(57)【要約】本発明は、溶液中でタンパク質のような夾雑物から、核酸分子、特にプラスミドＤＮＡを分離する方法であり、当該方法は、ａ）溶解時にリオトロピックイオンを形成する塩と核酸とを含む水性吸着溶液を準備する段階、ｂ）上記溶液を芳香族環基と１以上のチオエーテル基とを含むマトリックスに通して所望の核酸をマトリックスに吸着させる段階、ｃ）任意段階としてマトリックスを洗浄する段階、ｄ）上記マトリックスに水性溶出液を通して核酸分子を脱着させる段階であって、該溶出液が、リオトロピックイオンを形成する塩に加えて、吸着時に存在するリオトロピックイオンよりもリオトロピック性の低いイオンを溶解時に形成する塩の濃度増加によるイオン強度勾配を有する段階、及びｅ）所望の核酸分子を含むフラクションを単離する段階を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の夾雑物から核酸分子を分離する方法であって、
（ａ）溶解時にリオトロピックイオンを形成する塩と核酸とを含む水性吸着溶液を準備する段階、
（ｂ）上記溶液を芳香族環基と１以上のチオエーテル基とを含むマトリックスに通して所望の核酸をマトリックスに吸着させる段階、
（ｃ）任意段階としてマトリックスを洗浄する段階、
（ｄ）上記マトリックスに水性溶出液を通して核酸分子を脱着させる段階であって、該溶出液が、リオトロピックイオンを形成する塩に加えて、吸着時に存在するリオトロピックイオンよりもリオトロピック性の低いイオンを溶解時に形成する塩の濃度増加によるイオン強度勾配を有する段階、及び
（ｅ）所望の核酸分子を含むフラクションを単離する段階
を含んでなる方法。
【請求項２】
単離されるフラクションがプラスミドＤＮＡであり、タンパク質性成分及び／又はＲＮＡ及び／又はエンドトキシンを基本的に含んでいない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ａ）及び（ｄ）のリオトロピックイオン及び低リオトロピック性のイオンが、それぞれの塩から形成されるアニオンである、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
段階（ａ）の塩が硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
吸着溶液の塩濃度が約３Ｍ未満である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
溶出液中に溶解した塩が、塩化ナトリウム又は塩化カリウムのようなアルカリ塩である、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
溶出液の最大塩濃度が約３Ｍである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記マトリックスが芳香族チオエーテルリガンドの結合した担体からなり、該リガンドにおけるアリール基がピリジル、フェニル、ベンジル、トルイル、フェネチル、ナフチル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、キノリニル及びプリニル基からなる群から選択される、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記リガンドがチオエーテル基を介して担体に結合されている、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中の他成分からの核酸分子、特にプラスミドの分離に関する。本方法では、核酸分子の吸着用に芳香族チオエーテルリガンドを利用し、吸着分子を脱着させる新規スキームを提供するが、これによって方法全体の分離効率が格段に向上する。本方法は好ましくはクロマトグラフ法である。
【背景技術】
【０００２】
この十年間で様々な疾患の予防又は治療のため患者への治療遺伝子の投与が実現した。臨床用途ではウイルス感染の危険性を最小限に抑えるため非ウイルス系ベクターが好ましいことが多い。そのため、遺伝子治療用の高純度プラスミド及びプラスミド系ワクチンの要望が増している。保健機関の定める厳格な指針及び規則では、臨床用の精製スーパーコイルプラスミドＤＮＡの均質標品が要求されている。
【０００３】
クロマトグラフィーはスーパーコイルプラスミドＤＮＡの小規模精製及び大規模精製にうってつけの方法である（Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｇ．Ｎ．Ｍ．，Ｐｒａｚｅｒｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｆ．，Ｃａｂｒａｌ，Ｊ．Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｅｆ，Ｍ．  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ−Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｉｎ：Ｓｃｈｌｅｅｆ，Ｍ．（Ｅｄ．）Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００１，ｐ．１９３−２３６）。サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による分離法はプラスミドＤＮＡ精製に適していることが示されている（Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｇ．Ｎ．Ｍ．，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｇ．Ａ．，Ｐｒａｚｅｒｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｃａｂｒａｌ，Ｊ．Ｍ．Ｓ．  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＴＩＢＴＥＣＨ  ２０００；１８，３８０−３８８）。固定化合成オリゴヌクレオチドとプラスミドＤＮＡとの配列特異的な相互作用に基づくアフィニティクロマトグラフィーも提案されている（Ｓｃｈｌｕｅｐ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｂｙ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８；２６，４５２４−４５２８）。しかし、これらの技術のいずれによっても、非分析的用途に十分な量のスーパーコイルプラスミドＤＮＡの均質標品は得られない。
