(57)【要約】本発明はワクチン接種した対象に体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発するための抗原蛋白質ワクチン接種のアジュバントとしての種々の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の使用方法を提供する。これらの融合蛋白質と内在及び／又は外来抗原蛋白質を含む組成物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を含む組成物であって、融合蛋白質が疾患関連抗原の有効なアジュバントを含む前記組成物。
【請求項２】
更に抗原を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が前記抗原に対して抗体特異性をもつ請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がサイトカインドメイン、サイトカイン配列、サイトカインのサブ配列、ケモカインドメイン、ケモカイン配列、ケモカインのサブ配列、又はサイトカインもしくはケモカイン以外の免疫刺激剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及びそのフラグメントから構成される群から選択される免疫刺激剤ドメインを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がリンカーを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の抗体ドメインがＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に特異的な抗体を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の抗体ドメインが腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、真菌抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患抗原、又は寄生虫抗原に特異的な抗体を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の抗体ドメインが腫瘍抗原以外の抗原に特異的な抗体を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が抗体フラグメント、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ´ドメイン、Ｆ（ａｂ´）２ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン及びｓｃＦｖドメインから構成される群から選択されるドメインを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３から構成される群から選択されるドメインを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
抗原が可溶性抗原、マトリックスに結合した可溶性抗原、マトリックスに結合した不溶性抗原、抗原の不溶性凝集物、生存不能細胞関連抗原、もしくは生存不能生物関連抗原、又はリポソームに封入した抗原から構成される群から選択される１種以上の抗原を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
抗原がＨＥＲ２／ｎｅｕ又は腫瘍細胞から脱落したＨＥＲ２／ｎｅｕ、そのフラグメントを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
抗原が腫瘍抗原以外の抗原を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
抗原が対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
対象の体内の疾患状態が腫瘍、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、プリオン、自己免疫疾患、又は感染性寄生虫の１種以上に起因する請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
抗原が腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患関連抗原又は感染性寄生虫抗原を含む請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
抗原が外来抗原を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
外来抗原が対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原と実質的に同一の抗原を含む請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
抗原が第１の数の分子を含み、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が第２の数の分子を含む請求項２に記載の組成物。
【請求項２１】
第１の数の分子と第２の数の分子の比が約１：１であるか、第１の数の分子が第２の数の分子よりも多いか、第１の数の分子が第２の数の分子よりも少ないか、又は第２の数の分子が第１の数の分子により実質的に飽和されている請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
抗原と抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を選択時間にわたって選択条件下でインキュベートする請求項２に記載の組成物。
【請求項２３】
組成物が更に賦形剤又は医薬的に許容可能な賦形剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を提供する段階と、融合蛋白質を対象に投与する段階を含む免疫組成物の投与方法であって、融合蛋白質が疾患関連抗原に有効なアジュバントを含み、融合蛋白質と抗原が共同して対象に免疫応答を誘発する前記方法。
【請求項２５】
免疫組成物の投与が抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を提供する段階と、疾患関連抗原を提供する段階と、融合蛋白質と抗原を対象に投与する段階を含み、融合蛋白質が抗原の有効なアジュバントを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がサイトカインドメイン、サイトカイン配列、サイトカインのサブ配列、ケモカインドメイン、ケモカイン配列、ケモカインのサブ配列、又はサイトカインもしくはケモカイン以外のドメインを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及びそのフラグメントから構成される群から選択される免疫刺激剤ドメインを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の抗体ドメインがＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に特異的な抗体を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の抗体ドメインが腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、真菌抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患抗原、又は寄生虫抗原に特異的な抗体を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の抗体ドメインが腫瘍抗原以外の抗原に特異的な抗体を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が抗体フラグメント、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ´ドメイン、Ｆ（ａｂ´）２ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン及びｓｃＦｖドメインから構成される群から選択されるドメインを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が前記抗原に対して特異性をもつ請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
抗原が腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患関連抗原、又は感染性寄生虫抗原を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
抗原が腫瘍抗原以外の抗原を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
抗原が対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
対象の体内の疾患状態が腫瘍、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、プリオン、自己免疫疾患、又は感染性寄生虫の１種以上に起因する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗原が外来抗原を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
外来抗原が対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する疾患関連抗原と実質的に同一である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与する前、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与した後、又は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与するとほぼ同時に外来抗原を投与する請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
同時投与前に外来抗原を選択時間にわたって選択条件下で抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と共にインキュベートする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
抗原がＨＥＲ２／ｎｅｕ又は腫瘍細胞から脱落したＨＥＲ２／ｇＭ、そのフラグメントを含む請求項２４に記載の方法。
【請求項４３】
抗原が第１の数の分子を含み、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が第２の数の分子を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項４４】
第１の数の分子と第２の数の分子の比が約１：１であるか、第２の数の分子が第１の数の分子により実質的に飽和されているか、第１の数の分子が第２の数の分子よりも多いか、又は第２の数の分子が第１の数の分子よりも多い請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が第１の免疫刺激剤ドメインをもつ第１の融合蛋白質と少なくとも第２の免疫刺激剤ドメインをもつ少なくとも第２の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項４６】
第１のドメインと少なくとも第２のドメインが異なる免疫刺激剤ドメインを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
第１のドメインと少なくとも第２のドメインがケモカイン、サイトカイン、又は非サイトカイン／非ケモカイン免疫刺激分子の１種以上を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
第１のドメインと少なくとも第２のドメインがサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及びそのフラグメントから構成される群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
第１の融合蛋白質が第１の抗体特異性をもち、少なくとも第２の融合蛋白質が第２の抗体特異性をもつ請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
第１の抗体特異性と少なくとも第２の抗体特異性が単一分子に存在する異なる抗原、単一細胞に存在する異なる抗原、単一腫瘍細胞に存在する異なる抗原、単一生物に存在する異なる抗原に対する特異性である請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
単一生物がウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、プリオン、又は感染性寄生虫を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
投与が対象に免疫応答を誘発する請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項５３】
有効量の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与する段階を含む対象の疾患状態の予防又は治療処置方法であって、融合蛋白質が対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する疾患関連抗原の有効なアジュバントを含み、前記投与が疾患関連抗原に対する免疫応答を対象の体内に誘発する前記方法。
【請求項５４】
前記方法が有効量の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与する段階と疾患関連抗原を対象に投与する段階を含み、融合蛋白質が疾患関連抗原の有効なアジュバントを含む請求項５３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）及び§１２０に従い、本願は米国予備特許出願第６０／３６６９１７号（出願日２００２年３月２１日）と米国特許出願第１０／１１８４７３号（出願日２００２年４月５日）の優先権を主張し、その開示内容全体を全目的で本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明は米国国立衛生軍事研究所により交付された助成番号第ＣＡ８６９１５及びＤＡＭＤ１７−９９−１−９０９８号として政府助成下に創出された。
【背景技術】
【０００３】
種々の腫瘍及び癌の治療はめざましい進歩を遂げているが、残留疾患は依然としてこれらの疾患の臨床管理における大きな問題である。更に、感染性疾患の治療と特に予防は例えばＨＩＶ等のウイルス性疾患の伝染や結核、ブドウ球菌感染等の周知疾患の治療耐性変種の出現により相変わらず問題である。
【０００４】
腫瘍治療の場合、化学療法ストラテジーは重度毒性により必然的に制限され、非増殖性腫瘍細胞に対する効力が制限されている。従って、化学療法以外のアプローチを重視した新規方法が望ましい。例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメインに対するヒト化抗ＨＥＲ２／ｎｅｕモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（従来ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２として知られる）を使用してＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する進行腫瘍（例えば乳癌）をもつ患者を治療すると、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌蛋白質を過剰発現する腫瘍をもつ所定の患者に測定可能な応答を生じることができる。しかし、客観的応答を示すのはトラスツズマブを投与した患者の一部に過ぎず、トラスツズマブを化学療法と併用すればその抗腫瘍活性は増強するが、全患者が陽性応答するわけではない。更に、（例えば特に特定癌の家族暦をもつ個体では）このような腫瘍は有効な治療よりも有効な予防が一層望ましい。
【０００５】
従来、抗体−（ＩＬ−２）融合蛋白質は最良に特性決定され、動物モデルを使用した抗腫瘍実験で最も広く使用され、成功している（例えば非特許文献１参照）。多数の研究が腫瘍細胞の直接ターゲティング剤として抗体と例えばＩＬ−２の種々の組合せを利用している。例えば、Ｂ細胞リンパ腫３８Ｃ１３の表面に発現されるＩｇのイディオタイプ（Ｉｄ）に特異的なヒトＩｇＧ３とＣＨ３ドメインの末端に融合したヒトＩＬ−２から構成される腫瘍特異抗体−（ＩＬ−２）融合蛋白質が本発明者らにより既に開発されている。非特許文献２。この抗体融合蛋白質ＩｇＧ３−ＣＨ３−（ＩＬ−２）はＳｐ２／０で発現され、適正に会合して分泌された。抗ＩｄＩｇＧ３−ＣＨ３−（ＩＬ−２）は半減期がマウスで約８時間であり、ＩＬ−２（即ち別のドメインに融合していない場合）に報告されている半減期の１７倍であり、マウスで抗Ｉｄ  ＩｇＧ３自体よりも皮下腫瘍の良好な局在を示した。最も重要な点として、抗ＩｄＩｇＧ３−ＣＨ３−（ＩＬ−２）は抗体とＩＬ−２の併用投与に比較して高い抗腫瘍活性を示した。同じく非特許文献２（Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，１９９８），前出参照．更に、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３で発現されたキメラ抗ＩｄＩｇＧ１−（ＩＬ−２）融合蛋白質（ｃｈＳ５Ａ８−ＩＬ−２）は抗Ｉｄ抗体とＩＬ−２の組合せ又は無関係な特異性をもつ抗体−（ＩＬ−２）融合蛋白質よりも３８Ｃ１３腫瘍のｉｎ  ｖｉｖｏ根絶に高い効力を示した。非特許文献３参照。
【０００６】
癌治療における従来の抗体融合蛋白質の別の例としてはＳｐ２／０細胞で産生されたキメラ抗ＧＤ２ＩｇＧ１−（ＩＬ−２）融合蛋白質（ｃｈ１４．１８−ＩＬ−２）が挙げられる。非特許文献４；非特許文献５；及び非特許文献６参照。肺及び肝転移をと皮下ＧＤ２を発現するＢ１６メラノーマをもつマウスにｃｈ１４．１８−ＩＬ−２を投与した結果、特異的な強い抗腫瘍活性が生じた。この抗腫瘍活性は抗体（ｃｈ１４．１８）とＩＬ−２又は無関係な抗体−（ＩＬ−２）融合蛋白質に比較して有意であり、多数の動物で腫瘍の完全な根絶を生じた。Ｂｅｃｋｅｒ前出文献参照。ＣＴ２６−ＫＳＡ肝及び肺転移をもつマウスにＮＳ０で産生されたヒト化抗ＫＳＡ抗体−ＩＬ−２融合蛋白質（ｈｕＫＳ１／４−ＩＬ−２）を投与した場合にも同様の結果が得られた。非特許文献７及び非特許文献８参照。
【０００７】
抗体融合分子の他の例としてはＮＳ０で発現されたキメラ抗ヒトＭＨＣクラスＩＩ  ＩｇＧ１−ＧＭＣＳＦ融合体（ｃｈＣＬＬ−１／ＧＭＣＳＦ）（非特許文献９参照）や、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３で発現されたヒト化抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３とＩＬ−１２（非特許文献１０参照）、ＩＬ−２（非特許文献１１）及びＧＭＣＳＦ（非特許文献１２参照）の融合体が挙げられる。
【０００８】
上記全報告では、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、又はＧＭＣＳＦ等を含む抗体−サイトカイン融合蛋白質は動物モデルで腫瘍を直接標的とする直接抗腫瘍剤として使用されていることに留意することが重要である。抗体融合蛋白質は腫瘍表面上の抗原と結合し、腫瘍周囲の例えばＩ１−２等の局所濃度を増加する。例えばＩＬ−２が増加すると、場合により抗腫瘍活性が生じる。例えば非特許文献１１（Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，２００１），前出参照。
【０００９】
更に、本発明者らによる従来の報告には簡便なハプテン抗原であるダンシル（ＤＮＳ）に対して親和性をもつＩｇＧ３−（ＩＬ−２）融合蛋白質により抗原をＩＬ−２と結合することが記載されている。非特許文献１３参照。この報告で使用された抗原は疾患関連抗原よりも著しく人工的（ウシ血清アルブミン）であった。ハプテンと結合したウシ血清アルブミン（ＤＮＳ−ＢＳＡ）をモデル抗原として使用して本発明者らは抗ＤＮＳ−ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）に結合したＤＮＳ−ＢＳＡをマウスに注射すると、ＤＮＳ−ＢＳＡ−セファロース、抗ＤＮＳ−ＩｇＧ３と結合したＤＮＳ−ＢＳＡ、又は非特異的ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）と結合したＤＮＳ−ＢＳＡよりも高い抗体応答が誘発されることを示した。抗体−（ＩＬ−２）融合蛋白質を抗原と結合（非共有物理的結合）すると免疫応答が増強することが判明した（非特許文献１３（Ｈａｒｖｉｌｌら，１９９６），前出参照）が、１種の抗体融合蛋白質（抗体−（ＩＬ−２）融合蛋白質）しか使用されず、試験は体液性（抗体）免疫応答の特性決定に限定されていた。また、残念ながら、ダンシル基を使用すると抗原と抗体の間に低レベルの安定性しか得られないと思われる。このような不安定は適正なｉｎ  ｖｉｖｏ免疫刺激処置に問題となり得る。更に、ダンシル基を使用すると、ダンシル基がこれと結合する抗原上の特定エピトープをマスク又は変異させ、対象の適正な免疫応答刺激を妨げる恐れがある。
【００１０】
感染性疾患の場合には、多数の細菌（例えば黄色ブドウ球菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、寄生虫等が深刻な問題となる。例えば、細菌である黄色ブドウ球菌は高致死率をもたらす院内感染の一般原因である。黄色ブドウ球菌は例えば肺炎、心内膜炎、骨髄炎、敗血性関節炎、術後創傷感染、敗血症、毒素性ショック等の原因となり得る。残念ながら、多数の黄色ブドウ球菌株を含む多くの細菌は合成ペニシリン（例えばメチシリン）等の第一選択薬に耐性である。一部の黄色ブドウ球菌株を含む他の細菌は所謂最後の手段の抗生物質であるバンコマイシンを含む複数の薬剤に耐性である。他の感染因子（例えばウイルス、真菌等）の場合には、有効な薬剤治療は存在しないと思われる。例えば非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；及び非特許文献１７参照。細菌（及び、実際に真菌、マイコプラズマ等の他の感染因子）の多剤耐性株の存在は治療不能な感染の恐怖を生じており、医療及び公衆衛生の目下の課題である。多数の感染性生物（特にウイルス）に対するワクチン（例えばＤＮＡ及び蛋白質ワクチンの両者）の作製について従来多くの研究が行われており、このような研究は当業者に周知である。
【００１１】
腫瘍及び感染性疾患の抗原に対する有効な免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を増強するための簡便な治療及び／又は予防処置法が当分野で望まれている。本発明はこれらの方法や他の処置アプローチ及び方法を提供する。
【非特許文献１】Ｐｅｎｉｃｈｅｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，２００１，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔ  ２４８：９１−１０１
【非特許文献２】Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，１９９８“Ａｎ  ＩｇＧ３−ＩＬ−２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  １８：５９７−６０７
【非特許文献３】Ｌｉｕら，１９９８“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｂｌｏｏｄ  ９２：２１０３０−１２
【非特許文献４】Ｂｅｃｋｅｒら，１９９６“Ｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｔｈｅｒａｐｙ”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：２３６１−６
【非特許文献５】Ｂｅｃｋｅｒら，１９９６“Ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：７８２６−３１
【非特許文献６】Ｂｅｃｋｅｒら，１９９６“Ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｔｈｅｒａｐｙ”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９８：２８０１−４
【非特許文献７】Ｘｉａｎｇら，１９９７“Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７：４９４８−５５
【非特許文献８】Ｘｉａｎｇら，１９９９“Ｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ｌｏｎｇ−ｌｉｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：３６７６−８３
【非特許文献９】Ｈｏｒｎｉｃｋら，１９９７“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ＣＬＬ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｈｉｌｅ  ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”Ｂｌｏｏｄ  ８９：４４３７−４７
【非特許文献１０】Ｐｅｎｇら，１９９９，“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ＩＬ−１２  ＩｇＧ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ＩＬ−１２  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：２５０−８
【非特許文献１１】Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，２００１，“Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ”Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １０：４３−４９
【非特許文献１２】Ｄｅｌａ  Ｃｒｕｚら，２０００，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５１１２−２１
【非特許文献１３】Ｈａｒｖｉｌｌら，１９９６“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ３−Ｉｌ−２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：３１６５−７０
【非特許文献１４】Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら，１９９５“Ｍａｓｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｄａｉｒｙ  ｈｅｉｆｅｒｓ：ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ”Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ７８：１６０７−１８
【非特許文献１５】Ｌｏｗｙ，１９９８“Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３９：５２０−３２
【非特許文献１６】ＭｃＫｅｎｎｅｙら，１９９９“Ｂｒｏａｄｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１５２３−７
【非特許文献１７】Ｌｏｒｅｎｚら，２０００“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ”ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９：１４５−５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は抗原蛋白質ワクチン接種用アジュバントとしての種々の抗体−免疫刺激剤蛋白質融合体の使用方法と、対象の疾患状態の予防及び／又は治療処置方法を提供する。本発明の融合蛋白質と抗原を含む組成物も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１側面において、本発明は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の組成物に関し、融合蛋白質は疾患関連抗原の有効なアジュバントを含む。この側面の所定態様において、組成物は更に疾患関連抗原を含む。付加態様によると、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は疾患関連抗原に対して抗体特異性をもつ。これらの組成物における融合蛋白質の免疫刺激剤ドメインは場合によりサイトカイン（又はその配列もしくはサブ配列）、ケモカイン（又はその配列もしくはサブ配列）、又はケモカインもしくはサイトカイン以外の免疫刺激剤を含む。（例えば本発明の組成物の選択的態様に含まれるような）このような免疫刺激剤ドメインの例としては限定されないが、例えばサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及び上記の任意のもののフラグメントが挙げられる。更に、上記態様の任意のものは場合により更にリンカーをもつ。
