(57)【要約】本発明は、燐酸化標的分子の結合、検出および分離に使用され、その後の、燐酸化標的分子類または燐酸化可能分子類と相互作用する標的分子類の同定に使用される燐酸結合化合物に関するものである。燐酸結合化合物、酸および金属イオンを含む結合溶液であって、その際前記金属イオンは標的分子上の露出した燐酸基と前記燐酸結合化合物の金属キレート化部分とに同時に相互作用して、前記燐酸結合化合物と前記燐酸化標的分子との間に架橋を形成し、その結果三成分錯体を生成する前記結合溶液が提供される。本発明の結合溶液は、固定された可溶性燐酸化標的分子類の結合および検出に、燐酸化標的分子の錯体混合物からの分離に、およびキナーゼおよびホスファターゼ基質および酵素類を同定できるプロテオミック分析に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合溶液であって：
ａ）ＢＡＰＴＡ金属キレート化部分と；
ｂ）三価金属イオンと；
ｃ）酸
を含む結合溶液。
【請求項２】
結合溶液であって：
ａ）式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有し、式中、Ａは化学的部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは金属キレート化部分であり、ｍは１から４までの整数であり、ｎは０から４までの整数であるリン酸結合化合物と；
ｂ）三価金属イオンを含む塩と；
ｃ）酸
とを含む結合溶液。
【請求項３】
前記結合溶液がｐＨ約３ないしｐＨ約６有する請求項２記載の結合溶液。
【請求項４】
前記金属イオンがＧａ３＋、Ｆｅ３＋およびＡｌ３＋からなる群から選択される請求項３記載の結合溶液。
【請求項５】
前記塩が塩化ガリウムである請求項４記載の結合溶液。
【請求項６】
前記化学的部分が、色素がスルホン化されていないことを条件に、色素、酵素またはハプテンである標識であり、または前記化学的部分が反応基である請求項５記載の結合溶液。
【請求項７】
前記ハプテンがビオチンである請求項６記載の結合溶液。
【請求項８】
前記色素がベンゾフラン、キナゾリノン、キサンテン、インドール、ベンザゾールおよびボラポリアザインダセンからなる群から選択される請求項６記載の結合溶液。
【請求項９】
前記金属キレート化部分がＢＡＰＴＡである請求項６記載の結合溶液。
【請求項１０】
前記化合物が式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有し、式中、Ａは色素または反応基である化学的部分であり、Ｌはリンカーであり、ｍは１から４までの整数であり、ｎは０から４までの整数であり、Ｂは以下：
【化１】
2005539243.tif 000023
を含む式ＩＶを有し；
式中、前記色素または反応基はリンカーによってＲ１−Ｒ１２の少なくも一つに結合し、またはＲ１−Ｒ８の少なくも一つが環Ａまたは環Ｂと共に色素を形成し；
色素または反応基はでないＲ１−Ｒ８が、水素、ハロゲン、アルコキシ、アルキル、アリール、アミノ、カルボキシル、ニトロ、シアノ、チオエーテル、ヒドロキシル、スルフィニル、およびリンカーからなる群から独立的に選択され；
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２は水素、リンカーおよび低級アルキルからなる群から独立的に選択され、または隣接置換基Ｒ９およびＲ１０が一緒になって５員−または６員−脂環式または複素環式環を構成し；
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ１８は独立的に水素、低級アルキルまたはアルキルであり、アルキルまたは低級アルキルは任意にカルボキシルまたはアルコキシによって置換され；
ｐが１または２であり；
Ｒ１３およびＲ１４が独立的に水素または塩である
請求項９記載の結合溶液。
【請求項１１】
Ｒ１−Ｒ４の少なくも一つが独立的に色素または反応基であり、Ｒ５−Ｒ８がＨ、ＮＯ２、Ｆ、ＣＦ３、低級アルキルおよびリンカーからなる群から独立的に選択され、前記リンカーが任意にビオチン、反応基または色素に結合する請求項１０記載の結合溶液。
【請求項１２】
前記色素が独立的にＲ３、Ｒ２にまたは同時にＲ３とＲ２に結合する請求項１１記載の結合溶液。
【請求項１３】
前記Ｒ６またはＲ７がリンカーであり、前記リンカーが任意にビオチン、反応基または色素に結合する請求項１１記載の結合溶液。
【請求項１４】
前記Ｒ６およびＲ５が独立的にフッ素である請求項１１記載の結合溶液。
【請求項１５】
前記Ｒ６がＮＯ２である請求項１１記載の結合溶液。
【請求項１６】
前記式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有する前記リン酸結合化合物が化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２からなる群から選択される請求項１０記載の結合溶液。
【請求項１７】
前記結合溶液がさらに有機溶媒および緩衝剤を含む請求項２記載の結合溶液。
【請求項１８】
前記有機溶媒がアセトニトリルである請求項１７記載の結合溶液。
【請求項１９】
前記リン酸結合化合物が溶液中にあるか、または固体または半固体に固定される請求項９または請求項１０記載の結合溶液。
【請求項２０】
サンプル中のリン酸化標的分子を結合する方法であって：
ｉ）前記サンプルを請求項１−１９のいずれかの項に記載の結合溶液と接触させ；
ｉｉ）前記サンプルと前記結合溶液とを、前記リン酸結合化合物が前記リン酸化標的分子に結合するのに十分な時間インキュベートし、それによって前記リン酸化標的分子が結合する
諸工程を含む方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記リン酸結合化合物を適切な光源で照射し、それによって前記標識化リン酸化標的分子を検出することをさらに含む請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記リン酸化標的分子が、タンパク質類、ペプチド類、ヌクレオチド類、炭水化物類、ホスファターゼ基質類、キナーゼ基質類、脂質および無機リン酸からなる群から選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記リン酸化標的分子が固体または半固体基質に固定され、または溶液に溶解している請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記固体または半固体基質がゲル、膜、重合粒子またはアレイである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
膜に固定されたサンプル中のリン酸化標的分子を検出する方法であって：
ｉ）ゲル上の前記サンプルを任意に電気泳動法によって分離し；
ｉｉ）前記サンプルを膜に固定し；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の前記膜と固定液とを任意に接触させ；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の前記膜と請求項２−１９のいずれかの項に記載の結合溶液とを接触させ、前記溶液は、
ａ）式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有するリン酸結合化合物であって、式中、Ａは化学的部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは金属キレート化部分であり、ｍは１から４までの整数であり、ｎは０から４までの整数であるリン酸結合化合物；
ｂ）金属イオンを含む塩；および
ｃ）酸；
含み；
ｖ）工程ｉｖ）の前記膜と前記結合溶液とを、前記リン酸結合化合物が前記リン酸化標的分子に結合できる十分な時間インキュベートし；
ｖｉ）前記化合物を可視化して前記リン酸化標的分子を検出する
諸工程を含んでなる方法。
【請求項２６】
工程ｉｉｉ）が、前記膜を、前記固定溶液との接触後に洗浄溶液と接触させることをさらに含む請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記リン酸化標的分子がタンパク質、ペプチドおよびヌクレオチドからなる群から選択される請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、式中のＢが式ＶＩを有する前記リン酸結合化合物が、化合物１、２、３、４、５、９、１０、１１および１２からなる群から選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記工程ｖ）が、前記膜を、前記結合溶液との接触後に洗浄溶液と接触させることをさらに含む請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記膜に追加的検出試薬を付加することをさらに含む請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記追加的検出試薬が、総タンパク質に特異的な染色溶液、糖タンパク質に特異的な染色溶液または抗体である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ゲルに固定されたサンプル中のリン酸化標的分子を検出する方法であって、
ｉ）前記サンプルをゲルに固定し；
ｉｉ）任意に工程ｉ）の前記ゲルを固定溶液に接触させ；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の前記ゲルを請求項２−１９のいずれかの項に記載の結合溶液と接触させ、前記結合溶液は、
ａ）式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされる化合物であって、式中Ａは化学的部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｂは金属キレート化部分であり、ｍは１から４までの整数であり、ｎは０から４までの整数である化合物；
ｂ）金属イオンを含む塩；
ｃ）酸
を含み；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の前記ゲルと前記結合溶液とを、前記化合物が前記リン酸化標的分子と結合できるのに十分な時間インキュベートし；
ｖ）前記化合物を可視化し、それによって前記リン酸化標的分子を検出する
諸工程を含む方法。
【請求項３３】
前記リン酸化標的分子がタンパク質類、ペプチド類およびヌクレオチド類からなる群から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、式中Ｂが式ＶＩを有するリン酸結合化合物が化合物１、２、３、４、５、９、１０、１１および１２からなる群から選択される請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
追加的検出試薬を前記ゲルに付加することをさらに含む請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記追加的検出試薬が総タンパク質に特異的染色溶液または糖タンパク質に特異的な染色溶液である請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
工程ｉｉ）が、前記ゲルを、前記固定溶液との接触後に洗浄溶液と接触させることをさらに含む請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記方法が、工程ｉ）の前に最初に前記サンプルを焦点電気泳動にかけることをさらに含む請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
前記方法の前記工程ｉが前記サンプルを電気泳動分離することをさらに含む請求項３４記載の方法。
【請求項４０】
前記工程ｖ）が、前記ゲルを、前記結合溶液との接触後に洗浄溶液と接触させることをさらに含む請求項３４記載の方法。
【請求項４１】
基質上に固定されたサンプル中のリン酸化標的分子を検出する方法であって：
ｉ）前記サンプルを基質上に固定し；
ｉｉ）工程ｉ）の前記基質と請求項２−１９のいずれかの項に記載の結合溶液とを接触させ、前記結合溶液は、
ａ）式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされるリン酸結合化合物であって、Ａが化学的部分、Ｌがリンカー、Ｂが金属キレート化部分であり、ｍは１から４までの整数で、ｎは０から４までの整数であるリン酸結合化合物；
ｂ）金属イオンを含む塩；
ｃ）酸
を含み；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の前記基質と前記結合溶液とを、前記化合物が前記リン酸化標的分子に結合できるのに十分な時間インキュベートし；
ｉｖ）前記化合物を可視化し、それによってリン酸化標的分子を検出する
諸工程を含む方法。
【請求項４２】
前記サンプルがタンパク質類、ペプチド類、ヌクレオチド類、脂質、キナーゼ基質類、ホスファターゼ基質類、リン酸結合タンパク質類および炭水化物類からなる群から選択される請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記基質がポリマーゲル、ガラス、ポリマー膜、プラスチックミクロ粒子である請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、式中Ｂが式ＶＩを有する前記リン酸結合化合物が化合物１、２、３、４、５、９、１０、１１および１２からなる群から選択される請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記工程ｉｉｉ）が、前記基質を、前記結合溶液との接触後に洗浄溶液と接触させることをさらに含む請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
追加的検出試薬を前記基質に付加することをさらに含む請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記追加的検出試薬が総タンパク質に特異的な染色溶液、糖タンパク質に特異的な染色溶液または抗体である請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
リン酸化標的分子をサンプルから分離する方法であって：
ｉ）前記サンプルを請求項１−１９のいずれかの項に記載の結合溶液と接触させ；
ｉｉ）工程ｉ）の前記サンプルと前記結合溶液とを、前記化合物が前記リン酸化標的分子と結合できる十分な時間インキュベートして三成分錯体を形成させ；
ｉｉｉ）前記錯体を前記サンプルから分離し、それによって前記リン酸化標的分子を分離する
諸工程を含む方法。
【請求項４９】
前記結合溶液がさらにアセトニトリルを含む請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記分離が前記錯体を沈殿させることをさらに含む請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記分離が、塩基性溶液を前記沈殿錯体に添加し、前記錯体は解離し、それによって前記リン酸化標的分子をアフィニティークロマトグラフィーによって分離することをさらに含む請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記分離が任意に、有機抽出溶液を請求項５０または請求項５１の前記錯体に加え、それによって前記リン酸化標的分子を前記リン酸結合化合物から分離することをさらに含む請求項５０または請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記リン酸化標的分子が、タンパク質類、ペプチド類およびヌクレオチド類から選択される請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、式中Ｂが式ＶＩを有する前記化合物が、化合物１、２、３、４、５、６、９、１０、１２、１５および１６からなる群から選択される請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
サンプルからリン酸化標的分子を分離する方法であって：
ｉ）式ＩＶからなる群から選択される金属キレート化部分を含む基質を、三価金属イオンを含む塩で帯電し；
ｉｉ）前記基質を酸性結合緩衝液で平衡化し；
ｉｉｉ）前記サンプルを前記基質に加え、前記リン酸化標的分子は工程ｉｉ）の前記基質に結合し；
ｉｖ）前記リン酸化標的分子を前記基質から塩基性溶液で溶出し、それによって前記リン酸化標的分子が分離される
諸工程を含む方法。
【請求項５６】
前記基質がポリマー粒子、ポリマー膜、ガラスおよびプラスチックからなる群から選択される請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記リン酸化標的分子がタンパク質類、ペプチド類またはヌクレオチド類である請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記酸性結合緩衝液が約３ないし約６のｐＨを有する請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記三価金属イオンがＧａ３＋、Ｆｅ３＋およびＡｌ３＋からなる群から選択される請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
前記塩が塩化ガリウムである請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記基質が化合物２、５、１３、１４、１５および１６を含む請求項５９記載の方法。
【請求項６２】
サンプル中のリン酸化標的分子に結合するためのキットであって：
ｉ）請求項１−１９のいずれかの項に記載の結合溶液；および
ｉｉ）前記キットが、リン酸化および非リン酸化ポリペプチド類を含む分子量マーカーを任意に含む
キット。
【請求項６３】
前記キットが独立的に固定溶液、追加的検出試薬、標準または洗浄溶液をさらに含む請求項６２記載のキット。
【請求項６４】
前記キットがさらに基質を含む請求項６３記載のキット。
【請求項６５】
前記基質がホスファターゼまたはキナーゼ基質をさらに含む請求項６４記載のキット。
【請求項６６】
前記追加的検出試薬が独立的に総タンパク質に特異的な染色溶液、糖タンパク質に特異的な染色溶液または抗体である請求項６３記載のキット。
【請求項６７】
前記式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有する前記リン酸結合化合物が化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５および１６からなる群から選択される請求項６２記載のキット。
【請求項６８】
式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、式中Ａは化学的部分、Ｌはリンカー、Ｂは式ＩＶによる金属キレート化部分、ｍは１から４までの整数であり、ｎは０から４までの整数である固定されたリン酸結合化合物を含む基質。
【請求項６９】
式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、式中Ａは標識、Ｌはリンカー、ｍは１から４までの整数であり、ｎは０から４までの整数であり、Ｂは式ＩＶを有する金属キレート化部分である化合物であって、前記化合物は、以下：
【化２】
2005539243.tif 000024
【化３】
2005539243.tif 000025
【化４】
2005539243.tif 000026
【化５】
2005539243.tif 000027
【化６】
2005539243.tif 000028
からなる群から選択され、上記式中、Ｒ１９は−（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）−であり、Ｒ１３は独立的に水素または塩である
化合物。
【請求項７０】
下記の構造：
【化６Ａ】
2005539243.tif 000029
【化７】
2005539243.tif 000030
である式ＩＶによる金属キレート化部分を含む化合物であって、
上記構造式中、Ｒ１９は−（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）２−であり、Ｒ１３は独立的に水素または塩である
化合物。
【請求項７１】
式ＩＶ：
【化８】
2005539243.tif 000031
による金属キレート化部分を含む化合物であって、上記式中ＸはＨまたはＦ；Ｒ２０はＨ、メチルまたはフェニル；Ｒ２１はＣＨ３、Ｐｈ、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｐｈ、−（ＣＨ＝ＣＨ）２−Ｐｈ、２−ピロリル、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａであり；
Ｒ１９は−（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）２であり、Ｒ１３は独立的に水素または塩である、化合物。
【請求項７２】
三価ガリウムイオンと、リン酸化標的分子と、式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）によってあらわされ、式中Ａは化学的部分、Ｌはリンカー、Ｂは金属キレート化部分、ｍは１から４までの整数、ｎは０から４までの整数であるリン酸結合化合物とを含む三成分錯体。
【請求項７３】
ＢＡＰＴＡキレート化部分と、三価ガリウムイオンと、リン酸化標的分子とを含む三成分錯体。
【請求項７４】
リン酸化標的分子と請求項１−１９のいずれかの１項に記載の結合溶液とを結合させることによって確認されるリン酸化標的分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（序文）
（米国後援研究に関する陳述）
本発明は米国癌研究所によって認可された基金番号１Ｒ３３ＣＡ０９３２９２−０１の政府援助によって一部支援された。米国政府は本発明に多少の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はリン酸化標的分子類の検出および分離に使用するための金属キレート組成物および方法に関するものである。本発明はプロテオミックス、分子生物学、高処理量スクリーニングおよび診断学の分野に利用される。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
リン酸化および脱リン酸化は、リン酸基が標的分子、一般的にはタンパク質に付加したりそれらから除去されたりするプロセスである。可逆的リン酸化プロセスは、シグナル伝達、遺伝子発現、細胞周期調節、細胞骨格調節およびアポトーシスを含む細胞調節の重要な特徴である。例えばＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＨＯＳＰＨＯＲＹＬＡＴＩＯＮ（Ｍａｒｋｓ  Ｆ．ｅｄ．，１９９６）；Ｈｕｎｔｅｒ，”Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ−２０００  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ，”Ｃｅｌｌ，１００：１１３−１２７（２０００）を参照されたい。主として２種類の酵素（キナーゼおよびホスファターゼ）が可逆的タンパク質リン酸化を調節し、分子にリン酸基を付加したり、分子からリン酸基を除去したりしている。リン酸化反応はタンパク質機能の重要な特徴であり、したがってリン酸化タンパク質は、プロテオムが十分理解されるならば同定されるに違いない；しかし現在のところ、細胞および組織の調節循環に含まれる大きいタンパク質群を系統的に平行分析するための実際的方法がない。
Ｗｉｌｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＥＮＧ．Ｒｅｖ．１３：１９（１９９５）を参照されたい。
【０００４】
シグナル伝達は細胞調節のために重要なタンパク質リン酸化を含むプロセスの一例である。細胞外刺激因子がその認識した細胞表面受容体に結合した後、細胞タンパク質キナーゼの特殊な一組によってシグナル伝達が開始されることが多い。これらのキナーゼはその後標的分子をリン酸化し、改変された活性およびシグナルに対する連続的細胞反応をもたらす。Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ，”Ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：３０５−３１２（１９８６）。研究者は或るタンパク質がリン酸化タンパク質であるか否かを簡単に十分確認することはできない。さらにタンパク質上のリン酸化の部位を確認し、リン酸化の化学量を決定することが研究者には必要になる。セリン、スレオニンおよびチロシン  アミノ酸残基は真核細胞における最も一般的なリン酸化部位である。例えば  Ｇｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｔｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｓｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ”  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １５：４１７−４４０（１９９４）を参照されたい。例えばタンパク質リン酸化事象を理解する際、研究者は２つのレベルに焦点を合わせる。分析の第一のレベルはリン酸化に関与する分子の確認などを含む、あるタンパク質がリン酸化タンパク質であるかどうかの確認を必要とする。分析の第二のレベルはどのアミノ酸がリン酸化されるか、何種類のアミノ酸がリン酸化されるかの確認を要求する。本発明は両方の分析レベルのための材料および方法を提供する。本発明は幾つかのその他のリン酸およびチオリン酸含有物質、例えば炭水化物、ヌクレオチドおよび脂質のエステル類等を分析するための材料および方法も提供する。
【０００５】
現在、リンタンパク質類は、もっとも一般的には３２Ｐまたは３３Ｐを培養細胞内に導入後、またはタンパク質キナーゼによって非細胞部分に挿入後、オートラジオグラフィーによって検出される。Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ：Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．８０８：２３−４１（１９９８）：Ｇｕｙ，Ｇ．，Ｐｈｉｌｌｉｐ，Ｒ．およびＴａｎ，Ｙ．  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １５：４１７−４４０（１９９４）。このようなアプローチは組織培養サンプルなどの生物学的材料の限定された範囲に制限され、臨床的サンプルの分析は患者のインビボ標識化を必要とするため実現不可能である。放射性標識に代わる幾つかの方法もここ数年にわたって開発されてきた。
【０００６】
リンタンパク質類はイムノブロット法および免疫沈降法によっても検出できる。例えば  Ｓｏｓｋｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒｕｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｅｔａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８：１７５７−１７６４（１９９９）；Ｗａｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，”ＴｈｅインビトロａｎｄインビボＰｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｍａｐ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＭｕＳＫ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：４５８５−４５９０（２０００）を参照されたい。イムノブロット法は固相支持体上の非占有部位をタンパク質溶液でブロックした後、最も良く行われる。この方法は微量化学分析を妨害する。抗体の除去および染色は比較的苛酷な処理（すなわち６５℃まで加熱、０．１％ＳＤＳおよび１ｍＭ  ＤＴＴとのインキュベーション）を必要とする。これもその後の配列決定のためのタンパク質の使用および質量分析の際に問題となる。免疫沈降法では、抗−ホスホチロシン抗体だけが効果的分離を可能にする十分強固な結合をあらわす。ホスホチロシンに対する高品質の抗体が市販されているとはいえ、ホスホセリンおよびホスホスレオニン残基を特異的に認識する抗体には問題がかなり多くあり、アミノ酸配列に関して敏感であることが多い。これらの抗体の信頼性は、これら抗体とリンタンパク質類との相互関係の立体障害のために、疑問である。その上、抗体で検出する前にリンタンパク質が豊富にない場合、対象のタンパク質と同時に移行してくる関連のないタンパク質の存在が誤った陽性シグナルに導くかも知れない。そこで、イムノブロット法および免疫沈降法を使用するリン酸化タンパク質の同定はリン酸化チロシン残基を含むタンパク質に制限するのが効果的である。ＭｃＬａｃｈｌｉｎ  ＆  Ｃｈａｉｔ  （上記）参照。
【０００７】
或いは、リン酸化タンパク質を、発色性色素を使用して確認することができるが、成功率は制限される。カチオン性カルボシアニン色素”Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ”（１−エチル−２−［３−（３−エチルナフト［１，２−ｄ］チアゾリン−２−イリデン）−２−メチルプロペニル］ナフト［１，２ｄ］臭化チアゾリウム）はＲＮＡ、ＤＮＡ、リンタンパク質およびカルシウム−結合タンパク質を青色に染め、他方、非リン酸化タンパク質は赤く染まる。例えば  Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅ”  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：４３−５１（１９７３）；Ｈｅｇｅｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｐｈｏｓｖｉｔｉｎ）ｉｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｇｅｌｓ”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７８：３０８−３１１（１９７７）；Ｄｅｂｒｕｙｎｅ，”Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  Ａｌｋａｌｉ−Ｌａｂｉｌｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｌｋａｌｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌｓ”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１１０−１１５（１９８３）；”Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  Ｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ”Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  ４５：３２７−３５（１９７３）を参照されたい。Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌは、低特異性と低感度のために、リンタンパク質の検出には日常的には使用されていない。Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ  は一般的タンパク質色素であるクーマシーブリリアントブルーの感度の少なくも１０分の１の感度であり、３２Ｐ−オートラジオグラフィーまたは本特許に記載される諸技術に比べると感度が数桁低い。もう一つの発色性方法、ゲルコード（ＧｅｌＣｏｄｅ）（登録商標）リンタンパク質検出キット（ピアース・ケミカル社、ロックフォード、ＩＬ）はゲル中のリンタンパク質を検出するように設計されている；しかしこの方法には多くの制限がある。この方法によると、リンタンパク質はゲル中でセリンまたはスレオニンのリン酸エステルのアルカリ加水分解によって、遊離した無機リン酸のカルシウムイオンによる沈殿によって、不溶性リンモリブデン酸錯化合物の形成およびその後のメチルグリーン、マラカイトグリーンまたはローダミンＢなどの色素による前記錯化合物の可視化によって検出される［Ｃｕｔｔｉｎｇ  ＆  Ｒｏｔｈ（１９７３）に記載されている］。この染色法の検出感度はクーマシーブルー染色よりかなり低く、大体１００のホスホセリン残基を含むタンパク質であるホスビチンの８０−１６０ｎｇが市販キットによって検出される。染色法は非常に複雑で（７種類の試薬を含む）、アルカリ加水分解のためにはゲルを６５℃に加熱することが必要であり、それによってゲル基質は加水分解し、かなり膨張する。ホスホチロシン残基はアルカリ処理によって加水分解されないから、このアミノ酸残基のところでリン酸化されたタンパク質は、この方法による検出を逃れる。ＢＯＤＩＰＹ色素が反応性イミダゾール基に共有結合したリン酸選択的蛍光標識のための色素が、ペプシンリン酸化を検出するために開発された。米国特許第５５１２４８６号；Ｗａｎｇ  ＆  Ｇｉｅｓｅ，”Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｅｐｓｉｎ  ｂｙ  ＢＯ−ＩＭＩ”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３０：３２９−３３２（１９９５）を参照。
【０００８】
リンタンパク質の検出に加えて、リンタンパク質の化学的誘導体化および富化、その結果として錯体混合物からリンタンパク質を分離するための２種類の方法が存在する。例えば  Ｇｏｓｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｃｏｄｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔａｇ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｅｓ”Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５７８−２５８６（２００１）を参照されたい。第一の方法はシステイン残基を過蟻酸により酸化し、アルカリ加水分解してホスホセリンおよびホスホスレオニン残基からのリン酸基のβ−脱離を誘発し、エタンジチオールの付加、生成した遊離スルフヒドリル残基とビオチンとのカップリング、アビジンアフィニティークロマトグラフィーによるリンタンパク質の精製、溶出したリンタンパク質のタンパク質分解性消化、アビジン精製の第二ラウンドを行い、それから質量分析によって分析する（Ｏｄａ，Ｙ．，Ｎａｇａｓｕ，Ｔ．，Ｃｈａｉｔ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７９（２００１））。第一の方法はタグで置換されるリン酸基を除去するためにβ−脱離を利用する；これはビオチニル化チオール基で例示される。この際ペプチド類をアビジン樹脂上クロマトグラフィーによって分離できる。別の方法はサンプルのタンパク質分解性消化、システイン残基の還元およびアルキル化、ペプチド類のＮ−末端およびＣ−末端保護、シスタミンとのカルボジイミド縮合によるリン酸化残基におけるホスホルアミデート付加物の形成、ヨードアセテートに結合したガラスビーズ上にホスホペプチド類を捕獲、三フッ化酢酸による溶出および質量分析による評価（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７５−３７８（２００１））。これらの方法は時間がかかり、精製ホスホペプチドを必要とし、分離できるものが制限される。これらの両方法は試験タンパク質β−カゼインからの一リン酸化トリプシンペプチド断片を同定したが、両方とも四リン酸化ペプチド断片を検出することができなかった。
【０００９】
或いは、β−脱離／１，２−エタンジチオール付加、およびその後の修飾タンパク質の可逆的ビオチニル化によって、ホスホセリンおよびホスホスレオニン残基をＳ−（２−メルカプロエチル）システイニルまたはβ−メチル−Ｓ−（２−メルカプトエチル）システイニル残基に変換することに基づいて、タンパク質中のセリンおよびスレオニン  ホスホペプチドを特徴づけるための、化学的修飾およびアフィニティー精製を組み合わせた方法が明らかにされた。トリプシン消化後、ビオチニル化ペプチドをアフィニティー分離し、富化し、その後それらの構造を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／Ｍｓ）によって特徴づける。Ａｄａｍｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｗｉｔｈｉｎ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１５：１４８１−１４８８（２００１）を参照されたい。
【００１０】
蛍光検出法はプロテオミックスにおける大規模なタンパク質定量にはしばしば最善の解決であるようにみえる。しかし現在、複雑なサンプルからゲル分離されたリンタンパク質を特異的および可逆的に蛍光検出するための満足すべき方法はない。遊離スルフヒドリル基をヨードアセテートまたは過蟻酸塩によりブロックし、リン酸残基をアルカリ性β−脱離し、エタンジチオールを添加し、生成した遊離スルフヒドリル基を６−ヨードアセタミドフルオレッセインと反応させることによって、ホスホセリン残基を誘導体化し、フルオロフォア標識化できることが、毛細管電気泳動法でレーザー誘起性蛍光検出法によって証明された。同様な反応がタンパク質ミクロシーケンシング膜で行われた。しかしどの方法も直接ゲル中でリンタンパク質を検出するには適していないことが判明した。この方法の一つの問題は、セリン残基からのリン酸基の脱離と生成したデヒドロアデニン残基へのエタンジチオールの付加をペプチド主鎖の加水分解なしに行うためには、上記塩基とエタンジチオールとの間にデリケートなバランスがなければならないことである。
【００１１】
機器に基づく数種の方法もタンパク質リン酸化の測定のために使用できる。例えば３１Ｐ−ＮＭＲ、質量分析［例えば、Ｒｅｓｉｎｇ  ＆  Ａｈｎ，”Ｐｒｏｔｅｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８３−２９−４４（１９９７）；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，”Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ”  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）。Ａｆｆｏｌｔｅｒ，Ｍ．Ｗａｔｔｓ，Ｊ．，Ｋｒｅｂｓ，Ｄ．，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２３：７４（１９９４）；Ｌｉａｏ，Ｐ．，Ｌｅｙｋａｍ，Ｊ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．，Ｇａｇｅ，Ｄ．，Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１９：９（１９９４）；Ｏｄａ，Ｙ．，Ｈｕａｎｇ．Ｋ．，Ｃｒｏｓｓ，Ｆ．，Ｃｏｗｂｕｒｎ，Ｄ．，Ｃｈａｉｔ，Ｂ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６５９１（１９９９）を参照］およびタンパク質シーケンシングなど。非リン酸化タンパク質の質量をリン酸化タンパク質のそれに比較することによって完全なリン酸化タンパク質の分子量を得るために質量分析が使用されてきた。例えば  ＭｃＬａｃｈｌｉｎ  ＆  Ｃｈａｉｔ，”Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｏｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：５９１−６０２（２００１）を参照されたい。これらの方法は、研究者が両方のタンパク質を多量に精製しなければならないため、制限される。これらの方法はタンパク質およびペプチドのリン酸化状態を正確に特徴づけるが、その一方でこれらはリン酸化基質の高処理量スクリーニングには適さない。これらの方法はリンタンパク質がオートラジオグラフィーまたは抗ホスフォチロシン抗体を用いるイムノブロット法によって確認された後に行われるのが普通である。１５Ｎ−豊富化および１４Ｎ−豊富化培地に異なる細胞集団を培養することにより、質量分析によって２種類のサンプル中のリンタンパク質の相対的豊富さを直接定量する方法が最近導入されたとはいえ、このような方法の直線的動的範囲は１０倍の範囲に過ぎないことがはっきりと証明された。質量分析に関係するイオン抑制現象が、このような技術による異なるリンタンパク質の化学量論的比較を妨害する。
【００１２】
分子上のリン酸化部位（１つまたは複数）の分析のために、リン酸付着部位および化学量論のより詳細な分析には、対象のリンタンパク質のペプチド断片の研究が必要になることが多い。このような断片類は、トリプシンのようなプロテアーゼでリンタンパク質を消化することによって生成するのが普通である。しかしタンパク質のタンパク質分解性消化物の質量分析がタンパク質配列を完全に網羅するのは稀であり、対象領域が検出されずに終わることが多い。その上、タンパク質のリン酸化は準化学量論的であり、例えばこれらのリンタンパク質は対象のタンパク質からのその他のペプチド類に比べてより少量存在する。そのためリンタンパク質の同定および特徴づけは、質量分析の前にリンタンパク質を富化する高度に選択的な方法によって著しく改善される。リンタンパク質の構造または質量を化学的に変化させない試薬を使用して、リンタンパク質を検出することが特に有用である。
【００１３】
現在、複雑な混合物からホスホペプチドを選択的に富化することが、ＩＭＡＣとして知られる固定金属アフィニティクロマトグラフィによって行われている。この方法を使用すると、Ｆｅ３＋またはＧａ＋３のような金属イオンが、ペプチドまたはタンパク質の複雑な混合物の添加前に、キレート化支持体に結合する。例えば  Ｐｏｓｅｗｉｔｚ  ＆  Ｔｅｍｐｓｔ  ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｇａｌｌｉｕｍ（ＩＩＩ）Ａｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ”  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７１：２８８３−２８９２（１９９９）を参照されたい。カラムに結合したホスホペプチド類は高いｐＨまたはリン酸緩衝液の使用によって遊離することができる；ただし後者の工程では、質量分析の前にさらに脱塩工程が必要である。イミノ二酢酸およびニトリロ三酢酸キレータ類を有する樹脂が知られており、市販されている。例えば  Ｎｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｒｉｎｅ  ７５３  ｉｎ  ＣＦＴＲ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｔａｌ−Ｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ  ａｎｄ  Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６：２４３６−２４４５（１９９７）を参照されたい。しかし、現在の方法を使用すると、カラムに結合しないホスホペプチドの喪失（低親和性）、リン酸化ペプチド類のその後の溶出が困難、および固定金属イオンに対する親和性を有する非リン酸化ペプチドからのバックグラウンド（低特異性）などを含む幾つかの複雑な事態が生ずる。
【００１４】
分離したペプチド類の質量分析に基づく検出およびＩＭＡＣ支持体に結合するホスホペプチドの直接の  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析が明らかにされた。Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｅｔａｌ−Ｉｏｎ  Ｂｅａｄｓ  ｂｙ  Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，”  Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｓｔｒｏｍ．１１：２７３−２８３（２０００）を参照されたい。ＩＭＡＣは  ｏｎ−ｌｉｎｅ  で質量分析機器に直接連結し、またはＨＰＬＣおよび毛細管電気泳動（ＣＥ）などの分離法と共に使用して、ホスホペプチドを検出および分析する。
【００１５】
