(57)【要約】本発明は、微生物の増殖を阻害することによる抗汚染薬として有用な組成物であって、前記組成物は、スナギンチャク種（Zoanthus sp.）由来の抽出物および／またはその画分、および任意に脱臭剤を含む組成物、並びに約100%の微生物を汚染する抗細菌活性を有する前記抽出物およびその画分の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
スナギンチャク種（Zoanthus sp.）の抽出物の画分のいずれか一つを含む組成物であって、前記画分は、石油エーテル画分、クロロホルム画分、n-ブタノール画分、および水溶性画分である組成物。
【請求項２】
前記画分が、極性または無極性溶媒のいずれかを使用することによって調製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記活性のために好ましくは使用される動物種が、腔腸動物スナギンチャクである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、前記種の全部の体組織を使用することによって調製される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、特に細菌および珪藻に対して有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
微生物の増殖を阻害することによる抗汚染薬として有用な、スナギンチャク種からの抽出物およびその画分を製造するための使用であって、前記使用は：
(a) 洗浄した前記種の検体をメタノールに浸漬することと、
(b) 前記種の全部の体組織から粗抽出物を得ることと、
(c) 前記溶媒抽出物をデカントすることと、
(d) デカントした抽出物を濾過することと、
(e) 40℃で濾液を蒸発させて粗抽出物を濃縮することと、
(f) 極性を増大する溶媒を使用して、濃縮された粗抽出物を分画することと、
(g) 0.1〜5.0mg/6mm直径盤の間のメタノール溶液の範囲の濃度で、前記粗抽出物を、殺菌された濾紙盤上に導入することと、
(h) 前記盤から前記溶媒を蒸発させることと、
(i) 前記抽出物に微生物を曝露することと、
(j) 試験バクテリアをまいた寒天プレート上に前記盤を置くことと、
(k) 抽出物を含まない溶媒で対照を実施することと、
(I) 25〜32℃の間の範囲の温度において前記プレートを一晩インキュベートすることと、
(m) 増殖阻害ゾーンを測定することと、
(n) 前記抽出物を使用して、微生物の%阻害を決定することと、
(o) フラスコ内に100〜5000細胞/mlの間の範囲の濃度の初期細胞懸濁液と共に珪藻を配置することによって、粗抽出物および前記画分の抗珪藻活性を別々に決定することと、
(p) 前記細胞懸濁液に10〜5000ppmの間の範囲の濃度の前記粗抽出物を添加することと、
(q) 別々のフラスコ内に10〜500ppmの間の範囲の濃度の前記画分を添加することと、
(r) 12時間明るく、および次に12時間暗くする暴露条件で、25〜32℃の間の範囲の温度で、フラスコをインキュベートすることと、
(s)約6日後、すなわち珪藻の対数増殖期の間の後の%増殖阻害を決定することと、
を含む使用。
【請求項７】
前記活性のために好ましくは使用される前記種が、腔腸動物スナギンチャクである、請求項8に記載の使用。
【請求項８】
前記使用が、特に海環境において有効である、請求項8に記載の使用。
【請求項９】
前記使用が、特に汚染微生物に対して有効である、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
前記使用が、特に細菌および珪藻に対して有効である、請求項8に記載の使用。
【請求項１１】
5〜15の間の範囲の日数の間メタノールに前記洗浄された検体を浸す、請求項8に記載の使用。
【請求項１２】
前記種が、潮間に岩から得られる、請求項8に記載の使用。
【請求項１３】
デカントした抽出物が、ワットマン濾紙Iを通してろ過される、請求項8に記載の使用。
【請求項１４】
濾液が減圧を使用して蒸発される、請求項8に記載の使用。
【請求項１５】
前記使用が菌液のためにzobell海洋性寒天を使用する、請求項8に記載の使用。
【請求項１６】
細菌に対する前記抽出物の濃度が、好ましくは約0.5mg／mmの直径盤である、請求項8に記載の使用。
【請求項１７】
前記抽出物が好ましくは28℃でインキュベートされる、請求項8に記載の使用。
【請求項１８】
1mmより少ない増殖阻害ゾーンを記録する、請求項8に記載の使用。
【請求項１９】
前記分画する溶媒が、石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水溶のものを含む群より選択される、請求項8に記載の使用。
【請求項２０】
無極性の画分石油エーテルをアセトン（0.005〜.01 ml）に溶解する、請求項8に記載の使用。
【請求項２１】
細菌が、セレウス菌（Bacillus cereus）、B.サーキュランス（B. circulans）、シュードモナス・ベジキュラリス（pseudomonas vesicularis）、およびp.ピュチダ（p. putida）を含む群より選択される、請求項8に記載の使用。
【請求項２２】
抽出物の抗菌活性が100%である、請求項8に記載の使用。
【請求項２３】
珪藻が、ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）を含む群より選択される、請求項8に記載の使用。
【請求項２４】
抽出物で%増殖阻止を算出し、および／または50%以上の増殖阻止を有する画分が活性なものとみなされる、 請求項8に記載の使用。
【請求項２５】
前記抽出物が、350ppm以上の濃度で珪藻中の100%の阻害を示す、請求項8に記載の使用。
【請求項２６】
前記粗抽出物の画分の全てが珪藻に対する阻害力を示す、請求項8に記載の使用。
【請求項２７】
石油エーテル画分が、全ての画分で珪藻に対して最も有効である、請求項8に記載の使用。
【請求項２８】
石油エーテル画分が、約80ppm以上の濃度で珪藻に対して100%の阻害を示す、請求項8に記載の使用。
【請求項２９】
クロロホルム画分が、約200ppmの濃度で約100%の珪藻の阻害を示す、請求項8に記載の使用。
【請求項３０】
n-ブタノール画分が、150〜250ppmの間の範囲の濃度で珪藻に対して約100%の阻害を示す、請求項8に記載の使用。
