(57)【要約】  本発明は、ラミニン１の神経突起伸長促進ドメイン、即ちラミニン１のγ１鎖、に由来する生物学的活性ペプチドに関する。このようなペプチドとしては、デカペプチド配列ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩおよびその生物学的活性ドメインであるトリペプチド配列ＫＤＩを包含する、デカペプチドから誘導した部分ペプチドが挙げられる。本発明は生物学的活性トリペプチドモチーフＫＤＩおよびそれを用いたニューロン性または非ニューロン性の組織の再生促進、特に脊髄損傷の治療に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤用のトリペプチド配列ＫＤＩ（リジン−アスパラギン酸−イソロイシン）。
【請求項２】
損傷または変性した神経の修復用のトリペプチド配列ＫＤＩ。
【請求項３】
中枢神経または末梢神経の損傷の治療用のトリペプチド配列ＫＤＩ。
【請求項４】
脊髄損傷の治療用のトリペプチド配列ＫＤＩ。
【請求項５】
脊髄損傷の治療用の、トリペプチドモチーフＫＤＩ（リジン−アスパラギン酸−イソロイシン）を包含する生物学的活性ペプチド。
【請求項６】
トリペプチドモチーフＫＤＩを包含する生物学的活性ペプチドを用いた、脊髄損傷治療剤の製造方法。
【請求項７】
トリペプチドモチーフＫＤＩを用いた、脊髄損傷治療剤の製造方法。
【請求項８】
有効成分としてトリペプチドモチーフＫＤＩを包含し、医薬的に許容可能な担体および希釈剤からなる群より選ばれる少なくとも一種をさらに包含する医薬組成物。
【請求項９】
注射可能な液体であることを特徴とする、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
有効成分であるペプチドの濃度が０．０１〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
損傷神経の修復を必要とする動物の損傷神経を修復する方法であって、トリペプチドモチーフＫＤＩを包含する生物学的活性ペプチドを、動物に有効量投与することを包含する、修復方法。
【請求項１２】
該生物学的活性ペプチドがトリペプチド配列ＫＤＩであることを特徴とする、請求項１１に記載の修復方法。
【請求項１３】
該生物学的活性ペプチドが可溶性の形態であることを特徴とする、請求項１２に記載の修復方法。
【請求項１４】
該生物学的活性ペプチドが支持体に結合した形態であることを特徴とする、請求項１２に記載の修復方法。
【請求項１５】
脊髄損傷の治療を必要とする動物の脊髄損傷を治療する方法であって、トリペプチドモチーフＫＤＩを包含する生物学的活性ペプチドを、動物に有効量投与することを包含する治療方法。
【請求項１６】
該生物学的活性ペプチドがトリペプチド配列ＫＤＩであることを特徴とする、請求項１５に記載の治療方法。
【請求項１７】
ミニポンプ システムを用いて脊髄の外傷領域に直接該ペプチドを投与することを特徴とする、請求項１５または１６に記載の治療方法。
【請求項１８】
硬膜外腔注射によって該ペプチドを投与することを特徴とする、請求項１５または１６に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラミニン１の神経突起伸長促進ドメイン、即ちラミニン１のγ１鎖、に由来する生物学的活性ペプチドに関する。このようなペプチドとしては、デカペプチド配列ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩ（Arg Asp Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile）およびその生物学的活性ドメインであるトリペプチド配列ＫＤＩ（Lys Asp Ile）を包含する、デカペプチドから誘導した部分ペプチドが挙げられる。本発明は生物学的活性トリペプチドモチーフＫＤＩおよびそれを用いたニューロン性または非ニューロン性の組織の再生促進、特に脊髄損傷の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラミニン１は、齧歯動物の中枢ニューロンおよび末梢ニューロンのいずれもの神経突起の伸長を促進する（Liesi, 1990）。ラミニン１の神経突起伸長ドメインの一つは、ラミニン１のγ１鎖のＣ末端デカペプチドであるＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩ配列（P1543; p20; Liesi et al., 1989）に位置づけられた。
【０００３】
ヒトの脳および脊髄のニューロンは、共に神経突起の伸長によってマウスのラミニン１に対して接着および応答を示す。ラミニン１のヒト脳アイソフォームの配列の分析によって、マウスの基本型と約９６〜１００％の相同性を有することが判明した（Liesi et al., 2001）。
【０００４】
近年、神経組織におけるラミニン１の多種多様な作用が報告されている。例えば、ラミニン１は、アルツハイマー病のニューロン死に関与するアミロイドβペプチドの神経毒性を防ぐことが示されている（Bronfman et al., 1996; Drouet et al., 1999）。ラミニン１は、さらに小脳プルキンエ細胞の樹状突起性棘の発達に作用し（Seil, 1998）、長期増強（long term potentiation）（以下、屡々“ＬＴＰ”と称する）を調節することで、記憶処理にも影響を与える（Nakagami et al., 2000）。ラミニン スーパーファミリーに属する物質の大部分はヒトの胚の中枢神経系（central nerveous system）（以下、屡々“ＣＮＳ”称する）のニューロンおよびグリア細胞にも存在する（Liesi et al., 2001）ことから、ラミニンはヒトＣＮＳの発生と分化後の機能に種々の特異的な影響を与えると考えられる。
【０００５】
培養した中枢ニューロンに対してラミニン γ１鎖特異的抗体を用い、ラミニン１のγ１鎖の神経突起伸長ドメインがニューロン移動および軸索誘導において主要な役割を果たすことが示されている。小脳のニューロン移動における核回転期（nuclear rotation phase）（Liesi et al., 1995）、ニューロンの分化（Matsuzawa et al., 1996a）およびラット海馬ニューロンの軸索誘導（Matsuzawa et al., 1998）のいずれもが、ラミニン１のγ１鎖の神経突起伸長ドメインの影響を受けることが示されている。先の研究で本発明者のグループは、ラミニン１のγ１鎖の神経突起伸長ドメインが、weaverマウスの小脳に蓄積すること（Murtomaki et al., 1995）のみならず、アルツハイマー病患者の脳に蓄積すること（Murtomaki et al., 1992）を示した。したがって、高濃度のラミニン γ１鎖の神経突起伸長ドメインの蓄積が増加した場合に、ニューロンに毒性を与える可能性を本発明者のグループは提案した。この仮定に基づくと、γ１鎖ペプチドを中和する、神経突起伸長ドメインに対する抗体は、weaverマウスの顆粒ニューロンの細胞生存率および神経突起伸長を回復させる（Liesi and Wright, 1996）。
