(57)【要約】そのタンパク質の生物物理的性質又はアミノ酸組成から選択される性質に基づいて標的生物のプロテオームからタンパク質を選択することを含む、ワクチン候補物質を特定するための方法。例えば、この方法を用いて特定の属の１又はそれ以上のワクチン抗原の上記性質に関する第一セットのデータを収集し、同じ属からの１又はそれ以上のランダムなタンパク質の上記性質に関する対照セットのデータも収集する。次にこれらのデータセットを比較して、統計的な差を調べる。その後標的種のプロテオームを検討し、第一セットのデータにより類似した性質を有することに基づいてそのプロテオームから１又はそれ以上のワクチン候補物質を選択しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の生物物理的性質又はアミノ酸組成から選択される性質に基づいて標的生物のプロテオームからタンパク質を選択することを含む、ワクチン候補物質を特定するための方法。
【請求項２】
特定の属の１又はそれ以上のワクチン抗原の前記性質に関する第一セットのデータを収集すること、同じ属からの１又はそれ以上のランダムなタンパク質の前記性質に関する対照セットのデータを収集すること、標的種のプロテオームからのタンパク質の前記性質を検討すること、及び第一セットのデータに、より類似した性質を有するそのプロテオームからのワクチン候補物質を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一及び対照セットのデータを各々複数のタンパク質から得る、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が前記属の複数の種からである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記属が、細菌、酵母又はウイルスである、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記属が細菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記データセットを、細菌種、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、マルタ熱菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、鳥型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）、ウシ型結核菌ＢＣＧ株（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ブートン熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｃｏｎｏｒｉｉ）、斑点熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、ツツガムシ病リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、無乳症連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）及びペスト菌（Ｙｅｒｓｈｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）の１つ又はそれ以上からのタンパク質を使用して入手する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記データセットを、細菌種、炭疽菌、百日咳菌、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ウシ流産菌、マルタ熱菌、カンピロバクター・ジェジュニ、トラコーマクラミジア、クロストリジウム・ディフィシル、ウェルシュ菌、破傷風菌、コリネバクテリウム・シュードツベルクローシス、大腸菌、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリ、レジオネラ・ニューモフィラ菌、リステリア・モノシトゲネス、鳥型結核菌、ウシ型結核菌、ウシ型結核菌ＢＣＧ株、ヒト型結核菌、髄膜炎菌、パスツレラ・ムルトシダ、緑膿菌、ブートン熱リケッチア、斑点熱リケッチア、ツツガムシ病リケッチア、志賀赤痢菌、黄色ブドウ球菌、無乳症連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、化膿連鎖球菌、梅毒トレポネーマ及びペスト菌のすべてを使用して入手する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記性質が、分子量及び等電点から選択される生物物理的性質である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記性質がアミノ酸組成である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミノ酸組成を、個々のアミノ酸のパーセンテージ組成、又はそれらのアミノ酸の性質に基づいて分析する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ酸組成をそれらのアミノ酸の性質に基づいて分析し、その性質が疎水性、屈曲性、かさ高性（ｂｕｌｋｉｎｅｓｓ）及び変異性から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミノ酸組成を、個々のアミノ酸のパーセンテージ組成に基づいて分析する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
次の方程式：
【数１】
2005525626.tif 000017