【００１４】
本発明の組成物における融合蛋白質の抗体ドメインは限定されないが、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、真菌抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患抗原、又は寄生虫（例えば感染性哺乳動物寄生虫）に由来する抗原に特異的な抗体を場合により含む。他の態様では、このような融合蛋白質は腫瘍抗原以外の抗原に特異的な抗体ドメインを含む。更に、他の態様では、本発明の組成物における抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は抗体フラグメント、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ´ドメイン、Ｆ（ａｂ´）２ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン、ｓｃＦｖドメイン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３を含む。
【００１５】
更に本発明の組成物の所定態様では、抗原は例えば可溶性抗原、マトリックスに結合した可溶性抗原、マトリックスに結合した不溶性抗原、抗原の不溶性凝集物、生存不能細胞関連抗原、もしくは生存不能生物関連抗原、又はリポソームに封入した抗原を含む。更に、このような抗原は例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ（又は腫瘍細胞から脱落したＨＥＲ２／ｎｅｕ）又はそのフラグメントを含むことができる。更に、このような組成物における抗原は場合により腫瘍抗原以外の抗原、対象に由来する抗原、対象の体内の疾患状態に由来する抗原、対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原（例えば腫瘍、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、プリオン、自己免疫疾患、又は哺乳動物の感染性寄生虫等の感染性寄生虫の１種以上に起因する疾患状態）を含む。抗原は更に腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患関連抗原、又は感染性寄生虫抗原を含むこともできる。本発明の所定態様では、抗原は（場合により対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原と実質的に同一の）外来抗原である。
【００１６】
本発明の組成物の他の態様では、抗原分子数と融合蛋白質分子数が場合により約１：１である。他の態様では、これらの分子数は場合により抗原分子数が融合蛋白質分子数よりも多いか又は少ないか、又は融合蛋白質分子数が抗原分子数により実質的に飽和されるか、又は抗原分子数が融合蛋白質分子数により実質的に飽和されるような比である。
【００１７】
本発明の組成物は場合により選択時間にわたって選択条件下で（例えば４℃等で一晩又は１秒以下等の短時間）インキュベートする。本発明の組成物は更に場合により賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）を含む。
【００１８】
別の側面では、本発明は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を提供し、融合蛋白質を対象に投与することによる免疫組成物の投与方法に関し、融合蛋白質は疾患関連抗原に有効なアジュバントを含み、融合蛋白質と抗原が共同して対象に免疫応答を誘発する。更に、この側面の所定態様では疾患関連抗原を提供すると共に前記融合蛋白質を投与する（例えば融合蛋白質と抗原を対象に投与し、融合蛋白質は抗原の有効なアジュバントである）。所定態様では、融合蛋白質はサイトカイン（又はその配列もしくはサブ配列）、ケモカイン（又はその配列もしくはサブ配列）、又はケモカインもしくはサイトカイン以外の免疫刺激剤を含む。この側面の他の態様では、方法は（限定されないが）例えばサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及び上記の任意のもののフラグメント等の免疫刺激剤ドメインを含む融合蛋白質を使用する。
【００１９】
本発明のこの側面の方法で使用される融合蛋白質の抗体ドメインは場合により例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、真菌抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患抗原又は感染性寄生虫抗原（例えば哺乳動物の寄生虫）に特異的である。他の態様では、抗体ドメインは腫瘍抗原以外の抗原を含む抗原に特異的である。本発明のこの方法の側面における融合蛋白質の抗体ドメインは場合により（限定されないが）例えば抗体フラグメント、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ´ドメイン、Ｆ（ａｂ´）２ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン、ｓｃＦｖドメイン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３である。これらの方法の所定態様では、融合蛋白質は抗原に対して抗体特異性をもつ。
【００２０】
本発明のこれらの方法は抗原が例えば腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患抗原、寄生虫抗原（例えば哺乳動物に感染するもの）、腫瘍抗原以外の抗原、対象に由来する抗原、対象の体内の疾患状態に由来する抗原、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原を含む態様を包含する。場合によりこのような抗原をもたらす対象の体内の疾患状態は場合により例えば腫瘍、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、プリオン、自己免疫疾患、又は寄生虫（例えば哺乳動物に感染するもの）に起因する。本発明のこの側面における抗原は更に場合により外来抗原であり、場合により、対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する疾患関連抗原と実質的に同一でもよい。このような外来抗原は場合により抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を投与する前、又は場合により融合蛋白質を対象に投与した後、又は融合蛋白質を対象に投与するとほぼ同時に投与する。選択的同時投与前に抗原と融合蛋白質を特定時間にわたって特定条件下で（例えば４℃等で１秒又は殆ど瞬時のインキュベーションから一晩以上まで）インキュベートすることができる。本発明のこの側面における方法で使用される抗原は更に場合により例えば例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ、腫瘍細胞から脱落したＨＥＲ２／ｎｅｕ、又はこのようなＨＥＲ２／ｎｅｕのフラグメントを含む。方法の所定態様では、抗原分子数と融合蛋白質分子数は場合により約１：１である。他の態様では、抗原分子数と融合蛋白質分子数は場合により抗原分子数が融合蛋白質分子数よりも多いか又は少ないか、又は融合蛋白質分子数が抗原分子数により実質的に飽和されるか、又は抗原分子数が融合蛋白質分子数により実質的に飽和されるような比である。これらの方法の他の態様では２個以上の融合蛋白質を場合により使用する。このような多重融合蛋白質は各種免疫刺激剤ドメイン（例えば（限定されないが）非サイトカイン／非ケモカイン分子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及び上記の任意のもののフラグメントから選択されるような免疫刺激剤ドメイン）を含むことができる。更に、この側面の方法における多重融合蛋白質は場合により異なる特異性をもつ。選択的多重融合蛋白質は例えば単一分子上の異なる抗原、単一細胞上の異なる抗原、単一腫瘍上の異なる抗原、又は単一生物（例えばウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、プリオン、寄生虫）上の異なる抗原等に特異的であってもよい。免疫組成物の投与方法は更にこのような投与が対象に免疫応答を誘発する態様を含む。
【００２１】
更に別の側面では、本発明は対象の疾患状態の予防及び／又は治療処置方法に関する。このような方法は有効量の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与する段階を含み、融合蛋白質は疾患関連抗原（例えば対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する疾患関連抗原）の有効なアジュバントを含み、前記投与が疾患関連抗原（又は近縁抗原）に対する免疫応答を対象の体内に誘発する。このような疾患状態の予防及び／又は治療処置方法は更に場合により有効量の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与する段階と疾患関連抗原を対象に投与する段階を含み、融合蛋白質が疾患関連抗原の有効なアジュバントを含む。
【００２２】
本発明の上記及び他の目的及び特徴は添付図面を参照して以下の詳細な説明から更に明瞭に理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
定義
本欄又は明細書の他の箇所で特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００２４】
本明細書で使用する「対象」なる用語は限定されないが、哺乳類（例えばヒト、非ヒト霊長類（例えばサル）、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、サル、ヒツジ、又は他の非ヒト哺乳動物）と非哺乳類（例えば鳥類（例えばニワトリ又はアヒル）や魚類等の非哺乳類脊椎動物と非哺乳類無脊椎動物）を意味する。所定態様では、本発明の方法及び組成物は非ヒト動物を（予防及び／又は治療の両者で）処置するために使用される。多くの商業的に重要な動物は種々の癌や、特に問題となる種々のウイルス／細菌等の感染にかかり易く、本発明では場合によりこれらを処置する。
【００２５】
本明細書において「医薬組成物」なる用語は動物又はヒトを含む対象で医薬として使用するのに適した組成物を意味する。医薬組成物は一般に有効量の活性剤（例えば本発明の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質及び抗原蛋白質ワクチン）と医薬的に許容可能なキャリヤー（例えば緩衝液、アジュバント等）を含む。
【００２６】
「有効量」なる用語は所望結果を生じるために十分な用量又は量を意味する。所望結果は前記用量又は量のレシピエントにおける客観的又は主観的改善（例えば長期生存、腫瘍数及び／又はサイズの減少、疾患状態の有効な予防等）を含むことができる。
【００２７】
「予防処置」とは疾患、疾病ないし病態の徴候もしくは症状を示さないか、又は疾患、疾病ないし病態の初期徴候もしくは症状しか示さない対象に投与する処置であり、疾患、疾病ないし病態を発症する危険を軽減、防止又は低下させる目的で投与する。予防処置は疾患ないし病態に対する予防的処置として機能する。「予防活性」とは疾患、疾病ないし病態の徴候又は症状を示さない（か又は疾患、疾病ないし病態の初期徴候又は症状しか示さない）対象に投与した場合に対象が疾患、疾病ないし病態を発症する危険を軽減、防止又は低下させる蛋白質ワクチン接種とその抗体−免疫刺激剤融合蛋白質アジュバント、又はその組成物等の物質の活性である。「予防的に有用な」物質又は化合物（例えば蛋白質ワクチン接種とその抗体−免疫刺激剤融合蛋白質アジュバント）とは疾患、疾病ないし病態の発現を軽減、防止、処置又は低下させるのに有用な物質又は化合物を意味する。
【００２８】
「治療処置」とは疾患、疾病ないし病態の徴候又は症状を示す対象に投与する処置であり、疾患、疾病ないし病態の徴候又は症状を軽減又は除去する目的で投与する。「治療活性」とは疾患、疾病ないし病態の徴候又は症状を示す対象に投与した場合にこのような徴候又は症状を除去又は軽減する蛋白質ワクチン接種とその抗体−免疫刺激剤融合蛋白質アジュバント、又はその組成物等の物質の活性である。「治療的に有用な」物質又は化合物（例えば蛋白質ワクチン接種とその抗体−免疫刺激剤融合蛋白質アジュバント）とは疾患、疾病ないし病態の徴候又は症状を軽減、処置又は除去するのに有用な物質又は化合物を意味する。
【００２９】
本明細書で使用する「抗体」とは免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的又は部分的にコードされる１種以上のポリペプチドを含む蛋白質を意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子としてはκ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子と、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はκ又はλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεとして分類され、夫々免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥに相当する。典型的な免疫グロブリン（例えば抗体）構造単位はテトラマーを含む。各テトラマーはポリペプチド鎖の同一対２個から構成され、各対は１個の「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）をもつ。各鎖のＮ末端は抗原認識に主に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）なる用語は夫々これらの軽鎖と重鎖を意味する。
【００３０】
抗体は無傷免疫グロブリンとして又は各種ペプチダーゼによる消化により生成された多数の明確なフラグメントとして存在する。即ち、例えばペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合下の抗体を消化し、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１と結合した軽鎖であるＦａｂのダイマーＦ（ａｂ´）２を生じる。Ｆ（ａｂ´）２を温和な条件下で還元してヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊すると、Ｆ（ａｂ´）２ダイマーをＦａｂ´モノマーに変換することができる。Ｆａｂ´モノマーは主にヒンジ領域の部分をもつＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な記載についてはＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）参照）。種々の抗体フラグメントが無傷の抗体の消化により定義されているが、当業者に自明の通り、前記Ｆａｂ´フラグメント等は化学的又は組換えＤＮＡ技術によりｄｅ  ｎｏｖｏ合成することもできる。従って、本明細書で使用する抗体なる用語は完全抗体の修飾により生産されるか又は組換えＤＮＡ技術によりｄｅ  ｎｏｖｏ合成された抗体フラグメントも意味する。抗体としては可変重鎖と可変軽鎖を（直接又はペプチドリンカーを介して）相互に結合して連続ポリペプチドを形成した１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖないしｓｃＦｖ）抗体等の１本鎖抗体が挙げられる。
【００３１】
本明細書において「免疫刺激剤」又は「免疫刺激」分子又はドメイン等とは対象で（細胞性又は体液性又は両者の）免疫応答又は免疫作用を刺激又は誘発するように作用する（又は作用するのを補助する）分子又はドメイン等を意味する。このような分子の典型例としては限定されないが、例えばサイトカインとケモカインが挙げられる。サイトカインは例えば体液性及び／又は細胞性免疫応答を刺激するように作用する。サイトカインの典型例としては、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２等のインターロイキンが挙げられる。ケモカインは例えば種々の白血球を対象の体内の特定位置に選択的に吸引するように作用する。ケモカインは細胞移動と細胞活性化の両者を誘導することができる。ケモカインの一般例としては例えばＲＡＮＴＥＳ、Ｃ−Ｘ−Ｃファミリー分子、Ｉｌ−８、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β等が挙げられる。その他の情報については例えばＡｒａｉ，Ｋら，１９９０，“Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ｃｏｏｒｄｉｎａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：７８３＋；Ｔａｕｂ，１９９６“Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ−Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ  Ｖｏｏｄｏｏ  Ｔｈａｔ  Ｔｈｅｙ  Ｄｏ  Ｓｏ  Ｗｅｌｌ”Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ  ７：３５５−７６参照。
【００３２】
「疾患関連抗原」とは疾患状態（例えば癌又は自己免疫疾患）又は感染性生物（例えば細菌、ウイルス、プリオン、マイコプラズマ、真菌、寄生虫等の生物ないし感染因子による対象の感染）により対象に発生又は存在する抗原蛋白質、ペプチド、炭水化物、脂質、核酸、又はこれらの任意のものの組合せを意味する。疾患関連抗原は場合により蛋白質ワクチン接種として使用した場合に完全又は部分的に可溶性であり、あるいは前記抗原はマトリックス（例えばラテックスビーズ又は他のビーズ等）に結合した可溶性抗原、マトリックス（例えばラテックスビーズ又は他のビーズ等）に結合した不溶性抗原、抗原の不溶性凝集物、生存不能細胞関連抗原、生存不能生物関連抗原、又はリポソームに封入した抗原等である。所定態様では、融合蛋白質は場合により死滅しているか又は死につつあり（例えばアポトーシス）、１種以上の疾患関連抗原を含む疾患関連細胞／生物を標的とする。本発明の所定態様では、疾患関連抗原は外来抗原である。換言するならば、前記抗原は対象の外部に由来する。外来疾患関連抗原は場合により内在ないし非外来疾患関連抗原（例えば対象に由来するか、対象の体内の疾患状態及び／又は感染性生物に由来する抗原等）と同一であるか又は実質的に同一である。
【００３３】
蛋白質ワクチン接種のアジュバントとしての抗体−免疫刺激剤融合蛋白質
本発明は特定細胞（例えば腫瘍細胞、又は感染性細菌等）を直接標的として破壊するためなどに抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を使用するのではなく、抗原の可溶性形態（又は別の状態、下記参照）を標的とするものである。抗原はそのアジュバント（例えば免疫応答を増加するように作用又は補助する物質又は分子）として作用する抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と共同して抗原（例えば腫瘍細胞、感染性生物等に存在するもの等の疾患関連抗原）に対する免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を対象の体内に誘発する。従って、「疾患関連抗原の有効なアジュバント」（即ち本発明の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質）とは、（例えば本明細書に記載するような）前記抗原に対する免疫応答を対象の体内に誘発するという所望効果を生じるアジュバントである。抗体免疫刺激剤融合蛋白質がアジュバントとして作用する抗原は多くの態様では可溶性抗原であることが多いが、必ずしもその必要はない。他の態様では、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がアジュバントとして作用する抗原としては限定されないが、ビーズ等のマトリックスに結合した（可溶性又は不溶性）抗原、（いずれも例えば凝集し易くするなどのために他の材料を含んでいてもよい）抗原の不溶性凝集物もしくは可溶性抗原の凝集物、生存不能細胞関連抗原（例えば細菌、ウイルス等に由来する生存不能生物関連抗原も含む）、リポソームに封入した抗原等が挙げられる。更に、別の態様では、抗原に対してアジュバントとして作用する抗体−免疫刺激剤融合蛋白質自体を例えばリポソーム等に封入してもよく、抗原はリポソームに封入してもしなくてもよい。
【００３４】
本発明は抗原蛋白質ワクチン接種のアジュバントとしての種々の抗体−免疫刺激剤蛋白質融合体の使用方法と、対象の疾患状態の予防及び／又は治療処置方法を提供する。本発明の融合蛋白質と抗原を含む組成物も提供する。
【００３５】
更に、本発明の方法及び組成物により誘発される免疫応答は以下に詳述するように、対象の体内に存在する（か又は予防処置に使用する場合には対象の体内に存在すると予想もしくは不確定に予想される）疾患関連抗原又は近縁抗原分子に対して特異的である。従って、例えば本発明の１態様は場合により抗腫瘍関連（ＴＡＡ）抗原抗体−免疫刺激剤と治療処置として使用される可溶性疾患関連抗原（例えば、この場合にはＴＡＡ）を含む。このような処置により誘発される免疫応答は場合により例えば対象の体内に存在する腫瘍の細胞表面に存在する前記抗原（又は近縁抗原）に対して誘発される。
【００３６】
当然のことながら、上記及び本明細書の他の項では例えば抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と共に対象に投与する抗原として「抗原」を記載する。この使用は特に指定しない限り、例えば従来記載されているような疾患関連抗原を意味すると理解すべきである。
【００３７】
本発明の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は疾患関連抗原（例えば腫瘍細胞によりもしくは腫瘍細胞上に提示されるか又は腫瘍細胞から脱落した腫瘍抗原（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ）、あるいはウイルス、細菌（例えば黄色ブドウ球菌由来プロテインＡ抗原）、真菌、プリオン、寄生虫、自己免疫疾患等の感染性生物により又はこれらの生物上に提示される抗原）のアジュバントとして作用する。本発明は対象における疾患関連抗原の存在を惹起又は誘導した生物又は疾患に対する対象の治療及び／又は予防処置手段として、疾患関連抗原（とその抗体−免疫刺激剤アジュバント）により発生した体液性及び／又は細胞性免疫応答を利用する。
【００３８】
対象の免疫応答は場合により夫々の抗原（即ち夫々の疾患関連抗原）と結合して抗体−抗原免疫複合体を形成する抗体融合蛋白質により誘発される。図２参照。当然のことながら、このような選択的作用メカニズムは限定的であるとみなすべきではない。他の可能及び／又は付加的な作用メカニズムも場合により本発明の有効な方法及び組成物により使用される。場合により、この免疫複合体は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質とＤＣ又はＡＰＣ上の表面受容体（例えばＧＭＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２受容体等）の相互作用により樹状細胞（ＤＣ）又は別の適当な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に疾患関連抗原を送達する。図２参照。例えば融合蛋白質で使用される特定免疫刺激分子（例えば特定サイトカイン、ケモカイン等）に応じて抗原のＤＣ又はＡＰＣ提示は場合により一方又は両方即ち細胞性（ＴＨ１）と体液性（ＴＨ２）の免疫応答の活性化（例えば強力な活性化）をもたらす。このような活性化は場合により（例えばワクチン接種した対象を同一抗原又は所定態様では近縁疾患関連抗原で攻撃した場合に）特定疾患関連抗原に対して有意免疫防御活性を生じる。更に他の態様では、本発明により発生される免疫応答は（例えばワクチン接種した対象を再攻撃した場合に）疾患関連抗原に対して免疫防御性の応答を含む。更に他の態様では、本発明は免疫状態に検出可能な変化（例えば疾患関連抗原に対する細胞性及び／又は体液性免疫レベル又は応答の変化）を生じる。更に、場合により所定態様では、本発明の融合蛋白質は死滅しているか又は死につつある細胞（例えばアポトーシス細胞）又は細胞フラグメントを標的とする（細胞／細胞フラグメントは癌細胞等の疾患関連状態に由来するか又は１種以上の疾患関連抗原を含む）。従って、細胞／細胞フラグメントをコートする融合蛋白質は場合により細胞／細胞フラグメントが他の細胞（例えばＡＰＣ）により食菌し易くし、場合によりＡＰＣへのトラフィッキングと提示を改善する。
【００３９】
この場合も、本発明は無数の融合体と無数の疾患／病態に対するその使用も包含することにも留意すべきである。本発明の多くの実施例では、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体融合体等を１例として使用しているが、これは限定的であるとみなすべきでない。ＨＥＲ２／ｎｅｕ防御等に関する記載は本発明の方法及び組成物の一般概念を例証するためのものであり、即ち抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を抗原ワクチン接種のアジュバントとして使用すると、体液性及び／又は細胞性免疫応答を対象に誘発するので、このような抗原を示す疾患又は感染に対する対象の治療及び／又は予防処置として使用できることを例証するためのものである。
【００４０】
抗体−免疫刺激剤融合体及び疾患関連抗原とＡＰＣ又はＤＣの選択的相互作用は図２に示すように（例えば処置に使用される疾患関連抗原のみで生じるものから）抗原提示量及び／又は品質を変化させ、その結果、（同様に例えば抗体と融合した特定免疫刺激剤に応じて）疾患関連抗原に対して強力なＴ及び／又はＢ細胞免疫応答を生じることができる。更に、本発明の抗体融合蛋白質と融合する多くの免疫刺激剤（例えばサイトカイン）の一般免疫刺激活性は場合により標的抗原に対する免疫応答の増強（例えばＩＬ−２更に増殖シグナル、ＧＭＣＳＦ−ＡＰＣ活性化及びＩＬ−１２によるＴＨ１側への移行等）をそれ自体助長（又は場合によりこれを増強）することもできる。この場合も、このような選択的作用メカニズムは限定的であるとみなすべきではなく、本発明の方法及び組成物の効果はこれらの作用メカニズムのみに限定されない。
【００４１】
誘発される（即ち本発明の方法等を使用することにより発生される）免疫応答は例えば癌細胞又は感染因子の表面に発現される疾患関連抗原（体液性免疫応答）だけでなく腫瘍細胞又は感染因子細胞等の表面のＭＨＣクラスＩに関連する疾患関連抗原ペプチド（細胞性免疫応答）に対しても誘発される。所定態様では、本発明は更に他の近縁抗原（例えば蛋白質ワクチン接種として使用される抗原に構造的又は立体構造的に近縁の抗原）に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答も誘発する。例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕは上皮成長因子受容体１、２、及び３（ＥＧＦ１，ＥＧＦ２，ＥＧＦ３）等の他の成長因子受容体と高い相同性をもつので、本発明からＨＥＲ２／ｎｅｕに対して誘発される（体液性及び／又は細胞性）免疫応答は場合により標的疾患関連抗原（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）だけでなく、癌細胞上に発現される他の相同受容体に対しても誘発される。
【００４２】
所定態様では、本発明の方法等（及び本発明の毒物試験、使用試験等）は動物モデル（例えば下記実施例Ｉ及びＩＩ参照）で実施されるが、本発明はヒト対象を使用する態様（臨床試験等を含む）も含む。ヒトでは、他の動物対象と同様に、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を予防又は治療両者のワクチン接種における例えば可溶性抗原のアジュバントとして利用する。従って、本発明は特定抗原を発現する腫瘍（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ乳癌等）と、感染性生物（ウイルス、細菌等）により提示される疾患関連抗原をもつ患者を標的とし、腫瘍／感染性生物等が対象の体内に存在するとき（治療）又はこのような疾患／感染が対象に発生する前（予防）に処置することができる。従って、本発明の方法及び組成物により可能な用途は癌及び微生物感染を含む多数の疾患状態に対する防御におけるヒト及び他の動物の広範な処置を含む。
