(57)【要約】１）治療物質の液体製剤を霧化して霧化製剤を生成する工程、２）前記霧化製剤を凍結させて固体粒子を形成する工程、および３）前記固体粒子を、大気圧とほぼ同じ圧力で乾燥させて粉末を生成する工程を含み、前記乾燥工程は、振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で実施される、薬剤組成物を調製する方法を記載した。（１）治療物質の液体製剤を霧化して霧化製剤を生成する工程、（２）前記霧化製剤を凍結させて固体粒子を形成する工程、および（３）前記固体粒子を乾燥させて粉末を生成する工程を含み、霧化製剤は、平均平均粒径約３５から約３００ｍの液滴を含み、および／または粉末は、平均平均粒径約３５ｍから約３００ｍの乾燥粒子を含む、他の方法も記載した。また、上記方法によって作製される組成物、およびそれらの組成物を使用する方法も記載した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療物質または予防物質の液体製剤を霧化して霧化製剤を生成する工程、
前記霧化製剤を凍結させて固体粒子を形成する工程、および
前記固体粒子を、大気圧とほぼ同じ圧力で乾燥させて乾燥粒子を生成する工程
を含み、前記乾燥は、振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で実施される方法によって作られることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項２】
前記凍結した固体粒子は、乾燥されている間、流動状態にあることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記乾燥粒子の体積平均粒径は約３５μｍから約３００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記乾燥粒子の体積平均粒径は約５０μｍから約１００μｍであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記乾燥粒子の少なくとも約５０％は、前記平均の約８０％以内の体積粒径を有することを特徴とする請求項３に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
前記乾燥粒子の空気力学的平均粒径は約８μｍから約１４０μｍであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記乾燥粒子の空気力学的平均粒径は約２０μｍから約７０μｍであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
前記凍結は、前記液体製剤の凝固点よりも低い温度の流体または媒質に前記霧化製剤を導入することによって実施されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記流体または媒質の沸点または昇華点は前記霧化製剤のそれよりも低いことを特徴とする請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記流体は気体であることを特徴とする請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
前記流体は液体であることを特徴とする請求項８に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記乾燥粒子を凍結乾燥によってさらに乾燥させることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記粒子は流れている気体流の存在下で乾燥されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記噴霧、凍結および乾燥は連続プロセスで実施されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記噴霧、凍結および乾燥は単一の容器の中で実施されることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
前記治療物質はタンパク質、核酸またはウイルス粒子であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
前記治療物質は免疫抗原物質であることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
前記免疫抗原物質はインフルエンザワクチンであることを特徴とする請求項１７に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
前記インフルエンザワクチンは、不活化されたインフルエンザウイルス粒子、またはインフルエンザ血球凝集素タンパク質をコードし、ＣＭＶプロモーターに作動可能に結合された核酸を含むことを特徴とする請求項１８に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
前記治療物質はインスリンであることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項２１】
前記液体製剤は粘膜付着剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項２２】
前記粘膜付着剤はキトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチンまたはペクチンであることを特徴とする請求項２１に記載の薬剤組成物。
【請求項２３】
前記治療物質の前記液体製剤は、本質的に前記治療物質と水からなることを特徴とする請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項２４】
治療物質または予防物質の液体製剤を霧化した霧化製剤を凍結することによって形成された固体粒子を、振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で、大気圧とほぼ同じ圧力で乾燥させることによって調製されたものであることを特徴とする薬剤組成物。
【請求項２５】
治療物質の液体製剤を霧化して霧化製剤を生成する工程、
前記霧化製剤を凍結させて固体粒子を形成する工程、および
前記固体粒子を、大気圧とほぼ同じ圧力で乾燥させて乾燥粒子を生成する工程
を含み、
前記乾燥は、振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で実施されることを特徴とする薬剤組成物の調製方法。
【請求項２６】
前記凍結した固体粒子は、乾燥されている間、流動状態にあることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記乾燥粒子の体積平均粒径は約３５μｍから約３００μｍであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記乾燥粒子の体積平均粒径は約５０μｍから約１００μｍであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記乾燥粒子の少なくとも約５０％は前記平均の約８０％以内の体積粒径を有することを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記乾燥粒子の平均空気力学的粒径は約８μｍから約１４０μｍであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記乾燥粒子の平均空気力学的平均粒径は約２０μｍから約７０μｍであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記凍結は、前記液体製剤の凝固点よりも低い温度の流体または媒質に前記霧化製剤を導入することによって実施されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記流体または媒質の沸点または昇華点は前記霧化製剤のそれよりも低いことを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記流体は気体であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記流体は液体であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記乾燥粒子を凍結乾燥によって乾燥させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記粒子は流れている気体流の存在下で乾燥されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記噴霧、凍結および乾燥は連続プロセスで実施されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
前記噴霧、凍結および乾燥は単一の容器の中で実施されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療物質はタンパク質、核酸またはウイルス粒子であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項４１】
前記治療物質は免疫抗原物質であることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項４２】
前記免疫抗原物質はインフルエンザワクチンであることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記インフルエンザワクチンは、不活化されたインフルエンザウイルス粒子、またはインフルエンザ血球凝集素タンパク質をコードし、ＣＭＶプロモーターに作動可能に結合された核酸を含むことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療物質はインスリンであることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項４５】
前記液体製剤は粘膜付着剤を含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
前記粘膜付着剤はキトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチンまたはペクチンであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記治療物質の液体製剤は本質的に前記治療物質と水からなることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項４８】
治療物質の液体製剤を霧化した霧化製剤を凍結することによって形成された固体粒子を、振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で、大気圧とほぼ同じ圧力で乾燥する工程を含むことを特徴とする薬剤組成物調製方法。
【請求項４９】
請求項１に記載の有効量の薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項５０】
前記組成物を呼吸器、鼻腔内、直腸内、膣内、舌下または非経口経路によって投与することを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物は鼻腔内に投与されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物を粘膜に投与することを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
請求項８に記載の有効量の薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項５４】
請求項１６に記載の有効量の薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項５５】
請求項１７に記載の有効量の薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項５６】
請求項１８に記載の有効量の薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項５７】
請求項１９に記載の有効量の薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項５８】
請求項２０に記載の有効量の薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項５９】
請求項２１に記載の有効量の薬剤組成物を、それを必要としている患者に投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項６０】
それを必要としている患者に鼻腔内投与した後に有効な結果を得るのに必要な治療物質または予防物質の量を減らす方法であって、請求項１に記載の有効量の薬剤組成物を前記患者の鼻腔内に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項６１】
患者の免疫応答を誘発する方法であって、請求項１７に記載の有効量の免疫原性組成物を前記患者に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項６２】
