として使用され得ることを示す、特性を示す。１つの実施形態において、Ｍｕｎｓｏｎらの方法（１９９６、Ｗｈａｔ  ｍａｋｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ？  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｒｅ  ｄｅｓｉｇｎｓ  ｔｈａｔ  ｓｐｅｃｉｆｙ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１５８４−９３）が、Ｒｏｐタンパク質のへリックス領域のａ残基およびｄ残基を変異させて、増大した熱安定性を有する改変ポリペプチドおよび減少した熱安定性を有する改変ポリペプチドの両方を生成するために使用される。
【０１３３】
本発明の１つの局面において、機能的要素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、低分子、無機ナノ粒子、原子、原子のクラスター、磁気ナノ粒子、光ナノ粒子または電気的ナノ粒子。特定の機能的要素（この要素は、一般的にこの要素が結合しているアセンブリ単位の構造的特質から独立している）に関連している特異的な活性または特性が、以下が挙げられるが、これに限定されない非常に大きな範囲の可能性のある機能のセットから選択され得る：タンパク質によって与えられるような生物学的特性（例えば、転写、翻訳、結合、改変または触媒的特性）。別の実施形態において、アセンブリ単位に化学的、有機的、物理電気的（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ）、光学的、構造的、機械的、計算機的、磁気的およびセンサー的な特性を与える官能基が、用いられ得る。
【０１３４】
本発明の別の局面において、機能的要素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：金属ナノ粒子または金属酸化物ナノ粒子（Ａｒｇｏｎｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｆｏｒｄ，ＦＬ；ＮａｎｏＥｎｅｒｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ、ＣＯ；Ｎａｎｏｐｈａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｍｅｏｖｉｌｌｅ，ＩＬ；Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；ＴＡＬ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；金ナノ粒子または金でコーティングされたナノ粒子（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ；Ｎａｎｏｓｐｅｃｔｒａ  ＬＬＣ，Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）；免疫結合体（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ）；非金属ナノ粒子（Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）；セラミックナノファイバー（Ａｒｇｏｎｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｆｏｒｄ，ＦＬ）；フラーレンまたはナノチューブ（例えば、カーボンナノチューブ）（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ；Ｎａｎｏｌａｂ，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  ＭＡ；Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ；Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）；ナノ結晶（ＮａｎｏＧｒａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）；シリコンもしくはシリコンナノ結晶または粉末（ＭＴＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）；ナノワイヤ（Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）；または量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ；Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）。
【０１３５】
機能的要素はまた、任意の当該分野で公知の検出可能なマーカーを含む。このマーカーとしては，以下が挙げられる：３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈなどの様な放射能標識；発色団；発蛍光団；化学発光分子；または酵素マーカー。
【０１３６】
本発明の特定の実施形態において、機能的要素は、発蛍光団である。標識として選択され得る例示的な発蛍光団部分を、表５に示す。
【０１３７】
（表５：機能的要素として使用され得る発蛍光団部分）
４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸
アクリジンおよび誘導体：
アクリジン
アクリジンイソチオシアネート
５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）
４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ）−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド
アントラニルアミド
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ
クマリンおよび誘導体：
クマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １２０）
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １５１）
Ｃｙ３
Ｃｙ５
シアノシン（ｃｙａｎｏｓｉｎｅ）
４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）
７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン
ジエチレントリアミン  ペンタアセテート
４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸
４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸
５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）
４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）
エオシンおよび誘導体：
エオシン
エオシンイソチオシアネート
エリトロシンおよび誘導体：
エリトロシンＢ
エリトロシンイソチオシアネート
エチジウム
フルオレセインおよび誘導体：
５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）
２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）
フルオレセイン
フルオレセインイソチオシアネート
ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）
フルオレスカミン
ＩＲ１４４
ＩＲ１４４６
Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎイソチオシアネート
４−メチルランベリフェロン
オルト  クレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラローザニリン
Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ
Ｂ−フィコエリトリン
ｏ−フタルジアルデヒド
ピレンおよび誘導体：
ピレン
ピレンブチレート
スクシンイミジル  １−ピレン  ブチレート
Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）
ローダミンおよび誘導体：
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）
６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
リスアミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢスルホニルクロリド
ローダミン（Ｒｈｏｄ）
ローダミンＢ
ローダミン１１０
ローダミン１２３
ローダミンＸイソチオシアネート
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）
テトラメチルローダミン
テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）
リボフラビン
ロゾール酸
テルビウムキレート誘導体
別の実施形態において、機能的要素は、ルミノール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＯＬＤＴＭ  ＡＰＢ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）、Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）などのような化学発光基質である。
【０１３８】
別の実施形態において、機能的要素は、酵素である。特定の実施形態において、酵素は、特定の化学反応が行なわれるとき、酵素アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような検出可能なシグナルを生成し得る。
【０１３９】
別の実施形態において、機能的要素は、ハプテンまたは抗原（例えば、ｒａｓ）である。さらに別の実施形態において、機能的要素は、ビオチン（これに対して、標識されたアビジン分子またはストレプトアビジンが結合し得る）またはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）（これに対して、標識された抗ジゴキシゲニン抗体が結合し得る）のような分子である。
【０１４０】
別の実施形態において、機能的要素は、ピーナッツレクチンまたは大豆凝集素のようなレクチンである。さらに別の実施形態において、機能的要素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素のような毒素である（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９，Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（６２２３）：３９４−９７）。
【０１４１】
ペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインは、当該分野で一般に公知の分子生物学の手段を用いてタンパク様のアセンブリ単位に加えられ、融合タンパク質（このタンパク質中で、機能的要素が、タンパク質のＮ末端、タンパク質のＣ末端またはタンパク質中のループ中にタンパク質のフォールディングを妨害しないような方法で導入される）を産生し得る。非ペプチド機能的要素が、前記機能的要素に対する特異性を示すペプチドまたはタンパク質部分のアセンブリ単位をタンパク様部分に組み込むことによってアセンブリ単位に加えられ得る。
【０１４２】
別の実施形態において、完全抗体可変領域ドメイン（例えば、１本鎖可変ドメイン）が、機能的要素についてのアフィニティー標的として働くために、アセンブリ単位中に（例えば、その連結要素または構造的要素中に）組み込まれる。この実施形態において、完全抗体可変ドメインが例えば、連結要素または構造的要素の表面ループ中に挿入される場合、可撓性のセグメント（例えば、ポリグリシンペプチド配列）が、好ましくは可変ドメイン配列の各々の側に加えられる。このポリグリシンリンカーは、組換え融合タンパク質の合成後の元のタンパク質のフォールディングを促進する可撓性のスペーサーとして働く。この抗体ドメインは、機能的要素に対する結合特異性について選択され、この機能的要素としては、以下があり得るが，これらに限定されない：タンパク質もしくはペプチドまたは無機材料。
【０１４３】
本発明の別の実施形態において、機能的要素は、所望の最適な特性を有する量子ドット（半導体ナノ結晶、例えば、ＱＤＯＴＴＭ、Ｑｕａｎｔｕｍ，Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）であり得る。量子ドットは、特定の種類の量子ドットに対して特異性を有するペプチドを介してナノ構造中に組み込まれ得る。当業者に明らかであるように，特定の型の量子ドットに必要とされる親和性を有するこのようなペプチドの同定が、当該分野で周知の方法を使用して実行される。例えば、このようなペプチドは、アフィニティー精製方法を使用してファージ表示されたペプチドの大きなライブラリから選択される。適切な精製方法としては、例えば、バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）（Ｗｈａｌｅｙら、２０００，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（６７８７）：６６５−６８）およびアフィニティーカラムクロマトグラフィーが挙げられる。各々の場合において、標的の量子ドットは、固定化され、組換えファージディスプレイライブラリーは、固定された量子ドットに対してインキュベートされる。数回のバイオパニングが実行され、量子ドットに対して親和性を示すファージが、標準的方法によって同定され、その後ペプチドの特異性が標準ＥＬＩＳＡ方法を使用して試験される。
【０１４４】
代表的に、アフィニティー精製は、いくつかのアフィニティー精製工程を使用する反復性プロセスである。アフィニティー精製を使用して、特定の金属および半導体に対する親和性を有するペプチドを同定し得る（Ｂｅｌｃｈｅｒ，２００１，Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｍａｙ  １８−２０，２００１；Ｂｅｌｃｈｅｒら、２００１，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｐａｐｅｒｓ，２２２ｎｄ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ２６−３０，２００１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
【０１４５】
代替の方法は、ファージディスプレイ単鎖可変ドメインのライブラリーの使用および同じ型の選択プロセスの実行に指向される。従って、特定の実施形態において、機能的要素は、所望の特性を有する非タンパク質様ナノ粒子がナノ構造に結合される連結要素（相互作用部位）の使用を介してナノ構造に取り込まれる。２つの非限定的な例において、このような連結要素は、抗体可変ドメインの相補性決定領域またはアフィニティー選択ペプチドに由来する。
【０１４６】
ナノ結晶（単一のナノ粒子）の電子的特性とナノ粒子のアセンブリとを比較するのに一般的に使用される電子的な機能的要素およびフォトニクス機能的要素についての慣用的な試験（Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０）は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して組み立てられたナノ構造の分析のために使用される。
