(57)【要約】【解決手段】  微小誘電性粒子または他の物質を操作し、相互作用を有効化させ、光化学的に変化させ、および／または区分けするための装置および方法が開示される。この装置および方法は、各々がレーザ・ビームを受け取って複数のレーザ・ビームを形成する１つまたは複数の回折光学素子の使用を含む。これらのレーザ・ビームは、微小誘電性粒子または他の物質を操作し、相互作用を有効化させ、光化学的に変化させ、および／または区分けするために光学トラップのアレイを作り出すようにテレスコープレンズ系、およびその後、対物レンズ要素によって操作される。
2005534321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの光学トラップを使用して細胞外側および細胞膜を有する生きた細胞の中に外部物質を組み入れるための方法であって、
レーザ・ビームを受け取り、複数の分離したレーザ・ビームを形成するための回折光学素子を提供する工程と、
前記回折光学素子を形成する下流に配置された集束用要素を提供する工程であって、前記回折光学素子が前記集束用要素と協働し、集束したスポットもしくは焦点領域を形成するように、前記レーザ・ビームの各々を別々に集光し、それにより、各々の粒子に関して前記別々のレーザ・ビームのうちの１つを使用して前記スポットの中で粒子の各々について別々の光学トラップを形成するための手段を確立する工程と、
転移される前記外部物質をリボソームの中にカプセル化する工程と、
前記細胞外側の充分量を切除して、後に続くリボソーム融合のために前記細胞膜の領域を露出させるために光学メスを使用する工程と、
前記リボソームを前記細胞外側の近傍へと移動させるために光学系を使用する工程と、
前記リボソームと膜の界面に向けられるレーザ光のパルスを使用して化学的、電気的、または光学的融合のうちの少なくとも１つによって前記リボソームを前記細胞と融合させる工程と、
レーザ光の追加のパルスを使用して前記膜とリボソームの界面に穴を開けることを提供する工程と、
前記少なくとも１つのトラップで前記リボソームの内容物を前記細胞の中に移す工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記外部物質が前記細胞にとって内因性ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外部物質が親水性物質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記外部物質が、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ、キメラ分子、および発現因子で構成されるグループから選択される核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記外部物質が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、多糖類、染料、および薬学物質で構成されるグループから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生きた細胞への外部物質の組み入れの間に１つまたは複数の顕微鏡画像を記録する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
多重フォトン発生を最小限にするように前記レーザ・ビームの強度を制御し、それにより、細胞への損傷を最小限にする工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数の光学トラップを使用して吸収性粒子を形成する非吸収性粒子を区分けするための方法であって、
レーザ・ビームを受け取り、複数の分離したレーザ・ビームを形成するための回折光学素子を提供する工程と、
前記回折光学素子から下流に集束用要素を提供する工程であって、前記回折光学素子が前記集束用要素と協働し、前記レーザ・ビームの各々を別々に集光し、それにより、各々の粒子に関して前記別々のレーザ・ビームのうちの１つを使用して前記スポットの中で粒子の各々について別々の光学トラップを形成するための実質的に集束したスポットを形成する工程と、
前記光学トラップを通して吸収性粒子と非吸収性粒子を通過させ、それにより、光吸収が前記吸収性粒子を非特異的に破壊してそれらをさらに小さい破片へと小さくする工程と、
前記光学トラップ内に残された損傷を受けていない前記非吸収性粒子に関して前記小さい破片を分離する工程と、
前記光学トラップから前記非吸収性粒子を取り外す工程と、を含む方法。
【請求項９】
複数のホログラフィ式光学トラップおよび光学トラップと連携した照明スポットのうちの少なくとも一方を使用して物質上での光化学を通じて多数の空間分解構造を同時に作り出すための方法であって、
レーザ・ビームを受け取り、複数の分離したレーザ・ビームを形成するための回折光学素子を提供する工程と、
前記集束用要素と協働し、少なくとも１つの粒子を処理するための別々の光学トラップを形成するように前記レーザ・ビームの各々を別々に集光する集束用要素を、前記回折光学素子から下流に提供する工程と、
三次元のアクセス可能な容積内の前記光学トラップの配置を制御し、かつ前記光学トラップの光学特性の別々の変更を提供するようにプログラムを実行するコンピュータを提供する工程と、
前記物質の選択された光化学的変化を有効化することで前記光学トラップおよび照明スポットの回折限界焦点容積に付随する容積内の制御された光化学を容易にするために前記別々のレーザ・ビームの強度を調節する工程と、
前記光学トラップおよび前記光学トラップのうちの１つを伴った前記照明スポットのうちの少なくとも１つの場所と強度を操作することで多数の領域で光化学的変化を誘発し、それによって光化学的に規定されたパターンの多数のコピーを作製する工程と、を含む方法。
【請求項１０】
