(57)【要約】本発明は、ウイルス粒子濃度、特にアデノウイルスの任意の血清型のウイルス粒子濃度を測定する簡単、正確且つ再現可能な方法を開示する。より具体的には、アデノウイルスのようなサンプルウイルスについてウイルス粒子数／ミリリットル／吸光度単位／センチメートル（ｖｐ／ｍＬ−ＡＵ−ｃｍ）の単位で表す２６０ナノメーター（ｎｍ）での正確な吸光率／吸光係数、及びアデノウイルス調製物のような精製ウイルス調製物について２６０ｎｍでのこの確立された吸光率／吸光係数及び吸光度に基づくウイルス粒子濃度を測定するための紫外線（ＵＶ）吸光度方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ウイルス調製物の各血清型について吸光率／吸光係数（ε２６０）を計算し、
ｂ）前記ウイルス調製物からのサンプルのＡ２６０を測定し、および
ｃ）ステップａ）及びステップｂ）のε２６０及びＡ２６０測定値から前記ウイルスサンプルのウイルス粒子濃度を測定することを含む、ＵＶ吸光度測定からウイルス調製物のウイルス粒子濃度を測定する方法。
【請求項２】
ウイルス血清型がアデノウイルス血清型である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウイルス血清型がアデノウイルス５である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ａ）ウイルス血清型のウイルス調製物からのサンプルのウイルス粒子濃度を測定し、
ｂ）前記ウイルス調製物からの独立サンプルを、ウイルス粒子を完全に破壊しウイルスＤＮＡコンフォメーションを完全に破壊する条件下で処理し、
ｃ）ステップｂ）からのサンプルのＡ２６０を測定し、および
ｄ）ステップａ）のウイルス粒子濃度をステップｃ）のＡ２６０値と相関させることを含む、ウイルス血清型の吸光率／吸光係数（ε２６０）を計算する方法。
【請求項５】
ステップｂ）のサンプルに関する処理条件が、ウイルス粒子及びウイルスＤＮＡコンフォメーションの両方を完全に破壊する濃度でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をウイルス調製物に添加することを含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）のサンプルに関する処理条件が、少なくとも約１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加し、その後ウイルス粒子及びウイルスＤＮＡコンフォメーションの両方を完全に破壊する温度でインキュベートすることを含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ａ）アデノウイルス血清型の調製物からのサンプルのウイルス粒子濃度を測定し、
ｂ）前記ウイルス調製物からの独立サンプルを、ウイルス粒子を完全に破壊しウイルスＤＮＡコンフォメーションを完全に破壊する条件下で処理し、
ｃ）ステップｂ）からのサンプルのＡ２６０を測定し、および
ｄ）ステップａ）のウイルス粒子濃度をステップｃ）のＡ２６０値と相関させることを含む、アデノウイルス血清型の吸光率／吸光係数（ε２６０）を計算する方法。
【請求項８】
ステップｂ）のサンプルに関する処理条件が、ウイルス粒子及びウイルスＤＮＡコンフォメーションの両方を完全に破壊する濃度でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をウイルス調製物に添加することを含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）のサンプルに関する処理条件が、少なくとも約１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加し、その後ウイルス粒子及びウイルスＤＮＡコンフォメーションの両方を完全に破壊する温度でインキュベートすることを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス血清型がアデノウイルス５である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルス血清型がアデノウイルス５である請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロス・リファレンス
本願は、２００２年２月２０日に出願された米国仮出願第６０／３５８，３３１号に対して、３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）に基づく恩典を主張する。
連邦政府支援の研究開発に関する言及
該当なし。
マイクロフィッシュ付録に関する参照
該当なし。
【０００２】
本発明は、ウイルス調製物中のウイルス粒子濃度を測定するための改良方法に関する。本明細書に開示されている方法は、２６０ｎｍ吸光度を用いてウイルス粒子濃度を測定するための簡単、正確且つ再現可能な方法を提供する。この方法は特にアデノウイルス粒子濃度の分光光度測定に適用され得る。本発明の方法は吸光度測定の前に確実にウイルス粒子及びウイルスＤＮＡコンフォメーションを完全破壊し、よって光散乱干渉及び濃色効果による吸光度測定誤差を排除し、タンパク質濃度に直接相関する２６０ｎｍでの吸光係数を与えることができる。この方法により、ウイルス粒子濃度、特にアデノウイルス粒子濃度を測定する際の検査室間変動が少なくなる。