【０００６】
WO 93/24155は、神経組織、特に末梢神経の損傷を修復するための移植片として有用な医療手段を開示する。この医療手段はデカペプチドであるP1543を含んでいる。WO 98/43686は、例えば末梢神経の再生に用いることのできる、フィブリンをベースとした生体適合性材料を開示している。この材料は、上記デカペプチドを含む種々の生物活性ペプチドを含有している。さらに、Hager et al. (1998)は、マウス ラミニン１から得た対応するペプチドがラットの大脳新皮質のニューロンの電気活性を調節することを示した。
【０００７】
一方、WO 94/04560は、シュワン細胞分裂促進活性を有するタンパク質因子を開示している。その出願で開示されているペプチド配列の中には、ＫＤＩモチーフを包含する配列も含まれる。これら因子の用途としては、例えば神経の再生も提案されている。
【０００８】
US 5,780,090は、疎水性アミノ酸残基を有するトリペプチドを包含する食品用調味成分を開示している。トリペプチド配列ＫＤＩの調製がこの特許には開示されているが、ペプチドの医療用途は示唆されていない。
【０００９】
近年、ネトリン１はＧタンパク質共役型受容体機構を介して中枢ニューロンに作用することが示された（Corset et al., 2000）。興味深いことには、ＫＤＩ配列はトリのネトリン１に存在し（Serafini et al., 1994）、ヒトのネトリンタンパク質も、修飾されているもののこのドメインを有する（Meyerhardt et al., 1999）。しかしながら、この短い配列の存在がこれらのタンパク質においていかなる機能的意義を持つかは明らかではない。ＫＤＩ配列は、タンパク質の立体構造またはグリコシル化によりネトリン分子中に隠されている可能性がある。
【００１０】
発明の概要 
初期小脳ニューロンについて、ラミニン１のγ１鎖の神経突起伸長デカペプチド（ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩ; P1543）の作用機構を研究する一方で、このデカペプチドの生物学的機能（即ち、接着および神経突起の伸長）に寄与するトリペプチド（ＫＤＩ）配列を同定した。本発明者は、P1543およびトリペプチド配列ＫＤＩはいずれもヒト胚性ＣＮＳニューロンの接着および神経突起伸長を促進することを見出した。これらのペプチドは、ラット小脳ニューロンにおいて電流も誘導する。しかしながら、トリペプチドモチーフＫＤＩは、脊髄損傷の治療においてP1543よりも優れた特性を有することが判明した。
【００１１】
したがって、本発明の一つの目的は、デカペプチド配列ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩまたはトリペプチドモチーフＫＤＩを包含する、デカペプチド配列から誘導した部分ペプチドを用いた、脊髄損傷の治療方法に用いる薬剤の製造方法を提供することである。
【００１２】
ペプチドモチーフＫＤＩがラミニン１の神経突起伸長促進ドメインの生物学的活性に寄与するという本発明の新たな知見に基づく本発明の一つの目的は、生物学的活性ペプチドモチーフＫＤＩを包含する、デカペプチド配列ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩから誘導した薬剤用の部分ペプチドを提供することである。本発明の具体的な目的は、薬剤用のトリペプチド配列ＫＤＩを提供することである。
【００１３】
本発明の第一の目的は、脊髄損傷の治療方法に用いるための生物学的活性トリペプチドモチーフＫＤＩを提供することである。
【００１４】
その神経突起伸長促進活性故に、ＫＤＩペプチドは損傷神経全般を修復するための方法にも用いることができる。したがって、本発明の更なる目的は、神経、例えば末梢神経の損傷の治療方法に用いるためのトリペプチド配列ＫＤＩを提供することである。
【００１５】
本発明の更なる目的は、損傷神経の修復を必要とする動物の損傷神経を修復する方法であって、トリペプチドモチーフＫＤＩを包含する生物学的活性ペプチドを、動物に有効量投与することを包含する、修復方法を提供することである。
【００１６】
本発明の他の一つの目的は、脊髄損傷の治療を必要とする動物の脊髄損傷を治療する方法であって、トリペプチドモチーフＫＤＩを包含する生物学的活性ペプチドを、動物に有効量投与することを包含する治療方法を提供することである。ペプチドとしては、デカペプチド配列ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩ、およびトリペプチドモチーフＫＤＩを包含する、デカペプチドから誘導した部分ペプチドが好ましく、トリペプチド配列ＫＤＩが本発明の目的に最も好ましい。
【００１７】
ペプチドモチーフＫＤＩが生物学的活性ペプチドであるという本発明の知見に基づき、トリペプチドモチーフＫＤＩを包含するいかなるペプチドも、ニューロン性または非ニューロン性の組織の損傷または変性の再生および復活に有用である可能性を示した。ＫＤＩモチーフを包含するペプチドは、可溶性の形態および支持体（substrate）に結合している形態のいずれでも、このような作用に用いることができる。
【００１８】
したがって、本発明の更なる目的は、有効成分としてトリペプチドモチーフＫＤＩを包含し、医薬的に許容可能な担体および希釈剤からなる群より選ばれる少なくとも一種をさらに包含する医薬組成物を提供することである。
【００１９】
発明の詳細の説明 
本発明は、医療用途のための生物学的活性ペプチドを提供する。可溶性の形態または支持体に結合した形態のペプチドは、損傷した神経、例えば末梢神経、あるいは損傷または変性した中枢神経系を修復するのに有用である。本発明のペプチドは、特に脊髄損傷の治療に有用である。
【００２０】
