(57)【要約】【課題】半翅目ムスカリン性受容体をコードする新規核酸配列、ならびにそれらを含む組換え発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。【解決手段】単離半翅目ムスカリン性受容体、半翅目ムスカリン性受容体を発現する宿主細胞、ならびに半翅目ムスカリン性受容体および半翅目ムスカリン性受容体に特異的な抗体を生成する。半翅目ムスカリン性受容体のモジュレータを同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、その突然変異体、そのフラグメント、配列番号４、その突然変異体、およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、実質的に純粋な蛋白質。
【請求項２】
配列番号２、その突然変異体、およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
請求項１に記載の蛋白質をコードする核酸配列を含む、単離核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
配列番号１、ヌクレオチド数が少なくとも１０のそのフラグメント、配列番号３、およびヌクレオチド数が少なくとも１０のそのフラグメントから成る群より選択される、核酸配列を有する単離核酸分子。
【請求項７】
配列番号１、またはヌクレオチド数が少なくとも１０のそのフラグメントから成る、単離核酸分子。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換え発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
配列番号２におけるエピトープまたは配列番号４におけるエピトープに結合する、単離抗体。
【請求項１１】
半翅目類ムスカリン性受容体蛋白質活性のモジュレータを同定する方法であって、
前記半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有する組換え発現ベクターを含み、半翅目ムスカリン性受容体を発現する試験細胞とカルシウム含有溶液とを試験化合物が存在する状態で接触させ、前記試験細胞における細胞内カルシウム量を検出することにより試験アッセイを行う段階と、
前記半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有する組換え発現ベクターを含み、半翅目ムスカリン性受容体を発現する陰性対照細胞とカルシウム含有溶液とを前記試験化合物が不在の状態で接触させ、前記陰性対照細胞における細胞内カルシウム量を検出することにより陰性対照アッセイを行う段階と、
前記試験細胞における細胞内カルシウム量と前記陰性対照細胞における細胞内カルシウム量とを比較する段階と、
を含む、
前記陰性対照細胞における細胞内カルシウム量と比較した前記試験細胞における半翅目ムスカリン性受容体作動薬カルシウム量の変化によって、その試験化合物が半翅目ムスカリン性受容体蛋白質活性のモジュレータであることが示される、同定方法。
【請求項１２】
前記細胞の内部にある染料が細胞内カルシウムと相互作用することによって生じる蛍光を測定するアッセイを使用することにより細胞内カルシウムを検出する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有する組換え発現ベクターを含み、半翅目ムスカリン性受容体を発現する陽性対照細胞とカルシウム含有溶液とを、前記試験化合物が不在で半翅目ムスカリン性受容体作動薬が存在する状態で接触させ、前記陽性対照細胞における細胞内カルシウム量を検出することにより陽性対照アッセイを行う段階をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
半翅目ムスカリン性受容体を発現しない半翅目ムスカリン性受容体陰性対照細胞とカルシウム含有溶液とを、前記試験化合物が不在の状態で接触させ、前記半翅目ムスカリン性受容体陰性対照細胞によって吸収されたカルシウム量を検出することにより第二のタイプの陰性対照アッセイを行う段階と、および／または
半翅目ムスカリン性受容体を発現しない半翅目ムスカリン性受容体陰性対照細胞とカルシウム含有溶液とを、前記試験化合物が不在で半翅目ムスカリン性受容体作動薬が存在する状態で接触させ、前記半翅目ムスカリン性受容体陰性対照細胞によって吸収されたカルシウム量を検出することにより第三のタイプの陰性対照アッセイを行う段階と、
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記半翅目ムスカリン性受容体蛋白質が、配列番号２、その突然変異体、そのフラグメント、配列番号４、その突然変異体、およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記半翅目ムスカリン性受容体蛋白質が、配列番号２、その突然変異体、およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
半翅目ムスカリン性受容体蛋白質活性の阻害剤を同定する方法であって、
前記半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有する組換え発現ベクターを含み、半翅目ムスカリン性受容体を発現する試験細胞と、カルシウムおよび半翅目ムスカリン性受容体作動薬を含有する溶液とを、試験化合物が存在する状態で接触させ、前記試験細胞における細胞内カルシウム量を検出することにより試験アッセイを行う段階と、
前記半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有する組換え発現ベクターを含み、半翅目ムスカリン性受容体を発現する陰性対照細胞と、カルシウムおよび半翅目ムスカリン性受容体作動薬を含有する溶液とを、前記試験化合物が不在の状態で接触させ、前記陰性対照細胞における細胞内カルシウム量を検出することにより対照アッセイを行う段階と、
前記試験細胞における細胞内カルシウム量を前記対照細胞における細胞内カルシウム量と比較する段階と、
を含む、
前記対照細胞における細胞内カルシウム量と比較した前記試験細胞における細胞内カルシウム量の減少が、その試験化合物が半翅目ムスカリン性受容体蛋白質活性の阻害剤であることを示す、同定方法。
【請求項１８】
前記細胞の内部にある染料が細胞内カルシウムと相互作用することによって生じる蛍光を測定するアッセイを使用することにより細胞内カルシウムを検出する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記半翅目ムスカリン性受容体蛋白質が、配列番号２、その突然変異体、そのフラグメント、配列番号４、その突然変異体、およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
請求項８に記載の宿主細胞から前記蛋白質を単離する段階を含む、配列番号２、その突然変異体、そのフラグメント、配列番号４、その突然変異体、およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する、単離蛋白質を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農芸化学、獣医学または製薬学分野において有用なヌクレオチド配列に関する。詳細には、本発明は、農薬または医薬としての（潜在的）活性を有する化合物の同定または開発に有用なアミノ酸配列をコードする、または発現するために使用することができるヌクレオチド配列に関する。さらにいっそう詳細には、本発明は、本発明のヌクレオチド配列によってコードされている、または本発明のヌクレオチド配列の好適な発現によって得ることができる、―蛋白質またはポリペプチドなどの―アミノ酸配列にも関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルコリン（「Ａｃｈ」）は、昆虫ＣＮＳおよび抹消における主要な刺激性神経伝達物質であり、ニコチン性受容体およびムスカリン性受容体という二つの主要な種類から成るコリン作動性受容体によりシグナル伝達を媒介する（（非特許文献１）及び（非特許文献２））。ムスカリン性受容体（すなわち、ｍＡｃｈＲ受容体）は、ベンジル酸キヌクリジニル（「ＱＮＢ」）などのムスカリン性アンタゴニストリガンドが昆虫由来の分画神経組織に結合することが証明された１９８０年代以来、研究され、新規殺虫剤についての潜在的作用部位とみなされている（（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５））。オキソトレモリンなどのムスカリン作動薬、およびＱＮＢなどの拮抗薬がローカスト・シナプトム（ｌｏｃｕｓｔ  ｓｙｎａｐｔｏｍｅｓ）におけるＡｃｈＲ放出に影響を及ぼすことも判明した（非特許文献６）。ムスカリン性受容体は、ニコチン性受容体の殺虫剤の標的としての有意性をもたらす点でも関心を集めた。
【０００３】
【非特許文献１】Ｆｌｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４１，２６１９−２６２６，１９８３
【非特許文献２】Ｅｌｄｅｆｒａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔｓ．５
【非特許文献３】Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｎｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２０，１０１３−１０２９，１９７７
【非特許文献４】Ｅｌｄｅｆａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｏｕｓｅｆｌｙ  ｂｒａｉｎ．Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｅｒｏｍｏｎｅｓ  ｉｎ  Ｉｎｓｅｃｔｓ  ｅｄ  Ｓａｔｅｌ，Ｈａｌｌ  ａｎｄ  Ｈｏｄｅｂｒａｎｄ，５９−７０  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
【非特許文献５】Ｄｕｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，８１，１３４−６，１９７７
【非特許文献６】Ｂｒｅｅｒ  Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９０Ｃ，Ｎｏ．１，ｐｐ．２７５−２８０，１９８８
【０００４】
ニコチン性受容体は、リガンド型イオンチャネルであり、イミダクロプリドなどの一部の殺虫剤の作用部位である。１９９０年代に、昆虫標本におけるｍＡｃｈＲ作動薬および拮抗薬の活性（非特許文献７）、ならびにダニおよびアブラムシに対するムスカリン作動薬の昆虫活性（非特許文献８）についての電気生理学的測定および特性付けが報告された。
【０００５】
【非特許文献７】Ｔｒｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｎｅｃｅ，１８，Ｎｏ．２，ｐ  １０４−１０，１９９５
【非特許文献８】Ｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｓｃｉｎｃｅ，４９，２６８−７６，１９９７
【０００６】
１９８９年、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ムスカリン性受容体がクローニングされ、卵母細胞および哺乳動物細胞において発現された時に機能性であると判明した（（非特許文献９）、（非特許文献１０））。ショウジョウバエムスカリン性受容体の単離および発現は、ムスカリン性受容体としてのその機能を確立したが、脊椎動物においてその機能類似体を構成するサブユニットのいずれかに対する相同性は、３５％未満である。タバコに寄生するスズメガの幼虫由来の部分配列も単離され、クローニングされた（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｉｍｍｅｒ，ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｍｕｓｃａｒｉｎｉｃ  Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｈｏｒｎｗｏｒｍ，１９９８，ＵＭＩ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  ＭＩ  ＵＭＩ＃９９１５３９）。
【０００７】
【非特許文献９】Ｏｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２５５，２１９−２２５（１９８９）
【非特許文献１０】Ｓｈａｐｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６（２２），９０３９−９０３４（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の一つの実施形態は、農薬または医薬としての（潜在的）活性を有する化合物の同定または開発に有用なアミノ酸配列をコードする、またはそうしたアミノ酸配列を発現するために使用することができるヌクレオチド配列に関する。以下でさらに説明するこれらのヌクレオチド配列（それらの突然変異体およびフラグメントを含む）を本明細書では「本発明のヌクレオチド配列」とも呼ぶことにする。
【０００９】
本発明のもう一つの実施形態は、本発明のヌクレオチド配列によってコードされている、または本発明のヌクレオチド配列の好適な発現によって得ることができる、―蛋白質またはポリペプチドなどの―アミノ酸配列に関する。以下でさらに説明するこれらのアミノ酸配列（それらの突然変異体およびフラグメントを含む）を本明細書では「本発明のアミノ酸配列」とも呼ぶことにする。
【００１０】
本発明のさらにもう一つの実施形態は、例えば、本発明のアミノ酸配列の発現のための宿主細胞または宿主生物の形質転換における、本発明のヌクレオチド配列、好ましくは、以下で説明するような好適な遺伝子構成体の形態をした本発明のヌクレオチド配列の使用に関する。本発明は、本発明のヌクレオチド配列で形質転換された、または本発明のアミノ酸配列を発現することができる宿主細胞または宿主生物にも関する。
【００１１】
さらになおもう一つの実施形態において、本発明は、上述のヌクレオチド配列、アミノ酸配列、遺伝子構成体、宿主細胞または宿主生物を用いる、本発明のアミノ酸配列の生物学的活性をモジュレートすることができる化合物の同定方法または開発方法に関する。通常はアッセイまたはスクリーニングの形態であろうそうした方法も、以下でさらに説明する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本明細書では、本発明の核酸をひとまとめにして「本発明の核酸」と呼ぶことにする。また、以下の本発明のさらなる説明の文脈において適切な場合には、用語「本発明のヌクレオチド配列」および「本発明の核酸」は、本質的に同等であり、本質的に交換可能であると考えてよい。
【００１３】
また、本発明の意図として、核酸またはアミノ酸配列は、別の核酸、別の蛋白質もしくはポリペプチドまたは別の（高分子）生体成分などのそれが通常結合している少なくとも一つの他の成分（特に、高分子）からそれが分離されている時、―例えば、その天然生物源から―「本質的に単離されている（本質的に単離された形態である）」と考える。詳細には、核酸またはアミノ酸配列は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、さらに特に少なくとも１００倍、および１０００倍以上までそれが精製されている時、「本質的に単離されている」と考える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、本発明のアミノ酸配列を化合物および他の因子とのインビトロまたはインビボでの相互作用の（潜在的な）「標的（複数を含む）」として使用することができるという知見から確立されたものである（用語「標的」は、当該技術分野におけるその通常の意味を有する。例えば、（特許文献１）国際公開公報第９８／０６７３７号に与えられている定義を用いることができる）。従って、（例えば、本明細書において以下で説明するような方法によって）本発明のアミノ酸配列と相互作用することが確認された化合物または因子は、農芸化学、獣医学または製薬学分野において活性物質として有用でありうる。下記実施例４を参照されたし。