本発明は、カチオン性遷移金属、および金属キレート化部分および化学的部分、典型的には反応基またはフルオロフォアのような標識、またはそれらの組み合わせなどの化合物を使用してリンタンパク質およびホスホペプチド類を検出することによって現在の方法の制限を克服する。一価および二価金属カチオンに選択的に結合するポリカルボキシレート結合部位を使用するキレート化部分は種々あり、これらは蛍光カルシウムイオン−インジケータとして用いられることが多い。これらのインジケータの例は、例えばキン−２、フラ−２、インド−１（米国特許第４６０３２０９号）；フルオ−３およびロド−２（米国特許第５０４９６７３号）およびＦＵＲＡ  ＲＥＤ（登録商標）（米国特許第４８４９３６２号）である。カルシウムイオンに選択的であるＢＡＰＴＡベースのインジケータのファミリは  ＨＡＵＧＬＡＮＤ、ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（第９版、ＣＤ−ＲＯＭ，２００２年９月）に記載されている。ＢＡＰＴＡベースの金属キレータ類の例は米国特許第５７７３２２７号；第５４５３５１７号；第５５１６９１１号；第５５０１９８０号；第６１６２９３１号；および第５４５９２７６号にも記載されている。
【００１６】
遊離カルシウム濃度のインジケータは蛍光色素への選択的カルシウム結合に基づく。ＢＡＰＴＡ化合物類がＥＧＴＡキレータの同族体としてカルシウムなどのある種の二価カチオンに結合することは公知であるが、ＢＡＰＴＡ化合物類はほとんど全ての無機多価カチオンにも、カルシウムイオンに対するその化合物の親和性より高いかより低い親和性をもって結合することが知られている。生物学的細胞におけるカルシウム測定のためにそれらが選択的であり有用であるのは、生物系にこれらその他の多価カチオンが一般的に存在しないかまたは存在しても少ないことによる。ポリカチオン類のＢＡＰＴＡベースのインジケータ、例えば本発明に使用できるガリウムおよび同様な金属類などの親和性および選択性は、ｐＨ、溶媒組成物、イオン強度およびその他の実験変数のシフトによって変化し得る。カチオン選択性および親和性のこのシフトは、リン酸化標的の検出および分離の両方を含む開示された発明の全ての局面において重要である。
【００１７】
本発明はリン酸化タンパク質を同定し、分離し、分析し、定量するための現在開示されている方法の制限および欠点を克服し、それによって、リンタンパク質を検出し、分離し、その後に分析するための迅速かつ有効な高処理法の長期にわたる要求を幾らか満たす方法、化合物類および組成物類を提供する。本発明はリン酸をたった一つしか含まないホスホペプチド類およびリンタンパク質を、多数の工程またはサンプルの前処理を必要としない簡単な方法で正確に同定することができる。重要なことは、本発明がリン酸化プロテオムを正確に確認するための手段を提供する最初に知られた方法であり、本発明はリン酸化の増加を定量的に測定することができるということである。本発明はプロテオムにおける新規のリン酸化タンパク質を同定する重要なツールである。上記の方法は、特に総タンパク質の検出のための試薬と組み合わせて用いる際に、類を見ない定量的特性を有する。加えて、以下に記載するように、本発明の材料および方法はリン酸化タンパク質の検出および／または分離に制限されるものではない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の概要）
本発明はリン酸化標的分子を特異的に検出し、分離しおよび／または定量するためのリン酸結合化合物および方法を提供する。これらの化合物は、穏やかな酸性環境中に存在する場合、および適切な金属イオンの存在下において、例えばゲルに固定され、または固体または半固体基質上に吸着し、または実質的水溶液に溶解または懸濁しているリン酸化標的分子上のリン酸基に選択的に結合し、三成分錯体を形成する。
【００１９】
上記のリン酸結合化合物類は式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、その際Ａは化学的部分であり、Ｌはリンカー、Ｂは金属キレート化部分、ｍは１から４までの整数、ｎは０から４までの整数である。理論によって束縛されるものではないが、これら特殊なリン酸結合化合物類の金属キレート化部分は、三成分錯体を形成する反応において三価金属イオンおよび標的分子上のリン酸基に同時に結合する。この方法で、金属イオンはリン酸基と金属キレート化部分との間に架橋を形成し、その際化学的部分Ａはイオン性相互作用によってリン酸標的分子に効果的に結合する。こうして金属キレート化部分が、適切な条件下ではリン酸化標的分子に対して同時に親和性を有する金属イオンに結合することが本発明の要求である。
【００２０】
本発明の組成物および方法の有用性は、主として、上記化学的部分Ａがリンカーによって金属キレート化部分に共有結合し、本発明のリン酸結合化合物を形成する結果である。一般的には化学的部分Ａは標識または反応基である。
【００２１】
検出の目的で、Ａは通常、色素、発色団およびフルオロフォア（蛍光団）などの色素、ハプテン類、酵素類または放射性同位元素などの検出可能の標識である；ただし本発明の範囲内に入る広範囲の種類のその他検出可能標識も知られている。リン酸含有標的を分離する目的で、Ａは一般的には、アガロースなどのポリマー、表面、磁気粒子またはミクロスフェアに結合する標識または反応基である。金属キレート化部分と結合するポリマー、および金属イオンは、リン酸化標識分子と可溶性または不溶性三成分錯体を形成するように選択される。このような三成分錯体は複雑な混合物からリン酸化標的を選択的に分離するために、また、種々の検出スキームのコンポーネントとして特に有用である。本発明のその他の局面において、Ａは三成分錯体の溶解度を変える化学的部分であり、或いはアミン−反応基を含み、ポリマー類およびリン酸標的分子を含むアミン含有分子と共有結合を形成する。
【００２２】
本発明の”結合溶液（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）”（真の溶液、懸濁液、分散液およびそれらの固定変形体を含むと定義される）は式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有するリン酸結合化合物、選択された金属イオンを含む塩、および酸を含む。結合溶液または懸濁液の好ましい塩および金属イオン組成物および濃度は、ある程度、上記化合物の金属キレート化部分に依存する。特に有用な結合溶液はリン酸結合化合物のＢＡＰＴＡ−ベースのキレート化部分とガリウム塩との組み合わせである。予想外に、三価ガリウムイオンがＢＡＰＴＡ部分およびリン酸化標的部分に同時に結合し、おだやかな酸性環境が存在する場合にのみ有用な親和性を有する三成分錯体を形成することを我々は確認した。しかし、我々はＤＴＰＡ、ＩＤＡおよびフェナントロリンのようなその他の金属キレート化部分もガリウム三価イオンおよびリン酸基に同時に結合することを明らかにした。このため、結合溶液の一つの要求事項は酸の存在であり、その際結合溶液は約３ないし約６のｐＨを有するのが好ましく、一般的にはｐＨは約３ないし約４である。このｐＨを得るために使用される酸の性質は不適切であるようにみえる。しかしリン酸、ホスホン酸またはポリリン酸はこのｐＨを得るために使用すべきではない。なぜならばこれらは三成分錯体の安定性を低下させるからである。一般的にリン酸結合化合物は結合溶液または懸濁液では遊離している；しかしリン酸結合化合物を固体または半固体基質上に固定することができ、金属イオンおよび酸が加えられると結合溶液が形成され、サンプル中にリン酸化標的が存在する場合はその後に本発明の三成分錯体を形成する。
【００２３】
本発明の方法は、サンプルを、リン酸結合化合物、金属イオンおよび酸を含む結合溶液と接触させ、そのサンプルと上記結合溶液とを十分な時間インキュベートして上記結合溶液の化合物を前記リン酸化標的分子と結合させ、それによって前記リン酸化標的分子は三成分錯体を形成することを含む。
【００２４】
検出の目的のために、一般的には、上記化合物を含む生成した三成分錯体を照射し、化学的部分Ａの検出可能の光学特性を測定し、それによってリン酸化標的分子の存在を検出する。リン酸化標的分子は溶液中で、または固体または半固体基質上に固定されて検出できる。本発明の組成物および方法を使用して、リン酸化および非リン酸化標的分子の複雑なサンプル中に存在するリン酸化標的分子を検出し、または標的分子上のリン酸基の数の変化を検出することができる。リン酸化度の差は、生体高分子のリン酸化度の固有の差によることがあり（これはタンパク質の折りたたみにおける差を生じ得る）、または疾病状態のようなインビボプロセスによることもあり、または特異的キナーゼおよびホスファターゼを確認するためのインビトロアッセイと関連して生ずることもある。
【００２５】
或いは、この方法を利用して溶液からリン酸化標的分子を選択的に分離する際に、錯体の可視化は必要ないかもしれない。リン酸化標的分子を分離するために、三成分錯体を沈殿させ、固定し、クロマトグラフィーまたは電気泳動法によって、または磁場によって分離するかまたは溶液中にそのままにすることができる。ある場合には、有機抽出を使用して金属キレート化部分をリン酸化標的分子から分離することができる。三成分錯体が沈殿するかまたはそれ以外に固定される際には、リン酸化標的分子は非リン酸化標的分子およびサンプル中のその他の成分からアフィニティクロマトグラフィーによって、水、有機物または混合水／有機物洗浄溶液で単に洗うことによって分離される。ある場合には、抽出されたリン酸化標的分子を基質上に固定したままでさらに分析することが有益である。標的分子を液体クロマトグラフィー／質量分析、電気泳動分離法によって、結合した標的分子をその標的分子のいずれかの部分に対する抗体によって検出することによって、またはその他の種々の方法によってリン酸化標的分子を分離することは、その後の標的分子の分析のために有用である。より詳細に述べれば、リン酸化標的分子の分離は、元のサンプルの妨害成分を除去することになり、サンプルのその後の分析を簡単にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
１．定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明が特異的組成物または処理工程に制限されないことを理解すべきである。上記特異的組成物または処理工程は変化し得る。本明細書および添付の請求項に使用される単数型の”ａ””ａｎ”および”ｔｈｅ”は、文脈が明らかに記載していない限り、複数の対象物も含むことに注意しなければならない。例えば、”ａ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ”は複数のタンパク質を含み、”ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ”は複数の化合物を含むなどである。
【００２７】
特に別の定義がなされない限り、ここに使用する全ての技術的および科学的用語は本発明が関連する分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の目的のために下記の用語はここに記載のように定義される。
【００２８】
ここに使用される用語”アフィニテイ（親和性）”は２分子、例えば金属キレート化化合物と金属イオン、の結合相互作用強度である。
【００２９】
ここに使用される用語”アルキル”は１ないし２０の炭素原子、一般的には約１ないし約１０の炭素原子を含む直鎖、枝分かれ鎖または環状炭化水素鎖（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソープロピル、シクロプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、アダマンチル、ノルアダマンチルなど）であって、炭素原子を介して上記化合物に付着する鎖である。８個以下の炭素原子を有する直鎖、枝分かれ鎖、または環状炭化水素鎖は本明細書では”低級アルキル”とも言う。炭化水素鎖は飽和していてもよいし、不飽和度が１以上でもよい、すなわち１個以上の二重または三重結合を有するものでもよい。
【００３０】
用語”アミノ”または”アミン基”は−ＮＲ’Ｒ”（またはＮＲＲ’Ｒ”）であり、ここでＲ、Ｒ’およびＲ”は水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群から独立的に選択される。置換アミンは、Ｒ’およびＲ”が水素以外のものであるアミン基である。一次アミノ基において、Ｒ’およびＲ”は水素であり、二次アミノ基においては、両方でなくＲ’またはＲ”のどちらかが水素である。さらに、用語”アミン”および”アミノ”は、窒素のプロトン化および第四級化変形体、例えば基−ＮＲＲ’Ｒ”およびその生物学的適合性アニオン性対イオンなど、を含む。
【００３１】
ここに使用される用語”アリール”は、２０以下の炭素原子を有する環状芳香族炭素鎖、例えばフェニル、ナフチル、ビフェニル、およびアントラセニルを言う。アリール基の１個以上の炭素原子が例えばアルキル；アリール：ヘテロアリール：ハロゲン；ニトロ；シアノ；ヒドロキシル、アルコキシル、またはアリールオキシ；などで置換されていてもよい。
【００３２】
ここに使用される用語”水溶液”は、主として水である溶液で、水の特徴を有する溶液に関係する。水溶液が水の他に溶媒を含む場合、水が主たる溶媒であるのが普通である。
【００３３】
ここに使用される用語”ＢＡＰＴＡ”は、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸またはその同族体、誘導体、環融合変形体および共役化合物およびそれらの全金属および非金属塩、部分的塩および水加物である金属キレート化化合物であり、米国特許第４６０３２０９号；第４８４９３６２号；第５０４９６７３号；５４５３５１７号；第５４５９２７６号；第５５１６９１１号；第５５０１９８０号；第６１６２９３１号および第５７７３２２７号（上記）に開示されるあらゆる対応する化合物類を含める。一般的に使用する場合、”ＢＡＰＴＡ”は酸素原子で終わるＣ１−Ｃ３炭化水素架橋、例えばメチレンジオキシ（−ＯＣＨ２Ｏ−）、エチレンジオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）またはプロピレンジオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）架橋基によって結合する２個のベンゼン環を言う；この際ベンゼン環は、その化合物の金属イオン結合親和性、溶解度、化学的反応性、スペクトル特性またはその他の物理的特性を調節する１個以上の置換基によって任意に置換される。本発明の好ましい実施形態において、”ＢＡＰＴＡ”は、適切な三価金属イオンおよび酸と共にリン酸化標的分子を三成分錯体として検出または分離する化学的部分Ａに、共有結合する。ＢＡＰＴＡ誘導体はさらに、ＢＡＰＴＡ構造のベンゼン環が追加的芳香族または複素環によって置換されるかまたは前記芳香族または複素環と融合している化合物類も含む。
【００３４】
ここに使用される用語”ビオチン”は非制限的に置換および未置換ビオチン、およびそれらの同族体および誘導体、並びにカプロイルアミドビオチン、ビオサイチン、デスチオビオチン、デスチオビオサイチン、イミノビオチンおよびビオチンスルホンの置換および未置換誘導体を含む任意のビオチン誘導体を言う。
【００３５】
ここに使用する用語”ビオチン−結合タンパク質”はビオチンに選択的に結合する任意のタンパク質であり、非制限的に、ビオチンに対する抗体、置換または未置換アビジン、およびそれらの同族体および誘導体、並びに抗体類、ストレプトアビジン、フェリチンアビジン、ニトロアビジン、ニトロストレプトアビジン、ニュートラアビジン（登録商標）アビジン（中性に近い等電点を有するデ−グリコシル化修飾アビジン）およびそれらの色素−、酵素−またはポリマー−修飾変形体およびビオチン−結合タンパク質の固定型を含む。
【００３６】
ここに使用される用語”緩衝”は化学的物質の付加または離脱に対する溶液の酸性または塩基性の変化を最小にするように作用する系を言う。
【００３７】
ここに使用される用語”カルボニル”は官能基−（Ｃ＝Ｏ）−を言う。しかしこの基の代わりに同様な電子的および／または立体的特徴を有するその他の公知の基、例えばチオカルボニル（−（Ｃ＝Ｓ）−）；スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）−）；スルホニル（−ＳＯ２−）、ホスホニル（−ＰＯ２−）であってもよい。
【００３８】
用語”カルボキシ”または”カルボキシル”は基−Ｒ’（ＣＯＯＲ１３）であって、ここでＲ’がアルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリール、または置換ヘテロアリールである前記基である。Ｒ１３は水素または塩である。
【００３９】
ここに使用される用語”化学的部分Ａ”または”化学的部分”は、式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）によって金属キレート化化合物に共有結合し、本発明のリン酸結合化合物を形成する部分を言う。”化合物部分Ａ”は、リン酸化標的分子の検出および分離を容易にするために使用される以下に定義する標識を含む。用語”化合物部分Ａ”は一般的には標識である天然または合成部分であるが、非制限的に、反応基、一般的には、例えばアガロースのようなポリマー、アクリルアミド、ミクロ粒子類、抗体または抗原などのタンパク質、リン酸標的分子、および当業者に公知のものを含めるリガンドを、本発明のリン酸結合化合物に共有結合させる機能を有するスクシンイミジルエステルのようなアミン反応基でもよい。さらに化学的部分Ａは、本発明の金属キレート化部分でもよい。一般的に金属キレート化部分が本発明のリン酸結合化合物に結合する場合、それは反応基によって行われるが（共役結合反応）、反応基を用いない場合には金属キレート化部分は共役結合し、リンカーによって本発明のリン酸結合化合物に結合する。
【００４０】
ここに使用される用語”錯体”とは２つ以上の分子の例えば金属イオン−キレーターおよびタンパク質と錯化した（すなわちタンパク質に非共有結合した）金属との、一般的には非共有結合による結合、または例えば抗体と抗原、酵素と酵素基質、リガンドと受容体（例：ビオチンとアビジン）、核酸とその相補的鎖、タンパク質と、最初のタンパク質に親和性を有する別のタンパク質または核酸との結合などを言う。
【００４１】
ここに使用される用語”検出可能の反応”とは、観察によって、または機器によって直接または間接に検出できるシグナルの発生または前記シグナルの変化を言う。一般的には、検出可能の反応は、波長の分布パターンまたは吸光度または蛍光度の変化、または光散乱、蛍光寿命、蛍光分極における変化、またはこれらのパラメーターの組み合わせを起こす光学的反応である。或いは検出可能反応は、色素が本来蛍光性であり、金属イオンまたはリン酸化標的分子に結合した際にシグナルの変化を生じない場合のシグナル発生である。或いは検出可能反応は、リン酸化標的分子を含む本発明の三成分錯体が形成される結果として、色、蛍光、放射能または、検出可能標識のその他の物理的特性などのシグナルが、例えばゲル中、ブロット、またはアレイ上、ミクロプレートのウェル中、微量流体チェンバ内または微粒子上でサンプルの一部に立体的に局所化される結果である。
【００４２】
ここに使用される用語”直接的に検出可能”とは、化学的修飾または基質の添加を必要とすることなく、観察、機器、またはフィルムによって直ちに検出できる検出可能標識から発生する検出可能標識またはシグナルの存在を意味する。
【００４３】
ここに使用する用語”ＤＴＰＡ”とは、金属キレート化部分ジエチレントリアミン五酢酸またはその誘導体および米国特許第４９７８７６３号および第４６４７４４７号に開示される対応する任意の部分を言う。ＤＴＰＡは式（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）ＺＮ［（ＣＨ２）ＳＮ（ＣＨ２ＣＯ２）Ｒ１３］Ｔ（ＣＨ２）ＳＮ（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）Ｚによってあらわされ、式中リンカーはメチン炭素または窒素原子に結合し、Ｚは１または２、Ｓは１ないし５、Ｔは０ないし４、Ｒ１３は水素または塩である。
【００４４】
ここに使用される用語”色素（ｄｙｅ）”は観察できる検出可能シグナルをもたらす光を発生する化合物である。”色素”は、非制限的に色素（ｐｉｇｍｅｎｔｓ）、フルオロフォア、化学ルミネッセント化合物、ルミネッセント化合物および発色団を含める蛍光−および非蛍光化合物を含む。ここに使用される用語”フルオロフォア”は、本来蛍光性であるか、生物学的化合物に結合し、または酵素による代謝によって蛍光に変化を示す、すなわち蛍光発生性である組成物を言う。フルオロフォアを置換して、そのフルオロフォアの溶解度、スペクトル特性または物理的特性を変化させることができる。本発明のフルオロフォアはスルホン化されていない。当業者には多くのフルオロフォアが公知であり、非制限的にベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、インドール、ベンザゾール、ボラポリアザインダセンおよびキサンテンが含まれる。後者はフルオレッセイン、ローダミンおよびロドール、並びに、ＲＩＣＨＡＲＤ  Ｐ．ＨＡＵＧＬＡＮＤ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＴ  ＰＲＯＢＥＳ  ＡＮＤ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ（９版、ＣＤ−ＲＯＭを含む、２００２年９月）に記載されるその他のフルオロフォアを含む。
【００４５】
ここに使用される用語”酵素”は生体によって、または天然タンパク質分子の化学的修飾によってもたらされ、反応の完了時にそれ自体が破壊または変化することなくその他の基質の化学反応を触媒するタンパク質分子を言う。その他の基質の例としては、非制限的に、化学ルミネッセント、発色性および蛍光発生性物質またはタンパク質ベースの物質がある。
【００４６】
ここに使用される用語”ハロゲン”は置換基フルオロ、ブロモ、クロロおよびヨードおよびこれらのハロゲンの組み合わせおよび任意のハロゲンの複数のコピーを含む化合物を言う。
【００４７】
ここに使用される用語”ヘテロアリール”は、１個以上の炭素原子が非炭素原子、特に窒素、酸素または硫黄によって置換された、上に定義された任意の基である。
【００４８】
ここに使用される用語”ＩＤＡ”は式−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）２を有するイミド二酢酸金属キレート化部分であり、上記式中、Ｒ１３は水素または塩であり、リンカーは、フルオロフォアの芳香族環に結合する単一の共有結合でないという条件で窒素原子に結合している。
【００４９】
ここに、対象ペプチド、タンパク質およびタンパク質錯体に関連して使用される用語”分離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）”は、通常、タンパク質または錯体が内生的に見いだされる例えば細胞性混合物または媒質中に、上記ペプチド、タンパク質または錯体と混合して存在する混入した非リン酸化ペプチド、タンパク質またはその他の関連標的分子が実質的に排除されたペプチド、タンパク質またはタンパク質三成分錯体のプレパレーションについて言う。それに加えて、幾つかの実施形態において”分離された”は、細胞性混合物からペプチド、タンパク質または錯体を分離するために使用する本発明の試薬類をさらに分離することも言う。したがって、分離されたタンパク質またはタンパク質錯体は、サンプルのその他の成分から分離され、任意に、”混入”し、研究中およびその後の質量分析などによる分離中の錯体の操作を妨害するのが一般的である本発明のリン酸結合化合物（重合体基質を含む）から分離される。用語”分離された”は、例えばゲルまたはアレイ上の種々の物理的インジケータによって、またはカラムまたは毛細管中のディテクタを種々の時間に通過することによって、場所的または時間的に互いに分離されるリン酸化標的分子類にも言える。
【００５０】
ここに使用される用語”キット”は関連成分類、典型的には１種類以上の化合物または組成物のパッケージセットであって、任意に緩衝剤、分離用媒質、標準、ソフトウェアおよびその他の成分類を含むパッケージセットである。
【００５１】
ここに使用される用語”標識”は本発明の金属キレート化剤と組み合わせてリン酸化標的分子の検出および分離を容易にするために使用される検出可能部分である。典型的標識には、直接観察または測定でき、または間接的に観察または測定できる標識があり、例えばフルオロフォア、放射能および酵素リポータ標識などである（Ｐａｔｔｏｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２００２）７７１：３−３１；Ｐａｔｔｏｎ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２０００）２１：１１２３−１１４４）。このような標識は、非制限的に、放射計測デバイスで測定できる放射性標識；肉眼で観察でき、または分光光度計で測定できる顔料、色素またはその他の発色団；スピン標識分析器で測定できるスピン標識法；および色素によって吸収される光で励起することによって可視化され、または標準的蛍光計または画像化システムで測定することができる蛍光標識（フルオロフォア）（この場合は放出シグナルが適切な分子付加物の励起によって生成する）、例えば光学的特性または光散乱特性によって検出できる金属粒子、例えば金または銀粒子または金属棒コードなどを含む。上記標識は、シグナル化合物の化学的修飾によって放出シグナルが生成する化学ルミネッセント物質；金属含有物質；またはシグナルの酵素依存性二次的生成を起こす例えば無色物質から着色物質を形成するような酵素でもよい。用語”標識”は、標識化分子に選択的に結合でき、その後加えられる標識化分子を使って検出可能シグナルを生成することができる、”タグ”、ハプテンまたはその他のリガンドでもよい。例えば、タグとしてビオチンを使用し、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のアビジンまたはストレプトアビジン共役体を使用して上記タグに結合させ、その後発色性基質（例えばテトラメチルベンチジン）または蛍光発生性基質を使用してＨＲＰの存在を検知することができる。多数の標識およびタグおよびそれらを検出するための方法が当業者には公知であり、非制限的に、粒子、フルオロフォア、ハプテン、酵素およびそれらの発色性、蛍光発生性および化学ルミネッセント基質および上記ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫに記載されたその他の標識を含む。
【００５２】
ここに使用される用語”リンカー”または”Ｌ”は、標識を標識化化合物の金属キレート化部分に共有結合させるＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群から選択される１−３０個の非水素原子を組み込んだ単一共有結合または一組の安定共有結合を言う。
【００５３】
ここに使用される用語”金属キレータ”または”金属キレート化部分”は、金属イオンと結合してキレート環構造を形成する化学的部分を言う。本発明の目的のために、金属キレータは金属イオンに親和性を有し、上記金属イオンはおだやかな酸性条件下ではその金属キレータおよびリン酸標的分子に同時に親和性を有する。金属キレート化部分の例はＢＡＰＴＡ、ＩＤＡ、ＤＴＰＡおよびフェナントロリンである。金属キレータは、その金属キレータがスルホン化されていないという条件で、その化合物のイオン結合親和性、溶解度、スペクトル特性またはその他の物理的特性を調節する置換基によって任意に置換される。
【００５４】
ここに使用される用語”金属イオン”は、ｐＨ３ないし６で標的分子のリン酸基および本発明の金属キレート化化合物に同時に親和性を有する三価金属イオンであって、上記リン酸結合化合物および上記リン酸化標的分子の三成分錯体を形成するために使用できる三価金属イオンを言う。このような金属イオンは非制限的にＡｌ３＋、Ｆｅ３＋、およびＧａ３＋を含む。本発明の目的のために、金属イオンは金属キレート化部分および標的分子のリン酸基の両方に同時に親和性をもっていなければならず、こうして金属イオンは、金属キレート化部分に、金属イオンがなければあらわれない標的分子のリン酸基に対する親和性を与える。
【００５５】
ここに使用される用語”リン酸結合化合物”または”結合化合物”は式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）ｎであらわされる化合物であって、式中、Ａは化学的部分、Ｌはリンカー、Ｂは金属キレート化部分、ｍは１ないし４の整数、ｎは０ないし４である整数である化合物を言う。金属キレート化部分が標的分子上のリン酸基に間接的に結合する場合、これらの化合物は標識を効果的に、しかし非共有結合でリン酸化標的分子に結合させる。
【００５６】
ここに使用される用語”リン酸化標的分子”または”リン酸標的分子”は、各々単一エステル結合によってこのような分子に結合する１個以上のリン酸またはリン酸類似部分、または無機リン酸を有する分子を言う。リン酸類似体には非制限的に、チオリン酸、ボラリン酸、ホスホルアミド、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよびホスホロフルオリデートがある。リン酸化標的分子は非制限的にリンタンパク質、ホスホペプチド、リン脂質、ホスホグリカン、リン炭化水素、ホスホアミノ酸、ピロリン酸および無機リン酸およびそれらのチオリン酸類似体を含む。最もよく知られているリン酸化合物およびそれに続くリン酸化標的分子は次の３群のうちの１つに分類される；１）個々のリン酸基（例えばタンパク質またはペプチド上の無機リン酸またはリン酸基（ＰＯ３））；２）多重結合リン酸基（例えばピロリン酸またはＡＴＰのようなヌクレオチド）；または３）架橋リン酸基（例えば核酸）。本発明の目的のためには、リン酸化標的分子は第３群の分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを含まない。一般的にはリンタンパク質およびホスホペプチド類はチロシン、セリンまたはスレオニンアミノ酸残基上で翻訳後にリン酸化される。ペプチドおよびタンパク質のその他のリン酸化アミノ酸残基には１−ホスホ−ヒスチジン、３−ホスホ−ヒスチジン、ホスホ−アスパラギン酸、ホスホ−グルタミン酸があり、比較的一般的でないのはＮε−ホスホ−リジン、Ｎω−ホスホ−アルギニンおよびホスホ−システインである（Ｋａｕｆｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１：１９４−１９９；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ．Ａ  ８０８：２３−４１）。このように、リン酸化タンパク質またはペプチドはこれらアミノ酸残基を少なくも１つは有するのが普通である。リン酸化標的分子は、脂質または炭水化物などのその他の非ペプチド領域を組み込んだリン酸化タンパク質、例えばリポタンパク質およびリポ多糖も含む。それに加えて、タンパク質の脂質または炭水化物残基は、タンパク質またはペプチドのチロシン、セリンまたはスレオニンアミノ酸残基の代わりに、またはこれらと組み合わせてリン酸化され得る。例えばホスホマンノース修飾−またはＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸修飾タンパク質などである。その他の修飾は、ピリドキサールリン酸とリシンのイプシロン−アミノ基とのシッフ塩基、およびセリン残基のＯ−パンテテインを含む。ヌクレオチド三リン酸のガンマリン酸も、本発明の方法を用い、この処理法によって検出できる光標識タンパク質およびペプチドを作ることによって検出できる。本発明の目的では、リン酸化標的分子はリン酸化脂質および炭水化物を含む。
【００５７】
用語”タンパク質”および”ポリペプチド”は一般的な意味でここに用いられ、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを含む。用語”ペプチド”は１００未満のアミノ酸残基、一般的には１５未満のアミノ酸残基を有するポリペプチドを言う。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学的類似体であるアミノ酸ポリマーに適用され、天然に発生するアミノ酸ポリマーにも適用される。上記ペプチドまたはタンパク質をさらに、色素類、ハプテン類、放射性同位体類、天然および合成ポリマー類（ミクロスフェアも含む）、ガラス、金属類および金属性粒子、タンパク質および核酸などその他の部分に共役結合させ、または錯化させてもよい。
【００５８】
ここに使用される用語”サンプル”は上に定義したような天然または合成のリン酸化標的分子を含む任意の物質、またはリン酸標的分子またはリン酸化標的分子と直接相互作用する例えば酵素などの成分類を含む任意の物質を言う。一般的には、サンプルは精製または半精製リン酸化標的分子および内因性ホスト細胞タンパク質を含む。リン酸化標的分子は合成で作ることができ、または細胞（非制限的に、真核および原核細胞）、細胞抽出物、細胞ホモジネート、天然または組換え分子としての非細胞成分から、精製または半精製の形で得ることができる。或いは、リン酸化標的分子は組織ホモジネート、体液またはその他の生物学的液体、または合成タンパク質から得られる；これらは全て、本発明のサンプルを構成する。サンプルは水溶液または実質的な水溶液、生育可能の細胞培養物でもよいし、または固体または半固体表面、例えばポリマーゲル、膜、ミクロ粒子、光学繊維またはミクロアレイ上に固定されていてもよい。さらに、ここに使用される”サンプル”は、キナーゼまたはホスファターゼの基質、またはリン酸化標的分子に結合する分子（それはリン酸化されていてもリン酸化されていなくてもよい）も意味する。このようにして、サンプルは、リン酸−およびリン酸化標的分子と相互作用する成分類を含み、特にリン酸化標的分子に対する抗体類または標的分子のその他の領域に対する抗体類を含み、または例えばビオチニル化標的分子とアビジン誘導体との錯体類を含む。
【００５９】
ここに使用される用語”三成分錯体”は、リン酸結合化合物、本発明の三価金属イオンおよびリン酸標的分子を同時に含む組成物であって、その際上記金属イオンは上記化合物の金属キレート化部分および上記分子のリン酸基の両方に親和性を有し、金属イオンはこれら２分子間に架橋を形成する前記組成物を指す。それらの利用範囲によって制限されない限り、本発明における用語”結合”および”錯体形成”はこの三成分錯体の形成過程を意味する。
【００６０】
（ＩＩ．組成物および使用方法）
本発明はリン酸結合化合物、リン酸結合溶液、およびリン酸化標的分子を選択的に検出および／または分離する方法を提供する。本発明のリン酸結合化合物は、結合溶液中に存在する際には、リン酸化標的分子と選択的に結合し、その標的分子を検出および／または分離させる。上記結合溶液はリン酸化標的分子と結合する次の３種類の重要な成分を含む：１）式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、その際Ａは化学的部分であり、Ｌはリンカー、Ｂは金属キレート化部分、ｍは１から４までの整数、ｎは０から４までの整数であるリン酸結合化合物；２）金属イオンを含む塩；３）酸。結合溶液は、理想的にはｐＨ約３ないしｐＨ約６の酸性ｐＨを維持するための緩衝剤と、有機溶媒とを含むのが普通である。その際その使用および溶媒は用途に依存する；これについては後に述べる。リン酸結合化合物、金属イオンおよびリン酸化標的分子を含む三成分錯体は酸性環境では安定であるが、ｐＨが中性（ｐＨ７）またはアルカリ性（ｐＨ＞７．０）に近づくと、上記錯体は徐々に不安定になる。
【００６１】
結合溶液を使用して本発明の化学的部分Ａまたは天然または合成物質（Ａが反応基であるとき）を、リン酸化標的分子上の露出したリン酸基に非共有結合させる。その際化学的部分Ａは本発明のリン酸結合化合物類を含む。これら結合した標的分子はその後本明細書に記載される検出法の一つを使用して検出でき、または以下に記載する多数の方法によって分離される。結合溶液中の金属イオンは、酸性環境にある場合、リン酸基および本発明のリン酸結合化合物の金属キレート化部分の両方に親和性を有する。
【００６２】
こうして、リン酸結合化合物によるリン酸化標的分子の結合のための本発明の方法は下記の工程を含む：
ｉ）サンプルを結合溶液と接触させ；
ｉｉ）前記サンプルと前記結合溶液とを、前記化合物が前記リン酸化標的分子と結合できるような十分の時間インキュベートし、それによって前記リン酸化標的分子が結合する。
【００６３】
本発明の方法を、サンプルと結合溶液との間に十分な接触があるという条件で、無制限のアッセイフォーマットに使用できる。そのためこの方法は、本発明の結合溶液がアッセイの目的とは無関係に標的分子上の露出したリン酸基と接触する任意のフォーマットにおける無限に多数のアッセイを網羅するものとする。こうして本発明の方法は非制限的に、リン酸化標的分子の確認、脱リン酸化分子の確認、直接的または間接的にリン酸化または脱リン酸を起こす酵素類の確認、リン酸化標的分子と相互作用する分子の確認およびリン酸化標的分子の分離を考慮する。検出は実際的には、適切な標準および対照を用いて、リン酸化標的分子を定量し、識別し、その後分析および同定することを含む。
【００６４】
概して、本発明の理解を容易にするために、結合溶液の成分類を先ず最初に詳細に記載し、その後リン酸結合化合物および金属イオンが使用される多くの変形法を説明する。その後、本発明の方法において特に有益に使用される幾つかの新規の化合物の例示的使用法および合成法を記載する。
【００６５】
Ａ．リン酸結合化合物の構成成分
本発明のリン酸結合化合物は式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、その際Ａは化学的部分であり、Ｌは化学的部分を金属キレート化部分（Ｂ）に共有結合させるリンカーである。一般的には前記化学的部分は反応基か、または色素、ハプテンまたは酵素を含む標識である。金属キレート化部分は、リン酸およびリン酸類似基に親和性を有する金属イオンによって指定される；そのようなイオンにはＧａ３＋、Ｆｅ３＋およびＡｌ３＋がある。本発明の目的のために、例えば約ｐＨ３ないし約ｐＨ６の酸性環境である場合には、三価ガリウムイオンが標的分子上のリン酸基およびＢＡＲＴＡ、ＩＤＡ、ＤＴＰＡおよびフェナントロリンなどの数種のキレート化基に対し親和性を有することが判明した；ＢＡＲＴＡキレート化部分が最も好ましい。
【００６６】
１．リン酸結合化合物の化学的部分Ａ
Ａ．標識
リン酸結合化合物の標識は当業者に公知の任意の標識でよく、標識が金属キレート化部分に共有結合するか、または金属キレート化部分にリンカーが存在しない部分を含むかどちらかの場合は（リン酸結合化合物の標識は）本発明のリン酸結合化合物を形成する。標識は非制限的に、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、燐光性色素、タンデム色素（エネルギー転移対）、ミクロ粒子、ポリマー、ハプテン、酵素および放射性同位体を含む。好ましい標識は色素、蛍光タンパク質、ハプテンおよび酵素である。共有結合は単一共有結合または安定な化学的結合の組み合わせでよい。標識を金属キレート化部分に結合する共有結合は一般的には単一共有結合であるが、１−３０個の非水素原子を組み込んだ置換アルキル鎖でもよく、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群から選択される置換シクロアルキルでもよい。
【００６７】
本発明の色素は２８０ｎｍ以上に最大吸収を示す任意の化学的部分であり、リン酸結合化合物の一部である場合は、それは特異なスペクトル特性を維持し、検出可能シグナルを与える。好ましい色素はフルオロフォアまたは化学ルミネッセンス前駆体である。これらは直接検出可能であり、または追加的試薬または試薬類の添加によって蛍光または化学ルミネッセンスを与える。
【００６８】
本発明の色素は非制限的に：ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンズインドール、オキサゾールまたはベンズオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、米国特許出願第０９／９６８４０１号および第０９／９６９８５３号および米国特許第６４０３８０７号および第６３４８５９９号の任意の対応化合物を含むシアニン、カルボシアニン（米国特許出願第０９／５５７２７５号および米国特許第５４８６６１６号；第５２６８４８６号；５５６９５８７号；第５５６９７６６号；５６２７０２７号；および第６０４８９８２号の任意の対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（米国特許第４７７４３３９号；第５１８７２８８号；第５２４８７８２号；第５２７４１１３号；および第５４３３８９６号に記載される任意の対応化合物を含む、同上）、キサンテン（米国特許第６１６２９３１号；第６１３０１０１号；第６２２９０５５号；第６３３９３９２号；第５４５１３４３号；第６２２１６０６号；第６３５８６８４号；第６００８３７９号；第６１１１１１６号；第６１８４３７９号；第６０１７７１２号；第６０８０８５２号；第５８４７１６２号および米国特許第号出願番号０９／９２２３３３号に開示される任意の対応化合物を含む）、オキサジンまたはベンゾオキサジン、カルバジン（米国特許第４８１０６３６号に開示される任意の対応化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（米国特許第５６９６１５７号；第５４５９２７６号；第５５０１９８０号および第５８３０９１２号に開示される対応化合物を含む）、ベンゾフラン（米国特許第４６０３２０９号および第４８４９３６２号に開示された任意の対応化合物を含む）およびベンゾヘナレノン（米国特許第４８１２４０９号に開示された任意の対応化合物を含む）およびこれらの誘導体類を含む。ここに使用されるオキサジンはレゾルフィン類（米国特許第５２４２８０５号に開示される任意の対応化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびそれらのベンゾ置換同族体を含む。
【００６９】
上記色素がキサンテンである場合、その色素は任意にフルオレッセイン、ロドール（米国特許第５２２７４８７号および第５４４２０４５号に開示される任意の対応化合物を含む）、ローダミン（米国特許第５７９８２７６号および第５８４６７３７号の任意の対応化合物を含む）である。ここに使用されるローダミンおよびロドール色素は、その他の誘導体のなかでも、飽和または不飽和”ジュロリジン”環を有するキサンテンを含んでなる化合物を含む。ここに使用するフルオレッセインはベンゾ−またはジベンゾフルオレッセイン、セミナフトフルオレッセイン（米国特許第４９４５１７１号に開示される任意の対応化合物を含む）を含む。
【００７０】
本発明の好ましい色素はベンゾフラン、キノリン、キナゾリノン、キサンテン、インドール、ベンザゾール、およびボラポリアザインダセンを含む。好ましいキサンテンにはジュロリジン含有キサンテン並びにフルオレッセイン、ロドール、ローダミンおよびローザミンがある。
【００７１】
本発明のキサンテン類は、キサンテンベース色素に一般的に認められる置換基、例えばフェニルおよび置換フェニル部分などによって、キサンテンの中心環の炭素原子上が置換された化合物類および未置換のこれら化合物類を両方とも含む。好ましい蛍光色素はいずれもスルホン化されていないことが本発明の重要な局面である。
【００７２】
或いは、色素はキサンテンの９位置にある単一共有結合であるＬによって結合するキサンテンである。好ましいキサンテンは９位置に結合した３Ｈ−キサンテン−６−オル−３−オンの誘導体、９位置に結合した６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−オンの誘導体または９−位置に結合した６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−３−イミンの誘導体を含む。
【００７３】
一般的には前記色素は種々の置換基によって１回以上任意に置換された１個以上の芳香族環またはヘテロ芳香族環を含み、前記置換基は非制限的にハロゲン、ニトロ、シアノ、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、アリール、またヘテロアリール環系、ベンゾ、または当業者に公知の色素に一般的に存在するその他の置換基を含む。
【００７４】
本発明の一局面において、色素は４８０ｎｍ以上に最大吸収を有する。特に有用な実施形態において、前記色素は４８８ｎｍないし５１４ｎｍ、またはその近辺で（アルゴン−イオン  レーザー励起ソースの放出による励起に特に適する）、または５４６ｎｍ近辺で（水銀アーク灯による励起に特に適する）吸収する。多くの色素の場合のように、それらは発色団としても蛍光標識としても作用し、リン酸化標的分子のための比色測定標識および蛍光標識として同時に作用する化合物を生ずる。こうして、記載される蛍光色素は本発明の好ましい発色団でもある。
【００７５】