ヒトＣＮＳ損傷の実験モデルを用いて、ヒト中枢ニューロンの生存率および神経突起伸長がラミニン γ１鎖の可溶性ＫＤＩ−ドメインにより有意に高められることを示す。生物学的活性ＫＤＩ−ドメインがヒト中枢ニューロンを環境因子から保護する能力を検証するために、二種の培養系を用いた。第一には、ヒトの胚性脊髄および胚性大脳新皮質から単離した新鮮なニューロンを単層のヒト脊髄損傷星状細胞上で培養した。第二には、ヒトＣＮＳの幹細胞を含有する胚体（embryonal bodies）を、ヒト成体脊髄凍結切片中の白質の上で培養した。
【００２１】
ヒト脊髄星状細胞上では、低密度で培養したニューロンの神経突起伸長は乏しかったが、これは培地中にナノモル濃度のＫＤＩ−ドメインが存在することで有意に改善された。ニューロンの生存率も、低濃度のＫＤＩペプチドにより有意に増加した。ヒト成体脊髄断片上では、胚体中のニューロンは伸長を拒絶し、その神経フィラメント陽性神経突起は、胚体の境界線の内側を囲んだ。ＫＤＩ−ドメインの存在下では、ニューロンは長い神経突起を胚体から伸ばした。神経突起は、ヒト成体脊髄のミエリン鞘切片に直接接触して、白質上に接着及び伸長した。ＫＤＩ−ドメインが存在しない場合は、神経突起はミエリン上で伸長することは全くなく、in vitroで長時間放置した際に脊髄ミエリン上に広がるグリア細胞上で常に成長した。
【００２２】
本願のデータは、ラミニン γ１鎖のＫＤＩ−ドメインが適切な濃度で適用されれば、環境の阻害性シグナルにも関わらず、ヒト中枢ニューロンは生存可能であり且つ長い神経突起を伸長させることを示している。ニューロンの再生を妨げるミエリン由来因子およびグリア細胞由来因子はいずれも有意に中和され、中枢ニューロンは長い繊維を伸長し、保護性のＫＤＩ−ドメインが存在しない場合よりもより長く生存可能である。これらのデータは、ＫＤＩ−ドメインが哺乳類成体のＣＮＳの軸索成長阻害性シグナルを中和する可能性を強く示し、さらにＫＤＩ−ドメインがin vivoでの再生を促進する能力を検証するための実験の根拠となった。
【００２３】
雄ラット成体の脊髄損傷に関するin vivoでの実験においては、完全な腰椎横断を行った。動物は実験グループと対照グループに分け、それぞれＫＤＩペプチドおよびプラシーボを投与した。動物は、運動機能に関する試験を週に一度、３ヶ月間行った。３ヵ月後、各グループの動物を安楽死させ、脊髄を調べた。運動試験の結果から、ＫＤＩグループとプラシーボグループの間に有意な差が見られた。ＫＤＩグループのラットの平均運動スコアおよびＫＤＩグループのラットの脊髄の実体顕微鏡画像は、脊髄の回復が確実であることを示した。
【００２４】
本発明者のグループは、ＫＤＩ−ドメインが哺乳類成体のＣＮＳ損傷の再生を高める可能性があることを提案する。このペプチドは、脳部位のみならずヒトＣＮＳニューロンの生存率も高めることから、この配列が神経変性性疾患におけるニューロンの変性およびニューロン死の予防に用いることが可能なことを提案する。ヒトにおける脊髄損傷の再生を促進するための臨床的に適用可能な方法においては、ＫＤＩペプチドは可溶性の形態または生物分解性のポリマーに結合した形態で投与することができ、生物分解性のポリマーに結合した形態は、ペプチドをゆっくり放出すると同時に成長する軸索を方向付ける。軸索の再生は、手術を施した動物の運動機能の検証により３ヶ月間モニターする。３ヶ月後に組織を回収し、組織学的、分子細胞学的および免疫組織学的な分析に付して、トリペプチドの効果と再生の程度を立証することができる。その後、損傷領域中の軸索成長の程度は、神経線維のＤｉＩ標識を用いてモニターすることができる。
【００２５】
ＫＤＩペプチドは、神経変性性疾患、例えばパーキンソン病やアルツハイマー病の治療にも用いることができる。目的にかなった適切な医薬組成物は、髄腔に投与するか脳組織に注入することのできる注射可能な液体である。
【００２６】
本発明のペプチドは、例えばLiesi et al. (1989)の記載と同様に、従来のペプチド合成法を用いて調製してもよい。
【００２７】
本発明のペプチドを包含する、脊髄損傷治療用の医薬組成物は、注射に適した液状調製物であることが好ましい。ペプチドは滅菌した生理食塩水または水に溶解してもよい。医薬組成物は、血液脳関門を通過してＣＮＳに直接アクセスすることが可能な修飾ＫＤＩペプチドを包含してもよいし、ペプチドをゆっくり放出すると同時に、追加的な効果として成長する軸索を方向付ける、生物分解性のポリマーを包含していてもよい。
【００２８】
本発明のペプチドは、幅広い投与量範囲内で有効量投与することができる。有効量は年齢や問題となっている組織の状態に依存する。本発明のペプチドは、適用量を１回で投与してもよいし、例えばミニポンプ システムを用いて、連続的に投与してもよい。後者の場合は、１日あたりの投与量は１回の注射に用いる量を超えることはなく、動物実験によりあらかじめ決めなければならない。
【００２９】
本発明のペプチドの医薬組成物における濃度は、一般的に０．０１〜１００μｇ／ｍｌである。しかしながら、ＫＤＩペプチドの最適な濃度は、ドメイン依存性または組織依存性である場合もあることから、投与量の予備試験が最も重要であることに注意すべきである。個々の治療に用いる適切な投与量の決定は、当業者によく知られている技術の範囲内で行われる。
【００３０】
他の神経損傷（例えば末梢神経の損傷）を治療する場合には、ＫＤＩペプチドモチーフを包含する有用な医薬組成物は、例えばWO 93/24155のP1543デカペプチドに関する記載に基づいて、調製し投与することができる。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、意図した目的を達成するいかなる手段によっても投与することができる。例えば脊髄損傷の治療のために、カテーテルを介して損傷部位へ組成物を投与することができる。最も好ましい投与方法は、脊髄の外傷領域に直接ペプチド組成物を投与するためのミニポンプ システムを用いる方法である。この方法は、外傷領域を露出するための整形外科的手術に関連して容易に実行することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドの有益な効果を享受することが可能ないかなる動物にも投与することができる。ヒトは、そのような動物の中の主要な動物であるが、本発明はヒトの医療処置に限定するものではない。
【００３３】
従来の研究では、ラミニン γ１鎖の神経突起伸長ドメインが中枢ニューロンに対して神経栄養性／神経毒性の二元的な作用を有することを示しているが、マウスおよびヒトのラミニン γ１鎖に存在するＫＤＩ−モチーフが中枢ニューロンに対する一般的な神経毒性／神経栄養性モチーフであるか、それともラミニン γ１鎖の神経突起伸長ドメインに対してのみ活性を示すのかは、今後検討しなければならない。
【００３４】
本発明のペプチドの適切な投与量範囲を決定する際には、問題となっているドメインの持つ二元的な作用も考慮しなければならない。
