(57)【要約】本発明は、オートシーケンサーまたは生物情報工学ツールからピーク・データベースにピーク情報を抽出、収集し、データベース内でピーク情報を操作し、分析するための、新しいコンピュータ・プログラム製品に関するものである。
2005537460.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
位置とエリアで特徴付けられるピークの集合によって一般的に記述される、データ集合を高いスループットで分析するための方法。
【請求項２】
パラメータ・ファイルにしたがってピーク・データの集合を抽出、平滑化し、それらをデータファイルに保存するために生物情報工学ツールを用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ピークを表示する特定のプロファイルが作成されて分析されるようになっていることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ピーク・データベースが構築されることを特徴とする、請求項１〜請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ピーク・データベースが統計ツールによって分析されることを特徴とする、請求項１〜請求項４に記載の方法。
【請求項６】
予後判定基準または診断基準を決定するためにピーク・データベースの分析が用いられることを特徴とする、請求項１〜請求項５に記載の方法。
【請求項７】
予後判定基準および診断基準が、免疫病理学、がん治療、ＨＩＶ、感染症、または自己免疫疾患のような生理病理学の分野で用いられることを特徴とする、請求項１〜請求項６に記載の方法。
【請求項８】
方法が免疫レパートリーの分析のためのスループットの高い方法であることを特徴とする、請求項１〜請求項７に記載の方法。
【請求項９】
−ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含む生体サンプルで開始されることと、
−ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を精製することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、
−精製されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成すること、
−精製されたＤＮＡまたはｃＤＮＡに対し、たとえば免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体、可変領域（Ｖ）、結合領域（Ｊ）および定常領域（ｃ）のような抗原特異的受容体遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いることによって、ＰＣＲ法またはＳＤＡ法によってＤＮＡを増幅させること、
−増幅されたＤＮＡに対し、たとえば蛍光剤で標識されたＪまたはＣ特異的オリゴヌクレオチドによるランオフ伸長過程を行うことによって、検出のための標識の過程を行うこと、
−標識され、増幅された各ＤＮＡに対し、電気泳動分離がオートシーケンサー上で行われること、
−各電気泳動図について、標識され、増幅されたＤＮＡに対応する位置およびエリアを決定することでピークを同定することを含んでいる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標識され、増幅されたＤＮＡの読み込みに基づく分析方法が請求項１〜請求項８に記載の方法であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
コンピュータ・プログラム製品であり、
−コンピュータのストレージ・メディアと、
−生体分子用の分離技術によって生成された生データの分析をコンピュータが行うようにするための、コンピュータのストレージ・メディアに組み込まれたコンピュータ・プログラム・コード・メカニズムを含んでおり、該コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムが、
・少なくとも一つのデータベースから生データの第一集合と生データの第二集合を抽出するように構成された第一のコンピュータ・コード・デバイスと、
・生データの第一集合から第一の特徴に対応する第一の値を、生データの第二集合から第一の特徴に対応する第二の値を決定するように構成された第二のコンピュータ・コード・デバイスと、
・第一の値と第二の値を記憶装置に保存するように構成された第三のコンピュータ・コード・デバイスを有している、コンピュータのプログラム製品。
【請求項１３】
コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムがさらに、
−記憶装置から第一の値と第二の値を取り出し、第一の値と第二の値を、第二の記憶装置に保存されたユーザー設定に基づいてソートするように構成された第四のコンピュータ・コード・デバイスを有している、請求項１２に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項１４】
コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムがさらに、
−第四のコンピュータ・コード・デバイスによってソートされたように、第一の値と第二の値をグラフ表示するように構成された第五のコンピュータ・コード・デバイスを有している、請求項１３に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項１５】
コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムがさらに、
−生体分子用の分離技術によって生成された生データの第一集合と生データの第二集合の少なくとも一つを平滑化するように構成された第四のコンピュータ・コード・デバイスを有している、請求項１３に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項１６】
コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムがさらに、
−第一の値および第二の値の少なくとも一つをフォーマットするように構成された第五のコンピュータ・コード・デバイスを有している、請求項１３に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項１７】
コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムがさらに、
−生データの第一集合と生データの第二集合の少なくとも一つをパラメータ化するように構成された第四のコンピュータ・コード・デバイスを有している、請求項１２に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項１８】
コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムがさらに、
−生データの第一集合と生データの第二集合の少なくとも一つを分析するように構成された第四のコンピュータ・コード・デバイスを有している、請求項１２に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項１９】
コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムがさらに、
−第一の値および第二の値の少なくとも一つをエクスポートするように構成された第四のコンピュータ・コード・デバイスを有している、請求項１２に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項２０】
第一の特徴がピークを含む、請求項１２に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項２１】
生体分子用の分離技術がポリヌクレオチドのシーケンシングを含む、請求項１２に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項２２】
ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項２１に記載のコンピュータ・プログラム製品。
【請求項２３】
デバイスであり、
生体分子用の分離技術によって生成された生データを抽出するように構成された少なくとも一つのエクストラクタを含む装置であって、エクストラクタが、
−プロセッサと、
−プロセッサが読み込み可能な命令でエンコードされたコンピュータの読み込み可能なメディアを含んでおり、該命令がプロセッサによって実行されるとき、
・少なくとも一つのデータベースから生データの第一集合と生データの第二集合を抽出するように構成された抽出メカニズムと、
・生データの第一集合から第一の特徴に対応する第一の値を、生データの第二集合から第一の特徴に対応する第二の値を決定するように構成された、特徴決定メカニズムと、そして、
・第一の値と第二の値を保存するように構成された出力メカニズムを実装している装置。
【請求項２４】
システムであり、
−生体分子用の分離技術によって生成された生データのエントリーで満たされたデジタル・リポジトリと、
−プロセッサ、および、
−プロセッサの読み込み可能な命令でエンコードされたコンピュータの読み込み可能なメディアを含むシステムであって、該命令がプロセッサによって実行されるとき、
・デジタル・リポジトリから生データの第一集合と生データの第二集合を抽出するように構成された抽出メカニズムと、
・生データの第一集合から第一の特徴に対応する第一の値を、生データの第二集合から第一の特徴に対応する第二の値を決定するように構成された特徴決定メカニズムと、
・第一の値と第二の値を記憶装置に保存するように構成された出力メカニズムを実装しているシステム。
【請求項２５】
システムであり、
−生体分子用の分離技術によって生成された生データのエントリーで満たされたデジタル・リポジトリと、
−プロセッサ、および、
−プロセッサの読み込み可能な命令でエンコードされたコンピュータの読み込み可能なメディアを含むシステムであって、該命令がプロセッサによって実行されるとき、
・ネットワーク経由でデジタル・リポジトリから生データの第一集合と生データの第二集合を抽出するように構成された抽出メカニズムと、
・生データの第一集合から第一の特徴に対応する第一の値を、生データの第二集合から第一の特徴に対応する第二の値を決定するように構成された特徴決定メカニズムと、
・第一の値と第二の値を記憶装置に保存するように構成された出力メカニズムを実装しているシステム。
【請求項２６】
ネットワークの少なくとも一部がインターネット・プロトコル・ネットワークである、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
ネットワークの少なくとも一部がインターネットである、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号が生体分子用の分離技術によって生成された、抽出された生データを含んでいる、コンピュータのデータ信号。
【請求項２９】
搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号が、
−平滑化された生データを含んでおり、生データが生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる、コンピュータのデータ信号。
【請求項３０】
搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号が、
−フォーマットされた生データを含み、生データが生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる、コンピュータのデータ信号。
【請求項３１】
搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号が、
−パラメータ化された生データを含み、生データが生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる、コンピュータのデータ信号。
【請求項３２】
搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号が、
−分析された生データを含み、生データが生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる、コンピュータのデータ信号。
【請求項３３】
搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号が、
−エクスポートされた生データを含み、生データが生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる、コンピュータのデータ信号。
【請求項３４】
ソフトウェア・パッケージであり、前記ソフトウェア・パッケージがＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージ２．０．１で具現化されているソフトウェア・パッケージ。
【請求項３５】
ａ）生体サンプルを単離すること、
ｂ）生体サンプルから生データを抽出すること、そして
ｃ）ＩＳＥＡｐｅａｋｓを用いて生データをデータベースに集めることを含む方法。
【請求項３６】
前記生体サンプルが、培養培地、電気泳動サンプル、クロマトグラフィーカラム、ブロット膜、遠心分離管、またはマイクロアレイ・チップで構成されるグループから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体サンプルが一つまたはそれ以上の生体分子を含んでいる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体分子が、無傷細胞、細胞物質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質で構成されるグループから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体分子が標識される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記単離が、遠心分離、沈降、回分吸着、クロマトグラフィー、電気泳動、およびマイクロアレイ・チップで構成されるグループから選択される技術である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記抽出が生物情報工学ツールを用いることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記生物情報工学ツールが、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）、ＩＭＭＵＮＯＳＣＯＰＥ（登録商標）、ＧＥＮＯＴＥＳＴＥＲ（登録商標）、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（登録商標）、ＥＡＧＬＥＳＩＧＨＴ（登録商標）、ＱＵＡＮＴＩＴＹＯＮＥ（登録商標）、およびＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹ  ＳＵＩＴＥ（登録商標）で構成されるグループから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
さらに、ＩＳＥＡｐｅａｋｓを用いて前記生データを分析することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
診断または予後判定アプリケーション用のデバイスであり、
（ａ）ＴＣ受容体または免疫グロブリンのレパートリーを記述するためのオリゴヌクレオチドの集合と、
（ｂ）ＴＣ受容体または免疫グロブリンのレパートリーのデータの参照データベースと、そして、
（ｃ）分析すべきサンプルから結果を得るための、書かれた、または情報化されたガイドラインを含むデバイス。
【請求項４５】
生体サンプルがほ乳類から単離される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
コンピュータ・プログラム一覧の参照用補遺
コンピュータ・プログラム一覧補遺がコンパクト・ディスク読み出し専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）に三部（それぞれコピー１．１、コピー１．２、コピー１．３と標識）で保存されている。コンピュータ・プログラム一覧補遺の全内容をここで参照記号によって統合する。
【０００２】
コンピュータ・プログラム一覧補遺の三部のファイルのそれぞれは、２００３年７月１日に作成され、それぞれが以下のファイルを含んでいる。
【０００３】
名称  サイズ  ファイル・タイプ  更新日
Ａｄｍｉｎ  ４９ＫＢ  Ｔｅｘｔ  ２００２年７月１日
ＣＡｐｐＦｉｌｅ．ｃｐ  ７ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月５日
ＣＡｐｐＦｉｌｅ．ｈ  ３ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年３月３０日
ＣＡｐｐｌｅＳｃｒｉｐｔ．ｃｐ  ８ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＡｐｐｌｅＳｃｒｉｐｔ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＧｅｌ．ｃｐ  ６ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年８月１６日
ＣＧｅｌ．ｈ  ４ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＩＳＥＡｐｅａｋｓＡｐｐ．ｃｐ  １９ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月７日
ＣＩＳＥＡｐｅａｋｓＡｐｐ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＩＳＥＡｐｅａｋｓＡｐｐ．ｐｐｏｂ  ０ＫＢ  ＰＰＯＢ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月４日
ＣＩＳＥＡｐｅａｋｓＡｐｐ．ｒｓｒｃ  ０ＫＢ  ＲＳＲＣ  ｆｉｌｅ  ２００１年６月１９日
ＣＩＳＥＡｐｐ．ｃｐ  １１ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年４月２０日
ＣＩＳＥＡｐｐ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年３月２７日
Ｃｏｍｍｏｎ．ｐｐｏｂ  ０ＫＢ  ＰＰＯＢ  ｆｉｌｅ  ２０００年１１月１０日
Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ．ｈ  ５ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００２年６月２０日
Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ２４ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＣＯｕｔＰｕｔＤｏｃ．ｃｐ  ５ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年３月２７日
ＣＯｕｔＰｕｔＤｏｃ．ｈ  ３ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＰｉｃｔＰｌａｃｅｓ．ｃｐ  ８ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年８月１０日
ＣＰｉｃｔＰｌａｃｅｓ．ｈ  ３ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＰｒｅｆＦｉｌｅ．ｃｐ  ４ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年３月１日
ＣＰｒｅｆＦｉｌｅ．ｈ  １ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＲｕｎ．ｃｐ  ３４ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月７日
ＣＲｕｎ．ｈ  ３ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＴｅｘｔＤｏｃｕｍｅｎｔ．ｃｐ  ９ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＴｅｘｔＤｏｃｕｍｅｎｔ．ｈ  １ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＴｅｘｔＶｉｅｗ．ｃｐ  ２ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＣＴｅｘｔＶｉｅｗ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＤａｔａＡｎａｌｙｓｅｒ  ２３７ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＤａｔａＦｏｒｍａｔｅｒ  ８３ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＤａｔａＰａｒａｍｅｔｅｒ  ５５ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＤａｔａＵｔｉｌｉｔｙ  ６６ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＤＥＡｐｐ．ｐｐｏｂ  ０ＫＢ  ＰＰＯＢ  ｆｉｌｅ  ２０００年１２日２２日
ＤＥＡｐｐ．ｒｓｒｃ  ０ＫＢ  ＲＳＲＣ  ｆｉｌｅ  ２００１年６月１９日
ＤＳＡｐｐ．ｐｐｏｂ  ０ＫＢ  ＰＰＯＢ  ｆｉｌｅ  ２０００年１０月１９日
ＤＳＡｐｐ．ｒｓｒｃ  ０ＫＢ  ＲＳＲＣ  ｆｉｌｅ  ２００１年６月１９日
ＦｒｍＡｂｏｕｔ  ２２ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＦｒｍＤＦＰｒｅｆ  ２２ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＦｒｍｆｉｌｅＩｎｆｏ  ２１ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＦｒｍＬｉｃｅｎｃｅ  ２３ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＦｒｍＭａｉｎＭｅｎｕ  ２４ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＦｒｍＮｅｗＦｉｌｅ  ２１ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＦｒｍＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ２５ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＦｒｍＹｅｓＮｏ  ２０ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＧＳＥｘｐｏｒｔｓｃｒｉｐｔ  ２５ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＧＳＰｅａｋ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＧＳＰｒｏｆｉｌｅ．ｃｐ  ３ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＧＳＰｒｏｆｉｌｅ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＧＵＩ＿Ｍａｃｒｏｓ  ７６ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
ＩＳＥＡｐｐ．ｐｐｏｂ  ０ＫＢ  ＰＰＯＢ  ｆｉｌｅ  ２００１年３月２７日
ＩＳＥＡｐｐ．ｒｓｒｃ  ０ＫＢ  ＲＳＲＣ  ｆｉｌｅ  ２００１年６月１９日
ＩＳＰｅａｋ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＩＳＰｒｏｆｉｌｅ．ｃｐ  １５ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＩＳＰｒｏｆｉｌｅ．ｈ  ３ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＭｙＦｉｌｅＵｔｉｌｉｔｉｅｓ．ｃｐ  １８ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年８月１０日
ＭｙＦｉｌｅＵｔｉｌｉｔｉｅｓ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＭｙＵｔｉｌｉｔｉｅｓ．ｃｐ  ５ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月６日
ＭｙＵｔｉｌｉｔｉｅｓ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月５日
Ｐｅａｋ．ｈ  １ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月５日
ＰｉｃｔＰｌａｃｅ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
ＰｒｉｎｔｉｎｇＣｏｎｓｔａｎｔｓ．ｈ  １ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２０００年１０月５日
Ｐｒｏｆｉｌｅ．ｃｐ  ２１ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月１３日
Ｐｒｏｆｉｌｅ．ｃｐ．ｏｌｄ  １８ＫＢ  ＣＰ  ｆｉｌｅ  ２００１年３月１日
Ｐｒｏｆｉｌｅ．ｈ  ７ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００２年２月５日
Ｔｈｉｓｗｂｋ  ２１ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ  ９４ＫＢ  ＴＥＸＴ  ２００２年７月１日
Ｗｅｌｌ．ｈ  ２ＫＢ  Ｈ  ｆｉｌｅ  ２００１年１月２９日
【０００４】
本発明は、オートシーケンサーまたは生物情報工学ツールからピーク・データベースにピーク情報を抽出、収集し、データベース内でピーク情報を操作し、分析するための新しいコンピュータ・プログラム製品に関するものである。
【背景技術】
【０００５】
酵母（『Ｎａｔｕｒｅ』１９９７、３８７、補遺３−１０５）、ヒト（Ｖｅｎｔｅｒ他『Ｓｃｉｅｎｃｅ』２００１、２９１、１３０４−１３５１）、Ｃ．エレガンス（『Ｓｃｉｅｎｃｅ』１９９８、２８２、２０１２−８）、コメ（Ｊ．Ｙｕ他『Ｓｃｉｅｎｃｅ』２００２、２９６、７９、および、Ｓ．Ａ．Ｇｏｆｆ他『Ｓｃｉｅｎｃｅ』２００２、２９６、９２）を含むいくつかのゲノム・シーケンシング・プロジェクトによる近年の成果、ならびに進行中のシーケンシングの取り組みは、膨大なＤＮＡシーケンスの情報を生成した。これらのＤＮＡシーケンスは基礎的な「生命のメッセージ」をコードしている。しかし、ＤＮＡシーケンスがコードしている膨大な数の遺伝子とタンパク質の目録を作成し、調べることにより、細胞生物学、医薬品開発、そして治療方針に対する新たな知見を提供できる。
【０００６】
したがって、大量のゲノム・シーケンス・データを消化するために多くの新たな分析方法が開発されてきており、ここにはトランスクリプトーム、プロテオーム、そして代謝産物の分析も含まれる。タンパク質を対象とするスループットの高い分析およびその他の方法は、新情報の要因をタンパク質に求め、その他の巨大なデータ集合との重要なつながりを作成する。このゲノム情報によって明らかにされた可能性を実現するためには、多くの挑戦が行われなければならない。これらの中には、生のＤＮＡおよびＲＮＡのシーケンス・データを指標付けし、カタログ化すること、遺伝子の同定とそれらの発現の制御、タンパク質活性およびタンパク質−タンパク質、タンパク質−リガンドまたはタンパク質−ＤＮＡ／ＲＮＡの相互作用の解析がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般的に用いられるそのような方法は、ＤＮＡオートシーケンサーである。ＤＮＡオートシーケンサーは、ＤＮＡ断片の長さを測定するために幅広い応用において用いられており、該応用とは、ＤＮＡシーケンシング、マイクロサテライト法、一塩基多型法、制限断片長多型法または増幅断片長多型法、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型法、遺伝子発現の定量化および免疫受容体の多様性の分析である。これらの応用すべてが生データ（ピーク・エリアおよびヌクレオチドの長さ）へのアクセスを必要とする。生データはレーンあたり一ファイルに保存されるので、研究によって急速に数百ものファイルが生み出される。しかしながら、分析されたサンプル数が増えるにつれ、この生データを広範囲で効果的に取り出すことを可能にする、現状で使用可能なツールはない。
【０００８】
したがって、オートシーケンサーによって提供される広大な量の生データを取り扱うための新しいプログラムに対する決定的な必要性が残っているのである。さらに、この生データを効果的に取り出すための新しいプログラムに対する必要性が残っている。またさらに、広大な量の生データを分析するための新しいプログラムに対する必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの目的は、データのスループットの高い分析のための方法を提供することである。一つの実施態様は、パラメータ・ファイルにしたがってピーク・データの集合を抽出および／または平滑化し、それらをデータファイルに保存するための生物情報工学ツールを用いる方法である。さらなる実施態様では、ピークを示す特徴的なプロファイルを作成し、分析することができる。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、データベースを構築する方法である。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は、統計ツールによってデータベースを分析する方法である。一つの実施態様は、予後判定基準または診断基準を決定する方法である。さらなる実施態様では、予後判定基準および診断基準は、免疫療法、がん治療、ＨＩＶ、感染症、および／または自己免疫疾患のような生理病理学の分野で用いられる。
【００１２】
本発明のもう一つの目的は、免疫レパートリーを分析するためのスループットの高い方法である。
【００１３】
本発明のもう一つの目的は、生体サンプルからポリヌクレオチドの断片を精製することを含む、免疫レパートリーを分析するためのスループットの高い方法であり、該方法は、ポリヌクレオチド断片、精製されたポリヌクレオチドからのポリヌクレオチドの合成、ポリヌクレオチドの増幅を含む。ある実施態様では、ポリヌクレオチドはＰＣＲ法またはＳＤＡ法によって増幅される。さらなる実施態様は検出のためにポリヌクレオチドを標識することに関する。もう一つの実施態様は、ポリヌクレオチドを分離させること、分離マトリクスにおけるそれらの位置と、標識されたポリヌクレオチドに対応するエリアを測定することでピークを同定することに関する。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、
ａ）生体サンプルを単離することと、
ｂ）生体サンプルから生データを抽出すること、そして、
ｃ）ＩＳＥＡｐｅａｋｓを用いて生データをデータベースに集めることを含む方法である。
【００１５】
上記の目的は、以下の本発明のさらなる目的にしたがって達成し、実行することができる。
【００１６】
本発明のもう一つの目的はコンピュータ・プログラム製品であり、該製品は、
−コンピュータのストレージ・メディアと、
−コンピュータが生体分子用の分離技術によって生成された生データの分析を行うための、コンピュータのストレージ・メディアに組み込まれた、コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムを含んでおり、該コンピュータ・プログラム・コード・メカニズムは、
・少なくとも一つのデータベースから、生データの第一集合と生データの第二集合を抽出するように構成された、第一のコンピュータ・コード・デバイスと、
・生データの第一集合から第一の特徴に対応する第一の値を、生データの第二集合から第一の特徴に対応する第二の値を決定するように構成された、第二のコンピュータ・コード・デバイスと、
・第一の値および第二の値を記憶装置に保存するように構成された、第三のコンピュータ・コード・デバイスを有している。上記の目的はこれらのさらなる実施態様と組み合わせて実行してもよい。一つの実施態様は、記憶装置から第一の値および第二の値を取り出し、第二の記憶装置に保存されたユーザー設定に基づいて、第一の値および第二の値をソートするように構成されたコンピュータ・コード・デバイスである。一つの実施態様は、第四のコンピュータ・コード・デバイスによってソートされた第一の値および第二の値のグラフ表示を作成するように構成されたコンピュータ・コード・デバイスである。一つの実施態様は、生体分子用の分離技術によって生成された生データの第一集合および生データの第二集合の少なくとも一つを平滑化するように構成されたコンピュータ・コード・デバイスである。一つの実施態様は、第一の値および第二の値の少なくとも一つをフォーマットするように構成されたコンピュータ・コード・デバイスである。一つの実施態様は、生データの第一集合および生データの第二集合の少なくとも一つをパラメータ化するように構成されたコンピュータ・コード・デバイスである。一つの実施態様は、生データの第一集合および生データの第二集合の少なくとも一つを分析するように構成されたコンピュータ・コード・デバイスである。一つの実施態様は、第一の値および第二の値の少なくとも一つをエクスポートするように構成されたコンピュータ・コード・デバイスである。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、生体分子用の分離技術によって生成された生データを抽出するように構成されている、少なくとも一つのエクストラクタを具備するデバイスであり、該エクストラクタは、
−プロセッサと、
−プロセッサの読み込み可能な命令にエンコードされている、コンピュータの読み込み可能なメディアを含んでおり、該命令は、プロセッサによって実行されるとき、
・少なくとも一つのデータベースから生データの第一集合と生データの第二集合を抽出するように構成された抽出メカニズムと、
・生データの第一集合から第一の特徴に対応する第一の値を、生データの第二集合から第一の特徴に対応する第二の値を決定するように構成された特徴決定メカニズムと、そして、
・第一の値と第二の値を記憶装置に保存するように構成された出力メカニズムを実装している。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は、
−生体分子用の分離技術によって生成された生データのエントリーで満たされたデジタル・リポジトリと、
−プロセッサと、そして、
−プロセッサの読み込み可能な命令にエンコードされている、コンピュータの読み込み可能なメディアを具備するシステムであり、該命令は、プロセッサによって実行されるとき、
・デジタル・リポジトリから生データの第一集合と生データの第二集合を抽出するように構成された抽出メカニズムと、
・生データの第一集合から第一の特徴に対応する第一の値を、生データの第二集合から第一の特徴に対応する第二の値を決定するように構成された特徴決定メカニズムと、そして、
・第一の値および第二の値を記憶装置に保存するように構成された出力メカニズムを実装している。
【００１９】
本発明のもう一つの目的は、
−生体分子用の分離技術によって生成された生データのエントリーで満たされたデジタル・リポジトリと、
−プロセッサと、そして
−プロセッサの読み込み可能な命令にエンコードされているコンピュータの読み込み可能なメディアを具備するシステムであり、該命令は、プロセッサによって実行されるとき、
・ネットワークを介してデジタル・リポジトリから、生データの第一集合と生データの第二集合を抽出するように構成された抽出メカニズムと、
・生データの第一集合から第一の特徴に対応する第一の値を、生データの第二集合から第一の特徴に対応する第二の値を決定するように構成された特徴決定メカニズムと、そして、
・第一の値と第二の値を記憶装置に保存するように構成された出力メカニズムを実装している。
【００２０】
本発明のもう一つの目的は、搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号は、生体分子用の分離技術によって生成された、抽出された生データを含んでいる。
【００２１】
本発明のもう一つの目的は、搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号は平滑化された生データを含んでおり、該コンピュータのデータ信号において、生データは生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる。
【００２２】
本発明のもう一つの目的は、搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号はフォーマットされた生データを含んでおり、該コンピュータのデータ信号において、生データは生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる。
【００２３】
本発明のもう一つの目的は、搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号はパラメータ化された生データを含んでおり、該コンピュータのデータ信号において、生データは生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号は分析された生データを含んでおり、該コンピュータのデータ信号において、生データは生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる。
【００２５】
本発明のもう一つの目的は、搬送波として具現化されたコンピュータのデータ信号であり、前記コンピュータのデータ信号はエクスポートされた生データを含んでおり、該コンピュータのデータ信号において、生データは生体分子用の分離技術によって生成されたデータを含んでいる。
【００２６】
本発明のもう一つの目的はソフトウェア・パッケージであり、ここで前記ソフトウェア・パッケージは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ  Ｐａｃｋａｇｅのバージョン２．０．１によって具現化されている。