前記組成物を鼻腔内に投与することを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記免疫原性組成物はインフルエンザワクチンであることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記インフルエンザワクチンは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質をコードし、ＣＭＶプロモーターに作動可能に結合された核酸を含むことを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記インフルエンザワクチンは、不活化されたインフルエンザウイルス粒子、またはインフルエンザウイルスのサブユニットを含むことを特徴とする請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記免疫原性組成物は、初回抗原刺激−追加免疫レジメンの一部として投与されることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
【請求項６７】
初回抗原刺激は前記免疫原性組成物として投与され、追加免疫はウイルス製剤であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
初回抗原刺激は鼻腔内に投与され、追加免疫は筋肉内に送達されることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項６９】
図１Ｂに示されていることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は例えば、微粒子（例えば粉末）の形態の乾燥した薬剤組成物（乾燥薬剤組成物）を調製する方法に関する。このような組成物は、例えば（例えば鼻腔内投与後の）粘膜組織への投与に適している。本発明の方法によって調製された組成物、およびそれらの組成物を患者に投与する方法も記載される。本発明の例示的な組成物にはインスリンおよびインフルエンザ（「ｆｌｕ」）ワクチンが含まれ、インフルエンザワクチンには、不活化されたウイルス粒子、またはインフルエンザ血球凝集素をコードする核酸が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００２年１０月２２日出願の米国特許仮出願第６０／４１９，９５９号、２００１年１２月１１日出願の米国特許仮出願第６０／３３９，１５６号、および２００１年１１月１９日出願の米国特許仮出願第６０／３３１，９５２号の優先権を主張するものである。これらの明細書はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
乾燥薬剤組成物を製剤する複数の方法が報告されている。これらの方法は例えば、沈降工程、噴霧乾燥工程および／または乾燥した物質の機械的摩砕工程を含む。報告されたいくつかの方法は、水分の蒸発を速め、処理時間を短縮するために非水溶媒を利用する。このような溶媒は、乾燥中の薬剤物質（例えばタンパク質）を傷つける可能性がある。報告されたこれらの方法によって生成された粒子はしばしば凝集する傾向を示し、および／または薬剤として最適に使用するための適当な粒径、密度（例えばタップ密度）、形態および／または安定性を欠く傾向を示す。
【０００４】
したがって、１つまたは複数の上記の欠点あるいはその他の欠点を持たない乾燥薬剤組成物を生成する方法が求められている。
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００５２４７５号公報
【特許文献２】米国特許第６４５５２９２号明細書
【特許文献３】米国特許第４６０８７６４号明細書（Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ）
【特許文献４】米国特許第６２８４２８２号明細書（Ｍａａ）
【特許文献５】米国特許出願第０９／８７９，５１７号（2001年6月12日提出）
【特許文献６】米国特許出願第０９／７５８，７７６号（2001年1月12日提出）
【非特許文献１】W. H. Finley, "The mechanics of inhaled pharmaceutical aerosols,an introduction", Academic Press, London, UK (2001)
【非特許文献２】Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY
【非特許文献３】Ausubel, F. M. et al. (1995), Current Protocols in Molecular Biology, NY, John Wiley & Sons
【非特許文献４】The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman eds., Macmillan Publishing Co., New York
【非特許文献５】Roitt I., (1994), Essential Immunology, Blackwell Scientific Publications, London
【非特許文献６】Currents Protocols in Immunology, edited by John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献７】Robinson et al. (1995) in Vaccines 95, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp.69-75
【非特許文献８】Immunology Today Apr 21(4), 163-165, 2000
【非特許文献９】Richardson and Szekely (1961)
【非特許文献１０】Ranz (1952) Chem. Eng. Prog. 48, 247
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本出願は、例えば粉末の形態の薬剤組成物を調製する方法であって、例えば振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で、大気圧とほぼ同じ圧力で組成物を乾燥させることを含む方法に関する。他の実施形態では、本出願は、例えば微粒子（例えば粉末）の形態の薬剤組成物を調製する方法であって、例えば粉末が平均粒径が約３５μｍから約１００μｍである粒子を含む方法に関する。上記の方法によって作られた組成物、およびこれらの組成物を使用する方法も記載される。
【０００７】
本発明の様々な特徴およびそれに付随する利点は、添付の図面とともに本発明を検討して本発明をより理解したときにより完全に理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は例えば、微粒子（例えば粉末）の形態の乾燥した薬剤組成物（乾燥薬剤組成物）を調製する方法、これらの方法によって作られた組成物、およびこれらの組成物を使用して患者を治療する方法に関する。
【０００９】
本発明の一態様は薬剤組成物を調製する方法であり、この方法は、治療物質または予防物質の液体製剤を霧化して霧化製剤を生成する工程、前記霧化製剤を凍結させて固体粒子を形成する工程、および前記固体粒子を乾燥させて乾燥粒子（例えば粉末）を生成する工程のうちの１つまたは複数の工程を含む。好ましくは、前記霧化製剤は、体積平均粒径（非特許文献１に定義されている）が約３５μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約３００μｍの液滴を含み、および／または、前記粉末が、体積平均粒径が約３５μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約３００μｍの乾燥粒子を含む。最も好ましくは、これらの液滴または粒子の体積平均粒径が約５０μｍから約１００μｍである。好ましい実施形態では、乾燥粒子の少なくとも約５０％が体積平均粒径の約８０％以内の体積粒径を有し、より好ましくは、乾燥粒子の少なくとも約５０％が体積平均粒径の約６０％以内の体積粒径を有する。好ましい一実施形態では、前記粉末は、空気力学的平均粒径（前掲非特許文献１に定義されている）が約８μｍから約１４０μｍ、より好ましくは約８μｍから約８０μｍ、より好ましくは約２０μｍから約７０μｍの乾燥粒子を含む。本明細書では、この方法、およびこの方法によって作られた組成物を時に、「噴霧凍結乾燥（spray-freeze-dry）」法または「噴霧凍結乾燥」組成物と呼ぶ。
【００１０】
上記の薬剤組成物の粒子は、鼻腔内投与を容易にする適当な粒径、密度および／または形態を有する。特定の理論に結びつけたいわけではないが、鼻腔内投与の後、上記の組成物は粘膜、例えば鼻を内張りする粘膜または副鼻腔の粘膜に送達され、副鼻腔を通して肺系に進むことなくそこに付着すると考えられ、このような粘膜への付着によって、他の治療および予防組成物製剤を用いるよりも吸収速度が高まると考えられる。したがって、本発明の組成物がワクチンである場合には、有効な抗体応答をマウントするのに必要な時間が短縮され、粘膜免疫（例えばＩｇＡ応答によって媒介される免疫）が強化される。このような本発明のワクチンの鼻腔内投与は、全身と鼻粘膜の両方のＩｇＡ免疫応答を引き出す。
【００１１】
本発明の他の態様は、薬剤組成物を調製する方法であり、この方法は、治療物質または予防物質の液体製剤を霧化して霧化製剤を生成する工程、前記霧化製剤を凍結させて固体粒子を形成する工程、および前記固体粒子を、振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で、大気圧とほぼ同じ圧力で乾燥させて、乾燥粒子（例えば粉末）を生成する工程のうちの１つまたは複数の工程を含む。本明細書では「大気圧とほぼ同じ圧力」とは、約０．５気圧から約５気圧の圧力を意味する。「乾燥」とは、製剤の揮発性成分を凍結固体粒子から除去することを意味する。粉末は、体積平均粒径が好ましくは約３５μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約３００μｍ、最も好ましくは約５０μｍから約１００μｍの乾燥粒子を含み、および／または、乾燥粒子は、約８μｍから約１４０μｍ、好ましくは約８μｍから約８０μｍ、より好ましくは約２０μｍから約７０μｍの体積空気力学的平均粒径を有する。好ましい実施形態では、乾燥粒子の少なくとも約５０％が体積平均粒径の約８０％以内の体積粒径を有し、より好ましくは、乾燥粒子の少なくとも約５０％が体積平均粒径の約６０％以内の体積粒径を有する。凍結固体粒子は乾燥中、流動状態にあることが好ましい。本明細書では、この方法、およびこの方法によって作られた組成物を時に、「噴霧凍結大気圧乾燥（spray-freeze-atomospheric-dry）」法または「噴霧凍結大気圧乾燥」組成物と呼ぶ。この方法によって生成された組成物の利点は凝集しないことである。
【００１２】
本発明の組成物の他の利点は、容易にエアロゾル化され、良好な安定性、無菌性、放出用量および生物活性の保持を提供し、吸入装置などの送達装置中に残留物をほとんど残さず、液体の中で容易に元の状態に戻ることである。この粒子は、粒子のエアロゾル化、例えば呼吸器送達のためのエアロゾル化を容易にする低いタップ密度を示すことができる。この粒子は低い微粉レベルを示し、取扱いが容易である。本発明の方法では、よく制御された粒径分布を得ることができる。したがって、本発明の組成物はよく制御された粒径分布を含む。この粒子の形態は、粒子が凝集する可能性を低減させ、かつエアロゾル化をさらに容易にする。この組成物は、冷凍しなくても安定であり、例えば液体製剤よりも便利かつ安価な保管および輸送が可能である。本発明の組成物は、集団ワクチン接種に特によく適している。本発明の一実施形態では、本発明の組成物が呼吸器（例えば鼻腔内）投与によって投与される。本発明の組成物は鼻腔内投与に特によく適している。なぜなら、よく制御された粒径分布が鼻粘膜の正確なターゲティングが可能にするからである。注射（例えば皮内または皮下注射）による投与と比較した場合の呼吸器投与の利点には、患者コンプライアンスの増大および免疫応答の増強が含まれる。呼吸器投与は、痛みが伴わない実施が容易な非侵襲性の手法であり、この点からも呼吸器投与は有利である。
【００１３】
タップ密度の特性は当業者にはよく知られている。固体材料の粒子は、粉砕、摩砕または処理の後もそれぞれの真密度は変わらないが、材料はより大きな幾何学的空間を占める。言い換えると、幾何学的な密度は、粒子が球形の場合、真密度の５０％に近い。
【００１４】
粉末材料のハンドリングまたは振動は、相対的に小径の粒子を、相対的に大径の粒子間の間隙に移動させる。粉末が占有する幾何学的空間は低減し、その密度は増大する。最終的に、粒子の自然の充填は、圧力を加えない限り、それ以上測定されなくなる。粒子の最大充填が達成される。
【００１５】
タップ速度、タップ力（落下）およびシリンダー直径が制御された条件では、この最大充填効率の状態の再現性は極めて高い。このタップ密度の測定は、見掛けの体積に関する英国薬局方の方法、ＩＳＯ７８７／１１、ならびにタップ密度に関するＡＳＴＭ標準試験法Ｂ５２７、Ｄ１４６４およびＤ４７８１に正式に承認されている。
【００１６】