【０１４７】
特定の実施形態において、半導体ナノ結晶の独特な調和した特性は、これらの半導体ナノ結晶を、ナノデバイス（光伝導性ナノデバイスおよび発光ダイオードを含む）における使用に好ましくする。個々のナノ構造の電気的特性は、測定するのが困難であり、従って、光伝導性は、これらのナノ構造の特性の測定として使用される。光伝導性は、半導体および有機固体の特性の分析について使用される周知の現象である。光伝導性は、他の点では、絶縁性の有機固体において弱い相互作用分子の間で電子を輸送するのに長く使用されている。
【０１４８】
光電流スペクトル応答をまた使用して、ナノ構造におけるナノ結晶の吸収スペクトルをマップし、そして個々のナノ結晶の光電流スペクトル応答と比較し得る（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０を参照のこと）。さらに、光学スペクトルおよび光発光スペクトルをまた使用して、ナノ構造の光学特性を研究し得る（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０を参照のこと）。
【０１４９】
制御がナノ粒子のアレイの形成により影響すると、生成されるアレイの光学、電気的および磁性現象が広がる。ナノ粒子が三次元精度と共に取り込まれるナノ構造の段階的アセンブリから形成される固体の特性を三次元において制御することが可能であり、それによって、ナノデバイスの設計に有用な多くの異方性の特性を生じる。これらの集合の特性を特徴付けるための慣用的な試験および方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉ．３０：５４５−６１０を参照のこと）。
【０１５０】
例えば、タンパク質および量子ドットの組み合わせから作製されるバイオセンサーは、市販されている（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓら、１９９６，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ「ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：６０９−１１；Ｗｅｉｓｓら、米国特許第６，２０７，３９２号、表題「Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ」（２００１年３月２７日に発行された））。高特異性生物学的分子（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは抗体分子）と量子ドットとを複合する能力は、分子の標的に対するスペクトルフィンガープリントを提供する。異なるサイズの量子ドット（各々非常に異なるスペクトル特性を有する）を使用して、異なる特異性を有する分子に複合体化された各々は、同時に構成成分の複数の検出を可能にする。
【０１５１】
無機構造体（例えば、金属または半導体の量子ドットおよびナノ結晶）は、アセンブリされたナノ構造の分枝の末端としてナノ構造の段階的アセンブリに使用され得る。一旦、このような無機構造体を添加すると、さらなる基はこれらに結合し得ない。なぜなら、無機構造体は、ナノ構造へと操作される結合部位の任意のセットについての不確定な化学量論を有するからである。これは、アセンブリ単位が添加され、段階的アセンブリによって組み立てられたナノ構造を形成する配列に影響する。例えば、一旦特定のナノ結晶がナノ構造に添加されると、その型のナノ結晶を認識しそして結合する連結要素を有するさらなるアセンブリ単位を添加することは一般的に好ましくない。なぜなら、ナノ結晶に対するこのようなアセンブリ単位の位置決めを制御することは、一般的に可能でないからである。従って、ナノ結晶を最後または少なくともその特定の型のナノ結晶を結合するアセンブリ単位の全てを添加した後に添加する必要があり得る。好ましい実施形態において、ナノ結晶は、マトリクスになお結合され、そして十分に分離されるナノ構造に添加され、その結果各ナノ結晶は、単一のナノ構造にのみ結合し得、それによってナノ構造の複数架橋を防止する。
【０１５２】
１つの実施形態において、本発明の段階的アセンブリ方法に従って組み立てられた、強固なナノ構造は、ナノ構造レバーアームの末端に機能的な要素として結合した磁性ナノ粒子を含み、この磁性ナノ粒子は、局所的な磁場の非常に敏感なセンサーとして作用する。磁場の存在は、磁性ナノ粒子の位置を変えるのに作用し、ナノ構造レバーアームを結合した固体基板に対してナノ構造レバーアームを曲げる。特定の実施形態において、レバーアームの位置は、例えば、ナノ構造レバーアームに沿って他の位置（アセンブリ単位）に機能的要素として結合した光学ナノ粒子の位置の変化を通して検出され得る。レバーアームの移動の程度は較正され、磁場の測定を提供する。
【０１５３】
他の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ方法に従って組みたてられたナノ構造は、特定化された機能的要素の非存在において所望の特性を有する。このような実施形態において、段階的アセンブリプロセスは、例えば、微小液体システムの粒子を濾過するために使用され得る、小さな（ナノメートルスケール）、正確なサイズかつ十分に規定された孔を有する二次元ナノ構造または三次元ナノ構造を提供する。この実施形態のさらなる局面において、このように十分に規定された孔のみだけでなく、ナノ構造の分離特性を増強する機能的要素をも含むナノ構造が、アセンブリされ、分離される分子のサイズだけでなく、電荷ならびに／または親水性特性および／または疎水性特性に基づいて分離可能にする。このようなナノ構造は、ＨＰＬＣ分離に使用され得、非常に均一な充填物質およびこれらの物質に基づく分離を提供する。このような機能的要素の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：所望のクロマトグラフィー分離に使用されるｐＨで正または負に荷電した１つ以上の側鎖を含むペプチド配列；および疎水性側鎖または親油性側鎖を有する１つ以上のアミノ酸を含むペプチド配列。
【０１５４】
結合は、シリコンベースの電子チップなどのようなミクロ電子工学の回路において「スウィッチポイント」として働き得る構築的な構造である。特定の実施形態において、多価の抗体あるいはその結合誘導体または結合フラグメントは、結合構造として使用され、そして本発明の方法を使用してナノ構造へと取り込まれる。これらのナノ構造結合を含む生物電子工学デバイスおよび生物コンピューター（ｂｉｏｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ）デバイスの１つの非限定的な例は、量子セルオートマトン（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ：ＱＣＡ）である。
【０１５５】
（抗体産生）
抗体産生の一般的な方法および使用は、当該分野で一般に公知である。これらの方法は本発明の段階的アセンブリ方法およびアセンブリ単位における使用のための構造および連結要素を生成するために使用され得る（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【０１５６】
目的の抗原に対する抗体の分子クローンは、当該分野で周知の技術によって調製され得る。組換えＤＮＡ方法論を使用して、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １，２，３，５，６，８，９，１０，１３，１４，１５  ａｎｄ  １８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １，２，３，５，６，８，１０，１１，１２，１５，１６，１９，２０  ａｎｄ  ２４，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２，８，９，１０，１７  ａｎｄ  １８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００１，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃｏｉｃｏを参照のこと）。
【０１５７】
抗体は、細菌ペリプラズムへの分泌によって細胞内または細胞外のいずれかで細菌中に発現され得る（ＴｏｍｌｉｎｓｏｎおよびＨｏｌｌｉｇｅｒ，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−７９）。しかし、組換え抗体の細胞内発現は、タンパク質の不溶性凝集体の形成を頻繁に導き、この不溶性の凝集体は、封入体と言われ、細菌細胞質の非還元環境におそらく起因し、抗体ドメイン間のジスルフィド結合形成を阻害する。当該分野で一般的に公知の方法によって、強い変性剤を用いて、封入体の可溶化、次いで再生条件への曝露によって機能的タンパク質中へと抗体をリフォールディングすることを可能にする。
【０１５８】
再生の必要性を回避するために、細菌誘導性ペリプラズムのシグナル配列についてのコード配列は、抗体をコードする遺伝子のＮ末端部分でスプライシングされ、細菌性ペリプラズムに組換えタンパク質を指向し得る。ペリプラズム空間の酸化環境は、抗体ドメインの適切な折り畳み（ジスルフィド結合形成を含む）を支持する。機能的抗体の良い収率を生成するこれらの方法の成功は、抗体型、誘導および過剰産生の方法に依存し得る（Ｗａｒｄ，１９９２，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｏｓｔ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．６（７）：２４２２−２７；Ｗａｒｄ，１９９３，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｓ  ｈｏｓｔ，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４：１−２０；Ｚｈｕら、１９９６，Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１４（２）：１９２−９６；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ  ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ：ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１１）：６１５７−６２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−７９を参照のこと）。
【０１５９】
抗体分子は、例えば、免疫吸着もしくは免疫アフィニティークロマトグラフィー、クロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー））、またはその組み合せの当業者に周知の技術によって精製され得る。
【０１６０】
（ナノ構造の段階的アセンブリ）
抗体アセンブリ単位はアセンブリされ得、段階的アセンブリによってナノ構造を形成する。段階的アセンブリは、有機部分および無機部分が予め設計された三次元構築中に正確かつ精密に配置される、複合非断続性複数次元ナノ構造の超並列合成を可能にする。段階的アセンブリにおいて、一連のアセンブリ単位は、開始単位および／またはナノ構造中間体に、所定の予め設計された順番で添加される。多数の同一の開始剤が使用され、そしてサブユニットは、同時に全ての開始／中間体に添加されるので、段階的アセンブリは、超並行様式で複数の同一のナノ構造を組み立てる。好ましい実施形態において、開始単位は、固体基板、支持体またはマトリクスに結合される。さらなるアセンブリ単位は、連続的に、固相ポリマー合成に類似の手順で添加される。アセンブリされながら、開始単位上で形成された結合アセンブリ単位を含むナノ構造の中間段階は、ナノ構造中間体または単にナノ構造のいずれかとして一般的に記載される。各アセンブリ単位の、アセンブリ中のナノ構造中間体への添加は、先に添加されたアセンブリ単位によって表される連結要素の性質に依存し、続いて添加されたアセンブリ単位に関係ない。従って、アセンブリ単位は、アセンブリ中のナノ構造中間体上に曝露された連結要素のみに結合し得る；すなわち、添加されたアセンブリ単位は、自己相互作用をせず、そして／または重合しない。
【０１６１】
単一アセンブリ単位の連結要素は非相補的であり、従って、互いと相互作用しないので、未結合アセンブリ単位は、二量体または多量体を形成しない。添加されるべきアセンブリ単位は、完了まで中間体とのその反応を駆動するために、好ましくは、開始単位またはナノ構造中間体に対してモル過剰で提供される。段階的アセンブリ中の未結合アセンブリ単位の除去は、未結合アセンブリ単位がアセンブリプロセスの各サイクルにおいて洗浄され得るように、固体−基板−結合開始を使用して、段階的アセンブリを実行することによって促進される。
【０１６２】
このスキームは、相対的に低い非交差反応性の、相補的な連結対を使用する複雑なナノ構造のアセンブリを提供する。限定された数の連結要素が、アセンブリプロセスにおける任意の１つの工程でアセンブリ中間体の表面上に曝露されるので、より少ない連結対のみが使用される必要がある。相補的な連結要素を有するアセンブリ単位が、添加され、そしてナノ構造中間体についてインキュベートされ、アセンブリサイクルの間に、さらなるアセンブリ単位をナノ構造中間体に結合させ得る。次いで、過剰のアセンブリ単位を洗浄し、アセンブリプロセスの引き続く工程の間、これらが他のアセンブリ単位と所望でない相互作用を形成することを防止し得る。ナノ構造の各位置は、段階的アセンブリのプロセスによって独自に規定され得、そして異なる機能的要素は、任意の所望の位置で添加され得る。本発明の段階的アセンブリ法は、複合性ナノ構造の大量の平行製造を可能にし、そして異なる複合体ナノ構造は、階層的な様式において、より高次の構築にさらに自己アセンブリされ得る。
【０１６３】
図１１は、一次元での本発明の段階的アセンブリ法の実施形態を示す。工程１において、開始単位は、固体基板上に固定化される。工程２において、アセンブリ単位は、開始剤に添加され（すなわち、マトリクス結合開始単位）、２つの単位で構成されたナノ構造中間体を生じる。単一のアセンブリ単位のみが、この工程において付加される。なぜなら、第２のアセンブリ単位は、自己と相互作用（すなわち重合）し得ないからである。
【０１６４】
開始単位（すなわち、キャップ単位を含む段階的アセンブリの間に引き続いて添加される任意のアセンブリ単位）は、さらなる機能的要素を含み得、そして／または先に添加した単位と異なる長さの構造単位を含み得る。例えば、図１１の工程３において、機能的要素を含む第３のアセンブリ単位が添加される。工程４および５において、それぞれ設計された官能基を有するさらなるアセンブリ単位を添加する。従って、図１１に示される段階的アセンブリの実施形態において、第３、第４および第５のアセンブリ単位の各々は、独特の機能的要素を保有する（図においてアセンブリ単位の上部から突き出す幾何学的形状によって示される）。
【０１６５】
図１１に示される段階的アセンブリの実施形態は、２つの非交差反応性の相補的な連結対のみを必要とする。工程５の最終で構造の自己アセンブリが停止する場合、構造の自己アセンブリは、４つの非交差反応の相補的な連結対を必要とする。必要とされる連結対の数のこの相対的に適度な増加は、構造のサイズが増大するにつれてさらに大きくなる。例えば、図１１に図示される５つの工程の伸長によって組み立てられたＮ単位の線形構造について、段階的アセンブリは、なお、２つの非交差反応の相補的な連結対のみを必要とするのに対し、自己アセンブリは、（Ｎ−１）個の非交差反応の相補的な連結対を必要とする。
【０１６６】
組み立てられたナノ構造の数は、マトリクスに結合される開始単位の数によって決定されるが、一次元ナノ構造の各々の長さは、実行されるアセンブリサイクルの数の関数である。１つ以上の異なる機能的要素を有するアセンブリ単位を使用する場合、組み立ての順番は、他の機能的要素に対して各機能的要素の相対的な空間的配向を規定する。
【０１６７】
