(57)【要約】本発明は、被験試料中の分析物の検出のために使用しうるコンジュゲートに関する。特に、前記コンジュゲートは、異分子間性担体、少なくとも１０個の標識基、分析物特異的結合対成員（例えば、それぞれ対象とする抗原又は抗体と複合体を形成する抗体又は抗原）ならびにアクリジニウム含有化合物を分析物特異的結合対成員に間接的に結合する異分子間リンカーを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）親水性担体、ｂ）少なくとも１０個のシグナル生成基、ｃ）分析物特異的結合対成員及びｄ）リンカーを含むコンジュゲート。
【請求項２】
前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記少なくとも１０個のシグナル生成基が、発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
ａ．１）少なくとも１０個のシグナル生成基、２）分析物特異的結合対成員、３）親水性担体及び４）リンカーを含むコンジュゲートを、コンジュゲート／分析物複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で被験試料と接触させること；及び
ｂ．前記コンジュゲートの前記少なくとも１０個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって前記被験試料中の前記分析物の存在を判定すること
の工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法。
【請求項６】
前記分析物が、１）ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌、２）前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のフラグメント、３）前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌に対する抗体、及び４）前記ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌に対する前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１０個のシグナル生成基が、発光原、化学発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ａ．被験試料を、分析物／第一分析物特異的結合対成員複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で第一分析物特異的結合対成員と接触させること；
ｂ．（ａ）で生じた前記複合体を、分析物／第一分析物特異的結合対成員／コンジュゲート複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で、１）親水性担体、２）少なくとも１０個のシグナル生成基、３）第二分析物特異的結合対成員及び４）リンカーを含むコンジュゲートと接触させること；及び
ｃ．前記コンジュゲートの前記少なくとも１０個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって前記被験試料中の前記分析物の存在を判定すること
の工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法。
【請求項１１】
前記分析物が、１）ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌、２）前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌のフラグメント、３）前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌に対する抗体、及び４）前記ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌のフラグメントから成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１０個のシグナル生成基が、発光原、化学発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
１）親水性担体、２）少なくとも１０個のシグナル生成基、３）分析物特異的結合対成員及び４）リンカーを含むコンジュゲートを含む、被験試料における分析物の検出のためのキット。
【請求項１６】
ａ）少なくとも１０個のシグナル生成基を親水性担体に組み込むこと；
ｂ）リンカーを工程（ａ）で生じた前記生成物に結合させること；及び
ｃ）コンジュゲートを形成するために工程（ｂ）の前記結合リンカーと分析物特異的結合対成員とでコンジュゲート形成させること
の工程を含む、コンジュゲートを形成する方法。
【請求項１７】
前記親水性担体が、ポリペプチド、多糖及びポリオキシエチレンアミンから成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１０個のシグナル生成基が、発光原、色素原、発蛍光団、蛍光原及び放射性同位体から成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記分析物特異的結合対成員が、抗原、抗体、及び前記抗原又は前記抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は前記抗体のフラグメントから成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料中の分析物の検出のために使用しうるコンジュゲートに関する。特に、前記コンジュゲートは、少なくとも１０個のシグナル生成基又は標識、親水性担体、ヘテロ二官能性リンカー及び分析物特異的結合対成員（例えば、それぞれ対象とする抗原又は抗体と複合する抗体又は抗原）を含む。
【背景技術】
【０００２】
抗原又は抗体を検出する感受性の高い免疫測定法を実現するために多くの方法が開発されてきた。そのような方法は、例えば、標識などのシグナル生成化合物によって生じるシグナルを高めること、あるいはバックグラウンド干渉を低下させることを含む。化学発光標識をシグナル生成化合物として特異的に使用する免疫測定法が知られている。例えば、免疫測定法のための標識としてのアクリジニウム化合物の使用及びその後のこれらの標識からの短寿命化学発光シグナルの生成が、Ｉ．Ｗｅｅｋｓにより「Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｌａｂｌｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，」Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：１４７４−１４７８（１９８４）に述べられている。安定なアクリジニウムスルホンアミドエステルの使用は、米国特許第５，４６８，６４６号に述べられている。