【００２７】
上記の目的は本発明のいくつかの側面を強調している。本発明の追加の目的、特徴、および実施態様は、以下の本発明の詳細な説明で明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明のより完全な把握および付随する本発明の多くの利点は、本発明の同一物が下記の詳細な説明に付属の以下の図面を参照することによって、よりよく理解されるので、容易に理解されるものである。
【００２９】
図１は、コンピュータ・システム１１０１である。
【００３０】
図２は、ＣＴＲ、ＣＭ−、およびＣＭ＋マウスの典型的なＰＢＬのレパートリーである。ｃＤＮＡは、対照のマウス（ＣＴＲ）、神経兆候を伴わずに感染したマウス（ＣＭ−）およびＣＭを伴って感染したマウス（ＣＭ＋）のＰＢＬから得た。ＢＶ−ＢＣのＣＤＲ３スペクトラタイピングは、ＢＶ特異的プライマーとＢＣ特異的プライマーとの組み合わせでのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって行った。蛍光性ＢＣ特異的プライマーでのランオフの後、ＰＣＲ産物はＤＮＡオートシーケンサー上でサイズによって分離された。シーケンシング・ゲルはＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ製品によって分析した。典型的なサンプルが表示されている。横軸は、１０個のアミノ酸のＣＤＲ３断片を中心にしたヌクレオチドのサイズを示し、縦軸は、任意の単位における蛍光性の強さを示している。
【００３１】
図３では、判別分析によってＣＭ＋脾臓、ＣＭ−ＰＢＬ、およびＣＭ−脾臓のＢＶ−ＢＣレパートリーからＣＭ＋ＰＢＬが分離される。判別分析は、主成分分析で得られた変数の新しい集合について行われた。二変数グラフは二つの判別関数の値を示している。判別関数はグループを分離しようとする変数の一次結合である。Ｆ１からＦ５は各判別関数を表し、該判別関数は、関連づけられた固有値によって降順でソートされている。サンプル（８個のＣＴＲのＰＢＬ、６個のＣＴＲの脾臓、１０個のＣＭ−のＰＢＬ、８個のＣＭ−の脾臓、１３個のＣＭ＋のＰＢＬおよび１０個のＣＭ＋の脾臓）は、二変数プロットに示されているが、ＤＡがサンプルをうまくグループ化するために、ほとんど見られない。中心群に集中した信頼楕円（０．９５）は重ねられている。各群の密度の正規曲線は対角線に示されている。縦軸および横軸は、各関数に対する基準得点を示している。Ｆ４およびＦ５の密度の正規曲線は、群が十分に分離せず、これらの関数の有意性のないものからなることを表している。
【００３２】
図４では、ＣＭ＋のＰＢＬのレパートリーは、ＣＭ−のＰＢＬまたは脾臓のレパートリーより顕著に摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）が起こり、個別にクラスタを形成することができる。（ａ）ＢＶ−ＢＣの摂動（ＤＢＶ−ＢＣ）は、ＣＴＲ脾臓群を対照として用いて、ＩＳＥＡｐｅａｋｓで計算した。ＤＢＶ−ＢＣサンプルの平均（μＤＢＶ−ＢＣ）とその標準誤差が、ＣＭ＋、ＣＭ−およびＣＴＲマウスのＰＢＬおよび脾臓について示されている。ＤＢＶ−ＢＣは基準のレパートリーと同一の０から、完全に摂動が起こった１００までを範囲としている。（ｂ）ＤＢＶ−ＢＣに対して、ｋ＝４およびｋ＝３でのｋ平均クラスタ化によって得られたサンプルのクラスタの概略表示。各サンプルのＢＶ−ＢＣの摂動は、群成分の先行知識なしで分析された。ｋ＝５またはｋ＝６については、ＣＭ＋ＰＢＬサンプルは二つのクラスタに分裂した。（ｃ）ＰＢＬサンプル（６個のＣＴＲ、５個のＣＭ−および６個のＣＭ＋）のＢＶ−ＢＪレパートリーは、ＤＢＶ−ＢＪデータに対して、ｋ＝３でのｋ平均クラスタ化によって正しくグループ化された。
【００３３】
図５は、ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅおよび摂動の分析によって同定した多発性の拡張のＢＶ−ＢＪのＣＤＲ３プロファイルである。ＰＢＬのｃＤＮＡは、ＢＶ８．１またはＢＶ２特異的プライマーとＢＣ特異的プライマーで増幅した。ＰＣＲ産物はそれから、適切なＢＪ特異的プライマーでのランオフにかけた。生成物はオートシーケンサー上で分離させ、ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅとＩＳＥＡｐｅａｋｓで分析した。組み合わせが分析されたすべてのＰＢＬサンプルが示されている。横軸はヌクレオチドのサイズを示し、縦軸は任意の単位における蛍光性の強さを示している。
【００３４】
図６はＩＳＥＡｐｅａｋｓのアーキテクチャとデータのフローチャートである。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのモジュールと特殊ファイルは陰をつけた長方形で指示されている。
【００３５】
図７は、ＩＳＥＡｐｅａｋｓによるピークの平滑化と質の検査である。（Ａ）Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ製品によって供給されたヒトのＢＶ４−ＢＣを増幅したもののＣＤＲ３プロファイルである。九つのピークは肉眼で確認できる。（Ｂ）データ・エクストラクタで抽出した後（Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅの生のピーク・データ）、そしてデータ・スムーザーの三つのフィルタを適用した後で得られたピークのヒストグラムである。フィルタリング後、ピークはＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのプロファイルで見られるものに対応している。（Ｃ）データ・フォーマッターのファイルに現れる各フィルタを通した後の、このＢＶ４−ＢＣプロファイルのピーク・データの表である。データ・フォーマッターは薄い灰色で隣接するピークを、濃い灰色で不明瞭なピークを、中間的な灰色でメイン・ピークを、そして、ｍＴｈｅｏｒｅｔｉｃＬｅｎｇｔｈが要因だと考えられる第一のピーク（ここでは１９２ｎｔ）を太字で強調している。ＩＳＥＡｐｅａｋｓが色を用いることに注意すべきである。この例では、データ・スムーザーは最終的にすべての問題を解決した。すなわち、各ピークは対立のない理論的な長さに要因があると考えられるのである。
【００３６】
図８は、ＢＶ−ＢＣレパートリーにしたがったサンプルの分離である。判別分析は、主成分分析で得られた変数の新たな集合に対して行われた。二変数グラフは二つの判別関数でサンプルの値を示している。判別関数は、群を分離させようとする変数の一次結合である。Ｆ１からＦ３は、各判別関数を表し、該判別関数は関連づけられた固有値によって降順でソートされている。最初の二つの関数は統計的に有意であり、三つの群だけが分離されうること（ｐ＜０．０１）を示している。各サンプルは、二変数プロットで示されるが、ＤＡがサンプルをうまくグループ化するためにほとんど見られない。０．９５信頼楕円は中心群に集中し、重なっている。各群の密度の正規曲線は対角線に示されている。縦軸および横軸は各関数に対する基準得点を示している。Ｆ３の密度の正規曲線は、群がうまく分離せず、この関数の有意性のないもので構成されていることを表している。サンプル数は以下の通りである。８個のＣＴＲのＰＢＬ、６個のＣＴＲの脾臓、１０個のＨＰのＰＢＬおよび８個のＨＰの脾臓。
【００３７】
図９は、ＢＶ−ＢＣの摂動の表示である。各ＢＶ断片（横軸）と各サンプル（縦軸）に対するＢＶ−ＢＣの摂動は、カラー・コードされた。マウスのＩＤは三列目に指示されている。ＴＣＲＢの摂動は、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品で計算され、表示されている。コード化は以下の通りである。薄い灰色（ＤＢＶ−ＢＣ＜５）、中間的な灰色（＜１０）、濃い灰色（＜２０）、ピンク（＜２５）、赤（＜３０）、濃い赤（＜５０）、黒（＜１００）。「ｅｘｃｌ」は排除された組み合わせを意味し、該組み合わせでは再生された信号が弱すぎた。
【００３８】
図１０は、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡによって誘発されたＴＣＲＢレパートリーの摂動である。（Ａ）高寄生虫血症におけるＢＶ−ＢＣレパートリーの摂動（ＤＢＶ−ＢＣ）である。ＤＢＶ−ＢＣは、ＣＴＲの脾臓群を対照として用いて、ＩＳＥＡｐｅａｋｓで計算した。ＤＢＶ−ＢＣサンプルの平均（μＤＢＶ−ＢＣ）とその標準誤差が、ＨＰとＣＴＲのマウスのＰＢＬおよび脾臓について表されている。ＤＢＶ−ＢＣは、基準レパートリーと同一の０から、完全に摂動が起こった１００までを範囲としている。サンプル数は図８と同一である。（Ｂ）ＤＢＶ−ＢＣに対するｋ＝２でのｋ平均クラスタ化で得られたサンプルのクラスタの概略表示である。
【００３９】
図１１は、高寄生虫血症におけるＤＢＶ−ＢＪの摂動である。十一個のＰＢＬのサンプル（６個のＣＴＲおよび５個のＨＰ）のＢＶ−ＢＪレパートリーは、ＤＢＶ−ＢＪデータに対するｋ＝２でのｋ平均クラスタ化によって正しくグループ化された。
【００４０】
図１２は、ＨＰとＣＴＲのマウスのＰＢＬにおける、ＢＶ２−ＢＪ１．３とＢＶ２  ＢＪ１．１のＣＤＲ３プロファイルである。ＰＢＬのｃＤＮＡは、ＢＶ２特異的プライマーおよびＢＣ特異的プライマーで増幅した。ＰＣＲ産物はそれから、適切なＢＪ特異的プライマーでランオフにかけた。生成物はオートシーケンサー上で分離させ、ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅとＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージで分析した。横軸はヌクレオチドのサイズを示し、縦軸は任意の単位における蛍光性の強さを示している。
【００４１】
図１３はＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージの組織図である。
【００４２】
図１４はＩＳＥＡｐｅａｋｓのメイン・メニューである。
【００４３】
図１５はＩＳＥＡｐｅａｋｓの設定メニューである。
【００４４】
図１６はＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーである。
【００４５】
図１７はデータ・パラメータのＣＧＥＬワークシートである。
【００４６】
図１８はデータ・パラメータのＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳワークシートである。
【００４７】
図１９はデータ・フォーマッターのファイルである
【００４８】
図２０では、データ・アナライザーの「ｐａｒａ」ワークシートが、データ・アナライザーのさまざまなマクロをパラメータ化するために用いられている。
【００４９】
図２１はデータ・アナライザーの「Ｐｅａｋｓ」のワークシートである。
【００５０】
図２２は、「ＰｅｒｃｅｎｔＩｍｐｏｒｔ」マクロの結果を表すデータ・アナライザーのワークシートである。
【００５１】
図２３は「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ１」のマクロである。
【００５２】
図２４は「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ２」のマクロである。
【００５３】
図２５は「ＲＩＳ」のマクロである。
【００５４】
図２６は「ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅ」のマクロである。
【００５５】
図２７では、「ＤｒａｗＡｒｒａｙ」プロシージャがレパートリーにおける多様性の表示を作成している。
【００５６】
厳密に定義していなければ、ここで用いられるすべての技術用語および科学用語は、コンピュータ、ソフトウェア／プログラム・デザイン、生化学、細胞生物学、分子生物学、および医学における熟練した当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。
【００５７】
ここで説明されるものと類似または同等のすべての方法および材料は、ここで説明される適切な方法および材料を用いて、本発明の実施および検証で用いることができる。すべての出版物、特許出願、特許、およびここで言及されるその他の参考文献は全体として参照記号によって統合される。矛盾が起こる場合、定義も含め、本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法、および実施例はあくまで例示的であり、特定化されていなければ、制限する意図を持つものではない。
【００５８】
現代分子生物学の中心的なパラダイムでは、生物学的な情報はＤＮＡからＲＮＡ、そしてタンパク質へと流れる。この全体的なスキーマは強力な鋳型に基づく精度を生じさせ、鋳型に基づくこの精度においては、実験者は、他の生体分子の知識に基づいてこれらのクラスの生体分子のいずれもを操作することができる。さらに、シーケンスの相同性および類似性のパターンは、機能を予測し、進化の関係を明らかにするための道具である。近年のヒトのゲノム・シーケンシングの完了と、一般的に研究されている、他のいくつかの生物モデルにより、研究者たちは生体分子の複雑な相互関係を明らかにする先例のない位置にあり、これは、このパラダイムの枠組みにおいてだけではなく、遺伝子同定、タンパク質の発現、タンパク質活性の解析、そしてタンパク質−タンパク質の相互作用、タンパク質−リガンドの相互作用、タンパク質−薬物の相互作用、そしてタンパク質−ＤＮＡ／ＲＮＡの解析の枠組みにおいてでもある。したがって、研究者たちは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質の構造、活性、および関係を明らかにする、相当数の技術を考案してきた。
【００５９】
本発明は、部分的には、オートシーケンサーによって使用可能となった膨大な量の生データを扱うためのプログラムと、生データ抽出プログラムを提供するものである。オートシーケンサーおよび生データ抽出プログラムは、生体サンプルの成長培養、電気泳動、クロマトグラフィー、ブロット技術、遠心分離、ＤＮＡマイクロ・アレイ、またはタンパク質マイクロ・アレイもしくは糖残基アレイの結果をデジタル化するためにデザインされている。ピークの位置とエリアの性質は、これらの技術によって生み出される新しいデータの性質に依存し、周期的あるいは規則的である。たとえば、マイクロ・アレイの場合、ピークの位置はアレイ上のその座標（列ｘ行）に対応するものであり、つまり、ピーク・エリアは検出された信号の強さに対応するものである。
【００６０】
さらに、本発明は、オートシーケンサーおよび生データ抽出プログラムによって抽出されているこの生データを効果的に取り出すための新しいプログラムを提供するものである。
【００６１】
さらに、本発明は、オートシーケンサーおよび生データ抽出プログラムによって抽出された膨大な量の生データを分析するための新しいプログラムを提供するものである。
【００６２】
特に、生データ抽出プログラムおよびＤＮＡオートシーケンサーは、幅広い応用において、ＤＮＡ断片の長さを決定するために用いられており、該応用とはつまり、ＤＮＡシーケンシング、マイクロサテライト法、一塩基多型法、制限断片長多型法あるいは増幅断片長多型法、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型法、遺伝子発現の定量、および免疫受容体の多様性の分析である。これらの応用すべてが生データ（ピーク・エリアとヌクレオチドの長さ）へのアクセスを必要とする。生データはレーンあたり一ファイルに保存されているので、研究は急速に何百というファイルを生み出す。しかしながら、分析されるサンプル数が増えても、この生データを幅広く効果的に取り出すことを可能にする、現状で使用可能なツールはない。本出願人らはこれらの必要性を満たすためにＩＳＥＡｐｅａｋｓソフトウェア・パッケージを開発している。
【００６３】
一般的に、ＩＳＥＡｐｅａｋｓは生データを抽出し、それをシーケンシング・ゲルあたり一つのＥｘｃｅｌファイルに移動させる。そうして、さまざまなサンプルのデータはピーク・データベースに収集することができる。生データの抽出は、生物情報工学ツールから生成されたデータによって現状で使用可能であり、該ツールは、ＩＭＭＵＮＯＳＣＯＰＥ（登録商標）（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ他『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』１９９３、９０、４３１９−４３２３、フランス、パリのＩＮＳＥＲＭで利用可能）、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州フォスターシティ）およびＧＥＮＯＴＥＳＴＥＲ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、スウェーデン、ウプサラ）のプログラム、ピーク・エリアおよびサイズを判断するために用いられる最も一般的なパッケージを含む。成長培養、電気泳動サンプル、クロマトグラフィーカラム、ブロット膜、遠心分離管、またはマイクロアレイ・チップから生データを得るために用いられるプログラムはまた、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社、アメリカ合衆国ニュージャージー州ピスケートウェイ）、ＥＡＧＬＥＳＩＧＨＴ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州ラ・ホヤ）、ＱＵＡＮＴＩＴＹＯＮＥ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州ハーキュリーズ）、およびＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹ  ＳＵＩＴＥ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンタ・クララ）も含む。
【００６４】
したがって、本発明の範囲において、生データの一次資料は制限的ではない。模範的な一次資料は、成長培養、電気泳動サンプル、クロマトグラフィーカラム、ブロット膜、遠心分離管、またはマイクロアレイ・チップを含む。
【００６５】
一次資料から生データを抽出する手段は、技術またはリポートシステム、ならびにオートシーケンサーおよび用いられる生物情報工学ツールによってさまざまである。これらの技術は当該技術ではよく知られている。生体分子は標識することもしないこともできる。ＤＮＡおよびＲＮＡの生データの抽出は、たとえば、ＤＮＡ分子に結合した蛍光分子を用いる蛍光、ＤＮＡインターカレーション剤を用いる蛍光、または放射性同位体でＤＮＡの末端を標識するオートラジオグラフィーによって行うことができる。同様に、生のタンパク質データの抽出は、たとえば、蛍光標識、オートラジオグラフィー、Ｉｍｍｕｎｏｇｒａｐｈｙ、化学発光のようなリポーターによって行うことができる。
【００６６】
本発明の一つの実施態様は、データ集合のスループットの高い分析のための方法であり、該データ集合は一般的に、決定された位置とエリアを有するピークの集合によって記述される。この実施態様では、データは生物情報工学ツール（すなわち生データ抽出プログラムまたはＤＮＡオートシーケンサー）によって一次資料から抽出することができ、結果として現れるピークはそれから、ユーザー定義によるパラメータ・ファイルにしたがって平滑化される。平滑化されたピーク・データの各集合は、それからデータファイルに保存される。
【００６７】
もう一つの実施態様では、ピークを示す特徴的なプロファイル（データファイル）は、さらなる分析のために再作成することができる。
【００６８】
さらなる実施態様では、個々のデータファイルにあるピークは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓを用いて単一のピーク・データベースに集約することができる。
【００６９】
さらにもう一つの実施態様では、ピーク・データベースはＩＳＥＡｐｅａｋｓのプログラムに含まれた統計ツールによって分析される。
【００７０】
本発明のもう一つの実施態様は、決定された位置とエリアを有するピークの集合によって一般的に記述されるデータ集合の、スループットの高い分析によって予後判定基準および診断基準を決定するための方法であり、該方法は、生物情報工学ツール（すなわち生データ抽出プログラムまたはＤＮＡオートシーケンサー）によって一次資料からデータを抽出し、それから、ユーザー定義によるパラメータ・ファイルにしたがって、結果として表れるピークを平滑化することによるものである。データ集合の平滑化された各ピークは、それからデータファイルに保存され、該データファイルはピークを示す特徴的なプロファイル（データファイル）を含み、該プロファイルはさらなる分析のために再作成される。個々のデータファイルにあるピークは、それからＩＳＥＡｐｅａｋｓを用いて単一のピーク・データベースに集約し、このプログラムに含まれる統計ツールによって分析することができる。
【００７１】
この方法によって確立される予後判定基準および診断基準は、免疫療法、がん治療、ＨＩＶ、感染症、そして自己免疫疾患のような生理病理学の分野で用いることができる、
【００７２】
本発明の方法は、免疫レパートリーを分析するためのスループットの高い方法として用いることができる。
【００７３】
Ｔ細胞またはＢ細胞の免疫レパートリーは、非常に多くの場合、ＣＤＲ３スペクトラタイピングによって研究される。しかしながら、この方法で得られるデータは通常、偏った肉眼分析を受けている。したがって、ここで提供されるＩＳＥＡｐｅａｋｓソフトウェア・パッケージがオートシーケンサーからピーク・データを取り出し、扱うために用いられてきており、該オートシーケンサーからＣＤＲ３スペクトラタイプ・データが得られる。一般的な方法において、二つの新しい特殊なモジュールと多変量統計分析がＣＤＲ３スペクトラタイプを分析するために用いられる。第一のモジュールはピークの平滑化という決定的な問題に取り組むものである。第二のモジュールはＣＤＲ３スペクトラタイプを分析するためのツールボックスであり、該ツールボックスは摂動の計算、多発性のピークの発見、拡張の評価と判断を含んでいる。このアプローチを説明するために、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡの感染によって誘発された複雑なＴＣＲＢレパートリーの改変が評価され、実施例２に示されている。この全体的かつ網羅的なレパートリーの分析アプローチは、Ｔリンパ球およびＢリンパ球のレパートリーの研究にとって全体的に有利なものであり、現状では、多様な病変におけるヒトのコホート研究と臨床試験において用いられている。
【００７４】
感染症（Ｌｏｕｉｓ他「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」１９９８、１０、４５９、および、Ｂｏｕｂｏｕ他「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」１９９９、１１、１５５３）、自己免疫（Ｗａｇｎｅｒ他「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ」１９９８、９５、１４４４７）、あるいはがん（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ他「Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＴＣＲ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」、Ｊ．Ｒ．  Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ編『Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ』所収、１９９５、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、ｐ．２８７）のような異常な状況におけるＢ細胞あるいはＴ細胞の役割は、抗原特異的受容体のレパートリーを検討することによって広く研究されている。リンパ球の分化の間に、これらのヘテロ二量体性受容体の多様性が、Ｖ断片、（Ｄ断片）およびＪ断片の、体細胞ＤＮＡのランダムな再構成によって生じ、該断片は後でＣ断片へとスプライシングされる（Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｂｊｏｒｋｍａｎ『Ｎａｔｕｒｅ』１９８８、３３４、３９５）。Ｖ（Ｄ）Ｊ接合の生成物は相補性決定領域３（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ  ３（ＣＤＲ３））と呼ばれ、抗原と接触している。この領域は、除去または付加されるヌクレオチドの数と種類という点で不明確であり、したがって、アミノ酸の長さおよび組成においてさまざまである。
【００７５】
レパートリーを記述するためにいくつかのアプローチが用いられてきた。もっとも広く用いられているものの一つはＣＤＲ３スペクトラタイピングであり、該ＣＤＲ３スペクトラタイピングは、ＣＤＲ３の長さの分布を分析することで、Ｔ細胞群のレパートリーの多様性を記述する（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ他『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』１９９３、９０、４３１９）。簡潔に述べると、一連のＰＣＲ増幅はＶ特異的およびＣまたはＪ特異的プライマーで行う。これらＰＣＲ産物はそれから、蛍光分子と結合したＣまたはＪ特異的プライマーを用いるランオフ実験において標識し、ＤＮＡオートシーケンサーにロードして、Ｖ−ＣまたはＶ−Ｊの組み合わせのそれぞれにおけるさまざまなＣＤＲ３の長さを分離させる。ＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ）、ＩＭＭＵＮＯＳＣＯＰＥ（登録商標）（ＩＮＳＥＲＭ社、パリ）およびＧＥＮＯＴＥＳＴＥＲ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、ウプサラ）は、観察されたＣＤＲ３のピークのヌクレオチドサイズとエリアを決定するために用いる、三つの一般的なソフトウェア・パッケージである。このＣＤＲ３スペクトラタイピング技術は圧倒的に包括的な技術であり、たとえばヒトのＴＣＲＢレパートリーを２４００測定まで記述することができる（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ他『Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ』１９９５、１６、１７６）。過去には、ＣＤＲ３スペクトラタイプのデータは、主として質的には肉眼で分析されてきていたのだが、肉眼は分析にバイアスをもたらしうるものであり、関連する情報を見落とす可能性にもつながる。近年のオートシーケンサー（９６ウェルシーケンサーおよび／またはキャピラリーシーケンサー）の助けにより、今日では個体のコホートを分析することが可能である。このような高いスループットの獲得を追求する研究チームは、データの量に急速に圧倒される。ＣＤＲ３スペクトラタイプ法を完璧に用いるには、さまざまなゲルに対する多数のサンプル・ファイルに分散しているデータを、取り出し、取り扱い、編成し、そして客観的に分析する適切なソフトウェア・ツールの開発が必要なのである。
【００７６】
したがって、本発明者らは、ＩＳＥＡＰＥＡＫＳ（登録商標）ソフトウェア・パッケージを開発することで、ＧＥＮＥＳＣＡＮ（登録商標）、ＩＭＭＵＮＯＳＣＯＰＥ（登録商標）（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｉｘ『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』２００２、１８、３２９）およびＧＥＮＯＴＥＳＴＥＲ（登録商標）のソフトウェアのような生物情報工学ツールによって生成された生データを、取り出し、取り扱い、そして編成するようにした。さまざまなサンプルのデータは、ＥＸＣＥＬ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、アメリカ合衆国ワシントン州シアトル）のピーク・データベースに収集することができる。本発明によると、ＥＸＣＥＬ（登録商標）のピーク・データベースは、ＣＤＲ３レパートリーの全体的な記述を達成するための多変量統計学に基づいた、独自の方法を打ち立てるために用いられた。
【００７７】
この方法を説明するために、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ（ＰｂＡ）で感染させたＢ１０．Ｄ２マウスからのＴＣＲＢレパートリー・データを分析することで、マラリアにおける修飾を解析した（実施例２）。このモデルでは、ＰｂＡは、感染後７日から１０日の間に致命的な脳マラリアを、または、感染後三週間では、高寄生虫血症（ＨＰ）に起因する、死に至る深刻な貧血症を誘発する（Ｂｏｕｂｏｕ他『Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１９９９、１１、１５５３）。実施例２では、ＨＰを呈するマウスだけを対象とした。脳症候群を発現しているマウスは実施例２には含まれていないが、実施例１で説明されている。
【００７８】
本発明のもう一つの目的は、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含む生体サンプルで開始される、免疫レパートリーの分析を行うためのスループットの高い方法である。ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片はそれから精製される。ソースが精製されたＲＮＡであれば、ｃＤＮＡが逆転写ＰＣＲを用いて転写される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ』第３版、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。ＲＮＡを転写することで得られた、精製されたＤＮＡまたはｃＤＮＡを、次にＰＣＲまたはｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ法、Ｗａｌｋｅｒ他『Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』１９９６、４２、９−１３、および、Ｌｉｔｔｌｅ他『Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』１９９９、４５、７７７−７８４）によって増幅するのだが、該方法は、たとえば免疫グロブリンやＴ細胞受容体、可変領域（Ｖ）、結合領域（Ｊ）および定常領域（Ｃ）である抗原特異的受容体の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いるものである。増幅したＤＮＡは検出のために標識する。適切なＤＮＡ標識は、放射性同位元素標識（アメリカ合衆国カリフォルニア州コスタ・メサのＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社から入手可能）、化学発光プローブ、蛍光分子（幅広い範囲のものがアメリカ合衆国オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社から入手可能）を含み、該標識は、たとえば、蛍光剤で標識したＪまたはＣ特異的オリゴヌクレオチドによるランオフ伸長過程で用いる。標識した各増幅ＤＮＡをそれから、電気泳動によってオートシーケンサー内で分離し、電気泳動図を分析し、標識された増幅ＤＮＡに対応する位置とエリアを決定することによってピークを同定する。
【００７９】
決定された位置とエリアを有するピークの集合は、生物情報工学ツール（すなわち生データ抽出プログラムまたはＤＮＡオートシーケンサー）による電気泳動図から抽出され、それから、ユーザー定義によるパラメータ・ファイルにしたがって、結果として現れるピークを平滑化する。平滑化された各ピーク・データの集合はそれからデータファイルに保存されるのだが、該データファイルは、さらなる分析のために再構成される、ピークを表す特徴的なプロファイル（データファイル）を含んでいる。個々のデータファイルにあるピークは、それから、ＩＳＥＡｐｅａｋｓを用いて単一のピーク・データベースに集約され、このプログラムに含まれた統計ツールによって分析される。
【００８０】
現代分子生物学の中心的なパラダイムから明らかなように、本発明に導入しやすいサンプルは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む基本的な生体分子である。
【００８１】
本発明の対象となるタンパク質は、幅広い範囲のタンパク質のクラスを含み、それらのすべてが本発明の範囲内である。タンパク質のタイプの例には、まったくこれらに制限されるわけではないが、抗原タンパク質、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、キナーゼ、メチラーゼ、プロテアーゼ、複製に関与するタンパク質、細胞分裂に関与するタンパク質、そして細胞プロセスの調節とホメオスタシスに関与するタンパク質がある。
【００８２】
ここで用いられているように、「生体サンプル」という用語は、一つまたはそれ以上の生体分子を含む溶液、混合物、または懸濁液を指す。「生体分子」という用語は、無傷細胞、細胞物質、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を含む、あらゆる生物由来の物質を指す。これらの生体分子は、天然に発生するものであり、または、合成法によって得ることができる。さらに、いずれかの方法で得られた生体分子は修飾することもしないこともでき、また、抽出物のメンバーであることもでき、そして単離または精製することもできる。
【００８３】
「天然に発生するもの」という用語は、生きた宿主生物で見られる、あるいはそこから発現するＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を指す。この用語は、ゲノム発現したタンパク質、染色体発現したタンパク質、プラスミド発現タンパク質、コスミド発現タンパク質、ならびに、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよびコスミドＤＮＡを含む。したがって、この用語はまた、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよびコスミドＤＮＡから転写されたＲＮＡも包含している。
【００８４】
ＤＮＡまたはＲＮＡとの関係において、「合成法」という用度は、固相合成または液相合成を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡ用の適切な合成法の例は、Ｒａｙｎｅｒ他（『Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ』１９９８、８、７４１−７４７）、Ｌａｓｈｋａｒｉ他（『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』１９９５、９２、７９１２−７９１５）、およびＡｎｄｒｕｓ他（『Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ』１９９５、３４、１８３−１８４）によって与えられている。タンパク質との関係で、「合成法」という用語は、単一のチューブ中でインビトロで標的ＤＮＡを転写およびタンパク質へ翻訳することを指す。インビトロのタンパク質システム用の、商業的に入手可能な一般的な二つのキットは、ＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（登録商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、アメリカ合衆国カリフォルニア州カールスバッド）およびＴＮＴ（登録商標）高速転写／翻訳結合システム（Ｐｒｏｍｅｇａ社、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン）である。
【００８５】
ここで用いられているように、「修飾されていない」という用語は、発生した状態にある、つまり、いかなる複製後の改変、転写後の改変または翻訳後の改変（欠失、突然変異、付加）も有していないＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子に関するものである。
【００８６】
ここで用いられているように、「修飾された」という用語は、複製後、転写後、または翻訳後に改変したＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の分子に関するものである。これらの修飾は宿主にある原因で、または実験操作によって起こることがある。通常のＤＮＡおよびＲＮＡの修飾は、メチル化、アセチル化、ヌクレオシド除去、蛍光分子による標識、そして放射性同位元素による標識を含んでいる。同様に、通常のタンパク質の修飾は、メチル化、アセチル化、ヌクレオシド除去、蛍光分子による標識、放射性同位元素による標識、炭水化物、複合糖質、そして脂質を含んでいる。詳細な説明と理解は、糖質、複合糖質について容易に得ることができ、脂質によるタンパク質修飾は、とりわけ『Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ』（Ａｊｉｔ  Ｖａｒｋｉ編、１９９９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照することで得ることができる。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質用の適切な蛍光分子、およびそれらの詳細な説明は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（アメリカ合衆国オレゴン州ユージーン）によるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓで利用可能である。
【００８７】
本発明の枠組みにおいて、「単離した」または「精製した」ということは、天然の環境から分離していることを意味し、これはまた、その他の汚染タンパク質、ポリヌクレオチド、および／または、細胞抽出物で見られることの多いその他の生体物質を実質的に含んでいない。細胞抽出物を得るための技術は、Ｒｏｅ他（『ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ』１９９６、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（『Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ』第３版、２００１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、およびＳｃｏｐｅｓ（『Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ』１９９４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．）に記載されている。ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質を単離および／または精製する一般的な方法は、遠心分離、沈降、回分吸着、クロマトグラフィー、および電気泳動（Ｓｃｏｐｅｓ『Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ』１９９４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．）を含んでいる。