本発明の段階的アセンブリの方法における各工程の後、過剰の未結合アセンブリ単位を、除去工程（例えば、洗浄工程）によって、結合したナノ構造中間体から除去する。基板結合ナノ構造中間体は、適切な溶媒（例えば、水溶液または緩衝液）で洗浄され得る。溶媒は、相補的な連結要素の特異的な相互作用）を破壊することなく非特異的相互作用によって維持されるサブユニットを除去し得なくてはならない。適切な溶媒は、使用されるアセンブリ単位によって必要とされる場合、ｐＨ、塩濃度、化学組成物などによって変更し得る。
【０１６８】
ナノ構造中間体を洗浄するための緩衝液は、例えば、ＥＬＩＳＡプロトコルにおいて実行される洗浄工程に使用される緩衝液（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２章，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，２．１節「Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００１，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃｏｉｃｏを参照のこと）に記載される緩衝液）であり得る。
【０１６９】
特定の実施形において、アセンブリされたナノ構造は、「キャップ単位（ｃａｐｐｉｎｇ  ｕｎｉｔ）」の添加によって「キャップ」され、このキャップ単位は、単一の連結要素のみを保有するアセンブリ単位である。さらに、開始単位が、切断可能結合を介して固体基板に結合される場合、ナノ構造は、固体基板から除去され、そして単離され得る。しかし、いくつかの実施形態おいて、完全なナノデバイスは、固体基板に結合される間、機能的であり、そして除去される必要がなくなる。
【０１７０】
アセンブリ単位を添加する上記の工程は、完全なナノ構造がアセンブリされるまで、反復性の様式で繰り返され得、この後、完全なナノ構造は、開始単位内で設計された放出部分（例えば、プロテアーゼ部分）でマトリクスから第１のアセンブリ単位を固定化した結合を破壊することによってか、または放出について予め設計されたプロセス（例えば、ｐＨの低下）を使用することによって放出し得る。図１１および１２に図示されるように、段階的アセンブリのプロセスは、段階的アセンブリに企図される最も単純な実施形態の１つである。他の実施形態において、さらなる連結要素を有するアセンブリ単位を使用して、より複雑なアセンブリを作製し得る。アセンブリ単位は、個々に添加され得るか、特定の実施形態において、サブアセンブリとして添加され得る（図１２）。結果は、所望の設計パラメータを満足するために、互いに関連して空間的に分散される機能的要素を有する完全に規定されたナノ構造である。本明細書中に開示される組成物および方法は、これらの複合性の設計されたナノ構造のアセンブリ手段、および大きな構造の１つまたは複数のナノ構造の段階的アセンブリによって形成されたより複合性のナノデバイスのアセンブリ手段を提供する。多次元的なナノ構造の組みたては、例えば、個々の一次元ナノ構造にさらなる連結要素（これらのさらなる連結要素は、個々のナノ構造を一緒に結合する適切な交差連結試薬によって認識され、そして結合され得る）を含む正確に間隔を空けられたアセンブリ単位を取り込むことによって達成され得る。特定の好ましい実施形態において、このような交差連結は、例えば、抗体またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントであり得る。
【０１７１】
本発明の段階的アセンブリ法のいくつかの実施形態において、開始単位が固体支持体に係留される。このような係留は、ランダムではなく（すなわち、アセンブリ単位の可塑性のビオチン化またはランダムなビオチン化に対するタンパク質の非特異的結合（その後、固定化ストレプトアビジンの結合が続く）ではなく）、マトリックスまたは基板への開始単位の特定の要素の結合を伴う。この段階的アセンブリプロセスは、方向性のプロセスであって、次のアセンブリ単位の結合のために、開始単位上に妨害されていない連結要素を必要とする。基板への開始単位のランダムな結合は、ある場合には、次のアセンブリ単位の結合に必要とされる連結要素の妨害をもたらし、従って、ナノ構造が組み立てられる際における開始単位の数を低減させる。
【０１７２】
本発明の段階的アセンブリ法の他の実施形態において、開始単位は、固体基板に固定されない。この場合、除去工程（例えば、洗浄工程）が、以下：
（１）磁性ナノ粒子を開始単位に結合させること、および磁場をかけることによって非結合性のアセンブリ単位からナノ構造中間体を分離すること；
２）より大きいナノ構造中間体を、非結合性のアセンブリ単位から、遠心分離、沈殿または濾過によって分離すること；あるいは
３）ナノ構造中間体またはアセンブリナノ構造が、破壊的な処理（例えば、プロテアーゼ処理もしくは化学的分解）に対してより耐性であるような場合には、非結合性のアセンブリ単位が選択的に破壊されること；
によって、非固定化または係留されていない開始単位上に構築されたナノ構造上で実施され得る。
【０１７３】
タンパク質は、明確な結合特性を有し、そしてタンパク質の分子間の相互作用を操作するための技術は、当該分野で周知である（Ｈａｙａｓｈｉら、１９９５、Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｇｅｎｅ  １６０（１）：１２９〜３０；Ｈａｙｄｅｎら、１９９７、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（２）：２０１〜１２；Ｊｕｎｇら、１９９９、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４（１）：１６３−８０；Ｖｉｔｉら、２０００、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４８０〜５０５；Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４、Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜５５）。しかし、企図されたナノ構造の段階的アセンブリは、特異的な認識特性を有する生物学的分子（例えば、タンパク質および核酸）から主に構成される成分に限定される必要は無い。無機原子または無機分子の光学的特性、磁性特性または電気的特性は、段階的アセンブリによって組み立てられたナノ構造のいくつかの実施形態に必要とされる。
【０１７４】
タンパク質で構成されていない成分が有利に利用される、本発明の多くの実施形態が存在する。他の実施形態において、有機物質と無機物質の両方から構成されるナノ構造を構築するためにタンパク質または核酸の分子相互作用特性を利用することが可能であり得る。
【０１７５】
ある実施形態において、無機ナノ粒子が、本発明の段階的アセンブリ法を用いて、ナノ構造中に組み立てられる成分に付加される。これは、無機粒子への結合のために特異的に選択された連結要素を用いて行われ得る。例えば、Ｗｈａｌｅｙおよび共同研究者は、半導体結合表面に特異的に結合するペプチドを同定した（Ｗｈａｌｅｙら、２０００、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：６６５〜６８）。１つの実施形態において、これらのペプチドは、本明細書中に記載されたタンパク質成分中に、標準的なクローニング技術を用いて挿入される。タンパク質の段階的アセンブリは、本明細書中に開示されるように構築され、強固で明確な三次元アレイ中に、これらの結合部位を分配する手段を提供する。
【０１７６】
一旦、無機ナノ粒子の特定の型についての結合部位が全て配置されると、これらの無機ナノ粒子は、タンパク性のアセンブリ単位を付加するのに使用されるサイクルに類似した段階的アセンブリのサイクルを用いて付加され得る。これを達成するために、ある実施形態において、無機ナノ粒子の溶解性を提供するために、ナノ構造中間体がインキュベートされる溶液条件を調整することが必要であり得る。一旦、無機ナノ粒子がナノ構造中間体に付加されると、この無機ナノ粒子に、さらなる単位を管理された方法で付加することは不可能である。なぜなら、任意の集団の無機ナノ粒子に固有の微小不均一性のためである。これらの不均一性は、さらなる相互作用の幾何学および化学量論が制御不可能であることを示す。
【０１７７】
図１３は、本発明の段階的アセンブリ法に従うナノ構造へのタンパク質単位および無機元素の付加を示す図である。工程１において、開始単位を固体基板に結合させる。工程２において、アセンブリ単位を開始単位に特異的に結合させる。工程３において、さらなるアセンブリ単位を組み立てられたナノ構造に結合させる。このアセンブリ単位は、特定の無機元素に特異的な、操作された結合部位を構成する。工程４において、無機元素（クロスハッチされた楕円（ｃｒｏｓｓ−ｈａｔｃｈｅｄ  ｏｖａｌ）として示す）をこの構造に付加し、そして操作された結合部位に結合させる。工程５は、第２の型の無機元素に特異的に操作された結合部位を有する別のアセンブリ単位を付加し、そして第２の無機元素（長菱形（ｈａｔｃｈｅｄ  ｄｉａｍｏｎｄ）として示す）を工程６において付加させる。
【０１７８】
アセンブリ単位が付加される順序は、所望の構造および／または活性（アセンブリプロセスに用いられる生成物ナノ構造、および交差反応する連結要素対の数を最小化する必要性）によって決定される。従って、アセンブリの順序の決定は、段階的アセンブリによって組み立てられるべきナノ構造の設計の不可欠な部分である。連結要素が設計によって選択され、所望のナノ構造の段階的アセンブリを可能にする。連結要素の選択は、ナノ構造中に組み込まれるべき機能的要素と一般的に無関係であり、これらの連結要素は、必須の機能的要素および連結要素（所望の空間的位置に機能的要素の配置を提供する）を有するアセンブリ単位を組み立てるのに必要とされるように混合されそしてマッチングされる。
【０１７９】
例えば、２つの連結要素（３つの連結対を作る６つの連結要素を用いて設計された）を構成するアセンブリ単位は、相互作用しない任意の１８対の連結要素を含み得る。連結要素の２１対の可能な対が存在するが、これらの対のうちの３対は相互作用し（例えば、Ａ−Ａ’）、そしてアセンブリ単位におけるこれらの対の使用により、互いに同一のアセンブリ単位の自己会合を引き起こす。以下に示した実施例において、連結要素は、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、ＣおよびＣ’として示され、ここで、ＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’、ならびにＣおよびＣ’は、連結要素の相補的対（連結対）（すなわち、互いに特異的に結合するが、示された他の４つの連結要素のいずれにも結合しない）である。６つの代表的なアセンブリ単位（各々が２つの連結要素を含み、ここで各々の連結要素は、非同一な非相補的な連結要素を含む）が、以下に示される。この描写において、各々のアセンブリ単位は、固有の機能的要素（６つのセットの１つ）をさらに含み、Ｆ１〜Ｆ６として表される。これらの慣習に従って、６つの可能なアセンブリ単位が、以下のように設計され得る：
【０１８０】
【化１】
2005518454.tif 000009
本明細書中に開示される方法に従う段階的アセンブリは、以下に例証される線形の一次元ナノ構造を組み立てるために使用され得、各々のアセンブリ単位の順序および相対的なベクトル方向は、機能的要素（記号
【０１８１】
【化２】
2005518454.tif 000010
は、開始剤が結合される固体基板を表して使用され、そしてダブルコロンは、アセンブリ単位間の特異的相互作用を表す）の順序と無関係である：
【０１８２】
【化３】
2005518454.tif 000011
この図から明らかなように、多数の固有のアセンブリ単位が少数の相補的な連結要素を用いて構築され得る。さらに、アセンブリ単位の１つの型のみが、各々の段階的アセンブリサイクルに付加されるので、少数の相補的な連結要素のみが、多数の固有の複雑なナノ構造のアセンブリに必要である。従って、連結要素が、完成したナノ構造内部のアセンブリ単位の位置に両義性を付与することなく繰り返し使用され得る。
【０１８３】
上記の場合の各々において、２つまたは３つの連結対のみが使用される。これらの構造の任意の自己アセンブリは、７つの非交差反応連結対の使用を必要とする。これらの線形構造がＮ単位の大きさであって、２つまたは３つの連結対が依然として必要とされるのみであるが、自己アセンブリのためには、これらの線形構造は、（Ｎ−１）非交差反応する相補的連結対を必要とする。
【０１８４】
本発明の別の局面において、上に示したアセンブリ単位の２つの連結要素の位置を交換することによって、結合された機能的要素の空間的位置および配向が、組み立てられたナノ構造の全体的な構造内で変更される。本発明のこの局面は、本明細書中に開示されるように、ナノ構造の段階的アセンブリによって付与される設計柔軟性のさらに別の局面を明らかにする。
【０１８５】
開始剤またはナノ構造中間体への各アセンブリ単位の結合は、開始剤またはナノ構造中間体によって運ばれるアセンブリ単位の１つの連結要素と１つ以上の非結合相補的連結要素との間の特異的連結対相互作用の形成によって、媒介される。多数の実施形態において、単一の非結合相補的連結要素のみが、開始剤またはナノ構造中間体上に存在する。しかし、他の実施形態において、複数の同一のアセンブリ単位を、同一の連結要素を含むアセンブリ中間体上の複数の部位に付加することは、有利であり得る。これらの実施形態において、段階的アセンブリは、アセンブリ単位の並列加算によって進行するが、単一単位のみが中間体上の任意の１部位に結合され、そして関連する全ての部位でのアセンブリは、予め設計されたベクトル様式で生じる。
【０１８６】
ナノ構造の構造完全性は、段階的アセンブリのプロセスにわたって決定的な重要性があり、そしてこれらのアセンブリ単位は、好ましくは非共有結合性の相互作用によって連結される。特異的非共有結合性の相互作用は、例えば、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間に生じる相互作用である。特異的相互作用は、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間の複合体に、段階的アセンブリプロセス全体に渡って安定な相互作用を維持するのに十分な安定性を与えるために、適切な親和性を示すべきである特異的非共有結合性相互作用は、付加されたアセンブリ単位が、そのアセンブリ単位と相互作用するように設計された連結要素とのみ安定な相互作用を形成するように、適切な特異性を示すべきである。本明細書中に開示された段階的アセンブリプロセスの間、要素間に生じる相互作用は、好ましくは、操作可能には「逆転できない（不可逆である）」。この要求を満たす結合定数は、明確には定義され得ない。なぜなら、「不可逆性」は動力学的概念であり、結合定数が平衡特性に基づくためである。それにもかかわらず、１０−７以下の桁（すなわち、より高い親和性および典型的なダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）−エピトープ複合体のＫｄに類似）のＫｄ’での相互作用は、目的のタイムスケールで（すなわち、ナノ構造の段階的アセンブリの間）、代表的に「不可逆的に」作用する。
【０１８７】
しかし、分子間の相互作用は、ナノ構造の利用のタイムスケール（すなわち、その有効期限予測値または可使時間予測値）に「不可逆的に」作用する必要はない。ある実施形態において、本明細書中に開示される段階的アセンブリ法に従って組み立てられたナノ構造は、続いて、化学固定（例えば、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを用いた固定）によって安定化されるか、または架橋結合によって安定化される。２つのタンパク質を架橋結合するための最も一般的なスキームは、１つのアセンブリ単位上のアミノ基の第２アセンブリ単位上のチオール基に対する間接的なカップリングを含む（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第８版、２章、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｌｏｓｔｅｒら、１９９７、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．６９９（１〜２）：４３９−６１；Ｐｈｉｚｉｃｋｙら、１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９（１）：９４〜１２３を参照のこと）。