【００１５】
【特許文献１】国際公開公報第９８／０６７３７号公報
【００１６】
一つの実施形態において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列、特に、配列番号１および配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸であって、好ましくは（本質的に）単離形の核酸に関する。配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列は、ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）生物体から、下記実験の部でさらに説明するような方法で、抽出または単離したものである。
【００１７】
一般に、本発明のヌクレオチド配列は、核酸の形態である時、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよく、また、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。例えば、本発明のヌクレオチド配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ（例えば、ナショナル・バイオサイエンス社（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）（ミネソタ州プリマス（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＭＮ））から入手可能なＯｌｉｇｏ−４、およびフレッド・ハッチンソン癌研究所（ｔｈｅ  Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）を通してオンラインで入手可能なＨｅｎｉｋｏｆｆら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，７０，１６２８−１６３５，１９９８）からのＣｏｎｓｅｎｓｕｓ−Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＣＯＤＥＨＯＰ）などの好適なコンピュータプログラムを使用して設計することができる、所定の宿主細胞または宿主生物における発現に特異的に適応させたコドン使用のＤＮＡなど）であることができる。従って、本発明のヌクレオチド配列は、イントロン配列を含有することができ、一般に、異なるスプライス変異体も包含する。
【００１８】
さらにもう一つの実施形態は、本発明のヌクレオチド配列に対する二本鎖ＲＮＡ分子に関する（そのうちの一本の鎖は、本発明のヌクレオチド配列の少なくとも一部を通常は含むであろう）。本発明は、（例えば、宿主細胞または宿主生物、例えば、大腸菌などの菌株における好適な発現によって）そうした二本鎖ＲＮＡ分子を生じるために使用することができる遺伝子構成体にも関する。そうした構成体につては、（非特許文献１１）を参照されたし。
【００１９】
【非特許文献１１】Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９
【００２０】
広義では、用語「本発明のヌクレオチド配列」は、
―配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列の一部またはフラグメント；
―以下でさらに説明するような、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列の（天然または合成）突然変異体、変異体、対立遺伝子、類似体、オルソログ（本明細書では、以下、ひとまとめにして「突然変異体」と呼ぶ）；
―そうした（天然または合成）突然変異体の一部またはフラグメント；
―配列番号１または配列番号３（またはそれらの一部もしくはフラグメント）と少なくとも一つのさらなるヌクレオチド配列とのヌクレオチド融合体；
―（天然または合成）突然変異体（またはそれらの一部もしくはフラグメント）と少なくとも一つのさらなるヌクレオチド配列とのヌクレオチド融合体
も包含し、この場合、そうした突然変異体、部分、フラグメントまたは融合体は、好ましくは、以下でさらに説明するとおりである。
【００２１】
本発明は、上記ヌクレオチド配列の異なるスプライス変異体も包含する。
好ましくは、本発明のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド数が少なくとも５００、好ましくは少なくとも１，０００、さらに好ましくは少なくとも１，５００の長さを有し、且つ、ヌクレオチド数が多くとも２，０００、好ましくは多くとも１，８００、さらに好ましくは多くとも１，７００までの長さを有する。
【００２２】
配列番号１もしくは配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列の一部もしくはフラグメント、またはその（天然もしくは合成）突然変異体の一部もしくはフラグメントの例には、５’もしくは３’切断ヌクレオチド配列、またはフレームに開始コドンもしくは停止コドンが導入された配列が挙げられるが、それらに限定されない。また、本発明の一つ以上のヌクレオチド配列の二つ以上のそうした部分またはフラグメントを適切に組み合せて（例えば、フレーム内でライゲートして）、本発明のさらなるヌクレオチド配列を生じることができる。
【００２３】
好ましくは、いずれのそうした部分またはフラグメントも、配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列のヌクレオチド少なくとも１００、好ましくは少なくとも２５０、さらに好ましくは少なくとも５００、さらにいっそう好ましくは１００を上回る連続伸長を少なくとも一つ含むであろう。
【００２４】
また、―本明細書における開示に基づき―、当業者は、同じ種（の他の個体）から（例えば、それに限定されないが突然変異株または突然変異系を含む、異なる株または系統の個体から）配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列の天然「突然変異体」（上述のとおり）を同定、抽出または単離することができると予想される。―本明細書における開示に基づき―、当業者は、配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列の合成突然変異体（上述のとおり）を生成または抽出することもできると予想される。
【００２５】
一つの特定の実施形態において、前記突然変異体は、配列番号１のヌクレオチド配列またはその一部もしくはフラグメントをコードするような突然変異体である。
【００２６】
好ましくは、本明細書に記載のいずれの突然変異体も、配列番号１および配列番号３のヌクレオチド配列について以下で言及する構造的特徴または保存形質の一つ以上、好ましくはすべてを有するであろう。
【００２７】
詳細には、本明細書に記載の突然変異体、部分またはフラグメントはいずれも、本発明の対応するアミノ酸配列の活性部位または触媒部位、および本発明の対応するアミノ酸配列の結合ドメインを少なくともコードするような突然変異体、部分またはフラグメントでありうる。
【００２８】
また、本明細書に記載の突然変異体、部分またはフラグメントはいずれも、ヌクレオチドレベルで、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、特に９０％より高く、９５％以上までの程度の、配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１との「配列同一性」を好ましくは有するであろう。
【００２９】
また、好ましくは、本発明のヌクレオチド配列の突然変異体、部分またはフラグメントは、アミノ酸レベルで、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも８０％、特に、９０％より高く、９５％以上までの程度の、配列番号２または配列番号４、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列との「配列同一性」を有するアミノ酸配列をコードするようなヌクレオチド配列の突然変異体、部分またはフラグメントであろう。この場合の「配列同一性」率は、下記のように計算する。
【００３０】
このために、所定のヌクレオチド配列と、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列との「配列同一性」率は、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列内の対応する位置のヌクレオチドと同一である、その所定のヌクレオチド配列のヌクレオチドの数を、その所定のヌクレオチド配列の全ヌクレオチド数で割り、それに１００％を掛けることによって計算することができ、この場合、―配列番号１または配列番号３の配列と比較した―、ヌクレオチドの欠失、挿入、置換または追加は、各々、単一のヌクレオチド位置での相違と考える。
【００３１】
あるいは、配列同一性を判定するためのコンピュータプログラムを公的に利用することができる。配列同一性の判定に好ましいコンピュータプログラムは、ＦＡＳＴＡに類似したプログレッシブ・アラインメント法を使用するＧｅｎｅｗｏｒｋｓ  ｖ  ２．５（カリフォルニア州マウンテンビュー、インテリジェネティックス社（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  ＣＡ））におけるプログラムである。好ましくは、そのＧｅｎｅｗｏｒｋｓプログラムで使用されるパラメータは、ギャップ開始コスト＝５０、伸長ギャップ＝１００、最小対角線長＝４、最大対角線オフセット＝１２５である。二配列間の同一性についての他のコンピュータプログラム判定法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献１２）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（非特許文献１３）、およびＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（メリーランド州ベテスダ、インフォマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ））が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ（ｂｌａｓｔ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）および他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；（非特許文献１４）から公的に入手することができ、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６は、Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．ノースベテスダ（Ｎｏｒｔｈ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、ＭＤから入手することができる。
【００３２】
【非特許文献１２】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４）
【非特許文献１３】Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）
【非特許文献１４】Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）
【００３３】
また、好ましい態様において、本明細書に記載の突然変異体、部分またはフラグメントはいずれも、配列番号１または配列番号３の配列について上で説明した生物学的活性に本質的に、すなわち上述のアッセイにより測定して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％で、９０％以下の程度まで類似した生物学的活性を有する蛋白質またはポリペプチドをコードしているであろう。
【００３４】
好ましくは、本明細書に記載の突然変異体、部分またはフラグメントはいずれも、配列番号１または配列番号３、好ましくは配列番号１のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる、すなわち、「中等度緊縮」条件下、好ましくは「高度緊縮」条件下にあるような突然変異体、部分またはフラグメントである。そうした条件は、例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの標準的な手引書、ならびに（特許文献２）、（特許文献３）又は（特許文献４）から、当業者には明らかであろう。
【００３５】
【特許文献２】欧州特許第０  ９６７  ２８４号明細書
【特許文献３】欧州特許第１  ０８５  ０８９号明細書
【特許文献４】国際公開公報第００／５５３１８号公報
【００３６】
一つ以上のコード配列、非コード配列または調節配列を含む（しかし、これらに限定されない）、一つ以上のさらなるヌクレオチド配列と（上で説明したような）本発明のヌクレオチド配列の融合体の使用も、本発明の範囲内である。好ましくは、そうした融合体では、一つ以上のさらなるヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に、（以下で説明するように）機能できるように結合される（そのため、例えば、そのさらなるヌクレオチド配列がコード配列である時、そのヌクレオチド融合体は、以下で説明するような蛋白質融合体をコードする）。
【００３７】
もう一つの実施形態において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列に対するアンチセンス分子に関する。
【００３８】
本発明の核酸は、これもまた以下でさらに説明するような遺伝子構成体の形であってもよい。本発明の遺伝子構成体は、以下で説明するようなそれ自体知られている遺伝子構成体の一つ以上の要素に任意に連結された、本発明の少なくとも一つのヌクレオチド配列を一般に含むであろう。そうした遺伝子構成体は、ＤＮＡまたはＲＮＡでよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。これらの構成体は、所期の宿主細胞もしくは宿主生物の形質転換に適する形態、所期の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに適する形態、または所期の宿主生物における独立した複製、維持および遺伝形質に適する形態でもありうる。例えば、本遺伝子構成体は、例えばプラスミド、コスミド、酵母人工染色体（「ＹAＣ」）、ウイルスベクターまたはトランスポゾンなどのベクターの形態でありうる。特に、このベクターは、発現ベクター、すなわち、（例えば、以下で説明するような好適な宿主細胞または宿主生物において）インビトロまたはインビボで発現を生じることができるベクターでありうる。本発明のヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、本明細書では組換え発現ベクターとも呼ぶ。これらの構成体は、本明細書では「本発明の遺伝子構成体」とも呼ぶことにする。
【００３９】
好ましい実施形態において、そうした構成体は、
ａ）ｂ）に機能できるように結合された、本発明のヌクレオチド配列；
ｂ）プロモータおよび場合によっては好適なターミネータなどの一つ以上の調節要素
を含み、場合によっては、
ｃ）それ自体知られている遺伝子構成体の一つ以上のさらなる要素
も含む組み換え発現ベクターである。この場合、用語「調節要素」、「プロモータ」、「ターミネータ」、「さらなる要素」および「機能できるように結合された」は、本明細書において以下で示すような意味を有する。
【００４０】
上で言及した一つ以上の「さらなる要素」として、本発明の遺伝構成体（複数を含む）は、一つ以上の好適な調節要素（好適なプロモータ（複数を含む）、エンハンサ（複数を含む）、またはターミネータ（複数を含む）等）、３’―もしくは５’―非翻訳領域（複数を含む）（「ＵＴＲ」）配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカーもしくはレポーター遺伝子、または形質転換もしくは組込み（の効率）を助長もしくは増大させることができる要素を一般に含有しうる。そうした遺伝子構成体のこれらおよび他の好適な要素は、当業者には明らかであろうし、例えば、使用される構成体のタイプ、所期の宿主細胞または宿主生物；関心のある本発明のヌクレオチド配列を発現することができる方法（例えば、構成的発現、一過性発現、または誘導性発現によるもの）；および使用される形質転換法に依存しうる。
