(57)【要約】本発明はＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物をスクリーニングするためのアゴニスト非依存的方法に関する。アゴニストの不在下でＧＰＣＲが脱感作されており、ＧＲＫが修飾されていてよいＧＲＫを含有する細胞系が本発明に含まれる。本発明は、ＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうか、およびＧＰＣＲがアレスチンとの親和性を有しているかどうかを決定する方法に関する。増強されたアレスチン親和性を有する修飾されたＧＰＣＲが本発明に含まれる。これらの修飾されたＧＰＣＲは、本明細書で記載するアゴニスト非依存的方法およびアゴニスト依存的方法の双方を含む、脱感作を変化させる化合物をスクリーニングする方法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチンおよび修飾されたＧＲＫを含む細胞を提供するステップであって、ここに、前記ＧＰＣＲは前記ＧＲＫの発現時にアゴニスト非依存的様式で少なくとも部分的に内在化されているステップ、
（ｂ）前記細胞を化合物に暴露するステップ、
（ｃ）ＧＰＣＲ、アレスチンまたは修飾されたＧＲＫの細胞分布を決定するステップ、並びに
（ｄ）（１）前記化合物の存在下での細胞におけるＧＰＣＲ、アレスチンまたは修飾されたＧＲＫの分布および（２）前記化合物の不在下での細胞におけるＧＰＣＲ、アレスチンまたは修飾されたＧＲＫの分布の間の差異をモニター観察するステップ、
を含むＧＰＣＲ内在化を変化させる化合物を同定する方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）のＧＲＫが過剰発現される請求項１の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）のＧＲＫの発現が誘導可能である請求項１の方法。
【請求項４】
ＧＲＫがＣＡＡＸモチーフを含む請求項１の方法。
【請求項５】
ＧＰＣＲがＧＲＫによりリン酸化が増強されるように修飾されている請求項１の方法。
【請求項６】
ＧＰＣＲがβ2ＡＲ（Ｙ３２６Ａ）である請求項１の方法。
【請求項７】
ＧＰＣＲが図１で列挙されるＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ、修飾されたＧＰＣＲ、味覚受容体、ＡクラスＧＰＣＲ、ＢクラスＧＰＣＲ、変異ＧＰＣＲ、または生物学的に活性なそのフラグメントである請求項１の方法。
【請求項８】
ＧＲＫがＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６、または生物学的に活性なそのフラグメントである請求項１の方法。
【請求項９】
ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、またはアレスチンが検出可能なように標識されている請求項１の方法。
【請求項１０】
脱感作に関与する分子が検出可能なように標識されているか、または脱感作に関与する分子と相互作用する分子が検出可能なように標識されている請求項１の方法。
【請求項１１】
アレスチンが視覚アレスチン、錐体アレスチン、βアレスチン１、βアレスチン２、または生物学的に活性なそのフラグメントである請求項１の方法。
【請求項１２】
アゴニストが提供されない請求項１の方法。
【請求項１３】
工程（ｄ）の（１）と（２）の間の差異がＧＰＣＲ内在化の変調を示す請求項１の方法。
【請求項１４】
（ａ）ＧＰＣＲおよびＧＲＫを含む細胞を提供するステップ、
（ｂ）前記細胞を化合物に暴露するステップ、並びに
（ｃ）前記化合物の存在下でＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化が変化しているかどうかを決定するステップ、
を含むＧＰＣＲリン酸化を変化させる化合物を同定する方法。
【請求項１５】
ＧＰＣＲまたはＧＲＫの細胞分布が決定される請求項１４の方法。
【請求項１６】
（１）前記化合物の存在下での細胞におけるＧＰＣＲまたはＧＲＫの分布と（２）前記化合物の不在下での細胞におけるＧＰＣＲまたはＧＲＫの分布の間の差異をモニター観察する請求項１４の方法。
【請求項１７】
（１）と（２）の間の差異をＧＰＣＲのリン酸化に相関させる請求項１６の方法。
【請求項１８】
ＧＲＫが細胞膜に局在せず、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化が変化していることを示す請求項１４の方法。
【請求項１９】
ＧＰＣＲのリン酸化状態が決定される請求項１４の方法。
【請求項２０】
ＧＲＫの活性が決定される請求項１４の方法。
【請求項２１】
内在化されるＧＰＣＲの能力が決定される請求項１７の方法。
【請求項２２】
（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞を提供するステップであって、ここに、アレスチンは検出可能に標識されているステップ、
（ｂ）アレスチンの細胞分布を決定するステップ、並びに
（ｃ）アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲの細胞膜で発現される能力に相関させるステップ、
を含む目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する方法。
【請求項２３】
アレスチンが小胞、小窩、エンドソーム、または脱感作経路のその他の場所に局在する請求項２２の方法。
【請求項２４】
（ａ）ＧＰＣＲおよびＧＲＫを含む細胞を提供するステップであって、ここに、ＧＲＫは検出可能に標識されているステップ、
（ｂ）ＧＲＫの細胞分布を決定するステップ、並びに
（ｃ）ＧＲＫの細胞分布をＧＰＣＲの細胞膜で発現される能力に相関させるステップ、
を含む目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する方法。
【請求項２５】
ＧＲＫが細胞膜に局在する請求項２４の方法。
【請求項２６】
（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞を提供するステップであって、ここに、アレスチンは検出可能に標識されているステップ、
（ｂ）アレスチンの細胞分布を決定するステップ、並びに
（ｃ）アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力に相関させるステップ、
を含むＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力を分析する方法。
【請求項２７】
アレスチンまたはＧＰＣＲが小胞、小窩またはエンドソームに局在する請求項２６の方法。
【請求項２８】
請求項１で同定された化合物。
【請求項２９】
（ａ）請求項１で同定された化合物を提供するステップ、および
（ｂ）前記化合物を宿主に投与するステップ、
を含む宿主細胞におけるＧＰＣＲの脱感作を変調することにより疾患を処置する方法。
【請求項３０】
ＧＰＣＲおよび修飾されたＧＲＫを含む宿主細胞。
【請求項３１】
ＧＲＫが誘導可能であるか、または過剰発現される請求項３０の宿主細胞。
【請求項３２】
前記宿主細胞がさらにアレスチンを含み、前記アレスチンは検出可能なように標識されている請求項３０の宿主細胞。
【請求項３３】
少なくとも１つのＧＰＣＲ、ＧＲＫ、脱感作に関与する別の分子、または脱感作に関与する分子と相互作用する分子が検出可能なように標識されている請求項３０の宿主細胞。
【請求項３４】
（ａ）ＧＲＫをコードする核酸を提供するステップ、
（ｂ）コードされたＧＲＫがＣＡＡＸモチーフを含むようにＧＲＫをコードする核酸を変異させるステップであって、ここに、修飾された前記ＧＲＫはアゴニストの不在下でＧＰＣＲをリン酸化するステップ、および
（ｃ）細胞において修飾されたＧＲＫを発現するステップ、
を含むＧＰＣＲが構成的に内在化されているＧＲＫをコードする核酸を修飾する方法。
【請求項３５】
ＧＲＫをコードする核酸が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４を含む請求項３４の方法。
【請求項３６】
請求項３０の宿主細胞を含むＧＰＣＲの内在化を変調する化合物を同定するためのキット。
【請求項３７】
ＮＰＸＸＹモチーフおよびカルボキシル末端テールを含む修飾されたＧＰＣＲであって、
前記カルボキシル末端テールは推定されるパルミトイル化部位および１つまたはそれ以上のリン酸化のクラスタを含み、
カルボキシル末端テールは第２のＧＰＣＲのカルボキシル末端の部分に融合された第１のＧＰＣＲ部分のカルボキシル末端領域の保持された部分を含み、並びに
前記第２のＧＰＣＲは１つまたはそれ以上のリン酸化のクラスタを含み、そしてさらに第２のＮＰＸＸＹモチーフの下流に位置付けられるおよそ１０個から２５個のアミノ酸残基の推定される第２のパルミトイル化部位を含む修飾されたＧＰＣＲ。
【請求項３８】
第１のＧＰＣＲがＡクラス受容体である請求項３７の修飾されたＧＰＣＲ。
【請求項３９】
第１のＧＰＣＲがｈＧＰＲ３、ｈＧＰＲ６、ｈＧＰＲ１２、ｈＳＲＥＢ２、ｈＳＲＥＢ３、ｈＧＰＲ８、またはｈＧＰＲ２２である請求項３７の修飾されたＧＰＣＲ。
【請求項４０】
第２のＧＰＣＲがＢクラス受容体である請求項３７の修飾されたＧＰＣＲ。
【請求項４１】
Ｂクラス受容体がバソプレッシンＶ２受容体、ニューロテンシン１受容体、サブスタンスＰ受容体、およびオキシトシン受容体からなる群から選択される請求項３７の修飾されたＧＰＣＲ。
【請求項４２】
請求項３７の修飾されたＧＰＣＲをコードする核酸。
【請求項４３】
配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および９０からなる群から選択される核酸。
【請求項４４】
請求項４２の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４５】
請求項４４の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４６】
請求項４２の核酸を含む宿主細胞。
【請求項４７】
（ａ）請求項３７に記載の少なくとも１つの修飾されたＧＰＣＲを発現する細胞を提供するステップであって、ここに、前記細胞はさらに検出可能な分子に結合したアレスチンを含むステップ、
（ｂ）細胞を化合物に暴露するステップ、
（ｃ）細胞内のアレスチンの位置を決定するステップ、
（ｄ）前記化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置を前記化合物の不在下での細胞内のアレスチンの位置と比較するステップ、並びに
（ｅ）（１）前記化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置と（２）前記化合物の不在下での細胞内のアレスチンの位置の間の差異を相関させるステップ、
を含むＧＰＣＲ活性に対して化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４８】
アレスチンがエンドソーム、エンドサイトーシス小胞、または小窩で検出される請求項４７の方法。
【請求項４９】
請求項３７に記載の少なくとも１つの修飾されたＧＰＣＲを発現する細胞を含むＧＰＣＲの活性を変調する分子を同定するためのキットであって、前記細胞はさらに検出可能な分子に結合した脱感作に関与する分子を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアゴニスト非依存的の様式でＧＰＣＲ脱感作を検定する方法、このような方法に有用な宿主細胞、ＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物の同定方法、同定された化合物、および疾患処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）はホルモンまたはリガンド結合を細胞内シグナルに翻訳する細胞表面タンパク質である。ＧＰＣＲは全ての動物、昆虫および植物において見出されている。ＧＰＣＲシグナル伝達は、光伝達、嗅覚、神経伝達、血管緊張、心拍出量、消化、疼痛、並びに体液および電解質などのバランスの種々の生理学的機能の制御において極めて重要な役割を果たす。これらは非常に多くの生理学的機能に関与するが、ＧＰＣＲは多くの共通する構造的特徴を共有する。これらは細胞内および細胞外ループ並びに長さの異なる細胞内カルボキシル末端を交互に配することにより架橋された７個の膜ドメインを含有する。
【０００３】
ＧＰＣＲは非限定例としては、心臓適用、例えば狭心症、本態性高血圧、心筋梗塞、上室性および心室性不整脈、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、腎不全、糖尿病、呼吸器適用、例えば喘息、慢性気管支炎、気管支痙攣、肺気腫、気道閉塞、上気道適用、例えば鼻炎、季節性アレルギー、炎症性疾患、損傷に応答する炎症、リウマチ性関節炎、慢性炎症性腸疾患、緑内障、高ガストリン血症、消化管適用、例えば酸／消化液障害、びらん性食道炎、消化管分泌過多、肥満細胞症、胃小腸反射、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、疼痛、肥満、神経性大食症、うつ病、強迫性障害、器官形成異常（例えば心臓形成異常）、神経変性疾患、例えばパーキンソン病およびアルツハイマー病、多発性硬化症、エプスタイン・バール感染並びに癌などの多くの疾患に関係している。
【０００４】
ＧＰＣＲにより調節される生理学的応答の大きさはＧＰＣＲシグナル伝達およびシグナル停止の間のバランスに関連している。ＧＰＣＲのシグナル伝達はアレスチンと称される細胞内タンパク質のファミリーにより調節される。アレスチンは、アゴニスト活性化されたもの、および特にＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によりリン酸化されているものなどの活性化されたＧＰＣＲと結合する。
【０００５】
ＧＰＣＲなどの受容体はリガンド、ホルモン、および薬物と高度に特異的に結合するので、歴史的に薬物発見および治療薬の標的である。今日使用されている治療薬のおよそ５０％がＧＰＣＲを標的とするかまたは直接相互作用する。例えばＪｕｒｇｅｎ  Ｄｒｅｗｓ、「Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：Ａ  Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１９６０−１９６４（２０００）参照。
【０００６】
解釈が正確で、容易なＧタンパク質共役型受容体活性を検出する方法およびＧＰＣＲ活性を検定する方法が必要とされている。Ｂａｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８９１，６４６号および第６，１１０，６９３号に開示されている１つの方法は、ＧＰＣＲ並びにアレスチンおよび検出可能な分子の結合体を発現する細胞を使用し、その内容は全て参照して本明細書に組み込む。
【０００７】
数百のヒトＧＰＣＲしか知られていないが、ヒトゲノムには１０００以上のＧＰＣＲが存在すると推定されている。これらの公知のＧＰＣＲのうち、多くは依然リガンドに関連付けされていないオーファン受容体である。
【０００８】
ＧＰＣＲアンタゴニストを同定するための大部分の既存の方法はアゴニストの存在に依存する。ＧＰＣＲの活性化を防御する化合物を同定するためのアッセイは典型的には、干渉する化合物を同定するためにＧＰＣＲが最初に活性化されることが必要である。公知のアゴニストとの受容体に関しては、これらのアゴニストは現在これらの受容体を活性化するために使用されている。しかしながら、多くのＧＰＣＲは公知のリガンドまたはアゴニストを伴わないオーファン受容体である。
【０００９】
オーファン受容体に対するアンタゴニストの発見は典型的には先行するアゴニストまたはリガンドの発見に依存するので、ＧＰＣＲアッセイのアゴニスト依存性は依然問題となっている。ＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物をスクリーニングするアゴニスト非依存的方法は（１）スクリーニング方法においてアゴニスト添加の工程を排除する、および（２）オーファン受容体の脱感作を変化させる化合物の同定を可能にする。アゴニスト非依存的方法は、オーファン受容体の脱感作を変化させる化合物に関するスクリーニングに先行してオーファン受容体のアゴニストを同定する工程を排除する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明はＧＰＣＲ内在化を変化させる化合物を同定する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様は、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチンおよび修飾されたＧＲＫを含む細胞を提供することであって、ここで前記ＧＰＣＲは前記ＧＲＫの発現時にアゴニスト非依存的様式で少なくとも部分的に内在化されている、（ｂ）前記細胞を（複数の）化合物に暴露すること、（ｃ）ＧＰＣＲ、アレスチンまたは修飾されたＧＲＫの細胞分布を決定すること、並びに（ｄ）（１）（複数の）化合物の存在下での細胞におけるＧＰＣＲ、アレスチンまたは修飾されたＧＲＫの分布と（２）（複数の）化合物の不在下での細胞におけるＧＰＣＲ、アレスチンまたは修飾されたＧＲＫの分布の間の差異をモニター観察すること、を含むＧＰＣＲ内在化を変化させる化合物を同定する方法である。上記の方法ではアゴニストは提供されなくてもよい。前記方法では、工程（ｄ）の（１）と（２）の間の差異によりＧＰＣＲ内在化の変調を示すことができる。
【００１２】
ＧＲＫは過剰発現され、その発現は誘導可能であり、そしてそれはＣＡＡＸモチーフを含むことができる。ＧＲＫはＧＲＫ１、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＧＲＫ４、ＧＲＫ５、ＧＲＫ６または生物学的に活性なそのフラグメントでよい。
【００１３】
ＧＰＣＲをＧＲＫによりリン酸化が増強されるように修飾することができる。ＧＰＣＲはβ2ＡＲ（Ｙ３２６Ａ）、図１に列挙するＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ、修飾されたＧＰＣＲ、味覚受容体、ＡクラスＧＰＣＲ、ＢクラスＧＰＣＲ、変異体ＧＰＣＲ、または生物学的に活性なそのフラグメントでよい。
【００１４】
アレスチンは視覚アレスチン、錐体アレスチン、βアレスチン１、βアレスチン２、または生物学的に活性なそのフラグメントでよい。
【００１５】
ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、またはアレスチンを検出可能に標識することができる。脱感作に関与する分子を検出可能に標識することができるか、または脱感作に関与する分子と相互作用する分子を検出可能に標識することができる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、（ａ）ＧＰＣＲおよびＧＲＫを含む細胞を提供すること、（ｂ）細胞を（複数の）化合物に暴露すること、並びに（ｃ）（複数の）化合物の存在下でＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化が変化しているかどうかを決定すること、を含むＧＰＣＲリン酸化を変化させる化合物を同定する方法に関する。
