(57)【要約】  本発明は、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA, EC 4.1.2.4)およびその変種は、多種多様なドナーアルデヒドとアクセプターアルデヒドとの間の連続不斉アルドール反応を触媒するために使用することができるという知見を基づいている。この反応生成物は、典型的には少なくとも2個の新規ステレオジェン中心を含み、およびエネンチオマー的に純粋な形で生成することができる。このように、DERA触媒された不斉アルドール化学は、様々な生体活性分子の合成のためのシントンの生成に利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のアキラルなアルデヒド、第二のアキラルなアルデヒド、および第三のアキラルなアルデヒドを、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)またはそれらの変種と、連続不斉アルドール反応を促進するのに適した条件下で接触する段階を含む、鏡像異性体的に純粋なピラノースの製造方法であって、
第一と第二のアキラルなアルデヒド間の第一のアルドール反応が、第一の反応生成物を形成し、
第一の反応生成物と第三のアキラルなアルデヒドの間の第二のアルドール反応が、第二の反応生成物を形成し、
第二の反応生成物は自発的に分子内閉環反応を受け、鏡像異性体的に純粋なピラノースを形成する、方法。
【請求項２】
鏡像異性体的に純粋なピラノースを、鏡像異性体的に純粋なラクトンを生成するのに適した条件下で酸化させる段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
第一の反応生成物がβ-ヒドロキシ-アルデヒドである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
β-ヒドロキシ-アルデヒドが下記の構造を有する、請求項3記載の方法：
2005520510.tif 000080
式中、Rは、-H、-OH、N3、アルキル、またはアルコキシである。
【請求項５】
第一、第二、または第三のアキラルなアルデヒドの少なくとも一つはアセトアルデヒドである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
鏡像異性体的に純粋なピラノースが下記の構造のいずれか一つを有する、請求項1記載の方法：
2005520510.tif 000081
【請求項７】
2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ変種が、K172E、G205E、R207E、S238D、S239Eの置換、またはそれらのいずれかの組合せを有するDERAである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
アクセプターβ-ヒドロキシ-アルデヒドが、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)またはそれらの変種の存在下、連続不斉アルドール反応を促進するのに適した条件下で少なくとも1種のドナーアルデヒドと接触され、これによりエポチロン前駆体分子を生成することを含む、エポチロン前駆体分子の製造方法。
【請求項９】
β-ヒドロキシ-アルデヒドが下記の構造を有する、請求項8記載の方法：
2005520510.tif 000082
式中、Rは、-H、-OH、N3、アルキル、またはアルコキシである。
【請求項１０】
エポチロン前駆体分子がフラノースまたはピラノースである、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
β-ヒドロキシ-アルデヒドを、DERA変種の存在下、連続不斉アルドール反応を促進するのに適した条件下でアジド含有アクセプターアルデヒドと接触し、これによりアトロバスタチン前駆体分子を生成することを含む、アトロバスタチン前駆体分子の製造方法。
【請求項１２】
アクセプターアルデヒドが、3-アジドプロピオンアルデヒドである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
DERA変種がS238Dである、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
アミノ酸残基172、205、207、238、239、またはそれらのいずれかの組合せにおいて突然変異を有するDERAをコードしている単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
アミノ酸残基が、172グルタミン酸、205グルタミン酸、207グルタミン酸、238アスパラギン酸、239グルタミン酸、またはそれらのいずれかの組合せである、請求項14記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項14記載のポリヌクレオチドによりコードされた単離ポリペプチド。
【請求項１７】