【００４１】
好ましくは、本発明の遺伝子構成体において、一つ以上のさらなる要素は、本発明のヌクレオチド配列（複数を含む）に「機能できるように連結されている」か、互いに「機能できるように連結されている」（これは、それらが互いに機能しうる関係にあることを一般に意味する）。例えば、プロモータは、そのプロモータが、コード配列の転写または発現を開始または別様に制御もしくは調節することができる場合、コード配列に「機能できるように連結されている」と考える（この場合、前記コード配列は、前記プロモータ「の制御下」にあるとご理解いただきたい）。
【００４２】
一般に、二つのヌクレオチド配列が、機能できるように連結されている時、それらは、同じ配向であり、通常、同じリーディングフレーム内にもある。それらは、通常、本質的に隣接していることにもなるが、これは、必要でないこともある。
【００４３】
好ましくは、本発明において使用される遺伝子構成体（複数を含む）の任意のさらなる要素は、所期の宿主細胞または宿主生物において所期の生物学的機能を生じることができるような要素である。
【００４４】
例えば、プロモータ、エンハンサまたはターミネータは、所期の宿主細胞または宿主生物において「機能可能」でなければならず、これは、（例えば）前記プロモータが、それが（上で定義したように）機能できるように連結しているヌクレオチド配列―例えば、コード配列―の転写または発現を開始または別様に制御もしくは調節することができなければならないことを意味する。
【００４５】
そうしたプロモータは、構成的プロモータであってもよいし、または誘導性プロモータであってもよく、また、宿主細胞もしくは宿主生物の成長の特定段階で（のみ）発現を生じるようなプロモータであってもよいし、または多細胞宿主生物の特定の細胞、組織、器官もしくは部分において（のみ）発現を生じるようなプロモータであってもよい。
【００４６】
幾つかの特に好ましいプロモータには、哺乳動物細胞における発現用のサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）、シミアンウイルス−４０（「ＳＶ４０」）、例えば、ｐＳＶＬ  ＳＶ４０  Ｌａｔｅ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（ニュージャージー州ピスカタウェイ、ファルマシア・バイオテック社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））、もしくは単純疱疹ウイルス（「ＨＳＶ」）などの構成的プロモータ；またはＮｏｖａｇｅｎ（ウィスコンシン州マディソン、ノバジェン社（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ））からのｐＩＥベクターにおいて利用できる、（非特許文献１５）が記載している、即時初期バキュロウイルスプロモータなどの昆虫構成的プロモータ；またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールズバッド、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのベクターにおいて利用できる、（非特許文献１６）が記載しているショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）メタロチオネインプロモータなどの昆虫誘導性プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
【非特許文献１５】Ｊａｒｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．３９  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｅｄ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．Ｈａｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ  １９９５
【非特許文献１６】Ｂｕｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６  Ｎｏ．３  １０４３−１０６，１９９８
【００４８】
選択マーカーは、本発明のヌクレオチド配列で（首尾よく）形質転換された宿主細胞または宿主生物を、（首尾よく）形質転換されていない宿主細胞または生物と識別することができるようなマーカー、―すなわち、適切な選択条件下で―、それを可能ならしめるようなマーカーでなければならない。そうしたマーカーの幾つかの好ましいが非限定的な例は、抗生物質に対して耐性を生じる遺伝子（ゲネチシンもしくはＧ４１８（ニューヨーク州グランドアイランド、ギブコ−ビー．アール．エル社（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））、ヒドロマイシン、カナマイシンまたはアンピシリン等）；温度耐性を生じる遺伝子；または非形質転換細胞もしくは生物の生存に必須の一定の因子、化合物もしくは（食物）成分が培地内に不在の状態で宿主細胞もしくは宿主生物を維持することができるようにする遺伝子である。
【００４９】
リーダー配列は、―所期の宿主細胞または宿主生物において―、所望の翻訳後修飾を可能ならしめるような配列、または転写ｍＲＮＡをシグナルペプチドなど細胞の所望の部分もしくは細胞器官に向けるような配列でなければならない。リーダー配列は、前記細胞由来の発現産物の分泌を可能にすることもできる。それ故、リーダー配列は、宿主細胞または宿主生物において機能できるあらゆるプロ−、プレ−、またはプレプロ−配列でよく、それには、ピコルナウイルスリーダー、ポティウイルスリーダー、ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（「ＢｉＰ」）、タバコモザイクウイルスリーダー（「ＴＮＶ」）、およびトウモロコシクロロティックモットルウイルスリーダー（「ＭＣＭＶ」）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
発現マーカーまたはレポーター遺伝子は、―宿主細胞または宿主生物において―、遺伝子構成体（に存在する遺伝子またはヌクレオチド配列）の発現の検出を可能ならしめるようなものでなければならない。発現マーカーは、発現産物を、例えば、一つの細胞の一つの特定の部分もしくは細胞器官に、または多細胞生物の特定の細胞（複数を含む）、組織（複数を含む）、器官（複数を含む）もしくは部分（複数を含む）に局在させることも場合によってはできる。そうしたレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列との蛋白質融合体として発現されることもある。幾つかの好ましいが非限定的な例には、ＧＦＰなどの蛍光蛋白質；抗体認識蛋白質、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって供給されているベクターおよび抗体において利用できるＶ５エピトープもしくはポリヒスチジン；またはニッケルカラムでの精製が可能なポリヒスチジン、もしくはメトトレキセートカラムでの精製が可能なジヒドロ葉酸レダクターゼなどの精製親和性ハンドル；または大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子などの遺伝子を発現している細胞を選択できるマーカーが挙げられる。
【００５１】
前記プロモータ、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、および本発明の遺伝子構築体内に存在しうる、または本発明の遺伝子構築体において使用することができる、さらなる要素（ターミネータ、転写エンハンサ、翻訳エンハンサまたは組み込み因子など）の幾つかの非限定的な例については、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの一般手引書、（非特許文献１７）および（非特許文献１８）、ならびに（特許文献５）、（特許文献６）、（特許文献７）、（特許文献８）、（特許文献９）、（特許文献１０）、（特許文献１１）、（特許文献１２）、（特許文献１３）、（特許文献１４）および（特許文献１５）において与えられている例を参照されたし。他の例は、当業者には明らかであろう。
【００５２】
【非特許文献１７】Ｗ．Ｂ．Ｗｏｏｄｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）
【非特許文献１８】Ｄ．Ｌ．Ｒｉｄｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃ．ＥＬＥＧＡＮＳ  ＩＩ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）
【特許文献５】国際公開公報第９５／０７４６３号公報
【特許文献６】国際公開公報第９６／２３８１０号公報
【特許文献７】国際公開公報第９５／０７４６３号公報
【特許文献８】国際公開公報第９５／２１１９１号公報
【特許文献９】国際公開公報第９７／１１０９４号公報
【特許文献１０】国際公開公報第９７／４２３２０号公報
【特許文献１１】国際公開公報第９８／０６７３７号公報
【特許文献１２】国際公開公報第９８／２１３５５号公報
【特許文献１３】米国特許第６，２０７，４１０号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，６９３，４９２号明細書
【特許文献１５】欧州特許第１  ０８５  ０８９号明細書
【００５３】
本発明のもう一つの実施形態は、本発明のヌクレオチド配列、核酸もしくは遺伝子構成体で形質転換された、または本発明のヌクレオチド配列、核酸もしくは遺伝子構成体を含有する宿主細胞または宿主生物に関する。本発明は、本発明のアミノ酸配列を発現する、または（例えば、好適な条件下で）（少なくとも）発現することができる宿主細胞または宿主生物にも関する。本明細書では、そうした宿主細胞または宿主生物をひとまとめにして「本発明の宿主細胞または宿主生物」とも呼ぶことにする。
【００５４】
宿主細胞は、任意の好適な（真菌、原核または真核）細胞または細胞系、例えば、
―大腸菌株、杵菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）株を含む（しかし、これらに限定されない）菌株；
―コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の種由来の細胞を含む（しかし、これらに限定されない）真菌細胞；
―クリュイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種由来の細胞を含む（しかし、これらに限定されない）酵母細胞；
―アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞などの両生類細胞または細胞系
であってもよい。
【００５５】
本発明のヌクレオチド配列を殺虫剤化合物の発見および開発に使用する（使用すべき）時に特に有用でありうる一つの特定の実施形態において、宿主細胞は、
―Ｓ９およびＳｆ２１細胞などの、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ハスモンヨトウ近似種））を含む（しかし、これに限定されない）鱗翅目（ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）来の細胞または細胞系、
―アブラムシ（Ａｐｈｉｓ）由来の細胞または細胞系；
―シュナイダーおよびＫｃ細胞などの、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）由来の細胞または細胞系、および
―オオタバコガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）などの（以下で述べるような）関心のある有害生物種由来の細胞または細胞系
のような昆虫由来の細胞または細胞系でありうる。
【００５６】
宿主細胞は、ＣＨＯ―およびＢＨＫ―細胞、ならびにＨｅＫ、ＨｅＬａおよびＣＯＳなどのヒト細胞または細胞系を含む（しかし、これらに限定されない）哺乳動物細胞または細胞系であってもよい。
【００５７】
宿主生物は、
―Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）などの、シーノラブディティス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）属からの線虫を含む（しかし、これらに限定されない）線虫、
―アブラムシ（Ａｐｈｉｓ）種、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）種、または（上述したものなどの）関心のある特定の有害生物種を含む（しかし、これらに限定されない）昆虫、
―ゼブラフィッシュなどの他のよく知られているモデル生物、
―ラットまたはマウスなどの哺乳動物
を含む（しかし、これらに限定されない）、任意の好適な多細胞生物（脊椎動物または無脊椎動物）であってもよい。
【００５８】
他の好適な宿主細胞または宿主生物は、例えば上述の手引書および特許出願から、当業者には明らかであろう。
【００５９】
本発明のヌクレオチド配列を多細胞生物において発現させる時、それは、その生物全体にわたって発現させることもできるし、またはその生物の一つ以上の特定の細胞、組織、器官または部分でのみ発現させることも、例えば、前記細胞（複数を含む）、組織（複数を含む）、器官（複数を含む）または部分（複数を含む）に特異的なプロモータの制御下で発現させることによってできることにご留意いただきたい。
【００６０】
ヌクレオチド配列は、宿主細胞または宿主生物の成長または生活環の特定段階の間でのみ発現させることも、これもまた、例えば、前記成長または生活環の段階に特異的なプロモータの制御下で発現させることによってできる。また、既に上で述べたように、前記発現は、構成的発現であってもよいし、一過性発現であってもよいし、または誘導性発現であってもよい。
【００６１】
好ましくは、これらの宿主細胞または宿主生物は、本発明のアミノ酸配列（宿主生物の場合には、その少なくとも一つの細胞、部分、組織または器官において）を発現する、または（例えば、好適な条件下で）、（少なくとも）発現することができるような細胞または生物である。本発明は、例えば、細胞分割により、または有性もしくは無性生殖により得られる、本発明の宿主細胞または宿主生物のその後の世代、後代および子孫も包含する。
【００６２】
さらにもう一つの態様において、本発明は、（本明細書中で定義されているような）本発明のアミノ酸配列、特に、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列をコードする、または発現するために使用することができる核酸、好ましくは（本質的に）単離形の核酸に関する。本発明のアミノ酸配列の特に好ましい例は、配列番号２のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号２または配列番号４、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列は、当業者には公知のいずれかの蛋白質単離法および蛋白質精製法を使用して、上述の種から単離することができる。あるいは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列は、以下でさらに説明するように、好適な宿主細胞または宿主生物において、―配列番号１もしくは配列番号３のヌクレオチド配列またはそれらの好適な突然変異体などの―好適なヌクレオチド配列を適切に発現させることによって得ることができる。
【００６４】
もう一つの態様において、本発明は、（上で定義したような）本発明のアミノ酸配列、特に配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列、さらに特に配列番号２のアミノ酸配列を含む蛋白質またはポリペプチド、好ましくは（本質的に）単離形の蛋白質またはポリペプチドに関する。
【００６５】
広義では用語「本発明のアミノ酸配列」は、
―配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列の一部またはフラグメント；
