(57)【要約】本発明は式Ｉ［シクロ−（ｎ−Ａｒｇ−ｎＧｌｙ−ｎＡｓｐ−ｎＤ−ｎＥ）］のオリゴペプチド、および水溶解度が１．８ｍｇ／水ｍｌより高い部分的にエーテル化したβ−シクロデキストリンを含むオリゴペプチドの水性製剤およびその水性製剤の調製に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのオリゴペプチド
シクロ−（ｎ−Ａｒｇ−ｎＧｌｙ−ｎＡｓｐ−ｎＤ−ｎＥ）      （Ｉ）
［式中、
ＤおよびＥは、それぞれ互いに独立に、Ｇｌｙ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｓｐ（ＯＲ）、Ａｒｇ、Ｃｈａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（Ａｃ）、Ｌｙｓ（ＡｃＮＨ2）、Ｌｙｓ（ＡｃＳＨ）、Ｍｅｔ、Ｎａｌ、Ｎｌｅ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、４−Ｈａｌ−Ｐｈｅ、ｈｏｍｏＰｈｅ、Ｐｈｇ、Ｐｒｏ、Ｐｙａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｉａ、Ｔｉｃ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌを意味し、前記アミノ酸基は誘導体であってもよく、
Ｒは、１〜１８個の炭素原子数を有するアルキルを意味し、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを意味し、
Ａｃは、１〜１０個の炭素原子数を有するアルカノイル、７〜１１個の炭素原子数を有するアロイル、または８〜１２個の炭素原子数を有するアラルカノイルを意味し、
ｎは、対応するアミノ酸基のα−アミノ基上の、水素原子またはアルキル基Ｒ、ベンジルまたは７〜１８個の炭素原子数を有するアラルキル基を意味し、
ただし、少なくとも１つのアミノ酸基はＲを意味する置換基ｎを有し、また、光学活性なアミノ酸およびアミノ酸誘導体の基の場合、Ｄ体およびＬ体がともに含まれ、
また生理的に許容されるそれらの塩でもよい］
および水溶解度が１．８ｍｇ／ｍｌ水より大きなエーテル化β−シクロデキストリン
を含むオリゴペプチドの水性製剤。
【請求項２】
存在するエーテル化β−シクロデキストリンが部分的にエーテル化されたβ−シクロデキストリンであることを特徴とする請求項１に記載の水性製剤。
【請求項３】
エーテル化β−シクロデキストリンのエーテル置換基が、ヒドロキシエチル基および／またはヒドロキシプロピル基であることを特徴とする請求項１または２に記載の水性製剤。
【請求項４】
エーテル化β−シクロデキストリンのモル置換度が０．２〜１０であることを特徴とする請求項１から３の一項または複数項に記載の水性製剤。
【請求項５】
部分的にエーテル化したβ−シクロデキストリンのエーテル置換基に基づくモル置換度が０．２〜２であることを特徴とする請求項４に記載の水性製剤。
【請求項６】
部分的にエーテル化したβ−シクロデキストリンのエーテル置換基に基づくモル置換度が０．５〜０．８であることを特徴とする請求項４に記載の水性製剤。
【請求項７】
オリゴペプチドがシレンギチドであることを特徴とする請求項１から６の一項または複数項に記載の水性製剤。
【請求項８】
等張剤が等張性を達成するのに必要な量だけさらに存在することを特徴とする請求項１から７の一項または複数項に記載の水性製剤。
【請求項９】
ｐＨが５〜８、好ましくはｐＨが５．６〜７．４であることを特徴とする請求項１から８の一項または複数項に記載の水性製剤。
【請求項１０】
ｐＨが６〜７．２であることを特徴とする請求項９に記載の水性製剤。
【請求項１１】
シレンギチド２０〜１２０ｍｇ／ｍｌとモル置換度が０．５〜０．８のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン１５〜２５重量％を含有することを特徴とする請求項１から１０の一項または複数項に記載の水性製剤。
【請求項１２】
シレンギチド約８０ｍｇ／ｍｌとモル置換度が約０．５８〜０．７３のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン約２０重量％を含有することを特徴とする請求項１１に記載の水性製剤。
【請求項１３】
最初にβ−シクロデキストリンエーテルを水に溶解し、それに続いて活性成分およびさらなる補助剤を加えることを特徴とする請求項１から１２の一項または複数項に記載の水性製剤のための調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオリゴペプチドと水溶解度が１．８ｍｇ／水ｍｌより大きいエーテル化β−シクロデキストリンとを含む式Ｉのオリゴペプチドの水性製剤、および前記水性製剤の調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明による調剤中に存在するオリゴペプチドは、式Ｉのシクロペプチドである。
