(57)【要約】免疫系分子、特にヒト化された抗体およびその断片を作る方法が開示されている。典型的な方法は、個々の抗体フレームワーク領域間の類似性を最適化して、この分子を作るのに適したヒトフレームワーク領域を同定するのに役立つ。より大きい抗体フレームワーク間、超可変ドメイン間または両者間の比較が避けられる。この方法によりヒト化された抗体も開示されている。本発明は、好適な抗原親和性を有すると共に、ヒト免疫原性が最小限に抑えられたヒト化されたモノクローナル抗体の製造における用途を始めとする、広範囲の用途を有している。
2005537009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化された抗体可変（Ｖ）ドメインまたはその断片を製造する方法において、
ａ）非ヒト抗体可変（Ｖ）ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を、ヒト抗体フレームワークアミノ酸配列またはその断片のコレクションと比較し、
ｂ）非ヒトＦＲに対して最大のアミノ酸配列同一性を有するコレクションからヒトＦＲ配列を選択し、
ｃ）非ヒトＦＲのＤＮＡを突然変異させて、工程ｂ）からの選択されたヒトＦＲと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するヒト化されたＦＲ（ｈｕＦＲ）をコードせしめるようにし、
ｄ）非ヒトＶドメインにおけるＦＲのそれぞれについて、工程ａ）〜ｃ）を繰り返して、各ＤＮＡ配列がヒト化されたＦＲをコードする複数のＤＮＡ配列を作り、
ｅ）工程ｄ）からのｈｕＦＲＤＮＡ配列のそれぞれを、上記の少なくとも非ヒト抗体のＶドメインをコードしている第１のベクター内へ導入して、そのベクターでコードされた対応する非ヒトＦＲを置換し、その置換によって、各ｈｕＦＲをその対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）と作動的に結合せしめ、次いで
ｆ）宿主細胞内で、ヒト化された抗体Ｖドメインまたはその断片を作る条件下にて、その第１のベクターを発現させることを包含する方法。
【請求項２】
Ｖドメインまたは断片が、非ヒト抗体Ｌ（軽）鎖からのものである請求項１の方法。
【請求項３】
工程ａ）のＬ鎖Ｖドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）がＦＲ１である請求項２の方法。
【請求項４】
非ヒト抗体Ｌ鎖のＦＲ１と選択されたヒトＦＲとの間の配列同一性が、少なくとも約７０％である請求項３の方法。
【請求項５】
工程ｄ）が、更に、非ヒト抗体Ｌ鎖Ｖドメインの第２のフレームワーク領域（ＦＲ２）を上記コレクションと比較し、少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒトＦＲを選択することを含む請求項４の方法。
【請求項６】
工程ｄ）が、更に、非ヒト抗体Ｌ鎖Ｖドメインの第３のフレームワーク領域（ＦＲ３）を上記コレクションと比較し、少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒトＦＲを選択することを含む請求項５の方法。
【請求項７】
工程ｄ）が、更に、非ヒト抗体Ｌ鎖Ｖドメインの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）を上記コレクションと比較し、少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒトＦＲを選択することを含む請求項６の方法。
【請求項８】
ヒト化されたＬ鎖Ｖドメインが、配列において共有結合で結合されたもの：ｈｕＦＲ１−ＣＤＲ１−ｈｕＦＲ２−ＣＤＲ２−ｈｕＦＲ３−ＣＤＲ３−ｈｕＦＲ４，またはその断片を含有するものである請求項７の方法。
【請求項９】
各ＦＲにおけるバーニアゾーンアミノ酸残基は、抗体Ｌ鎖Ｖドメインの非ヒトおよびヒトＦＲにおいて同一である請求項２〜８の方法。
【請求項１０】
第１のベクターが、更に、ヒト化されたＬ鎖Ｖドメインに共有結合で結合したヒトＬ鎖定常ドメインまたはその断片を含む請求項２の方法。
【請求項１１】
ヒトＬ鎖定常ドメインがＣκ、Ｃγまたはその断片である請求項１０の方法。
〔請求項１１a〕ヒト化されたＬ鎖断片が、アミノ酸数で約９５から約２３５個までの間のアミノ酸長さを有する請求項１１の方法。
【請求項１２】
Ｖドメインまたは断片が、非ヒト抗体重鎖に由来する請求項１の方法。
【請求項１３】
工程ａ）の重鎖Ｖドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）がＦＲ１である請求項１２の方法。
【請求項１４】
ＦＲ１と選択されたヒトフレームワーク領域ＦＲとの間の配列同一性が、少なくとも約７０％である請求項１３の方法。
【請求項１５】
工程ｄ）が、更に、非ヒト重鎖Ｖドメインの第２のフレームワーク領域（ＦＲ２）を上記コレクションと比較し、少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒトＦＲを選択することを含む請求項１４の方法。
【請求項１６】
工程ｄ）が、更に、非ヒト重鎖Ｖドメインの第３のフレームワーク領域（ＦＲ３）を上記コレクションと比較し、少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒトＦＲを選択することを含む請求項１５の方法。
【請求項１７】
工程ｄ）が、更に、非ヒト重鎖Ｖドメインの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）を上記コレクションと比較し、少なくとも約７０％の配列同一性を有するヒトＦＲを選択することを含む請求項１６の方法。
【請求項１８】
ヒト化されたＬ鎖Ｖドメインが、配列において共有結合で結合されたもの：ｈｕＦＲ１−ＣＤＲ１−ｈｕＦＲ２−ＣＤＲ２−ｈｕＦＲ３−ＣＤＲ３−ｈｕＦＲ４，またはその断片を含有する請求項１７の方法。
【請求項１９】
各ＦＲにおけるバーニアゾーンアミノ酸残基は、抗体重鎖Ｖドメインの非ヒトおよびヒトＦＲにおいて同一である請求項１２〜１８の方法。
【請求項２０】
第１のベクターが、更に、ヒト化された重鎖Ｖドメインに共有結合で結合したヒト重鎖定常ドメインまたはその断片を含む請求項１２の方法。
【請求項２１】
ヒト重鎖定常ドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの１つである請求項２０の方法。
【請求項２２】
ヒトアミノ酸配列のコレクションが、完全に配列が明確にされたヒト抗体を含有する請求項１の方法。
【請求項２３】
コレクションが、更に、部分的に配列が明確にされたヒト抗体のアミノ酸配列を含む請求項２２の方法。
【請求項２４】
ヒト化された重鎖断片が、アミノ酸数で約９５から約５４０個までの間のアミノ酸長さを有する請求項２０の方法。
【請求項２５】
ａ）非ヒト抗体Ｌ鎖可変（Ｖ）ドメインのフレームワーク（ｌ−ＦＲ）のアミノ酸配列をヒト抗体Ｌ鎖アミノ酸配列またはその断片のコレクションと比較し、
ｂ）ｌ−ＦＲに対して最大のアミノ酸配列同一性を有するコレクションからヒトＦＲ配列を選択し、
ｃ）ｌ−ＦＲのＤＮＡを突然変異させて、工程ｂ）からの選択されたヒトＦＲと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するＬ鎖ヒト化ＦＲ（Ｌ−ｈｕＦＲ）をコードせしめ、
ｄ）Ｌ鎖ＶドメインにおけるＦＲのそれぞれについて、工程ａ）〜ｃ）を繰り返して、各ＤＮＡ配列がＬ−ｈｕＦＲをコードする複数のＤＮＡ配列を作り、
ｅ）工程ｄ）からのｈｕＦＲＤＮＡ配列のそれぞれを、少なくとも非ヒト抗体のＬ鎖Ｖドメインをコードしている第１のベクター内へ導入して、そのベクターでコードされた対応する１−ＦＲを置換し、その置換によって、各Ｌ−ｈｕＦＲをその対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）と作動的に結合せしめ、
ｆ）非ヒト抗体重鎖可変（Ｖ）ドメインのフレームワーク（ｈ−ＦＲ）のアミノ酸配列をヒト抗体重鎖アミノ酸配列またはその断片のコレクションと比較し、
ｇ）ｈ−ＦＲに対して最大のアミノ酸配列同一性を有するコレクションからヒトＦＲ配列を選択し、
ｈ）ｈ−ＦＲのＤＮＡを突然変異させて、工程ｇ）からの選択されたヒトＦＲと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するヒト化された重鎖ＦＲ（Ｈ−ｈｕＦＲ）をコードせしめるようにし、
ｉ）非ヒト重鎖Ｖ領域におけるｈ−ＦＲのそれぞれについて、工程ｆ）〜ｈ）を繰り返して、各ＤＮＡ配列がＨ−ｈｕＦＲをコードする複数のＤＮＡ配列を作り、
ｊ）工程ｉ）からのＨ−ｈｕＦＲＤＮＡ配列のそれぞれを、少なくとも非ヒト抗体の重鎖Ｖドメインをコードしている第２のベクター内へ導入して、そのベクターでコードされた対応するｈ−ＦＲを置換し、その置換によって、各Ｈ−ｈｕＦＲをその対応する重鎖ＣＤＲと作動的に結合せしめ、
ｋ）同一宿主細胞内で、ヒト化されたＬ鎖および重鎖を製造し、ヒト化された抗体またはその断片を作る条件下にて、第１および第２のベクターを発現させることからなるヒト化された抗体またはその断片を作る方法。
【請求項２６】
ヒト化されたＬ鎖および重鎖またはそれらの断片をコードするＤＮＡが単一のベクター上に含まれており、同一宿主内で共に発現される請求項２５の方法。
【請求項２７】
宿主が哺乳類、植物、鳥類または微生物である請求項２５および２６の方法。
【請求項２８】
第１のベクターが、更に、ヒト化されたＬ鎖Ｖドメインに共有結合で結合したヒトＬ鎖定常ドメインまたはその断片を含む請求項２５の方法。
【請求項２９】
Ｌ鎖定常ドメインがＣκ、Ｃγまたはその断片である請求項２８の方法。
【請求項３０】
第２のベクターが、更に、ヒト化された重鎖Ｖドメインに共有結合で結合したヒト重鎖定常ドメインまたはその断片を含む請求項２５の方法。
【請求項３１】
ヒト重鎖定常ドメインが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの１つである請求項３０の方法。
【請求項３２】
更に、ヒト化された抗体を宿主細胞から精製して、その抗体の実質的に純粋な製剤を製造することを含む請求項２５または２６の方法。
【請求項３３】
実質的に精製されたヒト化抗体が、元の非ヒト抗体の約１０倍を下らない親和力で、特異的に抗原と結合する請求項３２の方法。
【請求項３４】
元の非ヒト抗体がキメラである請求項３３の方法。
【請求項３５】
抗体がリポタイコ酸（lipotechoic acid）を特異的に認識し、結合する請求項３２の方法。
【請求項３６】
抗体がヒト組織因子を特異的に認識し、結合する請求項３２の方法。
【請求項３７】
ヒト化された抗体を治療薬として使用し、ヒトまたは動物の病気を治療する請求項３２の方法。
【請求項３８】
ヒト化された抗体を診断薬として使用する請求項３２の方法。
【請求項３９】
更に、ヒト化されたＶドメインからヒト化された単鎖抗体（ｓｃ−Ｆｖ）を作ることを含む請求項２５の方法。
【請求項４０】
ヒト化された抗体の断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’またはＦａｂの１つである請求項２５、２６または３２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト化された免疫系分子を作る方法を特徴とするものである。一形態において、本発明は、より大きいフレームワークまたは可変ドメインよりもむしろ個々の抗体フレームワーク領域間の配列同一性を最適化することを含む抗体のヒト化方法を提供する。本発明は、適当な結合親和性を有すると共に、ヒト免疫原性が最小限に抑えられたヒト化されたモノクローナル抗体の産生での用途を始めとする、広範囲の用途を有している。
【背景技術】
【０００２】
抗体は重要な用途を有しているという一般的な認識がある。例えば、多くのものが、強い特異性を有する抗原を検出することが知られている。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体がこれまで報告されている。一般に、Molecular Biology of the Cell (B. Alberts et al. Eds. 2nd edition)(1989) Garland Publishing, Inc., New York およびそこに引用された参考文献参照。
【０００３】
抗体の構造および機能を理解することに対して大きな関心が寄せられている。例えば、可変（Ｖ）ドメインの構造および機能について、多くのことが知られている。ほとんどすべての抗体（Ｖ）ドメインは、超可変相補性決定領域（“ＣＤＲ”）およびフレームワーク領域（“ＦＲ”）を含んでいる。ほとんどの抗体分子について、単一のＣＤＲが、介在するＦＲにより他のＣＤＲから分離されている。ＦＲは、抗原認識および結合のための適当な配置に、ＣＤＲループを置くのを助ける分子骨格として役立つことが認識されている。一般に、B. Alberts et al.上記、およびそこに引用された参考文献参照。
【０００４】
多くの研究者は、単一抗体Ｌ鎖可変ドメイン（ＶＬ）または重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からそっくりそのまま複数のＦＲを説明するものとして“フレームワーク”なる用語を用いている。従って、１つの抗体Ｖドメインは、各サブセットがその対応するＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）に結合している個々のネットワーク領域サブセット（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含んでいる。フレームワークは、単一の抗体から、そっくりそのままネットワーク領域サブセットで構成されている。
【０００５】
少なくともいくつかの抗体については、ＦＲ内のアミノ酸残基が抗原結合に寄与するものと考えられる。J. FooteおよびG. Winter, J. Mol. Biol. 244, 487 (1992)参照。
【０００６】
モノクローナル抗体を治療薬として使用しようとする試みが行われてきた。しかし、そのアプローチには、少なくともある種の抗体について問題がある。例えば、非ヒト源に由来する抗体に曝すことに伴う望ましくない免疫副作用が生ずる被験者もあることが報告されてきた。これらの副作用は、重大な健康問題を起こす恐れのあるものであり、生命にかかわるかもしれないことがある。
【０００７】
抗体を、被験者に免疫学的により受け入れられるようにしようとする試みが行われてきた。ヒトモノクローナル抗体についてのいくつかの報告があるが、このような分子は、作り難く、使い難いことが、一般に認められている。
【０００８】
抗体を、ヒトにより受け入れられるようにする別の方策は、ヒト抗体をコードする遺伝子を、非ヒト動物（例えば、マウス）に導入することであった。このような“遺伝子導入”動物は、ヒトの配列を持った抗体を作ると報告されてきた。しかし、このような動物を作ることは、困難で時間がかかることが多い。また、これらの遺伝子導入マウスは、独自に開発されたものであって、ヒト抗体遺伝子レパートリーは、決して最適とは言えない。
【０００９】
免疫学的に受け入れられる抗体を作る他のアプローチは、組換えＤＮＡ技術を使用することであった。１つのコンセプトは、得られた分子がヒト抗体に類似するように、非ヒト抗体をクローン化し、改変することであった。このような抗体は、“ヒト化されたもの（humanized）”と総称されている。Studnicka et al.に付与されている米国特許番号第５,７６６,８８６号、Queen et al. に付与されている第５,６９３,７６２号、Waldeman et al. に付与されている第５,９８５,２７９号、Winterに付与されている第５,２２５,５３９号、Pedersen et al. に付与されている第５,６３９,６４１号およびそれらに引用された参考文献参照。
【００１０】
抗体をヒト化するために、いくつかの具体的なアプローチが提案された。
１つの方策は、キメラ抗体分子として記載されているものを作ることを含む。一般的には、抗原を使用して、マウスなどの非ヒト動物を免疫する。次いで、従来技術を用いて、この動物からモノクローナル抗体を作る。従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アンプリフィケイションを用いて、モノクローナル抗体をコードする遺伝子を発生させる。マウス抗体可変ドメインをコードする分離された配列が、標準組換えＤＮＡ技術により、ヒト抗体の定常ドメインをコードする配列に遺伝子融合される。この方策は、ヒト−マウスキメラ抗体を作るのに使用されている。例えば、S. L. MorrisonおよびV. Oi, Adv. Immunol. 44, 65 (1989)参照。
【００１１】
残念ながら、キメラ抗体を作り使用する際に発生する問題についてのいくつかの報告があった。具体的には、被験者に抗体を投与した後の受け入れられない免疫反応についての記載があった。循環半減期の低下も、少なくともいくつかのキメラ抗体で問題であると考えられる。例えば、Boulianne et al., Nature 312, 643 (1984)、 Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495 (1990)およびBruggemann et al., J. Exp. Med. 170, 2153 (1989)参照。
【００１２】
ヒト化された抗体を作るまた別の方策が報告された。
１つのアプローチは、“ＣＤＲ接合（CDR grafting）”（“フレームワーク接合(framework grafting)”または“抗体再形成（antibody reshaping）”とも呼ばれることがある）として記載された。ＣＤＲ接合は、マウスＣＤＲをヒトＶドメインへ挿入することを含むと教示されている。次いで、このマウスＣＤＲを、対応するヒトＣＤＲで置換する。E. Padlan, Mol. Immunol. 28, 489 (1991)参照。通常、Ｖドメイン中のすべてのＦＲは、単一のヒト抗体から誘導される。当該分野のある人は、フレームワークのヒトＦＲが、マウスＣＤＲを正確に配置して、抗原と結合するであろうと予測した。このような抗体は、ヒト免疫系による認識を回避するであろうと期待された。例えば、Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)、Junghans et al.,上記、参照。
【００１３】
しかし、多くのＣＤＲ接合技術を使用するという問題があった。
例えば、いくつかの“接合された（grafted）”抗体は、受け入れられない抗原結合性を有している。Gorman et al., PNAS (USA) 88, 4181 (1991)参照。抗原結合を改善しようとする試みは、通常、ＣＤＲ接合Ｖドメインへマウス残基を戻し加えることによるが、必ずしも成功していなかった。Queen et al., PNAS (USA) 86, 10029 (1989)およびCo et al., PNAS (USA) 88, 2869 (1991)参照。
【００１４】
更に、“抗体再表面形成（antibody resurfacing）”として記載されているものを用いて、ヒト化された抗体を産生することが試みられた。１つのアプローチは、同種抗体の露出されたアミノ酸残基を、宿主抗体中に通常見られるもので置換することであった。できるだけ多くの抗原結合機能を維持しながら、抗体の免疫原性を低下させることが期待された。Roguska et al., PNAS (USA) 91, 969 (1994)参照。
【００１５】
残念ながら、多くの従来抗体再形成技術を使用するという問題があった。
例えば、多くの再形成抗体は、受け入れられない抗原結合性を示すと思われる。E. Padlan, Mol. Immunol. 28, 489 (1991)参照。更に、大部分の再形成技術は、再形成される抗体の構造についての詳細な知識を必要とする。溶剤の利用し易さおよび関連パラメーターについての実質的な情報が必要であることが多い。しかし、ヒト化される必要のある抗体について、このような情報は、必ずしも入手可能ではない。
【００１６】
大部分の抗体ヒト化技術に共通の大きな欠点は、ヒト化されるべき目的の抗体について、接合または再形成操作のために相対的に大きなフレームワークまたはＶドメインが選択されるということである。このような大きい抗体セグメントを、非ヒト抗体を操作するための基礎原料として使用するという考え方は、例えば、抗原結合親和性を低下させ、受け入れられない免疫原性を保持するというような、望ましくない結果を生んだ。これらの欠陥に対処するために、親和性を回復しようとする更なる努力がなされている。これらの努力は、概して、親和性を高めるのに十分な非ヒトアミノ酸残基を加えることと、一方で免疫原性も増加してしまうほど多くを加えないこととの間の折衷案に終わっている。
【００１７】
更に詳しくは、従来のヒト化技術の多くは、受け入れ難いほど大きい抗体フレームワーク、更に悪くは、Ｖドメイン全体を使用して抗体をヒト化する操作を含むものと考えられる。１つのアプローチによれば、大きい非ヒトフレームワークまたはＶドメインをクエリー（query）として使用して、このクエリーに対して受け入れ可能な配列同一性を有する一組のヒトフレームワークを同定する。同定されたヒトフレームワークは、もし使用された検索パラメーターに関して、クエリー非ヒト配列に対し最も大きい配列同一性を示せば、“最良適合（best fit）”であると言われることが多い。
【００１８】
相対的に大きいフレームワークまたはＶドメインとの比較に基づいて最良適合ヒトフレームワークを選択する過去の手法は、多くのヒト化された免疫系分子を作り使用しようとする試みを妨げてきたと考えられる。例えば、従来の抗体ヒト化方法を用いた場合、多くの潜在的な“最良適合”物を見逃していたと考えられる。即ち、“最良適合”物のプールをフレームワークまたはＶドメインに限定することにより、多くの抗体をヒト化する能力に障害が生じた。
【００１９】
更に、ヒト化された抗体を作る多くの従来法は、完全抗体配列を用いて“最良適合”物を検索していた。しかし、この方策は、重大な欠点をもたらす。
例えば、このような検索アプローチは、不完全に配列決定されたヒト抗体からのＦＲ配列を含むことはできない。この欠点は、ヒト抗体配列情報のより完全なコレクションを利用することを困難にしていた。
【００２０】
ヒト化された抗体を作る従来法は、他の欠陥を有すると考えられる。
例えば、多くのヒト化された抗体は、最適な抗原結合親和性を示さないと、当該分野では認識されている。ヒトＦＲに隣接する非ヒトＣＤＲのアミノ酸とそのＦＲの主要位置におけるアミノ酸残基（バーニアゾーン（vernier zone）残基と呼ばれる）との間の立体障害（干渉と呼ばれることもある）が、この問題の原因となっていると考えられる。従来のヒト化方法は、多くの潜在的な“最良適合”ヒトＦＲ配列を見逃していたと考えられるため、これらおよび関連する干渉問題に対処する能力が制限されていた。
【特許文献１】米国特許番号第５,７６６,８８６号
【特許文献２】米国特許番号第５,６９３,７６２号
【特許文献３】米国特許番号第５,９８５,２７９号
【特許文献４】米国特許番号第５,２２５,５３９号
【特許文献５】米国特許番号第５,６３９,６４１号
【非特許文献１】Molecular Biology of the Cell (B. Alberts et al. Eds. 2nd edition)(1989) Garland Publishing, Inc., New York
【非特許文献２】J. FooteおよびG. Winter, J. Mol. Biol. 244, 487 (1992)
【非特許文献３】S. L. MorrisonおよびV. Oi, Adv. Immunol. 44, 65 (1989)
【非特許文献４】Boulianne et al., Nature 312, 643 (1984)
【非特許文献５】Junghans et al., Cancer Res. 50, 1495 (1990)
【非特許文献６】Bruggemann et al., J. Exp. Med. 170, 2153 (1989)
【非特許文献７】E. Padlan, Mol. Immunol. 28, 489 (1991)
【非特許文献８】Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)
【非特許文献９】Gorman et al., PNAS (USA) 88, 4181 (1991）
【非特許文献１０】Queen et al., PNAS (USA) 86, 10029 (1989)
【非特許文献１１】Co et al., PNAS (USA) 88, 2869 (1991)
【非特許文献１２】Roguska et al., PNAS (USA) 91, 969 (1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
免疫系分子をヒト化するより有効な方法を有することは有用であろう。更に具体的には、適当な結合親和性を有し、ヒト免疫原性が最小限に抑えられたヒト化された免疫系分子を作るための基礎原料としての個々のフレームワークサブセット間の配列類似性を最適化することを含む、免疫系分子をヒト化する方法を有することは有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、免疫系分子をヒト化する有効で有用な方法を特徴とするものである。一形態において、本発明は、個々のフレームワーク領域サブセット（ＦＲ）間の配列同一性を最適化する、ヒト化された抗体およびその断片を作る方法を提供する。より大きい抗体フレームワークおよび／または可変ドメイン間の比較を避け、選択された“最良適合”ヒトＦＲを用いて、ヒト化された免疫系分子を作る。本発明は、適当な抗原親和性を有し、ヒト免疫原性が最小限に抑えられた免疫グロブリンを作る際の用途を始めとする、広範囲の重要な用途を有している。
【００２３】
我々は、広範囲の免疫系分子、例えば、抗体およびその抗原結合断片を“ヒト化する”新規な方法を発見した。この方法は、少なくとも１つの非ヒトＦＲと少なくとも１つの対応するヒトＦＲとの間の配列類似性を最適化することを一般に含んでいる。配列類似性は、一般的には、非ヒトＦＲの１、２または３つについて、より好ましくは、４つのＦＲすべて（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）について、最適化される。このような配列類似性は、一度に１つのＦＲ（例えば、ＦＲ１とＦＲ２のような連続したＦＲ）を考慮するか、あるいは目的とする用途に適するよう必要に応じて、一度に２つ以上（例えば、４つのＦＲすべてを合わせて）を考慮することにより、最適化されることができる。対応する非ヒトＦＲサブセットに対して最も高い配列類似性を有している１つ以上の同定されたヒトＦＲサブセットが、更なる操作のために選択される。選択されたヒトＦＲサブセットは、それが比較された非ヒトＦＲサブセットに関して、“最良適合”であると言われることが多い。本発明の方法は、更に、少なくとも１つの“最良適合” ヒトＦＲサブセットで、少なくとも１つの対応する非ヒトＦＲサブセットを置換することを含む。かくして、本発明の好ましい使用は、個々のヒトおよび非ヒトＦＲサブセットの少なくとも１つ、好ましくはすべての間の配列相似性を最大限にすることを意図する。フレームワークサブセット（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を合わせて）および可変ドメイン全体のレベルで配列類似性を最適化することは回避される。その後、選択された最良適合ヒトＦＲサブセットは、ここに述べるヒト化された免疫系分子を作るための成分として使用される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、多くの重要な効果を提供する。
例えば、従来の方法は、フレームワークサブセット全体または抗体可変ドメイン間の類似性に基づいて、最良適合ヒトフレームワーク（即ち、ＦＲ１−４）を検出することが多かった。このアプローチでは、例えば、ＦＲ選択感度の欠如をもたらすことによって、ヒト化された免疫グロブリンを作り使用しようとする努力が妨げられていたと考えられる。しかも、個々のヒトＦＲ間の多くの最良適合物が見逃されていた。
【００２５】
更に具体的には、従来のヒト化方法は、最良適合可能性の数を厳しく制限していたと考えられる。これに対して、本発明の方法は、それほど制約されない。即ち、本発明の最適の使用では、個々のＦＲサブセットのレベルで配列類似性を同定し、最大にすることが含まれる。更に大きいフレームワークセットおよび／または抗体可変ドメイン間の、より感度の低い配列比較は、特異的に回避される。本発明により提供されるこれらおよび関連する効果は、一般的に、ヒト化されるべき免疫系分子上のＦＲサブセットの数の算術的階乗により、最良適合可能性の数を増加させる。本発明のこの特徴は、ヒト化された分子を作り使用する機会を高め、ヒト化方法に関連するコストを下げるのに役立ち、ほとんど任意の問題とするヒト化された免疫系分子を作るための合理的な基礎材料を提供する。
【００２６】