【００４３】
例えば、予防ワクチン接種では、腫瘍（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍）を発症する危険の高い患者に場合により抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と適切な腫瘍抗原（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ等）の混合物をワクチン接種する。例えば、家族歴から乳癌を発症する確率の高い女性を場合により本発明の１態様で予防処置する。例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的な抗体を例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、及びＧＭＣＳＦと融合した抗体−免疫刺激剤融合蛋白質（即ち種々の抗体構築物）を場合により適量のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原と共に女性に投与する（下記参照）。一般に、このような融合蛋白質と抗原は対象に投与する前に適切な免疫複合体を形成するように一緒にインキュベートする。従って、本発明の使用により女性の免疫系にＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質に対する免疫応答を生じ、こうして女性は発生したＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する癌をより有効に治療できるようになり、場合により長期生存の機会を増すことができる。
【００４４】
この場合も、本発明の他の態様では別の疾患／病態、従って別の抗原等に対して別の抗体／免疫刺激組合せが使用されることに留意すべきである。従って、本発明は場合により対象を特定ウイルス、細菌等との接触から予防処置するためにも使用される。例えば、本発明は場合により特定ウイルス／細菌と接触する危険が高い環境におかれる医療従事者等のヒトを予防処置するために使用される。例えば、場合により例えば黄色ブドウ球菌汚染を受け易い医療従事者を抗プロテインＡ抗体−免疫刺激剤融合蛋白質とプロテインＡ抗原で予防処置する（例えばマウスを使用した類似例については下記実施例ＩＩ参照）。あるいは、例えば所定ウイルス（例えば性産業労働者のＨＩＶ等）と接触する可能性の高いヒトを場合により適切なＨＩＶ抗原に対して特異的な適切な抗体−免疫刺激剤融合体とこの特定抗原で予防処置する。
【００４５】
治療処置ワクチン接種では、患者（例えば特定抗原を発現する腫瘍をもつ患者）に抗原特異的抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と抗原（場合により可溶性抗原、上記参照）の混合物をワクチン接種する。この場合も、治療用ワクチン接種は例えば無数の腫瘍型（及び同一腫瘍上に提示される種々の抗原）とウイルス、細菌等の種々の感染の治療処置に適用可能である。従って、予防処置（上記参照）と同様に、標的抗原は腫瘍関連、ウイルス関連、細菌関連抗原等とすることができる。本発明の方法及び組成物を使用する治療処置は対象が疾患状態に対して有効な免疫応答を発生するのが困難な状況で特に有用である。例えば、疾患関連抗原がＡＰＣ等と適切に相互作用していない場合や、疾患関連抗原が免疫系により「自己」認識される場合等である。
【００４６】
状況によっては、患者は高レベルの特定標的抗原が患者の体内に存在する疾患プロフィールを示すことに留意すべきである。例えば、所定の腫瘍は（例えば腫瘍から抗原の脱落により）高循環レベルの可溶性抗原を発現する。所定のＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍がこのようなケースに該当し、腫瘍から高レベルの抗原が脱落する。更に、所定感染では、高レベルの標的抗原が患者に存在する可能性がある。所定の例えば細菌感染の結果、標的可能な内在抗原レベルが高くなる場合がある。例えば、種々の敗血症は場合により対象の血流中に高レベルの可溶性抗原を示す可能性がある。従って、場合によっては、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質単独を注射すれば所望抗原を標的するために十分である。換言するならば、患者の内在抗原（例えば可溶性ＨＥＲ２／ｎｅｕ、細菌抗原等）レベルは抗体−免疫刺激剤融合蛋白質により標的するのに十分高いので、所望免疫応答を誘発することができる。しかし、高レベルの内在抗原が存在する場合であっても、このような患者に場合により抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と標的抗原の混合物を注射することもできる。
【００４７】
本発明の種々の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と抗原は別々に使用してもよいし、併用してもよく、こうして付加的又は相乗的効果を生じる。本発明の種々の態様では、場合により種々の免疫刺激剤ドメインを同一抗体フレームワーク（即ち同一抗原に対する同一抗体−異なる融合体の場合と同様に下記実施例Ｉ参照）と併用する。別法及び／又は付加法として、複数抗原（例えば細菌細胞、マイコプラズマ等に存在する２種の異なる表面抗原、又は２種の異なる腫瘍関連抗原）を場合により使用する（即ち異なる抗原は各々これらの抗原を標的とする１種以上の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をもつ）。こうすると、各種微調整特異性層が本発明に組込まれるので、対象の疾患処置のより正確な制御とターゲティングが可能になる。
【００４８】
更に、（例えば抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体融合蛋白質等による処置により例証されるような）本発明の方法は必ずしも組換え抗体トラスツズマブ（ハーセプチン，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）処置等の治療技術の代法ではない。その代わりに、本発明は場合により代用療法として他の処置（例えば化学療法及び／又は放射線療法、抗生物質等の抗癌アプローチ）と併用される。例えば、状況によっては、（例えばＥＣＤＨＥＲ２を脱落する腫瘍で見られるように）循環抗原レベルの高い患者やトラスツズマブ処置に応答しない抗原の突然変異形（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕの突然変異形）をもつ患者（例えばＢａｓｅｌｇａら，１９９６“Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｗｅｅｋｌｙ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｒｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １４：７３７−４４参照）は場合により本発明の方法等が有効である。
【００４９】
更に、本発明の所定態様は成熟樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ作製にも有用である。このような場合には、対象から取得した樹状細胞を抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と適切な可溶性抗原（又はラテックスビーズに固定した抗原等の他のフォーマット）の混合物で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）処理する。その後、成熟プログラム樹状細胞を患者に再移植する。これは所定側面で上記所定選択的態様と同様であり、即ち、抗体−免疫刺激剤複合体が形成され、ＡＰＣ等と相互作用するが、この場合にはこのような相互作用がｅｘ  ｖｉｖｏで生じる。
【００５０】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質及び抗原ワクチンの成分と構築
本発明の実施例では例えば抗ＨＥＲ２／ｎｅｕやＩＬ−２、ＩＬ−１２、及びＧＭＣＳＦの抗体−サイトカイン融合蛋白質を使用したが、当然のことながら、本発明は本発明で使用する抗体−免疫刺激剤融合蛋白質に免疫刺激分子と抗体の無数の他の組合せを含む。換言するならば、該当ないし処置する特定病態／疾患に応じて免疫刺激分子（例えばサイトカイン、ケモカイン等）と抗体（例えば各種抗体フラグメント、各種アイソタイプの抗体、及び各種抗原に対する特異性をもつ各種抗体）の種々の組合せが本発明に含まれる。
【００５１】
例えば、実施例Ｉ等では（詳細な実施例ではサイトカインを使用して）ヒト腫瘍関連抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＣＤＨＥＲ２）の細胞外ドメインに特異的な抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を構築し、使用した。これらの抗体融合蛋白質はトラスツズマブ（ハーセプチン，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）の可変領域を含むヒトＩｇＧ３を免疫刺激サイトカインであるインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）と遺伝子工学的に融合することにより構成した。これらの組換え蛋白質を図１に示す。
【００５２】
本発明で使用する融合蛋白質の免疫刺激剤ドメインが多様であることに加え、使用する特定抗体ドメインも場合により多様である。本発明の実施例で使用した抗体ドメインは限定的であるとみなすべきではない。例えば、（例えば細菌抗原、ウイルス抗原、各種腫瘍関連抗原、マイコプラズマ抗原、寄生虫の抗原、プリオン、自己免疫疾患等に対する）種々の抗体はいずれも本発明の選択的態様である。抗原特異性のこの選択的多様性により、本発明の方法及び組成物を使用して無数の特定病態、疾患状態等を治療及び／又は予防することができる。抗体ドメインの抗原特異性が多様であるのみならず、蛋白質融合体を含む抗体フレームワークの型も種々のものを利用できる。例えば、本発明の抗体融合蛋白質の抗体ドメインは場合によりＦａｂ，Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、抗体フラグメント、及び種々のその組合せ等を含むことができる。
【００５３】
抗体
本発明は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を蛋白質ワクチン接種のアジュバントとして使用する。使用される抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は一般に蛋白質ワクチン接種で使用される抗原に特異的な免疫グロブリン分子（又はその一部）を含む。典型的態様では、抗体は疾患関連抗原に特異的である。
【００５４】
融合蛋白質の抗体ドメインは場合により免疫グロブリン分子の全部又は一部を含み、場合により免疫グロブリン可変領域（即ち疾患関連抗原に対する特異性領域）の全部又は一部を含み、場合によりＶ遺伝子、及び／又はＤ遺伝子及び／又はＪ遺伝子によりコードされる領域を含む。
【００５５】
上記に説明したように（上記定義参照）、本発明で使用される抗体は場合により態様の特定要件に応じてＦ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ，Ｆａｂ´、ｓｃＦｖ等を含む。所定態様はＩｇＧドメインを含む融合蛋白質を使用する。他方、他の態様はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ等の代替免疫グロブリンを含む。更に、種々の免疫グロブリンの考えられる全アイソタイプも本態様に含まれる。即ち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３等はいずれも本発明で使用される抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の抗体ドメインに含まれると予想される分子である。免疫グロブリンとアイソタイプの型の選択に加え、本発明の各種態様は種々のヒンジ領域（又はその機能的等価物）を含む。このようなヒンジ領域は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の各種ドメイン間にフレキシビリティを提供する。例えばＰｅｎｉｃｈｅｔら，２００１“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：９１−１０１参照。
【００５６】
種々の免疫刺激剤と融合した抗体ドメインの使用は当分野で比較的よく知られており、適切な免疫グロブリンの使用、選択、及び構築（又は購入）は当業者に公知である。例えばいずれも全目的で本明細書に組込むＤｅｌａ  Ｃｒｕｚら，２０００  “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５１１２−２１；Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，２００１，“Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ”Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １０：４３−４９；Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，２００１“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：９１−１０１（及びその引用文献）；及びＰｅｎｇら，１９９９，“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ＩＬ−１２  ＩｇＧ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｌ−１２  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：２５０−８参照。
【００５７】
免疫刺激剤
本発明の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を構成する別のドメインは免疫刺激剤ドメインである。上述のように、免疫刺激分子（又はドメイン）は対象の免疫応答又は免疫系の作用を刺激又は誘発するように作用する。抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の一部である免疫刺激剤ドメインは一般に（但し限定されないが）数種の広範な型である。一般に、態様としては限定されないが、サイトカインとケモカインが挙げられる。一般に、サイトカインは例えば体液性及び／又は細胞性免疫応答を刺激するように作用し、ケモカインは一般に免疫細胞移動及び活性化を誘導する。特定態様にどの免疫刺激剤を使用するかという選択は例えばどの特定免疫応答効果が所望されるか、例えば体液性応答であるか細胞性免疫応答であるか、その両者であるかに依存する。典型的態様では、疾患関連抗原に対する細胞性と体液性の両者の免疫応答が所望される。従って、下記実施例Ｉ及びＩＩに示すように、本発明の方法及び組成物では場合により種々の免疫刺激剤ドメインをもつ多重融合蛋白質を使用する。
【００５８】
当然のことながら、例示分子（例えばＩＬ−２等）を含む免疫刺激剤に関する本明細書の記載は限定的であるとみなすべきでない。換言するならば、本発明の種々の態様は免疫刺激分子（例えば本明細書に例示するもの以外又はそれに加えて他のサイトカイン、ケモカイン等）の種々の組合せを含むとみなすべきである。従って、本発明の抗体融合体で融合される特定サイトカイン／ケモカイン等（例えば種々のインターロイキン分子、インターフェロン、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン等）は限定的ではなく、種々の特定サイトカイン、ケモカイン、免疫刺激剤等を種々の用途に利用することができ、いずれも本発明を構成する。
【００５９】
例えば、本発明で使用することができる１個の一般免疫刺激剤ドメインはサイトカインを含む。サイトカインは白血球から主に分泌される成長因子の大ファミリーを含み、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、インターフェロン、インターロイキン、ＩＦＮ（インターフェロン）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）及びＣＳＦ（コロニー刺激因子）が挙げられる。種々のサイトカインは対象で体液性及び／又は細胞性免疫応答を刺激することができ、食細胞を活性化することができる。インターロイキンは白血球により分泌され、同様に白血球の種々の細胞性応答／作用に影響するサイトカインの１種（例えばＩＬ−２，ＩＬ−１２等）である。種々の態様において、インターロイキンが本発明の方法／組成物の免疫刺激剤ドメインとして使用される。更に、本発明の他の態様では、非インターロイキンサイトカインが抗体−免疫刺激剤融合体の免疫刺激剤ドメインを構成する。例えばＭｉｒｅ−Ｓｌｕｉｓ  １９９３  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：７４−７７；Ｃｏｌｏｍｂｏら，１９９２  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：４８５３−４８５７；Ａｒａｉ，Ｋ．ら，１９９０，“Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ｃｏｏｒｄｉｎａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：７８３＋等参照。
【００６０】
本発明の特定態様で使用される可能なサイトカインのより特定的な例としては、（限定されないが）以下のものが挙げられる。
【００６１】
ＩＬ−２。ＩＬ−２は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を構築するために使用される一般免疫刺激剤である。例えばＰｅｎｉｃｈｅｔら，２００１“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：９１−１０１とその引用文献参照。ＩＬ−２はＴ細胞を刺激して増殖させ、細胞毒性にさせる。更に、ＩＬ−２は細胞（例えば腫瘍細胞）に対して高い細胞毒性で応答するようにＮＫ細胞を誘導する。更に、ＩＬ−２は血管浸透性を増し、血管内液を血管外領域へ流出させる。
【００６２】
ＩＬ−１２。ＩＬ−１２は一般にプロフェッショナル抗原提示細胞により放出され、細胞性免疫を促進する。ＩＬ−１２はナイーブＣＤ４＋細胞をＴＨ１細胞に分化するように誘導することによりこの作用を行う。ＩＬ−１２は更にＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性を増強することができる。ＩＬ−１２により刺激されたＴ及びＮＫ細胞により産生されたＩＦＮ−γは他の免疫作用を生じることもできる。ＩＬ−１２は１本鎖又は２本鎖（ヘテロダイマー）変異体として存在することができる。本発明では場合によりどちらの型のＩＬ−１２も本発明で使用される抗体−免疫刺激剤の免疫刺激剤ドメインとして使用される。
【００６３】
ＧＭＣＳＦ。ＧＭＣＳＦは造血細胞の増殖と分化に関係があり、多面効果（例えば多数の細胞における抗原提示の増加）をもつ強力な免疫刺激剤である。更に、単球上のＭＨＣ  ＩＩや顆粒球及び単球上の接着分子の発現増加にも関与している。更に、ＧＭＣＳＦはＴ細胞増殖の増幅にも関与している。本発明の所定態様では、ＧＭＣＳＦは本発明で使用される抗体−免疫刺激剤誘導体の免疫刺激剤ドメインを構成する。
【００６４】
本発明の他の一般態様では、免疫刺激剤ドメインはケモカイン（又はそのフラグメント）を含む。ケモカインは例えば種々の白血球を特定位置に選択的に吸引し、細胞移動のみならず活性化も誘導することができる。ケモカインは一般にα、β、及びγサブタイプに分類される。その分類は蛋白質のアミノ末端の第１システイン残基のコンフィギュレーションにより分けられる。各種分類のケモカインは各種の類の炎症細胞を吸引するように作用する。従って、本発明で使用される融合蛋白質でこのような各種ケモカインを使用すると、このような融合蛋白質で処置した対象で各種免疫応答を活性化することができる。本発明で使用される融合蛋白質で使用することができるケモカインとしては（限定されないが）Ｃ−Ｘ−Ｃグループケモカイン、ＩＬ−８、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、Ｃケモカイン、リンホタクチン、ＣＸ３Ｃ（又はｃ−ｘ３−ｃ）ケモカイン、フラクタルカイン等が挙げられる。
【００６５】
本発明の他の態様はサイトカイン又はケモカイン以外の免疫刺激剤を含む抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を含む。例えば、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は場合によりＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）又は他の同様の免疫原化合物や、直接抗原提示なしにＴ細胞及び／又はＢ細胞の直接刺激を誘導する「スーパー抗原」を含む。スーパー抗原やＫＬＨ等の化合物（とその使用等）は当業者に周知である。例えばＪｏｈｎｓｏｎら，“Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｐｒｉｌ  １９９２，ｐ．９２−１０１，及びＳｅｋａｌｙ，Ｒ．（ｅｄ．）“Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ”Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．５，１９９３参照。
【００６６】
この場合も、（サイトカイン、ケモカイン等のいずれを含むかに関係なく）本発明で使用される融合蛋白質の各種態様における実際の特定免疫刺激分子は例えば特定疾患状態／病態、特定標的抗原、特定所望作用（例えば体液性免疫応答、細胞性免疫応答、又は両者の誘発）等に依存する。
【００６７】
構築
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の構築は当業者に周知である。例えばＰｅｎｉｃｈｅｔ  ら，２００１“Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ”Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １０：４３＋；Ｐｅｎｇ，１９９９，前出；及びＤｅｌａ  Ｃｒｕｚ，２０００，前出はいずれも抗体−免疫刺激剤融合蛋白質とその構築について記載している。文献には多数の他の資料も十分に存在する。
【００６８】
本発明で使用される特定抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は場合により（市販品の購入を含めて）当分野で公知の任意方法により取得又は作製される。例えば、適切な抗体フレームワーク（上記参照）をコードする核酸配列を場合により適切なベクター（例えば原核又は真核生物用の例えば発現ベクター）にクローニングし、ライゲーションする。更に、ベクターからの発現により抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が産生されるように適切な向きと位置で適切な免疫刺激分子をコードする核酸配列を場合により同一ベクターにクローニングする。所定の選択的態様は更に発現後修飾、例えば抗体サブユニットの会合等も必要である。上記（及び同様の）操作技術及び手法は当業者に周知である。関連指示は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年補遺版）に記載されている。所定の代替態様では、抗体ドメインと免疫刺激剤ドメインを例えば化学的手段により発現後会合する。
【００６９】
蛋白質ワクチン接種のアジュバントとしての抗体−免疫刺激剤の投与
組成物
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質及び／又は蛋白質ワクチン接種（例えば疾患関連抗原）は場合により適切な任意滅菌医薬キャリヤーと共に（治療又は予防）処置を必要とする対象に投与する。このような医薬キャリヤーは融合蛋白質と抗原の可溶性と作用を維持するように作用する。所定態様では、融合蛋白質／抗原と共に付加成分を投与することが所望される場合がある。例えば、所定処置レジメンでは、化学療法剤、抗生物質、成長因子を含む付加抗体融合蛋白質等をいずれも場合により本発明の組成物と共に加える。
【００７０】
典型的態様では、対象に投与する製剤としては滅菌水性又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションが挙げられる。このような態様としてはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、有機エステル（例えばオレイン酸エチル）及び当業者に公知の他の溶媒等の非水性溶媒が挙げられる。本発明の所定態様では生理的に許容可能なキャリヤー（又は賦形剤）を場合により使用する。このようなキャリヤーの例としては例えば食塩水、ＰＢＳ、リンゲル溶液、乳酸リンゲル溶液等が挙げられる。更に、安定性や無菌性を確保し易くするために防腐剤や添加剤を場合により組成物に加える。例えば、抗生物質や他の殺菌剤、酸化防止剤、キレート剤等もいずれも場合により本発明の組成物の種々の態様に加える。
【００７１】
本発明の組成物の製造では、典型的態様によると組成物を対象に投与する前に抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と特定疾患関連抗原を選択（又は特定）時間（例えば抗原と融合蛋白質の適切な免疫複合体を形成するように）インキュベートする。典型的態様では、このようなインキュベーションは４℃で例えば一晩実施される。しかし、他の態様ではインキュベーション温度及び時間は異なる。例えば、組成物を種々の時間と温度でインキュベーションすることができる。条件／温度の決定は例えば該当特定抗原、該当特定抗体融合蛋白質、抗原と抗体の親和性等に応じて決定する。本発明の所定態様では、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の分子数と適切な抗原の分子数の比はほぼ等しい（例えば１：１）。しかし、他の態様では、この比は場合により１：１ではない。例えば、所定態様では場合により抗体融合蛋白質分子数が抗原分子数よりも多いか、又は抗原分子数が抗体融合蛋白質分子数よりも多い。所定態様では、抗原分子数は抗体融合蛋白質分子数を完全に飽和するに十分に大きい。換言するならば、利用可能な全抗体は抗原と免疫複合体を形成する。他の態様では、抗原は制限的である（例えば利用可能な全抗原が抗体と免疫複合体を形成するために十分な数を上回る抗体が存在する）。他の態様では、成分間に等モル（又はほぼ等モル）が存在するように疾患関連抗原と抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の各種量を配分する。所定の典型的態様では、各成分の結合単位当量が等しくなるように又はほぼ等しくなるように各成分の量を配分する。下記実施例Ｉ参照。
【００７２】
所定態様では、組成物の各種成分を予め測定及び／又はプレパッケージング及び／又は付加測定の必要なしに即使用可能にする等の処理を行う。本発明は更に場合により本発明の方法及び／又は組成物を実施／使用するためのキットを含む。特に、これらのキットは場合により例えば適切な抗体−免疫刺激剤融合蛋白質（及び場合により相乗処置を実施するための多数のこのような蛋白質の混合物、上記参照）と、場合により適切な疾患関連抗原も含む。更に、前記キットは本発明の治療及び／又は予防処置を実施するための適切な賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）も含むことができる。前記キットは場合により本発明の組成物の構成及び／又は使用のための付加成分を含み、これらの成分としては限定されないが、例えば希釈剤、アジュバント等が挙げられる。
【００７３】
本明細書に記載する組成物は場合により本発明の方法を実施するため又は本発明の組成物を使用するために必要な全（又はほぼ全）成分（場合により例えば本発明の方法／組成物の使用説明書を含む）を含むようにパッケージングされる。例えば、キットは場合により例えば緩衝液、試薬、血清蛋白質、抗体、基質等を含むことができる。プレパッケージ試薬の場合には、キットは場合により測定せずに方法に即利用できるように予め測定又は予め配分した量、例えば予め測定した液体アリコート、又はキットの最終使用者が容易に再構成することができるように予め計量もしくは予め測定した固体試薬を含む。
【００７４】