【０００３】
シクロ−（ｎ−Ａｒｇ−ｎＧｌｙ−ｎＡｓｐ−ｎＤ−ｎＥ）      （Ｉ）
［式中、
ＤおよびＥは、それぞれ互いに独立に、Ｇｌｙ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ａｓｐ（ＯＲ）、Ａｒｇ、Ｃｈａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｌｙｓ（Ａｃ）、Ｌｙｓ（ＡｃＮＨ2）、Ｌｙｓ（ＡｃＳＨ）、Ｍｅｔ、Ｎａｌ、Ｎｌｅ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、４−Ｈａｌ−Ｐｈｅ、ｈｏｍｏＰｈｅ、Ｐｈｇ、Ｐｒｏ、Ｐｙａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｉａ、Ｔｉｃ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌを意味しており、ここで前記アミノ酸基は誘導体であってもよく、
Ｒは、炭素原子数１〜１８のアルキルを意味し、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを意味し、
Ａｃは、炭素原子数１〜１０のアルカノイル、炭素原子数７〜１１のアロイル、または炭素原子数８〜１２のアラルカノイルを意味し、
ｎは、対応するアミノ酸基のα−アミノ基上の水素原子またはアルキル基Ｒ、ベンジルまたは炭素原子数７〜１８のアラルキル基を意味し、
ただし、少なくとも１つのアミノ酸基はＲを意味する置換基ｎを有しており、また、光学活性なアミノ酸およびアミノ酸誘導体の基の場合、Ｄ体およびＬ体がともに含まれ、また生理的に許容されるそれらの塩でもよい。］
式ＩのオリゴペプチドはＥＰ  ０  ７７０  ６２２  Ａ２に記載されている。式Ｉ中に存在するアミノ酸および置換基の重要性およびこのペプチドの調製については、同明細書を参照されたい。
【０００４】
式Ｉのオリゴペプチドは、特にβ3−またはβ5−インテグリン受容体と内在性リガンドとの相互作用を阻害するインテグリン阻害剤として働く。その化合物はインテグリンαvβ3、αvβ5、αvβ6、αIIβ3に対して活性を示すばかりでなく、αvβ1受容体、およびαvβ8受容体に対しても活性を示す。αvβ3受容体およびαvβ6受容体の封鎖はここで特に重要である。内在性リガンド線維素原によるαvβ3受容体の刺激の阻止については特にここで言及しておかなければならない。
【０００５】
上述の相互作用の結果、特に脈管形成が抑制され、そのためこのオリゴペプチドは癌治療に適したものになっている。化学名シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＭｅ−Ｖａｌ）の環式ペンタペプチドであるオリゴペプチド、シレンギチド（ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ）については特にここで言及しなければならない。シレンギチドはすでに癌疾病の処置のための臨床試験のフェーズＩＩの段階にある。
【０００６】
他のペプチドと同様、式Ｉのオリゴペプチドも水溶液として非経口的に投与するのが望ましい。したがって治療に用いるにはオリゴペプチドの水溶液が必要である。この目的に用いられる水性オリゴペプチド溶液は特定の治療要件に合致しなければならない。特に活性成分を治療に必要な量含有しなければならないし、十分な有効期間がなければならない。
【０００７】
腫瘍疾病の処置には比較的大量の活性成分の非経口投与が必要である。そのペプチドの構造のために、それらオリゴペプチドは比較的水溶解度が高い。それにもかかわらず、治療に必要な活性成分の量が比較的多いので非経口的に投与すべき活性成分溶液の体積は比較的大きくなる。これはもはや単純な注射ではなしえず、代わりに点滴しなければならない。
【０００８】
たとえばシレンギチドの生理食塩水溶液中の飽和溶解度は約１９ｍｇ／ｍｌであり、したがって、治療に使用するためには、生理食塩水溶液に１５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して安全に非経口投与される。たとえばもし、１５００ｍｇの投与量がシレンギチドによる治療に必要な場合、投与量は１００ｍｌになる。これだけの体積になるともはや単に注射ではなく、点滴しなければならず、不利である。
【０００９】
投与する活性成分溶液の体積を減らすためには、それぞれの水溶液中の活性成分含有率を高めるのが望ましい。他のペプチドと同様、オリゴペプチドの溶解度はそれぞれの溶媒のｐＨに依存している。したがって溶解度を増加させるための適当な方法は特に水性溶媒のｐＨをそのオリゴペプチドが高い溶解度を示すような値に合わせることである。しかし、この目的に必要なｐＨ値は非生理的な範囲であり、非経口投与の点では極めて危険であると見なされる。さらに生理的なｐＨから大きくかけ離れたｐＨでは水溶液中でのペプチドの分解が促進されることとなり、このタイプの溶液は不十分な保存期間しか持たないことを意味する。