―配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列の（天然または合成）突然変異体、変異体、対立遺伝子、類似体、オルソログ（本明細書では、以下、ひとまとめにして「類似体」と呼ぶ）；
―そうした類似体の一部またはフラグメント；
―配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列（またはそれらの一部もしくはフラグメント）と少なくとも一つのさらなるアミノ酸残基または配列との融合体；
―類似体のアミノ酸配列（またはそれらの一部もしくはフラグメント）と少なくとも一つのさらなるアミノ酸残基または配列との融合体
も包含し、この場合、そうした突然変異体、部分、フラグメントまたは融合体は、好ましくは、以下でさらに説明するとおりである。
【００６６】
用語「本発明のアミノ酸配列」は、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−形などの上述のアミノ酸配列の「未熟」形、または好適なリーダー配列との融合体も包含する。また、本発明のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列を発現もしくは生成するために使用される宿主細胞もしくは宿主生物に依存して、翻訳後プロセシングに付されていてもよいし、適切にグリコシル化されていてもよく、または（例えば、それ自体、当該技術分野において公知の化学的技法によって）別様に修飾されてもよい。
【００６７】
配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列の一部もしくはフラグメント、またはその（天然もしくは合成）類似体およびその突然変異体の一部もしくはフラグメントの例には、Ｎ−およびＣ−切断アミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明の一つ以上のアミノ酸配列の二つ以上の部分またはフラグメントを適切に組み合わせて、本発明のアミノ酸配列を生じることができる。
【００６８】
好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、アミノ酸数が少なくとも１００、好ましくは少なくとも２５０、さらに好ましくは少なくとも５００の長さで、且つ、アミノ酸数が多くとも８００、好ましくは多くとも７５０、さらに好ましくは多くとも６００の長さを有する。
【００６９】
好ましくは、いずれのそうした部分またはフラグメントも、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列のアミノ酸少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、さらに好ましくは少なくとも２０、さらにいっそう好ましくは３０を超える連続伸長を少なくとも一つ含むであろう。
【００７０】
詳細には、本明細書に記載されているような部分またはフラグメントはいずれも、本発明の対応するアミノ酸配列の活性部位もしくは触媒部位、または本発明の対応するアミノ酸配列の結合ドメインを（少なくとも）含むような部分またはフラグメントである。当業者には明らかなように、そうした部分またはフラグメントは、（以下で一般的に説明するような）アッセイ法およびスクリーニング法で、ならびに（前記部分またはフラグメントが、結晶形で提供される時）Ｘ線結晶構造解析で、特に使用することができる。
【００７１】
また、―本明細書における開示に基づき―、当業者は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列の天然「類似体」（上述のとおり）を同定、抽出または単離することができると予想される。そうした突然変異体は、同じ種（の他の個体）から（例えば、それに限定されないが突然変異株または系統を含む、異なる株または系統の個体から）、または他の種（の個体）から抽出することができる。例えば、そうした類似体は、上述の昆虫種から抽出することができる。
【００７２】
―本明細書における開示に基づき―、当業者は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列の合成「類似体」（上述のとおり）を生じる、または抽出することもできると予想される。
【００７３】
好ましくは、本明細書に記載されているような突然変異体はいずれも、配列番号２または配列番号４、好ましくは配列番号２の配列について以下で言及する構造的特徴または保存形質の一つ以上、好ましくはすべてを有するであろう。
【００７４】
好ましくは、本明細書に記載されているような類似体、部分またはフラグメントはいずれも、アミノ酸レベルで、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらにいっそう好ましくは少なくとも８０％、および特に９０％より高く、９５％以上までの程度の、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列との「配列同一性」を有するような類似体、部分またはフラグメントであろう。
【００７５】
このために、所定のアミノ酸配列と、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列との「配列同一性」率は、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列内の対応する位置のアミノ酸残基と同一である所定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の数を、その所定のアミノ酸配列における総アミノ酸残基数で割り、それに１００％を掛けることによって計算することができ、この場合、―配列番号２または配列番号４の配列と比較した―、アミノ酸残基の欠失、挿入、置換または付加は、各々、単一のアミノ酸（位置）での相違と考える。
【００７６】
あるいは、前記配列同一性の程度は、上述したものなどの公知のコンピュータプログラムを使用して計算することができる。
【００７７】
また、アミノ酸レベルでのそうした配列同一性には、例えば、（特許文献１６）、（特許文献１７）、（特許文献１８）および（特許文献１９）から当業者にはよく知られている所謂「保守的アミノ酸置換」を考慮に入れることができ、そうした置換の（好ましい）タイプまたは組合せは、（特許文献２０）に挙げられている参照からの該当する教示を基に選択することができる。
【００７８】
【特許文献１６】ドイツ特許公開第２  ３５７  ７６８号公報
【特許文献１７】国際公開公報第９８／４９１８５号公報
【特許文献１８】国際公開公報第００／４６３８３号公報
【特許文献１９】国際公開公報第０１／０９３００号公報
【特許文献２０】国際公開公報第９８／４９１８５号公報
【００７９】
また、好ましくは、本明細書に記載されているような類似体、部分またはフラグメントはいずれも、配列番号２または配列番号４の配列について上で説明した生物学的活性に本質的に、すなわち、上述のアッセイによって測定して少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７５％で、９０％までの程度まで類似した生物学的活性を有するであろう。
【００８０】
例えば、（上で説明したような）本発明のアミノ酸配列と一つ以上のさらなるアミノ酸配列の融合体を使用して、例えば蛋白質融合体を生じることも、本発明の範囲内である。一般に、そうした融合体は、以下でさらに説明するように、適切な宿主細胞または宿主生物において、―本発明のヌクレオチド配列と一つ以上のさらなるコード配列との好適な融合体などの―本発明の好適なヌクレオチド配列を適切に発現させることによって得ることができる。
【００８１】
一つの特定の実施形態において、そうした融合体は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）、緑色蛍光蛋白質（「ＧＦＰ」）、ルシフェラーゼまたは別の蛍光蛋白質部分などのレポーター蛋白質と融合した本発明のアミノ酸配列を含むことができる。当業者には明らかであるように、そうした融合体は、発現分析または類似の方法論において特に使用することができる。
【００８２】
もう一つの実施形態において、融合パートナーは、発現されたアミノ酸配列を、例えば、そのアミノ酸配列または残基に対して指向性の親和性技術を使用して精製する際に使用することができるアミノ酸配列または残基でありうる。その後、前記配列または残基を（例えば、化学的または酵素的分解によって）除去して、本発明のヌクレオチド配列を生じることができる（このために、分解可能なリンカー配列によって、前記配列または残基を本発明のアミノ酸配列に場合によっては連結することができる）。そうした残基の幾つかの好ましいが非限定的な例は、複数のヒスチジン残基およびグルタチオン残基である。
【００８３】
一つの好ましいが、非限定的な態様において、そうした融合体はいずれも、配列番号２または配列番号４の配列について上で説明した生物学的活性に本質的に、すなわち、上述のアッセイによって測定して少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７５％で、９０％までの程度まで類似した生物学的活性を有するであろう。
【００８４】
本発明のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、以下の構造的特徴または保存形質の一つ以上が存在することを一般に特徴としうる：
ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）遺伝子について：配列番号３は、オープンリーディングフレームを包含するｃＤＮＡ配列であり、配列番号４は、配列番号３によってコードされる蛋白質であり、配列番号２は、シグナルペプチドをマイナスした同蛋白質である。前記アブラムシ（Ａｐｈｉｓ）ｍＡｃｈＲ蛋白質配列は、以下の表に記載されているような他のムスカリン性配列に関連し、この場合、関連値は、次のパラメータでＧｅｎｅｗｏｒｋｓ  ｖ  ２．５プログラムを使用して測定した：ギャップ開始コスト＝５０、伸長ギャップ＝１００、最小対角線長＝４、最大対角線オフセット＝１２５。典型的には、ムスカリン性受容体アミノ酸配列をアラインする時、膜貫通ＶとＶＩの間に位置する第三細胞内ループにおける非常に可変的なアミノ酸配列は、その同一性の計算から除外する。その第三ループを含めて、および除外して計算した同一性の値を以下の表に記載する。
【００８５】
【表１】
2005534291.tif 000002
【００８６】
図１Ａにおいて、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）追加シグナルペプチド配列は、太字で示されており、一方、残りのアブラムシ（Ａｐｈｉｓ）アミノ酸配列は、通常の活字で示されている。さらに、本発明は、これらのシグナル蛋白質が除去されているか、別のシグナル配列に置換されている単離蛋白質に関する。Ｓｆ９細胞において発現されたエキスタチン蛋白質に関する一つのシグナル配列の別のシグナル配列による置換、およびこの結果生じる蛋白質の発現は、（非特許文献１９）によって説明されている。これらの著者は、コンピュータ援用シグナルペプチド選択の使用も記載している。
【００８７】
【非特許文献１９】Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：４５３−９，１９９０
【００８８】
さらに、図１Ａにおいて、このアブラムシｍＡｃｈＲ受容体をコードする蛋白質の中の下線をつけた７つのペプチド配列は、見かけの膜貫通ドメインセグメントを示す。膜貫通ドメインＶとＶＩの間に位置する第三細胞内ループは、ムスカリン性受容体およびそうした受容体のＧ蛋白結合の特徴である。
【００８９】
他のムスカリン性受容体への類推によって、この機能性蛋白質は、単量体である可能性が高い。例えば、（非特許文献２０）を参照されたし。
【００９０】
【非特許文献２０】Ｈａｎｎａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｉｎ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｙ．Ｐｉｃｈｏｎ，１９９３，Ｂｉｒｋｈｕａｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｂａｓｅｌ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
【００９１】
上記に基づき、また、本発明はいずれの特定の説明または機序にも特に限定されないが、本ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、受容体としての（生物学的）活性を有する。詳細には、本発明は、穿孔および吸入に適合した口器を有するアブラムシ、ヨコバイ、コナジラミ、カイガラムシおよびナンキンムシである半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）の昆虫由来のムスカリン性受容体としての活性を示した。
【００９２】
当該技術分野では公知であるように、この種の生物学的活性は、例えば結合部位に対する標識された既知リガンドとの競合による標準的なアッセイ法を使用して；カルシウム蛍光染料を使用して、カルシウムフラックスを測定することにより；［３Ｈ］−イノシトールを使用してリン酸イノシトールの導入を測定するか、イノシトールの作動薬誘発刺激の阻害を測定することにより；ムスカリン性受容体へのグアノシン５’−［γ−３５Ｓ］−三リン酸結合により；グアノシン５’−［γ−３５Ｓ］−三リン酸結合の作動薬誘発刺激の阻害によって；蛍光共鳴エネルギー移動、時間分解蛍光もしくは蛍光光度もしくは比色レポーターアッセイなどの蛋白質相互作用に基づく蛍光アッセイにより；またはＧｑ蛋白結合受容体のアッセイ（ＤｉｃｋらおよびＴｒｉｍｍｅｒらの文献参照）に適するあらゆる手法により、測定することができる。好ましくは、生物学的活性は、カルシウム蛍光染料を使用してカルシウムフラックスを測定することにより測定する。しかし、昆虫ＣＮＳにおいて約２０〜１５０ｆＭ  ｍｇ−１の蛋白質で得られる発現レベルは低く、天然組織からムスカリン性受容体をスクリーニングするためのアッセイは困難である（Ｔｒｉｍｍｅｒらの文献参照）。
【００９３】
本発明のもう一つの実施形態は、中等度緊縮条件下、好ましくは高度緊縮条件下、特に、緊縮条件下（上に記載したものすべて）で、本発明のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる核酸プローブに関する。そうした核酸プローブは、それ自体公知の手法（これらについてもまた、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの一般手引書を参照されたし）を使用して、例えば、本発明のヌクレオチド配列を検出もしくは単離するために、または本発明のヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーとして使用することができる。
【００９４】
好ましくは、本発明の別のヌクレオチド配列を検出または単離するために使用される時、そうしたヌクレオチドプローブは、通常、ヌクレオチド数１５から１００の間、好ましくは２０から８０の間の長さを有する。増幅のためのプライマーとして使用される時、そうしたヌクレオチドプローブは、ヌクレオチド数２５から７５の間、好ましくは２０から４０の間の長さを有するであろう。
【００９５】
一般に、当業者は、本発明のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、―特に、配列番号１または配列番号２の配列―から開始し、場合によっては好適なコンピュータアルゴリズムを使用してそうしたプローブを設計することができる。また、当業者には明らかであるように、そうしたプローブは、変性プローブでありうる。
【００９６】
さらなる態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列の突然変異体および遺伝子構成体を調製する方法に関する。
【００９７】
本発明のヌクレオチド配列の天然突然変異体は、本実験の部に記載の方法に本質的に類似した方法で、あるいは、
―適切な発現ベクター系における関心のある種からのＤＮＡライブラリの構築、その後、その突然変異体配列の直接発現；