使用者が特定する三次元のパターン内の複数の前記光学トラップに関して多数の機能を規定する工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、極めて強い照明および強く集束させた光ビームの強度勾配を使用して微小誘電性粒子を操作するため、および変化させるための方法および装置に関する。詳細には、本発明はホログラムまたは回折格子といった回折光学素子によって誘導された集束レーザ光を使用して光学トラップまたはトラップを作り出し、様々な選択可能な光強度パターンのいずれか１つを使用して粒子状物質または影響を受ける他の物質を、無数の使用法のうちのいずれか１つにとって望ましい空間的パターンへと組み立てるかまたは誘導する方法および装置に関する。より詳細には、本発明は微小誘電性粒子または他の物質を操作するため、相互作用を有効化するため、光化学的に変換するため、および／または区分けするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホログラフィ式光学トラップを使用する空間分解光化学に関連する本発明の部分は、米国国立科学財団の補助金番号ＤＭＲ−９７３０１８９および米国国立科学財団のＭＲＳＥＣプログラムの補助金番号ＤＭＲ−９８８０５９５によって提供された米国政府の支援で為された。光学トラップを使用して吸収性粒子から非吸収性粒子を区分けする工程に関連する本発明の部分は、米国国立科学財団の補助金番号ＤＭＲ−９７３０１８９によって提供された米国政府の支援で為された。
【０００３】
屈折率が粒子のそれよりも小さい流体媒質中に浸された微小誘電性粒子の位置を操作するために、単一光ビームから得られる光学的勾配力を使用して光学トラップ（すなわちトラップ）を構成することは知られている。光学トラップの技術は反射性、吸収性、および低誘電定数の粒子の操作を同様に可能にするために普及してきた。同様に、米国特許第６，０５５，１０６号（２０００年４月２５日発行）は多数のトラップによる多数の粒子の操作を開示している。しかしながら、この発明の様々な用途に関して光学トラップを使用することは以前には知られていなかった。
【０００４】
Ａ．Ａｓｈｋｉｎらによって初めて述べられた光学トラップは、物質のメゾスコピック質量を捕捉、移動、およびそうでなければ操作するための確立された方法となった。Ａ．Ａｓｈｋｉｎらの「Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂｅａｍ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｆｏｒｃｅｓ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｔｒａｐ  ｆｏｒ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１，２８８〜２９０（１９８６）を参照されたい。それらの操作の中心となるものはトラップされる物質の損傷を避けるためにトラップ光の吸収を最小限にする工程である。光学的メスは反対の原理で動作し、密に集束したレーザ・ビームのエネルギーを使用することで軟質の物質を切開する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本出願は、集束したレーザ光ビームが異成分から成るサンプル中でいくつかの非吸収性の粒子にとって光学トラップとして動作し、同時にその他のものにとっては光学的メスとして動作する新たなハイブリッド・システムを開示し、権利主張する。
【０００６】
本発明の光学トラップ技術の別の応用例は、完全に破損せずに細胞膜を破り、裂け目を通して物質を移動させることによって生きた細胞の中に外部物質を導入する工程を含む。これを成し遂げるために、長さの短いＤＮＡのトランスフェクションのためのウィルス・ベクター、さらに大きな部分を転移させるための遺伝子銃およびその変形例、および膜貫通型の拡散を誘発するためのエレクトロポレーションを含む様々な方法が開発されてきた。物理的に大きな物質を転移させることに関すると、特にそれらの物質がそれ自体壊れ易い場合、いずれも適切には見えない。本明細書で述べられる方法および装置はこの問題および他の問題を解決する。
【０００７】
付け加えると、ホログラフィ式光学トラップは微小構造体を化学的に規定することに関して競合技術を上回るいくつかの利点を有する空間分解型光化学を有効化するために使用されることが可能である。例えば、光学トラップを備えた空間分解型光化学は光波長の小画分から巨視的規模までの範囲のサイズの特徴を備えた三次元構造の作成を容易にする。ディップペン・ナノリソグラフィおよびマイクロコンタクト印刷法といった技術は優れた空間分解能を提供するが、それらは三次元加工を行いにくい。極めて多種多様な光化学反応が知られており、これらのすべてが空間分解型フォトファブリケーションの方法論に馴染むことが可能である。したがって、空間分解光化学は殆どのマイクロもしくはナノの加工方法よりも柔軟性を提供する。ホログラフィ式光学トラップを備えた空間分解型光化学を実行することは、効率を大幅に改善することによって基本的手法の有用性を高める。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、単一および／または複数の装置を使用して、例えば単一のサンプル上で同時に動作する多数のホログラフィ式光学トラップ実現、および単一のサンプル上で同時に動作する多数の光学トラップと多数の強度領域といった複数の光学トラップを同時に達成するための改善された方法とシステムを提供することが本発明の目的である。
【０００９】
光学的勾配場を作り出すことで複数の粒子または他の光学的媒体を制御するようにホログラムを使用するための新たな方法および装置を提供することが本発明の追加的な目的である。
【００１０】
光回路製造、ナノ複合材料用途、電子部品の製造、光電子デバイス、化学的および生物学的センサ・アレイ、ホログラフィ・データ記憶マトリックスの組み立て、コンビナトリアル・ケミストリの簡易化、コロイドのセルフアセンブリの促進、および生物学的材料の取り扱いといった微小粒子の操作に関係する様々な工業的用途のために複数の光学トラップを確立する改善された方法およびシステムを提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１１】
生きた細胞に外部物質を組み入れるために光学トラップを使用するための改善された方法およびシステムを提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１２】