このようなキットは一般に本発明の方法を実施するため及び／又は本発明の組成物を使用するための適切な説明書も含む。所定態様では、キット／パッケージの成分は長期保存中の分解又は他の損失、例えば漏出を防ぐように安定化形態で提供される。多数の安定化方法／薬剤が保存しようとする試薬等に広く使用されており、例えば化学安定剤（即ち酵素阻害剤、殺菌剤／制菌剤、抗凝血剤）の添加等が挙げられる。
【００７５】
所定態様では、複数組成物を使用して対象を処置する。例えば、融合蛋白質／抗原混合物を場合により所定期間にわたって複数回対象に投与する。このような用量の範囲は場合により例えば対象の処置応答、処置の毒性及び／又は副作用等に応じて大幅に異なり、場合により各処置レジメン／対象に適合するように調節する。更に、融合蛋白質は場合により抗原との混合物でなく別個の組成物として対象に投与する。例えば、場合により融合蛋白質組成物を対象に投与する前、それとほぼ同時、又はその後に抗原組成物を対象に投与する。更に、本明細書に記載するように、疾患状態／病態によっては疾患関連抗原を別個に投与しない状況もある。例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍には多量のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を脱落させるものがある。選択的態様では、本発明は場合により投与した融合蛋白質と共に免疫複合体を形成するように使用することによりこのような脱落抗原を利用する。この場合も、このような選択的作用メカニズムは本発明の方法及び組成物の効果を制限するとみなすべきではない。
【００７６】
本発明の所定態様では、本発明は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の組成物に関し、前記融合蛋白質は疾患関連抗原の有効なアジュバントを含む。所定態様では、組成物は更に疾患関連抗原も含む。付加態様では、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は疾患関連抗原に対する抗体特異性をもつ。これらの組成物における融合蛋白質の免疫刺激剤ドメインは場合によりサイトカイン（又はその配列もしくはサブ配列）、ケモカイン（又はその配列もしくはサブ配列）、又はケモカインもしくはサイトカイン以外の免疫刺激剤を含む。（例えば本発明の組成物の選択的態様に含まれるような）このような免疫刺激剤ドメインの例としては限定されないが、例えばサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及び上記の任意のもののフラグメントが挙げられる。更に、上記態様の任意のものは場合により更にリンカーをもつ（他の態様は場合によりリンカーをもたない）。リンカー領域ないしドメインは場合により例えば融合蛋白質の免疫刺激剤ドメインと抗体ドメインの間等に配置される。
【００７７】
本発明の組成物における融合蛋白質の抗体ドメインは限定されないが、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、真菌抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患抗原又は寄生虫（例えば感染性哺乳動物寄生虫）に由来する抗原に特異的な抗体を場合により含む。他の態様では、このような融合蛋白質は腫瘍抗原以外の抗原に特異的な抗体ドメインを含む。更に、他の態様では、本発明の組成物における抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は抗体フラグメント、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ´ドメイン、Ｆ（ａｂ´）２ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン、ｓｃＦｖドメイン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３を含む。
【００７８】
更に、本発明の組成物の所定態様では、抗原は例えば可溶性抗原、マトリックスに結合した可溶性抗原、マトリックスに結合した不溶性抗原、抗原の不溶性凝集物、生存不能細胞関連抗原、もしくは生存不能生物関連抗原、又はリポソームに封入した抗原を含む。更に、このような抗原は例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ（又は腫瘍細胞から脱落したＨＥＲ２／ｎｅｕ）又はそのフラグメントを含むことができる。更に、このような組成物における抗原は場合により腫瘍抗原以外の抗原、対象に由来する抗原、対象の体内の疾患状態に由来する抗原、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原（例えば腫瘍、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、プリオン、自己免疫疾患、又は哺乳動物の感染性寄生虫等の感染性寄生虫の１種以上に起因する疾患状態）を含む。抗原は更に腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患関連抗原又は感染性寄生虫抗原も含むことができる。本発明の所定態様では、抗原は（場合により対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原と実質的に同一の）外来抗原である。
【００７９】
本発明の組成物の他の態様では、抗原分子数と融合蛋白質分子数は場合により約１：１である。他の態様では、これらの分子数は場合により抗原分子数が融合蛋白質分子数よりも多いか又は少ないか、又は融合蛋白質分子数が抗原分子数により実質的に飽和されるか、又は抗原分子数が融合蛋白質分子数により実質的に飽和されるような比である。
【００８０】
本発明の組成物は場合により選択（又は特定）時間にわたって選択（又は特定）条件下で（例えば４℃等で一晩又は１秒以下等の短時間）インキュベーションする。本発明の組成物は更に場合により賦形剤（例えば医薬的に許容可能な賦形剤）を含む。
【００８１】
下記実施例Ｉ及びＩＩは本発明の組成物と組成物の投与の数種の非限定例を示す。下記参照。当然のことながら、抗体と免疫刺激剤の他の組合せには場合により他の投与プロフィールが必要になろう（例えば所定免疫刺激剤ドメインには場合により特定緩衝液等が必要である）。更に、所定処置レジメンは場合により付加治療及び／又は予防成分（例えば抗生物質等）を含む。
【００８２】
投与
典型的態様では、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と抗原ワクチン接種を対象に非経口（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、又は皮下）注射する。他の態様では、本発明の組成物を非注射手段（下記参照）により送達する。一般に、このような投与の用量範囲は対象に所望効果を誘発（例えば疾患関連抗原に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答及び／又は例えば明確な抗腫瘍もしくは抗感染活性を誘発）するのに十分広い範囲とする。用量は場合により例えば対象の年齢、性別、種、及び体重、並びに（治療又は予防）処置する疾患状態の程度又は存在に基づいて各対象に最適化される。例えば、融合蛋白質／抗原組成物の用量は０．１ｍｇ未満／ｋｇ対象体重から２００ｍｇ以上／ｋｇ対象体重とすることができる。用量は例えば特定対象（年齢、体重、一般健康状態、性別、種等）、疾患状態の存在及び／又は進行もしくは段階、特定抗原、特定抗体融合蛋白質、及び免疫刺激剤により異なる。例えば、所定の選択的免疫刺激剤は高用量で毒性を示す（従って、組成物を多くしても必ずしも効果は増さない）。従って、投与を場合により各対象に個別設計する。用量は場合により連続投与する。換言するならば、複数用量を場合により処置期間にわたって投与する。投薬期間は場合により対象の応答に基づいて処置中に変更する。例えば、対象が特定期間内で十分に応答しない場合には用量及び／又は投薬タイミングを場合により増加又は変更する。
【００８３】
更に、下記実施例Ｉ及びＩＩは本発明の組成物を使用する投薬（量及びタイミング）スケジュールの非限定的な例を示す。このような処置スケジュールは同実施例ではマウス等で使用するように設計した例に過ぎず、限定的であるとみなすべきではない。
【００８４】
本発明は更に疾患ないし病態の治療又は予防処置方法に関し、本方法は対象に（体液性及び／又は細胞性）免疫応答を誘発する段階と、本明細書に記載するような本発明の１種以上の核酸又はポリペプチド／融合蛋白質／抗原（又は医薬的に許容可能な賦形剤と１種以上の前記核酸又はポリペプチド及び／又は融合蛋白質及び／又は抗原を含む組成物）を対象（例えば哺乳動物（例えばヒト、霊長類、マウス、ブタ、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヒツジ）；又は鳥類（例えばニワトリ又はアヒル）もしくは魚類等の非哺乳類脊椎動物又は無脊椎動物）にｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ投与することにより免疫組成物を投与する段階を含む。
【００８５】
本発明の１選択的側面では、ｅｘ  ｖｉｖｏ法において対象の１種以上の目的細胞又は細胞集団（例えば樹状細胞、抗原提示細胞等）を対象から取得又は取出し、疾患、疾病、又は他の病態を予防又は治療処置するのに有効な量の本発明の融合蛋白質及び抗原と接触させる。接触させた細胞を次に対象のこれらの細胞を取得した部位又は治療する対象の別の目的部位に（例えば筋肉内注射等により）再導入又は送達する。本発明の方法／組成物は前記細胞を必要部位（例えば腫瘍又は感染部位）に送達するか又は無関係の部位（例えば遠位体部分等）に送達するかに関係なく、場合により有効な免疫応答を誘発する。所望により、接触させた細胞を周知の標準付着、注射及び移植技術により対象の目的組織、臓器、又は系部位（例えば腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、臓器細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、子宮、膣、前立腺、口腔、舌等の細胞）に付着、注射、移植等してもよいし、又は例えば標準送達もしくは輸液技術を使用して血液もしくはリンパ系に送達してもよい。
【００８６】
本発明は更に場合により疾患、疾病、又は他の病態を予防又は治療処置するのに有効な量の本発明の抗体融合蛋白質及び／又は抗原と対象の１種以上の目的細胞又は細胞集団を直接又は間接的に接触させるｉｎ  ｖｉｖｏ方法も提供する。いずれのフォーマットでも、組織、臓器又は皮膚部位に導入する種々のフォーマット（例えば局所投与、（例えば注射針又は注射器を使用することによる）注射、又はワクチンもしくは遺伝子銃送達）の任意のものにより、抗体融合蛋白質及び／又は抗原を場合により細胞（例えば腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、感染部位（例えば腫瘍等）臓器細胞、血液細胞，皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、子宮、膣、前立腺、口腔、舌等の細胞）に投与ないし導入する。分子は例えば筋肉内、皮内、真皮下、皮下、経口、腹腔内、クモ膜下、静脈内に送達してもよいし、（例えば手術中等に）体腔内に配置してもよいし、吸入や膣もしくは直腸投与により導入してもよい。より典型的な態様では、本発明の抗体融合蛋白質及び／又は抗原は場合により処置を直接必要としない部位等に投与又は導入される。例えば、典型的態様では、本発明の抗体融合蛋白質及び／又は抗原を例えば腫瘍、感染部位等から遠位の部位に例えば筋肉内又は静脈内注射する（例えば上記参照）（例えば治療しようとする腫瘍が肺等に存在する場合には動物の脇腹に注射）。この場合でも免疫応答は本発明の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質／抗原組成物により発生される。
【００８７】
別の選択的側面では、本発明は対象の１種以上の目的細胞又は細胞集団（例えば腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、臓器細胞、血液細胞，皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、子宮、膣、前立腺、口腔、舌等の細胞）を対象から取得又は取出し、疾患、疾病、又は他の病態を予防又は治療処置するのに有効な生体活性分子として本発明で使用される抗体−免疫刺激剤融合蛋白質及び／又は抗原をコードするターゲット核酸を含むポリヌクレオチド構築物と前記１種以上の細胞又は細胞集団を接触させることにより形質転換させるｅｘ  ｖｉｖｏ方法を提供する。（例えば抗体−免疫刺激剤融合蛋白質及び／又は抗原を発現する）ポリヌクレオチド構築物（及び前記核酸配列の発現を制御するプロモーター）の細胞取込みが生じ、本発明のターゲット核酸配列が十分に発現される結果として疾患、疾病、又は他の病態を予防又は治療処置するのに有効な量の生体活性分子が産生されるように十分な量のポリヌクレオチド構築物及びプロモーターと１種以上の細胞又は細胞集団を接触させる。ポリヌクレオチド構築物は本発明の核酸配列の発現を制御するプロモーター配列（例えばＣＭＶプロモーター配列）及び／又は、所望により、本発明の別の目的分子等（例えばサイトカイン、アジュバント、又は補助刺激分子、又は他のポリペプチド等）の少なくとも１種以上をコードする１種以上の付加ヌクレオチド配列を含むことができる。
【００８８】
トランスフェクション後に、形質転換細胞を取得した対象の組織部位もしくは系又は対象の別の部位（例えば腫瘍細胞、腫瘍組織サンプル、臓器細胞、血液細胞、皮膚、肺、心臓、筋肉、脳、粘膜、肝臓、腸、脾臓、胃、リンパ系、子宮、膣、前立腺、口腔、舌等の細胞）にこれらの細胞を場合により再導入、送達又は導入する。所望により、周知の標準移植技術を使用して細胞を対象の目的組織、皮膚、臓器又は体系に移植してもよいし、標準送達もしくは輸液技術を使用して血液又はリンパ系に送達してもよい。形質転換細胞のこのような送達、投与又は導入は一般に上記投与経路又は方式の１種以上を使用することにより実施される。ターゲット核酸の発現は自然に発現させてもよいし、コードされる抗体−免疫刺激剤融合蛋白質及び／又は抗原が疾患又は病態を処置するために十分且つ有効な量で発現されるように誘導してもよい。組成物等の発現部位は対象の必要部位又はその近傍である必要はない。本明細書全体に説明するように、本発明の組成物における抗体−免疫刺激剤融合蛋白質及び／又は抗原は例えば腫瘍又は感染に対する免疫応答を誘発するために例えば腫瘍細胞、感染性生物等と必ずしも直接接触する必要はない。
【００８９】
別の選択的側面では、本発明は疾患、疾病、又は他の病態を予防又は治療処置するのに有効な本発明で使用される生体活性抗体−免疫刺激剤融合蛋白質及び／又は抗原をコードする核酸を含むポリヌクレオチド構築物と対象の１種以上の目的細胞又は細胞集団（例えば上記細胞及び細胞系及び対象を含む）を接触させる（か又は上記投与経路又は方式の１種以上を使用して細胞又は細胞集団に投与もしくは導入する）ことにより細胞又は細胞集団を対象の体内で形質転換させるｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提供する。
【００９０】
生体活性分子をコードする核酸配列と前記核酸配列の発現を制御するプロモーターを含むポリヌクレオチド構築物（及びプロモーター）の細胞取込みが生じ、本発明の核酸配列が十分に発現される結果として疾患又は病態を予防又は治療処置するために有効な量の生体活性抗体融合蛋白質及び／又は抗原が産生されるように十分な量のポリヌクレオチド構築物と細胞を上記投与経路又は方式の１種以上によりまず直接接触させることによりポリヌクレオチド構築物を場合により細胞に投与又は導入することができる。ターゲット核酸の発現は自然に発現させてもよいし、コードされる抗体融合蛋白質及び／又は抗原が適切な免疫応答を誘発することにより疾患又は病態を処置するために十分且つ有効な量で発現されるように誘導してもよい。ポリヌクレオチド構築物は核酸配列の発現を制御するプロモーター配列（例えばＣＭＶプロモーター配列）及び／又は、所望により、本発明で使用される別の目的分子（例えばサイトカイン、アジュバント、又は補助刺激分子、又は他の同様の分子）の少なくとも１種以上をコードする１種以上の付加ヌクレオチド配列を含むことができる。
【００９１】
上記ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ処置方法の各々において、本発明で使用される賦形剤と抗体融合蛋白質及び／又は抗原又は前記蛋白質をコードする核酸を含む組成物を投与又は送達することができる。１側面では、本発明で使用される医薬的に許容可能な賦形剤と前記分子又は核酸を含む組成物は疾患又は病態を処置するために有効な量を上記のように対象に投与又は送達される。
【００９２】
別の側面では、上記各ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ処置方法において、細胞又は対象に投与されるポリヌクレオチドの量は対象の１種以上の細胞に前記ポリヌクレオチドが取込まれ、前記核酸配列が十分に発現される結果として対象で免疫応答を増強又は誘発するために有効な量の生体活性分子が産生されるように十分な量とすることができる。別の側面では、前記各方法で細胞又は対象に投与される分子の量は対象で免疫応答を増強又は誘発するために十分な量とすることができる。
【００９３】
更に別の側面では、ポリヌクレオチド構築物（又はポリヌクレオチド構築物を含む組成物）を使用するｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ処置方法において、誘導型オンオフ遺伝子発現システムを使用することによりポリヌクレオチド構築物の発現を誘導することができる。このようなオンオフ遺伝子発現システムの例としては夫々Ｔｅｔ−Ｏｎ（登録商標）遺伝子発現システムとＴｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）遺伝子発現システムが挙げられる。他の制御可能ないし誘導型のオンオフ遺伝子発現システムも当業者に公知である。このようなシステムを使用すると、ポリヌクレオチド構築物のターゲット核酸の発現を精密、可逆的且つ定量的に調節することができる。ターゲット核酸の遺伝子発現は例えばターゲット核酸を含むポリヌクレオチド構築物を含む安定なトランスフェクト細胞を目的組織部位、臓器又は系に送達又は導入又はこれらと接触させた後に誘導することができる。このようなシステムは（例えば手術の完了及び／又は手術後の治癒に要する時間を考慮；ターゲット核酸を含むポリヌクレオチド構築物が発現用部位、細胞、系又は組織に到達するまでの時間を考慮；構築物で形質転換された細胞を含む移植片がこれをスプライス又は結合した組織又は臓器に取込まれるまでの時間を考慮する等の点で）ターゲット核酸の発現を遅延又は精密に制御することが望ましい処置方法及びフォーマットで特に有益である。
【００９４】
所定態様では、本発明は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を提供し、融合蛋白質を対象に投与することにより免疫組成物を投与する方法に関し、融合蛋白質は疾患関連抗原の有効なアジュバントを含み、融合蛋白質と抗原は共同して対象に免疫応答を誘発する。更に、所定態様では疾患関連抗原を提供すると共に前記融合蛋白質を投与する（例えば融合蛋白質と抗原を対象に投与し、融合蛋白質は抗原の有効なアジュバントである）。所定態様では、融合蛋白質はサイトカイン（又はその配列もしくはサブ配列）、ケモカイン（又はその配列もしくはサブ配列）、又はケモカインもしくはサイトカイン以外の免疫刺激剤を含む。他の態様では、本発明の方法は（限定されないが）例えばサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及び上記の任意のもののフラグメント等の免疫刺激剤ドメインを含む融合蛋白質を使用する。
【００９５】
本発明の方法の態様で使用される融合蛋白質の抗体ドメインは場合により例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原、腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、真菌抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患抗原、感染性寄生虫抗原（例えば哺乳動物の寄生虫）に特異的である。他の態様では、抗体ドメインは腫瘍抗原以外の抗原を含む抗原に特異的である。本発明のこのような態様における融合蛋白質の抗体ドメインは場合により（限定されないが）例えば抗体フラグメント、Ｆａｂドメイン、Ｆａｂ´ドメイン、Ｆ（ａｂ´）２ドメイン、Ｆ（ａｂ）２ドメイン、ｓｃＦｖドメイン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３である。これらの方法の所定態様では、融合蛋白質は抗原に対して抗体特異性をもつ。
【００９６】
本発明のこれらの方法は更に抗原が例えば腫瘍抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、マイコプラズマ抗原、プリオン抗原、自己免疫疾患抗原、寄生虫抗原（例えば哺乳動物に感染する寄生虫）、腫瘍抗原以外の抗原、対象に由来する抗原、対象の体内の疾患状態に由来する抗原、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する抗原を含む態様を包含する。場合によりこのような抗原を生じる対象の体内の疾患状態は場合により例えば腫瘍、細菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、プリオン、自己免疫疾患、又は寄生虫（例えば哺乳動物に感染する寄生虫）に起因する。本発明のこのような態様における抗原は更に場合により外来抗原であり、場合により対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来する疾患関連抗原に実質的に一致するものでもよい。このような外来抗原は場合により抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与する前、又は場合により融合蛋白質を対象に投与した後、又は融合蛋白質を対象に投与するとほぼ同時に投与する。選択的同時投与前に抗原と融合蛋白質を選択（又は特定）時間にわたって選択（又は特定）条件下で（例えば４℃等で１秒もしくはほぼ瞬時インキュベーションから一晩以上まで）インキュベーションすることができる。本発明のこのような態様で使用される抗原は更に場合により例えば例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ、腫瘍細胞から脱落したＨＥＲ２／ｎｅｕ、又はこのようなＨＥＲ２／ｎｅｕのフラグメントを含む。所定態様では前記方法において抗原分子数と融合蛋白質分子数は場合により約１：１である。他の態様では、抗原分子数と融合蛋白質分子数は場合により抗原分子数が融合蛋白質分子数よりも多いか又は少ないか、又は融合蛋白質分子数が抗原分子数により実質的に飽和されるか、又は抗原分子数が融合蛋白質分子数により実質的に飽和されるような比である。これらの方法の他の態様では２種以上の融合蛋白質を場合により使用する。このような多重融合蛋白質は異なる免疫刺激剤ドメイン（例えば（限定されないが）非サイトカイン／非ケモカイン分子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｃ−Ｃファミリーケモカイン、Ｃケモカイン、ＣＸ３Ｃケモカイン、スーパー抗原、成長因子、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＲＡＮＴＥＳ、ｍｉｐ１α、ｍｉｐ１β、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ、γインターフェロン、αインターフェロン、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ｍｉｐ２α、ｍｉｐ２β、ＰＦ４、血小板塩基性蛋白質、ｈＩＰ１０、ＬＤ７８、Ａｃｔ−２、ＭＣＡＦ、１３０９、ＴＣＡ３、ＩＰ−１０、リンホタクチン、フラクタルカイン、ＫＬＨ、及び上記の任意のもののフラグメントから選択されるもの）を含むことができる。更に、これらの方法における多重融合蛋白質は場合により異なる特異性をもつ。選択的多重融合蛋白質は例えば単一分子上の異なる抗原、単一細胞上の異なる抗原、単一腫瘍上の異なる抗原、又は単一生物（例えばウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、プリオン、寄生虫）上の異なる抗原等に特異的であることができる。免疫組成物の投与方法は更にこのような投与が対象に免疫応答を誘発する態様を含む。
【００９７】
更に他の態様では、本発明は対象の疾患状態の予防及び／又は治療処置方法に関する。このような方法は有効量の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与する段階を含み、融合蛋白質は疾患関連抗原（例えば対象に由来するか、対象の体内の疾患状態に由来するか、又は対象の体内の疾患関連生物に由来するもの）の有効なアジュバントを含み、前記投与が疾患関連抗原（又は近縁抗原）に対する免疫応答を対象の体内に誘発する。このような疾患状態の予防及び／又は治療処置方法は更に場合により有効量の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を対象に投与する段階と疾患関連抗原を対象に投与する段階を含み、融合蛋白質が疾患関連抗原の有効なアジュバントを含む。
【００９８】
ＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原とブドウ球菌プロテインＡ抗原に対する免疫応答を誘発するための本発明の使用
所定疾患／病態／等（例えば薬物処置が無効な微生物（例えば多剤耐性細菌等）感染や、所定癌、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕを提示する癌）の治療及び／又は予防処置における問題を解決するために可能な手段の１つは発現する腫瘍又は感染因子等に対して強力な免疫応答を誘発するように特定蛋白質で免疫する方法である。例えば、以下に詳述するように、本発明の所定態様では腫瘍細胞に対する免疫応答を患者に誘発することを見込んで癌患者を適切な抗原で処置（例えば注射／ワクチン接種）する。更に、このような処置（例えば適切な抗原によるワクチン接種）は所定型の感染性生物（例えばウイルス等）に対して免疫応答を誘発する一般アプローチである。感染性生物に対する伝統的なワクチン接種ストラテジーは当業者に周知である。
【００９９】
本発明は例えば腫瘍、感染因子（例えばウイルス等）に由来する疾患関連抗原に対する体液性及び／又は細胞性両者の免疫応答を対象に誘発するための有効な手段として蛋白質ワクチン接種のアジュバントとして抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を使用する（例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質について詳述する下記実施例Ｉ及び黄色ブドウ球菌プロテインＡについて詳述する実施例ＩＩ参照）。例えば下記実施例Ｉに示すように、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）を含む抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を蛋白質ワクチン接種として使用する抗原（同様に本明細書ではＨＥＲ２／ｎｅｕにより例証）の可溶性形態のアジュバント（即ち免疫エンハンサー）として使用した。当然のことながら、他の態様では、他の抗原を使用に選択する。上記参照。
【０１００】
本発明は例えば腫瘍又は感染因子の直接ターゲティングに抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を使用するのではなく、その代わりに、抗体融合体と抗原を併用して特定抗原（例えば腫瘍又は感染性生物）に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発する。このアプローチでは、抗腫瘍活性又は感染因子に対する免疫活性を誘発するために抗体融合蛋白質による腫瘍の直接ターゲティング又は感染因子の直接ターゲティングは必要ないことを特筆することが重要である。例えば、強力な抗腫瘍活性を生じる強力な細胞性及び体液性免疫応答を誘発するには、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をその特定抗原（例えば実施例ＩではＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン（ＥＣＤＨＥＲ２））と混合すれば十分である（即ち本発明の融合蛋白質等は内在体液性／細胞性免疫応答を刺激する）。
【０１０１】
