(57)【要約】本発明は、対応する天然の非修飾タンパク質と比べて改善された安定性を有する修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に関する。該修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、大量に発現および単離され、かくして、結晶学的研究および酵素反応速度論的研究などの該タンパク質のさらなるキャラクタリゼーションが可能となる。該精製した安定なタンパク質はまた、抗−ＡＤＡＭＴＳ抗体の産生およびＡＤＡＭＴＳ酵素に対する阻害剤の開発を容易にする。
2005534308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然の全長ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と少なくとも１つのアミノ酸において異なる、天然の全長ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と比べて改善された安定性を有する単離された修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項２】
天然の全長ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質が配列番号１５に列挙されるアミノ酸配列を含む請求項１記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項３】
修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と天然の全長ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質との間のアミノ酸配列の相違が、アミノ酸残基を置換、欠失、挿入および化学的に修飾することからなる群から選択される方法を用いて天然の全長ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質中の少なくとも１つのアミノ酸を改変することによって導入される請求項１記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項４】
ＡＤＡＭＴＳ４スペーサードメインの全てまたは一部の欠失を含み、ここに、修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質がアグリカナーゼ活性を有する、請求項１記載の単離された修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項５】
自己触媒活性を有さない請求項１記載の単離された修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項６】
ペプチドタグを含む請求項１記載の単離された修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項７】
修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアグリカナーゼ活性を破壊するＡＤＡＭＴＳ４触媒ドメイン中における変異を含む、請求項１記載の単離された修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項８】
さらに、ＡＤＡＭＴＳ４スペーサードメインの全てまたは一部の欠失を含む、請求項７記載の単離された修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項９】
配列番号１５に列挙されるアミノ酸配列を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と比べて改善された安定性を有し、配列番号１７、１９、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２、４０および４６−５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでいる単離された修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質。
【請求項１０】
請求項１記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
発現調節配列と共に作動する請求項１０記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
発現調節配列と共に作動する請求項１１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
請求項１記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入し；
該ポリヌクレオチドからの該修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞をインキュベートし；次いで
該宿主細胞から該修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質を精製することを特徴とする、修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の製造法。
【請求項１５】
請求項９記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入し；
該ポリヌクレオチドからの該修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞をインキュベートし；次いで
該宿主細胞から該修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質を精製することを特徴とする、修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の製造法。
【請求項１６】
修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアグリカナーゼ活性を測定し；
該修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質を候補物質と接触させ；
該修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアグリカナーゼ活性を該候補物質の存在下で測定し；次いで
該候補物質が該修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の活性に影響を及ぼすかどうかを決定する工程を特徴とする請求項１記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の阻害剤を同定する方法。
【請求項１７】
（ａ）請求項１記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の阻害剤または請求項１記載の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質に特異的に結合する抗体；および
（ｂ）医薬上許容される担体
を含んでなるアグリカナーゼ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１８】
該抗体が修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のアグリカナーゼ活性を阻害する請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
有効量の請求項１７記載の医薬組成物を哺乳動物中に導入する工程を特徴とする、哺乳動物においてアグリカナーゼ関連疾患を治療する方法。
【請求項２０】
アグリカナーゼ関連疾患が骨関節炎である請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の表示
本出願は、２００２年７月２９日に出願された米国仮特許出願番号第６０／３９８，７２１号の利益を主張し、その全開示は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、修飾されたアグリカナーゼ、かかる酵素をコードしているヌクレオチド、およびこれらの酵素を生産する方法に関する。本発明は、さらに、該修飾アグリカナーゼに対する阻害剤ならびに抗体の開発に関する。これらの阻害剤および抗体は、骨関節炎を包含する種々のアグリカナーゼ関連疾患の治療に有用でありうる。
【０００３】
発明の背景
アグリカン（aggrecan）は、関節軟骨の主要な細胞外成分である。それは、その圧縮性および弾力性という機械的特性を軟骨に与える原因となるプロテオグリカンである。アグリカンの喪失は、骨関節炎などの関節炎疾患における関節軟骨の分解に関係する。
アグリカンは、タンパク質分解に感受性の球間ドメインによって分離される２つのＮ−末端球状ドメインＧ１およびＧ２、その後ろにグリコサミノグリカン接着領域およびＣ−末端球状ドメインＧ３を含有する。アグリカンの球間ドメイン内において、少なくとも２つの酵素切断部位が同定されている。アグリカンの球間ドメイン内の１つの酵素切断部位（ａｓｎ３４１−ｐｈｅ３４２）は、いくつかの既知のメタロプロテアーゼによって切断することが観察された。アグリカン内の第２のアグリカン切断部位での切断（ｇｌｕ３７３−ａｌａ３７４）は、アグリカナーゼ活性に起因している。したがって、該切断部位（ｇｌｕ３７３−ａｌａ３７４）は、アグリカナーゼ切断部位と称される。
【０００４】
近年、多くのアグリカナーゼがクローン化されている。これらの酵素は、「ＡＤＡＭＴＳ」（A Disintegrin-like And Metalloprotease domain with ThromboSpondin type I motifsの略称である）と呼ばれる亜鉛メタロプロテアーゼのサブファミリーに属する。現在、ＡＤＡＭＴＳファミリーは、その共通のドメイン構造に基づいて互いに関連する１９のメンバーからなる。典型的なＡＤＡＭＴＳタンパク質は、フューリン（furin）切断部位において終結するプロ配列の上流の古典的シグナル配列、ファミリーメンバー間でよく保存されたメタロプロテアーゼドメイン、その機能的関連が今だ未知であるディスインテグリン様（disintegrin-like）モチーフ、および少なくとも１つのトロンボスポンジンＩ型（ＴＳＰ１）ドメインを含有する。ＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーは、含有するＴＳＰ−１ドメインの数において異なり、１〜１５個の範囲をとることができる（Cal et al., 2002; Somerville et al., 2003）。ＡＤＡＭＴＳ配列の最も多様な領域は、１０個の構造的に保存されたシステイン残基を含有するシステイン−リッチ領域の下流に位置する「スペーサー」ドメインである。ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、該スペーサードメインおよびＴＳＰ−１モチーフ内の相互作用によって細胞外マトリックスの成分と結合することができる（Kuno and Matsushima, 1998; Tortorella et al., 2000）。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ１）は、ＩＬ−１に刺激された軟骨によって合成され（Tortorella, et al., Science, 284:1664-1666, 1999）、骨関節炎などの変性関節疾患の間のアグリカンの分解に関連する（Abbaszade et al., J Biol Chem, 274: 23443-23450, 1999）。ＡＤＡＭＴＳ４はまた、ヒト神経膠腫において劇的に増加するタンパク質である脳において豊富なヒアルロナン結合性（brain-enriched hyaluranan binding：ＢＥＨＡＢ）／ブレビカン（brevican）の切断に関与する（Matthews et al., J. Biol. Chem. 275:22695-22703, 2000）。かくして、ＡＤＡＭＴＳ４のアグリカナーゼ活性を阻害することによって、骨関節炎およびいずれか他のＡＤＡＭＴＳ４関連疾患を改善することが可能である。しかしながら、ＡＤＡＭＴＳ４に対する研究結果は、精製ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の不安定性によって妨げられている。
【０００６】
発明の概要
本発明は、フューリンによるプロセシングを受けた全長ＡＤＡＭＴＳ４分子が自己触媒的Ｃ−末端切断（truncation）能を有するという観察に基づいている。自己消化されたＡＤＡＭＴＳ４分子は、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）に対する結合アフィニティーの著しい減少を示したが、アグリカナーゼ活性は保持していた。さらなる研究は、修飾されたドメイン構造を有するＡＤＡＭＴＳ分子が酵素的に活性である一方で、天然酵素と比べて改善された安定性を有することができることを明らかにした。例えば、末端切断されたスペーサードメインを有するか、またはスペーサードメインを有さない修飾ＡＤＡＭＴＳ４分子は、生物学的に活性であり、その全長分子よりも安定であることが見出された。該修飾ＡＤＡＭＴＳタンパク質は、大量に発現および単離でき、かくして、結晶学的研究および酵素反応論的研究などの該タンパク質のさらなるキャラクタリゼーションを可能にする。精製された安定なタンパク質はまた、抗−ＡＤＡＭＴＳ抗体の生産およびＡＤＡＭＴＳ酵素に対する阻害剤の開発を容易にする。
【０００７】
本発明の一の態様は、修飾ＡＤＡＭＴＳ４（ｍＴＳ４）タンパク質；ｍＴＳ４タンパク質をコードするヌクレオチド配列；およびｍＴＳ４タンパク質の生産方法に関する。好ましくは、本発明のｍＴＳ４タンパク質は、その全長タンパク質より安定であり、高レベルに発現されることができる。より好ましくは、本発明のｍＴＳ４タンパク質はより安定であり、生物学的に活性である。
一の具体例において、本発明は、生物学的に活性な単離ｍＴＳ４タンパク質を提供する。該ｍＴＳ４タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ工学によって、またはフューリンによるプロセシングを受けた全長ＡＤＡＭＴＳ４分子の自己消化によって生産されうる。該具体例は、特に、配列番号１７、１９、２２、２４、２６、２７および４６−４９に列挙されるアミノ酸配列を有するｍＴＳ４タンパク質ならびにその変種およびフラグメントを包含する。これらのタンパク質は、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４酵素のキャラクタリゼーション、抗−ＡＤＡＭＴＳ４抗体の生産、およびＡＤＡＭＴＳ４阻害剤のスクリーニングに使用してもよい。
【０００８】
もう一つ別の具体例において、本発明は、生物学的に活性ではないが、その天然タンパク質よりも安定である単離ｍＴＳ４タンパク質を提供する。該具体例は、特に、配列番号２９、３１、３２、４０および５０−５３に列挙されるアミノ酸配列を有するｍＴＳ４タンパク質ならびにその変種およびフラグメントを包含する。これらのタンパク質は、例えば、結晶学的研究に使用してもよい。
もう一つ別の具体例において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ４部分および非−ＡＤＡＭＴＳ４部分を含む単離ｍＴＳ４タンパク質を提供する。ｍＴＳ４タンパク質の非−ＡＤＡＭＴＳ４部分は、免疫認識またはタンパク質精製を容易にするためのタグとして、または分泌を増加させるためのシグナル配列として作用しうる。非−ＡＤＡＭＴＳ４含有ｍＴＳ４タンパク質は、例えば、対象において抗−ｍＴＳ４抗体を産生するため、ＡＤＡＭＴＳ４リガンドを精製するため、およびスクリーニングアッセイにおいてＡＤＡＭＴＳ４タンパク質とＡＤＡＭＴＳ４基質との相互作用を阻害する分子を同定するために使用できる。
【０００９】
もう一つ別の具体例において、本発明は、本発明のｍＴＳ４タンパク質をコードする核酸分子を特徴とする。該具体例は、特に、配列番号１７、１９、２２、２４、２６、２７、２９、３１、３２、４０および４６−５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を包含する。
もう一つ別の具体例において、本発明は、本発明のｍＴＳ４タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。これらのベクターは、本発明のｍＴＳ４タンパク質を生産するための新規な方法において用いてもよい。
【００１０】
本発明のもう一つ別の態様は、抗−ｍＴＳ４抗体、ｍＴＳ４の阻害剤、および抗−ｍＴＳ４抗体またはｍＴＳ４の阻害剤を用いるアグリカナーゼ関連疾患の治療法に関する。
一の具体例において、本発明のｍＴＳ４タンパク質は、骨関節炎などのアグリカナーゼ関連疾患の治療のためのアグリカナーゼの阻害剤およびアグリカナーゼに対する抗体の開発のために使用される。該具体例は、特に、酵素活性を阻害するアグリカナーゼの阻害剤を同定し、開発するための方法を包含する。
【００１１】
もう一つ別の具体例において、本発明は、アグリカナーゼの活性を阻害するための医薬組成物であって、本発明の抗−ｍＴＳ４抗体および／またはｍＴＳ４の阻害剤および医薬担体を含んでなる組成物を提供する。もう一つ別の具体例において、本発明は、本発明の抗−ｍＴＳ４抗体および／またはｍＴＳ４の阻害剤を含んでなる医薬組成物の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする、哺乳動物においてアグリカナーゼ活性を阻害する方法を提供する。
またもう一つ別の具体例において、本発明は、アグリカンの分解によって特徴付けられる疾患に罹患した患者の治療法およびかかる疾患の予防法を提供する。これらの方法は、かかる治療の必要な患者に、本発明の抗−ｍＴＳ４抗体および／またはｍＴＳ４の阻害剤を含んでなる医薬組成物の有効量を投与することを必要とする。
【００１２】
該開示のさらなる態様は、記載の一部に示され、一部、記載から明らかであり、および／または本発明を実施することから知ることができる。本発明は、特に請求の範囲において示され、その開示は請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。下記の詳細な記載は、本発明の種々の具体例の例示的表示であり、請求される本発明を限定するものではない。添付の図面は、記載と共に本明細書の一部を構成し、具体例を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。
【００１３】
図面の記載
図１は、ＡＤＡＭＴＳ４の自己消化イソ形態（パネルＡ）および切断部位（パネルＢ）を示す概略図である。
図２は、修飾ｍＴＳ４分子の種々の具体例（構築物Ｂ−Ｉ）を示す概略図である。
【００１４】
発明の詳細な記載
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解するために、ある特定の用語を最初に定義する。付加的な定義は、詳細な記載を通して示される。
