(57)【要約】本発明は、デンプン分解活性を有する新規なグリコシルヒドロラーゼ、およびこれらのグリコシルヒドロラーゼをコードする核酸、メタゲノムDNAから新規なグリコシルヒドロラーゼを特定しかつ単離するPCRに基づく方法、ならびにこれらの産業上の適用における種々の可能性に関する。とりわけ、このような酵素を含む洗濯組成物および清浄化組成物、ならびにそれらに対応する方法および可能な使用が、特に重要である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％一致するグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項２】
アミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％一致するグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項３】
アミノ酸配列が、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％一致するグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項４】
アミノ酸配列が、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％、極めて特に好ましくは100％一致するグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項５】
アミノ酸配列が、配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％一致するグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項６】
アミノ酸配列が、配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％一致するグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項７】
アミノ酸配列が、配列番号1〜３に示されるアミノ酸配列のうちの1つと少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼをコードする核酸。
【請求項８】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号4に示されるヌクレオチド配列と少なくとも75％一致する核酸。
【請求項９】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号4に示されるヌクレオチド配列と少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％一致する核酸。
【請求項１０】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号5に示されるヌクレオチド配列と少なくとも50％一致する核酸。
【請求項１１】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号5に示されるヌクレオチド配列と少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％、極めて特に好ましくは100％一致する核酸。
【請求項１２】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号6に示されるヌクレオチド配列と少なくとも60％一致する核酸。
【請求項１３】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号6に示されるヌクレオチド配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％一致する核酸。
【請求項１４】
請求項1〜6のいずれかに記載されるグリコシルヒドロラーゼから1つ以上の保存的アミノ酸置換によって入手可能である、グリコシルヒドロラーゼ。
【請求項１５】
アミノ酸配列が、配列番号308のコンセンサス配列に対して、特に13〜71位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項１６】
アミノ酸配列が、配列番号307のコンセンサス配列に対して、特に13〜101位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項１７】
アミノ酸配列が、配列番号305のコンセンサス配列に対して、特に9〜115位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項１８】
アミノ酸配列が、配列番号306のコンセンサス配列に対して、特に9〜113位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、配列番号7〜56として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号306のコンセンサス配列による9〜113位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項２０】
アミノ酸配列が、配列番号7〜56として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号305のコンセンサス配列による9〜115位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項２１】
アミノ酸配列が、配列番号107〜205として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号308のコンセンサス配列による13〜71位置に相当する部分領域にわたって、96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項２２】
アミノ酸配列が、配列番号107〜205として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号307のコンセンサス配列による13〜101位置に相当する部分領域にわたって、96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項２３】
請求項15〜22のいずれかに記載されたグリコシルヒドロラーゼから1つ以上の保存的アミノ酸置換によって入手可能であるグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項２４】
請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜22のいずれかに記載されたグリコシルヒドロラーゼの誘導体化、断片化、欠失変位または挿入変位によって入手可能であるグリコシルヒドロラーゼ。
【請求項２５】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、そのアミノ酸配列が、配列番号308のコンセンサス配列に対して、特に13〜71位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む核酸。
【請求項２６】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、そのアミノ酸配列が、配列番号307のコンセンサス配列に対して、特に13〜101位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む核酸。
【請求項２７】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、そのアミノ酸配列が、配列番号305のコンセンサス配列に対して、特に9〜115位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む核酸。
【請求項２８】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、そのアミノ酸配列が、配列番号306のコンセンサス配列に対して、特に9〜113位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む核酸。
【請求項２９】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、そのアミノ酸配列が、配列番号7〜56として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号306のコンセンサス配列による9〜113位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む核酸。
【請求項３０】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、そのアミノ酸配列が、配列番号7〜56として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号305のコンセンサス配列による9〜115位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む核酸。
【請求項３１】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、そのアミノ酸配列が、配列番号107〜205として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号308のコンセンサス配列による13〜71位置に相当する部分領域にわたって、96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む核酸。
【請求項３２】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、そのアミノ酸配列が、配列番号107〜205として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号307のコンセンサス配列による13〜101位置に相当する部分領域にわたって、96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む核酸。
【請求項３３】
請求項１４、２３または２４に記載のグリコシルヒドロラーゼをコードする核酸。
【請求項３４】
グリコシルヒドロラーゼをコードし、かつその配列が、配列番号57〜106、または206〜304として示されたヌクレオチド配列の1つに対して、好ましくはPCRプライマー配列によって特定されない位置で、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、特に好ましくは100％同一である核酸。
【請求項３５】
特にPCRプライマーであって、配列番号309〜316に示される配列の1つを有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
新規なグリコシルヒドロラーゼを同定および／または単離するための、請求項7〜13のいずれかまたは請求項25〜34のいずれかに記載の核酸の使用、または請求項35に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３７】
別のタンパク質への融合または結合のため、特に新規な酵素を開発するための、請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項３８】
別の核酸への融合のため、特に新規な酵素を開発するための、請求項7〜13のいずれかまたは請求項25〜34のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項３９】
請求項7〜13のいずれかまたは請求項25〜34のいずれかに記載された核酸領域のうちの1つを含むベクター。
【請求項４０】
請求項39に記載のクローニングベクター。
【請求項４１】
請求項40に記載の発現ベクター。
【請求項４２】
請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載されたタンパク質もしくは誘導体のうちの1つを発現するか、またはその発現を誘導され得、好ましくは、請求項39または41に記載の発現ベクターを用いる、宿主細胞。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、細菌、特に、周囲の培地へ前記生成されたタンパク質または誘導体を分泌する細菌であることを特徴とする請求項42に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
前記宿主細胞がグラム陽性細菌であることを特徴とする請求項43に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
前記宿主細胞は、Bacillus属、好ましくはBacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis、またはBacillus alcalophilus種に属することを特徴とする請求項44に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
前記宿主細胞は、真核生物細胞、特に、前記生成されたタンパク質を翻訳後に改変する真核生物細胞であることを特徴とする請求項42に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
ａ）メタゲノムＤＮＡが種々の存在環境から得られる、
ｂ）該メタゲノムＤＮＡが好適なクローニングシステム中にサブクローニングされる、
ｃ）この方法で生成された遺伝子ライブラリーが、新規なグリコシルヒドロラーゼについてのスクリーニングに供される、
ことを特徴とする新規なグリコシルヒドロラーゼを同定および単離するための方法。
【請求項４８】
前記メタゲノムＤＮＡの生物学的多様性を、グリコシルヒドロラーゼ特異的PCRプライマーを用いるPCRタイピングおよび引き続く配列決定によって決定することを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記工程c）におけるスクリーニングを、グリコシルヒドロラーゼ活性についての選択によって実行することを特徴とする請求項47または48に記載の方法。
【請求項５０】
前記工程c）におけるスクリーニングを、請求項48に従って生成されたPCRフラグメントに基づくプローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションによって実行することを特徴とする請求項48に記載の方法。
【請求項５１】
表1に列挙されたPCRプライマーから選択されたグリコシルヒドロラーゼ特異的PCRプライマー、好ましくはプライマー対GEX24／26およびGEX23／25から選択されるPCRプライマーを使用することを特徴とする請求項48に記載の方法。
【請求項５２】
請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載されたグリコシルヒドロラーゼを含むことを特徴とする、洗濯組成物または清浄化組成物。
【請求項５３】
0.000001wt％〜5wt％、さらに好ましくは0.00001〜4wt％、0.0001〜3wt％、0.001〜2wt％または0.01〜1wt％のグリコシルヒドロラーゼを含むことを特徴とする請求項52に記載の組成物。
【請求項５４】
請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼを、前記方法工程の少なくとも1つにおいて、好ましくは請求項52または53に記載の組成物中において、特に好ましくは機械中で用いることを特徴とする繊維製品または硬質表面を清浄化するための方法。
【請求項５５】
前記グリコシルヒドロラーゼを、0.01mg〜400mg、好ましくは0.02mg〜200mg、特に好ましくは0.02mg〜100mgの量で、該酵素によって特徴付けられる前記方法工程において用いることを特徴とする請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記グリコシルヒドロラーゼを、洗浄液１リットルあたり0.0005〜20mg、好ましくは0.005〜10mg、特に好ましくは0.005〜8mgの濃度で用いることを特徴とする請求項54または55に記載の方法。
【請求項５７】
好ましくは、繊維製品または硬質表面を清浄化するための請求項52または53に記載の洗濯組成物または清浄化組成物における、請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項５８】
前記グリコシルヒドロラーゼを、0.01mg〜400mg、好ましくは0.02mg〜200mg、特に好ましくは0.02mg〜100mgの量で用いることを特徴とする請求項57に記載の使用。
【請求項５９】
前記グリコシルヒドロラーゼを、洗浄液１リットルあたり0.0005〜20mg、好ましくは0.005〜10mg、特に好ましくは0.005〜8mgの濃度で用いることを特徴とする、請求項57または58に記載の使用。
【請求項６０】
繊維製品の製造における原料または中間製品の処理のため、特に綿の糊抜きのための、請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項６１】
請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼを使用することを特徴とする、デンプンの液化のため、特にエタノールの生成のための方法。
【請求項６２】
直鎖状および／または短鎖のオリゴ糖を生成する、請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項６３】
シクロデキストリンを加水分解する請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項６４】
多糖類担体またはシクロデキストリンから低分子量化合物を放出する請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用で。
【請求項６５】
食品および／または食品添加物の製造のための請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項６６】
動物の飼料および／または動物の飼料の添加物を生成するための請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項６７】
デンプン含有接着性結合を破壊する請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼの使用。
【請求項６８】
請求項1〜6のいずれかまたは請求項15〜24のいずれかに記載のグリコシルヒドロラーゼを使用することを特徴とする、一時的な糊付けのための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプン分解活性を有する新規なグリコシルヒドロラーゼ、およびこれらのグリコシルヒドロラーゼをコードする核酸、メタゲノムDNAから新規なグリコシルヒドロラーゼを特定しかつ単離するPCRに基づく方法、ならびにこれらの産業上の適用における種々の可能性に関する。とりわけ、このような酵素を含む洗濯組成物および清浄化組成物、ならびにそれらに対応する方法および可能な使用が、特に重要である。
【背景技術】
【０００２】
グリコシルヒドロラーゼは、２つ以上の炭水化物の間、または炭水化物と非炭水化物官能基との間のグリコシド結合を加水分解する極めて多様な群の酵素を指す。
【０００３】
特定の工業的および技術的な目的のグリコシルヒドロラーゼは、α−アミラーゼ（E.C.3.2.1.1）であり、これはデンプンおよびデンプン様ポリマー、例えば、アミロース、アミロペクチンまたはグリコーゲンなどのポリマーの内側に位置するα−1,4−グリコシド結合を加水分解して、デキストリンおよびβ−1,6−分岐オリゴ糖を形成する。それらは、工業的に利用される全ての酵素のなかでも最も重要である。これには以下の２つの理由が存在する：第一に、それらは通常、多くの基質分解酵素と同様、微生物によって周囲の培地中に放出され、その結果、発酵および培養培地からの精製によって比較的わずかな労力によって工業的規模で入手できる。第二に、アミラーゼは、広範な用途において必要とされている。
【０００４】
α−アミラーゼの主な工業的用途は、グルコースシロップの産生である。他の用途は、例えば、洗濯組成物および清浄化組成物における活性成分として、繊維製品の製造における原料の処理のため、接着剤の生成のため、または糖含有食品もしくは食品添加物の生成のための用途である。
【０００５】
工業において特に集中的に使用されるアミラーゼの一例は、Bacillus licheniformis由来のα−アミラーゼであって、これは、Termamyl（登録商標）の商標名でNovozymes A／S、Bagsvaerd, Denmarkから供給される。B.subtilis、またはB.amyloliquefaciensから入手し、かつ米国特許第1 227 374号に開示されているアミラーゼは、BAN（登録商標）の名称で同じ会社から市販されている。
【０００６】
このアミラーゼ分子およびその近位の関係は、特定の用途において酵素的特性である種々の分子生物学的改変の補助による、最適化の目的に基づいた多数の発明においてさらに開発されている。このような最適化は、例えば、基質特異性、種々の反応条件下の酵素の安定性、または酵素活性自体に関連し得る。言及され得るこのような最適化の例は、以下の特許文献である：繊維製品のサイズ化についての欧州特許0410498 BI、およびデンプンの液化についてのWO 96／02633 A1。
【０００７】
ほぼ未知である開始酵素のみの単なる最適化からなる開発は、達成され得る結果に制限される可能性があるので、それに並行して、他の天然の供給原由来の匹敵する酵素について集中的な研究が行なわれている。同定されているのは、食品、化粧品および医薬の製造のための例えば、Pimelobacter、PseudomonasおよびThermus由来のデンプン切断酵素（欧州特許 0 636 693 A2）、高温、または強酸性の反応条件（EP 0 727 485 A1、およびWO 96／02633 A1）でのデンプンの液化のためのRhizobium、Arthrobacter、BrevibacteriumおよびMicrococcus（欧州特許0 628 630 A2）由来、Pyrococcus（WO 94／19454 A2）およびSulfolobus由来の同じタイプの酵素である。アルカリpH値での使用のためのアミラーゼは、Bacillus sp.において発見されている（WO 95／26397 A1、およびWO 97／00324 A1）。洗濯組成物に対するそれらの低い感度の故に、種々のBacilli由来の他のアミラーゼ（EP 0 670 367 A1）が洗濯組成物または清浄化組成物における使用に好適である。
【０００８】
各々の領域の適用のために天然の供給源から単離された酵素のさらなる最適化を、例えば、分子生物学的方法（例えば米国特許第5171673号またはWO 99／20768 A1のような）、または化学的修飾（ドイツ特許第4013142号A1）によって行ってもよい。例えば、特許出願WO 99／43793 A1は、既知のNovamyl（登録商標）α−アミラーゼのさらなる開発を記載している。Novamyl（登録商標）と既知のシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTases）との間の配列の類似性をここで利用して、分子生物学的技術の補助によって、多数の関連分子を構築する。これらは、さらなるCGTase特異的なコンセンサス配列（ボックス）および機能を有するα−アミラーゼ、または逆にα−アミラーゼに典型的なさらなる領域および機能を有するCGTase、あるいはこの２つの分子のキメラを含む。この開発のポイントは、これらの適用についてNovamyl（登録商標）を最適化することである。
【０００９】
既知のグリコシルヒドロラーゼおよび特にアミラーゼの最適化に由来する新しい酵素は、それらの性質によって特性が限定される。なぜならそれらは、グリコシルヒドロキシラーゼの「適応度地形」において局所的最適条件を示すからである。可能性としてはさらに良好な局所的最適条件をさらに見出すためには、このような局所的最適条件をそれ自体が示すか、またはその方向への合理的な努力によって最適化することができる、他のオリジナル酵素から開始することが必要である。しかし、このようなオリジナル酵素であり得る新規なグリコシルトランスフェラーゼの発見には、古典的な微生物学的スクリーニングの経路による、所定の株の単離が必要である。しかし、存在する全ての微生物のうち95％より多くを培養することはできない。そのため、アミラーゼを含む、これらの微生物に存在する新規なグリコシルヒドロラーゼは、現在まで特徴づけはなされていない。
【００１０】
α−アミラーゼは代表的には、約55kDaの分子量を有する単量体酵素である。中央のドメインは、α／βバレル構造（TIMバレル）を有するが、これは現状の知識によれば、最も広範なタンパク質折り畳みモチーフに相当する。直線状タンパク質鎖は、各々の場合、交互の配列に存在する8つのα−ヘリックスおよび8つのβ−プリーツシートセグメント（βシート）からなり、このβ−プリーツシートが平行方向で環の形態に位置し、かつその外側がα−ヘリックスに囲まれるような方式で三次元的に折り畳む。
【００１１】
この酵素活性はおそらく、個々のヘリックスおよびβプリーツシートのC末端に位置するアミノ酸残基に由来する。
【００１２】
Bacillus licheniformis由来のターマミル（Termamyl）として既知のアミラーゼの例については、アミノ酸残基はアスパラギン酸231（一般的塩基触媒）およびグルタミン酸261（一般的酸触媒）である。もともと一般的な酸触媒とみなされた残基Asp328は、近年の研究によれば、活性部位において静電気的条件に対する本質的な影響を伴う。例えばHis 210のようなさらなる残基は、基質またはさらなる剤、例えば、Ca2+イオンなどの結合に関与すると考えられる。
【００１３】
アミラーゼそのもの以外に、さらなる酵素が、アミラーゼの上位群に含まれる。例えば、α−1,6−グルコシダーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTases）、イソアミラーゼ、ネオプルラナーゼ、グリコーゲン脱分岐酵素、デキストラングルコシダーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼ。
【００１４】
特定の構造的エレメントと比較的小型の独立したドメインの形態との間に挿入されるタンパク質ループによって、ある場合には広範に異なる基質結合特異性がもたらされる。
【００１５】
従って、Bドメインが存在して、β−プリーツシート3とヘリックス3との間に位置する。α−アミラーゼ、ならびにそれに密接に関連するα−1,6−グルコシダーゼおよびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（CGTases）の場合、これは、約40アミノ酸を含むが、また例えば、グルカン−脱分岐酵素の場合、270アミノ酸を含み得る（Jespersen, H.M.；E.A.MacGregor、B.Henrissat、M.Sierks、およびB.Svensson：「デンプンおよびグリコーゲンの脱分岐および分岐酵素（Starch- and Glycogen-Debranching and Branching Enzyme）」J.of Protein Chemistry、第12巻、791〜805頁、1993）。