【００３５】
本発明で得られたデータは、ラミニン γ１鎖およびその個々のドメインが、ニューロンの電気特性を変化させることによりその作用を調節する可能性を示している。本発明者のグループは、トリペプチドドメインＫＤＩがラミニン γ１鎖の神経突起伸長デカペプチド（P1543）中の生物学的活性ドメインであることを示した。ＫＤＩペプチドの有利な特徴は、非免疫原性の短いペプチドであることから、免疫学的反応を生じる危険性が最小なことである。さらに、このペプチドは調味成分としてすでに開示されていることから、ヒトに対して安全であると考えられる。
【００３６】
本発明者のグループは、ＫＤＩドメインがＧタンパク質共役型受容体機構を介してＣＮＳニューロンの発生初期の培養物に作用し、中枢ニューロンにおいてカリウム電流を誘導することも示している。このような作用は、いかなるラミニンについてもこれまで示されていない新たな知見であり、脳の分化後の機能におけるラミニン１のγ１鎖の追加的役割を示唆している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
材料と方法
【００３８】
ヒトＣＮＳ組織 
患者のインフォームドコンセントを得た後、且つ合法的な妊娠中絶によって得た６〜１２週齢の胎児からヒト胎児ＣＮＳ組織を調製した。組織はヘルシンキ大学中央病院（Helsinki University Central Hospital）の倫理学委員会の許可を得て回収した。実体顕微鏡下で同定したＣＮＳ組織は、はじめに冷生理食塩水に入れ、組織培養実験用に調製した。正常な成体脊髄組織は、神経標本バンク（Neurological Specimen Bank）（米国、ボルティモア）から入手した。
【００３９】
ヒト胚性脊髄グリア細胞の単離および培養 
ＣＮＳ組織をはじめに冷生理食塩水に入れた。脊髄組織を実体顕微鏡下で同定し、髄膜を慎重に取り去った。ヒト脊髄グリア細胞の単層培養物を得るために、パスツールピペットを用いた機械的粉砕により細胞を分離し、得られた細胞をLiesi et al. （2001）の記載と同様に、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した、１０％ウシ胎児血清（ユタ州、ローガン、Hyclone社製）含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地（英国、Gibco社製）の入ったペトリ皿（米国、ニューヨーク州、Corning社製）に入れた。このようにして１００％ＴＵＪ１陽性グリア細胞を含む培養物が得られ、このことはグリア細胞が星状細胞の前駆体であることを示した。
【００４０】
合成ペプチド上の培養ヒトニューロン 
細胞を、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および２００μＭのＬ−グルタミンを含有する滅菌培地（ＲＰＭＩ １６４０）中で粉砕により分離した。分離した細胞を、公知の方法（Matsuzawa et al., 1996b)で、マウス ラミニン１（ドイツ国、Boehringer-Mannheim社製）またはＫＤＩ−ｇｃペプチドとＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩ−ｇｃペプチドであらかじめ被覆してあるカバーグラスに植えた。ペプチドはMultiple Peptide Systems社（カリフォルニア州、ラ ホーヤ）から入手した。培養細胞は２４時間保持し、その後２％パラホルムアルデヒドで固定して免疫細胞化学分析用に処理した。
【００４１】
培養ヒトニューロンの免疫細胞化学分析 
ニューロン特異的チューブリンアイソフォームＴＵＪ１の免疫細胞化学分析を公知の方法（Liesi et al., 2001)で行った。簡単に説明すると、細胞を−２０℃においてメタノールで５分間処理して浸透化し、ＰＢＳで洗浄してからＴＵＪ１−モノクローナル抗体と共に室温で１時間インキュベートした。抗体は高い特異性があり、１：５００の希釈倍率で用いた。上記の免疫細胞化学処理後、ＰＢＳ：グリセロール（１：１）で細胞を植えたカバーグラスを覆い、適切なフィルターを組み合わせてOlympus Provis 蛍光顕微鏡で観察した。
【００４２】
培養ラット小脳 
妊娠１６日目のSprague-Dawley雌ラットをTaconic Farms社から購入し、国立アルコール乱用・依存症研究所（National Institute of Alcohol Abuse and Alcoholism）（ＮＩＨ）の動物室で、オートクレーブ処理したビタミンＡ（２０，０００ＩＵ／ｋｇ）含有ＮＩＨ−３１飼料を与えて飼育した。ラットを出産させ、３日齢雌子ラットの小脳組織を公知の方法（Matsuzawa et al.,1996a)で無菌的に単離した。公知の方法（Liesi and Wright, 1996)で小脳をトリプシン処理して単一細胞の懸濁液を得、１０5個の細胞をラミニン１をあらかじめ塗布した２２ｍｍのカバーグラス上に植えた。細胞をペニシリン、ストレプトマイシンおよび２００μＭのＬ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で、空気９５％、二酸化炭素５％の雰囲気下、３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞を電気生理化学分析に用いた。
【００４３】
電気生理化学分析 
分析値の記録は、公知の方法（Liesi and Wright, 1996)で、室温で、電圧固定したホールセルパッチ配置（whole-cell patch configuration）でList EPC-7 パッチクランプ用増幅器を用いた。ピペットはホウ珪酸ガラス管を引いて作製し、火炎で軽く磨いた。実験は室温で行った。ホールセル電流をGould 2400S ストリップチャートレコーダー（Gould 2400S strip chart recorder）で記録した。細胞膜電位は特に記載しない限り−４０ｍＶでクランプした。全ての槽溶液は、溶融シリカの入った内径２００μｍのバレルへの流入を調節するためのピンチバルブを介して多数のリザーバーから導入した。標準槽溶液は、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝化ＲＰＭＩ １６４０であった。標準ピペット溶液は、１００ｍＭのＣｓＭｅＳＯ4、１５ｍＭのＣｓＣｌ、５ｍＭのＢＡＰＴＡおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＫＯＨでｐＨ７．