(57)【要約】ＴＬＲ３を介して作用する、免疫刺激化合物、それらのアゴニストおよびアンタゴニストを同定、特徴付け、ならびに最適化するための組成物および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激化合物を同定するためのスクリーニング方法であって：
試験化合物の非存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介されるネガティブコントロール応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させること；
前記ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験応答を検出すること；および
前記試験応答がネガティブコントロール応答を超える場合、試験化合物は免疫刺激化合物であると決定すること、を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
免疫刺激化合物を同定するためのスクリーニング方法であって：
参照免疫刺激化合物の存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される参照応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させること；
前記ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験応答を検出すること；および
前記試験応答が参照応答に等しいかまたは該参照応答を超える場合、試験化合物は免疫刺激化合物であると決定すること、を含む、スクリーニング方法。
【請求項３】
ＴＬＲ３シグナリング活性を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法であって：
参照免疫刺激化合物のみの存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される参照応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物および参照免疫刺激化合物とを接触させること；
ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験−参照応答を検出すること；
前記試験−参照応答が前記参照応答を超える場合、試験化合物はＴＬＲ３シグナリング活性のアゴニストであると決定すること；および
前記参照応答が前記試験−参照応答を超える場合、試験化合物はＴＬＲ３シグナリング活性のアンタゴニストであると決定すること、を含む、スクリーニング方法。
【請求項４】
免疫刺激化合物の種特異性を同定するためのスクリーニング方法であって：
第１の種の機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる場合に、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される第１の種特異的応答を測定すること；
第２の種の機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる場合に、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される第２の種特異的応答を測定すること；および
前記第１の種特異的応答と前記第２の種特異的応答とを比較すること、を含む、スクリーニング方法。
【請求項５】
前記スクリーニング方法は複数の試験化合物に対して実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される応答は定量的に測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記機能的ＴＬＲ３は細胞において発現される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞は機能的ＴＬＲ３を天然に発現する単離された哺乳動物細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞は機能的ＴＬＲ３を天然では発現しない単離された哺乳動物細胞であって、該細胞はＴＬＲ３の発現ベクターを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は２９３ヒト線維芽細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞は、インターロイキン−６−ルシフェラーゼ（ＩＬ−６−ｌｕｃ）、ＩＬ−８−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ｐ４０−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ｐ４０−β−Ｇａｌ、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＡＰ１−ｌｕｃ、ＩＦＮ−α−ｌｕｃ、ＩＦＮ−β−ｌｕｃ、ＲＡＮＴＥＳ−ｌｕｃ、ＴＮＦ−ｌｕｃ、ＩＰ−１０−ｌｕｃ、Ｉ−ＴＡＣ−ｌｕｃ、およびＩＳＲＥ−ｌｕｃからなる群より選択されるレポーター構築物をコードする単離された核酸を含有する発現ベクターを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記レポーター構築物はＩＳＲＥ−ｌｕｃである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記機能的ＴＬＲ３は無細胞系の一部である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能的ＴＬＲ３は、ＭｙＤ８８、ＩＬ−１レセプター関連キナーゼ１〜３（ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ３）、腫瘍壊死因子レセプター関連因子１〜６（ＴＲＡＦ１〜ＴＲＡＦ６）、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＭｙＤ８８−アダプター−ライク（Ｍａｌ）、Ｔｏｌｌインターロイキン１レセプター（ＴＩＲ）ドメイン含有アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）、Ｔｏｌｌｉｐ、Ｒａｃ、ならびにそれらの機能的相同物および誘導体からなる群より選択される非ＴＬＲタンパク質との複合体の一部である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ＴＬＲタンパク質はＭｙＤ８８を含まない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記参照免疫刺激化合物は核酸である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸はＣｐＧ核酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記参照免疫刺激化合物は低分子化合物である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１９】
前記試験化合物は化合物のコンビナトリアルライブラリーの一部である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記試験化合物は核酸である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸はＣｐＧ核酸である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試験化合物は低分子化合物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試験化合物はポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される前記応答は、ＩＳＲＥ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ、ＩＰ−１０、およびＩ−ＴＡＣからなる群より選択されるプロモーター応答エレメントの制御下におけるレポーター遺伝子の誘導である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
プロモーター応答エレメントの制御下にある前記レポーター遺伝子は、ＩＳＲＥ−ｌｕｃ、ＩＬ−６−ｌｕｃ、ＩＬ−８−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ｐ４０−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ｐ４０−β−Ｇａｌ、ＩＦＮ−α−ｌｕｃ、ＩＦＮ−β−ｌｕｃ、ＲＡＮＴＥＳ−ｌｕｃ、ＴＮＦ−ｌｕｃ、ＩＰ−１０−ｌｕｃ、およびＩ−ＴＡＣ−ｌｕｃからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
プロモーター応答エレメントの制御下にある前記レポーター遺伝子はＩＳＲＥ−ｌｕｃである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記レポーター遺伝子は、ＩＦＮ−α１−ｌｕｃおよびＩＦＮ−α４−ｌｕｃからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される前記応答は、（ａ）ＡＰ１、ＮＦ−κＢ、ＡＴＦ２、ＩＲＦ３、およびＩＲＦ７からなる群より選択される転写因子に対して応答性を有する最小プロモーターの制御下におけるレポーター遺伝子の誘導；（ｂ）ケモカインの分泌；ならびに（ｃ）サイトカインの分泌からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される前記応答は、ＡＰ１−ｌｕｃおよびＮＦ−κＢ−ｌｕｃからなる群より選択されるレポーター遺伝子の誘導である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される前記応答は、１型ＩＦＮの分泌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される前記応答は、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ９（Ｍｉｇ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、およびＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）からなる群より選択されるケモカインの分泌である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させることは、それぞれの試験化合物について、それぞれ複数の濃度で試験化合物と接触させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出は前記接触の６〜１２時間後に実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記検出は前記接触の１６〜２４時間後に実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、自然免疫に関与すると考えられるＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）によるシグナル伝達に関与する。より具体的には、本発明は、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ３シグナリングアゴニスト、およびＴＬＲ３シグナリングアンタゴニストの同定ならびに特徴付けに有用なスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、自然免疫の重要な要素として作用する少なくとも１０種の高度に保存されたレセプタータンパク質（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０）のファミリーである。催炎性インターロイキン−１レセプター（ＩＬ−１Ｒ）ファミリーのメンバーとして、ＴＬＲは、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒ相同（ＴＩＲ）ドメインと呼ばれるそれらの細胞質ドメインにおいて相同性を共有する（公開されたＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＵＳ９８／０８９７９およびＰＣＴ／ＵＳ０１／１６７６６）。ＴＩＲによって仲介される細胞内シグナリング機構は、極めて重要な役割を有すると考えられるＭｙＤ８８（Ｗｅｓｃｈｅ  Ｈら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：８３７−４７；Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２：２５３−８；Ａｄａｃｈｉ  Ｏら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：１４３−５０；Ｋａｗａｉ  Ｔら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：１１５−２２）および腫瘍壊死因子レセプター関連因子６（ＴＲＡＦ６；Ｃａｏ  Ｚら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：４４３−６；Ｌｏｍａｇａ  ＭＡら（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ１３：１０１５−２４）と一般的に類似するようである。ＭｙＤ８８とＴＲＡＦ６との間のシグナル伝達は、少なくともＩＲＡＫ−１およびＩＲＡＫ−２を含むセリン−トレオニンキナーゼＩＬ−１レセプター関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）ファミリーのメンバーに関与することが知られている（Ｍｕｚｉｏ  Ｍら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１６１２−５）。
【０００３】
