(57)【要約】本発明は、乾癬の検出、特性付け、予防および処置のための組成物、キットおよび方法に関する。各種の標識が与えられ、一以上の標識の発現レベルの変化が、乾癬の存在と関連付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた、被検者からの試料中の標識の発現のレベルと、ｂ）対照試料中の標識の正常発現レベルとを対比して、該被検者からの試料中の発現のレベルと正常発現レベルとの有意差をもって被検者が乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の疾患状態の指示として評価することを特徴とする、被検者が乾癬ないしはｋＨ１−関連状態に疾患しているか否かの評価方法。
【請求項２】
標識が、該標識を含有するポリヌクレオチドの転写物またはその部分に対応する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該試料が、被検者から取得した細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該細胞が皮膚組織から採集される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該細胞が血液組織から採集される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該試料中の標識の発現のレベルが、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態に疾患していない被検者中の標識発現レベルとは約２倍以上異なる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該試料中の標識の発現のレベルが、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態に疾患していない被検者中の標識発現レベルとは約５倍以上異なる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該標識は非疾患組織には有意に発現しない請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該試料中の標識の発現レベルを、該試料中の標識に対応する蛋白の存在により検出する請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該蛋白の存在を該蛋白と特定的に結合する作用剤を用いて検出する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該作用剤が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群より選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
試料中の標識の発現のレベルを、該試料中の該標識を含む転写ポリヌクレオチドまたはその部分の存在を検出することにより評価する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
転写ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
転写ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出工程が転写ポリヌクレオチドを増幅する工程を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
試料中の標識の発現の程度を、該試料中の該標識とアニールするまたは厳重なハイブリッド形成条件にある標識を含むポリヌクレオチドとアニールする転写ポリヌクレオチドの存在を検出して、評価する請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）試料中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識から独立に選択した複数の標識の各々の発現レベルと、
ｂ）乾癬ないしＴＨ１−関連状態に疾患していない対照被検者から得た同じ型の試料中の該複数の標識の各々の正常発現レベルとを比較し、
一を超える標識の発現レベルが、対応する標識の正常発現レベルと比較して、有意に変化していることを以って、該被検者が乾癬ないしはＴＨ１−関連状態に疾患している表示とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
複数が２以上の標識である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
複数が５以上の標識である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）最初の時点における被検者試料中において、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群から選択した標識の発現を検出する工程。
ｂ）工程ａ）を以後の時点において繰り返す工程、および
ｃ）工程ａ）とｂ）とで検出した発現レベルを比較し、それから該被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の進行をモニターすることを特徴とする、被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の進行をモニターする方法。
【請求項２１】
該標識が、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識およびその組合せからなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
標識が転写ポリヌクレオチドまたはその部分に対応し、該ポリヌクレオチドが標識を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
試料が該被検者から取得した細胞を有する請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
該細胞が皮膚組織から収集される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該細胞が血液組織から収集される請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識であつて、被検者から取得され且つ試験化合物に触れさせ、あるいは試験化合物の存在下に維持された第１の試料中の該標識の発現と、ｂ）該被検者から取得され且つ該試験化合物と触れさせてない第２の試料中の該標識の発現とを比較し、
該第２の試料と比べて、該第１の試料中の該標識の発現レベルが有意に低いことをもって、該試験化合物の該被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制の有効性の表示とすることを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制のための試験化合物の有効性の評価方法。
【請求項２７】
該第１および第２の試料が該被検者から取得した単一試料の部分である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
該第１および第２の試料が該被検者から取得した、且つプールしてある試料である請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識であって、治療の少なくとも一部を該被検者に適用する前に被検者から取得された第１の試料中の該標識の発現と、ｂ）該治療の一部を適用した後の該被検者から取得した第２の標識中の該標識の発現とを比較し、
該第１の試料と比べて、該第２の試料中の該標識の発現レベルが有意に低いことをもって、該治療が該被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に有効であることの表示とすることを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に対する治療の有効性の評価方法。
【請求項３０】
ａ）表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識であって、治療の少なくとも一部を該被検者に適用する前に被検者から取得された第１の試料中の該標識の発現と、ｂ）該治療の一部を適用した後の該被検者から取得した第２の標識中の該標識の発現とを比較し、
該第１の試料と比べて、該第２の試料中の該標識の発現レベルが有意に増大されたことをもって、該治療が該被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に有効であることの表示とすることを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に対する治療の有効性の評価方法。
【請求項３１】
ａ）被検者から細胞を含む試料を採取し、
ｂ）該試料の画分を複数の試験組成物の存在下に別々に保持し、
ｃ）各画分中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識の発現を比較し、
ｄ）他の試験組成物に比べて、画分中で低いレベルの標識発現を誘起する一試験組成物を選択することを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制用組成物の選択方法。
【請求項３２】
ａ）被検者から細胞を含む試料を採取し、
ｂ）該試料の画分を複数の試験組成物の存在下に別々に保持し、
ｃ）各画分中の、表１Ｂおよび２Ｂに示す標識からなる群より選ばれた標識の発現を比較し、
ｄ）他の試験組成物に比べて、画分中で増大したレベルの標識発現を誘起する一試験組成物を選択することを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制用組成物の選択方法。
【請求項３３】
ａ）被検者から細胞を含む試料を採取し、
ｂ）該試料の画分を複数の試験組成物の存在下に別々に保持し、
ｃ）各画分中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識の発現を比較し、
ｄ）他の試験組成物に比べて、画分中で低いレベルの標識発現を誘起する少なくとも一の試験組成物を該被検者に投与することを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制方法。
【請求項３４】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現を評価する作用剤を含むことを特徴とする、被検者が乾癬ないしはＴＨ１−関連状態に疾患しているか否かの評価用キット。
【請求項３５】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する転写ポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸プローブを含むことを特徴とする、乾癬細胞又はＴＨ１−関連状態に関与する細胞の存在の評価用キット。
【請求項３６】
ａ）被検者から乾癬細胞又はＴＨ１−関連状態に関与する細胞を含む試料を採取し、
ｂ）該試料の画分を複数の試験組成物の存在下に別々に保持し、
ｃ）各画分中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識の発現を比較し、
ｄ）他の試験組成物に比べて、画分中で増大したレベルの標識発現を誘起する少なくとも一の試験組成物を該被検者に投与することを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制用組成物の選択方法。
【請求項３７】
ａ）複数の化合物およびｂ）表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現を評価する作用剤を含むことを特徴とする、複数の化合物の各々の被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に対する適性の評価用キット。
【請求項３８】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する蛋白と特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする、乾癬細胞又はＴＨ１−関連状態に関与する細胞の存在の評価用キット。
【請求項３９】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する転写ポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸プローブを含むことを特徴とする、乾癬細胞又はＴＨ１−関連状態に関与する細胞の存在の評価用キット。
【請求項４０】
ａ）細胞の画分を、試験化合物の存在下および不存在下に保持し、
ｂ）各画分中における、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現を比較し、
該試験化合物の不存在下に保持された画分に比べて、該試験化合物の存在下に保持された画分中の該標識の有意に増大されたレベルの発現をもって、該化合物が細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力があることの表示とすることを特徴とする、化合物の細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力の評価方法。
【請求項４１】
ａ）細胞の画分を、試験化合物の存在下および不存在下に保持し、
ｂ）各画分中における、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現を比較し、
該試験化合物の不存在下に保持された画分に比べて、該試験化合物の存在下に保持された画分中の該標識の有意に低下したレベルの発現をもって、該化合物が細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力があることの表示とすることを特徴とする、試験化合物の細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力の評価方法。
【請求項４２】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現の評価用作用剤と細胞を含むことを特徴とする、試験化合物の細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力の評価用キット。
【請求項４３】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する蛋白を、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の患者の細胞に投与することを特徴とする、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態患者の治療方法。
【請求項４４】
該蛋白の細胞への投与を、該蛋白をコード化するポリヌクレオチドを有するベクターを細胞に投与することにより行う、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応するポリヌクレオチドと相補的な逆型オリゴヌクレオチドを、患者の細胞に投与することを特徴とする、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態患者の治療方法。
【請求項４６】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態が進行する危険性のある被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制方法。
【請求項４７】
表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する遺伝子の発現を増大させることを特徴とする、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態が進行する危険性のある被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、アメリカ合衆国仮出願第６０／２０３，０８７号（２０００年５月９日出願）の優先権を主張するものであり、該仮出願の内容の全体を参照により包含するものとする。
【０００２】
（発明の背景）
乾癬は、銀色の鱗片（鱗屑）あるいはかさぶたで覆われた深紅斑性の周囲から明瞭に区画された皮膚領域で特徴付けられる慢性の皮膚疾患である。疾患の程度は、膝、肘および頭皮等に限定された小損傷領域から全身表面にわたる。乾癬は、静的な疾患ではなく、季節的変動、自然寛解ならびに身体的および情緒的健康が全て症状、従ってその管理に影響する。この疾患は、患者にとって情緒的にならびに身体的に消耗性であり、生活の質を大いに後退させるものである。合衆国においては、１〜３百万人が乾癬に罹患しており、毎年約２５万の新しい症例が発生している。現在、合衆国における乾癬治療費は、控え目に見ても２億４８００万ドル／年になる。
【０００３】
乾癬は、超増殖性と表皮ケラチノサイト（角質化）と区別しにくい点が特徴的である。乾癬の病因に関しては、二つの主要な仮説がある。第一は、遺伝的要因が、表皮ケラチノサイトの異常な増殖性を決定するというものである。細胞が、表皮の恒常性を維持するのに関与する外的刺激にもはや正常に応答しなくなる。細胞膜サイトカイン受容体の異常な発現あるいは膜内外信号変換の異常が、超増殖性の原因となっているかもしれない。乾癬の炎症は、超増殖性ケラチノサイトからの前炎症性分子の放出により二次的に起こる。
【０００４】
第二の仮説は、皮膚中の抗原供出性細胞と相互作用するＴ細胞が、前炎およびケラチノサイト−刺激性のサイトカインを放出するというものである（ハンコック，Ｇ．Ｅ．ほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１３９５−１４０２，１９８８）、遺伝的に予定された個人のＴ細胞のみが、そのような状況下で活性化される。ケラチノサイト自体が、抗原供出性細胞であるかも知れない。乾癬症域の細胞浸潤物はＣＤ４＋Ｔ細胞、より顕著にはＣＤ８＋Ｔ細胞、の流入を示す（Ｂｏｓ，Ｊ．Ｄほか、Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２８１：２３−３，１９８９；Ｂａｋｅｒ，Ｂ．Ｓ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１０：５５５−５６４，１９８４）。
【０００５】
乾癬における増殖は、ＴＧＦαおよびインターロイキン−６（ＩＬ−６）等のサイトカインの過形成および疾患皮膚における表皮生長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）の過発現と関連付けられてきた（Ｋｒｕｅｇｅｒほか、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍｅｔｏｌ．，９４：１３５５−１４０５，１９９０）。ＥＧＦ−Ｒは、１８０−ｋＤ細胞表面受容体であり、その活性はＥＧＦとＥＧＦ−Ｒの両方により制御される。普通の乾癬においては、ＥＧＦ−Ｒは、基底層から表皮角質層の表皮全体にわたって持続的に存在する。このような持続性のＥＧＦ−Ｒは、裸のマウスの生体内で生物学的に活性であることが示されている（Ｎａｎｎｅｙほか、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍｅｔｏｌ．，９８：２９６−３０１，１９９２）。
【０００６】
多くの研究により、乾癬患者の循環する多形核（ＰＭＮ）の白血球における酵素活性の増大についても示している。トルコのＯｐｅｎとその共同研究者（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｎｅ．ＡＣＴＡ  ２６４：４９，１９９７）は、ＰＭＮ白血球中のエラスターゼレベルと疾患活性とを関連付けた。乾癬活性患者中のＰＭＮエラスターゼ・レベルは、対照被検者中のそれと比べて６倍高かったが、乾癬休止段階においては２倍高いのみであった。エラスターゼのみが鋭敏な疾患活性標識となるものでなく、同時に起こる炎症反応が遊離のラジカル種を発生しているのを反映しているのである。ＰＭＮ中のエラスターゼ・レベルは、全白血球（ＰＭＮ）カウントおよび炎症の反映物、α−１−抗トリプシンのレベルとも関連するものである。
【０００７】
乾癬には種々の型があり、従って幾つかの効果的な治療方法および組合せが存在するが、特異的あるいは治効性のものは一つではない（参照：Ｓｔｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．乾癬の最新治療管理、Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９４年１月号、２８〜３５頁）。治療処理には、なかでも、コルチコステロイド、コール・タール、浴溶剤（たとえば塩）、レチフイド、ヴィタミンＤ３、閉塞性治療、シクロスポリンおよびメトトレキサートの使用が含まれる。その発癌性にも拘わらず、紫外Ａ放射線との組合せで、ソラレンが用いられている。場合により、紫外Ｂ放射線の使用も成功している。米国特許第４５１３０１１号、第４４９５２０３号、第４５０７３２１号、第４９３３３３０号、第４８４７２５７号、第４４９６５８８号、第４９８１６８１号、および第４５１８７８９号（これらの内容は、参照により本明細書に包含するものとする）は、乾癬処置用組成物を開示している。同様にＵ．Ｓ．ＦＤＡ  ＯＴＣ  Ｄｒｕｇ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ，Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ，４７巻、第２３３号（１９８２年１２月３日）第５４６４６−５４６８４頁（その内容は参照により本明細書に包含するものとする）は、乾癬の治療用組成物を開示している。しかしながら、現在話題になっている製品の多くは、刺激的であり、やっかいなものであり、あるいは単に効果的でない。話題となっているステロイドは、米国における乾癬市場の９０％を占めるが、皮膚萎縮性、毛細管拡張症、線条形成およびタキフィラキシーを含む多くの副作用を有する。
【０００８】
（発明の要約）
一態様において、本発明は、ａ）表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた、被検者からの試料中の標識の発現のレベルと、ｂ）対照試料中の標識の正常発現レベルとを対比して、該被検者からの試料中の発現のレベルと正常発現レベルとの有意差をもって被検者が乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の疾患状態の指示として評価することを特徴とする被検者が乾癬ないしはｋＨ１−関連状態に疾患しているか否かの評価方法を与える。好ましい態様においては、標識が、該標識を含有するポリヌクレオチドの転写物またはその部分に対応する。特に好ましい態様においては、該試料中の標識の発現のレベルが、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態に疾患していない被検者中の標識発現レベルとは約２倍以上、更に好ましい態様においては、５倍以上、異なる。他の好ましい態様においては、該標識は非疾患組織には有意に発現しない。
【０００９】
他の好ましい態様においては、該試料が、被検者から取得した細胞を含む。他の好ましい態様においては、該試料中の標識の発現レベルを、該試料中の標識に対応する蛋白の存在により検出する。特に好ましい態様においては、該蛋白の存在を該蛋白と特定的に結合する作用剤を用いて検出する。更に好ましい態様においては、該作用剤が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群より選択される。他の好ましい態様においては、試料中の標識の発現のレベルを、該試料中の該標識を含む転写ポリヌクレオチドまたはその部分の存在を検出することにより評価する。特に好ましい態様においては、転写ポリヌクレオチドがｍＲＮＡまたはｃＤＮＡである。他の特に好ましい態様においては、前記検出工程が転写ポリヌクレオチドを増幅する工程を含む。
【００１０】
更に別の好ましい態様においては、試料中の標識の発現の程度を、該試料中の該標識とアニールするまたは厳重なハイブリッド形成条件にある標識を含むポリヌクレオチドとアニールする転写ポリヌクレオチドの存在を検出して、評価する。他の好ましい態様においては、試料中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識から独立に選択した複数の標識の各々の発現レベルと、乾癬ないしＴＨ１−関連状態に疾患していない対照被検者から得た同じ型の試料中の該複数の標識の各々の正常発現レベルとを比較し；一を超える標識の発現レベルが、対応する標識の正常発現レベルと比較して、有意に変化していることを以って、該被検者が乾癬ないしはＴＨ１−関連状態に疾患している表示とする。特に好ましい態様においては、複数が２以上の標識である。より好ましい態様においては、複数が表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた５以上の標識である。
【００１１】
他の態様においては、本発明は、最初の時点における被検者試料中において、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群から選択した標識の発現を検出する工程；該検出工程を以後の時点において繰り返す工程；および上記二検出工程で検出した発現レベルを比較し、それから該被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の進行をモニターすることを特徴とする、被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の進行をモニターする法法が与えられる。好ましい態様においては、該標識が、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識およびその組合せからなる群から選択される。
【００１２】
他の好ましい態様においては、該標識が転写ポリヌクレオチドまたはその部分に対応し、該ポリヌクレオチドが標識を有する。他の好ましい態様においては、試料が該被検者から取得した細胞を有する。他の好ましい態様においては、該細胞が皮膚または細胞組織から収集される。
【００１３】
他の態様においては、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識であって、被検者から取得され且つ該験化物に触れさせ、あるいは試験化合物の存在下に維持された第１の試料中の該標識の発現と；該被検者から取得され且つ該試験化合物と触れさせてない第２の試料中の該標識の発現とを比較し；該第２の試料と比べて、該第１の試料中の該標識の発現レベルが有意に低いことをもって、該試験化合物の該被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制の有効性の表示とすることを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制のための試験化合物の有効性の評価方法を与える。好ましい態様においては、該第１および第２の試料が該被検者から取得した単一試料の部分である。他の好ましい態様においては、該第１および第２の試料が該被検者から取得した、且つプールしてある試料である。他の態様においては、本発明は表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識であって、治療の少なくとも一部を該被検者に適用する前に被検者から取得された第１の試料中の該標識の発現と；該治療の一部を適用した後の該被検者から取得した第２の標識中の該標識の発現とを比較し；該第１の試料と比べて、該第２の試料中の該標識の発現レベルが有意に低いことをもって、該治療が該被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に有効であることの表示とすることを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に対する治療の有効性の評価方法を与える。他の態様においては、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識であって、治療の少なくとも一部を該被検者に適用する前に被検者から取得された第１の試料中の該標識の発現と；該治療の一部を適用した後の該被検者から取得した第２の標識中の該標識の発現とを比較し、；該第１の試料と比べて、該第２の試料中の該標識の発現レベルが有意に増大されたことをもって、該治療が該被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に有効であることの表示とすることを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に対する治療の有効性の評価方法を与える。他の態様においては、本発明は、被検者から細胞を含む試料を採取し；該試料の画分を複数の試験組成物の存在下に別々に保持し、各画分中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識の発現を比較し；他の試験組成物に比べて、画分中で低いレベルの標識発現を誘起する一試験組成物を選択することを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制用組成物の選択方法を与える。
【００１４】
他の態様において、本発明は、被検者から細胞を含む試料を採取し；該試料の画分を複数の試験組成物の存在下に別々に保持し；各画分中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識の発現を比較し；他の試験組成物に比べて、画分中で増大したレベルの標識発現を誘起する一試験組成物を選択することを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制用組成物の選択方法を与える。
【００１５】
他の態様において、本発明は、被検者から細胞を含む試料を採取し；該試料の画分を複数の試験組成物の存在下に別々に保持し；各画分中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識の発現を比較し；他の試験組成物に比べて、画分中で低いレベルの標識発現を誘起する少なくとも一の試験組成物を該被検者に投与することを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制方法を与える。
【００１６】
他の態様において、本発明は、被検者から細胞を含む試料を採取し；該試料の画分を複数の試験組成物の存在下に別々に保持し；各画分中の、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識からなる群より選ばれた標識の発現を比較し；他の試験組成物に比べて、画分中で高いレベルの標識発現を誘起する少なくとも一の試験組成物を該被検者に投与することを特徴とする、被検者の乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制方法を与える。
【００１７】
他の態様において、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現を評価する作用剤を含むことを特徴とする、被検者が乾癬ないしはＴＨ１−関連状態に疾患しているか否かの評価用キットを与える。
【００１８】
他の態様において、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する転写ポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸プローブを含むことを特徴とする、乾癬細胞又はＴＨ１−関連状態に関与する細胞の存在の評価用キットを与える。
【００１９】
他の態様において、本発明は、複数の化合物および表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現を評価する作用剤を含むことを特徴とする、複数の化合物の各々の被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制に対する適性の評価用キットを与える。
【００２０】
他の態様において、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する蛋白と特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする、乾癬細胞又はＴＨ１−関連状態に関与する細胞の存在の評価用キットを与える。
【００２１】
他の態様において、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する転写ポリヌクレオチドと特異的に結合する核酸プローブを含むことを特徴とする、乾癬細胞又はＴＨ１−関連状態に関与する細胞の存在の評価用キットを与える。
【００２２】
他の態様において、本発明は、細胞の画分を、試験化合物の存在下および不存在下に保持し；各画分中における、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現を比較し；該試験化合物の不存在下に保持された画分に比べて、該試験化合物の存在下に保持された画分中の該標識の有意に増大されたレベルの発現をもって、該化合物が細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力があることの表示とすることを特徴とする、化合物の細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力の評価方法を与える。
【００２３】
他の態様において、本発明は、細胞の画分を、試験化合物の存在下および不存在下に保持し；各画分中における、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現を比較し；該試験化合物の不存在下に保持された画分に比べて、該試験化合物の存在下に保持された画分中の該標識の有意に低下したレベルの発現をもって、該化合物が細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力があることの表示とすることを特徴とする、化合物の細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力の評価方法を与える。
【００２４】
他の態様において、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識の発現の評価用作用剤と細胞を含むことを特徴とする化合物の細胞中で乾癬ないしはＴＨ１−関連状態を誘起する能力の評価用キットを与える。
【００２５】
他の態様において、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する蛋白を、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の患者の細胞に投与することを特徴とする、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態患者の治療方法を与える。好ましい態様においては、該蛋白の細胞への投与を、該蛋白をコード化するポリヌクレオチドを有するベクターを細胞に投与することにより行う。
【００２６】
他の態様においては、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応するポリヌクレオチドと相補的な逆型オリゴヌクレオチドを、患者の細胞に投与することを特徴とする、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態患者の治療方法を与える。
【００２７】
他の態様においては、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する遺伝子の発現を抑制することを特徴とする、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態が発達する危険性のある被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制方法を与える。
【００２８】
他の態様においては、本発明は、表１〜８、１０および１２ならびに図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶおよび図７に示す標識の群より選ばれた標識に対応する遺伝子の発現を増大させることを特徴とする、乾癬ないしはＴＨ１−関連状態が発達する危険性のある被検者における乾癬ないしはＴＨ１−関連状態の抑制方法を与える。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および請求項から明らかとなろう。
【００３０】
（発明の具体的説明）
本発明は、部分的には、選択した標識の発現と、被検者における乾癬もしくはＴＨ１−関連状態の存在との間における新たに発見された相関に関係する。これら標識の発現の、単独又は組合せにおける相対レベルが、被検者における乾癬の素因の表示および／又は被検者における乾癬の存在又は潜在的存在の診断になることが見出された。本発明は、標識のパネル、試料または被検者における乾癬もしくはＴＨ１−関連状態の検出方法、ならびに試料または被検者における乾癬もしくはＴＨ１−関連状態の発生の予見の方法を与えるものである。本発明は、またこれら標識を使って乾癬もしくはＴＨ１−関連状態を治療する方法を提供するものである。
【００３１】
本発明は、少なくとも部分的に、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す、遺伝的標識の同定に基づくものであり、これらは、皮膚組織が乾癬疾患損傷域にあるときは、正常な非疾患状態におけるときとは異なって発現する。乾癬罹患状態にある異なる４被検者からの乾癬疾患および非疾患状態の組織において発現するか否かを６８００の既知の遺伝子について選別した（例１参照）。統計的に有意（ｐ＜０．５）である差が、疾患と正常組織の間に同定される。この異なる発現は、発現の減少（例えば表１）あるいは発現の増加（たとえば表２）として観察された。