【背景技術】
【０００３】
治療に使用されるトランスフェクト遺伝子のインビボデリバリー用のベクターとして及びワクチン中へのアデノウイルスの導入は、最終的に多種多様の病気標的に適用されるよう研究及び開発が非常に注目されている。適当な有効性のためにトランスフェクトされるアデノウイルス粒子の用量レベルを推定するために使用される臨床研究は、ウイルス粒子濃度を査定するための正確且つ再現可能な方法を提供できる技術に大きく依存している。アデノウイルス粒子濃度を各種タイプのサンプル予備処理及び分光学的方法を用いて測定するための幾つかの方法が文献に公開されている（例えば、Ｌａｗｒｅｎｃｅ及びＧｉｎｓｂｅｒｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１：８５１−８６７（１９６７）；Ｍａｉｚｅｌら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６：１１５−１２５（１９６８）；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ及びＭｅｎｔｅｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，５０：２８１−２９２（１９９４）；Ｈｕｙｇｈｅら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６：１４０３−１４１６（１９９５）；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（１１）：７４９８−７５０９（１９９６）；Ｓｈａｂｒａｍら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，８：４５３−４６５（１９９７）参照）。上掲のＭａｉｚｅｌらは、特にアデノウイルス調製物のタンパク質含量と２６０ｎｍでの吸光度の相関関係を確立し、精製アドノウイルス調製物の吸光率は１．１×１０１２ウイルス粒子／吸光度単位（ＡＵ）であると報告した。この方法及び吸光率値はアデノウイルス粒子濃度を定量するための基礎として文献に広く引用されている。しかしながら、この分光学的方法の簡便さは魅力的であるが、この方法を適用するとタンパク質濃度を直接評価したときに比して精度は低く、分光学的方法から予想されるよりもアッセイ間及びアッセイ内変動が大きくなった。上掲したＭａｉｚｅらが言及した方法を含めたいずれの方法もアデノウイルス濃度を規定するための“普遍的な”アプローチを提供するほど常に十分に使用されていない。更に、これらの方法の多くは矛盾する結果を生ずる。実際、Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（１１）：７４９８−７５０９（１９９６））はアデノウイルスの濃度及び生物学的活性を評価しようとする研究でアデノウイルス調製物の２６０ｎｍでの吸光率の精度は更に研究を要する領域であると述べている。ウイルス粒子、特に遺伝子治療及び／または遺伝子ワクチン接種レジメ、例えば代表的な組換えアデノウイルスベクターで使用されているウイルス粒子の濃度を測定するための簡単、正確且つ再現可能な方法を得ることが望ましい。本発明は上記要求に関し、ウイルス粒子濃度を分光学的方法を用いて測定するための簡単で正確且つ容易に再現可能な方法を開示することにより上記要求を満たす。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、ウイルス粒子濃度、特にアデノウイルスの任意の血清型のウイルス粒子濃度をＵＶ分光光度法により測定するための簡単、正確且つ再現可能な方法に関する。より具体的には、アデノウイルスのようなサンプルウイルスについてウイルス粒子数／ミリリットル／吸光度単位／センチメートル（ｖｐ／ｍＬ−ＡＵ−ｃｍ）の単位で表す、２６０ナノメーター（ｎｍ）での正確な吸光率／吸光係数、並びにアデノウイルス調製物のような精製ウイルス調製物について２６０ｎｍでのこの確立された吸光率／吸光係数、及び吸光度に基づいてウイルス粒子濃度を測定するための紫外線（ＵＶ）吸光度方法を開示する。好ましいサンプルウイルスはＤＮＡの分子量の初期計算値が公知である任意のアデノウイルスであり、よって本明細書に記載されている一連の簡単な数学上の計算が可能である。
【０００５】
従って、本発明はＵＶ吸光度測定からウイルス調製物のウイルス粒子濃度を測定する改良方法に関し、その方法は前記ウイルス調製物の各血清型について吸光率／吸光係数（ε２６０）を計算し、ウイルス調製物からのサンプルのＡ２６０を測定し、前記したε２６０及びＡ２６０測定値から前記ウイルスサンプルのウイルス粒子濃度を測定することを含む。上記したように、好ましいウイルスはアデノウイルスの任意の血清型であるが、特に好ましい血清型にはＡｄ５、Ａｄ２、Ａｄ２４、Ａｄ３１、Ａｄ４、Ａｄ１２、Ａｄ６、Ａｄ１７、Ａｄ３３、Ａｄ４２及びＡｄ１６が含まれる。Ａｄゲノムの分子量を計算することができる任意のアデノウイルスサンプルについて上記改良方法を実施することが可能である。よって、ゲノムが既にＤＮＡ配列決定されている任意のＡｄが本発明の方法に従うことができる。