【００１０】
オリゴペプチドの溶解度を高めるために膨大な研究がなされたが、望ましい成果は得られていない。たとえば、エタノールやプロパンジオールなど生理的に許容される有機溶媒を加えてシレンギチドの溶解度を改良しようと試みられたが、失敗であった。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒやポリソルベート８０などの界面活性剤の添加も同様にシレンギチドの溶解度の有意な改善はもたらさなかった。
【００１１】
クエン酸、リン酸緩衝液および界面活性剤の混合液を用いればシレンギチドの溶解度を高めることができたが、この溶液は貯蔵に対して安定ではなかった。
【００１２】
ＥＰ  ０１４９  １９７はシクロデキストリンエーテルがわずかに水溶性の薬剤の水溶解度を向上させることができることを開示している。この場合、薬剤がシクロデキストリンの環システムの疎水性の空洞中に入り込んだ包接化合物が形成されるといわれている。薬剤を空洞に入れるための前提条件は薬剤が空洞に適合することである。したがって薬剤はある空間的なサイズを超えてはならない。ＥＰ  ０  １４９  １９７で言及されている薬剤はすべて低分子量の化学物質であって、水溶解度が低い。これに対して、今問題にしている活性成分は水溶解度が比較的良好で、さらに比較的高分子量であり、したがって、空間的サイズが比較的大きいペプチドである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって本発明の目的は、式Ｉのオリゴペプチドの含有率を非経口投与に適する程度に高めた水性製剤を提供することである。その製剤は毒物学的に許容されない補助剤は含有してはならず、かつ比較的長時間にわたって安定でなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
驚くべきことに、これらの要件に合致する、式Ｉのオリゴペプチドの他に水溶解度が１．８ｍｇ／ｍｌより大きいβ−シクロデキストリンエーテルを含有する溶液の形態の製剤が見いだされた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明による製剤は、冷蔵庫の温度（２〜８℃）で、さらに室温（２５℃、６０％ｒ．ｈ．）でさえ、少なくとも６カ月間安定に貯蔵できる。驚くべきことに、本発明による製剤は、より高い温度でかつ大気湿度レベルで、たとえば温度３０℃、６０％ｒ．ｈ．（相対湿度）で３カ月間、４０℃、７５％ｒ．ｈ．でも４週間安定に貯蔵できる。
【００１６】
β−シクロデキストリンは、室温で水に１．８ｍｇ／ｍｌの飽和溶解度を有し、７個のグルコース単位からなる、α−１，４結合した環式オリゴ糖である。β−シクロデキストリンの（無水の）グルコース単位はそれぞれ２−、３−、および６−位に遊離のヒドロキシル基を有しており、いずれもエーテル化可能である。もしグルコース単位の遊離のヒドロキシル基のすべてまたは一部が１個または複数の極性の（すなわち水に溶けやすい）基を含むアルキル基、たとえばヒドロキシアルキル基でエーテル化されると、純粋なβ−シクロデキストリンに比べて増加した水溶解度をもつエーテル化β−シクロデキストリンが形成される。水溶解度を増加させる適当なヒドロキシアルキル基は、たとえば、ヒドロキシエチル基またはヒドロキシプロピル基であり、これらは、β−シクロデキストリンとエチレンオキサイドやプロピレンオキサイドなど対応するアルキレンオキサイドとの反応によりβ−シクロデキストリン中に導入することができる。
【００１７】
存在するエーテル置換基としてはヒドロキシエチル基および／またはヒドロキシプロピル基が好ましい。
【００１８】
水性製剤は、部分的にエーテル化したβ−シクロデキストリン、すなわち、無水のグルコース単位のヒドロキシル基の一部のみがエーテル化した形態で存在するβ−シクロデキストリンを含むことが好ましい。
【００１９】
エーテル化の際のβ−シクロデキストリンに対するアルキレンオキサイドの量に応じて、置換度の異なるエーテル化β−シクロデキストリンが形成される。エーテル置換に基づく置換度は以下にモル置換度（ＭＳ）として表す。これは（無水）グルコース単位１モルあたりに使用されたアルキレンオキサイドのモル量を意味する。
【００２０】
本発明によれば、水性製剤中に存在する部分的にエーテル化されたβ−シクロデキストリンはモル置換度０．２〜１０である。エーテル化βシクロデキストリンは０．２〜２のモル置換度が好ましく、０．５〜０．８のモル置換度が特に好ましく、約０．５８〜０．７３のモル置換度が最も好ましい。
【００２１】
