(57)【要約】本発明は、それを使用して、宿主細胞中でコールドショック応答を誘発する条件下で異種ポリペプチドを生産することができる、ＤＮＡ分子またはベクターおよびこのＤＮＡまたはベクターを含有する宿主細胞に関する。ＤＮＡ分子およびベクターは、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列ならびにその発現を指示するコールドショック誘導性遺伝子由来のプロモーターおよび５’−ＵＴＲを含む。さらに、コールドショック誘導性条件下で翻訳を増強するＡＴリッチ配列が、異種ポリペプチドのコード配列中、またはコード配列とコールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲとの間に挿入されたさらなるエレメント中のいずれかに存在する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ポリペプチドを発現可能なＤＮＡ分子であって：
異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；ならびに
コールドショック応答を誘発する条件下で異種ポリペプチドの発現および生産を制御するように異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、コールドショック誘導性プロモーターおよび５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を含み、
ここで（１）開始コドンの下流４番目〜７番目のコドン付近に１２ヌクレオチドのＡＴリッチ配列を含む翻訳増強エレメントが、コールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲと異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との翻訳インフレーム融合体を形成するように配置されているか、または（２）異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が開始コドンの下流４番目〜７番目のコドンにＡＴリッチ配列を含むかのいずれかである、ＤＮＡ分子。
【請求項２】
コールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲが、配列番号１のヌクレオチド２２〜４４１、配列番号３のヌクレオチド１１〜２１４、配列番号５のヌクレオチド１２〜２１３、配列番号７のヌクレオチド１１〜２０１、そのフラグメント、およびそのバリアントからなる群より選択される、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
（１）が存在する、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
コールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲが、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、７つのコドンのヌクレオチド配列からなる翻訳増強エレメントによって連結されており、ここで第１のコドンが開始コドンであり、４番目〜７番目のコドンがＡＴリッチ配列を形成する、請求項３記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
翻訳増強エレメントが配列番号９のヌクレオチド１〜１８を含む、請求項４記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、開始コドンの下流４番目〜７番目のコドンにＡＴリッチ配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の下流に配置されたコールドショック誘導性遺伝子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）をさらに含む、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
３’−ＵＴＲが、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧ、およびｃｓｐＩからなる群の３’−ＵＴＲより選択される、請求項７記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】
３’−ＵＴＲが配列番号１のヌクレオチド４４２〜５３９を含む、請求項７記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
コールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲ領域配列が、翻訳開始部位のすぐ下流にｌａｃＩオペレーター配列を含む、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】
ｌａｃＩオペレーター配列が配列番号１０のヌクレオチド配列である、請求項１０記載のＤＮＡ分子。
【請求項１２】
ベクターである、請求項１記載のＤＮＡ分子。
【請求項１３】
自己複製ベクターである、請求項１２記載のベクター。
【請求項１４】
ｐＣｏｌｄＩである、請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
ｐＣｏｌｄＩＩである、請求項１３記載のベクター。
【請求項１６】
ｐＣｏｌｄＩＩＩである、請求項１３記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１記載のＤＮＡ分子で形質転換された原核生物宿主細胞。
【請求項１８】
大腸菌である、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項１９】
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ活性を欠くポリヌクレオチドホスホリラーゼ変異体である、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項２０】
遊離３０Ｓリボソームサブユニットとは結合するが、７０Ｓリボソームサブユニットとは結合しない１５ｋＤａ  ＲｂｆＡタンパク質を欠くｒｂｆＡ変異体である、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項２１】
ｃｓｄＡ  ＲＮＡヘリカーゼ活性を欠くｃｓｄＡ  ＲＮＡヘリカーゼ変異体である、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項２２】
宿主細胞中でｃｓｄＡ  ＲＮＡヘリカーゼを過剰発現するベクターで同時形質転換された、請求項１７記載の宿主細胞。
【請求項２３】
以下の工程を包含する異種ポリペプチドの生産方法：
請求項１７記載の宿主細胞を、栄養培地中、宿主細胞の正常生理学的増殖温度で培養する工程；
インキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より少なくとも１３℃低い温度に低下させることによって培養宿主細胞をコールドショックに供して、異種ポリペプチドの生産を誘導する工程；および
コールドショックに供した宿主細胞を低下させたインキュベーション温度でインキュベートして、異種ポリペプチドを生産する工程。
【請求項２４】
生産された異種ポリペプチドを回収する工程をさらに包含する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
インキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より少なくとも２０℃低い温度に低下させる、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
培養宿主細胞をコールドショックに供した後に、栄養培地を、異種ポリペプチドを検出可能に標識するための化合物を含有する培地に交換する工程をさらに包含する、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
化合物が、無視できる量が宿主細胞中に通常見出される同位体を含有する、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
同位体が１５Ｎまたは１３Ｃである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
化合物が、１５ＮＨ４Ｃｌ、（１５ＮＨ４）２ＳＯ４、１３Ｃ−グルコース、１５Ｎで標識されたアミノ酸残基、１３Ｃで標識されたアミノ酸残基、ならびに１５Ｎおよび１３Ｃの両方で標識されたアミノ酸残基からなる群より選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞が、１つ以上の主要コールドショックタンパク質を欠く変異体である、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
変異宿主細胞がＣｓｐＡを欠く、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
変異宿主細胞がＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、およびＣｓｐＥを欠く、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
以下の工程を包含する異種ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを得るための方法：
化合物で検出可能に標識された異種ポリペプチドを生産するように、低下させたインキュベーション温度で、請求項２６記載の方法でインキュベートしたコールドショックに供した宿主細胞を単離する工程；および
単離したコールドショックに供した宿主細胞に対する全細胞ＮＭＲ分光法、または単離したコールドショックに供した宿主細胞の細胞溶解物由来の上清に対するＮＭＲ分光法を実施して、異種ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを得る工程。
【請求項３４】
単離したコールドショックに供した全細胞に対する全細胞ＮＭＲ分光法を実施する、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
単離したコールドショックに供した宿主細胞の細胞溶解物由来の上清に対するＮＭＲ分光法を実施する、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
以下の工程を包含する異種ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを得るための方法：
栄養培地中、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換され、コールドショックに応答した異種ポリペプチドの発現および生産が可能な原核生物宿主細胞を培養する工程；
インキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より低い温度に低下させることによって培養宿主細胞をコールドショックに供して、異種ポリペプチドの生産を誘導する工程；
培養宿主細胞をコールドショックに供した後に、栄養培地を、異種ポリペプチドを検出可能に標識するための化合物を含有する培地に交換する工程；
コールドショックに供した宿主細胞を低下させたインキュベーション温度でインキュベートして、化合物で検出可能に標識された異種ポリペプチドを生産する工程；
低下させたインキュベーション温度でインキュベートしたコールドショックに供した宿主細胞を単離する工程；および
単離したコールドショックに供した宿主細胞に対する全細胞ＮＭＲ分光法、または単離したコールドショックに供した宿主細胞の細胞溶解物由来の上清に対するＮＭＲ分光法を実施して、異種ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを得る工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種ポリペプチドのコールドショック誘導性発現および生産のためのＤＮＡ分子、ベクター、宿主および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
３７℃で増殖させた大腸菌細胞を低温（例えば１５℃）に移すと、コールドショックタンパク質と呼ばれる一組のタンパク質が一過性に非常に高レベルで馴化期（acclimation phase）と呼ばれる増殖遅延期の間に誘導される（Jones et al., 1987）。これらのコールドショック特異的タンパク質としてはＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＩ、ＣｓｄＡ、ＲｂｆＡ、ＮｕｓＡおよびＰＮＰが挙げられる（概説については以下を参照のこと：Phadtare et al., 1999, 2000 and 2002; Yamanaka et al., 1998）。これらの中で、ＣｓｐＡが７０アミノ酸残基からなる主要コールドショックタンパク質としてとして同定されている。
【０００３】
大腸菌のＣｓｐＡファミリーは９つの相同タンパク質ＣｓｐＡ〜ＣｓｐＩからなるが、これらの中でＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＧおよびＣｓｐＩのみがコールドショック誘導性である。興味深いことに、ｃｓｐＡ遺伝子は正常増殖温度および低増殖温度の両方において不可欠ではない（Bae et al., 1997）。ＣｓｐＡファミリーのメンバーは細胞の低温馴化の間に互いに機能的に重複しているので、ＣｓｐＡホモログのいずれもがコールドショック適応を単独では担っていないようである（Xia et al., 2001）。実際、ΔｃｓｐＡΔｃｓｐＢΔｃｓｐＧ  ３重欠失株はなお生存可能であるが、ΔｃｓｐＡΔｃｓｐＢΔｃｓｐＧΔｃｓｐＥ  ４重欠失株は低温でコロニーを形成することができない。興味深いことに、ＣｓｐＤ以外、９つのＣｓｐＡホモログからのいずれもの単一の遺伝子が４重欠失株の低温感受性を相補可能であることが示されている（Xia et al., 2001）。ＣｓｐＡがＣｓｐＢ、ＣｓｐＧおよびＣｓｐＩとは異なって調節されていることが示されている（Etchegaray et al., 1996およびWang et al., 1999）。高レベルのＣｓｐＡの産生は２４℃と１０℃との間で見られ、一方ＣｓｐＢおよびＣｓｐＧは２０℃より低い温度への温度変化の後でのみに産生され、最大誘導は１５℃においてである。ＣｓｐＩは１０〜１５℃の間で誘導される。タンパク質合成を完全にブロックする条件下で低温でＣｓｐＡ、ＣｓｐＢおよびＣｓｐＧが誘導されることも示されている（Etchegaray et al., 1999）。