を用いて、比較を行い、各々のアミノ酸にアミノ酸スコアを割り当てる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アミノ酸含量に基づいて標的生物内のタンパク質の配列にスコアを与え、各々のアミノ酸には下記：
【表１】
2005525626.tif 000018
に従ってスコアを与え、スコアの最高２０％内にある前記標的生物からの１又はそれ以上のタンパク質をワクチン候補物質として選択する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
ワクチン候補物質を、スコアが最高１０％内にあるタンパク質から選択する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質をワクチンとして入手し、試験する段階をさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
データセットの分析をインシリコで実施する、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を用いて特定されるワクチン候補物質。
【請求項２０】
防御的免疫応答を生じさせる、請求項１９に記載のワクチン候補物質、あるいはそのフラグメント又はそれらの変異体を含むワクチン。
【請求項２１】
前記ワクチンがタンパク質又はポリペプチドの形態である、請求項２０に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記ワクチンが、防御免疫応答を生じさせるワクチン候補物質あるいはそのフラグメント又はそれらの変異体をコードする核酸を含む、請求項２１に記載のワクチン。
【請求項２３】
生ワクチンである、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法における使用のための第一及び対照データセット、及び請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法を実施するためのコンピュータ読取り可能な指示を含む、コンピュータ読取り可能な媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば病原生物、特に細菌のプロテオームからワクチン候補物質を特定するための方法、この方法を用いて特定されるワクチン及びそれにおいて有用なコンピュータ読取り可能な媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去２００年間にわたって、細菌性病原体によって引き起こされる感染症を制御するためのワクチンの使用は有効且つ安全であることが証明されてきた。これらのワクチンの多くは経験的アプローチを用いて発見されており、そのようなワクチンは、細菌性病原体の生弱毒化形態、死滅細菌細胞及び細菌の個別成分（サブユニット）を含む。多くの細菌ワクチンがまだ広く使用されているが、２０世紀後半には、他の多くの感染症の制御のために抗生物質療法に頼る方向へのシフトが起こった。
【０００３】
最近の、多くの細菌性病原体の抗生物質耐性株の出現は、疾患を予防するためにワクチンを使用することへの関心の再現を促した。しかし、既存の細菌ワクチンの多くは、感染に対して適切なレベルの防御を提供しないとみなされている。さらに、ワクチン接種後の一過性副作用の潜在的可能性が強く認識されていることから、全細菌細胞に基づくワクチンよりもサブユニットワクチンの使用により力点が置かれることになった。また、まだ有効なワクチンが作られていない感染生物もいくつか存在する。
【０００４】
ワクチンサブユニットの選択には経験的アプローチがまだ使用されているが、試験するための候補サブユニットの選択は一般に、病原体と宿主の間の分子相互作用に関する多大の背景知識に依存する。多くの細菌性病原体についてはこの情報が得られていない。より最近になって、バイオインフォマティクスに基づくアプローチは候補タンパク質サブユニットを細菌ゲノム配列からインシリコで選択することを可能にしうるという認識が高まってきた。これらの方法は、実験的アプローチよりもはるかに迅速に潜在的候補物質に関してゲノム全体をスクリーニングするために使用でき、それ故ワクチンに関する前臨床試験へとより速やかに進むことを可能にする。
【０００５】
一般に、「インシリコ」アプローチは、候補タンパク質が細菌の外側表面に位置する又は細菌から外部に移行するという仮定に基づいてきた。一部の研究者達は、細胞質膜を横切る外部移行を指令するシグナル配列を備えたタンパク質をコードするＯＲＦを初めて特定した（Ｇｏｍｅｚ  Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２０００，６６：２３２３−２３２７；Ｐｉｚｚａ  Ｍ．ら、２０００）。このデータセットはその後、膜貫通ドメインを含むタンパク質を排除するため（Ｐｉｚｚａら、２０００；Ｇｏｍｅｚら、２０００、前出）、及びリポタンパク質結合部位（Ｇｏｍｅｚら、２０００、前出；Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２０００、１９：６０１−６１２）又は表面固定に関連する他のモチーフ（Ｐｉｚｚａら、２０００、前出；Ｒｏｓｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ，２００１、１９：４１３５−４１４２）を有するタンパク質を包含するためにスクリーニングされた。これらのアプローチは新規サブユニットを生成したが、これらのアプローチの予測力は、種々の細菌種における外部移行及びタンパク質プロセシング経路についての知識が限られていること、及び外膜タンパク質の分子構造についての知識が限られていることの両方によって制限されている。さらに、一部のワクチン抗原は主として細菌の外側表面には位置しないことに留意しなければならない。
【０００６】