２に調整）を含有していた。逆転電位試験は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ2および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）を含有する低Ｋ+槽溶液ならびに１１５ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ2および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）を含有する高Ｋ+槽溶液で行った。全ての槽溶液は３００ｎＭのＴＴＸを含有していた。逆転電位試験用ピペット溶液は、１１０ｍＭのＫ−アスパラギン酸、１０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ2、５ｍＭのＢＡＰＴＡおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整）を含有していた。ネルンスト逆転電位をHille (1992)の方法にしたがって計算した。ペプチドおよび融合タンパク質は試験の直前に等分した標準槽溶液に加えた。記録と記録の間には、細胞を含むペトリ皿を標準槽溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝化ＲＰＭＩ １６４０、ｐＨ７．４）で灌流した。実験システムの品質検査は、標準槽溶液を含有する２つのリザーバーの間で切り換えることで、灌流による人為信号を検出し、活性ペプチドの管への付着の有無を判断した。ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩペプチド、ＥＩＩＫＤＩペプチドおよびＫＤＩペプチドはいずれもMultiple Peptide Systems社（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した。融合タンパク質（B2-3、B2-4およびB2-5）と対照ペプチドであるラミニン α１鎖（AG10、AJ5およびAI12）は、国立歯科衛生研究所（National Institute of Dental Research、ＮＩＨ）のYoshi Yamada博士とAtsusi Utani博士によって寄贈されたものであり、公知の方法（Utani et al., 1994 and Nomizu et al., 1995)で精製した。
【００４４】
ヒト脊髄のグリア細胞上における、ヒト胚性大脳新皮質ニューロンの生存率 
ヒト胚性脊髄グリア細胞をLiesi et al. (2001)の記載と同様に１０％ウシ胎児血清中でコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになった培養グリア細胞をトリプシン処理し、処理後の細胞を２２ｍｍのカバーグラス当たりに１００，０００個細胞を再度植えつけ、コンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになった培養グリア細胞の培地を正常なヒト成体の血清に交換し、ゲージが１８Ｇの滅菌針を用いて傷つけた。１μｇ／ｍｌ（３μＭ）または１０μｇ／ｍｌ（３０μＭ）のＫＤＩペプチドと１μＭのP1543ペプチド（ｐ２０）、さらに５０〜１００，０００個の新鮮な単離ヒト胚性大脳新皮質ニューロンをグリア細胞上に添加した。対照となる培養細胞にはニューロンを添加したが、ペプチドまたは損傷のいずれかを加えなかった。細胞を空気９５％、二酸化炭素５％の雰囲気下、３７℃で７２時間培養し、ニューロンの定量および神経突起の長さの測定のために固定した。グリア細胞単層上のニューロンを、ニューロン特異的チューブリンアイソフォーム（ＴＵＪ１）に対するマウスモノクローナル抗体を用いて免疫学的染色により視覚化した。各実験あたり３個のカバーグラス上から任意に選択した６個の領域中のニューロン数を計測することで結果を評価した。こうすることで、一回の実験あたり３００個を超えるニューロンを計測した。結果の統計学的分析を、Instat（ｖ２．０３）プログラム（カリフォルニア州、サンディエゴ、GraphPad社製）を用い、一変量分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびStudent-Newman-Keuls法による多重比較法で行った。
【００４５】
ヒト脊髄のグリア細胞上における、ヒト胚性脊髄ニューロンの生存率 
ヒト胚性脊髄（８〜１０週齢のもの）から単離したばかりの組織を機械的に分離し、分離した細胞の５０，０００個を、ヒト胚性脊髄グリア細胞がコンフルエントになっている２２ｍｍのカバーグラスに植えた。ニューロンを植える前に、グリア細胞の単層を１８Ｇの針を用いて傷つけた。細胞を正常なヒト成体の血清中で７２時間培養した。ＫＤＩ（０．０３５５〜１．０μｇ／ｍｌ）の存在下または存在しない条件におけるグリア細胞の単層上の脊髄ニューロンの数を、ＴＵＪ１標識培養細胞に基づいて推定した。統計学的分析は、一変量分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびStudent-Newman-Keuls法による多重比較法で行った。
【００４６】
ヒトＣＮＳ部位の胚体 
脊髄または大脳新皮質に由来する未熟幹細胞を含有する胚体は、機械的に分離したＣＮＳ細胞をＢ２７サプリメント（英国、Gibco社製）、抗体および５００μＭのＬ−グルタミン酸を含有する神経細胞培養用基礎培地（英国、Gibco社製）を入れた１０ｃｍのペトリ皿（Corning社製）に加えることで調製した。胚体はプラスチック製のペトリ皿に接着することはできずに集合体を形成し、その集合体は大きくなって新たな胚体を培地中に放出した。
【００４７】
ヒト脊髄損傷の実験モデル系（Ｉ）：グリア細胞の影響 
コンフルエントな状態の培養脊髄グリア細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いてトリプシン処理し、得られた細胞を２２ｍｍのカバーグラス上に５×１０4個の密度で再度植えつけた。細胞はコンフルエントな単層を形成するまで培養した。この時点で細胞の培地を１０％正常ヒト成体血清含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地に交換し、グリア細胞の単層を１８Ｇの針を用いて傷つけた。損傷後、ＫＤＩペプチド（米国、カリフォルニア州、ラ ホーヤ、Multiple Peptide Systems社製）を培地に加え、その後、脊髄または大脳新皮質から分離したばかりの新鮮な細胞の懸濁液を、細胞数が２×１０4個になるようにカバーグラスに加えた。２４〜４８時間後、培養物を２％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中で１５分間固定し、公知の方法（Liesi et al., 2001）でＴＵＪ１を用いた免疫学的染色に付した。