【００８８】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質を単離および／または精製するために日常的に用いられているクロマトグラフィー技術は、液体クロマトグラフィーおよびカラムクロマトグラフィーを含む。
【００８９】
本発明の枠組みにおける「液体クロマトグラフィー」は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ、中圧液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）を含む。当業者は、これらの技術のさらなる詳細な説明についてはＳｃｏｐｅｓ（『Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ』１９９４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．）を参照することになる。
【００９０】
本発明の枠組みにおける「カラムクロマトグラフィー」は、イオン交換クロマトグラフィー、無機吸着剤、疎水性吸着剤、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、陽イオンポリマー−核酸複合体、親硫黄性吸着剤、混合機能吸着剤、アフィニティクロマトグラフィー、免疫吸着クロマトグラフィー、色素−リガンドクロマトグラフィー、およびゲル濾過クロマトグラフィーを含んでいる。当業者は、これらの技術のさらなる詳細な説明についてはＳｃｏｐｅｓ（『Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ』１９９４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．）を参照することになる。
【００９１】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはタンパク質を単離／精製するために日常的に用いられている電気泳動技術は、未変性ゲルによる電気泳動、尿素ゲル電気泳動、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、勾配ゲル電気泳動、等電点電気泳動、二次元ゲル電気泳動、およびキャピラリー電気泳動を含んでいる。付加的な電気泳動技術は、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、およびウェスタンブロッティングのような、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質を単離、分離、および／または精査するためのゲルと膜を組み合わせた技術を含むことができる。当業者は、これらの技術のさらなる詳細な説明についてはＳｃｏｐｅｓ（『Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ』１９９４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｉｎｃ．）、および、Ａｕｓｕｂｅｌ他（『Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』１９９４、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）を参照することになる。
【００９２】
ここで用いられている「成長培養」という用語は、固体、液体、気体の培地でバクテリア、ファージ、ウイルス、および真核細胞を成長させることを指す。
【００９３】
図１はコンピュータ・システム１１０１を示しており、該システム上に本発明の実施態様を実装することができる。コンピュータ・システム１１０１は、バス１１０２またはその他の情報通信用の通信メカニズムと、情報を処理するための、バス１１０２に結合されたプロセッサ１１０３を含んでいる。コンピュータ・システム１１０１はまた、ランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）または他のダイナミック・ストレージ・デバイス（たとえばダイナミックＲＡＭ（ＤＲＡＭ）、スタティックＲＡＭ（ＳＲＡＭ）、およびシンクロナスＤＲＡＭ（ＳＤＲＡＭ））のようなメインメモリ１１０４を含んでおり、このメインメモリ１１０４は、プロセッサ１１０３によって実行されるべき情報と命令を保存するためにバス１１０２に結合されている。さらに、メインメモリ１１０４は、プロセッサ１１０３による命令の実行中に、一時変数またはその他の中間情報を保存するために用いることができる。コンピュータ・システム１１０１はさらに、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）１１０５またはその他のスタティック・ストレージ・デバイス（たとえばプログラマブルＲＯＭ（ＰＲＯＭ）、消去可能なＰＲＯＭ（ＥＰＲＯＭ）および電気的に消去可能なＰＲＯＭ（ＥＥＰＲＯＭ））を含んでおり、これらのＲＯＭは、プロセッサ１１０３用のスタティックな情報と命令を保存するためにバス１１０２に結合されている。
【００９４】
コンピュータ・システム１１０１はまた、磁気ハード・ディスク１１０７のような、情報と命令を保存するための一つまたはそれ以上のストレージ・デバイスを制御するための、バス１１０２に結合されたディスク・コントローラ１１０６と、リムーバブル・メディア・ドライブ１１０８（たとえばフロッピー・ディスク・ドライブ、読み出し専用コンパクト・ディスク・ドライブ、読み出し／書き込み用コンパクト・ディスク・ドライブ、ＣＤジュークボックス、テープ・ドライブ、そして着脱可能な磁気光学ドライブ）を含んでいる。適切なデバイス・インタフェース（たとえば、小型コンピュータ用周辺機器インタフェース（ＳＣＳＩ）、ｉｎｔｅｒｇｒａｔｅｄ  ｄｅｖｉｃｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ（ＩＤＥ）、拡張ＩＤＥ（Ｅ−ＩＤＥ）、ダイレクト・メモリ・アクセス（ＤＭＡ）、またはウルトラＤＭＡ）を用いて、ストレージ・デバイスをコンピュータ・システム１１０１に追加することができる。
【００９５】
コンピュータ・システム１１０１はまた、特定目的用の論理回路（たとえば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣｓ））または設定可能な論理回路（たとえば、単純プログラマブル論理回路（ＳＰＬＤｓ）、複合プログラマブル論理回路（ＣＰＬＤｓ）、およびフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡｓ））を含んでいる。
【００９６】
コンピュータ・システム１１０１はまた、ディスプレイ・コントローラ１１０９も含んでおり、該コントローラがバス１１０２に結合されていることで、カソード・レイ・チューブ（ＣＲＴ）のような、コンピュータのユーザーに情報を表示するためのディスプレイ１１１０を制御するようになっている。コンピュータ・システムは、コンピュータのユーザーと相互作用し、プロセッサ１１０３に情報を供給するために、キーボード１１１１およびポインティング・デバイス１１１２のような入力デバイスを含んでいる。ポインティング・デバイス１１１２は、たとえば、方向情報とコマンド選択をプロセッサ１１０３に通信し、カーソルの動きをディスプレイ１１１０上でコントロールするためのマウス、トラックボール、ポインティング・スティックなどであってよい。さらに、プリンタは、コンピュータ・システム１１０１によって保存および／または生成されたデータの印刷されたリストを供給することができる。
【００９７】
コンピュータ・システム１１０１はプロセッサ１１０３に応えて、本発明のプロセス過程の一部または全部を実行し、該プロセッサ１１０３は、メインメモリ１１０４のような記憶装置に含まれている一つまたはそれ以上の命令の、一つまたはそれ以上のシーケンスを実行する。このような命令は、ハード・ディスク１１０７またはリムーバブル・メディア・ドライブ１１０８のような、他のコンピュータの読み込み可能なメディアからメインメモリ１１０４に読み込むことができる。マルチプロセス構成における一つまたはそれ以上のプロセッサはまた、メインメモリ１１０４に含まれている命令のシーケンスを実行するために用いることもできる。他の実施態様では、ハードワイヤード回路をソフトウェアの命令の代わり、あるいはソフトウェアの命令と組み合わせて用いることができる。したがって、実施態様は、ハードウェア回路とソフトウェアのいかなる特定の組み合わせにも限定されない。
【００９８】
上述したように、コンピュータ・システム１１０１は、少なくとも一つのコンピュータの読み込み可能なメディアまたは記憶装置を含んでいることで、本発明の教示内容にしたがってプログラムされた命令を備え、データ構造、テーブル、レコード、またはその他のここで詳細化されたデータを含むようになっている。コンピュータの読み込み可能なメディアの例は、コンパクト・ディスク、ハード・ディスク、フロッピー・ディスク、テープ、磁気光学ディスク、ＰＲＯＭｓ（ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュＥＰＲＯＭ）、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、または、あらゆる他の磁気メディア、コンパクト・ディスク（たとえばＣＤ−ＲＯＭ）、または、あらゆる他の光学メディア、パンチ・カード、紙テープ、または穿孔パターンを伴うその他の物理メディア、搬送波（以下で説明）、またはコンピュータが読み込める他のどのようなメディアでもある。
【００９９】
任意の一つのコンピュータが読み込み可能なメディア、またはコンピュータが読み込み可能なメディアの組み合わせに保存されている状態で、本発明は、コンピュータ・システム１１０１をコントロールするための、本発明を実装するための一つまたは複数のデバイスを駆動するための、そして、コンピュータ・システム１１０１が人間である使用者と相互作用できるようにするためのソフトウェアを含んでいる。このようなソフトウェアは、これに限定されるわけではないが、デバイス・ドライバ、オペレーティング・システム、開発ツール、そしてアプリケーション・ソフトを含むことができる。このようなコンピュータが読み込み可能なメディアはさらに、本発明のコンピュータ・プログラム製品を含んでいることで、本発明を実行する中で行われる処理の全部または一部（処理が分散されている場合）を行うようになっている。
【０１００】
本発明のコンピュータ・コード・デバイスは、あらゆる解釈可能または実行可能なコード・メカニズムであることができ、以下のものに限定されるわけではないが、スクリプト、解釈可能なプログラム、ダイナミック・リンク・ライブラリ（ＤＬＬｓ）、Ｊａｖａクラス、および完全に実行可能なプログラムを含んでいる。さらに、本発明の処理の一部はよりよいパフォーマンス、信頼性、および／またはコストのために分散させることができる。
【０１０１】
ここで用いられる「コンピュータが読み込み可能なメディア」という用語は、実行のためにプロセッサ１１０３に命令を供給することに参与するあらゆるメディアを指す。コンピュータが読み込み可能なメディアは多くの形態をとることができ、該形態は、これに限定されるわけではないが、非揮発性メディア、揮発性メディア、および伝送メディアを含む。非揮発性メディアは、たとえば、ハード・ディスク１１０７またはリムーバブル・メディア・ドライブ１１０８のような光学ディスク、磁気ディスク、および磁気光学ディスクを含む。揮発性メディアは、メインメモリ１１０４のようなダイナミック・メモリを含む。伝送メディアは、同軸ケーブル、銅線および光ファイバーを含み、バス１１０２を形成するワイヤも含んでいる。伝送メディアはまた、無線波通信および赤外線データ通信中に発生するような、音波または光波の形をとることもできる。
【０１０２】
コンピュータが読み込み可能なメディアのさまざまな形式は、実行のためにプロセッサ１１０３に対する一つまたはそれ以上の命令の、一つまたはそれ以上のシーケンスを遂行することに関与することができる。たとえば、命令は、最初からリモート・コンピュータの磁気ディスクにロードすることもできる。リモート・コンピュータは、本発明の全部または一部をリモートで実行するための命令をダイナミック・メモリにロードし、モデムを用いて電話回線を介して命令を送信することができる。コンピュータ・システム１１０１にローカルなモデムは、電話回線上のデータを受信し、データを赤外線信号に変換するために赤外線送信器を用いることができる。バス１１０２に結合された赤外線検出器は、赤外線信号で運ばれたデータを受信し、バス１１０２に置くことができる。バス１１０２はデータをメインメモリ１１０４に運び、該メインメモリからプロセッサ１１０３は命令を取り出し、実行する。メインメモリ１１０４によって受信された命令は、プロセッサ１１０３による実行の前もしくは後に、光学的にストレージ・デバイス１１０７または１１０８に保存することができる。
【０１０３】
コンピュータ・システム１１０１はまた、通信インタフェース１１１３も含み、該インタフェースはバス１１０２に結合されている。通信インタフェース１１１３は双方向のデータ通信を提供し、たとえばローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）１１１５に接続されているネットワーク・リンク１１１４、または、インターネットのようなもう一つの通信ネットワーク１１１６に結合されている。たとえば、通信インタフェース１１１３は、パケット・スイッチされたあらゆるＬＡＮに接続するためのネットワーク・インタフェース・カードであってよい。もう一つの例としては、通信インタフェース１１１３は、非対称型デジタル加入者回線（ＡＤＳＬ）のカード、総合デジタル通信網（ＩＳＤＮ）のカード、または、通信回線のタイプに対応する通信接続データを供給するモデムであってよい。無線リンクもまた、実装することができる。このようなあらゆる実装において、通信インタフェース１１１３は、さまざまなタイプの情報を表すデジタル・データ・ストリームを搬送する電気信号、電磁信号、または光信号を送信し、受信する。
【０１０４】
ネットワーク・リンク１１１４は、典型的には一つまたはそれ以上のネットワークを介してデータを他のデータ・デバイスに供給する。たとえば、ネットワーク・リンク１１１４は、ローカル・ネットワーク１１１５（たとえばＬＡＮ）、または、通信ネットワーク１１１６を介して通信サービスを提供するサービス・プロバイダによって操作される装置を介して、他のコンピュータへの接続を提供することができる。好ましい実施態様では、ローカル・ネットワーク１１１４および通信ネットワーク１１１６は、好ましくは、デジタル・データ・ストリームを搬送する電気信号、電磁信号または光信号を用いる。さまざまなネットワークを介する信号とネットワーク・リンク１１１４上の信号、および、コンピュータ・システム１１０１へ、そしてコンピュータ・システム１１０１からデジタル・データを搬送する通信インタフェース１１１３を介する信号は、典型的には情報を移送する搬送波の形式である。コンピュータ・システム１１０１は、ネットワーク１１１５および１１１６、ネットワーク・リンク１１１４および通信インタフェース１１１３を介して、プログラム・コードを含めて、データを送信し、受信することができる。さらに、ネットワーク・リンク１１１４は、ＬＡＮ１１１５を介して、携帯情報端末（ＰＤＡ）、ノート型コンピュータ、または携帯電話のようなモバイル機器１１１７への接続を提供することができる。ＬＡＮ通信ネットワーク１１１５および通信ネットワーク１１１６は両方とも、デジタル・データ・ストリームを搬送する電気信号、電磁信号または光信号を用いる。さまざまなネットワークを介する信号とネットワーク・リンク１１１４上の信号、および、システム１１０１へ、そしてシステム１１０１からデジタル・データを搬送する通信インタフェース１１１３を介する信号は、典型的には情報を移送する搬送波の形式である。プロセッサ・システム１１０１は、ネットワーク、ネットワーク・リンク１１１４および通信インタフェース１１１３を介して、プログラム・コードも含めて、通知を送信し、データを受信することができる。
【０１０５】
全体的に本発明を説明してきたが、さらなる理解はいくつかの固有の実施例によって得ることができるのだが、該実施例は、ここでは例示としてのみ提供されるものであって、特定化していないときには、限定する意図を有するものではない。
【実施例１】
【０１０６】
例１．１：マウスと寄生虫
８週齢のＢ１０．Ｄ２マウスをＨａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社から購入した。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡのクローン１．４９Ｌ（Ａｍａｎｉ、Ｖ．、Ｍ．Ｉ．Ｂｏｕｂｏｕ、Ｓ．Ｐｉｅｄ、Ｍ．Ｍａｒｕｓｓｉｇ、Ｄ．Ｗａｌｌｉｋｅｒ、Ｄ．Ｍａｚｉｅｒ、Ｌ．Ｒｅｎｉａ、１９９８「Ｃｌｏｎｅｄ  ｌｉｎｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ  ｄｉｆｆｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  ａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｍａｌａｒｉａ」『Ｉｍｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ』６６、４０９３−４０９９）は、親切にもＷａｌｌｉｋｅｒ博士（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、イギリス、エジンバラ）から提供され、研究所において、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス内で維持されている。このクローンはマウスにおいて神経症候群を誘発し、該神経症候群は部分的にヒトのＣＭの一つに似ている。赤血球期の寄生虫を、１０％のグリセロールを含有するＡｌｓｅｒｖｅｒ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎにスタビラートとして、液体窒素で低温保存した。感染は、寄生された１０６個の赤血球を腹腔内注射することで誘発した。感染後７日から１０日の間に、９０％のマウスが脳マラリアを起こしたのだが、該脳マラリアは、運動失調、麻痺、頭部の偏向および痙攣によって特徴付けられ、深い昏睡と死が続く。これらのマウスはＣＭ＋群を構成した。ＣＭ−のマウスは、感染後１１日から１６日の間に屠殺したのだが、これはなぜなら、それらは末期においてはＣＭの兆候を示さなかったが、２０％以上が寄生虫血症を見せていたからである。
【０１０７】
例１．２：細胞の調製物
血液を後眼窩穿刺によりヘパリン中に得た。単核球をｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、フランス）で単離した。脾臓を取り除き、細胞を３％ＦＣＳ−ＰＢＳの中で懸濁した。赤血球を、室温で５分間にわたって、塩化アンモニウム緩衝液（ＡＫＣ）に溶解した。それから、細胞調製物をＰＢＳで二回洗浄した。リンパ球様細胞を、死細胞を排除するために、エオシンのもとでＭａｌａｓｓｅｚセルを用いて計数した。
【０１０８】
例１．３：ＴＣＲＢレパートリー
全ＲＮＡを、ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ社、オハイオ州シンシナティ）を用いて、各サンプルについて９００００個以上の単核球から抽出した。２０μｇのグリコーゲン（Ｒｏｃｈｅ社、フランス、メイラン）を用いることで、ＲＮＡの最適な沈降とペレットの視覚化を確実にするようにした。ＴＣＲのＢＶ−ＢＣとＢＶ−ＢＪのＣＤＲ３スペクトラタイピング用のプロトコルは上で説明したが、該プロトコルを本例において用いた（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｍ．Ｃｏｃｈｅｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｍ．Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｔｈｅ  ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎｓ  ｖａｒｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３、Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｊ．Ｅｖｅｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９５「Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＴＣＲ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」、Ｊ．Ｒ．Ｏｋｓｅｎｂｅｒｇ編『Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ』所収、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ、２８７−３２５）。ＢＣ、ＢＶおよびＢＪのプライマー・シーケンスは、上で説明したものであるが（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｍ．Ｃｏｃｈｅｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｍ．Ｚｏｌｌｅｒ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｔｈｅ  ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎｓ  ｖａｒｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３）、ただし、ＢＶ８．３（５’−ＴＧＣＴＧＧＣＡＡＣＣＴＴＣＡＡＡＴＡＧＧＡ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＢＶ１３（５’−ＡＧＧＣＣＴＡＡＡＧＧＡＡＣＴＡＡＣＴＣＣＡＣ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は除く。ＢＶ５．３（Ｃｈｏｕ、Ｈ．Ｓ．、Ｓ．Ｊ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｃ．Ｌｏｕｉｅ、Ｓ．Ａ．Ｇｏｄａｍｂｅ、Ｍ．Ｒ．Ｐｏｚｚｉ、Ｍ．Ａ．Ｂｅｈｌｋｅ、Ｋ．Ｈｕｐｐｉ  ａｎｄ  Ｄ．Ｙ．Ｌｏｈ、１９８７「Ｔａｎｄｅｍ  ｌｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｕｎｕｓｕａｌ  ＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｒｅｇｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』８４、１９９２−１９９６）、ＢＶ１７（Ｗａｄｅ、Ｔ．、Ｊ．Ｂｉｌｌ、Ｐ．Ｃ．Ｍａｒｒａｃ���、Ｅ．Ｐａｌｍｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｗ．Ｋａｐｐｌｅｒ、１９８８「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｂ  １７  ｉｎ  ｓｏｍｅ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｅ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１４１、２１６５−２１６７）、および、ＢＶ１９（Ｌｏｕｉｅ、Ｍ．Ｃ．、Ｃ．Ａ．Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｙ．Ｌｏｈ、１９８９「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  （Ｖｂ）  ｇｅｎｅｓ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ』１７０、１９８７−１９９８）はＢ１０．Ｄ２マウスでは機能的ではないため、これらは増幅しなかった。ＢＶ−ＢＪレパートリーについては、ＢＶ２、ＢＶ３、ＢＶ４、ＢＶ５．１、ＢＶ６、ＢＶ７、ＢＶ８．１−３、ＢＶ９、ＢＶ１４およびＢＶ１６の遺伝子を分析した。ＰＣＲ産物を３６ウェルオートシーケンサーＡＢＩ３７３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州フォスターシティ）にロードし、各プライマーの組み合わせについてピークのプロファイルを形成するヌクレオチドの長さにしたがって分離し、フレーム内の転写産物について期待される３つのヌクレオチドで切れ目を設けた。各ピークはＣＤＲ３の長さに対応した。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ製品（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｍ．Ｃｏｃｈｅｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｍ．Ｚｏｌｌｅｒ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｔｈｅ  ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎｓ  ｖａｒｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３）を、ピーク・エリアとヌクレオチドの長さを得るために用い、ＣＤＲ３プロファイルはシーケンサーから生データを表示する。
【０１０９】
例１．４：ＢＶ−ＢＪの直接シーケンシング
直接シーケンシングは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）の推薦にしたがって、６５％と１００％の間のＢＶ−ＢＪプロファイルを示すピークについて、ＢＶおよびＢＪプライマーを用いて行った。ＢＶ−ＢＪのＰＣＲ産物をまず、再増幅した。ＰＣＲ産物はそれから、０．５単位のエビ由来アルカリ・フォスファターゼ（ＵＳＢ）と５単位のエキソヌクレアーゼＩ（ＵＳＢ）で、３７℃で４０分間インキュベートし、続いて８０℃で２０分間インキュベートした。ＤＮＡのアラインメントはＧＣＧ製品を用いて行った。
【０１１０】
例１．５：ＣＤＲ３スペクトラタイプ分析用の方法とツール
本発明の発明者らは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ（登録商標）（著作権表示２０００−２００２、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ、フランス、パリ）を開発することで、本研究で得られた大量のデータを抽出、平滑化、管理、そして分析するようにした（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｘ、２００２「ＩＳＥＡｐｅａｋｓ：ａｎ  Ｅｘｃｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｄａｔａ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』１８、３２９−３３０ページおよび実施例２）。ＣＤＲ３ピークの強さはさまざまな増幅の間では比較できないため、各ＣＤＲ３の長さの使用割合は、ＣＤＲ３ピーク・エリアをプロファイル内のすべてのピーク・エリア全体で割ることによって得られた。
【０１１１】
ＢＶ−ＢＣレパートリーの摂動を、先に説明したように対照群と比較した（Ｇｏｒｏｃｈｏｖ、Ｇ．、Ａ．Ｕ．Ｎｅｕｍａｎｎ、Ａ．Ｋｅｒｅｖｅｕｒ、Ｃ．Ｐａｒｉｚｏｔ、Ｔ．Ｓ．Ｌｉ、Ｃ．Ｋａｔｌａｍａ、Ｍ．Ｋａｒｍｏｃｈｋｉｎｅ、Ｇ．Ｒａｇｕｉｎ、Ｂ．Ａｕｔｒａｎ、ａｎｄ  Ｐ．Ｄｅｂｒｅ、１９９８「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ａｎｄ  ＣＤ８＋Ｔ−Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ＡＩＤＳ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ４＋ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ」『Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ』４、２１５−２２１、Ｈａｎ、Ｍ．、Ｌ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｐ．Ｋｅｈｎ、Ｋ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ、Ｊ．Ｃｕｒｒｉｅｒ、ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９９「Ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＴＣＲα  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｄｏｕｂｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）ａｎｄ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ」『Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１６３、３０１−３１１）。サンプルの摂動（μＤＢＶ−ＢＣ）は、各ＢＶ断片の摂動（ＤＢＶ−ＢＣ）の平均である。摂動の指標は、μμＤＢＶ−ＢＪ、つまりすべてのＢＶ断片およびＢＪ断片に対するＤＢＶ−ＢＪの平均を計算することで、ＢＶ−ＢＪレパートリーまで拡張された。ＢＶ−ＢＣおよびＢＶ−ＢＪの摂動は、同一のプロファイルである０から、完全に異なったプロファイルである１００までを範囲とする。参照のために、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＴＣＲｇおよびＴＣＲｄはそれぞれ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、およびＴＣＲΔを指すものである。さらに、ＴＣＲａｂはＴＣＲαβを指し、ＴＣＲｇｄはＴＣＲγΔを指す。
【０１１２】
ＣＤＲ３の拡張の多発性は、ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅ（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｘ、２００２「ＩＳＥＡｐｅａｋｓ：ａｎ  Ｅｘｃｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｄａｔａ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』１８、３２９−３３０）で量的に評価されたのだが、該ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅはサンプルの各群の各ピークに得点を付けた。対照群の最高得点はその他の群のための閾値として用いられた。この閾値を上回る得点をもつピークは多発的に拡張していると考えられた。
【０１１３】
例１．６：統計
多変量統計はレパートリーのデータを分析するために用いられた。第一のアプローチにおいて、各レパートリーはｎ次元の空間におけるベクトルと見なされ、該空間においてｎはレパートリーを記述する変数の数である。欠測値は変数全体の平均で置き換えられた（Ｒｅｎｃｈｅｒ、Ａ．Ｃ．１９９５『Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ』、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２７）。変数の数（ＢＶ−ＢＣレパートリーについて２３０ピーク）は判別分析の理論的制約にとって多過ぎたため、主成分分析（ＰＣＡ）を用いることで減らされた。ＰＣＡは、オリジナルのデータ集合に含まれている変動性を保持しているデータ集合から新しい変数を抽出する。線形判別分析（ＤＡ）が、さまざまな群を比較するために新しいデータ集合に対して行われた。ＤＡは判別関数を計算するのだが、該判別関数は、群間変動を最大化し、群内変動を最小化するものである。各判別関数の有意性は、ウィルクス統計学のχ２近似値を用いて検証された（Ｒｅｎｃｈｅｒ、Ａ．Ｃ．１９９５『Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ』、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２７）。
【０１１４】
一方向または双方向の単変量分散分析（ＡＮＯＶＡ）が、サンプルの摂動データ（μＤＢＶ−ＢＣあるいはμμＤＢＶ−ＢＪ）を分析するために用いられた。有意であるとき、二つのカテゴリ間の比較はフィッシャーの制約付最小有意差法で行われた。一方向の多変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡ）がＤＢＶ−ＢＪを比較するために用いられた。ウィルクス・ラムダのＭＡＮＯＶＡ  Ｆ統計量近似値、ロイの最大根、ピライのトレース、およびホテリング−ローレイのトレースの多変量統計が計算された。これら四つの統計の力は同等ではないため（Ｒｅｎｃｈｅｒ、Ａ．Ｃ．１９９５『Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ』、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２７）、四つすべてが有意であるとき、ＭＡＮＯＶＡは有意であるとみなされた。ｐで指示された値はこれら四つの統計について得られたｐ値の最大値に対応する（Ｓｐａｎａｋｉｓ、Ｅ．  ａｎｄ  Ｄ．Ｂｒｏｕｔｙ−Ｂｏｙｅ、１９９７「Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」『Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ』７１、４０２−４０９）。有意であるとき、一方向のＡＮＯＶＡを各変数（ＢＶ−ＢＣの摂動）に対して行うことで、考慮に入れられた群における差を評価した。このことによって、単変量検定の全体的なエラー率を最小化することができる（Ｒｅｎｃｈｅｒ、Ａ．Ｃ．１９９５『Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ』、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、６２７）。
【０１１５】
サンプル間の類似性をさらに評価するために、ユークリッド距離でのｋ平均クラスタ化が用いられた。クラスタの有意性は、クラスタ内の特定の群のサンプル数を偶然観察する可能性を計算することで評価された（Ｔａｖａｚｏｉｅ、Ｓ．、Ｊ．Ｄ．Ｈｕｇｈｅｓ、Ｍ．Ｊ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｒ．Ｊ．Ｃｈｏ、ａｎｄ  Ｇ．Ｍ．Ｃｈｕｒｃｈ、１９９９「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ」『Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ』２２、２８１−２８５）。
【０１１６】
ＰＣＡ、ＤＡおよびｋ平均クラスタ化は、ＳＹＳＴＡＴ  １０（ＳＰＳＳ）を用いて行われた。ＡＮＯＶＡおよびＭＡＮＯＶＡはＳｔａｔ  Ｖｉｅｗ５．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．社）を用いて行われた。統計は、ｐ＜０．０１のときに有意であるとみなされた。
【０１１７】
例１．７：Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ法による脳マラリアにおけるＴＣＲＢレパートリーの分析。
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡによってＢ１０．Ｄ２マウスにおいて誘発された脳マラリア（ＣＭ）におけるＴＣＲＢレパートリーを、網羅的なＣＤＲ３の長さのスペクトラタイピングを用いて分析した（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｍ．Ｃｏｃｈｅｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｍ．Ｚｏｌｌｅｒ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｔｈｅ  ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎｓ  ｖａｒｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３）。ＢＶ−ＢＣレパートリーを、感染していない対照（ＣＴＲ）のマウス、ならびに感染してＣＭを発現したマウス（ＣＭ＋）および発現しなかったマウス（ＣＭ−）から調製した全ｃＤＮＡについて研究した。実験未使用のマウスのＰＢＬと脾臓では、ＢＶ−ＢＣの各組み合わせに対するＣＤＲ３プロファイルは釣鐘状であり、さまざまな多クローン性レパートリーを示唆するものである（図２および表示していないデータ）。ＣＭ＋およびＣＭ−マウスのＴＣＲＢレパートリーは大きく改変しており、ほとんどすべてのＣＤＲ３プロファイルが釣鐘状のプロファイルとは異なっており、多数の拡張が証明された（図２）。これら複合的なレパートリーの修飾の中で、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡの感染に対する防御反応に貢献するものがある一方で、病変に関与するものもあった。ＣＭ＋およびＣＭ−マウスのＣＤＲ３プロファイルを比較することで、マウスＣＭ＋では見られ、マウスＣＭ−では見られないであろうＣＭに関与する、潜在的に発病に結びつくクローンを同定することが可能になった。
