(57)【要約】本発明は、骨損失の危険性がある脊椎動物における骨格系障害を処置する際、ならびに骨増殖の必要性によって特徴付けられる状態を処置する際、骨折を処置する際、および軟骨障害を処置する際に使用するための、組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、骨増殖を増強するためのＮＯ−ビスホスホネートアセンブリの使用に関する。この動物は、動物が、骨粗鬆症、骨折もしくは骨欠乏、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、歯周病もしくは歯周欠損、転移性骨疾患、骨移植、骨の分節性欠損、骨溶解性骨疾患、形成術後、補綴関節手術後の変性性関節状態、歯移植後または軟骨の障害もしくは傷害を有し得る／罹患し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物における骨形成または骨無機質密度を増強するための方法であって、このような増強を必要とする該脊椎動物に、治療有効量のＮＯ−ビスホスホネートを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＮＯ−ビスホスホネートが、ＮＯ−（４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン）ビス−ホスホネート（ＮＯ−アレンドロネート）、ＮＯ−（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン）ビス−ホスホネート（ＮＯ−パミドロネート）、ＮＯ−（ジクロロメチレン）−ビス−ホスホネート、（ＮＯ−クロドロネート）、ＮＯ−［１−ヒドロキシ−２（３−ピリジニル）−エチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−リセドロネート）、ＮＯ−［１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ゾロンドロネート）、ＮＯ−（１−ヒドロキシエチリデン）−ビス−ホスホネート（ＮＯ−エチドロネート）、ＮＯ−［１−ヒドロキシ−３−（メチルペンチルアミノ）プロピリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−イバンドロネート）、ＮＯ−［［（４−クロロフェニル）チオ］メチレン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−チルドロネート）、ＮＯ−（６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン）−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ネリドロネート）、ＮＯ−（［３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−オルパドロネート）、ＮＯ−［（シクロヘプチルアミノ）−メチレン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−イカドロネート）またはＮＯ−［１−ヒドロキシ−２−イミダゾ−（１，２−ａ）ピリジン−３−イルエチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ＹＨ５２９）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記脊椎動物被験体が、哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＯ−ビスホスホネートが、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤とともに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記動物が、骨粗鬆症、骨折もしくは骨欠乏、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、歯周病もしくは歯周欠損、転移性骨疾患、骨移植、骨の分節性欠損、骨溶解性骨疾患、形成術後、補綴関節手術後の変性性関節状態、歯移植後または軟骨の障害もしくは傷害を有する／罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記動物に、骨増殖を増強するかまたは骨吸収を減少させるさらなる薬剤を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、骨形態形成タンパク質、成長ホルモン、エストロゲン、スタチン、ビスホスホネート、骨原性因子、抗吸収剤、軟骨由来の形態形成タンパク質、分化因子、骨増殖刺激化合物、ＮＦ−κＢインヒビター、プロテアソームインヒビター、プロテアソーム産生インヒビターまたはステロイドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＯ−ビスホスホネートおよびさらなる薬剤が、同時にまたは順次、投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＯ−ビスホスホネートおよびさらなる薬剤が、単一の薬学的処方物中に処方されるか、または各々が別々の薬学的処方物において処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
脊椎動物における骨芽細胞の増殖および／または分化を刺激する方法であって、このような刺激および／または分化を必要とする該脊椎動物に、治療有効量のＮＯ−ビスホスホネートを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
脊椎動物における骨吸収を減少させる方法であって、このような減少を必要とする該脊椎動物に、治療有効量のＮＯ−ビスホスホネートを投与する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
ＮＯ−ビスホスホネート、および骨増殖を増強するかまたは骨吸収を減少させるさらなる薬剤を含む組合せ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組合せを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨損失の危険性がある脊椎動物における骨格系障害を処置する際、ならびに骨増殖の必要性によって特徴付けられる状態を処置する際、骨折を処置する際、および軟骨障害を処置する際に使用するための、組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、骨増殖を増強するためのＮＯ−ビスホスホネート活性（例えば、ＮＯ−ビスホスホネート化合物）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
骨は、骨芽細胞（これは、新しい骨を生じる）および破骨細胞（これは、骨を破壊する）によって媒介される複雑なプロセスにおいて、不断の破壊および再合成を受ける。これらの細胞の活性は、多数のサイトカインおよび増殖因子により制御され、その多くが現在同定されており、クローン化されている。
【０００３】
骨形成を増強するかまたは骨吸収を阻害する必要性によって特徴付けられる非常に多数の状態が存在する。おそらく、最も明らかなものは、骨折の場合であり、ここで、骨増殖を刺激して、骨修復を急がせて、完了させることが望ましい。骨形成を増強する薬剤はまた、顔の再建手順に有用である。他の骨欠乏状態としては、骨の分節性欠損、歯周病、転移性骨疾患、骨溶解性骨疾患および結合組織修復が有益である状態（例えば、軟骨の欠損または傷害の治癒または再生）が挙げられる。また大変重大であるのは、加齢性骨粗鬆症および閉経後のホルモン状態に関連する骨粗鬆症を含め、骨粗鬆症の慢性状態である。骨増殖の必要性によって特徴付けられる他の状態としては、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、廃用性骨粗鬆症、糖尿病関連の骨粗鬆症、およびグルココルチコイド関連の骨粗鬆症が挙げられる。
【０００４】
骨折は、ギプス包帯、装具、係留デバイスおよび他の全く機械的な手段をもっぱら使用して、依然として処置されている。閉経後骨粗鬆症に関連した骨のさらなる悪化は、エストロゲンまたはビスホスホネートで処置されており、これらは、一部の個体にとっては欠点を有し得る。骨または他の骨格障害（例えば、軟骨に関連する骨格障害）の処置は、骨形成を増強することもしくは骨吸収を阻害することのいずれか、またはその両方によって達成され得る。
【０００５】
骨組織は、骨細胞を刺激する能力を有する因子の優れた供給源である。従って、屠殺場から得られるウシ骨組織抽出物は、骨の構造的整合性を維持する役割を果たす構造タンパク質だけでなく、骨細胞を刺激して増殖させ得る、生物学的に活性な骨増殖因子もまた含む。これらの後者の因子の中には、トランスフォーミング増殖因子β、ヘパリン結合性増殖因子（例えば、酸性線維芽細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子）、インスリン様増殖因子（例えば、インスリン様増殖因子Ｉおよびインスリン様増殖因子ＩＩ）ならびに骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）と呼ばれる、最近記載されているタンパク質ファミリーがある。これらの増殖因子の全ては、他種類の細胞ならびに骨細胞に影響を及ぼす。