【請求項３１】
水性画分が、140〜250ppm の間の範囲の濃度で、珪藻に対して70〜85%の間の範囲の阻害活性を示す、請求項8に記載の使用。
【請求項３２】
前記抽出物／画分が、非標的生物に対していかなる有毒な／有害な効果も有しない、請求項8に記載の使用。
【請求項３３】
寒天板拡散を使用して培養液中の微生物をアッセイする、請求項8に記載の使用。
【請求項３４】
前記使用が、食物中の汚染を防止するために使用される、請求項8に記載の使用。
【請求項３５】
前記使用が、生体試料中の汚染を防止するために使用される、請求項8に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の増殖を阻害することによる抗汚染薬として有用な組成物であって、前記組成物は、スナギンチャク種（Zoanthus sp.）由来の抽出物および／またはその画分、および任意に脱臭剤を含む組成物、並びに約100%の微生物を汚染する抗細菌活性を有する前記抽出物およびその画分の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
海生生物の化学的な抗汚染防御ストラテジーは、細菌、真菌、藻、無脊椎の幼生、その他などの生物体を汚染する標的のいずれかに対して直接（Amadeら、1987, Mar.Biol. 94, 271-275; Slatteryら、1995, J. Exp. Mar.Biol.Ecol, 190,61-77 ;Shellenberger and Ross, 1998, Northwest Science, 72(1), 23-33）または集落阻害、幼生の脱皮速度、光合成、その他同様のその他の汚染測定を使用して（Kon-yaら、1994, Fish. Sci, 60 (6), 773-775; Katoら、1995, Tetrahedron letters, 36 (12), 2133-2136; Mizobuchiら、1996, FisheriesSci 62(1), 98-100; Becerroら、1997,J Chem. Ecol, 23 (6), 1527-1547）研究されてきた。
【０００３】
海生生物の二次代謝産物産生についての情報は、大部分は化合物の単離および特徴づけについて論じており、これらの生態学的および生物学的な重要性についてはほとんど知られていない。近年、この方向で、一部の試みがウミトサカ、ヤギ目のサンゴ虫、藻、海綿、コケムシ、その他などのいくつかの群に対しなされたが(Targett, 1988, in Marine Biodeterioration, M. F. Thompson. , R. Sarojini. , R. Nagabhushanam. , A A Balkema eds, Rotterdam, 607-617; Standingら、1984,J Chem. Ecol, 10,823-824 ; Davisら、1991, Mar. Ecol, Prog. Ser, 72,117-123 ; Vitalinaら、1991, in Bioactive compoundsfrom marine organisms, M. F. Thompson. , R. Sarojini. , R. Nagabhushanam eds, Oxford and IBH Publishing Co. Pvt. Ltd, 63-68; Szewzykら、1991, Mar. Ecol. Prog. Ser, 75,259-265）、多くのその他の群では研究されていないままである。スナギンチャク（Zoanthids）（門腔腸動物;ファミリースナギンチャク目）は、このような、化学的防御ストラテジーに関してごくわずかな注目しか受けていない群である。
【０００４】
スナギンチャク（Zoanthids）は、深海の、着生の、コロニーを形成する、何千もの個々ポリープで構成される生物体である。いくつかの化学物質がスナギンチャク（Zoanthidsから単離されており、種々の薬理学的性質を有する（Moore and Scheuer, 1971, Science, 172, 495-498 ; Ciminoら、1973, ; Sturaroら、1982; Raoら、1985, J. Org. Chem, 50, 3757-3760 ; Bakusら、1986,JChem. Ecol, 12,951-987 ; Quinn, 1988, in Bioorganic Marine Chemistry, P. J. Scheuer ed. Vol. 2,25-27 ;Shigemoriら、1999,J Nat. Prods, 62 (2), 373）。しかし、天然の生息地におけるこれらの代謝産物の機能については、ほとんど何も知られていない。
【０００５】
ゴア（インドの西海岸）のアンジュナ（Anjuna）ビーチでは、これらは密度の高いマットとして生じ、大きな潮間領域にコロニーを作る。したがって、本発明の主な対象は、スナギンチャク種の抽出物を利用し、および抗汚染技術に有用な天然産物を同定するための、共通の微少汚染生物体、すなわち細菌および珪藻に対して抗汚染防御特性を有する産物を同定することである。
【０００６】
海環境に曝露されるどの表面も、生体高分子層の吸着で始まり、続いて細菌フィルムの形成、羽状の珪藻および原生動物の増殖という連続した変化を受ける（Baier, 1984, in Marine Biodeterioration : An Interdisciplinary Study, J. D. Costlow and R. C. Tipper, ed, Naval Institute Press, Anapolis, Maryland, 57-62; Mitchell and Kirchman, 1984, in MarineBiodeterioration : An Interdisciplinary Study, J. D. Costlow and R. C. Tipper, ed, Naval Institute Press,Anapolis, Maryland, 49-56; Wahl, 1989, Mar. EcoLProg. Ser, 58,175-189）。結果的に、微生物膜を形成する種々の細菌種は、定着して成体に変化する無脊椎動物の幼生を構成する後半の定着種に対して影響を及ぼし、阻害し、または時に効果を有さないであろう（Bakusら、1986, J. Chem. Ecol, 12,951-987）。微生物膜が幼生および藻類のムカゴの定着のために必要であることが示されるほとんどの場合には、細菌増殖の阻害は、微生物膜の形成を防げ、幼生の定着を阻害し、最終的に表面に表在生物がないままになる。
