(57)【要約】ラセミのＮ−アシル化β−アミノカルボン酸から生体触媒として加水分解酵素の存在でＮ−アシル化β−アミノカルボン酸のエナンチオ選択的加水分解により光学的活性β−アミノカルボン酸を製造する方法が記載され、その際、Ｎ−アシル化β−アミノカルボン酸のＮ−アシル置換基（Ｉ）が構造式Ｉ（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ互いに独立にＨ、ハロゲン、アルキル基、ＯＨ、アルコキシ基およびアリールオキシ基から選択され、Ｒ３はハロゲン、アルコキシ基およびアリールオキシ基から選択される）、（ＩＩ）構造式ＩＩＡまたはＩＩＢまたは相当する塩の構造式、または（ＩＩＩ）構造式ＩＩＩまたは相当する塩の構造式で示される。
2005520552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラセミのＮ−アシル化β−アミノカルボン酸から生体触媒として加水分解酵素の存在でＮ−アシル化β−アミノカルボン酸のエナンチオ選択的加水分解により光学的活性β−アミノカルボン酸を製造する方法において、前記Ｎ−アシル化β−アミノカルボン酸のＮ−アシル置換基が（Ｉ）構造式Ｉ：
【化１】
2005520552.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ互いに独立にＨ、ハロゲン、アルキル基、ＯＨ、アルコキシ基およびアリールオキシ基から選択され、
Ｒ３はハロゲン、アルコキシ基およびアリールオキシ基から選択される）、
（ＩＩ）構造式ＩＩＡまたはＩＩＢ：
【化２】
2005520552.tif 000009
または相当する塩の構造式、または
（ＩＩＩ）構造式ＩＩＩ：
【化３】
2005520552.tif 000010
または相当する塩の構造式で示されることを特徴とする光学的活性β−アミノカルボン酸を製造する方法。
【請求項２】
Ｎのアシル化β−アミノカルボン酸のＮ−アシル置換基が構造式Ｉを示し、式中、Ｒ１、Ｒ２がそれぞれ互いに独立にＨ、塩素、臭素、フッ素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、メトキシおよびエトキシから選択され、Ｒ３が塩素およびメトキシから選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２がそれぞれＨであり、Ｒ３が塩素である請求項２記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１がＨに等しく、Ｒ２およびＲ３がそれぞれ塩素である請求項２記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２がそれぞれＨであり、Ｒ３がメトキシである請求項２記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がそれぞれフッ素である請求項１記載の方法。
【請求項７】
Ｎ−アシル化β−アミノカルボン酸が構造式ＩＶ：
【化４】
2005520552.tif 000011
（式中、Ｎ−アシル置換基は請求項１に記載されたものを表し、Ｒ４はＨ、アルキル基、ＯＨ、アルコキシ基およびハロゲンから選択される）を有する芳香族Ｎ−アシル化β−アミノカルボン酸である請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
Ｎ−アシル置換基が請求項１の構造式Ｉを示し、式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれＨであり、Ｒ３は塩素であり、Ｒ４はＨに等しい請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｎ−アシル化β−アミノカルボン酸が以下の構造式Ｖ：
【化５】
2005520552.tif 000012