多くの細菌性病原体のゲノム配列が現在決定済みであるか又はここ数年のうちに完了する予定であり、これは、疾患のための改善された全処置又は治療を提供するためにこれらのゲノム配列がどのように解釈できるかを検討する重要な仕事を促すことになった。これまでの研究者達は、ワクチン抗原の考えられる細胞局在部位を細胞の表面上とみなしており、新規ワクチン候補物質についての予測細菌プロテオームを調べるために細胞局在部位を予測するアルゴリズムを使用してきた。
【０００７】
ワクチン候補物質の予測のための他のこれまでの方法は、既知のワクチンと配列類似性を有するタンパク質を見出すためのアルゴリズムを使用することを含んだ。しかし、そのような手法は新しいファミリーのワクチン候補物質を予測することができない。報告されているさらなる方法は、遺伝子の５’末端の縦列反復配列を検索した。そのような反復配列が一部のビルレンス遺伝子に関連していたためである（Ｈｏｏｄ  ＤＷら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ．１９９６、９３：１１１２１−１１１２５）。しかし、多くにビルレンス関連遺伝子はそのような反復配列を持たず、そのためこの方法によっては特定されない。
【０００８】
分泌タンパク質を特定するためのシグナル配列の検索も、候補ワクチン抗原を特定するために多くの研究者によって使用されてきた（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉら、２００１、前出、Ｊａｎｕｌｃｚｙｋ  ＲとＲａｓｍｕｓｓｅｎ  Ｍ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００１、６９：４０１９−４０２６）。しかし、そのようなプログラムは、タンパク質を運び出すために使用される種々の方法及び種々の細菌が有する種々のシグナル配列を考慮することができない。また、そのようなアルゴリズムは、タンパク質の細胞局在部位を予測するとき１００％の精度を提供せず、可能な候補物質を見落とすことがありうる。以前に指摘されたように（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＤＬ．Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２０００、１：２８９−２９６）、古典的リーダー配列を持たないタンパク質抗原はこの方法を用いて特定されない。そのような例の１つは、既知のＴ細胞抗原である、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）からのワクチン抗原ＥＳＡＴ−６（Ｓｏｎｒｅｎｓｏｎ  ＡＬ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９５，６３：１７１０−１７１７、Ｌｉ  Ｚ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９９９，６７：４７８０−４７８６、Ｏｌｓｅｎ  ＡＷ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００１，６９：２７７３−２７７８）であり、これはこの方法を用いると見落とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、意外にも、報告されているタンパク質ワクチン抗原のある種の性質が代表的対照タンパク質データセットとは有意に異なることを見出した。これは、既知のタンパク質ワクチン抗原のそれらの性質を、対照データセット中の代表的タンパク質であるが無作為に選択したタンパク質の性質と比較することにより、可能性のあるワクチン抗原を特定できることを示唆する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、タンパク質の生物物理的性質又はアミノ酸組成から選択される性質に基づいて標的生物のプロテオームからタンパク質を選択することを含む、ワクチン候補物質を特定するための方法を提供する。
【００１１】
特に該方法は、ランダムに選択したタンパク質の性質と比較して所望の防御免疫原性を有することが知られる一連のタンパク質（すなわちワクチン抗原）の上記性質の比較に基づいてアルゴリズムを構築することを必要とする。
【００１２】
ここで使用する「生物物理的性質」の語は、分子量又は等電点（ｐＩ）のような、全体としてのタンパク質のバルク特性を指す。また、アミノ酸組成は、疎水性、かさ高性、屈曲性及び変異性などの配列内の個々のアミノ酸の性質、より特定すると、単純アミノ酸構造又はその組成を考慮することにより、選択の基礎として使用することができる。
【００１３】
意外にも、これらの性質と、タンパク質が防御免疫応答を生じる能力、それ故ワクチンとして適用できる能力の間には特に良好な相関が存在することが見出された。そのような基本的性質と機能又は活性との間のそのような相関はこれまでに認められていなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
特に、該方法は、特定の属の１又はそれ以上のワクチン抗原の上記性質に関する第一セットのデータを収集すること、同じ属からの１又はそれ以上のランダムなタンパク質の上記性質に関する対照セットのデータを収集すること、標的種のプロテオームからのタンパク質の上記性質を検討すること、及び第一セットのデータにより類似した性質を有するそのプロテオームからのワクチン候補物質を選択することを含む。
【００１５】
適切には、第一及び対照セットのデータを各々複数のタンパク質から入手し、それらのタンパク質自体を、適切には、選択した属の複数の種から入手する。
【００１６】
該方法は、ワクチンを必要とするあらゆる属の生物、例えばマイコプラズマ、ウイルス、酵母及び細菌を含む細菌に適用しうるが、好ましくはグラム陰性菌とグラム陽性菌の両方を含む細菌に適用される。
【００１７】