多くの（但し、全てではない）ＴＬＲに対するリガンドについての記載がある。例えば、ＴＬＲ２は、ペプチドグリカンおよびリポペプチドに対する応答においてシグナル伝達することが報告されている（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａら（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：１−５；Ｂｒｉｇｈｔｂｉｌｌ  ＨＤら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７３２−６；Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓ  ＡＯら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７３６−９；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：４４３−５１；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  ＤＭら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：８１１−５）。ＴＬＲ４はリポ多糖（ＬＰＳ）に対する応答においてシグナル伝達することが報告されている（Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋら（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：３７４９−５２；Ｐｏｌｔｏｒａｋ  Ａら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０８５−８；Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：３９４−７）。細菌性フラジェリンはＴＬＲ５に対する天然のリガンドであることが報告されている（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１０９９−１１０３）。ＴＬＲ６は、ＴＬＲ２と共同して、プロテオグリカンに対する応答においてシグナル伝達することが報告されている（Ｏｚｉｎｓｋｙ  Ａら（２０００）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：１３７６６−７１；Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏら（２００１）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：９３３−４０）。最近、ＴＬＲ９は、ＣｐＧ  ＤＮＡに対するレセプターであることが報告された（Ｈｅｍｍｉ  Ｈら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−５）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
本発明は、それ自体でＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）を介して信号伝達するか、またはＴＬＲ３を介するシグナリングに影響を及ぼす化合物の同定および特徴付けに有用なスクリーニング方法ならびに組成物を提供する。ＴＬＲ３を介してそれ自体で信号伝達する化合物は免疫刺激性であると推定される。ＴＬＲ３を介するシグナリングに影響を及ぼす化合物には、ＴＬＲ３シグナリング活性のアゴニストおよびアンタゴニストの両方が含まれる。本発明によって提供される方法は、ハイスループットスクリーニングに適応可能であり、従って、ＴＬＲ３シグナリング活性のこれまで知られていなかった誘導因子、アゴニスト、およびアンタゴニストの同定ならびに特徴付けを加速する。
【０００５】
本発明の方法は、ＴＬＲ３シグナリング活性を評価する能力に少なくとも部分的に依存する。驚くべきことに、ＴＬＲ３シグナリング活性に感受性のある特定のプロモーター応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子を有するレポーター構築物は本発明のスクリーニングアッセイに有用であることを本発明により発見した。例えば、驚くべきことに、インターフェロン特異的応答エレメント（ＩＳＲＥ）の制御下にあるレポーター遺伝子はＴＬＲ３シグナリング活性に感受性を有することを本発明により発見した。
【０００６】
また、驚くべきことに、ＴＬＲリガンドのためのスクリーニングアッセイならびにＴＬＲシグナリング活性に関与する他のアッセイは、（ａ）試験および／または参照化合物の濃度、（ｂ）アッセイの動力学、ならびに（ｃ）レポーターの選択の変項の少なくとも１つを最適化することによって利益を得ることができることを本発明により発見した。アッセイデータの解釈はこれらの変項のそれぞれの影響を受け得る。
【０００７】
１つの態様では、本発明は、免疫刺激化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明の本態様に従う方法は、（ａ）試験化合物の非存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介されるネガティブコントロール応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる工程；（ｂ）ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験応答を検出する工程；および（ｃ）試験応答がネガティブコントロール応答を超える場合、試験化合物は免疫刺激化合物であると決定する工程、を含む。本発明の本態様および全ての態様では、１つの実施態様において、スクリーニング方法は複数の試験化合物に対して実施される。本発明の本態様および全ての態様に従う化合物は、１つの実施態様において、化合物のライブラリー、好ましくは、化合物のコンビナトリアルライブラリーのメンバーである。また、本発明の本態様および全ての態様では、試験化合物は、好ましくは低分子化合物、核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、または脂質である。より好適な実施態様において、試験化合物は、低分子化合物または核酸である。１つの実施態様において、核酸である試験化合物としてＣｐＧ核酸が用いられる。
【０００８】
別の実施態様では、本発明は、免疫刺激化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明の本態様に従う方法は、（ａ）参照免疫刺激化合物の存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される参照応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる工程；（ｂ）ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験応答を検出する工程；および（ｃ）試験応答が参照応答に等しいかまたは該参照応答を超える場合、試験化合物は免疫刺激化合物であると決定する工程、を含む。本発明の本態様および他の態様では、参照免疫刺激化合物は、好ましくは低分子化合物、核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、または脂質である。１つの実施態様において、参照免疫刺激化合物はＣｐＧ核酸である。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、ＴＬＲ３シグナリング活性を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明の本態様に従う方法は、（ａ）参照免疫刺激化合物のみの存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される参照応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物および参照免疫刺激化合物とを接触させる工程；（ｂ）ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験−参照応答を検出する工程；（ｃ）試験−参照応答が参照応答を超える場合、試験化合物はＴＬＲ３シグナリング活性のアゴニストであると決定する工程；ならびに（ｄ）参照応答が試験−参照応答を超える場合、試験化合物はＴＬＲ３シグナリング活性のアンタゴニストであると決定する工程、を含む。
【００１０】
さらなる別の態様では、本発明は、免疫刺激化合物の種特異性を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明の本態様に従う方法は、（ａ）第１の種の機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる場合に、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される第１の種特異的応答を測定する工程；（ｂ）第２の種の機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる場合に、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される第２の種特異的応答を測定する工程；および（ｃ）第１の種特異的応答と第２の種特異的応答とを比較する工程、を含む。好適な実施態様において、第１の種の機能的ＴＬＲ３はヒトＴＬＲ３である。１つの好適な実施態様において、第１の種の機能的ＴＬＲ３はヒトＴＬＲ３であり、かつ第２の種の機能的ＴＬＲ３はマウスＴＬＲ３である。
【００１１】
本発明の前記態様の好適な実施態様において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される応答は定量的に測定される。
【００１２】
また、本発明の前記態様の好適な実施態様において、機能的ＴＬＲ３は細胞において発現される。例えば、１つの実施態様において、細胞は機能的ＴＬＲ３を天然に発現する単離された哺乳動物細胞である。あるいは、別の実施態様において、細胞は機能的ＴＬＲ３を天然で発現しない単離された哺乳動物細胞であって、該細胞はＴＬＲ３の発現ベクターを有する。例えば、１つの好適な実施態様において、細胞はヒト２９３線維芽細胞である。他の実施態様において、機能的ＴＬＲ３は無細胞系の部分である。
【００１３】
ＴＬＲ３シグナリングに感受性のあるレポーター構築物を含む細胞は、機能的ＴＬＲ３を発現する細胞に関与する本発明の実施態様において特に有用である。１つの実施態様において、細胞は、核因子−カッパＢ−ルシフェラーゼ（ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ）、ＩＦＮ−特異的応答エレメントルシフェラーゼ（ＩＳＲＥ−ｌｕｃ）、インターロイキン−６−ルシフェラーゼ（ＩＬ−６−ｌｕｃ）、インターロイキン−８−ルシフェラーゼ（ＩＬ−８−ｌｕｃ）、インターロイキン１２ｐ４０サブユニッＴｏｌｌシフェラーゼ（ＩＬ−１２ｐ４０−ｌｕｃ）、インターロイキン１２ｐ４０サブユニット−βガラクトシダーゼ（ＩＬ−１２ｐ４０−β−Ｇａｌ）、活性化タンパク質１−ルシフェラーゼ（ＡＰ１−ｌｕｃ）、インターフェロンα−ルシフェラーゼ（ＩＦＮ−α−ｌｕｃ）、インターフェロンβ−ルシフェラーゼ（ＩＦＮ−β−ｌｕｃ）、ＲＡＮＴＥＳ−ルシフェラーゼ（ＲＡＮＴＥＳ−ｌｕｃ）、腫瘍壊死因子−ルシフェラーゼ(ＴＮＦ−ｌｕｃ)、ＩＰ−１０−ルシフェラーゼ（ＩＰ−１０−ｌｕｃ）、インターフェロン−誘導性Ｔ細胞α化学誘導物質−ルシフェラーゼ（Ｉ−ＴＡＣ−ｌｕｃ）の群から選択されるレポーター構築物をコードする単離された核酸を有する発現ベクターを含む。好適な実施態様において、レポーター構築物はＩＳＲＥ−ｌｕｃである。
【００１４】
本発明の前記態様のそれぞれに従う１つの実施態様において、機能的ＴＬＲ３は、ＭｙＤ８８、ＩＬ−１レセプター関連キナーゼ１〜３（ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ３）、腫瘍壊死因子レセプター関連因子１〜６（ＴＲＡＦ１〜ＴＲＡＦ６）、ＩκＢ、ＮＦ−κＢ、ＭｙＤ８８−アダプター−ライク（ＭｙＤ８８−ａｄａｐｔｅｒ−ｌｉｋｅ；Ｍａｌ）、Ｔｏｌｌインターロイキン１レセプター（ＴＩＲ）ドメイン含有アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰ）、Ｔｏｌｌｉｐ、Ｒａｃ、ならびにそれらの機能的相同物および誘導体からなる群より選択される非ＴＬＲタンパク質との複合体の部分である。関連する実施態様において、機能的ＴＬＲ３は、ＭｙＤ８８を含まない上記に列挙した非ＴＬＲタンパク質との複合体の一部である。
【００１５】
また、本発明の前記態様のそれぞれに従って、１つの実施態様において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される応答は、ＩＳＲＥ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ、ＩＰ−１０、およびＩ−ＴＡＣからなる群より選択されるプロモーター応答エレメントの制御下におけるレポーター遺伝子の誘導である。例えば、好適な実施態様において、プロモーター応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子は、ＩＳＲＥ−ｌｕｃ、ＩＬ−６−ｌｕｃ、ＩＬ−８−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ｐ４０−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ｐ４０−β−Ｇａｌ、ＩＦＮ−α−ｌｕｃ、ＩＦＮ−β−ｌｕｃ、ＲＡＮＴＥＳ−ｌｕｃ、ＴＮＦ−ｌｕｃ、ＩＰ−１０−ｌｕｃ、およびＩ−ＴＡＣ−ｌｕｃからなる群より選択される。１つの好適な実施態様において、プロモーター応答エレメントの制御下にあるレポーター遺伝子はＩＳＲＥ−ｌｕｃである。さらに別の好適な実施態様において、レポーター遺伝子は、ＩＦＮ−α１−ｌｕｃおよびＩＦＮ−α４−ｌｕｃからなる群より選択される。
【００１６】