【００３２】
更に、１０６の核酸の母集団における単一の転写の発現を検出できるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を用いることにより、乾癬において異って発現するが、試料サイズの関係で統計的には有意でないとみなされていたいくつかの遺伝子が同定された。これらの選択された遺伝子の、乾癬に罹患している異なる３被検者からの疾患または非疾患組織皮膚試料における発現は、例１（表８）に記載されるように遺伝子チップ分析により評価される。非疾患組織に比べて、ディフェンシン、ＰＤ−ＥＣＧＦ、ＴＰＡ、ＭＭＰ−１２、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ２、１ＦＩ−２７、ＭＭＰ−１６およびＭＭＰ−２は、疾患組織において発現が増加し、他方、ＴＩＭＰ−３、ＡＰＯ−Ｅ、ＩＤ４およびＰＢＸ２（表８）は反対であった。
【００３３】
乾癬および非乾癬組織の選別に内部対照として使用されるパネル遺伝子には、表９に示す乾癬に関係すると当業界で知られている４つの遺伝子がある。表２に示すように、これら４つの遺伝子の各々は、非乾癬皮膚細胞に比べて乾癬皮膚細胞において有意に増大していることが見出された。表１および２に示される他の標識遺伝子のいくつかは、以前（Ｂａｒｅｎｄｒｅｎほか、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１１３：３２２〜３２８，１９９；ｎａｉｒほか、Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．６：１３４９−１３５６，１９９７；およびＣａｐｏｎほか、Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６５：１７９８−１８００，１９９９）に結合の研究により乾癬と関連すると見出されていた三つの染色体座；すなわち６ｐ２１．３、１７ｑおよび１ｑ２１、にマッピングすることが見出された（表６および７参照）。表６および７中の遺伝子は当業界において知られているが、これらが、乾癬あるいはＴＨ１−関連状態と関連づけられてはいなかった。
【００３４】
乾癬に罹患する被検者からの血液試料を解析した（表１０（例２Ａ））。ある種の遺伝子は各々の組織に個有であったが、血液と皮膚細胞の結果の間で規律は異なるものの、いくぶんの重なりが見出された（表１、２、８および１０）。
【００３５】
一般の炎症反応において異なる発現を示す遺伝子と区別するために、過−または抑制−発現であると（本明細書で記載されるように）同定された遺伝子について、非乾癬免疫あるいは炎症反応を起こしている組織において、その発現を評価した（例２Ｂ）。被検者の非乾癬皮膚にテープを貼って剥すことにより局所的炎症応答を起し、この炎症領域から採った皮膚細胞の遺伝子発現を評価した（表１〜５）。別に遅延型の過敏症（ＤＴＨ）反応を生起させるために、非乾癬被検者もしくは非疾患皮膚組織からの組織を抗原に露呈した。この反応は、損傷個所に、２４〜７２時間のうちに、硬化、腫張および単球浸潤として顕著に起ることが知られている。この炎症組織の遺伝子発現を上記のように評価した（表１〜５）。結果としての、乾癬と発現が関連する遺伝子を表３に示すが、更に、これには表５に示すＳＴＡＴ３およびＴＵＢＢ２遺伝子も含まれる。但し、乾癬と一般の炎症あるいは免疫反応の双方に異なる発現を示すものは、表１および４に示す。
【００３６】
乾癬の病因は未だ知られていないが、Ｔ−ヘルパー１（ＴＨ１）細胞が、多発性硬化症、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病、および慢性関節リウマチと同様に、この病気の初期および／または進行に関与していると考えられる。従って、本明細書に記載するように、活性化Ｔ−ヘルパー細胞における遺伝子の発現の差を評価した。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞をホルボールエステルＰＭＡおよび／またはイオノマイシンに露呈してこれら細胞を活性化し、遺伝子発現を評価した（例２Ｃ参照）。表１に示すように、いくつかの遺伝子が、Ｔｈ２細胞よりはＴｈ１細胞において、増大した発現を示している。
【００３７】
乾癬遺伝子類別セットを同定するために、８人の乾癬患者のサブセットからの非損傷ならびに損傷皮膚のｍＲＮＡ発現プロフィールの鑑別を行った。多くの異なる進行度の遺伝子が同定された。個々の患者において、３４０〜１３２１の遺伝子が平均して２桁以上の増加または減少を示した（表１１）。正常皮膚と非疾患皮膚とは高度の類似性を示し、３４遺伝子のみが２倍以上の差を示した。これら二つの定義グループ間においては、４７６遺伝子が統計的に９５％の信頼性で有意差を示すと判定された。このリストを更に選別して、非損傷および損傷皮膚で２倍以上の発現レベルの差を示す遺伝子のみを選別した。１５９の遺伝子がこの第２の規準に適合した（図３）。Ｇｏｌｕｂほか（（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１−５３７）の定義した級別予知解析によれば、この１５９の遺伝子セットは、正常な非損傷または損傷皮膚に固有の発現パターンを１００％の精度で予知するのに用いることができる。従って、これらの１５９遺伝子は、斑状乾癬の病状分類セットを構成する。
【００３８】
このセットのなかにおいて、従来乾癬と関連づけられていなかった多くの遺伝子が異なる調節を受けるものと同定された。例えば、Ｓ１００Ａ１２（カルジザリンＣ、ＥＮＲＡＧＥ）、Ｓ１００Ａ１１およびＳ１００Ａ２などの多発性Ｓ１００類メンバー、マトリクス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−１２）およびヘパリン結合蛋白１７（ＨＢＰ−１７）の過発現が観察された（図３）。ＭＭＰ−１２は、以前より、ミクロ行列解析により、クローンおよびＲＡ組織で抑制発現されることが示されていた。またＨＢＰ１７は新脈管形成および創傷治癒に役立つことが示されている。ケリチン２、アポリポ蛋白Ｅ（ＡＰＯＥ）、ＧＡＴＡ３、Ｒｂ１、カルポニン１（ＣＮＮ１）、シスタチン６（ＣＳＴ６）、ＴＩＭＰ−３およびＴＮＸＡなどのいくつかの遺伝子は、非損傷皮膚に比べて乾癬損傷皮膚で進行抑制された。炎症および免疫調節に関与する、ＩＬ−４Ｒ、ＣＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＳＴＡＴ−１、ＩＦＩ２７、ＩＦＩ５６、ＭＸ１、ＭｎＳＯＤおよびＭＣＰ１などの他の遺伝子は、非損傷組織に比べて損傷組織で増大した。
【００３９】
追加の１６乾癬患者の解析により、損傷皮膚において、ＨＡＲＰ、Ｓ１００Ａ１２、ＨＲＢ１７、ＩＬ−４Ｒ、ＣＣＮＦ、ＬＡＤ１、ＭＡＰＫＫ３ｂ、ＭＭＰ−１２、ＭＴＸおよびＤＳＧ３ｍＲＮＡのレベルの増大が確認された（図４Ａ）。また非損傷皮膚に比べて、損傷皮膚において、ＣＳＴ６、ＴＮＸＡ、ＩＤ４、ＴＩＭＰ−３、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−５およびＡｐｏＥのレベル低下が確認された（図４Ｂ）。
【００４０】
異なる機械的要因を有する他の皮膚炎症状態（例えば遅延型過敏症反応（ＤＴＨ）およびテープ剥離）について発現プロフィールを形成することにより、乾癬の病態生理学における調節（進行）の異なる遺伝子の役割を特性付けた。正常および損傷皮膚において調節の異なる１８２〜９２５の遺伝子から同定された非疾患領域とＤＴＨ反応部位との生態組織検査の比較を行った（表１１）。平均して、２５９遺伝子が、全ての被検者に対して２倍以上の差を示した。別の３被検者からの正常皮膚およびテープ剥離皮膚の生態組織検査も行った。３志望者を通じて、概ね６２〜３０９遺伝子が正常と損傷皮膚で差を示した（表１１）。全３テープ剥離試料において、１６１遺伝子が、平均して２倍以上の調節の差を示すものとして同定された（図５Ａ）。
【００４１】
これらの発現プロフィールと本明細書で同定した１５９の乾癬病遺伝子の発現プロフィールとを比較した。定性的に異なる調節を受けた遺伝子をグループ化した。三つの炎症状態において１３の遺伝子が異なる進行度を示した：すなわち、ＳＣＣＡ２，ＫＲＴ１６，ＫＲＴ６Ｅ，ＰＳＲＲ１Ｂ，ＧＮＡ１５，ＭＸ１，ＳＲＭ，ＺＰＦ３６，Ｓ１００Ａ２，Ｓ１００Ａ７，Ｓ１００Ａ９，ＰＩ３およびＤＥＦＢ２である（図５Ｂ）。Ｓ１００Ａ１２（ＥＮＲＡＧＥ）、ＲＡＧＥおよびＧＡＴＡ−３を含む９４遺伝子で乾癬のみにおいて特定的に調節された。２３遺伝子が乾癬と引き続くＤＴＨ反応とで異なる調節を受けた：すなわち、ＰＳＭＢ１０，ＳＣＡＡ１，ＩＦＩ２７ＥＰ，ＰＳＭＡ２８，ＣＤ４７，ＳＣＹＡ２，ＰＲＳＳ６，ＩＬ４Ｒ，ＰＬＳＣＲ１，ＣＤ２，ＣＨＩＴ１，ＳＯＤ２，ＣＤＣ２５，ＣＡＳＰ４，３ＰＫ，ＬＧＡＬＳ３ＢＰ，ＴＨＢＤ，Ｈ２ＡＺ，ＨＡＬ，ＡＲＧ１，ＧＡＲＳ，ＡＬＤＨ１０およびＡＴＰ１Ｂ１（図５Ｃ）である。２０遺伝子は、乾癬と引き続くテープ剥離で異なる調節を受けた：すなわちＫＲＴ１７，ＨＢＰ１７，ＣＴＳＬ，ＰＲＳＳ３，ＳＰＲＲ２Ａ，ＣＤ２４，ＨＳＰＡ８，ＬＡＤ１，ＥＩＦ５Ａ，ＵＰ，ＡＮＴ２，ＢＥＮＥ，Ｋ９８＿ＴＣＰ１，ＲＡＮＢＰ１，ＰＣＢＤ，ＭＤＦＩ，ＳＦ２Ｐ３２，ＤＳＧ３，ＴＯＰ１，ＤＤＸ，Ｋ５，ＰＨＢ，ＰＣＳＫ４，ＣＥＢＰＤ，ＥＬＰ１，ＥＴＲ１０１，ＬＤＬＲ，ＥＩＦ５，ＫＲＴ２ＡおよびＯＳＦ２ＯＳ（図５Ｄ）である。１１の遺伝子は、ＤＴＨとテープ剥離とで共通であったが、乾癬とはそうでない。
【００４２】
多くの異なる発現を示した遺伝子を乾癬受容座にマッピングした（表１２）。例えば、ＲＡＧＥ、ＭＤＦ１、ＩＤ４およびＴＮＸＡを６ｐ２１．３のＰＳＯＲ１座にマッピングした。非損傷組織と比べて、ＭＤＦ１は損傷組織でより多く発現し、ＩＤ４、ＲＡＧＥおよびＴＮＸＡは、損傷組織でより少なく調節された。６ｐ２１．３のＨＬＡ座に位置するＩＤ４は、基本らせん−ループ−らせん（ｂＨＬＨ）類転写因子の優勢／劣勢調節因子であり、種々の細胞直系に対し、細胞変化および増殖の拮抗質として作用する（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎほか（１９９４）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：７４９−７５５；Ｐａｇｌｉｎｃａほか（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２７：２００−２０３）細胞損傷はＩＤ４の下方調節を起し、アポトーシスの低減につながる（Ａｎｄｒｅｓ−Ｂａｒｇｕｉｎほか（１９９８）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ９：４０７５−４０８０；Ａｎｄｒｅｓ−Ｂａｒｇｕｉｎほか（１９９９）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２４７：３４７−３５５）。ＩＤ４発現の低減は、それが遺伝変異によるものであれ、傷害に伴うものであれ、ケラチノサイトの成長を制御するいくつかの下流ｂＨＬＨ転写因子の抑制調節につながる。
【００４３】
ＭＡＰキナーゼ類（ＰＲＫＭＫ３；ＭＥＫ３）を含む、染色体１７ｑのＰＳＯＲ２座のいくつかの遺伝子、炎症過程に関与する二つの遺伝子、すなわちケモカインＳＣＹＡ２およびＭａｃ−２結合蛋白、の異なる発現が観察された。ＰＲＫＭＫ３は、マイトジェン−活性キナーゼ、キナーゼ３（ＭＫ３）、すなわちｐ３８ＭＡＰＫの上流調節因子である。ｐ３８ＭＡＰＫは、ＴＮＦ−αなどの前炎症分子により活性化され、炎症過程に関与する。ｐ３８抑制作用は、炎症状態の低減をもたらす（Ｈｅｒｌａａｒほか（１９９８）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  ５：４３９−４４７）。
【００４４】
染色体ｌｑ２１のＰＳＯＲ４座にマッピングするいくつかの遺伝子は損傷組織においてより多く発現し、これらは、ＭＴＸおよびＳ１００Ａ１２、Ｓ１００Ａ２およびＳ１００Ａ９などのＳ１００遺伝子類のメンバーである。興味のあることにはＳ１００Ａ１２（Ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ  Ｃ）は、６ｐ２１．３のＰＳＯＲ１座にマッピングするＲＡＧＥ受容体の配位子である（Ｈｏｆｍａｎほか（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９７：８８９−９０１）。ｌｑ２１に位置するＳ１００Ａ１２は、前炎ＮＦ−κＢ経路の活性化と関連付けられている。一遺伝子ＡＣＰＰはＰＳＯＲ５座にマッピングし、信号変換に関与する三遺伝子（ＣＮＮ１，ＧＮＡ１５）またはＬＤＬシグナル（ＬＤＬＲ）は、１９ｐ１３のＰＳＯＲ６座にマッピングした。より多くの患者母集団によるＰＲＫＭＫ３、ＨＢＰ１７、Ｓ１００Ａ１２、ＭＴＸ、ＴＮＸＡおよびＩＤ４などの、これら遺伝子の選択されたグループの定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析により初期遺伝子破片を見出し、検査した全患者についてこの抑制調節の一致を示した（図４Ａおよび４Ｂ）。
【００４５】
薬剤治療過程を上回る発現パターン変化を示す遺伝子を同定するために、薬剤治療前および治療中の応答および非応答被検者間での損傷皮膚の発現プロフィールの比較を行った。薬理発現パターンの同定に資するために自己組織マッピング（ＳＯＭｓ）を採用した（Ｔａｍａｙｏほか（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：２９０７−２９１２）。被検者には、γｈｌＬ−１１もしくはシクロスポリンＡによる治療を行った。反応患者における薬剤治療過程中に変化した４つの遺伝子発現パターンをこの遺伝子セットについて同定した（図６）。これに対し、非応答患者は、薬剤治療中にこの遺伝子セットで有意な変化を見せなかった。
【００４６】
臨床上の改善を反映する、あるいは臨床上の改善にもかかわらず変化しない遺伝子とは異なり、臨床上の改善に先立つ遺伝子発現の変化は、病状の進行の原因となる役割を果たしているものと解される。この考え方により、ｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリンＡによる治療介入に引き続く臨床上の改善に先立つ時点での正常または非乾癬レベルに戻った３６の異なって調節された遺伝子の下位セットを同定した（図６のＩ）。このグループのメンバーには、ＩＤ４、ＨＢＰ−１７、ＫＲＴ１６、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ１２、ＧＮＡ１５、ＭＴＸ、ＰＲＫＭＫ３およびＳＣＹＡ２が含まれ、これらは全て乾癬病座に局在化した。加えて、ＩＬ−４Ｒ、ＣＤ２およびＧＡＴＡ３等の免疫調節遺伝子のいくつかも、この範疇に属する。
【００４７】
第２のパターンは、発現レベルが臨床上の改善に先立ちはしないが、薬剤治療の最後においてのみ非損傷皮膚のレベルに戻った遺伝子に対応する（図６、グループＩＩ）。この群には、異なって調節された１６５遺伝子中の９７遺伝子が含まれた。第３の発現パターンは、患者の皮膚損傷の臨床上の改善にも拘わらず、その発現パターンが治療過程中に変化しなかった１９遺伝子を含む（図６、グループＩＩＩ）。最後の群は、薬剤治療過程にわたって発現レベルが増大した遺伝子を含むものである。これらの遺伝子のいくつか、例えばＴＮＸＡ、ＲＡＧＥ、ＩＤ４およびＧＡＴＡ３等の発現レベル変化は、臨床上の改善に先行した（図６、グループＩＶ）。臨床上の改善に先立つ遺伝子発現レベルの変化は、病状の進行の原因となる役割を果す、あるいは臨床上の有効性の早期の標識となる遺伝子を同定するものである。定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、より多くの患者母集団における、これら早期応答性遺伝子の遺伝子発現変化を解析した。ＰＲＫＭＫ３、ＩＤ４、ＣＳＴ６およびＴＮＸＡについて、ｒｈＩＬ−１１で治療した１５患者およびシクロスポリンＡで治療した９患者により、Ｓ１００Ａ１２、ＨＢＰ１７、Ｋ１６、ＣＣＮＦ、ＳＣＹＡ２の遺伝子発現レベルを解析した。上記解析と一致して、応答患者には、薬剤治療に引き続き１週間で早くも同様な遺伝子発現レベルの変化が生じたが非応答患者については、生じなかった。多くの場合、この遺伝子発現の変化は、これらの患者における臨床上の改善に先立って起った。薬剤治療の停止に伴い、これらの遺伝子のうち、Ｋ１６、Ｓ１００Ａ１２およびＣＣＮＦ等のいくつかの、ｍＲＮＡ発現レベルは、１２週で、非治療損傷域のレベルへ向って、リバウンドしはじめ、これら遺伝子の病状進行への原因的役割を支持している。これらの結果は、また、これら遺伝子又はそれにより決定される経路が、好適な治療介入点であることを示す。
【００４８】
従って、本発明は、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７（例えば、ＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）に示す遺伝子又はその下位セット、ならびに対応するｍＲＮＡ転写物およびコード化したポリペプチドの乾癬もしくはＴＨ１−関連状態の存在または進行の危険に対する標識としての使用に関する。これらの標識はまた病状の程度および／又は深刻さとの相関に役立つ。複数の標識のパネルは、キットまたは固体サポート用に便宜にアレイ化できる。これら標識は、乾癬又はＴＨ１−関連状態の治療、あるいは乾癬又はＴＨ１−関連状態の治療の有効性の評価にも有用である。
【００４９】
一つの観点によれば、本発明は、その量または活性により、乾癬又はＴＨ１−関連状態の存在との相関を示す標識を与える。本発明の標識は、核酸分子（たとえばＤＮＡ、ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡ）またはポリペプチドであり得る。これら標識は、その量または活性が、非乾癬組織に比べて、乾癬組織において、増加または減少する。例えば“ＢＥＮＥ”（アクセス番号：Ｕ１７０７７）と称される遺伝子は、非乾癬組織に比べて、乾癬組織において、発現レベルが増大し（表３）、“ＣＲＩＰ１”と称される遺伝子は、乾癬組織において、発現レベルが減少する（表１）。これら遺伝子（および表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７中の他の遺伝子）についての、ｍＲＮＡの増加又は減少、ならびにこれら遺伝子（および表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７中の他の遺伝子）の蛋白生成物の発現レベルの増加又は減少は、乾癬又はＴＨ１−関連状態標識として役立つ。好ましくは、本発明の標識の増大もしくは減少したレベルは、適当な対照試料と比較して統計的に有意な大きさのものである。特に好ましい態様においては、対照試料に比べて、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍あるいはそれ以上を標識とする。同様に当業者は、好ましい検出方法は、得られる検出値がその方法における検出下限よりも上である事実を認識するであろう。
【００５０】
本発明のＲＮＡまたは蛋白標識の相対量の測定は、当業界に知られる任意の方法によることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌほか編集のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２）。典型的なＲＮＡ検出方法には、細胞または組織試料からのＲＮＡ抽出に続いて、抽出されたＲＮＡに対し、該標的ＲＮＡに特定的な標識プローブ（例えば相補核酸分子）のハイブリッド化を行い、該プローブを検出する方法（ノザンブロット）が含まれる。典型的な蛋白検出方法には、細胞または組織試料から蛋白抽出を行い、標的蛋白に特定的な標識プローブ（例えば抗体）のハイブリッド化を行い、次いで該プローブを検出する方法が含まれる。標識グループは、放射性同位体、蛍光化合物、酵素もしくは補酵素であり得る。特定の蛋白および核酸分子の検出は、当業者に知られている他の多くの方法のなかで、電気泳動、カラム・クロマトグラフィー、直接塩基配列決定、または定量的ＰＣＲ（核酸分子の場合）で達成することができる。
【００５１】
ある態様によれば、遺伝子そのもの（例えばＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）を乾癬又はＴＨ１−関連状態の標識として用いられる。例えば、ある遺伝子（例えば表１の遺伝子）に対応する核酸が、例えば該遺伝子の全体または部分的欠失により、存在しないことは、疾患と相関付けられる。同様に、例えば遺伝子の複製により、ある遺伝子（例えば表２の遺伝子）に対応する核酸の増加も、疾患と関連付けられる。
【００５２】
本発明の標識遺伝子の全部または一部の複製の存在または数の検出は、当業界で知られている任意の方法で行い得る。典型的に、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの存在および／または量は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ解析により好便に評価でき、この方法においては、細胞または組織試料からの全ＤＮＡを抽出し、標識プローブ（例えば相補ＤＮＡ分子）でハイブリッド化し、該プローブを検出する。標識グループは、放射性同位体、蛍光化合物、酵素もしくは補酵素であり得る。他のＤＮＡ検出および／または定量の有用な方法には、当業者に知られているように、直接塩基配列決定、ゲル電気泳動、カラム・クロマトグラフィーおよび定量的ＰＣＲが含まれる。
【００５３】
本発明は、上記分子とは構造的に異なる核酸および蛋白分子（例えば、わずかに変化した核酸またはアミノ酸配列を有するもの）であって、上記分子と同じ性質を有するもの（例えばコードしたアミノ酸配列、または非本質的アミノ酸残査のみが異なるもの）をも包含する。この様な分子については対立遺伝子変異体が含まれ、サブセクションＩで更に詳細に記載する。
【００５４】
他の観点によれば、本発明は、乾癬又はＴＨ１−関連状態の症状と関連する量または活性を有する標識（例えば、例３参照）を提供するものである。これら標識は、乾癬又はＴＨ１−関連状態と正または負に相関する量または活性が増大または減少する。また別の観点によれば、本発明は、被検者において、乾癬又はＴＨ１−関連状態の進行する危険性と相関する量または活性を有する標識を与えるものである。これら標識は、被検者における乾癬又はＴＨ１−関連状態の進行の可能性と直接関連する活性又は量の増加または減少のいずれかを示すものである。
【００５５】
各々の標識は個々に考慮し得るものである。但し、解析の信頼性を増大するために、本発明の方法および組成物において、二以上の標識を組み合せることは、本発明の範囲内である。本発明は、他の観点によれば、本発明の標識類のパネルを与えるものである。好ましい態様によれば、これら標識パネルは、任意の一パネルを構成する標識類が、ある特徴を共有するものである。例えば、第１のパネルの標識は、各々、非乾癬組織に比べて、乾癬組織で量または活性が増加するものであり、第２のパネルの標識の各々は、非乾癬組織に比べて乾癬組織において、量または活性が減少するものとする。標識類の異なるパネルを、異なる組織からの標識により構成することができる（例えば血液（表１０））または皮膚細胞（表１および２）、あるいは乾癬病状の異なる成分（例えばより一般化した炎症反応（表１、２または４）または乾癬自体（表３）で代表させることができる。本発明の標識パネルは、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示されている。当業者には、本発明の方法は、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示すパネルのいずれか一、または、その一部またはそれらの組合せ、により実行し得ることは明らかであろう。
【００５６】
当業者には、本発明の標識パネルを固体支持体上に好適に与え得ることが理解できよう。例えばｍＲＮＡ等のポリヌクレオチドをアレイ（例えばハイブリッド化解析のための遺伝子チップ・アレイ）と、樹脂（例えばカラム・クロマトグラフィー用のカラムに充填する樹脂）と、またはマトリクス（例えばノザンブロット分析用のニトロセルロース・マトリクス）と結合することができる。標識（類）と、共有的にまたは非共有的に、相補関係を有する分子の固定により、試料中の各標識の存在または活性の個別の分析が可能になる。例えば、アレイにおいて、標識パネルの個々のメンバーと相補性を有すポリヌクレオチド（類）を、既知の異なるアレイ上の位置に個別に付着させることができる。アレイを、例えば被検者からの皮膚細胞試料から抽出したポリヌクレオチドとハイブリッド化することができる。アレイ上の任意の位置のアレイとの該試料からのポリヌクレオチドのハイブリッド化が検出され、従って該試料中の標識の存在および量が確認される。好ましい態様においては、“遺伝子チップ”アレイが採用される（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）。同様に、ウエスタン分析を、被検者からの蛋白試料とハイブリッド化した異なるポリヌクレオチド標識に特定的な固定抗体に適用できる。
【００５７】
当業者には、全標識蛋白または核酸分子を支持体に結合する必要のないことは明らかであるから；検出（例えばハイブリッド化）のために充分な長さの標識部分、例えば７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、１００あるいはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸を含む長さである標識の部分は、検出のために充分であろう。
【００５８】
本発明の核酸および蛋白標識は、被検者からの任意の組織または細胞から分離し得る。好ましい態様によれば、この組織は、皮膚組織または血液組織である。しかしながら、当業者には、体液（例えば、尿、胆汁、漿疫、リンパ、唾液、粘液および膿）を含む他の組織試料を、本発明の標識分離源として用いることができ、またこれらの中において、本発明の標識の存在、活性および／または量を評価することもできる。一以上の標識自体を含む組織試料を本発明方法に有用であり、当業者はこのような試料を好便に取得し、貯蔵しおよび／又は保存する方法に通じているであろう。
【００５９】
本発明以前に、いくつかの標識が、乾癬と関連していることは知られていた。それらの標識を表９に示す。これら標識は、本発明の標識には含まれない。しかしながら、これら標識は、本発明の方法、パネルおよびキットにおいて、本発明の標識と好便に組み合わせることができる。
【００６０】
他の観点において、本発明は、患者が乾癬又はＴＨ１−関連状態により罹患しているか、否かを、評価するのに有用な抗体を生成する分離されたハイブリドーマの製造法を与えるものである。この方法においては、本発明の標識に対応する蛋白を分離する（例えば、それが発現した細胞の精製により、あるいは該蛋白を公知方法により、生体内でまたは生体外でコード化する核酸の転写およびトランスレーションにより。脊椎動物、好ましくはマウス、ねずみ、うさぎ、羊等の哺乳類を分離された蛋白または蛋白断片を用いて、免疫処置する。脊椎動物を、必要に応じて（且つ好ましくは）少なくとも１回追加免疫処理して、該動物が、蛋白または蛋白断片に対して、しっかりした免疫応答を示すようにする。免疫処置した動物から脾臓を分離し、不朽化した細胞条片と融合してハイブリドーマを形成する。このようにして形成したハイブリドーマを標準的方法によりスクリーニングして、蛋白または蛋白断片と特定的に結合する一以上のハイブリドーマを同定する。本発明は、またこの方法により製造したハイブリドーマおよび該ハイブリドーマを用いて製造した抗体を包含する。
【００６１】
本発明は、被検者における、乾癬又はＴＨ１−関連状態、または乾癬又はＴＨ１−関連状態の進行の危険性の、診断方法を与える。これらの方法においては、被検者からの試料（例えば皮膚細胞または血液細胞を含む試料）を分離して、乾癬又はＴＨ１−関連状態にないことが既知の被検者から、あるいは同被検者の乾癬又はＴＨ１−関連状態の存在により変化されていないことが既知の組織からの第２の試料との対比において、本発明の一以上の標識の存在量および／または活性を検出する。これら二つの試料中の標識レベルを比較し、対象試料中の一以上の標識の有意な増加または減少により、乾癬又はＴＨ１−関連状態の存在または存在の危険性を判定する。
【００６２】
本発明は、また被検者における乾癬又はＴＨ１−関連状態の症状の評価方法を与える。これらの方法においては、被検者から試料（例えば皮膚細胞または血液細胞を含む試料）を分離し、乾癬又はＴＨ１−関連状態にないことが既知の被検者から、あるいは同被検者の乾癬又はＴＨ１−関連状態の存在により変化されていないことが既知の組織からの第２の試料との対比において、本発明の一以上の標識の存在量および／または活性を検出する。これら二つの試料中の標識レベルを比較し、対象試料中の一以上の標識の有意な増加または減少により、乾癬又はＴＨ１−関連状態の症状（深刻さ）を判定する。
【００６３】
本発明は、また被検者における乾癬又はＴＨ１−関連状態の治療（例えば抑制）方法を与える。これらの方法においては、被検者から試料（例えば皮膚細胞または血液細胞を含む試料）を分離し、乾癬又はＴＨ１−関連状態にないことが既知の被検者から、あるいは同被検者の乾癬又はＴＨ１−関連状態の存在により変化されていないことが既知の組織からの第２の試料との対比において、本発明の一以上の標識の存在量および／または活性を検出する。これら二つの試料中の標識レベルを比較し、対象試料中の一以上の標識の有意な増加または減少を視察する。発現ないしは活性が有意に減少した標識については、その患者に発現した標識蛋白を与えるか、減少した標識に対応するｍＲＮＡまたはＤＮＡを導入して処置して（たとえば遺伝子治療により）、該被検者における標識蛋白を増加させる。また、発現ないしは活性が有意に増加した標識については、その患者に増加した標識と反対型のｍＲＮＡまたはＤＮＡを与えて処置して（たとえば遺伝子治療により）、あるいは標識蛋白に特定的な抗体を与えることにより該被検者における標識蛋白を減少させる。このようにして、被検者は、乾癬又はＴＨ１−関連状態に対して処置する。
【００６４】
本発明は、また被検者における乾癬又はＴＨ１−関連状態の進行を阻止する方法を与える。その方法においては、発現または活性が有意に減少した標識について、該標識蛋白の投与または減少した標識に対応するｍＲＮＡまたはＤＮＡを導入して（例えば遺伝子治療により）、該被検者における標識蛋白レベルを増大させる。発現または活性が有意に増加した標識については、増加した標識と反対型のｍＲＮＡまたはＤＮＡを投与して（例えば遺伝子治療により）、あるいは該標識蛋白に特定的な抗体を投与して、該被検者における該標識蛋白レベルを減少する。このようにして、被検者における乾癬又はＴＨ１−関連状態の進行を阻止する。
【００６５】
本発明は、また、被検者における乾癬又はＴＨ１−関連状態の処置または治療の評価方法を与える。この方法においては、乾癬又はＴＨ１−関連状態に罹患して、処置または治療中の被検者から試料（例えば皮膚細胞または血液細胞を含む試料）を分離し、乾癬又はＴＨ１−関連状態に罹患しているが処置または治療を受けていない被検者からの第２の試料との対比で、また乾癬又はＴＨ１−関連状態に罹患していない被検者からの、あるいは同被検者の乾癬又はＴＨ１−関連状態の存在に影響されていないことが既知の組織からの第３の試料との対比において、前記第１の試料中における本発明の一以上の標識の存在、量および／または活性を検出する。該３の試料中の標識レベルを比較し、他の試料と比べて、第１の試料中の一以上の標識の有意な増加又は減少を観察し、乾癬又はＴＨ１−関連状態の存在、存在の危険性あるいは症状と関連付ける。
【００６６】
本発明は、また、乾癬又はＴＨ１−関連状態の治療用の薬剤組成物を与えるものである。これら組成物には、本発明の標識蛋白および／または核酸を含み（例えば標識は非乾癬組織に比べて乾癬組織で量または活性が減少するものである）、本明細書で記載するように構成される。代りに、それら組成物は、本発明の標識蛋白に特定的に結合される抗体および／または本発明の核酸と相補的な逆型の核酸を含み（例えば標識は非乾癬組織に比べて乾癬組織で量または活性が増加するものである）、本明細書で記載するように構成される。
【００６７】
本発明は、さらに試料（例えば、乾癬又はＴＨ１−関連状態の危険性のある被検者からの試料）中の、乾癬細胞またはＴＨ１−関連状態に関与する細胞の評価用キットを与えるものであり、該キットは抗体を含み、該抗体は表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示された標識のグループから選択された蛋白と特定的に結合するものである。
【００６８】
本発明は、更に、試料（例えば、乾癬又はＴＨ１−関連状態の危険性のある被検者からの試料）中の、乾癬細胞またはＴＨ１−関連状態に関与する細胞の存在の評価用のキットを与えるものであり、該キットは、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示された標識のグループから選択された標識に対応する転写ポリヌクレオチドと特定的に結合する核酸プローブを含むものである。
【００６９】
本発明は、更に被検者の乾癬又はＴＨ１−関連状態を抑制するための複数の化合物の各々の好適性を評価するためのキットを与えるものである。そのキットは試験すべき複数の化合物と、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される一以上の標識のグループから選択された標識の発現を評価するための試薬を含むものである。
【００７０】
標準的な技法により本発明の上記組成物および方法を修正することは、当業者にとって容易であり、本発明に包含することを意図するものである。
【００７１】
本発明の理解を容易とするために、いくつかの用語および表現を以下に定義する。
【００７２】
本明細書においては、「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」の語は、互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドあるいはこれらの類似体であれ、ヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態を含むものとする。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し、既知または非既知の任意の機能を達成し得る。以下のものは、非限定的なポリヌクレオチドの例である：遺伝子または遺伝子断片、エキソン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、リコンビナント・ポリヌクレオチド、分岐ヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意のアミノ酸配列を有する分離ＤＮＡおよび分離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの構成の前または後に達成し得る。ヌクレオチドの配列の間に非ヌクレオチド成分が介在し得る。ポリマー化の後にポリヌクレオチドを、例えば標識成分との接合等により、更に修飾することもできる。この語は更に二本鎖および一本鎖分子を含む。別に特定ないしは要求されない限り、ポリヌクレオチドである本発明の態様は、二本鎖形および二本鎖形を形成することが既知あるいは予知される二つの相補一本鎖の各々をともに含む。
【００７３】
ポリヌクレオチドは、特定の順番の４つのヌクレオチド塩基、すなわちアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ならびにポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にグアニンに代るウラシル（Ｕ）で構成される。すなわち、「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現を中央演算装置を有するコンピュータのデータベースに入力し、機能的遺伝学および相同性検索などの生命情報科学応用に用いることができる。
【００７４】
「遺伝子」は、転写および翻訳後に特定のポリペプチドあるいは蛋白にコード化できる少なくとも一つの開いた読み枠を含むポリヌクレオチドを含むものである。本明細書に記載するポリヌクレオチド配列は、いずれも関連する当該遺伝子のより大なる断片あるいは全長コード化配列を同定するのに用いられるものである。より大きな断片配列を分離する方法は、当業者に知られており、それらのいくつかは本明細書に記載する。
【００７５】
「遺伝子生成物」には、遺伝子が転写および翻訳されることにより生成したアミノ酸（例えばペプチドもしくはポリペプチド）が含まれる。
【００７６】
本明細書において、他の（第１の）ポリヌクレオチドに対し、ある「ポリヌクレオチドが対応する」という表現は、それが、該第１のポリヌクレオチドと以下の関係のいずれかに該当するときに用いる。
【００７７】
１）該第２のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドを含み、該第２のポリヌクレオチドが遺伝子生成物をコード化する。
【００７８】
２）該第２のポリヌクレオチドが、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡまたはこれらのポリヌクレオチドの断片中の第１のポリヌクレオチドの５′または３′体である。例えば、第２のポリヌクレオチドが該第１および第２のポリヌクレオチドを含む遺伝子の断片である、該第１および第２のポリヌクレオチドは、蛋白あるいは抗体などの遺伝子生成物の遺伝子コード成分という関係を有する。しかしながら、該第２のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドを含む、あるいは重複することは、本明細書で「対応する」の定義に該当するために必要ではない。例えば、第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドの３′−非翻訳領域の断片であり得る。第１および第２のポリヌクレオチドは、遺伝子生成物の遺伝子コード化の断片であり得る。第２のポリヌクレオチドがある遺伝子のエキソンであり、第１のポリヌクレオチドが該遺伝子のイントロンである。