データセットを構築する適切な細菌のリストを下記の表１に示す。好ましくは、表１に列挙するすべての細菌種からのタンパク質を用いてデータセットを構築する。
【００１８】
特に好ましい実施態様では、個々のアミノ酸のパーセンテージ組成に基づいてデータセットを検討するか又は分析する。
【００１９】
この実施態様は、それ故、既知のワクチン効果を有する１又はそれ以上の種からのタンパク質の個々のアミノ酸含量を分析する段階、及びこれを上記種からランダムに選択した一連のタンパク質の個別アミノ酸含量と比較する段階、及びその結果を比較する段階を含む工程を包含する。
【００２０】
適切な比較は、最初に次の方程式：
【００２１】
【数２】
2005525626.tif 000002
を用いてタンパク質配列内の各々のアミノ酸にアミノ酸スコアを割り当てることによって実施する。
【００２２】
この分析を下記の表１に列挙するすべての種から誘導されるすべてのタンパク質に適用するとき、各々のアミノ酸は下記の表４に示すスコアを有する。この情報により、適切な数字を適用することに基づいて、標的生物のプロテオーム内のタンパク質の配列に「総合」スコアを与えることができる。ワクチン用途のためには、タンパク質は好ましくはこのスケール上で高いスコアを有することが見出された。そこで例えば、スコアの最高２０％内、適切には上位１０％内、より好ましくは上位３％内にある上記標的生物からのタンパク質をワクチン候補物質として選択しうる。
【００２３】
必要に応じて、ワクチンプロフィールにより密接に「適合する」ワクチン候補物質を選択するために、１又はそれ以上の異なる性質を用いた分析が適用できる。すべての場合に、分析は適切にはインシリコで実施され、下記に例示するような公共領域にあるソフトウエアを使用して実施しうる。
【００２４】
ひとたびワクチン候補物質が特定されれば、それを入手し、ワクチンとしての適切性を確認するために試験しうる。例えば、細菌ソースから単離するか、あるいは、例えばペプチド又はタンパク質シンセサイザーを用いて化学的に又は当技術分野において周知のように組換えＤＮＡテクノロジーを用いて合成しうる。すなわち該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞を形質転換するために使用され、原核又は真核細胞でありうるが、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核宿主細胞である、プロモーターなどの必要な制御エレメントを含む発現ベクターに組み込む。
【００２５】
ワクチン候補物質は、それが防御免疫応答を生じることを確認するために、例えば動物モデル及び臨床治験においてインビトロ及び／又はインビボで試験しうる。
【００２６】
上述したように特定されたワクチン候補物質は、本発明のさらなる局面を形成する。
【００２７】
さらに、これらの候補物質又はその防御的変異体又はこれらのいずれかの防御的フラグメントを有効成分として使用し、当技術分野で了解されているような医薬適合性の担体を含有しうるワクチンは、本発明のさらなる局面を形成する。ワクチンは、有効成分の性質及び使用される製剤のタイプなどの因子に依存して、経口、非経口、吸入、ガス注入又は鼻内経路を含む様々な経路による投与に適しうる。有効ワクチン成分はペプチドのタンパク質の形態で使用しうるか、又はこれらをコードする核酸を、それらが宿主動物の体内で発現されるように使用しうる。例えば、それらは、その後「生」ワクチンとして使用されるウイルス又は腸内集落形成生物などの生物を形質転換するために使用しうるか、又はいわゆる「裸のＤＮＡ」ワクチンの形態でプラスミド内に組み込んでもよい。
【００２８】
ここ使用するとき、「変異体」の表現は、配列内の１又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸を置換しているという点でそれらが由来する基本配列とは異なるアミノ酸の配列を指す。アミノ酸置換は、あるアミノ酸が広い意味で類似した性質を有する異なるアミノ酸で置き換えられている場合「保存的」とみなしうる。非保存的置換は、アミノ酸が異なる種類のアミノ酸で置き換えられている場合である。大雑把に言えば、ポリペプチドの生物活性を変化させない場合には非保存的置換はごくわずかしか可能でない。適切には、変異体はその基本配列と少なくとも６０％同一、好ましくは少なくとも７５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一である。
【００２９】
この場合の同一性は、例えばＬｉｐｍａｎ−ＰｅａｒｓｏｎのアルゴリズムをＫｔｕｐｌｅ：２、ギャップペナルティー：４、ギャップ長ペナルティー：１２、標準ＰＡＭスコアリングマトリックスと共に使用して判定できる（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．とＰｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｅａｒｃｈｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，ｖｏｌ．２２７，１４３５−１４４１）。
【００３０】
「そのフラグメント」の語は、完全なアミノ酸配列と同じ活性を有する所与のアミノ酸配列の部分を指す。フラグメントは、適切には基本配列からの少なくとも５個、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む。
【００３１】
さらなる局面では、本発明は、上述した方法における使用のための第一及び対照データセット、及び上述した方法を実施するためのコンピュータ読取り可能な指示を含む、コンピュータ読取り可能な媒体を提供する。
【００３２】
上記陽性データセットをさらに改善するために、新たに報告されたワクチン抗原を追加しうる。
【００３３】