【０００４】
ｃｓｐＡの発現は複雑に、すなわち転写、ｍＲＮＡ安定性および翻訳効率のレベルで調節されている（概説についてはPhadtare et al., 2000およびYamanaka et al., 1998を参照のこと）。ｃｓｐＡ遺伝子は１５９塩基からなる著しく長い５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を有している。ｃｓｐＡ  ５’−ＵＴＲの欠失解析によって、この領域が３７℃におけるその極度の不安定性（半減期１２秒未満）を担っており、低温におけるｍＲＮＡ安定化に対する正の効果を有していることが示された（Jiang et al., 1996およびMitta et al., 1997）。ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡはコールドショック直後に劇的に安定化（半減期２０分超）される。この安定化は一過性であり、細胞が低温に適応すると失われる。これが次にｃｓｐＡの発現を調節する。
【０００５】
ｃｓｐＡの誘導は特異的な転写因子を必要としないので、ｃｓｐＡのコールドショック誘導は熱ショック誘導とは非常に異なっている。興味深いことに、ｃｓｐＡプロモーターは３７℃で活性であるが、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡはこの温度で非常に不安定であるのでＣｓｐＡは大いに減少する。従って、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲはそのコールドショック誘導性において重大な役割を果たしている。近年、ＣｓｐＡは３７℃で対数増殖期の初期の間に産生され、そのｍＲＮＡは対数増殖期の中期から後期までに不安定になることが示されている（Yamanaka et al., 2001およびBrandi et al., 1999）。ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ領域は、いくつかのコールドショックｍＲＮＡの間で保存されている「コールドボックス」配列を含んでいる。この領域は、その後にＡＵリッチ配列が続く安定なステム−ループ構造を形成する（Fang et al., 1998）。本発明者らの研究室は、ステム−ループの欠失によってｍＲＮＡが顕著に不安定化され、コールドショックで誘導されるｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの量が約５０％減少するので、この領域がコールドショック後の正常なｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの誘導に必須であることを示した。しかし、ＡＵリッチ配列（AU-rich track）はｍＲＮＡをわずかに不安定化する。ステムの完全性は安定化機能にとって必須であるが、ループ配列の完全性はさほど重要ではない（Xia et al., 2001）。
【０００６】
開始コドン（ＡＵＧ）およびコード配列の両方を欠く変異ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡを過剰発現させると、染色体ｃｓｐＡ発現の抑制解除とともに低温での激しい増殖阻害が生じる。さらに、過剰発現されたＲＮＡは３０Ｓおよび７０Ｓリボソームと安定に結合する。本発明者らの研究室の結果によって、５’−ＵＴＲが単独で、低温においてリボソームに対する顕著な親和性を有することが実証された。１５℃で５’−ＵＴＲを過剰産生させると、コールドショック応答の誘導が遅延し、ＣｓｐＡのみならずＣｓｐＢおよびＣｓｐＧの合成も延長される（Fang et al., 1998およびJiang et al., 1996）。これらの効果は、５’−ＵＴＲとＣｓｐＡとの同時産生によって抑制される。ｃｓｐＡプロモーターの−３５領域のすぐ上流のＡＴリッチ配列は、ＵＰエレメントとして機能して、ｃｓｐＡの転写を増強することが示されている。ＵＰエレメントを欠失させると、ｃｓｐＡプロモーターの活性が減少した（Goldenberg et al., 1997およびMitta et al., 1997）。より高いプロモーター活性に寄与する別の重要な要因は、−１０領域のすぐ上流のＴＧｎモチーフの存在である（Kumar et al., 1993）。このモチーフが−１０領域とともに拡張された−１０領域を構成し、この領域の存在下では−３５領域は不可欠ではないことが報告されている。
【０００７】
重要なことに、ｃｓｐＡの発現は翻訳のレベルでも調節されている。増殖遅延期（馴化期）の間のコールドショックタンパク質の優先的な合成は、大部分の他の細胞性（非コールドショック）ｍＲＮＡとは異なり、それらのｍＲＮＡが、ＲｂｆＡおよびＣｓｄＡのようなコールドショックリボソーム因子なしに低温で翻訳開始複合体を形成するメカニズムを有することを示唆する。本発明者らの研究室の最近のデータは、低温でその翻訳を増強するＣｓｐＡのコード配列内のエレメントが存在することを示している。ＣｓｐＡ、ＣｓｐＢ、ＣｓｐＧ、ＣｓｐＩ、ＣｓｄＡおよびＲｂｆＡのようなコールドショックタンパク質のｍＲＮＡが、翻訳開始を増強するダウンストリームボックス（ＤＢ）と呼ばれるエレメントをコード領域中に有することが提唱されている（Mitta et al., 1997）。最初は、ＤＢ配列は１６Ｓ  ｒＲＮＡの最後から２番目のステム中の領域に相補的であるとして提唱され、開始コドンの数塩基下流に位置する。いかにしてＤＢが翻訳開始を増強するかが議論されており（Etchegaray et al., 1999およびO'Connor et al., 1999）、１６Ｓ  ｒＲＮＡへの結合を介する翻訳前開始複合体の形成を容易にすることによる最初に提唱されたメカニズムは正確なメカニズムではないかもしれない。
【０００８】
「ＬＡＣＥ効果」（短縮型ｃｓｐＡ発現の低温抗生物質効果（low-temperature antibiotic effect of truncated cspA expression））と称する現象が大腸菌において観察された（Jiang et al., 1996およびXia et al., 2001）。短縮型ｃｓｐＡ遺伝子を低温で過剰発現させると、細胞増殖は完全にブロックされる。これは、短縮型ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡによるほぼ全ての細胞性リボソームの捕捉によって引き起こされることが実証されている。この短縮型ｍＲＮＡはなお、低温において非適応リボソームと前開始複合体を形成することができる。短縮型ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡによるリボソームの捕捉の明白な実証が、ｐＵＣベクター中にクローン化されたｃｓｐＡ遺伝子の２番目（ｐＡ０１Ｓ）、または１１番目（ｐＡ１０Ｓ）または３１番目（ｐＡ３０Ｓ）のいずれかにターミネーターコドンを組み込むことによって実施された（Xia et al., 2001）。３７℃では、これらのプラスミドを保持する細胞は完全に正常であるが、コールドショックに際して細胞は完全に増殖を停止する。細胞は１５℃でコロニーを形成することができず、いずれのタンパク質も３５Ｓ−Ｍｅｔで標識されなかった。これらの細胞のポリソームプロフィールを解析したところ、開始コドンのみを発現する細胞（ｐＡ０１Ｓ）はモノソームのみを含んでおり、ポリソームピークはなかった。ｐＡ１０Ｓを保持する細胞はジおよびモノソームを示し、ｐＡ３０Ｓを保持する細胞はトリ、ジおよびモノソームを示し、ここでも大きなポリソームピークはなかった。さらに、主要な細胞性ｍＲＮＡ（ｌｐｐ）が、短縮型ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの優勢によって、ポリソームから排除されることが示された。これらの結果は、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの強い翻訳能が開始の段階で決定されることを明白に実証する。この研究において、本発明者らの研究室は、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲ内の上流領域が、ＬＡＣＥ効果に導く翻訳開始複合体の形成における重要な役割を果たすことも示した（Xia et al., 2001）。
【０００９】
ＣｓｐＡおよびそのホモログは、ｍＲＮＡ中の二次構造を不安定化することによりＲＮＡシャペロンであることが提唱されている（Bae et al., 2000; Jiang et al., 1997およびPhadtare et al., 2001）。ΔｃｓｐＡΔｃｓｐＢΔｃｓｐＧΔｃｓｐＥ  ４重欠失株は低温で増殖できず、単一のｃｓｐ遺伝子が低温感受性を相補できるので（Xia et al., 2001）、ＲＮＡシャペロン機能は、安定な二次構造形成（これはｍＲＮＡの翻訳に阻害的である）をブロックすることによる低温での細胞性ｍＲＮＡの効率的な翻訳に重大であると考えられている（Phadtare et al., 2001）。
【００１０】
ｃｓｐＡプロモーターを含む低温誘導性ベクターは、凝集傾向のあるタンパク質（例えば、プレＳ２−Ｓ’−β−ガラクトシダーゼおよびＴｏｌＡＩ−β−ラクタマーゼ）の発現に有用であることが示されている（Mujacic et al., 1999; Vasina et al., 1997およびVasina et al., 1996）。米国特許第６，３３３，１９１号Ｂ１には、ｃｓｐＡおよびｃｓｐＢのプロモーターならびにこれらのプロモーターを有するベクターが開示されている。
【００１１】
本明細書におけるいずれもの文献の引用は、本願のいずれの請求項の特許性に対しても、その文献が関連する先行技術であるかまたは重要であると考慮されるとの認定として意図されるものではない。いずれもの文献の内容または日付に関する記載は、出願時に出願人に利用可能な情報に基づいており、その記載の正確さに関する認定を構成するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、宿主細胞中でコールドショック応答を誘発する条件下で宿主中で異種ポリペプチドを発現可能なＤＮＡ分子およびベクターを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のＤＮＡ分子は、コールドショック応答を誘発する条件下で宿主中で異種ポリペプチドの発現および生産を指示する、コールドショック誘導性遺伝子のプロモーターおよび５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）配列に作動可能に連結された異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。さらに、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が開始コドンの下流４番目〜７番目のコドン付近にＡＴリッチ配列（天然または作製（すなわち、部位特異的変異誘発により））を有するか、または翻訳増強エレメントが異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とコールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲ配列との間に挿入されているかのいずれかである。この翻訳増強エレメントは、開始コドンおよび、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との翻訳インフレーム融合体を形成するように、開始コドンの下流４番目〜７番目のコドン付近にＡＴリッチ配列を含む。
【００１４】
本発明は、本発明のＤＮＡ分子またはベクターで形質転換された宿主細胞および、例えば全細胞または細胞溶解物ＮＭＲ分光法のための、コールドショック誘導性条件下での異種タンパク質の生産のためのこの宿主細胞の使用方法も提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、異種ポリペプチドのコールドショック誘導性発現および生産のためのＤＮＡ分子、ベクター、宿主および方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
モデル系として大腸菌を使用して、本発明者らの研究室は、低温でのみの増殖に必要とされるいくつかのコールドショックタンパク質が存在することを見出した。これらのコールドショックタンパク質の中で、ＣｓｐＡが主要コールドショックタンパク質であり、これはコールドショックに際して１０６分子／細胞（１０−４Ｍ）より高いレベルで誘導される。ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの翻訳開始は低温において非常に効率的であることが示されており、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡは他の全ての細胞性ｍＲＮＡの翻訳を抑制する能力を有することが見出されている。例えば、ナンセンスコドンをｃｓｐＡの開始コドンの直後に付加すると、ｐＵＣベクター中の短縮型ｃｓｐＡ遺伝子由来のｍＲＮＡは、コールドショックに際して全ての細胞性リボソームを捕捉し、他の細胞タンパク質の合成を完全にブロックし、それにより低温での細胞増殖を完全に阻害する。この現象は「ＬＡＣＥ効果」と称する。それゆえ、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの顕著な翻訳の利点を、そのコールドショック誘導性ｍＲＮＡ安定化およびその高度に効率的なプロモーターとともに使用して、本発明者らはコールドショック誘導性ベクター−宿主系を設計した。ここで、全ての細胞性リボソームは低温においてクローン化遺伝子産物の生産のみにささげられ、それによってコールドショックに際して目的の遺伝子産物／タンパク質の非常に高い発現が提供される。
【００１７】
ｃｓｐＡプロモーターを含む低温誘導性ベクターは凝集傾向のあるタンパク質（例えば、プレＳ２−Ｓ’−β−ガラクトシダーゼおよびＴｏｌＡＩ−β−ラクタマーゼ）の発現に有用であることが示されているが（Mujacic et al., 1999; Vasina et al., 1996 and 1997）、他のエレメントは低コールドショック誘導温度での効率的な翻訳にとって非常に重大である。
【００１８】
