(57)【要約】植物プロフィリンまたは機能的に等価なペプチドの多量体は、アレルギーの診断および処置に好ましい形態である。多量体を示す、天然および合成の分子全体またはフラグメントは、１）アレルギーの処置のための脱感作剤として、および２）患者をスクリーニングして、プロフィリンアレルゲン性を決定するために使用される。また、本発明は、（ａ）多量体プロフィリンを含む免疫原性組成物を得る工程；および（ｂ）該組成物の有効用量を、該哺乳動物が脱感作されるまで、増分用量にて連続的に投与する工程、を包含する、哺乳動物を脱感作する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物を脱感作する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）多量体プロフィリンを含む免疫原性組成物を得る工程；および
（ｂ）該組成物の有効用量を、該哺乳動物が脱感作されるまで、増分用量にて連続的に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記多量体プロフィリンが、天然に存在するプロフィリン、合成プロフィリン、または組換え生成されたプロフィリンからなる群より選択される、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記プロフィリンが、ホモ多量体の複合体として存在する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記多量体プロフィリンが、プロフィリンの合成ペプチドフラグメントを含む、方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、前記多量体プロフィリンが、プロフィリン多量体化から生じる新規の配列を有する合成ペプチドフラグメントを含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記多量体プロフィリンが、組換えＤＮＡ技術により作製されるペプチドフラグメントを含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記多量体プロフィリンが、セロリ（Ａｐｉ  ｇ４，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号ＱＰＸＦ３７）、ピーナッツ（Ａｒａ  ｈ５，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｑ９ＳＱ１９）、カバノキ花粉（Ｂｅｔ  ｖ２，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ２５８１６）、バミューダグラス（Ｃｙｎ  ｄｌ２，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ０４７２５）、ダイズ（Ｇｌｙ  ｍ３，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ６５８０９，Ｏ６５８１０）、ヒマワリ（Ｈｅｌ  Ａ２，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ８１９８０）、ラテックス（Ｈｅｖ  ｂ８，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号ＣＡＢ５１９１４、Ｏ６５８１２、Ｑ９ＳＴＢ６、Ｑ９Ｍ７Ｎ０、Ｑ９Ｍ７Ｍ９、Ｑ９Ｍ７Ｍ８、Ｑ９ＬＥ１８）、Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ａｎｎｕａ（Ｍｅｒ  ａ１，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ４９８９４）、オリーブ花粉（Ｏｌｅ  ｅ２，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ１９９６３、Ｏ０２４１７０、Ｏ２４１７１）、チモシーグラス（Ｐｈｌ  ｐ１１，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ３５０７９、Ｏ２４６５０、Ｏ２４２８２）、セイヨウミザクラ（Ｐｒｕ  ａｖ４，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｑ９ＸＦ３９）、西洋ナシ（Ｐｙｒ  ｃ４，Ｑ９ＸＦ２７）、トウモロコシ花粉（Ｚｅａ  Ｐｒｏ  Ｉ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｂ３５０８１；Ｚｅａ  Ｐｒｏ  ＩＩ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ３５０８０；ＺＭＰｒｏ  ＩＩＩ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ３５０８３；ＺｍＰｒｏＩＶ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ２２６５５；ＺｍＰｒｏＶ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｑ９ＦＲ３９）、ヒト（プロフィリンＩ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ０７７３７；プロフィリンＩＩアイソフォーム１，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号ＮＰ＿４４４２５２；およびプロフィリンＩＩアイソフォーム  ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号ＮＰ＿００２６１９）、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される単量体を含む、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記免疫原性組成物が、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、投与経路が、非経口経路、経口経路、経鼻経路、吸入経路または直腸経路からなる群より選択される、方法。
【請求項１０】
合成ペプチドであって、以下：
（ａ）連続してつながり、かつ表３の単量体プロフィリンから選択される、約７〜２１のアミノ酸を含み；
（ｂ）該アミノ酸が少なくとも１つのプロリンを含み；そして
（ｃ）該アミノ酸が少なくとも１つの酸性アミノ酸を含む、
ことにより特徴付けられる、合成ペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の合成ペプチドであって、前記アミノ酸配列が、凝集により露出される結合領域において、１つのプロフィリン分子から、図５に示される隣接プロフィリン分子へと配列を延ばすことにより見出される、同じ新規な配列である、合成ペプチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載の合成ペプチドの凝集体を含む、プロフィリン多量体。
【請求項１３】
請求項１１に記載の植物プロフィリンの多量体形態であって、ヘテロ多量体としてさらに規定される、多量体形態。
【請求項１４】
請求項１１に記載の植物プロフィリンの多量体形態であって、合成物としてさらに規定される、多量体形態。
【請求項１５】
以下の特徴：
（ａ）単量体植物プロフィリンを含み、各々の単量体は、各々少なくとも１つのシステインを含むアミノ酸配列またはそのフラグメントを有する；および
（ｂ）少なくとも２４ｋＤａの推定分子量を有する、
を有する植物プロフィリンの精製多量体形態。
【請求項１６】