当然のことながら、本明細書全体に説明するように、種々の疾患／病態に種々の免疫刺激剤と抗体の組合せを使用できるだけでなく、種々の態様では、抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の種々の組合せを併用することができる。例えば、所定処置レジメンでは、免疫応答を刺激する相乗効果を生じるように（例えば下記実施例ＩにおいてＩｇＧ３−ＩＬ−２、ＩｇＧ３ＩＬ−１２等を使用して実施したように）種々の抗体−免疫刺激剤融合体を同一処置期間に対象に投与することができる。更に、所定の選択的態様では、同一腫瘍又は感染因子上の種々の抗原を同一処置期間にターゲティングする。例えば、感染性細菌上の２種以上の表面抗原を場合により本発明の２種以上の異なる抗体−免疫刺激剤融合蛋白質でターゲティングする。
【０１０２】
上記記載から明らかなように、本発明の方法、組成物等を使用すると対象の処置時間を節約することができる。迅速な応答と作用は多くの病態の処置（例えば後期癌、進行細菌感染等の治療）で最も重要である。例えば、抗体融合蛋白質を抗原ワクチンのアジュバントとして使用すると、その抗原に対する抗体の高親和性を利用できる。従って、本発明の使用は疾患関連抗原と免疫刺激剤（例えばサイトカイン又は他の免疫刺激分子）を併用する簡単な方法であり、免疫刺激剤（例えばサイトカイン又は他の免疫刺激剤）と遺伝子工学的に融合した抗原から構成される抗体融合蛋白質を構築する必要がない。このような融合体は扱いにくく、共有結合パートナーの一方又は両方の活性が低減（即ち抗体又は免疫刺激剤の活性が低減）しかねない。更に、本発明のような抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の使用は循環抗原（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ脱落可溶性ＨＥＲ２／ｎｅｕ、感染性微生物からの可溶性抗原等）をターゲティングする唯一の方法である。当然のことながら、この場合も、（本明細書の実施例で使用するような）ＨＥＲ２／ｎｅｕを提示する癌及び黄色ブドウ球菌感染の処置における本発明の使用の利点は本明細書に記載する情報から明らかなように、多数の他の疾患状態、感染、癌等の処置でも得られる。
【０１０３】
本発明の特性を例証するために本明細書で使用する全例示蛋白質（例えば抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（１Ｌ−２）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ））は適正に会合及び分泌されるように決定した。従って、融合蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を還元及び非還元両者の条件下に予想分子量で泳動した。更に、融合蛋白質は適切な抗原と結合し、リガンド及び抗体関連機能を実施した。より重要な点として、例示抗体融合蛋白質による直接処置（例えば静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は他の投与方法）の結果、抗体単独（同一可変領域を含む抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３）では防御を付与できない条件下でヒトＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するマウス腫瘍モデルで有意な抗腫瘍活性が得られた（下記及びＰｅｎｇら，１９９９；Ｄｅｌａ  Ｃｒｕｚら，２０００；Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，２００１，いずれも前出参照）。
【０１０４】
本発明の非限定的な１例としては、動物モデルにおけるＥＣＤＨＥＲ２ワクチン接種の免疫エンハンサーとしての抗体−サイトカイン融合蛋白質（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）、及び抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ））の使用が挙げられる（より詳細なプロトコールの記載については下記参照）。当然のことながら、ＥＣＤＨＥＲ２はＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメインを含む（例えば腫瘍細胞により脱落されるドメイン；本発明の実施例で使用される組換え型は対象で脱落されるこのような細胞外ドメインと同じである）。要約すると、マウスにヒトＥＣＤＨＥＲ２、ＥＣＤＨＥＲ２と抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体、又はＥＣＤＨＥＲ２と各抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−サイトカイン融合蛋白質を（別々に）ワクチン接種した。ブースター後にラットＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質（ＴＵＢＯ）を発現する同系癌でマウスを攻撃した。ＥＣＤＨＥＲ２＋全３種の抗体−サイトカイン融合蛋白質をワクチン接種したマウスには対照群（即ちＰＢＳ，ＥＣＤＨＥＲ２又はＥＣＤＨＥＲ２＋抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体）のマウスに比較して腫瘍増殖速度の有意低下と長期生存数の増加が認められた。ＥＣＤＨＥＲ２＋抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をワクチン接種したマウスには対照群に比較して高いＥＣＤＨＥＲ２特異抗体力価が検出された。ＥＣＤＨＥＲ２＋抗体−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種した群は最高の抗体力価を示した。これらのマウスからの免疫血清はＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現するヒト乳癌）に対して有意ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を示した。ＳＫ−ＢＲ−３の阻害レベルは抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体の阻害レベルに相関した。更に、ＥＣＤＨＥＲ２＋抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をワクチン接種したマウスは高レベルのＥＣＤＨＥＲ２特異的ＩｇＧ２ａ抗体を産生し、ＴＨ１型免疫応答が誘発されたことが判明した。可溶性ＥＣＤＨＥＲ２と共にインキュベーションすると、ＥＣＤＨＥＲ２＋抗体−（ＧＭＣＳＦ）融合蛋白質をワクチン接種したマウスからの脾細胞は他の群に比較して有意刺激とＩＦＮ−γ分泌を示した。これらの結果から、本発明の組成物により体液性と細胞性の両者の応答が誘発されたために抗腫瘍活性が観察されたと思われる。更にこれらの結果から、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−サイトカイン融合蛋白質は患者でＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に対する有効な予防及び治療剤となり得ると思われる（下記参照）。この場合も、当然のことながら、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−免疫刺激剤融合蛋白質に関する記載は本発明で蛋白質ワクチン接種のアジュバントとして使用される抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の一般分類の例証として使用される。
【０１０５】
ヒトＧＭＣＳＦとヒトＩＬ１２はマウスでは不活性であるため、本発明の所定実施例ではマウスＧＭＣＳＦとマウスＩＬ−１２を使用した。本発明の融合蛋白質の実施例ではマウスＧＭＣＳＦ及びＩＬ−１２を使用してマウスモデルで本発明を試験することができた。このような構築は限定的であるとみなすべきではなく、従って、本発明は他の動物系（例えばヒト等）及び他の動物分子（例えばヒトＧＭＣＳＦ、ヒトＩＬ−１２等）にも適用可能である。更に、本明細書の例証ではヒトＩｇＧ３を使用したが、任意免疫グロブリンアイソタイプを使用することができる（上記参照）。更に、本発明の概念はｓｃＦｖ等の他種の抗体フレームワークにも直接適用することができる。上記参照。
【０１０６】
実施例Ｉの考察
実施例Ｉはマウスを（ＥＣＤＨＥＲ２）＋抗体−サイトカイン融合蛋白質で免疫する結果ととして細胞性（ＴＨ１）と体液性（ＴＨ２）の両面の免疫応答が強力に活性化されることを例証する。この活性化はＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍で免疫応答マウスを攻撃した場合の有意抗腫瘍活性に結び付けられる。抗体−免疫刺激剤（例えばサイトカイン）融合蛋白質は図２に示すように抗体−サイトカイン融合蛋白質とＧＭＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２受容体等のＤＣ表面受容体の相互作用を介するか、及び／又は場合により抗体−免疫刺激剤融合蛋白質自体が標的抗原（疾患関連抗原）に対する免疫応答の増強を助長（例えばＩＬ−２細胞増殖シグナル、ＧＭＣＳＦ  ＡＰＣ活性化、ＩＬ−１２によるＴＨ１側への移行等）することによりＥＣＤＨＥＲを樹状細胞ＤＣ（又は他の抗原提示細胞（ＡＰＣ））にターゲティング及び送達するが、場合により、上記のような効果が生じると思われる。上記に説明したように、本発明の方法及び組成物の選択的作用メカニズムは限定的であるとみなすべきではなく、本発明の方法及び組成物の効果と範囲を限定するとみなすべきでもない。
【０１０７】
実施例Ｉでは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質を発現する腫瘍に対して使用することにより本発明の方法及び組成物を例証する。ＨＥＲ２／ｎｅｕプロト癌遺伝子（ｃ−ｅｒｂＢ−２としても知られる）は上皮成長因子受容体と一部相同であって前記受容体に固有のチロシンキナーゼ活性をもつＨＥＲ２／ｎｅｕ又はｐ１８５ＨＥＲ２として知られる１８５ｋＤａ膜貫通糖蛋白質受容体をコードする。Ｃｏｕｓｓｅｎｓら，１９８５“Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｈａｒｅｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１１３２−９；Ａｋｉｙａｍａら，１９８６“Ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃ−ｅｒｂＢ−２  ｇｅｎｅ：ａ  １８５−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１６４４−６；及びＳｔｅｒｎら，１９８６“ｐ１８５，ａ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｉｓ  ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６：１７２９−４０参照。この遺伝子はシステインリッチ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインの３個のドメインから構成される（例えばＣｏｕｓｓｅｎｓ，Ａｋｉｙａｍａ，及びＳｔｅｒｎ，いずれも前出参照）。ヒト乳癌（Ｈａｙｅｓら，２００１“Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＨＥＲ−２／ｅｒｂＢ−２／ｃ−ｎｅｕ（ＨＥＲ−２）ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｂ  Ｓｔｕｄｙ  ８６６２”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：２７０３参照）の２５〜３０％（又は他の文献では２０〜４０％）と、卵巣癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、前立腺癌（例えばＥｓｓｅｒｍａｎら，２００１“Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｐ１８５  ｎｅｕ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｎｅｕ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４７：３３７参照）及び肺癌（例えばＫａｐｔａｉｎら，２００１“Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”Ｄｉａｇｎ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  １０：１３９参照）にＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現が認められる。この過剰発現はＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子増殖の結果として正常組織の１００倍になる場合もある（例えばＹａｒｄｅｎ，２００１“Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６１：１参照）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現は乳癌患者における非再発率と総合生存率の両面の独立予測因子である。例えばＳｌａｍｏｎら，１９８７“Ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｌａｐｓｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１７７−８２；Ｓｌａｍｏｎら，１９８９“Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−１２；Ｐｒｅｓｓら，１９９３“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：５６７５−８２；及びＳｅｓｈａｄｒｉら，１９９３“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １１：１９３６−４２参照。ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は卵巣癌（Ｓｌａｍｏｎら，１９８９，前出参照）、胃癌（Ｙｏｎｅｍｕｒａら，１９９１，“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｅｒｂｂ−２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｐｏｏｒ  ｓｈｏｒｔ  ｔｅｒｍ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５１：１０３４−１０３８参照）、子宮内膜癌（Ｂｅｒｃｈｕｃｋら，１９９１“Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｉｎ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｔａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ”Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １６４：１５−２１参照）、及び唾液腺癌（Ｐｒｅｓｓら，１９９４“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｇｌａｎｄ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：５６７５−８２参照）患者の予後にも重要である。ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現患者では内臓転移と微小転移性骨髄疾患の発生率が高く、ＨＥＲ２／ｎｅｕが転移に関与していることを示唆している（Ｐａｎｔｅｌら，１９９３“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｍｉｃｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ”Ｊ  Ｎａｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８５：１４１９−１４２４；及びＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉら，１９９４  “Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ｅｒｂＢ−２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｏｏｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４９：６５０−５参照）。
【０１０８】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは成長因子受容体として機能し、細胞分化、接着及び運動に役割を果たすと考えられている。例えばＫａｐｔａｉｎ，前出参照。ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は腫瘍の病因と攻撃性に直接役割を果たすことが文献に示唆されており（Ｋａｐｔａｉｎ，前出参照）、新規に診断された原発性乳癌患者における臨床効果不良に関係することも示唆されている（Ｈａｙｅｓ，前出参照）。現今では、ＨＥＲ９／ｎｅｕを発現する進行乳癌患者に抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（Ａｂ）であるトラスツズマブ（ハーセプチン，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を投与すると、客観的応答を誘導することができる。Ｋａｐｔａｉｎ，前出参照。化学療法を併用すると、トラスツズマブと相乗作用してその抗腫瘍活性を強化することができる。しかし、明確な応答が観察されるのは一部の患者に限られており（Ｋａｐｔａｉｎ，前出参照）、臨床転帰を改善するように設計した付加処方が依然として必要である。
【０１０９】
悪性腫瘍ではＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質レベルが高く、この分子は細胞外に接触し易く、更に可溶性ＥＣＤ  ＨＥＲ２／ｎｅｕが随時腫瘍から脱落すること（及び前記蛋白質が関連する癌の重篤度と有病率）から、ＨＥＲ２／ｎｅｕは腫瘍特異的ワクチン接種の優れた腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。しかし、残念ながら、ＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質を使用した免疫は動物（非ヒト）モデルで非常に期待外れであった。例えば、Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｋ．Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ．２００１  “Ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：１２参照。腫瘍細胞を直接標的とする抗体−サイトカイン融合体（例えばＩＬ−２とハーセプチンの可変領域の抗体融合蛋白質、例えばＰｅｎｉｃｈｅｔ  ２００１（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），前出，Ｐｅｎｇ，１９９９，前出、及びＤｅｌａ  Ｃｒｕｚ  ２０００，前出参照）を使用してある程度成功しているが、このような抗体は所定腫瘍の処置に欠点がある（例えば血管新生不良により腫瘍に接近できなかったり、抗体が脱落抗原と結合するために腫瘍に接近できない等）。当然のことながら、このような従来の抗体−サイトカイン腫瘍処置はウイルス、細菌等の感染因子に起因する疾患／病態の（治療又は予防）処置にも応用できない。
【０１１０】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは正常組織での発現率が低く、多数の異なる型の癌で過剰発現することから能動的免疫療法の魅力的なターゲットになっている。Ｋａｐｔａｉｎ，前出参照。ＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質に特異的なワクチンは多数の異なるヒト悪性腫瘍の治療及び／又は予防に広く利用されよう。例えばＤｉｓｉｓら，２００１  “Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｒｉａｌｓ：ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｍｏｄｅｌ”Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：２６３参照。実際に、ＤＮＡワクチンはｎｅｕトランスジェニック動物でラットＨＥＲ２／ｎｅｕ（ｎｅｕ）を発現する腫瘍に対して防御免疫を誘導することが従来示されている。例えばＲｏｖｅｒｏら，２０００“ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒａｔ  ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ  ｐ１８５  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５１３３；Ｌａｃｈｍａｎら，２００１“ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｎｅｕ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：２５９；Ｃｈｅｎら，１９９８“ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｏｒ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  Ｎｅｕ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｎｅｕ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：９１６５；及びＰｕｐａら，“Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｎｅｕ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｆｏｒ  ｒａｔ  ｐｒｏｔｏ−ｎｅｕ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：７５参照。ＨＥＲ２／ｎｅｕのペプチドワクチンも動物モデルで耐性を「克服」し、抗腫瘍活性を発生することができた。例えばＮａｇａｔａら，１９９７“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｃ−ｅｒｂＢ−２？ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ＣＴＬ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ  ｈｏｓｔｓ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：１３３６；及びＤｉｓｉｓら，１９９６“Ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｗｈｏｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ，ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５６：３１５１参照。しかし、不完全フロイントアジュバント中のｎｅｕで免疫したラットはｎｅｕ特異的応答を示さなかった（Ｄｉｓｉｓ，１９９６  前出参照）。ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＥＣＤ蛋白質でラットを免疫するとｎｅｕに対する免疫応答を生じた（Ｔａｙｌｏｒら，１９９６“Ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｒａｉｓｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｅ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ，ｂｕｔ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｒａｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂ１０４  ｔｕｍｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｎｅｕ”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４２：１７９参照）ことから、「自己」腫瘍抗原と高相同性の外来蛋白質は「自己」腫瘍抗原に対する応答を発生するのに有効であるらしいことが示唆された（Ｄｉｓｉｓら，１９９８“ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：３７）が、ｎｅｕを発現する腫瘍に対する防御は付与しなかった（Ｔａｙｌｏｒ，前出参照）。従って、自己腫瘍抗原に対する耐性を克服しても腫瘍防御を付与するには不十分であるらしい。この点は異種免疫原性ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質を発現する同系腫瘍を拒絶しない免疫応答マウスでも実証された。Ｆｏｙら，２００１“Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＤＮＡ  ｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ａ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ”Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２５９８；Ｓｈｉｋｕら，２０００  “Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ  ＤＮＡ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４６：Ｓ７７；及びＰｅｎｉｃｈｅｔら，１９９９“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｅｘｐｒｅｓｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍｉｃｅ”Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ４９：１７９参照。特に、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）及び細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をワクチン接種するといずれも検出可能な免疫応答を誘発したが、抗腫瘍活性を示したのはＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩＣＤをワクチン接種したマウスのみであった（Ｆｏｙ，前出参照）。このように、免疫応答の誘発が必ずしも抗腫瘍応答に結び付くわけではない。従って、耐性の克服に加え、腫瘍増殖に対する防御を生じるために適切な応答の強化が不可欠である。
【０１１１】
ＨＥＲ２／ｎｅｕをもつ悪性腫瘍患者に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であるＨＥＲ２／ｎｅｕに対する所定レベルの体液性及び細胞性免疫が存在することは示されている（Ｄｉｓｉｓら，１９９８“ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：３７；Ｙｉｐら，２００１“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｔｉ−ＥｒｂＢ−２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６６：５２７１；及びＤｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．ら，２００１“Ｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：１２参照）が、このような免疫は患者に防御を付与するには明らかに不十分である。既存免疫を増強すると治療効果があるらしいと予想されている（Ｄｉｓｉｓ  １９９８，前出参照）が、ペプチド又はペプチドバルス樹状細胞（ＤＣ）ワクチンを使用してＨＥＲ２／ｎｅｕに対する免疫のブーストを目的とした最近の臨床試験はまだ臨床効果を示していない。例えばＤｉｓｉｓ  １９９９，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４：１２８９＋；Ｂｒｏｓｓａｒｔ，Ｐ．ら，２０００“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ”  Ｂｌｏｏｄ  ９６：３１０２；及びＭｕｒｒａｙ，Ｊ．ら，２０００“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ”  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：７１参照。従って、ＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質を標的とするワクチン処方として、免疫耐性を克服して既存免疫をブーストするだけでなく、癌を根絶することが可能な免疫応答を発生するように設計された処方が依然として必要である。この点で、本発明の方法、組成物等はＨＥＲ２／ｎｅｕを提示する癌等の疾患状態の処置に適用可能である。