従って、本発明は、コールドショック条件下で異種ポリペプチドを発現可能なＤＮＡ分子を提供し、ここでＤＮＡ分子は好ましくは自己複製発現ベクターである。本発明のＤＮＡ分子は、目的の異種ポリペプチド／タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれに作動可能に連結されて、コールドショック応答を誘発する条件下、宿主細胞中での目的の異種ポリペプチドの発現および生産を制御および指示するコールドショック誘導性プロモーターおよび５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）を含む。翻訳効率を増強するために、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が開始コドンの下流４番目〜７番目のコドン付近にＡＴリッチ配列（天然または作製（すなわち、部位特異的変異誘発により））を有するか、または翻訳増強エレメントがポリペプチドとコールドショック誘導性プロモーターおよび５’ＵＴＲ配列との間に挿入されている。この翻訳増強エレメントは、開始コドンおよび、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との翻訳インフレーム融合体を形成するように、開始コドンの下流４番目〜７番目のコドン付近にＡＴリッチ配列を含む。
【００１９】
本発明者らは、ＡＴリッチ配列が翻訳を翻訳開始段階で増強することを見出した。ＡＴリッチ配列（開始コドンの下流の二次構造を有しない）がリボソームの移行を容易にし、それによって翻訳開始およびその後の伸長反応の効率を増強し得ることが提唱される。これは次にｍＲＮＡの安定性および最終的なポリペプチド／タンパク質生産を増加させる。ＡまたはＡ／ＴリッチなメッセンジャーＲＮＡは構造形成されず、そのような容易に変形可能なｍＲＮＡはリボソームによって効率的に受け入れられ、従って翻訳開始および／または初期伸長に有利であることが提唱される。
【００２０】
用語「異種ポリペプチド」は天然の宿主細胞中でコールドショック誘導性プロモーターから天然には発現されない任意のポリペプチドを意味することが意図される。従って、「異種ポリペプチド」は、それがコールドショック誘導性プロモーターから天然に発現されない限り、コールドショック誘導性プロモーターおよび５’ＵＴＲと同じ供給源（例えば、大腸菌）由来のポリペプチドであり得るが、好ましくは、このポリペプチドは、コールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲの供給源とは異なる供給源（例えば、ヒトのような非大腸菌供給源）において天然に発現される。
【００２１】
ＤＮＡ分子は、それが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含み、そしてその配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されている場合に、異種ポリペプチドのようなポリペプチドを「発現可能」であるといわれる。作動可能な連結は、調節ＤＮＡ配列と発現させようとするＤＮＡ配列とが遺伝子発現を可能にするように連結されている連結である。一般に、遺伝子発現に必要とされる調節領域は、プロモーター領域および、ＲＮＡに転写されるとタンパク質合成の開始を合図するＤＮＡ配列を含む。そのような領域は通常、転写および翻訳の開始に関与する５’非コード配列を含む。
【００２２】
プロモーター領域は、そのプロモーターがＤＮＡ配列の転写をもたらすことができれば、そのＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。本明細書で用いる「プロモーター配列」は、ＤＮＡ上に見出され、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるプロモーターの配列である。従って、異種ポリペプチドを発現させるためには、宿主細胞によって認識される転写および翻訳シグナルが必要である。
【００２３】
用語「コールドショック」は、その正常生理学的増殖温度より十分低いインキュベーション／増殖温度の降下（例えば、少なくとも約１３℃の温度降下）に宿主細胞が供されることを意味する。
【００２４】
ヌクレオチド配列に適用される用語「ＡＴリッチ」は、少なくとも７０％のＡＴ塩基含量を有するものと定義する。
【００２５】
コールドショック誘導性プロモーターおよび５’ＵＴＲ配列は、好ましくは、大腸菌ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧまたはｃｓｐＩ遺伝子由来のコールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲ配列のいずれかである。上記の大腸菌コールドショックタンパク質のプロモーターおよび５’−ＵＴＲ領域ならびにコード領域および３’−ＵＴＲ領域のヌクレオチド配列を、配列番号１（ｃｓｐＡ）（コードされるＣｓｐＡのアミノ酸配列を配列番号２に示す）、配列番号３（ｃｓｐＢ）（コードされるＣｓｐＢのアミノ酸配列を配列番号４に示す）、配列番号５（ｃｓｐＧ）（コードされるＣｓｐＧのアミノ酸配列を配列番号６に示す）、および配列番号７（ｃｓｐＩ）（コードされるＣｓｐＩのアミノ酸配列を配列番号８に示す）に示す。これらの配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースからも、登録番号ＡＥ０００２５２（ＣｓｐＢおよびＣｓｐＩ）、ＡＥ０００４３３（ＣｓｐＡ）ならびにＡＥ０００２０１（ＣｓｐＧ）で入手可能である。ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧおよびｃｓｐＩのプロモーターおよび５’−ＵＴＲ領域の配列は、それぞれ配列番号１のヌクレオチド２２〜４４１、配列番号３のヌクレオチド１１〜２１４、配列番号５のヌクレオチド１２〜２１３および配列番号７のヌクレオチド１１〜２０１に対応し、図１３にアラインメントとして示す。
【００２６】
当業者には理解されるように、本発明のＤＮＡ分子において使用するためのコールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲは、コールドショック誘導性条件下での効率的な発現および翻訳を指示する能力が維持される限り、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧまたはｃｓｐＩのいずれかのプロモーターおよび５’−ＵＴＲ配列のフラグメントまたはバリアントであり得る。特定の配列が欠失、置換または挿入されているフラグメントおよびバリアントは本発明に包含されることが意図され、手引きが実施例に提供される。
【００２７】
本発明の１つの好ましい実施態様は、ＡＴリッチ配列が異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の４番目〜７番目のコドンにすでに存在して、翻訳増強エレメントとして作用する場合である。このＡＴリッチ配列は、異種ポリペプチドをコードする天然のヌクレオチド配列中に存在するか、またはコード配列に導入する（すなわち、部位特異的変位誘発により）かのいずれかであり得る。例えば、コドン４〜コドン７の領域のＡＴ含量は、各コドンの第３の塩基がＧまたはＣである場合、それをＡまたはＴに置き換えることによって増加させることができる。これは通常、コドン使用の縮重により、この領域のアミノ酸配列を変化させずに行うことができる。
【００２８】
別の好ましい実施態様は、コールドショック誘導性プロモーターおよび５’−ＵＴＲ配列が、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に、７つのコドンのヌクレオチド配列からなる翻訳増強エレメント（ここで第１のコドンが開始コドンであり、４番目〜７番目のコドンがＡＴリッチ配列を形成する）によって好適に連結されている場合である。そのような翻訳増強エレメントの１つの実施態様は、実施例３に記載されるｐＣｏｌｄＩＩベクターのＮｄｅＩ部位中へのクローニングから生成されるような、配列番号９のヌクレオチド１〜１８のヌクレオチド配列である。
【００２９】
好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧまたはｃｓｐＩのいずれか由来の３’ＵＴＲのような、３’ＵＴＲ配列も含む。３’ＵＴＲの特に好ましい実施態様は、配列番号１のヌクレオチド４４２〜５３９を含むｃｓｐＡ  ３’−ＵＴＲまたはそのフラグメントである。
【００３０】
別の実施態様において、本発明のＤＮＡ分子は所望により、配列番号１０のヌクレオチド配列のようなｌａｃＩオペレーター配列を、コールドショック誘導性プロモーターの転写開始部位のすぐ下流に含んでもよい。非誘導条件下の漏れの低レベルの発現であっても、異種ポリペプチドがその正常生理学的増殖温度での宿主細胞の増殖に対して毒性である場合に、そのようなｌａｃＩオペレーターを、問題を回避するために使用し得る。こうして、異種タンパク質をコールドショック下でＩＰＴＧの存在下でのみ生産することができる。
【００３１】
本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含むベクターも提供する。好ましくは、ベクターは自己複製し、コールドショック応答を誘発する条件下で宿主中での異種ポリペプチドの発現を指示する。本発明のベクターの好ましい実施態様は、実施例３に記載するｐＣｏｌｄＩ、ｐＣｏｌｄＩＩおよびｐＣｏｌｄＩＩＩベクターである。これら３つのベクターは全て同じｐＵＣ１９の骨格を有する（ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、次いでＫｌｅｎｏｗでフィルインした）が、挿入配列は異なる。図１２Ａ〜１２ＣはそれぞれｐＣｏｌｄＩ、ＩＩおよびＩＩＩの挿入配列を示す。
【００３２】
本発明の別の局面は、本発明のＤＮＡ分子またはベクターで形質転換された原核生物宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は大腸菌である。本明細書中実施例４において記載するように、宿主細胞が、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ活性を欠くポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ｐｎｐａｓｅ）変異体（ｐｎｐ−）、または遊離３０ｓリボソームサブユニットとは結合するが、７０ｓリボソームサブユニットとは結合しない１５ｋＤａ  ＲｂｆＡタンパク質を欠くｒｂｆＡ変異体（ｒｂｆＡ−）であることが好ましい。本発明の宿主細胞の別の好ましい実施態様は、ｐｎｐ−およびｒｂｆＡ−の両方である宿主細胞である。さらなる実施態様は、ＣｓｄＡ  ＲＮＡヘリカーゼ活性を欠くｃｓｄＡ  ＲＮＡヘリカーゼ変異体（ｃｓｄＡ−）および宿主細胞中でＣｓｄＡ  ＲＮＡヘリカーゼを過剰発現するベクターで同時形質転換された宿主細胞を含む。これらのｃｓｄＡ−またはＣｓｄＡ過剰発現宿主細胞は、好ましくはｐｎｐ−および／またはｒｂｆＡ−でもある。
【００３３】
本発明のさらなる局面は、限定するものではないが、医学上重要なタンパク質（例えば、治療剤または標的として有用なヒトタンパク質）、熱変成を受けやすいタンパク質、標識タンパク質およびＮＭＲ研究において使用するためのタンパク質を包含する異種ポリペプチドの生産方法に関する。この方法は、本発明のＤＮＡ分子またはベクターを含む本発明の宿主細胞を、栄養培地中、宿主細胞の正常生理学的増殖温度で培養する工程、および次いでインキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より少なくとも１３℃低い温度に低下させることによって培養宿主細胞をコールドショックに供して、異種ポリペプチドの生産を誘導する工程を包含する。コールドショックに供した宿主細胞を低下させたコールドショック温度で維持して、異種ポリペプチドを生産期の間に生産させる。次いで、生産された異種ポリペプチドを回収する。別の実施態様において、インキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より少なくとも２０℃低い温度に低下させる。
【００３４】
本発明の方法の利点は以下のとおりである：
１．タンパク質の誘導を温度低下によって実施するので、ＩＰＴＧのような化学的誘導物質を必要としない。
２．コールドショックに際して、細胞は、単一の目的タンパク質にささげられたタンパク質合成装置に転換される。全ての細胞性リボソームがベクター中にクローン化されたタンパク質のｍＲＮＡに捕捉されるので、細胞中での他の全てのタンパク質の合成は実質的にブロックされる。
３．それゆえ、コールドショック後に培地を交換することによって（例えば、１２Ｃ−グルコース／１４ＮＨ４Ｃｌベースの培地から１３Ｃ−グルコース／１５ＮＨ４Ｃｌベースの培地）、目的のタンパク質のみを同位体で標識し、１３Ｃ、１５Ｎ−同位体標識した試料のための精製プロセスを除くことができる。
４．分子量２０ｋＤａのタンパク質を生産する場合（総細胞タンパク質の６０％のレベル、このタンパク質のみがコールドショックに際して新たに合成されることに留意のこと）、１リットル当たりのタンパク質の総収量は約１２０ｍｇである。このタンパク質の８０％が可溶性形態で生産され、４ｍｌの緩衝液中の細胞懸濁物またはこの懸濁物から調製される細胞溶解物（超音波処理し、次いで遠心分離して細胞片および膜画分を除去）を仮定すると、目的のタンパク質の２５ｍｇ／ｍｌまたは１．２５ｍＭの溶液を得ることができ、これをＮＭＲ分光法に直接使用することができる。
５．ＮＭＲ分光法を１ｍｌ未満で行うことができるので、培養サイズを２５０ｍｌに減じることができ、高価な１３Ｃ−グルコースおよび１５Ｎ−ＮＨ４Ｃｌ（または（１５ＮＨ４）２ＳＯ４）の使用を４分の１に削減することができる。さらに、細胞は提唱する条件下でコールドショックに際して増殖することができないので、全体の炭素利用は増殖中の細胞よりずっと少ないはずである。それゆえ、培地中のグルコース濃度を１３Ｃ−グルコースに通常使用する濃度（０．２％）より低くすることができる。これにより、高価な１３Ｃ−グルコースの消費がさらに節約される。
６．いくつかのタンパク質は熱変成を非常に受けやすい。特に、より低い温度環境に通常生存する生物（例えば、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）由来のタンパク質の大腸菌中での発現は、より高い温度で発現させることに問題がある。提唱するコールドショックベクター−宿主系は、この問題を回避する。
７．いくつかのタンパク質の発現はＴ７ベクター系を用いた場合に、より高いかもしれないが、タンパク質の折り畳みの問題のみならず、転写および翻訳の調節のためにも、他のタンパク質の発現は提唱するコールドショックベクター系を用いてのみ達成されるかもしれない。これは、ヒトから細菌までの非常に多数の遺伝子が利用可能になると、ますます明らかになり得る。
８．ますます多くの医学上重要なヒトタンパク質が同定されているので、これらのタンパク質を可溶性形態で多量に発現させることは重要である。本発明のコールドショックベクター系は、従来のＴ７発現系の代替または相補系として作用する。
【００３５】