【０００７】
この試みでは、試験動物を収集し、粗メタノール抽出物を調製した。次いで、抽出物の抗汚染の潜在能力を、研究室において既知の汚染珪藻および細菌に対して探査した。粗抽出物の活性を試験した後に、極性を増大する溶媒を使用して分画した。これらの画分を、汚染する珪藻に対して試験した。評価の結果、スナギンチャク種の抽出物が抗汚染特性を有することが明らかとなる。
【０００８】
本発明の目的
本発明の主な目的は、スナギンチャク種由来の抽出物を含む組成物を開発することである。
【０００９】
本発明のもう1つの主な目的は、抗汚染特性を有する組成物を開発することである。
【００１０】
本発明のさらに、もう1つの目的は、動物スナギンチャク種の抽出物由来の画分を開発することである。
【００１１】
本発明のさらにもう1つの目的は、極性を増大する溶媒、すなわち石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水性画分を使用して、粗抽出物を分画することである。
【００１２】
本発明のさらにもう1つの目的は、汚染珪藻に対して最も有効である画分を同定することである。
【００１３】
本発明のさらにもう1つの目的は、スナギンチャク種由来の抽出物を含む組成物を調製することの使用を開発することである。
【００１４】
本発明のさらにもう1つの目的は、100%の抗細菌活性を有する前記組成物を調製することの使用を開発することである。
【００１５】
本発明のさらにもう1つの目的は、汚染微生物に対して100%の微生物増殖阻害活性を有する前記組成物を調製することの使用を開発することである。
【００１６】
本発明のさらにもう1つの目的は、抗微生物の活性を有する前記組成物を調製することにおける使用であって、前記活性は、特に海環境において有効である使用を開発することである。
【００１７】
本発明のさらにもう1つの目的は、抗微生物の活性を有する前記組成物を調製することにおける使用であって、前記活性は、特に細菌および珪藻に対して有効である使用を開発することである。
【発明の開示】
【００１８】
本発明の要旨
本発明は、微生物の増殖を阻害することによる抗汚染薬として有用な組成物であって、前記組成物は、スナギンチャク種由来の抽出物および／またはその画分、および任意に脱臭剤を含む組成物、並びに約100%の微生物を汚染する抗細菌活性を有する前記抽出物およびその画分の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の詳細な記載
したがって、本発明は、微生物の増殖を阻害することによる抗汚染薬として有用な組成物であって、前記組成物は、スナギンチャク種由来の抽出物および／またはその画分、および任意に脱臭剤を含む組成物、並びに約100%の微生物を汚染する抗細菌活性を有する前記抽出物およびその画分の使用に関する。
【００２０】
本発明の1つの態様において、スナギンチャク種由来の抽出物および／またはその画分、および任意に脱臭剤を含む組成物であって、前記組成物は、微生物に対する抗汚染薬として有用である。
【００２１】
本発明のもう1つの態様において、前記抽出物およびその画分は、極性または無極性のいずれかの溶媒を用いて調製される。
【００２２】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記活性のために好ましくは使用される動物種は、腔腸動物スナギンチャクである。
【００２３】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記組成物が、前記種の全部の体組織を使用することによって調製される。本発明のさらにもう1つの態様において、前記脱臭薬剤は、前記抽出物および画分の活性に対して影響を示さない。
【００２４】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記抽出物および／または画分および脱臭薬剤の比は、1：1〜1：10の間の範囲である。
【００２５】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記組成物は、特に細菌および珪藻に対して有効である。
【００２６】
本発明のさらなる態様において、微生物の増殖を阻害することによる抗汚染薬として有用な、スナギンチャク種からの抽出物およびその画分を製造するための使用。
【００２７】
本発明のもう1つの態様において、洗浄した種の検体をメタノールに浸漬する。
【００２８】
本発明のさらにもう一つの態様において、種の全部の体組織から粗抽出物を得る。
【００２９】
本発明のさらにもう1つの態様において、溶媒抽出物をデカントする。
【００３０】
本発明のさらにもう1つの態様において、デカントした抽出物を濾過する。
【００３１】
本発明のさらにもう1つの態様において、40℃で濾液を蒸発させて濃縮された粗抽出物を得る。
【００３２】
本発明のさらにもう1つの態様において、極性を増大する溶媒を使用して、濃縮された粗抽出物を分画する。
【００３３】
本発明のさらにもう1つの態様において、0.1〜5.0mg/6mm直径盤の間のメタノール溶液の範囲の濃度で、前記粗抽出物を、殺菌された濾紙盤上に導入する。
【００３４】
本発明のさらにもう1つの態様において、盤から溶媒を蒸発させる。
【００３５】
本発明のさらにもう1つの態様において、抽出物に微生物を曝露する。
【００３６】
本発明のさらにもう1つの態様において、試験細菌をまいた寒天プレート上に前記盤を置く。
【００３７】
本発明のさらにもう1つの態様において、抽出物を含まない溶媒で対照を実施する。
【００３８】
本発明のさらにもう1つの態様において、25〜32℃の間の範囲の温度において前記プレートを一晩インキュベートする。
【００３９】
本発明のさらにもう1つの態様において、増殖阻害ゾーンを測定する。
【００４０】
本発明のさらにもう1つの態様において、抽出物を使用して、微生物の%阻害を決定する。
【００４１】
本発明のさらにもう1つの態様において、フラスコ内に100〜5000細胞/mlの間の範囲の濃度の初期細胞懸濁液と共に珪藻を配置することによって、粗抽出物および前記画分の抗珪藻活性を別々に決定する。