本発明の他の態様は、上記の薬剤組成物を作る方法であり、この方法では、凍結が、液体製剤の凝固点よりも低い温度を有する低温の流体または媒質に霧化製剤を導入することによって実施される（本明細書では用語「流体」が圧縮ガスなどの気体と液体の両方を包含する）。該方法において、前記流体または媒質の沸点または昇華点が霧化製剤のそれよりも低い。該方法において、乾燥は、大気圧とほぼ同じ圧力で（好ましくは振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で）、または凍結乾燥によって、あるいはこれらの組合せによって実施され、好ましくは、凍結と乾燥がともに、低温の気体の中で、大気圧とほぼ同じ圧力で（好ましくは振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で）実施される。該方法において、治療物質または予防物質は、タンパク質（例えばインスリン）、核酸またはウイルス粒子であり、あるいは、治療物質は、インフルエンザワクチンなどの免疫抗原物質であり、インフルエンザワクチンが例えば、不活化されたインフルエンザ粒子、サブユニットインフルエンザワクチン、またはインフルエンザ血球凝集素タンパク質をコードする核酸を含み、特に、血球凝集素タンパク質が構成プロモーター、特にＣＭＶプロモーターなどの強い構成プロモーターの管理下にある。該方法において、液体製剤がさらに、粘膜付着剤（例えばキトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチン、ペクチン）などの薬剤として許容される賦形剤を含み、あるいは、液体製剤が本質的に治療物質と水とからなる。
【００１７】
本発明の他の態様は、上記の方法によって調製された薬剤組成物、すなわち、体積平均粒径が約３５μｍから約３００μｍ、好ましくは約５０μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約１００μｍであり、および／または、空気力学的平均粒径が約８μｍから約１４０μｍ、より好ましくは約８μｍから約８０μｍ、より好ましくは約２０μｍから約７０μｍである乾燥粒子を含む薬剤組成物である。組成物中の乾燥粒子の少なくとも約５０％が体積平均粒径の約８０％以内の体積粒径を有することが好ましく、乾燥粒子の少なくとも約５０％が体積平均粒径の約６０％以内の体積粒径を有することがより好ましい。
【００１８】
本発明の他の態様は、それを必要としている患者を治療する方法であり、この方法は、本発明の方法によって生成された有効量の薬剤組成物および／または前の段落に記載した特性を有する有効量の薬剤組成物を患者に投与することを含む。該方法において、組成物は、呼吸器、鼻腔内、直腸内、膣内、舌下または非経口経路、好ましくは鼻腔内経路によって投与され、および／または粘膜に投与される。他の態様は、それを必要としている患者に鼻腔内投与した後に有効な結果を得るのに必要な治療物質または予防物質の量を減らす方法であり、この方法は、有効量の本発明の薬剤組成物を患者の鼻腔内に投与することを含む。他の態様は患者の免疫応答を誘発する方法であり、この方法は、有効量の本発明の免疫原性組成物を患者に投与することを含み、例えば、組成物は鼻腔内に投与され、および／または組成物は本発明のインフルエンザワクチンである。
【００１９】
他の態様は、薬剤組成物を調製する方法であり、この方法は、治療物質または予防物質の液体製剤の霧化製剤を凍結させることによって形成した固体粒子を、振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの存在下で、大気圧とほぼ同じ圧力において乾燥させることを含む。
【００２０】
他の態様は、薬剤組成物を調製する方法であり、この方法は、前記治療物質または予防物質の液体製剤を霧化して霧化製剤を生成することを含み、前記霧化製剤を凍結させて固体粒子を形成し、前記固体粒子を乾燥させて粉末を生成した後に、前記乾燥粉末が、平均平均粒径が約３５μｍから約３００μｍ、好ましくは約５０μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約１００μｍの乾燥粒子を含み、前記乾燥粒子の少なくとも約５０％が前記平均の約８０％以内の体積粒径を有し、かつ前記乾燥粒子が約８μｍから約１４０μｍの空気力学的平均粒径を有する。
【００２１】
本発明の方法および組成物では、様々な治療または予防物質を使用することができる。本明細書では「治療物質」（本明細書では時に「活性薬剤物質」またはＡＰＩとも呼ぶ）が、それを投与した細胞、組織、器官または患者において治療効果を誘発することができる作用物質を意味する。１種または複数の治療物質を含む組成物は、患者に投与したときに「臨床的に有効な結果」を生み出すことができる。本明細書では用語「臨床的に有効な結果」とは、臨床的に有用な生体応答を意味し、診断と治療の両方で使用される。例えば、本発明の組成物は診断検査法で使用することができ、および／または、本発明の組成物を使用して、病気の症状または患者の状態を治療し、予防し、および／または改善させることができる。
【００２２】
治療物質は様々なタイプの作用物質とすることができ、これには例えばポリペプチド（タンパク質）、ポリヌクレオチド（核酸）、ステロイドなどの小分子、ウイルス粒子が含まれる。本明細書では、用語ポリペプチドとタンパク質が相互交換可能に使用され、同様に、用語ポリヌクレオチドと核酸も相互交換可能に使用される。
【００２３】
適当なポリペプチドまたはペプチドには、成長因子、サイトカイン、抗原、抗体、インターロイキン、リンホカイン、インターフェロン、酵素などが含まれ、これらには、抗ＩｇＥ抗体、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、カルシトニン、エリトロポエイチン（ＥＰＯ）、第ＩＸ因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長ホルモン（特にヒト成長ホルモン）、ヘパリン（低分子量ヘパリンを含む）、インスリン、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、インターロイキン、インターフェロンα、βおよびγ、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ソマトスタチンおよび類似体、バソプレシンおよび類似体、卵胞刺激ホルモン、アミリン、毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor）、成長ホルモン放出因子、インスリノトロピン（insulinotropin）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、神経発育因子、副甲状腺ホルモン、α−１抗トリプシン、抗ＲＳＶ抗体、ＤＮアーゼ、Ｈｅｒ２、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子遺伝子生成物、嚢胞性線維症の治療に有効である）、インスリンなどが含まれが、それらに限定されるわけではない。好ましい実施形態において、ポリペプチドはインスリンである。マーカータンパク質などのポリペプチドを使用することもできる。
【００２４】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、細菌、ウイルス、原生動物、他の寄生生物（マラリアなどを含む）などの感染因子の内部または表面に見出される。このようなポリペプチドは、例えばワクチンに使用される免疫抗原物質の働きをすることができる、
【００２５】
ポリペプチドは、天然ポリペプチドであってもよく、または組換えによって生成することもできる。ポリペプチドは、特許文献１で論じられている例えば変異体ポリペプチドなどのように、当技術分野で認知されている様々な修飾の任意のものによって修飾することができる。本発明で使用するポリペプチドは、完全長のタンパク質の断片とすることができる。任意の望ましいサイズ（長さ）のポリペプチドを使用することができる。例えば、１種または複数種のエピトープおよび／または抗原性配列を含むペプチドは、免疫応答を誘発する作用物質の働きをすることができる。
【００２６】
適当なポリヌクレオチドには例えば、対象となる治療用ポリペプチドをコードする組換え配列を含むベクターが含まれる。これらのポリヌクレオチドは、上記の治療用ポリペプチドまたは他のポリペプチドをコードするものとすることができる。このような配列をクローン化する方法、および対象となる配列が適当な発現制御配列に作動可能に結合された組換えベクターを生成する方法は、定型的かつ慣用的である。一般的な方法には、非特許文献２および３に記載の方法が含まれる。ただしこれらの他にも多くの文献がある。語句「発現制御配列」とは、この配列に対して機能的に（「作動可能に」）結合したポリヌクレオチドがコードしているポリペプチドの発現を調節するポリヌクレオチド配列を意味する。発現は、ｍＲＮＡまたはポリペプチドのレベルで調節することができる。したがって、発現制御配列は、ｍＲＮＡに関係した要素およびタンパク質に関係した要素を含む。このような要素には、プロモーター、エンハンサー（ウイルス性または細胞性）、リボソーム結合配列、転写ターミネーターなどが含まれる。発現制御配列がヌクレオチドコード配列に作動可能に結合されるのは、発現制御配列がそのコード配列の発現を達成するように配置されたときである。例えば、コード配列の５’末端にプロモーターが作動可能に結合されているとき、このコード配列の発現はこのプロモーターによって駆動される。強い構成プロモーター、調節可能プロモーターなどの適当な発現制御配列は当業者には明白であろう。
【００２７】
ポリヌクレオチドは、天然ポリヌクレオチドとすることができ、または組換えによって生成することができる。本発明で使用するポリヌクレオチドは、完全長の核酸の断片、例えば完全長のタンパク質の断片をコードする核酸断片とすることができる。臨床的に有効な結果を与えるものである限り、望ましいサイズの任意のポリヌクレオチドを使用することができる。
【００２８】
本発明の組成物および方法で使用することができるポリヌクレオチドは、当業者には明白な様々な形態をとることができ、これにはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、オリゴヌクレオチド、一本鎖または二本鎖分子などが含まれる。核酸は、例えば核酸を安定化することまたは核酸の細胞への取込みを増強することを補助する多数の既知の修飾の任意のものを含むことができる。このような修飾には例えば、特許文献２に論じられているものが含まれる。
【００２９】
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、ワクチン、例えばＤＮＡワクチンの働きをする。インフルエンザ血球凝集素タンパク質をコードし、インフルエンザ感染の少なくともいくつかの症状に対する保護を提供するこのようなＤＮＡワクチンの構造および使用については本明細書の別の場所で詳細に論じる。例えば実施例５〜８を参照されたい。このような核酸は、完全長のタンパク質またはその断片、例えば免疫応答を誘発することができる抗原性ペプチドをコードすることができる。
【００３０】
核酸は、コード配列または非コード配列（例えば調節配列）を含むことができる。ポリペプチドをコードする他に、核酸は例えばアンチセンス分子またはリボザイムであることができる。よく知られているタイプのアンチセンス分子またはリボザイムのいくつかの議論については、例えば特許文献２を参照されたい。
【００３１】
適当なウイルス粒子には、例えばワクチンの抗原として働くことができる部分的にまたは完全に不活化された、ウイルス粒子（例えばインフルエンザウイルス、ＲＳＶ、ポリオウイルスなど）が含まれる。好ましい実施形態では、ウイルスは、不活化インフルエンザウイルスである。典型的なインフルエンザ株には例えばＡ／ＰＲ／８／３４およびPort Chalmers株が含まれる。また、慣用の方法によって調製されるサブユニットワクチンも含まれる。他の実施形態では、治療用タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を含む鼻腔内投与に適した慣用のウイルスベクターが含まれる。該ウィルスベクターには、アデノウイルスベースのベクターまたはＡＡＶベースのベクターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば嚢胞性線維症の治療に適した遺伝子を含む適当な任意の治療用遺伝子を使用することができる。
【００３２】
適当なステロイドには、例えば喘息、気管支痙攣または他の状態を治療するための当業者に周知の従来のステロイドが含まれる。
【００３３】
対象となる治療物質は、最初に、従来の様々な液体を使用して、液体製剤として製剤することができる。液体は、例えば水（例えば注射可能な等級の水）、様々な慣用の緩衝液などの水性液体であることが好ましい。それらは、塩を含んでいても、または含んでいなくてもよい。緩衝液のｐＨは、一般的には選択されるタンパク質または他のタイプの治療物質が安定するｐＨが選択され、当業者はこのｐＨを突き止めることができる。一般的に、緩衝液のｐＨは生理的ｐＨの範囲にあるが、一部のタンパク質は、これよりも広い範囲のｐＨ、例えば酸性のｐＨで安定である。したがって、最初の液体製剤の好ましいｐＨ範囲は約１から約１０であり、約３から約８であることが特に好ましく、約５から約７であることがさらに好ましい。当業者には理解されるとおり、使用できる適当な緩衝液は多数存在する。適当な緩衝液には、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、重炭酸アンモニウムおよび炭酸アンモニウムが含まれが、それらに限定されるわけではない。一般的には、モル濃度が約１ｍＭから約２Ｍの緩衝液が使用され、約２ｍＭから約１Ｍであることが好ましく、約１０ｍＭから約０．５Ｍであることが特に好ましく、５０から２００ｍＭであることがさらに好ましい。溶液中に存在する場合、塩は一般的には約１ｍＭから約２Ｍの濃度で使用され、約２ｍＭから約１Ｍであることが好ましく、約１０ｍＭから約０．５Ｍであることが特に好ましく、５０から２００ｍＭであることがさらに好ましい。適当な塩にはＮａＣｌが含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００３４】
液体製剤は、溶液、懸濁液、スラリ、コロイドなど様々な形態をとることができる。
【００３５】