当業者には理解されるように、本発明の異種ポリペプチドの生産方法を使用して、検出可能に標識された化合物（例えば、無視できる量以下が宿主細胞中に通常見出される同位体である１３Ｃまたは１５Ｎで標識された化合物）を取り込ませることができる。検出可能に標識された化合物を本発明の方法によって生産された異種ポリペプチド中に取り込ませることが所望される場合（例えば、ＮＭＲ分光分析のために）、栄養培地を、異種ポリペプチドを検出可能に標識するための化合物を含有する培地に交換／置換する。検出可能に標識された化合物は、好ましくは１５ＮＨ４Ｃｌ、（１５ＮＨ４）２ＳＯ４、１３Ｃ−グルコース、１５Ｎで標識された単一のアミノ酸残基、１３Ｃで標識された単一のアミノ酸残基、または１５Ｎおよび１３Ｃの両方で標識された単一のアミノ酸残基である。１５ＮＨ４Ｃｌ、（１５ＮＨ４）２ＳＯ４および１３Ｃ−グルコースは、生産された異種ポリペプチド全体の非選択的な標識を提供し、一方１５Ｎおよび／または１３Ｃで標識された単一のアミノ酸残基（すなわち、Ｇｌｕ）は、特定の単一のアミノ酸残基に対応する異種ポリペプチド中の残基位置での選択的標識を提供する。
【００３６】
下記の実施例５は、タンパク質精製なしの細胞溶解物上清のＮＭＲ分光法に適切な異種ポリペプチド（ＥｎｖＺのＡＴＰ結合ドメイン）の生産を実証する。実施例５において宿主細胞として使用した大腸菌Ｂ株ＢＬ２１は、主要コールドショックタンパク質（例えば、ＣｓｐＡ）のいずれかを欠く変異体ではない。しかし、標識された主要コールドショックタンパク質の存在から生じるＮＭＲ分光法におけるバックグラウンドノイズがより少ないことが所望される場合は、１つ以上の主要コールドショックタンパク質を欠く、（好ましくはＣｓｐＡまたはＣｓｐＡと別のコールドショックタンパク質との組み合わせを欠く（例えば４重変異体ΔｃｓｐＡΔｃｓｐＢΔｃｓｐＧΔｃｓｐＥにおけるような）変異宿主細胞を代わりに使用することができる。
【００３７】
さらに、本発明は、異種ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを得るための方法を提供する。この方法は、栄養培地中、異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で形質転換され、コールドショックに応答した異種ポリペプチドの発現および生産が可能な原核生物宿主細胞を培養する工程を包含する。これに、インキュベーション温度を宿主細胞の正常生理学的増殖温度より低い温度に低下させることによって培養宿主細胞をコールドショックに供して、異種ポリペプチドの生産を誘導する工程が続く。コールドショック後に、栄養培地を、異種ポリペプチドを検出可能に標識するための化合物を含有する培地に交換／置換する。コールドショックに供した宿主細胞を、低下させたインキュベーション温度でインキュベートして、化合物で検出可能に標識された異種ポリペプチドを生産し、次いで単離する。ＮＭＲ分光法を、単離したコールドショックに供した宿主細胞に対して（全細胞ＮＭＲ分光法）、または単離したコールドショックに供した宿主細胞の細胞溶解物由来の上清に対してのいずれかで実施して、異種ポリペプチドのＮＭＲスペクトルを得ることができる。
【００３８】
本発明を概説したが、本発明は以下の実施例を参照してより容易に理解される。実施例は例示のために提供するのであって、本発明の限定を意図するものではない。
【実施例１】
【００３９】
プロトタイプベクターの構築
ＮｄｅＩ部位を有しないｐＵＣ１９ベクター（New England BioLabs, Beverly, MA）を、もとのプラスミドをＮｄｅＩで消化し、次いでＫｌｅｎｏｗでのフィルインおよびライゲーションによって作製した。Ｔ７／ｃｓｐＡプロモーター、ＣｓｐＡの５’−ＵＴＲ領域およびそのコード領域を含むＰＣＲ産物を、ｐＣＵ１９ΔＮｄｅＩプラスミドのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化した。次いで、これら２つの制限部位をＫｌｅｎｏｗでのフィルインによって欠失させた。部位特異的変異誘発によって、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位をｃｓｐＡ終止コドンの直後に作製した。６Ｈｉｓタグ、プロテアーゼ切断用の第Ｘａ因子部位、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩを含むマルチクローニング部位、ならびにｃｓｐＡの３’領域を含む第２のＤＮＡフラグメントを合成し、このベクター中にクローン化した。プロトタイププラスミドベクターの地図を図１に示す。
【００４０】
Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ由来のタンパク質のクローニングおよび発現
いくつかのタンパク質は熱変成を非常に受けやすい。特に、より低い温度環境に通常生存する生物（例えば、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来のタンパク質の大腸菌中での発現は、より高い温度で発現させることに問題がある。５つのＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質を選択し、Ｇ．Ｍｏｎｔｅｌｉｏｎｅ博士より提供を受けた（ＷＲ４９、ＷＲ３５、ＷＲ２６、ＷＲ２７およびＷＲ５３と称する、それぞれ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号：ＡＶ１８５３２０、ＡＶ１８３３９８、Ｃ５０７８８、Ｄ７１９２３およびＣ４８８４８）。これらをｐＥＴベクター中にクローン化し、３７℃で十分に発現させることができなかった（図２Ａ）。これらのタンパク質をコードする遺伝子を含む挿入断片を、図１に記載のコールドショックベクター中にサブクローニングした。細胞を３７℃でＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで増殖させ、次いで１５℃に移し、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルｂ−Ｄチオガラクトピラノシド、Ｔ７プロモーターを誘導するため）を用いて誘導し、試料を０、１２および２４時間で取り出し、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図２Ａは、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いた誘導の３時間後のｐＥＴベクターを使用した３７℃でのこれら全てのタンパク質の発現レベルを示し、図２Ｂは、それぞれのコールドショックベクターを使用した１５℃でのそれらの発現を示す。タンパク質ＷＲ４９およびＷＲ３５は、ｐＥＴ発現ベクターを使用して３７℃で全く発現させることができなかった（それぞれ、図２Ａ中レーン２および４）。タンパク質ＷＲ２６は非常に弱く発現された（図２Ａ、レーン６）。これら３つのタンパク質の全ては、コールドショックベクターを使用して１５℃で大いに発現された。タンパク質ＷＲ２７およびＷＲ５３の発現も、コールドショックベクターを使用した場合、有意に高かった。また、コールドショックベクターを使用して、従来のベクターを用いた場合に十分に発現させることができなかったヒトタンパク質の発現に成功した。
【００４１】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質生産の時間プロフィール
次に、コールドショックベクターを使用したタンパク質生産の時間プロフィールを検討した。従来のＴ７ベクターを使用して３７℃で全く発現させることができなかったかまたは非常に弱く発現されたかのいずれかであるＷＲ４９、ＷＲ３５およびＷＲ２６タンパク質を選択した（図２Ａ）。それぞれのプラスミドを含む細胞を３７℃でＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで増殖させ、次いで１５℃に移し、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導し、試料を０時間から１２０時間まで２４時間間隔で取り出し、タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。図３はこれらのタンパク質の発現レベルを示す。各々のタンパク質の最大発現は３〜４日以内に見られ、その後安定に維持された。次に、他の全ての細胞タンパク質の発現が有意に阻害され、その結果ほぼ８５％純粋な目的のタンパク質が生産された。
【００４２】
ｃｓｐＡプロモーターのみを含むコールドショックベクターを使用したタンパク質の発現
本発明者らの特定の目的は、目的のタンパク質を細胞中９０〜９５％の翻訳効率で、総細胞タンパク質の６０〜７０％より高いタンパク質収率で合成し、細胞溶解物または直接細胞懸濁物をＮＭＲ分光法に直接使用し得るようにすることにある。ＮＭＲ分光法の前にＣｓｐＡからの目的のタンパク質の分離および精製が必要とされるので、融合タンパク質はこの局面で問題を引き起こす。従って、本発明者らの研究室は、ｃｓｐＡプロモーターを有しｃｓｐＡコード領域は有しないコールドショックベクターも構築した。このベクターはｃｓｐＡ  ５’ＵＴＲの上流にｌａｃオペレーターも含み、従って、目的の遺伝子をＩＰＴＧによって誘導することができる。医学的展望から重要であるタンパク質γ−インターフェロンを選択した。γ−インターフェロンをコードする遺伝子をこのベクター中にクローン化し、１５℃でのその生産をＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質について上記したように確認した。図４Ａは３７℃および１５℃でのγ−インターフェロンタンパク質の発現を示す。ｃｓｐＡ  ５’ＵＴＲが３７℃におけるｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの不安定性およびそのためのその発現の欠如の原因であるという事実に一致して、この温度ではγ−インターフェロンの発現は観察されなかった（レーン６）。他方、これは１５℃ではよく発現された（レーン２〜５）。しかし、他の細胞タンパク質は、３７℃での増殖からのキャリーオーバーの結果として存在するようである。この可能性を確認するために、細胞を１５℃でパルスラベルした。細胞を標識培地中で対数期まで増殖させ、１５℃に移した。以前に記載のように（Xia et al., 2001）培養物の１ｍｌを５ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを用いて標識した。細胞を非放射性メチオニンを添加することによってチェイスした。細胞を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、１００ｍｌのＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ここで、γ−インターフェロンは標識細胞タンパク質の９０％より多くを構成することが見出された（図４Ｂ、レーン２）。このことは、γ−インターフェロンがコールドショックベクターを用いて１５℃でほぼ排他的に生産され得ることを示唆する。従って、この方法は、１３Ｃおよび１５Ｎのような同位体を用いて特異的にタンパク質を標識することにおいて非常に有用であり、タンパク質精製なしに全細胞ＮＭＲ分光法を可能にする。
【００４３】
タンパク質合成開始を促進するｍＲＮＡ下流シスエレメントの同定
本発明のコールドショックベクター系をさらに改良するために、本発明者らの研究室は、ｌａｃＺ発現系を介して分子レパートリーを構築することによって、タンパク質合成開始を促進する開始コドン下流のｍＲＮＡシスエレメントを探査した。使用した配列は以下のとおりである：５’−ＧＧＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−ｌａｃＺ−終止シグナル−３’（配列番号１１）。開始コドンおよびランダム挿入配列に下線を付している。この配列をＩＰＴＧ誘導性ｐＩＮＩＩＩベクター（Inouye, 1983）中にクローン化し、このプラスミドをＣＬ８３細胞中に形質転換した。１３０個のクローンをランダムに選択し、配列決定した。
【００４４】
１３０個のクローンのうち５７個を、Millerの方法（Miller, 1992）によるβ−ガラクトシダーゼ活性の測定のために選択した。非常に興味深いことに、β−ガラクトシダーゼ活性の範囲は１５００〜４３０００単位であり、このことはコドン４〜コドン７のコード領域が遺伝子発現において重要な役割を果たすことを示す。より高い酵素活性を担う特定のコンセンサス配列は存在しないが（データは示さず）、高いβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンにおいて（Ａ＋Ｔ）／（Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ）の比率はほぼ７０％であった（図５）。より高いｌａｃＺ発現を示すクローンにおいて、最も頻繁に使用されるコドンは、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、ＬｅｕおよびＩｌｅのようなアミノ酸をコードするものであることも明らかであった。高いβ−ガラクトシダーゼ活性を有する４つのクローンを選択し、フレームシフト変異をそれらの各々に導入した。表１からわかるように、終止コドンの導入を生じた２つの変異以外（表中、下線を付している）、いずれの変異もｌａｃＺ発現に対して有意な影響を有しなかった。
【００４５】
【表１】
2005518804.tif 000002
【００４６】
このように、特定のコドン使用はｌａｃＺ発現に対して明白な影響を有しなかった。このことは、高いＡＴ含量がより高い発現に重要であるという見解を支持する。それゆえ、ダウンストリームボックスの翻訳増強効果は、その１６Ｓ  ＲＮＡに相補的な配列ではなく、そのより高いＡＴ（ＡＵ）含量に起因するようである。開始コドンの下流のＡ／Ｔリッチ配列は大腸菌におけるタンパク質の翻訳を増強するかもしれない。なぜなら、Ａ／Ｔリッチ配列の、安定性のより低い二次構造が、開始リボソーム数の増加を生じさせるかもしれないからである。
【００４７】
β−ガラクトシダーゼ活性の増加はタンパク質発現の増加に起因する
上記５７個のクローンを、それらのタンパク質プロフィールおよびβ−ガラクトシダーゼ活性に関してさらに分析した。それぞれのプラスミドを含む細胞を３７℃でＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。タンパク質の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質バンド強度を濃度測定分析によって測定した。β−ガラクトシダーゼ活性を上記のように実施した。図６からわかるように、β−ガラクトシダーゼ活性はそれぞれのタンパク質レベルによく対応する。本発明者らは、より高いβ−ガラクトシダーゼ活性がタンパク質自体のより高い比活性に起因すると結論付ける。
【００４８】