【００１７】
ＧＰＣＲまたはＧＲＫの細胞分布を決定することができる。（１）（複数の）化合物の存在下での細胞におけるＧＰＣＲまたはＧＲＫの分布と（２）（複数の）化合物の不在下での細胞におけるＧＰＣＲまたはＧＲＫの分布の間の差異をモニター観察することができる。（１）と（２）の間の差異はＧＰＣＲのリン酸化に相関し得る。
【００１８】
ＧＲＫは細胞膜には位置していないことがあり、これはＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化が変化していることを示している。ＧＰＣＲのリン酸化状態を決定することができる。ＧＲＫの活性を決定することができる。内在化されるＧＰＣＲの能力を測定することができる。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞を提供することであって、ここでアレスチンは検出可能に標識されている、（ｂ）アレスチンの細胞分布を決定すること、並びに（ｃ）アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲの細胞膜で発現される能力に相関させること、を含むＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する方法に関する。アレスチンは小胞、小窩エンドソーム、または脱感作経路のその他の場所に局在し得る。
【００２０】
加えて、本発明は（ａ）ＧＰＣＲおよびＧＲＫを含む細胞を提供することであって、ここでＧＲＫは検出可能に標識されている、（ｂ）ＧＲＫの細胞分布を決定すること、並びに（ｃ）ＧＲＫの細胞分布をＧＰＣＲの細胞膜で発現される能力に相関させること、を含むＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する別の方法に関する。ＧＲＫは細胞膜に局在し得る。
【００２１】
別の態様では、本発明は（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞を提供することであって、ここでアレスチンは検出可能に標識されている、（ｂ）アレスチンの細胞分布を決定すること、並びに（ｃ）アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力に相関させること、を含むＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力を分析する方法に関する。アレスチンまたはＧＰＣＲは小胞、小窩またはエンドソームに局在し得る。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の方法により同定された化合物に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は（ａ）本発明の方法により同定した化合物を提供すること、および（ｂ）化合物を宿主に投与すること、を含む宿主細胞におけるＧＰＣＲの脱感作を変調することにより疾患を処置する方法に関する。
【００２４】
本発明の別の態様は、ＧＰＣＲおよび修飾されたＧＲＫを含む宿主細胞に関する。ＧＲＫは誘導可能であるか、または過剰発現できる。宿主細胞はさらにアレスチンを含むことができ、ここでアレスチンを検出可能に標識することができる。ＧＰＣＲ、ＧＲＫまたは脱感作に関与するその他の分子、もしくは脱感作に関与する分子と相互作用する分子を検出可能に標識することができる。
【００２５】
本発明の別の態様は（ａ）ＧＲＫをコードする核酸を提供すること、（ｂ）コードされたＧＲＫがＣＡＡＸモチーフを含むようにＧＲＫをコードする核酸を変異させることであって、ここで修飾されたＧＲＫはアゴニストの不在下でＧＰＣＲをリン酸化する、および（ｃ）細胞において修飾されたＧＲＫを発現すること、を含むＧＰＣＲが構成的に内在化されているＧＲＫをコードする核酸を修飾する方法に関する。ＧＲＫをコードする核酸は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、または３４を含むことができる。
【００２６】
本発明またはＧＰＣＲおよび修飾されたＧＲＫを含む宿主細胞を含む、ＧＰＣＲの内在化を変調する化合物を同定するためのキットにも関する。
【００２７】
別の態様では、本発明はＮＰＸＸＹモチーフおよびカルボキシル末端テールを含む修飾されたＧＰＣＲに関し、ここでカルボキシル末端テールは推定されるパルミトイル化部位および１つまたはそれ以上のリン酸化のクラスタを含み、ここでカルボキシル末端テールは第２のＧＰＣＲのカルボキシル末端の部分に融合された第１のＧＰＣＲ部分のカルボキシル末端領域の保持された部分を含み、そしてここで第２のＧＰＣＲは１つまたはそれ以上のリン酸化のクラスタを含み、そしてさらに第２のＮＰＸＸＹモチーフの下流に位置付けられるおよそ１０個から２５個のアミノ酸残基の第２の推定されるパルミトイル化部位を含む。第１のＧＰＣＲはＡクラス受容体でもよい。第１のＧＰＣＲはｈＧＰＲ３、ｈＧＰＲ６、ｈＧＰＲ１２、ｈＳＲＥＢ２、ｈＳＲＥＢ３、ｈＧＰＲ８、またはｈＧＰＲ２２でもよい。第２のＧＰＣＲはＢクラス受容体でもよい。Ｂクラス受容体をバソプレッシンＶ２受容体、ニューロテンシン１受容体、サブスタンスＰ受容体、およびオキシトシン受容体からなる群から選択することができる。
【００２８】
本発明は修飾されたＧＰＣＲをコードする核酸に関する。配列番号３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および９０からなる群から選択される核酸は本発明に含まれる。核酸を含む発現ベクターもまた本発明に含まれる。発現ベクターまたは核酸を含む宿主細胞もまた含まれる。
【００２９】
別の態様では、本発明は（ａ）少なくとも１つの修飾されたＧＰＣＲを発現する細胞を提供することであって、ここで細胞はさらに検出可能な分子に抱合されたアレスチンを含む、（ｂ）細胞を化合物に暴露すること、（ｃ）細胞内のアレスチンの位置を検出すること、（ｄ）化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置を化合物の不在下での細胞内のアレスチンの位置と比較すること、並びに（ｅ）（１）化合物の存在下での細胞内のアレスチンの位置と（２）化合物の不在下での細胞内のアレスチンの位置の間の差異を相関させること、の工程を含むＧＰＣＲ活性に対する化合物をスクリーニングする方法に関する。アレスチンをエンドソーム、エンドサイトーシス小胞、または小窩で検出することができる。
【００３０】
本発明の別の態様は少なくとも１つの修飾されたＧＰＣＲを発現する細胞を含むＧＰＣＲの活性を変調する分子を同定するためのキットであって、ここで細胞はさらに検出可能な分子に抱合された脱感作に関与する分子を含む。
【００３１】
本発明の目的および利点は以下の詳細な記載を図面と組み合わせて読むことにより理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明に従って、当分野の技術範囲内で従来の分子生物学、微生物学、免疫学および組換えＤＮＡ技術を用いることができる。このような技術は文献中で十分に説明されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版（２００１）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ−ＩＶ巻、［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（２００２、隔月に更新）］；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第Ｉ−ＩＩＩ巻、［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（１９９４）］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ−ＩＶ巻、［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（２００２、隔月に更新）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」［Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編（１９８４）］；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ」第４版［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（２０００）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」（１９８８）；「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」第１号、［Ｈａｒｌｏｗ，ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄａｖｉｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）］；「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、［Ｈａｒｌｏｗ，ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄａｖｉｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）］；「Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｓ」［Ｔ．Ｈａｇａら編（１９９９）］参照。
【００３３】
特記しない場合、明細書および請求の範囲で用いる以下の用語は以下で提示する意味を有する。
【００３４】
「レプリコン」はインビボでＤＮＡ複製の自律性単位として機能するいずれかの遺伝的エレメント（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である；すなわちその独自の調節下で複製できる。
【００３５】
「ベクター」は、付着したセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが付着できるレプリコン、例えばプラスミド、ファージまたはコスミドである。
【００３６】
「ＤＮＡ」分子は１本鎖形態または２本鎖らせんのいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形態を意味する。この用語は分子の１次および２次構造のみを意味し、そしていずれかの特定の３次形態に限定するものではない。従って、この用語は特に直鎖状ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色体で見出される２本鎖ＤＮＡを含む。特定の２本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合、ＤＮＡの非転写鎖（すなわちｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の方向の配列のみを提示する通常の慣例に従って、配列を本明細書に記載することができる。
【００３７】
「複製起点」はＤＮＡ合成の開始に関与するこれらのＤＡＮ配列を意味する。
【００３８】
ＤＮＡ「コード化配列」は、適当な制御配列の調節下に置かれた場合にインビボで転写され、そしてインビボでポリペプチドに翻訳される２本鎖ＤＮＡ配列である。コード化配列の境界は５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード化配列には、非限定例としては原核細胞配列、真核細胞ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核細胞（例えば哺乳動物）ＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列などが挙げられる。ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は通常コード化配列の３’に位置付けられるであろう。
【００３９】
転写および翻訳調節配列は、宿主細胞におけるコード化配列の発現を提供するＤＮＡ制御配列、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等である。
【００４０】
宿主細胞におけるコード化配列の発現は誘導可能でもよい。誘導可能とは、発現を制御できることを意味する。例えば、核酸は細胞に存在することができるが、必要なシグナルが提供されるまで発現されない。典型的には、タンパク質の誘導可能な発現は、タンパク質の転写を誘導するために必要なシグナルを必要とするプロモーターにより調節される。しかしながら、また細胞における目的のＤＮＡ配列の数を増加させる方法または配列により、発現を誘導することもできる。このような方法または配列は複製起点、およびＤＡＮの細胞への物理的な添加を含む。
【００４１】
「プロモーター配列」は細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し、そしてコード化配列の下流（３’方向）の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。本発明を定義する目的のために、プロモーター配列は転写開始部位によりその３’末端で結合し、そして上流（５’方向）に伸長して、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最低数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内で転写開始部位（好都合なことに、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングにより定義される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合に寄与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核細胞プロモーターは、いつもではないが、しばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。原核細胞プロモーターは−１０および−３５コンセンサス配列に加えてシャイン‐ダルガノ配列を含有する。
【００４２】
「発現調節配列」は別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼがコード化配列をｍＲＮＡに転写する場合、コード化配列は細胞の転写および翻訳調節配列の「調節下」にあり、これは次いでコード化配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。
【００４３】
「シグナル配列」はコード化配列の前に含まれ得る。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に向けるか、またはポリペプチドを培地に分泌するように宿主細胞に伝達する、ポリペプチドに対してＮ末端のシグナルペプチドをコードし、そしてこのシグナルペプチドはタンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞により切り取られる。シグナル配列が原核細胞および真核細胞に天然にある種々のタンパク質に随伴されるのを見出すことができる。
【００４４】
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」なる用語は本発明のプローブを意味し、２つまたはそれ以上、好ましくは３つ以上のリボヌクレオチドからなる分子として定義される。その正確な大きさは多くの因子に依存し、その因子は今度はオリゴヌクレオチドの最終的な機能および使用に依存する。
【００４５】
本明細書で用いる「プライマー」なる用語は精製された制限酵素消化でのように自然発生でも、または合成的に生成されても、オリゴヌクレオチドを意味し、これは、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される、すなわちヌクレオチドおよび誘導物質、例えばＤＮＡポリメラーゼの存在下並びに適当な温度およびｐＨの条件下に置かれた場合、合成の開始点として作用できる。プライマーは１本鎖または２本鎖のどちらでもよく、そして誘導物質の存在下で望ましい伸長生成物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは温度、プライマーの供給源および方法の使用などの因子に依存する。例えば、診断適用のためには、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５個から２５個またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それより少ないヌクレオチドを含有してもよい。
【００４６】
本明細書のプライマーは特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に「実質的に」相補的であるように選択される。これはプライマーがその各々の鎖とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。従って、プライマー配列が鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチドフラグメントがプライマーの５’末端に付着でき、プライマー配列の残りは鎖に相補的である。また別に、プライマー配列がそれとハイブリダイズする鎖の配列と十分に相補的であり、そしてそれにより伸長生成物の合成のための鋳型を形成するのであれば、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーに組み入れることができる。
【００４７】
本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」なる用語は、細菌性酵素を意味し、その各々は特異的ヌクレオチド配列、またはその近くで、２本鎖ＤＮＡを切断する。
【００４８】
外因性または異種性ＤＮＡが細胞内に導入された場合、細胞はこのようなＤＮＡにより「形質転換されて」いる。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合して）も、または組み込まれなくてもよい。例えば原核生物、酵母および哺乳動物細胞において、形質転換ＤＮＡはエピソームエレメント、例えばプラスミドに保持される。真核生物細胞に関しては、持続的発現形質転換細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれて、染色体複製により娘細胞に遺伝する。この持続的発現は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含む、真核生物細胞の細胞系またはクローンを確立する能力により実証される。「クローン」とは、単一の細胞または有糸分裂による共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系」とは、多くの世代でインビトロで安定して成長できる１次細胞のクローンである。
【００４９】