（式中、Ｒ５はアルキル基を表す）の脂肪族Ｎ−アシル化β−アミノカルボン酸である請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
加水分解酵素がアシラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたはエステラーゼである請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
アシラーゼがタイプＩのブタ腎臓アシラーゼである請求項９記載の方法。
【請求項１２】
加水分解酵素がアスペルギルスに由来するプロテアーゼである請求項９記載の方法。
【請求項１３】
プロテアーゼがアスペルギルスオリザエに由来する請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は光学的活性β−アミノカルボン酸の製造方法に関する。
【０００２】
光学的活性β−アミノカルボン酸はアルカロイドおよび抗生物質のような天然の物質で存在し、その単離は特に薬剤の製造に基本的な中間生成物として重要性が増加することによりますます注目されている（特にＥ.Ｊｕａｒｉｓｔｉ、Ｈ.Ｌｏｐｅｚ−Ｒｕｉｚ、Ｃｕｒｒ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.１９９９、６，９８３−１００４参照）。光学活性β−アミノカルボン酸の遊離した形およびその誘導体は興味深い薬理作用を示し、修飾ペプチドの合成に使用できる。
【０００３】
現在までジアステレオマー塩によるラセミ化合物の古典的分割法（Ｈ.Ｂｏｅｓｃｈ等、Ｏｒｇ.Ｐｒｏｃ.Ｒｅｓ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍ.２００１、５、２３−２７で提案された方法）および特にリチウムフェニルエチルアミドのジアステレオ選択的添加（Ａ.Ｆ.Ａｂｄｅｌ−Ｍａｇｉｄ、Ｊ.Ｈ.Ｃｏｈｅｎ、Ｃ.Ａ.Ｍａｒｙａｎｏｆｆ、Ｃｕｒｒ.Ｍｅｄ.Ｃｈｅｍ.１９９９、６，９５５−９７０）がβ−アミノカルボン酸を製造する方法として定着している。後者の方法は集中的に研究されたとみなされ、製造中に生じる多くの欠点にもかかわらず有利に採用されている。一方で化学量論の量のキラル試薬が要求され、これが接触不斉法に比べて大きい欠点である。更に脱プロトン化により化学量論の試薬を活性化するために、例えばｎ−ブチルリチウムのような高価な、更に有毒な助剤を必要とする。十分な立体選択性のために、更に約−７０℃の低い温度での反応の実施が重要であり、これが反応器の材料の高い需要、付加的な費用およびエネルギーの高い消費を示す。
【０００４】
生体触媒による光学的活性β−アミノカルボン酸の製造が現在副次的役割しか果たしていないにもかかわらず、特に生体触媒反応の経済的および生態的利点の理由により好ましい。化学量論の量のキラル試薬の使用を省いてその代わりに天然の環境にやさしい触媒を構成する少ない触媒量の酵素を使用する。更に水性媒体中で効果的に使用されるこれらの生体触媒はその触媒特性および高い有効性のほかに多くの合成の金属を含む触媒と異なり、金属を含む供給材料、特に重金属を含み、それゆえ有毒である供給材料の使用を省くことができる利点を示す。
【０００５】
技術水準では例えばβ−アミノカルボン酸のエナンチオ選択的Ｎ−アシル化に関する多くの記載がすでに存在する。
【０００６】
例えばＬ．Ｔ．Ｋａｎｅｒｖａ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、Ｖｏｌ.７．Ｎｏ６、１７０７〜１７１６、１９９６は有機溶剤およびＣａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａに由来するリパーゼＳＰ５２６またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａに由来するリパーゼＰＳ中での生体触媒による２，２，２−トリフルオロエチルエステルを用いる種々の環状脂肪族β−アミノカルボン酸のエチルエステルのエナンチオ選択的Ｎ−アシル化を記載する。