【００４８】
脊髄グリア細胞上のヒトＣＮＳニューロンの生存率および神経突起伸長を、６個の培養物から任意に選択した１０個の領域を計測することにより評価した。総計２６５個の細胞を数えた。（１０細胞体を超える長さの）長い神経突起の数も同様に推定した。結果の評価には一変量分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。
【００４９】
ヒト脊髄損傷の実験モデル系（ＩＩ）：ミエリンの影響 
正常なヒト成体の脊髄の凍結切片（厚さ：１０μｍ）を、スライドグラス（SuperFrost Plus slide）（ドイツ国、Menzel社製）に載せて冠状面で切断した。各スライドグラスには３つの切片を載せた。新鮮な切片を載せたスライドグラスを、滅菌した培養用プレート（Quadriperm-plate）（ドイツ国、In Vitro Systems & Services社製）に即座に入れて１０ｍｌの培地を加えた。培地は、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加した１０％正常ヒト成体血清含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２であった。２個の胚体を各切片の白質領域に載せ、培養物を空気９５％、二酸化炭素５％の雰囲気下、湿度９８％、３７℃のインキュベーターに入れた。ＫＤＩペプチド（米国、カリフォルニア州、ラ ホーヤ、Multiple Peptide Systems社製）を１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で培地に加え、１０個のアミノ酸からなる前駆体（ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩ）を等モル濃度加えた。対照培養物にはペプチドを加えなかった。１０日後、培養物を固定し、神経フィラメントタンパク質と追加のニューロンマーカーおよびグリア細胞マーカーを免疫学的染色に付し、胚体中の神経突起および細胞を同定した。接着した胚体および成体白質組織に直接伸びている神経突起の数を各スライドグラスごとに数え、結果を一変量分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。対照培養物および培地に５〜１０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドを添加した培養物においては、胚体から伸びる（１００μｍを超える）長い神経突起の数を数え、結果の分析にはノンパラメトリックなWhitney-Mann検定を用いた。
【００５０】
雄ラット成体の脊髄損傷についての研究 
方法と実験計画：
強いペントバルビタール麻酔下における腰椎の完全な横断を４０匹の雄Sprague-Dawleyラット成体に行った。浸透圧ミニポンプ（Osmotic mini pump）を皮下に埋め込み、一群（ＫＤＩ−グループ）においては予備試験によって決定した濃度（１０〜１００μｇ／ｍｌ）でＫＤＩペプチドを連続流入し、もう一つの群（プラシーボ−グループ）ではプラシーボを連続流入した。術後の痛みを軽減するために双方のグループにモルヒネを与えた。動物は運動機能試験を週に１回、３ヶ月間行った。運動スコアテストを標準的な運動評価試験（歩行、牽引による伸張（tow-spread）、台乗せ反射（placing）および回避行動（withdrawal））を用いて行った。ミニポンプによりはじめに薬剤が３０日間投与され、可能であれば更に実験を（最大３ヶ月まで）延長して行った。３ヵ月後、各グループの動物を安楽死させ、脊髄を免疫細胞化学、生化学およびＲＮＡ分析に用いるために急速冷凍するか、in situハイブリダイゼーションおよび回復についての組織学的分析のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した脊髄の損傷部位の遥か上方にＤｉＩを注入し、損傷部位を横切る軸索の成長をモニターした。動物の脳および坐骨神経も急速冷凍または固定し、後の分析に用いるために保存した。
【００５１】
結果
ラミニン１誘導ペプチドの電気生理学的影響 
ラミニン１のγ１鎖由来の合成ペプチドおよび融合タンパク質の、ラット小脳ニューロンに対する電気生理学的影響について検証した（図１および図２）。
【００５２】
P1543部位をカバーする融合タンパク質（B2-5; Utani et al., 1994）は、デカペプチドP1543により誘導される電流に類似した電流を誘導することができた（図１のＣブロック）。ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩ配列全体を含む１５アミノ酸を欠失している４０μｇ／ｍｌの融合タンパク質（B2-3）の投与は、小脳顆粒ニューロンにおける電流を誘導しなかった（図１のＡブロック）。活性配列のＤＩ末端を切りとった融合タンパク質（B2-4）も小脳ニューロンにおける電流を誘導しなかった（図１のＢブロック）。これらの結果は、実際の神経突起伸長ドメイン、例えばラミニン１のγ１鎖の最も小さい生物学的活性配列、を同定することに繋がるより小さなペプチドを定義する一助となった。
【００５３】
６アミノ酸からなるペプチドであるＥＩＩＫＤＩは小脳顆粒ニューロンにおいて電流を誘導し（図２のＡ）、それはP1543により誘導される電流と同等だった（図２のＤを参照）。中枢ニューロンにおいて電流を誘導する最も短いペプチドはトリペプチドであるＫＤＩである（図２のＢ）のに対し、ラミニン１のα１鎖由来の関連のないペプチド（AG10; AI12; AJ5）は小脳顆粒ニューロンにおいて電流を誘導しなかった（図２のＣ）。
【００５４】
ヒト脊髄のグリア細胞上における、ヒト胚性大脳新皮質ニューロンの生存率 
大脳新皮質ニューロンの中には、脊髄グリア細胞（SC+n）、損傷脊髄グリア細胞（SC+LE+n）または１０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチド存在下の脊髄グリア細胞（LE+KDI10+n）に接着し神経突起を伸ばすものがあった（図３）。しかしながら、このような種々の条件間におけるニューロンの生存率に統計的な差異は見られなかった。１μｇ／ｍｌのP1543ペプチド（ｐ２０）の添加は、大脳新皮質ニューロンの接着および神経突起伸長に有意（ｐ＜０．００１）な改善をもたらした（p201+LE+n）。しかしながら、次にＫＤＩペプチドを１μｇ／ｍｌ添加したところ、大脳新皮質ニューロンの接着と神経突起伸長はいずれも有意（ｐ＜０．００１）に改善された（KDI1+LE+n）。ＫＤＩ（１μｇ／ｍｌ）によりもたらされる改善は、ｐ２０（１μｇ／ｍｌ）により誘導される改善に比べて統計的に有意であった。