【０００６】
骨形成の原因となる細胞は、骨芽細胞である。前駆体から成熟骨形成細胞へと骨芽細胞が分化するにつれて、これらは、骨基質の多くの酵素および構造タンパク質（１型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチンおよびアルカリホスファターゼが挙げられる）を発現および分泌する。これらもまた、骨基質中に貯蔵される多くの増殖調節ペプチドを合成し、そしておそらく正常な骨形成の原因である。これらの増殖調節ペプチドとしては、ＢＭＰ（Ｈａｒｒｉｓ  Ｓ．ら（１９９４）前出）が挙げられる。胎仔ラットの頭蓋冠骨芽細胞の一次培養物の研究において、頭蓋冠の骨芽細胞、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４およびＢＭＰ６は、鉱化された骨小節（Ｈａｒｒｉｓ  Ｓ．ら（１９９４）前出）の形成の前に、培養細胞によって発現される。アルカリホスファターゼ、オステオカルシンおよびオステオポンチン同様、ＢＭＰは、培養骨芽細胞が増殖して分化するにつれて、培養骨芽細胞によって発現される。
【０００７】
しかし、これらのデータは、デキサメタゾンおよび他のインデューサー（例えば、ＢＭＰ）が骨芽細胞の分化を誘導し、オステオカルシンｍＲＮＡを刺激するという報告とは逆である（Ｂｅｌｌｏｗｓ，Ｃ．Ｇ．ら，Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｂｉｏｌ（１９９０）１４０：１３２−３８；Ｒｉｃｋａｒｄ，Ｄ．Ｊ．ら，Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｂｉｏｌ（１９９４）１６１：２１８−２８）。さらに、Ｄｕｃｙ，Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２：４４８−５２は、オステオカルシン欠損マウスが、骨吸収を損なうことなく、骨形成の増加および改善された機能的品質の骨によって特徴付けられる表現型を示すと近年報告した。Ｄｕｃｙらは、彼らのデータが、オステオカルシンアンタゴニストが（骨粗鬆症の予防または処置のための）エストロゲン補充療法に関連した治療用途のものであり得ることを示唆すると述べる。しかし、骨増殖を刺激するかまたは骨損失を緩和するさらなる処置についての必要性が存在し続ける。
【０００８】
ビスホスホネート（以前はジホスホネートと呼ばれた）は、２つのＣ−Ｐ結合によって特徴付けられる化合物である。これらの２つの結合が同じ炭素原子に存在する場合、Ｐ−Ｃ−Ｐ構造となり、この化合物は、ジェミナル（ｇｅｒｍｉｎａｌ）ビスホスホネートと呼ばれている。それゆえ、これらは、酸素の代わりに炭素を含むピロホスフェートのアナログである。アレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）、エチドロネート（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ）、イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イカドロネート（ｉｃａｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート（ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、リセドロネート（ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）、チルドロネート（ｔｉｌｕｄｒｏｎａｔｅ）およびゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）を含め、多数の公知の薬理学的に活性なビスホスホネートが存在する。これらの薬理学的に活性なビスホスホネートの主な効果は、インビトロおよびインビボの両方での吸収を阻害することである。これらの効果は、強く結合（ｂｏｎｅ）している骨の表面における固相リン酸カルシウムに対するこれらの化合物の顕著な親和性に関連がある。本質的には、これらは、骨を標的としており、そこでの破骨細胞活性の薬理学的阻害を惹起する。ビスホスホネートの作用形態は、まだ完全には解明されていない。インビボでのそれらの作用が、完全ではなかったとしても大部分が、結晶溶解の生理化学的な阻害以外の機構によって媒介されていることは疑いがない。ビスホスホネートが破骨細胞の活性を阻害することによって作用するという一般的合意が存在する。破骨細胞は、ビスホスホネート含有骨と接触するときに阻害される。これは、無機質に対するそれらの強い親和性に起因して、ビスホスホネートが骨上へ堆積し、次いで破骨細胞がビスホスホネート含有骨を飲作用し始めたときに破骨細胞が阻害されるという仮説を支持する。ビスホスホネートが破骨細胞活性を阻害する生化学的機構は、まだ不明であり、そしておそらく、１より多くの機構が作動し得る。
【０００９】
今まで調査されたビスホスホネートは、吸収され、貯蔵され、そして身体内に未改変で排出されるようである。従って、ビスホスホネートは、動物中および溶液中で非生体分解性のようである。ビスホスホネートについての大部分の薬物動態学的データは、エチドロネート、クロドロネートおよびパミドロネートを用いて得られた。腸管吸収は、１％と１０％との間である。吸収されたビスホスホネートのうちの２０％と５０％との間のものは、骨に局所し、残りは迅速に尿中に排出される。
【００１０】
窒素含有ビスホスホネート（例えば、アレンドロネートおよびパミドロネート）は、骨損失を防止する際に有効であることが示されているが、これらの薬物はまた、上部消化管に損傷を引き起こし得るようであり、そしてそれらは、アレンドロネートで処置された患者における重篤な食道炎の症例がいくつか報告されている。アレンドロネートはまた、骨粗鬆症および骨のパジェット病の処置のために処方された用量で健常なボランティアに与えられた場合、ヒトの胃において糜爛および潰瘍を引き起こし、そして既存の病変の治癒を妨害することが示されている。
【００１１】
循環しているビスホスホネートの半減期は短く、ラットにおいては、ほんの数分のオーダーである。ヒトにおいては、これはいくらか長く、約２時間である。いくつかの動物種における急性投与、亜急性投与および慢性投与は、ほとんど毒性を現さなかった。催奇形試験、マイトジェン試験および発癌性試験は、陰性であった。
【００１２】
他の薬剤は、骨の吸収を防止することによって作動するようである。従って、米国特許第５，２８０，０４０号は、骨粗鬆症の処置に有用と記載される化合物を開示する。これらの化合物は、おそらく、骨吸収を防止することによってこの結果を達成する。
【００１３】
一酸化窒素（ＮＯ）は、骨の代謝活性に重大な影響を及ぼすことが最近示された。この生物学的に活性な分子は、一酸化窒素シンターゼと呼ばれる一組の酵素によって生物学的に生成される。この酵素には、３つの公知の形態が存在する。第１に、この酵素の発現、従って、一酸化窒素の酸性が多くの炎症刺激によって誘導され得る誘導可能な形態である、ｉＮＯＳ。第２に、誘導できない構成型形態である、ｅＮＯＳ。
【００１４】
脈管内皮が血管拡張を刺激する能力の障害として定義される内皮機能不全は、アテローム性動脈硬化症の発症ならびにアテローム性動脈硬化症の素因となる種々の病理学的状態（例えば、高コレステロール血症、高血圧、２型糖尿病、ハイパーホモシスト（ｈｙｐｅｒｈｏｍｏｃｙｓｔ）貧血症および慢性腎不全）において重要な役割を果たす。内皮機能不全の主な原因は、内皮ＮＯシンターゼ（ｅＮＯＳ）によって脈管内皮においてＬ−アルギニンから産生される強力な生物学的血管拡張剤である一酸化窒素（ＮＯ）の減少した生物学的利用能である。脈管の疾患において、ＮＯの生物学的利用能は、ｅＮＯＳによるＮＯ産生の減少および／または酸化的ストレスの増加に起因したＮＯ分解の増強を含むさまざまな機構によって損なわれ得る。ｅＮＯＳの非活性化は、その内因性インヒビターＮ（Ｇ）Ｎ（Ｇ）−ジメチル−Ｌ−アルギニン（ＡＤＭＡ））の上昇した血漿レベルとしばしば関係している。高コレステロール血症において、有機ＮＯドナーを使用した最近のインビボおよびインビトロでの研究によって示唆されるように、ＮＯの全身欠損はまた、肝臓による低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の合成および代謝を調整することによってそのレベルを上昇させ得る。ＮＯの生物学的利用能の上昇によって脈管疾患の危険性を減らすことを目的とする治療ストラテジーは、開発され続ける。
【００１５】