例として、本発明を使用して、目的の非ヒト抗体をヒト化することができる。この例では、配列比較に利用可能なヒトＦＲサブセットのプールは、配列情報が入手可能な（具体的に、不完全可変ドメイン配列からのＦＲ配列情報を含む）Ｌ鎖および重鎖のそれぞれにおける４つのフレームワークサブセット（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）のそれぞれの算術的階乗である。主要な結果は、少なくとも約４倍のプールサイズの増加である。いくつかの実施態様においては、不完全Ｖドメイン配列からの最良適合ＦＲの利用可能性により、プールサイズは、より大きいものとなるであろう。このことは、選択に利用可能なヒトＦＲサブセットのプールのサイズを増大させるので、従来法に優る大きな利点である。かくして、潜在的最良適合ヒトＦＲ可能性が高められる。従って、最良適合ヒトＦＲサブセットを検出する機会は、過去のアプローチに比較して、本発明により高くなる。
【００２７】
本発明の方法は、他の重要な効果を提供する。
先に述べた通り、本発明の目的は、ヒト化されるべき各非ヒトＦＲサブセットについて、最良適合を最適化し、選択することである。この方法は、過去のアプローチとは異なり、対象の免疫系分子内で、他のＦＲとは本質的に独立して行われる。かくして、適合しないアミノ酸の数は、それらが少しでも存在する限り、本発明方法を使用することにより実質的に少なくなるであろう。利用可能な完全に配列決定されたヒト抗体および可変ドメインのプールによって制限されることが多い過去の方法とは異なり、本発明の使用により、最良適合ヒトＦＲサブセットを選択する新しい機会が提供される。本発明は、更に、対応する非ヒトＦＲと比較した場合、不一致がまったくないかほとんどない状態で、最良適合ヒトＦＲを検出するより良い機会を提供する。本発明方法の実施は、このように、多種類の免疫系分子を作り使用する機会を高めるであろう。重要なことには、このような方法は、それが得られた元の非ヒトまたはキメラ分子と比較した場合、抗原結合親和性が実質的に維持されたヒト化された抗体および断片を調製するのに用いることができる。
【００２８】
従って、１つの形態において、本発明は、ヒト化された抗体可変（Ｖ）ドメインまたはその断片を産生する方法を提供する。好ましい断片は、抗原と、単独またはその対応するＶドメイン結合相手もしくは断片と組み合わせて結合する。大部分の実施態様において、この方法は、下記工程の少なくとも１つ、好ましくはすべてを含む。
【００２９】
一般的に、目的とする非ヒト抗体ＦＲサブセット、好ましくは、かかるＦＲの約４つ未満、より好ましくは、ＦＲ１またはＦＲ２などの約１つのＦＲ、の少なくとも１つのアミノ酸配列を、対応するヒトアミノ酸抗体または可変ドメイン配列もしくはその断片のプールと比較する。他のコレクションを、部分的フレームワーク配列のコレクションを含むいくつかの用途に使用してもよいが、ほとんどの場合、対応するヒト化された抗体フレームワークアミノ酸配列のコレクションを比較のために使用する。対応するヒトＦＲサブセットは、対応する非ヒトＦＲサブセットに関して最良適合を有するプールから選択される。一般的に、適当な最良適合ヒトＦＲサブセットは、対応する非ヒトＦＲサブセットと比較した場合、少なくとも約７５％の配列同一性を示し、好ましくは、少なくとも約８０％の配列同一性を、更に好ましくは、少なくとも約９０％から約１００％までの配列同一性を示す。
【００３０】
次いで、非ヒトＦＲサブセットが突然変異誘発を受けて、上で同定された最良適合ヒトＦＲサブセットを本質的にコードする。下記のように、標準突然変異誘発方法の１つまたは組み合わせを用いることができる。好ましくは、非ヒトＦＲサブセットの突然変異誘発は、選択されたヒトＦＲサブセットと実質的に同一、即ち、選択されたサブセットと少なくとも約７５％同一、好ましくは、少なくとも約８０％同一、更に好ましくは、少なくとも約９０％から約１００％まで同一であるヒト化されたＦＲサブセット（“ｈｕＦＲ”と呼ばれることがある）を作るように行われる。
【００３１】
本発明の先のヒト化工程を必要に応じて繰返し、非ヒトＶドメインの１つ以上の目的とするＦＲサブセットをヒト化することができる。更に具体的には、これらの工程を、１回、２回、３回またはそれを超える回数でさえ繰り返すことができ、各ＤＮＡ配列が対応ｈｕＦＲサブセットをコードしている複数の各ＤＮＡ配列を作る条件下で行うことができる。ほとんどの場合（例えば、完全にヒト化された免疫系分子が必要な場合のように）、これらの工程を約３〜４回繰り返して、ＦＲサブセット（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）のそれぞれをヒト化するのが有用であろう。かくして、非ヒト抗体が関与する実施態様においては、免疫グロブリンＬ鎖および重鎖のそれぞれにおけるＦＲサブセットのそれぞれが、上記ヒト化工程に付されるであろう。
【００３２】
本発明の実施には、目的とする結果が得られる限り、非ヒトＦＲをヒト化するための特別な順番は必要ない。
次いで、ｈｕＦＲサブセットをコードするＤＮＡ配列の１つまたは組み合わせを、標準組換え方法を用いて、適当な（第１）ベクター内へ置換する。好ましくは、第１のベクターが、少なくともヒト化されるべき非ヒト抗体のＶドメインをコードする。しかし、いくつかの実施態様においては、第１のベクターが、免疫グロブリンＬ鎖または重鎖定常ドメインまたは共有結合でＶドメインに結合したその断片を更にコードする。
【００３３】
好ましい置換工程は、一般に、ｈｕＦＲＤＮＡ配列の少なくとも１つ、好ましくはすべてが、ベクターでコードされた１つ以上の対応非ヒトＦＲサブセットの置換に用いられる条件下で行われる。ＦＲ置換の順序は、通常、目的とするヒト化された分子が作られる限り、重要ではない。例えば、先ず、非ヒトＦＲ１をヒト化し、次いで非ヒトＦＲ２をヒト化することができる。あるいは、非ヒトＦＲ１の前に非ヒトＦＲ２をヒト化することができる。好ましい置換工程は、通常の操作によって行われ、ｈｕＦＲサブセットのそれぞれが、１つ以上の対応相補性決定領域（ＣＤＲ）に動作可能(operatively)に結合することになる。
【００３４】
第１のベクターは、下記のような広範囲の適当な宿主細胞において、１つ以上のコードされたヒト化された免疫系分子を発現するように使用することができる。一般的に好ましい方法は、宿主細胞内でヒト化された抗体Ｖドメインまたはその断片を発現することにつながる。更に好ましい方法は、それに随伴する細胞成分からヒト化された分子を精製しようとするアプローチと十分両立し得る。
【００３５】
本発明は、所定の非ヒトＦＲサブセットにおける各不一致位置での非ヒトアミノ酸を、目的とするヒトアミノ酸へ変換する広範囲の組換えアプローチに十分適合し得る。利用可能な組換えアプローチの一例は、特定部位の突然変異誘発または関連ＰＣＲ系方法である。本発明により潜在最良適合ヒトＦＲサブセットのプールがより大きくなるので、不一致がより少なくなり、ヒトＦＲサブセットを同定する可能性がより高くなる。本発明のこの特徴は、特定の免疫系分子がヒト化されようとするとき、考慮される必要のあるＦＲ不一致の数を減らすのに役立つ。これらおよびその他の発明効果は、多くの従来のヒト化方法によくあるコストおよび時間消費を減らすのに役立つ。
【００３６】
上述のように、大部分の従来のヒト化アプローチは、得られた分子の受け入れられない抗原結合により妨げられていた。更に具体的には、大部分の従来のヒト化された抗体は、元の分子と比較したとき、同系の抗原に対する親和性が低すぎる。多くの元のキメラ抗体は、その抗体のヒト化されたバージョンよりも良好な抗原結合特性を有する。この理論に束縛されることを望むものではないが、このような受け入れられない抗原結合は、大部分、ＣＤＲ（バーニアゾーン残基）に近接したＦＲサブセット内の１つ以上のアミノ酸から生じる障害に起因するものでありうると考えられる。少なくともいくつかの抗体については、バーニアゾーン残基が抗体Ｖドメインによる抗原結合に起因するかもしれないとの報告がある。
【００３７】
バーニアゾーン障害問題をできるだけ少なくしようとする過去の試みは、おおむね不成功であったか、あるいは補正するのに高度なコンピュータアルゴリズムを必要とし、これらは、コンピュータを使用した分子モデリングおよび構造知識に著しく依存する。
例えば、1つのアプローチにおいて、障害を減らすのに役立つように、コンピュータ支援モデリングソフトウエアが使用されてきた。このようなソフトウエアは、複雑で、使用し難いことが多い。本発明は、複雑なソフトウエアからの支援なしに、最良適合ｈｕＦＲサブセットの検出および選択を最適化することにより、この問題に対処するものである。即ち、本発明は、より最良適合した候補を提供し、それによりバーニアゾーンおよびヒト化されるべき免疫系分子内のほかの場所での不一致の機会を減らす。従って、本発明の使用により、元の免疫系分子の抗原結合を顕著に維持することができる。この発明効果は、問題の非ヒト抗体が抗原に対して非常に高い親和性（Ｋｄ＞１０−９Ｍ以上）を有している場合、特に重要である。そのような状況において、高親和性は、ＣＤＲを適当な形状に保持することが必要になることが多い。本発明は、バーニアゾーン不一致の潜在力をできるだけ少なくするかあるいは除去することによって、これらの要求に実質的に応えるものである。過去の方法では、バーニアゾーン不一致に対処するのに役立つよう、Ｘ線結晶またはコンピュータ利用抗体情報を使用していた。注目に値すべきは、本発明は、このような情報へのユーザー依存を低減し、多くの場合それらを回避するものである。
本発明の他の形態を以下に述べる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
上述のように、本発明は、ヒト化された免疫系分子を作る方法を特徴とするものである。このような分子の例としては、ヒト化された抗体可変（Ｖ）ドメイン、ヒト化された抗体（キメラおよびモノクローナル）およびその抗原結合断片が挙げられる。例えば、本発明は、少なくとも１つの非ヒトフレームワーク（ＦＲ）サブセット、一般的には、２、３または４つのかかるサブセットおよび１つ以上の対応ヒトＦＲサブセット間の配列類似性を最適化することを含む、抗体ヒト化の新規な方法を提供する。少なくとも１つの選択されたヒト化されたＦＲサブセット（ｈｕＦＲ）で、対応する非ヒトＦＲサブセットを置換して、その分子をヒト化する。本発明の好ましいヒト化された免疫系分子は、良好な抗原結合親和性と被験者における最小の免疫原性を特徴とする。
【００３９】
免疫系分子をヒト化するのに本発明を使用することの利点は、下記実施例６〜９を始めとする開示を通じて明らかにされる。上述のように、過去のヒト化の試みと本発明との重要な相違は、本発明方法が、最良適合を持った複数のＦＲを検索すると言うことである。これに対して、従来の試みは、フレームワーク全体（通常、単一の抗体可変ドメインから誘導される）、更に悪いものは、可変ドメイン全体を用いて最良適合を決定していた。このように、本方法で同定されたＦＲを、各抗体鎖について４つもの多くの異なる抗体から誘導することができ、抗体当り合計８つのＦＲが得られる。本発明のこの特徴は、検出可能な最良適合ＦＲの利用可能プールを大きく拡大するものである。最良適合を持ったＦＲを検索するに際してこのような自由度があることにより、より多くのＦＲを考慮でき、検索における制約がより少なくなる。これらの利点は、最良適合を提供するのに、より少ないアミノ酸置換、より少ないバーニア残基への変換で、より良い相同性または同一性スコアを提供するものである。最良適合を有するフレームワーク全体を検索する際には、その結果が、そのフレームワーク全体にわたって妥協点のある(compromise)最良適合となる。いくつかの例では、両鎖についてのフレームワーク全体が単一の抗体から採られ、より制約の少ない検索では、各鎖についてのフレームワークが異なる抗体からもたらされることができる。
【００４０】
更に詳しくは、後掲の実施例６は、抗ＴＡＣ抗体をヒト化しようとする過去の試みと本発明方法（ここでは、“ＦＲ最良適合ヒト化（FR Best Fit Humanization）”と呼ばれることがある）とのコンピュータでの（in silico）比較を行っている。この実施例に示すように、本発明を使用すると、優れた結果が得られる。即ち、本発明による抗ＴＡＣ抗体の仮想ヒト化により、より良い抗体が作られる。
【００４１】
本発明を使用することの更なる利点は、実施例７（Ｍｃ３抗体）、実施例８（抗ＴＦ抗体）および実施例９（抗ＬＴＡ抗体）に示されたコンピュータ内の結果から明らかである。実施例６を始めとするこれらの実施例においては、記載された抗体の仮想ヒト化により、従来のヒト化アプローチと対比した場合、優れたヒト化された抗体が作られる。このように、本発明は、広範囲のヒト化された免疫系分子を作り使用するのに用いることのできる一般的な応用の１つである。
【００４２】
上述のように、本発明は、抗体やその断片などの広範囲の免疫系分子をヒト化するのに用いられることができる。特定の本発明方法は、ヒト化された抗体可変（Ｖ）ドメインまたはその抗原結合断片を作るのに用いることができる。上述のように、好ましい断片は、一般的には、対応するＶドメイン結合相手または断片と組み合わせて、特異的に抗原と結合する。一実施態様において、本方法は、下記工程の少なくとも１つ、好ましくはすべてを含む。
（ａ）非ヒト抗体可変（Ｖ）ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）サブセットのアミノ酸配列を、ヒト抗体フレームワークまたは可変ドメインアミノ酸配列もしくはその断片のコレクションと比較する。
（ｂ）非ヒトＦＲサブセットに対して最大のアミノ酸配列同一性を有するコレクションから、ヒトＦＲサブセットを選択する。
（ｃ）非ヒトＦＲサブセットのＤＮＡに突然変異誘発を起こさせて、工程ｂ）からの選択されたヒトＦＲサブセットと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するヒト化されたＦＲサブセットをコードするようにする。
（ｄ）非ヒトＶドメイン内のＦＲサブセットそれぞれについて、工程ａ）〜ｃ）を繰り返し、各ＤＮＡ配列がヒト化されたＦＲサブセット（ｈｕＦＲ）をコードする複数のＤＮＡ配列を作る。
（ｅ）工程ｄ）からのｈｕＦＲＤＮＡ配列のそれぞれを、少なくとも非ヒト抗体のＶドメインをコードしている第１のベクター内へ導入して、そのベクターでコードされた対応する非ヒトＦＲサブセットを置換し、その置換によって、各ｈｕＦＲがその対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）と有効に結合し、宿主細胞内で、ヒト化された抗体Ｖドメイン、完全な抗体またはその抗原結合断片を作ることになる条件下にて、その第１のベクターを発現させる。
【００４３】
ヒト化されるべきＶドメインまたはその抗原結合断片は、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むであろう。これから分かるように、免疫グロブリンＬ鎖および重鎖は、ある種の構造類似性を共有している。例えば、配列が相対的に保存されている４つのフレームワーク領域サブセット（ＦＲ１〜４）の内の１つのフレームワークを、それぞれが含んでいる。ＦＲ１〜４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）のそれぞれは、３つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３により、共有結合で連結されている。４つのＦＲは、主としてβシート構造を示し、相互に連結したＣＤＲは、連結ループを、またある場合には、βシート構造の形成部分を形成しているという一般的な認識がある。大部分のＣＤＲは、隣接しているＦＲに近接して保持され、反対側のＬ鎖または重鎖からの対応するＣＤＲで抗原結合部位を形成するのに役立つ。広範なＣＤＲおよびＦＲが開示されている。Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, NIH Publication No. 91-3242 (1991)参照。
ＥＰ−Ａ−０２３９４００および米国特許番号第５,９８５,２７９号（ＣＤＲが、ＦＲとは異なる種から由来している別の抗体を作る方法を述べている）も参照。
【００４４】
“抗原結合断片”という語句は、特異的に抗原と結合する抗体の少なくとも一部を意味する。このような断片の例としては、抗体ＶドメインおよびそのＶドメイン結合相手が挙げられる。更に適当な断片としては、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、適当な大きさにしたマーカー断片を用いるサイズ排除クロマトグラフィー、質量分析またはアミノ酸分析を始めとする各種標準法により測定されたＶドメインおよびそのＶドメイン結合相手についての総合分子量が、約１５キロダルトンから約４０キロダルトンまでの間、好ましくは約２０キロダルトンから約３０キロダルトンまでの間、更に好ましくは約２５キロダルトンであるＶドメインの一部が挙げられる。
【００４５】
更に適当な抗原結合断片としては、抗原結合Ｖドメインの少なくとも一部単独または同系定常（Ｃ）ドメインもしくはその断片との組み合わせが挙げられる（“同系（cognate）”は、同一免疫グロブリン重（Ｈ）鎖または軽（Ｌ）鎖の２つの成分間の関係を示すのに用いられる）。一般的に、Ｃドメイン断片は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、適当な大きさにしたマーカー断片を用いるサイズ排除クロマトグラフィー、質量分析またはアミノ酸分析を始めとする各種標準法により測定された分子量が、約５キロダルトンから約５０キロダルトンまでの間、更に好ましくは約１０キロダルトンから約４０キロダルトンまでの間である。更に適当な抗原結合断片を以下に開示する。
【００４６】
“特異的結合（specific binding）”という用語または同様な用語は、ここに開示される分子であって、他の分子と結合して特異的結合対を形成する分子を意味する。しかし、この分子は、例えば、ウエスターンブロッティングＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、モビリティシフトアッセイ（mobility shift assay）、酵素免疫測定法、競合アッセイ、飽和アッセイまたは当該技術分野で知られたその他の蛋白結合アッセイで測定した場合、他の分子を認識せず、あるいは他の分子に結合しない。一般的には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.) (1989)およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989) 参照。分子間の特異性結合を検出する方法の例は、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1988)参照。
【００４７】
“ヒト化されたもの（humanized）”という語句は、少なくとも１つのヒトＦＲサブセット、好ましくはその２つまたは３つ、より好ましくは４つのヒトＦＲサブセット、および非ヒト源、通常はラットまたはマウス免疫グロブリンなどの齧歯類、からの１つ以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンを意味する。本発明の典型的に好ましいヒト化イムノグロブリンは２個もしくはより好ましくは３個のＣＤＲを含むものであろう。定常ドメインは、存在する必要はないが、生体内使用が意図される場合のヒト化された抗体の機能を助けるのに有用なことが多い。好ましい定常ドメインは、存在する場合、ヒト免疫グロブリン定常ドメインと実質的に同一であり、即ち、アミノ酸配列に関して少なくとも約９０％同一であり、好ましくは少なくとも９５％以上同一である。従って、ＣＤＲを除いて考えれば、ヒト化された免疫グロブリンのすべての部分が、天然に存在するヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一であることが好ましい。
【００４８】
アミノ酸配列同一性を測定する方法は、当該分野においては標準的なもので、ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡ（医療図書館（National Library of Medicine）（米国）のウエブサイトから入手可能）を用いるコンピュータ利用アプローチの他に、目視検査が挙げられる。大部分の実施態様のための好ましい照合プログラムは、国際ImMunoGeneTics （ＩＭＧＴ）データベース用ウエブサイトから入手可能であり、本実施態様のためのより好ましい照合プログラムは、Kabatデータベースで入手可能な、Matchと呼ばれるプログラムである。Johnson G, Wu T.,“Kabat database and its application: Future directions”, Nucleic Acids Res. 29, 205-206 (2001)参照。
【００４９】
“ヒト化された抗体”という語句は、ヒト化されたＬ鎖およびヒト化された重鎖免疫グロブリンを含む抗体を意味する。S. L. Morrison、上掲、V. Oi et al.、上掲、Teng et al.、上掲、Kozbor et al.、上掲、Olsson et al.、上掲、および先に引用された文献参照。従って、“ヒト化された抗体断片”は、その抗体の一部、好ましくは特異的に抗原と結合する部分を意味する。
【００５０】
上述のように、本発明は、各個別の非ヒトＦＲのアミノ酸配列を、ヒトアミノ酸配列のコレクション、好ましくはヒト抗体フレームワークアミノ酸配列を含む配列のコレクションと比較、最適化しようとする１つ以上の方法工程を含む。実際には、最高の配列同一性スコアを有するヒトフレームワークにおけるＦＲは、非ヒト抗体ＦＲに対応するＦＲであったが、これは、必ずしも検索パラメーターによって要求されるものではない。“対応する”は、抗体Ｖドメイン上の同一または類似位置からの２つのＦＲ間の関係を意味する。例えば、所定の抗体Ｌ鎖からの齧歯類ＦＲ１は、そのＬ鎖からのヒトＦＲ１に対応する。対応は、ＦＲ番号で示されることが多く、例えば、齧歯類ＦＲ１はヒトＦＲ１と対応し、齧歯類ＦＲ２はヒトＦＲ２と対応する等である。
【００５１】
この方法の一実施態様において、記載されたＶドメインまたは断片は、非ヒト抗体Ｌ鎖からのものである。上述のように、ＦＲサブセットヒト化の厳密な順番は、一般には重要ではない。即ち、本発明の一例では、この方法における工程ａ）のＬ鎖ＦＲサブセットが第１の可変ドメインフレームワーク領域（ＦＲ１）である。しかし、他の実施態様においては、他のＦＲサブセット、例えばＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４を、ＦＲ１の前にヒト化することができる。
【００５２】
上述のように、この方法の工程ｂ）は、非ヒトＦＲサブセットに対して最大のアミノ酸配列同一性を有する複数のヒトアミノ酸配列から、ヒトＦＲサブセットを選択することを含む。ヒト化されるべき非ヒトフレームワークがＦＲ１である実施態様において、非ヒト抗体Ｌ鎖のＦＲ１と選択されたヒトＦＲの間の配列同一性は、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、更により好ましくは少なくとも約９５％である。
【００５３】
また、上述のように、具体的な発明方法は、各非ヒトフレームワーク領域の反復性の（一般には、逐次的）ヒト化を含む。従って、ＦＲ１を操作する実施態様においては、この方法は、引き続いてＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の操作を含む。上述のように、ＦＲをヒト化する厳密な順番は重要ではないが、利便性のために、Ｌ鎖および重鎖フレームワークを番号順、即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の順にヒト化するのが有用であるかもしれない。
【００５４】
従って、一発明実施態様において、この方法の工程ｄ）は、更に、非ヒトＬ鎖（または重鎖）Ｖドメインの第２の非ヒトフレームワーク領域（ＦＲ２）をコレクションと比較し、そのヒトＦＲサブセット（実際には、これが一般にヒトＦＲ２である）に対して、少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するヒトＦＲサブセットを選択することを含む。この方法の工程ｄ）は、更に、非ヒトＬ鎖（または重鎖）Ｖドメインの第３のフレームワーク領域（ＦＲ３）をコレクションと比較し、ヒトＦＲサブセット（実際には、これが一般にヒトＦＲ３である）に対して、少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するヒトフレームワーク領域を選択することを含むであろう。一般的に、工程ｄ）は、更に、非ヒトＬ鎖（または重鎖）Ｖドメインの第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）をコレクションと比較し、その対応するヒトフレームワークサブセット（実際には、これが一般にヒトＦＲ４である）に対して、少なくとも約７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するヒトフレームワーク領域を選択することを含むであろう。
【００５５】
本記載から明らかなように、本発明は、T細胞受容体、主要組織適合複合体、抗体を含むがこれらに限定されるものではない任意のヘテロダイマー免疫グロブリン状分子のＬ鎖Ｖドメイン、重鎖Ｖドメインおよびその抗原結合断片を始めとする多種多様な免疫系分子をヒト化するのに使用されることができる。一実施態様において、ヒト化されたＬ鎖（または重鎖）は、配列内に共有結合で結合された次の成分を含む：ｈｕＦＲ１−ＣＤＲ１−ｈｕＦＲ２−ＣＤＲ２−ｈｕＦＲ３−ＣＤＲ３−ｈｕＦＲ４。本発明方法は、関連定常ドメインおよびその断片を更に含む分子の他に、Ｌ鎖または重鎖Ｖドメインの抗原結合断片をも包含するものである。
【００５６】
上述のように、本発明の目的は、Ｖドメインの少なくとも１つにおける潜在バーニアゾーン障害問題を最小限に抑え、好ましくは排除した、ヒト化された抗体（および抗原結合断片）を産生することである。この発明の特徴は、免疫系分子とその同系抗原との間の特異的結合を最大にするのに役立つ。従って、この方法の一実施態様においては、非ヒトＦＲサブセットを抗体Ｖドメインの対応するヒトＦＲサブセットと比較した場合、可変ドメインのＬ鎖および重鎖の少なくとも１つにおける各ＦＲサブセット内のバーニアゾーンアミノ酸残基が同一である。例えば、Ｌ鎖または重鎖上の非ヒトＦＲ１のバーニアゾーンアミノ酸残基は、ヒトＦＲ１サブセット内の対応する残基と同一でなければならない。
【００５７】
この方法に用いられる第１のベクターは、一般的に、目的とする宿主におけるコードされた免疫系分子の適当な発現に必要な配列情報を含む。免疫系分子がヒト化されたＬ鎖Ｖドメインである実施態様において、第１のベクターがヒトＬ鎖定常ドメインまたはその断片を含んでいれば、それは、多くの場合有用であろう。一般的には、これに限られないが、ヒトＬ鎖定常ドメインまたは断片は、ヒト化されたＬ鎖に共有結合で結合するであろう。
【００５８】
好ましい実施態様では、ヒトＬ鎖定常ドメインは、Ｃκ、Ｃγまたはその断片である。多くの場合、ヒト化されたＬ鎖断片は、アミノ酸数で約８０から約２５０個までの間、好ましくはアミノ酸数で約９５から約２３５個までの間、更に好ましくはアミノ酸数で約１０４から約２２５個までの間のアミノ酸長さを有するであろう。ヒト化されたＬ鎖断片の大きさは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、適当な大きさにしたマーカー断片を用いるサイズ排除クロマトグラフィー、質量分析またはアミノ酸分析を始めとする各種標準法により測定することができる。
【００５９】
ヒト化された免疫系分子が、重鎖Ｖドメインである実施態様では、ヒト化された重鎖断片は、例えば、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、適当な大きさにしたマーカー断片を用いるサイズ排除クロマトグラフィー、質量分析またはアミノ酸分析を始めとする各種標準法により測定した場合、アミノ酸数で約８０から約６５０個までの間、好ましくはアミノ酸数で約９５から約５４０個までの間、更に好ましくはアミノ酸数で約１０２から約５２７個までの間のアミノ酸長さを有するであろう。
【００６０】
上述のように、本発明の目的は、非ヒト免疫系分子からの各フレームワーク領域を、ヒトフレームワークサブセットのコレクションと単独に比較する新規なヒト化方法を提供することである。従って、例えば、キメラ抗体をヒト化するために、重鎖（ＨＣ）可変ドメイン内の第１のフレームワーク領域（ＦＲ１）の配列を、ヒト抗体の重鎖可変ドメイン内のＦＲサブセットに関するすべての既知の配列と比較する。最高の同一度または相同度（アミノ酸配列での最少の不一致数）を有する候補が同定される。次いで、好ましくは、この工程を、ＨＣでのＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のそれぞれについて繰り返す。Ｌ鎖の可変ドメインにおけるＦＲについて、同様な工程を実施する。本発明の目的とする用途に合わせて、必要に応じて同一または異なる抗体から、最良適合ヒトＦＲサブセットを選んでもよい。これは、選択された最良適合が単一ヒト抗体配列からのそっくりそのままの単一フレームワークである他のヒト化方法から、顕著に隔たっている。
【００６１】
この方法の具体的な実施態様において、第１のベクターは、更に、ヒト化された重鎖に共有結合で結合するヒト重鎖定常ドメインまたはその断片を含む。好ましくは、ヒト定常ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４アイソタイプの１つまたはその断片である
【００６２】