【０００７】
Ｖ.Ｍ.Ｓａｎｃｈｅｚ等はＮ−アセチル化β−アミノカルボン酸エステルの製造によるＣａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａに由来するリパーゼを用いる（±）−エチル−３−アミノブチラートのラセミ化合物の生体触媒による分割を研究した（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、Ｖｏｌ.８，Ｎｏ.１、３７−４０）。
【０００８】
欧州特許（ＥＰ−Ａ）０８９０６４９号にはアミダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼおよびリパーゼからなる群から選択される加水分解酵素の存在でのカルボン酸エステルを用いるエナンチオ選択的アシル化および引き続くアミノエステルの未反応エナンチオマーの単離によるラセミのアミノエステルからの光学的活性アミノエステルの製造方法が開示されている。
【０００９】
ＷＯ９８／５０５７５号はラセミのβ−アミノカルボン酸のエナンチオマーを立体選択的にアシル化させ、他のエナンチオマーを実質的に反応させない条件下でラセミのβ−アミノカルボン酸、アシル供与体およびペニシリンＧアシラーゼを接触させ、これによりキラルβ−アミノカルボン酸を取得することによりキラルβ−アミノカルボン酸またはその相当するエステルを取得する方法に関する。
【００１０】
α−アミノカルボン酸の場合に工業的にすでに実現される生体触媒技術をβ−アミノカルボン酸に適用することが特に好ましい。加水分解酵素、特にアシラーゼを使用する酵素による脱アセチル化によるＮ−アセチル基で置換されたラセミのＮ−アセチル−α−アミノカルボン酸または相当する誘導体のラセミ化合物の分割が特に興味深い。ラセミ出発化合物は酢酸誘導体を用いて容易に製造することができ、更にその合成はその場で可能であり、付加的な単離工程なしにＮ−アセチル化生成物を直接生体触媒反応に使用することができる。アセチル化反応の収率は定量的な範囲で存在し、出発化合物、例えばクロロ酢酸、メトキシ酢酸または無水酢酸は大量に使用できる廉価な化学物質である。他のアシル誘導体と比較したこれらのアセチル誘導体の他の利点は反応後に酢酸（またはその置換された誘導体）からＮ−アセチルアミノカルボン酸を容易に分離できることである。
【００１１】
しかし現在までβ−アミノカルボン酸に関するこの構想の適用は成功していない。不幸にも加水分解酵素、特にアシラーゼがこの種の反応に適していると思われないことが判明した。Ｈ．Ｋ．Ｃｈｅｎａｕｌｔ、Ｊ.Ｄａｈｍｅｒ、Ｇ.Ｍ.Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ.１９８９、１１１、６３５４−６３６４は非環状または環状Ｎ−アシル−β−アミノカルボン酸が基質として適していないことを確定した。非環状化合物に関してＮ−アセチル化合物を研究した。この結果は他の加水分解酵素、特にアシラーゼを使用する発明者自身の試験により確認された。
【００１２】
現在までペニシリンアシラーゼを使用するラセミのＮ−フェニルアセチル−βアミノカルボン酸のエナンチオ選択的加水分解のみが記載されている。（Ｖ.Ａ.Ｓｏｌｏｓｈｏｎｏｋ、Ｖ.Ｋ.Ｓｖｅｄａｓ、Ｖ.Ｐ.Ｋｕｋｈａｒ、Ａ.Ｇ.Ｋｉｒｉｌｅｎｋｏ、Ａ.Ｖ.Ｒｙｂａｋｏｖａ、Ｖ.Ａ.Ｓｏｌｏｄｅｎｋｏ、Ｎ.Ａ.Ｆｏｋｉｎａ、Ｏ．Ｖ.Ｋｏｇｕｔ、Ｉ.Ｙ.Ｇａｌａｅｖ、Ｅ.Ｖ.Ｋｏｚｌｏｖａ、Ｉ.Ｐ.Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ、Ｓ.Ｖ.Ｇａｌｕｓｈｋｏ、Ｓｙｎｌｅｔｔ１９９３、３３９−３４１、Ｖ.Ｓｏｌｏｓｈｏｎｏｋ、Ａ.Ｇ.Ｋｉｒｉｌｅｎｋｏ、Ｎ.Ａ.Ｆｏｋｉｎａ、Ｉ.Ｐ.Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ、Ｓ.Ｖ.Ｇａｌｕｓｈｋｏ、Ｖ.Ｐ．Ｋｕｋｈａｒ、Ｖ.Ｋ.Ｓｖｅｄａｓ、Ｅ.Ｖ.