【００７９】
３）第２のポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドの補体である。
【００８０】
「プローブ」の語は、ポリヌクレオチド操作において用いられるときは、ある目的試料中の目標物に対してハイブリッド化してこれを検出するための試薬ないしは作用剤として用いられるオリゴヌクレオチドを含む。通常は、ブローブは、ハイブリッド化の前または後に、ラベルまたはラベル付着手段を有する。好適なラベルには、放射性同位体、蛍光色素、化学発光性化合物、色素および酵素を含む蛋白が含まれる。
【００８１】
「プライマー」には、通常は目的試料中の目標物あるいは「テンプレート」とハイブリッド化により結合するための、しかし現在は自由である３′−ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドが含まれ、これはその後、該目標物と相補的であるポリヌクレオチドのポリマー化を促進するものである。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、「上流」および「下流」プライマーを含む「プライマー対」または「プライマー組」、およびＤＮＡポリメラーゼおよび典型的には熱安定性ポリメラーゼ酵素等からなるポリマー化触媒を用いて、目標ポリヌクレオチドの反復複製物を生成する反応である。当業界においてＰＣＲ方法はよく知られており、例えばＭａｅ  Ｐｈｅｒｓｏｎほか、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）に教示されている。ＰＣＲもしくは遺伝子クローニング等のポリヌクレオチドの反復複製物の製造法を、本明細書では、包括的に「複製」と称する。プライマーは、またサザンまたはノザンブロット分析等のハイブリッド化反応にも用いられる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂａｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９参照）。
【００８２】
「ｃＤＮＡ」の語は、逆トランスクリプターゼ等の酵素によりｃＤＮＡを生成する細胞あるいは有機体中に存在するｍＲＮＡ分子である、相補ＤＮＡを包含する。「ｃＤＮＡライブラリー」には、酵素逆トランスクリプターゼによりｃＤＮＡ分子に転換され、更に「ベクター」（異種ＤＮＡの付加に引き続いて複製を継続できる他のＤＮＡ分子）に挿入される細胞または有機体中に存在するｍＲＮＡ分子の集合体が含まれる。ライブラリーのベクターの例としては、バクテリアに感染するウィルスであるバクテリオファージ（例えばラムダ・ファージ）が含まれる。ライブラリーは、目的の特定ｃＤＮＡ（従って、およびｍＲＮＡ）によって調べられる。
【００８３】
「遺伝子配達媒体」には、一以上のポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入することのできる分子が含まれる。遺伝子配達媒体の例には、リポソーム、天然ポリマーおよび合成ポリマーを含む生体許容性のポリマー；リポ蛋白、多糖類；リポ多糖類、合成ウィルス・エンベロープ、金属粒子；およびバキュロウィルス、アデノウィルスおよびレトロウィルスなどのバクテリア、ウィルスおよびウィルス・ベクター；バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターおよび各種の真核生物および原核生物宿主における複製および／または発現のために当業界において典型的に記載されてきた他の再結合ベクターが含まれる。遺伝子配達媒体は、挿入ポリヌクレオチドの複製、遺伝子治療ならびに単純なポリペプチドおよび蛋白の発現に用いられる。
【００８４】
「ベクター」には、挿入ポリヌクレオチドを宿主にあるいは宿主間で転送する自己複製核酸分子が含まれる。この語には、主として細胞中への核酸の挿入の機能を有するベクター、主として核酸の複製の機能を有する複製ベクター、および主としてＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳の機能を有する発現ベクターを含むことを意図している。また、上記機能の二以上を与えるベクターも包含することを意図している。
【００８５】
「宿主細胞」には、ベクターの受容体あるいは外因性の核酸分子、ポリヌクレオチド、および／または蛋白の導入のための受容体として使用可能であり、あるいは使用されてきた個別細胞または細胞培養物を含むことを意図している。また単細胞の子孫も含むことを意図している。子孫は、自然、突然または意図的変異のため、もとの親細胞と完全に同一（形態的、遺伝的または全ＤＮＡ補体において）であることは必ずしも必要でない。細胞は、真核性または原核性であり得、バクテリア細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞およびたとえば、ねずみ（ｍｕｒｉｎｅおよびラット）、シミアン（ｓｉｍｉａｎ）あるいはヒト細胞などの哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
「遺伝的に修飾された」の語は、異なる遺伝子または核酸配列を含むおよび／または発現する細胞を含み、またこれによりその細胞または子孫の遺伝子型または表現型を修飾するものを含むものである。この語には、細胞の内因性ヌクレオチドに対する、任意の追加、削除および分裂を含むものである。
【００８７】
本明細書において、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチドあるいは蛋白に翻訳される過程を含む。該ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから得られる場合には、発現には、もし適当な真核生物宿主が選択されれば、ｍＲＮＡのスプライシングが含まれる。発現に要求される制限因子には、ＲＮＡポリメラーゼ結合のプロモータ配列およびリボソーム結合の転写開始配列が含まれる。例えば、バクテリア発現ベクターには、ｌａｃプロモータおよび転写開始のためのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列および開始コドンＡＵＧが含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｊ．，Ｆｒｉｔｚ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ．Ｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。同様に真核生物発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する異種もしくは同種のプロモータ、ポリアデニル化信号、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム脱離用の停止コドンが含まれる。これらのベクターは、市販されあるいは当業界において、よく知られている方法、例えば以下に一般的に述べるベクター構成法により構成することができる。
【００８８】
遺伝子について用いられる「異なって発現した」の意味には、遺伝子あるいは該遺伝子によりコード化された蛋白生成物から転写したｍＲＮＡの異なる生成が含まれる。遺伝子の異なる発現は、正常あるいは対象発現レベルと比較して、より大なる発現あるいはより小なる発現であり得る。ある観点においては、それは対照試料の発現レベルに比べて、２．５倍、好ましくは５倍、好ましくは１０倍以上高いか、低い場合を含む。「異なって発現した」には、また、細胞または組織におけるヌクレオチド配列が、対照細胞においては発現しなかったのに発現した場合、および対照細胞においては発現したのに、発現しなかった場合が含まれる。
【００８９】
「ポリペプチド」の語は、下位単位であるアミノ酸、アミノ酸類似体およびペプチド類似体の二以上からなる化合物が含まれる。これら下位単位は、ペプチド結合により結合される。他の態様においては、下位単位は、エステル、エーテル等の他の結合により結合される。本明細書において、「アミノ酸」の語は天然および／又は非天然ないしは合成アミノ酸を包含し、グリシンおよびＤまたはＬの光学異性体の双方を含み、更にアミノ酸類似体およびペプチド類似体を含む。三以上のアミノ酸を含むペプチドは、通常オリゴペプチドと呼ばれる。三以上よりも多いアミノ酸のペプチド鎖は、ポリペプチドあるいは蛋白と称される。
【００９０】
「ハイブリッド化」は、一以上のポリヌクレオチドが反応してヌクレオチド残基の塩基間に水素結合を介して安定化された錯体を形成する反応を含む。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、あるいは任意の他の配列特定的な方法により形成される。錯体は、二重構造を形成する二本鎖、多重鎖構造を形成する三本以上の鎖、自己ハイブリッド化を起す一本の鎖あるいはこれらの任意の組合せを有することができる。ハイブリッド化は、ＰＣＲ反応の開始、リボザイムによるポリヌクレオチドの酵素開裂などのより広汎なプロセスの一過程を構成し得る。
【００９１】
ハイブリッド化反応は、異なるレベルの厳格さ（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）の条件の下で行い得る。ハイブリッド化の厳格さには、二以上の核酸分子が互いにハイブリッド化する際の困難さを含む。厳格な条件下において、６０％以上、６５％以上、７０％以上、あるいは７５％以上と同一の核酸分子はハイブリッド化状態で残るが、より低い割合の同一性の分子は、ハイブリッド状態で残存することができない。好ましい、しかし限定的でない高度に厳格なハイブリッド化条件の例においては、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で約４５℃、続いて０．２ＸのＳＳＣで一回以上洗浄し、０．１％ＳＤＳで５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、更に好ましくは６５℃となる。
【００９２】
二つの一本鎖ポリヌクレオチド間での反平行配置でハイブリッド化を行う場合には、この反応は「アニーリング」と呼ばれ、これらのポリヌクレオチドは「相補性」であると称される。二本鎖のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとは、もし第１のポリヌクレオチドの鎖の一本と第２のポリヌクレオチドとの間でハイブリッド化が起るのであれば、前者は後者に対して「相補性」あるいは「相同性」であるといわれる。「相補性」あるいは「相同性」（一のポリヌクレオチドが他に対して相補的である度合い）は、一般に受け容れられている塩基対ルールに従い、互いに水素結合される対立鎖中の塩基割合により定量できる。
【００９３】
「抗体」には、抗原上のエピトープと結合し得る免疫グロブリン分子が含まれる。本明細書において、この語は、単一クローン系および多クローン系の抗体のように完全な免疫グロブリン分子のみでなく、抗イディオタイプ抗体、変異体、断片、融合蛋白、二特異性抗体、ヒト化蛋白、ならびに要求された特異性の抗原認識部位を有する免疫グロブリン修飾物をも包含するものである。
【００９４】
本明細書において、「乾癬」は、最も普通には、銀白鱗片で覆われたふくれた炎症損傷域として現われる非伝染性の皮膚異常を含む。「乾癬」の語は、種々の症状で現われる乾癬を包含するものであり、それには、斑乾癬、膿庖性乾癬、紅皮乾癬、滴状乾癬、逆乾癬が含まれる。また乾癬性の関節炎も含まれる。
【００９５】
本明細書において、「ＴＨ１−関連状態」には、Ｔ−ヘルパー１（ＴＨ１）細胞が、初期にあるいは進行過程で役割を果していると考えられる、乾癬類似の病状を含むものである。ＴＨ１−関連状態には、リューマチ性関節炎、多発性硬化症およびクローン（Ｃｒｏｈｎ’ｓ）病が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００９６】
本明細書において、用語「乾癬組織」、「乾癬細胞」、「疾患組織」または「非疾患組織」の語は、乾癬に罹患した被検者からの組織であり、乾癬に疾患している組織自体をいう。乾癬組織の一例は、乾癬損傷域、かさぶたあるいは膿疱から採取した上皮組織等の皮膚組織である。「非乾癬組織」または「非乾癬細胞」には、乾癬に罹患していない被検者からの、あるいは乾癬に罹患している被検者ではあるが、乾癬の症状を示していない領域から採取した組織または細胞が含まれる。例えば、非乾癬組織には、罹患被検者からの、乾癬損傷（かさぶたあるいは膿疱）に影響されていない皮膚領域からの皮膚細胞が含まれ、また乾癬に罹患していない被検者からの上皮細胞が含まれる。
【００９７】
本明細書において、「標識」の語には、乾癬又はＴＨ１−関連状態に罹患している被検者、あるいは乾癬又はＴＨ１−関連状態の疾患細胞において、存在するか存在しない、あるいは量又は活性が増大または減少している、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子が含まれる。標識の量または活性の相対的変化は、乾癬又はＴＨ１−関連状態の発生または発生の危険性と関連づけられる。
【００９８】
本明細書において、「標識パネル」の語は、その量又は活性が、乾癬又はＴＨ１−関連状態の発生またはその危険性と関連付けられた標識の一群を含むものである。ある態様においては、標識パネルは、乾癬又はＴＨ１−関連状態に罹患している被検者または疾患細胞において、その量又は活性が増加または減少のいずれかを示す標識群のみを含む。他の態様においては、標識パネルは、乾癬又はＴＨ１−関連状態の発生またはその危険性と関連付けられた特定の型の組織に存在する標識群のみを含む。
【００９９】
本発明の各種の観点を、以下の項目で更に詳細に述べる。
【０１００】
Ｉ．分離された核酸分子
本発明の一観点は、それ自体が本発明の遺伝子標識（例えばｍＲＮＡ）である核酸分子、あるいは本発明のポリペプチド標識をコード化する、分離された核酸分子、またはその断片に関する。本発明の他の観点は、試料中の本発明の標識をコード化する核酸分子の同定のためのハイブリッド化プローブとしての使用に充分な分離された核酸断片、ならびに本発明の標識をコード化する核酸分子の増幅または変異用のＰＣＲプライマーとして用いる核酸断片、に関する。本明細書において、「核酸分子」の語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類似体を用いて生成したＤＮＡもしくはＲＮＡ類似体を含むことを意図している。核酸分子は、一本鎖あるいは二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１０１】
「分離された核酸分子」の語は、天然の核酸源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子を含む。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「分離された」の語は、ゲノムＤＮＡが天然に関与する染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「分離された」核酸分子は、該核酸分子がそれから得られた有機体のゲノムＤＮＡ中の天然には該核酸分子の横にある配列（すなわち該核酸の５′および３′末端に位置する配列）がないことが望ましい。例えば、各種の態様において、分離された本発明の標識核酸分子、あるいは本発明のポリペプチド標識をコード化する核酸分子は、天然には該核酸分子を得た細胞のゲノムＤＮＡ中の該核酸分子の横にあるヌクレオチド配列を、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂよりも少なく含むことができる。更に、ｃＤＮＡ分子等の分離されたＤＮＡ分子は、他の細胞物性、あるいはリコンビナント法により生成された際の培地を実質的に含まない、また化学的に合成された際の化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないものとすることができる。
【０１０２】
本発明の核酸分子、例えば表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子のヌクレオチド配列を有する核酸分子、あるいはその部分は、標準的分子生物学の技法および本発明で与える配列情報を用いて、分離することができる。表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子の一の核酸配列の全部又は一部をハイブリッド化プローブとして用いて、本発明の標識遺伝子または本発明のポリペプチド標識をコード化する核酸分子を、標準のハイブリッド化およびクローニング技法により、分離することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，ｊ．，Ｆｒｉｔｚ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ．Ｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９参照）。
【０１０３】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいは代りにゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、また、標準的ＰＣＲ増幅技法による適当なオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、分離することができる。かくして増幅された核酸は適当なベクターにクローニングされ、ＤＮＡ配列解析により特性付けられる。更に、標識ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチド、あるいは本発明の標識をコード化するヌクレオチド配列を、例えば自動化したＤＮＡシンセサイザーを用いて、標準的合成技法により調製することができる。
【０１０４】
別の好ましい態様によれば、本発明の分離した核酸分子は、本発明の標識のヌクレオチド配列（例えば、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子の組）あるいはこれらヌクレオチド配列の一部、の補体である核酸分子を有する。そのようなヌクレオチド配列の補体である核酸分子は、該ヌクレオチド配列にハイブリッド化して安定な二重体を形成する程度に、該ヌクレオチド配列に対して充分に相補的である。
【０１０５】
本発明の核酸分子は、更に、本発明の標識核酸の核酸配列の一部のみ、あるいは本発明の標識ポリペプチドをコード化する遺伝子、例えばプローブまたはプライマーとして用いられる断片、であり得る。該プローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドからなる。該オリゴヌクレオチドは典型的には、厳格な条件の下に、本発明の標識核酸または本発明の標識ポリペプチドの連続するヌクレオチド単位の、少なくとも約７ないし１５、好ましくは約２０ないし２５、更に好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、４００あるいはそれ以上に、ハイブリッド化するヌクレオチド配列の領域を有する。
【０１０６】
標識遺伝子あるいは本発明の標識ポリペプチドをコード化する核酸のヌクレオチド配列に基づくプローブは、本発明の標識遺伝子および／または標識ポリペプチドに対応する転写体または遺伝子配列の検出に用いられる。好ましい態様においては、該プローブは、それに付着したラベル基を有するものであり、該ラベル基は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素あるいは酵素補因子であり得る。該プローブは、本発明の標識ポリペプチドを誤発現（例えば過発現または不足発現）する、あるいは本発明の標識遺伝子のより多くのあるいはより少なる複製物を有する、細胞または組織を同定するための診断テキストキットの一部として用いることができる。例えば、被検者からの細胞試料中の標識ポリペプチド・コード化核酸のレベルを決定し、標識ポリペプチドをコード化する遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量を決定し、あるいは本発明の標識遺伝子の変異または削除の存在を評価することができる。
【０１０７】
本発明には、更に、遺伝子コードの縮重により表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子の核酸配列とは異なり、従って、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子によりコード化されるのと同じ蛋白をコード化する核酸分子が含まれる。
【０１０８】
表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子のヌクレオチド配列に加えて、当業者には、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子によりコード化される蛋白のアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列の多形が、母集団（例えばヒト母集団）に存在することが理解できよう。そのような表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子の遺伝子多形は、対立遺伝子の自然変異により母集団中の個体に存在する。対立遺伝子は、ある遺伝子座に交互に起る遺伝子群の一である。更に、ＲＮＡ発現レベルに影響するＤＮＡ多形は、該遺伝子の（例えば調節また分壊への影響による）全体発現レベルにも影響し得る。「対立遺伝子変異」の語には、与えられた座に起るヌクレオチド配列、あるいは該ヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチドが含まれる。本明細書において、「遺伝子」および「組替え型遺伝子」の語は、本発明の標識ポリペプチドをコード化する開いた読み枠を含む核酸分子を意味する。
【０１０９】
本発明の標識遺伝子の自然対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子あるいは本発明の標識蛋白をコード化する遺伝子は、それらの、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子との相同性に基づいて、本明細書に開示されるｃＤＮＡあるいはその一部を、厳格なハイブリッド化条件の下での標準的なハイブリッド化技法におけるハイブリッド化プローブとして用いることにより、分離される。本発明の標識遺伝子の自然対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、本発明の標識遺伝子または本発明の標識蛋白をコード化する遺伝子と同じ染色体または座にマッピングすることにより分離することができる。
【０１１０】
他の態様においては、本発明の分離された核酸分子は、少なくとも１５，２０，２５，３０，５０，１００，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００，８５０，９００，９５０，１０００，１１００，１２００，１３００，１４００，１５００，１６００，１７００，１８００，１９００，２０００あるいはそれ以上のヌクレオチドを含む長さを有し、本発明の標識遺伝子、または標識蛋白をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列に、厳格な条件の下にハイブリッド化する。本明細書において、「厳格な条件の下にハイブリッド化する」とは、典型的には、少なくとも６０％が相同体であるヌクレオチド配列が互いにハイブリッド形成して残るようなハイブリッド化および洗浄の条件を記載することを意図している。好ましくは、約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、更に好ましくは約８５％以上あるいは約９０％以上が相同体である配列が互いにハイブリッド形成して残る条件である。このような厳格な条件は、当業者に既知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  社発行（１９８６）、６．３．１−６．３．６に見出される。厳格なハイブリッド化条件の好ましい、但し非限定的な例としては：６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）約４５℃、引き続いて、０．２Ｘ  ＳＳＣで１回以上洗浄、０．１％ＳＤＳ  ５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、更に好ましくは６５℃、が挙げられる。好ましくは、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子の一の配列に厳格な条件の下にハイブリッド化する本発明の分離核酸分子は、天然に産する核酸分子である。本明細書において、「天然に産する」核酸分子には、自然界に産する（例えば天然蛋白をコード化する）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡないしＤＮＡ分子が含まれる。
【０１１１】
母集団に存在する本発明の標識遺伝子および標識蛋白配列をコード化する遺伝子の天然に産する遺伝子対変異体に加えて、当業者は、本発明の標識遺伝子または標識蛋白をコード化するヌクレオチド配列に変異による変化が導入され、これら蛋白の機能活性を変化させることなくアミノ酸配列の変化をもたらし得ること、を理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基へのアミノ酸置換をもたらす、ヌクレオチド置換が可能である。「非必須」アミノ酸残基は、生物活性を変化させることなく野生型配列の蛋白から変化させ得る残基であり、これに対し「必須」アミノ酸残基は、生物活性上要求される。例えば、ある遺伝子の対立遺伝子変異体又は相同体中で（例えば異なる種からの遺伝子の相同体中で）保存されるアミノ酸残基は、特に変化に不適合であることが予見される。
【０１１２】
従つて、本発明の別の観点は、本発明の標識蛋白をコード化する核酸分子のうち活性に必須でないアミノ酸残基に変化を含むものに関する。それら蛋白は、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子でコード化される標識蛋白とはアミノ酸配列で異なるが、依然として、生物活性を維持するものである。ある態様においては、該蛋白は、本発明の標識蛋白と、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％あるいはそれ以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１１３】
本発明の標識蛋白と相同性の蛋白をコード化する核酸分子の分離物は、該標識蛋白をコード化する遺伝子のヌクレオチド配列に、コード化した蛋白に一以上のアミノ酸の置換、加入あるいは削除を行うように一以上のヌクレオチドの置換、加入あるいは削除を行うことにより創出することができる。
【０１１４】
標準的な技法、例えば局所指向変異誘発およびＰＣＲ−媒介変異誘発等、により、本発明の遺伝子（例えば表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子）に変異を導入することができる。好ましくは保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換を、予見される非必須アミノ酸残基の一以上について行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を該アミノ酸と類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換する操作である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基群は、当業界において規定されている。これらのアミノ酸群には、塩基側鎖を有するもの（例：リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸側鎖を有するもの（例：アスパルテン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するもの（例：グリシン、アスパラギニン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するもの（例：アラニン、ヴァリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分極側鎖を有するもの（例：スレオニン、ヴァリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するもの（例：チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。代りに、本発明の遺伝子のコード化配列の全てまたは一部にランダムに変異を導入することができる。例えば、飽和変異誘発であり、生成する変異体は、生物活性について選別をかけられ、活性を維持する変異体を同定することができる。変異誘発に引き続いて、コード化蛋白は組換え的に発現され、その活性が決定される。
【０１１５】
本発明の別の観点は、本発明の標識遺伝子および標識蛋白をコード化する遺伝子とは逆型（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）である分離された核酸分子に関する。「逆型」の核酸は、蛋白をコード化するある型の核酸に対して相補的、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対し相補的あるいはｍＲＮＡ配列に対し相補的、であるヌクレオチド配列を有する。従って、逆型の核酸は、ある型の核酸に水素結合できる。逆型の核酸は、本発明の遺伝子（例えば、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子）の全コード鎖に対し、またはその一部に対し相補的であり得る。一態様において、逆型の核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対し逆型である。「コード領域」の語には、アミノ酸に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域が含まれる。他の態様においては、逆型核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対し逆型である。「非コード領域」には、アミノ酸に翻訳されないコード領域の横に存在する５′および３′配列（すなわち、５′および３′−非翻訳領域とも呼ばれる）が含まれる。
【０１１６】
本発明の逆型核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対法則により設計することができる。該逆型核酸は、本発明の遺伝子に対応するｍＲＮＡの全コード領域に対し相補性であり得るが、より好ましくは、コードまたは非コード領域の一部のみに対して逆型のオリゴヌクレオチドである。逆型オリゴヌクレオチドは、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０のヌクレオチドを含む長さであり得る。本発明の逆型核酸は、当業界に既知の化学合成および酵素配位反応により形成することができる。例えば逆型核酸（例えば逆型オリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増すため、または逆型と常型の二つの核酸間に形成される二重体の物理的安定性を増すために種々修飾されたヌクレオチド（例えばチオリン酸誘導体およびアクリジン−置換ヌクレオチド）を使用することができる。逆型核酸を生成するために用いられる修飾ヌクレオチドには例えば以下のものが含まれる：５−フロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリヂン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルウェオシン、５′−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（Ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）Ｗ、および２，６−ジアミノプリン。代りに、該逆型核酸は、逆型配位で核酸をサブクローニングして形成した発現ベクターを用いて生物学的に製造することもできる（すなわち、挿入した核酸から転写されたＲＮＡは、目的核酸とは逆型配位となる。これについては次の項で更に述べる）。
【０１１７】
本発明の逆型核酸分子は、典型的には被検者に投与されるか、あるいはその場で生成されて、本発明の標識蛋白をコード化する細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッド化または結合させて、転写および／または翻訳の抑制により、該蛋白の発現を抑制する。ハイブリッド化は、慣用のヌクレオチドの相補性により、安定な二重体を形成するか、あるいはＤＮＡ二重体に結合する逆型核酸分子の場合には、該二重らせんの主要な溝における特定相互反応により達成される。本発明の逆型核酸の投与経路の例としては、組織部位（例えば、皮膚）への直接注入が含まれる。代りに、逆型核酸分子を選択された目標細胞に修飾し、次いで系統的に投与される。例えば、系統的投与のためには、逆型分子を、例えば該逆型核酸分子を細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドあるいは抗体へと修飾して、選択された細胞表面の受容体又は抗原に特定的に結合させる。逆型核酸分子は、本明細書で記載するベクターを用いて、細胞に到達させることもできる。逆型分子の充分な細胞内濃度を達成するために、該逆型核酸分子を強力なｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモータの制御下においたベクターを構成することが好ましい。
【０１１８】
また別の態様によれば、本発明の逆型核酸分子は、α−アノマー型の核酸分子である。α−アノマー型核酸分子は、相補ＲＮＡと特定の二重鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のβ単位とは異なり、鎖が互いに平行に伸びている（Ｇａｕｌｔｉｅｒほか（１９８７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）、該逆型核酸分子は、また２′−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅほか（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅほか（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）であり得る。
【０１１９】
また別の態様によれば、本発明の逆型核酸はリボザイムである。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡ分子であり、それらが相補領域を有するｍＲＮＡ等の一本鎖核酸を開裂することができる。すなわち、リボザイム（例えばハマーヘッド・リボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ  およびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１））を用いて、本発明の遺伝子（例えば、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子））のｍＲＮＡ転写体を触媒的に開裂して、該ｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる。標識蛋白をコード化する核酸に特異性を有するリボザイムを、本明細書で開示する本発明の遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、設計することができる。例えば、その活性サイトのヌクレオチド配列が、標識蛋白をコード化するｍＲＮＡ中の開裂されるべきヌクレオチド配列と相補性であるテトラハイメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を、構成することができる。例えばＣｅｃｈほか米国特許第４９８７０７１号およびＣｅｃｈほか米国特許第５１１６７４号各明細書参照。代わりに、本発明の遺伝子から転写したｍＲＮＡをＲＮＡ供給源の集合体から特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに用いることもできる。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８参照。
【０１２０】
代りに、本発明の遺伝子（例えば、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子）の発現を、これら遺伝子の調節領域に対して相補性であるヌクレオチド配列（例えばプロモータおよび／または補強剤）をターゲティングして、目標細胞における遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成することにより、抑制することができる。一般的には、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ほか（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）：８０７−１５参照。
【０１２１】