前記多量体プロフィリンが、セロリ（Ａｐｉ  ｇ４，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｑ９ＸＦ３７）、ピーナッツ（Ａｒａ  ｈ５，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｑ９ＳＱ１９）、カバノキ花粉（Ｂｅｔ  ｖ２，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ２５８１６）、バミューダグラス（Ｃｙｎ  ｄｌ２，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ０４７２５）、ダイズ（Ｇｌｙ  ｍ３，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ６５８０９，Ｏ６５８１０）、ヒマワリ（Ｈｅｌ  Ａ２，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ８１９８２）、ラテックス（Ｈｅｖ  ｂ８，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号ＣＡＢ５１９１４、Ｏ６５８１２、Ｑ９ＳＴＢ６、Ｑ９Ｍ７Ｎ０、Ｑ９Ｍ７Ｍ９、Ｑ９Ｍ７Ｍ８、Ｑ９ＬＥ１８）、Ｍｅｒｃｕｒｉａｌｉｓ  ａｎｎｕａ（Ｍｅｒ  ａ１，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ４９８９４）、オリーブ花粉（Ｏｌｅ  ｅ２，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ１９９６３、Ｏ０２４１７０、Ｏ２４１７１）、チモシーグラス（Ｐｈｌ  ｐ１１，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ３５０７９、Ｏ２４６５０、Ｏ２４２８２）、セイヨウミザクラ（Ｐｒｕ  ａｖ４，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｑ９ＸＦ３９）、西洋ナシ（Ｐｙｒ  ｃ４，Ｑ９ＸＦ２７）、トウモロコシ（Ｚｍ  ＰＲＯＩ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｂ３５０８１；Ｚｍ  Ｐｒｏ  ＩＩ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ３５０８２；ＺｍＰｒｏ  ＩＩＩ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ３５０８３；ＺｍＰｒｏＩＶ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｏ２２６５５；ＺｍＰｒｏＶ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｑ９ＦＲ３９）、ヒト（プロフィリンＩ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号Ｐ０７７３７；プロフィリンＩＩアイソフォームａ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号ＮＰ＿４４４２５２；およびプロフィリンＩＩアイソフォームｂ，ＧＥＮＥ  ＢＡＮＫ登録番号ＮＰ＿００２６１９）またはこれらの組み合わせからなる単量体プロフィリンの群より選択される、組成物。
【請求項１７】
アレルギーの診断試験であって、該試験は、以下の工程：
（ａ）多量体プロフィリンまたはその機能的に等価なフラグメントの薬学的組成物を得る工程；
（ｂ）被験体に該組成物を投与する工程；および
（ｃ）アレルゲン性が推定される反応を決定する工程、
を包含する、試験。
【請求項１８】
哺乳動物を脱感作するための多量体プロフィリンまたはその機能的等価物の使用。
【請求項１９】
請求項１０に記載の合成ペプチドに対する抗体。
【請求項２０】
請求項１２に記載の多量体プロフィリンに対する抗体。
【請求項２１】
請求項１５に記載の多量体プロフィリンに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、米国特許係属出願６０／２７２，１４９号（２００１年２月２８日出願）からの優先権を主張する。
【０００２】
植物プロフィリンの多量体は、アレルギーの診断および処置に好ましい形態である。天然および合成の、分子全体またはその多量体の機能的等価物であるフラグメントは、１）アレルギーの処置のための脱感作剤；および２）患者をスクリーニングしてプロフィリンアレルゲン性を決定するための診断剤、として使用される。
【０００３】
プロフィリンは、全ての真核生物細胞において発現される細胞骨格タンパク質であり、Ｇ−アクチンを隔離し、そして膜結合ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸に結合し（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９７６；ＴｈｅｒｉｏｔおよびＭｉｔｃｈｉｓｏｎ、１９９３；ＳｏｈｎおよびＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ、１９９４；Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−ＣｌｅｒｍｏｎｔおよびＪａｎｍｅｙ、１９９１；Ｂａａｌｏｕｔ、１９９６；ＬａｓｓｉｎｇおよびＬｉｎｄｂｅｒｇ、１９８５；Ｖａｌｅｎｔａら、１９９３）、これにより、細胞形態およびシグナル伝達両方に影響する。プロフィリンは、複数の供給源（例えば、ヒト細胞、木、草、雑草（ｗｅｅｄ）花粉）から同定および精製され、そして組換えＤＮＡ技術によって産生された（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９２ａ、ｂ；Ｖｒｔａｌａら、１９９６ａ、ｂ；Ｓｕｓａｎｉ、１９９５；Ｐａｕｌｉら、１９９６；ＫｗｉｔａｋｏｗｓｋｉおよびＢｒｕｎｓ、１９９８；Ｈｏｎｏｒｅら、１９９３）。
【０００４】
ヒトプロフィリン多量体（すなわち、プロフィリン自己会合）の存在は、Ｂａｂｉｃｈら（１９９６）によって最初に報告され、ここで、四量体（相互連絡した４つのプロフィリン分子の複合体；プロフィリン４を形成する）は、関連の高親和性アクチン結合形態として同定された。イムノブロット分析、キャピラリーゾーン電気泳動分析およびドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析によって、約１４．８ｋＤａの分子量のヒトプロフィリン単量体が、ほとんどの二量体（プロフィリン２）および四量体を含む多量体を形成することを示すと解釈された。さらに、機能的有意性は、プロフィリンの四量体形態に選択的に結合するアクチンによって推測された。続いて、別の研究が、カバノキ、ヒトおよび酵母由来のプロフィリンは、自己会合することを示した（Ｍｉｔｔｅｒｍａｎら、１９９８）が、機能的有意性も臨床的有意性も取り組まれなかった。
【０００５】
ヒト、植物および動物から同定された種々のプロフィリン単量体の間で、広範な相同性（約４０〜９９％）が存在する。異なる植物種由来のプロフィリン間の顕著な相同性を示した構造分析が、報告された（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９２；Ｖｒｌａｌａら、１９９６）。しかし、植物プロフィリンは、共通の抗体認識部位（エピトープ）を共有するようである。特に、プロフィリン感受性アレルギー患者ＩｇＢ抗体は、異なるプロフィリンと交差反応する。さらに、組換えカバノキプロフィリンに対して惹起されたウサギポリクローナル抗体（ＶａｌｅｎｔａおよびＫｒａｆｔ、１９９５）は、報告された植物プロフィリンの実質的に全てと交差反応する。利用可能なデータは、ある植物供給源由来のプロフィリンが、個体をいくつかの植物種に対して交差感作（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）し得、そして、Ｉ型過敏症を有する幾人かの患者が、広範な、わずかに関連する花粉および食品に対する反応を示す理由を説明し得ることを示す。
【０００６】
推定４４，０００，０００人の（北米、欧州および日本からの）患者は、植物、動物およびラテックスのような物質中に見出されるプロフィリンに対するＩ型アレルギーに罹患する。Ｉ型アレルギー症状としては、枯草熱、鼻水の出る鼻（ｒｕｎｎｙ  ｎｏｓｅ）、そう痒、ぜん鳴および皮膚反応、ならびに、広く公表された、顕微鏡量のピーナッツに対する致死的反応が挙げられる。Ｉ型アレルギーはまた、喘息の発達に関連する。よって、プロフィリンに独特な任意の局面が、アレルギーの診断および処置のさらなる研究および開発のための基礎を、次々と提供し得る。
【０００７】
欧州での研究は、種々の植物供給源から単離されたプロフィリンアイソフォームが、一般的アレルゲンまたはアレルゲン全体（ｐａｎ−ａｌｌｅｒｇｅｎ）として作用し得ること（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９２ａ、ｂ；１９９１；ＶａｌｅｎｔａおよびＫｒａｆｔ、１９９５）、および全ての花粉アレルギー患者（Ｉ型アレルギーを有する）の約２０％が、組換えカバノキプロフィリンに対するＩｇＥ反応性を示すこと（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９２ａ、ｂ；１９９１；ＶａｌｅｎｔａおよびＫｒａｆｔ、１９９５）を報告した。組換えカバノキプロフィリン、ならびにカバノキ、チモシーグラスおよびヨモギ由来の天然のプロフィリンは、花粉アレルギー患者の好塩基球からのＩｇＥ媒介ヒスタミン放出を誘発し得る。本発明者による北米集団の研究（Ｐｓａｒａｄｅｌｌｉｓら、２０００）はまた、プロフィリンに対するアレルギー患者の感受性を示した。よって、プロフィリンは、アレルゲン全体であり得、そして有意数のＩ型アレルギー患者の感作および維持に応答性である。
【０００８】
