(57)【要約】  本発明は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して、混合物から目的の化合物を分離する方法に関する。混合物の試料の最初の分離は、分取スケールＨＰＬＣカラム上における目的の化合物の保持時間および溶離時間を予測するために、また場合によって、予想された目的の化合物が混合物中に存在することを確証するために実施される。次いで、分取スケールＨＰＬＣを使用して、化合物の予測された溶離時間を使用し、混合物から化合物の少なくとも一部分を分離し、かつ回収する。
2005512029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）目的の化合物を含有する混合物を提供するステップであり、前記目的の化合物が予測された質量を有しているステップと、
（ｂ）分析用ＨＰＬＣカラムを使用し前記混合物の一部分を分離に掛けて、溶出液流を生成させるステップと、
（ｃ）質量分析計を使用し前記溶出液流を分析して、前記分析用ＨＰＬＣカラム上の前記目的の化合物の保持時間を測定するステップと、
（ｄ）分取スケールＨＰＬＣカラムからの前記目的の化合物の溶離時間を予測するステップであり、
（１）前記分析用ＨＰＬＣカラムにおける前記化合物の前記測定された保持時間と共に、前記分析用ＨＰＬＣカラムと前記分取スケールＨＰＬＣカラムの間の予め測定された相関関数を使用し、前記分取スケールＨＰＬＣカラムからの目的の化合物の保持時間を予測するサブステップと、
（２）その時間ウィンドウ以内に前記化合物が溶離すると予測される、前記予測された保持時間前後の時間ウィンドウを選択するサブステップと
によるステップと、
（ｅ）残留している混合物の全部もしくは一部分を、分取スケールＨＰＬＣカラム、ＨＰＬＣ適合性検出器、およびフラクションコレクタを備えている分取スケールＨＰＬＣ系に掛けるステップと、
（ｆ）前記フラクションコレクタを使用し、前記目的の化合物の少なくとも一部分を回収するステップであり、前記フラクションコレクタが、前記予測された溶離時間以内に前記ＨＰＬＣ適合性検出器によりピークが検出されると起動されるステップと
を含む、混合物から目的の化合物を分離する方法。
【請求項２】
前記ＨＰＬＣ検出器が、ＵＶ検出器、ＥＬＳＤ、屈折率検出器、および化学発光窒素検出器からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記質量分析計から回収されるデータが、本質的に前記目的の化合物の前記予測された質量と、前記分析ＨＰＬＣカラム上の前記化合物の前記保持時間とからなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分析用ＨＰＬＣカラムを使用した前記分離から、ＵＶクロマトグラムが作成されない請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）目的の化合物を含有する混合物を提供するステップであり、前記目的の化合物が予測された質量を有しているステップと、
（ｂ）分析用ＨＰＬＣカラムを使用し混合物の一部分を分離に掛けて、溶出液流を生成させるステップと、
（ｃ）質量分析計を使用し溶出液流を分析して、分析用ＨＰＬＣカラム上の目的の化合物の保持時間を測定するステップと、
（ｄ）分析用ＨＰＬＣカラム上の前記目的の化合物の前記測定された保持時間を使用し、分取スケールＨＰＬＣカラムからの前記目的の化合物の溶離時間を予測するステップと、
（ｅ）残留している混合物の全部もしくは一部分を、分取スケールＨＰＬＣカラムを備えている分取スケールＨＰＬＣ系に掛けるステップと、
（ｆ）前記予測された溶離時間を使用し、前記目的の化合物の少なくとも一部分を回収するステップと
を含む、混合物から目的の化合物を分離する方法。
【請求項６】
前記目的の化合物の溶離時間を予測する前記ステップが、
（１）前記分析用ＨＰＬＣカラムにおける前記化合物の前記測定された保持時間と共に、前記分析用ＨＰＬＣカラムと前記分取スケールＨＰＬＣカラムの間の予め測定された相関関数を使用し、前記分取スケールＨＰＬＣカラムからの目的の化合物の保持時間を予測するステップと、
（２）その時間以内に前記化合物が溶離すると予測される、前記予測された保持時間前後の時間ウィンドウを選択するステップと
を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
人工神経回路網を使用して、ステップ（ｄ）における前記溶離時間を予測する請求項５に記載の方法。
【請求項８】
動的相関関数を使用して、ステップ（ｄ）における前記溶離時間を予測する請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記分取スケールＨＰＬＣ系に、ＨＰＬＣ適合性検出器が含まれる請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出器が、ＵＶ検出器、ＥＬＳＤ、屈折率検出器、および化学発光窒素検出器からなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記質量分析計から回収されるデータが、本質的に前記目的の化合物の前記予測された質量と、前記分析用ＨＰＬＣカラム上の前記化合物の前記保持時間とからなる請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析用ＨＰＬＣカラムを使用した