(57)【要約】本発明は、１つ又は複数の鎖状のコロイド粒子集合体に関し、上記鎖は不可逆的な様式で生み出され、そして上記粒子の直鎖組織に関係している部位と異なる、ある種に対する少なくとも１つの認識部位を有することを特徴とする。本発明は、さらに特に流体中の少なくとも１つのの種の検出及び/又は入射のための前記集合体の製造方法、及びコロイド鎖の集合体を用いて官能化された表面エレメント、及びそのような表面エレメントを含むハイブリダイゼーション・ネットワークに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の鎖の形をしたコロイド粒子集合体であって、上記鎖が不可逆的に組織化され、かつ、種に対する１つ以上の認識部位を有し、そして上記部位が上記粒子の直鎖組織に関与するリガンドと異なる前記集合体。
【請求項２】
前記コロイド粒子が、本質的に球形である、請求項１に記載のコロイド粒子集合体。
【請求項３】
前記鎖がフレキシブル又はセミ−フレキシブルである、請求項１又は２に記載の集合体。
【請求項４】
前記鎖が１よりも大きな、好ましくは３より大きなアスペクト比を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項５】
前記粒子が、完全に又は部分的に有機的な性質であり、好ましくは有機鉱物的な性質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項６】
前記粒子が本質的に鉱物的な性質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項７】
前記粒子が本質的にシリカから成るか、又はシリカ・シェルを含む、請求項６に記載の集合体。
【請求項８】
前記粒子が、強磁性材料、フェリ磁性材料、反強磁性材料、超常磁性材料、導電性材料、又は半導体材料ベースである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項９】
前記コロイド粒子が、重合体の有機層でコートされた鉱物の核を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項１０】
前記粒子間の結合力が、上記粒子間の共有結合によって維持される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項１１】
前記粒子間の結合力が、分子又は巨大分子による架橋から生じる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項１２】
前記粒子間の結合力が、直接上記粒子間の、あるいは上記粒子の表面に存在する反応性官能基を介して、分子又は巨大分子との特異的な相互作用に関与する、請求項１０又は１１に記載の集合体。
【請求項１３】
前記反応性官能基が、アミン、カルボン酸、アルコール、アルデヒド、チオール、エポキシド、又はヒドラジン官能基、及び／又はハロゲン原子である、請求項１２に記載の集合体。
【請求項１４】
前記粒子間の結合力が、静電的、疎水性、又はファン・デル・ワールス型の相互作用に関与する、請求項１〜９又は１１のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項１５】
前記認識部位が：核酸又はその合成アナログ、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、タンパク質錯体、プロテオグリカン、ポリサッカライド、遺伝子断片、抗体、抗原、酵素、エピトープ、ハプテン、他の化学種を特異的に認識できる化学的官能基、金属に特異的なリガンド、触媒部位、分子フットプリント、疎水性基、酵素又は酵素の一部、から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項１６】
前記認識部位が、分子、イオン、表面エレメント、あるいは分子若しくはイオンのその他の特異的部分であって引力相互作用を生じるか、又は特定の種若しくは特定カテゴリーの種との化学反応を生じることができるものである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項１７】
前記認識部位が、芳香族又は複素環式化学官能基を含む化合物又は水素結合を生じることができる部位から選択される、請求項１６に記載の集合体。
【請求項１８】
前記粒子が、少なくとも２つの異なるタイプの認識部位を有する単一の鎖又は一組のコロイド鎖状に組織化される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項１９】
いろいろなタイプの認識部位又は官能基が、予定している鎖に従って所定の順序で組織化される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項２０】
前記粒子又はその一部が、同一又は異なる１つ以上のラベルを有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項２１】
前記集合体が、いくつかの鎖から成り、各鎖は所定のタイプの認識部位、又は反応性官能基を有し、必要に応じて、少なくとも１つの所定のタイプのラベルを有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の集合体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の集合体を製造するために有用な方法であって、少なくとも以下のステップ：
−１つ以上の直鎖物の形をしたコロイド粒子を集合させ、そして
−上記物を不可逆的に架橋することができる少なくとも１つの物質と接触させる、
を含む前記方法。
【請求項２３】
前記架橋物質が、重合体から、好ましくは高分子電場質から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子の直鎖集合体が、磁界又は電場の一時的又は持続的な作用によって得られる、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記粒子の組織化が、ミクロ流体セルで、又は少なくとも２つの本質的に平行な面を有するチャンネル又はチャンバ内で行われる、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の集合体を調製するために有用な方法であって、少なくとも以下のステップ：
−少なくとも１つの架橋物質又は架橋物質の前駆物質と、コロイド粒子を混合する及び／又はグラフトし、
−上記コロイド粒子を１つ以上の直鎖物の形に集合させ、そして
−直鎖組織に維持された上記粒子間の架橋を開始する、
を含む方法。
【請求項２７】
前記第三のステップが、温度の変化、電場又は磁界の電磁放射の適用、ｐＨの変化、及び／又は光化学反応と関係する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のコロイド粒子集合体の少なくとも１つを用いた、少なくとも１つの種を生体外で診断し、及び／又は分析し、精製し、同定し、分離し、又は測定する方法。
【請求項２９】
前記種が、タンパク質、核酸、核酸の合成等価物、プロテオグリカン、ハプテン、酵素、抗体、抗原、合成巨大分子、汚染物質、細胞小器官、細胞、ウイルス、微生物、天然又は合成起源のナノ粒子又はミクロ粒子、有機又は有機鉱物分子、薬剤及び医療品から選ばれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも以下のステップ：
−チャンネル又は容器内で、不可逆的な鎖状のコロイド粒子集合体を使用し、
−分離、検出及び／又は分析する少なくとも１つの種と、前記集合体を接触させ、そして
−予定している種と上記集合体との見込まれるハイブリダイゼーションを検出する手段を使用する、
を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
その間に前記鎖とハイブリダイズしなかった生成物が除去されるか、又はその間に前記鎖と反応した生成物が回収される洗浄ステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記コロイド粒子の鎖が、チャンネル内で又は表面上で、いくつかの異なる区間の形に配列される、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記鎖を含む区間を、少なくとも１つの分析される種を含む流体が通過する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
電気クロマトグラフィー、アフィニティー電気泳動又はクロマトグラフィー装置における請求項１〜２１のいずれか１項に記載のコロイド粒子集合体の使用方法。
【請求項３５】
マイクロリアクターとしての請求項１〜２１のいずれか１項に記載のコロイド粒子集合体の使用方法。
【請求項３６】
前記粒子に結合した認識部位が触媒部位である、請求項３５に記載のコロイド粒子集合体の使用方法。
【請求項３７】
コンビナトリアル・ケミストリーにおける請求項１〜２１のいずれか１項に記載のコロイド粒子集合体の使用方法。
【請求項３８】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のコロイド粒子集合体を担持する表面エレメント。
【請求項３９】
前記コロイド鎖の活性表面積が上記鎖を担持する表面エレメントの表面積よりも大きい、請求項３８に記載の表面エレメント。
【請求項４０】
前記鎖がその一端を介して前記表面に結合されていることを特徴とする、請求項３８又は３９に記載の表面エレメント。
【請求項４１】
前記鎖の前記表面への結合が、上記鎖と上記表面の間に共有結合を生成することにより、分子又は巨大分子によって架橋することにより、及び／又は疎水性若しくはファン・デル・ワールス型の静電的相互作用によって得られる、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の表面エレメント。
【請求項４２】
前記鎖を、前記表面上で、異なる認識部位を有するコロイド鎖を含む少なくとも２つの異なる領域に集める、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の表面エレメント。