アミノ酸残基172がグルタミン酸である、DERAのアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸残基205がグルタミン酸である、DERAのアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸残基207がグルタミン酸である、DERAのアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸残基238がアスパラギン酸である、DERAのアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸残基239がグルタミン酸である、DERAのアミノ酸配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項２２】
Δace、adhC、DE3の特徴を有する、単離された大腸菌。
【請求項２３】
2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)変種をコードしているポリヌクレオチドで形質転換された原核生物を培養する段階を含む、野生型DERAポリペプチドと比べ拡大された基質特異性を有するDERA変種の同定方法であって、該原核生物は、唯一の炭素源としてアセトアルデヒドを利用するかまたは増殖のためにアセトアルデヒド補充を必要とし、これにより該原核生物の増殖が、野生型DERAポリペプチドと比べ拡大された基質特異性を有する2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)変種の存在の指標となる、方法。
【請求項２４】
原核生物が大腸菌株である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
原核生物胞が大腸菌-SELECTである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
原核生物がΔace、adhC、DE3の特徴を有する、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
原核生物がΔace、adhCの特徴を有する、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
原核生物がΔaceの特徴を有する、請求項24記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一部、米国立衛生研究所(NIH)により授与された研究助成金第GM44154号の下で、米政府の支援により成された。米国政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は一般に、有機合成における酵素の使用、より詳細に述べると、生体活性化合物の製造に関するアルドラーゼ-触媒した不斉合成に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
現在酵素は、それらの優れた化学-、位置-および立体-特異性のために、不斉有機合成における触媒として、広範に利用されている。アルドラーゼは、特に有用な酵素種であり、その理由はこれらの酵素は、新たに形成されたステレオジェン中心での高度の立体選択性制御を伴いC-C結合形成を触媒するからである。今日までに20種よりも多いアルドラーゼ構造が報告されており、そのほとんどは共通のα8β8バレル構造モチーフを含んでいる。最近の酵素の分子内遺伝、タンパク質工学、および位置指定修飾の進歩は、合成用途に関する酵素触媒の範囲を更に拡大している。
【０００４】
酵素2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA, EC 4.1.2.4)は、シッフ塩基形成するI型クラスのアルドラーゼであり、これはアセトアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド3-リン酸(G3P)の可逆的アルドール反応を触媒し、D-2-デオキシリボース-5-リン酸(DRP)を生成する。この酵素は、大腸菌(E. coli)において過剰発現され、その構造および触媒機構が、原子レベルで決定されている。しかしこの特定のアルドラーゼの不斉有機合成における利用の可能性については、まだ完全にはわかっていない。
【０００５】
加えて、アルドラーゼが対応する天然ではない基質の範囲の拡大に加え、それらの不安定性および高いコストを克服することは、更にそれらの合成用途の範囲を増大するために重要である。本発明はこれらの問題点に対処し、更に関連した利点を提供する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA, EC 4.1.2.4)およびその変種は、多種多様なドナーアルデヒドとアクセプターアルデヒドの間の連続不斉アルドール反応を触媒するために使用することができるという発見を基にしている。この反応生成物は、典型的には少なくとも2個の新規ステレオジェン中心を含み、および鏡像異性体的に純粋な形において生成することができる。このように、DERA触媒した不斉アルドール化学は、様々な生体活性分子の合成のためのシントンの生成に利用することができる。