【００４２】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記細胞懸濁液に10〜5000ppmの間の範囲の濃度の前記粗抽出物を添加する。
【００４３】
本発明のさらにもう1つの態様において、別々のフラスコ内に10〜500ppmの間の範囲の濃度の前記画分を添加する。
【００４４】
本発明のさらにもう1つの態様において、12時間明るく、および次に12時間暗くする暴露条件で、25〜32℃の間の範囲の温度で、フラスコをインキュベートする。
【００４５】
本発明のさらにもう1つの態様において、約6日後、すなわち珪藻の対数増殖期の間の後の%増殖阻害を決定する。
【００４６】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記活性のために好ましくは使用される前記種は、腔腸動物スナギンチャクである。
【００４７】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記使用は、特に海環境において有効である。
【００４８】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記使用は、特に細菌および珪藻に対して有効である。
【００４９】
発明のさらにもう1つの態様において、5〜15の間の範囲の日数の間メタノールに前記洗浄された検体を浸す。
【００５０】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記種は潮間に岩から得られる。
【００５１】
本発明のさらにもう1つの態様において、デカントした抽出物が、ワットマン濾紙Iを通してろ過される。
【００５２】
本発明のさらにもう1つの態様において、濾液が減圧を使用して蒸発される。
【００５３】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記使用は菌液のためにzobell海洋性寒天を使用する。
【００５４】
本発明のさらにもう1つの態様において、細菌に対する前記抽出物の濃度は、好ましくは約0.5mg／mmの直径盤である。
【００５５】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記抽出物は、好ましくは28℃でインキュベートされる
本発明のさらにもう1つの態様において、1mmより少ない増殖阻害ゾーンを記録する
本発明のさらにもう1つの態様において、前記分画する溶媒は、石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水溶のものを含む群より選択される。
【００５６】
本発明のさらにもう1つの態様において、無極性の画分石油エーテルをアセトン（0.005〜.01 ml）に溶解する
本発明のさらにもう1つの態様において、細菌は、セレウス菌（Bacillus cereus）、B.サーキュランス（B. circulans）、シュードモナス・ベジキュラリス（pseudomonas vesicularis）、およびp.ピュチダ（p. putida）を含む群より選択される。
【００５７】
本発明のさらにもう1つの態様において、抽出物の抗菌活性は、100%である。
【００５８】
本発明のさらにもう1つの態様において、珪藻は、ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）を含む群より選択される珪藻は、Navicula subinflataおよびNitzschia closteriumを含む基から選択される。  本発明のさらにもう1つの態様において、抽出物で%増殖阻止を算出し、および／または50%以上の増殖阻止を有する画分が活性なものとみなされる。
【００５９】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記抽出物は、350ppm以上の濃度で珪藻中の100%の阻害を示す。
【００６０】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記粗抽出物の画分の全てが珪藻に対する阻害力を示す。
【００６１】
本発明のさらにもう1つの態様において、石油エーテル画分が、全ての画分で珪藻に対して最も有効である
本発明のさらにもう1つの態様において、石油エーテル画分は、約80ppm以上の濃度で珪藻に対して100%の阻害を示す。
【００６２】
本発明のさらにもう1つの態様において、クロロホルム画分は、約200ppmの濃度で約100%の珪藻の阻害を示す
本発明のさらにもう1つの態様において、n-ブタノール画分は、150〜250ppmの間の範囲の濃度で珪藻に対して約100%の阻害を示す。
【００６３】
本発明のさらにもう1つの態様において、水性画分は、140〜250ppm の間の範囲の濃度で、珪藻に対して70〜85%の間の範囲の阻害活性を示す
本発明のさらにもう1つの態様において、前記抽出物／画分は、非標的生物に対していかなる有毒な／有害な効果も有しない、
本発明のさらにもう1つの態様において、寒天板拡散を使用して培養液中の微生物をアッセイする。
【００６４】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記使用は、食物中の汚染を防止するために使用される。
【００６５】
本発明のさらにもう1つの態様において、前記使用は、生体試料中の汚染を防止するために使用される。
【００６６】
本発明のさらなる態様において、本発明は、スナギンチャク種から抗汚染粗抽出物を製造するための方法であって、前記方法は、以下の工程を含む方法を提供する：
i)潮間に岩から生きている／新鮮なスナギンチャク種の検体の収集する工程。
【００６７】
ii）新鮮な海水で検体をきれいに洗浄し、メタノールに約10日間浸漬する工程。
【００６８】
iii)ワットマン濾紙Iを通してろ過し、40℃で減圧蒸発させて抽出物を粗残基に濃縮する工程。
【００６９】
ある態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、抗菌性の性質を示す。好ましい態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ピュミラス（Bacillus pumilus）、シュードモナス・ベジキュラリス（pseudomonas vesicularis）、およびシュードモナス・ピュチダ（pseudomonas putida）などの汚染細菌の増殖を阻害する。
【００７０】