少なくとも約６５％（好ましくは少なくとも約８０％、および最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドが規定の長さのＤＮＡ配列に一致する場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」である。配列データバンクで利用可能な標準的なソフトウェアを用いて、またはその特定の系に関して定義されるような、例えばストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより、実質的に相同である配列を同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当分野の技術範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第ＩおよびＩＩ巻、前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前出；参照。
【００５０】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、および８９と同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列もまた本発明の範囲内であると理解すべきであるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、および９０に縮重するものもまた範囲内であると理解すべきである。「縮重する」とは異なる３文字コドンが特定のアミノ酸に特定化するために用いられることを意味する。
【００５１】
「アレスチン」は自然発生および人工のアレスチンの変種の全ての型を意味し、非限定例としては視覚アレスチン（しばしばアレスチン１と称される）、錐体アレスチン（しばしばアレスチン４と称される）、βアレスチン１（しばしばアレスチン２と称される）、およびβアレスチン２（しばしばアレスチン３と称される）などがある。
【００５２】
「βＡＲＫ１」はβアドレナリン作動性受容体キナーゼ１と称され、ＧＲＫ２とも呼ばれるＧＲＫである。
【００５３】
「βＡＲ」はβアドレナリン作動性受容体と称されるＧＰＣＲである。
【００５４】
ＧＰＣＲの「内在化」は細胞表面膜から細胞内小胞膜へのＧＰＣＲの転位置であり、この場合、細胞の外側に残存する物質に接近不能であろう。
【００５５】
「カルボキシル末端テール」は膜スパン７に続くＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを意味する。多くのＧＰＣＲのカルボキシル末端テールは、７番目の膜貫通ドメインの終わりを特徴付ける保存されたＮＰＸＸＹモチーフの直後に始まる（すなわちＮＰＸＸＹモチーフに後続するものがＧＰＣＲのカルボキシル末端テールである）。カルボキシル末端テールは比較的長く（およそ数十から数百個のアミノ酸）、比較的短く（およそ数十個のアミノ酸）、または事実上存在しなくてよい（およそ１０個のアミノ酸よりも少ない）。本明細書で用いる「カルボキシル末端テール」は３つの変種全て（比較的長くても、比較的短くても、または事実上存在しなくても）を意味し、そして（複数の）パルミトイル化システイン残基を含有してもしなくてもよい。
【００５６】
好ましくは、「Ａクラス受容体」はＨＥＫ−２９３細胞においてアレスチン−ＧＦＰに会合してアレスチンタンパク質と一緒にエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに転位置しない。
【００５７】
好ましくは、「Ｂクラス受容体」はＨＥＫ−２９３細胞においてアレスチン−ＧＦＰに会合してアレスチンタンパク質と一緒にエンドサイトーシス小胞またはエンドソームに転位置する。
【００５８】
「ＤＡＣ」はいずれかの脱感作活性化合物を意味する。脱感作活性化合物は、過程を刺激するか、または阻止するかのいずれかにより、ＧＰＣＲ脱感作メカニズムに影響を及ぼすいずれかの化合物である。ＤＡＣは、非限定例としては、アレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ホスホイノシチド３−キナーゼ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、タンパク質ホスファターゼ等を含む、過程のいずれかの細胞成分および過程に関係しているいずれかの細胞構造に作用することにより、ＧＰＣＲ脱感作経路に影響を及ぼすことができる。ＤＡＣには非限定例としてはアレスチンのＧＰＣＲへの転位置を阻止する化合物、アレスチンのＧＰＣＲへの結合を阻止する化合物、アレスチンのＧＰＣＲへの転位置を刺激する化合物、ＧＰＣＲに結合するアレスチンを刺激する化合物、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化を阻止する化合物、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化を刺激する化合物、ＧＰＣＲに結合するＧＲＫを刺激または阻止する化合物、ＧＰＣＲのタンパク質ホスファターゼ脱リン酸を阻止する化合物、ＧＰＣＲのタンパク質ホスファターゼ脱リン酸を刺激する化合物、ＧＰＣＲ内在化または細胞表面へのリサイクルを防御する化合物、ＧＰＣＲからのアレスチンの放出を制御する化合物、ＧＰＣＲのアンタゴニスト、インバースアゴニスト等がある。ＤＡＣはＧＰＣＲ脱感作過程を阻止または刺激でき、そしてＧＰＣＲの従来のアゴニストおよびアンタゴニストとしてＧＰＣＲの同一のリガンド結合部位に結合することができない。ＤＡＣはＧＰＣＲとは独立して作用でき、すなわちこれは１つの特定のＧＰＣＲまたは１つの特定のＧＰＣＲの型にそれほど特異的ではない。ＤＡＣはアゴニストまたはアンタゴニストと（複数の）同一部位に結合できるが、受容体を脱感作しない（恐らく受容体が適切にリン酸化されるか、またはアレスチンもしくはいずれか別のタンパク質に結合するのを変えないことによる）。ＤＡＣは受容体のアロステリック部位に結合でき、そして脱感作を阻止または増強できる。
【００５９】
「検出可能な分子」は分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、放射活性、並びに非限定例としては蛍光、リン光、および生物発光および放射活性減衰などの光学的手段により検出可能ないずれかの分子を意味する。検出可能な分子には、非限定例としてはＧＦＰ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ローダミン抱合抗体等がある。検出可能な分子は放射性同位元素、エピトープタグ、親和性標識、酵素、蛍光基、化学発光基等を含む。検出可能な分子は（複数の）その他の分子とのその相互作用の機能として直接的または間接的に検出される分子を含む。
【００６０】
「ＧＦＰ」は天然供給源から単離できる種々の自然発生形態のＧＦＰ、または遺伝子操作されて人工的に修飾されたＧＦＰを意味する緑色蛍光タンパク質を意味する。ＧＦＰは当分野で周知である。例えば、米国特許第５，６２５，０４８号、第５，７７７，０７９号、および６，０６６，４７６号参照。ＧＦＰを、天然供給源から単離された、または遺伝子操作された、非限定例としては黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェリン、紫外光またはいずれかの中間波長で励起される蛍光タンパク質などのその他の蛍光タンパク質と容易に交換することができる。本明細書で用いる「ＧＦＰ」は当分野で公知の全ての蛍光タンパク質を意味する。
【００６１】
「未知のまたはオーファン受容体」はそのリガンドが未知であるＧＰＣＲを意味する。
【００６２】
「下流」とはアミノ末端に関してアミノ酸配列のカルボキシル末端に向かうことを意味する。
【００６３】
「上流」とはカルボキシル末端に関してアミノ酸配列のアミノ末端に向かうことを意味する。
【００６４】
特定の好ましい特性を有するアミノ酸を置換するためにアミノ酸置換体を導入することができる。例えば、Ｃｙｓは別のＣｙｓとのジスルフィド架橋の形成を可能にするための潜在的部位として導入することができる。特定の「触媒性」残基としてＨｉｓを導入することができる（すなわちＨｉｓは酸または塩基として作用でき、そして生化学的触媒において最も一般的なアミノ酸である）。タンパク質構造のβターンを誘導するその特に平面構造のためにＰｒｏを導入することができる。
【００６５】
少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）のアミノ酸残基が同一であるかまたは同類置換を示す場合、２個のアミノ酸配列は「実質的に相同」である。
【００６６】
ＤＮＡ構築物の「異種性」領域とは、天然ではより大きな分子と会合して見出されない、より大きなＤＮＡ分子のＤＮＡの識別可能なセグメントである。従って、異種性領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、遺伝子は供給源生物のゲノムにおいて哺乳動物ゲノムＤＮＡをフランキングしないＤＮＡにより通常フランキングされるであろう。異種性コード化配列の別の実例は、コード化配列そのものが天然には見られない構築物である（例えばゲノムコード化配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、または元来の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子の変種または自然発生変異は本明細書で定義するＤＮＡの異種性領域を生じない。
【００６７】
「医薬上許容される」という語句は、ヒトに投与した場合生理学的に耐性があり、典型的にはアレルギーまたは類似の有害反応、例えば異常亢進、めまい等を生み出さない分子物質および組成物を意味する。
【００６８】
本明細書で用いる「治療的有効量」という語句は病理学のいくつかの特徴、例えば血圧、呼吸器排出量の上昇等を防御および好ましくは低減するのに十分な量を意味する。
【００６９】
発現調節配列がそのＤＮＡ配列の転写および翻訳を調節および制御する場合、ＤＮＡ配列は発現調節配列に「操作可能なように連結されている」。「操作可能なように連結されている」という用語は発現されるＤＮＡ配列の前に特有の開始シグナル（例えばＡＴＧ）を有すること、および発現調節配列の調節下でＤＮＡ配列の発現およびＤＮＡ配列によりコードされる所望の生成物の生成を可能にする正確な読み枠を維持することを含む。組換えＤＮＡ分子に挿入するのが望ましい遺伝子が特有の開始シグナルを含有しない場合、このような開始シグナルを遺伝子の前に挿入することができる。
【００７０】
「ハイブリダイゼーション」は水素結合を意味し、これは相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン・クリック型、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型水素結合であってもよい。例えばアデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は水素結合の形成を介して対を形成する相補的塩基である。
【００７１】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の双方ための５×ＳＳＣおよび６５℃に実質的に等しい塩および温度条件を意味する。しかしながら、このような「標準的なハイブリダイゼーション条件」がバッファー中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、誤対合率、ホルムアミドパーセントなどの特定の条件に依存することは当業者に理解されよう。ハイブリダイズする２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡかどうかもまた「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定において重要である。このような標準的なハイブリダイゼーション条件は当業者により、周知の方式に従って容易に決定され、ここで望む場合、ハイブリダイゼーションは典型的には予測されたまたは決定されたＴｍより１０から２０℃下回り、高ストリンジェンシーで洗浄する。
【００７２】
「動物」とは脊椎動物（例えばカエル、サンショウウオ、ニワトリまたはウマ）および無脊椎動物（例えば虫など）を含む動物界のいずれかのメンバーを意味する。また「動物」は「哺乳動物」を含むことを意味する。好ましい哺乳動物には家畜（例えば、畜牛、水牛、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギなどの有蹄動物）、およびげっ歯類（例えばマウス、ハムスター、ラットおよびモルモット）、イヌ科、ネコ科、霊長類、オオカミ、ラクダ科、シカ科、げっ歯動物、鳥類および魚類などがある。
【００７３】
「（複数の）アンタゴニスト」はアゴニストに結合する野生型および／または修飾されたＧＰＣＲ、野生型および／または修飾されたＧＰＣＲ脱感作、野生型および／または修飾されたＧＰＣＲ結合アレスチン、野生型および／または修飾されたＧＰＣＲエンドソーム局在化、内在化等に干渉する全ての作用物質を含み、野生型および／または修飾されたＧＰＣＲに影響する作用物質、並びに野生型および／または修飾されたＧＰＣＲシグナル発生、脱感作、エンドソーム局在化、再感作等に関与するその他のタンパク質に影響する作用物質を含む。
【００７４】
「修飾されたＧＰＣＲ」とはそのカルボキシル末端テールのアミノ酸配列に１つまたはそれ以上の修飾を有するＧＰＣＲを意味する。このようにカルボキシル末端テールを全体または部分的に修飾することができる。アミノ酸配列におけるこれらの修飾には１つまたはそれ以上のアミノ酸の変異、１つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入、１つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、および１つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失され、１つまたはそれ以上のアミノ酸が欠失されたアミノ酸の代わりに付加されている、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換などがある。このような修飾されたＧＰＣＲは本明細書、および米国特許出願第０９／９９３，８４４号（その全てを参照して本明細書に組み込む）に記載されている。
【００７５】
「ＧＰＣＲ」はＧタンパク質共役型受容体を意味し、そして自然状態で天然に発生するＧＰＣＲおよび修飾されているＧＰＣＲを含む。
【００７６】
「推定されるパルミトイル化部位」はパルミタート付加の予測される部位を意味し、好ましくはシステイン残基である。本発明で用いるＧＰＣＲでは、推定されるパルミトイル化部位は好ましくはＮＰＸＸＹモチーフの下流の１０から２５個、好ましくは１５から２０個のアミノ酸残基である。
【００７７】
「リン酸化部位のクラスタ」は効率よくリン酸化され得る故にリン酸化部位として容易に機能し得るアミノ酸残基のクラスタを意味する。アミノ酸のクラスタはＧＰＣＲのカルボキシル末端テールの、２つのうちの２つ、３つのうちの２つ、３位置のうちの３つ、４位置のうちの３つ、４つのうちの４つ、５位置のうちの４つ、５つのうちの５つ等の連続したアミノ酸位置を占める。リン酸化部位のこれらのクラスタは好ましくはセリン（Ｓ）および／またはスレオニン（Ｔ）残基のクラスタである。得られた修飾ＧＰＣＲが十分な親和性を伴ってアレスチンと結合してアレスチンをエンドソームに補充するように、リン酸化部位のクラスタをＧＰＣＲ配列に置換、挿入、または付加することができる。
【００７８】
「ＮＰＸＸＹモチーフ」は７番目の膜貫通ドメインの終わりを特徴付ける保存アミノ酸モチーフを意味する。保存アミノ酸モチーフは最も頻繁にはアスパラギンおよびプロリンで始まり、２個の不特定のアミノ酸そして次にチロシンが続く。２個の不特定のアミノ酸はＧＰＣＲの間で変動してよいが、全体のＮＰＸＸＹモチーフは保存される。
【００７９】
「異常なＧＰＣＲ脱感作」および「異常な脱感作」は、活性な受容体および脱感作された受容体の間のバランスが野生型条件に対して変化しているように、ＧＰＣＲ脱感作経路が破壊されていることを意味する。通常よりもさらに活性な受容体があるか、または野生型条件よりも脱感作されている受容体があるかのいずれかである。異常なＧＰＣＲ脱感作は構成的に活性な、または構成的に脱感作されているＧＰＣＲの結果でよく、その受容体のシグナル発生において正常を超えた上昇またはその受容体のシグナル発生において正常を下回る低下に至る。
【００８０】
「生物学的サンプル」は、対象および対象内に存在する組織、細胞および流動体から単離された組織、細胞および体液を含むことを意図し、ここで該サンプルは血液、血清、尿サンプル、便サンプル、腫瘍サンプル、細胞洗浄液、口腔サンプル、唾液、体液、組織抽出物、新たに収集された細胞、または組織培養においてインキュベートされている細胞でよい。
【００８１】
「併用投与」、「組み合わせ投与」、「同時投与」または「同時に投与された」は、同一時点で、または観察された結果が、２つもしくはそれ以上の化合物が同一時点で投与された場合と本質的に同一である十分に接近した時間で化合物が投与されることを意味する。
【００８２】
「保存された異常」は、非限定例としては、異常なＧＰＣＲシグナル伝達を引き起こし得る、ＧＰＣＲ、ＧＲＫ、アレスチン、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、タンパク質ホスファターゼ等の異常などのＧＰＣＲ経路における異常を意味する。この異常なＧＰＣＲシグナル発生はＧＰＣＲ関連疾患の原因となり得る。
【００８３】
「脱感作されたＧＰＣＲ」は現在、アゴニストに応答し、そして従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化する能力を備えていないＧＰＣＲを意味する
【００８４】
「脱感作された経路」は、脱感作過程のいずれかの細胞成分、並びに脱感作過程に関係しているいずれかの細胞構造およびそれに続く過程を意味し、非限定例としてはアレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、タンパク質ホスファターゼ等がある。本発明の検定の方法では、例えば細胞質中、細胞膜、クラスリンコート小窩、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、いずれかの中間の段階等で、ポリペプチドを検出することができる。
【００８５】
「ＧＰＣＲシグナル伝達」はＧタンパク質の活性化を誘導されたＧＰＣＲを意味する。これは例えばｃＡＭＰ生成をもたらすであろう。
【００８６】
「Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ」（ＧＲＫ）はＧＰＣＲをリン酸化する能力を有するいずれかのキナーゼ含む。本発明で用いることができる特定のＧＲＫを図２に列挙する。スプライスバリアント、生物学的に活性なフラグメント、修飾されたＧＲＫ、および動物、そしてその他の生物に由来するＧＲＫが含まれる。
【００８７】
「ホモ・サピエンスＧＰＣＲ」はホモ・サピエンスにおいて天然に発生するＧＰＣＲを意味する。
【００８８】
「インバースアゴニスト」は、ＧＰＣＲへの結合時にＧＰＣＲの基底の固有の活性を阻害する化合物を意味する。インバースアゴニストはアンタゴニストの１つの型である。
【００８９】