【請求項４３】
請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の表面エレメントを含むハイブリダイゼーション・ネットワーク。
【請求項４４】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載のコロイド粒子集合体を含むミクロ流体セル又はチャンネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として持続的なコロイド鎖の形に組織化された磁性コロイド粒子に関する。本発明は、また、流体中に存在する特定の種の検出及び／又は分析のためのそのような鎖の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体サンプルに含まれる種を選別及び／又は分析する方法はすでに知られている。それらの方法は、一般に、ＤＮＡ又はタンパク質“チップ”のような表面に配置されたハイブリダイゼーション・アレー、又はマイクロビーズ、又はその２つのアプローチの組み合わせを用いる。しかし、以下の分析で明らかにされるように、これらの方法には制限がある。
【０００３】
“チップ”の場合、考えている生物的リガンド（ＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、タンパク質）がある表面の予め定められた“スポット”にin situでデポジット又は合成される。各スポットは、普通、表面積が１００ミクロン×１００ミクロン以下であり、したがって限られた表面積に多数の認識部位を設けることが可能であり、かつ少量のサンプルで限られた時間内に多数の分子的な分析を行うことが可能である。このようなシステム、及びそれを調製する手段は、例えば、U.S, Patent No. 5,744,305 (Affymetrix)、Schena et al., Science, 270, 467-470, 1995、に記載されている。しかし、これらのチップは、いくつかの用途では、その感度がまだ不十分である。もっと重大なことは、そのハイブリダイゼーションの速度（kinetics）が、通常の溶液におけるハイブリダイゼーションと比べて著しく低下することである。最後に、この方法には再現性が欠如している。この場合、これらの問題点は、大体においてチップとハイブリダイゼーション・メカニズムの物理化学的な側面に基づいている（例えば、M. S. Shchepinov, S.C. Case-Green, E.M. Southern, Nucleic Acid Res. 25, 1155-61 (1997) を参照のこと）。
【０００４】
考えられる第二の方法は、テストされる分析物（analyte）を、ある表面に並べられた微小球のネットワークを用いて結合することである。この方法によれば表面でアクセスできるいろいろな機能を担った微小球を好適に用意することができる。しかし、球の活性表面積は、もちろん、テスト装置の表面でそれが占めている面積と同じ程度の大きさである。したがって、この方法も感度の点で大きくゲインすることはできない。
【０００５】
磁性マイクロビーズもミクロ流体チャンネルでオリゴヌクレオチドを分析するために提案されている。マイクロビーズがあるチャンネルに導入され、そのチャンネルのある部位に局所磁界によって保持される；磁性ビーズのコンパクトな積層から成るゾーンがこうして形成される。分析される種を含む液体がこの積層を通して循環される。前記の種のハイブリダイゼーションは蛍光によって検出される。種が循環するため、速度は明らかに通常のＤＮＡ“チップ”の場合に比べて速い。さらに、このシステムはリサイクルできる。すなわち、磁界を除去するとビーズは再び動けるようになる。しかし、この方法の原理を実証するために用いられた分析物の濃度は、実際にチップで用いられている濃度に比べてずっと高い。これは、感度が低いということを示唆している。これは特に、ビーズがコンパクトに集まっていることで説明できるかもしれない。検出器に最も近いビーズが他のビーズに光が伝わるのにスクリーンになって、検出に効果的に関与するのは表面に最も近いビーズだけになる。
【０００６】
最後に、微小球も、種、特に生物的な種、を、表面又はミクロ流体チャンネルに配置されるネットワークとは異なる配置で同定し分析するのに用いられる。それらは特に、分析又は調製に用いられる、“磁気選別”と呼ばれる方法である。最も普通の方法では、分析される種（細胞、ＤＮＡ、タンパク質）を含む液体が、磁性粒子に接触させられる。この磁気システムの現在のバージョンは、単離する細胞に特異的な機能を担っている磁性粒子を最初の溶液に導入するというものである。結合後、ビーズとそれに結合した種は磁石を用いてペレット化され、上澄みは除去される。この方法は現在、本質的には濃縮された対象の二元的選別に提案されている。それはさらに、情報を生成するためのオンライン分析を必要とする。この磁気的方法は、実施するのに簡単であるが２つの重要な制限がある：すなわち、不完全な選択性と純粋に二元的な性質である。これらは両方共、純粋な種又はいくつかの規準に対応する種を求める場合にこの手順を反復することを必要とする。選択性の欠如は、何よりもまず、粒子の“沈殿”のさいの上澄みの流出によって生じ、動いているビーズが流体の一部を、したがって、まわりの生物学的な対象を一緒に移動させる。磁気的な圧力の力は、ペレットにトラップされたどんな対象をもビーズに強く結びつけるように働くので、非特異的な結合の問題も考慮に入れなければならない。
【発明の開示】
【０００７】
ここで、本発明は、液体サンプルにおける種を診断及び／又は調製、同定、分析、又は測定するための新しい手段（tool）を、すなわち、感度、速度、及び再現性の点で満足できる結果を与える新しい手段を提案することを目的とする。
【０００８】
もっと厳密に言うと、本発明の第一の主題は、１つ以上の鎖の形のコロイド粒子集合体（an assembly of colloidal particles）であって、前記鎖は不可逆的に組織化され、ある種に対する少なくとも１つの認識部位を有することを特徴とし、前記部位は前記粒子の直鎖の組織に関与しているリガンドと異なる。
【０００９】
本発明においては、“コロイド粒子の鎖”又は、区別なしに、“コロイド糸（thread）”又は“コロイド鎖”という用語は、本質的に直鎖のコロイド粒子集合体を意味するものとする。いろいろな幾何学的な組織のこのような集合体を本発明の文脈において用いることができる。特に、鎖の幅が本質的にコロイド粒子の幅である“パール・ネックレス”集合体、又は鎖の各断面がいくつかの粒子を含む“カラム”集合体、を用いることができる。
【００１０】
本発明によるコロイド鎖は、アスペクト比（断面の最大寸法に対する長さの比）が１よりも顕著に大きく、普通は３よりも大きく、好ましくは５よりも大きい。しかし、多くの用途でずっと大きなアスペクト比、１０以上という、又は１００よりも大きなアスペクト比が有利であると分かることがある。
【００１１】
本発明によるコロイド鎖は、比較的硬い（本質的に棒の形をとる）ことも、半ば硬い（長さと同程度の曲率半径を有することが可能）ことも、フレキシブル（長さよりもずっと小さな曲率半径を有することが可能）であることもある。フレキシブルな鎖の場合、上の記述における長さは、前記鎖の曲線横座標に沿って伸びる。ある好ましい変形例では、それらはセミ−フレキシブル又はフレキシブルである。
【００１２】
一般に、本発明によるコロイド鎖は本質的に円形である。しかし、コロイド鎖は、この断面の最大寸法がコロイド鎖の最大長さよりも少なくとも３という因子だけ小さい限り、他のどんな形をとってもよい。
【００１３】
いくつかの用途では、 “単一分子”法で、ＤＮＡの個々の分子に関してすでに用いられているものとのアナロジーによって、与えられたタイプの単一コロイド鎖を用いることができる。しかし、一般に、コロイド鎖の組を用いることが好ましい。
【００１４】
本発明では、“コロイド粒子”という用語は、多数の原子又は分子から成り、流体中で浮遊状態で維持できるコンパクトな三次元物体を意味するものとする。コロイド粒子の寸法は、普通、数十ナノメートルから数ミクロンの間であり、稀には数十ミクロンである。例えば、ラテックス粒子、ミクロン又はサブミクロン・サイズのマイクロゲル又は磁性ビーズ、ナノクリスタル又はミクロクリスタル、が本発明によるコロイド粒子を構成する。好ましくは、これらの粒子はブラウン運動によって浮遊状態に維持される。しかし、沈殿を生じる粒子も、使用するときに、例えば撹拌又は超音波振動によって再懸濁させることが可能である場合、本発明におけるコロイド粒子と見なすことができる。
【００１５】
本発明によるコロイド粒子の鎖を構成するのに用いられるコロイド粒子は、本質的に球形であることが好ましい。
【００１６】
これらのコロイド粒子は、有機、鉱物、又は有機鉱物であってよい。ある好ましい変形例では、コロイド粒子は完全に又は部分的に有機的な性質であり、好ましくは有機鉱物的な性質である、すなわち、有機成分と好物成分の両方を有する。
多くのタイプの有機鉱物粒子が、商業的に入手可能、又は当業者に公知である。それらは、有機成分から得られる性質と鉱物成分から得られる性質を組み合わせて、非常に多様な性質を有する本発明によるコロイド鎖を構成することを好適に可能にする。
【００１７】
鉱物成分（又は、本質的に鉱物である場合は全粒子）の化学的性質に関しても、非常に多様な性質が可能であり、特に金属の粒子、例えば、金、銀、又はチタンのミクロ粒子又はナノ粒子、半導体金属の酸化物、金属酸化物、炭素粒子、特異的蛍光又は光吸収性質を有する“量子ドット”、及び／又は誘電体又は導電性物質、などである。磁性物質、例えば、超常磁性、フェリ磁性、強磁性、又は反強磁性物質、そうでなければ導電性又は半導体物質、は本発明にとって特に好適である。
【００１８】
半導体酸化物としては、本質的にシリカ又は酸化ケイ素から成る粒子又はシリカ・シェル（silica shell）を含む粒子は特に有利である。
【００１９】