【００１５】
「アグリカナーゼ活性」なる語は、アグリカンに結合するアグリカナーゼ酵素によって遮断または開始される少なくとも１つの細胞性プロセスをいう。一般には、アグリカナーゼ活性は、ｇｌｕ３７３−ａｌａ３７４でのアグリカンのタンパク質分解的切断をいう。アグリカナーゼ活性は、限定するものではないが、アグリカナーゼのアグリカンへの結合およびアグリカナーゼによるアグリカンの切断を包含する。アグリカナーゼ活性は、また、本発明の修飾されたアグリカナーゼとアグリカンとの結合、または該修飾されたアグリカナーゼによるアグリカンの切断から生じる生物学的応答を包含する。
「修飾されたアグリカナーゼ」なる語は、本明細書で使用される場合、天然のアグリカナーゼと比べて少なくとも一つのアミノ酸の置換、挿入、欠失または修飾によって改変されたアグリカナーゼをいう。本発明の修飾されたアグリカナーゼは、対応する天然アグリカナーゼ分子よりも大きな安定性を有しうる。本発明の修飾されたアグリカナーゼはまた、イン・ビボおよびイン・ビトロの両方において、対応する天然のアグリカナーゼタンパク質よりも高レベルで発現されることができる。修飾されたアグリカナーゼは、先の段落で定義されたアグリカナーゼ活性の少なくとも１つを保持する場合、「生物学的に活性」である。修飾されたアグリカナーゼは、該タンパク質の異なる部分におけるアミノ酸置換、修飾、挿入および欠失などの複数の改変を含有していてもよい。
【００１６】
「安定性」なる語は、本明細書で使用される場合、一般に、タンパク質の分解速度の減少をいい、それにより、その半減期、溶解度および／または発現レベルが増加する。いくつかの因子、例えば、ｐＨ、塩濃度、温度、例えばプロテアーゼによるタンパク質分解、金属イオン、タンパク質の自己触媒作用、疎水性などがイン・ビトロおよびイン・ビボにおいてタンパク質安定性に影響を及ぼす。タンパク質をより安定にする条件は、一般に、通常よりも長く、折りたたみコンホメーションでタンパク質を維持する条件を包含し、それにより、より長期間、その生物学的活性を保存する。タンパク質の安定性の増加は、一般に、その半減期および発現レベルを増加し、それにより、治療目的および阻害剤の開発のために、該タンパク質を大量に精製することが可能となる。
【００１７】
本発明の種々の態様は、下記のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。本明細書に引用される特許よび科学文献は、当業者に入手可能な知見を確立している。本明細書中に引用される発行された米国特許、許可された出願、公開された出願（米国および他国）およびＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を包含する参考文献は、特別および個々に出典明示により本明細書の一部とされることが示されているときと同じ程度に出典明示により本明細書の一部とされる。
【００１８】
ＩＩ．修飾ＡＤＡＭＴＳ４（ｍＴＳ４）分子およびその有用性
ヒト染色体１の１ｑ２１−ｑ２３座に位置するヒトＡＤＡＭＴＳ４遺伝子は、８３７個のアミノ酸よりなるプロ−タンパク質をコードする（配列番号１）。該タンパク質は、Ｎ−末端プロ−ペプチド（アミノ酸残基１−２１２）、メタロプロテイナーゼ触媒ドメイン（アミノ酸残基２１３−４３６）、ディスインテグリン様ドメイン（アミノ酸残基４３７−５１９）、ＴＳＰ−１モチーフ（アミノ酸残基５２０−５７６）、システインリッチドメイン（アミノ酸残基５７７−６８５）およびスペーサー（アミノ酸残基６８６−８３７）を含有する。ＡＤＡＭＴＳファミリーの他のタンパク質とは異なり、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は完全にＣ−末端ＴＳＰ−１モチーフを欠く。
ＡＤＡＭＴＳ４プロ−タンパク質のＮ−末端プロ−ペプチドは、トランス−ゴルジ内でフューリンまたは関連するプロ−タンパク質転換酵素によって切断されることができ、その結果、プロ−ペプチド領域を欠く成熟酵素の分泌をもたらす。フューリンによるプロセシングを受けたＡＤＡＭＴＳ４は、酵素的に活性であり、通常、「全長」ＡＤＡＭＴＳ４酵素と呼ばれる。
【００１９】
ＡＤＡＭＴＳ４は、軟骨の主要なプロテオグリカンであるアグリカン、および脳特異的細胞外マトリックスタンパク質であるブレビカンの分解の原因である。アグリカンおよびブレビカンのＡＤＡＭＴＳ４による分解は、関節炎疾患において、中枢神経系の機能において、および神経膠腫の進展において潜在的に、該酵素の重要な役割を示唆する。
ＡＤＡＭＴＳ４酵素活性の阻害は、アグリカンの喪失を防ぎ、骨関節炎に関連する軟骨分解を改善しうる。しかしながら、ＡＤＡＭＴＳ４阻害剤を開発するための努力は、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の一般的に低い発現レベルおよび安定性の低さのため、該酵素を大量に単離および精製することが困難であるという事実によって妨げられてきた。したがって、疾患におけるＡＤＡＭＴＳ４の役割を研究するために、また、アグリカン切断を含む疾患を治療するための療法および組成物を開発するために、新規な形態のＡＤＡＭＴＳ４を同定し、さらに、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質を大量に単離および精製する方法を開発する必要性がある。修飾ＡＤＡＭＴＳ４分子は、アグリカンの切断に関して生物学的に活性であってもよく、その全長分子よりも高レベルで発現されることができる。それらは、ＡＤＡＭＴＳ４および他のアグリカナーゼに対する阻害剤をスクリーンするため、およびＡＤＡＭＴＳ４に対する抗体を開発するために使用することができる。より安定なｍＴＳ４分子は、また、酵素速度論的研究および結晶学的研究を通じて、ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のより良好な生物化学的および生物物理学的キャラクタリゼーションを可能にする。
【００２０】
以後使用する場合、本発明の修飾ＡＤＡＭＴＳ４（ｍＴＳ４）分子は、単離ポリペプチドおよび単離ポリヌクレオチドの両方を包含する。
【００２１】
単離ポリペプチド
本発明の一の態様は、単離ｍＴＳ４タンパク質に関係する。一の具体例において、ｍＴＳ４タンパク質は、アグリカナーゼ活性を有し、アグリカナーゼの阻害剤をスクリーンするために使用できる。もう一つ別の具体例において、ｍＴＳ４タンパク質はアグリカナーゼに対する抗体を開発するために使用される。
修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、標準的な分子生物学的および細胞生物学技術を用いて生産されうる。アグリカナーゼ活性を有する修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４フラグメントのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。ＡＤＡＭＴＳ４コーディング配列のフラグメントのライブラリーは、修飾ＡＤＡＭＴＳ４のスクリーニングおよびそれに続くその選抜のためのＡＤＡＭＴＳ４フラグメントの多彩な集団を生じるために使用することができる。一の具体例において、コーディング配列フラグメントのライブラリーは、一分子あたり約一回ニッキング（nicking）が起こる条件下で、ＡＤＡＭＴＳ４コーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処理し、該二本鎖ＤＮＡを変性させ、該ＤＮＡを復元して、異なるニック産物由来のセンス／アンチセンス対を含むことのできる二本鎖ＤＮＡを形成させ、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理によって一本鎖部分を再形成した二本鎖物から除去し、次いで、得られたフラグメントライブラリーを発現ベクター中にライゲートすることによって、作成することができる。該方法により、種々のサイズのＤＡＭＴＳ４タンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【００２２】
末端切断によって作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当該分野において知られている。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析に馴染みやすい最も広く用いられている技術は、典型的には、複製可能な発現ベクター中に該遺伝子ライブラリーをクローニングすること、適当な細胞を得られるベクターのライブラリーで形質転換すること、および所望の活性の検出により、その遺伝子生産物が検出された遺伝子をコードしているベクターの単離が容易になる条件下で、該コンビナトリアル遺伝子を発現させることを包含する。ライブラリー中で機能的変異体の頻度を増加する技術である反復的アンサンブル変異誘発（recursive ensemble mutagenesis; ＲＥＭ）は、ｍＴＳ４変異体を同定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（DeLagrave et al., Protein Engineering, 6:327 331, 1993）。
【００２３】
約１００個未満のアミノ酸、一般には約５０個未満のアミノ酸を有するＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の一部分は、また、当業者によく知られた技術を用いて、合成手段により作成されてもよい。例えば、かかるポリペプチドは、市販の固相技術、例えば、伸長しているアミノ酸鎖にアミノ酸が連続的に加えられるメリフィールド（Merrifield）固相法を用いて合成されうる。
本発明は、また、ｍＴＳ４融合タンパク質を提供する。ｍＴＳ４融合タンパク質は、互いにフレーム内で融合されたＡＤＡＭＴＳ４−関連ポリペプチドおよび非−ＡＤＡＭＴＳ４ポリペプチドを含有する。ＡＤＡＭＴＳ４−関連ポリペプチドは、修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質またはその変種の全てまたは一部に相当する。
【００２４】
各ポリペプチドがその第二および第三構造中に確実に折りたたまれるのに十分な距離をおいてＡＤＡＭＴＳ４−関連ポリペプチドを非−ＡＤＡＭＴＳ４ポリペプチド成分から分離するために、ペプチドリンカー配列を使用してもよい。かかるペプチドリンカー配列は、当該分野でよく知られた標準的な技術を用いて、該融合タンパク質中に組み込まれる。適当なペプチドリンカー配列は、下記の因子：（１）柔軟な伸長したコンホメーションをとる能力；（２）ＡＤＡＭＴＳ４−関連ポリペプチドおよび非−ＡＤＡＭＴＳ４ポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用することのできる第二構造をとる能力の欠如；および（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応しうる疎水性または荷電残基の欠如に基づいて選択されうる。好ましいペプチドリンカー配列は、ｇｌｙ、ａｓｎおよびｓｅｒ残基を含有する。他の中性近くのアミノ酸、例えば、ｔｈｒおよびａｌａもまた、リンカー配列に用いてもよい。リンカーとして有効に使用されうるアミノ酸配列は、当該分野でよく知られている。該リンカー配列は、一般に、１〜約５０個のアミノ酸長であってもよい。リンカー配列は、ＡＤＡＭＴＳ４−関連ポリペプチドおよび非−ＡＤＡＭＴＳ４ポリぺプチドが機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用できる非必須のＮ−末端アミノ酸領域を有する場合、必要ではない。
【００２５】
ｍＴＳ４タンパク質は、ｍＴＳ４タンパク質の同定および／または精製を容易にするためのペプチドタグを含有していてもよい。該ペプチドタグは、特定のペプチドよりなる短いピース（例えば、ポリ−Ｈｉｓ、Ｆｌａｇ−エピトープ、ｓｔｒｅｐ−タグ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＨＡ−タグ）または小型タンパク質（細菌性グルタチオン−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（thioredoxin）、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質など）である。該タグ配列は、該タンパク質配列中のどこに配置されてもよい。好ましくは、タグ配列は該タンパク質のＣ−末端に置かれるか、または該タンパク質の２つのドメイン構造の間に挿入される。タグ配列は、しばしば、標的遺伝子と共にクローン化され、融合タンパク質の一部として発現される。一般に、これらの融合−タグに対する抗体がすでに、融合タンパク質発現および精製をモニターするために入手可能である。したがって、融合−タグは、二次抗体に非常によく似た万能タグとして作用する。多くのタグはそれ自体の特徴を有する。ポリ−Ｈｉｓ−融合タンパク質（６ｘＨｉｓ）は、ニッケル−セファロースまたはニッケル−ＨＲＰに結合することができる。ＧＳＴ−融合タンパク質は、グルタチオン−セファロースに結合することができる。したがって、融合タンパク質の高度の精製が、たった一回のアフィニティー精製工程において達成できる。融合タンパク質の純化の後、タグ−抗体が可能になる。非常に多くの場合、融合タンパク質を直接、動物中に注入して抗体を作成する。いくつかの融合タグは、タグを含有しない組み換えタンパク質を作成するために、酵素処理によって後で除去することができる。
【００２６】
好ましくは、本発明のｍＴＳ４融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって生産される。該融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成機を包含する従来の技術によって合成できる。別法では、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続的な遺伝子フラグメント間に相補的な突出部を生じるアンカープライマーを用いて行うことができ、それを次いで、アニールし、再増幅してキメラ遺伝子配列を作成することができる。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする多くの発現ベクターが市販されている。ＡＤＡＭＴＳ４−関連ポリヌクレオチドは、融合部分をＡＤＡＭＴＳ４−関連ポリペプチドにフレーム内で連結するような発現ベクター中でクローン化することができる。
【００２７】
シグナル配列は、本発明のｍＴＳ４またはｍＴＳ４融合タンパク質の分泌および単離を容易にするために使用することができる。シグナル配列は、典型的には、一般に、一以上の切断事象において分泌の間に成熟タンパク質から切断される疎水性アミノ酸のコアによって特徴付けられる。かかるシグナルペプチドは、それらが分泌経路を通過するときに、成熟タンパク質からのシグナル配列の切断を可能にするプロセシング部位を含有する。
本発明は、さらに、修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質のフラグメントおよび変種を包含する。例えば、多くの保存的アミノ酸置換が、タンパク質の構造およびコンホメーションを有意に修飾することなく可能であり、かくして、生物学的特性も維持されることが知られている。例えば、保存的アミノ酸置換は、塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン間で；酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸間で；非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシン間で；および非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステイン間で作成されうることが認められる。かくして、原型ｍＴＳ４タンパク質のこれらの修飾および欠失は、原型ｍＴＳ４タンパク質の生物学的に活性な代替物として使用してもよい。ｍＴＳ４またはｍＴＳ４融合タンパク質の所定の変種が原型タンパク質の生物学的活性を維持するかどうかは、両方のタンパク質（原型タンパク質およびその変種）を実施例に記載される生物学的活性アッセイに付すことによって容易に決定できる。
【００２８】
特に、生物学的機能的に等価のポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを免疫学的具体例に使用する場合、類似のアミノ酸の置換を親水性に基づいて作成することもできる。出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第４，５５４，１０１号には、その隣接するアミノ酸の親水性を基準として、ポリペプチドの最も大きな局所的平均親水性がその免疫原性および抗原性と相関すること、すなわち、該ポリペプチドの生物学的特性と相関することが記載されている。アミノ酸は、同様の親水性を有する別のアミノ酸で置換することができ、生物学的等価、特に、免疫学的に等価のポリペプチドを依然として得ることができることが理解される。
一の具体例において、活性部位変異をｍＴＳ４分子中に導入して、該酵素の触媒活性を故意に阻害する。該アプローチは、特に、ｍＴＳ４タンパク質の結晶化および構造決定、次いで、ｍＴＳ４の阻害剤を同定し、開発する目的で有用である。本発明のｍＴＳ４の活性部位変異体の増加した安定性は、疾患治療のための阻害剤の開発におけるその後の使用のための大量のｍＴＳ４分子の精製および単離を可能にする。例えば、Ｅ３６２Ｑ変異は、ｍＴＳ４を生物学的に不活性にし、それにより、結晶化のために大量の不活性なタンパク質の精製を可能にする。
【００２９】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的）は、かかる置換が望まれるときに、当業者によって決定できる。例えば、アミノ酸置換は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの重要なアミノ酸残基を同定するために、または記載の本発明のアグリカナーゼ活性を増加または減少するために使用することができる。例示的アミノ酸置換を表１に示す。
【００３０】
【表１】
2005534308.tif 000003
【００３１】
ある特定の具体例において、保存的アミノ酸置換は、また、典型的には生物学的系における合成よりもむしろ、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を含む。