光学的に非吸収性の粒子を光学的に吸収性の粒子から区分けするための改善された方法およびシステムを提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００１３】
空間分解型光化学を使用して異成分から成る構造体の作製を実施するための改善された方法およびシステムを提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００１４】
様々な粒子を区分けする用途に関して光学的勾配場の一時的かつ空間的に変化する構造を構成するための改善された方法およびシステムを提供することが本発明のなおも別の目的である。
【００１５】
誘電性金属材料および他の物質を操作するために、選択可能な経時変化性および／または特定の光学トラップの空間的アレイを構成するように１つまたは複数の回折光学素子と併せて１つまたは複数のレーザ・ビームを使用するための新たな方法およびシステムを提供することもやはり本発明の目的である。
【００１６】
他の同様に形成された光学トラップと併せて、微小誘電性粒子または他の物質を操作し、相互作用を有効化し、光化学的に変換し、および／または区分けするように使用されることが可能な静的または動的な光学トラップを形成するために単一の入力レーザ・ビーム、回折光学素子、および集光レンズを使用する改善された方法およびシステムを提供することが本発明のなおもさらなる目的である。
【００１７】
様々な工業的用途のために、光学トラップのアレイの走査を可能にするビーム走査システムを備えた回折光学素子へと入力されるレーザ・ビームを使用する改善された方法およびシステムを提供することもやはり本発明のさらなる目的である。
【００１８】
対物レンズの焦点面に相対して選択可能な場所でトラップ構造を形成するために、レーザ・ビーム、回折光学素子、および集光型光学系を使用して光学トラップ構造を構成するための新たな方法および装置を提供することが本発明の追加的な別の目的である。
【００１９】
光学トラップの三次元的配列を作り出すように回折光学素子へと入力されるレーザ・ビームを使用するための新たな方法および装置を提供することが本発明のなおも別の目的である。
【００２０】
時間依存性のアドレス指定可能な位相シフト媒体（例えば液晶位相シフト・アレイまたは他の位相媒体）を回折光学素子として使用して多数の独立した向きを決められる光学トラップを作り出すための新たな方法を提供することが本発明の別の目的である。
【００２１】
微視的粒子の分離のために時間依存性の光学的勾配場を作り出すための新たな方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００２２】
タンパク質の結晶化を含めた複数の生物学的対象物の操作のため、または他の相変化を導入するための新たな方法を提供することが本発明のさらに別の目的である。
【００２３】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、添付の図面と関連付けて為される以下の好ましい実施形態の説明から容易に明らかとなるであろう。そこでは類似した要素は全体を通じて類似した番号を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明はＧｒｉｅｒらの米国特許第６，０５５，１０６号の中で開示され、権利主張された「Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｙｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｆｏｒｃｅｓ」に関するいくつかの使用例を提示する。その装置はこれ以降の光学トラップ、光学トラップと光学勾配力トラップという用語の使用によって包含される。前置きとして、図１および２はいくつかの先行技術の方法およびシステムを例示している。これらのシステムを最初に概説し、その後、本発明の方法を図３〜７Ａおよび７Ｂの光学トラップ実施形態の範例の観点から説明する。図１の先行技術の光学トラップのシステム１０では、光学勾配力は、屈折率が粒子１４のそれよりも小さい媒質１６中に分散した微小誘電性粒子１４を制御可能に操作するために単一の光ビーム１２を使用することから生じる。光学勾配力の性質はよく知られており、反射性、吸収性、および低誘電定数の粒子を同様に操作することを可能にするためにその原理が普及してきたことも良く理解されている。
【００２５】
光学トラップのシステム１０は、粒子を操作するために必要な光学的捕捉効果を実行するために必要とされる力を加えることが可能な光ビーム１２（例えばレーザ・ビーム）を使用することによって適用される。光学トラップ１０の従来式の形式を作り出すために使用される方法は、集光用光学要素（例えば対物レンズ２０）の背面開口部２４を通して、各々が特定のコリメーションを有する１つまたは複数の光ビームを発射することである。図１に記載されるように、光ビーム１２は「ｗ」の幅を有し、光軸２２に相対して入力角度Φを有する。光ビーム１２は対物レンズ２０の背面開口部２４へと入力されて前面開口部２６から出力され、画像化容積３２の焦点面３０内の焦点２８へと実質的に一点集中し、焦点２８は光学トラップ３３と一致する。概して、回折限界の焦点へと運ばれ、かつ軸方向放射圧力に逆らって粒子を安定にトラップするために充分に大きい軸方向強度勾配を有するいずれの光ビームも光学トラップ・システム１０用の基礎を形成することが可能である。
【００２６】
そのような焦点を作り出すことは充分に高い開口数と充分に補正された収差を備えた集束要素を必要とする。概して、トラップを形成するための最小限の開口数は約０．９から約１．０である。
【００２７】
光ビーム１２がコリメートされたレーザ・ビームであり、かつ光軸２２と一致する軸を有するケースでは、光ビーム１２は対物レンズ２０の背面開口部２４に入り、対物レンズ焦点面３０の中心点ｃでイメージング体積３２内の焦点へと運ばれる。光ビーム１２の軸が光軸２２に関して角度Φ動かされると、ビーム軸３１と光軸２２は背面開口部２４の中心点Ｂで一致する。この移動は視野を横切る光学トラップの平行移動を、対物レンズ２０の角度変化によって決まる量で可能にする。イメージング体積３２の中の選択される位置に光学トラップを形成するために２つの変数、すなわち角度移動Φと光ビーム１２の変動収束が使用されることが可能である。異なった角度Φで異なった視準の度合いを備えて多数の光ビーム１２が背面開口部２４へと加えられることを条件とすると、多数の光学トラップ３３が異なる場所に配置されることが可能である。