【０００３】
発光シグナルの生成は、例えばアダマンチン、カンホラン（ｃａｍｐｈｏｒａｎｅ）、ノルボルナンなどの少なくとも２個の縮合環を有する多環式アルキレンを含むジオキセタン化合物への酵素又は求核物質の作用から生じると記述されてきた（例えば、米国特許第４，９３１，２２３号及び米国特許第５，０６８，３３９号参照）。分子の光放出パターンが非常に高い発光計数をもたらし、その結果ハプテン、分析物、ポリヌクレオチド等について感受性の高い正確なアッセイを提供するように、アリール基が適切な電子供与基で多置換されている、化学発光性の電子豊富なアリール置換１，２−ジオキセタン化合物が開示されている。これらの置換アリール含有１，２−ジオキセタン化合物は免疫測定法において直接標識として使用でき、あるいは適切な脱離基で誘導体化したとき、酵素又は化学物質によって化学発光シグナルを生成することができる。安定な１，２−ジオキセタン化合物の使用は、米国特許第６，００１，６５９号に述べられている。
【０００４】
化学発光標識を有するコンジュゲートは、一般に抗原又は抗体を標識で直接標識化することによって作製される。しかし、抗原又は抗体の直接標識化にはいくつかの制限があり、ａ）抗原又は抗体への標識の高い組込み率を有するコンジュゲートは高いバックグラウンド又は非特異的な結合を示し、及びｂ）標識が、抗原上の鍵となるエピトープ又は抗体の結合部位において又はその近くでランダムに結合することがあり、分析物と分析物特異的結合対成員の間のアクセスを遮断する。両方の因子がアッセイの感受性を低下させる。それ故、直接標識化から作製されるコンジュゲートは、最適に機能するために大部分がコンジュゲート当り２から３個の標識、まれには６個を越える標識が組み込まれる。
【０００５】
ランダムな結合反応による抗体結合部位の遮断は、コンジュゲートに関する抗体活性を低下させる（例えば、Ｂｅｎｉａｒｚら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７、８８−９５（１９９６）参照）。ＩｇＧ又はＩｇＭ上の糖鎖部分を通した複合によって抗体結合部位の遮断を回避するための方法が試みられてきた（例えば、Ｈｕｓｓａｉｎらによって記述された「Ｆｃ部位特異的複合」（「Ｆｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５、４８２−４９０（１９９４）及びＪ．Ｚａｒａらによって記述された「糖鎖指定複合」（「ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６、３６７−３７２（１９９５）参照）。これらの糖鎖指定複合に関する不都合な点は、例えば、複雑な化学反応及びコンジュゲートの低い収率である。
【０００６】
免疫測定法において生成される化学発光シグナルを増強し、増幅する方法は当技術分野で既知である。アビジン−ビオチンなどのシグナルエンハンサーの使用も知られている。
例えば、米国特許第４，２２８，２３７号は、アビジンで標識した酵素も同時に使用する方法における、リガンドのためのビオチン標識特異的結合物質の使用を述べている。さらに、ビオチン−抗ビオチン系の使用が国際公開広報第ＷＯ９２／０８９７９号に述べられている。また、米国特許第４，９２７，７６９号は、界面活性剤の添加によってアクリジニウムエステル標識コンジュゲートから生成される化学発光シグナルを増強する方法を記述している。加えて、米国特許第４，９５９，１８２号は、界面活性剤及びそれに結合した蛍光化合物の添加によってアルカリホスファターゼ触媒１，２−ジオキセタンから生成される化学発光シグナルを増幅する方法を述べている。（免疫測定法においてシグナルを高めるための増幅戦略は、Ｌ．Ｊ．ＫｒｉｃｋａとＤ．Ｗｉｌｄにより「Ｓｉｇｎａｌ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第２版、Ｄ．Ｗｉｌｄ編集、ｐ．１５９−１７６（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｎ．Ｙ．２００１）において総説されている）。
【０００７】
発光シグナルを増幅するために多数のコピーの発光原基をコンジュゲートに組み込むためのアプローチが記述されている。例えば、米国特許第５，６５６，５００号及び米国特許第５，６５６，４２６号は、アッセイにおいて化学発光シグナルを増幅するために、多くのアクリジニウム分子を被包し、特異的結合物質に連結するためのリポソームを使用する。しかし、リポソームからのアクリジニウムの漏出が重大な難点である。もう１つの方法は、アッセイにおいて高い発光効率を達成するために、特異的結合物質を標識するための複数の発光原基を有するアクリジニウム化合物の使用を述べている（米国特許第８，０７８，５０２号参照）。そのような化合物から作製したコンジュゲートは安定であるが、まだ、わずかにコンジュゲート当り２から５個の発光原基という低い組込み率の難点を抱える。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記に鑑みて、高く且つ特異的なシグナルの生成のために１０コピー以上の標識を有する安定なコンジュゲートの作製のための方法は現在のところ知られていない。本発明のような、そのようなコンジュゲートは、感染のごく初期の段階で、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のコア抗原などの非常に小量の分析物（ｐｇ／ｍｌ濃度以下）の検出において極めて有用であると考えられる。
【０００９】
ここで参照するすべての米国特許及び公表文献は、それらの全体が参照してここに組み込まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ａ）親水性担体、ｂ）少なくとも１０個のシグナル生成基又は標識、ｃ）分析物特異的結合対成員及びｄ）リンカーを含むコンジュゲートを包含する。前記親水性担体は、例えば、ポリペプチド（例えばＢＳＡ）、多糖（例えば誘導体化デキストラン又はシクロデキストラン）又はポリオキシエチレンアミンでありうる。少なくとも１０個でなければならない前記シグナル生成基は、例えば、発光原（例えばアクリジニウムエステル及びアクリジニウムスルホンアミドなどのアクリジニウム含有化合物、フェナントリジニウム及び１，２−ジオキセタンルミノール）、色素原、発蛍光団、蛍光原又は放射性同位体でありうる。さらに、それらは同じエレメント又はその混合物でありうる（例えば、１０個のアクリジニウムエステル又はいくつかのアクリジニウム含有化合物といくつかのフェナントリジウム化合物の混合物等）。前記分析物特異的結合対成員は、例えば、抗原、抗体、あるいは抗原又は抗体と同じ結合活性を有する前記抗原又は抗体のフラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２）でありうる。
【００１１】