また別の態様においては、本発明の核酸分子をその塩基部分、糖部分あるいはリン酸骨格部分において修飾することにより、該分子の例えば安定性、ハイブリッド化能および溶解度を改善することができる。例えば、核酸分子のリン酸デオキシリボース骨格を修飾してペプチド核酸を生成することができる（例えば、Ｈｙｒｕｐ  Ｂほか（１９９６）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３）。本明細書において、「ペプチド核酸」あるいは「ＰＮＡ」の語は、核酸擬似体（ｍｉｍｉｃｓ）、例えばリン酸デオキシリボース骨格が擬似ペプチド（ｐｓｅｕｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）骨格により置きかえられ、４つの核塩基のみが保持されているＤＮＡ擬似体、を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対して特異的なハイブリッド化を許容することが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、例えばＨｙｒｕｐ  Ｂほか（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−０’  ＫｅｅｆｅほかＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．９３：１４７０−６７５に記載されるように、標準的な固体ペプチド合成技法を用いて行うことができる。
【０１２２】
ＰＮＡは治療および診断に応用される。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘発しあるいは複製を抑制することにより、遺伝子発現の配列特異性モジュレーションに対し、逆型のあるいは抗原剤として使用することができる。本発明の核酸分子（例えば表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子）のＰＮＡは遺伝子における単一塩基対変異の解析（例えばＰＮＡ−指向性ＰＣＲクランピング法）に；また他の酵素と組合せて人工制限酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ（１９９６）上記）として、あるいはＤＮＡ配列決定あるいはハイブリッド化のプローブまたはプライマー（Ｈｙｒｕｐ  Ｂほか（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−０’  Ｋｅｅｆｅ，上記）として用いられる。
【０１２３】
他の態様においては、ＰＮＡは（例えばその安定性および細胞取込みを強化するために）、親油基あるいは他の補助基を付加して、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成して、あるいはリポソーム他の業界で既知の薬剤送達手段を使用することにより、修飾することができる。例えば、本発明の核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成して、ＰＮＡとＤＮＡの有利な特性を組み合せることができる。該キメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えばＲＮＡｓｅ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）を許容して、ＤＮＡ部と相互作用させ、他方ＰＮＡ部は高い結合親和性と特異性を与える。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基の重なり、核塩基間の結合の間および方位等により選択した適当なリンカーにより結合される（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ（１９９６）上記）およびＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ほか（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載の方法により、行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的ホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上に形成でき、修飾ヌクレオシド類似体、例えば５′−（４−メトキシトリチル）アミノ−５′−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトがＰＮＡとＤＮＡの５′末端との間に用いられる（Ｍａｇ．Ｍ．ほか（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次いでＰＮＡモノマーを、逐次結合させて、５′−ＰＮＡセグメントと３′−ＤＮＡセグメントのキメラ分子を製造する（Ｆｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．ほか（１９９６）上記）。代りに、５′−ＤＮＡセグメントと３′−ＰＮＡセグメントによりキメラ分子を合成することもできる（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｈ．ほか（１９７５）Ｂｉｏｏｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
【０１２４】
他の態様においては、オリゴヌクレオチドに、ペプチド基（例えば生体内で宿主細胞受容体に向わせるために）、あるいは細胞膜を横切る移動性を与えるための薬剤（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０）、更には血液−脳間バリアー（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０３１４）、等の他の付加基を含ませることもできる。更にオリゴヌクレオチドを、ハイブリッド化をきっかけとする開裂剤（例えばＫｒｏｌほか（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６）あるいは層間挿入剤（例えばＺｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．５：５３９−５４９）により修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドを他の分子（例えばペプチド、ハイブリッド化をきっかけとする架橋剤、輸送剤、またはハイブリッド化をきっかけとする開裂剤）と共役させることもできる。更には、オリゴヌクレオチドに検出のためラベルを付すことができる：ラベルは他の試剤（例えば、酵素ラベルの基剤）により、あるいはハイブリッド化により直ちに検出可能な態様とする（例えば放射性ラベル、蛍光ラベルあるいは米国特許第５８７６９３０号明細書に記載されるような分子標識を使用）。
【０１２５】
ＩＩ．分離された蛋白および抗体
本発明の一つの観点は、分離された標識蛋白および生物学的に活性なその部分、ならびに抗標識蛋白抗体特性を向上する免疫抗原として使用されるポリペプチド断片に関する。一態様によれば、本来の標識蛋白が、標準的蛋白精製技術により細胞あるいは組織源から分離される。他の態様によれば、組換え型ＤＮＡ技法により標識蛋白を製造する。組換え技術の代りに、標識蛋白あるいはポリペプチドを標準的ペプチド合成技法により化学的に製造することができる。
【０１２６】
「分離された」または「精製された」蛋白または生物学的に活性なその部分は、それから標識蛋白を得たところの細胞または組織源からの細胞物質または他の汚染性蛋白を実質的に含まない、あるいは化学的に合成されたときには、化学的前駆体あるいは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」の表現は、それから標識蛋白が分離されあるいは組換え的に製造された細胞の細胞成分から該蛋白が分離されて得られた標識蛋白の調製物を含むものである。一態様においては、「細胞物質を実質的に含まない」の表現は、非標識蛋白（本明細書で「汚染蛋白」とも呼ぶ）を約３０％未満（乾燥重量として）、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満の割合で含む標識蛋白調製物を含むものである。標識蛋白あるいはその生物学的に活性な部分が組換え法により製造されるときには、培地を実質的に含まないことが好ましい、すなわち、培地が約２０％未満であることが好ましく、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満（蛋白調製物の容積基準）である。
【０１２７】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」の表現は、標識蛋白の合成に関与した化学的前駆体あるいは他の化学物質を分離した該標識蛋白の調製物を含むものである。ある態様においては、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」の表現は、化学的前駆体または他の化学物質を約３０％未満（乾燥重量基準）、より好ましくは約２０％未満、更に好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満含む蛋白調製物を含むものである。
【０１２８】
本明細書において、標識蛋白の「生物学的に活性な部分」の語は、該標識蛋白のアミノ酸配列と充分に相同性のある、あるいは該アミノ酸配列から誘導されたアミノ酸配列を有する標識蛋白の断片であり、該標識蛋白の全長よりは少ないアミノ酸を含むが、標識蛋白の少なくとも一つの活性を示すもの、を含む。典型的には、生物学的に活性な部分は、該標識蛋白の少なくとも一つの活性を有する領域ないし特色を有する。標識蛋白の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸を含むポリペプチドであり得る。標識蛋白の生物学的に活性な部分は、標識蛋白−媒介活性を修飾する発達因子の目標部として使用される。
【０１２９】
好ましい態様においては、標識蛋白は、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子によりコード化される。他の態様においては、標識、蛋白は表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子によりコード化される標識蛋白と相同性であり、標識蛋白の機能活性を保持するが、上記項目Ｉ．で詳述したような自然対立遺伝子変化あるいは変異誘発によりアミノ酸配列が異なるものである。従って、他の態様においては、標識蛋白は、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子でコード化されるアミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％あるいはそれ以上と相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１３０】
二つのアミノ酸配列あるいは二つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を最適な対比のために整列させる（例えば、第１および第２のアミノ酸もしくは核酸配列の一方または双方に間隔を導入することができ、非相同配列は比較のためには無視することができる）。好ましい態様においては、比較のために整列させる参照配列の長さは、該参照配列の長さの３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％、８０％、９０％以上とされる。そして、アミノ残基あるいはヌクレオチドは、対応するアミノ酸位置あるいはヌクレオチド位置で比較される。第１の配列のある位置が第２の配列の対応位置と同じアミノ酸残基あるいはヌクレオチドで占められているときは、その位置で同一とされる（本明細書において、アミノ酸または核酸が同一であるとは、アミノ酸または核酸が相同性であることと等価である）。二つの配列間のパーセント同一性は、これら配列で共有される同一位置の数の関数であり、この際、該二つの配列の最適な整列のために導入される間隔の数と各間隔の長さを考慮に入れる。
【０１３１】
二つの配列間での、配列の比較と、パーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成される。好ましい態様においては、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに導入されたＮｅｅｄｌｅｍおよびＷｕｎｓｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムと、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクス；間隔の重み：１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さの重み：１、２、３、４、５または６とを用いて決定される。もう一つの好ましい態様によれば、二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェア・パッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムと、ＮＷＳｇａｐｄｎａ−ＣＭＰマトリクス、間隔の重み：４０、５０、６０、７０または８０；および長さの重み：１、２、３、４、５または６とを用いて決定される。他の好ましい態様においては、二つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、４：１１−１７（１９８９））アルゴリズムと、ＰＡＮ１２０重み残基表、間隔長さペナルティ：１２および間隔ペナルティ：４とを用いて決定される。
【０１３２】
本発明の核酸および蛋白配列は、更に、例えば他の群の構成員あるいは関連配列を同定するために、公共のデータベースで検索を行うための「質問配列」として用いることもできる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌほか（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア１００、ワード長＝１２を用いて行われ、本発明の核酸分子と相同性のヌクレオチド配列が得られる。ＢＬＡＳＴ蛋白検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３を用いて行われ、本発明の標識蛋白分子と相同性のアミノ酸配列が得られる。比較のための間隔付きの配列を得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌほか（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるようにＧｏｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する際には、各プログラム（たとえば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の基準設定値（デフォルト、パラメータ）を用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照。
【０１３３】
本発明は、更にキメラあるいは融合標識蛋白を与える。本明細書において、標識「キメラ蛋白」または「融合蛋白」は、非標識ポリペプチドと機能的に結合した標識ポリペプチドからなる。「標識ポリペプチド」には、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子でコード化されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、これに対し、「非標識ポリペプチド」は、該標識蛋白とは実質的に相同性のない蛋白（例えば同一または異なる有機体から得られた標識蛋白とは異なる蛋白）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。標識融合蛋白内で、ポリペプチドは、標識蛋白の全部または一部に対応し得る。好ましい態様においては、標識融合蛋白は、標識蛋白の少なくとも一つの生物学的活性部分を有する。該融合蛋白において、「機能的に結合した」の意味は、該標識ポリペプチドと非標識ポリペプチドが、互いに枠にはまって（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）融合していることを意図する。該非標識ポリペプチドは、該標識ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に融合される。
【０１３４】
例えば、一態様において、融合蛋白は、標識配列がＧＳＴ配列のＣ−末端に融合しているＧＳＴ−標識融合蛋白である。このような融合蛋白は、組換え型標識蛋白の精製を容易にする。
【０１３５】
他の態様においては、融合蛋白は、Ｎ末端に異種信号配列を含む標識蛋白である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）においては、異種信号配列を用いることにより、標識蛋白の発現および分泌が増加される。そのような信号配列は、当業界においてよく知られている。
【０１３６】
本発明の標識融合蛋白は、薬剤組成物に導入され、本明細書に示すように被検者の生体内に投与される。標識融合蛋白は、標識蛋白基質に影響する。標識融合蛋白の使用は、例えば（ｉ）標識蛋白をコード化する遺伝子の異常修飾ないし変異、（ｉｉ）標識蛋白−コード化遺伝子の誤調節；および（ｉｉｉ）標識蛋白の異常後翻訳修飾、等により起される異常（例えば乾癬又はＴＨｌ−関連状態）の治療に有用である。
【０１３７】
更に、本発明の標識融合蛋白は、免疫物質としても用いられ、被検者における抗標識蛋白抗体を生成するため、標識蛋白配位子を精製するため、ならびに選別検定において、標識蛋白の標識蛋白基質との相互作用を抑止する分子を同定するために用いられる。
【０１３８】
好ましくは、本発明の標識キメラあるいは融合蛋白は、標準的組換ＤＮＡ技法により製造される。例えば、異なるポリペプチド配列のためのＤＮＡ断片コードは、慣用的技法、例えば平滑末端あるいは千鳥末端連結端、制限酵素消化による適当な端末形成、望ましくない結合を避けるための適当なアルカリホスホターゼ処理としての凝集端の充填および酵素連結などにより、きっちり互いに連結される。他の態様においては、自動化ＤＮＡ合成器を含む慣用法により、融合遺伝子が合成される。代りに、アンカー・プライマーを用いて、遺伝子断片のＰＣＲ増幅を用いて、連続する二つの遺伝子断片の間に相補的な懸垂体を形成し、これらを引き続いてアニーニングおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる。（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，編集者；Ａｕｓｕｂｅｌほか、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ：１９９２）。更に、融合成分（例えばＧＳＴポリペプチド）を既にコード化する多くの発現ベクターが市販されている。標識蛋白コード化核酸は、発現ベクターにクローニングされ、融合成分が標識蛋白ときっちり（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）連結される。
【０１３９】
信号配列は、分泌蛋白あるいは他の興味ある蛋白の分泌および分離を容易化するために用いられる。信号配列は、典型的には、疎水性アミノ酸の核によって特徴付けられるものであり、該アミノ酸は、一般に分泌の際に一以上の分裂事象により成熟蛋白から分割される。これら信号ペプチドはプロセシング部位を有し、これにより成熟蛋白が、分泌経路を通過するにつれて成熟蛋白からの信号配列の分割が可能になる。すなわち、本発明は、ある信号配列を有する記載したポリペプチド、ならびにそれから信号配列が蛋白分解により分裂したポリペプチド（すなわち分裂生成物）に関する。一態様においては、信号配列をコード化する核酸配列は、発現ベクターにより、興味のある蛋白、例えば通常は分泌されないあるいは分離の困難な蛋白、に機能的に結合される。該信号配列は、例えば発現ベクターが変換された有核細胞宿主からの該蛋白の分泌を促し、そして該信号配列は次いであるいは同時に分裂される。該蛋白は、次いで当業界に知られた方法により、細胞外媒体より精製される。代りに、信号配列は、精製を容易にする配列を用い、例えば、ＧＳＴ領域により、目的蛋白に結合される。
【０１４０】
本発明は、標識蛋白に対するアゴニスト（擬症剤）あるいは拮抗剤として作用する本発明の標識蛋白の変態物に関する。標識蛋白の変態物は、たとえば標識蛋白の離散点変異あるいは切断等の変異誘発により生成される。標識蛋白のアゴニストは、標識蛋白の天然の形態の生物学的活性と同じ、あるいはその一部（ｓｕｂ−ｓｅｔ）を有する。標識蛋白の拮抗剤は、例えば標識蛋白の活性を競合的に修飾することにより、天然形の標識蛋白の活性の一以上を抑止する。かくして、限定的な機能の変態物により処理することにより、特定の生物学的活性を引き出すことができる。ある態様においては、天然形の蛋白の生物学的活性の一部を有する変態物による被検者の治療は、天然形の標識蛋白自体による治療に比べて被検者における副作用が少ない。
【０１４１】
標識蛋白のアゴニスト（擬症剤）または標識蛋白拮抗剤として作用する標識蛋白変態物は、標識蛋白アゴニストまたは拮抗剤（アンタゴニスト）活性に対する標識蛋白の変異体（例えば切断変異体）の無作為配列集合体（ライブラリ）を選別することにより同定できる。ある態様においては、標識蛋白変態物の多様な集合体が核酸レベルでの無作為配列的変異誘発により生成され、多様な遺伝子集合体（ライブラリ）によりコード化される。標識蛋白変態物の多様な集合体は、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することにより製造され、これにより潜在的標識蛋白配列の変質物の組を個別のポリペプチドとして、あるいは代りに該標識蛋白配列を含む（例えばファージ・ディスプレイのための）より大なる融合蛋白の組として、発現させることができる。変質オリゴヌクレオチド配列から潜在的標識蛋白変態物を製造するために用いられる方法には各種のもいることにより、一混合物中に、所望の潜在的標識蛋白配列の組をコード化する全ての配列を与えることができる。変質オリゴヌクレオチドの合成法は当業界に知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａ  ｋｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａほか（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａほか（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅほか（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７）。
【０１４２】
更に、本発明の標識蛋白に対応する蛋白コード配列の断片の集合体を用いて、標識蛋白変態物の選別（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）および引き続く選択のための標識蛋白断片の多様な母集団を生成することができる。一態様においては、コード配列断片の集合体を、標識蛋白コード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を一分子当り約一のニッキング（一本鎖におけるホスホジエステル結合の加水分解的切断）が起る条件下でのヌクレアーゼにより処理し、二本鎖ＤＮＡを変質させ、該ＤＮＡを復元して異なるニッキング生成物からのセンス／アンチセンスの組を含む二本鎖ＤＮＡを形成し、改質した二重体からＳ１ヌクレアーゼで処理して一本鎖部分を除き、生成した断片集合体を連結して発現ベクターを形成する。この方法により、該標識蛋白の種々の大きさのＮ−末端、Ｃ−末端および中間断片をコード化する発現集合体（ライブラリ）を得ることができる。
【０１４３】
点変異あるいは切断により形成された遺伝子生成物の無作為配列集合体の選別のため、ならびに選択した特性を有する遺伝子生成物のためのｃＤＮＡ集合体の選別のため、いくつかの技法が当業界に知られている。高出力解析に適合した大きな遺伝子ライブラリの最も広く使用される技法によれば、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターへとクローニングし、生成したベクターのライブラリを用いて適当な細胞を変形し、且つ所望の活性の検出により生成物を検出した遺伝子をコード化するベクターの分離を容易になる条件下で無作為配列の遺伝子を発現させる。ライブラリ中の機能的変異体の頻度を強化するための新しい変異誘発技法であるＲＥＮ（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎ  ｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を選別診断と組合わせて標識変態物を同定することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８；Ｄｅｌｇｒａｖｅほか（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１４４】
分離された標識蛋白またはその一部もしくは断片は、抗体を生成する免疫原として用いられ、該免疫原は標準的な技法により標識蛋白と結合されて多クローンあるいは単一クローン性の抗体調製に用いられる。全長標識蛋白が用いられるが、本発明はまた、免疫原として用いられるこれら蛋白の抗原ペプチド断片をも与えるものである。ある標識蛋白の抗原ペプチドは、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示される遺伝子によりコード化されるアミノ酸配列の少なくとも８のアミノ酸残基を有し、更に標識蛋白のエピトープを包含し、該ペプチドに対して与えられた抗体は、該標識蛋白と特定の免疫錯体を形成する。好ましくは、抗原ペプチドは、１０以上のアミノ酸残基、更に好ましくは１５以上のアミノ酸残基、より好ましくは２０以上のアミノ酸残基、最も好ましくは３０以上のアミノ酸残基を有する。
【０１４５】
該抗原ペプチドに包含される好ましいエピトープは、標識蛋白の表面に存在する標識蛋白の領域であり、例えば親水性領域ならびに高い抗原性領域である。
【０１４６】
標識蛋白免疫原は、適当な被検者（例えば、うさぎ、やぎ、マウスまたは他の哺乳動物）を該免疫原で免疫化して抗体を調製するために用いられる。適当な免疫原調製物には、例えば、組換え発現された標識蛋白あるいは化学的に合成された標識ポリペプチドが含まれる。調製物には、更に、Ｆｒｅｕｎｄの完全もしくは非完全補助薬または同様な免疫刺激剤を含めることができる。免疫原標識蛋白調製物による適当な被検者は、多クローン性抗標識蛋白抗体応答を引き起こす。
【０１４７】
従って、本発明の他の態様は、抗標識蛋白抗体に関する。本明細書において、「抗体」の語には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち標識蛋白の如き、抗原と特定的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を有する分子、が含まれる。
【０１４８】
免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分には、抗体をペプシンのような酵素で処理して生成されるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ′）２断片が含まれる。本発明は、標識蛋白と結合する多クローン性および単一クローン性抗体を与える。本明細書において、「単一クローン性抗体」または「単一クローン性抗体組成物」の語は、特定のエピトープと免疫反応可能な抗原結合部位を一種のみ含む抗体分子の母集団を包含する。従って、単一クローン性抗体は、典型的には、それが免疫反応する特定の標識蛋白に対して、単一の結合親和性を示す。
【０１４９】
多クローン性抗標識蛋白抗体は、上述するように、本発明の標識で適当な被検者を免疫処理することにより調製される。免疫被検者における抗標識蛋白抗体価は、固定された標識蛋白を用いる酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）等の、標準的技法により、ある時間にわたってモニターされる。所望ならば、標識蛋白に向けられた抗体分子を哺乳動物（の例えば血液）から分離して、例えば蛋白Ａクロマトグラフィー等の既知の方法により、更に精製して、ＩｇＧ画分を取得することができる。免疫処理後の任意の時点、例えば抗標識蛋白抗体価が最高の時点において、被検者から抗体生成細胞を得て、標準的な技法により単一クローン性抗体を調製することができる。例えば当初ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｒ．ｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７により記載されたハイブリドーマ法（更に、Ｂｒｏｗｎほか（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎほか（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４８９０−８３；Ｙｅｈほか（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈほか（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２９：２６９−７５）より最近のヒト細胞法（Ｋｏｚｂｏｒほか（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ４：７２），ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅほか（１９８５），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，第７７−９６頁）またはトリオーマ法。単一クローン性抗体ハイブリドーマの製造法は良く知られている（一般的に、Ｒ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒほか（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６）。簡単に云えば、不朽化した細胞株（典型的には骨髄腫）を、上記のように標識蛋白抗原により免疫処理された哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾臓球）と融合させ、生成したハイブリドーマ細胞を選別して、本発明の標識蛋白と結合する単一クローン性抗体を製造するハイブリドーマを同定する。
【０１５０】
融合リンパ球および不朽化細胞株のための多くのよく知られたプロトコルのいずれも、抗標識蛋白単一クローン性抗体の生成のために用いられる（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆａｒｅほか（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；ＧｅｆｔｅｒほかＳｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，上記；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｙａｌｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．上記；Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，上記）。更に当業者は、それら方法の多くの変型もまた有用であることを理解できよう。典型的には、不朽化細胞株（例えば骨髄腫細胞株）を、リンパ球と同一の哺乳動物種から得る。例えば、本発明の抗原調製物で免疫処理したマウスのリンパ球を不朽化したマウスの細胞株と融合させることにより、ねずみ（ｍｕｒｉｎｅ）のハイブリドーマを製造できる。好ましい不朽化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に敏感なマウスの骨髄腫細胞株である。いくつかの骨髄腫細胞株を、標準的技法の融合相手として用いることができる。例えばＰ３−ＮＳ１／−Ａｇ４−１，Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株。これら骨髄腫株はＡＴＣＣから利用可能である。典型的にはＨＡＴ−感受性のマウス骨髄腫細胞をポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウスの脾臓球と融合させる。融合により生成したハイブリドーマ細胞は、非融合および非生成的に融合した骨髄腫細胞を殺すＨＡＴ培地（非融合脾臓球は転形されていないので数日後に死ぬ）を用いて選択される。本発明の単一クローン性抗体を生成するハイブリドーマは、ハイブリドーマ培地の上澄液を、例えば標準ＥＬＩＳＡ検定により標識蛋白と結合する抗体を求めて選別することにより検出することができる。
【０１５１】
単一クローン性抗体選別ハイブリドーマを調製する代りに、組換え型無作為配列免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリ）を、標識蛋白を用い、標識蛋白と結合する免疫グロブリンライブラリーの構成員を分離して選別することにより、単一クローン性標識蛋白抗体を同定し、分離することができる。ファージ・ディスプレイ・ライブラリを生成し選別するキットは市販されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号：２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｓｕｒｆ  ＺＡＰＴＭ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，カタログ番号：２４０６１２）。更に、抗体ディスプレイ・ライブラリの生成および選別に特に適合した方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒほか米国特許第５２２３４０９号明細書；ＫａｒｙほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９；ＤｏｗｅｒほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９１／１７２７１；ＷｉｎｔｅｒほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／２０７９１；ＭａｒｋｌａｎｄほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１５６７９；ＢｒｅｉｔｌｉｎｇほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＨｃＣａｆｆｅｒｔｙほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７；ＧａｒｒａｄほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０；ＬａｄｎｅｒほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙほか（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅほか（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓほか（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓほか（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎほか（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍほか（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄほか（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎ．ｂｏｏｍほか（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓほか（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほかＮａｔｒｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４，に記載されている。
【０１５２】
更に、標準的組換え型ＤＮＡ法により製造される、ヒトおよび非ヒト部分を有する、キメラおよびヒト化単クローン抗体などの、組換え型抗標識蛋白抗体は、本発明の範囲内である。そのような、キメラおよびヒト化単クローン性抗体は、当業界に知られる組換え型ＤＮＡ法により製造される。例えばＲｏｂｉｎｓｏｎほか国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；ＡｋｉｒａほかＥＰ出願１８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．ＥＰ出願１７１，４９６；ＭｏｒｒｉｓｏｎほかＥＰ出願１７３，４９４；ＮｅｕｂｅｒｇｅｒほかＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３；ＣａｂｉｌｌｙほかＵＳ特許番号４，８１６，５６７；ＣａｂｉｌｌｙほかＥＰ出願１２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒほか（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕほか（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−９４４３；Ｌｉｕほか（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎほか（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａほか（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄほか（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗほか（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉほか（１９８６）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  Ｕ．Ｓ．特許５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓほか（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎほか（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒほか（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０。