本発明の前記態様のそれぞれに従うさらなる１つの実施態様において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される応答は、（ａ）ＡＰ１、ＮＦ−κＢ、ＡＴＦ２、ＩＲＦ３、およびＩＲＦ７からなる群より選択される転写因子に対して応答性を有する最小プロモーターの制御下におけるレポーター遺伝子の誘導；（ｂ）ケモカインの分泌；ならびに（ｃ）サイトカインの分泌からなる群より選択される。例えば、１つの好適な実施態様において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される応答は、ＡＰ１−ｌｕｃおよびＮＦ−κＢ−ｌｕｃからなる群より選択されるレポーター遺伝子の誘導である。別の好適な実施態様において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される応答は、１型ＩＦＮの分泌である。さらに別の好適な実施態様において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される応答は、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ９（Ｍｉｇ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、およびＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）からなる群より選択されるケモカインの分泌である。
【００１７】
本発明のスクリーニング方法の感度および解釈は最適化することができる。そのような最適化は、（ａ）試験および／または参照化合物の濃度、（ｂ）アッセイの動力学、ならびに（ｃ）レポーター、のいずれか１つあるいは組み合わせの適切な選択に関与する。従って、本発明の最初の３つの態様のそれぞれに従い、１つの実施態様において、機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させることは、それぞれの試験化合物について、それぞれ複数の濃度で試験化合物と接触させることをさらに必要とする。例えば、それぞれの試験化合物は、ｌｏｇ増加的に異なる様々な濃度で評価することができる。また、本発明の前記態様のそれぞれに従って、ある実施態様では、検出は接触の４〜１２時間後、好ましくは６〜８時間後に実施される。同様に、本発明の前記態様のそれぞれに従う別の一実施態様において、検出は接触の１６〜２４時間後に実施される。接触の４〜１２時間後、好ましくは６〜８時間後に実施される検出は、それより遅い時間における検出よりも相互作用の親和性に対してより感度が高いと考えられる。接触の１６〜２４時間以降に実施される検出は、レセプター／リガンド相互作用の安定性および期間に対してより感度が高いと考えられる。さらに、特定のレポーター構築物は、他のものよりも特定のＴＬＲに対してより感度が高いため、特定のアッセイの読み取りにおけるシグナル対ノイズ比を増加するためには、ＴＬＲアッセイに対してレポーターが適切に一致することが重要である。
【００１８】
本出願は、図および他の図面に言及する実施例を含む。参考にした図は例示のみであって、請求される本発明の実施態様に必須ではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
特定の態様において本発明は、免疫刺激核酸および免疫刺激性の低分子化合物を含むがそれらに限定されない免疫刺激化合物の同定、特徴付け、および最適化に有用なスクリーニング方法、ならびにＴＬＲ３シグナリングのアゴニストおよびアンタゴニストの同定および最適化のためのアッセイを提供する。本発明に従う方法は、細胞ベースのアッセイおよび無細胞系アッセイの両方を含む。特定の好適な実施態様において、該スクリーニング方法は、ハイスループット様式で実施される。該方法を使用して、ＴＬＲ３シグナリングに関与する免疫活性化を調節する能力について化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００２０】
１つの態様では、本発明は、免疫刺激化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明の本態様に従う方法は、（ａ）試験化合物の非存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介されるネガティブコントロール応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる工程；（ｂ）ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験応答を検出する工程；および（ｃ）試験応答がネガティブコントロール応答を超える場合、試験化合物は免疫刺激化合物であると決定する工程を含む。第２の態様では、本発明は、免疫刺激化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明の本態様に従う方法は、（ａ）参照免疫刺激化合物の存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される参照応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる工程；（ｂ）ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験応答を検出する工程；および（ｃ）試験応答が該参照応答に等しいかまたは該参照応答を超える場合、試験化合物は免疫刺激化合物であると決定する工程を含む。本発明のこれらの２つの態様は、一方がネガティブコントロールに対する試験化合物の比較に関与し、他方がポジティブコントロールに対する試験化合物の比較に関与する点で異なる。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の態様について、ＴＬＲ３は、好ましくは、ヒトＴＬＲ３またはマウスＴＬＲ３などの哺乳動物ＴＬＲ３である。ヒトＴＬＲ３およびマウスＴＬＲ３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については先に記載されている。ヒトＴＬＲ３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＮＭ  ００３２６５（配列番号１）として見出すことができ、９０４アミノ酸を包含するヒトＴＬＲ３の推定アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＮＰ  ００３２５６（配列番号２）として見出すことができる。マウスＴＬＲ３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＦ３５５１５２（配列番号３）として見出すことができ、９０５アミノ酸を包含するマウスＴＬＲ３の推定アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＡＫ２６１１７（配列番号４）として見出すことができる。
【００２２】
本明細書において使用される「機能的ＴＬＲ３」は、ＴＬＲ３リガンドに特異的に結合し、Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１レセプター（ＴＩＲ）ドメインを介してシグナル伝達する上記の天然に存在する全長ＴＬＲ３ポリペプチドを含むポリペプチドを指すべきである。従って、天然に存在する全長ＴＬＲ３に加えて、機能的ＴＬＲ３はまた、そのポリペプチドがＴＬＲ３リガンドに特異的に結合し、ＴＩＲドメインを介してシグナル伝達をする限り、対立遺伝子変異体、融合蛋白質、およびそれらの短縮されたバージョンも指す。好適な実施態様において、機能的ＴＬＲ３は、配列番号２に記載のアミノ酸３８〜７０７によって提供されるアミノ酸配列を有するヒトＴＬＲ３細胞外ドメインを含む。別の好適な実施態様において、機能的ＴＬＲ３は、配列番号４に記載のアミノ酸３９〜７０８によって提供されるアミノ酸配列を有するマウスＴＬＲ３細胞外ドメインを含む。好ましくは、機能的ＴＬＲ３は、ＴＬＲ３のＴＩＲドメインを介してシグナル伝達する。
【００２３】
本発明の本態様および他の態様の特定の実施態様において、機能的ＴＬＲ３は、細胞において天然に、または人工的に発現される。いくつかの実施態様において、本発明の方法において使用されるためのＴＬＲ３を発現する細胞は、ＴＬＲ３を発現し、他のＴＬＲを発現しない。あるいは、いくつかの実施態様において、本発明の方法において使用されるためのＴＬＲ３を発現する細胞は、ＴＬＲ３および少なくとも１つのＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９の両方を発現する。１つの実施態様において、細胞は、機能的ＴＬＲ３を天然に発現する単離された哺乳動物細胞である。ＴＬＲ３を発現することが既知である細胞および組織として、樹状細胞（ＤＣ）、上皮内細胞、および胎盤が挙げられる（Ｍｕｚｉｏ  Ｍら（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：５９９８−６００４；Ｃａｒｉｏ  Ｅら（２０００）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：７０１０−７；Ｒｏｃｋ  ＦＬら（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：５８８−９３）。本明細書において使用される用語「単離された」とは、細胞または化合物の場合を参考にすると、細胞または化合物が通常天然に関連する成分、例えば、他の細胞、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物またはｉｎ  ｖｉｖｏ系を、意図する使用に実際的および適切な程度で実質的に含まないかまたはこれらから分離されることを意味する。
【００２４】
別の実施態様では、上記細胞は、天然に発生したままではＴＬＲ３を発現することはできないが、ＴＬＲ３の発現ベクターの人工的導入を介してＴＬＲ３を発現可能にされる細胞である。ＴＬＲ３を欠く細胞株の例として、ヒト２９３線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）およびＨＥｐ−２ヒト上皮細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２３）が挙げられるがこれらに限定されない。ＴＬＲ９を欠く細胞株の例として、ヒト２９３線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ＭｏｎｏＭａｃ−６、ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ＣＨＯ、および任意のＴＬＲ９ノックアウトが挙げられるがこれらに限定されない。典型的に、細胞は、それがＴＬＲ３を天然または人工的に発現することが可能であるかどうかにかかわらず、好ましくは、ＴＬＲ３レセプターを介して開始されるシグナル伝達に必要な全てのエレメントを有する。例えば、ＴＬＲ３シグナリングには、シグナル伝達の初期段階においてアダプタータンパク質ＭｙＤ８８が必要であると考えられている。対照的に、ＴＬＲ３は、ＭｙＤ８８を必要としないようであるが、さらに下流の他の因子、例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびＭＡＰＫの下流の因子を必要とし得る。
【００２５】
必要であれば、特定のＴＬＲの細胞または細胞株への導入は、（本明細書に記載のような）遺伝子発現配列に操作可能に連結されたＴＬＲをコードする核酸配列による細胞または細胞株の一過的または安定なトランスフェクションによって好適に達成される。例えば、本発明の方法において使用されるＴＬＲ３を発現するように人工的に誘導された細胞は、ＴＬＲ３発現ベクターで一過的または安定にトランスフェクトされている細胞を含む。この目的のために一過的または安定なトランスフェクションの任意の適切な方法を用いることができる。
【００２６】
ＴＬＲ３の発現ベクターは、少なくとも、真核または原核細胞内でＴＬＲ３の発現を指令することができる遺伝子発現配列に操作可能に連結された機能的ＴＬＲ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。「遺伝子発現配列」は、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサーの組み合わせなどの任意の調節ヌクレオチド配列であって、該配列が操作可能に連結されている核酸配列の効率的な転写および翻訳を可能にする。ＴＬＲ３核酸での「遺伝子発現配列」は、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサーの組み合わせなどの任意の調節ヌクレオチド配列であって、該配列が操作可能に連結されているＴＬＲ３核酸配列の効率的な転写および翻訳を可能にする。例えば、遺伝子発現配列は、構成性または誘導性プロモーターなどの哺乳動物またはウイルスプロモーターであってもよい。構成性哺乳動物プロモーターは、次の遺伝子のプロモーター：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β−アクチンプロモーターおよび他の構成性プロモーターを含むがこれらに限定されない。真核細胞において構成的に機能するウイルスプロモーターの例としては、例えば、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウスモロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの末端反復配列(ＬＴＲ)、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーターが挙げられる。他の構成性プロモーターは当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターには、誘導性プロモーターも含まれる。誘導性プロモーターは誘導因子の存在下で発現される。例えば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターは、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは当業者に公知である。
【００２７】
一般に、遺伝子発現配列は、必要であれば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などのそれぞれ転写および翻訳に関与する５’−非転写および５’−非翻訳配列を含むべきである。特に、そのような５’−非転写配列は、操作可能に連結したＴＬＲ３核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。遺伝子発現配列は、必要に応じて、所望されるエンハンサー配列または上流にアクチベーター配列を含む。