【０００７】
本発明の一つの局面において、鏡像異性体的に純粋なピラノースを生成するための方法が提供される。このような方法は、例えば、第一のアキラルなアルデヒド、第二のアキラルなアルデヒド、および第三のアキラルなアルデヒドの、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)またはそれらの変種との、連続不斉アルドール反応を促進するのに適した条件下での接触により行うことができ、ここで第一と第二のアキラルなアルデヒドの間の第一のアルドール反応は、第一の反応生成物を形成し、ここで第一の反応生成物と第三のアキラルなアルデヒドの間の第二のアルドール反応は、第二の反応生成物を形成し、ここで第二の反応生成物は、自発的に分子内閉環反応を受け、鏡像異性体的に純粋なピラノースを形成する。
【０００８】
本発明の別の局面において、エポチロン前駆体分子を生成する方法が提供される。このような方法は、例えば、アクセプターであるβ-ヒドロキシ-アルデヒドを、少なくとも1種のドナーアルデヒドと、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)またはそれらの変種の存在下、連続不斉アルドール反応を促進するのに適した条件下で接触し、これによりエポチロン前駆体分子を生成することにより行うことができる。
【０００９】
別の局面において、アトロバスタチン前駆体分子を生成する方法が提供される。このような方法は、例えばβ-ヒドロキシ-アルデヒドを、アジド含有アクセプターアルデヒドと、DERA変種の存在下、連続不斉アルドール反応を促進するのに適した条件下で接触し、これによりアトロバスタチン前駆体分子を生成することにより、行うことができる。
【００１０】
別の局面において、下記突然変異のいずれか一つを有する単離された2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ：K172E、G205E、R207E、238D、またはS239E、および本発明のアルドラーゼをコードしているポリヌクレオチドが提供される。
【００１１】
更に別の局面において、Δace、adhC、DE3の特徴を有する、単離された大腸菌が提供される。
【００１２】
本発明の更なる局面において、野生型DERAポリペプチドと比べ、拡大された基質特異性を有する2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)変種を同定する方法が提供される。このような方法は、例えばDERA変種をコードしているポリヌクレオチドにより形質転換された原核細胞を培養することにより行うことができ、ここで原核細胞は、アセトアルデヒドを唯一の炭素源として利用するか、または増殖のためのアセトアルデヒド補充を必要とするかのいずれかであり、これにより原核細胞の増殖は、野生型DERAポリペプチドと比べ、拡大された基質特異性を有する2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)変種の存在の指標となる。
【００１３】
発明の詳細な説明
一つの局面において、本発明は、鏡像異性体的に純粋なピラノースを生成する方法を提供する。このような方法は、例えば、第一のアキラルなアルデヒド、第二のアキラルなアルデヒド、および第三のアキラルなアルデヒドを、2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)またはそれらの変種と、連続不斉アルドール反応を促進するのに適した条件下で接触することにより行うことができ、ここで第一と第二のアキラルなアルデヒドの間の第一のアルドール反応は、第一の反応生成物を形成し、ここで第一の反応生成物と第三のアキラルなアルデヒドの間の第二のアルドール反応は、第二の反応生成物を形成し、ここで第二の反応生成物は、自発的に分子内閉環反応を受け、鏡像異性体的に純粋なピラノースを形成する。この連続アルドール／閉環化学を、反応経路1に概説している。
【００１４】
2005520510.tif 000002
反応経路1：DERAを用いた非天然のピラノースの調製。a)pH7.5、DERA、アセトアルデヒド；b)Br2、BaCO3、経路AおよびBの詳細については、本文参照のこと。
【００１５】
この連続反応において、第一のアルドール生成物は、第二のアルドール反応の基質として作用し、鏡像異性体的に純粋な3,5-ジヒドロキシアルデヒドを生じ、これは次に閉環し安定したピラノースを形成し、従って縮合に向かう反応を推進する。これらの1,3-ポリオールシステムは、有用なシントンであるので、この酵素的方法論の範囲が更に検証された。一つの戦略は、β-ヒドロキシ-アルデヒドのアクセプターとしての利用であり(反応経路1)、安定したヘミアセタールを形成するように閉環する生成物を生成し、従って縮合へ向かう反応を推進する。このヘミアセタールは更に酸化され、ラクトンを生じる。実際この酸化は時々、精製を非常に容易にし、より重要なことには、このラクトンは更に他の有用なシントンへ変換することができる。いくつかの異なる基質を試験し、および結果を表6にまとめている。