Ｋｏｚｌｏｖａ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ１９９４、５、１１１９−１１２６、Ｖ.Ｓｏｌｏｓｈｏｎｏｋ、Ｎ.Ａ.Ｆｏｋｉｎａ、Ａ.Ｖ.Ｒｙｂａｋｏｖａ、Ｉ.Ｐ.Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ、Ｓ.Ｖ.Ｇａｌｕｓｈｋｏ、Ａ.Ｅ.Ｓｏｃｈｏｒｉｎｓｋｙ、Ｖ．Ｐ．Ｋｕｋｈａｒ、Ｍ.Ｖ.Ｓａｖｃｈｅｎｋｏ、Ｖ.Ｋ.Ｓｖｅｄａｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ１９９５、６，１６０１−１６１０、Ｇ.Ｇａｒｄｉｌｌｏ、Ａ.Ｔｏｌｏｍｅｌｌｉ、Ｃ.Ｔｏｍａｓｉｎｉ、Ｅｕｒ.Ｊ.Ｏｒｇ.Ｃｈｅｍ.１９９９、１５５−１６１）。この方法を使用する欠点はエナンチオ選択的加水分解の後の生成物混合物の困難な再処理である。遊離β−アミノカルボン酸の分離後にフェニル酢酸およびＮ−フェニルアセチル−β−アミノカルボン酸からなる混合物が得られるが、分解が困難である。
【００１３】
本発明の基礎となる課題は、光学的活性β−アミノカルボン酸を製造する、新しい、簡単にかつ経済的に実施できる方法を実現することである。
【００１４】
意想外にも、前記課題は、ラセミのＮ−アシル化β−アミノカルボン酸から生体触媒として加水分解酵素の存在でＮ−アシル化β−アミノカルボン酸のエナンチオ選択的加水分解により光学的活性β−アミノカルボン酸を製造する方法により解決され、その際、前記Ｎ−アシル化β−アミノカルボン酸のＮ−アシル置換基が、（Ｉ）構造式Ｉ：
【００１５】
【化１】
2005520552.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ互いに独立にＨ、ハロゲン、有利に塩素、臭素およびフッ素、有利に１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基、特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルおよびｔ−ブチル、ＯＨ、有利に１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシ基、特にメトキシおよびエトキシ、および有利に６〜１４個の炭素原子を有するアリールオキシ基、特にフェノキシから選択され、
Ｒ３はハロゲン、有利に塩素、有利に１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシ基、特にメトキシおよび有利に６〜１４個の炭素原子を有するアリールオキシ基、特にフェノキシから選択される）、
（ＩＩ）構造式ＩＩＡまたはＩＩＢ：
【００１６】
【化２】
2005520552.tif 000004
または相当する塩の構造式、または
（ＩＩＩ）構造式ＩＩＩ：
【００１７】
【化３】
2005520552.tif 000005
または相当する塩の構造式で示される。
【００１８】
文献から入手できる以前の見解および発明者自身の研究の結果に反して特別なＮ−アシル化β−アミノカルボン酸と加水分解酵素の反応が行われることは全く予測できないことである。
【００１９】
エナンチオ選択的加水分解は特に効果的なやり方で、Ｒ３が塩素であり、適当な場合はＲ１およびＲ２が塩素であり、またはＲ３がメトキシであり、またはＲ１、Ｒ２およびＲ３がそれぞれフッ素である場合の構造式Ｉを有するＮ−アシル置換基を使用して行われる。例示的Ｎ−アシル置換基はＮ−クロロアセチル、Ｎ−ジクロロアセチル、Ｎ−メトキシアセチル、およびＮ−トリフルオロアセチルである。これらのＮ−アシル置換基の他の利点は加水分解の進行中にこれから生じる酢酸誘導体が生成物混合物からそのかなり低い分子量により容易に分離できることである。
【００２０】
前記方法は特に以下の構造式ＩＶ：
【００２１】
【化４】
2005520552.tif 000006