任意選択で液体製剤は、薬剤として許容される１種または複数種の慣用の賦形剤を含むことができる。「賦形剤」は、一般的にＡＰＩの製剤の効能を増強するために添加される化合物または材料を指す。賦形剤の例には、例えば凍結保護剤および溶解保護剤が含まれ、これらは、噴霧凍結乾燥プロセスまたは噴霧凍結大気圧乾燥プロセス中のタンパク質の安定性、および、後の粉末生成物の長期安定性および流動性を保証しまたは増大させるために添加される。適当な保護剤は、一般的には、比較的に自由に流動する微粒子固形物であり、水と接触しても増粘または重合したりせず、患者によって吸入されるかまたは他の方法で患者の体内に導入されても本質的に無毒であり、治療物質との間で、その生体活性を変化させるような重大な相互作用を生じない。適当な賦形剤には、ヒトおよびウシ血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；単糖類（ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど）、二糖（乳糖、トレハロース、スクロースなど）、シクロデキストリン類および多糖類（ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど）を含む炭水化物；グルタミン酸一ナトリウム、グリシン、アラニン、アルギニン、ヒスチジン、疎水性アミノ酸（トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなど）などのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどの賦形塩；三価以上の糖アルコールなどのポリオール（例えば、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール）；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；Pluronic類；界面活性剤；およびこれらの組合せが含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい賦形剤には、例えばトレハロース、スクロースおよびマンニトールが含まれる。他のクラスの賦形剤である粘膜付着剤は、ＡＰＩと粘膜表面との接触を増大させるためにしばしば使用される。粘膜付着剤の例には、例えばキトサン、デルマタン硫酸、コンドロイチンおよびペクチンが含まれる。さらに、ＡＰＩの溶解度を高める従来の共溶剤を、本明細書に開示したＳＦＤプロセスに適した液体製剤に添加することができる。
【００３６】
一般的に、粘膜付着剤を使用するときには、約１から９５重量％の量で使用され、この量が約１から５０重量％であることが好ましく、約５から５０重量％であることが特に好ましく、約５から２０重量％であることがさらに好ましい。一般的に、凍結保護剤は、約５重量％から約９５重量％の濃度で使用される。
【００３７】
一実施形態では、本発明の乾燥粉末は増量剤または担体と混合される。それらは、後に、患者に送達される粉末中の治療物質の濃度を低減させるのに使用される。すなわち、単位用量あたりの材料の体積を大きくすることが望ましいことがある。増量剤を使用して、分散装置内での粉末の分散性を高め、および／または粉末の取扱い特性を改良することもできる。これは、噴霧乾燥プロセス中の増量剤または担体の使用とは区別される。適当な増量剤は、一般に（水の吸収を防ぐため）結晶性であり、これには乳糖およびマンニトールが含まれるが、それらに限定されるわけではない。したがって、乳糖などの増量剤を加える場合には、様々な比率で加えることができ、対象となる治療物質と増量剤との比が約９９：１から約１：９９であることが好ましく、約１：５から約５：１であることがより好ましく、約１：１０から約１：２０であることが特に好ましい。
【００３８】
本発明の液体製剤は、従来の様々な手法によって霧化することができる。液体製剤は例えば、２流体ノズル、加圧ノズルまたはロータリーディスクを通して噴霧することができ、あるいは超音波ネブライザまたは振動オリフィスエアロゾル発生器（ＶＯＡＧ）を用いて霧化することができる。一実施形態では、BD AccuSprayノズルなどの加圧ノズルを用いて液体製剤を霧化する。
【００３９】
好ましい実施形態では、霧化された液滴（例えば噴霧された液滴）の平均質量径が少なくとも約２０μｍ、好ましくは約３５μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約３００μｍ、より好ましくは約５０μｍから約１００μｍとなるように霧化条件が最適化される。所望のサイズの液滴の生成を最適化する方法は慣用的ある。変更することができる条件には、霧化用気体の流量、霧化用気体の圧力、液体の流量などがある。同様に、ノズルのタイプおよびサイズを変更することもできる。液滴径は、レーザー回折などの慣用の技術を使用して容易に測定することができる。乾燥粒子の粒径は、例えば走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、レーザー回折などの慣用の技術によって測定することができる。例えば、図４および１８にそれぞれ、実施例１に示した方法によって生成された試料に関して、レーザー回折によって測定された液体試料および乾燥粉末試料の典型的な粒径分布を示す。
【００４０】
凍結させた霧化粒子を大気圧とほぼ同じ圧力で乾燥させる、本明細書の別の場所で論じる一実施形態では、霧化液滴の直径を少なくとも約２０μｍ、好ましくは約２０μｍおよび約３００μｍ、より好ましくは約３５μｍから約１００μｍまたは約５０μｍから約１００μｍとすることができる。
【００４１】
液体製剤を霧化した後、液滴を急速に凍結させて固体粒子を形成する。液滴は、霧化工程の直後、または実質的に直後に凍結させることが好ましい。
【００４２】
一実施形態では、霧化液滴を形成する液体製剤の凝固点よりも低い温度の冷液体の中に浸すことによって、霧化液滴を凍結させる。好ましい実施形態では、この冷液体の温度が約−２００℃から−８０℃、より好ましくは約−２００℃から−１００℃、最も好ましくは約−２００℃である（液体窒素は約−１９６℃）。適当な任意の冷液体を使用することができ、これには、液体窒素、アルゴンおよびヒドロフルオロエーテル類、または圧縮ＣＯ２、ヘリウム、プロパン、エタンなどの圧縮液体、あるいは当該技術においてよく知られている同等の不活性液体が含まれる。例えば一実施形態では、例えば液体窒素などの適当な冷液体を含む容器の上方に配置された噴霧ノズルを通して治療物質の液体製剤を霧化する。この冷液体と接触すると液滴は即座に凍結する。実施例２では、このような凍結手法を利用した、不活化インフルエンザウイルス粒子組成物の調製を示す。
【００４３】
他の実施形態では、冷却チャンバ中の液滴の凝固点よりも低い温度の気体（例えば冷たい空気、窒素、ヘリウムまたはアルゴン）の中に液滴を通すことによって液滴を凍結させる。好ましい実施形態では、この冷気体の温度が約−５℃から−６０℃、より好ましくは約−２０℃から−４０℃である。気体は、冷却コイル、熱交換器、チラー冷却器などの慣用の方法によって冷却することができる。気体の温度は、慣用の手順、例えば液体窒素、固体炭酸または凝固点下の温度を生み出す同等の低温剤を用いて低下させることができる。実施例１および１ｂでは、本発明の組成物を生成するのに使用することができる一般的な装置および方法を説明する。これらの装置および方法では、適当な冷却チャンバに霧化液滴を通すことによって霧化液滴を気体の中で冷却する。
【００４４】
固体凍結粒子を形成した後に、この粒子を乾燥させて粉末を生成する。「乾燥」とは、無視できる量の液体しか含まないこと、例えば、例えば吸入装置の中で粒子が容易に分散してエアロゾルを形成するような含水率を有することを意味する。この含水率は一般に約１５重量％未満であり、約１０％未満であることが好ましく、約１％未満から約５％であることが特に好ましい。
【００４５】
本発明の一実施形態では、慣用の凍結乾燥装置を使用した（減圧）凍結乾燥によって凍結液滴を乾燥させる。この方法は一般に「噴霧凍結乾燥」法またはＳＦＤ法と呼ばれ、この方法によって作られた組成物は「噴霧凍結乾燥」組成物またはＳＦＤ組成物と呼ばれる。例えば、一実施形態では、液体窒素を含む（Virtis凍結乾燥フラスコなどの）容器の中に粒子を噴霧することによって粒子を凍結させ、次いでこの容器を慣用の凍結乾燥器に取り付け、過剰な液体窒素を蒸発させることができる。凍結したエアロゾルは、典型的には約４８時間以内に乾燥し、約１重量％未満の水分レベルに達する。あるいは、大気圧とほぼ同じ圧力の冷空気の中で凍結させ、任意選択で（後に論じるように）大気圧とほぼ同じ圧力で部分的に乾燥させた液滴を、次いで凍結乾燥フラスコに入れ、そして凍結乾燥にかけることができる。
【００４６】
他の実施形態では、大気圧とほぼ同じ圧力の乾燥した冷気体（例えば空気、窒素またはヘリウム）流の中で昇華させることによって凍結液滴を乾燥させる。本明細書では「大気圧とほぼ同じ圧力」とは、約０．５気圧から約５気圧までの圧力を意味する。気体の温度は、種々の慣用の手順の任意のもの、例えば液体窒素、固体炭酸または同等の低温剤を用いることによって低下させることができる。本明細書では、このようにして乾燥させた本発明の粒子を時に「噴霧凍結大気圧乾燥」粒子と呼ぶ。好ましい実施形態では、同じ「噴霧凍結大気圧」チャンバで霧化した液滴を凍結および乾燥させて、凍結手順と乾燥手順とを単一の工程で実施できるようにする。
【００４７】
大気圧とほぼ同じ圧力の冷空気中で固体凍結粒子を乾燥させる１つの装置および方法が、特許文献３に開示されている。本明細書の実施例１ａおよび１ｂも参照されたい。他のタイプの慣用の装置も使用することができる。
【００４８】
好ましい実施形態、例えば実施例１ｂおよび１１に示した実施形態では、大気圧とほぼ同じ圧力の冷気体の中で、かつ粒子の流動化を増強する条件の存在下で霧化凍結粒子を乾燥させる。最も好ましい実施形態では、乾燥プロセス中に振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せが存在する条件で霧化凍結粒子を乾燥させる。本明細書で使用する用語「内部装備」は、チャンバ（例えばＳＦＤチャンバ）または流動床の内側の例えばブレード、プレートなどの任意の物理的な障害を指す。このような処理によって粒子は流動状態を達成することができる。このような流動化を達成するための方法および装置は実施例１ｂおよび１１で論じられている。
【００４９】
また、実施例１ｂおよび１１に記載の方法および装置は、チャネリングを防ぐのに役立つ。チャネリングは、微粒子の最も望ましくない流動化特性の１つであり、低または高流動化速度で起こりうる。チャネリングは、ディストリビュータから流動床の表面へ延びる空隙の中を気体が上昇するときに起こる。これらの垂直チャネルは、時間の経過とともにベッドを横切って移動することがあり、その結果、ベッドの脱流動化が起こる。ベッドには小さな亀裂もあり、これらの亀裂は垂直チャネルへ気体を排出する。気体の流速が増大するにつれ、極めて凝集性の高い一部の粒子に対しては、小さなチャネルだけでなく、ラットホールと呼ばれる大きなチャネルも形成される。この問題が生じるのは、粒子間力が、流体が粒子に対して発揮することができる力よりも著しく大きいためである。
【００５０】
例えば２流体ノズル、加圧ノズルまたは超音波ノズルを使用して噴霧凍結させた噴霧凍結粉末は、流動化させるのが非常に難しくなることがある。流動床で乾燥させると、このような粒子は容易にチャネリングを引き起こしまたは容易に凝集し、急速かつ完全に乾燥させることが困難または不可能にさえなる。本発明者らは、乾燥プロセス中の振動、内部装備、機械的攪拌またはこれらの組合せの導入が、このような粒子を流動化させるのに有効となり得ることを認めた。
【００５１】
他の実施形態では、先に説明した大気圧とほぼ同じ圧力の乾燥した冷気体（例えば空気）流の中での昇華と、凍結乾燥とを組み合わせることによって凍結液滴を乾燥させる。例えば、大気圧とほぼ同じ圧力で部分的に乾燥させた（例えば望ましくない量の液体を依然として含むケーキまたは粉末を形成した）組成物を凍結乾燥器に移し、そこで組成物をさらに乾燥させる。
【００５２】
乾燥させた組成物は、慣用の方法を使用して集めることができる。一実施形態では、乾燥粒子をフィルタの上に集め、そこから取り出して例えば医療用途に使用する。このような方法、およびこのような方法の実施に使用することができる装置の説明については、実施例１ａ、１ｂおよび図１Ａ、１Ｂを参照されたい。他の実施形態では、噴霧凍結大気圧乾燥粒子を生成物容器の中に集める。部分的に乾燥した粒子は密でないケーキを形成することができ、その中に残った水分は、乾燥した冷空気流の中での追加の大気圧昇華によって除去することができる。あるいは任意選択で、部分的に乾燥した粒子を、凍結乾燥器または他の適当な装置に移し、減圧（大気圧よりも低い圧力）下でさらに乾燥させることができる。
【００５３】
上記の任意の方法によって乾燥させた粒子は、実質的に同じ特性（例えば粒径、孔隙率など）を示す。
【００５４】
本発明の大気圧噴霧凍結乾燥プロセス、特に振動および／または内部装備を用いたプロセスは、乾燥粒子を生成し、収率を増大させる経済的に実現可能な方法を提供する。この方法によって調製された組成物は、例えば呼吸器投与を容易にする特性を有することができる。例えば特許文献４に開示されている噴霧凍結乾燥プロセスとは違い、本発明のこの実施形態は、単一の装置を用いて乾燥粒子を生成する。本発明の霧化、凍結および乾燥を単一の容器で実施し、これによって試料の汚染および収率の低下を引き起こす可能性がある試料の移送の必要性を排除することが好ましい。さらに、操作全体を連続操作として実施し、これによって効率を高めることができる。「連続操作」とは、工程と工程の間に時間的中断がなく、および／または物理的な隔離がない（例えば霧化凍結粒子を乾燥のために別の容器に移さない）ことを意味する。薬剤組成物の調製に利用される他の噴霧凍結乾燥プロセスは、多くの場合に、噴霧凍結チャンバから凍結粒子を取り出し、凍結乾燥器に移すことを伴う第２の凍結乾燥工程を含む。このような追加の工程は、噴霧凍結乾燥プロセスの商業的な実現可能性を低下させ、さらに、粒子の中に捕らえられた水分の部分的な融解によって粒子の凝集を引き起こす可能性がある。