「修飾されたＧＲＫ」はそれが脱感作を変化させるように修飾されたＧＲＫを意味する。
【００９０】
「自然発生ＧＰＣＲ」は天然に存在するＧＰＣＲを意味する。
【００９１】
「臭気物質リガンド」は、受容体への結合時に匂いの知覚に至るリガンド化合物を意味し、アゴニストおよびアンタゴニスト分子などの、合成化合物および／または組換えにより生成された化合物を含む。
【００９２】
「臭気物質受容体」は通常嗅覚ニューロンの表面に見られる受容体タンパク質を意味し、これは活性化された場合（通常臭気物質リガンドの結合による）匂いの知覚に至る。
【００９３】
本明細書で用いる「医薬上許容される担体」という用語は、化学物質を担持または輸送するのに関係する医薬上許容される材料、組成物または溶剤、例えば液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を意味する。
【００９４】
「感作されたＧＰＣＲ」は現在、アゴニストに応答し、そして従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化する能力を有しているＧＰＣＲを意味する。
【００９５】
「変調」は発現の少なくとも上方制御もしくは下方制御、またはタンパク質の活性の上昇もしくは低下を含む。タンパク質の変調はタンパク質またはタンパク質を制御する化合物の活性の上方制御、下方制御、上昇または低下を含む。変調はまた遺伝子、ｍＲＮＡまたは目的のタンパク質の合成におけるその他のいずれかの工程の制御をも含む。
【００９６】
「過剰発現された」タンパク質は野生型の発現レベル以上のレベルで発現されたタンパク質を意味する。
【００９７】
「修飾されたＧＲＫ」はＧＲＫのＣ末端のアミノ酸配列において１つまたはそれ以上の修飾を有するＧＲＫを意味する。修飾されたＧＲＫは構成的に細胞膜に局在する。ＧＲＫはＣＡＡＸモチーフの付加により修飾されているのが好ましい。
【００９８】
「ＣＡＡＸ」モチーフは４個のアミノ酸配列を意味し、ここでＣはシステインであり、Ａは脂肪族アミノ酸であり、そしてＸはタンパク質のＣ末端アミノ酸である。
【００９９】
「構成的」活性とは、アゴニストの不在下で生じる活性を意味する。例えば、構成的に細胞膜に局在する修飾されたＧＲＫは、修飾されたＧＲＫがアゴニストの不在下で細胞膜に局在することを意味する。
【０１００】
「ＧＲＫ−Ｃ２０」はそれに付加されたゲラニルゲラニル基を有する能力を備えている修飾されたＧＲＫを意味する。ＧＲＫ２−Ｃ２０はこの様式で修飾されたＧＲＫ２である。ＧＲＫ−Ｃ２０はＣＡＡＸモチーフを含有するのが好ましい。
【０１０１】
本発明者はＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物をスクリーニングするためのアゴニスト非依存的方法を開発した。本発明者はアゴニスト不在下でＧＰＣＲが脱感作されている細胞系を開発した。これらの細胞系は修飾されていてよいＧＲＫを含む。これらの細胞系を用いて、本発明者はアゴニスト不在下でＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物をスクリーニングするための方法を開発した。これらの方法はスクリーニング方法からアゴニスト添加の工程を排除する。この工程の排除により（１）公知のアゴニストでＧＰＣＲの脱感作を変化させる化合物に関するさらに有効なスクリーニング方法が作られる、そして（２）公知のアゴニストがないオーファンＧＰＣＲの脱感作を変化させる化合物に関するスクリーニング方法が提供される。本発明者はＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定し、そしてＧＰＣＲがアレスチンに関して親和性を有しているかどうかを決定するための方法を開発し、好ましくはこれらの方法はオーファンＧＰＣＲおよびＧＲＫを含有する宿主細胞を利用し、ここでＧＰＣＲはＧＲＫの発現時にアゴニスト非依存的な様式で少なくとも部分的に内在化されており、従ってアゴニスト添加の必要性が排除される。本発明者はアレスチンに関する親和性を上昇させるためにＧＰＣＲを修飾した。これらの修飾されたＧＰＣＲは脱感作を変化させる化合物をスクリーニングするためのアゴニスト非依存的方法に有用である。
【０１０２】
ＧＰＣＲおよび脱感作
ＧＰＣＲのアゴニストへの暴露は、その同族ヘテロ三量体Ｇタンパク質からの受容体の脱共役に関与するそのシグナル発生能力の迅速な減衰を生み出す。アゴニスト特異的または相同脱感作を媒介する細胞メカニズムは、アゴニスト占有受容体がＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によりリン酸化され、そして次にアレスチンタンパク質と結合する２工程過程である。
【０１０３】
アゴニストがＧＰＣＲに結合した後、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）がＧＰＣＲの細胞内ドメインをリン酸化することが知られている。リン酸化の後、アレスチンタンパク質はＧＲＫリン酸化受容体と会合し、そして受容体をその同族Ｇタンパク質から脱共役させる。アレスチンとリン酸化ＧＰＣＲとの相互作用はＧＰＣＲシグナル伝達を終止させ、そしてシグナル発生しない、脱感作された受容体を生み出す。
【０１０４】
脱感作されたＧＰＣＲに結合したアレスチンはアダプタータンパク質として機能することによりＧＰＣＲをクラスリンコートされた小窩またはエンドサイトーシスのためのその他の細胞機構に対して標的化し（すなわち、内在化）、ＧＰＣＲをエンドサイトーシス機構の成分、例えばアダプタータンパク質２（ＡＰ−２）およびクラスリンに連結させる。内在化されたＧＰＣＲは脱リン酸化されて、再感作された細胞表面に戻ってリサイクルされるか、または細胞内に保持されて、分解される。アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用の安定性は、ＧＰＣＲの脱リン酸化、リサイクル、および再感作の速度に影響する１つの因子である。脱感作過程におけるＧＰＣＲリン酸化および脱リン酸の関与は２００１年１１月５日出願の米国特許出願第０９／９３３，８４４号で例示されており、その開示はその全てを参照して本明細書に組み込む。
【０１０５】
本明細書に記載する方法を用いて、本発明者はアレスチンに関する親和性を有していない特定のＧＰＣＲを同定した。本発明者はこれらのそのカルボキシル化末端テールに適切に位置付けられる１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタを含むようにＧＰＣＲを修飾した。この修飾により、修飾されたＧＰＣＲが、一体としてエンドソーム内に内在化されるアレスチンとの安定した複合体を形成することが可能になる。これらの修飾されたＧＰＣＲはＧＰＣＲ活性を検定する方法において有用である。これらの修飾されたＧＰＣＲはＧＰＣＲのアゴニストを同定するのに有用である。これらの修飾されたＧＰＣＲは本明細書で記載するアゴニスト非依存的スクリーニングにおいて有用である。
【０１０６】
ＤＲＹモチーフを含有するように変化されたＧＰＣＲを用いるアゴニスト非依存的スクリーニング方法が米国特許出願第１０／０５４，６１６号に記載されており、これはその全てを参照して本明細書に組み込む。ＧＰＣＲの変化はそのスクリーニング方法に含まれ；利用される各々のＧＰＣＲはその様式で変化されていなければならない。
【０１０７】
本発明者は、ＧＲＫを用いるアゴニスト非依存的スクリーニング方法を開発したが、それらのＧＲＫは修飾されていてもよい。これらのＧＲＫはアゴニストの不在下でＧＰＣＲをリン酸化する。これらのリン酸化されたＧＰＣＲはアゴニストの不在下で内在化する。本発明者はこれらの修飾されたＧＲＫを利用するＧＰＣＲ内在化のアンタゴニストに関するアゴニスト非依存的スクリーニング方法を開発した。これらの方法は米国特許出願第１０／０５４，６１６号に記載されたＧＰＣＲ変化を必要としない。
【０１０８】
以前に、特定のＧＲＫが細胞膜に構成的に局在することが示された。Ｉｎｇｌｅｓｅらは構成的にイソプレニル化されて膜に局在化されたＧＲＫ２−Ｃ２０を構築した。
【０１０９】
本発明者は構成的に細胞膜に局在するＧＲＫの細胞発現の結果ＧＰＣＲの構成的脱感作に至ることを決定した。これらのＧＲＫを過剰発現でき、その発現は誘導可能であり、それをコードする核酸はベクターに位置付けられるかまたはゲノムに組み込まれていてよい。本発明者は構成的に細胞膜に局在するＧＲＫを発現する宿主細胞を構築した。これらの宿主細胞はまたアレスチンをも発現できる。これらの宿主細胞に目的のＧＰＣＲを導入した。ＧＲＫ含有細胞を用いて目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定し、ＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力を分析し、そして構成的に脱感作されたＧＰＣＲを検出するための方法を開発した。本発明者はこれらの脱感作方法を築き上げ、そしてＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物を同定するアゴニスト非依存的方法を開発した。これらの方法は、ＧＰＣＲアゴニストが公知であっても、または未知であっても、ＧＰＣＲの内在化を変化させる化合物の同定に有用である。
【０１１０】
本発明者はまた、発現が増加した野生型または修飾されたＧＲＫは、ＧＲＫが細胞膜に構成的に局在するかどうかに関わらず脱感作を上昇されることも決定した。
【０１１１】
本発明は修飾されたＧＰＣＲ、修飾されたＧＰＣＲのポリペプチド、修飾されたＧＰＣＲをコードする核酸分子、修飾されたＧＰＣＲをコードする核酸分子を含有するベクター、修飾されたＧＰＣＲの核酸構築を可能にするベクター、および修飾されたＧＰＣＲを含有する細胞に関する。本発明はさらに修飾されたＧＰＣＲを用いるアッセイ系、修飾されたＧＰＣＲを含有する細胞を用いるアッセイ系、アッセイ系を用いて同定された化合物、同定された化合物を用いる処置方法、アッセイ系を用いる疾患診断の方法、並びに本発明のアッセイ試薬および本発明の細胞を含有するキットに関する。
【０１１２】
特定のコドンを異なるアミノ酸をコードするコドンに変化させるようにＧＰＣＲまたは修飾されたＧＰＣＲに変異を作ることができる。このような変異は一般的には可能なヌクレオチド変化を最も少なくすることにより作製される。得られたタンパク質におけるアミノ酸を非保存様式（すなわち特定の大きさまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸のコドンを別の分類に属するアミノ酸に変化させることにより）または保存様式（すなわち特定の大きさまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸のコドンを同一分類に属するアミノ酸に変化させることにより）で変化させることによりこの種の置換変異を作製することができる。このような保存変化は一般に得られたタンパク質の構造および機能にそれほど大きな変化を導かない。非保存変化は得られたタンパク質の構造、活性または機能を変化させる可能性がさらに高い。本発明は得られたタンパク質の活性または結合特性を有意に変化させない保存変化を含有する配列を含むと考えるべきである。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明の修飾されたＧＰＣＲは、そのカルボキシル末端テールに適切に位置付けられた１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタを有するように修飾されているＧＰＣＲを含む。これらの修飾されたＧＰＣＲはアゴニスト刺激のおよそ３０分以内にアレスチンをエンドソームに補充する。これらの修飾されたＧＰＣＲは本明細書で記載する細胞内のエンドソームにアレスチンを補充し、ここでＧＰＣＲはアゴニスト非依存的様式でリン酸化される。
【０１１４】
本発明の修飾されたＧＰＣＲはそのカルボキシル末端テールに適切に位置付けられた１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくは１つまたはそれ以上のリン酸化部位のクラスタを含む。本発明者は、そのカルボキシル末端テールに適切に位置付けられた１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタを含有するＧＰＣＲは、アレスチンに関する親和性が上昇しており、そしてアゴニストでの刺激後、または本明細書に記載するアゴニスト非依存的様式でのいずれかで、ＧＰＣＲリン酸化時にエンドソームでアレスチンと同時局在することを見出した。本発明者はまた、ＧＰＣＲがアレスチンに対する親和性を上昇させるために、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタがＧＰＣＲテール内に最適に位置付けられなければならないことを見出した。従って、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタがカルボキシル末端テール内に最適に位置付けられるように、修飾されたＧＰＣＲを構築することができる。１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタがカルボキシル末端テール内に確実に適切に位置付けられるように、修飾されたＧＰＣＲを形成するために融合されるべきポリペプチドの部分を選択する。また別に、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタがカルボキシル末端テール内に確実に適切に位置付けられるように、修飾されたＧＰＣＲを作製するための別個の点変異の位置を選択することができる。
【０１１５】
本発明者は、本発明の修飾されたＧＰＣＲが、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）活性を変化させることができる化合物をスクリーニングするためのアッセイに有用であることを見出した。本発明を使用できるアッセイの実例には、非限定例としては米国特許第５，８９１，６４６号および第６，１１０，６９３号に記載されるものなどがあり、その開示はその全てを参照して本明細書に組み込む。本発明を使用できるアッセイのさらなる実例には、非限定例としては蛍光共鳴エネルギー転位（ＦＲＥＴ）を用いるアッセイおよび、Ａｎｇｅｒｓ，Ｓ．、Ｓａｌａｈｐｏｕｒ，Ａ．、Ｊｏｌｙ，Ｅ．、Ｈｉｌａｉｒｅｔ，Ｓ．、Ｃｈｅｌｓｋｙ、「β2−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＢＲＥＴ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７（７）：３６８４−３６８９に記載される生物発光共鳴エネルギー転位（ＢＲＥＴ）技術を用いるアッセイなどがある。
【０１１６】
本発明者はこれらの修飾されたＧＰＣＲがＧＰＣＲ内在化を変化させることができる化合物をスクリーニングするためのアゴニスト非依存的アッセイに有用であることを決定した。本発明を用いることができるアッセイの実例には、非限定例としては本明細書で記載するアッセイなどがある。
【０１１７】
ＧＰＣＲ脱感作を増強する方法
本発明ではＧＰＣＲ脱感作を増強する方法が提供される。１つの実施形態は修飾されていてもよいＧＲＫの発現に関する。ＧＲＫを過剰発現することができるか、またその発現を誘導することができる。これらの方法を用いて、修飾されたＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ、味覚受容体、変異ＧＰＣＲ、β２ＡＲ  Ｙ３２６Ａ  ＧＰＣＲ変異体、またはその他のＧＰＣＲなどのＧＰＣＲの脱感作を分析することができる。本発明に有用な特定のＧＰＣＲを図１に列挙する。
【０１１８】
好ましい実施形態では、発現系およびＧＲＫをコードする核酸を含有する細胞が提供される。ＧＲＫの発現が構成的なＧＰＣＲの脱感作に至るように、ＧＲＫを修飾することこができる。ＧＲＫを過剰発現することができ、そしてその発現を誘導することができる。
【０１１９】
好ましくは、修飾されていてよいＧＲＫ、およびアレスチンを含む宿主細胞を提供する。次いでＧＰＣＲをこれらの細胞に加える。ＧＰＣＲのアゴニスト非依存的脱感作を検出する。図４、５、６および７はこの方法の実例である。検出方法を以下に記載する。
【０１２０】
本発明は、目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する方法を提供する。細胞膜で発現されるＧＰＣＲは以前に記載された化合物同定の方法に有用である。
【０１２１】
目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する方法は、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞を提供することであって、ここでアレスチンは検出可能なように標識されている、（ｂ）アレスチンの細胞分布を決定すること、並びに（ｃ）アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲの細胞膜で発現される能力に相関させること、を含む。
【０１２２】
本発明のこの態様の好ましい実施形態を実施例２、３、４、５、６および７に記載し、そして図４、５、６および７で説明する。
【０１２３】
目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する別の方法は、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞を提供することであって、ここでＧＲＫは検出可能なように標識されている、（ｂ）ＧＲＫの細胞分布を決定すること、および（ｃ）ＧＲＫの細胞分布をＧＰＣＲの細胞膜で発現される能力に相関させること、を含む。
【０１２４】
本発明はＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力を分析する方法を提供する。アレスチンに結合するＧＰＣＲは以前に記載された化合物同定の方法に有用である。
【０１２５】
ＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力を分析する好ましい方法は、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、およびＧＲＫを含む細胞を提供することであって、ここでアレスチンは検出可能なように標識されている、（ｂ）アレスチンの細胞分布を決定すること、並びに（ｃ）アレスチンの細胞分布をＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力に相関させること、を含む。
【０１２６】
本発明のこの態様の好ましい実施形態を実施例２、３、４、５、６および７に記載し、そして図４、５、６および７で説明する。
【０１２７】
この方法を用いて、特定のＧＰＣＲはアレスチンに結合して、そして脱感作される。しかしながら、特定のＧＰＣＲは米国特許出願第０９／９９３，８４４号に記載されるように、ＧＰＣＲの修飾なしには脱感作されない。本発明者は、図３に列挙する、公知のおよびオーファンＧＰＣＲなどのいくつかのＧＰＣＲを修飾した。修飾時に、これらの修飾されたＧＰＣＲは前記の系で構成的に脱感作された。
【０１２８】
修飾されたＧＰＣＲ