【０００４】
この問題を避けるため、従前は、ニックの入ったプラスミドＤＮＡの形成を最小限に抑える試料調製技術を開発することに努力が向けられいた。しかし、このアプローチは再現が困難であり、得られるプラスミドＤＮＡの品質は最終製品について規定された厳格な規格を満足しなかった（Ｌｅｖｙ，Ｍ．Ｓ．，Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｒ．Ｄ．，Ａｙａｚｉ−Ｓｈａｍｌｏｕ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｄｕｎｎｉｌｌ，Ｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｕｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００；１８，２９６−３０５）。そこで、上流プロセスの最適化のための面倒な作業を大幅に低減せしめるスーパーコイルプラスミドＤＮＡの新規で確実な分離プロトコルを開発する必要性が認識されている。
【０００５】
Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ他は、タンパク質精製にチオフィリック（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ；親チオ性の意）クロマトグラフィーを提案した（Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｓａｌｔ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９；１７６，３３０−３３７；  Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．，Ｍａｉｓａｎｏ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｅｗ，Ｍ．  Ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ−ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９８５；１８５，３０６−３１０）。後日特許出願された国際公開第９５／３３５５７号パンフレットにおいて、Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ及びＰｏｒａｔｈは、１９８９年の報文で検討されたものと類似しているが、アルカリ性環境での諸性質を改良するためチオフィリック基がリガンドの残りの部分から離隔させた耐アルカリ性タンパク質吸着剤を開示している。タンパク質の吸着は高濃度のリオトロピック塩によって促進され、脱着は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）で従来慣用されていた条件を用いて、つまりリオトロピック塩を別の低リオトロピック塩又は単に水で置き換えることによって達成される。
【０００６】
近年、チオエーテルを含む各種リガンド構造が大規模プロセスに応用可能と思われる条件下でプラスミドＤＮＡの様々なアイソフォームを結合する能力について検討された。これはスウェーデン国特許出願公開第０１０１３８０．４号明細書に開示されている（ただし、この明細書は本願出願時点では公開されていない）。従って、スーパーコイルプラスミドＤＮＡと相互作用して選択的に精製するための「最適リガンド」に必要な具体的構造の範囲を絞ることができた。その結果、新規な一群のチオフィリックリガンド、すなわち芳香族チオエーテルが特定されたが、これらはプラスミドＤＮＡのアイソフォームを効果的に識別する。これらのリガンドを含む媒体は、単一のクロマトグラフィー段階でスーパーコイル（共有結合閉環状（ｃｃｃ））プラスミドＤＮＡをそのアイソフォームの開環（ｏｃ）形から効率的に分離することが示されている。従って、これらの媒体の使用は前途有望であり、遺伝子治療及びＤＮＡワクチン用の高度精製スーパーコイルプラスミドＤＮＡの生産を容易にするはずである。
【０００７】
しかし、プラスミドＤＮＡをそのアイソフォームから分離することができても、その他にも解決すべき問題が残っている。例えば、所望の核酸を含んだ細胞溶解物は通常酵素のような１種以上のタンパク質や様々な分解生成物も含んでいる。従前報告された方法は所望の核酸からタンパク質を概ね分離することはできるが、得られる分解能は、効率的な生産プロセスには十分に満足できるものではない。デオキシ核酸（ＤＮＡ）を含む細胞溶解物は通常リボ核酸（ＲＮＡ）と残留タンパク質も含んでいる。しかし、上述のようなプラスミドＤＮＡが医薬用に望まれる状況では、いずれも除去すべき夾雑物とみなされる。さらに、プラスミドＤＮＡのクロマトグラフ精製では、ほとんどの場合、医薬品の厳格な条件を満すために除去する必要のあるエンドトキシン（宿主菌の膜成分）も一緒に精製される。そのため、上述の夾雑物からの核酸の分離に関してチオフィリッククロマトグラフィーを用いた精製プロトコルを改良する必要性がある。
【特許文献１】国際公開第９５／３３５５７号パンフレット
【特許文献２】スウェーデン国特許出願公開第０１０１３８０．４号明細書