【００２８】
三次元的に光学的トラップを実行するために、トラップされる粒子に加えられる光学勾配力は光の散乱と吸収から生じる他の放射圧力を超えなければならない。概して、これは背面開口部２４で光ビーム１２の波面が適切な形状を有することを必要とする。例えば、ガウスＴＥＭ００入力レーザに関すると、ビーム径ｗは背面開口部２４の直径と実質的に一致すべきである。さらに一般的なビーム・プロファイル（例えばラゲール−ガウス・モード）に見合う条件が設定されることが可能である。
【００２９】
図２の別の先行技術のシステムでは、光学トラップ・システム１０は対物レンズ２０の視野を横切って光学トラップ３３を平行移動させることが可能である。テレスコープ３４はレンズＬ１、および図１の先行技術のシステム内の中心点Ｂに光学的に共役である点Ａを設定するＬ２で構成される。図２のシステムでは、点Ａを通過する光ビーム１２は点Ｂも通過し、その結果、光学トラップ・システム１０として機能するための基本的必要条件を満たす。コリメーションの度合いは図２に示されるようにレンズＬ１とＬ２の位置決めによって維持され、それらの焦点距離および他の光学特性はテレスコープ３４の特性の移行を最適化するように選択される。特に、テレスコープ３４の倍率は光ビーム１２の角度移動、および対物レンズ２０の背面開口部２４の平面でのビームの幅ｗを最適化するように選択されることが可能である。前述したように、概して、いくつかの光ビーム１２が使用されることでそれらに付随するいくつかの光学トラップを形成することが可能である。そのような多数の光ビーム１２は多数の独立した入力ビームから、または従来式の反射型および／または屈折型光学要素によって操作される単一ビームから作り出されることが可能である。
【００３０】
図３に示された１つの光学トラップ構造では、光学トラップの任意のアレイが形成されることが可能である。回折光学素子４０は対物レンズ２０の背面開口部２４と共役の平面４２に実質的に配置される。明瞭化するために単一の回折出力ビーム４４だけが示されていることに留意すべきであり、複数のそのようなビーム４４が回折光学素子４０によって作り出されることが可能であることは理解されるはずである。回折光学素子４０に入射する入力光ビーム１２は、回折光学素子４０の性質の特徴である出力ビーム４４のパターンへと分割され、それらの各々が点Ａから発する。その結果、前述した下流の光学要素による結果として出力ビーム４４は点Ｂを通過する。複数の対象物を互いに特定の空間関係で各々の対象物を特定の配向で作り出すことが望ましいいくつかの状況では、関連する対象物の動きが生じるよりも速いタイムスケールで複数の対象物を作り出すことが必要になるであろう。このタイムスケールは種々の要因の中でも媒質の粘度の関数であろう。そのような状況では、複数の対象物の並列での作製を可能にする装置が順々に対象物を作製する装置を上回る利点を提供することが可能である。
【００３１】
図３の回折光学素子４０は入力光ビーム１２に対して直角であるように示されているが、しかし多くの他の配列も可能である。例えば図４では、光ビーム１２は光軸２２に相対して傾斜角度βで到達し、回折光学素子４０に対して直角ではない。この実施形態では、点Ａから発する回折ビーム４４はイメージング体積３２の集束面５２に光学トラップ５０を形成するであろう（図１で最も良好に見られる）。この配列の光学トラップ・システム１０では入力光ビーム１２の非回折部分５４は光学トラップ・システム１０から除外されることが可能である。したがってこの構成は、一層少ないバックグラウンド光の処理を可能にし、光学トラップを形成する工程の効率と効力を向上させる。
【００３２】
回折光学素子４０はコンピュータで作り出されるホログラムを含むことが可能であり、それが入力光ビーム１２を予め選択された所望のパターンへと分割する。そのようなホログラムを図３および４の光学要素の残余と組み合わせることは各々の回折ビームの波面を別々に整形するために回折光学素子４０が使用される任意のアレイの作製を可能にする。したがって、光学トラップ５０は対物レンズ２０の焦点面５２ばかりでなく、焦点面５２の外にもまた配置されることが可能となって光学トラップ５０の三次元配列を形成する。
【００３３】
図３および図４の光学トラップ・システム１０で、やはり含まれるものは回折ビーム４４を集光することで光学トラップ５０を形成するための対物レンズ２０（またはフレネル・レンズのような他の類似した機能の同等の光学装置）といった集束用の光学要素である。さらに、テレスコープ３４もしくは他の受け渡し用光学系は前の背面開口部２４の中心点Ｂと共役の点Ａを作り出す。回折光学素子４０は点Ａを含む平面内に配置される。
【００３４】
別の実施形態では、テレスコープ３４を使用せずに光学トラップ５０の任意のアレイが作製されることが可能である。そのような実施形態では、回折光学素子４０は点Ｂを含む平面内に直接置かれることが可能である。本発明の別の形では、テレスコープ３４ではなくホログラム自体の中にレンズのうちの１つが配置されることが可能である。
【００３５】
光学トラップ・システム１０では固定型または時間依存性のいずれかの回折光学素子４０が使用される可能性がある。動的もしくは時間依存性のバージョンに関すると、光学トラップ５０の経時変化アレイを作ることが可能であり、それはそのような特徴を利用するシステムの一部であってもよい。付け加えると、これら動的光学要素４０は互いと相対して多様化した光学特性を備えた活発に動く粒子または他の物質に使用されることが可能である。例えば、回折光学素子４０はコンピュータで作り出される位相変調を入射レーザ・ビームの波面にコード化する液晶の空間光変調器であってもよい。別の実施形態では、空間光変調器はまた、回折光学素子の代わりに位相リングと併せて使用されることも可能である。
【００３６】