【０１８８】
本発明のある実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法によるナノ構造の組立ては、アセンブリ単位間の非共有結合性の相互作用を用いて、比較的強固で安定なアセンブリ単位を連結することを包含する。それにもかかわらず、有用なアセンブリ単位に組み込まれる連結要素は、むしろ混乱し（つまり、安定でも強固でもない）、その後、第２の連結要素と相互作用して、安定な、好ましくは強固な連結対を形成し得る。したがって、本発明のある実施形態において、個々のアセンブリ単位は、アセンブリ前に、不安定な可撓性のドメイン含み得、これは、アセンブリ後には、より強固になる。好ましい実施形態において、本明細書中に開示された組成物および方法を用いて組み立てられたナノ構造は、強固な構造である。
【０１８９】
本発明の方法に従って、ナノ構造の剛性の分析、ならびに任意の構造的不備または欠陥の同定が、当該分野で周知の方法（例えば、電子顕微鏡検査法）を用いて実施される。
【０１９０】
別の実施形態において、構造的剛性は、固体表面に完成したナノ構造の一端を直接的に付着させることによって（すなわち、可撓性係留を用いることなく）、試験され得る。次いで、ナノ構造の他端（または、多分岐構造である場合、ナノ構造の末端分岐）は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）チップに接着され、このチップは可動である。チップを動かす目的で、チップに力がに適用される。ナノ構造が可撓性である場合、適用された力とナノ構造の偏向によって認められたチップ移動との間には、おおよその比例関係が存在する。対照的に、ナノ構造が強固である場合、ナノ構造偏向およびチップ移動はほとんど無いかまたは全くない。なぜなら、適用される力のレベルが、強固なナノ構造が破壊される点まで増加するためである。その時点では、これ以上の力は適用されないにもかかわらず、ＡＦＭチップの大きな移動がある。２つの末端の接着点がナノ構造よりも強い限りは、この方法は、剛性の有用な測定値を提供する。
【０１９１】
本発明によると、ナノ構造中の各位置は、全ての他の位置と区別可能である。なぜなら、各アセンブリ単位が、その隣接単位と密に、かつ特異的に、かつ固有に相互作用するように設計され得るからである。各アセンブリ単位は、このナノ構造内の位置とは異なる活性および／または特性を有し得る。このナノ構造中の各位置は、段階的アセンブリプロセスによって、ならびに各アセンブリ単位および／または所望の位置で加えられる機能的要素の特性によって、固有に規定される。さらに、本明細書中に開示される段階的アセンブリ法およびアセンブリ単位は、十分に規定されたサイズ、形状および機能の複雑なナノ構造を構築するための大規模な大量並列自動化製造プロセスに供することができる。
【０１９２】
本発明の方法および組成物は、本明細書中で用いられるアセンブリ単位の構築において使用されるタンパク質が可能である正確な寸法、均一性、および空間形状の多様性を利用する。さらに、本明細書中以下に記載されるように、本発明の方法は有利である。なぜなら、遺伝子操作技術が、本明細書中に開示される本発明の方法において使用される生物学的材料の特性を改変および変更するため、ならびに微生物中で多量のこのような材料を合成するために使用され得るからである。
【０１９３】
（開始アセンブリ単位）
開始アセンブリ単位は、本発明の段階的アセンブリ法によって形成されるナノ構造に組み込まれた第１のアセンブリ単位である。開始アセンブリ単位は、特定の実施形態において、共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用によって、固体基板または他のマトリクスに結合され得る。開始アセンブリ単位は、「開始単位」としても公知である。
【０１９４】
ナノ構造の段階的アセンブリは、選択されたアセンブリ単位の開始単位への非共有結合的な方向性付加によって始まる。本発明の方法によると、アセンブリ単位が、（ｉ）開始単位のインキュベーションによって、開始単位に付加され、この開始単位は、いくつかの実施形態において、付加されるべき次のアセンブリ単位を含む溶液中で、マトリクスまたは基板に固定される。このインキュベーション工程の後に、（ｉｉ）除去工程（例えば、洗浄工程）が続き、ここで過剰のアセンブリ単位が、開始単位の付近から除去される。
【０１９５】
アセンブリ単位は、特異的な非共有結合の形成によって、開始単位に結合する。次のアセンブリ単位の連結要素は、これらの連結要素が開始単位上の予め指定された部位のみに結合するように選択される。１つのアセンブリ単位のみが、第１の段階的アセンブリサイクルの間に、開始単位上の標的連結要素に付加され得、そしてこのアセンブリ単位の標的開始単位への結合は、方向性である。所望のアセンブリ単位の全てがナノ構造の所望の設計に従ってナノ構造に組み込まれるまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことによって、段階的アセンブリが続く。
【０１９６】
本発明の段階的アセンブリ法の好ましい実施形態において、開始単位が、基板に固定され、そしてさらなる単位が、固相ポリマー合成と類似の手順で、連続的に付加される。
【０１９７】
開始単位は、アセンブリ単位のカテゴリーであり、従って、本発明のアセンブリ単位で含まれると本明細書中以下に記載される構造的連結要素および／または機能的要素のいずれかを含み得る。従って、開始単位は、以下の分子、またはそれらの結合誘導体もしくは結合フラグメントのいずれかを含み得る：モノクローナル抗体；多重特異的抗体、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）；二重特異的、キメラまたは二重特異的なヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディまたは多量体ｓｃＦｖフラグメント；細菌ピリンタンパク質、ロイシンジッパー型コイルドコイル、４へリックス束、ペプチドエピトープまたはＰＮＡ、あるいは本明細書中に開示される任意の他の型のアセンブリ単位。
【０１９８】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの連結要素を含む開始アセンブリ単位を提供する。他の実施形態において、本発明は、２つ以上の連結要素を有する開始アセンブリ単位を提供する。
【０１９９】
開始単位は、種々の方法でマトリクスに連結され得る。連結方法の選択は、いくつかの設計要因（開始単位のタイプ、最終のナノ構造がマトリクスから除去されるべきか否か、最終のナノ構造の化学などが挙げられるが、これらに限定されない）によって決定される。可能な連結方法としては、開始エピトープへの抗体の結合、Ｈｉｓタグ化開始剤、マトリクス結合ドメイン（例えば、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン）を含む開始単位、抗体または抗体由来開始単位については、抗体結合タンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）、ビオチン化開始剤のストレプトアビジン結合、ＰＮＡ係留、および開始剤のマトリクスへの特異的な共有結合的連結が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
特定の実施形態において、開始単位は、固体基板に固定される。開始単位は、抗体または抗原の固定のための当該分野で一般的に使用される方法を使用して、固体基板に固定され得る。抗体または抗原の固定のための当該分野で周知の多数の方法がある。これらの方法としては、プラスチックＥＬＩＳＡプレートへの非特異的吸着；タンパク質のビオチン化、その後の、プラスチック基板にすでに吸着されたストレプトアビジンまたはアビジンに結合することによる固定（例えば、Ｓｐａｒｋｓら、１９９６、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｂ．Ｋ．Ｋａｙ，Ｊ．ＷｉｎｔｅｒおよびＪ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２２７−５３を参照のこと）が挙げられる。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに加えて、タンパク質は、多数の他の固体支持体（例えば、セファロース（Ｄｅｄｍａｎら、１９９３，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８；２３０２５−３０）、または常磁性ビーズ（Ｓｐａｒｋｓら、１９９６，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｂ．Ｋ．Ｋａｙ，Ｊ．ＷｉｎｔｅｒおよびＪ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２２７−５３））に固定され得る。使用され得るさらなる方法としては、アミンを含有する生物学的分子の、アルデヒドを含有する固体支持体上での還元的アミノ化（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐ．１８６）、ジメチルピメリミデート（ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＭＰ）の使用、およびいずれかの末端にイミドエステル基を有するホモ二官能性架橋剤の使用（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２０５−０６）が挙げられる。この試薬は、結合プロテインＡを含む不溶性支持体に抗体分子を固定する際の使用が見出されている（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９８２，Ａ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｍｕｎｏｍａｔｒｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１０７６６−６９）。
【０２０１】
特定の実施形態において、開始単位は、係留化ドメイン（Ｔ）（これは固定された抗原／ハプテンを認識し、そしてこれらに結合する）および対向するドメイン（Ａ）（続いて、このドメインに、段階的アセンブリ中にさらなるアセンブリ単位が付加する）を含む二重特異的抗体である。抗体８Ｆ５（これは、抗原性ペプチドＶＫＡＥＴＲＬＮＰＤＬＱＰＴＥ（配列番号１）に由来するヒトライノウイルス（血清型２）ウイルスキャプシドタンパク質Ｖｐ２に対して指向される）は、Ｔドメインとして使用される（Ｔｏｒｍｏら、１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒａｌ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（１０）：２２４７−５６）。Ａドメインは、二重特異的抗体単位１について先に記載された同じリゾチーム抗イデオトープ抗体（Ｅ５．２）である。従って、完全開始アセンブリ単位は、８Ｆ５×７３０．１．４（Ｔ×Ａ）を対向するＣＤＲとして含む。開始単位が、構築され、そして二重特異的抗体を含む連結要素および／または構造的要素を特徴付けるための本明細書中で記載された方法を使用して機能的に特徴付けされる。
【０２０２】
開始単位を固体支持体マトリクスに固定するために、ライノウイルス抗原性ペプチドが、第Ｘａ因子の配列ＩＥＧＲのＮ末端（ＮａｇａｉおよびＴｈｏｇｅｒｓｅｎ，１９８４，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９（５９７１）：８１０−１２）で、ならびに第Ｘａ因子の配列と抗原性ペプチド配列との間で、スプライシングされた短い可撓性リンカーを介して、プロテアーゼ認識ペプチド第Ｘａ因子に融合され得る。この融合ペプチドは、ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（６炭素長のスペーサーアームを有し、１級アミンを介するカップリングを許容するセファロース誘導体）に共有結合され得る。（あるいは、カルボキシル基を介する共有結合のためのセファロース誘導体が使用され得る）。共有結合された融合タンパク質は、開始単位（Ｔ×Ａ）中の係留化ドメイン「８Ｆ５」の認識エピトープとして働く。
【０２０３】
一旦、開始剤が固定されると、続いて、さらなるダイアボディ単位（ダイアボディアセンブリ単位１および２）が、結合ドメインＡ’から一方向で、段階的アセンブリに付加され得る。段階的アセンブリが完了すると、ナノ構造は、支持体マトリクスに架橋され得るか、またはプロテアーゼ第Ｘａ因子の付加の際に、このマトリクスから放出され得る。このプロテアーゼは、共有結合された抗原性／第Ｘａ因子の融合ペプチドを切断し、支持体マトリクスからインタクトなナノ構造を放出する。なぜなら、設計によって、設計されたタンパク質アセンブリ単位のいずれにも、第Ｘａ因子認識部位が含まれないからである。
【０２０４】
第Ｘａ因子の付加を必要としない固体支持体マトリクスからのペプチド融合物の切断の代替方法もまた、実行され得る。この方法は、セファロースマトリクスに結合した切断可能なスペーサーアームを使用する。抗原ペプチドは、フェニルエステル結合を介してマトリクスに共有結合される。一旦、固定された抗体が開始アセンブリ単位に結合すると、この開始アセンブリ単位は、ｐＨ７．４（開始単位／抗原複合体（および関連のナノ構造）が支持体マトリクスから放出される点）におけるイミダゾールグリシン緩衝液を用いるスペーサーアームの化学的切断まで、この支持体マトリクスに連結されたままである。
【０２０５】
（連結要素を特徴付けるための方法）
（抗体ファージディスプレイ技術によって連結要素相互作用を同定するための方法）