【００２８】
一般に、遺伝子発現配列の影響または制御下に、核酸コーディング配列の転写および／または翻訳を配置するような方法で、核酸コーディング配列および遺伝子発現配列に共有結合させる場合、核酸コーディング配列および遺伝子発現配列は「操作可能に連結される」という。従って、遺伝子発現配列の影響または制御下にＴＬＲ３核酸コーディング配列の転写および／または翻訳を配置するような方法でＴＬＲ３核酸配列および遺伝子発現配列に共有結合させる場合、ＴＬＲ３核酸配列および遺伝子発現配列は「操作可能に連結される」という。ＴＬＲ３配列を機能的タンパク質に翻訳させることを所望する場合、５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの導入によってＴＬＲ３配列の転写が生じ、かつ２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が（１）フレームシフト変異を生じず、（２）プロモーターがＴＬＲ３配列の転写を指令する能力を妨害せず、そして（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しないならば、２つのＤＮＡ配列は連結される。従って、得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、遺伝子発現配列がＴＬＲ３核酸配列の転写を生じることができる場合、遺伝子発現配列はＴＬＲ３核酸配列に操作可能に連結される。
【００２９】
特定の実施態様において、ＴＬＲ発現ベクターは、２つの異なるＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ３および第２のＴＬＲの縦列発現を可能にするように構築される。そのような縦列発現ベクターは、単一の形質転換またはトランスフェクションを使用して２つのＴＬＲを発現することが所望される場合に使用することができる。あるいは、ＴＬＲ３発現ベクターは、第２のＴＬＲの発現を可能にするように構築された第２の発現ベクターと共同で使用することができる。
【００３０】
スクリーニングアッセイは、ＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路に基づく多くの可能な読み取りシステムのいずれかを有することができる。好適な実施態様において、スクリーニングアッセイの読み取りは、生来の遺伝子の使用、あるいは、代替的に、トランスフェクトされたかまたはそうでなければ、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ、ｐ３８、および／もしくはＥＲＫに関与するＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路に応答性である人工的に導入されたレポーター遺伝子構築物に基づく（Ｈａｅｃｋｅｒ  Ｈら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：６９７３−８２）。これらの経路は、κＢキナーゼ複合体を含むキナーゼおよびｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼを活性化する。従って、アッセイに特に有用なレポーター遺伝子およびレポーター遺伝子構築物は、例えば、ＮＦ−κＢに対して感受性のあるプロモーターに操作可能に連結されたレポーター遺伝子を含む。そのようなプロモーターの例としては、制限されないが、ＮＦ−κＢ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＴＮＦ−αのプロモータが挙げられる。ＴＬＲ感受性プロモーターに操作可能に連結されるレポーター遺伝子としては、制限されないが、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）など）、生物発光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、米国特許第５，４９１，０８４号明細書）など）、表面発現型分子（例えば、ＣＤ２５）、および分泌型分子（例えば、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＴＮＦ−α）を挙げることができる。特定の好適な実施態様において、レポーターは、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ（ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ；Ｈａｅｃｋｅｒ  Ｈら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：６９７３−８２）、ＩＬ−１２ｐ４０−ｌｕｃ（Ｍｕｒｐｈｙ  ＴＬら（１９９５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５：５２５８−６７）およびＴＮＦ−ｌｕｃ（Ｈａｅｃｋｅｒ  Ｈら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ  １８：６９７３−８２）から選択される。酵素活性の読み取りに依存するアッセイでは、アッセイの一部として基質を供給することができ、検出は、化学発光、蛍光、発色、放射性標識の取り込み、薬物耐性、または酵素活性の他のマーカーに関与することができる。分子の表面発現に依存するアッセイでは、検出は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析または機能的アッセイを使用して達成することができる。分泌型分子は、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）またはバイオアッセイを使用してアッセイすることができる。これらおよび他の適切な読み取りシステムは当該分野において周知であり、市販されている。
【００３１】
従って、機能的ＴＬＲ３を発現し、本発明の方法に有用である細胞は、いくつかの実施態様において、ＴＬＲシグナリングを検出するのに有用なレポーター構築物をコードする単離された核酸を含む発現ベクターを有する。ＴＬＲシグナリングを検出するのに有用なレポーター構築物をコードする単離された核酸を含む発現ベクターは、ＴＬＲ３シグナリングの結果として活性化されると出願人らが考える転写因子に応答性である最小プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むことができる。そのような最小プロモーターの例としては、制限されないが、次の遺伝子：ＡＰ１、ＮＦ−κＢ、ＡＴＦ２、ＩＲＦ３、およびＩＲＦ７のプロモーターが挙げられる。他の実施態様において、ＴＬＲシグナリングを検出するのに有用なレポーター構築物をコードする単離された核酸を含む発現ベクターは、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０サブユニット、１型ＩＦＮ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、およびＩＳＲＥから選択されるプロモーター応答エレメントの制御下にある遺伝子を含むことができる。プロモーター応答エレメントは、一般に、例えば、縦列反復のような複数コピーで存在する。例えば、本発明において有用なＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター構築物はストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（カタログ番号２１９０９２）より入手することが可能であり、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流のＴＡＴＡボックスに連結した５×ＩＳＲＥ縦列反復を含む。本明細書において他に考察するように、レポーター自体は、当該分野において認識される方法による検出に適切な任意の遺伝子産物であることができる。検出のためのそのような方法としては、例えば、自発性または刺激型光放出、酵素活性、可溶性分子の発現、細胞表面分子の発現などを挙げることができる。
【００３２】
上記のように、免疫刺激化合物を同定するために、機能的ＴＬＲ３を、試験化合物に接触させる。免疫刺激化合物は、免疫細胞と接触する場合に免疫応答を誘発することが可能な天然または合成の化合物である。本発明の方法について、免疫刺激化合物は、機能的ＴＬＲ３ポリペプチドを発現する免疫細胞と接触する場合に免疫応答を誘発することが可能な天然または合成の化合物を指す。好ましくは、免疫応答は、ＴＬＲ３シグナル伝達経路の活性化であるかまたは該活性化に関与する。従って、本発明の方法を使用して同定および特徴付けされる免疫刺激化合物は、特に、ＴＬＲ３リガンド、即ち、ＴＬＲ３に選択的に結合し、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を誘導する化合物を含む。免疫刺激化合物として、一般に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む核酸；オリゴペプチド；ポリペプチド；リポ多糖を含む脂質；オリゴ糖および多糖を含む炭水化物；ならびに低分子化合物が挙げられるが、これらに限定されない。従って、「試験化合物」は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む核酸；オリゴペプチド；ポリペプチド；リポ多糖を含む脂質；オリゴ糖および多糖を含む炭水化物ならびに低分子化合物を指す。試験化合物は、既知の生物活性を伴う化合物ならびに既知の生物活性を伴わない化合物を含む。
【００３３】
「参照免疫刺激化合物」は、機能的ＴＬＲポリペプチドを発現する免疫細胞と接触する場合に免疫応答を特徴的に誘発する免疫刺激化合物を指す。本発明のスクリーニング方法では、参照免疫刺激化合物は、機能的ＴＬＲ３ポリペプチドを発現する免疫細胞と接触する場合に免疫応答を特徴的に誘発する天然または合成の化合物である。好ましくは、免疫応答は、ＴＬＲ３シグナル伝達経路の活性化であるかまたは該活性化に関与する。従って、参照免疫刺激化合物は、適切な条件下で機能的ＴＬＲ３と接触する場合にＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される参照応答を特徴的に誘発する。参照応答は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って測定することができる。重要なことに、参照免疫刺激化合物は、特に、本発明の方法のいずれか１つに従う免疫刺激化合物として同定される試験化合物を含む。従って、参照免疫刺激化合物は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む核酸；オリゴペプチド；ポリペプチド；リポ多糖を含む脂質；オリゴ糖および多糖を含む炭水化物；ならびに低分子化合物であることができる。
【００３４】
低分子化合物には、約１．５ｋＤａ未満の分子量を有する天然に存在する、合成、ならびに半合成の有機および有機金属化合物が含まれる。低分子化合物の例として、ほとんどの薬物、ポリマー材料のサブユニット、ならびにそれらの類似体および誘導体が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法において使用される試験化合物および参照化合物について本明細書において使用される「核酸」は、２つ以上の個々のヌクレオシドまたはヌクレオチド単位の任意のポリマーを指すべきである。典型的に、個々のヌクレオシドまたはヌクレオチド単位は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオチド、およびリボヌクレオチドのいずれか１つまたは組み合わせを含む。核酸の個々のヌクレオチドまたはヌクレオシド単位は、天然に存在するものであってもまたは天然には存在しないものであってもよい。例えば、個々のヌクレオチド単位は、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、チミジン、およびウラシルを含むことができる。天然に存在する２’−デオキシおよび２’−ヒドロキシ形態に加えて、個々のヌクレオシドはまた、例えば、アルマンＥ（Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ）ら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４３−８４に記載されているような改変された塩基部分および／または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシドも含む。個々のヌクレオチドまたはヌクレオシド単位間の結合は、天然に存在するものであってもまたは天然には存在しないものであってもよい。例えば、結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、ならびに当該分野において既知であり、隣接するヌクレオシドまたはヌクレオチド単位に連結するのに適切なペプチド結合および他の共有結合であることができる。核酸試験化合物および核酸参照化合物は、典型的に、３〜４単位から数十の単位、例えば１８〜４０単位までのサイズの範囲である。
【００３６】
ＩＳＮＡの置換されたプリンおよびピリミジンは、シトシンなどの標準的なプリンおよびピリミジンならびにＣ−５プロピン置換塩基などの塩基類似体を含む（Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷら（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４０−４）。プリンおよびピリミジンとして、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに他の天然に存在するおよび非天然の核酸塩基、置換されたおよび置換されていない芳香性部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
試験化合物として使用することができる化合物のライブラリーは、様々な商業的供給者から入手することができ、コンビナトリアルケミストリー技術を含む当該分野において周知である技術を使用して、それらを受注生産することができる。特に、ハイスループットスクリーニング方法との組み合わせでは、そのような方法はスクリーニングの特に自動化されたマルチチャンネル方法を含み、本発明の方法に従って試験化合物の大きなライブラリーをスクリーニングすることができる。大きなライブラリーは、数百、数千、数万、数十万、および数百万もの化合物を含むことができる。