図５に例示された他の実施形態では、光学トラップ５０の連続的な平行移動を実行するようにシステムが構築されることが可能である。ジンバルを装備したミラー６０が点Ａにその回転の中心を備えて配置される。光ビーム１２はミラー６０の表面上に入射し、点Ａを通る軸を有し、背面開口部２４へと投射される。ミラー６０の傾斜はミラー６０に相対した光ビーム１２の入射角度の変化を引き起こし、この特徴は結果的に得られる光学トラップ５０を平行移動させるために使用されることが可能である。第２のテレスコープ６２はレンズＬ３、および点Ａと共役である点Ａ’を作り出すＬ４から形成される。点Ａ’に置かれた回折光学素子４０がここで回折ビーム６４のパターンを作り出し、それらの各々が点Ａを通過することで光学トラップ・システム１０内のトラップ５０の１つを形成する。
【００３７】
図５の実施形態の動作で、ミラー６０はトラップのアレイ全体をユニットとして平行移動させる。この方法論は、光学トラップのアレイを静止基板と正確に位置合わせするため、小さい振幅の高速振動変位を通じて光学トラップ５０を動的に固めるため、ならびに総合的な平行移動能力を必要とするあらゆる用途のために有用である。
【００３８】
光学トラップ５０のアレイはまた、試料ステージを動かすことによって、または望遠鏡３４を調節することによって試料ステージに相対して縦方向に平行移動させられることが可能である。付け加えると、光学トラップのアレイは試料ステージを動かすことによって試料に相対して横方向に平行移動させられることもやはり可能である。この特徴は対物レンズの視野の範囲を超えた移動のために特に有用であろう。
【００３９】
図６に示された他の実施形態では、光学トラップ１０によって捕捉された粒子の画像を見ることを可能にするように光学系が配置される。２色性ビーム・スプリッタ７０もしくは他の同等のビーム・スプリッタが対物レンズ２０と光学トラップ・システム１０の光学列の間に挿入される。例示された実施形態では、ビーム・スプリッタ７０は光学トラップのアレイを形成するために使用される波長の光を選択的に反射し、他の波長を透過させる。その結果、光学トラップ５０を形成するために使用される光ビーム１２が高効率で背面開口部２４へと伝えられ、その一方で画像を形成するために使用される光ビーム６６は画像化光学系へと通過することが可能である。
【００４０】
生きた細胞に外部物質を組み入れるための方法の本発明のさらに別の実施形態が説明される。光学的トラップ、光学的に誘発される膜融合、および光学的切断の組み合わせを使用して生きた細胞の中に人工染色体のような外部物質を組み入れるために光学トラップ装置が都合よく使用され得ることが最近判明した。限定しないで例を挙げると、この方法は移される物質、例えばリボソームをカプセル化する工程、リボソームを細胞膜に融合させる工程、および接合部に穴を開けて転移を有効化する工程を含む。第１の工程は様々な可能で知られている技術のいずれも活用する。いったんカプセル化が完了すると、リボソームが光学トラップで捕捉され、ターゲット細胞に向けて平行移動させられる。光に対する材料の感度に応じて、１つよりもいくつかの別々の光学トラップが好ましい可能性があり、そのケースではホログラフィ式光学トラップが、走査式光学トラップのような他の技術よりも利点を提供する。
【００４１】
多数の捕捉ポイントを順々にアドレス指定する走査式光学トラップとは違って、ホログラフィ式光学トラップはそれらのトラップの各々を連続的に照明する。走査式光学トラップに関して連続照明のトラップと同じトラップ力を達成するためには、少なくとも同じ時間平均の強度を提供しなければならない。これは、走査式のトラップが少なくともトラップ領域の数に比例する因数でさらに高いピーク強度を有する必要があることを意味する。この高いピーク強度は光学的に誘発されるトラップ対象物質の損傷の機会を増大させる。この損傷は少なくとも３つのメカニズム、すなわち（１）局所加熱につながる単一フォトン吸収、（２）光化学的変質につながる単一フォトン吸収、および（３）光化学的変質につながる多重フォトン吸収から生じる可能性がある。事象（１）および（２）はトラップ対象材料およびその周囲の流体媒質による吸収が弱い光波長を選択することによって緩和することが可能である。事象（３）はさらに普遍的な問題であって、部分的には、長波長の光で作業することによって緩和される。本開示の光重合の中心的メカニズムである多重フォトン吸収は強度の累乗（すなわち、２フォトン吸収に関するとＩ２）に比例する速度で生じる。そのような過程の速度はトラップ用ビームのピーク強度を下げることによって急速に低下する。結果として、低い強度で連続的に照明されるホログラフィ式光学トラップは時分割型の走査式トラップよりも好ましい。さらに、ホログラフィ式光学トラップ法は拡大した対象物の容積全体にわたってどのような走査式トラップ技術が行うよりも多くの独立したトラップを配分することに役立つ。特に、単一の平面に限定される走査式トラップとは違って、ホログラフィ式光学トラップ三次元的輪郭で対象物を横切ってトラップを配分することが可能である。
【００４２】
対象物上の多数の場所の間にトラップ力を配分することはさらに、ホログラフィ式光学トラップが対象物のいずれの一点に加わる最大の強度および最大の力も最小限にすることを可能にする。これは複数の釘の生えた土台であると考えられることが可能であって、いずれの１本も損傷の原因となり得るが、多くの釘の間に荷重を配分することは局所的な力を損傷の閾値よりも下に減少させる。
【００４３】
その結果、ホログラフィ式光学トラップは走査式トラップおよび従来式の個別の光学トラップの両方を上回る大きな利点を提供する。細胞自体が運動性であれば、それもやはりホログラフィ式光学トラップで定位置に保たれ、かつ配向を決められることが可能である。いくつかの用途、例えば物質が細胞の特定の部分へと移され、その他をバイパスしなければならないときに、光学トラップの操作は有利である。細胞とリボソームの両方を同時に保持するためにホログラフィ式光学トラップの単一のセットを使用することが可能である。
【００４４】