この鉱物成分は、コロイド鎖を構成するコロイド粒子の核心にトラップされていても、その表面に存在していてもよい。例えば、第一の好ましい変形によれば、導電性を得るために粒子の表面に金属の層を有することが可能である。好適には、この層は、当業者には公知の多くの方法での銀タイプのデポジション・プロセスによって得られる（例えば、DNA-templated assembly and electrode attachment of a conducting silver wire, E. Brown, Y. Eichen, U. Sivan, G.Y. Ben Yosph, Nature, 391, 775-778 (1998)を参照のこと）。別の好ましい変形によると、金属又は半導体粒子の大きな割合がコロイド鎖の内部に含まれる。
【００２０】
磁性物質成分という特定の場合には、前記成分がコロイド粒子の核心にあることが好ましい。
有機成分の化学的性質に関して言うと、これも非常に多様であることが可能であり、特に例えば、植物、石油をベースとする、又は合成のオイル、アクリルアミド、ポリスチレン、又はポリカーボネート、の誘導体などの、架橋された又は架橋されないいろいろな重合体、及びもっと一般的に、ラテックスを構成するのに用いられるいずれかの物質、を含むことができる。
【００２１】
特に、本発明に好適なものは、鉱物の核を含み、重合体型の有機層、例えば、ポリスチレン又はポリカーボネート・タイプの重合体、又はアクリル・タイプのモノマー、例えば、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、グリシジル・アクリレート又はメタクリレート、２−ヒドロキシエチル・メタクリレート（ＨＥＭＡ）、又はエチレン・ジメタクリレート（ＥＤＭＡ）など、がコーティングされたものである。ポリ（メチル・メタクリレート）であってもよい。有機シェルは表面の有機官能基（functions）の存在によって、認識部位及び／又は二次化合物をグラフト（graft）する可能性、及び前記粒子を直鎖に組織する手段を提供するという利点がある。表面の反応性官能基としては当業者に周知のどんなタイプの反応性官能基を用いてもよい。非限定的な例をあげると、カルボン酸、アミン，アルコール、又はチオール基、重合可能な官能基、例えば、二重又は三重結合、特にアリル又はアクリル官能基、そうでなければポリオール、ヒドラジン、又はエポキシドなどがあげられる。また、生物学的なタイプのリガンド、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、ジゴキシゲニン、又はアンチジゴキシゲニン、及びもっと一般的に生物学でグラフト部位（grafting site）としてよく用いられる抗体や抗原、又はそうでなければ遷移金属に対する強い結合部位、例えば、ニッケルに対する“ヒスチジン・ケージ”、などであってもよい。
【００２２】
本発明のコロイド粒子集合体は、直鎖に組織化されて、コロイド粒子の不可逆的な鎖又は不可逆的な鎖の組を形成する。
【００２３】
本発明では、“不可逆的”という用語は、外部磁界がなくなったときにコロイド粒子の直鎖の鎖が自発的に及び／又はある時間の後に離れることができないことを表すものとする。この場合、直鎖の組織のために外部の磁界又は電界の持続的な維持を必要とする粒子の鎖は本発明の範囲から除外される。
【００２４】
本発明によるコロイド粒子集合体の不可逆的な性質は、他方、粒子が懸濁される流体の組成についての与えられた条件の下での不可逆性を意味するものとする。したがって、そのような集合体は、たとえ、それが形成された液体の組成又はｐＨと著しく異なる組成又はｐＨを有する液体で希釈することによってそれを溶解できるとしても、不可逆であると見なされる。
【００２５】
本発明のコロイド鎖では、粒子間の結合力は、好ましいバージョンでは、粒子間の共有結合によって維持することができ、それは分子又は巨大分子による架橋によって得られる。
この共有結合は、これらの粒子の表面に存在する反応性官能基を介して、直接に粒子間の、又は粒子と分子又は巨大分子の間の特異的な相互作用に関わる。反応性官能基は、アミン、カルボン酸、アルコール、アルデヒド、チオール、エポキシド、又はヒドラジン官能基、及び／又はハロゲン原子である。
【００２６】
コロイド粒子間の直鎖組織の構成と維持には、また、静電的、疎水性、又はVan der Waal相互作用が関与してもよい。コロイド粒子を互いに結合するには、分析される又は分離される種に関して働くものと異なる、前記粒子間の直接の又は他の分子又は巨大分子による特異的な相互作用が関与することも可能である。
【００２７】
本発明の粒子の集合体は、少なくとも１つのある種に対する認識部位を有し、好ましくは少なくとも１つの与えられたタイプのいくつかの認識部位を有する。
“認識部位”という用語は、ある特定の種又は特定カテゴリーの種に対する引力相互作用又は化学反応を生じることができる分子、イオン、表面エレメント、又はそうでなければ分子又はイオンの特定部分、を意味するものとする。
【００２８】
いくつかの異なるタイプの認識部位が、同じ鎖、又は鎖の組が用いられる場合は異なる鎖、に担持されることがある。部位のタイプの数は、特に５より大きい、又は１０より大きい、又は例えば、ＤＮＡ又はタンパク質“チップ”など、いくつかの応用では数百から数万までになる。
【００２９】
本発明によるコロイド鎖を特徴づける認識部位は、好ましくは、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド）、又はその合成アナログ（ＰＮＡ、ＬＮＡ、チオール化又はメチル化オリゴヌクレオチド、など）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、タンパク質錯体、プロテオグリカン、及びポリサッカライド、から選ばれる。また、遺伝子断片、抗体、抗原、酵素又は酵素の部分、又はタンパク質の生物的に活性な部分、エピトープ、及びハプテン、から選ぶこともできる。しかし、上で述べたように、種を検出及び／又は分析する目的で考慮される認識部位のタイプは、単数又は複数の鎖の形でコロイド粒子を持続的に組織することにそれ自身が関与している特異的リガンドとは異なっている。したがって、直鎖の集合体が、例えば、ビオチン／アビジン対のようなリガンド対の共有結合によって得られるが、さらに、考えている対の特異的なリガンド以外に、すなわち、上の例ではビオチン又はアビジン以外に、少なくとも１つの認識部位を有しないコロイド粒子の鎖は本発明の範囲から除外される。
【００３０】
本発明の粒子の鎖に存在する認識部位は、また、他の化学種を、例えば、それと結合することによって（例えば、例をあげると遷移金属に結合できるクラウン・エーテル、又はその逆）、又はそれと反応することによって（例えば、やはり例をあげると、タンパク質を消化できるトリプシン又はアルファ−キモトリプシン）、特異的に認識できる化学的官能基（function）から選ぶこともできる。また、それらは金属に特異的なリガンド、分子フットプリント、触媒部位、疎水基、又はさらに一般的に、クロマトグラフィーでいくつかの種に対する特異的なアフィニティーをカラムに付与する官能基、であってもよい。特に、本発明の粒子の鎖に存在する認識部位は、芳香族又は複素環式の化学的官能基を含む化合物、又は水素結合を生じることができる部位、から選ぶことができる。
【００３１】
本発明では、“種”という用語は、分子又は巨大分子、粒子、原子、イオン、又は天然の有機又は合成起源の対象、例えば、核酸、タンパク質、酵素、抗体、抗原、ペプチド、ポリペプチド、ハプテン、ポリサッカライド、プロテオグリカン、器官、ウイルス、細胞、細胞の組、微生物、又はコロイド、を意味するものとする。また、天然又は合成起源のナノ粒子又はミクロ粒子、有機又は有機鉱物分子、薬剤、医薬品、又は汚染物質、であることもある。
【００３２】
ある好ましい変形によれば、本発明によるコロイド鎖又はコロイド鎖の組は少なくとも２つの異なるタイプの認識部位を有する。
【００３３】
この場合、本発明によるコロイド鎖の全く新しい利点は、直鎖という性質のために、コロイド鎖はそのバックボーンに沿っていろいろなタイプの認識部位を有することができるということである。本発明のある好ましい非常に特異な変形では、いろいろなタイプのこれらの部位が、考えているコロイド鎖に沿って予め定められた（又は、配列された）順序で配置されている。アクセス可能な認識部位の多様さを考えると、同じ認識部位を異なる順序で有するコロイド鎖を区別できるということは、配列が関与しない従来のコロイド粒子に比べてはるかに豊富な組み合わせを有することを可能にする。
【００３４】
さらに、球形粒子に比べて、本発明によるコロイド鎖は、同じ粒子体積で表面積／体積比が向上している。この場合、コロイド鎖を平坦表面上及び／又はあるチャンネル内に取り付けることによって、表面にデポジットされた認識部位に比べてずっと大きな活性表面が得られ、特に、この活性表面は前記チャンネル内で数十ミクロンにわたって伸びることが可能である。本発明のこの様態については、以下の説明でさらに詳しく論ずる。
【００３５】
ある好ましい実施の形態では、本発明によるコロイド鎖はまた、検出においてきわめて有用な、１つ以上の同一の又は異なるラベルを有する。
【００３６】
この種の多くのラベルが当業者には公知である。特に好適な系列は、電磁放射、特に可視、紫外、又は赤外の光と相互作用できるラベル、又はある一定の刺激の作用の下で光を放出できるラベル、の系列である。
【００３７】
それらは、分子、分子錯体、又は“量子ドット”など、ある波長範囲内で光を吸収できるラベル、又は蛍光又はリン光ラベルである。また、電気化学的な反応が可能な分子（例えば、例をあげると、ハイドロキノン又はその誘導体）、エレクトロルミネッセント効果又はケミルミネッセント効果が可能な分子（エレクトロアクティブ又はケモアクティブ化合物）を有する本発明によるコロイド鎖も有利に用いることができる。例をあげると、いくつかのホースラディッシュ・ペルオキシダーゼをベースとするラベルは当業者には周知であり、本発明の文脈で用いることができる。
【００３８】
有利なことは、従来のコロイド粒子と異なり、本発明によるコロイド鎖は、同一又は異なる１つ以上のラベルを結合することができるということである。
もちろん、上述の実施形態は、また、異なる認識部位、又は認識部位とラベルの組み合わせにもあてはまる。
【００３９】