【０１５３】
完全なヒト抗体が、ヒト被検者の治療のためには特に望ましい。これら抗体は、内因性の免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子を発現できる遺伝子導入マウスを用いることにより製造できる遺伝子導入マウスは、選択された抗原、例えば本発明の標識に対応するポリペプチドの全部又は一部、を用いて常法により免疫処理される。該抗原に対して向けられた単クローン性抗体は、慣用のハイブリドーマ法により得ることができる。遺伝子導入マウスに宿されたヒト免疫導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の過程で再配列し、クラス・スイッチおよび体性変異を起す。この方法を用いることにより、治療上有用な、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体を製造できる。このヒト抗体製造技術の概観のためには、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（１９９５）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３参照。このヒト抗体およびヒト単クローン性抗体の製造の詳細議論およびこれら抗体製造のプロトコルに関しては、例えばＵＳ特許５，６２５，１２６；ＵＳ特許５，６３３，４２５；ＵＳ特許５，５６９，８２５；ＵＳ特許５，６６１，０１６およびＵＳ特許５，５４５，８０６を参照。更に、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）等の会社が、上記と類似の技術により、選択された抗原に対してのヒト抗体を与えるために、利用可能である。
【０１５４】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は「案内された選択（ｇｕｉｄｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技法により生成される。この方法によれば、選択された非ヒト単クローン性抗体、例えばねずみ（ｍｕｒｉｎｅ）の抗体を、試料エピトープを認識する完全なヒト抗体の選択への案内のために用いる（Ｊｅｓｐｅｒｓｅほか、１９９４，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３）。
【０１５５】
抗標識蛋白抗体（例えば単クローン性抗体）を、親和性クロマトグラフィーあるいは免疫沈でん法等の標準的技法により、本発明の標識蛋白を分離するのに用いることができる。抗標識蛋白抗体は、天然の標識蛋白の細胞からの、および宿主細胞中で発現された組換え型製造標識蛋白の精製を容易化することができる。また抗標識蛋白抗体は、標識蛋白の発現の量およびパターンを評価するために、標識蛋白（例えば、細胞溶解産物あるいは細胞上澄液中の）を検出するために用いられる。抗標識蛋白は、診断のために診療テスト方法の一部として、例えば、与えられた治療プログラムの有効性を決定するために、蛋白レベルをモニターするために用いられる。検出は、抗体を検出可能な物質とカップリング（すなわち、物理的に結合）することにより、容易化される。検出可能な物質には、各種の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生発光物質、および放射性活性物質が含まれる。好適な酵素の例には、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ・ホスホターゼ、ガラクトシダーゼ、アセチルコリンステラーゼが；好適な補欠分子族錯体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが；好適な蛍光物質の例には、アムベリフェロン、フルオレシン、フルオレシン・イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレシン、塩化ダンシルおよびフィコエリスリンが；生発光性物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリンが；また好適な放射活性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈが、含まれる。
【０１５６】
ＩＩＩ．組換え型発現ベクターおよび宿主細胞
本発明の別の観点は、本発明の標識蛋白（あるいはその一部）をコード化する核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクター、に関する。本明細書において、「ベクター」には、それに結合された他の核酸を輸送可能な核酸分子が含まれる。ベクターの一つの型として「プラスミド」があり、これは他のＤＮＡセグメントが結合可能な円形二重鎖ＤＮＡループを含む。別の型のベクターとして、ウイルスベクターがあり、ここでは追加のＤＮＡがウイルスゲノムに結合可能である。ある種のベクターは、それが導入された宿主細胞において自律的な複製が可能である（例えばバクテリア複製源を有するバクテリア・ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに包含され、それにより宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある種のベクターは、それが機能的に結合した遺伝子の発現を指令することができる。このようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称する。通常、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態を採る。プラスミドが最も通常のベクター形態であるので、本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は代替的に用いられる。しかしながら、本発明は、これ以外の発現ベクターを包含することを意図するものであり、例えば同様な機能を果すウイルスベクター（例えば複製欠陥型レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）がある。
【０１５７】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を宿主細胞中での発現に好適な形態で含むものであり、これは該組換え型発現ベクターが、発現のために用いられる宿主細胞に基づいて選択された、発現されるべき核酸配列と機能的に結合した一以上の調節配列を含むことを意味するものである。
【０１５８】
組換え型発現ベクターにおいて、「機能的に結合した」の意味は目的とするヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現（例えば生体外での転写／翻訳系における、あるいはベクターが宿主細胞に導入された際の宿主細胞における）を許容するように調節配列と結合されることを意味する。「調節配列」の語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含む意図で用いている。これら調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くの宿主細胞においてヌクレオチド配列の連続的発現を指令するもの、およびある種の宿主細胞にのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば組織特異的調節配列）が含まれる。当業者には、発現ベクターの設計が、転換されるべき宿主細胞の選択、所望の蛋白発現レベル等の要因に依存することが容易に理解できよう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入されて、ここに記載されるような、核酸でコード化される融合蛋白あるいはペプチド（例えば標識蛋白、標識蛋白の変異形、融合蛋白等）を含む蛋白あるいはペプチドを生成する。
【０１５９】
本発明の組換え型発現ベクターは、原核生物あるいは真核生物細胞中での標識蛋白の発現用に設計され得る。例えば、標識蛋白は、大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクター使用）、酵母細胞あるいは哺乳類細胞中で発現され得る。好適な宿主細胞は更に、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に議論されている。代りに、組換え型発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、生体外で転写および翻訳され得る。
【０１６０】
原核生物蛋白の発現は、最も多くは、融合または非融合蛋白の発現を指令する形成性または誘発性プロモーターを含むベクターを用いて、大腸菌中で行われる。融合ベクターは、大腸菌中でコード化された蛋白、通常は組換え型蛋白のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を加える。典型的には、それら融合ベクターは、三つの目的：１）組換え型蛋白の発現の増加、２）組換え型蛋白の溶解度の増加および３）親和精製における配位子として作用することによる組換え型蛋白の精製の手助け、に役立つ。融合発現ベクターにおいては、しばしば、融合部と、組換え型蛋白の接合部に蛋白分壊部位が導入されることにより、融合蛋白の精製に引き続く融合部からの組換え型蛋白の分離が可能になる。これら酵素およびその同族認識系には、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれ、これらは、標準的組換え型蛋白に対して、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合蛋白、あるいは蛋白Ａ、を融合させる。
【０１６１】
精製した融合蛋白は、たとえば、標識活性検定（例えば、以下に詳述する直接検定あるいは競合検定）、あるいは標識蛋白に特異的な抗体の生成、に用いられる。
【０１６２】
好適な誘発性非融合大腸菌発現ベクターには、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒほか、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写を利用する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎｌ）を媒介したＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写を利用する。このウィルス・ポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御の下でのＴ７ｇｎｌ遺伝子を宿す寄生プロファージからの宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＭＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１６３】
大腸菌における組換え型蛋白発現を最大化するための一つの方法は、該蛋白を欠損容量の宿主細菌中で発現して該組換え型蛋白を分解的に開裂することである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。別の方法は、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌中で優先的に利用されるように、変更することである（Ｗａｄａほか（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。このような本発明の核酸配列の変更は、標準的なＤＮＡ合成技法により行うことができる。
【０１６４】
ある態様においては、標識蛋白発現ベクターとして酵母発現ベクターが用いられる。酵母Ｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉほか（１９８７）Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚほか（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）がある。
【０１６５】
代りに、本発明の標識蛋白は、バギュロウィルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現させることができる。培養した昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中での蛋白発現に利用可能なバキュロウィルスベクターにはｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈほか（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）、が含まれる。
【０１６６】
更に他の態様においては、本発明の核酸は、哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞中で発現される。哺乳類発現ベクターには、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎほか（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が含まれる。哺乳類細胞中で使用された場合、発現ベクター制御機能は、しばしばウィルス調節要素により与えられる。例えば、一般に用いられるプロモーターは、ポリオーマウィルス属、アデノウィルス２、サイトメガロウィルスおよびシミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウィルス４０、から得られる。原核生物および真核生物細胞の双方についての他の好適な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）の第１６および１７章参照。
【０１６７】
他の態様においては、組換え型哺乳類発現ベクターは、特定の細胞型（例えば特定の核酸の発現に用いられる組織特異性の調節要素）において、優生的に該核酸の発現を指令することのできるものである。組織特異性調節要素は、当業界に既知である。限定的でない例として、好適な組織特異性プロモーターには、アルブミン・プロモーター（肝臓特異性；Ｐｉｎｋｅｒｔほか（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ系特異性プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２２３−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン類（Ｂａｎｅｒｊｉほか（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異性プロモーター類（例えば神経系プロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、すい臓特異性プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄほか（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異性プロモーター（たとえば乳漿プロモーター；ＵＳ特許番号４，８７３，３１６およびＥＰ出願公開番号２６４，１６６）。成長調節プロモーターも含まれる：例えばネズミのホックス（ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテイン・プロモーター（ＣａｍｐｅｒｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６６）。
【０１６８】
本発明は更に、逆型の配向の発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を有する組換え型発現ベクターを与える。すなわち、該ＤＮＡ分子は、本発明の遺伝子（例えば表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子）に対応するｍＲＮＡと逆型（ａｎｔｉ  ｓｅｎｓｅ）のＲＮＡ分子の（該ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にするように調節配列に機能的に結合される。逆型配向にクローニングされた核酸に機能的に結合された調節配列は、各種の細胞型、例えばウィルス・プロモーターおよび／又はエンハンサー、における逆型ＲＮＡ分子の連続的発現を指令するように選択されるか、あるいは、逆型ＲＮＡの直接且つ連続的な組織特異性あるいは細胞型特異性発現を指令する。該逆型発現ベクターは、該ベクターが導入される組換え型プラスミド、ファージ中央体あるいは減衰ウィルスの形態であり得る。逆型遺伝子を使用する遺伝子発現の調節については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，ＨほかＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ（遺伝子解析の分子ツールとして）、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，巻１（１）１９８６参照。
【０１６９】
本発明の他の観点は、本発明の核酸分子（例えば、表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子）を導入する宿主細胞に関するものであり、宿主細胞ゲノムの特定部位への相同的再結合を示す配列を有する本発明の組換え型発現ベクターまたは核酸分子がともに導入される。「宿主細胞」および「組換え型宿主細胞」の語は、本明細書において、代替的に用いられる。これらの語は、特定の被検者細胞のみでなく、それら細胞の子孫あるいは潜在的な子孫も含むものと理解される。変更により、あるいは環境の影響により、後続する世代において、ある種の修飾が起り得るので、それら子孫は、事実、親細胞と同一でないかも知れないが、それでも本明細書における該用語の範疇に含まれる。
【０１７０】
宿主細胞は、原核あるいは真核生物細胞のいずれでもあり得る。例えば、本発明の標識蛋白は、大腸菌等の細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞あるいは哺乳類細胞（例えば中国ハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）中で発現し得る。他の好適な宿主細胞は当業者に既知である。
【０１７１】
ベクターＤＮＡは慣用の（形質）転換あるいはトランスフェクション技法により原核あるいは真核生物細胞に導入される。本明細書において、「転換」および「トランスフェクション」の語は、当業界において知られる宿主細胞に外来核酸（例えばＤＮＡ）を導入する各種の技法を意味することを意図するものであり、これには、燐酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポ移入、およびエレクトロポレーションが含まれる。好適な宿主の転換あるいはトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｚ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ．Ｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、および他の実験室マニュアルに見出される。
【０１７２】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのために、使用する発現ベクターおよびトランスフェクション技法によっては、細胞の小部分のみがそのゲノムに外来ＤＮＡを取り込まれることが知られている。これら組込み体を同定し選択するために、通常は、選択可能な標識をコード化し得る（例えば抗生物質に抵抗する）遺伝子を目的遺伝子とともに宿主細胞に導入する。好ましい選択可能な標識には、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキサート等の薬剤に対して抵抗性のものが含まれる。選択可能な標識をコード化する核酸は、別のベクターに導入し得る。導入された核酸により安定にトランスフェクションされた細胞は、薬剤選択により同定される（例えば選択可能な標識遺伝子を導入した細胞は生き残るが、他の細胞は死滅する）。
【０１７３】
本発明の宿主細胞、例えば培地中の原核あるいは真核生物細胞は、標識蛋白を製造（すなわち発現）するために用いられる。従って、本発明は、また、本発明の宿主細胞を用いる標識蛋白の製造法をも与えるものである。その方法の一態様においては（標識蛋白をコード化する組換え型発現ベクターを導入した）、本発明の宿主細胞を、本発明の標識蛋白を製造するのに好適な媒体中で培養する。別の態様においては、更に該媒体あるいは宿主細胞から標識蛋白を分離する。
【０１７４】
本発明の宿主細胞は、またヒト以外の遺伝子導入動物の製造に用いられる。例えば、一態様においては、本発明の宿主細胞は本発明の標識蛋白コード化配列を導入した、授精された卵母細胞または胚幹細胞である。これら宿主細胞は、次いで本発明の標識蛋白をコード化する外因性の配列を導入した非ヒト遺伝子導入動物、あるいは本発明の標識蛋白をコード化する内因性の配列を変異させた相同性の組換え型動物の創生に用いられる。これら動物は、標識蛋白の作用および／または活性の研究のため、あるいは標識蛋白活性の修飾体の同定および／または評価に有用である。本明細書において、「遺伝子導入動物」は、一以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯動物である。他の遺伝子導入動物の例には、非ヒト霊長類、羊、犬、牛、やぎ、鶏、両性動物等を含む。導入遺伝子は、遺伝子導入動物の細胞ゲノムに統合され且つ成長動物のゲノムに残る外因性のＤＮＡであり、それにより該遺伝子導入動物の一以上の細胞型あるいは組織において、コード化遺伝子生成物の発現を指令するものである。本明細書において、「相同性組換え型動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス、であり、本発明の内因性遺伝子（例えば表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子）が、該内因性遺伝子と動物細胞、例えば胚幹細胞に導入された外因性ＤＮＡ分子との間での相同性組換えにより、該動物の成長に先立って変更されたものである。
【０１７５】
本発明の遺伝子導入動物は、標識コード化核酸を、授精された卵母の牡前核に、例えば微細注入、あるいはレトロウィルス感染により導入し、擬似妊娠した牝の育成動物中で該卵母を成長させることにより創生される。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた遺伝子導入体に導入することができ、これにより導入遺伝子の発現の効率を増大することができる。組織特異性の調節配列を、導入遺伝子に機能的に結合して、標識蛋白の特定細胞への発現を指令することができる。胚子操作および微少注入による遺伝子導入動物、特にマウス等の動物、の生成は、当業界において慣用化しており、例えばＵＳ特許第４，７３６，８６６および４，８７０，００９（いずれもＬｅｄｅｒほか）、ＵＳ特許第４，８７３，１９１（Ｗａｇｎｅｒほか）、ならびにＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）、に記載されている。同様な方法が、他の遺伝子導入動物に使用される。遺伝子導入創始動物は、そのゲノムにおける本発明の導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞における本発明の遺伝子に対応するｍＲＮＡの発現に基づいて同定できる。遺伝子導入創始動物は、該導入遺伝子を有する追加の動物の育成に用いられる。更に、標識蛋白をコード化する導入遺伝子を有する遺伝子導入動物は、更に他の導入遺伝子を他の遺伝子導入動物へと育成することができる。
【０１７６】
相同性組換え型動物を創生するために、削除、加入あるいは置換を行い、例えば機能的崩壊などの変異を行った本発明の遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製する。該遺伝子はヒト遺伝子でもあり得るが、より好ましくは、本発明の遺伝子（例えば表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子）の非ヒト相同体である。例えば、マウス遺伝子を、該マウス遺伝子中で本発明の内因性遺伝子を変異させるのに適したベクター等の相同組換え核酸分子を調製するのに用いることができる。好ましい態様においては、該相同組換え核酸分子を、相同性組換えに際して、本発明の該内因性遺伝子を機能的に崩壊する（すなわち、もはや機能的蛋白をコード化しないようにする、あるいはいわゆる「ノック・アウト」ベクターにする）ように、設計する。代りに相同組換え核酸分子を、相同性組換えに際して、該内因性遺伝子を変異ないし変化させるが、依然として機能性蛋白をコード化する（例えば上記調節領域を変化して、内因性標識蛋白の発現を変化させる）ように設計することもできる。該相同組換え核酸分子において、本発明の遺伝子の変化部分は、その５′および３′末端の横に付加的な本発明の遺伝子配列を置き、該相同組換え核酸分子に担持される外因性遺伝子とある細胞（例えば胚幹細胞）の内因性遺伝子との間での相同性組換えが起るようにする。該追加の横に置く核酸配列は、該内因性遺伝子との相同性組換えがうまく起るように充分な長さとする。典型的には、（５′末端と３′末端の双方において）数キロベースの横置きＤＮＡを相同組換え核酸分子に含める（例えば相同性組換えベクターの記載として、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ，およびＣａｐｅｃｃｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３参照）。該相同組換え核酸分子は（例えばエレクトロポレーションにより）、細胞（例えば胚幹細胞株）に導入され、導入された遺伝子が内因性遺伝子と相同的に組換えられた細胞が選択される（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ほか（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５）、選択された細胞は、次いで動物（例えばマウス）の胚盤胞に注入されて集合キメラを形成する（例えばＢｌａｄｌｅｙ，Ａ．，Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編集（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）第１１３−１５２頁）。キメラ状胚は次いで適当な擬似妊娠した牝の育成動物に移植され、育成される。相同組換えＤＮＡをその胚芽に宿す子孫は、導入遺伝子の生殖細胞系伝達により該相同組換えＤＮＡを全細胞に含む動物の繁殖に用いられる。相同組換え核酸分子、例えばベクターあるいは相同組換え動物の形成法は、更に、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４および（Ｌｅ  Ｍｏｕｅｌｌｅｃほか）ＷＯ９１／０１１４０（Ｓｍｉｔｈｉｅｓほか）；ＷＯ９２／０９６８（Ｚｉｊｌｓｔｒａほか）；およびＷＯ９３／０４１６９（Ｂｅｒｎｓほか���、に記載されている。
【０１７７】
別の態様によれば、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む遺伝子導入非ヒト動物が製造可能である。そのような系の一例としては、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘ  Ｐリコンビナーゼ系があり、その記載としては、例えばＬａｓｋｏほか（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロマイセス・セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコンビナーゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎほか（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘ  Ｐリコンビナーゼ系を導入遺伝子の発現調節に使用するときには、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択された蛋白の双方をコード化する導入遺伝子を含む動物が必要になる。このような動物は、例えば選択された蛋白をコード化する導入遺伝子を含む動物とリコンビナーゼをコード化する動物との二つの動物を交配することにより、「二重」遺伝子導入動物を構築することにより与えられる。
【０１７８】
本明細書で記載する非ヒト遺伝子導入動物のクローンは、またＷｉｌｍｕｔほか（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３ならびにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載の方法により製造することもできる。簡単に云えば、遺伝子導入動物からの細胞、例えば体幹細胞を、分離し、成長サイクルから出てＧ０期に入らせる。該休止細胞は、次いで、例えば電気パルスを使用することにより、該休止細胞が分離された同種の動物の摘出された卵母と、融合させる。再構築された卵母を次いで培養し、桑実胚あるいは未分化胚芽細胞へと発達させ、擬似妊娠牝育成動物に転移させる。この牝育成動物から出産された子孫は、細胞、例えば体幹細胞、が分離された動物のクローンとなる。
【０１７９】
ＩＶ．薬剤組成物
本発明の核酸分子（例えば表１〜１０、１２および図３、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図６のグループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩおよびグループＩＶ、ならびに図７に示す遺伝子）、標識蛋白の断片、および抗標識蛋白抗体（本明細書において「活性化合物とも称する」は、投与に適した薬剤組成物に含められる。これら組成物は、典型的には、該核酸分子、蛋白あるいは抗体と、薬学的に許容される担体を含む。本明細書において「薬学的に許容される担体」の語は、薬剤投与に適合する、溶剤、分散媒、塗剤、抗菌性および抗真菌性物質、等張性および吸収遅延剤等のいずれか、および全てを含む。薬学的活性物質に対するこれらの媒体および物質の使用は、当業界に周知である。活性化合物と不適合ないかなる慣用媒体あるいは物質でもない限り、その組成物中の使用は意図されている。補助活性化合物も組成物中に含めることができる。
【０１８０】
本発明には、本発明の標識に対応するポリペプチドあるいは核酸の発現または活性を修飾する薬剤組成物の調製方法が含まれる。これら方法には、本発明の標識に対応するポリペプチドあるいは核酸の発現または活性を修飾する薬剤とともに薬学的に許容される担体を調製することも含まれる。それら組成物は、更に追加の活性剤を含むことができる。従って、本発明は、本発明の標識に対応するポリペプチドあるいは核酸の発現または活性を修飾する薬剤および一以上の追加の活性化合物とともに薬学的に許容される担体を含めて薬剤組成物を調製する方法を含む。
【０１８１】
本発明は、更に（ａ）標識に結合する、あるいは（ｂ）標識の活性を修飾する（例えば刺激または抑制する）効果を有する、あるいは、より特定的に（ｃ）標識の天然の基質（例えばペプチド、蛋白、ホルモン、補因子または核酸）に対する標識の相互作用に対して修飾効果を有する、あるいは（ｄ）標識の発現に対する修飾効果を有する、修飾剤、すなわち候補あるいは試験化合物または薬剤（例えばペプチド、擬ペプチド、ペプトイド、小分子あるいは他の薬剤）を同定する方法（本明細書で「選別検定」ともいう）を与えるものである。これら検定は、典型的には、標識と一以上の検定成分との反応を含むものである。他の成分は、試験化合物自体、または試験化合物と標識の天然の結合の相手との組合せであり得る。
【０１８２】
本発明の試験化合物は、天然および／または合成化合物の系統的なライブラリー、を含む任意のソースから得られる。試験化合物は、また当業界に知られる無秩序配列ライブラリー法による多くの方法、たとえば生物学的ライブラリー、ペプトイドライブラリー（ペプチドの機能を有するが、酵素劣化に耐性であるが、それにも拘わらず生活性を維持する新規な非ぺプチド骨格を有する分子のライブラリー；例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎほか、１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５）；空間的に処理される並列固体相あるいは溶液相ライブラリー；逆重量を必要とする合成ライブラリー法；１ビード−１化合物ライブラリー法および親和性クロマトグラフ選択を用いる合成方法、のいずれかによって得られる。生物学的ライブラリーとペプチドライブラリーによる方法は、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの方法は、化合物のペプチド、非ペプチドライブラリーあるいは小分子ライブラリーに適用される（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｙ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１８３】
本発明の薬剤組成物は、意図する投与ルートに適合されるように構成される。投与ルートの例には、非経口、例えば静脈、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮性（局所）、経粘膜および直腸注入が含まれる。非経口、皮内あるいは皮下投与のための溶液または検濁液には以下のものが含まれ得る：すなわち、注射水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒、等の殺菌した希釈剤；ベンジルアルコール、メチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、燐酸塩等の緩衝剤；塩化ナトリウム、デキストロース等の浸透圧調整剤。ｐＨは塩酸、水酸化ナトリウム等の酸または塩基により調整される。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器あるいは繰り返し投与用のガラスびん等に収容される。
【０１８４】
注射用に好適な薬剤組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌の注射用溶液または分散液を即席に調製するための無菌粉剤が含まれる。静脈内投与のための適当な担体には、無菌性の水、クレモホル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）あるいは燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、が含まれる。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、易注入性となる程度に流体でなければならない。また製造および貯蔵条件下に安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から、保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール等）およびこれらの適当な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適当な流動性は、例えばレシチン等の被覆の使用により、分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、あるいは表面活性剤を使用することにより、維持される。微生物の作用の抑制は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の各種抗細菌剤および抗真菌剤の使用により達成される。多くの場合において、例えば糖類、マニトール、ソルビトール等のポリアルコール、および塩化ナトリウム等の等張剤を加えることが望ましい。注射組成物の吸収の長期化は、組成物中に、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン等の吸収遅延剤を加えることにより、達成することができる。
【０１８５】
無菌注射溶液は、活性化合物（例えば標識蛋白断片又は抗標識蛋白抗体）の必要量を上記の成分の一または組合せを適当な溶媒に加え、濾過殺菌を行うことにより調製できる。一般的にいって、分散液は、活性化合物を、基礎分散媒体および上記列挙物からの必要な成分を含む無菌ビヒクル中に含めることにより調製される。無菌注射液のための無菌粉末の場合には、好ましくは、予め殺菌濾過した活性成分と所望の付加成分の溶液を真空乾燥および凍結乾燥することにより粉末化される。
【０１８６】
経口投与組成物は、一般に、不活性希釈剤と食用担体を含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、圧縮により錠剤化される。経口治療投与のためには、活性化合物を賦形剤とともに含め、錠剤、トローチあるいはカプセルの形態で使用される。経口組成物は、また液状担体を用いて口洗浄剤としても用いられ、液状担体中の化合物は経口投与され、一洗ののち、吐き出すか飲み込まれる。薬学的に許容される結合剤および／または助剤を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、類似である以下の成分あるいは化合物のいずれかを含むことができる：微結晶セルロース、トラガカンス・ガム、ゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローツ（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤；蔗糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ風味等の風味剤。