【０００６】
本発明はまた、その定数の誘導が各ウイルスの粒子濃度を測定するために（本明細書に開示されているような）ＵＶベース方法を考察するようにウイルス血清型について吸光率／吸光係数（ε２６０）を計算する簡単、正確且つ再現可能な方法に関する。このウイルス血清型のε２６０の計算方法は、ウイルス血清型のウイルス調製物からのサンプルのウイルス粒子濃度をまず測定し、前記ウイルス調製物からの独立サンプルを、ウイルス粒子を完全に破壊しウイルスＤＮＡコンフォメーションを完全に破壊する条件下で処理し、独立サンプルのＡ２６０を測定し、最初のウイルス粒子濃度をＡ２６０値と相関させることを含む。ウイルス血清型のε２６０を正確に計算するためにはウイルス粒子の完全破壊及びウイルスＤＮＡコンフォメーションの完全破壊を生ずる処理条件が必要であることが本明細書に開示されている。好ましくはこの方法はアデノウイルスの任意の血清型のε２６０を計算するのに適用されるが、特にＡｄ５、Ａｄ２、Ａｄ２４、Ａｄ３１、Ａｄ４、Ａｄ１２、Ａｄ６、Ａｄ１７、Ａｄ３３、Ａｄ４２及びＡｄ１６を含めた血清型に対して適用することが好ましい。
【０００７】
本明細書中、“Ａｄ”はアデノウイルスを指す。
【０００８】
本明細書中、“ＵＶ”は紫外線を指す。
【０００９】
本明細書中、“ε２６０”はウイルス粒子数／ミリリットル／吸光度単位／センチメートル（ｖｐ／ｍＬ−ＡＵ−ｃｍ）の単位で表す２６０ｎｍでの吸光率／吸光係数を指す。
【００１０】
本明細書中、“ＳＤＳ”はドデシル硫酸ナトリウムを指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、各ウイルス調製物中のウイルス粒子濃度を測定する分光学的方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、各アデノウイルス調製物中のアデノウイルス粒子濃度を測定する分光学的方法に関する。本発明の主題の中心は、残留宿主細胞核酸及び他の潜在的な汚染物質が各サンプル内のアデノウイルス粒子の測定に影響を及ぼす濃度以下でしか存在していないサンプル中の、ウイルス粒子濃度（本明細書ではＡｄ５血清型を例示）を測定する改良方法にある。この改良方法に供した例示アデノウイルス調製物は１．２３〜１．３３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を示したが、これは前記調製物中で合理的に一貫した核酸／タンパク質比を示す。本明細書の概説から、本発明を実施するために使用されるウイルス調製物は、各ウイルス調製物が本明細書に記載の方法に従うよう宿主核酸及び他の宿主汚染物質が十分に除去されたウイルス調製物であることは明らかである。
【００１３】
従って、本発明は、具体的には幾つかの要件：（１）ウイルスタンパク質含量の直接定量のようなウイルス質量の正確な評価；（２）上記したように、測定に有意な影響を及ぼす前記要素に関して評価しようとする調製物間の組成的一致の実証；及び（３）分析方法が全てのサンプルで等しく一定の評価を生ずる保証；の確立に基づくアデノウイルス粒子濃度を査定するための簡単、正確且つ再現可能な紫外（ＵＶ）吸光度方法に関する。Ｍａｉｚｅｌら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６：１１５−１２５（１９６８））が言及しているように、アデノウイルス調製物のタンパク質含量と２６０ｎｍでの吸光度との間に相関関係が存在し、精製アデノウイルス調製物の吸光率（ε２６０値）が１．１×１０１２ウイルス粒子／吸光度単位（ＡＵ）と報告されていることは当業界で公知である。この方法及び吸光率値はアデノウイルス粒子濃度を定量するための基礎として文献中に広く引用されている。しかしながら、この分光学的方法の簡便さは魅力的であるが、この情報を利用するとタンパク質濃度を直接評価したときに比して精度が低くなる恐れがある。別の研究で、分光学的評価用アデノウイルス調製物を作成するために使用される規定サンプル処理方法が一貫したウイルス粒子の破壊及びウイルスＤＮＡの完全アンフォールディングを確実にするのに十分でないことが示されていた。これにより、次に（１）ヘリカルＤＮＡに対するランダムコイルＤＮＡの量の変化に関連した異なる濃色性、及び（２）まれではあるが残遺ウイルス粒子により生ずる散乱光のために２６０ｎｍ吸光度測定値が変化する。２６０ｎｍでの吸光度の上昇として示される濃色効果の大小はＤＮＡ破壊の程度に関連している（例えば、Ｔｉｎｏｃｏ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８２：４７８５−４７９０（１９５９）；Ｒｈｏｄｅｓ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：３６０９−３６１７（１９６１）；及びＰａｉｎｔｅｒ及びＫｏｅｎｉｇ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１５：２４１−２５５（１９７６）参照）。更に、Ｍａｉｚｅｌ係数は明らかに吸光度測定前に完全に破壊されていないアデノウイルスから導き出されており、インキュベーション時間もかなり不正確に（すなわち、一晩）規定されているので、同一方法を用いて実験間及び検査室間で一定のＤＮＡ破壊を達成することは困難であろう。よって、Ｍａｉｚｅｌが実験的に導いた係数はＤＮＡが異なる程度にまたは好ましいとされる完全に破壊されている他の実験には適用されないことがある。