本発明は修飾されたＧＰＣＲに関する。本発明の修飾されたＧＰＣＲはそのカルボキシル末端テールに１つまたはそれ以上の修飾を含むことができる。これらの修飾はカルボキシル末端テールの特定の領域内に１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタを挿入することを含むことができる。このように、カルボキシル末端テールを全体にまたは部分的に修飾することができる。多くのＧＰＣＲのカルボキシル末端テールは７番目の膜貫通ドメインの終わりを特徴付ける保存されたＮＰＸＸＹモチーフの直後に始まる（すなわちＮＰＸＸＹモチーフに後続するものがＧＰＣＲのカルボキシル末端テールである）。多くのＧＰＣＲのカルボキシル末端テールはＮＰＸＸＹモチーフの下流におよそ１０個から２５個のアミノ酸残基、好ましくは１５個から２０個のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位を含む。この部位は典型的には１つまたはそれ以上のシステイン残基である。ＧＰＣＲのカルボキシル末端テールは比較的長い、比較的短い、または事実上存在しなくてよい。本発明者はＧＰＣＲのカルボキシル末端テールがアレスチン結合の親和性を決定すると決定した。
【０１２９】
本発明者はカルボキシル末端テールの特定のアミノ酸モチーフが安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進し、すなわち最終的にアレスチンのエンドソームへの補充を促進できることを見出した。これらのアミノ酸モチーフは１つまたはそれ以上のアミノ酸、好ましくはアミノ酸残基のクラスタを含み、これは効率良くリン酸化され、すなわちリン酸化部位として容易に機能できる。アミノ酸のクラスタは２つのうちの２つ、３つのうちの２つ、３のうちの３つ、４位置のうちの３つ、４つのうちの４つ、５位置のうちの４つ、５つのうちの５つ等の連続したアミノ酸位置を占めることができる。従って安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するアミノ酸のクラスタは「リン酸化部位のクラスタ」である。これらのリン酸化部位のクラスタは好ましくはセリンおよびスレオニン残基のクラスタである。
【０１３０】
アレスチンと安定した複合体を形成するＧＰＣＲは１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタを含む。１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタの存在に加えて、安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するために、その部位はカルボキシル末端テール内に適切に位置付けられなければならないことが見出されている。安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するために、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくは１つまたはそれ以上のリン酸化のクラスタはＧＰＣＲの推定されるパルミトイル化部位の下流のおよそ１５個から３５個（好ましくは１５個から２５個）のアミノ酸残基でよい。加えて、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化のクラスタはＧＰＣＲのＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ２０個から５５個（好ましくは３０個から４５個）のアミノ酸残基でよい。適切に位置付けられる１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタを含有するＧＰＣＲは典型的にはＢクラス受容体である。
【０１３１】
実例として、Ｖ２Ｒ受容体は推定されるパルミトイル化部位の下流の１９個のアミノ酸残基で、およびＮＰＸＸＹモチーフの下流の３６個のアミノ酸残基で安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するリン酸化部位のクラスタ（ＳＳＳ）を含むことが見出されている。ＮＴＲ−２受容体は推定されるパルミトイル化部位の下流の２６個のアミノ酸残基、およびＮＰＸＸＹモチーフの下流の４５個のアミノ酸残基で、安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するリン酸化部位のクラスタ（ＳＴＳ）を含む。オキシトシン受容体（ＯＴＲ）受容体は、１つは推定されるパルミトイル化部位の下流の２０個のアミノ酸残基でもう１つは推定されるパルミトイル化部位の下流の２９個のアミノ酸残基、並びに１つはＮＰＸＸＹモチーフの下流の３８個のアミノ酸残基で、もう１つはＮＰＸＸＹモチーフの下流の４７個のアミノ酸残基で各々、安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進する２つのリン酸化部位のクラスタ（ＳＳＬＳＴおよびＳＴＬＳ）を含む。サブスタンスＰ受容体（ＳＰＲ、ニューロキニン１受容体としても知られている）は、推定されるパルミトイル化部位の下流の３２個のアミノ酸残基、およびＮＰＸＸＹモチーフの下流の５０個のアミノ酸残基で安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体の形成を促進するリン酸化部位のクラスタ（ＴＴＩＳＴ）を含む。
【０１３２】
本発明者はＧＰＣＲ／アレスチン複合体のカルボキシル末端テール内に適切に位置付けられる１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化のクラスタを欠如するＧＰＣＲが、あまり安定でなく、そして細胞膜、またはその近くで解離することを決定した。これらのＧＰＣＲは典型的にはＡクラス受容体、嗅覚受容体、味覚受容体等である。しかしながら、本発明者は、１つまたはそれ以上のリン酸化部位を天然に欠如し、そしてアレスチンに対して低親和性であるＧＰＣＲでこれらの受容体のカルボキシル末端テールを修飾することにより安定したＧＰＣＲ／アレスチン複合体を達成できることを見出した。好ましくは、カルボキシル末端テール内に適切に位置付けられる１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくは１つまたはそれ以上のリン酸化部位のクラスタを含むようにカルボキシル末端テールを修飾する。
【０１３３】
本発明はこれらの修飾されたＧＰＣＲのポリペプチド配列を含む。本発明の修飾されたＧＰＣＲはカルボキシル末端テール内に適切に位置付けられる１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化のクラスタを有するように修飾されているＧＰＣＲを含む。本発明の修飾されたＧＰＣＲのポリペプチド配列はまた１つまたはそれ以上の付加、欠失、置換または変異を有する配列を含む。これらの変異は保存された様式（すなわち特定の大きさまたは特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸に由来するコドンを同一のグループに属するアミノ酸に変化させることによる）で為された置換変異であるのが好ましい。このような保存変化は概して得られたタンパク質の構造および機能をあまり変化させない。本発明は得られたタンパク質の活性または結合特性を有意に変化させない保存変化を含有する配列を含むと考えるべきである。
【０１３４】
本発明の修飾されたＧＰＣＲはＮＰＸＸＹモチーフ、ＮＰＸＸＹモチーフの下流におよそ１０個から２５個のアミノ酸残基（好ましくは１５個から２０個のアミノ酸）の推定されるパルミトイル化部位、および修飾されたカルボキシル末端テールを含有するＧＰＣＲを含む。修飾されたカルボキシル末端テールは、リン酸化部位が修飾されたＧＰＣＲの推定されるパルミトイル化部位の下流のおよそ１５個から３５個、好ましくは１５個から２５個のアミノ酸残基であるような、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくは１つまたはそれ以上のリン酸化部位のクラスタを有する。修飾されたカルボキシル末端テールは、リン酸化部位が修飾されたＧＰＣＲのＮＰＸＸＹの下流のおよそ２０個から５５個、好ましくは３０個から４５個のアミノ酸残基であるような、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくは１つまたはそれ以上のリン酸化部位のクラスタを有していてもよい。
【０１３５】
本発明はさらに修飾されたＧＰＣＲをコードする単離された核酸分子を含む。修飾されたＧＰＣＲと同一のアミノ酸を有する修飾されたＧＰＣＲをコードするが、縮重されている修飾されたＧＰＣＲをコードするＤＮＡ配列は本発明の範囲内であることを理解すべきである。「縮重されている」とは、異なる３文字コドンを用いて特定のアミノ酸を指定することを意味する。
【０１３６】
当業者には容易に理解されるように、多くのＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを、７番目の膜貫通ドメインの終わりを特徴付ける保存されたＮＰＸＸＹモチーフにより同定することができる。
【０１３７】
本発明による修飾されたカルボキシル末端領域を含有する修飾されたＧＰＣＲを作製するために、リン酸化部位またはリン酸化部位のクラスタを欠如するか、またはアレスチンとの親和性が低いかもしくは知られていないＧＰＣＲは、そのカルボキシル末端テールにアミノ酸残基の１つまたはそれ以上の付加、置換、欠失または変異を有することができる。カルボキシル末端テールが１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタを含むように修飾されるように、これらの付加、置換、欠失または変異を行う。実例としては、修飾されたＧＰＣＲを提供するためにアミノ酸残基の別個の点変異を作ることができる。実例としては、３つの連続したアミノ酸をセリン残基に変異させて修飾されたＧＰＣＲを提供することができる。１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタがカルボキシル末端テール内に適切に位置付けられるようにこれらの変異を作る。
【０１３８】
加えて、修飾されたカルボキシル末端テール領域を含有する修飾されたＧＰＣＲを作製するために、リン酸化部位またはリン酸化部位のクラスタを欠如するか、またはアレスチンとの親和性が低いかもしくは未知であるＧＰＣＲの核酸配列において、特定のコドンが異なるアミノ酸、好ましくはセリンまたはスレオニンをコードするコドンに変化するように、変異を作製することができる。このような変異は一般的には可能なヌクレオチド変化を最も少なくすることにより作製される。１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくはリン酸化部位のクラスタを作製するために、得られたタンパク質のアミノ酸が変化するようにこの種の置換変異を作ることができる。また実例として、核酸配列の別個の点変異を作ることができる。リン酸化部位が修飾されたＧＰＣＲの推定されるパルミトイル化部位の下流のおよそ１５個から３５個のアミノ酸残基に位置するようにこれを位置付ける。
【０１３９】
さらに、本発明の修飾されたＧＰＣＲを提供するために、適切に位置付けられたリン酸化部位を欠如するか、またはアレスチンとの親和性が低いかもしくは未知であるＧＰＣＲもまた、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスタを有するＧＰＣＲのものと全体でまたは部分的に交換されたそのカルボキシル末端テールを有することもできる。交換の部位は保存されたＮＰＸＸＹモチーフの後かまたはこれを含むことができる。代替としては、ＧＰＣＲの推定されるパルミトイル化部位を保存されたＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基で同定することができ、そして交換の部位は（複数の）パルミトイル化システインの後かまたはこれを含むことができる。好ましくは、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスタを欠如するか、またはアレスチンとの親和性が低いかもしくは未知であるＧＰＣＲのカルボキシル末端テールは推定されるパルミトイル化部位に近接したアミノ酸残基で交換される。さらに好ましくは、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスタを欠如するか、またはアレスチンとの親和性が低いかもしくは未知であるＧＰＣＲのカルボキシル末端テールはＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位で、パルミトイル化されたシステイン残基が維持されるように交換される。好ましい様式での交換により、リン酸化部位のクラスタが修飾されたＧＰＣＲのカルボキシル末端テール内で適切に確実に位置付けられることが可能になる。テールを交換することができ、従って、核酸配列または対応するアミノ酸配列の操作により修飾されたＧＰＣＲを構築することができる。
【０１４０】
別の代替では、ＧＰＣＲ、例えばＮＰＸＸＹモチーフを含有しないＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを疎水性プロットから予測することができ、従って交換部位を選択することができる。疎水性プロットに基づいて、当業者は、ＧＰＣＲが膜に固定されると考えられる場所を予測し、そして結果的に推定されるパルミトイル化部位を導入する場所を予測することができる。この技術を用いて、ＮＰＸＸＹモチーフも推定されるパルミトイル化部位も有していないＧＰＣＲを修飾して参照の点（例えば推定されるパルミトイル化部位）を作製することができる。次いで導入された推定されるパルミトイル化部位を用いてテール交換を位置づけることができる。
【０１４１】
交換に用いられるカルボキシル末端テールは、１つまたはそれ以上の適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスタを有し、そしてＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位を有する第２のＧＰＣＲに由来してよい。同定されたテールを保存されたＮＰＸＸＹモチーフの後でまたはそれを含んで交換することができる。代替として、ＧＰＣＲの推定されるパルミトイル化部位を保存されたＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基で同定することができ、そして（複数の）パルミトイル化システインの後でまたはそれを含んでテールを交換することができる。好ましくは、リン酸化部位のクラスタを有するＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを推定されるパルミトイル化部位に近接したアミノ酸残基で交換する。さらに好ましくは、リン酸化部位のクラスタを含有するカルボキシル末端テールの一部がパルミトイル化システイン残基の直ぐ下流のアミノ酸残基で始まるように、リン酸化部位のクラスタを有するＧＰＣＲのカルボキシル末端テールをＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位で交換する。好ましい様式での交換により、リン酸化部位のクラスタが修飾されたＧＰＣＲのカルボキシル末端テール内で適切に確実に位置付けられることが可能になる。交換に用いられたリン酸化部位のクラスタを有するカルボキシル末端テールはカルボキシル末端に抱合された検出可能な分子を有することができる。テールを交換することができ、そして結果的に、核酸配列または対応するアミノ酸配列の操作により修飾されたＧＰＣＲを構築することができる。
【０１４２】
加えて、交換に用いられたカルボキシル末端テール部分は、１つまたはそれ以上のリン酸化部位、好ましくは１つまたはそれ以上のリン酸化部位のクラスタを有するＧＰＣＲに由来するアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有するように合成されたポリペプチドを起源とすることができる。合成されたポリペプチドはＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位を有してよい。合成されたポリペプチドは、ポリペプチドの全体的な構造および機能に影響しないかまたは変化させないアミノ酸残基の１つまたはそれ以上の付加、置換、変異または欠失を有してよい。
【０１４３】
さらに、交換に用いられたカルボキシル末端テールは１つまたはそれ以上のリン酸化部位のクラスタを有するＧＰＣＲに由来するアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有することが認識された自然発生ポリペプチドを起源とすることができる。ポリペプチドはＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位を有してよい。ポリペプチドは、ポリペプチドの全体的な構造および機能に影響しないかまたは変化させないアミノ酸残基の１つまたはそれ以上の付加、置換、変異または欠失を有してよい。
【０１４４】
適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスタを欠如するか、またはアレスチンとの親和性が低いかもしくは未知であるＧＰＣＲの第１のカルボキシル末端テール部分を、１つまたはそれ以上のリン酸化部位のクラスタを有するＧＰＣＲまたはポリペプチドの第２のカルボキシル末端テール部分と融合させることにより、修飾されたカルボキシル末端テール領域を含有する修飾されたＧＰＣＲを作製することができる。交換に用いられる第２のＧＰＣＲまたはポリペプチドはＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位を有してよい。従って、修飾されたＧＰＣＲの修飾されたカルボキシル末端領域は、リン酸化部位のクラスタを有するＧＰＣＲまたはポリペプチドのカルボキシル末端テールの一部に融合された、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスタを欠如するか、またはアレスチンとの親和性が低いかもしくは未知であるＧＰＣＲに由来するカルボキシル末端テールの一部を含む。適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスタを欠如するＧＰＣＲのテールを、保存されたＮＰＸＸＹモチーフの後でまたはそれを含んで交換することができ、そして保存されたＮＰＸＸＹモチーフの後でまたはそれを含んでリン酸化部位のクラスタを含有するカルボキシル末端テールに融合することができる。代替として、適切に位置付けられたリン酸化部位のクラスタを欠如するＧＰＣＲのテールを（複数の）パルミトイル化システインの後でまたはそれを含んで交換することができ、そして（複数の）パルミトイル化システインの後でまたはそれを含んでリン酸化部位のクラスタを含有するテールに融合することができる。テールを交換することができ、そしてその結果、核酸配列または対応するアミノ酸配列の操作により修飾されたＧＰＣＲを構築することができる。
【０１４５】
