(57)【要約】  免疫刺激性オリゴヌクレオチド (CpG ODN)を含んで成る組成物及びFcR指向性免疫治療薬を開示する。さらに、前記組成物を用いて FcR媒介性抗原提示、ADCC、及び他のFcR媒介性免疫応答を向上させる方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Fc受容体及び標的抗原に結合する多重特異的分子と組み合わされた一種以上のCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２】
前記多重特異的分子がヒトFcγ受容体に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Fcγ受容体がFcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、及びFcγRIII (CD16)から成る群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記Fcγ受容体がFcγRI (CD64)である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記多重特異的分子が二重特異的抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記標的抗原が腫瘍細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記腫瘍細胞が、卵巣、乳房、精巣、前立腺、白血病及びリンパ腫の腫瘍細胞から成る群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記標的抗原が病原体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記病原体がウィルス又は細菌である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、エフェクタ細胞の存在下で、標的抗原を発現している細胞のFc受容体媒介性抗体依存的細胞傷害性 (ADCC)を向上させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記エフェクタ細胞が、好中球、単球、マクロファージ、及び多核白血球 (PMN)から成る群より選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記エフェクタ細胞が好中球である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記FcγRI (CD64)の発現が好中球上で上方調節される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞がリンパ腫細胞である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
化学療法薬をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、標的抗原を発現している細胞のFc受容体媒介性抗原提示を向上させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、Fc受容体標的化抗原の樹状細胞媒介性交差提示を向上させる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記多重特異的分子が、Fc受容体に、前記受容体の天然のリガンド結合部位とは異なる部位で結合する抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記多重特異的分子が、一抗体フラグメント又は一本鎖抗体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記多重特異的分子がヒト抗体又はそのフラグメントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
FcR標的化抗原に組み合わされた一種以上のCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドを含むワクチン組成物。
【請求項２２】
前記抗原が、腫瘍抗原、ウィルス抗原及び細菌抗原から成る群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記腫瘍抗原が、卵巣、乳房、精巣、前立腺、白血病、及びリンパ腫の腫瘍抗原から成る群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記Fc受容体がヒトFcγ受容体である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記Fcγ受容体がFcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、及びFcγRIII (CD16)から成る群より選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記Fcγ受容体がFcγRI (CD64)である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記FcR標的化抗原が融合タンパク質を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２８】
化学療法薬をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、標的抗原を発現している細胞のFc媒介性抗原提示を向上させる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３０】
前記エフェクタ細胞が、好中球、単球、マクロファージ、及び多核白血球 (PMN)から成る群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記エフェクタ細胞が好中球である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
FcγRI (CD64)の発現が好中球上で上方調節される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３３】
前記細胞がリンパ腫細胞である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、Fc受容体標的化抗原の樹状細胞媒介性交差提示を向上させる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３５】
前記FcR標的化抗原が、Fc受容体に、前記受容体の天然のリガンド結合部位とは異なる部位で結合する抗体を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３６】
前記FcR標的化抗原が、一抗体フラグメント又は一本鎖抗体を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３７】
前記FcR標的化抗原がヒト抗体又はそのフラグメントを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３８】
Fc受容体及び標的抗原に結合する多重特異的分子と組み合わされた一種以上のCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む、標的細胞のFc受容体媒介性ADCCを向上させる方法。
【請求項３９】
Fc受容体及び標的抗原に結合する多重特異的分子と組み合わされた一種以上のCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドを含む組成物を対象に投与するステップを含む、標的細胞の成長を阻害する方法。
【請求項４０】
化学療法薬の投与をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記化学療法薬がドキソルビシン (アドリアマイシン)、シスプラチン ブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、及びシクロホスファミド ヒドロキシウレアから成る群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
放射線治療の施与をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
サイトカインの投与をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記サイトカインが顆粒球 コロニ刺激因子 (G-CSF)、顆粒球-マクロファージコロニ刺激因子 (GM-CSF)、インターフェロン-γ(IFN-γ)、及び腫瘍壊死因子(TNF)から成る群より選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記Fcγ受容体がFcγRI (CD64)である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記多重特異的分子が二重特異的抗体を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的抗原が腫瘍細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記腫瘍細胞がリンパ腫細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記標的抗原が病原体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記多重特異的分子がヒト抗体又はそのフラグメントを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
FcR標的化抗原と組み合わされた一種以上のCpG含有オリゴデオキシヌクレオチドを含むワクチン組成物を投与するステップを含む、Fc受容体媒介性抗原提示を向上させる方法。
【請求項５２】
前記抗原が腫瘍抗原、ウィルス抗原及び細菌抗原から成る群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記Fcγ受容体がFcγRI (CD64)である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記FcR標的化抗原が融合タンパク質を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が標的抗原を発現している細胞のFc受容体媒介性抗原提示を向上させる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
化学療法薬の投与をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
放射線治療の施与をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
サイトカインの投与をさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、引用をもってその内容をここに援用することとする、２００１年８月３０日出願の米国特許第６０／３１０，４３７号に基づく優先権を主張するものである。
【発明の背景】
【０００２】
非メチル化CpGモチーフを含有する合成オリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）が免疫応答を刺激することが示されている。5,6,7例えば、CpG ODNは免疫エフェクター細胞を活性化して多数のサイトカインの産生を誘導する。39加えて、CpG ODNは、樹状細胞の成長、活性化及び成熟を誘導する。40,41,42またCpG ODNは、腫瘍標的に対する細胞傷害性を向上させる。例えば単独又はモノクローナル抗体と組み合わせて投与した場合、CpG ODN は動物腫瘍モデルで免疫応答を促進する。8,9,10しかしながら、CpG ODNのこのような治療効果が知られる一方で、これらの効果の陰にある機序はまだ理解が乏しい。従って、当業では、これらの機序を解明し、それによりCpG ODN媒介型治療を向上させることが求められている。
【０００３】
モノクローナル抗体（mAb）の開発は、現在の免疫治療にとってもう一つの貴重な進歩だった。リツキシマブ及びトラツズマブなどのmAbでの近年の経験では、これらの薬物は患者のかなりの数でよく寛容され、腫瘍の退縮を惹起できることが実証されている。11-13残念ながら、治療を受けた者の大半は短命か、又は部分的な応答を見せたに過ぎなかった。13従って、抗体媒介型の免疫治療を向上させる技術を開発する必要もある。
【０００４】
過去１０年にわたってFc受容体（FcR）の生理機能及びそれらの免疫での役割の理解に大きな進展が見られた。Fc受容体はモノクローナル抗体の活性にとって重要であり、生理学的機能の過剰を惹起することができる。今日までのところ、免疫治療法はIgGに対する白血球FcR（FcγR）に主に集中してきている。21FcγRI (CD64); FcγRII (CD32)；及びFcγRIII (CD16)といった三種類のクラスのFcγRが現在、認識されている。22,23IgGに対するヒト高親和受容体であるFcγRI (CD64)は、単球、マクロファージ、顆粒球（サイトカインの誘導を受けて）及び樹状細胞（DC）を含む骨髄系譜の細胞でのみ、発現する。31 CD64 は、その細胞分布、構造及び機能の上で、白血球FcRの中でもユニークである。CD64 は抗原提示細胞による抗原特異的CD4＋T細胞応答を促進する能力を有し、 強力な抗腫瘍ワクチン応答を惹起する。32,35これらの性質のために、この受容体は抗体治療にとって最適な惹起分子と考えられている。24
【０００５】
CD64を発現する免疫細胞種の中でも、樹状細胞（DC）は免疫治療にとって有望なターゲットと考えられているが、それはなぜなら、これらは主要組織適合性複合体（MHC）クラスI経路を介して外因性抗原を交差提示するという能力により、抗原刺激を受けていないCD8＋T細胞の応答まで惹起できるからである。DCは専門的な抗原提示細胞であり、一次免疫応答を誘導する固有の能力を持つ。組織に常在する未熟DCは高いエンドサイトーシス活性及びファゴサイトーシス活性を示すが、成熟するとこれらの活性が下方調節されて、その代わりに抗原提示活性が上方調節される。25DC媒介性抗原提示の結果、CD4＋及びCD8＋T細胞の両方の活性化が関与する特異的免疫応答が惹起される。一般に外因性抗原はMHCクラスII分子上で提示され、内因性抗原はMHCクラスI経路を通じて提示される。しかしながら、外因性抗原がDCによりクラスI分子上に交差提示されることは、一次CD8＋T細胞応答を惹起する強力な経路となっているかも知れない。26,3原則的に、交差提示とは、抗原の液相内部移行の結果、クラスIに限定された提示が高濃度で起きるのみという非効率的なプロセスである。28,5しかしながら、複合体形成した抗原がFcγRに媒介されて取り込まれると、交差提示の効率が著しく向上する。30