色素に加えて、酵素も式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有するリン酸結合化合物の標識として使用される。酵素類は、検出可能シグナルの増幅が可能で、アッセイ感度を高めることができるため、好ましい標識である。酵素そのものは検出可能反応を起こさないが、それが適切な基質に接触すると基質を破壊するように作用し、変化した基質が蛍光シグナル、比色シグナルまたはルミネッセントシグナルを生成する。酵素類は検出可能シグナルを増幅する。なぜならば標識する化合物上の一つの酵素が多数の基質分子を検出可能シグナルに変換するからである。これは、サンプル中のリン酸化標的分子が少量しかなく、或いは上記酵素と比べて同等のまたはより強いシグナルを与えるようなフルオロフォアが存在しない場合には有益である。フルオロフォアは、不安定な三成分錯体に導く追加的アッセイ工程を必要としないから最も好ましい。上記酵素基質は好ましい測定可能の生成物、例えば色、蛍光またはルミネッセンスを与えるように選択される。このような基質はこの分野では広く用いられ、その多くは  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ（同上）に記載されている。
【００７６】
好ましい比色測定用−または蛍光発生性基質と酵素との組み合わせは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のような酸化還元酵素および３，３’−ジアミノベンチジン（ＤＡＢ）または３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）のような基質を使用する。これは識別できる色（それぞれ褐色および赤色）を与える。検出可能生成物を与えるその他の比色酸化還元酵素基質には、非制限的に：２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸および４−クロロ−１−ナフトールなどがある。蛍光発生性基質には非制限的に、ホモバニリン酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元フェノキサジン類および還元ベンゾチアジン類、例えばＡｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬およびその変種など（米国特許第４３８４０４２号）、および還元ジヒドロキサンテン類、例えばジヒドロフルオレッセインなど（米国特許第６１６２９３１号）およびジヒドロローダミン、例えばジヒドロローダミン１２３などがある。チラミドであるペルオキシダーゼ基質（米国特許第５１９６３０６号；第５５８３００１号および第５７３１１５８号）は、それら自体が酵素の作用前に本来検出可能であるが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）として記載されるプロセスにおいてペルオキシダーゼの作用によって”固定される”という理由で、ペルオキシダーゼ基質の特異なクラスである。これらの基質は、細胞、組織、またはアレイであるサンプル中の標的を標識するために広く利用され、その後顕微鏡検査、フローサイトメトリー、光学的走査および蛍光測定によって検出される。
【００７７】
また別の好ましい比色測定用（およびある場合には蛍光発生性）基質と酵素との組み合わせは、酸性ホスファターゼまたはこのようなホスファターゼの組換え変形体などのホスファターゼ酵素を、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルリン酸、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルリン酸、ｐ−ニトロフェニルリン酸、またはｏ−ニトロフェニルリン酸のような比色測定基質と組み合わせて、または４−メチルウンベリフェリルリン酸、６，８−ジフロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニルリン酸（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５８３０９１２号）、フルオレッセイン  二リン酸、３−Ｏ−メチルフルオレッセインリン酸、レゾルフィンリン酸、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オンー７−イル）リン酸（ＤＤＡＯリン酸）、またはＥＬＦ９７、ＥＬＦ３９または関連リン酸類（米国特許第５３１６９０６号および第５４４３９８６号）のような蛍光発生性基質と組み合わせて使用する。
【００７８】
グリコシダーゼ類、特にβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコロニダーゼおよびβ−グルコシダーゼはその他の適切な酵素である。適切な比色測定基質には非制限的に、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）および同様なインドリルガラクトシド、グルコシド、およびグルクロニド、ｏ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）およびｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドがある。好ましい蛍光発生性基質はレゾルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレッセイン  ジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレッセイン  ジグルクロニドおよびそれらの構造的変種（米国特許第５２０８１４８号；第５２４２８０５号；第５３６２６２８号；第５５７６４２４号；および第５７７３２３６号）、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびフッ素化クマリンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（米国特許第５８３０９１２号）を含む。
【００７９】
その他の酵素には、非制限的に、コリンエステラーゼおよびペプチダーゼなどのヒドロラーゼ類、グルコースオキシダーゼおよびチトクロームオキシダーゼなどの酸化酵素類および、適切な基質が知られている還元酵素類がある。
【００８０】
化学ルミネッセンスを生成する酵素類およびそれらの適切な基質が幾つかのアッセイには好ましい。これらは非制限的に、ルシフェラーゼおよびエクオリンの天然および組換え型を含む。ホスファターゼ、グルコシダーゼおよびオキシダーゼのための化学ルミネッセンス生成基質、例えば安定なジオキセタン類、ルミノール、イソルミノールおよびアクリジニウム  エステル類がその他に有用である。ホスファターゼ酵素のための数種の化学ルミネッセント基質が知られており、そのなかにはＢＯＬＤ  ＡＰＢ化学ルミネッセント基質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）が含まれる。
【００８１】
酵素類に加えて、ビオチン、ジオキシゲニン、および２，４−ジニトロフェニルなどのハプテン類も好ましい標識である。ビオチンが有用であるのは、それが酵素系に作用して検出可能シグナルをさらに増幅し、また、それが分離目的のアフィニティクロマトグラフィーに使用するタグとして機能するからである。検出の目的では、ビオチンに親和性を有する酵素結合物、例えばアビジン−ＨＲＰなどが使用される。その後ペルオキシダーゼ基質が加えられて検出可能シグナルを生成する。分離の目的では、ビオチンに親和性を有するアビジンのようなタンパク質をアガロースビーズに共役結合させる。ビオチン標識金属キレート化部分は、リン酸化標的分子に接触後、カラム上で磁気粒子に結合するか、または溶液中のアビジンビーズと共にインキュベートすると、リン酸化標的分子を分離および／または濃縮する。ビオチンの好ましい型はデスチオビオチン類似体である；後者はアビジン−ベースの親和性基質に容易に吸着し、それから容易に放出される。ある用途においては、アビジンの好ましい型はＣａｐｔＡｖｉｄｉｎビオチン結合タンパク質（モレキュラー・プローブス）である；これはビオチニル化化合物を容易に放出する。
【００８２】
ハプテン類はその他の誘導体中、特にホルモン、天然発生−および合成薬剤、汚染物質、アレルゲン、アフェクタ分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学的中間体、ヌクレオチドなどを含む。
【００８３】
蛍光またはルミネッセントタンパク質も本発明のリン酸結合化合物のための標識として使用される。蛍光タンパク質の例としては緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アクォリンおよびフィコビリタンパク質およびそれらの誘導体がある。蛍光タンパク質、特にフィコビリタンパク質は、タンデム色素標識−標識化試薬を作るために、またはミクロフェアまたはアレイのような基質に固定されたハプテン標識−標識化化合物またはリン酸化標的分子を間接的に検出するために特に有用である。これらのタンデム色素は、大きいストークス−シフトを得る目的で蛍光タンパク質およびフルオロフォアを含む；その際放射スペクトルは蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長からさらにシフトする。この特性は、放射される蛍光を最大限に活用しようとするサンプル中の少量の標的分子を検出するために特に有益である；言い換えれば、放射された光は上記蛍光タンパク質によってほとんどまたは全く吸収されない。これを研究するために、蛍光タンパク質およびフルオロフォアはエネルギー転移対として機能する；この際上記蛍光タンパク質は、アクセプタ  フルオロフォアが吸収する波長で発光し、その後そのフルオロフォアが上記蛍光タンパク質単独で得られる波長に比べて上記蛍光タンパク質からさらに離れた波長で発光する。或いは、フルオロフォアはエネルギードナーとして機能し、蛍光タンパク質はエネルギーアクセプタとして機能する。特に有用な蛍光タンパク質は米国特許第４５２０１１０号；第４８５９５８２号；第５０５５５５６号に開示されるフィコビリタンパク質および米国特許第４５４２１０４号に開示されているフルオロフォア  ビリンタンパク質組み合わせである。或いは、２種類以上のフルオロフォア色素がエネルギー転移対としてはたらくことができ、その際一つのフルオロフォアはドナー色素であり、他の一つはアクセプタ色素である（米国特許第６３５８６８４号；第５８６３７２７号；第６３７２４４５号および第５６５６５５４号に開示されている任意の化合物を含む）。
【００８４】
Ｂ．反応基
本発明は、必ずしも当業者が標識であると理解するようには機能しないが、本発明に使われるその他の物質も考慮する。このような物質にはポリマー分子（特に約１６ミクロン未満の直径を有するポリスチレン  ミクロスフェア）、磁気粒子、重合膜およびガラスなど、固体および半固体の基質が含まれる。これらの物質は、リン酸結合化合物が固定される場合に分離目的などのためにアッセイを行う場合、またはその後のアッセイが本発明に記載されるような固定されたリン酸化標的分子上で直接行われる場合に特に有用である。
【００８５】
その上、反応基によって任意の生物学的成分を上記リン酸結合化合物に共有結合させることができる；上記生物学的成分としては非制限的に、タンパク質、ペプチド、糖および多糖、核酸（ヌクレオチドおよびヌクレオシドを含む）、アミノ酸、小器官、細胞および細胞性抽出成分類が含まれる。
【００８６】
そのため、本発明のリン酸結合化合物は、リン酸結合化合物を基質、ミクロ粒子、リン酸標的分子に、または直接生物学的成分に共有結合させるためのアミン反応基などの反応基も含むことができる。例えば、リン酸結合化合物、金属イオンおよびリン酸化標的分子を含む三成分錯体が生成する際、上記反応基は上記リン酸化標的分子と付加的共有結合を形成することができる。これは上記錯体の安定性を効果的に高め、リン酸化標的分子のよりストリンジェントな分離および分析を可能にする（おだやかな酸性ｐＨ範囲を超えても上記錯体を維持することができるなど）。
【００８７】
典型的には、ある分子へのリン酸結合化合物の共有結合は、求電子性基と求核性基との間の化学反応の結果である。しかし、光活性化される反応基が使われる場合、共有結合は上記結合溶液が照射されたときに起きる。このことは、リン酸化標的分子だけが本発明の結合化合物に対して確実に共有結合するためには特に好都合である。
【００８８】
その他の分子を本発明のリン酸結合化合物に共有結合させるために使用できる多数の求電子性および求核性反応基が当業者には公知である。これらその他の分子としては非制限的に、標識、生物学的成分（タンパク質、核酸）、ミクロ粒子、ミクロプレートのウェルのようなプラスチック、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、多糖、特にアガロース、デキストランおよびセルロースなどのポリマー類があり、米国特許第５４５３５１７号に開示される任意の化合物を含む。
【００８９】
２．リンカー
上記のように、本発明の化学的部分Ａはリン酸結合化合物類の一部であり、それらはリンカーによって金属キレート化部分に共有結合して本発明の化合物類を形成し、または標識および金属キレート化部分がベンゾフランおよびＢＡＰＴＡなどの芳香族環を共有している。例えば、化学的部分およびキレート化部分が芳香族環を共有する場合、リンカーは存在せず、式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）のｎは０である。好ましい実施形態はリンカーが存在しない標識化化合物である；しかし単一共有結合としてのリンカーも同様に好ましい。
【００９０】
リンカーが存在する場合、そのリンカーは一般的にＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰからなる群から選択される１−３０個の非水素原子を組み込む。リンカーは一般的に置換アルキルまたは置換シクロアルキルである。或いは、フルオロフォアが金属キレート化部分に直接結合してもよいし（その場合リンカーは単一結合である）またはアルキルリンカーがベンゼン環またはベンゼン環の当業者には公知の置換基を有する置換ベンゼンを含んでもよい。リンカーが単一共有結合でない場合、そのリンカーは任意に単一、二重、三重または芳香族炭素−炭素結合、並びに炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、硫黄−硫黄結合、炭素−硫黄結合、リン酸素結合、燐−窒素結合、および窒素−プラチナ結合を含む安定な化学的結合の任意の組み合わせである。リンカーが２０未満の非水素原子を組み込み、エーテル、チオエーテル、チオ尿素、アミン、エステル、カルボキサミド、スルホンアミドおよびヒドラチド結合および芳香族またはヘテロ芳香族結合の任意の組み合わせからなるのが好ましい。一般的にはリンカーは単一炭素−炭素結合およびカルボキサミド、スルホンアミド、エーテルまたはチオエーテルの組み合わせである。上記リンカーの結合はリンカーに見いだすことができる下記の部分を生成するのが一般的である：エーテル、チオエーテル、カルボキサミド、チオ尿素、スルホンアミド、尿素、ウレタン、ヒドラジン、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、シクロアルキルおよびアミン部分。標識化合物のすぐれた例は下記の３種類の（Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）リンカー構造式を有する：式（Ｉ）−（ＣＨ２）ｅＣ（Ｘ）ＮＨ（ＣＨ２）ｅ（ＮＨＣ（Ｘ）（ＣＨ２）ｅ）ｄ−および式（ＩＩ）−（（Ｃ６Ｒ”４）Ｏ）ｄ（ＣＨ２）ｅ（Ｃ（Ｘ）ＮＨ（ＣＨ２）ｅ）ｇ（ＮＨ）ｄＣ（Ｘ）ＮＨ（Ｃ６Ｒ”４）（ＣＨ２）ｅ−、および式（ＩＩＩ）−（ＮＨＣ（Ｘ）（ＮＨ）ｄ（ＣＨ２）ｅ（ＮＨ）ｄＣ（Ｘ）（ＮＨ）ｄＣ（Ｘ）（ＮＨ）ｄ（ＣＨ２）ｅ（ＮＨＣ（Ｘ）（ＣＨ２）ｅ）ｄ）−、式中ＸはＯまたはＳ、ｄは０−１、ｅは０−６、ｇは１−４およびＲ”は独立的にＨ、ハロゲン、アルコキシまたはアルキルである。Ｘ、ｄ、ｅおよびｇはリンカー内で独立的に選択されることは理解される。
【００９１】
こうして、本発明の選択された実施形態は下記のリン酸結合化合物式（ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸおよびＸＩ）である：式（ＶＩＩ）（Ａ）（Ｂ）、リンカーなし；式（ＶＩＩＩ）（Ａ）−（ｎ）（Ｂ）、リンカーは単一共有結合である；式（ＩＸ）（Ａ）−［（ＣＨ２）ｅＣ（Ｘ）ＮＨ（ＣＨ２）ｅ（ＮＨＣ（Ｘ）（ＣＨ２）ｅ）ｄ］−（Ｂ）；式（Ｘ）（Ａ）−［（Ｃ６Ｒ”４）Ｏ）ｄ（ＣＨ２）ｅ（Ｃ（Ｘ）ＮＨ（ＣＨ２）ｅ）ｇ（ＮＨ）ｄＣ（Ｘ）ＮＨ（Ｃ６Ｒ”４）（ＣＨ２）ｅ］−（Ｂ）および式（ＸＩ）（Ａ）−［ＮＨＣ（Ｘ）（ＮＨ）ｄ（ＣＨ２）ｅ（ＮＨ）ｄＣ（Ｘ）（ＶＨ）ｄ（ＣＨ２）ｅ（ＮＨＣ（Ｘ）（ＣＨ２）ｅ）ｄ］−（Ｂ）、上記式中、Ａは化学的部分で、Ｂは金属キレート化部分である。
【００９２】
リンカーの任意の組み合わせを使用して化学的部分および金属キレート化部分を共に結合させることができる。さらに、金属キレート化部分は、エネルギー転移対などの任意の別の標識、またはアガロースなどの付加的物質、リンカーを付加的物質またはリン酸化標的分子に結合させるように機能するミクロ粒子または反応基に結合するために使用できる１つより多いリンカーを有することができる。好ましい実施形態は、標識にリンカーによって、またはリンカーなしで結合し、付加的物質にも結合する金属キレート化部分を含む。リンカーは、標識化合物の物理的性質、例えば金属キレート化部分の結合親和性および色素のスペクトル特性などを変えるように置換することもでき、またはアミン−またはチオール反応基で置換することもできる。
【００９３】
リンカーのまた別の重要な特徴は、化学的部分Ａとキレート化部分Ｂとの間に適当なスペースを与えて、化学的部分が、金属キレート化部分の結合ドメインへの金属イオンの結合、およびリン酸化標的分子への金属イオンの結合に対して立体障害を起こさないようにすることである。本発明の好ましい実施形態がリンカーなしで色素を含む金属キレート化部分であることからわかるように、全ての化学的部分が立体障害をもたらすものではないことは当然である。しかしビオチンのようなある種の標識は一般的にリンカーによって金属キレート化部分に結合する。そのため、本発明のリン酸結合化合物のリンカーは（１）化学的部分Ａを金属キレート化部分に結合させるために、（２）化学的部分と金属キレート化部分との間に十分は距離を作り、金属キレート化部分および標的分子上のリン酸基の親和性を立体阻害しないようにし、（３）リンカーの原子の選択によって、または間接的に置換基のリンカーへの付着によって、リン酸化標的分子に対する金属キレート化部分の親和性を変化させるために重要である。
【００９４】
しかし、リンカーがリン酸結合化合物の必須成分ではなく、幾つかの好ましい化合物はリンカーを含まないことが認められる。
【００９５】
３．金属キレート化部分
金属キレート化部分は金属イオンに結合し、同時に標的分子上の露出したリン酸基に対して親和性を有する。その際金属キレート化部分、金属イオンおよびリン酸化標的分子間に三成分錯体が形成される。リン酸基に結合することが判明した金属イオンには三価のガリウム、鉄およびアルミニウムがある。ある条件下でこれらのイオンに結合する金属キレート化部分としてはＢＡＰＴＡ、ＩＤＡ、ＤＴＰＡおよびフェナントロリン類がある。こうして金属キレート化部分は１）リン酸基に親和性を有する金属イオンに結合し、２）金属イオンとリン酸基との結合を妨害せず、３）安定な三成分錯体を維持しなければならない。これらの三条件に適合する金属キレート化部分は、ここに使用されるようなＢＡＰＴＡ、ＩＤＡ、ＤＴＰＡＢＡＰＴＡを含み、類似体として金属キレート化部分の蛍光および非蛍光誘導体（１、２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’四酢酸）および、米国特許第４６０３２０９号；第４８４９３６２号；第５０４９６７３号；第５４５３５１７号；第５４５９３２７６号；第５５１６９１１号；第５５０１９８０号；および第５７７３２２７号に開示される対応化合物を含むそれらの塩類を含む。これらのＢＡＰＴＡベースの金属キレート化部分は、それらが生理的条件、すなわちｐＨ約７で二価のカルシウムイオンに結合することができるため主としてカルシウムインディケータとして、そしてマイクロモル近辺およびマイクロモル以下の範囲の遊離カルシウムイオン濃度のインディケータとして、当業者にはよく知られている。しかし、本発明に記載のリン酸化標的分子をこれらのインディケータで検出するという本発明の方法の実施に際して総合的に見てカルシウムは効果のない金属であることを我々は見いだした。
【００９６】
明確にするために、制限するものではないが下記の構造が式ＩＶを有する本発明の好ましいＢＡＰＴＡ金属キレート化部分を示す：
【００９７】
【化９】
2005539243.tif 000002
【００９８】
好ましくは環Ａおよび環Ｂが２個の酸素原子間の炭化水素架橋によって結合している。この式中、ｐは０、１、または２であり、環置換基（Ｒ１−Ｒ８）は独立的に、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、脂環式、ヘテロ脂環式、アルキル、アリール、アミノ、アルデヒド、カルボキシル、ニトロ、シアノ、チオエーテル、スルフリル、およびリンカー（Ｌ）からなる群から独立的に選択される。或いは、２個の隣接環置換基が一緒になって、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アリール、融合アリール、ヘテロアリールまたは融合ヘテロアリールである環置換基を形成する。好ましくは、ＢＡＰＴＡ金属キレート化部分は少なくも２個の非水素置換基を有し、最も好ましいＢＡＰＴＡ金属キレート化部分は置換基の１つとしてフッ素原子によって、最も好ましくはＲ６またはＲ３の位置が置換されている（例えば化合物１、２、５、７、８および１２）。一般的には化学的部分をＢＡＰＴＡに結合させるリンカーはＲ３またはＲ６位置である。置換基としてカルボニル基を好ましくはＲ７に含むＢＡＰＴＡ金属キレート化部分、例えば化合物９および１２も同様に好ましい。特殊の理論によって束縛されるものではないが、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６またはＲ７位置において置換されたフッ素またはカルボニルのような電子吸引基は、三価ガリウムイオンをキレート化するために特に有益なＢＡＰＴＡキレート化部分を生成し、その後キレート化されたガリウムイオンとリン酸化標的分子上の露出リン酸基との同時相互作用が可能になり、安定な三成分錯体を形成するようにみえる。
【００９９】
架橋置換基Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は水素、低級アルキルまたは隣接置換基Ｒ９およびＲ１０からなる群から独立的に選択され、一緒になって５員−または６員−脂環式環またはヘテロ脂環式環を形成する。Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、およびＲ１８は独立的にＨまたは低級アルキルである；Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、およびＲ１８は全て水素であるのが好ましい。Ｒ１３およびＲ１４は独立的に水素または塩である。
【０１００】
本発明の化学的部分がリンカーによってＢＡＰＴＡ金属キレート化部分のＲ１−Ｒ１２のいずれかに結合し、または色素標識が、リンカーが存在しない金属キレート化部分の芳香族環の一つを含むことは理解される。そのため、Ｒ１−Ｒ１２の２つの隣接置換基が、互いに、そしてそれらが結合する芳香族環と組み合う際には、フルオロフォアまたは発色団標識を構成する。しかしリン酸結合化合物は１つより多いリンカーを有することができ、色素標識はどのリンカーとも結合せず、４つの他のリンカーが金属キレート化化合物に存在してその他の標識または反応基を結合させることができる。本発明の一局面において、２つの隣接環置換基（Ｒ１−Ｒ４またはＲ５−Ｒ８）が一緒になって、融合ベンゾフランまたヘテロアリール−またはカルボキシヘテロアリール−置換ベンゾフラン  フルオロフォアである色素標識を形成する。この色素標識が本発明の化合物に融合する場合、それはＲ２とＲ３との間でまたはＲ６とＲ７との間で融合するのが好ましい。
【０１０１】
キサンテン誘導体色素は本発明の特に有用な色素である；その際ＢＡＰＴＡまたは置換ＢＡＰＴＡ金属結合化合物のベンゼン環のどちらか片方または両方が、一般的Ｃａ２＋インジケータ類、フルオロ−３、フルオロ−４およびロド−２の場合のように（米国特許第５０４９６７３号、同上）単一化学的結合によってキサンテン環に結合し、またはオレゴングリーン（登録商標）ＢＡＰＴＡインジケータにおけるように（米国特許第６１６２９３１号、同上）フェニルまたは置換フェニルスペーサを介して結合している。キサンテン環は一般的にはＢＡＰＴＡの窒素官能基にパラの位置でＢＡＰＴＡに結合するのが一般的である。特に好ましいのは、フルオロフォアがローダミンまたはハロゲン化フルオレッセインであるキサンテン含有ＢＡＰＴＡ誘導体である。ＢＡＰＴＡキレータの５−位置がロドー５Ｆおよびフルオロ−５Ｆを含むＦによって置換された蛍光ＢＡＰＴＡ誘導体が特に好ましい。
【０１０２】
ここに使用されるＤＴＰＡはジエチレントリアミン四酢酸キレート化部分およびその誘導体である。これらには米国特許第４９７８７６３号および第４６４７４４７号に開示される任意の対応化合物が含まれる。ＤＴＰＡ金属キレート化部分は、（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）ＺＮ［（ＣＯ２）ＳＮ（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）］Ｔ（ＣＨ２）ＳＮ（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）Ｚを含む式Ｖによってあらわされる。上記式中、リンカーはメチン炭素または窒素原子に結合し、Ｚは１または２、Ｓは１ないし５、Ｔは０−４、そしてＲ１３は独立的に水素または塩である。
【０１０３】
ここに使用されるＩＤＡはイミノ二酢酸化合物およびその誘導体であり、−（Ｌ）−Ｎ（ＣＨ２ＣＯ２Ｒ１３）２を含む式ＶＩであらわされる。上記式中、Ｒ１３は独立的に水素または塩であり、前記リンカーが単一共有結合でないという条件がある。ＩＤＡ金属キレート化部分はリンカーによって化学的部分に結合しなければならない；その際リンカーは少なくも一つの非水素原子を含む。理論によって束縛されるものではないが、リンカーが三成分錯体の安定性を高め、本発明の金属イオンに対する金属キレート化部分の親和性を調節するようにみえる。
【０１０４】
上記の特殊の金属キレート化部分に加えて、我々はフェナントロリン−ベースのキレータ類もおだやかな酸性条件下では金属イオンおよびリン酸標的分子と三成分錯体を形成することを見いだした。ここに使用されるフェナントロリンは１、１０−フェナントロリン化合物およびその誘導体であり、以下の構造：
【０１０５】
【化１０】
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【０１０６】
によってあらわされる。
【０１０７】
任意の芳香族炭素原子を、米国特許第６３１６２６７号（同上）に開示されている置換基など、当業者に公知の置換基で置換することができる。或いは、リンカーを任意の芳香族炭素原子に結合させて、化学的部分Ａをフェナントロリン部分に共有結合させ、本発明のリン酸結合化合物を形成することができる。
【０１０８】
Ｂ．リン酸結合化合物
三成分錯体の形成後に適切なシグナルを提供するリン酸結合化合物の合成法は、化学的部分Ａと金属キレート化部分との間の適切な化学的結合の選択、および金属キレート化部分上の適切な置換基の選択に関係する。これらの選択は、生成するリン酸結合化合物が、金属およびリン酸化標的分子の両方に最適な同時結合親和性を有し、永続的三成分錯体を促進する十分な溶解度を有するように行われる。正しくない選択は、十分な結合親和性をもたず、永続的三成分錯体を形成しないリン酸結合化合物を生成する。正しくない選択は、リン酸化標的化合物以外の被検体に対して、リン酸結合化合物の過剰な非選択的結合を生起し、高いバックグラウンド、したがって低いシグナル−対−ノイズ比をもたらす。本発明の実施に適した化合物類は実施例１Ｄの方法によって最も良くスクリーニングされる。
【０１０９】
ＢＡＰＴＡ誘導体が本発明の種々の局面の実施に特に適切であることを我々は発見した。本発明の新規のリン酸結合化合物（その合成および使用は実施例に説明される）は、キナゾリノン蛍光色素を有するＢＡＰＴＡキレート化部分（化合物６、７、および２３）、ボラポリアザインダセン蛍光色素を有するＢＡＰＴＡキレート化部分（化合物８、２４および２７ａ−ｆ）、キサンテン−ベース色素を有するＢＡＰＴＡキレート化部分（化合物１１、１９、２６および２５）、ビオチン標識を有するＢＡＰＴＡキレート化部分（この際ビオチンはリンカーによって結合している）（化合物９、１２、１５および１８）、ベンゾチアゾール標識を有するＢＡＰＴＡキレート化部分（化合物１７）、アガロースが共有結合しているＢＡＰＴＡキレート化部分（化合物１３および１４）、リンカーによってＢＡＰＴＡ化合物に結合したアニリンを含むＢＡＰＴＡ化合物（化合物１０）を含む。新規の化合物は、リンカーによってＤＴＰＡキレート化部分に結合するボラポリアザインダセン  フルオロフォア標識も含む（化合物２０、２１および２２）。これらの新規のリン酸結合化合物はリン酸化標的分子の検出および分離に使用される。これらの化合物の合成は実施例３０−４８に例示される。
【０１１０】
本発明のリン酸結合化合物はガリウム（ＩＩＩ）−リン酸化標的分子錯体に対し十分な非共有結合親和性を示し、永続的三成分錯体から過剰の試薬をすすぎ去ることができる。さらに、ある種のリン酸結合化合物は三成分錯体の形成後に最適シグナルを提供し、したがって環境的により敏感であることが判明した。この高いシグナルはリン酸結合化合物−ガリウム（ＩＩＩ）−リン酸化標的分子錯体のよく調整された疎水性の関数であるようにみえる。そのため、検出可能反応、例えば溶液中のリン酸化標的分子の標識化などが所望される場合、および検出可能反応が蛍光反応である場合、それは一般的には蛍光の変化、例えば蛍光の強度、励起−または発光波長分布、蛍光寿命、蛍光分極の変化またはこれらの組み合わせである。ガリウムイオンおよびリン酸化標的分子がキレータに結合する際の検出可能最適反応は、蛍光強度の約２倍以上の変化である。
【０１１１】
しかし、リン酸化標的分子またはリン酸結合化合物が固定されるという用途（この際固定された三成分構造が生成する）では、金属キレート化部分のキレート化およびその後の三成分錯体形成による検出可能蛍光の増加は必要ないかも知れない。これは、安定な三成分錯体によるものであり、この際、非結合リン酸結合化合物を洗浄し除去することができ、リン酸化結合化合物からの蛍光反応がリン酸化標的分子を十分に可視化することによる。したがってこの状況における好ましい実施形態は、本発明の金属イオンおよびリン酸化標的分子に結合した際に蛍光の変化をほとんどまたは全く受けないリン酸結合化合物である。
【０１１２】
金属キレート化部分と標識との組み合わせは、環境的に敏感である（すなわち金属イオンおよびリン酸化標的分子に同時に結合して三成分錯体を形成した際に蛍光変化を生じる）か、または敏感でない（すなわち蛍光シグナルの変化を生じない）リン酸結合化合物を提供する。強い検出可能シグナルを生成し、三成分錯体の形成を容易にする本発明の最も好ましい蛍光色素は、ベンゾフラン、キノリン、キナゾロン、キサンテン、ベンザゾール、およびボラポリアザインダセン化合物およびそれらの種々の誘導体を含む。これらの蛍光色素は、上記色素が金属キレート化部分を含むとき、強い検出可能シグナルを生成する。好ましい蛍光色素はいずれもスルホン化されていないことが本発明の重要な観点である。
【０１１３】
【表２−１】
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【０１１４】
【表２−２】
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【０１１５】
【表２−３】
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【０１１６】
【表２−４】
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【０１１７】
【表２−５】
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【０１１８】
【表２−６】
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【０１１９】
【表２−７】
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【０１２０】
【表２−８】
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【０１２１】
【表２−９】
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【０１２２】
Ｃ．結合溶液
本発明の結合溶液は下記の構成成分類を含んでなる：
ａ）式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）であらわされ、式中、Ａが化学的部分であり、Ｂが金属キレート化部分であり、ｍが１ないし４の整数であり、ｎは０ないし４の整数であるリン酸結合化合物；
ｂ）金属イオンを含む塩；
ｃ）酸。
【０１２３】
上記結合溶液は、以下に記載される方法、およびサンプルが存在するメジウムに依って、種々のやり方で調製できる。より詳細に述べれば、結合溶液は式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有するリン酸結合化合物、金属イオンを含む塩および、その結合溶液のｐＨを３−６に調節するのに十分な水溶液中の酸を含む；任意に上記結合溶液は有機溶媒または有機溶媒とその他のイオン性または非イオン性成分、例えば塩化ナトリウムとの混合物を含む。結合溶液の任意の構成成分類を一緒にまたは別々に、特定の順序にこだわらずに加えることができ、そして以下に明らかになるように、リン酸結合化合物を固体または半固体基質に固定してもよい。その際金属イオンおよび酸がその基質に加えられ、本発明の結合溶液を形成する。したがってリン酸結合化合物は結合溶液中で遊離して溶液を形成する必要はなく、固体または半固体基質表面に固定されてもよい。検出法および分離法などの方法に依存して、金属イオンおよびリン酸結合化合物の濃度を調節する必要があることを我々は見いだした。
【０１２４】
可溶性リン酸結合化合物は水、ＤＭＡＳＯ、ＤＭＦまたはメタノールなどの溶媒に、通常約０．１μＭないし１０μＭの最終濃度で溶解することによってつくられる；リン酸結合化合物は結合溶液中に約０．５μＭないし５μＭの濃度で存在するのが好ましく、最も好ましいのは約１．０μＭである。しかし結合溶液を使用してリン酸化標的分子を溶液から沈殿させるという用途では、結合溶液中のリン酸結合化合物のより高濃度−約０．０５ｍＭないし１ｍＭが好ましい−が所望される。沈殿の目的の場合、その濃度は高めるが、リン酸結合化合物  対  金属イオンの比は、検出目的のために用いられる結合溶液の場合の比に等しくする。
【０１２５】
金属イオンを含む塩類は、塩化ガリウムから作られる三価ガリウムイオンを含むのが好ましいが、当業者に公知の任意のガリウム塩でもよい。
【０１２６】
或いは、鉄およびアルミニウムイオンも本発明の結合溶液に使用される。本発明に使用できるガリウム塩は非制限的に、アセチルアセトネート、アルゼニド、ブロミド、塩化物、フッ化物、ヨウ化物、硝酸塩、亜硝酸塩、窒化物、過塩素酸塩、硫酸塩および亜硫酸塩、硫化物を含む。ガリウム塩は一般的には結合溶液中に約１０ｎＭないし約１ｍＭの濃度で存在する；ガリウム塩の濃度は約０．５μＭないし１０μＭであるのが好ましい。しかし沈殿の目的では、ガリウム塩は約０．１ｍＭないし約０．５ｍＭ濃度より若干高いのが好ましい。
【０１２７】
ガリウムイオンに関するリン酸結合化合物の安定性および特異性およびリン酸化標的分子に関するガリウムイオンの安定性および特異性の分析をｐＨの関数として評価した（実施例１）。これらの結果に基づいて、好ましい結合溶液は、結合反応のためのおだやかな酸性条件を提供する酸を含むことが確認された。実際、本発明の重要で予想外だった局面は、金属キレート化基がおだやかな酸性条件下でガリウムのような三価カチオン類と結合し、中性ｐＨに近くまで高まったｐＨレベルで蛍光シグナルを生成することである。酸性環境とは、６．９未満のｐＨを有する溶液と定義される。適切な典型的酸性成分は非制限的に、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、過塩素酸または硫酸である。酸性成分は一般的には１％ないし２０％の濃度で存在し、塩基によって適切なｐＨに緩衝される。結合溶液のｐＨは約ｐＨ３−６がより好ましく、ｐＨ約４が最も好ましい。酢酸はｐＨ４またはその近くで使用される好ましい酸である。使用する各化合物の最適ｐＨは使用する化合物によってわずかに変化する；化合物２ではｐＨ４．０が好ましい。
【０１２８】
結合溶液のｐＨは酸性成分の他に、緩衝剤の挿入によって任意に修正できる。特に、組成物中にアルコールも含まれてる場合、緩衝剤の存在が電気泳動ゲルに固定されたリン酸化標的分子の結合を予想外に改善することを我々は見いだした。酸性環境を維持し、サンプル中のリン酸化標的分子と適合する任意の緩衝剤を上記結合溶液に適切に含めることができる。
【０１２９】
有用な緩衝剤は蟻酸塩、酢酸塩、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸、イミダゾール、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジニルエタンスルホン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンアセテート、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、塩酸を含む。この際前記緩衝剤はガリウムイオンとキレート化しない。典型的緩衝剤は酢酸ナトリウムである。この緩衝剤は一般的には結合溶液中に約２０ｍＭないし５００ｍＭ濃度；より好ましくは約５０ｍＭないし２００ｍＭの濃度で存在する。
【０１３０】
結合溶液中の水混和性有機溶媒、典型的にはアルコールの挿入は、結合溶液がｐＨ緩衝剤および塩を含む際には推奨される。ホルムアミドのような極性の高い溶媒の使用が許されるとはいえ、一般的には極性有機溶媒は１−６炭素原子を有するアルコール、または２−６炭素原子を有するジオールまたはトリオールである。好ましいアルコールは１，２−プロパンジオールである。極性有機溶媒は、存在する際には一般的に濃度５−５０％で結合溶液に含まれる。極性有機溶媒の存在は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−コーテドタンパク質に結合する場合に、典型的にはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから電子ブロットされたリン酸化タンパク質またはペプチドに結合する場合に特に有益である。一般的にこの好ましい操作において、ＳＤＳは結合溶液の添加前にゲルまたはブロットから、固定および洗浄によって取り上げられる；しかし、若干のＳＤＳは残り、本発明の結合法を妨害するかも知れない。理論によって束縛されるものではないが、アルコールの存在は、サンプルの洗浄または固定によって除去されなかったＳＤＳを除去することによってリン酸化タンパク質またはペプチドのルミネッセント標識化を改善するように見える。しかし、ニトロセルロース膜は高濃度のアルコール（例えば約２０％以上）によって損傷を受けるかも知れない。そこでリン酸化タンパク質類またはペプチド類を固定する膜を損傷しない溶媒濃度を選択するように注意しなければならない。
【０１３１】
（Ｄ．使用法）
１．方法
本発明のリン酸結合化合物を非制限的に、リン酸化標的分子の分析およびモニターのために使用できる。このやり方ではリン酸化標的分子を、標的分子上のリン酸基の数、リン酸化に関係する酵素類の確認、このような標的分子がプロテオムにおいて有する役割および、（その後の分析で）標的分子上のリン酸基の付着部位に関する情報を提供する非制限的アッセイフォーマットで検出することができる。その後の分析は本発明の化合物を使用してリン酸化標的分子を選択的に検出および／または分離した後に行われる。
【０１３２】
本発明の方法は、固定したサンプル上で、リン酸結合化合物が固定されているサンプルで、またはサンプルと標識化合物が共に溶液中にあるというサンプルで行うことができる。結合溶液は、リン酸結合化合物、三価金属イオンおよびサンプル中の任意のリン酸化標的分子の接触を容易にするようなやり方でサンプルと組み合わせられる。その際三成分錯体の形成が化学的部分Ａと存在するリン酸化標的分子とを効果的に結合させる。サンプルが固体または半固体支持体上に固定されている場合、接触を最大にするような条件、例えばしずかに混合するまたは揺り動かすという条件下で、結合溶液をサンプルと共にインキュベートするのが一般的である。
【０１３３】
ゲル上に固定されたリン酸化標的分子を検出するための本発明の方法は一般的には下記の工程を含む：
ｉ）サンプルをゲル上に固定する；
ｉｉ）任意に工程ｉ）のゲルを固定溶液と接触させる；
ｉｉｉ）工程ｉｉ）のゲルを本発明の結合溶液と接触させる；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）のゲルと結合溶液とを、前記化合物が前記リン酸化標的分子と結合するのに十分な時間インキュベートする；
ｖ）リン酸結合化合物を可視化し、それによって前記リン酸化標的分子を検出する；そして
ｉｖ）任意に、第二（または第三）染色を上記ゲルに行い、総タンパク質、またはその他の種類の例えば糖タンパク質などのタンパク質、またはその両方を検出する。
【０１３４】
サンプルをゲル上に固定することは、そのサンプルの電気泳動分離を含むのが一般的である。上記ゲルとしては、非制限的に、標的分子を互いに分離するための当業者に公知の任意のゲルがあり、電流がそのゲルを通過し、標的分子が電荷およびサイズに基づいて移動するアガロースおよびポリアクリルアミドなどのポリマーベースのゲルが含まれる。したがってゲル（還元型および天然）としては一次元および二次元ゲルおよび等電点電気泳動ゲルも含まれる。毛細管電気泳動はゲル、ポリマー含有溶液または溶液のみを使用して行われる。
【０１３５】
任意に、ゲル上で分離されたサンプルは当業者に公知の方法によって重合膜に移され、その膜を今度は本発明の結合溶液と接触させ、リン酸化標的分子を選択的に検出する。膜に固定されたリン酸化標的分子を検出する本発明の方法は一般的には下記の工程を含む：
ｉ）サンプルをゲル上で電気泳動で分離する；
ｉｉ）分離したサンプルを膜に移す；
ｉｉｉ）任意に工程ｉｉ）の膜と固定溶液とを接触させる；
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の膜と結合溶液とを接触させる；
ｖ）工程ｉｖ）の膜と結合溶液とを、前記化合物がリン酸化標的分子と結合するのに十分な時間インキュベートする；そして
ｖ）前記化合物を可視化し、それによって前記リン酸化および標的分子を検出し、
ｖｉ）任意に第二（または第三）の色素をその膜に加えて、総タンパク質か、またはその他の種類の例えば糖タンパク質などのタンパク質、またはその両方を検出する。
【０１３６】
タンパク質ゲル電気泳動を行う際には、サンプル調製または使用緩衝剤のどちらかの成分としてＳＤＳを使用するのが一般的である。しかしＳＤＳは本発明の結合溶液を阻害するから、結合溶液の添加前にゲルまたは膜から除去しなければならない。ゲルおよび膜は固定され、洗浄される結果、大部分または全てのＳＤＳがそのゲルまたはブロットから除去される。ゲルおよび膜のために好ましい固定溶液はメタノールおよび酢酸などである；任意に固定溶液はグルタールアルデヒドを含む。メタノールは約３５−５０％濃度で存在し、酢酸は約０−１５％濃度で存在し、グルタールアルデヒドは約０−２％の濃度で存在する。一般的には固定後に１００％の水でゲルまたは膜を洗う。
【０１３７】
しかし本発明の目的では、結合溶液は天然または非還元ゲル上で分離されたリン酸化標的分子も検出する。そこで、ＳＤＳを含まないこれらゲルを使用する方法では、固定溶液の工程は必要ない。
【０１３８】
サンプルがゲル上で分離され、または重合膜に移され、任意に固定され、洗浄された後に、そのゲルまたはブロットを結合溶液と共にインキュベートする（実施例２−９）。リン酸化タンパク質またはペプチドを結合溶液と共に、リン酸結合化合物／金属イオン錯体が、存在するリン酸化タンパク質またはペプチドと結合するのに十分な時間インキュベートする。この時間は２４時間以下であるのが好ましく、この時間が８時間未満であるのがより好ましく、このインキュベーション時間が２時間未満、５分以上であるのが最も好ましい。結合溶液と共にインキュベートした後にゲルまたは膜を、好ましくは酸性緩衝液およびアセトニトリルを含む混合物で洗浄するのが普通である；本発明において使用される有用な緩衝剤としては非制限的にＮａＯＡｃ、ギ酸塩および２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸がある。緩衝剤は洗浄溶液中に約２５ｍＭないし約１００ｍＭの濃度で存在するのが一般的である。その上洗浄溶液に任意にアセトニトリルを含めると、通常、非特異的標識化が低減することが判明した。アセトニトリルは１−７％の濃度で存在することが好ましく、３−４％がより好ましい。これに代わる洗浄溶液は１０−２０％の１，２−プロパンジオールからなる。