【００１６】
（表１）  DERAにより触媒されたアルドール縮合
2005520510.tif 000003
[a]反応性鏡像異性体を基にした。
[b]保護されたアルデヒドからの2工程の総収量。
【００１７】
アクセプターアルデヒドにおけるC2の立体配置は、酵素的反応の結果に影響を及ぼす。
2005520510.tif 000004
【００１８】
極性基(例えば、R=OH、N3)がこの位置にある場合に、D異性体は、L異性体よりも圧倒的に好ましいことは分かっていた；ラセミアクセプターアルデヒドが使用される場合には、D異性体生成物のみが形成される(表1、エントリー2-4)。対照的に、疎水基がC2位にある場合は、反対の鏡像選択性が認められる(表1、エントリー5-7)：5aは、ラクトン5bを、2工程を経て収率48％でもたらす一方で、その鏡像異性体である6aは、微量の6bを生じるのみであり、ラセミアルデヒド7aは7bのみを生じる。DERAの構造を基にした分子モデリングは、C2位のOH基のためにThr170およびLys172で構成される親水性結合ポケット、並びにC2位のH原子のための疎水性ポケットを明らかにした。結合のスイッチは、メチル基およびメトキシ基が疎水性ポケット内にある5aおよび7aについて認められ、これは鏡像選択性の変更を生じる。
【００１９】
酵素反応から調製された1,3-ポリオールシステムは、有用なシントンとして役立つ。一例は、β-ヒドロキシ基により指示されたキレート化制御下での、β-ヒドロキシラクトンの臭化アルキルによる立体選択的C2アルキル化に関連している(反応経路2)。
2005520510.tif 000005
反応経路2. 立体選択的アルキル化。a)Br2、BaCO3、12時間、62％；b)LDA、HMPA、-78℃、臭化アルケン、36時間、LDA＝リチウムジイソプロピルアミド、HMPA＝ヘキサメチルホスホロアミド。
【００２０】
この反応は、ラクトンの還元後により多様化されたピラノースを提供し、および有機合成のために追加の有用な中間体を形成することができる。アルキル化実験において、その他のジアステレオマーは検出されなかった。9aの相対立体配置は、NMR実験により明白に確認された。
【００２１】
中間体9aおよび9bの両方の利用可能性は、可能性のある抗癌剤としてエポチロンを調製するための、Suzukiカップリングまたはオレフィン複分解戦略のいずれかの選択を可能にした。臭化アリルは、より活性があり、および比較的高収量で9aを生じるので、C12-C13(Z)二重結合の構築のためには、Suzukiカップリング戦略が選択された(反応経路3)。9aに加え、DERAにより調製された化合物11も、重要なシントンとして使用された。
【００２２】
2005520510.tif 000006
反応経路3：エポチロンAおよびCの逆合成。PMP＝4-メトキシフェニル、TBS＝tert-ブチルジメチルシリル。
【００２３】
本発明者らのフラグメントA(反応経路4)の合成において、9aのラクトン環が、最初に開環され、ジオール12となり、これは次にPMPアセタールとして保護された。LiAlH4による還元後、ヒドロキシを、メシル化その後の還元により除去し、両方とも優れた収量であった。トルエン中における化合物13のPMP保護基のDIBALによる位置選択的切断は、唯一の生成物として第一級アルコールを生じ、これはDess-Martinペルヨージナンにより酸化し、アルデヒド14を生じた。化合物14はその後、tert-ブチル酪酸イソブチリルと縮合し、化合物15を収率70％で生じた(d.r. 8:1)。Me4NBH(AcO)3による立体選択的還元は、所望のジオール(d.r. 10:1)の形成を生じた。β-ヒドロキシ基の位置選択的シリル化、それに続く酸化は、フラグメントAを生じた。
【００２４】
2005520510.tif 000007
反応経路4. フラグメントAの合成。a)MeONa、-30℃、60％；b)アニスアルデヒドジメチルアセタール、CSA、95％；c)LiAlH4、0℃〜RT、90％；d)MsCl、NEt3、94％；e)LiAlH4、88％；f)DIBAL、トルエン、93％；g)Dess-Martin酸化、96％；h)NaH、nBuLi、0℃、70％；i)Me4NBH(OAc)3、-30℃、83％；j)TBSOTf、2,6-ルチジン、0℃、10分間、100％；k) Dess-Martin酸化、3時間、90％。CSA＝10-カンファースルホン酸、PMP＝4-メトキシフェニル、Ms＝メシル＝メタンスルホニル、DIBAL＝ジイソブチル水素化アルミニウム、TBS＝tert-ブチルジメチルシリル、Tf＝トリフレート＝トリフルオロメタンスルホニル。
【００２５】
化合物16におけるC2の立体配置は本発明者らの合成経路(反応経路5)において必須ではないので、ラセミ体ラクトアルデヒドアセタール16を、本発明者らの現在の合成において使用した。興味深いことに、D異性体は、DERAの基質として受入れられることを、本発明者らは発見したが、L異性体生成物は本発明者らの実験においては検出されなかった。フラグメントBの調製は、比較的直接的であった(反応経路5)。