別の代替では、ＧＰＣＲ、例えばＮＰＸＸＹモチーフを含有しないＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを疎水性プロットから予測することができ、そしてその結果交換することができる。交換の部位を疎水性プロットに従って選択することができる。疎水性プロットに基づいて、当業者は、ＧＰＣＲが膜に固定されると考えられる場所を予測することができ、そして結果的に推定されるパルミトイル化部位を導入する場所を予測することができる。この技術を用いて、ＮＰＸＸＹモチーフも推定されるパルミトイル化部位も有していないＧＰＣＲを修飾して参照の点（例えば推定されるパルミトイル化部位）を作製することができる。次いで導入された推定されるパルミトイル化部位を用いてテール交換を位置づけることができる。推定されるパルミトイル化部位の導入後、得られたテールを、１つまたはそれ以上のリン酸化部位のクラスタを有し、そしてＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位を有するＧＰＣＲまたはポリペプチドの第２のカルボキシル末端テール部分と融合することができる。
【０１４６】
好ましくは、修飾されたＧＰＣＲの修飾されたカルボキシル末端領域を推定されるパルミトイル化部位に近接したアミノ酸残基で融合する。さらに好ましくは、修飾されたＧＰＣＲの修飾されたカルボキシル末端領域を、アレスチンとの親和性が低い第１のＧＰＣＲに由来する部分が、ＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位を介してＮＰＸＸＹモチーフに由来するアミノ酸残基を含み、そしてリン酸化部位のクラスタおよびＮＰＸＸＹモチーフの下流のおよそ１０個から２５個（好ましくは１５個から２０個）のアミノ酸残基の推定されるパルミトイル化部位を有する第２のＧＰＣＲが、カルボキシル末端の終わりまで伸長する第２のＧＰＣＲの推定されるパルミトイル化部位のすぐ下流のアミノ酸残基で始まるアミノ酸残基を含むように融合する。リン酸化部位のクラスタがカルボキシル末端テール内に適切に確実に位置付けられ、そして修飾されたＧＰＣＲがその構造および機能する能力を維持するので、この融合は好ましい。
【０１４７】
実例としては、Ａクラス受容体またはオーファン受容体は、公知のＢクラス受容体に由来するカルボキシル末端テールの一部と交換されたそのカルボキシル末端テールの一部を有することができる。さらに、実際には存在しないカルボキシル末端テールを有する受容体、例えば嗅覚受容体および味覚受容体は公知のＢクラス受容体に由来するカルボキシル末端テールの一部と交換されたそのカルボキシル末端テールの一部を有することができる。これらの交換に用いられるＢクラス受容体テールはカルボキシル末端に融合された検出可能な分子を有することができる。
【０１４８】
遺伝子操作の分野で標準的な分子生物学的技術、非限定例としてはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素、発現ベクター、プラスミド等により修飾されたＧＰＣＲを作製することができる。実例としては、リン酸化部位のクラスタを欠如するＧＰＣＲのアレスチンに対する親和性を増強するようにベクター、例えばｐＥＡｒｒＢ（アレスチン結合が増強されている）を設計することができる。ベクター、例えばｐＥＡｒｒＢベクターを形成するために、アレスチンと安定した複合体を形成するＧＰＣＲカルボキシル末端のＰＣＲ増幅されたＤＮＡフラグメントを適当な制限酵素により消化し、そしてプラスミドにクローニングすることができる。このようなプラスミドの１つの概略図を図４Ａで説明する。修飾されるＧＰＣＲのＤＮＡもまたＰＣＲ増幅し、適当な位置で制限酵素により消化し、そして図４Ｂで説明するようにベクター、例えばｐＥＡｒｒＢにサブクローニングすることができる。発現される場合、修飾されたＧＰＣＲはカルボキシル末端に融合されたポリペプチドを含有する。ポリペプチドはリン酸化部位のクラスタを含む。好ましくは、ポリペプチドは、アレスチンと安定した複合体を形成する受容体のＧＰＣＲカルボキシル末端を起源とする。
【０１４９】
このような修飾されたＧＰＣＲはまた、異常遺伝子スプライシングまたは単一のヌクレオチド多型の結果として天然に起こり得る。このような自然発生の修飾されたＧＰＣＲは修飾されたエンドサイトーシス標的を有すると予測される。これらの自然発生の修飾されたＧＰＣＲは多くのＧＰＣＲ関連の疾患状態に関係し得る。
【０１５０】
図３で示すように、本発明者はいくつかのＧＰＣＲを修飾した。β２アドレナリン作動性受容体、ドーパミンＤ１Ａ受容体、ｍｕオピオイド受容体、オーファンＧＰＲ３、オーファンＧＰＲ６、オーファンＧＰＲ１２、オーファンＧＰＲ７、オーファンＧＰＲ８、オーファンＧＰＲ５５、オーファンＳＲＥＢ２、およびオーファンＳＲＥＢ３を本明細書に記載するように修飾した。これらの修飾されたＧＰＣＲは修飾されたＧＰＣＲのテール内に適当に位置付けられるリン酸化部位のＶ２Ｒクラスタ（ＳＳＳ）を含有する。
【０１５１】
標準的な受容体結合アッセイにより示すことができるように、修飾された受容体は、アレスチンに対する親和性の上昇、およびアレスチンとのその複合体の安定性の上昇を除いて、そしてアレスチンを伴う輸送の能力、並びにリサイクルおよび再感作の能力において野生型の対応物とは本質的に区別不能である。例えば、修飾された受容体は膜で適当に発現され、そしてアゴニストまたはリガンドに対する類似の親和性を有する。しかしながら、修飾されたＧＰＣＲはアレスチンに関する親和性が上昇しており、その結果、野生型の対応物よりもさらに安定なアレスチンとの複合体を形成し、そしてエンドソームへ輸送する場合、アレスチンと結合したままである。
【０１５２】
これらの修飾されたＧＰＣＲはＧＰＣＲのアゴニストに関してスクリーニングするためのアッセイにおいて、およびＧＰＣＲ脱感作を変化させる化合物を同定するためのアゴニスト非依存的アッセイにおいて有用である。
【０１５３】
修飾されたＧＰＣＲを用いるＧＰＣＲ活性を検定する方法
本発明の修飾されたＧＰＣＲはＧＰＣＲ活性を検定する方法において有用である。アレスチンとの望ましい相互作用または会合よりも弱いＧＰＣＲおよびアレスチンとの相互作用または会合が未知であるＧＰＣＲを研究するために、本発明の修飾されたＧＰＣＲをアッセイにおいて用いることができる。修飾されたＧＰＣＲを用いる本発明の方法は感受性のあるアッセイを提供し、例えばエンドソームにおけるアレスチン／ＧＰＣＲの検出を増強させることができる。本発明の修飾されたＧＰＣＲを用いるアッセイは、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、脱感作活性化合物等に関して化合物およびサンプル溶液をスクリーニングするのに有用であろう。一度同定されると、これらの化合物はＧＰＣＲ活性を変調させることができる薬物として有用であり、そしてＧＰＣＲが関係している１つまたはそれ以上の疾患状態の処置に有用である可能性がある。
【０１５４】
本発明による好ましいアッセイでは、本発明の修飾されたＧＰＣＲを発現する細胞が提供され、そしてこれらの細胞はさらにアレスチンおよび検出可能な分子の抱合体を含有することができる。
【０１５５】
ＧＰＣＲ経路において機能するので、検出可能な分子に結合したアレスチンは検出され、そしてモニター観察されることが可能である。例えば細胞質で一様に分布する、細胞膜に集中する、クラスリンコート小窩に集中する、エンドソームに局在する等のアレスチンの位置を検出することができる。アゴニスト刺激に応答して、ＧＰＣＲに対するアレスチンの近接性、およびいずれかの細胞構造への近接性をモニター観察できる。例えばアゴニスト刺激に応答して、細胞膜でＧＰＣＲに近接して、クラスリンコート小窩でＧＰＣＲと共に集まり、エンドソームでＧＰＣＲと同時局在して等でアレスチンを検出することができる。
【０１５６】
本発明の修飾されたＧＰＣＲはアレスチンに対して親和性が上昇しており、そしてＧＰＣＲとアレスチンとの安定した複合体を提供し、そしてそれによりＧＰＣＲのアレスチンとのエンドソームへの同時局在を促進する。本発明の検定方法では、例えば細胞質で、細胞膜でＧＰＣＲに近接して集中し、クラスリンコート小窩でＧＰＣＲに接近して集中し、エンドソームでＧＰＣＲと同時局在する等でアレスチンを検出できる。好ましくはエンドソームでＧＰＣＲと同時局在するアレスチンを検出することも可能である。
【０１５７】
細胞膜でのアレスチンとＧＰＣＲとの会合をアゴニスト添加後直ぐに、例えばおよそ１秒から２分後に検出できる。エンドソームでのアレスチンとＧＰＣＲとの同時局在をアゴニスト添加の数分以内、例えばおよそ３分から１５分以内に検出することができ、そして延長された時間、例えば１時間後まで持続することができる。エンドソームでのアレスチンとＧＰＣＲとの会合により強力で、迅速に認識可能なシグナルを得ることができる。４０倍の倍率の対物レンズでは、シグナルはドーナツ状の外観であることがある。エンドソーム小胞に同時局在するアレスチンおよびＧＰＣＲの区画化の結果であるシグナルは通常は容易に検出され、長期間存続できる。
【０１５８】
本発明のＧＰＣＲ経路活性を評価する好ましい方法は、（ａ）少なくとも１つの本発明の修飾されたＧＰＣＲを発現し、そしてさらにアレスチンおよび検出可能な分子の抱合体を含む細胞を提供すること、（ｂ）アレスチンの転位を誘導すること、並びに（ｃ）転位経路に沿ってアレスチンと修飾されたＧＰＣＲとの相互作用を検出すること、を含む。
【０１５９】
アレスチンと修飾されたＧＰＣＲとの相互作用を、例えばエンドソームで、クラスリンコート小窩で、細胞膜に近接して集中して等で検出することができる。好ましくは、アレスチンと修飾されたＧＰＣＲとの相互作用はエンドソームで検出される。エンドソームにおけるアレスチンとＧＰＣＲとの相互作用をアゴニスト添加の数分以内、例えばおよそ３分から１５分以内で検出することができ、長期間、例えば１時間後も存続することができる。エンドソームにおけるアレスチンとＧＰＣＲとの会合により、強力で、迅速に認識可能な、長時間存続できるシグナルを得ることができる。
【０１６０】
本発明のＧＰＣＲ活性に関して化合物をスクリーニングする方法では、少なくとも１つの修飾されたＧＰＣＲを発現する細胞が提供される。細胞はさらに検出可能な分子に抱合されたアレスチンを含有する。細胞を試験される化合物に暴露する。細胞内のアレスチンの位置を検出する。化合物の存在下での細胞内でのアレスチンの位置を化合物の不在下での細胞内でのアレスチンの位置と比較し、そして（１）化合物の存在下での細胞内でのアレスチンの位置と（２）化合物の不在下での細胞内でのアレスチンの位置の間の差異を相関させる。
【０１６１】
実例としては、本発明の修飾されたＧＰＣＲを用いてＧＰＣＲアゴニスト活性に関して化合物およびサンプル溶液をスクリーニングすることができる。この方法では、少なくとも１つの本発明の修飾されたＧＰＣＲを発現し、そしてさらにアレスチンおよび検出可能な分子の抱合体を含む細胞を提供する。細胞を試験される化合物またはサンプル溶液に暴露する。アレスチンと修飾されたＧＰＣＲとの相互作用が被験化合物または溶液に暴露した後で上昇するかどうかを検出し、そして上昇は化合物または溶液がＧＰＣＲアゴニスト活性を有していることを示している。アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用をエンドソームで、クラスリンコート小窩で、細胞膜に近接して等で検出することができる。修飾されたＧＰＣＲを検出可能な分子と、好ましくはカルボキシル末端で抱合させることもできる。前記で説明したように、本発明のようなＧＰＣＲに対する修飾はアゴニストまたはリガンドに関するＧＰＣＲの天然の親和性に影響すべきでない。
【０１６２】
また実例として、本発明の修飾されたＧＰＣＲを用いて、化合物およびサンプル溶液をＧＰＣＲアンタゴニストまたはインバースアゴニスト活性に関してスクリーニングすることもできる。本発明の少なくとも１つの修飾されたＧＰＣＲを発現し、さらにアレスチンおよび検出可能な分子の結合体を含む細胞が提供される。細胞を試験される化合物またはサンプル溶液に、およびＧＰＣＲに関する公知のアゴニストに暴露する。アレスチンと修飾されたＧＰＣＲとの相互作用が被験化合物または溶液に暴露した後で低下するかどうかを検出し、そして低下は化合物または溶液がＧＰＣＲアンタゴニストまたはインバースアゴニスト活性を有していることを示している。アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用をエンドソームで、クラスリンコート小窩で、細胞膜に近接して等で検出することができる。修飾されたＧＰＣＲを検出可能な分子と、好ましくはカルボキシル末端で抱合させることもできる。前記で説明したように、本発明のようなＧＰＣＲに対する修飾はアンタゴニストまたはインバースアゴニストに対するＧＰＣＲの天然の親和性に影響を及ぼすべきでない。
【０１６３】
さらに実例として、本発明の修飾されたＧＰＣＲを用いて、化合物およびサンプル溶液をＧＰＣＲ脱感作活性に関してスクリーニングすることもできる。本発明の少なくとも１つの修飾された第１のＧＰＣＲを発現し、さらにアレスチンおよび検出可能な分子の抱合体を含む第１の細胞が提供される。第１の細胞を試験される化合物またはサンプル溶液に、および第１のＧＰＣＲに関する公知のアゴニストに暴露する。アレスチンと第１の修飾されたＧＰＣＲとの相互作用が被験化合物または溶液に暴露した後で低下するかまたは上昇しないかどうかを検出し、そして低下または上昇の欠如は化合物または溶液がＧＰＣＲ脱感作活性を有していることを示している。アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用をエンドソームで、クラスリンコート小窩で、細胞膜に近接して等で検出することができる。次いで本発明の少なくとも１つの第２の修飾されたＧＰＣＲを発現し、そしてさらにアレスチンおよび検出可能な分子の抱合体を含む第２の細胞が提供される。第２の修飾されたＧＰＣＲは第１の修飾されたＧＰＣＲと関連しない。第２の細胞を試験される化合物またはサンプル溶液に、および第２のＧＰＣＲに関する公知のアゴニストに暴露する。アレスチンと第２の修飾されたＧＰＣＲとの相互作用が被験化合物または溶液に暴露した後で低下するかまたは上昇しないかどうかを検出し、そして低下または上昇の欠如は化合物または溶液が発現されたＧＰＣＲに非依存的なＧＰＣＲ脱感作活性を有していることを示している。アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用をエンドソームで、クラスリンコート小窩で、細胞膜に近接して等で検出することができる。
【０１６４】
本発明のＧＰＣＲ経路活性を評価する方法は細胞不含のアッセイをも含む。本発明の細胞不含のアッセイでは、そこに本発明の修飾されたＧＰＣＲが堆積されている基質が提供される。アレスチンおよび検出可能な分子の抱合体を含有する流動体もまた提供される。アレスチンの転位置が誘導され、アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用が検出される。ＧＰＣＲおよびアレスチンを全細胞から得ることができ、そして精製後に細胞不含のアッセイにおいて使用することができる。修飾されたＧＰＣＲはアレスチン結合部位およびアゴニスト結合部位を有し、そして多層または２層脂質小胞で担持される可能性がある。修飾されたＧＰＣＲを担持する小胞を基質上に堆積させることができ、そして修飾されたＧＰＣＲは脂質小胞で担持され、そしてアレスチン結合部位がアレスチンに暴露され、そして受容体結合部位がアゴニストに接近可能であるように、基質上に堆積されることも可能である。基質は、そこにＧＰＣＲを堆積できるいずれかの人工的な基質でよく、非限定例としてはガラス、プラスチック、ダイヤモンド、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイヤモンド、生体適合性モノマー、生体適合性ポリマー、ポリマービーズ（有機および無機ポリマーを含む）等がある。
【０１６５】
本発明は、本発明の検定方法によりリガンド、アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、またはＤＡＣとして同定された化合物に関する。これらの化合物を用いてＧＰＣＲが関係しているいずれかの疾病状態の１つを処置することができる。同定された化合物をヒトまたは非ヒトに、ＧＰＣＲが関係している症状、障害または疾患を処置または改善させるために治療的有効用量で投与することができる。治療的有効用量はこのような症状、障害または疾患の徴候の改善に至るのに十分な化合物のその量を意味する。
【０１６６】
ＧＰＣＲ脱感作を変調する化合物を同定する方法
本発明はＧＰＣＲ脱感作を変調する化合物のスクリーニング方法に関する。方法はＧＰＣＲを構成的にリン酸化し、結果的に構成的脱感作に至る修飾されたＧＲＫを利用する。これらを用いて、たとえＧＰＣＲアゴニストが未知であっても、ＧＰＣＲの脱感作を変化させる化合物を同定することができる。一度同定されると、これらの化合物はＧＰＣＲ活性を変調させることができる薬物として有用であり、そしてＧＰＣＲが関係している１つまたはそれ以上の疾患の処置に有用である。
【０１６７】
本発明による好ましい方法では、発現系および修飾されたＧＲＫをコードする核酸を含有し、結果的に細胞において発現されたＧＰＣＲの構成的脱感作に至る細胞が提供される。これらの細胞はさらにＧＦＰに抱合されたアレスチンを含有することができる。
【０１６８】
ＧＰＣＲ内在化を阻止する化合物を同定する好ましい方法は、（ａ）ＧＰＣＲ、アレスチン、および修飾されたＧＲＫを含む細胞を提供すること、（ｂ）細胞を（複数の）化合物に暴露すること、（ｃ）ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を決定すること、並びに（ｄ）（１）（複数の）化合物の存在下での細胞における標識された分子の位置と（２）（複数の）化合物の不在下での細胞における標識された分子の位置の間の差異をＧＰＣＲ内在化の変調に相関させることを含む。この方法の非限定的な実施形態を図４、５、６、および７並びに実施例２、３、４、５、６および７で記載する。
【０１６９】
工程（ａ）のＧＲＫは、前記したように、ＧＲＫ１、２、３、４、５、６またはその他のＧＲＫのいずれかでよく、スプライシング変種、生物学的に活性なフラグメント、または修飾されたＧＲＫを含む。ＧＲＫは過剰発現できるか、および／またはその発現は誘導可能でよい。ＧＲＫはＣＡＡＸモチーフを含んでよい。
【０１７０】
前記の方法では、アゴニストを提供してもしなくてもよい。
【０１７１】
標識された分子を検出し、そしてＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を決定する方法を以下に記載する。
【０１７２】
本発明に有用なＧＰＣＲには、非限定例としては公知のアゴニストを有するＧＰＣＲ、公知のアゴニストを有さないＧＰＣＲ、図１に列挙したＧＰＣＲ、図３、４、５、６、および７で説明したＧＰＣＲ、ＡクラスＧＰＣＲ、ＢクラスＧＰＣＲ、味覚受容体、嗅覚受容体、オーファン受容体、修飾されたＧＰＣＲ、米国特許出願第１０／０５４，６１６号、第０９／９９３，８４４号、第１０／０９５，６２０号、第１０／１０１，２３５号、第０９／６３１，４６８号、第１０／１４１，７２５号、第１０／１６１，９１６号、第０９／４６９，５５４号、第０９／７７２，６４４号、第６０／３９３，７８９号および第６０／３７９，９８６号（参照して本明細書に組み込む）に記載されるＧＰＣＲまたは前記のＧＰＣＲの生物学的に活性なフラグメントなどがある。
【０１７３】
タンパク質発現のためのベクターおよび核酸、宿主細胞
本発明は過剰発現されるか、またはその発現が誘導可能であるＧＲＫを含む修飾されたＧＲＫに関する。
【０１７４】