前記分離から、ＵＶクロマトグラムが作成されない請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記分析用ＨＰＬＣカラムを使用した前記分離から、ＵＶクロマトグラムが作成されない請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＰＬＣ系が前記目的の化合物の少なくとも一部分を回収するフラクションコレクタを備え、前記フラクションコレクタが、前記予測された溶離時間以内に前記ＨＰＬＣ適合性検出器によりピークが検出されると起動される請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記分取スケールＨＰＬＣ系に、ＨＰＬＣ適合性検出器が含まれない請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップ（ｆ）の回収がＨＰＬＣ適合性検出器を使用せずに実施される請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）複数の反応生成物混合物を提供するステップであり、各混合物が予測された質量を有する目的の化合物を含有すると予測されるステップと、
（ｂ）分析用ＨＰＬＣカラムを使用し、各反応生成物混合物の一部分を別々に分離に掛けて、複数の溶出液流を生成させるステップと、
（ｃ）質量分析計を使用し各溶出液流を分析して、前記溶出液流が予測された質量を有する化合物を含有することを確証し、かつ前記分析用ＨＰＬＣカラム上の予測された質量を有する各化合物の保持時間を測定するステップと、
（ｄ）前記分析用ＨＰＬＣカラム上の予測された質量を有する各化合物の前記測定された保持時間を使用し、分取スケールＨＰＬＣカラムからの予測された質量を有する各化合物の溶離時間を予測するステップと、
（ｅ）前記予測された質量を有する化合物を含有することが確証された各残留する混合物の全部もしくは一部分を、分取スケールＨＰＬＣカラムおよびフラクションコレクタを備えている分取スケールＨＰＬＣ系に別々に掛けるステップと、
（ｆ）各化合物の前記予測された溶離時間を使用し、前記フラクションコレクタにより、存在していることが確証された各化合物の少なくとも一部分を別々に回収するステップと
を含む、複数の反応生成物混合物中の目的の化合物を分離する方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）において生成される少なくとも２つの溶出液流を、共通の質量分析計中でのステップ（ｃ）における分析のために組み合わせ、前記溶出液流中の前記予測された目的の化合物が、質量分析により識別可能な異なった予測質量を有するように、前記少なくとも２つの溶出液流を選択している請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）において生成される少なくとも２つの溶出液流を、共通の質量分析計中でのステップ（ｃ）における分析のために組み合わせ、前記溶出液流中の前記予測された目的の化合物が質量分析により識別可能であるように、前記溶出液流の少なくとも一方を機械的にコード化する請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
各化合物の溶離時間を予測する前記ステップが、
（１）前記分析用ＨＰＬＣカラムにおける各化合物の前記測定された保持時間と共に、前記分析用ＨＰＬＣカラムと前記分取スケールＨＰＬＣカラムの間の予め測定された相関関数を使用し、前記分取スケールＨＰＬＣカラム上の予測された質量を有する各化合物の保持時間を予測するステップと、
（２）その時間ウィンドウ以内に予測された質量を有する各化合物が溶離すると予測される、各予測された保持時間前後の時間ウィンドウを選択するステップと
を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
人工神経回路網を使用して、ステップ（ｄ）における各化合物の前記溶離時間を予測する請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記分析用ＨＰＬＣカラムを使用した前記分離の直後に、興味ある前記化合物の純度を測定するステップをさらに含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記分取スケールＨＰＬＣ系に、ＨＰＬＣ適合性検出器が含まれる請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出器が、ＵＶ検出器、ＥＬＳＤ、屈折率検出器、および化学発光窒素検出器からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分析ＨＰＬＣカラムを使用した前記分離から、ＵＶクロマトグラムが作成されない請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
興味ある各化合物の溶離時間を予測する前記ステップが、
（１）前記分析用ＨＰＬＣカラム上における各化合物の前記測定された保持時間と共に、前記分析用ＨＰＬＣカラムと前記分取スケールＨＰＬＣカラムの間の所定の相関関数を使用し、前記分取スケールＨＰＬＣカラム上の予測された質量を有する各化合物の保持時間を予測するステップと、
（２）その時間ウィンドウ以内に予測された質量を有する各化合物が溶離すると予測される、各予測された保持時間前後の時間ウィンドウを選択するステップと