本発明はまた、ａ）１）少なくとも１０個のシグナル生成基、２）分析物特異的結合対成員、３）親水性担体及び４）リンカーを含むコンジュゲートを、コンジュゲート／分析物複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で被験試料と接触させること；及びｂ）前記コンジュゲートの少なくとも１０個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって被験試料中の前記分析物の存在を判定すること、の工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法を包含する。前記分析物は、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、真菌、前記ウイルス、寄生生物、細菌又は真菌のフラグメント、前記ウイルス、細菌、寄生生物又は真菌に対する抗体、及び前記ウイルス、細菌、寄生生物及び真菌に対する抗体のフラグメントでありうる。コンジュゲートのエレメントは上述した通りでありうる。
【００１２】
さらに、本発明は、（ａ）被験試料を、分析物／第一分析物特異的結合対成員複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で第一分析物特異的結合対成員と接触させること；（ｂ）（ａ）で生じた前記複合体を、分析物／第一分析物特異的結合対成員／コンジュゲート複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下で、１）親水性担体、２）少なくとも１０個のシグナル生成基、３）第二分析物特異的結合対成員及び４）リンカーを含むコンジュゲートと接触させること；及び（ｃ）前記コンジュゲートの少なくとも１０個のシグナル生成基によって生じるシグナルの生成を検出することによって被験試料中の分析物の存在を判定すること、の工程を含む、被験試料において分析物を検出する方法を包含する。分析物は、コンジュゲートと同様に上述した通りでありうる。
【００１３】
さらに、本発明は、１）親水性担体、２）少なくとも１０個のシグナル生成基、３）分析物特異的結合対成員及び４）リンカーを含むコンジュゲートを含む、被験試料における分析物の検出のためのキットを包含する。
【００１４】
また、本発明は、（ａ）少なくとも１０個のシグナル生成基を親水性担体に組み込むこと；（ｂ）リンカーを工程（ａ）で生じた前記生成物に結合させること；及び（ｃ）コンジュゲートを形成するために工程（ｂ）の前記結合リンカーに分析物特異的結合対成員を結合させること、の工程を含む、コンジュゲートを形成する方法を包含する。やはり、コンジュゲートのエレメントは上述した通りでありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、コンジュゲート、コンジュゲートを作製する方法及びコンジュゲートを使用する方法に関する。コンジュゲートは４つのエレメントを含む。より特定すると、コンジュゲートは、１）親水性担体、２）少なくとも１０コピーの同じか又は異なる標識又はシグナル生成基、３）リンカー及び４）分析物特異的結合対成員を含む。前記親水性担体は、好ましくは少なくとも１０コピー、より好ましくは少なくとも２０コピー、さらに一層好ましくは少なくとも３０コピー、最も好ましくは少なくとも４０コピーの同じシグナル生成基又は標識あるいは異なるシグナル生成基又は標識が組み込まれている。（１０−４０の間のすべての整数も本発明の範囲内に含まれるとみなされる。）標識は親水性担体に直接結合され、その担体とへテロ二官能性リンカーを通して分析物特異的結合対成員に間接的に連結される（図１参照）。コンジュゲートの親水性担体は、へテロ二官能性リンカーによって分析物特異的結合対成員（すなわち抗原又は抗体）に結合又は連結される。コンジュゲートは、標識によって生成されるシグナルを増幅し、それによって被験試料中の分析物の検出を示す。特に、本発明のコンジュゲートは被験試料中の対象分析物についての感受性を高める能力を有する。
【００１６】
「標識」又は「シグナル生成化合物」は、それ自体検出可能であるか又は検出可能な産物を生成するために１個以上の付加的な化合物と反応させうる。シグナル生成化合物の例は、色素原、放射性同位体（例えばＩ−１２５、Ｉ−１３１、Ｐ−３２、Ｈ−３、Ｓ−３５及びＣ−１４）、化学発光化合物（例えばアクリジニウム含有化合物）、発蛍光団、時間分解蛍光原、発光原及び粒子（可視又は蛍光）を含む。酵素（例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ）も検出可能シグナルの生成において使用しうる。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えばポリメラーゼ連鎖反応）及びラマン分光法などの他の検出系も有用である。本発明の標識又はシグナル生成基は、好ましくは発光原基である。同じか又は異なる発光原又は化学発光基を使用しうる。シグナル生成のための発光原基は、例えば、アクリジニウムエステル、アクリジニウムスルホンアミド、フェナントリジニウム、１，２−ジオキセタン及びルミノールから選択しうる。好ましい発光原化合物は、米国特許第５，４６８，６４６号に述べられている、アクリジニウムスルホンアミドである。これらの化合物は通常の保存条件下で安定であるが、化学的に引き金を引かれると高い量子収率で光を放出しうる。
【００１７】
疎水性非特異的結合を軽減するために使用する「親水性担体」は、例えば、ポリペプチド、タンパク質（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、ポリオキシエチレンアミン及び多糖（例えば誘導体化シクロデキストラン及びデキストラン）から選択しうる。前記担体は、１）多くの標識を結合することができ及びその後分析物特異的結合対成員と共役反応することができる、例えばアミンなどの基で高度に官能基化されており、２）高度に水溶性であり、及び３）中性又は負に荷電しているべきである。最後の２つの物理的性質は、コンジュゲートの溶解度を高め、非特異的結合を低下させる。好ましい親水性担体はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。前記担体は、分析物特異的結合物質又は成員に、抗体の場合はそのリンカーアームを使用して、２つの重鎖の間のそのヒンジ部位で結合する。
【００１８】
高い非特異的結合と低い抗体活性の制限のゆえに、直接標識から作製されるコンジュゲートはほとんど、最適アッセイ成績のために６より高い抗体への標識の組込み率を有していない。しかし、ここで述べる新規コンジュゲートは、分析物特異的結合対成員（例えば抗体又は抗原）当り少なくとも１０個の発光原基を担持し、意外にも、直接標識から作製した対照コンジュゲート（最適組込みは抗体当り４から６個の発光基）と比較したとき、バックグラウンドは等しいか又はそれより低いが、陽性対照（例えばＨＣＶコア抗原陽性対照）よりも有意に良好な応答を与える。
【００１９】