修飾されたＧＲＫをコードする核酸が提供される。本発明はこれらのタンパク質の発現、過剰発現、および誘導可能な発現に関する。以下に記載するようなベクターに含まれる適当な発現系により発現を行うことができる。
【０１７５】
本発明の１つの態様は（１）修飾されたＧＲＫをコードする核酸と（２）ＧＰＣＲの構成的脱感作に至る修飾されたＧＲＫの発現のための系との組み合わせに関する。修飾されたＧＲＫの発現のためのこの系はプロモーターまたは複製起点を含むことができる。
【０１７６】
本発明の別の態様は、修飾されたＧＰＣＲ、修飾されたＧＰＣＲをコードする核酸、および修飾されたＧＰＣＲ発現のための宿主細胞に関する。
【０１７７】
修飾されたＧＰＣＲをコードする核酸が提供される。本発明はこれらのタンパク質の発現、過剰発現、および誘導可能な発現に関する。以下に記載するようなベクターに含まれる適当な発現系により発現を行うことができる。
【０１７８】
本発明の特徴は本明細書に開示するＤＮＡ配列の発現である。当分野で周知であるように、適当な発現ベクターの発現調節配列にＤＮＡ配列を操作可能なように連結させ、そしてその発現ベクターを用いて適当な単細胞性宿主を形質転換することによりＤＮＡ配列を発現させることができる。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれていても（共有結合する）いなくてもよい。
【０１７９】
本発明のＤＮＡ配列の発現調節配列へのこのような操作可能な連結は、言うまでもなく、既にＤＮＡ配列の一部でない場合、ＤＮＡ配列の上流の正確な読み枠での開始コドン、ＡＴＧの供給を含む。
【０１８０】
広範な種類の宿主／発現ベクター組み合わせを本発明のＤＮＡ配列の発現において用いることができる。有用な発現ベクターは、例えば染色体のセグメント、非染色体および合成ＤＮＡ配列から成っていてもよい。適当なベクターにはＳＶ４０の誘導体および公知の細菌性プラスミド、例えば大腸菌プラスミドｃｏｌ  Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体、プラスミド例えばＲＰ４；ファージＤＮＡ、例えば多くのファージλの誘導体、例えばＮＭ９８９、およびその他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３および糸状１本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば２μプラスミドまたはその誘導体、真核細胞で有用なベクター、例えば昆虫または哺乳動物細胞で有用なベクター、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから誘導されるベクター、例えばファージＤＮＡまたはその他の発現調節配列を用いるように修飾されているプラスミド等がある。
【０１８１】
広範な種類のいずれかの発現調節配列（それに操作可能なように連結されたＤＮＡ配列の発現を調節する配列）をこれらのベクターにおいて使用して本発明のＤＮＡ配列を発現させることができる。このような有用な発現調節配列には、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモーター、酸ホスファターゼのプロモーター（例えばＰｈｏ５）、酵母α接合因子のプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子の発現を調節することが解っているその他の配列、並びに種々のその組み合わせなどがある。
【０１８２】
広範な種類の単細胞性宿主もまた本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに有用である。これらの宿主は、周知の真核および原核細胞宿主、例えば大腸菌の株、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイシン、酵母などの真菌、植物細胞、線虫細胞、およびＨＥＫ−２９３、Ｕ２ＯＳ、ＣＨＯ、ＲＩ．Ｉ、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞などの動物細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えばＳｆ９）、並びに組織培養中のヒト細胞および植物細胞を挙げることができる。本発明の１つの態様では、宿主細胞はＧＲＫ−Ｃ２０およびアレスチンを含む。本発明の別の態様では、宿主細胞はＧＲＫ−Ｃ２０、アレスチン、およびＧＰＣＲを含む。
【０１８３】
全てのベクター、発現調節配列および宿主が同等にうまく機能して本発明のＤＮＡ配列を発現するというわけではないことは理解されよう。全ての宿主が同一の発現系で同等にうまく機能するというわけではない。しかしながら、当業者は適切なベクター、発現調節配列、および宿主を過度な実験を行なうことなく選択でき、本発明の範囲から逸脱することなく望ましい発現を達成する。例えば、ベクターの選択において、ベクターは宿主の中で機能しなければならないので、宿主を考慮しなければならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、およびベクターによりコードされるいずれかその他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現もまた考慮されるであろう。
【０１８４】
発現調節配列の選択では、通常種々の因子を考慮に入れる。これらには、例えば、特に可能性のある２次構造に関して、系の相対的な強度、その調節能力、および発現される特定のＤＮＡ配列または遺伝子とのその適合性などがある。例えば選択したベクターとの適合性、その分泌特性、タンパク質を正確にフォールディングするその能力、およびその発酵要件、並びに発現されるＤＮＡ配列によりコードされる生成物の宿主に対する毒性、および発現生成物の精製の容易さを考慮することにより適当な単細胞性宿主を選択するであろう。
【０１８５】
これらのおよびその他の因子を考慮して、当業者は発酵中または大規模な動物培養において本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現調節配列／宿主の組み合わせを構築することができる。
【０１８６】
本発明の範囲内で誘導されたタンパク質複合体／サブユニットのヌクレオチド配列から修飾されたＧＲＫ類似体を調製できることもさらに目的とする。フラグメントなどの類似体を、例えばＧＲＫ材料のペプシン消化により生成することができる。突然変異タンパク質などの他の類似体をＧＲＫコード化配列の標準的な特定部位の突然変異誘発により生成することができる。「ＧＲＫ活性」を呈する類似体、例えば小分子は、プロモーターまたはインヒビターとして機能しても、公知のインビボおよび／またはインビトロアッセイによって同定され得る。
【０１８７】
前記したように、修飾されたＧＲＫ６をコードするＤＮＡ配列をクローニングよりもむしろ合成により調製することができる。ＧＲＫアミノ酸配列に適当なコドンを用いてＤＮＡ配列を設計することができる。一般には、配列を発現に用いる場合、意図される宿主のために好ましいコドンを選択する。完全な配列は標準的な方法により調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全なコード化配列に組み立てる。例えばＥｄｇｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１（１９８４）参照。
【０１８８】
合成ＤＮＡ配列によりＧＲＫ類似体または「突然変異タンパク質」を発現する遺伝子の便宜的な構築が可能になる。また別に、ＤＮＡコード化突然変異タンパク質を元来のまたは修飾されたＧＲＫ遺伝子またはｃＤＮＡの特定部位の突然変異誘発により作製することができ、そして突然変異タンパク質を従来のポリペプチド合成を用いて直接作ることができる。
【０１８９】
非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的な組み込みのための一般的な方法はＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｎｏｒｅｎ、Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｊ．  Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８（１９８９年４月）に記載されている。この方法を用いて非天然アミノ酸での類似体を作製することができる。
【０１９０】
精製に役立つエピトープタグもしくはエピトープ配列などの付加的モチーフを、修飾されたＧＲＫまたは修飾されたＧＰＣＲをコードする核酸に組み込むことができる。好ましくは、モチーフをコードする核酸は核酸の５’または３’の末端でよく、結果的にタンパク質のＮまたはＣ末端でのモチーフが存在することになる。
【０１９１】
抱合体
本発明の検定方法で用いる細胞はアレスチンタンパク質および検出可能な分子の抱合体を含むことができる。本発明の細胞および方法では、細胞はまた本発明の修飾されたＧＰＣＲおよび検出可能な分子の抱合体を含むこともできる。
【０１９２】
全形態のアレスチン、自然発生および人工の変種、非限定例としては視覚アレスチン、錐体アレスチン、βアレスチン１、およびβアレスチン２などを本発明において使用することができる。本発明の修飾されたＧＰＣＲは検出可能なレベルまで全形態のアレスチンと相互作用することができる。
【０１９３】
アレスチンとの抱合に用いることができる検出可能な分子には、非限定例としては分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、放射活性、および光学的手段、非限定例としては生物発光、リン光、蛍光などにより検出可能な分子などがある。検出可能な分子には、非限定例としてはＧＦＰ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ローダミン抱合抗体等がある。検出可能な分子は放射性同位元素、エピトープタグ、アフィニティ標識、酵素、蛍光基、化学発光基等を含む。検出可能な分子には、（複数の）他の分子とのその相互作用の機能として直接的または間接的に検出される分子が挙げられる。これらの検出可能な分子は生物学的に適合する分子であるべきであり、そしてＧＰＣＲ系と相互作用するアレスチンの能力に影響を及ばすべきではなく、そしてアレスチンとＧＰＣＲ系との相互作用は検出される検出可能な分子の能力に影響を及ばすべきではない。好ましい検出可能な分子は光学的に検出可能な分子であり、化学的、機械的、電気的にまたは放射活性により励起されて蛍光、リン光、または生物発光を放射できるような、光学的に検出可能なタンパク質を含む。さらに好ましい検出可能な分子は、本質的には例えばＧＦＰを含む蛍光タンパク質などの蛍光分子などである。検出可能な分子はＢａｒａｋら（米国特許第５，８９１，６４６号および第６，１１０，６９３号）に記載される方法によりアレスチンタンパク質に抱合され得る。検出可能な分子はフロントエンドで、バックエンドで、または中央でアレスチンに抱合され得る。
【０１９４】
ＧＰＣＲまたは生物学的に活性なそのフラグメントを検出可能な分子と抱合させることもできる。好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端を検出可能な分子と抱合させる。検出可能な分子に抱合されたまたは付着したカルボキシル末端テールをカルボキシル末端テール交換に用いて検出可能に標識されたＧＰＣＲを提供することができる。
【０１９５】
ＧＰＣＲが検出可能な分子と抱合される場合、ＧＰＣＲのアレスチンとの近接性を容易に検出することができる。加えて、ＧＰＣＲが検出可能な分子と抱合される場合、ＧＰＣＲのアレスチンとの区画化を容易に確認することができる。ＧＰＣＲとの抱合に用いられる検出可能な分子には、例えば化学的、機械的、電気的にまたは放射活性により励起されて蛍光、リン光、または生物発光を放射できるような、光学的に検出可能な分子などの前記したものを含むことができる。好ましい光学的に検出可能な分子を免疫蛍光、発光、蛍光、およびリン光により検出することができる。
【０１９６】
例えば、ＧＰＣＲは免疫蛍光分子に抱合された抗体で標識された抗体でもよく、またはＧＰＣＲは発光供与体と抱合されてもよい。特に、ＧＰＣＲを例えばルシフェラーゼ、例えばウミシイタケ・ルシフェラーゼ、またはローダミン抱合抗体、例えばローダミン抱合抗ＨＡマウスモノクローナル抗体と抱合させることができる。好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを発光供与体、例えばルシフェラーゼと抱合させることができる。ＧＰＣＲ、好ましくはカルボキシル末端テールもまたＬ．Ｓ．Ｂａｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．「Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｉｎｔａｃｔ  β2−Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．５１：１７７−１８４（１９９７）に記載されるようにＧＦＰと抱合させることができる。
【０１９７】
細胞型および基質
本発明の細胞は少なくとも１つの本発明の修飾されたＧＰＣＲを発現することができる。細胞はさらにアレスチンタンパク質および検出可能な分子の抱合体を含むことができる。有用な細胞には、真核および原核細胞、非限定例としては細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞、および動物細胞などがある。適当な動物細胞には、非限定例としては、ＨＥＫ−２９３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、および種々の初代哺乳動物細胞などがある。その組織全体にわたって、または特定の器官もしくは組織型内で、アレスチンおよび検出可能な分子の抱合体を発現する動物モデルを用いることもできる。
【０１９８】
本発明の細胞は、ＧＰＣＲのエンドサイトーシス小胞またはエンドソームへのアゴニスト非依存的局在化をもたらす１つの修飾されたタンパク質を発現できる。
【０１９９】
基質はその上に本発明の複数の細胞を堆積させることができる。基質は、非限定例としてはガラス、プラスチック、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイヤモンド、生体適合性モノマー、または生体適合性ポリマー材料等のいずれかの適当な生物学的基質でよい。
【０２００】
検出方法
検出可能に標識されたアレスチンの細胞内位置、検出可能に標識されたＧＰＣＲの細胞内位置、または検出可能に標識されたアレスチンまたはＧＰＣＲ／アレスチン複合体のその他のメンバーの、ＧＰＣＲまたはいずれかその他の細胞構造との相互作用、例えば細胞膜でのアレスチンまたはＧＰＣＲの集中、エンドソームでのアレスチンとＧＰＣＲの同時局在、およびクラスリンコート小窩でのアレスチンまたはＧＰＣＲの集中等を検出する方法は使用する（複数の）検出可能な分子に依存して変化する。
【０２０１】
当業者は使用する（複数の）検出可能な分子に適した検出方法を容易に考案することができる。光学的に検出可能な分子に関しては、放射された光の再分布または再配向により蛍光、生物発光またはリン光における変化を測定することができるいずれかの光学的方法を用いることができる。このような方法には、例えば偏光顕微鏡検査、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、エバネッセント波励起顕微鏡検査、および標準的な共焦点顕微鏡検査などがある。
【０２０２】
好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰに抱合させて、そしてアレスチン−ＧＦＰ抱合体を共焦点顕微鏡検査により検出することができる。別の好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰに抱合させ、そしてＧＰＣＲを免疫蛍光分子に抱合させ、そして抱合体を共焦点顕微鏡検査により検出することができる。さらなる好ましい実施形態では、アレスチンをＧＦＰに抱合させ、そしてＧＰＣＲのカルボキシル末端をルシフェラーゼに抱合させ、そして抱合体を生物発光共鳴放射技術により検出することができる。さらに好ましい実施形態では、アレスチンをルシフェラーゼに抱合させ、そしてＧＰＣＲをＧＦＰに抱合させ、そして抱合体を生物発光共鳴放射技術により検出することができる。本発明の方法はＧＰＣＲ活性の検出を対象とする。本発明の方法によりリアルタイムでのＧＰＣＲ経路の増強されたモニター観察が可能になる。
【０２０３】
好ましい実施形態では、検出可能な分子の局在化パターンを決定する。さらに好ましい実施形態では、検出可能な分子の局在化パターンの変化を決定することができる。局在化パターンは検出可能な分子の細胞分布を示すことができる。特定の検出方法は２００２年３月１２日出願の米国特許出願第１０／０９５，６２０号に記載されており、これは２００１年３月１３日出願の米国仮特許出願第６０／２７５，３３９号に対する優先権を主張し、その内容は全て参照して本明細書に組み込む。
【０２０４】
分子を別の検出可能なように標識された分子、例えば抗体とのその相互作用により検出することもできる。
【０２０５】
試験キット
本発明のさらなる実施形態では、ＧＰＣＲの活性を変調するのに有効な潜在的薬物をスクリーニングするためのアッセイ系を含む商業用試験キットを準備することができる。試験キットは本明細書に記載する細胞、核酸またはタンパク質を含むことができる。試験キットを用いて本明細書に記載するいずれかの方法を実施することができる。目的のＧＰＣＲを試験キットの宿主細胞に導入することができる。試験キットは、ＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうか、リン酸化または非リン酸化ＧＰＣＲがアレスチンに結合するかどうか、またはリン酸化または非リン酸化ＧＰＣＲが内在化されるかどうかを決定するのに有用であろう。試験キットは目的のＧＰＣＲの脱感作を変化させる化合物の同定に有用であってもよい。
【０２０６】
ＧＰＣＲを試験系に導入することができ、そして期待される薬物を得られた細胞培養に導入することもでき、そしてその後培養物を試験して細胞内のＧＰＣＲ活性（例えばシグナル伝達、リサイクリング、アレスチンに対する親和性等）におけるいずれかの変化を観察する。
【０２０７】
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態をさらに十分に説明するために提示するものである。しかしながら、これらは本発明の広範な範囲を限定するように意図されるものでは決してない。
【実施例１】
【０２０８】
実験手順
本発明者はウシＧＲＫ２−Ｃ２０  ｃＤＮＡ（Ｉｎｇｌｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２））を発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１ｚｅｏ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。このｃＤＮＡの発現により、カルボキシル末端に付加されたＣＡＡＸモチーフ（ここでＣはシステインであり、Ａは小型の脂肪族残基であり、そしてＸは非電荷のアミノ酸である）を伴うＧＲＫ２が生成される。ＧＲＫ２の末端に付加された特定のＣＡＡＸモチーフ、ＣＶＬＬはこのタンパク質のゲラニルゲラニル化（Ｃ２０イソプレニル化）を指示する。炭素数２０のゲラニルゲラニル脂質基のＧＲＫ２のカルボキシル末端への酵素特異的共有結合により、それが細胞膜で局在することが可能になる（Ｉｎｇｌｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２））。