【０１８７】
吸入投与のためには、化合物は、適当な推進剤（例えば二酸化炭素等のガス）を含む加圧容器または分与器からのエアースプレー状態で、または噴霧器（ネブライザー）により投与される。
【０１８８】
経粘膜あるいは経皮的手段によっても全身的な投与は可能である。経粘膜あるいは経皮的投与のためには、組成物中に、透過すべき障壁に対し好適な浸透剤を使用する。そのような透過剤は、当業界に一般的に知られており、例えば、経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁塩、フシジン酸誘導体などが含まれる。経皮投与のためには、当業界に知られているように、活性化合物は、軟こう、こう薬、ゲル、クリームに調製される。
【０１８９】
化合物は、また（例えばココアバターおよび他のグリセリド等の慣用の坐薬基質とともに）坐薬の形態で、あるいは直腸投与用の停留浣腸剤として調製することもできる。
【０１９０】
一態様においては、活性化合物は、該化合物の身体からの急速な離脱を防止するような担体とともに、例えば埋没物あるいはマイクロカプセル化分与系を含む制御離脱性組成物に調製される。エチレン−酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸等の、生物解性あるいは生物適合性ポリマーを使用することができる。そのような組成物の調製法は、当業者には自明のことである。それら物質は、アルザ社（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバ社（Ｎｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｅｅｌｓ，Ｉｎｃ．）から市販されている。リポソーム懸濁物（これは、ウィルス性抗原へ向けられたモノクローナル抗体とともに感染細胞に向けられたリポソームを含む）もまた薬学的に許容される担体として用いられる。これらは、例えばＵＳ特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に既知の方法により調製可能である。
【０１９１】
投与の容易さと投与量の安定化のために、投与量単位形態で経口または非経口投与組成物を調製することが好ましい。本明細書でいう投与量単位形態は、治療される被検者に対する単位投薬に適した物理的に分離した単位を意味するものであり、各単位は、必要な薬学的担体とともに所望の治療効果を果すべく計算された予め定めた量の活性化合物を含むものである。本発明の投与単位形態の処方は、活性化合物の個有の特性と達成されるべき特定の治療効果ならびに個々の治療のための活性化合物の調剤に個有の制限に指示され且つ直接的に依存するものである。
【０１９２】
これら化合物の毒性および治療効果は、細胞培養物および実験動物について標準的な医学的手順で、例えばＬＤ５０（母集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（母集団の５０％に治療効果が認められる投与量）。毒性と治療効果の間での投与量比が治療係数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表わされる。大なる治療係数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物も用いられるが、非疾患細胞への可能な損傷を最小にして、副作用を低減するために、化合物を疾患組織部位へ向ける投与形態を設計する注意を払う必要がある。
【０１９３】
細胞培養検定および動物試験で得られたデータを、ヒトに使用する投与量範囲の決定に使用することができる。化合物の投与量は、好ましくは、毒性が小または無く、ＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。この範囲内で、投与量は、採用される投与形態および投与経路に依存して変化し得る。本発明法で使用されるいかなる化合物も、治療に有効な投与量は、まず細胞培養検定から推計される。投与量は、細胞培養物について決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大値の半分の抑制を達成する試験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルについて策定される。これらの情報を用いて、ヒトに対する有効投与量をより正確に決定する。血漿中濃度は、例えば高性能液クロマトグラフにより測定される。
【０１９４】
本発明の核酸分子をベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして用いることができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈注射、局所投与（ＵＳ特許第３５２８４７０号参照）により、あるいは定位注射（例えばＣｈｅｎほか（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９／３０５４−３０５７参照）により被検者に投与することができる。
【０１９５】
遺伝子治療ベクターの薬剤調製物には、許容される希釈剤中の該遺伝子治療ベクター、あるいは遺伝子分子ビヒクルを埋込んだ遅延放出マトリクスが含まれる。代りに、例えばレトロウィルス・ベクター等の完全な遺伝子配達ベクターが組換え細胞から損なわれずに生成されるときは薬剤調製物には該遺伝子配達ベクターを生成する一以上の細胞が含まれる。
【０１９６】
薬剤組成物は、投与指示書とともに、容器、パックあるいは分与器に含められる。
【０１９７】
Ｖ．コンピュータ読取り可能な手段およびアレイ
本発明の標識を含むコンピュータ読取り可能な媒体も与えられる。本明細書において、「コンピュータ読取り可能な媒体」には、コンピュータにより直接読取りおよびアクセス可能な媒体が含まれる。限定的ではないが、これら媒体には、フロッピーディスク、ハードディスク貯蔵手段および磁気テープを含む磁気貯蔵媒体；ＣＤ−ＲＯＭ等の光学貯蔵手段；ＲＡＭおよびＲＯＭ等の電気的貯蔵手段；および磁気／光学貯蔵媒体などのこれらカテゴリーの混生物が含まれる。当業者は、現在知られているコンピュータ読み取り可能な媒体のいずれかにより、本発明の標識を記録したコンピュータ読取り可能な媒体を含む製品を創出することができることは容易に理解できよう。
【０１９８】
本明細書において、「記録」には、コンピュータ読取り可能な媒体に、情報を貯える過程が含まれる。当業者は、現在知られているコンピュータ読み取り可能な媒体への情報の記録方法のいずれかを採用して、本発明の標識を含む製品を生成することができることは容易に理解できよう。
【０１９９】
種々のデータ処理プログラムおよびフォーマットを用いて、本発明の標識情報をコンピュータ読取り可能な媒体に貯蔵することができる。例えば該標識に対応する核酸配列を、ワードパーフェクト、マイクロソフトワード等の市販ソフトウェアにより、ワープロのテキストファイルに再生することができ、あるいは、ＤＢ２、サイベース、オラクル等の応用データベースに貯蔵したＡＳＣＩＩファイルの形態に再生することができる。本発明の標識を記録したコンピュータ読取り可能な媒体を得るために、任意の数のデータ・プロセッサー構築フォーマット（例えばテキスト・ファイルあるいはデータベース）を適合させることができる。
【０２００】
本発明の標識をコンピュータ読取可能な形態で与えることにより、種々の目的のために、標識配列情報に日常的にアクセスすることができる。例えば当業者は、コンピュータ読取可能な形態の本発明のヌクレオチドあるいはアミノ酸配列を、目標とする配列あるいは構造主題を該データ貯蔵手段に貯えられた配列と比較するために、用いることができる。特定の目標、配列あるいは主題と適合する、本発明の配列の断片あるいは領域を同定するために検索手段を用いることができる。
【０２０１】
本発明は更に、標識のアレイ（配列物）を含む。このアレイは、アレイ中の一以上の標識の発現を検定するために用いられる。一態様においては、アレイは、組織における遺伝子発現を検定することにより、アレイ中の遺伝子の組織特異性を確認するために用いられる。このようにして、約８６００までの遺伝子の発現が同時に検定できる。これにより、一以上の組織で特異的に発現される一連の遺伝子検査結果を示すプロファイルが得られる。
【０２０２】
そのような定性的決定に加えて、本発明は、遺伝子発現の定量を可能にする。すなわち、組織特異性のみでなく、組織中への一連の遺伝子の発現レベルを確認できる。従って、遺伝子をその組織発現自体および該組織における発現レベルにより分類できる。これは、例えば、二あるいはそれ以上の組織間での遺伝子発現の関係を確認するのに有用である。すなわち、一組織が乱れたときには、第２の組織における遺伝子発現への効果を決定できる。この意味で、生物学的刺激に応答して、一の細胞型の他の細胞型への効果を決定できる。この決定は、例えば、その遺伝子発現レベルにおける細胞−細胞相互作用の効果を知るのに有用である。もしある薬剤を一細胞型の処置のために処理するが、他の細胞型には望ましくない効果を有するときには、本発明によれば、該望ましくない効果の分子的根拠を決定し、対応薬剤を共投与するか、その望ましくない効果を処置する機会が与えられる。同様に、一細胞型においても、望ましくない生物学的効果を分子レベルで決定できる。すなわち、ある薬剤の目標遺伝子の発現に対する効果を確認し、対応処置を取ることができる。
【０２０３】
他の態様においては、アレイを、該アレイ中の一以上の遺伝子の時間的発現過程を観察するのに用いられる。これは、本明細書に記載するような種々の生物学的意味において起り得る：例えば発達および区別、病状の進行、細胞変態および老化などの対外プロセス、痛み、食欲等の自律神経および神経学的プロセス、更には学習、記憶等の認識機能である。
【０２０４】
アレイは、更に、同一または別の細胞における一遺伝子の発現の他の遺伝子の発現への影響を確認するのに有用である。これは、例えば、もし究極的あるいは下流の目標が調節できないときに、治療の介入のために交互に分子目標を選択することを与える。
【０２０５】
アレイは、また正常および疾患細胞における一以上の遺伝子の異なる発現パターンを確認するのに有用である。これは、診断あるいは治療の介入のための分子目標として役立ち得る一連の遺伝子を与える。
【０２０６】
ＶＩ．予知薬
本発明は、また診断検定、予後検定、薬理遺伝学、および臨床試行のモニターを予後（予知）のために用いて予防的に個体を処置する、予知薬の分野に関する。従って、本発明の一観点は、生物試料（例えば血液、漿液、細胞、組織）中の、標識蛋白および／または核酸発現ならびに標識蛋白活性を決定して、個体が標識蛋白、核酸発現あるいは活性と関連する、病気あるいは異常な疾患状態にあるか、あるいは異常の進行の危険性があるか、の診断検定に関する。本発明はまた、個体が、標識蛋白、核酸発現あるいは活性と関連する、異常を発達させる危険があるか否かを決定する予後（あるいは予知）検定に関する。例えば、遺伝子のいくつかの複製物を生物試料中で検定できる。これら検定を予後あるいは予知のために用いて、標識蛋白、核酸発現あるいは活性と関連する、あるいは特徴付けられる異常（例えば、乾癬又はＴＨ１−関連状態）の発生に先立って、個体を予防的に処置することができる。
【０２０７】
本発明の別の観点は、作用剤（例えば薬剤、組成物）の臨床試行における標識の発現または活性に対する影響をモニターすることである。
【０２０８】
これらの、および他の作用剤については、以下の各項で更に詳記する。
【０２０９】
１．診断検定
生物の試料中の本発明の標識蛋白あるいは核酸の存在または不存在を検知する方法の一例としては、被検者から生物試料を取得し、該生物試料を、該蛋白をコード化することにより蛋白または核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出可能な化合物または作用剤と接触させて、該生物試料中における該標識蛋白または核酸の存在を検知する方法が挙げられる。本発明の標識遺伝子または蛋白と対応するｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための適当な作用剤の例としては、本発明のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリッド化するラベル付き核酸プローブが挙げられる。本発明の診断検定に使用するのに適したプローブを記載する。
【０２１０】
標識蛋白を検出するための好ましい作用剤は、標識蛋白と結合できる抗体、好ましくは検出可能なラベルを付した抗体である。抗体は多クローン性であり得るが、好ましくは単クローン性である。完全な抗体あるいはその断片（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ′）２）を用いることができる。プローブまたは抗体について「ラベル付き」の語は、該プローブまたは抗体に、検出可能な物質を結合（物理的結合）することにより直接ラベル付けをすることと加えて、直接ラベル付けされた作用剤との反応性により、該プローブまたは抗体を間接的にラベル付けることを包含することを意図する。間接ラベル付けの例には、蛍光的にラベル付けされた第２の抗体により第１の抗体を検出すること、およびＤＮＡプローブのビオチンによる末端ラベル付けが含まれ、それは蛍光ラベル付けされたストレプトアジビンにより検出される。「生物試料」の語は、被検者から分離された組織、細胞および生物液、ならびに被検者中の組織、細胞および液を含む意味で用いられる。すなわち、本発明の検出方法は、生体外および生体内の生物試料中の、標識ｍＲＮＡ、蛋白あるいはゲノムＤＮＡの検出に用いられる。例えば標識ｍＲＮＡの生体外検出法にはノザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ハイブリッド化およびその場（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリッド化が含まれる。標識蛋白の生体外検出法には、酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット分析、免疫沈澱法、および免疫蛍光法が含まれる。標識ゲノムＤＮＡの生体外検出法には、サザン・ハイブリッド化が含まれる。更に、標識蛋白の生体内検出法には、被検者中にラベル付き抗標識抗体を導入する方法が含まれる。例えば、該抗体は放射線活性標識によりラベル付けされ、被検者中におけるその存在および位置は、標準的な画像化技法により検出される。
【０２１１】
一態様においては、生物試料は、被検者からの蛋白分子を含む。代りに、生物試料は、被検者からのｍＲＮＡ分子または被検者からのゲノムＤＮＡ分子を含む。好ましい生物試料の例としては、被検者から慣用法により分離された漿液試料が挙げられる。
【０２１２】
他の態様においては、対照生物試料（例えば非乾癬組織）を対照被検者から取得し、該対照試料を、標識蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出可能な化合物または作用剤と接触させ、生物試料中における標識蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し、該対照試料中の標識蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと試験試料中の標識蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとを比較する方法がとられる。
【０２１３】
本発明には、更に、生物試料中の標識の検出のためのキットが含まれる。例えば、該キットは、生物試料中の標識蛋白またはｍＲＮＡを検出可能なラベル付き化合物または作用剤；該試料中の標識量の決定手段；および該試料中の標識量と標準との比較手段を含むことができる。該化合物または作用剤は適当な容器中に充填される。該キットには更に、標識蛋白または核酸の検出のための、該キットの使用指示書を含めることができる。
【０２１４】
２．予後決定
本明細書に記載の診断法は、また、異常な標識発現または活性と関連する病状あるいは異常を有するか、あるいは発生の危険のある被検者を同定するためにも利用される。本明細書において、「異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）」とは、野生型の標識発現または活性とは、異なる標識発現または活性を包含するものである。異常な発現または活性には、増加または減少した発現または活性、ならびに野生型の発現発達パターンまたは非細胞発現パターンには従わない発現または活性を包含するものである。例えば、異常な標識発現または活性は、標識遺伝子の変異により、該標識が過少発現または過大発現を起す場合、ならびにその変異により、非機能標識蛋白あるいは野生型のようには機能しない蛋白、例えば標識配位子と相互作用しないあるいは非標識蛋白配位子と相互作用する蛋白、を生成する場合を包含するものとする。
【０２１５】
前述の診断検定および後述する検定を含む、本明細書に記載の検定は、乾癬又はＴＨ１−関連状態等の、標識蛋白活性または核酸発現の誤調節と関連する異常を有するか、発生の危険を有する被検者の同定に利用できる。代りに、予後検定を乾癬又はＴＨ１−関連状態等の、標識蛋白活性または核酸発現の誤調節と関連する異常を有するか、発生の危険を有する被検者の同定に利用できる。すなわち、本発明は、異常な標識発現または活性と関連する病状あるいは異常の同定方法を与えるものであり、該方法においては、試験試料を被検者から取得して、標識蛋白または核酸（例えばｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出し、標識蛋白または核酸の存在により、異常な標識発現または活性と関連した病状あるいは異常を有するか、発生の危険を有する被検者の診断とする。本明細書において、「試験試料」には、目的とする被検者から取得した生物試料が含まれる。例えば、試験試料は、生体液（例えば血液）、細胞試料あるいは組織（例えば皮膚）であり得る。
【０２１６】
更に、本明細書に記載の予後検定は、ある被検者について、作用剤（例えば作用薬、拮抗薬、擬似ペプチド、蛋白、ペプチド、核酸、小分子あるいは他の薬剤候補）を投与して、標識発現または活性の増加又は減少と関連して病状または異常の治療を行ってよいか、どうかを決定するために使用できる。例えば、それら方法により、ある被検者に乾癬又はＴＨ１−関連状態等の異常に対する作用剤による治療を有効に行えるか否かを決定するために用いられる。すなわち、本発明は、ある作用剤が標識発現または活性の増加または減少と関連する異常の治療に有効であるか否かを決定する方法を与えるものであり、該方法においては試験試料を取得して標識蛋白または核酸発現を検出して、例えば標識蛋白または核酸の発現または活性の豊富さにより、ある被検者への誤作用剤の、標識発現の増加又は減少と関連する異常に対する投与の妥当性の診断とする。
【０２１７】
本発明法は、また標識遺伝子における遺伝子変化を検出して、該変化遺伝子を有する被検者が、標識蛋白活性または核酸発現の調節不良に特徴付けられる異常、例えば乾癬又はＴＨ１−関連状態の危険があるか、否か、を決定するためにも用いられる。好ましい態様においては、被検者からの細胞試料中の、標識蛋白をコード化する遺伝子の完全性に影響する変化または標識遺伝子の調節不良により特徴付けられる遺伝子変化の存在または不存在を検出することが含まれる。例えば、そのような遺伝子変化は、１）標識遺伝子からの一以上の分子の脱落、２）標識遺伝子に対する一以上の分子の付加、３）標識遺伝子の一以上の分子の置換、４）標識遺伝子の染色体再配列、５）標識遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写レベルの変化、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターン等の標識遺伝子の異常な修飾、７）標識遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写における非野生型スプライシングパターンの存在、８）非野生型レベルの標識蛋白、９）標識遺伝子の対立因子損失および１０）標識蛋白の翻訳後の不適修飾、のいずれか少なくとも一の存在により確認できる。本明細書に記載するように、標識遺伝子の変化を検出するために用いられる多数の検定が知られている。好ましい生物試料は、被検者から慣用法により分離された組織（例えば皮膚）または血液試料である。
【０２１８】
ある態様においては、変化の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプローブ／プライマーの使用により行われる（例えばＵＳ特許４，６８３，１９５および４，６８３，２０２参照）。例えばアンカーＰＣＲあるいはＲＡＣＥ  ＰＣＲあるいは代りに連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばＬａｎｄｅｇｒａｎほか（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａほか（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４参照）が挙げられ、特に後者は標識遺伝子における点変異の検出に特に有用である（Ａｂｒａｖａｙａほか（１９９５）Ｎａｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２参照）。この方法には、被検者から細胞試料を収集する工程、該試料の細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡあるいは双方）を分離する工程、該核酸試料を該標識遺伝子（もし存在すれば）のハイブリッド化および増幅が起る条件下で標識遺伝子と特異的にハイブリッド形成する一以上のプライマーと接触させる工程、および増幅生成物の存在または不存在を検出するか、あるいは増幅生成物の寸法を検出し、それを対照試料と比較する工程、が含まれる。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書で記載する変異検出技法のいずれかと組合せる、予備増幅工程として使用することが望ましいと考えられる。
【０２１９】
代替的増幅方法には、自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ほか（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ほか（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ほか（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、あるいは他の任意の核酸増幅方法が挙げられ、これに続いて当業者によく知られた方法で増幅分子の検出が行われる。これらの検出方式は、非常に少ない数の核酸分子が存在する場合のその検出に特に有用である。
【０２２０】
別の態様においては、試料細胞からの標識遺伝子中の変異は、制限酵素分裂パターンの変化により同定される。例えば、試料および対照ＤＮＡは、分離され、（必要に応じて）増幅され、一以上の制限エンドヌクレアーゼにより消化され、その断片長さ寸法をゲル電気泳動により決定し、比較する。断片長さ寸法の試料および対照ＤＮＡ間での差異は、試料ＤＮＡ中の変異を示すものである。更に配列特異性リボザイム（例えばＵＳ特許第５、４９８，５３１号参照）を使用して、リボザイム開裂部位の発達または喪失により、特異変異の存在について、採点することができる。
【０２２１】
他の態様においては、本発明の標識遺伝子または標識蛋白をコード化する遺伝子は、試料および対照核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）を数百あるいは数千のオリゴヌクレオチド・プローブを含む高密度アレイとハイブリッド化することにより同定される（Ｃｒｏｎｉｎ．Ｍ．Ｔ．ほか（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ほか（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３−７５９）。例えば、標識中の遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎほか（上記）に記載される光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定される。簡単にいうと、プローブの第１のハイブリッド化アレイを用いて、試料および対照中の長延長ＤＮＡを走査し、配列の重なるプローブの直線アレイを形成して、配列間での塩基変化を同定する。この工程により、点変異の同定ができる。次いで、全ての変種あるいは変異と相補的である、より小さい特異プローブアレイを用いる第２のハイブリッド化アレイにより特定の変異の特性付けを行う。各変異アレイは、平行なプローブの組を有し、その一方は野生型遺伝子に対し相補性であり、他方は変異遺伝子に相補性である。
【０２２２】
更に別の態様においては、当業界において知られている各種の配列化反応のいずれかを用いて、試料標識の配列と、対応する野生型（対照）配列とを比較することにより直接に標識遺伝子の配列決定をする。配列決定反応の例としてはＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）あるいはＳａｎｇｅｒ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）によって開発された技法に基づくものが含まれる。診断検定を行うに当っては、各種の自動化配列決定手法のいずれかを使用することも考慮する（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）、質量分析による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎほか（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎほか（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９参照）も含まれる）。
【０２２３】
本発明の標識遺伝子または標識蛋白をコード化する遺伝子における変異を検出する他の方法には、分割作用剤からの保護によりＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖における不斉合塩基を検出する方法が含まれる（Ｍｅｙｅｒｓほか（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般に云って、「不整合分割」の技法は、組織試料から得た潜在的変異ＲＮＡまたはＤＮＡと野生型標識配列を含む（ラベル付き）ＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリッド化することにより形成したヘテロ二本鎖を与えることから始まる。この二本鎖を、対照および試料鎖間の塩基対不整合により存在するような二本鎖の一本鎖領域を分割する作用剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をＲＮアーゼおよびＳ１ヌクレアーゼで処理されたＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドで処理して、酵素的に不整合領域を消化することができる。他の態様においては、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理し次いでピペリジンで処理して、不整合領域を消化することができる。不整合領域の消化の後、生成物を変性ポリアクリルアミド・ゲルにより寸法分離して、変異部位を同定する。例えばＣｏｔｔｏｎほか（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａほか（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５参照。好ましい態様においては、対照ＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のためにラベル付けされる。
【０２２４】
また別の態様においては、不整合分割反応に、二本鎖ＤＮＡ中の不整合塩基対を認識する一以上の蛋白（いわゆる「ＤＮＡ不整合修復」酵素）を、細胞試料から得た標識ｃＤＮＡにおける点変異を検出し、マッピングするべく決定された系において、使用する。例えば、大腸菌の変異Ｙ酵素は、Ｇ／Ａ不整合のＡを分割し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／Ｔ不整合のＴを分割する（Ｈｓｕほか（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７−１６６２）。一例の態様においては、標識配列、例えば野生型標識配列に基づくプローブを、試験細胞からのｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ生成物とハイブリッド化する。二本鎖をＤＮＡ不整合修復酵素で処理し、分割生成物が生じたら、これを電気泳動等の方法により検出する。例えばＵＳ特許５，４５９，０３９参照。
【０２２５】
他の態様においては、電気泳動における輸送性の変化により、本発明の標識遺伝子または標識蛋白をコード化する遺伝子の変異を同定する。例えば、一本鎖立体配座多形（ＳＳＣＰ）を使用して、変異および野生型核酸間の電気泳動輸送性の差異を検出することができる（Ｏｒｉｔａほか（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６、更にＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９、参照）。試料および対照核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性し、復元させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列により異なり、結果として生ずる電気泳動輸送性の変化により、唯一の塩基変化でも検出可能となる。ＤＮＡ断片はラベル付けされ、あるいはラベル付きプローブで検出される。この検定の感度は、ＲＮＡ（ＤＮＡよりは）により増強され、二次構造が配列変化により敏感になる。好ましい態様においては、ヘテロ二本鎖分析を用いて、ヘテロ二本鎖分子を電気泳動輸送性の変化に基づいて分離する（Ｋｅｅｎほか（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ７：５）。
【０２２６】
更に別の態様においては、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中の変異あるいは野生型断片の移動を、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｅｙｅｒｓほか（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）を用いて検定する。ＤＧＧＥを分析法として用いるときは、例えばＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＲＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプを加えることにより、ＤＮＡを完全に変性しないように修飾する。更なる態様においては、変性勾配の代りに温度勾配を用いて、対照および試料ＤＮＡ中の輸送性の差異を同定する（ＲｏｓｅｍｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１２７５３）。
【０２２７】
点変異検出の他の方法には、限定的ではないが、選択オリゴヌクレオチドハイブリッド化、選択増幅あるいは選択プライマー発現が含まれる。例えば既知の変異を中央に配したオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全な整合が見出されるときのみハイブリッド化が許容される条件で標的ＤＮＡとハイブリッド化する（Ｓａｉｋｉほか（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉほか（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６２３０）。それら対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡあるいはいくつかの異なる変異体とハイブリッド化され、オリゴヌクレオチドはハイブリッド化膜に付着し、ラベル付標的ＤＮＡとハイブリッド化される。
【０２２８】
代りに、選択ＰＣＲ増幅による対立遺伝子増幅技術を本発明と組合せて用いることができる。特異増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、目的変異を分子中に有する（増幅が鑑別ハイブリッド化に依存するようにする）（Ｇｉｂｂｓほか（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）か、一プライマーの究極３′−末端に有して、適当な条件下に不整合により、ポリメラーゼ発現を防止ないし低減する（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８）。更に、変異領域に新しい制限部位を導入して、分割に基づく検出を創出することが望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉほか（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。ある種の態様においては、増幅用のＴａｑリガーゼを用いて行うこともできる（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９）。それらの場合、５′配列の３′末端において完全な整合がある場合のみ連結が発生し、増幅の存在または不存在を探索することにより、特定部位での既知の変異の存在の検出を可能にする。
【０２２９】
本明細書に記載の方法は、例えば本明細書に記載の少なくとも一つのプローブ核酸あるいは抗体試薬を含む予め包装された診断キットを用いることにより行われ、標識遺伝子の関与する病状の徴候あるいは家族履歴を有する被検者の診断のための診療決定等に好便に使用可能である。
【０２３０】
更に、標識を発現する任意の細胞型あるいは組織を、本明細書に記載の予後検定に用いることができる。
【０２３１】
３．診療試行中の効果のモニタリング
作用剤（例えば薬剤）の標識蛋白の発現または活性に対する影響（例えば乾癬又はＴＨ１−関連状態の修飾）のモニタリングは、基礎薬剤選別のみでなく、診療試行においても行われる。例えば、本明細書に記載の選別決定により、標識遺伝子発現、蛋白レベルの増大あるいは標識活性の上方調節のために決定された作用剤の有効性は、標識遺伝子発現、蛋白レベルの減少あるいは標識活性の下方調節を示す被検者の診療試行において、モニターされる。代りに本明細書に記載の選別決定により、標識遺伝子発現、蛋白レベルの減少あるいは標識活性の下方調節のために決定された作用剤の有効性は、標識遺伝子発現、蛋白レベルの増大あるいは標識活性の上方調節を示す被検者の診療試行において、モニターされる。このような診療試行においては、標識遺伝子および好ましくは、例えば標識関連異常（例えば乾癬又はＴＨ１−関連状態）に関与している他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の表現型の「読出し」または標識として使用することができる。
【０２３２】
限定的なものでなく、例えば、本発明の標識遺伝子および標識蛋白をコード化する遺伝子を含む標識活性（本明細書に記載の選別検定で同定される。）を修飾する、ある作用剤（例えば化合物、薬または小分子）で処理された細胞中で修飾された遺伝子を同定することができる。すなわち、標識関連異常（例えば乾癬又はＴＨ１−関連状態）に対する作用剤の有効性を、例えば診療試行において、検討するために、細胞を分離し、またＲＮＡを調製して、標識関連異常に関与する標識および他の遺伝子のそれぞれの発現レベルについて分析する。遺伝子発現レベル（例えば遺伝子発現パターン）を、本明細書に記載したような、ノザンブロット分析あるいはＲＴ−ＰＣＲにより定量し、あるいは代りに本明細書に記載の方法により生成した蛋白量を測定するか、あるいは標識または他の遺伝子の活性レベルを測定することにより定量する。このように、遺伝子発現パターンは、作用剤に対する細胞の生理学的応答を示す標識として役立つ。この応答状態を、個体の該作用剤による治療前あるいは治療中の各時点において決定する。
【０２３３】
好ましい態様において、本発明は、被検者の作用剤（例えば作用薬、拮抗薬、擬似ペプチド、蛋白、ペプチド、核酸、小分子あるいは他の薬剤候補）（本明細書に記載の選別検定により同定される）の有効性をモニタリングする方法を与えるものであり、該方法は、（ｉ）該作用剤の投与前の被検者からの試料を取得する、（ｉｉ）該投与前試料中の標識蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する、（ｉｉｉ）該被検者からの一以上の投与後試料を取得する、（ｉｖ）該投与後試料中の標識蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する、（ｖ）投与前試料中の標識蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルと投与後の一以上の試料中の標識蛋白、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの発現レベルとを比較する、および（ｖｉ）必要に応じて、該被検者に対する該作用剤の投与量を変更する、各工程を含む。例えば、検出されたよりも高いレベルに標識の発現または活性を増大させたい場合には、該作用剤の投与量の増加、すなわち該作用剤の効果の増強、が好ましい。逆に検出されたよりも低いレベルに標識の発現または活性を低下させたい場合には、該作用剤の投与量の減少、すなわち該作用剤の効果の低減、が好ましい。この態様によれば、観察される表現型の応答がない場合にも、標識発現または活性を作用剤の有効性を指示するものとして用いられる。