（式中、Ｎ−アシル置換基はすでに記載されたものを表し、Ｒ４はＨ、有利に１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基、特にメチル、エチル、プロピルおよびブチル、ＯＨ、有利に１〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基、特にメトキシおよびエトキシおよびハロゲンから選択される）を有するＮ−アシル化β−アミノカルボン酸の変換による光学的活性芳香族β−アミノカルボン酸の製造に適している。Ｎ−アシル置換基が請求項１記載の構造式Ｉを示し、式中、Ｒ１およびＲ２がそれぞれＨであり、Ｒ３が塩素であり、Ｒ４がＨに等しい場合が特に有利である。
【００２２】
本発明による方法は相当するラセミのＮ−アシル化３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸からの光学的活性３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸（β−アミノ−β−フェニルプロピオン酸）の製造に特に適している。
【００２３】
本発明による方法は以下の構造式Ｖ：
【００２４】
【化５】
2005520552.tif 000007
（式中、Ｒ５はアルキル基、特にメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、またはｔ−ブチル基または置換されたアルキル基、特に置換されたメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルまたはｔ−ブチル基を表す）を有するＮ−アシル化β−アミノカルボン酸の変換による光学的活性脂肪族β−アミノカルボン酸の製造に有利である。置換基は有利にハロゲン、ベンジルおよびＮ−，Ｏ−およびＳ−含有置換基から選択される。
【００２５】
ラセミのβ−アミノカルボン酸から適当な酸塩化物または無水物と反応させることにより出発化合物として使用されるラセミのＮ−アシル化β−アミノカルボン酸が一般に得られる。ラセミのＮ−アシル化β−アミノカルボン酸のその場での製造およびその生体触媒反応への直接的使用が可能である。
【００２６】
本発明による方法において加水分解酵素として多数の酵素を使用することができる。適当な加水分解酵素は例えばアシラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼまたはエステラーゼであり、有利にアシラーゼである。タイプＩのブタ腎臓アシラーゼの使用が特に適していることが示された。しかし有利にアスペルギルス、より有利にアスペルギルスオリザエに由来するプロテアーゼを使用することによる反応も可能である。
【００２７】
使用される酵素は本来の形でまたは固定された形で使用することができる。遺伝子工学的に作成された酵素の使用も可能である。
【００２８】
本発明による方法は有利に水溶液中で実施する。ｐＨ値は一般に６〜１０であり、有利に７〜９である。
【００２９】
水溶液中でＮ−アシル化β−アミノカルボン酸の濃度は反応混合物の全量に対して有利に２〜４０質量％、より有利に５〜２０質量％である。
【００３０】
水溶液中で実施するほかに、本発明による方法は有機溶剤中で、有利に例えばメタノールおよびエタノールのような水と混合できる溶剤中でおよび水と有機溶剤の適当な混合物中で実施することができる。
【００３１】
添加される酵素の量は加水分解酵素の種類および酵素製造の活性に依存する。反応のための酵素の最適な量は当業者により簡単な予備試験により容易に確定することができる。
【００３２】
酵素触媒作用下のＮ−アシル化β−アミノカルボン酸の加水分解は通常は１０〜６０℃、特に２０〜４０℃の温度で実施する。
【００３３】
反応の進行を一般的な方法により、例えばＨＰＬＣにより容易に観察することができる。ラセミ化合物の分割はラセミのＮ−アシル化β−アミノカルボン酸の５０％の変換率でわかるように終了する。これは一般に反応室から例えば濾過、有利に限外濾過により酵素を除去することにより行う。