本明細書に記載されるアグリカナーゼタンパク質の配列の他の特異的変異は、グリコシル化部位の修飾を含む。これらの修飾は、Ｏ−連結またはＮ−連結グリコシル化部位を含んでいてもよい。例えば、グリコシル化の不在またはほんの一部のみのグリコシル化は、アスパラギンに連結したグリコシル化認識部位でのアミノ酸置換または欠失に起因する。該アスパラギン連結グリコシル化認識部位は、適当な細胞性グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかであり、ここに、Ｘは通常、いずれかのアミノ酸である。グリコシル化認識部位の最初または三番目のアミノ酸位置のうち１つまたはその両方での種々のアミノ酸置換または欠失（および／または二番目の位置でのアミノ酸欠失）は、その修飾されたトリペプチド配列にて非グリコシル化をもたらす。さらに、アグリカナーゼ関連タンパク質の細菌性発現は、また、たとえグリコシル化部位が修飾されないままであっても、非グリコシル化タンパク質の産生をもたらすであろう。
【００３２】
単離ポリヌクレオチド
本発明のもう一つ別の態様は、ｍＴＳ４タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。ｍＴＳ４分子のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、標準的な分子生物学技術および本明細書中に提供される配列情報ならびに当該分野で既知の配列情報を用いて調製できる。天然または修飾されたＡＤＡＭＴＳ４遺伝子配列は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは別法では、ゲノムＤＮＡ、および適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的なＰＣＲ増幅技術にしたがって増幅できる。そのようにして増幅されたポリヌクレオチドは、適当なベクター中にクローン化でき、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。さらに、天然または修飾されたＡＤＡＭＴＳ４配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いて、調製できる。一の具体例において、ｍＴＳ４配列は、翻訳効率を改善するために、修飾されたＫｏｚａｋ配列を含んでいてもよい。
【００３３】
遺伝コードの縮重の結果として、同じポリペプチドをコードする多くのポリヌクレオチド変種が存在することは、当業者に明らかであろう。これらのポリヌクレオチド変種のいくつかは、元のポリヌクレオチドに対して最小の配列ホモロジーを有する。それでもなお、コドン使用における相違のために変化するポリヌクレオチドが、本発明によって特に意図されている。
本発明は、また、ｍＴＳ４タンパク質の変種をコードしているポリヌクレオチドに関する。ｍＴＳ４タンパク質の変種をコードしている単離ポリヌクレオチド分子は、一以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列中に導入することによって作成でき、その結果、一以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされたタンパク質中に導入される。かかる技術は当該分野でよく知られている。変異は、標準的な技術によって、例えば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ−媒介性突然変異誘発によって、ｍＴＳ４タンパク質中に導入することができる。別法では、変異は、ｍＴＳ４タンパク質のコーディング配列の全てまたは一部に沿って、例えば、飽和突然変異誘発によって、無作為に導入することができ、得られる変異体を生物学的活性についてスクリーンして、野生型タンパク質活性を阻害することのできる変異体（ドミナントネガティブ変異体）を同定することができる。突然変異誘発後、そのコードされたタンパク質を組み換え発現することができ、該タンパク質の活性を決定することができる。
【００３４】
ポリヌクレオチドをさらに修飾して、イン・ビボでの安定性を増加させてもよい。可能な修飾は、限定するものではないが、５’および／または３’末端でのフランキング配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合によりもむしろ、チオリン酸または２−ｏ−メチルの使用；および／またはイノシン、キューオシン（queosine）およびワイブトシン（wybutosine）などの特殊な塩基ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル−メチル−、チオ−および他の修飾形態を含むことを包含する。
【００３５】
ＩＩＩ．発現ベクター
本発明のもう一つ別の態様は、ｍＴＳ４タンパク質の発現方法において有用なベクターを包含する。好ましくは、本発明のベクターは、ｍＴＳ４またはｍＴＳ４の活性な部位変異体をコードする上記のＤＮＡ配列を含有する。ベクターは、本発明の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の発現を可能にする適当な発現調節配列を含有しうる。
一の具体例において、本発明のベクターは、宿主細胞中のポリヌクレオチドの発現に適当な形態でｍＴＳ４をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。該ベクターは、一般に、発現されるべきポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した、発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択される一以上の調節配列を有する。発現ベクターの設計が、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存することができることは、当業者に明らかであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞中に導入され、それにより、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質またはペプチドを包含するタンパク質またはペプチドを生産することができる。
【００３６】
本発明の発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるｍＴＳ４の発現のために設計することができる。例えば、ｍＴＳ４は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現することができる。別法では、発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、イン・ビトロで転写および翻訳することができる。
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を指示する構造性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸をそこにコードされるタンパク質に、通常、組み換えタンパク質のアミノ末端に付加する。かかる融合ベクターは、典型的には、１）組み換えタンパク質の発現を増加するため；２）組み換えタンパク質の溶解度を上げるため；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組み換えタンパク質の精製を補助するためという三つの目的にかなう。しばしば、融合発現ベクターにおいて、融合タンパク質の精製後に、融合部分からの組み換えタンパク質の分離を可能にするために、タンパク質分解的切断部位が融合部分と組み換えタンパク質の接合点に導入される。かかる酵素、およびその同種の認識配列は、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを包含する。典型的な融合発現ベクターは、各々、ＧＳＴ、ＭＢＰまたはプロテインＡを標的組み換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Pharmacia Piscataway, NJ）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA）およびｐＲＩＴＳ（Pharmacia, Piscataway, NJ）を包含する。
【００３７】
適当な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃおよびｐＥＴ１１ｄを包含する。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現したウイルス性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）によって媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。該ウイルス性ポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写調節下、Ｔ７  ｇｎ１遺伝子を有する内在性プロファージ由来の宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＳＬＥ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組み換えタンパク質発現を最大にするための一の戦略は、組み換えタンパク質をタンパク質分解的に切断するための能力が減少した宿主細菌中で該タンパク質を発現させることである。もう一つ別の戦略は、各アミノ酸のための個々のコドンがＥ．ｃｏｌｉ中で優先的に利用されるものとなるように、発現ベクター中に挿入されるべきポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を改変することである。本発明のポリヌクレオチド配列のかかる改変は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実施することができる。
【００３８】
もう一つ別の具体例において、ｍＴＳ４発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中での発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２（Invitrogen Corporation, San Diego, CA）およびｐｉｃＺ（Invitrogen Corp, San Diego, CA）を包含する。
別法では、ｍＴＳ４は、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において発現させることができる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズおよびｐＶＬシリーズを包含する。
またもう一つ別の具体例において、哺乳動物発現ベクターを用いて、ｍＴＳ４を哺乳動物細胞中において発現する。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣおよびｐＨＴｏｐを包含する。哺乳動物細胞中で使用する場合、発現ベクターの調節機能は、しばしば、ウイルス性調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０（Simian Virus 40）から由来する。別法では、発現ベクターの調節機能は、天然ＡＤＡＭＴＳ４プロモーターまたは組織特異的調節エレメントによって提供されうる。
【００３９】
本発明は、さらに、細胞、組織または発現用の哺乳動物にポリヌクレオチドを送達するための遺伝子送達ビヒクルを提供する。例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は、遺伝子送達ビヒクルにおいて局所的または全身に投与できる。これらの構築物は、イン・ビボまたはエクス・ビボ様式においてウイルス性または非ウイルス性ベクターアプローチを利用できる。かかるコーディング配列の発現は、内在性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを用いて誘導することができる。イン・ビボでのコーディング配列の発現が構成されるか、または調節されることができる。本発明は、意図したポリヌクレオチドを発現できる遺伝子送達ビヒクルを包含する。該遺伝子送達ビヒクルは、好ましくは、ウイルス性ベクターであり、より好ましくは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスまたはアルファウイルス性ベクターである。ウイルス性ベクターは、また、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポーベウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルスまたはトガウイルスベクターであることもできる。
【００４０】
本発明のｍＴＳ４構築物の細胞中への送達は、上記のウイルスベクターに限定されない。例えば、核酸発現ベクター、死んだ単独のアデノウイルスに結合しているか、または結合していないポリカチオン濃縮ＤＮＡ、リポソーム、リガンド結合ＤＮＡ、真核生物細胞送達ビヒクル、光重合したハイドロゲル材料の沈殿、ハンドヘルドの遺伝子移入パーティクルガン、電離放射線、核電荷中和または細胞膜との融合などの他の送達方法および媒体を用いてもよい。粒子媒介による遺伝子移入を用いてもよい。例えば、高レベル発現のための慣用的な調節配列を含有する慣用的なベクター中に配列を挿入することができ、次いで、合成遺伝子移入分子、例えば、アシアロオロソムコイド、インスリン、ガラクトース、ラクトースまたはトランスフェリンなどの細胞標的リガンドに結合したポリリジン、プロタミンおよびアルブミンのような重合体ＤＮＡ結合カチオンと共にインキュベートすることができる。裸の（naked）ＤＮＡを用いてもよい。裸のＤＮＡの取込効率は、生物分解性ラテックスビーズを用いて改善されうる。
【００４１】
ＩＶ．アグリカナーゼタンパク質の産生
本発明の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、上記の発現ベクターで形質転換または感染した細胞を培養することによって産生しうる。該タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いて精製してもよい。精製したｍＴＳ４タンパク質は、実質的に、共に産生される他のタンパク質材料ならびに他の汚染物質を含有しない。回収した精製タンパク質は、アグリカンを切断することによってタンパク質分解性アグリカナーゼ活性を示すと考えられる。かくして、本発明のタンパク質はさらに、アグリカン分解性分子の存在を決定するアッセイにおいてアグリカン分解活性を明らかにできる能力によって特徴付けられうる。これらのアッセイまたはその開発は、当業者の知見内である。かかるアッセイは、アグリカン基質をアグリカナーゼ分子と接触させ、アグリカンフラグメントの産生をモニターすることを含みうる（例えば、Hughes et al., Biochem. J. 305:799-804, 1995; Mercuri et al, J. Bio. Chem. 274:32387-32395, 1999参照）。
適当な細胞または細胞系統は、哺乳動物細胞、例えば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生産物産生および精製の方法は、当該分野で既知である。付随の実施例において記載されるもう一つ別の適当な哺乳動物細胞系統は、サルＣＯＳ−１細胞系統である。哺乳動物細胞系統ＣＶ−１もまた、適当でありうる。
【００４２】
細菌細胞もまた適当な宿主でありうる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、シュードモナス、他のバチルスなどの種々の株もまた、該方法において使用してもよい。細菌細胞における本発明のｍＴＳ４タンパク質の発現の場合、アグリカナーゼのプロ−ペプチドをコードしているＤＮＡは、一般に必要とされない。
【００４３】
当業者に知られている酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能でありうる。さらに、所望の場合、昆虫細胞を本発明の方法における宿主細胞として利用してもよい。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986)およびその引用文献を参照のこと。
宿主細胞中で産生した修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用いる適当な精製スキームによって宿主細胞から単離できる。標準的な精製方法は、電気泳動、分子、免疫学、およびイオン交換、疎水性、アフィニティーおよび逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーならびにクロマトフォーカシングを包含するクロマトグラフィー技術を包含する。例えば、ｍＴＳ４タンパク質は、抗−ｍＴＳ４抗体カラムを用いて精製してもよい。タンパク質濃縮と共に、限外ろ過およびダイアフィルトレーション（diafiltration）技術も有用である。必要な精製度は、修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の用途に依存して変化するであろう。いくつかの例において、精製は必要ない。
【００４４】
Ｖ．抗体の作成
本発明のもう一つ別の態様によると、ｍＴＳ４  ＡＤＡＭＴＳ４、または他のＡＤＡＭＴＳ４−関連タンパク質に特異的な抗体が調製される。抗−ｍＴＳ４抗体は、ｍＴＳ４のアグリカナーゼ活性を阻害する抗体および阻害しない抗体の両方を包含する。抗−ｍＴＳ４抗体はまた、「ネオエピトープ抗体」も包含し、これは、ＡＤＡＭＴＳ４またはｍＴＳ４のタンパク質分解的切断によって露出した新しいＮ−またはＣ−末端アミノ酸配列を特異的に認識するが、元の（切断されていない）分子上のかかるエピトープには結合しない抗体をいう。抗−ｍＴＳ４抗体は、アグリカナーゼまたは関連タンパク質の検出および／または精製に、あるいはアグリカナーゼの効果を阻害または予防するのに有用でありうる。
【００４５】
ｍＴＳ４タンパク質、またはｍＴＳ４タンパク質の抗原性フラグメントは、免疫源として使用できる。ｍＴＳ４タンパク質の抗原性ペプチドは、ｍＴＳ４アミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、そのペプチドに対して生じた抗体がｍＴＳ４タンパク質と特異的な免疫複合体を形成するようなｍＴＳ４タンパク質のエピトープを包含する。好ましくは、該抗原性ペプチドは、少なくとも８個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１６個のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸残基を含む。
ｍＴＳ４免疫原（例えば、ｍＴＳ４タンパク質、そのフラグメント、またはｍＴＳ４融合タンパク質）は、典型的に、適当な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫原で免疫することによって抗体を調製するために使用される。適当な免疫原調製物は、例えば、組み替え発現したｍＴＳ４免疫原または化学的に合成したｍＴＳ４免疫原を含むことができる。該調製物は、さらに、アジュバント、例えば、フロイントの完全または不完全アジュバント、または類似の免疫刺激剤を含むことができる。免疫原調製物を用いる適当な対象の免疫化は、抗−ｍＴＳ４抗体応答を誘導する。モノクローナルおよびポリクローナル抗−ｍＴＳ４抗体を調製、単離および使用するための技術は、当該分野でよく知られている。