一酸化窒素（ＮＯ）は、骨細胞機能に重要な影響を有する遊離ラジカルである。内皮イソ型の一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）は、構成的なベースで骨において広く発現され、一方、誘導性ＮＯＳは、炎症性刺激に応答してのみ発現される。ニューロンＮＯＳが骨細胞によって発現されるか否かは、現在不明である。炎症促進性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ）は、骨細胞におけるｉＮＯＳ経路の活性化を引き起こし、そして、この経路から誘導されるＮＯは、サイトカインおよび炎症誘発性骨損失を増強する。ＮＯのこれらの作用は、ＮＯ産生の増加およびサイトカイン活性化によって特徴付けられる、慢性関節リウマチのような炎症性疾患における骨粗鬆症の病因に関連する。インターフェロンγは、他のサイトカインと合わされた場合、ＮＯ産生の特に強力な刺激因子であり、常に高濃度のＮＯの産生を引き起こす。これらの高レベルのＮＯは、骨吸収および骨形成を阻害し、そして重篤な炎症において、骨の代謝回転を抑制するように作用し得る。ｅＮＯＳイソ型は、骨芽細胞活性および骨形成を調節する際に重要な役割を果たすようである。なぜなら、ｅＮＯＳノックアウトマウスは、不完全な骨形成に起因した骨粗鬆症を有するからである。他の研究は、ｅＮＯＳ経路から誘導されたＮＯが骨におけるエストロゲンの効果のメディエーターとして作用することを示した。ｅＮＯＳはまた、骨格（ここで、ｅＮＯＳは、プロスタグランジンとともに作用する）に対して機械的荷重の効果を媒介し、骨形成を促進し、そして骨吸収を抑制する。薬理学的ＮＯドナーは、実験動物における骨量を増やすことを示した。そして、予備的な証拠は、これらの薬剤がまた、ヒトにおける骨の代謝回転に影響を及ぼし得ることを示唆する。これらのデータは、Ｌ−アルギニン／ＮＯ経路が、骨疾患の防止および処置における治療的介入のための新しい標的を表すことを示す。
【００１６】
多くの生物学的事象における一酸化窒素の重要性のため、多数のＮＯ放出化合物が現在合成されている。これらの多くは、ＮＯを非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤＳ）（例えば、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフェナクおよびナプロキセン）に連結する用途を含む。これらの薬剤は、血流および粘液分泌を増加させ、そして胃におけるフリーラジカル生成を減少させることにより、ＮＳＡＩＤによる所望でない影響から消化管を逃れさせることが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
（発明の要旨）
一つの局面では、本発明は、脊椎動物被験体における、骨形成もしくは骨無機質密度を増強する方法、または、病理学的な骨状態を処置する方法、または変性性関節状態を処置する方法に関し、この方法は、このような処置を必要とする脊椎動物被験体に、（ＮＯ−ビスホスホネート）を放出し得る形態で一酸化窒素が結合されている有効量のビスホスホネートを投与し、それにより、この脊椎動物被験体において骨形成もしくは骨無機質密度が増強されるか、またはこの病理学的骨状態もしくは変形性関節状態が処置される工程を包含する。このＮＯ−ビスホスホネートは、単独で、組合せで、または骨増殖を促進するかもしくは骨吸収を阻害するさらなる薬剤もしくは第２の薬剤と関連して用いられ得る。
【００１８】
別の局面では、本発明は、（好ましくは、薬学的組成物の形態の）組合せに関し、この組合せは、ＮＯ−ビスホスホネート化合物と、骨増殖を促進するかまたは骨吸収を阻害する非ＮＯ−ビスホスホネート化合物とを含む。単独で、組合せで、または骨増殖を促進するかもしくは骨吸収を阻害する非ＮＯ−ビスホスホネート化合物を有する、ＮＯ−ビスホスホネート化合物を含むキットおよび製品が提供される。
【００１９】
任意の適切な骨エンハンサーもまたは骨吸収インヒビターが、組合せにおいて用いられ得る。組合せで用いられ得るこのような薬剤の例としては、以下が挙げられる：骨形態形成因子、抗吸収剤、骨原性因子、軟骨由来の形態形成タンパク質、成長ホルモン、エストロゲン、ビスホスホネート、スタチン、分化因子、ＮＦ−κＢの活性を阻害する化合物（例えば、抗ＮＦ−κＢ抗体）、ＮＦ−κＢの産生を阻害する化合物（例えば、例えば、抗ＮＦ−κＢアンチセンスオリゴ）、プロテアソーム活性の活性を阻害する化合物（例えば、プロテアソームタンパク質に特異的に結合する抗体）およびプロテアソームタンパク質の産生を阻害する化合物（例えば、プロテアソームタンパク質をコードする遺伝子またはＲＮＡと相補的であるアンチセンスオリゴ）。臨床用途については、抗体は好ましくは、モノクローナル抗体またはヒト化抗体である。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明に従って、骨欠損を罹患している被験体における骨欠損（骨粗鬆症、骨折、溶骨性病変および骨分節欠陥を含む）を処置する方法が提供され、この方法は、この被験体に、骨増殖を刺激するのに十分な量のＮＯ−ビスホスホネートを投与する工程を包含する。
【００２１】
開示を明確にするため、そして、限定ではなく、発明の詳細な説明は、以下のサブセクションに分けられる。
【００２２】
（Ａ．定義）
異なって定義されない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において言及される、全ての特許、出願、公開された出願および他の刊行物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースからの配列は、それらの全体が参考として引用される。このセクションに示される定義が、本明細書中に参考として援用される出願、公開された出願および他の刊行物ならびにＧｅｎＢａｎｋおよび他のデータベースからの配列に示される定義と逆であるかさもなければ不一致の場合、このセクションに示される定義が優先する。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも一つ」または「１以上」を意味する。本明細書中で用いられる場合、「または」は、代替または組合せを意味する。
【００２４】
本明細書中で用いられる場合、「増強する」は、脊椎動物における、骨形成もしくは骨増殖、または骨無機質密度を促進、増大または刺激することを意味する。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、特定の疾患を処置するための化合物の「有効量」は、この疾患に関連した症状を改善するかまたは何らかの様式で低減するに十分な量である。このような量は、単回用量として投与されてもよく、またはそれが有効であるレジメンに従って投与されてもよい。この量は、この疾患を治癒し得るが、代表的には、この疾患の症状を改善するために投与される。反復投与は、症状の所望の改善を達成するために必要とされ得る。本発明においては、組成物の「有効量」は、統計学的に有意な硬化を生じる量である。例えば、治療的な使用のための「有効量」は、以下を提供するために本明細書において必要とされる活性化合物を含む組成物量である：骨折修復の治癒率における臨床的に有意な増加；骨粗鬆症における骨損失の逆転；軟骨欠損または軟骨障害の逆転；骨粗鬆症の発症の防止または遅延；骨折の偽関節および伸延骨形成における骨形成の刺激および／または増強；補綴デバイスへの骨増殖の増加および／または加速；ならびに歯の欠損の修復。このような有効量は、慣用的最適化技術を使用して決定され、そして処置されるべき特定の状態、患者の状態、投与経路、処方物、ならびに実施者の判断および当業者に明らかな他の要因に依存している。
【００２６】
本明細書中で用いられる場合、「薬学的に受容可能な塩、エステルまたは他の誘導体」は、このような誘導体化のための公知の方法を使用して当業者によって容易に調製され得、かつ、相当な毒性の影響がなく動物または人間に投与され得る化合物を産生し、かつ薬学的に活性であるかまたはプロドラッグである、任意の塩、エステルまたは誘導体を包含する。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、「処置」は、状態、障害または疾患の症状が改善されるかまたはさもないと有益に変更される、任意の様式を意味する。処理はまた、本明細書における組成物のあらゆる薬学的使用を包含する。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、特定の薬学的組成物の投与による特定の障害の症状の「改善」とは、永続的であろうと一時的であろうと、持続しようと一過性であろうと、その組成物の投与に起因するかまたはその組成物の投与に関連した任意の低下をいう。
【００２９】
本明細書中で用いられる場合、「実質的に純粋な」とは、このような純度を評価するために当業者によって用いられる標準的分析方法（例えば、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））によって決定した場合に容易に検出可能な不純物を含まないようにみえるに十分に均質であるか、またはさらなる精製がその物質の物理的特性および化学低特性（例えば、酵素活性および生物学的活性）を検出可能に変更しないに十分に純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための、化合物の精製のための方法は、当業者に公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体または異性体の混合物であってもよい。このような場合、さらなる精製は、化合物の比活性を増大させ得る。
【００３０】
本明細書中で用いられる場合、「抗体」は、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント（これは、軽鎖および重鎖可変領域から構成される））を包含する。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、「ヒト化抗体」とは、ヒトへの投与が免疫反応を誘発しないように、「ヒト」配列のアミノ酸を含むように改変された抗体をいう。このような抗体の調製のための方法は、公知である。例えば、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、非可変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づく抗体を発現するために、組換えＤＮＡ技術によって改変される。コンピュータープログラムは、このような領域を同定するように設計されている。