―適切な発現ベクター系における関心のある種からのＤＮＡライブラリの構築、その後、（以下で説明するような）本発明のプローブでの、または本発明のヌクレオチド配列での前記ライブラリのスクリーニング；
―関心のある種由来の突然変異体配列をコードするｍＲＮＡの単離、その後、逆転写酵素を使用するｃＤＮＡ合成
によって、またはそれ自体公知の他の好適な方法（複数を含む）または手法（複数を含む）［これについては、例えば（非特許文献２１）および（非特許文献２２）などの標準的な手引書を参照されたし］によって、得ることができる。
【００９８】
【非特許文献２１】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ．ｅｄ．），Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
【非特許文献２２】Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）
【００９９】
本発明のヌクレオチド配列のそうした合成配列を生じるための手法は、当業者には明らかであろうし、また、例えば、自動ＤＮＡ合成；部位特異的突然変異誘発；一つ以上の天然配列の二つ以上の部分の結合、および切断発現産物の発現を導く突然変異誘発；一つ以上の制限部位の導入（例えば、好適な制限酵素を使用して簡単に消化またはライゲートできるカセットまたは領域を生じるため）、ならびに例えば、テンプレートとして天然ＧＰＣＲの配列を使用し、一つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用するＰＣＲ反応による突然変異誘発、を含むことができるが、それらに限定されない。これらおよび他の手法は、当業者には明らかであろうし、また、それらについてもまた、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの標準的な手引書を参照されたし。
【０１００】
一般的に、本発明の遺伝子構成体は、例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌらなどの標準的な手引書に記載されている手法を使用し、上記の一つ以上のさらなる要素に本発明のヌクレオチド配列を適切に連結することにより生じることができる。
【０１０１】
多くの場合、本発明の遺伝子構成体は、それ自体公知の好適な（発現）ベクターに本発明のヌクレオチド配列を挿入することによって得られるだろう。好適な発現ベクターの幾つかの好ましく非限定的な例には、
―哺乳動物細胞における発現用のベクター：ｐＳＶＬ  ＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ｐ、ｐＭＡＭｎｅｏ（クローンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＳＧ５（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）および１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）；
―細菌細胞における発現用のベクター：ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）およびｐＱＥベクター（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））；
―酵母または他の真菌細胞における発現用のベクター：ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
―昆虫細胞における発現用のベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＩ１（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＭＴ／Ｖ５Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
が挙げられる。
【０１０２】
さらなる態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列、核酸または遺伝子構成体での宿主細胞または宿主生物の形質転換方法に関する。本発明は、宿主細胞または宿主生物を形質転換する、本発明のヌクレオチド配列、核酸または遺伝子構成体の使用にも関する。
【０１０３】
一つの特定の実施形態によると、宿主細胞または宿主生物における本発明のヌクレオチド配列の発現を、もとの（例えば、天然）宿主細胞または宿主生物と比較して、低下させることができる。これは、例えば当該技術分野においてよく知られているアンチセンスもしくはＲＮＡ干渉法を使用する一過性の方法で、または本発明のヌクレオチド配列のランダム、部位特異的もしくは化学的突然変異誘発を使用する構成的方法で、達成することができる。
【０１０４】
好適な形質転換法は、当業者には明らかであろうし、また、所期の宿主細胞または宿主生物、および使用される遺伝子構成体に依存しうる。好適な手法の幾つかの好ましく非限定的な例には、衝撃形質転換、（微量）注射、トランスフェクション（例えば、好適なトランスポゾンを使用）、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションおよびリポフェクションが挙げられる。これらおよび他の好適な手法についてもまた、上述の手引書および特許出願を参照されたし。
【０１０５】
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列または遺伝子構成体で首尾よく形質転換された宿主細胞または宿主生物を検出および選択するための段階を行ってもよい。これは、例えば、本発明の遺伝子構成体中に存在する選択可能なマーカーを基にした選択段階であってもよいし、または例えば特異的抗体を使用する、本発明のアミノ酸配列の検出を含む段階であってもよい。
【０１０６】
形質転換宿主細胞（安定な細胞系の形態でありうる）または宿主生物（安定な突然変異体系または株の形態でありうる）が、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１０７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明のアミノ酸配列を生成するための方法に関する。
【０１０８】
本発明のアミノ酸配列を生成し、または本発明のアミノ酸配列の発現を達成するために、形質転換宿主細胞または形質転換宿主生物は、一般に、本発明の（所望の）アミノ酸配列が発現または生成されるような条件下で、保持、維持または培養することができる。好適なる条件は、当業者には明らかであろうし、また、それは、使用される宿主細胞または宿主生物に、および本発明の（該当）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節要素に通常は依存するであろう。これもまた、上の本発明の遺伝子構成体に関する段落において述べた手引書および特許出願を参照されたし。
【０１０９】
一般に、好適な条件には、好適な培地の使用、好適な食物源または好適な栄養の存在、適温の使用、および場合によっては、好適な誘発因子または化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が、誘発性プロモータの制御下にある時）を挙げることができ、当業者は、これらすべてを選択することができる。もう一度述べるが、そうした条件下、構成的な方法で、一過性の方法で、または適切に誘発された時のみ、本発明のアミノ酸配列を発現することができる。
【０１１０】
本発明のアミノ酸配列は、（上で述べたように）未熟形で（先ず）生成することができ、その後、それを、使用される宿主細胞または宿主生物に依存して翻訳後修飾に付すことができることも、当業者には明らかであろう。また、本発明のアミノ酸配列は、これもまた使用される宿主細胞または宿主生物に依存して、グリコシル化することができる。
【０１１１】
その後、本発明のアミノ酸配列は、（分取）クロマトグラフィーおよび電気泳動法、分別沈殿法、親和法（例えば、本発明のアミノ酸配列と融合した特異的分解性アミノ酸配列を使用）、および分取免疫手法（すなわち、単離すべきアミノ酸配列に対する抗体を使用）などの、それ自体公知の蛋白質単離法および蛋白質精製法を使用して、宿主細胞または宿主生物から、または前記宿主細胞または宿主生物を培養した培地から単離することができる。
【０１１２】
一つの実施形態において、このようにして得られたアミノ酸配列を使用して、前記配列またはその抗原部分またはエピトープに対して特異的な抗体を生じることもできる。
【０１１３】
一つの実施形態において、本発明は、本発明のアミノ酸配列、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列、またはそれらの類似体、変異体、対立遺伝子、オルソログ、部分、フラグメントもしくはエピトープに対して特異的に生じる抗体、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体に関する。もう一つの実施形態において、本発明は、本発明のアミノ酸配列、好ましくは配列番号４、またはそれらの類似体、変異体、対立遺伝子、オルソログ、部分、フラグメントもしくはエピトープに対して特異的に生じる抗体、例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体に関する。
【０１１４】
本発明のさらなる態様を形成するそうした抗体は、例えば、（特許文献２１）、（特許文献２２）、（特許文献２３）、（特許文献２４）、（特許文献２５）、（特許文献２６）および（特許文献２７）に記載されているような、それ自体公知の方法で生成することができる。多くの場合、限定的ではないが、そうした方法は、本発明の適切なアミノ酸配列またはその免疫原性部位（特異的エピトープなど）により、前記アミノ酸に対する抗体を生じるような量で、およびそうした方式に従って用いて免疫応答性宿主を免疫し、その後、そのようにして生じた抗体を、例えば、前記宿主由来の血液または血清から回収するような方法を含むであろう。
【０１１５】
【特許文献２１】ドイツ特許公開第２  ３５７  ７６８号公報
【特許文献２２】米国特許第５，６９３，４９２号明細書
【特許文献２３】国際公開公報第９５／３２７３４号公報
【特許文献２４】国際公開公報第９６／２３８８２号公報
【特許文献２５】国際公開公報第９８／０２４５６号公報
【特許文献２６】国際公開公報第９８／４１６３３号公報
【特許文献２７】国際公開公報第９８／４９３０６号公報
【０１１６】
例えば、ポリクローナル抗体は、場合によっては、免疫原性担体（ウシ血清アルブミンまたはスカシガイのヘモシアニンなど）、またはフロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムもしくは類似の無機物ゲルなどのアジュバント、またはスカシガイのヘモシアニンもしくは類似の界面活性物質を使用して、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ラット、ブタまたはマウスなどの好適な宿主を本発明のアミノ酸配列（のエピトープ）で免疫することによって得ることができる。好適な免疫応答を生じた後（通常は、１〜７日以内）、公知のイムノアッセイ法を使用して所望の特性（すなわち、特異性）を有する抗体をスクリーニングする段階を場合によっては含む、それ自体公知の方法（これについても、例えば、（特許文献２８）を参照されたし）で、それら抗体を、その免疫された動物から採取した血液または血清から単離することができる。
【０１１７】
【特許文献２８】国際公開公報第９６／２３８８２号公報
【０１１８】
例えば、モノクローナル抗体は、これもまた本質的には上に挙げた参考文献に記載されているような、ハイブリドーマをベースにした手法および類似の手法を含む、培養での無限継代細胞系を使用して生産することができる。従って、本発明のアミノ酸配列に対するモノクローナル抗体を生産する細胞および細胞系は、本発明のさらなる態様を形成し、同様に、それ自体公知の手法をまた使用してそうした細胞を培養し、その培養物または培地から抗体を単離することを一般に含む、本発明のアミノ酸配列に対する抗体を生産するための方法も、本発明のさらなる態様を形成する。
【０１１９】
また、本発明のアミノ酸配列に対するＦａｂ−フラグメント（Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦａｂフラグメントなど）は、ペプシンまたは別のプロテアーゼで抗体を消化し、Ｓ−Ｓ結合を還元して、パパインおよび還元試薬でそれぞれ処理することによって、得ることができる。Ｆａｂ発現ライブラリは、例えば、（非特許文献２３）の方法によって得ることできる。
もう一つの実施形態において、本発明のアミノ酸配列、またはそうしたアミノ酸配列を発現する宿主細胞または宿主生物を使用して、本発明のアミノ酸配列の（生物学的）活性をモジュレートすることができ、または本発明のアミノ酸配列と別様に相互作用することができる化合物または他の因子を同定または開発することもでき、そうした使用は、本発明のさらなる態様を形成する。当業者には明らかであるように、本文脈における本発明のアミノ酸配列は、そうした化合物または因子との相互作用のための標的としての役割を果たすであろう。
【０１２０】
【非特許文献２３】Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：１２７５−１２８１
【０１２１】
本文脈において、用語「モジュレート」、「モジュレーション」、「モジュレータ」および「標的」は、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有し、これについては、とりわけ、（特許文献２９）において与えられている定義を参照されたし。一般に、モジュレータは、生物学的活性またはプロセス（例えば、本発明のアミノ酸配列の生物学的活性）の機能特性を強化、抑制もしくは低減することができるか、別様に変化させ、影響を及ぼし、もしくは作用することができる（総称して、「モジュレーション」と呼ぶ）化合物または因子である。
【０１２２】
【特許文献２９】国際公開公報第９８／０６７３７号公報
【０１２３】
この文脈において、本発明のアミノ酸配列は、インビトロでのモジュレーションのための標的として（例えば、アッセイまたはスクリーニングの一部として）、またはインビボでのモジュレーションのための（例えば、農芸化学、獣医学または製薬学用途に活性化合物として例えば使用することができ、その標的をモジュレートすることがわかっている化合物または因子によるモジュレーションのための）標的としての役割をはたすことができる。
【０１２４】
例えば、本発明のアミノ酸配列、宿主細胞または宿主生物は、一次的スクリーニング（例えば、その標的に関する活性が未知である試験化学物質のセットまたはライブラリからその標的のモジュレータを同定するために使用されるスクリーニング）、または二次的アッセイ（例えば、一次的スクリーニングでのヒットの妥当性を検査するために使用される、または例えば、ヒット・ツー・リード化学法（ｈｉｔｓ−ｔｏ−ｌｅａｄｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の一部として、ヒットした分子の最適化に使用されるアッセイ）など、本発明のアミノ酸配列のモジュレータの同定または開発に使用することができるアッセイまたはスクリーニングの一部として使用することができる。
【０１２５】
例えば、そうしたアッセイまたはスクリーニングは、インビトロアッセイまたはスクリーニングとして構成することができ、一般に、それは、その標的の潜在的モジュレータとして試験される化合物または因子（本明細書では、以下、「試験化学物質」とも呼ぶ）をその標的に結合させ、同時に、前記結合によって発生したシグナルを測定することを含むであろう。そうしたインビトロスクリーニングに適する手法は、当業者には明らかであろうし、例えば、（非特許文献２４）および（非特許文献２５）に記載されている。例えば、そうしたアッセイまたはスクリーニングは、試験化学物質を使用して、検出可能なリガンド（例えば、放射性リガンドまたは蛍光リガンド）を標的からはずし、同時に、そのモジュレータによってその標的からはずしたリガンドの量を測定する、結合アッセイまたはスクリーニングとして構成することができる。
【０１２６】
【非特許文献２４】Ｅｌｄｅｆｒａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，Ｖｏｌ．１，ｐａｇｅ  ２６２−２７１