【００４６】
したがって、本発明のもう一つ別の態様は、モノクローナルまたはポリクローナル抗−ｍＴＳ４抗体に関する。本発明は、ｍＴＳ４タンパク質に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を提供する。
抗−ｍＴＳ４抗体は、標準的な技術、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降によって、ｍＴＳ４タンパク質またはｍＴＳ４−関連タンパク質を単離するために使用できる。抗−ｍＴＳ４抗体は、ｍＴＳ４タンパク質またはｍＴＳ４−関連タンパク質、例えば、全長ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質、ｍＴＳ４−融合タンパク質、またはその変種および変異体を細胞から精製するのを容易にすることができる。さらに、抗−ｍＴＳ４抗体を、ｍＴＳ４タンパク質またはｍＴＳ４−関連タンパク質を検出するために用いて、該タンパク質の発現の発現量および発現パターンを評価することができる。ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と交差反応する抗−ｍＴＳ４抗体は、例えば、所定の処理方針の効率を決定するために、臨床試験法の一部として、組織中のＡＤＡＭＴＳ４タンパク質レベルをモニターするために診断上使用することができる。検出は、検出可能な物質に抗体を結合する（すなわち、物理的に結合する）ことによって容易にすることができる。検出可能な物質の例は、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を包含する。適当な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例は、アンベリフェロン（umbelliferone）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンを包含し；発光物質の例は、ルミノールを包含し；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含し；適当な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび３Ｈを包含する。
【００４７】
ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と交差反応する抗−ｍＴＳ４抗体は、また、増加したＡＤＡＭＴＳ４発現を有する細胞または組織に対する治療物質を目標とするのに有用である。例えば、小型分子ＡＤＡＭＴＳ４アンタゴニストのような治療物質を抗−修飾ＡＤＡＭＴＳ４抗体に結合して、増加したＡＤＡＭＴＳ４発現を有する細胞または組織に対する治療物質を目標とすることができる。
治療剤は、直接または間接的に適当なモノクローナル抗体に結合（例えば、共有結合）していてもよい。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他と反応できる置換基を有する場合に可能である。例えば、一方が有するアミノまたはスルフヒドリル基のような求核性基が、他方が有する無水物または酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができる。
【００４８】
別法では、治療剤と抗体がリンカー基を介して結合することが望ましい場合がある。リンカー基は、結合能力の妨害を回避するために薬剤から抗体を遠ざけるためのスペーサーとして機能することができる。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を増加するように作用でき、かくして、結合効率を上げることができる。化学反応性の増加は、また、薬剤の使用、または薬剤上の官能基の使用を容易にすることができ、さもなければ、それは不可能であったであろう。
ホモ−およびヘテロ−官能性の両方の種々の二官能性または多官能性試薬（例えば、the catalog of the Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.に記載されるもの）がリンカー基として使用されうることは、当業者に明らかであろう。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化した炭水化物残基によってもたらされてもよい。
【００４９】
本発明のイムノコンジュゲートの抗体部分から離れたときに治療剤がより強力である場合、細胞中への内在化の間、または内在化時に切断可能なリンカー基を使用することが望ましい。多くの異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出のためのメカニズムは、ジスルフィド結合の還元による、感光性結合の照射による、誘導体化アミノ酸側鎖の加水分解による、血清補体媒介性加水分解による、および酸触媒性加水分解による切断を包含する。
一以上の薬剤が抗体に結合することが望ましい場合もある。一の具体例において、薬剤の複数の分子が一つの抗体分子に結合する。もう一つ別の具体例において、一種以上の薬剤が一の抗体に結合してもよい。特定の具体例にかかわらず、一以上の薬剤を有するイムノコンジュゲートが種々の方法において調製されうる。例えば、一以上の薬剤を抗体分子に直接結合させてもよく、または複数の結合部位を提供するリンカーを用いることができる。
【００５０】
ＶＩ．阻害剤の開発
本発明のｍＴＳ４タンパク質は、ＡＤＡＭＴＳ４および他のアグリカナーゼに対する阻害剤の開発に使用してもよい。アグリカナーゼ阻害剤は、アグリカナーゼ関連疾患の治療に使用してもよい。例えば、アグリカン分解の増加は、骨関節炎の進行に関連する。２つの軟骨アグリカナーゼ、ＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５は、明白なコラーゲン異化作用およびその組織無欠性の崩壊に先んずる関節炎疾患の初期段階において、関節軟骨からアグリカンが異化および喪失する主な原因である（Caterson et al., Matrix Biol. 19:333-44, 2000）。したがって、ＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５活性の阻害には、骨関節炎の治療の可能性がある。
アグリカナーゼに対する阻害剤を開発するために、様々な努力がなされてきた。メタロプロテアーゼ３の内在性組織阻害剤（ＴＩＭＰ−３）のＮ−末端阻害ドメインは、ヒトＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５の強力な阻害剤であり、ナノモル以下の範囲のＫ（ｉ）値を有する（Kashiwagi et al. J. Biol. Chem. 276:12501-12504, 2001）。さらなる研究は、他のＴＩＭＰもまた、ＡＤＡＭＴＳ４活性を阻害しうることを明らかにした。例えば、ＴＩＭＰ−３はＡＤＡＭＴＳ４活性を７．９ｎＭのＩＣ（５０）値で最も効率良く阻害し、それは、ＴＩＭＰ−１（３５０ｎＭ）およびＴＩＭＰ−２（４２０ｎＭ）の少なくとも４４倍低い値であり、ＴＩＭＰ−４（３５％阻害で２μＭ）の少なくとの２５０倍低い値であった（Hashimoto et al., FEBS Lett. 494:192-195, 2001）。
【００５１】
シクロスポリンＡが、関節軟骨エクスプラントにおいてＩＬ−１−誘導性アグリカナーゼ媒介性プロテオグリカン異化作用を阻害することができるという証拠がある（Little et al., Arthritis Rheum. 46:124-129, 2002）。ＡＤＡＭＴＳ１活性の抑制は、また、特異的なモノクローナル抗体、およびＴＩＭＰ−２および３を包含するいくつかのメタロプロテアーゼ阻害剤を用いて達成された（Rodriguez-Manzaneque et al.,  Biochem. Biophys. Res. Commun. 293:501-508, 2002）。
増加した安定性および発現レベルを有する修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質により、大量のアグリカナーゼ分子の生産が可能となって、アグリカナーゼに対する阻害剤の開発が可能となる。したがって、本発明はまた、アグリカナーゼ阻害剤を同定するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とういう）を提供する。かかる方法は、典型的には、ｍＴＳ４タンパク質と一以上の試験成分との間の反応を含む。他の成分は、試験化合物自体であってもよく、または試験化合物とｍＴＳ４タンパク質の結合パ−トナーの組み合わせであってもよい。
【００５２】
本発明の一の態様は、ｍＴＳ４タンパク質とその結合パートナー、例えば、アグリカンとブレビカンの結合を妨害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。一の具体例において、シンチレーション近接アッセイ（scintillation proximity assay）を用いる。該アッセイにおいて、ｍＴＳ４タンパク質を１２５Ｉのような同位元素で標識する。結合パートナーをシンチラント（scintillant）で標識し、それは、放射能減衰に最も近いとき（すなわち、ｍＴＳ４タンパク質がその結合パートナーに結合したとき）に発光する。発光の減少は、化合物が２つのタンパク質の結合を妨害したことを示すであろう。
【００５３】
別法では、蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイを用いることができた。ＦＲＥＴアッセイにおいて、蛍光エネルギー供与体は、１のタンパク質（例えば、ｍＴＳ４タンパク質）からなり、蛍光エネルギー受容体は第２のタンパク質（例えば、ｍＴＳ４タンパク質の結合パートナー）からなる。受容体分子の吸収スペクトルが供与体発蛍光団の発光スペクトルと一部重複する場合、供与体によって放射された蛍光が受容体によって吸収される。供与体分子は、該タンパク質上の蛍光残基（例えば、トリプトファンまたはチロシン残基などの内在性蛍光）、または該タンパク質に共有結合した発蛍光団（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣ）であることができる。そこで、適当な供与体分子は、上記の受容体／供与体スペクトルの必要条件を考慮して選択される。
【００５４】
かくして、該例において、ｍＴＳ４タンパク質を蛍光分子（すなわち、供与体発蛍光団）で標識し、その結合パートナーを消光分子（すなわち、受容体）で標識する。ｍＴＳ４タンパク質およびその結合パートナーが結合するとき、ｍＴＳ４タンパク質単独の場合と比べて、蛍光発光が消光または減少するであろう。同様に、ｍＴＳ４タンパク質−パートナー複合体の相互作用を解離することのできる化合物は、蛍光発光の増加をもたらすであろう。蛍光発光の増加は、該化合物がｍＴＳ４タンパク質とその結合パートナーとの結合を妨害したことを示す。
【００５５】
もう一つ別の具体例において、アグリカナーゼ感受性タンパク質配列を構成するＦＲＥＴペプチドを、アグリカナーゼの基質として使用する。アグリカナーゼが該ペプチドを切断するとき、その蛍光物質（fluor）が同じペプチド上の消光物質から遊離し、蛍光が生じる。化合物による該蛍光発生の阻害は、正の結果と判断される。
【００５６】
２つのタンパク質の結合または解離を検出するためのもう一つ別のアッセイは、蛍光偏光または異方性である。該アッセイにおいて、研究されるタンパク質（例えば、ｍＴＳ４タンパク質）を適当な蛍光寿命を有する発蛍光団で標識する。次いで、該タンパク質試料を垂直に偏光した光で励起する。次いで、水平および垂直に偏光した発光の強度を決定することによって、異方性の値を算出する。次に、標識したタンパク質（ｍＴＳ４タンパク質）をｍＴＳ４タンパク質結合パートナーと混合し、異方性を再び測定する。蛍光異方性強度は標識タンパク質の回転自由度に関連するので、溶液中でタンパク質が敏速に回転すればするほど、異方性の値は小さくなる。かくして、標識したｍＴＳ４タンパク質が複合体（例えば、ｍＴＳ４タンパク質−パートナー）の一部である場合、該ｍＴＳ４タンパク質は溶液中でよりゆっくりと回転し（遊離した、結合していないｍＴＳ４タンパク質と比べて）、異方性強度は増加する。次いで、ｍＴＳ４タンパク質−パートナー複合体の相互作用を解離することのできる化合物は、異方性の減少をもたらし（すなわち、標識したｍＴＳ４タンパク質はより敏速に回転する）、それは、該化合物がｍＴＳ４タンパク質とその結合パートナーとの結合を妨害したことを示す。
【００５７】
より伝統的なアッセイは、ｍＴＳ４タンパク質−結合パートナーを１２５Ｉのような同位体で標識し、ｍＴＳ４タンパク質と一緒にインキュベートし、次いで、ｍＴＳ４タンパク質を免疫沈降することを含むものであった。遊離したｍＴＳ４タンパク質を増加する化合物は、沈殿カウントを減らすであろう。放射能の使用を回避するために、その代わりとして、ｍＴＳ４タンパク質−結合パートナーを酵素−結合抗体で標識することができた。
別法では、ｍＴＳ４タンパク質−結合パートナーをアッセイプレートの表面に固定することができ、ｍＴＳ４タンパク質を放射性タグで標識することができた。カウント数の増加は、ｍＴＳ４タンパク質とその結合パートナーとの結合を妨害した化合物を同定するものであった。
【００５８】
さらに、結合相互作用の評価は、Ｂｉａｃｏｒｅ技術を用いて行ってもよく、ここに、ｍＴＳ４タンパク質またはその結合パートナーをマイクロチップに、化学的修飾によって直接、あるいは抗体−エピトープ結合（例えば、ｍＴＳ４タンパク質に対する抗体）、エピトープタグに向けられた抗体（例えば、Ｈｉｓタグ）または融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ）を介してつないで結合させる。次いで、第二のタンパク質を該「チップ」上に流すことによって加え、シグナルの変化を検出する。最後に、試験化合物を「チップ」上に流すことによって加え、シグナルの変化を検出する。
【００５９】
本発明の試験化合物は、一般に、小型分子または生物分子のいずれかである。小型分子は、限定するものではないが、無機分子および小型有機分子を包含する。生物分子は、限定するものではないが、哺乳動物中において生物活性を有する天然および合成化合物、例えば、脂質、ステロイド、ポリペプチド、多糖類、およびポリヌクレオチドを包含する。一の好ましい具体例において、試験化合物は小型分子である。もう一つ別の好ましい具体例において、試験化合物は生物分子である。
【００６０】
本発明の試験化合物は、天然および／または合成化合物の組織的ライブラリーを包含するいずれの入手可能な供給源から得てもよい。試験化合物は、また、生物学的ライブラリー；ペプトイドライブラリー（酵素的分解に対して耐性があるが、生物活性のままである新規な非ペプチド骨格を有するが、ペプチドの機能性を有する分子のライブラリー）；空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する当該分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかによって得てもよい。生物学的ライブラリーおよびペプトイドライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小型分子ライブラリーに応用可能である。本明細書中で使用される場合、「結合パートナー」なる語は、ｍＴＳ４タンパク質の基質として、またはｍＴＳ４タンパク質に対する結合アフィニティーを有するリガンドとして作用する分子をいう。
【００６１】
もう一つ別の具体例において、アッセイは、細胞／組織を試験化合物に曝露する前、および曝露した後に、細胞または組織中におけるアグリカナーゼ発現のレベルを決定することを含む。該アグリカナーゼ発現は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲおよび実時間ＰＣＲなどの標準的な技術を用いて、タンパク質レベルまたはＲＮＡレベルにおいて決定されうる。
本発明は、本発明のｍＴＳ４タンパク質の活性または発現を阻害することのできる試験化合物について、ハイスループットスクリーニングを実施する方法を提供する。一の具体例において、ハイスループットスクリーニングの方法は、試験化合物とｍＴＳ４タンパク質を組み合わせ、次いで、ｍＴＳ４タンパク質に対する試験化合物の影響を検出することを含む。
【００６２】
様々な種類の活性化試験化合物の反応性をスクリーンおよび／または研究するために、当該分野でよく知られた種々のハイスループット機能的アッセイを組み合わせて使用してもよい。該結合系はしばしば予測困難なので、幅広い範囲の結合メカニズムを検出するために、多くのアッセイを設定する必要があるかもしれない。限定するものではないが、ＢＲＥＴＲ（登録商標）またはＦＲＥＴＲ（どちらも、Packard Instrument Co., Meriden, CT製）を包含する種々の蛍光に基づく技術が当該分野でよく知られており、活性についてハイスループットおよび超ハイスループットスクリーニングが可能である。大きな感受性を有する大量の種々の試験化合物をスクリーンすることのできる能力により、さらにアグリカナーゼの潜在的な阻害剤を提供するための本発明の治療標的の分析が可能となる。
【００６３】
試験化合物を本発明の修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と組み合わせ、それらの間の結合活性を決定することによって、結合系を解明するための診断的分析を行うことができる。サイトセンサー・ミクロフィジオメーター（cytosensor microphysiometer）を用いる一般的アッセイを、代謝活性化を測定するために使用してもよいが、カルシウム動員の変化は、ＦＬＩＰＲＲ（Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA）などの蛍光に基づく技術を用いることによって検出できる。さらに、アポトーシス細胞の存在は、ＴＵＮＥＬアッセイによって決定してもよく、それは、アポトーシスの間にゲノムＤＮＡの切断から生じる遊離の３−ＯＨ末端を検出するためにフローサイトメトリーを利用するものである。上記のように、様々な種類の活性化試験化合物の反応性をスクリーンおよび／または研究するために、当該分野でよく知られた種々の機能的アッセイを組み合わせて使用してもよい。好ましくは、本発明のハイスループットスクリーニングアッセイは、ＢＩＡＣＯＲＥＲシステム（Biacore International AB, Uppsala, Sweden）によって提供されるような、標識なしのプラズモン共鳴を利用する。表面プラズモン波が金属／液体中間面で励起する場合、プラズモンフリー共鳴が起きる。試料との接触の結果として該表面から方向をもった光を反射することによって、表面プラズモン共鳴が表層で屈折率の変化を引き起こす。表層での所定の質量濃度変化に関する屈折率変化は、多くの生物活性剤（タンパク質、ペプチド、脂質およびポリヌクレオチドを包含する）について類似し、ＢＩＡＣＯＲＥＲセンサー表面を官能基化してこれらの種々の生物活性剤を結合することができるので、かくして、試験化合物の幅広い選択の検出が達成できる。