【００２６】
2005520510.tif 000008
反応経路5. フラグメントBの合成。a)Dowex(H+)、40℃、その後pH7.5、DERA、アセトアルデヒド、3日間、38％(D鏡像異性体を基にした2工程)；b)AcCl、pyr、95％；c)BF3、Et2O、H2O/CH3CN、0℃、84％；d)1,3-プロパンジチオール、TiCl4、-78℃、97％；c)DMSO、(COCl)2、95％；f)nBuLi、THF、-78℃、88％；g)Hg(ClO4)2、CaCO3、THF/H2O、RT、2時間；h)Ph3P=CHI、NaN(TMS)2、HMPA、THF、-78℃、60％(2工程)、Ac＝アセチル、pyr＝ピリジン、DMSO＝ジメチルスルホキシド、THF＝テトラヒドロフラン、TMS＝トリメチルシリル。
【００２７】
このβ-ヒドロキシ基は、選択的に保護され、およびヘミアセタールは、1,3-プロパンジチオールで処理され、ジチアン17を生じ、これは酸化され、ケトン18を収率95％で生じた。化合物18の酸化ホスフィンによるWittig反応は、化合物19を生じた。ジチアンのHg(OCl4)2による脱保護後、アルデヒド生成物を直接(Ph3P+CH2I)I-でカップリングし、フラグメントBをこれら2工程について収率60％で得た。
【００２８】
フラグメントAおよびBのSuzukiカップリングは、Danishefskyらの論文に説明されたように、速やかに進行し、化合物20を生じた(反応経路6)。
【００２９】
2005520510.tif 000009
反応経路6. エポチロンA合成の最終工程。a)[PdCl2(dppf)2]、Ph3As、Cs2CO3、9-BBN、65％；b)MeONa(触媒)、MeOH、85％；c)TMSOTf、2,6-ルチジン；d)NaOH(触媒)、MeOH、2工程について78％；e)Yamaguchi条件、85％:f)DDQ、CH2Cl2、99％；g)HF・Pyr、THF、95％；h)DMDO、45％。dppf＝ビス(ジフェニルホスファニル)フェロセン、9-BBN＝9-ボラビシクロ[3,3,1]ノナン、DDQ＝2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-1,4-ベンゾキノン、DMD0＝3,3-ジメチルジオキシラン。
【００３０】
アセチルおよびtert-ブチルエステル保護基を取り除いた後、ヒドロキシ酸21をYamaguchiマクロラクトン化条件に晒し、中間体22を得た。PMPおよびTBS保護基を、各々、DDQおよびHF・ピリジンにより除去し、最終的にエポチロンCとした。1,3-ジメチルジオキシラン(DMDO)の新たに調製した溶液によるエポキシ化は、合成エポチロンAを生じ、その物理特性([α]D、1H, 13C NMR、MS、IR)は、報告されたデータと一致した。
【００３１】
まとめると、DERAにより触媒した酵素反応による、非天然のピラノースシントンの合成の新規戦略が開発された。この戦略は、非常に収束的かつ効果的である。β-ヒドロキシ-指示した高度に立体選択的アルキル化と組合せ、多様化された1,3-ポリオールを調製することができる。それらの天然の生成物合成への適用は、エポチロンAおよびCの簡潔な全体合成により例証される。
【００３２】
更なる本発明の局面において、拡大された基質特異性を有する2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA)変種を同定する方法が提供される。実際、DERAの特異性をその天然の基質D-2-デオキシリボース-5-リン酸(DRP)を超えるよう拡大し、およびリン酸化されない基質とのその活性を改善することは望ましい。
【００３３】
酵素特性を変更する多くの方法が現存している。これらは、例えば溶媒または基質操作、酵素吸着および酵素の共有的化学修飾を含む。より最近になって、酵素特異性を変更するために、部位特異的突然変異誘発法およびランダム突然変異誘発法が、利用されている。前者は、酵素の触媒機構、基質特異性決定因子および三次元構造の詳細な理解を必要とすることが多い。対照的に、ランダム突然変異誘発法は、特異性決定因子の事前の理解も、構造の知識も必要としない。遺伝子ライブラリーを作成する多くの確固たる方法が現存している。この方法の限界は、所望の表現型を同定するための、ハイスループット法を欠いていることである。x-アミノ酸タンパク質に関して20xの変種が可能であることにより、この検索は不可能な作業となっている。所望の酵素活性または特性を同定するために使用され得る一般的方法は、以下のものである：活性のインビトロスクリーニング、結合のインビトロスクリーニング、および活性のインビボ選択。これらの各々の欠点は、自動化されないことによる低い処理量、触媒への連結結合の困難および非天然の活性についての実行の困難である。従って、所望の酵素活性をスクリーニングするための一般的ハイスループット法の開発は、触媒として酵素を使用する有機合成の進歩にとって重要である。
【００３４】