“キメラ抗体”という語句または複数の形態を含む関連語句は、Ｌ鎖および重鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、一般的には遺伝子工学により構成された抗体を意味する。例えば、マウスモノクローナル抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）ドメインは、γ１、γ２、γ３またはγ４などのヒト定常（Ｃ）ドメインに結合してもよい。他の哺乳類種を用いてもよいが、代表的な治療用キメラ抗体は、このように、マウス抗体からのＶまたは抗原結合ドメインおよびヒト抗体からのＣまたはエフェクタードメインからなるハイブリッド蛋白質である。具体的なキメラ抗体は、抗組織因子抗体、ｃＨ３６および下記の抗リポタイコ酸(anti-lipotechoic acid)抗体、ｃ９６−１１０（Ａ１１０と呼ばれることもある）である。
【００６３】
上述のように、この発明方法は、非ヒト抗体可変（Ｖ）ドメインフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を、複数のヒトアミノ酸配列、好ましくはヒト抗体フレームワークアミノ酸配列またはその断片の配列のコレクションと比較する。このようなコレクションの例は、完全に配列決定されたヒト抗体を含むデータベースからのものである。従来のヒト化方法とは異なり、このコレクションは、部分的に配列決定されたヒト抗体の１つ以上のアミノ酸配列を更に含んでもよい。あるいは、このコレクションは、部分的に配列決定されたヒト抗体のみから実質的に成っていてもよい。このようなコレクションの例としては、次のデータベース：ＧｅｎＢａｎｋ、ＩＭＧＴ、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＫａｂａｔ、上掲が挙げられるが、これらには限定されない。
【００６４】
本発明のより具体的な例において、ヒト化された抗体またはその抗原結合断片を作る方法が提供される。一実施態様において、この方法は、下記工程の少なくとも１つ、好ましくはすべてを含む。
ａ）非ヒト抗体Ｌ鎖可変（Ｖ）ドメインフレームワーク領域（ｌ−ＦＲ）のアミノ酸配列をヒト抗体Ｌ鎖フレームワークアミノ酸配列のコレクションと比較する。
ｂ）ｌ−ＦＲに対して最大のアミノ酸配列同一性を有するコレクションからヒトＦＲサブセットを選択する。
ｃ）ｌ−ＦＲのＤＮＡに突然変異誘発を起こさせて、工程ｂ）からの選択されたヒトＦＲサブセットと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するＬ鎖ヒト化ＦＲサブセット（Ｌ−ｈｕＦＲ）をコードするものとする。
ｄ）Ｌ鎖Ｖ領域におけるＦＲサブセットのそれぞれについて、工程ａ）〜ｃ）を繰り返して、各ＤＮＡ配列がＬ−ｈｕＦＲをコードする複数のＤＮＡ配列を作る。
ｅ）工程ｄ）からのｈｕＦＲＤＮＡ配列のそれぞれを、少なくとも非ヒト抗体のＬ鎖Ｖドメインをコードしている第１のベクター内へ導入して、そのベクターでコードされた対応する１−ＦＲを置換し、その置換によって、各Ｌ−ｈｕＦＲがその対応する相補性決定領域（ＣＤＲ）と有効に結合する。
ｆ）非ヒト抗体重鎖可変（Ｖ）ドメインフレームワーク領域（ｈ−ＦＲ）のアミノ酸配列をヒト抗体重鎖アミノ酸配列のコレクションと比較する。
ｇ）ｈ−ＦＲに対して最大のアミノ酸配列同一性を有するコレクションからヒトＦＲサブセットを選択する。
ｈ）ｈ−ＦＲのＤＮＡに突然変異誘発を起こさせて、工程ｇ）からの選択されたヒトＦＲと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するヒト化された重鎖ＦＲサブセット（Ｈ−ｈｕＦＲ）をコードするものとする。
ｉ）非ヒト重鎖Ｖドメインにおけるｈ−ＦＲのそれぞれについて、工程ｆ）〜ｈ）を繰り返して、各ＤＮＡ配列がＨ−ｈｕＦＲをコードする複数のＤＮＡ配列を作る。
ｊ）工程ｉ）からのＨ−ｈｕＦＲＤＮＡ配列のそれぞれを、少なくとも非ヒト抗体の重鎖Ｖドメインをコードしている第２のベクター内へ導入して、その抗体の対応するｈ−ＦＲを置換し、その置換によって、各Ｈ−ｈｕＦＲがその対応する重鎖ＣＤＲと有効に結合する。
ｋ）宿主細胞内で、ヒト化されたＬ鎖および重鎖を産生し、ヒト化された抗体またはその断片を作ることになる条件下にて、第１および第２のベクターを発現させる。
前記方法の一実施態様においては、第１および第２のベクターが同一宿主内で共に発現される。他の実施態様においては、ヒト化されたＬ鎖および重鎖またはその断片をコードするＤＮＡ分子が単一のベクターに含まれ、同一宿主内で共に発現される。
【００６５】
前記抗体ヒト化方法で使用する適当な第１のベクターとしては、コードされた免疫系分子の適当な発現に必要な配列情報が挙げられるであろう。例えば、利用可能な第１のベクターとしては、ヒト化されたＬ鎖Ｖドメインと共有結合で結合したヒトＬ鎖定常ドメインまたはその断片が挙げられるであろう。好ましくは、定常ドメインは、Ｃκ、Ｃγまたはその断片である。
【００６６】
この方法による好ましい第２のベクターとしては、一般的に、更に、ヒト化された重鎖Ｖドメインと共有結合で結合したヒト重鎖定常ドメインまたはその断片が挙げられる。例えば、ヒト定常ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの１つであることができ、その断片または他のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ）を含む。
【００６７】
本発明は、自然にそれに随伴する細胞成分から、ヒト化された免疫系分子を精製しようとする追加の工程とも両立し得る。従って、一実施態様においては、前記方法は、ヒト化された抗体を宿主細胞から精製して、抗体の実質的に純粋な製剤を産生することを含む１つ以上の工程を更に含むであろう。好ましくは、実質的に精製されたヒト化抗体が、元の非ヒト抗体の約１０倍を下らない親和力で、特異的に抗原と結合する。
【００６８】
明らかなように、本発明は、広範囲のヒト化された免疫系分子を作るのに使用されることができる。例えば、本発明のヒト化された抗体としては、１）ヒトＦＲサブセットに対して、それぞれ個々に、アミノ酸配列が少なくとも約９０％同一、好ましくは、それに対して少なくとも９５％同一、より好ましくは、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約９８％から１００％同一であるＬ鎖および重鎖フレームワーク領域（ＦＲ）、２）マウスなどの齧歯類からの少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは、マウスからのすべてのＣＤＲ、および３）対応するヒト免疫グロブリン定常ドメインに対して、少なくとも約９０％同一、好ましくは、少なくとも９５％から約１００％まで同一であるヒト免疫グロブリン定常ドメインが挙げられる。得られたヒト化抗体が、ＣＤＲを与える抗体と同じ抗原に結合すると期待されるので、抗体は、“ヒト化”工程により“ヒト化された”ことが分かるであろう。
【００６９】
ここに記載されている具体的なヒト化された免疫系分子、通常はヒト化された抗体は、必要に応じて、隣接または非隣接であることのできる１つ以上の更に追加の保存（conservative）アミノ酸置換を有してもよいことが更に分かるであろう。例えば、このような置換は、一般的には、抗原結合またはその他の免疫グロブリン機能に対して実質的にほとんどあるいは全く影響がないであろう。複数の形態を含む“保存置換（conservative substitution）”という語句は、ｇｌｙ←→ａｌａ；ｖａｌ←→ｉｌｅ←→ｌｅｕ；ａｓｐ←→ｇｌｕ；ａｓｎ←→ｇｌｎ；ｓｅｒ←→ｔｈｒ；ｌｙｓ←→ａｒｇおよびｐｈｅ←→ｔｙｒの組み合わせを意味する。
【００７０】
本発明の抗体は、開示された方法および測定法で使用される場合は、実質的に純粋であることが好ましい。“実質的に純粋”である抗体と言う場合、自然にそれに随伴する成分から分離された抗体または蛋白質を意味する。例えば、標準イムノアフィニティーまたはプロテインＡアフィニティー精製技術を使用して、抗原またはプロテインＡ樹脂として天然ＴＦを用いることにより、ハイブリドーマまたは細胞培養液から本発明の抗体を精製することができる。同様に、標準イムノアフィニティー精製技術で本発明の抗体を用いることにより、天然ＴＦを純粋な形で得ることができる。特に、全蛋白質の少なくとも５０％（所定サンプル中の全蛋白質の重量％）が本発明の抗体または蛋白質である場合、抗体または蛋白質は純粋である。抗体または蛋白質は、全蛋白質の少なくとも６０重量％であることが好ましく、より好ましくは、全物質の少なくとも７５重量％、更に好ましくは、少なくとも９０重量％、最も好ましくは、少なくとも９８重量％である。純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、カラムクロマトグラフィー（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、質量分析またはアミノ酸分析などの既知の方法により、容易に測定することができる。
【００７１】
このような実質的に精製されヒト化された抗体は、広範囲の抗原に特異的に結合するのに用いることができる。例えば、一実施態様において、リポタイコ酸（lipotechoic acid）または関連脂肪酸を特異的に認識し、結合するのに、本発明方法によって産生される抗体を使用することができる。ヒト組織因子を特異的に認識し、結合する他のヒト化された抗体および断片が産生される。
【００７２】
本発明によるヒト化された免疫系分子は、広範囲の重要な用途を提供する。例えば、ヒトまたは動物の病気を予防、治療するのに、本発明のヒト化された抗体および抗原結合断片を使用することができる。その他の考えられる用途としては、診断薬が挙げられる。
【００７３】
本発明によるヒト化用抗体は、種々の源から容易に得ることができる。また、それらは、新規に作ることができる。１つのアプローチにおいて、天然ヒトＴＦの精製されたサンプルまたは上述のような免疫原性ペプチド単独で、あるいはキャリアと複合させて、あるいはアジュバントとの混合物として、哺乳類を免疫することにより、このような分子を調製することができる。適当な哺乳類としては、羊、山羊、ウサギ、モルモット、ラット、マウスなどの代表的な実験動物が挙げられる。ラットおよびマウス、特にマウスは、モノクローナル抗体を得るのに好ましい。抗原は、皮下、腹腔内、静脈、筋肉または皮内注射などの多数の適当な経路のどれによってでも、哺乳類に投与することができる。最適の免疫間隔、免疫投与量などは、比較的広い範囲内で変更することができ、この開示に基づいて、経験的に決定することができる。代表的な方法では、何ヶ月にもわたって、抗原を数回注射する。抗体は、免疫された動物の血清から、標準技術により集められ、検索されて、目的とする抗原に特異的な抗原を見出す。モノクローナル抗体は、抗体を産生する細胞内で産生されることができ、これらの細胞は、ハイブリドーマ細胞を形成するための標準融合技術を用いてモノクローナル抗体を生成するのに使用されることができる。G. Kohler et al., Nature 256, 456 (1975)参照。一般的には、これは、抗体産生細胞を骨髄腫細胞などの不死（immortal）細胞株と融合させて、ハイブリッド細胞を産生することを含む。また、Huse et al., Science 256, 1275 (1989)の方法により、細胞からモノクローナル抗体を産生することができる。このような抗体は、もし必要であれば、従来の方法により配列決定されることができる。
【００７４】
いくつかの用途では、ヒト化されるべき抗体として、キメラ抗体、例えば、非ヒト動物可変ドメインとヒト定常ドメインを結合する抗体分子を使用することが望ましいかもしれない。例えば、可変ドメインの一部、特に抗原結合ドメインの保存領域がヒト由来であり、超可変領域だけが非ヒト由来であるヒト可変ドメインキメラを産生することにより、種々のタイプのこのようなキメラ抗体を産生することができる。S. L. Morrison, Science 229, 1202-1207 (1985), Oi et al., Bio Techniques 4, 214 (1986), Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 7308-7312 (1983), Kozobor et al., Immunology Today 4, 72-79 (1983), Olsson et al., Meth. Enzymol. 92, 3-16 (1983)におけるヒト化されたキメラ抗体およびその生産方法についての議論も参照。
【００７５】
更に、特定のヒトモノクローナル抗体を作るのに、遺伝子導入マウスを利用することができる。例えば、ヒト抗体レパートリーを有する遺伝子導入マウスが作られており、問題の抗原で免疫することができる。次いで、抗原と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るのに、このような免疫された遺伝子導入マウスからの脾細胞を使用することができる。N. Longberg et al., Nature 368, 856-859 (1994), L. L. Green et al., Nature Gent. 7, 13-21 (1994), S. L. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855 (1984)参照。
【００７６】
ポリメラーゼ連鎖反応により、本発明の抗体をコードする核酸を調製することもできる（後述の実施例１に開示されたプライマー参照）。一般的には、Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed. (1989)参照。このような核酸は、既知の方法、例えば、リン酸トリエステル法（Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed. 1984)参照）により、あるいは市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用することにより合成することもできる。このような本発明の調製された核酸は、既知技術によって本発明の抗体を発現させるのに利用することができる。例えば、制限酵素を使用して、構成物を導入し、次いで連結反応を行うために、ベクターに切り込みを入れるなどの既知の方法で、本発明の抗体をコードする核酸を、適当なベクター内へ導入することができる。次いで、挿入された核酸配列を含み、プロモーター配列に適当に作動可能に結合されたベクターは、発現用宿主細胞へ導入される。一般には、Sambrook et al.、上掲参照。適当なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に経験的に基づいて行われることができる。例えば、ベクターは、使用される宿主細胞と両立できるものであり、それに対して適正なレプリコンを持たなければ成らない。更に、ベクターは、挿入された核酸配列を収容できなければならない。適当な宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌、ストレプトマイセスリビダンス（Streptomyces lividans）もしくはその他のバクテリアの宿主、サッカロミセスセレビジエ（Ｓaccharomyces cerevisae）もしくはその他の酵母、黒色アスペルギルスもしくはその他の菌類、またはその他の微生物宿主、ＣＨＯ、ＢＫまたはＮＳＯ哺乳類細胞、鳥類または植物宿主などの広範囲の原核または真核細胞が挙げられるであろう。
【００７７】
具体的な発明実施態様によると、ここに述べた方法は、細胞内でベクターを発現させるのに適した条件下で、１つ以上の目的とするベクタータイプを植物細胞へ導入する工程を含むであろう。問題の具体的な植物細胞は、アラビドプシス（Arabidopsis）である。米国特許番号第６，４１７，４２９号およびその引用文献参照。
【００７８】
例えば、Ｖドメインまたはその抗原結合断片を作る前記方法において、工程ｅ）は、第１のベクターを植物細胞、好ましくはアラビドプシスへ導入し、その中で第１のベクターを発現させて、抗体Ｖドメインを作ることを含むであろう。この方法は、その抗原結合断片を含む完全な（全部の）抗体を発現させるように、容易に適合される。
【００７９】
ヒト化された抗体またはその抗原結合断片を作る先に述べた方法に関し、工程ｋ）は、第１および第２のベクターを植物細胞、好ましくはアラビドプシスへ導入し、その中でベクターを発現させて、目的とする分子を作ることを含むであろう。いくつかの発明実施態様において、第１および第２のベクターの代わりに、以下で“メガ”ベクターと呼ばれるものを用いることができる。
【００８０】
本発明の抗体の分子量は、目的とする用途や抗体が複合または組換え融合トキシン、医薬、放射性同位元素、検出可能標識などを含んでいるかどうかなどのいくつかの因子によって変わるであろう。分子量は、もし抗体に何らかの改変（グリコシル化など）が行われれば、翻訳後改変の性質および程度によっても変わるであろう。改変は、非グリコシル化抗体を産生する大腸菌や、グリコシル化抗体を産生する哺乳類細胞などの真核宿主での発現に用いられる宿主の機能である。一般に、本発明の抗体は、約２０から１５０ｋＤａまでの間の分子量を有する。このような分子量は、蛋白染色（protein staining）やウエスターンブロット分析を伴なうＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの分子サイジング法により、容易に測定することができる。
【００８１】
“本発明の抗体”またはその他の同様な用語は、免疫グロブリン全体及び目的とする抗原に結合する免疫学的に活性な断片を指す。免疫グロブリンおよびその免疫学的に活性な（抗原結合）断片としては、エピトープ結合部位（即ち、抗体認識抗原により特異的に結合されることのできる部位またはエピトープ）が挙げられる。典型的な抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ｖ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２断片、免疫グロブリンのジスルフィド結合を減らすことによって生成される“半分子（half molecule）”、単鎖免疫グロブリンまたはその他の適当な抗原結合断片が挙げられる（Bird et al., Science 242, 423-426 (1988)、Huston et al., PNAS (USA) 85, 5879 (1988)、Webber et al., Mol. Immunol. 32, 249 (1995)参照）。抗体またはその免疫学的に活性な断片は、動物のもの（例えば、マウスやラットなどの齧歯類）でも、あるいはキメラ形でもよい（Morrison et al., PNAS 81, 651 (1984)、Jones et al., Nature 321, 522 (1986)参照）。本発明の単鎖およびヒト化された抗体は、本発明のいくつかの用途に有用であろう。
【００８２】
従って、他の実施態様によれば、前記方法は、ヒト化されたＶ領域からヒト化された単鎖抗体（ｓｃ−Ｆｖ）を作ろうとする追加の工程を更に含む。更に、ヒト化された抗体の断片、特に、その抗原結合断片の他に、Ｆ（ｖ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’またはＦａｂも、従来法によって作ることができる。
【００８３】
同様に、“本発明の核酸”は、発現されて、そのような用語の意味がすぐ上で規定されているような本発明の抗体を供給することができるヌクレオチド配列を指す。
【００８４】
ある場合に、本発明の抗体を改変して、望ましい生物学的、化学的、物理的性質をそれに付与することが望ましい。従って、本発明方法は、１つ以上のヒト化された免疫系分子を医薬と接合する（即ち、共有結合で結合する）ことを意図する追加の従来法と両立し得るものである。このような結合は、ヘテロ二官能性蛋白架橋剤、例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミドなどの結合分子の使用を始めとするいくつかの方法、あるいは組換え方法により達成されることができる。この発明のヒト化された抗体の使用と両立し得る具体的な接合方策は、P. Rhode et al.へのＰＣＴ出願ＷＯ９９／２１７５２に記載されている。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989)、Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory Manual, CSH Publications, NY (1988)も参照。
【００８５】
本発明の具体的なヒト化された抗体は、必要に応じて、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、これらに制限されるものではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４アイソタイプ、またはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭを有してもよい。
ここに開示されるヒト化された抗体は、実施例１〜９で後述するものを始めとする方策の１つまたは組み合わせにより産生することができる。
【００８６】
実施例１および４に記載されたアプローチにおいては、抗体をヒト化するのに４つの一般的な工程を用いた。先ず、ｃＨ３６マウス−ヒトキメラ抗体から、マウス抗体Ｌ鎖および重鎖のアミノ酸配列を得た。第２に、どのヒト抗体フレームワーク領域が“最良適合”を示すか、即ち、マウスフレームワーク領域アミノ酸配列に最もよく似ているかを決定することにより、ｃＨ３６抗体をヒト化した。第3に、該当するＬ鎖および重鎖ＦＲ配列をヒト化し、第４に、ヒト化されたＬ鎖または重鎖（あるいはヒト化されたＬ鎖および重鎖、例えば、下記メガベクター参照）をコードする分離された核酸のトランスフェクションおよび発現を行った。
【００８７】
更に具体的に言うと、“ＦＲ最良適合”アプローチを、キメラ抗組織因子抗体ｃＨ３６をヒト化するのに適用した。このアプローチでは、マウス可変ドメインに対して最も相同であるこれらのヒト抗体可変ドメイン配列についてのすべての入手可能なプロテインデータベースを検索（比較）するのに、図１Ａおよび１Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４）に示したマウスＬ鎖および重鎖化変ドメイン配列を使用した。例えば、Kebat et al.、上掲参照。この工程を実施するには、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよび関連プログラムなどの多数の容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することができる。Ｌ鎖および重鎖のフレームワーク領域１、２、３および４は、これらの部位が抗原結合に対する適当な方向付け（orientation）にＣＤＲを保持していることがほとんど一般に分かっているので、特に興味深いものであった。検索からの出力ステミング（stemming）は、一般的には、照会マウス配列に最も相同な配列のリスト、各配列に対する相同性パーセントおよび対応するマウス配列に対する各ヒト配列の配置であった。分析は、一般に、Ｌ鎖および重鎖について別個に行われた。
【００８８】
“ＦＲ最良適合”アプローチによれば、不一致アミノ酸数は、照会マウスＦＲサブセットとヒトＦＲサブセットとの間で最小限に抑えられた。ほとんどの場合、適当なヒトフレームワーク領域サブセットは、次の同一性基準に基づいて選択された。Ｌ鎖については、マウスＦＲ１のアミノ酸配列は、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約８０％同一であり、マウスＦＲ２は、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約９０％同一であり、マウスＦＲ３は、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約９０％同一であり、マウスＦＲ４は、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約７５％同一であった。そして、重鎖については、マウスＦＲ１のアミノ酸配列は、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約８０％同一であるように選択され、マウスＦＲ２は、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約８５％同一であり、マウスＦＲ３は、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約７０％同一であるように選択され、マウスＦＲ４は、ヒトＦＲサブセットに対して少なくとも約９０％同一であった。一般的には、類似のヒトフレームワーク領域配列候補を評価する場合、保存（conservative）アミノ酸置換が好都合であった。このような因子を考慮した場合、得られたヒトフレームワーク領域は、キメラｃＨ３６抗体のヒト化の良好な基準点として機能することが分かった。
【００８９】
目的とするヒトフレームワーク領域について一旦決定が行われたら、組換えポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＬ鎖および重鎖の両方で目的とするアミノ酸置換を行った。一般的には、マウス可変ドメインフレームワークに突然変異誘発を起こさせて、目的とする残基を含むようにするために、オリゴヌクレオチドを作り、使用した。種々の長さを有するオリゴヌクレオチドを使用した。組換えＰＣＲおよび関連方法に関する一般的な開示についてはＷＯ９２／０７０７５参照。
【００９０】
一般に、クローニングには標準ＰＣＲを使用して、クローニングまたは診断用制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し、可変ドメインの末端に位置するアミノ酸残基を変化させた。多数のアミノ酸残基を一度に変化させるには、特にこれらの残基が可変ドメインの中央にあった場合は、ＰＣＲに基づく突然変異誘発を使用した。１つ以上のアミノ酸置換を一度に導入するには、特定部位の突然変異誘発を使用した。各工程後、部分的にヒト化されたクローンを配列決定し、これらの可変ドメインの一部を、後で、発現ベクター中へクローン化した。これらの操作を行う更に具体的な方法は、実施例の項に記載されている。
【００９１】
前記“ＦＲ最良適合”アプローチを、各非ヒトＦＲをヒト化するのに適用した後、ヒト化されたフレームワーク領域（ｈｕＦＲ）および／またはＣＤＲをコードする突然変異誘発を受けた核酸を、Ｌ鎖または重鎖定常ドメインをコードする適当なＤＮＡへ結合した。次いで、このような構成物を、発現ベクター中へクローン化し、宿主細胞、好ましくは哺乳類細胞中へトランスフェクトした。これらの工程は、当該分野において知られている組換えおよび細胞培養技術を用いることにより行われた。
【００９２】
１つのアプローチにおいて、下記の方法により、ヒト化された抗体を調製することができる。
（ａ）発現宿主およびＩｇ重鎖またはＬ鎖の可変ドメインを少なくともコードするＤＮＡ配列に動作可能に結合した適当なプロモーターに適したレプリコンを含む第１の発現ベクターを調製する。この可変ドメインは、個別にヒト化されたフレームワーク領域（ＦＲ１〜４）および目的とする抗体からのマウスＣＤＲ１〜３から成る。
（ｂ）相補的ＩｇＬ鎖または重鎖それぞれの可変ドメインを少なくともコードするＤＮＡ配列に動作可能に結合した適当なプロモーターを含む第２の複製可能な発現ベクターを調製する。この可変ドメインは、対応する個別にヒト化されたフレームワーク領域（ＦＲ１〜４）および抗体からのマウスＣＤＲ１〜３から成る。
（ｃ）細胞株を第１のまたは両方の調製ベクタ−でトランスフェクトする。
（ｄ）該トランスフェクトされた細胞株を培養して、該ヒト化された抗体を産生する。
好ましくは、工程（ａ）および（ｂ）におけるＤＮＡ配列は、ヒト抗体鎖からの適当な定常ドメインをコードする。適当なアイソタイプとしては、これらに制限されるものではないが、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４が挙げられる。
【００９３】
また、本発明の適当なヒト化された抗体は、Ｉｇ重鎖またはＬ鎖の可変ドメインを少なくともコードするＤＮＡ配列に動作可能に結合した適当なプロモーターを含む単一の複製可能な“メガ“ベクターを作ることによって、調製することができる。この可変ドメインは、個別にヒト化されたフレームワーク領域（ＦＲ１〜４）および対象の抗体からのマウスＣＤＲ１〜３のそれぞれを含有する。
【００９４】
一実施態様において、メガベクターは、更に、相補的ＩｇＬ鎖または重鎖それぞれの可変ドメインを少なくともコードするＤＮＡ配列に動作可能に結合した適当なプロモーターを含むであろう。この可変ドメインは、対応する個別にヒト化されたフレームワーク領域（ＦＲ１〜４）およびｃＨ３６抗体からのマウスＣＤＲ１〜３またはその他の適当なＣＤＲを含有する。メガベクターの使用は、ヒト化された抗体の単一のベクターからの発現が必要である際に、多くの場合、適当であろう。
【００９５】
ヒト化されたｃＨ３６抗体を作る上記方法が、本発明による他のヒト化された抗体および抗原結合断片を作るのに容易に採用されうることは明らかであろう。
この発明のヒト化方法に好都合な抗体の具体例は、後に述べる実施例のほかに、ＵＳＳＮ  Ｎｏ．０９／９９０，５８６および６０／３４３，３０６出願に開示されている。
【００９６】