もう１つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、全ての濃度で汚染珪藻の増殖を阻害する。
【００７１】
好ましい態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、600ppm以上の濃度で、ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）および400ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の珪藻の増殖を完全に阻害する。
【００７２】
本発明のさらにもう1つの態様において、極性を増大する溶媒、すなわち石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水性画分に基づいて、スナギンチャク種から粗抗汚染の抽出物を分画し、これら全ての分画の抗汚染特性を汚染珪藻ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して試験するための方法であって、前記方法は、生きている／新鮮な収集したZoanthusからの種粗製を得ることと、これらを海水できれいに洗浄することと、約10日間メタノールに浸漬することと、抽出物をワットマン濾紙Iを通してろ過することと、および40℃で減圧下で粗残渣に濃縮することとを含む。
【００７３】
ある態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水性画分の中で、溶媒の極性を増大することに基づいて分画される。
【００７４】
もう１つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物の全ての4つの画分は、汚染珪藻のナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の増殖を阻害する。
【００７５】
さらにもう一つの態様において、全ての画分のパーセント阻害は、濃度によって変化する。
【００７６】
さらにもう一つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物の石油エーテル画分は、汚染珪藻のナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の増殖を阻害するためにより有効である。
【００７７】
もう一つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物の石油エーテル画分は、160pm以上の濃度で、ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）および80ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の珪藻の増殖を完全に阻害する。
【００７８】
本発明のさらなる態様において、スナギンチャク種から粗抗汚染の抽出物を分画し、前記粗抽出物を汚染細菌および珪藻に対して試験するための方法。また、本発明は、粗抽出物の分画のため、および画分の汚染細菌に対する抗汚染特性を試験するための方法に関する。
【００７９】
スナギンチャク種からの抗汚染粗抽出物の調製のための方法であって、前記方法は、潮間に岩から生きている／新鮮なスナギンチャク種の検体の収集することと、新しい海水で検体をきれいに洗浄し、メタノールに約10日間浸漬することと、ワットマン濾紙Iを通してろ過し、40℃で減圧蒸発させて抽出物を粗残基に濃縮することとを含む。
【００８０】
本発明のさらにもう1つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、抗菌性の特性を示す。
【００８１】
本発明のさらにもう1つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ピュミラス（Bacillus pumilus）、シュードモナス・ベジキュラリス（pseudomonas vesicularis）、およびシュードモナス・ピュチダ（pseudomonas putida）などの汚染細菌の増殖を阻害する。
【００８２】
本発明のさらにもう1つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、全ての濃度で汚染珪藻の増殖を阻害する。
【００８３】
本発明のさらにもう1つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、600ppm以上の濃度で、ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）および400ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の珪藻の増殖を完全に阻害する。
【００８４】
本発明のさらにもう1つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、抗汚染薬として/水性環境において、潜在的用途を有するであろう。
【００８５】
本発明のさらにもう1つの態様において、極性を増大する溶媒、すなわち石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水溶画分に基づいて、スナギンチャク種から粗抗汚染の抽出物を分画し、これら全ての分画の抗汚染特性を汚染珪藻ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して試験するための方法であって、前記方法は、生きている／新鮮な収集したZoanthusからの種粗製を得ることと、これらを海水できれいに洗浄することと、約10日間メタノールに浸漬することと、抽出物をワットマン濾紙Iを通してろ過することと、および40℃で減圧下で粗残渣に濃縮することとを含む。
【００８６】
本発明のさらにもう1つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物は、石油エーテル、クロロホルム、ノルマル・ブタノール、および水性画分の中で、溶媒の極性を増大することに基づいて分画される。
【００８７】
もう１つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物の全ての4つの画分は、汚染珪藻のナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の増殖を阻害する。