を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記分析用ＨＰＬＣカラムを使用した前記分離から、ＵＶクロマトグラムが作成されない請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分取スケールＨＰＬＣ系に、ＨＰＬＣ適合性検出器が含まれる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記分取スケールＨＰＬＣ系に、前記目的の化合物の少なくとも一部分を回収するフラクションコレクタが含まれ、前記フラクションコレクタが、前記予測された溶離時間以内に前記ＨＰＬＣ適合性検出器によりピークが検出されると起動される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
（ａ）目的の化合物を含有する混合物を提供するステップと、
（ｂ）薄層クロマトグラフィを使用し混合物の一部分を分離に掛けて、前記目的の化合物のＲｆ値を測定するステップと、
（ｃ）前記目的の化合物の前記測定されたＲｆ値を使用し、分取スケールＨＰＬＣカラム上の前記目的の化合物の溶離時間を予測するステップと、
（ｄ）残留する混合物の全部もしくは一部分を、分取スケールＨＰＬＣカラムを備えている分取スケールＨＰＬＣ系に掛けるステップと、
（ｅ）前記予測された溶離時間を使用し、前記目的の化合物の少なくとも一部分を回収するステップと
を含む、混合物から目的の化合物を分離する方法。
【請求項３１】
前記目的の化合物の溶離時間を予測する前記ステップが、
（１）前記目的の化合物の前記測定されたＲｆ値と共に、前記ＴＬＣからのＲｆ値と前記分取スケールＨＰＬＣカラム上の保持時間との間の予め測定された相関関数を使用し、前記分取スケールＨＰＬＣカラムからの前記目的の化合物の保持時間を予測するステップと、
（２）その時間ウィンドウ以内に前記化合物が溶離すると予測される、前記予測された保持時間前後の時間ウィンドウを選択するステップと
を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｂ）が、
（１）薄層クロマトグラフィを使用し前記混合物の一部分を分離に掛けて、１つまたは複数のスポットまたは領域を生成させるステップと、
（２）質量分析計を使用し複数のスポットまたは領域を分析して、前記目的の化合物を含有する前記スポットまたは領域を決定するステップと、
（３）前記目的の化合物のＲｆ値を測定するステップと
を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
人工神経回路網を使用して、ステップ（ｃ）における前記溶離時間を予測する請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
動的相関関数を使用して、ステップ（ｃ）における前記溶離時間を予測する請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速液体クロマトグラフィを使用した、１種または複数の混合物からの１種または複数の目的の化合物の分離に関する。
【背景技術】
【０００２】
混合物から反応生成物を同定し、かつ分離するための種々の方法が知られている。これらの方法は、コンビナトリアルケミストリにより得られる化合物の精製ライブラリを作製するために重要である。
【０００３】
米国特許第５６７００５４号は、半分取もしくは分取スケールで複雑な混合物の反応生成物または天然の生成物を分離し、同定し、精製し、かつ定量する、自動化された高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）系を教示している。その特許は、質量分析データと共に第１のＨＰＬＣカラムからクロマトグラムを作成し、かつデジタル記憶させて、半分取もしくは分取ＨＰＬＣ系における試料精製の基準にすることを教示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
分取ＨＰＬＣ系の基準になる、電子的に記憶されたＵＶクロマトグラフデータおよび質量分析計データに頼らない、混合物から反応生成物を分離する方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を使用して、混合物から目的の化合物を分離することに関する。本発明の一態様によれば、混合物から目的の化合物を分離する方法であって、（ａ）目的の化合物を含有する混合物を提供するステップであり、目的の化合物が予測された質量を有しているステップと、（ｂ）分析用ＨＰＬＣカラムを使用し混合物の一部分を分離に掛けて、溶出液流を生成させるステップと、（ｃ）質量分析計を使用し溶出液流を分析して、分析用ＨＰＬＣカラム上の目的の化合物の保持時間を測定するステップと、（ｄ）分析用ＨＰＬＣカラム上の目的の化合物の測定された保持時間を使用し、分取スケールＨＰＬＣカラムからの目的の化合物の溶離時間を予測するステップと、（ｅ）残留している混合物の全部もしくは一部分を、分取スケールＨＰＬＣカラムを備えている分取スケールＨＰＬＣ系に掛けるステップと、（ｆ）予測された溶離時間を使用し、目的の化合物の少なくとも一部分を回収するステップとを含む方法が提供される。
【０００６】