【０１３９】
こうしてリン酸結合化合物の結合および洗浄後、もしもリン酸結合錯体がフルオロフォアまたは発色団を含むならば、三成分錯体を直接照射し、リン酸化標的分子を可視化することができる。或いは、ブロット上のリン酸化標的分子の存在および位置を、標識に対する抗体、例えば抗−ＢＡＰＴＡ抗体、抗フルオロフォア抗体、抗ハプテン抗体またはアビジン（標識がビオチン誘導体である場合）などを使用して検出できる。後者はその後、ウエスタンブロット上のタンパク質を検出するために使用される標準的手段、例えばリン酸化標的分子の標識化を示す蛍光、化学ルミネッセンスまたは放射能などによって検出される。
【０１４０】
本発明の結合溶液のリン酸結合化合物は、種々のメジウム中におけるそれらのリン酸化標的分子に対する結合能力に依って選択される。したがってゲル中のリン酸化標的分子に結合するための好ましいリン酸結合化合物は本発明の化合物１−４および７−１１を含む。膜上のリン酸化標的分子に結合する好ましい化合物は本発明の化合物１、４および７を含む。
【０１４１】
２−Ｄゲル中のリン酸化タンパク質またはペプチドを確認する特別の利点は、ホスホプロテオームを正確に確認し、リン酸基の付加または離脱に関するタンパク質の翻訳後修飾を定量することができることである。より詳細に述べれば、リン酸化タンパク質またはペプチドを標識化し、その間同時にまたはその後に総タンパク質染色を実施することは、リン酸化プロテオームを確認し、その一方でそのシグナル強度を総タンパク質染色に比較して、リン酸化レベルに補正することができる（実施例６、７および１３を参照）。総タンパク質に特異的な任意の蛍光色素を使用してゲル中の総タンパク質を染めることができる；好ましい染色はゲルのためのＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ色素または米国特許第６３１６２７６Ｂ１号に開示されている任意の色素である。ＭＤＰＦおよびＣＢＱＣＡなどその他の蛍光色素も膜上の検出に使用される。ＳＤＳは本発明の染色混合物で染色する前に洗浄によって除去されるから、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ色素のような総タンパク質色素が好ましい、というのは、ＳＤＳはそれらの染色機能に関しては重要でないからである。しかし染色感度のためにＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｅｄ色素およびＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｔａｎｇｅｒｉｎｅ色素などの、着色感度のためにＳＤＳを必要とする色素を使用する際にはプロトコルの変化が行われ、総タンパク質の着色工程の前にゲルにＳＤＳを加え直し、総タンパク質を着色するための着色溶液にＳＤＳを含める（Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２００１）２２（５）：９１９−３２）。ＳＤＳをゲルに加え直すための好ましい混合物は、２％酸／０．０００５％ＳＤＳおよび任意に４０％エタノールであり、その際ゲルを少なくも１時間インキュベートする。或いは、総タンパク質着色は本発明のリン酸化標的分子着色の前に行うことができる；そのため、この場合にはゲルにＳＤＳを加え直す必要はなく、本発明によって考慮されるようにリン酸化標的分子着色工程の前に単にＳＤＳを除去するだけでよい。したがってゲルのまた別の好ましい総タンパク質着色は非制限的に、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｔａｎｇｅｒｉｎｅ色素およびＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｅｄ色素または米国特許第５６１６５０２号または米国特許出願第０９／６３２９２７号に開示されている任意の色素を含む。或いは、あまり好ましくないとはいえ、ゲルの総タンパク質着色はクーマッシーブルーまたは銀染色を含む。それらは当業者に公知の着色技術を利用する。或いは、着色ブロットのために有用な総タンパク質色素はＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｏｓｅ  Ｐｌｕｓ色素およびＤｙｅＣｈｒｏｍｅ（登録商標）色素または米国特許第６３２９２０５Ｂ１号および米国特許出願第１０／００５０５０号に開示されている任意の色素溶液である。
【０１４２】
２−Ｄゲルにおけるリン酸化標的分子の標識化は、糖タンパク質の着色を含むことである、この際プロテオームの３−ｗａｙ分析を実現できる（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １：８４１−８５５（２００１））。好ましい糖タンパク質色素はＰｒｏ−Ｑ（登録商標）エメラルド３００色素またはＰｒｏ−Ｑ（登録商標）エメラルド４８８色素、Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）Ｆｕｃｈｓｉａ色素または米国特許出願第０９／９７０２１５号に開示されているその他の任意の色素である。さらに、サンプルがオリゴヒスチジン親和性ペプチドとの融合タンパク質を含む場合、Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）サファイア３６５または４８８色素を使用してこれらのタンパク質またはペプチドを同時に検出することができる。
【０１４３】
このようにして単一の２−Ｄゲル電気泳動実験において本発明によってタンパク質の発現レベルおよびタンパク質の機能的特質、例えばタンパク質のリン酸化などを両方共平行して確認することができる。画像分析ソフトウエア、例えばＣｏｍｐｕｇｅｎ’ｓＺ３プログラムまたはＰｈｏｒｅｔｉｘ  Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ソフトウエアなどを使用して分析することができる。任意の２画像を再画像化し、それら画像間の差を目で検査することができ、定量的情報を、計算した示差発現データと共に表の形で容易に取り出すことができる。
【０１４４】
或いは、一次元ポリアクリルアミドゲルおよび対応ブロットを上に記載の着色法および色素を使用して総タンパク質または糖タンパク質に関して同時にまたは引き続き染めることができる。本発明の方法を使用して標識されたゲルまたはブロットを対比染色する特別の利点は、非特異的標識化と、少数のリン酸基を有するリン酸化標的分子の標識化とを区別できることである。これはリン酸化程度がわずかに変化したリン酸化標的分子を正確に確認するために重要である。
【０１４５】
ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙなどの総タンパク質色素でブロットまたはゲルを対比染色すると本発明の色素から発生する蛍光シグナルを総タンパク質色素から発生する蛍光に比較して比較分析（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ）することができる。（図１１および実施例２２を参照）。この比較分析は分子の全体的リン酸化状態並びにリン酸基の付加または除去に関するリン酸化標的分子の化学量論的測定も可能にする。
【０１４６】
ポリアクリルアミドゲルにおいて分離されたリン酸化タンパク質またはペプチド類を着色するためのその他の特別な利点が得られるのは、本発明の化合物のスポッと検出をその後の分析のための質量分析法と組み合わせることによって対象のタンパク質を分析する場合である。例えば、リンタンパク質類はゲル中で同時に移動するため、対象のリンタンパク質を特異的に確認し分析するためにはその後の分析が必要であり、または望まれる。このようなその後の分析は、あるタンパク質から誘導されるペプチド塊の一組の測定によって、すなわち質量分析（ＭＳ）によるペプチドマッピングによって、または個々のペプチド類からのアミノ酸配列情報を得ることによって、すなわちＭＳ／ＭＳまたはエドマン分解によるタンパク質配列決定によって達成できる。こうして本発明の組成物および方法を使用してひとたび確認されたタンパク質バンドまたはスポットをゲルから切り取り、すすぎ、任意に還元およびＳ−アルキル化し、その後ゲル中で配列特異的プロテアーゼ、例えばトリプシンなどで標準的プロトコルを使用して現場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）消化する。Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：８５０−５８（１９９６）を参照されたい。こうして生成したペプチド混合物をゲルから抽出し、標準的プロトコルによってＭＳで分析する。ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  レーザー脱着／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析が非常に感度がよいことが多い。タンパク質のゲル中消化のための方法は  Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．２：７４−８９（１９９８）に記載されている。
【０１４７】
本発明は、非制限的に、米国特許出願第２００２／００７６７２７号；米国特許出願第２００２／０１０６７８５号；米国特許出願第２００２／００５５１８６号；ＷＯ９９／３９２１０；ＷＯ００／６３７０１；ＷＯ０２／２５２８８号；ＷＯ０１／１８５４５号、ＷＯ００／０４３８０号および米国特許第６４０３３６８号；第６４７５８０９号；６３６５４１８号；第６４０９９２１号；第５５９５９１５号；第６４６１８０７号；第６３９９２９９号に開示される方法およびアレイを含む広範囲のミクロアレイ・フォーマットに使用されるように考慮されている。ヒドロゲル−コーテド−スライドなど、アレイに固定されたリン酸化標的分子、例えば米国特許第号特許第６３７２８１３号；第６３９１９３７号；第６３８７６３１号；第６４１３７２２号に開示されたものおよびパーキン・エルマーによって製造されたものなども、本発明の方法および組成物を使用して検出できる（実施例１８および１９）。或いは、リン酸結合化合物をこれらのアレイに固定することができる。
【０１４８】
アレイ上のリン酸化標的分子を検出するための本発明の方法は一般的には次の工程を含む：
ｉ）前記サンプルをアレイ上に固定する；
ｉｉ）工程ｉ）のアレイを結合溶液と接触させる、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の前記アレイと前記結合溶液とを、前記化合物が間接的に前記リン酸化標的分子と結合するのに十分な時間インキュベートする；
ｉｖ）前記化合物を適切な光源で照らし、それによって前記リン酸化標的分子を検出する。
【０１４９】
当業者に公知の方法、例えば非制限的に、圧（ｐｉｅｚｏ）アレイプリンタまたはその他のアレイプリンタ技術を使用し、リン酸化標的分子を固定し、抗体などの分子を結合し、サンプルを加えてアレイ上のリン酸化標的分子に非共有結合させるなどの方法によってサンプルをアレイに固定する。一般的にはアレイはサンプルに共有結合する分子、またはサンプルに選択的に結合するタンパク質に結合する分子、例えばアミン反応基などを含む。
【０１５０】
アレイを結合溶液と十分な時間インキュベートし、リン酸結合化合物、金属イオン（一般的にはガリウム）およびリン酸化標的分子との間に三成分錯体を形成させる。或いはアレイはアレイ表面に固定された金属イオンと錯体を形成したリン酸結合化合物を含むことができる−−その際サンプルはアレイと共にインキュベートされる−−、そして標的分子が金属イオン／リン酸結合錯体と結合し、照射されると一般的にリン酸化標的分子の検出が行われ、非結合のサンプルは洗い流される。このやり方で、ホスファターゼまたはキナーゼを検出するアッセイが適切なペプチドまたはタンパク質基質で行われ、生成したリン酸化または脱リン酸化ペプチドまたはタンパク質がスポットされ、またはアレイ上で合成される；その際ペプチド上のリン酸基はアレイ上のリン酸結合化合物／金属イオン錯体に結合する。或いは、キナーゼおよび／またはホスファターゼ基質がアレイ上にスポットされ、または合成され、その後酵素キナーゼ（およびＡＴＰ）またはホスファターゼがそのアレイに加えられる。酵素を除去した後、そのアレイを用いてリン酸化標的分子を検出および／または分離し、標的分子へのリン酸基の添加および／または標的分子からのリン酸基の離脱を起こす酵素類およびそれらの効率を決定する。
【０１５１】
一般的にはホスファターゼおよびキナーゼのペプチド基質は標的プロトコルを用いてスポッティングまたは合成することによってアレイに固定され、そのホスファターゼまたはキナーゼ酵素（未知のサンプルを含むか、または分離された酵素である）が加えられ、その後リン酸基の存在が本発明の結合溶液を使用して検出される。例えば、本発明の方法および結合溶液は例えば種々のタンパク質キナーゼのためのタンパク質基質アレイ（例えばミオシン軽鎖、ＭＡＲＣＫＳ、ミエリン塩基性タンパク質、カゼイン、ｓｒｃ−抑制Ｃキナーゼ基質、インスリン受容体基質１、核因子９０、Ｒａｐ１、転写因子ｓｔａｔ５ａ）と共に有用である。ホスファターゼまたはキナーゼ酵素を含むサンプルを、酵素基質を含むアレイと共にインキュベートする；適切な条件下でそれら酵素のための適切な反応添加物と共にインキュベートした後、リン酸化生成物を本発明の結合溶液で検出できる。検出可能標識が例えばフルオロフォアである場合、蛍光シグナルの座標が、液中に存在するキナーゼの読みおよびアレイ上の種々の酵素基質（ペプチドまたはタンパク質）に対するそれらの活性を与える。アレイでリン酸化標的分子を検出することは多くの可能性を与える。上記の説明は、本発明をアレイ技術と組み合わせて使用する方法に制限されるものではない。
【０１５２】
本発明のキナーゼおよびホスファターゼアッセイは例えばチロシンキナーゼのインヒビタおよびアクチベータのスクリーニングも可能にし、それに加えてキナーゼおよびホスファターゼ酵素のモニターおよび精製も可能にする。その上、アレイ上の酵素基質の検出によって、本発明の方法はキナーゼおよび、ホスファターゼのための公知の溶液ベースのアッセイに比べて感度が遥かに高まり、アレイ上で検出するための蛍光または化学ルミネッセンスの利用は、放射化学的検出に比べてより高密度の標識化を可能にする。
【０１５３】
上記のように、キナーゼ基質を、マイクロプレート、重合ビーズまたはヒドロゲル・アレイのようなアレイを含む表面、固体または半固体基質に共有または非共有結合させ、アッセイを非連続的な不均一なやり方で行う。このキナーゼ基質はキナーゼ・コンセンサスリン酸化部位、好ましくはペプチドまたはランダムポリマー（ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ：Ｔｙｒ）、ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ：Ａｌａ：Ｔｙｒ））を含む。このキナーゼ基質は任意にフルオロフォアを含む。キナーゼを含むと予想されるサンプルをＡＴＰと共にキナーゼ基質と組み合わせる；その際活性キナーゼ酵素はリン酸をキナーゼ基質に結合させる。リン酸基の結合を、キナーゼ溶液の除去および十分な洗浄後に測定する。その際上記の結合溶液がそのキナーゼ基質に加えられる。一般的にはリン酸結合化合物はフルオロフォアを含み、キナーゼ活性はそのフルオロフォアを照射することによって測定される。或いは、リン酸結合化合物はペルオキシダーゼのような酵素を含む；その際キナーゼ活性は、適切な酵素基質の添加、蛍光測定器、または色や化学ルミネッセンスの測定機器による検出後に、測定される。さらに、そのアッセイに、選択されたキナーゼまたはホスファターゼのインヒビタを使用して、例えばオルトバナジン酸ナトリウムの使用によってキナーゼの特異性を高めてもよい。さらに、本発明のアッセイ法を使用してキナーゼおよび／またはホスファターゼのインヒビタまたはアクチベータをスクリーニングすることができる。或いは、ホスファターゼ基質、リン酸化ペプチドまたはタンパク質がマイクロウェルプレート、重合体粒子またはヒドロゲルなどの固体または半固体基質に結合している場合、このアッセイはホスファターゼ活性の測定のために容易に適応できる。
【０１５４】
本発明の材料および方法は、ＦＲＥＴベースのアッセイによってキナーゼまたはホスファターゼを検出および／または定量するためにも使用できる。例えばフルオロフォアで標識したペプチドをリン酸結合化合物／金属イオン（一般的にはガリウム）錯体のフィコエリトリン誘導体と組み合わせることができる。そのペプチドがリン酸化されると、そのペプチドはフィコエリトリンと結合し、このアッセイにおいて発光最大値がシフトする。例えばペプチド上ユーロピウム−ベース−キレートおよびリン酸結合化合物／金属イオン錯体のアロフィコシアニン誘導体を用いて時間分解性蛍光を得ることができる。ドナーフルオロフォアはこの例では３３５ｎｍで励起することができ、６２０ｎｍから６６５ｎｍへの発光シフトはペプチドが金属キレータおよびガリウム錯体と相互作用することを示す。
【０１５５】
こうして、本発明の一つの局面において、ニトロゲナーゼ、ホスホリボシル−ピロリン酸・シンテターゼ、ウンデカプレニル−ピロリン酸・シンテターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ヌクレオシド三リン酸ピロホスホヒドロラーゼ、ピロリン酸−フルクロース６−リン酸１−ホスホトランスフェラーゼ（ＰＦＰＰＴ）、アデニルトランスフェラーゼ硫酸、ＵＴＰ−グルコース１−リン酸  ウリジニルトランスフェラーゼ（ＵＧＰＰ）、アスパラギン・シンテターゼ、およびＵＤＰ−グルコース・ピロホスホリラーゼなど、多数の酵素が無機ピロリン酸化合物の代謝に関係し、したがって開示された発明によって定量する標的となり得る。
【０１５６】
さらに、本発明の方法および材料はリガンド・オーバーレイ法を含む機能的プロテオミックスの研究にも有用である。例えば配列したタンパク質をホスファチジルイノシトール４、５−ビホスフェート（Ｐ１Ｐ２）と共にインキュベートし、その後上記結合溶液と共にインキュベートした後、上記タンパク質を検出する。標識化の差がホスファチジルイノシチド−結合タンパク質の重要な種類を映し出す。ＳＷＩ／ＳＮＦ様ＢＡＦ、クロマチン・リモデリング錯体およびコフィリン／ＡＤＦ（遍在するアクチン結合タンパク質）などのタンパク質類は本発明の方法を使用して確認できるかも知れない（Ｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９（５）：２８２４−９（２００２））；Ｏｊａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４０（５１）：１５５６２−９（２００１）。リガンド・オーバーレイ・アッセイのまた別の例は、ＧＴＰ結合タンパク質である；ここで小ＧＴＰ結合タンパク質は高分解能２−Ｄゲル電気泳動によって分離され、その後復元条件下でニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜に移し、ＧＴＰで試験することができる。結合ＧＴＰはその後本発明の結合溶液と結合し、ＧＴＰ−結合タンパク質の確認が行われる。種々のその他の膜オーバーレイ・ヌクレオチド−結合アッセイが本発明の結合溶液を使用して行われる；その際、その一組の少なくも一つがリン酸基（１個または複数）を含む場合は、任意のリガンドおよび結合タンパク質を使用して新規の結合タンパク質を多分確認することができる（Ｇｒｏｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１９９４）３−４：４７８−８１）。
【０１５７】
リン酸化標的分子またはリン酸結合化合物を固定して含むことに対して、本発明の組成物および方法は、溶液中に遊離しているリン酸化標的分子の結合、検出および分離にも有用である。リン酸化標的分子を含むと推測されるサンプルを、蛍光色素−標識化リン酸結合化合物を含む結合溶液と共にインキュベーとする；その際リン酸化標的分子は蛍光分極によって検出される（実施例１４）。蛍光分極は、フルオロフォアによる発光が回転放散によって脱分極されるという知見、または分子が溶液中でタンブルする速度に基づく。Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｒａｄ．１：３９０−４０１（１９２６）を参照されたい。こうして溶液中のリン酸化標的分子を検出する際には、本発明の化合物および方法は米国特許第６２０７３９７号に記載されているように、蛍光分極を利用することが考えられる。リン酸化標的分子の検出は、蛍光色素−標識化リン酸結合化合物がリン酸化標的分子、例えばリンタンパク質の結合によって分子量の変化を受けると分極の変化が起こる、という考察に基づく。図１０を参照されたい。
【０１５８】
予想に反して、比較的高濃度の、化合物５のようなより疎水性のリン酸結合化合物を等モル量の金属イオンと共におだやかな酸性環境で使用する際、リン酸化標的分子、一般的にはペプチド類を三成分錯体の不溶性を利用して錯体溶液から分離することもできる。リン酸化標的分子を溶液から分離するための本発明の方法は下記の工程を含む：
ｉ）サンプルを本発明の結合溶液と接触させ；
ｉｉ）工程ｉ）のサンプルおよび結合溶液を、前記化合物とリン酸化標的分子とが結合するのに十分な時間インキュベートし、三成分錯体を形成し；
ｉｉｉ）前記錯体を前記溶液から分離し、それによって前記リン酸化標的分子を分離する。
【０１５９】
本発明の疎水性リン酸結合化合物は、検出目的のための結合溶液より１００倍までの濃度で結合溶液中に存在する場合、通常不溶性凝集体を形成し、そのとき三成分錯体が生成する。ある種の疎水性リン酸結合化合物のこの特性を利用してホスホペプチドの分離法を開発した。例えば、ある種の疎水性リン酸結合化合物を含む結合溶液を、三成分錯体の形成を容易にするようなやり方でサンプルと共にインキュベートする場合、上記錯体は遠心分離によって溶液から沈殿する（実施例１３）。そのため、一般的には結合混合物およびサンプル溶液をボルテックスし、または当業者に公知の方法で混合して、結合（凝集体の形成）を容易にすると同時に三成分錯体の沈殿を阻止する。三成分錯体の形成後、沈殿した錯体を分離するような方法で溶液を処理する；その際好ましい方法は遠心分離である。生成したペレットはリン酸化標的分子を含み、それをその後ＭＳなどの方法でさらに分析できる。この方法は錯体からのホスホペプチドまたはリンタンパク質のアフィニティ”プル−ダウン”を利用し（例えば細胞抽出物タンパク質の消化）、それによって酸性ｐＨでリン酸結合化合物は金属（一般的にはガリウム）イオンおよびホスホペプチドまたはリンタンパク質と錯体化し、沈殿を形成する。さらに溶液からリン酸化標的分子を沈殿させるために使用する方法においては、アルミニウムイオン、および鉄イオンを含む塩化第二鉄を使用して三成分錯体を形成することもできる。
【０１６０】
本発明は凝集後のリン酸化標的分子の分離も考慮する。その際リン酸結合化合物をリン酸化標的化合物から除去し、リン酸結合化合物のない溶液が生成する。これは、リン酸結合化合物が任意にハプテンのようなタグを含む場合に実現する。この際このタグ標識は、リン酸結合化合物をリン酸化標的分子から引き離す道具として機能する。好ましいタグ標識はビオチンである；その際ビオチン結合タンパク質を含む基質が、リン酸結合化合物をリン酸化標的分子から分離するためのメジウムとして使われる。より詳細に述べれば、生成した沈殿ペレットを、金属イオン、リン酸結合化合物およびリン酸化標的分子錯体を解離させる溶媒、例えばｐＨ約７−１０の塩基性溶液中またはＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのキレータを含む溶液中に再懸濁する。その溶液をその後ビオチン結合タンパク質に結合したセファロースビーズを含むカラムなどの基質に加える。そこではビオチンを含むリン酸結合化合物はビーズに結合し、リン酸化標的分子はカラムを通過する。生成した溶出液はリン酸結合化合物のないリン酸化標的分子を含む。これはある用途には望ましい。或いはリン酸結合化合物、金属イオンおよびリン酸化標的分子の解離混合物を、ビオチン結合タンパク質を含むビーズと共にスラリーとしてインキュベートすることができる。その際サイズ排除または遠心分離などの重力によるビーズの除去によってリン酸結合化合物のないリン酸化標的分子の溶液が生成する。沈殿可能の三成分錯体の形成のために好ましい化合物は化合物２、５、９、１２、２０、２１および２２などである。
【０１６１】
ある場合には、リン酸結合化合物を、アフィニティー精製を必要とせずにリン酸化標的分子から除去することができる。このやり方では凝集した三成分錯体を有機抽出緩衝液（実施例２７）と接触させる。ペレットをアセトニトリル、クロロホルムなどの有機溶媒および水と混合すると、水性相に入るリン酸化ペプチド、および有機相に溶解するリン酸結合化合物が生成する。
【０１６２】
分離したリン酸化標的分子は多数の方法、例えば非制限的にゲル電気泳動法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどによって分析できる。さらに、以下に記載するように、ホスホペプチド類はβ−脱離を用い、その後求核原子を添加して誘導体化し、リン酸化部位の確認を容易にする。
【０１６３】
溶液中の錯体サンプルからのリン酸化標的分子の分離に加えて、本発明は固定されたリン酸結合化合物を使用してリン酸化標的分子を捕獲するという標的分子の分離も考慮する（実施例１５、２５および２６）。これは多数のやり方で行われ、その方法はアフィニティーカラム、フェロフルード・ビーズおよび膜を用いて例示される；しかしこの方法は例証に過ぎず、本発明の方法を制限するものではない。
【０１６４】
固定されたリン酸結合化合物を使用して溶液からリン酸化標的分子を分離する本発明の方法は、一般的には次の工程を含む：
ｉ）固定されたリン酸結合化合物を含む基質であって、金属キレート化部分が式ＩＶを含んでなる基質を、金属イオンを含む塩で帯電し；
ｉｉ）上記基質をおだやかな酸性の結合緩衝液で平衡化し；
ｉｉｉ）サンプルを上記基質に加え、リン酸化標的分子は工程ｉｉ）の基質に結合し；
ｉｖ）リン酸化標的分子を基質から溶出し、前記リン酸化標的分子は分離される。
【０１６５】
基質はポリマー膜、アガロース、ラテックスなどのポリマー粒子、磁気またはセファロースビーズ、およびスライド、ビーズまたは任意の繊維類などのガラスを含む当業者に公知の任意の基質でよい。ビーズはスラリー中に存在するか、またはサンプルが通過する充填カラムとして存在し、膜類はリン酸化標的分子を捕獲する。このようなカラムの例はアガロースに結合した（例えば化合物１３および１４）または樹脂に結合した（固定アフィニティーカラム（ＩＭＡＣ））リン酸結合化合物を含むアフィニティー基質である。この方法に利用されるその他の化合物は特に化合物１５、２０、２１および２２である。
【０１６６】
アフィニティーカラムまたは有機抽出緩衝剤を使用して分離リン酸化標的分子からリン酸結合化合物を取り除く沈殿法とは異なり、本発明の方法の基質はまさにリン酸結合化合物の金属キレート化部分の構成成分を任意に含むことができる；その構成成分は金属塩の添加後、金属（好ましくはガリウム）イオンと結合する。しかし式（Ａ）ｍ（Ｌ）ｎ（Ｂ）を有するリン酸結合化合物は次のような基質を形成することができる：すなわちその基質においてＡが反応基であり、その反応基を利用してＬによってＢが基質物質に結合する。このように上記基質はサンプルの添加前に金属イオンによって帯電する。その後この基質をおだやかな酸性の結合緩衝液で平衡化する；或いは金属イオンおよび酸性結合緩衝剤液が一つの溶液中に存在する。酸性結合緩衝液は結合溶液として同じ成分類を使用するのが一般的である。酸性結合緩衝液中のサンプルをその後混合物に加える。この混合物中ではリン酸化標的分子が、金属キレート化部分に錯化した金属イオンと結合する。リン酸化標的分子の分離は、リン酸結合化合物（金属キレート化部分）、金属イオンおよびリン酸化標的分子の三成分錯体を解離する溶液の添加によって達せられる。溶出溶液が塩基および塩基性ｐＨ緩衝剤を含むのが好ましい。有用な塩基には、非制限的に、水酸化バリウム、水酸化ナトリウムおよび水酸化アンモニウムがある。これらに代わる塩基性アミン溶液も有用な溶出剤である。サンプルおよび金属イオンリン酸化標的分子錯体と適合し、その錯体を解離する任意の塩基が好ましい。さらに、アセトニトリルなどの有機溶媒は、リン酸化標的分子をリン酸結合化合物基質から溶出するのに有用であり、その後リン酸化標的分子をＭＳなどによって分析するので、より好ましい。
【０１６７】
多くのリン酸化標的分子は少量しか存在しないことがよくあるため、本発明の分離法はそのようなリン酸化標的分子の精製および富化のために特に有用である。これらの方法は粗ペプチド混合物からリン酸化ペプチド類を精製するために有用であり、この精製は、後にＭＡＬＤＩ、ＭＳまたはナノ電子スプレータンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によってペプチド類を分析する方法においては有用である。アフィニティー基質によって精製および／または富化され、または複雑な溶液から分離されたサンプルを用意するために非常に種々様々の方法が使われることが考えられる。例えば乾燥分離されたホスホペプチドを水に再懸濁し、その後ＬＣ−ＭＳ分析をする。
【０１６８】
本発明のＩＭＡＣはＧｙｒｏｓＡＢ（アップザラ、スエーデン）によって開発されたＣＤテクノロジーなどのマイクロ流体素子学的目的にも容易に適応できる。その際、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるペプチドマッピングなどのプロテオミック分析のためのサンプルの高処理量スクリーニングが実現される。つまり、ＧｙｒｏｓＡＢテクノロジーは数百の微小構造（カラム）を有するＣＤマイクロラボラトリーを含む：ここではサンプルは遠心分離速度に基づきカラムを通過して流れ、溶出したサンプルはＣＤで分析され、タンパク質消化からＭＳ分析まで全工程をＣＤ上で行うことができる。カラムにはＢＡＰＴＡ化合物（化合物１３または１４）を含む粒子を充填することができる；サンプルをそのカラムを通過させ、蛍光または化学ルミネッセントシグナルによってリン酸化ペプチド濃度を分析するか、またはＣＤ上の基質に適用し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析をする。こうして本発明の方法はサンプルの高処理量スクリーニングのためのマイクロ流体素子学にしたがう。これはプロテオミック研究のために有益である。
【０１６９】
本発明は、混合物中のリンタンパク質またはホスホペプチドの迅速定量分析のための質量分析ベースの方法で使用するための分析用試薬および方法を提供する。これらの試薬および方法をタンパク質類サンプル混合物中のタンパク質の検出および確認に適用できる。この方法によって分離されたペプチドは混合物中にタンパク質が存在することを特徴づける。分離ペプチドまたはタンパク質は質量分析（ＭＳ）法によって、そして配列データベース検索技術の適用によって特徴づけられ、その配列ペプチドの元であるタンパク質が確認される。
【０１７０】
以下の参考文献は、タンパク質同定のための質量分析法の例であり、本発明の材料および方法に関して利用できる：Ｉｄｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：９２９−９３４（２００１）；Ｇｙｇｉ  ＆  Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：３９６−４０１（２０００）；Ｇｏｏｄｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：１１１２−８（２０００）；Ｇｏｏｄｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４：３４４−８（２０００）；ＭｃＬａｃｈｌｉｎ  ＆  Ｃｈａｉｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：５９１−６０２（２００１）；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  ＆  Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：２６９−２９５（２００１）；Ｖｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６９５９−６６（２００１）；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７５−８（２００１）。当業者はこれらの現在使用できる質量分析法が本発明の材料および方法と適合することを理解する。しかし、本発明はこれら材料および方法が質量分析法と共に使用でき、しかも同じまたは同様な結果を得るために役立つことも考慮する。さらに本発明によって、検出前に、ホスホペプチドを逆相、正常相またはイオン交換カラムにかけ、不都合な物質を上記ホスホペプチドサンプルから除去することができる。
【０１７１】
本発明はまた別の検出、精製および／または富化法も考慮する。例えば本発明の材料および方法を、ラテックスマイクロビーズを２種類のフルオロフォアで標識化することを含むＬｕｍｉｎｅｘ法（米国特許第５９８１１８０号および米国特許第６２６８２２２号）と共に使用してもよい。２種類のフルオロフォアの正確な比率を用いて、多くの異なるビーズのセットを作ることができる：その各々は上記２種類の色素の比によって生じるカラーコードに基づき、レーザービーム中で特異的であり、識別可能である。特異なビーズのセットに結合する特異的分子に対する捕獲抗体の代わりに、本発明の金属キレータを使用することができる、すなわちリン酸結合化合物および金属イオン錯体またはビオチン標識化リン酸結合化合物類に結合するビオチン結合タンパク質類である。だがサンプルに結合する抗体を使用し、リン酸化標的分子を本発明の結合溶液で検出することもできる。例えば、被検体がビーズ上の金属−キレータ錯体に結合した後、フィコエリトリンに結合したディテクタ抗体をレポータとして使用してもよい。最終結果はカラー・コーデド・ミクロビーズ上の抗体／金属−キレータ・サンドイッチアッセイである。上記ビーズおよびレポータ分子はＬｕｍｉｎｅｘ１００機器において、それらがフローセルを通過する際に二重レーザーシステムによって読み取られる。１つのレーザーがそのビーズ（アッセイのためのカラーコード）を検出し、他のレーザーがレポータシグナルを検出する。こうして、本発明では、リン酸化標的分子の分離および検出のためのビーズ検出にしたがって、ディテクタ抗体の代わりに金属キレート化錯体が使用できることが考慮されている。
【０１７２】
代わり得るものとして、自動ビーズおよび粒子捕捉装置のための磁気ビーズ分離、例えばデキスタ・マグネティック・テクノロギジー（Ｄｅｘｔｅｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるライフセプ（ＬｉｆｅＳｅｐ）磁気ビーズまたはキャプティベート（Ｃａｐｔｉｖａｔｅ）・フェロフルード（モレキュラー・プローブス社）が本発明の材料および方法に使用でき（米国特許第６４１３４２０号；米国特許出願第０８／８６８５９８号；米国特許出願第２００２０１１７４５１号；米国特許第４３３９３３７号；米国特許第５８３４１２１号）、またはフェロフルードビーズが使用できる（実施例２７）。磁気分離は小さい磁気ビーズに付着した特異的アフィニティコーティング、例えばリン酸結合化合物によって機能する。ビーズとリン酸化標的分子を含むサンプルとを、上記リン酸化標的分子がビーズ上の金属イオン／リン酸結合化合物にしっかりと結合する機会が生じるように混合する。ひとたび付着すると、上記ビーズと三成分錯体とを、強い磁場によって分離することができる。これらの工程により、リン酸化標的分子はビーズ上に結合したまま残してもよいし適切な溶媒または塩基性緩衝液中で洗うことによって遊離することもできる。こうして効率的な迅速な分離が可能であり、したがって本発明は、リン酸結合化合物／金属イオン錯体を磁気ビーズ分離のための公知の方法で使用することも考慮している。
【０１７３】
このようにリン酸化標的分子の分離、精製および富化のためには、固定アフィニティ基質の新規の使用を含む非常に多様な材料および方法が提供される。
【０１７４】
本発明はリン酸化セリン、スレオニンまたはチロシンアミノ酸の識別分離および同定のための化合物および方法を提供する。リン酸化標的分子を、質量分析またはその他の類似の方法を使わずに標識化および分離するための上記の材料および方法は、一般的にタンパク質のリン酸化を検出するために用いられるが、そのタンパク質またはポリペプチド上のリン酸の特異的位置に関する情報は与えない。本発明は固定アフィニティ基質または上記の沈殿法によって得られ、分離されたリン酸化タンパク質またはペプチドをさらに分析してリン酸化ペプチド類を識別確認することも考慮する。分離したリン酸化タンパク質をタンパク質消化し、その後酸加水分解またはアルカリ加水分解して、分析する。
【０１７５】
水酸化バリウムまたは水酸化ナトリウムのような塩基はペプチド類の脱リン酸化を触媒し、活性デヒドロアラニン誘導体を形成する。この化合物はアミンまたはチオール含有化合物による攻撃を受けやすく、元のホスホペプチドの安定な誘導体を形成する。これらの誘導体はより疎水性であり、そのためＨＰＬＣ、質量分析、またはエドマン配列決定によって同定されやすい。使用条件下では、ホスホセリン残基は脱離および付加を受け、ホスホスレオニン残基は、脱離を受けるが付加は受けず、ホスホチロシン残基は上記処理によって変化しない。この知識によって識別確認が行われる。エドマン分解においては、酸または塩基の送達中にリン酸がβ脱離され、精製するデヒドロ−アミノ酸は速やかにジチオトレイトール（ＤＴＴ）付加物を形成する。Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：７７６（１９９３）を参照されたい。対照的に、セリンおよびスレオニン上のＯ−Ｈｅｘ−Ｎ−Ａｃはエドマン分解において安定である。Ｇｏｏｌｅｙ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：５５７（１９９７）を参照されたい。このように本発明を利用してセリンまたはスレオニンリン酸化およびグリコシル化を識別することができる。
【０１７６】
エドマン分解は、β−脱離および誘導体後にセリンおよびスレオニンを定量する有効な方法である。Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．８０８：２３−４１（１９９８）を参照されたい。これらの修飾生成物も酸加水分解に抵抗し、逆相ＨＰＬＣ分析によって定量することができる。Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３９７：１１３（１９８７）および  Ｈｏｌｍｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：２１（１９８７）などを参照されたい。同様なアプローチを使って、毛細管ゾーン電気泳動およびレーザー誘起性蛍光による特徴づけによって、ペプチドおよびタンパク質のホスホセリン含有量を定量する。Ｆａｄｄｅｎ  ＆  Ｈａｙｓｔｅａｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２５：８１（１９９５）。
【０１７７】
ナノエレクトロスプレーＭＳ／ＭＳはリン酸化部位を正確に決定するためのホスホペプチド配列決定に使用される。Ｓｔｅｎｓｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １：２０７−２２２（２００２）。ゲル内消化は、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：８５０−５８（１９９６）およびＪａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５１３−３０（１９９８）に記載されたように行うことができる。本発明は、上記材料および方法を質量分析法と共に使用して同じ結果が得られることも考慮している。
【０１７８】
ホスホペプチドの配列およびリン酸化部位（１箇所または複数）の確認は、タンデム質量分析とコンピューターによるデータベース検索プログラムの組み合わせによっても決定することができる：例えばＳＥＱＵＥＳＴ（商標、ワシントン大学、シアトル  ＷＡ）（ＭｃＣｏｒｍｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：７６７−７７６（１９９６）；Ｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９７６−９８９（１９９４）；米国特許第５５３８８９７号など。種々のＭＳ法が提供され、これらの方法に使用できるが、ＭＡＬＤＩ／ＭＳおよびエレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ／ＭＳ）法が一般的に使用される。
【０１７９】
２．サンプルの調製
サンプルはリン酸化標的分子を含む任意の材料、キナーゼおよびホスファターゼと相互作用する基質類、およびキナーゼおよびホスファターゼ基質と相互作用する物質類およびリン酸化標的分子と結合する任意の物質を含む任意の材料を含めると定義される。一般的にはサンプルは生物学的起源であり、組織、細胞または細胞集団、細胞抽出物、細胞ホモジネート、精製−または再構成タンパク質、組換えタンパク質、融合タンパク質、体液およびその他の生物学的液、ウィルスまたはウィルス粒子、プリオン、非細胞成分、または合成ペプチドまたはタンパク質である。本発明のサンプルの調製に使用される細胞性材料の考えられるソースは、非制限的に植物、動物、真菌、細菌、始原細胞、またはこのような有機体から誘導される細胞系を含む。サンプルは全血、血漿、血清、鼻分泌物、痰、唾液、尿、汗、経皮的浸出物、脳脊髄液などでもよい。或いは、サンプルは細胞からの全臓器、組織または細胞でよい。このようなサンプルのソースの例は、筋肉、眼、皮膚、生殖腺、リンパ節、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、充実腫瘍、マクロファージ、メソテリウムなどを含む。
【０１８０】
本発明の結合溶液と組み合わせる前に、サンプル中のリン酸化標的分子または酵素基質サンプルがリン酸結合化合物に近づけるようなやり方でサンプルを調製する。或いは、サンプルは酵素または、リン酸化標的分子と相互作用する結合タンパク質を含むことができる。一般的には本発明に使用されるサンプルは組織、細胞、細胞抽出物、細胞ホモジネート、精製−または再構成タンパク質、ペプチド、組換えタンパク質、生物学的液、脂質、アミノ酸、核酸および炭水化物または合成タンパク質を含む。しかし所望の標的（露出したリン酸基を含む標的分子）は、その他の別の生物学的成分が存在するため、結合溶液の添加前に精製または分離する必要がある。所望のリン酸化標的分子およびその他の別個の成分は、本発明の方法の過程において、互いに、またはサンプル中のその他の成分類から、移動度によって（例えば電気泳動ゲルまたは毛細管）、大きさによって（例えば遠心分離、ペレット化または密度勾配）または結合親和性によって（例えばフィルター膜またはアフィニティ樹脂）任意に分離することができる。例えば、サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルミドゲル上で分離する場合には、サンプルを先ず最初に、トリス、グリセロール、ＤＴＴ、ＳＤＳ、およびブロモフェノールブルーを含むＳＤＳ−サンプル緩衝液のような適切な緩衝液中で平衡化する。本発明の幾つかの局面においては、リン酸化標的分子は分析前に分離されないことが好ましい。
【０１８１】
分離に適さないサンプルソース、例えば全細胞または組織ホモジネートで始める際には、先ず最初にそのサンプルを、当業者に公知の技術を使用して調製する必要がある。サンプルの調製は、リン酸化標的分子がそのサンプル中にどのように含まれているかによる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０：６６０−６６３（１９９９）を参照されたい）。
【０１８２】
一般的にはサンプル中のリン酸化ペプチドおよびタンパク質は約５００ダルトンより大きい分子量を有する。より一般的には、リン酸化ペプチドおよびタンパク質は８００ダルトンより大きい。本発明の一局面において、リン酸化タンパク質はある範囲の分子量に相当する種々の分子量を有するリン酸化タンパク質の混合物を含む。その際そのリン酸化タンパク質は、標識化リン酸化タンパク質またはペプチドが正確に分析されるように、分子量の標準として使用される。本発明の方法を受けるリン酸化ペプチドを含むサンプルは天然または合成サンプルから作成することができ、リン酸化タンパク質サンプルの化学的、物理的または酵素的消化の結果でもよい。タンパク質は任意の酵素的方法、例えばトリプシン消化などを使用して消化できる。消化物中のペプチドは、タンデム質量分析法によるペプチドの配列決定を容易にするような大きさであることが好ましく、一般的には約１０ないし約５０アミノ酸長さの範囲の大きさである。或いは、これらのペプチドは本発明の方法におけるホスファターゼ基質としてもはたらき、このような酵素類を確認し、それらの量および／または酵素活性を測定することができる。