【０１１８】
例１．８：脳マラリアにおけるＴＣＲＢレパートリーの特異的な改変
ＣＭに関与する改変を同定するために、ＣＴＲ群、ＣＭ−群およびＣＭ＋群のいくつかの個体のエクスビボのＰＢＬおよび脾細胞のＴＣＲＢレパートリーを分析した。全体で１１５０個のＢＶ−ＢＣのＣＤＲ３プロファイルが５５個のサンプルについて得られた。それぞれが６〜８個のピークを含んでいるＢＶ−ＢＣプロファイルのこの集合の分析には、生物情報工学ツールと多変量統計を統合する独自のアプローチを用いることが必要であった。ＴＣＲＢレパートリーのすべてのピーク・データを、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品で抽出、フォーマット、そして編集することで、ピーク・データベースを構築した。主成分分析は、変数の初期数を減らすために用いられた。新しいデータ集合は９７％のオリジナルの情報を保持していた。線形判別分析（ＤＡ）を、ＣＭ＋およびＣＭ−マウスにおける感染に起因する全体的な修飾を証明するために用いた。ＤＡによって、さまざまな群の多変量の観察が同じ統計学的な母集団のサンプルであるかどうかを判断した。所与の群のすべての構成要素は、共同で近くにクラスタを形成した（図３）。さらに、サンプル群は統計的に有意な四つのクラスタに分離し、最初の三つの判別関数だけが有意であった。つまり、ＣＭ＋ＰＢＬ、ＣＭ−ＰＢＬ、ＣＭ−脾臓、および、ＣＭ＋脾臓、ＣＴＲのＰＢＬ、そしてＣＴＲの脾臓を含有する群である。
【０１１９】
レパートリーをさらに特徴付けるために、各サンプルに対するＣＤＲ３スペクトラタイプの摂動の指標を計算する、もう一つの既知の方法が用いられた（Ｇｏｒｏｃｈｏｖ、Ｇ．、Ａ．Ｕ．Ｎｅｕｍａｎｎ、Ａ．Ｋｅｒｅｖｅｕｒ、Ｃ．Ｐａｒｉｚｏｔ、Ｔ．Ｓ．Ｌｉ、Ｃ．Ｋａｔｌａｍａ、Ｍ．Ｋａｒｍｏｃｈｋｉｎｅ、Ｇ．Ｒａｇｕｉｎ、Ｂ．Ａｕｔｒａｎ、ａｎｄ  Ｐ．Ｄｅｂｒｅ、１９９８「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ−Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ＡＩＤＳ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ４＋ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ」『Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ』４、２１５−２２１）。すべてのレパートリーをＣＴＲ脾臓レパートリーと比較することで、ＢＶ−ＢＣの各組み合わせに対する摂動指標（ＤＢＶ−ＢＣ）が得られた。μＤＢＶ−ＢＣ、つまりＢＶ−ＢＣの摂動の平均は、区画（ＰＢＬおよび脾臓）とマウスのさまざまな群（ＣＴＲ、ＣＭ−およびＣＭ＋）の間で双方向の分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較した（図４ａ）。ＡＮＯＶＡは、量的な従属変数に対する質的要因の効果を比較した。Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡによる感染は、マウスの群（ｐ＜０．０００１）とリンパの区画（ｐ＝０．０００２）の両方に起因するＴＣＲＢの摂動の有意な変質へとつながった。ＣＭ＋マウスのＰＢＬレパートリー（平均＝２０．２）はＣＭ−マウス（平均＝１５．２、ｔ検定、ｄｆ＝２１、ｐ＜０．０００１）よりも大きく摂動が起こった。この観察を裏付けるために、ｋ平均クラスタ化を用いることで、群が群構成の知識なしでＢＶ−ＢＣの摂動に基づいて分離されうるかどうかを確認したのだが、これは、ＤＡおよびＡＮＯＶＡで該当した。ｋ＝３（またはｋ＝４）のとき、１３個のＣＭ＋ＰＢＬサンプルのすべてが、１７個（または１６個）のサンプルを含む群において共同でクラスタをなし、該サンプルはｐ＝１．６４Ｅ−９（ｐ＝３．８６Ｅ−１０）で生じる可能性を有していた（図４ｂ）。ＰＢＬのＢＶ−ＢＣレパートリーは、ＣＭ−マウスに比べてＣＭ＋マウスで特に改変したようであったので、ＰＢＬについてのみさらなる分析を行った。
【０１２０】
例１．９：ＰＢＬレパートリーのＢＶ−ＢＣの摂動がＣＭの予測を可能にする。
ＰＢＬのＢＶ−ＢＣレパートリーの改変がサンプルを分類するために用いることができるかどうかを確認する調査を行った。トレーニング集合と検定集合に分けるほど十分にはサンプル数が多くなかったので、ジャックナイフ法が用いられ、該方法において、各サンプルは順番に取り置かれ、ＤＡが残りのサンプルに対して行われることで、分類関数が得られた。これらの関数はそれから、取り置かれたサンプルがどの群に属するかを判断するために用いられた。
【０１２１】
表１は、８５％のＣＭ＋のＰＢＬサンプルが正確に分類されていることを示し、ＰＢＬレパートリーの摂動がＣＭ＋マウスとＣＭ−マウスを判別するために用いることができることを示している。
【０１２２】
【表１】
2005537460.tif 000003
【０１２３】
例１．１０：感染中のＢＶ−ＢＪのＰＢＬレパートリーの分析
さらに精確にＣＭにおけるＴＣＲＢレパートリーを記述するために、ＴＣＲＢレパートリー全体の三分の二以上に相当する、２１個中９個のＢＶ遺伝子に対するＢＶ−ＢＪレパートリーの分析を行った。総数２３００のＢＶ−ＢＪプロファイルが生成された。ＢＶ−ＢＣレパートリーとＢＶ−ＢＪレパートリーの分析から得られた摂動の結果を比較するために、まず、各サンプルについてのすべてのＢＶ遺伝子およびＢＪ遺伝子に対する平均のＤＢＶ−ＢＪ（μμＤＢＶ−ＢＪ）を計算した。三つのＰＢＬ群（ＣＴＲ、ＣＭ−およびＣＭ＋）が有意に異なっていた（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０００１）。また、ＣＭ＋のＰＢＬレパートリー（平均＝３２．３）が、ＣＭ−のＰＢＬレパートリー（平均＝２４．５、ｐ＝０．００３５）よりも大きく改変していた。ＤＢＶ−ＢＪデータについてｋ平均クラスタ化を用いることで、三つの群すべてがまた、群構成の先行知識なしで再構成された（図４ｃ）。６個中５個のＣＭ＋のＰＢＬサンプル（ｐ＝０．０００１）がＣＴＲサンプルおよびＣＭ−サンプルから離れて共同でクラスタを形成した。
【０１２４】
どのＢＶ遺伝子がこの差異に関与しているのかを判断するため、ＢＶ−ＢＪレパートリーに基づくＢＶ遺伝子の摂動（μＤＢＶ−ＢＪの摂動）を計算した。ＭＡＮＯＶＡ分析は、三つの群が統計的に異なっている（ｐ＝０．０１）ことを示した。しかしながら、μＢＶ８．１−ＢＪ（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０１）だけが、ＣＭ−マウスに比べて、ＣＭ＋マウスにおいて有意により大きく改変していた。最終的に、ＭＡＮＯＶＡおよびその後のＡＮＯＶＡによるＢＶ８．１−陽性Ｔ細胞におけるＢＪ断片の関与性の分析は、ＤＢＶ８．１−ＢＪ１．１、ＤＢＶ８．１−ＢＪ１．６、ＤＢＶ８．１−ＢＪ２．１、およびＤＢＶ８．１−ＢＪ２．２だけを示した。
【０１２５】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓを、ＰＢＬサンプルにおける各ＢＶ遺伝子に対するＢＪの割合を計算するために用いた。これらの割合をＭＡＮＯＶＡによって比較した。ＢＪの使用は、ＣＴＲ群、ＣＭ−群、ＣＭ＋群の間では有意には差異がなかった（データ非表示）。したがって、ＢＶ−ＢＪの摂動のＣＤＲ３スペクトラタイプは、ＢＪ使用の変化に関係していない。
【０１２６】
例１．１１：多発性の病原性クローンの同定
ＰＢＬのＢＶ−ＢＣレパートリーおよびＢＶ−ＢＪレパートリーのデータを、ＣＭに関連する病原性Ｔ細胞のクローンについて研究した。ＣＭ＋マウスには多発的に存在するがＣＭ−マウスには存在しない病原性クローンの同定に焦点を当てた。そのため各群における多発性に対するピークに得点をつけるＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅを用いた（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｘ、２００２「ＩＳＥＡｐｅａｋｓ：ａｎ  Ｅｘｃｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｄａｔａ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』１８、３２９−３３０）。ＢＶ−ＢＣレパートリーについては、ＣＴＲ群の閾値より高い得点を有しているＣＭ−群またはＣＭ＋群におけるピークはない（データ非表示）。したがって、多発的に拡張していると見られたＢＶ−ＢＣのピークはない。同じ得点付けによるアプローチをＢＶ−ＢＪレパートリーにおける多発性のクローンを同定するために用いた。ＣＭ＋ＰＢＬマウスにおける１２２個のピークは、ＣＴＲのＰＢＬ群で定義された対応する閾値を超える得点を有している。それらは、対応するピークの得点を減算することでＣＭ−群の得点と比較した。ピークを降順でソートすることで、ＣＭ＋で最も多発的で、ＣＭ−では不在のものを同定した。最も異なって発現した三つの多発性のピークは、ＢＶ８．１−ＢＪ１．５およびＢＶ８．１−ＢＪ２．２のプロファイルに属している（表２および図５）。ＢＶ２−ＢＪ１．３のピークが、ＣＭ＋マウスおよびＣＭ−マウスの両方において多発的に拡張し、したがって表２で下位にランクされたピークの一例として示されている（この点については後で検討することとする）。ＢＶ８．１のピークは直接シーケンシングした。二つのＢＶ８．１−ＢＪの組み合わせのそれぞれについて、類似のアミノ酸シーケンスがいくつかのＣＭ＋の個体で発見された（表３）。逆に、ＣＭ−サンプルにおけるＰＣＲ産物についての直接シーケンシングでは、読むことのできるＣＤＲ３シーケンスは得られなかった（データ非表示）。
【０１２７】
【表２】
2005537460.tif 000004
【０１２８】
【表３】
2005537460.tif 000005
【０１２９】
例１．１２：検討
上記研究の目的は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡのクローン１．４に感染したＢ１０．Ｄ２マウスの脳マラリア（ＣＭ）におけるＴＣＲＢレパートリーを網羅的に解析することであった。この目的のために、新しい包括的な方法とツールが、ＣＤＲ３スペクトラタイピング・アプローチの幅広い使用に基づいて開発された。結果は、ＴＣＲＢレパートリーがＣＭ−マウスのＰＢＬに比べて、ＣＭ＋マウスのＰＢＬにおいて特に改変したのに対し、脾臓においては差異が証明されなかったことを示している。ＴＣＲＢレパートリーのこの摂動は、ＣＭ＋マウスに存在しＣＭ−マウスには不在である多発性のクローンによって部分的に説明される。
【０１３０】
ＣＤＲ３スペクトラタイピングを用いるレパートリーの分析は、２４００回までの測定によって、一つのサンプルのエクスビボのＴＣＲＢレパートリーの全てを記述した。高い数値のパラメータが測定されたため、用いた細胞の量が十分であったことが確認された。特に、材料の不足がＰＣＲ増幅に、確率論的に有利に作用する傾向がある。したがって、一連の細胞の希釈をレパートリーの分析によって慎重に決定し、用いた細胞の数をレパートリーのデータの質を保証するために十分なものとした（Ａ．Ｓｉｘ他、非公刊データ）。さらに、多発性のＢＶ−ＢＪのＣＤＲ３の拡張の同定は、ここで記録されたレパートリーの修飾が人為的ではないことを示している（表３）。
【０１３１】
開発された独自の生物情報工学ツールによって、本研究で生成された３４５０個のＣＤＲ３プロファイルを分析できるようになった。三つの独立した多変量統計はすべて、一貫して６個の実験群を同じように３から４のクラスタに集めた。さらに、期待されているように、ＣＴＲのＰＢＬ群とＣＴＲの脾臓群は、ＤＡ、ＡＮＯＶＡおよびｋ平均クラスタ化（ｋ＝３）に対しては分離されなかった。まず、Ｔ細胞のレパートリー・データは、クラス予測によって分析されたとき、診断／予後判定情報を提供することができることが実証された。ＢＶ−ＢＣレパートリーの改変によって、ＣＭ＋マウスの８５％のＰＢＬサンプルの群分類が可能になった。ＣＭ−マウスのＰＢＬサンプルは、誤って分類されることが多かった（５０％）。しかしながら、１０個中一つのＣＭ−ＰＢＬサンプルだけが誤ってＣＭ＋ＰＢＬとして分類されたことは、感染した個体がＣＭを発現させていることを間違って予測する危険性が小さいことを示している。
【０１３２】
独自の数量得点付け方法、ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅ（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｘ、２００２「ＩＳＥＡｐｅａｋｓ：ａｎ  Ｅｘｃｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｄａｔａ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』１８、３２９−３３０）を用いることで、１０４０個のＢＶ−ＢＪのＣＤＲ３ピークにおけるＴ細胞クローンの多発性の拡張を同定した。特定のＢＶ−ＢＣまたはＢＶ−ＢＪプロファイルで摂動が起こることは、このプロファイル内で多発性の拡張があることを意味しないのだが、それは、プライベートな拡張もプロファイルを乱しうるからだということに留意すべきである。驚くべきことに、多発性のピークはＢＶ−ＢＣのレベルで見られなかった。二つの説明が与えられよう。ＢＶ−ＢＣレパートリーにおける多発性のピークは、得点付け方法の検出の限界を下回っていたのかもしれない。だがこれは起こりがたいのだが、それはなぜなら、ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅによって、少数のサンプルについてでさえ、肉眼で確認できない多発性を検出できるからである（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｘ、２００２「ＩＳＥＡｐｅａｋｓ：ａｎ  Ｅｘｃｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｄａｔａ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』１８、３２９−３３０）。より可能性があるのは、ＢＶ−ＢＣデータとＢＶ−ＢＪデータの間の「緩衝効果」の結果だったかもしれないということである（Ｂｏｕｄｉｎｏｔ、Ｐ．、Ｓ．Ｂｏｕｂｅｋｅｕｒ、ａｎｄ  Ａ．Ｂｅｎｍａｎｓｏｕｒ、２００１「Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｕｂｌｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｉｖａｔｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｔｅｌｅｏｓｔ  ｆｉｓｈ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１６７、６２０２−６２０９）。ＢＶ−ＢＪレパートリーのより精確なレベルでの変動は、対応するＢＶ−ＢＣレパートリーにおいて平均化されるのだが、それはなぜなら、これらのレパートリーはすべてのＢＶ−ＢＪレパートリーの追加だったからである。この「緩衝効果」の例は、図５において、ＢＶ８．１＋細胞について視覚化することができ、該図において、ＢＶ８．１−ＢＪ１．５およびＢＶ８．１−ＢＪ２．２のレベルで見られる修飾は、ＢＶ８．１−ＢＣのレベルで平滑化されていた。この効果はまた、ＣＭ＋マウスのＰＢＬサンプルの摂動に対しても見られ、該摂動は、ＢＶ−ＢＣレパートリーで評価されたときは２０．２、ＢＶ−ＢＪレパートリーでは３２．３であった。これは、ＢＶ−ＢＪレパートリーはＢＶ−ＢＣより１２倍精確であり、したがって、レパートリーのより精密な記述を与えたからである。最終的に、ＢＶ−ＢＪレパートリーは所与のＢＶ遺伝子の内部において量的なものであるので（Ｍｕｓｅｔｔｅ、Ｐ．、Ａ．Ｇａｌｅｌｌｉ、Ｐ．Ｔｒｕｆｆａ−Ｂａｃｈｉ、Ｗ．Ｐｅｕｍａｎｓ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、ａｎｄ  Ｇ．Ｇａｃｈｅｌｉｎ、１９９６「Ｔｈｅ  Ｊｂ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈ��  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｖｂ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ  ａｎｄ  Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｓ」『Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』２６、６１８−６２２、Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｓ．Ｄｅｌａｓｓｕｓ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ｃ．Ｓａｕｃｉｅｒ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｒｕｎ  ｔｏ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ」『Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ』２１、５７７−５８３）、この「緩衝効果」を計算によって検証することができた。ＢＶ−ＢＣプロファイルは実に、ＢＶ−ＢＪデータで構築されていたのである（データ非表示）。
【０１３３】
マラリアの神経病因に対するＴαβ細胞の関連は、抗体による減少（Ｃｕｒｆｓ、Ｊ．Ｈ．、Ｔ．Ｐ．Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓ、Ｃ．Ｃ．Ｈｅｒｍｓｅｎ、Ｃ．Ｒ．Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ａ．Ａ．ｖａｎ  Ｚｏｎ、ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．Ｅｌｉｎｇ、１９８９「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』７５、１３６−１４０、Ｇｒａｕ、Ｇ．Ｅ．、Ｐ．Ｆ．Ｐｉｇｕｅｔ、Ｈ．Ｄ．Ｅｎｇｅｒｓ、Ｊ．Ａ．Ｌｏｕｉｓ、Ｐ．Ｖａｓｓａｌｌｉ、ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．Ｌａｍｂｅｒｔ、１９８６「Ｌ３Ｔ４＋Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｐｌａｙ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１３７、２３４８−２３５４、Ｈｅｒｍｓｅｎ、Ｃ．、Ｔ．Ｖａｎｄｅｗｉｅｌ、Ｅ．Ｍｏｍｍｅｒｓ、Ｒ．Ｓａｕｅｒｗｅｉｎ、ａｎｄ  Ｗ．Ｅｌｉｎｇ、１９９７「Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｏｆ  ＣＤ４＋  ｏｒ  ＣＤ８＋  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｄｉｓｅａｓｅ」『Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ』１１４、７−１２、Ｙａｎｅｚ、Ｄ．Ｍ．、Ｊ．Ｂａｔｃｈｅｌｄｅｒ、Ｈ．Ｃ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｙｄｅ、Ｄ．Ｄ．Ｍａｎｎｉｎｇ、ａｎｄ  Ｗ．Ｐ．Ｗｅｉｄａｎｚ、１９９９「ｇｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ」『Ｉｍｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ』６７、４４６−４４８）、およびヌードマウスの使用（Ｆｉｎｌｅｙ、Ｒ．Ｗ．、Ｌ．Ｊ．Ｍａｃｋｅｙ、ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．Ｌａｍｂｅｒｔ、１９８２「Ｖｉｒｕｌｅｎｔ  Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ｍａｌａｒｉａ：ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１２９、２２１３−２２１８）、またはノックアウトマウスの使用（Ｙａｎｅｚ、Ｄ．Ｍ．、Ｊ．Ｂａｔｃｈｅｌｄｅｒ、Ｈ．Ｃ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｅｙｄｅ、Ｄ．Ｄ．Ｍａｎｎｉｎｇ、ａｎｄ  Ｗ．Ｐ．Ｗｅｉｄａｎｚ、１９９９「ｇｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡ」『Ｉｍｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ』６７、４４６−４４８、Ｂｏｕｂｏｕ、Ｍ．Ｉ．、Ａ．Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ｄ．Ｖｏｅｇｔｌｅ、Ｄ．Ｍａｚｉｅｒ、Ｐ．−Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、ａｎｄ  Ｓ．Ｐｉｅｄ、１９９９「Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｒｒｙｉｎ��  ｔｈｅ  ＴＣＲ  Ｖｂ８  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｉｍｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ』１１、１５５３−１５６２）によって実証された。本研究の結果は、これらの先行研究に加えられ、感染中に免疫システムを刺激する多くのＰ．ｂｅｒｇｈｅｉの分子にも関わらず、ＣＭにおいて、ＴＣＲＢのＰＢＬレパートリーにおける大きな摂動と多発性のＣＤＲ３ピークの存在をエクスビボで実証した。単一抗原に対する多発性反応と対照してみると（Ｌｅｖｒａｕｄ、Ｊ．Ｐ．、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｐ．Ｌａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｍｏｙｅｎ、Ｖ．Ｂｒｉｃｈａｒｄ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９６「Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｐ８１５  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ』１８３、４３９−４４９、Ｆａｕｒｕ、Ｍ．、Ｓ．Ｃａｌｂｏ、Ｊ．Ｋａｎｅｌｌｏｐｏｕｌｏｓ、Ａ．Ｍ．Ｄｒａｐｉｅｒ、Ｐ．Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、ａｎｄ  Ｄ．Ｒｕｅｆｆ−Ｊｕｙ、１９９９「Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ：ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  ｓｐｉｔｅ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１６３、６５１１−６５１９）、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉに対する多発性反応は、ＢＶ−ＢＣレベルでは見られなかったため、緩やかであった。このことはＴ細胞の一般的な活性化に関連していたと考えられ、おそらくｐｌａｓｍｏｄｉｕｍのマイトジェンに起因し（Ｂａｌｌｅｔ、Ｊ．Ｊ．、Ｐ．Ｄｒｕｉｌｈｅ、Ｍ．Ａ．Ｑｕｅｒｌｅｕｘ、Ｃ．Ｓｃｈｍｉｔｔ、ａｎｄ  Ｍ．Ａｇｒａｐａｒｔ、１９８１「Ｐａｒａｓｉｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」『Ｉｍｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ』３３、７５８−７６２、Ｒｉｌｅｙ、Ｅ．Ｍ．、Ｇ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｌ．Ｎ．Ｏｔｏｏ、Ｓ．Ｊｅｐｓｅｎ、ａｎｄ  Ｂ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、１９８８「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｇａｍｂｉａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ａｔｔａｃｋ  ｏｆ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』７３、１７−２２、Ｈｏ、Ｍ．、Ｈ．Ｋ．Ｗｅｂｓｔｅｒ、Ｂ．Ｇｒｅｅｎ、Ｓ．Ｌｏｏａｒｅｅｓｕｗａｎ、Ｓ．Ｋｏｎｇｃｈａｒｅｏｎ、ａｎｄ  Ｎ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ、１９８８「Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩＬ−２  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｆａｌｃ��ｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１４１、２７５５−２７５９）、該ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍのマイトジェンは、抗原特異的クローンの拡張を妨げる。群の間で観察されたＢＪの使用の安定性は、この観察と一致している（データ非表示）。
【０１３４】
ＴＣＲＢレパートリーの修飾は、ＰＢＬが脾臓を反映するという、通常よく受け入れられている考えとは対照的に、ＣＭ＋マウスのＰＢＬにおいてのみ証明された。これはまた、脾臓がＣＭの発生に必要であるということとも対照的である（Ｃｕｒｆｓ、Ｊ．Ｈ．、Ｔ．Ｐ．Ｓｃｈｅｔｔｅｒｓ、Ｃ．Ｃ．Ｈｅｒｍｓｅｎ、Ｃ．Ｒ．Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ａ．Ａ．ｖａｎ  Ｚｏｎ、ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．Ｅｌｉｎｇ、１９８９「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』７５、１３６−１４０、Ｍｅｒｃａｄｏ、Ｔ．Ｉ．、１９７３「Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｐｌｅｎｅｃｔｏｍｙ  ｏｆ  ａ  ｐａｒａｌｙｚｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｒａｔｓ」『Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ』３４、１４２−１４４、Ｈｅｒｍｓｅｎ、Ｃ．Ｃ．、Ｅ．Ｍｏｍｍｅｒｓ、Ｔ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｅｌ、Ｒ．Ｗ．Ｓａｕｅｒｗｅｉｎ、ａｎｄ  Ｗ．Ｍ．Ｅｌｉｎｇ、１９９８「Ｃｏｎｖｕｌｓｉｏｎｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ  ｃａｎ  ｂｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ  ｂｙ  ｓｐｌｅｎｅｃｔｏｍｙ  ｏｒ  ａｎｔｉ−Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ』１７８、１２２５−１２２７）。ＣＭ＋マウスの脾臓において特定の改変がないことは、この器官に存在するＴ細胞の大部分における刺激された細胞の希薄化と、それらが活性化されたときに再循環するようになっていることで説明できるだろう（Ｍａｃｋａｙ、Ｃ．Ｒ．、ａｎｄ  Ｕ．Ｈ．ｖｏｎ  Ａｎｄｒｉａｎ、２００１「Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ｌｏｃａｌ  ｈｅｒｏｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｇｇｌｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ」『Ｓｃｉｅｎｃｅ』２９１、２３２３−２３２４）。
【０１３５】
神経病因に関連するＴ細胞クローンはさまざまなタイプであり得る。第一に、ある個体に固有であるプライベートなもの、または、さまざまな個体に存在し、ときどき共通のクローンとして指定されることもある多発的なものでありうる。第二に、それらの機能は病原性、保護性、または調節性でありうる。神経病因に関連する多発性のクローンは、それらがＣＭ＋マウスに存在し、ＣＭ−マウスには存在しないことを評価することで同定された。もっとも多発性があり、異なって発現する１０個のピークのうち５個は、ＢＶ８．１断片を用いる。それらが病原性の役割を有していることを支持する観察は、ＢＶ８．１／２＋細胞の減少が、ＣＭの発生率を９０％から４０％まで減少させたということである（Ｂｏｕｂｏｕ、Ｍ．Ｉ．、Ａ．Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ｄ．Ｖｏｅｇｔｌｅ、Ｄ．Ｍａｚｉｅｒ、Ｐ．−Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、ａｎｄ  Ｓ．Ｐｉｅｄ、１９９９「Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ＴＣＲ  Ｖｂ８  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１１、１５５３−１５６２）。ＢＶ６断片、ＢＶ７断片およびＢＶ９断片を用いるものを含んだその他のピークは、ＣＭ＋マウスにおいて同定された（表２）。このことは、ＢＶ６、ＢＶ７、ＢＶ８．１、ＢＶ９を用いるＴ細胞を取り除いたスーパー抗原を用いて処理したマウスにおいては、ＣＭが見られないことと関係している（Ｂｏｕｂｏｕ、Ｍ．Ｉ．、Ａ．Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ｄ．Ｖｏｅｇｔｌｅ、Ｄ．Ｍａｚｉｅｒ、Ｐ．−Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、ａｎｄ  Ｓ．Ｐｉｅｄ、１９９９「Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ＴＣＲ  Ｖｂ８  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１１、１５５３−１５６２、Ｇｏｒｇｅｔｔｅ、Ｏ．、Ａ．Ｅｘｉｓｔｅ、Ｍ．Ｉｄｒｉｓｓａ−Ｂｏｕｂｏｕ、Ｓ．Ｂａｇｏｔ、Ｊ．−Ｌ．Ｇｕｅｎｅｔ、Ｄ．Ｍａｚｉｅｒ、Ｐ．−Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、ａｎｄ  Ｓ．Ｐｉｅｄ、２００２「Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｅａｒｉｎｇ  Ｖｂ８．１  ＴＣＲ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＭＴＶ−７  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｉｍｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ』近刊）。
【０１３６】
防御に関与しうるＣＭ−特有の多発性のピークは同定されなかったが（データ非表示）、ＢＶ２−ＢＪ１．３のピークは、二つの群について得られた高得点で判断されるように、多発的にＣＭ＋およびＣＭ−マウスの両方に存在していた（表２および図５）。このピークはＣＭ−マウスでもっとも拡張していたピークであった（データ非表示）。神経病因に寄与するメカニズムはしたがって、ＢＶ２およびＢＶ８．１拡張クローンの間の調節径路の結果でありうるものであり、それらのサイトカインの特徴の改変へとつながる（ｄｅ  Ｋｏｓｓｏｄｏ、Ｓ．、ａｎｄ  Ｇ．Ｅ．Ｇｒａｕ、１９９３「Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１５１、４８１１−４８２０）。
【０１３７】
要するに、これらの結果は、ＣＭの発現に関与するＴ細胞クローンはほとんどないということを示唆しうるものである。各個体についての免疫学的歴史は、近交系の個体間における新た生じるレパートリーを異なったものとする（Ｂｏｕｓｓｏ、Ｐ．、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｊ．Ｄ．Ａｌｔｍａｎ、Ｍ．Ｈａｕｒｙ、Ｊ．Ｋａｎｅｌｌｏｐｏｕｌｏｓ、Ｊ．Ｐ．Ａｂａｓｔａｄｏ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９８「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｆｌｅｃｔ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｎａｉｖｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ」『Ｉｍｍｕｎｉｔｙ』９、１６９−１７８）。これらの変動性によって、寄生虫の同じスタビラートで感染させた遺伝子的に同一のマウスの群の中で、あるものだけがＣＭを発現した理由を説明できるだろう。
【０１３８】
先行研究では、フロー・サイトメトリーによって、ＣＭ＋マウスのＰＢＬにおいてＢＶ８．１／２＋Ｔ細胞が増加することが観察されている一方で、ＣＭ＋マウスの脾臓でも、ＣＭ−マウスのＰＢＬにおいても脾臓においても拡張は見られていない（（Ｂｏｕｂｏｕ、Ｍ．Ｉ．、Ａ．Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ｄ．Ｖｏｅｇｔｌｅ、Ｄ．Ｍａｚｉｅｒ、Ｐ．−Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、ａｎｄ  Ｓ．Ｐｉｅｄ、１９９９「Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ＴＣＲ  Ｖｂ８  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」『Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１１、１５５３−１５６２）、データ非表示）。この増加は、少数のＴ細胞クローンの拡張によって引き起こされていれば、ＢＶ８．１／２−ＢＣプロファイルの、釣鐘状をしたＣＤＲ３の長さの分布を乱すはずである。しかし、ＣＭ＋マウスのＰＢＬのＢＶ８．１／２−ＢＣレパートリーは、ＣＴＲマウス（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．１７）との比較でもＣＭ−マウス（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．２９）との比較でも摂動が起こっていなかった。さらに、用いられたＢＪ断片の修飾は、ＣＭ＋マウスでは観察されなかった。したがって、ＣＭ＋マウスのＰＢＬにおけるＢＶ８．１／２細胞の発現の増加は、モノクローナルまたはオリゴクローナルの増加が原因ではありえず、したがってポリクローナルによるものである。ＢＶ８．１／２は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉの感染で観察されるように、スーパー抗原のような分子によって刺激することができるであろう（Ｐｉｅｄ、Ｓ．、Ｄ．Ｖｏｅｇｔｌｅ、Ｍ．Ｍａｒｕｓｓｉｇ、Ｌ．Ｒｅｎｉａ、Ｆ．Ｍｉｌｔｇｅｎ、Ｄ．Ｍａｚｉｅｒ、ａｎｄ  Ｐ．−Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、１９９７「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」『Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』９、１７−２５）。神経病因におけるこのような分子の関与は、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ（Ｓｕｂａｕｓｔｅ、Ｃ．Ｓ．、Ｆ．Ｆｕｈ、Ｒ．Ｄ．Ｍａｌｅｆｙｔ、ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、１９９８「ａｂ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  ｉｎ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｕｎｅｘｐｏｓｅｄ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１６０、３４０３−３４１１）とＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｉｎｆａｎｔｕｍ（Ａ．Ｓａｓｓｉ、Ａ．Ｃｏｌｌｅｔｔｅ他、非公刊の結果）による感染症について報告されている
【０１３９】
この報告において提案された独自の方法により、免疫レパートリーの網羅的な分析が可能になった。マラリアのマウス・モデルに応用され、該方法は、Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡによって誘発される神経病理が、少数のＴ細胞クローンの多発性の拡張と共に、特にＰＢＬにおいて見られるＴＣＲＢレパートリーの全体的な摂動と関連することを実証した。
【０１４０】
この方法はヒトのマラリアに容易に置き換えることができるのだが、それはなぜなら、ＰＢＬは実験するために簡単に利用できるからである。ＰＢＬの摂動と神経病理の間の同一の関連性がＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアで見られるかどうかということを知ることは興味深いことである。さらに、分類実験によって、ＣＭ＋マウスとＣＭ−マウスを分離できるようになり、したがって、ヒトのマラリアにおける免疫反応をよりよく理解するための新たなツールを提供できる。これらの仮説はマラリア患者のコホートを研究することで検証されているところである。最後に、リンパ球レパートリーを解読するための独自のアプローチは、さまざまな病理学的条件に置き換えることができる。たとえば、この方法論は、骨髄移植後またはワクチン接種後の患者を臨床的に追跡調査するときに用いられる。提示された結果とアプローチは、免疫学の分野における生物情報工学の進展に対する確実な基盤を提供するものなのである。