転写ではなく翻訳の増強がより高いβ−ガラクトシダーゼ活性を担う
得られたクローンを、それらのβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて、（ｉ）４３，０００〜３５，０００、（ｉｉ）３５，０００〜２５，０００、（ｉｉｉ）２５，０００〜１０，０００および（ｉｖ）１０，０００未満の範囲の酵素単位を示すクローンとして４つのグループに分けることができた。これら４つのグループ全てを表す１６個のクローン（各々から４個）を選択し、ｌａｃＺ  ｍＲＮＡレベルをこれらのクローンにおいてｌａｃＺに対応するオリゴヌクレオチドを使用してプライマー伸長によって確認した（Etchegaray et al., 1999）。図７は、これらのクローンにおけるβ−ガラクトシダーゼ活性、タンパク質レベルおよびｌａｃＺ  ｍＲＮＡレベルを示す。図６において実証されたことと同様に、β−ガラクトシダーゼ活性はタンパク質レベルに対応した。しかし、高および低レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンは同様のレベルのｌａｃＺ  ｍＲＮＡを示し、このことは、より高いβ−ガラクトシダーゼ活性が転写のアップレギュレーションには起因しないことを示す。従って、本発明者らは、それが翻訳増強の結果であると結論付ける。
【００４９】
開始コドン下流のＡ／Ｔ（Ａ／Ｕ）リッチエレメントは翻訳開始を増強する
次に、本発明者らの研究室は、翻訳の開始または延長がこの効果を担うかどうかを調べた。最高および最低の活性を示す２つのクローンを選択した。それらの配列、配列番号１４および配列番号２６を図８に示す。４２，４００単位のβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンは開始コドンの下流にＡ／Ｔリッチ配列ＡＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴ（配列番号１４）を有しており、一方４４１０単位の活性を示すクローンはＧ／Ｃリッチな対応する配列ＣＧＧＴＣＴＣＴＣＣＧＣ（配列番号２６）を有していた。これらの２つのクローンのリボソームプロフィールを検討した。リボソームを調製し、以前に記載されたように分画した（Etchegaray et al., 1996およびXia et al., 2001）。プライマー伸長を実施して、ポリソームおよび７０Ｓ、５０Ｓまたは３０ＳリボソームにおけるｌａｃＺ  ｍＲＮＡの分布を検討した。ネガティブコントロールとしてｏｍｐＡ  ｍＲＮＡのレベルも検討した。図８からわかるように、より低いβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンに比較して、より高い活性を示すクローンは、ポリソームおよびショ糖勾配の７０Ｓ画分においてより高いｌａｃＺ／ｏｍｐＡ  ｍＲＮＡ比を示した。このことは、より高いβ−ガラクトシダーゼ発現が、開始コドン下流のＡ／Ｔリッチ配列によって媒介される翻訳開始の増強に起因することを示唆する。
【実施例２】
【００５０】
ＬＡＣＥ効果を担うｃｓｐＡ  ｍＲＮＡ中の翻訳シスエレメントの同定
ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡは、１５９塩基長の５’ＵＴＲ（非翻訳領域）を含んでおり、これはＬＡＣＥ効果において最も本質的な役割を果たすと考えられる。本発明者らの研究室は、ＬＡＣＥ効果が、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡによって全ての機能的細胞性リボソームが捕捉され、それによって他の全ての細胞性ｍＲＮＡの翻訳開始複合体の形成が阻害されることによって引き起こされることを実証した。他の全てのｍＲＮＡの３０Ｓリボソームとの相互作用を妨げるこのｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの能力は、その高度に効率的な、リボソームとの開始複合体を形成する能力に起因すると推測される。
【００５１】
原核生物において、以下の少なくとも２つの、翻訳開始に重要なエレメントが存在する：一方はリボソーム結合配列（いわゆるシャイン．ダルガーノ配列（ＳＤ））であり、他方は開始コドンＡＵＧである。さらに、いくつかのその他の翻訳開始増強のためのエレメントが報告されている（Gold et al., 1988）。例えば、「イプシロン」と称するＳＤ配列上流の翻訳増強エレメントが存在することが報告されている（Olins et al., 1989）。「ダウンストリームボックス」と称する開始コドン下流のエレメントもまた存在することが議論されている（Etchegaray et al., 1999a and 1999b; O'Connor et al. 1999）。５’ＵＴＲ中の二次構造が翻訳開始の調節に関与することに留意することも重要である。特に、ＳＤ配列またはその付近の二次構造の形成は、開始複合体の形成にしばしば阻害的である（Yamanaka et al., 1999）。
【００５２】
細胞中の細菌ｍＲＮＡの安定性は、遺伝子発現調節における別の重要な要因である。特に、著しく長い５’−ＵＴＲを有するｃｓｐＡ  ｍＲＮＡのようなｍＲＮＡは、一般にエンドヌクレアーゼの攻撃をより受けやすい傾向にある。実際、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡはより高い温度で非常に不安定である。３７℃で、その半減期は１２秒未満しかなく、この不安定性がＳＤ配列のすぐ上流のＡＵリッチ配列に起因することが示されている。この領域での塩基置換変異によって、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡが劇的に安定化されて、３７℃においてＣｓｐＡ産生が構成的になることが示されている（Fang et al., 1998）。翻訳開始増強に必須のｃｓｐＡ  ５’−ＵＴＲ中のエレメントが同定される。これらの解析を通して、翻訳開始効率をさらに改善することが可能である。以下のアプローチがとられる。
【００５３】
（ｉ）翻訳開始効率評価系の開発
ＬＡＣＥ効果は、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの高度に有効な翻訳開始能力によって引き起こされることが実証されている（Xia et al., 2001）。ＬＡＣＥ効果は以下によって規定される：（ａ）１５℃でのクローンを保持する細胞のコロニー形成に対するクローンの抗生物質効果、（ｂ）１５℃での全細胞タンパク質中への［３５Ｓ］メチオニン取り込みに対するクローンの効果（これはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる）、および（ｃ）ＬＡＣＥ惹起クローンを保持する細胞の増殖曲線。
【００５４】
個々のクローンにおけるＬＡＣＥ効果の強さを評価するために、ＬＡＣＥ効果を定量的に測定できることが重要である。例えば、ｃｓｐＡ遺伝子中それぞれ２番目、１１番目および３１番目のコドンにナンセンスコドンを挿入することによって以前に構築されたｐＡ０１Ｓ、ｐＡ１０ＳおよびｐＡ３０Ｓの場合、本発明者らの研究室は、１５℃でのコロニー形成の完全な阻害およびコールドショック後１５℃での細胞タンパク質中への［３５Ｓ］メチオニン取り込みに対するほぼ完全な阻害効果を示した。しかし、これら３つのクローンは、コロニー形成およびタンパク質合成がより高い温度で測定されれば、それらのＬＡＣＥ効果の有効性によって評価することができるかもしれない。厳密なＬＡＣＥ効果を有するこれらのクローンは、２０℃または２５℃でもそれらの有効なＬＡＣＥ効果をなお保有するかもしれないが、より弱いＬＡＣＥ効果を有するものは２０℃でコロニーを形成し始め、この温度でタンパク質合成が観察されるかもしれない。それゆえ、簡単なプレーティング法は、個々のＬＡＣＥ惹起クローンの有効性を評価可能であるべきである。本発明者らの研究室はこの方法をその研究室で利用可能なＬＡＣＥ惹起クローン、ｐＡ０１Ｓ、ｐＡ１０ＳおよびｐＡ３０Ｓ（Xia et al., 2001）を用いて試験する。これらのプラスミドを保持する細胞を４つのＬＢアガープレートにプレーティングし、別々に３７、２５、２０および１５℃でインキュベートする。ＬＡＣＥ効果の強さを、より高い温度でのコロニー形成の阻害を検討することによって、そして所定の温度でのコロニーの大きさによっても分類する。
【００５５】
次いで、異なる温度でのＬＡＣＥ効果を［３５Ｓ］メチオニン取り込みおよび増殖曲線によって確認する。これらの方法のいずれによっても、構築された個々のクローンについてのＬＡＣＥ有効性の評価について同様の結果を得ることができると考えられる。しかし、プレーティングは３つの中で最も簡単な方法であるので、それが他と同様に有効であることが判明すればこの方法を使用する。
【００５６】
（ｉｉ）ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲの解析
所定のＲＮＡの二次構造をいくつかの異なる方法で得ることができる。特に、細胞中の１つのｍＲＮＡによって取られる正確な二次構造は決定するのが困難である。それにもかかわらず、コンピュータープログラムを使用して、ｍＲＮＡの見込みのある安定な二次構造を予測することができる。図９は、ＲＮＡ折り畳みのためのＺｕｋｅｒプログラム（バージョン３．１、www.bioinfo.math.rpi.eduで利用可能）を使用したコンピューター解析によるｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの５’−ＵＴＲの最も安定な二次構造を示す。これは、Ｉ〜ＶＩの６つの二次構造が存在することを示し、それらの安定性はそれぞれ−７．０、−１４．８、−２．１、−８．３、２．７、１．５Ｋｃａｌと算出される。ＶＩＩで示される二次構造は３’末端で形成されるものであり、ρ非依存性転写ターミネーターであると考えられる。
【００５７】
６つの二次構造のうち、構造ＩはｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの安定性にとって重要なコールドボックスであることが知られており、従ってこれを除くことはできない。他の構造ＩＩ〜Ｖの役割を研究するアプローチにおいて、ｃｓｐＡのコード配列中の３１位にナンセンスコドンを有するｐＡ３０Ｓ（Xia et al., 2001）を使用して、これらを１つずつ欠失させてＬＡＣＥ効果に対する欠失の影響を検討する。欠失によりなんらかの影響が見出されれば、特に構造ＩＩの場合、この大きな構造をさらに小さなフラグメントに切断して調べる。図９に示すように、このステム領域をさらに３つの部分ＩＩａ、ＩＩｂおよびＩＩｃに分割することができる。以下の欠失を構築する：ΔＩＩａ、ΔＩＩｂ、ΔＩＩｃ、ΔＩＩｂΔＩＩｃ、ΔＩＩａΔＩＩｂ、およびΔＩＩａΔＩＩｃ。ｐＡ３０Ｓ中のこれらの欠失を、それらのＬＡＣＥ効果について、（ｉ）節で開発したプレーティング法を使用して検討する。
【００５８】
構造ＩＶの役割
この領域が翻訳効率に重要な役割を果たすことが以前に示された（Yamanaka et al., 1999）。本発明者らの研究室は、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧおよびｃｓｐＩにおいて高度に保存されており、ＳＤ配列の１１塩基上流に位置する、アップストリームボックスと称する１３塩基の配列（塩基１２３〜１３５；ＵＢ配列）が、ＳＤ配列に加えて、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡの翻訳効率に関与する別のシスエレメントであるかもしれないことを報告した（Xia et al., 2001およびYamanaka et al., 1999）。この構造の正確な必要性を、構造内のより小さな領域の欠失および塩基置換によって構造をさらに切断して調べることによって検討する。
【００５９】
構造Ｖの役割
バクテリオファージＴ７中の遺伝子の翻訳を増強することが提唱されている「イプシロン」と称するＳＤ配列上流のシスエレメントが存在することに留意することも興味深い（Olins et al. 1989）。エプシロン配列ＵＵＡＡＣＵＵＵＡ（配列番号２７）は最初、バクテリオファージＴ７遺伝子１０リーダー領域中に見出された。１６Ｓ  ｒＲＮＡに対する相補性が拡張されると、イプシロンがエンハンサーから非依存性翻訳イニシエーターに転換されることが報告されている。イプシロンが、その天然の９ヌクレオチド長の１６Ｓ  ｒＲＮＡに対する相補性および開始コドンへの１６ヌクレオチド長の距離で翻訳イニシエーターとしての最大活性を示すことが示されている。これらの条件下で、その効率はコンセンサスシャイン・ダルガーノ配列の効率に匹敵した（Golshani et al., 2000）。構造Ｖの配列はイプシロンに類似している（図９、１０Ａおよび１０Ｂ）。
【００６０】
まず、ＳＤ配列（ＡＡＧＧ）のすぐ上流の１０塩基の配列ＵＵＡＡＵＵＡＵＵＡ（配列番号２８のヌクレオチド１６〜２５）をＬＡＣＥ効果におけるその役割について解析する。このイプシロン様配列はＡおよびＵ残基のみからなる。種々の欠失変異（図１０Ａ中の変異体１、２、９、１０および１１）ならびに置換変異を構築する（変異体３〜８）。これらの変異のＬＡＣＥ効果に対する影響によって、このエレメント中にイプシロン配列について提唱されるような特有の配列要件が存在するかどうかが明らかになる。１０塩基の配列が翻訳増強（またはＬＡＣＥ効果）における有意な役割を有することを本発明者らの研究室が実証することができれば、配列を、それが単独でＳＤ配列なしでも翻訳を開始する能力を有するかどうについて検討する。この目的のために、ｃｓｐＡ  ＳＤ配列（ＡＡＧＧ）を、それをＡＡＣＣに変異させることによって除く（図１０Ｂ中変異１２）。変異体１２がＬＡＣＥ効果を発揮することができれば、１０塩基の配列を欠失させて、この領域が実際にリボソーム結合に必要とされることを確認することができる（変異体１３）。次に、イプシロン様配列と開始コドンとの間の距離の要件を、変異体１４、１５および１６に示すように欠失変異によって決定する。
【００６１】
いわゆるイプシロン配列がいかなる配列特異性もなしにまさにそのＡＵリッチ性のために機能する可能性がある。この理由のために、本発明者らの研究室はまた、ＡＵ配列を、現在の１０塩基から１３、１４および１６塩基長のＡＵ配列にスクランブルまたは延長して、ＬＡＣＥ効果に対するそれらの影響を検討する。ＡＵリッチ配列が実際に翻訳を増強することができる場合は、ＬＡＣＥ効果が細胞性リボソームの捕捉から生じることを確認するために、野生型ｃｓｐＡ  ＲＮＡ、変異体１（図１０Ａ）および変異体１２（図１０Ｂ）の間でポリソームパターンを比較する。
【００６２】