【０１８３】
燐脂質（ここでは燐脂質は標的分子である）を含むサンプル類は、それらの疎水性のため、固体または半固体の基質に適用する前に、燐タンパク質を含むサンプルに匹敵する改変を行って調製される。大部分のサンプルは一般的には、本発明の組成物および方法で結合する前に、ある種の抽出処理を必要とする。対象のリン酸化標的分子が組織サンプル、または細胞壁を有する有機体からのサンプルである場合、機械的または化学的破壊が必要である。適切な手段は当業者には公知であり、非制限的に組織ホモジナイザーまたはフレンチ・プレッシャ・セルを有機溶媒抽出と組み合わせて使用することなどを含む。細胞破壊および断片化法は  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９７）に記載されている。サンプルを種々の疎水性を有する溶媒で抽出する。最適溶媒は対象のリン酸化標的分子の性質に依存する。検出のために適したサンプルを生成する当業者に公知の抽出法が本発明によって考慮される。
【０１８４】
一般的に、リン酸化標的分子（タンパク質、ペプチド、炭水化物または脂質）は固体または半固体上または固体または半固体中に存在する。本発明の一局面において、この基質は電気泳動メジウム、例えばポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、直鎖ポリアクリルアミド溶液、ポリビニルアルコールゲル、またはヒドロゲルなどを含む。固体または半固体基質には膜、例えばフィルタ膜、ニトロセルロース、ポリ二弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、またはナイロン膜などもある。この場合リン酸化標的分子はブロッティング、スポッティング、電子ブロッティング（タンクおよびセミドライ）、毛細管ブロッティングまたは当業者に公知のその他の塗布法によって膜に固定される。本発明によれば、固体および半固体基質はガラススライド、プラスチック基質（例えばマルチ−ウェル−プレートまたはピン）、ガラスまたはポリマービーズまたは繊維または半導体材料も含む。リン酸化標的分子は支持体上に規則的パターンでまたはランダムに配列する。本発明の好ましいアレイはヒドロゲルガラススライド支持体であり、ここにサンプルのリン酸化標的分子が規則的パターンで配列している。本発明は、リン酸化標的分子が基質物質上の固定された後にリン酸化されることを考える。その場合酵素基質は固定され、適切な酵素およびリン酸が固定基質と共にインキュベートされる。本発明のある局面において、リン酸化標的分子は固体または半固体基質から遊離し、すなわち固定されておらず、水溶液中に可溶化された分子として存在することが好ましい。
【０１８５】
３．照射
典型的検出法において、本発明のリン酸結合化合物と結合後または結合中の任意の時に、サンプルを可視化し、それによってリン酸化標的分子が検出される。可視化には種々の方法があり、それはリン酸結合化合物の金属キレート化部分に共有結合している化学的部分Ａに依存する。化学的部分Ａが標識である場合、可視化は試薬を励起し、検出可能の光学的反応を生成する光の波長で照らし、その光学的反応を検出するための手段によって観察することを含むのが一般的である。本発明のリン酸結合化合物を照らすために有用な機器は非制限的に、手で持つ紫外線ランプ、水銀アーク灯、キセノンランプ、レーザーおよびレーザー・ダイオードを含む。これらのイルミネーションソースは任意にレーザー・スキャナー、蛍光ベースのマイクロプレート・リーダー、標準またはミニ蛍光光度計、またはクロマトグラフィー検出器に一体化している。標準または予測される反応と比較した結合度および／または結合部位は、サンプルが所定の特性、すなわちリン酸化標的分子を有するかどうか、そしてどの程度有するかを明らかにする。
【０１８６】
光度的反応は任意に目による検査によって、または下記の装置：ＣＣＤカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査デバイス、蛍光光度計、光ダイオード、量子カウンター、エピフルオレッセンス顕微鏡、走査顕微鏡、蛍光ベースのマイクロプレート・リーダーのいずれかを使用して、または光電子増倍管など、シグナルを増幅する手段によって検出される。
【０１８７】
検出可能の光学的反応は定量化され、サンプル混合物中のリン酸化標的分子のリン酸化度の測定に使用される。一般的に定量は、上記光学的反応を、調製した標準または検量曲線に比較することによって行われる。測定された光学的反応と、既知濃度のリン酸化標的分子の標準希釈から得られるものとを電気泳動ゲル、ヒドロゲル中でまたは膜上で比較するのが普通である。概して、正確な測定が望まれる場合はいつでも標準曲線を作成しなければならない。或いは、所望の試薬−標的結合物に対して標準化された標準色素または標準色素粒子との比較によって標準曲線が作成される。
【０１８８】
或いは、染色された電気泳動ゲルを使用して錯体サンプル混合物の組成を分析し、付加的にサンプル中の粒子状リン酸化標的分子の相対的量を決定する。これは、例えば分子上のリン酸基の数の決定、およびタンパク質量の増加と特定のタンパク質またはペプチド上のリン酸基の増加とを識別するための総タンパク質染色と組み合わせて実施できる。
【０１８９】
高周波誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ−ＭＳ）は環境−、生物−および医薬サンプルの痕跡元素分析のために有用な技術である。最近、レーザー・アブレーションＩＣＰ−ＭＳを使用し、燐を、βカゼインから遊離されるｍ／ｚ３１シグナルとして直接測定できることが電子ブロット膜で証明された（Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｓｔ  １２７：４５９−４６１（２００２））。五リン酸化タンパク質１６ｐｍｏｌｅがブロット上で検出できたとはいえ、この方法はポロアクリルアミドゲルでは非常に高いバックグラウンドシグナルのために成功しなかった。これは疑いもなく等圧種の存在およびポロアクリルアミドゲル基質から発生する隣接種および電気泳動緩衝成分とのオーバーラップによるものである。低濃度の燐の検出は、アルゴンＩＣＰにおける燐の低いイオン化度および質量３１（１５Ｎ１６Ｏおよび１４Ｎ１６Ｏ１Ｈ）で直接、質量３２（１６Ｏ２および３２Ｓ）で間接的に起きる多原子種の妨害の存在によって、ＩＣＰ−ＭＳに対して幾つかの分析的問題をあらわす。ＩＣＰ−ＭＳを使用して、本発明の方法で着色したリンタンパク質を検出することができた。検出法は下記の工程を含むと想定される。第一に、ゲル電気泳動によって分離されたタンパク質を固定してＳＤＳを除去する。典型的固定剤は４０％メタノール／１０％酢酸である。次に、ゲルを本発明の方法によってリンタンパク質について染色する。次に、ゲルを洗い、過剰の色素を除去する。より目立ったリンタンパク質をこの時点で蛍光画像によって可視化し、適切な洗浄時間の検査および調節によってバックグラウンド染色を最小にすることができる。その後ゲルを乾燥し、そのゲルを  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、に記載される方法に類似の方法によってレーザー・アブレーションＩＣＰ−ＭＳ法にかける。サンプリングは単一または多重斑点分析、直線走査またはラスタリングによって行うことができる。ラスタリングの場合は  Ｌｏｏ  ＲＲ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：４０６３−７０（２００１）に記載されるようにして得られたデータから仮想ゲルを構成することができる。ルテニウム含有ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ色素染色法を使用して、リンタンパク質染色からのガリウム（アルミニウムまたは鉄）シグナル、並びに総タンパク質染色についてルテニウムを独立的に定量できた。
【０１９０】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）などの非常に多様な機器を使用してリン酸化標的分子を検出できることが本発明によって予測される。一連の種々の方法、例えば自動高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−ＭＳ／ＭＳ、毛細管−ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、および固相抽出（ＳＰＥ）−毛細管ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）−ＭＳ／ＭＳなどが  Ｆｉｇｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １９：１８１１−１８１８（１９９８）に記載されている。
【０１９１】
蛍光分極を測定する際には多くの型のオートメーションが使用され、当業者には公知である。一例として、分極実験または測定のために備えられた任意の標準蛍光光度計を本発明のこの実施形態の実施のために使用し、混合物の照射および分極の測定の両方を行う。フルオロフォアを励起するのに適した波長は上記のようにそのフルオロフォアの性質に依存する。一般的には、カット−オフ・フィルターを使用して波長範囲を決める。その波長範囲はフルオロフォアの励起および発光波長によって決められる。例えば、フルオレッセイン標識ペプチドでは、一般的には４８５ｎｍの励起カット−オフ・フィルターを使用する。標準的蛍光光度計または蛍光ベース−プレート・リーダーなどを使用できる。付け加えると、オートメーションの当業者は種々の機器を使用して、本発明の材料および方法によって蛍光分極を測定できる。
【０１９２】
１，２−ビス（２−アミノ−５，６−ジフルオロフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＴＦ−ＢＡＰＴＡ）または本発明に記載される任意の弗化物含有リン酸結合分子をガリウムと共に使用してリン酸化標的分子に結合することが、１９Ｆ−ＮＭＲ分光光度測定の使用によって検出された（Ｄｏｕｇｈｔｙ  ＤＡ，Ｔｏｍｔｓａ  Ｌ．Ｍａｇｅｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  １９９６；１４（７−８）：８６９−７３）。さらに、放射性ガリウム−６７（半減期：７８時間）、ガリウム−６８（半減期：１．１３時間）またはガリウム−７２（半減期：１４．１時間）を本発明の任意のリン酸結合化合物と共に使用して、オートラジオグラフィーまたはシンチグラフィーによって検出可能なシグナルを生成することができた。
【０１９３】
上述のように、本発明では非常に多様な検出法が使用されるが、好ましい方法は蛍光の使用を含むものである。リン酸化標的分子に同時に結合するリン酸結合化合物金属（好ましくはガリウム）イオン錯体からの蛍光は、普通の光顕微鏡または蛍光顕微鏡を含む種々の画像化法で可視化することができる。
【０１９４】
ＩＩＩ．発明のキット
リン酸化標的分子と相互作用する酵素を標識化、分離および同定するための適切なキットも本発明の一部を形成する。このようなキットは容易に手に入る材料および試薬からつくることができ、種々の実施形態に含まれる。キットと内容はアッセイプロトコルの設計または検出または測定のための試薬に依存する。全てのキットは説明書、適切な試薬類およびリン酸結合化合物、分離メジウム、および必要に応じて固体支持体を含む。一般的には説明書には、試薬濃度または少なくも１つのアッセイ法、一緒に加える試薬とサンプルとの相対的量などのパラメーター、試薬／サンプル混合物の保持期間、温度、緩衝条件などを記載した具体的表現を含み、ユーザーが上記のいずれの方法または調製も実施できるようにしている。
【０１９５】
リン酸化標的分子を結合するためのキットは、一般的には溶液に作られる結合試薬を含み、結合溶液は上述したものと同じである。任意にキットは下記のいずれかを含む；リン酸化および非リン酸化標的分子のための分子量マーカー、総タンパク質色素および糖タンパク質のための染色溶液。キットを使用してゲル中またはブロット上のリン酸化タンパク質またはペプチドを検出する際には、一般的には分子量マーカーがキットの一部である。或いは、キットを使用して溶液中またはアレイ上のリン酸化標的分子を染色する場合は分子量マーカーはキットの一部にはならないのが普通である。
【０１９６】
本発明のまた別のキットは、キナーゼまたはホスファターゼの確認、またはそれらの活性の測定および／またはこれらの酵素に対するインヒビタおよびアクチベータの効果の評価に使用される。一般的にはこのキットは適切な基質材料に固定された適切な基質、結合溶液および適切な対照を含む。或いは、リン酸結合化合物が基質に固定され、末端ユーザーが基質および酵素の両方を提供する。このキットは、固定されたリン酸結合化合物に加えると本発明の結合溶液を形成する、金属イオン塩および酸または適切な緩衝剤を含む溶液を有する。
【０１９７】
本発明のまた別のキットは、複雑なサンプル混合物からリン酸化タンパク質またはペプチドを分離するのに使用される。この場合三成分錯体が溶液から引き出される。キットは任意に結合溶液、溶出緩衝剤および任意にタンパク質またはハプテン結合支持体を含み、支持体は、適切なアフィニティ試薬、例えばビオチン−またはハプテン−結合タンパク質、抗体、レシチン、支持体に共有結合したタンパク質結合核酸またはその他のビオポリマーを含むマルチウェル−プレート、アガロース樹脂、ポリマーミクロビーズまたは磁気ビーズである。さらにキットは、任意に１つ以上のスピンカラム、標準ペプチド混合物および求核性誘導化合物を含む。
【０１９８】
リン酸化タンパク質またはペプチドを複雑なサンプル溶液から分離するために使用される本発明のまた別のキットは、基質、一般的にはカラムの形の基質に共有結合するリン酸結合化合物を含む基質を有する。このキットは、一般的には基質に固定されたリン酸結合化合物の他に、金属塩、洗浄用緩衝剤、おだやかな酸性の結合溶液、および溶出緩衝液を含む。金属塩は好ましくは塩化ガリウムであり、溶出緩衝液は好ましくは水酸化バリウムを含む。
【０１９９】
キットの想定ユーザーおよびユーザーの特殊な要求に応じて、本発明によって非常に多様なその他のキットおよびキット成分が作られることは当業者には理解される。
【０２００】
ここに記載される適用は、本発明の非常に多様な潜在的用途を単に説明するためのものであって、発明の範囲を決して制限するものではない。本発明の詳細な説明は既に記載されているので、下記の実施例は本発明を説明する目的で与えられ、本発明の範囲または請求項に対して制限となるものではない。
【実施例】
【０２０１】
本明細書に使用する命名法、および以下に記載する細胞培養、分子遺伝学およびタンパク質化学における実験室的操作法は概ね当業者には公知で、一般的に使用されるものである。酵素反応および精製工程は製造者の仕様明細書に沿って行われるのが普通である。単位、接頭語および記号はＳＩ承認型で表示される。数字の範囲はその範囲を決める数字を含め、指示された範囲内の各整数を含む。
【０２０２】
（実施例１：リン酸化標的分子に対するガリウムおよびガリウムイオンのＢＡＰＴＡ選択性の確認およびリン酸結合化合物のスクリーニング法）
（Ａ）三価ガリウムイオンを有するＢＡＰＴＡはリンタンパク質を選択的に検出する。
【０２０３】
金属キレート化化合物の包括的検索を行い、ガリウム塩（塩化ガリウム）と結合した際にリン酸化−および非リン酸化標的分子の混合物中でリン酸化標的分子（特にホスホペプチドおよびリンタンパク質）を選択的に検出する蛍光試薬類を確認した。これらの化合物について、それらがガリウム（ＩＩＩ）イオンに結合する能力およびリンタンパク質オボアルブミンを選択的に検出する能力を蛍光分光光度計で試験した。ガリウム（ＩＩＩ）イオンへの結合は、７５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ中５μｇまでの塩化ガリウムが存在する際の、同じ化合物の蛍光増加によって確認された。オボアルブミン検出も蛍光増加によって判断したが、この場合これら化合物は７５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１４μＭオボアルブミン、および０．５μＭ塩化ガリウムを含む溶液中に置かれた。リンタンパク質検出の選択性は、塩化ガリウムのない同じ溶液の存在下で蛍光がほとんど増加しないことから判断した。
【０２０４】
化合物１を使用し、鉄およびガリウムを含む種々の金属イオンをスクリーニングして、リンタンパク質検出に最も適しているイオン（類）を選択した。金属イオン類を、化合物１との結合、リンタンパク質検出、および総タンパク質染色に関して、７５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５−５μＭ金属イオン中、４μＭオボアルブミンまたは１μＭリゾチームの存在下または不在下で５３０ｎｍにおける蛍光増加をモニターすることによって試験した。化合物１に結合した三価カチオンだけが５３０ｎｍにおいて蛍光増加を起こし、ガリウム（ＩＩＩ）だけが、化合物１に結合したときに選択的にリンタンパク質を指示することができた。したがってガリウムイオンがリンタンパク質検出に最も好ましい金属である。この方法に基づいて推定し、別のイオンが上記金属キレート化部分に結合するその他の化合物類を確認した。
【０２０５】
（Ｂ）化合物１のリン酸化合物類に対する異なる結合親和性。
【０２０６】
ガリウム（ＩＩＩ）イオンと錯化した化合物１は７５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ中で種々のリン酸基質類に対し異なる親和性を有する。試験したリン酸含有化合物の或るものは無機リン酸化合物、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸に結合したリン酸、ピロリン酸化合物、ＡＴＰおよびＤＮＡであった。これらのリン酸−ベースの基質の、化合物１／ガリウム（ＩＩＩ）イオン試薬に対する親和性は無機リン酸化合物、およびタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸に結合したリン酸では、〜５０μＭ、ピロリン酸化合物およびＡＴＰでは〜２００ｎＭであることが確認され、ＤＮＡでは結合は検出されなかった。これらの数字を化合物１のガリウム（ＩＩＩ）イオンに対する２．５μＭに比較してみる。大部分の公知のリン酸化合物は、ＢＡＰＴＡガリウム（ＩＩＩ）イオンとの結合の仕方によって、以下の３種類の一つに入るはずである；１）単一リン酸基（すなわち無機リン酸化合物またはタンパク質上のリン酸）、２）多重結合リン酸基（すなわちピロリン酸化合物またはＡＴＰ）、または３）架橋リン酸基（すなわち核酸）。
【０２０７】
（Ｃ）化合物４はガリウム（ＩＩＩ）イオンおよびリン酸に同時に結合して二重の発光波長を示す。
【０２０８】
７５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ中の濃度０．１−１．０μＭの化合物４は、４１０ｎｍ（励起３５０ｎｍ）に中心を有する単一の発光ピークを示す。１０ｎＭないし１ｍＭの塩化ガリウムを添加すると、４１０ｎｍ発光は減少し、同時に４９０ｎｍの発光が増加し、４７５ｎｍにアイソベスティック点を有する。この青色発光状態から緑色発光状態への移行の半−最大反応が約１．８μＭ塩化ガリウムで起きる。そこで、７５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）および１４０ｍＭ  ＮａＣｌ中で０．１μＭの化合物４は１．７μＭ塩化ガリウムと共に、４１０ｎｍおよび４９０ｎｍ発光ピークを両方示す。リン酸の添加は、発光ピーク間の平衡をより長い波長４９０ｎｍピークの方に変化させることができる。
【０２０９】
（Ｄ）ガリウムおよび固定されたリン酸化標的分子に同時に結合するリン酸結合化合物のスクリーニング。
【０２１０】
試験タンパク質のパネルを変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に置き、電気泳動によって分離し、ゲルを４５％メタノール、５％酢酸で固定した。一般的に被検ゲルはミオシン、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラーゼｂ、オボアルブミン（２リン酸）、カルボニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビタ、リゾチーム、アプロチニン、α２−マクログロブリン、ホスホリラーゼｂ、グルコースオキシダーゼ、ウシ血清アルブミン、α１酸糖タンパク質、カルボニックアンヒドラーゼ、アビジン、およびリゾチームを各５００−６００ｎｇ含んでいた。ゲルはα−カゼイン（８リン酸）の４倍希釈シリーズ、５００ｎｇ−２ｎｇを担持して含んでいた。このためゲルは異なる物理化学的特性を有する一連のタンパク質、例えば疎水性結合ポケットを有するタンパク質（ＢＳＡなど）、グリコシル化タンパク質（α２−マクログロブリン、グルコースオキシダーゼおよびアビジン）、酸性タンパク質（大豆トリプシンイヒビタ）、塩基性タンパク質（リゾチームおよびアプロチニン）および２種類のリンタンパク質（オボアルブミン、α−カゼイン）を含んでいた。α−カゼインの希釈シリーズはリンタンパク質染色感度の推定値を与えた。異なる色素標識および異なるキレート化部分を含むリン酸結合化合物の選択が先ず最初にｐＨ３．０ないし７．０の最小結合緩衝液中で種々の金属イオンで、金属イオンの存在下または不在下においてスクリーニングされた。色素および金属イオンの濃度は０．１ないし１０μＭ、一般的には０．３ないし３μＭで、１．０μＭの場合が最も多かった。リンタンパク質を優先的に染色する結合条件は、典型的にはｐＨ３．０ないし５．５、およびある種の三価金属イオンの存在であった。これらの条件下において、最適な優先的リンタンパク質染色は、ある種の色素標識およびＢＡＰＴＡキレート化部分および等モル濃度のＧａ３＋で実現した。適切な色素をさらに評価すると、最適ｐＨが４．０であること、および塩（例えば２５０−７５０ｍＭ  ＮａＣｌ）の添加が、主として非リンタンパク質の染色強度の低下によって、染色特異性を改善することが判明した。色素の広範囲のスクリーニングが５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、５００ｍＭ塩化ナトリウム中、１μＭの候補色素、１μＭのＧａ３＋で行われた。
【０２１１】
（Ｅ）結合溶液の生成
結合溶液は、モル比１：２ないし２：１で金属イオンを有するリン酸結合化合物および約ｐＨ３．０ないし６．０の緩衝液を含む。一般的に結合溶液はｐＨ３．０ないし５．５の緩衝液（５０ないし１００ｍＭ）、塩（１００ないし１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、または１００ないし３００ｍＭ  ＭｇＣｌ２など）および、等モル濃度（一般的に検出目的には１ないし１０μＭずつ）のＧａ３＋およびリン酸結合化合物（化合物２など）を含む。金属イオンおよびリン酸結合化合物の濃度は、分離目的のためには、検出目的のための結合溶液中の濃度より少なくも１００倍高い濃度である（実施例１３）。ゲル染色のための最適結合溶液は次のようである：５００μｇの化合物２を８７３μｌの水に溶解し、１ｍＭストック溶液とした。５ｇのＧａＣｌ３を２８．４ｍＬの水に溶解して１Ｍ溶液とし、その１ｍＬを９ｍＬ水と合わせて０．１Ｍ溶液を作り、その１０μＬを９９０μＬ水に加えて１ｍＭストック溶液とした。酢酸ナトリウム三水加物１３６ｇを約８００ｍｌの水に溶解し、１２Ｍ  ＨＣｌ  約２３．５ｍＬを加えてｐＨを４．０に調節し、水を加えて容量を１リットルにすることによって、酢酸ナトリウムの１Ｍストック溶液（ｐＨ４．０）を１リットル調製した。２３３．８  ＮａＣｌを約８００ｍＬの水に溶解し、水を加えて容量１リットルにするというやり方で、塩化ナトリウムの４Ｍストック溶液１リットルを調製した。酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム溶液を０．４５μＭフィルタを通して濾過した。１００ｍＬの結合溶液のためには、１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）５ｍｌ、４Ｍ塩化ナトリウム１２．５ｍｌおよび１，２プロパンジオール２０ｍＬを水と合わせ、最終容量１００ｍＬとし、それに撹拌下で１ｍＭＧａＣｌ３  １００μＬおよび１ｍＭ化合物２  １００μｌを加えて１μＭ化合物２、１μＭ  Ｇａ３＋、２０％１，２−プロパンジオール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、の最終結合溶液を得た。
【０２１２】
（実施例２：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中のリンタンパク質の検出）
リンタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、標準法にしたがい４％Ｔ、２．６％Ｃスタッキングゲル、ｐＨ６．８、および１３％Ｔ、２．６％Ｃ分離ゲル、ｐＨ８．８、を用いて分離した。％Ｔは総モノマー濃度（アクリルアミド＋クロスリンカー）をグラム／１００ｍＬであらわしたものであり、％Ｃはクロスリンカー（例えば、Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス−アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアクリロイルピペラジンまたはその他の適切な作用物質）のパーセンテージである。分離ゲルは巾８ｃｍ、高さ５ｃｍ、厚さ７．５ｃｍであった。電気泳動後、ゲルを１００ｍＬの４５％メタノールおよび５％酢酸中に９０分間浸すことによって固定した。そのゲルを水中で２回、合計３０分間洗った。それからそのゲルを本発明の結合溶液に加え（実施例１Ｅ）、室温でおだやかなオービタル振とう（通常５０ｒｐｍ）下で１２０分間インキュベートした。結合緩衝液は５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０％ｖ／ｖ１，２−プロパンジオール、１μＭ塩化ガリウムを含んでいた。結合溶液を調製するために、化合物２の１ｍＭストック溶液  １２０μＬおよび塩化ガリウムの１ｍＭストック溶液１２０μＬを１０８０μＬの水に加えた。この混合物を５９ｍＬの結合緩衝液に加えて結合溶液を得た。あるいは、リン酸結合化合物および塩化ガリウムを別々に、直接結合希釈液６０ｍＬに加えてもよい。本発明のその他のリン酸結合化合物を使用する結合溶液を調製し、ゲル染色を同様に試験することができる。結合溶液中でインキュベートした後、ゲルを７５ｍＬの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）で洗い、３０分間ずつ２回洗浄した。
【０２１３】
化合物２と５３２ｎｍで励起し得るその他の色素とを用いて、富士フィルムＦＬＡ３０００レーザースキャナー上で、５３２ｎｍ励起波長および５８０ｎｍバンドパス発光フィルタを用いて画像が得られた。紫外線または５３２ｎｍ以下の可視波長で吸収する蛍光リン酸結合化合物では、励起は３００ｎｍを用いて行い、検出はロッシュＬｕｍｉ−ｉｍａｇｅｒまたは富士フィルムＦＬＡ３０００レーザースキャナーにより、４７３ｎｍ励起および５８０ｎｍバンドパス発光を用いて行った。データはイメージ・ゲージ分析（Ｉｍａｇｅ  Ｇａｕｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）ソフトウエアを用いて表示し、リンタンパク質の画像は暗いバンドとして表示された。リン酸を含まないタンパク質類は標識化されないか、またはリンタンパク質に比較して非常に軽度に染色された。ゲルを上記のように、ただし結合溶液から塩化ガリウムを除いて標識化したときには、リンタンパク質は選択的には染色されず、バックグラウンドから区別されず、非常に軽度の非特異的染色を示した。ゲルを５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）で一晩洗い、上記のようにして画像を得た。バックグラウンドおよび非特異的染色はリンタンパク質に比較してさらに減少した。塩化ガリウムの代わりにその他のガリウム塩を使用すると、試験した全てのインジケータに関して匹敵する結果が得られた；しかしＦｅ３＋およびＡｌ３＋を含むその他の金属はリンタンパク質の染色に関して劣る結果を与えた。
【０２１４】
メタノール／酢酸中におけるゲルの固定は一晩行ってもよいし、ゲルを固定液に数日間そのままにしてもよい。塩化ナトリウムの代わりに、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムなど、その他の塩類を使用することができる。塩化ナトリウム濃度は１００ｍＭないし１０００ｍＭが好ましい。もしも塩類が結合溶液に含まれていなければ、非リンタンパク質の非特異的染色が増加する。非特異的染色は〜５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）でよく洗うことによって低い水準まで減少する。蟻酸塩および２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸など、ＮａＯＡｃ以外の緩衝剤を使用してもよい。１，２−プロパンジオールを除くと、ゲルのバックグラウンド染色は増加するが、それでもリンタンパク質は選択的に染まる。酸性ｐＨの最も効果的な範囲はｐＨ３．０から６．０までである。
【０２１５】
（実施例３：ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおけるリンタンパク質および総タンパク質の連続二色性検出）
実施例２のようにリンタンパク質を検出した後、ゲルを６０ｍｌＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）と共に、おだやかにオービタル振とう（一般的には５０ｒｐｍ）しながら一晩インキュベートした。次にそのゲルを７％酢酸、１０％メタノール中で、やはり５０ｒｐｍでインキュベートした。リン酸化および非リン酸化タンパク質からのオレンジ色のシグナルを標準ＣＣＤカメラ−ベース−画像化システムで、３００ｎｍＵＶ光励起および６００ｎｍバンドパスフィルタを使用して集めた。
【０２１６】
（実施例４：ポリアクリルアミドゲル中のホスホペプチドの検出）
ウシミルクβ−カゼインのトリプシン消化によって生成したペプチド類をＮｏｖｅｘ（登録商標）トリシン  ゲル（１６％ポリアクリルアミド、インビトロゲン（登録商標）ライフ・テクノロジーズ）を用いる電気泳動によって分離した。電気泳動後、そのゲルを１００ｍＬの４０％メタノール、１０％酢酸中で１時間固定し、それから１００ｍＬの４０％メタノール、０．８２Ｍ  ＮａＯＡｃ、０．５％グルタールアルデヒド中で１時間固定した。ゲルを水を３回変えて洗い、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１μＭ化合物２、１μＭ塩化ガリウムを含む染色溶液３０ｍＭ中で１００分間インキュベートした。その後ゲルを５０ｍＭ  ＮａＯＡｃを３回変えて７５分間洗った。画像を５３２励起および５８０ｎｍバンドパス発光フィルタを備えた富士フィルムＦＬＡ３０００レーザー−ベース・スキャナーで生成し、データはイメージ・ゲージ分析ソフトウエアを用いて表示した。β−カゼインのトリシン消化から生ずる２つの公知のホスホペプチドがゲル上にはっきり目立つバンドとして可視化された。ゲルを６０ｍＬ  ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル色素で、ゲルをその色素中で一晩インキュベートし、その後そのゲルを１７％錯酸、１０％メタノール中で３０分間インキュベートすることによって染色した。
【０２１７】
（実施例５：等電点電気泳動ゲルにおけるリンタンパク質の検出）
等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、ｐＨ勾配を形成する種々の化学物質を用いる種々のプレ−カストおよび実験室で作られたゲルを使用して行うことができる。この例において、アムホリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）ＰＡＧプレートに、マルチフォア（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ）ＩＩ  電気泳動装置（アマーシャム−ファーマシア・バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰＨａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、アプザラ、スェーデン）を使用して製造者の使用説明書によって１５００ｖｏｌｔ／時間を水平に流した。そのゲルを４５％メタノール、５％酢酸の１００ｍＬ中で一晩固定した。ゲルを等容量の水を数回変えて洗い、５０ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ３．０）、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１μＭ  化合物２、および１μＭ塩化ガリウムを含む染色溶液５０ｍＬ中で１３０分間インキュベートした。ゲルを５０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ３．０）、１Ｍ  ＮａＣｌの５０ｍＬで３０分間ずつ２回洗い、それから５０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ３．０）中で洗った。画像を実施例２に記載したようにして得た。
【０２１８】
（実施例６：二次元ゲルにおけるリンタンパク質の検出）
ヒトＭＲＣ−５肺線維芽細胞溶解物タンパク質混合物（１５０μｇ）を尿素緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、１％ツイッタジェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１０、０．８％担体両性電解質）（３−１０）、６５ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈し、一次元ＩＰＧストリップ（３−１０非直線、１８ｃｍ）上に置いた。一晩再水和した後、それらストリップを鉱油で覆い、タンパク質を７５０００ｖｏｌｔ  ｔｏｔａｌで濃縮した。ＩＰＧストリップを、３７５ｍＭトリス塩基、ｐＨ８．８、を含む１ｍｍ厚さ、２０ｃｍ×２０ｃｍ、１２．５％Ｔ、２．６％Ｃポリアクリルアミドゲルの頭頂部に載せ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を標準的方法によって行った：ただし、陰極電極緩衝液は５０ｍＭトリス、３８４ｍＭグリシン、２％ＳＤＳ、ｐＨ８．８、であり、一方陽極電極緩衝液は２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２％ＳＤＳ、ｐＨ８．８、であった。二次元電気泳動後、ゲルを７５０ｍＬ４５％メタノール、５％酢酸中で２０時間固定した。ゲルを１回に７０分間ずつ水で２回洗い、それから５００ｍｌ染色溶液中に置いた。染色溶液は５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、２５０ｍＭ塩化ナトリウム、２０％ｖ／ｖ１，２−プロパンジオール、１μＭ化合物２、１μＭ塩化ガリウムを含んでいた。化合物２の１ｍＭストック溶液５００μＬおよび塩化ガリウムの１ｍＭストック溶液５００μＬを９ｍＬの水に加えた。この混合物を染色緩衝液４９０ｍＬに加えた。ゲルを結合溶液中で８時間インキュベートした；その溶液を傾瀉し、ゲルを５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、８００ｍＬで３０ないし４０分間ずつ３回変えて洗った。５３２ｎｍ励起および５８０ｎｍバンドパス発光フィルタを備えた富士フィルムＦＬＡ３０００レーザースキャナー上に画像が得られ、データはイメージ・ゲージ分析ソフトウエアを使用して表示した。リンタンパク質の画像は暗いスポットとしてあらわれた。リン酸を含まないタンパク質は染色されないか、またはリンタンパク質に比較して非常に軽度に染色された。ゲルを上記のように、ただし染色溶液からＧａＣｌ３を除去して染色すると、リンタンパク質は選択的に染色されず、バックグラウンドまたは軽度の非特異的染色から区別することができなかった。その上、リンタンパク質の染色は同じタンパク質の異なるリン酸化パーセンテージと相関するスポット列を生成した；すなわちタンパク質は同じ分子量を有するが、リン酸基の添加または除去によってその変化は異なる。こうして２−Ｄゲル分析は本発明の方法を使用してリンタンパク質を同定するための有用なツールであり、単一タンパク質のリン酸化の変化を確認することができる。
【０２１９】
（実施例７：２−Ｄゲルにおけるリンタンパク質および総タンパク質の連続二色性検出）
電気泳動およびリンタンパク質検出を実施例６のように行った。リンタンパク質の検出後、ゲルを５００ｍＬ  ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル色素で染めた：その際ゲルを色素と共に一晩インキュベートし、その後ゲルを７％酢酸１０％メタノールで３０分間ずつ２回変えて洗った。実施例２に記載したようにして画像を得た。或いはリン酸化および非リン酸化タンパク質からのオレンジ色シグナルを、３００ｎｍＵＶ光励起および６００ｎｍバンドパスフィルタを備えた標準ＣＣＤカメラ−ベースの画像化システムで集めた。
【０２２０】
（実施例８：ＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に電気ブロットされたリンタンパク質の検出）
対象のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によって分離し、標準的方法を用いてＰＶＤＦ膜に移し、その膜を空気乾燥した。ＰＶＤＦ膜を速やかに１００％メタノールに浸し、４０％メタノール、５％酢酸の溶液で１５分間洗い、水を２回変えて１０分間ずつ洗った。そのブロットを結合溶液に加え、室温でおだやかにオービタル振とうしながら８０分間インキュベートした。その結合溶液は５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１μＭ化合物１または化合物４および１μＭ塩化ガリウムを含んでいた。リン酸結合化合物の１ｍＭストック溶液６０μＬおよび塩化ガリウムの１ｍＭストック溶液６０μＬを５４０μＬの水に加えた。この混合物を色素緩衝液２９．５ｍＬに加えた。或いは、リン酸結合化合物および塩化ガリウムを別々に色素希釈液３０ｍＬに加えてもよい。色素溶液中でインキュベーション後、ゲルを５０ｍＬ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、５０ｍＬで３０ないし５０分間ずつ２回洗った。
【０２２１】
画像は、反射性３００ｎｍＵＶ光源および化合物４のための４６５ｎｍバンドパス発光フィルタを備えた標準ＣＣＤカメラ画像化システム（ＢｉｏＲａｄ  ＦｌｕｏｒＳ  Ｍａｘ）で得た。リン酸を含まないタンパク質は標識化されずまたはリンタンパク質に比較して非常に軽度に染色された。ブロットを上記のように、ただし色素溶液からＧａＣｌ３を除いて染色したときには、リンタンパク質は選択的には染色されず、バックグラウンドまたは軽度の非特異的染色から区別できなかった。化合物１で画像化するために、湿ったブロットを４７３ｎｍ励起レーザーおよび５２０ｎｍバンドパス発光フィルタを備えた富士フィルムＦＬＡ３０００レーザースキャナーに面を接するように置き、データをイメージ・ゲージ分析ソフトウエアを用いて表示した。
【０２２２】
（実施例９：ＰＶＤＦ膜に電子ブロットしたリンタンパク質および総タンパク質の二色性検出）
ＰＶＤＦ膜上のリンタンパク質および総タンパク質の連続二色性検出は、標識化および画像化されたブロットを後染色して、実施例８に示したようにＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ブロット染色でリンタンパク質を検出するというやり方で行われた。ブロットは１０％メタノール、７％酢酸の溶液に、面を下にして１５分間浮遊させ、その後ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ色素で１５分間表面染色を行った。ブロットを面を下にして水で１０分間ずつ３回洗った。膜を空気乾燥した。総タンパク質からの総シグナルを、３００ｎｍＵＶ抗原および６１０ｎｍバンドパスフィルタを備えた標準ＣＣＤカメラ画像化システム（ＢｉｏＲａｄ  ＦｌｕｏｒＳ  Ｍａｘ）で得た。
【０２２３】
二色性染色は、実施例８のように、反射性３００ｎｍＵＶ光源および４６５ｎｍバンドパス発光フィルタを備えた標準ＣＣＤカメラ画像化システム（ＢｉｏＲａｄ  ＦｌｕｏｒＳ  Ｍａｘ）で画像を得ることによって実現した。化合物４／Ｇａ（ＩＩＩ）で染色されたリンタンパク質からのシグナルは、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙで染色され、４６５ｎｍバンドパスフィルタでは検出できなかった総タンパク質からのシグナルと区別できた。
【０２２４】
化合物１では、上記のようなＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ染色および生成画像は総タンパク質からの蛍光をあらわし、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ画像を実施例６のようにして得られた蛍光画像に比較した際、上記リンタンパク質類はサブセットとしてあらわれる。
【０２２５】
（実施例１０：ホスファターゼ活性の検出）
リンタンパク質および非リン酸化タンパク質を市販のコウシ腸アルカリホスファターゼと共に標準条件下で３７℃で３０分間インキュベートした。対照消化物は同じ条件下で酵素を加えずに行われた。適切な試験タンパク質は、ウシα−カゼイン、オボアルブミン、およびペプシンをリンタンパク質として含み；ウシ血清アルブミン、ヒナドリ卵白リゾチームおよび大豆トリプシンインヒビタを非リン酸化タンパク質として含む。電気泳動を実施例２のように行い、対照（非消化）およびホスファターゼ処理サンプルを１対として１レーンにつき１２５０ｎｇのタンパク質を載せた。リンタンパク質検出を実施例２のように行った。標識ごとに９０分目に画像を取り、一晩洗浄後に再度画像を取った。また別のゲルを実施例２のように標識化したが、この際は結合溶液に塩化ガリウムを含まなかった。完全結合溶液で標識したゲルでは、対照、非消化サンプルタンパク質との比較は、リンタンパク質がソフトウエア・ディスプレーによって暗いバンドとしてあらわれ、非リン酸化タンパク質は標識されず、または非常に軽度に染色されることを示した。塩化ガリウムを含まない組成物で標識したゲルでは、リンタンパク質は非リンタンパク質と同程度に標識されず、または同程度に非常に軽度の染色を示し、このレベルのシグナルは塩化ガリウムを含む完全組成物で標識したゲルにおける非リンタンパク質類と同じであった。完全標識化ゲルにおける１対のリンタンパク質の比較は、アルカリホスファターゼ処理サンプルからのシグナルが非消化対照からのシグナルより有意に少ないことを示した。検出できたとしても非常に低レベルの非リンタンパク質からのシグナルは、実質的に対照および酵素処理サンプルと同じであった。
【０２２６】
リンタンパク質の検出後、ゲルを総タンパク質について実施例２のようにＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル色素で染色し、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ染色画像を実施例３および実施例７のようにして得た。総タンパク質染色のシグナルは両方のゲルで対の対照および消化サンプルと同様であった。これはアルカリホスファターゼ処理リンタンパク質サンプルからの減少したシグナルがタンパク質分解によるものではないことを示すものである。
【０２２７】
（実施例１１：キナーゼ活性の検出）
ウシ筋ミオシン軽鎖を製造者の説明書にしたがって市販のクローン化カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ニューイングランド  ビオラボ社）と共に、１００ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および提供された緩衝成分と共にインキュベートした。平行して対照インキュベーションを酵素なしで行った。各反応混合物のサンプルを隣接レーンに置き、電気泳動によって実施例２に記載のように分析した。ゲルを４５％メタノール、５％酢酸の１００ｍＬ中で６０分間固定した。ゲルを水で数回変えて洗った。一つのゲルを５０ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ３．０、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、１μＭ化合物２、１μＭ塩化ガリウムを含む結合溶液３０ｍＬ中で１１０分間インキュベートした。その他のゲルを、塩化ガリウムを除いた同じ溶液中でインキュベートした。ゲルを５０ｍＬの５０ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ３．０、１０００ｍＭ  ＮａＣｌで３０分ずつ２回洗い、その後５０ｍＭの５０ｍＭ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ｐＨ３．０で洗った。リンタンパク質の画像獲得を実施例２のように行い、リンタンパク質の二色性検出を実施例３のように行った。