【００８８】
さらにもう一つの態様において、全ての画分のパーセント阻害は、濃度によって変化する。
【００８９】
さらにもう一つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物の石油エーテル画分は、汚染珪藻のナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の増殖を阻害するためにより有効である。
【００９０】
もう一つの態様において、スナギンチャク種の粗抽出物の石油エーテル画分は、160ppm以上の濃度で、ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）および80ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の珪藻の増殖を完全に阻害する。
【００９１】
本発明のさらにもう1つの態様において、スナギンチャク種の全ての粗抽出画分は、より詳細には、石油エーテル画分は、水性環境における抗汚染薬として潜在的な使用を有するであろう。
【００９２】
本発明は、以下の実施例の助けによってさらに説明されるが、本発明の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
【実施例１】
【００９３】
アンジュナ・ビーチ（ゴア）から収集したスナギンチャク種を本発明に使用した。動物は、金属へらを使用して干潮期間の間に潮間の岩から慎重に掻き落とした。約2kgの湿重量の検体を研究に使用した。検体を新鮮な海水で徹底的に洗浄し、粗抽出物調製のために6〜10日間メタノールに浸漬した。抽出物を全ての体組織から得た。溶媒抽出物をデカントして、ワットマン濾紙Iを通してろ過し、40℃で減圧蒸発して、粗抽出物に濃縮した。これにより、約30gmの粗抽出物が得られた。本実施例は、スナギンチャク種から粗メタノール抽出物を調製するために使用される使用方法（useology）を図示する。
【実施例２】
【００９４】
5種の細菌単離体（全てが汚染群集に属している）をアッセイのために使した。細菌アッセイ法は、Zobell海洋性寒天（media, Mumbai）を使用して、寒天板の拡散の使用（Amadeら、1987, Mar. Biol, 94,271-275）によって行った。アッセイ法のために使用した菌種は、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ピュミラス（Bacillus pumilus）、シュードモナス・ベジキュラリス（pseudomonas vesicularis）、およびシュードモナス・ピュチダ（pseudomonas putida）であった。メタノールに調製した抽出物の0.5mg/6mmの直径盤の濃度を殺菌された濾紙盤上に導入した。溶媒の蒸発後、溶媒のみを含む試験細菌対象（二つ）と共にまいた寒天板の上においた。それぞれの濃度の4つの複製をアッセイのために使用し、平均値を示してある。プレートを室温(<<28℃)で一晩インキュベートした。増殖阻害ゾーンは、mmで測定した。（Berquist and Bedford, 1978, Mar. Biol, 46,215-221）。＜1mmの測定の阻害ゾーンは、記録しなかった。この活性の結果は、表1に示してある。本実施例は、スナギンチャク種の抽出物をを利用する抗菌性アッセイを実施するために使用される方法論を図示する。
【００９５】
表1．  スナギンチャク種の粗抽出物による抗菌性のスクリーニング  
【表１】
2005520840.tif 000002
+=1-2mmの直径の阻害  
【実施例３】
【００９６】
珪藻のナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）（いずれも汚染群集に属している）は、濃縮した海水中で維持した（Gentile and Johnsor, 1974, in, Proceedings on a Workshop on Marine Bioassays, convened by Gerarldine Cox, USA, 128）。約500〜1000細胞ml''1の初期細胞懸濁液で、活発に増殖する培養をアッセイ法に使用した。一連の抽出物の濃度は、200〜1000ppmの間の範囲である。蒸留水中に調製したそれぞれの抽出物の保存液(1 cc =50mg）の一定分量を、所望の実験的濃度および体積に対応して取り、125mlの三角フラスコに50mlに調整した。全てのアッセイ法は、4回行った。対照フラスコは、培地中の藻細胞のみを含んだ。フラスコは、12時間明るく、および次に12時間暗くする暴露条件で、室温（約28℃）でインキュベートした。増殖阻害は、約6日後、すなわち付着した藻類の細胞の数に関して対数増殖期の間の後に、セジウィック・ラフタ（Sedfwick rafter）を使用して決定し、表2には%増殖阻害として発現してある。
【００９７】
50%の発育阻止を生じ得る抽出物を活性なものとみなした。本実施例は、粗スナギンチャク種を利用して、抗珪藻アッセイ法を行うために使用される方法論を図示する。
【００９８】
表2：粗抽出物の異なる濃度での珪藻のパーセント増殖阻害。
【表２】
2005520840.tif 000003
【実施例４】
【００９９】
次いで、極性を増大する溶媒、すなわち石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水溶液を使用して、粗抽出物を4つの画分に分画した。全ての画分は、前述の使用を使用して、表3に示したとおりに活性について試験した。保存液の調製の間に蒸留水に不溶性であった無極性の画分は、アセトンに溶解した（0.005〜0.01ml）。これらのセットのための対照フラスコは、培地中にアセトン（保存液を作製するために添加したのと同じ体積）プラス細胞を含んだ。本実施例は、粗抽出物の分画のため、およびこれらを抗珪藻アッセイ法について試験するために使用される方法論を図示する。
【０１００】
表3  スナギンチャク種の粗抽出物の4つの画分の異なる濃度でのパーセント増殖阻害。
【表３】
2005520840.tif 000004
【実施例５】
【０１０１】
本実施例は、粗抽出物およびスナギンチャク種の画分を使用する抗珪藻アッセイ法における結果の処理に使用される方法論を図示する。
【０１０２】
パーセント増殖阻害は、以下の式を使用して算出した。