【０００６】
発明の概要
本発明はFcR媒介型免疫治療を向上させる組成物及び方法を提供するものである。具体的には、本発明の一部として、免疫刺激性のCpG含有オリゴヌクレオチド（CpG ODN) がFcR媒介性免疫応答、特にFcγRI（CD64）媒介性免疫応答、を向上させることが発見された。従って、本発明の組成物及び方法は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組み合わせたFcR指向性化合物を包含するものである。
【０００７】
例えばここで解説する研究で実証するように、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、二重特異的抗体を含む、FcR標的化抗体により誘導される抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を向上させるために用いることができる。このように、ある実施態様では、本発明は、標的細胞又は病原体を狙ったモノクローナル抗体又はFcR標的化二重特異的もしくは多重特異的抗体と組み合わせた一種以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む組成物を提供するものである。ADCCを誘導する対象となる典型的な標的細胞には、限定はしないが、腫瘍細胞、例えば卵巣、乳房、精巣及び前立腺の腫瘍や、白血病及びリンパ腫を由来とする細胞がある。典型的な標的病原体には、例えばウィルス及び細菌がある。
【０００８】
本発明で用いられる二重特異的及び多重特異的抗体が、標的細胞又は病原体や、Fc受容体（例えばヒトFc受容体）に結合する結果、例えば単球、マクロファージ又は活性化多核白血球などのエフェクタ細胞により、この標的細胞又は病原体のFcR媒介性ADCCが誘導される。標的化するために好適なFc受容体には、Fcガンマ受容体（FcγR）、特にFcγRI（CD64）だけでなく、FcγRII（CD32）及びFcγRIII（CD16）もある。しかしながら、IgA受容体（例えばFcαRI）などの他のFc受容体も標的化することができる。ある具体的な実施態様では、本二重特異的又は多重特異的抗体は、Fc受容体に、この受容体の天然のリガンド結合部位（即ちこの受容体の免疫グロブリンFc（例えばIgG又はIgA）結合部位）とは異なる部位で結合する。従って、本二重特異的又は多重特異的抗体の結合は、生理的レベルの免疫グロブリンによっては遮断されない。
【０００９】
本発明の二重特異的及び多重特異的抗体は、ある実施態様では、相互に化学的又は遺伝子的に連結された二種以上の抗体もしくは抗体フラグメント（例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv、又は一本鎖Fv)を含有する。好適な抗体には、完全ヒトモノクローナル抗体や、「キメラ」及び「ヒト化」抗体がある。マウスモノクローナル抗体も使用できる。
【００１０】
従って、別の局面では、本発明は、一種以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドと、標的細胞及びCD64などのFc受容体を指向する二重特異的抗体とを含んで成る組成物を対象に投与することにより、前記対象の癌細胞などの標的細胞のFcR媒介性ADCC又は致死（例えば溶解又はファゴサイトーシス）を向上させる方法を提供するものである。本方法は、標的（例えば腫瘍）細胞の成長を阻害又は防ぐことにより、多種の疾患、特に癌の治療に用いることができる。
【００１１】
さらに以下に解説する研究で実証されるように、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを用いて、Fc受容体媒介性の抗原提示を向上させることができる。例えばここでは、免疫刺激性オリゴヌクレオチド がCD64標的化抗原の樹状細胞(DC)媒介性交差提示(MHCクラスＩ提示）を増加させることができることが示されている。
【００１２】
従ってさらに別の局面では、本発明は、FcR標的化抗原と組み合わされた一種以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むワクチン組成物を提供する。適した抗原には、対応する免疫応答の増加が好ましいようなあらゆる抗原が含まれる（例えばワクチンとして使用可能な抗原など）。典型的な抗原には、腫瘍、ウィルス及び細菌抗原がある。
【００１３】
FcR標的化抗原は、この抗原が抗原提示細胞（APC）に指向するように、この細胞に結合する成分に抗原を連結する方法により、FcRを標的指向させる。FcRに結合する成分とは、典型的には、FcRに結合する抗体もしくは抗体フラグメントである。例えばFcR標的化抗原は、FcRに結合する抗体もしくは抗体フラグメントに（例えば化学的又は遺伝子的に）連結させた抗原を含有する融合タンパク質又は分子複合体であってよい。具体的な実施態様では、本FcR標的化抗原は、CD64などのFcRに指向する一本鎖抗体に連結させた抗原を含んで成る一本鎖融合タンパク質を含んで成るものである。
【００１４】
従って別の局面では、本発明は、一種以上の免疫刺激性オリゴヌクレオチドを、FcR標的化抗原と組み合わせて対象に投与することにより、前記対象において、CD64標的化抗原の樹状細胞（DC）媒介性交差提示（MHCクラスＩ提示）などのFc受容体媒介性（例えばCD64媒介性）抗原提示を向上させる方法を提供する。このような方法で抗原提示を向上させると、CD64指向性の腫瘍ワクチンの治療効果を増強し、抗原特異的抗体応答を誘導することができる。このように、限定はしないが癌、自己免疫疾患、及び病原体（例えばウィルス及び細菌）感染を含む多種の疾患を治療及び／又は防止することができる。
【００１５】
本発明の治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体中に調合でき、また何らかの適した投与経路で対象に投与できる。典型的には本組成物は、治療効果を生ずるような適切な量及び投薬計画で、注射により投与される。本発明のすべての実施態様において、当該免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、FcR標的化分子（例えば抗原もしくは腫瘍指向性二重特異的抗体）と一緒に単一の組成物中に調合してそれらを同時投与できるようにしてもよいが、あるいは代替的には、当該の免疫刺激性オリゴヌクレオチド及びFcR標的化分子を、２つの別個の組成物として別々に調合することもできる。この例では、 前記の別々の組成物を一緒に（同時に）投与することも、又は別々に（順次）投与することもできる。
【００１６】
さらに本発明の治療用組成物を、他の治療的薬剤及び細胞傷害性薬剤と同時投与することもできる。例えば、これらを、ドキソルビシン (アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、 及びシクロホスファミド ヒドロキシウレアなどの化学療法薬と一緒に同時投与することができる。さらに本発明の組成物を放射線治療と併用投与することもできる。さらに本発明の組成物を、例えばサイトカインなど、Fcα受容体又はFcγ受容体などのFc受容体の発現又は活性を向上させる又は阻害するなど、調節する薬剤と併用投与することもできる。治療中に投与する典型的なサイトカインには、顆粒球コロニ刺激因子 (G-CSF), 顆粒球−マクロファージコロニ刺激因子(GM-CSF)、インターフェロン-γ（IFN-γ）、及び腫瘍壊死因子 (TNF)、がある。典型的な治療薬には、とりわけ、抗新生物薬、例えばドキソルビシン (アドリアマイシン)、シスプラチンブレオマイシンスルフェート、カルムスチン、クロラムブシル、及びシクロホスファミドヒドロキシウレア、がある。
【００１７】
本発明の他の特徴及び長所は以下の詳細な説明及び請求の範囲から明白であろう。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明では、FcR媒介性 免疫応答、特にFcγRI (CD64)媒介性免疫応答を増強するために、免疫刺激性 CpG-含有オリゴヌクレオチド (CpG ODN)を用いる。免疫刺激性 CpG含有オリゴヌクレオチドをFcR標的化免疫治療薬と同時投与することにより、 当該薬剤の治療効果を向上させる。これは、本発明の一部である、免疫刺激性 CpG含有オリゴヌクレオチドは、貪食細胞の増殖を含め、CD64の発現を増加させ、エフェクタ細胞を刺激する、という発見に基づくものである。
【００１９】
本発明をより容易に理解できるよう、以下の用語を以下の通りに定義しておく。
【００２０】
用語「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」、「免疫刺激性 CpG含有オリゴヌクレオチド」及び「CpG ODN」はここでは交換可能に用いられており、すべて、限定はしないがFcR媒介性 ADCC、特にFcγRI媒介性ADCC、及びFcR媒介性抗原提示、特にFcγRI媒介性抗原提示を含む、FcR媒介性免疫応答を増加させることのできる、シトシン、グアニンヌクレオチド配列を含有するオリゴヌクレオチドを言う。好適な免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、２乃至１００塩基対長、より好ましくは１０乃至５０塩基対長、そして最も好ましくは１５乃至２５塩基対長（例えば約２０塩基対）のものである。
【００２１】
本発明で用いる免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、その内容全体を引用をもってここに援用することとする米国特許第6,194,388号に解説された通りに調製できる。そこで解説されているように、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、式；5'X1X2CGX3X43'（但し式中、 C及びG はメチル化しておらず、X1、X2、X3、及びX4はヌクレオチドであり、そしてGCGトリヌクレオチド配列は5' 末端及び 3' 末端に、又は、5' 末端及び 3' 末端近傍に存在していない）で表されるコンセンサス有糸分裂促進性CpGモチーフを含有する。
【００２２】
用語「二重特異的分子」には、２つの異なる結合特異性部分を有する、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド複合体など、あらゆる作用物質が包含されるものと、意図されている。例えば、当該分子は、（ａ）腫瘍抗原などの細胞表面抗原、及び（ｂ）FcRγRI（CD64）などのエフェクタ細胞表面上のFc受容体、に結合するか、又は相互作用するものでよい。典型的な二重特異的分子には、異なる結合特異性部分を有する２種の抗体又は抗体フラグメントを相互に連結したものから成る「二重特異的抗体」が含まれる。用語「多重特異的分子」には、２つ以上の異なる結合特異性部分を有する、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質もしくはペプチド複合体など、あらゆる作用物質が包含されるものと、意図されている。従って「多重特異的分子」には、二重特異的分子や、３つ以上の結合特異性部分を有する分子が含まれる。例えば、当該分子は、（ａ）細胞表面抗原、及び（ｂ）エフェクタ細胞表面上のFc受容体、及び（ｃ）少なくとも１つの他の成分、に結合するか、又は相互作用するものでよい。従って本発明は、限定はしないが、細胞表面抗原と、エフェクタ細胞上のFc受容体などの他の標的とを指向する二重特異的、三重特異的、四重特異的、及び他の多重特異的分子を包含するものである。
【００２３】
「二重特異的抗体」はジアボディも含む。ジアボディはVH及びVLドメインが一個のポリペプチド鎖上に発現しているが、この同じ鎖上の２つのドメインの間で対を成すには短すぎるリンカを用いることで、これらドメインを別の鎖の相補ドメインと対を成させて、２つの抗原結合部位を生じるようにした二価の二重特異的な抗体である (例えば Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照されたい）。
【００２４】
ここで前述したように、本発明で用いる多重特異的分子（例えば二重特異的抗体）は、Fc受容体（例えばFc受容体に対して一個以上の結合特異性部分を有するなど）、好ましくはCD64などのFcガンマ受容体、を指向する。このようなFcガンマ指向性二重特異的分子及び二重特異的抗体は、この引用をもってその内容全文をここに援用することとする米国特許第5,635,600号に解説された通りに作製できる。本発明で用いるFcアルファ受容体（CD89）を指向する二重特異的分子は、この引用をもってその内容全文をここに援用することとする米国特許第6,193,966号に解説された通りに調製できる。本発明で使用可能な他の二重特異的分子は、この引用をもってその内容全文をここに援用することとする米国特許第5,837,243号に解説されている。
【００２５】
ある実施態様では、Fc受容体に対する結合特異性部分を、その結合がヒト免疫グロブリンＧ（IgG）では遮断されない、FcγRIに対するヒトモノクローナル抗体によって提供する。これらの好適なモノクローナル抗体の作製及び特徴付けは、この引用をもってその教示全体をここに援用することとするFanger らのPCT出願 WO 88/00052 及び米国特許第4,954,617号に解説されている。これらの抗体は、FcγRI、FcγRII又はFcγRIIIのエピトープに、当該受容体のFcγ結合部位とは異なる部位で結合するため、それらの結合は生理レベルのIgGでは実質的に遮断されない。本発明で有用な具体的な抗FcγRI抗体は、mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62 及び mAb 197である。mAb 32を産生するハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから、ATCC登録番号HB9469で入手できる。抗FcγRI mAb 22、mAb22のF(ab'）2フラグメントは、メダレックス社（ニュージャージー州、アナンデール）から入手できる。他の実施態様では、抗Fcγ受容体抗体は、ヒト化型のモノクローナル抗体22 (H22)である。H22抗体の作製及び特徴付けは、Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 及びPCT/US93/10384に解説されている。H22抗体産生細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに、１９９２年１１月４日に指定番号HA022CL1で預託され、登録番号CRL 11177を受けている。