【００３４】
ラセミのＮ−アシル化β−アミノカルボン酸のエナンチオ選択的加水分解の結果として、１つのエナンチオマーから相当するβ−アミノカルボン酸が生じるが、他のエナンチオマーはほとんど反応しない。現在存在するＮ−アシル化β−アミノカルボン酸およびβ−アミノカルボン酸からなる混合物は一般的な方法により容易に分離することができる。例えば適当なｐＨ値での抽出および／または濾過処理が混合物の分離に十分に適している。
【００３５】
所望のエナンチオマーを分離後に残留する好ましくないエナンチオマーを技術水準で知られた方法によりラセミ化し、工程に再び導入する場合に本発明による方法をより経済的にすることが可能である。
【００３６】
この循環の結果として、ラセミのＮ−アシル化β−アミノカルボン酸から全部で５０％より多い所望のエナンチオマーを得ることが可能になる。
【００３７】
本発明による方法は光学的に活性のβ−アミノカルボン酸の製造に適しているだけでなく、例えば薬剤または作物保護剤の製造に結合する複雑な多工程の合成の部分であってもよい。
【００３８】
本発明を以下の実施例により説明する。
【００３９】
例１（比較例）
反応容器中でｐＨ８.０を有する５０ミリモル燐酸ナトリウム緩衝液９００μｌ、ラセミ−Ｎ−アセチル−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の０.１モル水溶液１００μｌおよびタイプＩのブタ腎臓アシラーゼ（製造、Ｓｉｇｍａ）５ｍｇからなる溶液を３０℃で２４時間撹拌し、引き続きＨＰＬＣ（カラム：Ｎａｕｔｉｌｕｓ、溶離剤：Ｈ２Ｏおよびアセトニトリル、容積比８０：２０、トリフルオロ酢酸０.１容積％、２２０ｎｍ、毎分１ｍｌ、注入：溶離剤９００μｌ＋反応混合物１００μｌ）により変換率を決定する。変換率は１％未満である。
【００４０】
例２
反応容器中でｐＨ８.０を有する５０ミリモル燐酸ナトリウム緩衝液９５０μｌ、アセトン中のラセミ−Ｎ−クロロアセチル−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の１０％（ｗ／ｖｏｌ％）溶液５０μｌおよびタイプＩのブタ腎臓アシラーゼ（製造、Ｓｉｇｍａ）５ｍｇからなる溶液を３０℃で２４時間撹拌し、引き続きＨＰＬＣ（カラム：Ｎａｕｔｉｌｕｓ、溶離剤：Ｈ２Ｏおよびアセトニトリル、容積比８０：２０、トリフルオロ酢酸０.１容積％、２２０ｎｍ、毎分１ｍｌ、注入：溶離剤９００μｌ＋反応混合物１００μｌ）により変換率を決定する。変換率は１４％である。
【００４１】
例３
反応容器にｐＨ７.０を有する燐酸カリウム緩衝液およびラセミ−Ｎ−クロロアセチル−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸１２７ｍｇ（０.５ミリモル）からなる水溶液５０ｍｌを装入する。引き続きタイプＩのブタ腎臓アシラーゼ（製造、Ｓｉｇｍａ）１２０ｍｇを添加し、反応混合物を室温で反応させる（約２５℃）。５日後の変換率は９％であり、１９日後に４６％である（反応試料のＨＰＬＣによる）。
【００４２】
例４
反応容器に、ＮａＯＨによりｐＨ８.２に調整したラセミ−Ｎ−クロロアセチル−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸１２７ｍｇ（０.５ミリモル）の水溶液５０ｍｌを装入し、３０℃の温度にする。引き続きタイプＩのブタ腎臓アシラーゼ（製造、Ｓｉｇｍａ）１２０ｍｇを添加し、反応混合物を３０℃の反応温度で反応させる。５日後変換率は２４％である（反応試料のＨＰＬＣによる）。１３日の時間の後に反応混合物をまず限外濾過により酵素成分から分離する。澄んだ濾液が得られ、これから形成された光学活性３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸に関する変換率およびエナンチオ選択性が決定される。変換率は３５％であり、エナンチオ選択性に関してｅｅ値＞９８％が確定した。
【００４３】
例５