【非特許文献２５】Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１１，ｐａｇｅｓ  ３２５−３２９
【０１２７】
そうしたアッセイまたはスクリーニングは、本発明の宿主細胞を試験化学物質と接触させるか、試験化合物に曝露し、同時に、その宿主細胞による少なくとも一つの生物学的応答を測定する、細胞ベースのアッセイまたはスクリーニングとして構成することもできる。
【０１２８】
また、そうしたアッセイまたはスクリーニングは、本発明の宿主生物を試験化学物質と接触させるか、試験化合物に曝露し、同時に、その宿主生物による少なくとも一つの生物学的応答（麻痺または死を含むが、これらに限定されない表現型の変化、行動の変化または生理学的変化など）を測定する、動物全身スクリーニングとして構成することもできる。
【０１２９】
それ故、一般に、上記のアッセイおよびスクリーニングは、試験化学物質を標的（またはその標的を発現している宿主細胞もしくは宿主生物）と接触させ、詳細には、試験化学物質による標的のモジュレーションを代表するシグナルを生成するような方法で試験化学物質を標的（またはその標的を発現している宿主細胞もしくは宿主生物）と接触させる段階を少なくとも一つ含むであろう。その後の段階において、前記シグナルを検出することができる。
【０１３０】
従って、一つの態様において、本発明は、
ａ）本発明のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列を含有し、もしくは発現している宿主細胞もしくは宿主生物と試験化学物質とを、前記試験化学物質と前記アミノ酸配列の間の相互作用を代表するシグナルを生成することができるような方法で接触させる段階；および場合によっては、
ｂ）そのようにして生じることができるシグナルを検出する段階
を少なくとも含む、本発明のアミノ酸配列と試験化学物質との相互作用を代表するシグナルを生成するための方法に関する。
【０１３１】
もう一つの態様において、本発明は、
ａ）本発明のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列を含有し、もしくは発現している宿主細胞もしくは宿主生物と試験化学物質とを、前記試験化学物質と前記標的の間の相互作用を代表するシグナルを生成することができるような方法で接触させる段階；および場合によっては、
ｂ）前記アミノ酸配列のモジュレータを同定することができる、そのようにして生成することができるシグナルを検出する段階
を少なくとも含む、本発明のアミノ酸配列のモジュレータを（例えば、試験化合物のセットまたはライブラリから）同定するための方法に関する。
【０１３２】
従って、本発明は、半翅目ムスカリン性受容体蛋白質活性のモジュレータを同定する方法を提供する。本方法は、半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有し、その半翅目ムスカリン性受容体を発現する組換え発現ベクターを含む試験細胞と、カルシウム含有溶液とを、試験化合物が存在する状態で接触させ、その試験細胞における細胞内カルシウム量を検出することによって試験アッセイを行う段階を含む。本方法は、半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有し、半翅目ムスカリン性受容体を発現する組換え発現ベクターを含む陰性対照細胞と、カルシウム含有溶液とを、前記試験化合物が不在の状態で接触させ、前記陰性対照における細胞内カルシウム量を検出することによって陰性対照アッセイを行う段階も含む。その試験細胞における細胞内カルシウム量を前記陰性対照細胞における細胞内カルシウム量と比較する。前記陰性対照細胞における細胞内カルシウム量と比較した、前記試験細胞における半翅目ムスカリン性受容体作動薬カルシウム量の変化により、その試験化合物が半翅目ムスカリン性受容体蛋白質活性のモジュレータであることが示される。幾つかの好ましい実施形態において、試験細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞である。幾つかの好ましい実施形態において、細胞内カルシウムは、その細胞内カルシウムと相互作用するその細胞の内部にある染料によって生じる蛍光を測定するアッセイを使用して検出される。幾つかの好ましい実施形態において、本方法は、半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有し、半翅目ムスカリン性受容体を発現する組換え発現ベクターを含む陽性対照細胞とカルシウム含有溶液とを、試験化合物が不在で、半翅目ムスカリン性受容体作動薬が存在する状態で接触させ、その陽性対照細胞における細胞内カルシウム量を検出することによって、陽性対照アッセイを行う段階をさらに含む。前記半翅目ムスカリン性受容体作動薬は、好ましくはカルバモイルクロリンである。幾つかの実施形態において、本方法は、
半翅目ムスカリン性受容体を発現しない半翅目ムスカリン性受容体陰性対照細胞とカルシウム含有溶液とを、試験化合物が不在の状態で接触させ、前記半翅目ムスカリン性受容体陰性対照細胞によって吸収されたカルシウム量を検出することにより第二のタイプの陰性対照アッセイを行う段階；および／または
半翅目ムスカリン性受容体を発現しない半翅目ムスカリン性受容体陰性対照細胞とカルシウム含有溶液とを、試験化合物が不在で半翅目ムスカリン性受容体作動薬が存在する状態で接触させ、前記半翅目ムスカリン性受容体陰性対照細胞によって吸収されたカルシウム量を検出することにより第三のタイプの陰性対照アッセイを行う段階
をさらに含む。前記半翅目ムスカリン性受容体作動薬は、好ましくはカルバモイルクロリンである。好ましい実施形態において、本方法で使用される半翅目ムスカリン性受容体蛋白質は、配列番号２、その突然変異体、そのフラグメント、配列番号４、その突然変異体、およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態において、半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列は、配列番号１または配列番号３である。
【０１３３】
幾つかの実施形態によると、半翅目ムスカリン性受容体蛋白質活性の阻害剤を同定する方法は、半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有し、半翅目ムスカリン性受容体を発現する組換え発現ベクターを含む試験細胞と、カルシウムおよび半翅目ムスカリン性受容体作動薬を含有する溶液とを、試験化合物が存在する状態で接触させ、前記試験細胞における細胞内カルシウム量を検出することにより試験アッセイを行う段階を含む。対照アッセイも、半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列を含有し、半翅目ムスカリン性受容体を発現する組換え発現ベクターを含む陰性対照細胞と、カルシウムおよび半翅目ムスカリン性受容体作動薬を含有する溶液とを、試験化合物が不在の状態で接触させ、前記陰性対照細胞における細胞内カルシウム量を検出することによって行われる。その試験細胞における細胞内カルシウム量を対照細胞における細胞内カルシウム量と比較する。対照細胞における細胞内カルシウム量と比較したその試験細胞における細胞内カルシウム量の低下は、その試験化合物が半翅目ムスカリン性受容体蛋白質活性の阻害剤であることを示す。幾つかの好ましい実施形態において、試験細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞である。幾つかの好ましい実施形態において、細胞内カルシウムは、細胞内カルシウムと相互作用するその細胞の内部にある染料によって生じた蛍光を測定するアッセイを使用することにより検出される。幾つかの好ましい実施形態において、半翅目ムスカリン性受容体作動薬は、カルバモイルコリンである。幾つかの好ましい実施形態において、半翅目ムスカリン性受容体蛋白質は、配列番号２、その突然変異体、そのフラグメント、配列番号４、その突然変異体、およびそのフラグメントから成る群より選択されるアミノ酸配列を有する。幾つかの好ましい実施形態において、前記半翅目ムスカリン性受容体をコードする核酸配列は、配列番号１または配列番号３である。
【０１３４】
当業者には明らかであるように、試験化学物質は、化合物のセットまたはライブラリ（多様なセットもしくはライブラリであってもよいし、または的を絞ったセットもしくはライブラリであってもよい）の一部でありうる。そうしたスクリーニングに使用することができるライブラリは、当該技術分野において公知の組合せ化学法、または化学合成のための通常の手段を使用して作成することができる。
【０１３５】
本発明のアッセイおよびスクリーニングは、中等度から高度の処理能力で、例えば、好適なロボット工学を使用して自動式で行うことができる。詳細には、この実施形態において、本発明の方法は、標準２４、９６、３８４、１５３６または３４５６ウエルプレートなどのマルチウエルプレートのウエル内で試験化合物と標的を接触させることにより行うことができる。
【０１３６】
通常、本発明のスクリーニングまたはアッセイでは、各測定のために、標的または宿主細胞もしくは宿主生物を単一の試験化合物のみと接触させるであろう。しかし、例えば、その組合せが相乗効果を生じるか否かを判定するために、―同時に、または逐次的に―、二つ以上の試験化合物を標的と接触させることも、本発明の範囲内である。
【０１３７】
ある試験化学物質が、（例えば、本明細書において上で説明したようなスクリーニングまたはアッセイによって）本発明のアミノ酸配列についてのモジュレータであると同定されたら、それ自体を本発明のアミノ酸関連アミノ酸配列のモジュレータ（例えば、農芸化学、獣医学または製薬学用の活性物質として）使用してもよいし、または最終使用のために、例えば、溶解度、吸着、バイオアベイラビリティ、毒性、安定性、永続性、環境影響などの特性を改善するように、場合によっては最適化してもよい。本発明のヌクレオチド配列、アミノ酸配列、宿主細胞または宿主生物および方法が、そうした最適化法に、例えば、二次的アッセイ（の一部）としてさらに使用できることは、当業者には明らかであろう。
【０１３８】
本発明は、モジュレータ（例えば、試験化学物質、化合物または因子）が、（インビボまたはインビトロで）標的をモジュレートする際の、もしくはすることによる、またはモジュレータ（例えば、試験化学物質、化合物または因子）が、（インビボまたはインビトロで）標的と相互作用する際の、もしくはすることによる、いずれの特定の方法または機序にも特に限定されない。例えば、モジュレータは、その標的のための作動薬、拮抗薬、逆作動薬、不完全作動薬、競合阻害剤、非競合阻害剤、補因子、アロステリック阻害剤もしくは他のアロステリック因子であってもよいし、または別の蛋白質もしくはポリペプチド、受容体、もしくは細胞小器官の一部などの、その（生物学的）活性を随伴する別の生体成分に対する標的の結合を増強もしくは低減する化合物もしくは因子であってもよい。それ故、このモジュレータは、（例えば、共有結合により、または水素結合により、標的の活性部位で、アロステリック部位で、結合ドメインで、または別の部位で）その標的と結合し、（可逆的、不可逆的または競合的方式で）その標的の活性部位をブロックし、（可逆的、不可逆的または競合的方式で）その標的の結合ドメインをブロックし、またはその標的の配座に影響を及ぼすか、これを変化させることができる。
【０１３９】
それ故、試験化学物質またはモジュレータは、例えば、
―標的の既知基質の類似体；
―例えば、２から２０の間、好ましくは３から１５の間のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド；
―アンチセンスまたは二本鎖ＲＮＡ分子；
―蛋白質、ポリペプチド；
―  補因子または補因子の類似体
であることができる。
【０１４０】
試験化学物質またはモジュレータは、参照化合物または因子であることもでき、それらは、標的をモジュレートするか、標的と別様に相互作用することがわかっている化合物（例えば、標的の既知基質または阻害剤）であってもよいし、またはその標的が属する一般クラスからの他のメンバーをモジュレートするか、それらと別様に相互作用することがわかっている、一般に知られている化合物である化合物または因子（例えば、前記クラスの既知基質または阻害剤）であってもよい。
【０１４１】
しかし、好ましくは、試験化学物質またはモジュレータは、小分子であり、この場合の小分子とは、分子量１５００未満、好ましくは１０００未満の分子単位を意味する。これは、例えば、有機、無機または有機金属分子でよく、これらは、水溶性塩などの好適な塩の形態であってもよい。用語「小分子」は、（総）分子量が上に示した範囲内である限り、錯体、キレートおよび類似の分子単位も包含する。
【０１４２】
さて、次の非限定的な実験の部により、本発明をさらに説明する。
実験の部：
【実施例】
【０１４３】
１．ムスカリン性受容体配列同定
材料および方法
アブラムシ・ポリＡ  ＲＮＡ単離：
水中０．１％のピロ炭酸ジエチル溶液（ウィスコンシン州ミルウォーキー、アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から入手可能な「ＤＥＰＣ」）を３７℃で約１６時間インキュベートし、その後、オートクレーブで６０分間処理した。すべてのガラス器具類を４時間、２５０℃で加熱乾燥させ、すべてのボトルキャップを０．１％ＤＥＰＣ溶液に浸漬した。Ｂｒａｕｎホモジナイザーのマイクロプローブ（ペンシルベニア州アレンタウン、Ｂ．ブラウン・バイオテック・インターナショナル（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）から入手可能）を５０ｍＬの１００％エタノール（ニュージャージー州フィリップスバーグ、ジェー．ティー．ベーカー社（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から入手可能）に浸漬し、その後、２５ｍＬのＲＮＡｚｏｌＢ（テキサス州ヒューストン、キンナ・バイオテック・ラボラトリーズ社（ＣＩＮＮＡ−ＢＩＯＴＥＣＸ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）からの塩酸グアニジニウム製剤）中でランした。ワタアブラムシをワタから収集し、風袋計量済みの遠視分離管の中に入れ、氷の上に置いた。約１．２ｇのアブラムシ材料を採収した後、それらのアブラムシを−７０℃で凍結した。次に、それらのアブラムシ（１．０ｇ）を０．５ｇのアリコート二つに計り分け、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  Ｍｉｃｒｏ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（本明細書中では、「ＰＭＫ」と呼ぶ。Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から入手可能）からのＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  １．５ｍＬ中、周囲温度で、３０秒間、最高速度で均質化した。ＰＭＫからのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３ｍＬを添加し、得られた混合物を１０秒間、均質化した。得られたマセレートを、周囲温度で１０秒間、ＳＳ３４ローター（ノースカロライナ州アシュビル、ソーバル・プロダクツ社（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｌ．Ｐ，Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ）から入手可能）において１２０００ｇで遠心分離することにより浄化した。その上清を、ＰＭＫ指定のＰＭＫからのオリゴ−ｄＴスピンカラムでバッチ処理をした。二つのカラムそれぞれについて計１．５ｍＬの三つの溶離液をプールし、ＵＶ分光測定によってＲＮＡを定量した。酢酸カリウム溶液１３０ｕＬ、無水エタノール２．６ｍＬ、およびＰＭＫで提供されたグリコーゲン２０ｕＬを添加することにより、ｍＲＮＡを沈殿させた。それらの遠心分離管を２０℃で約１６時間保管し、得られたｍＲＮＡ沈殿を１４０００ｇで１５分間遠心分離することによりペレットにした。それらのペレットを８０％エタノール水溶液で洗浄し、蒸留水に再び懸濁させた。
【０１４４】
第一鎖ｃＤＮＡの合成：