翻訳増強における構造Ｖの役割のさらなる確認を、ｃｓｐＡプロモーター、５’ＵＴＲ、およびｌａｃＺ遺伝子に融合したｃｓｐＡの１３番目のコドンまでのコード領域を含む、すでに構築したｐＡｌａｃＺを用いて実施する。上記と同様の欠失および置換変異もまた、このｐＡｌａｃＺベクターを使用して作製する。染色体遺伝子から産生されるｃｓｐＡの自己調節効果を回避するためにΔｃｓｐＡ細胞を形質転換用宿主として使用し、これらのプラスミドから発現されるｃｓｐＡのレベルをβ−ガラクトシダーゼアッセイによって検討する。これらの実験を通して、翻訳開始における構造Ｖの正確な役割を決定する。
【実施例３】
【００６３】
コールドショックベクターの構築
３形態のコールドショックベクターを構築する。第１のタイプｐＣｏｌｄＩ（図１１Ａ）は、遺伝子のコード領域がＣｓｐＡのコード領域全体との融合タンパク質としてクローン化されるベクターである。図１２Ａに示す配列番号４５は、ｐＵＣ１９（New England BioLabs, Beverly, MA）の平滑末端化したＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位内の挿入断片として存在する。第２のベクターｐＣｏｌｄＩＩ（図１１Ｂ）は、目的の遺伝子のコード領域が７番目のコドンの後に（コドン１〜７はＭｅｔＡｓｎＨｉｓＬｙｓＶａｌＨｉｓＭｅｔ（配列番号５０）である）、７番目のＭｅｔコドンに作製された唯一のＮｄｅＩ部位でクローン化されるベクターである。この余分の配列はシス翻訳増強エレメント（ＡＴＧＡＡＴＣＡＣＡＡＡＧＴＧＣＡＴＡＴＧ；配列番号９、ＮｄｅＩ部位に下線を付している）によってコードされ、これを用いてクローン化遺伝子発現がこの配列を有しないクローンより８倍高いことが示された（Etchegaray et al., 1999）。図１２Ｂに示す配列番号４６は、ｐＵＣ１９の平滑末端化したＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位内の挿入断片として存在する。第３のタイプｐＣｏｌｄＩＩＩ（図１１Ｃ）は、コード領域がＮｄｅＩ部位を使用して開始コドンに直接クローン化されるベクターである。このベクターにおいて、図１２Ｃに示す配列番号４７は、ｐＵＣ１９の平滑末端化したＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位内の挿入断片として存在する。
【００６４】
３つのベクターｐＣｏｌｄＩ、ｐＣｏｌｄＩＩおよびｐＣｏｌｄＩＩＩは、それら全てがｃｓｐＡプロモーター、ｃｓｐＡ  ５’−ＵＴＲ領域およびｃｓｐＡ  ３’末端転写ターミネーター部位を有するｐＵＣ１９のバックグラウンドを有する点で同一のベクターである。差異は、これに加えて、ｐＣｏｌｄＩはｃｓｐＡのコード領域を有し、ｐＣｏｌｄＩＩはＡＴリッチなＤＢ配列を有することにある。ｐＣｏｌｄＩ中にｃｓｐＡのコード領域を含めることにより、その固有の高効率翻訳開始特性が利用される。Ｎ末端のＣｓｐＡドメインの折り畳みが、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）融合タンパク質の場合に示されるように、クローン化遺伝子産物の折り畳みを補助する可能性もある。さらに、ｐＣｏｌｄＩは、このベクターから生産された産物をＮｉ−ＮＴＡカラムによって精製し、Ｎ末端フラグメントを第Ｘ因子での切断によって取り除くことができるように、ＮｄｅＩクローニング部位の上流に６Ｈｉｓタグおよびそれに続く第Ｘａ因子切断部位を有するように設計されている。
【００６５】
ｐＣｏｌｄＩＩベクターを使用する場合に、６個のアミノ酸残基ＭｅｔＡｓｎＨｉｓＬｙｓＶａｌＨｉｓ（配列番号５０の残基１〜６）が所定の遺伝子の開始コドンの前に付加されることに留意することが重要である。それゆえ、各々の場合についてこの余分のＮ末端伸長がクローン化遺伝子産物の構造および機能に影響を与えるかどうかを確認しなければならない。この余分の配列を利用してこの配列に対する抗血清を生じさせることができる。これを産物の同定のために、そして必要な場合、精製のために使用してもよい。
【００６６】
これらのベクターの全ては、目的の遺伝子のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、同じリーディングフレームでクローン化することができ、ｐＣｏｌｄベクターおよび従来のｐＥＴベクターの間で相互に交換可能であるように設計されている。目的の遺伝子が大腸菌の細胞増殖に毒性である場合、漏れの低レベルの遺伝子発現であっても、３７℃での増殖中に問題を引き起こすかもしれない。この理由のために、ｃｓｐＡ転写開始部位のすぐ下流にｌａｃＩオペレーター配列ＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＧＴＧ（配列番号１０）を有するｐＣｏｌｄＩ、ｐＣｏｌｄＩＩおよびｐＣｏｌｄＩＩＩを、クローン化遺伝子の発現が低温でＩＰＴＧの存在下のみで誘導され得るように構築する。これらのｐＣｏｌｄベクターはそれぞれｐＣｏｌｄＩｏ、ｐＣｏｌｄＩＩｏおよびｐＣｏｌｄＩＩＩｏと称する。
【００６７】
さらに、以下のように、より高いコールドショック発現に最良の可能なＳＤ配列、および開始コドン下流の配列（ダウンストリームボックス）の影響の決定を試みる：
【００６８】
（ｉ）ＳＤ配列
ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡ中に見出されるＳＤ配列（ＡＡＧＧ）は、１６Ｓ  ＲＮＡの３’末端との最高の相補性を有する可能なＳＤ配列と比較すると、最良のＳＤ配列ではない。これを、ｃｓｐＡ  ＳＤ領域をより長いコンセンサス配列に（例えば、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡ中にＡＧＧを挿入することによってＡＡＧＧＡＧＧＵに）変化させることによって改良し得る。ＳＤ配列を塩基ごとに点変異によって図１０Ａおよび１０Ｂに示すように変化させる。最後に最良のＳＤ配列をベクターのために決定する。
【００６９】
（ｉｉ）ｐＣｏｌｄＩＩＩ中のＡＵＧ下流の配列による翻訳増強効果
いわゆるダウンストリームボックス（ＤＢ）効果は、４番目のコドンから７番目のコドンの領域（１２塩基の配列）において付加したランダム配列の解析についての実験から判断したところ、実際、翻訳開始に対してその効果を発揮する。実施例１（図５）に示すように、ＬＡＣＥ効果を有意に増強するＤＢ配列は、基本的にＡＴリッチ配列からなる（Sprengartおよびその共同研究者らによって最初に提唱されたような１６Ｓ  ｒＲＮＡに対する相補的配列ではない）。興味深いことに、それ自体の開始コドンから直接発現させても非常に高レベルで発現されるγ−インターフェロンは（図４Ａおよび４Ｂ）、この領域に１２残基中９個のＡ／Ｔ残基を有する。ｐＣｏｌｄＩＩＩベクターを使用する場合、コドン４からコドン７の領域のＡＴ含量を、各コドンの第３の塩基がＧまたはＣであればそれをＡまたはＴに置き換えることによって増加させることができる。これは、コドン使用の縮重により、この領域のアミノ酸配列を変化させずに行うことができる。一旦遺伝子をｐＣｏｌｄＩＩＩ中にクローン化すれば、最初の７つのコドンにおける変化したＡＴ含量の効果が各クローンの遺伝子産物の発現にとってより良好であるか否かを検討する。
【実施例４】
【００７０】
宿主系の改良
上記コールドショックベクターを使用して発現しようとするタンパク質の最大収量を得るために、本発明者らは宿主系を改良して、低温での増殖条件を確立しようとする。宿主の改良についての重要な考慮は以下のとおりである；（ｉ）クローン化遺伝子のｍＲＮＡの安定化、（ｉｉ）コールドショック適応をブロックするための馴化期の延長、ならびに（ｉｉｉ）翻訳開始およびタンパク質合成を増強し得るコールドショックリボソーム因子（例えば、ＣｓｄＡ）の産生の増加。
【００７１】
（ｉ）宿主細胞としてｐｎｐ欠失細胞を使用する１５℃でのクローン化タンパク質発現の延長
コールドショックに際して大腸菌細胞の増殖は一過性に停止し、この馴化期の間に特異的コールドショックタンパク質が高度に誘導される。馴化期の終わりにそれらの合成は新たな基底レベルまで低下し、その間に非コールドショックタンパク質合成が回復し、細胞増殖が再開する。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ（ＰＮＰａｓｅ）はコールドショック誘導性エキソリボヌクレアーゼであり、ｍＲＮＡ分解に関与するＲＮＡデグラドソーム（RNA degradosome）の成分である。ＰＮＰａｓｅは、馴化期の終わりにＣｓｐ産生を抑制するために必要とされることが、本発明者らの研究室において示されている。ＰＮＰａｓｅは１５℃でのｃｓｐ  ｍＲＮＡの選択的分解に重要であることが見出された（Yamanaka et al., 2001）。ｐｎｐ変異体において、コールドショックに際してのＣｓｐの誘導は野生株と同様に正常に観察された；しかし、それらの産生はもはや自己調節されず、コールドショック処理を通して高レベルで維持された。これにより、２５℃より低い温度での細胞の増殖停止および劇的なコロニー形成能の低下が生じた。その結果、コールドショックに際して、細胞は２４時間後でも高レベルのＣｓｐを維持した。ポリ（Ａ）ポリメラーゼ変異体およびＣｓｄＡ  ＲＮＡヘリカーゼ変異体において、コールドショックに際してのＣｓｐ発現は有意に延長される。このことはＰＮＰａｓｅがポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびＣｓｄＡ  ＲＮＡヘリカーゼと協力してコールドショック適応において重大な役割を果たすことを示す。それゆえ、本発明者らのコールドショックベクターのために宿主としてｐｎｐ欠失株を使用することは、ずっと長い期間のクローン化遺伝子発現の維持を補助すると考えられる。そのような細胞はすでに本発明者らの研究室において利用可能である。ＰＮＰａｓｅの非存在下で、本発明のコールドショックベクターからのｃｓｐＡの発現が延長され、その結果、目的のタンパク質の発現が延長されることが予想される。ｐｎｐ欠失細胞を目的のタンパク質をコードする遺伝子に対応する挿入断片を含むコールドショックベクターを用いて形質転換し、細胞を３７℃でＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで増殖させ、次いで１５℃に移す。試料を０時間から１２０時間まで１２時間間隔で取り出して、タンパク質生産をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【００７２】
（ｉｉ）宿主細胞としてｒｂｆＡ欠失細胞を使用する１５℃でのクローン化タンパク質発現の延長
遺伝子ｒｂｆＡは、遊離３０Ｓリボソームサブユニットとは結合するが、７０Ｓリボソームサブユニットとは結合しない１５ｋＤａのタンパク質（ＲｂｆＡ）をコードする（Dammel et al., 1995）。この遺伝子は、最初、１６Ｓ  ｒＲＮＡの５’へリックス中に位置する優性低温感受性変異のマルチコピーサプレッサーとして単離された。ｒｂｆＡ欠失変異体は、ｐｎｐ欠失細胞と同様に、低温で増殖障害を示す（Dammel et al., 1995）。本発明者らの研究室は、ＲｂｆＡがコールドショックタンパク質であり、そしてｒｆｂＡ欠失株において低温での激しい増殖阻害にかかわらず、コールドショックタンパク質およびリボソームタンパク質が高度に誘導され、それらの発現がｐｎｐ欠失細胞と同様に構成的になることを示した（Dammel et al., 1995）。本発明者らの研究室は近年ＲｂｆＡが、低温での翻訳開始および３０Ｓリボソームサブユニットの成熟に関与する点で二重の機能を有することを示した。ｒｂｆＡの欠失の結果ＣｓｐＡのようなコールドショックタンパク質の構成的発現が生じるという事実を考慮すると、これらの細胞は１５℃でコールドショックベクターを使用するタンパク質の発現に理想的である。
【００７３】
ｐｎｐおよびｒｂｆＡ欠失株はすでに構築されており、これら２つの遺伝子の二重欠失変異体が、コールドショックベクターを使用するタンパク質の発現のために作製される。ＢＸ４１と称するｒｂｆＡ変異株を、破壊したｒｂｆＡ対立遺伝子を形質導入することによってＣＤ２８株から構築した。Dammel and Noller (1995)に開示されるＣＤ２８をその研究室から入手し、Ｐ１ファージを使用してＭＣ４１００に形質導入した。Ｋｕｓｈｎｅｒ博士の研究室の論文（Arraiano et al. (1988)）に開示されるｐｎｐ変異株をその研究室から入手した。
【００７４】
ｐｎｐ株のｒｂｆＡ株でのファージＰ１ｖｉｒ媒介形質導入（Miller, 1992）を使用して、二重欠失変異体を作製する。例えば、Ｐ１ファージを使用してｒｂｆＡ変異株溶解物を作製し、次いでｒｂｆＡ、ｐｎｐａｓｅ二重変異体を、ｒｂｆＡ溶解物およびｐｎｐａｓｅ（ｐｎｐ）変異株を使用するＰ１形質導入によって作製する。Ｐ１形質導入後の各コロニーのｒｂｆＡ  ＰＣＲ産物を確認して、それらがｒｂｆＡ変異体であることを確認する。これらの変異株のコンピテントセルを作製し、次いでコンピテントセル中にｐＩＮｒｂｆＡプラスミドを形質転換し、１５℃インキュベートし、低温感受性について確認して、二重変異を確認する。
【００７５】
（ｉｉｉ）クローン化遺伝子発現におけるＣｓｄＡの役割
大腸菌のポリ（Ａ）ポリメラーゼは、ファーウエスタン分析によって、ＲＮＡ、ＲＮａｓｅＥ、ならびにＲｈｌＥ、ＳｒｍＢおよびＣｓｄＡのＤＥＡＤ−ｂｏｘ  ＲＮＡヘリカーゼと相互作用することが報告された（Raynal et al., 1999）。これらの中でＣｓｄＡはコールドショック誘導性タンパク質であり、ＡＴＰ非存在下で２本鎖ＲＮＡを巻き戻す活性を有する（Jones et al., 1996）。ＲｂｆＡと同様に、ＣｓｄＡは低温での増殖に必須である（データは示さず）。ＣｓｄＡの機能は、低温で形成された安定な二次構造を巻き戻すことによってｍＲＮＡの翻訳効率を増加させるリボソームの機能に必須であると提唱されている（Jones et al., 1996）。
【００７６】
ｐｎｐおよびｒｂｆＡ欠失株と同様にコールドショック遺伝子発現が延長されているｃｓｄＡ欠失変異体を構築した。ｐＵＣ７Ｋｍ（Ｐｓｔ）由来のカナマイシン耐性遺伝子（１．３Ｋ  ＨｉｎｃＩＩフラグメント）を、ｃｓｄＡ遺伝子（あるいはｄｅａｄＤおよびｍｓｓＢ）のコード領域の中央にｐＫＸ１６４中のＥｃｏＲＶ部位において挿入し、ｐＫＮＪ９０２６を得た。次いで、破壊したｃｓｄＡ（ｃｓｄＡ：：Ｋａｎ）を含む直鎖化したｐＫＮＪ９０２６  ＤＮＡフラグメントをｒｅｃＤ変異体ＦＳ１５７６の染色体に導入した。カナマイシン耐性形質転換体を単離し、染色体上のｃｓｄＡの破壊をサザンハイブリダイゼーションによって確認した。ｃｓｄＡ：：Ｋａｎ変異を野生株ＭＣ４１００中に形質導入してＫＮＪ１３０を得た。しかし、ｐｎｐおよびｒｂｆＡ欠失の場合に予測されるようにはｃｓｄＡ欠失はクローン化遺伝子の発現を補助しないかもしれない。これは、ＣｓｄＡが非コールドショックタンパク質のｍＲＮＡの巻き戻しに必要とされるかもしれないからである。本発明者らのコールドショックベクター系は非コールドショックタンパク質に使用されるので、宿主系中のＣｓｄＡがクローン化遺伝子の発現の補助もするかもしれない。翻訳開始に必要とされるエレメントはｃｓｐＡに由来するので、ＣｓｄＡとは対照的に、ＲｂｆＡは、本発明者らのコールドショックベクターを用いるクローン化遺伝子発現には必要とされなさそうであることに留意のこと。