【０２２８】
総タンパク質の染色は両レーンにおいて同じ３つの主要バンドプロフィールを示した。リンタンパク質のための染色は両レーンにおいて一つの主要バンドをあらわした。酵素を含む反応に相当するレーンのバンドからのシグナルは、酵素を含まない対照のシグナルより３．４倍多かった。
【０２２９】
（実施例１２：ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌの検出）
ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ媒介性アポトーシスに関係する細胞シグナリング因子を決定するために、２−Ｄ電気泳動および質量分析を含むプロテオミックス・アプローチを用いる。このアプローチは、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ（アミノ酸１１４−２８１）の可溶性断片で数秒ないし数時間の種々の時間処理した、および処理しなかった結腸癌細胞（Ｃｏｌｏ２０５）の２−Ｄゲルを比較することを含む。２−Ｄゲルの比較に役立つように、ガリウムイオンに結合した化合物７を、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ総タンパク質染色と組み合わせて使用する。細胞シグナル化はタンパク質リン酸化を含むことが多いので、化合物７の使用は死滅受容体シグナリングまたはアポプトティックシグナリングに関係するらしいスポットを明らかにする。ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ処理および非処理Ｃｏｌｏ２０５細胞では著しく異なるタンパク質スポットがその後の質量分析によって確認される。
【０２３０】
（実施例１３：ホスホペプチド類の沈殿）
２種類の非リン酸化ペプチド（アンギオテンシンＩおよびＩＩ）および２種類のリン酸化ペプチド（ｐＴ／ｐＹおよびＲＩＩ）の混合物を合わせ（５μＬ）、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、０．２ｍＭＧａＣｌ３および０．１ｍＭ化合物９を含むｌ１００μＬの最終容量にする。混合物を室温で１時間激しくボルテックスし、その後ミクロヒュージュ中でフルスピードで５分間遠心分離した。上澄液を取り、保存した。ペレットを、ミクロピペット先端で１００μＬ洗浄緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、０．２ｍＭ  ＧａＣｌ３）中ですりつぶすことによって再懸濁した。サンプル類を再び５分間遠心沈殿し、上澄液洗浄成分を取り、分析した。ペレットを１００μＬ５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡに溶解し、その後ＨＰＬＣまたはＭＡＬＤＩ質量分析によって分析した。ペレットは種々の異なる選択された塩基性溶液中に溶解することもできる。
【０２３１】
沈殿後にリン酸結合化合物の除去が必要ならば、クロロホルム抽出を使用することができる。また、任意のビオチニル化リン酸結合化合物、例えば化合物９、をこの沈殿操作に使用することができる。ペレットの分離後、およびリン酸結合化合物／ガリウム錯体から有機または塩基性処理によってホスホペプチドを分離した後に、上記リン酸結合化合物を固定ストレプトアビジン支持体（例えばストレプトアビジン−アガロースまたはストレプトアビジン磁気ビーズ）を使用して除去できる。
【０２３２】
（実施例１４：化合物２−Ｇａ３＋を使用する蛍光分極による溶液中のホスホペプチドの検出）
化合物２−Ｇａ３＋とリンタンパク質およびホスホペプチドとの錯体化を明らかにするために、遊離色素の蛍光分極を試験し、リン酸化および非リン酸化タンパク質およびペプチドの存在下で錯体（化合物２−Ｇａ３＋）と比較した。
【０２３３】
まず第一に、（１）リンタンパク質（オボアルブミン）および（２）対照の非リン酸化タンパク質（リゾチーム）で分析試験を行った。１．０μＭの化合物２を含む変更結合溶液を５０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ３．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ中で、室温において、さらに（ａ）１μＭ塩化ガリウム、（ｂ）１００μＭリゾチーム  プラス１μＭ  塩化ガリウム、または（ｃ）および１００μＭオボアルブミン  プラス１μＭ塩化ガリウムを含む溶液類と平行してインキュベートした。生成した溶液類の蛍光分極を励起５３０ｎｍおよび発光５４５ないし７００ｎｍで蛍光分光光度計で測定した。積分した分極発光スペクトルは異方性”ｒ値”、ｒ＝０．１０＋／−０．００３＋／−０．０２（化合物２プラス  ガリウム）；ｒ＝０．１０＋／−０．００２（化合物プラス  リゾチーム非リン酸化対照）；ｒ＝０．３４＋／−０．００２（化合物２プラス  ガリウム  プラス  オボアルブミン）を与えた。これは化合物２がこのリンタンパク質にリン酸化依存性結合することを示唆する（図１０Ａを参照）。
【０２３４】
第二に、（１）ホスホペプチド、（２）非リン酸化ペプチドおよび（３）ペプチドを含まない対照で分析試験を行った。リン酸化および非リン酸化デルタ睡眠誘発ペプチドＤＳＩＰ（Ｔｙｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−（ＰＯ３）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ）はＳｙｎＰｅｐ社（ダブリン、ＣＡ）から購入し、オボアルブミン（Ｃａｔ．Ａ−７６４１）およびリゾチーム（Ｃａｔ．Ｌ−７６５１）はシグマケミカル社（セントルイス、ＭＯ）から購入した。この分析試験のために結合溶液（５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１μＭ化合物２および１μＭＧａＣｌ３）中の各ペプチド１００μｇおよび無ペプチド対照を室温で３０分間インキュベートした。蛍光分極および異方性測定はＡｍｉｃｏ−Ｂｏｗｍａｎシリーズ−２分光計（スペクトロニックインスツルメント社、ロチェスター、ＮＹ）を使用し、励起波長を５５５±４ｎｍに設定し発光波長を５８０ｎｍ±４ｎｍに設定して行った。或いは、蛍光はＷａｌｌａｃ１４２０マルチラベル・カウンター（パーキンエルマー・ライフ・サイエンシス）で、励起波長の設定５３５±１７．５ｎｍ、発光波長の設定５９０ｎｍ±１７．５ｎｍを用いて測定された。結合溶液単独、および非リン酸化ペプチドの存在下での結合溶液は同様な蛍光分極および異方性を示した。しかしホスホペプチドの存在下では蛍光分極および異方性値に顕著な増加がある。この結果はホスホペプチドが溶液中の化合物２−Ｇａ３＋に特異的に結合し、非リン酸化ペプチドは結合しないことを証明するものである。図１０Ｂを参照されたい。
【０２３５】
このアッセイは、三価ガリウムイオンに結合する化合物のスクリーニング法および溶液ベースのキナーゼアッセイ法も提供する。
【０２３６】
（実施例１５：基質固定されたリン酸結合化合物による、複雑なタンパク質消化物からのホスホペプチドの分離および特徴づけ）
リン酸結合化合物−アガロースカラム（化合物１３または１４）（一般的には２００μＬのメジウム）に０．１Ｍ  ＧａＣｌ３を担持させ、流出する物質のｐＨが約７．０に近づくまで脱イオンＨ２Ｏで洗った。カラムを５カラム容量の結合溶液（１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ３．０））で平衡化した。ホスホペプチド混合物をＳｐｅｅｄＶａｃ（サバント（Ｓａｖａｎｔ））または同様な器具中で真空乾燥し、結合溶液に溶解した。このペプチド混合物の最終的ｐＨが３．０でない場合は、１−１０Ｍ酢酸で適切に調節することができる。タンパク質消化物（１−５ｍｇ／ｍＬ）を１カラム容量未満（ただし２分の１未満ではいけない）適用し、その後２カラム容量の結合溶液を適用する。流出（ＦＴ）フラクションを合一し、その後の分析のために保存した。カラムを２カラム容量の１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ７．０）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％アセトニトリルで洗い、その後１カラム容量のＮａＯＡｃ（ｐＨ７．０）で洗った。ＦＴフラクションを合一し、その後の分析のために保存した。結合したペプチドは３カラム容量の飽和Ｂａ（ＯＨ）２で溶出し、それらを１本のチューブに集めた。生成した溶出フラクションのｐＨはｐＨ１１．０より高かった。そうでなければ、それを飽和Ｂａ（ＯＨ）２  で直ちに調節した。溶出フラクションを３０℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを２部分に分け、その一つを氷酢酸でｐＨ５．０−７．０に中性化し、凍結保存した。１／２容量の脱イオン水をもう一つのチューブに加え、その後濃縮求核チオールまたはアミン（メチルアミン、システインまたはβ−メルカプトエチルアミン）を添加し、出発サンプル／Ｈ２Ｏ容量の１／６を超えない容量中０．１−０．５Ｍの最終濃度にした。反応混合物を３０℃でさらに６０分間インキュベートし、その後氷酢酸でｐＨ５．０−７．０に中性にした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析では、ペプチドをサンプルからＣ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（ミリポア）を使って標準プロトコルによって精製し、ＳｐｅｅｄＶａｃ乾燥器中で真空乾燥し、５０％アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡ中に溶解した。同じ溶媒中の等量の１０ｍｇ／ｍＬ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ基質（α−シアノ−５−ヒドロキシケイ皮酸）を加えた。この溶液を徹底的に混合し、１μＬをＭＡＬＤＩ標的にスポットした。
【０２３７】
両ペプチドフラクションの差次的質量分析は、ペプチド上のリン酸化部位の数並びにホスホアミノ酸の性質の決定に導いた。使用した条件下ではホスホセリン残基だけが脱離および求核性付加を受ける（リン酸の喪失−９８ａｍｕ、求核性付加試薬の質量＋）。ホトスレオニン残基は脱離のみを受け（リン酸喪失のみ、−９８ａｍｕ）、ホスホチロシン残基は、ホスホチロシンが強塩基中で安定なため、変化しない。
【０２３８】
（実施例１６：オボアルブミン上のリン酸の数の定量）
１μＭおよび４μＭオボアルブミンの溶液を７５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１μＭ化合物４および１．７μＭ塩化ガリウム中で、室温で５−１０分間インキュベーションした。生成溶液の蛍光強度を蛍光分光光度計で、４１０ｎｍで測定し、標準リン酸検量曲線に比較し、オボアルブミン上のリン酸数を決定した。標準リン酸検量曲線は既知濃度（１、２、４、６、８および１０μＭ）の１９アミノ酸ホスホセリン含有ペプチドを７５ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１μＭ化合物４、および１．７μＭ塩化ガリウム中で平衡化し、４１０ｎｍで蛍光強度を測定した。次にその蛍光強度をホスホペプチドの既知濃度に対してグラフにした。オボアルブミンを含む溶液からの蛍光強度を標準曲線に比較すると、〜２μＭおよび８μＭのリン酸があらわれた。最後に、タンパク質の濃度を計算するとオボアルブミンの１分子あたり２個のリン酸基が確認された。
【０２３９】
（実施例１７：リン脂質の検出）
本発明によるリン脂質の検出を試験するために、種々のリン脂質をニトロセルロース膜にスポットした。リン脂質は、エケロン・リサーチ・ラボ社（Ｅｃｈｅｌｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）から、ＰＩＰアレイＴＭと呼ばれるフォーマットで入手した。それは８種類のホスホイノシチド類を異なる濃度で含む。ＰＩＰアレイＴＭは、リン脂質検出のための本発明の限界感度を決定するために用いられた。
【０２４０】
ＰＩＰアレイＴＭ
１．Ｐｔｄｌｎｓ  100 50 25 12.5 6.3 3.2 1.6pmol
２．Ｐｔｄｌｎｓ  （３）Ｐ
３．Ｐｔｄｌｎｓ  （４）Ｐ
４．Ｐｔｄｌｎｓ  （５）Ｐ
５．Ｐｔｄｌｎｓ  （３、５）Ｐ２
６．Ｐｔｄｌｎｓ  （４、５）Ｐ２
７．Ｐｔｄｌｎｓ  （３、４）Ｐ２
８．Ｐｔｄｌｎｓ  （３、４、５）Ｐ３
１つのＰＩＰアレイＴＭを５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中で１５分間洗った。洗浄後、そのＰＩＰアレイＴＭを５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）、２０％１，２−プロパンジオール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１μＭ化合物１、および１μＭ  ＧａＣｌ３中で１時間インキュベートした（アレイをオービタル・シェーカー上で１００−１５０ＲＰＭでインキュベートする）。ＰＩＰアレイＴＭをインキュベートした後、アレイを５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）中で１５分間ずつ３回、オービタル・シェーカー上で１００−１５０ＲＰＭで洗い、未結合色素を除去し、バックグラウンド蛍光を弱める。ＰＩＰアレイＴＭの画像を、レーザー−ベースのスキャナー（富士ＦＬＡ３０００）を用い、励起波長４７３ｎｍおよび５２０ｎｍの発光フィルタで生成した。８種類のホスホイノシチドのうち、４種類が強い陽性シグナルを与えた。これらはホスファチジン酸、ホスホイノシチド（４、５）Ｐ２、ホスホイノシチド（３、４）Ｐ２およびホスホイノシチド（３、４、５）Ｐ３であった。最も強いシグナルはホスホイノシチド（３、４）Ｐ２で、次はホスホイノシチド（４、５）Ｐ２、それからホスホイノシチド（３、４、５）Ｐ３であった。
【０２４１】
（実施例１８：マイクロアレイ上のリンタンパク質検出）
β−カゼイン、オボアルブミン、ペプシンおよびウシ血清アルブミンを含む４種類の特異的、精製タンパク質をソースプレート（３８４ウェル  プレート）から、ＢｉｏＣｈｉｐＡｒｒａｙｅｒＴＭ（パッカード・インスツルメント社、メリドン、ＣＴ）を使用して水中０．９７５μｇ／ｍＬ−０．５ｍｇ／ｍＬ濃度で、ＨｙｄｒｏＧｅｌ被覆スライド（パーキンエルマー）上に並べた。ＢｉｏＣｈｉｐＡｒｒａｙｅｒＴＭは４本のガラス毛細管からなるＰｉｅｚｏＴｉｐＴＭディスペンサーを使用する。タンパク質はＰｉｅｚｏＴｉｐＴＭから、容量３３３ｐＬの小滴として分配され、直径１７５ミクロンのアレイスポットを５００ミクロンの水平および垂直ピッチで形成する（ピッチ＝スポットの中心と中心の間隔）。タンパク質は１０個の希釈点をもつ４列に二重に配列され、１６０スポットの配列が形成される。アレイの生成した濃度範囲は１６６．５ｐｇ／スポット−０．３２５ｐｇ／スポットである。リンタンパク質の検出のために、スライドを、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０％１，２−プロパンジオール、１μＭ  ＧａＣｌ３および０．０５Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、を含む緩衝液中１μＭ化合物２中で、回転器上で１時間インキュベートした。それからそのスライドを、１０％メタノールを含む０．０５Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０中で回転器上で１時間洗い、その後水で１５分間洗った。スライドを、スライドホールダーでローターに固定されたマイクロアレイ高速遠心管（テレケム（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ））で〜６０００ｒｐｍで短時間スピンし、過剰の液体を除去した。スライドを乾燥した後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）５０００ＸＬマイクロアレイ分析システム（パッカードインスツルメント社、メリドン、ＣＴ）を用い、５４３．５ｎｍレーザーおよび５７０ｎｍまたは５９２ｎｍ発光フィルタを使用してアレイを画像化した。タンパク質あたりのリン酸濃度は次のように決定された：β−カゼイン、５リン酸；オボアルブミン、２リン酸；ペプシン、１リン酸；ＢＳＡ、リン酸なし。
【０２４２】
（実施例１９：マイクロアレイ上のホスホペプチドの検出）
２種類のペプチド、ケムプチドおよびｐＤＳＩＰ、をソースプレート（３８４ウェル）からヒドロゲル被覆スライド（パーキンエルマー）上に水中０．０３１２５ないし２ｍｇ／ｍＬペプチドの濃度で配置した。ケムプチドのアミノ酸配列はＬｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（ＭＷ７７１．９）であった。ｐＤＳＩＰのアミノ酸配列はＴｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（分子量９２９．５）であった。アレイに、８ピン４列（合計３２）で固定される手動ガラススライドアレイアー（Ｖ＆Ｐ  サイエンティフィック、サンジエゴ、ＣＡ）を使用してスポットした。スポットの大きさは〜５００ミクロン直径、１．１２５ミクロン水平ピッチ、７５０ミクロン垂直ピッチであった（ピッチ＝スポットの中心から中心までの間隔）。そのハンドアレイアーはソースプレートからペプチド６ｎＬを集め、アレイ表面に直接接触によって〜６ｎＬを移した。生成したペプチド濃度は０．１８ないし１２ｎｇ／スポットであった。ペプチドを６回繰り返して配置し、８４スポットのアレイを生成した。上記のホスホペプチド、ｐＤＳＩＰ、を特異的に検出するために、スライドを０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０％１，２−プロパンジオール、１μＭ  ＧａＣｌ３および０．０５Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、を含む緩衝液中１μＭ化合物２色素中で回転器上で１時間インキュベートした。そのスライドを、１０メタノールを含む０．０５Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、中で、回転器上で１時間洗浄し、その後水中で１５分間洗浄した。スライドホールダーでローターに固定されたマイクロアレイ高速遠心管（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ）中で〜６０００ｒｐｍで短時間スピンし、過剰の液体を除去した。スライドを乾燥した後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）５０００ＸＬマイクロアレイ分析システム（パッカード・インスツルメント社、メリドン、ＣＴ）を用い、５４３．５ｎｍレーザーおよび５７０ｎｍまたは５９２ｎｍ発光フィルタを使用してアレイを画像化した。
【０２４３】
（実施例２０：マイクロアレイ・フォーマットにおける固定されたキナーゼ基質の検出；グリコーゲン・シンターゼ１−１０の選択的検出）
２種類の特異的ペプチド、Ａｂｌペプチドおよびグリコーゲン・シンターゼ１−１０を、ソースプレート（３８４ウェルプレート）から、水中０．０３−２ｍｇ／ｍＬの濃度でヒドロゲル被覆スライド（パーキンエルマー）に配列した。Ａｂｌペプチド（ニューイングランド・ビオラボ社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））はＡｂｌチロシンキナーゼの基質であり、そのアミノ酸配列はＥ−Ａ−Ｉ−Ｙ−Ａ−Ａ−Ｐ−Ｆ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｋ（分子量１３３６）である。グリコーゲンシンターゼ１−１０（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））はカルシウム−カルモジュリン−依存性タンパク質キナーゼＩＩの基質であり、そのアミノ酸配列はＰ−Ｌ−Ｓ−Ｒ−Ｔ−Ｌ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ（分子量１０４５．２）である。アレイを８ピン４列（合計３２）に固定した手動ガラススライドアレイアー（Ｖ＆Ｐサイエンティフィック、サンジエゴ、ＣＡ）を用いてスポットした。スポットの大きさは直径〜５００ミクロン、１．１２５水平ピッチおよび７５０ミクロン垂直ピッチである（ピッチ＝スポットの中心から中心までの間隔）。ハンドアレイアーはソースプレートから６ｎＬのペプチドを集め、ヒドロゲル被覆スライドに直接接触によって〜６ｎＬを移した。生成したペプチド濃度は０．１８ないし１２ｎｇ／スポットである。ペプチドを６回繰り返して配列し、９６スポットのアレイを生成した（そのうち１２スポットは０ｎｇ／スポットであった）。配列後、スライドを一晩湿度の高い室に置いたままにする。その後スライドを１時間、１００ｍＭＨＥＰＥＳ、１％ＢＳＡ中で回しながらブロックした（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｌａｂｑｕａｋｅ  ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）。ブロッキング後、スライドホールダーでローターに固定させた小さいマイクロアレイ高速（最大〜６０００ｒｐｍ）遠心管（テレケム）中でスライドを短時間スピンし、過剰の液体を除去した。次に、Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｈｙｂｒｉｗｅｌｌ（登録商標）ハイブリダイゼーション・シーリング・システム（４０×２２×０．２５ｍｍ）をヒドロゲルポリアクリルアミドパッドを包囲するようにヒドロゲル被覆スライドに付着することによって、キナーゼ反応を行った。反応は、２０，０００Ｕ／ｍＬまたは１６００単位の酵素（カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ、ＮＥＢ）を含む８０μＬの反応容量で、その酵素と共に供給された緩衝液、ＣａＣｌ２、カルモジュリンおよびＡＴＰを用いて行われた。１ＸＣａｍＫＩＩ緩衝液は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５を含んでいた。ＣａＣｌ２、カルモジュリンおよびＡＴＰの使用濃度は２ｍＭ、１．２μＭおよび０．１ｍＭであった。酵素を含む反応溶液は、シールカバー上の２つの口の１つからピペットでＨｙｂｒｉｗｅｌｌ（登録商標）に置かれた。両方の口はシールタブでシールし、ＣＭＴ−ハイブリダイゼーション・チェンバ（ＶＷＲサイエンティフィック社）に置き、ニューテイター（クレイ・アダムス（Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ））上、３７℃インキュベータ中でインキュベートした。キナーゼ反応は３時間行われた。インキュベーション後、スライドをハ���ブリダイゼーションチェンバから取り出し、１０％ＳＤＳ中で２度、５分間ずつ洗い、その後水中で撹拌しながら５分間ずつ５−７回洗った。スライドを、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０；５００ｍＭ  ＮａＣｌ；２０％１．２−プロパンジオール；および１μＭ  ＧａＣｌ３を含む１μＭ化合物２を含んでなる結合溶液に直ちに移し、４５分間撹拌した。スライドを３回１５分ずつ５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、１０％メタノールで洗い、その後１５分間水で洗った。スライドをその後乾燥し、スキャン・アレイ（登録商標）５０００ＸＬマイクロアレイ分析システム（パッカード・インスツルメント社、メリドン、ＣＴ）を用い、５４３．５ｎｍレーザーおよび５７０ｎｍまたは５９２ｎｍ発光フィルタを使用して画像化した。カルモジュリン依存性キナーゼＩＩはグリコーゲン・シンターゼ１−１０ペプチドを特異的にリン酸化する。５４３．５ｎｍ励起および５７０ｎｍ発光フィルタを使用した場合グリコーゲン・シンターゼペプチドはそのアレイ上で蛍光標識される唯一のペプチドである。キナーゼ反応後の検出感度は少なくも０．３７５ｎｇまたは０．３５ｐｍｏｌである。
【０２４４】
（実施例２１．マイクロアレイ・フォーマットにおける固定されたキナーゼ基質の検出；Ａｂｌペプチド基質の特異的検出）
次の実験は下記のような相違はあるが本質的に実施例２０に記載されたように行われた。２種類の特異的ペプチド、Ａｂｌペプチドおよびケムプチド、をソースプレート（３８４−ウェルプレート）から、０．０３ないし２ｍｇ／ｍｌ水の濃度でヒドロゲル被覆スライド（パーキンエルマー）上に配列した。ケムプチド（ニューイングランド・ビオラボ）はｃＡＭＰ−依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）触媒サブユニットの基質であり、そのアミノ酸配列はＬ−Ｒ−Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｌ−Ｇ（分子量７７１）である。アレイは実施例２０に記載のようにスポットされ、キナーゼ反応は既述のように行われた。その反応は３，７５０Ｕ／ｍＬまたは３００単位の酵素（Ａｂｌタンパク質チロシンキナーゼ、ＮＥＢ）を含む８０μＬ反応容量中で、この酵素と共に供給された緩衝液およびＡＴＰを使用して実施された。１ＸＡｂｌ緩衝液は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭジチオトレイトール、０．０１％Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５を含んでいた。スライドの標識化および画像化は既述のように行われた。５４３．５ｎｍｎｍ励起および５７０ｎｍ発光フィルタを使った場合、Ａｂｌペプチド基質はアレイ上の蛍光標識される唯一のペプチドである。キナーゼ反応後の検出感度は少なくも０．１８ｎｇまたは０．１４ｐｍｏｌである。
【０２４５】
（実施例２２：本発明の結合溶液を使用するリン酸化標的分子の比率測定分析および総タンパク質色素ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙゲル染色）
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにリンタンパク質および非リンタンパク質の低減希釈液を載せ、ゲルを実施例２に記載のように染色した。ゲルを照射し、各タンパク質濃度および各染色（リンタンパク質および総タンパク質）につて蛍光シグナル（強度）を定量した。これらの蛍光強度の比、リンタンパク質および総タンパク質、をウェルに加えたタンパク質量（ｎｇ）に対してグラフにした。各染色の蛍光光度をタンパク質濃度に対してプロットし、このグラフから２染色の各々の定数、Ｙ切片値を計算することができる。Ｙ切片値を蛍光強度値から差し引き、生成した比を（リンタンパク質  対  総タンパク質）再びタンパク質濃度に対してグラフにする。生成したグラフの数値から、染色されたリンタンパク質が非リン酸化タンパク質より５０−１００倍大きい比の数値を有することが明らかにされ、非特異的染色および少量のリンタンパク質が非リン酸化タンパク質から区別された。図１０を参照されたい。
【０２４６】
実施例２３：マイクロアレイ上の固定ペプチドのリン酸化中におけるＡＴＰ−γ−Ｓの挿入およびその後の本発明の結合溶液によるホスホロチオエート基の検出
Ａｂｌペプチド、ケムプチドおよびグリコーゲンシンターゼ１−１０を含む３種類の特殊なペプチドをソースプレート（３８４−ウェルプレート）から水中０．０３μｇ／ｍないし０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でヒドロゲル被覆スライド（パーキンエルマー）上に配列した。タンパク質を、４本のガラス毛細管からなるＰｉｅｚｏＴｉｐＴＭディスペンサーを利用するＢｉｏＣｈｉｐＡｒｒａｙｅｒＴＭ（パッカード・インスツルメント社、メリドン、ＣＴ）でスポットした。タンパク質はＰｉｅｚｏＴｉｐＴＭから３３３ｐＬの小滴として分配され、直径１７５ミクロンのアレイスポットを、５００ミクロン水平ピッチおよび垂直ピッチで生成した（ピッチ＝スポットの中心から中心までの間隔）。各ペプチドを１５希釈点からなる２倍希釈系列から四重に配列し、２４０スポットのアレイを生成した（水のスポット＝０ｐｇ／スポットタンパク質  を６０スポット含む）。生成したペプチド濃度は０．０１ｐｇ／スポットないし１６６．５ｐｇ／スポットであった。配列後、スライドを湿度の高い室に一晩置いた。スライドを１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．５、において揺り動かしながら１時間ブロックした（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ  Ｌａｂｑｕａｋｅ  ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）。ブロッキング後、スライドを、スライドホールダ（テレケム）でロータに固定された小さいマイクロアレイ高速（最大〜６０００ｒｐｍ）遠心管で短時間スピンし、過剰の液体を除去した。次に、Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｈｙｂｒｉｗｅｌｌ（登録商標）ハイブリダイゼーション・シーリング・システム（４０×２２×０．２５ｍｍ）をヒドロゲル被覆スライドに付着させて、ヒドロゲル・アクリルパッドを含む領域を包囲することによってキナーゼ反応を行った。この反応は、３７５０Ｕ／ｍＬまたは３００単位の酵素（Ａｂｌタンパク質チロシン・キナーゼ）を含む８０μＬ反応容量で、酵素と共に供給された緩衝液を使用して行われた。１ＸＡｂｌ緩衝液は５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、２ｍＭジチオトレイトール、０．０１％Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５を含んでいた。ＡＴＰ−γ−Ｓ（シグマケミカル社）を使用濃度０．１０ｍＭでＡＴＰの部位で置換した。対照反応を第二のスライド上でＡＴＰそのものを使って同時に行い、酵素を使用濃度０．１０ｍＭで供給した。その酵素を含む反応溶液をシールカバー上の２つの口のうちの１つを通してＨｙｂｒｉｗｅｌｌ（登録商標）にピペットで加えた。それらの口をシール−タブでシールし、ＣＭＴ−ハイブリダイゼーションチェンバ（ＶＷＲサイエンティフィック）に置き、ニューテイター（クレイ・アダムス）上、３７℃インキュベーター中でインキュベートした。キナーゼ反応は３時間行われた。インキュベーション後、スライドをハイブリダイゼーションチェンバから取り出し、１０％ＳＤＳ中で２度、５分間ずつ洗い、その後水中で撹拌しながら５分間ずつ５−７回洗った。スライドを、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％１．２−プロパンジオール、および１μＭ  ＧａＣｌ３中１μＭ化合物２の溶液に直ちに移し、４５分間揺りうごかした。スライドを３回１５分ずつ５０���Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、４％アセトニトリルで洗い、その後１５分間水で洗った。スライドを乾燥し、スキャン・アレイ（登録商標）５０００ＸＬマイクロアレイ分析システム（パッカード・インスツルメント社、メリドン、ＣＴ）を用い、５４３．５ｎｍレーザーおよび５７０ｎｍまたは５９２ｎｍ発光フィルタを使用して画像化した。Ａｂｌタンパク質チロシン・キナーゼはＡｂｌペプチドのチロシン残基をホスホロチオエート（または対照としてリン酸）でリン酸化する。５４３．５ｎｍ励起および５７０ｎｍ発光フィルタを使用した場合、Ａｂｌペプチド基質はこのアレイ上で蛍光標識される唯一のペプチドである。キナーゼ反応後の検出感度は、ＡＴＰ−γ−Ｓを用いて標識化されたペプチド２．６ｐｇであった。比較により、ＡＴＰを使用する対照反応において、Ａｂｌペプチド０．３２５ｐｇが標識され、化合物２を含む結合溶液で検出された。
【０２４７】
（実施例２４：膜上に固定されたストレプトアビジンまたはリン酸結合化合物によるホスホペプチドの分離：）
ポール（Ｐｏｌｌ）から購入したイムノダイン膜を、十分な５−１０ｍｇ／ｍＬストレプトアビジンまたはＢＡＰＴＡ−アミンを加えて膜を湿らす（約１５μＬ／ｃｍ２）ことによって標識化した。１５−３０分間乾燥後、膜を５分間ずつ３回、５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＥで洗い、それから水で５分間ずつ２回洗った。実験は６ｍｍ直径の円形の膜を使用して行われた。ストレプトアビジン標識膜を２００μＬの４０μＭ化合物９／２５０μＭＧａＣｌ３に浸すことによって担持させ、ＢＡＰＴＡ標識化膜は２００μＬの２５０ｕＭ  ＧａＣｌ３に浸すことによって担持させた。１０％アセトニトリル／４００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４、で１回洗い、その後水で２回洗った後、それらの膜を、２種類の非ホスホペプチドおよび３種類のホスホペプチドを２μｇずつ含む（総ペプチド約６ナノモル）ペプチド混合物１００μＬに１５分間浸した。膜を１０％アセトニトリル／４００ｍＭ  ＮａＣｌ／１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４、で１回洗い、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４で５分間ずつ２回洗った。最後に膜を、１００μＬの５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡで溶出した。溶出液およびペプチド上澄液（膜のインキュベーション後のペプチド溶液）をＭＡＬＤＩ分析のために調製した。
【０２４８】
（実施例２５：フェロフルード・ビーズに固定されたストレプトアビジンによるホスホペプチドの分離）
Ａ．ストレプトアビジン・フェロフルード磁気粒子とＢＡＰＴＡ−ビオチン色素との組み合わせ使用によるホスホペプチドの分離
ストレプトアビジン・フェロフルード磁気粒子をＢＡＰＴＡ−ビオチン化合物と組み合わせて使用し、複雑な混合物からホスホペプチドを分離した。化合物９および２種類のローダミン−ビオチン色素（化合物１５および化合物２５）でビオチンおよびストレプトアビジン間の結合により磁気粒子を標識化した。リン酸結合化合物を洗い流した後、粒子に０．１Ｍ  ＧａＣｌ３を付加し、その後０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０で洗った。磁気粒子のスラリー（４ｍｇ／ｍＬ）５０μＬをホスホペプチド混合物に加えて総容量１００μＬとする。おだやかに２０分間ボルテックスして上記粒子をインキュベートし、磁気分離器を使用して上記粒子を分離した。上澄液を除去し、ビーズを１００μＬ１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、で２回洗った。ホスホペプチドを１００μＬ５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡで溶出した。分離したペプチドをＭＡＬＤＩによって分析し、リン酸化ペプチドだけが分離されることを証明した。
【０２４９】
Ｂ．ストレプトアビジン・フェロフルード粒子を使用するホスホペプチドの定量的結合  ホスホペプチド類の定量的結合を標識化フェロフルード粒子を使用して行った。ストレプトアビジン・フェロフルード粒子を化合物９で飽和するまで標識化した。未結合色素を洗い流した後、粒子に０．１Ｍ  ＧａＣｌ３を付加し、その後０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０で洗った。磁気粒子（４ｍｇ／ｍＬ）１００μＬに、ホスホペプチド５５０ｐｉｃｏｍｏｌを含む標準ペプチド混合物を加えた。混合物をおだやかにボルテックスしながら２０分間インキュベートした。磁気分離器を使用して粒子を分離し、生成した上澄液を除去した。ビーズを１００μＬの１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、で２回洗い、０．１５水酸化アンモニウムでホスホペプチドを溶出した。ホスホペプチドの９５％（５５０ｐｍｏｌ）以上が分離された。
【０２５０】
Ｃ．塩基の脱離／付加と組み合わせたホスホペプチドのフェロフルード粒子分離
化合物９で標識化したストレプトアビジン・フェロフルード（ＳｔＦＦ）粒子をホスホペプチド分離のために使用し、塩基の脱離／付加と組み合わせた。ホスホペプチドをＳｔＦＦ上で分離し、その後ホスホペプチドを５０μＬの０．１５Ｍ  Ｂａ（ＯＨ）２で溶出した。その後、３μＬメチルアミンをその溶出液に加え、ペプチド類を３７℃で１時間インキュベートした。反応物を氷酢酸で中和してｐＨ４．０とし、溶出したペプチド類をＺｉｐＴｉｐｓで脱塩した。ストレプトアビジン−標識化フェロフルードビーズの使用はアビジンとビオチンとの強力な相互作用を可能にし、比較的大きいリン酸化標的分子の分離が容易になる。
【０２５１】
（実施例２６：ＤＴＰＡ化合物によるホスホペプチドの沈殿）
ＤＴＰＡ（化合物２０、２１および２２）を含むリン酸結合化合物を沈殿反応に使用して、錯体溶液からホスホペプチドを分離した。沈殿反応は１００μＭ  化合物２０、２１または２２、２００μＭ  ＧａＣｌ３、１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、および５μＬの８−ペプチド混合物（各２５０ｎｇ／μＬ）を含んでいた。サンプル類を２０分間激しくボルテックスし、その後１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄液を除去し、保存し、ペレットは１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０、で、ピペット先端による再懸濁および再遠心分離によって２回洗った。最終的ペレットを１００μＬの５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡに溶解した。上澄液およびペレットフラクションを５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡで１：１００に希釈し、その後ＭＡＬＤＩ基質と１：１に混合し、ＭＡＬＤＩ標的上にスポットした。ＭＡＬＤＩ分析の結果、リン酸化ペプチドの選択的分離が証明された。
【０２５２】
（実施例２７：本発明の結合溶液による総ホスホペプチドの連続的検出、およびその後のホスホチロシン特異的モノクローナル抗体と、（Ａ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗マウスまたは（Ｂ）Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｏｎｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７マウスＩｇＧ標識試薬とを使用するペプチド中のホスホチロシン残基の特異的検出（両方ともマイクロアレイ・フォーマット））
（Ａ）３組のペプチド類、ケムプチド、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃおよびＤＳＩＰのリン酸化および非リン酸化型をソースプレート（３８４−ウェル）から、水中０．９５μｇ／ｍｌ−０．５ｍｇ／ｍｌペプチド濃度でヒドロゲル被覆スライド（パーキンエルマー）に配列した。その際実施例２０に記載したＢｉｏＣｈｉｐＡｒｒａｙｅｒＴＭ（パーキンエルマー）を使用した。アレイ上でホスホペプチドを特異的に検出するために、スライドを、ロティセリー（あぶり器）上で、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０％１，２プロパンジオール、１μＭ  ＧａＣｌ３、および０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、を含む緩衝液中１μＭ  化合物２を含む結合溶液中で４５分間インキュベートした。その後スライドをロティセリー上で、４％アセトニトリルを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、中で１５分間ずつ３回洗い、水で１５分間ずつ２回洗った。スライドをスライドホールダでロータに結合したミクロアレー高速遠心管（テレケム）中で〜６０００ｒｐｍで短時間スピンし、過剰の液体を除去した。スライドを乾かした後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）５０００ＸＬマイクロアレイ分析システム（パッカード・インスツルメント社、メリドン、ＣＴ）を用い、５４３．５ｎｍレーザーおよび５７０ｎｍ発光フィルタを使用してアレイを画像化した。この結合溶液は１．３−２．６ｐｇ  ＤＳＩＰ、２．６−５．２ｐｇ  ｐＫｅｍｐｔｉｄｅおよび１０．４−２０．８ｐｇ  ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（ｐＹ）を特異的に標識した。ホスホペプチドの検出後、直ちにスライドを５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ツイーン−２０、０．２５％ＭＯＷＩＯＬ−４８８、０．５％ＢＳＡを含むブロッキング緩衝液に入れ、回しながら３−５時間インキュベートした。その後スライドを、ホスホチロシン・モノクローナル抗体（１．５ｍｇ／ｍＬで供給された；Ｐ−Ｔｙｒ−１００；セル・シグナリング・テク）の１：１０００希釈（最終濃度１．５μｇ／ｍＬ）を含むブロッキング緩衝液（上記）に移し、回しながら４℃で一晩インキュベートした。一次抗体と共に一晩インキュベートした後、スライドをブロッキング緩衝液中で１０分間ずつ３回洗い、その後Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ヤギ抗マウス（２ｍｇ／ｍＬで供給された）の１：５０００希釈（最終濃度０．４μｇ／ｍＬ）を含むブロッキング緩衝液中で回しながら４５分間インキュベートした。最後にスライドをブロッキング緩衝液中で１０分間ずつ２回洗い、その後５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で５分間ずつ２回洗い、マイクロアレイ高速遠心管中で短時間スピンした。スライドを乾かした後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）５０００ＸＬマイクロアレイ分析システム（パッカード・インスツルメント社、メリドン、ＣＴ）を用い、５４３．５ｎｍレーザー／５７０ｎｍ発光フィルタの組と、６３２．８ｎｍレーザー／６７０ｎｍ発光フィルタの組の２つのプロトコルを使用してアレイを画像化した。５４３．５ｎｍ励起および５７０ｎｍ発光フィルタの組を使用した場合シグナルは検出されなかった。６３２．８ｎｍ励起および６７０ｎｍ発光フィルタの組を使用した場合、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（ｐＹ）��５．２ｐｇの感度で特異的に検出された。
【０２５３】
（Ｂ）一次抗体と共に一晩インキュベートした後、スライドをブロッキング緩衝液中で１０分間ずつ３回洗い、それからＺｅｎｏｎ（登録商標）Ｏｎｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７マウスＩｇＧ標識化試薬（２００μｇ／ｍＬで供給される）の１：１００希釈（最終濃度２μｇ／ｍＬ）を含むブロッキング緩衝液中で回しながら４５分間インキュベートした。最後にスライドをブロッキング緩衝液中で５分間１回、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で５分間１回洗い、マイクロアレイ高速遠心管中で短時間スピンした。スライドを乾かした後、ＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）５０００ＸＬマイクロアレイ分析システム（パッカード・インスツルメント社、メリドン、ＣＴ）を用い、５４３．５ｎｍレーザー／５７０ｎｍ発光フィルタの組と、６３２．８ｎｍレーザー／６７０ｎｍ発光フィルタの組の２つのプロトコルを使用してアレイを画像化した。５４３．５ｎｍ励起および５７０ｎｍ発光フィルタの組を使用した場合シグナルは検出されなかった。６３２．８ｎｍ励起および６７０ｎｍ発光フィルタの組を使用した場合、ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（ｐＹ）が０．６５ｐｇの感度で特異的に検出された。
【０２５４】
実施例２８：本発明の結合溶液を使用するホスホペプチドのサイズ排除カラム（ＳＥＣ）および逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ分析