【００１６】
さらなるドメインがC末端、例えば、全ての酵素におけるCドメイン、および1つ以上のさらなるDまたはEドメイン（例えば、CGTasesにおいて）に位置する。これらは同様に、基質結合に関与すると考えられる。
【００１７】
この一般的に類似の構造にかかわらず、この直鎖状タンパク質鎖の配列相同性は、広範に変化し、これによって、特徴的な配列セグメントを、新規なアミラーゼについて効率的な方式で検索するために用いることができるプローブとして規定することは、極度に困難になる。
【００１８】
折り畳みを担う構造的エレメントはまた、一次構造における相同性なしに形成することができる。従って、Bacillus licheniformisおよびBacillus amyloliquefaciens由来のアミラーゼは、80％を上回って同一である。対照的に、細菌、動物および植物起源の全てのアミラーゼにおよぶ相同性は、10%未満である（Nakajimaら、Appl. Microbiol. Biotechnol., 23巻、355〜360（1986））。
【００１９】
さらなるTIMバレルタンパク質は、同一のタンパク質折り畳み構造にもかかわらず、いずれにしてももはや相同ではない。
【００２０】
従って、相同性の観点からほとんど類似性を有さないタンパク質は、それにもかかわらず、含まれるアミノ酸残基の触媒性反応に必要である同様のタンパク質折り畳みパターンおよび好適な位相学的配置が存在する限り、同一であるかまたは密接に関係する酵素活性を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
まとめると、潜在的に興味深いグリコシルヒドロラーゼを生成する多くの微生物を培養することが不可能であることによって、グリコシルヒドロラーゼのファミリー内にしばしば存在するわずかな小さい配列相同性、その両方によって、新規なグリコシルヒドロラーゼの発見には大きな問題が存在するということができる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
驚くべきことに、新規なグリコシルヒドロラーゼは、環境的なサンプル、いわゆるメタゲノムDNAからDNAをスクリーニングすることによって特徴付けることが可能で、かつ工業的に利用可能な方式で提供可能であるということが見出された。
【００２３】
従って、本発明の相互に独立した態様は、配列識別番号（配列番号）1、2および3として本明細書において以下で列挙される配列に詳述される新規なグリコシルヒドロラーゼ、それに対して実質的に相同であるグリコシルヒドロラーゼ、ならびに保存的アミノ酸置換によって配列1〜3に記載される配列から得ることができるグリコシルヒドロラーゼである。本発明のさらなる態様は、前述のグリコシルヒドロラーゼの1つをコードする核酸（DNAまたはRNA）である。
【００２４】
本明細書中、以降において「少なくともX％」という形の表現は、「Xおよび100の極値、ならびにその間の全ての整数および非整数のパーセンテージを含むX〜100％」を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
タンパク質とは、本発明の目的については、天然のアミノ酸からなるポリマーであって、実質的に線状の構造を有し、ほとんどの場合、その機能を発揮するために3次元構造をとるポリマーを意味する。本明細書においては、19個のタンパク質原性の天然に存在するLアミノ酸が、国際的に用いられる1文字コードおよび3文字コードによって示される。
【００２６】
酵素とは、本発明の目的については、特定の生化学的機能を発揮するタンパク質を意味する。グリコシルヒドロラーゼとは、グリコシド結合を加水分解するタンパク質を意味する。好ましい、工業的に重要なグリコシルヒドロラーゼは、デンプン分解タンパク質またはデンプン分解機能を有する酵素であり、すなわち、多糖類のα−1,4−グリコシド結合、特に多糖類の内部に位置する結合を加水分解する酵素のことをいう。これらはまた、α−1,4−アミラーゼ（E.C.3.2.1.1）、または短縮してα−アミラーゼとも呼ばれる。
【００２７】
多くのタンパク質が、いわゆるプレタンパク質として、すなわちシグナルペプチドとともに産生される。次いで、この後者の単一のペプチドとは、タンパク質のN末端部分であって、その機能が通常は、産生細胞から周辺質へまたは周囲の媒体への産生されたタンパク質の輸送、および／またはその正確な折り畳みを保証することであるタンパク質のN末端部分を意味する。実質的に、このシグナルペプチドは、天然の条件下でシグナルペプチダーゼによって残りのタンパク質から切断されて、その結果このタンパク質は、最初に存在したN末端アミノ酸なしにその実際の触媒活性を発揮する。
【００２８】
工業的適用において、成熟ペプチド、すなわちその産生後にプロセシングされた酵素は、プレタンパク質に対するそれらの酵素活性の故に好ましい。
【００２９】
プロタンパク質は、タンパク質の不活性な前駆体である。シグナル配列を有するその前駆体は、プレプロタンパク質と呼ばれる。
【００３０】
核酸とは、本発明の目的については、天然にヌクレオチドから構成され、かつ情報の担体として働く分子であって、タンパク質または酵素における直鎖状アミノ酸配列をコードする分子を意味する。それらは、一本鎖の形態であっても、この一本鎖に相補的な一本鎖の形態であっても、または二本鎖の形態であってもよい。分子生物学的操作のためには、天然に、さらに耐久性のある情報の担体として、核酸DNAが好ましい。対照的に、RNAは、例えば、発現細胞においてのような天然の環境で本発明を実施するために生成される。なぜなら、本発明に必須のRNA分子は同様に、本発明の実施形態に相当するからである。
【００３１】
DNAの場合、各々の場合における3つの可能性のあるリーディングフレームの全てにおいて2つの相補鎖の配列を考慮しなければならない。異なるコドントリプレットが、同じアミノ酸をコードすることが可能で、その結果特定のアミノ酸配列が、わずかな同一性しか示すことができない複数の異なるヌクレオチド配列に由来し得る（遺伝子コードの縮重性）という事実を考慮しなければならない。さらに、異なる生物体は、これらのコドンの用法において相違を示す。これらの理由によって、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列は両方とも保護の範囲としての考慮に包含されるべきであり、示されたヌクレオチド配列は、各々の場合において、特定のアミノ酸配列をコードする単なる一例であるとみなされるべきである。
【００３２】
タンパク質に相当する情報単位も、本発明の目的に関して遺伝子とみなされる。
【００３３】
当業者は、現在一般に既知である方法、例えば、分子生物学および／またはタンパク質化学の標準的な方法と組み合わせた化学合成またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）などによって、完全な遺伝子でありさえすれば、既知のDNAおよび／またはアミノ酸配列に基づいて対応する核酸を調製することが可能である。このような方法は、例えば、「Lexikon の生化学（Lexikon der Biochemie）」、Spektrum Akademischer Verlag、Berlin、1999、第1巻、267〜271頁、および第2巻、227〜229頁に開示される。
【００３４】
例えば、それ自体既知である分子生物学の方法によってもたらされ得る変更のような、ヌクレオチド配列における変更は、変異と呼ばれる。変更の性質に依存するが、既知の例は、欠失、挿入もしくは置換の変異、または異なる遺伝子もしくは遺伝子の一部が一緒に融合される変異である；これらは遺伝子変異である。関連の生物体は変異体と呼ばれる。変異した核酸に由来するタンパク質は、改変体と呼ばれる。従って、例えば、欠失、挿入、置換の変異、または融合は、欠失変異、挿入変異、置換変異の遺伝子または融合遺伝子をもたらし、タンパク質レベルで、対応する欠失、挿入または置換の改変体または融合タンパク質をもたらす。
【００３５】
フラグメントとは、天然のタンパク質または完全に翻訳された遺伝子に相当するタンパク質よりも小さく、例えば合成的に入手することも可能である、全てのタンパク質またはペプチドを意味する。それらはそれらのアミノ酸配列に基づいて関連する完全なタンパク質に割り当てられ得る。それらは、例えば、同一の構造をとってもよいし、またはタンパク質分解活性、もしくは例えば、基質の複合体生成のような部分的活性を発揮してもよい。出発タンパク質のフラグメントおよび欠失改変体は、原則的に同様である。しかし、フラグメントとは比較的小さい小片を示す傾向であり、欠失変異体は、短い領域のみ、すなわち個々の部分的機能のみを欠く傾向である。
フラグメントは、核酸レベルで部分的配列に対応する。
【００３６】
化学的タンパク質またはハイブリッドタンパク質とは、本発明の目的については、同じ生物体由来または異なる生物体由来の異なるポリペプチド鎖に天然に由来するエレメントから構成されるタンパク質を意味する。この手順はまた、シャッフリングまたは融合変異誘発とも呼ばれる。このような融合のポイントとは、例えば、融合されるタンパク質部分の補助によって特定の酵素機能をもたらすか、またはそれを改変することであり得る。これに関して、このようなキメラタンパク質が単一のポリペプチド鎖から構成されるか、または異なる機能を分配し得る複数のサブユニットから構成されるかは、本発明の目的にとって重要ではない。後者の代替を実施するため、例えば、単一のキメラポリペプチド鎖を、特定のタンパク質分解性切断によって翻訳後に、または単なる精製工程後に、複数に分解することが可能である。
【００３７】
挿入変異によって得られたタンパク質とは、それ自体既知の方法によって、核酸フラグメントまたはタンパク質フラグメントの出発配列への導入を通じて得られた改変体を意味する。原則的にそれらの類似性の故に、それらはキメラタンパク質に割り当てられるべきである。それらは、完全なタンパク質のサイズに対する、未変化のタンパク質部分のサイズの比においてのみ、後者とは異なる。このような挿入変異したタンパク質における外来タンパク質の割合は、キメラタンパク質よりも少ない。
【００３８】
逆位変異誘発、すなわち、配列の部分的逆位は、欠失および挿入の両方の特別な形態とみなすことができる。同じことが、分子の種々の部分のもとからのアミノ酸配列とは異なる再分類にあてはまる。これは、もとからのタンパク質の欠失改変体、挿入改変体、およびシャッフリング改変体とみなすことができる。
【００３９】
誘導体とは、本発明の目的については、タンパク質であって、その純粋なアミノ酸鎖が化学的に修飾されているタンパク質を意味する。このような誘導体化は、例えば、宿主生物体によるタンパク質生合成と関連して生物学的に生じる。この目的のために分子生物学の方法を使用することができる。しかし、それらはまた化学的に、例えば、アミノ酸の側鎖の化学的な変換によって、またはこのタンパク質に対する別の化合物の共有結合によって実施することもできる。このような化合物はまた、例えば、本発明のタンパク質に対して、例えば二官能性化合物を介して結合される他のタンパク質であってもよい。このような修飾は、例えば、基質特異性または基質に対する結合の強度に影響し得るか、または結合する物質がインヒビターである場合は、酵素活性の一時的なブロックをもたらし得る。このことは、例えば、貯蔵の期間について価値があり得る。誘導体化とは、同様に、高分子支持体に対する共有結合を意味する。
【００４０】
タンパク質はまた、抗血清または特定の抗体との反応を介して免疫学的に関連するタンパク質の群に含まれ得る。それらがある群に属することは、抗体によって認識される同じ抗原決定基を有することによって識別される。
【００４１】
本発明の目的に関して、全ての酵素、タンパク質、フラグメントおよび誘導体は、明確にそうであると述べられる必要がない限り、タンパク質の一般名称として包含される。
【００４２】
ベクターとは、本発明の目的に関して、核酸からなるエレメントであって、かつ目的の遺伝子を特徴付ける核酸領域を含む、エレメントである。それらは、複数の世代または細胞分裂にわたって、種または細胞株中で残りのゲノムとは独立して複製する安定な遺伝的エレメントとして、目的の遺伝子を確立することができる。ベクターは、特に細菌において用いられる場合、特異的なプラスミドであって、これは環状の遺伝子エレメントと呼ばれる。遺伝子操作においては、一方の、貯蔵のために、従ってある程度までは遺伝子操作のためにも用いられる、クローニングベクターと呼ばれるベクターと、もう一方の、宿主細胞において目的の遺伝子を確立する機能を実施する、すなわち関連のタンパク質の発現が可能であるベクターとの間を区別する。
【００４３】
考慮の対象である酵素の酵素活性は、例えば、一般的に利用可能なデータベースに寄託される既知の酵素との比較によって、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列から推測することができる。この活性は、実際の反応に関与しないタンパク質の他の領域によって質的にまたは定量的に改変され得る。これは、例えば、酵素安定性、活性、反応条件、または基質特異性に影響し得る。
【００４４】
このような比較は、考慮の対象であるタンパク質のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における類似の配列を相互に関連付けることによって行なう。これは、相同性決定と呼ばれる。関連位置の表上の相関はアラインメントと呼ばれる。ヌクレオチド配列の解析において、次には、相補鎖および各々の場合の可能性のあるリーディングフレームの3つ全て；同様に、遺伝コードの縮重性および生物体に特異的なコドン用法を考慮しなければならない。アラインメントは現在、例えばFASTAまたはBLASTアルゴリズムのようなコンピュータープログラムによって作製される。この手順は例えば、Science、第227巻、1435〜1441頁において、D. J. LipmanおよびW. R. Pearson（1985）によって記載される。
比較された配列が一致する、コンパイル処理の全ての位置は、コンセンサス配列と呼ばれる。
【００４５】
このような比較によってまた、相互に比較された配列の類似性または相同性について行なわれるべき状態が可能になる。これは同一性パーセント、すなわち、同じ位置での同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合として表現される。相同性のさらに広範な定義としては、この値の保存的アミノ酸置換が挙げられる。ここで用いられる用語は類似性パーセントである。このような状態は、完全なタンパク質もしくは遺伝子、または個々の領域についてのみ用いることができる。
【００４６】
アラインメントの作製は、配列空間を規定する最初の工程である。この仮定上の空間は、個々の位置における配置換えによってもたらされ、そのアラインメントの関連する個々の位置に存在する全てのバラツキを考慮することによって生じる、全ての配列を含む。あらゆる仮定上可能なタンパク質分子が、この配列空間においてあるポイントを形成する。従って、例えば、実質的に同一であるが、各々の場合に2つの異なる位置でのみ2つの異なるアミノ酸を有する2つのアミノ酸配列は、4つの異なるアミノ酸配列の配列空間の基礎となる。ある空間で各々の個々の配列についてさらに相同な配列が見いだされる場合、極めて大きい配列空間が得られる。極めて相同性が低い配列はまた、各々の場合にこのような高い相同性が対で存在することによって、ある配列空間に属することが認識され得る。
【００４７】
異なるタンパク質の相同な領域とは、一次アミノ酸配列における一致によって認識され得る、同じ機能を有する領域である。これは、完全に同一である限り、ボックスと呼ばれる極めて小さい領域にまたがり、これはわずか２〜３のアミノ酸しか含まず、通常、全体的活性に必須である機能を発揮する。相同な領域の機能とは、完全なタンパク質によって発揮される機能のごくわずかな部分的機能、例えば、基質の複合体形成または遷移複合体のための個々の水素結合の形成などを意味する。
【００４８】
本発明の目的については、スクリーニング（ハイブリダイゼーションスクリーニングまたはDNAスクリーニング）と、活性アッセイとの間を区別しなければならない。形質転換体の「スクリーニング」とは一般に、所望の形質転換事象が生じているクローンを認識するのに好適な検出反応を意味する。従って、通常これは、例えば、周知のブルー−ホワイト選択において、組み換えの後に形質転換体が得られるか、またはもはや存在しないかという生化学的活性の検出を行なうことが目的である。このタイプの生化学的検出反応は、本発明の目的に関しては活性アッセイとも呼ばれる。
【００４９】
しかし、スクリーニングとはまた、特定の核酸を有する遺伝子ライブラリーの検索、従って、可能性としては、実質的に同様の核酸配列の同定を示す。これは、例えば、先行技術から十分に周知であるサザンブロットまたはノーザンブロットハイブリダイゼーションによって行なう。この用語はまた、生物体または核酸の集合から新規な遺伝子を同定および／または入手するための本発明のPCRベースの方法も包含する。この方法は、既知の遺伝子由来の対応する領域に対して高い相同性を有する可変性の3’領域および5’領域を有するPCRプライマーを用いるという点で特徴付けられる。
【００５０】
酵素の能力とは、各々の場合に考慮される工業部門におけるその活性を意味する。これは、実際の酵素活性に基づくが、また特定のプロセスに関連するさらなる要因にも依存する。これらの要因としては、例えば、安定性、基質結合、基質を担持する物質との相互作用、または他の成分との相互作用、特に相乗作用が挙げられる。従って、例えば、ある酵素が洗濯組成物または清浄化組成物における使用に好適であるか否かを検討する場合、さらなる構成要素を用いて処方された組成物の洗浄能力または清浄化能力へのその酵素の寄与を考慮する。種々の工業的適用のために、ある酵素を、それ自体既知の分子生物学の技術、特に上述の技術によって、さらに発展させかつ最適化することが可能である。
【００５１】
本発明の第一の態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号1に示されるアミノ酸配列と少なくとも75％、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％一致する、グリコシルヒドロラーゼである。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％、極めて特に好ましくは100％一致する、グリコシルヒドロラーゼである。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号3に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％一致する、グリコシルヒドロラーゼである。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号1〜３に示されるアミノ酸配列のうちの1つと少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％同一であるか、またはそのアミノ酸配列が、配列番号1〜３に示されるアミノ酸配列のうちの1つと少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号4に示されるヌクレオチド配列と少なくとも75％、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％一致する、核酸である。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号5に示されるヌクレオチド配列と少なくとも50％、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、特に少なくとも80％、特に好ましくは少なくとも90％、極めて特に好ましくは100％一致する、核酸である。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、かつそのヌクレオチド配列が、配列番号6に示されるヌクレオチド配列と少なくとも60％、少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％、特に好ましくは少なくとも95％、極めて特に好ましくは100％一致する、核酸である。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、上述のグリコシルヒドロラーゼのうちの1つから1つ以上の保存的アミノ酸置換によって入手可能である、グリコシルヒドロラーゼである。
【００５９】
本発明のさらなる態様は、新規なグリコシルヒドロラーゼを同定および単離するための方法であって、この方法は、
ａ）メタゲノムＤＮＡが種々の存在環境から得られる、
ｂ）このメタゲノムＤＮＡが好適な、特に細菌のクローニングシステム中にサブクローニングされる、
ｃ）この方法で生成された遺伝子ライブラリーが、新規なグリコシルヒドロラーゼについてのスクリーニングに供される、
という点で特徴付けられる。
【００６０】
本発明の方法の重要な実施形態において、メタゲノムDNAの生物学的多様性は、グリコシルヒドロラーゼ特異的PCRプライマーを用いるPCRタイピングおよび引き続く配列決定によって決定され、１つ以上の配列空間をカバーする多数の遺伝子フラグメント（PCRフラグメント）を生成する。
【００６１】
本発明のグリコシルヒドロラーゼは、本発明の方法によって提供されている。
【００６２】
メタゲノムDNAを入手するために本発明にとって好ましい存在環境とは地面（土壌）である。土壌サンプルを、当業者に既知の方式、例えば、乾燥および機械的なサイズの減量で処理する。次いでこのサンプルを化学的に消化して、このサンプル中に存在するDNAを、例えば、Zhou, J.Bruns, M.A., Tiedje, J.M.（1996）による刊行物：「土壌からのDNA回収の多様な組成物（DNA recovery from soils of diverse composition）」、Appl.Environ.Microbiol., 第62巻、316〜322頁に記載されたように抽出する。
【００６３】
工程c）におけるスクリーニングは好ましくは、グリコシルヒドロラーゼ活性についての選択によって、例えば、デンプン含有寒天プレート上で透明なゾーンを形成するクローンの選択によって実施される。
【００６４】
工程b）を実施するために好適なクローニングシステムは、当業者に既知である。例えば、Escherichia coliおよびStreptomyces lividans、だけでなくBacillus；さらに、酵母および真菌、例えば、Saccharomyces、Candida、Pichia、Aspergillusなど。
【００６５】
しかし、工程c）におけるスクリーニングはまた、上述のPCRフラグメントに基づくプローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションによって実施することもできる。このプローブは、この場合、PCRフラグメントの単一の遺伝子フラグメントか、さもなければ複数のフラグメント、極端な場合には、未分類のプールに由来してもよい。
【００６６】
正の反応には、ハイブリダイゼーション条件に依存する最小の相同性が必要である。単一の、以前に既知の酵素遺伝子に由来するプローブを用いる遺伝子ライブラリーのスクリーニングによれば、見出される正のクローンの多様性の幅はかなり制限される。関連に乏しい遺伝子を含む、この遺伝子ライブラリーに実際に存在する遺伝子を見つけることができるためには、多様なプローブであって、その組成は詳細に特徴付けられていなくてもよいが、配列空間のできるだけ大きい部分を包含するプローブを用いることが有用である。
【００６７】
できるだけ大きい配列空間を包含するために好適なプローブの選択は、参考として本明細書に援用される、DE-A-101 31 441.8-41、またはPCT／EP02／06842に記載されるように行なう。
【００６８】
これは、必要に応じて、見出された個々のクローンの配列の解析によって、完全性および配列相同性の決定のためにオープンリーディングフレーム（ORF）をチエックすることを伴う。
【００６９】
個々の過剰に発現されたクローンは、例えば、洗濯組成物および清浄化組成物に特有のpH、温度および処方物成分に対して、それらの安定性を生化学的に特徴づけ、検討することができる。
【００７０】
本発明の方法において使用することができるグリコシルヒドロラーゼ特異的PCRプライマーは、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸の高度に保存された領域に結合するプライマーである。このプライマー結合部位は、異なる長さのできるだけ小さいループを有するタンパク質セグメントをコードする領域にさらに隣接すべきである。
【００７１】
好適なグリコシルヒドロラーゼ特異的PCRプライマーは特に、触媒性活性残基の直接近傍に分類されるグリコシルヒドロラーゼの領域をコードする核酸領域に結合するプライマーである。従って、例えば、β−プリーツシート３、β−プリーツシート４、およびβ−プリーツシート７のC末端の領域についてのプライマーである。
【００７２】
本発明の方法において特に好ましく使用することができるグリコシルヒドロラーゼ特異的PCRプライマーは、表1に列挙されるプライマーであり、これはプライマー対GEX24／26およびGEX23／25が特に好ましい。
【００７３】
グリコシルヒドロラーゼの配列空間をカバーする多数のPCRフラグメントが、本発明の方法の補助によって提供されている。
【００７４】
50個のDNA配列は、プライマー対GEX24／26によって提供されており、配列番号57〜106として配列表に列挙される。これらのDNA配列に相当するアミノ酸配列は、配列番号7〜56として配列表に列挙される。
【００７５】
99個のDNA配列は、プライマー対23／25、GEX36／38、および210-211／25によって提供されており、配列番号206〜304として配列表に列挙される。3つのプライマーの組み合わせによって作製された配列は、本質的に同じDNAセグメントをカバーするので、それらは、以下と一緒に処理されて、必要に応じて、簡便のためにGEX23／25と呼ばれる。これらのDNA配列に相当するアミノ酸配列は、配列番号107〜205として配列表に列挙される。
【００７６】
PCRフラグメントの配列アラインメントの作製によって、この配列空間またはその部分的空間に相当するコンセンサス配列が得られた。
【００７７】
従って、本発明のさらなる態様は、コンセンサス配列AおよびBに示される配列空間、またはコンセンサス配列DおよびCに示された配列空間の代表とみなされるグリコシルヒドロラーゼである。
【００７８】
コンセンサス配列A、D、BおよびCは、図5〜8に、および配列表に、配列番号305〜308として示される。
【００７９】
示されるコンセンサス配列には、位置1〜8および116〜123（A）、1〜8、114〜121（D）、1〜12、102〜109（B）、および1〜12、72〜78（C）において、ごくわずかな分散しかない。このことは、本明細書において以降に、実施例に記載されており、かつこの配列を同定するために使用されたPCRに基づく方法から明らかになる：これらの部分的配列は、増幅のために使用されたプライマーが結合したDNA領域に相当する。この結合が生じる条件のストリンジェンシーに依存して、異なるヌクレオチド配列を結合させて増幅させることも可能である。従って、これらの位置での比較的低い選択性によって、生成物として得られたDNAは、テンプレートと完全には一致しない。この理由によって、特に上記に示された配列セグメントの間の位置に相当するコンセンサス配列の内部の部分的領域について保護が求められる。