図８Ｃに示されるように、細胞２００は、例えば植物細胞のように不透過性の壁２１０を有する。光学メスは壁２１０を十分に切り取るために使用されることが可能であり、その後のリボソームの融合のために細胞膜２１５の領域を露出させる。この切断もしくは切除に使用される最も適当なレーザはリボソーム２２０および細胞２００を保持するため、および移動させるために使用されるよりも短い波長で動作することになる。材料の損傷が普通は望ましくないトラップとは違って、切除は集束された光と材料の間の強い相互作用を必要とする。したがって、損傷を最小限にするために上記で検討された条件はまた、所望の損傷を最適化するための指針も提供する。特に、短波長の光は長波長の光よりも１フォトン当たり多くのエネルギーを保持している。したがって、各々のフォトン吸収は細胞壁２１０および細胞膜２１５の中の化学結合を分断して巨大分子の位置を変えるために充分なエネルギー提供する確率がさらに高い。そのような変質すべての速度は短い波長の光ほど高められる。
【００４５】
いったん細胞膜２１５の区画が露出されると、今度もやはり光学トラップ力を使用してリボソーム２２０が近傍へと動かされることが可能である（図８Ａ参照）。リボソームの外葉に組み入れられたタンパク質もしくは他の生化学的薬剤の作用を通じて化学的に、あるいはリボソーム細胞膜界面に向けられた１つまたは複数の光パルスを通じて光学的に融合が達成されることが可能である（図８Ｂ参照）。
【００４６】
融合は１回の工程で転移を達成するように進行する可能性があり、そうでなければ細胞膜−リボソーム界面に穴を開けるためにさらなる化学処理または追加的な光パルスが必要とされる可能性がある。いったん界面が穿孔されると、リボソームの内容物（物質２４０）は拡散を通じて細胞２００の内部２３０に移ることが可能であり、そうでなければ１つまたは複数の光学トラップで細胞２００の中に移されることが可能である。付け加えると、例えば人工染色体については、細胞膜２１５と細胞質を通して物質を移すために光学トラップを使用し、その後、核膜を切開して核２５０の中に直接的に転移を達成することによって物質２４０は細胞核２５０の中に直接収納されることが可能である。
【００４７】
いったん転移が完了すると、収集される前のさらなる観察のために細胞２００は同じ場所に保持されることもあり得る。特に、上述の処理工程全体が閉鎖微小流体系の中で生じるのであれば、保持および収集の両方が光学トラップの操作によって容易にされることが可能である。
【００４８】
試料の選択から細胞の収集までの処理工程全体は観察用の従来式の光学顕微鏡を使用して実行されることが可能である。実に、この処理法のための光学トラップおよび光学メスを作り出すために使用される同じ光学列がその進捗状況をモニタするためにもやはり使用されることが可能である。さらに、すべての工程がホログラフィ式光学トラップまたは関連する操作技術を使用して実行されるならば、処理工程全体が自動化されることもやはり可能であり、光学トラップおよびそれらの動きをプログラムするためにデジタル記録の顕微鏡画像が使用される。
【００４９】
細胞２００の中に導入される物質もしくは材料２４０はあらゆる物質である可能性があり、それが導入される細胞２００の内因性物質ではないことが好ましい。その物質は普通では細胞膜を横断することが不可能な物質であることが好ましい。細胞２００の中に導入される物質は親水性の物質であることが好ましいが、しかしその物質が疎水性であることもやはり可能である。あらゆる生物学的分子またはあらゆる巨大分子、例えば分子の複合体が細胞２００の中に導入される可能性がある。物質２４０は概して１００ドルトン以上の分子量を有する。さらに好ましい実施形態では、物質２４０はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミド、染色体、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド配列、またはリボザイム）またはキメラ分子もしくはその断片、または発現ベクターといった核酸分子である。付け加えると、物質２４０はタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、多糖類、染料、薬剤のような薬学物質といったあらゆる生物活性分子である可能性がある。
【００５０】
この考察は単一のリボソームの内容物を使用して単一の細胞を改造するための方法に焦点を絞ってきたけれども、多数のリボソームを単一の細胞に融合させるため、および多数の細胞を同時に処理するために同じ手法が使用されることが可能である。
【００５１】
本発明の別の形では、非吸収性の粒子３１０を吸収性粒子２９０から区分けするために提供されるシステムと方法が構築される（図９参照）。集束されたレーザ光ビームから都合よく光学トラップもしくはトラップのアレイ３００が形成されることが可能であり、それが試料中のいくつかの非吸収性粒子３１０のための光学トラップとして、およびその他で光学メスとして動作することが見出された。しかしながら従来、光学メスによって為されたように吸収性粒子２９０を正確に切断するためではなく、光吸収は非特異的に吸収性粒子２９０を破壊し、それにより、それらを極めて小さい破片３３０へと小さくするために使用される。その後、これらの小さい破片は光学トラップ３２０内に残された損傷を受けていない非吸収性粒子から分離されることが可能である。
【００５２】
この方法の有用性の範例は血液試料中の癌細胞を探す課題である。通常では、検査が始まることが可能となる前に試料中の膨大な数の赤血球が候補の癌細胞から分離されなければならないであろう。可視域の波長、例えば５３２ｎｍの波長で動作する光学トラップから出る光は赤血球によって強く吸収され、その結果、局所加熱を通じてそれらを破壊することに使用されることが可能である。しかしながら、他の無着色の細胞が同じ可視トラップによって捕捉され、さらなる検査のために操作される可能性がある。例えば、赤血球のサイズよりも著しく小さい特徴的間隔で配列された可視光学トラップのアレイについて考える。外部から媒介される流体の流れによって光学トラップのこのアレイを通じてドライブされる細胞の混合物がこれらの光学トラップに遭遇するであろう。強く吸収する細胞は光との相互作用を通じて膜断片といったはるかに小さい成分へと小さくされるであろう。これら小さい成分は光と比較的弱い相互作用を有し、わずかの部分がアレイのいくつかのトラップによって捕捉される可能性がある。しかしながら、それらは流体の流れによって洗い流される確率の方がさらに高い。弱吸収性の細胞は光によって損傷を受けるのではなく、アレイの中の１つまたは複数の光学トラップに遭遇してトラップ力を受けるであろう。