【００３２】
用語「実質的に」同一もしくは相同または類似の表現は、当業者によって理解されるように文脈によって変化し、そして一般に、少なくとも７０％の同一性を意味し、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を意味する。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、「組成物」とは、任意の混合物をいう。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはこれらの任意の組合せであり得る。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合、「組合せ」とは、２つ以上の物の間での任意の関連付けをいう。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合、用語「被験体」は、ヒト、ならびに他の動物脊椎動物種（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、齧歯動物など）を包含する。この被験体が、骨形成または骨無機質密度を増強する望ましさに適切な被験体であることが当業者によって理解される。好ましくは、被験体は、哺乳類であり、より好ましくは霊長類であり、そして最も好ましくはヒトである。
【００３６】
本明細書中で用いられる場合、骨増殖欠損に関連した「処置する」または「処置」は、骨欠乏症状の発症の延期および／または発症するかもしくは発症すると予想されるこのような症状の重篤度の低減を包含する。これらの用語は、既存の骨もしくは軟骨の欠乏症状の改善、さらなる症状の防止、症状の根本代謝原因の改善もしくは防止、骨吸収の防止もしくは逆転、および／または骨増殖の助長をさらに包含する。従って、この用語は、軟骨、骨もしくは骨格の欠乏を有するか、またはこのような欠乏を発症する可能性を有する脊椎動物被験体に有益な結果が与えられたことを示す。
【００３７】
「骨欠乏」によって、改変されない場合に、被験体が、所望されるよりも少ない骨を示すか、または被験体の骨が、所望されるほどには完全でも粘着性でもない、骨吸収に対する骨形成の比率の不均衡を意味する。骨欠乏はまた、骨折から、外科的介入から、または歯の疾患もしくは歯周疾患から生じ得る。「軟骨欠損」によって、損傷を受けた軟骨、所望されるよりも少ない軟骨、または所望されるほどには完全でも粘着性でもない軟骨を意味する。「骨障害」は、骨欠乏および軟骨欠損の両方を包含する。
【００３８】
本明細書中で用いられる場合、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物についての略称は、他に示されない限り、それらの一般的な用法、認識された略語、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１７２６を参照のこと）に従う。
【００３９】
（Ｂ．骨形成を増強するための方法およびそれらの使用）
１つの局面では、本発明は、脊椎動物被験体における、骨形成もしくは骨無機質密度を増強する方法、または病理学的骨状態を処置する方法、または変性性関節状態を処置する方法に関し、この方法は、このような処置を必要とする脊椎動物被験体に、有効量のＮＯ−ビスホスホネートを投与し、それにより、この脊椎動物被験体において、骨形成もしくは骨無機質密度が増強されるか、またはこの病理学的骨状態もしくは変性性関節状態が処置される工程を包含する。この化合物は、単独で用いてもよく、または骨増殖を促進するかもしくは骨吸収を阻害するさらなる薬剤もしくは第２の薬剤とともに用いてもよい。
【００４０】
任意のＮＯ−ビスホスホネートが、本発明の方法で用いられ得る。特に、これとしては、特定のＮＯ−ビスホスホネート（例えば、ＮＯ−（４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン）ビス−ホスホネート（ＮＯ−アレンドロネート）、ＮＯ−（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン）ビス−ホスホネート（ＮＯ−パミドロネート）、ＮＯ−（ジクロロメチレン）−ビス−ホスホネート、（ＮＯ−クロドロネート）、ＮＯ−［１−ヒドロキシ−２（３−ピリジニル）−エチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−リセドロネート）、ＮＯ−［１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ゾロンドロネート）、ＮＯ−（１−ヒドロキシエチリデン）−ビス−ホスホネート（ＮＯ−エチドロネート），ＮＯ−［１−ヒドロキシ−３−（メチルペンチルアミノ）プロピリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−イバンドロネート）、ＮＯ−［［（４−クロロフェニル）チオ］メチレン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−チルドロネート）、ＮＯ−（６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン）−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ネリドロネート（ｎｅｒｉｄｒｏｎａｔｅ））、ＮＯ−（［３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−オルパドロネート（ｏｌｐａｄｒｏｎａｔｅ））、ＮＯ−［（シクロヘプチルアミノ）−メチレン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−イカドロネート）およびＮＯ−［１−ヒドロキシ−２−イミダゾ−（１，２−ａ）ピリジン−３−イルエチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ＹＨ５２９））が挙げられる。
【００４１】
本発明の方法は、不完全な骨増殖、過活動性の骨吸収またはその両方のいずれによって引き起こされようとも、骨形成欠損に関連した、任意の疾患、障害または状態を処置するために用いられ得る。任意の病理学的な歯の状態または変性性関節状態が、本発明の方法で処置され得る。本発明の方法によって処置され得る例示的な状態としては、以下が挙げられる：骨粗鬆症、骨折または骨欠乏、骨の分節性欠損、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、歯周病または歯周欠損、転移性骨疾患、骨溶解性骨疾患、形成術後（ｐｏｓｔ−ｐｌａｓｔｉｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ）、補綴関節手術後、ならびに歯移植後。
【００４２】
本発明の方法の他の用途としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：骨欠損および骨欠乏症（例えば、閉鎖骨折、開放骨折、および偽関節骨折で生じるもの）の修復；閉鎖骨折および開放骨折の低減における予防的使用；形成外科における骨の治癒の促進；非セメント化補綴関節および歯科用インプラントへの骨内増殖の刺激；閉経前の女性におけるピーク骨量の上昇；成長不足の処置；歯周病および歯周欠損の処置、ならびに他の歯修復プロセス；伸延骨形成の間の骨形成の増加；ならびに他の骨格障害（例えば、加齢性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、糖尿病関連の骨粗鬆症、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症もしくはグルココルチコイド関連骨粗鬆症、または廃用性骨粗鬆症および関節炎、または骨形成の刺激によって利益を受ける任意の状態）の処置；先天性、外傷誘発性または外科的な骨切除（例えば、癌処置のため）のおよび美容外科における修復；軟骨の欠損、傷害または障害を制限または処置すること。そして、創傷治癒または組織修復において有用であり得る。
【００４３】
（Ｃ．組合せ、キットおよび製品）
特定の実施形態では、本発明の方法は、被験体に、骨増殖を促進するかまたは骨吸収を阻害するさらなる薬剤を投与する工程をさらに包含し得る。ＮＯ−ビスホスホネートとこの第２の薬剤とは、同時にまたは順次投与され得る。
【００４４】
任意の適切な骨エンハンサーまたは骨吸収インヒビターが、さらなる薬剤としてこの組合せ治療において用いられ得る。組合せ治療において用いられ得る例示的な化合物としては、骨形態形成因子、抗吸収剤、骨原性因子、軟骨由来の形態形成タンパク質、成長ホルモン、エストロゲン、ビスホスホネート、スタチン、分化因子、ＮＦ−κＢの活性を阻害する化合物、ＮＦ−κＢの産生を阻害する化合物、プロテアソーム活性の活性を阻害する化合物およびプロテアソームタンパク質の産生を阻害する化合物が挙げられる。好ましくは、骨形成を増強するかまたは病理学的な歯の状態もしくは変性性関節状態を処置するために用いられるの化合物は、以下で開示され、そして以下の公開ＰＣＴ国際特許出願に開示された化合物もまた用いられ得る：ＰＣＴ／ＵＳ００／４１３６０（２０００年１０月２０日出願）；およびＷＯ００／０２５４８。