【００８０】
酵素データベースGenBank（National Center for biotechnology Information NCBI, National Institute of Health、Bethesda, MD, USA）における完全なPCRフラグメントに由来する149個のアミノ酸配列の比較によって、それらが、グリコシルヒドロラーゼの部分的配列の全てであるということが確認される。
【００８１】
この比較の結果は、表２に示される。また、ここで、各々の場合に、見出された部分的配列に最も類似である全体的データベース、およびこれらの2つの間の相同性の程度が、示される。このデータベースに寄託された配列との比較によって、最も類似のタンパク質は、95.1％（プライマー対23／25）同一および91％（プライマー対24／26）という相同性のレベルを有することが示される。
【００８２】
これらのアミノ酸配列107〜205は、配列番号307および308とのコンセンサス配列によって記載される配列空間の部分空間に相当する配列空間を規定する。これは、保護の好ましい範囲に包含される。従って、この配列空間におけるあらゆるポイントが、本発明の部分的配列に相当する。
【００８３】
言い換えれば、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号307および308とのコンセンサス配列を有する部分的領域において相同性であり得、これらの2つの配列のうちの1つにおいて好適な位置に位置する唯一のアミノ酸をこの領域に有する、全てのグリコシルヒドロラーゼが特許請求の範囲内である。この意味で、それらは、これらの配列のうちの1つに対してこの部分の任意の位置にたどることができる。
【００８４】
従って、本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号307（B）および308（C）とのこれらのコンセンサス配列のうちの1つに対して96％、さらに好ましくは97％、98％、99.25％、99.5％、99.75％、または特に好ましくは100％同一であるか、またはこれらの配列のうちの1つに対して直接任意の相同な位置にたどることができる部分を含む、グリコシルヒドロラーゼである。これは特に、上記のように、コンセンサス配列Bの13〜101位置、またはコンセンサス配列Cの13〜71位置に相当する部分的領域にわたってあてはまる。
【００８５】
従って、本発明のさらなる態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号305（A）および306（D）とのこれらのコンセンサス配列のうちの1つに対して92％、さらに好ましくは93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または特に好ましくは100％同一であるか、またはこれらの配列のうちの1つに対して直接、任意の相同な位置にたどることができる部分を含む、グリコシルヒドロラーゼである。これは特に、上記のように、コンセンサス配列Aの9〜115位置、またはコンセンサス配列Dの9〜113位置に相当する部分的領域にわたってあてはまる。
【００８６】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号7〜56として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に、配列番号306のコンセンサス配列による位置9〜113に相当する部分的領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含むグリコシルヒドロラーゼである。
【００８７】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号7〜56として示されるアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号305のコンセンサス配列による9〜115位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、グリコシルヒドロラーゼである。
【００８８】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号107〜205として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号308のコンセンサス配列による13〜71位置に相当する部分領域にわたって、96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、グリコシルヒドロラーゼである。
【００８９】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、そのアミノ酸配列が、配列番号107〜205として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号307のコンセンサス配列による13〜101位置に相当する部分領域にわたって、96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、グリコシルヒドロラーゼである。
【００９０】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、本発明のグリコシルヒドロラーゼから1つ以上の保存的アミノ酸置換によって入手可能である、グリコシルヒドロラーゼである。
【００９１】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼであって、請求項1〜6のいずれかまたは請求項14〜21のいずれかに記載されるグリコシルヒドロラーゼの誘導体化、断片化、欠失変位または挿入変位によって入手可能である、グリコシルヒドロラーゼである。
【００９２】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号308のコンセンサス配列に対して、特に13〜71位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【００９３】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号307のコンセンサス配列に対して、特に13〜101位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【００９４】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号305のコンセンサス配列に対して、特に9〜115位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【００９５】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号306のコンセンサス配列に対して、特に9〜113位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【００９６】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号7〜56として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号306のコンセンサス配列による9〜113位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【００９７】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号7〜56として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号305のコンセンサス配列による9〜115位置に相当する部分領域にわたって、少なくとも92％、特に少なくとも94％、好ましくは少なくとも96％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【００９８】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号107〜205として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号308のコンセンサス配列による13〜71位置に相当する部分領域にわたって、96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【００９９】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、そのアミノ酸配列が、配列番号107〜205として示されたアミノ酸配列のうちの1つに対して、特に配列番号307のコンセンサス配列による13〜101位置に相当する部分領域にわたって、96％、特に少なくとも97％、好ましくは少なくとも98％、好ましくは少なくとも99％、特に好ましくは100％同一である部分を含む、核酸である。
【０１００】
本発明のさらなる特異的な態様は、本発明のグリコシルヒドロラーゼをコードする核酸である。
【０１０１】
本発明のさらなる特異的な態様は、グリコシルヒドロラーゼをコードする核酸であって、かつその配列が、配列番号57〜106、または206〜304として示されたヌクレオチド配列の1つに対して、好ましくはPCRプライマー配列によって特定されない位置で、少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、特に好ましくは100％同一である、核酸である。
【０１０２】
本発明のさらなる特異的な態様は、オリゴヌクレオチド、特にPCRプライマーであって、配列番号309〜316に示される配列の1つを有する、オリゴヌクレオチドである。
【０１０３】
本発明のさらなる態様は、請求項37〜68に記載されている。
【０１０４】
潜在的にコンセンサス配列による改変体をコードする核酸が、一般的に既知の方法によって生成され得る。例えば、「生物化学辞典（Lexikon der Biochemie）」 Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999は、第1巻、267〜271頁において、DNAの新規な合成の方法（methods for de novo synthesis of DNA）を、第2巻、227〜229頁において、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を提示する。この配列は、必要に応じて、特定の属に特徴的なコドン用法で、アミノ酸の一般に既知のコードシステムによって特定することができる。
【０１０５】
この目的のためには、例えば、Fritsch、SambrookおよびManiatisのマニュアルである「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular cloning：a laboratory manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、1989に開示のような全ての従来のかつ都合のよい方法を使用することが可能である。個々の塩基置換をDNAに導入するためにPCRを使用することも可能である。
【０１０６】
本発明のグリコシルヒドロラーゼは、例えば、化学的修飾、酵素または酵素フラグメントの直接進化または配列シャッフリングによってさらに最適化されて、新規なタンパク質または融合タンパク質（ハイブリッド、キメラタンパク質）を得ることができる。これについて既知の方法は、例えば、以下のような酵素の直接進化の方法である：「インビボの相同組み換え（In vivo homologous recombination）」（Zhang、Y.M.、Buchholz, F., Muyrers, J.P.P., Stewart, A.F.（1998）：「大腸菌における組み換えを用いるDNA操作のための新しい論理（A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli）」、Nat.Genetics, 第20巻、123〜128頁）、「ねじれ型伸長プロセスStEP（Staggered extension process StEP）」（Zhao, H.、Giver, L.、Shao, Z., Affholter、J.A.、Arnold, F.H.(1998)：「インビトロ組み換えにおけるねじれ型伸長プロセス（StEP）による分子進化（Molecular evolution by staggered extension process（StEP）in vitro recombination）」、Nat.Biotechnol., 第16巻258〜261頁）、「ランダムプライミング組み換え（Random priming recombination）」（Shao，Z.、Zhao, H.、Giver, L.、Arnold, F.H.(1998)：「インビトロ組み換えにおけるランダムプライミング：直接進化のための効率的なツール（Random priming in vitro recombination：an effective tool for directional evolution）」、Nucleic Acids Res., 第26巻、681〜683頁）、「DNAシャッフリング（DNA shuffling）」（Stemmer、W.P.C.（1994）：「DNAシャッフリングによるインビトロでのタンパク質の急速な進化（Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling）」、Nature、第370巻、389〜391頁）、および「分子増殖（Molecular breeding）」（Ness, J.E., Welch, M., Gilver, L., Bueno, M., Cherry, J. R., Borchert, T.V., Stemmer, W. P. C., Minshull, J.（1999）:「スブチリシンのサブゲノム配列のDNAシャッフリング（DNA shuffling of subgenomic sequences of subtilisin）」、Nat. Biotechnol., 第17巻、893〜896頁。
【０１０７】
本発明のグリコシルヒドロラーゼは、安定剤によって、特に貯蔵の間、例えば、物理的効果、酸化またはタンパク質分解による、例えば変性、分解または不活性化から、保護され得る。多くの場合、安定剤の相補的な、または相互に増強された組み合わせがまた使用される。
【０１０８】
安定剤の1つの群は、可逆性プロテアーゼインヒビター、例えば、例えば、塩酸ベンズアミジンおよびロイペプチン、ホウ砂、ホウ酸、ボロン酸、それらの塩およびエステルなど、ペプチドアルデヒドまたは純粋にペプチドインヒビター、例えば、オボムコイドまたは特定のスブチリシンインヒビターである。さらなる、通常の酵素安定剤は、アミノアルコール、例えば、モノ−、ジ−、トリエタノール−およびプロパノールアミン、C12までの脂肪族カルボン酸、ジカルボン酸、低級脂肪族アルコール、ただし特にポリオール、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロプレングリコールまたはソルビトールなどである。特に物理的効果またはpHの変動に対して酵素調製物を安定化するために、カルシウム塩、例えば、酢酸カルシウム、ギ酸カルシウム、マグネシウム塩、広範なポリマー、例えば、リグニン、セルロースエステル、ポリアミドまたは水溶性ビニルコポリマーなどが同様に用いられる。還元剤および酸化防止剤、例えば、亜硫酸ナトリウムまたは還元糖などが、酸化的分解に対するタンパク質の安定性を増大する。
【０１０９】
グリコシルヒドロラーゼについての工業において確立された多くの可能性のある適用は例えば、Wiley, New York、1998によって刊行された、H. Uhligの著作「工業的酵素およびそれらの適用（Industrial enzymes and their applications）」のようなマニュアルに列挙される。以下の記載は、限定的なリストとして解釈されるべきではなく、可能性のある工業的用途の選択を示す。類似性の範囲の外側に存在する個々のタンパク質が好適であるということが理解されるべきである。なぜなら、さらなる適用のためのそれらの酵素的な特性、特にデンプン分解性の特性は、そこには表現としては請求されておらず、従って、それらは本発明の保護の範囲内に包含される。
【０１１０】
本発明の本態様の１実施形態は、洗濯組成物および清浄化組成物であって、それらが本発明のグリコシルヒドロラーゼまたはその誘導体を含むという点で特徴付けられる組成物である。
【０１１１】
グリコシルヒドロラーゼ、および特にアミラーゼの用途の1つの重要な領域は、繊維製品または固体表面、例えば、陶器類、床もしくは台所用品などの清浄化のための洗濯組成物または清浄化組成物における活性成分としての領域である。これらの適用において、デンプン分解活性は、加水分解によって、または基質からの離脱によって、炭水化物含有汚れおよび特にデンプンに基づく汚れを分解するように働く。このような場合、それらは、好適な媒体中か、そうでなければ洗濯組成物または清浄化組成物において単独で用いられてもよい。このために選択されるべき条件、例えば、温度、pH、イオン強度、酸化還元条件または機械的効果などは、特定の清浄化問題について、すなわち汚れおよび基質に関して、最適化されるべきである。従って、洗濯組成物および清浄化組成物のための通常の温度は、手での洗濯・清浄用組成物についての10℃から、40℃および60℃、さらに機械用組成物についてまたは工業的適用についての95℃までの範囲である。関連の組成物の成分は好ましくはまた、相互に適合する。温度は通常、現在の洗濯機および食器洗い機に継続的に調節され得るので、全ての中間の温度がまた含まれる。同様に、以下に列挙された組成物の他の成分を介して特定の清浄化目的のために他の条件が極めて専門的に設計されてもよい。
【０１１２】
本発明の好ましい組成物は、この組成物の洗濯能力または清浄化能力が本発明のデンプン分解酵素を添加することによって、この方法で定義可能な任意の条件下で、この酵素なしの処方物に比べて改善されることによって識別される。この点で、本発明の組成物に組み込まれたデンプン分解性タンパク質は、好ましくは、洗濯組成物または清浄化組成物の洗濯能力および／または清浄化能力を改善することができるタンパク質である。
【０１１３】
さらに好ましい組成物は、デンプン分解酵素および汚れを除去するように相乗作用的に作用する他の成分によって識別される。これは、例えば、界面活性剤のような、この組成物の他の成分によって、デンプン分解タンパク質の加水分解物が可溶化されることによって例えば、行なわれる。本発明のタンパク質は、大量消費者または工業的使用者のための組成物中で、および私的な使用者のための製品中で用いることが可能であり、当分野で好都合であるかおよび／または確立されている全ての提示はまた、本発明の実施形態に相当する。
【０１１４】
本発明の洗濯組成物または清浄化組成物は、考えられる全てのタイプの清浄化組成物であって、濃縮物および未希釈で用いられる組成物の両方；洗濯機または手での洗濯または洗浄において、商業的規模での使用のための組成物を意味する。それらには、例えば、繊維製品、カーペット、または天然繊維のための洗濯組成物が挙げられ、これに関して洗濯組成物という用語が、本発明に従って用いられる。それらはまた、食器洗い機用の食器洗浄組成物、または硬質表面、例えば、金属、ガラス、磁器、セラミック、タイル、石材、塗装表面、プラスチック、木または皮革のための手による食器洗浄組成物またはクリーナーを包含する。清浄化組成物という用語は、これらについて本発明に従って用いられる。あらゆるタイプの洗濯または清浄化組成物は、本発明のタンパク質がそれに添加されている限り、本発明の実施形態に相当する。
【０１１５】
本発明の実施形態は、当分野で確立された全ての形状物、および／または本発明の組成物の全ての好都合な形状物を包含する。これらとしては、例えば、固体、粉末、液体、ゲルまたはペースト状である組成物であって、必要に応じて、圧縮されるかまたは圧縮されていない複数の相からやはり構成される、組成物が挙げられる。以下もまたそれに属する、例えば：大型の容器および小分けしての両方でパッケージングされた、押出成形物、顆粒、錠剤または小袋。
【０１１６】
グリコシルヒドロラーゼ、特にアミラーゼは、例えば、以下の成分の１つ以上と、本発明の組成物中で組み合わせられる：非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤および／または陽イオン界面活性剤、漂白剤、漂白剤活性化剤、漂白触媒、ビルダーおよび／またはコビルダー、溶媒、増粘剤、金属イオン封鎖剤、電解質、蛍光増白剤、再付着防止剤、防蝕剤、特に銀保護剤、防汚剤、色移り防止剤、発泡防止剤、研磨剤、色素、芳香剤、抗菌剤、紫外線吸収剤、酵素、例えば、プロテアーゼ、（必要に応じてその他）アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼまたはオキシダーゼなど、安定剤、特に酵素安定剤、および当分野で既知の他の成分。
【０１１７】
好ましい組成物は、それらが0.000001wt％〜5wt％、さらに好ましくは0.00001〜4wt％、0.0001〜3wt％、0.001〜2wt％、または0.01〜1wt％のデンプン分解タンパク質または誘導体を含むという点で特徴付けられる。
【０１１８】
用いられる非イオン界面活性剤は好ましくは、アルコキシル化、有利にはエトキシル化され、特に好ましくはアルコール１モルあたり8〜18個の炭素原子、平均して1〜12モルのエチレンオキシド（EO）を有する一級アルコールであり、ここでこのアルコール基は、直線または好ましくは2位でメチル分岐してもよく、またはオキソアルコール基中に通常存在するように混合物中に直鎖状およびメチル分岐した基を含んでもよい。しかし、特に好ましいのは、例えばココナツ、パーム、獣脂またはオレイルアルコール由来の12〜18個の炭素原子、及びアルコール1モルあたり平均2〜8個のEOを有する天然起源のアルコールの直鎖状基を含むアルコールエトキシレートである。好ましいエトキシル化アルコールとしては、例えば、3EOまたは4EOを有するC12-14アルコール、7EOを有するC9-11アルコール、3EO、5EO、7EOまたは8EOを有するC13-15アルコール、3EO、5EOまたは7EOを有するC12-18アルコール、およびそれらの混合物、例えば、3EOを有するＣ12-14アルコールおよび5EOを有するC12-18アルコールの混合物が挙げられる。与えられたエトキシル化度は、統計学的平均であり、これは特定の生成物について整数であっても少数であってもよい。好ましいアルコールエトキシル化物は、狭い同族体分布を有する（狭範囲エトキシレート、NRE）。これらの非イオン界面活性剤に加えて、12個より多いEOを有する脂肪アルコールを用いることもできる。それらの例は、14EO、25EO、30EOまたは40EOを有する獣脂アルコールである。
【０１１９】
単独の非イオン界面活性剤として、または他の非イオン界面活性剤と組み合わせてのいずれかで用いられる、好ましく用いられる非イオン界面活性剤のさらなる種類は、アルコキシル化された、好ましくはエトキシル化されるかまたはエトキシル化されかつプロポキシル化された脂肪酸アルキルエステル、好ましくはアルキル鎖中に1〜4炭素原子を有する、特に脂肪酸メチルエステルである。
【０１２０】
有利に用いることができる非イオン界面活性剤のさらなる種類は、アルキルポリグリコシド（ＡＰＧ）である。用いることができるアルキルポリグリコシドは、一般式ＲＯ（Ｇ）２を満たす。ここでＲは、直鎖または分岐鎖の、特に2位でメチル分岐しており、飽和または不飽和の、8〜22、好ましくは12〜18個の炭素原子を有する脂肪族基であり、Gは、5または6個の炭素原子を有するグルコース単位、好ましくはグルコースを意味する記号である。グリコシル化の程度Zは、ここでは、1.0〜4.0、好ましくは、1.0〜2.0、特に1.1〜1.4である。直鎖状アルキルポリグリコシド、すなわちポリグリコシル残基がグルコース基であり、アルキル基がn−アルキル基であるアルキルポリグリコシドを用いることが好ましい。
【０１２１】
アミンオキシド型の非イオン界面活性剤、例えばN−ココアルキル−N,N−ジメチルアミンオキシドおよびN−獣脂アルキル−N,N−ジヒドロキシエチルアミンオキシド、ならびに脂肪酸アルカノールアミドの非イオン界面活性剤がまた好適であり得る。これらの非イオン界面活性剤の割合は好ましくは、エトキシル化脂肪アルコールの割合以下であり、特にその半分以下である。
【０１２２】
さらなる好適な界面活性剤は、式（ＩＩ）：
【０１２３】
【化１】
2005525793.tif 000002
【０１２４】
［式中、RCOは6〜22個の炭素原子を有する脂肪族アシル基であり、R1は、水素、アルキルまたは1〜4個の炭素原子を有するヒドロキシアルキル基であり、［Z］は、3〜10個の炭素原子および3〜10個水酸基を有する、直鎖または分岐ポリヒドロキシアルキル基である。］
で示されるポリヒドロキシ脂肪酸アミドである。
このポリヒドロキシ脂肪酸アミドは、アンモニア、アルキルアミンまたはアルカノールアミンを用いた還元糖の還元的アミン化、および引き続く脂肪酸、脂肪酸アルキルエステルまたは脂肪酸塩化物でのアシル化によって通常得ることができる既知の物質である。
【０１２５】
ポリヒドロキシ脂肪酸アミドの群はまた、式（ＩＩＩ）： 
【０１２６】
【化２】
2005525793.tif 000003
【０１２７】
［式中、Rは、7〜12個の炭素原子を有する、直鎖または分岐鎖のアルキルまたはアルケニル基であり、R1は、2〜8個の炭素原子を有する、直鎖、分岐鎖または環状のアルキル基またはアリール基であり、R２は、1〜8個の炭素原子を有する、直鎖、分岐鎖または環状のアルキル基またはアリール基またはアリール基であり、ここでC1-4アルキルまたはフェニル基が好ましく、［Z］は、直鎖状ポリヒドロキシルアルキル基であって、そのアルキル鎖は、少なくとも2つのヒドロキシル基で置換されているか、またはこの基のアルキル化、好ましくはエトキシル化またはプロポキシル化誘導体である。］
で示される化合物を含む。
【０１２８】
［Z］は好ましくは、還元糖、例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、ガラクトース、マンノースまたはキシロースの還元的アミノ化によって得られる。N−アルコキシ−またはN−アリールオキシ置換化合物は、例えば、触媒としてのアルコキシドの存在下で脂肪酸メチルエステルとの反応によって、所望のポリヒドロキシ脂肪酸アミドに変換され得る。
【０１２９】
用いられる陰イオン界面活性剤は、例えば、スルホン酸塩型および硫酸塩型の界面活性剤である。スルホン酸塩型の好適な界面活性剤は好ましくは、C9-13−アルキルベンゼンスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、すなわちアルケンおよびヒドロキシアルカンスルホン酸塩の混合物、ならびにガス状の三酸化イオウによるスルホン化および引き続くこのフルホン化生成物のアルカリまたは酸加水分解によって、末端または内部の二重結合を有するC12-18モノオレフィンから例えば得られるような、ジスルホン酸塩である。また、好適なのは、例えば、スルホ塩素化またはスルホキシド化、引き続く加水分解または中和によってC12-18アルカンから得られるアルカンスルホン酸塩である。同様に、α−スルホ脂肪酸（エステルスルホン酸塩）のエステル、例えば、硬化ココナツ油、パーム核油または獣脂脂肪酸のα−スルホン化メチルエステルも好適である。