【００３８】
従って、好適な実施態様において、試験化合物をスクリーニングするための方法は、例えば、アレイに基づくアッセイシステムならびに自動化されたおよび半自動化された工程を組み入れることによって、大規模かつハイスループットにより実施することができる。例えば、アッセイは、マルチウェルプレートの形状寸法に適したマルチウェル送達デバイスを使用する系統的様式で、細胞が個々のウェルに分散され、試薬が添加されるマルチウェルプレートを使用して、設定することができる。ハイスループットスクリーニングアッセイでの使用に適した手動およびロボット化されたマルチウェル送達デバイスは、当業者に周知である。各ウェルおよびアレイ素子は、試験化合物などの特定の試験条件に対して１対１の様式で地図化することができる。読み取りもまた、好ましくは、マルチウェルプレートリーダーデバイスなどを使用して、このマルチウェルアレイにおいて実施することができる。そのようなデバイスの例は当該分野において周知であり、商業的供給源を介して入手することができる。数ダース、数百、数千、もしくは数百万ものパラレルアレイが１日または１週間で実施できるように、サンプルおよび試薬の取り扱いを自動化して、スクリーニングアッセイのスループット能力をさらに増強することができる。十分にロボット化されたシステムは、合成か棒物のコンビナトリアルライブラリーの作製および分析などのアプリケーションの分野において公知である。例えば、米国特許第５，４４３，７９１号明細書および同第５，７０８，１５８号明細書を参照のこと。
【００３９】
本明細書において使用される「ＣｐＧ核酸」または「ＣｐＧ免疫刺激核酸」は、少なくとも１つのメチル化されていないＣｐＧジヌクレオチド（シトシン−グアニンジヌクレオチド配列、即ち、「ＣｐＧ  ＤＮＡ」または５’シトシン続いて３’グアニンを含有し、リン酸結合で連結されるＤＮＡ）を含有する核酸であり、免疫系の成分を活性化する。ＣｐＧ核酸全体がメチル化されていなくてもよく、または部分がメチル化されていなくてもよいが、５’ＣＧ３’の少なくともＣはメチル化されていない状態でなければならない。
【００４０】
１つの実施態様において、ＣｐＧ核酸は、少なくとも式：
５’−Ｎ１Ｘ１ＣＧＸ２Ｎ２−３’
で表され、
式中、Ｘ１およびＸ２はヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｎ１およびＮ２は、それぞれ約０〜２５Ｎからなる核酸配列である。いくつかの実施態様において、Ｘ１はアデニン、グアニン、もしくはチミンであり、および／またはＸ２はシトシン、アデニン、またはチミンである。他の実施態様では、Ｘ１はシトシンであり、および／またはＸ２はグアニンである。
【００４１】
本発明によるＣｐＧ核酸の例として、表１に列挙される核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
【表１】
2005505284.tif 000002
【００４３】
【表２】
2005505284.tif 000003
【００４４】
【表３】
2005505284.tif 000004
【００４５】
本明細書において使用される用語「ＴＬＲシグナル伝達経路によって仲介される応答」は、ＴＬＲとＴＬＲを介してシグナリング事象を誘発する免疫刺激化合物との間の相互作用を特徴とする応答を指す。そのような応答は、典型的に、Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒシグナリング、例えば、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ、およびＩＲＡＫ分子の通常のエレメントに関与するが、ＴＬＲ３の場合、ＭｙＤ８８の役割は、他のＴＬＲファミリーのメンバーほど明確ではない。本明細書において考察されるように、そのような応答には、ＮＦ−κＢプロモーターなどの特定のプロモーターの制御下にある遺伝子の誘導、特定のサイトカインレベルの上昇、特定のケモカインレベルの上昇などが含まれる。ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にある遺伝子は、ＮＦ−κＢプロモーターを天然に含む遺伝子であってもよく、またはＮＦ−κＢプロモーターが挿入されている構築物中の遺伝子であってもよい。ＮＦ−κＢプロモーターを天然に含む遺伝子として、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ４０、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＬ−１２ｐ４０−ｌｕｃ、およびＴＮＦ−ｌｕｃが挙げられるが、これらに限定されない。サイトカインレベルの上昇は、ＴＬＲ免疫刺激化合物相互作用に対する応答におけるサイトカインの産生の増加または安定性の上昇または分泌の増加から生じ得る。Ｔｈ１サイトカインとして、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１２が挙げられるが、これらに限定されない。予想外であるが、プロモーター応答エレメントＩＳＲＥは、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を介するシグナリングの結果として、即ち、ＩＦＮ−γの産生とは独立して直接活性化されることを本発明により発見した。Ｔｈ２サイトカインとして、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において特に重要なケモカインとしては、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ９（Ｍｉｇ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、およびＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
別の態様では、本発明は、ＴＬＲ３シグナリング活性を調節する化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明の本態様に従う方法は、（ａ）参照免疫刺激化合物のみの存在下において、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される参照応答を可能にする条件下で、機能的ＴＬＲ３と試験化合物および参照免疫刺激化合物とを接触させる工程；（ｂ）ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される試験−参照応答を検出する工程；（ｃ）試験−参照応答が参照応答を超える場合、試験化合物はＴＬＲ３シグナリング活性のアゴニストであると決定する工程；ならびに（ｄ）参照応答が試験−参照応答を超える場合、試験化合物はＴＬＲ３シグナリング活性のアンタゴニストであると決定する工程を含む。試験−参照応答は、試験化合物および参照免疫刺激化合物がＴＬＲ３と同時に接触する場合に決定される試験応答のタイプを指す。試験化合物がＴＬＲ３シグナリング活性のアゴニストでもアンタゴニストでもない場合、試験−参照応答および参照応答は区別できない。
【００４７】
本明細書において使用されるアゴニストは、参照刺激に対するＴＬＲの応答の増強を引き起こす化合物である。応答の増強は、参照刺激自体に対する応答について相加的であるかまたは相乗的であり得る。さらに、アゴニストは、直接的または間接的に作用して、応答の増強を引き起こすことができる。従って、本明細書において使用されるＴＬＲ３シグナリングのアゴニストは、参照刺激に対するＴＬＲの応答の増強を引き起こす化合物である。
【００４８】
本明細書において使用されるアンタゴニストは、参照刺激に対するＴＬＲの応答の減少を引き起こす化合物である。さらに、アンタゴニストは、直接的または間接的に作用して、応答の減少を引き起こすことができる。従って、本明細書において使用されるＴＬＲ３シグナリングのアンタゴニストは、参照刺激に対するＴＬＲの応答の減少を引き起こす化合物である。
【００４９】
免疫刺激化合物、ＴＬＲ３シグナリングのアゴニスト、およびＴＬＲ３シグナリングのアンタゴニストの同定ならびに特徴付けに加えて、本発明の方法はまた、リード化合物の最適化を可能にする。リード化合物の最適化は、本発明のスクリーニング方法の反復アプリケーションに関与し、さらに、スクリーニングの任意の所定の段階またはラウンドにおいて最良の候補を選択し、次いで、スクリーニングの以後のラウンドにおけるベンチマールまたは参照として該候補に差し替える工程をさらに含む。後者のプロセスは、スクリーニングのための候補試験化合物の選択および作製において改変するためのパラメータの選択をさらに含むことができる。例えば、スクリーニングの特定のラウンド由来のリード化合物を基本として使用し、スクリーニングの以後のラウンドにおける使用のための新たな試験化合物の集束されたライブラリーを開発することができる。
【００５０】
別の態様では、本発明は、免疫刺激化合物の種特異性を同定するためのスクリーニング方法を提供する。本発明の本態様に従う方法は、（ａ）第１の種の機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる場合、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される第１の種特異的応答を測定する工程；（ｂ）第２の種の機能的ＴＬＲ３と試験化合物とを接触させる場合、ＴＬＲ３シグナル伝達経路によって仲介される第２の種特異的応答を測定する工程；および（ｃ）第１の種特異的応答と第２の種特異的応答とを比較する工程に関与する。
【００５１】
ＴＬＲ３を含む種特異的ＴＬＲはヒトに限定されないが、むしろ、ヒトまたは非ヒト供給源から誘導されるＴＬＲを含むことができる。非ヒト供給源の例としては、マウス、ラット、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、およびウマが挙げられるが、これらに限定されない。他の種として、ニワトリおよび魚、例えば、養殖種が挙げられる。
【００５２】
ＴＬＲ３を含む種特異的ＴＬＲはまた、生来のＴＬＲポリペプチドであるが、これに限定されない。特定の実施態様において、ＴＬＲは、例えば、細胞外ドメインおよび細胞質ドメインが異なる種由来のＴＬＲポリペプチドから誘導されるキメラＴＬＲであることができる。上記のようなキメラＴＬＲポリペプチドとして、例えば、ヒトＴＬＲ細胞外ドメインおよびマウスＴＬＲ細胞質ドメインを挙げることができ、各ドメインはそれぞれの種の対応するＴＬＲから誘導される。代替的実施態様において、そのようなキメラＴＬＲポリペプチドは、異なるＴＬＲスプライス変異体またはアロタイプで作製されるキメラを含むことができる。本発明のスクリーニング方法に有用な他のキメラＴＬＲポリペプチドは、第１のタイプのＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ３および第１のタイプのＴＬＲと同じかまたは別の種の別のＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９で作製されるキメラポリペプチドを含む。２つを超えるポリペプチド、例えば、異なる供給源から誘導される細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインの全てから誘導される配列を組み入れるキメラポリペプチドも考慮されるが、但し、少なくとも１つの前記ドメインはＴＬＲ３ポリペプチドから派生する。さらなる例として、１つのＴＬＲ３の細胞外ドメイン、別のＴＬＲ３の細胞内ドメイン、およびルシフェラーゼ、ＧＦＰなどの非ＴＬＲレポーターを含むような構築物も考慮される。当業者であれば、そのようなキメラＴＬＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を設計および作製する仕方を認識するであろう。
【００５３】
また、本明細書に記載の、ＴＬＲ３に基づくアッセイを含むがこれに限定されないＴＬＲに基づくスクリーニングアッセイは、試験化合物の濃度、試験化合物の安定性、検出の動力学、およびレポーターの選択などのパラメータに感受性のあることも本発明により発見した。これらのパラメータは、所定のスクリーニングアッセイからのほとんどの情報を誘導するために最適化することができる。重要なことに、検出の動力学によって、相互作用の親和性および相互作用の安定性または期間などの情報のタイプが区分けされるようである。例えば、より早期の時間ポイント、例えば、ＴＬＲと試験および／または参照化合物との間の接触の６〜８時間後に採取された測定値は、より遅い時間ポイント、例えば、接触の１６〜２４時間以上後で得られた測定値よりも相互作用の親和性についてより多くの情報に反映するようである。さらに、ＮＦ−κＢ誘導性レポーターは一般に、本発明のアッセイと同様のＴＬＲに基づくスクリーニングアッセイに有用である一方、場合により、ＮＦ−κＢ誘導性以外のレポーターはより高い感度を付与するようである。例えば、ＩＬ−８−ｌｕｃレポーターは、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃよりもＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対して有意に高い感受性を示す。従って、レポーターの選択はＴＬＲ依存性であるようである一方、動力学および濃度に関するパラメータは、より化合物依存性であるようである。従って、本発明のスクリーニング方法を実施する場合、該方法は、各試験化合物について少なくとも２つの濃度および２つの時間ポイントを使用して得られる測定値を含めることによって、増強されることが予想される。典型的に、２〜３ｌｏｇ範囲の濃度に及ぶ少なくとも３つの濃度が用いられる。もちろん、例えば、より広い初期範囲の濃度を使用して実施されたより早期のスクリーニングの結果に基づく適切な環境下で、より細密な濃度範囲を用いることもできる。
【００５４】
本発明は、以下の実施例を参考にしてより十分に理解されるであろう。しかし、これらの実施例は、本発明の特定の実施態様を例示することのみを意図するものであって、本発明の特許請求の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１．ヒトＴＬＲ３（ｈＴＬＲ３）およびマウスＴＬＲ３（ｍＴＬＲ３）の発現ベクター