一実施形態においては、（１）分析用ＨＰＬＣカラムにおける化合物の測定された保持時間と共に、分析用ＨＰＬＣカラムと分取スケールＨＰＬＣカラムの間の予め測定された相関関数を使用し、分取スケールＨＰＬＣカラムからの目的の化合物の保持時間を予測するステップと、（２）その時間ウィンドウ以内に化合物が溶離すると予測される、予測された保持時間前後の時間ウィンドウを選択するステップとによって、目的の化合物の溶離時間を予測している。他の実施形態においては、動的相関関数を使用して、目的の化合物の溶離時間を予測する。さらなる実施形態においては、人工神経回路網（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）を使用し、目的の化合物の溶離時間を予測する。
【０００７】
本発明の他の態様によれば、複数の反応生成物混合物中の目的の化合物を分離する方法を提供している。その方法は、（ａ）複数の反応生成物混合物を提供するステップであり、各混合物が予測された質量を有する目的の化合物を含有すると予測されるステップと、（ｂ）分析用ＨＰＬＣカラムを使用し、各反応生成物混合物の一部分を別々に分離に掛けて、複数の溶出液流を生成させるステップと、（ｃ）質量分析計を使用し各溶出液流を分析して、溶出液流が予測された質量を有する化合物を含有することを確証し、かつ分析用ＨＰＬＣカラム上の予測された質量を有する各化合物の保持時間を測定するステップと、（ｄ）分析用ＨＰＬＣカラム上の予測された質量を有する各化合物の測定された保持時間を使用し、分取スケールＨＰＬＣカラムからの予測された質量を有する各化合物の溶離時間を予測するステップと、（ｅ）予測された質量を有する化合物を含有することが確証された各残留している混合物の全部もしくは一部分を、分取スケールＨＰＬＣカラムおよびフラクションコレクタを備えている分取スケールＨＰＬＣ系に別々に掛けるステップと、（ｆ）各化合物の予測された溶離時間を使用し、フラクションコレクタにより、存在することが確証された各化合物の少なくとも一部分を別々に回収するステップとを含む。
【０００８】
一実施形態においては、ステップ（ｂ）において生成される少なくとも２つの溶出液流を、共通の質量分析計中のステップ（ｃ）における分析のために組み合わせる。溶出液流中の予測された目的の化合物が、質量分析により識別可能な異なった予測質量を有するように、少なくとも２つの溶出液流を選択している。
【０００９】
他の実施形態においては、ステップ（ｂ）において生成される少なくとも２つの溶出液流を、共通の質量分析計中のステップ（ｃ）における分析のために組み合わせる。溶出液流中の予測された目的の化合物が、質量分析により識別可能であるように、溶出液流の少なくとも一方を機械的にコード化する。
【００１０】
本発明のさらに他の態様により、混合物から目的の化合物を分離する方法であって、（ａ）目的の化合物を含有する混合物を提供するステップと、（ｂ）薄層クロマトグラフィを使用し混合物の一部分を分離に掛けて、目的の化合物のＲｆ値を測定するステップと、（ｃ）目的の化合物の測定されたＲｆ値を使用し、分取スケールＨＰＬＣカラム上の目的の化合物の溶離時間を予測するステップと、（ｄ）残留する混合物の全部もしくは一部分を、分取スケールＨＰＬＣカラムを備えている分取スケールＨＰＬＣ系に掛けるステップと、（ｅ）予測された溶離時間を使用し、目的の化合物の少なくとも一部分を回収するステップとを含む方法を提供している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明により、１種または複数の混合物から１種または複数の目的の化合物を分離する方法を提供する。本発明は、分取スケールＨＰＬＣカラム上における化合物の保持時間を予測するための混合物の試料の最初の分離、および場合によって、予想される目的の化合物が混合物中に存在することの確証を包含する。最初の分離は、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を使用して、または質量分析と組み合わせた分析用高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ−ＭＳ）を使用することにより実施できる。次いで、分取スケールＨＰＬＣを使用して、１種または複数の混合物から１種または複数の化合物を分離し、回収することができる。
【００１２】
特に指示がない限り、本明細書および特許請求範囲において使用する下記の用語は、下記に示す意味を有する：
「分析用高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）」は、ナノグラム〜低マイクログラムの範囲のフラクションを生成させることが可能なＨＰＬＣ系を意味する。本発明の典型的な分析用ＨＰＬＣ系には、適切な固定相、適切な移動相を充填したカラム、およびカラムを通して移動相を通過させる１台もしくは複数のポンプが含まれる。移動相は、無勾配でまたは勾配により供給できる。
【００１３】
「分取スケールＨＰＬＣ」は、高マイクログラム、ミリグラム、もしくはグラムサイズの生成物フラクションを生成させることが可能なＨＰＬＣ系を意味し、分取および半分取カラムの両方を含むが、分析用ＨＰＬＣカラムは含まない。本発明の典型的な分取スケールＨＰＬＣには、適切な固定相、適切な移動相を充填したカラム、およびカラムを通して移動相を通過させる１台もしくは複数のポンプが含まれる。移動層は、無勾配でまたは勾配により供給できる。
【００１４】
特定の成分または化合物の「保持時間」は、試料導入時と、その成分もしくは化合物のピーク最大値の出現時との間の経過時間を意味する。