【０１３０】
さらなる好適な陰イオン界面活性剤は、スルフェート化脂肪酸グリセロールエステルである。脂肪酸グリセロールエステルは、モノエステル、ジエステルおよびトリエステル、ならびにそれらの混合物であって、1〜3モルの脂肪酸でのモノグリセロールのエステル化による調製の間、または0.3〜2モルのグリセロールとのトリグリセリドのエステル転移反応の間に得られるようなものを意味する。ここで、好ましいスルフェート化脂肪酸グリセロールエステルは、6〜22個の炭素原子を有する飽和脂肪酸、例えば、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはベヘン酸のスルフェート化生成物である。
【０１３１】
好ましいアルキル（アルケニル）スルフェートは、C12-C18脂肪アルコール、例えば、ココナツ脂肪アルコール、獣脂アルコール、ラウリル、ミリストイル、セチルまたはステアリルアルコールの、またはC10-C20−オキソアルコールの硫酸モノエステル、および同じ鎖長の二級アルコールのそれらのモノエステルのアルカリ金属塩、特にナトリウム塩である。さらに好ましいのは、この鎖長のアルキル（アルケニル）スルフェートであって、これは合成の石油化学に基づく直鎖アルキル基を含み、脂肪化学の原料に基づいて等価な化合物と類似の分解挙動を有する。洗濯能力の観点から、C12-C16−アルキルスルフェートおよびC12-C15−アルキルスルフェート、ならびにC14-C15−アルキルスルフェートが好ましい。2,3−アルキルスルフェートはまた好適な陰イオン界面活性剤である。
【０１３２】
1〜6モルのエチレンオキシドでエトキシル化された直鎖または分岐鎖のC7-21アルコールの硫酸モノエステル、例えば、平均で3.5モルのエチレンオキシド（EO）を有する2−メチル−分岐C9-11−アルコール、または1〜4のEOを有するC12-18−脂肪アルコールがまた好適である。それらの発泡挙動が高いことによって、それらは、比較的少量のみで、例えば、5wt％まで、通常1〜5wt％の量で清浄化組成物中に用いられる。
【０１３３】
さらに好適な陰イオン界面活性剤はまた、アルキルスルホコハク酸の塩であって、これはまた、スルホコハク酸塩またはスルホコハク酸エステルとも呼ばれ、これはコハク酸とアルコール、好ましくは脂肪アルコール、特にエトキシル化脂肪アルコールとのモノエステルおよび／またはジエステルである。好ましいスルホコハク酸塩は、C8-18脂肪アルコール基またはそれらの混合物を含む。特に好ましいスルホコハク酸塩は、それ自体が非イオン界面活性剤である、エトキシル化脂肪アルコールに由来する脂肪アルコール基を含む（説明については上記を参照のこと）。これに関して、スルホコハク酸塩であってその脂肪アルコール基が狭い同族体分布を有するエトキシル化脂肪アルコールに由来するスルホコハク酸塩が、次に特に好ましい。同様に、アルキル（アルケニル）鎖中に好ましくは8〜18個の炭素原子を有するアルキル（アルケニル）コハク酸またはその塩を使用することもできる。
【０１３４】
さらに好適な陰イオン界面活性剤は、特に石鹸である。飽和脂肪酸石鹸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、硬化エルカ酸およびベヘン酸の塩、特に、天然の脂肪酸、例えば、ココナツ、パーム核または獣脂の脂肪酸由来の石鹸混合物が好適である。
【０１３５】
石鹸を含む陰イオン界面活性剤は、それらのナトリウム、カリウムまたはアンモニウムの塩の形態で、また、モノ−、ジ−またはトリエタノールアミンのような有機塩基の可溶性塩として存在してもよい。陰イオン界面活性剤は好ましくは、それらのナトリウム塩またはカリウム塩の形態、特にナトリウム塩の形態である。
【０１３６】
界面活性剤は、本発明の清浄化組成物または洗濯組成物に、最終の製剤基づいて、好ましくは5wt％〜50wt％、特に8wt％〜30wt％の全体的な量で、存在し得る。
【０１３７】
本発明の組成物は、漂白剤を含んでもよい。漂白剤として機能して、水中でH2O2を生じる化合物のうちで、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム四水和物および過ホウ酸ナトリウム一水和物は、特に重要である。用いることができる他の漂白剤は、例えば、ペルオキソプロホスフェート、クエン酸過水和物、およびH2O2生成過酸塩または過酸、例えば過硫酸またはペルオキソ硫酸である。尿素ペルオキソ水和物ペルカルバミドも有用であり、これは式H2N-CO-NH2・H2O2で記載することができる。特に、硬質表面を清浄化するために、例えば食器洗い機に用いられる場合、この剤は、所望の場合、有機漂白剤の群由来の漂白剤を含んでもよいが、その使用は繊維製品を洗濯するための洗剤においても原則的に可能である。代表的な有機漂白剤は、過酸化ジアシル、例えば、過酸化ジベンゾイルなどである。さらに代表的な有機漂白剤は、ペルオキシ酸であり、特定の例は、アルキルペルオキシ酸およびアリールペルオキシ酸である。好ましい代表物は、ペルオキシ安息香酸およびその環置換誘導体、例えば、アルキルペルオキシ安息香酸であるが、またペルオキシ−α−ナフトエ酸およびモノペルフタル酸マグネシウム、脂肪族または置換脂肪族ペルオキシ酸、例えば、ペルオキシラウリン酸、ペルオキシステアリン酸、ε−フタルイミドペルオキシカプロン酸（フタルイミドペルオキシヘキサン酸、PAP）、o−カルボキシ−ベンザミドペルオキシカプロン酸、N−ノネニルアミドペルアジピン酸およびN−ノネニルアミドペルコハク酸塩、ならびに脂肪族およびアラリファティックのペルオキシジカルボン酸、例えば、1,12−ジペルオキシカルボン酸、1,9−ジペルオキシアゼライン酸、ジペルオキシセバシン酸、ジペルオキシブラッシル酸、ジペルオキシフタル酸、2−デシルジペルオキシブタン−1,4−二酸、N,N−テレフタロイルジ（6−アミノペルカプロン酸）が用いられてもよい。
【０１３８】
この製剤の漂白剤含量は、有利には過ホウ酸一水和物または過炭酸塩を用いて、1〜40wt％、特に10〜20wt％であり得る。アミラーゼと過炭酸塩との相乗的な使用、またはアミラーゼと過カルボン酸との相乗的な使用は、WO 99／63036およびWO 99／63037に開示される。
【０１３９】
60℃以下の温度での洗濯の場合に、特に洗濯物の事前処理の場合に、改善された漂白作用を達成するために、この組成物はまた、漂白活性化剤を含んでもよい。用いることができる漂白活性化剤は、過加水分解条件下で、好ましくは1〜10個の炭素原子、特に2〜4個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキソカルボン酸、および／または置換されたかもしくは置換されていない過安息香酸を生じる化合物である。このような数の炭素原子のO−アシルおよび／もしくはN−アシル基、ならびに／または置換されるかもしくは置換されていないベンゾイル基を担持する物質が好適である。ポリアシル化されたアルキレンジアミン、特に、エチレンジアミン四酢酸（TAED）、アシル化されたトリアジン誘導体、特に1,5−ジアセチル−2,4−ジオキソヘキサヒドロ−1,3,5−トリアジン（DADHT）、アシル化グリコルリル、特に1,3,4,6−テトラアセチル−グリコルリル（TAGU）、N−アシルイミド、特にN−ノナノイルスクシンイミド（NOSI）、アシル化フェノールスルホン酸塩、特に、n−ノナノイル−またはイソノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（n−またはイソ−NOBS）、アシル化ヒドロキシカルボン酸、例えば、トリエチルO−アセチルクエン酸（TEOC）、無水カルボン酸、特に、無水フタル酸、無水イサトイン酸、および／または無水コハク酸、カルボキサミド、例えば、N−メチルジアセトアミド、グリコリド、アシル化多価アルコール、特に、トリアセチン、二酢酸エチレングリコール、酢酸イソプロフェニル、2,5−ジアセトキシ−2,5−ジヒドロフランおよびエノールエステルであって、ドイツ特許出願DE196 16 693およびDE 196 16 767に開示されたもの、ならびにアシル化ソルビトールおよびマンニトール、またはそれらの混合物であって、欧州特許出願EP 0 525 239（SORMAN）に開示されたもの、アシル化糖誘導体、特にペンタアセチルグルコース（PAG）、ペンタアセチルフルクトース、テトラアセチルキシロースおよびオクタアセチルラクトース、ならびにアセチル化された、必要に応じてN−アルキル化されたグルカミン、またはグルコノラクトン、トリアゾールまたはトリアゾール誘導体、および／または特に、カプロラクタム、および／またはカプロラクタム誘導体、好ましくは、N−アシル化ラクタム、例えば、N−ベンゾイルカプロラクタムおよびN−アセチルカプロラクタムであって、国際特許出願WO 94／27970、WO 94／28102、WO 94／28103、WO 95／00626、WO 95／14759、およびWO 95／17498に開示されたものが好ましい。ドイツ特許出願DE 196 16 769に開示された親水的に置換されたアシルアセタール、ならびにドイツ特許出願DE 196 16 770および国際特許出願WO 95／14075に開示されたアシルラクタムは同様に、好適に用いられる。ドイツ特許出願DE 44 43 177に開示された従来の漂白剤活性化剤の組み合わせを用いることもまた可能である。ニトリル誘導体、例えば、シアノピリジン、ニトリルクオーツ、例えば、N−アルキルアンモニウムアセトニトリル、および／またはシアノアミド誘導体をまた用いることができる。好ましい漂白剤活性化剤は、4−（オクタノイルオキシ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム、n−ノナノイル−またはイソノナノイルオキシベンゼンスルホン酸（n−またはイソ−NOBS）、ウンデセノイルオキシ−ベンゼンスルホン酸（UDOBS）、デデカノイルオキシベン��ンスルホン酸ナトリウム（DOBS）、デカノイルオキシ安息香酸（DOBA、OBC10）、および／またはドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（OBS 12）、およびN−メチルモルホリニウムアセトニトリル（MMA）である。このような漂白剤活性化剤は、総組成物に対して、0.01〜20wt％、好ましくは0.1〜15wt％の量、特に1wt％〜10wt％の通常の量的範囲で存在してもよい。
【０１４０】
従来の漂白剤活性化剤に加えてまたは代えて、「漂白触媒」が存在してもよい。これらの物質は、漂白増強遷移金属塩または遷移金属錯体、例えば、Mn、Fe、Co、RuまたはMoのサレン錯体またはカルボニル錯体である。N−含有トライポッド（三脚）リガンドを含むMn、Fe、Co、Ru、Mo、Ti、VおよびCu錯体、ならびにCo、Fe、CuおよびRuアミン錯体はまた、漂白触媒として安定であり、DE 197 09 284 A1に記載されるような化合物を用いることが好ましい。WO 99／63038によるアセトニトリル誘導体、およびWO 99／63041による漂白活性化繊維金属錯体化合物は、アミラーゼと組み合わせて漂白活性化作用を発現することができる。
【０１４１】
本発明の組成物は通常、１つ以上のビルダー、特にゼオライト、ケイ酸塩、炭酸塩、有機コビルダー、およびそれらの使用に反対する環境的理由がない場合、リン酸を含む。後者は、特に食器洗い機のための清浄化組成物における使用のための好ましいビルダーである。
【０１４２】
ここで言及され得る化合物は、一般式NaMSixO2x+1・yH2Oの結晶の、層状ケイ酸ナトリウムであって、ここでMはナトリウムまたは水素であり、xは、1.6〜4の数、好ましくは1.9〜4.0であり、yは、0〜20の数であり、xの好ましい値は、2、3または4である。この種類の結晶フィロケイ酸塩は、例えば、欧州特許出願EP 0 164 514に記載される。示した式の好ましい結晶フィロケイ酸塩は、Mがナトリウムでありxが2または3の値をとるものである。特に、Na2Si2O5・yH2Oであるβ−ケイ酸ナトリウムおよびδ−二ケイ酸ナトリウムの両方が好ましい。この種類の化合物は、例えば、SKS（登録商標）（Clariant）の商品名で販売されている。従って、SKS-6（登録商標）は、主に式Na2Si2O5・yH2Oを有するδ二ケイ酸ナトリウムであり、SKS-7（登録商標）は主に、β−二ケイ酸ナトリウムである。δ二ケイ酸ナトリウムと酸（例えば、クエン酸またはカルボン酸）との反応によって、それぞれSKS-9（登録商標）およびSKS-10（登録商標）（Clariant）の商品名で販売されるカネマイトであるNa2Si2O5・yH2Oが得られる。このようなフィロケイ酸塩の化学的修飾を用いることも有利であり得る。従って、例えば、フィロケイ酸塩のアルカリ度は、好適に影響され得る。リン酸塩または炭酸塩でドープされたフィロケイ酸塩は、δ二ケイ酸ナトリウムと比べて、結晶形態が変化し、より急速に溶解して、δ−二ケイ酸ナトリウムと比べてカルシウム結合能の増大を示す。従って、一般的実験式xNa2O・ySiO2 zP2O5のフィロケイ酸塩であって、ここでx対y比が、0.35〜0.6に相当し、x対z比が、1.75〜1200に相当し、y対z比が、4〜2800に相当するものは、特許出願DE 196 0106に記載されている。フィロケイ酸塩の溶解度はまた、特に微細に顆粒化されたフィロケイ酸塩を用いて増大することができる。結晶フィロケイ酸塩の化合物を他の成分とともに用いることも可能である。ここで言及され得る化合物は、特に、有利な識別可能な作用を有して、特に洗濯組成物の錠剤中で用いられるセルロース誘導体を有する化合物、ならびにポリカルボキシレートを有する化合物、例えば、クエン酸またはポリマーのポリカルボキシレート、例えば、アクリル酸のコポリマーである。
【０１４３】
1:2〜1:3.3、好ましくは1:2〜1:2.8、特に1:2〜1:2.6のNa2O：SiO2係数を有し、遅い溶解および二次洗濯組成物特性を有する無定型（非結晶）ケイ酸ナトリウムを使用することも可能である。従来の無定型ケイ酸ナトリウムに対して遅い溶解は、種々の手段、例えば、表面処理、配合、圧密／圧縮によって、または過乾燥によって得ることができる。本発明の範囲内で、「無定型」という用語はまた、「X線無定型」を意味する。これは、X線回折実験においてケイ酸塩が結晶物質に代表的な鋭いX線反射を生じないが、その代わり、最良でも、数度（角度）の回折角の幅の１つ以上の散乱X線照射の極大を有することを意味する。しかし、特に良好なビルダー特性でさえ、電子回折実験において、ケイ酸塩粒子があまり規定されないか、またはさらに先鋭な回折極大値を生じる可能性が極めて高い。これは、この生成物が10〜数百nm、好ましくは最大でも50nmまでの値、特に最大でも20nmまでのサイズを有する微結晶性領域を有するという効果であると解釈される。特に好ましいのは、圧縮された／圧密された無定型ケイ酸塩、配合された無定型ケイ酸塩、および過乾燥されたX線無定型ケイ酸塩である。
【０１４４】
微結晶性の、結合水を含有する合成ゼオライトであって、必要に応じて用いられ得るものは好ましくは、ゼオライトAおよび／またはPである。ゼオライトPとしては、ゼオライトMAP（登録商標）（Crosfieldからの商品）が特に好ましい。しかし、ゼオライトXならびにA、Xおよび／またはPの混合物がまた好適である。市販されており、かつ本発明の範囲内で好適に用いることができる製品は、例えば、ゼオライトXおよびゼオライトAの結晶（約80wt％のゼオライトX）であって、これは商品名VEGOBOND AX（登録商標）としてCONDEA Augusta S.p.A.から販売されており、以下の式：
nNa2O・(1-n)K2O・Al2O3・（2-2.5）SiO2・（3.5-5.5）H2O
によって記載することができる。
【０１４５】
好適なゼオライトは、10μm未満の平均粒子サイズ（容積分布；測定方法：Coulter counter）を有し、好ましくは18〜22wt％、特に20〜22wt％の結合水を含む。
【０１４６】
ビルダー物質として一般に既知のリン酸塩の使用も、このような使用が環境的な理由によって避けるべきでない限り、当然ながら可能である。商業的に入手可能な多数のリン酸塩のなかでも、アルカリ金属リン酸塩は、洗濯組成物および清浄化組成物の工業において最も重要であり、三リン酸五ナトリウムまたは三リン酸五カリウムが特に好ましい。
【０１４７】
これに関連して、アルカリ金属リン酸塩は、種々のリン酸のアルカリ金属（特にナトリウムおよびカリウム）塩についての総称的用語であって、メタリン酸（HPO3）nとオルトリン酸H3PO4との間、ならびにさらに高分子量の代表物を識別することができる。リン酸塩は、いくつかの利点を組み合わせる：それらは、アルカリ担体として働き、機械部分上への石灰沈着および織布への石灰付着を防ぎ、さらに清浄化能力に寄与する。
【０１４８】
リン酸二水素ナトリウムであるNaH2PO4は、二水和物として（密度1.91fcm-3、融点60℃）、および一水和物（密度2.04gcm-3）として存在する。両方の塩とも白色粉末であり、水中で極めて容易に溶解し、加熱の際に結晶化の水を失って、200℃で弱い酸性の二リン酸塩（リン酸二水素ナトリウムであるNa2H2P2O7）に、さらに高温ではトリメタリン酸ナトリウム（Na3P3O9）およびマドレル（Maddrell）塩に転化する（以下を参照）。NaH2PO4は酸性であり；それは、リン酸が水酸化ナトリウム溶液を用いて4.5のpHに調整して、スラリーを噴霧したときに形成される。リン酸二水素カリウム（一級または一塩基性リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、KDP）、KH2PO4は、2.33gcm-3の白色塩であり、253℃の融点を有し［ポリリン酸カリウム（KPO3）xの形成をともなって溶解］、水に容易に溶ける。
【０１４９】
リン酸水素二ナトリウム（二級リン酸ナトリウム）Na2HPO4は、水中で極めて容易に可溶である無色結晶の塩である。これは、無水型で、2モルの水（密度2.066gcm-3、95℃で水の喪失）、7モルの水（密度1.69gcm-3、融点48℃で5H2Oを失う）、および12モルの水（密度1.52gcm-3、融点35℃で5H2Oを失う）とともに存在し、100℃で無水になり、さらに強度の加熱の際に二リン酸塩Na4P2O7に転化する。リン酸一水素二ナトリウムは、指示薬としてフェノールフタレインを用いる炭酸ナトリウム溶液によるリン酸の中和によって調製される。リン酸一水素二カリウム（二級または二塩基のリン酸カリウム）であるK2HPO4は無定型であって、その白色塩は水に容易に溶解する。
【０１５０】
リン酸三ナトリウム、第三リン酸ナトリウムであるNa3PO4は、無色の結晶であって、これは、12水和物の形態で、1.62gcm-3の密度および73〜76℃の融点（分解）を有し、10水和物（19〜20％ P2O5に相当する）の形態で、100℃の融点を有し、無水型で（39〜30％ P2O5に相当する）2.536gcm-3の密度を有する。リン酸三ナトリウムは、アルカリ反応によって水中で容易に溶解し、正確に1モルのリン酸二ナトリウムおよび1モルのNaOHの溶液を蒸発することによって調製される。リン酸三カリウム（四級または三塩基性リン酸カリウム）であるK3PO4は、白色で、密度2.56gcm-3の融解性顆粒粉末であって、1340℃の融点を有し、水中でアルカリ反応によって容易に溶解される。これは、例えば、炭素および硫酸カリウムとのトーマススラグの加熱の間に生成される。より高い価格にもかかわらず、より容易に溶解すること、従って高度に有効である、リン酸カリウムはしばしば、清浄化組成物の工業において対応するナトリウム化合物よりも好ましい。
【０１５１】
二リン酸四ナトリウム（ピロリン酸ナトリウム）Na4P2O7は、無水型（密度2.534gcm-3、融点988℃、880℃も報告されている）で、および10水和物として（密度1.815〜1.836gcm-3、融点94℃で水を失う）存在する。両方の物質とも無色の結晶であって、水中でアルカリ反応によって溶解する。Na4P2O7は、＞200℃へのリン酸二ナトリウムの加熱の間に、またはリン酸と炭酸ナトリウムとの化学量論比での反応および噴霧による溶液の脱水によって形成される。10水和物は、重金属塩および硬度成分を複合し、これによって水の硬度を低下させる。二リン酸カリウム（ピロリン酸カリウム）であるK4P2O7は、三水和物の形態で存在して、無色で、密度が2.33gcm-3の吸湿性粉末であり、これは、水（25℃で1％強度溶液のpHが10.4である）に溶解する。
【０１５２】
NaH2PO4およびKH2PO4の縮合は、それぞれ高分子量のリン酸ナトリウムおよびリン酸カリウムを生じ、そのうちでも環状の代表物である、それぞれメタリン酸ナトリウムおよびメタリン酸カリウム、ならびに鎖状タイプの、それぞれポリリン酸ナトリウムおよびポリリン酸カリウムは識別され得る。後者について特に、複数の名称が用いられる：溶融リン酸塩または熱リン酸塩、グラハム塩、クロール塩およびマドレル塩。全ての高級のナトリウムおよびカリウムのリン酸塩はまとめて、縮合リン酸塩と呼ばれる。
【０１５３】
工業的に重要な三リン酸五ナトリウム、Na5P3O10（トリポリリン酸ナトリウム）は、非吸湿性白色水溶性の塩であって、無水であるかまたは6H2Oと結晶を形成し、その一般式は、NaO-［P（O）（ONa）-O］n-Na（ここでn=3である）である。100gの水中に、室温で、結晶水なしの約17gの塩が溶解し、60℃で約20g、100℃で約32gが溶解する。2時間でこの溶液を約100℃に加熱する場合、加水分解によって、約8％のオルトリン酸および15％の二リン酸が形成する。三リン酸五ナトリウムの調製において、リン酸は、炭酸ナトリウム溶液または水酸化ナトリウム溶液と、化学量論比で反応し、その溶液は噴霧によって脱水される。グラハムの塩および二リン酸ナトリウムと同様に、三リン酸五ナトリウムは、多くの不溶性の金属化合物（石灰石鹸などを含む）を溶解する。三リン酸五ナトリウムK5P3O10（トリポリリン酸カリウム）は、例えば、50wt％強度溶液の形態で（＞23％P2O5、25％K2O）商業的に入手可能である。ポリリン酸カリウムは、洗濯組成物および清浄化組成物の工業において広範に用いられる。さらに、トリポリリン酸カリウム・ナトリウムがまた存在し、これも同様に本発明の範囲内であり得る。それらは、例えば、トリメタリン酸ナトリウムがKOHで加水分解されるときに、形成する：
（NaPO3）3+2 KOH→Na3K2P3O10+H2O
【０１５４】
本発明によれば、これらはトリポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸カリウムまたはこれら2つの混合物と正確に同じ方法で用いることができる。トリポリリン酸ナトリウムおよびトリポリリン酸カリウムの混合物、またはトリポリリン酸カリウムおよびトリポリリン酸カリウム・ナトリウムの混合物、またはトリポリリン酸ナトリウムおよびトリポリリン酸カリウムおよびトリポリリン酸カリウム・ナトリウムの混合物もまた、本発明に従って用いることができる。
【０１５５】
本発明の洗濯組成物および清浄化組成物において用いることができる有機コビルダーは、特に、ポリカルボキシレートまたはポリカルボン酸、重合体のポリカルボキシレート、ポリアスパラギン酸、ポリアセタール、必要に応じて酸化されたデキストリン、さらなる有機コビルダー（以下を参照のこと）、およびリン酸塩である。これら種類の物質を以下に記載する。
【０１５６】
使用可能な有機ビルダー物質は、例えば、そのナトリウム塩の形態で使用可能なポリカルボン酸であって、このポリカルボン酸という用語は、2つ以上の酸性基を担持するカルボン酸を意味する。これらの例は、その使用が環境的理由によって回避されるべきでない限り、クエン酸、アジピン酸、コハク酸、グルタル酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、糖酸、アミノカルボン酸、ニトリロ三酢酸（NTA）、およびそれらの混合物である。好ましい塩は、ポリカルボン酸、例えば、クエン酸、アジピン酸、コハク酸、グルタル酸、酒石酸、糖酸の塩、およびそれらの混合物である。
【０１５７】
酸自体を使用することも可能である。それらのビルダー作用に加えて、酸は代表的にはまた、酸性化剤成分の特性を有し、従って、残りの成分の混合物から得られるpHが所望されない場合、より低くかつより弱いpHの洗濯組成物または清浄化組成物を確立するように機能する。システムに相性がよく、環境的に安全な酸、例えば、クエン酸、酢酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸、グリコール酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、グルコン酸およびそれらの任意の混合物が、ここで特に言及されるべきである。しかし、鉱酸、特に、硫酸、または塩基、特に、アンモニウムまたはアルカリ金属水酸化物も、pH調節剤として機能することができる。本発明の組成物は、このような調節剤を好ましくは20wt％以下、特に、1.2wt％〜17wt％の量で含む。
【０１５８】
好適なビルダーはまた、重合体のポリカルボキシレートであり、それらは、例えば、ポリカルボン酸、またはポリメタクリル酸のアルカリ金属塩、例えば、500〜70000g／モルの相対分子量を有するものである。
【０１５９】
重合体ポリカルボキシレートについて得られる分子量は、本明細書の目的について、各々の酸型の平均分子量、Mwであって、これは通常UV検出器を用いて、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によって決定される。研究したポリマーに対するその構造的な類似性に基づいて、ポリアクリル酸外部標準に対して測定を行なって、現実の分子量値を得た。これらの数値は、標準としてポリスチレンスルホン酸を用いて得られた分子量値とはかなり異なる。ポリスチレンスルホン酸に対して測定した分子量は通常、本明細書で得られる分子量よりもかなり高い。
【０１６０】
好適なポリマーは、特に、ポリアクリレートであり、これは好ましくは、2000〜20000g／モルの分子量を有する。それらの優れた溶解度によって、2000〜10000g／モル、特に好ましくは3000〜5000g／モルの分子量を有する短鎖ポリアクリレートが、この群において、次に好ましいであろう。
【０１６１】
また、コポリマーポリカルボキシレート、特にアクリル酸とメタクリル酸とのもの、およびアクリル酸またはメタクリル酸とマレイン酸とのものも好適である。特に好適であることが明らかにされているコポリマーは、アクリル酸とマレイン酸とのコポリマーであって、これは50〜90wt％のアクリル酸および50〜10wt％のマレイン酸を含む。遊離酸に基づく、それらの相対分子量は、一般に2000〜70000g／モル、好ましくは20000〜50000g／モル、特に30000〜40000g／モルである。この（コ）ポリマーのポリカルボキシレートは、粉末または水溶液のいずれかとして用いられ得る。この（コ）ポリマーポリカルボキシレートは、この組成物の含量の0.5〜20wt％、特に1〜10wt％であってもよい。
【０１６２】
水中でのこの溶解度を改善するため、ポリマーはまた、アリルスルホン酸、例えば、アリルオキシベンゼンスルホン酸およびメタアリルスルホン酸などを単量体として含んでもよい。
【０１６３】