【表４】
2005520840.tif 000005
式中、O=零時間における種菌細胞の数  
A=6日後の対照フラスコの中の付着した細胞数  
B =6日後の実験フラスコの中の付着した細胞数  
本発明の利点：  
1.これは、スナギンチャク種の粗抽出物の抗汚染特性が同定された最初のものである。
【０１０３】
2. 実験室の研究では、スナギンチャク種の粗抽出物が、任意の海洋基層にコロニーを作る一次生物体である汚染細菌および珪藻の増殖を効率的に阻害することを示した。
【０１０４】
3. 粗抽出物から分離された全ての4つの画分、すなわち石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水性画分は、抗汚染特性を示した。
【０１０５】
4. 4つの画分の中で、石油エーテル画分は、汚染珪藻の増殖を阻害することにおいてより有効であることが見いだされた。
【０１０６】
5. これは天然物であるので、非標的生物に対していかなる中毒性／副作用も有さないであろう。
【０１０７】
6. これは、抗汚染の産物中に天然の化合物を形成する可能性を有する。
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月10日(2004.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の増殖を阻害することによる抗汚染活性を示す抗汚染組成物であって、スナギンチャク種（Zoanthus sp.）のメタノール性の（methanolic）粗抽出物から得られる1つまたは複数の画分および任意に脱臭剤を1：1〜1：10の範囲の比で含み、前記画分は、石油エーテル画分、クロロホルム画分、n-ブタノール画分、および水溶性画分のいずれかである組成物。
【請求項２】
前記使用される動物種が、腔腸動物スナギンチャクである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、特に細菌および珪藻に対して有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記石油エーテル画分が、全ての画分のうちで最も珪藻に対して有効である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記画分が、非標的生物体に対していかなる有毒な/有害な効果も有さない、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記使用が、食物中の汚染を防止するために使用される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記使用が、生物学的検体の汚染を防止するために使用される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記細菌種が、セレウス菌（Bacillus cereus）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ピュミラス（Bacillus pumilus）、シュードモナス・ベジキュラリス（pseudomonas vesicularis）、およびシュードモナス・ピュチダ（pseudomonas putida）からなる群より選択される、請求項3に記載の組成物。
【請求項９】
前記珪藻種が、ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）およびニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）からなる群より選択される、請求項3に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抽出物が、1から2mMの直径の阻害範囲で抗菌活性を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
前記石油エーテル画分が、約80ppm以上の濃度で珪藻に対して100%の阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ロロホルム画分が、約200ppmの濃度で約100%の珪藻の阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１３】
前記n-ブタノール画分が、150〜250ppmの間の範囲の濃度で珪藻に対して約100%の阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１４】
前記水性画分が、140〜250ppm の間の範囲の濃度で、珪藻に対して70〜85%の間の範囲の阻害活性を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抽出物の600ppmが、珪藻ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）の100%の増殖阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抽出物の400ppmが、珪藻ニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の100%の増殖阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１７】
前記石油エーテル画分が、160ppm以上の濃度でナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）に対して、および80ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して100%の阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１８】
前記クロロホルム画分が、200ppm以上の濃度でナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）に対して100%の阻害を、および200ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して少なくとも85％の阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項１９】