用途によっては、特に種又は生物流体の分析では、本発明によるコロイド鎖は非特異的な吸着現象を防止することができる分子を表面に有することが有利である。このような分子は当業者には周知である。それらは、特に、親水性重合体、例えば、ポリオキシエチレン、ポリプロピレン・グリコール、ポリサッカライド及び、特に、デキストラン又はそうでなければポリアクリルアミド、又はアクリルアミドの親水性重合体、例えば、“Doramide”、ポリ−Ｎ−アクリルアミノプロパノール、ポリ−Ｎ−アクリルアミノエタノール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリジメチルアクリルアミド、又はジメチルアクリルアミド及びアリル・グリシジル・エーテルの共重合体、などである。このような重合体を本発明によるコロイド鎖の表面に、最初の粒子の調製の間に又は前記鎖の形成後に、前記粒子の表面に組み込まれた反応性官能基を用いて、又は直接の吸着によってグラフトすることができる。
【００４０】
本発明の文脈では、いくつかのコロイド鎖に分かれ、各鎖は与えられたタイプの認識部位又は反応性官能基を有し、適当な場合、少なくとも１つの与えられたタイプのラベルを有することを特徴とするコロイド鎖の組が特に好適である。
【００４１】
用途に応じて、長さが実質的に同一であるコロイド鎖の組、又は逆に長さが異なるコロイド鎖の組、を用いることが可能である。
ある好ましい変形では、前記組におけるコロイド鎖は 長さに関する多分散性が１．５未満、好ましくは１．２未満である。多分散性は質量平均であると理解される。
【００４２】
別の好ましい変形では、コロイド鎖の長さを２つのサブファミリーを区別する規準として用いることが可能であり、したがって、あるコロイド鎖の組の中で、異なる長さを有するコロイド鎖のいくつかのサブファミリーを、いろいろなサブファミリーの間でサイズ分布の重複なしに、用いることが可能である。好ましくは、この変形では、コロイド鎖のサイズとそれが有する認識部位のタイプの間に相関が確立される。
【００４３】
本発明の第二の主題は、本発明のコロイド粒子集合体を調製するのに用いられる方法であって、少なくとも：
−コロイド粒子を１つ以上の直鎖物の形に組み立てるステップ；及び
−前記物を、不可逆的にそれらを架橋させることができる少なくとも１つの物質と接触させるステップ；
を含む方法である。
ある好ましい変形では、接触させるステップは前記物質を前記物の近くで移動させることである。
【００４４】
この場合、第一のステップは、コロイド粒子に一次的に又は持続的に電界又は磁界を印加することによって実行できる。
すなわち、外部の電磁界によって、懸濁されているコロイド粒子にダイポール・モーメントを付与することが可能である：ダイポールは電磁界の方向に向き、電磁界の軸の方向に引き合い、直角方向で反発して、カラム又は“パール・ネックレス”を構成する。ある変形では、直流又は交流電界と、媒質中に懸濁し、この媒質と異なる電気分極性を示す粒子を用いることができる。
【００４５】
ある好ましい変形では、磁界で整列する磁性粒子を用いることもできる。この変形では超常磁性粒子が特に有利である。
【００４６】
本発明によるコロイド鎖をマイクロ流体セルの内部、好ましくは少なくとも２つの本発明に平行な面を有するチャンネル又はチャンバ内で本発明によるコロイド鎖を構成するようにコロイド粒子を整列させることが特に好適である。
【００４７】
電磁界の方向に関しては、いろいろな幾何形状が可能である。一様な長さのコロイド鎖を得るためには、コロイド粒子を整列させるために用いられる電磁界が本質的に一様であり前記面に直角であることが有利である。しかし、非常に長いコロイド鎖を得るためには、整列が行われる空洞のサイズが大きい方向と電磁界が平行であるような形態が好ましい。特に、この場合、電磁界が、整列が行われるチャンネルの軸と平行又はこの軸及びその断面の最小寸法の両方と直角であることが、チャンネルが平行六面体のチャンネルである場合、有利である。電磁界がチャンネルの軸と平行であるとき、コロイド粒子の密度を調整して前記チャンネルの断面が、平均して、本発明による物体を１つ以下しか含まない用にすることが有利である。
【００４８】
コロイド粒子の整列を不可逆にすることを目標としたステップに関しては、いろいろな手順及び／又は粒子のタイプを考えることができる。
【００４９】
第一の手順は、超常磁性コロイド粒子を、重合体型の、特に多電場質の、例えば、ポリアクリル酸タイプの架橋物質で安定化させることである。磁界が存在しない状態で、又は弱い磁界の存在下で、粒子は短い範囲で重合体鎖による立体的な反発（steric repulsion）を示す。ある閾値より大きな磁界で、磁性粒子はますます強く互いに押しつけられるようになる；いくつかの鎖はこの立体的なバリアを超えて、粒子間の架橋を実現することができ、それにより、その結びつきは本質的に不可逆的になる、又は少なくともそれに非常に長い寿命を与える。多電場質の利点は、反対の荷電と強く相互作用できるという他に、電界によってコロイド鎖と接触させることができるということである。
【００５０】
第二の手順は、外部電磁界によって半透過性の壁を有するセルの内部で粒子をカラム（柱）に組み立て、粒子を互いに架橋させることができる物質を、この壁を超えて、拡散させるというものである。
【００５１】
単に外部電磁界の作用だけで、アジュバント分子が関与する必要もなく互いに不可逆的に結合する粒子を用いることもできる。この実施形態の例は、実施例８と９に示される。この結合力は、粒子間の疎水性相互作用の結果と解釈され、この相互作用は、外部電磁界の作用の下で斥力ポテンシャルのバリアをこえた後で関与するようになる。
【００５２】
最後に、粒子の整列は静電相互作用によって不可逆的なものにすることができる：例えば、負に荷電した（例えば、カルボン酸化された）磁性粒子を磁界中でフィラメントに組織した後、ポリカチオンと接触させることが可能である（例えば、それらを反対の方向に動かす電界を用いて）：ポリカチオンは、例えば、例をあげるとポリリシン又はポリヒスチジンは、粒子に結合してそれらを不可逆的に架橋し、アニオンの可逆鎖をカチオンの不可逆鎖に変換する“電荷反転”を実行する。この実施形態の例は実施例１２で示される。このプロセスは、ポリアクリル酸やポリグルタミン酸など、第二の電荷反転を実行するポリアニオンによって繰り返すことができる。ある特に好ましい変形では、この第二の電荷反転は核酸によって得られ、それが同時に認識部位の役割を演じ、したがって、単純な不可逆コロイド鎖を本発明によるコロイド鎖、すなわち、認識部位を有するコロイド鎖に変換する。このような実施形態の例は、実施例７で示される。
【００５３】
別の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも：
−少なくとも１つの架橋物質又は架橋物質の前駆物質とコロイド粒子を混合する及び／又はコロイド粒子にグラフトするステップ；
−前記コロイド粒子を１つ以上の直鎖物に組み立てるステップ；及び
−直鎖の組織で維持される粒子の間の架橋を開始させるステップ；
を含む。
【００５４】
この場合、コロイド鎖を構成し、その後、電磁放射によって、例えば光化学反応という形で、粒子を架橋することからプロセスを開始することができる。例えば、５−アジドナフタレン−１−スルホニル・クロリド、４，４´−ジアジドスチルベン−２，２´−ジスルホン酸、又はもっと一般的に、“Molecular Probes” catalog, chapter 5.3に記載されているような光反応性架橋物質、を用いることができる。
【００５５】
光化学反応を間接的に利用することもできる。例えば、カルボン酸官能基、中性の形のポリアミンの鎖（例えば、１０．２を超えるｐＨでのポリリシン）、及びオルソニトロベンジル、又はもっと一般的にニトロ又はニトロソ基を含む化合物（例えば、H. Morrisson, The chemistry of Nitro and Nitroso groups, Feuer H. Ed., Interscience, New York, 1969, section 1, chapter 4, 又はR. Bressauer, J. P. Paris, in Advances in Photochemistry, W. A. Noyes, G. S. Hammond, J. N. Pitts editors, Interscience, New York, 1963, p.275, 又はR. W. Yip et al., J. Phys. Chem., 95, p.6078 (1991) R53, を参照のこと）を有する磁性コロイド粒子の混合物を形成することができる。後者の化合物は、別に“プロトン・ケージ”として知られており、紫外線の作用の下で異性化してプロトンを放出し、中性ポリアミン鎖をポリカチオンに変換するに十分なほどｐＨを高める。この方法の利点は、媒質が光にさらされない間は粒子の凝集を回避することができ、したがって、いろいろな成分の混入を実行し、コロイド粒子を鎖に組織した後に光を作用させることができるということである。光は重合体と前記粒子の間に引力を生じ、所望の直鎖形態で粒子の架橋を生じる。
【００５６】
コロイド粒子間の架橋は、また、温度の変化及び／又はｐＨの変更によっても開始させることができる。
【００５７】
最後に、最初の粒子が自発的に短距離での引力ポテンシャルと長距離での斥力ポテンシャルを示す場合、外部電磁界（磁性粒子の場合は磁界、誘電体粒子の場合は電界）を高めることによって架橋を開始させることができる。
【００５８】
ある特定の実施の形態では、本発明の方法は、コロイド粒子の集合又はその官能化が行われるチャンネル１の他に１つ以上の二次フィード（feed）チャンネルを含むミクロ流体セルで実施することができる。
【００５９】
コロイド粒子の鎖への組織化は、実施例８のように、予め認識部位及び／又は同一又は異なるラベルを有する粒子に対して行われることも、逆に、実施例６と７のように、官能化されていない粒子に対して行われることもある。第一の場合、同一の又は異なる認識部位及び／又は同一の又は異なるマーカーを有するいろいろな粒子が組織化されて、予め定められた順序で前記直鎖物を構成する。第二の場合、直鎖に組織化される粒子は、前記物を構成した後に認識部位、及びオプションとしてラベル、が装備される。
【００６０】
もちろん、上記の２つの変形を組み合わせることも可能である、すなわち、第一のステップでいくつかの認識部位及び／又はラベルを有するコロイド粒子を組み立て、これらの粒子に他の認識部位及び／又はラベルを、予め定められた又は定められない順序で、付け加えることもできる。