また、3つ以上の異なる単量体単位の生分解性ポリマー、例えば、単量体としてアクリル酸の塩およびマレイン酸の塩、ならびにビニルアルコールもしくはビニルアルコール誘導体を含むもの、またはモノマーとして、アクリル酸の塩および2−アルキルアリルスルホン酸の塩、ならびに糖誘導体を含むものが特に好ましい。
【０１６４】
さらに好ましいコポリマーは、好ましくは単量体として、アクロレインおよびアクリル酸／アクリル酸塩またはアクロレインおよび酢酸ビニルを有するものである。
【０１６５】
言及され得るさらに好ましいビルダー物質はまた、重合体アミノジカルボン酸、その塩またはそれらの前駆体物質である。ポリアスパラギン酸またはその塩および誘導体が特に好ましい。
【０１６６】
さらなる好適なビルダー物質は、ポリアセタールであって、これは、ジアルデヒドと、5〜7個の炭素原子および少なくとも3つの水酸基を有するポリカルボン酸との反応によって得ることができる。好ましいポリアセタールは、ジアルデヒド、例えば、グリオキサール、グルタルアルデヒド、テレフタルアルデヒドおよびそれらの混合物から、ポリカルボン酸、例えば、グルコン酸および／またはグルコヘプタン酸から得られる。
【０１６７】
さらに好適な有機ビルダー物質は、デキストリン、例えば、炭水化物のオリゴマーまたはポリマーであり、これは、デンプンの部分的な加水分解によって得ることができる。加水分解は、慣用的なプロセス、例えば、酸触媒プロセスまたは酵素触媒プロセスによって実施することができる。加水分解物は好ましくは、400〜500000g／モルの範囲の平均分子量を有する。ここで、0.5〜40、特に2〜30の範囲のデキストロース当量（DE）を有する多糖類が好ましいが、ここでDEとは、100のDEを有するデキストロースと比べた多糖類の作用の低下の共通の指標である。3〜20のDEを有するマルトデキストリンおよび20〜37のDEを有する乾燥グルコースシロップ、ならびに2000〜3000g／モルの範囲の高い分子量を有する「黄色デキストリン」および「白色デキストリン」の両方を用いることができる。
【０１６８】
このようなデキストリンの酸化誘導体は、サッカライドの環の少なくとも1つのアルコール基をカルボン酸基へ酸化することができる酸化剤との、それらの反応生成物である。本発明の組成物のために特に好ましい有機ビルダーは、それぞれ、出願EP 472 042、WO 97／25399およびEP 755 944の酸化デンプンおよびそれらの誘導体である。
【０１６９】
オキシジコハク酸およびジコハク酸の他の誘導体、好ましくはエチレンジアミンジコハク酸も、さらに好適なコビルダーである。ここで、エチレンジアミンN,N’−ジコハク酸(EDDS)は好ましくは、そのナトリウム塩またはマグネシウム塩の形態で用いられる。これに関して、またさらに好ましいのは、グリセロールジコハク酸およびグリセロールトリコハク酸である。ゼオライト含有処方物および／またはケイ酸含有処方物における好適な使用量は、3〜15wt％である。
【０１７０】
用いることができるさらなる有機コビルダーは、例えば、アセチル化ヒドロキシカルボン酸またはその塩であって、これは必要に応じてラクトン型で存在してもよく、少なくとも4個の炭素原子および少なくとも1つの水酸基および多くとも2つの酸性基を含む。
【０１７１】
コビルダー特性を有するさらなる種類の物質は、ホスホン酸塩である。これらは特に、ヒドロキシアルカンおよびアミノアルケンのホスホン酸塩である。ヒドロキシアルカンホスホン酸塩の中でも、コビルダーとして特に重要なのは、1−ヒドロキシエタン−1,1−ジホスホン酸塩（HEDP）である。中性である二ナトリウム塩およびアルカリ性（pH9）である三ナトリウム塩を、ナトリウム塩として用いることが好ましい。好適なアミノアルカンホスホン酸塩は好ましくは、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸塩（EDTMP）、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸塩（DTPMP）およびそれらの高次のホモログである。それらは、好ましくは、天然のナトリウム塩の形態で、例えば、EDTMPの六ナトリウム塩として、またはDTPMPの七ナトリウム塩および八ナトリウム塩として用いられる。ここで、ホスホン酸塩に由来するビルダーとしてHEDPを用いることが好ましい。さらに、アミノアルカンホスホン酸塩は、顕著な重金属結合能を有する。従って、特に、この剤が漂白剤も含む場合、アミノアルカンホスホン酸塩、特にDTPMP、またはこのホスホン酸塩の混合物を用いることが好ましいかもしれない。
【０１７２】
さらに、アルカリ土類金属イオンと錯体を形成することができる全ての化合物をコビルダーとして用いることができる。
【０１７３】
本発明の組成物は、ビルダー物質を、必要に応じて、90wt％までの量を含んでもよく、好ましくは75wt％までの量を含んでもよい。本発明の洗濯組成物は、特に5wt％〜50wt％のビルダー含量を有する。硬質表面を清浄化するため、特に食器洗い機のための本発明の組成物において、ビルダー物質含量は特に5wt％〜88wt％までであり、好ましくは、水不溶性ビルダー材料がこの組成物中で用いられる。特に食器洗い機のための本発明の組成物の好ましい実施形態は、20wt％〜40wt％の水溶性有機ビルダー、特にアルカリ金属クエン酸塩を、5wt％〜15wt％のアルカリ金属炭酸塩、および20wt％〜40wt％のアルカリ金属二ケイ酸塩を含む。
【０１７４】
洗濯組成物および清浄化組成物のゲル状組成物に対して液体中で用いることができる溶媒は、それらが所定の濃度範囲の水と混和できる限り、例えば、一価アルコールもしくは多価アルコール、またはアルカノールアミンまたはグリコールエーテルの群から選ばれる。好ましくは、この溶媒はエタノール、n−またはi−プロパノール、ブタノール、エチレングリコールメチルエーテル、エチレングリコールエチルエーテル、エチレングリコールプロピルエーテル、エチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールエチルエーテル、プロピレングリコールメチル、エチルまたはプロピルエーテル、ジプリピレングリコールモノメチルまたはモノエチルエーテル、ジイソプロピレングリコールモノメチルまたはモノエチルエーテル、メトキシ、エトキシまたはブトキシトリグリコール、1−ブトキシエトキシ−2−プロパノール、3−メチル−3−メトキシブタノール、プロピレングリコールt−ブチルエーテル、およびこれらの溶媒の混合物から選択される。
【０１７５】
本発明のゲル状洗濯組成物および清浄化組成物に対して、0.1〜20wt％、ただし好ましくは15wt％未満、特に10wt％未満の量で、液体中で溶媒を用いることができる。
【０１７６】
粘度を調整するため、１つ以上の増粘剤または増粘系を本発明の組成物に添加してもよい。膨潤剤とも呼ばれるこれらの高分子量物質は通常、このプロセスにおいて、液体を吸収して膨潤し、最終的に粘性の真溶液またはコロイド様溶液に変換する。
【０１７７】
好適な増粘剤は、無機または高分子有機化合物である。無機増粘剤としては、例えば、ポリケイ酸、粘土鉱物、例えば、モンモリロナイト、ゼオライト、シリカおよびベントナイトが挙げられる。有機増粘剤は、天然のポリマー、変性された天然ポリマー、および完全に合成のポリマーから選ばれる。このような天然ポリマーは、例えば、寒天、カラギーナン、トラガカント、アラビアゴム、アルギン酸塩、ペクチン、ポリオース、グアー粉、イナゴマメ粉、デンプン、デキストリン、ゼラチンおよびカゼインである。増粘剤として用いられる変性天然物質は主に、変性デンプンおよびセルロースから選ばれる。ここで言及され得る例は、カルボキシメチルセルロースおよび他のメチルセルロースエーテル、ヒドロキシエチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロース、およびイナゴマメ粉エーテルである。完全に合成の増粘剤は、ポリマー、例えばポリアクリル酸およびポリメタクリル化合物、ビニルポリマー、ポリカルボン酸、ポリエーテル、ポリイミン、ポリアミドおよびポリウレタンである。
【０１７８】
増粘剤は、最終組成物に対して、5wt％までの、好ましくは0.05〜2wt％、特に好ましくは0.1〜1.5wt％までの量で存在してよい。
【０１７９】
本発明の洗濯組成物および清浄化組成物は、必要に応じて、さらなる常套成分として、金属イオン封鎖剤、電解質およびさらに賦形剤を含み得る。
【０１８０】
本発明の繊維製品洗濯組成物は、最適の蛍光増白剤として、ジアミノスチルベンジスルホン酸の誘導体またはそのアルカリ金属塩を含んでもよい。好適なのは、例えば、4,4’−ビス（2−アニリノ−4−モルホリノ−1,3,5−トリアジニル−6−アミノ）−スチルベン−2，2'−ジスルホン酸の塩、またはモルホリノ基の代わりに、ジエタノールアミノ基、メチルアミノ基、アニリノ基または2−メトキシエチルアミノ基を有する同様の構造の化合物である。さらに、置換ジフェニルスチリル型の蛍光増白剤が存在してもよい。例えば、4,4’−ビス（2−スルホスチリル）ジフェニル、4,4’−ビス（4−クロロ−3−スルホスチリル）ジフェニル、または4−（4−クロロスチリル）−4’−（2−スルホスチリル）ジフェニルのアルカリ金属塩。上述の蛍光増白剤の混合物をまた用いることができる。
【０１８１】
再付着防止剤は、織物繊維から脱落した汚れを液体の懸濁物中に保持するという機能を有する。この目的のために好適なのは水溶性コロイド、通常、事実上有機の、例えば、デンプン、糊、ゼラチン、デンプンもしくはセルロースのエーテルカルボン酸もしくはエーテルスルホン酸の塩、またはセルロースもしくはデンプンの酸性スルホンエステルの塩である。酸性基を含む水溶性ポリアミドがまたこの目的に好適である。さらに、上述以外のデンプン誘導体、例えば、アルデヒドデンプンが用いられてもよい。セルロースエーテル、例えば、カルボキシメチルセルロース（Na塩）、メチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、および混合エーテル、例えば、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース、およびそれらの混合物が、例えば、組成物に対して0.1〜5wt％の量で含まれるのが好ましい。
【０１８２】
銀腐食を防止するために、銀腐食防止剤を、本発明の食器洗い用清浄化組成物において用いてもよい。このような防止剤は、先行技術において既知である。例えば、ベンゾトリアゾール、塩化鉄（III）またはCoSO4。例えば、欧州特許EP 0 736 084 B1に開示されるように、酵素とともに用いるのに特に好適な銀腐食防止剤は、マンガン、チタン、ジルコニウム、ハフニウム、バナジウム、コバルトまたはセリウムの塩および／または錯体であって、ここでは特定の金属が任意の酸化状態II、III、IV、VまたはVIで存在する。このような化合物の例は、MnSO4、V2O5、V2O4、VO２、TiOSO4、K2TiF6、K2ZrF6、Co(NO3)2、Co(NO3)3、およびそれらの混合物である。
【０１８３】
汚れ離脱活性成分または撥汚れ物質は、通常ポリマーであって、これは洗濯組成物中で用いる場合、洗濯物の繊維に対して汚れ離脱特性を付与するか、および／または他の洗濯組成物の成分が汚れを離脱させる能力を補助する。硬質表面の清浄化組成物におけるそれらの使用でも、匹敵する効果が観察できる。
【０１８４】
特に有効であり、かつ以前から知られている汚れ離脱活性成分は、ジカルボン酸、アルキレングリコールおよびポリアルキレングリコール単位を有するコポリエステルである。それらの例は、ポリエチレンテレフタレートおよびポリオキシエチレングリコールのコポリマーまたは混合ポリマーである（それぞれ、DT 16 17 141、およびDT 22 00 911）。ドイツ公開明細書DT 22 53 063号は、とりわけ、二塩基性カルボン酸およびアルキレンまたはシクロアルキレンポリグリコールのコポリマーを含む酸性剤を開示する。ドイツ特許DE 28 57 292号およびDE 33 24 258号、および欧州特許 EP 0 253 567号は、エチレンテレフタレートおよびポリエチレンオキシドテレフタレートのポリマーならびに洗濯組成物中でのその使用を記載している。欧州特許EP 066 944は、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、芳香族ジカルボン酸およびスルホン化芳香族ジカルボン酸のコポリマーを特定のモル比で含有する組成物に関する。欧州特許EP 0 185 427は、エチレンおよび／またはプロピレンテレフタレートおよびポリエチレンオキシドテレフタレート単位を有する、メチルまたはエチル基末端キャップポリエステル、ならびにこのような防汚ポリマーを含有する洗濯組成物を開示する。欧州特許 EP 0 241 984は、オキシエチレン基およびテレフタル酸単位に加えて、置換エチレン単位およびグリセロール単位も含むポリエステルを開示する。欧州特許EP 0 241 985は、オキシエチレン基およびテレフタル酸単位に加えて、1,2−プロピレン、1,2−ブチレンおよび／または3−メトキシ−1,2−プロピレン基を含み、C1−〜C4−アルキル基で末端基キャップされるポリエステルを開示する。欧州特許出願EP 0 272 033は、C1-4−アルキルまたはアシル基によって少なくとも部分的に末端基キャップされ、ポリプロピレンテレフタレートおよびポリオキシエチレンテレフタレート単位を有するポリエステルを開示する。欧州特許EP 0 274 907は、スルホエチル末端基キャップされたテレフタレート含有防汚ポリエステルを開示する。欧州特許出願EP 0 357 280によれば、不飽和末端基のスルホン化によって、テレフタレート、アルキレングリコールおよびポリC2-4−グリコール単位を有する防汚ポリエステルが生成される。国際特許出願WO 95／32232は、汚れを脱落できる酸性の芳香族ポリエステルに関する。国際特許出願WO 97／31085は、綿からなる材料のための、複数の機能的な単位を有する非重合体の汚れ離脱活性成分を開示している：例えば、陽イオン性であり得る第一の単位は、静電気的相互作用の手段によって綿表面に吸着できる。そして疎水性である第二の単位は、水／綿の境界に活性成分が残る原因である。
【０１８５】
本発明の洗濯組成物における使用のために好適な色移り防止剤としては、特に、ポリビニルピロリドン、ポリビニルイミダゾール、重合体のN−酸化物、例えば、ポリ（ビニルピリジンN−酸化物）およびビニルピロリドンとビニルイミダゾールとのコポリマーが挙げられる。
【０１８６】
機械清浄化プロセスにおける使用のために、この剤に発泡防止剤を添加することが有利であり得る。好適な発泡防止剤の例は、高い割合のC18-24脂肪酸を有する天然起源または合成起源の石鹸である。好適な非界面活性剤型の発泡防止剤の例は、オルガノポリシロキサンおよびそれらの、必要に応じてシラン処理された微細シリカとの混合物、さらにパラフィン、ワックス、微結晶性ワックス、およびこれらとシラン処理シリカまたはビス−ステアリル−エチレンジアミンとの混合物である。有利なのは、また、異なる発泡防止剤の混合物、例えば、シリコーン、パラフィンまたはワックスの混合物からなる使用である。この発泡防止剤、特にシリコーンおよび／またはパラフィンを含有するものは、好ましくは、顆粒、水溶性または分散性の支持物質に結合される。ここで、特に好ましいのは、パラフィンおよびビス−ステアリルエチレンジアミドの混合物である。
【０１８７】
硬質表面のための本発明の清浄化組成物は、さらに研磨作用を有する成分、特に、石英粉末、木粉、ポリマー粉末、チョークおよびガラスビーズ、ならびにそれらの混合物からなる群からの成分を含む。研磨剤は、本発明の清浄化組成物中に、好ましくは20wt％以下、特に、5wt％〜15wt％で存在する。
【０１８８】
製品の審美的な魅力を改善し、さらに消費者に、洗濯および清浄化能力に加えて、視覚的にかつ感覚的に「代表的かつ間違えようのない」生成物を提供するために、色素および芳香剤を洗濯組成物および清浄化組成物に添加する。香油および／または芳香剤として、個々の芳香化合物、例えば、エステル、エーテル、アルデヒド、ケトン、アルコールおよび炭化水素型の合成物を使用することが可能である。エステル型芳香化合物は、例えば、酢酸ベンジル、イソ酪酸フェノキシエチル、酢酸p-tert-ブチルシクロヘキシル、酢酸リナリル、酢酸ジメチルベンジルカルビニル、酢酸フェニルエチル、安息香酸リナリル、ギ酸ベンジル、グリシン酸エチルメチルフェニル、プロピオン酸アリルシクロヘキシル、プロピオン酸スチルアリルおよびサリチル酸ベンジルである。エーテルは例えば、ベンジルエチルエーテルを含む；アルデヒドは、例えば、8〜18個の炭素原子を有する直鎖状アルカナール、シトラール、シトロネラル、シトロネリルオキシアセトアルデヒド、シクラメンアルデヒド、ヒドロキシシトロネラル、リリアルおよびボージュナールを含む；ケトンは、例えば、イオノン、α−イソメチルイオノンおよびメチルセドリルケトンを含む；アルコールは、アネトール、シトロネロール、オイゲノール、ゲラニオール、リナロール、フェニルエチルアルコールおよびテルピネオールを含む；炭化水素は、主にテルペン、例えば、リモネンおよびピネンを含む。しかし、一緒になって魅力的な芳香の様子を生じる異なる芳香剤の混合物の使用が好ましい。このような香油はまた、植物供給源、例えば、松根油、かんきつ油、ジャスミン油、バラ油、またはイランイランノキの油から入手可能であるような、天然の芳香剤混合物を含んでもよい。同様に好適なのは、マスカテル、セージ油、カモミール油、丁子油、香油（バーム油）、ミント油、桂皮油、ライム花油、ネズの実油、ベチベルソウ油、オリバナム油、ガルバナム油、およびラブダナム油、およびまたオレンジ花油、橙花油、オレンジ果皮油、およびビャクダン油である。洗濯組成物および清浄化組成物の芳香剤量は通常、0.01wt％未満であるが、芳香剤は処方物全体の2wt％までを構成し得る。
【０１８９】
芳香剤は、洗濯組成物および清浄化組成物中に直接組み込まれてもよい；しかしまた、担体に対して芳香剤を付与して、これによって、清浄化されるべき材料に対する香料の付着を強化し、芳香剤の徐放的放出によって、特に処理された繊維製品において長期の芳香を保証することが有利であり得る。このような担体として確立されている材料は、例えば、シクロデキストリンであり、さらに、シクロデキストリン−香料複合体について、さらなる助剤でコーティングすることもできる。芳香のための別の好ましい担体は、記載されたゼオライトXであり、これがまた界面活性剤の代わりに、または界面活性剤との混合において芳香を吸収し得る。従って、記載されたゼオライトX、および好ましくはこのゼオライト上に少なくとも部分的に吸着される芳香剤を含む洗濯組成物および清浄化組成物が好ましい。
【０１９０】
好ましい色素であって、その選択が当業者には決して困難でない色素は、高い貯蔵安定性、ならびにこの組成物の他の成分および光に対する非感受性を有し、また織物繊維に対して明白な親和性を有さず、そのためそれらを染色することがない。
【０１９１】
微生物を制御するため、洗濯組成物または清浄化組成物は抗菌剤を含んでもよい。抗菌スペクトルおよび作用機序に依存して、ここで静菌と殺菌との間、静真菌と殺真菌との間などを区別する。これらの群に由来する重要な物質の例は、塩化ベンザルコニウム、スルホン酸アルキルアリール、ハロフェノールおよび酢酸フェニル水銀である。抗菌作用および抗菌剤という用語は、本発明の教示内に、当分野で共通の意味を有するが、これは例えば、K. H. Wallhaeusserによって、「殺菌、消毒−保存の実践：菌の同定−衛生操作（Paraxis der Sterilisation, Desinfektion−Konservierung：Keimidentifizierung−Betriebshygiene）」（第5版−Stuuugart；New York：Thieme、1995）に記載されており、ここに記載された抗菌作用を有する物質の全てを使用することが可能である。好適な抗菌剤は好ましくは、以下の群から選択される：アルコール、アミン、アルデヒド、抗菌の酸またはその塩、カルボン酸エステル、酸アミド、フェノール、フェノール誘導体、ジフェニル、ジフェニルアルカン、尿素誘導体、酸素アセタール、窒素アセタールならびにまた酸素および窒素の形式、ベンズアミジン、イソチオアゾリン、フタルイミド誘導体、ピリジン誘導体、抗菌界面活性剤化合物、グアニジン、抗菌両性化合物、キノリン、1,2−ジブロモ−2,4−ジシアノブタン、ヨード−2−プロピルブチルカルバミン酸、ヨウ素、ヨードフォア、ペルオキソ化合物、ハロゲン化合物、および上記の任意の混合物。
【０１９２】
抗菌剤は、以下から選択されてもよい：エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、1,3−ブタンジオール、フェノキシエタノール、1,2−プロピレングリコール、グリセロール、ウンデシレン酸、安息香酸、サリチル酸、ジヒドロ酢酸、o−フェニルフェノール、N−メチルモルホリノアセトニトリル（MMA）、2−ベンジル−4−クロロフェノール、2,2’−メチレンビス（6−ブロモ−4−クロロフェノール）、4,4’−ジクロロ−2’−ヒドロキシジフェニルエーテル（ジクロサン）、2,4,4’−トリクロロ−2’−ヒドロキシジフェニルエーテル（トリクロサン）、クロルヘキシジン（chlorohexidine）、N−(4−クロロフェニル)−N−（3,4−ジクロロフェニル）尿素、N,N’−（1,10−デカンジイルジ−1−ピリジニル−4−イリジン）−ビス（1−オクタンアミン）二塩酸塩、N,N’−ビス（4−クロロフェニル）−3,12−ジイミノ−2,4,11,13−テトラ−アザテトラデカンジイミドアミド、グルコプロタミン、抗菌界面活性四級化合物、二グアニジンおよびポリグアニジンを含むグアニジン、例えば、1,6−ビス（2−エチルヘキシルビグアニドヘキサン）二塩酸塩、1,6−ジ−（N1、N1’−フェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン四塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−フェニル−N1,N1−メチルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン二塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−o−クロロフェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン二塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−2,6−ジクロロフェニル−ジグアニド−N5、N5’）ヘキサン二塩酸塩、1,6−ジ−[N1,N1’−β−（p−メトキシフェニル）ジグアニド−N5、N5’]ヘキサン二塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−α−メチル−β−フェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン二塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−pω−ニトロフェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン二塩酸塩、ω：ω−ジ−（N1,N1’−フェニルジグアニド−N5、N5’）−ジ−n−プロピルエーテル二塩酸塩、ω：ω’−ジ−（N1,N1’−p−クロロフェニルジグアニド−N5、N5’）−ジ−n−プロピルエーテル四塩酸塩、1,6−ジ−（N1、N1’−2,4−ジクロロ−フェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン四塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−p−メチルフェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン二塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−2,4,5−トリクロロフェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン四塩酸塩、1,6−ジ−［N1,N1’−α−（p−クロロフェニル）エチルジグアニド−N5、N5’］ヘキサン二塩酸塩、ω：ω−ジ−（N1,N1’−p−クロロフェニルジグアニド−N5、N5’）m−キシレン二塩酸塩、1,12−ジ−（N1,N1’−p−クロロフェニルジグアニド−N5、N5’）ドデカン二四塩酸塩、1,10−ジ−（N1,N1’−フェニルジグアニド−N5、N5’]ドデカン四塩酸塩、1,12−ジ−（N1,N1’−フェニルジグアニド−N5、N5’）ドデカン四塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−o−クロロフェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン二塩酸塩、1,6−ジ−（N1,N1’−o−クロロフェニルジグアニド−N5、N5’）ヘキサン四塩酸塩、エチレンビス（1−トリイルビグアニド）、エチレンビス（p−トリビグアニド）、エチレンビス（3,5−ジメチルフェニルビグアニド）、エチレンビス（p-tert-アミルフェニルビグアニド）、エチレンビス（ノニル−フェニルビグアニド）、エチレンビス（フェニルビグアニド）、エチレンビス（N−ブチルフェニルビグアニド）、エチレンビス（2,5−ジエトキシフェニルビグアニド）、エチレンビス（2,4−ジメチルフェニルビグアニド）、エチレンビス（o−ジフェニルビグアニド）、エチレンビス（混合アミルナフチルビグアニド）、N−ブチルエチレンビス（フェニルビグアニド）、トリメチレンビス（o−トリイルビグアニド）、N−ブチル−トリメチルビス（フェニルビグアニド）など、およびその対応する塩、例えば、酢酸塩、グルコン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、クエン酸塩、亜硫酸水素塩、フッ化物、ポリマレイン酸塩、N−ココアルキルサルコシネート、亜リン酸塩、次亜リン酸塩、ペルフルオロオクタン酸塩、ケイ酸塩、ソルビン酸塩、サリチル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、イミノ二酢酸塩、桂皮酸塩、チオシアン酸塩、アルギン酸塩、ピロメリット酸塩、テトラカルボキシブチレート、安息香酸塩、グルタル酸塩、モノフルオロホスホン酸塩、ペルフルオロホスホン酸塩、ならびにそれらの任意の混合物。また、ハロゲン化キシレンおよびクレゾール誘導体、例えば、p−クロロメタクレゾールまたはp−クロロメタキシレン、ならびに植物起源（例えば、スパイスまたはハーブ由来）、動物起源、および微生物起源の天然の抗菌剤も好適である。以下を用いることも好適であり得る：抗菌界面活性四級化合物、植物起源の天然抗菌剤、および／または動物起源の天然抗菌剤、最も好ましくはカフェイン、テオブロミンおよびテオフィリン、ならびに精油、例えば、オイゲノール、チモールおよびゲラニオールからなる群に由来する植物由来のの少なくとも1つの天然の抗菌剤、ならびに／またはミルクタンパク質、リゾチームおよびラクトペルオキシダーゼのような酵素を含む群に由来する動物由来の少なくとも1つの天然抗菌剤、ならびに／またはアンモニウム、スルホニウム、ホスホニウム、ヨードニウムまたはアルソニウム基、ペルオキソ化合物および塩化化合物を有する少なくとも1つの抗菌界面活性四級化合物。微生物に由来する物質である「バクテリオシン」を使用することも可能である。
【０１９３】