【非特許文献１】Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｇ．Ｎ．Ｍ．，Ｐｒａｚｅｒｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｆ．，Ｃａｂｒａｌ，Ｊ．Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｌｅｅｆ，Ｍ．  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ−Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ．Ｉｎ：Ｓｃｈｌｅｅｆ，Ｍ．（Ｅｄ．）Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ：Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００１，ｐ．１９３−２３６
【非特許文献２】Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｇ．Ｎ．Ｍ．，Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｇ．Ａ．，Ｐｒａｚｅｒｅｓ，Ｄ．Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｃａｂｒａｌ，Ｊ．Ｍ．Ｓ．  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＴＩＢＴＥＣＨ  ２０００；１８，３８０−３８８
【非特許文献３】Ｓｃｈｌｕｅｐ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｃｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｂｙ  ｔｒｉｐｌｅｘ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９８；２６，４５２４−４５２８
【非特許文献４】Ｌｅｖｙ，Ｍ．Ｓ．，Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｒ．Ｄ．，Ａｙａｚｉ−Ｓｈａｍｌｏｕ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｄｕｎｎｉｌｌ，Ｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｕｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０００；１８，２９６−３０５
【非特許文献５】Ｏｓｃａｒｓｓｏｎ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．Ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｓａｌｔ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９；１７６，３３０−３３７
【非特許文献６】Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．，Ｍａｉｓａｎｏ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｂｅｌｅｗ，Ｍ．Ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ−ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９８５；１８５，３０６−３１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的の一つは、１種以上の芳香族チオエーテルリガンドを含むマトリックスを用いて溶液からＤＮＡのような核酸を分離する代替法を提供することである。上記その他の目的は、特許請求の範囲に開示した方法によって達成される。
【０００９】
本発明のさらに具体的な目的は、かかるマトリックスに結合した分子を脱着する方法であって、タンパク質、ＲＮＡ及び／又はエンドトキシンのような１種類以上の望ましくない成分からプラスミドがより効率的に分離される方法を提供することである。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、上述の脱着法であって、プラスミドの異なるアイソフォーム同士の分離、さらに具体的にはｏｃプラスミドＤＮＡからｃｃｃプラスミドＤＮＡを分離することもできる脱着法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一つの態様では、溶液中の夾雑物から核酸分子を分離する方法であって、
（ａ）溶解時にリオトロピックイオンを形成する塩と核酸とを含む水性吸着溶液を準備する段階、
（ｂ）上記溶液を芳香族環基と１以上のチオエーテル基とを含むマトリックスに通して所望の核酸をマトリックスに吸着させる段階、
（ｃ）任意段階としてマトリックスを洗浄する段階、
（ｄ）上記マトリックスに水性溶出液を通して核酸分子を脱着させる段階であって、該溶出液が、リオトロピックイオンを形成する塩に加えて、吸着時に存在するリオトロピックイオンよりも溶解時にリオトロピック性の低いイオンを形成する塩の濃度増加によるイオン強度勾配を有する段階、及び
（ｅ）所望の核酸分子を含むフラクションを単離する段階
を含んでなる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
定義
本明細書で用いる「タンパク質性」という用語には、完全なタンパク質だけでなく、タンパク質の一部又は痕跡部、その他ペプチド構造を含む分子が包含される。
【００１３】