それはともあれ、コロイド鎖を分離するのに用いられるコロイド粒子はもちろん上で述べたような特異性を有する。
【００６１】
本発明の第三の主題は、本発明によるコロイド粒子の直鎖の集合体を担持する表面エレメントである。この場合、表面が予め定められた場所で本発明による不可逆的に構成されたコロイド鎖を示すことが特に有利である。
【００６２】
有利な形として、表面上のこれらのコロイド鎖の延長が、第一に認識のための比表面積（specific surface）を、第二に標的と接触させられる上澄み溶液の体積を顕著に増加させることを可能にする。この場合、前記コロイド鎖の表面積は、前記鎖を担持する表面エレメントの面積よりも大きく、好ましくは少なくとも因子４以上大きい。
【００６３】
例えば、直径が２００ナノメートルのコロイド鎖が２０マイクロメートルの長さで１−マイクロメートルの等距離にある場合、比表面積は投影された表面の１平方マイクロメートルあたり１２平方マイクロメートルである。
【００６４】
好ましくは、コロイド鎖はその一端で表面に結合する。この結合は、鎖と表面の間に共有結合を形成することによって、分子又は巨大分子で架橋することによって、及び／又は静電的、疎水性、又はファン・デル・ワールス型の相互作用によって、得られる。認識部位と種の間に作用するものとは異なる特異的な相互作用も考えられる。
【００６５】
コロイド鎖をその一端で表面に結合させることによって、“コロイド・ブラシ”が形成される。このような表面の一例が実施例５に示されている。このブラシは上澄み溶液内でアクティブに伸ばすことができる、例えば、鎖が磁性物質を含む場合、“チップ”の表面に直角に磁界を印加することによって伸ばすことができる。
【００６６】
多くの応用では、前記表面上の鎖を、好ましくは前記表面上の予め定められた位置にある多数の異なる領域で一緒にすることが有利である。好ましくは、表面は、異なる認識部位を有するコロイド鎖を含む少なくとも２つの異なる領域を含む。
いろいろな方法を用いて、本発明による直鎖の集合体を担持する表面を構成することができる。
【００６７】
普通、それらの方法は次のステップを含む：
−コロイド鎖に、又は前記鎖を構成する粒子の少なくともいくつかに、認識部位をグラフトするステップ；及び
−前記コロイド鎖を前記表面に結合させるステップ。
【００６８】
好ましくは、表面にコロイド鎖を結合させるステップは、前記鎖を整列させることができる電磁界の存在下で行われる。例えば、鎖が電気二重極モーメント又は電気分極性を有する場合、電界をこのために用いることができる。鎖が磁気二重極モーメント又は磁気分極性を有する場合恥界を用いることができる。
【００６９】
ある好ましい変形では、前記電磁界が多数の局所勾配を示し、それが鎖を表面の予め定められた場所へ導く。
これらの外部電磁界によって、前記電磁界が表面にどちらかといえば直角である又はどちらかといえば平行であるのに応じてコロイド鎖がどちらかといえば表面に直角に又はどちらかといえば表面に平行に向けられる表面を得ることもできる。
オプションとして、これらの方法はまた、前記鎖にラベルを組み込むステップを含む。
【００７０】
これらのいろいろなステップが実行される順序は、実施の便宜に応じて変えることができる。特に、表面へのグラフトは、認識部位の結合の前、それと同時、又はその後であっても、又はラベルの結合の前、それと同時、又はその後であってもよい。ラベルの結合はそれ自体、このオプションが選択される場合、認識部位の結合の後、それと同時、又はその前であってもよい。
【００７１】
最後に、鎖の形にコロイド粒子を組み立てることは、表面へのそのグラフトの前であっても、それと同時であってもよい。可能である場合、第二のオプションの方が好ましい。第二のオプションは、最終的な表面を得るために必要なステップの数を減らすからである。
【００７２】
本発明の１つの主題は、また、本発明によるコロイド鎖を担持する表面エレメントを含むハイブリダイゼーション・ネットワークである。このネットワークは、低密度、中密度、又は高密度が可能である。表面にデポジットされたこのようなハイブリダイゼーション・ネットワークは一般に“ＤＮＡチップ”、“オリゴヌクレオチド・チップ”、又は“タンパク質チップ”と呼ばれる。
【００７３】
このタイプの応用では、鎖は考えている表面エレメント上の多数の異なる領域にグループ分けされる。好ましくは、前記領域は前記表面上の予め定められた又はピンポイントされる位置を占める。やはり好ましくは、少なくとも２つの異なる領域が異なる認識部位を有するコロイド・スレッド（thread）を含む。各々が異なるタイプの認識部位を有する、異なる領域が多数あることが好ましい。しかし、場合によっては、再現性を監視（control）及び／又は測定するためにある程度の冗長性を導入することが望ましい。
【００７４】
本発明によるコロイド鎖から形成される“チップ”は、従来のチップに比べて多くの利点がある：第一に、比表面積が大きくなり、それによって感度が高くなる、特に非特異的リガンドとの競合の場合に感度が増加する。サンプル体積、したがって認識部位のすぐ近くに置かれるサンプルに含まれる種の数も大きく増加し、それは速度（kinetics）と感度を増加させる。最後に、磁性コロイド鎖、又はもっと一般的に外部電磁界に敏感なコロイド鎖、の場合、例えば、振動する外部磁界又は電界を印加することによって、コロイド鎖をまわりの媒質に対して動揺させることが可能であり、それによってハイブリダイゼーション反応を加速することも可能になる。
【００７５】
外部電磁界に敏感なタイプの本発明によるコロイド鎖を利用すると、再現性の高いネットワークを得ることも可能になる：実際、コロイド鎖は長さを校正（calibrate）することができ、その物理的な自己組織性が領域の全面にわたって一様な予め定められた分布を実現する。
【００７６】
さらに、フィラメントへの認識部位のグラフトはバッチで実行されるので、従来のデポジション又は“スポッティング”の場合に比べて高度なコントロールが可能であり、表面へのデポジションの前の品質管理の対象にすることができる。
【００７７】
本発明の１つの主題は、また、本発明によるコロイド粒子集合体を収容するミクロ流体セル又はチャンネル又はミクロコンテナー、である。“ミクロ流体セル”という用語は、寸法の１つが１００ｎｍから１ｍｍの間にあり、流体の輸送を可能にするチャンネル又はチャンネルの組を含むデバイスを意味するものとする。
【００７８】
ある好ましい変形では、前記鎖はチャンネルの内部で多数の異なる領域に組織化される。別の好ましい変形では、前の変形を排除するものではないが、前記鎖はチャンネルの面の１つに結合する。
【００７９】
最後に、本発明によるコロイド鎖はまた、アフィニティー電気泳動、電気クロマトグラフィー、又はクロマトグラフィー装置において、特に分離マトリックスとして、利用することができる。この場合、サンプルに含まれる分析物が前記装置に導入される。そこで、分析物はチャンネル内を適当な場（クロマトグラフィーでは圧力場、電気泳動又は電気クロマトグラフィーでは電界）によってチャンネル内を輸送される。いろいろな分析物がコロイド鎖に存在する認識部位と異なる相互作用をして、そこに引き留められる、又は大きく又は小さく減速される。したがって、当業者に周知の手段によって（例えば、蛍光、紫外吸収、屈折測定、電気化学、等によって）コロイド鎖の間を通過した後又はその間に分析物を検出することが可能である。通過時間の差は、分析物とコロイド鎖との親和度に関する情報、そして該当する場合、その性質に関する情報を提供する。この方法は、本発明によるコロイド鎖の最も普通の寸法がミクロン領域にあるので、ミクロ流体システムに特に好適である。
【００８０】
別のシリーズの応用では、本発明によるコロイド鎖が“マイクロリアクター（microreactor）”として有用である。この場合、認識部位は触媒部位であり、これが非常に大きな表面積／体積比によって反応を活性化することができる。コロイド鎖がバルク（bulk）で用いられる場合、例えば遠心分離、又は磁気選別によって、それを容易に回収することができ、溶解された触媒（非常に良く分散するが回収が難しい）と固体触媒（洗浄によって容易にリサイクルされるが比較的分散しない）の間の良い折衷になる。本発明によるコロイド鎖に基づくマイクロリアクターの実施形態の一例は実施例１３で示される。
【００８１】
特に好ましい別の変形では、マイクロリアクターとして用いられる本発明のコロイド鎖がある表面に結合され、反応物質を交換し反応生成物を集めることが固体触媒によるのと同じように可能になり、認識部位の移動度と分散はずっと大きくなる。
【００８２】
本発明によるコロイド鎖は、また、コンビナトリアル・ケミストリーにおける応用で有利である。問題としているケースでは、酵素を触媒として有するコロイド鎖がコンビナトリアル・ケミストリー及び診断で特に有利である。すなわち、非限定的な例をあげると、キモトリプシン又はアルファ−キモトリプシンを本発明による磁性コロイド粒子に、Bilkova J., Chromatogr. A, 852,141-149 (1999)に記載された手順によってグラフトすることが可能である。次ぎに、これらの粒子を実施例１から８までに記載される方法のいずれかによって組み立てる。最初にポリ（HEMA-co-EDMA）タイプの微小球からのコロイド鎖の組み立てを行い、Bilkova J., Chromatogr. A, 852,141-149 (1999)に記載された用にそれらをヒドラジドで官能化し、次ぎにそれらを実施例１から８までに記載される手順のいずれかによってコロイド鎖に組み立て、Bilkova J., Chromatogr. A, 852,141-149 (1999)のステップ２．９における手順を繰り返してキモトリプシンを配向された仕方で結合させることもできる。こうして、タンパク質を消化できるコロイド鎖が得られる。
【００８３】
本発明の１つの主題は、また、本発明によるコロイド鎖又はそのようなコロイド鎖を担持する表面を含む分子認識ミクロコンテナー又はデバイスである。
【００８４】
実際、もっと一般的に、本発明によるコロイド鎖は、種の分析、単離、及び／又は調製など、多数の用途で特に有利であることが分かっている。
したがって、本発明の１つの主題は、また、少なくとも１つの本発明の粒子の集合体を用いて、少なくとも１つの種をex vivoで診断、及び／又は、分析、分離、精製、測定、又は同定する方法である。
【００８５】