“組み立てる（assembling）”または“組み立てられた（assembled）”という語は、ヒト化されたフレームワークまたはフレームワーク領域をベクター内へ導入するのに標準組換え技術を使うことを意味する。このような組立て（assembly）は、アプローチの１つもしくは組み合わせ、または合成ＤＮＡ合成技術により行われることができ、これらのアプローチとしては、反復変化を単一フレームワークまたはフレームワーク領域配列に導入すること、断片を切断し、共に張り合わせること（制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼの使用による）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般には、Harlow and Lane、上掲、およびAusubel et al.、上掲参照。
【００９７】
ヒト化された抗体を作る上記方法は、ほぼ任意の利用可能な突然変異誘発技術で実施することができる。特に、関連する方法工程では、フレームワーク内の目的とする齧歯類アミノ酸を適当なヒトアミノ酸で置換するのに、特定部位の突然変異誘発および／または標準ＰＣＲ方法を用いることができる。改変された断片もしくは全コーディング領域のＤＮＡ合成、標準組換えＤＮＡを用いるin vitro(試験管内)組み換え、遺伝子工学技術またはそれらの組み合わせにより、それを達成することもできる。一般的には、改変された（ヒト化された）フレームワークまたはフレームワーク領域の配列は、データベースからの選択されたヒトフレームワークまたはフレームワーク領域配列に対応する。
【００９８】
本発明の適当な核酸は、ここに開示されたヒト化抗体またはその断片の重鎖またはＬ鎖の少なくとも１つをコードする。一般的には、核酸は、単離された核酸を含む組換えＤＮＡベクターである。ＤＮＡベクターは、一般的には、更に、自然結合または異種プロモーター領域を始め、ヒト化された免疫グロブリンコーディング配列に動作可能に結合した発現制御ポリヌクレオチド配列を含むであろう。発現制御配列は、真核宿主細胞を軽質転換またはトランスフェクトすることのできるベクター内の真核プロモーター系であることが好ましいであろうが、原核宿主の制御配列を用いてもよい。ベクターが一旦適当な宿主に取り込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高度発現に適した条件下に保持され、所望に応じて、Ｌ鎖、重鎖、Ｌ鎖／重鎖ダイマー、完全な抗体、結合断片またはその他の免疫グロブリン形態のコレクションおよび精製が次に行われてもよい。
【００９９】
目的とするヒト化された抗体を最終的に発現させることのできる本発明の核酸配列は、種々の異なる技術によるほか、種々の異なるポリヌクレオチド（ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ポリヌクレオチド等）および成分（例えば、Ｖ、Ｊ、ＤおよびＣ領域）から形成されることができる。ゲノムおよび合成配列を結合することは、現在最も一般的な生産方法であるが、ｃＤＮＡ配列を利用してもよい。例えば、S. L. Morrison、上掲、Oi et al.、上掲、Teng et al.、上掲、Kozbor et al.、上掲、Olsson et al,、上掲、ヨーロッパ特許公開番号第０２３９４００号、L. Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988)およびそれらの引用文献参照。
【０１００】
本発明の使用は、広範囲の適当な宿主、例えば、哺乳類、植物または微生物宿主細胞で可能である。一実施態様において、適当なＤＮＡ発現ベクターとしては、目的とするＤＮＡ配列で形質転換されるこれらの細胞の検出を可能にする１つ以上の選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ジェネティシン、ヒグロマイシン、ピューロマイシン、ネオマイシン等が挙げられる（例えば、米国特許番号第４,７０４,３６２号参照。これは、ここに引用により開示される。）。大腸菌は、本発明のポリヌクレオチドをクローン化するのに特に有用な１つの原核宿主である。他の使用に適した微生物宿主としては、枯草菌などのバシラス菌、サルモネラ、セラチアなどの他の腸内細菌、各種シュードモナス種および放線菌類（例えば、ストレプトマイセス種）、酵母（例えば、サッカロマイセス種）、菌類（例えば、アスペルギルス種）などのその他の微生物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。これらの原核宿主において、発現ベクターを作ることもでき、このベクターは、一般的に、宿主細胞で使用可能な発現制御配列を含むであろう（例えば、プロモーターおよび複製起点）。更に、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、ファージ・ラムダからのプロモーター系などの種々のよく知られたプロモーターがいくらでも存在するであろう。通常、プロモーターは、場合によってはオペレーター配列と共に、発現を制御し、転写および翻訳を開始し、完了するために、リボソーム結合部位配列などを有している。酵母などの他の微生物を発現に用いてもよい。サッカロマイセスは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは解糖酵素および複製起点、終止配列などを所望に応じて含む、プロモーターなどの発現制御配列を有している好適なベクターがある場合、好ましい宿主である。
【０１０１】
上記微生物に基づく系の他に、本発明のポリペプチドを発現させ、産生するのに、真核宿主を用いてもよい。Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publisher, N.Y, N.Y. (1987)参照。これは、ここに参考のために開示される。多くの実施態様において、一般には、真核宿主が好ましく、代表的には、哺乳類細胞株が好ましいが、これらに限定されるものではなく、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＮＳ０細胞、ＢＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株またはハイブリドーマの形質転換されたＢ細胞が挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーなどの発現制御配列（Queen et al., Immunol. Rev. 89, 46-68 (1986)）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニレーション（polyadenylation）部位および転写終止配列などの必要な処理情報部位を含む。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。他の実施態様においては、真核宿主が制限なしに植物または植物細胞である場合、真核宿主が好ましく、例えば、アラビドプシス、ニコチニアなどが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、本発明の抗体を発現させ、作るのに、植物細胞培養も使用できる。別の実施態様においては、真核宿主が昆虫細胞、鳥類種、または形質転換動物である場合には、真核宿主が一般に好ましいであろう。
【０１０２】
本発明を実施するための好ましいＤＮＡベクターは、下記の動作可能に結合した配列：抗生物質耐性マーカー、例えば、アンピシリン耐性、Ｆ１由来および重鎖（ＨＣ）またはＬ鎖（ＬＣ）可変ドメインを含む。その可変ドメインを、順序通りに、動作可能に結合した次の成分：ＨＣ可変ドメイン、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常ドメイン、第１ポリＡ部位、ＳＶ４０プロモーター、ネオマイシン耐性などの抗生物質耐性マーカー、第２ポリＡ部位、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーおよび適当なリーダー配列を含む適当なＨＣ発現ベクターに挿入することができる。
【０１０３】
更に好ましいＤＮＡベクターは、イントロンが適当なヒトカッパ定常ドメインに動作可能に結合した齧歯類カッパイントロン（例えば、マウス）に動作可能に結合したＬＣ可変ドメイン、およびネオマイシン耐性などの抗生物質耐性マーカーを含む。
【０１０４】
上述のように、単一の核酸から本発明のヒト化された抗体を発現させるのが、多くの場合、非常に好ましいであろう。好ましいＤＮＡベクターは、ここでは“メガ”ベクターと呼ばれることがあり、順序通りに動作可能に結合した次の成分：ＳＶ４０プロモーター、ネオマイシンなどの抗生物質耐性マーカー、第１ポリＡ部位、第１ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＬＣ可変ドメイン、齧歯類カッパイントロン（例えば、マウス）、ヒトカッパエクソン、第２ポリＡ部位、第２ＣＭＶプロモーター／エンハンサー、ＨＣ可変ドメインおよびヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４重鎖定常ドメインを含む。このようなメガベクターの具体例は、実施例１〜３で後述するヒト化された抗ＴＦＩｇＧ１抗体発現ベクターである。図２も参照。
Ａ  ヒト化された抗組織因子結合抗体の調製
【０１０５】
ヒト化された抗組織因子結合抗体の調製および使用については、係属中の米国出願番号第０９／９９０，５８６号および第６０/３４３,３０６号にすでに記載した。後述の実施例１〜３も参照。
【０１０６】
簡単にいうと、好ましい抗体は、ヒト組織因子と結合して、結合複合体を形成する。組織因子は、天然に存在するものでも、組換えヒト（ｒｈＴＦ）でもよい。複合体に結合する第X因子または第IX因子は、阻害されることが好ましい。好ましい発明実施態様において、ヒト化された抗体は、約１ｎＭ未満、好ましくは約０．５ｎＭ未満、より好ましくは約０．０１ｎＭから約０．４ｎＭまでの間のｈＴＦへの見掛け親和定数（ＫＡ、Ｍ−１）を有している。ヒト化された抗体への親和定数を測定することについての更なる情報については、後述の実施例１〜３を参照。“特異的結合”とは、ＲＩＡ、ウエスターンブロットまたはＥＬＩＳＡなどの標準免疫学的技術により測定されたとき、ヒト化された抗体が、ＴＦ（またはｒｈＴＦ）とは検出可能な結合複合体を形成し、他の抗原とは結合体を形成しないことを意味する。
【０１０７】
この発明により作られたより好ましいヒト化された抗ＴＦ結合抗体は、表面プラズモン分析（特に、後述する実施例３の方法によるＢＩＡＣｏｒｅ分析）により測定した場合、少なくとも約１×１０８Ｍ−１の天然ヒトＴＦへの見掛け親和定数（ＫＡ、Ｍ−１）を示し、より好ましくは、表面プラズモン分析により測定した場合、少なくとも約５×１０８Ｍ−１、更に好ましくは、表面プラズモン共鳴分析により測定した場合、少なくとも約３×１０９Ｍ−１の天然ヒトＴＦへの見掛け親和定数（ＫＡ、Ｍ−１）を示す。本発明の抗体のこのような実質的な結合親和性は、以前に報告された抗体のはるかに低い結合親和性とはまったく対照的である。
【０１０８】
この点について、まったく低有効濃度のヒト化された組織因子結合抗体を用いることができ、例えば、後述する実施例３に記載されているようなin vitro(生体外)測定法において、所望のようにＴＦ機能を阻害するのに（例えば、少なくとも９５、９８または９９パーセント阻害）比較的低濃度の抗体を使用することができる。本方法によってヒト化された特定の組織因子結合抗体の核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および３）およびアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４）配列、即ち、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７。図面の図１Ａおよび図１Ｂ参照。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２は、それぞれ、Ｌ鎖可変ドメインの核酸およびアミノ酸であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４は、それぞれ、重鎖可変ドメインの核酸およびアミノ酸であり、超可変領域（ＣＤＲ即ち相補性決定領域）には、これらの配列のすべてにおいて下線が引かれている。
【０１０９】
本発明の別の組織因子結合ヒト化抗体は、図１Ａおよび図１Ｂに示すＬ鎖または重鎖の一方かまたは両方に対して、実質的なアミノ酸配列同一性を有するであろう。より詳しくは、このような抗体としては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／または４に対して少なくとも約７０パーセントの相同性（アミノ酸配列同一性）、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／または４に対して約８０パーセント以上の相同性、更に好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および／または４に対して約８５、９０または９５パーセント以上の相同性を有するものが挙げられる。
【０１１０】
本発明の更に詳細な組織因子結合ヒト化抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４の超可変領域（図１Ａおよび図１Ｂにおいて二重の下線で示されている）に対して高度のアミノ酸配列同一性を有するであろう。具体的な抗体は、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７のＬ鎖可変ドメインの対応する超可変領域の１つ、２つまたは３つに対して高度の配列同一性（少なくとも９０％または９５％のアミノ酸配列同一性）を有するか、あるいはこれらと同一であるＬ鎖可変ドメインの１つ、２つまたは３つの超可変領域を持っているであろう（これらの超可変領域は、図１Ａにおいて下線で示され、次の通りである。
１）ＬＡＳＱＴＩＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
２）ＡＡＴＮＬＡＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および
３）ＱＱＶＹＳＳＰＦＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
【０１１１】
ここに記載された方法でヒト化され、組織因子に結合している更に具体的な抗体は、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の重鎖可変ドメインの対応する超可変領域の１つ、２つまたは３つに対して高度の配列同一性（少なくとも９０％または９５％のアミノ酸配列同一性）を有するか、あるいはこれらと同一である重鎖可変ドメインの１つ、２つまたは３つの超可変領域を持っているであろう（これらの超可変領域は、図１Ｂにおいて下線で示され、次の通りである。
１）ＴＤＹＮＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
２）ＹＩＤＰＹＮＧＩＴＩＹＤＱＮＦＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）および
３）ＤＶＴＴＡＬＤＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
【０１１２】
本発明のある核酸は、次に示す適度に厳しい(stringent) 条件（ここでは、“標準ストリンジェンシイ（normal stringency）”条件と呼ばれる）下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列に結合するのに十分な長さのもの（好ましくは、少なくとも約１００、２００または２５０塩基対）であることが好ましい：０．９Ｍ生理的食塩水／０．１２Ｍクエン酸ナトリウム（６×ＳＳＣ）緩衝液中に２０％ホルムアミドを含む交雑緩衝液を３７℃の温度で使用し、３７℃においてその２×ＳＳＣ緩衝液で１回洗浄したとき、結合が残存している交雑緩衝液の使用。
【０１１３】
より具体的には、本発明のある核酸（好ましくは、少なくとも約１００、２００または２５０塩基対）は、下記の高度に厳しい条件（ここでは、“高ストリンジェンシイ（high stringency）”条件と呼ばれる）下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列に結合するであろう：０．９Ｍ生理的食塩水／０．１２Ｍクエン酸ナトリウム（６×ＳＳＣ）緩衝液中に２０％ホルムアミドを含む交雑緩衝液を４２℃の温度で使用し、４２℃においてその１×ＳＳＣ緩衝液で２回洗浄したとき、結合が残存している交雑緩衝液の使用。
【０１１４】
本発明の核酸は、好ましくは、少なくとも２０塩基対、より好ましくは、少なくとも約５０塩基対からなり、更に好ましくは、本発明の核酸は、少なくとも約１００、２００、２５０または３００塩基対を有するものである。
一般に、本発明の好ましい核酸は、好ましい結合親和性およびここに述べる他の性質を示す本発明の抗体を発現するであろう。
【０１１５】
本発明の他の核酸は、図１Ａおよび図１Ｂに示すＬ鎖または重鎖の一方かまたは両方に対して、実質的な配列同一性を有するであろう。より詳しくは、好ましい核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および／または３に対して少なくとも約７０パーセントの相同性（ヌクレオチド配列同一性）、より好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および／または３に対して約８０パーセント以上の相同性、更に好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および／または３に対して約８５、９０または９５パーセント以上の相同性を有する配列からなるであろう。
【０１１６】
本発明の更に具体的な核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および３の超可変領域（図１Ａおよび図１Ｂにおいて下線で示されている）に対して高度の配列同一性を有するであろう。このような核酸としては、抗体Ｌ鎖可変ドメインをコードすると共に、超可変領域をコードし、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の対応する超可変領域をコードする配列の１つ、２つまたは３つに対して高度の配列同一性（少なくとも９０％または９５％のヌクレオチド配列同一性）を有するか、あるいはこれらと同一である１つ、２つまたは３つの配列を持つものが挙げられる。（これらの超可変領域は、図１Ａにおいて下線で示され、次の通りである。
１）ＣＴＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
２）ＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）および
３）ＣＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＣＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴＴＣＡＣＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
【０１１７】
より具体的な核酸は、抗体重鎖可変ドメインをコードすると共に、超可変領域をコードし、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７の対応する超可変領域をコードする配列の１つ、２つまたは３つに対して高度の配列同一性（少なくとも９０％または９５％のヌクレオチド配列同一性）を有するか、あるいはこれらと同一である１つ、２つまたは３つの配列を持つ。（これらの超可変領域は、図１Ｂにおいて下線で示され、次の通りである。
１）ＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
２）ＴＡＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴＣＴＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）および
３）ＧＡＴＧＴＧＡＣＴＡＣＧＧＣＣＣＴＴＧＡＣＴＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）
【０１１８】
ＴＦに結合する本発明の更に具体的なヒト化された抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）１、２、３および４のそれぞれが、図３Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２〜８２）に示されるＬ鎖ＦＲ配列、好ましくは、図３Ａに“ＬＣ−０９”として示される配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約９５％以上の同一性を有しているものである。更に具体的なヒト化された抗体は、図５Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）または図６Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）に示される配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約９５％以上の同一性を有するＬ鎖定常ドメインを含む。
【０１１９】
更に具体的なヒト化された抗体は、フレームワーク領域（ＦＲ）１、２、３および４のそれぞれが、図４Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３〜９６）に示される重鎖配列、好ましくは、図４Ａに“ＨＣ−０８”として示される配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約９５％以上の同一性を有しているものである。更なるヒト化された抗体は、図５Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）または図６Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）に示される配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約９５％以上の同一性を有する重鎖定常ドメインを含む。
【０１２０】
ある実施態様において、ヒト化された抗体は、係属中の米国出願番号第０９／９９０，５８６号および第６０/３４３,３０６号に開示されているようなＩｇＧ１（ｈＯＡＴ）またはＩｇＧ４（ｈＦＡＴ）アイソタイプを有するであろう。
【０１２１】
本発明により、ここに記載されるヒト化された抗体の機能性断片も提供される。このような断片の例としては、約１ｎＭ未満、好ましくは約０．５ｎＭ未満、より好ましくは約０．０１ｎＭから約０．４ｎＭまでの間の親和定数（Ｋｄ）でＴＦと結合するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましいのは、抗原結合Ｆａｂ，Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）２断片である。
【０１２２】
上述のように、本発明は、少なくとも１つのマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト化された抗体を特徴とする。１つの発明実施態様において、抗体は、ヒト組織因子（ＴＦ）に特異的に結合して、複合体を形成する。一般的には、ＴＦまたはＴＦ：ＦＶＩＩａへの第X因子または第IX因子の結合およびＴＦ：ＦＶＩＩａによるそれへの活性化が阻害される。上述のように、好ましいＣＤＲ（Ｌ鎖および重鎖）は、齧歯類源由来、一般的にはマウス由来である。
【０１２３】
本発明のヒト化された抗体の一実施態様において、抗体は、更に、少なくとも１つのフレームワーク領域（ＦＲ）サブセットを含む。すべてのＦＲ（Ｌ鎖および重鎖）がヒトであることが好ましい。
【０１２４】
より詳しい実施態様に於いて、ヒトＴＦに結合する重鎖超可変領域の第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、図４Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して少なくとも約９５％以上同一である。一般的には、重鎖超可変領域の第２のＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、図４Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０１）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、好ましくは、少なくとも約９５％以上同一である。好ましくは、重鎖超可変領域の第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、図４Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）に示されるＣＤＲ３配列に対して少なくとも９０％同一であり、より好ましくは、その配列に対して少なくとも約９５％以上同一である。
【０１２５】
他の発明実施態様に於いては、ヒトＴＦに結合するＬ鎖超可変領域の第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、図３Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、好ましくは、少なくとも約９５％以上同一である。一般的には、Ｌ鎖超可変領域の第２のＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、図３Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、好ましくは、約９５％以上同一である。好ましくは、Ｌ鎖超可変領域の第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、図３Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）に示されるＣＤＲ３配列に対して少なくとも９０％同一であり、より好ましくは、その配列に対して約９５％以上同一である。
【０１２６】
本発明の更なるヒト化された抗体は、図４Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）において“ＦＲ１  ＨＣ−０８”として示されるアミノ酸配列に対して、ＦＲ１が少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して約９５％以上同一であるヒトＴＦに結合する重鎖超可変領域の第１のフレームワーク領域（ＦＲ１）を含む。一実施態様に於いて、ＦＲ１は、次のアミノ酸変化の少なくとも１つを含む：Ｅ１がＱへ；Ｑ５がＶへ；Ｐ９がＧへ；Ｌ１１がＶへ；Ｖ１２がＫへ；Ｑ１９がＲへ；およびＴ２４がＡへ。これらのアミノ酸変化のすべてが多くの用途に好ましい状態で、ＦＲ１は、これらのアミノ酸変化の２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含むことが好ましい。
【０１２７】
ヒトＴＦに好適に結合する本発明の更なるヒト化された抗体は、図４Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）において“ＦＲ２  ＨＣ−０８”として示される配列に対して、ＦＲ２が少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して約９５％以上同一である重鎖超可変領域の第２のフレームワーク領域（ＦＲ２）を含む。一実施態様に於いて、ＦＲ２は、次のアミノ酸変化の少なくとも１つを含む：Ｈ４１からＰへ；およびＳ４４からＧへ。好ましいＦＲ２は、これらのアミノ酸変化の両方を含む。
【０１２８】
本発明は、重鎖超可変領域の第３のフレームワーク領域（ＦＲ３）が、図４Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）において“ＦＲ３  ＨＣ−０８”として示される配列に対して少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して約９５％以上同一であるヒトＴＦに結合する、ヒト化された抗体を特徴とするものでもある。一実施態様に於いて、ＦＲ３は、次のアミノ酸変化の少なくとも１つを含む：Ｓ７６からＴへ；Ｔ７７からＳへ；Ｆ８０からＹへ；Ｈ８２からＥへ；Ｎ８４からＳへ；Ｔ８７からＲへ；Ｄ８９からＥへ；およびＳ９１からＴへ。これらのアミノ酸変化の７つすべてが一般に好ましいが、好ましいＦＲ３は、これらのアミノ酸変化の２つ、３つ、４つ、５つまたは６つを含む。
【０１２９】
重鎖超可変領域の第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）が、図４Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）において“ＦＲ４  ＨＣ−０８”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して少なくとも約９５％以上同一であるヒトＴＦに好適に結合する、ヒト化された抗体を特徴とするものでもある。ＦＲ４は、次のアミノ酸変化を含むことが好ましい：Ｌ１１３からＶへ。