【００６４】
ルミネセンス酸素チャネリングを用いるアグリカン切断の阻害剤のためのハイスループットスクリーニングアッセイが近年、Peppardらによって開発された（Peppard et al., J. Biomol. Screen.  8:149-156, 2003）。該アッセイは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎＴＭ（登録商標）技術を利用する。該技術において、特異的生物学的相互作用によって「供与体」ビーズおよび「受容体」ビーズを近付け、レーザー光で刺激し、ルミネセンス酸素トンネリングによってシグナルを発生する。該スクリーニングアッセイは、アグリカンの炭化水素側鎖に対する特異的抗体を使用して骨格を作成し、それにより、アグリカンは供与体および受容体ビーズ間に架橋を形成することができ、かくして、ビーズ同士を近付けて、レーザー光での照射においてシグナルを生じることができる。消化されたアグリカンは、かかる架橋を形成することができず、シグナルを発生しない。該消化の阻害剤は、シグナルの復活として検出することができる。
【００６５】
また、アグリカナーゼ阻害剤の同定および開発のためのアッセイは、例えば、アグリカンおよび阻害剤の混合物をｍＴＳ４タンパク質と接触させ、次いで、例えば、アグリカナーゼ感受性部位での切断によって生じるアグリカンフラグメントの検出および測定によって、アグリカナーゼ活性阻害の度合いを測定することを含んでいてもよい。阻害剤は、タンパク質、ペプチド、抗体または化学化合物であってもよい。一の具体例において、阻害剤は、アグリカナーゼ分子上の活性部位に結合するペプチド分子である。例えば、ｍＴＳ４分子の活性部位変異体をペプチド阻害剤の開発に使用することができる。
【００６６】
ＶＩＩ．疾患治療および診断
アグリカナーゼの阻害剤およびアグリカナーゼ活性を阻害する抗体を、アグリカナーゼ関連疾患の治療に使用してもよい。本発明のアグリカナーゼの阻害剤または抗体を用いることによって治療可能であると考えられる種々の疾患は、限定するものではないが、骨関節炎、神経膠腫、癌、炎症性関節疾患、慢性関節リウマチ、敗血症性関節炎、歯周疾患、角膜潰瘍、蛋白尿、アテローム斑破裂に由来する冠状動脈血栓症、動脈瘤性大動脈疾患、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸障害症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、脳および造血性悪性腫瘍、骨粗鬆症、パーキンソン病、偏頭痛、鬱、末梢神経障害、ハンチントン病、多発性硬化症、眼血管新生、黄斑変性、動脈瘤、心筋梗塞、自己免疫障害、外傷性関節傷害後の変性軟骨喪失、頭部外傷、栄養障害性表皮水疱症、脊髄傷害、急性および慢性神経変性障害、骨減少症、側頭下顎関節疾患、神経系の脱髄性疾患、器官移植毒性および拒絶、カヘキシー、アレルギー、組織潰瘍、再狭窄、および改変したアグリカナーゼ活性または改変したアグリカナーゼレベルによって特徴付けられる他の疾患を包含する。
【００６７】
アグリカナーゼの活性を阻害する本発明の阻害剤および抗体および／またはアグリカナーゼの発現を低下させる化合物は、細胞外マトリックスの分解を含む哺乳動物におけるいずれかの疾患の治療において使用されうる。有効量の抗−アグリカナーゼ抗体、またはアグリカナーゼ阻害剤、またはその両方を、骨関節炎などの疾患、またはアグリカナーゼおよびアグリカナーゼ関連タンパク質によるアグリカンなどのマトリックスタンパク質の分解によって特徴付けられる開示された他の疾患の治療に使用することができる。
【００６８】
ＶＩＩＩ．医薬組成物
本発明のもう一つ別の態様は、（１）ｍＴＳ４阻害剤または抗−ｍＴＳ４抗体および（２）医薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。本発明の組成物は、アグリカナーゼ酵素またはアグリカナーゼ様活性を有するタンパク質によるアグリカンの分解によって特徴付けられる疾患の治療において使用されうる。
【００６９】
本明細書中で使用される場合、「医薬上許容される担体」なる語は、医薬投与に適合する溶媒、可溶化剤、増量剤、安定化剤、結合剤、吸収剤、基剤、緩衝化剤、滑沢剤、放出制御ビヒクル、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、滑沢剤、分散媒、コーティング、抗菌または抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などいずれか、および全てを包含するものである。医薬上活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。いずれかの慣用的な媒体または薬剤が活性化合物に適合しない場合を除いて、組成物におけるその使用が意図される。また、補足剤を組成物中に組み込むこともできる。本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸投与を包含する。非経口、皮内または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、下記の成分：注射用水、セーライン溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリンなどの滅菌希釈剤；プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などのバッファーおよび塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調節のための薬剤を含むことができる。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てのシリンジまたは複数回投与用バイアル中に封入することができる。
【００７０】
注射可能な用途に適当な医薬組成物は、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即席調製のための滅菌粉末を包含する。静脈内投与の場合、適当な担体は、生理学的セーライン、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬＴＭ（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）を包含する。全ての場合、注射可能な組成物は、滅菌されており、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合、所望の粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成できる。多くの場合、等張剤、例えば、塩化ナトリウム、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトールなど）を組成物中に含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期間の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含ませることによって達成することができる。
【００７１】
滅菌注射溶液は、所望の量のアグリカナーゼ阻害剤または抗−アグリカナーゼ抗体を、上記の成分の一つまたは組み合わせを含有する適当な溶媒中に混合し、必要ならば、次いでフィルター滅菌することによって調製できる。一般に、分散液は、活性化合物を基礎となる分散媒および上記から選択される所望の他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に混合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を予めフィルター滅菌したその溶液から生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【００７２】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入でき、または錠剤に圧縮することができる。経口治療薬投与の目的で、活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチまたはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物は、また、口内洗浄剤として有用な流体担体を用いて調製でき、ここに、流体担体中における化合物は口に入れられ、音を立てて動かされ、次いで、吐き出されるか、または飲み込まれる。医薬上適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として配合することができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、下記の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含有することができる：微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Primogel）またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステルテス（Stertes）などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（glidant）；シュークロースまたはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバーなどのフレーバー剤。
【００７３】
吸入による投与の場合、組成物はエーロゾルスプレーの形態で、適当なプロペラント、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する圧縮容器またはディスペンサー、またはネブライザーから送達される。
【００７４】
一の具体例において、生物活性化合物を含有しうる治療薬部分は、体内からの迅速な排除から該化合物を保護する担体、例えば、埋め込み剤およびマイクロカプセル封入送達系を包含する放出制御処方と一緒に調製される。生物分解性の生物適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。かかる処方の調製法は、当業者に明らかであろう。また、材料は、例えば、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.から、商業上入手可能である。また、リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞を標的とするリポソームを包含する）を医薬上許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような当業者に既知の方法にしたがって調製することができる。
【００７５】
投与の容易性および投与量の均一性のために、単位投与形態において経口または非経口組成物を処方することが特に有益である。本明細書中で使用される場合、単位投与形態は、治療対象に対する単位投与量として適する物理的に分離した単位を包含し；各単位は、必要な医薬担体と共に所望の治療的効果を生じるように計算された、予め決定された量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与形態のための明細は、活性化合物特有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、および個体の治療のためにかかる活性化合物を配合することの当該分野に固有の制限によって指示され、また、それらに直接依存する。
医薬組成物は、投与説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサー内に入れることができる。
【００７６】
ＩＸ．投与
本発明は、アグリカンの分解によって特徴付けられる疾患に罹患している患者を治療する方法を包含する。これらの方法は、かかる治療の必要な患者に、アグリカナーゼ阻害剤または該タンパク質分解活性を阻害する抗−アグリカナーゼ抗体を含んでなる組成物の有効量を投与することを必要とする。本発明のアグリカナーゼ阻害剤は、アグリカナーゼ活性を阻害することによって、または単純に、病態においてアグリカナーゼのレベルを調節することによって、機能しうると考えられる。
【００７７】
本発明の抗−アグリカナーゼ抗体およびアグリカナーゼ阻害剤は、ヒトまたは動物における種々の医学的障害を診断または治療するのに有用である。一の具体例において、本発明の抗体は、同じ抗体によって結合されていないアグリカナーゼタンパク質と比べて、アグリカナーゼタンパク質に関連した少なくとも１つの活性を阻害または減少させるために使用することができる。一般に、本発明の組成物は、抗体またはその結合フラグメントが約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、または約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの投与範囲で投与されるように、患者に投与される。患者への投与後に抗体が患者の体内を循環できる時間の間隔を最大にするために、抗体はボーラス投与量として投与される。また、最初のボーラス投与後に、連続的注入を用いてもよい。
【００７８】
もう一つ別の具体例において、本発明は、アグリカナーゼの阻害剤、例えば、生物分子および化学化合物の投与に向けられる。阻害剤の有効量は、所望の生物学的結果を達成するためにアグリカナーゼの活性を減少させるのに有用な投与量である。一般に、阻害剤を投与するための適当な治療的投与量は、例えば、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。阻害剤は、一度に投与することができ、または一日一回、週に一回もしくは月に一回などの間隔で投与することができる。アグリカナーゼ阻害剤の投与のための投与計画は、例えば、該阻害剤のそのアグリカナーゼ標的に対するアフィニティー、阻害剤の半減期、および患者の状態の重篤度に基づいて調整できる。一般に、阻害剤は、その循環レベルを最大にするために、ボーラス投与量として投与される。また、ボーラス投与後に連続的注入を用いてもよい。
【００７９】
かかる化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な投与量）を決定するために、細胞培養または実験動物モデルにおいて標準的な医薬的手法によって決定することができる。毒性効果および治療効果間の投与量比が治療指数となり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す阻害剤が一般に好ましい。
【００８０】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて有用な投与量範囲の処方において使用できる。かかる化合物の投与量は、わずかな毒性を伴うか、または毒性を伴わずにＥＤ５０を示す一連の循環濃度内にあってもよい。該投与量は、使用される投与形態および使用される投与経路によって該範囲内で変化しうる。本発明にしたがって使用されるいずれかの阻害剤の場合、治療上有効な投与量は、最初に、細胞培養アッセイから見積もることができる。投与量は、細胞培養アッセイによって決定した場合にＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験抗体の濃度）を示す循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方されうる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定されうる。いずれかの特定の投与量の効果は、適当なバイオアッセイによってモニターできる。適当なバイオアッセイの例は、アグリカナーゼ活性を測定する、例えば、ＢＣ−３（Roberts et al., Arthritis Rheum.  44:2586-98, 2001）などの抗体試薬を用いて、アグリカンネオエピトープの存在または減少について滑液をモニターするためのアッセイならびに実施例７に記載のアッセイ、ＤＮＡ複製アッセイ、転写に基づくアッセイ、および免疫学的アッセイを包含する。
【００８１】
本発明の治療方法は、アグリカナーゼ阻害剤組成物を埋め込み剤またはデバイスとして、局所的に、全身に、または局部的に投与することを包含する。組成物の投与のための投与方針は、アグリカナーゼタンパク質の作用を修飾する種々の因子、病理の部位、疾患の重篤度、患者の年齢、性別および食事、いずれかの炎症の重篤度、投与時間および他の臨床上の因子に基づいて、担当医師によって決定されるであろう。一般に、全身または注射投与は、最小限に効果的な投与量で開始し、投与量は、予め選択した時間経過にわたって、正の効果が観察されるまで増加されるであろう。その後、投与量の付加的な増加は、出現するであろういずれかの逆効果を考慮しながら、対応する効果の増加をもたらすレベルまでに制限されるであろう。最終組成物への他の既知因子の添加もまた、投与量に影響を及ぼす場合がある。
疾患進行の定期的な評価によって、進行をモニターすることができる。例えば、Ｘ線、ＭＲＩまたは他の画像診断法、滑液分析、および／または臨床試験によって、進行をモニターすることができる。
【００８２】
Ｘ．アッセイおよび検出方法
本発明の阻害剤および抗体は、試料中のアグリカナーゼの存在または不在を決定するため、または試料中のアグリカナーゼを定量するためのアッセイおよび検出方法において使用することができる。本発明の阻害剤および抗体は、アグリカナーゼタンパク質をイン・ビボまたはイン・ビトロで検出するために使用してもよい。これらのタンパク質の存在またはレベルを疾患と相関させることによって、当業者は関連疾患を診断できるか、またはその重篤度を決定することができる。目下開示されている阻害剤および抗体によって診断されうる疾患は上記に示される。
【００８３】
抗体を用いて使用するための検出方法は、当該分野でよく知られており、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、イムノブロット、ウェスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降、および他の同等の技術を包含する。該抗体は、さらに、タンパク質（例えば、アグリカナーゼタンパク質）を検出するためのこれらの技術のうちの少なくとも一つを組み込む診断キットにおいて提供されうる。かかるキットは、他の成分、パケージング、説明書、またはアグリカナーゼタンパク質の検出を補助するための他の材料、および該キットの使用に関する説明書を含んでいてもよい。タンパク質阻害剤、例えば、ペプチド阻害剤をかかる診断アッセイに使用する場合、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイを用いることができる。
【００８４】