２−６０μＭホスホペプチド（または対照、１００μｍ非−ホスホペプチド）、２０μＭ化合物２、４０μＭ  ＧａＣｌ３、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４、および０−２０％エチルアルコールまたはイソプロピルアルコールを含むサンプル１０−４０μＬをサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅ３０、１０×３００ｍｍまたはＳｕｐｅｒｄｅｘＰｅｐｔｉｄｅ  ３．２×３００ｍｍ）上に注入した。移動相は５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌプラス２０％エチルアルコールまたはイソプロピルアルコールであった。操作時間は４５分であった。ＵＶおよび蛍光シグナルをそれぞれ２１４ｎｍおよび５５５励起／５８０発光でモニターした。
【０２５５】
ＳＥＣの結果は、本発明の結合溶液の存在下および非ホスホペプチドに比較して、ホスホペプチド（６０μＭ）の存在下で蛍光シグナルが高まることを明らかにした。
【０２５６】
同じサンプルをＶｙｄａｃ２３８ＴＰ５２、２．１×２５０ｍｍＣ１８カラムを用いる逆相ＨＰＬＣによっても分析した。溶媒Ａ＝１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４、０−２０％エチルアルコール。溶媒Ｂ＝１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４、２０％エチルアルコール、６０％メタノール。勾配分離を、０−５５％溶媒Ｂで０．２ｍＬ／ｍｉｎの速度で３０分間にわたり行った。ＵＶ（２１４ｎｍ）および蛍光（励起５５５／発光５８０）シグナルをモニターした。
【０２５７】
ＲＰの結果は、本発明の結合溶液および塩化ガリウムを含まない溶液の存在下で蛍光シグナルが高まることを証明した。モノ−ホスホチロシン、モノ−ホスホスレオニンおよびモノホスホセリン含有ペプチドを含むサンプルを分析し、同等の結果を得た。
【０２５８】
（実施例２９：本発明の結合溶液を使用するストレプトアビジン−ポリスチレン・ビーズ上のホスホペプチド類の検出）
ストレプトアビジン−ポリスチレンビーズ（４．０−４．９μＭ）に２種類のビオチニル化合成ペプチド、ホスホペプチドまたは非−ホスホペプチドのどちらかを担持させた。そのホスホペプチドは分子量１８１２ｇ／ｍｏｌを有し、アミノ酸配列はビオチニル−ε−アミノカプロイル−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＯＨであった。非ホスホペプチドは分子量２３４２．５５ｇ／ｍｏｌで、アミノ酸配列はビオチニル−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２であった。ビーズを１００ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に加え、その後染色する前に同じ緩衝液で数回洗った。ビーズの両方の組を０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、１μＭＧａＣｌ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、および２０％１，２−プロパンジオール中１μＭ化合物２で４５分間染色した。染色後、ビーズを０．０５Ｍ酢酸、ｐＨ４．０、４％アセトニトリル中で洗い、ホスホペプチド担持ビーズと非ホスホペプチド担持ビーズとを種々の比で混合した。全ての工程は回転および激しい超音波処理およびボルテックスを伴って行われた。混合ビーズ集団をその後Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８００エピ−蛍光顕微鏡を用い、オメガ・オプティカル社のフィルターセットＸＦ１０２−２（励起：５６０ＡＦ５５；二色性：５９５ＤＲＬＰ；発光：６４５ＡＦ７５）を使用して画像化した。ホスホペプチド担持ビーズの蛍光シグナルは非ホスホペプチド担持ビーズの平均６倍高いことが判明した。
【０２５９】
（実施例３０：ストレプトアビジン−ポリスチレン粒子に結合したペプチド基質のキナーゼー媒介性リン酸化を本発明の結合溶液を使用して検出）
ストレプトアビジン−ポリスチレンビーズ（４．０−４．９μＭ）にクロスチドと呼ばれるビオチニル化合成ペプチドを担持させた。クロスチドはセリン／スレオニン・キナーゼＡｋｔ／タンパク質キナーゼＢのペプチド基質であり、アミノ酸配列、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙを有する１８０８ｇ／ｍｏｌペプチドである。ビーズを１００ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に加え、担持後、染色する前に同じ緩衝液で数回洗った。その後ストレプトアビジン・ポリスチレン粒子上のクロスチドペプチドを、２００μＭ  ＡＴＰを補充した４０μＬ中１５ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、１８．７５ｍＭβ−リン酸グリセロール、３．７５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．７５ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．７５ｍＭ  ＤＴＴ中、５００ｎｇのＡｋｔ／ＰＫＢキナーゼを用いてリン酸化した。対照反応は、キナーゼ酵素を除くＡＴＰを含む全ての反応成分を加えて行われた。リン酸化は、連続的に回しながら３０℃で６０分間行われ、ビーズとキナーゼとを加えて１００℃で５分間インキュベートして停止した。ビーズを１００ｍＭトリス、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５中でインキュベートし、その後０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、１μＭ  ＧａＣｌ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、および２０％１，２−プロパンジオールを含む緩衝液中１μＭ化合物２で４５分間染色した。染色後、ビーズを０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０、４％アセトニトリルで洗い、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８００エピ蛍光顕微鏡を用い、オメガ・オプティカル社のフィルタセットＸＦ１０２−２（励起：５６０ＡＦ５５；二色性：５９５ＤＲＬＰ；発光：６４５ＡＦ７５）を使用して画像化した。Ａｋｔ／ＰＫＢキナーゼにさらされたペプチド担持ビーズ蛍光シグナルは、標準偏差のオーバーラップなしに、酵素にさらされなかった対照ペプチド担持ビーズより２．２倍高いことが判明した。
【０２６０】
（実施例３１：化合物２の合成）
２０ｍＬプロピオン酸中３−ジメチルアミノフェノール（０．４７ｇ、３．５ｍｍｏｌ）および５−フルオロ−５’−ホルミルＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（１．００ｇ、１．７ｍｍｏｌ）の溶液を１００℃で２時間加熱し、冷やし、１２０ｍＬのＮａＯＡｃ水溶液に注入した。生成した紫色のガムを水で洗い、酢酸エチルに溶解し、蒸発すると、ジヒドロ−Ｒｈｏｄ−５Ｆ−テトラメチルエステルが赤色フォームとして得られる。
【０２６１】
１：１クロロホルム／メタノール（４０ｍＬ）中ジヒドロ−Ｒｈｏｄ−５Ｆテトラメチルエステル（１．２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）にクロラニル（０．５１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。その溶液を室温で一晩撹拌し、蒸発した。残留物をフラッシュクロマトグラフィーによって、溶出液としてクロロホルム／メタノール／酢酸（５０：５：１）を使用して精製すると、０．５４ｇのＲｈｏｄ−５Ｆテトラメチルエステルが赤色フォームトシテ得られた。
【０２６２】
ジオキサン（２５ｍＬ）中Ｒｈｏｄ−５Ｆテトラメチルエステル（０．４８ｇ、０．５５ｍｍｏｌ）に１Ｍ  ＫＯＨ（４．４ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を一晩撹拌し、その後蒸発した。残留物を１０ｍＬ水に溶解し、５％ＨＣｌ５０ｍＬを加えた。沈殿物を濾過して取り、乾燥するとＲｈｏｄ−５Ｆ遊離酸２７５ｍｇが赤色粉末として得られた。この生成物をＫＯＨ水溶液でカリウム塩に変形し、その後セファデックスＬＨ−２０上で水でカラムクロマトグラフィーを行うと、化合物２の三カリウム塩が赤色粉末として得られた。
【０２６３】
（実施例３２：化合物５の合成（ローダミンＢＡＰＴＡ化合物））
２０ｍＬプロピオン酸中、８−ヒドロキシジュロリジン（０．７６ｇ、４．１ｍｍｏｌ）、５−フルオロ−５’−ホルミル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（１．１６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）およびｐ−ＴｓＯＨ（２０ｍｇ）を６０℃で一晩加熱し、その後冷やし、１５０ｍＬの３Ｍ  ＮａＯＡｃ中に注入した。紫色粉末を濾過によって集め、水ですすぎ、乾燥すると、ジヒドロ−Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｆテトラメチルエステル２．１５ｇが紫色粉末として得られた。
【０２６４】
１：１クロロホルム／メタノール（８０ｍＬ）中のジヒドロ−Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｆテトラメチルエステル（２．１ｇ、２．４ｍｍｏｌ）にクロラニル（１．４５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で４時間撹拌し、その後蒸発した。残留物をクロロホルム／メタノール／酢酸を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｆテトラメチルエステル３．０ｇが赤色フォームとして得られた。
【０２６５】
ジオキサン（２５ｍＬ）およびメタノール（２５ｍＬ）中Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｆテトラメチルエステル（３．０ｇ、２．９ｍｍｏｌ）に１Ｍ  ＫＯＨ（３０ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を一晩撹拌し、その後蒸発した。残留物を１０ｍＬ水に溶解し、これを５０ｍＬの５％ＨＣｌに加えた。沈殿物を濾過し、乾燥すると、化合物５遊離酸５００ｍｇが紫色粉末として得られた。この遊離酸の１００ｍｇをＫＯＨ水溶液で三カリウム塩に変形し、その後セファデックスＬＨ−２０上で水でクロマトグラフィーを行うと、４０ｍｇの化合物５が紫色粉末のカリウム塩として得られた。
【０２６６】
（実施例３３：キナゾリノン標識化ＢＡＰＴＡ（Ｑ−ＢＡＰＴＡ）化合物（化合物７および２３）の合成）
５−フルオロ−Ｑ−ＢＡＰＴＡ（化合物７）の製法：ｐ−トルエンスルホン酸（ＴｓＯＨ）の触媒量を１０ｍｌジクロロエタン／５ｍＬエタノール中アントラミルアミド（２９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）および５’−フルオロ−５−ホルミル−４−ヒドロキシ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（１２８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を一晩還流し、その後冷やした。クロラニル（５７ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、溶液を蒸発し、残留物を５％メタノール／クロロホルムを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると化合物７のテトラメチルエステル５０ｍｇが明るい琥珀色の固定された油として得られた；ｍ／ｚ７１１（Ｃ３４Ｈ３４Ｎ４Ｏ１２Ｆで計算して７１０）。
１：１ジオキサン：メタノール（５ｍＬ）中化合物７（５０ｍｇ．０．０７ｍｍｏｌ）テトラメチルエステルの緑色溶液に、１Ｍ  ＫＯＨ水溶液（０．５６ｍＬ、０．５６ｍｍｏｌ）を加えた。黄色溶液を一晩撹拌し、その後蒸発した。残留物をセファデックスＬＨ−２０上で水で精製すると５３ｍｇの化合物７がカリウム塩として黄色粉末として生成した；ｍ／ｚ（ポジティブモード）６５５（Ｃ３０Ｈ２３Ｎ４Ｏ１２Ｆで計算して６５１）。
【０２６７】
５，６−ジフルオロ−Ｑ−ＢＡＰＴＡ（化合物２３）の製法：５，６−ジフルオロ−４’−ヒドロキシ−５’−ホルミルＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（０．１００ｇ、０．１６３ｍｍｏｌ）およびアントラミルアミド（０．０２２ｇ、０．１６２ｍｍｏｌ）を塩化メチル（１０ｍＬ）およびエタノール（５ｍＬ）の混合液に溶解した。ＴｓＯＨ（５ｍｇ）を加え、反応混合液を３時間還流した。クロラニル（０．０４４ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）をこの溶液に加えた。混合物をさらに２時間還流し、蒸発した。粗生成物を２：１クロロホルム−酢酸エチルを溶出液として使用し、分取ＴＬＣによって精製した。主要成分（Ｒｆ＝０．５）を酢酸エチルで分離し、その溶液を蒸発し、５，６−ジフルオロ−Ｑ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステルが無色粉末（０．０２９ｇ、２４％）として得た。
【０２６８】
５，６−ジフルオロ−Ｑ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（０．０２７ｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）を１ｍＬメタノールおよび１ｍＬジオキサンの混合液に加えた。１Ｍ  ＫＯＨ（１ｍＬ）を溶液に加え、反応混合物を室温に一晩保持した。揮発物を蒸発し、粗生成物を水に再溶解し、セファデックスＬＨ−２０カラム上で水で溶出して精製した。粗生成物を凍結乾燥すると５，６−ジフルオロ−Ｑ−ＢＡＰＴＡカリウム塩（化合物２３）が黄色粉末（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｋ）として得られた。
【０２６９】
【化１１】
2005539243.tif 000013
【０２７０】
実施例３４：（ボラポリアザインダセンＢＡＰＴＡ）化合物（化合物８および２４）の合成
ＢＯＤＰＹ  ＦＬ色素ＢＡＰＴＡ−５Ｆ（化合物８）の製法：９ｍＬ酸性無水物中５−フルオロ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（１．００ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）の冷溶液に７０％硝酸（０．１５ｍＬ、２．３ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、その反応溶液を３０ｍＬ  ＮａＰＡｃ水溶液に注入し、その後飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えた。混合物をクロロホルムで抽出した（２×３０ｍＬ）。抽出液をブラインで洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮して琥珀色の残留物にした。これを酢酸エチル／ヘキサンを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると０．４３ｇの５−ニトロ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステルが黄色粉末として得られる。
【０２７１】
１：１メタノール／ジオキサン（１０ｍＬ）中５−ニトロ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡ、テトラメチルエステル（０．４３ｇ、０．７２ｍｍｏｌ）に１Ｍ  ＫＯＨ（５．８ｍＬ、５．８ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を一晩撹拌して蒸発した。残留物を１０ｍＬ水に溶解し、ＨＣｌ水溶液でｐＨを２に低下させた。沈殿物を集め、乾燥すると５−ニトロ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡ遊離酸が黄色粉末として得られた。
【０２７２】
３０ｍＬメタノール中５−ニトロ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡ遊離酸（０．３１ｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の溶液を１０％Ｐｄ／炭素（０．１５ｇ）上で、３８ｐｓｉ水素ガス下で６時間振とうし、濾過し、蒸発すると５−アミノ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡ遊離酸０．２６ｇが無色粉末として得られた。
【０２７３】
５ｍＬ無水ＴＨＦ中ＢＯＤＰＹ  ＦＬ色素遊離酸（モレキュラー・プローブ社、Ｄ−２１８３、２７ｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をアルゴン下で塩化オキサリル（０．２０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．２０ｍｍｏｌ）で処理した。１５分後、溶液を蒸発した。残留物を３ｍＬ無水ジオキサンに溶解した。この溶液を炭酸ナトリウムでｐＨ＝９．５に調節した水５ｍＬ中、５−アミノ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡ遊離酸（５０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）にゆっくり加えた。この溶液を一晩撹拌し、蒸発して乾燥に近い状態にした。この溶液をセファデックスＬＨ−２０上で水で溶出して精製すると、ＢＯＤＰＹ  ＦＬ色素ＢＡＰＴＡのナトリウム塩（化合物８）４１ｍｇがオレンジ色粉末として得られた。
【０２７４】
ＢＯＤＰＹ  ＦＬ色素−ＥＤＡ−ＢＡＰＴＡ（化合物２４）の製法
水３ｍＬ中のＢＯＤＰＹ  ＦＬエチレンジアミン塩酸塩（１５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ、モレキュラー・プローブス）の溶液のｐＨを炭酸水素ナトリウムの滴下によって７．６に高めた。２ｍＬジオキサン中、５−イソチオシアネート−ＢＡＰＴＡ遊離酸（２２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。ｐＨを炭酸ナトリウムで９．５まで高め、オレンジ色の溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を蒸発して２ｍＬまでにし、この溶液をセファデックスＬＨ−２０上で水で溶出するとＢＯＤＰＹ  ＦＬ−ＥＤＡ−ＢＡＰＴＡナトリウム塩（化合物２４）１７ｍｇが、凍結乾燥後に、細かいオレンジ色粉末として得られた（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｎａ）。化合物２４
【０２７５】
【化１２】
2005539243.tif 000014
【０２７６】
（実施例３５：ビオチニル化ＢＡＰＴＡ化合物（化合物９、１２および１８）の合成）
ビオチン−ＢＡＰＴＡ−５Ｆ（化合物１２）の製法
５−ニトロ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステルの溶液を酢酸エチル中１０％Ｐｄ／Ｃ上で触媒水素化によって還元した。無水ジクロロメタン／ＴＨＦ（４：１、５ｍＬ）中、生成５−アミノ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（０．１０ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）にグルタル酸無水物（４０ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）および触媒性ＤＭＡＰを加えた。溶液を一晩撹拌し、それから蒸発した。残留物を１０％メタノール／クロロホルムを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、５−アミノ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステルのグルタルアミド０．１３ｇが油として得られた。
【０２７７】
５ｍＬ無水ＴＨＦ中、５−アミノ−５’−フルオロＢＡＰＴＡ、テトラメチルエステルのグルタルアミド（０．１８ｍｍｏｌ）および無水アセトニトリルに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルウロニウム  テトラフルオロボレート（１０８ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、２ｍＬ無水ＤＭＦ中ビオチンエチレンジアミン臭化水素酸塩（６６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、モレキュラー・プローブス）およびＤＩＥＡ（０．０５ｍＬ）の溶液を加えた。一晩撹拌後、揮発物を蒸発した。残留物を水（１５ｍＬ）ですりつぶし、生成した沈殿を集め、水ですすぎ、乾燥すると、ビオチン−ＢＡＰＴＡ−５Ｆテトラメチルエステル０．１０ｇが灰色粉末として得られた。
【０２７８】
１：１メタノール／ジオキサン（４ｍＬ）中、ビオチン−ＢＡＰＴＡ−５Ｆテトラメチルエステル（０．１０ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）に１Ｍ  ＫＯＨ（１．０ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を一晩撹拌し、その後蒸発した。残留物を水を用いてセファデックスＬＨ−２０で精製すると、ビオチン−ＢＡＰＴＡ−５Ｆ（化合物１２）カリウム塩が凍結乾燥後、無色粉末として得られた。
Ｒｈｏｄ−ビオシチン（化合物１８）の製法
無水ＴＨＦ中４−（スクシンイミジルオキシカルボニル）−ｒｈｏｄテトラメチルエステルの０．５Ｍ溶液に、１．１等量のＮ−ｔ−ＢＯＣ−エチレンジアミンおよび１．１等量のＤＩＥＡを加えた。生成した溶液を３０分間撹拌し、蒸発した。残留物をクロロホルム／メタノール／酢酸を使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。精製した炭酸塩をジクロロメタンに溶解し、トリフルオロ酢酸（２０等量）で処理した。この溶液を３０分間撹拌し、蒸発し、乾燥すると、４−カルボキシ−ｒｈｏｄテトラメチルエステルのエチレンジアミンカルボキサミドが得られる。
【０２７９】
ＤＭＦ中、４−カルボキシ−ｒｈｏｄテトラメチルエステルのエチレンジアミンカルボキサミドの０．５Ｍ溶液に、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−ビオシチン  スクシンイミジルエステル（１．５等量、Ｗｉｌｂｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１：５８４−９８（２０００）に記載されている）およびＤＩＥＡ（１．５等量）を加えた。生成した溶液を、ＴＬＣが蛍光性出発原料の消費を示すまで室温で撹拌した。揮発物を真空中で除去し、残留物をクロロホルム／メタノール／酢酸を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−ｒｈｏｄ−ビオシチン  テトラメチルエステルが得られた。
【０２８０】
１：１メタノール／ジオキサン中Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−ｒｈｏｄ−ビオシチンテトラメチルエステルの０．５Ｍ溶液を１２等量の１Ｍ  ＫＯＨで処理した。生成した溶液を室温で一晩撹拌し、その後蒸発乾固した。残留物をセファデックスＬＨ−２０上で水を用いて精製すると、凍結乾燥後、化合物１８が赤色粉末として得られる（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｋ）。
化合物１８
【０２８１】
【化１３】
2005539243.tif 000015
【０２８２】
Ｒｈｏｄ−４−ビオチン−ＢＡＰＴＡ（化合物９）の製法
（２’−ニトロフェノキシ）−２−クロロエタン（２０．１５ｇ、０．１０ｍｏｌ）、メチル（４−ヒドロキシ−３−ニトロ）ベンゾエート（２１．６７ｇ、０．１１ｍｏｌ）、およびＫ２ＣＯ３（２７．６０ｇ、０．２０ｍｏｌ）の懸濁液を１３０℃で１６時間撹拌し、室温まで冷まし、氷水（１．２Ｌ）に注入した。沈殿物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗い、乾燥すると（４’−メトキシカルボニル−２’−ニトロフェノキシ）−２−（２”−ニトロフェノキシ）エタン３２．００ｇが黄色固体として得られた。４’−メトキシカルボニル−２’−ニトロフェノキシ−２−（２”−ニトロフェノキシ）エタン（２０．０ｇ、５５．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中、１０％Ｐｄ／Ｃ（３．０ｇ）上で４０ｐｓｉで５時間水素化した。混合物をセライトによって触媒から濾別した。濾液を蒸発し、エーテル（１００ｍＬ）を加えた。生成物を濾過し、エーテルで洗うと（２×２５ｍＬ）、１’−アミノ−４’−メトキシカルボニルフェノキシ）−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン、１３．２ｇ、がオフ−ホワイトの固体として得られた。
【０２８３】
２’−アミノ−４’−メトキシカルボニルフェノキシ−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン（１３．２０ｇ、４４ｍｍｏｌ）、メタノール（５０ｍＬ）、ジオキサン（５０ｍＬ）および１Ｍ  ＫＯＨ（１００ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を６５℃で５時間撹拌し、その後一晩室温で撹拌した。混合物を蒸発し、残留物をＨ２Ｏ（５００ｍＬ）に懸濁した。１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ５．０にした。沈殿生成物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗い、フィルタ上で４時間乾かし、その後エーテルで洗うと、２’−アミノ−４’−カルボキシ−１’−フェノキシ−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン１２．５ｇがオフ−ホワイト固体として得られた。
【０２８４】
ベンゾフェノンヒドラゾン（６．６６ｇ、３４ｍｍｏｌ）と黄色ＨｇＯ（１７．６０ｇ、８０ｍｍｏｌ）とをヘキサン（２００ｍＬ）中で３時間激しく撹拌することによってジフェニルジアゾメタンを製造した。混合物を無機物から濾別し、蒸発し、残留物をアセトン（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液を、アセトン中２’−アミノ−４’−カルボキシ−１’−フェノキシ）−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン（５．７６ｇ、２０ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。混合物を３５℃で１６時間撹拌し、その後過剰のジフェニルジアゾメタンをＡｃＯＨ（２ｍＬ）で２時間にわたり分解した。混合物を蒸発し、粗生成物をＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって、溶出液としてＣＨＣｌ２を用いて精製すると２’−アミノ−４’ジフェニルメトキシカルボニルフェノキシ−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン  ６．８０ｇがオフ−ホワイト固体として得られた。
【０２８５】
ＭｅＣＮ（４００ｍＬ）中、２’−アミノ−４’ジフェニルメトキシカルボニルフェノキシ−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン（８．２８ｇ、１８．２４ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１６．３ｍＬ、９４ｍｍｏｌ）、メチルブロモアセテート（３５．３ｍＬ、３７６ｍｍｏｌ）およびＮａｌ（１．５０ｇ、１０ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌下で７０時間還流し、室温まで冷まし、蒸発した。残留物をＣＨＣｌ３（５００ｍＬ）に溶解し、１％ＡｃＯＨ（３×２００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で洗い、濾過し、蒸発した。残留物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、ヘキサン中３０−４０％ＥｔＯＡｃの勾配を溶出液として使用して精製すると、４−ジフェニルメトキシカルボニル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル、１０．０１ｇ、が白色固体として得られた。
【０２８６】
ＤＭＦ（３５ｍＬ）中、ＰＯＣｌ３（５ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）から作られたフィルスマイヤー試薬の溶液に、ＤＭＦ（１５ｍＬ）中、４−ジフェニルメトキシカルボニル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（３．７１ｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この混合物を４０℃で２４時間撹拌し、その後フィルスマイヤー試薬の別の部分（２５ｍｍｏｌ）を導入し、混合物を４０℃で７０時間撹拌した。混合物を室温に冷まし、速やかに氷−飽和Ｋ２ＣＯ３混合物（１２００ｍＬ）に注入した。１時間後、沈殿物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗い、乾燥すると、４−ジフェニルメトキシカルボニル−５’−ホルミル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル３．７８ｇが無色固体として得られた。
【０２８７】
プロピオン酸（４０ｍＬ）中、４−ジフェニルメトキシカルボニル−５’−ホルミル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（２．９ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、ｍ−ジメチルアミノフェノール（１．２１ｇ、８．８ｍｍｏｌ）およびＴｓＯＨ（１００ｍｇ）の混合物を６８℃で２０分間撹拌し、その後室温に冷まし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（６００ｍＬ）に注入した。１時間後、沈殿物を濾過し、水で洗い、乾燥すると、４−ジフェニルメトキシカルボニル−ジヒドロロドテトラメチルエステル、３．７０ｇ、が赤紫色固体として得られた。
【０２８８】
ＣＨＣｌ３およびＭｅＯＨ（各々４０ｍＬ）中、４−ジフェニルメトキシカルボニル−ジヒドロロドテトラメチルエステル（２．０５０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）および粉末クロラニル（０．４９２ｇ、２．０ｍｍｏｌ）混合物を２時間撹拌し、濾過し、蒸発した。残留物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、ＣＨＣｌ３／１％ＡｃＯＨ中５−６．５％ＭｅＯＨ勾配を溶出液として用いて精製し、粗生成物を得た。これをＣＨＣｌ３に再溶解し、ＳｉＯ２から濾別し、蒸発すると、４−ジフェニルメトキシカルボニル−ロドテトラメチルエステル０．５３３ｇが暗紫色固体として得られた。
【０２８９】
ジオキサン（２ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１ｍＬ）中、４−ジフェニルメトキシカルボニル−ロド  テトラメチルエステル（５１ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）に１Ｍ  ＫＯＨを加えｐＨ１２．０にする。混合物を２０時間撹拌し、その後ｐＨを０．１Ｍ  ＨＣｌによって９．０に調節した。混合物を蒸発し、残留物をセファデックスＬＨ−２０上で溶出液としてＨ２Ｏを用いて精製した。精製物を凍結乾燥し、４−カルボキシ−ロド四カリウム塩２６ｍｇを赤紫色固体として得た。
【０２９０】
ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中、４−ジフェニルメトキシカルボニル−ロド  テトラメチルエステル（１０２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（１０ｍＬ）を加え、生成した混合物を１時間撹拌し、それから蒸発し、ＣＨＣｌ３（３×１０ｍＬ）と共蒸発した。エーテル（１０ｍＬ）を加え、沈殿物を濾過し、エーテル（３×１０ｍＬ）で洗うと、４−カルボキシ−ロド  テトラメチルエステル８２ｇが暗紫色固体として得られた。
【０２９１】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中４−カルボキシ−ロド  テトラメチルエステル（８０ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）にＤＩＥＡ（０．３５ｍＬ、２ｍｍｏｌ）および乾燥Ｏ−トリフルオロアセチル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＴＦＡ−ＳＥ、２２５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を２時間撹拌し、その後さらにＴＦＡ−ＳＥ（１１３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を導入し、この混合物をさらに１６時間撹拌した。混合物をＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）で希釈し、１％ＡｃＯＨ（３×２０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２５ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（５０ｍＬ）で洗い、濾過し、蒸発した。エーテル（２５ｍＬ）を加え、沈殿物を濾過し、エーテルで洗うと、４−（スクシンイミジルオキシカルボニル）−ロド  テトラメチルエステルが暗紫色固体として得られた。
【０２９２】
ＤＭＦ（１ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．０５５ｍＬ、０．４０ｍｍｏｌ）中ビオチンカダベリン（３４ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ、モレキュラー・プローブス社）に、４−（スクシンイミジルオキシカルボニル）−ロド  テトラメチルエステル（３６ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を３時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（２００ｍＬ）で希釈し、１％ＡｃＯＨ（３×１５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で洗い、濾過し、蒸発した。残留物を２枚の分取ＴＬＣ  ＳｉＯ２プレート上で、ＣＨＣｌ３中１２％ＭｅＯＨおよび２．５％ＡｃＯＨを溶出液として用いて精製すると、４−（Ｎ−（５”−ビオチニルアミノペンチル）アミノカルボニル）−ロド  テトラメチルエステルが３８ｍｇ得られた。
【０２９３】
ＭｅＯＨ（２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中４−（Ｎ−（５”−ビオチニルアミノペンチル）アミノカルボニル）−ロド  テトラメチルエステル（３０ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）に、１Ｍ  ＫＯＨを加えてｐＨ１２．０にした。混合物を２０時間撹拌し、それから０．１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ８．５に調節した。混合物を蒸発し、残留物をセファデックスＬＨ−２０上で、溶出液としてＨ２Ｏを使用して精製した。生成物を凍結乾燥すると化合物９（４−（Ｎ−（５”−ビオチニルアミノペンチル）アミノカルボニル）−ロド  四カリウム塩）、３０ｍｇ、がオレンジ色固体として得られた。
【０２９４】
（  実施例３６：４−（４’−（アミノフェニル）−２エチルアミノ）カルボニルメチル−ロド三カリウム塩（化合物１０）の合成）
（２’−ニトロフェニル）−２−クロロエタン（５．８７ｇ、２９ｍｍｏｌ）、メチル４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセテート（６．１５ｇ、２９ｍｍｏｌ）、およびＫ２ＣＯ３（８．２８ｇ、６０ｍｍｏｌ）の懸濁液を１２０℃で１６時間撹拌し、室温に冷まし、氷水（０．６Ｌ）に注入した。沈殿物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗い、乾燥すると、（４’−メトキシカルボニルメチル−２’−ニトロフェニル）−２−（２”−ニトロフェノキシ）エタン、４．４９ｇが黄色固体として得られた。
【０２９５】
４’−（メトキシカルボニルメチル−２’−ニトロフェノキシ）−２−（２”−ニトロフェノキシ）エタン（９．６ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２５０ｍＬ）中１０％Ｐｄ／Ｃ（１．０ｇ）上で４０ｐｓｉで１６時間水素化した。混合物をセライトによって触媒から濾別した。濾液を蒸発し、残留物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、ヘキサン中２５−３５％ＥｔＯＡｃ勾配を用いて精製すると、（２’−アミノ−４’−メトキシカルボニルメチルフェノキシ）−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン５．５３ｇがオフ−ホワイト固体として得られた。
【０２９６】
（２’−アミノ−４’−メトキシカルボニルメチルフェノキシ）−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン（５．５０ｇ、１７．４ｍｍｏｌ）、メタノール（４０ｍＬ）、ジオキサン（４０ｍＬ）、および１Ｍ  ＫＯＨ（３５ｍＬ、３５ｍｍｏｌ）の混合物を４５℃で１時間撹拌し、それから一晩室温で撹拌した。混合物を蒸発し、残留物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）に懸濁した。１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ３．０とした。沈殿物を濾過し、Ｈ２Ｏで洗い、乾燥すると、（２’−アミノ−４’−カルボキシメチル−１’−フェノキシ）−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン４．５９ｇがオフ−ホワイト固体として得られた。
【０２９７】
ヘキサン（７０ｍＬ）中、ベンゾフェノンヒドラゾン（２．９４ｇ、１５ｍｍｏｌ）および黄色ＨｇＯ（８．８０ｇ、４０ｍｍｏｌ）を５時間激しく撹拌することによってジフェニルジアゾメタンを製造した。混合物を無機物から濾別し、濾液を蒸発し、残留物をアセトン（２０ｍＬ）に再溶解した。この溶液をアセトン（１２０ｍＬ）中、２’−アミノ−４’−カルボキシメチル−１’−フェノキシ）−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン（３．０２ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。生成した混合物を３５℃で１６時間撹拌し、過剰のジフェニルジアゾメタンをＡｃＯＨ（０．５ｍＬ）で２時間にわたって分解した。混合物を蒸発し、粗生成物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、ＣＨＣｌ３中１％ＭｅＯＨを溶出液として用いて精製すると、（２’−アミノ−４’−ジフェニルメトキシカルボニルメチルフェノキシ）  −２−（２”−アミノフェノキシ）エタン４．４４ｇがオフ−ホワイト固体として得られた。
【０２９８】
ＭｅＣＮ（９０ｍＬ）中、２’−アミノ−４’ジフェニルメトキシカルボニルメチルフェノキシ）−２−（２”−アミノフェノキシ）エタン（２．１２ｇ、４．５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（４．０ｍＬ、２３．５ｍｍｏｌ）、メチルブロモアセテート（８．８ｍＬ、９４ｍｍｏｌ）、およびＮａＩ（０．５０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）の混合物を７０時間還流し、室温に冷まし、蒸発した。残留物をＣＨＣｌ３（５００ｍＬ）に溶解し、１％ＡｃＯＨ（３×２００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で洗い、濾過し、蒸発した。残留物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、溶出液としてヘキサン中３０−４０％ＥｔＯＡｃの勾配を用いて精製すると、４−ジフェニルメトキシカルボニルメチル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル、２．８２ｇが無色固体として得られた。
【０２９９】
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中、ＰＯＣｌ３（１．５ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）から作られたフィルスマイヤー試薬の溶液に、ＤＭＦ（５ｍＬ）中、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル）−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（３．７８ｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を２４時間撹拌し、それから直ちに氷−飽和Ｋ２ＣＯ３混合物（５００ｍＬ）に注いだ。その混合物をＣＨＣｌ３で抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾かし、蒸発した。生成物の混合物をＳｉＯ２上でヘキサン中３０−４０％ＥｔＯＡｃの勾配を用いて分離すると、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル）−５’−ホルミル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル１．６５ｇが無色固体として得られた。
【０３００】
プロピオン酸（１０ｍＬ）中、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル）−５’−ホルミル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（７８４ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ｍ−ジメチルアミノフェノール（３０１ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）およびＴｓＯＨ（２０ｍｇ、触媒）の混合物を６０℃で２０時間撹拌し、室温にまで冷まし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（１５０ｍＬ）に注いだ。１時間後、沈殿物を濾過し、水で洗い、乾燥すると、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル）−ジヒドロロド  テトラメチルエステルが赤紫色固体として４５０ｍｇ得られた。
【０３０１】