【００７７】
これらの考慮に基づいて、本発明者らのベクター中にクローン化されたいくつかの遺伝子の発現に対する、ｃｓｄＡ欠失のみならずＣｓｄＡ過剰発現の効果も検討する。ＣｓｄＡの過剰発現はこれらの遺伝子をｐＩＮＩＩＩベクター（Inouye, 1983）中にクローン化することによって実施され、細胞中にコールドショックベクターとともに同時形質転換する。ｐＩＮＩＩＩベクターを使用して、ＣｓｄＡをコールドショック前にＩＰＴＧを用いて誘導することができ、目的遺伝子の発現のコールドショック誘導に対するその効果を評価することができる。
【００７８】
（ｉｖ）増殖培地条件の標準化
本研究の目標は、目的のタンパク質を全細胞タンパク質合成の９０〜９５％のレベルで、総細胞タンパク質の６０〜７０％より高いタンパク質収率で合成することにある。従って、遠心分離による膜画分およびリボソーム画分のような不溶性物質の除去後の細胞溶解物を、さらに精製せずにＮＭＲ分光法に使用し得る。そのような場合、溶解していない全細胞懸濁物でさえもＮＭＲ分光法に適用し得る。それゆえ、培地をコールドショック後に交換することによって（例えば、１２Ｃ−グルコース／１４ＮＨ４Ｃｌベースの培地から１３Ｃ−グルコース／１５ＮＨ４Ｃｌベースの培地）、目的のタンパク質のみを同位体で標識し、精製プロセスを除くことができる。分子量２０ｋＤａのタンパク質を総細胞タンパク質の６０％のレベルで生産すると仮定すると（このタンパク質のみがコールドショックに際して新たに合成されることに留意のこと）、１リットル当たりのタンパク質の総収量は約１２０ｍｇであると予想される。このタンパク質が可溶性形態で生産され、細胞溶解物を培養物から４ｍｌ中に調製すると（超音波処理し、次いで超遠心分離して細胞片、膜画分およびリボソーム画分を除去）、目的のタンパク質の３０ｍｇ／ｍｌまたは１．５ｍＭの溶液を得ることができ、これをＮＭＲ分光法に直接使用することができる。ＮＭＲ分光法を１ｍｌ未満で行うことができるので、培養サイズを２５０ｍｌに減じることができ、高価な１３Ｃ−グルコースおよび１５Ｎ−ＮＨ４Ｃｌ（または（１５ＮＨ４）２ＳＯ４）の使用を４分の１に削減することができる。１５Ｎ、１３Ｃまたは両方で標識されたアミノ酸を単独でまたは組み合わせて使用することができる。さらに、細胞は提唱する条件下でコールドショックに際して増殖することができないので、全体の炭素利用は増殖中の細胞よりずっと少ないはずである。それゆえ、培地中のグルコース濃度を１３Ｃ−グルコースに通常使用する濃度（０．２％）より低くすることができる。これにより、高価な１３Ｃ−グルコースの消費がさらに節約される。
【００７９】
どれだけのグルコースがＬＡＣＥ効果による影響を受けた細胞のコールドショックインキュベーションの間に変換されるかを決定するために、コールドショック後のタンパク質生産に対するグルコース濃度（０．２％、０．１５％、０．１％、０．０５％および０．０２５％）の影響を試験する。実施例１記載の発現系を保持する細胞を試験する。コールドショック前に、細胞（１０ｍｌの培養物）を遠心分離によって採集し、Ｍ９培地で洗浄し、異なる濃度のグルコースを含有するＭ９培地１０ｍｌ中に再懸濁する。これらの培養物をコントロール培養物（遠心分離なし；合計６つの培養物）とともに１５℃でインキュベートし、タンパク質生産を２４時間ごとに５日間検討する。このようにして、タンパク質収量を低下させない培地中グルコースの最少必要量を決定する。グルコース濃度を決定した後、その条件を、可溶性タンパク質を高収率で生産する利用可能ないくつかのクローンに適用して、それらを１３Ｃおよび１５Ｎで標識する。細胞溶解物を使用するこれらのタンパク質に対するＮＭＲ分光法を実施し、コールドショックベクターの有効性を評価する。
【実施例５】
【００８０】
タンパク質精製なしのＮＭＲ分光法
ＮＭＲ分光分析［（１Ｈ−１５Ｎ）ＨＳＱＣ］をタンパク質精製なしの全細胞溶解物由来の上清を使用して実施した。本発明者らの研究室とＯｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｋｕｒａ博士との共同研究においてそのＮＭＲ溶液構造がすでに決定されているので（Nature 386:88-92, 1998）、この実験のために、大腸菌の浸透圧感知ヒスチジンキナーゼＥｎｖＺのＡＴＰ結合ドメイン（１６４残基）をモデル系として使用した。
【００８１】
Ｍ９最少培地中のｐＣｏｌｄ−ＥｎｖＺ（ＡＴＰ結合ドメインまたはフラグメントＢ）を保持する大腸菌ＢＬ２１の培養物５００ｍｌをＯＤ６００ｎｍが０．６になるまで増殖させた。細胞を遠心分離によって採集し、０．１％１５ＮＨ４Ｃｌおよび０．４％グルコースを含有する予冷したＭ９最少培地２５０ｍ中に再懸濁した。再懸濁した細胞を４８時間１５℃で増殖させた後、細胞を遠心分離によって回収し、凍結融解および超音波処理の繰り返しによって溶解した。細胞片および膜画分（ペレット）を超遠心分離によって分離した後、得られた上清をＮＭＲ分析に直接使用した。
【００８２】
図１４Ａは、クーマシーブリリアントブルーで染色した超遠心分離後に得られた上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図１４Ａ中のＥｎｖＺ  ＡＴＰ結合ドメインは総タンパク質試料のほぼ８０％に相当する。特に注目すべきことに、図１４Ａのゲルに見られるマイナーバンドの大部分は３７℃での細胞から持ち込まれたタンパク質のものであり、それゆえ１５Ｎで標識されていない。図１４Ｂは全細胞溶解物、ならびに超遠心分離後に得られたペレットおよび上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【００８３】
精製ＥｎｖＺ  ＡＴＰ結合ドメインのスペクトル（図１５Ｂ）に匹敵する明瞭な（１Ｈ−１５Ｎ）ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトルが、タンパク質精製手順なしの全細胞溶解物の上清から得られた（図１５Ａ）。コールドショックベクター系を使用して１５Ｎおよび／または１３Ｃでの単一膜タンパク質の排他的標識を達成するこのアプローチは、異種タンパク質および膜タンパク質のインサイチュでのタンパク質精製なしの構造決定を可能にする。
【００８４】
本発明を十分に記載したが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく過度の実験なしに、本発明が広範囲の等価なパラメーター、濃度及び条件内で実施可能であることを当業者は理解する。
【００８５】
本発明をその特定の実施態様に関して記載したが、さらなる改変が可能であることが理解される。本願は、添付の請求の範囲に記載のように、本発明が関連する技術分野内で公知であるかまたは通常の慣習内に入り、そして本明細書上記の本質的特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含めて、一般に本発明の原理に従う本発明のいずれもの変形、用途、または適用を包含することが意図される。
【００８６】
刊行論文または要旨、公開または対応米国または外国特許出願、発行米国または外国特許、あるいはいずれものその他の参考文献を含む本明細書中で引用する全ての参考文献は、引用文献中に示される全てのデータ、表、図、および本文を含めて、全体を出典明示で援用する。さらに、本明細書中に引用する参考文献内で引用される参考文献の内容全体も、全体を出典明示で援用する。
【００８７】
公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法または従来の方法に対する言及は、いかにしても、本発明のいずれかの局面、記載または実施態様が関連分野において開示、教示または示唆されることを認めるものではない。
【００８８】
特定の実施態様の上記記載は、当該分野の知見（本明細書において引用する参考文献の内容を含む）を適用することによって、その特定の実施態様を、過度の実験なしに、本発明の一般的な観念から逸脱することなしに、他者が種々の適用のために容易に改変およびまたは適応できるように十分に本発明の一般的な性質を示す。それゆえ、そのような適応および改変は、本明細書中に示す教示および手引きに基づいて、開示する実施態様の等価物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書中の用語は説明目的のためのものであり、限定を目的とするものではなく、その結果、本明細書中の用語は本明細書に示す教示および手引きを当業者の知見と組み合わせて考慮して当業者によって解釈されるべきであることを理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明により、異種ポリペプチドのコールドショック誘導性発現および生産のためのＤＮＡ分子、ベクター、宿主および方法が提供される。
参考文献
Bae, W., P. G. Jones, and M. Inouye. 1997. CspA, the major cold shock protein of Escherichia coli, negatively regulates its own gene expression. J Bacteriol 179:7081-8.
Bae, W., B. Xia, M. Inouye, and K. Severinov. 2000. Escherichia coli CspA-family RNA chaperones are transcription antiterminators. Proc Natl Acad Sci U S A 97:7784-9.
Brandi, A., R. Spurio, C. O. Gualerzi, and C. L. Pon. 1999. Massive presence of the Escherichia coli 'major cold-shock protein' CspA under non-stress conditions. Embo J 18:1653-9.
Dammel, C. S., and H. F. Noller. 1995. Suppression of a cold-sensitive mutation in 16S rRNA by overexpression of a novel ribosome-binding factor, RbfA. Genes Dev 9:626-37.
Etchegaray, J. P., and M. Inouye. 1999. CspA, CspB, and CspG, major cold shock proteins of Escherichia coli, are induced at low temperature under conditions that completely block protein synthesis. J Bacteriol 181:1827-30.
Etchegaray, J. P., and M. Inouye. 1999. A sequence downstream of the initiation codon is essential for cold shock induction of cspB of Escherichia coli. J Bacteriol 181:5852-4.
Etchegaray, J. P., and M. Inouye. 1999. Translational enhancement by an element downstream of the initiation codon in Escherichia coli. J Biol Chem 274:10079-85.
Etchegaray, J. P., P. G. Jones, and M. Inouye. 1996. Differential thermoregulation of two highly homologous cold-shock genes, cspA and cspB, of Escherichia coli. Genes Cells 1:171-8.
Fang, L., Y. Hou, and M. Inouye. 1998. Role of the cold-box region in the 5' untranslated region of the cspA mRNA in its transient expression at low temperature in Escherichia coli. J Bacteriol 180:90-5.
Fang, L., W. Jiang, W. Bae, and M. Inouye. 1997. Promoter-independent cold-shock induction of cspA and its derepression at 37 degrees C by mRNA stabilization. Mol Microbiol 23:355-64.
Gold, L. 1988. Posttranscriptional regulatory mechanisms in Escherichia coli. Annu Rev Biochem 57:199-233.
Goldenberg, D., I. Azar, A. B. Oppenheim, A. Brandi, C. L. Pon, and C. O. Gualerzi. 1997. Role of Escherichia coli cspA promoter sequences and adaptation of translational apparatus in the cold shock response. Mol Gen Genet 256:282-90.
Golshani, A., V. Kolev, M. G. AbouHaidar, and I. G. Ivanov. 2000. Epsilon as an initiator of translation of CAT mRNA in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 273:528-31.
Inouye, M. 1983. Multipurpose expression cloning vehicles in Escherichia coli. New York Academic Press, NY.
Jiang, W., L. Fang, and M. Inouye. 1996. Complete growth inhibition of Escherichia coli by ribosome trapping with truncated cspA mRNA at low temperature. Genes Cells 1:965-76.