【００１５】
「予測された溶離時間」は、化合物もしくは成分がそれ以内に溶離すると予測される、分取スケールＨＰＬＣカラム上の化合物もしくは成分の予測された保持時間前後の期間もしくは時間の「ウィンドウ」を意味する。
【００１６】
「反応生成物混合物」は、特定の反応生成物（すなわち予測される興味のある化合物）を生成させると予測される反応物を組み合わせることにより得られる混合物を意味する。反応生成物混合物は、予測された化合物、他の反応生成物、および／または試薬を含むことができる。
【００１７】
「予測された化合物」は、混合物中に存在すると予測された化合物を意味する。
【００１８】
「予測された質量」は、予測された化合物の、予測された分子量を意味する。
【００１９】
「クロマトグラム」は、検出器シグナル出力を時間もしくは溶離体積に対してプロットしたものである、クロマトグラフィにより得られる記録を意味する。
【００２０】
「ＨＰＬＣ適合性検出器」は、化合物ピークの溶離における検出可能なシグナルを提供することが可能な、ＨＰＬＣ系における使用に適した検出器を意味する。化合物がカラムから溶離するときシグナルを発生することが可能な検出器が、ＨＰＬＣ適合性検出器である。所望の成分を検出することが可能な検出器は、所望されないピークを検出することが不可能であるため「不適合性」検出器というわけではない。
【００２１】
「人工神経回路網」は、生物学的神経回路網が作動する形で作動するように設計された数学系を意味する。すなわち、神経回路網はデータ間の関係を学習し、記憶し、かつ作り出すことができる。神経回路網は、重み付けした関係により一緒に連結された多重相互接続された処理単位を有する処理系から構成される。
【００２２】
本発明により、予測された質量を有する目的の化合物を含有するとそれぞれ予測される、１種または複数の化合物を提供している。１種または複数の混合物は１種または複数の反応生成物混合物とすることができ、かつ、例えば、化合物のライブラリを提供することを目指したコンビナトリアルケミストリにより提供できる。各混合物の一部分を分離に掛け、分取スケールＨＰＬＣカラム上の目的の化合物の保持時間を予測し、また場合によって、試料中に興味ある１種または複数の化合物が存在することを確証する。
【００２３】
本発明の一態様において、分析用ＨＰＬＣ系を使用し各混合物の一部分を別々に分離に掛けて、溶出液流を生成させる。分離を用いて目的の化合物の保持時間を決定し、それを使用して、下記でさらに考察するように、分取スケールＨＰＬＣ上の目的の化合物の保持時間を予測する。分析用ＨＰＬＣカラム上に各試料を別々に導入し、１台または複数のポンプにより移動相を無勾配でまたは勾配によりカラムに供給する。特定の混合物に適合可能である、また混合物から目的の化合物を分離するのに有用などんな分析用ＨＰＬＣ系も、本発明について使用できる。ＨＰＬＣ系の構成部分（例えば、カラム、固定相、および移動相など）、ならびにその系で使用している条件（例えば圧力および流速など）は、系に導入しようとする特定の化合物および混合物により変更できる。
【００２４】
一実施形態においては、それぞれの溶出液流は、例えばＵＶ検出器などのＨＰＬＣ適合性検出器を通過させて、所望の化合物が、分離／精製ステップ（すなわち、分取スケールＨＰＬＣカラムを使用した分離）を用いずに済むほど十分に純粋であるかどうかを判定する。所望の化合物をさらに精製する必要がない場合、その化合物を含有する残留している混合物の精製ステップをバイパスさせる。所望の化合物が十分に純粋な形で存在していない場合、その化合物を含有する混合物は、下記でより完全に考察する精製ステップに掛ける。
【００２５】
分析用ＨＰＬＣからのそれぞれの１つまたは複数の溶出液流は、質量分析計を使用し分析して、その溶出液流（したがってまた最初の混合物）が予測された質量を有する化合物を含有することを確証する。特定の溶出液流について予測された質量を有する化合物が検出される場合、質量分析計を使用して、分析用ＨＰＬＣカラム上のその化合物の保持時間を決定する。質量分析計は、回収されるデータが、興味ある１種または複数の化合物の予測された質量、および１種または複数の化合物の分析用ＨＰＬＣカラムにおける保持時間だけであるように構成できる。予測された質量を有する目的の化合物が検出されない場合、目的の化合物を含有すると予測される混合物は、分取スケールＨＰＬＣを使用した分離ステップには掛けない。特定の混合物に適合可能である、また目的の化合物の予測された質量を検出するため有用などんな質量分析計も、本発明について使用できる。
【００２６】
一実施形態においては、それぞれの複数の混合物の一部分を別々に分析用ＨＰＬＣに掛けて、複数の溶出液流を生成させる。分析ＨＰＬＣカラムからの少なくとも２つの複数の溶出液流を、共通の質量分析計における分析のため組み合わせることができる。他の溶出液流も組み合わせ、同一のまたは異なる質量分析計に供給できる。組み合わせた溶出液流は、それぞれの予測される興味のある化合物が、他の１つまたは複数の溶出液流中の１種または複数の目的の化合物の質量から質量分析により識別可能である異なった予測された質量を有するように選択できる。同一のもしくは類似の質量を有する溶出液流も、質量分析計におけるピークがお互いから識別可能であるようにコード化されている限り、共通の質量分析計における分析のため組み合わせることができる。このような溶出液流は、機械的手段を使用してコード化することができる。