下記で詳細に述べるように、本発明の方法を用いて、出願人は、陽性データセット内のタンパク質のｐＩ及び分子量の両方が対照データセットと統計的な有意さを示すことを見出した。ｐＩ分析で見られる２ピークパターンが試みたすべてのデータセットにおいて発生する。細菌は、現実には酸性又は塩基性条件を経験する（及びまれに中性条件に遭遇する）可能性が高く、それが中性条件でのｐＩ分析におけるトラフ（谷）を説明しうる。
【００３４】
さらに、本発明に従った分析は、ワクチン抗原の疎水性、かさ高性、屈曲性及び変異性が対照データセットのこれらの性質と有意に異なることを明らかにした。これまでに記述されている大部分のワクチン抗原は表面に露出されているか又は分泌されるので、周囲の環境と接触する可能性が高い。これはそれらの疎水性に反映され、それ故疎水性を尺度として用いる２つのデータセットの間で認められる差を説明すると考えられる。変異性の差は、それらの抗原提示を変化させ、それによって宿主の免疫系を免れる病原体の能力を反映すると考えられる。関連する細胞表面タンパク質の表現型変異が一部の種の臨床単離物において認められ、抗原タンパク質が感染期間中に突然変異し、進化しうることを示唆した（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、１９８５）。これはまた、タンパク質表面上の小さな可撓性残基の使用が突然変異の必要性を反映すると考えられるので、かさ高性と屈曲性の比較において見られる差を説明しうる。
【００３５】
上述したワクチン抗原アミノ酸採点スケールを使用して、ワクチン抗原は外膜及び分泌されたタンパク質と有意の採点類似性を有することが認められた。現在までに特定された大部分のワクチン抗原は表面露出されているか又は分泌されることが知られているので、これは予想される。この特定採点アルゴリズムは、既知の抗原を肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）プロテオームからのタンパク質の上位１０％内に等級付けることができた。
【００３６】
他の細菌プロテオームもここで述べる採点アルゴリズムを用いて等級付けたが、我々の陽性データセットに含まれる既知のワクチン抗原はほとんどの場合スコアの上位１０％内に分類される（データは示していない）。
【００３７】
この試験は、ワクチン候補物質の予測のためのツールとしての一部の性質、特にアミノ酸組成の有効な使用を明らかにしている。ここで述べるアプローチは、プロテオーム又はプロテオームの実質的な部分が入手可能であるか又は入手可能となるあらゆる病原生物、特に細菌に適用できる。配列類似性、モチーフ又は細胞内局在部位に基づいていないので、他の予測ツールが見落とす可能性のあるワクチン候補物質を特定するはずである。
【００３８】
本発明の方法は、潜在的ワクチン候補物質をその細胞局在部位に関わりなく特定することを可能にするという意味で強固である。そのタンパク質内に特定配列又はモチーフが存在することを必要としない。例えば、アミノ酸組成に基づく本発明の方法を使用して、上述した既知のＴ細胞抗原である、ヒト型結核菌からのＥＳＡＴ−６は、ヒト型結核菌の予測プロテオーム全体の中で８５位に等級付けられたタンパク質であった（すなわち上位３％、データは示していない）。
【００３９】
ここで、添付の表及び図面を参照しながら実施例によって本発明を詳細に説明する。
【００４０】
表１は、ワクチン抗原データセットを構築するために使用したタンパク質のデータソースを列挙する。表に示す参考文献からワクチン抗原タンパク質を選択した。
【００４１】
表２は、対照データセットを構築するために使用したタンパク質のデータソースを列挙する。表に示すような既存のデータベースからタンパク質を選択した。
【００４２】
（１ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ；２ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；３ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ；４ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｃｏｒｐ．ｃｏｍ；５ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ；６ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｏｕ．ｅｄｕ）
表３は、細菌の細胞内局在タンパク質データベースの要約である。タンパク質は、表に列挙する種からのＳＷＩＳＳＰＲＯＴ注釈付きタンパク質データベースより選択した。各々の細胞内局在部位からのタンパク質を、細胞内局在部位データベースを形成するように分類した。
【００４３】
表４は、ワクチン抗原及び対照データベースのアミノ酸組成、及び本発明の好ましい実施態様のアルゴリズムをそれらに適用した結果を示す。ワクチン抗原と対照ベース内のタンパク質の平均パーセンテージアミノ酸組成及び標準偏差を列挙している。同じ中央値を共有する２つのデータベースの確率（Ｐ）をウィルコクソンの順位和検定によって算定し、小数第３位以下を切り捨てる。０．０５以下のＰの値は有意に異なり、該方法の中で示したようにスコアを割り当てた。
【００４４】
表５は、ワクチン抗原スケールによって採点した肺炎連鎖球菌Ｒ６のタンパク質を示す。ワクチン抗原スケールによって採点したとき上位５０に等級付けられる肺炎連鎖球菌のタンパク質を列挙している。肺炎連鎖球菌の他の既知のワクチン抗原も、それらの順位及びワクチン抗原スコアと共に示している。＊は、バイオインフォマティクス法によってこれまでに認識されたワクチン候補物質を表わす（Ｈｏｓｋｉｎｓら、２００１）。
【００４５】
表６は、陽性及び対照データセットと様々な細胞内局在部位についてのデータベースとの比較に関するＰスコアを示す。ワクチン抗原スケールを使用して陽性又は対照データセットからのタンパク質を採点し、様々な細胞内局在部位からのタンパク質のデータベースと比較した。同じ中央値を共有する２つのデータベースの確率（Ｐ）をウィルコクソンの順位和検定によって算定した。