【００１４】
本発明は、ウイルス粒子濃度を測定する際に、簡潔さが正確さ及び再現性と平行している信頼性を有する、本明細書に開示されている方法を導入することができる２つの関連分野での進歩を包含する。すなわち、本発明は一部、（１）完全ＤＮＡコンフォメーション破壊の条件下にて２６０ｎｍでのアデノウイルスの吸光率／吸光係数が本明細書中で１．８×１０１２ｖｐ／ｍＬ−ＡＵ−ｃｍと開示されている、所与の組の実験条件に関する２６０ｎｍでのアデノウイルスの正確な吸光率／吸光係数の測定、及び（２）光散乱干渉を避けるための完全なウイルス粒子破壊だけでなく、重要なことに（１）に記載したと同一のサンプル予備処理条件下で既に確立されている吸光率／吸光係数を用いて、２６０ｎｍでの吸光度測定から精製アデノウイルス調製物のウイルス粒子濃度を正確且つ高精度で測定できるようにＤＮＡコンフォメーションが完全に破壊される実験的サンプル予備処理条件の確立を示す。Ａｄ５ウイルスについて例示されている予備処理条件は、１００℃において１％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中で４分間のインキュベーションであった。実施例１はＡｄ５／Ａｄ２−関連アデノウイルスについて求めたε２６０値の正確な測定を開示している。本明細書の概説から、ウイルス粒子及びＤＮＡコンフォメーションの両方の完全破壊を生ずる代替的予備処理条件を当業者が利用できることは明白である。この代替物は各種アデノウイルス血清型及び他のウイルスについて、（ｉ）正確なε２６０値及び（ｉｉ）ウイルス粒子濃度を測定するための一般的な予備処理条件を計算することができるように活用することができる。
【００１５】
上記したように、Ｍａｉｚｅｌら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６：１１５−１２５（１９６８））は、アデノウイルス粒子濃度が、既に確立されているアデノウイルスの２６０ｎｍ吸光率／吸光係数を用いて２６０ｎｍでアデノウイルス紫外（ＵＶ）吸光度を測定することより求めることができることを立証した。アデノウイルス溶液の２６０ｎｍ吸光度測定には、誤って高い吸光度測定値を生ずる粒子からの光散乱の干渉影響を最小限にする／排除するために、ウイルス粒子を破壊すべくサンプルをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で予備処理しなければならない。吸光率／吸光係数の測定は、完全に独立した方法によりウイルス粒子濃度を測定し、この濃度を同一アデノウイルス溶液についての２６０ｎｍでの吸光度測定値と相関させ、１センチメートル（ｃｍ）路長光学セルでの１吸光度単位（ＡＵ）に対する比を正規化することを含む。本明細書に例示されているように、最初のステップはアデノウイルス粒子濃度をローリータンパク質方法により計算することを含んでいた。また、ウイルス粒子濃度を確立するためのこの独立した方法は、容量あたりのタンパク質質量の単位でタンパク質濃度を測定し、このタンパク質濃度をタンパク質質量／ビリオンを用いてウイルス粒子／容量に変換することを含む。前記したタンパク質質量／ビリオンは上掲したＧｒｅｅｎ及びＰｉｎａにより与えられた情報（すなわち、アデノウイルスのＤＮＡ分子量は２．３×１０７であり、ＤＮＡは乾燥重量ウイルス質量の１３％を占めると見做されるという事実）に基づいて計算される。各アデノウイルスの分子量は公知である（例えば、Ａｄ２については上掲のＧｒｅｅｎ及びＰｉｎａを参照するかまたはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１４０５のような公知のゲノムＤＮＡ配列からＭＷを計算）。ここで、ウイルスＤＮＡの分子量＝２．３×１０７ｇ／モル。ＤＮＡはアデノウイルスのビリオンの乾燥重量の１３％であるので、以下のようになる。
【００１６】
【数１】
2005517942.tif 000002
【００１７】
また、アデノウイルス血清型はＤＮＡ及びタンパク質のみから構成され、タンパク質はビリオンの８７％を占めるので、以下のようになる。
【００１８】
ＭＷウイルスタンパク質＝０．８７（１．７７×１０８）＝１．５４×１０８ｇ／モル。
【００１９】
１ウイルス粒子あたりのタンパク質質量＝ＭＷウイルスタンパク質／アボガドロ数であるので、以下のようになる。
【００２０】
【数２】
2005517942.tif 000003
【００２１】
調製物のウイルス粒子濃度（ｖｐ／ｍＬ）は実験的に測定したタンパク質濃度及びタンパク質質量／ｖｐに関する上記係数から次のように計算され得る：
ウイルス粒子濃度（ｖｐ／ｍＬ）＝タンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）／２．５６×１０−１０（μｇタンパク質／ビリオン）
【００２２】
その後、（１）ローリータンパク質分析により測定されるような公知のウイルス粒子濃度を有するアデノウイルスサンプル、及び（２）いずれも等しくＳＤＳ処理／希釈されている（１）のアデノウイルスサンプル及びマトリックスブランクの２６０ｎｍ吸光度測定が判明する限り、アデノウイルス吸光率／吸光係数は計算され得る。