考えている種は、上で同定されたものである。
これらの診断及び／又は分析方法は、特に、少なくとも次のステップを含む手順に従って実行することができる：
ａ）チャンネル又はコンテナー内のコロイド粒子集合体を用いるステップ；
ｂ）前記集合体を少なくとも１つの検出、分離、及び／又は分析される種と接触させるステップ；及び
ｃ）前記集合体による、考えている種のハイブリダイゼーションを検出する手段を用いるステップ。
【００８６】
オプションとして、調製用途では、コロイド鎖と相互作用した生成物、又は逆に、相互作用しなかったもの、を回収することが有利である。
またオプションとして、プロセスはまた洗浄ステップを含み、そのさいにサンプルに含まれる、鎖とハイブリダイズしなかったいくつかの生成物が除去される、又はそのさいに前記鎖と反応した生成物が回収される。
【００８７】
本発明では、“ハイブリダイゼーション”という用語は、ある種がある認識部位と特異的に結合する相互作用を意味するものとする。
【００８８】
本発明の方法の場合、コロイド粒子の鎖は、あるチャンネル又は表面でいくつかの鎖から構成される異なるゾーンという形で配置される。このような場合、前記コロイド鎖を含むゾーンは一般に、少なくとも１つの分析される種を含む流体によって通過される。
【００８９】
本発明は、このタイプの動作に特に好適である；実際、洗浄のさいにコロイド鎖は倒れて、流れに対してほとんど抵抗とならずに容易かつ迅速な洗浄が可能になる、流れがストップされるとただちにコロイド鎖は立ち上がり（コロイド鎖が磁性的である場合、オプションとして、磁界によってこの起立を活性化させることができる）、再び大きな体積を占めるようになる。したがって、オープン・チューブで得られる洗浄の容易さと、ゲルで得られる部位密度（site density）を組み合わせて、後者が示す流れに対する高い抵抗を回避することができる。
【００９０】
ステップｃ）で用いられる手段のうち、蛍光、リン光、化学発光、光吸収、表面プラズモン共鳴、又は放射能、を用いることが好ましい。また、電流の測定を用いる検出方法、例えば、コロイド鎖の付近で分子認識デバイスに含まれる１つ以上の回路における電流の測定による方法を用いることもできる。後者の変形は、導電性のコロイド鎖の場合、又は電気化学反応又はサイクリック電流計測によって検出できる生成物を生じることができる分子認識部位を用いるコロイド鎖の場合、特に好適である。磁界又は磁界の変化に敏感な１つ以上のエレメントを用いることもできる。後者の変形は、磁気的性質を有するコロイド鎖で特に好適である。
【００９１】
検出に関していうと、第一の変形では、検出はin situで、ハイブリダイゼーションが行われる、又はもっと一般的に、流体に含まれるいくつかの種と本発明によるコロイド鎖に担持される認識部位の間の相互作用が行われるチャンネル又はコンテナーの中で行うことができる。第二の変形では、検出は別のデバイスにおいて、ハイブリダイゼーション又は相互作用の段階の後で行うことができる。特に、最初にハイブリダイゼーション・チャンバでハイブリダイゼーションを行い、次ぎにチップ・リーダーで検出を行うことによって、従来の“ＤＮＡチップ”又は“タンパク質チップ”と同じような仕方で本発明によるハイブリダイゼーション・ネットワークを利用することができる。多数のタイプのコロイド鎖を用いる分子認識の探索を同時に実行したい場合、チャンネル内部又は表面上で、前記鎖を比較的コンパクトな（普通、円形の）ゾーンに、又は、他方では、帯状に、組織することができる。
【００９２】
非限定的な例をあげると、本発明によるコロイド鎖、及びこれらのコロイド鎖を用いるいろいろなコンポーネントやデバイス、は、診断；分子又は巨大分子、粒子、原子、イオン、天然有機物又は合成起源の物体、例えば、生物的に活性な種、など、の探索及び／又は調製、例えば、核酸、タンパク質、酵素、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ポリサッカライド、プロテオグリカン、小器官、癌細胞、希少細胞（rare cells）、上皮細胞、内皮細胞、出生前診断のための細胞、ＧＭＯｓ、病原細胞、ウイルス、抗体、又は微生物；化学的活性物質の探索、例えば、有毒生成物、薬剤、又は汚染物質；動物、植物、又は微生物の変種の認識；突然変異の検出；アレルギーの探索；遺伝子解析（genotyping）；疾病に関わる遺伝子の探索；コンビナトリアル・ケミストリー手順から得られる反応生成物の探索及び／又は調製。
【実施例】
【００９３】
実施例１：
巨視的容器（試験管）内における磁界の存在下での多電場質を用いる直径１．３プラス又はマイナス０．３マイクロメートルの粒子からのコロイド鎖の調製。
【００９４】
ａ／“Emulsion: theory and practice”, Becher, P., Rheinhold, New York, (1965), に記載されている手順に従って、水中で硫酸ドデシルによって安定化された、オクタン−ベースのフェロ流体（ferrofluid）（Rhone Poulenc）の逆エマルジョンからなる磁性ビーズが調製される。Bibette, J. Colloid Interface Sci., 147, 474. (1991)に記載されている手順に従って、１．３マイクロメートル、プラス又はマイナス０．３マイクロメートル、という粒子サイズが分画結晶化によって選択される。ある変形では、商業的に入手できる磁性粒子、例えば、Bang Laboratoires, Estapor, Merck, Eurolab, Prolabo, Uptima, 又はPolysciences,などの会社から市販されているもの、をそのまま使用できる。
【００９５】
ｂ／エマルジョンは、Nonyl Phenol Ethozykate、又はＮＰ１０（Sigma Aldrich）、の０．１％溶液で数回（少なくとも５回）洗浄される。洗浄は磁性液滴を磁石によって容器の底にプールし、上澄みを洗浄液に代えて、磁石を除いた後に激しく撹拌することによって好適に行われる（粒子の集合が弱い場合は、オプションとして超音波振動を用いてもよい）。この操作が数回繰り返され、洗浄の終わった後、体積で０．１％のオーダーの粒子濃度にするためにある量のＮＰ１０溶液を加える。
【００９６】
ｃ／ポリアクリル酸又はＰＡＡ（Sigma Aldrich、Ｍｗ＝２５０ ０００）溶液を加えてＰＡＡ濃度を０．１％にする。ｐＨは４にしなければならない。この混合物をおだやかに撹拌しながらインキュベートさせる。
【００９７】
ｄ／サンプルを含む試験管をコイルの中に置いて、磁界をゆっくりと高める。鎖が形成され、試験管をそのまま磁界中で約５分〜１５分インキュベートさせる。１０ｍＴのオーダーの磁界閾値を超えると、磁界を除いた後も鎖は不可逆的に集合したままで残される。鎖の平均の長さ及び直径は、磁界の振幅と磁性粒子の濃度を調整することによって調節できる。例をあげると、図１ａに示されている鎖は、５０ｍＴという磁界及び体積で０．１％という粒子濃度で得られた（観察はスライドとカバーの間、磁界が存在しない状態で、Zeiss Axiovert 100顕微鏡で、油浸対物レンズ１００Ｘ、１．３．を使用。これらの条件の下で、“パール・ネックレス”タイプのフレキシブルな鎖（図１ａ）、“パール・ネックレス”タイプのセミ・フレキシブルな鎖（図１ｂ、左側）、及び“カラム”タイプの硬い鎖（図１ｂ、右側）の共存が見られる。粒子濃度がもっと低いと、ほとんどがパール・ネックレスになり、粒子濃度がもっと高いと、ほとんどがカラム・タイプになる。この方法によれば、大量の本発明によるコロイド鎖を容易に得ることができる。他方、これらの鎖はきわめて多分散性である。
【００９８】
実施例２：
校正された（calibrated）長さの単分散コロイド鎖の生成
実施例１と同じ手順がステップｃまで実行される。
【００９９】
ステップｄでは、試験管を用いる代わりに、溶液は、Xia, Y. Xia, G.M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed, 37,550 (1998) に従ってポリジメチルシロキサンの成形によって調製された１００マイクロメートルという一様な厚さを有するチャンネルに導入され、５０ｍＴの磁界がチャンネルの厚さに直角に印加される。磁界を除去すると、チャンネルの厚さに等しい一様な長さ（７０マイクロメートル）のセミ−フレキシブルな鎖が得られる（図１ｃを参照のこと）（観察条件は実施例１の場合と同じ）。
【０１００】
実施例３：
ポリリシンで架橋されたコロイド鎖の調製
ａ／実施例１のａ／に従って磁性粒子が調製される。
【０１０１】
ｂ／これらの粒子が、実施例２におけるように調製されたチャンネルに、加圧又は毛管張力によって、０．１％から２０％までの間で必要に応じて変えられる濃度で導入される。５０ｍＴというオーダーの磁界がチャンネルの厚さに直角に印加される。これによってコロイド鎖が得られる。この鎖は、磁性ビーズの懸濁液の初期濃度が低い場合（普通、５％未満）は“パール・ネックレス”タイプであり、初期濃度が低い場合は“カラム”タイプである。
【０１０２】
ｃ／ポリ−Ｌ−リシン（０．１％ｗ／ｖ溶液、Sigma Aldrich）が、電気泳動ニヨッテチャンネルに導入される（ビーズの体積比率２％で、ポリ−Ｌ−リシンはチャンネル内の濃度が０．０５重量％となるように導入される）。このために、チャンネルの端に位置する２つの貯蔵部に２つの電極が設けられる。ポリリシンは貯蔵部の１つに溶液の形で導入され、この貯蔵部に位置する電極を他の貯蔵部に位置する電極に対して正の電位にして、チャンネル内に数Ｖ／ｃｍの電界を維持するようにする。図２ａに見られる様な不可逆コロイド鎖が得られる。
【０１０３】
実施例４：
ポリリシンで架橋され、一端で表面に結合されたコロイド鎖の調製（図２ｂ）
ａ／実施例１のステップａにおけるように、磁性粒子を調製、又は入手する。
ｂ／エマルジョンは、Nonyl Phenol Ethozykate、又はＮＰ１０（Sigma Aldrich）、の０．１％溶液で数回（少なくとも５回）洗浄される。洗浄は磁性液滴を磁石によって容器の底にプールし、上澄みを洗浄液に代えて、磁石を除いた後に激しく撹拌することによって好適に行われる（粒子の集合が弱い場合は、オプションとして超音波振動を用いてもよい）。この操作が数回繰り返され、洗浄の終わった後、体積で５％のオーダーの粒子濃度にするためにある量のＮＰ１０溶液を加える。