【００２６】
さらに別の好適な実施態様では、Fc受容体に対する結合特異性部分を、その結合がヒト免疫グロブリンＡ（IgA）では遮断されない、Fc-アルファ受容体（FcαRI(CD89））などのヒトIgA受容体に結合する抗体によって提供する。IgAリガンド結合ドメイン以外でFcαRIに結合する、A3、A59、A62及びA77と同定された４種類のFcαRI特異的モノクローナル抗体が解説されている(Monteiro, R.C. et al., 1992, J. Immunol. 148:1764)。
【００２７】
FcαRI及びFcγRIは本発明で用いるために好適なトリガー受容体である。なぜならこれらは、（１）単球、PMN、マクロファージ及び樹状細胞などの免疫エフェクタ細胞上で主に発現する；（２）高レベル（例えば細胞１個当たり5,000-100,000）で発現する；（３）細胞傷害活性（例えばADCC、ファゴサイトーシス）の媒介物質である；（４）それらを標的指向させた、自己抗原を含む抗原の抗原提示の向上を媒介する、からである。
【００２８】
用語「抗体」には、ここで言及する場合、抗体全体や、そのあらゆる抗原結合フラグメント（即ち「抗原結合部分」）又は一本鎖が含まれる。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、ここで用いる場合、抗原への特異的結合能を維持した、抗体のうちの一つ以上のフラグメントを言う。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のうちの数フラグメントに行わせることができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例には、（ｉ）VL、VH、CL及びCH1ドメインから成る一価のフラグメントであるFabフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのFabフラグメントから成る二価のフラグメントであるF(ab'）2フラグメント；（ｉｉｉ）VH及びCH1ドメインから成るFdフラグメント；（ｉｖ）抗体の一本の腕のVL及びVHドメインから成るFvフラグメント；（ｖ）VHドメインから成るdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域(CDR)、がある。さらに、Fvフラグメントの２つのドメインVL及びVHは別々の遺伝子にコードされているが、これらは、VL及びVH領域が対を成して一価の分子を形成するような一個のタンパク質鎖に作製できるようにする合成リンカーにより、組換え法を用いて接合することができる（一本鎖Fv（scFv）として知られる；例えば Bird et al. (1988) Science 242:423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい)。このような一本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるものと、意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、それらのフラグメントは、インタクト抗体と同じ態様で実用性についてスクリーニングされている。
【００２９】
ここで用いる用語「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成から成る抗体分子の製剤を言う。モノクローナル抗体組成物は単一の結合特異性及び親和性を特定のエピトープに対して示す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、単一の結合特異性を示すと共に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を由来とする可変領域及定常領域を有するような抗体を言う。ある実施態様では、本ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物から得たＢ細胞を、不死化細胞に融合させて含むハイブリドーマにより産生される。
【００３０】
ヒト抗体は、すべてLonberg 及びKay、並びにジェンファーム・インターナショナルに付与された米国特許第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；及び5,770,429号； Surani らに付与された米国特許第5,545,807号；１９９８年６月１１日に公開された国際公報WO 98/24884；１９９４年１１月１０日に公開されたWO 94/25585；１９９３年６月２４日に公開された WO 93/1227,；１９９２年１２月２３日に公開されたWO 92/22645；１９９２年３月１９日に公開された WO 92/03918；に開示されている。これらのすべての開示全体を引用をもってここに援用することとする。
【００３１】
FcR媒介性免疫応答及びFcR媒介性抗原提示を言及する場合の用語「向上させる」、「増強する」及び「増加させる」は、ここでは交換可能に用いられており、本発明のFcR指向性治療薬を免疫刺激性オリゴヌクレオチドと併用して投与した場合を、それを免疫刺激性オリゴヌクレオチドなしで投与した場合と比較したときの、免疫応答（例えばADCC、細胞溶解、ファゴサイトーシス、抗体産生及びオプソニン化、サイトカイン産生等）又は抗原提示における何らかのレベルの増加を包含するものである。
【００３２】
ここで用いる用語「成長を阻害する」（例えば細胞に言及するとき）には、コントロール細胞に比較したときの細胞の成長の何らかの測定可能な減少、例えば少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、又は100%の細胞成長阻害など、を包含すると意図されている。
【００３３】
ここで用いる用語「結合を阻害する」及び「結合を遮断する」（例えば細胞リガンドのその受容体への阻害／遮断を言及する場合など）は交換可能に用いられており、少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%、又は100%など、部分的及び完全の両方の阻害／遮断を包含するものである。
【００３４】
用語「核酸分子」とは、ここで用いる場合、DNA分子及びRNA分子を包含するものと、意図されている。核酸分子は一本鎖でも、又は二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖DNAである。このように、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは短い核酸分子である。
【００３５】
核酸の場合、用語「実質的な相同性」とは、２つの核酸又はそのうちの指定された配列が、最適にアライメントして比較した場合に、適当なヌクレオチドの挿入又は欠失がありながらも、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％乃至９５％、そしてより好ましくはヌクレオチドの少なくとも約９８％乃至９９．５％、が同一であることを指す。代替的には、数セグメントがその鎖の相補鎖に選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするときに、実質的な相同性が存在することとする。
【００３６】
二つの配列間のパーセント同一性は、これら二つの配列を最適にアライメントするのに導入せねばならないギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れたときの、これら配列に共通の同一位置の数の関数である（即ち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×100）。二つの配列間の配列の比較及びパーセント同一性の決定は、以下の非限定的な例に解説するように、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
【００３７】
二つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで入手できる）のGAPプログラムを用い、NWSgapdna.CMP マトリックスを用いて、ギャップ・ウェイトを40、50、60、70、又は80 にし、そしてレングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして決定することができる。二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性はまた、ALIGNプログラム（バージョン2.0)に組み込まれた E. マイヤース及びW. ミラーのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) を用い、PAM120 ウェイト残基表を用いて、ギャップ・レングス・ペナルティを12、そしてギャップ・ペナルティを4にして、決定することもできる。さらに、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェア・パッケージ（http://www.gcg.comで入手できる)のGAPプログラムに組み込まれたニードルマン及びワンシュ (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))のアルゴリズムを用い、Blossum 62 マトリックス又はPAM250マトリックスを用いて、ギャップ・ウェイトを16、14、12、10、8、6、又は4にし、レングス・ウェイトを1、2、3、4、5、又は6にして、決定することができる。
【００３８】
ここで用いる用語「エフェクタ細胞」とは、免疫応答の認識及び活性化段階でなく、免疫応答のエフェクタ段階に関与する免疫細胞を言う。免疫細胞の例には、骨髄又はリンパ系由来の細胞、例えばリンパ球（例えば、Ｂ細胞及び細胞溶解性Ｔ細胞（CTL）を含むＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多核白血球、顆粒球、マスト細胞、及び好塩基球、がある。いくつかのエフェクタ細胞は特異的Fc受容体を発現し、特異的免疫機能を果たす。好適な実施態様では、エフェクタ細胞は、ADCCを誘導できる好中球など、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ADCC）を誘導することができる。例えば、FcRを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的致死や、他の免疫系構成成分への抗原提示又は抗原提示細胞への結合に関与している。他の実施態様では、エフェクタ細胞は、標的抗原、標的細胞、又は微生物を貪食することができる。エフェクタ細胞上の特定のFcRの発現は、サイトカインなどの体液性因子により調節することができる。例えば、FcγRIの発現がインターフェロンガンマ（IFN-γ）により上方調節されることが判明している。この発現亢進により、FcγRI担持細胞の標的に対する細胞傷害活性が増す。エフェクタ細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食又は溶解することができる。
【００３９】
ここで用いる用語「標的細胞」は、本発明の組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、二重特異的もしくは多重特異的分子）の標的とすることができる、対象（例えばヒト又は動物）内の何らかの望ましくない細胞を言う。好適な実施態様では、本標的細胞は、例えば膀胱、乳房、結腸、腎臓、卵巣、前立腺、腎細胞、扁平細胞、肺（非小細胞）、並びに頭部及び頸部の腫瘍細胞、など、腫瘍抗原を発現又は過剰発現している細胞である。他の標的細胞には滑膜線維芽細胞がある。
【００４０】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異的もしくは多重特異的分子に利用できる他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。
【００４１】
キメラマウス−ヒトモノクローナル抗体（即ちキメラ抗体）は、当業で公知の組換えDNA技術により作製できる。例えば、マウス（又は他の種の）モノクローナル抗体分子のFc定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で消化して、このマウスFcをコードする領域を取り除き、ヒトFc定常領域をコードする遺伝子の同等の部分に置換する（Robinson et al., 国際特許公報 PCT/US86/02269; Akira, et al., ヨーロッパ特許出願 184,187; Taniguchi, M., ヨーロッパ特許出願 171,496;  Morrison et al., ヨーロッパ特許出願 173,494; Neuberger et al., 国際出願 WO 86/01533; Cabilly et al. 米国特許第4,816,567号；Cabilly et al., ヨーロッパ特許出願125,023; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; 及びShaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559を参照されたい）。
【００４２】
さらに本キメラ抗体は、抗原結合に直接は関与していないFv可変領域の配列を、ヒトFv可変領域由来の同等の配列に置換することによって、ヒト化することができる。ヒト化キメラ抗体の概略的レビューはMorrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207 及びOi et al., 1986, BioTechniques 4:214に提供されている。これらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも一方から、免疫グロブリンFv可変領域の全部又は一部をコードする核酸配列を単離、操作、及び発現させるステップを含む。このような核酸の源は当業者に公知であり、例えば、抗GPIIbIIIa抗体産生ハイブリドーマである7E3から得てもよい。こうして、キメラ抗体又はそのフラグメントをコードする組換えDNAを適した発現ベクタ内にクローンできる。適したヒト化抗体は、代替的には、CDR 置換法米国特許第5,225,539号；Jones et al. 1986 Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; 及びBeidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060によっても作製できる。