鳥類骨髄芽球性ウイルス（「ＡＭＶ」）逆転写酵素Ｉ（ウィスコンシン州マディソン、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を１．０μｇのテンプレートＲＮＡに添加することにより、逆転写を開始させた。その逆転写反応には、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＲｉｂｏＣｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔに入っていた次の試薬も含めた：５ｕＬのＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、１ｕＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＮａｓｉｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｏｔｏｒ、２．５ｕＬの４０ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、およびＲａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒ，Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマーか、変性遺伝子特異的プライマー。３’ＲＡＣＥ反応については、ＧＩＢＣＯ  Ｏｉｇｏ（ｄＴ）Ａｄａｐｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（ＡＰ）（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから入手可能）を使用して、そのｍＲＮＡを逆転写した。５’Ｒａｃｅ反応については、遺伝子特異的プライマーを逆転写に使用した。それらの反応物をＧｅｎｅａｍｐ  ９６００熱循環器（パーキン−エルマー−エー．ビー．アイ．社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩ））に配置し、Ｒａｎｄｏｍ  Ｈｅｘａｍｅｒについては６０分間、３７℃で、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５プライマーおよびＧＩＢＣＯ  Ｏｉｇｏ（ｄＴ）Ａｄａｐｔｅｒプライマーについては４２℃で、または遺伝子特異的プライマーについては５０℃で保持した。その後、５分間、９９℃に加熱し、その後、５分間、５℃にすることにより、ＡＭＶ  ＲＴを不活性化した。
【０１４５】
第二鎖ｃＤＮＡの合成：
第二鎖の合成は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト、クローンテック・ラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））からのＭａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、ＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの方法（Ｇｅｎｅ，２５，２６３，１９８３）に従って行った。第一鎖反応を利用し、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、１０ｍＭ混合物で４つのジヌクレオチドすべて、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲｎａｓｅ  Ｈを添加することにより、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｇｅｎｅａｍｐ  ９６００熱循環器を用いてその反応物を２時間１４℃でインキュベートすることより、その第二鎖反応を完了させた。Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔからのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを１０ユニット添加した。得られたｃＤＮＡを１６℃で４５分間インキュベートして、そのｃＤＮＡに平滑末端を生じさせた。その反応をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、（アルドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））から入手可能）で停止させ、（非特許文献２６）に記載されているように、フェノールクロロホルムによって二本鎖ｃＤＮＡを抽出した。その二本鎖ｃＤＮＡを含有する水性相を容積二分の一の４Ｍ酢酸アンモニウムおよび容積２．５の１００％エタノールでエタノール沈殿させた。得られた二本鎖ｃＤＮＡペレットを８０％エタノール水溶液で洗浄し、蒸留水に再び懸濁させた。５’ＲＡＣＥ反応については、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡアダプターでその二本鎖ｃＤＮＡをライゲートした。
【０１４６】
【非特許文献２６】Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９
【０１４７】
ＰＣＲ増幅：
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒのプロトコルに従って、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ａｍｐｌｉｔａｑ  ｂａｓｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔで提供されたバッファおよびｄＮＴＰを利用して、２０μＬのｃＤＮＡ反応を１００μＬにした。変性プライマーを用いる増幅には、典型的には、４５から５５℃の範囲のアニーリング温度を用い、アイソフォーム特異的プライマーを伴う増幅には、５０から６０℃のアニーリング温度を用いた。両方の場合、アニーリング温度を、２０サイクルの間、１サイクルあたり０．５度、すなわち１０度低下させるタッチダウンＰＣＲを利用した。それぞれＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  ３’ＲＡＣＥ  ｋｉｔ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）およびＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔと一緒に提供されたプライマーおよびプロトコルを用いて、３’および５’ＲＡＣＥ反応を行った。それらのＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動法により特性付けした。第二「ネステッド」増幅を行った時、バンドをＮｕＳｉｅｖｅゲル（ペンシルベニア州フィラデルフィア、エフ．エム．シー．社（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ））から切り出し、７０℃に加熱することによって溶融した。その溶融アガロースを温水で１：１希釈し、１：５μＬアリコートを第二の１００μＬ増幅容器に直接移した。
【０１４８】
プライマーの合成および設計：
オリゴヌクレオチドは、ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）により合成され、凍結乾燥ペレットとして提供されたものであり、使用前にそれをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒからの１ｘＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒで再構成した。エヌ．ビー．アイ．サイエンティフィック・ソフトウェア社（ＮＢＩ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ミネソタ州プリマス（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ））からのＯＬＩＧＯ  ４．０プログラム、およびＦｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒを通してオンラインで利用できるＨｅｎｉｋｏｆｆら（非特許文献２７）からのＣｏｎｓｅｎｓｕｓ−Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（「ＣＯＤＥＨＯＰ」）を使用して、ＰＣＲプライマーおよびプローブを設計し、アニーリング温度を概算した。
【０１４９】
【非特許文献２７】Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）
【０１５０】
サブクローニングおよびシーケンシング：
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．（カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））指定のＳｔｒａｔａｃｌｅａｎ樹脂で三回抽出することにより、ＰＣＲ反応物から蛋白質を取り出した。プライマーが、人工的制限部位を含んでいた場合には、それらを消化した。より日常的には、クレノウポリメラーゼ処理薬を充填することによりそれらのアンプリマーを平滑末端にし、その後、常用の手順によりリン酸化した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。その後、それらのアンプリマーを、ＳｅａｐｌａｑｕｅゲルまたはＮｕＳｉｅｖｅゲル（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐ．）でゲル精製し、ＱＩＡＥＸ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州チャッツワース（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）から入手可能）を使用してそのアガロースから抽出した。ＱＩＡＧＥＮ  Ｃｏｒｐ．の推奨に従って、Ｑｉａｑｕｉｋ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｃｏｒｐ．から入手可能）でアルカリ溶解プラスミドの単離および精製を行った。染料ターミネータ循環反応を利用した熱循環型シーケンシング反応を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｍｐｌｉｔａｑ  ＦＳシーケンシングキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩから入手可能）で行い、５％Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒゲルを用い、ＡＢＩ  Ｐｒｉｚｍ  ３７７自動ＤＮＡシーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−ＡＢＩから入手可能）でランすることによりその反応生成物を分析した。熱によるポリメラーゼの組込みミスのため、ヌクレオチドの割当てにエラーが生じることを回避する手段として、複数のクローン間でコンセンサスが達成することができるまで、ＰＣＲ反応生成物を有する５〜１０のクローンを両方向で配列した。Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｇｅｎｅ  Ｗｏｒｋｓプログラムを使用して、シーケンシングコンティグを組み立てた。
【０１５１】
プライマー：
利用したプライマーは、次のとおりであった：
【０１５２】
【表２】
2005534291.tif 000003
【０１５３】
上記オリゴヌクレオチドの中の変性プライマーには、［ＩＵＰＡＣ協定に従って］標識Ｎ（Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）、Ｈ（Ａ、ＣまたはＴ）、Ｓ（ＣまたはＧ）、Ｙ（ＣまたはＴ）、Ｗ（ＡまたはＴ）、Ｄ（Ａ、ＧまたはＴ）あるいはＲ（ＡまたはＧ）の位置で、モノマーの統計的な混合物が組み込まれる。下線が付いている配列は、制限部位である。
【０１５４】
ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）配列増幅
ワタアブラムシに関する増幅の説明は、すべて、図１Ａに記載の対応配列を基準にして配列位置を示す。膜貫通ドメインに下線を付ける。
【０１５５】
ネステッドＰＣＲ反応において、最初にプライマー１および５、そしてその後プライマー１および２を使用して、ヌクレオチド１２１から５５８のワタアブラムシ配列からのフラグメントを増幅し、それをクローニングして、シーケンシングした。この領域は、図１Ａに示されているように膜貫通ドメイン２の直ぐ上流から膜貫通ドメイン５までの配列から成る。この増幅について、および本明細書に記載のｍＲＮＡからの他の増幅において、増幅基質は、逆プライマー、この場合はプライマー３で逆転写することによって生成したことは、ご理解いただけよう。
【０１５６】
プライマー９でｍＲＮＡを逆転写し、その後、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔを利用して５’ＲＡＣＥを行うことにより、そのワタアブラムシ配列の上流から膜貫通ドメイン１までを拡張した。プライマー１０および１１でタッチダウンＰＣＲを行い、その後、プライマー１０および１１での反応から生じたｃＤＮＡを用い、プライマー１２および１３でネステッドＰＣＲを行った。得られたアンプリマーによって、ヌクレオチド４９から３３８の配列情報が生じた。プライマー１１および１３は、それぞれ、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  ｋｉｔからのＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ  １および２である。
【０１５７】
大きな細胞内ループ３を包含する、膜貫通ドメイン５の直ぐ上流から膜貫通ドメイン７までの領域を含む前記アブラムシ配列は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｒｉｂｏｃｌｏｎｅ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．から入手可能）からのランダム六量体で逆転写し、その後、プライマー６および８でタッチダウンＰＣＲを行うことによって生じた。この反応から生じたｃＤＮＡを、その後、ネステッドプライマー６および７で増幅して、５１６から１５５６のアンプリマーを生じた。最後に、ランダム六量体で逆転写し、その後、プライマー１４および１５でＰＣＲを行うことによってその３’末端を生じた。プライマー１５は、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  ３’−ＲＡＣＥシステムで提供されたＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（「ＵＡＰ」）である。１４２６から１６５７〜１６５９の停止コドンまでのアンプリマーを生じた。上記反応からアンプリマーを単離し、クローニングして、シーケンシングした。
【０１５８】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）配列の増幅
前記ワタアブラムシ配列に翻訳開始部位を追加するために、そのアブラムシ配列の５’末端にムスカリン性受容体のためのショウジョウバエシグナルペプチドを追加することによってキメラを構築した。そのショウジョウバエシグナルペプチドは、第一に、その配列に正確にマッチしたプライマーを使用してそれを単離する段階、そして次に人工プライマーを使用して修飾する段階による二段階で調製した。ショウジョウバエの幼虫をカロライナ・バイオロジカル・サプライ社（Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｂｉｏｌｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ）（ノースカロライナ州バーリングトン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ））から購入し、上でアブラムシについて説明したのと同じ方式でｍＲＮＡを抽出した。
【０１５９】