【０１０４】
ｃ／連続相が、０．１重量％のＮＰ１０と０．８９重量％のポリ−Ｌ−リシンの混合物に置き換えられる。このために、磁性ビーズを磁石を用いてチューブの底にプールし、上澄みを取り除いて所望の混合物に代える。
【０１０５】
ｄ／エマルジョンがチャンネルに導入される。５０ｍＴの磁界がチャンネルの厚さに直角に印加される。磁界を取り除いた後、チャンネルの下の壁に結合した校正された鎖のブラシが得られる。
【０１０６】
実施例５：
ポリジメチルアクリルアミドと結合した、一端で表面に結合したコロイド鎖の調製
ａ／磁性粒子を実施例１のステップａにおけるように調製、又は入手する。
ｂ／一様な厚さを有するチャンネルが、Xia, Y. Xia, G.M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed, 37,550 (1998) に従ってポリジメチルシロキサンの成形によって調製される。このチャンネルに、質量で０．１５％のポリジメチルアクリルアミドの溶液を満たして、４０分間インキュベートさせる。
【０１０７】
ｃ／チャンネルを、２．１ｇ／ｌのTriton X405の溶液でリンスした後、ａで調製された磁性粒子の懸濁液で満たす。
ｄ／チャンネルをコイルの中心に置き、寄生的な流れを避けるためにチャンネルの端における圧力が平衡した後、カラムを生成するに十分な磁界（１〜数十ｍＴのオーダー）をチャンネルの厚さに直角に印加する。磁界は１時間維持される。
ｅ／磁界を除去すると、チャンネルの下の壁に結合したコロイド鎖の“ブラシ”が得られる。
【０１０８】
実施例６：
平均して鎖あたり１分子の“ラムダ・ファージ”ＤＮＡを有する本発明によるコロイド鎖の調製
ａ／実施例１に記載された手順でコロイド鎖が調製される。
ｂ／ポリ−Ｌ−リシンの溶液（０．１％ｗ／ｖ溶液、Sigma Aldrich）を加えて、混合物中のポリ−Ｌ−リシン濃度が０．００２％となるようにする。混合物を周囲温度でおだやかに撹拌しながら４０分間インキュベートさせる。
【０１０９】
ｃ／ＤＮＡを懸濁液に加えると、恐らく平坦表面で用いられると同様なメカニズムによって、ＤＮＡはコロイド鎖の表面のいくつかの点に結合する（例えば、“The world of Microarrays, J. Boguslavsky, Drug Discovery and Development, S5-S32 (2001), を参照のこと）。カラム上のＤＮＡの濃度は、溶液に加えられるＤＮＡの濃度、及びそのサイズを調整することによって大きく変えることができる。図３ａでは、コロイド鎖あたりほぼ１巨大分子のＤＮＡ（ラムダ・ファージ、Amersham Pharmacia Biotech Inc）が結合していた。コロイド鎖は黒い外観を有し、蛍光マーカー（YOYO-1、Molecular Probes; 10塩基対あたり１分子のYOYO-1）でラベルされたＤＮＡｓは外観が明るい（測定はepifluorescenceで、励起用の水銀ランプと１００Ｘ対物レンズを備えたZeiss Axiovert 100 顕微鏡で行われた）。
【０１１０】
実施例７：
ポリリシンによってコロイド鎖に結合された、“PhiX 174”タイプのＤＮＡ分子の一様被覆（covering）を有する本発明によるコロイド鎖の調製
実施例６におけると同様の手順が、ステップｃで異なる性質のＤＮＡ及び異なるＤＮＡ濃度を用いて実行される。“PhiX 174”タイプの短いＤＮＡの混合物が用いられる（PhiX 174 RF DNA/Hae III Fragments; Gibco BRL）。最終的に、ＤＮＡの濃度は０．５μｇ／ｍｌであり、ポリ−Ｌ−リシンの濃度は０．００２重量％である。次ぎにコロイド鎖は、磁石を用いてチューブでペレットにし（pelleting）、上澄みを実施例６のｂで用いたものと同じ溶液に代えることによって洗浄される。観察条件は実施例６の場合と同じであり、ＤＮＡで一様に被覆されたコロイド鎖が得られた（図３ｂ）。
【０１１１】
実施例８：
表面に結合された、“抗マウス”認識機能を有する、“カラム”タイプの本発明によるコロイド鎖の生成
ａ／一様な厚さのチャンネルを含むミクロ流体デバイスが、Xia, Y. Xia, G.M. Whitesides, Angew. Chem. Int. Ed, 37,550 (1998) に従ってポリジメチルシロキサンの成形によって調製される。
【０１１２】
ｂ／抗マウスUptibeads（０．３μｍ；Uptima）が、メーカーによって販売されたときの元の濃度で、最初のサンプルに存在する塊を壊すように超音波振動で振とうされ、ａで調製されたミクロ流体デバイスのチャンネルに導入される。このデバイス自身をコイルの中心に置いてチャンネル内にその厚さ方向に向いた本質的に一様な磁界を作り出す。観察では、コイルで囲まれたデバイスをZeiss Axiovert 100顕微鏡に載せて１００Ｘ、１．３．油浸対物レンズとCohu CCD カメラを用いて可視化する。５０ｍTeslaの磁界を印加する。磁界を取り去ると、粒子はチャンネルの内側表面に一端で結合したカラムの形でまとまったままで残り、その結合点のまわりで方向を変えてランダムに向くことができる（図ａ）。
【０１１３】
実施例９：
ストレプトアビジン機能を有する、“カラム”タイプの、本発明によるコロイド鎖の直接架橋による生成
ストレプトアビジンUptibeads（０．８８μｍ）が、メーカーによって販売された元の溶液の濃度で、超音波振動で振とうされて最初のサンプルに存在する塊を壊し、実施例８に記載された様なミクロ流体セルに入れられる。磁界を取り去ると、粒子はカラム（柱）の形でまとまったままで残る（図４ｂ）。
【０１１４】
実施例１０：
ガラクトース・オキシダーゼで配向された仕方で予め官能化された磁性粒子からのコロイド鎖の生成
ａ／磁性粒子の調製
HEMA-co-EDMAの粒子がエマルジョンでの重合によって調製され、次ぎにHorak et al. Biotechnol. Progr., 15 (1999) に記載されている手順に従ってヒドラジンによって活性化される。
【０１１５】
ｂ／活性化された（酸化された）ガラクトース・オキシダーゼの調製
キノコ寄生菌Dactylium dendroidesからのガラクトース・オキシダーゼ（３５０ＩＵ）（Sigma Aldrich）の溶液が、２ｍＭのＣｕＳＯ4及び１ｍＭのＤ−Ｆｕｃｏｓｅ（Acros Organics, Geel, Belgium）を含む２．５ｍｌの０．１Ｍアセテート・バッファー、ｐＨ５．５，に溶解される。１００ＩＵのカタラーゼ（Sigma Aldrich）が加えられる。３７℃で１０分間、及び４℃で１５分間インキュベートした後、２５０μｌのＮａＩＯ4が溶液に加えられ、４℃で３０分間撹拌して、ガラクトース・オキシダーゼのグリコシド鎖を選択的に活性化する。３０μｌのエチレン・グリコールを加えて反応を停止させ、撹拌を１０分間続ける。低分子量成分をSephadex G-25カラムによる濾過で除去する。
【０１１６】
ｃ／酸化され精製されたガラクトース・オキシダーゼの磁性粒子への結合
ａで調製された活性化された磁性粒子の溶液１．５ｍｌが、精製されたガラクトース・オキシダーゼ溶液に、粒子表面に対しガラクトース・オキシダーゼが過剰になるように加えられる。４℃で撹拌しながら２４時間インキュベーションが行われる。サポートが０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍアセテート・バッファー、ｐＨ４，で洗浄される。洗浄は２ｍＭのＣｕＳＯ4を含む０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６，で数回、溶出液の酵素活性がもはや検出できなくなるまで繰り返される（オキシダーゼ活性は、Avidad et al., J. Biol. Chem., 237, 2736 (1962) に記載されているように、Ｄ−ガラクトースの酸化に基づくテストを用いて測定される）。その後、反応しなかったヒドラジン・グループは、０．１Ｍアセテート・バッファー、ｐＨ５．５，中の０．２Ｍアセトアルデヒドの溶液で２４時間粒子をインキュベートすることによってブロックされる。最後に粒子は２ｍＭのＣｕＳＯ4を含む０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６，の溶液中で平衡される（equilibrated）。
【０１１７】
ｄ／コロイド鎖の形成
ｃで調製された粒子の溶液のアリクオットに、ポリアクリル酸又はＰＡＡ（Sigma Aldrich、Ｍｗ＝２５０ ０００）溶液を加えてＰＡＡ濃度を０．１％にする。この混合物をおだやかに撹拌しながらインキュベートさせる。サンプルを含む試験管をコイルの中に置いて、磁界をゆっくりと高める（Ｎ．Ｂ．十分な磁界を印加することができるコイルを有用な場合、ＰＡＡの添加は省くことができ、それによってガラクトース・オキシダーゼ機能がアクセスしやすくなり、最終コロイド鎖の触媒収率が改善される）。鎖が形成され、試験管をそのまま磁界中で約１５分インキュベートさせる。磁界を除いた後、オキシダーゼ活性（Avidad et al., J. Biol. Chem., 237, 2736 (1962) に記載されているようなＤ−ガラクトースの酸化に基づくテストを用いる分光測光測定によって実証される）を有する不可逆的コロイド鎖が得られる。
【０１１８】
実施例１１：
ガラクトース・オキシダーゼによるコロイド鎖の機能化
ａ／磁性粒子の調製
磁性コロイド粒子、例えば、Horak et al. Biotechnol. Progr., 15 (1999) に従って調製されるHEMA-co-EDMAの粒子、又はAdemtech 粒子、の溶液を調製する。次ぎに、ポリアクリル酸又はＰＡＡ（Sigma Aldrich、Ｍｗ＝２５０ ０００）溶液を加えてＰＡＡ濃度を０．１％にする。この混合物をおだやかに撹拌しながらインキュベートさせる。サンプルを含む試験管をコイルの中に置いて、磁界をゆっくりと高める。鎖が形成され、試験管をそのまま磁界中で約１５分インキュベートさせる。磁界を除いた後、不可逆的コロイド鎖が得られる。（Ｎ．Ｂ．十分な磁界を印加することができるコイルを有用な場合、ＰＡＡの添加は省くことができ、それによってガラクトース・オキシダーゼ機能がアクセスしやすくなり、最終コロイド鎖の触媒収率が改善される）。次ぎに、これらをHorak et al. Biotechnol. Progr., 15 (1999) に記載されている手順に従ってヒドラジンによって活性化する。