例えば、機械的なバンド拡幅を使用して、同一の質量を有する２つのピークを識別することができる。すなわち、同一の質量を有する２つのピークの一方を広げることによって、質量分析によるピークを識別し、またそのピークが得られた混合物と相関させることができる。例えば、一方のＨＰＬＣカラムにおいてより幅広の配管を使用する、一方のカラムの配管がより長いものを使用する、または、一方のカラムについてより大きい空き体積を有する連結線を使用するなどの種々の方法によって、１つのＨＰＬＣカラムから溶離する化合物ピークを、他のＨＰＬＣカラムからの化合物ピークに対して広げることができる。これらの方法は、他方のＨＰＬＣカラムからのピークと比較して、一方のＨＰＬＣカラムから溶離される化合物に余分の溶媒が確実に混合されるようにし、したがって他方のカラムからのピークと比較して、そのカラムからのピークを広げている。
【００２７】
本発明の他の態様においては、各混合物の一部分は、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を使用した分離に掛けては、１つまたは複数のスポットまたは領域を生成させる。ＴＬＣの結果を使用して、興味ある各化合物のＲｆ値を測定し、目的の化合物の、下記にさらに詳細に記述している分取スケールＨＰＬＣカラム上における保持時間の予測に使用する。ＴＬＣを使用して、例えば、試料の隣に予測された化合物のスポットを作る、予測された化合物および試料の同時スポットを作る、異なる溶媒もしくは溶媒混合物を使用して多重ＴＬＣを行う、かつ／または二次元ＴＬＣを行うことにより、予測された目的の化合物が元の混合物中に存在することを確証する。さらに、目的の化合物を含有するスポットもしくは領域を同定するために、ＴＬＣを質量分析と組み合わせて（ＴＬＣ−ＭＳ）、目的の化合物の正しいＲｆ値を測定し、かつ／または試料中に存在する目的の化合物を確証する。ＴＬＣ−ＭＳは、例えばＴＬＣプレートからスポットもしくは領域を取り出し、次いでそのスポットもしくは領域を溶媒中に入れて質量分析を実施するか、または１つもしくは複数のスポットもしくは領域の質量分析を直接ＴＬＣプレート上で実施する（例えば、質量分析計のイオン源を通してスポットもしくは領域を移動させることによる）。
【００２８】
分析用ＨＰＬＣまたはＴＬＣを使用した最初の分離の後、最初の分離に基づいて１種または複数の混合物中に存在する１種または複数の化合物について分取スケールＨＰＬＣカラムからの溶離時間を予測する。特定の化合物の溶離時間は、分析用ＨＰＬＣカラム上の化合物について測定された保持時間を使用して、またはＴＬＣを使用して測定された化合物のＲｆ値を使用して、予測する。分取スケールＨＰＬＣカラム上の化合物の保持時間を最初に予測することにより、次いで、その時間ウィンドウ内にその化合物が溶出されると予測される、分取スケールＨＰＬＣカラム上で予測された保持時間前後の時間「ウィンドウ」を選択することにより、溶離時間を予測している。分取スケールＨＰＬＣカラム上の保持時間および溶離時間は、他の方法を使用して予測できる。
【００２９】
溶離時間を予測する一方法は、「相関関数」を使用して保持時間を予測することを包含する。「相関関数」は、分析用ＨＰＬＣカラム上の保持時間の、分取スケールＨＰＬＣカラム上の保持時間（特定成分について）に対する相関（線形または他の方法で）とすることができる。２つ以上の試験化合物を使用して、各カラム上の各化合物の保持時間を測定することにより、分析用ＨＰＬＣカラムと分取スケールＨＰＬＣカラムとの間の相関関数を測定することができる。ある範囲の極性および非極性試験化合物を使用して、相関関数を測定することが好ましい。例えば、下記の組みの化合物を使用して、相関関数を測定することができる：アセトフェノン、ベンゼン、トルエン、エチルパラベン、プロピルパラベン、および２，６−ジメチルナフタレン。しかし、本発明においては、異なる性状の範囲を有する、もしくは有しない他の組みの化合物を使用できることに注目すべきである。
【００３０】
同様に、ＴＬＣからのＲｆ値（特定成分について）の、分取スケールＨＰＬＣカラム上の保持時間（特定成分について）に対する相関（線形または他の方法で）である「相関関数」を使用して、分取スケールＨＰＬＣカラム上の化合物の保持時間を測定することができる。２つ以上の試験化合物を使用して、各試験化合物のＴＬＣ上のＲｆ値および各試験化合物の分取スケールＨＰＬＣカラム上の保持時間を測定することにより、ＴＬＣと分取スケールＨＰＬＣカラムとの間の相関関数を測定することができる。
【００３１】
分取スケールＨＰＬＣカラム上の化合物の保持時間を予測した後、溶離時間を予測する。溶離時間は、予測された保持時間前後の時間「ウィンドウ」を使用して予測している。すなわち、予測された保持時間前および後の、少なくともいくらかの、また好ましくは全てのもしくは大部分の、目的の化合物が回収されると予測される時間を選択している。ウィンドウは、全てのもしくは大部分の目的の化合物がそれ以内に溶離するような十分な時間のものであることが好ましい。時間ウィンドウが小さ過ぎる場合、全ての目的の化合物が回収されないであろう。時間ウィンドウが大き過ぎる場合、目的の化合物として他の成分が回収され、分離の価値が低下する恐れがある。予測される溶離時間は、分析用ＨＰＬＣ（またはＴＬＣ）と分取スケールＨＰＬＣとの間の相関ファクタに基づいて予測された保持時間中に存在する可能性のある誤差を補償する余分な時間を含むことができる。
【００３２】