【０１３０】
ヒトＴＦに結合する、本発明による更なるヒト化された抗体は、図３Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）において“ＦＲ１  ＬＣ−０９”として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して少なくとも約９５％以上同一であるＬ鎖超可変領域の第１のフレームワーク領域（ＦＲ１）を特徴とする。一実施態様に於いて、ＦＲ１は、次のアミノ酸変化の少なくとも１つを含む：Ｑ１１からＬへ；Ｌ１５からＶへ；Ｅ１７からＤへ；およびＳ１８からＲへ。４つのアミノ酸変化すべてが一般に好ましいが、好ましいＦＲ１は、このようなアミノ酸変化の２つまたは３つを含む。
【０１３１】
本発明は、Ｌ鎖超可変領域の第２のフレームワーク領域（ＦＲ２）が、図３Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）において“ＦＲ２  ＬＣ−０９”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して少なくとも約９５％以上同一であるヒトＴＦに結合する、ヒト化された抗体を特徴とするものでもある。好ましいＦＲ２は、次のアミノ酸変化を含む：Ｑ３７からＬへ。
【０１３２】
本発明は、Ｌ鎖超可変領域の第３のフレームワーク領域（ＦＲ３）が、図３Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）において“ＦＲ３  ＬＣ−０９”として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して少なくとも約９５％以上同一であるヒトＴＦに結合する、ヒト化された抗体を含むものでもある。一実施態様に於いて、ＦＲ３は、次のアミノ酸変化の少なくとも１つを有する：Ｋ７０からＤへ；Ｋ７４からＴへ；Ａ８０からＰへ；Ｖ８４からＡへ；およびＮ８５からＴへ。５つのアミノ酸変化すべてが一般に好ましいが、好ましいＦＲ３は、このようなアミノ酸変化の２つ、３つまたは４つを含む。
【０１３３】
ヒトＴＦに結合する、本発明の更なるヒト化された抗体は、図３Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）において“ＦＲ４  ＬＣ−０９”として示される配列に対して、少なくとも９０％同一であり、好ましくは、その配列に対して少なくとも約９５％以上同一であるＬ鎖超可変領域の第４のフレームワーク領域（ＦＲ４）を含む。一実施態様に於いて、ＦＲ４は、次のアミノ酸変化の少なくとも１つ、好ましくはすべてを含む：Ａ１００からＱへ；およびＬ１０６からＩへ。
【０１３４】
本発明は、上記ヒト化された抗体のヒトＴＦ結合断片を特徴とするものでもある．このような断片の例としては、Ｆａｂ，Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）２が挙げられる。
この発明により作られる、更なる好ましいヒト化された抗ＴＦ抗体については、ＵＳＳＮ０９／９９０，５８６および６０／３４３，３０６特許出願を参照のこと。そこに開示されているように、次の３つの核酸ベクター、ｐＳＵＮ３６（ヒト化された抗ＴＦ抗体ＩｇＧ１−ＨＣ発現ベクター）、ｐＳＵＮ３７（ヒト化された抗ＴＦ抗体ＩｇＧ４−ＨＣ発現ベクター）およびｐＳＵＮ３８（ヒト化された抗ＴＦ抗体ＬＣ発現ベクター）が、ブタペスト条約に従って、10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209のAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄托されている。これらのベクターには、次の受託番号が与えられた：ＰＴＡ−３７２７（ｐＳＵＮ３６）、ＰＴＡ−３７２８（ｐＳＵＮ３７）およびＰＴＡ−３７２９（ｐＳＵＮ３８）。
【０１３５】
この発明のヒト化された抗ＴＦ抗体を作り、使用するための適当な発現、精製方法は、ＵＳＳＮ０９／９９０，５８６および６０／３４３，３０６特許出願に開示されている。
Ｂ  ヒト化された抗ＬＴＡ結合抗体の調製
【０１３６】
元の抗ＬＴＡキメラ抗体は、次の特許出願の主題である："Opsonic and Protective Monoclonal and Chimeric Antibodies specific of Lipotechoic Acid of Gram Positive Bacteria"、継続中のU.S.S.N０９／０９７，０５５（ＷＯ９８／５７９９４）として公開）。
【０１３７】
ヒト化された抗ＬＴＡ（リポタイコ酸）結合抗体の調製および使用は、実施例４、５で後述する。好ましい抗体は、一般に、ＬＴＡと結合して、特定の結合複合体を形成する。特定のキメラ抗ＬＴＡ抗体は、約１μＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、より好ましくは約２０ｎＭから約２ｎＭまでの間の見掛け親和定数（ＫＡ、Ｍ−１）で、抗原に結合する。抗ＬＴＡ抗体を特徴づけることに関する更なる情報については、後述の実施例５を参照のこと。
【０１３８】
リポタイコ酸は、ブドウ球菌、ある種の連鎖球菌およびエンテロコッカス属を始めとするある種のグラム陽性菌に見出される細胞成分である。それは、分子量が異分散(heterodisperse) である混合高分子ポリマーの一部として、細胞壁にくみこまれており、このＬＴＡ成分は、細胞壁内およびその断片内に見出すことができ、極めて広い分子量範囲を有することができる。
【０１３９】
より好ましいヒト化された抗ＬＴＡ結合抗体は表面プラズモン分析（特に、後述する実施例３の方法によるＢＩＡＣｏｒｅ分析）により測定した場合、少なくとも約５×１０６Ｍ−１のＬＴＡへの結合定数（ＫＡ、Ｍ−１）を示し、より好ましくは、表面プラズモン分析により測定した場合、少なくとも約１×１０７Ｍ−１、更に好ましくは、表面プラズモン共鳴分析により測定した場合、少なくとも約１×１０８Ｍ−１のＬＴＡへのＫａを示す。
【０１４０】
一実施態様に於いて、ＬＴＡ抗原に結合するＬ鎖超可変領域の第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）は、図７Ａ（下線部分）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であり、好ましくは、少なくとも約９５％以上同一である。一般的には、同じＬ鎖超可変領域の第２のＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、図７Ａ（下線部分）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であり、好ましくは、少なくとも約９５％以上同一である。好ましくは、Ｌ鎖超可変領域の第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３）も、図７Ａ（下線部分）に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは、少なくとも約９５％以上の配列同一性を示す。
【０１４１】
重鎖超可変領域に関して、更に好ましい抗ＬＴＡ抗体は、図７Ｂ（下線部分）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して、少なくとも約９０％の同一性、好ましくは、少なくとも約９５％以上の同一性を示す。一般的には、同じＬ鎖超可変領域の第２のＣＤＲ（ＣＤＲ２）は、図７Ｂ（下線部分）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であり、好ましくは、少なくとも約９５％以上の同一性を示す。好ましくは、Ｌ鎖超可変領域の第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３）も、図７Ｂ（下線部分）に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも約９０％同一であり、より好ましくは、少なくとも約９５％以上の配列同一性を示す。
【０１４２】
本発明の更に具体的な抗ＬＴＡ抗体としては、フレームワーク領域サブセット（ＦＲ）１、２、３および４のそれぞれが、実施例５の表６に示されるＬ鎖ＦＲ配列のそれぞれに対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも約９５％、９８％から１００％までの同一性を有するものが挙げられる。一実施態様に於いて、フレームワークは、次のアミノ酸変化の少なくとも１つ、好ましくはすべてを含む：Ｄ１からＱへ；Ｓ５からＴへ；Ｌ１１からＭへ；Ｅ１７からＤへ；Ｍ２１からＩへ；Ｓ４１からＱへ、Ｒ７６からＡへ；Ｖ７７からＭへ；およびＭ１０２からＫへ。特に好ましい抗ＬＴＡ抗体は、実施例５の表６において、Ａ１１０−ＬＣについて示されるＬ鎖ＦＲサブセット、即ち、ＬＣ−ＦＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の残基１〜２３）、ＬＣ−ＦＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の残基２４〜３８）、ＬＣ−ＦＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の残基３９〜７０）およびＬＣ−ＦＲ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の残基７１〜８０）のそれぞれの少なくとも１つ、好ましくはすべてを有する。
【０１４３】
ＬＴＡ抗原に特異的に結合する、更に具体的なヒト化された抗体としては、フレームワーク領域サブセット（ＦＲ）１、２、３および４のそれぞれが、実施例５の表７に示される重鎖配列に対して、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは、約９５％、９８％から１００％までの同一性を有するものが挙げられる。一実施態様に於いて、フレームワークは、次のアミノ酸変化の少なくとも１つ、好ましくはすべてを含む：Ｍ３からＱへ；Ｋ１５からＧへ；Ｑ７８からＫへ；Ｓ７９からＮへ；Ｍ８０からＳへ；Ｎ８７からＳへ、Ｍ９５からＶへ；Ｖ９９からＡへ；およびＬ１１９からＶへ。特に好ましい抗ＬＴＡ抗体は、実施例５の表７において、Ａ１１０−ＨＣについて示されるＨ鎖ＦＲサブセットのそれぞれの少なくとも１つ、好ましくはすべてを有する。即ち、ＨＣ−ＦＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の残基１〜２５）、ＨＣ−ＦＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の残基２６〜３９）、ＨＣ−ＦＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の残基４０〜７１）およびＨＣ−ＦＲ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の残基７２〜８２）である。
【０１４４】
いくつかの実施態様において、ヒト化された抗ＬＴＡ抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ｈＯＡＴに類似）またはＩｇＧ４重鎖定常ドメイン（ｈＦＡＴに類似）アイソタイプを有するであろう。係属中のＵＳＳＮ０９／９９０，５８６および６０／３４３，３０６特許出願参照。
更に好ましい抗ＬＴＡ抗体は、実施例５の表６および７に示されるＬ鎖および重鎖ＦＲのそれぞれを有するであろう。
【０１４５】
更に好ましいヒト化された抗ＬＴＡ抗体は、図９Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも約９８％以上の同一性を持つアミノ酸Ｌ鎖可変ドメインを有するであろう。更に好ましくは、このような抗体は、図９Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）に示される配列と同一であるＬ鎖可変ドメインを有するであろう。更に好ましい抗体は、図９Ｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性、好ましくは、少なくとも約９８％以上の同一性を持つアミノ酸重鎖可変ドメインを有するであろう。更に好ましくは、このような抗体は、図９Ｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）に示される配列と同一である重鎖可変ドメインを有するであろう。
【０１４６】
本発明のある特定の例においては、ＬＴＡに特異的に結合し、少なくとも１つの齧歯類ＣＤＲ、通常はマウス由来のものを含むヒト化された抗ＬＴＡ抗体が提供される。ＬＴＡ抗原がこの抗体に特異的に結合して、複合体を形成することが好ましい。このようなヒト化された抗ＬＴＡ抗体は、重鎖上に、下記成分の少なくとも１つ、好ましくはすべてを含むことも好ましい。
【０１４７】
ａ）図９Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）
ｂ）図９Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第２のＣＤＲ（ＣＤＲ２）
ｃ）図９Ｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３）
ｄ）表６Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の残基１〜２３）に“ＬＣ−ＦＲ１”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第１のフレームワークサブセット（ＦＲ１）
ｅ）表６Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の残基２４〜３８）に“ＬＣ−ＦＲ２”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第２のフレームワークサブセット（ＦＲ２）
ｆ）表６Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の残基３９〜７０）に“ＬＣ−ＦＲ３”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第３のフレームワークサブセット（ＦＲ３）
ｇ）表６Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９の残基７１〜８０）に“ＬＣ−ＦＲ４”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第４のフレームワークサブセット（ＦＲ４）
【０１４８】
特定の実施態様において、ヒト化された抗ＬＴＡ抗体は、Ｌ鎖上に、下記成分の少なくとも１つ、好ましくはすべてをも含む。
ｈ）図９Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５）に示されるＣＤＲ１アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）
ｉ）図９Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）に示されるＣＤＲ２アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第２のＣＤＲ（ＣＤＲ２）
ｊ）図９Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７）に示されるＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３）
ｋ）表７Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の残基１〜２５）に“ＨＣ−ＦＲ１”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第１のフレームワークサブセット（ＦＲ１）
ｌ）表７Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の残基２６〜３９）に“ＨＣ−ＦＲ２”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第２のフレームワークサブセット（ＦＲ２）
ｍ）表７Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の残基４０〜７１）に“ＨＣ−ＦＲ３”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第３のフレームワークサブセット（ＦＲ３）
ｎ）表７Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８の残基７２〜８２）に“ＨＣ−ＦＲ４”として示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一である第４のフレームワークサブセット（ＦＲ４）
好ましくは、ヒト化された抗体は、更に、図６Ａ（ｈＦＡＴ（ＩｇＧ４）  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）のＬ鎖定常配列を含む。ヒト化された抗体が、図６Ｂ（ＩｇＧ４  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）の重鎖定常領域を含むのも好ましい。
【０１４９】
本発明は、図９Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９〜１１４）および図９Ｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８〜１２３）それぞれに示される１つ以上のアミノ酸抗ＬＴＡＬ鎖可変ドメインおよび抗ＬＴＡ重鎖可変ドメインをコードする核酸分子を更に含む。より特定の核酸は、ここに開示される好ましい結合親和性およびその他の性質を示す抗ＬＴＡ結合抗体少なくとも一部を発現する。このような核酸の分子量は、従来のゲル電気泳動法により測定した場合、一般に、約１０００塩基対（ｂｐ）未満、好ましくは、約２００ｂｐから約７５０ｂｐまでの間であろう。
本発明による特に好ましい核酸は、図８（ｐＪＲＳ３９１）で表されるプラスミドである。
【０１５０】
本発明によって提供されるのは、ここに開示されるヒト化された抗ＬＴＡ抗体の機能性断片でもある。このような断片の例としては、約１００ｎＭ未満、好ましくは約２５ｎＭ未満、より好ましくは約１ｎＭから約５ｎＭまでの間の見掛け親和定数（ＫＡ、Ｍ−１）でＬＴＡに結合するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましいのは、抗原結合Ｆａｂ，Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）２断片、単鎖Ｆｖおよび全長抗体である。
【０１５１】
一般に、本発明の核酸は、分離され、所定のフラクション内に存在する全核酸の通常少なくとも約０．５重量％、好ましくは少なくとも約２重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成する。部分的に純粋な核酸は、与えられたフラクション内に存在する全核酸の少なくとも約１０重量％、好ましくは少なくとも約３０重量％、より好ましくは少なくとも約６０重量％を構成する。純粋な核酸は、所定のフラクション内に存在する全核酸の少なくとも約８０重量％、好ましくは少なくとも約９０重量％、より好ましくは少なくとも約９５重量％を構成する。
【０１５２】
次の実施例は限定的なものでなく、本発明を説明するものである．次の実施例および他の部分で、本発明の方法は、マウス抗組織因子抗体Ｈ３６および抗リポタイコ酸抗体Ａ１１０のヒト化に適用される。Ｈ３６は、Ｈ３６．Ｄ２およびＨ３６．Ｄ２．Ｂ７とも呼ばれるが、Ｈ３６は、母クローンにより産生される抗体であり、Ｈ３６．Ｄ２は、一次クローンから得られ、一方、Ｈ３６．Ｄ２．Ｂ７は、二次クローンから得られる。ＴＦを阻害する抗体の能力および他の物理的性質に関して、これらの３つのクローンから産生された抗体間に差は認められていない。一般的な使用において、Ｈ３６は、これらのクローンまたは抗体を産生する関連細胞株の何れかによって産生された抗ＴＦ抗体を示すのに使われることが多い。Ｈ３６のマウス−ヒトキメラバージョンは、ｃＨ３６（およびＳｕｎｏｌ−ｃＨ３６とも）と呼ばれる。抗リポタイコ酸抗体Ａ１１０は、９６−１１０、ｃ９６−１１０およびＢＳＹＸ−Ａ１１０とも呼ばれ、マウス−ヒトキメラ抗体である。
【０１５３】
Ｈ３６抗体を作り、使用することに関する更なる開示については、ＵＳＳＮ０９／９９０，５８６および６０／３４３，３０６特許出願を参照のこと。米国特許第５，９８６，０６５号も参照。
ここに述べる文献は、すべて、参照のため、完全にそっくりそのまま開示に含まれる。
【実施例１】
【０１５４】
抗組織因子抗体のヒト化
Ｈ３６．Ｄ２と呼ばれる特定のマウス抗体（上述のようにＨ３６と呼ばれることもある）の作り方および使い方の記載は、米国特許第５，９８６，０６５号に記載されている．本実施例は、その抗体のヒト化されたバージョンの作り方および使い方を示す。ヒト化されたＨ３６抗体は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）免疫反応の可能性をできるだけ小さくするのに役立つことを始めとして、種々の用途を有している。これらおよびその他の望ましくない反応は、ヒトの治療用途でのＨ３６抗体の使用に問題を提起する。
【０１５５】
Ａ．  キメラ抗組織因子抗体（ｃＨ３６）の調製
先に述べたＨ３６抗体は、ＩｇＧ２ａマウス抗体である。臨床開発のために、Ｈ３６を先ずマウス−ヒトキメラ抗体に変換した。これを行うために、Ｈ３６用重鎖およびＬ鎖遺伝子をクローン化した（米国特許第５，９８６，０６５号参照）。重鎖可変ドメインをヒトＩｇＧ４定常（Ｆｃ）ドメインに融合し、Ｌ鎖可変ドメインをヒトカッパＬ鎖定常ドメインに融合した。得られたＩｇＧ４キメラ抗体をｃＨ３６と呼んだ（Ｓｕｎｏｌ−ｃＨ３６とも呼ぶ）。慢性疾患の患者でのＨ３６またはｃＨ３６の複数回使用のためには、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）免疫反応を減らし、あるいは取り除くように、完全にヒト化したｃＨ３６が好ましい。ｃＨ３６のヒト化について以下に述べる。
【０１５６】
Ｂ．ｃＨ３６抗体のヒト化方策
キメラ抗組織因子抗体ｃＨ３６のヒト化を、本発明の“ＦＲ最良適合”法を用いることによって行った。この方法は、既知のアミノ酸配列またはヒトＩｇＧ断片の配列を有する多数のヒトＩｇＧが、公衆データベースから入手可能であるという事実を十分に活用するものである。ｃＨ３６におけるマウス重鎖およびＬ鎖可変ドメインの個々のフレームワーク領域の配列を、Ｋａｂａｔデータベース（http://immuno.bme.nwu.edu参照）の各重鎖もしくはＬ鎖可変ドメインまたはヒトフレームワーク（またはその断片）の配列と比較する。目的とするヒト化用ヒトＩｇＧフレームワーク領域サブセットを選択するには、次の基準を用いた。（１）不一致アミノ酸の数をできるだけ少なく保った。（２）バーニアゾーン内のアミノ酸（このゾーン内のアミノ酸は、ＣＤＲ構造を調整し、抗原への一致を微調整するかもしれない。Foote, J. and Winter, G., J of Mol. Bio. 244(2), 487-499 (1992)参照）は、未変更のままにした。（３）保存アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）は、類似候補を評価する際に、好ましかった。この比較に用いる照合プログラムは、Ｋａｂａｔデータベースで入手できる。Johnson G., Wu T., "Kabat database and its application: Future directions", Nucleic Acids Res. 29, 205-206 (2001)参照。このプログラムは、マウス配列とＫａｂａｔデータベースのヒト配列との間の相同領域を見つけて、並べる。このユニークなＦＲ最良適合法を用いることにより、目的とするＩｇＧのヒト化されたＬＣまたはＨＣ可変ドメインは、少ない場合は１つのヒトＩｇＧ分子から或いは多い場合は４つの異なるヒトＩｇＧ分子から、全部で４つのＦＲを持つことが期待される。
【０１５７】
Ｂ（ｉ）ヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインフレームワーク領域の選択
ｃＨ３６・ＬＣのフレームワーク領域のそれぞれにおけるアミノ酸配列を、ＫａｂａｔデータベースのヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのＦＲにおけるアミノ酸配列と比較した。上に述べた３つの基準に基づいて、最良適合ＦＲを選択した。
【０１５８】
ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００５１９１のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ｃＨ３６・ＬＣ・ＦＲ１のヒト化のために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０１９３０８のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ｃＨ３６・ＬＣ・ＦＲ２のヒト化のために選択した。ｃＨ３６・ＬＣ・ＦＲ１において次の突然変異を行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００５１９１のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた：Ｑ１１ョ Ｌ、Ｌ１５ョ Ｖ、Ｅ１７ョ Ｄ、Ｓ１８ョ Ｒ。ｃＨ３６・ＬＣ・ＦＲ２について１つの突然変異Ｑ３７ョ Ｌを行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０１９３０８のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた（配列情報については表１Ａ参照）。
【０１５９】
ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０３８２３３のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ｃＨ３６・ＬＣ・ＦＲ３のヒト化のために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００４７３３のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ｃＨ３６・ＬＣ・ＦＲ４のヒト化のために選択した。ｃＨ３６・ＬＣ・ＦＲ３において次の突然変異を行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０３８２３３のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変領域のアミノ酸配列に合わせた：Ｋ７０ョ Ｄ、Ｋ７４ョ Ｔ、Ａ８０ョ Ｐ、Ｖ８４ョ Ａ、Ｎ８５ョ Ｔ。ｃＨ３６・ＬＣ・ＦＲ４において２つの突然変異Ａ１００ョ ＱおよびＬ１０６ョ Ｉを行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００４７３３のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた（配列情報については表１Ｂ参照）。
【０１６０】
Ｂ（ｉｉ）ヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインフレームワーク領域の選択
ｃＨ３６・ＨＣのフレームワーク領域のそれぞれにおけるアミノ酸配列を、ＫａｂａｔデータベースのヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのＦＲにおけるアミノ酸配列と比較した。上に述べた３つの基準に基づいて、最良適合ＦＲを選択した。
【０１６１】
ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００００４２のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ｃＨ３６・ＨＣ・ＦＲ１のヒト化のために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０２３９６０のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ｃＨ３６・ＨＣ・ＦＲ２のヒト化のために選択した。ｃＨ３６・ＨＣ・ＦＲ１において次の突然変異を行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００００４２のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた：Ｅ１ョ Ｑ、Ｑ５ョ Ｖ、Ｐ９ョ Ｇ、Ｌ１１ョ Ｖ、Ｖ１２ョ Ｋ、Ｑ１９ョ Ｒ、Ｔ２４ョ Ａ。ｃＨ３６・ＨＣ・ＦＲ２において２つの突然変異Ｈ４１ョ Ｐ、Ｓ４４ョ Ｇを行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０２３９６０のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた（配列情報については表２Ａ参照）。