【００４３】
特定のヒト抗体のCDRの全部を、非ヒトCDRの少なくとも一部分に置換してもよいが、又は、CDRのうちのごく一部を、非ヒトCDRに置換してもよい。ヒト化抗体をFc受容体に結合させるのに必要な数のCDRを置換するだけでよい。
【００４４】
抗体は、ヒト抗体のCDRの少なくとも一部分を非ヒト抗体由来のCDRと置換できれば、いかなる方法によっても、ヒト化することができる。Winterは、本発明のヒト化抗体の調製に使用してもよい方法を解説している（その内容を引用をもってここに援用することを明示しておく、１９８７年３月２６日提出の英国特許出願GB 2188638A）。ヒトCDRは、国際出願WO 94/10332 の標題 Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytesに解説された通りにオリゴヌクレオチド部位指定変異誘発法を用いて非ヒトCDRに置換してもよい。
【００４５】
さらに、特定のアミノ酸を置換、欠失又は追加してあるキメラ抗体及びヒト化抗体も、本発明の範囲内にある。特に、好適なヒト化抗体は、例えば抗原への結合を向上させるなどのためにフレームワーク領域にアミノ酸置換を有するものである。例えばマウスCDRを有するヒト化抗体においては、ヒトフレームワーク領域に位置するアミノ酸を、マウス抗体の相当する位置にあるアミノ酸と置換することができる。このような置換は、場合によっては抗原に対するヒト化抗体の結合を高めることが知られている。アミノ酸を追加、欠失、又は置換してある抗体をここでは改変された抗体又は変更された抗体と呼ぶ。
【００４６】
改変された抗体という用語には、さらに、抗体の数部分を欠失、追加、又は置換するなどにより改変されたモノクローナル抗体、キメラ抗体、及びヒト化抗体などの抗体が包含されるものと、意図されている。例えば抗体は、定常領域を欠失させ、それを抗体の血清半減期などの半減期、安定性又は親和性を増すはずの定常領域に置換することにより、改変することができる。いかなる改変も、当該の二重特異的及び多重特異的分子が、FcγRに対して特異的な抗原結合領域を少なくとも１つ有し、少なくとも１つのエフェクタ機能を惹起する限り、本発明の範囲内にある。
【００４７】
本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、化学的技術、（例えばD. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807)、「ポリオーマ」技術（Readingの米国特許第4,474,893号を参照されたい）、又は組換えDNA技術を用いて作製できる。
【００４８】
具体的には、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、当業で公知であり、ここに紹介された実施例で解説する方法を用いて、例えば抗FcR及び抗HER-2結合特異性部分など、構成部分の結合特異性部分を結合させることにより、調製できる。例えば本二重特異的及び多重特異的分子の各結合特異性部分を別々に作製しておき、後で相互に結合することができる。これら結合特異性部分がタンパク質又はペプチドである場合、多種の結合又は架橋剤を共有結合に用いることができる。架橋剤の例には、プロテインＡ、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、及びスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-1-カルボキシレート (スルホ-SMCC) (例えばKarpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい)がある。他の方法にはPaulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229:81-83)、及びGlennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)が解説したものがある。好適な結合剤は 両者ともピアース・ケミカル社（イリノイ州ロックフォード）から入手できるSATA 及びスルホ-SMCCである。
【００４９】
結合特異性部分が抗体（例えば二種のヒト化抗体）である場合、これらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して結合させることができる。ある特に好適な実施態様では、前記ヒンジ領域を修飾して、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１つ、を結合前に含有させておく。
【００５０】
代替的には、両方の結合特異性部分を同じベクタにコードさせ、同じホスト細胞内で発現及び集合させることができる。この方法は、当該二重特異的及び多重特異的分子がMAb×MAb、MAb×Fab、Fab×F(ab')2又はリガンド×Fab融合タンパク質である場合に特に有用である。例えば二重特異的分子など、本発明の二重特異的及び多重特異的分子は、例えば一本鎖二重特異抗体、１つの一本鎖抗体及び結合決定基を含む一本鎖二重特異的分子、又は２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異的分子など、一本鎖分子であってもよい。さらに二重特異的及び多重特異的分子は一本鎖分子であってもよく、あるいは少なくとも２つの一本鎖分子を含んで成るものでもよい。二重及び多重特異的分子を調製する方法は、例えば米国特許第5,260,203号；米国特許第5,455,030号；米国特許第4,881,175号；米国特許第5,132,405号；米国特許第5,091,513号；米国特許第5,476,786号；米国特許第5,013,653号；米国特許第5,258,498号；及び米国特許第5,482,858号に解説されている。
【００５１】
ここで用いる「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性あるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、当該の担体が静脈内、筋肉内、皮下、腸管外、脊髄もしくは表皮投与（例えば注射又は輸注により）に適しているとよい。投与経路によっては、活性化合物、即ち抗体、二重特異的及び多重特異的分子を、当該化合物を不活化しかねない酸及び他の天然条件の作用から当該化合物を保護する物質で被覆してもよい。
【００５２】
本発明の組成物は、当業で公知の多種の方法で投与することができる。当業者であれば理解されるように、投与の経路及び／又は形態は、所望の結果に応じて様々であろう。当該活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロ封入送達系を含む制御放出製剤など、急速な放出から当該化合物を保護する担体と一緒に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸など、生分解性で生体適合性あるポリマを用いることができる。このような製剤の調製法が数多く、特許付与されているか、又は当業者に広く公知である。 例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【００５３】
特定の投与経路で本発明の化合物を投与するには、当該化合物の失活を防ぐ物質でそれを被覆するか、又は当該化合物と同時投与することが必要な場合がある。例えば本化合物を、適したリポソーム、ヴィロソームなどの担体又は希釈剤に入れて対象に投与してもよい。薬学的に許容可能な希釈剤には生理食塩水及び水性の緩衝液がある。リポソームには水中油中水CGFエマルジョンや、従来のリポソームがある(Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27)。
【００５４】
薬学的に許容可能な担体には無菌の水溶液又は分散液並びに、無菌の注射液又は分散液の即時調製用の無菌粉末がある。このような媒質及び薬剤の、薬学的に活性な物質のための使用は当業で公知である。従来の媒質又は薬剤が当該活性化合物にとって不適合でない限り、本発明の医薬組成物中のその使用は考察されたところである。補助的な活性化合物も、本組成物中に組み込むことができる。
【００５５】
治療用の組成物は典型的に無菌でなければならず、また製造及び保管条件下で安定でなければならない。本組成物は、高い薬物濃度に適した溶液、マイクロ乳液、リポソーム、又は他の秩序ある構造として調合することができる。当該の担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適した混合物などを含有する溶媒又は分散媒であってよい。適した流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子の大きさを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持できる。多くの場合、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸塩及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることにより、可能である。
【００５６】
無菌の注射用溶液は、必要量の活性化合物を適した溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の１つ又は組み合わせと一緒に 加えた後、滅菌マイクロ濾過を行うことにより、調製できる。分散液は一般的には、塩基性の分散媒と、上に列挙したものの中で必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に当該活性化合物を加えることで、調製されている。無菌の注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥（凍結乾燥）であり、その結果、活性成分及び付加的な所望の成分の粉末が、予め殺菌濾過されたその溶液から生じる。
【００５７】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療的応答）が得られるように調節される。例えば単一の巨丸剤を投与してもよく、複数に分割された用量を一定期間にわたって投与しても、又は、治療状況の緊急度を指標として用量を比率的に増減させてもよい。投与の容易さ及び投薬量の均一性のためには、非経口用組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。ここで用いる単位剤形とは、治療しようとする対象にとって単位型の投薬量として調整された物理的に別個の単位を言う。各単位は、必要な薬品用担体との関連から所望の治療効果を生ずるよう計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の詳細は、（ａ）活性化合物の固有の特徴、及び、達成しようとする特定の治療効果、及び（ｂ）このような活性化合物を、個体の感受性の治療に向けて配合する技術に内在する限界、によって決定され、またこれらに直接依存する。
【００５８】
薬学的に許容可能な抗酸化剤の例には：（１）水溶性の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；（２）油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ-トコフェロール、等；及び（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸等がある。
【００５９】
治療用組成物の場合、本発明の調合物には、経口、鼻孔、局所（口腔内及び舌下を含む）、直腸、膣及び／又は非経口投与に適したものが含まれる。当該調合物は適宜、単位剤形で提供してもよく、製薬業で公知の何らかの方法で調製してもよい。一個分の剤形を作製するために担体物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、治療しようとする対象、及び特定の投与形態に応じて様々であろう。一個分の剤形を作製するために担体物質と組み合わせることのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生む組成物量となるであろう。概して、100パーセントのうちで、この量は約0.01パーセント乃至約99パーセントの活性成分、好ましくは約0.1パーセント乃至約70パーセント、最も好ましくは約1パーセント乃至約30パーセントの範囲であろう。
【００６０】
ここで用いる文言「非経口投与」及び「非経口的に投与する」とは、通常は注射による、腸管内及び局所投与以外の投与形態を意味し、その中には、限定はしないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び輸注、がある。
【００６１】
本発明の医薬組成物中に用いてもよい適した水性及び非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びこれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、がある。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料を用いたり、分散液の場合には必要な粒子の大きさを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持できる。
【００６２】
これらの組成物には、保存剤、湿潤剤、乳濁剤及び分散剤などのアジュバントを含有させてもよい。微生物の存在を防ぐには、上述の滅菌法と、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の多種の抗菌剤及び抗カビ剤の含有の両方を行うと、確実になろう。例えば糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含めることも好ましい場合がある。加えて、注射用の薬形の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を含めることにより、可能であろう。
【００６３】