反応容器中でｐＨ７.５を有する５０ミリモル燐酸ナトリウム緩衝液９５０μｌ、アセトン中のラセミ−Ｎ−クロロアセチル−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸の１０％（ｗ／ｖｏｌ％）溶液５０μｌおよびアスペルギルスオリザエに由来するプロテアーゼ（製造、Ｓｉｇｍａ、プロテアーゼＸＸＩＩＩ）５ｍｇからなる溶液を３０℃で４日間撹拌し、引き続き例２と同様にＨＰＬＣにより変換率を決定する。変換率は６％である。
【００４４】
例６：（Ｓ）−３−アミノ−３−（フェニル）プロピオン酸の最適化された製造
１００ｍｌ反応容器中でラセミ−Ｎ−クロロアセチル−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸６０.４ｍｇ（純度＞９８％、０.２５ミリモル）を水１２.５ｍｌに添加し、ＮａＯＨを使用してｐＨ７.７５に調節する。この後で０.００１モル塩化コバルト（ＩＩ）溶液２.５ｍｌを添加し、緩衝溶液（５０ミリモル燐酸塩緩衝液）１２.５ｍｌで一杯に満たし、生じた溶液を３７.５℃の温度にする。引き続きタイプＩのブタ腎臓アシラーゼ（製造、Ｓｉｇｍａ）６０ｍｇを添加し、反応混合物を３７.５℃の反応温度で反応させる。１日後変換率は４３.２％であり、２日後４８.７％である（反応試料のＨＰＬＣによる）。この後で反応混合物を限外濾過により酵素成分から分離する。澄んだ濾液が得られ、これから形成された光学活性（Ｓ）−３−アミノ−３−フェニルプロピオン酸に関するエナンチオ選択性が決定される。エナンチオ選択性に関して９９.０％のｅｅ値が確定された。
【００４５】
例７：光学活性３−アミノ−３−（２−チオフェニル）プロピオン酸の最適化された製造
１００ｍｌ反応容器中でラセミ−Ｎ−クロロアセチル−３−アミノ−３−（２−チエニル）プロピオン酸６３ｍｇ（純度：９８.３％、０.２５ミリモル）を水１２.５ｍｌに添加し、ＮａＯＨを使用してｐＨ７.７５に調節する。この後で０.００１モル塩化コバルト（ＩＩ）溶液２.５ｍｌを添加し、緩衝溶液（５０ミリモル燐酸塩緩衝液）１２.５ｍｌで一杯に満たし、生じた溶液を３７.５℃の温度にする。引き続きタイプＩのブタ腎臓アシラーゼ（製造、Ｓｉｇｍａ）６０ｍｇを添加し、反応混合物を３７.５℃の反応温度で反応させる。１日後変換率は４９.２％であり、２日後５０.０％である（反応試料のＨＰＬＣによる）。この後で反応混合物を限外濾過により酵素成分から分離する。澄んだ濾液が得られ、これから形成された光学活性３−アミノ−３−（２−チエニル）プロピオン酸に関するエナンチオ選択性が決定される。エナンチオ選択性に関して９９.０％より高いｅｅ値が確定された。
【００４６】
例８：光学活性３−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニル）プロピオン酸の最適化された製造
１００ｍｌ反応容器中でラセミ−Ｎ−クロロアセチル−３−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニル）プロピオン酸６６.１ｍｇ（純度：９８.２％、０.２５ミリモル）を水１２.５ｍｌに添加し、ＮａＯＨを使用してｐＨ７.７５に調節する。この後で０.００１モル塩化コバルト（ＩＩ）溶液２.５ｍｌを添加し、緩衝溶液（５０ミリモル燐酸塩緩衝液）１２.５ｍｌで一杯に満たし、生じた溶液を３７.５℃の温度にする。引き続きタイプＩのブタ腎臓アシラーゼ（製造、Ｓｉｇｍａ）６０ｍｇを添加し、反応混合物を３７.５℃の反応温度で反応させる。１日後変換率は３２.９％であり、２日後４５.６％である（反応試料のＨＰＬＣによる）。この後で反応混合物を限外濾過により酵素成分から分離する。澄んだ濾液が得られ、これから形成された光学活性３−アミノ−３−（ｐ−フルオロフェニル）プロピオン酸に関するエナンチオ選択性が決定される。エナンチオ選択性に関して９５.０％より高いｅｅ値が確定された。
【国際調査報告】
2005520552.tif 000013
2005520552.tif 000014