ヒトプロフィリン多量体形態の発見を報告する研究（Ｂａｂｉｃｈら、１９９６）において考察および引用されたように、研究者らは、しばしばそれらが外来タンパク質として退けられた程度に対してさえ、プロフィリン多量体の存在が、何らかの関係を有するとは考えていなかった。以前の研究者は、植物のプロフィリン多量体が存在することを認識していなかったか、またはアレルゲン性形態としてのプロフィリン多量体の問題と取り組んでいなかったかのいずれかであった。しかし、タンパク質凝集／自己会合の生物学的重要性についてほとんど知られていない。この現象は一般に、あるとしても生物学的役割がわかりにくいままである、生じる生化学的誘因と考えられている。生物学的役割が見出されたとしても、臨床的役割は、必ずしも明らかにはならない。例えば、アレルギーの分野では、本出願の前例を示す、今日までに脱感作ショットのために用いられる特異的多量体タンパク質は存在しない。
【０００９】
全体として、特異的アレルゲンは極めてわずかしか同定されていない；それゆえ、特異的アレルゲン性形態のプロフィリンの同定が臨床的に有用である。その結果、脱感作を誘発するための、精製された特異的な原因性アレルギー因子の注射のために利用可能な組成物はほとんどない。大部分の薬は、原因ではなく、アレルギー症状を処置するために用いられる。ワクチン接種は、治癒処置に最も近い、唯一の処置である；ワクチン接種は、免疫系の反応パターンを変更して、症状を停止させ得、そして特定の患者では、枯草熱から喘息への悪化を防止し得る。ワクチンは、患者の免疫グロブリン／抗体応答の型をＩｇＥから主にＩｇＧへと変える（「セロコンバージョンとも呼ばれる」）脱感作因子として用いられる。ＩｇＥは、患者の身体からアレルゲンを浄化する、患者の共通の応答であるが、通常公知のアレルギー症状である副作用（例えば、鼻水の出る鼻、ゼイゼイいう肺、かゆみのある眼、皮膚の発疹、悪心）をも惹起し、一方、ＩｇＧは、このような副作用を伴わずにアレルゲンの除去を補助し得る。従って、好首尾の脱感作ワクチンは、所定のアレルゲンに対する上昇したＩｇＥレベルに比較してわずかであるＩｇＧ応答を引き起こす。
【００１０】
今日までのアレルギーワクチン接種処置は、ほとんど、患者がアレルギーであるアレルゲン性物質（例えば、イネ科植物花粉）由来の抽出物のカクテルの注射からなっている。特異的アレルゲンはごくわずかしか同定されていないので、カクテルが用いられる。投薬量を徐々に増加させることによって、患者の免疫応答が変化し、そして患者は最終的に、セロコンバージョンによって、このアレルゲンに対してアレルギー反応をもはや示さなくなる。その結果、このような組成物の利用可能性は処置を改善するが、（カクテルではなく）より特異的なアレルゲンがより有効であり、再現性良く調製され、そして一般に、より少ない副作用を有する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明の１つの局面は、アレルゲン性形態としてのプロフィリン多量体の同定である。
【００１２】
アレルゲン性に関して、多量体のような、より大きな抗原は、さらなるエピトープを提示して、より大きなＩｇＥ媒介ヒスタミン放出を惹起し得る。この可能性を探求して、本発明が導かれた。本発明の局面は、以下を包含する：１）その植物プロフィリン形態の多量体；および２）多量体形態は、単量体よりもアレルゲン性である。組換え植物プロフィリン多量体化が研究され、そして免疫アッセイが開発されて、植物プロフィリンに対する個体のＩｇＥの反応性が評価された。集団内のＩ型過敏症と植物プロフィリンへの反応性との間の相関は、米国（イリノイ）において調べられ、そしてプロフィリンが２０％〜３０％の患者において汎アレルゲンであるという考えを支持することが見出された。それゆえ、プロフィリン多量体の診断用途および治療用途は、顕著な臨床的影響を有する。
【００１３】
本発明は、哺乳動物を脱感作するための方法および組成物に関する。この組成物は、多量体形態を生じる、天然に存在するか、合成物であるかまたは組換え産生された、プロフィリン（単量体の供給源は表３に列挙される）の産生および／または精製を含む。この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）多量体プロフィリンを含む免疫原性組成物を入手する工程；および
（ｂ）有効用量の組成物を、該哺乳動物が脱感作されるまで、逐次増加する用量で投与する工程。
【００１４】
本発明はまた、以下のようなイムノアッセイによる診断手段のための多量体プロフィリン組成物の利用に関する：
（ａ）確立されたＲＡＳＴ（ラジオアレルゴソルベントテスト）または任意の皮膚試験（これらはプロフィリンに対する患者の感受性を診断するものとして当業者に公知である）を介して、多量体プロフィリンを含む有効用量の組成物を投与する手段；および
（ｂ）この組成物を組織、血液、血清中に適用するかまたはプラズマアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ／ＥＬＩＳＡ；放射免疫アッセイ／ＲＩＡ；免疫−放射測定アッセイ／ＩＲＭＡ；ＲＡＳＴ；発光イムノアッセイ／ＬＩＡ；磁気アレルゴソルベント試験／ＭＡＴ）に適用してプロフィリンに対する患者の反応性を検出する手段。
【００１５】
このプロフィリン多量体は、天然のペプチドもしくは合成ペプチドまたは天然のポリペプチドもしくは合成ポリペプチドの形態であり得るか、あるいは組換え法によって作製され得る。この組成物は、当業者に公知である、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含み得る。投与は、非経口、経口、経鼻、吸入または直腸経路を介してなされ得る。処置投薬量は、ＩｇＥに関連する症状の軽減によって測定されるような臨床的な効力を生じるのに十分な量であり；診断投薬量は、それぞれの手順（例えば、皮膚試験＝刺激作用；生物学的アッセイ＝プロフィリンに結合する患者のＩｇＥの検出）における測定可能な反応を生じるのに十分な量である。
【００１６】
１）Ｉ型アレルギー患者の２０〜３０％は、プロフィリンと反応するＩｇＥを有すること；および２）アレルゲン性のプロフィリン多量体の本発明における発見を考えれば、プロフィリン多量体またはその同族種（すなわち、多量体プロフィリンに非常に酷似しているかまたはそれに類似のもの）が、これらのアレルギー型の診断およびワクチン処置に重要である。
【００１７】
他の供給源（例えば、ヒト、カバの木の花粉）から決定されたプロフィリンのサイズとの一致において、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびイムノブロット分析によって、有意な１４．８ｋＤａのタンパク質が、植物（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）プロフィリンアイソフォーム（ＺｍＰＲＯ１）のｃＤＮＡで形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉから精製さたことを明らかになった。より高分子量のタンパク質（特に６０ｋＤａおよび３０ｋＤａ）がまた観察され、これは還元剤の非存在下において優性でありそしてより大きくなった（＞９０ｋＤａ）。プロフィリンに対するヒトＩｇＥ反応性を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定し、その活性を、陰性（Ｉ型アレルギーなし）、陽性（Ｉ型植物アレルギー）またはその他（すなわち、古典的にＩ型植物アレルギー以外のアレルギー）のいずれかに分類された患者の血清サンプルを使用して展開した。８人の陰性コントロールのうちの１人およびその他に分類された１４人のうちの３人と比較して、ＩｇＥ−ＺｍＰＲＯ１複合体は、Ｉ型植物アレルギーを有する９人の患者のうち３人に見られた。続いて、点濾過イムノブロットを展開し、還元剤の存在下または非存在下において希釈されたプロフィリンを吸収し、それぞれ、大部分が単量体であるプロフィリンまたは大部分が多量体であるプロフィリンを得た。陽性患者由来の免疫グロブリンＥは、プロフィリン多量体に好ましい条件下において、ＺｍＰＲＯ１へのより大きい結合強度を示した。要約すると、組換えＺｍＰＲＯ１プロフィリンは、多量体を形成し、そして組換えＺｍＰＲＯ１は、先進のＥＬＩＳＡに適している。プロフィリンは、パン−アレルゲン（ｐａｎ−ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ）可能性を有しており、プロフィリン多量体は、単量体よりもより大きい免疫原性を有している。
【００１８】
さらなるタンパク質を同定するためのほぼ最大限のタンパク質負荷と相対的により感受性のＳＤＳ−ＰＡＧＥ染色手順との組み合わせは、クーマシーブルータンパク質染色を用いる代表的な報告と比較して、多量体形態の同定を明らかにした。さらに、植物プロフィリンおよびヒトプロフィリンは、化学的還元に抵抗する能力において類似し得る。ヒトプロフィリンのコンピュータに基づく分子モデリングによって、過酷な還元剤からジスルフィド結合のいくつかを保護するプロフィリン−プロフィリン相互作用が生じることが示唆された（図５）。