Jiang, W., L. Fang, and M. Inouye. 1996. The role of the 5'-end untranslated region of the mRNA for CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, in cold-shock adaptation. J Bacteriol 178:4919-25.
Jiang, W., Y. Hou, and M. Inouye. 1997. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone. J Biol Chem 272:196-202.
Jones, P. G., M. Mitta, Y. Kim, W. Jiang, and M. Inouye. 1996. Cold shock induces a major ribosomal-associated protein that unwinds double-stranded RNA in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 93:76-80.
Jones, P. G., R. A. VanBogelen, and F. C. Neidhardt. 1987. Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli. J Bacteriol 169:2092-5.
Kumar, A., R. A. Malloch, N. Fujita, D. A. Smillie, A. Ishihama, and R. S. Hayward. 1993. The minus 35-recognition region of Escherichia coli sigma 70 is inessential for initiation of transcription at an "extended minus 10" promoter. J Mol Biol 232:406-18.
Kushner et al., Stabilization of discrete mRNA breakdown products in ams pnp rnb multiple mutants of Escherichia coli K-12, J. Bacteriol. 170:4625-4633 (1988)
Miller, J. H. 1992. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Mitta, M., L. Fang, and M. Inouye. 1997. Deletion analysis of cspA of Escherichia coli: requirement of the AT-rich UP element for cspA transcription and the downstream box in the coding region for its cold shock induction. Mol Microbiol 26:321-35.
Mujacic, M., K. W. Cooper, and F. Baneyx. 1999. Cold-inducible cloning vectors for low-temperature protein expression in Escherichia coli: application to the production of a toxic and proteolytically sensitive fusion protein. Gene 238:325-32.
O'Connor, M., T. Asai, C. L. Squires, and A. E. Dahlberg. 1999. Enhancement of translation by the downstream box does not involve base pairing of mRNA with the penultimate stem sequence of 16S rRNA. Proc Natl Acad Sci U S A 96:8973-8.
Olins, P. O., and S. H. Rangwala. 1989. A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J Biol Chem 264:16973-6.
Phadtare, S., J. Alsina, and M. Inouye. 1999. Cold-shock response and cold-shock proteins. Curr Opin Microbiol 2:175-80.
Phadtare, S., and Inouye, M. 2002. Cold Shock in "Encyclopedia of Environmental Microbiology". John Wiley & Sons, New York.
Phadtare, S., Yamanaka, K, and Inouye, M. 2000. The Cold Shock Response in The Bacterial Stress Responses. ASM Press, Washington DC.
Phadtare, S. U., M. Inouye, and K. Severinov. 2001. The nucleic acid melting activity of Escherichia coli CspE is critical for transcription antitermination and cold-acclimation of cells. J Biol Chem 276.
Raynal, L. C., and A. J. Carpousis. 1999. Poly(A) polymerase I of Escherichia coli: characterization of the catalytic domain, an RNA binding site and regions for the interaction with proteins involved in mRNA degradation. Mol Microbiol 32:765-75.
Sprengart, M. L., E. Fuchs, and A. G. Porter. 1996. The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli. Embo J 15:665-74.
Vasina, J. A., and F. Baneyx. 1997. Expression of aggregation-prone recombinant proteins at low temperatures: a comparative study of the Escherichia coli cspA and tac promoter systems. Protein Expr Purif 9:211-8.
Vasina, J. A., and F. Baneyx. 1996. Recombinant protein expression at low temperatures under the transcriptional control of the major Escherichia coli cold shock promoter cspA. Appl Environ Microbiol 62:1444-7.
Wang, N., K. Yamanaka, and M. Inouye. 1999. CspI, the ninth member of the CspA family of Escherichia coli, is induced upon cold shock. J Bacteriol 181:1603-9.
Xia, B., J. P. Etchegaray, and M. Inouye. 2001. Nonsense mutations in cspA cause ribosome trapping leading to complete growth inhibition and cell death at low temperature in Escherichia coli. J Biol Chem 276:35581-8.
Xia, B., H. Ke, and M. Inouye. 2001. Acquirement of cold sensitivity by quadruple deletion of the cspA family and its suppression by PNPase S1 domain in Escherichia coli. Mol Microbiol 40:179-88.
Xia, B., H. Ke, W. Jiang, and M. Inouye. 2001. The Cold Box stem-loop proximal to the 5'-end of the Escherichia coli cspA gene stabilizes its mRNA at low temperature. J Biol Chem.
Yamanaka, K., L. Fang, and M. Inouye. 1998. The CspA family in Escherichia coli: multiple gene duplication for stress adaptation. Mol Microbiol 27:247-55.
Yamanaka, K., and M. Inouye. 2001. Induction of CspA, an E. coli major cold-shock protein, upon nutritional upshift at 37 degrees C. Genes Cells 6:279-90.
Yamanaka, K., and M. Inouye. 2001. Selective mRNA degradation by polynucleotide phosphorylase in cold shock adaptation in Escherichia coli. J Bacteriol 183:2808-16.
Yamanaka, K., M. Mitta, and M. Inouye. 1999. Mutation analysis of the 5' untranslated region of the cold shock cspA mRNA of Escherichia coli. J Bacteriol 181:6284-91.
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】図１は、プロトタイプコールドショックベクターｐＣｏｌｄの構造の模式図を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、３７℃（図２Ａ）および１５℃（図２Ｂ）におけるＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質の発現を示すゲルである。図２Ａにおいて、各々の場合のＩＰＴＧ存在下（＋）および非存在下（−）でのタンパク質発現を示す。図２Ｂにおいて、各々の場合の０、１２および２４時間でのコールドショックベクターを使用した１５℃でのＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質の発現を示す。
【図３】図３は、コールドショックベクターを用いたＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質の生産の３つの時間プロフィールを示すゲルである。１５℃でのＷＲ４９、ＷＲ３５およびＷＲ２６の０、２４、４８、７２、９６および１２０時間の発現を示す。全細胞溶解物を分析した。ゲルをクーマシーブルー色素で染色した。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、コールドショックベクターを使用したγ−インターフェロンの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシー染色を図４Ａに示す。レーン１：ＩＰＴＧ前、１５℃；レーン２〜５：それぞれ１５℃での２４、４８、７２および９６時間の発現；レーン６：３７℃での発現。パルスラベルした細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図４Ｂに示す。レーン１：３７℃での発現；レーン２〜４：それぞれ１５℃での１、３および５時間の発現。
【図５】図５は、Ｎ１２−下流配列のＡ／Ｔ含量とβ−ガラクトシダーゼ活性との間の相関を示すグラフである。５７個のランダムに選択したクローンの各々について、Ａ＋Ｔの数を計数し、対応するβ−ガラクトシダーゼ活性に対してプロットした。
【図６】図６は、選択したクローンのタンパク質レベルとβ−ガラクトシダーゼ活性との関係のグラフを示す。それぞれのプラスミドを含有する細胞を３７℃でＯＤ６００ｎｍが０．５になるまで増殖させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。タンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、バンドの強度を濃度測定分析によって測定した。
【図７】図７は、選択したクローンのβ−ガラクトシダーゼ活性、タンパク質レベルおよびｌａｃＺ  ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフとゲルの組み合わせである。
【図８】図８は、最高および最低のβ−ガラクトシダーゼ活性を示すクローンのポリソームプロフィールにおけるｌａｃＺおよびｏｍｐＡ  ｍＲＮＡの分布のグラフおよびゲルである。それぞれのＮ１２配列（配列番号１４および配列番号２６）を示す。
【図９】図９は、ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡ  ５’−ＵＴＲの構造の模式図を示す。１０番目の塩基ごとに点を付している。アップストリームボックス（ＵＢ）を四角で囲み、ＳＤ配列を太字で示し、開始コドンに下線を付しており、ｃｓｐＡ  ＯＲＦを太字で示すとともに四角で囲んでいる。ｃｓｐＡ  ＯＲＦの上流の５’−ＵＴＲ配列は配列番号４８に対応し、ｃｓｐＡ  ＯＲＦ下流の３’−ＵＴＲ配列は配列番号４９に対応する。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、５’−ＵＴＲ  ｃｓｐＡ  ｍＲＮＡ中のＳＤ配列の上流のイプシロン様配列を示す。図１０Ａはイプシロン様配列の変異解析であり、ここで野生型配列をＷｔで示す（配列番号２８）。イプシロン配列を太字で示す。図１０ＢはＳＤ配列およびイプシロン配列とＡＵＧコドンとの間の距離の変異解析である。イプシロン様配列１〜１６はそれぞれ配列番号２９〜４４である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃは、ｐＣｏｌｄＩ、ＩＩおよびＩＩＩベクターの構造の模式図を示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ＫｌｅｎｏｗでフィルインしたｐＵＣ１９ベクターに挿入したヌクレオチド配列、配列番号４５（図１２Ａ）、配列番号４６（図１２Ｂ）および配列番号４７（図１２Ｃ）を示す。
【図１３】図１３は、ｃｓｐＡ、ｃｓｐＢ、ｃｓｐＧおよびｓｃｐＩのプロモーター、５’−ＵＴＲおよび最初の１３コドンのヌクレオチドの配列アラインメントである。ｃｓｐＩと同一のヌクレオチドを点で示す。アラインメントを最大化するために、いくつかのギャップを導入し、これらをダッシュによって示す。転写開始部位を太字で記し、＋１で示す。転写開始コドンＡＴＧも太字で記し、下線を付している。最も相同な配列（ＵＰエレメント、−３５領域、−１０領域、コールドボックス、上流配列、シャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列およびダウンストリームボックス）を四角で囲み示している。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、超遠心分離後の上清（４８時間コールドショックでインキュベートした、ｐＣｏｌｄＩ−ＥｎｖＺ  ＡＴＰ結合ドメインを保持する大腸菌ＢＬ２１の培養物５００ｍｌ）のクーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１４Ａ）ならびに大腸菌ＢＬ２１のコールドショック後の全細胞溶解物、ペレットおよび上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（図１４Ｂ）を示す。ＥｎｖＺ  ＡＴＰ結合ドメインはフラグメントＢとしても知られている。図１４Ｂにおいて、レーン１：コールドショック１２時間後にかけた全細胞溶解物５０μｌ；レーン２：コールドショック２４時間後にかけた全細胞溶解物５０μｌ；レーン３：コールドショック３６時間後にかけた全細胞溶解物５０μｌ；レーン４：コールドショック４８時間後にかけた全細胞溶解物５０μｌ；レーン５：２回目の超音波処理の間の１５０００ｒｐｍ、３０分の遠心分離後にかけたペレット（総量１ｍｌ）２μｌ；レーン６：２回目の超音波処理の間の４５０００ｒｐｍ、４時間の超遠心分離後にかけたペレット（総量１ｍｌ）２μｌ；レーン７：２回目の超音波処理の間の４５０００ｒｐｍ、４時間の超遠心分離後にかけた上清１μｌ；レーン８：１回目の超音波処理の間の４５０００ｒｐｍ、４時間の超遠心分離後にかけた上清（ＮＭＲ用試料）１μｌ；
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、精製していないＥｎｖＺ  ＡＴＰ結合ドメインを含有する細胞溶解物上清の（１Ｈ−１５Ｎ）ＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトル（図１５Ａ）および精製ＥｎｖＺ  ＡＴＰ結合ドメインのＨＳＱＣ  ＮＭＲスペクトル（図１５Ｂ）を示す。
【配列表】
2005518804.tif 000003
2005518804.tif 000004
2005518804.tif 000005
2005518804.tif 000006
2005518804.tif 000007
2005518804.tif 000008
2005518804.tif 000009
2005518804.tif 000010
2005518804.tif 000011
2005518804.tif 000012
2005518804.tif 000013
2005518804.tif 000014
2005518804.tif 000015
2005518804.tif 000016
【図１】
2005518804.tif 000017
【図２Ａ】
2005518804.tif 000018
【図２Ｂ】
2005518804.tif 000019
【図３】
2005518804.tif 000020
【図４Ａ】
2005518804.tif 000021
【図４Ｂ】
2005518804.tif 000022
【図５】
2005518804.tif 000023
【図６】
2005518804.tif 000024
【図７】
2005518804.tif 000025
【図８】
2005518804.tif 000026
【図９】
2005518804.tif 000027
【図１０Ａ】
2005518804.tif 000028
【図１０Ｂ】
2005518804.tif 000029
【図１１】
2005518804.tif 000030
【図１２Ａ】
2005518804.tif 000031
【図１２Ｂ】
2005518804.tif 000032
【図１２Ｃ】
2005518804.tif 000033
【図１３】
2005518804.tif 000034
【図１４】
2005518804.tif 000035
【図１５Ａ】
2005518804.tif 000036
【図１５Ｂ】
2005518804.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月1日(2004.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005518804000001.app
【国際調査報告】
2005518804.tif 000038
2005518804.tif 000039