ヒトＴＬＲ３の発現ベクターを作製するために、ヒト２９３細胞から作製されたｃＤＮＡから、プライマー５’−ＧＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＧＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＡＣ−３’（センス、配列番号９）および５’−ＧＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＧ−３’（アンチセンス、配列番号１０）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ヒトＴＬＲ３を増幅した。プライマーは、発現ベクターへの以後のクローニングでの使用のために、５’末端にＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入している。得られた増幅産物フラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）でクローニングし、単離し、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで切断し、ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。挿入物を完全に配列決定し、タンパク質に翻訳した。ｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＮＭ００３２６５（配列番号１）として入手可能なｈＴＬＲ３について公開されたｃＤＮＡ配列に対応する。オープンリーディングフレームは、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＰ  ００３２５６（配列番号２）に対応する配列を有する９０４アミノ酸長のタンパク質をコードする。
【００５６】
【表４】
2005505284.tif 000005
【００５７】
【表５】
2005505284.tif 000006
【００５８】
【表６】
2005505284.tif 000007
【００５９】
マウスＴＬＲ３（ｍＴＬＲ３）の対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は公知である。ｍＴＬＲ３  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＦ３５５１５２として報告されており、ｍＴＬＲ３のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＡＫ２６１１７として報告されている。
【００６０】
【表７】
2005505284.tif 000008
【００６１】
【表８】
2005505284.tif 000009
【００６２】
【表９】
2005505284.tif 000010
【００６３】
実施例２．ＩＦＮ−α４レポーターベクターの作製方法
本発明の実施では、多くのレポーターベクターを使用することができる。いくつかのレポーターベクター、例えば、ルシフェラーゼレポーターベクターｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびｐＡＰ１−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が市販されている。これらの２つのレポーターベクターは、それぞれ、ＮＦ−κＢまたはＡＰ１のゲノムＤＮＡから誘導される上流（５’）のプロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を配置する。他のレポーターベクターは、所望されるプロモーターおよびルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、および当業者に公知である他のレポーターなどの適切なレポーターを含有するベクターを使用する標準的な方法に従って、構築することができる。以下に、本発明における使用のために構築されるレポーターベクターの例をいくつか示す。
【００６４】
ＩＦＮ−α４は、即時型１型ＩＦＮである。ＩＦＮ−α４の−６２０〜＋５０プロモーター領域に対する配列特異的ＰＣＲ産物をヒト２９３細胞のゲノムＤＮＡから誘導し、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））のＳｍａＩ部位にクローニングした。得られる発現ベクターは、ＩＦＮ−α４の上流（５’）−６２０〜＋５０プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＩＦＮ−α４の−６２０〜＋５０プロモーター領域の配列は、表６において配列番号１１として提供される。
【００６５】
【表１０】
2005505284.tif 000011
【００６６】
実施例３．ＩＦＮ−α１レポーターベクターの作製方法
ＩＦＮ−α１は、後期１型ＩＦＮである。ＩＦＮ−α１の−１４０〜＋９プロモーター領域に対する配列特異的ＰＣＲ産物をヒト２９３細胞のゲノムＤＮＡから誘導し、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））のＳｍａＩ部位にクローニングした。得られる発現ベクターは、ＩＦＮ−α１の上流（５’）−１４０〜＋９プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。
実施例４．ＩＦＮ−βレポーターベクターの作製方法
ＩＦＮ−βは、即時型１型ＩＦＮである。ＩＦＮ−βの−２８０〜＋２０プロモーター領域を、ＥｃｏＲＩおよびＴａｑＩ部位での切断によって、ｐＵＣβ２６ベクター（Ａｌｇａｒｔｅ  Ｍら（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３（４）：２６９４−７０２）から誘導した。３００ｂｐ制限フラグメントをクレノウ酵素によって充填し、ＮｈｅＩ消化および充填ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。得られる発現ベクターは、ＩＦＮ−βの上流（５’）−２８０〜＋２０プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＩＦＮ−βの−２８０〜＋２０プロモーター領域の配列は、表７において配列番号１２として提供される。
【００６７】
【表１１】
2005505284.tif 000012
【００６８】
実施例５．ＲＡＮＴＥＳレポーターベクターの作製方法
ケモカインＲＡＮＴＥＳの転写は、ＩＲＦ３およびＮＦ−κＢによって少なくとも部分的に調節されると考えられている（Ｌｉｎ  Ｒら（１９９９）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９（２）：９５９−６６；Ｇｅｎｉｎ  Ｐら（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：５３５２−６１）。ＲＡＮＴＥＳの−３９７〜＋５プロモーター領域を含む４８３ｂｐ配列特異的ＰＣＲ産物をヒト２９３細胞のゲノムＤＮＡに由来し、ＰｓｔＩで切断され、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩ部位を使用してｐＣＡＴ−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした（クレノウ酵素で埋めた）。次いで、得られたＲＡＮＴＥＳ／クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポータープラスミドから、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩで切断してＲＡＮＴＥＳの−３９７〜＋５プロモーター領域を単離し、クレノウ酵素で埋め、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｈｅＩ部位にクローニングした（クレノウ酵素で埋めた）。得られる発現ベクターは、ＲＡＮＴＥＳの上流（５’）−３９７〜＋５プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。Ｇｅｎｉｎ  Ｐら（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：５３５２−６１に記載の挿入配列−３９７〜＋５と、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＢ０２３６５２（配列番号１３）とを比較したところ、新たな制限部位を作製しない２つのポイント欠失（配列番号１３の位置１０５および２７３）があることが明らかとなった。ＲＡＮＴＥＳの−３９７〜＋５プロモーター領域の配列は、表８において配列番号１４として提供される。
【００６９】
【表１２】
2005505284.tif 000013
【００７０】
【表１３】
2005505284.tif 000014
【００７１】
【表１４】
2005505284.tif 000015
【００７２】
実施例６．ヒトＩＬ−１２  ｐ４０レポーターベクターの作製方法
レポーター構築物は、ヒトＩＬ−１２ｐ４０ゲノムＤＮＡに由来する短縮型（−２５０〜＋３０）および全長（−８６０〜＋３０）プロモーター領域を使用して作製された。１つのレポーター構築物では、短縮型ＩＬ−１２ｐ４０プロモーターを、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へのＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ挿入物としてクローニングした。得られる発現ベクターは、ヒトＩＬ−１２ｐ４０の上流（５’）−２５０〜＋３０プロモーター領域の制御下にβｇａｌ遺伝子を含む。第２のレポーター構築物では、全長ＩＬ−１２ｐ４０プロモーターを、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）へのＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ挿入物としてクローニングした。得られる発現ベクターは、ヒトＩＬ−１２ｐ４０の上流（５’）−８６０〜＋３０プロモーター領域の制御下にβｇａｌ遺伝子を含む。第３のレポーター構築物では、ヒトＩＬ−１２ｐ４０の短縮型−２５０〜＋３０プロモーターを、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へクローニングした。得られる発現ベクターは、ヒトＩＬ−１２ｐ４０の上流（５’）−２５０〜＋３０プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。第４のレポーター構築物では、ヒトＩＬ−１２ｐ４０の全長ＩＬ−１２ｐ４０プロモーターを、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へクローニングした。得られる発現ベクターは、ヒトＩＬ−１２ｐ４０の上流（５’）−８６０〜＋３０プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。
実施例７．ヒトＩＬ−６レポーターベクターの作製方法
レポーター構築物は、ヒトＩＬ−６ゲノムＤＮＡに由来する−２３５〜＋７プロモーター領域を使用して作製される。１つのレポーター構築物では、ＩＬ−６領域を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へのＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ挿入物としてクローニングする。得られる発現ベクターは、ヒトＩＬ−６ゲノムＤＮＡに由来する上流（５’）−２３５〜＋７プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。
実施例８．ヒトＩＬ−８レポーターベクターの作製方法
レポーター構築物は、ヒトＩＬ−８ゲノムＤＮＡに由来する−５４６〜＋４４および短縮型−１３３〜＋４４プロモーター領域を使用して作製されている(Ｍｕｋａｉｄａ  Ｎら(１９８９)Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３：１３６６−７１)。各レポーター構築物では、ＩＬ−８プロモーター領域を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へのＫｐｎＩ−ＸｈｏＩ挿入物としてクローニングした。得られる発現ベクターの１つは、ヒトＩＬ−８ゲノムＤＮＡに由来する上流の（５’）−５４６〜＋４４プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。得られる発現ベクターのもう１つは、ヒトＩＬ−８ゲノムＤＮＡから誘導される上流（５’）−１３３〜＋４４プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含む。
実施例９．ヒトＴＬＲ３とヒトＴＬＲ９との配列比較
ヒトＴＬＲ３およびＴＬＲ９はいくらかの構造共有性を有する相同タンパク質である。両方とも細胞外ドメインおよび細胞内ドメインを有する膜貫通タンパク質であるようである。共通の特徴として、シグナル配列および膜貫通ドメインが挙げられる。ほとんどのＴＬＲに共通の類似性は、システインリッチドメインおよびＴＩＲドメインを含んでいることである。ほとんどのＴＬＲは、それらの細胞外ドメインにロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）を有する。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９は、類似の構造を有するようである。ＴＬＲ３およびＴＬＲ９のロイシン反復の規則性について以下に示す。これらの４つのＴＬＲは、構造化されていないヒンジ領域で分離することによって、２つの細胞外サブドメイン、ドメイン１およびドメイン２に分解することができる。ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９は、ドメイン１中に１４個のＬＲＲ、ドメイン２中に１２個のＬＲＲを有する。ＴＬＲ９は、既知の核酸バインダーであり、ＣｐＧ−ＤＮＡと相互作用する。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８はまた、おそらく核酸と相互作用するであろうと思われている。ＴＬＲ３はドメイン１中に１１個のＬＲＲを有し、ドメイン２中に１２個のＬＲＲを有し、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９に共通の最初の３つの反復を欠く。構造に関する配慮に基づいて、ＴＬＲ３は、核酸または類似の構造と相互作用すると仮定される。