本発明による水溶液中に存在するオリゴペプチドは、上記一般式Ｉで網羅されるどのオリゴペプチドでもよい。水性製剤中に存在するオリゴペプチドは、シクロ−（ＮＭｅＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−ＮＭｅＶａｌ）、シクロ−（Ａｒｇ−ＮＭｅＧｌｙ−Ａｓｐ−ＤＰｈｅ−Ｖａｌ）、シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＭｅＡｓｐ−ＤＰｈｅ−Ｖａｌ）、またはシクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＮＭｅＤＰｈｅ−Ｖａｌ）が好ましい。シレンギチドが特に好ましい。すでに上述したように、シレンギチドは化学名シクロ−（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＮＭｅ−Ｖａｌ）である。
【００２２】
水性製剤がオリゴペプチドの浸透的性質のためにまたシクロデキストリンのために等張性となっていない場合には、等張剤、好ましくはたとえば、塩化ナトリウムや塩化カリウムなど生理的に許容される塩、あるいは、たとえばグルコース、グリセリン、マンニトールなど生理的に許容されるポリオールまたは糖が等張性を達成するのに必要な量でさらに存在させることができる。
【００２３】
さらに、本発明による水性製剤はさらに、生理的に許容される補助剤、たとえば、アスコルビン酸やグルタチオンなどの抗酸化剤、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、クロロブタノール、チオマーサルまたはベンザルコニウムクロライドなどの保存剤、あるいはさらなる安定剤、構造形成剤および、たとえばＰＥＧ  ３０００、３３５０、４０００、６０００などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはデキストランなどの可溶化剤を含んでもよい。
【００２４】
さらに、本発明による水性製剤は緩衝剤を含んでもよい。それは原理的には希望するｐＨにするのに適した生理的に許容される物質であれば何でもよい。どのような緩衝液物質であっても５ｍｍｏｌ／ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度で存在し、１０〜２０ｍｍｏｌ／ｌの濃度が好ましい。
【００２５】
好ましい緩衝液はクエン酸緩衝液またはリン酸緩衝液である。適当なリン酸緩衝液は、リン酸のモノナトリウム塩および／またはジナトリウム塩およびカリウム塩の溶液であり、たとえばリン酸水素二ナトリウムまたはリン酸二水素カリウム、およびたとえば、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムの混合物などナトリウム塩とカリウム塩の混合物である。
【００２６】
この水性製剤は５〜８のｐＨが有利であり、５．６〜７．４のｐＨが好ましく、６〜７．２のｐＨが特に好ましい。オスモル濃度は２５０〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇが好ましい。このようにすれば水性製剤は直接静脈を通してまたは動脈を通して実質的に痛みなしに投与可能となる。
【００２７】
本発明の好ましい実施形態によれば、水性製剤はシレンギチド２０〜１２０ｍｇ／ｍｌ、およびモル置換度が０．５〜０．８のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン１５〜２５重量％を含有する。
【００２８】
発明の特に好ましい実施形態によれば、水性製剤はシレンギチド約８０ｍｇ／ｍｌ、およびモル置換度が約０．５８〜０．７３の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン約２０重量％を含有する。
【００２９】
この水性製剤は製剤中に存在する物質を逐次水に溶解することによって調製することができる。有利なやり方としては、まずシクロデキストリンエーテルを水に溶かし、次いでオリゴペプチドおよび他の補助剤をその後に加える。したがって本発明はまた、まずβ−シクロデキストリンエーテルを水に溶かし、活性成分およびさらなる補助剤をその後に加えることを特徴とする、本発明による水性製剤の調製方法に関する。
【００３０】
必要ならば、特定のオリゴペプチド、β−シクロデキストリンエーテルおよびさらなる補助剤を含む溶液を５〜８のｐＨに合わせる。その溶液をその後無菌濾過する。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例によって本発明を説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【００３２】
実施例１
シレンギチドの例によるオリゴペプチドの飽和溶解度
飽和溶解度を決定するために、オリゴペプチドを室温でそれぞれの場合について記載した溶媒中で１時間攪拌した。結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
2005534671.tif 000002
【００３４】