「核酸分子」という用語は本明細書では「ヌクレオチド」と同義に用いられ、ＤＮＡ、例えば開環状（ｏｃ又はニック）プラスミドＤＮＡ、スーパーコイル（ｃｃｃ）プラスミドＤＮＡのようなプラスミド、その他ゲノムＤＮＡのような他のＤＮＡ、並びにｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｓＲＮＡのようなＲＮＡが包含される。
【００１４】
「溶液（又は溶出液）をマトリックスに通す」という表現は、マトリックスを何らかの方法で溶液又は溶出液と接触させ、ある期間後にその溶液又は溶出液を除去することを意味する。従って、この用語は動的クロマトグラフ法のみならず、バッチ処理法も包含する。
【００１５】
「溶出液」という用語は、本明細書では、クロマトグラフィーにおけるその通常の意味、すなわち固相（吸着マトリックス）と生成物（核酸分子）との相互作用を変化させて固相からの生成物の選択的解離を促進することができる溶液を意味する。
【００１６】
「リオトロピック」という用語は、イオンが、溶媒中での相互作用の疎水性にどれくらい影響を与えることができるかの尺度である。
【００１７】
発明の詳細な説明
さらに具体的には、本発明の第一の態様は、溶液中の夾雑物から核酸分子を分離する方法であり、当該方法は、
（ａ）溶解時にリオトロピックイオンを形成する塩と核酸とを含む水性吸着溶液を準備する段階、
（ｂ）上記溶液を芳香族環基と１以上のチオエーテル基とを含むマトリックスに通して所望の核酸をマトリックスに吸着させる段階、
（ｃ）任意段階としてマトリックスを洗浄する段階、
（ｄ）上記マトリックスに水性溶出液を通して核酸分子を脱着させる段階であって、該溶出液が、リオトロピックイオンを形成する塩に加えて、吸着時に存在するリオトロピックイオンよりもリオトロピック性の低いイオンを溶解時に形成する塩の濃度増加によるイオン強度勾配を有する段階、及び
（ｅ）所望の核酸分子を含むフラクションを単離する段階
を含む。
【００１８】
最も好ましい実施形態では、段階（ａ）及び（ｄ）のイオンは、それぞれの塩が溶解する際に生じるアニオンである。
【００１９】
本発明の方法は、細胞（例えば組換え細胞）で発現される核酸分子の単離に用いることができる。従って、本方法は、核酸分子を含む溶液を用意すべく細胞を破壊する第一段階も含む。かかる破壊は、標準的なプロトコルでの例えばアルカリ溶解のような溶解によって実施される（例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ参照）。従って、上記の段階（ａ）で準備される溶液は、好ましくは細胞残渣を基本的に含まない。また、本発明は、溶液中のヌクレオチド混合物の分析、すなわち分析目的の分離にも有用である。
【００２０】
本方法の好適な実施形態では、段階（ｅ）で単離されるフラクションはプラスミドＤＮＡであり、ＲＮＡを基本的に含まない。上述の通り、これは医薬品の厳格な要件である。以降の実験の項で示す通り、ＲＮＡは、ＤＮＡの溶出時にマトリックスにしっかりと結合したまま残る。所望に応じて、マトリックスを再生するため水又は低塩濃度の緩衝液でマトリックスを洗浄することによってＲＮＡを容易に除去することができる。しかし、別の実施形態では、本発明の方法によって、ＤＮＡも含む溶液からＲＮＡが例えば理化学的研究用に回収される。これらの実施形態はいずれも、核酸分子同士が分離されるだけでなく、溶液中に存在するタンパク質性成分やエンドトキシンのような夾雑物からも核酸分子が分離されるという明瞭かつ予想外の利点を示す。実験の項に示すように、本発明で用いるマトリックスに結合したタンパク質は核酸とは異なるステージで溶出されるので、別のフラクションに回収することができる。
【００２１】
本発明は、芳香族チオエーテルリガンドを含むマトリックスからの新規な溶出原理を用いることによって細胞溶解物中のＤＮＡからタンパク質性成分とＲＮＡを共に分離することができることを示す。さらに、本方法は、エンドトキシンのような他の夾雑物から所望の核酸分子を効率的に分離することも判明した。従って、本発明の方法は、例えば遺伝子療法、ＤＮＡワクチン、及び遺伝子療法に関する研究などに用いられる核酸の精製に有用である。好適な実施形態では、本方法は、遺伝子治療グレードの基準を満たす単離スーパーコイルプラスミドＤＮＡを与える。上述の通り、かかるキャリアを単離するための従前報告された方法は、こうした目的には満足できるものでなかった。
【００２２】
本方法の一実施形態では、段階（ａ）で準備される溶液は、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムのような溶解アルカリ塩を含む。従って、吸着時に溶液中に存在するアニオンは強リオトロピック性の硫酸イオンである。ある具体的な実施形態では、上記塩の濃度は約３．０Ｍ未満であり、例えば２．５Ｍである。当業者には自明であろうが、その上限は各々の塩の溶解度によって決まる。ただし、当業者には自明であろうが、マトリックスに用いられた具体的なリガンドだけでなく分離すべき核酸によっては、状況が異なれば必要とされる塩濃度が異なることもある。吸着段階における溶液のｐＨは、溶出段階におけるｐＨと異なっていてもよい。ただし、分離すべき核酸の安定性を確保するため、ｐＨは生理学的ｐＨ、すなわち約６．５〜８．５の範囲内にとどめるべきである。
【００２３】
好適な実施形態では、所望の核酸が吸着したマトリックスは、段階（ｄ）での溶出前に洗浄される。洗浄中、緩く結合した夾雑物は除去される。かかる洗浄は、常法に従って当業者が容易に実施し得る。
【００２４】
本発明における段階（ｄ）は適当な水性溶出液を用いて実施されるが、該溶出液は、リオトロピックイオンを形成する塩に加えて、イオン強度の上昇勾配、例えば連続勾配を含む。ただし、スーパーコイルプラスミドＤＮＡの大規模生産のような目的如何によっては、段階的勾配を使用するのが望ましいこともある。
【００２５】