【００５３】
無傷の細胞は破壊された細胞の断片よりも光学的トラップの影響を受けやすい、さらに大きく、さらに多くの領域を有し、したがって光学トラップのアレイによって優先的にトラップされるであろう。光学トラップのアレイの中に局在する細胞は、光学トラップ自体を移動させることによって、例えば本譲受人の以前の出願（Ｇｒｉｅｒらの米国特許出願番号０９／８７５，８１２号、２００２年１２月１２日に公開された米国特許公開ＵＳ２００２−０１８５５９２Ａ１号）の特徴を活用すると、トラップされた細胞を試料容器内の収集領域へと輸送するように試料容器を移動させることによって、または定期的にトラップをオフに切り換え、流体の流れを通じて細胞を収集領域へと向けることによって収集のために輸送されることが可能である。これらの方式のいずれでも、光を吸収しない細胞は吸収する細胞から切り離されて収集される。
【００５４】
この手法は細胞の区分けから、吸収係数が少なくとも１つの特定の光波長に関して十分に異なるあらゆる他の材料の区分けへと一般化されることが可能である。この操作の利点は望ましくない吸収性物質を除去する高い正確さ、および他の能動的区分け工程を実行する能力を含む。同じ利点がこの切除式の粒子区分け方法の他の用途にもあると思われる。
【００５５】
光学的切除式の粒子区分け法の好ましい実施形態では、非吸収性粒子の分離はホログラフィ式光学トラップ技術で作り出される多数の光学トラップを備えて有効化される。取り除かれる吸収性粒子に対するトラップされた粒子の分離は前に開示された能動的トラップ操作、光学的蠕動、流れの中での受動的側方離脱の技術で実行されることが可能である。この分離はまた、吸収性粒子の削除から生じる廃棄物を流し出すための１つの通路および選別された非吸収性粒子を収集するための他の通路を備えた微小流体装置でも実行されることが可能である。
【００５６】
光学トラップの以前の使用法では、トラップされるあらゆる物質に損傷を与えない光波長を選択するために多くの注意が必要とされた。本発明では、目標は混合試料のうちの望ましくない部分母集団によって強く吸収され、回収されるべき他の部分母集団によって極めて弱く吸収される波長を選択することである。弱吸収性の部分母集団の回収は従来式の方法を通じて進行するし、このケースでは分離は能動的な選別ではなく望ましくない画分の受動的破壊を通じて達成される。これはまた、フロー・サイトメトリのような他の分析方法のための前処理工程であることも可能である。
【００５７】
限定はされないが例を挙げると、この方法は血液のスクリーニングを通じた癌の早期検出のために使用されることが可能である。すなわち、最も早期の段階にあるいくつかの種類の癌は特に明確な腫瘍を形成しないが、しかしその代わりに異常な細胞の領域を規定し、それは血流中に剥がれ落ち易い。実際では、それらの細胞の検出は患者が早期の段階の癌を有している兆候を与える。そのような検出は、完全な腫瘍もしくはその生成物質の検出を必要とする他の方法のずっと以前に少なくとも暫定診断を提供する。したがってこの方法は早期の、かつ一層効果的な治療を提供するであろう。これは、高密度でヘモグロビンを担持した赤血球を血中に搬送される他の細胞から分離するための遠心分離に関する従来式の分離方法と対比されることが可能である。しかしながら、遠心分離はしばしば軽い細胞を重い細胞と飛沫同伴させ、その結果、検出を極めて困難にする。
【００５８】
本発明の方法を使用すると、血液試料は赤血球の細胞構造を破壊し、白血球および考え得る癌細胞といった赤血球ではない細胞を無傷で残す波長と強度を有する光学トラップのアレイを通して流されることが可能である。実際では、赤血球はトラップするには小さ過ぎる断片へと小さくされるであろう。対照的に、損傷を受けていない細胞は光学トラップによってトラップされ、例えば順々にトラップのパターンを更新することによってその後の分析のために収集ポイントへと輸送されることが可能である。
【００５９】
本発明のさらに別の実施形態では、方法は空間分解光化学を導入する工程に関する。光は光化学反応のための活性化エネルギーを与えることが可能であり、１フォトンが光化学反応を開始させるための充分なエネルギーを付帯していないケースでは。２つ以上のフォトンが同時に吸収され、それにより全吸収フォトンの組み合わせエネルギーが反応のための活性化閾値を超える場合、光化学反応はそれでも進むことが可能である。多重フォトン過程が進行する速度は利用可能な光の強度に非線形的に応じて決まり、２フォトン吸収は光強度の平方、ｌ２に比例して生じる。強度に対するこの非線形的依存性はさらに大きな試料内の選択された容積の中でのみ光化学反応を開始させ、空間分解方式で進行させるために使用されることが可能である。反応は充分に強く照明される領域で生じるだけであってその他では生じない。
【００６０】
光学トラップは密に集束された光ビームであり、したがって、光化学を通じて空間分解された構造を作り出すための理想的な方法を提供する。光学トラップ内の焦点は照明領域のうちの最も高強度の領域である。この焦点領域を強度を光化学的変化の目に見える程度の速度の閾値に近く調節することは、光学トラップの回折限界焦点容積に匹敵する容積内で制御された光化学を容易にする。光学トラップは概して小さい容積の物質をトラップおよび操作するために使用されるのに対して、ここではそれらは所望の方式で物質を変化させるために使用されている。直径で１０マイクロメートルの小ささの光重合したデバイスを作り出すように２フォトン光化学を開始して伝播させる局所的に強い照明を作り出すために当該技術で単一の光学トラップが訴えられた。以前の従来式の方法で光化学パターンを規定する工程は、流体の前駆体を通じて単一光学トラップを平行移動させる工程、または単一の固定型トラップを通過して流体を平行移動させる工程のどちらかを必要とする。どちらのケースでも、空間分解光化学によって構造を作り出す過程は順々にターゲット容積を照明する工程を含む。
【００６１】