【００５５】
この乾燥手順の後に、本発明の組成物は、自由に流動する粉末の形態を得ることができる。本発明の組成物の乾燥した多孔質の粒子は、乾燥前の凍結液滴とほぼ同じ粒径（幾何学的直径）、およびほぼ同じ形状を有する。
【００５６】
本発明の乾燥粒子は望ましい空気力学的特性を示す。乾燥粒子の慣性衝突および重力沈降は、動物の呼吸器トラック内での粒子の堆積プロファイルを左右する。このような堆積プロファイルを求める方法は、当該技術において定型的かつ慣用的である。例えば、空気力学的粒径は、実際の粒径に、粒子密度と水の密度との比の平方根をかけた積と定義される（ｄａｅ＝（ｓｇ）１／２ｄｐ、ｓｇ＝ρ粒子／ρ水、ｄａｅは空気力学的粒径、ｄｐは粒径である）。
【００５７】
本発明の乾燥粉末は他にも望ましい特性を示す。実施例９および１０に、本発明の方法によって作られたインスリン組成物のいくつかの特性を示す。この粒子は、望ましい形態（これはＳＥＭによって示される）および望ましい密度を示す。さらに、この粒子は、使用後に送達装置に残る残留粉末の量が少なく、例えば液体インスリン製剤よりも高い安定性を示し、液体の中で容易に元の状態に戻る。
【００５８】
本発明の組成物を使用して、様々な医学的状態を治療することができる。治療することができる多くの状態には、糖尿病、感染症、あるいは本明細書に論じられている治療物質または他の治療物質によって治療することができる任意の状態が含まれる。好ましい実施形態では、本発明の組成物はワクチンである。
【００５９】
本発明の一態様は、それを必要としている患者を治療する方法であり、この方法は、本発明の方法によって生成された有効量の薬剤組成物を前記患者に投与することを含む。本明細書では「有効量」とは、所望の応答を誘発するのに有効な量を意味する。例えば、免疫抗原組成物の有効量は、検出可能な免疫応答を誘発するのに有効な量である。有効量は、患者の年齢、体重および／または臨床状態、投与方法、投与計画などのよく知られた因子を考慮し、慣用の手順に従って経験的に決定することができる。患者は任意の動物とすることができ、家畜、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウサギなどの哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが好ましい。
【００６０】
本発明の組成物は、当業者に知られている様々な経路によって投与することができ、これには、呼吸器、鼻腔内、直腸内、膣内、舌下、経口または非経口経路が含まれるが、それらに限定されるわけではない。一実施形態では、本発明の組成物を、鼻腔および副鼻腔の粘膜組織を含む粘膜組織に投与する。ただし粘膜組織はこれらに限定されるわけではない。好ましい実施形態では、本発明の組成物を、呼吸器系を通して、それを必要としている患者に投与する。本明細書では、「呼吸器系を通した投与」または「呼吸器投与」とは、作用物質を鼻を通して（鼻腔内に）投与することを意味する。投与後、作用物質は鼻腔および副鼻腔を通り、場合によっては肺に入る。
【００６１】
慣用の投与方法を使用してもよい。適当なアプリケータ（例えば吸入器）は当技術分野において知られている。典型的な送達装置には、特許文献５および特許文献６に開示されている装置が含まれが、それらに限定されるわけではない。投与量は、当業者に知られている慣用の手順によって決定することができる。例えば非特許文献４を参照されたい。考慮すべき因子には、関与する特定の作用物質の活性、作用物質の代謝安定性および作用の長さ、投与のモードおよび時間、薬物の組合せ、排出速度、治療する種、ならびに治療を受けている対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事および特定の病態の重症度が含まれる。有効な免疫応答を誘発するための用量（例えば有効なワクチン接種のための用量）は当業者にはよく知られている。
【００６２】
本発明の他の態様は、治療組成物をそれを必要としている患者へ送達することによって疾患（例えば状態または病気）を治療する方法であり、この方法は、患者の鼻腔および／または副鼻腔の粘膜膜に本発明の薬剤組成物を投与することを含む。他の態様は、治療組成物をそれを必要としている患者に投与する方法であり、この方法は、患者の鼻腔および／または副鼻腔の粘膜膜に本発明の薬剤組成物を投与することを含む。他の実施形態は、本発明の有効量の薬剤組成物を含む単位用量容器または乾燥粉末吸入器である。
【００６３】
本発明の組成物は、鼻腔内投与後に、液体製剤または例えば噴霧乾燥製剤などの他のタイプの乾燥製剤よりも大きな治療効果を達成することができる。例えば実施例２および３を参照されたい。したがって、本発明は、それを必要としている患者に鼻腔内投与した後に有効な結果を得るのに必要な治療物質の量を減らす方法に関し、この方法は、本発明の有効量の薬剤組成物を前記患者の鼻腔内に投与することを含む。
【００６４】
一態様では、本発明が、患者の免疫応答を誘発する方法に関し、この方法は、本発明の有効量の免疫抗原組成物を患者に投与することを含む。本明細書で使用する用語「免疫応答」とは、例えば多細胞生物が、その生物の細胞またはその生物の細胞外体液を侵す抗原性物質に対する抗体を産生する機構を包含する。このように産生される抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｍなどの免疫学的クラスに属することができる。他のタイプの応答、例えば細胞性免疫および体液性免疫も含まれる。抗原に対する免疫応答はよく研究されており、広く報告されている。免疫学の概説が非特許文献５に記載されている。免疫学の方法は、定型的かつ慣用的である（例えば非特許文献６を参照されたい）。
【００６５】
一態様では、本発明は、ワクチン（生物の免疫系を刺激し、それによって将来の害に対する保護を提供するために使用される作用物質）に関する。例えばインフルエンザワクチンは、インフルエンザによる感染に対して、限界はあるが少なくともある程度まで患者を保護することができる、すなわち、インフルエンザワクチンは、インフルエンザウイルスの感染によって生じる症状の少なくとも一部を改善する。本発明のワクチン組成物は、例えばタンパク質（例えばサブユニットワクチン中のタンパク質）、ウイルス粒子、または対象となる抗原をコードするＤＮＡの形態をとることができる。
【００６６】
実施例２に、不活化インフルエンザウイルス粒子を含む本発明の噴霧凍結乾燥（ＳＦＤ）組成物の調製を示す。この実施例は、特定のインフルエンザウイルス株の使用を示す。他のインフルエンザ株を使用することもできることを当業者は理解しよう。
【００６７】
大部分の感染因子は体内に入り、粘膜を通してその病態生理学的効果を発揮する。感染に対する保護は、局所的に産生された粘膜ＩｇＡで感染因子を無力化することによって、体内に入る最初の部位で提供することができる。全身性免疫応答は、慣用の免疫経路（ＩＭ、ＩＤなど）によって容易に引き出されるが、粘膜応答は一般に達成するのが相対的に難しい。乾燥粉末ワクチンの鼻腔内（ＩＮ）送達の利点は、全身性免疫応答と粘膜免疫応答との両方を誘発することができることである。さらに、粉末ワクチンのＩＮ送達では、粘膜による粉末薬物の取込みの有効性のため、必要な用量を減らすことができる。
【００６８】
実施例２では、賦形剤を含む噴霧凍結乾燥インフルエンザワクチンの鼻腔内送達が、はるかに大量のワクチンを筋内送達したときと同等の抗体産生を生み出すことを示す。
【００６９】
実施例３では、不活化ＳＦＤインフルエンザ粒子はＩｇＧおよびＩｇＡ応答を引き出すことができ、賦形剤としてキトサンが存在するときにはこれらの応答が増強されることを示す。
【００７０】
実施例４にはインフルエンザの安定性の調査を示す。凍結乾燥プロセスによって粒子の安定性は不利に変化せず、凍結乾燥粒子の摩砕は安定性を劇的に低下させる。
【００７１】
実施例５〜７では、ＤＮＡインフルエンザワクチンの調製および使用を示す。本発明の方法を使用して、ＤＮＡ分子を含むワクチン組成物を調製し、および／または送達することができる。ＤＮＡワクチン、例えばＤＮＡインフルエンザワクチンを設計する方法は、本明細書の他の場所で論じられているとおり当技術分野ではよく知られている。実施例５では、マーカー遺伝子、ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡプラスミドを、液体製剤または本発明の方法に従って調製した乾燥（ＦＤ）製剤の形態でラットの鼻腔内に導入するモデル系を説明する。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は鼻の組織では観察されるが肺組織では観察されない。粉末製剤のＩＮ投与は、液体製剤に匹敵する遺伝子発現レベルを示す。実施例６および７では、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）コード配列を含むＤＮＡワクチンを生成する方法を示し、さらに、ラットに接種するとこのようなワクチンが著しい応答を誘発することを示す。本発明に従って調製され鼻腔内に投与された賦形剤トレハロースを含むＳＦＤ製剤は、同等の量を鼻腔内に導入した液体製剤または同等の量を筋内に導入した製剤よりも強い抗体応答を誘発する。
【００７２】
実施例８では、例えばインフルエンザ血球凝集素をコードするＤＮＡを用いて初回抗原刺激を行い、続いてインフルエンザウイルス粒子を用いて追加免役する免疫レジメンを説明する。このレジメンでは予想外に高い抗体応答が得られる。
【００７３】
他の態様では、本発明が、インスリンを含む呼吸器投与用の本発明の薬剤組成物、この組成物を作る方法、およびこの組成物を使用して患者を治療する方法に関する。インスリンの呼吸器送達には、例えば皮内または皮下注射による投与に優るいくつかの利点があり、これには、患者コンプライアンスの増大、および糖尿病患者が自分で頻繁に注入する必要性の排除が含まれる。本発明のインスリン製剤のいくつかの特性が実施例９および１０に示される。
【００７４】
本明細書の実施例２〜１０では、「ＳＦＤ」法とも呼ばれる噴霧凍結乾燥法によって組成物を調製する。これらの実施例の組成物では、粒子の平均平均粒径が少なくとも約２０μｍである。これらの組成物は、噴霧凍結大気圧乾燥法によって調製した組成物（実施例１、１１および１２）に匹敵し、したがってこの知見は、噴霧凍結大気圧乾燥法によって調製された組成物にも当てはまる。以上の説明および以下の実施例では、すべての温度が補正なしのセ氏温度で記載されており、特に明記しない限り、全ての部およびパーセントは重量による。
【実施例】
【００７５】
（実施例１）
１ａ）本発明の噴霧凍結大気圧乾燥薬剤組成物を調製するための方法および装置
様々な装置の任意のものを使用して、本発明の薬剤組成物を生成することができる。図１を参照すると、本発明に従って使用することができる噴霧凍結大気圧乾燥装置が１０として示されている。活性薬剤成分（ＡＰＩ）、例えば呼吸器系への投与に適した薬剤成分を生成する方法の一例を以下に示す。給液ライン１２が霧化噴霧ノズル１４に流体接続されている。給液多院の中には、後に詳細に説明するようにＡＰＩと適当な液体の混合物が入っている。噴霧ノズル１４は、噴霧凍結大気圧乾燥チャンバ１６の中に配置されている。好ましい実施形態では、この混合物を霧化するために、霧化ライン１８（例えば圧縮ガスを使用）が噴霧ノズル１４と連結している。霧化気体には例えば窒素、酸素または空気が含まれる。適当な粒径の霧化粒子を生成するのには慣用の他のタイプのノズルも有効であり、これには、２流体アトマイザ、圧力アトマイザ、超音波ネブライザ、またはより好ましい振動オリフィスエアロゾル発生器（ＶＯＡＧ）が含まれ、これらはそれぞれより均一な粒径分布を生成することが知られている。霧化された液滴の迅速な凍結を促進するため、乾燥チャンバの中に冷液体（例えば窒素）または冷固体（例えばドライアイス）を配置することができる。
【００７６】
１次乾燥段の乾燥チャンバ１６の温度を一般に約−２０℃から−４０℃に維持するために、冷却系２０が乾燥チャンバ１６に冷空気を供給する。乾燥チャンバ１６の温度は、混合物の凝固点よりも十分に低い温度に維持することが好ましい。冷空気は、液体窒素、固体ＣＯ２または同等の冷却剤を利用して凝固点よりも低い温度を生み出す二重化冷却チャンバ２２によって生成される。二重化冷却チャンバ２２は、１つのチャンバ２２を停止する必要がある場合でも冷却系の運転を維持するための柔軟性を提供する。冷空気注入ライン２４は、大気圧凍結空気を冷却系２０から乾燥チャンバ１６へ供給する。冷空気帰還ライン２６は乾燥チャンバ１６から冷空気を受け取り、それを冷却系２０に戻して、乾燥チャンバ１６と冷却チャンバ２２との間の循環を維持する。乾燥チャンバ１６の内部の好ましくはノズル１４と冷空気帰還ライン２６の間にフィルタ２８が配置されている。フィルタ２８は、ＡＰＩの噴霧凍結大気圧乾燥粒子を集める。そこから、将来の医療使用のためのＡＰＩを回収することができる。
【００７７】
乾燥チャンバ１６に注入する冷空気の温度を望ましい温度範囲に維持するために、冷却系２０と乾燥チャンバ１６の間の冷空気注入ライン２４の中に温度コントローラ３０が配置されている。チャンバ１６から漏れ出た残留材料を集め、これによって残留材料が冷却系２０を汚染することを防ぐために、チャンバ１６と冷却系２０間の冷空気排出ライン２６の中に追加のエアフィルタ３２が配置されている。保守または他の運転上の処置のために乾燥チャンバ１６を封鎖するため、冷空気注入ラインおよび冷空気排出ライン２４、２６の中には、温度コントローラ３０と追加のフィルタ３２の間に弁３４が配置されている。
【００７８】