【実施例２】
【０１４１】
例２−１：ＴＣＲＢレパートリーのデータ
本研究で用いた寄生虫、マウスおよびＴＣＲのＢＶ−ＢＣとＢＶ−ＢＪのＣＤＲ３スペクトラタイプの生データは、上記の例１．１で説明されている。簡潔に説明すると、８週齢のＢ１０．Ｄ２マウスを、ＰｂＡが寄生した１０６個の赤血球を腹腔内注射することによって感染させた。感染後７日から１０日の間に、ＰｂＡはいくつかのマウスにおいて脳症候群を誘発し、該脳症候群は脳マラリアのモデルとして用いられた。いかなる脳の兆候も示さないマウスは、高寄生虫血症に起因する深刻な貧血症で、感染後三週間で死亡した。本報告でＨＰ＋として指定されるこれらのマウスは、感染後１１日から１６日の間に、２０％を超えて寄生虫血症を示したときに屠殺したが、このことは、それらが致命的な脳マラリアの時期を生きていたことを示している。これらのマウスのＰＢＬおよび脾臓のＴＣＲＢレパートリーを分析した。プロファイル内の各ＣＤＲ３ピークの使用パーセントは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓのデータ・アナライザー・モジュールで計算され、ピーク・データベースに集約された。
【０１４２】
例２−２：データ平滑化アルゴリズム
一連のデータ・フィルタをＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品のデータ・スムーザーのモジュールに実装することで、ＣＤＲ３スペクトラタイプを得るようにし、該スペクトラタイプはいくつかのピークで構成されている。ｋ番目のサンプルのｊ番目のプロファイルのｉ番目のピークは、任意の単位におけるエリアＡｉ、ｊ、ｋおよびヌクレオチドの長さＬｉ、ｊ、ｋによって記述することができる。ピークは昇順の長さによってソートされる。各プロファイルについて、λｊは１０個のアミノ酸のＣＤＲ３に対するＰＣＲ産物の理論上の長さに相当するものである。
【０１４３】
第一のフィルタはバックグラウンド・ノイズと、ユーザー定義によるパラメータにしたがって定められた切り捨て値を下回るピークを取り除いた。さらに、同一の長さのピークは足し合わされた。第二のフィルタは、隣接するピークとして指示される、Ｌｉ＋１、ｊ、ｋ−Ｌｉ、ｊ、ｋ＝１であるピークを修正し、そして、フレーム内のＶ（Ｄ）Ｊ再構成について期待される三つのヌクレオチドの切れ目の設定は考慮しない。したがって、隣接ピークの各ペアは、Ｌｉ、ｊ、ｋ−λｊまたはＬｉ＋１、ｊ、ｋ−λｊが３の倍数であるかどうかを判断するために検証された。この基準が満たされたとき、対応するピークは生物学的に期待されるピークに起因するものであり、隣接ピークは足し合わされる。そうでなければ、ピークは二つの連続した期待されるピークの間にはないので、決定することは不可能である。よって、それらはＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品のデータ・フォーマッター・モジュールによって手動で修正するために、変更せずに残される。
【０１４４】
最後のフィルタはさらに繊細な問題を解決した。
【０１４５】
前述したフィルタによるピーク処理に続いて、いくつかのピークは残され（不明瞭なピークとして指示される）は、該ピークは同じ理論上の長さに起因すると考えることができる。しかし、これらの不明瞭なピークは実際、二つの区別される理論上のピークに対応した。プロファイル（ｊ、ｋ）においてこの問題を引き起こす可能性のあるシフトを評価するめに、３によるＬｉ、ｊ、ｋ−λｊのユークリッド除法が、余りが｛−１、０、１｝の一つの要素に割り当てられるように計算された。余りの平均が０．５より高ければ（それぞれが−０．５より小さい）、すべてのプロファイルの長さはヌクレオチドの長さ（それぞれ１）の−１だけシフトされている。その後、プロファイルは、ユーザーに不明瞭なピークが残っていることを警告するために再度分析された。
【０１４６】
例２−３：ＣＤＲ３スペクトラタイプ分析と統計のための方法
三つの異なった方法が、ピーク・データベースを分析するためにＭａｃＯＳのＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品に実装された。
【０１４７】
最初のアプローチでは、各ＣＤＲ３の長さの使用パーセントを直接用いて、ピーク・データベースの包括的な記述を与えるために、多変量統計が用いられた。各レパートリーはｎ次元空間のベクトルと見なされ、該空間においてｎは、レパートリーを記述する変数の数である。欠測値は、Ｒｅｎｃｈｅｒ（『Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ』、１９９５、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で推薦されているように、変数の全体の平均によって置き換えられた。結果として現れる変数の数（ＢＶ−ＢＣレパートリーに対して２３０ピーク）は、判別分析の理論的制約にとって大きすぎた。主成分分析（ＰＣＡ）を最初に用いることで、変数の数を減少させた。ＰＣＡはオリジナルのデータ集合に含まれる変動性を保持しているデータ集合から、新しい変数を抽出する。それから、線形判別分析（ＤＡ）を新しいデータ集合に対して行うことで、さまざまな群を比較した。ＤＡは判別関数を計算するのだが、該判別関数は、群間変動を最大化し、群内変動を最小化する。各判別関数の有意性は、ウィルクス統計学のχ２近似値を用いて検証されたのだが、該統計学についてはＲｅｎｃｈｅｒ参照のこと（『Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ』、１９９５、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１４８】
第二の方法は、対照群との比較によってＢＶ−ＢＣレパートリーの摂動を評価した（Ｇｏｒｏｃｈｏｖ他『Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ』１９９８、４、２１５、および、Ｈａｎ他『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１９９９、１６３、３０１）。μＤＢＶ−ＢＣはＢＶ−ＢＣの摂動の平均として定義され、該平均はすべてのサンプルの摂動に対応する。同様に、ＤＢＶ−ＢＪはＢＶ−ＢＪの摂動として定義される。μμＤＢＶ−ＢＪは、分析されたすべてのＢＶ−ＢＪの組み合わせに対するＢＶ−ＢＪの全体の摂動として定義された。すべてのＢＶ−ＢＣとＢＶ−ＢＪの摂動は、０（同一プロファイル）から１００（完全に異なったプロファイル）までを範囲とする。双方向の分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびｔ検定を用いることで、サンプルのμＤＢＶ−ＢＣとμμＤＢＶ−ＢＪをそれぞれ分析するようにした。ＡＮＯＶＡが有意であるとき、二つのカテゴリ間の比較はフィッシャーの制約付最小有意差法で行われた。サンプル間のさらなる類似性を評価するために、ユークリッド距離でのｋ平均クラスタ化と、Ｗａｒｄ最小分散基準での階層クラスタ化が用いられた。ｋ平均クラスタ化から得られたクラスタの有意性は、クラスタ内の特定群のサンプル数を偶然観察する可能性を計算することによって評価された（Ｔａｖａｚｏｉｅ他『Ｎａｔｕｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ』１９９９、２２、２８１）。
【０１４９】
第三の方法において、サンプルの群における多発性の拡張は、ＩＳＥＡｐｅａｋｓによって計算されたＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅで得点をつけられた（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｉｘ『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』２００２、１８、３２９）。得点はサンプルの各群における各ピークについて計算された。対照群のＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅはそれから、バックグラウンド・ノイズを取り除くために減算された。
【０１５０】
ＰＣＡ、ＤＡおよびｋ平均クラスタ化がＳＹＳＴＡＴ  １０（ＳＰＳＳ社）で行われた。ＡＮＯＶＡはＳｔａｔＶｉｅｗ５．０（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．社）で行われた。ここで用いられた多変量統計に対する理論的考察は、Ｒｅｎｃｈｅｒ（『Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ』１９９５、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で確認することができる。統計はｐ＜０．０１のときに有意であると見なされた。
【０１５１】
例２−４：ＣＤＲ３スペクトラタイピング分析に対するＩＳＥＡｐｅａｋｓのモジュール。
大量のＣＤＲ３スペクトラタイプ・データの分析を可能にするために、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品を用いることで、既に説明したように、オートシーケンサーＧｅｎｅＳｃａｎ、ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅまたはＧｅｎｏｔｅｓｔｅｒからＥｘｃｅｌのピーク・データベースへデータを抽出、フォーマット、そして収集するようにした（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｉｘ『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』２００２、１８、３２９）。二つのモジュールが特にＣＤＲ３スペクトラタイプ・データ用にデザインされ、データの平滑化とデータの分析の問題に取り組んでいる（図６）。
【０１５２】
レーンの移動と、ＧｅｎｅＳｃａｎ、ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅまたはＧｅｎｏｔｅｓｔｅｒオートシーケンサーのピーク発見アルゴリズムにおける差異は、ゲルで観察されるものと、これらのソフトウェアによって与えられている図（図７Ａおよび図２Ｂ）の間の相違という結果になる。この問題は決定的に重要なのだが、それはなぜなら、二つの実験ピーク・データが、理論的に一つだけが期待される場所で発見されるときにはピーク・データベースを構築できないからである。したがって、自動分析には、この問題を最初に解決することが必要である。ＣＤＲ３のピークは、抹消リンパ球で見られるフレーム内の再構成について期待される三つのヌクレオチドで分離されなければならない。これに基づき、フィルタは、ピーク・データを平滑化するためにデザインされ、データ平滑化モジュールに実装された（図７Ｃ）。
【０１５３】
ピーク・データの問題の解決策は、９個のマウスのＢＶ−ＢＣレパートリーで評価された。生データは１４１の問題を呈し、該問題の三分の一は、バックグラウンド・ノイズの除去と同一の長さのピークを足すことからなる第一フィルタによって解決された。４５個の隣接するピークの８２％と、５０個の不明瞭なピークの６０％は残り二つのフィルタで解決され、該フィルタによって、手動のデータ修正に必要な時間量が大幅に減った。要するに、８０％のピークの問題が解決されたのである。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのデータ・フォーマッターのシートで強調されている、残りの不一致は、異なった二つのサンプルに対する同一のＢＶ−ＢＣまたはＢＶ−ＢＪの組み合わせの、二つのＣＤＲ３プロファイルを比較することで、ユーザーによって修正する必要がある。
【０１５４】
それから、第二のモジュールであるデータ・アナライザーを用いることで、ＣＤＲ３のピーク・データベースを構築し、分析するようにした。ＩＳＥＡｐｅａｋｓによって、レパートリーの摂動（Ｇｏｒｏｃｈｏｖ他『Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ』１９９８、４、２１５、および、Ｄｅｃｈａｎｅｔ他『Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ』１９９９、１０３、１４３７）、オリゴクローナル拡張（Ｃｏｃｈｅｔ他『Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１９９２、２２、２６３９）、または、特定の感染あるいは免疫付与に応じてさまざまな個体によって用いられる再構成として定義された多発性のクローン（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｉｘ『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』２００２、１８、３２９）の評価が可能になった。各プロファイルのＣＤＲ３の長さの平均、各群に対するレパートリーの平均およびプロファイルあたりのピークの数も計算された。さらに、集計表は、各ＢＶ−ＢＣまたはＢＶ−ＢＪプロファイルの多様性がプロットされている、さまざまなサンプルを表示し、該集計表はカラー・コード化されている。要するに、データ・アナライザーのモジュールによって、免疫レパートリーのデータを包括的かつ客観的に分析できるようになったのである。
【０１５５】
第三のモジュールにおいて、ツールはＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ製品を使いやすくするために考案された。たとえば、第一ツールは、データ・パラメータのファイルを用いたＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ３．１αの分析マクロを作成した。第二ツールは、データ表示の問題に取り組むものであった。典型的には、実験者はさまざまなサンプルのＣＤＲ３スペクトラタイプを収集する必要があるが、該スペクトラタイプは、難解な名前のついた、異なったフォルダに分散しているＣＤＲ３プロファイルを含むファイルに結果として現れた。ＩＳＥＡｐｅａｋｓはこの問題を、ランの各ロードを記述するファイルを割り当てることで解決する。それから、データ・エクストラクタがこのパラメータ・ファイルを用いることで、１６×１２個のプロファイルの生成物に供給されているテンプレートに集める前に、すべての必要なファイルを見つけ、コピーし、リネームするようになっている。
【０１５６】
例２−５：マウス・マラリアにおけるＢＶ−ＢＣレパートリーの修飾の分析。
高寄生虫血症（ＨＰ）に起因する深刻な貧血症を発現している、ＰｂＡに感染したマウスの群におけるＴＣＲＢレパートリーを分析することで、ＨＰマウスと感染していない対照（ＣＴＲ）のマウスとの比較によって、ＰｂＡの感染で誘発されたレパートリーの修飾を研究した。この寄生虫によって誘発された複雑な変化を把握するために多変量統計が必要となった。
【０１５７】
ＢＶ−ＢＣレパートリーは、３２個のサンプルに相当するＰＢＬと脾臓の区画の両方において分析された。ＩＳＥＡｐｅａｋｓを用いることで、６７２個のＣＤＲ３プロファイルから生データを取り出した。平滑化の後、ピーク・データベースが形成された。第一のアプローチにおいて、四つのサンプル群（ＣＴＲのＰＢＬ、ＣＴＲの脾臓、ＨＰのＰＢＬおよびＨＰの脾臓）の間の差異は、主成分分析（ＰＣＡ）によってＣＤＲ３のピークの変数の数を減らした後、判別分析（ＤＡ）によって評価された。この新しいデータ集合について行われたＤＡの結果は、９９％のオリジナル・データ情報を保持するものであり、図８に表示されている。最初の二つの判別関数だけが統計的に有意であり、三群のみが分離していることを示しており、該三群とは、ＨＰのＰＢＬ、ＨＰの脾臓およびＣＴＲのサンプルである。したがって、ＰｂＡによる感染は全体的に、ＢＶ−ＢＣレパートリーの改変を誘発していた。
【０１５８】
この改変の性質に対する洞察を得るために、サンプルとＣＴＲの脾臓群の間の摂動指標（ＤＢＶ−ＢＣ）を計算した。ＤＢＶ−ＢＣデータは客観的に、カラー・コード・アレイに視覚化されている（図９）。全体的に、ＨＰのサンプルにおける摂動がより大きいように思われた。この観察を検証するために、サンプルの摂動（μＤＢＶ−ＢＣ）、つまりＤＢＶ−ＢＣの平均を、器官（ＰＢＬまたは脾臓）および臨床状態（ＣＴＲまたはＨＰ）の要因を用いて、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって比較した（図１０Ａ）。臨床状態の要因だけが有意であり（ｐ＜０．０００１）、血液と脾臓の区画の区別なしに、感染がＴＣＲＢレパートリーの改変を誘発することを確証した。
【０１５９】
典型的には、ピーク・データに対するＤＡと摂動データに対するＡＮＯＶＡの両方を用いることで、サンプルの既知の群の間の差異を評価した。しかし、もう一つの多変量統計法であるｋ平均クラスタ化を用いることで、群構成に先験的な知識なしで、関係づけられているサンプルをクラスタ化することができる。この方法はＢＶ−ＢＣレパートリー・データに応用された（図１０Ｂ）。クラスタ分析によって、一つを除いて（ｐ＝２．８×１０−８）、すべてのＣＴＲサンプルと感染したサンプルが分離できた。したがって、三つの独立した統計法は、ＰｂＡによる感染が、血液と脾臓の区画の両方においてＢＶ−ＢＣレパートリーの改変を誘発することを示した。
【０１６０】
例２−６：マウス・マラリアにおける血液のＢＶ−ＢＪレパートリーの修飾の分析。
ＢＶ−ＢＣのＣＤＲ３スペクトラタイプによるレパートリーの記述の精確さを、ＢＶ−ＢＪレパートリーを研究することで評価した。９個の（２１個中）ＢＶ遺伝子のＢＶ−ＢＪスペクトラタイプは、ＴＣＲＢレパートリーの三分の二以上に相当するものであり、ＰＢＬ区画において研究された。同様に、ＣＴＲのＰＢＬ基準群と比較して、各サンプルのレパートリーの改変も研究した。ＩＳＥＡｐｅａｋｓは各ＢＶ断片およびＢＪ断片についての改変（ＤＢＶ−ＢＪ）を計算した。ＢＶ断片およびＢＪ断片におけるＤＢＶ−ＢＪの平均（μμＤＢＶ−ＢＪ）は、各サンプルについての改変を量的に測定した。ＨＰマウスのＰＢＬのＢＶ−ＢＪレパートリー（平均＝２４．５）はまた、ＣＴＲマウス（平均＝１１．９、ｔ検定、ｄｆ＝９、ｐ＝０．０００１）におけるよりも多く改変した。
【０１６１】
このＢＶ−ＢＪレパートリーの改変が群構成の先験的な知識なしでサンプルのクラスタ化を可能にしたかどうかを評価するために、階層的クラスタ化およびｋ平均クラスタ化が用いられた。両方の方法が群の完全な分離を達成し（ｐ＝０．００２）、これらのサンプル間の強い非類同性を確証した（図１１）。
【０１６２】
例２−７：マラリアにおける多発性クローンの同定。
分析したＣＤＲ３レパートリーのもう一つの興味深い特徴は、類似のクローンの多発的なＣＤＲ３の拡張が攻撃に応じて見られたことである。ＰｂＡ寄生虫は非常に多数の抗原を含んでおり、ＴＣＲＢレパートリーの大きな改変を誘発した。それらの多発性について１０５６ピークのそれぞれに客観的に得点をつけるＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅ（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ  ａｎｄ  Ｓｉｘ『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』２００２、１８、３２９）を用いた。ＢＶ−ＢＣレパートリーでは多発的に拡張していたピークは見られなかった。ＢＶ−ＢＪデータの分析により、多発性のピーク、特に、９個のアミノ酸のＣＤＲ３の長さを伴う、ＢＶ２−ＢＪ１．３およびＢＶ２−ＢＪ１．１のピークを発見することが可能になった（表４）。
【０１６３】
【表４】
2005537460.tif 000006
【０１６４】
図１２は、対応するＢＶ２−ＢＪ１．３と、ＢＶ２−ＢＪ１．１のＣＤＲ３プロファイルを示している。ＢＶ９−ＢＪ１．５は多発的に拡張しているとは考えられないのだが、それはなぜなら、十分な信号が各群において一つのサンプルからのみ得られたからである。直接シーケンシングによって、非常に類似したＣＤＲ３シーケンスが見つかったため、これらの拡張が共通のクローンに相当することが確証された（表５）。
【０１６５】
【表５】
2005537460.tif 000007
【実施例３】
【０１６６】
例３．１：免疫レパートリーを分析するためのＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージ２．０．１と、ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅとのインタフェース−その全容。
ＩＳＥＡｐｅａｋｓ２．０．１α製品は、ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ製品のすべてのバージョンと共に用いることができる（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｍ．Ｃｏｃｈｅｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｍ．Ｚｏｌｌｅｒ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｔｈｅ  ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎｓ  ｖａｒｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３）。しかし、最新版であるＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ３．１αを用いることによって、この製品のために考案されたＩＳＥＡｐｅａｋｓのすべてのユーティリティを用いることが可能になる（下記参照）。したがって、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のあらゆるＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｕｔｏｍａｔｅ（３７０Ａ、３７３、３１０または３７７）による蛍光シグナルをＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅまたはＧｅｎｅＳｃａｎ２．２．１の分析の後に分析することができる。ＭＥＧＡＢＡＣＥシーケンサーおよびＧＥＮＯＴＥＳＴＥＲ（登録商標）のソフトウェアのような適切なソフトウェアでその他のオートシーケンサーを用いることによって、同様の結果に達することができる。Ｅｘｃｅｌ、ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅおよびＧｅｎｅＳｃａｎのソフトウェアを利用する、または利用しないＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅの技術（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｍ．Ｃｏｃｈｅｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｍ．Ｚｏｌｌｅｒ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｔｈｅ  ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎｓ  ｖａｒｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３）は、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ２．０．１α製品で用いることができる。
【０１６７】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品の使用に先立ち、さまざまな分析過程が図１３にまとめられている。サンプルはＶ  ｔｏ  ＣまたはＶ  ｔｏ  Ｊのプライマーの組み合わせを用いて増幅し、ＰＣＲ産物は蛍光プライマーを用いたランオフ増幅で標識する。標識されたＰＣＲ産物をオートシーケンサーにロードして、それらのヌクレオチドの長さにしたがって分離する。ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の製品である、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓを用いることで、ウェルあたり一つの生データのファイルを生成する。ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅおよびＧｅｎｅＳｃａｎはこれらのファイルを用いることで、蛍光シグナルを分析するようにする。これらは両方とも、同定されたピークのヌクレオチドのサイズとエリアを含んでいるファイルを生成する。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのマクロを通して、ゲル全体を自動的に分析することが可能であり、ウェルの数およびウェルあたりのロードの数と同じだけのＰＩＣＴファイルが生成される。これらのＰＩＣＴファイルは、分析された蛍光シグナルのプロファイル、ならびに、ピークの長さとエリアを含んでいる。それらを集めることで、テンプレート・ファイルを用いて、レパートリー全体のイメージを形成することができる。「プロファイル」は、ＰＩＣＴファイルに保存されている、分析された蛍光シグナル、もしくはヌクレオチドのサイズおよびピーク・エリアによるＣＤＲ３ピークの記述のいずれかを指すものである。
【０１６８】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品は、生じうる以下の問題の例解決するために開発されている（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．他、２００２「Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＣＤＲ３  ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｌａｒｉａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＩＳＥＡｐｅａｋｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ」、準備中の原稿、Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｘ、２００２「ＩＳＥＡｐｅａｋｓ：ａｎ  Ｅｘｃｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｄａｔａ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』１８、３２９−３３０）。第一に、ピーク・データを取り出すためにＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅまたはＧｅｎｅＳｃａｎで使用可能なツールがないこと。第二に、肉眼で確認されるピークの数とＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのＰＩＣＴファイルまたはＧｅｎｅＳｃａｎのファイルに示されるピークの数に隔たりがあること。第三に、データ分析の問題に取り組む製品がない一方で、スループットの高いシーケンサーを用いることで生成されるデータの量が増えていること。ＩＳＥＡｐｅａｋｓはこれらの問題に答えを与えるものである。図１３は、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ製品の全体のアーキテクチャを示している。ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅまたはＧｅｎｅＳｃａｎによって生成されたデータは、データ・エクストラクタを用いて抽出することができる。データ・スムーザーは、免疫レパートリーの応用に適合化されている。データ・エクストラクタおよびデータ・スムーザーはデータ・パラメータで作成されたファイルでパラメータ化される。得られたデータはそれから、データ・フォーマッター・ＥｘｃｅｌテンプレートおよびＩＳＥＡｐｅａｋｓ・Ｅｘｃｅｌアドインを用いてＥｘｃｅｌファイルにインポートされる。データ・アナライザーとアドインを用いた後、さまざまな器官、個体および群に対する実験全体のピーク・データを収集することができる。レパートリーの摂動の分析を行うために、いくつかのテストが実施されている。
【０１６９】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージは、実験者がＥｘｃｅｌデータベースのピークを抽出し、収集することを助ける。このデータベースは免疫レパートリーを分析するために用いられる。さらに、固有のモジュールが実装されている（すなわちデータ・スムーザー、およびデータ・アナライザーの分析部）。データ・パラメータによって、ユーザーは、データ・エクストラクタおよびデータ・スムーザーを用いてデータの抽出と平滑化をパラメータ化することができる。
【０１７０】
データ・フォーマッターはＥｘｃｅｌ中のデータを表示する。データ・アナライザーは、さまざまなデータ・フォーマッターのファイルに分散しているピークの収集と、免疫レパートリー用のこのピーク・データベースの分析の両方を行う。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのマクロの自動構築、または単一のシートにＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのＰＩＣＴファイルを集めることなど、便利なユーティリティがパッケージに組み込まれている。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのソフトウェアは下線を引いた赤字部分に表示されている。
【０１７１】
データ・フォーマッターはＥｘｃｅｌ中のデータを表示するために用いられる。データ・アナライザーは、さまざまなデータ・フォーマッターのファイルに分散しているピークの収集と、免疫レパートリー用のこのピーク・データベースの分析の両方を行う。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのマクロの自動構築や、単一のシートにＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのＰＩＣＴファイルを集めることなど、便利なユーティリティがパッケージに組み込まれている。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのソフトウェアは下線を引いた赤字部分に表示されている。
【０１７２】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓ・Ｅｘｃｅｌアドインはメニュー・バーを表示しており、該メニュー・バーから、用いられている適切なファイル・タイプを選択した後、マクロを起動することができる。正しいアイコンをクリックしてＩＳＥＡｐｅａｋｓ・Ｅｘｃｅｌのメイン・メニューを起動することで、それでなければ、設定メニュー（図１５）にアクセスすることができるショートカット（ａｌｔ＋ｏｐｒｉｏｎ＋ｍ）（図１４）を用いることで、新規ファイルを作成し、Ｅｘｃｅｌのアクティブ・ファイルの設定または情報が得られ、またはＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーがリセットされる。
【０１７３】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓ・Ｅｘｃｅｌアドインの設定は図１５に表示されている。画面のアップデートが無効のとき、いくつかの時間のかかるＩＳＥＡｐｅａｋｓのマクロは画面をアップデートしようとせず、その結果、計算はより早い。Ｅｘｃｅｌのステータス・バー（画面の下）は、ユーザーに実行の進行状況を指示するものである。ｋＭａｘＰｅａｋＮｂは表示されることになる、プロファイルあたりのピークの最大数である（データ・フォーマッターのセクションを参照）。ｋＧｅｌＷｅｌｌＮｂは、用いられるシーケンシング・ゲルのウェルの数である。３６個のウェルのオートシーケンサーについては、この設定値は３６にセットされることになる。ｋＰｒｏｆｉｌｅＮｂＰｅｒＲｅｐは一つのレパートリーにおけるプロファイルの数である。この値はゲル中のデータを分離するために用いられる。たとえば、一般的なヒトのＶβ−Ｃβレパートリーは２４個の異なった組み合わせを分析し、したがって、この設定値は２４にセットされることになり、３６個のウェルのゲルのデータは、レパートリーあたり一つのシートで、３つのシートに表示されることになる（二重ロードが想定されている）。ｋＧｅｌＷｅｌｌＮｂおよびｋＰｒｏｆｉｌｅＮｂＰｅｒＲｅｐのパラメータは、最後のボタン・コマンドを用いて、ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バー（図１６参照）から修正することができることに注意すべきである。第一の図はｋＧｅｌＷｅｌｌＮｂであり、第二の図はｋＰｒｏｆｉｌｅＮｂＰｅｒＲｅｐである。ｋＭａｘＣｏｌＮｂおよびｋＭａｘＬｉｎＮｂは、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのプロファイルを集めるときにＩＳＥＡｐｅａｋｓによって用いられることで（下記参照）、集められることになっているファイル数を決定するようになっている。
【０１７４】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓの設定メニューによって、ユーザーはＩＳＥＡｐｅａｋｓ・Ｅｘｃｅｌアドインによって用いられる設定値を変更できる。
【０１７５】
データ・エクストラクタとデータ・スムーザーは、標準的なマッキントッシュのアプリケーションである。メニューは使用可能なさまざまな機能を指示している。ダイアログ・ボックスは、ユーザーがパラメータ・ファイルまたは抽出すべきデータが保存されているフォルダを選択するように指示する。
【０１７６】
さまざまなファイルがＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージによって用いられる。ユーザーがファイルを区別することを助けるために、該ファイルはさまざまなファイル・タイプを割り当てられており、該タイプは以下に説明される。
−「ＡＰＰＬ」ファイルはＩＳＥＡｐｅａｋｓのアプリケーション・ファイルである。
−「ＣＧＥＬ」ファイルは、ゲル全体のＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅまたはＧｅｎｅＳｃａｎのデータを抽出し、平滑化するために、データ・エクストラクタとデータ・スムーザーによって用いられるパラメータ・ファイルである。ＣＧＥＬファイルはまた、データ・エクストラクタのユーティリティ・メニューを用いてＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ３．１αマクロを作成するためにも必要とされる。ＣＧＥＬファイルはデータ・パラメータで作成される。
【０１７７】
「ＣＰＩＣ」ファイル（ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳファイル）は、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅを用いてＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのＰＩＣＴファイルを収集する準備をするために、データ・エクストラクタと共に用いるパラメータ・ファイルである。さまざまなサンプルを分析するためにさまざまなゲルをロードした後、分析されたすべてのサンプルに対する特定のプロファイルを収集したいと思うかもしれない。この退屈な作業を補助するため、データ・エクストラクタは、ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルによって指示されているような、この特定のプロファイルに対応するファイルを自動的にコピーし、リネームするものである。ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳファイルはデータ・パラメータで作成される。データ・エクストラクタが所望のＰＩＣＴファイルをコピーした後、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅソフトウェアを用いることで、ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージによって提供されているテンプレート中のＰＩＣＴファイルにセーブされたプロファイルを収集することができる。このテンプレートは、１６行１２列からなる空プロファイルのアレイを含んでいる。
【０１７８】
「ＤＡＴＡ」ファイルは、ピーク・データを含んでいるデータ・エクストラクタとデータ・スムーザーの出力ファイルである。これらのファイルは、ピークをＥｘｃｅｌにインポートするために、データ・フォーマッターによって用いられるものである。
【０１７９】
「ＣＯＵＰ」ファイルは、セーブすることができるデータ・エクストラクタとデータ・スムーザーの出力ログファイルである。
【０１８０】
「ＴＥＸＴ」ファイルは通常のテキスト・ファイルであり、データ・エクストラクタで作成されたＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ３．１αのマクロを含んでいる。
【０１８１】
「ＰＲＥＦ」ファイルはＩＳＥＡｐｅａｋｓの設定ファイルである。
【０１８２】
例３．２：データ・パラメータ
ａ）ＣＧＥＬパラメータ・ファイル
データ・パラメータは、データ・エクストラクタとデータ・スムーザーにとって必要なＣＧＥＬパラメータ・ファイルを作成することを助けるものである。このファイルには、抽出、分析しようとするものの性質、および、それを遂行しようとする方法に関する情報を与えるものである（図１７）。この例では、選択されたＥｘｃｅｌのワークシートはＣＧＥＬパラメータ・ファイルのデータの一部を示している。
【０１８３】
Ｅｘｃｅｌ（登録商標）９８を用いてデータ・パラメータのファイルを開く。図１７はデータ・パラメータのファイルの一例を示している。シーケンシングゲルの各ウェルについて、以下のさまざまなパラメータの少なくとも一つを特定化することができる。
【０１８４】
「ｍＩｓＣｏｎｓｉｄｅｒｅｄ」パラメータ：パラメータを０に設定することは、たとえばウェルにサンプルがロードされていないために、このウェルを分析しようとしていないことを意味する。これを１に設定することは、このウェルが抽出され、平滑化されることを意味する。