抗菌剤として好適である四級アンモニウム化合物（QAC）は、一般式（R1）（R2）（R3）（R4）N+X-を有し、ここでR1〜R4は、C1−C22−アルキル基、C7−C28−アラルキル基、または複素環式基と同一であるか、または異なり、ここで2つ、またはピリジンのような芳香族組み込みの場合には、さらに3つの基が、窒素原子と一緒になって、複素環、例えば、ピリジニウムまたはイミダゾリニウム化合物を形成し、X−は、ハライドイオン、硫酸イオン、水酸化物イオン、または同様の陰イオンである。最適な抗菌作用のために、少なくとも1つの基が好ましくは、8〜18個、特に12〜16個の鎖長の炭素原子を有する。
【０１９４】
QACは、三級アミンとアルキル化剤、例えば、塩化メチル、塩化ベンジル、硫酸ジメチル、臭化ドデシル、そうでなければエチレンオキシドなどとの反応によって調製されてもよい。1つの長いアルキル基および2つのメチル基を有する三級アミンのアルキル化は、特に容易に進行し、2つの長い基および1つのメチル基を有する三級アミンの四級化は、温和な条件下で塩化メチルの補助によって実施され得る。3つの長いアルキル基またはヒドロキシ置換アルキル基を有するアミンは、低い反応性を有して、好ましくは、硫酸ジメチルを用いて四級化される。
【０１９５】
好適なQACの例は、塩化ベンザルコニウム（N−アルキル−N,N-ジメチルベンジルアンモニウムクロライド、CAS No. 8001-54-5）、ベンザルコンB（m、p−ジクロロベンジルジメチル−C12−アルキルアンモニウムクロライド、CAS No. 58390-78-6）、塩化ベンズオキソニウム（ベンジルドデシルビス（2−ヒドロキシエチル）アンモニウムクロライド）、臭化セントリモニウム（N−ヘキサデシル−N,N−トリメチルアンモニウムブロミド、CAS No. 57-09-0）、塩化ベンゼトニウム（N,N−ジメチル−N−［2−［2−［p−（1,1,3,3−トトラメチルブチル）フェノキシ］エトキシ］エチル］−ベンジルアンモニウムクロライド、CAS No. 121-54-0）、ジアルキルジメチルアンモニウムクロライド、例えば、ジ−n−デシルジメチルアンモニウムクロライド（CAS No. 7137-51-5-5）、ジデシルジメチルアンモニウムブロミド（CAS No. 2390-68-3）、ジオクチルジメチルアンモニウムクロライド、1−セチルピリジニウムクロライド（CAS No. 123-03-5）およびチアゾリンヨード（CAS No. 15764-48-1）、およびそれらの混合物である。特に好ましいQACは、C8−C18−アルキル基を有する塩化ベンザルコニウム、特にC12−C14−アラルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドである。
【０１９６】
ベンザルコニウムハライド、および／または置換ベンザルコニウムハライドは、商業的に入手可能である。例えば、LonzaのBarquat（登録商標）、MasonのMarquat（登録商標）、Witco／Sherex のVariquat（登録商標）およびLonzaのHyamine（登録商標）、ならびにLonzaのBardac（登録商標）。さらなる市販の抗菌剤は、N−（3−クロロアリル）ヘキサミニウムクロライド、例えば、Dowicide（登録商標）およびDowicil（登録商標）（Dowから）、塩化ベンゼトニウム、例えば、Rohm ＆ HaasのHyamine（登録商標）1622、塩化メチルベンゼトニウム、例えば、Rohm ＆ HaasのHyamine（登録商標）10X、塩化セチルピリジニウム、例えば、Marrell Labsの塩化セパコールである。
【０１９７】
抗菌剤は、0.0001wt％〜1wt％、好ましくは0.001wt％〜0.8wt％、特に好ましくは0.005wt％〜0.3wt％、特に0.01〜0.2wt％の量で用いられる。
【０１９８】
この組成物は、処理済の繊維製品に結合し、繊維の光安定性および／または他の処方成分の光安定性を改善し得る紫外線（UV）吸収剤を含んでもよい。UV吸収剤とは、有機物質であって、紫外照射を吸収することができ、かつその吸収されたエネルギーを再度、さらに長波長の照射の形態で、例えば熱で放射することができる有機物質（光保護フィルター）を意味する。
【０１９９】
これらの所望の特性を有する化合物は、例えば、無放射線失活を介して活性である化合物および2位および／または4位に置換基を有するベンゾフェノンの誘導体である。さらに、置換ベンゾトリアゾール、3位でフェニル置換されたアクリル酸塩（2位でシアノ基を有するかまたは有さない、桂皮酸誘導体）、サリチル酸塩、有機Ni錯体および天然物質、例えば、ウンベリフェロンおよび内因性ウロカニン酸も好ましい。特に重要なのは、ビフェニル、特にスチルベン誘導体であって、これは例えば、欧州特許0728749 Aに記載され、かつCibaから、Tinosorb（登録商標）FDまたはTinosorb（登録商標）FRとして市販されている。言及され得るUV−B吸収剤は、以下のものである：3−ベンジリデンカンファーまたは3−ベンジリデンノルカンファーおよびその誘導体、例えば、3−（4−メチルベンジリデン）カンファー（欧州特許0693471 B1に記載）；4−アミノ安息香酸誘導体、好ましくは2−エチルヘキシル4−（ジメチルアミノ）ベンゾエート、2−オクチル4−（ジメチルアミノ）ベンゾエート、およびアミル4−（ジメチルアミノ）ベンゾエート；桂皮酸のエステル、好ましくは2−エチルヘキシル4−メトキシシンナメート、プロピル4−メトキシシンナメート、イソアミル4−メトキシシンナメート、2−エチルヘキシル2−シアノ−3,3−フェニルシンナメート（オクトクリレン）；サリチル酸のエステル、好ましくは2−エチルヘキシルサリチレート、4−イソプロピルベンジルサリチレート、ホモメンチルサリチレート；ベンゾフェノンの誘導体、好ましくは2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン、2−ヒドロキシ−4−メトキシ−4’−メチルベンゾフェノン、2,2’−ジヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン；ベンザルマロン酸のエステル、好ましくはジ−2−エチルヘキシル4−メトキシベンズマロネート；トリアジン誘導体、例えば、2,4,6−トリアニリノ−（p−カルボ−2’−エチル−1’−ヘキシルオキシ）−1,3,5−トリアジンおよびオクチルトリアゾンなど（欧州特許0818450 A1に記載）、またはジオクチルブタミドトリアゾン（Uvasorb（登録商標）HEB）；プロパン−1,3−ジオン、例えば、1−（4−tert−ブチルフェニル）−3−（4’−メトキシフェニル）プロパン−1,3−ジオン；ケトトリシクロ（5.2.1.0）デカン誘導体（欧州特許0694521 B1に記載）。さらに好適なのは、以下である：2−フェニルベンズイミダゾール−5−スルホン酸およびそのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、アルカリアンモニウム、アルカノールアンモニウムおよびグルカアンモニウムの塩；ベンゾフェノンのスルホン酸誘導体、好ましくは、2−ヒドロキシ−4−メトキシベンゾフェノン−5−スルホン酸およびその塩；3−ベンジリデンカンファーのスルホン酸誘導体、例えば、4−（2−オキソ−3−ボルニリデンメチル）ベンゼンスルホン酸および2−メチル−5−（2−オキソ−3−ボルニリデン）スルホン酸およびその塩。
【０２００】
好適な代表的UV−Aフィルターは、特に、ベンゾイルメタンの誘導体、例えば、DE 19712033 A1（BASF）に記載のような、1−（4’−tert−ブチルフェニル）−3−（4’−メトキシフェニル）プロパン−1,3−ジオン、4−tert−ブチル−4’−メトキシジネンゾイルメタン（Parsol 1789）、1−フェニル−3−（4’−イソプロピルフェニル）プロパン−1,3−ジオン、およびエナミン化合物などである。UV−AフィルターおよびUV−Bフィルターは当然ながら、混合して用いることができる。このような可溶性物質に加えて、不溶性光保護顔料、すなわち微分散された、好ましくはナノ化された、金属酸化物または塩も、この目的に好適である。好適な金属酸化物の例は、特に、酸化亜鉛および二酸化チタン、ならびに、鉄、ジルコニウム、シリコン、マンガン、アルミニウムおよびセリウムの酸化物、ならびにそれらの混合物である。用いることができる塩はケイ酸塩、硫酸バリウム、またはステアリン酸亜鉛である。酸化物および塩は既に、皮膚のケアおよび皮膚保護エマルジョンおよび美容化粧品のための顔料の形態で用いられている。この粒子はここで、100nm未満、好ましくは5〜50nm、特に15〜30nmの平均直径を有すべきである。それらは、球状を有してもよいが、また楕円形状、または球形からある程度変形した形状を有する粒子を用いることもできる。この顔料は表面処理されていてもよく、すなわち、親水性であっても疎水性であってもよい。代表的な例は、コーティングされた二酸化チタン、例えば、二酸化チタンT 805（Degussa）またはEusolex（登録商標）T2000（Merck）である；好適な疎水性コーティング剤は、好ましくはシリコーン、特に好ましくは、トリアルコキシオクチルシランまたはシメチコンである。微粉末化された酸化亜鉛を用いることが好ましい。さらなる好適なUV光保護フィルターは、SOEFW−Journal、第122巻(1996)p543において、P.Finkelによる概説に見出すことができる。
【０２０１】
UV吸収剤は、通常0.01wt％〜5wt％、好ましくは0.03wt％〜1wt％の量で用いられる。
【０２０２】
プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼまたはセルラーゼのような酵素は、洗濯組成物および清浄化組成物において、活性成分として数十年も前から用いられている。当該組成物それぞれの洗濯能力および清浄化能力に対するそれらの特別なな貢献は、プロテアーゼの場合、タンパク質性汚れを分解する能力であり、アミラーゼの場合は、デンプン含有汚れを分解する能力であり、リパーゼの場合は、脂肪分解活性である。セルラーゼは好ましくは、特に、洗濯組成物の二次洗濯能力に対する寄与の故に、かつ繊維製品に対するそれらの繊維作用の故に、洗濯組成物中で用いられる。特定の加水分解物は、他の洗濯または清浄化組成物成分によって、浸食、溶解、乳化または懸濁されるか、またはそれらのより大きい溶解度によって、洗浄液で洗い流され、これにより、有利なことに酵素と他の成分との間の相乗効果が生じる。
【０２０３】
本発明の組成物は、本発明に必須のタンパク質に加えて、他のデンプン分解酵素、特にα−アミラーゼを含む。これら組成物はまた、洗濯組成物および清浄化組成物における使用が確立されている酵素を含み得る。商業的に入手可能なアミラーゼの例は、ＢＡＮ（登録商標）、Termamyl（登録商標）、Purastar（登録商標）、Amylase−LT（登録商標）、Maxamyl（登録商標）、Dyramyl（登録商標）、および／またはPurafect（登録商標）OxAmである。これらは、種々の酵素が、相互に補完することができる場合に好適である。このような補完は、例えば、調節に関して、例えば、相互の活性化によって、または不活性化によって生じ得る。これは、本発明にとって必須ではないアミラーゼ活性に対して効果を有する、本発明に必須の酵素の、例えば少なくとも1つの部分（既知のα−アミラーゼに対して相同ではない）から生じ得る。しかし、この共同使用も、異なる基質特異性の故に有用であり得る。両方とも本発明の実施形態である。
【０２０４】
化学的に多様な汚れを特に考慮すれば、洗濯組成物および清浄化組成物中に、洗濯活性および／または清浄化活性を有する他の酵素と一緒に、デンプン分解性酵素を使用することが有利であり得る。従って、本発明のタンパク質の外、さらなる酵素によって特徴付けられる洗濯組成物または清浄化組成物も、本発明の好ましい実施形態である。
【０２０５】
さらなるアミラーゼ以外に、さらなる酵素には、例えば、プロテアーゼだけでなく、リパーゼ、クチナーゼ、エステラーゼ、プルラナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよび／またはキシラナーゼ、ならびにそれらの混合物が挙げられる。特に好ましいのは、プロテアーゼ、リパーゼ、β−グルカナーゼ、および／またはセルラーゼである。さらなる酵素は、その各々の酵素活性によって対応する組成物の清浄化能力を拡大する。これら酵素としては、酵素漂白系の成分として、例えば、オキシドリダクターゼまたはペルオキシダーゼ、例えばラッカーゼ（WO 00／39306）、β−グルカナーゼ（WO 99／06515およびWO 99／06516）、またはペクチン分解性酵素（WO 00／42145）が挙げられ、これらはとりわけ特殊な洗濯組成物において使用される。
【０２０６】
本発明の組成物において使用される商業上入手可能な酵素の例は、プロテアーゼ、例えば、スブチリシン（Subtilisin） BPN’、Properase（登録商標）、BLAP（登録商標）、Optimase（登録商標）、Opticlean（登録商標）、Maxatase（登録商標）、Maxacal（登録商標）、Mazapem（登録商標）、Alcalase（登録商標）、Esperase（登録商標）、Savinase（登録商標）、Durazym（登録商標）、Everlase（登録商標）、および／またはPurafect（登録商標）G、またはPurafect（登録商標）OxPおよびリパーゼ、例えば、Lipolase（登録商標）、Lipomax（登録商標）、Lumafast（登録商標）、および／またはLipozym（登録商標）である。
【０２０７】
このような組成物におけるプロテアーゼ活性は、Tenside、第7巻（1970）125〜132頁に記載される方法によって決定することができる。従って、それらはPU（プロテアーゼ単位）で示される。好ましい組成物のプロテアーゼ活性は、調製物1gあたり1500000プロテアーゼ単位に達することがある。
【０２０８】
使用できる酵素を入手することに関して、主として好適なのは、細菌または真菌のような微生物、例えば、Bacillus subtilis、B. licheniformis、Streptomyces griseus、Humicola lanuginosa、H. insolens、Pseudomonas pseudoalcaligenes、またはP. cepacia、特に、これらの株によって天然に生成された酵素混合物、または他の株由来のものとの混合物から得られるものである。それらは、例えば、ドイツ公開明細書DE 19 40 488およびDE 21 21 397、米国特許US 3 623 957およびUS 4 264 738、欧州特許出願EP 006 638、および国際特許出願WO 91／02792に記載される好適な微生物から発酵プロセスによって既知の方式で得られる。
【０２０９】
必要に応じて付加的に用いられるこれらの酵素は、例えば、欧州特許0 564 476において、または国際特許出願WO 94／23005において記載されるように、早期の不活性化からそれらを保護するために、担体上に吸着されるか、および／または包囲物質に埋包されていてもよい。それらは、例えば、国際特許出願WO 94／18314に開示されるように、洗濯組成物中に、好ましくは10wt％まで、特に0.2wt％〜2wt％の量で存在し、特に好ましくは、酸化的分解に対して安定化された酵素を使用する。
【０２１０】
本発明のタンパク質は、例えば、物理的効果、酸化またはタンパク質分解性切断による例えば、変性、分解または失活から、安定剤によって、特に貯蔵の間、保護され得る。タンパク分解の阻害は特に微生物から得られたタンパク質について重要である。なぜならほとんどの微生物が、周囲の培地中に消化酵素として種々のプロテアーゼを分泌するからである。これらは、引き続く精製段階の間、目的のタンパク質に対してかなりの害を生じ得る。本発明に必須のタンパク質はまた、洗濯組成物および清浄化組成物においてプロテアーゼを伴うかもしれず、従って特別な保護を必要とする。
【０２１１】
本発明の組成物はまた、この目的のための安定剤を含んでもよい。安定剤の1つの群は、洗浄液中で組成物の希釈の際に解離する可逆性プロテアーゼインヒビターである。塩酸ベンズアミジンおよびロイペプチンは、この目的のために定着している。ホウ砂、ホウ酸、ボロン酸、またはそれらの塩もしくはエステルは、頻繁に用いられるが、とりわけ、特に、芳香族基を有する誘導体、例えば、オルト、メタ、またはパラ置換フェニルボロン酸、特に4−ホルミルフェニルボロン酸、またはこの化合物の塩もしくはエステルである。ペプチドアルデヒド、すなわち、還元C末端を有するオリゴペプチド、特に2〜50モノマーからなるものがまた、洗濯組成物および清浄化組成物におけるプロテアーゼの可逆的阻害のために使用される。ペプチドである可逆性プロテアーゼインヒビターとしては、とりわけ、オボムコイドが挙げられる。プロテアーゼスブチリシンについての特定の可逆性ペプチドインヒビターはまた、プロテアーゼ含有組成物、ならびにプロテアーゼおよびインヒビターから構成される対応する融合タンパク質における使用のために好適である。
【０２１２】
さらなる酵素安定剤は、アミノアルコール、例えば、モノ−、ジ−、トリエタノール−、およびプロパノールアミン、ならびにそれらの混合物、C12までの脂肪族カルボン酸、例えば、コハク酸、他のジカルボン酸、またはこのような酸の塩である。末端キャップ脂肪アミドアルコキシレートも、この目的に好適である。ビルダーとして使用されるある種の有機酸は、WO 97／18287に開示されるように、含まれる酵素をさらに安定化することができる。
【０２１３】
低級脂肪族アルコール、特にポリオール、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはソルビトールなどが、さらに頻繁に使用される酵素安定剤である。リン酸ジグリセロールはまた、物理的効果による変性から保護する。カルシウムおよび／またはマグネシウムの塩、例えば、酢酸カルシウムまたはギ酸カルシウムが、同様に使用される。
【０２１４】
ポリアミドオリゴマーまたはポリマー化合物、例えば、リグニン、水溶性ビニルコポリマーまたはセルロースエーテル、アクリルポリマーおよび／またはポリアミドは、酵素調製物を、とりわけ、物理的効果またはpH変動に対して安定化する。ポリアミンN−オキシド含有ポリマーは、酵素安定剤および色移り防止剤として同時に作用する。他のポリマー性安定剤は、直鎖状C8-C18ポリオキシアルキレンである。アルキルポリグリコシドはまた、本発明の組成物の酵素的成分を安定化し、好ましくはそれらの能力をさらに向上させることができる。架橋されたN含有化合物は好ましくは、防汚剤として、かつ酵素安定剤として二重の機能を果たす。疎水性非イオン性ポリマーは、好ましくは、他の安定剤と混合されて、必要に応じて存在するセルラーゼに対して、好ましくは本発明の酵素に対しても安定化効果を有する。
【０２１５】
還元剤および酸化防止剤は、酸化的分解に対する酵素の安定性を増大する；例えば、イオウ含有還元剤は、通常この目的のために用いられる。他の例は、亜硫酸ナトリウムおよび還元糖である。
【０２１６】
特に安定剤の組み合わせは、例えば、ポリオール、ホウ酸および／またはホウ砂の組み合わせ、ホウ酸もしくはホウ酸塩、還元塩およびコハク酸または他のジカルボン酸の組み合わせ、あるいはホウ酸またはホウ酸塩と、ポリオールまたはポリアミノ化合物との組み合わせ、および還元塩との組み合わせが使用される。ペプチドアルデヒド安定剤の効果は、ホウ酸および／またはホウ酸誘導体およびポリオールとの組み合わせによって、なおさらには、カルシウムイオンのさらなる使用によって、有利に増強される。
【０２１７】
安定化された酵素活性を有する組成物は、本発明の好ましい実施形態に相当する。特に好ましいのは、記載された複数の方法により安定化された酵素を有する組成物である。
【０２１８】
本発明の組成物は、例えば、含まれる活性物質が、時間または空間において、相互に離れて放出されるように、それらが2以上の相からなるという点に特徴がある。これに関して可能なのは、異なる凝集状態の相であるが、特に同じ状態凝集の相も可能である。
【０２１９】
2つ以上の固体成分から構成される本発明の組成物は、種々の固体成分、特に、種々の成分および／または異なる放出特性を有する粉末、顆粒または押出成形物を、相互に、全体的に緩い形態で混合することによって、簡単な方法で調製することができる。2つ以上の相から構成される本発明の固体組成物は、既知の方法で、例えば、噴霧乾燥または顆粒化により調製することができる。この場合、この酵素および場合により他の熱感受性成分、例えば漂白剤などは、必要に応じて、後に別々に添加される。増大した嵩密度、特に650g／l〜950g／lの範囲の嵩密度を有する本発明の組成物は、好ましくは、欧州特許EP 0 486 592に開示され、かつ押出し成形工程を有するプロセスにおいて調製される。顆粒化プロセスを用いたさらなる好ましい製造方法は、欧州特許 EP 0 642 576に開示されている。
【０２２０】
タンパク質は、固体組成物について、例えば、乾燥され、顆粒化され、カプセル化されるか、またはカプセル化されかつさらに乾燥された形態で使用してもよい。それらは別々に、すなわち、独立した相として、または同じ相中に他の成分と一緒に、圧密してまたはせずに、添加されてもよい。マイクロカプセル化酵素を、固体形態で処理する場合、噴霧乾燥、遠心分離または再溶解のような当分野で既知の方法によって、処理から得られる水溶液から水を除去し得る。この方法で得られた粒子は、通常、50〜200μmの粒子サイズを有する。
【０２２１】
カプセル化された形態は、他の成分、例えば、漂白剤などから酵素を保護するために、または徐放を可能とするために、好適である。これらのカプセルの寸法に依存して、ミリカプセル、マイクロカプセルおよびナノカプセルの間で区別されるが、酵素にはマイクロカプセルが特に好ましい。この種のカプセルは、例えば、特許出願WO 97／24177およびDE 199 18 267に開示される。さらなる可能なカプセル化方法は、デンプンまたはデンプン誘導体により、洗濯組成物または清浄化組成物中での使用に好適な酵素をカプセル化することである。これは、酵素溶液と、デンプンまたはデンプン誘導体の溶液または懸濁液との混合から開始する。このようなカプセル化方法は、ドイツ特許出願DE 199 56 382に記載される。
【０２２２】
少なくとも2つの固体相を一緒に結合して存在させることも可能である。即ち、1つの可能性は、本発明の固体組成物を錠剤に圧縮または圧密して提供することである。このような錠剤は、単一相であっても多相であってもよい。従って、この方法によって、2つの相を有する本発明の固体組成物を導入することが可能になる。錠剤の形態の本発明の組成物は、単相であっても多相であっても、単一色または多色であってもよく、および／または1つ以上の層からなってもよいが、好ましくは全ての成分（必要に応じて各々1つの層）を、一緒に混合して混合物とすること、およびこの混合物を従来の錠剤プレス、例えば、偏心プレスまたは回転プレスを用いて、圧縮力を50〜100kN／cm2、好ましくは60〜70kN／cm２の範囲で圧縮することによって製造される。特に多層錠剤の場合には、少なくとも1つの層を事前に圧縮することが有利であり得る。これは好ましくは、5〜20kN／cm2の間、特に10〜15kN／cm2の間の圧縮力で実施される。この方法で製造された錠剤は好ましくは、10g〜50gの重量、特に、15g〜40gの重量を有する。この錠剤の3次元形状は、任意であり、丸形でも、楕円形でも、角形でもよく、その中間の形状もまた可能である。
【０２２３】
多相組成物中において、少なくとも1つの相がアミラーゼ感受性物質、特にデンプンを含むこと、またはそれによって少なくとも部分的に囲まれるかまたはコーティングされることが特に有利である。このようにすると、この相が、外的な影響から物理的に安定化および／または保護され、同時に、洗浄液中で活性であるアミラーゼによって侵食され、その結果、成分の放出が促進される。
【０２２４】
本発明の同様に好ましい組成物は、それが全体的に液体形、ゲル形またはペースト形であるという点に特徴がある。含まれるタンパク質、好ましくは、本発明のタンパク質は、このような組成物に添加されるが、これは、好ましくは、技術水準に従って実施されるタンパク質の単離、および濃縮液または非濃縮液中の、例えば、液体形、例えば溶液、懸濁液またはエマルジョンとして、それだけでなくゲル形またはカプセル化粉末または乾燥粉末としての調製から出発する。従来の溶媒における溶液の形態でのこの形の本発明の洗濯組成物または清浄化組成物は通常、成分を単に混合することによって製造され、これは、未希釈で、または溶液として自動ミキサーへ入れることができる。
【０２２５】
本発明の1つの実施形態は、液体、ゲル状またはペースト状であって、本発明にとって必須のタンパク質、および／または他の含まれるタンパク質のうちの1つ、および／または他の含まれる成分のうちの1つが添加され、カプセル化され、好ましくはマイクロカプセルの形状である組成物である。これらの中でも特に好ましいのは、アミラーゼ感受性材料からなるカプセルを有する組成物である。アミラーゼ感受性材料および本発明に必須であるデンプン分解酵素の、洗濯組成物または清浄化組成物におけるこのような組み合わせ使用によって、デンプン分解酵素がマイクロカプセルの分解を助け、それによって、例えば、カプセル化された成分の放出のプロセスを制御するという方法で、相乗作用的な効果が示され得る。その結果、それらの放出は、貯蔵の間、および／または清浄化プロセスの開始の時点で生じないだけでなく、特定の時点でのみ生じる。広範な種々の成分および広範な種々のカプセル形を有する複合型の洗濯および清浄化組成物のシステムは、この機構に基づいてもよく、本発明の特に好ましい実施形態に相当する。
【０２２６】
洗濯組成物または清浄化組成物の成分が、少なくとも2つの異なる相、例えば、錠剤形の洗濯組成物または清浄化組成物と一緒にされている2つ以上の固体の相、または粉末形で同じ組成物内の異なる顆粒に分布される場合、匹敵する効果が得られる。食器洗い機および洗濯組成物の両方における使用のための2相または多相のクリーナーは、既知である。早期に活性化された相におけるデンプン分解酵素の活性は、後の相がアミラーゼ感受性の外皮もしくはコーティングによって包まれる場合、またはアミラーゼ感受性材料が、固相の全体的構成に相当して、その部分的もしくは完全な加水分解が関連する相を分解する場合、後の相の活性化のための前提条件である。従って、この目的のために本発明に対して必須である酵素の使用は、本発明の好ましい実施形態に相当する。
【０２２７】
洗濯組成物および清浄化組成物の成分は好適には、その能力を相互に補助できる。清浄化能力を増強するためのアミラーゼおよび色移り防止剤の相乗作用的使用は、例えば、出願WO 99／63035に開示される。コビルダーとして同時に使用することができるポリマー、例えば、アルキルポリグリコシドは、含まれた酵素の活性を安定化し、安定性を増すことができるということも、例えば出願WO 98／45396から、既知である。従って、好ましくはデンプン分解活性を有する本発明のタンパク質または誘導体にとっては、この組成物の洗濯能力または清浄化能力に対するその寄与において、上記で列挙された他の成分の1つによって、変性され、特に安定化されるか、および／または増強されることが、好ましい。従って、本発明の組成物に対応して調節された処方物は、本発明の特に好ましい実施形態に相当する。
【０２２８】
先の説明によれば、繊維製品または硬質表面を清浄化するための本発明の方法は、方法工程の少なくとも1つにおいて、好ましくはデンプン分解活性を有する、本発明のタンパク質または誘導体を用いることによって改善され得る。その結果、この方法は、本発明に従うものであり、従って本発明の実施形態である。