【実施例１】
【００４６】
データセットの構築
ワクチン抗原データセットの構築
特許及び公表文献を検索して、疾患の適切な動物モデルにおいて免疫原として使用したとき防御応答を誘導することが示された細菌タンパク質のリストを導くことによってワクチン抗原を特定した。候補物質がデータベースへの組込みに関して適格であるためには、該タンパク質の全部又は一部又は対応するＤＮＡが、感染の適切な動物モデルを使用した免疫後に防御応答を誘導すること、又は毒性成分の攻撃誘発作用に対して防御応答を誘導することを示していなければならない。それらの選択された物質をＦＡＳＴＡフォーマット済みデータベースファイルに登録した。
【００４７】
合計で７２のワクチン抗原を特定した（表１）。これらのタンパク質は２３の属の３２細菌種に由来した。ワクチン抗原データセットに含まれる７２抗原のうちで、２６はグラム陽性菌に由来し、４６はグラム陰性菌に由来した（この試験のためにミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）はグラム陽性菌として扱った）。
【００４８】
ワクチン抗原のアミノ酸配列は、公的に入手可能な配列データベース、主としてｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で問い合わせできるＮＣＢＩデータベースから得た。この試験において使用するために特定したワクチン抗原タンパク質を表１に示す。
【００４９】
対照データセットの構築
意味のある比較を可能にするために、各々の属からの登録の割合に関してワクチン抗原データセットを反映する対照データベースを構築した。対照データセットに関しては、ワクチン抗原データセットに含まれる各々の属を代表するとみなした単一種を選択した。またその種は、予測プロテオーム全体又はゲノム配列の入手可能性にも基づいて選択した。次に、ワクチン抗原データセット内の各々の登録に関して、ＰＥＲＬで書かれたルーチンを使用して、対照データセットに包含するために対応する種のプロテオームから３５のタンパク質をランダムに選択した。ゲノム配列が入手可能であるが注釈付きでない場合は、Ｇｌｉｍｍｅｒ（Ｄｅｌｃｈｅｒら、１９９９）を使用してそのプロテオームを予測した。これらの場合には、ＴＩＧＲからのプログラムｆａｓｔａｂｌａｓｔ．ｐｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ．ｕｋで見出される）を適合させ、すべての予測タンパク質配列のＦＡＳＴＡファイルを作成するために使用した。ワクチン抗原データセットに含まれる属のいずれかの成員について完全なゲノム配列が入手可能でない場合は、選択した種からの既知のタンパク質全部を、公的に入手可能なタンパク質配列データベース（ＮＣＢＩ）からダウンロードした。すべてのプロテオームデータをＦＡＳＴＡフォーマットで保存した。対照データベースを構築するために使用した属、種及びデータソースを表２に示す。
【００５０】
対照データセットのサイズは、最終サイズが典型的細菌ゲノムによってコードされるタンパク質の数とほぼ等しいことを保証するように構築した。注釈付きゲノム配列は、シグナルペプチドを包含して、タンパク質配列を含む。対照データセット内のタンパク質は主として予測プロテオーム及びゲノムデータから導いたので、それらはシグナル配列を包含する。陽性データベースが対照データセットを反映することを保証するために、使用した配列もシグナル配列を包含した。上記ワクチン抗原及び対照データセットを、下記で詳述するすべての比較のために使用した。
【実施例２】
【００５１】
対照及びワクチン抗原データベース内のタンパク質の物理的性質の分析
対照及びワクチン抗原データベース内の各々のタンパク質の予測分子量及び予測等電点（ｐＩ）を算定するためにプログラムをＰＥＲＬで書いた。その結果を等級付け、１５Ｄａ（図１ａ）又は０．４ｐＩ単位（図１ｂ）の漸増量に対応するヒストグラムビンに分類して、各ヒストグラムビン内の各々のデータベースのパーセンテージに対して測定した。２つのデータベースにおける分子量とｐＩの分布を図１のヒストグラムに示している。分子量、ｐＩ又はスコアの差の統計的有意性は、ウィルコクソンの順位和検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ，１９４５；Ｍａｎｎ  ＆  Ｗｈｉｔｎｅｙ，１９４７）によって算定した。このノンパラメトリック検定は、２つのデータセットを比較するとき分布に関する仮説を立てず、２つのデータベース内のスコアの分布の確率（Ｐスコア）を同一として回帰する。＜０．０５のＰスコアを有意とみなした。
【００５２】
対照と陽性データセットの両方においてｐＩ値の２ピーク分布も、分析した予測プロテオームのすべてに関して認められた（大腸菌、ヒト型結核菌、ヘリコバクター・ピロリ、髄膜炎菌及び肺炎連鎖球菌を含む−データは示していない）。各々のデータセットについての平均値を算定し、データの分布の比較を可能にするために、ウィルコクソンの順位和検定を適用した。陽性と対照データセットの比較は、分子量及びｐＩ値の分布が有意に異なること（分子量についてはＰ＝０．５×１０−６及びｐＩについてはＰ＝０．００２）を明らかにした。
【実施例３】
【００５３】
ワクチン抗原及び対照データセットのアミノ酸組成