【００７３】
ＴＬＲ３の構造は、興味深い特徴がＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９と異なる。表１３を見ると、ＴＩＲドメイン内では、ＭｙＤ８８相互作用にはプロリン（太字で示す）が必要であることが示されている。ＮＦ−κＢの活性化のためにＴＬＲ９がシグナルを伝達するには、ＭｙＤ８８が必要である。ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方はまた、このプロリンを有する。しかし、ＴＬＲ３はこの位置でアラニンを有する（これも太字で示す）。出願人らは、この差異のためにＭｙＤ８８はＴＬＲ３と相互作用することができず、従って、例えば、ＴＬＲ９と比較して、シグナル伝達パターンの変化が生じ得るものと考えている。
【００７４】
【表１５】
2005505284.tif 000016
【００７５】
【表１６】
2005505284.tif 000017
【００７６】
実施例１０．２９３線維芽細胞におけるＴＬＲ９シグナリングの再構成
マウスおよびヒトＴＬＲ９をクローニングするための方法については、係属中の米国特許出願第０９／９５４，９８７号明細書および対応する公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ／０１／２９２２９（両方とも２００１年９月１７日に出願され、それらの内容は参考として援用される）に記載されている。ｐＴ−Ａｄｖベクター（クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）製）内のヒトＴＬＲ９  ｃＤＮＡおよびマウスＴＬＲ９  ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ部位を使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）に個々にクローニングした。「機能獲得型（ｇａｉｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」アッセイを利用して、ＣｐＧ−ＤＮＡ非応答性ヒト２９３線維芽細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）におけるヒトＴＬＲ９（ｈＴＬＲ９）およびマウスＴＬＲ９（ｍＴＬＲ９）シグナリングを再構成することが可能であった。リン酸カルシウム法を使用して、上記の発現ベクターを２９３線維芽細胞にトランスフェクトした。
【００７７】
【表１７】
2005505284.tif 000018
【００７８】
【表１８】
2005505284.tif 000019
【００７９】
【表１９】
2005505284.tif 000020
【００８０】
【表２０】
2005505284.tif 000021
【００８１】
【表２１】
2005505284.tif 000022
【００８２】
【表２２】
2005505284.tif 000023
【００８３】
【表２３】
2005505284.tif 000024
【００８４】
ＮＦ−κＢ活性化はＩＬ−１／ＴＬＲシグナル伝達経路の中心であるため（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２：２５３−２５８（１９９８）；Ｍｕｚｉｏ  Ｍら（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：２０９７−１０１）、細胞にはｈＴＬＲ９でトランスフェクトするか、またはｈＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ由来ルシフェラーゼレポーター構築物で同時トランスフェクトした。ヒト２９３線維芽細胞を、（図１Ａ）ｈＴＬＲ９および６倍ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポータープラスミド（ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｂａｓｕｅｒｌｅ、独国、ミュンヘンより贈呈された）または（図１Ｂ）ｈＴＬＲ９単独で一過的にトランスフェクトした。ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６、２μＭ、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ、配列番号１５）、ＧｐＣ−ＯＤＮ（２００６−ＧＣ、２μＭ、ＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴ、配列番号１６）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）または培地による刺激後、ルシフェラーゼ読み取りによるＮＦ−κＢ活性化（８時間、図１Ａ）またはＥＬＩＳＡによるＩＬ−８産生（４８時間、図１Ｂ）を監視した。結果は、３つの独立した実験を代表する。図１は、ｈＴＬＲ９を発現する細胞がＣｐＧ−ＤＮＡに応答したが、ＬＰＳには応答しなかったことを示す。
【００８５】
図２は、ｍＴＬＲ９のトランスフェクションに対する同じ原理を実証する。ヒト２９３線維芽細胞をｍＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ｌｕｃ構築物で一過的にトランスフェクトした（図２）。ＩＬ−８産生についても同様のデータが得られた（示さず）。従って、２９３細胞においてＴＬＲ９（ヒトまたはマウス）を発現させると、ＬＰＳ応答のｈＴＬＲ４再構成に類似のＣｐＧ−ＤＮＡ刺激に対し機能の獲得が生じる。
【００８６】
ヒトＴＬＲ９、マウスＴＬＲ９、またはＮＦ−κＢ−ｌｕｃレポータープラスミドを伴ういずれかのＴＬＲ９を発現する安定なクローンを作製するために、１０ｃｍプレート中、１６μｇのＤＮＡで２９３細胞をトランスフェクトし、０．７ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、独国、Ｃｏｌｂｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で選択した。例えば、図３に示すように、ＲＴ−ＰＣＲによって、クローンをＴＬＲ９発現について試験した。ＯＤＮによる刺激後、ＩＬ−８産生またはＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性についてもクローンをスクリーニングした。４つの異なるタイプのクローンを作製した。
２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃ：ヒトＴＬＲ９および６倍ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーターを発現する
２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃ：マウスＴＬＲ９および６倍ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーターを発現する
２９３−ｈＴＬＲ９：ヒトＴＬＲ９を発現する
２９３−ｍＴＬＲ９：マウスＴＬＲ９を発現する
図４は、ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６、２μＭ）、ＧｐＣ−ＯＤＮ（２００６−ＧＣ、２μＭ）、Ｍｅ−ＣｐＧ−ＯＤＮ（２００６メチル化、２μＭ；ＴＺＧＴＺＧＴＴＴＴＧＴＺＧＴＴＴＴＧＴＺＧＴＴ、Ｚ＝５−メチルシチジン、配列番号１７）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）または培地による刺激後に、ＮＦ−κＢ活性化を監視することによって測定した安定な２９３−ｈＴＬＲ９−ｌｕｃクローンを実証する。安定なクローン２９３−ｈＴＬＲ９によるＩＬ−８産生を利用しても同様の結果が得られた。２９３−ｍＴＬＲ９−ｌｕｃはまた、ＣｐＧ−ＯＤＮ（１６６８、２μＭ；ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、配列番号１８）、ＧｐＣ−ＯＤＮ（１６６８−ＧＣ、２μＭ；ＴＣＣＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、配列番号１９）、Ｍｅ−ＣｐＧ−ＯＤＮ（１６６８メチル化、２μＭ；ＴＣＣＡＴＧＡＺＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ、Ｚ＝５−メチルシチジン、配列番号２０）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）または培地によっても刺激し、ＮＦ−κＢ活性化を監視することによって測定した（図５）。安定なクローン２９３−ｍＴＬＲ９によるＩＬ−８産生を利用しても同様の結果が得られた。結果は、少なくとも２つの独立した実験を代表する。これらの結果は、ＣｐＧ−ＤＮＡ非応答性細胞株が安定に遺伝的にＴＬＲ９で補完され、モチーフ特異的様式でＣｐＧ−ＤＮＡに対し応答性になり得ることを実証する。これらの細胞は、複数の種においてＴＬＲ９により誘導される自然免疫に対する最適リガンドのスクリーニングのために使用することができる。
実施例１１．２９３線維芽細胞におけるＴＬＲ３シグナリングの再構成
ｐＴ−Ａｄｖベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製）内のヒトＴＬＲ３  ｃＤＮＡおよびマウスＴＬＲ３  ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ部位を使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）に個々にクローニングした。リン酸カルシウム法を使用して、上記の得られた発現ベクターを、ＣｐＧ−ＤＮＡ非応答性ヒト２９３線維芽細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３）にトランスフェクトした。「機能獲得型」アッセイを利用して、ヒト２９３線維芽細胞におけるヒトＴＬＲ３（ｈＴＬＲ３）およびマウスＴＬＲ３（ｍＴＬＲ３）シグナリングを再構成することが可能であった。
【００８７】
ＮＦ−κＢ活性化はＩＬ−１／ＴＬＲシグナル伝達経路の中心であるため（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２：２５３−８；Ｍｕｚｉｏ  Ｍら（１９９８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７：２０９７−１０１）、第１の組の実験では、ヒト２９３線維芽細胞をｈＴＬＲ３のみでトランスフェクトするか、またはｈＴＬＲ３およびＮＦ−κＢ由来ルシフェラーゼレポーター構築物で同時トランスフェクトした。
【００８８】
同様に、第２の組の実験では、２９３線維芽細胞をｈＴＬＲ３のみでトランスフェクトするか、またはｈＴＬＲ３およびＩＦＮ−α４誘導性ルシフェラーゼレポーター構築物で同時トランスフェクトした（上記の実施例２に記載）。
【００８９】
第３のグループの実験では、２９３線維芽細胞をｈＴＬＲ３のみでトランスフェクトするか、またはｈＴＬＲ３およびＲＡＮＴＥＳ誘導性ルシフェラーゼレポーター構築物で同時トランスフェクトした（上記の実施例５に記載）。
実施例１２．ヒトおよびマウスＴＬＲ９のＴＩＲドメインにおけるプロリンからヒスチジンへの変異Ｐ９１５ＨによるＴＬＲ９シグナリングの変化
Ｔｏｌｌ様受容体は、アダプター分子ＭｙＤ８８の結合後にシグナリングを開始する細胞質Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）相同ドメインを有する（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら（１９９８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２：２５３−８；Ｋｏｐｐ  ＥＢら（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：１５−８）。他者による報告は、マウスＴＬＲ４（Ｐｒｏ７１２からＨｉｓ、Ｐ７１２Ｈ）またはヒトＴＬＲ２（Ｐｒｏ６８１からＨｉｓ、Ｐ６８１Ｈ）におけるシグナリングＴＩＲドメインの単一点突然変異は、それぞれリポ多糖またはグラム陽性細菌に対する宿主免疫応答を廃止することを示している（Ｐｏｌｔｏｒａｋ  Ａら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２０８５−８；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  ＤＭら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：８１１−５）。部位特異的突然変異を介して、ヒトＴＬＲ９およびマウスＴＬＲ９の位置９１５での等価なプロリン（Ｐ）をヒスチジン（Ｈ；Ｐ９１５Ｈ）に変異させた。これらの突然変異は、ヒトＴＬＲ９に対するプライマー５’−ＧＣＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＣＴＴＴＧ−３’（配列番号２１）および５’−ＣＡＡＡＧＡＧＧＧＴＴＴＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＧＣ−３’（配列番号２２）ならびにマウスＴＬＲ９に対するプライマー５’−ＣＧＡＧＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＡＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号２３）および５’−ＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＣＣＡＡＴＣＴＣＧ−３’ （配列番号２４）を使用することによって作製した。変異ＴＬＲ９、ｈＴＬＲ９−Ｐ９１５ＨおよびｍＴＬＲ９−Ｐ９１５Ｈの発現ベクターを構築し、標準的組換えＤＮＡ技術を使用して確認した。
【００９０】