本発明の特定の実施形態において、本発明の方法において使用するために適切な連結要素は、抗体ファージディスプレイ技術を使用して、スクリーニングされ、そしてそれらの相互作用が同定される。組換え抗体またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントの産生のためのファージディスプレイ技術は、有機および無機の両方の、広範な多様な抗原（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖および半導体表面など）に結合し得るタンパク質を産生するために使用され得る。ファージディスプレイ技術のための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｍａｒｋｓら、１９９１，Ｂｙ−ｐａｓｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｖ−ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ｐｈａｇｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７；Ｎｉｓｓｉｍら、１９９４，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ”ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｔ”ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：６９２−９８；Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら、１９９６，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｕｌ  ＲＮＡ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｖ  ｇｅｎｅ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：６２９−３９；Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら、１９９７，Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０７：６１−６７；Ｗｉｌｌｅｍｓら、１９９８，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １２：１２９５−１３０２；ｖａｎ  Ｋｕｐｐｅｖｅｌｔら、１９９８，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｆｕｒｔｈｅｒ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｋｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１２９６０−６６；Ｈｏｅｔら、１９９８，Ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＵｌｓｎＲＮＰ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｕ１Ｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｅｐｉｔｏｐｅ  ｍａｐｐｉｎｇ，ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａ��ｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖ−ｇｅｎｅ  ｕｓａｇｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３５：１０４５−５５を参照のこと）。
【０２０６】
組換え抗体技術は、ハイブリドーマ細胞由来の既知の特異性を有する抗体の単離を可能にするが、これは、特異的ｍＡｂの迅速な生成を可能にしない。ハイブリドーマを生成するための、別々の免疫と引き続く細胞融合とが、目的の各ｍＡｂを生成するために必要である。これは、時間を消費し、かつ困難であり得る。
【０２０７】
好ましい実施形態において、抗体−ファージディスプレイ技術は、これらの制限を克服するために使用され、その結果、目的の特定の抗原を認識するｍＡｂは、より効率的に生成され得る（方法については、Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４，Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−５５；Ｈａｙａｓｈｉら、１９９５，Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｇｅｎｅ  １６０（１）：１２９−３０；ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら、１９９６，Ｐｈａｇｅ  ｄｉａｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（９）：１１４９−５４；Ｊｕｎｇら、１９９９，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４（１）：１６３−８０；Ｖｉｔｉら、２０００，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４８０−５０５を参照のこと）。一般に、抗体ファージディスプレイ技術において、ＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子のＦｖまたはＦａｂ抗原結合部分は、ヒト脾臓細胞またはヒト末梢血リンパ球由来のｃＤＮＡから、適切なプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって「レスキュー」される。レスキューされたＶＬ遺伝子およびＶＨ遺伝子のレパートリー（ＤＮＡ配列）は、一緒にスプライシングされ、そしてバクテリオファージの微量外被タンパク質（例えば、Ｍ１３もしくはｆｄ、またはその結合誘導体）へと挿入されて、融合バクテリオファージ外被タンパク質を生成する（Ｃｈａｎｇら、１９９１，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｂ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｎ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｓｕｒｆａｃｅｓ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１０）：３６１０−１４；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｌｅ，１９９９，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２（２）：１７３−２０１）。得られたバクテリオファージは、ファージタンパク質外被の外表面に融合した機能的抗体、ならびにファージゲノム中に組み込まれた抗体ＶＬおよびＶＨをコードする遺伝子フラグメント１コピーを含む。
【０２０８】
これらの方法を使用して、バクテリオファージがディスプレイする、目的の特定の抗原に対する親和性を有する抗体は、例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって、標的エピトープもしくは抗原（これは、固体表面またはマトリクス上に固定化される）に対する、ディスプレイされた抗体を保有する組換えバクテリオファージの集団の結合を介して、単離され得る。結合、未結合または弱く結合したファージ粒子の除去、およびファージ複製の反復サイクルにより、所望のＶＬ遺伝子フラグメントおよびＶＨ遺伝子フラグメントを保有するバクテリオファージの富化集団が得られた。
【０２０９】
目的の抗原としては、ペプチド、タンパク質、免疫グロブリン定常領域、ＣＤＲ（抗イディオタイプ抗体の産生について）、他の高分子、ハプテン、低分子、無機の粒子および表面が挙げられ得る。
【０２１０】
一旦精製されると、連結されたＶＬ遺伝子フラグメントおよびＶＨ遺伝子フラグメントは、当該分野で公知の標準的なＤＮＡ分子技術によって、バクテリオファージゲノムからレスキューされ得、クローニングおよび発現され得る。この方法によって生成される抗体の数は、遺伝子レパートリーのサイズおよび多様性と直接的に相関し、そして実質的に任意の標的分子に対する抗原性についてスクリーニングされ得る多様な抗体ライブラリーが生成される最適な方法を提供する。抗体ファージディスプレイ技術によって生成されたｍＡｂは、しばしば、ピコモル濃度〜ナノモル濃度範囲で、抗原に対する特異的結合を実証する（Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｎｏｎｉｍｍｕｎｅ  ｐｈａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｙ：ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１１）：６１５７−６２）。
【０２１１】
本発明の方法において有用な抗体、またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントは、上記のように構築および特徴づけされた、抗体またはフラグメントファージディスプレイライブラリーを使用して、選択され得る。このようなアプローチは、本発明の方法において使用するために適切な抗体またはフラグメントの同定を劇的に増大させるために、高い複雑性（例えば、１０９）を有するライブラリーを効率的にスクリーニングするための方法を提供するという利点を有する。
【０２１２】
特定の実施形態において、免疫グロブリンレパートリーをクローニングするための方法（「レパートリークローニング」）が、本発明の段階的アセンブリ方法において使用するための抗体を産生するために使用される。レパートリークローニングは、抗体産生動物を含むことなしに、実質的に任意の種類の抗体の産生のために使用され得る。免疫グロブリンレパートリーをクローニングするための方法（「レパートリークローニング」）は、当該分野で周知であり、そして完全にインビトロで実施され得る。一般に、レパートリークローニングを実施するために、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が、末梢血から得られたＢリンパ球から抽出される。このｍＲＮＡは、逆転写酵素および標準的なプロトコルを使用して、ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして働く（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｔｏｏｌｓ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｔｒｏｕｂｌｅｓｈｏｏｔｉｎｇ，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ＩＡ，ＩＣ，ＩＩＡ，ＩＩＢ，ＩＩＣ  ａｎｄ  ＩＩＩＡ，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｊａｎｕｓｚ  Ａ．Ｚ．Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｊｕｌｉａ  Ｍ．Ｐｏｌａｋ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ７，１１，１４  ａｎｄ  １８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３，４，１１，１５  ａｎｄ  ２４，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）。免疫グロブリンｃＤＮＡは、適切なプライマーを使用して、この複雑なｃＤＮＡ混合物から、ＰＣＲによって特異的に増幅される。所望の結合特性を有する免疫グロブリンフラグメントを構築するために、抗体軽鎖（Ｌ）および抗体重鎖（Ｈ）をコードする遺伝子からのＰＣＲ産物が得られる。ついで、これらの産物は、ファージミドベクター中に導入される。ファージ外被タンパク質との融合物としてバクテリオファージゲノムに組み込まれた、クローニングされた遺伝子または遺伝子フラグメントは、適切な細菌宿主中で発現され、バクテリオファージの表面上に保有されるハイブリッドｓｃＦｖ免疫グロブリンの合成を導く。従って、バクテリオファージ集団は、レパートリー中に含まれる全ての特異性を有する免疫グロブリンの混合物を提示する。
【０２１３】
抗原特異的免疫グロブリンは、抗原免疫吸着とその後のファージ複製の反復プロセスによって、この集団から選択される。目的の抗原にのみ特異的なバクテリオファージは、複数回の選択後に残存し、そしてさらなる操作のため、または可溶性形態で、かつ大量でのファージコードタンパク質を発現するために、新規のベクターおよび／または宿主へと導入され得る。
【０２１４】
従って、上記のように、抗体ファージディスプレイライブラリーは、本明細書中で開示されるようなナノ構造の段階的アセンブリにおいて使用するためのアセンブリ単位の構築において連結要素として使用され得る抗体のエピトープ結合領域の、単離、精製および改善のために、使用され得る。
【０２１５】
（ｘ線結晶学を使用する、連結要素相互作用を特徴付けるための方法）
多くの例において、タンパク質間またはタンパク質とペプチドとの間の分子認識は、実験的に決定され得る。本発明の１局面において、連結要素相互作用を規定し、そして連結対の形成に重要な、タンパク質−タンパク質相互作用は、当該分野で一般に公知のＸ線結晶学的方法によって、特徴付けおよび同定される。このような特徴付けにより、本発明の組成物および方法において有用であり得る連結対相互作用を認識することが、当業者に可能となる。
【０２１６】
（連結要素の特異性および親和性を特徴付けるための方法）
２つの相補的連結要素が特異的に相互作用するという検証は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、分析的限外濾過、またはＢＩＡｃｏｒｅ方法論（Ａｂｒａｈａｍら，１９９６，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．９（５−６）：４５６−６１；Ａｔｗｅｌｌら，１９９６，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ｄｉｍｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｒｉｎ  ａｎｄ  Ｎ９  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（１７−１８）：１３０１−１２；Ｍｕｌｌｅｒら（１９９８），Ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｎｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｄｉｔｙ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２（１−２）：４５−４９）、または当該分野で周知の他の類似の方法を使用して確立され得、これらは、分子間結合相互作用の強度を実証および／または定量するのに適している。
【０２１７】
（構造的要素、連結要素および機能的要素の設計および操作）
規定された結晶構造、または高度に相同性の物質の既知の結晶構造に基づく相同性モデリングにより明らかにされるように、本発明の構造的要素、連結要素および機能的要素の設計、ならびにこれらを含むアセンブリ単位の設計は、所望の結合相互作用におけるそれらの構造の分析および決定によって容易にされる。１つ以上の機能的要素を含む有用なアセンブリ単位の設計は、好ましくは、以下の工程の幾つかまたは全部を含み得るが、これらに限定されない、一連の決定および分析を包含する：
（ｉ）ナノ構造の所望の全体的な機能に基づいて、組み込まれるべき機能的要素の選択；
（ｉｉ）標的機能に基づく所望の形状の選択、特に、機能的要素の相対的位置の決定；
（ｉｉｉ）これらのペプチドまたはタンパク質の決定、同定または選択を介する連結要素の選択（例えば、コンビナトリアルライブラリから）であり、これらのペプチドまたはタンパク質は、所望のナノ構造に組み込まれるべき機能的ナノ粒子に対する特異性を有する、選択；
（ｉｖ）例えば、量子ドットなどのようなナノ粒子を含む機能的要素間の、必要とされる分離に基づく、正確な寸法を有する適切な剛性の構造を提供しかつ正確な形状および化学量論を有する連結要素の組み込みのための位置を有する構造的要素の選択；
（ｖ）工程（ｉｉｉ）からの、ペプチドまたはタンパク質の連結要素および工程（ｉｖ）において選択された構造的要素を組み込む融合タンパク質の設計であって、それにより、アセンブリ単位の構造的要素および連結要素の折り畳みが、破壊されない（例えば、βターンにおける組み込みを介する）、設計；
（ｖｉ）ナノ構造の全体的な設計の状況において生じる融合タンパク質のコンピューターモデリングおよび機能的仕様によって必要とされる場合に構造的寸法を最適化するための設計の精錬；または
（ｖｉｉ）段階的アセンブリのためのアセンブリ配列の設計。
【０２１８】
構造的要素タンパク質の改変は、通常、例えば、問題のタンパク質のアミノ酸配列の挿入、欠失、または改変を含む。多くの場合、改変は、ネイティブのタンパク質において現存しない連結要素を加えるための挿入または置換を含む。挿入変異の成功を決定するための慣習的な試験の非限定的な例は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルである。生じる融合変異体タンパク質のＣＤスペクトルが、ネイティブのタンパク質のＣＤと比較され得る。