この結果はオリゴペプチドの水への飽和溶解度はアルコール類、エタノールおよびプロパンジオールの添加によっては増加せずかえって減少することを示している。対照的に、酸性の範囲における種々の緩衝液混合液は著しい飽和溶解度の増加をもたらす。界面活性剤をオリゴペプチドの溶解度の増加した酸性の溶液に加えても、さらなる著しい溶解度の増加はもたらさない。界面活性剤の代わりに、あるいは界面活性剤に加えて、グリセリンを酸性のその溶液に添加すると溶解度の減少さえ観測された。
【００３５】
実施例２
実施例１から選ばれたオリゴペプチドの飽和溶解度の高い組成物の安定性
シレンギチドが高い飽和溶解度を示す選ばれた組成物を２５℃、６０％ｒ．ｈ．および４０℃、７５％ｒ．ｈ．で８週間および２６週間貯蔵し、最初（開始時）と貯蔵時間後に高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＵＶ）でシレンギチド濃度を分析した。結果を表２に示す。
【００３６】
【表２】
2005534671.tif 000003
【００３７】
シレンギチド６０ｍｇ／ｍｌの濃度の製剤で十分な安定性を示すものはない。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＲＨ４０またはポリソルベート８０ＶＳの添加では純粋な緩衝液に比べて良好な安定性は得られなかった。１５ｍｇ／ｍｌのシレンギチドを含有する３種類の製剤の試験では著しくよい結果を示した。等張ＮａＣｌ溶液では最も安定であった。
【００３８】
実施例３
β−シクロデキストリンエーテルを添加した場合のオリゴペプチドの飽和溶解度
実施例１と同様に、シレンギチドを例として、オリゴペプチドの飽和溶解度に対するβ−シクロデキストリンエーテル（ＭＳ  ０．６３）添加の効果を決定した。結果を表３に示す。
【００３９】
【表３】
2005534671.tif 000004
【００４０】
この結果はβ−シクロデキストリンエーテルの添加による、シレンギチドの溶解度の著しい増加を示している。実施例１の添加剤の試験とは対照的に、溶解度の増加はβ−シクロデキストリンエーテルの濃度に直接比例している。
【００４１】
実施例４
注射用の水１ｍｌあたり
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＭＳ  ０．６３）２００ｍｇ
シレンギチド８０ｍｇ
を含有む水性製剤
指示量の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを指示量の約９０％の注射用の水に攪拌しながら溶解し、指示量のオリゴペプチドを加え、清澄な溶液が得られた後、残りの溶媒を加えた。得られた溶液を無菌濾過し、６ｍｌの小瓶に各２ｍｌの溶液を入れ、栓でシールし圧着した。
【００４２】
実施例５
等張性生理食塩水溶液中またはβ−シクロデキストリンエーテル溶液中にオリゴペプチドを含む製剤の安定性比較試験
実施例４による製剤、および等張性生理食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）中に１５ｍｇ／ｍｌのシレンギチドを含む同様に調製した製剤を安定性試験に供した。この目的のために水性製剤を種々の温度で、ある時間貯蔵し、適当な分析法で分析した。オリゴペプチドの場合の水溶液における可能性のある不安定性は、主として転移および加水分解生成物の生成で明らかとなる。シレンギチドの場合、分解生成物は依然として同じ発色団を持っており、出発物質と同様にＨＰＬＣ−ＵＶで決定することができる。結果を表４〜６に示す。
【００４３】
【表４】
2005534671.tif 000005
【００４４】
【表５】
2005534671.tif 000006
【００４５】
【表６】
2005534671.tif 000007
【００４６】
実施例３による製剤中に存在するオリゴペプチドは、等張性生理食塩水溶液中の製剤におけるよりも５倍を超える濃い濃度で存在するが、β−シクロデキストリンエーテルを含む実施例３による製剤は等張性生理食塩水溶液中の製剤と同程度の安定性を示す。
【００４７】
分析試験法：
外観
調製した製剤は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．に記載されているように光源の助けを借りて黒い壁を背景として目視で粒子を検査した。
【００４８】
シレンギチドの検定および純度測定
検定および純度測定は、ＨＰＬＣ−ＵＶ法により、波長２１５ｎｍで行った。分離にはＲＰ１８相を用いた。使用した溶離液はリン酸二水素ナトリウムとリン酸からなるｐＨ３．６の緩衝液であり、これをアセトニトリルと同じ割合で混合した。添加するアセトニトリルの割合を変化させてグラジエント溶離を行った。
【国際調査報告】
2005534671.tif 000008
2005534671.tif 000009
2005534671.tif 000010
2005534671.tif 000011
2005534671.tif 000012
2005534671.tif 000013
2005534671.tif 000014
2005534671.tif 000015