阻害剤が診断目的に向けられている場合、例えば、リガンド基（例えば、ビオチン）または検出可能なマーカー基（例えば、蛍光基、放射性同位体または酵素）でそれらを修飾することが望ましいことがある。所望により、該抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでもよい）を従来の技術を用いて標識してもよい。適当な標識は、発蛍光団、発色団、放射性原子、電子密度の高い試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドを包含する。酵素は、典型的には、その活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を分光光度計で定量可能な青色色素に変えるその能力によって検出できる。他の適当な結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびプロテインＡ、および当該分野で既知の多くの受容体−リガンドカップルを包含する。
【００８５】
下記の実施例は、ＡＤＡＭＴＳ４およびｍＴＳ４タンパク質を発現、単離およびキャラックタリゼーションするにおいて、本発明の実施を説明するものである。
【実施例】
【００８６】
ＸＩ．実施例
実施例１：全長ヒトＡＤＡＭＴＳ４のクローニングおよび精製
ヒトＡＤＡＭＴＳ４  ｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いてクローン化した。該ｃＤＮＡの５’−および３’−側の半分の重複する部分を増幅するように、２セットのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。ＰＣＲ鋳型として使用された７つのヒト複数組織ｃＤＮＡライブラリーのうち、子宮ｃＤＮＡライブラリーのみが適当なサイズ（１２９４ｂｐの５’−アンプリマー（amplimer）（配列番号２）および１４２１ｂｐの３’−アンプリマー（配列番号３））のＰＣＲ産物をもたらした。ＰＣＲ−増幅フラグメントをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ（５’−産物）またはＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ（３’−産物）で消化し、ＥｃｏＲＩ−およびＮｏｔＩ−消化したＣＯＳ発現ベクターｐＥＤ６−ｄｐｃ２中にライゲートし、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ細胞（Invitrogen）中に形質転換した。ＡＤＡＭＴＳ４のクローン化したＰＣＲフラグメントを配列決定し、ＡＤＡＭＴＳ４  ｃＤＮＡの公開されているヌクレオチド配列（配列番号４）（Tortorella et al., Science 284:1664-1666, 1999）と比較した場合、３つのサイレント変化を有することが見出された。これらの変化は、配列番号４の塩基対４６６でのＣからＴへの変化、塩基対２１３１でのＡからＧへの変化、および塩基対２７５８でのＡからＧへの変化であった。５’−プライマーセットは、５’−ＡＡＡＴＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＴＣＣ−３’（配列番号５）（該プライマーは、ＡＴＧ開始コドンの上流に、８−ｂｐ尾部（ＡＡＡＴＧＧＧＣ）（配列番号６）、ＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）（配列番号７）および最適化したＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣ）（配列番号８）を組み込んだ）および５’−ＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＴＡＧＣＣＡＴＴＧＴ−３’（配列番号９）であった。３’−プライマーセットは、５’−ＣＴＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧ−３’（配列番号１０）および５’−ＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡＧＧＴＴＡＴＴＴＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１１）（該プライマーは、ＡＤＡＭＴＳ４のＴＡＡ終止コドンの下流に、８−ｂｐ尾部（ＧＡＣＴＧＡＣＴ）（配列番号１２）およびＮｏｔＩ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）（配列番号１３）を組み込んだ）であった。
【００８７】
無傷ＡＤＡＭＴＳ４コーディング配列を含有するＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメント（配列番号１４）をｐＨＴｏｐ中にサブクローン化した。該プラスミドは、アデノウイルス主要後期プロモーターの大部分を除去し、ｔｅｔオペレーターの６つの繰り返しを挿入することによって（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA  89:5547-5551, 1992）、ｐＥＤ（Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19:4485-4490, 1991）から誘導された。ＡＤＡＭＴＳ４を安定に発現しているＣＨＯ細胞系統は、ｐＨＴｏｐ／ＡＤＡＭＴＳ４をＣＨＯ／Ａ２細胞中へトランスフェクトし、０．０５μＭメトトレキサート中でクローンを選択することによって得られた。該ＣＨＯ／Ａ２細胞系統は、転写アクチベーター、ｔｅｔリプレッサーとヘルペスウイルスＶＰ１６転写活性化ドメインとの間の融合を安定に組み込むことによって（Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA  89:5547-5551, 1992）、ＣＨＯ  ＤＵＫＸＢ１１細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA  77:4216-4220, 1980）から誘導された。
【００８８】
ＣＨＯ細胞−馴化培地を採取し、バッファーＡ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０μＭ  ＺｎＣｌ２）で３倍希釈し、５０μ  Ｐｏｒｏｓ  ＨＱカラム（PE Biosystems, Foster City, CA）に付した。該カラムをバッファーＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１０μＭ  ＺｎＣｌ２）で洗浄し、５０ｍＭ〜１．０Ｍ  ＮａＣｌを含有するバッファーＢの直線勾配を用いてタンパク質を溶出した。さらに、バッファーＣ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および１０μＭ  ＺｎＣｌ２）での１０倍希釈後に５０μ  Ｐｏｒｏｓ  ＨＳカラムに付すことによって、ＡＤＡＭＴＳ４−含有フラクションを精製し、該カラムを１０倍カラム量で洗浄した。５０ｍＭ〜１．０Ｍ  ＮａＣｌを含有するバッファーＣの直線勾配を用いて該カラムからタンパク質を溶出し、算出した２８０ｎｍでの吸光率を、Gill and von Hippel（Gill and von Hippel, Anal. Biochem.  182:319-326, 1989）によって概説されたようなタンパク質濃度の決定に用いた。
【００８９】
実施例２：自己消化による末端切断されたＡＤＡＭＴＳ４分子の産生
精製組み換えヒトＡＤＡＭＴＳ４は、少量（全タンパク質の＜５％）の５３ｋＤ物質と一緒に、６８ｋＤバンドとして優先的にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動した。自己触媒的消化は、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．１−１．０Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−アセテート、ｐＨ７．３中において、精製ＡＤＡＭＴＳ４を１０ｐｇ／ｍｌ〜５６９ｐｇ／ｍｌの濃度範囲でインキュベートすることによって、３７℃で行われた。自己消化産物は、クーマシーブルー染色によって、銀染色によって、またはＬ９０２６抗体を用いるウェスタンイムノブロット分析によって視覚化された。
【００９０】
３７℃にて、１６時間までの種々の時間でのインキュベーション後、ＡＤＡＭＴＳ４は、６８ｋＤ（ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ６８））、５３ｋＤａ  ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３））および４０ｋＤ（ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０））のイソ形態として検出された。ＡＤＡＭＴＳ４を１０ｐｇ／ｍｌ〜５６９ｐｇ／ｍｌの濃度範囲および１．０Ｍまでの塩濃度で用いて行ったインキュベーションの結果は、実質的に同一であった。同一条件下でのＡＤＡＭＴＳ４  ＡＳＭのインキュベーションは、検出可能なイソ形態を生じ、かくして、ＡＤＡＭＴＳ４のプロセッシングが自己触媒的であったことが確認された（Flannery et al., J. Biol. Chem. 277:42775-42780）。
【００９１】
実施例３：自己消化されたＡＤＡＭＴＳ４イソ形態のアミノ酸配列決定および質量分析
Ｎ−末端配列分析の場合、自己消化されたＡＤＡＭＴＳ４イソ形態のアリコートを１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜に写し、クーマシーブルーで染色した。ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ６８）、ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）およびＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０）に相当する切り出したバンドを、ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １４０Ｓ  ＰＴＨアナライザー（Procise-HT）を用いるオンラインでのＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４９１Ａ  Ｐｕｌｓｅｄ−Ｌｉｑｕｉｄシークエンサー上での自動配列決定に付した。
【００９２】
Ｃ−末端配列分析の場合、自己消化されたＡＤＡＭＴＳ４イソ形態をＰｏｒｏｓ  ＨＱのカラム上での分画によって分離した。次いで、結合されていないＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）およびＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０）を２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｐＭ  ＺｎＣｌ２中における０．０５−１．０Ｍ  ＮａＣｌのアイソクラチック勾配を用いて溶出されるＰｏｒｏｓ  ＨＳのカラム上で分画した。質量分析は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ（ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳ）アナライザー（Micromass UK, Ltd, Manchester, U.K.）を用いて行った。試料を濃縮し、ＡＢＩ  ＰｒｏＳｏｒｂカートリッジを用いて脱塩した。Ｃ−末端配列分析は、ミネソタ州ロチェスターのメイヨ・プロテイン・コア・ファシリティー（Mayo Protein Core Facility）で、チオヒダントイン誘導体化（derivitization）化学を用いるＡＢＩ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｃ装置上で行った。
【００９３】
図１は、フューリンによるプロセシングを受けた全長ＡＤＡＭＴＳ４成熟酵素（ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ６８））および自己消化イソ形態ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）およびＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０）の構造の概略図である。全長ＡＤＡＭＴＳ４成熟酵素は、６２５個のアミノ酸（ｐｈｅ２１３−ｌｙｓ８３７、配列番号１５）を含有し、それは、配列番号１４の位置６４８−２５２２に対応するヌクレオチド配列（配列番号１６）によってコードされる。自己消化されたイソ形態ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）は、４８２個のアミノ酸（ｐｈｅ２１３−ｌｙｓ６９４、配列番号１７）を含有し、それは、配列番号１４の位置６４８−２０９３に対応するヌクレオチド配列（配列番号１８）によってコードされる。自己消化されたイソ形態ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０）は、３６９個のアミノ酸（ｐｈｅ２１３−ｔｈｒ５８１、配列番号１９）を含有し、それは、配列番号１４の位置６４８−１７５４に対応するヌクレオチド配列（配列番号２０）によってコードされる。
【００９４】
ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ６８）の配列は、Ｗｉｎｋｅｄオリゴサッカライドに対するコンセンサス結合部位を含有せず、該研究に使用された組み換えＡＤＡＭＴ４は実際、グリコシル化されていなかったことが明らかである。結果として、ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）の５２，３５６ダルトンの測定質量（ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された）は、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ６９４−ＯＨの検出されたＣ−末端配列と一致し、それは、Ｌｙｓ６９４−Ｐｈｅ６９５ペプチド結合の自己触媒的切断を示す。同様に、ＡＤＡＭＴＳ−４（ｐ４０）について検出されたＣ−末端配列−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ５８１−ＯＨは、Ｔｈｒ５８１−Ｐｈｅ５８２で自己触媒的切断を示し、Ｐｈｅ２１３−Ｔｈｒ５８１の算出された質量（３９，７５７ダルトン）は、ＬＣ−ＴＯＦ−ＭＳによって測定された４０，０４０ダルトンの質量とよく一致する。
【００９５】
実施例４：自己触媒作用により生じたＡＤＡＭＴＳ４イソ形態の硫酸化ＧＡＧｓに対するアフィニティー
精製ＡＤＡＭＴＳ４および自己触媒的ＡＤＡＭＴＳ４イソ形態は、非還元条件下、ＳＤＳＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に写した。ビオチン化ヘパリン（ｂＨｅｐ）、市販の（標識した）硫酸化ＧＡＧを用いるアフィニティーブロッティングは、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４中でｂＨｅｐ（Calbiochem, San Diego, CA，０．０５ｐｇ／ｍｌ）と一緒に膜をインキュベートすることによって行った。結合競合実験のために、膜を非標識ヘパリン（０．５−５０ｐｇ／ｍｌ）と一緒に１時間プレインキュベートした。付加的な競合実験は、以前に記載されたように塩化セシウム中における平衡密度遠心分離によって分画した４ＭグアニジンＨＣｌ抽出物から調製され、以前に記載されたようにコンドロイチナーゼＡＢＣ、ケラタナーゼおよびケラタナーゼＩＩを用いるか、または用いないで処理したウシ関節軟骨Ｄ１アグリカンを用いて行った。ＡＤＡＭＴＳ４自己触媒的イソ形態は、また、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中における０．１−１．０Ｍ  ＮａＣｌの段階勾配を用いて溶出されるヘパリンセファロース・アフィニティー・カラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて分離した。
【００９６】
アフィニティーブロッティング実験は、ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ６８）が０．５Ｍ  ＮａＣｌの存在下でビオチン化ヘパリンを結合したのに対し、かかる結合がＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）またはＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０）において観察されなかったことを示した。同様に、「スペーサー」ドメインを欠くＡＤＡＭＴＳ４  ＡＳＭ  Ｃ−末端欠失変異体（Ｍｅｔ１−ｐｈｅ５７５）は、これらの条件下でｂＨｅｐを結合しなかった（Flannery et al., J. Biol. Chem. 277:42775-42780）。自己触媒的ＡＤＡＭＴＳ４イソ形態は、また、ヘパリン−セファロースへの結合の減少を示した。０．８Ｍ  ＮａＣｌの存在下でヘパリン−セファロースカラムから溶出したＡＤＡＭＴＳ４（ｐ６８）と比べると、ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）およびＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０）は、各々、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび０．４Ｍ  ＮａＣｌで溶出した。結合競合実験において、非標識ヘパリンを用いるアフィニティーブロットのプレインキュベーションは、用量依存的に、ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ６８）に対するｂＨｅｐの結合を阻害した。さらに、ウシアグリカンは、また、ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ６８）に対するｂＨｅｐの結合を阻害し、該結合競合は、アグリカンＧＡＧｓの存在に依存した（Flannery et al., J. Biol. Chem. 277:42775-42780）。末端切断したイソ形態の両方がＴＳＰ−１モチーフを維持するので（図１参照）、ＡＤＡＭＴＳ４「スペーサー」ドメイン内に位置する付加的な部位がＧＡＧ結合およびグリコシル化アグリカンとの相互作用に寄与することが明らかである（Flannery et al., J. Biol. Chem. 277:42775-42780）。
【００９７】
実施例５：自己触媒作用により生じたＡＤＡＭＴＳ４イソ形態のアグリカナーゼ活性