【０２０９】
細胞培養
ヒト胚性腎（ＨＥＫ−２９３）細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、そして１０（溶液百分率濃度）％熱不活化ウシ胎仔血清およびゲンタミシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養した。Ｇ４１８選択（０．４ｍｇ／ｍｌ）を用いる標準的な手順により、アレスチン−ＧＦＰ（ＨＥＫ２９３−ＡｒｒＧＦＰ）を安定して発現するＨＥＫ−２９３細胞を作製した。ＨＥＫ−２９３細胞をアレスチン−ＧＦＰ、目的のＧＰＣＲ、およびＧＲＫ２−Ｃ２０で一過性にトランスフェクトした。平行して実施する対照実験用に、ＨＥＫ−２９３細胞をアレスチン−ＧＦＰ、目的のＧＰＣＲ、およびＧＲＫ２−Ｃ２０なしで一過性にトランスフェクトした。ＨＥＫ−２９３細胞をアレスチン−ＧＦＰ、目的のＧＰＣＲ、およびＧＲＫ２−Ｃ２０で一過性にトランスフェクトした。平行して実施する対照実験用に、ＨＥＫ−２９３細胞をアレスチン−ＧＦＰ、目的のＧＰＣＲ、およびＧＲＫ２−Ｃ２０なしで一過性にトランスフェクトした。全てのトランスフェクションを以前に記載されているリン酸カルシウム共沈法（Ｏａｋｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９））により実施した。トランスフェクションの後、細胞を培養培地（１０％  ＦＣＳおよび１０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）を添加したＥＭＥＭ）中におよそ２４時間培養した。次いで細胞を３５ｍｍガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ）に蒔き、そしてさらに１６時間から２４時間インキュベートした。トランスフェクトされたＧＰＣＲは公知のＧＰＣＲ（天然リガンドが公知である受容体）およびオーファンＧＰＣＲ（天然リガンドが依然同定されていない受容体）の双方を含んだ。
【０２１０】
共焦点顕微鏡検査
トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞を３５ｍｍガラス底皿（ＭａｔＴｅｋ）に蒔き、そして一晩培養した。翌日、培地を除去して１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加した血清不含培地と交換して、３７℃でさらに１時間インキュベートした。次いでＺｅｉｓｓレーザー走査型共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ５  Ｐａｓｃａｌ）を用いてアレスチン−ＧＦＰの分布を評価した。単線励起（４８８ｎｍ）およびＬＰ５０５エミッションフィルターを用いて生存細胞から６３倍油浸対物レンズで画像を得た。
【実施例２】
【０２１１】
修飾されたＧＲＫの発現時の公知ＧＰＣＲアゴニスト非依存的脱感作
本発明者は、細胞膜で発現されるＧＲＫ２−Ｃ２０の過剰発現（Ｉｎｇｌｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２））が、アレスチン−ＧＦＰを発現する細胞系において、リガンドの添加なしでアレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへの結合を促進することを決定した。
【０２１２】
アレスチン−ＧＦＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をＧＲＫ２−Ｃ２０を伴って、または伴わずに目的のＧＰＣＲで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を用いてアレスチン−ＧＦＰの分布を決定した。クラスリンコート小窩、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路におけるその他の段階でのアレスチン−ＧＦＰの局在化はＧＰＣＲに結合したアレスチン−ＧＦＰを示した。このように、アレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへの結合により可視化されたＧＰＣＲ脱感作を分析した。
【０２１３】
アゴニストを添加しない場合、アレスチン−ＧＦＰは、ＧＲＫ２−Ｃ２０およびいずれかのカンナビノイド２型受容体（ＣＢ２Ｒ）を発現する細胞の細胞膜の小さい点（恐らくクラスリンコート小窩）に局在した（図４）。さらに、アゴニストを添加しない場合、アレスチン−ＧＦＰは、ＧＲＫ２−Ｃ２０およびいずれかのアンジオテンシンＩＩ型ＩＡ受容体（ＡＴ１ＡＲ）、バソプレッシンＶ２受容体（Ｖ２Ｒ）（図４）またはニューロキニン１／サブスタンスＰ受容体（ＮＫ−１またはＳＰＲ）を発現する細胞のエンドサイトーシス小胞に局在した。各々の受容体（ＣＢ２Ｒ、ＡＴ１ＡＲ、Ｖ２Ｒ、またはＳＰＲ）を発現するがＧＲＫ２−Ｃ２０を欠如する対照細胞では、アレスチン−ＧＦＰは細胞質で散在性に発現され、そして細胞膜の小窩または細胞内の小胞で有意な程度まで局在しなかった（図４）。
【実施例３】
【０２１４】
修飾されたＧＲＫの発現時のオーファンＧＰＣＲアゴニスト非依存的脱感作
本発明者は、細胞膜で発現されるＧＲＫ２−Ｃ２０の過剰発現（Ｉｎｇｌｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２））がアレスチン−ＧＦＰを発現する細胞系において、リガンドの添加なしでアレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへの結合を促進することを決定した。
【０２１５】
前記したように、アレスチン−ＧＦＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をＧＲＫ２−Ｃ２０を伴って、または伴わずに目的のＧＰＣＲで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を用いてアレスチン−ＧＦＰの分布を決定した。クラスリンコート小窩、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路におけるその他の段階でのアレスチン−ＧＦＰの局在化はＧＰＣＲに結合したアレスチン−ＧＦＰを示した。このように、アレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへの結合により可視化されたＧＰＣＲ脱感作を分析した。
【０２１６】
アゴニストを添加しない場合、アレスチン−ＧＦＰはオーファン受容体ＧＰＲ５５を発現する細胞の細胞膜の小さい点（恐らくクラスリンコート小窩）に局在した（図７）。ＧＰＲ５５を発現するがＧＲＫ２−Ｃ２０を欠如する対照細胞では、アレスチン−ＧＦＰは細胞質で散在性に発現され、そして細胞膜の小窩または細胞内の小胞で有意な程度まで局在しなかった（図７）。その他のオーファンＧＰＣＲを以下に記載する。
【実施例４】
【０２１７】
ＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力を分析する方法
本発明者は目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する方法を開発した。好ましくは、本明細書に記載するアゴニスト非依存的様式でＧＰＣＲが脱感作する宿主細胞において、オーファンＧＰＣＲの発現を分析することができる。
【０２１８】
前記したように、アレスチン−ＧＦＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞をＧＲＫ２−Ｃ２０を伴って、または伴わずに目的のＧＰＣＲで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を用いてアレスチン−ＧＦＰの分布を決定した。クラスリンコート小窩、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路におけるその他の段階でのアレスチン−ＧＦＰの局在化はＧＰＣＲに結合したアレスチン−ＧＦＰを示した。このように、アレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへの結合により可視化されたＧＰＣＲ脱感作を分析した。
【０２１９】
前記したように、特定のＧＰＣＲはクラスリンコート小窩、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路におけるその他の段階で局在化した。アレスチン結合はその後に続く脱感作経路における局在化に必要であるので、この局在化はＧＰＣＲがアレスチンに結合する能力を有していることを示した。アレスチンと結合しないＧＰＣＲは脱感作経路に進入または局在しない。アレスチンと結合しないＧＰＣＲを、アレスチンに結合するように変化させることができる。以下に記載するように、本発明者はアレスチン親和性を増強するように、ある種のＧＰＣＲを修飾した。
【実施例５】
【０２２０】
ＧＰＣＲのアレスチンに結合する能力を上昇させる方法
本発明者は、アレスチンへのその結合を増強させるようにＧＰＣＲを修飾した。これらの修飾は米国特許出願第０９／９９３，８４４号に記載されている。Ｃ末端テールでＧＲＫによりさらに良好にリン酸化されるようにＧＰＣＲを修飾した。その結果、これらの修飾さてリン酸化されたＧＰＣＲはアレスチンに対する結合が増強されていた。本発明者は内在化が増強されていることを実証した。Ｅの文字（リン酸化が増強されていることに関する）をこの様式で修飾されたＧＰＣＲの名前の終わりに加える。
【０２２１】
修飾されたＧＰＣＲ構築物は標準的なプロトコールに従ってポリメラーゼ連鎖反応により作製され、そしてＨＡエピトープを含有する。推定されるパルミトイル化部位の後で、ＧＰＣＲおよびＶ２Ｒのカルボキシル末端テールが互いに交換されているキメラ受容体を構築した（図３）。ＤＮＡシークエンシングによりＤＮＡ構築物の配列を確認した。
【０２２２】
Ｖ２Ｒカルボキシル末端に融合されるＮＰＸＸＹの下流１０個から２５個のアミノ酸（好ましくは１５個から２０個）のシステイン残基（推定されるパルミトイル化部位）のコドンの直後にＮｏｔ  Ｉ制限酵素部位（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）を導入したプライマーで目的のＧＰＣＲの核酸をＰＣＲ増幅した。次いでＮｏｔ  Ｉ制限酵素部位および受容体ａｔｇ開始コドンの上流の付加制限酵素部位を用いて増幅された受容体ＤＮＡフラグメントをｐＥＡｒｒＢ−１ベクター（米国特許出願第０９／９９３，８４４号に記載）にサブクローニングした。発現される場合、修飾されたＧＰＣＲは受容体カルボキシル末端に融合された３１個のアミノ酸ペプチドを含有する。最初の２個のアミノ酸はＮｏｔ  Ｉ部位のにより提供されるＡｌａ残基であり、そして最後の２９個のアミノ酸はＶ２Ｒカルボキシル末端に由来する。
【０２２３】
本発明者は前記および米国特許出願第０９／９９３，８４４号に記載の以下の受容体のカルボキシル末端テールを修飾した。β２アドレナリン作動性受容体（β２ＡＲＥ）、ドーパミンＤ１Ａ受容体（Ｄ１ＡＲＥ）、ｍｕオピオイド受容体（ＭＯＲＥ）、オーファンＧＰＲ３（ＧＰＲ３Ｅ）、オーファンＧＰＲ６（ＧＰＲ６Ｅ）、オーファンＧＰＲ１２（ＧＰＲ１２Ｅ）、オーファンＧＰＲ７（ＧＰＲ７Ｅ）、オーファンＧＰＲ８（ＧＰＲ８Ｅ）、オーファンＧＰＲ５５（ＧＰＲ５５Ｅ）、オーファンＳＲＥＢ２（ＳＲＥＢ２Ｅ）、およびオーファンＳＲＥＢ３（ＳＲＥＢ３Ｅ）。「Ｅ」は「増強されたアレスチン結合」を意味する。アゴニストの添加なしで、ＧＲＫ２−Ｃ２０と同時発現される場合、アレスチン−ＧＦＰは前記で列挙した各々の修飾されたＧＰＣＲに関してエンドサイトーシス小胞に局在した（図４、５、６および７）。これらの修飾された受容体のいくつか（例えばオーファンＧＰＲ６Ｅ）に関しては、小量であるが有意な量のアレスチン−ＧＦＰがＧＲＫ２−Ｃ２０を欠如する対照細胞の細胞内小胞において局在することが観察された（図５）。しかしながら、これらの受容体を伴うＧＲＫ２−Ｃ２０の過剰発現はこの応答において著明な上昇を促進した（図５）。これらの修飾されたＧＰＣＲ、野生型配列、およびＨＡタグ化された修飾されたＧＰＣＲのアミノ酸および核酸配列を図３および配列番号３５〜９０に示す。
【実施例６】
【０２２４】
目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する方法
本発明者は目的のＧＰＣＲが細胞膜で発現されるかどうかを決定する方法を開発した。
【０２２５】
アレスチン−ＧＦＰで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、ＧＲＫ２−Ｃ２０を伴う場合と、伴わない場合で目的のＧＰＣＲで一過性にトランスフェクトした。共焦点顕微鏡を用いてアレスチン−ＧＦＰの分布を決定した。クラスリンコート小窩、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路におけるその他の段階でのアレスチン−ＧＦＰの局在化はＧＰＣＲに結合したアレスチン−ＧＦＰを示した。このように、アレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへの結合により可視化されたＧＰＣＲ脱感作を分析した。
【０２２６】
前記したように、特定のＧＰＣＲはクラスリンコート小窩、エンドサイトーシス小胞、エンドソーム、または脱感作経路におけるその他の段階で局在化した。細胞膜発現はその後に続く脱感作経路における局在化に必要であるので、この局在化はＧＰＣＲが細胞膜において発現されることを示唆した。細胞膜で発現されないＧＰＣＲは脱感作経路に局在しない。細胞膜で発現されないＧＰＣＲを、細胞膜で発現されるように変化させることができる。例えばＧＰＣＲの発現を変化させることができるか、ＧＰＣＲのアミノ酸配列を変化させることができるか、またはＧＰＣＲを別の宿主細胞に導入することができる。
【実施例７】
【０２２７】
ＧＰＣＲ変異体の脱感作をモニター観察する
ＧＰＣＲ変異体を含む細胞における脱感作をモニター観察することができる。ＧＰＣＲ変異体の脱感作はＧＲＫの過剰発現に依存する可能性がある。
【０２２８】
チロシン残基３２６をアラニンに変換した点変異を含有するヒトβ2ＡＲ−Ｅ−Ｙ３２６Ａを含むベクターをアレスチン−ＧＦＰおよび、修飾されていてよいＧＲＫを発現する細胞にトランスフェクトする。前記したように「Ｅ」はＧＰＣＲが修飾されていることを示す。Ｙ３２６Ａ変異によりＧＰＣＲが、リン酸化およびその後に続く脱感作のために過剰発現されたＧＲＫに依存的になる。β2ＡＲ−Ｅ−Ｙ３２６Ａはアゴニスト不在下でＧＲＫ２−Ｃ２０の発現時に脱感作する。誘導プロモーター、複製起点などの複製調節機構を用いて、または細胞内のベクター量を手動で変化させて、細胞内のＧＲＫ核酸の量を変化させる方法などでＧＲＫの発現を変化させることができる。
【０２２９】
細胞を９６ウェルまたは高密度プレートに播種し、そして一晩インキュベートした。翌朝誘導系のアクチベーターまたは溶液のみをウェルに添加してＧＲＫまたは修飾されたＧＲＫの過剰発現を誘導する。ＧＲＫ（修飾されたＧＲＫではない）を発現する細胞にアゴニストを添加する。
【０２３０】
次いで目的の化合物をウェルに添加して、化合物がアレスチン−ＧＦＰの内在化を変化させるかどうかを調べる。次いで細胞を２％  パラホルムアルデヒドで固定し、そして画像分析系を用いてアレスチン−ＧＦＰ転位の量を測定する。
【０２３１】
種々の具体的な材料、手順および実例を参照することにより本発明を記載し、そして説明してきたが、発明がその目的のために選択された特定の材料、材料の組み合わせ、および手順に限定されないことは理解される。当業者により理解されるような、このような詳細の多くの変法が含まれ得る。
【０２３２】
以下は前記の開示および特に実験手順および論考に関連する文献のリストである。以下の文献および前記の記載で参照されたいずれの文献も、その全てを参照して本明細書に組み込むと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】本発明で用いることができるＧＰＣＲのリストである。
【図２】本発明で用いることができるＧＲＫのリストである。特定のＧＲＫのアミノ酸および核酸配列を示す。修飾されたＧＲＫであるＧＲＫ２−Ｃ２０のアミノ酸および核酸配列を示す。
【図３】アレスチンに対する親和性が増強されるように修飾されているＧＰＣＲのリストである。アミノ酸および核酸配列を示す。
【図４】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的転位置を説明する。
【図５】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的転位置を説明する。
【図６】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的転位置を説明する。
【図７】ＧＲＫ２−Ｃ２０の存在下でのアレスチン−ＧＦＰのＧＰＣＲへのアゴニスト非依存的転位置を説明する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
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【図２Ｑ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図３Ｑ】
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【図３Ｒ】
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【図３Ｓ】
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【図３Ｔ】
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【図３Ｕ】
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【図３Ｖ】
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【図３Ｗ】
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【図３Ｘ】
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【図３Ｙ】
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【図３Ｚ１】
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【図３Ｚ２】
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【図３Ｚ３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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