【０２３４】
Ｃ．処置方法
本発明は、異常な標識発現または活性と関連する異常の危険性がある（あるいは感受性である）かあるいは異常を有する被検者を処置する予防および治療法の双方を与えるものである。予防および治療の双方としての処置は、薬理ゲノム科学の分野で得られた知識に基づいて、特別仕立てあるいは修飾され得る。本明細書において、「薬理ゲノム科学」には、遺伝子配列決定、統計遺伝子学および薬剤に対する遺伝子発現解析等の診療開発および市場における遺伝子技術を含むものである。より詳しくは、この語は、被検者個々の薬剤に対する応答を該被検者の遺伝子が如何に決定するか（例えば被検者の「薬剤応答表現型」あるいは「薬剤応答遺伝子型」）の研究を意味する。すなわち本発明の別の観点によれば、個体の予防ないし治療処置を、本発明の標識分子または標識修飾剤を用いて、個体の「薬剤応答遺伝子型」により特別仕立てする方法を与えるものである。薬理ゲノム科学は、診療士または医師が、予防あるいは治療処置を絞って、被検者が、その処置から最も利益を得、毒性の薬剤関連副作用を受ける処置を避けることを可能にする。
【０２３５】
１．予防法
一観点において、本発明は、ある被検者における標識蛋白の発現または活性と関連した疾患あるいは症状（例えば乾癬又はＴＨ１−関連状態）を、該被検者に、標識蛋白あるいは標識蛋白発現または少なくとも一つの標識蛋白活性を修飾する作用剤を投与することにより、防止する方法を与えるものである。増大したまたは減少した標識発現または活性が原因であるあるいは寄与する疾患の危険性のある被検者は、例えば、本明細書に記載する診断あるいは予後検定のいずれか、または組合せにより同定できる。標識蛋白発現の変化に特徴的な徴候が顕著化する前に予防剤の投与をして、疾患または異常を防止し、あるいはその進行を遅らすことができる。標識異常の型（例えば発現レベルの上昇または低下）に依存して、例えば、標識蛋白、標識蛋白作用薬または標識蛋白拮抗薬を、該被検者の処置に用いることができる。本明細書で記載する選別検定に基づき、適当な作用剤が決定される。
【０２３６】
２．治療法
本発明の別の観点は、治療目的で標識蛋白発現または活性を修飾する方法に関する。すなわち、本発明の修飾法のある例示態様においては、ある細胞を標識蛋白または該細胞と関連する標識蛋白活性の一以上を修飾する作用剤と接触させることが含まれる。標識蛋白活性を修飾する作用剤は、本明細書で記載する作用剤であり得る。例えば核酸または蛋白、標識蛋白の天然の標的分子（例えば標識蛋白基質）、標識蛋白抗体、標識蛋白作用薬あるいは拮抗薬、標識蛋白作用薬あるいは拮抗薬の擬似ペプチドまたは他の小分子である。一態様においては、該作用剤により、一以上の標識蛋白活性を刺激する。このような刺激剤の例としては、活性標識蛋白および細胞に導入された標識蛋白をコード化する核酸分子がある。他の態様においては、該作用剤により、一以上の標識蛋白活性を抑制する。そのような抑制剤の例としては、逆型標識蛋白核酸分子、抗標識蛋白抗体および標識蛋白抑制剤が含まれる。これらの修飾法は、体外で（例えば細胞を作用剤で培養）あるいは体内で（例えば作用剤を被検者に投与）で実施可能である。このように、本発明は、標識蛋白もしくは核酸分子の異常な発現または活性で特徴付けられる病状の疾患被検者の治療法を与えるものである。一態様においては、作用剤（例えば本明細書に記載の選別検定で同定された作用剤）あるいは標識蛋白発現または活性を修飾（例えば上方または下方調節）する作用剤の組合せが投与される。他の態様においては、減少したあるいは異常な標識蛋白発現または活性を補償するために、標識蛋白または核酸分子を治療剤として投与する。
【０２３７】
標識蛋白が異常に下方調節されている場合、および／または標識蛋白活性の上昇が効果的であると予想されるときは標識蛋白活性の刺激が望ましい。例えば、標識が下方調節されているときおよび／または標識蛋白活性の上昇が効果的であると予想されるときは、標識蛋白活性の刺激が好ましい。同様に標識蛋白が異常に上方調節されているとき、および／または標識蛋白活性の低下が望ましいと予想されるときは、標識蛋白活性の抑制が好ましい。
【０２３８】
３．薬理ゲノム科学
本発明の標識蛋白および核酸分子ならびに本明細書に記載の選別検定で同定された標識蛋白活性（例えば標識遺伝子発現）に対し刺激あるいは抑制効果を有する作用剤あるいは修飾剤は異常な標識蛋白活性と関連する標識関連異常（例えば乾癬又はＴＨ１−関連状態）の（予防あるいは治療）処置のために、個体に投与される。この処置と関連して、薬理ゲノム科学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬剤に対する個体の応答との関係の研究）が検討され得る。療法の代謝における差異は、投与量と薬学的に活性な薬剤の血中濃度との関係を変えることにより、深刻な毒性あるいは治療失敗につながり兼ねない。従って、医師あるいは診療士は、標識分子あるいは標識修飾剤による治療における投与量および生活規則の計画とともにある標識蛋白または標識分子を投与するか否かを決定する適切な薬理科学的研究において得た知識の適用を考慮する。
【０２３９】
薬理ゲノム科学は、投薬処置の変更と疾患者における異常な作用の故に、薬剤に対する応答における診療上有意な遺伝的変化を扱う。例えばＥｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ほか（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ほか（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６参照。一般的に、薬理ゲノム科学的状態の二つの型が区別される。薬剤が身体に作用する態様を変化する単一因子として伝達される遺伝的条件（薬剤作用の変化）または身体が薬剤に作用する態様を変化する単一因子として伝達される遺伝的条件（薬剤代謝の変化）とである。これらの薬理ゲノム科学条件は、稀な遺伝的欠陥として、あるいは自然に起る多形として、起り得る。例えば、グルコース６−リン酸デハイドロジナーゼ欠陥（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝的酵素病であり、酸化剤薬（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびファバ豆（ｆａｖａ  ｂｅａｎ）の食後の溶血反応が主たる診療上の困難となっている。
【０２４０】
「ゲノム・ワイド関連」と呼ばれる薬剤応答を予告する遺伝子を同定する薬理ゲノム科学的手法は、主として、既知の遺伝子関連標識からなるヒト・ゲノムの高解像マップ（例えば、ヒト・ゲノムの、それぞれが二変異物を有する６０，０００〜１００，０００の多形または変化部位からなる「二対立」遺伝子標識マップ）に依存する。このような高解像マップを、各々がフェーズＩＩ／ＩＩＩ薬剤試行に参加する統計的に有意な数の被検者のゲノムを含むマップと比較して、特定の観察された薬剤応答あるいは副作用と関連する遺伝子を同定する。代りに、このような高解像マップをヒト・ゲノムの数千万の既知の単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）の組合せから生成することもできる。本明細書において、「ＳＮＰ」は、ＤＮＡの延長における単一のヌクレオチド塩基中に発生する一般的な変質を意味する。例えば、ＤＮＡの１０００塩基毎に、一の割合で発生する。ＳＮＰは病理過程に関与することもあるが、大多数は病気と関連ないものである。そのようなＳＮＰの発生に基づく遺伝子マップが与えられれば、複数の個体を、それらの個々のゲノムの中の特定のＳＮＰパターンに基づいて、遺伝子カテゴリーにグループ化できる。このように、遺伝子的に類似の個体グループ毎に、それらに共通の特性を考慮に入れて、治療生活規則を特別仕立てすることができる。
【０２４１】
代りに、「候補遺伝子法」と呼ばれる方法を用いて、薬剤応答を予告する遺伝子を同定することもできる。この方法によれば、薬剤目標（たとえば、本発明の標識蛋白）をコード化する遺伝子が知られると、その遺伝子の全ての共通変種を核母集団において、かなり容易に同定することができ、該遺伝子の一変種が他の変種と対応すれば、これは特定の薬剤応答と関連すると決定される。
【０２４２】
ある例示態様においては、薬剤代謝酵素が、薬剤作用の強度および持続性の主たる決定因子である。薬剤代謝酵素（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多形の発見により、何故、ある種の被検者がある薬剤の標準的且つ安全量の投与を受けたときに、期待された薬剤効果が得られず、あるいは過大な薬剤応答ならびにひどい毒性を受けるのか、についての説明が与えられた。これらの多形は、その母集団について、二つの表現型で表わされる。ＰＭの有病率は、別の母集団では異なる。例えば、ＣＹ２ＰＤ６の遺伝子コードは高度に多形であり、ＰＭ中にいくつかの変異種が見出されているが、これらは全て機能性ＣＹＰ２Ｄ６の欠如をもたらす。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝の劣る者は、標準の量の投与を受けたときに、過大な薬剤応答および副作用をしばしば起す。代謝産物が治療活性部であれば、ＰＭは治療応答を示さず、これは、そのＣＹＰ２Ｄ６−形成代謝産物モルヒネに媒介されたコデインの鎮痛効果と同様である。他の極端な例は、いわゆる超急速代謝者であり、標準投与量には応答しない。最近、超急速代謝者の分子的根拠は、ＣＹＰ２Ｄ遺伝子増幅によると同定されている。
【０２４３】
代りに、「遺伝子発現プロフィール化」と呼ばれる方法が、薬剤応答を予告する遺伝子の同定に利用されている。例えば、例えばある薬剤（例えば、本発明の標識分子あるいは標識修飾剤）を投与した動物により、毒性に関与する遺伝子経路が刺激されたかどうかの表示を与え得る。
【０２４４】
上記した薬理ゲノム科学的方法の一以上から得られた情報を個体の予防または治療処置における適当な投与量と治療生活規則の策定に用いることができる。この知識を、薬剤の選択および投与量決定に適用することにより、副作用や治療失敗を避けることができ、従って、標識分子あるいは標識修飾剤（例えば、本明細書で記載の例示的選別検定の一により同定された修飾剤）による被検者の処置における治療あるいは予防効果を増強することができる。
【０２４５】
本発明を以下の例により更に説明するが、これら例は限定的なものと解されるべきでない。本出願を通じて引用された全ての文献、特許および公開された特許出願ならびに図および表は、参照により本明細書に含まれる。
【０２４６】
【実施例】
実施例１：標識ｃＤＮＡの同定および特性付け
（Ａ）ハイブリッド化のためのＲＮＡ調製
生体外転写（ＩＶＴ）反応中にラベル付きリボヌクレオチドを含めることにより、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター部位を含むクローンからラベル付きＲＮＡを調製した。ビオチン・ラベル付きまたはフルオレセイン・ラベル付きＵＴＰおよびＣＴＰ（ラベル付き：ラベルなし＝１：３）およびラベルなしＡＴＰおよびＧＴＰをＴ７ＲＮＡポリメラーゼの２５００Ｕとの反応に用いた。反応に続き、取り込まれなかったヌクレオチド・トリホスフェートを寸法選択膜（ミクロコン−１００，Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｙ，ＭＡ）により除いた。ＲＮＡの全モル濃度は２６０ｎｍの吸収測定に基づく。ＲＮＡの定量に続き、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテートｐＨ８．１、酢酸カリウム１００ｍＭ、酢酸マグネシウム３０ｍＭ中で、９４℃に３０〜４０分間加熱して、ＲＮＡを約５０塩基の平均の長さに無秩序に断片化した。断片化は、ＲＮＡ二次構造からの干渉の可能性を低減し、近い間隔のプローブ分子との多重干渉効果を減少する。細胞ＲＮＡから直接に作った物質として、Ｆａｖａｌｏｒｏほか（（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：７１８−７４９）の方法により細胞質ＲＮＡを抽出し、ポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴ選択工程（Ｐｏｌｙ  Ａｔｒａｃｔ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により分離した。Ｅｂｅｒｗｉｎｅほか（（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ８９：３０１０−３０１４）記載の手順を修正した方法により増幅した。ポリ（Ａ）ＲＮＡ  １μｇを、ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ，ＭＤ）およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを含むオリゴｄＴプライマーを用いて、二本鎖ｃＤＮＡに転換した。第二の鎖合成後に、反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、二本鎖ＤＮＡを膜濾過工程（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ−１００，Ａｍｉｃｏｎ）により分離した。ラベル付きｃＤＮＡは、上記したようなＩＶＴ工程によりｃＤＮＡプールから直接生成した。２６０ｎｍの吸収からラベル付きｃＲＮＡの全モル濃度を決定し、平均的ＲＮＡの大きさは１０００リボ核酸と推定した。１ＯＤがＲＮＡ  ４０μｇに等しく、細胞ｍＲＮＡの１μｇが３ｐｍｏｌのＲＮＡの分子からなるという慣習に従った。細胞ｍＲＮＡにも直接に、中間ｃＤＮＡ合成工程を用いることなく、ラベル付けを行った。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを記載したように断片化し、断片の５′末端をキナーゼ処理してビオチン化オリゴヌクレオチド（５′−ビオチン−ＡＡＡＡＡＡ−３′）ともに、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の存在下で一晩培養した。代りに、ｍＲＮＡ、ビオチンと結合したソラレン誘導体へのＵＶ−誘起架橋結合により直接ラベル付けした（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）。
【０２４７】
（Ｂ）アレイハイブリッド化および走査
ハイブリッド化溶液は、ＮａＣｌ  ０．９Ｍ、ＮａＨ２ＰＯ４  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．００５％を含むものとし、ｐＨ７．６に調節した（「６×ＳＳＰＥ−Ｔ」と称する）。更に、該溶液には、０．５ｍｇ／ｍｌのラベルなしの退化したニシンの精液ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含めた。ハイブリッド化に先立ち、該ハイブリッド化溶液中でＲＮＡ試料を９９℃で１０分間加熱し、氷上に５分間置き、ハイブリッド化フローセル中に加えるに先立って室温で平衡化させた。ハイブリッド化に続き、溶液を除き、アレイを６×ＳＳＰＥ−Ｔにより２２℃で７分間洗い、更に０．５×ＳＳＰＥ−Ｔにより４０℃で１５分間洗った。ビオチンラベル付きＲＮＡを用いるときは、ハイブリッド化ＲＮＡは、読取りに先立ち、ストレプトアビジン−フィコエリスリン共役体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により染色した。ハイブリッドアレイは、アビジン−フィコエリスリン２μｇ／ｍｌを含む６×ＳＳＰＥ−Ｔにより４０℃で５分間染色した。アレイを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ製のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ用走査型共焦点顕微鏡（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡから市販されている）により読取った。該走査器は、励起源としてアルゴンイオンレーザーを含むものであり、発光は５３０ｎｍバンドパス・フィルター（フルオレセイン）または５６０ｎｍ長波長フィルター（フィコエリスリン）のいずれかを通して光電子増倍器で読み取られる。正常型（ｓｅｎｓｅ）または逆型（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）配向の核酸をハイブリッド化に用いた。いずれかの配向のプローブ（互いに逆相補性）を有するアレイを、光化学工程の順序を逆にして、同じフォトグラフィー・マスクの組を用いることにより製造し、相補ヌクレオチドを取り込む。
【０２４８】
（Ｃ）ハイブリッド化パターンおよび強度の定量解析
アレイの定量的走査に引き続き、既知寸法のアレイおよび隅の対照領域を標識として用いて画像にグリッドを位置合せする。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの開発したソフトウェア（共焦点スキャナーとともに市販されている）を用いることにより画像を、位置および強度情報を含む単純テキスト・ファイルに変換する。この情報を、該アレイ上の物理的位置に関する情報を含む他のテキスト・ファイルと合体させて、該ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド・プローブを設定した該ＲＮＡの特定位置の配列および同定のための探索を行う。ハイブリッド化の結果の定量的解析には、特定のＲＮＡの存在の下には、平均して、ＰＭプローブは、そのＭＭパートナーに比べて、より強くハイブリッド化するという仮定に基づく簡単な形態のパターン認識が含まれる。ＰＭハイブリッド化信号が、ＭＭ信号より大であるという例の数は、各プローブ・セットに対し、ＰＭ／ＭＭ比の対数平均として計算されている。これらの値を用いて、あるＲＮＡの存在あるいは非存在に関する決定を（予め定めた決定マトリクスに従い）行う。ＲＮＡ量を決定するためには、各プローブ系について差（ＰＭ−ＭＭ）の平均を計算する。この差法の有利な点は、特異ハイブリッド化がよりＰＭプローブに寄与するのに対し、無秩序クロス・ハイブリッド化が、平均してＰＭおよびＭＭプローブに対し均等に寄与するからである。対となる差を平均することにより、クロス・ハイブリッド化の寄与は相殺傾向となるのに対し、真の信号は積極的に加算されるからである。二つの異なるＲＮＡ試料間の差を評価するに際して、同等に合成された複数のアレイについての並列実験からのハイブリッド化信号を直接比較する。差（ＰＭ−ＭＭ）の平均における変化の大きさは、各試料について既知量で差し込まれた（ｓｐｉｋｅｄ）内部標準細菌およびファージＲＮＡについてのスパイク試験の結果および信号と比較することにより解釈される。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより開発されたデータ解析プログラムにより、これら操作は自動的に行われる。
【０２４９】
（Ｄ）オリゴヌクレオチド・プローブ選択規則
各ＲＮＡの翻訳領域の３′末端における６００塩基の配列からオリゴヌクレオチド・プローブを選択した。一般的に云ってプローブは、任意の有用領域について決定され、コード領域の３′および５′末端、特定エキソンあるいは処理転写体の特異的な非翻訳領域を探索するために用いられる。更なる選択を、特異性とハイブリッド化特性を基準にして行った。特異性は、潜在的プローブ配列をモニターされる他の遺伝子の全長配列と比較することにより狭く評価し、（３以下の塩基のループを含めて）１７以上の位置で整合するものを除いた。この型の検索はより広汎に、プローブ配列をある特定の有機体の既知の全遺伝子配列と比較することにより行うこともできる。ハイブリッド化特性は、アレイハイブリッド化実験結果から発展させた一般配列規則に基づいて、評価した。特定サイトカインＤＮＡのプールを、厳格な条件の下に、１６０００プローブのねずみ（ｍｕｒｉｎｅ）サイトカインアレイとハイブリッド化した。更に、サイトカインＲＮＡを含まない複合ＲＮＡ母集団を同じアレイとハイブリッド化した。これらの二つの型の実験により、いずれのプローブが強くかつ特異的にハイブリッド化するか、ならびにいずれのプローブがより弱くあるいは無秩序なハイブリッド化剤であるかを決定した。これらのデータからプローブ選択の一般規則を抽き出すのに二つの方法を用いた。第１の方法においてはある配列形態の結果としてのプローブ特性を直接比較した。これにより、２０マー・プローブの選択についての発見的規則が得られた：すなわち（１）ＡまたはＴの合計数が１０未満、（２）ＣまたはＧの合計数が９以下、（３）８塩基のいずれの窓においてもＡまたはＴの数が７未満、（４）８塩基のいずれかの窓においてもＣまたはＧの数が６未満、（５）一行において、ＣまたはＧが５以下、（６）一行において、ＡまたはＧが６以下、（７）パリンドローム値が７未満（パリンドローム値はプローブの自己相補性の尺度である）、である。第２の方法によれば、該発見的規則に用いられた同じハイブリッド化データ上で整えられた神経ネットワークを用いた。該２０マー・プローブを８０ビット長入力ベクターに、最初の４ビットを該プローブで第１位置を、次の４ビットで該ビットの第２位置を、……それぞれ代表させるように、マッピングした。該ネットワークから二つの出力、すなわちハイブリッド化強度とクロスハイブリッド強度、が得られた。出力を、実験出力の９５％が０から１の範囲に収まるように直線的に目盛った。ネットワークは、Ｎｅｕｒａｌ  Ｗｏｒｋｓ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ２．５（Ｎｅｕｒａｌ  Ｗａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）からの標準パラメータを用いて、逆伝播ネットワークとして整えられた。該神経ネットワークは、８０入力ニューロン、２０ニューロンの一隠し層および２ニューロンの出力層を有する逆伝播ネットワークである。Ｓ状伝達関数を用いた。プローブ選択の最後の工程として、最も多くのオリゴヌクレオチド合成工程を要したプローブを排除した。最大工程数は６０（２０マーの任意の集合体を得るのに理論的に必要な８０工程より２０工程少ない）に制限した。この切り詰め工程は合成時間およびコストの節約に寄与する。
【０２５０】
（Ｅ）皮膚からの乾癬標識の同定
乾癬関連遺伝子を同定するために、４乾癬患者からの非疾患および疾患部皮膚を、上記したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｈｕ６８００  Ｇｅｎｅ  Ｃｈｉｐを用いて解析した。該解析において、非疾患皮膚を基準として用いた。１１０の遺伝子が統計的に有意な（ｐ＜０．５）二倍以上の遺伝子発現の増加または減少を示した。非乾癬組織に比べて、乾癬組織で発現の低下した遺伝子（合計１０）を表１に示す。これに対し、非乾癬組織に比べて、乾癬組織で発現の増加した遺伝子（合計１００）を表２に示す。乾癬と関連する（すなわち、乾癬組織で異なる発現を示す）ことが以前より知られていた遺伝子がいくつかある、すなわちＫＲＴ１７，Ｓ１００Ａ７，ＦＡＢＰ５およびＰ１３（表９）。これら遺伝子は、方法論の確かさを検証するために、積極的な対象物として解析に含めた。
【０２５１】
上記検定の検出限界は、約１：１０，０００分子である。当業界によく知られているより高感度の遺伝子発現変化の決定方法としては、逆トランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）がある。これらの研究を、何人かの乾癬患者からの非疾患および疾患皮膚からのいくつかの遺伝子について行った。その結果、更に１３の遺伝子が、非乾癬組織に比べて乾癬組織で、発現変化（発現の増大または減少のいずれか）を示した。遺伝子チップ解析を上記のように行い、異なる３患者から採取した試料についての結果を表８に示し、倍数変化によって遺伝子をランク付けした。
【０２５２】
（Ｆ）標識の位置解析
乾癬と関連があると知られるヒト遺伝子座がいくつかある。これには６ｐ２１．３，１７ｑおよびｌｑ２１がある（ＢａｌｅｎｄｒａｎほかＪ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１１３：３２２−３２８，１９９９；ＮａｉｒほかＨｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．６：１３４９−１３５６，１９９７；およびＣａｐｏｎほかＪ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６５：１７９８−１８００，１９９９）。本発明の遺伝子はマッピングされ、それら標識遺伝子のいくつかは、これらの既知の乾癬座に位置付けされている。但し、これらはいずれも以前は乾癬と関連付けられることはなかつた。これら遺伝子は表６および７に示してある（表７は、より少なく従って統計的有意性の低い遺伝子を含む）。
【０２５３】
実施例２：乾癬関連標識の更なる解析
（Ａ）血液からの乾癬関連標識の同定
皮膚組織の代りに血液組織を用いる以外は、上記実施例１（Ｅ）と同様の遺伝子チップ解析を行った。この解析により非疾患被検者からの血液試料と比べて、発現が増加した、または減少した遺伝子を表１０に示す。いくつかの遺伝子（例えばＳ１００Ａ１２、ＳＣＹＡ４）は、皮膚と血液結果の双方に現れるが、他は血液結果（表１０）あるいは皮膚結果（表１および２）に特異的である。
【０２５４】
（Ｂ）一般炎症反応についての標識でもある乾癬関連標識の同定
乾癬は白い鱗状の皮膚片で覆われた疾患皮膚領域で特徴付けられる。これらの疾患域は、部分的に局所的な炎症応答を含む。表１および２に示す遺伝子が乾癬自体に応答して異なる発現を示すか、あるいは炎症一般に応答するかを確認するために、二つの異なる検定を行った。第１の検定（テープ剥離検定）においては、テープ片を被検者の非乾癬皮膚に貼り付け、急に剥して局所的な炎症応答を刺激した。生じた皮膚の炎症領域から試料を採取し、ＲＮＡを抽出して上記遺伝子チップ解析を行い、正常な非テープ接触領域を対象と比較した。
【０２５５】
第２の検定においては、被検者の非乾癬皮膚に抗原を投与して遅延型の過敏（ＤＴＨ）応答を発生させた。当業界に知られているように（例えばＢｌｏｃｋ（１９９９）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ５（１）：７参照）、各種の抗原のいずれかを、被検者に皮膚注射すると、２４〜７２時間のうちに損傷域に硬化、ふくれおよび赤みを帯びた湿潤などの痕跡応答が現れ、これはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって修飾されたためであると考えられている。炎症域から試料を採取し、ＲＮＡを抽出して上記と同様に解析した。
【０２５６】
非乾癬組織に比べて、乾癬組織で発現低下を示すことが同定されていた遺伝子（表１）の全てが一般的な炎症反応を起した組織において発現の低下を示すことが見出された。非乾癬組織に比べて乾癬組織で発現の増大を示すことで知られていた遺伝子の一部は、正常組織に比べて炎症組織において、発現レベルの増大または低下を示し、これらの遺伝子は、一般の炎症組織に比べて、乾癬組織に特異的であることが示された（表３）。乾癬組織と一般炎症領域の両者で発現レベルの増大を示したものは表４に挙げてある。
【０２５７】
（Ｃ）乾癬におけるＴ−ヘルパー１細胞の改善
Ｔ−ヘルパー１細胞（ＴＨ１）が乾癬の原因または病態生理学において重要な役割を示していると考えられている。従って、本発明の標識のいくつかがＴ−ヘルパー細胞活性化に応答して発現される可能性について評価した。選択された標識の発現を活性化したＴＨ１およびＴ−ヘルパー２（ＴＨ２）細胞の双方において調べた。
【０２５８】
１．清純なＣＤ４＋Ｔ細胞の分離と細胞培養条件
北ロンドン輸血サービス（Ｎｏｒｔｈ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）または乳幼児さい帯（Ｒｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．；Ｃｈｅｌｓｅａ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）から血液を得た。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｍ−４５０ＣＤ４  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いる免疫磁気分離法により精製した。この方法で分離されたさい帯血液ＣＤ４＋細胞は＞９６％ＣＤ４＋であり、全てが清純な（ｎａｉｖｅ）表現型であった。
【０２５９】
２．Ｔ細胞の刺激
サイトカインの誘起のために、ＣＤ４＋細胞、ＩＬ−１２を含まない媒体中で一夜、予備培養し、再懸濁した（１０６細胞／ｍｌ）。５ｎＭカルシウム・イオノフォア・イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）および１００ｎＭ４−ホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（ｓｉｇｍａ）を含む媒体中で、０．２、６および２４時間培養した後、細胞を遠心分離により回収し、リン酸緩衝食塩水により１回洗浄してから、上記のようにＲＮＡを分離し、標識解析を行った。
【０２６０】
表５に示すように、いくつかの遺伝子がＴＨ２−細胞中に比べてＴＨ１細胞中で、２倍以上の発現を示した。これらのうち、三つのもの（ＭＸ１、ＧＮＡ１５およびＴＳＳＣ３）は、炎症で一般的に誘起されることが既知であるが、二つ（ＳＴＡＴ３およびＴＵＢＢ２）は、炎症誘起性であることは知られていなかったものである。他の異常、例えば多発性硬化症、クローン病および慢性関節リウマチがＴＨ１成分と関連することが知られているので、これらの標識は、他のＴＨ１−関連状態と同様に、これら他の疾患とも関連しているかも知れない。
【０２６１】
実施例３：標識解析を通じたｒｈＩＬ−１１およびシクロスポリンＡによる乾癬治療の有効性の評価
本発明の標識の一用途は、乾癬又はＴＨ１−関連状態の異なる処置ないし治療の有効性の評価にある。この実施例では、乾癬の二つの異なる治療、すなわちシクロスポリンＡ（ＣＳＡ）と組換えヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）の有効性の標識基準の解析を記載し、これら薬剤による処置の有効性の組織病理学的解析の結果を比較する。
【０２６２】
（Ａ）検査計画および被検者加入基準
重い乾癬（体表面積の＞１０％）に疾患した３人の被検者に２．５または５．０ｍｇ／ｋｇのｒｈＩＬ−１１を、８週間皮下投与した（Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１５２７−１５３７）、ｒｈＩＬ−１１の投与量選択は、生物学的活性が認められた、クローン（Ｃｒｏｈｎ）病の患者における診療試行の結果に基づいた。更に、同程度の病状の３被検者について、前述したように５ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡを投与した（Ｇｏｔｔｌｉｅｂほか（１９９２）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９８：３０２−３０９）。処置とともに、乾癬斑を選択して毎週病状の評価を行った。疾患皮膚から６ｍｍ打抜き生検試料を、ｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリンＡ処置前および処置中の１、４および８週において、採取した。更に処置開始前に、患者の選択する位置の非疾患皮膚の６ｍｍの打抜き生検試料を得た。生検試料は、免疫組織化学解析およびＲＮＡ調製に均等に分配された。
【０２６３】
（Ｂ）診療および組織病理学評価
各被検者についての包括的な評価は、治療前および後の各被検者の乾癬面積および重度計数（ＰＡＳＩ）評点に基づき、前述した方法により行った（Ｇｏｔｔｌｉｅｂほか（１９９２）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９８：３０２−３０９）。疾患生検試料部位における局所的病状活性のグレードは、乾癬重度計数（ＰＳＩ）により決定した。個々の乾癬疾患部を、鱗屑、紅斑および硬変の各々について、０〜６点の尺度（０：無、１：痕跡、２：軽、３：軽〜中、４：中、５：中〜重、６：重）を用い、最終評点は、個々の症状についての合計で０〜１８の範囲で定める（ＦｒｅｄｄｒｉｋｓｓｏｎおよびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎ（１９７８）Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １５７：２３８−２４４；およびＣｏｖｅｎほか（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３３：１５１４−１５２２）。組織病理学評価は、６ｍｍ打抜き生検試料の１／２について行った。ｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリンＡ処理の前および処理中の乾癬疾患部の凍結生検試料から低温切片（６μｍ）を調製した。切片は、ＣＤ３、ＣＤ８、Ｋ１６、Ｋｉ６７、ＩＣＡＭ−１またはＨＬＡ−ＦＲに対する抗体と反応させ、前述したように免疫組織化学的に処理した。前述（Ｇｏｔｔｌｉｅｂほか（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：４４２−４４７）の方法により、コンピュータ補助画像解析を行い、組織切片における皮下厚さおよびＣＤ３＋、ＣＤ８＋またはＫｉ６７＋細胞数を定量した。
【０２６４】
（Ｃ）標識解析
上記生検試料から標準法によりＲＮＡを抽出し、上記した遺伝子チップ解析により選別した。全三患者（番号３０１、３０２および３０４）を５ｍｇ／ｋｇのＣＳＡで処理した。図１に示すように、患者＃３０１は治療中において、ほとんど標識発現の変化を示さず、また組織病理学的解析（ＰＳＩ評点参照）により、検査中、中〜重の乾癬状態を示した。患者＃３０２および＃３０４は、初期の治療前試料から４週間の時点で試験した標識蛋白の多くにおいて、標識発現の顕著な（２倍を超える）増加あるいは減少を示した。同様にこれら二人については、ＰＳＩ評点が、実験の過程において、顕著に減少した。
【０２６５】
ｒｈＩＬ−１１による治療の標識解析においても同等な知見が得られた（図２）。患者＃２０２は、検査中を通じＰＳＩ評点９〜１１でわかるように治療に応答しなかった。患者＃２０２においては標識の大部分の発現は、検査中同様に変化しなかった。これに対し、ｒｈＩＬ−１１で処理した二患者においては、検査の当初の間に比べて、試験した標識の多くにおいて、８週までに二倍以上の発現の低下を示し、１２週までに殆ど全ての標識が発現の低下を示した。この結果は、８週および１２週における、ＰＳＩ評点の（それぞれ４および５への）低下と相関する。
【０２６６】
従って、本発明の標識の発現レベルは、ＣＳＡおよびｒｈＩＬ−１１による乾癬治療の有効性と相関し、これら二化合物の乾癬治療における有効性は、標識解析により評価できる。
【０２６７】
実施例４：疾患皮膚、非疾患皮膚および非乾癬炎症皮膚における乾癬関連標識の発現パターンの解析
蛋白機能およびレベルに影響するコード領域における変異は、伝統的に病気関連遺伝子について、検討されてきた。本実施例は、７０００を超えるヒト遺伝子を含むオリゴヌクレオチドアレイを用いて、非疾患および疾患乾癬皮膚ならびに非乾癬患者からの炎症皮膚のゲノム的走査をすることにより、ｍＲＮＡレベルで影響されるそのような遺伝子および／または経路について、記載するものである。多数の異なる調節を示した遺伝子が同定され、乾癬疾患と他の皮膚型との明瞭な分類ができた。
【０２６８】
（Ａ）検査計画および被検者加入基準
重い斑乾癬（体表面積の＞１０％）を有する患者は調査に加入する適格があると判断した。患者は、外来患者の基準で、ｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリンＡによる皮下処置を毎日８週間行った。投与量とスケジュールの選択は、前述（Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１５２７−１５３７）と同様に、ｒｈＩＬ−１１（２．５μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日、１ｍｇを週１日および２ｍｇを週１回）およびシクロスポリンＡ（５μｇ／ｋｇ／日）とした。処置のはじめに、検査コーディネイターにより、疾患の重度評点の判定のために、乾癬斑を選択した。６ｍｍの打抜き生検試料を、この疾患皮膚からｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリン処置前ならびにＩＬ−１１またはシクスロポリン処置中の１、４、８および１２週に採取した。さらに、処置に先立って、患者の選択する位置の非疾患皮膚から６ｍｍ打抜き生検試料を採取した。生検試料は、免疫組織化学解析およびＲＮＡ調製に均等に分配された。健康な志願者から、正常皮膚を採取した。
【０２６９】
（Ｂ）組織病理学評価
乾癬疾患部からｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリンＡの処置前、処置中および処置後に得た凍結生検試料から６μｍの低温切片を調製した。切片は、ＣＤ３、ＣＤ８、ケラチン１６、Ｋｉ６７、ＩＣＡＭ−１またはＨＬＡ−ＤＲの抗体と反応させ、前述（Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか、上述）したように免疫組織化学的に処理した。上記と同様に診断病状活性は、ＰＳＩ評点によりグレード分けした。
【０２７０】
（Ｃ）ＲＮＡの分離およびラベル付きマイクロアレイ・プローブの調製