自己触媒作用により生じたＡＤＡＭＴＳ４イソ形態、ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）およびＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０）のアグリカナーゼ活性は、実施例７に記載の方法を用いて決定された。簡単に言うと、ウシアグリカンを精製ＡＤＡＭＴＳ４（ｐ５３）およびＡＤＡＭＴＳ４（ｐ４０）と一緒に、３７℃にて１６時間インキュベートした。消化産物をコンドロイチナーゼＡＢＣおよびケラタナーゼで脱グリコシル化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、アグリカン球間ドメイン内でのｇｌｕ３７３−ａｌａ３７４ペプチド結合のアグリカナーゼ切断によって生じたネオエピトープ配列３７４ＡＲＧＸＸ（配列番号２１）を特異的に検出するモノクローナル抗体ＢＣ−３を用いるウェスタンブロットによって視覚化した。結果は、両方のイソ形態がアグリカナーゼ活性を有することを示した（Flannery et al., J. Biol. Chem. 277:42775-42780）。
【００９８】
実施例６：修飾されたヒトＡＤＡＭＴＳ４分子の産生および精製
図２は、天然のプロセシングを受けていないＡＤＡＭＴＳ４分子（構築物Ａ）および種々の非修飾ヒトＡＤＡＭＴＳ４分子（構築物Ｂ−Ｉ）の概略図示す。構築物Ａに示すように、ＡＤＡＭＴＳ４のプロセシングを受けていないプロ−タンパク質（配列番号１）は、シグナルペプチド（ｓｐ）、プロ−ペプチド（ｐｒｏ）、触媒ドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、ＴＳＰ−１ドメイン、システイン−リッチドメインおよびスペーサードメインを含有する。
構築物Ｂ−Ｄは、標準的な分子生物学技術を用いて作成された末端切断したＡＤＡＭＴＳ４構築物である。構築物Ｂ（配列番号２２）は、ディスインテグリン様ドメイン、ＴＳＰ−１モチーフ、システインリッチドメインおよびスペーサーを欠くが、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ，配列番号２３）を含有する末端切断したＡＤＡＭＴＳ４分子である。該構築物由来のフューリンによるプロセシングを受けたタンパク質は、酵素的に不活性である（配列番号４６）。構築物Ｃ（配列番号２４）は、タグ配列（ＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ，配列番号２５）およびスペーサー領域の大部分を除去したＣ−末端欠失を含有する。構築物Ｄ（配列番号２６）は、構築物Ｃのタグ付加していないバージョンである。構築物ＣおよびＤの両方がＣＨＯ細胞中で発現されることができる。構築物ＣおよびＤのフューリンによるプロセシングを受けた成熟タンパク質（各々、配列番号４７および４８）は、アグリカナーゼ活性を有する。
【００９９】
構築物Ｅ（配列番号２７）は、フレーム内で、Ｃ末端上のＳｔｒｅｐタグと共に、アミノ酸−ＧＳＧＳＧＤＤＤＤＫ−（配列番号２８）のコーディング配列をＡＤＡＭＴＳ４の触媒ドメインとディスインテグリン様ドメインの間に挿入することによって作成された。該−ＧＳＧＳＧ−は、柔軟なアミノ酸スペーサーを構成し、該−ＤＤＤＤＫ−は高特異的プロテアーゼエンテロキナーゼの認識部位を構成する。該構築物は、図２のＢを用いて得られた結果が触媒ドメインの後ろのＣ末端ドメインのコーディング配列の除去が不活性タンパク質をもたらしたことを示した後に、調製された。構築物Ｂ由来のタンパク質は、適当にプロセシングを受けた（プロ−ドメインのフューリン切断）が、該プロ−ペプチドは触媒ドメインと結合したままであった。Ｃ末端ディスインテグリン様、ＴＳＰ−１、ｃｙｓ−リッチ、およびスペーサードメインの存在が触媒ドメインの折りたたみおよび／または切断されたプロ−ペプチドの置換を促進して活性酵素を産生する可能性がある。構築物Ｅの目的は、全長ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質の翻訳および折りたたみを可能にし、Ｃ末端タグ（ＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ，配列番号２５）によって精製を可能にし、次いで、外来的に加えられたエンテロキナーゼで切断して、活性アッセイおよび構造決定に従う無傷触媒ドメインの作成を可能にすることにあった。
【０１００】
構築物Ｆ−Ｉは、活性部位変異（ＡＳＭ）を有する修飾ＡＤＡＭＴＳ４分子である。全長ＡＳＭ構築物Ｇ（配列番号２９）は、一塩基対変化（位置１０８４にてＧからＣへ）を野生型ＡＤＡＭＴＳ４中に導入することによって、Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘導キット（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて作成された。該ヌクレオチド変化は、位置３６２でのｇｌｕからｇｌｎへの一アミノ酸変化をもたらした（Ｅ３６２Ｑ）。ＦＬＡＧタグ（ＶＤＹＫＤＤＤＤＫ，配列番号３０）も含有する構築物Ｇを実施例１に記載のようにＣＨＯ細胞中で発現し、精製した。該Ｅ３６２Ｑ変異は、構築物Ｇの成熟タンパク質（配列番号５０）のアグリカナーゼ活性を破壊した。しかしながら、該変異タンパク質は、天然ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質よりも安定である。
【０１０１】
末端切断したＡＳＭ構築物Ｈ（配列番号３１）およびＩ（配列番号３２）は、組み込まれた制限部位を有するＰＣＲプライマーを用いて構築物Ｇの一部をＰＣＲ増幅することによって作成された。構築物Ｈは、スペーサードメインを欠き、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグを含有する。構築物Ｉは、スペーサーおよびＴＳＰ−１ドメインを欠き、Ｃ末端ＦＬＡＧエピトープタグを含有する。構築物Ｈの場合、５’−プライマーは：Ａｇ１Ｂ１Ｆ：
５’ＴＡＡＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＴＣＣＣＧ３’（配列番号３３）であった。３’−プライマーは：Ａｇ１Ｂ２Ｒ：
５’ＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧ３’（配列番号３４）であった。構築物Ｉの場合、５’−プライマーは：Ａｇ１Ｂ１Ｆ：
５’ＴＡＡＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＧＣＡＴＣＣＣＧ３’（配列番号３３）であった。３’−プライマーは：Ａｇ１Ｂ１Ｒ：
５’ＴＡＴＴＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＴＧＧＡＡＴＡＴＴＧＡＡＧＴＣＣＴＧＧ３’（配列番号３５）であった。
【０１０２】
ＰＣＲ増幅は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＢＤ  ＡｄｖａｎｔａｇｅＴＭ−ＧＣ２Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘによって記載される標準的な条件を用いて行われた。特有の制限部位、５’末端のＥｃｏＲＩおよび３’末端のＡｃｃＩを含有した増幅産物を、Ｃ−末端ＦＬＡＧタグを有するｐＨＴｏｐ中において、結局、２段階でサブクローン化した。簡単に言うと、標準条件を用いて制限酵素ＥｃｏＲ１およびＡｃｃＩでＰＣＲ産物を消化した。消化産物をアガロースゲル上で分画し、予想サイズに相当するバンドをゲルから切り出した。ＢｉｏＲａｄのＰｒｅｐ−Ａ−Ｇｅｎｅキットを用い、製造者の指示にしたがって、ＤＮＡをゲルから回収した。回収したＤＮＡを、２つの合成オリゴヌクレオチドＦｌａｇ１  ５’ＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＣＴＡＧＴＧＣＴＡＴＣＧＴＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＴＡＡＧＣ３’（配列番号３６）およびＦｌａｇ２  ５’ＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＴＡＣＧＡＴＡＧＣＡＣＴＡＧＣＡＴＡＧＧ３’（配列番号３７）を一緒にアニーリングし、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ｐＴＡｄｖベクター中に方向性をもってクローニング（ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ）することによって構築された中間ベクターｐＴＡｄｖ−ＦＬＡＧ中に方向性クローン化（ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ）した。ｐＴＡｄｖ−ＦＬＡＧクローニングベクターの完全ヌクレオチド配列を配列番号３８に列挙する。
【０１０３】
次いで、配列確認した組み換えプラスミドを標準技術を用いて増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した。次いで、該ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメントを上記のようにゲル精製し、ｐＨＴｏｐベクター中に方向性をもってクローン化した（配列番号３９）。
２つの構築物をＣＨＯ／Ａ２細胞中に発現させ、抗−ＦＬＡＧアガロースアフィニティーゲル（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を用いて馴化培地から精製した。ポリクローナルウサギ抗−ヒトＡＤＡＭＴＳ４抗血清Ｌ９０２６（該酵素の全ドメイン由来の８つの別個の合成ペプチドの免疫化混合物を用いて作成した）を、ＨｉＴｒａｐプロテインＧ  ＨＰアフィニティーカラム（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）上で精製した。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）上でのタンパク質分離後、ウェスタンイムノブロッティングおよびＥＣＬ試薬（Amersham Pharmacia Biotech）を用いるＨｙｂｏｎｄニトロセルロース膜上での検出のために、該抗体を１．５ｐｇ／ｍｌ濃度で用いた。フューリンによるプロセシングを受けた構築物Ｈ（配列番号５１）および構築物Ｉ（配列番号５２）はアグリカナーゼ活性を欠くが、野生型ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質よりも安定である。
【０１０４】
挿入を有する全長ＡＤＡＭＴＳ４  ＡＳＭ構築物もまた作成された（構築物Ｆ，配列番号４０）。該構築物は、ディスインテグリン様ドメインとＴＳＰ−１モチーフとの間に挿入されたｓｔｒｅｐタグ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ，配列番号４１）を含有する。構築物Ｆは、精製された全長ＡＤＡＭＴＳ４の収量が不十分であるという問題を解決しようとして設計された。ＡＤＡＭＴＳ４のＣ末端タグ付加は、自己触媒的Ｃ末端プロセシングによる該タグの喪失のため、最適状態に及ばないことがわかった。構築物Ｆにおいて、Ｓｔｒｅｐタグをディスインテグリン様ドメインとＴｓｐドメインの間に内部移動させた。該位置において、ｃｙｓ−リッチおよびスペーサードメイン内のいずれの自己触媒も、Ｓｔｒｅｐタグを遊離しない。
【０１０５】
実施例７：発現されたアグリカナーゼの生物学的活性
本発明の修飾されたアグリカナーゼなどの発現されたアグリカナーゼタンパク質の生物学的活性は、下記の活性にしたがってアッセイしてもよい。
蛍光ペプチドアッセイ：発現タンパク質を、アグリカンのアグリカナーゼ切断部位のアミノ酸を含む合成ペプチドと一緒にインキュベートする。該合成ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかを発蛍光団で標識し、他方の末端は消光物質を含む。該ペプチドの切断は、発蛍光団と消光物質を分離し、蛍光を顕在化させる。該アッセイから、発現されたアグリカナーゼタンパク質がアグリカナーゼ部位でアグリカンを切断できることが確定され、相対蛍光は発現タンパク質の相対活性を決定する。
【０１０６】
ネオエピトープウェスタンブロット：発現されたアグリカナーゼタンパク質を無傷アグリカンと一緒にインキュベートする。得られた試料のいくつかの生物化学的操作（透析、コンドロイチナーゼ処理、凍結乾燥および復元）の後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に付す。該ゲルを、アグリカナーゼ切断後にのみ露出するアグリカン上の部位に特異的な抗体と一緒にインキュベートする。該ゲルをニトロセルロース紙上に写し、二次抗体を用いて展開した（ウェスタンアッセイと呼ばれる）結果、アグリカンのアグリカナーゼによって生じる切断産物と一致する分子量を有する生産物を示すバンディング・パターンが得られる。該アッセイは、発現したアグリカナーゼタンパク質が天然のアグリカンをアグリカナーゼ切断部位で切断し、また、切断産物の分子量を与えるという知見をもたらす。該バンドの相対密度は、相対的なアグリカナーゼ活性を示すことができる。
【０１０７】
一の具体例において、ウシ関節軟骨アグリカンを精製ＡＤＡＭＴＳ４または修飾ＡＤＡＭＴＳ４タンパク質と一緒に、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．３中、３７℃で１６時間インキュベートした。消化産物を、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Seikagaku America, Falmouth, MA; １ｍＵ／μｇアグリカン）、ケラタナーゼ（Seikagaku；１ｍＵ／μｇアグリカン）およびケラタナーゼＩＩ（Seikagaku；０．０２ｍＵ／μｇアグリカン）の存在下、３７℃で２時間インキュベートすることによって脱グリコシル化した。消化産物を、４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（Invitrogen, Carlsbad, CA）上で分離し、次いで、ニトロセルロースへ電気泳動によって写した。免疫反応産物は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＡＧＧ−Ｃ１（０．０４μｇ／ｍｌ）またはＭＡｂ  ＢＣ−３（Dr. C. Hughes および Prof. B. Caterson, Cardiff University, UKによって寛大にも提供された；１：１００のハイブリドーマ培養上清）を用いるウェスタンブロッティングによって検出された。次いで、アルカリホスファターゼに結合した二次ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Promega Corp., Madison, WI；１：７５００）を膜と一緒にインキュベートし、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（Promega）を用いて免疫反応バンドを視覚化した。全抗体インキュベーションを、室温で１時間行い、イムノブロットは基質と一緒に室温で５−１５分間インキュベートして、最適な色の発現を達成した。
【０１０８】
アグリカンＥＬＩＳＡ：発現タンパク質を、予めプラスチックウェルに付着させた無傷アグリカンと一緒にインキュベートする。該ウェルを洗浄し、次いで、アグリカンを検出する抗体と一緒にインキュベートする。該ウェルを二次抗体で展開する。最初の量のアグリカンがウェル中に残存する場合、抗体染色は濃厚である。アグリカンが発現されたアグリカナーゼタンパク質のアグリカナーゼ活性によって消化された場合、アグリカンがプレートから剥がれ、次いで、アグリカン被覆ウェルの抗体による染色は減少する。該アッセイは、発現タンパク質がアグリカンを切断すること（アグリカナーゼ部位だけでなく、該タンパク質のどこででも）ができるかどうかを示し、さらに相対的なアグリカン切断を決定することができる。
【０１０９】
簡単に言うと、マイクロタイタープレート（Costar）をヒアルロン酸（ICN）、次いで、コンドロイチナーゼ（Seikagaku Chemicals）で処理したウシアグリカンで被覆した。修飾されたアグリカナーゼを発現しているＣＨＯ細胞由来の馴化培地を該アグリカン被覆プレートに加えた。球間ドメイン内のｇｌｕ３７３−ａｌａ３７４で切断されたアグリカンを洗い去った。残りの非切断アグリカンを３Ｂ３モノクローナル抗体（ICN）、次いで、抗−マウスＩｇＭ−ＨＲＰ二次抗体（Southern Biotechnology）で検出した。最終的な発色は、３，３’’，５，５’’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ，BioFx Laboratories）を用いた。別法では、修飾されたアグリカナーゼを不活性プロ形態において合成することができ、フューリンによってプロセシングをしてその成熟種を得ることができる。
【０１１０】
実施例８：修飾されたアグリカナーゼのための発現ベクターの構築
当業者は、修飾されたアグリカナーゼをコードしている配列を既知の哺乳動物発現ベクター、例えば、ｐＣＤ（Okayama et al., Mol. Cell Biol.  2:161-170, 1982）、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４（Gough et al., EMBO J.  4:645-653, 1985）およびｐＭＴ２  ＣＸＭ中に挿入することによって、修飾されたアグリカナーゼのための発現ベクターを構築することができる。
哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２  ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂ）の誘導体であり（Wong et al., Science 228:810-815, 1985）、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を含有し、さらに、ｃＤＮＡクローンの挿入のためのＸｈｏｌ部位を含有する点で後者と相違する。ｐＭＴ２  ＣＸＭの機能的エレメントが記載されており（Kaufman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA  82:689693, 1985）、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２塩基（ｂｙ）エンハンサーを含むＳＶ４０複製開始点、５’スプライス部位およびアデノウイルス後期ｍＲＮＡ上に存在する大量のアデノウイルス三成分（tripartite）リーダー配列を含むアデノウイルス主要後期プロモーター、３’スプライスアクセプター部位、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）インサート、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、およびＥ．ｃｏｌｉ中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を包含する。