【００１９】
（詳細な説明）
アレルギー患者のＩｇＥは、異なる供給源由来のプロフィリンと交差反応することが示されている。本発明は、種々の植物種（木、草、雑草）、食物（例えば、ピーナッツ）中に存在するアレルゲンに関するプロフィリン、およびヒトにおいて見出されたプロフィリンに関する。本発明の新規な局面は、プロフィリン多量体が排他的でない場合、好ましいアレルゲン形態であるということである。この多量体形態の大きさは、単量体形態（ここで、複数の単量体（約１４ｋＤａ）は、２８ｋＤａ、３６ｋＤａおよび６０ｋＤａの大きさで、またはその間の範囲にわたり得る多量体を含む）よりも大きいか、または図１および図２のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルについて記載されるような１００ｋＤａ以上の多量体である。この多量体は、同じ同一性を有する自己会合のプロフィリンから生じ得るか（ホモ多量体）、または、プロフィリン間での交差会合から生じ得る（ヘテロ多量体）。ヘテロ多量体の１つの例は、トウモロコシ花粉のプロフィリンのファミリーが、多量体を形成するために互いに結合する場合であり；別の例は、交雑種のへテロ多量体（例えば、トウモロコシ−カバノキ花粉プロフィリン複合体）である。ヘテロ多量体は検出されなかったが、おそらく、独特の配列が、このようなヘテロ多量体から同定され得、このヘテロ多量体は、プロフィリン感受性Ｉ型アレルギーの処置および／または診断のための、最終的には最も強力で、そして、一般的に適用可能な形態である。
【００２０】
プロフィリン多量体は、例えば以下による当業者に公知の方法から作製される：自然中の本来の供給源からの精製、化学合成、または組換えＤＮＡ技術。このプロフィリンまたはプロフィリンペプチド、およびプロフィリンフラグメントは、引き続き、ポリ−１−プロリン（Ｂａｂｉｃｈら、１９９６；Ｊａｎｍｅｙ、１９９１）またはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）を使用する通常のアフィニティークロマトグラフィー法によって精製される。本明細書中で使用する場合、用語「合成的な」は、ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現によってか（Ｐｓａｒａｄｅｌｌｉｓら、２０００；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１）、またはコード化ヌクレオチド配列、もしくは既知のプロフィリンアミノ酸配列由来の特異的に設計されたアミノ酸配列に基づく市販の化学合成によって生成された、全てのペプチドおよびポリペプチドを含む。
【００２１】
多量体化する全てのプロフィリン分子を作製することに加えて、合成ペプチドはまた、治療および診断のための新規なプロフィリンに基づくペプチドおよびポリペプチドを作製するために、以下の要件を有し得る：７〜２１のアミノ酸長であり、少なくとも１つのプロリンを含み、そして、少なくとも１つの酸性アミノ酸を含む。この要件は、以下の各々からの集団的予測から導かれる：１）効率的に作製され得る最小の大きさは、免疫認識に十分であり、さらに、大きな分子と比較して、潜在的な副作用を軽減するのに十分小さい；２）多量化の際に、プロフィリン内およびプロフィリン間で生じる曲がり（ｂｅｎｄ）は、プロリンによってこのペプチド中で模倣され得る；３）水溶性ための荷電アミノ酸は、抗体−ペプチド相互作用を潜在的に促進する；４）プロフィリン多量体についてのもっともらしい多量体構造は、コンピューターモデル化により推定され（図５）、これは、外側のプロリンおよび荷電残基のための役割と一致する。従って、ＩｇＥを有するヒトは、恐らく、プロフィリン複合体（多量体化から生じる）の曝露部分、または図５中に示される隣接するさらなるプロフィリン分子から配列を続ける、１つのプロフィリン分子からのアミノ酸配列の一部に対する抗体を作製する。
【００２２】
表３は、アレルギーの可能性を有するプロフィリンの配列を示す。この配列は、多量体化プロフィリンを発達させ、以前に記載されたパラメーターを与えられて、アレルギー処置および診断のためのペプチドフラグメントを作製するための根底を形成する。
【００２３】
植物プロフィリンの、ヒトおよび種々の植物種から臨床学的に関連する多量体を形成する能力は、本発明の新規な局面である。この生化学的データおよびコンピューターに基づくモデル化は、種々の種由来のプロフィリンが多量体を形成し得るということに一致した。さらに、図５からのデータは、プロフィリンが、強すぎる還元剤（通常は、強力な化学結合を破壊する）から相対的に保護される強力な化学結合（スルフィドリル結合）に起因して、強く結合されたままである多量体を形成すること、ならびに２つのプロフィリン分子についての化学自由エネルギー（有利な状態）が、自己会合することを示した。従って、２つのプロフィリン分子についての性質は、自己会合することであり、これは、プロフィリンがなぜ単量体とともに存在するのかを説明する。
【００２４】
発明の背景でも論議したように、多量体は、以前は、観察されなかったか、汚染物として取り下げられていたか、または臨床的関連性について研究されていなかった。２つの他の理由が、以下の結果から明らかとなった：（１）ヒトプロフィリン（多量体を形成する）を認識するためのウサギ抗−植物プロフィリンＩｇＧがないことが、植物多量体が存在しないという証拠（なぜならば、この抗体がヒトプロフィリン多量体を認識した場合、研究者らは植物プロフィリン多量体を探すであろうから）として解釈され得た；そして（２）より感応性の染色を、現在のＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験におけるタンパク質の検出に使用した。例えば、クーマシーブルーは、最小のバックグラウンドでタンパク質を検出するために、他人によって使用された好ましい染色であり、これによって、「より透明な」ゲルを与え、そして、優先的に、ゲル上にロードされた最も多量なタンパク質を検出する。対照的に、本明細書中で使用する銀染色は、より感応性であり、そして、バックグラウンドタンパク質を捕らえる。このゲルは、どちらかと言えば暗く、そして、より暗いバックグラウンドを生成することに加えて、タンパク質バンドは、時には、近い大きさの他の多くのタンパク質と混ざる（例えば、図１および図２）。従って、この分野での公開された研究の多くは、クーマシーブルー染色ゲルを示しており、これは、なぜ多量体が以前に明らかとならず、また記述されなかったのかを、部分的に説明し得る。
【００２５】
実際に、確立されたプロフィリンの単離方法は、しばしば、１２〜１５ｋＤａの細胞骨格分子の２倍以上のサイズで認識される、異質でかつ未同定のタンパク質を生じていた（Ｂａｂｉｃｈら、１９９６に議論されている）。これらのバンドは、二量体または他のプロフィリン多量体として探求されず、コンタミネーションとして片付けられた。さらに、アレルギー研究に使用されるプロフィリンは、アレルゲン性について試験する場合に、組成（単量体−多量体）を決定することなく精製されるか、または合成されていた。例えば、他の研究者らは、プロフィリン単量体のサイズだけ（１４ｋＤａ）が、特許された産物（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９６；米国特許第５，５８３，０４６号および米国特許第５，６４８，２４２号）を命名する（Ｐ１４）ために使用された点で、アレルギー疾患の診断および治療のための産物として、仮定されたプロフィリン単量体を重視しただけだった。対照的に、Ｐｓａｒａｄｅｌｌｉｓら、２０００で議論されるように、そして図４に示されるように、プロフィリン多量体は、排他的でないとしても、好ましいアレルゲン性形態として、提唱される。
【００２６】
プロフィリン多量体に関する臨床的関連性は、Ｉ型アレルギーを有するヒト由来のＩｇＥの優先的結合を立証したアッセイによって得られた。より大きなプロフィリン多量体は、それらのサイズおよび感受性のあるヒトへの新規の抗原提示（それによってＩｇＥに媒介されるアレルギー反応を誘導する）に起因して、よりアレルゲン性であった。このプロフィリン多量体特性の使用は、以下を包含する：１）アレルギーの処置；および２）当業者に公知の診断方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲＭＡ、ＲＡＳＴ、ＬＩＡ、ＭＡＴ）において、患者のアレルギー反応性を決定すること。これらのアッセイに使用されるプロフィリンは、多量体プロフィリン分子全体（天然または合成）、ペプチドフラグメント（天然または合成）、あるいは多量体化の際に反応に曝されるかまたはプロフィリン−プロフィリン相互作用を介して独自に見られるかのいずれかのプロフィリン構造由来のペプチドフラグメント（合成の新抗原）を含む。このタンパク質およびペプチドは、ａ）〜ｃ）のいずれかである：ａ）標準の精製方法によって植物組織またはヒト組織から入手した（例えば、図１および図２に示される、ポリ−ｌ−プロリンアフィニティーカラム精製されたプロフィリン）；またはｂ）標準の市販の化学合成物を用いて当業者によって作製された；あるいはｃ）組換えＤＮＡ技術。