このような方法は、好ましくは、上記のような組成物を、この方法工程の少なくとも1つにおいて使用するという点に特徴がある。
【０２２９】
このような方法は、好ましくはデンプン分解活性を有する本発明のタンパク質または誘導体を、機械中、例えば、通常の家庭用食器洗い機または家庭用洗濯機中で、本発明の酵素を望ましくは0.01mg〜400mg、好ましくは0.02mg〜200mg、特に好ましくは0.02mg〜100mgの量で、この酵素によって特徴付けられた方法工程において使用するという点で、特に好ましく特徴付けられる。
【０２３０】
それから得られる濃度は、洗浄液１リットルあたり、デンプン分解タンパク質が有利には0.0005〜20mg、好ましくは0.005〜10mg、特に好ましくは0.005〜8mgである。このタンパク質濃度は、既知の方法、例えばBCA法（ビシンコニン酸；2,2’−ビキノリル−4,4’−ジカルボン酸）またはビウレット法（A. G. Gornall, C. S. BardawillおよびM. M. David, J. Biol. Chem. 177（1948）751〜766頁）を用いて決定することができる。
【０２３１】
先の記載によれば、好ましくはデンプン分解活性を有する本発明のタンパク質または誘導体の使用であって、繊維製品もしくは硬質表面を清浄化するための清浄化活性を有するかまたは清浄化効果を助長する少なくとも1つの他の活性成分と一緒かまたは単独での使用は、本発明の実施形態に相当する。
これは好ましくは、本発明の組成物の使用によって生じる。
【０２３２】
好ましくはデンプン分解活性を有する本発明の組成物、または本発明のタンパク質もしくは誘導体は、好ましくは上記に示される量範囲で使用され、その結果、洗浄液でこのデンプン分解性タンパク質の上記の濃度が得られる。この用量は、清浄すべき対象に依存して、この組成物の製造業者によって、または最終使用者によって管理され得る。
【０２３３】
好ましくはデンプン分解活性を有する本発明のタンパク質または誘導体を用いるためのさらなる可能性は、2つ以上の相からなる洗濯組成物または清浄化組成物において、洗浄化活性を有するかまたは洗浄化効果を補助する少なくとも1つの他の活性物質と一緒にまたは単独で提供される場合に、それ自体または他の相を活性化することである。
【０２３４】
好ましくはデンプン分解活性を有する本発明のタンパク質または誘導体を用いるためのさらなる可能性は、カプセル化された成分を有する洗濯組成物または清浄化組成物において、洗浄化活性を有するかまたは洗浄化効果を補助する少なくとも1つの他の活性物質と一緒にまたは単独で提供される場合に、カプセルからこの成分を放出することである。
【０２３５】
さらなる実施形態は、繊維製品製造における原料または中間生成物の処理のため、特に綿の糊抜きのための本発明のタンパク質または誘導体の使用である。
【０２３６】
繊維製品、例えば綿製品ための原料および中間製品は、さらに良好な処理を可能にするために、その製造およびさらなる処理の間にデンプンで仕上げされる。ヤーン、中間製品および繊維製品に対して適用されるこの方法は、糊付（サイジング）と呼ばれる。本発明のデンプン分解性タンパク質は、サイズ（糊）、すなわち、デンプン含有保護層を除去するため（糊抜き）に好適である。
【０２３７】
さらなる実施形態は、デンプンの液状化のため、特にエタノール生成のための方法であるが、この方法は、本発明のこのタンパク質または誘導体をその方法で使用するという点で特徴付けられる。
【０２３８】
デンプンの液化のために、水または緩衝液中で膨潤したデンプンを、デンプン分解性酵素とともにインキュベートして、これによって多糖類を、さらに小さい成分に、最終的には主にマルトースにまで切断する。本発明の酵素は、その生化学的特性の故に、対応する生産プロセスに十分に適合することができる場合、好ましくは、このようなプロセスまたはその部分工程のために使用される。これは、例えば、同じ反応条件を必要とする他の酵素に加えて、ある工程にそれらの酵素が導入されるべきである場合であり得る。本発明のデンプン分解性タンパク質は、目的が正にそれ自体が生成する生成物に向けられている場合、特に好ましい。デンプンの液化はまた、エタノールまたはそれに由来する下流産物、例えば酢酸を得るための多段階プロセスにおける1つの工程である。
【０２３９】
さらなる実施形態は、直鎖および／または短鎖オリゴ糖を生成するための本発明のタンパク質または誘導体の使用によって提示される。
【０２４０】
本発明のデンプン分解性タンパク質は、その酵素活性の故に、デンプン様ポリマーから、比較的短いインキュベーション時間後に、主に比較的高分子量のオリゴ糖、例えば、マルトヘキソース、マルトヘプトース、またはマルトオクトースを生成する。より長いインキュベーション時間後、より低分子量のオリゴ糖、例えば、マルトースまたはマルトトリオースなどの割合が、反応生成物の中で増大する。特定の反応生成物に特に目的が存在する場合、本発明のタンパク質の対応する改変体を用いることが可能であり、および／またはこの反応条件を好適に設計することができる。これは、この目的が純粋な化合物にあるのではなく、類似の化合物の混合に、例えば、単に特定の物理的特性を有する溶液、懸濁液またはゲルの作製にある場合などに特に魅力的である。
【０２４１】
さらなる実施形態は、シクロデキストリンを加水分解するための本発明のタンパク質または誘導体の使用によって示される。
【０２４２】
シクロデキストリンは、α−1,4−グリコシドを結合した環状オリゴ糖であり、その最大の経済的重要性は、6、7または8個のグルコースモノマーから構成されるα−、β−またはγ−シクロデキストリン（またはシクロヘキサ−、−ヘプタ−、もしくは−オクタ−アミラーゼ）が有する。これらは、疎水性ゲスト分子、例えば、芳香剤、香味料または薬学的に活性な物質などとの包含化合物を形成することが可能であり、これから、このゲスト分子が必要に応じて再度放出され得る。このような包含化合物は、例えば、食料品を製造するため、製剤のため、または化粧品のための成分、例えば、最終消費者のための対応する生成物中での使用の領域にとって、重要である。従って、シクロデキストリンからの成分の放出は、本発明のタンパク質の可能性のある用途に相当する。
【０２４３】
さらなる実施形態は、多糖類担体またはシクロデキストリンからの低分子量化合物の放出のための本発明のタンパク質または誘導体の使用によって示される。
【０２４４】
本発明のデンプン分解性タンパク質はまた、その酵素活性の故に、他のα−1,4−グリコシド結合多糖類から低分子量化合物を放出することもできる。これは、シクロデキストリンに関しては、分子レベルで、例えば、マイクロカプセルの形態でカプセル化された成分などのさらに大きいシステムで生じる。例えば、デンプンは、貯蔵の間に反応混合物中に規定の量で導入されるべき、例えば酵素のような化合物をカプセル化するために当分野では確立された材料である。このようなカプセルからの徐放のプロセスは、本発明のデンプン分解酵素によって補助され得る。
【０２４５】
さらなる実施形態は、食品および／または食品添加物を製造するための本発明のタンパク質または誘導体の使用によって示される。
【０２４６】
動物の食餌および／または動物の食品添加物を製造するための本発明のタンパク質または誘導体の使用は同様に、本発明のこの態様の実施形態に相当する。
【０２４７】
デンプンまたはデンプン由来の炭水化物が、食品または動物の食餌の成分としての役割を果たすならいかなる場合でも、デンプン分解活性を用いてこれらの製品を製造することができる。これは、ポリマーの糖に比べてモノマーまたはオリゴマーの割合を増大し、これが食品の味覚、消化性または粘りのために有益であり得る。これは、ポリマー糖の割合を減少すべきであり、かつ甘味および／またはより容易に溶解する糖の割合を増大すべき場合、ある種の動物の飼料の製造のために必要であり得るが、例えば、果汁、ワインまたは他の食品の製造にも必要であり得る。上述のデンプンの液化および／またはエタノール産生のために可能な用途は、この原理の工業的改良とみなされ得る。
【０２４８】
さらに、アミラーゼは、パン製品の、ステイリング（staling）として知られる味覚の損失を相殺する（抗ステイリング効果）。この目的のためには、ベーキングの前にパン生地にそれを添加することが好適である。従って、本発明の好ましい実施形態は、本発明のタンパク質を、パン製品を製造するために用いる実施形態である。
【０２４９】
デンプン含有接着剤結合を破壊するために、本発明のタンパク質または誘導体を使用することにより、さらなる実施形態が示される。
【０２５０】
同様に、一時的な結合方法であって、本発明のタンパク質または誘導体をそのために使用するという点で特徴付けられる方法は、本発明のこの態様の実施形態に相当する。
【０２５１】
他の天然産物に加えて、デンプンはまた、紙の製造ならびに紙およびボードの糊付けにおいて結合剤として数百年にわたって用いられている。これは、例えば、印刷物および本に関連する。長期間にわたって、このようなに紙は、例えば、湿度のような望ましくない影響を受けており、湿度によってシワができたり、裂けたりして、これが完全な破壊をもたらし得る。このような紙およびボードの修復において、接着層を破壊することが必要であり得るが、これは本発明のデンプン分解タンパク質の使用によって、著しく促進することができる。
【０２５２】
デンプンまたはセルロースのような植物性ポリマー、ならびにそれらの水溶性の誘導体は、とりわけ、接着剤またはペーストとして用いられる。この目的のためには、ますそれらを水で膨潤し、糊付けのために対象物に適用された後、乾燥しなければならず、それによって対象物は基材上に固定される。本発明の酵素はこのような水性懸濁液に添加されて、得られたペーストの接着特性に影響を与えることができる。しかし、この機能に代えてまたは加えて、本発明の酵素をこのペーストに加えて、長期間、例えば数年間の乾燥後、糊付けのための対象物上に不活性で残すこともできる。後に、酵素を活性化するために、例えば加湿による環境的条件を意図的に変更して、このペーストを破壊することができる。この方法では、糊付けされた対象物は基材から再度、いっそう容易に脱離できる。この目的には、本発明の酵素は、そのデンプン分解活性の故に、一時的結合プロセスにおける分離剤として、または糊付けされた対象物を脱離するためのいわゆる「スイッチ」として働く。
【０２５３】
以下の実施例により本発明を説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０２５４】
実施例１：微生物の存在環境からのメタゲノムDNAの単離
土壌サンプルの入手
土壌サンプルを（とりわけ）ドイツにおける種々の場所から入手して、最初に乾燥しながら機械的に処理した（4mmおよび1mmの篩いを通した篩い分け）。
【０２５５】
（土壌からのDNA単離）
DNA調製のために、13.5mlの抽出緩衝液（100mM Tris-HCl、pH 8.0；100mM EDTA, pH 8.0；100mM リン酸ナトリウム、pH8.0；1.5M NaCl；1% ヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム）の添加によって、5gの土壌をスラリーにした。この懸濁液を、液体窒素（N2）の添加によって3回急速凍結させて、乳鉢中で粉砕して、マイクロ波で煮沸した。50mlのスクリューキャップ容器中に移して、1.5mlのリゾチーム溶液（50mg／ml）を添加した後に、この懸濁液を、37℃で30分間インキュベートして、5分間の間隔で反転させた。200μlのプロテイナーゼK溶液（10mg／ml）の添加後に、前述同様に反転させながら37℃で30分間のインキュベーションを続けた。この後に、65℃で2時間のSDSでの処理を続けた（容器の反転は20分ごと）。遠心分離（6000×g、10分）および4.5mlの抽出緩衝液と1mlの10％SDSとを用いたスラリー化後に、沈殿物を再度抽出して、65℃で10分間インキュベートして、前述同様に遠心分離した。2つの遠心分離からの上澄みを合わせ、1容積のフェノール／クロロホルム（1:1）と混合して、前述同様に遠心分離した。0.6容積のイソプロパノールの添加、ならびに室温での1時間のインキュベーションおよび16000×gで20分間の遠心分離によって、上部の水相からこのDNAを沈殿させた。このDNAペレットを70％エタノールで洗浄して、空気中で乾燥させ、次いで200μlのTE緩衝液（100mM Tris-HCl pH 8.0；1mM EDTA pH8.0）中で溶解させた。
【０２５６】
分離用ゲル電気泳動（0.7％アガロース）およびその後の抽出（QIAex II Gel Extraction Kit；Qiagen, Hilden）によって、溶解された阻害性フミン酸から高分子量のゲノムDNAを最終的に分離した。
【実施例２】
【０２５７】
実施例２：発現遺伝子ライブラリーの設定、およびデンプン分解活性についてのスクリーニング
異種宿主生物であるEscherischia coliにおける発現クローニングを、メタゲノムからの完全なα−アミラーゼ遺伝子のクローニングおよび単離のために選択した。未知のドナー生物体のプロモーターの異種の認識は、宿主生物体E. coliにおいて想定できないので、IPTG（イソプロピルチオガラクトシド）を用いて既知の方式で誘導されるE. coliプロモーターである、pUC18プラスミドベクター（GenBank NCBI／NIH、Bethesda, Acc.−No. L08752；図1）上のlacオペロンのβ−ガラクトシダーゼプロモーター（lacプロモーター）を利用した。従って、宿主株において、lacIg遺伝子型（例えば、JM109）を用いて、IPTGの添加によって、このプロモーターの制御下で遺伝子の発現を誘導することができる。
【０２５８】
E. coli株JM 109、DH 10BおよびDH 12Sは、メタゲノム由来α−アミラーゼをクローニングすること、およびその活性依存性検出ための好適なシステムであることが証明されている。この理由は、それらが、malSによってコードされたペリプラズム酵素を有するが（Freundlieb, S., Boos, W. （1986）：「Alpha-amylase of Escherichia coli, mapping and cloning of the structural gene, malS、 and identification of its product as a periplasmic protein」；J. Biol. Chem. 261(6)2946〜2953頁）、それらは、実験条件下でアミラーゼのごくわずかな放出しか示さなかったということである。
【０２５９】
土壌からの精製メタゲノムDNAを、制限酵素、好ましくはSau3AIを用いて部分的に切断し、好ましくは8〜12kbに及ぶフラグメントサイズ範囲を分別し、ゲル電気泳動によって単離した。これらのDNAフラグメントを、好適なベクター、好ましくは制限酵素BamHIを用いて直線化したpUC18プラスミドベクター中に連結させた（図1）。
【０２６０】
メタゲノムDNAの分取部分的消化のための至適制限パラメーターを確立するために、4μgのDNAおよび制限酵素（Sau3AI）を、1×緩衝液中にDNA1μgあたり0.3〜0.4Uの濃度で用いて、最初に制限反応速度論を実行した。この緩衝液には必要に応じて、製造業者の指示に従ってウシ血清アルブミン（BSA）を含み、総容積20μlである。この目的のためにこの混合物を最初、酵素なしで37℃で平衡化した。次いで、制限エンドヌクレアーゼを添加することによって、それぞれの反応を開始した。0〜10分の間の固定間隔で、各々の場合、2μlの反応混合物を、氷上で1×停止緩衝液（6×：10mM Tris, pH 7.0；20％グリセロール；0.1％ SDS）に添加して、0.7％アガロースゲル上で分析した。この方法において、部分的消化のための至適の制限消化時間を、各々のDNA調製物について個々に確立した。
【０２６１】
分取部分的消化は、15〜20の個々の混合物中で制限反応速度論について完全に同一の手順を用いて行った。1×停止緩衝液を添加することによって反応を停止した後、この混合物を、0.7％アガロースゲル上で電気泳動によって分別し、8〜12kbのサイズを有するゲルの領域を、切断して、透析チューブ中で4℃で2時間の電気溶出によって単離した。1／10容積の3M酢酸ナトリウムおよび2.5倍容積のエタノールを用いて、DNAを沈殿させて、より少ない容積を採取して、より小さい断片のさらなる除去のために、引き続く電気溶出および新たな濃度を用いる第二のゲル電気泳動に供した。
【０２６２】
プラスミドベクターpUC18との連結は、１×リガーゼ緩衝液中の、製造業者の指示に従ってCIAP（ウシ胸腺由来のアルカリホスファターゼ）で脱リン酸化された100ngのBamHI−直線化pUC18ベクター、および800ngの部分的に切断されたゲノムDNA、および好適な量のリガーゼ（この場合、600NEB単位）を用いて、総容積20μl中で、16℃一晩で行なった。
【０２６３】
コンピテントなE. coli DH12S細胞（Gibco Life Technologies, Karlsruhe）の形質転換は、電気形質転換によって行った。この目的のために、1μlの連結混合物および25μlの細胞を混合し、氷上のエレクトロポレーションキュベット中で1分間インキュベートし、製造業者の指示に従って、エレクトロポレーター（BTX（登録商標）ECM630、Genetronics Inc. San Diego, USA）中で処理した。直後に、1mlのSOC培地（2％ バクトトリプトン（Bacto tryptone；）0.5％酵母抽出液；10mM NaCl；2.5mM KCl；pH 7.0，NaOHで調節；オートクレーブして；10mM MgSO4およびMgCl2、ならびに20mM D（+）グルコースを補充した）へ移した後、プレートする前に37℃で1時間の回復期間を続けた。
【０２６４】
遺伝子ライブラリーの質を試験するために、全体で生成された主な形質転換体の数およびインサートを保有するクローンの数を、試験プレートにおいてブルーホワイト選択によって決定した。この目的のために、連結混合物の1μlおよび10μlの部分を、アンピシリン、IPTG、X-Galを含有するLB培地にプレートし（上記のように）、37℃で一晩インキュベートした。正確にクローニングされたインサートのサイズを確認するために、試験プレートの少なくとも10個の白色コロニーからプラスミドを単離して、ゲル電気泳動による、引き続くサイズ解析によって、好適な制限消化を実施した。
【０２６５】
遺伝子ライブラリーのスクリーニングにおいて、メタゲノムライブラリーにおける個々の組み換えE. coliクローンがデンプンを分解する能力を決定した。この目的のために、1％の可溶性デンプン（Merck, Darmstadt, Order No. #1252）を含むLB寒天を用いた。この寒天の上ではデンプンを分解し得るクローンを、分解のゾーンによって特定できる。曇ってくるまで、4℃での2〜4週間のプレートの初期貯蔵が必要であり、これによって、このプレート上の活性なコロニーの周囲の除去としてデンプンの貯蔵分解が可視化された。このためには、このプレートにIPTG（100mM）を添加して、プロモーターを誘導し、アンピシリン（100μg／ml）を添加して、形質転換体に対する選択圧を加えた。
【０２６６】
各々の場合に生成されたライブラリーの力価について適した、規定の容積の形質転換体混合物を、1プレート（直径14cm）（一次プレート）あたり約10000コロニーで、ガラスビーズによって均一にプレートした。37℃で16時間のインキュベーション後、このプレートを、アミラーゼ発現および放出のために、さらに28℃で24〜48時間インキュベートした。28℃でのインキュベーションは通常、デンプンの可視性分解のために不可欠であった。タンパク質折り畳みの改善および外側の細胞膜の透過化処理がこれに関与する可能性がある（Stathopoulos, C., Georgiou, G., Earhart, C. F. （1996）：「Characterization of Escherichia coli expressing an Lpp’OmpA（46-159）PhoA fushion protein localized in the outer membrane」；Appl. Microbiol. Biotechnol., 45（1-2）、112-119）。従って、各々の場合に生成されたα−アミラーゼの放出は、それに関連しており、放出されない細胞質アミラーゼを検出するために細胞溶解をさらに実施することは、不必要であった。同じデンプンプレート上での新たな（二次的な）プレートによる、一次プレートのゾーン領域からのコロニーの単離後、新たなゾーン形成に基づいてアミラーゼを生成する単一のコロニーを選択することができた。このクローンを固定した後にフォトドキュメンテーションのために、50％ルゴール液（Merck）を用いたデンプンプレートの染色は、デンプンなしの領域（分解ゾーン）の明瞭な可視化に好適であることが証明された。
【０２６７】
少量調製（Qiagen, Hilden, Germanyからのキット、製造業者の指示によって用いた）後に得られた活性クローンのプラスミドDNAを、EcoRIまたはSacI／HindIIIを用いて、制限解析でインサートのサイズについて試験して、次いで配列決定した。この場合、インサートに隣接するM13プライマー（M13フォワード：5’−GTAAAACGACGGCCAG−3’；M13リバース：5’−CAGGAAACAGCTATGAC−3’）を最初に用いて、最終的に当分野で既知のようにいわゆるプライマーウォーキングによって完全な配列を得た。
【実施例３】
【０２６８】
実施例３：PCRによるメタゲノムプールの特徴づけ
土壌由来のメタゲノムDNAにおけるグリコシルヒドロラーゼの遺伝子配列の含量を評価するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってDNA増幅を実施した。HotStar Taqポリメラーゼ（Qiagen、Hilden）およびグリコシルヒドロラーゼ特異的プライマーを用いてこれを実施した（表1）。この目的のために、上記の方法によって単離されたメタゲノムDNAの0.1μl部分を200μM dNTP（各々の場合、dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、20pmolの一対の各プライマー（フォワード／リバース）、2.5U HotStar Taq−ポリメラーゼ（Qiagen, Hilden）、および1×PCR緩衝液の存在下で、総容積50μlで使用した。150〜300bpのサイズのフラグメントを以下のサイクルで増幅した：95℃15分間、1サイクル、95℃、各30秒間35サイクル、57℃（GEX036／038）または60℃（他のプライマー対）で30秒、72℃で30秒；72℃で7分間1サイクル。
【０２６９】
プライマー対GEX024／026およびGEX023／025を用いて、各々の場合、固有のPCR産物を増幅させた（それぞれ、300bpおよび280bp；図4）。この場合の増幅は、メタゲノムDNAの1:10希釈後にのみ頻繁に可能であった。これはおそらく、臨界閾値よりも希釈することによって不活性化されるDNA調製物中の阻害性成分に起因する。プライマー対GEX036／038を用いて、もとの反応の4μlを用いる再増幅後にのみ、PCRフラグメント（150および300bp）を得た。
【０２７０】
全てのPCRフラグメントは最初に、製造業者の指示に従って、配列決定のためにpCR2.1−TOPO（登録商標）ベクター中に、TOPO TAキット（Invitrogen，Groningen NL）を用いる中間クローニングを受けた。E. coli−TOP（登録商標）10F’（Invitrogen, Groningen NL）への形質転換のために連結産物を用いた。アンピシリン（100μg／ml）、IPTG（100mM）およびX-Gal（40mg／ml）を用いるLB培地上での組み換えクローンのブルー／ホワイト選択後、白色クローンのプラスミドDNAを少量調製後に単離して、EcoRIを用いて、インサートDNAの含量について制限解析で試験した。この場合、インサートサイズの相違が、特にGEX024／026および036／038を有するPCR由来のクローンにおいて証明され（図4）、これはメタゲノムにおける増幅されたグリコシルヒドロラーゼの配列の分子多様性を反映する。
【０２７１】
ABI PRISM（登録商標）310（Perkin Elmer, Weiterstadt）上で、製造業者の指示に従って、AmpliTaq-FS-Big Dye（登録商標）Terminatorキット（Perkin Elmer, Weiterstadt）を用い、200〜500ngのプラスミドDNA、10pmolのプライマー（TopoF：5’−GCTCGGATCCACTAGTAACG−3’およびTopoR：5’−CTCTAGATGCATGCTCGAG−3’）、4μlのプレミックスを総容積20μl中で使用して、インサートDNAを有するプラスミドの配列解析をルーチンで行なう。
【０２７２】
得られたDNA配列を、FASTAプログラム（Pearson WR、Lipman DJ. (1988)Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sci USA Apr；85(8):2444〜8）を用いて、BlastX、BlastNおよびBlastPアルゴリズム（Altschul SF、Gish W, Miller W, Myers EW、Lipman DJ（1990）Basic local alignment research tool. J mol boil 1990 Oct 5；215(3):403〜10）によって、配列データベースGenBank（Rel 122.0）に存在する全体と比較して、アミノ酸配列へ概念的に転写させて、この方法でα−アミラーゼおよび他のグリコシルヒドロラーゼの部分的配列として同定した（表２を参照と）。
【０２７３】
コンスタントプライマー領域の部分であって、読み取り定義の配列決定が遅いことによって未知であるか、または予期せぬことに合成的に存在する配列とは異なる領域を、アミノ酸配列レベルでのみ補正して、これによって対応する配列表に入れた。従って、これらの定常的なプライマー領域におけるDNA配列が、概念的に翻訳されたアミノ酸配列と異なる可能性はある。
【０２７４】
このアミノ酸配列は、配列番号7〜56および配列番号107〜205に挙げられた配列に列挙され、コンセンサス配列A〜Dに含まれる。
【実施例４】
【０２７５】
実施例4：見出されたアミラーゼ遺伝子の配列解析
上記の発現スクリーニングにおけるゾーン形成によってアミラーゼ活性を示したクローニングHA 11を完全に配列決定した。配列解析によって2つのオープンリーディングフレームの存在が明らかになった。その1つはORF1であって、相同性比較によってアミラーゼ遺伝子として同定可能であった。由来するタンパク質配列は、配列番号1に示される。Fasta3検索の結果によって、72.3％のAA相同性を有する最も類似の酵素としてBacillus属由来のアミラーゼが明らかになった。このアミラーゼは、タンパク質配列のカルボキシル末端において、最も類似の既知の配列において実験的に検証された新しいタイプのデンプン結合ドメインと広範囲の相同性を示した（Sumitani, J.；Tottori, T., Kawaguchi, T. およびArai, M.；Biochem J 350, 477〜484(2000)）。
【０２７６】