段階（ｄ）で用いられる溶出液のイオン強度の上昇は、溶出液中の塩濃度を高めることによってもたらされるが、その塩は、吸着溶液中に溶解したイオンよりも低リオトロピック性のイオン（例えばアニオン）を形成することができるものである。当業者に周知の通り、イオンのリオトロピック性は、離液順列とも呼ばれるホフマイスター系列に従って評価される。この溶解塩は溶媒中の条件を徐々に変化させるが、かかる変化が容易に分離されるフラクションとしてのＤＮＡ及びＲＮＡの脱着に有用であることを本発明者は見出した。実際、大半のリガンドに関して、単に水の添加によってＲＮＡが最後のフラクションとして溶出されることが判明した。タンパク質及びエンドトキシンは水の添加によってのみ除去することができ、これらの分子のマトリックスへの結合がもっぱら疎水結合メカニズムによることを示しており、核酸の展開するメカニズムとは全く異なる。ある実施形態では、溶出液中に溶解した塩は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムのようなアルカリ塩である。例えば、低リオトロピック性のアニオンは塩化物イオンである。ある具体的な実施形態では、最大塩濃度は約３Ｍである。ただし、吸着溶液に溶解した塩に関して上述した通り、個々の具体的なリガンド及び所望核酸に関して、最適条件を決定するために慣用技術による試験が必要なこともある。吸着段階と同様、溶出時のｐＨ値は核酸の安定領域に保つべきである。
【００２６】
このように、本発明は、芳香族チオエーテルリガンドを介してマトリックスに吸着した核酸が、上述のイオン強度を高める勾配によって効率的に溶出できるという予想外の知見に基づく。さらに具体的には、溶出液は、吸着段階で用いられる緩衝液のような、リオトロピックイオンを形成する塩と、さらにイオン強度の上昇勾配からなる。これは、溶出緩衝液からリオトロピック塩を除くことによって溶出を行う上述の国際公開第９５／３３５５７号に記載されているような芳香族チオエーテルリガンドマトリックスの使用法とは全く異なる。従来技術では、芳香族チオエーテルの溶出は、水溶液の添加（これによってリオトロピック塩は希釈される）又はリオトロピック塩に置き換わる塩の添加によって行われている。換言すれば、塩全体の濃度は、溶出時に減少するか或いは同じような値に保たれる。しかし、吸着に用いたものと同じ緩衝液を使用し、これにイオン強度の上昇勾配を補うことによって、芳香族チオエーテルリガンドの溶出を実施することができることを示したのは本発明者が最初である。
【００２７】
本方法で使用されるマトリックスに関して説明すると、マトリックスは、チオエーテル結合を介して支持体に結合したリガンドからなり、リガンドに関しては以下さらに詳しく説明する。各々のマトリックスは１種以上のリガンド構造を含んでいてもよい。
【００２８】
ある実施形態では、使用されるリガンドは芳香族チオエーテルを含んでおり、そのアリール基はピリジル、フェニル、ベンジル、トルイル、フェネチル、ナフチル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、キノリニル及びプリニル基から選択される。
【００２９】
好適な実施形態では、ピリジル−Ｓ及び／又はフェニル基はさらに、例えば図１に示すような、アリール基上の置換基を含んでいる。担体材料に結合して本発明のマトリックスを形成するリガンドは、メルカプトピリジン、メルカプトアルキルピリジンでもよい。この場合、チオエーテル結合を介して担体材料に結合するのはメルカプト基である。さらに、上述の通り、リガンドの一部をなすアリール基は、フェニル、ベンジル、トルイル、フェネチル、ナフチル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、インドリル、キノリニル、プリニルであってもよい。芳香族環にさらに置換基を追加してもよい。本発明の芳香族チオエーテルリガンドに追加置換基を加えることによって、広範な異なる分離媒体を設計し得る。置換基としては、例えば１種以上のアミン基、ニトロ基、エーテル基、チオール基及び／又はフッ素のようなハロゲンがある。これらの追加置換基は、所望に応じてさらに炭素原子を含んでいてもよい。また、当業者には自明であろうが、上述の環構造において炭素原子をヘテロ原子で置き換えてもよい。なお、本明細書において「芳香族チオエーテルリガンド」という用語は、適宜望ましい範囲で置換することのできる広範な化合物を包含し、その幾つかの具体例を図１に示す。リガンド密度は１０〜５００μｍｏｌｅ／ｍＬ担体、好ましくは１０〜１００μｍｏｌｅ／ｍＬ担体である。
【００３０】
本発明で用いるマトリックスは支持体に結合した複数のリガンドを含んでいるが、リガンドは同じ化学構造のものでも異なる化学構造のものでもよい。支持体はいかなる形態のものでもよく、例えば実質的に球状の粒子、メンブラン、フィルター、マイクロタイタープレートなどがある。支持体は適当な周知の無機又は有機材料であれば、どんなものでもよい。無機支持体の具体例は、ガラス、シリカその他の不活性粒状鉱物である。有機支持体の具体例は、アガロース、デキストラン、ジビニルベンゼンなどである。様々な樹脂又はポリマーに基づく数多くの市販品が入手可能であり、例えばアガロース又は架橋アガロース（例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））、デキストラン（例えばＳｅｐｈａｄｅｘ（商標），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））、ポリスチレン／ジビニルベンゼン（ＭｏｎｏＢｅａｄｓ（商標），ＳＯＵＲＣＥ（商標），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））、被覆ポリスチレン、アクリルポリマー、デキストランアクリルポリマー（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））、ビニルグラフトポリマー又はビニルポリマー、シリカデキストランやシリカ−アクリルポリマーやシリカ−ポリエチレンイミンのような各種のシリカ系樹脂などがある。好適な実施形態では、マトリックスは架橋アガロースであり、例えばエポキシ活性化を用いてリガンドで官能化しておくことができる。