【００２３】
【数３】
2005517942.tif 000004
上記式中、ＣＬはローリータンパク質分析から誘導されるウイルス粒子濃度（単位：ｖｐ／ｍＬ）であり、ΔＡ２６０は２６０ｎｍでの（試験サンプル）−（マトリックスブランク）の吸光度の差であり、Ｆは吸光度測定値を得るために使用したサンプル希釈係数であり、ｂはサンプルキュベットの路長（この場合、１ｃｍ）である。
（グループＣ血清型や類似のＤＮＡ塩基対数を有する他のもののような）アデノウイルスの場合には、以下のようになる。
【００２４】
【数４】
2005517942.tif 000005
【００２５】
最後に、２６０ｎｍ吸光度及びε２６０からウイルス粒子濃度を計算するためには、以下のものが必要である：（１）既に確立されているアデノウイルスε２６０、及び（２）ＳＤＳ処理したアデノウイルス試験サンプル及びマトリックスブランクの２６０ｎｍ吸光度測定値：
【００２６】
【数５】
2005517942.tif 000006
上記式中、ＣＡ２６０は２６０ｎｍでの吸光度から求めたウイルス粒子濃度であり、ΔＡ２６０は２６０ｎｍでの（試験サンプル）−（マトリックスブランク）の吸光度の差（すなわち、Ａ２６０試験−Ａ２６０ブランク）であり、Ｆは吸光度測定値を得るために使用したサンプル希釈係数であり、Ｂはセルの路長さ（単位：ｃｍ）であり、ε２６０は２６０ｎｍでのアデノウイルスの吸光率（単位：ｖｐ／ｍＬ−Ａｕ−ｃｍ）である。
【００２７】
本発明の１態様は、ＳＤＳサンプル予備処理が無傷のウイルス粒子外皮を破壊するだけでなく、ウイルスＤＮＡのコンフォメーションをも破壊してα−ヘリカルコンフォメーションからランダロコイルコンフォメーションへの破壊時にＤＮＡに濃色効果（特定波長での吸光度の増加）を示させることである。濃色効果は上掲のＭａｉｚｅｌらでは考慮されていなかった。更に、濃色効果の程度はＤＮＡ破壊の程度に関連している。従って、本明細書に示すように、実験条件は、一致した吸光度測定値が生ずる再現可能な程度のＤＮＡ破壊を得るためにＳＤＳ（または、ウイルス及びＤＮＡウイルスの両方を完全に破壊させる任意の他の代替化合物）の濃度及び吸光度測定前のインキュベーション時間に関して臨界的に規定されなければならない。理想的には、ＤＮＡを完全に破壊させる条件は最も一致した吸光度測定値を生じるものでなければならない。上掲のＭａｉｚｅｌらは幾つかの問題点、すなわち（ｉ）条件はきわめて曖昧に規定されている（例えば、特定のインキュベーション時間ではなく“室温で一晩インキュベーション”、０．５％対１％という矛盾するＳＤＳ濃度）。ＤＮＡ破壊の程度はこれらの指示をどのように解釈するかにより異なり得る；（ｉｉ）タンパク質ゲル電気泳動研究で確認されるように、０．５％  ＳＤＳと一晩インキュベーションではウイルスタンパク質を完全に破壊するには十分でないと報告されている；及び（ｉｉｉ）吸光率係数は絶対ウイルス粒子数／吸光度単位で報告されている。この値はｖｐ／ｍＬ−Ａｕ−ｃｍの単位であると仮定されているが、この仮定が正しいかはわからない；を開示している。
【００２８】
従って、本発明の主題は、ウイルスＤＮＡコンフォメーションを完全に破壊するサンプル予備処理条件を用いて正確な２６０ｎｍウイルス吸光率／吸光係数を得ることであり、これにより簡単でロバストな技術により精製ウイルス調製物についてウイルス粒子濃度を正確且つ再現可能に測定できる。この方法は上に詳記されており、アデノウイルス粒子を測定するための一貫した再現可能な方法を開示している実施例１に例示されている。これらの結果は厳格なサンプル調製方法及び厳密なタンパク質濃度測定を含めた広範囲の分光学的分析に基づいている。その後、この方法を幾つかの精製アデノウイルス調製物に適用すると、独立したタンパク質濃度測定に非常にうまく相関するウイルス粒子濃度が分光学的に測定され、アッセイ精度は±１０％（１相対標準偏差；ＲＳＤ）であると確認された。全体として、本明細書に記載されている方法により、従来の確立されている方法よりもより正確且つ高精度の結果を生ずるアデノウイルス粒子濃度を規定する簡単、ロバスト且つ厳密な方法が提供される。
【００２９】
本発明を更に説明するために、本発明の非限定的実施例を以下に提示する。
【実施例１】
【００３０】
精製Ａｄ５調製物についてのＡｄ５濃度の測定
材料及び方法
精製血清型５アデノウイルス調製物は、メルク研究所の発酵・細胞培養部門及びワクチンバイオプロセス工学部門から得た。本研究にはＡ２６０／Ａ２８０吸光度比が１．２〜１．３の精製アデノウイルス調製物のみを含めた。本発明の方法を例示するために使用するようなアデノウイルスベクターは、援用により本明細書に含まれるとするＨｉｔｔら，「哺乳動物細胞への遺伝子導入のためのヒトアデノウイルスベクター(Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer into Mammalian Cells)」，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４０：１３７−２０６において概説されているような公知の方法を用いて構築され得る。前記したアデノウイルスベクターを構築する際、プラスミドまたはシャトルベクターに挿入することがしばしば有利である。この技術は公知であり、上掲したＨｉｔｔらに記載されている。