第二のリーディングフレームORF2であって、完全な利用可能な遺伝子配列に基づいて、Streptomyces coelicolor A3（Redenbach, M；Kieser, H. M.；Depanaite, D.；Eichner, A, Cullum J；Kinashi, H. およびHopwood, D. A., Mol. Microbiol 21, 77〜96（1996））由来の最も類似の遺伝子（二機能性アミラーゼ−デキストリナーゼ）に対して46％の相同性を有するリーディングフレームは、ゲノムクローンにごく不完全にしか存在しなかった。3’末端における終止コドンは失われており、その結果、現実の遺伝子は、既知のクローニング配列を超えて延びる。
【０２７７】
HA11由来のアミラーゼ遺伝子を、PCRおよび好適なプライマーオリゴヌクレオチドの使用によって、単離されたゲノムクローンから増幅して、E. coli−Streptomyces shuttleベクターpEX601中でクローニングした。異種の宿主Streptomyces lividans TK24における発現後、培養上清中で得た酵素を、生化学的に特徴付けした。
【０２７８】
二機能性ORF 2のアミラーゼドメインを、このアミラーゼに対する相似性において別々にクローニングして、S. lividans TK 24中で発現した。上清の解析によって、DNSAアッセイによって測定可能なアミラーゼ活性は明瞭に明らかになった。二機能性ORF 2の、この方法でクローニングされかつ発現された部分は、HA 13と呼ばれ、そのタンパク質配列は、配列番号3に示される。
【実施例５】
【０２７９】
実施例5：発現された遺伝子の生化学的特徴付け
α−アミラーゼの適用の多様な領域の見地から、酵素の適用に基づく選択についての基礎であり得る酵素特性を特徴付けた。この酵素は、この目的について、実施例4による遺伝子配列のクローニングおよび異種発現によって調製できる。デンプン分解活性は、改変ジニトロサリチル酸アッセイ（DNSA アッセイ；Hofstetter, F. &E. Borel (1951)；Helv. Chim. Acta, 34, 2133〜2139）によって決定した。これは、多糖類の還元末端の増加に基づいて決定される、複合デンプン基質の加水分解を引き起こし、これは、加水分解活性の指標として働く未反応のDNSA試薬の540nmでの吸収を伴う。
【０２８０】
このアッセイを実施するために、基質溶液（1％可溶性デンプン（Merck分析級）を含有する180mM Tris−マレイン酸緩衝液、pH 8.6、または180mMの好適なアッセイ緩衝液）のうち25μl部分を、PCRサーモサイクラーの96ウェルプレート（0.2ml「薄壁プレート」#3416、Molecular Bioproducts MβP、San Diego, USA）のサンプルおよびブランクウェル中に導入して、50℃または特定のアッセイ温度で、サーモサイクラーブロック中で5分間プレインキュベートした。各ウェルへの20μlの酵素溶液の添加後、50℃または特定のアッセイ温度で15分間基質変換を行なった。サンプルおよびブランクウェルへの65μlのDNSA試薬（8.8gのジニトロサリチル酸、250gの酒石酸カリウムナトリウム、6.3gの二亜硫酸ナトリウム、334mlの4.5％（w／v）NaOH、915mlのH2O）の添加、およびブランクウェルへの20μlの酵素溶液の添加後、100℃に予備加熱されたサーモブロックへ直ちにアッセイプレートを移して、100℃で20分間インキュベートした。96ウェル測定プレート（PS−マイクロプレート、96ウェル#655101、Greiner）中に導入された200μlのH2O中に、アッセイ混合物の60μl部分を移すこと、引き続いてマイクロタイタープレートスペクトル光度計（Spectramax 190、Molecular Devices、Sunnivale USA）を用いて、参照としてH2Oを用いて、540nmでの吸収を決定することによって、サンプルを測定した。各々の場合に3回の測定を実施した；3つのサンプルウェルの平均から3つのブランクウェルの平均を差引きすることによって評価を行なった。
【０２８１】
温度プロフィール
上記の手順によって、種々の温度で100mM Tris−マレイン酸塩（pH 8.6）を用いて変換を実施することによって温度プロフィールを決定した。α−アミラーゼHA11（配列番号1）は、50.4℃で最大活性を有することが見出された。60°を超える温度では、この酵素の活性の損失がもたらされた（表3を参照のこと）。アミラーゼドメインHA13については、最大は55.5℃であることが見出された（表4を参照のこと）。
【０２８２】
アミラーゼドメインHA13の温度安定性
50℃〜69.7℃の温度勾配での15分間のプレインキュベーション後、引き続く変換およびDNSAアッセイをTris-HCl（pH8.6）中において、50℃で上記のように行なった。表5によれば、60℃を超えれば安定性が顕著に低下することが示される。
【０２８３】
pH変動に対する安定性
種々のpH条件下でα−アミラーゼの活性を決定するために、特定のpHについて好適な緩衝液を用いて4〜12のpH範囲で、デンプン基質溶液を調製した。アッセイ条件下での希釈後に100ｍＭの濃度が得られるように、この緩衝濃度は、各々の場合に180mMまで調節された。50℃において上記に示されたように、それぞれのpH値でのデンプン分解活性を決定した。2つのアミラーゼ（HA 11およびHA 13）についてのそれぞれの緩衝液および相対的活性値は、表6に見出される。両方のアミラーゼともpH5〜6.5の範囲で最大値を示すこと、アミラーゼHA13は、広範な最大値によって識別され、12でさえかなり活性が残留していることが証明される。
【０２８４】
界面活性剤に対する安定性
0〜1％の間にSDSの最終濃度を調節することによって、界面活性剤安定性を決定した。基質変換は、100mM Tris-HCl pH8.6を用いて50℃で15分間行なった（表7＝HA11；表8=HA13）。
【０２８５】
漂白剤の効果
100mMのグリシン−NaOH（pH9.5）中で0.7%までのH2O2の作用から漂白剤の効果を決定した。好適な条件下の室温でのH2O2の存在下におけるプレインキュベーションの後に、50℃で15分間のさらなるインキュベーションを続けた。次いで、DNSAアッセイ中で基質変換を測定した（表9：HA11；表10:HA13）
【０２８６】
錯化剤の効果
2mM CaCl2または1mM EDTAの濃度を100mM Tris-HCl（pH8.6）中で調節することによって、50℃で15分間錯化剤の効果を検討した（表11＝HA11；表12＝HA13）。
【実施例６】
【０２８７】
実施例6：洗濯能力の検討
標準的な試験汚れを用いるミニ洗濯試験において、調製されたアミラーゼサンプルの洗濯能力を決定した。標準的な試験汚れは、織布上に固着されたデンプン、および色指示薬（ポリエステル／綿混紡上のデンプンであるEMPA 162、および綿上のコーンスターチであるCFT PCS 26）から構成された。
【０２８８】
この目的のために、19.6cm2の織布サンプルを、漂白剤を添加しまたはせずに、20ml洗濯液中でインキュベートした。各々の場合に使用した酵素の量は、37℃でpH6.5で1分あたりに、可溶性デンプンから生成できる、12μmolのグルコースに相当する還元糖の量である。織布サンプルを40℃、80rpmで90分間インキュベートした。次いで、それらをH2Oでリンスして、乾燥させて、ミノルタ（Minolta）表面光度計を用いて、色（L値）を決定した。次いで、未処置の織布サンプルとの相違を形成することによって、デンプンの脱落、従って洗濯能力の指標としての発光を決定した。結果を表13に示す。
【０２８９】
同じ酵素活性を使用した場合、HA11（配列番号1）の洗濯能力が各々の場合に最大であったことが明らかである。Termamyl（登録商標）は、より弱いが、各々の場合にBAN（登録商標）よりも良い。これらの酵素は、漂白剤含有処方物の存在下において低下を示した。対照的にHA13（配列番号3）は、漂白剤に対してかなり感受性であることが証明されており、その結果、漂白剤なしの処方物における洗濯能力は、他の酵素の洗濯能力よりも低いが、漂白剤含有処方物においてはTermamylに匹敵するものであった。
【０２９０】
図のリスト
図１は、発現遺伝子ライブラリーのために用いたプラスミドベクターpUC18（GenBank Acc. L08752）を示す図である。
このベクターを、Sau3AI消化されたメタゲノムDNAの取り込みのためにBamHIを用いて直線化した。ORI：複製起点；lacI：lacレプレッサーのための遺伝子；lacZアルファ：β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドのための遺伝子；アンピシリンR：β−ラクタマーゼ。
【０２９１】
図２は、特定の酵素濃度での至適制限時間を確立するための土壌からのメタゲノムDNAのSau3AI制限反応速度論の解析を示す図である。
1μgのDNAあたり0.3UのSau3A1との20μlの完全な混合物から、1×停止緩衝液に0、1、2、3、4、5、6、8および10分後に2μlの部分を移して、0.7％アガロースゲル上で分画した（レーン1〜9、左から右）。マーカー（M）：1kb DNAラダー（頂部から底部へ：10；8；6；5；4；3.5；3；2.5；2；1.5；1．ここで5分間の制限に相当するレーン7は、サイズ範囲8〜12kbで最適な部分的消化を示す）。
【０２９２】
図３は、メタゲノム発現遺伝子ライブラリーにおけるアミラーゼを検出する活性アッセイを示す図である。
Lugo1染色した、1%可溶性デンプンを含むLB寒天プレート。アミラーゼ発現組み換え体であるE.coliクローンは、ルゴール染色後に青白くなる、コロニーの周囲のデンプン分解のゾーンを示す。
A）E. coliの形質転換後のプラスミド発現遺伝子ライブラリーの完全なプレート由来のゾーン形成クローンの「親プレート」（一次プレート）の例。
B）親のプレートのデンプンゾーン領域からの再プレート（二次プレート）後の単離されたコロニー。個々のコロニーのゾーンの有無は明白である。ゾーンを有するコロニー由来のプラスミドを解析して、それらのインサートDNAを配列決定した。
左：分解の青白いゾーンを有するルゴール染色されたプレート
右：ルゴール染色なしの曇ったデンプン上の活性なクローンの清澄なゾーン。
【０２９３】
図４は、土壌メタゲノムDNAに対するプライマーGEX023／025、GEX024／026、およびGEX036／038を用いたPCR反応産物のサイズ解析を示す図である。
土壌S196(A)および土壌S131（C）からのPCR反応産物のサイズ解析の例。アミラーゼ特異的プライマーGEX024／026（A,レーン1）、GEX023／025（A、レーン2）およびGEX036／038（C、レーン1）を用いて、PCRを実施して、その反応産物を2％アガロースゲル中に分画した（反応容積の1／10）。Streptomyces属の株B124由来のゲノムDNAに対するGEX024／026を用いたPCR（C、レーン2）を、陽性コントロールとして並行して行った。PCR条件のためのテキスト（上記）を参照されたい。
マーカー（M）：100bp DNAラダー（bpとして頂部から底部まで：3000、2000、1500、1200、1031、900、800、700、600、500、400、300、200、100）。
プライマー対GEX024／026を用いて、300bpのバンドが増幅され、プライマー対GEX023／025を用いて280bpのフラグメントが増幅されたが、300bpおよび150bpのサイズの2つの産物は、もとのPCR混合物の再増幅後にのみGEX036／038で増幅される。全てのPCR産物をクローニングして、2％アガロースゲル（B）でのEcoRI制限によるインサートの切除後に、18までのクローンのDNAを分画した。PCR産物GEX023／025についてのクローンは、全体で約280bpのインサートDNAサイズを示す（B、左側）、GEX024／026のPCR由来のクローンについてのフラグメントサイズは、300〜350bpの間で変化する（B、右側）。GEX036／038のPCR由来のクローンは、約300bpおよび150bpのフラグメントを示す（D）。
【０２９４】
図５は、土壌微生物由来の50個のグリコシルヒドロラーゼのコンセンサス配列−A−およびアミノ酸置換を示す図である。
このコンセンサス配列は、Clustal X バージョン1.64b（標準的設定）とのアラインメントに基づく。アミノ酸位置1〜8および116〜123は、PCRプライマー配列（GEX024／026）によって特定された部分である。
【０２９５】
図６は、土壌微生物由来の42個のアミラーゼのコンセンサス配列−D−（Aに対する配列空間）およびアミノ酸置換を示す図である。
このコンセンサス配列は、Clustal X バージョン1.64b（標準的設定）とのアラインメントに基づく。アミノ酸位置1〜8および114〜121は、PCRプライマー配列（GEX024／026）によって特定された部分である。
【０２９６】
図７は、土壌微生物由来の99個のグリコシルヒドロラーゼのコンセンサス配列−B−およびアミノ酸置換を示す図である。
このコンセンサス配列は、Clustal X バージョン1.64b（標準的設定）とのアラインメントに基づく。アミノ酸位置1〜12および102〜109は、PCRプライマー配列（GEX023／210／211／036およびGEX25／038）によって特定された部分である。
【０２９７】
図８は、土壌微生物由来の10個のアミラーゼのコンセンサス配列−C−（Bに対する配列空間）およびアミノ酸置換を示す図である。
このコンセンサス配列は、Clustal X バージョン1.64b（標準的設定）とのアラインメントに基づく。アミノ酸位置1〜12および72〜78は、PCRプライマー配列（GEX023／210／211およびGEX25）によって特定された部分である。
【０２９８】
図９は、Streptomyces lividans TK24におけるメタゲノムアミラーゼの発現のために用いたプラスミドシャトルベクターpEX601の図である。
このベクターは、pWHM680pro由来のermE／MCS／ターミネーターカセット（BgIII／EcoRI）を、BamHI／EcoRI消化ベクターpWHM601中に挿入することによって生成した。マルチクローニング部位に存在するBamHI認識配列を用いてアミラーゼ遺伝子をクローニングした。pWHM601およびpWHM680proは、両方ともC. R. Hutchinson博士（University of Wisconsin, Pers. communication）の研究室から得られる。
挿入された遺伝子の発現は、構成的ermEプロモーターから出発して行なう。
ベクターおよびそこに含まれたエレメントの示されたサイズを評価する。StreptomycesのSCP2＊レプリコン複製起点；ermE、S. erythreaのermEアッププロモーター；アプラマイシンRアプラマイシン耐性遺伝子。Streptomyces lividansにおけるアミラーゼ遺伝子の発現はまた、他の好適なシャトルベクター、例えば、pAX5aなどを用いて達成できる（Fass S. H., Eagels, J. W. 1996； Influence of Specific Signal Peptide Mutations on Expression and Secretion of the alpha-Amylase Inhibitor Tendamistat in Streptomyces lividans，J. Biol. Chem. 271, Number 25,15244〜15252）。
【０２９９】
表1：グリコシルヒドロラーゼをコードするメタゲノムDNA配列の部分的配列の増幅のためのPCRプライマー
変性塩基位置の記号（異なるヌクレオチドの混合物）：R=AG；Y=CT；M=AC；K=GT；W=AT；S=CG；B=CGT；D=AGT；H=ACT；V=ACG；N=ACGT
【表１】
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【０３００】
表2：GenBankにおけるそれらの最も近い関連物に対して同一性を有する149個のシグナル配列の列挙（NCBI；公表121.0）；2001年2月2日にFASTAプログラムを用いて決定）
【０３０１】
【表２−１】
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【０３０２】
【表２−２】
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【０３０３】
【表２−３】
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【０３０４】
【表２−４】
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【０３０５】
【表２−５】
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【０３０６】
【表２−６】
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【０３０７】
表3：HA11由来のα−アミラーゼの温度プロフィール
【表３】
2005525793.tif 000011
【０３０８】
表4：Ha13アミラーゼ
15分間のプレインキュベーション後の温度プロフィール（HA11に対する類似性において）および温度安定性を決定した。次いで、100mM Tris HCl pH8.6中で50℃の残留活性を決定した。
DNSSアッセイにおける50℃〜69.7℃の温度勾配においての基質変換
【表４】
2005525793.tif 000012
【０３０９】
表5：HA13由来のアミラーゼドメインの温度安定性
50℃〜69.7℃の温度勾配で15分間のプレインキュベーション後のDNSAアッセイにおける基質変換、次いでTris-HCｌ pH8.6中で50℃における基質変換
【表５】
2005525793.tif 000013
【０３１０】
表6：アミラーゼHA11およびHA13のpH安定性
DNSAアッセイの50℃で15分間における、それぞれの干渉系における基質変換
【表６】
2005525793.tif 000014
【０３１１】
表7：アミラーゼHA11の活性に対する界面活性剤の効果
100mM Tris-HCl pH8.6を用いる50℃15分間のDNSAアッセイにおける基質変換
【表７】
2005525793.tif 000015
【０３１２】
表8：アミラーゼHA13の活性に対する界面活性剤の効果
100mMのTris−HCl pH8.6を50℃で15分間用いるDNSAアッセイにおける基質変換
【表８】
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【０３１３】
表9：HA11アミラーゼに対する漂白剤の効果
100mMのグリシン−NaOH pH9.5を用いるDNSAアッセイにおける基質変換。好適な条件下で室温でのプレインキュベーションの後に、50℃で15分間のさらなるインキュベーションを続ける。
【表９】
2005525793.tif 000017
【０３１４】
表10：HA13アミラーゼに対する漂白剤の効果
100mMのグリシン−NaOH pH9.5を用いるDNSAアッセイにおける基質変換。好適な条件下で室温でのプレインキュベーションの後に、50℃で15分間のさらなるインキュベーションを続ける。
【表１０】
2005525793.tif 000018
【０３１５】
表11：HA11アミラーゼのカルシウム依存性
100mMのTris−HCl pH8.6を用いる、50℃、15分間のDNSAアッセイにおける基質変換。
【表１１】
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【０３１６】
表12：HA13アミラーゼドメインのカルシウム依存性
100mMのTris−HCl pH8.6を用いる、50℃で15分間のDNSAアッセイにおける基質変換。
【表１２】
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【０３１７】
表13：洗濯能力の検討
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０３１８】
【図１】発現遺伝子ライブラリーのために用いたプラスミドベクターpUC18（GenBank Acc. L08752）を示す図。このベクターを、Sau3AI消化されたメタゲノムDNAの取り込みのためにBamHIを用いて直線化した。ORI：複製起点；lacI：lacレプレッサーのための遺伝子；lacZアルファ：β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドのための遺伝子；アンピシリンR：β−ラクタマーゼ。
【図２】特定の酵素濃度での至適制限時間を確立するための土壌からのメタゲノムDNAのSau3AI制限反応速度論の解析を示す図。1μgのDNAあたり0.3UのSau3A1との20μlの完全な混合物から、1×停止緩衝液に0、1、2、3、4、5、6、8および10分後に2μlの部分を移して、0.7％アガロースゲル上で分画した（レーン1〜9、左から右）。マーカー（M）：1kb DNAラダー（頂部から底部へ：10；8；6；5；4；3.5；3；2.5；2；1.5；1．ここで5分間の制限に相当するレーン7は、サイズ範囲8〜12kbで最適な部分的消化を示す）。
【図３】メタゲノム発現遺伝子ライブラリーにおけるアミラーゼを検出する活性アッセイを示す図。Lugo1染色した、1%可溶性デンプンを含むLB寒天プレート。アミラーゼ発現組み換え体であるE.coliクローンは、ルゴール染色後に青白くなる、コロニーの周囲のデンプン分解のゾーンを示す。A）E. coliの形質転換後のプラスミド発現遺伝子ライブラリーの完全なプレート由来のゾーン形成クローンの「親プレート」（一次プレート）の例。B）親のプレートのデンプンゾーン領域からの再プレート（二次プレート）後の単離されたコロニー。個々のコロニーのゾーンの有無は明白である。ゾーンを有するコロニー由来のプラスミドを解析して、それらのインサートDNAを配列決定した。左：分解の青白いゾーンを有するルゴール染色されたプレート右：ルゴール染色なしの曇ったデンプン上の活性なクローンの清澄なゾーン。
【図４】土壌メタゲノムDNAに対するプライマーGEX023／025、GEX024／026、およびGEX036／038を用いたPCR反応産物のサイズ解析を示す図。
土壌S196(A)および土壌S131（C）からのPCR反応産物のサイズ解析の例。アミラーゼ特異的プライマーGEX024／026（A,レーン1）、GEX023／025（A、レーン2）およびGEX036／038（C、レーン1）を用いて、PCRを実施して、その反応産物を2％アガロースゲル中に分画した（反応容積の1／10）。Streptomyces属の株B124由来のゲノムDNAに対するGEX024／026を用いたPCR（C、レーン2）を、陽性コントロールとして並行して行った。PCR条件のためのテキスト（上記）を参照のこと。
マーカー（M）：100bp DNAラダー（bpとして頂部から底部まで：3000、2000、1500、1200、1031、900、800、700、600、500、400、300、200、100）。
プライマー対GEX024／026を用いて、300bpのバンドが増幅され、プライマー対GEX023／025を用いて280bpのフラグメントが増幅されたが、300bpおよび150bpのサイズの2つの産物は、もとのPCR混合物の再増幅後にのみGEX036／038で増幅される。全てのPCR産物をクローニングして、2％アガロースゲル（B）でのEcoRI制限によるインサートの切除後に、18までのクローンのDNAを分画した。PCR産物GEX023／025についてのクローンは、全体で約280bpのインサートDNAサイズを示す（B、左側）、GEX024／026のPCR由来のクローンについてのフラグメントサイズは、300〜350bpの間で変化する（B、右側）。GEX036／038のPCR由来のクローンは、約300bpおよび150bpのフラグメントを示す（D）。
【図５】土壌微生物由来の50個のグリコシルヒドロラーゼのコンセンサス配列−A−およびアミノ酸置換を示す図。このコンセンサス配列は、Clustal X バージョン1.64b（標準的設定）とのアラインメントに基づく。アミノ酸位置1〜8および116〜123は、PCRプライマー配列（GEX024／026）によって特定された部分である。
【図６】土壌微生物由来の42個のアミラーゼのコンセンサス配列−D−（Aに対する配列空間）およびアミノ酸置換を示す図。このコンセンサス配列は、Clustal X バージョン1.64b（標準的設定）とのアラインメントに基づく。アミノ酸位置1〜8および114〜121は、PCRプライマー配列（GEX024／026）によって特定された部分である。
【図７】土壌微生物由来の99個のグリコシルヒドロラーゼのコンセンサス配列−B−およびアミノ酸置換を示す図。このコンセンサス配列は、Clustal X バージョン1.64b（標準的設定）とのアラインメントに基づく。アミノ酸位置1〜12および102〜109は、PCRプライマー配列（GEX023／210／211／036およびGEX25／038）によって特定された部分である。
【図８】土壌微生物由来の10個のアミラーゼのコンセンサス配列−C−（Bに対する配列空間）およびアミノ酸置換を示す図。このコンセンサス配列は、Clustal X バージョン1.64b（標準的設定）とのアラインメントに基づく。アミノ酸位置1〜12および72〜78は、PCRプライマー配列（GEX023／210／211およびGEX25）によって特定された部分である。
【図９】Streptomyces lividans TK24におけるメタゲノムアミラーゼの発現のために用いたプラスミドシャトルベクターpEX601の図。
このベクターは、pWHM680pro由来のermE／MCS／ターミネーターカセット（BgIII／EcoRI）を、BamHI／EcoRI消化ベクターpWHM601中に挿入することによって生成した。マルチクローニング部位に存在するBamHI認識配列を用いてアミラーゼ遺伝子をクローニングした。pWHM601およびpWHM680proの両方ともC. R. Hutchinson博士（University of Wisconsin, Pers. communication）の研究室からである。
挿入された遺伝子の発現は、構成的ermEプロモーターから出発して行なう。
ベクターおよびそこに含まれたエレメントの示されたサイズを評価する。StreptomycesのSCP2＊レプリコン複製起点；ermE、S. erythreaのermEアッププロモーター；アプラマイシンRアプラマイシン耐性遺伝子。Streptomyces lividansにおけるアミラーゼ遺伝子の発現はまた、他の好適なシャトルベクター、例えば、pAX5aなどを用いて達成できる（Fass S. H., Eagels, J. W. 1996； Influence of Specific Signal Peptide Mutations on Expression and Secretion of the alpha-Amylase Inhibitor Tendamistat in Streptomyces lividans，J. Biol. Chem. 271, Number 25, 15244〜15252）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月24日(2004.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005525793000001.app
【国際調査報告】
2005525793.tif 000198
2005525793.tif 000199
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