【００３１】
本プロセスは、流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ）又は充填層として準備したマトリックスで実施することができ、動的（すなわちクロマトグラフィー）にも、バッチ式でも実施できる。充填層吸着では、クロマトグラフィーガラムにマトリックスを充填し、精製プロセスで用いられる溶液はすべて通常同じ方向でカラムに流される。しかし、流動層吸着では、カラムに通常は下方から液体を流すことによって、マトリックスを膨張させ、平衡化する。安定な流動層は、試料の適用及び洗浄段階で粒子の沈降又は上昇速度と流速とが均衡している時に形成される。流動層の溶出段階では、マトリックスは沈降して充填層マトリックスのように振る舞う。
【００３２】
一実施形態では、マトリックス粒子の平均粒径は約１０〜３００μｍの範囲にあり、例えば１０〜２０μｍ、２０〜５０μｍ、５０〜１００μｍ、１００〜２００μｍ又は２００〜３００μｍである。ただし、粒子は好都合なことに、２５０μｍ、２１２μｍ、１８０μｍ、１５０μｍ、１２５μｍ、１０６μｍ、９０μｍ、７５μｍ、６３μｍ、４５μｍ、３７μｍ、３０μｍ、２５μｍ、２０μｍ、１５μｍのように、市販の篩装置で利用可能などのような粒径にも調製できる。
【００３３】
図面の詳細な説明
図１は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））と反応させた各種の芳香族チオエーテル化合物の具体例を示す。この図面にみられるように、芳香族チオエーテル化合物には様々な置換基を設けることができ、各々、様々な目的に応じて有益となり得る結合特性及び溶出特性をもたらし得る。
【００３４】
図２は、プラスミドＤＮＡの調製を示す。２．０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０でプレコンディショニングしておいたＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））カラムにアルカリ溶解物をロードする。３０ｃｍ／ｈでのクロマトグラフィー後、プラスミドＤＮＡがＲＮＡから分離される。さらに、プラスミドＤＮＡを、以降のチオフィリック芳香族クロマトグラフィーでの実験のために必要とされる緩衝液に回収すればよい。
【００３５】
図３ａ及び図３ｂは、本発明の芳香族チオエーテルリガンドを用いた異なるカラムでのスーパーコイルプラスミドＤＮＡの精製を示す。プラスミドＤＮＡ試料は図２と同様に調製し、２．０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０でプレコンディショニングしておいたカラムにロードする。スーパーコイルプラスミドＤＮＡの脱着は、同じ緩衝液中で２Ｍ  ＮａＣｌへのグラジエント（勾配）をかけることによって得られる。これらの条件下では、開環状プラスミドＤＮＡはマトリックスに結合しないが、スーパーコイルプラスミドＤＮＡは結合し、ＮａＣｌ濃度を高めることにより溶出させることができる。図３ｃ及び図３ｄは、類似したリガンドではあるが、芳香族でない（図３ｃ）か或いはチオエーテルの存在しない（図３ｄ）リガンドの比較例である。実験は、図３ａ及び図３ｂと同一の試料及び緩衝液で実施される。クロマトグラムから、これらのリガンドのいずれも、図３ａ及び図３ｂに示すタイプのクロマトグラフィーに適していないことは明らかである。図３ｅは、図３ａと同様の実験で得られた試料のレーザー誘起蛍光キャピラリーゲル電気泳動後の電気泳動図を表す。開環形のプラスミドＤＮＡは芳香族チオエーテルリガンドに保持されなかったが、スーパーコイル形のプラスミドは吸着され、線形勾配で早期に溶出された。
【００３６】
図４は、アルカリ溶解物のチオフィリック芳香族クロマトグラフィーマトリックスへの吸着及び脱着を示す。清澄化アルカリ溶解物試料を、（ＮＨ4）2ＳＯ4の最終濃度が２．２５Ｍとなるように、４Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０で希釈する。２．２５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０中では、すべての核酸分子がマトリックスに吸着する。ただし、脱着は核酸ごとに異なる。プラスミドＤＮＡのアイソフォームは、２．２５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０緩衝液中で３Ｍ  ＮａＣｌへのグラジエントをかけることによって分離することができ（高倍率の挿入図参照）、一方、ＲＮＡをマトリックスから溶出できるのは（ＮＨ4）2ＳＯ4の濃度を下げるグラジエントをかけたときだけであり、様々なタイプの核酸分子を完全かつ確実に分離できる。
【００３７】
図５は、プラスミドＤＮＡとリポ多糖類（ＬＰＳ）との分離を示す。プラスミドＤＮＡにＲＮＡと蛍光ＬＰＳを混ぜ、２．２５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０中で平衡化しておいた２−メルカプトピリジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））にロードする。プラスミドＤＮＡアイソフォームは、平衡緩衝液中で３Ｍ  ＮａＣｌへのグラジエントをかけて導電率を増加させることで溶出するが、他方でＲＮＡとＬＰＳは、水へのグラジエントをかけて導電率を低下させることで溶出する。
【００３８】