アデノウイルスは本質的に（非機能的または欠失されるＥ１及びＥ３領域を有する）アデノウイルス配列及び便利な制限部位に隣接している遺伝子発現カセット（例えば、ＨＩＶ  ｐ５５  ｇａｇ）を含む。シャトルベクターのプラスミド部分はしばしば、真核細胞において抗生物質が発現しないように原核プロモーターの転写制御下で抗生物質耐性マーカーを含む。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子及び他の医薬的に許容され得る抗生物質耐性マーカーを使用し得る。原核生物における発酵によるポリヌクレオチドの高レベル産生を助けるために、シャトルベクターが複製の原核起源を含み、高コピー数を有していることが有利である。多数の市販されている原核クローニングベクターが上記した利点を与える。非必須ＤＮＡ配列を除去することが望ましい。ベクターが真核細胞において複製し得ないことも望ましい。こうすることにより、ポリヌクレオチドワクチン配列がレシピエントのゲノムに組込まれる危険が最小限となる。ポリヌクレオチドの発現を特定組織タイプに限定することが望ましいときにはいつでも、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを使用し得る。ウイルスベクターは公知の細胞株２９３やＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）を含めた各種Ｅ１相補細胞株において増殖され得る。これらの細胞株は両方とも、アデノウイルスＥ１遺伝子産物を発現する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）はいずれも援用により本明細書に含まれるとする国際特許出願公開第９７／００３２６号パンフレット（１９９７年１月３日に公開）及び米国特許第６，０３３，９０８号明細書に記載されている。これは、複製欠損（ＦＧ）アデノウイルスの産生を補うが、相同組換えによる複製コンピテントアデノウイルスの生成を防止するように設計されたＥ１遺伝子セグメントを導入した一次ヒト網膜芽細胞株である。特に興味深い細胞はＡＤ５Ｅ１Ａ及びＰＥＲ．Ｃ６（商品名）のような４５９〜３５１０ｂｐのＥ１Ｂ遺伝子をコードする導入遺伝子で安定的に形質転換されている。２９３細胞は、援用により本明細書に含まれるとするＧｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９−７２（１９７７）に記載されている。増殖させたウイルスベクターは、残留宿主細胞核酸及び他の潜在的な汚染物質が各サンプル内のアデノウイルス粒子の測定に影響を及ぼす濃度以下で存在するサンプルが生ずる、��業界で公知の任意の方法により精製され得る（例えば、いずれも援用により本明細書に含まれるとするＨｕｙｇｈｅら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６：１４０３−１４１６（１９９５）及び２００１年２月２７日に付与されたＺｈａｎｇらの米国特許第６，１９４，１９１号明細書参照）。
【００３１】
タンパク質濃度
アデノウイルスサンプルのタンパク質濃度はＬｏｗｒｙ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３：２６５−２７５（１９５１））の方法により測定し、ＮＩＳＴまたはＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を用いて校正した。１ビリオンあたりのタンパク質含量は、アデノウイルス血清型２について既に確立されている２．３×１０７ｇ  ＤＮＡ／モル  ウイルス（ビリオン乾燥重量の１３％というウイルスＤＮＡ含量）のＤＮＡ分子量に基づいて２．５６×１０−１０μｇ  タンパク質／ｖｐと算出された（Ｇｒｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．，５７：１３０２−１３０９（１９６７）；Ｇｒｅｅｎ及びＰｉｎａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．，５１：１２５１−１２５９（１９６４）；Ｇｒｅｅｎ及びＰｉｎａ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０：１９９−２０７（１９６３））。アデノウイルス血清型５遺伝子配列はアデノウイルス血清型２遺伝子配列と９９．４％相同である（Ｇｒｅｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，９３：４８１−４９２（１９７９））。よって、本明細書に例示したＡｄ５に対する上記計算の適合性を示す。ウイルス粒子濃度はタンパク質濃度から、実験的に誘導したタンパク質濃度を２．５６×１０−１０μｇ  タンパク質／ビリオンの定数で割ることにより算出した。全てのタンパク質アッセイには２．８〜２０μｇ  ＢＳＡの範囲のＢＳＡ校正標準及び精製アデノウイルスの参照調製物を含めた。
【００３２】
吸光度測定