【０１１９】
ｂ／活性化された（酸化された）ガラクトース・オキシダーゼの調製
キノコ寄生菌Dactylium dendroidesからのガラクトース・オキシダーゼ（３５０ＩＵ）（Sigma Aldrich）の溶液が、２ｍＭのＣｕＳＯ4及び１ｍＭのＤ−Ｆｕｃｏｓｅ（Acros Organics, Geel, Belgium）を含む２．５ｍｌの０．１Ｍアセテート・バッファー、ｐＨ５．５，に溶解される。１００ＩＵのカタラーゼ（Sigma Aldrich）が加えられる。３７℃で１０分間、及び４℃で１５分間インキュベートした後、２５０μｌのＮａＩＯ4が溶液に加えられ、４℃で３０分間撹拌して、ガラクトース・オキシダーゼのグリコシド鎖を選択的に活性化する。３０μｌのエチレン・グリコールを加えて反応を停止させ、撹拌を１０分間続ける。低分子量成分をSephadex G-25カラムによる濾過で除去する。
【０１２０】
ｃ／酸化され精製されたガラクトース・オキシダーゼのコロイド鎖への結合
ａで調製された活性化された磁性粒子の溶液１．５ｍｌが、精製されたガラクトース・オキシダーゼ溶液に、粒子表面に対しガラクトース・オキシダーゼが過剰になるように加えられる。４℃で撹拌しながら２４時間インキュベーションが行われる。サポートが０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．１Ｍアセテート・バッファー、ｐＨ４，で洗浄される。洗浄は２ｍＭのＣｕＳＯ4を含む０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６，で数回、溶出液の酵素活性がもはや検出できなくなるまで繰り返される。その後、反応しなかったヒドラジン・グループは、０．１Ｍアセテート・バッファー、ｐＨ５．５，中の０．２Ｍアセトアルデヒドの溶液で２４時間粒子をインキュベートすることによってブロックされる。最後に、粒子は２ｍＭのＣｕＳＯ4を含む０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６，の溶液中で平衡される（equilibrated）。オキシダーゼ活性は、Avidad et al., J. Biol. Chem., 237, 2736 (1962) に記載されているようなＤ−ガラクトースの酸化に基づくテストを用いる分光測光測定によって実証される。
【０１２１】
実施例１２：
タンパク質の消化のためのトリプシン認識部位を有する、“マイクロリアクター”タイプの磁性粒子の不可逆カラムの調製
実施例１に従って磁性粒子の鎖が調製される。鎖はリンスされ、ノニル・フェノールが加えられたリン酸バッファー、ｐＨ７．３，に、４００マイクロリットルのバッファーに磁性粒子１ｍｇという比率で再懸濁される（溶液Ａ）。鎖を、磁石を試験管から少なくとも２ｃｍの距離に保って注意深く沈殿させる。次ぎにトリプシンが、Greg T. Hermanson “Bioconjugate Techniques” 1996, Academic Press, London による仕事で記述されたものから導出された手順に従って固定される（immobilized）。
【０１２２】
さらに、５００マイクロリットルのリン酸バッファー、ｐＨ７．３，中の３０ｍｇのエチレン・カルボジイミド（ＥＤＣ）の溶液Ｂが調製される。
４００マイクロリットルのリン酸バッファー、ｐＨ７．３，中の５ｍｇのＳ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）の溶液Ｃも調製される。
最後に、溶液Ｄが調製される：すなわち、７．５ｍｇのＴＰＣＫトリプシンが５０マイクロリットルのリン酸バッファー、ｐＨ７，に溶解され、１ミリリットルあたり１６マイクログラムのベンザミジンの溶液５マイクロリットルが加えられる。
【０１２３】
溶液Ｄはただちに、磁界を印加せずに、Gilson ピペット（その先端は剪断を減らすために切り取られている）でおだやかに撹拌しながら、溶液Ａに加えられる。次ぎに溶液Ｂが加えられ、続いて溶液Ｃが、やはりおだやかに撹拌しながら加えられる。溶液はそのまま３時間インキュベートさせ、その後、溶液Ａと同一のノニル・フェノールを含むリン酸バッファー、ｐＨ７．３，でバッファーを２回又は３回代えて洗浄される。沈殿に関して、溶液Ａの調製に関して述べた手順が実行される。
【０１２４】
トリプシンの活性は、H. F. Gaertner and A. J. Puigserver, Enzyme Micro. Technol., 14, 150 (1992) 及びP. S. Gravet et al., Int. Biochem. 23, 1085 (1991), に記載されている手順に従って、比色測定を用いて測定される。
BAPNA（ベンゾイルアルギニン ｐ−ニトロニリンＨＣｌ）のモル濃度０．１から１までの一連の溶液が、Ｔｒｉｓバッファー中で、基質として用いられる。トリプシンを有する粒子の集合体が溶液に導入される。１時間インキュベートされた後、消化反応で生成されたｐ−ニトロニリンの量が、４１０ｎｍでの溶液の吸収によって、UV-vis分光測光計（Shimazu UV(160A)）を用いて測定される。活性の時間的な安定性は図５に示されている。
【０１２５】
ある変形では、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）（Kisker）をベースとする磁性ビーズを同じ手順で用いることができる。本質的に鉱物の、本発明によるコロイド粒子の不可逆的集合体がこれによって得られる。この変形では、トリプシン−又はストレプトアビジン−タイプの認識部位の結合はグルタルアルデヒドによる粒子の活性化によって行われる。
【０１２６】
実施例１３：
ビオチンでラベルされた赤血球を捕捉するストレプトアビジン機能を有するコロイド鎖の調製
ａ／ストレプトアビジン機能を有するコロイド鎖のブラシが、実施例９で記載されているようにチャンネル内に調製される。
【０１２７】
ｂ／ヒト赤血球が次の手順に従ってビオチンでラベルされる：
・６μｌの血液が１ｍｌの２７０ｍ０ｓｍｏｌ ＰＢＳに入れられる、
・０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩バッファー、ｐＨ＝８．５、で３回洗浄が行われる（３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離）、
・ペレットを取り、０．４ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ−ＰＥＧ３４００−ビオチン５００μｌが加えられる、
・インキュベーションが３０分間行われる、
・上澄みを除去するために、遠心分離が３０００ｒｐｍで１分間行われ、５００μｌのＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡが加えられる。
【０１２８】
ｃ／次ぎに、赤血球がチャンネルに導入され、例えば、Doyle et al., Science, 295, (5563), 2237, (2002), に記載されているように、電界によって鎖のブラシを通って移動する。赤血球は、図６に示されているように、磁性粒子のカラムに結合する。
実施例及び以下の図面は、本発明の範囲を非限定的に例示するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１ａ】実施例１の手順に従って調整された、平均直径１．３マイクロメートル、プラス又はマイナス０．３マイクロメートルの磁性粒子からの、ポリアクリル酸によって不可逆的に架橋される、“パール・ネックレス”タイプのフレキシブル・コロイド鎖の例。
【図１ｂ】実施例１の手順に従って調整された、平均直径１．３マイクロメートル、プラス又はマイナス０．３マイクロメートルの磁性粒子からの、ポリアクリル酸によって不可逆的に架橋された、“カラム”タイプの硬いコロイド鎖及び“パール・ネックレス”タイプのセミフレキシブル・コロイド鎖の例。
【図１ｃ】実施例２に記載された手順による、不可逆的に組織化された、長さ７０マイクロメートルの、“パール・ネックレス”タイプの単分散セミフレキシブル・コロイド鎖の例。
【図２ａ】実施例３に従って調整された、ポリリシンによって架橋されたコロイド鎖の例。
【図２ｂ】実施例４に従って調整された、ポリリシンによって架橋され、その末端で表面に接着したコロイド鎖の例。
【図３】ＤＮＡ分子を有するコロイド鎖の例：ａ／実施例６に従って調整された、平均して鎖あたり１ＤＮＡ分子を有する鎖；ｂ／実施例７に従って調整された、“Phi X 174”ＤＮＡの一様な被覆（covering）を有するコロイド鎖。
【図４】抗体を有するコロイド鎖：ａ／実施例８に従って調整された、“抗マウス”抗体を有するコロイド鎖；ｂ／実施例９ａに従って調整された、直径１ミクロンのビーズから調製された、ストレプトアビジンを有するコロイド鎖。
【図５】実施例１３に従って調整され、かつ、トリプシン認識部位を有する、本発明によるコロイド粒子集合体の酵素プロテアーゼ活性。
【図６】実施例１４に従って調製された、ストレプトアビジン認識部位を有する本発明によるコロイド粒子集合体を担持する表面を含むマイクロチャンネルの内部への、ビオチン部位を有する赤血球細胞の捕獲。
【図１ａ】
2005517957.tif 000002
【図１ｂ】
2005517957.tif 000003
【図１ｃ】
2005517957.tif 000004
【図２ａ】
2005517957.tif 000005
【図２ｂ】
2005517957.tif 000006
【図３ａ】
2005517957.tif 000007
【図３ｂ】
2005517957.tif 000008
【図４ａ】
2005517957.tif 000009
【図４ｂ】
2005517957.tif 000010
【図５】
2005517957.tif 000011
【図６】
2005517957.tif 000012
【国際調査報告】
2005517957.tif 000013
2005517957.tif 000014
2005517957.tif 000015
2005517957.tif 000016