本発明のコンジュゲートを作製しうるいくつかの方法が存在する。好ましい方法では、化合物を形成するために、最初に親水性担体（例えばＢＳＡ）に多数のコピーの発光原基（例えばアクリジニウム）を組み込む（図１参照）。生じた生成物（例えば（発光原基）ｘ−親水性担体、例えば（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ））を、次に、ヘテロ二官能性リンカーで活性化する。活性化（発光原基）ｘ−親水性担体）化合物、例えば（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ上の基（例えばマレイミド）を使用して、最終コンジュゲートを形成するために分析物特異的結合対成員（例えば抗体又は抗原）上の基、例えばスルフヒドリル基と反応させる。（「ｘ」は、各々の親水性担体分子に共有結合によって組み込んだ発光原基の平均コピー数を表わす。
【００２０】
（発光原基）ｘ−親水性担体）化合物を分析物特異的結合対成員（例えば抗体又は抗原）に連結するために様々なヘテロ二官能性リンカーが使用できる。そのようなヘテロ二官能性リンカー、特にマレイミド活性エステルリンカーは、第一分子上のアミンと化学選択的に反応し、次に生理的ｐＨで高度に制御された方法でチオール含有第二分子にコンジュゲート形成するので、特に好ましい。ヘテロ二官能性リンカーは、例えばスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−６−アミドカポレート、伸びきり（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）長鎖リンカー（米国特許第４，９９４，３８５号参照）から選択することができる。
【００２１】
さらに、分析物特異的結合物質が抗体である場合は、抗体重鎖のヒンジ部位におけるジスルフィド結合の還元から生成されるスルフヒドリル基を使用しうる。このコンジュゲート形成工程は、コンジュゲートによる抗体結合部位の遮断を回避してより良好な感受性を可能にする。抗体のヒンジ部位における重鎖間のジスルフィド結合は、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（５から５０ｍＭ）によって環境温度で短時間のうちに（すなわち３０分以内に）容易にスルフヒドリル基に還元される。例えばゲルろ過によって過剰のＤＴＴを除去した後、前記スルフヒドリル基を、効率的にコンジュゲートの形成を生じさせる、活性化（発光原基）ｘ−親水性担体（例えば（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ）上のマレイミド基と選択的に反応させる。前記抗体は、例えば全ＩｇＭ、ＩｇＧ又は（Ｆａｂ’）２でありうる。
【００２２】
抗原が分析物特異的結合対成員であり、（発光原基）ｘ−親水性担体）化合物（例えば（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ）に結合しなければならないときは、いくつかの方法でスルフヒドリル基を抗原上に生成しうる。例えば、ジスルフィド結合からスルフヒドリル基を生成することができる。例えば、ＤＴＴ又はシステイン２−メルカプトエチルアミンなどの還元剤を使用しうる（ジスルフィド結合を含む抗原に関して）。あるいは、スルフヒドリル基を導入するためにＴｒａｕｔ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ、２−イミノチオラン塩酸塩（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用しうる。やはり、スルフヒドリル基の目的は、活性化（発光原基）ｘ−親水性担体（例えば（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ）上のマレイミド基と反応させることである。
【００２３】
本発明のコンジュゲートは多くの用途を有する。例えば、被験試料における対象分析物の検出において使用しうる。特に、本発明は、不均質免疫測定法から生成される特異的発光シグナルの存在を検出することによって被験試料中の分析物の存在を判定するための方法を包含する。１つの方法では、コンジュゲート（及び特にコンジュゲートの分析物特異的結合対成員）に対象分析物との複合体を形成させるために、コンジュゲートを被験試料と接触させうる。そのような複合体が形成されるとき、コンジュゲートの発光原基は、次に、検出可能な化学発光シグナルを生成する。シグナルの検出は前記試料における分析物の存在を指示する。
【００２４】
診断アッセイにおいて前記コンジュゲートを使用するもう１つの方法は、最初に対象分析物を含む被験試料を、分析物／分析物特異的結合対成員の複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で分析物特異的結合対成員と共にインキュベートして、第一混合物を形成することを含む。
【００２５】
本発明に関して、「分析物特異的結合対成員」は、特異的結合対の成員である。すなわち、そのうちの１個が、化学的又は物理的手段を通して第二分子に特異的に結合する、２個の異なる分子である。それ故、一般的免疫測定法の抗原及び抗体特異的結合対に加えて、他の特異的結合対は、ビオチンとアビジン、糖質とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターと受容体分子、補因子と酵素、酵素阻害因子と酵素を含みうる。分析物特異的結合対成員はまた、コンジュゲート（上述したような）とプローブ（すなわち被験試料中に存在する特異的ポリヌクレオチド（すなわち分析物）を特定するために使用できる規定された核酸セグメント）の組合せを含みうる。（プローブならびにここで使用するいくつかの他の用語の定義については、例えば米国特許第６，２０７，３８０  Ｂ１号参照。）さらに、特異的結合対は、もとの特異的結合成員の類似体である成員、例えば分析物類似体を含みうる。免疫反応性特異的結合成員は、組換えＤＮＡ分子によって形成されるものを含む、抗原、抗原フラグメント、モノクローナル及びポリクローナルの両方の抗体及び抗体フラグメント、及びそれらの複合体を包含する。（本発明に関して、抗体の「部分」又は「フラグメント」は、結合特性に関して完全な抗体と機能的に同じように反応する抗体のサブユニットと定義される。さらに、本発明に関して、抗原の「部分」又は「フラグメント」は、抗原に由来する少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸を含むアミノ酸配列と定義される。（ヌクレオチド配列の「部分」又は「フラグメント」は、特定ヌクレオチド配列の領域に対応する（すなわち同一又は相補的）少なくとも６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドの隣接配列を指す。）
被験試料は、例えば、赤血球、白血球、血小板、血清及び血漿などの全血成分、腹水、尿、脳脊髄液などの何らかの生体液、ならびに対象分析物を含有しうる身体の他の成分（すなわち組織）でありうる。
【００２６】