アデノウイルスサンプルの２６０ｎｍでの吸光度は、水バックグラウンドを０吸光度に設定したＢｅｃｋｍａｎダイオードアレイ分光光度計を用いて測定した。吸光度測定のためにサンプル容量４０μｌ及び路長１ｃｍのサブミクロ石英キュベット（Ｓｔａｒｎａ  Ｃｅｌｌｓ）を用いた。サンプル及びブランクを測定するために同一キュベットを用いた。試験サンプルを１．０％ｗ／ｖ  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に加え、しっかりと蓋をし、１００±１℃の加熱ブロックにおいて４分間インキュベートした。インキュベート後、サンプルを室温に冷却し、吸光度測定前に反転／渦巻きサイクルを少なくとも５回実施して十分に混合した。２６０ｎｍでの吸光度に対する賦形剤及び試薬の関与を説明するために、アデノウイルスを含まないが試験サンプルマトリックスを含むブランクサンプルも同様に処理した。予期せぬことにポリプロピレンチューブからチューブ製造業者に応じて異なる量のＵＶ吸収物質が浸出したので、インキュベーションをガラス管で実施することが推奨され、好ましい。浸出による吸光度をブランク測定により試験サンプルから差し引いた。吸光度の差の精度は浸出問題により影響されないように見えたが、精度は僅かに影響を受けた。
【００３３】
アッセイにおいて許容できるレベルの正確さと精度を維持するために、試験サンプルとマトリックスブランク間の吸光度の差が０．０５吸光度単位（ＡＵ）以上のもののみを使用した。また、吸光度測定値が計器の限界及びベールの法則の範囲内で直線であるように、１ＡＵ未満の吸光度測定値のみを許容し得ると見做した。試験サンプルで１ＡＵ以上の吸光度値が観察されたならば、サンプルの予備処理を含めた全測定を元の試験サンプルを適当に希釈して繰り返した。上記した成分を含むマトリックスブランクは典型的には０．１ＡＵ未満の吸光度値を有していた。試験サンプル及びマトリックスブランク吸光度測定の各記録は、試験サンプルに関連する任意の変動を計器変動に関連するものから区別するのに役立った。
【００３４】
結果及び考察
（タンパク質濃度アッセイ）
タンパク質濃度分析は、精製アデノウイルスの単一参照調製物（ロットＡ）を用いて６ヶ月間にわたり数回実施した。結果を表１に要約する。ウイルス粒子濃度（ｖｐ／ｍＬ）はタンパク質濃度測定から以下のように計算した：ウイルスＤＮＡの分子量（ＭＷ）＝２．３×１０７ｇ／モル  ウイルス（上掲のＧｒｅｅｎら（１９６７））であり、ＤＮＡはビリオン乾燥重量の１３％を占める（上掲のＧｒｅｅｎ及びＰｉｎａ（１９６４））。従って、ウイルス粒子のＭＷ＝１．７６×１０８ｇ／モル  ウイルス、及びウイルスタンパク質のＭＷ＝１．５４×１０８ｇ／モル；１ウイルス粒子あたりのタンパク質質量＝ウイルスタンパク質のＭＷ／アボガドロ数＝２．５６×１０−１０μｇ  タンパク質／ウイルス粒子；ウイルス粒子濃度＝タンパク質濃度／１ウイルス粒子あたりのタンパク質質量。全体として、結果は非常に一致しており、このロットのウイルス粒子濃度は４．９×１０１１ｖｐ／ｍＬ（タンパク質濃度に基づいて）であり、ＲＳＤは２．８％であった。
【００３５】
【表１】
2005517942.tif 000007
【００３６】
（ＵＶ吸光度）
本研究で使用した１１個の精製アデノウイルス調製物は１．２３〜１．３３のＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を示した（表２）。これは、この分析に影響を及ぼすレベル以下の残留宿主細胞核酸を含む前記調製物における、適性に一致した核酸／タンパク質比を反映している。従って、ここで得られたアデノウイルス２６０ｎｍ吸光率の使用は産物の純度に対して比較的非感受性である。
【００３７】
【表２】
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【００３８】
２６０ｎｍでの吸光率値（ε２６０）を確立するために、精製アデノウイルスのコントロール調製物（ロットＡ）に関して試験サンプルとブランク間の２６０ｎｍでの吸光度の差を求めた。この単一調製物についての吸光度の差は、アッセイの変動性及び厳密さを考察するために７ヶ月間にわたって異なる９日に２６回の分析で求めた。吸光度の測定値は上記したようなＳＤＳ予備処理した精製アデノウイルスサンプルの２倍希釈物を用いて得た。図１は、２６０ｎｍ吸光度差データΔ２６０（すなわち、Ａ２６０試験−Ａ２６０ブランク）について９個の日平均及び標準偏差に加えて分析数／日を示す。これらの結果から、複数の調製物を正確な結果を得るために試験しなければならないことを示唆している。時折の個別の結果は全体の平均から最高１５％しか異なっていないことが判明しているのに対して、３つの近接の分析の結果は約５％だけ異なっていたからである。日内及び日間変動性の全類似性から、２つの反復分析で見られた時々高い変動性は恐らくピペッティング変動及び／またはサンプル処理の加熱／冷却サイクル中の小容量サンプルの示差蒸発に関連していたことが示唆される。後者の状況は、予備処理インキュベーション中サンプルチューブにしっかり蓋をし、室温に冷却後のインキュベーション後に反転及び渦巻きにより十分に混合することにより排除され得る。いずれにせよ、任意の所与のサンプルを同日または異なる日に３回分析することにより、平均結果は±４％のオーダーの（ＲＳＤ）を有すると予想される。
【００３９】