本発明の実践において、DERAのX線構造およびその提唱された触媒機構(図1)が、逆方向鏡像選択性を伴う酵素反応のための、新規非リン酸化基質のデザイン、並びに非リン酸化非天然の基質であるD-2-デオキシリボース(DR)の逆アルドール反応の代謝回転を改善するための突然変異誘発による酵素の変更のための指針として使用される。DERA、更にはほとんどのアルドラーゼの活性部位は、典型的にはα／βバレルであり(図2)、これは、方向性のある進化による他の酵素の触媒活性の変更に有用な共通の骨格であることが示されており(公知のタンパク質の約10％はこの折畳みを有する)、拡大された基質特異性を伴う新規DERA触媒の開発のための良好なモデルであると考えられる。
【００３５】
最近決定された結合したDRPとのカルビノールアミン共有複合体における大腸菌DERAの1.05Åの三次元構造(図3)により、5種の変種が、非天然の基質DRに対する活性を改善するという期待の下でデザインされた。リン酸結合ポケットは、残基Gly171、Lys172、Gly204、Gly205、Val206、Arg207、Gly236、Ser238およびSer239から構成される。しかし、Ser238の側鎖のみが、DRPのリン酸部分との直接水素結合による接触を形成する。
【００３６】
非天然の基質の静電気的特徴と相補的であるようなものに対する酵素活性部位の静電気的環境を変更することにより、基質特異性を変化させる簡単な方法の有用性が明らかにされている。従って酵素活性部位を検討することにより、2個の塩基性残基が、酸性残基への突然変異誘発の標的とされた。その結果K172EおよびR207E変種が調製された。加えて、リン酸結合ポケット内の3個の中性側鎖が、酸性のもので置換えられ、G205E、S238DおよびS239E変種を作成した。これらのデザインされた突然変異の目標は、負帯電したDRPにとって好ましいものから非リン酸化中性DR基質への、WT-DERAの基質特異性の変更であった。
【００３７】
逆-アルドール方向におけるDERAの拡大された基質特異性は、アルドール方向における拡大された基質特異性と平行であることが予想された。
【００３８】
従って、これらの変種は、逆-アルドール方向で特徴付けられる。5種の各変種について、天然の基質DRPとの活性(表2)は、導入された負帯電された残基と負帯電したDRPのリン酸部分の間の静電気的反発により予想されるように、実質的に減少した。
【００３９】
（表２）  理論的にデザインされたDERAリン酸結合ポケットの突然変異の影響
2005520510.tif 000010
aデータなし
【００４０】
全ての場合において、特にR207Eについて、変種対WTの、DRPと比べたDRの特異性定数の比  {kcat/KM(DR)}／{kcat/KM(DRP)}  の増加により示されるように、非天然の基質に対する特異性は改善される。明らかにこの残基は、データにより証明されたようにDRP遷移状態結合にとって重要であり、並びにこの残基の9種の最も近い大腸菌DERAの相同体についてのこの残基の保存された性質と一致している。しかしより短いDR基質について、残基207は、実質的変化に作用するのに十分に近傍ではないことがあり、その理由はこの変種に関して、DR特異性は、WTと比べて事実上変更されないからである。2種のデザインされたDERA変種は、基質としてのDRとのWT活性よりもより高いものを示した。これらの中で、S238D変種が最も活性があり、WT-DERAと比べ、kcat/KMで2.5倍の改善があった。S239Eは、WTと比べ、kcat/KMで1.3倍の改善を示した。S239EおよびS238Dの両方について、天然のリン酸化された基質に関するkcat/KMは、静電気的反発により予想されたように実質的に減少した。興味深いことに、WT構造においては、S238の側鎖のみが、この基質に直接的に接触し、並びにその近接性は、より小さいDR基質に対してさえも基質特異性をある程度変更することができるように見える。G205E突然変異は、DRおよびDRPの両方に関して事実上不活性であるタンパク質を生じる。この残基は、DERAの9種の相同体において厳密に保存され、およびその突然変異は、構造的動揺に作用することがある。K172E突然変異は、DR基質とのkcat/KMの5倍の減少を生じる。
【００４１】
DERA触媒した逆-アルドール反応における改善は、合成上有用であるかどうかを確立するために、本発明者らは、WTと比べたDERA変種の、アセトアルデヒドと(±)-グリセロアルデヒドの間のアルドール反応を触媒する効率を評価した。アルドール方向において、基質消費の分光法と組合せた-アッセイおよび生成物形成の薄層クロマトグラフィー分析の両方により評価されたような、DERA変種の相対活性は、以下のようである：S238〜DS239W＞WT＞R207E＞K172E＞G205E。従ってアルドール反応活性は、速度論的逆-アルドール活性データと平行しており、およびこの方法を正当化している。従ってリン酸化されない基質のアルドールおよび逆-アルドールの両反応を触媒するDERAの2種の改善された変種が開発されている。
【００４２】