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて６ｍｍ全厚皮膚生検試料から全ＲＮＡを分離した。２μｇの全ＲＮＡを、５′末端にＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するオリゴｄＴプライマーでプライム処理することによりｃＤＮＡに変換した。ＲＮＡは、１×第１鎖緩衝剤、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび０．５ｍＭ各ｄＮＴＰ中の２００単位Ｓｕｐｅｒｓｅｒｉｐｔ  ＲＴ  ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で５０℃、１時間の逆転写を行った。第２鎖ｃＤＮＡは、４０単位ＤＮＡ  ｐｏｌＩ、１０単位大腸菌ＤＮＡリガーゼ、２単位ＲＮアーゼＨ、３０μｌ第２鎖緩衝剤、３ｍｌ  １０ｍＨ各ｄＮＴＰおよび最終容量が１５０μｌになる量のｄＨ２Ｏを加え、１５℃で２時間培養して、合成した。このｃＤＮＡを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼキット（Ａｍｂｉｏｎ）による生体外転写のテンプレートとして用い、ビオチン化ＣＴＰおよびＵＴＰ（Ｅｎｚｏ）を加えた。ラベル付きｃＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＲＮＡを濃縮し、分光光度計で定量した。ラベル付きＲＮＡ（１０μｇ）は４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート８．０、１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、３０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ中、３５分間、９４℃で４０μｌに断片化した。
【０２７１】
（Ｄ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘミクロアレイへのハイブリッド化および蛍光の検出
ラベル付き且つ断片化したＲＮＡプローブを、にしんの精子ＤＮＡ  １００μｇ／ｍｌおよびアセチル化ＢＳＡ  ５０μｇ／ｍｌを含む１×ＭＥＳ緩衝剤中に希釈し、６８００のヒト遺伝子からなるオリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）。ラベル付きプローブを９９℃、５分間、次いで４５℃、５分間変性し、急いで不溶物を遠心分離により除いた。ハイブリッド化後、プローブを除去し、カートリッジを製造者（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の記載通りに、６×ＳＳＰＥＴで極度に洗浄した。
【０２７２】
データ解析はＧＥＮＥＣＨＩＰ  ３．２ソフトウェア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）により行い、各チップを内部細菌遺伝子対照物に対し正規化した。図３および表１２のデータを生成するために、遺伝子は、Ｅｉｓｅｎほか（（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１４８６３−１４８６８）の方法により、発現プロフィールの類似性に基づき階層別グループ化した。所定の試験において、全試料中に存在しないと決定された遺伝子は、倍数変化の基準ライン２未満のものと同様に、解析からは除いた。
【０２７３】
（Ｅ）定量的逆トランスクリフターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）解析
前述（Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか、前述）に記載の通り、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。患者生検試料からのＲＮＡ試料は、１０単位のＲＱ１ＤＮアーゼＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により３７℃、３０分間処理した。ＲＮＡをエタノール沈殿させ、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）−処理殺菌水中に再懸濁した。ｒＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、２５ｎｇの全ＲＮＡを逆転写し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｔａｑ  Ｍａｎ  ＥＴ  ＲＴ−ＲＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）とともに遺伝子特異性センスおよびアンチセンス・プライマーおよび５′末端を６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）で蛍光ラベル付けしたプローブを用い、更に製造者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の指定するＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出系を用いる単管検定により、増幅した。プライマーおよび蛍光ラベル付きプローブは、Ｐｒｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて生成し、且つＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒが合成した配列特異性増幅物は、増幅サイクル中に６−ＦＡＭの増大蛍光信号として検出された。遺伝子特異性メッセージレベルの定量は、既知ｍＲＮＡレベルの標準曲線からの蛍光強度と未知ｍＲＮＡの蛍光強度との比較に基づいた。ヒト酸性リボソーム蛋白（ＨＡＲＰ）に対応する遺伝子増幅は、ＲＮＡ量の変化の対照として全ての試料について行った（Ｖａｎ  Ｒｕｉｓｓｅｎほか（１９９８）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１０：３５８−３６３）。次いで全ての遺伝子は、ＨＡＲＰｍＲＮＡレベルに正規化された。遺伝子特異性メッセージレベルは、標準曲線から決定した正規化メッセージ単位としてグラフ化した。汚染テンプレートの対照として各増幅反応に無テンプレートの対照を含めた。有効な試料解析のためには、無テンプレート対照の蛍光強度はゼロであることが必要である。
【０２７４】
遺伝子発現変化の定量的尺度は、ＪＭＰ統計的発見ソフトウエアパッケージ（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて統計的に評価した。Ｆテストによれば、グループ間で変化は等しくなく、従って、データは対数変換した。非疾患および疾患皮膚間の差は、２−尾対Ｔ−テストにより解析した。非対Ｔ−テストを正常と非疾患皮膚の比較に用いた。全比較において、ｐ値＜０．０５を統計的有意として用いた。ＡＮＯＶＡを薬剤治療グループ間の差の比較に用いた。
【０２７５】
（Ｆ）患者分布統計学および非疾患、乾癬および正常皮膚の包括的発現解析
乾癬疾患部で異なる発現を示す疾患特異性遺伝子を発現するために、６ｍｍ−全厚打抜き生検試料を、中ないし重症の２４患者の非疾患および疾患皮膚から採取した。比較のために、非乾癬患者の正常皮膚からも限定的な数の生検試料を採取した。生検試料は、二分割し、半分は組織学的解析に供し、半分は瞬間凍結してＲＮＡ発現解析に用いた。患者分布統計によると、男女が均等に分割され、乾癬患者は、２３〜６１才で平均は４１才であった。患者のＰＡＳＩ評点は１１．６〜６８の範囲で平均は２９．７であった。平均生検部位評点（ＰＳＩ）は９で範囲は５〜１４であった（表１１）。皮下厚さ、Ｋｉ６７＋およびＫ１６ケラチノサイトおよびＣＤ３＋皮下リンパ球浸潤測定による組織解析で、疾患の診断が確認された（表１１）。
【０２７６】
８乾癬患者のグループ（サブセット）の疾患および非疾患皮膚から、ＲＮＡを調製して、正常皮膚と比較した。試料は約７０００のヒト遺伝子を含むオリゴヌクレオチドアレイ（Ｕｎｉｇｅｍコレクション：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）について解析した。包括的な遺伝子発現の比較によると、概ね１２９５〜１８５８遺伝子（試料ゲノムの１９％−２６％）が非疾患皮膚で発現し、１３５２〜２５８７遺伝子（試料ゲノムの１９％〜３８％）が疾患皮膚で発現した（表１１）。正常皮膚で発現した遺伝子数は、１３８３〜２３７５（２０〜２２％）で変化し、正常と疾患部で包括的な発現プロフィールに明白な差異は示さなかった。
【０２７７】
階層的相関係数、正常および非疾患皮膚の集合アレイならびに疾患皮膚のアレイを用いて、正常、非疾患および疾患皮膚試料における全発現遺伝子の発現パターンの集合解析を行った。これらの分類のデンドログラムによれば、類似皮膚型間についての発現プロフィールの患者間類似性が、患者内の非疾患および疾患皮膚型間の類似性に比べて大であることが示された。これら患者における、病状の重さあるいは他の利用可能な分布統計において、この集合パターンを説明し得る相関は見出されなかった。この結果によれば、発現プロフィールの非疾患および疾患皮膚における発現の有意度は、別の比較においても現れるであろうことを示している。
【０２７８】
（Ｇ）乾癬疾患遺伝子分類セットの同定
該８乾癬患者のグループの非疾患から疾患皮膚のｍＲＮＡ発現プロフィールの識別を行った。分類統計パラメータの混乱を減少するために、同一個人からの非疾患および疾患皮膚間での対をなす比較を行った。多数の異なる調節を示した遺伝子を同定した。概ね３４０〜１３２１遺伝子が、個別患者において、平均して２倍以上の増加または減少を示した（表１１）。直線回帰解析によれば、これら二つの母集団間での相関係数は０．８７となった。正常皮膚と非疾患皮膚との比較もまた高い類似度（相関係数＝０．９７）を示し、わずかに３４遺伝子が２倍以上の差異を示した。
【０２７９】
病状と無関係に異なる調節を示す遺伝子を減少するために、データ解析に統計的手法を採取した。非疾患および疾患皮膚間での平均頻度遺伝子発現値を計算し、対をなすｔ−試験を行った。これら二つの定義のグループ間で、信頼度の５％以上で、４７６遺伝子が統計的に有意に異なると同定された。このリストを互いにふるい分けて、非疾患と疾患皮膚間で平均して２倍以上の発現レベルの差を示す遺伝子のみを選択した。１５９遺伝子がこの第２の規準に適合した（図３）。これに対し、試料を無秩序に二グループに分類したときには、８アレイの２グループ間において、わずかに２８〜１０２遺伝子が統計的に有意となり、グループ間でわずかに６〜１５遺伝子が２倍以上の差を示した。Ｇｏｌｕｂほか（（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１−５３７））の定めた規則に従う分類予知解析によれば、上記１５９遺伝子の組は、正常、非疾患あるいは疾患皮膚に個有な発現パターンを１００％の確度で予知するために用いられる。従って、これら１５９の遺伝子は、斑乾癬についての、病気分類セットを構成する。
【０２８０】
（Ｈ）乾癬分類遺伝子の特性付け
上記異なる調節を示した１５９の遺伝子を可能な限り機能で特性付けた。関連する遺伝子は、転写調節、代謝制御、蛋白処理、細胞内信号、細胞サイクル制御、リンパ球調節および細胞外マトリクス破壊等の各種の機能に特性付けた。これら遺伝子の多くは、乾癬において、異なる調節を受けることが報告されている。例えば、ソリアシン（Ｓ１００Ａ７）、脂肪酸結合蛋白（ＦＡＢＰ５）、エラフィン（ＳＫＡＬＰ、ＰＩ３）、レチノイン酸結合蛋白（ＣＲＡＢ２）、鱗屑細胞癌抗原２（ＳＳＡＡ２）、デフェンシン（ＤＥＦＢ２）、ケソチン１７（Ｋ１７）よびケリチン１６（Ｋ１６）であり、本例で用いる比較法と一致するものである（図３）。
【０２８１】
以前は乾癬と関連付けられていなかった多くの遺伝子が、異なった調節を受けるものと同定された。例えば、過発現を示すものとして、Ｓ１００類メンバーのいくつか、例えば８１００Ａ１２（カルジザリンＣ、ＥＮＲＡＧＥ）、Ｓ１００Ａ１１およびＳ１００Ａ２；マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−１２）およびヘパリン結合蛋白１７（ＨＢＰ−１７）が見出される（図３）。例えばケリチン２、アポリ蛋白Ｅ（ＡＰＯＥ）、ＧＡＴＡ３、Ｒｂ１、カルポニン１（ＣＮＮ１）、シスタチン６（ＣＳＴ６）、ＴＩＭＰ−３およびＴＮＸＡは、非疾患皮膚に比べて、乾癬疾患皮膚で下方調節された。炎症および免疫調節に関与する、例えばＩＬ−４Ｒ、ＣＤ２、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＳＴＡＴ−１、ＩＦＩ２７、ＩＦＩ５６、ＭＸ１、ＭｎＳＯＤおよびＭＣＰ１は、非疾患組織に比べて疾患組織で上昇した（図３）。
【０２８２】
いくつかの転写調節の変化のオリゴアレイによる検出が正規対数法により確認され、定量ＰＣＲにより、より大なる乾癬患者母集団について確認された。追加の１６乾癬患者の解析により、Ｓ１００Ａ１２、ＨＢＰ１７、ＩＬ−４Ｒ、ＣＣＮＦ、ＬＡＤ１、ＭＡＰＫＫ３、ＭＭＰ−１２およびＤＳＧ３ｍＲＮＡレベルの疾患皮膚における上昇が確認された（図４Ａ）。またＣＳＴ６、ＴＮＸＡ、ＩＤ４、Ｔｉｍｐ３、ＧＡＴＡ−３、ＩＬ−５およびＡｐｏＥは、非疾患皮膚に比べて、疾患皮膚において、低いレベルを示すことも確認された。
【０２８３】
（Ｉ）他の皮膚炎症状態との比較発現プロフィール
異なる機構要件の他の皮膚炎症状態の発現プロフィールを生成して、これらの異なる調節を示す遺伝子の乾癬病態生理学における役割を特性付けた。これらの状態には、遅延型の過敏反応（ＤＴＨ）などの抗原誘起炎症およびテープ剥離等の皮膚刺激が含まれた。ＤＴＨ反応を誘起するために、３人の志願者がＤＮＣＢで感作され、７２時間後に第２回目のＤＮＳＢ投与が行われた。ＤＨＴ反応部位で採取した生検試料と、正常および疾患皮膚間で異なる調節を示した１８２〜９２５遺伝子が示された非疾患領域との比較が行われた（表１１）。平均して、三人の志願者全てにおいて、２５９遺伝子が２倍以上の差異を示した（図５Ａ）。三人の異なる被検者から、正常皮膚およびテープ剥離皮膚から生検試料を得た。該３志願者を通じて、概ね６２〜３０９遺伝子が、正常対疾患皮膚で差異を示した（表１１）。３テープ剥離試料の全てにおいて、１６１遺伝子が、平均して２倍以上の調節を示すものとして同定された（図５Ａ）。
【０２８４】
これらの発現プロフィールと１５９乾癬疾患遺伝子との比較がなされた（図５Ａ）。定性的に異なる調節を受けた遺伝子は、一緒にグループ化された。Ｋ１６、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ７、Ｓ１００Ａ９、Ｐ１３およびＤＥＦＢ２を含む１３遺伝子は、３炎症状態の全てにおいて異なる調節を受けた（図５Ｂ）。Ｓ１００Ａ１２（ＥＮＲＡＧＥ）、ＲＡＧＥおよびＧＡＴＡ−３を含む９４遺伝子が乾癬のみにおいて特異的に調節された。ＳＴＡＴ−１、ＩＬ−４ＲおよびＳＣＹＡ−２は、乾癬およびＤＴＨ反応後において異なる調節を受け（図５Ｃ）、Ｋ１７、Ｋ２ＡおよびＨＢＰ１７を含む３０遺伝子が乾癬および引き続くテープ剥離において異なる調節を受けた。１１遺伝子は、ＤＴＨとテープ剥離において共通であったが、乾癬においてはそうでなかった（データ非図示）。
【０２８５】
乾癬とＤＴＨ試料に共通の遺伝子は、単核細胞、Ｂ−細胞およびＴ−細胞等の免疫系の各種の細胞型で発現される免疫特異性の遺伝子あるいはＩＬ−１２またはＩＮＦ−γのような前炎免疫修飾サイトカインにより誘起される遺伝子であった。乾癬とテープ剥離試料とに共通の遺伝子は、ケラチノサイトのように上皮起源の細胞において発現される。乾癬特異性遺伝子は、好中球、白血球および角膜実質細胞等の細胞型の範囲と重なった。これら遺伝子はまた、代謝（ＡＴＰ１ＡＬ１、ＨＡＬ）、転写調節（ＩＤ１  ＩＤ４）、免疫修飾および炎症（Ｓ１００Ａ１２、ＩＦ１５６）および角質化膜発達および角膜実質細胞成長調節（ＴＧＭ１、ＧＴＢ２、ＳＰＲＲ２Ａ）等の細胞機能ないし役割の範囲と重なった。
【０２８６】
（Ｊ）異なる調節を受けた遺伝子の乾癬症座へのマッピング
多くの異なる調節を受けた遺伝子は、同定された６乾癬感受性遺伝子へマッピングした（表１２）。例えばＲＡＧＥ、ＭＤＦ１、ＩＤ４およびＴＮＸＡは、６ｐ２１．３のＰＳＯＲ１座にマッピングした。ＭＤＦＩは、非疾患部と比べて疾患部へ上方発現し、ＩＤ４、ＲＡＧＥおよびＴＮＸＡは下方発現した。ＭＡＰキナーゼ類のメンバー（ＰＲＫＭＫ３；ＭＥＫ３）、炎症過程に関与する二遺伝子、すなわちＳＣＹＡ２およびＭａｃ−２結合蛋白を含むいくつかの遺伝子について、染色体１７ｑのＰＳＯＲ２座への異なる発現が観察された。染色体１ｑ２１のＰＳＯＲ４座にマッピングしたいくつかの遺伝子が疾患領域で上方発現した；ＭＴＸならびにＳ１００Ａ１２、Ｓ１００Ａ２およびＳ１００Ａ９等のいくつかのＳ１００遺伝子類メンバーである。興味のあることには、Ｓ１００Ａ２は、６ｐ２１．３のＰＳＯＲ１座にマッピングしたＲＡＧＥ受容体の配位子である（Ｈｏｆｆｍａｎほか（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９７：８８９−９０１）。一遺伝子ＡＣＰＰは、３ｑ２１のＰＳＯＲ５座にマッピングした。また信号変換（ＣＮＮ１、ＧＮＡ１５）またはＬＤＬ信号発生（ＬＤＬＲ）に関与する三遺伝子は１９ｐ１３のＰＳＯＲ６座にマッピングした。より大なる患者母集団における、これら遺伝子の選択されたグループ、例えばＰＲＫＭＫ３、ＨＢＰ１７、Ｓ１００Ａ１２、ＭＴＸ、ＴＮＸＡおよびＩＤ４、の定量ＲＴ−ＰＣＲ解析により、最初の遺伝子チップによる知見が確認され、検査した患者の全てについてのこの逆調節との対応が示された（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０２８７】
（Ｋ）応答遺伝子の薬理ゲノム科学的分類により同定された患者の薬理学的処置  遺伝子発現の変化は通常、病状と関連するという暗黙の仮定がある。しかしながら、発現変化は、また疾患過程の結果でもあり得る。発現が診療上の改善を反映して変化する、あるいは、診療上の改善にも拘わらず変化しない遺伝子に比べて、診療上の改善に先立って起る遺伝子変化は、病状進行についてのより多くの因果的役割を果たしていると仮定した。調節変化を示した遺伝子と疾患との可能な因果関係をよりよく理解するために、以前より乾癬疾患評点を有意に改善することが示されている治療法による薬理処置の前、中および後において、乾癬患者から疾患部生検試料を採取した。
【０２８８】
患者は、実験として、免疫修飾サイトカインｒｈＩＬ−１１あるいは免疫抑制剤シクロスポリンＡで処置した。インターロイキン１１は、乾癬患者に対して活性を有し、診療上および組織病理学上の評点の改善を示し、それらの変化は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１２ｐ４０等のタイプＩのサイトカインの発現レベルの時間的減少、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５等のタイプＩＩのサイトカインの上方発現と関連する（Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎｉ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４：１５２７−１５３７）。ｒｈＩＬ−１１は、一部、ＮＦ−κＢ核転座の抑制を通じて前炎サイトカイン生成を減少することを示している（Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５６６１−５６７０）。シクロスポリンＡは、乾癬に活性な免疫抑制剤であり、乾癬疾患部で前炎サイトカインｍＲＮＡ生成を抑制する（Ｇｏｔｔｌｉｅｂほか（１９９２）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９８：３０２−３０９；Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか、上記）。機能的には、シクロスポリンＡは、多くの前炎経路、特にカルシニューリン／ＮＦＡＴ経路、に対し抑制効果を示すｒｈＩＬ−１１とは区別される。これら二薬剤による処置後の非疾患および疾患皮膚間での発現レベルの比較により、治療介入経路の種々の範囲をカバーできる。
【０２８９】
ｒｈＩＬ−１１は、皮下経路により、５μｇ／ｋｇ／日あるいは週１回１ｍｇまたは２ｍｇの投与量で、患者に投与された。シクロスポリンＡは、５μｇ／ｋｇ／日で投与した（Ｇｏｔｔｌｉｅｂほか上記）。１５患者をｒｈＩＬ−１１で、また９患者をシクロスポリンＡで、８週間処置した。これらの処置に対するこれら患者の応答速度は以前に報告した（Ｇｏｔｔｌｉｅｂほか、上記；Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか、上記）。
ｒｈＩＬ−１１処置患者１５人中８人、およびシクロスポリンＡ処置患者９人中８人が、いくつかの診療上および組織病理学上の変化で定義される治療応答を示したと判断された（Ｔｒｅｐｉｃｃｉｏほか上記）。
【０２９０】
薬剤処置中にわたって発現パターン変化を起した遺伝子を同定するために、薬剤投与前および薬剤投与開始後１、４、８および１２週の時点で、応答および非応答患者間で、疾患皮膚の発現パターンを比較した。最初に、ｒｈＩＬ−１２処置患者４人（３人は応答あり、１人は非応答）およびシクロスポリン処置患者３人（２人は応答あり、１人は非応答）について、遺伝子チップ解析を行った。これらの７患者について、疾患および非疾患皮膚間で有意に異なる発現を示した１６５遺伝子について、処置中の発現レベルをモニターした。
【０２９１】
薬理ゲノム発現パターンの同定に資するために、自己組織マップ（ＳＯＭ）を採用した（Ｔａｍａｙｏほか（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：２９０７−２９１２）。応答患者における薬剤処置中の４つの遺伝子発現パターンが、この遺伝子セットにより同定された（図６）。これに対し、非応答患者は、薬剤処置期間を通じて、この遺伝子セットにおいて、発現パターンの有意な変化を示さなかった。これらの集団の一は、薬剤治療開始から１週で早くも非疾患皮膚レベルへ発現レベルが戻り始めた遺伝子に相当する（図６、グループＩ）。これらの変化は、平均ＰＡＳＩ評点で測定される有意な診療上の改善に先立って現れた。ＨＢＰ１７、ＳＣＹＡ２、ＰＲＫＭＫ３、ＧＮＡ１５、ＰＨＢおよびＭＴＸを含む３６遺伝子のレベルは、ｒｈＩＬ−１１処置および／シクロスポリンＡ処置応答患者の１週間の治療で有意な変化が認められたが、検査した非応答患者については認められなかった。第２のパターンは、その発現パターンが、疾患皮膚のレベルに戻ったが、それは薬剤治療の終わりのみにおいてであって、診療の改善に先立つものではなかった（図６、グループＩＩ）。この集団は、異なる調節を示した１６５遺伝子中、９７遺伝子が含まれる。第３の発現パターンには、患者皮膚疾患部における診療上の改善にも拘わらず、治療期間中、発現レベルが変化しなかった１９遺伝子が含まれる（図６、グループＩＩＩ）。最後の集団には、薬剤処置期間にわたって、その発現レベルが上昇した遺伝子が含まれる。例えばＴＮＸＡ、ＲＡＧＥ、ＩＤ４およびＧＡＴＡ３など、これら遺伝子のいくつかの発現レベル変化は、診療改善に先立って現れた（図６、グループＩＶ）。
【０２９２】
診療改善に先立つ遺伝子発現レベルの変化は、疾患進行に関する潜在的原因の役割を示すか、あるいは診断有効性の早期標識となり得るものである。より大なる患者母集団について、これら早期応答性遺伝子の遺伝子発現変化を解析するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｓ１００Ａ１２、ＨＢＰ１７、Ｋ１６、ＣＣＮＦ、ＳＣＹＡ２、ＰＲＫＭＫ３、ＩＤ４、ＣＳＴ６およびＴＮＸＡの遺伝子発現レベルを、ｒｈＩＬ−１１処置の１５患者およびシクロスポリンＡ処置の９患者について解析した（図７、データ図示せず）。前のより小さい患者母集団ついての遺伝子チップ解析と一致して、応答患者については薬剤治療後１週間において早くもシクロスポリンＡまたはｒｈＩＬ−１１に応答する同様な遺伝子発現変化が観察されたが、非応答患者については観察されなかった。多くの例において、この遺伝子発現変化は、これら患者の診療改善に先立って起った。ｒｈＩＬ−１１とシクロスポリン処置患者間で定性的な有意差は認められなかった。８週における薬剤治療の停止後、Ｋ１６、Ｓ１００Ａ１２およびＣＣＮＦ等のこれらの遺伝子のいくつかについては、ｍＲＮＡ発現レベルが１２週で非処置疾患部レベルへとリバウンドし始め、これら遺伝子の病状進行との因果的役割を示した（図７）。これらの結果はまた、これら遺伝子あるいはこれら遺伝子で定まる経路が、適当な治療介入点であることを示している。
【０２９３】
（Ｌ）遺伝子解析
多数の患者からの乾癬疾患および非疾患皮膚の遺伝子発現プロフィールの比較により、異なる調節を示す１５９を超える遺伝子が同定された。予知解析により、これら遺伝子は、病状の予知セットを構成することが示された。この手法の実効化として、ソリアシン、エラフィン、ＦＡＢＰ５、デフェンシン、Ｋ１６およびＳＣＣＡ２等の乾癬疾患部で異なる調節を受けるものとして以前から同定されていた多くの遺伝子について、遺伝子発現プロフィールを同定した。この遺伝子セットと、ＤＴＨおよびテープ剥離等の他の皮膚炎症状態との比較により、このセットを構成する遺伝子のいくつかは、乾癬特異性であるが、他のものは、一般の皮膚炎症状態と共通であり、他の自己免疫疾患にも同様に関与し得る。
【０２９４】
ＤＴＨ応答において、抗原特異的に活性化される遺伝子は、慢性関節リウマチ、クローン病等の各種の炎症状態に関与し得るが、テープ剥離反応において活性化される遺伝子は、皮膚の一般損傷においてより根源的に関与し得るものである。ＤＴＨ応答において、上方発現を示すものとして今回の研究で同定された調節変化遺伝子であるＭＭＰ−１２は、以前、マクロアレイ解析によりクローン病およびＲＡ組織において、下方調節を受けるものとして示されているものである（Ｈｅｌｌｅｒほか（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：２１５０−２１５５）。ＨＢＰ１７のようにテープ剥離試料において上方発現した他の遺伝子は、新脈管形成および傷治癒に関与するものとして示されているものである（Ｃｚｕｂａｙｋｏほか（１９９７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１３７−１１４０）。最後に、免疫修飾治療による患者処置後のこの遺伝子セットの解析によれば、診療改善に先立つ遺伝子発現パターンの同定に薬理ゲノム解析が利用できることが示される。早期応答遺伝子は、疾患プロセスに根源的に関与し得る。
【０２９５】
これらの遺伝子発現プロフィールの変化に基づき、例えば腫瘍細胞および乾癬疾患部において異なる調節を受ける遺伝子、例えばＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＳＴ６（シスタチン６）およびＨＢＰ１７（ヘパリン結合蛋白１７）、の間において、ある種の類似性が認められる。ＣＴＳＢは、抗原処理に関与するリソソームシステインプロテアーゼである。腫瘍状態において、ＣＴＳＢは多くの腫瘍型に発現し、その局在化は、新脈管形成、炎症および壊死領域と相関する（Ｈｕｇｈｅｓほか、上記）。腫瘍細胞の接触抑制の喪失に関するものと解される。カテプシンＢの抗プロテアーゼ抑制剤であるシスタチン６の発現は、腫瘍試料において下方調節を受け、これは腫瘍の進行と関連付けられている（Ｓｏｔｉｒｏｐｏｎｌｏｕほか、上記）。乾癬患者の表皮におけるカテプシンＢの上方発現およびシスタチン６の下方発現は、ケラチノサイト成長および変化の下方調節に寄与し得る。同様に、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）対応ヘパリン結合蛋白であるＨＢＰ１７は、鱗屑性の細胞癌で上方発現される（Ｃｚｕｂａｙｋｏほか、上記）。ＨＢＰ１７のリボ酵素特異性ターゲッティングは、マウスの異種移植腫瘍の成長抑制と新脈管形成をもたらした。面白いことに、ＨＢＰ１７は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼにより上方調節され、ｐ３８の抑制は、ＨＢＰ１７生成の損失をもたらし、疾患の進行におけるｐ３８経路の関与を示している（Ｈａｒｒｉｓほか、上記）。乾癬におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の下方調節および炎症過程への影響は、表皮におけるＨＢＰ１７の上方調節をもたらし、新脈管形成の増大と異常なケラチノサイト成長をもたらすものであろう。
【０２９６】
面白いことに、本明細書で同定される乾癬遺伝子セットにおける２８遺伝子は６つの既知の乾癬感受性座のいずれかにマッピングする。染色体疾患座にある下方調節遺伝子は、該疾患の病因に根源的に関与しているかと思われる。転写調節あるいはメッセージ安定性に影響するこれら２８遺伝子の領域における常染色体あるいは体幹変異は、感染進展の危険の増大に関与し得る。更に、これらの遺伝子のいくつかは、転写因子にコードし、その異常な発現は該疾患の進展に更に寄与する下流経路を下方調節するのに寄与し得る。
【０２９７】
これら２８遺伝子は、転写および細胞内信号修飾体から免疫修飾および炎症に関与する分布生成物への細胞表面信号受容体まで、多様な細胞機能を有する。これらの遺伝子の細胞増殖／変化ならびに免疫あるいは炎症修飾に関する既知の機能は、これら分子の蛋白生成物の該疾患の病因への関与を支持するものである。例えば、一遺伝子として、６ｐ２１．３のＨＬＡ座に位置するＩＤ４は、転写因子の塩基性らせん−ループ−らせん（ｂＨＬＨ）の優勢／劣勢調節体であり、各種の細胞直系物における細胞変化および増殖の一般的な拮抗物質となる（Ｒｅｉｃｈｍａｎほか、Ｄａｇｌｉｓｃｃａほか；上記）。細胞損傷は、ＩＤ４の下方調節をもたらし、細胞消滅の減少をもたらす（Ａｎｄｒｅｓ−Ｂｒａｇｕｉｎほか、（１９９８））、Ａｎｄｒｅｓ−Ｂｒａｇｕｉｎほか、（１９９９）、上記）。上皮におけるＩＤ４の減少は、それが遺伝的変異によるものであれ、傷害によるものであれ、ケラチノサイト成長を抑制するいくつかの下流のｂＨＬＨ転写因子の下方調節をもたらす。他の遺伝子として、ｌｑ２１に位置するＳ１００Ａ１２（カルグラニュリンＣ）は、前炎ＮＦ−κＢ経路の活性化に関するものとされていたＲＡＧＥ受容体の可溶性リガンドである（Ｗｉｃｋｉほか、Ｈｏｆｍａｎほか、上記）。該ＲＡＧＥ遺伝子は、６ｐ２１．３のＰＳＯＲ１座にマッピングする。最後に、ＰＲＫＭＫ３は、ｐ３８ＭＡＰＫの上方調節体である、マイトジェン−活性化蛋白キナーゼゼキナーゼ３（ＭＫＫ３）である（Ｅｎｓｌｅｎほか、上記）。ｐ３８ＭＡＰＫは、ＴＮＦ−αなどの前炎分子により活性化され、炎症過程に関与する。ｐ３８活性の遮断により、炎症状態は低減する（Ｈｅｒｌａａｒ、上記）。
【０２９８】
本明細書で記載した結果によれば、ｌｑ２１のＰＳＯＲ４座に位置するＳ１００遺伝子類の多くが、疾患組織に等価的に調節変化を示し、これは従来の知見と調和している（Ｈａｒｄｏｓほか（１９９６）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０６：７５３−７５８）。座制御領域における変異によりこれら知見が説明できよう。Ｓ１００Ａ１２等の、該座における単一Ｓ１００遺伝子が危険性に寄与しているかも知れないし、あるいは未同定の遺伝子がこれらの変異と結合不均衡にあるのかも知れないし、あるいはいくつかの下方調節Ｓ１００遺伝子が連携して危険性に寄与しているのかも知れない。診療改善に先立つ遺伝子発現変化は、診療改善を反映する遺伝子発現変化あるいは診療改善にもかかわらず発現の変化しない遺伝子よりも、疾患の進行により因果的に関与していると思われる。異なる調節を示した３６遺伝子のサブセットは、ｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリンＡによる治療介入後に、診療改善に先立つ時点で、正常あるいは非疾患レベルに戻るものと同定された。このグループに属するメンバーは、ＩＤ４、ＨＢＰ−１７、ＫＲＴ１６、Ｓ１００Ａ２、Ｓ１００Ａ９、Ｓ１００Ａ２、ＧＮＡ１５、ＭＴＸ、ＰＲＫＭＫ３およびＳＣＹＡ２を含み、これらは全て乾癬疾患座に局在化した。更に、例えばＩＲ−４Ｒ、ＣＤ２およびＧＡＴ３等のいくつかの免疫修飾遺伝子がこのカテゴリに入った。
【０２９９】
【表１】
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【０３００】
【表２】
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【０３０１】
【表３】
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【０３０２】
【表４】
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【０３０３】
【表５】
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【０３０４】
【表６】
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【０３０５】
【表７】
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【０３０６】
【表８】
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【０３０７】
【表９】
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【０３０８】
【表１０】
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【０３０９】
【表１１】
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【０３１０】
【表１２】
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【０３１１】
【表１３】
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【０３１２】
【表１４】
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【０３１３】
【表１５】
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【０３１４】
均等物
当業者は、本明細書で記載した特定の態様の多くの均等物を認識し、あるいは定型的な実験により確認できるであろう。それら均等物は、以下のクレームの範疇に入ることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１：対照の非疾患（例えば非乾癬）皮膚試料と対比した乾癬用シクロスポリンＡ治療中の患者からの皮膚試料における標識蛋白発現表。淡い陰影を付した値は、対照値に比べて少なくとも２倍減少した標識発現レベルを示し、濃い陰影を付した値は対照値に比べて、２倍以上増加した標識発現レベルを示す。
【図２】
図１（つづき）
【図３】
図１（つづき）
【図４】
図２：対照の非疾患（例えば非乾癬）皮膚試料と対比した乾癬用組換え型ヒトＩＬ−１１（ｒｈＩＬ−１１）治療中の患者からの皮膚試料における標識蛋白発現表。淡い陰影を付した値は、対照値に比べて少なくとも２倍減少した標識発現レベルを示し、濃い陰影を付した値は対照値に比べて、２倍以上増加した標識発現レベルを示す。
【図５】
図２（つづき）
【図６】
図３：乾癬の疾患および非疾患皮膚間での１６５の統計的に有意に発現した遺伝子を記載する表。６人の乾癬患者からの疾患および非疾患皮膚を取得し、オリゴヌクレオチド列へとＲＮＡ・ハイブリッド形成した。６非疾患試料および６疾患試料の平均頻度値と標準偏差値を計算した。対をなす学生によるｔテストを行いｐ値を検出する。０．０５より小さい値は統計的に有意であると解した。遺伝子発現が何倍変化するかを、非疾患皮膚と対比した損傷皮膚の平均頻度の比として計算した。データを何倍の変化であるかで示し、平均頻度値に対しコード化した。機能的有意性により、遺伝子をグループ化してある。
【図７】
図３（つづき）
【図８】
図４Ａおよび図４Ｂは、より多くの患者母集団によるいくつのチップ結果のＲＴ−ＰＣＲ確認のグラフであり、図４Ａは、非疾患皮膚に比べて乾癬疾患部で上昇した遺伝子を示し、図４Ｂは乾癬疾患部に比べて、非疾患部で上昇した遺伝子を示す。非疾患および疾患皮膚に対しての平均発現値および標準偏差を示した。学生ｔ試験を行って、統計有意性を示す。
【図９】
図５Ａ：ＤＴＨ、テープ剥離および乾癬発現結果のＶｅｎ図表比較。非疾患および疾患乾癬皮膚間、正常およびＤＴＨ皮膚間ならびに正常およびテープ剥離皮膚間において、２倍以上に異なる調節を示した遺伝子を計算した。各種試料タイプの重なりを計算した。
図５Ｂ：テープ剥離後および乾癬疾患部において異なる調節を受けた２９遺伝子の棒グラフ。
【図１０】
図５Ｃ：ＤＴＨ反応後および乾癬疾患部において異なる調節を示した２６遺伝子の棒グラフ。
図５Ｄ：ＤＴＨ反応後、テープ剥離および乾癬疾患部において、異なる調節を示した１６遺伝子の棒グラフ。
【図１１】
図６：ＩＬ−１１およびシクロスポリン処置後の選別された遺伝子についての自己組織マップ（ＳＯＭ）解析結果を示す。ｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリンＡで処置した７患者からの非疾患および疾患皮膚についてオリゴヌクレオチドアレイ解析を行った。生検試料を基準および処置後１週、４週、８週および１２週で採取した。患者は、診療および組織病理学の基準から応答者（ｎ＝４）および非応答者（ｎ＝３）に分類した。応答者および非応答者グループの基準、１週、４週、８週および１２週の疾患部皮膚における平均発現値を計算した。２８の生検試料を用いて４集団（１×４）ＳＯＭを得た。各ＳＯＭに含まれる遺伝子はマップの右側に示す。遺伝子は乾癬疾患遺伝子座によってコード化される。
【図１２】
図７：より大なる患者母集団を用いた、ＲＴ−ＰＣＲにより早期応答遺伝子解析のグラフを示す。ｒｈＩＬ−１１またはシクロスポリンＡで処置した２４患者から得た皮膚生検試料を、基準および治療１週、４週、８週および１２週で得た。患者は診療および組織病理学基準の組合せにより、治療応答者と非応答者に分割された。選択された遺伝子について定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。各時点での患者の平均ＴａｑＭａｎ単位および標準偏差を計算して示す。統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を「＊」で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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