分析物は、被験試料中に存在しうる又は存在しない可能性がある、検出すべき物質である。分析物は、それに対する抗体又はそのフラグメント（例えばＩｇＭ、ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’ｍＦ（ａｂ’）２）、抗原又はそのフラグメントなどの天然に生じる特異的結合成員が存在する物質、又はそれに対する特異的結合成員を作製することができる物質でありうる。それ故、分析物は、アッセイにおいて１個以上の特異的結合対成員に結合することができる物質である。分析物の語はまた、抗原性物質、ハプテン（すなわち部分抗原、又は抗体に結合することができるが、キャリアタンパク質に結合しない限り抗体形成を誘導することができない非タンパク質結合成員）、抗体又はそれらの組合せを包含する。特異的結合対の成員として、分析物は、例えばビタミンＢ１２の測定のための特異的結合対の成員としての内因子タンパク質の使用、又は糖質の測定のための特異的結合対の成員としてのレクチンの使用のように、天然に生じる特異的結合パートナー（すなわち対）によって検出することができる。分析物は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、細菌、酵母、核酸配列、臨床化学アッセイにおいて検出される何らかの物質、ウイルス（例えばＢ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びＨＴＬＶ）、寄生生物、上記のフラグメント（例えばエピトープ）ならびに上記物質のいずれかの代謝産物又は上記物質のいずれかに対する抗体を含みうる。そのような抗体の作製のための詳細及び特異的結合成員としての使用の適合性は当業者に周知である。
【００２７】
ひとたび分析物／分析物特異的結合成員対の複合体が形成されれば、それらを上述したコンジュゲートと接触させうる。特に、前記コンジュゲートは、もう１つの分析物特異的結合対成員、親水性担体及び第二混合物を形成するための多数のコピーの１種類以上の発光原化合物又は基を含む。本発明に関して、コンジュゲートは、分析物に特異的な物質（すなわち分析物特異的結合対成員）が親水性担体を通して共有結合する（リンカーアームによって）少なくとも１０個の発光原化合物又は基を含む。
【００２８】
第二混合物を、次に、分析物／分析物特異的結合成員対／コンジュゲート複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。最後に、発光原基によって生成される検出可能シグナル存在を測定することによって被験試料中の分析物の存在を判定する。
【００２９】
分析物特異的結合対成員を固相に付着させうることに先ず留意すべきである。固相は、不溶性であるか又はその後の反応によって不溶性にすることができる物質を指す。固相は、捕獲試薬（すなわち分析物又は補助特異的結合成員のいずれかに特異的な非標識特異的結合成員）を誘引し、固定化するその内在性能力によって選択しうる。あるいは、固相は、捕獲試薬又は分析物特異的結合成員を誘引し、固定化する能力を有する付加的な受容体を保持しうる。固相はまた、捕獲試薬を誘引し、固定化する能力を有する付加的な受容体を保持しうる。固相の例は、ガラス繊維、セルロース、ナイロンパッド、浸漬棒、試験紙、ポリマー又はガラスビーズ、ミクロ粒子、チューブ、シート、プレート、マイクロタイターウエル、高分子フィルム、紙、シリカゲル、アガロース、スライド、ウェッブ、テープ、試験管又は内因性電荷を有する又は荷電物質を保持しうる何らかの物質を含む。前記コンジュゲートはまた、溶液中で実施されるアッセイにおいても使用しうる。
【００３０】
本発明のコンジュゲートはまた、特定ウイルス感染（例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ等）、細菌感染、寄生生物感染等に関連する特定ヌクレオチド配列又はその部分（上記で定義したような）を検出するために核酸検出又は分子スクリーニングアッセイにおいても使用しうることに留意すべきである。そこで、そのようなアッセイに関して、分析物特異的結合対成員は、被験試料中の対象配列にハイブリダイズするプローブ（又は核酸配列）である。特に、「プローブ」は、標的配列に相補的であり、適切な条件下で標的配列にハイブリダイズするために使用される特異的オリゴヌクレオチド配列である。プローブと分析物が特定の度合の配列同一性を有する場合、プローブ／分析物ハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野の通常技術のいずれかによって決定できる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｈａｍｅｓ編集、１９８５、Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）参照；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹも参照のこと）。
【００３１】
本発明のコンジュゲートを使用しうる他のアッセイは、例えば、蛍光偏光（例えば溶液中での均一アッセイ）、間接アッセイ、直接アッセイ、競合測定法、高速試験、分子スクリーニングアッセイ、ウエスタンブロット法、阻害アッセイ、光サイトメトリー及び組織染色アッセイを含む（Ｑｕｉｎｎ，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第２版、Ｗｉｌｄ編集、２００１参照）。そのような様式は当業者には容易に理解される。
【００３２】
本発明はまた、上述したコンジュゲートを含むキットを包含する。そのようなキットは、例えばウイルス、細菌、真菌（例えば酵母）及び寄生生物感染から生じる核酸配列、抗原、抗体又はその部分（例えばハプテン、エピトープ、Ｆａｂフラグメント等）を検出するために使用できる。
【００３３】
上記方法及び、特に、上記コンジュゲートは、コンジュゲートを使用する現在使用可能なアッセイにおける代替物として使用することができ、それによって１）対象分析物の検出時のシグナル増幅及び２）対象分析物に対する感受性を改善することに留意すべきである。
【００３４】
本発明は、以下の非制限的実施例を使用して例示されうる：
【実施例】
【００３５】
（実施例Ｉ）
（アクリジニウム）ｘ−ウシ血清アルブミンの作製
結晶性ＢＳＡを、０．１％ＣＨＡＰＳ［３−（３−コラミドプロピルジメチルアミノ）−１−プロパンスルホン酸塩］を含むリン酸緩衝液中に６．７ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することによってウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の溶液を作製した。ＤＭＦ［Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド］中のアクリジニウム活性エステル２９０ｍｌを、４ｍｌアンバーバイアル中の前記ＢＳＡ溶液１ｍｌに加えた。前記活性エステルは、１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキサミド（米国特許第５，４６８，６４６号）及びＮ−ヒドロキシスクシニミドから作製し、４ｍｇ／ｍｌでＤＭＦに溶解した。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌して混合し、その後５０−６０分間環境温度下に置いた。次にＧ２５ゲルろ過のために溶液をＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に移し、０．１％ＣＨＡＰＳを含むリン酸緩衝液で溶出した。前端空隙で黄色ピークを清浄な４ｍｌアンバーバイアルに収集した。タンパク質濃度及びＢＳＡ分子当りの組み込まれたアクリジニウムを評価するために２８０及び３７０ｎｍでアクリジニル化ＢＳＡの吸光度を測定した。濃度は１．４５ｍｇ／ｍｌ、１２．８アクリジニウム／ＢＳＡと算定された。