対照及びワクチン抗原データベース内の各々のタンパク質を公表スケールに従って採点できるようにＰＥＲＬプログラムを書いた。ワクチン抗原及び対照データセット内のタンパク質のアミノ酸組成を４つの異なるスケールを用いて分析した。これらのデータセットに存在する全アミノ酸を、これまでに報告された採点方法に従って疎水性（Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）、屈曲性（Ｂｈａｓｋａｒａｎ  ＆  Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ、１９８８）、かさ高性（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９６８）又は相対変異性（Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８）に関して採点した。
【００５４】
これらの分析の各々からの結果を再び等級付け、２５の等しく分配されたヒストグラムビンに分類し、総データベースのパーセンテージとしてプロットした（図２ａ−ｄ）。各々のスケールについて陽性と対照データセットを比較する、生じたＰスコアは、統計的に異なることが認められた（疎水性、ｐ＝３．７×１０−６、かさ高性、ｐ＝８×１０−１４、屈曲性、ｐ＝１×１０−５、変異性、ｐ＝２．２×１０−９）。
【実施例４】
【００５５】
対照及びワクチン抗原データベースのアミノ酸組成の算定
ＦＡＳＴＡフォーマット済みデータベース内のあらゆるタンパク質のパーセンテージアミノ酸組成を算定するためにＰＥＲＬプログラムを書いた。［これまでの研究者達は、最小マハラノビス距離アルゴリズム（Ｌｅａｓｔ  Ｍａｈａｌａｎｏｂｉｓ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（Ｃｅｄａｎｏら、１９９７）を用いて５つのタンパク質細胞局在部位を予測するためにアミノ酸組成を使用するプログラム、ＰｒｏｔＬｏｃｋを記述している］。この方法を我々が開発したものと比較したが、より良好なデータを与えないことが認められた（データは示していない）。］
その後、新しい採点アルゴリズムを開発するためにアミノ酸組成を用いる細菌タンパク質ワクチン抗原の予測のための新規方法を試みた。
【００５６】
これは、各々のアミノ酸についての標準偏差に加えて、各データベースの平均アミノ酸組成を算定することを可能にした。対照とワクチン抗原データベースの間のアミノ酸組成の統計的有意差をウィルコクソンの順位和検定によって算定した。アミノ酸組成及び２つのデータベース間の差の有意性を表４に示す。
【００５７】
採点アルゴリズムの開発
対照及びワクチン抗原データセットのアミノ酸組成に基づいてアミノ酸に関するスコア表を作成した。各々のデータベースのアミノ酸組成を上述したように算定し、統計的な有意差を調べた。２つのデータベース内での存在に統計的な有意差を示したアミノ酸にスコアを割り当てた。平均データベーススコアを使用して各々のアミノ酸スコアを次のように算定した：
【００５８】
【数３】
2005525626.tif 000003
【００５９】
対照データベースと比較したときワクチン抗原データベースにおいて高い発生率を示したアミノ酸は、それ故、正のスコアを獲得し、一方ワクチン抗原データベースに存在しなかったものは負のスコアを獲得した。２つのデータベース間で統計的有意差を示さなかったものは０と採点した。各々のアミノ酸が獲得したスコアを表４に示す。
【００６０】
次にこの採点表を使用して、陽性及び対照データセット内の個々のタンパク質を採点した。タンパク質の平均スコアは、該タンパク質内の各アミノ酸についてのスコアを合計し、該タンパク質内のアミノ酸の数で割って算定した。それらのタンパク質をこのスコアで等級付け、結果を２５の等しく分配されたヒストグラムビンに割り当てた（図３）。陽性と対照データベースの間の差は高度に有意であって、２×１０−２９のＰ値を有しており、物理的性質、疎水性、屈曲性、変異性又はかさ高性に関して達成されたよりも高いスコアであった。
【実施例５】
【００６１】
実施例４の採点アルゴリズムの試験
実施例４のワクチン抗原採点スケールを使用して、記述されている細胞内データベースの各々からのタンパク質を採点した。これらのデータベースによって得たスコアの分布を図４に示す。ワクチン抗原採点スケールを肺炎連鎖球菌Ｒ６株のプロテオーム（Ｈｏｓｕｋｉｎｓら、２００１）にも適用し、その上位５０のスコアのタンパク質を表５に列挙している。次に、陽性データベースに含まれる肺炎連鎖球菌ワクチン抗原のこの採点リスト中の順位を特定した。分泌モチーフ及び／又は予測ビルレンス因子との類似性を有するタンパク質を予測するために、バイオインフォマティクス手法を用いてこれまでに特定された５つの他のワクチン候補物質（Ｗｉｚｅｍａｎｎら、２００１）の採点順位も調べた。
【実施例６】
【００６２】
細胞内局在タンパク質データベースに適用したワクチン採点アルゴリズム
ワクチン抗原と対照データセットのアミノ酸組成の相違は、ワクチン抗原の可能性のある細胞局在部位の相違を反映すると仮定した。この可能性を調べるため、上述した採点アルゴリズムを、既知の細胞局在部位（細胞質、内膜、ペリプラズム、外膜及び分泌タンパク質）を有するタンパク質の群に適用した。
【００６３】
ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ注釈付きタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ）を、対照データセットに含まれる各々の細菌種からの定義された細胞内局在部位を有するタンパク質に関して検索した。タンパク質の細胞内局在部位が「推定上」、「類似性により」又は「示唆される」として列挙されている登録タンパク質はデータベースから除外した。各々の細胞内局在部位について別々のデータベースを構築し、細胞質、内膜、ペリプラズム、外膜及び細胞外移行タンパク質データベースを作成した。グラム陽性膜タンパク質は内膜データベースに含めた。
【００６４】
生じた細胞内局在部位データベース及び種当りのタンパク質の数を表３に列挙する。
【００６５】