【０１１２】
ＥＣＤＨＥＲ２の低免疫原性は樹状細胞（ＤＣ）におけるＥＣＤＨＥＲ２の不適正な取込みとトラフィキングに関係があり、その結果としてＭＨＣクラスＩＩ提示欠損を生じることは示唆されている。Ｈｉｌｔｂｏｌｄら，２０００，“Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＭＵＣ１  ｉｓ  ａ  ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：３７３０−４１参照。しかし、図２に示す選択的相互作用（例えば抗原と複合体化した抗体−免疫刺激剤がＡＰＣ又はＤＣと相互作用するという本発明の概念）は場合により抗原提示量及び／又は品質を変化させ、その結果、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に対して強力なＴ及びＢ細胞免疫応答を生じる。更に、本発明の抗体融合蛋白質に融合した免疫刺激剤（例えばサイトカイン）の選択的一般免疫刺激活性は場合により標的抗原に対する免疫応答の増強（例えばＩＬ−２−細胞増殖シグナル、ＧＭＣＳＦ−ＡＰＣ活性化及びＩＬ−１２によるＴＨ１側への移行）をそれ自体助長する。この場合も、このような選択的作用メカニズムは限定的であるとみなすべきではない。上記参照。
【０１１３】
誘発される（即ち本発明の方法等の使用により発生される）免疫応答は癌細胞の表面に発現されるＨＥＲ２／ｎｅｕ（体液性免疫応答）だけでなく癌細胞の表面のＭＨＣクラスＩに関連するＨＥＲ２／ｎｅｕペプチド（細胞性免疫応答）に対しても誘発される。この場合も、種々の態様で他の抗原／腫瘍／細胞を標的とする場合には、本発明は更にこれらの抗原等に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答も誘発する。実施例Ｉでは、ＨＥＲ２／ｎｅｕが上皮成長因子受容体１、２、及び３（ＥＧＦ１，ＥＧＦ２，ＥＧＦ３）等の他の成長因子受容体と高い相同性をもつので、誘発される（体液性及び／又は細胞性）免疫応答は標的抗原（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）だけでなく、癌細胞上に発現される他の相同受容体に対しても誘発される。
【０１１４】
例証する実施例Ｉでは、ＥＣＤＨＥＲ２蛋白質ワクチン接種のアジュバントとしての抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の効力を試験した。ＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質で免疫すると、腫瘍細胞増殖を刺激する抗体を誘導することにより有害な効果を生じるらしいことは示唆されている（Ｙｉｐ，前出参照）が、本発明を使用した場合にこのような活性は観察されなかった。逆に、どの抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をワクチン接種した場合にもヒトＨＥＲ２／ｎｅｕでなくラットｎｅｕ蛋白質を発現するマウス細胞（ＴＵＢＯ）に対する有意防御がマウスに付与された。換言するならば、ＴＵＢＯ細胞はラットｎｅｕ蛋白質を発現し、ワクチン接種したマウスはこの蛋白質に対して防御された。下記参照。ＴＵＢＯ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖は抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体により変化しなかったが、ＳＫ−ＢＲ−３細胞は増殖を阻害され、高レベルの抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧを含有する血清を使用した場合に最高の阻害が観察された。３種の異なる抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を使用して同程度の抗腫瘍活性が生じたが、抗体及び細胞性免疫応答を分析した処、これらの高度防御機序は異なる経路で機能することが示唆された。更に、上記知見は本発明により発生される免疫応答が場合により近縁及び／又は類似抗原に対する応答も発生できることを例証するものである。下記実施例Ｉ参照。
【０１１５】
実施例Ｉでは、抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体応答の品質と量は免疫スケジュールに依存した。高いＴＨ２（Ｓｕら，２００２“ＩＬ−１２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｃｈａｂａｕｄｉ  ＡＳ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：１３４８参照）抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ１応答が観察されたのはＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）とＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスのみであった。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスは高いＴＨ１（Ｓｕら，前出参照）抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３応答を示したが、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスでは低い応答しか誘発されなかった。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスでは更に低いＬｇＧ２及びＬｇＧ３応答しか誘発されなかった。これらのレジメンから得られた血清移行によると、体液性経路を介してＴＵＢＯに対する防御を媒介できると思われる。移行した免疫血清の特性決定によると、腫瘍防御には抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体応答の品質と量が重要であるらしいことが示唆された（例えば抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ１レベルは例えば腫瘍防御レベルと相関を示さなかった）。ＥＣＤＨＥＲ２単独をワクチン接種したマウスからの未防御血清中の抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａレベルがＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスからの防御血清と同等であったという知見は、腫瘍防御が抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａにより媒介されないことを示唆した。他方、抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ３レベルは防御レベルと相関しており、観察される防御におけるその関与が示唆された。しかし、当然のことながら、抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａを介する防御が本発明を使用する他の免疫条件で生じる可能性がないという訳ではない。
【０１１６】
実施例Ｉでは、可溶性ＥＣＤＨＥＲ２の存在下におけるＩＦＮ−γの脾細胞増殖及び分泌の量はワクチン接種レジメンに依存した。これはユニークな細胞性免疫レパートリーがワクチン接種マウスで発生したことを意味し、従って、ＴＵＢＯ攻撃に対して観察された防御におけるその重要性を示唆している。実際に、免疫血清がナイーブマウスを防御する能力と細胞活性化レベルには逆の相関が認められた。例えば、ナイーブマウスに最強防御を付与したのはＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスではなく、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスからプールした移行血清であった。他方、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスの脾細胞は可溶性ＥＣＤＨＥＲ２に対する応答の増幅を示したが、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスは示さず、体液性経路による防御が不十分な条件では細胞性応答の活性化が必要であるらしいことが判明した。
【０１１７】
以上の結果をまとめると、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスの防御は主に体液性経路により媒介され、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスの防御には細胞性応答が関与している。更に、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスの防御は体液性と細胞性の両者の応答に依存した。従って、これらの結果から、体液性と細胞性の両者の応答を併用すると、相乗効果が生じ、より強力な抗腫瘍応答が得られると思われる。このような例として、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスはＴＵＢＯ攻撃から１９日後に５頭で腫瘍が検出されなかったが、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスでは３頭であり、対照群では皆無であった。
【０１１８】
ＴＵＢＯに対する抗腫瘍応答を増強するには、ＩＦＮ−γによる細胞毒性エフェクター細胞の活性化が場合により必要である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ワクチン接種したマウスをＴＵＢＯ細胞で攻撃すると、腫瘍微小環境内のＡＰＣがラットｎｅｕ蛋白質（ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕと＞９０％相同）を含むＴＵＢＯ細胞抗原をプロセシングし（Ｔａｙｌｏｒら，１９９８“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｎｅｕ／ＨＥＲ２−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｕｒｓ”  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ５：１５３５参照）、ＥＣＤＨＥＲ２でプライミングされたＴ細胞に抗原を提示することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイによると、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）とＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスでは活性化Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの強力な分泌が顆粒球、マクロファージ、及び単球等のエフェクター細胞の細胞毒性能（例えばＡｒａｉら，１９９０“Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ｃｏｏｒｄｉｎａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：７８３；Ｃｈｅｎら，１９９５“Ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ２５１  ｘ  ２２（ａｎｔｉ−ＣＤ３３  ｘ  ａｎｔｉＣＤ６４）”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １：１３１９；及びＶａｉｃｋｕｓら，１９９０“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  Ｌｙｍ−１−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ”Ｂｌｏｏｄ  ７５：２４０８参照）を誘導し、更に抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）でマウスＩｇＧ２ａ抗体（例えばＲｏｄｏｌｆｏら，１９９８“ＩｇＧ２ａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）１２−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＩｇＧ１  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＩＬ−４  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５８：５８１２参照）により選択的に利用されるＦｃγＲＩ受容体のアップレギュレーション（例えばＣｈｅｎ，前出；Ｖａｉｃｋｕｓ，前出；Ｈａｒｔｎｅｌｌら，１９９２  “ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１４７１；ｔｅ  Ｖｅｌｄｅら，１９９２“ＩＬ−１０  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  Ｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ，ＩＬ−４，ａｎｄ  ＩＬ−１０”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９：４０４８；Ａｎｓｅｌｍｉｎｏら，１９８９“Ｈｕｍａｎ  ｂａｓｏｐｈｉｌｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩ（ＣＤｗ３２）ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８４：９０７；Ｂｕｃｋｌｅら，１９８９“Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３：２２９５；及びＫｌｅｂａｎｏｆｆら，１９９２  “Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｔｏｒａｇｅ”  Ｂｌｏｏｄ  ８０：２２５参照）を誘導すると思われる。従って、エフェクター細胞が有効なＡＤＣＣを媒介するように多数のＦｃγＲＩ受容体をもっているという条件で、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスで検出されるように比較的低い抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａレベルでＴＵＢＯに対する防御応答を生じることが可能である。実際に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてマウスＩｇＧ２ａ抗体を介してＩＦＮ−γにより誘導されたＡＤＣＣの増加はＦｃγＲＩ誘導の効果であると推測された（Ｖａｉｃｋｕｓ，前出参照）。更に、活性化エフェクター細胞は場合により抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体によりＴＵＢＯにターゲティングされる。ナイーブマウスでは活性化エフェクター細胞が最適に達しないか又は他の点で欠損しているので高レベルの抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧを含有する移行血清の防御効果が弱いが、これは上記の理由から説明することができる。実際に、ｎｅｕ−ＤＮＡをワクチン接種した防御マウスに移植されたＴＵＢＯはＰＭＮが多量に浸潤しており、誘発された抗ｎｅｕ抗体により媒介されていることが示唆されている（Ｒｏｖｅｒｏ，前出参照）。
【０１１９】
ＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とするワクチンストラテジー（例えば本発明のストラテジーを含む）は場合によりモノクローナル抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体の受動的注入よりもＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する癌患者の処置に有効である。受動的モノクローナル抗体注入の１つの欠点は循環期間が短く（Ｄｉｓｉｓ  ２００１，前出参照）、その治療能が弱まるという点である。患者に臨床応答を誘導するためには最適循環レベルのトラスツズマブが不可欠であることが判明した（Ｂａｓｅｌｇａら，１９９６  “Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｗｅｅｋｌｙ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ｐ１８５ＨＥＲ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １４：７３７参照）。従って、ＧＥＲ２／ｎｅｕを標的とする有効なワクチンは場合によりＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的細胞性応答を含む抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体の能動的連続供給（Ｄｉｓｉｓ  ２００１，前出参照）を可能にし、より有効なＨＥＲ２／ｎｅｕ悪性腫瘍に対する免疫を生じると思われる。内在体液性応答の内在性はモノクローナル抗体の長期使用を制限する免疫原性の付加欠点を回避できると思われる（Ｄｉｓｉｓ  ２００１，前出参照）。
【０１２０】
本発明は免疫強化性抗体−免疫刺激剤（例えばサイトカイン等）をアジュバントとして使用する完全ＥＣＤＨＥＲ２による蛋白質ワクチン接種を提供し、本明細書の実施例に例証するように、動物モデルで強力な抗腫瘍活性を提供する。抗腫瘍活性は場合により本発明では最適用量及びレジメンスケジュールの決定と各種抗体−免疫刺激剤融合蛋白質間の潜在的相乗効果により最適化される。更に場合により、本発明ではワクチン接種時の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と疾患関連抗原（例えば本発明では可溶性ＥＣＤＨＥＲ２）の予想される相互作用を試験し、例えば腫瘍防御等を助長するように最適化する。しかし、抗体−免疫刺激剤と疾患関連抗原のこのような最適相互作用が必要であるか否かに関係なく、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−免疫刺激剤融合蛋白質は患者の治療において疾患関連抗原蛋白質ワクチン接種のアジュバントとして使用することができる（例えば抗ＨＥＲ２／ｎｅｕとＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍等）。例えば抗ＢＳＡ抗体応答を増強するためにはダンシル化ＢＳＡと抗ダンシル−（ＩＬ−２）抗体−融合蛋白質の相互作用が必要であったことを示すＨａｒｖｉｌｌら，１９９６“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  ＩｇＧ３−ＩＬ−２  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５７：３１６５参照。
【０１２１】
実施例ＩＩの考察
（治療及び／又は予防）抗腫瘍処置としての使用に加え、本発明の方法及び組成物は場合により感染性疾患因子に対する（同様に、治療及び／又は予防）処置として（例えばウイルス、細菌、マイコプラズマ、真菌、プリオン、又は寄生虫感染等の処置として）も使用される。このような使用は細菌である黄色ブドウ球菌を使用して実施例ＩＩ（下記参照）で例証される。
【０１２２】
黄色ブドウ球菌はグラム陽性細菌であり、院外感染の一般原因であり、高致死率をもたらす院内感染の最高頻度の単離細菌病原体である。例えばＮｉｃｋｅｒｓｏｎら，１９９５“Ｍａｓｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ｄａｉｒｙ  ｈｅｉｆｅｒｓ：ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ”Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ  ７８：１６０７−１８；Ｌｏｗｙ，１９９８  “Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３９：５２０−３２；ＭｃＫｅｎｎｅｙら，１９９９“Ｂｒｏａｄｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１５２３−７；及びＬｏｒｅｎｚら，２０００“Ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ”ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９：１４５−５３参照。黄色ブドウ球菌に起因するヒト疾患としては肺炎、心内膜炎、骨髄炎、敗血性関節炎、術後創傷感染、敗血症、及び毒素性ショック症候群が挙げられる。例えばＮｉｃｋｅｒｓｏｎら，前出；Ｌｏｗｙ，前出；ＭｃＫｅｎｎｅｙら，前出；及びＬｏｒｅｎｚら，前出参照。更に、黄色ブドウ球菌は経済的に重要な動物の深刻な病原体でもある。例えばＮｉｃｋｅｒｓｏｎら，前出；及びＭｃＫｅｎｎｅｙら，前出参照。更に、この細菌の所定株は合成ペニシリン（例えばメチシリン）等の第一選択薬に耐性である。大病院のブドウ球菌単離株の４０〜６０％にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株が含まれる。例えばＮｉｃｋｅｒｓｏｎら，前出；Ｌｏｗｙ，前出；及びＭｃＫｅｎｎｅｙら，前出参照。他方、所謂最後の手段の抗生物質であるバンコマイシンに対して低感受性のＭＲＳＡ株が最近出現し、更に大きな問題となっている。例えばＭｃＫｅｎｎｅｙら，前出参照。これらのバンコマイシン耐性（又は中間）黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）株の出現は治療不能なブドウ球菌感染の恐怖を生じている。そこで、黄色ブドウ球菌感染に対処する代替ストラテジーが緊急に必要であり、この細菌は本発明の方法及び組成物を例証するための理想的ターゲットである。
【０１２３】
黄色ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）は全黄色ブドウ球菌株の９５％に存在する４２ｋＤａ蛋白質である。この蛋白質はドメインＥ，Ｄ，Ａ，Ｂ，及びＣと呼ばれるタンデムに配置された５個の高相同性細胞外Ｉｇ結合ドメインを含む（例えばＢｏｙｌｅ，１９９０，ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｅｄ．Ｂｏｙｌｅ，Ｍ．Ｐ．Ｄ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ），Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１７−２８；及びＧｒａｉｌｌｅら，２０００“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７：５３９９−４０４参照）。この蛋白質は分泌型と膜結合型の両者で存在し、そのメカニズムは明確でないが、実験モデルによると、分泌型プロテインＡ（ＳｐＡ）はブドウ球菌ビルレンスを増強することが分かっている（例えばＰａｔｅｌら，１９８７“Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｔｏｘｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａｌｌｅｌｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ”Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５５：３１０３−１０；及びＧｒａｉｌｌｅら，２０００，前出参照）。
【０１２４】
プロテインＡは２種の異なる抗体結合活性をもち、まず各結合ドメインはＦｃ（エフェクター機能に関与するＩｇＧの定常領域）と結合することができ、第２に、各ドメインはＦａｂ（抗原認識に関与する抗体フラグメント）と結合することができる。例えばＢｏｙｌｅ，前出；及びＧｒａｉｌｌｅら，前出参照。Ｆｃ結合部位（即ちプロテインＡが抗体と結合する部位）は大半のＩｇＧサブクラスのＣＨ２とＣＨ３の界面のＬ字領域に局限されている。この結合性は抗体の標識と精製に広く使用されている（例えばＴａｓｈｉｒｏら，１９９５“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４：４７１−８１；及びＧｒａｉｌｌｅら，前出参照）。プロテインＡのＦａｂ結合特異性は十分に特性決定されていないが、抗体重鎖の可変領域上の１部位に関与することが示されている。例えばＶｉｄａｌら，１９８５“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｈｅ  ＶＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５：１２３２−８；及びＧｒａｉｌｌｅら，前出参照。抗体配列使用との相関によると、プロテインＡのＦａｂ結合特異性はＦａｂ重鎖ＶＨ３ファミリーのヒト可変領域の産物に限定されると思われる。ＶＨ３ファミリーは遺伝性ＶＨ遺伝子のほぼ半数を占める。例えばＨｉｌｌｓｏｎら，１９９３“Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ＶＨ３  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：３３１−６；及びＧｒａｉｌｌｅら，前出参照。Ｆａｂ重鎖（ＶＨ）の可変領域は抗原認識に関与する超可変領域を介さずにフレームワーク残基を介してプロテインＡと相互作用する。
【０１２５】
プロテインＡが黄色ブドウ球菌株の（全部ではないとしても）大半に存在するという事実と、ビルレンス因子としてのその役割と、黄色ブドウ球菌細菌の表面に発現されることから、プロテインＡは蛋白質ワクチン接種の優れた候補である。下記実施例ＩＩに説明するように、蛋白質ワクチン接種のアジュバントとして使用される抗体−免疫刺激剤融合蛋白質が防御免疫応答を誘発する能力を試験した。下記参照。
【０１２６】
ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）及びＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）抗体融合蛋白質の存在下でマウスに可溶性プロテインＡをワクチン接種すると（ブースターの必要あり）、可溶性及び不溶性両形態のプロテインＡ（即ち遊離可溶性プロテインＡとＣｏｗａｎ  Ｉの表面に結合したプロテインＡ）に対する抗体応答を増強する能力が認められる。下記参照。従って、抗体融合蛋白質の有用性は融合免疫刺激剤（例えばサイトカイン）に依存する。以上の結果から、抗体融合蛋白質はマウスでプロテインＡに対する抗体免疫応答の有効なエンハンサーであり、ヒト及び動物の両者で黄色ブドウ球菌感染の予防と治療にこの技術を潜在的に使用できると考えられる。
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例ではＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原／抗体及び種々のサイトカイン（例えばＩＬ−２，ＩＬ−１２，ＧＭＣＳＦ）と黄色ブドウ球菌に由来するプロテインＡ抗原を利用する。しかし、この場合も、本発明の方法（例えば、抗原送達のアジュバントとしての抗体−免疫刺激剤融合体の使用）は抗体と免疫刺激剤等の多種多様な組合せに適用することができ、無数の疾患／病態の処置に有用である（即ちＨＥＲ２／ｎｅｕを提示する腫瘍やブドウ球菌感染の処置に止まらない）ことに留意すべきである。
【０１２８】
実施例Ｉ：細胞外ドメインＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質ワクチン接種の有効なエンハンサーとしての抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体融合蛋白質