【００３６】
（実施例ＩＩ）
（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡへのマレイミド基の結合
（ａ）３０原子リンカーによる活性化
（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ  １ｍｌ（アンバーバイアル中の実施例１より）を、５ｍＭでＤＭＦに溶解した３０原子リンカー、スクシニミジル（４−トリカプロアミドシクロヘキシルメチル）Ｎ−マレイミド（米国特許第４，９９４，３８５号）１０８μｌに加えた。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌によって混合し、その後６０分間環境温度下に置いた。次にゲルろ過のために溶液をＰＤ１０カラムに移し、０．１％ＣＨＡＰＳ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ［エチレンジアミン四酢酸塩］を含むリン酸緩衝液で溶出した。前端で（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−３０原子マレイミドを含む黄色ピークを清浄な４ｍｌアンバーバイアルに収集し、同日の複合の時まで氷浴中で保存した。
【００３７】
（ｂ）長鎖ＳＭＣＣによる活性化
（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ  １ｍｌ（アンバーバイアル中の実施例１より）を、ＤＭＦ中で５ｍＭに新鮮溶解したスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−６−アミドカポレート（ＬＣ−ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）１０８μｌに加えた。反応バイアルに栓をして、渦動攪拌によって混合し、６０分間環境温度下に置いた。次に、ゲルろ過のために溶液をＰＤ１０カラムに移し、０．１％ＣＨＡＰＳ及びＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液で溶出した。前端で（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−ＬＣマレイミドを含む黄色ピークを清浄な４ｍｌアンバーバイアルに収集し、同日の複合の時まで２−８℃の冷蔵庫で保存した。
【００３８】
（実施例ＩＩＩ）
還元Ｍａｂ  ｃ１１−１０  ＩｇＧと（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−３０原子マレイミドとのコンジュゲート形成
モノクローナル抗ＨＣＶコア抗原である、１．５ｍｌバイアル中の０．１％ＣＨＡＰＳを含むｐＨ７．０のリン酸緩衝液１ｍｌ中のクローンｃ１１−１０（Ｔｏｎｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｏｈｉ−Ｍａｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）３．５ｍｇに、蒸留水中に２５ｍＭの濃度まで新鮮溶解した０．５Ｍジチオトレイトール５０μｌを加えた。溶液を静かに逆転させることによって混合し、３０分間環境温度下に置いた。次に、ゲルろ過のために溶液をＰＤ１０カラムに移し、０．１％ＣＨＡＰＳ及び５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むｐＨ７．０のリン酸緩衝液で溶出した。Ａ２８０ピークにおける還元ＩｇＧを空隙容量から清浄な４ｍｌアンバーバイアル中に収集し、コンジュゲート形成時まで氷浴で保存した。
【００３９】
還元抗体の収集後１０分以内にコンジュゲート形成を開始した。実施例ＩＩ（ａ）からの（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−３０原子マレイミド２．２ｍｌを、アンバーバイアル中の還元ｃ１１−１０  ＩｇＧ  １ｍｌに加え、静かに逆転させることによって混合した。バイアルを１８から２０時間、２から８℃の冷蔵庫内に置いた。そのコンジュゲート混合物を０．１％の最終濃度までＰｒｏｃｌｉｎ  ３００（Ｒｏｈｍ−Ｈａａｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｅｎｎ．）に加え、０．２２ミクロンフィルターでろ過した。
【００４０】
その粗コンジュゲートを、３００×７．８ｍｍ  Ｂｉｏ−Ｓｉｌ  ＳＥＣ−４００−５カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）によるサイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分画し、０．１％ＣＨＡＰＳを含むリン酸緩衝食塩水で溶出した。ＨＰＬＣはＢｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で実施した。流速は１ｍｌ／分であり、溶出物を２８０と３７０ｎｍの波長の二元チャンネルで監視した。各々の注入量は２００μｌであり、遊離ＩｇＧのピークに先立つピーク付近で３つの分画を収集した。タンパク質濃度及びＩｇＧ分子当りの組み込まれたアクリジニウムを評価するために、各々の分画の吸光度をＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ−７分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）において２８０及び３７０ｎｍで測定した。以下の表はその評価を示す：
【００４１】
【表１】
2005530143.tif 000002
【００４２】
１０．５−１１．５分の保持時間を有する分画３は、１：１のモル比のアクリジニウム−ＢＳＡ及びＩｇＧとの単量体コンジュゲートを示す、約２２０ｋＤａの分子量（ＨＰＬＣ溶出プロフィールに関するタンパク質標準品に基づく）に対応するピーク（２８０及び３７０ｎｍ）を含む。分画１及び２は、アクリジニウム−ＢＳＡとＩｇＧの様々な組合せのオリゴマーコンジュゲートの混合物を示す、３００から６７０ｋＤａの範囲の分子量に対応する９．０から１０．５分の保持時間を有する伸長前端肩部として出現した。
【００４３】
（実施例ＩＶ）
還元Ｍａｂ  ｃ１１−１０  ＩｇＧと（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−ＬＣマレイミドとのコンジュゲート形成