*ｐ＜０．００１は、Student-Newman-Keuls多重比較検定（ＡＮＯＶＡ）による。
【００５５】
従って、これらの実験結果は、ＫＤＩペプチドが損傷脊髄グリア細胞上でのヒト大脳新皮質ニューロンの生存率を向上することを示している。また、低濃度のＫＤＩペプチドが、この作用においてP1543ペプチドよりも優れていることも示している。
【００５６】
ヒト脊髄由来グリア細胞上における、ヒト胚性脊髄ニューロンの生存率および神経突起伸長 
図４Ａは、in vitroにおいてヒト脊髄グリア細胞単層上で７２時間培養した後に長い神経突起（＞１００μｍ）を伸ばしているヒト脊髄ニューロンの数を示している。ＫＤＩペプチドが存在しない場合は、長い神経突起を持つニューロンはほとんど見られなかった（SC+LE+n）。０．１μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドの添加は、長い神経突起を有する細胞の数を有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。この濃度が脊髄ニューロンの生存を支持するのに最も適していることにも注目されたい。１．０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドの添加も損傷を与えた対照に比べて長い神経突起を有する細胞の数を有意に増加させた。
【００５７】
図４Ｂは、in vitroにおいてヒト脊髄グリア細胞単層上で７２時間培養した後のヒト脊髄ニューロンの数を示している。対照の培養（SC+n）では、脊髄ニューロンの中にはグリア細胞の単層に接着するものがあり、グリア細胞単層の損傷（SC+LE+n）は接着を増加した。ナノモル濃度のＫＤＩペプチドの添加（ＳＣ＋ＬＥ＋ｎ／ＫＤＩ ０．０３５５μｇ／ｍｌ；ＳＣ＋ＬＥ＋ｎ／ＫＤＩ ０．１μｇ／ｍｌ）は、脊髄ニューロンの生存率を有意に（ｐ＜０．００１）増加させた。０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドの添加は、損傷したグリア細胞単層のみの場合の生存率と変わらない程度にしか脊髄ニューロンの生存率を向上させなかった（有意差は見られなかった）。
【００５８】
したがって、図４Ａおよび４Ｂは、ＫＤＩペプチドがヒト脊髄ニューロンの生存および神経突起伸長を司る因子であることを示している。これらのデータを図３に示す結果と比較すると、脊髄ニューロンがこのような処理に用いた大脳新皮質ニューロンよりもＫＤＩの添加量に対する感受性が高いこともわかる。
【００５９】
ヒト胚性ＣＮＳニューロンの接着および神経突起伸長 
ＫＤＩトリペプチド（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）およびデカペプチドP1543（１μｇ／ｍｌ；ＲＤＩＡＥＩＩＫＤＩ）は、ヒトＣＮＳニューロンの接着および神経突起伸長を支持した。ガラスに共有的に架橋しているＫＤＩペプチド（０．１μｇ／ｍｌ）は、ヒト中枢ニューロンの接着および神経突起伸長を促進する（図５Ａ）。ＫＤＩペプチド（１０μｇ／ｍｌ）上のヒト中枢ニューロンの神経突起伸長の２つの例においては、ニューロンはトリペプチド上に接着し、長い神経突起を伸ばすことを示した（図５Ｂおよび図５Ｃ）。ガラスにカップリングしているP1543（１μｇ／ｍｌ）は、ＫＤＩペプチドと同様にヒト中枢ニューロンの神経突起伸長を促進する（図５Ｄ）。縮尺を示す横線の長さは１０μｍである。これら２種の支持体におけるニューロンの接着特性と神経突起伸長特性に差異は見られなかった（データは示さない）。
【００６０】
図６のＡおよびＢは、in vitroにおいてヒト脊髄グリア細胞損傷単層上で４８時間培養した後の、ヒト胚性脊髄由来ＴＵＪ１−免疫反応性ニューロンを示している。図６のＡでは、写真の右下隅のニューロンは、０．１μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドが培地中に存在する条件下で長い神経突起を伸ばしている。図６のＢでは、脊髄ニューロンはＫＤＩペプチドが培地中に存在しない条件下では長い神経突起は伸ばさない。
【００６１】
胚体の接着および神経突起伸長 
図７は、ヒト成体脊髄凍結切片中の白質の上の胚体（ＥＢＳ；白抜きのカラム）および長い神経突起を伸ばしているＥＢＳ（黒いカラム）の平均数を示す。ＫＤＩペプチド（５〜１０μｇ／ｍｌ）の存在下では、胚体は白質によく接着し、白質のミエリンと直接接触している部分から胚体は長い神経突起（＞１００μｍ）を伸ばした。接着し神経突起を出した胚体の数は、対照（ＣｔＲ；ｐ＜０．０１）または１０アミノ酸からなる前駆体ペプチドP1543（ｐ２０；ｐ＜０．０１）の存在下と比較して、ＫＤＩの存在下で有意に多かった。これらの結果は、ＫＤＩペプチドがP1543デカペプチドよりも有利な効果をもたらすことを示している。
【００６２】
図８は、in vitroにおいて１０日間培養した際の、胚体からヒト成体脊髄の白質に伸びる長い神経突起の数に対するＫＤＩペプチドの効果を示す。ＫＤＩペプチドが存在しない場合（ＣｔＲ）は、神経突起はヒト脊髄切片の白質上でほとんど伸びなかった。５〜１０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドの存在下では、多くの長い神経突起が胚体から伸長し、白質に直接接触しながら伸びた（ｐ＜０．０００１；ノンパラメトリックなMann-Whitney検定）。
【００６３】
図９のＡ〜Ｄは、in vitroで１０日間培養した後の、ヒト成体脊髄の白質上におけるヒト脊髄胚体による神経フィラメントタンパク質の発現および神経フィラメント陽性神経突起の伸長を示す。
（図９のＡ） ＫＤＩペプチドを添加していない対照培養においては、胚体はヒト成体脊髄の白質に接着することができた。白質への神経突起伸長は見られないが、神経フィラメント陽性繊維（矢印）が胚体の外周を囲んだ。
（図９のＢ） 図９のＡと同じ胚体の高倍率写真であり、胚体から伸びたわずかな小さく短い神経突起を示す。
（図９のＣ） ５〜１０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドの存在下では、長い神経フィラメント陽性神経線維が胚体から伸びている。