【０１１１】
プラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭは、ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲｌ消化によって得られ、それは、寄託番号ＡＴＣＣ６７１２２のもと、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ATCC, Rockville, Maryland, USA）に寄託されている。ＥｃｏＲｌ消化は、ｐＭＴ２−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡインサートを切り出し、それにより、直線状のｐＭＴ２を生じ、それをライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換するために使用することができる。プラスミドｐＭＴ２  ＤＮＡは、常法によって調製できる。次いで、ループアウト／イン突然変異誘発を用いてｐＭＴ２  ＣＸＭを構築する（Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636, 1984）。これは、ｐＭＴ２のＳＶ４０複製開始点およびエンハンサー配列の近くのＨｉｎｄＩＩＩ部位に関連して塩基１０７５〜１１４５を除去する。さらに、それは、下記の配列：５’−ＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号４２）をヌクレオチド１１４５に挿入する。該配列は、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を含有する。ｐＭＴ２３と呼ばれるｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔｌ、ＥｃｏＲｌ、ＳａｌｌおよびＸｈｏｌの認識部位を含有する。プラスミドｐＭＴ２  ＣＸＭおよびｐＭＴ２３  ＤＮＡは、常法によって調製してもよい。
【０１１２】
ｐＭＴ２１に由来するｐＥＭＣ２８１もまた、本発明の実施に適当でありうる。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦから誘導されるｐＭＴ２に由来する。上記のように、ＥｃｏＲｌ消化はｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡインサートを切り出し、それにより、直線状のｐＭＴ２を生じ、それをライゲートし、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性に形質転換するために使用することができる。プラスミドｐＭＴ２  ＤＮＡは、常法によって調製することができる。
ｐＭＴ２１は、下記の２つの修飾によってｐＭＴ２から誘導される。まず、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃ尾部由来の１９Ｇ残基の範囲を含むＤＨＦＲ  ｃＤＮＡの５’非翻訳領域の７６ｂｐの欠失を引き起こす。該過程において、Ｘｈｏｌ部位を挿入して、ＤＨＦＲからすぐ上流に下記の配列：
【化１】
2005534308.tif 000004
を得る。
【０１１３】
第二に、独特のＣｌａｌ部位を、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａｌでの消化、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ（Klenow）フラグメントでの処理、およびＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ，配列番号４４）へのライゲーションによって導入する。これは、アデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域由来の２５０塩基（ｂｙ）セグメントの欠失を引き起こすが、ＶＡＩ  ＲＮＡ遺伝子発現または機能を妨害しない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲｌおよびＸｈｏｌで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を誘導するために使用する。
【０１１４】
ＥＭＣＶリーダーの一部をｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１（S.K. Jung, et al, J. Virol. 63:1651-1660, 1989）からＥｃｏＲｌおよびＰｓｔｌでの消化によって得、それにより、２７５２塩基（ｂｙ）フラグメントを得る。該フラグメントをＴａｑｌで消化し、５０８塩基（ｂｙ）のＥｃｏＲＩ−Ｔａｑｌフラグメントを得、それを低融点アガロースゲル上の電気泳動によって精製する。６８塩基（ｂｙ）アダプターおよびその相補鎖は、下記の配列：
【化２】
2005534308.tif 000005
を有する５’Ｔａｑｌ突出末端および３’Ｘｈｏｌ突出末端を用いて合成する。
【０１１５】
該配列は、ヌクレオチド７６３〜８２７のＥＭＣウイルスリーダー配列と合致する。また、それは、ＥＭＣウイルスリーダー内の位置１０のＡＴＧをＡＴＴに変化させ、その後ろにＸｈｏｌ部位が位置する。ｐＭＴ２１  ＥｃｏＲＩ−１６ｈｏｌフラグメント、ＥＭＣウイルスＥｃｏＲｌ−Ｔａｇｌフラグメント、および６８塩基（ｂｙ）オリゴヌクレオチドアダプターＴａｇｌ−１６ｈｏｌアダプターの三者のライゲーションにより、ベクターｐＥＭＣ２／６１を得る。
該ベクターは、ＳＶ４０複製開始点およびエンハンサー、アデノウイルス主要後期プロモーター、多数のアデノウイルス三成分リーダー配列のｃＤＮＡコピー、小型ハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲおよびＱ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を、哺乳動物細胞中における所望のｃＤＮＡの高レベル発現を指示するために適当な関係において含有する。
【０１１６】
発現ベクターの構築は、アグリカナーゼ関連ＤＮＡ配列の修飾を含みうる。例えば、アグリカナーゼをコードしているｃＤＮＡは、コーディング領域の５’および３’末端の非コーディングヌクレオチドを除去することによって修飾できる。欠失した非コーディングヌクレオチドは、発現に有益であることが知られる他の配列によって置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。これらのベクターは、アグリカナーゼまたはアグリカナーゼ様タンパク質の発現のための適当な宿主細胞中に形質転換される。さらに、該アグリカナーゼ配列は、アグリカナーゼをコードしているプロ−ペプチド配列を欠失させ、それらを他のアグリカナーゼタンパク質の完全プロ−ペプチドをコードしている配列で置換することによって、アグリカナーゼまたはアグリカナーゼ様タンパク質を発現するように操作することができる。また、修飾されたアグリカナーゼ（例えば、修飾ＡＤＡＭＴＳ４）中のタンパク質ドメインを異なるアグリカナーゼ（例えば、修飾ＡＤＡＭＴＳ５）由来の対応するドメインで置換することも可能である。
【０１１７】
当業者は、また、コーディング配列に隣接する哺乳動物調節配列を除去するか、または細菌配列で置換して、修飾されたアグリカナーゼ分子の細胞内または細胞外発現のための細菌ベクターを作成することができる。例えば、該コーディング配列をさらに操作することができた（例えば、他の既知の技術によって、他の既知のリンカーにライゲートするか、または非コーディング配列をそれから欠失させるか、もしくはその中のヌクレオチドを改変させることによって修飾された）。次いで、修飾されたアグリカナーゼコーディング配列を、Taniguchiら（Taniguchi et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:5230-5233, 1980）によって記載されるような手法を用いて、既知の細菌ベクター中に挿入することができた。該例示的細菌ベクターを次いで、細菌宿主細胞中に形質転換して、本発明のアグリカナーゼタンパク質を発現することができた。細菌細胞中におけるアグリカナーゼ関連タンパク質の細胞外発現を生じる方法の場合、例えば、欧州特許出願第ＥＰ１７７，３４３号を参照のこと。
【０１１８】
類似の操作を昆虫細胞中における発現のための昆虫ベクター（例えば、欧州特許出願公開第ＥＰ１５５，４７６号に記載の手法を参照）の構築のために実施することができる。また、酵母細胞による本発明の因子の細胞内または細胞外発現のための酵母調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することができた。（例えば、ＰＣＴ出願公開第Ｗ０８６／００６３９号および欧州特許出願第ＥＰ１２３，２８９号に記載の方法を参照のこと）。
哺乳動物、細菌、酵母または昆虫宿主細胞系における本発明のアグリカナーゼ関連タンパク質を高レベルに生産する方法は、異種アグリカナーゼ関連遺伝子の複数のコピーを含有する細胞の構築を含みうる。異種遺伝子は増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結され、そのため、増加した遺伝子コピーを含有する細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）の増加濃度中での増殖について選択することができる（Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol., 159:601-629, 1982）。該アプローチは、多くの異なる細胞型と共に用いることができる。
【０１１９】
例えば、修飾されたアグリカナーゼのコーディング配列を含有する発現プラスミドおよびＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３（Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304, 1982）を、リン酸カルシウム共沈殿およびトランスフェクション、エレクトロポレーションまたはプロトプラスト融合を包含する種々の方法によって、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−１３１１中に同時導入することができる。ＤＨＦＲ発現形質転換体は、透析した胎仔ウシ血清を含有するアルファ培地中での生育について選択され、次いで、ＭＴＸの増加濃度（例えば、０．０２、０．２、１．０および５ｐＭ  ＭＴＸの連続段階）中での生育によって増幅について選択される（Kaufman et al. Mol. Cell Biol., 5:1750, 1983）。形質転換体をクローン化し、生物学的に活性な修飾されたアグリカナーゼ発現を、上記のアッセイの少なくとも１つによってモニターする。アグリカナーゼタンパク質発現は、ＭＴＸ耐性レベルの増加と共に増加すべきである。修飾されたアグリカナーゼポリペプチドは、３５Ｓメチオニンまたはシステインを用いるパルス標識およびポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当該分野で既知の標準的な技術を用いて特徴付けられる。他の修飾されたアグリカナーゼまたはアグリカナーゼ様タンパク質を生産するために、同様な手法を用いることができる。
【０１２０】
実施例９：抗体の調製
本発明の修飾されたアグリカナーゼに対する抗体を調製する。アグリカナーゼ活性を阻害することのできる抗体を開発するために、最初の２回の免疫化の場合、フロイントの完全アジュバント中に、その後はフロイントの不完全アジュバント中に混合した修飾されたアグリカナーゼタンパク質でマウスの一群を２週間毎に免疫する。免疫期間を通して、血液をサンプリングし、循環抗体の存在について試験する。９週で、循環抗体を有する動物を選択し、連続３日間、免疫し、殺す。脾臓を取り出し、細胞中に均質化する。５０％ＰＥＧ１５００を用いて、確立された手法によって、該脾臓細胞を骨髄腫融合パートナー（Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３系統）に融合する（Oi and Herzenberg, Selected Methods in Cellular Immunology, W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, 351, 1980）。該融合細胞を９６−ウェルマイクロタイタープレート中に２ｘ１０５細胞／ウェル密度で播種する。２４時間後、細胞を、いずれかの非融合骨髄細胞を有効に殺し、融合骨髄細胞を殺さないＨＡＴ選択（Littlefleld et al., Science, 145:709, 1964）に付す。
【０１２１】
抗−アグリカナーゼ抗体を分泌する首尾良く融合されたハイブリドーマ細胞を、固相および溶液相ＥＬＩＳＡによって同定する。修飾されたアグリカナーゼタンパク質は、上記のようにＣＨＯ細胞から調製され、ポリスチレン上を被覆させるか（固相アッセイの場合）、またはビオチン化される（溶液に基づくアッセイの場合）。中和アッセイもまた、アグリカンでポリスチレンプレート上を被覆し、アグリカナーゼ活性がハイブリドーマ上清の添加によって阻害される場合に用いられる。さらなる研究のために、アグリカナーゼ抗体を発現しているハイブリドーマを培養し、増殖させる。選択されたハイブリドーマを限定希釈によってクローン化し、低温保存する。該ハイブリドーマによって産生される抗体のイソ型は、マウス免疫グロブリン・イソタイピング・キット（ZymedTm Laboratories, Inc., San Francisco, CA）を用いて決定される。
【０１２２】
実施例１０：抗−アグリカナーゼ抗体を用いる患者の治療方法
実施例１０にしたがって開発された抗体を、アグリカンの喪失または過剰のアグリカナーゼ活性に関連する疾患または障害に罹患している患者に投与することができる。患者は、一度に、または間隔をおいて、例えば、１日１回、該組成物を服用し、該疾患または障害の症状および徴候は改善する。例えば、アグリカンの喪失が減少または終止し、関節軟骨の分解が減少または終止する。骨関節炎の症状は減少または消失する。これは、本発明の組成物がアグリカンの喪失または過剰のアグリカナーゼ活性に関連する疾患または障害の治療に有用であることを示す。該抗体は、また、骨関節炎に罹りやすい患者、例えば、家族歴もしくは該疾患の兆しを有するが、まだその影響を受け始めていない人に使用することもできる。実験設計案を表２に示す。
【０１２３】
【表２】
2005534308.tif 000006
【０１２４】
上記の記載は、本発明の目下好ましい具体例を詳述するものである。これらの記載を考慮して、当業者がその実施において、多くの修飾および変更を起こすことが予想される。該修飾および変更は、本明細書に添えられる特許請求の範囲内に包含されると考えられる。本出願に引用される文献の全てが出典明示により、全体として本明細書中に組み込まれる。さらに、データベースおよび開示される全ての引用文献中に列挙される全ての配列は、出典明示により全体として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
（原文に記載なし）
【配列表】
2005534308.tif 000007
2005534308.tif 000008
2005534308.tif 000009
2005534308.tif 000010
2005534308.tif 000011
2005534308.tif 000012
2005534308.tif 000013
2005534308.tif 000014
2005534308.tif 000015
2005534308.tif 000016
2005534308.tif 000017
2005534308.tif 000018
2005534308.tif 000019
2005534308.tif 000020
2005534308.tif 000021
2005534308.tif 000022
2005534308.tif 000023
2005534308.tif 000024
2005534308.tif 000025
2005534308.tif 000026
2005534308.tif 000027
2005534308.tif 000028
2005534308.tif 000029
2005534308.tif 000030
2005534308.tif 000031
2005534308.tif 000032
2005534308.tif 000033
2005534308.tif 000034
2005534308.tif 000035
2005534308.tif 000036
2005534308.tif 000037
2005534308.tif 000038
2005534308.tif 000039
2005534308.tif 000040
2005534308.tif 000041
2005534308.tif 000042
2005534308.tif 000043
2005534308.tif 000044
2005534308.tif 000045
2005534308.tif 000046
2005534308.tif 000047
2005534308.tif 000048
2005534308.tif 000049
2005534308.tif 000050
2005534308.tif 000051
2005534308.tif 000052
2005534308.tif 000053
2005534308.tif 000054
2005534308.tif 000055
2005534308.tif 000056
2005534308.tif 000057
2005534308.tif 000058
2005534308.tif 000059
2005534308.tif 000060
2005534308.tif 000061
2005534308.tif 000062
2005534308.tif 000063
2005534308.tif 000064
2005534308.tif 000065
2005534308.tif 000066
2005534308.tif 000067
2005534308.tif 000068
2005534308.tif 000069
2005534308.tif 000070
【図１】
2005534308.tif 000071
【図２−１】
2005534308.tif 000072
【図２−２】
2005534308.tif 000073
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月24日(2005.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005534308000001.app
【国際調査報告】
2005534308.tif 000074
2005534308.tif 000075
2005534308.tif 000076