種々の細胞内局在部位の各データセットを、ワクチン抗原及び対照データベースの両方と比較した。現在最も知られているワクチン抗原は表面発現又は排出タンパク質であるので、この分析は、陽性データセットと外膜及び分泌タンパク質の両方のデータベースとの間の類似性を明らかにするであろうと予想された。０．３８及び０．３０（外膜及び分泌タンパク質）のＰスコアはこれを確認した（図４及び表６）。対照データセットはすべての細胞内局在部位データセットと有意の差を示し、それがすべての局在部位からのタンパク質の良好なランダム混合物を含むことを確認した。
【実施例７】
【００６６】
試験プロテオームに適用したワクチン採点アルゴリズム
実施例４のアルゴリズムがワクチン抗原についての予測プロテオーム全体をスクリーニングするために使用できるかどうかを評価するため、肺炎連鎖球菌のプロテオームを分析した。この予測プロテオームに該アルゴリズムを適用したとき、既知の防御抗原である表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）（Ｂｒｉｌｅｓら、２０００）は１１位に等級付けられるタンパク質として特定された。他の既知の肺炎連鎖球菌防御抗原は、スコアの上位１０％内にあたる、上位１９０内のタンパク質に分類されることが認められた（表５）。Ｗｉｓｅｍａｎｎら（２００１）によって特定され、マウスモデルにおいて防御免疫応答を与えることが見出された５つのタンパク質のうちで、１つを除くすべてが我々の採点アルゴリズムによって等級付けたタンパク質の上位１０％内であることが認められた。５つのうちで、Ｗｉｚｅｍａｎｎらによって特定されたシグナルペプチダーゼＩＩ開裂部位モチーフを有する保存された機能未知タンパク質（ＳＰ１０１）は、３４７位の最も低い順位を有していた（表５）。
【００６７】
【表２】
2005525626.tif 000004
2005525626.tif 000005
2005525626.tif 000006
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【００６８】
【表３】
2005525626.tif 000008
2005525626.tif 000009
2005525626.tif 000010
【００６９】
【表４】
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【００７０】
【表５】
2005525626.tif 000012
【００７１】
【表６】
2005525626.tif 000013
【００７２】
【表７】
2005525626.tif 000014
2005525626.tif 000015
【００７３】
【表８】
2005525626.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１ａ】図１ａは、予測分子量とｐＩによって採点したワクチン抗原と対照データベースのヒストグラムを示す。ヒストグラムは、ワクチン抗原と対照データベースを（ａ）予測分子量及び（ｂ）予測ｐＩに関して分析することによって得たスコアを示している。各々の対の数値についての併合分布を２５の等しい大きさのヒストグラムビンに分け、ｘ軸の表示はそのヒストグラムビンの上限を示す。各ヒストグラムビン内の各々のデータベースのパーセンテージをｙ軸に示している。
【図１ｂ】図１ｂは、予測分子量とｐＩによって採点したワクチン抗原と対照データベースのヒストグラムを示す。ヒストグラムは、ワクチン抗原と対照データベースを（ａ）予測分子量及び（ｂ）予測ｐＩに関して分析することによって得たスコアを示している。各々の対の数値についての併合分布を２５の等しい大きさのヒストグラムビンに分け、ｘ軸の表示はそのヒストグラムビンの上限を示す。各ヒストグラムビン内の各々のデータベースのパーセンテージをｙ軸に示している。
【図２】図２は、４つの異なる尺度によって採点したワクチン抗原と対照データベースのヒストグラムを示す。ヒストグラムは、ワクチン抗原と対照データベースを（ａ）Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性スケール、（ｂ）Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎらのかさ高性スケール、（ｃ）ＢｈａｓｋａｒａｎとＰｏｎｎｕｓｗａｍｙの屈曲性スケール及び（ｄ）Ｄａｙｈｏｆｆらの相対変異性スケールで採点することによって得たスコアを示している。各々の対のスコアについての併合分布を２５の等しい大きさのヒストグラムビンに分け、ｘ軸の表示はそのヒストグラムビンの上限を示す。個々のスコアを記録した各々のデータベースのパーセンテージをｙ軸に示している。
【図３】図３は、ワクチン抗原スケールによって採点したワクチン抗原と対照データベースを示すヒストグラムである。ヒストグラムは、ワクチン抗原と対照データベースをワクチン抗原スケールで採点することによって得たスコアを示している。個々のスコアを記録した各々のデータベースのパーセンテージをｙ軸に示している。２つの母集団のスコアの併合分布を２５の等しい大きさのヒストグラムビン（各ビン当り０．１０３のスコア）に分け、ｘ軸の表示はそのヒストグラムビンの上限を示す。
【図４】図４は、ワクチン抗原スケールによって採点した他のデータベースのヒストグラムを示す。ヒストグラムは、ワクチン抗原スケールを使用して（ａ）細胞質タンパク質、（ｂ）内膜タンパク質、（ｃ）ペリプラズムタンパク質、（ｄ）外膜タンパク質、（ｅ）分泌タンパク質、（ｆ）ワクチン抗原データベース及び（ｇ）対照データベースを採点することによって得たスコアを示している。個々のスコアを記録した各々のデータベースのパーセンテージをｙ軸に示している。２つの母集団のスコアの併合分布を２５の等しい大きさのヒストグラムビンに分け、ｘ軸の表示はそのヒストグラムビンの上限を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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