ＣＨＣｌ３およびＭｅＯＨ（各２０ｍＬ）中、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル）−ジヒドロロド  テトラメチルエステル（４２０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）および粉末クロラニル（１２２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）の混合物を３時間撹拌し、濾過し、蒸発した。残留物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、ＣＨＣｌ３／０．５％ＡｃＯＨ中５−７％ＭｅＯＨの勾配を溶出液として用いて精製すると、粗生成物が得られ、それをＣＨＣｌ３に再溶解し、ＳｉＯ２から濾別し、蒸発すると、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル−５’−テトラメチル）−ロド  テトラメチルエステル２７５ｍｇが暗紫色固体として得られた。
【０３０２】
ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）中、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル−５’−テトラメチル）−ロド  テトラメチルエステル（２５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（２０ｍＬ）を加え、生成した混合物を１時間撹拌し、それから蒸発し、ＣＨＣｌ３（３×３０ｍＬ）と共蒸発した。この残留物にエーテル（３０ｍｌ）を加え、沈殿物を濾過し、エーテル（３×１０ｍＬ）で洗うと、４−カルボニルメチル−ロド  テトラメチルエステル２００ｍｇが暗紫色固体として得られた。
【０３０３】
ＤＭＦ（５ｍＬ）およびＤＩＥＡ（０．４ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）中４−カルボキシメチル−ロド  テトラメチルエステル（１２８ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）に、乾燥ＴＦＡ−ＳＥ（３３８ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１６時間撹拌し、その後４−アミノフェニルエチルアミン（０．４ｍＬ、４ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（０．４ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）の溶液を導入した。混合物を２時間撹拌し、ＣＨＣｌ３（５００ｍＬ）で希釈し、１％ＡｃＯＨ（３×１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（２×２００ｍＬ）で洗い、濾過し、蒸発した。エーテル（２５ｍＬ）を残留物に加え、沈殿した生成物を濾過し、エーテルで洗うと、４−（４’−（アミノフェニル）−２エチルアミノ）カルボニルメチル−ロド  テトラメチルエステル１２６ｍｇが暗赤色固体として得られた。
【０３０４】
ジオキサン（２ｍＬ）、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（１ｍＬ）中、４−（４’−（アミノフェニル）−２−エチルアミノ）カルボニルメチル−ロド  テトラメチルエステル（１００ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）に１Ｍ  ＫＯＨを加え、ｐＨ１２．０にした。混合物を５０時間撹拌し、その後ｐＨを０．１Ｍ  ＨＣｌで９．０に調節した。混合物を蒸発し、残留物をセファデックスＬＨ−２０上で、溶出液としてＨ２Ｏを使用して精製し、生成物を凍結乾燥すると、化合物１０が赤橙色固体として２１ｍｇ得られた。
【０３０５】
（実施例３７：ＢＡＰＴＡ−アガロース化合物（化合物１３および１４）の合成）
ＢＡＰＴＡ−アガロース（化合物１３）の製法
３ｍＬ無水ＤＭＦ中、５−イソチオシアネート−ＢＡＰＴＡ遊離酸（６５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、米国特許第５４５３５１７号）の溶液を、１５ｍＬＤＭＦで希釈したアミノアガロースのスラリー（５０％水性スラリー、１６μｍｏｌアミン／ｍＬ、６ｍＬ、９６μｍｏｌアミン、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））に加えた。ｐＨをＤＩＥＡ（１．５ｍＬ）で１０に高めた。生成した明褐色混合物を室温で４８時間撹拌し、その後遠心分離した。ＢＡＰＴＡ−アガロース（化合物１３）ペレットをアセトン（２×）および水（２×）ですすぎ、その後水に懸濁させた。
ＢＡＰＴＡ−５Ｆ−アガロース（化合物１４）の製法
１２ｍＬ  ＨＣｌ水溶液中５−アミノ−５’−フルオロ−ＢＡＰＴＡ遊離酸（０．２６ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液を１２ｍＬのクロロホルムで希釈し、その後チオホスゲン（３ｍＬ）で処理した。オレンジ色の混合物を室温で一晩撹拌し、その後蒸発した。混合物を遠心分離し、褐色ゴムを生成し、それを乾かし、２ｍＬ無水ＴＨＡに溶解した。２０ｍＬの酢酸エチルを加えると、沈殿が生じた。それを遠心分離すると５−フルオロー５’−イソチオシアネート−ＢＡＰＴＡ遊離酸が明るい灰褐色の粉末として得られる。
【０３０６】
１ｍＬ無水ＤＭＦ中、５−フルオロー５’−イソチオシアネート−ＢＡＰＴＡ遊離酸（２５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を５ｍＬ  ＤＭＦで希釈したアミノアガロースの５０％水性スラリー２ｍＬに加えた。ｐＨを数滴のＤＩＥＡによって１０まで高めた。明褐色混合物を室温で４８時間撹拌し、遠心分離した。ＢＡＰＴＡ−５Ｆ−アガロース（化合物１４）ペレットをアセトン（２×）および水（２×）ですすぎ、水に懸濁させた。
【０３０７】
実施例３８：化合物（ＴＡＭＲＡ−ビオチンＢＡＰＴＡ化合物）の合成
５ｍＬジオキサン中、ＢＡＰＴＡ−４−イソチオシアネート遊離酸（１８ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の溶液を、４ｍＬ水中、５−（および６−）−テトラメチルローダミン  ビオシチン（モレキュラー・プローブス社、２９ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。生成したｐＨ（３．５）を炭酸ナトリウム水溶液で１０まで高めた。生成した赤い溶液を周囲温度で一晩撹拌し、真空で濃縮した。残留物をセファデックスＬＨ−２０上でカラムクロマトグラフィーによって、溶出液として水を用いて精製した。生成物を凍結乾燥すると、ＴＡＭＲＡ−ビオチン−ＢＡＰＴＡ２６ｍｇが赤色粉末として得られた：ＬＣＭＳ  ｍ／２  ７２６（Ｃ７３Ｈ８４Ｎ１１Ｏ１７Ｓ２として計算して１４５２）。
【０３０８】
（実施例３９：化合物１６（ローダミンＢＡＰＴＡ化合物）の合成）
プロピオン酸５ｍＬ中、５−ホルミル−５’−ニトロ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）および８−ヒドロキシジュロリジン（１２５ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を窒素下で７０℃で１時間加熱し、室温に冷まし、３０ｍＬの濃酢酸カリウム溶液に注入した。混合物をクロロホルムで抽出し、ブラインで洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発して赤色油にし、それを酢酸エチル／ヘキサンを用いてフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、ジヒドロ−Ｘ−Ｒｈｏｄ−５Ｎテトラメチルエステル０．２２５ｇが黄色フォームとして得られた。
【０３０９】
１：１クロロホルム／メタノール（５ｍＬ）中ジヒドロ−Ｘ−ロド−５Ｎテトラメチルエステル（０．１２ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）にクロラニル（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を一晩撹拌し、５０ｍＬクロロホルムで希釈し、ブラインで洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発した。残留物を１５％メタノール／クロロホルムを使用するフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、Ｘ−ロド−５Ｎテトラメチルエステル６３ｍｇが紫色粉末として得られた。
【０３１０】
５ｍＬメタノール中、Ｘ−ロド−５Ｎテトラメチルエステル（０．１１ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）に２Ｍ  ＫＯＨ（０．６ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で一晩撹拌し、その後蒸発した。残留物を水（５ｍＬ）に溶解し、２Ｍ  ＨＣｌによってｐＨ２に低下させた。沈殿を遠心分離によって集め、新鮮ＫＯＨ水溶液に溶解し、ＨＣｌ水溶液で沈殿させた。この操作を５回繰り返すと、化合物１６の遊離酸９０ｍｇが紫色の粉末として得られた。
【０３１１】
（実施例４０：４−ヒドロキシ−５−ベンゾチアゾリル−ＢＡＰＴＡ（化合物１７）の製法）
ＤＭＳＯ（５ｍＬ）中、４−ヒドロキシ−５−ホルミル−５’−メチルＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（０．４０ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）および２−アミノチオフェノール（７５ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の溶液を１５分間還流加熱した。冷後、黄色溶液を５０ｍＬの水で希釈した。黄色沈殿を濾過し、乾燥し、その後酢酸エチル／ヘキサンを用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製すると、４−ヒドロキシー５−ベンゾチアゾリル−ＢＡＰＴＡ低テトラメチルエステル０．２２ｇが黄色フォームとして得られた。
【０３１２】
１：１メタノール／ジオキサン（１０ｍＬ）中、４−ヒドロキシー５−ベンゾチアゾリル−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（０．２１ｇ、０．３０ｍｍｏｌ）に１Ｍ  ＫＯＨ（３．０ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を３時間撹拌し、蒸発した。残留物をセファデックスＬＨ−２０上で、溶出液として水を使用して精製すると、０．１３ｇの化合物１７が黄緑色粉末として得られた（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｋ）。
【０３１３】
【化１４】
2005539243.tif 000016
【０３１４】
実施例４１：４’−カルボキシメチル−４−メトキシ−ロド、カリウム塩（化合物１９）の合成
（４’−メトキシ−２’−ニトロフェノキシ）−２−クロロエタン（１１．２９ｇ、４８．７ｍｍｏｌ）、ネチル−４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニルアセテート（１０．８０ｇ、５１２ｍｍｏｌ）、およびＫ２ＣＯ３（１３．８０ｇ、１００ｍｍｏｌ）の懸濁液を１３０℃で４時間撹拌し、室温まで冷やし、氷水（０．８Ｌ）に注ぎ、２日間凝固させた。沈殿を濾過し、Ｈ２Ｏで洗い、乾燥すると（４’−メトキシカルボニルメチル−２’−ニトロフェノキシ）−２−（４”−メトキシ−２”−ニトロフェノキシ）エタン、１５．１ｇが黄色固体として得たれた。
【０３１５】
（４’−メトキシカルボニルメチル−２−ニトロフェノキシ）−２−（４”−メトキシ−２”−ニトロフェノキシ）エタン（１５．０ｇ、４３．３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２中１０％Ｐｄ／Ｃ（２．０ｇ）上で４５ｐｓｉで１６時間水素添加した。
【０３１６】
混合物をセライトを通して濾過した。濾液を蒸発し、残留物をエーテル（２００ｍＬ）で処理した。沈殿を濾過し、エーテル（３×２５ｍＬ）で洗うと、（２’−アミノ−４’−メトキシカルボニルメチルフェノキシ）−２−（２”−アミノ−４”−メトキシフェノキシ）エタン１１．２１ｇがオフ−ホワイト固体として得られた。
【０３１７】
（２’−アミノ−４’−メトキシカルボニルメチルフェノキシ）−２−（２”−アミノ−４”−メトキシフェノキシ）エタン（８．６５ｇ、２５ｍｍｏｌ）、メタノール（８０ｍＬ）、ジオキサン（８０ｍＬ）および１Ｍ  ＫＯＨ（５０ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）の混合物を６０℃で１時間撹拌し、その後一晩室温で撹拌した。混合物を蒸発し、残留物をＨ２Ｏ（３００ｍＬ）に懸濁した。１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ４．０にした。沈殿を濾過し、Ｈ２Ｏで洗い、乾燥すると（２’−アミノ−４’−カルボキシメチル−１’−フェノキシ）−２−（２”−アミノ−４”−メトキシフェノキシ）エタンがオフ−ホワイト固体として６．８４ｇ得られた。
【０３１８】
ヘキサン中、ベンゾフェノンヒドラゾン（５．８８ｇ、３０ｍｍｏｌ）および黄色ＨｇＯ（１７．６０ｇ、８０ｍｍｏｌ）を６時間激しく撹拌することによってジフェニルジアゾメタンを製造した。この混合物を無機物から濾別し、濾液を蒸発して残留物をアセトン（４０ｍＬ）に再溶解した。この溶液を、アセトン（２００ｍＬ）中、（２’−アミノ−４’−カルボキシメチル−１’−フェノキシ）−２−（２”−アミノ−４”−メトキシフェノキシ）エタン酸（６．６４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。生成した混合物を３５℃で４８時間撹拌し、蒸発し、残留物をＣＨＣｌ３に懸濁させた。この懸濁液にＡｃＯＨ（４ｍＬ）を加えて過剰の試薬を分解し、混合物を２時間撹拌し、蒸発し、粗生成物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、溶出液としてＣＨＣｌ３中０．５％ＭｅＯＨを使用して精製し、（２’−アミノ−４’−ジフェニルメトキシカルボニルメチル）フェノキシ）−２−（２”−アミノ−４”−メトキシフェノキシ）エタン７．８１ｇ（７８％）がオフ−ホワイト固体として得られた。ＭｅＣＮ（１５０ｍＬ）中ジアミン（２’−アミノ−４’−ジフェニルメトキシカルボニルメチルフェノキシ）−２−（２”−アミノ−４”−メトキシフェノキシ）エタン（４．６２ｇ、９．３ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（５２ｍＬ、３００ｍｍｏｌ）、メチル  ブロモアセテート（１９ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）、およびＮａＩ（０．７５ｇ、５ｍｍｏｌ）の混合物を撹拌しながら７０時間還流し、室温に冷やし、蒸発した。残留物をＣＨＣｌ３（４００ｍＬ）に溶解し、１％ＡｃＯＨ（３ｘ２００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ（２ｘ２００ｍＬ）で洗い、濾過し、蒸発した。残留物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、溶出液としてヘキサン中２５−４０％ＥｔＯＡｃの勾配を使用して精製し、４−ジフェニルメトキシカルボニルメチル−４’−メトキシ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル３．０１ｇが無色固体として得られた。
【０３１９】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中、ＰＯＣｌ３（０．２８ｍＬ、３ｍｍｏｌ）から作られたフィルスマイヤー試薬の溶液に、ＤＭＦ中（２ｍＬ）４−ジフェニルメトキシカルボニルメチル−４’−メトキシ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（７６２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を２時間撹拌し、速やかに氷−飽和Ｋ２ＣＯ３混合物（５０ｍＬ）に移した。混合物をＣＨＣｌ３（７×２０ｍｌ）で抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、蒸発した。生成物の混合物をＳｉＯ２上カラムクロマトグラフィーによって、ヘキサン中３０−４５％ＥｔＯＡｃ勾配を用いて分離すると、４−ジフェニルメトキシカルボニルメチル−５’−ホルミル−４’−メトキシ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル、７６０ｍｇが無色固体として得られた。
【０３２０】
プロピオン酸（２０ｍＬ）中、４−ジフェニルメトキシカルボニルメチル−５’−ホルミル−４’−メトキシ−ＢＡＰＴＡテトラメチルエステル（１．５８ｇ，２．０ｍｍｏｌ）、ｍ−ジメチルアミノフェノール（６０２ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）、およびＴｓＯＨ（５０ｍｇ、触媒）の混合物を６０℃で２０時間撹拌し、室温まで冷やし、３Ｍ  ＮａＯＡｃ（３００ｍＬ）に注入した。１時間後、沈殿生成物を濾過し、水で洗い、乾燥すると、４−ジフェニルメトキシカルボニルメチル−５’−ジヒドロロド  テトラメチルエステル、２．００ｇが赤紫色固体として得られた。
【０３２１】
ＣＨＣｌ３およびＭｅＯＨ（各５０ｍＬ）中、化合物４−ジフェニルメトキシカルボニルメチル−４’−メトキシ−５’−ジヒドロロド  テトラメチルエステル（２．００ｇ、１．９ｍｍｏｌ）および粉末クロラニル（０．５０ｇ、２ｍｍｏｌ）の混合物を４時間撹拌し、濾過し、蒸発した。残留物をＳｉＯ２上フラッシュクロマトグラフィーによって、ＣＨＣｌ３／０．５％ＡｃＯＨ中５−７％ＭｅＯＨ勾配を使用して精製すると、粗生成物が得られ、それをＣＨＣｌ３に再溶解し、ＳｉＯ２から濾別し、蒸発すると、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル）−４’−メトキシ−ロド、テトラメチルエステル、４８０ｇが暗紫色固体として得られた。
【０３２２】
ジオキサン（１ｍＬ）、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２ｍＬ）中、４−（ジフェニルメトキシカルボニルメチル）−４’−メトキシ−ロド、テトラメチルエステル（４５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、１Ｍ  ＫＯＨを加えｐＨ１２．０とする。混合物を５０時間撹拌し、その後０．１Ｍ  ＨＣｌによってｐＨを９．０に調節した。混合物を蒸発し、残留物をセファデックスＬＨ−２０カラム（２．６×９０ｃｍ床）で、溶出液としてＨ２Ｏを使用して精製し、凍結乾燥すると１２ｍｇの化合物１９が赤色固体として得られた（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｋ）。
【０３２３】
【化１５】
2005539243.tif 000017
【０３２４】
（実施例４２：ＤＴＰＡ金属−キレート化部分を含む化合物２０の合成）
ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）カダベリン、モレキュラー・プローブス  Ｄ−６２５１、１０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌを２ｍＬ水中（Ｓ）−１−ｐ−イソチオシアネートベンジルジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡイソチオシアネート、モレキュラー・プローブスＩ−２４２２１、１０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）の混合物に溶解した。炭酸ナトリウム水溶液でｐＨを１０にした。生成した青色の溶液を室温で２日間撹拌し、真空濃縮した。残留物をセファデックスＬＨ−２０上のカラムクロマトグラフィーによって、溶出液としてＥ−ピュア水を用いて精製すると、化合物２０が紫色粉末として２ｍｇ得られた。
【０３２５】
（実施例４３：ＤＴＰＡ金属キレート化部分を含む化合物２１の合成）
カルバメート２１の合成のために、塩化メチレン２０ｍＬ中ペンタ−ｔ−ブチル１−（Ｓ）−（ｐ−アミノベンジル）−ジエチレントリアミンペンタアセテート（Ｄｏｎａｌｄ  Ｔ．Ｃｏｒｓｏｎ  ＆  Ｃｌａｕｄｅ  Ｆ．Ｍｅａｒｅｓ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１（２）：２９２−２９９（２０００）、０．８００ｇ、１．０３ｍｍｏｌ）の溶液にピリジン１ｍＬを加え、その後塩化メチレン（５ｍＬ）中、Ｎ−ＣＢＺ−６−アミノヘキサン酸（０．２９０ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）の酸塩化物の溶液を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌し、真空濃縮した。残留物を酢酸エチル１００ｍＬに溶解し、生成した溶液を１０％ＨＣｌ（２×３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶液を濃縮し、シリカゲルカラム（酢酸充填）上に入れた。カラムを酢酸エチルで溶出して不純物を除去し、それから所望生成物を１０：１クロロホルム−メタノールで溶出した。純粋なフラクションを合一し、溶媒を蒸発するとアミン２１ａ（０．５４ｇ、５４％）が粘稠な油として得られた。
【０３２６】
アミノ酸２１ｂを合成するために、カルバメート２１ａ（０．７００ｇ、０．６３３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのＴＦＡに溶解した。この反応混合物を３日間室温に保持した。揮発物は蒸発し、残留物をトルエンから２度再蒸発すると粘稠な油が残った。その油を酢酸と共に撹拌し、固化させた。生成固体を濾過し、乾燥すると、アミノ酸２１ｂ（０．４００ｇ、９６％）が得られた。
【０３２７】
化合物２１の合成のために、アミノ酸２１ｂ（０．０９０ｇ、０．１４７ｍｍｏｌ）を水１０ｍＬに懸濁した。１Ｍ  ＫＯＨを用いてｐＨを〜８に調節した。生成した溶液を、ＤＭＦ５ｍＬ中ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、モレキュラー・プローブスＤ−６１１７、０．０３ｇ、０．０４９ｍｍｏｌの溶液に加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌した。ｐＨをモニターし、最初の２時間中に〜８に調節した。溶液を蒸発し、残留物を水に再溶解し、セファデックスＬＨ−２０上で水を用いて溶出して精製した。合一したフラクションを〜３ｍＬになるまで濃縮し、凍結乾燥すると、化合物２１が赤色粉末として０．０６１ｇ得られた。
【０３２８】
【化１６】
2005539243.tif 000018
【０３２９】
（実施例４４：ＤＴＰＡ金属−キレート化部分を含む化合物２２の合成）
ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  ＥＤＡ、モレキュラー・プローブスＤ−２３９０、７ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌを、２ｍＬ水中、ＤＴＰＡイソチオシアネート、モレキュラー・プローブスＩ−２４２２１、１０ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌの混合物に溶解した。炭酸ナトリウム水溶液でｐＨを１０に高めた。生成したオレンジ色溶液を室温で３．５時間撹拌し、それから蒸発した。残留物をセファデックスＬＨ−２０上で溶出液として水を用いて精製すると、２９ｍｇの化合物２２がオレンジ色粉末として得られた。
【０３３０】
（実施例４５：化合物２５−ＢＡＰＴＡ−ビオチンの合成）
２ｍＬ水中ビオチン−カダベリン（２１ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、モレキュラー・プローブス）の溶液に、２滴の飽和炭酸ナトリウム溶液を加えた。３ｍＬジオキサン中、５−イソチオシアネート−ＢＡＰＴＡ遊離酸（２５ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。さらに炭酸ナトリウム溶液を加えることによって反応液のｐＨを９．５まで高めた。溶液を周囲温度で一晩撹拌した。揮発物を真空で除去し、残留物をセファデックスＬＨ−２０上クロマトグラフィーによって、溶出液として水を用いて精製すると化合物２５が薄い褐色の粉末４０ｍｇとして得られた（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｎａ）。
【０３３１】
【化１７】
2005539243.tif 000019
【０３３２】
（実施例４６．化合物２６−ロド−ＢＡＰＴＡ−ＢＡＰＴＡの合成）
１：１水：ジオキサン（５ｍＬ）中、４−カルボキシ−ロド  テトラメチルエステルのエチレンジアミンカルボキサミド（実施例３４におけるように０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に、１：１水：ジオキサン（８ｍＬ）中５−イソチオシアネート−ＢＡＰＴＡ遊離酸（２４ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。炭酸水素ナトリウムの水溶液の添加によってｐＨを８．５に高めた。生成した赤い溶液を周囲温度で一晩撹拌し、真空で濃縮し、セファデックスＬＨ−２０上カラムクロマトグラフィーによって、溶出液として水を用いて精製すると、中間体テトラメチルエステルテトラカルボキシレート１１ｍｇが赤色粉末として得られた。この中間体（０．００７ｍｍｏｌ）の１．４ｍＬ水中溶液に、１Ｍ  ＫＯＨ（０．０７ｍｍｏｌ）を加えた。３時間後、ｐＨ（１３）を酢酸水溶液で９まで低下し、その後真空中で濃縮した。生成残留物をセファデックスＬＨ−２０上カラムクロマトグラフィーによって、溶出液として水を用いて精製すると化合物２６が赤色粉末として得られた（Ｒ＝ＣＨ２ＣＯ２Ｋ）。
【０３３３】
【化１８】
2005539243.tif 000020
【０３３４】
（実施例４７：化合物２７ａ−ｉの合成）
２７ａの合成は化合物２７ａ−２７ｆの合成に用いられる方法を説明するために役立つ。塩化オキサリル（１８μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を、５ｍＬ無水ＴＨＦ中４，４−ジフルオロー５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（モレキュラー・プローブス  Ｂ−２１８３、５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に加え、その後ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３５μＬ、０．２０ｍｍｏｌ）を加えた。生成溶液を室温で１５分間撹拌し、真空中で濃縮した。生成した酸塩化物を３ｍＬの乾燥ジオキサンに溶解した。この溶液を、５ｍＬ中２７’（８３ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、Ｘ＝Ｈ）の溶液に撹拌下で滴下した；炭酸ナトリウムでｐＨを９に維持した。生成した濁ったオレンジ色混合物を１時間撹拌し、シリカゲルＴＬＣ分析により２７ａ（Ｒｆ０．４０、ジオキサン−イソプロピルアルコール−水−水酸化アンモニウム１５：５８：１３：１４）の形成が示された。揮発物を真空下で除去し、残留物をセファデックスＬＨ−２０上カラムクロマトグラフィーによって、溶出液として水を用いて精製した。純粋生成物フラクションを一つにし、凍結乾燥すると、２７ａがふわふわしたオレンジ色粉末９９ｍｇとして得られた（６８％収率）：１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ７．３４（ｓ，１Ｈ）、６．９８−６．６８（ｍ，８Ｈ）、６．３３（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．１９（ｓ，１Ｈ）、４．１８（ｍ，４Ｈ）、３．６６（ｓ，８Ｈ）、３．１８（ｔ，７．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．７２（ｔ，７．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．４１（ｓ，３Ｈ）、２．１３（ｓ，３Ｈ）；ＬＣＭＳ（ｍ／ｚ）７６５（Ｃ３６Ｈ３８Ｎ５Ｏ１１ＢＦ２で計算して７６５）。
【０３３５】
【化１９】
2005539243.tif 000021
【０３３６】
（実施例４８：化合物２８（ダンシルＢＡＰＴＡ）の合成）
３ｍＬジオキサン中、ダンシルクロリド（２２ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）の溶液を、１：１ジオキサン／水（１０ｍＬ）中５−アミノ−ＢＡＰＴＡ（４０ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）溶液、ｐＨ９（炭酸ナトリウムで維持する）、に加えた。生成した溶液を室温で１時間撹拌し、真空濃縮した。残留物をセファデックスＬＨ−２０上カラムクロマトグラフィーによって、溶出液として水を用いて精製すると、化合物２８がバフ色の粉末４０ｍｇとして得られた。
【０３３７】
【化２０】
2005539243.tif 000022
【０３３８】
（実施例４９：２−Ｄゲルからのリンタンパク質の質量分析による同定）
２−Ｄゲルを標準的プロトコルによって操作する。全ての工程は、容量５００ｍｌ／ゲルで、オービタル・シェーカー上で５０ｒｐｍで行われた。ＳＤＳを除去するために２−Ｄゲルを５０％ＭｅＯＨ、７％ＨＡｃ中で１時間後に１回変えて一晩固定した。翌日ゲルをｄＨ２Ｏで４×１５分間洗い、その後本発明の結合溶液で２．５−３時間染色した。非特異的染色を除去し、並びにバックグラウンドを弱めるために、５０ｍＭ酢酸溶液、ｐＨ４．０、４％アセトニトリル中で１時間ずつ３回洗った。その後５０ｍＭ  ＮａＡｃ、１５＋％１，２−プロパンジオール、ｐＨ４．０中でさらに１時間洗い、その後５３２ｎｍレーザー励起および５８０ｎｍ発光フィルタで画像化した。上記洗浄は夜中に続けられ、翌日に画像化を繰り返した。
【０３３９】
リンタンパク質染色の後にＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色を夜間行い、１０％ＭｅＯＨ、７％ＨＡｃ中で２〜３時間脱色し、その後再び画像化した。ゲルを４７３ｎｍレーザー励起および５８０ｎｍ発光フィルタで走査し、スポットを切り出した。脱色するためにそれらスポットを１．５ｍＬ遠心管中に置き、１００μＬ５０％ＭｅＯＨ、５％ＨＡｃで３０分間、１００μＬ０．１％ＴＦＡで３０分間、１００μＬ５０％ＭｅＯＨ／５％ＨＯＡｃで３０分間脱色し、最後に１００μＬ１００％アセトニトリル（ＡＣＮ）中で１０分間脱色した。それらのピースを完全に空気乾燥し、その後還元し、アルキル化した。タンパク質が２−Ｄゲル電気泳動の前に既に還元され、アルキル化されている場合は次の工程は省かれる。
【０３４０】
システイン類のアルキル化および還元のために、０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３中２０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）の十分量を加え、乾燥したゲルピースを完全に覆うようにする（〜５０μＬ）。そのゲルピースが再膨潤するように、より多くを加える必要がある。５６℃で１時間インキュベートする。ＤＴＴ溶液を除去し、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中１００ｍＭヨードアセタミド（ＩＡＡｍ）を等量加える。室温、暗所で３０分間インキュベートし、上澄液を棄て、ゲルピースを時々ボルテックスしながら１００μＬ０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３で１５分間ずつ洗い、過剰の試薬類を除去する。ゲルピースから過剰の試薬を悉く抽出するために、時々振とうしながら１００μＬ  ０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３／５０％ＡＣＮで洗う。上澄液を棄て、１００％ＡＣＮで洗う。上澄液を棄て、ゲルピースを完全に乾燥する（空気乾燥）。
【０３４１】
ゲル中でトリプシン消化するために、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／１０％ＡＣＮ中０．０５ｍｇ／ｍｌ改良トリプシン（プロメガ社）の新鮮溶液を調製する。直ちに使用しない場合はそれを氷上に保持する。上記新鮮トリプシン溶液１０μＬを加え、次の工程を行うまで、すなわち１０分間、ゲルピースにトリプシン溶液をしみ込ませる。２０μＬ  ５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／１０％ＡＣＮ（ＶＴＯＴ＝３０μＬ）を加え、３７℃で一晩インキュベートすると、ゲルピースを完全に再膨潤する。
【０３４２】
ペプチド類を抽出するために、１μＬ  １０％ＴＦＡを加え；１０分間／ＲＴボルテックスによって消化を停止し、スピンし、上澄液を取り、０．５ｍｌエッペンドルフ管に入れる。ピースに５０μＬ  ０．１％ＴＦＡを加え、３０分間インキュベートする。振とうし、スピンし、この上澄液と最初の上澄液とを合わせる。５０μＬ６０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡを３０分間加え、振とうし、スピンし、管中の最初の上澄液に合わせる。ペプチド類をＳｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で乾燥し、再び１０μＬ１０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡに溶解する。
【０３４３】
ペプチド混合物を、ミリポアからのＣ１８ＺｉｐＴｉｐカラムで脱塩し濃縮し、またはサンプル濃度によっては直接スポッとすることができる。０．５μＬ基質（５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中５ｍｇ／ｍｌα−シアノ  ４ヒドロキシシンナミックス酸）と、０．５μＬの標的サンプルとを混合する。スポットを乾燥し、質量分析によって分析する。
【０３４４】
既述の実施例において使用する試薬類は市販されており、または市販の器具、方法、または当業者に知られまたは製法が実施例に記載されている試薬類を使用して調製することもできる。上記の説明および結果から、本発明は、リン酸化標的分子を前例のない５００−１０００倍の濃度範囲で検出できるなど、生物学的サンプルのリン酸化標的分子の標識化のために現在使用できる方法に比べて、著しく優れていることは明らかである。本発明は、感度を高めた簡単な方法でリン酸化標的分子を標識化並びに分離することができるという点で、現在使用されている方法の欠点を克服する。本発明の方法が溶液中のまたは固定されているリン酸化標的分子を標識化することができ、本発明のリン酸結合化合物は固定されていても溶液中でも、これら標的分子のリン酸化のための酵素類を確認することができることは高く評価される。実施例は本発明の多くの異なる実施形態の徹底的説明を提供するものではない。したがって、上述の発明を明快に理解するために例証および実施例がかなり詳細に記載されたとはいえ、添付の請求項の精神または範囲を逸脱することなく多くの変更および改良が加えられ得ることは当業者には当然である。
【０３４５】
この明細書に記載された全ての公報および特許出願は、各公報または特許出願を具体的かつ個別に参考として組み込めるように、参考として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０３４６】
【図１】図１：塩化ガリウムおよび化合物２を含む結合溶液を使用したポリアクリルアミドゲル中のリン酸化標的分子（オボアルブミン）の選択的検出（１Ａ）を、総タンパク質を染色した（ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ）同じゲル染色後（１Ｂ）と比較したものである（実施例２を参照）。タンパク質混合物は約５００μｇが担持され、全部で９種類のタンパク質を含み、その一つは２個のリン酸基を含むリンタンパク質（オボアルブミン）であった。図は、リン酸化されていないことが知られている、わずかに染色されたまたは染色されない８種類のタンパク質のバックグラウンドに対してオボアルブミンが選択的に検出されることを示す。
【図２】図２：塩化ガリウムおよび化合物１を含む結合溶液を使用するＰＶＤＦ膜上のリン酸化標的分子（オボアルブミン）の選択的検出（２Ａ）を総タンパク質染色によって染色した後の同じ膜（２Ｂ）（ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ブロット染色）に比較したものである（実施例８を参照）。図は、わずかに染色された、または染色されない５種類の非リン酸化タンパク質をバックグラウンドにしたオボアルブミンの選択的検出を示す。
【図３】図３：塩化ガリウムおよび化合物２を含む結合溶液を使用したゲル中のリン酸化タンパク質の検出の感度および直線的動力学的範囲を示す（実施例２を参照）；（３Ａ）はリン酸基の比率が異なる５種類のタンパク質の比較であり、（３Ｂ）はペプシンとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との比較である。タンパク質は２倍希釈系列でＳＤＳポリアクリルアミド  ミニ−ゲルに２ｎｇ−１０００ｎｇ載せられた；各タンパク質サンプルは系列ごとに４回ずつゲル上で行われた。リンタンパク質はα−カゼイン（７または８リン酸）：脱リン酸α−カゼイン（１または２リン酸）；β−カゼイン（５リン酸）；オボアルブミン（２リン酸）およびペプシン（１リン酸）であった。ＢＳＡはリン酸を含まず、陰性対照として使用された。結果は、本発明の方法および結合溶液が五リン酸化タンパク質（β−カゼイン）をたった１−２ｎｇでも検出し、一リン酸化タンパク質（ペプシン）８ｎｇを検出することを示した。
【図４】図４：α−カゼインおよびペプシンをホスファターゼ基質として使用した際のタンパク質ホスファターゼ活性の検出を示す。ゲルを塩化ガリウムおよび化合物２を含む結合溶液と共にインキュベートし、基質をタンパク質ホスファターゼとインキュベートした後に、リン酸基が対照と比較して減少することが示された。実施例６を参照。
【図５】図５：ペプチド類の溶液を塩化ガリウムおよび化合物５を含む結合溶液と共にインキュベートした際の、非リン酸化ペプチド（アンギオテンシンＩおよびＩＩ、分子量１２９７および１０４６）を含む溶液からのホスホペプチド（ｐＴ／ＰＹおよびＲＩＩ；分子量１６７０および２１９３）（パネルＢおよびＣ）の分離を示す。混合物を１時間インキュベートし、５分間遠心分離した。生成した上澄液（全パネルにおいて一番下のスペクトル）およびペレット沈殿物（全パネルにおいて一番上のスペクトル）をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって分析した。パネルＡは専ら上澄液中にある非リン酸化ペプチドを示し、図ＢおよびＣはペレット中の純度９５％以上の２種類のホスホペプチドを示す。
【図６】図６：ガリウムイオンを担った化合物１３または化合物１４を含む、アフィニティクロマトグラフィー基質カラムから溶出したリン酸化ペプチド（α−カゼイン）の分析を示す。パネルＡは脱リン酸後（左側のピーク組）およびその後メチルアミンで誘導体化した後（右側のピーク組）の精製α−カゼインホスホセリンペプチド類の示差ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を示す。結果は３種類全てのペプチドがメチルアミン付着によるホスホセリン誘導体であることを示す。パネルＡのＡおよびＢは一リン酸化（メチルアミンで＋３１ａｍｕ）、そしてＣは三リン酸化（３メチルアミンで＋９３ａｍｕ）であった。パネルＢはＢＡＰＴＡ−アガロース（化合物１３または化合物１４）カラム対市販の金属アフィニティカラム（ピアースケミカル社）から溶出したホスホペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳプロフィールを示す。使用条件下では、ＢＡＰＴＡ−アガロースカラムは複雑なペプチド混合物から精製された全て予想通りのホスホペプチド（矢印）を示す。パネルＣは、強塩基（−９８ａｍｕ）およびメチルアミンで処理した後の一ホスホスレオニンおよび一ホスホチロシン残基を有する対照ペプチド（ＭＷ＝１８７０）を示す。結果は、単一のリン酸のみが除去され（スレオニンから−９８ａｍｕ）、その後メチルアミンの付加（＋３２ａｍｕ）がないことを示し、単一ホスホスレオニン残基が確認される。ホスホチロシンはこれらの除去条件下で変化がないことによって決定される。
【図７】図７：ミクロアレイを、化合物２および塩化ガリウムを含む結合溶液とインキュベートした際の、ヒドロゲル（ＨｙｄｒｏＧｅｌ）ミクロアレイ（パーキンエルマー、フォスターシティ、ＣＡ）上のリンタンパク質（β−カゼイン）の検出を示す。実施例１８を参照。タンパク質を１６６ｎｇから０．３２４ｐｇに一連の２倍希釈することによってミクロアレイに載せた。結果は、ヒドロゲル・ミクロアレイ上に五リン酸化タンパク質０．６５ｐｇが検出されることを示した。
【図８】図８：ミクロアレイを化合物２および塩化ガリウムを含む結合溶液と共にインキュベートした際のヒドロゲル・ミクロアレイ（パーキンエルマー社）上のホスホペプチド（ｐＤＩＳＰ）の検出を示す。実施例１９を参照されたい。このペプチドを１２ｐｇから０．１８ｐｇまで一連の２倍希釈をすることによってミクロアレイに載せた。結果は、たった３００ｆｇの一リン酸ペプチドがヒドロゲル・ミクロアレイに検出できることを示した。
【図９】図９：化合物２および塩化ガリウムを含む結合溶液と共にインキュベートしたヒドロゲル・ミクロアレイ（パーキンエルマー）上のリン酸化ペプチド類の検出による、タンパク質キナーゼ活性（９Ａ；ＣａＭＰＫＩＩ）および（９Ｂ；Ａｂｌチロシンキナーゼ）の検出を示す。実施例２０および２１を参照。ペプチドグリコーゲン・シンターゼ１−１０がＣａＭＰＫＩＩのキナーゼ活性を示すことが検出され、ペプチドＡｂｌがＡｂｌチロシンキナーゼのキナーゼ活性を示すことが検出された。
【図１０】図１０：分極値を結合溶液単独と、リン酸化および非リン酸化タンパク質またはペプチド、オボアルブミン、およびデルタ睡眠誘起性ペプチドを含む結合溶液とで比較することによって（１０Ａ）リンタンパク質および（１０Ｂ）ホスホペプチドを検出することを示す。実施例１４を参照。結合溶液単独および非リン酸化タンパク質またはペプチドの存在する結合溶液は非常に類似した蛍光分極および異方性を示す。しかしリンタンパク質またはホスホペプチドの存在下においては蛍光分極値の顕著な増加がみられる。この結果は、溶液中でリンタンパク質およびホスホペプチドが溶液中の化合物２−Ｇａ３＋錯体に選択的に結合し、非リン酸化タンパク質またはペプチドは結合しないことを示す。
【図１１−１】図１１：本発明の結合溶液およびＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色で標識化したタンパク質類の放射分析を示す。これによって非特異的染色および少量のリンタンパク質から非リン酸化タンパク質を区別できることがわかる。実施例２２を参照。リン酸化および非リン酸化タンパク質を含むタンパク質混合物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、リンタンパク質を、化合物２および塩化ガリウムを含む結合溶液で検出した。ゲルをＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙタンパク質ゲル染色で後染色すると、全てのタンパク質が検出された。図１１Ａ）は総タンパク質に比較したリン酸化タンパク質の三成分錯体の蛍光強度の比を示す。図１１Ｂ）はタンパク質濃度に対してプロットしたリン酸化タンパク質錯体および総タンパク質の蛍光強度を示し、Ｙ切片の一定値が得られる。図１１Ｃ）は、タンパク質濃度に対してプロットしたＹ切片値の比をあらわす。これはリンタンパク質が非リン酸化タンパク質に比べて５０−１００倍大きい比を有することを示す。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2005539243.tif 000041
【図１１−１】
2005539243.tif 000042
【図１１−２】
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【国際調査報告】
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