【００４５】
骨形成を刺激し得る低分子は、１９９８年４月３０日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９８／１７２６７、１９９７年５月１日に公開されたＷＯ９７／１５３０８および１９９７年１２月２４日に公開されたＷＯ９７／４８６９４において開示されている。これらの薬剤は一般に、リンカーによって空間的に分離された２つの芳香族系を含む。さらに、１９９８年６月１８日公開のＰＣＴ出願ＷＯ９８／２５４６０は、スタチンとして公知のクラスの化合物の、骨形成を増強する際の使用を開示する。
【００４６】
このＮＯ−ビスホスホネートおよびさらなる薬剤は、単一の薬学的組成物中に処方され得る。あるいは、これらは、別個の薬学的組成物として処方され得る。
【００４７】
プロテアソーム活性、ＮＦ−κＢもしくはその両方の他の公知のインヒビターは、文献から確認され得るか、または化合物は、当該分野で公知のアッセイを使用して、これらの活性について試験され得る。さらに、プロテアソーム活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の、またはＮＦ−κＢをコード化するヌクレオチド配列の、有効な発現のレベルを低下させるインヒビター（例えば、アンチセンスポリヌクレオチド）が、評価され得、そして本発明の方法において用いられ得る。また提供されるのは、化合物（例えば、スルファサラジン（Ｌｉｐｔａｙら，，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１２８（７）：１３６１−９（１９９９））；およびＷａｈｌら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０１（５）：１１６３−７４（１９９８））およびカルパインインヒビターＩＩ）である。
【００４８】
（Ｅ．ＮＯ−ビスホスホネートについてのアッセイ）
多数のアッセイを用いて、本発明の方法において用いられ得る化合物および組合せまたは薬学的組成物の効力を同定および／または評価し得る。
【００４９】
細胞培養培地、血清または血漿中での一酸化窒素の産生は、総一酸化窒素についての入手可能なアッセイキット（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに亜硝酸塩／硝酸塩（ＮＯ２−／ＮＯ３−）キット（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いることにより測定され得る。一酸化窒素による可溶性グアニル酸シクラーゼの細胞内活性化は、サイクリックＡＭＰ／ＧＭＰ酵素イムノアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）の使用により測定され得る。
【００５０】
（スクリーニングアッセイ−骨）
本発明の方法で使用される化合物の骨原性活性は、インビトロスクリーニング技術（例えば、骨形態形成タンパク質関連プロモータに連結したレポーター遺伝子の転写の評価）を使用して、または他のアッセイにおいて、証明され得る。
【００５１】
（ＡＢＡスクリーニングアッセイのための技術）
ある化合物（内因的に産生される骨形態形成因子の産生についての代用物）がＢＭＰプロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現を刺激し得ることの実証による、骨形成を刺激する化合物についての迅速なスループットスクリーニング試験は、１９９５年６月２日に出願された米国出願第０８／４５８，４３４号（その内容全体は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。このアッセイはまた、Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｅｒｙ，Ｎ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１３７：３３１−３９において、不死化されたマウス骨芽細胞（Ｔ−抗原のＢＭＰ２プロモーター駆動発現から構成されるトランスジーンを発現するマウスから誘導される）の研究の一部として記載される。この研究では、この不死化細胞は、マウスＢＭＰ２プロモーター（−２７３６／１１４ｂｐ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むプラスミドで安定にトランスフェクトされ、そして組換えヒトＢＭＰ２に対して用量依存様式で応答した。
【００５２】
手短に述べると、このアッセイは、骨形態形成タンパク質（特に、ＢＭＰ２またはＢＭＰ４）のプロモータがレポーター遺伝子（代表的に、ルシフェラーゼ）に連結している構築物によって永久にまたは一過性に形質転換された細胞を利用する。次いで、これらの形質転換細胞は、レポーター遺伝子産物の産生について評価される；ＢＭＰプロモータを活性化する化合物は、レポータータンパク質の産生を駆動し、このレポータータンパク質は、容易にアッセイされ得る。何千もの化合物は、この迅速スクリーニング技術に供されており、そして、非常に少ないパーセンテージのみが、ビヒクルによって産生されるよりも５倍高い発現レベルのレポーター遺伝子を誘発し得る。ＢＭＰプロモータを活性化する化合物は、いくつかの群に分類され、ここで、各々の群のメンバーは、不活性な化合物に存在しない特定の構造的特徴を共有する。活性な化合物（「ＢＭＰプロモータ−活性化合物」または「活性化合物」）は、骨増殖または軟骨増殖を促進する際に、従って、骨増殖または軟骨増殖を必要とする脊椎動物の処置において有用である。
【００５３】
ＢＭＰプロモータ−活性化合物は、特異性および毒性を試験する種々の他のアッセイにおいて調べられ得る。例えば、非ＢＭＰプロモータまたは応答エレメントは、レポーター遺伝子に連結され得、そして適切な宿主細胞に挿入され得る。細胞傷害性は、例えば、ＢＭＰプロモーター−レポーター遺伝子含有細胞および／または非ＢＭＰプロモーター−レポーター遺伝子含有細胞の視覚検査または顕微鏡検査によって決定され得る。あるいは、これらの細胞による核酸および／またはタンパク質の合成は、モニターされ得る。インビボでのアッセイのために、組織は、取り出され得、そして視覚的にまたは顕微鏡によって調べられ得、そして必要に応じて、組織学的検査を容易にする色素または染料に関連して調べられ得る。インビボでのアッセイ結果を評価する際に、従来の医薬品化学／動物モデル技術を用いて試験化合物の生体分布を調べることもまた有用であり得る。
【００５４】
（（インビトロでの）新生仔マウス頭蓋冠アッセイのための技術）
骨吸収または骨形成についてのアッセイは、Ｇｏｗｅｎ  Ｍ．およびＭｕｎｄｙ  Ｇ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８６）１３６：２４７８−８２によって記載されたアッセイと同様である。手短に述べると、生後４日目に、ＩＣＲ  Ｓｗｉｓｓ白色マウスの仔の前頭骨および頭頂骨を顕微解剖によって取り出し、そして矢状縫合に沿って分割する。吸収についてのアッセイでは、これらの骨をＢＧＪｂ培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）＋０．０２％（またはこれより低い濃度）β−メチルシクロデキストリン中でインキュベートし、ここで、この培地はまた、試験物質またはコントロール物質を含む。アッセイを行って骨形成を評価する際に用いられる培地は、６μｇ／ｍｌインスリン、６μｇ／ｍｌトランスフェリン、６ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸、それぞれ１．２５ｍＭおよび３．０ｍＭのカルシウム濃度およびホスフェート濃度を補充したＦｉｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＢＧＪ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ）であり、そして２日毎に１００μｇ／ｍｌの濃度になるようなアスコルビン酸を添加する。インキュベーションを、５％のＣＯ２および９５％の空気の加湿雰囲気中で９６時間にわたって３７℃にて行う。
【００５５】
これらの新生仔マウス頭蓋冠は、測定可能なレベルのアルカリホスファターゼを含み、そしてこれは、骨形成活性の半定量的尺度として、頭蓋冠自体から、またはある程度、インキュベーション培地中でのいずれかで測定され得る。培地中のアルカリホスファターゼ活性の測定のために、５０μｌをアッセイの終了時に取り出す。次いで、この活性を、標準的アルカリホスファターゼ試薬を使用して測定する。
【００５６】
骨はインキュベーション培地から取り出され、そして２４時間〜４８時間にわたって１０％の緩衝化ホルマリン中で固定され、１４％のＥＤＴＡ中で１週間にわたって脱灰され、そして段階的なアルコールによって処理され；そしてパラフィンワックス中に包埋される。頭蓋冠の３μｍ切片を調製する。代表的切片を、骨形成または骨吸収の組織形態学的評価のために選択する。骨変化は、２００μｍ離れて切断された切片について測定される。骨芽細胞および破骨細胞は、それらの特徴的な形態によって識別される。
【００５７】