還元ｃ１１−１０  ＩｇＧを、実施例ＩＩＩで述べたのと同じ手順によってｃ１１−１０  ＩｇＧ  １．７８ｍｇ／ｍｌから作製した。また、還元抗体の収集後１０分以内にコンジュゲート形成を開始した。実施例ＩＩ（ｂ）からの（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−ＬＣマレイミド０．８ｍｌをアンバーバイアル中の還元ｃ１１−１０  ＩｇＧ０．２５ｍｌに加え、静かに逆転させることによって混合した。バイアルを１８から２０時間、２から８℃の冷蔵庫内に置いた。０．１％までのＰｒｏｃｌｉｎ  ３００を前記コンジュゲート混合物に加え、０．２２ミクロンフィルターでろ過した。その粗コンジュゲートを実施例ＩＩＩで述べたようにＳＥＣ−ＨＰＬＣで分画した。各々の注入量は２００μｌであり、遊離ＩｇＧのピークに先立つピーク付近で２つの分画を収集した。各々の分画を２８０及び３７０ｎｍで測定し、ＩｇＧ濃度及びＩｇＧモル比当りの組み込まれたアクリジニウムの評価を以下の表に示す。
【００４４】
【表２】
2005530143.tif 000003
【００４５】
１０．５から１１．４分の保持時間を有する分画２は、１：１のモル比のアクリジニウム−ＢＳＡ及びＩｇＧとの単量体コンジュゲートを示す、約２２０ｋＤａの分子量（ＨＰＬＣ溶出プロフィールに関するタンパク質標準品に基づく）に対応する主ピーク（２８０及び３７０ｎｍ）を含む。分画１は、アクリジニウム−ＢＳＡとＩｇＧの様々な組合せのオリゴマーコンジュゲートの混合物を示す、３００から６７０ｋＤａの範囲の分子量に対応する９．５から１０．５分の保持時間を有する伸長前端肩部の一部である。
【００４６】
（実施例Ｖ）
Ｍａｂ  ｃ１１−１０  Ｆａｂ’と（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−ＬＣマレイミドとのコンジュゲート形成
ｃ１１−１０（Ｆａｂ’）２をペプシン消化によって作製し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００Ｇカラムから精製した（Ａｏｙａｇｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｒｏｂｉｏｌ．３７，ｐ．１８０２−１８０８（１９９９））。アクリジニウム−ＢＳＡとｃ１１−１０  Ｆａｂ’とのコンジュゲート形成を実施例ＩＩＩで述べたのと同じ手順によって実施した。但しＩｇＧの代りにｃ１１−１０（Ｆａｂ’）２  ０．５ｍｇから出発した。ｃ１１−１０（Ｆａｂ’）２のＤＴＴ還元からｃ１１−１０  Ｆａｂ’２を収集した後１０分以内にコンジュゲート形成を開始した。実施例ＩＩ（ｂ）からの（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−ＬＣマレイミド０．８ｍｌをアンバーバイアル中の還元ｃ１１−１０  Ｆａｂ’０．８ｍｌに加え、静かに逆転させることによって混合した。バイアルを１８から２０時間、２から８℃の冷蔵庫内に置いた。そのコンジュゲート混合物をＰｒｏｃｌｉｎ  ３００に加えて０．１％にし、０．２２ミクロンフィルターでろ過した。その粗コンジュゲートを、Ｖａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，Ｃａｌｉｆ．）において６００×２１ｍｍ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３，０００カラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ  ＬＬＣ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）によるサイズ排除ＨＰＬＣで分画し、０．１％ＣＨＡＰＳを含むリン酸緩衝食塩水で溶出した。流速は３ｍｌ／分であり、溶出物を２８０と３７０ｎｍの波長の二元チャンネルで監視した。注入量は１ｍｌであり、３２から３８分の保持時間から、毎分１つの分画で６つの分画を収集した。タンパク質濃度及びＦａｂ’当りの組み込まれたアクリジニウムを評価するために、各々の分画の吸光度をＶａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  ５０  Ｓｃａｎ分光光度計（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）において２８０及び２７０ｎｍで測定した。Ｆａｂ’濃度及びＦａｂ’モル比当りの組み込まれたアクリジニウムの評価を以下の表に示す。
【００４７】
【表３】
2005530143.tif 000004
【００４８】
３２−３４分の保持時間を有する分画１及び２は、２：１のモル比のアクリジニウム−ＢＳＡ及びＦａｂ’とのコンジュゲートを示す、約２００ｋＤａの分子量（ＨＰＬＣ溶出プロフィールに関するタンパク質標準品に基づく）に対応するサイドピーク（２８０及び３７０ｎｍ）を含む。分画５及び６は、ほぼ、１：１のモル比のアクリジニウム−ＢＳＡ及びＦａｂ’とのコンジュゲートの大きさである１５０ｋＤａ（天然ＩｇＧの大きさ）に対応する３６から３８分の保持時間を有する主ピークから成る。分画３及び４は、コンジュゲートの２つのピークの間の重複する肩部である。すなわち、これらはおそらく両方の種類の混合物である。
【００４９】
（実施例ＶＩ）
ＨＣＶコア抗原に関するサンドイッチアッセイ
Ｄ．ＳｈａｈとＪ．Ｓｔｅｗａｒｔによる出版物「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｐａｎｅｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ−ＰＲＩＳＭ」（Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ｄ．Ｗｉｌｄ編集、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹ，ＮＹ）の中に述べられているように単一チャンネルＰＲＩＳＭ（登録商標）装置を使用してアッセイを実施した。
【００５０】
簡単に述べると、対照あるいは血清又は血漿試料１００μｌ；界面活性剤、ＢＳＡ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及び０．１％アジ化ナトリウムを加えたホウ酸緩衝食塩水である標本希釈用緩衝液（ＳＤＢ）５０μｌ；及びｃ１１−１４  Ｍａｂ抗ＨＣＶコア抗原（ＴｏｎｅｎからのＭａｂ）と結合した微粒子５０μｌをステーション１のインキュベーションウエルに加えた。反応トレーを１８分間かけてステーション４まで徐々に移動させた。ステーション４で、界面活性剤と０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を加えたトリス塩類溶液である転移洗浄緩衝液によって反応混合物を反応ウエルに移した。反応混合物中の微粒子を反応ウエル内の繊維状マトリックス（液体は通過させる）によって捕獲した。ステーション５で、アクリジニウム標識抗ＨＣＶコアを含むコンジュゲート５０μｌを反応ウエルに加えた。反応トレーを２２．３分間かけてステーション８まで移動させた。ステーション８で、反応ウエル中の反応混合物を、界面活性剤と０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を加えたＭＥＳ［２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸］緩衝食塩水である最終洗浄緩衝液で洗った。次にそのトレーをステーション９まで移動させ、ステーション９でトリガー溶液、アルカリ過酸化水素を反応ウエルに注入し、そのシグナルを光電子増倍管によって測定した。各々の反応ウエルからの化学発光計数を積分し、その試料ＩＤと共にバッチファイルに整列保存した。