本発明の化合物を製薬としてヒト及び動物に投与する場合、これらを単独で与えることもできるが、又は、例えば0.01%乃至99.5%（より好ましくは0.1%乃至90%）の活性成分を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含有する医薬組成物としても、与えることができる。
【００６４】
選択した投与経路に関係なく、適した水和型で用いてもよい本発明の化合物、及び／又は、本発明の医薬組成物は、当業者に公知の常法により、薬学的に許容可能な剤形に調合される。
【００６５】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与形態にとって、患者に毒性となることなく所望の治療応答を得るために有効量の活性成分が得られるよう、変更してもよい。選択される投薬量レベルは、用いる本発明の特定の組成物又は、そのエステル、塩又はアミドの活性、投与経路、投与機関、用いる特定の化合物の排出速度、治療期間、用いる特定の組成物と併用する他の薬物、化合物及び／又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び以前の医療歴等、医業で公知の因子を含め、多種の薬物動態学的因子に依拠することとなろう。
【００６６】
当業において通常の技術を有する医師又は獣医であれば、本医薬組成物の必要な有効量を容易に決定及び処方することができる。例えば、この医師又は獣医は、当該医薬組成物中に用いる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を得るのに必要なそれより少ないレベルで開始し、この投薬量を所望の効果が得られるまで次第に増加させていってもよい。一般的には、本発明の組成物の適した一日当たりの用量は、治療効果を生むために有効な最も少ない用量である化合物量であろう。このような有効量は一般に、上で解説した因子に依拠するであろう。投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下によることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与するとよい。必要に応じ、治療用組成物の有効な一日分の用量を、２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上の小分けした用量に分けて別々に、全日にわたって適当な間隔を置きながら、選択的には単位剤形で投与してもよい。本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、本化合物を医薬調合物（組成物）として投与することが好ましい。
【００６７】
治療用組成物は当業で公知の医療器具を用いて投与できる。例えばある好適な実施態様では、本発明の治療用組成物を、例えば米国特許第5,399,163号；第5,383,851号；第5,312,335号；第5,064,413号；第4,941,880号；第4,790,824号；又は第4,596,556号に開示された器具などの無針皮下注射器具で投与することができる。本発明で有用な公知のインプラント及びモジュールの例には、制御された速度で薬品を分配するインプラント可能なマイクロ輸注ポンプを開示する米国特許第4,487,603号；薬品を皮膚を透過させて投与する治療器具を開示する米国特許第4,486,194号；精確な輸注速度で医薬を送達する医療用輸注ポンプを開示する米国特許第4,447,233号；継続的な薬物送達のための可変流量式のインプラント可能な輸注装置を開示する米国特許第4,447,224号；多チャンバ区画室を有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4,439,196号；及び浸透圧薬物送達系を開示する米国特許第4,475,196号、がある。これらの特許を引用をもってここに援用することとする。数多くの他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールが当業者に公知である。
【００６８】
以下の実施例で本発明をさらに描出することとするが、以下の実施例を更に限定的なものと捉えられてはならない。本出願全体を通じて引用された全図面及び全参考文献、特許及び公開済み特許出願の内容を、引用をもってここに援用することを明示しておく。当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説した本発明の具体的な実施例の同等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような同等物は以下の実施例及び請求の範囲の包含するところと意図されている。
【００６９】
実施例
第一部  −  免疫刺激性オリゴヌクレオチドはFcR（CD64）の発現を増加させ、CD64媒介性腫瘍細胞致死を向上させる
材料及び方法
マウス：  hFcγRIについてトランスジェニックのFVB/NマウスをBalb/Cに戻し交雑した。30F12同腹仔及びC3H/HeNマウスをこれらの実験に用いた。hFcγRI-Tg動物を用いたすべての実験で、Tgマウスをそれらの非トランスジェニック（NTg）同腹仔と対応させた。メスのCH3/HeNマウスはハーラン・スプラーグ・ドーリー（インディアナ州インディアナポリス）から得た。マウスの交配及び飼育は、トランスジェニック・マウス・ファシリティ・オブ・ザ・セントラル・ラボラトリ・アニマル・ファシリティ（オランダ、ユトレヒト）か、又は、アイオワ大学（アイオワ州アイオワ・シティ）のアニマル・ケア・ユニットで行われ、８乃至１６週齢で用いられた。実験はすべて、ユトレヒト市又はアイオワ大学の動物倫理委員会の承認を受けた。
【００７０】
細胞株：  HER-2/neuを過剰発現する乳癌細胞株であるSK-BR-3をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ヴァージニア州マナサス、ATCC、HTB-30）から得た。31 10% 熱不活化ウシ胎児血清（FBS) (ユタ州ローガン、ハイクローン社）、50μg/ml ストレプトマイシン、50 IU/ml ペニシリン及び4 mM L-グルタミン(すべてギブコBRL社）を添加した、RPMI 1640培地（ギブコBRL社、スコットランド、ペーズリー、ライフテクノロジーズ社）から成る、ここで完全培地と呼ばれる培地で細胞を培養した。ヒトHER-2/neuを安定にトランスフェクトした3-メチルコラントレン誘導マウス線維肉腫細胞株CMS7HEは、空のベクタをトランスフェクトしたコントロール細胞株CMSneoと一緒に、珠玖 洋博士（日本、三重県、三重大学医学部）より提供された。32,33これらの細胞は462μg/ml ゲネチシン (G418 スルフェート；ギブコBRL社）を添加した完全培地で維持された。もとの38C13細胞株のサブクローンであるマウスＢ細胞リンパ腫細胞株38C13 DCは、2-メルカプトエタノールを添加した完全培地中に維持された。この細胞株を抗腫瘍動物モデルで広汎に用いた。34,35接着した細胞株はすべて、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に入れたトリプシン-EDTA（ライフ・テクノロジーズ社）を用いて剥がした。腫瘍接種に用いた細胞は対数期で採集され、各実験の前に、FACS分析でHER-2/neuの安定な発現について検査し、潜在的なマイコプラズマ混入についても検査した。
【００７１】
抗体：  未標識の、又は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）-、R-フィコエリトリン（RPE）、もしくはビオチンで標識済みの一群の抗マウスmAbを用いて、様々なマウスエフェクタ細胞集団を検出した。CD3-FITC (クローン 17-2a；ラット IgG2bκ）、CD4-RPE (ラットIgG2bκ)、CD8a-FITC (ラットIgG2aκ)、CD25-RPE (ラットIgGI)、CD11c-ビオチン標識（クローンHL3；ハムスター IgG1)、CD11b-FITC (ラットIgG2b)、CD45R-FITC (クローン B220；ラット IgG2a)、マウス FcγRII/III-RPE (クローン 2.4G2；ラット IgG2b)、GR-I-RPE (クローン RB6-8C5；ラット IgG2b)、ストレプタベジン（原語：Streptavedine）-RPE、CD80 (クローン 16-10A1；ハムスター IgG2)、及び CD86 (クローン GL1；ラット IgG2)はすべて、ファーミンジェン社 (カリフォルニア州サンディエゴ、BDファーミンジェン社、BDサイエンセズ）から購入した。F4/80-FITC (クローン Cl: A3-1；ラット IgG2b)はセロテック社（英国、オックスフォード）から得た。 抗マウスMHC IIであるモノクローナル抗体 M5/114は、ギオルギ・クラール博士（オランダ、アムステルダム、ブリー大学）より提供いただき、4D11 (クローン mLGl-1；ラット IgG2a)は我々の研究室のハイブリドーマで作製した。36 FITC結合マウス抗ヒトFcγRI (CD64；mAb 22；マウスIgGI)、mAb 32.2 (マウス IgGl)、及びHER-2/neuに対する未結合マウス mAb (520C9；マウス IgGl) はメダレックス社（ニュージャージー州アナンデール、メダレックス社）から提供された。F(ab')2 ヤギ抗マウス IgG (H＋L) (カリフォルニア州サンフランシスコ、プロトス・イムノリサーチ社）、F(ab')2 ロバ抗ラットIgG (H＋L）-FITC、及びF(ab')2 ヤギ抗ヒトIgG-FITC (ペンシルヴァニア州ウェスト・グレース、ジャクソン・イムノリサーチ社）を含め、結合体にしていない一次mAbを用いる場合には、対比染色のために多数のmAbを用いた。c-neu (Ab5；クローン TA-l；マウス IgGl) を用いて腫瘍細胞株（英国、ケンブリッジ、オンコジーン社）の HER-2/neu発現レベルを評価した。31マウスIgGl 及びIgG2a 抗イディオタイプ mAb (クローン MS5A10 及びMS11G6) は以前に解説されており、プロテインＡを用いたアフィニティ・クロマトグラフィで細胞培養上清から精製された。38,39BsAb MDX-H210 (hFcγRI×HER-2/neu) は、標的抗体H22 (hFcγRI)、及び520C9 (HER-2/neu) (メダレックス社)のF(ab')フラグメント同士を化学的に架橋することで作製された。40
【００７２】
CpG ODN:    CpG ODN はコーリー・ファーマシューティカル・グループ（マサチューセッツ州ウェレズリー）から提供された。CpG ODN 1826 (配列TCCATGACGTTCCTGACGTT)を免疫刺激性 CpG ODNとして用い、そしてCpG モチーフを変異させた CpG ODN 1982 (配列 TCCAGGACTTCTCTCAGGTT)をそのコントロールとして役立てた。リムルス検定（メリーランド州ウォーカーズビル、LAL-アッセイバイオホイッテカー社）でCpG ODN を検査し、12.5 ng/mg 未満のレベルのリポ多糖類を含有することを立証した。
【００７３】
フローサイトメトリ：  マウス全血、単離ヒトもしくはマウス白血球、又はマウス腫瘍細胞を３０分間、標識済みもしくは未標識のmAbと一緒にインキュベートした。次に、1%ウシ血清アルブミン（BSA）及び0.01%アジドを添加したPBS中で細胞を３回、洗浄した。未標識の一次mAbを用いた場合には、対比染色を、ヤギ抗マウス抗体のFITC標識もしくはRPE標識F（ab'）2フラグメントで行った。FACS(R)溶解溶液（カリフォルニア州サンホセ、ベクトン・ディッキンソン社）を用いて全血試料を溶解及び固定した。試料はすべて、FA CSCaliburフローサイトメータ（ベクトン・ディッキンソン社）で解析した。
【００７４】
細胞傷害性検定：  腫瘍細胞を６ウェルプレートに5×103細胞／ウェルの濃度になるようにプレートし、CpG ODN を様々な濃度(2.8、5、7.5、10、及び20μg／ml)で加えた。プレートを３７℃で加湿したインキュベータ内でインキュベートし、増殖及び形態について細胞を毎日、顕微鏡検査した。４日目に細胞をトリプシン-EDTAで剥がし、生存及びHER-2/neu発現についてFACS分析で検査した。細胞を未結合の抗HER-2/neu mAb c-neu (1:20) で染色し、F(ab')2 ヤギ抗マウス IgG (H＋L) FITC (1:100)で対比染色した。試料の最初の分析後、それらに10μlのプロピジウムヨウ素（原語：propidium iodine）(1 mg/ml；1: 1 00)を加えた後に、死んだ細胞のパーセンテージを定量するために２回目の測定をした。
【００７５】
ADCC検定：  Valerius らのものを少し改変したクロム51（51Cr）放出検定を用いた。24簡単に説明すると、腫瘍細胞を200μCi51Cr（英国、バッキンガムシャイア、アマーシャム社）と一緒に２時間、インキュベートした。培地で３回、洗浄した後、5×103個の標的細胞を、感作mAb／BsAb、CpG ODN、及び50μlの全血を含有する丸底のマイクロタイタ・プレートに加えた。マウス全血をエフェクタ細胞の供給源として用いた。マウスを３日間、150μgのマウス顆粒球コロニ刺激因子 (G-CSF) で皮下(s.c.) (カリフォルニア州サウザンド・オークス、アムジェン社)で処理して白血球の血中数を増やしてから、眼窩穿刺で血液を採集した。最終量200μlのうちのエフェクター対標的細胞の比はほぼ80:1だった。３７℃で一晩インキュベート後、遠心分離で検定を終えた。51Cr放出を三重のウェルから採った上清で測定した。細胞傷害性のパーセンテージは式：
実験のcpm  −  基礎cpm
％特異的溶解＝  最大cpm  −  基礎cpm  ×100
を用いて計算したが、このとき最大の51Cr放出は、Zap-oglobin  (英国、ルートン、カウンター・エレクトロニクス社；10 % 最終濃度)を標的細胞に加えて判定され、基礎放出は、感作抗体及びエフェクタ細胞の非存在下で測定された。これらの条件下では、大変低いレベルの抗体媒介性非細胞傷害性（エフェクタ細胞なし）及び抗体非依存的致死が観察されたに過ぎなかった（＜5%特異的溶解）。
【００７６】