他の補助アッセイは、試験化合物の非ＢＭＰプロモーター媒介効果を決定するためのコントロールとして用いられ得る。例えば、マイトジェン活性は、プロモーターとしての血清応答エレメント（ＳＲＥ）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を特徴とするスクリーニングアッセイを使用して測定され得る。より詳細には、これらのスクリーニングアッセイは、ＳＲＥ媒介経路（例えば、プロテインキナーゼＣ経路）によるシグナル伝達を検出し得る。例えば、骨芽細胞アクチベーターＳＲＥ−ルシフェラーゼスクリーニングおよびインスリン模倣物ＳＲＥ−ルシフェラーゼスクリーニングは、この目的のために有用である。同様に、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）媒介性経路の試験化合物刺激もまたアッセイされ得る。例えば、ＰＴＨおよびカルシトニン（２つの骨活性薬剤）についてのレセプターによってトランスフェクトされた細胞は、上昇したｃＡＭＰ濃度を検出するために、ＣＲＥ−ルシフェラーゼスクリーニングにおいて用いられ得る。従って、試験化合物のＢＭＰプロモータ特異性は、このような補助的アッセイの使用によって調べられ得る。
【００５８】
（Ｆ．処方物および投与）
単独であろうと骨を促進するさらなる薬剤との組合せであろうと、ＮＯ−ビスホスホネートは、全身投与または局所投与され得る。全身での使用のために、本明細書中の化合物は、従来の方法による、非経口送達（例えば、静脈内送達、皮下送達、筋肉内送達、腹腔内送達、鼻腔内送達または経皮送達）または腸内送達（例えば、経口送達または直腸送達）のために処方される。静脈内投与は、長期にわたって、一連の注射によって行われてもよく、または連続注入によって行われてもよい。注射または別々の場所での他の投与経路による投与は、１週間に１度から１日３回までの間隔をおいて実施され得る。あるいは、本明細書中に開示された化合物は、周期的様式で投与され得る（開示された化合物の投与；続いて投与なし；続いて開示された化合物の投与など）。処置は、所望の結果が達成されるまで続けられる。一般に、薬学的処方物は、薬学的に受容可能なビヒクル（例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、水中の５％デキストロース、微量金属を含むホウ酸緩衝化生理食塩水など）と組み合わせた本発明の化合物を含む。処方物は、一つ以上の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上のタンパク質損失を防止するためのアルブミン、滑沢剤、フィラー、安定剤などをさらに含み得る。処方方法は当該分野で周知であり、例えば、本明細書中に参考として援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，最新版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示される。本発明において用いるための薬学的組成物は、無菌で非発熱性の液体溶液または液体懸濁液、コーティングされたカプセル剤、坐剤、凍結乾燥粉末、経皮パッチまたは当該分野で公知の他の形態の形態であり得る。局所投与が、損傷部位もしくは欠損部位での注射、またはその部位での固体キャリアの挿入もしくは取付け、または粘液の直接的な局在的塗布などによって行われ得る。局所投与については、この送達ビヒクルは好ましくは、骨または軟骨を増殖させるためのマトリックスを提供し、より好ましくは、有害な影響を伴わずに被験体によって吸収され得るビヒクルである。
【００５９】
創傷部位への本明細書中の化合物の送達は、制御放出組成物（例えば、本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０８５９に記載されている制御放出組成物）の使用によって増強され得る。この型のフィルムは、補綴デバイスおよび外科用移植物のためのコーティングとして特に有用である。これらのフィルムは、外科用のネジ、ロッド、ピン、プレートなどの外表面の周りに巻かれ得る。この型の移植可能なデバイスは、整形外科手術において慣用的に用いられる。このフィルムはまた、骨充填材料（例えば、ヒドロキシアパタイトブロック、鉱物質除去骨基質プラグ、コラーゲン基質など）をコーティングするために使用され得る。一般に、本明細書中に記載される、フィルムまたはデバイスは、骨折部位で骨に適用される。適用は一般に、標準的外科的手順を用いた、骨への移植または表面への取り付けによる。
【００６０】
上記のコポリマーおよびキャリアに加えて、生分解性フィルムおよび生分解性マトリックスは、他の活性成分または不活性成分を含み得る。特に興味深いのは、組織の増殖または浸潤を促進する薬剤（例えば、増殖因子）である。この目的のための例示的な増殖因子としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。骨増殖を促進する薬剤（例えば、骨形態形成タンパク質（米国特許第４，７６１，４７１号；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３６６）、オステオゲニン（Ｓａｍｐａｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７１０９−１３）およびＮａＦ（Ｔｅｎｃｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．（１９８９）２３：５７１−８９））もまた好ましい。生分解性フィルムまたは生分解性マトリックスは、硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリ無水物、骨または皮膚のコラーゲン、純粋なタンパク質、細胞外マトリックス成分など、およびそれらの組合せを含む。このような生分解性材料は、生分解性でない材料と組み合わせて用いられて、所望の機械的特性、化粧品特性または組織界面特性もしくはマトリックス界面特性を提供し得る。
【００６１】
本発明の化合物の送達のための代替的方法は、以下の使用を含む：ＡＬＺＥＴＴＭ浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；徐放性マトリックス材料（例えば、Ｗａｎｇら（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９０／１１３６６）に開示された徐放性マトリックス材料）；帯電したデキストランビーズ（例えば、Ｂａｏら（ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０３１２５）に開示される通り）；コラーゲンベースの送達系（例えば、Ｋｓａｎｄｅｒら，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．（１９９０）２１１（３）：２８８−９４に開示される通り）；メチルセルロースゲル系（Ｂｅｃｋら，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．（１９９１）６（１１）：１２５７−６５に開示される通り）；アルギネートベースの系（Ｅｄｅｌｍａｎら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９１）１２：６１９−２６に開示される通り）。骨内での徐放局所送達について当該分野で周知の他の方法としては、含浸され得る多孔質のコーティングされた金属哺補綴物、および治療組成物がその中に組み込まれている中実のプラスチックロッドとが挙げられる。
【００６２】
本発明の化合物はまた、骨吸収を阻害する薬剤と関連して用いられ得る。抗吸収剤（例えば、エストロゲン、ビスホスホネートおよびカルシトニン）は、この目的に好適である。より詳細には、本明細書中に開示される化合物は、骨欠乏状態の補正を得るために十分な期間（例えば、何ヶ月〜何年）にわたって投与され得る。一旦骨欠乏状態が補正されると、脊椎動物は、補正された骨状態を維持するために、抗吸収性化合物が投与され得る。あるいは、本明細書中に開示された化合物は、周期的な様式（開示された化合物の投与、続いて抗吸収性化合物の投与、続いて開示された化合物の投与）で、抗吸収性化合物とともに投与され得る。
【００６３】
さらなる処方物において、以下に記載の調製物のような従来調製物が用いられ得る。
【００６４】
水性懸濁剤は、薬理学的に受容可能な賦形剤（懸濁化剤（例えば、メチルセルロース）および湿潤剤（例えば、レシチン、リゾレシチンまたは長鎖脂肪アルコール）を含む）と混合した活性成分を含み得る。この水性懸濁剤はまた、業界標準に従って、保存剤、着色剤、矯味矯臭剤、甘味剤などを含み得る。
【００６５】
局所（ｔｏｐｉｃａｌ）適用および局部（ｌｏｃａｌ）適用のための調製物は、低級脂肪族アルコール、ポリグリコール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール）、脂肪酸エステル、油のエステルおよび脂肪のエステル、ならびにシリコーンを含み得る薬学的に適切なビヒクル中に、エアゾールスプレー、ローション剤、ゲル類および軟膏を含む。この調製物は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはトコフェロール）および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル）をさらに含み得る。
【００６６】
非経口調製物は、特に、無菌の、または滅菌された、製品を含む。活性化合物および周知の注射可能なキャリアのいずれかを含む、注射可能な組成物が提供され得る。これらは、浸透圧を調節するための塩を含み得る。
【００６７】