冷却系２０およびチャンバ１６に冷却空気を循環させるため、追加のエアフィルタ３２と冷却系２０の間の冷空気排出ライン２６の中に、ポンプまたはブロワ３６が配置されている。それぞれの冷却チャンバ２２の入口４０および出口４２のところには入口および出口弁３８が配置されており、これによってそれぞれの冷却チャンバ２２を、保守または他の運転上の処置のために冷空気循環ライン２４、２６から個々に遮断することができる。さらに、チャンバ１６を冷却系２０から遮断したときに冷却系２０の中で冷却空気を循環させることができるように、冷空気注入ライン２４と冷空気排出ライン２６の間に流体接続されたバイパス弁ライン４６の中にバイパス弁４４が配置されている。
【００７９】
噴霧ノズル１４はチャンバ１６の中に置かれているので、運転中のノズル１４の温度は、噴霧ノズル１４に供給されている混合物の凝固点よりも低い。したがって噴霧弁１４は凍結し、チャンバ１６の中で混合物が適当に霧化されることが妨げられる傾向がある。したがって、弁の温度を混合物の凝固点よりも高い温度に維持するために、弁１４には加熱テープ４８が機能可能に接続されている。当業者に知られているであろうように、噴霧ノズル１４の温度を混合物の凝固点よりも高い温度に維持する慣用の方法を使用することもできる。
【００８０】
運転時には、噴霧ノズルを通して霧化されたＡＰＩをチャンバ１６に導入し、同時に冷却系２０からチャンバ１６に冷空気を導入することによって霧化したＡＰＩを急速に凍結させる。チャンバ１６の中を循環している空気が、凍結粒子を流動化した状態に維持することが好ましい。粒子は流動状態に維持され、さらにフィルタ２８に集められ、その間に、循環している冷却空気がこれらの粒子を乾燥させる。これは、チャンバ１６の中で凍結し、今や固体となった粒子の中に捕捉される可能性がある液体を除去することによって実施される。冷却空気を継続的に循環させることによって、それぞれの粒子の中の水分は無視できる量まで低減する。１次乾燥が完了したら、２次乾燥を容易にし、試料取り出し中の結露を低減するために、任意選択で循環気体の温度を室温まで徐々に上昇させることができる。
【００８１】
噴霧ノズル１４は霧化された混合物を、チャンバ１６の中の注入冷却ライン２４に向かって導くことが好ましい。しかし、噴霧ノズル１４は、排出冷却管路２６の方へ向け、またはこの噴霧凍結大気圧乾燥プロセスを最適化するのに必要な乾燥チャンバ１６の別の方向へ向けることもできることを理解されたい。さらに、噴霧ノズル１４を選択して、所与のＡＰＩおよび送達方法にとって望ましい様々な粒径の霧化粒子を生じさせることができる。
【００８２】
あるいは、任意選択で、凍結、乾燥させた粒子をフィルタ２８から取り出し、減圧で動作する凍結乾燥器または別の適当な装置に導入し、そこで残留水分を除去し、粒子を完全に乾燥させる。当技術分野で知られているとおり、凍結乾燥器では水は固相から気相へ直接に変化するので、凍結乾燥器では粒子は脱水されるが、凍結した状態に維持される。
【００８３】
この噴霧凍結大気圧乾燥プロセスに噴霧工程が含まれることによって、大気圧とほぼ同じ圧力で溶液を処理して乾燥微粒子物質にすることができる。大気圧とほぼ同じ圧力で噴霧凍結物質を処理すると、容易にエアロゾル化する患者への投与に適したＡＰＩが得られる。さらに、本発明が教示する方法は、適当なＡＰＩを生成する経済的な商業化手段を提供する。
【００８４】
１ｂ）内部装備を備えた振動流動床を使用して本発明の噴霧凍結大気圧乾燥薬剤組成物を調製するための方法および装置
図１Ａに示した装置の別形態を図１Ｂに示す。この別形態は、振動手段（４９）および特殊な内部装備（５０）を備えている。この振動手段と内部装備は、大気圧とほぼ同じ圧力の乾燥した冷空気流の中で凍結固体粒子が昇華によって乾燥するときに、凍結固体粒子が流動状態を達成することを可能にする。これは、凍結粒子が粘着性または凝集性であるときに特に有用であり、粉末ケーキ形成プロセスにおいて、粘着性の凍結粉末を流動化し、エラトリエーションするときに有益である。
【００８５】
生成物の収率を増大させるため、完全に密封された系を設計して凍結粉末が漏れないようにすることができる。フィルタディスク、濾紙ディスクまたは濾紙を使用して、下の流動床からエラトリエーションした粉末を捕捉することができる。粘着性の凍結粉末を流動化し、エラトリエーションするときには、振動、インターバル、機械的攪拌またはこれらの組合せが有用である。昇華が進むにつれて、凍結粒子は多孔質となり（より軽くなり）、空気力学的挙動が変化する。部分的に乾燥した粒子が、出口のディスクフィルタに密でないケーキを形成する可能性があり、そこから、残った水分を、例えば乾燥した冷気体流を使用した大気圧とほぼ同じ圧力での昇華によって除去することができる。
【００８６】
実施例１ａの方法と同様に、噴霧ノズルを通して霧化されたＡＰＩをチャンバ１６に導入し、同時に冷却系２４からチャンバ１６に冷空気を導入することによって霧化したＡＰＩを急速に凍結させる（図１Ｂ参照）。運転中は、振動器４９を、最適化された周波数（０〜１００Ｈｚ）および振幅で作動させる。冷却ライン２４からチャンバ１６の底を通してチャンバ１６に入った乾燥冷流動化気体が凍結粒子を流動化させる。振動ならびにチャンバ１６の中に位置する特殊な内部装備（静止ブレード）５０の補助によって、大径の凝集粒子塊は破壊される。このような運転条件では、凝集性の粉末では普通に起こるチャネリングが低減され、または完全に排除される。ほとんどの場合、小さな凍結粒子は容易にエラトリエーションされ、流動化気体によってフィルタ２８に運ばれる。この流動化／エラトリエーションプロセスでは、フィルタ２８上に粉末ケーキが徐々に蓄積する。
【００８７】
先に説明したものなどの粒子密封系の使用によって、大きな流量が使用可能であり、粉末ケーキ形成プロセスでは乾燥速度を速めるために大きな流量が推奨される。大流量の固定床状態での凍結粉末の乾燥速度は小流量流動床状態でのそれよりもずっと速いので、大流量は乾燥プロセスでも使用される。振動および／または内部装備を用いる本発明の大気圧噴霧凍結乾燥は、乾燥粒子を生成し収率を増大させる経済的に実現可能な方法を提供する。
【００８８】
あるいは、より速い乾燥速度が予想される場合には、このような乾燥プロセスにおいて高速または循環流動床を使用することもできる。高速または循環流動床は通常、下部の高密度流動床、上部の希薄流動床、および粉末戻し系からなる。このようなプロセスでは、冷流動化空気によって凍結粒子が流動化および運搬され、上部のサイクロンによって集められ、次いで、特別に設計された粉末弁を通して高密度流動床に戻される。冷却を容易にするため、内部サイクロンが好ましく、ある抵抗を有するように特別に設計された帰還粉末弁は、粉末だけを下方へ移動させ、流動化空気は通さない。粒子の凝集をバラバラにし、粒子の循環を向上させるため、同様の内部装備を使用することも好ましい。
【００８９】
あるいはまた、任意選択で、凍結、乾燥させた粒子をフィルタから取り出し、減圧で動作する凍結乾燥器または別の適当な装置に導入し、そこで残留水分を除去し、粒子を完全に乾燥させる。当技術分野で知られているとおり、凍結乾燥器では水分は固相から気相へ直接に変化するので、凍結乾燥器では粒子は脱水されるが、凍結した状態に維持される。
【００９０】
振動および／または内部装備を用いる本発明の大気圧噴霧凍結乾燥は、乾燥粒子を生成し収率を増大させる経済的に実現可能な方法を提供する。
【００９１】
（実施例２）  不活化インフルエンザウイルス粒子の鼻送達
不活化された完全インフルエンザウイルスA/PR/9/34H1N1粒子全体の乾燥粉末製剤を、噴霧凍結乾燥バッチプロセスで調製した。インフルエンザウイルス製剤を水性溶液に混合し、次いでこれを、BD AccuSprayノズルを用いて霧化した。ノズルの先端から約２インチ（５．０８ｃｍ）の位置で測定するSympatech回折計を用いて液体粒子の粒径データを得た。これらの濃度で生成された粒子のメジアン粒径は約５０ミクロンであった。BD AccuSprayノズルによって生成される典型的な粒径分布を図４に示す。Virtis凍結乾燥フラスコに液体窒素を入れ、このフラスコを噴霧ノズルの下に置いた。ノズルと液体窒素の距離は約３インチ（７．６２ｃｍ）であった。霧化された液滴は、液体窒素と接触すると即座に凍結した。このフラスコを凍結乾燥器に取り付け、直ちに過剰な液体窒素を蒸発させた。凍結したエアロゾルは典型的には４８時間以内に乾燥し、約１重量％未満の水分レベルに達した。
【００９２】
１つの実験において、インフルエンザワクチンの様々な製剤の鼻腔内（ＩＮ）または筋内（ＩＭ）送達後の免疫応答の強さを判定する試験を実施した。この調査はラットで実施し、以下の群を評価した。
【００９３】
【表１】
2005518430.tif 000002
【００９４】
ラットは、第０週、第３週および第６週の３回、免疫した。第３週、第５週および第８週に血清試料を採取し、第８週に鼻洗浄液を採取した。
【００９５】
それぞれのインフルエンザワクチン送達に続いて、インフルエンザワクチンに対する免疫応答の大きさを判定するために血液試料を採取した。免疫応答の大きさは、インフルエンザワクチンに対する抗体（Ａｂ）応答によって測定した。それぞれのワクチン接種時に送達された粉末の量も求めた。慣用の方法を使用して、免疫応答の効力、送達された粉末の量などの因子を求めた。図２に、それぞれの免疫後の血清Ａｂ力価を示す。まとめると、ＩＭ送達後の血清Ａｂ力価は、鼻腔内送達による血清抗体力価よりも累積的に高かったが、噴霧凍結乾燥インフルエンザワクチンのＩＮ送達は、低いワクチン送達量にもかかわらず（２次免疫で０〜１０％）、匹敵するレベルの血清Ａｂ応答に到達することができた。まとめると、ワクチン量が十分であれば、噴霧凍結乾燥インフルエンザワクチンのＩＮ送達は、ＩＭ群のそれに匹敵する血清Ａｂ応答レベル、およびＩＮ液体群の血清Ａｂ応答レベルよりも良好な応答を誘発することができることをこの実験は示唆している。
【００９６】
表１に示すとおり、ＩＮインフルエンザワクチン接種群はすべて、陽性の鼻ＩｇＡ応答を引き出すことができ、それに対して、ＩＭ注入後およびＩＮ負対照の鼻ＩｇＡ力価は陰性である。この調査は、ＳＦＤインフルエンザワクチンのＩＮ送達が、鼻粘膜応答と全身性免疫応答の両方を引き出すことができることを示している。
【００９７】
【表２】
2005518430.tif 000003
【００９８】
（実施例３）  キトサンを含み／含まないＳＦＤインフルエンザワクチンのＩＮ送達後の血清免疫応答および鼻粘膜免疫応答の比較
この用量変動実施例では、ＳＦＤの完全インフルエンザウイルスのＩＮ送達後のBrown Norwayラットの免疫応答を、キトサンを用いた場合と用いない場合とで比較する。ラットを４匹ずつ含む以下の群を評価した。
【００９９】
【表３】
2005518430.tif 000004
【０１００】
この実施例では、不活化された完全インフルエンザウイルス株A/PR/8/34H1N1全体を使用した。ラットを３回、ＩＮ投与で免疫した。その結果は、図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、インフルエンザワクチン１０μｇ用量は、１μｇ用量よりも強い血清Ｉｇおよび鼻ＩｇＡ応答を誘発し、キトサンを含む製剤は、キトサンを含まない製剤よりも強い血清Ａｂ応答を誘発することを指示している。
【０１０１】
（実施例４）  インフルエンザ活性の調査
一連の実験および摩砕プロセスは、インフルエンザワクチンの活性に影響を及ぼす。この調査では、血球凝集素アッセイ（ＨＡ）をインフルエンザ活性の指標として採用した。このアッセイは、インフルエンザワクチンのＨＡ力価を、インフルエンザワクチンの効力の指標であるニワトリの赤血球を凝集させるインフルエンザウイルスの能力に基づいて試験するものである。これを簡単に説明する。不活化インフルエンザウイルス粒子の粉末試料を２つ調製した。第１の試料を凍結乾燥し、第２の試料凍結乾燥後に摩砕した。摩砕試料は、Wig-L-Bugボールマイクロミルを使用して摩砕した。このミルは、エンドキャップを有する１インチ（２．５４ｃｍ）ステンレス鋼バイアルを使用する。摩砕試料は、１つのステンレス鋼ボールベアリングと一緒にバイアルに入れ、ミルの所定の位置に固定する。このバイアルを、可変速度で所定の時間にわたって、端から端まで振動させる。摩砕後、小スパチュラを使用して試料を取り出す。凍結乾燥し摩砕したインフルエンザ粉末を水で還元して、総タンパク質濃度に基づいて元の液体インフルエンザワクチン濃度に戻した。元の状態に戻したインフルエンザワクチンの活性を、そのＨＡ力価を当初のインフルエンザワクチンのそれと比較することによって判定した。結果を以下に示す。
【０１０２】
【表４】
2005518430.tif 000005
【０１０３】
これらのデータは、ＨＡ力価に関して、凍結乾燥プロセスがワクチン活性に実質的に影響を及ぼさないことを指示している。しかし、摩砕プロセスはＨＡ力価を劇的に低下させた。同じＨＡ力価調査を使用して、ＳＦＤ法がインフルエンザワクチンの活性に影響を及ぼすかどうかを評価した。ＳＦＤ法によって作られたインフルエンザ粉末を水で還元し、総タンパク質濃度に基づいて元の液体インフルエンザワクチン濃度に戻した。元の状態に戻したインフルエンザワクチンの活性を、そのＨＡ力価を元のインフルエンザワクチンのそれと比較することによって判定した。
【０１０４】
その結果は、ＳＦＤ法が、インフルエンザワクチン活性に不利な影響を及ぼさなかったこと、およびワクチン活性を完全に保持した、直ぐに投与できる自由に流動するインフルエンザワクチン粉末を、追加の摩砕操作なしで調製できることを示している。
【０１０５】
（実施例５）  ルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（「裸のＤＮＡ」）のＩＮ送達
有効な遺伝子治療およびＤＮＡベースの免疫感作は、送達された遺伝子からのタンパク質発現を必要とする。そのため、このような治療の実現可能性を判定するための予備的なモデルとして、リポータ遺伝子系が一般に使用される。この調査では、様々なＤＮＡ用量および製剤をＩＮ送達した後のルシフェラーゼ活性を評価した。