【００２７】
プロフィリンは、種々の天然供給源からポリ（ｌ−プロリン）−セファロース４Ｂアフィニティークロマトグラフィーを用いて、以前に記載されたように精製された（Ｂａｂｉｃｈら、１９９６；Ｐｓａｒａｄｅｌｌｉｓら、２０００；Ｊａｎｍｅｙ，１９９１）。プロフィリンは、目的の細胞から直接単離されようと、あるいは合成されようと、１０ｍｌのポリ（ｌ−プロリン）−セファロース４Ｂカラムに流すことによって他の成分全てを除いて精製された。それぞれ、４Ｍおよび８Ｍの尿素を用いて溶出されたアクチンおよびプロフィリンは、遠心分離法によって濃縮された（ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３，Ａｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。プロフィリンは、最初に、Ｇ−緩衝液（０．１  ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）で洗浄され、濃縮され（１〜３ｍｇ／ｍｌ）、そして２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２中で、−２０℃で、使用まで保存した。プロフィリンの供給源（例えば、材料および方法（ＺｍＰＲＯ１プロフィリンの発現および精製）にさらに記載される、トウモロコシの花粉のＺｍＰＲＯ１プロフィリンについて）は、組換えＤＮＡ技術（Ｐｓａｒａｄｅｌｌｉｓら、２０００；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２００１）を介し得る。
【００２８】
特定のアレルゲンに対する患者のスクリーニングは、臨床的設定における診断の役に立つ。本発明のこのタンパク質は、プロフィリンに対して感受性であるアレルギー患者を同定するために使用され、そして患者のセロコンバージョンに対する脱感作剤として使用される。次いで、患者がプロフィリンを認識するＩｇＥを有する場合、脱感作剤（すなわち「アレルギー反射（ａｌｌｅｒｇｙ  ｓｈｏｔ）」）は、本発見から開発され、それによって、ＩｇＧは、患者の初期免疫応答となり、臨床的利点を生じる（すなわち、ＩｇＥに関連する副作用無く、身体からアレルゲンを取り除く）。
【００２９】
開発されたＥＬＩＳＡは、Ｉ型アレルギー患者のＩｇＥのＺｍＰＲＯ１プロフィリンの認識を測定するために、引き続いて使用された。既知のアレルギーを有さない患者間で、プロフィリンに対して１つの陽性の反応性（８人中１人）；種々の（例えば、ペニシリン、織物、塵埃）非Ｉ型アレルギーを有する患者における最小の反応性（１４人中３人）および花粉に対するＩ型アレルギーを示す患者間での顕著な反応性（６人中３人）が存在した。プロフィリンに対して陽性反応を示す３つのサンプル由来の生データ（表２）は、最小のバックグラウンド（すなわち、プロフィリンでコートしたウェルに血清を加えた場合の、プロフィリンでコートしていないウェルに対する比較的高い吸光度の比）で、プロフィリンに対する強いＩｇＥ反応性を示した。この結果は、Ｉ型アレルギー患者が植物のプロフィリンに対して免疫反応性であるという以前の研究と一致し（Ｖａｌｅｎｔａら、１９９２；１９９１、および１９９５；Ｐａｕｌｉ  １９９６）、そして本発明のアプローチが、Ｉ型アレルギーを有する患者についてのスクリーニングに有用であることを示す。
【００３０】
プロフィリンの単量体および多量体のアレルゲン性の可能性を、ドットフィルトレーション（ｄｏｔ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）免疫ブロット分析によって試験した（図４）。ＥＬＩＳＡがより感受性かつ定量的であるが、単量体プロフィリン状態を支持するため（プロフィリン間のスルフヒドリル結合の破壊に起因するが、以前に記載されたように、不完全な効果を有する）に使用される還元剤の存在は、プラスチックウェルへのプロフィリンの吸着を妨害する。従って、ドットブロット濾過装置を使用して、還元剤を除去した。全ての例において、−ＢＭＥ／プロフィリンと比較して、より大きな応答が、＋ＢＭＥ／プロフィリン（すなわち、優勢に多量体形態としてのプロフィリン）のＩｇＥ認識から測定された。陰性コントロール患者（すなわち、血清（−））からの比較的弱い信号とは対照的に、陽性血清カテゴリー由来のＩｇＥは、（±ＢＭＥにかかわらず）プロフィリンの有意により大きな認識を表示し、これによって、プロフィリンの、アレルゲンとしてのより高い次数を示唆した。
【００３１】
植物の花粉に対する１型アレルギーを宣言した９人の患者のうちの３人が、開発されたＥＬＩＳＡを用いて、ＺｍＰＲＯ１プロフィリンに対する有意な反応性を示した。種々雑多なカテゴリー（例えば、埃）由来の３つのさらなる血清サンプルはまた、陽性応答を生じた。このことは、多くの１型アレルギー患者がしばしばアレルゲンとして埃を含むことを考慮すれば、予測され得る；さらに、ラテックス中でのＩｇＥ結合成分としてのプロフィリンの同定（Ｖａｌｌｉｅｒら、１９９５）は、１型候補の従来のスペクトルの外側であると考えられるアレルゲンが、実際には、１型アレルギー患者のＩｇＥによって認識され得るという問題を提起する。
【００３２】
ＩｇＥによる、ＺｍＰＲＯ１プロフィリン多量体の比較的大きな認識は、提唱されたパンアレルゲン（ｐａｎ−ａｌｌｅｒｇｅｎ）としての植物プロフィリンの新規局面を明らかにする。プロフィリン多量体のより大きな認識は、単純な相加効果に起因するのではない。なぜなら、同量の全プロフィリンが、ドット免疫ブロット試験において使用された各ウェルに添加されたからである。従って、このことは、プロフィリン多量体が相乗的に作用して、結合部位へのアクセスを立体的に容易にするか、または独自のエピトープを提示するかのいずれかであることを明らかにする。以下のことが考えられる：（ｉ）以前に推定されたよりも多くの１型アレルギー患者が、プロフィリンを認識するＩｇＥを有すること；および（ｉｉ）プロフィリン多量体は、１型アレルギーの原因となる因子であること。
【００３３】
（表１  ＺｍＰＲＯ１プロフィリンとのヒトＩｇＥの反応性についての酵素結合イムノソルベントアッセイ）
【００３４】
【表１】
2005505495.tif 000002
３つの患者カテゴリー由来の血清サンプルとの、プロフィリンの陽性（＋）反応または陰性（−）反応（Ｎ＝３０サンプル；各点に対して四連の決定）、Ｚｍ＝Ｚｅａ  ｍａｙｓ。
【００３５】
（表２  陽性サンプルからの生データ）
【００３６】
【表２】
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表１に同定した３つの陽性サンプルについての、コーティングされていないウェルに対する、プロフィリンでコーティングされたウェルからの光学密度（ＯＤ）の比（平均ＯＤが示される；標準誤差は、平均の１０％以内であった）。
【００３７】
（表３）
【００３８】
【表３】
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【実施例】
【００３９】
（実施例）
（実施例１：多量体プロフィリンの生成および精製）
本発明は、組換えＺｍＰＲＯ１プロフィリン（これは、多量体形態を生じる）の生成および精製に関する。引き続いて、ウェスタン免疫ブロット分析およびＥＬＩＳＡ（これは、アレルギー患者のＩｇＥ反応性を評価するために開発された）によってこのタンパク質が免疫学的に異なることを同定した。見かけ上四量体の６０ｋＤａのプロフィリンが、より高次の多量体（＞９７ｋＤａ）に加えて見出され、これを、非還元条件下で増幅した。比較的高い割合のアクリルアミドゲルを使用して可視化し、そしてＺｍＰＲＯ１プロフィリンの単量体またはより低次の多量体を研究したが、選好性の高次プロフィリン多量体が頻発するようである；すなわち、多量体の破壊のための、熱および還元剤への曝露にもかかわらず、より大きな多量体プロフィリン形態が、一般的なままであった。植物プロフィリンが多量体を形成する能力を試験して、脱感作のために最適な分子形態を決定した。ＺｍＰＲＯ１  ｃＤＮＡによってコードされる、精製された組換えタンパク質を、銀染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離によって可視化した（図１、２ａ）。１４．８ｋＤａにおける優勢なバンドを、形質転換したＥ．ｃｏｌｉにおいて、特に、タンパク質産生を誘導するためのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ｔｈｉｏｇａｌａｃｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ））の後に確認した。