腫瘍モデル：  38C13 マウス B 細胞リンパ腫モデルでは、免疫コンピテントなC3H/HeNマウスで急速かつ継続的に成長する5×103個の38C13 T3C腫瘍細胞を、腹腔内(i.p.)注射し、そしてCpG ODN 及びmAb を実験プロトコルに従って注射した。2×106個のCMS7HE 細胞を、オスのF12 Tg-hFcγRI 及びNTg マウスの右腹に皮下接種して、別の箇所32で詳述された皮下充実腫瘍を樹立した。これらの腫瘍は均一に成長し、キャリパーを用いて容易に測定できた。腫瘍体積を長さ×幅×高さ（mm3）で報告した。BsAbを毎日２回、腹腔内注射し、そしてCpG ODN を腫瘍の近傍か、又は、頸部に、実験プロトコルに従って皮下注射した。in vivoでの継代後に、腫瘍細胞を安定なHER-2/neu発現についてFACS分析で検査した。活動レベル、毛皮の波立ち、下痢、及び全体的外見を含め、毒性及び不調の兆候について、マウスを１週間に３回、チェックした。
【００７７】
統計学的解析：  群データを平均の平均±標準偏差（SEM）で報告した。群間の違いを対応のない（又は適当な場合には対応のある）スチューデントt検定で解析した。p<0.05レベルのときに有意と認めて有意水準を示す。
【００７８】
実施例１：  CpG ODN は抗腫瘍性mAbの効果を高める
38C13 マウス B細胞リンパ腫モデルによる以前の実験では、IgG2a 及びIgG1 アイソタイプの抗イディオタイプマウス mAbが抗腫瘍活性を示したが、IgG2a mAb の方がより効果的であることが実証された。34このモデルではCpG ODNは抗腫瘍性IgG2a抗体の効果を高めた。8CpG ODNが MS5AlO IgG1 mAbの抗腫瘍活性に及ぼす効果を評価した。同じ特異性を持つIgG2a抗体による処理も評価した。CpG ODNはIgG2a mAbの効果を高めた。対照的に、IgG1 mAbの効果に対する検出可能な作用は何ら観察されなかった（図１）。
【００７９】
実施例２：  CpG ODNによるPMN hFcγRIの発現の誘導
マウス IgGl 及びIgG2a mAb間の大きな違いの１つは、IgG2a mAb のhFcγRIに対する結合能である。28,29従って、CpG ODNがこの受容体に及ぼす作用をhFcγRIトランスジェニックマウス・モデルで評価した。hFcγRI Tg FVB/N マウスはhFcγRIを単球、マクロファージ、未熟樹状細胞 (DC)、及び少数ではあるが多核白血球(PMN)で、構成的に発現する。30hFcγRIの PMN上での発現は、in vivoにおいて、IFN-γ又はG-CSpの刺激を受けたときに上方調節される。41,42 F12マウスは同一の発現パターン及びhFcγRI 調節を示した。大半の他の白血球集団とは対照的に、CpG ODN のPMNに対する作用についてはほとんど知られていない。
【００８０】
従って、CpG ODN がPMN上でのhFcγRIの発現をin vivoで変化させるかどうかを検査した。CpG ODN 1826を１回、皮下投与してから３日後にhFcγRIの発現を調べた。図２Ａに示すように、TgマウスのPMN上で hFcγRIが発現し、CpG ODN 1826で処理したTgマウスでは発現の向上が見られた。反対に、NTgマウスではhFcγRIの発現は検出されなかった。CpG ODN 1826による処理で、単球及びDC上でのhFcγRIの発現レベルも向上した (n=3、データは図示せず)。加えて、hFcγRI発現レベルはCpG ODNにより用量依存的に上方調節された（図２Ｂ）。 CpG ODN 1826を１回、皮下投与した後のhFcγRI発現の動態を評価した。 明確な時間応答曲線が観察され、 hFcγRI発現の上方調節がCpG ODN 1826を１回投与した後に最長で５日間、 観察された（図３）。
【００８１】
実施例３：  CpG ODNの食細胞に対する免疫刺激作用
CpG ODN 1826が食細胞に対して免疫刺激性かどうかを評価するために、hFcγRI Tg 及びNTgマウスにCpG ODN 1826を０日目に１用量、注射した。様々な時点で100μlの全血を採取し、PMN、単球、DC、T細胞及びB細胞集団をフローサイトメトリで分析した。
【００８２】
１日目にPMNのパーセンテージの明かな増加が観察されたが、これも３日目までには基線に戻った。単球は匹敵するパターンを示し、細胞数は３日目に最高に達した。DCについては、Tg 及びNTg マウスの両方が増加を示したが、その程度は異なった。B細胞及びT細胞数に変化はなかった（図４Ａ−Ｅ）。
【００８３】
系譜特異的マーカに加え、活性化マーカ (MHC II、B7-1、B7-2、さらにマウス FcγRII/III)も研究した。Tg動物で評価したFcγRII/IIIの発現は３日目に僅かな増加（MFIで）を見せた（図４Ｆ）。他の活性化マーカでは、変化はそのいずれにも検出されなかった。
【００８４】
実施例４：  CpG ODNのhFcγRI媒介性ADCCに対する作用
MDX-H210はhFcγRI(CD64) 及び腫瘍抗原HER2/neuを指向する二重特異的抗体（BsAb）である。G-CSFで刺激を受けたマウス PMN によるMDX-H210媒介性ADCCが、CpG ODN 1826の影響を受けるかどうかを調査した。トランスジェニックPMNでは、CpG ODN 1826の添加後にMDX-H210を通じた腫瘍細胞致死の向上が示された。さらに、MDX-H210 及びCpG ODN 1826の組合せは、大変低いBsAb濃度でも効果的だった（図５）。特異的溶解の向上は、コントロールCpG ODN 1982 とMDX-H210の組合せでは観察されなかった。NTgの PMN は、マウスFcγRII/IIIを介して細胞傷害性を惹起する抗HER-2/neuマウスIgG1 mAbであるmAb520C9を介した場合以外は、溶解を媒介できなかった。43
【００８５】
実施例５：  BsAb誘導性抗腫瘍活性に対するCpG ODNの作用
CpG ODN 単独でも充実腫瘍細胞にとって細胞傷害性であるかを評価するために、いくつかの細胞株 SK-BR-3、RZ#l4＋、CMS7neo、及びCMS7HE をテストした。CpG ODN 1826 及び1982は細胞形態にも、増殖にも、抗原発現にも、又は生存率にも影響を及ぼさなかった（n=3、データは図示せず）。CpG ODN は腫瘍細胞に直接の傷害作用を示さなかったが、食細胞の免疫刺激を誘導してhFcγRI発現レベルを向上させたことから、これらのin vivoでの効果をさらに評価した。hFcγRI指向性BsAbをCpG ODNと組み合わせて用いることで、hFcγRI の抗腫瘍作用惹起能を検査した。マウス線維肉腫を持つマウス(CMS7HE)をMDX-H210 及び CpG ODN 1826の組合せで処理した。腫瘍成長の明確な低下が、MDX-H210及びCpG ODN 1826の組合せで処理したTgマウスで観察されたが、他方、他のすべての処理群（及びNTgマウス）で腫瘍は進行的に成長した（図６）。不活性のCpG ODN 1982を用いて行った実験では、何ら治療効果は見られなかった。
【００８６】
結論
実施例１−５は、CpG ODN が FcγRIの発現を増加させることを示している。CpG ODNを１回、皮下注射すると、マウスPMN上でのhFcγRIの発現が、時間及び濃度依存的に上方調節された。加えて、PMN、単球、及びDCの絶対数が増加したが、Ｔ細胞及びＢ細胞数に明白な変化はなかった。CpG ODNはTh2型応答ではなくThl型応答を誘導することが公知である。その結果、hFcγRIの上方調節に有利なサイトカイン・プロフィールとなる。46Valerius らによる以前の研究24,47では、hFcγRIが上方調節されると食細胞の機能が亢進することが記述されている。実施例１−５で解説した実験は、 CpG ODNはhFcγRIの発現を向上させるだけでなく、hFcγRI陽性細胞のファゴサイトーシス能も向上させることを示している。具体的には、hFcγRI指向性BsAbがCPG ODNと組み合わされたことで、ADCCにhFcγRI陽性PMNが用いられて細胞傷害性が上昇したことが観察された。
【００８７】
さらに実施例１−５で解説した研究から、CpG ODNはIgG2a誘導性抗腫瘍作用を向上させることも結論付けることができる。観察された結果に基づき、そしてマウス IgG2a mAbのFcγRIに対する特異性に基づくと28,29、 これらの研究で、 FcγRIが、CpG ODN のmAb治療法の効果を高める能力で中心的な役割を果たすこと、そしてin vivoではCpG ODNとhFcγRI媒介性溶解との間に相乗作用が存在すること、が裏付けられた。
【００８８】
実施例１−５で解説した充実腫瘍モデル研究で得られたデータは、CpG ODNをin vivo投与した後の抗腫瘍効果の向上におけるhFcγRIの役割を示している。CpG ODN は明らかに、HER2/neu陽性腫瘍細胞を発現している腫瘍細胞の、MDX-H210媒介性成長阻害とADCCとを向上させた。観察された結果はさらに、抗腫瘍mAbと一緒に投与されたCpG ODNの抗腫瘍活性を媒介する上で、hFcγRI陽性PMN、単球、及びマクロファージが重要な役割を果たすことも示した。
【００８９】
従って、実施例１−５は、本発明のCpG ODN組成物が直接的な抗腫瘍効果及び能動抗腫瘍免疫応答の両方を誘導することを実証するものである。ADCC及び能動抗腫瘍免疫応答の発生の両方の向上は、 CpG ODNをhFcγRI指向性のアプローチと組み合わせて用いることで達成された。
【００９０】
第二部  −  免疫刺激性オリゴヌクレオチドはFcR(CD64)媒介性抗原提示を向上させる材料及び方法
マウス：   オランダ、ユトレヒト大学のトランスジェニック・マウス・ファシリティ・オブ・セントラル・アニマル・ラボラトリでC57Bl6 (F1) 又はBalb/cマウス(F12)と交配したヒトCD64 Tg動物8を飼育し、維持した。C57Bl6 及び Balb/c マウスはハーラン社（オランダ、ホルスト）から得られた。８乃至１２週齢のヒトCD64発現動物を、それらのNTg同腹仔と共にこの実験で用いた。実験はすべて、ユトレヒト大学動物倫理委員会より認可を受けた。
【００９１】
細胞株：  H-2b-限定OVAエピトープSIINFEKL44を認識するTCRを発現するRF33細胞株と、Iad限定法45でOVAペプチドを認識するOVA特異的D011.10 細胞株を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FBS) (ユタ州ローガン、ハイクローン社、Fetalclone I）、50 IU/ml ペニシリン (ギブコBRL社) 及び50μg/ml ストレプトマイシン (ギブコBRL社)を添加した RPMI 1640培地(スコットランド、ペーズリー、ライフ・テクノロジーズ社、ギブコ BRL社）で培養した。インターロイキン 2 (IL-2) 依存的 CTLL-2 細胞株46を、10% FBS、50 IU/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシン及び100 U/ml IL-2 (オランダ、アルクマール、ベーリンガー・インゲルハイム社、Immunokine）を加えたRPMI 1640培地で増殖させた。
【００９２】
抗体：  CD80 (クローン 16-10A1)、CD86 (クローン GL1)、CD11c ビオチン (クローン HL3)、CD32/16 PE (クローン 2.4G2)、Gr-1 PE (クローン RB6-8C5)、CD45R/B220 ビオチン (クローン RA3-6B2)、CD3 FITC (クローン 17A2) はファーミンジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ、BDファーミンジェン社、BDバイオサイエンセズ社）から得られた。CD64 PE 及びSA-PE はベクトン・ディッキンソン社 (カリフォルニア州サンホセ、BDバイオサイエンセズ社）から購入された。F4/80 ビオチン (クローン Cl: A3-1) はセロテック社（英国、オックスフォード）から得られた。CD40 PE (クローン 3.23) はイムノテック社 (フランス、マルセイユ）から購入され、F(ab')2フラグメントマウス抗ラットIgG (H＋L) はジャクソン・イムノリサーチ社 (ペンシルバニア州ウェスト・グレース）から購入された。NLDC-14547及び M5/114抗クラスＩＩ48は、 ギオルギ・クラール博士（（オランダ、アムステルダム、ブリー大学）からご厚誼により提供された。
【００９３】
抗原：  OVAの免疫優性ペプチドであるSIINFEKL (OVA 257-264)をアイソジェン社(オランダ、マアルセン)から得た。オブアルブミン複合体は、40μg/ml 鶏卵OVA (ミズーリ州セントルイス、シグマ社）を、80μg/ml特異ウサギ IgG血清（シグマ社）と一緒に２０分間、３７℃でインキュベートすることで作製した。22 OVA 結合体はN-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート (SATA) （イリノイ州ロックフォード、ピアース社）及びSPDP (ピアース社)を化学的架橋剤として用いて調製された。4922-OVA融合タンパク質を以下の通りに作製した。抗CD64モノクローナル抗体H22 のVH及びVLコーディング領域をPCRで得た。VH用のプライマ（テキサス州ウッドランズ、ジェノシス・バイオテクノロジーズ社から購入したもの）は 、正方向プライマがGATCGATCGATATCCAACTGGTGGAGAGCGGTG であり、逆方向プライマがGTACTCAGTCCGGAGCCGCCACCTCCTGAGCTCACGGTGACCGGGGTCCCTTGであった。VL用のプライマは、正方向プライマがGTACTCAGTCCGGAGGTGGAGGCAGCGGAGGGGGCGGATCCGACATCCAGCTGACCCAGであり、逆方向プライマがCAGTCAGTTCTAGAGTCAGCTCGAGCAGCTAGATTTGATTTCCACCTTGGTCC であった。 H22軽鎖をコードする発現ベクタをテンプレートとして用いた。PCR は、GeneAmp PCR 試薬キットを、Amplitaq DNA ポリメラーゼ (カリフォルニア州フォスター・シティ、PEアプライド・バイオシステムズ社）と一緒にメーカの指示に従って用いて行われた。増幅後のDNA断片を精製した後、ベクタpcDNA3/CAT (カリフォルニア州カールスバッド、インビトロジェン社）に別々に連結した。 DNA配列決定をナショナル・バイオサイエンセズ社（ミネソタ州プリマス）で行い、VH及びVL遺伝子の一体性を確認した。免疫グロブリンシグナル配列 (MGWSCIILFLVATATGVHS)は、シグナル配列及びリボソーム結合部位をコードする２つの相補的オリゴマをアニールすることで構築された。そのセンス・オリゴマはAGCTTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTGGCCACAGCTACCGGTGTCCACTCCGAT であり、アンチセンス・オリゴマはATCGGAGTGGACACCGGTAGCTGTGGCCACCAAGAAGAGGATGATACAGCTCCATCCCATGGTGAであった。