分子モデリング(図4)は、この生成物の末端ヒドロキシル基が、Asp238-CO2への2.9〜3.2Åの水素結合を形成することが可能であることを示している。これは、S238D変種の非リン酸化基質に対する増大した活性を説明することができる。更に、Asp側鎖コンホメーション(回転異性体)の最適化は、活性部位における水分子への水素結合(2.5Å)の獲得をもたらす。この水分子は、Lys172のNζへの2.9Åの第二の水素結合を形成する。第一の生成物複合体(図4A)は、(R)-配置または(D)-配置されたC4位のヒドロキシル基とこの水分子との間の水素結合(2.7Å)形成を示している。この水素結合は、(S)-配置されたC4位を伴う第二の複合体(図4B)には存在せず、これは図4Aに示された生成物形成について観察された優先性を説明することができる。
【００４３】
DERAおよびS238D変種は、D-グリセラルアルデヒドに加え、他の2-置換された3-ヒドロキシ-プロピオンアルデヒドを受入れ、並びに鏡像選択性の反転が、2-メチル-または2-メトキシ-3-ヒドロキシ-プロピオンアルデヒドが基質として使用される場合に観察される(図5)。両方の場合において、L-鏡像異性体が、野生型にとって好ましい基質であるが、面選択性は、未変化のままである(図5A)。このメチル-由来の生成物は、エポチロンの全体合成において使用される。加えて、S238D変種は、より良い基質としてL-2-メチル誘導体を受入れ、kcat/KMは野生型のそれと比べ5倍改善する。これらの結果は、構造を基にした分子モデリングと一致している。前記および図4記載のように、D-グリセルアルデヒドの2-ヒドロキシ基(生成物の4-ヒドロキシ基に相当)と相互作用する水分子は、DERA触媒の鏡像選択性の決定において重要な役割を果たす。対応するD-2-メチル誘導体は、メチル基が水分子およびThr170のカルボニル酸素と密に接触しているので、基質ではない。他方で、L-鏡像異性体の2-メチル基のこの酵素への結合は、エネルギーがありより好ましく(図4C)、そのメチル基はGly171のCα(3.5Å)、A1a203のCβ(3.9Å)との、およびGly204のCα(3.6Å)との、ファンデルワールス接触における疎水性環境を示している。その結果、機構的試験およびモデリング試験の両方が、DERA触媒における2個の水分子の重要な役割を明らかにしている：一方は、触媒において酸および塩基として作用し、並びに他方は、図1に示されたような、アクセプター基質の鏡像選択的結合に関与している。
【００４４】
一般にS238D変種は、非リン酸化基質をアクセプターとして許容するために、野生型DERAよりも優れているが、これは、3-アジドプロピンアルデヒドを第一のアクセプターとして並びにアセトアルデヒドの2個の分子をドナーとして使用する新規連続アルドール反応も触媒し、コレステロール降下薬Lipitor(商標)の合成に有用な重要な中間体である、アジドエチルピラノースを形成する(図5B)。しかしアジドアルデヒドは、野生型酵素の基質ではない。
【００４５】
本明細書において報告された活性の2.5倍の改善が助長される一方で、ほとんどの突然変異は活性の減少につながることを考慮すると、更なる増強が望ましい。アルドラーゼの基質範囲の増大は、ランダム突然変異誘発により先に確立されているにもかかわらず、処理量の限界から、遺伝子の小さい割合のみを特徴付けることができる。従って変種の有意な集団の活性を迅速に評価するために、より高い処理量の活性-ベースのスクリーニング法が必須である。従って拡大された基質範囲を伴うDERA変種の同定のための方向付けられた進化のプログラムのための調製において、高処理量分析に適したインビボ選択システムが開発された。
【００４６】
DERAの合成可能性の指標としての改善された逆-アルドール活性のスクリーニングの正当性が確立されたことで、逆-アルドール方向が選択システムの開発のために選択された。アセトアルデヒドをその唯一の炭素源として利用するまたはアセトアルデヒドに増殖を依存する細胞は、DRまたは代わりの非天然の基質に関する改善された活性を伴うDERA変種の選択を補助する上で望ましかった。増殖にアセトアルデヒドを必要とする大腸菌株SELECT(Δace、adhC、DE3)を操作した。SELECTのふたつの特徴が重要である。第一に、生存可能なピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceF)の非存在は、唯一の炭素源としてグルコース中で増殖した場合に、酢酸塩栄養要求株に影響を及ぼす。第二に、アルコールデヒドロゲナーゼ活性およびアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の両方を有するadhEの耐気性のものの構成的過剰生成は、アセトアルデヒドのアセチル-CoAへの転換に影響を及ぼし、その結果酢酸塩栄養要求株を圧倒する(図6)。
【００４７】