図６は、１．０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０中の２−メルカプトピリジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））に免疫グロブリンがどのように吸着し得るかを示す。免疫グロブリンはＮａＣｌで導電率を上昇させても溶出できない。タンパク質を脱着するには、（ＮＨ4）2ＳＯ4濃度を下げて導電率を減少させる必要がある。これは疎水結合によることを示しており、本発明で用いる芳香族チオエーテル型リガンドへの核酸分子の結合メカニズムとは異なる。
【００３９】
図７は、プラスミドＤＮＡ分子の溶出用に、ＮａＣｌを他の塩で置き換えることができることを示す。図２と同様に調製したプラスミドＤＮＡを、２．０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０中の２−メルカプトピリジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））にロードし、ローディング用緩衝液中で１Ｍ  ＫＣｌへのグラジエントをかけると溶出される。
【００４０】
図８は、プラスミドＤＮＡがどのようにして３．０ＭのＮａ2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０中でプレコンディショニングしておいたカラムにロードされ、プレコンディショニング用の緩衝液中１Ｍ  ＮａＣｌへのグラジエントで溶出されるかを示す。この図は、チオフィリック芳香族クロマトグラフィーマトリックスに核酸分子を結合させるために用いられる疎水塩を置き換えることができることを示す。
【００４１】
図９ａ及び図９ｂは、本発明で用いる芳香族チオエーテルリガンドから塩濃度を減少又は増加させて溶出した時のエンドトキシンプロフィールの差を示す。プラスミドＤＮＡは、図２と同様に調製し、２．０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０で、２−メルカプトピリジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））にロードする。従って、スーパーコイルプラスミドＤＮＡは、水へのグラジエント（図９ａ）又は２ＭのＮａＣｌ、２．０Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０へのグラジエントとその後の水へのグラジエント（図９ｂ）によって溶出される。標準ＬＡＬ試験を用いたエンドトキシン含有量について幾つかのフラクションを試験した。実験から、大半のエンドトキシンが導電率を低下させたときに溶出することは明らかである。その結果、スーパーコイルプラスミドＤＮＡは好ましくは導電率を増加させることによって溶出させる。こうすることで、エンドトキシンの共溶出を伴わずに、スーパーコイルプラスミドＤＮＡを溶出し、回収することができる。
【００４２】
実験
以下、本発明を実施例によって開示するが、実施例は単なる例示のためのものにすぎず、特許請求の範囲に規定する本発明を限定するものと解釈すべきではない。本明細書中で引用した文献は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【００４３】
クロマトグラフィー媒体のプロトタイプ
すべてのリガンド（図２ａ〜図２ｄの挿入図）は、既存の方法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｍａｌｌｉａ，Ａ．Ｋ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９２，ｐ．５１−１３２）によってエポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））に結合させた。リガンド濃度は、利用可能な結合部位よりも過剰になるように選定し、洗浄後に、結合リガンド量を元素分析（硫黄又は窒素）によって検査した。
【００４４】
プラスミドＤＮＡ
この研究では、プロテインＡの一部を表すインサート（本発明ではインサートの正体は重要でない）を有するｐＵＣ１９プラスミドからなる６１２５塩基対のプラスミドを使用した。プラスミドは、既存のプロトコル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１α株にトランスフェクションし、増殖させた。清澄化アルカリ溶解物は、Ｈｏｒｎ他（Ｈｏｒｎ，Ｎ．Ａ．，Ｍｅｅｋ，Ｊ．Ａ．，Ｂｕｄａｈａｚｉ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍａｒｑｕｅｔ，Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９９５；６，５６５−５７３）の方法に従って調製した。粗プラスミドＤＮＡ標品（開環形アイソフォームとスーパーコイル形アイソフォームの両方を含む）を調製して、図２で使用した。緩衝液を、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０中の所望のＳＯ42-濃度（図３、図７及び図９では２．０Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；図４及び図６では２．２５Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；図８では３．０Ｍ  Ｎａ2ＳＯ4）に変えるためＩＮｄＥＸ（商標）１００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に充填したＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（スウェーデン国ウプサラ））に、１リットルの清澄化アルカリ溶解物を３０ｃｍ／ｈでロードした。同時に、この手順でＲＮＡその他の夾雑物（図示せず）も除去された。
【００４５】
クロマトグラフ法