最後のステップは、sFvの3'末端にコーディング領域を構築すること、小型のリンカ (Gly4Ser)、c-myc タグ(EQKLISEEDLN)、及び6-Hisの尾を加えることだった。この遺伝子断片は４つのオリゴマ：A=3DTCGAGCGGAGGCGGGGGTAGGGATATCGCGGCCGCAGAACAGAAACTC、B=3DTGAGATGAGTTTCTGTTCTGCGGCCGCGATATCGCTACCCCCGCCTCCGC、C=3DATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGCGCCGCACATCACCATCATCACCATTGATT、D=3DCTAGAATCAATGGTGATGATGGTGATGTGCGGCGCCATTCAGATCCTCTTC、を用いて構築された。正方向プライマ：ATAAGAATGCGGCCGCAGGCTCCATCGGCGCAGC 及び逆方向プライマ：ATAAGAATGCGGCCGCAGGGGAAACACATCTGCを用いて、OVA配列をコードするcDNAに対してPCRを行った。次にその産物を消化し、22sFvを含有するpJG225プラスミド内に挿入して、22 sFv 及び OVA遺伝子融合物 (22-OVA)を作った。この遺伝子融合物の正確な方向、フレーム及び一体性をDNA配列決定で確認した (ニューハンプシャー州ハノーヴァー、ダートマス・メディカル・スクール、モラキュラー・バイオロジー・コア・ファシリティ）。22-OVA組換えバキュロウィルスを作製するために、22-OVA配列をpVL1393バキュロウィルス・トランスファ・ベクタ (カリフォルニア州サンディエゴ、BDファーミンジェン社）内に挿入して、スポドプテラ-フルギペルダ （Spodoptera frugiperda）(Sf9)昆虫細胞 (BD ファーミンジェン社)に、直線化したバキュロウィルス DNAと22-OVA pVL1393ベクタを、 BDバキュロゴールド・トランスフェクション・キットをメーカの推奨通りに用いて同時トランスフェクトした。トリコプラシア-ニー（Trichopluscia Ni ）(Hi-5)昆虫細胞（インビトロジェン社）に、22-OVA をコードする高力価のバキュロウィルスを、１０の感染多重度で感染させた。４日後、その上清を採集し、濃縮し、当該タンパク質コンストラクトをプロテインＬカラム（カリフォルニア州パロアルト、クロンテック社）を用いて精製した。精製済みのタンパク質コンストラクトを6%アクリルアミドゲルで泳動させ、クーマシー・ブリリアント・ブルーで染色して、純度を検査した。加えて、タンパク質コンストラクトはすべて、リポ多糖類（LPS）の混入についてもリムラス・アメボサイト・ライセートQCL-1000 検定キット (メリーランド州ウォーカーズビル、バイオホイッテカー社）で検査した。
【００９４】
CpG ODN:  合成ODNはコーリー・ファーマシューティカル・コーポレーション（マサチューセッツ州ウェレズリー）より提供された。以下の配列：TCCATGACGTTCCTGACGTTを持つCpG ODN 1826を用いた。加えて、CpG ODN をLPSの混入についてリムラス・アメボサイト・ライセートQCL-1000 検定キット (メリーランド州ウォーカーズビル、バイオホイッテカー社）で検査した。
【００９５】
DCの生成：  骨髄由来DC (BMDC) はイナバの解説した通りに得られた。50簡単に説明すると、骨髄をマウス大腿骨から採取し、赤血球を溶解させ、濾過済みのRPMI＋（10% FBS、50 IU/ml ペニシリン及び50μg/ml ストレプトマイシンを加えたRPMI 1640培地）で1×106/ml個で、10 ng/ml 顆粒球／ マクロファージ コロニ刺激因子 (GM-CSF; ワシントン州シアトル、イムネックス社）又は10 ng/ml GM-CSF＋50ng/ml 腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α；オランダ、ウーデン、ハイカルト社）のいずれかの存在下で成長させた。非接着細胞を１日目に再プレートし、２日目及び４日目に非接着細胞を培養物から取り除き、同時に培地を取り替えた。非接着DC及び接着の弱いDCを７日目、８日目又は９日目に摘み出した。
【００９６】
フロー・サイトメトリ分析：  ７日目のDC (DC7) (1.105）、100μg/ml CpG ODN と一緒に２４時間培養後の８日目のDC 、及び、一部を1μg/ml LPS（シグマ社）と一緒に４８時間培養した９日目のDC (DC9)を、5%熱不活化マウス血清で３０分間、室温（RT）で遮断した。細胞をFACS 緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、0.1% アジド、1% ウシ血清アルブミン (BSA))で洗浄し、関連抗体と一緒に２０分間、RTでインキュベートした。細胞を洗浄し、必要に応じて特異二次抗体と一緒にインキュベートした。細胞をフローサイトメトリにより、FACSCalibur (BDバイオサイエンセズ社)を用いて分析した。未染色の細胞、アイソタイプ・コントロール、及び二次（蛍光色素標識済み）抗体を陰性コントロールとして用いた。
【００９７】
MHC クラスＩＩ抗原提示検定：   DC7又はDC9 (1.105個の細胞)をRPMI＋で２回、洗浄し、100μl RPMI＋／ウェル中に再懸濁させた。DC を多様な濃度のOVA-IgGαOVA複合体及び1×105個のDO11.10 T 細胞と一緒に２４時間、３７℃でインキュベートした。過剰量のOVA (0.4 mg/ml)を陽性コントロールとして用いた。D011.10 細胞から放出されたIL-2の存在を、5×103個のIL-2 依存的CTLL-2細胞を多種の培養上清と一緒に培養することで判断した。一晩のインキュベート後、1μCiの3Hチミジン (英国バッキンガムシャイア、アマーシャム社）を各ウェルに加え、細胞を２４時間後にガラス製ファイバフィルタ（フィンランド、ツルク、ウォラック社）上に採集して、液体シンチレーション計数を行った。
【００９８】
MHC クラスＩ抗原提示：  DC7 （1×105）をRPMI＋培地で２回、洗浄し、150μl RPMI＋／ウェル内に再懸濁させた。DC をOVA-IgGαOVA複合体、22-OVA 、又は22×OVA、と一緒に、10μg/ml CpG ODN 1826 を加えて、もしくは加えずに、２４時間、３７℃でインキュベートした。SIINFEKLペプチド (0.29 mg/ml)を陽性コントロールとして役立てた。２４時間後、細胞をRPMI−培地 (RPMI 1640培地のみ)で１回、洗浄し、1.5 % パラホルムアルデヒドを用いて２０分間、RTで固定した。細胞をRPMI−培地で１回、洗浄した後、50 mM NH4CLで６０分間、RTで反応停止させた。細胞をRPMI−培地で３回、洗浄した後、100μl RPMI＋／ウェル中に再懸濁させた。1×105個のRF33 細胞を50μlの量、加え、３６時間、３７℃でインキュベートした。100μlの培養上清を各ウェルから回収した。RF33細胞が培養上清中に放出したIL-2の存在を上述のように判定した。
【００９９】
実施例６：  樹状細胞（DC）表現型に対する細胞培養の効果
マウスDCは、骨髄細胞を GM-CSF、GM-CSF/IL-4、又はGM-CSF/TNF-αなどの成長因子と一緒に培養すると多数、得ることができる。培養時間や、用いる特定の成長因子の種類は、DCの成熟状態及びFcR発現プロフィールにとって重要である。50、51、52未熟DCは、（受容体を媒介した）抗原取り込みの上では効率的であり、共刺激性及びMHCクラスII分子の低／中間発現で特徴付けられる。DCが成熟すると共刺激性及びMHCクラスII分子が上方調節され、と同時に、外因性抗原の受容体媒介性取り込み能やプロセッシング能が下方調節される。25
【０１００】
GM-CSF、GM-CSF/IL-4、又はGM-CSF/TNF-αと一緒に培養したCD64-Tg 及び NTg DCの成熟状態及びFcR発現パターンを評価するために、細胞表面マーカの発現をフローサイトメトリで分析した。７日間の培養期間後、非接着性細胞及びゆるく接着した細胞（DC7）を、DC マーカ（即ちCD11c、及びDEC-205)、共刺激分子（即ち CD40、CD80、及びCD86)、MHC クラスＩＩ及びFcRの発現について染色した。GM-CSF/IL-4と一緒に培養されたDCは典型的なDC表現型を示したが、ヒトCD64発現は低かった（n=3、データは図示せず）。これはおそらくは、IL-4が骨髄系細胞上のCD64発現を下方調節するという事実に起因するものであろう。32,53GM-CSF又はGM-CSF/TNF-αを用いた培養プロトコルの結果、CD11c、及びDEC-205の発現に示されるような、特徴的なDC表現型をDCが持つこととなった。DC7は、CD86及びCD80 の発現が低い／中間の未熟な表現型を示した。しかしながら、GM-CSF/TNF-αDC7は、GM-CSF DC7よりも高いレベルでCD86及びMHCクラスIIを発現し、より成熟した表現型であることを示した。加えて、DC7は、GR-1及びF4/80などの骨髄系マーカを発現したが、B 細胞（図７Ａ、Ｂ) 又はT 細胞マーカは何ら発現しなかったことが見出された (n=4、データは図示せず）。GM-CSF 及びGM-CSF/TNF-α DC7 は両方ともヒトCD64を発現した。CD64発現はGM-CSF/TNF-α DC7の方が低かった（図７Ａ、Ｂ）。このことは、成熟ヒトDCはCD64発現を下方調節するという発見と一致している。54DCを９日間培養した場合（DC9）、 両方の培養プロトコルで、より成熟したDC表現型が現れ、共刺激性及びMHCクラスＩＩ分子の上方調節に反映された。
【０１０１】
未熟DCは、LPSなどの炎症性刺激により、成熟DCに成長するように惹起することができる。55ヒトCD64-Tg 及びNTg のGM-CSF 及びGM-CSF/TNF-α DC7 をLPSと一緒に２日間培養した場合の効果を検査した。GM-CSF (図７Ｃ) 及びGM-CSF/TNF-α DC の両者とも、共刺激性分子（例えばCD40、CD80及び CD86)、MHCクラスＩＩ、及びDC マーカ（即ちCD11c 及びDEC-205)の上方調節に反映されるように、成熟を示した。ヒトCD64発現は、成熟時に下方調節されることが判明した。
【０１０２】
実施例７：  MHC クラスＩＩ抗原提示能
DCの成熟状態が表現型だけでなく機能でも特徴付けられるため、DC7及びDC9のMHCクラスＩＩ抗原提示能を検査した。DCを過剰量のOVA (400μg/ml)と一緒にインキュベートして、液相抗原取り込み能及びその後のプロセッシング能を評価するか、又は、100 ng/ml OVA-IgGαOVA免疫複合体とインキュベートして、FcR媒介性 取り込み／プロセッシングを研究した。OVA抗原提示の読み取り値として、OVA特異的MHCクラスＩＩ限定D011.10 T細胞を用いた。OVAを高濃度で投与した場合には、ヒトCD64-Tg (図８）及びNTg (n=4、データは図示せず) のDC7 及びDC9 の両者が、OVAの液相惹起性内部移行及びプロセッシングを行うことができた。しかしながら、FcR媒介性 OVA取り込み、及びその後のMHCクラスＩＩ提示のレベルはDC9の方が著しく低かった。このことは、DC表現型がより成熟したものである（９日間培養した場合）と、受容体媒介性の取り込み及びプロセッシングが下方調節されることを示していた。
【０１０３】
GM-CSF/TNF-αと一緒に培養した場合には、MHCクラスＩＩ発現レベルは高くなった（図７）が、GM-CSF DC7は、 GM-CSF/TNF-α DC7よりもMHCクラスＩＩ抗原提示の上ではより効果的だった（図８）。このことは、FcR媒介性MHCクラスＩＩ抗原提示の効率が劣ることに反映されるように、TNF-αがDCの活性化及び機能的成熟を惹起する51という事実に起因するのかも知れない。GM-CSF及びGM-CSF/ TNF-α DC7 を用いて、ヒトCD64媒介性交差提示を詳細に研究した。
【０１０４】
実施例８：  CpG ODN がDC 細胞表面マーカに及ぼす効果
CpG ODN はDCの分化及び成熟に直接的な効果を示し、MHCクラスＩ限定ペプチド及び液相内部移行後の抗原の交差提示を向上させることができる。41CpG ODNがFcR惹起性抗原提示に及ぼす効果を研究するために、CpG ODNが、GM-CSF 及びGM-CSF/TNF-α未熟DCの細胞表面マーカ発現に及ぼす効果を分析した。DC7 をCpG ODNと一緒に２４時間、インキュベートし、細胞表面マーカの発現レベルを調べた。共刺激性及び MHCクラスＩＩ分子の上方調節と、ヒトCD64及びマウス CD32/CD16 などのFcRの下方調節に反映されるように（図９）、CpG ODN はDC7を活性化した。DEC-205分子はCpG ODN によってDC上で下方調節された（図９）が、他方、LPSでそれが上方調節された（図７Ｃ）。この発見は、DCの CpG ODN 及びLPSに対する感受性が異なるという事実に起因するかも知れない。41
【０１０５】
CpG ODNによる刺激は、GM-CSF DCに比較して、GM-CSF/TNF-α DCの共刺激性及びMHCクラスＩＩマーカ発現により大きな効果を持っていた（図９）。
【０１０６】
実施例９：  CpG ODN はFcR標的化免疫複合体の交差提示を向上させる
CpG ODN がFcR惹起性交差提示に及ぼすアジュバント効果を研究した。ヒトCD64-Tg 及びNTg のGM-CSF 又は GM-CSF/TNF-α DC7を様々な濃度のOVA-IgGαOVA免疫複合体と一緒に、CpG ODNを加えて、又は加えずに、インキュベートした。２４時間後、DCを固定し、MHCクラスＩ限定OVA特異的RF33 T細胞を３６時間、加えた。IL-2の放出をCTLL-2増殖検定を用いて評価した。免疫優性OVAペプチドSIINFEKLを、MHCクラスＩ限定抗原提示能に関する陽性コントロールとして役立てた。ペプチドと一緒にインキュベートすると、ヒトCD64-Tg GM-CSF 及びGM-CSF/TNF-α（図１０Ａ）及びNTgのDC7は、同様な3H-チミジン取り込みレベルを示した。加えて、これらのDCをCpG ODN で刺激すると、ペプチド提示が明らかに向上した（図１０Ａ）。ヒトCD64-Tg GM-CSF 及び GM-CSF/TNF-α DC7 (図１０Ｂ)の両方及びNTg DC7が、低濃度でもOVA複合体を交差提示する上で効率的であることが見出された。このプロセスは、DCをCpG ODNで刺激した場合に２倍乃至４倍、向上した。マーカ分析では、CpG ODNで刺激を受けたGM-CSF/TNF-α DC7が、より高いレベルの共刺激性分子を発現したことが示された（図９）。さらにGM-CSF/TNF-α DC7 をCpG ODN で刺激すると、OVAペプチドのMHCクラスＩ提示がより効率的となった。しかしながら、免疫複合体のFcR媒介性 MHCクラスＩ交差提示は、GM-CSF DC7に比較して低かった（図１０）。