【０１８５】
「ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」パラメータ：このボックスには、このウェルにロードされたサンプルの性質を描出する文字列を入力することができる。この文字列は「；」という文字を含んではならない。
【０１８６】
「ｍＬｅｎｇｔｈ」パラメータ：このボックスには期待される断片のサイズを入力する。たとえば、レパートリーの分析では、１０個のアミノ酸のＣＤＲ３を伴うＰＣＲ断片について期待される値を入力する。
【０１８７】
「ｍＮｅｗＯｒｄｅｒ」パラメータ：このパラメータは、さまざまなウェルの新しい出現順を設定する。この機能によって、さまざまなウェルの自動ソートが可能になる。この新しい並びは、抽出と３ｅ）の段落で用いられることになる。
【０１８８】
二重ロードはシーケンシングゲルのロード容量を拡張するために広まっている方法である。このためにデータ・パラメータでは二重ロードが可能なのである。二重ロードしなければ、第二のロード用のすべてのウェルのｍＩｓＣｏｎｓｉｄｅｒｅｄパラメータを０に設定するだけである。ワークシートの左隅のその他のパラメータは、ランの分析用の一般的なパラメータである。これらは以下の通りである。
【０１８９】
「ｍＴｙｐｉｃａｌＰｉｃｔＦｉｌｅＮａｍｅ」パラメータは、データファイルのパラメータの名前である。「ｍＴｙｐｉｃａｌＰｉｃｔＦｉｌｅＮａｍｅ」パラメータは、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのソフトウェアによって自動的に割り振られる、またはＧｅｎｅＳｃａｎのデータからＩＳＥＡｐｅａｋｓによって自動的に作成される二つの図以外の他の図は含んではならないことに注意すべきである。この制約は、「Ｚ  ２４／２／９８  ２４．１」のような名前の使用を不可能にし、代わりに「Ｚ  ２４．１」を用いる。この文字列は「；」という文字を含んではならない。
【０１９０】
「ｍＧｅｌＷｅｌｌＮｂ」パラメータ：ロードされたシーケンシングゲルのウェル数である。この値はたとえば３６、４８、または９６でありうる。
【０１９１】
「ｍＢａｃｋｇｒｏｕｎｄＮｏｉｓｅ」の値は閾値であり、該閾値の下では、シグナルはノイズと見なされ、無視されることになる。
【０１９２】
「ｍＣｕｔｏｆｆ」の値はデータ・スムーザーによって用いられるもので、最大エリアのパーセンテージであって、該最大エリアのパーセンテージの下では、シグナルを無視することが望まれる。
【０１９３】
「ｍＭｅｔｈｏｄＦｌａｇ」の値はデータ・スムーザーの段落で検討することとする。この値を２に設定することで、ｍＴｈｅｏｒｉｃＬｅｎｇｔｈの値に基づく修正を使用する。この値を３に設定することで、プロファイルの最大エリアのピークの長さに基づく修正を使用する。
【０１９４】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーでは、データ・パラメータのさまざまなマクロにアクセスすることができる。「ＩｍｐｏｒｔＣＧｅｌＦｉｌｅ」というマクロを用いることで、Ｅｘｃｅｌファイルにパラメータ・ファイルをインポートすることができ、該Ｅｘｃｅｌファイルにおいてパラメータは容易に変更できる。ダイアログ・ボックスは、ユーザーにファイルを選択するように指示する。「ＣｒｅａｔｅＣＧｅｌＦｉｌｅ」というマクロを用いることで、パラメータ・ファイルを作成することができる。誰かが同じ実験をしていれば（それぞれの時間に同一の方法で各自のゲルをロードする）、一度だけＣＧＥＬパラメータ・ファイルを作成することが必要になることに注意すべきである。「ＣＧＥＬＰａｇｅＳｅｔＵｐ」というマクロは、ページのセットアップを含んでいる空白シートを作成するものであり、該セットアップを用いることでＣＧＥＬファイルに新しい値を入力することができる。ＣＧＥＬパラメータ・ファイルの使用法を理解するためには、データ・エクストラクタまたはデータ・スムーザーのセクションを参照せよ。
【０１９５】
最後に、ＩｍｐｏｒｔＣＧｅｌＦｉｌｅマクロまたはＣｒｅａｔｅＣＧｅｌＦｉｌｅマクロを実行することは、インポートされた、または作成されたファイルにおいて使用された値でＥｘｃｅｌの設定を自動的にアップデートすることになる。ＣｒｅａｔｅＣＧｅｌＦｉｌｅマクロを用いるとき、Ｅｘｃｅｌがフリーズしたように思われるかもしれない。この問題を解決するためには、以下のＰｉｔｆａｌｌｓのセクションを参照せよ。
【０１９６】
ｂ）ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイル
ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージは、ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのＰＩＣＴファイルの収集という面倒な問題を解決するための便利なユーティリティを提供する。例として、６匹のマウスのＶβ−Ｃβレパートリー（サンプルあたり２４プロファイル）と、６匹のマウスのＶβ８．１−Ｊβレパートリー（サンプルあたり１２プロファイル）を分析したとしよう。確かに、これら６匹のマウスのＶβ８．１−Ｃβプロファイルと１２個のＶβ８．１−Ｊβプロファイルを比較しようとするのだが、これらのすべてのファイルは、さまざまなフォルダに分散した１３×６＝７８個の異なったファイルに保存されている。単一のイメージ上にこれら７８個のプロファイルを置くために、これらのファイルのそれぞれを開き、そのプロファイルを単一文書にコピーしなければならないだろう。ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージは簡単な解決法を提供してくれる。ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルによって、収集しようとするＰＩＣＴファイルを特定化することができる。これらのファイルはデータ・エクストラクタのユーティリティによってコピーされる。最終的に、コピーされたファイルは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージに提供されているテンプレート、または、カスタマイズしたテンプレートを用いて、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅソフトウェアによって収集される。
【０１９７】
データ・パラメータはＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルの作成を助けるのだが、該ファイルは、さまざまなフォルダに分散しているＰＩＣＴファイルの収集を用意するために必要なものである。このファイルには、比較するために同一のペーパー・シートに収集しようとしているＰＩＣＴファイルに関する情報を供給することになる。データ・エクストラクタのセクションは、ＰＩＣＴファイルの収集を用意するためにＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルを用いることを説明することになる。図１８は、データ・パラメータのファイルの一例を示している。シートの左部分の上に、すべての収集手順に必要な一般的なパラメータが表示されている。これらのパラメータは以下で説明する。
【０１９８】
「ｍＤｅｓｔＦｏｌｄｅｒＮａｍｅ」というパラメータは、複製されたＰＩＣＴファイルが保存されることになるフォルダの名前を特定化する。
【０１９９】
「ｍＭａｘＣｏｌＮｂ」パラメータは、レパートリーのテンプレート・ファイルで用いられる行数を特定化する。
【０２００】
「ｍＭａｘＬｉｎＮｂ」パラメータは、レパートリーのテンプレート・ファイルで用いられる列数を特定化する。
【０２０１】
この例では、ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳワークシートの一部を確認することができる。各ファイルについて、さまざまなパラメータがリストされており、該パラメータによって、データ・エクストラクタのユーティリティは、さまざまなゲルのフォルダを処理し、ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルに指示されたＰＩＣＴファイルを選択できるようになる。この例は本文で想定された場合に対応する（６匹のマウスに対するＶβ８．１−ＣβとＶβ８．１−Ｊβの収集、またｅｘａｍｐｌｅフォルダも参照）。
【０２０２】
各ファイルについて、さまざまなパラメータを特定化することができる。これらのパラメータは以下で説明される。
【０２０３】
「ｍＩｓＣｏｎｓｉｄｅｒｅｄ」パラメータ：パラメータを０にセットすることは、このプロファイルの位置を用いようとしていないことを意味する。これを１にセットすることは、このプロファイルの位置が考慮されていることを意味する。
【０２０４】
「ｍＦｏｌｄｅｒＮａｍｅ」パラメータは、対応するプロファイルに加えようとするＰＩＣＴファイルがあるフォルダの名前である。この文字列は「；」という文字を含んではならない。
【０２０５】
「ｍＣＧＥＬＦｉｌｅＮａｍｅ」というパラメータは、対応するｍＦｏｌｄｅｒＮａｍｅのＣＧＥＬパラメータ・ファイルの名前である。このＣＧＥＬファイルは、そのデータがこのフォルダに保存されているゲルがどのようにロードされているかということを記述し、ＰＩＣＴファイルと同じフォルダになければならないものである。このことは、ＣＧＥＬパラメータが体系的にフォルダ内に残されることを必要とするということに注意すべきである。この文字列は「；」という文字を含んではならない。
【０２０６】
「ｍＳｅｔ」というパラメータは、レパートリーの集合の数である（各集合はｍＷｅｌｌｓＮｂＰｅｒＳｅｔで定義された数のウェルを有している）。たとえば、６個の異なったＶβのＶβ−Ｊβレパートリーをあるゲルにロードすることができる一方で、三匹のマウスのＶβ−Ｃβレパートリーを同一のゲルにロードすることができる。第一の例では、第三のレパートリーのプロファイルを取り上げようとすればｍＳｅｔは３にセットしなければならず、その一方で、第二の例では、６個のＶβが異なっているため、特定のＶβ−Ｊβの組み合わせの発生は一つだけであるので、ｍＳｅｔは１にセットしなければならない。このパラメータが０にセットされることはない。
【０２０７】
「ｍＷｅｌｌｓＮｂＰｅｒＳｅｔ」というパラメータは、レパートリーあたりのプロファイルの数である。３個のＶβ−Ｃβレパートリーを分析するために用いられた、二重ロードされた３６個のウェルのゲルに対しては、このパラメータは２４にセットしなければならない。６個の異なったＶβのＶβ−Ｊβレパートリーを分析するために用いられた、二重ロードされた３６個のウェルのゲルに対しては、すべてのプロファイルの記述が異なることになるため、このパラメータは７２にセットしなければならない。このパラメータは０にセットされることはない。
【０２０８】
「ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」というパラメータは、分析されたプロファイルの性質の記述であり、該プロファイルは、データ・エクストラクタがこのゲルのすべてのＰｉｃｔファイルから取り出すようにしようとするものである。この文字列は、「；」という文字を含んではならない。
【０２０９】
これらのパラメータは、対応するＣＧＥＬパラメータ・ファイル、特にｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ用に与えられたパラメータに一致して設定しなければならないことと、各設定は各ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎの生起を一回だけ含んでいなければならないことに注意すべきである。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーを用いて、ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルを処理するように設定されている２つのマクロにアクセスすることができる。「ＩｍｐｏｒｔＣＰｉｃｔＰｌａｃｅｓＦｉｌｅ」というマクロによって、ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルをインポートすることが可能になる。ダイアログ・ボックスは、ユーザーにファイルを選択するように指示する。「ＣｒｅａｔｅＣＰｉｃｔＰｌａｃｅｓＦｉｌｅ」というマクロは、アクティブなＥｘｃｌｅシートのデータを用いることで、新しいＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルを作成するようになっている。ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳＰａｇｅＳｅｔＵｐマクロによって、ユーザーは新たなパラメータを入力することになる、空白のフォーマットされたシートを構築することができる。最後に、ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳファイルのインポートまたは作成は、ファイル中で用いられている値でＥｘｃｅｌアドインの設定をアップデートするものである。
【０２１０】
ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルの使用法はデータ・エクストラクタのセクションで詳細に説明する。供給されたテンプレートによって、１６行１２列で編成された１９２個までのプロファイルを収集できる。
【０２１１】
例３．３：データ・エクストラクタ
データ・エクストラクタは、ＣＧＥＬパラメータ・ファイルによって供給された情報を用いて、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ、ＧｅｎｅＳｃａｎ、およびＧｅｎｏｔｅｓｔｅｒのファイルからデータを抽出する（図１３）。ＧｅｎｅＳｃａｎのデータは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージのＧＳＥｘｐｏｒｔｓｃｒｉｐｔを用いることで、まずエクスポートされなければならない。ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅおよびＧｅｎｅＳｃａｎの両方のデータに対する抽出過程を詳述した後、３つのＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅに関連するユーティリティが説明される。つまり、ＰＩＣＴファイルのリネーム、ＣＧＥＬパラメータ・ファイルを用いてＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ３．１αのマクロを作成すること、そして、さまざまなゲルについて分析されたプロファイルを集めるために、レパートリー・テンプレートにＰＩＣＴファイルを収集することである。
【０２１２】
ａ）ＧｅｎｅＳｃａｎのエクスポート・スクリプト
ゲルのデータは、ウェルあたり一つのＧｅｎｅＳｃａｎのファイルに保存される。行うべき第一の作業は、データのピークをＩＳＥＡｐｅａｋｓによって読み込み可能なテキスト・ファイルにエクスポートすることである。これを補助するため、ＩＳＥＡｐｅａｋｓは、エクスポート過程を自動化するためのアップルスクリプトを供給する。ＧＳＦｉｌｅｎａｍｅのリストを生成するためにデータ・パラメータを用いる。名前はｍＮｅｗＯｒｄｅｒパラメータの直下に入力しなければならない（図１８参照）。ＩＳＥＡｐｅａｋｓ・Ｅｘｃｅｌのメニュー・バーを用いてＧＳＣｒｅａｔｅＦｉｌｅＬｉｓｔマクロを起動する。供給されたアップルスクリプトはこのファイルを用いることになる。
【０２１３】
それから、ＧｅｎｅＳｃａｎを開くことで、ＧｅｎｅＳｃａｎのカレントフォルダを、各自のＧｅｎｅＳｃａｎのファイルが保存されているフォルダにセットする。これを行う一般的な方法は、サンプル・ファイルの一つを開き、適切なフォルダにあるときにアクションをキャンセルすることである。アップルスクリプトのＧＳＥｘｐｏｒｔｓｃｒｉｐｔを起動し、データを含むフォルダを選び、ファイル名のリストを選択し、最後に、エクスポートされたファイルで用いるべき第一の番号を指示する。スクリプトはＧｅｎｅＳｃａｎの各ファイルを開き、データをエクスポートすることになる。データ抽出の次の過程は次のセクションで説明される。
【０２１４】
ｂ）データ抽出
データ・エクストラクタはデータファイルを読み込み、ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのＰＩＣＴファイルまたはエクスポートされたＧｅｎｅＳｃａｎのデータファイルもしくはＧｅｎｏｔｅｓｔｅｒのエクスポートされたデータのいずれかの、ピークの長さとエリアを抽出する（前セクション参照）。ファイルのアイコンをダブルクリックしてデータ・エクストラクタのプログラムを起動する（Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのデータについてのみ）。メニュー中の適切な機能を選択する。データ・エクストラクタは、すべてのウェルのフォーマットに対するデータを抽出することができ、サンプルの再ソートを確実に行う（ＣＧＥＬパラメータ・ファイルに指示される）。
【０２１５】
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのデータ抽出を起動するために、「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」メニューの中の「Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  Ｄａｔａ」という項目を選択する（ショートカットでは−Ｉ）。ＩＳＥＡｐｅａｋｓでエクスポートされたＧｅｎｅＳｃａｎのデータファイルの抽出を起動するために（ＧｅｎｅＳｃａｎのエクスポート・スクリプトのセクションを参照）、「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」メニューの中の「Ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  Ｄａｔａ」という項目を選択する（ショートカットでは−Ｇ）。ＭｅｇａＢＡＣＥデータファイル、すなわち、Ｅｘｃｅｌでタブ区切りされたＴＥＸＴにエクスポートされたＧｅｎｏｔｅｓｔｅｒのデータファイルの抽出を起動するために、「Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」メニューの中の「Ｆｏｒ  ＭｅｇａＢＡＣＥ  Ｄａｔａ」という項目を選択する（ショートカットでは−Ｍ）。ユーザーはそれから、ダイアログ・ボックスに「ＣＧＥＬ」パラメータ・ファイルを選択するように指示される。このファイルはデータファイルと同じフォルダになければならず、行われたことを調べ直そうとする場合、またはＰＩＣＴファイルの収集ユーティリティを使おうとする場合に、ゲルのフォルダにデータを抽出するために用いられたパラメータ・ファイルを残すことは非常に適している。実行中、プログラムの進行状況はウィンドウに示される。この出力ファイルはテキスト・ファイルとしてセーブすることができ、抽出されたファイルをリスト化する。抽出されたファイルは、平滑化フィルタでは解決できなかった隣接するピークも不明瞭なピークもリスト化される。プログラムは「ｄａｔａ．０」というファイルを生成する。このファイルは、データ・フォーマッターにインポートすることもできるあらゆる計算なしで、データファイルに保存されているすべてのデータを含んでいる（以下の７５ページを参照）。このとき、データ・エクストラクタはピークを保持するだけであり、該ピークの長さは、ｍＴｈｅｏｒｉｃｌｅｎｇｔｈ値の＋／−２０ｎｔである。
【０２１６】
ｃ）Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのユーティリティ：「．Ｐｉｃｔ」ファイルのリネーム。
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ（著作権表示）用のいくつかの便利なユーティリティがデータ・エクストラクタのプログラムに組み込まれており、「Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ」というメニューを介してそれらにアクセスすることができる。「ｒｅｎａｍｅ．Ｐｉｃｔ  ｆｉｌｅｓ」というユーティリティを用いることで、エクスポートされたＧｅｎｅＳｃａｎのファイルの、各自のＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのＰＩＣＴの名前を変更する。古い第一のウェルのファイルを選択し、所望の新しい名前とゲルのウェルの番号を指定するように指示されるようになっている。これは、生成したファイルがＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅによって「Ｚ  ＸＸ．Ｐｉｃｔ．３」と名前を付けられているときに有用となりうる。つまり、たしかにそれらを「Ｚ  ＸＸ．Ｐｉｃｔ．１」とリネームすることで、それらを各自のテンプレート・レパートリーに収集できるようにするからである。
【０２１７】
ｄ）Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのユーティリティ：Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ３．１αのマクロの作成。
第二のユーティリティによって、データ・パラメータで作成されたパラメータ・ファイルを用いてＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ（著作権表示）３．１αのマクロを作成できるようになる。このユーティリティはＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅの古いバージョンには対応していない。ＣＧＥＬパラメータ・ファイルを選択し、範囲と、新しいマクロを作成するために用いられることになるＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのマクロのテンプレート、そして最後に、作成すべき新しいマクロの場所と名前を指定するように指示される。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのテンプレート・マクロは、パッケージ（３６個のウェルのゲルに対して「Ｍａｃｒｏｔｅｍｐｌａｔｅ」と名前を付けられている）またはどのようなＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ３．１αのマクロに供給されるものであってよい。
【０２１８】
この便利なユーティリティは、マクロを変更するという面倒な作業を省くことになるのだが、該作業は、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅが分析すべき蛍光シグナル間の長さを変えるために、７２個（二重ロードされた３６個のウェルのゲルについて）のマクロ命令のそれぞれを選択することによるものである。これらの操作はしばしばエラーの原因となる。
【０２１９】
ｅ）Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのユーティリティ：．Ｐｉｃｔファイルのプロファイルを収集する準備。
データ・パラメータのセクションはＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルの作成とインポート、ならびにＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅデータに対するその有用性を扱った。「Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ」というメニューの中の「Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ．Ｐｉｃｔ  ｆｉｌｅ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ」を選択する。ダイアログ・ボックスはまず、ＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳパラメータ・ファイルを要求し、それからすべてのデータを含んでいるフォルダを選択するように指示するのだが、該フォルダは、データを含むすべてのフォルダに共通のルートフォルダである。最後に、使用するデフォルトのＰＩＣＴファイルを指示する。このデフォルト・ファイルは、ｍＩｓＣｏｎｓｉｄｅｒｅｄが０に設定されているときに（６９ページ参照）用いられることになる。つまり、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅがテンプレート・レパートリーの各ファイルについてのＰＩＣＴファイルを見つける必要があるのである。操作の進行状況が示されている：データ・エクストラクタはパラメータ・ファイルを読み込み、適切なファイルを見つけ、それらを出力フォルダにリネームする。出力フォルダは選択されたフォルダに作成される。リネームするとき、既存ファイルが上書きされることに注意すべきである。
【０２２０】
ここで、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅと、ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージに供給された「１６ｘ１２ＲｅｐＩＳｔｅｍｐｌａｔｅ」というテンプレート・ファイルを用いて、作成されたファイルの集合でイメージを形成する。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅを開き、「Ｏｐｅｎ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」というオプションを用いてテンプレート・ファイルを開き、そして「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  Ｒｅｐ．」というオプションを選択する。データ・エクストラクタによって出力フォルダに作成されたファイルの一つを選択する。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅはそれから、各プロファイルを適切な場所に置く。
【０２２１】
例３．４：データ・スムーザー
データ・スムーザーはピークの平滑化を行う。つまり、バックグラウンド・ノイズと二重ピークを除去し、その他の問題を解決する。
【０２２２】
データ・スムーザーを開く。「Ｔｏ  ｉｍｐｏｒｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｅ  ｔｈｅ  ｄａｔａ」というオプションを選び、ＣＧＥＬパラメータ・ファイルとデータ・エクストラクタによって作成された「ｄａｔａ．０」というファイルを選択する。ウィンドウは行われた操作を描き出す。確認できることについて説明しよう。データ・スムーザーはまずデータをインポートし、各プロファイルについて、「ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」と「ｍＴｈｅｏｒｉｃＬｅｎｇｔｈ」というパラメータ、ならびに、インポートされたピークの数がリスト化される。そして分析が開始される。ＣＧＥＬパラメータ・ファイルで特定化した値を用いてバックグラウンド・ノイズが除去される。エリアがプロファイルの最大エリアのｍＣｕｔｏｆｆ割合より少ないピークは削除される。この過程の後、すべてのゲルのピークを含んでいる「ｄａｔａ．１」というファイルがセーブされる。
【０２２３】
他の二つのフィルタが免疫レパートリーのデータのために特別にデザインされており、該データのピークは、フレーム内の再構成に必要であるように、周縁において３ｎｔの間隔でスペースを開けられるようになっている。「隣接する」ピークの修正には二つの異なったアルゴリズムが可能である。隣接ピークの一方は、ｍＭｅｔｈｏｄＦｌａｇで選択された方法にしたがって他方に足し合わされる。パラメータであるｍＭｅｔｈｏｄＦｌａｇが２にセットされていれば、基準はｍＴｈｅｏｒｉｃＬｅｎｇｔｈを用いて計算された理論上の長さとなる。３にセットされているとき、基準は最大エリアのピークの長さとなる。この過程の後、「ｄａｔａ．２」というファイルが生成される。
【０２２４】
そして、データ・スムーザーはもう一つの問題を解決しようとする。つまり、二つの連続するピークがときどき同一の理論上の長さに起因するとされることがあるという問題である。これらを「不明瞭な」ピークと称する。この問題は、ＧｅｎｅＳｃａｎまたはＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅによる非常に不精確な長さの分析によって生じる。この問題は決定的なものなのだが、それは、データ・アナライザーを用いてさまざまなサンプルのすべてのピークを収集しようとするとき、二つのピークの一方が削除されるからである。各プロファイルについて、さまざまなパラメータがリスト化される。この問題の一つが発見されるプロファイルを追跡すると、データ・スムーザーがそれを解決しようとすることが分かる。この試行の後、データ・スムーザーは再び不明瞭なピークを探す。つまり、もしまだいくつかが検出されれば、ユーザーはデータ・フォーマッターにおいて問題を解決するように指示されることになる。最後に、「ｄａｔａ．３」というファイルが生成される。データ・スムーザーのプログラムのログを忘れずにセーブする。
【０２２５】
例３．５：ＩＳＥＡｐｅａｋｓのＤＥＳ
ＩＳＥＡｐｅａｋｓのＤＥＳはデータ・エクストラクタとデータ・スムーザーの機能を集約する。ある機能は二つではなく一つのアプリケーションを実行し、「ｄａｔａ．０」というファイルは平滑化を行うために自動的に用いられる。
【０２２６】
例３．６：データ・フォーマッター
データ・フォーマッターを用いることで、Ｅｘｃｅｌにおいて、データ・エクストラクタとデータ・スムーザーによって抽出され、平滑化されたデータが表示される。Ｅｘｃｅｌでは、修正は必要ならば容易に行われる。カスタム分析を行うことも良いスタートである。シーケンシングゲルのデータは単一のデータ・フォーマッターのファイルに保存される。データは設定値にしたがって表示されることになる。つまり、データは、ｋＧｅｌＷｅｌｌＮｂ／ｋＰｒｏｆｉｌｅＮｂＰｅｒＲｅｐのさまざまなシートに分けられる（ＣＧＥＬパラメータ・ファイルのセクションを参照）。用いられたデータ・フォーマッターのファイルが十分なデータシートを含んでいなければ（図１９）、ＩＳＥＡｐｅａｋｓは欠測シートを作成する。たとえば、ヒトとマウスのＶβ−Ｃβレパートリーは通常、２４個のプロファイルで構成されている（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｍ．Ｃｏｃｈｅｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｍ．Ｚｏｌｌｅｒ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｔｈｅ  ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎｓ  ｖａｒｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３、Ｅｖｅｎ、Ｊ．、Ａ．Ｌｉｍ、Ｉ．Ｐｕｉｓｉｅｕｘ、Ｌ．Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ、Ｐ．Ｙ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ、Ａ．Ｔｏｕｂｅｒｔ、Ｔ．Ｈｅｒｃｅｎｄ、Ｆ．Ｔｒｉｅｂｅｌ、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９５「Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎａｌｙｓｅｄ  ｂｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ  ＣＤＲ３  ｓｉｚｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」『Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１４６、６５−８０）。したがって、ゲルあたり２４個のプロファイルの３つまでの異なる集合を有してもよい。これら３つの集合が入力される方法は、ゲルのデータを抽出するために与えられたＣＧＥＬパラメータ・ファイルに依存する。
【０２２７】
データをインポートするためには、ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーの「ＩｍｐｏｒｔＤａｔａ」というマクロを用いる。インポートしようとする「ｄａｔａ」ファイルを選択する。「Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ」（ａｌｔ＋ｏｐｔｉｏｎ＋ｃ）というマクロが自動的に起動され、該マクロは、インポートされたデータに基づいてさまざまな割合を計算する。二つのグラフ表示は、得られた割合を示す。「ＬｅｎｇｔｈＣｈｅｃｋ」（ａｌｔ＋ｏｐｔｉｏｎ＋ｌ）というマクロもまた、自動的に起動され、連続しているピークは黄色で強調され、「不明瞭な」ピークは赤で強調され、最大ピークは緑で、そしてｍＴｈｅｏｒｉｃＬｅｎｇｔｈに帰することができる最初のピークは太字で強調されている。インポートは、ＣＧＥＬパラメータにセットされたｍＮｅｗＯｒｄｅｒの並び方に依存し、また、設定値にも依存する。特に、さまざまなデータシートの数は、ｋＧｅｌＷｅｌｌＮｂとｋＰｒｏｆｉｌｅＮｂＰｅｒＲｅｐの値によって決定されることになる。
【０２２８】
最大ピークは緑で強調されている。この例では、ＩＳＥＡｐｅａｋｓの設定は３６個のウェルのゲルと、レパートリーあたり１２個のプロファイルに設定されている（６匹のマウスのＶ□についての６つのデータシートはＶβ−Ｊβレパートリーを完成する）。
【０２２９】
「ｍＩｓＣｏｎｓｉｄｅｒｅｄ」というパラメータを用いることで、所与のピークを前のピークに足し合わせること（ｍＩｓＣｏｎｓｉｄｅｒｅｄ＝２）、あるいは、次のピークに足し合わせること（ｍＩｓＣｏｎｓｉｄｅｒｅｄ＝３）、もしくは該所与のピークを排除すること（ｍＩｓＣｏｎｓｉｄｅｒｅｄ＝０）ができる。セルの背景を青にセットすることで、オリジナル・データの修正を追跡する（ａｌｔ＋ｏｐｔｉｏｎ＋ｂ）こと、またはブランクにする（ａｌｔ＋ｏｐｔｉｏｎ＋ｅ）ことができる。これらの特徴を用いることで、黄色または赤で報告されている隣接ピークまたは不明瞭なピークを修正する。これらの修正を終えた後、「Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ」マクロを再度実行することで、計算をアップデートする。「ＬｅｎｇｔｈＣｈｅｃｋ」マクロを再度実行するのだが、該マクロは、もしいくつかの長さが修正されていなければ、ユーザーに警告を発するものである。Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ／ＬｅｎｇｔｈＣｈｅｃｋはアクティブなワークシートにだけ適用されることに注意すべきである。「ＰｅａｋＰａｇｅＳｅｔＵｐ」および「ＰｅｒｃｅｎｔＰａｇｅＳｅｔＵｐ」というマクロによって、それぞれピーク・アレイとパーセンテージの設定値を用いて表示を描出することができる。
【０２３０】
計算は、サンプル全体における各組み合わせ（たとえば、Ｖ  ｔｏ  ＣまたはＶ  ｔｏ  Ｊ）に対する各断片の使用パーセントと、各プロファイル（ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）の使用割合、そして各プロファイル中の各断片の長さの使用割合である。これらの割合はヒストグラムに表示される（「％プロファイル」および「％ＣＤＲ３」シート）。
【０２３１】
例３．７：データ・アナライザー
データ・アナライザーは二つの機能を有している。つまり、異なったデータ・フォーマッター・ファイルに保存されたデータを収集することと、免疫レパートリーについてのこの大量のデータを分析することである。データ・アナライザーのマクロは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーを用いてアクセスすることができる。まず、データ・アナライザーのパラメータ化を、そして、ピーク・データベースを形成するために、さまざまなデータ・フォーマッターのファイルに分散しているデータの取り出しを説明することにする。最後に、すべての行われた摂動とオリゴクローナル性のテスト、ならびに、いくつかの便利なユーティリティを詳述することにする。もちろん、データ・アナライザーはＩＳＥＡｐｅａｋｓ・Ｅｘｃｅｌアドインの設定値を用いるものである。
【０２３２】
ａ）パラメータ化
データ・アナライザーのファイルを開く。まず、インポートしようとするさまざまなファイルを特定化することが必要となる。「ｐａｒａ」ワークシートを選択する。各データ集合が見つかるデータ・フォーマッターのファイル名、ワークシート名、データ集合が属する群、そして最後に、このサンプルが何であるかを記述する文字を特定化する（図２０）。すべてのデータ・フォーマッターのファイルが同一のフォルダになければならないことに注意すべきである。
【０２３３】
ここでは、９匹のマウスのＶβ−Ｃβレパートリーを分析した実験が説明されている。二つの分析されたマウスの群におけるレパートリーを比較するために、二つの群が作成された（「Ｇｒｏｕｐ」カラムを参照）。群の数は１から始まる連続する整数値でなければならないことに注意すべきである。
【０２３４】
ｂ）「ＴａｋｅＰｅａｋｓ」マクロ
パラメータ化が行われた後、ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーの「ＴａｋｅＰｅａｋｓ」という項目を選択することで、ピークの取り出しと整列を始める。まず、ピーク・エリアまたはピークの使用割合のどちらを取り出そうとしているのかを選ぶ。各データ・フォーマッターのファイルが開かれ、データ・アナライザーは、「Ｐｅａｋｓ」シートにおける同じ性質と長さのデータを収集する。たとえば、レパートリーの分析では、あるＣＤＲ３の長さを伴うＴＣＲＢＶ８．１を用いて、ピークに関するすべての使用割合が収集されることになる（図２１）。ピークは出現順にソートされる。「ｌｅｎｇｔｈ  ｆａｉｌｅｄ」は、この特定の長さがサンプル中にないことを意味する。「ｅｘｃｌｕｄｅｄ」は、このプロファイルがこの特定のレパートリーについては考慮されていないことを意味する。「ＬｅｎｇｔｈＣｈｅｃｋ」の手順（下記参照）が自動的に起動されることで、長さが適切であることを確認する。実行の進行状況はＥｘｃｅｌのステータス・バーに指示される（画面の下）。
【０２３５】