ＨＥＲ２／ｎｅｕ分子は多数のヒト癌（例えば乳癌、卵巣癌、前立腺癌及び肺癌）で過剰発現され、予後不良に結び付けられる。上述のように、ＨＥＲ２／ｎｅｕを標的とする所定のＤＮＡ及びペプチドワクチンは動物モデルでＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する癌に対して有意防御を誘発した。しかし、ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＣＤＨＥＲ２）の完全細胞外ドメインを使用したワクチンは同一効力を示さなかった。本明細書に詳述するように、本発明は免疫刺激サイトカインとしてＩＬ−２，ＩＬ−１２又はＧＭＣＳＦを含む数種の抗ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（Ａｂ）−免疫刺激剤融合蛋白質とその使用を例証する（この場合も、例えば治療する特定疾患、増強すべき特定作用等に応じて場合により他の免疫刺激分子を融合して本発明で使用される分子を構築する）。
【０１２９】
実施例Ｉで使用される抗体−免疫刺激剤融合蛋白質（及び本発明の同様の関連融合体）は免疫刺激剤（例えばサイトカイン）活性とＨＥＲ２／ｎｅｕ結合能をもつ。これらの抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がＥＣＤＨＥＲ２ワクチン接種の免疫エンハンサーとして作用するか否かを調べるために、ヒトＥＣＤＨＥＲ２、ＥＣＤＨＥＲ２＋抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（ＩｇＧ３）、又はＥＣＤＨＥＲ２＋各抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をマウスにワクチン接種した。ブースター投与後にラットＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質を発現する同系癌（即ちＴＵＢＯ）でマウスを攻撃した。ＥＣＤＨＥＲ２＋全３種の抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をワクチン接種したマウス群では対照群のマウス（即ちＰＢＳ、ＥＣＤＨＥＲ２又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３を投与したマウス）に比較して腫瘍増殖速度の有意低下と長期生存数の増加が認められた。
【０１３０】
全ワクチン接種群で抗ＥＣＤＨＥＲ２体液性免疫応答が検出され、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）及びＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスは高レベルを示した。これらの２群は対照群に比較して抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体レベルが高かった。これらの結果からＴＨ２及びＴＨ１両者の免疫応答が誘発されたことが判明した。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスは高レベルのＩｇＧ２ａ抗体を示したが、ＩｇＧ１抗体レベルは高くなく、ＴＨ１免疫応答が誘発されたことが分かった（上記参照）。
【０１３１】
マウスからの免疫血清はＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質を過剰発現するヒト乳癌）に対して有意ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗増殖活性を示し、阻害レベルは抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体のレベルに相関した。可溶性ＥＣＤＨＥＲ２と共にインキュベーションすると、ＥＣＤＨＥＲ２＋抗体−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスからの脾細胞は他の群に比較して有意増殖と有意ＩＦＮ−γ分泌を示した。このような結果は（本実施例に例証するような）本発明が体液性と細胞性の両者の応答を誘発することを示す。従って、体液性と細胞性の両者の応答が（本実施例で認められるように）観察される抗腫瘍活性を助長することができる。本実施例は本発明の使用により、患者で例えばＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する腫瘍に対する予防及び治療レジメンとしての蛋白質ワクチン接種のアジュバントとして抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体−免疫刺激剤融合蛋白質を使用できることを示す。重要な点として、他の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体処置に非応答性の患者も場合により（本実施例に例証するように）本発明の方法及び組成物の使用により効果を得ることができる。この場合も、他の疾患をターゲットとして抗体／免疫刺激剤／抗原の他の組合せを使用することができ、このような組合せも本発明に含まれることに留意することが重要である。
【０１３２】
本発明を例証する本実施例では、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに種々の組成でヒトＥＣＤＨＥＲ２蛋白質をワクチン接種した。ラットｎｅｕ蛋白質を過剰発現する移植可能な癌であるＴＵＢＯでワクチン接種マウスを攻撃した。例えばＲｏｖｅｒｏ，Ｓ．Ａ．ら，２０００，“ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒａｔ  ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ  ｐ１８５  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５１３３参照。下記の通り、可溶性ＥＣＤＨＥＲ２単独で免疫したマウスは対照群に比較して低い抗腫瘍免疫しか示さなかった。他方、免疫増強用サイトカインＩＬ−２，ＩＬ−１２又はＧＭＣＳＦを抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体（ヒトＩｇＧ３）と融合してワクチンアジュバントとして使用すると（即ち本発明の方法自体）、抗腫瘍活性の顕著な増強が認められた。抗ＨＥＲ２融合蛋白質に関する詳細な情報については、例えばいずれも全目的で本明細書に組込むＰｅｎｇ，Ｌ．Ｓ．ら，１９９９“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ＩＬ−１２  ＩｇＧ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ＩＬ−１２  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：２５０；Ｐｅｎｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｌ．ら，２００１“Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ”Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １０：４３；及びＤｅｌａ  Ｃｒｕｚ，Ｊ．Ｓ．ら，２０００“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５１１２参照。
【０１３３】
材料と方法
マウス
本実施例ではＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手した１０〜１２週齢雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。全実験（実施例Ｉ及び実施例ＩＩの両者）は実験動物の飼育と使用に関する米国国立衛生研究所指針（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って実施した。
【０１３４】
細胞株
ＴＵＢＯはｎｅｕ蛋白質を過剰発現するクローン化細胞株である。この細胞株はマウス乳腺癌ウイルスプロモーターにより誘導したトランスフォーミングラットｎｅｕ癌遺伝子を導入したトランスジェニックＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスで自然発生した小葉癌から樹立された。Ｒｏｖｅｒｏ，Ｓ．ら，前出参照。ＴＵＢＯ細胞は正常ＢＡＬＢ／ｃマウスで進行的に増殖し、ＢＡＬＢ−ｎｅｕＴ−トランスジェニックマウスに出現する癌と組織学的に類似する小葉癌を生じる。同じくＲｏｖｅｒｏ，Ｓ．，前出参照。本実施例では、グルタマックス、グルコース、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ピリドキシン−ＨＣｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、及び２０％胎仔ウシ血清（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）を加えたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）でＴＵＢＯ細胞を培養した。本実施例では、ＨＥＲ２／ｎｅｕ蛋白質を過剰発現するヒト乳癌細胞株であるＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）も使用した。ＳＫ−ＢＲ−３細胞はＬ−グルタミン、ペニシリン、及びストレプトマイシンと５％ウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を加えたイスコブ変法ダルベッコ培地ＩＭＤＭで培養した。
【０１３５】
抗体−免疫刺激剤融合蛋白質とＥＣＤＨＥＲ２
ＩｇＧ３、ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）、ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）及びＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）免疫刺激剤融合蛋白質の構築、精製及び生物活性の分析については文献に記載されている。いずれも全目的で本明細書に組込むＰｅｎｇ，Ｌ．Ｓ．ら，１９９９“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ＩＬ−１２  ＩｇＧ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ＩＬ−１２  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：２５０；Ｐｅｎｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｌ．ら，２００１“Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ”Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １０：４３；及びＤｅｌａ  Ｃｒｕｚ，Ｊ．Ｓ．ら，２０００“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５１１２参照。本実施例で使用されるＩｇＧ３と抗体−免疫刺激剤融合蛋白質はモノクローナル抗ＨＥＲ２／ｎｅｕであるハーセプチンと同一の可変領域を含む。可溶性ヒトＥＣＤＨＥＲ２を分泌する細胞株であるＢＨＫ／ｅｒｂＢ２はＪａｍｅｓ  Ｄ．Ｍａｒｋｓ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から入手した。可溶性ＥＣＤＨＥＲ２はＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｓａｌａ，スウェーデン）に固相化したＩｇＧ３によるアフィニティークロマトグラフィーを使用してＢＨＫ／ｅｒｂＢ２培養上清から精製した。全精製蛋白質を透析用緩衝液（脱イオン水中５０ｍＭ  Ｔｒｉｓベース，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．８）で透析し、ビシンコニン酸蛋白質アッセイ（ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により濃度を測定した。使用前に蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、クーマシーブルー染色して純度、サイズ及び完全性を評価した。
【０１３６】
マウスワクチン接種とＴＵＢＯ攻撃
マウス８頭２群に０日目と３５日目（５週目「ブースター」）にＥＣＤＨＥＲ２単独８μｇ、ＥＣＤＨＥＲ２８μｇ＋ＩｇＧ３  １４μｇ、ＥＣＤＨＥＲ２８μｇ＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）１６μｇ、ＥＣＤＨＥＲ２８μｇ＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）１６μｇ、又はＥＣＤＨＥＲ２８μｇ＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）２７μｇを右脇腹に皮下注射した。当然のことながら、成分を異なる容量で使用したのは組成物の成分間に１：１当量の結合単位を達成するようにモル濃度を等しくするためである。マウス１頭当たり１５０μｌを注射する濃度で１ＥＣＤＨＥＲ２：１Ｆ（ａｂ´）２比となるように抗体又は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をＥＣＤＨＥＲ２と混合した。混合物を注射前に一晩４℃で放置した。希釈剤（ＰＢＳ）を注射したマウスを対照群とした。ブースターから３週間後（即ち３５日目から３週間後）に各ワクチン接種群の１組のワクチン接種マウスの左脇腹にハンクス平衡塩類溶液ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）１５０μｌ中ＴＵＢＯ細胞１０６個を攻撃注射した。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウス８頭のうちの１頭はワクチン接種とは無関係の理由でＴＵＢＯ細胞攻撃前に死亡した。
【０１３７】
マウスの腫瘍増殖をモニターし、腫瘍攻撃後７日目からキャリパーで測定した。直径１．５ｃｍ以上の腫瘍をもつマウスを安楽死させた。同日にワクチン接種マウスをＴＵＢＯで攻撃し、他方の未攻撃ワクチン接種マウス群から血液（血清試験と受動免疫移行に使用）と脾細胞を採取し、下記付加試験で処理及び使用した。
【０１３８】
ＥＣＤＨＥＲ２に対するマウス抗体応答の特性決定
ＴＵＢＯ攻撃の２日前のマウス又は未攻撃ワクチン接種マウスから採取した血清についてＥＣＤＨＥＲ２に対する抗体をＥＬＩＳＡにより分析した。ＥＬＩＳＡは濃度１μｇ／ｍｌのＥＣＤＨＥＲ２５０μｌをコートした９６ウェルマイクロタイタープレートを使用して実施した。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でブロックした。洗浄後に、１％ＢＳＡを添加したＰＢＳ中の血清の希釈液をウェルに加え、一晩４℃でインキュベーションした。１時間３７℃でＡＰ標識ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と共にインキュベーションすることにより結合したＩｇＧを検出した。洗浄後、ジエタノールアミン緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶かしたｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウムを２時間加え、プレートを４１０ｎｍで読取った。同齢のナイーブマウスからの血清を陰性対照として使用した。全ＥＬＩＳＡは各プレートに内部陽性対照曲線を使用して２回ずつ行った。上記のように作製した９６ウェルマイクロタイタープレートと検出剤としてＡＰ標識ラット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）又はＡＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を使用してマウス抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３応答をＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１３９】
ＴＵＢＯ及びＳＫ−ＢＲ−３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ
ＩＭＤＭ（Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及び５％ウシ胎仔血清を添加）１００μｌ中のＴＵＢＯ細胞５ｘ１０３個又はＳＫ−ＢＲ−３細胞２ｘ１０４個を９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに加えた。５６℃で３０分間インキュベーションすることにより各細胞レジメンからのプール血清から補体を除去した後、Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及び５％ウシ胎仔血清を加えたＩＭＤＭで希釈し、１００倍及び３００倍の最終検量線用希釈液とした。容量１００μｌの免疫血清をＴＵＢＯ細胞又はＳＫ−ＢＲ−３細胞に加えて最終容量２００μｌ／ウェルとした。これらの細胞を次に４８時間又は６日間（夫々ＴＵＢＯ及びＳＫ−ＢＲ−３）５％ＣＯ２，３７℃インキュベーターでインキュベーションした。インキュベーション時間の終点から１２時間前にプレートのウェルに３Ｈ−チミジン（ＩＣＮ，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）を最終濃度５μＣｉ／ｍｌとなるようにパルスした。次にＭｉｃｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ，ノルウェー）を使用して細胞を回収し、グラスファイバーフィルター（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）に通した。活発に増殖する細胞によるＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込みを１２０５  Ｂｅｔａｐｌａｔｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ，Ｔｕｒｋｕ，フィンランド）で測定した。全アッセイは３回ずつ実施した。
【０１４０】
培養ＴＵＢＯ細胞はＳＫ−ＢＲ−３細胞に比較して迅速に増殖するので、ＴＵＢＯ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに必要な細胞数のほうが少なく、インキュベーション時間が短くてすむ。本データは免疫血清と共にインキュベーション後のＴＵＢＯ細胞又はＳＫ−ＢＲ−３細胞による３Ｈ−チミジン取込み（ＣＰＭ）として示す。ハーセプチンと同一の可変領域を含むＩｇＧ３はＳＫ−ＢＲ−３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を阻害するのに有効であるので、陽性対照として使用した。ＴＵＢＯ細胞で使用するのに利用可能な陽性対照は入手できなかった。
【０１４１】
免疫血清の移行
マウスをランダムに各群６頭ずつに分けた。−１日目にナイーブマウスにプール免疫血清１７５μｌを静脈内注射した。０日目にＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）１５０μｌ中ＴＵＢＯ細胞１０６個をマウスの右脇腹に注射した。同齢の未処置マウス群もＴＵＢＯ細胞で攻撃した。腫瘍増殖をモニターし、７日目から２１日目まで３日毎にキャリパーで測定した。
【０１４２】
マウス脾細胞単離、可溶性ＥＣＤＨＥＲ２蛋白質による刺激及びＩＦＮ−γ定量
ワクチン接種マウスからの脾臓を抽出してプールし、無菌法を使用してすりガラス試料スライドで解離した。分離した脾細胞を１００μｍセルストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｎｅｓ，ＮＪ）に通して大型破片を除去した。赤血球（ＲＢＣ）を脱イオン水中０．８５％塩化アンモニウムに溶解した。５０ＩＵ／ｍｌマウスＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、１０％胎仔ウシ血清及び１μｇ／ｍｌ可溶性ＥＣＤＨＥＲ２蛋白質を加えたＲＰＭＩ１６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と共に脾細胞５ｘ１０６個／ｍｌ／ウェルを２４ウェル組織培養プレートのウェルに加えた。ウェル内容物を５％ＣＯ２，３７℃インキュベーターでインキュベーションした。８４時間後にウェルに３Ｈ−チミジン５μＣｉを最終濃度約５μＣｉ／ｍｌまで１２時間（合計刺激時間９６時間）パルスした。２４ウェル組織培養プレートの単一ウェルからの細胞を９６ウェル丸底組織培養プレートのウェル４個ずつに移し、回収した。ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込みを上記のように測定した。本データは実験ウェルの平均３Ｈ  ＣＰＭを対照ウェル（ＰＢＳをワクチン接種したマウスの脾細胞）の平均３Ｈ  ＣＰＭで割った値として定義される刺激指数（ＳＩ）として表す。
【０１４３】
ＩＦＮ−γ分泌レベルを測定するために、２４ウェル組織培養プレートの単一ウェルからの上清を３６時間及び８４時間刺激後に取出し、抗ＩＦＮ−γ捕獲抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を予めコートした９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル２個ずつに加えた。上清を系列希釈（２倍）し、４℃で一晩放置した。翌日、プレートを洗浄し、検出用ＡＰ標識抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を加えた。次にプレートを３７℃で１時間放置した。洗浄後にジエタノールアミン緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に溶かしたｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウムをウェルに加え、プレートを４１０ｎｍで読取った。各プレートで作成したＩＦＮ−γ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）標準曲線を使用して結果の定量を行った。この読取りからのデータはＩＦＮ−γ濃度（ｐｇ／ｍｌ）からバックグラウンド（ＰＢＳ対照）レベルを差し引いた値として示す。
【０１４４】
統計分析
生存率曲線でＰｅｔｏ−Ｐｅｔｏ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｔｅｓｔを使用した以外は、本実施例の全統計分析はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｒａｎｋ  Ｔｅｓｔを使用して実施した。いずれの場合も、ｐ値が≦０．０５の場合に結果が有意であるとみなした。
【０１４５】
実施例Ｉの結果
ＥＣＤＨＥＲ２ワクチン接種と抗腫瘍活性
ＢＡＬＢ／ｃマウスに０週目と５週目に（上記のように）ＰＢＳ、ＥＣＤＨＥＲ２単独、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）を皮下ワクチン接種した。ワクチン接種期間を通して明白な副作用は観察されなかった。初回ワクチン接種から８週間後にＴＵＢＯ細胞１０６個をワクチン接種マウスの左脇腹に皮下注射した。攻撃から７日後に、ＰＢＳ、ＥＣＤＨＥＲ２単独及びＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種した全マウスに測定可能な腫瘍が存在したが、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）ワクチン接種マウス群の８頭のうちの２頭とＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）ワクチン接種マウスの７頭のうちの５頭は腫瘍を示さなかった。図３ａ参照。腫瘍は全ＰＢＳ投与マウスで均等に進行的に増殖したが、ＥＣＤＨＥＲ２単独及びＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスは腫瘍サイズのばらつきを示した。ＥＣＤＨＥＲ２＋抗体−免疫刺激剤融合蛋白質をワクチン接種したマウスの腫瘍は指定日内では小さいままであるか又は存在しなかった。図３ａ参照。
【０１４６】
図３はＴＵＢＯで攻撃したワクチン接種マウスにおける腫瘍増殖を示す。上述のように、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス８頭からなる群に−５６日目と−２１日目にＰＢＳ（図３の○参照）、ＥＣＤＨＥＲ２蛋白質単独（図３の□参照）、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３（図３の◇参照）、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）（図３の◆参照）、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）（図３の黒四角参照）又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）（図３の●参照）を皮下ワクチン接種した。この場合も、上述のように、０日目にＴＵＢＯ細胞１０６個をマウスの左脇腹に皮下注射した。７日目から１９日目まで３日毎に個体（図３Ａ）又は平均（図３Ｂ）の平均腫瘍サイズを測定した。図３Ｃはマウスの生存率曲線を示す。検査時に直径が１．５ｃｍを越える腫瘍をもつマウスを安楽死させ、攻撃に耐えなかったとみなした。１１０日目に腫瘍をもたないマウスを（＊）により示す。
【０１４７】
１９日目にＥＣＤＨＥＲ２単独及びＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３ワクチン接種マウスはＰＢＳ対照に比較して腫瘍の縮小（ｐ＜０．０２）が明白であった。図３ｂ参照。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウス又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスでは全指定日内で腫瘍サイズが有意に小さかった（ＰＢＳ、ＥＣＤＨＥＲ２単独又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスに比較してｐ≦０．０５）。図３Ｂ参照。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスの平均腫瘍サイズはＰＢＳ、ＥＣＤＨＥＲ２単独、又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスよりも小さかったが、有意に小さい腫瘍が観察されたのは１３、１６及び１９日目のみであった（ｐ＜０．０５）。図３Ｂ参照。
【０１４８】
この場合も、検査時に直径が１．５ｃｍを越える腫瘍をもつマウスを安楽死させ、ＴＵＢＯ攻撃に耐えなかったとみなした。これを考慮した生存率曲線から明らかなように、ＥＣＤＨＥＲ２を抗体−免疫刺激剤融合蛋白質と併用したワクチン接種レジメンのほうが優れている（ＥＣＤＨＥＲ２単独又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスに比較してｐ＜０．０５）。図３Ｃ参照。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３とＥＣＤＨＥＲ２単独をワクチン接種したマウスの間に有意差は観察されなかった（ｐ＝０．２０）。攻撃後１１０日目に、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウス８頭のうちの１頭とＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウス８頭のうちの２頭は腫瘍発生を示さなかった。図３ｃ参照（星印で示す）。
【０１４９】
マウス抗ＥＣＤＨＥＲ２によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍増殖阻害に対する（ＴＵＢＯ細胞でなく）ＳＫ−ＢＲ−３細胞の感受性
抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体による腫瘍増殖阻害に対するＴＵＢＯ細胞とＳＫ−ＢＲ−３細胞の感受性を調べるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイを実施した。ＴＵＢＯ細胞をワクチン接種マウスの免疫血清と共にインキュベーションした場合には細胞増殖阻害は検出されなかった。図４ａ参照。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の場合には、免疫血清は有意抗増殖活性を示した（図４ｂ参照）。図５から明らかなように、細胞増殖阻害レベルは抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧレベルに相関した。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）及びＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ２）をワクチン接種したマウスからの免疫血清は高い増殖阻害を示し、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスからの免疫血清は弱い阻害しか誘発しなかったが、低い血清希釈倍率でＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３及びＥＣＤＨＥＲ２単独をワクチン接種したマウスの阻害よりもまだ高かった。
【０１５０】
図４はＴＵＢＯ細胞とＳＫ−ＢＲ−３細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に及ぼす血清の影響を示す。ＴＵＢＯ又はＳＫ−ＢＲ−３細胞をＴＵＢＯ細胞攻撃の２日前にワクチン接種マウスから採取した補体不活化プール免疫血清と共にインキュベーションした。インキュベーション終了の１２時間前にウェルに３Ｈ−チミジンをパルスした。図４Ａのデータは１００倍希釈免疫血清と共に４８時間インキュベーション後にＴＵＢＯ細胞に取込まれた３Ｈ−チミジン（ＣＰＭ）を示し、図４Ｂのデータは１００倍及び３００倍（図４ｃ）希釈免疫血清と共にインキュベーションした場合にＳＫ−ＢＲ−３細胞に取込まれた３Ｈ−チミジンレベル（ＣＰＭ）を示す。誤差線は得られた数値の範囲を示す。
【０１５１】
図５はマウス抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体応答を示す。ＴＵＢＯ細胞攻撃の２日前に採取したワクチン接種マウスからの血液試料を集め、血清をプールした。プール血清の抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡにより試験した。ＰＢＳ対照ウェルの抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧレベルは検出不能であったので、ブランクとして使用した。図５の数値は指定血清希釈倍率におけるウェル２個のＯＤ４１０ｎｍの平均強度を示す。誤差線は２個の数値の範囲を示す。
【０１５２】
免疫血清の受動的移行
抗ＥＣＤ抗体がＴＵＢＯ細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害できないことから、ＴＵＢＯ細胞に対して有効な抗腫瘍応答を誘発するには恐らくｉｎ  ｖｉｖｏ環境が必要であるのではないかと考えられた。この可能性を試験するために、ナイーブマウスにプール免疫血清を静脈内注射した後、翌日にＴＵＢＯ細胞１０６個を皮下攻撃投与した。腫瘍増殖をモニターし、攻撃後７日目から２１日目まで３日毎にキャリパーで測定した。ＰＢＳ、ＥＣＤＨＥＲ２単独及びＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスからの血清を注射したマウスは実験期間を通して明白な抗腫瘍活性を示さなかった。下表Ｉ参照。未処置マウスに比較してＥＣＤＨＥＲ２＋抗体融合蛋白質をワクチン接種したマウスは指定日に観察された平均腫瘍サイズが小さかった。他方、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスからの血清を注射したマウスでは１３日目のみに有意に小さい腫瘍が観察された（未処置マウスに比較してｐ＝０．０３）。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスからの血清を注射したマウスは１６日目と１９日目に有意に小さい腫瘍を示した（未処置マウスに比較して夫々ｐ＝０．０３及びｐ＝０．０５）。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスからの血清を注射したマウスは１３、１６、１９及び２１日目に有意に小さい腫瘍を示した（未処置マウスに比較してｐ≦０．０５）。表Ｉ参照。
【０１５３】
【表１】
2005520853.tif 000002
【０１５４】
移行免疫血清の抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体の特性決定
移行免疫血清の抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３レベルを分析した。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）とＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスのプール血清はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３又はＥＣＤＨＥＲ２単独をワクチン接種したマウスのプール血清に比較して高レベルの抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ１を示した。図６ａ参照。これに対して、抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａ応答はＥＣＤ＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）をワクチン接種したマウスのプール血清が著しく高く、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスの応答は低く、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）では更に低レベルであった。図６ｂ参照。ＥＣＤＨＥＲ２単独をワクチン接種したマウスのプール血清ではＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスに比較して実質的な抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａレベルが検出されたが、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスでは抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａは殆ど又は全く検出されなかった。各マウスの血清を分析した結果、（ＥＣＤＨＥＲ２単独をワクチン接種したマウス８頭のうちで）過剰反応マウス１頭が検出可能な抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａ応答を示した。他の７頭のマウスでは検出可能な抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａ応答は殆ど又は全く検出されなかった。表ＩＩ参照。抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ３レベルは抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ２ａレベルと同様であったが、ＥＣＤＨＥＲ２単独をワクチン接種したマウスのプール血清ではＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスのプール血清に比較して高レベルの抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ３は観察されなかった。図６ｃ参照。
【０１５５】
【表２】
2005520853.tif 000003
【０１５６】
上記に説明したように、図６は移行免疫血清の抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧの特性決定を示す。ワクチン接種マウスからの移行プール血清の抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧ１（図６ａ参照）、ＩｇＧ２ａ（図６ｂ参照）、及びＩｇＧ３（図６ｃ参照）レベルをＥＬＩＳＡにより試験した。数値は夫々１０００倍、５０倍、及び５０倍血清希釈倍率の２個のウェルのＯＤ410nmの平均強度を表す。ＰＢＳ対照をブランクとして使用した。誤差線は２個の数値の範囲を示す。
【０１５７】
ＥＣＤＨＥＲ２蛋白質によるワクチン接種マウスからの脾細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激
ワクチン接種マウスで誘発される細胞性免疫応答を測定するために、可溶性ＥＣＤＨＥＲ２蛋白質と共にインキュベーション後に脾細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖する能力を評価した。ＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込みにより増殖を測定した。４８時間インキュベーション後に、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスからの脾細胞には有意増殖が検出され、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスからの脾細胞ではそれよりも弱い増殖が検出された。脾細胞がＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）、ＥＣＤＨＥＲ２単独又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスに由来する場合には非常に弱い刺激しか観察されなかった。図７ａ参照。可溶性ＥＣＤＨＥＲ２蛋白質と共に９６時間インキュベーション後にも同様の結果が観察された。図７ｂ参照。
【０１５８】
図７はＥＣＤＨＥＲ２蛋白質による脾細胞増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を示す。ワクチン接種マウスからのプール脾細胞を２４ウェル組織培養プレートで可溶性ＥＣＤＨＥＲ２と共にインキュベーションし、インキュベーション時間（即ち図７ａに示すように４８時間又は図７ｂに示すように９６時間）の終了の１２時間前に３Ｈ−チミジンをパルスした。２４ウェル組織培養プレートの単一ウェルからの細胞を９６ウェル丸底組織培養プレートのウェル４個ずつに移し、セルハーベスターで回収した。シンチレーションカウンターを使用して３Ｈ−チミジン取込み（ＣＰＭ）を測定した。図７のデータは（上記に定義したような）刺激指数（ＳＩ）として表す。誤差線は４回の測定から得られた数値の範囲を表す。
【０１５９】
刺激脾細胞のＩＦＮ−γ産生
可溶性ＥＣＤＨＥＲ２蛋白質と共にインキュベーションした脾細胞の上清のＴＨ１又はＴＨ２サイトカイン、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４のレベルを試験した。例えばＡｒａｉ，Ｋ．Ｉ．ら，１９９０“Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ｃｏｏｒｄｉｎａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：７８３＋参照。３６時間の刺激時間後に、ワクチン接種マウスからの脾細胞の上清にはＰＢＳ対照に比較してＩＦＮ−γ産生の増加が検出され、レベルはＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）＞ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）＞ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）＞ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３＞ＥＣＤＨＥＲ２単独の順であった。図８ａ参照。ＰＢＳを投与したマウスからの脾細胞を使用した場合にはＩＦＮ−γを検出することができなかった。８４時間刺激後に、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスからの脾細胞の上清には更にＩＦＮ−γ産生の増加が検出された。産生ピークは約１，５００ｐｇ／ｍｌであった。図８ｂ参照。ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスの上清では多少のＩＦＮ−γ増加が観察されたが、ＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＩＬ−１２）、ＥＣＤＨＥＲ２単独又はＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３をワクチン接種したマウスからの脾細胞の上清では増加は殆ど又は全く認められなかった。図６ｂ参照。３６時間後に全上清中のＩＬ−４レベルはアッセイ感度を下回った（＜３０ｐｇ／ｍｌ，データは示さず）。しかし、８４時間後にはＥＣＤＨＥＲ２＋ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）をワクチン接種したマウスからの脾細胞の上清のみで低いＩＬ−４レベルを観察することができた（３６ｐｇ／ｍｌ）。
【０１６０】
図８はワクチン接種マウスからの脾細胞（刺激後）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＦＮ−γ産生を示す。可溶性ＥＣＤＨＥＲ２と共に３６時間（図８ａ）又は８４時間（図８ｂ）インキュベーション後にワクチン接種マウスの脾細胞からの上清を回収し、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ分泌レベルを定量した。各プレートで標準曲線を作成し、ＩＦＮ−γ濃度（ｐｇ／ｍｌ）からバックグラウント（ＰＢＳ対照）レベルを差し引いた数値として表した。誤差線は２個の数値の範囲を表す。
【０１６１】
実施例ＩＩ：黄色ブドウ球菌ビルレンス因子プロテインＡに対する免疫応答を増強するための抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の使用
プロテインＡと抗体−免疫刺激剤融合蛋白質
上記に要約したように、ヒト腫瘍関連抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕの細胞外ドメイン（ＥＣＤＨＥＲ２）に特異的な抗体−免疫刺激剤（例えばサイトカイン）融合蛋白質を構築し、その作用を特性決定した。このような融合蛋白質は（トラスツズマブ（ハーセプチン，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）の可変領域を含む）ヒトＩｇＧ３を免疫刺激性サイトカインであるインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）と遺伝子工学的に融合することにより構成した。Ｐｅｎｉｃｈｅｔ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．２００１，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：９１−１０１；Ｐｅｎｇ，Ｌ．Ｓ．ら，１９９９，“Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ＩＬ−１２  ＩｇＧ３  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ＩＬ−１２  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：２５０−８；及びＤｅｌａ  Ｃｒｕｚ，Ｊ．Ｓ．ら，２０００，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｔａｉｎｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：５１１２−２１参照。
【０１６２】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ融合蛋白質の特性決定（即ち上記参照）を行う過程で、ハーセプチンの可変領域を含む抗体はプロテインＡと結合することが判明した。他のアイソタイプとは異なり、ヒトＩｇＧ３はプロテインＡと結合しないのでこの知見は意外であった。このような結合は抗体の可変領域を介して生じることが判明した（Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，未発表結果）。この知見はハーセプチン可変領域がＶＨ３遺伝子フアミリーによりコードされるという最近の報告と一致した（Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｐ．ら，２０００“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ｅ−ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ａｎｄ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｖ−ｆｒａｇｍｅｎｔ”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：２６−３６参照）。
【０１６３】
上述のように、ＶＨ３領域をもつ抗体はその可変領域の「フレームワーク」を介してプロテインＡと結合する。しかし、プロテインＡ結合部位は古典的なＦｃ部位とは異なることに留意しなければならない（Ｔａｓｈｉｒｏ  Ｍ．ら，１９９５，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４：４７１−８１；Ｖｉｄａｌ  Ｍ．Ａ．ら，１９８５“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｈｅ  ＶＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３５：１２３２−８；Ｇｒａｉｌｌｅ  Ｍ．ら，２０００，“Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５３９９−４０４参照）。従って、開発された抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ融合蛋白質（例えば実施例Ｉに例証するもの）は「抗プロテインＡ」融合蛋白質の１類としても作用する。
【０１６４】
抗体融合蛋白質の２種（即ち実施例Ｉで使用したように抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）と抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ））を使用することにより可溶性プロテインＡと結合できることを利用し、このような抗体−免疫刺激剤融合蛋白質がプロテインＡ細菌抗原の免疫原性を増強できるか否かを調べた。
【０１６５】
材料と方法
マウス
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）をＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入した。１群のマウスに抗体又は抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の存在下又は不在下に可溶性プロテインＡを皮下注射した。別の群のマウスには対照としてＰＢＳ単独を注射した。各群のマウスは合計８頭／群とした。
【０１６６】
可溶性プロテインＡによるワクチン接種
可溶性プロテインＡ（Ｐ４９３１，Ｓｉｇｍａ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）５μｇを１ＸＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中にてＩｇＧ３＝２０μｇに等価の抗体モル比で抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３（免疫刺激剤と融合せずに抗体単独）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）又は抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）２０μｇと共に一晩４℃でインキュベーションした。翌日、混合物のサンプルをマウスの右脇腹に皮下注射した。各マウスの同一脇腹に５週間ブースター注射した。
【０１６７】
酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ用血清の作製
免疫後、マウスから８週間毎週採血した。血液を集めて４℃で一晩保存した。翌日、血清を集めて−２０℃で保存した。各群の全マウスの血清をプールし、血清試験用として１５０倍に希釈した。
【０１６８】
ＥＬＩＳＡを使用した血清試験
ＥＬＩＳＡを使用してマウスで発生した可溶性プロテインＡとＣｏｗａｎ  Ｉ（不溶性表面蛋白質プロテインＡを発現する黄色ブドウ球菌の標準株）に対する抗体応答のレベルを試験した。
【０１６９】
１０％ｍ／ｖホルマリンで殺菌したＣｏｗａｎ  Ｉ（Ｐ７１５５，Ｓｉｇｍａ）の溶液を炭酸緩衝液で希釈し（約２３５倍）、ＯＤ６５０ｎｍ＝０．１とした。これを９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−２，Ｄｙｎｔｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）に５０μｌ／ウェルで加え、４℃で一晩インキュベーションした。プロテインＡ（Ｐ３８３８，Ｓｉｇｍａ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を炭酸緩衝液で希釈し、最終濃度１μｇ／ｍｌとした。希釈したプロテインＡを９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェルで加え、４℃で一晩インキュベーションした。３％ウサギ血清のＰＢＳ溶液を希釈剤及びブロッキング溶液として使用し、マウス抗体が抗体のＦｃ又はＦａｂ領域を介してプロテインＡと結合しないようにした。ＰＢＳ中３％ウサギ血清と共にインキュベーションすると、マウス抗体がＦｃ又はＦａｂ領域を介してプロテインＡと結合するのを阻止するのに極めて有効であることは既に分かっている（Ｐｅｎｉｃｈｅｔら，未発表結果）。ブロッキングにより、本実施例で検出される抗体結合はプロテインＡの各種エピトープに特異的である。集めたマウス血清をＰＢＳ中１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で４５０倍に希釈し、各ウェルに容量５０μｌを加えた後、２倍系列希釈した。Ｃｏｗａｎ  Ｉに固相化した不溶性プロテインＡと可溶性プロテインＡに対して高い抗体力価を示すプール抗血清をＰＢＳ中１％ＢＳＡで１３５０倍に希釈し、陽性対照として使用した。２０，０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して結合マウスＩｇＧを検出した。９６ウェルプレートをＰＢＳで４回洗浄し、（ジエタノールアミン緩衝液に溶かした）ＡＰ−基質を容量５０μｌ／ウェルでプレートに加えた。ＰＢＳ単独をワクチン接種したマウスの血清を対照としし、ブランクとして使用し、４１０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１７０】
結果
可溶性プロテインＡをコートしたプレートを使用した抗体免疫応答の検出
図９に示すように、ＰＢＳ中可溶性プロテインＡ（ＳＰＡ）又はＩｇＧ３、ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）及びＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスからの血清を免疫後８週間毎週採取し、プールした。可溶性プロテインＡをコートしたプレートを使用して試料の抗プロテインＡ応答をＥＬＩＳＡにより（２個ずつ）アッセイした。ＰＢＳ単独を投与したマウスから構成される陰性対照群をブランクとして使用した。図９のデータは２個のウェルの平均ＯＤ４１０として示す。ブースター（初回ワクチン接種から５週間後に投与）を矢印で示す。
【０１７１】
図９から明らかなように、ＩｇＧ３及びＩｇＧ３−（ＩＬ−２）群はいずれもブースター前はＰＢＳ群と比較してプロテインＡに対して高い抗体応答を示さなかった。他方、ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）群は高い抗プロテインＡ応答を示した。ブースター投与後、ＩｇＧ３、ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）、及びＩｇＧ３−（ＩＬ−２）群はＰＢＳ群に比較して高い抗プロテインＡ応答を示すことができた。更に、ブースター投与後には、ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）群はＩｇＧ３及びＩｇＧ３−（ＩＬ−２）群の両者に比較して最高の抗プロテインＡ応答を示した。
【０１７２】
プロテインＡを発現するＣｏｗａｎ  Ｉをコートしたプレートを使用した抗体免疫後応答の検出
ＰＢＳ中可溶性プロテインＡ（ＳＰＡ）又はＩｇＧ３、ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）及びＩｇＧ３−（ＩＬ−２）をワクチン接種したマウスからの血清を免疫後８週間毎週採取し、プールした。Ｃｏｗａｎ  Ｉをコートしたプレートを使用して試料の抗プロテインＡ応答の徴候をＥＬＩＳＡにより２個ずつアッセイした（Ｃｏｗａｎ  Ｉの表面にプロテインＡを結合）。ＰＢＳ単独を投与したマウスから構成される陰性対照群をブランクとして使用した。図１０のデータは２個のウェルの平均ＯＤ４１０として示す。初回ワクチン接種から５週間後にブースター投与した（矢印で示す）。図１０に示すように、ブースター前の数週間に高い抗プロテインＡ応答を発生したのはＩｇＧ３−（ＩＬ−２）群のみであった（Ｃｏｗａｎ  Ｉの表面にプロテインＡを結合）。ブースター後の数週間に後期応答の著変は認められなかった。ブースター投与後、ＩｇＧ３、ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）及びＩｇＧ３−（ＩＬ−２）群はＰＢＳ群に比較して応答を示した。更に、ＩｇＧ３−（ＧＭＣＳＦ）群はブースター後にＩｇＧ３及びＩｇＧ３−（ＩＬ−２）群の両者に比較して最高の応答を発生した。
【０１７３】
以上、明確に理解できるように本発明を詳細に説明したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】本発明により使用される典型的抗体−免疫刺激剤融合蛋白質の模式図である。
【図２】本発明により使用される抗体融合蛋白質と可溶性抗原の免疫複合体の作製と抗原提示細胞への前記複合体の提示を示す模式図である。
【図３Ａ】ＴＵＢＯで攻撃したワクチン接種マウスにおける本発明の典型的融合蛋白質／抗原ワクチン接種処置の抗腫瘍活性を示す。
【図３Ｂ】ＴＵＢＯで攻撃したワクチン接種マウスにおける本発明の典型的融合蛋白質／抗原ワクチン接種処置の抗腫瘍活性を示す。
【図３Ｃ】ＴＵＢＯで攻撃したワクチン接種マウスにおける本発明の典型的融合蛋白質／抗原ワクチン接種処置の抗腫瘍活性を示す。
【図４】パネルＡ〜ＣはＴＵＢＯ及びＳＫ−ＢＲ−３細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に及ぼす血清の影響を示す。
【図５】ワクチン接種マウスにおけるマウス抗ＥＣＤＨＥＲ２抗体応答を示す。
【図６】パネルＡ〜Ｃはワクチン接種マウスの転移免疫血清の抗ＥＣＤＨＥＲ２ＩｇＧの特性決定を示す。
【図７】パネルＡ〜ＢはＥＣＤＨＥＲ２蛋白質によるワクチン接種マウスの脾細胞の増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激を示す。
【図８】パネルＡ〜Ｂはワクチン接種マウスからの脾細胞（刺激後）によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＦＮ−γ産生を示す。
【図９】ワクチン接種マウスにおけるマウス抗プロテインＡ抗体応答を示す。
【図１０】ワクチン接種マウスにおけるマウス抗プロテインＡ（Ｃｏｗａｎ  Ｉに結合）抗体応答を示す。
【図１】
2005520853.tif 000004
【図２】
2005520853.tif 000005
【図３Ａ】
2005520853.tif 000006
【図３Ｂ】
2005520853.tif 000007
【図３Ｃ】
2005520853.tif 000008
【図４】
2005520853.tif 000009
【図５】
2005520853.tif 000010
【図６】
2005520853.tif 000011
【図７】
2005520853.tif 000012
【図８】
2005520853.tif 000013
【図９】
2005520853.tif 000014
【図１０】
2005520853.tif 000015
【国際調査報告】
2005520853.tif 000016
2005520853.tif 000017