他の外来のバンド（＞３０ｋＤａ）は、おそらく、より好都合なＰＬＰ（ポリ−ｌ−プロリン）アフィニティービーズスラリーと共に残った、多量体プロフィリンおよび／または細胞タンパク質を含んだ。カラムクロマトグラフィーによって分離されたＺｍＰＲＯ１プロフィリンは、より清浄な調製物を与え、これもまた、還元条件下と非還元条件下との両方で試験した（図２ａ）。優勢なバンドが、単量体ＺｍＰＲＯ１植物プロフィリン（約１４．８ｋＤａ）について予測されたように出現したが、ヒトプロフィリンについての報告と一致して、還元剤に対して耐性の、より高分子量のプロフィリン（例えば、より高次の多量体プロフィリン）が残った。約６０ｋＤａのバンド（図２ａ、＋ＢＭＥ）は、ゲルの頂部近く（＞９７ｋＤａ）のタンパク質の明確な凝集に加えて、還元剤に対して耐性の四量体の形成を示唆した。タンパク質がより大きいほど、非還元条件下でより顕著になり（図２ａ、−ＢＭＥ）、そして単量体プロフィリンの対応する損失に関連する。スタッキングゲル中に残った染色されたタンパク質の存在は、天然タンパク質（すなわち、プロフィリン）の凝集／多量化の知見をさらに支持した。還元剤の非存在下で１４．８ｋＤａに相当する任意のかすかなタンパク質は、感受性基質を用いて対応する免疫ブロットを現像すると、より明らかになった（図２ｂ）。しかし、ウェスタン免疫ブロッティングは、より高分子量のプロフィリン多量体についての、一貫しない陽性の同定を与えた；おそらくこのことは、種々のタンパク質の大きさの移動における異なる効率、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、イオン結合）の際に起こり得る正味の電荷の変化、９０ｋＤａを超えるプロフィリン多量体を、スタッキングゲルから分離ゲルへと移動させることが困難であること、またはプロフィリンの凝集／多量化が起こる場��のエピトープマスキングに起因する抗体認識の欠如に起因した。実際、観察されるウエスタンイムノブロットのバンドの強度（単量体＞四量体＞＞より高い多量体（ｈｉｇｈｅｒ  ｏｒｄｅｒ））における差異は、これらの説明を支持する。総合的に、これらの結果は、免疫学的に異なるＺｅａ  ｍａｙｓプロフィリンが生産されて、精製されて、そして優先的に多量体を形成することを示唆する。
【００４０】
（実施例２：アレルギー性個体由来のヒト血清が、ＺｍＰＲＯ１を認識することの証明）
ＥＬＩＳＡを発展させて、精製された組み換えタンパク質をさらに免疫学的に同定し、そしてアレルギー性個体由来のヒト血清がＺｍＰＲＯ１を免疫学的に認識するか否かについて研究するための手段を提供した。６つの代表的なコントロールウェルを示し（図４）、これらのうち精製されたタンパク質で覆われたウェルのみが有意な呈色応答（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を導いた。さらに、ウサギ抗ヒトプロフィリンＩｇＧは、ＺｍＰＲＯ１を認識しなかった。このことはウサギ抗植物プロフィリンＩｇＧがヒトプロフィリンを認識不可能であることに類似である（Ｋａｒａｋｅｓｉｓｏｇｌｏｕら、１９９６）。従って、ＺｍＰＲＯ１プロフィリンについて選択的な明確なシグナル−ノイズ比を有する方法を構築して、そしてその方法により免疫学的に異なる植物プロフィリンの生成がさらに確認された。
【００４１】
（材料および方法）
（試薬）
Ｚｅａ  ｍａｙｓの花粉に由来するプロフィリンのアイソフォームをコードするｃＤＮＡ（ＺｍＰＲＯ１；）（Ｓｔａｉｇｅｒら、１９９３）を、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性のプロモーターを有するトランスフェクションのベクター（ｐＥＴ２３ａ；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）において用意した；ＺｍＰＲＯ１  ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質産物を認識する、ポリクローナルのウサギＩｇＧもまた、用意した。臭化シアン（ＣＮＢｒ）で活性化されたセファロース４Ｂを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）より購入して、そしてポリ（Ｌ−プロリン）（ＰＬＰ；１００００〜３００００ＭＷ）をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）より購入した。
【００４２】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合したモノクローナル抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗ヒトＩｇＥ）および銀染色キットを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）より購入した。
【００４３】
（患者の血清サンプル）
慣用的な採血からのヒト血清サンプルを、適切な患者の同意と共に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）から得た；患者が申し出たアレルギーを、各血清容器上に注釈としてつけた。標準的な遠心分離方法によって全血から単離した血清を、４℃で保存するか（そして１週間以内に使用する）、またはアリコートに分け、そして−２０℃で保存した。サンプルを、以下の３つの群のうちの１つに分類した：（ｉ）アレルギーの申し出なし；（ｉｉ）種々雑多な反応（すなわち、植物アレルギーではない、例えば、粉塵アレルギー、接着テープアレルギー、人工材料アレルギーなど）；または（ｉｉｉ）植物の花粉に対する古典的Ｉ型アレルギー。
【００４４】
（ＺｍＰＲＯ１プロフィリンの発現および精製）
予め温めたコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を、製造業者からのプロトコルの改変によって、そして植物（Ｖｒｔａｌａら、１９９６；Ｓｕｓａｎｉ、１９９５；Ｋａｒａｋｅｓｉｓｏｇｌｏｕ、１９９６）およびヒトプロフィリン（Ｇｉｅｓｅｈｎａｎｎら、１９９５）について本質的に記載されたように、ＺｍＰＲＯ１／ｐＥＴ−２３ａを用いて形質転換した。種々の形質転換したＥ．ｃｏｌｉクローンの溶解物からのＤＮＡ含量および質を、標準的な分光光度測定（すなわち、２６０ｎｍ、濃度；２６０ｎｍ／２８０ｎｍ、相対的なヌクレオチド純度  対  タンパク質）、およびアガロース（０．７％）ゲル電気泳動によって分析した。最も高い濃度のＺｍＰＲＯ１  ｃＤＮＡを発現するＥ．ｃｏｌｉクローンを、プロフィリン産生のために選択した。
【００４５】
１０ｍＬ  Ｌ−ｂｒｏｔｈ（ｇ／Ｌ；１０  トリプトン、５  バクト酵母抽出物（ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）、１０  ＮａＣｌ＋０．１５  アンピシリン）中で３７℃にて１０時間最初に増殖させた形質転換Ｅ．ｃｏｌｉを、最終１Ｌ容量のＬ−ｂｒｏｔｈにし、そしてさらに２時間インキュベートし（３７℃、１００ｒ．ｐ．ｍ．にて穏かに攪拌）、その後、さらに６時間のインキュベーションに対してＩＰＴＧ（０．４ｍｍｏｌ／Ｌ  最終濃度）またはビヒクルのいずれかを添加した。培養物を遠心分離し（１０００ｇ、３０分、２２℃）、ペレットを得、このペレットを、５容量の氷冷した溶解緩衝液（０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２μｍｏｌ／Ｌ  ロイペプチン、１μｍｏｌ／Ｌ  アプロチニン、０．２μｍｏｌ／Ｌ  ペプスタチン、５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）中に再懸濁し、そして超音波処理した（連続的な出力制御設定２×１０ｓ、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｃ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃａ．，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ，ＵＳＡ）。以前に記載されるように（Ｂａｂｉｃｈら、１９９６；Ｊａｎｍｅｙ、１９９１）、この溶解物を遠心分離し（１２０００ｇで３０分間、４℃）、そして上清をポリ（Ｌ−プロリン）−セファロース４Ｂ（すなわち、ＰＬＰビーズ）アフィニティーカラム上に注いだ。簡単にいうと、尿素を用いた段階的な溶出勾配を使用して、２ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ｐＨ７．