以前の方法とは異なり、本発明は多数の場所で同時に空間分解光化学を実行することで異種成分または同一成分のいずれかから成る構造を作り出すために多数のホログラフィ式光学トラップを使用する。例えば以前の方法では、一度に多数の同じ構造のコピーを引き出すために多数のビームを使用することが可能であり、その結果、多数の同じ構造を同時に作製することを可能にする。場合によっては、単一の構造の多様な態様を作り出すために多数の光ビームを使用することが可能であり、その結果、はるかに高速で作製されることが可能になる。最後に、拡大された容積の周りの外側構造を作り出し、かつ内側容積構造（すなわちその容積の周りに別個に作製された外殻の内側の構造）を同時に作り出すために別々のビームが使用されることが可能である。それらの技術のすべてに共通しているものはゲルのような一様な物質から成る構造の作製である。ここでは、先行技術とは異なり、光学トラップと化学的変化の操作の独自の組み合わせが有効化され、したがって単一もしくは多数の異種構造の作製もやはり可能にする。例えば、特定の対象物が前もって形成される場合、それらを決まった位置に保持するために特定の光学トラップが使用され、その一方で光化学的に変化した物質で構成される相互接続を作り出すために他の同様に集束された光ビームが使用され、それによって異種構造を作り出すことが可能である。
【００６２】
さらに、従来式の光学トラップとは異なり、ホログラフィ式光学トラップは多数の光学トラップを使用者が特定するどのような三次元的パターンにも規定するようにコンピュータで作り出される回折光学素子を使用する。そのようなトラップ・パターン内の各焦点は、光化学的変化を誘発するために使用することができる。コンピュータ・アルゴリズムは三次元のアクセス可能な容積内のあらゆる場所に１つまたは複数の光学トラップを配置することを可能にし、かつそれらのトラップの特性の個別の変更もやはり可能にする。前のトラップから移動した場所、またはトラップの特性がわずかに異なる場所にトラップで新たな構造を作り出す工程は、新たなホログラムを算出して投射することによって達成される。したがって、光化学的に規定されるパターンの多数のコピーを作製するためにトラップの固定配列が前駆体溶液を通じて操られることが可能であるが、しかし大きな変化を達成するためには一連の小さな措置が必要とされる可能性がある。反対に、ホログラフィ式光学トラップのアレイ内の個々のトラップは、コンピュータで作り出される回折パターンの配列を算出して投射することによって別々に動かされることが可能であり、各々のトラップの位置は各々のパターンで要求される通りに更新される。これは、多数のトラップが多数の領域で同時に光化学的変化を誘発させることを可能にし、１つまたは複数の光化学的に規定される構造の多数の部分を効率的にアドレス指定するために有用であろう。これらの用途でのホログラフィ式光学トラップ技術の利点としては、大幅に改善される処理効率や、形成工程の態様に応じて決まる可能性のある最終製品の材料特性を最適化するように開始したり成長普及率を上げたりする機会が含まれる。
【００６３】
本発明の方法では、ホログラフィ式光学トラップは倍周波Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザから得られる波長５３２ｎｍの光を使用してＮｏｒｌａｎｄ  Ｔｙｐｅ７３  ＵＶ硬化接着剤およびＮｏｒｌａｎｄ  Ｔｙｐｅ８８  ＵＶ硬化接着剤を光重合させることによって利用される。ＵＶ励起される光開始剤およびフリーラジカル阻害剤を含む前駆体溶液からポリアクリルアミドを光重合させるために光学トラップが使用された。
【００６４】
本発明の好ましい実施形態が示され、説明されてきたが、特許請求の範囲に述べられている、より広い態様の本発明から逸脱することなく様々な変更および修正が為され得ることは当業者にあきらかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】単一の光学トラップに関する先行技術の方法およびシステムを例示する図である。
【図２】単一の操縦可能な光学トラップに関する先行技術の方法およびシステムを例示する図である。
【図３】回折光学素子を使用する方法およびシステムを例示する図である。
【図４】入力の光ビームに相対して傾けられた光学要素を使用する他の方法およびシステムを例示する図である。
【図５】回折光学素子を使用する連続的に平行移動可能な光学トラップ（トラップ）のアレイを例示する図である。
【図６】光学トラップを使用して粒子を操作し、その一方で光学トラップのアレイを見るための画像もまた形成するための方法およびシステムを例示する図である。
【図７Ａ】図６の光学系を使用して４×４の光学（トラップ）のアレイの画像を例示する図である。
【図７Ｂ】トラップ用照明が消えた直後であるが球体が拡散し終える前の、図７Ａの光学トラップによって水中に懸濁された直径１マイクロメートルのシリカ球体の画像を例示する図である。
【図８Ａ】細胞の中に物質を転移させる処理の第１の工程を例示する図であって、リボソーム内にカプセル封入された物質が光学トラップで固定化される。
【図８Ｂ】細胞膜に融合されるリボソームを例示する図である。
【図８Ｃ】リボソーム細胞接合部の裂け目を通して移されるリボソーム内の物質を示す図である。
【図９】吸収性の粒子からの非吸収性の粒子の分離を例示する機能ブロックの流れ図であって、非吸収性のサンプルは光学トラップ・アレイによって偏向させられ、吸収性サンプルは微小断片へと破壊され、偏向を受けない。
【図１】
2005534321.tif 000003
【図２】
2005534321.tif 000004
【図３】
2005534321.tif 000005
【図４】
2005534321.tif 000006
【図５】
2005534321.tif 000007
【図６】
2005534321.tif 000008
【図７Ａ】
2005534321.tif 000009
【図７Ｂ】
2005534321.tif 000010
【図８Ａ】
2005534321.tif 000011
【図８Ｂ】
2005534321.tif 000012
【図８Ｃ】
2005534321.tif 000013
【図９】
2005534321.tif 000014
【国際調査報告】
2005534321.tif 000015
2005534321.tif 000016
2005534321.tif 000017
2005534321.tif 000018
2005534321.tif 000019