【０２１９】
挿入が小さい場合（例えば、短いペプチド）、適切に折り畳まれた挿入変異体のスペクトルは、ネイティブのタンパク質のスペクトルに非常に類似する。挿入がタンパク質ドメイン全体である場合（例えば、単鎖可変ドメイン）、融合タンパク質のＣＤスペクトルは、個々の成分（すなわち、ネイティブのタンパク質ならびにネイティブのタンパク質および機能的要素を含む融合タンパク質の成分）のＣＤスペクトルの合計に対応するはずである。この対応は、融合タンパク質の２つの成分の正確な折り畳みについての慣習的な試験を提供する。
【０２２０】
好ましくは、融合タンパク質の首尾よい操作の更なる試験がなされる。例えば、融合タンパク質がその標的の全てに結合し、それゆえに、全ての連結対と首尾よく相互作用する能力の分析がなされ得る。これは、多くの適切なＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施され得る；少なくとも１つのＥＬＩＳＡを実施して、ナノ構造を形成するのに必要とされる各々の連結対に対する、改変されたタンパク質の親和性および特異性を試験する。
【０２２１】
（段階的アセンブリ法の使用およびそれにより構築されたナノ構造の使用）
本発明の段階的アセンブリ法およびアセンブリ単位は、無数のナノ構造の構築における用途を有する。このようなナノ構造の使用は、容易に明らかとなり、この使用としては、一次元、二次元、および三次元の構造（例えば、繊維、ケージ、または固体）の高度に規則正しい十分に規定されたアレイを必要とする適用が挙げられ、これらの構造は、それらが他の物質と会合できるようにする特定の結合部位を含み得る。
【０２２２】
特定の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法により製造されたナノ構造は、一次元構造である。例えば、段階的アセンブリにより製造されたナノ構造は、他の物質（例えば、エアロゲル、紙、プラスチック、セメントなど）の構造的補強剤のために使用され得る。特定の実施形態において、長い一次元繊維の形態を取るように段階的アセンブリにより製造されるナノ構造は、例えば、製造の間、紙、セメントまたはプラスチックに組み込まれて、加えられた湿度および乾燥引張り強度を提供する。
【０２２３】
別の実施形態において、ナノ構造は、同定または認識の目的のために使用され得るパターン化またはマーキングされた繊維である。このような実施形態において、ナノ構造は、例えば、蛍光色素、量子ドット、または酵素などのような機能的要素を含み得る。
【０２２４】
さらなる実施形態において、特定のナノ構造は、偽造に対するマーカーとして紙および織物に含浸される。この場合、（例えば、キットで市販される）単一の色が関連する抗体反応を使用して、物質の起源を検証する。あるいは、このようなナノ構造は、組み込みの前または後のいずれかに色素、インクもしくは他の物質と結合して、紙もしくは織物を染色し得るか、または、他の方法でそれらの外観もしくは特性を改変し得る。
【０２２５】
別の実施形態において、ナノ構造は、例えば、製造の間にインクまたは色素に組み込まれて、可溶性または混和性を増大させる。
【０２２６】
別の実施形態において、一次元構造のナノ構造（例えば、繊維）は、所望の位置に１つ以上の酵素機能的要素または触媒機能的要素を保有する。このナノ構造は、酵素反応または触媒反応のための支持構造または足場として機能し、その効率を増大させる。このような実施形態において、ナノ構造を使用して、所望の反応順序における酵素または他の触媒を「取り付ける」か、または位置付けし、反応「アセンブリライン」を提供し得る。
【０２２７】
別の実施形態において、一次元のナノ構造（例えば、繊維）は、アセンブリジグとして使用される。２つ以上の成分（例えば、機能的単位）がナノ構造に結合され、それにより、空間的配向を提供する。これらの成分は、結合または融合され、次いで、生じた融合生成物は、ナノ構造から放出される。
【０２２８】
別の実施形態において、ナノ構造は、一次元、二次元または三次元の構造であり、この構造は、ナノ粒子（例えば、熱特性、電気的特性または磁気特性を有する金属粒子または他の粒子）を規定された間隔で取り付けるための支持体または枠組みとして使用され、そして、この構造は、ナノワイヤまたはナノ回路を構築するために使用される。
【０２２９】
別の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法を使用して、一次元ナノ構造（繊維）と金属との電極のないプレーティングを達成し、規定されたサイズおよび／または形状を有するナノワイヤを構築する。例えば、機能的要素として金属粒子を含むナノ構造が構築され得る。
【０２３０】
別の実施形態において、機能的要素として磁気粒子を含む一次元ナノ構造（例えば、繊維）は、外部磁場により整列されて、ナノ構造を通って流れる流体を制御する。別の実施形態において、外部磁場を使用して、ＬＣＤ型ディスプレイにおいて使用するために、機能的要素として光学部分を含むナノ構造（例えば、繊維）を整列または脱整列させる。
【０２３１】
別の実施形態において、ナノ構造は、電子顕微鏡のためのサイズ標準物質または正確な寸法のマーカーとして使用される。
【０２３２】
他の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法により製造されたナノ構造は、二次元または三次元構造である。例えば、１つの実施形態において、ナノ構造は、規定された孔サイズを有するメッシュであり、二次元ふるいまたはフィルターとして機能し得る。
【０２３３】
別の実施形態において、ナノ構造は、アセンブリ単位の三次元六角形アレイであり、この単位は、分子ふるいまたはフィルターとして使用され、サイズによって粒子を選択的に分離するための、正確な直径の規則的な垂直孔を提供する。このようなフィルターは、溶液の滅菌（すなわち、微生物またはウイルスを除去するため）に使用され得るか、または一連の分子量カットオフフィルターとして使用され得る。この実施形態において、孔のタンパク質成分（例えば、構造的要素または機能的要素）は、特定の表面特性（すなわち、親水性または疎水性、特定のリガンドを結合する能力など）を提供するように改変され得る。とりわけ、この型の濾過デバイスの利点は、孔の均質性および直線性であり、そしてマトリクスに対する孔の高い比率である。
【０２３４】
本明細書に開示される方法およびアセンブリ単位を使用して、種々の二次元および三次元構造（例えば、多角形構造（例えば、八角形））ならびに開放固体（例えば、三角形から形成される四面体、二十面体）、ならびに正方形および矩形から形成される箱型または立方体（例えば、節１１、実施例６に開示される立方体）を構築し得ることは、当業者に対して明らかである。この構造の範囲は、構造的要素の異なる軸上で操作され得る連結要素および機能的要素の型によってのみ限定される。
【０２３５】
別の実施形態において、二次元または三次元のナノ構造を使用して、機能的単位として光学的部分、電気的部分、磁気的部分、触媒性部分、または酵素的部分を含む表面コーティングを構築し得る。このようなコーティングは、例えば、光学的コーティングとして使用され得る。このような光学的コーティングを使用して、コーティングされた物質の吸着特性または反射特性を変更し得る。
【０２３６】
本発明のナノ構造を使用して構築された表面コーティングはまた、電気的コーティングとして（例えば、静的遮蔽表面または（コーティングが光学的に透明である場合は）レンズ用の自己ダスティング表面として）使用され得る。この表面コーティングはまた、磁気コーティング（例えば、コンピュータハードドライブの表面のコーティング）として使用され得る。
【０２３７】
このような表面コーティングはまた、触媒コーティングまたは酵素コーティングとして（例えば、表面保護として）使用され得る。特定の実施形態において、このコーティングは、抗酸化剤コーティングである。
【０２３８】
別の実施形態において、このナノ構造は、機能的要素として光学的部分、電気的部分、磁性部分、触媒性部分、酵素部分を有する、開いた枠組みまたは足場を構築するために使用され得る。このような足場は、上記のような光学的部分、電気的部分、磁性部分、触媒性部分、または酵素部分のための支持体として使用され得る。特定の実施形態において、このような足場は、より厚いかまたはより密集した分子のコーティングを形成するために、あるいは所望の光学的特性、電気的特性、磁気的特性、触媒特性、または酵素特性を有する可溶性のミクロンサイズの粒子を支持するために配列される、機能的要素を構成し得る。
【０２３９】
別の実施形態において、ナノ構造は、酵素結合ドメインまたは抗体結合ドメインが結合して高密度の多価プロセシング部位を提供し得る、枠組みまたは足場として働く。この多価プロセシング部位は、結合しなければ不溶性である酵素を結合して可溶化するか、または種々の分子種をトラップし、保護し、そして送達する。
【０２４０】
別の実施形態において、ナノ構造は、アドレス可能な位置を有する高密度コンピュータメモリを構築するために使用され得る。
【０２４１】
別の実施形態において、ナノ構造は、人工ゼオライト（すなわち、水からイオンを吸収し得る天然鉱物（含水ケイ酸塩）を構築するために使用され得、ここで、このナノ構造の設計は、開いた枠組みを通って流れる反応物の高効率のプロセシングを促進する。
【０２４２】
別の実施形態において、このナノ構造は、新素材のための基礎として働き得る開いた枠組みまたは足場を構築するために使用され得る。例えば、この枠組みは、特性（例えば、強度、密度、確定粒子充填および／または種々の環境中での安定性）の独特の調和性を保有し得る。
【０２４３】
特定の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法はまた、コンピュータアーキテクチャ（例えば、量子ドットの空間的に組織化されたアレイからなる量子セルラーオートマトン（ＱＣＡ））を構築するために使用され得る。ＱＣＡ技術において、論理状態は、電圧レベルによってではなく、空間的に配置された量子ドットから構成されるＱＣＡセルに含まれる個々の電子の位置によって符号化される。段階的アセンブリは、バイナリー情報の格納のために必要な幾何学的配置に従って、量子ドット粒子を空間的に組織化する順序で実施され得る。量子ドットセルラーオートマトンのためのＱＣＡセルの空間的配置および構築のための段階的アセンブリを使用して作製され得る、論理デバイスの例としては、ＱＣＡワイヤ、ＱＣＡインバータ、多数決ゲートおよび全加算器（Ａｍｌａｎｉら、１９９９、Ｄｉｇｉｔａｌ  ｌｏｇｉｃ  ｇａｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ−ｄｏｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４１２）；２８９−９１；ＣｏｗｂｕｒｎおよびＷｅｌｌａｎｄ，２０００、Ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７（５４５７）：１４６６−６８；Ｏｒｌｏｖら、１９９７、Ｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｕｍ−Ｄｏｔ  Ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９２８−３２）が挙げられる。
【０２４４】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、ここでさらに記載される。
【０２４５】
（実施例１：ペプチドエピトープを含む連結要素を有するナノ構造の段階的アセンブリ）
本実施例は、Ｃ末端において融合された異なるペプチドを各々有する一価Ｆａｂフラグメント（「Ｆａｂ１」および「Ｆａｂ２」）を使用する段階的アセンブリを開示する（図４）。
【０２４６】
Ｆａｂ１のＣＤＲは、Ｆａｂ２のＣ末端に融合されたペプチドに対して特異性を有する。同様に、Ｆａｂ２のＣＤＲは、Ｆａｂ１のＣ末端に融合されたペプチドに対して特異性を有する。
【０２４７】
２組の連結対は、これらの２つのアセンブリ単位間の特異的な相互作用を提供する。第１のＦａｂは、標準的な方法を使用して、固体支持体に固定化され得る。次いで、この表面は、Ｆａｂ１に対して特異性を示す融合されたペプチドを有するＦａｂ２を含む溶液とともにインキュベートされ得る。このインキュベーションにより、Ｆａｂ１の１つのコピー（固定化されている）およびＦａｂ２の１つのコピーから構成されるナノ構造中間体の形成が生じる。次いで、この中間体は、Ｆａｂ１を含む溶液に対してインキュベートされ得、その結果、Ｆａｂ１のコピーに連続的に結合されたＦａｂ２のコピーに結合されたＦａｂ１のコピーから構成される中間体の形成が生じる。次いで、このアセンブリプロセスは、必要とされる直線構造のサイズを達成するのに必要である限り、反復して継続し得る。
【０２４８】
アセンブリ単位１は、ＣＤＲ（ＣＤＲ１）を有する抗体Ｆａｂフラグメントを含む一価アセンブリ単位であり、このＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、連結されたＣ末端ペプチドエピトープ（ペプチド１）を有するペプチド２に特異的に結合する。
【０２４９】
アセンブリ単位２は、ＣＤＲ（ＣＤＲ２）を有する抗体Ｆａｂフラグメントを含む一価アセンブリ単位であり、このＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、連結されたＣ末端ペプチドエピトープ（ペプチド２）を有するペプチド１に特異的に結合する。
【０２５０】
（連結対）
連結対１：  連結要素ペプチド１は、連結要素ＣＤＲ２と相互作用する。
【０２５１】
連結対２：  連結要素ペプチド２は、連結要素ＣＤＲ１と相互作用する。
【０２５２】
【数１】
2005518454.tif 000012
（実施例  ２；多重特異性タンパク質アセンブリ単位を使用する段階的アセンブリ）
この実施例は、多重特異性タンパク質アセンブリ単位を使用する本発明の段階的アセンブリ方法の実施形態を開示する。多重特異性タンパク質アセンブリ単位の置換および組合せが、２価および４価のアセンブリ単位を利用する、複雑な１次元高分子のナノ構造、２次元高分子のナノ構造、および３次元の高分子ナノ構造の構築（例えば、図１４に示す段階的アセンブリが挙げられる）のために使用され得る。
【０２５３】
４点結合部を含むナノ構造の段階的アセンブリは、最低限５つのアセンブリ単位および４つの結合対を必要とするのみである。必要とされる５つのアセンブリ単位は、４つの二重特異性アセンブリ単位および１つの四重特異性アセンブリ単位を含む。この実施例において、隣接するアセンブリ単位を結合するために使用される結合対は、本質的にイディオトープ／抗−イディオトープである。最小限の４つのこのようなイディオトープ／抗−イディオトープ結合対は、この実施例の段階的アセンブリにとって必要である。
【０２５４】
（ａ）アセンブリ単位
図１４中：
アセンブリ単位−１は、非相互作用性（イディオトープ／抗−イディオトープ）結合対ＡおよびＢを含む２価のタンパク質アセンブリ単位である。
【０２５５】
アセンブリ単位−２は、非相互作用性（イディオトープ／抗−イディオトープ）結合対Ｂ'およびＡ'を含む２価のアセンブリ単位である。
【０２５６】
アセンブリ単位−３は、非相互作用性（イディオトープ／抗−イディオトープ）結合対Ｂ'およびＡ'ならびに非相互作用性（イディオトープ／抗−イディオトープ）結合対ＣおよびＤを含む４価のアセンブリ単位である。
【０２５７】
アセンブリ単位−４は、非相互作用性（イディオトープ／抗−イディオトープ）結合対Ｃ'およびＡを含む２価のアセンブリ単位である。
【０２５８】
アセンブリ単位−５は、非相互作用性（イディオトープ／抗−イディオトープ）結合対Ｄ'およびＢ'を含む２価のアセンブリ単位である。
【０２５９】
（ｂ）相補的結合対
Ａは、相補的結合対１として、Ａ'と結合する。
【０２６０】
Ｂは、相補的結合対２として、Ｂ'と結合する。
【０２６１】
Ｃは、相補的結合対３として、Ｃ'と結合する。
【０２６２】
Ｄは、相補的結合対４として、Ｄ'と結合する。
【０２６３】