所望の場合、骨原性薬剤は、さまざまな病原性状態を処置する際に使用するためのリポソームを調製する報告された方法のいずれかによって、リポソーム中に組み込まれ得る。本発明の組成物は、マクロファージ、単球、ならびにリポソーム組成物を取り込む他の細胞および組織および器官にこれらの化合物を指向させるために、リポソーム中に組み込まれた上記の化合物を利用し得る。本発明のリポソームに取り込まれた化合物は、非経口投与によって利用されて、より低い用量の化合物の有効な使用を可能にし得る。リガンドはまた、リポソームの特異性をさらに焦点を合わせるために組み込まれ得る。
【００６８】
リポソーム調製の適切な従来方法としては、以下によって開示される方法が挙げられるがこれらに限定されない：Ｂａｎｇｈａｍ，Ａ．Ｄ．ら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９６５）２３：２３８−２５２、Ｏｌｓｏｎ，Ｆ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９７９）５５７：９−２３、Ｓｚｏｋａ，Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８，Ｋｉｍ，Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９８３）７２８：３３９：３４８、およびＭａｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９８６）８５８：１６１−１６８。
【００６９】
リポソームは、卵、植物供給源または動物供給源のような天然供給源由来のリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトールなど）を含め、従来の合成リン脂質リポソーム材料または天然リン脂質リポソーム材料のうちのいずれかと組み合わせた本発明の化合物から作製され得る。また利用され得る合成リン脂質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリン、ならびに対応する合成ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロール。コレステロールまたは他のステロール、コレステロールヘミスクシネート、糖脂質、セレブロシド、脂肪酸、ガングリオシド、スフィンゴ脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および他のカチオン性脂質は、当業者に公知であるように、リポソームに組み込まれ得る。リポソームにおいて使用されるリン脂質および添加物の相対量は、所望により変更され得る。好ましい範囲は、リン脂質の約６０モルパーセント〜９０モルパーセントである；コレステロール、コレステロールヘミスクシネート、脂肪酸またはカチオン性脂質は、０モルパーセント〜５０モルパーセントの量で用いられ得る。リポソームの脂質層に組み込まれる本発明の化合物の量は、約０．０１モルパーセント〜約５０モルパーセントの脂質の濃度で変動し得る。
【００７０】
上記の処方を有するリポソームは、モノクローナル抗体の組み込みまたは標的に特異的な他のリガンドを用いて、それらの意図される標的に対してさらにより特異的にされ得る。例えば、ＢＭＰレセプターに対するモノクローナル抗体は、Ｌｅｓｅｒｍａｎ、Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）２８８：６０２−６０４の方法による、リポソームに組み込まれるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）への連結によってリポソームに組み込まれ得る。
【００７１】
本発明の化合物は、骨形成細胞もしくはそれらの前駆体の増殖を刺激するために、または骨形成細胞前駆体の分化を誘導するために、インビトロまたはエキソビボのいずれかで用いられ得る。本明細書中に記載される化合物はまた、骨形成細胞をこのような細胞を必要とする環境に誘引するために、標的組織または標的器官の環境を改変し得る。本明細書中で用いられる場合、用語「前駆体細胞」とは、分化経路が運命付けられているが、一般にマーカーも、成熟した完全に分化した細胞としての機能も発現しない細胞をいう。本明細書中で用いられる場合、用語「間葉細胞」または「間葉幹細胞」とは、何回も分裂し得、かつ骨格組織（軟骨、骨、腱、靭帯、骨髄支質および結合組織が挙げられる）を生じる、多能性先祖細胞をいう（Ａ．Ｃａｐｌａｎ，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．（１９９１）９：６４１−５０を参照のこと）。本明細書中で用いられる場合、用語「骨原細胞」は、骨が細胞および骨芽細胞前駆体を包含する。より詳細には、開示された化合物は、骨髄間葉細胞を含んでいる細胞集団を刺激し、それによって、その細胞集団中の骨原細胞の数を増やすために有用である。好ましい方法では、造血細胞は、開示された化合物による刺激の前または後のいずれかで細胞集団から除去される。このような方法の実施によって、骨原細胞は、増大し得る。増大させた骨原細胞は、その必要がある脊椎動物被験体に注入（または再注入）され得る。例えば、被験体自身の間葉幹細胞を、本発明の化合物にエキソビボで曝露し、そして得られる骨原性細胞を被験体内の所望の部位に注入または指向させ得、ここで、骨原性細胞のさらなる増殖および／または分化が免疫注射を伴わずに起こり得る。あるいは、開示された化合物に曝露された細胞集団は、ヒト胎児の不死化された骨芽細胞または骨原細胞であり得る。このような細胞が脊椎動物被験体に注入または移植される場合、これらの非自己細胞を「免疫保護」することまたはレシピエントを（好ましくは局所的に）免疫抑制して、移植および骨もしくは軟骨の修復を増強することが有利であり得る。
【００７２】
（例えば、骨形成が所望される骨粗鬆症において）ＮＯ−ビスホスホネートに必要とされる投薬量は、単独であろうと、または骨を促進するさらなる薬剤との組合せであろうと、処置群とコントロール群との間での骨量における統計的に有意な差として明らかである。骨量におけるこの差は、例えば、処置群において、骨量の５％〜２０％以上の増加として見られ得る。治癒における臨床的に有意な増加の他の尺度としては、例えば、破壊強度および破壊張力、破壊強度および破壊ねじれ、４点曲げ、骨生検における結合性の増加および当業者に周知の他の生物力学的試験が挙げられ得る。治療レジメンに関する一般的ガイダンスは、目的の疾患の動物モデルにおいて実施される実験から得られる。
【００７３】
ＮＯ−ビスホスホネートの投薬量は、単独であろうと、または骨を促進する第２の薬剤との組み合わせであろうと、処置についての必要性の程度および重篤度、投与される化合物の活性、被験体の全般的健康状態、ならびに当業者に周知の他の考慮事項に依存して変動する。一般に、これらは、代表的なヒトに対して、１日あたり、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与され得る。非経口用量は、適切には、経口用量の２０％〜１００％である。経口投与は、（容易さ、患者の容認性などの理由から）状態が骨欠乏である大部分の例において好ましいが、代替の投与方法が、選択された化合物および選択された欠損または疾患について適切であり得る。化合物レベルは、当該分野で公知の任意の適切な方法によってモニタリングされ得る（例えば、Ｂｏｕｌｅｙら，Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｍｏｎｉｔ．，２３（１）：５６−６０（２００１）；およびＬａｎｇｍａｎｎら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．，７３５（１）：４１−５０（１９９９）を参照のこと）。
【実施例】
【００７４】
（Ｇ．実施例）
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、本発明を限定することを意図しない。
【００７５】
（実施例１：ハイスループットスクリーニング）
このスクリーニングでは、標準のポジティブコントロールは、化合物５９−０００８（「ＯＳ８」とも示す）であった。この化合物は、以下の式の化合物である：
【００７６】
【化１】
2005530819.tif 000002
【００７７】
より詳細には、２Ｔ３−ＢＭＰ−２−ＬＵＣ細胞（上記で引用したＧｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９６）１３７：３３１−３９に記載された、安定に形質転換された骨芽細胞株）を用いた。この細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％グルタミンを含むα−ＭＥＭ、１０％  ＦＣＳ（「プレーティング培地」）を用いて培養し、そして１週間に１回、１：５に分けた。このアッセイのために、この細胞を、４％  ＦＣＳを含むプレーティング培地中に再懸濁し、マイクロタイタープレート中に（５０μｌ中）５×１０３細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、そして５％  ＣＯ２中で３７℃で２４時間にわたってインキュベートした。このアッセイを開始するために、ＤＭＳＯ中の５０μｌの試験化合物またはコントロールを、各ウェル中に２×濃度で添加し、その結果、最終容積は１００μｌであった。最終的な血清濃度は、２％のＦＣＳであり、そして最終的なＤＭＳＯ濃度は１％であった。化合物５９−０００８（１０μＭ）を、ポジティブコントロールとして用いた。