２／０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２に対する一晩の透析（４℃）に対してプロフィリンを収集および精製し、遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ−３、Ａｍｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって約１ｍｇ／ｍＬの最終濃度に濃縮する（これを、−２０℃で保存した）。いくつかの場合、ＺｍＰＲＯ１プロフィリンを、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物：ＰＬＰビーズスラリー（１：４容量；４℃にて４〜１６時間、穏かな振盪）の同時インキュベーションによって単離し、続いて、ペレットへと遠心分離し、そしてそのプロフィリン−ＰＬＰビーズ複合体を洗浄した（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  グリシン、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＤＴＴ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ７．８を用いて３回）。最終のペレットを懸濁し、そしてサンプル緩衝液中で（β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）の有りまたは無し）煮沸した。
【００４６】
ＰＬＰビーズスラリー（例えば、図１；最初の精製およびＥ．ｃｏｌｉ中でプロフィリンが作製されたことの確認）またはカラムクロマトグラフィーのいずれかによって単離されたタンパク質を、標準的な銀染色したドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；１５％  アクリルアミドゲル）技術によって分析した。プロフィリンを、以前に記載されたように（Ｂａｂｉｃｈら、１９９６）、ウエスタンイムノブロッティングによってさらに特徴付けた。このイムノブロットを、ウサギ抗ＺｍＰＲＯ１一次抗体（１：１０００）および西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化したヤギ抗ウサギ二次抗体（１：５００）を用いたインキュベーションによって展開させた。タンパク質を、蛍光基質または強化金属基質（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌまたは金属ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）のいずれかを用いて可視化した。
【００４７】
（抗プロフィリン抗体の開発）
プロフィリン抗体を、記載されるように（Ｂａｂｉｃｈら、１９９６；Ｓｔａｉｇｅｒら、１９９３）、組換えプロフィリンまたはネイティブなプロフィリンのいずれかに対して作製した。アフィニティーカラム精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気溶出の後、プロフィリンをアジュバント（ＲＩＢＩ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）と結合体化させ、そしてＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅウサギの１０ヶ所の別個の位置に（ＲＩＢＩプロトコルに従う）注射した。ウサギ血清抗プロフィリンＩｇＧをチオフィル吸着クロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって精製し、４．５ｍｇ  ＩｇＧ／ｍｌの平均ピーク画分濃度を得た。抗プロフィリンＩｇＧ抗体を、抗原を含有するウエスタンイムノブロット上でスクリーニングした。
【００４８】
（ヒトＩｇＥ−ＺｍＰＲＯ１プロフィリン検出のための酵素結合イムノソルベント検定法）
精製ＺｍＰＲＯ１生成物（５０ｎｇ／ウェル）またはコントロールビヒクル［ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）、ｐＨ７．４）を、一晩４℃で保存した９６ウェルイムノアッセイプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ−２、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ，ＵＳＡ）の指定したウェルに添加した。ＥＬＩＳＡのための適切なウェルを展開するための一般的な順序は、以下であった：（ｉ）非特異的部位をブロックする（４％  脱脂粉乳、０．１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０２％  ＮａＮ３（ＴＢＳ中）、２０％  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｐｅｉｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製）、２時間、４℃）；（ｉｉ）１×ＴＢＳで洗浄、そして血清サンプルまたはコントロールビヒクルのいずれかを用いてインキュベートする（ＴＢＳまたは熱非働化ウシ胎仔血清；４℃で一晩）；（ｉｉｉ）サンプルを廃棄し、ＴＢＳをサンプルウェルに添加するか、または一次ウサギＩｇＧ抗植物プロフィリン（ＴＢＳ中に１：１０００希釈、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０１％  ＢＳＡ、１．５時間）をコントロールウェルに添加して、ＺｍＰＲＯ１プロフィリンのコーティングを確実にする；そして（ｉｖ）全てのウェルを１×ＴＢＳで洗浄、適切な二次抗体（血清を含むウェル中にはヤギ抗ヒトＩｇＥ−ＨＲＰ、またはコントロールウェルにはヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ；１：５００希釈、２時間、４℃）を添加する。次いでこのプレートを広範囲に洗浄し、比色定量方法の基質として２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）を用いて展開させ（ただし、他の確立されたＨＲＰ基質もまた、予備的な研究において好首尾であった）、そして光学濃度を、マイクロタイタープレートリーダー（λ５７０ｎｍ）を用いて測定した。プロフィリン標準物質の連続希釈アッセイによって、このアッセイが、１ウェル当たり０．１ｎｇと１００ｎｇとの間のプロフィリン添加で線形であることを示した。プロフィリンを含むウェルから得た光学濃度  対  プロフィリンを含まないウェルから得た光学濃度の間に少なくとも１つの標準偏差の差異が存在する場合、その血清サンプルはプロフィリンと反応性であると考えられた（すなわち、陽性）。陽性と示された血清は、１０％と１００％との間の濃度のシグナル強度において、線形の増加を与えた。
【００４９】
（ドット−フィルトレーションイムノブロット）
いくつかの場合、支持ニトロセルロース（０．２μｍの孔サイズ）を用いるドットフィルトレーションイムノブロットアッセイ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ．Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、ＺｍＰＲＯ１単量体  対  ＺｍＰＲＯ１多量体のアレルギー誘発の可能性を決定するためのＥＬＩＳＡに代わる必要なアッセイである。プロフィリンは、還元状態下（４．５％  ＢＭＢ、９５℃で３分間）または非還元状態下のいずれかに配置し（それぞれ、単量体状態または多量体状態に有利であるように）、そして引き続いて、ドットイムノブロットに付着させ（５０ｎｇ／ウェル、２時間）、その後、膜から培地を除去するために吸引フィルトレーションをした。次いで、ＴＢＳを用いて洗浄することによってＢＭＥを除去し、そしてドットイムノブロットを、ＥＬＩＳＡ方法と類似の抗体を用いたがＨＲＰ基質としては強化金属ＤＡＢを用いて展開させた。免疫認識の強度（すなわち、暗さ）についての定量的な値は、そのドットフィルトレーションイムノブロットをコンピューターでスキャンし、そしてＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）ソフトウェアプログラムを用いることによって（ヒストグラム、ブラックチャネルの下で）得た。平均の明度値を、各ドットをカバーする個定数のピクセル（４８６）から得、そして対応する暗さの値は、１００×明度値の逆数によって計算した（すなわち、相対値の増加は、暗さの増加または免疫反応性の増加を示す）。異なる処理の平均間の比較を、スチューデントｔ検定によって作成した（ＳｏｋａｌおよびＲｏｈｌｆ、１９８１）。
【００５０】
（哺乳動物を脱感作または減感作するための投与方法）
本発明は、哺乳動物を脱感作または減感作するためのプロフィリンポリペプチドアレルゲン（例えば、多量体プロフィリンのフラグメント）の使用に及ぶ。このようなポリペプチドは、標準的な薬学経験に従って、単独または薬学的に受容可能なキャリアもしくは希釈剤と組合わせてのいずれかで哺乳動物に投与され得る。