（ｃ）多重特異性タンパク質アセンブリ単位を使用する段階的アセンブリのプロトコル
段階的アセンブリの以下の工程を図１４に示す。生じたナノ構造を図１４、工程１１に示す。
【０２６４】
【数２】
2005518454.tif 000013
（実施例  ３：高分子ナノ構造の製造）
高分子アセンブリを構築するために、２つの組み立てられたナノ構造中間体を、本発明の段階的アセンブリ方法を使用して互いに結合させ得る。この実施例は、２つのナノ構造中間体からの高分子ナノ構造の製造を記載する。
【０２６５】
図１５は、図１４に示す段階的アセンブリプロトコルによって製造された２つのナノ構造中間体の段階的アセンブリを示す。ナノ構造中間体１を図１４の工程１１に示す。ナノ構造中間体２を図１４の工程８に示す。下の節９．１のプロトコルは、相補的結合対の結合による２つのナノ構造中間体の付加を記載する。
【０２６６】
（相補的連結対の結合による２つのナノ構造中間体の付加のためのプロトコル）
段階的アセンブリの以下の工程を図１５に示す。生じた高分子ナノ構造を図１５、工程５に示す。
【０２６７】
【数３】
2005518454.tif 000014
（実施例  ４：２価および二重特異性のダイアボディ連結対の自己アセンブリおよび段階的アセンブリの実証）
（自己アセンブリの実証）
本明細書中で既に開示したように、段階的アセンブリは、発現させて精製した非交差反応性のダイアボディアセンブリ単位構築物を使用して実行され得る。１つのダイアボディアセンブリ単位は、自己ポリマー化（すなわち、自己アセンブリ）しないので、各ダイアボディ単位タンパク質のみの溶液は、清澄なままであるはずである。
【０２６８】
しかし、２つの溶液を混合した場合、このダイアボディ単位は、結合単位としてオリゴマー化して、長い繊維を形成し得る（この２つのダイアボディ単位は、代替される（図１））。この自己アセンブリは、肉眼、単純な光散乱実験または濁度試験により容易に観察可能であり、ネガティブ染色されたポリマーロッドの電子顕微鏡分析により、容易に確認され得る。
【０２６９】
（段階的アセンブリの実証）
開始剤をセファロース固体支持マトリクスに固定し、次いで、そのマトリクス結合開始剤をダイアボディアセンブリ単位１に接触させることにより、段階的アセンブリを実行する。これに洗浄工程が続き、この工程では、余剰のダイアボディ単位１を結合しているナノ構造（開始剤単位および結合しているダイアボディ単位１を含む）から除去する。次いで、ナノ構造をダイアボディアセンブリ単位２とインキュベートし、続いて洗浄およびダイアボディアセンブリ単位１のさらなるコピーなどの存在下でインキュベートする。これを何サイクルも行う（図１１）。電子顕微鏡分析を使用して、種々の結合と洗浄のサイクルを通じて組み立てられたポリマーの長さおよび構造を決定する。これらの長さは、正確にサイクルの回数に比例する。
【０２７０】
（実施例５：光散乱によるポリマー化の分析）
高分子モノマー（例えば、この実施例で使用するダイアボディ）のポリマー化の程度は、光散乱によって分析され得る。光散乱光度計（例えば、ＤＡＷＮ−ＤＳＰ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ））による光散乱測定により、重量平均分子量の決定、粒子サイズ、形状および粒子−粒子対相関の決定のための情報が提供される。
【０２７１】
（実施例６：スクロース勾配沈降による分子量（ポリマー化の程度）決定）
異なる長さを有する結合ダイアボディ単位を、ゾーン超遠心分離のスクロース勾配において、異なる速度で沈降させる。次いで、ポリマー化の程度とスベドベリ単位での沈降との間の量的関係性を計算する。この方法は、一般的な自己アセンブリ、および新しいダイアボディ単位を付加する各工程での段階的アセンブリのプロセスの効率を特徴付ける上で、有用である。
【０２７２】
（実施例７：電子顕微鏡分析によるロッドの形態および長さ）
スクロース勾配分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後の、ロッドを含む部分的に精製した画分は、明確である。この適切な画分のサンプルを、その形態を決定するために、ＥＭグリッド上に置き、染色またはシャドウして、電子顕微鏡分析により大きな構造体を探す。
【０２７３】
（実施例８：３次元立方体の段階的アセンブリ）
この実施例は、段階的アセンブリによる、操作されたトリアボディフラグメントおよびダイアボディフラグメント由来の構造要素を含むアセンブリ単位からの３次元立方体構造の製造を開示する。このアセンブリ単位の結合要素は、トリアボディまたはダイアボディの多重特異性結合ドメインである。
【０２７４】
トリアボディは、３価であり、立方体様の構造体の頭頂を構成する。ダイアボディは、２価であり、この実施例では、２つのダイアボディを立方体構造の縁を構築し、それによって、トリアボディ間の空間をつなぐために使用する。
【０２７５】
開始剤単位の場合において、添加するペプチドエピトープを、固体支持体を固定するためのトリアボディ構造要素内の連結要素として、操作する（および段階的アセンブリにおいてこの立方体の第１の頭頂として定義される）。これにより、トリアボディ開始剤単位としての連結要素は、４つの非相補的連結要素を含み、このうち３つは、トリアボディの三重特異性結合ドメインで構成され、４番目の要素は、固体支持マトリクスと相互作用するように特異的に設計されたトリアボディ内の操作されたペプチドエピトープに由来する。開始剤単位に含まれるペプチドエピトープを、開始剤単位から切断され得る、あらかじめ設計された放出部分（例えば、プロテアーゼ部位）を含むように操作し得るし、三次元ナノキューブの完全なナノ製造において、固体支持マトリクスのナノ構造に結合させ得る。トリアボディの３次元構造は、よく特徴付けされているので（Ｐｅｉら、１９９７、Ｔｈｅ  ２．０−Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｃｏｇｎａｔｅ  ＶＨ−ＶＬ  ｄｏｍａｉｎ  ｐａｉｒｓ  ｓｈｏｗｓ  ａ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＶＨ  ＣＤＲ３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１８）：９６３７−４２）、タンパク質構造体内の挿入点を、本明細書において既に議論したように、利用可能なＸ線座標の画像的調査によって、さらなる連結要素を操作するために同定し得る。
【０２７６】
３つの三重特異性結合ドメインを連結要素として含む別のトリアボディは、別のアセンブリ単位（立方体の他の７つの頭頂）を構成する。他のアセンブリ単位、すなわち、２つの二重特異性結合ドメインを連結要素として含むダイアボディ単位は、立方体の縁を形成する（縁は、立方体の規定された頭頂の間のベクトル格子として規定され得る）。立方体の各縁は、２つのダイアボディアセンブリ単位から製造される。この実施例において、合計３２個のアセンブリ単位が、３次元ナノ立方体のナノ製造のために必要である：８トリアボディ（８個の頭頂を構成する、１個の開始剤単位および７個のアセンブリ単位）ならびに２４個のダイアボディ（全て、１２個の縁を構成するアセンブリ単位）。合計７個の非交差反応性の相補的連結対が、ナノ立方体の製造のために必要である。
【０２７７】
トリアボディは、その３つの頭頂のそれぞれに１個の連結要素（ＣＤＲ）を含む３次元の正三角形柱形状のタンパク質である。他方、ダイアボディは、２個の対向する連結要素（ＣＤＲ）を有する長方形柱形状のタンパク質である。トリアボディおよびダイアボディで構成される３次元（３−Ｄ）立方体のナノ製造には、結合したアセンブリ単位の形状および空間的関係性が、図１６に示す３次元立方体の規定された設計規格書の範囲内であることが必要である。
【０２７８】
結合したトリアボディおよびＦａｂフラグメントの特定の形状および空間的配向が、物理的に特徴付けられている（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、１９９８、Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２５（３）：４７９−８４）。３個のＦａｂアームは、トリアボディの頭頂に結合した場合、共平面的ではないが、代わりに、１つの方向に一緒に向けられており、三脚の脚のようである（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、１９９８、Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｔｒｉｍｅｒｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２５（３）：４７９−８４）。トリアボディに結合した、隣接するＦａｂアーム間の角度は、８０°〜１３６°の間であることが測定され（すなわち、これは、立方体の３つの縁と結合した頭頂を形成するための結合したアセンブリ単位の必要な形状および空間的関係性の範囲内である）、ダイアボディとＦａｂフラグメントの結合の角度は、６０°〜１８０°の間で測定された（これは、２つの隣接するダイアボディ要素の結合（結合（ｊｏｉｎｉｎｇ））で立方体の１つの縁を構成するために必要な配置および空間的関係性の範囲内である）。立方体の平面縁間のこの角度は、９０°で規定されており、立方体縁の角度は、１８０°である。そのために、立方体の頭頂としてトリアボディを、そして縁としてダイアボディを利用すること、抗体フラグメント内の固有の限定された構造可撓性ならびに観察される抗体フラグメントの特徴的な幾何学的結合および空間的結合を考慮に入れることによって、本明細書で開示する３次元立方体を構築することが、可能となり得る。
【０２７９】
立方体は、最初に、７個の非交差反応性の相補的連結要素対を同定することによって構築される。この実施形態において、イディオトープ／抗イディオトープ対を、上で開示した標準的方法を使用して構築する。これらの対の要素である１４個の連結要素が、下に開示するアーキテクチャによって示されるように、二重特異性ダイアボディおよび三重特異性のトリアボディに取り込まれる。図１６は、文字で示す連結対（ＡはＡ’に相補的であり、Ｂは、Ｂ'に相補的である）を有する立方体構造のアセンブリの図示である；および、アセンブリの順番を数字で示す。第１の単位は、開始剤単位であり、数字「１」によって示され、連結要素Ａ、ＢおよびＣを含む。第２の単位（「２」）は、連結要素Ａ'およびＤを含む。単位１が固定された表面を、要素２を含む溶液とインキュベートする場合、この要素に、単位１の相補的結合部位「Ａ」が付加され、単位１および単位２を含むナノ構造中間体を生じる。余剰のアセンブリ単位２のコピーを洗い流した後、この中間体を、連結要素Ｄ'およびＡを含むアセンブリ単位３に対してインキュベートする。この単位は、単位２の相補的な連結要素と特異的に結合し、単位１、２および３を含むナノ構造中間体を生じる。次いで、このプロセスは、全構造が形成されるまで、インキュベーションおよび洗浄の交互の工程に続く。３２個のアセンブリ単位が同時に１つに付加されるので、このアセンブリプロセスには、３１の工程が存在し得る（単位１を固体基材に固定する工程は数えていない）。
【０２８０】
ナノ構造の段階的アセンブリを計画する上で鍵となる要素は、このプロセスの各工程の後で、曝される連結要素を追跡することである。このナノ立方体構造のアセンブリにおいて、以下の連結要素が、各工程の後で曝される：
【０２８１】
【数４】
2005518454.tif 000015
2005518454.tif 000016
単位３２が付加された後は、曝される連結要素はない。
【０２８２】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によって、その範囲が制限されない。実際に、本明細書に記載したものに加えて、本発明の種々の改変物が、上記の記載から当業者には明らかとなる。このような改変は、添付した特許請求の範囲の範囲内であることが企図される。
【０２８３】
各出版物、特許および特許出願が、全ての目的のために、その全体が参考として援用されることを、詳細かつ独立して示されるのと同程度に、本明細書で引用した全ての参考文献は、全ての目的のためにその全体が参考として、本明細書に援用されている。
【０２８４】
任意の出版物の引用は、それらの出願日に先立つ開示のためであり、これらの出版物を先行発明として、本発明が拒絶されることを容認すると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２８５】
【図１】イディオトープ／抗イディオトープＦａｂ−Ｆａｂ相互作用の図。この図は、イディオトープ／抗イディオトープ相互作用を介して相互作用する２つのＦａｂフラグメントのα炭素の見取り図を示す（ｐｄｂ  エントリー  １ＣＩＣ）。太線は、重鎖を表し、細い線は、Ｆａｂフラグメントの軽鎖を表す。イディオトープ／抗イディオトープ性タンパク質結合相互作用のほとんどは、相補性決定領域（ＣＤＲ）において得られる重鎖のループの間に存在する。この場合、Ｆａｂの間の会合は、結果としてほぼ直線的な会合となる。
【図２】ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）のα炭素見取り図の三次元構造（ｐｄｂ  エントリー  １ＬＭＫ）（上）および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体（ｐｄｂ  エントリー  ２ＡＰＡ）（下）の三次元的構造を表す線図。単量体ｓｃＦｖ構造について（下）、太線は、重鎖を表し、細い線は、軽鎖を表す。しかし、二量体ダイアボディ構造（上）について、太線は、一方のｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の両方を表し、一方細い線は、他方のｓｃＦｖの重鎖および軽鎖の両方を表す。より長いペプチドリンカーによって、一緒に結合される重−軽可変ドメインを有するｓｃＦｖ構築物は、安定な単量体を形成する。より短いリンカーを有する構築物は、第２のｓｃＦｖ分子と会合して、示されるような二価のダイアボディを形成する。両方の構造に含まれる免疫グロブリンフォールド（ｆｏｌｄ）が、非常に類似していることに留意のこと。ｓｃＦｖおよびダイアボディ、またはその誘導体および結合フラグメントを、アセンブリ単位の設計のための基本的要素として使用し得る。
【図３】単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）の図。図の上半分は、ＶＨ−リンカー−ＶLｓｃＦｖフラグメント中の単量体結合、ダイアボディ会合、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）会合およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）会合を示す。図の下半分は、ＶL−リンカー−ＶHｓｃＦｖフラグメント中のこのような会合を示す。ｓｃＦｖドメイン間のこれらの会合は、ＶＨ単位およびＶL単位と連結するペプチドリンカーの長さに依存している。より長いペプチドリンカー（１２〜１５残基）は、単量体形成を好み、一方、より短いリンカー（０〜５残基）は、多量体構造を好む。ＶＨ遺伝子およびＶL遺伝子の結合順序はまた、多量体形成、結果として生じるｓｃＦｖタンパク質の活性および安定性に影響する。この型の組換え抗体が、ＩｇＧから誘導される最も小さい抗原結合存在物の１つを表し、アセンブリ単位製作において構造的要素および連結要素として利用され得る。
【図４】２つのダイアボディ単位、単位１（Ａ）および単位２（Ｂ）ならびにその会合した遺伝子の図。Ａ。単位１は、Ａ×Ｂダイアボディであり、ＡのＶＨドメインおよびＶLドメインがリゾチームイディオトープ性抗体（Ｄ１．３）を規定し、ＢのＶＨドメインおよびＶLドメインは、ウイルス中和イディオトープ性抗体を規定する（７３０．１．４）。所望されるダイアボディ産物の精製を容易にするために、ＶＨＡおよびＶLＢをコードする遺伝子は、ヘキサヒスチジンタグを含み、一方、ＶＨＢおよびＶLＡをコードする遺伝子は、含まない。Ｂ。単位２は、Ｂ’×Ａ’ダイアボディであり、Ｂ’のＶＨドメインおよびＶLドメインが、ウイルス中和イディオトープ性抗体（４０９．５．３）を規定し、Ａ’のＶＨドメインおよびＶLドメインが、リゾチームイディオトープ性抗体（Ｅ５．２）を規定する。所望されるダイアボディ産物の精製を容易にするために、ＶＨＢ’およびＶLＡ’をコードする遺伝子は、ヘキサヒスチジンタグを含み、一方、ＶＨＡ’およびＶLＢ’をコードする遺伝子は、含まない。