図２０に示されたパラメータは、対応するデータをインポートするために用いられた。各ピークについて、ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ、ＣＤＲ３領域のアミノ酸の長さ、ＰＣＲ産物のヌクレオチドの長さ、および１０個のアミノ酸のＣＤＲ３のＰＣＲ産物のヌクレオチドの長さが指示される。各サンプルについて、このプロファイル中のピークの長さと、このピークの使用割合が続く。
【０２３６】
ｃ）「ＬｅｎｇｔｈＣｈｅｃｋ」マクロ
「ＴａｋｅＰｅａｋｓ」マクロの後に「ＬｅｎｇｔｈＣｈｅｃｋ」手順が自動的に起動されることで、長さが適切であることを確認する。特に、データ・スムーザーによって報告されたすべての不明瞭なピークがデータ・フォーマッターにおいて修正されていなければ、いくつかのピークが欠けることになり、プロファイルに対するさまざまなピーク・エリアの合計が１００％になることはない。連続するピークの長さは黄色で強調されている。これらの問題は、先に進む前に修正する必要があり、通常、対応するデータ・フォーマッターのファイルに戻ることを意味する。実行の進行状況はＥｘｃｅｌのステータス・バーに指示される（画面の下）。
【０２３７】
ｄ）「ＩｍｐｏｒｔＰｅｒｃｅｎｔ」マクロ
「ＩｍｐｏｒｔＰｅｒｃｅｎｔ」の手順を用いることで、プロファイルの使用割合と蛍光シグナルを取り出すことができる。図２２は、「ＩｍｐｏｒｔＰｅｒｃｅｎｔ」を用いて、使用割合とシグナルを収集する例を示している。「ＩｍｐｏｒｔＰｅｒｃｅｎｔ」の手順は、「ＴａｋｅＰｅａｋｓ」マクロに関して、「ｐａｒａ」シートに入力されたパラメータを用いる。実行の進行状況はＥｘｃｅｌのステータス・バーに指示される（画面の下）。
【０２３８】
この例は、図２０のパラメータを用いての、９匹のマウスのＶβ−Ｊβレパートリーの取り出しを示している。上のアレイは１２個の異なったプロファイル（ここではＶβ−Ｊβ）の使用割合を、下のアレイでは蛍光シグナルを表示している。
【０２３９】
ｅ）「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ１」マクロ
この「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ１」というマクロは、レパートリーの摂動を分析するために用いることができる、プログラムされた分析の第一のタイプである。この方法は、ｎ＝１次元の距離を用いることを意味する。この方法は、絶対値の距離に基づいていることで、平均的な対照群に対して各レパートリーを比較する（Ｇｏｒｏｃｈｏｖ、Ｇ．、Ａ．Ｕ．Ｎｅｕｍａｎｎ、Ａ．Ｋｅｒｅｖｅｕｒ、Ｃ．Ｐａｒｉｚｏｔ、Ｔ．Ｓ．Ｌｉ、Ｃ．Ｋａｔｌａｍａ、Ｍ．Ｋａｒｍｏｃｈｋｉｎｅ、Ｇ．Ｒａｇｕｉｎ、Ｂ．Ａｕｔｒａｎ、ａｎｄ  Ｐ．Ｄｅｂｒｅ、１９９８「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ａｎｄ  ＣＤ８＋Ｔ−Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏ  ＡＩＤＳ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ４＋ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ」『Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ』４、２１５−２２１、Ｈａｎ、Ｍ．、Ｌ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｐ．Ｋｅｈｎ、Ｋ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ、Ｊ．Ｃｕｒｒｉｅｒ、ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９９「Ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＴＣＲα  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｄｏｕｂｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）ａｎｄ  ＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ」『Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１６３、３０１−３１１）。この距離は、各プロファイル中の各ＣＤＲ３の長さの使用割合を用いて計算される。
【０２４０】
各サンプルの群を群番号で特定化していることを確認する（図２０、カラムＤ）。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーを用いて「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ１」というマクロを選択する。ユーザーは、対照群の番号を入れるように指示される。対照の平均レパートリーが計算され、チェックされる。つまり、各プロファイルのピークの使用の合計は１００％になるべきものなのである。それから、データ・アナライザーは各ピークについて、各レパートリーとこの平均レパートリーの間の距離を計算する（図２３）。最後に、各プロファイルについて、あるレパートリーと対照の平均レパートリーの間の距離が計算される。ＩＳＥＡｐｅａｋｓは、各プロファイルの摂動を平均化することで、プロファイルの摂動の平均を計算する。実行の進行状況はＥｘｃｅｌのステータス・バーに指示される（画面の下）。Ｅｘｃｅｌ（登録商標）の機能を用いて、こうして結果をプロットし、ソートすることができる。「ＦｉｌｌＥｘｃｌｕｄｅｄ」というマクロを用いることで、「ｎｂ＿ＣＴＲ＝０」または「ｅｘｃｌｕｄｅｄ」のすべての発生を、その群の同一プロファイルの摂動の平均で置き換えることができる。これは、後に続くＭＡＮＯＶＡのような統計分析にとって便利なものとなりうる（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．、Ｓ．Ｂａｇｏｔ、Ｐ．−Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、Ａ．Ｓｉｘ、ａｎｄ  Ｓ．Ｐｉｅｄ、２００２「Ａ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ＴＣＲＢ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」投稿中）。
【０２４１】
上のアレイは各サンプルの各プロファイルの摂動を示し、下のアレイは対照の平均レパートリーと比べた、各ピークの摂動を示している（Ｐｃ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、カラムＣ）。
【０２４２】
ｆ）「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ２」マクロ
「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ２」というマクロは、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒによって説明されたレパートリーの摂動を評価するための、もう一つの提案された方法である（Ｄｅｃｈａｎｅｔ、Ｊ．、Ｐ．Ｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ａ．Ｌｉｍ、Ｃ．Ｒｅｔｉｅｒｅ、Ｖ．Ｐｉｔａｒｄ、Ｘ．Ｌａｆａｒｇｅ、Ｓ．Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、Ｃ．Ｍｅｒｉｃ、Ｍ．Ｍ．Ｈａｌｌｅｔ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、Ｌ．Ｐｏｔａｕｘ、Ｍ．Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ、ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｍｏｒｅａｕ、１９９９「Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ」『Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ』１０３、１４３７−１４４９）。この方法はまた、あるレパートリーと計算された平均の対照レパートリーの間の距離を計算するが、先行する方法とは異なっている。つまり、用いられるｎ次元の距離が標準的な二次元距離なのである（ｎ＝２）。第二に、用いられるデータが量的であることであり、ＣＤＲ３の長さの分析が行われるが、各プロファイルの使用割合も評価されるのである（たとえば、例に従うとＶα）。この方法はその他の量的なデータにも拡大することができる。つまり、各プロファイルの使用割合は、ＦＡＣＳ分析（Ｄｅｃｈａｎｅｔ、Ｊ．、Ｐ．Ｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ａ．Ｌｉｍ、Ｃ．Ｒｅｔｉｅｒｅ、Ｖ．Ｐｉｔａｒｄ、Ｘ．Ｌａｆａｒｇｅ、Ｓ．Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ、Ｃ．Ｍｅｒｉｃ、Ｍ．Ｍ．Ｈａｌｌｅｔ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、Ｌ．Ｐｏｔａｕｘ、Ｍ．Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ、ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．Ｍｏｒｅａｕ、１９９９「Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ」『Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ』１０３、１４３７−１４４９）、半定量的なＣＤＲ３の長さの分析（Ｅｖｅｎ、Ｊ．、Ａ．Ｌｉｍ、Ｉ．Ｐｕｉｓｉｅｕｘ、Ｌ．Ｆｅｒｒａｄｉｎｉ、Ｐ．Ｙ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ、Ａ．Ｔｏｕｂｅｒｔ、Ｔ．Ｈｅｒｃｅｎｄ、Ｆ．Ｔｒｉｅｂｅｌ、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９５「Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎａｌｙｓｅｄ  ｂｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ−ｃｈａｉｎ  ＣＤＲ３  ｓｉｚｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ」『Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１４６、６５−８０、Ｄａｖｉｄ−Ａｍｅｌｉｎｅ、Ｊ．、Ａ．Ｌｉｍ、Ｆ．Ｄａｖｏｄｅａｕ、Ｍ．Ａ．Ｐｅｙｒａｔ、Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｔｈｅｌｏｔ、Ｇ．Ｓｅｍａｎａ、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｊ．Ｇａｓｃｈｅｔ、Ｈ．Ｖｉｅ、Ｊ．Ｅｖｅｎ、ａｎｄ  Ｍ．Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ、１９９６「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａ��ｔｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１５７、４６９７−４７０６、Ｃａｉｇｎａｒｄ、Ａ．、Ｐ．Ｙ．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ、Ｖ．Ｍｏｒａｎｄ、Ａ．Ｌｉｍ、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ａ．Ｍ．Ｌｅｒｉｄａｎｔ、Ｔ．Ｈｅｒｃｅｎｄ、Ｊ．Ｅｖｅｎ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、ａｎｄ  Ｆ．Ｔｒｉｅｂｅｌ、１９９４「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ」『Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ』５４、１２９２−１２９７）、またはＴａｑｍａｎ（Ｌａｎｇ、Ｒ．、Ｋ．Ｐｆｅｆｆｅｒ、Ｈ．Ｗａｇｎｅｒ、ａｎｄ  Ｋ．Ｈｅｅｇ、１９９７「Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｖｂ−ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｕｓｉｎｇ  ＴａｑＭａｎＲ  ＰＣＲ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ』２０３、１８１−１９２）によって評価することができる。半定量的なＣＤＲ３の長さの分析については、データ・フォーマッターは自動的に使用割合を計算することになる。ＦＡＣＳ分析については、割合はデータ・フォーマッターに入力され、データ・フォーマッターによって計算された割合を置き換えるものである。
【０２４３】
群の番号は「ｐａｒａ」シートのファイルに入力しなければならない（図２０）。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーを用いて「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ２」マクロを選択する。ユーザーは、対照群の数を与えるように指示される。データ・フォーマッターの各ファイルが開かれることで、各プロファイルの使用割合が取り出されるようになっている。対照の平均レパートリーが計算され、チェックされる。つまり、各プロファイルのピークの使用の合計は１００％になるべきなのである。それから、データ・アナライザーは、各ピークに対する、あるレパートリーとこの平均レパートリーの間の距離を計算する（図２４）。最後に、あるレパートリーと対照の平均レパートリーの間の距離が各プロファイルについて計算される。実行の進行状況はＥｘｃｅｌのステータス・バーに指示される（画面の下）。
【０２４４】
上のアレイは、各プロファイルとサンプル（行２）の摂動を示し、下のアレイは各ピークの摂動を示している。
【０２４５】
ｇ）「ＲＩＳ」マクロ
オリゴクローナル性を記述するために、もう一つの計算が用いられた。刺激の相対指数（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  ｏｆ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）である（Ｃｏｃｈｅｔ、Ｍ．、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ａ．Ｒｅｇｎａｕｌｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ｃ．Ｌｅｃｌｅｒｃ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９２「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ」『Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』２２、２６３９−２６４７、Ｃｉｂｏｔｔｉ、Ｒ．、Ｊ．Ｐ．Ｃａｂａｎｉｏｌｓ、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．Ｄｅｌａｒｂｒｅ、Ｉ．Ｖｅｒｇｎｏｎ、Ｊ．Ｍ．Ｋａｎｅｌｌｏｐｏｕｌｏｓ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９４「Ｐｕｂｌｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｉｖａｔｅ  Ｖ  ｂｅｔａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｎ  ｅｇｇ  ｗｈｉｔｅ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  （ＨＥＬ）  ｉｎ  ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｖｅｒｓｕｓ  ＨＥＬ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ』１８０、８６１−８７２）。この分析はＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージに実装されている。
【０２４６】
ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーの中にある「ＲＩＳ」というマクロを選択する。対照として用いるべきサンプル群を指示する。特定のサンプルを明確にするためには、新しい群の識別番号をこのサンプルに与えるだけである。平均の対照レパートリーが計算される。ＲＩＳは各サンプルの各ピークについて計算される（図２５）。各群の平均ＲＩＳが各ピークについて計算される。実行の進行状況はＥｘｃｅｌのステータス・バーに指示される（画面の下）。
【０２４７】
刺激の相対指数（ＲＩＳ）は各ピークについて計算される。Ｐｃ（コントロール）は計算されたレパートリーの平均である。「ｅｘｃｌｕｄｅｄ」がサンプル中で分析できなかったプロファイルを指示するのに対し、「∞」は平均的なコントロール・レパートリーにないピークを指示する。
【０２４８】
ｈ）「ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅ」マクロ
レパートリーの集合のオリゴクローナル性を評価するため、または多発性のピークを見つけるため、各ピークに対するオリゴクローナル性を定量するために得点が開発された（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．、Ｓ．Ｂａｇｏｔ、Ｐ．−Ａ．Ｃａｚｅｎａｖｅ、Ａ．Ｓｉｘ、ａｎｄ  Ｓ．Ｐｉｅｄ、２００２「Ａ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ＴＣＲＢ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｍａｌａｒｉａ」投稿中、Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｘ、２００２「ＩＳＥＡｐｅａｋｓ：ａｎ  Ｅｘｃｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｄａｔａ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』１８、３２９−３３０）。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーの中の「ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅ」という項目を選ぶことでマクロを起動する。得点はまず、各ピークについて計算され、後で全体の得点が各群について計算される（図２６、カラムＭ）。他の群と比較された特定のサンプル群の得点を用いてピークをソートすることで、多発性のピークを見つけることになる（Ｃｏｌｌｅｔｔｅ、Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｉｘ、２００２「ＩＳＥＡｐｅａｋｓ：ａｎ  Ｅｘｃｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ＧｅｎｅＳｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｄａｔａ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ、ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ」『Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ』１８、３２９−３３０）。実行の進行状況はＥｘｃｅｌのステータス・バーに指示される（画面の下）。
【０２４９】
上のアレイは各サンプルに対して、プロファイルあたりのピーク数をまとめている。下のアレイはまず、個体あたりの得点と群あたりの得点を示している（カラムＭおよびＮ）。ピークは、第一群のオリゴクローンの得点にしたがってソートされており、第二群は対照である（図２０参照）。
【０２５０】
ｉ）「Ｓｈｏｈｅｉ」マクロ
もう一つの便利なユーティリティがデータ・アナライザーに実装されている。所与のＶβ、ＪβおよびＣＤＲ３の長さを用いて、細胞の特定の集合の定量化に対して得られたピークをインポートすることができるのである（Ｈｏｒｉ、Ｓ．他、準備中の原稿）。それを行うためには、パラメータ・ファイルを作成するためにデータ・パラメータを用いるのだが、該パラメータ・ファイルは、位置１からｎまでの同一の増幅をｎ回繰り返すことを命令するものである。それから、データ・エクストラクタとデータ・スムーザーを用いることで、ピークを抽出し、平滑化する。データ・フォーマッターによって、こうして、ピークをＥｘｃｅｌにインポートできるようになる。得られたピークを確認し、必要な修正を行う。
【０２５１】
データ・アナライザーを開く。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーの「Ｓｈｏｈｅｉ」というマクロをクリックすることで、分析を開始する。ピーク・データが保存されているデータ・フォーマッターのファイルを選択し、正しいワークシートを指示する。それから、データ・アナライザーがピーク・エリアをインポートし、計算を行うことで、これらの特定のＶβ、ＪβおよびＣＤＲ３の長さを用いて細胞の数を評価する。
【０２５２】
ｊ）「ＤｒａｗＡｒｒａｙ」マクロ
いくつかのレパートリーを分析するとき、レパートリーの多様性を視覚化することは扱いやすいものではない。多様性のカラー・コーディングが、多様性を視覚化するための一般的な方法である（Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｃ．、Ｍ．Ｃｏｃｈｅｔ、Ｓ．Ｄａｒｃｈｅ、Ａ．Ｃａｓｒｏｕｇｅ、Ｍ．Ｚｏｌｌｅｒ、ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、１９９３「Ｔｈｅ  ｓｉｚｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂ  ｃｈａｉｎｓ  ｖａｒｙ  ａｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ」『Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ』９０、４３１９−４３２３、Ｌｉｍ、Ａ．、Ａ．Ｔｏｕｂｅｒｔ、Ｃ．Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ、Ｍ．Ｄｏｕｇａｄｏｓ、Ｄ．Ｃｈａｒｒｏｎ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、ａｎｄ  Ｊ．Ｅｖｅｎ、１９９６「Ｓｐｒｅａｄ  Ｏｆ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ」『Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』４８、７７−８３、Ｍｅｍｐｅｌ、Ｍ．、Ｂ．Ｆｌａｇｅｕｌ、Ｆ．Ｓｕａｒｅｚ、Ｃ．Ｒｏｎｅｔ、Ｌ．Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、Ｇ．Ｇａｃｈｅｌｉｎ、ａｎｄ  Ｐ．Ｍｕｓｅｔｔｅ、２０００「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｌｅｐｒｏｕｓ  ａｎｄ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｓａｒｃｏｉｄ  ｇｒａｎｕｌｏｍａｓ−Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｖ  ａｌｐｈａ  ２４−ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｌｅｐｒｏｓｙ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｖ  ａｌｐｈａ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ」『Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ』１５７、５０９−５２３、Ｍｕｓｅｔｔｅ、Ｐ．、Ｈ．Ｂａｃｈｅｌｅｚ、Ｂ．Ｆｌａｇｅｕｌ、Ｃ．Ｄｅｌａｒｂｒｅ、Ｐ．Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ、Ｌ．Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ、ａｎｄ  Ｇ．Ｇａｃｈｅｌｉｎ、１９９９「Ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｈａｌｏ  ｎｅｖｉ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１６２、１７８９−１７９４）。ＩＳＥＡｐｅａｋｓは自動的にこの表示を生成することができる。このマクロは非常に便利であるのだが、それはなぜなら、こうして、ＧｏｒｏｃｈｏｖまたはＤｅｃｈａｎｅｔの得点のような多様性の客観的な分類を伴うこの表示を用いることが可能だからである。
【０２５３】
まず、「ｐａｒａ」シート中のカラー・コーディングをパラメータ化する（図２０）。値（たとえばＧｏｒｏｃｈｏｖの値）が入力されているセルのアレイを選択する。選択されたアレイはプロファイルの記述を含んでいなければならないが、サンプルの記述は含んでいてはならない。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーで「ＤｒａｗＡｒｒａｙ」手順を起動することで、新しいグラフを作成する（図２７）。
【０２５４】
各プロファイルについて、多様性／摂動が色でコードされる。各群のサンプル間の差異は明白である。
【０２５５】
ｋ）「ＰｅａｋＮｂ」マクロ
「ＰｅａｋＮｂ」というマクロを用いることで、各プロファイル中のピークの数を得ることができる。この数はレパートリーのオリゴクローナル性を指示するものでありうる。
【０２５６】
ｌ）「ＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅＭｅａｎ」マクロ
「ＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅＭｅａｎ」というマクロは、「ｐａｒａ」シートで決定されたような、各群についての平均レパートリーを計算する。考慮されるサンプル数もまた、言及される。この方法は共通の拡張を同定するために用いることができる（Ｈａｎ、Ｍ．、Ｌ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ、Ｐ．Ｋｅｈｎ、Ｋ．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ、Ｊ．Ｃｕｒｒｉｅｒ、ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、１９９９「Ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ＴＣＲα  ａｒｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｄｏｕｂｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ（ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−）ａｎｄＣＤ８＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ」『Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ』１６３、３０１−３１１）。
【０２５７】
ｍ）「ＣＤＲ３Ｍｅａｎ」マクロ
「ＣＤＲ３Ｍｅａｎ」というマクロは、各プロファイルおよび各サンプルに対するＣＤＲ３の長さの平均を計算する。これはＭｕｇｎａｉｎｉ他で示されているように便利なものでありうる（Ｍｕｇｎａｉｎｉ、Ｅ．Ｎ．、Ｔ．Ｅｇｅｌａｎｄ、Ａ．Ｍ．Ｓｙｖｅｒｓｅｎ、Ａ．Ｓｐｕｒｋｌａｎｄ、ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｂｒｉｎｃｈｍａｎｎ、１９９９「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ３  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ＣＤＲ３  ｌｅｎｇｔｈｓ  ｆｒｏｍ  ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」『Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ』２２３、２０７−２１６）。
【０２５８】
ｎ）「ＳｅｐａｒａｔｅｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」マクロ
「ＳｅｐａｒａｔｅｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」というマクロは、ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎにしたがってピークをグループ化させることで、ピークの視覚的な分離を達成させるものである。このマクロは、ピークを再ソートして各自の独自の基準に合わせていれば、便利なものとなる。ただ、ピークを分けようとしているエリアを選択し、ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーの「ＳｅｐａｒａｔｅｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ」を選択する。ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（または他の情報など）を含んでいるカラムのカラム番号を指定するように指示される。
【０２５９】
ｏ）「Ｅｘｐｏｒｔ＿Ｐｅａｋｓ」マクロ
「Ｅｘｐｏｒｔ＿Ｐｅａｋｓ」というマクロはプロファイル中の各ピークに対する使用割合を含んでいるアレイを生成する。このアレイは、Ｅｘｃｅｌから他のソフトウェア（Ｓｔａｔ  Ｖｉｅｗのような統計ソフトも含めて）にデータをエクスポートするためにより適している。
【０２６０】
ｐ）「Ｉｎｖｅｒｓｅ＿Ａｒｒａｙ」マクロ
「Ｉｎｖｅｒｓｅ＿Ａｒｒａｙ」というマクロはあらゆるＥｘｃｅｌのアレイを反転させるためのユーティリティである。マクロは、ワークシートを含んでいるデータが起動中であるときに呼び出されるべきものであり、そして置き換えようとするアレイを指示する。結果は別々のワークシートに入力される。その代わりに、アレイを置き換えるために、Ｅｘｃｅｌの特別なコピーを用いることができる。
【０２６１】
ｑ）結論
これらのテストおよびユーティリティを結合させることによって、肉眼では不可能となってしまうような、レパートリーの良好な表示を得られる。追加の得点付けの方法は現在開発中であり、将来のバージョンには実装されることになっている。
【０２６２】
例３．８：データ・ユーティリティ
データ・ユーティリティはデータ・フォーマッターのファイルを処理するためのユーティリティを提供する。
【０２６３】
ａ）「ＲｅｎａｍｅＮａｔｕｒｅ」マクロ
このユーティリティは各ウェルの記号表示を変更するために用いられる。「ｐａｒａ」シートにおいて変更すべきさまざまなファイルを特定化しなければならない一方で、「ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ」シートでは、「ｉｎ」の行に探すべき文字列を入力し、「ｒｅｐｌａｃｅ  ｂｙ」の行には、代わりに用いようとする文字列を入力する。「ＮｅｗＮａｍｅ」の行がこのマクロでは使われないことに注意すべきである。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーの「ＲｅｎａｍｅＮａｔｕｒｅ」を選んだ後で、処理すべきデータ・フォーマッターのファイル（すべて同一のフォルダになければならない）の一つを選択する。それから、すべての特定化されたファイルにおいて、「ｉｎ」の文字列に現れたそれぞれは、対応する「ｒｅｐｌａｃｅ  ｂｙ」の文字列によって自動的に置換されることになる。
【０２６４】
データ・ユーティリティのＥｘｃｅｌテンプレートでは、この研究所で用いられたパラメータ化の例のついたワークシートを見つけることができる。
【０２６５】
ｂ）「ＣｈａｎｇｅＯｎｅｍＴｈｅｏｒｉｃＬｅｎｇｔｈ」マクロ
このマクロは、すべてのシートと、プロファイルのｐａｒａシートで指示されたすべてのデータ・フォーマッターのファイルにあるｍＴｈｅｏｒｉｃＬｅｎｇｔｈパラメータを、ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎとユーザーが入力した新しいｍＴｈｅｏｒｉｃＬｅｎｇｔｈの値にしたがって置換するものである。
【０２６６】
「ＳｈｉｔｆｍＬｅｎｇｔｈｓ」マクロ
このマクロは、すべてのシートと、プロファイルのｐａｒａシートで指示されたすべてのデータ・フォーマッターのファイルにあるすべてのピークのｍＬｅｎｇｔｈの値を、ｍＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎとユーザーが入力した新しいｍＴｈｅｏｒｉｃＬｅｎｇｔｈの値にしたがってシフトさせるものである。
【０２６７】
ｄ）「ＤＦＣｏｎｖｅｒｔｅｒ」マクロ
「ＤＦＣｏｎｖｅｒｔｅｒ」というマクロによって、古いデータ・フォーマッターのファイルを最新版のデータ・フォーマッターに変換できるようになる。データ・ユーティリティを開き、「ｐａｒａ」シートに入力する。つまり、変換すべきファイルの名前、ならびに、新しい名前を入力するのであり、該新しい名前の下で、ＩＳＥＡｐｅａｋｓが各自の変換されたデータをセーブするようにする（シートの行はこのマクロでは用いられない。したがって、データ・フォーマッターは一回だけ現れるようになっている）。「ｐａｒａ」シートを用いることで、ファイルの巨大の集合を変換できるようになる。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーの「ＤＦＣｏｎｖｅｒｔｅｒ」という項目を選択する。
【０２６８】
各自の古いデータ・フォーマッターのファイルが保存されているフォルダを指示する（新しいデータ・フォーマッターのファイルもまた、このフォルダに保存されることになる）。変換が開始される。古いファイルのそれぞれが開かれ、データが転送され、そして割合の計算が行われ、ページのセットアップもまた、コピーされる。
【０２６９】
ｅ）「ＤＦＳｐｌｉｔｅｒ」マクロ
このマクロによって、データ・フォーマッターのファイルに保存されたデータを、新しく作成されたデータ・フォーマッターのファイルの別々のデータシートに分けられるようになる。たとえば、Ｖβ０８．１−ＪβおよびＶβ０８．２−Ｊβレパートリーを分析し、ＩＳＥＡｐｅａｋｓアドインの設定を、プロファイルのこれら二つの群が共通のデータシート（１２＋１２＝２４プロファイル）に収集されるようにセットすることを想定しよう。他のデータユーティリティマクロのために行われるように、ＤＦＳｐｌｉｔｅｒは、「ｐａｒａ」シート内に特定されているすべてのワークブック中の、さまざまなデータシートにデータを分割できるようにする。「ｐａｒａ」シートに分割すべきワークブックの名前を入力し、データ・フォーマッターのファイルのテンプレート（ｄａｔａ．１のシートを含んでいなければならない）と、データシートが分割される回数を指示する（たとえば２回）。マクロは各ワークブックを開き、データを分割することになる。マクロはプロファイルの数が分割数によって割り切れることと、設定が作成されたワークブック（たとえば、１２であるべき設定）に適切であることを確認する。
【０２７０】
例３．９：実例
各例について、「Ｒｅａｄｍｅ．ｔｘｔ」ファイルが、実例ツアーを行うためにするべきことのさらなる詳細を与えてくれる。
【０２７１】
ＤＰ＆Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｉｌｅｓ
「ＤＰ＆Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｉｌｅｓ」というフォルダの中にあるファイルは、ＣＧＥＬパラメータ・ファイルと、３ＳＥＴＣＰ  ｖ２．０と３ＳＥＴ２．１  ｖ２．０用の対応するＥｘｃｅｌのデータ・パラメータのシートを供給する。つまり、３６個のウェルのゲル、３つのヒトのＶβ−Ｃβレパートリー、ｍ３ＳＥＴ  ｖ２．０：３６個のウェルのゲル、３つのマウスのＶβ−Ｃβレパートリー；Ｖｂ２、３、５．１、４、１６、７−Ｊｂ  ｖ２．０；および、Ｖｂ６、９、８．１、８．２、１４、８．３−Ｊｂ  ｖ２．０：二つの３６個のウェルのゲルに対する１２個のマウスＶβ−Ｊβレパートリーの分析である。これらのファイルはマクロに関連づけられたデータ・パラメータで用いることができる。
【０２７２】
ＤＥ、ＤＳ、ＤＥＳ＆ＤＦ：Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのデータ
「ＩＳ  Ｅｘａｍｐｌｅ」というフォルダの中にあるファイルは、ＣＧＥＬパラメータ・ファイルから、データ・フォーマッターのファイルにある抽出されたデータのフォーマッティングへの、ゲルの分析例を提供している。
【０２７３】
ＤＥ、ＤＳ、ＤＥＳ＆ＤＦ：ＧｅｎｅＳｃａｎのデータ
「ＧＳ  Ｅｘａｍｐｌｅ」というフォルダの中にあるファイルは、ＣＧＥＬパラメータ・ファイルからデータ・フォーマッターのファイルにある抽出されたデータのフォーマッティングへの、２つのゲルの分析例を提供している。この「ＧＳ  Ｅｘａｍｐｌｅ」にあるＲｅａｄｍｅ．ｔｘｔを参照のこと。
【０２７４】
ＤＡ
「ＤＡ」というフォルダは、データ・アナライザーのすべてのマクロの結果が保存されている、「ＤＡ  ２．０ｅｘ」というデータ・アナライザーのファイルで用いられた、データ・フォーマッターのファイルを収集する。
【０２７５】
Ｕｔｉｌｉｔｉｅｓ
「．Ｐｉｃｔ  ｆｉｌｅｓ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ」というフォルダは、ＣＰＩＣファイル・パラメータ（「ＣＰｉｃｔＰｌａｃｅｓ  ｐａｒａ  ｖ２．０」）にしたがって、さまざまなＰＩＣＴファイルを収集したデータと結果を収集する。