【０１０７】
実施例１０：  CpG ODNはヒトCD64標的化抗原の交差提示を向上させる
ヒトCD64がOVAのDC媒介性交差提示を誘導する能力や、CpG ODN による刺激がこのプロセスに及ぼす効果を以下の通りに研究した。
【０１０８】
GM-CSF及びGM-CSF/TNF-α DC7はヒトCD64-Tgマウス及びNTg同腹仔の骨髄から産生させた。OVAをヒトCD64に標的指向させるため我々は２つのアプローチを採った。一番目として、ヒトCD64に対するモノクローナル抗体H22のsFvフラグメントをOVAに遺伝子的に連結した (22-OVA)。この分子は、この受容体の架橋なしに、OVAをヒトCD64の標的に設定するものである。二番目として、OVAをモノクローナル抗体H22の全IgGに化学的に架橋することで（22×OVA）、OVAをヒトCD64に標的指向させる、この受容体を架橋する分子を作製した。DC7 を22×OVA又は 22-OVAのいずれかと一緒に、CpG ODNを加えて、又は加えずに２４時間、インキュベートした。DCを固定した後、MHCクラスＩ限定OVA特異的RF33 T細胞と一緒に３６時間、インキュベートした。RF33T細胞によるIL-2産生のレベルをCTLL増殖で判断した。
【０１０９】
OVAのヒトCD64惹起性交差提示は、Tg GM-CSF DC7でも、又はGM-CSF/TNF-α DC7でも観察されなかった。しかしCpG ODNを添加した場合には、CpG ODNの刺激を受けたヒトCD64 Tg DC7の抗原提示能がNTg DC7に比較して高いことに反映されたように、ヒトCD64媒介性抗原提示に有意な増加が観察された（図１１）。22-OVA及び22×OVA の両方が交差提示を惹起したという事実は、ヒトCD64の架橋がこのプロセスにとって重要でないことを示した。さらに、GM-CSF/TNF-αが発現したCD64の方がより低レベルであり、より成熟した表現型を有していたが、ヒトCD64-Tg GM-CSF 及びGM-CSF/TNF-α DCは、22-OVA又は22×OVAの存在下で、OVA提示の上で同じような活性であった（図１１）。 これらの発見から、他の（マウス）FcRを標的化した抗原とは対照的に、ヒトCD64を特異的に標的化した抗原は、未熟及びより成熟したDCにおいて効率的な交差提示を惹起したことが示された。30
【０１１０】
結論
実施例６−１０に解説した研究は、ヒトCD64が、DCによる交差提示を惹起できること、そしてCpG ODN はこの交差提示を向上させることを示している。DCと同時培養した場合のCpG ODNは共刺激性分子の発現を向上させたが、in vitroでFcR DCの発現の下方調節を惹起した。CpG ODNはまた、MHCクラスＩ限定ペプチド提示も向上させたが、これは、CpG ODNがGM-CSF/T-αDCによるペプチド提示で最も大きな効果を示したように、表現型の成熟度と正に相関していた。これは、CpG ODN がMHCクラスＩ限定エピトープのアジュバントとして働くこと42、 そしてペプチド又はタンパク質で刺激したDCを CpG ODN処理すると、このDCのクラスＩ限定T細胞活性化能が向上すること、を示す文献データとも一致している。56
【０１１１】
CpG ODNはFcR発現レベルを下方調節したという事実にもかかわらず、OVA-IgGαOVA免疫複合体のFcR媒介性交差提示は、CpG ODN活性化時には２倍乃至４倍に上方調節された（図９）。FcR媒介性抗原提示は液相媒介性提示に比較して、１００倍乃至１０００倍効率的であることが報告されている。30実施例６−１０で解説した結果は、CpG ODN が、成熟を誘導（そして同時にFcRを下方調節する）するにもかかわらず、FcR媒介性交差提示プロセスをさらに向上させる能力を、初めて記載したものである。このように、CpG ODN による活性化は、DCベースのワクチン治療法を向上させることができる。
【０１１２】
潜在的なin vivo ヒトCD64標的化戦略を研究するために、 OVA をIgGリガンド結合ドメイン以外で標的化した。GM-CSF 又はGM-CSF/TNF-α DCのいずれを用いても、ヒトCD64惹起性交差提示は見られなかった。しかし、DCをCpG ODNで活性化した場合には、共刺激性分子の発現が上方調節され、抗原提示能の向上、ヒトCD64の発現の下方調節、効率的なヒトCD64媒介性交差提示が観察された。これらの発見は、ヒト骨髄系U937細胞においてCD64標的化抗原がMHCクラスＩ分子と一緒に共局在化すること36、 そして記載されたヒトCD64が、骨髄系THP-1細胞において前立腺特異抗原をMHCクラスＩ交差提示経路に標的指向させることができること59を示した先のデータと一致する。
【０１１３】
加えて、実施例６−１０で解説した研究から得られたデータは、ヒトCD64トランスジェニック・マウスモデルでヒトCD64を標的化したときに見られる、良く解説された強力な抗腫瘍応答及びワクチン応答35,60,61を裏付けるものである。
【０１１４】
ヒトCD64は、大規模な受容体架橋の必要なく、抗原を効率的に内部移行させる能力を示す。34,62実施例６−１０に示したデータは、さらに、このような架橋は交差提示にも不要であることも示している。このことから、ヒトCD64は交差提示機序に向けて比較的に容易に利用できることが分かる。
【０１１５】
DCは免疫応答の最も強力な惹起因子であり25,40、そしてMHCクラスＩ限定抗原提示経路を通じて外因性抗原を収束させる29,41ことができるという事実のおかげで、これらは新しい治療概念の開発にとって重要なツールとなる。実施例６−１０で解説した研究で得られたデータは、ヒトCD64がDC交差提示を惹起できること、そして CpG ODNがこの効果を向上させること、を裏付けている。さらにこのデータは、CD64の発現は骨髄系細胞に限られている（他のFcRファミリーのメンバーとは対照的に）ことを示している31。従って、CpG ODN をCD64標的化法と組み合わせると、従来のDCベースの免疫治療に対して、顕著な進展がもたらされる。
【０１１６】
同等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施例の同等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような同等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
【０１１７】
参考文献
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【０１１８】
引用による援用
ここで引用した全特許、係属中特許出願及び他の公開文献の全文を、引用をもってここに援用することとする。
【０１１９】
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施例の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、B細胞リンパ腫に対するマウスIgG2a誘導型免疫治療に及ぼすCpG ODNによる効果向上を示すグラフである。６匹のC3H/HeNマウスのグループに38C13 T3C腫瘍細胞を０日目に腹腔内接種した。最後に、マウスを１日１回、（５日目、７日目及び１０日目）に100μgのmAb (IgG1 又は IgG2a)のみか、20μgのCpG ODN 1826か、又は組合せで処理した。処理スケジュールを右側に示す。生存率を毎日記録した。同様な結果を、３つの個別の実験で得た。
【図２】図２Ａ及びＢは、CpG ODN のPMN hFcγRI (CD64)発現レベルに対する効果を示すグラフである。hFcγRI- Tg 及び NTg マウスを１用量の5、7.5、又は10μgのCpG ODN 1826で皮下的に処理し、生理食塩水(0.9% NaCl)で処理したマウスをコントロールとした。PMN上でのhFcγRI発現レベルを全血のFACS分析で判定した。Tgマウス、7.5μg CpG ODN 1826で処理したTgマウス、及びNTg マウスのPMN のhFcγRI発現レベルをパネルＡに示す。様々なCpG ODN濃度で処理したTgマウスのhFcγRJ発現レベルをパネルＢに示す。パネルＡでは、コントロールFITC標識マウス IgGを、NTgマウスの曲線と重ねた。実験を３回繰り返し、同様な結果を得た。
【図３】図３は、hFcγRI発現に対するCpG ODNの動態を示すグラフである。hFcγRI-Tg 及びNtg マウスに１用量の7.5μg CpG ODN 1826を皮下注射し、そして生理食塩水で処理したTgマウスをコントロールとした。hFcγRI発現レベルを連続５日間、全血のFACS分析で判定した。図示した時点でのhFcγRI発現レベルを示す。図１Ａにおいて、無関係のマウス IgG のレベルは、NTgマウスのレベルと同一であった。 同様な結果を３つの個別の実験で得た。
【図４】図４Ａ−Ｆは、白血球に対するCpG ODNのin vivoでの効果を示すグラフである。hFcγRI-Tg 及び NTg マウスを7.5μgの CpG ODN 1826で処理し、生理食塩水で処理したマウスをコントロールとした。全血をFACSにより、系譜特異的マーカ（材料及び方法の項を参照されたい）を用いて分析した。様々なパネルに示したデータは、顆粒球(A)、単球( B)、DC (C)、T 細胞 (D)、及びB細胞 (E)について、５つの連続する時点での細胞のパーセンテージを表す。加えて、マウス FcγRII/III の発現を、(F)、Tg＋生理食塩水（白抜き四角）、Tg＋ CpG ODN 1826 (塗りつぶした四角)、NTg＋生理食塩水（白抜き三角）、NTg＋CpG ODN 1826 (塗りつぶした三角)で判定した。同様な結果を３つの個別の実験で得た。
【図５】図５は、hFcγRI媒介性ADCCに対するCpG ODNの効果を示すグラフである。51Crで標識したSK-Br-3細胞を様々な濃度のBsAb MDX-H210 及び10μg/ml CpG ODN 1826 もしくは1982と一緒にインキュベートした。mAbである抗HER-2/neu mAb 520C9 (mIgG1; 2μg/ml)のない培地、又は CpG ODNのみ (1826 又は1982；10μg/ml)をコントロールとした。顆粒球数を増やすために、実験開始に先立ちTg 及び NTg マウスをG-CSF で３日間、処理した。判定はすべて三重にして行われ、同様な結果が３つの個別の実験で得られた。
【図６】図６は、hFcγRI指向性充実腫瘍免疫治療に対する CpG ODNの効果向上を示すグラフである。６匹のhFcγRITg 及びNTg マウスのグループに7.5μg CpG ODN 1826 を−１日目に皮下投与した。０日目にCMS7HE腫瘍細胞を右脇腹に皮下接種した。最後に、これらを１日２回（１−５日目、及び９−１３日目）に 10μg MDX-H210 又は100μl PBSで処理した。７日目に２回目の用量のCpG ODN 1826 を投与した。処理スケジュールを右側に示す。腫瘍体積を１週間に３回、測定し、動物を毒性について採点した。同様な結果を３つの個別の実験で得た。
【図７】図７Ａ−Ｃは、DC7細胞表面マーカ発現に対する培養条件の効果を示すグラフである。マウスCD64-Tg 及びNTg DC を７日間、GM-CSF (A)又は GM-CSF/TNF-α（B)のいずれかの存在下で培養した。DC7をさらに２日間、LPS (L)の存在下で培養して、DCの成熟を調べた (C)。特異的マーカの発現をフローサイトメトリで分析した。A及びBで、コントロールは白抜きの柱状グラフで示され、モノクローナル抗体（mAb）は塗りつぶした柱状グラフで示されている。Cでは、コントロールを塗りつぶした柱状グラフトして示し、そしてmAbを灰色の線（LPSなし）又は黒線（LPS有り）で示す。３つの実験のうちの１つを例示する。
【図８】図８は、DCのMHCクラスＩＩ抗原提示能を示すグラフである。GM-CSF又はGM-CSF/TNF-αのいずれかの存在下で７又は９日間培養したヒトCD64-Tg DCを過剰量のOVA (400μg/ml)、又はOVA-IgGαOVA複合体 (100 ng/ml)、及びOVA特異的MHC クラスＩＩ限定DO11.10 T細胞と一緒に２４時間、３７℃でインキュベートした。T細胞によるIL-2産生レベルをCTLL-2増殖検定で判定した。データは、複式判定値の平均値を４回の実験のうちの一代表例で表す。
【図９】図９は、DC細胞表面マーカ発現に対するCpG ODNの効果を示す。ヒトCD64-Tg DCを７日間、GM-CSF 又は GM-CSF/TNF-αの存在下で培養した。次に、CpG ODN (100μg/ml)を２４時間、加えた。様々なマーカの細胞表面発現をフローサイトメトリで分析した。図示のデータは３つの個別の実験の代表値であり、同一の結果が出た。
【図１０】図１０は、MHCクラスＩ提示に対するCpG ODN の効果を示す。ヒトCD64-Tg DCを７日間、GM-CSF 又はGM-CSF/TNF-αのいずれかの存在下で培養した。これらのDC を、124μg/ml SIINFEKL (A)か、又は様々な濃度のOVA-IgGαOVA免疫複合体のいずれかと一緒に、CpG ODN の存在下又は非存在下で２４時間、３７℃でインキュベートした。細胞を固定し、洗浄し、MHCクラスＩ限定 OVA特異的 RF33 T 細胞と一緒に２４時間、３７℃でインキュベートした。T細胞の放出したIL-2 をCTLL-2増殖検定で判定した。４つのうちの１つの実験を代表で示す。
【図１１】図１１は、ヒトCD64媒介性交差提示に対するCpG ODNの効果を示す。ヒトCD64-Tg 及びNTg DCを７日間、GM-CSF (A, B)又は GM-CSF/TNF-α（C, D）のいずれかの存在下で培養した後、22-OVA (遺伝子操作されたもの) (A, C)又は22×OVA (化学的に架橋したもの) (B, D)と一緒に、CpG ODNを加えて、又は加えずに、２４時間、３７℃でインキュベートした。細胞を固定し、洗浄し、MHCクラスＩ限定OVA特異的RF33 T 細胞と一緒に２４時間、３７℃でインキュベートした。T細胞の放出したIL-2をCTLL-2増殖検定で判定した。３つのうちの１つの実験を代表で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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