【図５】インタクトなＩｇＧ１のα炭素見取り図を表す線図（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｐｄｂ）エントリー  １ＩＧＹ）（Ｈａｒｒｉｓら、１９９８，Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ＩｇＧ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５（５）：８６１−７２）。（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｐｄｂ）の記載について、Ｂｅｒｍａｎら、２０００，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３５−４２；Ｓａｑｉら、１９９４，ＰｄｂＭｏｔｉｆ−−ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｃｏｍｐｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０（５）：５４５−４６を参照のこと。）太線は、重鎖を表し、細い線は、軽鎖を表す。ＦａｂフラグメントのＦｖドメインおよびＣＨ１ドメインならびにＦｃフラグメントのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインが、標識される。灰色の矢印によって指示される、玉と棒のモデリング（ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｔｉｃｋ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ）は、ジスルフィドシステイン結合を表す。ジスルフィド架橋相互作用のクラスターが、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントとの間に位置する可撓性のヒンジ領域において生じる。これらの相互作用は、二量化を補助し得、免疫グロブリンにおける異なった高度に可撓性の領域の構造的統合を提供する。図は、プログラムＳＥＴＯＲで作成された（Ｅｖａｎｓ，１９９３，ＳＥＴＯＲ：Ｈａｒｄｗａｒｅ  ｌｉｇｈｔｅｄ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｏｌｉｄ  ｍｏｄｅｌ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，１１：１３４−３８）。
【図６】アセンブリ単位の設計のための構造的要素として用いられ得るＦａｂフラグメントのα炭素見取り図を表す線図（ｐｄｂ  エントリー  １ＣＩＣ）。太線は、重鎖を表し、細い線は、軽鎖を表す。重鎖（ＶＨおよびＣＨ１）ならびに軽鎖（ＶＬおよびＣＬ）のドメインが、標識される。可撓性のＦａｂ「エルボー」または可変ドメインおよび定常ドメインに接触する屈曲領域がまた、示される。屈曲のＦａｂ角度が、同じ抗体のクラスのメンバー間でさえ、かなり変動する（１２７−１７６°）。
【図７】一価、二価、単一特異的および二重特異的抗体を含む種々のＩｇＧの概略表示。単一の細胞株から誘導されるＩｇＧは、ＩｇＧに対して同型である。従って、生じるＩｇＧは、二価単一特異的抗体である。ハイブリッドハイブリドーマ（例えば、クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ））が、融合細胞株から生じる。ハイブリッドハイブリドーマによって産生されるＩｇＧは、異種性二価二重特異的（例えば、異種性Ｆ（ａｂ’）２）およびホモ接合二価単一特異的（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）ＩｇＧの混合物であり得る。従って、ハイブリッドハイブリドーマヘテロ二量体は、二価二重特異的Ｆ（ａｂ’）２の供給源を表す。インタクトなＩｇＧ分子またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントをアセンブリ単位の設計のための基本的要素として使用し得る。
【図８】プロテアーゼへの制限された曝露において、成分フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃに切断されるＩｇＧ分子の概略的表示。いくつかのジスルフィド結合相互作用を含むヒンジ領域が、Ｆａｂフラグメントの二量化を保つのを補助する。還元性条件へのＦ（ａｂ’）２の続く曝露は、フラグメント間のヒンジジスルフィド架橋相互作用を中断させて単量体Ｆａｂを産生する。ＩｇＧの分離した機能性フラグメントが、アセンブリ単位の設計における特異的使用（例えば、化学的架橋による二価二重特異的異種性Ｆ（ａｂ’）２の作製）のために単離され得る（すなわち、Ｆａｂフラグメント）。
【図９】種々の特異性を含む抗原結合フラグメントの多量化を促進するために開発された二量化モチーフ。Ｊｕｎ−ＦｏｓもしくはＧＣＮ４（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２，Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−５３；ｄｅ  Ｋｕｒｉｆら、１９９６，Ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ，ｄｉｍｅｒｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｅｍｉ−ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（１３）：７６３０−３４）のようなロイシンジッパーモチーフ（細長い卵形として示される）またはＲｏｐ（Ｐａｃｋら、１９９３，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｗｉｔｈ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ａｖｉｄｉｔｙ  ａｓ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１１（１１）：１２７１−７７；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９８，Ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｄｉｔｙ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２（１−２）：４５−４９）のような４ヘリックス束モチーフ（（Ｃ）および（Ｄ）において長方形で示される）を使用して、抗原結合多量体の安定な二量化を促進し得る。これらの二量体化した抗原結合多量体をアセンブリ単位製作において構造的要素および連結要素として利用され得る。
【図１０】ＲＯＰタンパク質の４ヘリックス束の図。
【図１１】アセンブリ単位の段階的アセンブリ。実際には、段階的アセンブリの各工程は、大規模に平行な様式で実行される。工程１において、開始単位は、固体基板上に固定化される。本明細書中に例示される本発明の実施形態において、この開始単位は、単一の連結要素を有する。工程２において、第二のアセンブリ単位が付加される。この第二の単位は、２つの非相補的連結要素を有し、その結果、これらの単位は、溶液中で自己会合しない。第二のアセンブリ単位上の連結要素の１つは、開始単位上の連結要素と相補的である。未結合のアセンブリ単位は、各工程の間に洗浄して除去される（示されず）。  インキュベーション後、第二のアセンブリ単位は、開始単位に結合し、２つのアセンブリ単位から作製されたナノ構造中間体の形成を生じる。工程３において、第三のアセンブリ単位が付加される。この単位は、２つの非相補的連結要素を有し、このうち１つは、ナノ構造中間体上の非対合連結要素に対してのみ、相補的である。この単位はまた、機能的単位（「Ｆ３」）を有する。  機能的要素「Ｆ４」を有する第四のアセンブリ単位および機能的要素「Ｆ５」を有する第五のアセンブリ単位が、それぞれ、工程４および５において、工程２および３と正確に類似する様式で付加される。各々の場合において、連結要素の選択は、１つより多い単位が一度に付加されるのを防ぎ、そして予め指定された位置における機能的単位の厳密に制御されたアセンブリを導く。
【図１２】サブアセンブリからのナノ構造の生成。ナノ構造は、図２において上記されたような、個々のアセンブリ単位の付加のために使用されるのと類似の工程を使用して、サブセンブリの連続的付加によって生成され得る。矢印は、成長中のナノ構造へのサブアセンブリの付加を示す。
【図１３】本発明の段階的アセンブリ方法に従う、ナノ構造へのタンパク質単位および無機要素の付加を示す図。工程１において、開始単位は、固体基板に結合される。工程２において、アセンブリ単位は、開始単位に特異的に結合される。工程３において、さらなるアセンブリ単位が、アセンブリを受けているナノ構造に結合される。このアセンブリ単位は、特定の無機要素に対して特異的な操作された結合部位を含む。工程４において、無機要素（網がけした楕円として示される）が、この構造に付加され、そして操作された結合部位によって結合される。工程５は、第二の型の無機要素に対して特異的なように操作された結合部位を有する別のアセンブリ単位を付加し、そして第二の無機要素（網がけした菱形として示される）が、工程６において付加される。
【図１４】２次元ナノ構造を作製するために、４つの二重特異的アセンブリ単位および１つの四重特異的アセンブリ単位を利用する、段階的アセンブリの１１の工程の図。
【図１５Ａ】サブアセンブリとしてナノ構造中間体を利用する段階的アセンブリの図。工程１〜３において、ナノ構造中間体が構築され、２つの連結要素がキャップされ、そしてナノ構造中間体が固体基板から放出される。工程５において、工程３からのナノ構造中間体が、インタクトなサブアセンブリとして、アセンブリ中間体（工程４において固体基板に結合して示される）に付加される。
【図１５Ｂ】サブアセンブリとしてナノ構造中間体を利用する段階的アセンブリの図。工程１〜３において、ナノ構造中間体が構築され、２つの連結要素がキャップされ、そしてナノ構造中間体が固体基板から放出される。工程５において、工程３からのナノ構造中間体が、インタクトなサブアセンブリとして、アセンブリ中間体（工程４において固体基板に結合して示される）に付加される。
【図１６】図１６（ＡＡ−ＢＦ）は、例示的な立方体ナノ構造の段階的アセンブリにおいて使用される一連の３２工程の図である。立方体ナノ構造は、操作されるダイアボディフラグメントおよびトリアボディフラグメントからの構造的要素を含むアセンブリ単位からアセンブリされる。アセンブリ単位の連結要素は、ダイアボディまたはトリアボディ由来の多重特異的結合ドメインである。７つの相補的連結対が使用される：ＡとＡ’、ＢとＢ’、ＣとＣ’、ＤとＤ’、ＥとＥ’、ＦとＦ’、ならびにＧとＧ’。番号付け（１−３２）は、各々の工程の間に付加されるアセンブリ単位を指示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６ＡＡ】
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【図１６ＡＢ】
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【図１６ＡＣ】
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【図１６ＡＤ】
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【図１６ＡＥ】
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【図１６ＡＦ】
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【図１６ＡＧ】
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【図１６ＡＨ】
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【図１６ＡＩ】
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【図１６ＡＪ】
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【図１６ＡＫ】
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【図１６ＡＬ】
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【図１６ＡＭ】
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【図１６ＡＮ】
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【図１６ＡＯ】
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【図１６ＡＰ】
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【図１６ＡＱ】
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【図１６ＡＲ】
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【図１６ＡＳ】
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【図１６ＡＴ】
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【図１６ＡＵ】
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【図１６ＡＶ】
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【図１６ＡＷ】
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【図１６ＡＸ】
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【図１６ＡＹ】
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【図１６ＡＺ】
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【図１６ＢＡ】
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【図１６ＢＢ】
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【図１６ＢＣ】
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【図１６ＢＤ】
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【図１６ＢＥ】
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【図１６ＢＦ】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月21日(2005.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005518454000001.app
【国際調査報告】
2005518454.tif 000065
2005518454.tif 000066