【０１０６】
Ａ．液体製剤
その中にホタルルシフェラーゼをコードする配列がＣＭＶプロモーターの制御下に置かれているプラスミド（ｐＣＭＶ−ＬＵＣ）を使用した。ｐＣＭＶ−ＬＵＣは、Aldevron LLC (3233 15th St.South、Fargo、ND、58104)から入手した。液体製剤を調製し、ＰＢＳ５０μｌ中の用量５０μｇまたは１００μｇをBrown NorwayラットにＩＮ送達した。ＤＮＡ送達後２４時間して鼻および肺の組織を採取し、ホモジナイズし、ルミネセンスアッセイを使用してルシフェラーゼ活性を試験した。
【０１０７】
図５によれば、ルシフェラーゼ活性は鼻の組織では検出されたが、肺組織では検出されなかった。ＤＮＡ１００μｇのＩＮ送達は、ＤＮＡ５０μｇのＩＮ送達よりも高いルシフェラーゼ活性を示した。
【０１０８】
Ｂ．液体製剤と乾燥粉末製剤の比較
ｐＣＭＶ−ＬＵＣの液体製剤は上記のとおりに調製した。賦形剤としてトレハロースを使用して、実施例４に記載したとおりの凍結乾燥および摩砕によって、乾燥粉末（ＦＤ）製剤を調製した。いくつかの製剤にはキトサン賦形剤も存在した。液体製剤のＰＢＳ５０μｌ中の用量１００μｇ、または粉末製剤の粉末５ｍｇ中の用量１００μｇをラットに投与し、試料を上記と同様に分析した。
【０１０９】
図６によれば、乾燥粉末製剤および液体製剤はともに、鼻の組織で高いルシフェラーゼ活性を示したが、肺組織では示さなかった。乾燥粉末のＩＮ送達は、液体製剤で得られるレベルに匹敵するレベルのルシフェラーゼ活性を示す。この結果は、ＳＦＤ粉末の形態でＤＮＡを送達することの実現可能性を指示するものである。
【０１１０】
（実施例６）  ＤＮＡインフルエンザワクチン
インフルエンザウイルス表面抗原血球凝集素をコードするＤＮＡ配列を、ＣＭＶ初期プロモーターのＣＭＶＰｒｏ配列の制御の下に含むプラスミドを、慣用の組換え技法を使用して調製した（非特許文献７）。このプラスミド（ｐＦＬＵ−ＨＡ）を慣用の技法によって精製し、いくつかの方法、すなわち筋内（ＩＭ）、鼻腔内／液体製剤（ＩＮ−液体）、および賦形剤トレハロースを含む鼻腔内／ＳＦＤ（ＩＮ−ＳＦＤ−トレハロース）によってラットに接種した。血清Ａｂ応答を測定した。図３に示すとおり、ＳＦＤインフルエンザワクチンのＩＮ送達は、少なくともＩＭ注入のそれに匹敵する血清Ａｂ応答を引き出し、ＩＮ液体送達のそれよりも高い応答を引き出す。この調査では、ＩＮ  ＳＦＤインフルエンザワクチン接種が従来のＩＭ注入よりも優れた利点を示した。
【０１１１】
（実施例７）  ＤＮＡインフルエンザワクチンを用いた免疫
上記のＩＮ  ＤＮＡ粉末送達の予備的な結果に基づいて、より大規模な調査を実施して、様々なＤＮＡワクチン製剤投与後の免疫応答を比較した。ｐＦＬＵ−ＨＡプラスミドを、任意選択でトレハロース／キトサンを含む液体製剤（ＰＢＳ）または乾燥粉末製剤として調製した。ＦＤ（標準凍結乾燥製剤）とＳＦＤ（噴霧凍結乾燥製剤）の２つのタイプの乾燥製剤を使用した。第０日、第２１日および第４２日において、Brown Norwayラットに、それぞれの乾燥製剤のプラスミドＤＮＡ５０μｇを鼻腔内（ＩＮ）投与し、これに相当する量の液体製剤を筋内（ＩＭ）またはＩＮ投与した。血清試料を第２１日、第３５日および第５６日に採取し、鼻洗浄液を第５６日に採取した。
【０１１２】
図７によれば、粉末製剤のＩＮ投与後の血清抗体力価はＩＭ注入に匹敵し、液体製剤のＩＮ投与よりも強かった。ＩＮ  ＳＦＤ／キトサン製剤は免疫の初期に最も強いＡｂ応答を誘発する。このことは、ＳＦＤ／キトサン投与によって、ワクチン接種量および／または投与頻度を減らすことができる可能性を示唆している。
【０１１３】
第２表は、ＩＮ  ＳＦＤ  ＤＮＡ送達した複数の群の数匹を除きすべての実験群で鼻ＩｇＡ応答が見られないことを示している。
【０１１４】
【表５】
2005518430.tif 000006
【０１１５】
この調査の結果は全体として、動物モデルでより良好な血清および鼻粘膜免疫応答を誘発するＳＦＤ／キトサンＤＮＡ製剤の潜在的な有利性を示している。
【０１１６】
（実施例８）  インフルエンザＤＮＡ初回抗原刺激＋ウイルス追加免疫レジメン
ＨＩＶを含む数多くの病気に対して最近開発されたワクチン接種法に、最初の「処刑抗原刺激」と第２の「追加免疫」とで異なるワクチンクラスを使用するいわゆる「プライム−ブースト（prime-boost）」法がある（非特許文献８）。例えば、ワクチンのプラスミドＤＮＡバージョンで初回抗原刺激し、次いでサブユニットタンパク質、不活化ウイルスまたはベクター化ＤＮＡ製剤で追加免役する。この調査ではこのレジメンを採用して、異なる免疫経路および異なる組合せの免疫経路を通して様々な製剤を送達したときの免疫応答の効力を調べた。
【０１１７】
ｐＦＬＵ−ＨＡプラスミドを、実施例５に記載したとおりに液体製剤または乾燥製剤（ＦＤ、ＦＤ−トレハロース／キトサン、ＳＦＤ、ＳＦＤ−トレハロース／キトサン製剤）として調製した。これらの製剤を、免疫番号１および２（初期免疫）に対して使用した。
【０１１８】
免疫番号３（追加免疫）に対しては、不活化インフルエンザを、ＰＢＳ（液体）またはトレハロース／キトサン（乾燥粉末）製剤として調製した。それぞれの群を２つの下位群に分け、その一方をＩＭ液体インフルエンザウイルス免疫にかけ、もう一方を様々な製剤のＩＮインフルエンザウイルス免疫にかけた。
【０１１９】
選択した製剤を用いて第０日、第２１日および第４２日にBrown Norwayラットを免疫した。血清試料を第２１日、第３５日および第５６日に採取し、鼻洗浄液、膣洗浄液およびＢＡＬを第５６日に採取した。
【０１２０】
ワクチン接種レジメンおよび観察されたＡｂ応答の概要を第３表Ａから第３表Ｃに示す。それらのデータは以下のことを示している。  
・ＤＮＡ初回抗原刺激＋インフルエンザウイルス追加免疫は、ＤＮＡまたはウイルス単独よりもはるかに強い血清抗インフルエンザＡｂ力価を引き出す。  
・ＩＮ  ＳＦＤ／キトサンＤＮＡ初回抗原刺激＋ＩＭウイルス追加免疫は、ＤＮＡまたはＩＭウイルス単独よりもはるかに強い鼻ＩｇＡ応答を引き出す。  
・ＩＮ  ＳＦＤ／キトサンＤＮＡ初回抗原刺激＋ＩＭウイルス追加免疫は、ＩＮ  ＦＤ／キトサンＤＮＡ初回抗原刺激＋ＩＭウイルス追加免疫よりも強い鼻ＩｇＡ応答を引き出す。  
・ＩＮ  ＳＦＤ／キトサンＤＮＡ初回抗原刺激＋ＩＭウイルス追加免疫は、キトサンを含まない同じ戦略よりも強い鼻ＩｇＡ応答を引き出す。  
・ＩＮ  ＳＦＤ／キトサンＤＮＡ初回抗原刺激＋ＩＭウイルス追加免疫は、ＩＮ液体ＤＮＡ初回抗原刺激＋ＩＭウイルス追加免疫よりも強い鼻ＩｇＡ応答を引き出す。  
・すべての群のＢＡＬ液で陽性のＩｇＡおよび総Ｉｇ力価が検出された。
【０１２１】
第３表（下記）は、インフルエンザＤＮＡ初回抗原刺激＋ウイルス追加免疫を用いた試験を示す。第３表Ａは、インフルエンザＤＮＡ初回抗原刺激および追加免疫試験の１回めの採血の血清総Ｉｇ力価（第２１日）を示す。第３表Ｂは、インフルエンザＤＮＡ１次免疫および追加免疫試験の２回めの採血の血清Ｉｇ力価（第３５日）を示す。第３表Ｃは、インフルエンザＤＮＡ初回抗原刺激および追加免疫試験の３回めの血清総Ｉｇ力価（第５６日）を示す。第３表Ｄは、インフルエンザＤＮＡ初回抗原刺激および追加免疫試験の鼻ＩｇＡ力価（第５６日）を示す。第３表Ｅは、インフルエンザＤＮＡ初回抗原刺激および追加免疫試験の膣ＩｇＡ力価（第５６日）を示す。第３表Ｆは、インフルエンザＤＮＡ初回抗原刺激および追加免疫試験のＢＡＬ  ＩｇＡ力価（第５６日）を示す。第３表Ｇは、インフルエンザＤＮＡ初回抗原刺激および追加免疫試験のＢＡＬ総Ｉｇ力価（第５６日）を示す。
【０１２２】
第３表Ａから第３表Ｃに示すとおり、この調査の粉末群は一般に、液体群よりも強い血清Ａｂ力価を誘発する。さらに、ＤＮＡ免疫単独も、またはＩＭウイルス免疫単独も陽性の鼻ＩｇＡ応答を引き出さないことから、ＳＦＤ／キトサン１次免疫＋ＩＭ追加免疫後の強い鼻ＩｇＡ応答（表３Ｄ、群５ａ）は予期しなかったものである。ＩＮ  ＳＦＤ  ＤＮＡ／キトサン初回抗原刺激＋ＩＭ追加免疫は、ＩＮ  ＤＮＡまたはＩＭウイルス単独よりも良好な免疫応答を誘発する。
【０１２３】
【表６】
2005518430.tif 000007
【０１２４】
【表７】
2005518430.tif 000008
【０１２５】
【表８】
2005518430.tif 000009
【０１２６】
【表９】
2005518430.tif 000010
【０１２７】
【表１０】
2005518430.tif 000011
【０１２８】
【表１１】
2005518430.tif 000012
【０１２９】
【表１２】
2005518430.tif 000013
【０１３０】
（実施例９）  ＳＤおよびＳＦＤによるインスリンおよびインスリン／賦形剤
第４表には、ラクトース賦形剤と組み合わせた噴霧乾燥インスリン組成物および噴霧凍結乾燥インスリン組成物の実験によって決定された物理特性がまとめられている。これらの組成物の形成の間、霧化器から噴霧されている溶液の出口温度、ならびに粒子の収率（％）およびタップ密度（ｇ／ｃｍ３）も監視した。試料およびデータを下表に示す。
【０１３１】
【表１３】
2005518430.tif 000014
【０１３２】
この表に示されているとおり、噴霧凍結乾燥された本質的に純粋なインスリンおよびインスリン／ラクトースの４０／６０溶液のタップ密度は、噴霧乾燥インスリン粒子および噴霧乾燥インスリン／ラクトース粒子のタップ密度よりも著しく低かった。ＳＦＤ粉末組成物は、噴霧乾燥組成物よりも良好なタンパク質安定性および生体活性を保持していた。対照的に、噴霧乾燥した純粋インスリンおよびインスリン／ラクトース（４０／６０）粉末は著しく高密度であり、０．２９および０．４９ｇ／ｃｍ３のタップ密度を有した。特定の理論に結びつけたいわけではないが、出願人は、これらの利点が生じるのは、噴霧凍結乾燥が、従来の噴霧乾燥よりもはるかに低い温度（およそ１００℃低い温度）で実施されるためであると考えている。
【０１３３】
インスリンの２重量％水溶液およびインスリン／ラクトース（４０／６０）の５重量％溶液を、本発明の噴霧凍結乾燥手順によって処理した。得られた多孔質粒子は、動物の呼吸器系へ送達するのに適したエアロゾル特性を示した。
【０１３４】
出願人の試験によれば、最も小さな空気力学的粒径を示す粒子は、賦形剤を含まないインスリン、すなわち本質的に純粋なインスリンからなる噴霧凍結乾燥法を用いて得られることが指示された。しかし、インスリンと賦形剤とからなる製剤が呼吸器系に投与する目的に適していることは、本発明の範囲に含まれると理解される。さらに、ＳＦＤインスリン粒子（図１９）は、噴霧乾燥インスリン／ラクトース粒子に比べて、周囲条件（２０℃、相対湿度５３％）に１５分間暴露したとき、および保管中に、検出可能な水和を事実上示さなかった。対照的に、図２０は、同じ周囲条件に１５分間暴露した後のＳＦＤインスリン／ラクトース粒子の形態を示す。一般に、ＳＦＤインスリン／ラクトース粒子は、＞５０％の相対湿度に暴露すると少なくとも２から５重量％の水分を吸収する。これらの結果は、本発明の方法によって生成されたＳＦＤ多孔質インスリンが、ＳＦＤ多孔質インスリン／ラクトースに比べて、周囲の水分に対する相対的に高い抵抗性を持つことを指示している。
【０１３５】
本発明で教示される方法によって提供される他の望ましい属性は、使用後に送達装置に残る残留粉末の大幅な低減である。特定の送達装置から受け入れられた用量（パーセント）は重量測定によって計算される。例えば、特許文献５および特許文献６に開示されている装置などの送達装置とともに使用したとき、本発明の方法に従って調製されたＡＰＩでは、送達装置に５％未満の残留パワーしか残らなかった。それに比べて、噴霧乾燥粉末では同じ送達装置で約２０重量％の粉末が残留した。さらに、ＳＦＤ粉末のエアロゾル化が効率的であることが視角的に観察され、呼吸器送達装置には残留粉末が実質上残らなかった。ＳＤ粉末（左下のカプセル）およびＳＦＤ粉末（右上のカプセル）を含むこの装置からの薬物担体カプセルのカプセル膜を破った後の写真が図２１に示されている。この図はＳＦＤ粉末の優れたエアロゾル特性を明らかに示している。
【０１３６】
（実施例１０）  ＳＦＤインスリン粉末と液体インスリンの安定性
ＳＦＤインスリンの安定性を、今日広く投与されている標準液体インスリンであるU500 Liquid Lilly Humulin-R／ｍ−クレゾールに対して評価した。ＳＦＤ純粋インスリンおよびインスリン／トレハロースを、４０℃、相対湿度７５％で８週間試験した。アルミニウムの上包の中に密封した純粋インスリンも同様に試験した。液体インスリンは、２５℃（室温）、相対湿度６０％で試験した。それぞれの試料の安定性を判定するために、試料に対するデスアミド（Desamido）形成のパーセントを測定した。デスアミドの形成パーセントは、開始時、第１週、第２週、第４週、第６週および第８週に判定した。
【０１３７】
デスアミドは、患者にインスリンに対する免疫を生じさせることによって糖尿病患者に悪い影響を及ぼすことが知られている。ＦＤＡ（米国食品医薬品局）は、インスリン中のデスアミドの含有量を１０％未満に制限することとしている。
【０１３８】
この８週にわたる評価を通じてＳＦＤ純粋インスリンは非常に安定であることが証明された。ＳＦＤ純粋インスリンの結果は以下のとおりである。
【０１３９】
【表１４】
2005518430.tif 000015
【０１４０】
アルミニウムで包んだＳＦＤ純粋インスリン試料は、８週間の試験期間を通して化学的安定性を示した。６週めの評価までデスアミドの検出量は統計誤差を下回り、無視できると考えられた。デスアミドの検出量は、第６週の評価で０．７５％のピークに達した。アルミニウムで包んだＳＦＤ純粋インスリンの結果は以下のとおりである。
【０１４１】
【表１５】
2005518430.tif 000016
【０１４２】