【０１６２】
ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０３７０１０のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ｃＨ３６・ＨＣ・ＦＲ３のヒト化のために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００００４９のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、ｃＨ３６・ＨＣ・ＦＲ４のヒト化のために選択した。ｃＨ３６・ＨＣ・ＦＲ３において次の突然変異を行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０３７０１０のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた：Ｓ７６ョ Ｔ、Ｔ７７ョ Ｓ、Ｆ８０ョ Ｙ、Ｈ８２ョ Ｅ、Ｎ８４ョ Ｓ、Ｔ８７ョ Ｒ、Ｄ８９ョ Ｅ、Ｓ９１ョ Ｔ。ｃＨ３６・ＨＣ・ＦＲ２において１つの突然変異Ｌ１１３ョ Ｖを行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号００００４９のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた（配列情報については表２Ｂ参照）。
【０１６３】
表１  ｃＨ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）とヒトＬ鎖（ＬＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）ＦＲ配列の比較
【表１】
2005537009.tif 000003
【０１６４】
表２  ｃＨ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）とヒト重鎖（ＨＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）ＦＲ配列の比較
【表２】
2005537009.tif 000004
【０１６５】
目的とするヒトフレームワーク領域について一旦決定が行われたら、Ｌ鎖および重鎖の両方で目的とするアミノ酸置換を行うのに、次の３つの技法を用いた。（１）クローニングには標準ＰＣＲを使用して、クローニングまたは診断用制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し、可変ドメインの末端に位置するアミノ酸残基を変化させた。（２）多数のアミノ酸残基を一度に変化させるには、特にこれらの残基が可変ドメインの中央にあった場合は、ＰＣＲに基づく突然変異誘発を使用した。（３）１つ以上のアミノ酸置換を一度に導入するには、特定部位の突然変異誘発を使用した。特定部位の突然変異誘発は、Stratageneの“Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit”（カタログ＃２００５１８）に記載されたプロトコルに従って行われた。
【０１６６】
各工程後、部分的にヒト化されたクローンを配列決定し、これらの可変ドメインの一部を、後で、発現ベクター中へクローン化した。ＬＣ突然変異株を発現させるには、プラスミドｔＫＭＣ１８０を用い、ＨＣ突然変異株をＩｇＧ１またはＩｇＧ４としてそれぞれ発現させるには、ｐＪＲＳ３５５またはｐＬＡＭ３５６ベクターを使用した。次いで、これらのクローンの一部を組み合わせ、一過的にＣＯＳ細胞で発現させて、ＥＬＩＳＡにより発現レベルを測定した。
【０１６７】
最後の完全にヒト化された形の抗ＴＦ重鎖およびＬ鎖可変ドメインを、ここでは“メガベクター"と呼ばれることもあるものの中にクローン化し、ＩｇＧ発現のために、ＣＨＯおよびＮＳＯ細胞の中へトランスフェクトした。次いで、分析するのに十分な量のヒト化された抗ＴＦを産生するのに、安定な細胞株が使用された。得られたヒト化されたバージョンは、もともと１００％ヒトのものである（ＣＤＲ配列を考慮しない場合）。ヒト化されたＩｇＧ４カッパバージョンは、ｈＦＡＴ（humanized IgG Four Anti-Tissue Factor antibody）と呼ばれ、ＩｇＧ１カッパバージョンは、ｈＯＡＴ（humanized IgG One Anti-Tissue Factor antibody）と呼ばれる。ｃＨ３６のこれらの完全にヒト化されたバージョンは、血栓症、癌、炎症性疾患などの慢性適応症を治療することを対象としている。
【０１６８】
Ｃ  ヒト化された抗ＴＦ抗体重鎖の生成
１  ＰＣＲ増幅および抗ＴＦ・ｍＡｂ・ｃＨ３６重鎖（ＨＣ）可変ドメインのｐＧｅｍ・Ｔ−ｅａｓｙ中へのクローン化は、テンプレートとしてプラスミドｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ．Ａ８（キメラＨ３６用発現ベクター）を用い、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２およびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いて行った。プライマーＴＦＨＣ１ｓ２は、開始コドンの上流に、ＢｓｉＷＩ部位を導入し、フレームワーク（ＦＲ）１にＥ１からＱへのアミノ酸変化も導入した。プライマーＴＦＨＣ１ａｓは、ＦＲ４にＬ１１３からＶへのアミノ酸変化を導入した。この工程の結果、構成物ＨＣ０１が得られた。
【０１６９】
２  先の構成物（ＨＣ０１）と下記の４つのプライマーを用いた、ＰＣＲに基づく突然変異誘発により、構成物ＨＣ０２が生成された。上流ＰＣＲには、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２およびＴＦＨＣ７ａｓを用いた。下流ＰＣＲには、プライマーＴＦＨＣ７ｓおよびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いた。テンプレートとして上流および下流ＰＣＲ生成物を用い、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２およびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いたＰＣＲにより、ＨＣ０２が得られた。プライマーＴＦＨＣ７ｓおよびＴＦＨＣ７ａｓの使用により、ＦＲ２に２つのアミノ酸変化が導入された：Ｈ４１からＰへ；及びＳ４４からＧへ。
【０１７０】
３  テンプレートとしてＨＣ０２を用い、下記の４つのプライマーを用いた、ＰＣＲに基づく突然変異誘発により、構成物ＨＣ０３が生成された。上流ＰＣＲには、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２およびＴＦＨＣ５ａｓ２を用いた。下流ＰＣＲには、プライマーＴＦＨＣ５ｓおよびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いた。テンプレートとして上流および下流ＰＣＲ生成物を用い、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２およびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いたＰＣＲにより、ＨＣ０３が得られた。プライマーＴＦＨＣ５ｓおよびＴＦＨＣ５ａｓ２の使用により、ＦＲ３に３つのアミノ酸変化が導入された：Ｔ８７からＲへ；Ｄ８９からＥへ；及びＳ９１からＴへ。
Bgl IIサイトも８７位に導入された。
【０１７１】
４  プライマーＴＦＨＣ２ｓおよびＴＦＨＣ３ａｓを用い、テンプレートとしてｐＧｅｍ中のＨＣ０３を使用して、ＰＣＲ増幅を行った。ＴＦＨＣ２ｓは、ｐＧｅｍ中のクローン化部位の上流にある。ＴＦＨＣ３ａｓは、フレームワーク３内にあり、ＦＲ３に２つのアミノ酸変化を導入した：Ｈ８２からＥへ；およびＮ８４からＳへ。得られたＰＣＲバンドをｐＧｅｍの中へクローン化し、次いで、適当な大きさの挿入物をＢｓｉＷＩおよびＢｇｌＩＩで消化した。ＨＣ０３の中へのこの断片のクローン化により、ＨＣ０４が得られた。
【０１７２】
５  テンプレートとしてＨＣ０４を用い、次のプライマーを用いた、ＰＣＲに基づく突然変異誘発により、ＨＣ０５が得られた。上流ＰＣＲには、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２およびＴＦＨＣ６ａｓを用いた。下流ＰＣＲには、プライマーＴＦＨＣ６ｓおよびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いた。テンプレートとして上流および下流ＰＣＲ生成物を用い、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２およびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いた突然変異誘発性ＰＣＲにより、ＨＣ０５が得られた。この工程により、ＦＲ３に次のアミノ酸変化が導入された：Ｓ７６からＴへ；Ｔ７７からＳへ；およびＦ８０からＹへ。
【０１７３】
６  テンプレートとしてＨＣ０５を用い、次の４つのプライマーを用いた、ＰＣＲに基づく突然変異誘発により、ＨＣ０６が得られた。上流ＰＣＲには、プライマーＴＦＨＣ２ｓおよびＴＦＨＣ２ａｓ２を用いた。下流ＰＣＲには、プライマーＴＦＨＣ３ｓ２およびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いた。ＴＦＨＣ２ａｓ２を用いた増幅により、ＦＲ１に、アミノ酸変化が導入された：Ｐ９からＧへ。プライマーＴＦＨＣ３ｓ２変化：Ｑ１９からＲへ；およびＴ２４からＡへ。テンプレートとして上流および下流ＰＣＲ生成物を用い、プライマーＴＦＨＣ１ｓ２およびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いたＰＣＲにより、ＨＣ０６が得られた。
【０１７４】
７  ＦＲ１の２位置におけるＩからＭへの点突然変異が、ＨＣ０６の構築中に自然発生的に導入された。テンプレートとしてＨＣ０６を用い、プライマーとしてＴＦＨＣ１ｓ３およびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いたＰＣＲ増幅により、この間違った置換が補正され、アミノ酸変化もＦＲ１へ導入された：Ｑ５からＶへ。得られた構成物はＨＣ０７であった。
【０１７５】
８  テンプレートとしてＨＣ０7を用い、次のプライマーを用いた、ＰＣＲに基づく突然変異誘発により、構成物ＨＣ０８が得られた。上流生成物にはＴＦＨＣ２ｓおよびＴＦＨＣ２ａｓ３を用いた。下流生成物は、ＴＦＨＣ１ｓ３およびＴＦＨＣ１ａｓ２を用いて、予め増幅された（工程７参照）。プライマーＴＦＨＣ２ａｓ３の使用により、ＦＲ１に２つのアミノ酸変化が導入された：Ｌ１１からＶへ；およびＶ１２からＫへ。自然発生的な点突然変異の結果、ＣＤＲ２の位置６４におけるフェニルアラニンからロイシンへ（Ｆョ Ｌ）の変化が生じた。更にスクリーニングと配列決定を行うことにより、構成物ＨＣ０８Ｒ１が得られ、これは、ＣＤＲ２の位置６４においてＦの正しい配列を有している。
【０１７６】
９  ＨＣ０７からの特定部位の突然変異誘発により、２つの構成物ＨＣ１１およびＨＣ１２が生成された。２つの相補プライマーＴＦＨＣ８ｓＰおよびＴＦＨＣ８ａｓＰを、テンプレートとしてのＨＣ０７と共に使用して、ＦＲ１に３つのアミノ酸変化を含むＨＣ１１を産生した：Ｇ９からＰへ；Ｌ１１からＶへ；およびＶ１２からＫへ。次いで、ＨＣ１１をメチル化し、次回の特定部位の突然変異誘発のためにカラム精製した。テンプレートとしてＨＣ１１を使用し、相補プライマーＴＦＨＣ９ｓＬおよびＴＦＨＣ０ａｓＬを用いたＰＣＲにより、ＦＲ１にＶ１１からＬへの突然変異を有するＨＣ１２が生成された。
【０１７７】
１０  テンプレートとしてＨＣ１２を使用し、相補プライマーＴＦＨＣ１０ｓＫおよびＴＦＨＣ１０ａｓＫを用いたＰＣＲを行うことにより、ＨＣ１２から構成物ＨＣ０９が得られた。ＨＣ０９は、ＦＲ１にアミノ酸変化を含んでいる：Ｋ１２からＶへ。
【０１７８】
１１  ＨＣ０９から、構成物ＨＣ１０が作られた。テンプレートとしてＨＣ０９を使用し、相補プライマーＬＶ−１およびＬＶ−２を用いたＰＣＲにより、ＨＣ１０が生成され、これは、ＦＲ１にＬ１１からＶへの突然変異を含んでいる。
【０１７９】
各突然変異工程の後、部分的にヒト化されたか、あるいは完全にヒト化されたクローンを配列決定し、これらの可変ドメインの一部を、後で発現ベクターの中へクローン化した。ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃに融合したＨＣ突然変異株を発現させるのに、ｐＪＲＳ３５５またはｐＬＡＭ３５６ベクターが使用された。
【０１８０】
図３Ａ〜Ｄは、工程１〜１１を要約し、ＦＲ１〜４に導入された付加的なアミノ酸変化を示す。ＨＣ０８を除いて、他のすべての重鎖突然変異株およびｃＨ３６は、ＣＤＲ２の位置６４にＦを含む。ＨＣ０８は、位置６４において、ＦからＬへの突然変異を有する。図４Ｂ〜Ｄは、重鎖ＣＤＲ配列を示す。
【０１８１】
重鎖ヒト化に用いられるプライマー
2005537009.tif 000005
2005537009.tif 000006
【０１８２】
Ｄ  ヒト化された抗ＴＦ抗体L鎖の生成
１  テンプレートとしてプラスミドｐＪＡＩｇＧ４ＴＦ．Ａ８（キメラＨ３６用発現ベクター）を用い、プライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１およびＴＦＬＣ１ａｓ２を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。この工程により、クローン化部位、ＡｇｅＩ、が開始コドンの上流に導入された。ＦＲ４にはＬ１０６Ｉ突然変異も導入された。この工程により、構成物ＬＣ０３が得られた。
【０１８３】
２  相補プライマーＴＦＬＣ５ｓおよびＴＦＬＣ５ａｓを用い、テンプレートとしてＬＣ０３を用いて、特定部位の突然変異誘発を行った。この工程により、ＦＲ２に突然変異Ｑ３７Ｌが導入され、診断目的のためのＰｓｔＩ部位が加えられた。この新しい構成物をＬＣ０４と呼ぶ。
【０１８４】
３  テンプレートとしてＬＣ０４を用い、プライマーＴＦＨＣ２ｓおよびＴＦＬＣ２ａｓ１を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。この工程により、工程６で用いられることになる断片Ａが生成された。この工程により、ＦＲ１にＱ１１ＬおよびＬ１５Ｖ突然変異が導入された。
【０１８５】
４  テンプレートとしてＬＣ０４を用い、プライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１およびＴＦＬＣ１ａｓＲを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。これにより、ＬＣ可変ドメインの末端にＫｐｎＩ部位が導入された。このＰＣＲ断片を、ｐＧＥＭ中にクローン化することにより、工程６で用いられることになるｐＧＥＭ０４Ｋが得られた。
【０１８６】
５  テンプレートとしてＬＣ０４を用い、プライマーＴＦＬＣ２ｓおよびＴＦＬＣ４ａｓを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。この工程により、工程６で用いられることになる断片Ｃが生成された。この工程で、３つの突然変異、ＦＲ１でのＥ１７Ｄ、Ｓ１８ＲおよびＦＲ４でのＡ１００Ｑが導入された。
【０１８７】
６  テンプレートとして断片Ａおよび断片Ｂを用い、プライマーＴＦＬＣ２ｓおよびＴＦＬＣ４ａｓを用いた特定部位の突然変異誘発により、断片Ｄが得られた。断片ＤをｐＧＥＭ０４Ｋの中にクローン化することにより、構成物ＬＣ０５が得られた。
【０１８８】
７  テンプレートとしてｐＧＥＭ０４Ｋを用い、プライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１およびＴＦＬＣ４ａｓを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。この工程により、断片Ｈが生成され、次いで、これがｐＧＥＭ０４Ｋの中にクローン化された。これにより、ＦＲ４にＡ１００Ｑ突然変異が導入され、この構成物をＬＣ０６と呼ぶ。
【０１８９】
８  テンプレートとしてＬＣ０６を用い、プライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１およびＴＦＬＣ３ａｓを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。この工程により、工程１０で用いられることになる断片Ｉが生成された。これにより、ＦＲ３にＫ７０ＤおよびＫ７４Ｔ突然変異が導入された。
【０１９０】
９  テンプレートとしてＬＣ０６を用い、プライマーＴＦＬＣ３ｓ２．１およびＴＦＬＣ４ａｓを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。この工程により、工程１０で用いられることになる断片Ｆが生成された。これにより、ＦＲ３にＡ８０Ｐ突然変異が導入された。
【０１９１】
１０  テンプレートとして断片Ｉおよび断片Ｆを用い、プライマーＴＦＬＣ１ｓ２．１およびＴＦＬＣ４ａｓを用いたＰＣＲにより、断片Ｊが得られた。断片ＪをｐＧＥＭの中にクローン化することにより、構成物ＬＣ０７が得られた。
【０１９２】
１１  相補プライマーＴＦＬＣ０８ｓｄｓおよびＴＦＬＣ０８ｓｄｓａを用い、テンプレートとしてＬＣ０７を用いて、特定部位の突然変異誘発を行った。この工程により、ＦＲ３に突然変異Ｖ８４ＡおよびＮ８５Ｔが導入された。この構成物をＬＣ０８と呼ぶ。
【０１９３】
１２  突然変異Ｑ１１Ｌ、Ｌ１５Ｖ、Ｅ１７Ｄ、Ｓ１８ＲおよびＱ３７Ｌを含むＬＣ０５からのＡｇｅＩ〜ＥｃｏＯ１０９Ｉ断片を、ＬＣ０８の中にクローン化する。これにより、構成物ＬＣ０９が得られた。
【０１９４】
１３  テンプレートとしてＬＣ０９を用い、相補プライマーＬＣ１０５およびＬＣ１０３を用いて、特定部位の突然変異誘発を行った。この工程により、ＦＲ３にＴ８５Ｎ突然変異が導入され、構成物ＬＣ１０が得られた。
【０１９５】
１４  テンプレートとしてＬＣ１０を用い、相補プライマーＬＣ１１５およびＬＣ１１３を用いて、特定部位の突然変異誘発を行った。この工程により、ＦＲ３にＤ７０Ｋ突然変異が導入された。これにより、構成物ＬＣ１１が得られた。
【０１９６】
１５  テンプレートとしてＬＣ１１を用い、相補プライマーＬＣ１２５ａおよびＬＣ１２３ａを用いて、特定部位の突然変異誘発を行った。この工程により、ＦＲ２にＫ４２Ｑ突然変異が導入された。これにより、構成物ＬＣ１２が得られた。
【０１９７】
各突然変異工程の後、部分的にヒト化されたか、あるいは完全にヒト化されたクローンを配列決定し、これらの可変ドメインの一部を、後で発現ベクターｔＫＭＣ１８０の中へクローン化した。
【０１９８】
Ｌ鎖ヒト化に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー
2005537009.tif 000007
2005537009.tif 000008
【０１９９】
図５Ａは、ヒトカッパＬ鎖定常ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）の配列を示す。図５Ｂは、ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を示す。図６Ａは、ｈＦＡＴ（ＩｇＧ４）定常ドメイン配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）を示す。図６Ｂは、ヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）を提供する。上記免疫グロブリン定常ドメインに関する更なる開示については、ＵＳＳＮ０９／９９０，５８６および６０／３４３，３０６をも参照のこと。
【実施例２】
【０２００】
ヒト化された抗ＴＦ抗体の発現および精製
部分的にヒト化されたか、あるいは完全にヒト化されたＬＣおよびＨＣクローンを、発現ベクターの中へクローン化した。ヒトカッパ鎖に融合したＬＣ突然変異株を発現させるのに、プラスミドｔＫＭＣ１８が使用され、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＦｃに融合したＨＣ突然変異株を発現させるのに、ｐＪＲＳ３５５またはｐＬＡＭ３５６ベクターが使用された。次いで、ＨＣおよびＬＣクローンのいくつかの組み合わせを、ＣＯＳ細胞の中に共にトランスフェクトした。ＣＯＳ細胞内の一時的に発現されたＩｇＧを、全ＩｇＧ産生およびＴＦへの結合について、ＥＬＩＳＡにより測定した。これらの特定のベクターに関する開示については、係属中の米国出願０９／９９０，５８６および６０／３４３，３０６を参照のこと。
【０２０１】
最後の完全にヒト化された形の抗ＴＦ重鎖およびＬ鎖可変ドメイン（ＨＣ０８とＬＣ０９の組み合わせ）を、メガ発現ベクター（ｐＳＵＮ３４、図２参照）と呼ばれることもあるものの中にクローン化し、ＩｇＧ発現のために、ＣＨＯおよびＮＳＯ細胞の中へトランスフェクトした。ＩｇＧ４ｋまたはＩｇＧ１ｋヒト化抗ＴＦ抗体を産生する、安定にトランスフェクトされた細胞株を、クローン化した。次いで、この選択された安定な細胞株を使用して、分析するのに十分な量のヒト化された抗ＴＦを産生した。得られたヒト化されたバージョンは、もともとほぼ１００％ヒトのものである（ＣＤＲ配列を考慮しない場合）。ヒト化されたＩｇＧ４カッパバージョン（ｐＳＵＮ３５により産生）は、ｈＦＡＴ（humanized IgG Four Anti-Tissue Factor antibody）と呼ばれ、ＩｇＧ１カッパバージョン（ｐＳＵＮ３４により産生）は、ｈＯＡＴ（humanized IgG One Anti-Tissue Factor antibody）と呼ばれる。ｃＨ３６のこれらの完全にヒト化されたバージョンは、血栓症、癌、炎症性疾患などの慢性適応症を治療することを対象としている。
【０２０２】
ｈＯＡＴ（ＨＣ０８とＬＣ０９の組み合わせ）を発現するＮＳＯ細胞株の１つ（ＯＡＴ−ＮＳＯ−Ｐ１０Ａ７）を解凍し、１５ｍｌチューブ内の１０％ＦＢＳを追加したＩＭＤＭ培地１０ｍｌ中で増殖し、遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍｌの新しい培地に再懸濁させ、Ｔ２５フラスコに移して、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。中空繊維バイオリアクターに接種するのに十分な数の細胞を調製するために、細胞を増やして、合計６×１０８個の細胞を得た。バイオリアクターは、メーカーの取扱説明書通りに設定された。集菌された細胞をペレット化し、３５％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ６０ｍｌに再懸濁、バイオリアクターの毛細管外スペース（extracapillary space）に注入した。グルコースおよび乳酸塩の濃度を毎日観測し、集菌した物質を遠心分離して、プールした。抗ＴＦ抗体濃度について、集菌された物質をＥＬＩＳＡ測定法により試験した。次いで、抗ＴＦ抗体（ｈＯＡＴ）を含むプールされたサンプルを精製し、次のように分析した。
【０２０３】
Ａ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  セファロース高速流動クロマトグラフィー（Fast Flow Chromatography）
組換えヒト化抗ＴＦモノクローナル抗体は、２つのＬ鎖と２つの重鎖から成る。重鎖は、マウス可変ドメイン（上述のように、もとのまままたはヒト化された）とヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４Ｆｃドメインとの融合体であり、一方、Ｌ鎖は、マウス可変ドメイン（上述のように、もとのまままたはヒト化された）とヒトκドメインを含む。ヒトＩｇＧＦｃ領域が、プロテインAまたは組換えプロテインＡ（rProtein A）に対して高度の親和性を有することは、明確に立証されている。
【０２０４】
サンプル１ｍｌ当り０．０８ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を添加することにより、ヒト化された抗ＴＦ抗体（ｈＯＡＴ）を含む集菌プールを、ｐＨ８．０ア ０．１に調整した。次いで、低蛋白質結合０．２２ミクロンフィルター（例えば、Nalge Nunc International製、 ポリエーテルスルホン膜を有するＮａｌｇｅｎｅ滅菌使い捨て組織培養フィルターユニット、）Cat．No．167−0020）でサンプルを濾過する。サンプルアプリケーションに続いて、５ベッド容積(bed volume) の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０でrProtein Aカラム（Pharmacia製）を洗浄して、培地蛋白質などの未結合物質を除去する。集菌培地は、ウシ血清を高含有量含むので、カラムからウシＩｇＧを除去するのに、段階ｐＨ勾配洗浄を用いた。段階ｐＨ勾配は、バッファーＡ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム）中のバッファーＢ（１００ｍＭ酢酸）の相対的パーセンテージを増加させることにより達成された。典型的なｐＨ段階洗浄では、２０％、４０％および６０％バッファーＢを用いた。１００％バッファーＢでカラムを溶離し、Ａ２８０に基づいて画分を集める。１Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基の添加により、プールされた画分をｐＨ８．５に調整した。
【０２０５】
Ｂ．  Ｑセファロース高速流動クロマトグラフィー
アニオンイオン交換クロマトグラフィーは、それらの電荷により蛋白質を分離するのに非常に有効である。rProtein Aカラムから溶離され、ｐＨ調整されたサンプルを、２倍容量の水で希釈した。ｐＨをチェックし、８．５に調整する。次いで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で平衡させた５ｍｌ（１．６×２．５ｃｍ）Q Sepharose Fast Flowにサンプルを充填し、（１）５ベッド容積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、および（２）１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む４ベッド容積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５でカラムを洗浄した。次いで、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含むベッド容積の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５でＩｇＧプロテインを溶離した。限外濾過装置を用いて、プロテインピーク（protein peaks）をプールし、ＰＢＳ内へバッファー交換（buffer-exchanged）した。
上記と同じトランスフェクション、細胞培養および精製方法を用いて、ｈＦＡＴも産生し、精製した。
【実施例３】
【０２０６】
ヒト化された抗ＴＦ抗体の性質
Ａ  ヒト化された抗ＴＦ抗体によるＴＦ機能の阻害
抗ＴＦ抗体の重要な性質の１つは、組織因子が誘発する血液凝固を阻害するその能力である。ＴＦ活性を阻害する精製されたｈＯＡＴおよびｈＦＡＴの能力を、標準ＰＴ測定法で測定した。ＰＴ測定法は、組織因子に依存する血液凝固時間を測定するのに広く用いられる。この測定法の原理は、組織因子（ＴＦ）が、血漿中で第ＶＩＩａ因子と複合体を形成するということである。次いで、この複合体は、第Ｘ因子をＦＸａに活性化する。次いで、ＦＸａは、第Ｖａ因子とリン脂質の存在下で、プロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンは、最終的には血栓を形成することになる。標準ＰＴ測定法では、脂質化されたＴＦを血漿に加えて、血液凝固を開始させ、Organon Teknika Coag-A-Mate Coagulation Analyzerまたは同等装置により、凝固を記録する。
【０２０７】
抗ＴＦ抗体、Ｈ３６、は、ユニークな機構により、ヒトＴＦ活性を阻害する。ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体へ結合する第Ｘ因子および第ＩＸ因子が妨げられるように、それがＴＦ（遊離または第ＶＩＩａ因子と複合）へ結合し、ＴＦ：ＦＶＩＩａによるＦＸおよびＦＩＸ活性化が阻害される（米国特許第５，９８６，０６５号参照）。ＰＴ試験において、ヒト血漿に添加された抗ＴＦ抗体による凝固時間の延長は、このＴＦに依存する凝固が阻害されていることを明白に示すものである。凝固時間は、ＴＦ活性の量に関連している。ＴＦ標準曲線は、連続的に希釈されたＴＦのＰＴ凝固時間を測定することにより生成される。ＴＦ標準曲線のデータから、抗ＴＦ抗体によるＴＦ活性の阻害が決定される。
【０２０８】
試薬：Innovin (Cat No 68100-392)およびCi-Trol Coagulation Control, Level I (Cat No 68100-336)は、VWRから得られる。脂質化されたヒトＴＦは、米国特許第５，９８６，０６５号の実施例３に記載されるようにして産生された。