【００５１】
脱感作方法としては、漸増する用量のプロフィリンの、連続的な、非経口投与、経口投与、鼻腔投与、吸入投与または直腸投与が挙げられる。本明細書中に使用される場合、用語非経口は、皮下注射、静脈内注射または筋内注射を含む。
【００５２】
１適用当たり約１ｐｇ〜１０ｍｇの範囲の用量が、「有効量」として使用され得る。しかし、ＩｇＥ関連症状の低下によって測定されるような臨床的な効果を生じるのに十分な投与量および投与回数（診断的な使用または投薬量）は、反応を生じるのに十分な量であるか、または反応を測定するための方法に含むのに十分な量である。希釈剤およびキャリアは、一般的に受容された臨床手順に従って、当業者によって選択される。
【００５３】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｚｍ  ＰＲＯ１  ｃＤＮＡで形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ銀系ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離の写真を示す；Ｚｍ  ＰＲＯ１  ｃＤＮＡでコードされたタンパク質を（材料および方法）に記載したようにアフィニティービーズスラリー分離（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｅａｄ  ｓｌｕｒｒｙ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）によって精製した；列１は、形質転換されていないＥ．ｃｏｌｉ（陰性コントロール）であり；列２は、ｐＥＴ２３ａ／ＺｍＰＲＯ１ベクターを含むＥ．ｃｏｌｉであり；列３は、ｐＥＴ２３ａ／ＺｍＰＲＯ１ベクターおよびＩＰＴＧ（プロフィリンタンパク質の発現を誘導するために）を含むＥ．ｃｏｌｉであり；矢印は、単量体プロフィリンを示し；タンパク質分子量マーカー泳動を、右に示した（ｋＤａ）。
【図２】図２は、アフィニティーカラムで精製された、形質転換されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＺｅａ  ｍａｙｓ  Ｚｍ  ＰＲＯ１の写真を示す；（ａ）その結果は、図１における銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥと類似であるが、プロフィリンは、本明細書中で（材料および方法）に記載したようにアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって分離される；列１は、還元条件下（＋β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ））であり；矢印は、単量体プロフィリンの位置を示し；列２は、非還元条件（−ＢＭＥ）である；（ｂ）サンプルの対応するイムノブロットは（ａ）と平行してはしる；列３は、＋ＢＭＥであり；列４は、−ＢＭＥである；ウサギ抗−ＺｍＰＲＯ１と西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化された２次ヤギ抗−ウサギＩｇＧ法を使用して、免疫学的に異なるプロフィリンタンパク質を可視化した；タンパク質分子量マーカー泳動は、左に示される（ｋＤａ）。
【図３】図３は、植物プロフィリンのために開発された酵素結合イムノソルベント（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ）検定法からのウェルの写真を示す；ウェル１〜２、２次抗体のみを使用する；ウェル３〜４、１次抗体＋２次抗体を使用する；ウェル５〜６、１次抗体＋２次抗体＋Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＺｍＰＲＯ１プロフィリンを使用する；トリス緩衝化生理食塩水＋ＺｍＰＲＯ１プロフィリン（すなわち、陰性コントロール）は、測定可能な光学密度を与えなかった（図示せず）。
【図４】図４は、Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ＺｍＰＲＯ１プロフィリンおよびヒトＩｇＥのドットフィルトレーション（ｄｏｔ−ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）免疫ブロットを示す。プロフィリンは、アレルギーを示す患者由来の血清［血清（＋）］またはアレルギーを有さない患者由来の血清［血清（−）］；コントロール、ウサギ抗ＺｍＰＲＯ１抗体（陽性コントロール）の添加前に、単量体［＋β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）］または多量体（−ＢＭＥ）のいずれかを支持する条件下で、ドットフィルトレーション装置上に吸着および濾過された；比色アッセイの３連のウェルの測定を、全てのサンプル（バックグラウンド、−ＢＭＥ＋プロフィリン＋２次抗体＋金属ジアミノベンジジン基質；バックグラウンドは、＋ＢＭＥを含んだ場合、異ならなかった）について示す；暗さの強度についての定量的な値（平均±ＳＥＭ）を、本明細書中の材料および方法に記載されるように計算し、そして各行の隣に示す；スチューデントｔ検定によって、ある特定のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる対応する＋ＢＭＥ行に対する−ＢＭＥについて、＊Ｐ＜０．０５または＊＊Ｐ＜０．０１の有意水準が明らかになった。
【図５】図５は、プロフィリン自己会合のコンピューターに基づく分子分析を示す。結晶プロフィリンヒトプロフィリンＩの構造（Ｍｅｔｚｌｅｒら、１９９５）を、二量体化についての分子モデリングおよび「適合度」の分析のためにコンピューター上にダウンロードした。プロフィリン構造を分析するためのソフトウェアは、ＱＵＡＮＴＡ（コアプログラム；品質グラフィックスおよび立体化学的識見のための分子モデリング、グラフィックスおよび操作（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔ））、複数の物理化学操作（例えば、相互作用、反応、自由エネルギー計算、エネルギー最小化など）のためのＣＨＡＲＭｍ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｔ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ；Ｈａｒｖａｒｄ，ＭＡのＫａｒｐｌｕｓ研究室による）；ポアソン−ボルツマン計算、ブラウン動力学、ｐＫａ、酵素−基質相互作用のためのＵＨＢＤ（ＭｃＣａｍｍｏｎ研究室からのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｕｓｔｏｎ  Ｂｒｏｗｎｉａｎ  Ｄｙｎａｍｉｃｓプログラムパッケージソフト）；ＱＵＡＮＴＡとＵＨＢＤとのインターフェースのためのＵＨＢＤＩＮＴ；相同性モデリングを使用して１次アミノ酸配列から３次元構造を推測し、標的配列に対する相同配列の３次元結晶構造を検索（ｓｅａｒｃｈ）および検索（ｒｅｔｒｉｅｖｅ）し、そしてこのような構造に基づいてモデルを構築するためのタンパク質モデリングシステムのための、ＱＰＲＯＴＮを含んだ。確率の高い形態のプロフィリン自己会合を、図５に示す。記号：  灰色＝二量体を構成する２つのヒトプロフィリンＩ分子の構造を表し、それぞれが以下を含む：    白色＝アクチン結合ドメイン    黒色＝イオウ基が会合したシステイン残基３つの内側のシステイン（アミノ酸位置番号１６、７０、１２７）の間の可能なスルフヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）結合のうち、番号１６および１２７（それぞれが、異なるタンパク質部分からである）（２つの大部分灰色の相互接続された構造）は、近くにあり、対分子間で２つのジスルフィド架橋（Ｓ−Ｓ結合）を形成するに適した立体的一致に利用可能であった（矢印は、黒色の相互接続された分子を指す）。３次元のコンホメーションはまた、Ｓ−Ｓ結合を取り囲む比較的保護性のポケットを明らかにした。９０°近くの曲げが２つのプロフィリン間で観察され、アクチン結合ドメインとシステイン番号７０とはアクセス可能である（例えば、右のプロフィリン部分上の黒色の露出した分子として見られ得る）。プロフィリン−プロフィリン結合の結果として生じる独特の領域（括弧の間で示される）は、アレルギー／ＩｇＥ反応の推定エピトープを表し、従って、プロフィリン関連Ｉ型アレルギーの処置および診断のための新規なペプチドの開発のために使用され得るアミノ酸配列を有する。
【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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