ウィンドウとして選択される実際の時間の長さは、分析用ＨＰＬＣカラムからの化合物の平均ピーク幅（例えばＵＶ検出器または質量分析計により得られる）、ＴＬＣからの化合物スポットの直径、ならびに／または流速および試料量などのＨＰＬＣファクタを含む、いくつかのパラメータにより導くことができる。
【００３３】
静的相関関数（例えば線形相関関数）を使用する他に、分取スケールＨＰＬＣにおける目的の化合物の保持／溶離時間への分析用ＨＰＬＣデータ（またはＴＬＣデータ）の動的相関を使用することができる。すなわち、一定ではない因子（例えばカラム寿命にわたるカラムにおける変化、温度など）を予測において考慮に入れることができる。さらに静的相関では一定である因子（例えば流速、移動相、カラムサイズなど）への変動を、動的相関では考慮することができる。このような動的相関を使用して、分取スケールＨＰＬＣにおけるパラメータを変化させることにより、目的の化合物の保持時間および溶離時間を予測することができる。その上、依然として保持時間および溶離時間を予測することができながら、分取スケールＨＰＬＣの間使用される成分および／または条件（例えば流速、移動相など）を変化させて、混合物からの化合物の最良の分離を得ることができる。
【００３４】
人工神経網を使用して、保持時間および溶離時間を予測することもできる。線形相関関数と異なり、神経網は、非線形および動的な形態で、分析用ＨＰＬＣカラム上の保持時間に基づいて、またはＴＬＣからのＲｆ値に基づいて、分取スケールＨＰＬＣカラム上の化合物の保持時間を予測することが可能である。神経網は、混合物からの化合物の最良の分離を得るために、分取スケールＨＰＬＣにおいて使用される異なった成分および／または条件を選択することができる可能性もある。
【００３５】
次いで、分取スケールＨＰＬＣ系を使用し、それぞれの残留する１種または複数の混合物（またはそれらの一部分）を別々に分離に掛けて、溶出液流を生成させる。予測された目的の化合物を含有することが確証された１種または複数の混合物だけを、分取スケールＨＰＬＣ系における分離に掛けることが好ましい。分取スケールＨＰＬＣ系には分取スケールＨＰＬＣカラムが含まれ、また好ましくはフラクションコレクタが含まれる。各試料を分取スケールＨＰＬＣカラムに導入し、１台または複数のポンプによりカラムに移動相を無勾配で、もしくは勾配によりカラムに供給する。特定の混合物に適合可能である、また混合物から目的の化合物を分離するのに有用などんな分取スケールＨＰＬＣ系も、本発明について使用できる。そのＨＰＬＣ系の構成部分（例えば、カラム、固定相、および移動相など）、およびその系で使用している条件（例えば圧力および流速など）は、系に導入しようとする特定の化合物および混合物により変更できる。
【００３６】
分取スケールＨＰＬＣ系は、１台または複数のＨＰＬＣ適合性検出器を含むこともできる。使用できる検出器の例には、紫外（ＵＶ）検出器、蒸発性光散乱検出器（ＥＬＳＤ）、屈折率検出器（無勾配用）、および化学発光窒素検出器が含まれる。しかし、本発明の方法において、分取スケールＨＰＬＣ系にＨＰＬＣ適合性検出器が存在すること、または使用されることを必要とせず、また本発明の一態様において分取スケールＨＰＬＣに検出器を全く使用していない点が注目される。
【００３７】
それぞれの分離の間、目的の化合物の予測された溶離時間を使用してその化合物（または化合物の一部分）を回収する。フラクションコレクタを使用して特定の化合物の予測された溶離時間の間、フラクションコレクタをつけることにより化合物を回収できる。すべての他の時間の間、溶出液は典型的に廃棄コレクタに誘導される。
【００３８】
一実施形態においては、ＨＰＬＣ適合性検出器を使用せず、予測された溶離時間だけを使用して、目的の化合物（または化合物の一部分）を回収する。
【００３９】
他の実施形態においては、ＨＰＬＣ適合性検出器（例えば、ＵＶ検出器など）からのシグナルと組み合わせて、予測された溶離時間を使用して、目的の化合物（または化合物の一部分）を回収する。予測された溶離時間以内で、ピークが検出されると、コレクタをつけ、または起動させる。目的の化合物の予測された溶離時間以内でピークが検出された場合だけ、検出器からフラクションコレクタへ、シグナルが送られることに注目するのが重要である。予測された溶離時間以内でピークが検出されなくなったら、フラクションコレクタのスイッチを切る。このような系は、ピークが終わるまで予測された溶離時間の外側でフラクションコレクタによる回収を継続するよう設計されたアルゴリズムをも使用できる。
【００４０】
本発明によれば、最初の分析用ＨＰＬＣからのＵＶクロマトグラムを作成しかつ記憶する必要なしに、１種または複数の混合物から、１種または複数の化合物を迅速かつ効率的に分離することが可能になる点が有利である。すなわち、本発明を使用して、分析用ＨＰＬＣカラムからのＵＶクロマトグラムを使用せずに、化合物の溶離時間を予測し、かつその化合物を回収できる。しかし、所望される場合このようなクロマトグラムを作成でき、かつ使用できる。
【００４１】
本発明を、非限定的であることを意図している下記の例示的実施例によってさらに説明するが、それらは限定しようとするものではない。
【実施例１】
【００４２】