すべてのカラムクロマトグラフィーは、ＡＫＴＡ（商標）ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて７５ｃｍ／ｈで実施した。１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．０中適当なＳＯ42-濃度（図５では１．０Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；図３、図７及び図９では２．０Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；図４及び図６では２．２５Ｍ  （ＮＨ4）2ＳＯ4；図８では３．０ＭのＮａ2ＳＯ4）でプレコンディショニングしておいたカラムに試料をロードし、カラム容積の１０倍量（図３、図５及び図６）又は５倍量（図４、図７、図８及び図９ａ〜ｂ）の同一緩衝液中での塩（図３ａ〜ｄでは２Ｍ  ＮａＣｌ、図４、図５、図６、図８及び図９ｂでは３Ｍ  ＮａＣｌ、図７では１Ｍ  ＫＣｌ）へのグラジエント又は水（図９ａ）へのグラジエントで溶出した。図４、図５、図６、図８及び図９ｂでは、塩グラジエントに続いて、夾雑物を完全に除去するため水グラジエントをかけた。
【００４６】
蛍光リポ多糖類
クロマトグラフ法におけるエンドトキシンの溶出プロフィールを評価するために、様々なプラスミドＤＮＡアイソフォームを含む５ｍｌ試料に、ＲＮＡと、２．５μｇ／ｍｌの大腸菌由来の蛍光標識１００００Ｄａリポ多糖類アイソフォーム（Ｉｓｏｔｙｐｅ  ０５５：Ｂ５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（オランダ国ライデン））を混ぜた。フラクションを回収し、製造業者の指示通り蛍光を記録した。
【００４７】
分析法
図４及び図５のピーク１、２、３及び４は、それらの２６０ｎｍ／２８０ｎｍ吸光度比及び１％アガロースゲル電気泳動での電気泳動移動度パターン及び臭化エチジウム染色（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）（図示せず）によって、それぞれ非核酸、開環状プラスミドＤＮＡ、スーパーコイルプラスミドＤＮＡ及びＲＮＡであると判断された。エンドトキシン値は、製造業者の指示に従って標準ＬＡＬ試験で求めた。
【００４８】
レーザー誘起蛍光キャピラリーゲル電気泳動は、Ｓｃｈｍｉｄｔ他（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．，Ｆｒｉｅｈｓ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｆｌａｓｃｈｅｌ，Ｅ．（２００１）：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ，ｉｎ：Ｍ．Ｓｃｈｌｅｅｆ（Ｅｄ．）：”Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”，ｐｐ．２９−４３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）に記載の通り実施した。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】分離性を有し、本発明で有用な芳香族チオエーテルリガンドの具体例を示す。
【図２】アルカリ溶解物の集団分離後に得られるクロマトグラムを示し、プラスミドＤＮＡフラクションとＲＮＡフラクションが分離して得られることを示す。
【図３ａ】挿入図に示すリガンドのクロマトグラフィーで得られた結果を示す。
【図３ｂ】挿入図に示すリガンドのクロマトグラフィーで得られた結果を示す。
【図３ｃ】挿入図に示すリガンドのクロマトグラフィーで得られた結果を示す。
【図３ｄ】挿入図に示すリガンドのクロマトグラフィーで得られた結果を示す。
【図３ｅ】芳香族チオエーテルリガンドでのクロマトグラフィーで得られた試料のレーザー誘起蛍光キャピラリーゲル電気泳動後の電気泳動図を示す。
【図４】芳香族チオエーテルリガンドでの清澄化アルカリ溶解物の結合と各種核酸フラクションの溶出を示すクロマトグラムである。
【図５】芳香族チオエーテルリガンドでのクロマトグラフィー後のプラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ及びリポ多糖類のプロフィールを表すクロマトグラムである。
【図６】芳香族チオエーテルリガンドでの免疫グロブリンのクロマトグラフィーで得られた結果を示す。
【図７】ＫＣｌ濃度の上昇勾配でのプラスミドＤＮＡ溶出を示すクロマトグラムである。
【図８】芳香族チオエーテルリガンドでのプラスミドＤＮＡ精製用リオトロピック塩としてのＮａ2ＳＯ4を使用を実証するクロマトグラムである。
【図９ａ】塩濃度低下溶出（図９ａ）と塩濃度上昇溶出（図９ｂ）とを対比したときのエンドトキシンプロフィールの差を示すクロマトグラムを示す。
【図９ｂ】塩濃度低下溶出（図９ａ）と塩濃度上昇溶出（図９ｂ）とを対比したときのエンドトキシンプロフィールの差を示すクロマトグラムを示す。
【図１】
2005517445.tif 000002
【図２】
2005517445.tif 000003
【図３ａ】
2005517445.tif 000004
【図３ｂ】
2005517445.tif 000005
【図３ｃ】
2005517445.tif 000006
【図３ｄ】
2005517445.tif 000007
【図３ｅ】
2005517445.tif 000008
【図４】
2005517445.tif 000009
【図５】
2005517445.tif 000010
【図６】
2005517445.tif 000011
【図７】
2005517445.tif 000012
【図８】
2005517445.tif 000013
【図９ａ】
2005517445.tif 000014
【図９ｂ】
2005517445.tif 000015
【国際調査報告】
2005517445.tif 000016
2005517445.tif 000017
2005517445.tif 000018