方法：ＰＴ試験は、Coagulation Analyzerを用いて、３７℃で行われる。０．０１ｍｌ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ）または抗ＴＦ抗体を含む０．１ｍｌのヒト血漿（Ci-Trol Control Level I）に、０．２ｍｌの脂質化された組換えヒト組織因子（例えば、Innovin）を添加することにより、ＰＴ反応が開始される。
【０２０９】
１  メーカーの取扱説明書に従って、Innovinのバイアルに純水を加える。試薬を３７℃に温める。試薬は、４〜８℃で保存されれば、数日間安定である。
２  Ci-Trolの各バイアルに１ｍｌの純水を加える。混合して可溶化する。２つ以上のバイアルを用いる場合は、これらを１つの容器（例えば、１０ｍｌ試験管）に入れて混合する。１ｍｌのCi-Trolで５回の測定を行うことができる（各測定で２×０．１ｍｌ＝０．２ｍｌを使用する）。Ci-Trolは、氷上に保存され、数時間持続することができる。
３  抗ＴＦ抗体ストックから、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡを含む一連の抗ＴＦ抗体溶液（２００ｎＭ〜１６００ｎＭ）を作る。
４  １０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡまたは１０μｌの希釈抗ＴＦを、０．１ｍｌのCi-Trolを含むツインウエルキュベットの各ウエルに加える。０．１ｍｌチップを有するピペットを用いて、各ウエルを混合する。ウエル内に気泡がないことを確かめる。抗ＴＦ（または緩衝液）を血漿（Ci-Trol）と混合することに続いて、血漿に０．２ｍｌのInnovinを加えることにより、１０分以内に凝固時間を測定する。
５  ＴＦ標準曲線について、先ず、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡでInnovin（１００％ＴＦ）を２０％、１０％、５％および２．５％に希釈する。次いで、希釈されたInnovinサンプルを用いることを除いて、工程４のようにＰＴ測定を実施した。
【０２１０】
表３は、ＰＴ凝固時間に及ぼすｃＨ３６、ｈＯＡＴおよびｈＦＡＴの影響の要約である。表４のデータと比較して、ｃＨ３６、ｈＯＡＴおよびｈＦＡＴは、ＴＦ機能の非常に強い阻害を示した。１２．９ｎＭを超えるプロテイン濃度において、すべての抗体が約９５％の阻害を達成した。表３の結果も、ｈＯＡＴおよびｈＦＡＴの両方が、ｃＨ３６にみられるのと非常によく似たＴＦ依存血液凝固阻害能を示したので、上記方法による抗ＴＦ、ｃＨ３６、のヒト化が、ｃＨ３６阻害活性に顕著な影響を及ぼさなかったことを示している。
【０２１１】
【表３】
2005537009.tif 000009
＃すべての測定は、表４と同じ１００％ＴＦ活性（濃度）サンプルを使用した。
【０２１２】
【表４】
2005537009.tif 000010
【０２１３】
Ｂ  親和定数の測定
ＴＦに対するヒト化された抗ＴＦ抗体の親和性は、ＣＭ５センサーチップ上に共有結合で固定化された組換えヒト組織因子を用いて、表面プラズモン共鳴（Pharmacia BiosensorからのBIAcore）により測定された。親和定数は、BIAcoreコンピュータソフトウエアにより、４つの抗ＴＦモノクローナル抗体濃度（０．１２５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭおよび１ｎＭ）から計算された平均データであった。表５の結果は、ｃＨ３６およびｈＦＡＴの両方が、ＴＦに対して同様な親和性を有するので、上記方法による抗ＴＦ、ｃＨ３６、のヒト化が、ＴＦに対するｃＨ３６親和性に顕著な影響を及ぼさないことを示している。
【０２１４】
【表５】
2005537009.tif 000011
【実施例４】
【０２１５】
抗ＬＴＡ抗体のヒト化
Ａ  キメラ抗ＬＴＡ抗体
Ｂ  抗ＬＴＡ抗体のヒト化方策
キメラ抗ＬＴＡ（リポタイコ酸）抗体、Ａ１１０、のヒト化を、 “ＦＲ最良適合”法を用いることによって行った。この方法は、既知のアミノ酸配列を有する多数のヒトＩｇＧ可変ドメインが、公衆データベースから入手可能であるという事実を十分に活用するものである。Ａ１１０におけるマウス重鎖およびＬ鎖可変ドメインの個々のフレームワークを、Ｋａｂａｔデータベース（http://immuno.bme.nwu.edu参照）のそれらの対応するヒトフレームワークと比較する。目的とするヒト化用ヒトＩｇＧフレームワークを選択するには、次の基準を用いた。（１）不一致アミノ酸の数をできるだけ少なく保った。（２）バーニアゾーン内のアミノ酸（このゾーン内のアミノ酸は、ＣＤＲ構造を調整し、抗原への一致を微調整するかもしれない。Foote, J. and Winter, G., J of Mol. Bio. 244(2), 487-499 (1992)参照）は、未変更のままにした。（３）保存アミノ酸置換（conservative amino acid substitution）は、類似候補を評価する際に、好ましかった。この比較に用いる照合プログラムは、Ｋａｂａｔのインターネットホームページで入手できる。このプログラムは、マウス配列とＫａｂａｔデータベースのヒト配列との間の相同領域を見つけて、並べる。このユニークなＦＲ最良適合法を用いることにより、目的とするＩｇＧのヒト化されたＬＣまたはＨＣ可変ドメインは、１つという少ないヒトＩｇＧ分子から４つもの多くの異なるヒトＩｇＧ分子へと誘導される全部で４つのＦＲを持つかもしれないと期待される。
【０２１６】
Ｂ（ｉ）ヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインフレームワークの選択
Ａ１１０・ＬＣのフレームワークのそれぞれにおけるアミノ酸配列を、ＫａｂａｔデータベースのヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインの対応するＦＲにおけるアミノ酸配列と比較した。上に述べた３つの基準に基づいて、最良適合ＦＲを選択した。
【０２１７】
ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０３６０４７のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、Ａ１１０・ＬＣ・ＦＲ１およびＦＲ３のヒト化のために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０３７６５８のヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、Ａ１１０・ＬＣ・ＦＲ２のヒト化のために選択し、番号００４７６３を、ＦＲ４のヒト化のために選択した。Ａ１１０・ＬＣで次の突然変異を行い、選択されたＦＲを有するヒトＩｇＧカッパＬ鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた。Ｄ１ョ Ｑ、Ｓ５ョ Ｔ、Ｌ１１ョ Ｍ、Ｍ２１ョ Ｉ、Ｓ４２ョ Ｑ、Ｒ７６ョ Ａ、Ｖ７７ョ ＭおよびＭ１０２ョ Ｋ（配列情報については表６参照）。
【０２１８】
Ｂ（ｉｉ）ヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインフレームワークの選択
Ａ１１０・ＨＣのフレームワークのそれぞれにおけるアミノ酸配列を、ＫａｂａｔデータベースのヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインの対応するＦＲにおけるアミノ酸配列と比較した。上に述べた３つの基準に基づいて、最良適合ＦＲを選択した。
【０２１９】
ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０００４６８のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、Ａ１１０・ＨＣ・ＦＲ１のヒト化のために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０００５６５のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、Ａ１１０・ＨＣ・ＦＲ２のヒト化のために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０００６２８のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、Ａ１１０・ＨＣ・ＦＲ３のヒト化のために選択した。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０３１５７１のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、Ａ１１０・ＨＣ・ＦＲ４のヒト化のために選択した。Ａ１１０・ＨＣ・ＦＲ１で次の突然変異を行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０００４６８のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた：Ｍ３ョ ＱおよびＫ１５ョ Ｇ。ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０００５６５ＦＲ２配列に合わせるために、Ａ１１０・ＨＣ・ＦＲ２については変更の必要はなかった。Ａ１１０・ＨＣ・ＦＲ３に６つの突然変異を行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０００６２８のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた：Ｑ７８ョ Ｋ、Ｓ７９ョ Ｎ、Ｍ８０ョ Ｓ、Ｎ８７ョ Ｓ、Ｍ９５ョ ＶおよびＶ９９ョ Ａ。Ａ１１０・ＨＣ・ＦＲ４で１つの突然変異Ｌ１１９ョ Ｖを行い、ＫａｂａｔデータベースＩＤ番号０３１５７１のヒトＩｇＧ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列に合わせた（配列情報については表７参照）。
【０２２０】
表６  Ａ１１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）とヒトＬ鎖（ＬＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）ＦＲ配列の比較
【表６】
2005537009.tif 000012
【０２２１】
表７  Ａ１１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）とヒト重鎖（ＨＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）ＦＲ配列の比較
【表７】
2005537009.tif 000013
【０２２２】
目的とするヒトフレームワークについて一旦決定が行われたら、次の３つの技法を用い、Ｌ鎖および重鎖の両方で目的とするアミノ酸置換を行なった。（１）クローニングには標準ＰＣＲを使用して、クローニングまたは診断用制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し、可変ドメインの末端に位置するアミノ酸残基を変化させた。（２）多数のアミノ酸残基を一度に変化させるには、特にこれらの残基が可変ドメインの中央にあった場合は、突然変異誘発ＰＣＲを使用した。（３）１つ以上のアミノ酸置換を一度に導入するには、特定部位の突然変異誘発を使用した。特定部位の突然変異誘発は、Stratageneの“Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit”（カタログ＃２００５１８）に記載されたプロトコルに従って行われた。
【０２２３】
各工程後、部分的にヒト化されたクローンを配列決定し、これらの可変ドメインの一部を、後で、発現ベクター中へクローン化した。ＬＣ突然変異株を発現させるには、プラスミドｔＫＭＣ１８０を用い、ＨＣ突然変異株をＩｇＧ１として発現させるには、ｐＪＲＳ３５５を使用した。次いで、これらのクローンの一部を組み合わせ、一過的にＣＯＳ細胞で発現させた。
【０２２４】
最後の完全にヒト化された形の抗ＬＴＡ重鎖およびＬ鎖可変ドメインを、ここでは“メガベクター"と呼ばれることもあるものの中にクローン化し、ＩｇＧ発現およびＬＴＡ結合分析のために、ＣＯＳ細胞の中へトランスフェクトした。
【０２２５】
Ｃ  ヒト化された抗ＬＴＡ抗体重鎖の生成
１  ＰＣＲ増幅および抗ＬＴＡ・ｍＡｂ・Ａ１１０重鎖（ＨＣ）可変ドメインのｐＧＥＭ・Ｔ−ｅａｓｙ（Promega）中へのクローン化は、テンプレートとしてプラスミドｐＪＲＳ３３４（Ａ１１０用発現ベクター）を用い、プライマーＨＣｈｕＦ１およびＨＣｈｕＲ２を用いて行った。プライマーＨＣｈｕＦ１は、可変ドメインの最初のコドンの上流に、ＢｓｉＷＩ部位を導入し、フレームワーク（ＦＲ）１にＭ３からＱへのアミノ酸変化も導入した。プライマーＨＣｈｕＲ２は、ＦＲ４にＬ１１９からＶへのアミノ酸変化を、またクローニング目的のためのＣ−末端ＥｃｏＲＩ制限部位を導入した。この工程により、構成物ｐＪＲＳ３６２が得られることになった。次いで、この断片を、ＢｓｉＷＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片として発現ベクターｐＪＲＳ３５５の中へサブクローン化して、ｐＪＲＳ３７０を得た。
【０２２６】
２  抗ＬＴＡ・ｍＡｂ・Ａ１１０重鎖（ＨＣ）可変ドメイン断片のＰＣＲ増幅は、テンプレートとしてプラスミドｐＪＲＳ３３４（Ａ１１０用発現ベクター）を用い、Ｎ末端断片用のプライマーＨＣｈｕＦ１およびＨＣｈｕＲ１ならびにＣ末端断片用のプライマーＨＣｈｕＦ２およびＨＣｈｕＲ２を用いて行った。ＰＣＲにより、ＦＲ３に更に２つの突然変異：Ｎ８７からＳへおよびＭ９５からＶへを含む可変ドメイン断片が得られた。この断片をｐＧＥＭ・Ｔ−ｅａｓｙの中へクローン化した結果、構成物ｐＪＲＳ３６４が得られた。
【０２２７】
３  次いで、他の突然変異を重鎖可変ドメインへ導入するのに、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅシステム（Stratagene）を用いる特定部位の突然変異誘発を使用した。一対の相補プライマーＪＳＳ８０およびＪＳＳ８１をプラスミドｐＪＲＳ３６４と組み合わせて、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼで増幅した。ＤｐｎＩによる生成物の消化に続き、ＤＮＡを用いて、大腸菌ＸＬ１Ｂを形質転換した。この操作の結果、ＦＲ３にＶ９９からＡへの突然変異が生じた。この構成物をｐＪＲＳ３７３と呼んだ。この断片を、ＢｓｉＷＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片として発現ベクターｐＪＲＳ３５５の中へクローン化した結果、プラスミドｐＪＲＳ３８０が得られた。
【０２２８】
４  次いで、他の突然変異を重鎖可変ドメインへ導入するのに、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅシステム（Stratagene）を用いる特定部位の突然変異誘発を使用した。一対の相補プライマーＪＳＳ８２およびＪＳＳ８３をプラスミドｐＪＲＳ３７３と組み合わせて、ＰｆｕＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼで増幅した。生成物の消化に続き、ＤＮＡを用いて、大腸菌ＸＬ１Ｂを形質転換した。この操作の結果、ＦＲ１にＫ１５からＧへの突然変異が生じた。この構成物をｐＪＲＳ３７８とした。この断片を、ＢｓｉＷＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片として発現ベクターｐＪＲＳ３５５の中へクローン化した結果、プラスミドｐＪＲＳ３８１が得られた。
【０２２９】
５  抗ＬＴＡ・ｍＡｂ・Ａ１１０重鎖（ＨＣ）可変ドメイン断片のＰＣＲ増幅は、テンプレートとしてプラスミドｐＪＲＳ３８１（Ａ１１０の突然変異ＨＣＡ用発現ベクター）を用いて行った。Ｎ末端断片用にはプライマーＭＶ−ＨＣ  ＬｅａｄｅｒおよびＪＳＳ８７を、Ｃ末端断片用にはプライマーＪＳＳ８６およびＨＣＶ  Ｂａｃｋを用いた。ＰＣＲにより、ＦＲ３に更に３つの突然変異：Ｑ７８からＫへ；Ｓ７９からＮへ；およびＭ８０からＳへを含む可変ドメイン断片が得られた。この断片を、ＢｓｉＷＩ〜ＥｃｏＲＩ制限断片として発現ベクターｐＪＲＳ３５５の中へクローン化した結果、構成物ｐＪＲＳ３８３が得られた。
【０２３０】
重鎖ヒト化に用いられるプライマー
Ｄ  ヒト化された抗ＬＴＡ抗体Ｌ鎖の生成
１  ＰＣＲ増幅および抗ＬＴＡ・ｍＡｂ・Ａ１１０重鎖（ＬＣ）可変ドメインのｐＧＥＭ・Ｔ−ｅａｓｙ（Promega）中へのクローン化は、テンプレートとしてプラスミドｐＪＲＳ３３４（Ａ１１０用発現ベクター）を用い、プライマーＬＣｈｕＦ１およびＬＣｈｕＲ３を用いて行った。プライマーＬＣｈｕＦ１は、可変ドメインの最初のコドンの上流に、ＡｇｅＩ部位を導入し、フレームワーク１にアミノ酸変化：Ｄ１からＱへ；およびＳ５からＴへも導入した。プライマーＬＣｈｕＲ３は、ＦＲ４にＭ１０２からＬへのアミノ酸変化を、またクローニング目的のためのＣ−末端ＢｓｔＢＩ制限部位を導入した。この工程により、構成物ｐＪＲＳ３６３が得られた。
【０２３１】
２  抗ＬＴＡ・ｍＡｂ・Ａ１１０Ｌ鎖（ＬＣ）可変ドメイン断片のＰＣＲ増幅は、テンプレートとしてプラスミドｐＪＲＳ３３４（Ａ１１０用発現ベクター）を用い、１つのＮ末端断片（ＬＣＮ１）用のプライマーＬＣｈｕＦ１およびＬＣｈｕＲ１ならびに第２のＮ末端断片（ＬＣＮ２）用のプライマーＬＣｈｕＦ１およびＬＣｈｕＲ２を用いて行った。ＰＣＲにより、ＦＲ３に更に２つの突然変異：Ｎ８７からＳへおよびＭ９５からＶへを含む可変ドメイン断片が得られた。この断片をｐＧＥＭ・Ｔ−ｅａｓｙの中へクローン化した結果、構成物ｐＪＲＳ３６４が得られた。１つの断片（ＬＣＣ１）用のプライマーＬＣｈｕＦ２およびＬＣｈｕＲ３ならびに第２の断片（ＬＣＣ２）用のプライマーＬＣｈｕＦ３およびＬＣｈｕＲ３を用いて、２つのＣ末端断片が生成された。プライマーＬＣｈｕＦ２およびＬＣｈｕＲ２（ＬＣ１）を用いて、ＰＣＲ用内部断片も生成された。
【０２３２】
３  テンプレートとして断片ＬＣＮ１およびＬＣＣ１を用い、プライマーとしてＬＣｈｕＦ１およびＬＣｈｕＲ３を用いるＰＣＲ反応を行い、得られた生成物をｐＧＥＭ・Ｔ−ｅａｓｙの中へクローン化して、プラスミドｐＪＲＳ３６５を産生した。この結果、ＦＲ２にＳ４１からＱへの他の突然変異が生じた。
【０２３３】
４  テンプレートとして断片ＬＣ１およびＬＣＣ２を用い、プライマーとしてＬＣｈｕＦ１およびＬＣｈｕＲ３を用いるＰＣＲ反応を行い、得られた生成物をｐＧＥＭ・Ｔ−ｅａｓｙの中へクローン化して、プラスミドｐＪＲＳ３６６を産生した。この結果、ＦＲ３に２つの他の突然変異が生じた。
【０２３４】
５  テンプレートとして断片ＬＣＮ２およびＬＣＣ２を用い、プライマーとしてＬＣｈｕＦ１およびＬＣｈｕＲ３を用いるＰＣＲ反応を行った。次いで、テンプレートとしてこの新しい断片とＬＣＮ１を用い、プライマーとしてＬＣｈｕＦ１およびＬＣｈｕＲ３を用いて、第２のＰＣＲを行った。得られた生成物をｐＧＥＭ・Ｔ−ｅａｓｙの中へクローン化して、プラスミドｐＪＲＳ３６７を産生した。これにより、すべてのＬ鎖突然変異が、１つのＬ鎖可変ドメイン断片内で組み合わされた。
【０２３５】
６  次いで、ＰＣＲにより、すべてのＬＣ可変ドメインクローン内のＬ１０２をＫに変換した。テンプレートとしてプラスミドｐＪＲＳ３６３、３６５、３６６および３６７を用い、可変ドメインを、プライマーＬＣｈｕＦ１およびＬＣｈｕＲ４を用いて、再増幅した。得られた生成物をｐＧＥＭ・Ｔ−ｅａｓｙの中へ再度クローン化して、プラスミドｐＪＲＳ３６３Ｋ、３６５Ｋ、３６６Ｋおよび３６７Ｋを生成した。
【０２３６】
７  その後、ヒト化された４つのバージョンすべてを、ＡｇｅＩ〜ＢｓｔＷＩ制限断片として、Ｌ鎖発現ベクター、ｔＫＭＣ１８０、の中へクローン化した。種々の突然変異株Ｌ鎖の哺乳類細胞発現用の最終構成物を、ｐＪＲＳ３７４、３７５、３７６および３７７と呼んだ。
【０２３７】
８  抗ＬＴＡ・ｍＡｂ・Ａ１１０Ｌ鎖（ＬＣ）可変ドメイン断片のＰＣＲ増幅は、テンプレートとしてプラスミドｐＪＲＳ３７６（６つの突然変異を含むヒト化されたＡ１１０Ｌ鎖用発現ベクター）を用い、Ｎ末端断片（ＬＣＮ１）用のプライマーＭＶ−ＬＣ  ｌｅａｄｅｒおよびＪＳＳ８９ならびにＣ末端断片用のプライマーＪＳＳ９０およびＬＣ  ｒｅｖｅｒｓｅを用いて行った。テンプレートとしてこれらの断片を使用し、プライマーＭＶ−ＬＣ  ｌｅａｄｅｒおよびＬＣ  ｒｅｖｅｒｓｅを用いたＰＣＲ反応の結果、突然変異：Ｌ１１からＭへ；およびＭ２１からＩへを含む生成物が得られた。次いで、これらの生成物を、ＡｇｅＩ〜ＢｓｔＷＩ制限断片として、ｔＫＭＣ１８０、ＬＣ発現ベクター、の中へクローン化して、プラスミドｐＪＲＳ３８４を生成した。
【０２３８】
上記発現ベクターのすべてについて、ＣＯＳ細胞を使用する同時トランスフェクション実験における抗体発現能に対する陽性テストを行った。ヒト化された重鎖およびＬ鎖Ａ１１０可変ドメインの組み合わせのすべてが、ＥＬＩＳＡを用いてテストしたとき、ＬＴＡに結合した。その後、組み合わせ発現ベクター、即ち、重鎖およびＬ鎖コーディング領域の両方を有する単一プラスミドを構築した。ｐＪＲＳ３８３およびｐＪＲＳ３８４から切り出された可変ドメインから作られた全部で１６の突然変異（重鎖８つおよびＬ鎖８つ）を含む最終発現プラスミドを、ｐＪＲＳ３９４と呼んだ。ＣＯＳ細胞をトランスフェクトするのにこのプラスミドを使用した場合、産生された抗体は、ＥＬＩＳＡ実験により示されるように、ＬＴＡに結合することができた。
【０２３９】
クローニングに用いられるプライマー：
名称 オリゴ配列
2005537009.tif 000014
【実施例５】
【０２４０】
ヒト化された抗ＬＴＡ抗体の特性決定
Ａ  組換えヒト化ｃ９６−１１０抗体変異株の一過的産生  
抗ＬＴＡ抗体のヒト化されたバージョンを特徴づけるために、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Qiagen）を使用して、６ウエルの組織培養ウエルで、メーカーにより記載されているようにして、プラスミドｐＪＲＳ３３４，３９１、３９２および３９４（図１０参照）をＣＯＳ細胞の中へトランスフェクトした。プラスミドｐＪＲＳ３３４は、ｃ９６−１１０抗体をコードし、プラスミドｐＪＲＳ３９１〜３９４は、ｃ９６−１１０のヒト化された変異株をコードする。２日後、キメラ抗体の産生について、上澄みを測定した。次いで、発現された抗体がS. aureus ＬＴＡ抗原に結合する可能性について、これらの抗体を測定した。
【０２４１】
抗体産生測定は、１：５００希釈にて、ヤギ抗ヒトＦｃ（Pierce）で被覆された９６ウエルのマイクロタイタープレート（Maxisotp F8; Nunc, Inc.）からの８ウエルのストリップで行われた。プレートを粘着フィルムで被覆して、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｗａｓｈ溶液（イミダゾール／ＮａＣｌ／０．４％Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを１回洗浄した。次いで、一時的にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培養上澄み希釈液の１００マイクロリットルを複製ウエル（duplicate wells）に適用し、プレートローター上で、室温で６０分間インキュベートさせた。このプレートを、Ｗａｓｈ溶液で７回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＨ+Ｌ−ＨＲＰ（Zymed）結合体を、サンプル／結合体希釈剤に１：４０００の比で希釈し、希釈液の１００マイクロリットルをサンプルのそれぞれに加え、次いで、プレートローター上で、室温で６０分間インキュベートした。サンプルを上記のようにして洗浄し、次いで、１００μＬ／ウエルのＡＢＴＳ展開基質（BioFx）により、室温で１分間インキュベートした。１００μＬ／ウエルのＱｕｅｎｃｈバッファー（BioFx）で反応を停止し、自動マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した（表８および図１１の結果参照）。この測定は、これらのプラスミド構成物によるＣＯＳ細胞のトランスフェクションの結果、ヒトＩｇＧおよびカッパドメインの両方を含む分子を産生する細胞が得られることを示している。細胞上澄みのそれぞれにおける抗体濃度の概算は、ヒトモノクローナルＩｇＧ１を用いた０．５μｇ／ｍＬ〜０．０４μｇ／ｍＬでの一連の希釈を標準曲線と比較することにより求められた。
【０２４２】
〔表８〕
表８  ＣＯＳ細胞における抗体産生（Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍ）
希釈度      pJRS391      pJRS392    pJRS393    pJRS394    pJRS334
1：1        1.01          1.09       1.14       1.2         1.05
1：2        0.56          0.65       0.75       0.88        0.68
1：4        0.36          0.44       0.52       0.57        0.41
1：8        0.17          0.34       0.33       0.36        0.27
1：16       0.13          0.19       0.23       0.26        0.18
【０２４３】
Ｂ  ヒト化された変異株によるＬＴＡに対する抗体結合の特性決定
次いで、発現された抗体のS. aureus ＬＴＡへの結合能について、抗体含有培養上澄みを測定した。活性測定は、ＰＢＳを用い、１μｇ／ｍＬでS. aureus ＬＴＡ（Sigma）により被覆された９６ウエルのマイクロタイタープレート（Maxisotp F8; Nunc, Inc.）からの８ウエルのストリップで行われた。プレートを被覆して、４℃で一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳでプレートを１回洗浄した。次いで、培養上澄み希釈液の１００マイクロリットルを複製ウエル（duplicate wells）に適用し、プレートローター上で、室温で６０分間インキュベートさせた。このプレートを、Ｗａｓｈ溶液で７回洗浄した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＨ+Ｌ−ＨＲＰ（Zymed）結合体を、サンプル／結合体希釈剤に１：４０００の比で希釈し、希釈液の１００マイクロリットルをサンプルのそれぞれに加え、次いで、プレートローター上で、室温で６０分間インキュベートした。サンプルを上記のようにして洗浄し、次いで、１００μＬ／ウエルのＡＢＴＳ展開基質（BioFx）により、室温で１０〜１５分間インキュベートした。１００μＬ／ウエルのＱｕｅｎｃｈバッファー（BioFx）で反応を停止し、自動マイクロタイタープレートＥＬＩＳＡリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける吸光度値を測定した（表９および図１の結果参照）。この測定は、これらのプラスミド構成物による細胞のトランスフェクションの結果、同等水準のヒト化されたＡ110抗体を産生する細胞が得られることを示している。
【０２４４】
〔表９〕
表９  抗体結合測定（Ｏ．Ｄ．４０５ｎｍ）
当量[Ab]       pJRS391      pJRS392    pJRS393    pJRS394  pJRS334
in ng/mL
100.00           1.45         0.86        1          1.1      1.65
50.00           0.98         0.4         0.45       0.45     0.93
25.00           0.42         0.23        0.27       0.27     0.43
12.50           0.2          0.13        0.16       0.15     0.25
6.25           0.1          0.1         0.1        0.1      0.13
【０２４５】
Ｃ  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を用いるｃ９６−１１０の親和定数測定
その後、表面プラズモン共鳴を用いて、これらの抗体を調べ、S. aureus ＬＴＡへの抗体結合を評価した。表10のこれらの結果から、ＰＪＲＳ３９１により産生されたヒト化Ａ１１０抗体は、そのＬＴＡへの結合能が、元の抗体Ａ１１０（またはｃ９６−１１０）に匹敵することが明らかである。従って、ヒト化されたバージョンは、その元のものと同等のＬＴＡに対する見掛け結合親和性を有しているに違いない。
【０２４６】
Ｃ−１  小胞調製および安定化