ヒトＴＬＲ９変異体、ｈＴＬＲ９−Ｐ９１５Ｈの刺激では、２９３細胞をｈＴＬＲ９またはｈＴＬＲ９−Ｐ９１５Ｈの発現ベクターで一過的にトランスフェクトし、１６時間後に、ＯＤＮ２００６またはＯＤＮ１６６８により様々な濃度で刺激した。同様に、マウスＴＬＲ９変異体、ｍＴＬＲ９−Ｐ９１５Ｈの刺激では、２９３細胞をｍＴＬＲ９またはｍＴＬＲ９−Ｐ９１５Ｈの発現ベクターで一過的にトランスフェクトし、１６時間後に、ＯＤＮ２００６またはＯＤＮ１６６８により様々な濃度で刺激した。刺激の４８時間後、上清を回収し、ＩＬ−８産生をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、ＴＬＲ９活性が、ヒトおよびマウスＴＬＲ９の両方のＴＩＲドメインのＰ９１５Ｈ突然変異により破壊され得ることを実証した。
実施例１３．ヒトＴＬＲ３およびヒトＴＬＲ９間（ｈＴＬＲ３−ｈＴＬＲ９およびｈＴＬＲ９−ｈＴＬＲ３）のＴＩＲドメインの交換
ＴＬＲ３およびＴＬＲ９は多くの構造的特徴を共有する一方、ＴＬＲ３は、ＴＩＲドメインに極めて重要な位置でプロリンではなくアラニンを有するため、ＴＬＲ９が行うようなＭｙＤ８８を介するシグナル伝達をすることができない。ここで記載されているキメラＴＬＲは、本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。ヒト細胞外ＴＬＲ３およびヒトＴＬＲ（ｈＴＬＲ３−ＴＩＲ９）のＴＩＲドメインからなる分子を作製するために、以下のアプローチを使用することができる。部位特異的突然変異誘発を介して、ヒトＴＬＲ３およびヒトＴＬＲ９にＣｌａＩ制限部位が導入される。ヒトＴＬＲ９では、ＤＮＡ配列５’−ＧＧＣＣＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴ−３’（３０２６〜３０４０、配列番号２５）を５’−ＧＧＣＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴ−３’（配列番号２６）に変異させ、ＣｌａＩ部位を導入する（配列の下線部分）が、アミノ酸配列（ＧＬＳＩＦ、アミノ酸７９８〜８０２）は未変化のままにする。ヒトＴＬＲ３では、ＤＮＡ配列５’−ＧＧＧＴＴＣＣＣＡＧＴＧＡＧＡ−３’（２１１２〜２１２６、配列番号２７）を５’−ＧＧＧＴＴＡＴＣＧＡＴＴＡＧＡ−３’（配列番号２８）に変異させ、ＣｌａＩ部位を導入し、野生型ヒトＴＬＲ３配列（ＧＦＰＶＲ、アミノ酸６８５〜６８９）由来の３つの位置（アミノ酸６８６、６８７、６８８）が異なるアミノ酸配列（ＧＬＳＩＲ、アミノ酸６８５〜６８９）を作製する。
【００９１】
ｈＴＬＲ３−ＴＩＲ９。ヒトＴＬＲ９のためのプライマーは、５’−ＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号２９）および５’−ＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＴＡＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧ−３’（配列番号３０）である。ヒトＴＬＲ９のＴＩＲドメインに接続したヒトＴＬＲ３の細胞外部分を含有する発現ベクターを作製するためには、ヒトＴＬＲ３発現ベクターをＣｌａＩで切断し、制限量のＥｃｏＲＩならびにヒトＴＬＲ９発現ベクターのＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって作製されるヒトＴＬＲ９のＴＩＲドメインをコードするフラグメントを、ｈＴＬＲ３の細胞外部分を含有するベクターフラグメント内で連結させる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へのトランスフェクションにより、発現ベクターｈＴＬＲ３−ＴＩＲ９（ヒト細胞外ＴＬＲ３−ヒトＴＬＲ９  ＴＩＲドメイン）が得られる。ｈＴＬＲ３−ＴＩＲ９の発現産物は、ＴＬＲ３リガンドと相互作用することができ、また、ＭｙＤ８８仲介性シグナル伝達経路を介してシグナル伝達することもできる。
【００９２】
ｈＴＬＲ９−ＴＩＲ３。アナログ戦略を使用して、ｈＴＬＲ９の細胞外ドメインとｈＴＬＲ３のＴＩＲドメインとの融合構築物を調製する。ヒトＴＬＲ３のＴＩＲドメインに接続されたヒトＴＬＲ９の細胞外部分を含有する発現ベクターを構築するために、ヒトＴＬＲ９発現ベクターをＣｌａＩで切断し、制限量のＥｃｏＲＩならびにヒトＴＬＲ３発現ベクターのＣｌａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって作製されるヒトＴＬＲ３のＴＩＲドメインをコードするフラグメントを、ｈＴＬＲ９の細胞外部分を含有するベクターフラグメント内で連結させる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）へのトランスフェクションにより、発現ベクターｈＴＬＲ９−ＴＩＲ３（ヒト細胞外ＴＬＲ９−ヒトＴＬＲ３  ＴＩＲドメイン）が得られる。ｈＴＬＲ９−ＴＩＲ３の発現産物は、ＴＬＲ９リガンド、例えば、ＣｐＧ  ＤＮＡと相互作用することができ、ＴＬＲ３と同様の様式でシグナル伝達経路を介してシグナル伝達することができる。
実施例１４．ＴＬＲに対するリガンド親和性の差異を検出するための高感度ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
マウスＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトしたヒト２９３線維芽細胞を、以下の十分にホスホロチオエート化したオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）で１６時間刺激した。
【００９３】
【表２４】
2005505284.tif 000025
【００９４】
刺激物の濃度は、１０μＭ〜２ｎＭの間で滴定された。図６に、非刺激バックグラウンドと比較したＯＤＮ濃度に対するＮＦ−κＢルシフェラーゼの誘導倍数のデータをプロットする。データは、ＥＣ５０または最大活性を決定することができる典型的な１次結合を示す。ＥＣ５０は、５０％の最大活性化を生じるリガンド刺激物の濃度として定義される。図に示されるように、ＥＣ５０はＯＤＮ５８９０の４２ｎＭ〜ＯＤＮ５８９７の１２２０ｎＭの範囲である。アッセイは、リガンドの微細な変化を高感度で識別することを実証する。
実施例１５．ＴＬＲスクリーニングアッセイに対するアッセイ動力学の影響
前記実施例１４と同様にして以下のＯＤＮリガンドで曲線を調製した。ここで、＊は、ホスホロチオエートを示し、 はホスホジエステル結合を示す。
【００９５】
【表２５】
2005505284.tif 000026
【００９６】
１〜２４時間の様々な時間のアッセイインキュベーションで刺激曲線のファミリーを決定した。各時間ポイントでの各リガンドのＥＣ５０を決定した。次いで、時間に対してＥＣ５０をプロットし、図７に示すような結果曲線を得た。
【００９７】
図７から明らかなように、活性の動力学は、試験したリガンドに依存して変動することが実証される。ルシフェラーゼは３時間の半減期を有するため、シグナルは一過的であり、一定のプロモーター誘導性活性を維持する必要がある。維持することは、リガンド／レセプター複合体によって送達されるシグナルに直接関連する。従って、前記方式での時間動力学を分析することにより、リガンド／レセプター相互作用の親和性および経時的に見たレセプターに対するリガンドのアベイラビリティの両方を決定することができる。ＯＤＮ５８９０は、ＯＤＮ２００６と比較してより高い親和性を有する。より不安定なジエステル結合を組み入れることによって、破壊されやすいリガンドを作製する場合、活性曲線は、ＯＤＮ５７４６、５９０２および５４９７などのように時間の経過と共に上昇する。
【００９８】
ＴＬＲ／リガンド相互作用に対するスクリーニングアッセイでは、アッセイを１つの時間ポイントに限ると、アッセイに偏りが生じる。２４時間目では、ＯＤＮ２００６および５８９０のみがリガンド候補であるように思われるが、しかし、これは明らかに事実と異なる。アッセイはまた、より早い時間ポイント（本実施例では６時間）がレセプター／リガンド親和性間の最も大きな差異を決定する最適な時間ポイントであることを実証する。スクリーニングアッセイの最適化は、スクリーニングから得られるべき所望される情報、例えば、相互作用のより高い親和性対レセプター／リガンド相互作用の安定性および期間に依存して調整することができる。
【００９９】
図８は、本実施例におけるように、マウスＴＬＲで示されるのと同じ原理が、利用したＴＬＲにかかわらず適用することができることを実証する。この組のデータについては、ヒトＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼで安定にトランスフェクトした２９３細胞を使用した。
実施例１６．ＴＬＲスクリーニングアッセイでの最大活性に対するアッセイ動力学の影響
前記実施例１５と同様にしてデータを回収したが、図９および１０では時間に対して最大活性（最大誘導倍数）をプロットした。そのようなデータ分析により、生物学的有効性が予測される。これらの図からも見ることができるように、親和性の低い方のＯＤＮ、例えば、実施例１５のＥＣ５０曲線から実証されるＯＤＮ２００６および５８９０は、高い活性を送達する時点で明らかに効率が低い。
実施例１７．プロモーターの利用に依存するＴＬＲスクリーニングアッセイの異なる結果
ヒト２９３線維芽細胞を、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ならびにルシフェラーゼ遺伝子を誘導する次のプロモーターを有する次のレポーター構築物：ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＰ−１０−ｌｕｃ、ＲＡＮＴＥＳ−ｌｕｃ、ＩＳＲＥ−ｌｕｃ、およびＩＬ−８−ｌｕｃで一過的にトランスフェクトした。最大活性濃度の特定のリガンドで、細胞を１６時間刺激した。ＴＬＲ９をＣｐＧ  ＯＤＮ２００６で刺激し；ＴＬＲ８およびＴＬＲ７をイミダゾールキナロン（ｉｍｉｄａｚｏｌｑｕｉｎａｌｏｎｅ）Ｒ８４８で刺激した。結果を図１１に示す。図から明らかなように、使用したプロモーターは、問題のＴＬＲに依存して、スクリーニングアッセイの結果に影響する。例えば、ＮＦ−κＢは、試験した全てのＴＬＲに信頼できるマーカーである一方、この組の実験では、ＩＳＲＥは、ＴＬＲ８に対してある程度までしか機能的ではなかった。ＩＬ−８プロモーターは、ＴＬＲ７またはＴＬＲ８スクリーニングアッセイに特に感受性があるが、ＴＬＲ９アッセイではそれほど効率的ではない。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ＣｐＧ−ＯＤＮ、ＧｐＣ−ＯＤＮ、ＬＰＳ、および培地を含む様々な刺激への暴露に対する応答においてヒトＴＬＲ９をトランスフェクトした２９３線維芽細胞から産生される（Ａ）ＮＦ−κＢの誘導ならびに(Ｂ)ＩＬ−８の産生量を示す２つの棒グラフを表す。
【図２】ＣｐＧ−ＯＤＮ、メチル化されたＣｐＧ−ＯＤＮ（Ｍｅ−ＣｐＧ−ＯＤＮ）、ＧｐＣ−ＯＤＮ、ＬＰＳ、および培地を含む様々な刺激への暴露に対する応答において、マウスＴＬＲ９をトランスフェクトした２９３線維芽細胞から産生されるＮＦ−κＢの誘導を示す棒グラフを表す。
【図３】トランスフェクトされていないコントロール２９３細胞、ｍＴＬＲ９をトランスフェクトした２９３細胞（２９３−ｍＴＬＲ９）、ならびにｈＴＬＲ９をトランスフェクトした２９３細胞（２９３−ｈＴＬＲ９）におけるマウスＴＬＲ９（ｍＴＬＲ９）、ヒトＴＬＲ９（ｈＴＬＲ９）、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対する逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイの結果を示す一連のゲル画像を現す。
【図４】安定にトランスフェクトされた２９３−ｈＴＬＲ９細胞における様々な刺激によるＮＦ−κＢ−ｌｕｃの誘導の程度を示すグラフを表す。
【図５】安定にトランスフェクトされた２９３−ｍＴＬＲ９細胞における様々な刺激によるＮＦ−κＢ−ｌｕｃの誘導の程度を示すグラフを表す。
【図６】マウスＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ｌｕｃを安定にトランスフェクトしたヒト２９３線維芽細胞と接触させた、一連の４つの関連する免疫刺激核酸について、濃度の関数としての応答の誘導の程度を示すグラフを表す。列挙した濃度は、それぞれのリガンドに対するＥＣ５０に対応する。
【図７】マウスＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ｌｕｃを安定にトランスフェクトしたヒト２９３線維芽細胞と接触させた、一連の５つの免疫刺激核酸に対するＥＣ５０決定値の動力学を示すグラフを表す。
【図８】ヒトＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ｌｕｃを安定にトランスフェクトしたヒト２９３線維芽細胞と接触させた、図７に掲載されたものと同じ一連の５つの免疫刺激核酸に対する、ＥＣ５０決定値の動力学を示すグラフを表す。
【図９】マウスＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ｌｕｃを安定にトランスフェクトしたヒト２９３線維芽細胞と接触させた、図７に掲載されたものと同じ一連の５つの免疫刺激核酸に対する、最大活性（応答の誘導）の動力学を示すグラフを表す。
【図１０】ヒトＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ｌｕｃを安定にトランスフェクトしたヒト２９３線維芽細胞と接触させた、図７に掲載されたものと同じ一連の５つの免疫刺激核酸に対する最大活性（応答の誘導）の動力学を示すグラフを表す。
【図１１】ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ならびにＴＬＲ９（各ＴＬＲは特定の参照ＴＬＲリガンドと接触させた）との組み合わせで、様々なルシフェラーゼレポーター構築物（ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ、ＩＰ−１０−ｌｕｃ、ＲＡＮＴＥＳ−ｌｕｃ、ＩＳＲＥ−ｌｕｃ、およびＩＬ−８−ｌｕｃ）を使用して測定した応答の誘導を示す棒グラフを表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505284.tif 000143
【国際調査報告】
2005505284.tif 000144
2005505284.tif 000145
2005505284.tif 000146
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