【０２７６】
例３．１０：Ｐｉｔｆａｌｌｓ
プログラムを操作するとき、いくつかのエラーは極めてふつうのことである。ＩＳＥＡｐｅａｋｓにおける文字列が「；」という文字を含んではならないことを思い出そう。データ・エクストラクタは「．ｐｉｃｔ」ファイルのどれも開かない。「ｍＴｙｐｉｃａｌＰｉｃｔＦｉｌｅＮａｍｅ」（図１７）の値が正しいかどうか確認する。データファイルの名前は、該データファイルがＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ（登録商標）ソフトウェアによって自動的に割り当てられた２つ以上の図を含んでいなければ、どのようなものであってもよい。これがあてはまっていなければ、プログラムは警告を発することになる。また、選択された「．ｐｉｃｔ」ファイルとＣＧＥＬパラメータ・ファイルが同一のフォルダにあることを確認する。ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージで用いられるファイルのさまざまなタイプを混同しないように気をつける。タイプと対応するアイコンは、混同する可能性を制限するように作成されている。さまざまなファイル・タイプを区別するための良い方法は、ファイル名に接頭辞を加えることである。「Ｉｓ  ｍ３ＳＥＴ」は、「ｍ３ＳＥＴ」というＣＧＥＬパラメータ・ファイルを用いて作成されたＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのマクロということになる。ＣｒｅａｔｅＣＧｅｌＦｉｌｅマクロを用いるとき、Ｅｘｃｅｌがフリーズしたように見えることがあるかもしれない。これは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓアドインが通信しているその他のアプリケーションがＥｘｃｅｌに、ジョブが終わっていることを伝えないからである。これを避けるためには、ＣｒｅａｔｅＣＧｅｌＦｉｌｅを実行した直後に、各自のマックのデスクトップ（またはＥｘｃｅｌに関係しないあらゆるウィンドウ）をクリックする。Ｅｘｃｅｌが終了すると、Ｆｉｎｄｅｒがアクティブになる。Ｅｘｃｅｌに戻るだけである。
【０２７７】
以下の例は、ＩＳＥＡｐｅａｋｓソフトウェアを用いる分析として与えられ、該ソフトウェアの良好な作動を確認するためのものである。
【実施例４】
【０２７８】
例４．１  マウスの実験モデルでの、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａの感染におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球レパートリーの摂動。
【０２７９】
例４．２：実験モデル
この研究は野生由来のＰＷＫ近交系マウスで実行したのだが、ＰＷＫマウスの臨床的および生物学的特徴がヒトで観察されるものと類似しているため、該マウスがヒトのＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒの感染に対する、有望な新しいモデルとして選択された。ＰＷＫマウスは、フットパッドでＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒに感染させた。感染後７週、２０週および２７週で、６匹のマウス群を屠殺した。リンパ球の懸濁液を、リンパ節（Ｇ）と脾臓（Ｒ）から抜き取って調製し、ＣＤ４＋とＣＤ８＋の亜群に分けた。６匹の追加のマウスを感染直後に屠殺し、対照として用いた。
【０２８０】
ＲＮＡ全体を抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ技術を応用することで、ＶβＣβレパートリーの多様性を記述した。
【０２８１】
例４．３：疑問
感染中のＴリンパ球レパートリーの摂動はどのようなものか。
感染後の早期（７週）と後期（２７週）で摂動は異なるのか。
器官によって摂動は異なるのか。
ＣＤ４＋とＣＤ８＋の亜群によって摂動は異なるのか。
【０２８２】
例４．４：結果
結果は、以下のページと、この分析をまとめた図２９〜図１２５に示されている。
−ＩＳＥＡｐｅａｋｓデータは、ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのＴＣＲのＢＶ−ＢＣレパートリーのデータから集められ、「ＤａｔａＡｎａｌｙｓｅｒ  Ｐｅａｋｓ」という四つのデータベースに収集された。
ｉ．感染後０週、７週、２０週、２７週の脾臓ＣＤ８＋のサンプル。
ｉｉ．感染後０週、７週、２０週、２７週の脾臓ＣＤ４＋のサンプル。
ｉｉｉ．感染後０週、７週、２０週、２７週のリンパ節ＣＤ８＋のサンプル。
ｉｖ．感染後０週、７週、２０週、２７週のリンパ節ＣＤ４＋のサンプル。
−「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」（Ｇ１％）の表が生成され、対照群について測定された平均的な変動性に対して、すべてのサンプルの各Ｖβ−Ｃβプロファイルについての全体的な変動性が表示された。それから、「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」は、群がレパートリーの多様性に基づいて統計的に異なっているかどうかを判断するために、ＡＮＯＶＡによって計算された。
−「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の表が各群について生成され、群内の多発性のクローンリンパ球の拡張を示唆するものである、多発性のオリゴクローンのピークが存在する可能性を示している。発見的には、閾値は対照群の「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の最大値に対応し、該対照群については、有意な拡張は期待されていない。ここでは有意な拡張のみを示している。
−「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ」の表（Ｒ％）が作成され、すべてのサンプルの各Ｖβ−Ｃβプロファイルに対する発現レベルを示している。ここで用いられた発現条件は量的なものではなく、したがってこの値は大きな変化が観察されたときにのみ示唆的であることに注意すべきである。
−７週と２７週についての合成グラフが描かれ、Ｖβ−Ｃβの組み合わせの「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」を表しており、該組み合わせに対し、「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」は対照のマウスより統計的に大きかった。
【０２８３】
例４．５：結論
発明の明細書ＤＩ９９−９２とＤＩ０２−４８および対応する特許分野で説明されている、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法の実行によって得られた分析の要素に基づき、我々は以下の結論を裏付けることができる。
−ＣＤ８＋レパートリーは、特に脾臓において、ＣＤ４＋レパートリーよりあまり大きな摂動が起こらないように見える。
−ＲのＣＤ８＋の中で摂動が起こった少数のＶβ−Ｃβの組み合わせが７週目の群と２７週目の群で見られる。逆に、ＧのＣＤ８＋の中で摂動が起こったＶβ−Ｃβの組み合わせは、摂動が２７週目の群における対照群に近いとき、ほとんどが７週目の群の中で見られる。
−ＣＤ４＋のレパートリーについては、多くのＶβ−Ｃβの組み合わせは脾臓およびリンパ節において摂動が起こっている。かさねて、より際立っていることには、ＧのＣＤ４＋の中で摂動が起こっているＶβ−Ｃβの組み合わせは、２７週目の群の摂動より、７週目の群の中での方が、ほとんど常に高くなっている。
【０２８４】
寄生虫感染のもう一つのマウスの実験モデル（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒに感染したＰＷＫマウス）において、これらの結果はしたがって、繊細なリンパ球レパートリーの摂動を判別するためのＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法の威力を示すものであり、これを用いなければ、該摂動は肉眼では検出できないであろう。
【実施例５】
【０２８５】
例５．１：マウス実験モデルにおけるαβＴリンパ球のレパートリーに対するＬＡＣＫタンパク質の効果。
【０２８６】
例５．２：実験モデル
この研究は、７週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃマウスで行った。それらはフットパッドの部位で、ＬＡＣＫプロテインまたはＬＡＣＫｐ（１５６−１７３）ペプチドを注射され、抗ＩＬ−２抗体による処理を伴った、または伴っていないものである。マウスのすべての群は５匹の個体を含んでいる。五匹の追加のマウスはＤＭＥＭ緩衝液を注射され、対照として用いられた。
【０２８７】
リンパ節の抜き取りを、注射後１６時間で行った。全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。
【０２８８】
まず、Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅの技術を応用することで、Ｖβ４、Ｖβ８．１、Ｖβ３、Ｖα２、Ｖα８およびＶα１５のＴＣＲＢＶ−ＢＣの組み合わせに対する、ＶαＣαとＶβＣβレパートリーの多様性が記述された。第二に、Ｖβ４−ＪβとＶβ８．１−Ｊβの多様性を分析した。
【０２８９】
例５．３：疑問
ＬＡＣＫプロテインまたはＬＡＣＫｐ１５６−１７３ペプチドによる免疫付与に続いて、αβＴリンパ球の多様性の摂動を検出することができるのか。
【０２９０】
例５．４：結果
ＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのデータはＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法を実行して分析された（データの抽出、データの平滑化、データのフォーマット化、ピーク・データベースの構築、データの分析）。結果は以下のページ、および、この分析をまとめている図２９〜図１２５に提示されている。
−多様なゲルを通してデータの抽出を用意するために、ＩＳＥＡｐｅａｋｓで「データ・アナライザーＤＡ」の表が作成された。群におけるサンプルの分布が示されるのはこのレベルである。
−「データ・アナライザーのピーク」の表は、すべてのグループのすべての個体について得られたピークのデータベースに対応している。
−「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の表は、対照群（群番号１−ＤＭＥＭ注射）について測定された平均的な変動性に対して、すべてのサンプルのＶα−Ｃαプロファイル、Ｖβ−ＣβプロファイルまたはＶβ−Ｊβの各プロファイルについての全体的な変動性を表示している。
−各群についての「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の表は、群内での多発性のクローンリンパ球の拡張を示唆するものである、多発性のオリゴクローンのピークが存在する可能性を示している。発見的には、閾値は対照群の「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の最大値に対応し、該対照群については有意な拡張は期待されていない。
−「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の表は「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の値によって正規化されている。各個体およびＶα−Ｃα／Ｖβ−Ｃβ／Ｖβ−Ｊβの各組み合わせについて、個体の「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の値は、群のＶα−Ｃα／Ｖβ−Ｃβ／Ｖβ−Ｊβの組み合わせに対する最大のＯｌｉｇｏｓｃｏｒｅの割合によって正規化され、該群は、対照群について測定されたＶα−Ｃα／Ｖβ−Ｃβ／Ｖβ−Ｊβの組み合わせに対する最大のＯｌｉｇｏｓｃｏｒｅの考慮対象になっている。
−「アレイ描画」の表は「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の値のためのものである。
−「アレイ描画」の表は、「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」によって正規化された「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の値のためのものである。
【０２９１】
例５．５：結論
発明の明細書ＤＩ９９−９２とＤＩ０２−４８および対応する特許分野で説明されている、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法の実行によって得られた分析の要素に基づき、我々は以下の結論を裏付けることができる。
−Ｖα−ＣαレパートリーもＶβ４−Ｃβレパートリーも、対照群との比較によるいかなる摂動も示さないのに対し、Ｖβ８．１−Ｃβレパートリーは摂動への傾向を示す。
−対照群内のＶβ４−Ｊβの組み合わせの平均摂動に対する、Ｖβ４−Ｊβの組み合わせの摂動の比較は、まったく差異を示さない。すべてのピークの代表性について、それは同じである。
−Ｖβ８．１−Ｊβの組み合わせに関して、対照群を上回る摂動がＶβ８．１−Ｊβ１．１、Ｖβ８．１−Ｊβ１．２、Ｖβ８．１−Ｊβ２．２、Ｖβ８．１−Ｊβ２．７の組み合わせについて観察され、より小さい範囲としてはＶβ８．１−Ｊβ１．３の組み合わせについて観察されたのだが、これは四つの実験群に対してのことである。この摂動は代表性とは関係していない。逆に、ＯｌｉｇｏｓｃｏｒｅによってＧｏｒｏｃｈｏｖ摂動を正規化するとき、以下の組み合わせに対する、オリゴクローンのピーク拡張の発生に関係した、摂動の高まりが現れる。
・ＬＡＣＫ群およびＬＡＣＫｐ群内のＶβ８．１−Ｊβ１．１、Ｖβ８．１−Ｊβ１．２、Ｖβ８．１−Ｊβ１．３、Ｖβ８．１−Ｊβ１．４。
・四つの実験群内のＶβ８．１−Ｊβ２．１、Ｖβ８．１−Ｊβ２．２、Ｖβ８．１−Ｊβ２．３、Ｖβ８．１−Ｊβ２．４およびＶβ８．１−Ｊβ２．７。
・抗ＩＬ−２抗体による処理を伴う、または伴わないＬＡＣＫｐペプチドの群におけるＶβ８．１−Ｊβ１．５。
【０２９２】
もう一つのマウス実験モデルにおいて、これらの結果はしたがって、繊細なリンパ球レパートリーの摂動を判別するためのＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法の威力を示すものであり、これを用いなければ、該摂動は肉眼では検出されないであろう。
【実施例６】
【０２９３】
例６．１：脳マラリアのマウス実験モデルにおけるαβＴリンパ球レパートリーの摂動の動態。
【０２９４】
例６．２：実験モデル
この研究は２ヶ月齢のＢ１０．Ｄ２マウスで行った。それらを１０６個のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ＡＮＫＡのクローン１．４９Ｌが寄生した赤血球の腹腔内注射によって感染させた。我々は、マウスの六つの群を構成した。つまり、Ｊ３、Ｊ４、Ｊ５およびＪ６群である（それぞれ、感染後３日、４日、５日、そして６日である）。Ｊ４、Ｊ５およびＪ６群は１０匹のマウスを含でおり、Ｊ３群は５匹のマウスを含んでいた。ＴＳＰ群は感染した２０匹の個体を含み、脳マラリア（ＣＭ）の発症を追跡するために用いた。寄生虫血症を、マウスを屠殺する前に、感染を確認するために体系的に評価した。五匹の追加のマウスは感染させず、対照として用いた（ＴＮ群）。血液、脾臓および脳を各個体について収集した。ＴＳＰ群については、収集は、ＣＭの臨床兆候の発症期に行ったのだが、該兆候は、麻痺症状、頭部の偏向、呼吸困難によって評価した。ＴＮ群については、収集は実験の１４日目に行った。全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。
【０２９５】
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ技術を応用することで、２３個すべてのＶβのＴＣＲＢＶ−ＢＣの組み合わせに対して、Ｖβ−Ｃβレパートリーの多様性が記述された。
【０２９６】
例６．３：疑問
Ｐ．ｂｅｒｇｈｅｉ感染におけるＶβ−Ｃβレパートリーの摂動の動態はどのようであるか。
【０２９７】
例６．４：結果
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのデータは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法を実行して分析された（データの抽出、データの平滑化、データのフォーマット化、ピーク・データベースの構築、データの分析）。結果は以下のページと、この分析をまとめている図２９〜図１２５に提示されている。
−多様なゲルを通してデータの抽出を用意するために、「データ・アナライザーＤＡ」の表がＩＳＥＡｐｅａｋｓで作成された。群におけるサンプルの分布が示されるのはこのレベルである。
−「データ・アナライザーのピーク」の表は、すべての群のすべての個体について得られたピークのデータベースに対応している（印刷せず）。
−「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の表は、対照群（感染していないＴＮ群）について測定された平均的な変動性に対して、すべてのサンプルの各Ｖβ−Ｃβプロファイルについての全体的な変動性を表示している。
−各群についての「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の表は、群内での多発性のクローンリンパ球の拡張を示唆するものである、多発性のオリゴクローンのピークが存在する可能性を示している。発見的には、閾値は対照群の「ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅ」の最大値に対応し、該対照群については有意な拡張は期待されていない（印刷せず）。
−「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の表は、「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の値によって正規化されている。各個体およびＶβ−Ｃβの各組み合わせについて、個体の「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の値は、群のＶβ−Ｃβの組み合わせに対する最大のＯｌｉｇｏｓｃｏｒｅの割合によって正規化され、該群は、対照群について測定されたＶβ−Ｃβの組み合わせに対する最大のＯｌｉｇｏｓｃｏｒｅの考慮対象となっている（印刷せず）。
−「アレイ描画」の表は、「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の値のためのものである。
−「アレイ描画」の表は、「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」によって正規化された「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の値のためのものである。
−いくつかの実験群が小さなサイズであるにもかかわらず、Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動のデータは、Ｖβ−Ｃβの各組み合わせについて、群間の統計的に有意な差異を同定するために、分散分析によって分析された。予備考察を確証するために、もう一つの分散分析が個体の三つの集合についてのみ行われた。つまり、対照、Ｊ３、およびＪ４の群を含む第一の集合、Ｊ５群に対応する第二の集合、そしてＪ６およびＴＳＰの群を含む第三の集合である。
【０２９８】
例６．５：結論
発明の明細書ＤＩ９９−９２とＤＩ０２−４８および対応する特許分野で説明されている、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法の実行によって得られた分析の要素に基づき、我々は以下の結論を裏付けることができる。
−この実験の全体的な結果は、レパートリーの摂動は、感染していない対照と比較して、ＣＭにおいて観察されうるものだという、我々の先行する観察を確証するものである。
−この研究から、レパートリーの摂動は感染中に進行していると考えられる。その一方で、レパートリーは全体として、一方ではＴＮ、Ｊ３、およびＪ４の群の間では異なってはおらず、また、Ｊ６とＴＳＰの間でも異なっていない。Ｊ５群は中間的であるようである。
−いくつかのＶβ−Ｃβの組み合わせについては、摂動のシフトがＪ４とＪ５の間で起こる。その他の組み合わせについては、Ｊ５とＪ６の間で起こる。これは、三つの集合［ＴＮ、Ｊ３、Ｊ４］、［Ｊ５］および［Ｊ６、ＴＳＰ］の分散分析から得られたデータを見ることで確証される。
【０２９９】
これらの結果は、Ｖβ−Ｃβレパートリーの摂動データの予測的／診断的な値を提案するものである。これらは、繊細なリンパ球レパートリーの摂動を判別するためのＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法の威力を示すものであり、これを用いなければ、該摂動は肉眼では検出されないであろう。
【実施例７】
【０３００】
例７．１：マウスのマラリア・モデルにおけるαβＴリンパ球のレパートリーに対して、放射線照射したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓをワクチン接種する効果。
【０３０１】
例７．２：実験モデル
この研究はＣ５７ＢＬ／６マウスで行った。マウスは以下のように群を構成した。
−マウスの一つの群は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ感染に対する防御性を誘発するために、放射線照射したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓで三回免疫付与した（Ｉ３＊）。
−マウスの一つの群は、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ感染に対する防御性を誘発するために、放射線照射したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓで三回免疫付与し、後で感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓを攻撃させた（Ｉ３＊Ｓ）。
−マウスの一つの群は、感染性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓを攻撃させた（Ｓ）。
−操作していないマウスの追加の群は、対照として用いた（Ｔ）。
【０３０２】
攻撃の一週間後、脾臓（Ｒ）と肝臓（Ｆ）を収集し、リンパ球の懸濁液を調製した。全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。
【０３０３】
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ技術を応用することで、２３個すべてのＶβのＴＣＲＢＶ−ＢＣの組み合わせについて、Ｖβ−Ｃβレパートリーの多様性が記述された。
【０３０４】
例７．３：疑問
−群間のレパートリーの多様性の摂動の差異を検出することができるのか。
−特に、放射線照射したｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓでマウスが免疫付与されているときとされていないときで、攻撃における差異が存在するのか（Ｓ群対Ｉ３＊Ｓ群）。
−器官の間で差異はあるのか（肝臓対脾臓）。
【０３０５】
例７．４：結果
Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅのデータは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法を実行して分析された（データの抽出、データの平滑化、データのフォーマット化、ピーク・データベースの構築、データの分析）。結果は以下のページとこの分析をまとめている図２９〜図１２５に提示されている。
−「データ・アナライザーＤＡ」の表は、多様なゲルを通してデータの抽出を用意するために、ＩＳＥＡｐｅａｋｓで作成された。群におけるサンプルの分布が示されるのはこのレベルである。
−「データ・アナライザーのピーク」の表は、すべての群のすべての個体について得られたピークのデータベースに対応している（印刷せず）。
−「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の表は、対照群（感染していないＴＮ群）について測定された平均的な変動性に対して、すべてのサンプルの各Ｖβ−Ｃβプロファイルについての全体的な変動性を表示している。
−平均の「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」のグラフは、各Ｖβ−Ｃβの組み合わせについて、そして平均に対して、器官（Ｒ＆Ｆ）の間と実験群（Ｔ群、Ｓ群、Ｉ３群＊＆Ｉ３＊Ｓ群）の間の摂動を比較している。
−各群に対する「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の表は、群内における多発性のクローンリンパ球の拡張を示唆するものである、多発性のオリゴクローンのピークが存在する可能性を示している。発見的には、閾値は対照群の「Ｏｌｉｇｏｓｃｏｒｅ」の最大値に対応し、該対照群は有意な拡張を期待されていない。
−「アレイ描画」の表は「Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動」の値のためのものである（印刷せず）。
−Ｇｏｒｏｃｈｏｖ摂動のデータは各Ｖβ−Ｃβの組み合わせについて、群間の統計的に有意な差異を同定するために分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析された。
−主成分分析に続く判別分析は、ピークの割合の情報に基づいて区別されうる群の数を判断するために行われた。最初の五つの要因にしたがったデータのプロットが示されている。
【０３０６】
例７．７：結論
発明の明細書ＤＩ９９−９２とＤＩ０２−４８および対応する特許分野で説明されている、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法の実行によって得られた分析の要素に基づき、我々は以下の結論を裏付けることができる。
【０３０７】
添付の表にまとめられているように、データの統計分析は器官（Ｒ対Ｆ）または実験群（特にＩ３＊Ｓ群対Ｓ群）の間におけるレパートリーの摂動の差異を示している。この研究によって、我々は、データを分析する上での判断を助ける決定ツリーを描くようになった（添付文書を参照）。ＰＣＡ／ＤＡ分析もまた、実験群＋器官の組み合わせがＶβ−Ｃβレパートリーの多様性の情報に基づいて区別できるという証拠を与えるものである。要因１、２および３が、実験群Ｆ３＊対Ｆ３＊Ｓ対ＦＴ／ＲＴ／Ｒ３＊Ｓ対ＦＳ／Ｒ３＊／ＲＳの間を判別できると考えられる。この分析は、放射線照射したｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓによるワクチン接種に続く、免疫反応の防御性の要素を判断することを助けてくれるものである。
【０３０８】
もう一つのマウスの実験モデルでは、これらの結果はしたがって、繊細なリンパ球レパートリーの摂動を判別するためのＩＳＥＡｐｅａｋｓ方法の威力を示すものであり、これを用いなければ、該摂動は肉眼では検出されないであろう。
【０３０９】
生データのコンピュータ一覧表示の参照記号およびＩＳＥＡｐｅａｋｓソフトウェアの補遺。
ここでは生データのコンピュータ一覧表示が三部のファイル（それぞれコピー２．１、コピー２．２、コピー２．３、コピー３．１、コピー３．２およびコピー３．３と標識）で、二つの別々の読み出し専用メモリのコンパクト・ディスク（ＣＤ−ＲＯＭ）にファイルされている。生データ補遺の全内容がここで参照記号によって統合されている。
【０３１０】
生データ補遺のコンピュータ一覧表示の三部のそれぞれは、２００３年７月１日に作成された。
【０３１１】
ここでは、ＩＳＥＡｐｅａｋｓ２．０．１Ａのソフトウェア・プログラムのコンピュータ一覧表示が三部のファイル（それぞれコピー４．１、コピー４．２および４．３と標識）で、別々の読み出し専用メモリのコンパクト・ディスク（ＣＤ−ＲＯＭ）にファイルされている。ＩＳＥＡｐｅａｋｓのソフトウェア・プログラムのコンピュータ一覧表示の全内容が、ここで参照記号によって統合されている。
【０３１２】
生データ補遺のコンピュータ一覧表示の三部のそれぞれは、２００３年７月１日に作成された。
【０３１３】
上記技術を考慮して、本発明に対する数多くの修正および変更が可能である。したがって、添付の請求の範囲内において、ここで特定的に説明したものを超えなければ、本発明は実行することができるものであると理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０３１４】
【図１】コンピュータ・システム１１０１を表す図である。
【図２】ＣＭ−、ＣＭ＋およびＣＴＲマウスの典型的なＰＢＬのレパートリーを表す図である。
【図３】判別分析によってＣＭ＋脾臓、ＣＭ−ＰＢＬ、およびＣＭ−脾臓のＢＶ−ＢＣレパートリーからＣＭ＋ＰＢＬが分離されることを表す図である。
【図４ａ】ＣＴＲ脾臓群を対照として用いて、ＩＳＥＡｐｅａｋｓで計算されたＢＶ−ＢＣの摂動（ＤＢＶ−ＢＣ）を表す図である。
【図４ｂ】ＤＢＶ−ＢＣに対して、ｋ＝４およびｋ＝３でのｋ平均クラスタ化によって得られたサンプルのクラスタを概略的に表示する図である。
【図４ｃ】ＤＢＶ−ＢＪデータに対して、ｋ＝３でのｋ平均クラスタ化によって正しくグループ化されたＰＢＬサンプル（６個のＣＴＲ、５個のＣＭ−および６個のＣＭ＋）のＢＶ−ＢＪレパートリーを表す図である。
【図５】ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅおよび摂動分析によって同定された多発性の拡張のＢＶ−ＢＪのＣＤＲ３プロファイルを表す図である。
【図６】ＩＳＥＡｐｅａｋｓのアーキテクチャとデータのフローチャートを表す図である。
【図７Ａ】Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ製品によって供給されたヒトのＢＶ４−ＢＣを増幅したもののＣＤＲ３プロファイルである。
【図７Ｂ】データ・エクストラクタで抽出した後（Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅの生のピーク・データ）、そしてデータ・スムーザーの三つのフィルタを適用した後で得られたピークのヒストグラムを表す図である。
【図７Ｃ】データ・フォーマッターのファイルに現れる各フィルタを通した後の、このＢＶ４−ＢＣプロファイルのピーク・データの表である。
【図８】ＢＶ−ＢＣレパートリーにしたがったサンプルの分離を表す図である。
【図９】ＢＶ−ＢＣの摂動を表す図である。
【図１０Ａ】高寄生虫血症におけるＢＶ−ＢＣレパートリーの摂動（ＤＢＶ−ＢＣ）を表す図である。
【図１０Ｂ】ＤＢＶ−ＢＣに対するｋ＝２でのｋ平均クラスタ化で得られたサンプルのクラスタを概略的に表す図である。
【図１１】高寄生虫血症におけるＤＢＶ−ＢＪの摂動を表す図である。
【図１２】ＨＰとＣＴＲマウスのＰＢＬにおける、ＢＶ２−ＢＪ１．３とＢＶ２  ＢＪ１．１のＣＤＲ３プロファイルを表す図である。
【図１３】ＩＳＥＡｐｅａｋｓパッケージの組織図を表す図である。
【図１４】ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメイン・メニューを表す図である。
【図１５】ＩＳＥＡｐｅａｋｓの設定メニューを表す図である。
【図１６】ＩＳＥＡｐｅａｋｓのメニュー・バーを表す図である。
【図１７】データ・パラメータのＣＧＥＬワークシートを表す図である。
【図１８】データ・パラメータのＣＰＩＣＴＰＬＡＣＥＳワークシートを表す図である。
【図１９】データ・フォーマッターのファイルを表す図である。
【図２０】データ・アナライザーの「パラ」ワークシートが、データ・アナライザーのさまざまなマクロをパラメータ化するために用いられていることを表す図である。
【図２１】データ・アナライザーの「ピーク」のワークシートを表す図である。
【図２２】「ＰｅｒｃｅｎｔＩｍｐｏｒｔ」マクロの結果を表すデータ・アナライザーのワークシートを表す図である。
【図２３】「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ１」のマクロを表す図である。
【図２４】「Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ２」のマクロを表す図である。
【図２５】「ＲＩＳ」のマクロを表す図である。
【図２６】「ＯｌｉｇｏＳｃｏｒｅ」のマクロを表す図である。
【図２７】「ＤｒａｗＡｒｒａｙ」プロシージャがレパートリーにおける多様性の表示を作成することを表す図である。
【図２９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３７】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図３９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４７】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図４９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５７】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図５９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６７】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図６９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７７】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図７９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８７】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図８９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図９０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図９１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図９２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図９３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図９４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図９５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図９６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図９８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１００】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０７】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１０９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１６】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１７】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１８】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１１９】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１２０】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１２１】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１２２】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１２３】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１２４】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【図１２５】実施例４から実施例７の結果を示す図である。
【符号の説明】
【０３１５】
１１０１  コンピュータ・システム
１１０２  バス
１１０３  プロセッサ
１１０４  メインメモリ
１１０５  読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）  
１１０６  ディスク・コントローラ
１１０７  ハード・ディスク
１１０８  リムーバブル・メディア・ドライブ
１１０９  ディスプレイ・コントローラ
１１１０  ディスプレイ
１１１１  キーボード
１１１２  ポインティング・デバイス
１１１３  通信インタフェース
１１１４  ネットワーク・リンク
１１１５  ローカル・エリア・ネットワーク（ＬＡＮ）
１１１６  通信ネットワーク
１１１７  モバイル機器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2005537460.tif 000057
【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
2005537460.tif 000088
【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９８】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【国際調査報告】
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2005537460.tif 000132
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