（図９のＤ） 高倍率で撮影することによって、神経フィラメント陽性神経突起がヒト成体脊髄の白質上に直接伸びたことが明らかになった。ヒト成体脊髄の断面図も神経フィラメント陽性であることに注目されたい。
【００６４】
in vivoにおけるラットの損傷脊髄の再生 
図１０は、損傷から３ヶ月後のラット成体の、プラシーボ処理脊髄（図１０のＡとＢ）およびＫＤＩペプチド処理脊髄（図１０のＣとＤ）の実体顕微鏡画像である。脊髄の腹側（ＡとＣ）は損傷部位を示す（白い矢印）。プラシーボ処理脊髄（Ｂ）の背側（黒い矢印）では、ＫＤＩ処理脊髄の背側（Ｄ）よりも瘢痕がずっと大きい。
【００６５】
予備的運動機能スコアをＫＤＩ処置動物と対照動物から得た。得られたスコアは歩行スコアに基づくものであり、個々の動物の処置を知らない人によって評価されたものである。各動物に対するスコアは、手術後１２週の追跡期間で得られた歩行スコアの合計により算出した。歩行スコアは（テーブル上の）平坦な表面での動物の歩行の評価からなる。プラシーボグループの６個体およびＫＤＩグループの６個体のスコアを解析し、統計学的に比較した。総脊髄横断を受けたラットの運動機能スコアの統計学的評価は、両側Ｐ値でノンパラメトリックなMann-Whitney検定を用いて行った。得られたＰ値は０．００２２であり、非常に有意だと考えられる。プラシーボグループの平均運動機能スコアは１１±２．４（標準誤差）であり、ＫＤＩグループの平均運動機能スコアは７８±５．８（標準誤差）であった。手術を施していない正常動物の同じ観察期間内における平均運動機能スコアは１２０だった。
【００６６】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】P1543ペプチド配列を含有する融合タンパク質の、ラミニン１塗布支持体上の小脳顆粒ニューロンの電気特性に対する影響。
【図２】P1543デカペプチド由来の種々の短いペプチドの、ラミニン１塗布支持体上の小脳顆粒ニューロンの電気特性に対する影響。
【図３】可溶性ＫＤＩペプチドの存在下（１μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌ）または非存在下、あるいは１μｇ／ｍｌのP1543デカペプチド存在下における、損傷から７２時間後にヒト脊髄グリア細胞上で生存しているヒト胚性大脳新皮質ニューロンの平均数。略語：（SC+n）＝脊髄グリア細胞、（SC+LE+n）＝損傷脊髄グリア細胞、（LE+KDI10+n）＝１０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチド存在下の損傷細胞、（KDI1+LE+n）＝１０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチド存在下の損傷細胞、（p201+LE+n）＝１μｇ／ｍｌのP1543ペプチド存在下の損傷細胞。
【図４Ａ】In vitroにおいてヒト脊髄グリア細胞単層上で７２時間培養した後に長い神経突起（＞１００μｍ）を伸ばしているヒト脊髄ニューロンの数。略語：（SC+LE+n）＝損傷脊髄グリア細胞、（SC+LE+n, KDI0.1）＝０．１μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチド存在下の損傷脊髄グリア細胞、（SC+LE+n, KDI1.0）＝１．０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチド存在下の損傷脊髄グリア細胞。
【図４Ｂ】In vitroにおいてヒト脊髄グリア細胞単層上で７２時間培養した後のヒト脊髄ニューロンの数。略語：（SC+n）＝脊髄グリア細胞、（SC+LE+n）＝損傷脊髄グリア細胞、（SC+LE+n, KDI0.0355 - KDI1.0）＝０．０３５５〜１．０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチド存在下の損傷脊髄グリア細胞。
【図５Ａ】ペプチドＫＤＩ−ｇｃ上でのＴＵＪ１陽性ヒト胚性脳ニューロンの接着および神経突起伸長。“ｇｃ”は、公知の方法（Matsuzawa et al., 1996b）でガラスに短いペプチドを共有カップリングするために行うGly-Cys付加を表す。
【図５Ｂ】ペプチドＫＤＩ−ｇｃ上でのＴＵＪ１陽性ヒト胚性脳ニューロンの接着および神経突起伸長。
【図５Ｃ】ペプチドＫＤＩ−ｇｃ上でのＴＵＪ１陽性ヒト胚性脳ニューロンの接着および神経突起伸長。
【図５Ｄ】Ｐ１５４３−ｇｃ上でのＴＵＪ１陽性ヒト胚性脳ニューロンの接着および神経突起伸長。
【図６】In vitroにおいてヒト脊髄グリア細胞損傷単層上で４８時間後の、ヒト胚性脊髄由来ＴＵＪ１−免疫反応性ニューロン。Ａ：０．１μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドを培地に添加したもの。Ｂ：ＫＤＩペプチドが培地中に存在しないもの。
【図７】ヒト成体脊髄凍結切片中の白質の上の胚体（ＥＢＳ；白抜きのカラム）および長い神経突起を伸ばしているＥＢＳ（黒いカラム）の平均数。ＫＤＩ＝ＫＤＩトリペプチドを添加したもの；ｐ２０：デカペプチドＰ１５４３を添加したもの；ＣｔＲ＝対照実験であり、ペプチドを添加していないもの。
【図８】胚体からヒト成体脊髄の白質に伸びる長い神経突起の数に対するＫＤＩペプチドの効果。ＫＤＩ＝ＫＤＩトリペプチドを添加したもの；ＣｔＲ＝対照実験であり、ペプチドを添加していないもの。
【図９】In vitroで１０日間培養した後の、ヒト成体脊髄の白質上におけるヒト脊髄胚体による神経フィラメントタンパク質の発現および神経フィラメント陽性神経突起の伸長。Ａ：ＫＤＩペプチドを添加していない対照培養；Ｂ：Ａと同じ胚体の高倍率写真であって、実験系の該略図は、ヒト成体脊髄の冠状面切断切片上の胚体を置いた場所を示している；Ｃ：５〜１０μｇ／ｍｌのＫＤＩペプチドを添加したもの；Ｄ：Ｃの胚体の高倍率写真。
【図１０】損傷から３ヶ月後のラット成体の、プラシーボ処理脊髄（図１０のＡとＢ）およびＫＤＩペプチド処理脊髄（図１０のＣとＤ）の実体顕微鏡画像。ＡおよびＣでは腹側脊髄を撮影した。ＢおよびＤは背側極を示す。背側極の結合組織瘢痕は、プラシーボ処理脊髄およびＫＤＩ処理脊髄のいずれにも存在したが、ＫＤＩ処理脊髄に見られる瘢痕はかなり小さい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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