ロットＡについてのＵＶ吸光度データの全評価から、ΔＡ２６０値は０．１３５吸光度単位、ＲＳＤは９．１％と推定される。ロットＡのこの平均吸光度値を用いて、ロットＡの平均ウイルス粒子濃度を表１に示し、希釈係数２でこの精製アデノウイルス調製物の２６０ｎｍ吸光率（ε２６０）は１．８×１０１２ｖｐ／ｍＬ−Ａｕ−ｃｍと算出され得る。この吸光率値がタンパク質濃度アッセイ及びＵＶ吸光度の両方の変動を反映していると仮定すると、誤差の伝搬からアデノウイルスε２６０の推定値について９．５％  ＲＳＤの最終精度が生じる。７回繰返したタンパク質濃度分析及びΔＡ２６０値の２６個の独立測定に基づくこの吸光率値から、精製アデノウイルス調製物のε２６０が厳密に測定される。よって、ε２６０値をこのレポートに記載されている簡単な厳密分析方法と共に用いて類似アデノウイルス調製物のウイルス粒子濃度を測定することができる。
【００４０】
別の１０個の精製アデノウイルス調製物をロットＡの分析に関して記載したと同じ方法を用いて、ＵＶ吸光度及びタンパク質濃度について分析した。異なるロットの評価から、ウイルス粒子濃度の計算のための新しく誘導したε２６０値が適用でき、ＵＶ吸光度分析対タンパク質濃度分析に基づくウイルス粒子濃度間の関係がロット毎に大きく変化しなかったことが実証できた。別の測定値として、各ウイルス調製物についてＡ２６０／Ａ２８０吸光度比を計算して、これらの調製物の相対純度の一致性を査定した。これらのデータを表２に示す。
【００４１】
タンパク質濃度分析のみから誘導したウイルス粒子濃度は吸光率係数を含んでおらず、よって分光学的測定値に対して「直交する」と見做され得る。これらのデータを、直接タンパク質濃度分析から誘導したウイルス粒子濃度に対するＵＶ吸光度より誘導したウイルス粒子濃度の比較として図２に示す。２組の結果の相関は非常に良好であり、０．９９９を越えるｒ２値が得られた。この結果は、上記ウイルス調製物における核酸／タンパク質比に非常に一致していることを確認する。更に、修飾ＵＶアッセイの回帰線の勾配が１．０に非常に近いという事実から、ここで求めたε２６０値（１．８×１０１２ｖｐ／ｍＬ−Ａｕ−ｃｍ）が、より面倒なタンパク質濃度推定から誘導したウイルス粒子濃度とかなり正確に一致しているＵＶ吸光度データからウイルス粒子濃度を測定することができる。また、両方法の結果は、別の“直交”方法である精製アデノウイルス調製物のウイルスＤＮＡ含量を定量する定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析から誘導したウイルス粒子濃度とうまく相関している。
【００４２】
更に、Ｍａｉｚｅｌら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６：１１５−１２５（１９６８））に開示されている吸光率係数の使用に比した、本明細書に記載されている新しく誘導したアデノウイルス２６０ｎｍ吸光率（ε２６０）を用いる改変ＵＶ吸光度方法の利点は、ＵＶ吸光度誘導ウイルス粒子濃度（Ｍａｉｚｅｌらの係数に基づく）対、タンパク質濃度のみから誘導したウイルス粒子濃度の類似比較プロット（図２）を検査したとき容易に自明となる。予想されるように、Ｍａｉｚｅｌ係数を用いた結果は有意に異なっており、ウイルス粒子濃度は本明細書に記載されているε２６０値を用いて誘導したウイルス粒子濃度よりも４０％低いだけでなく、１．０をはるかに下回るウイルス濃度相関の勾配（すなわち、ＵＶ誘導対タンパク質誘導）を示している。後者の結果は、本明細書に記載されている方法からウイルス粒子濃度がより正確に査定されることが裏付けられる。
【００４３】
全体として、本研究で規定した方法により簡単で厳密な分析を用いてウイルス粒子濃度を直接測定するために、新しく誘導した２６０ｎｍアデノウイルス吸光率と共に使用され得る精製アデノウイルス調製物についての２６０ｎｍ吸光度値を測定することができ、古典的な方法（すなわち、ローリー方法）によりタンパク質濃度分析から独立して誘導される結果に一致する結果が得られた。精製アデノウイルス調製物を特徴づけるための一般的方法としてこの方法及び関連２６０ｎｍ吸光率値を適用すると、Ｍａｉｚｅｌ方法で過去１０年間にわたり見られた一般的用途が与えられ、より正確な結果及び非常に改善された検査室間厳密さが得られる。
【００４４】
本発明の範囲は本明細書に記載されている特定実施態様により限定されない。実際、本明細書に記載されている実施態様に加えて本発明の各種修飾が上記記載から当業者には自明であろう。そのような修飾は請求の範囲の範囲内であると解される。
【００４５】
複数の文献を本明細書中に引用したが、これらの開示内容は援用により本明細書に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】１日あたりの各種反復分析についての日内平均値として示す、アデノウイルス対照ロットの２６個の分析から誘導した２６０ｎｍでの吸光度差のデータを示す。日内標準偏差をエラーバーで示す。１日あたりに分析した反復試験数をもリストする。
【図２】１０個の異なるアデノウイルス調製物についてのＵＶ吸光度分析対直接タンパク質分析から求めたウイルス粒子濃度データの相関プロットを示す。ＵＶ吸光度から得たウイルス粒子濃度のデータを、本発明で求めたε２６０値（黒菱形）及びＭａｉｚｅｌ法により求めたε２６０値（黒四角）の両方の適用について示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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