予測された質量３３５を有するトリフルラリン（ｔｒｉｆｌｕｒａｌｉｎ）を含有すると予測された混合物（溶媒としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を使用して）を提供した。混合物の試料（１０ｍｇ／ｍＬのうち１μＬ）を、下記の構成部分を有する分析用ＨＰＬＣカラム上に導入した：固定相−Ａｎｓｙｓ  ＭｅｔａＣｈｅｍ  Ｐｏｒａｒｉｓ  Ｃ−１８Ａ  ５μ；移動相−時間（ｔ）＝０分において５５％ＣＨ３ＯＨ：４５％Ｈ２Ｏ、ｔ＝３分において１００％ＣＨ３ＯＨまで勾配により移動し、かつｔ＝４分まで１００％ＣＨ３ＯＨのまま残留する；カラム長さ５０ｍｍ；およびカラム直径４．６ｍｍ。周囲温度のもとに流速１．５ｍＬで分析用ＨＰＬＣを作動させた。
【００４３】
Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＡＱＡ質量分析計を、カラムからの溶出液が質量分析計に流れるように分析用ＨＰＬＣカラムに接続した。質量電荷比３３５±〜３．０だけを検出するように質量分析計を較正した。質量分析計を使用して、質量電荷比のピーク最大値が現れる時間を測定することにより、化合物の保持時間を計算した。図１は、溶離時間対質量電荷比３３５の相対存在率の質量クロマトグラムである。図１において３３５と表示したピークによって示されるように、化合物の保持時間は３．３分と測定された。
【００４４】
次に、分取スケールＨＰＬＣカラムからの化合物の溶離時間を予測した。分析用ＨＰＬＣカラム上の保持時間対分取スケールＨＰＬＣカラム上の保持時間の線形相関である「相関関数」を使用して、溶離時間を予測した。分離の前に、アセトフェノン、ベンゼン、トルエン、および２，６−ジメチルナフタレンを含む１組の試験化合物（すなわち、非極性試験ミックス）を使用して相関関数を測定した。上記において考察した分析用ＨＰＬＣカラム、および下記で述べる分取スケールＨＰＬＣカラムを使用して、各試験化合物を溶離させた。結果を下記の表Ｉに示す。
【００４５】
【表１】
2005512029.tif 000003
【００４６】
分析用ＨＰＬＣカラムにおける保持時間のデータ（すなわち、ＰＲＥＰＲＥＰ  ＲＴ）を、分取スケールＨＰＬＣカラムにおける保持時間のデータ（すなわち、ＰＲＥＰ  ＲＴ）に対してプロットして、線形相関関数（すなわち、ＰＲＥＰ  ＲＴ＝勾配×ＰＲＥＰＲＥＰ  ＲＴ＋切片）に到達した。測定した相関関数は下記の通りであった：ＰＲＥＰ  ＲＴ＝１．０５５２×ＰＲＥＰＲＥＰ  ＲＴ＋０．４１４５。相関係数（すなわちｒ２）は０．９８３２と測定された。図２は、グラフの形式で相関関数を例示する。相関関数を使用して、分取スケールＨＰＬＣカラム上のトリフルラリンの予測された保持時間は、３．９０分（すなわち２３４秒）と決定された。次いで、この予測された保持時間を使用して、分取スケールＨＰＬＣカラム上の化合物の予測された溶離時間を測定した。予測された保持時間２３４秒からの予測された溶離時間±２０秒を使用して、全てのもしくは大部分の化合物ピークを確実に回収した（すなわち、使用した予測された溶離時間は、ＨＰＬＣカラム上への混合物の導入から２１４秒〜２５４秒であった。）。
【００４７】
次いで、分取スケールＨＰＬＣカラムを使用して、化合物を含有する残留している混合物を分離に掛けた。使用した分取スケールＨＰＬＣカラムは、下記の構成成分を内蔵していた：固定相−Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｔｅｒｒａ（登録商標）Ｐｒｅｐ  ＭＳ  Ｃ１８  ５μ；移動相−時間（ｔ）＝０分において５０％ＣＨ３ＯＨ：５０％Ｈ２Ｏ、ｔ＝６．２分において１００％ＣＨ３ＯＨまで勾配により移動した；カラム長さ５０ｍｍ；およびカラム直径１９ｍｍ。周囲温度のもとに流速２８ｍＬ／分で分取スケールＨＰＬＣを作動させた。
【００４８】
波長２５４ｎｍにおける吸光度を試験することが可能なＵＶ検出器を分取スケールＨＰＬＣカラムに接続した。予測された溶離時間以内において、正勾配を有するピークを検出した場合だけ回収を開始するように設計したアルゴリズムを使用した。予測された溶離時間の間に、ＵＶ検出器により正勾配を有するピークを検出すると、カラムに接続されたフラクションコレクタにシグナルを送って、溶出液を回収容器に向かわせた。ピークの勾配が負勾配〜ゼロに、または負勾配〜正勾配に変化した場合は回収を終了し、また他の正勾配を検出した場合は再び回収を開始するようにもアルゴリズムを設計した。分取スケールＨＰＬＣに取り付けたＵＶ検出器からのデータに対応するＵＶクロマトグラムを、図３に示しており、図３は予測された溶離時間以内に回収されたフラクション（すなわちフラクションＦ１：１）を示している。
【００４９】
本発明を詳細に、かつその特定の実施形態を参照して記述しているが、本発明の精神および範囲から逸脱せずに種々の変更および修正を行うことができることは、当分野の技術者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】溶離時間対質量電荷比３３５の相対存在率の質量クロマトグラム（実施例１により得られた）を示す図である。
【図２】分析用ＨＰＬＣ保持時間（すなわち、ＰＲＥＰＲＥＰ  ＲＴ）対分取スケールＨＰＬＣ保持時間（すなわち、ＰＲＥＰ  ＲＴ）の相関関数（実施例１により得られた）をグラフで示す図である。
【図３】予測された溶離時間以内に分取スケールＨＰＬＣ系において回収された実際のフラクションを示すＵＶクロマトグラム（実施例１により得られた）である。
【図１】
2005512029.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
2005512029.tif 000007