【００５１】
アッセイ対照：陰性キャリブレータ（ＮＣ）は、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢコア及びＨＣＶに関して試験陰性のカルシウム再添加正常ヒト血漿である。ＨＣＶＡｇ検出能を評価するためにＨＣＶ抗原陽性のＡｇＰＣをＨＣＶＡｇ陽性ヒト血漿（ＮＡＢＩ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）から希釈した。この血漿はＨＣＶ抗体に関して試験陰性であったが、ＰＣＲ（核酸ポリメラーゼ連鎖反応）によって１７，０００，０００ＨＣＶ  ＲＮＡコピー／ｍｌでＮＡＴ（核酸試験）陽性であり、またＨＣＶ  Ａｇアッセイでも高度に試験陽性であった。
【００５２】
（実施例ＶＩＩ）
（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−３０原子結合ｃ１１−１０  ＩｇＧのコンジュゲートの試験
各々実施例ＩＩＩにおいてＳＥＣ−ＨＰＬＣから単離したコンジュゲート分画２及び３を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を加えた３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝食塩水のコンジュゲート希釈液中で１００ｎｇ／ｍｌに希釈した。１０−（３−スルホプロピル）−Ｎ−（２−カルボキシエチル）−９−アクリジニウムカルボキサミドの直接標識から作製したｃ１１−１０コンジュゲートを対照として使用した。それらのコンジュゲートをＮＣ及びＡｇＰＣに対する応答に関して同じバッチで試験した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するＰ／Ｎ比を算定した。バックグラウンドは６ＮＣの平均計数であり、陽性応答は２回の試験でのＡｇＰＣの平均計数であった。
【００５３】
【表４】
2005530143.tif 000005
注：陰性対照、ＮＣは、プール陰性血漿から調製した；プール中の各々の標本は、試験でＨＢｓＡｇに関して非反応性であり、ＨＢｃ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ及びＨＣＶに対する抗体に関して陰性であった。ＨＣＶ抗原陽性のＡｇＰＣは実施例ＶＩに述べられている。Ｐ／Ｎは、化学発光の計数における試料応答対陰性対照応答の比率である。Ｐ／Ｎの数値は、アッセイにおけるＨＣＶコア抗原の感受性又は検出能に関する良好な評価を提供する。対照コンジュゲートと比較して、コンジュゲート分画２及び３の両方が、同等のＮＣ計数であったが、計数及びＰ／Ｎ値においてＡｇＰＣに対する有意により良好な応答を示した。
【００５４】
（実施例ＶＩＩＩ）
（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−ＬＣ結合ｃ１１−１０  ＩｇＧのコンジュゲートの試験
実施例ＩＶにおいてＳＥＣ−ＨＰＬＣから単離したコンジュゲート分画２を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を加えたＭＯＰＳ食塩水のコンジュゲート希釈液中で１００ｎｇ／ｍｌに希釈した。実施例ＶＩＩの直接標識アクリジニウムと同じｃ１１−１０コンジュゲートを対照として使用した。両方のコンジュゲートをＮＣ及びＡｇＰＣに対する応答に関して同じバッチで検討した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するＰ／Ｎ比を算定した。バックグラウンドは１２ＮＣの平均計数であり、陽性応答は４回の試験でのＡｇＰＣの平均計数であった。
【００５５】
【表５】
2005530143.tif 000006
【００５６】
対照コンジュゲートと比較して、コンジュゲート分画１（オリゴマーコンジュゲート）は、ＡｇＰＣに対する２倍以上のシグナル応答と幾分より高いＮＣ計数を示し、一方分画２（単量体コンジュゲート）は、ＡｇＰＣに対するさらに一層良好なシグナル応答と同等のＮＣ計数及びＰ／Ｎ値の２．５倍の上昇を示した。言い換えると、単量体コンジュゲートは、オリゴマーコンジュゲート又は対照Ａｃｒ−ｃ１１−１０コンジュゲートと比較して、ＨＣＶコアＡｇの検出において有意により良好な感受性を提供する。
【００５７】
（実施例ＩＸ）
（アクリジニウム）ｘ−ＢＳＡ−ＬＣ結合ｃ１１−１０  Ｆａｂ’のコンジュゲートの試験
実施例ＶにおいてＳＥＣ−ＨＰＬＣから単離したコンジュゲート分画を、界面活性剤、ウシ胎児血清及び０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ  ３００を加えたＭＯＰＳ食塩水のコンジュゲート希釈液中で各々５０ｎｇ／ｍｌに希釈した。実施例ＶＩＩの直接標識アクリジニウムと同じｃ１１−１０コンジュゲートを対照として使用した。すべてのコンジュゲートをＮＣ及びＡｇＰＣに対する応答に関して同じバッチで検討した。感受性を評価するために各々のコンジュゲートに関するＰ／Ｎ比を算定した。バックグラウンドは６ＮＣの平均計数であり、陽性応答は２回のＡｇＰＣの平均計数であった。
【００５８】
【表６】
2005530143.tif 000007
【００５９】
対照コンジュゲートと比較して、３つのコンジュゲート分画すべてが有意に低いＮＣ計数であったが、ＡｇＰＣに対してはるかに高い応答を示し、Ｐ／Ｎ値は３．６から６．６倍高かった。明らかに、１：１の比率のアクリジニウム−ＢＳＡ及びＦａｂ’とのコンジュゲート（分画６）は、ＨＣＶコアＡｇ検出における非常に良好な感受性上昇を示した。２：１モル比のアクリジニウム−ＢＳＡ及びＦａｂ’とのコンジュゲート（分画２）は、最も高い感受性を示した。言い換えると、このコンジュゲートは、同じアッセイ系において、対照Ａｃ−ｃ１１−１０  ＩｇＧコンジュゲートによって検出可能な濃度の１／６以下の濃度のＨＣＶコア抗原を検出することができるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、本発明のコンジュゲートを作製しうる方法を例示する。
【図１】
2005530143.tif 000008
【国際調査報告】
2005530143.tif 000009
2005530143.tif 000010