【００７８】
処理した細胞を、３７℃および５％のＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで、培地を取り出し、そして細胞をＰＢＳで３回リンスした。過剰のＰＢＳの除去後、２５μｌの１×細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ１５３Ａ）を各ウェルに添加し、そして少なくとも１０分間インキュベートした。必要に応じて、これらのプレート／サンプルを、この時点で凍結し得る。各ウェルに対して、５０μｌのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｅ１５２Ａ；１０ｍｌ  Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ緩衝液／７ｍｇ  Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ基質）を添加した。ルミネセンスを、自動化９６ウェルルミノメーターで測定し、そして１ウェルあたりのルシフェラーゼ活性のピコグラムまたはタンパク質１マイクログラムあたりのルシフェラーゼ活性のピコグラムのいずれかとして表現した。
【００７９】
（実施例２：インビトロ骨形成）
選択された化合物および適切なコントロールを、骨形成活性（「（インビトロでの）新生仔マウス頭蓋冠アッセイのための技術」において上記した）についてインビトロ（エキソビボ）でアッセイした。エキソビボの頭蓋冠の組織形態学的測定評価を、ＯｓｔｅｏＭｅｔｒｉｃｓ骨形態測定法測定プログラムを、製造業者の指示に従って用いて実施した。標準的な点計数接眼レンズ格子線を有する、１０倍または２０倍のいずれかの対物レンズを用いて測定を行った。
【００８０】
新たな骨形成を、（２０×対物レンズを用いて）各骨（１群あたり４本の骨）の３つの代表的切片における１視野で形成された新骨面積を測定することにより、決定した。各測定を、縫合の末端から１／２視野距離で実施した。総骨および古い骨の両方の面積を測定した。データを、新たな骨幅として、ｍｍで表現した。
【００８１】
骨芽細胞数を、点の計数によって決定する。骨の両側の骨表面に並んだ骨芽細胞の細胞数を、２０×対物レンズを用いて、１視野において計数する。データを、骨芽細胞数／骨表面ｍｍとして表現する。
【００８２】
アルカリホスファターゼ活性を、「（インビトロでの）新生仔マウス頭蓋冠アッセイのための技術」において上記で詳述した通りにインキュベーション培地中で測定する。
【００８３】
一酸化窒素放出ビスホスホネート結合体の着想の例は、Ｏ−ニトロソアナログがアレンドロネート（４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン）ビス−ホスホネート（図１）に連結されて、［４−（４’−ニトロオキシメチル）ベンゾイルアミノ−１−ヒドロキシブチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯＸ−アレンドロネート）（図２）が作製される場合に見られる。
【００８４】
【化２】
2005530819.tif 000003
【００８５】
【表１】
2005530819.tif 000004
【００８６】
【表２】
2005530819.tif 000005
【００８７】
【表３】
2005530819.tif 000006
【００８８】
数字は、平均±標準誤差を表す（ｎ＝５）。＊ｐ＜０．０５、ｔ検定またはＤｕｎｎｅｔｔ検定による片側分散分析（ＡＮＯＶＡ）。
【００８９】
本明細書中に記載される実施例および実施形態が、例示の目的のみであって、それらを考慮した種々の改変もしくは変更が、当業者に示唆され、かつ本願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲に組み込まれるべきであることが理解される。本明細書中に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的のために、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。
【００９０】
上記の文献の引用は、上記のいずれかが関連する先行技術であることの承認であることを意図せず、これらの文書の内容または日付についての何の承認も構成しない。
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月18日(2005.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊椎動物における骨形成または骨無機質密度を増強するための組成物であって、治療有効量のＮＯ−ビスホスホネートを含む、組成物。
【請求項２】
前記ＮＯ−ビスホスホネートが、ＮＯ−（４−アミノ−１−ヒドロキシブチリデン）ビス−ホスホネート（ＮＯ−アレンドロネート）、ＮＯ−（３−アミノ−１−ヒドロキシプロピリデン）ビス−ホスホネート（ＮＯ−パミドロネート）、ＮＯ−（ジクロロメチレン）−ビス−ホスホネート、（ＮＯ−クロドロネート）、ＮＯ−［１−ヒドロキシ−２（３−ピリジニル）−エチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−リセドロネート）、ＮＯ−［１−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）エチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ゾロンドロネート）、ＮＯ−（１−ヒドロキシエチリデン）−ビス−ホスホネート（ＮＯ−エチドロネート）、ＮＯ−［１−ヒドロキシ−３−（メチルペンチルアミノ）プロピリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−イバンドロネート）、ＮＯ−［［（４−クロロフェニル）チオ］メチレン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−チルドロネート）、ＮＯ−（６−アミノ−１−ヒドロキシヘキシリデン）−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ネリドロネート）、ＮＯ−（［３−（ジメチルアミノ）−１−ヒドロキシプロピリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−オルパドロネート）、ＮＯ−［（シクロヘプチルアミノ）−メチレン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−イカドロネート）またはＮＯ−［１−ヒドロキシ−２−イミダゾ−（１，２−ａ）ピリジン−３−イルエチリデン］−ビス−ホスホネート（ＮＯ−ＹＨ５２９）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脊椎動物被験体が、哺乳動物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＮＯ−ビスホスホネートが、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記動物が、骨粗鬆症、骨折もしくは骨欠乏、原発性副甲状腺機能亢進症および続発性副甲状腺機能亢進症、歯周病もしくは歯周欠損、転移性骨疾患、骨移植、骨の分節性欠損、骨溶解性骨疾患、形成術後、補綴関節手術後の変性性関節状態、歯移植後または軟骨の障害もしくは傷害を有する／罹患している、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
骨増殖を増強するかまたは骨吸収を減少させるさらなる薬剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記薬剤が、骨形態形成タンパク質、成長ホルモン、エストロゲン、スタチン、ビスホスホネート、骨原性因子、抗吸収剤、軟骨由来の形態形成タンパク質、分化因子、骨増殖刺激化合物、ＮＦ−κＢインヒビター、プロテアソームインヒビター、プロテアソーム産生インヒビターまたはステロイドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＮＯ−ビスホスホネートおよびさらなる薬剤が、同時にまたは順次に投与するために処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＮＯ−ビスホスホネートおよびさらなる薬剤が、単一の薬学的処方物中に処方されるか、または各々が別々の薬学的処方物において処方される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
脊椎動物における骨芽細胞の増殖および／または分化を刺激する組成物であって、治療有効量のＮＯ−ビスホスホネートを含む、組成物。
【請求項１２】
脊椎動物における骨吸収を減少させる組成物であって、治療有効量のＮＯ−ビスホスホネートを含む、組成物。
【請求項１３】
ＮＯ−ビスホスホネート、および骨増殖を増強するかまたは骨吸収を減少させるさらなる薬剤を含む組合せ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組合せを含む、キット。
【国際調査報告】
2005530819.tif 000007
2005530819.tif 000008