Kalb et al., Biochemica et Biophysica Acta 1103, 307-316 (1992)の方法により、リポタイコ酸（ＬＴＡ）含有小胞を調製した。簡単にいうと、ホスファチジルエタノールアミンリノレオイルパルミトイル（PE-L-P, SIGMA, St. Louis, MO）のクロロホルム溶液を、真空下で蒸発乾固する。ＢＩＡｃｏｒｅ溶出液（ＨＢＳ）および黄色ブドウ球菌（SIGMA, St. Louis, MO）からのＬＴＡを加えて、０．２ｍＭ ＰＥ−Ｌ−ＰのＨＢＳ溶液及び１％ＬＴＡのＰＥ−Ｌ−Ｐを作った。激しい渦巻き撹拌の後、この溶液をポリカーボネートフィルター（０．１μｍ細孔、Nucleopore Corning）に８回通す。この溶液を、直ちにＢＩＡｃｏｒｅＨＰＡチップ（BIAcore Inc. Piscataway, NJ）上に、約１４００ＲＵのプラトー（plateau）が得られるまで射出する。小胞は、自然に、ＨＰＡチップの表面に融合する。
【０２４７】
Ｃ−２  ＳＰＲ分析
結合速度を、ＭＰＥ−Ｌ−Ｐ／１％ＬＴＡで被覆されたＨＰＡチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ計器（BIAcore Inc. Piscataway, NJ）で測定した。濃度の異なるｃ９６−１１０を表面上に射出した。チップ表面は再生できないので、表面当り１回だけの射出を行った。会合および解離速度を、１対１結合モデルを用いて、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗｅａｒ２．０（BIAcore Inc. Piscataway, NJ）で測定した。
【０２４８】
【表１０】
2005537009.tif 000015
【実施例６】
【０２４９】
抗ＴＡＣ抗体のヒト化と本発明のＦＲ最良適合アプローチとのコンピュータ比較
アプローチを比較するために、ヒト化が行われ、刊行物に記載された特定の抗体を、ＦＲ最良適合アプローチによるヒト化の結果と比較する。過去において、当時のヒト化研究が行われたとき、Ｋａｂａｔデータベースは、このコンピュータ比較が行われたときほど広大なものではなかった。データベースの拡大により、最良適合について考慮に入れることのできるフレームワークの数は増加している。データベース拡大の結果として生じた偏りを補正するために、最良適合検索の見直しが行われ、その結果が示された。
【０２５０】
この実施例では、抗ＴＡＣ抗体について、比較を行った。表１１および１２に、コンピュータヒト化を示す。各表の1行目には、出発マウス抗体配列が記録されており、２行目は、最良適合を示すフレームワークが、Ｌ鎖可変ドメインで０３５９２１、重鎖可変ドメインで０３５９１８であった当時のヒト化された抗体（Queen et al., PNAS 86, 10029-10033 (1989)）の配列である。各表の３行目は、この比較の時点において求められた好ましい最良適合フレームワークを示す。最後の行は、ＦＲ最良適合アプローチを使用して、好ましいと思われる配列を示す。
【０２５１】
この比較を行うに際し、ＦＲ最良適合アプローチの利点は、必要なアミノ酸置換の全体の数、変更を必要としたバーニア残基の数および全体の相同性スコアを調べることによって理解されることができる。アミノ酸置換の数を最小限にすることによって、実際のヒト化に伴うコストと労力が減る。バーニア残基が好ましいアミノ酸として保持されているＦＲを同定することによって、抗体結合親和性に最小限の影響を与えることになるべきであるＣＤＲの確認への悪影響が最小限に抑えられる。他のフレームワークに基づくアプローチに比較して、ＦＲ最良適合アプローチでは、Ｌ鎖および重鎖の全体の相同性スコア（即ち、相同性パーセント）がより良好であることが分かる。
【０２５２】
抗ＴＡＣ抗体に関して、当初のヒト化は、Ｌ鎖および重鎖それぞれについての最良適合を有するフレームワークとして、０３５９２１および０３５９１８を選択することに基づいていた。このヒト化は、Ｌ鎖フレームワークでは、８６のアミノ酸のうち２８（そのうちの5つはバーニア残基である）の置換を必要とし、重鎖フレームワークでは、８７のアミノ酸のうち２９（そのうちの5つはバーニア残基である）の置換を必要とした。拡大されたＫａｂａｔデータベースを使用して、ＣＥＡ４−８Ａ（００４７５２）フレームワークがＬ鎖に最良適合を有し、Ａ１０（０４５９０３）抗体が重鎖に最良適合を有していた（Ｌ鎖および重鎖可変ドメインフレームワークが同じ抗体に由来する必要はないということを前提とする緩やかな基準を用いて）。この結果、当初のヒト化された抗ＴＡＣに比較して、より良好な適合が得られ、全置換が少なくてよく（３０対５７）、バーニアゾーン残基の変化も少なくてよく（４対１０）、より良い相同性が得られることになる。しかし、ＦＲ最良適合では、２３のアミノ酸置換だけでよく、そのうちの３つだけがバーニア残基であり、優れた結果が得られる。マウス抗ＴＡＣと当初のヒト化された抗ＴＡＣとの間の全体の相同性は、７４％であった。全体の相同性は、拡大されたデータベースでは、８６.５%であるが、ＦＲ最良適合アプローチを用いる場合は、８９．６％に向上する。
【０２５３】
抗ＴＡＣＬ鎖に関するヒト化アプローチの比較
ａａ変化          バーニア          ％相同性
hu抗TAC             28/106               5               73.6%
CEA4-8A(004752)     24/106               3               77.4%
FR最良適合          18/106               2               83%
抗ＴＡＣ重鎖に関するヒト化アプローチの比較
ａａ変化          バーニア          ％相同性
hu抗TAC             29/116               5               75%
A10(045903)          6/116               1               94.8%
FR最良適合           5/116               1               95.7%
抗ＴＡＣ可変ドメインに関するヒト化アプローチの全体比較
ａａ変化          バーニア          ％相同性
hu抗TAC             57/222               10              74.3%
A10(045903)         30/222                4              86.5%
FR最良適合          23/222                3              89.6%
【０２５４】
表１１  ＦＲ最良適合アプローチ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）を始めとするアプローチによるヒト化された抗ＴＡＣＬ鎖（ｈｕＡｎｔｉ−ＴＡＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）、ｍｕＡｎｔｉ−ＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）およびＣＥＡ４−８Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）の比較
【表１１】
2005537009.tif 000016
【０２５５】
表１２  ＦＲ最良適合アプローチ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）を始めとするアプローチによるヒト化された抗ＴＡＣ重鎖（ｈｕＡｎｔｉ−ＴＡＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）、ｍｕＡｎｔｉ−ＴＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）およびＡ１０（０４５９０３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）の比較
【表１２】
2005537009.tif 000017
【実施例７】
【０２５６】
Ｍｃ３抗体のヒト化と本発明のＦＲ最良適合アプローチとのコンピュータ比較
前の実施例のように、この実施例では、第２のヒト化された抗体をコンピュータで再検討して、この抗体に使用されたヒト化アプローチをＦＲ最良適合アプローチによるヒト化と比較する。データベース拡大の結果として生じた偏りを補正するために、最良適合検索の見直しが行われ、その結果が示された。
【０２５７】
この実施例では、Ｍｃ３抗体について、比較を行った。表１３および１４に、コンピュータヒト化を示す。各表の1行目には、出発マウス抗体配列が記録されており、２行目は、当初のヒト化された抗体（米国特許番号第５,６３９,６４１号）の配列である。各表の３行目は、この比較の時点において求められた好ましい最良適合フレームワークを示す。最後の行は、ＦＲ最良適合アプローチを使用して、好ましいと思われる配列を示す。
【０２５８】
Ｍｃ３抗体に関して、当初のヒト化は、米国特許番号第５,６３９,６４１号に開示された。このヒト化は、Ｌ鎖フレームワークでは、１０７のアミノ酸のうち１６残基（そのうちバーニア残基はなかった）、重鎖フレームワークでは、１１７のアミノ酸のうち１４残基（そのうちバーニア残基はなかった）の置換を必要とした。拡大されたＫａｂａｔデータベースを使用して、ＶＬクローン４７（０２４３００）フレームワークがＬ鎖可変ドメインに最良適合を有し、Ａ１０（０４５９０３）抗体が重鎖可変ドメインに最良適合を有していた（Ｌ鎖および重鎖可変ドメインフレームワークが同じ抗体に由来する必要はないということを前提とする緩やかな基準を用いて）。これらのフレームワークを使用しても、得られたコンピュータ“ヒト化”抗体は、当初ヒト化された抗体ほど良好ではなかった。これは、追加の変化が、本来、当初のヒト化されたＭｃ３用である方法によって推奨されたという事実によるものである。当初のヒト化に必要であった３０のアミノ酸変化と比較して、コンピュータからの最良適合フレームワークでは、３５のアミノ酸変化が必要となった。いずれのヒト化においても、バーニアゾーン残基の変化は、必要でなかった。しかし、本発明のＦＲ最良適合では、２６のアミノ酸置換だけでよく、バーニア残基変化は不要であり、優れた結果が得られる。マウスＭｃ３とコンピュータでヒト化された例との間の全体の相同性は、当初のヒト化されたＭｃ３について、８２．２％および８５％である。本ＦＲ最良適合アプローチでは、最良の全体の相同性は、８９．７％である。
【０２５９】
Ｍｃ３Ｌ鎖に関するヒト化アプローチの比較
ａａ変化          バーニア          ％相同性
huMc3(037000)           16/107               0               85%
フレームワーク(024300)  19/107               0               82.2%
FR最良適合              11/107               0               89.7%
Ｍｃ３重鎖に関するヒト化アプローチの比較
ａａ変化          バーニア          ％相同性
huMc3(037000)           14/117               0               88%
フレームワーク(045903)  16/117               0               86.3%
FR最良適合              15/117               0               87.2%
Ｍｃ３可変ドメインに関するヒト化アプローチの全体比較
ａａ変化          バーニア          ％相同性
huMc3(037000)            30/224              0               86.6%
フレームワーク(045903)   35/224              0               84.4%
FR最良適合               26/224              0               88.4%
【０２６０】
表１３  イムノゲンのテンプレート対フレームワーク最良適合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）対ＦＲ最良適合アプローチ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４）を用いる、ヒト化されたＭｃ３Ｌ鎖（ＨｕＭｃ３−ＬＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）とＭｃ３−ＬＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）の比較
【表１３】
2005537009.tif 000018
【０２６１】
表１４  イムノゲンのテンプレート対フレームワーク最良適合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）対ＦＲ最良適合アプローチ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８）を用いる、ヒト化されたＭｃ３重鎖（ＨｕＭｃ３−ＨＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）とＭｃ３−ＨＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）の比較
【表１４】
2005537009.tif 000019
【実施例８】
【０２６２】
抗ＴＦ抗体のヒト化のコンピュータ比較：フレームワーク対ＦＲ最良適合アプローチ
上記実施例１からの抗体を用いて、ヒト化方法の他の比較を行った。比較は、最良適合について、全フレームワークアプローチにより行われ、抗ＴＦ抗体についてのＦＲ最良適合アプローチと比較する。この比較は、つい最近、当初のヒト化と比較して、コンピュータで再度実施された。得られた最良適合は、より良好に適合するＦＲを提供するＫａｂａｔデータベースの拡大のために、実施例１に示した結果とは必ずしも同じではない。それにもかかわらず、ＦＲ最良適合アプローチが、フレームワーク最良適合アプローチに優る利点を提供するという結論は、依然としてそのままである。
【０２６３】
最良適合フレームワークを同定する検索を行った場合、結果は、下に表１５および１６で示す通りである。表の１行目は、当初のマウスモノクローナル抗体配列であり、２行目は、実施例１からのヒト化された抗ＴＦ抗体についての当初のＦＲ最良適合配列を示し、３行目は、最良適合フレームワークについての配列であり、４行目は、ＦＲ最良適合アプローチを用いて、つい最近求められた最良適合である。抗ＴＦ抗体Ｌ鎖についての最良適合フレームワーク（表１５）は、ｓｃＦ１１（０４９１５０）であり、１３のアミノ酸置換を必要とすることになり、１つのバーニアゾーン残基を変更し、相同性は８７.９%である。抗ＴＦ抗体Ｌ鎖についての更新されたＦＲ最良適合は、ＦＲ１については０４１９５０、ＦＲ２については０１９３０８、ＦＲ３については０３８２３３、ＦＲ４については０３６０３８であり、１０のアミノ酸置換を必要とすることになり、バーニアゾーン残基の変更は０であり、相同性は９０．７%である。抗ＴＦ抗体重鎖についての最良適合フレームワーク（表１６）は、Ａ１０（０４５９０３）であり、２０のアミノ酸置換を必要とすることになり、１つのバーニアゾーン残基を変更し、相同性は８２．９%である。抗ＴＦ抗体重鎖についてのＦＲ最良適合アプローチは、ＦＲ１については００００４２、ＦＲ２については０２３９６０、ＦＲ３については０４５９０３、ＦＲ４については０４７７２２であり、１５のアミノ酸置換を必要とすることになり、バーニアゾーン残基の変更は０であり、相同性は８７．２%である。３３のアミノ酸置換を必要とすることになり、２つのバーニアゾーン残基を変更し、相同性が８５．３%であるフレームワーク最良適合アプローチと比較して、ＦＲ最良適合アプローチ全体では、２５のアミノ酸置換を必要とし、バーニアゾーン残基の変更は０であり、相同性は８８．８%である。
【０２６４】
抗ＴＦ可変ドメインに関するヒト化アプローチの全体比較
ａａ変化          バーニア          ％相同性
実施例１            30/224               0               86.6
フレームワーク      33/224               2               85.3
ＦＲ最良適合        25/224               0               88.8
【０２６５】
表１５  フレームワーク最良適合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９）対ＦＲ最良適合アプローチ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０）を用いる、ヒト化された抗ＴＦＬ鎖（ｃＨ３６−ＬＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）と（ヒト−ＬＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）の比較
【表１５】
2005537009.tif 000020
【０２６６】
表１６  フレームワーク最良適合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）対ＦＲ最良適合アプローチ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）を用いる、ヒト化された抗ＴＦ重鎖（ｃＨ３６−ＨＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）と（ヒト−ＨＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）の比較
【表１６】
2005537009.tif 000021
【実施例９】
【０２６７】
抗ＬＴＡ抗体のヒト化のコンピュータ比較：フレームワーク対ＦＲ最良適合アプローチ
上記実施例３からの抗体を用いて、ヒト化方法の他の比較を行った。比較は、最良適合について、全フレームワークアプローチにより行われ、抗ＬＴＡ抗体（Ａ１１０）についてのＦＲ最良適合アプローチと比較する。実施例８のように、この比較は、つい最近、当初のヒト化と比較して、コンピュータで実施され、得られた最良適合は、より良好に適合するＦＲを提供するＫａｂａｔデータベースの拡大のために、実施例３に示した結果とは必ずしも同じではない。この特定の場合には、最良適合を有するＦＲは、以前のヒト化およびつい最近のコンピュータ比較の両方において同一である。しかし、これらの結果は、ＦＲ最良適合アプローチが、フレームワーク最良適合アプローチに優る利点を提供するという結論を支持する。
【０２６８】
最良適合フレームワークを同定する検索を行った場合、結果は、下に表１７および１８で示す通りである。表の１行目は、当初のマウスモノクローナル抗体配列であり、２行目は、実施例４からのヒト化された抗ＬＴＡ抗体についての当初のＦＲ最良適合配列を示し、これは、つい最近ＦＲ最良適合検索を行った場合、同じ結果となるものであり、３行目は、最近求められた最良適合フレームワークについての配列である。抗ＬＴＡ抗体Ｌ鎖についての最良適合フレームワーク（表１７）は、０３６０４７であり、１０７のアミノ酸から１３のアミノ酸置換を必要とすることになり、２つのバーニアゾーン残基を変更し、相同性は８７.９%である。抗ＬＴＡ抗体Ｌ鎖についてのＦＲ最良適合は、ＦＲ１については０３６０４７、ＦＲ２については０３７６５８、ＦＲ３については０３６０４７、ＦＲ４については００４７６３であり、９のアミノ酸置換を必要とすることになり、バーニアゾーン残基の変更は０であり、相同性は９１．６%である。抗ＬＴＡ抗体重鎖可変ドメインについての最良適合フレームワーク（表１８）は、０２８８９７であり、１２３のアミノ酸から１５のアミノ酸置換を必要とすることになり、４つのバーニアゾーン残基を変更し、相同性は８７．８%である。抗ＴＦ抗体重鎖についてのＦＲ最良適合アプローチは、ＦＲ１については０００４６８、ＦＲ２については０００５６５、ＦＲ３については０００６２８、ＦＲ４については０３１５７１であり、９のアミノ酸置換を必要とすることになり、２つのバーニアゾーン残基を変更し、相同性は９２．７%である。２８のアミノ酸置換を必要とすることになり、６つのバーニアゾーン残基を変更し、相同性が８７．８%であるフレームワーク最良適合アプローチと比較して、ＦＲ最良適合アプローチ全体では、１８のアミノ酸置換を必要とし、２つのバーニアゾーン残基を変更し、相同性は９２．２%である。
【０２６９】
表１７  フレームワーク最良適合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）を用いる、ヒト化された抗ＬＴＡＬ鎖（Ａ１１０−ＬＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）と（ヒト−ＬＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）の比較
【表１７】
2005537009.tif 000022
【０２７０】
表１８  フレームワーク最良適合（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７4）を用いる、ヒト化された抗ＬＴＡ重鎖（Ａ１１０−ＨＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）と（ヒト−ＨＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）の比較
【表１８】
2005537009.tif 000023
【０２７１】
本発明は、その好ましい実施態様について詳細に記載された。しかし、本発明の精神と範囲の中で、本開示を考慮して、当業者が改変および改良を行うことができるであろうことは、十分理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、超可変領域（ＣＤＲまたはComplementarity Determining Region)に下線を引いた（核酸配列には一重下線、アミノ酸配列には二重下線）、Ｈ３６．Ｄ３．Ｂ７、マウス抗組織因子抗体、のＬ鎖および重鎖可変ドメインの核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および３）およびアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４）配列を示す。
【図２】図２は、ヒト化された抗ＴＦＩｇＧ１抗体発現ベクター（ｐＳｕｎ−３４）のプラスミドマップを示す図面である。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、抗ＴＦ抗体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２〜８２）の部分的または完全にヒト化されたＬ鎖（ＬＣ）可変ドメインの配列である。図３Ａは、完全にヒト化されたＬＣフレームワーク（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）を表す“ＬＣ−０９”と名づけられた配列を示す。ｃＨ３６およびＬＣ−０９のＬ鎖ＣＤＲ配列は、図３Ｂ〜Ｄ（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、６および７）に示される。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、抗ＴＦ抗体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３〜９６）の部分的または完全にヒト化された重鎖（ＨＣ）可変ドメインの配列を示す図面である。図４Ａは、完全にヒト化されたＨＣフレームワーク（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）を表す“ＨＣ−０８”と名づけられた配列を示す。ｃＨ３６およびＨＣ−０８の重鎖ＣＤＲ配列は、図４Ｂ〜Ｄ（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４、１０４、９、１０１、１０および１０）に示される。
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ＩｇＧ１抗組織因子抗体（ｈＯＡＴ）におけるヒト定常ドメインを示す配列であり、図５ＡはヒトカッパＬ鎖定常ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）を示し、図５ＢはヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を示す。これらの図は、ｈＯＡＴ（ＩｇＧ１）定常ドメインアミノ酸配列を示す。
【図６】図６Ａ〜Ｂは、ＩｇＧ４抗組織因子抗体（ｈＦＡＴ）におけるヒト定常ドメインを示す配列であり、図６ＡはヒトカッパＬ鎖定常ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）を示し、図６ＢはヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）を示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、超可変領域（ＣＤＲまたはComplementarity Determining Region)に下線を引いた（核酸配列には一重下線、アミノ酸配列には二重下線）、Ａ１１０、キメラ抗ＬＴＡ抗体、のＬ鎖および重鎖可変ドメインの核酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５および１０７）およびアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６および１０８）配列を示す。
【図８】図８は、ヒト化された抗ＬＴＡＩｇＧ１（ｐＪＲＳ３９１）をコードする発現ベクターのプラスミドマップを示す図面である。
【図９】図９Ａ〜Ｈは、抗ＬＴＡ抗体の部分的または完全にヒト化された可変ドメインの配列を示す図面である。図９Ａは、ヒト化されたＬ鎖（ＬＣ）可変ドメインフレームワーク領域（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９〜１１４）の配列を示す。図９Ｂ〜Ｄは、Ｌ鎖ＣＤＲ１〜３（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５〜１１７）を示す。図９Ｅは、部分的または完全にヒト化された重鎖（ＨＣ）可変ドメインフレームワーク領域（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８〜１２３）を示す。図９Ｆ〜Ｋは、重鎖ＣＤＲ１〜３（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４〜１２６）を示す。
【図１０】図１０は、評価用のヒト化されたＡ１１０抗体を産生するプラスミド構成物を示す表である。
【図１１】図１１は、異なるプラスミドによるヒト化された抗ＬＴＡによる抗体発現の測定を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＬＴＡ結合の測定を示すグラフである。
【図１】
2005537009.tif 000024
【図２】
2005537009.tif 000025
【図３】
2005537009.tif 000026
【図４】
2005537009.tif 000027
【図５】
2005537009.tif 000028
【図６】
2005537009.tif 000029
【図７】
2005537009.tif 000030
【図８】
2005537009.tif 000031
【図９】
2005537009.tif 000032
【図１０】
2005537009.tif 000033
【図１１】
2005537009.tif 000034
【図１２】
2005537009.tif 000035
【配列表】
2005537009000001.app
【誤訳訂正書】
【提出日】平成17年4月26日(2005.4.26)
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００２年８月２９日に出願されたＵＳＳＮ１０／３０，８８０に基づく優先権を主張するものであり、同出願は、米国仮出願ＵＳＳＮ６０/３４３,３０６に基づく優先権を主張する米国出願番号第０９／９９０，５８６号の一部継続出願である。米国出願番号第０９／９９０，５８６号は、米国出願番号第０８／８１４，８０６号（現在、米国特許番号第５,９８６,０６５号）の分割出願である米国出願番号第０９／２９３，８５４号に関連する。米国出願番号第１０／３０，８８０号、第０９／９９０，５８６号、第６０/３４３,３０６号および米国特許番号第５,９８６,０６５号については参考のために本発明の開示に含まれる。
本発明は、ヒト化された免疫系分子を作る方法を特徴とするものである。一形態において、本発明は、より大きいフレームワークまたは可変ドメインよりもむしろ個々の抗体フレームワーク領域間の配列同一性を最適化することを含む抗体のヒト化方法を提供する。本発明は、適当な結合親和性を有すると共に、ヒト免疫原性が最小限に抑えられたヒト化されたモノクローナル抗体の産生での用途を始めとする、広範囲の用途を有している。
【国際調査報告】
2005537009.tif 000036
2005537009.tif 000037
2005537009.tif 000038
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