前記n-ブタノール画分が、160ppm以上の濃度でナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）に対して100%の阻害を示し、および160ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して少なくとも65％の阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項２０】
前記水性画分が、200ppm以上の濃度でナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）に対して、および160ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して67%以上の阻害を示す、請求項1に記載の組成物。
【請求項２１】
微生物の増殖を阻害することによる抗汚染薬として有用な、スナギンチャク種からの抽出物およびその画分を製造するための使用であって、前記使用法は：
(a) 洗浄した前記種の検体をメタノールに浸漬することと、
(b) 前記種の全部の体組織から粗抽出物を得ることと、
(c) 前記溶媒抽出物をデカントすることと、
(d) デカントした抽出物を濾過することと、
(e) 40℃で濾液を蒸発させて濃縮された粗抽出物を得て、極性を増大する溶媒を使用して濃縮された粗抽出物を分画することと、
を含む方法。
【請求項２２】
5〜15の間の範囲の日数の間メタノールに前記洗浄された検体を浸す、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記種が、潮間に岩から得られる、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記デカントした抽出物が、ワットマン濾紙Iを通してろ過される、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
前記濾液が減圧を使用して蒸発される、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
前記極性を増大する溶媒が、石油エーテル、クロロホルム、n-ブタノール、および水溶液からなる群より選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項２７】
前記無極性の画分石油エーテルを0.005〜0.01 mlのアセトンに溶解する、請求項21に記載の方法。
【請求項２８】
前記粗抽出物の画分の全てが珪藻に対する阻害活性を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項２９】
前記石油エーテル画分が珪藻に対して最も有効である、請求項21に記載の方法。
【請求項３０】
前記石油エーテル画分が、約80ppm以上の濃度で珪藻に対して100%の阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３１】
前記クロロホルム画分が、約200ppmの濃度で約100%の珪藻の阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３２】
前記n-ブタノール画分が、150〜250ppmの間の範囲の濃度で珪藻に対して約100%の阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３３】
前記水性画分が、140〜250ppm の間の範囲の濃度で、珪藻に対して70〜85%の間の範囲の阻害活性を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３４】
前記抽出物の600ppmが、珪藻ナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）の100%の増殖阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３５】
前記抽出物の400ppmが、珪藻ニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）の100%の増殖阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３６】
前記石油エーテル画分が、160ppm以上の濃度でナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）に対して、および80ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して100%の阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３７】
前記クロロホルム画分が、200ppm以上の濃度でナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）に対して100%の阻害を、および200ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して少なくとも85％の阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３８】
前記n-ブタノール画分が、160ppm以上の濃度でナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）に対して100%の阻害を示し、および160ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して少なくとも65％の阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項３９】
前記水性画分が、200ppm以上の濃度でナビキュラ・スビンフラタ（Navicula subinflata）に対して、および160ppm以上の濃度でニッチア・クロステリウム（Nitzschia closterium）に対して67%以上の阻害を示す、請求項21に記載の方法。
【請求項４０】
前記画分が非標的生物体に対していかなる有毒なまたは有害な効果も有さない、請求項2１に記載の方法。
【国際調査報告】
2005520840.tif 000006
2005520840.tif 000007
2005520840.tif 000008
2005520840.tif 000009