ショウジョウバエｍＲＮＡをランダム六量体で逆転写し、その後、ＰＣＲ反応を先ずプライマー１７と１６の間で行い、その後、プライマー１７と１８の間でネステッド反応を行って、５’ＵＴＲの一部、開始コドンおよびシグナルペプチドを含む、ショウジョウバエ５’末端の７３から３１１（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託Ｍ２７４９５における番号付けを使用）のフラグメントを生じた。得られたアンプリマーを、プライマー１９および２０で再び増幅して修飾し、前記アブラムシ配列にライゲートするために、適切な制限部位、１９についてはＳｍａＩ部位半分およびＳａｃＩＩ、２０についてはＳａｃＩ、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩを追加した。得られたアンプリマーにより、ショウジョウバエ配列の位置６３から２２４（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託Ｍ２７４９５における番号付けを使用）までのフラグメントが生じた。そのアンプリマーを洗練して、リン酸化し、ＳｍａＩ切断ｐＵＣ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から「Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ  ｐＵＣ１８」として入手可能）にライゲートして、完全にシーケンシングした。それは、（ジーンバンクアクセッションＭ２７４９５の番号付けを使用して）ジーンバンク寄託物と完全に一致することが見出された。そのプラスミドをｐＵＣＤｒｏｓと標識した。
【０１６０】
２．発現ベクター
プライマー：
利用したプライマーは、次のとおりであった：（下線を付けた配列は、追加した制限部位を示す）
【０１６１】
【表３】
2005534291.tif 000004
【０１６２】
アブラムシ（Ａｐｈｉｓ）ムスカリン性受容体
アブラムシムスカリン性受容体の二つの重複ピースを増幅し、特異的ＥｃｏＲＩ部位を使用して、その二つのピースを完全アブラムシムスカリン配列にライゲートした。プライマー２２を使用して逆転写を起こさせ（図１Ａにおける７９９で開始）、その後、プライマー２１および２２でＰＣＲを、プライマー２３および２１でネステッドＰＣＲを行うことにより、その特異的ＥｃｏＲｉ部位の３’断片を生成した。プライマー２４を使用して逆転写を起こさせ（図１Ａにおける３７８で開始）、その後、先ずプライマー２５および２６、そしてその後、プライマー２７および２６でネステッドＰＣＲを行うことにより、その特異的ＥｃｏＲＩ部位を含有する５’断片を生成した。プライマー２７および２８でそのアンプリマーを再び増幅することにより、制限部位を追加した。両方のアンプリマーを洗練して、リン酸化し、ｐＵＣ１８にライゲートして、シーケンシングした。
【０１６３】
発現のための完全配列を組み立てるために、上で説明したようなショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）シグナルペプチドアンプリマーを含有するベクターｐＵＣＤｒｏｓを、ＳａｃＩＩおよびＳｍａＩ（マサチューセッツ州ベバリー、ニューイングランド・バイオラボラトリーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から入手可能）でベクターｐＵＣ１８Ｄｒｏｓを消化することにより、上で説明したようにして生じた５’アブラムシ配列にライゲートし、その後、それらの末端を脱リン酸化した。プライマー２１および２３から上で説明したようにして生じた５’アブラムシ配列を洗練し、リン酸化し、ＳａｃＩＩで消化して、次にショウジョウバエシグナルペプチドを含有するｐＵＣベクターｐＵＣ１８Ｄｒｏｓにライゲートした。得られたベクターをシーケンシングし、ｐＵＣ１８ＤｒｏｓＡｐｈｉｄ２１−２３と標識した。
【０１６４】
その後、ショウジョウバエシグナルペプチドおよび５’アブラムシ配列を含有するベクターｐＵＣ１８ＤｒｏｓＡｐｈｉｄ２１−２３をＥｃｏＲＩで消化し、ショウジョウバエシグナルペプチドを含有するフラグメントおよび５’アブラムシフラグメントを遊離させることにより完全なアブラムシ配列が生成された。得られたフラグメントを、その後、アブラムシ配列の３’末端を含有するベクターｐＵＣ１８Ａｐｈｉｄ２７−２８に、そのベクターを先ずＥｃｏＲＩで消化し、その末端を脱リン酸化することによって挿入した。そのＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ１８Ａｐｈｉｄ２７−２８に、その後、その５’フラグメントをライゲートして、その遺伝子の組立てを完了した。このベクターｐＵＣ１８ＤｒｏｓＡｐｈｉｄｍＡｃｈＲからの挿入物をシーケンシングし、それを使用して、その発現ベクターのための挿入物を生じた。
【０１６５】
その発現ベクターを構築するために、ジーンバンクアクセッション番号Ｕ１３８６８のｐＳＶＬ  ＳＶ４０  Ｌａｔｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒを使用して、そのアブラムシ蛋白質を構成的に発現させた。その発現ベクターを組み立てるために、前記ｐＳＶＬ  ＳＶ４０  Ｌａｔｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＶｅｃｔｏｒをＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）で消化し、脱リン酸化した。同様にＢａｍＨＩで消化することにより、ｐＵＣ１８ＤｒｏｓＡｐｈｉｄｍＡｃｈＲベクターから完全なショウジョウバエ・アブラムシムスカリン性キメラフラグメントを遊離させた。得られたフラグメントをｐＳＶＬ  ＳＶ４０ベクターにライゲートし、シーケンシングした。得られた発現ベクターをｐＳＶＬｍＡｃｈＲ６−１０と標識した。
【０１６６】
３．ムスカリン性受容体安定性細胞系
材料および方法：
発現ベクターｐＳＶＬｍＡｃｈＲ６−１０を使用して、ＣＨＯ細胞においてアブラムシムスカリン性受容体を発現させた。ジョン・ウィレー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０００）およびＪａｒｖｉｓら（非特許文献２８）に概説されているようなリン酸カルシウム法を使用して、そのｐＳＶＬｍＡｃｈＲ６−１０ベクターを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（「ＡＴＴＣ」，バージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ））から入手したＣＨＯ  Ｋ１細胞に形質転換した。安定な細胞系を生じるために、ジーンバンクアクセッション番号Ｕ１３８６２のベクターｐＮｅｏ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から入手可能）を、ｐＳＶＬｍＡｃＲ６−１０ベクターでコトランスフェクトして、抗生物質ゲネチシンまたはＧ−４１８に対する耐性を付与した。このｐＮｅｏプラスミドは、抗生物質Ｇ−４１８を代謝することができる蛋白質アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（「ＡＰＨ」）をコードする。ＡＰＨ蛋白質がそれらの細胞において発現されると、それらの細胞は、抗生物質Ｇ−４１８に対して耐性となる。さらに、Ｊａｒｖｉｓら（非特許文献２９）が記載しているように、ｐＮｅｏプラスミドを含有する細胞の約５０％がｐｓｖｌｍａｃｈｒプラスミドも含有することも期待できると予想して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をｐＮｅｏベクターおよびｐＳＶＬｍＡｃｈＲ６−１０ベクターでコトランスフェクトすることにより、ＡＰＨ蛋白質とアブラムシムスカリン性受容体の両方を発現している細胞を選択することができる。
【０１６７】
【非特許文献２８】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．ＮＪ，Ｖｏｌ．３９  １８７−２０１
【非特許文献２９】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｖｏｌ．３９  １９８
【０１６８】
ｐＳＶＬｍＡｃｈＲ６−２ベクターおよびｐＮｅｏベクターを含有するリン酸カルシウム溶液中でＣＨＯ−Ｋ１細胞を３〜１６時間トランスフェクトした後、それらの細胞を新鮮な培地Ｆ−１２Ｋ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａですすぎ、抗生物質を含有しない１０％ウシ胎仔血清Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎ  Ｓｅｒｕｍ（両方ともＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから入手可能）を１６時間にわたって補充した。その後、８００ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８をその培地に添加し、それらの細胞を５％二酸化炭素中、３７℃でインキュベートすることにより形質転換細胞を選択した。７〜１０日後、独立コロニーが明らかになり、１４日目、Ｊａｒｖｉｓら（非特許文献３０）が記載したように公知のプロトコルに記載されているようなクローニングシリンダーを使用して個々のコロニーを取り出すことにより、細胞をクローニングした。ｐＮｅｏで形質転換されなかった対照細胞は、この曝露後、消滅した。その後、クローン性コロニーを、８８０ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８に恒常的に暴露しながら、９６ウエル組織培養プレート内で合流間近まで成長させた。単一クローン性クローンを保証するために、それらの９６ウエルプレートからの細胞を希釈し、６０ｍｍの組織培養ペトリ皿に配置して、次にクローンを約１０〜１４日成長させた後、選択した。その後、クローニングシリンダーを使用してそれらのクローンをもう一度選び取り、９６ウエルプレートに配置した。８８０ｍｇ／ｍＬのＧ−４１８で選択しながら、クローンを、４８、２４および６ウエルプレート内で継時的に成長させた。その後、クローンを２５ｍＬフラスコに移し、８８０ｍｇ／ｍＬの抗生物質Ｇ−４１８を含有するＦ−１２Ｋ培地中で継代させた。その継代クローンのムスカリン活性を、ムスカリン作動薬塩化カルバモイルコリン（シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）から入手可能）の添加により誘発されたカルシウムフラックスをモニターすることによってスクリーニングした。カルシウムフラックスは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中のカルシウムの測定についての製造業者の説示どおりにＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｎｏ  Ｗａｓｈ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ  Ｋｉｔ（モレキュラー・デバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）から入手可能）を使用して９６ウエルプレート形式に設定したＦＬＩＰＲ（登録商標）３８４  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）から入手可能）で測定した。クローンは、それらの効力、すなわち作動薬塩化カルバモイルコリンの存在下で生じたシグナルの振幅、および１ｍＭの塩化カルバモイルコリンにより誘導される最大蛍光の５０％を達成するために必要な作動薬の用量という観点でそれらの有効度によって選択した。以下の実施例４に記載のアッセイの開発には、クローンｐＳＶＬｍＡｃｈＲ６−２を選択した。
【０１６９】
【非特許文献３０】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９９５，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｖｏｌ．３９  １９８
【０１７０】
４．アッセイ法
上で説明したようなｐＳＶＬｍＡｃｈＲベクターおよびｐＮｅｏベクターで安定にトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を使用してアッセイを行い、クローンｐＳＶＬｍＡｃｈＲ６−２と同定した。１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから入手可能）を含有するＦ−１２Ｋ培地中、５％二酸化炭素下、３７℃で細胞を成長させた。ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬからＶｅｒｓｅｎｅ  １：５０００として入手可能）を使用して培養フラスコから細胞を取り出した。細胞を１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから入手可能）で洗浄し、９６ウエル黒色透明底プレート（マサチューセッツ州ケンブリッジ、コスター社（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手可能）にプレーティングした。それらの細胞を約１６時間、５％二酸化炭素中、３７℃でインキュベートした。その後、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中のカルシウムの測定についてのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓの説示どおりに、ＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｎｏ  Ｗａｓｈ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ  Ｋｉｔに入っていたＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔでそれらの細胞を処理した。それらの細胞は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓの説示どおりにＦＬＩＰＲ（登録商標）を使用してＦＬＩＰＲ（登録商標）Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔをロードしたそれらの細胞に最終濃度３０ｕＭの実験化合物を添加することにより、ムスカリン性受容体モジュレータのスクリーニングに使用した。それらの細胞の蛍光を２分間にわたってＦＬＩＰＲ（登録商標）３８４  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ｓｙｓｔｅｍにより測定した。ムスカリン作動薬、濃度１ｍＭの塩化カルバモイルコリンにより生じた蛍光シグナルと比較した場合の実験化合物により誘発された蛍光刺激のパーセントを測定することによって作動薬を同定した。溶媒和剤、最終濃度０．６％容量／容量のジメチルスルホキシドにより生じたバックグラウンド蛍光を、前記塩化カルバモイルコリンおよび実験化合物処理細胞シグナルから減算した。拮抗薬などの受容体の活性を低下させるモジュレータを判定するために、実験化合物を添加した後に、１ｍＭの塩化カルバモイルコリンでのシグナルの約５０％を誘発する濃度の塩化カルバモイルコリンで細胞を処理した。この場合、阻害率は、実験化合物が不在の状態で塩化カルバモイルコリンにより処理された細胞が生じた蛍光シグナルのパーセンテージとしての、実験化合物が存在する状態で塩化カルバモイルコリンが生じた蛍光シグナルとして計算した。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１Ａ−１】ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のｍＡｃｈＲ受容体をコードしていると推測される蛋白質を示す。
【図１Ａ−２】ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のｍＡｃｈＲ受容体をコードしていると推測される蛋白質を示す。
【図１Ａ−３】ワタアブラムシ（Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のｍＡｃｈＲ受容体をコードしていると推測される蛋白質を示す。
【配列表】
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