トレハロース賦形剤を含むＳＦＤインスリンを評価した。このケースでは、第６週までデスアミドは検出されなかった。全体に、トレハロースの添加はＳＦＤインスリンの貯蔵寿命を著しく向上させた。結果は以下のとおりである。
【０１４３】
【表１６】
2005518430.tif 000017
【０１４４】
同様に、さらに基準となる液体インスリンを８週にわたって評価して、デスアミドの増加量を決定した。８週間の評価期間にわたって、液体インスリンの安定性は、ＳＦＤインスリンに比べてはるかに劣ることが証明された。実施した週単位の試験に加えて、さらに液体インスリンを２４および７２時間にて評価した。これらの早期の評価ではデスアミドの増加は検出されなかった。この調査の重大な変更点は、ＳＦＤインスリンに比べてずっと過酷でない保管状態で液体インスリンを評価したことである。さらに液体インスリンは、デスアミドの成長を遅らせる化学保存剤ｍ−クレゾールを含んでいた。
【０１４５】
【表１７】
2005518430.tif 000018
【０１４６】
ＳＦＤインスリン試料のそれぞれ、液体インスリンよりも著しく安定であることが証明された。液体インスリンは、ＳＦＤ粉末製剤よりもかなり速く劣化した。４０℃、相対湿度７５％の８週間の試験を通じて、アルミニウムで包んだＳＦＤインスリンは、試験した試料の中で最も安定であることが判明した。これらの結果は、ＳＦＤ粉末インスリンが、現在市販されている液体インスリン製剤よりも遥かに安定であることを指示している。
【０１４７】
図１０に、試験したＳＦＤ純粋インスリンおよび液体インスリンのデスアミドの増加速度を示す。
【０１４８】
（実施例１１）  振動流動床噴霧凍結乾燥
内部装備および振動が存在すると、本明細書の他の場所で説明したように、内部装備および振動の存在下、大気圧とほぼ同じ圧力（減圧なし）で、噴霧凍結乾燥多孔質粒子がうまく生成された。内部装備および振動に助けられた流動化によって、凍結エアロゾルの昇華は増強されることが示された。２０重量％マンニトール溶液（図１１）（すなわち８０重量％が水分）を−２０℃で乾燥させると、４０分未満以内で水分は０．３重量％に達した。これは、特許文献３で得られた結果を上回っている。
【０１４９】
２０重量％マンニトールの含水率および乾燥時間を（乾燥ガス流速の関数として）図１１に示す。この表に示された最も下側の乾燥曲線はＢＤＴで生成されたものであり、残りのデータは文献（特許文献３）から抽出したものである。ＴＧＡの結果を基にすると、気体流速２ｍ／ｓで４０分乾燥した後の残留水分は約０．３％であった。粒子の形態は、図１２に示したＳＥＭによって示されるように多孔質である。２０μｍ未満の噴霧凍結エアロゾルは粒子間の強い凝集力を示し、流動化気体は明らかにベッドを上方へ貫くチャネリングを起こした。内部装備および振動なしで噴霧凍結粉末を０．３９ｍ／ｓ、−２０℃の条件で乾燥させたところ、チャネリングのために、３時間の乾燥後に粉末の９５重量％が流動床の下部に残ることが分かった。流動床のチャネリングの結果、乾燥効率は不十分なものになった。（３時間の乾燥後）粉末のおよそ５重量％が流動床の上部にエラトリエーションされ、これは、流動床の下部から集められた粉末よりもずっと速い速度で乾燥された。エラトリエーションは、気体の空塔速度が粒子／凝集体の終端速度よりも速いときに、流動床からの流動化気体によって微粒子が運搬されるプロセスである。流動床内の乾燥気体の流速およびエルトリエーションの効果は、質量輸送分析によって実施例１３で説明される。様々な時点に上部および下部から集められた試料の水分レベルを図１４に示す。噴霧凍結粉末の５％のみが乾燥床の上部にエラトリエーションされた。９５％の凍結粉末は下部に残った。この不十分な乾燥効率はチャネリングのせいであった。流動床の上部にエラトリエーションされ（フィルタディスクによって集められ）た粉末を３０分および６０分後にサンプリングした。これらの粉末のＳＥＭ像を図１５および図１６に示す。６０分後に集められた粉末が、３０分後に集められた粉末よりも乾燥しているようには見えなかった。新たにエラトリエーションされた部分的に乾燥した粉末をより乾燥した粉末と混合すると、試料を取り出した後にこれらの粒子を凝集させた。内部装備および振動の補助を用いると、すべての粉末が流動床の上部にエラトリエーションされて均一なケーキを形成し、これによってチャネリングが排除され、効率的な乾燥が得られた。図１７に示すように、高い乾燥気体流速２ｍ／ｓで、２０重量％マンニトールは、低い乾燥気体流速０．３９ｍ／ｓよりもずっと速い速度で乾燥して多孔質粉末（残留水分０．３重量％）となった。この図は、振動流動床ＳＦＤプロセスの昇華時間に対する流量の効果を示している。振動および内部装備を用いると、すべての粉末が乾燥床の上部にエラトリエーションされた。高い流量では乾燥時間が短縮され、したがって効率が高まった。
【０１５０】
（実施例１２）  流動床および固定床乾燥器内の乾燥プロセスの物質移動分析
２０μｍ粒子の終端沈降速度は約０．０１２ｍ／ｓ（速度＝ρｐｄｐ２ｇ／１８μ）であり、これは、単一の凍結粒子のエラトリエーションが起こったときに対応する。このような低気体流量（低レイノルズ数）での質量輸送係数は非常に小さい。気固系流動床では、質量輸送係数ｋをレイノルズ数と関連づける下記の経験式が確立されている（非特許文献９）。
【０１５１】
Ｓｈ＝０．３７Ｒｅ１．８    ０．１＜Ｒｅ＜１５
【０１５２】
上式で、Ｓｈはヌッセルト数（＝ｋｄｐ／Ｄ）、ｋは質量輸送係数、Ｄは拡散係数、ｄｐは粒径）、Ｒｅはレイノルズ数（＝ρｇｕｄｐ／μ）である。
【０１５３】
粒子凝集体の粒径ｄａが２００μｍ、窒素の密度が１．２９ｋｇ／ｍ３、窒素流体の粘度が１．８１×１０−５ｋｇ／ｍ／ｓ（Ｐａ・ｓ）、流体速度が０．０１２ｍ／ｓ（単一の２０μｍ粒子の終端速度。単一の粒子の終端速度よりも速い流動化気体流速で、流動床での凝集体の衝突および摩滅から得られる単粒子は運び去られ、またはエラトリエーションされる）、（Ｒｅ＝０．１７１）の場合、Ｓｈは１．５４×１０−２である。
【０１５４】
０．０１２ｍ／ｓを超える乾燥気体流速で、粒子（２０μｍ以下）は流動床から外へエラトリエーションされ、該粒子をフィルタまたはサイクロンによって集める必要がある。特許文献３およびＢＤＴによる操作は、粒子の終端速度をはるかに超えており、冷乾燥気体流が凍結粉末を連続的に乾燥させるにつれて、フィルタディスクが粉末を集める。実際、湿った凍結粉末はエラトリエーションされ、流動床の上部出口に均一なケーキを形成する。乾燥気体が高速で流れているとき、この乾燥プロセスは固定床乾燥器のそれと同様となる。また固定床の質量輸送は、非特許文献１０によって提案されている下記の経験式から計算することができる。
【０１５５】
【数１】
2005518430.tif 000019
【０１５６】
上式で、Ｓｃはプラントル数（＝μ／ρｇＤ）である。高いＲｅで、例えば粒径が２０μｍ、窒素密度が１．２９ｋｇ／ｍ２、窒素流体の粘度が１．８１×１０−５ｋｇ／ｍ／ｓ、流体速度が２．０ｍ／ｓ（発明者の実験では６０リットル毎分、窒素の圧力４０ｐｓｉ）の場合、Ｓｈは４．７と計算される。低Ｒｅの流動床と高Ｒｅの固定床の気体と固体の間の質量輸送を比較すると、この２つの状況の物質移動の比は約１：３００である。
【０１５７】
一連の実験では、５重量％ＰＥＧ溶液（水分９５％）を乾燥させる乾燥窒素の流速が０．０３ｍ／ｓであった。この流量では、一部の粉末がエラトリエーションされ（濾紙によって集められ）た。しかし、濾紙上に「粉末」は観察されなかった。これらの凍結粒子はまだ完全には乾燥されておらず、濾紙の表面に堆積する際に解凍してしまったためである。４時間後に（真に流動化された）ベッドの下部に集められた流動化凍結試料は依然として９３％の水分を含んでいた。この観察は、低速の流動化は不十分な質量輸送（乾燥）速度を生じさせるという発明者のプラントル数分析を支持している。
【０１５８】
以上の記述から、当業者は、本発明の必須の特性を容易に確認することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に本発明を適合させるための本発明の変更および修正を実施することができる。
【０１５９】
当業者なら、さらなる詳細なしに、以上の記述を使用して、本発明をその最も完全な程度に利用ができるものと信じる。したがって、以上の好ましい特定の実施形態は、単に例示を目的としたものとの解釈すべきであり、いかなる意味においても本明細書の残りの開示を制限するものではない。
【０１６０】
以上の説明および図面中に引用したすべての特許出願、特許および文献の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１Ａ】本発明の噴霧凍結大気圧乾燥装置の概略図である。
【図１Ｂ】振動および内部装備を備えた噴霧凍結乾燥構成の概略図である。
【表１８】
2005518430.tif 000020
【図２】様々なインフルエンザワクチン製剤のＩＮ送達後の血清抗体（Ａｂ）応答を示す図である。
【表１９】
2005518430.tif 000021
【図３】ｐＦＬＵ−ＨＡを用いた免疫後の血清Ａｂ応答ラットを示す図である。
【表２０】
2005518430.tif 000022
【図４】レーザー回折によって測定された、accusprayノズルによって生成された粒径分布液体ウイルス粒子を示す図である。
【図５】ＩＮ液体ｐＣＭＶ−ＬＵＣ送達後のルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す図である。
【図６】ＩＮ  ｐＣＭＶ−ＬＵＣ送達後のラットのルシフェラーゼ遺伝子の発現を示す図である。
【図７】ｐＦＬＵ−ＨＡ免疫後の血清Ａｂ力価を示す図である。
【表２１】
2005518430.tif 000023
【図８】accusprayノズルを通して噴霧し凍結乾燥によって乾燥させたＳＦＤインスリンの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。
【図９】図９に示したＳＦＤインスリンのより高い倍率の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である。
【図１０】ＳＦＤおよび液体インスリン試料で検出された安定性の尺度であるデスアミド（化学的劣化）を示す図である。
【表２２】
2005518430.tif 000024
【図１１】凍結乾燥大気圧法によって生成された組成物の水分および乾燥時間を示す図である。
【表２３】
2005518430.tif 000025
【図１２】噴霧凍結大気圧乾燥プロセスによって生成されたマンニトール粉末のＳＥＭ像である。
【図１３Ａ】キトサンを用いた場合と用いない場合のＳＦＤインフルエンザワクチンのＩＮ送達後の血清免疫応答を比較した図である。
【図１３Ｂ】キトサンを用いた場合と用いない場合のＳＦＤインフルエンザワクチンのＩＮ送達後の鼻粘膜免疫応答を第５６日において比較した図である。
【図１４】振動および内部装備を用いない統合ＳＦＤプロセス（低乾燥気体流速（０．３９ｍ／ｓ）で、流動床の上部および下部から集めた試料の水分レベルを示す図である。
【図１５】流動床の上部から３０分後にサンプリングした粒子のＳＥＭである。
【図１６】流動床の上部から６０分後にサンプリングした粒子のＳＥＭである。
【図１７】２つの異なる気体流速で乾燥させた粉末の多孔性を示す図である。昇華時間に対する流量の効果が示されている（Ｖ−ＦＢ−ＳＦＤ）。
【図１８】Accusprayノズルを通して噴霧凍結させ、凍結乾燥によって乾燥させることによって得たマンニトール粒子の粒径分布を示す図である。粒径分布はレーザー回折によって測定した。
【図１９】ＳＦＤ純粋インスリン粉末の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像である（この粉末は、インスリン／ラクトースよりも高い水分抵抗性を有する）。
【図２０】周囲の水分へ暴露した後のＳＦＤインスリン／ラクトース複合粉末のＳＥＭである。
【図２１】カプセル膜を破った後のＳＤ（噴霧乾燥）およびＳＦＤ（噴霧凍結乾燥）粉末を有するカプセルを示す図である。ＳＦＤ粉末を有するカプセルには目に見えるラクトースは残っていない。
【図１Ａ】
2005518430.tif 000026
【図１Ｂ】
2005518430.tif 000027
【図２】
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【図３】
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【図４】
2005518430.tif 000030
【図５】
2005518430.tif 000031
【図６】
2005518430.tif 000032
【図７】
2005518430.tif 000033
【図８】
2005518430.tif 000034
【図９】
2005518430.tif 000035
【図１０】
2005518430.tif 000036
【図１１】
2005518430.tif 000037
【図１２】
2005518430.tif 000038
【図１３Ａ】
2005518430.tif 000039
【図１３Ｂ】
2005518430.tif 000040
【図１４】
2005518430.tif 000041
【図１５】
2005518430.tif 000042
【図１６】
2005518430.tif 000043
【図１７】
2005518430.tif 000044
【図１８】
2005518430.tif 000045
【図１９】
2005518430.tif 000046
【図２０】
2005518430.tif 000047
【図２１】
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【国際調査報告】
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