大腸菌SELECTは、酢酸塩またはアセトアルデヒド給源のいずれかを補充した培地において良好に増殖し、および望ましい表現型を示す(図7)。SELECTは、DERA発現しているプラスミドpET30a WT DERAにより形質転換し、およびその後可溶性活性DERA酵素の発現について増殖条件を最適化した。更に選択条件を、DERAの天然の基質DRPを補充基質として使用し最適化し、および図6は、生存可能な選択条件が達成されることを図示している。2-炭素補充が存在しない場合、WT DERAを発現するプラスミドで形質転換されたSELECT細胞も、発現しないプラスミドで形質転換されたものも(-)、増殖しない。対照的に、酢酸ナトリウム補充の存在下では、両方とも増殖する。両方共が、酢酸ナトリウムのDRPと一緒の、または酢酸ナトリウムのDRと一緒のいずれの存在下でも増殖することは、これらの補充基質も、それらの代謝産物も、これらの細胞に対して毒性がないことを明らかにしている。この選択システムの原理は、WT DERAを発現するプラスミドで形質転換された大腸菌SELECT細胞のみが、DRPが補充基質として使用される場合には増殖するという事実から証明される。更に内因性ゲノム大腸菌DERAは、そのアセトアルデヒドおよびD-グリセルアルデヒド-3-リン酸への代謝によって、DRPの2-炭素源としてのDRPの使用に影響を及ぼすのに十分な高レベルで発現されないことが確立された。WT DERAは非天然の基質DRを効率的に受入れることができないので、DERA発現していないプラスミド(pET30a-)で形質転換されたSELECT細胞も、DERA発現しているプラスミド(pET30a WT DERA)形質転換されたものも、DRを補充した場合には増殖しない。従って新規の活性-ベースの選択システムが確立され、および選択するため、並びにDRおよび他の非リン酸化基質の逆-アルドール反応を触媒することができるDERA変種選択するために使用することができる。この目的のために、新規DERA変種を同定する作業が進行中である。
【００４８】
望ましい活性を伴う酵素を欠損している細菌株の表現型を逆行する変種酵素を同定するためのインビボ選択をベースにした方法の検出力を明らかにするいくつかの例が、報告されている。しかしほとんどの例において、このようなシステムは、栄養要求株を圧倒する別の天然の酵素への天然の酵素の活性を形質転換する突然変異を同定するために使用される。加えて、失活した酵素に対する未変性の活性を伴う変種を同定するために選択が使用されるいくつかの例も、明らかにされている。今日までの非天然の酵素特異性または活性を同定しているインビボ選択の報告された例は、抗生物質耐性を付与する遺伝子産物に関連している。しかしより最近になって、エラー-傾向のあるT7ポリメラーゼの同定、並びに4種の塩基コドンtRNAの同定のための革新的増殖選択をベースにしたアッセイ法は、抗生物質耐性選択を使用し開発された。これらの洗練された例は各々、改善されたかまたは変更された活性を伴う変種を同定することのいて、選択または相補性の方法が潜在的検出力を有することを明らかにしている。従って、本明細書に説明された拡大された基質範囲を伴うDERA変種を同定するために操作された大腸菌株SELECTを利用するインビボ活性ベースの選択システムは、超-ハイスループット法で、非天然および合成的に有用な基質特異性を伴う酵素を同定することが可能である選択法の第一の例の一つである。
【００４９】
DERAおよびその触媒機構の高解像度X線構造を用い、本発明者らは、アクセプター基質および酵素の両方が、酵素的アルドール反応の効率および特異性を変更するために、変更することができることを明らかにし、これは非リン酸化基質および野生型またはS238D変種を使用する鏡像選択性の反転、並びにS238D変種を使用する新規基質特異性を含む。このS238D変種は、非天然の基質DRとのDERA活性における2.5倍の改善を示した。これは、3-アジドプロピオンアルデヒドを、連続アルドール反応における新規基質として受入れ、新規アジドピラノースを形成する一方で、野生型酵素は、このアジドアルデヒドに対し不活性である。非リン酸化基質による新規アルドール反応を触媒するために、DERA変種の同定の効率をより改善するために、本発明者らは、この種のアルドール反応のアクセプター特異性および立体選択性を拡大するために使用されるであろう選択システムを開発した。
【００５０】
本発明は更に、純粋に例示されている下記実施例を参照し理解されるが、これらは特許請求の範囲に記載された本発明の真の範囲を限定するものと見なされてはならない。
【００５１】
実施例
実施例1
D-2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼの基質特異性を拡大するための構造ベースの突然変異誘発
核酸操作は、常法に従い行った。TAQ DNAポリメラーゼは、Stratagene社から得た。Quiagen QIAprep Spin Miniprep Kitを、プラスミド調製に使用した。PCR産物は、1％アガロースゲル上での電気泳動により精製し、その後QIAEXII Agarose Gel Extraction Kitを用い抽出した。制限エンドヌクレアーゼおよびT4リガーゼは、New England Biolabs社から得た。エレクトロコンピテントな大腸菌BL21(DE3)細胞、pET30 LICおよびpET30aプラスミド、並びにHis-結合金属キレート樹脂は、Novagen社から得た。オリゴヌクレオチドプライマーは、Operon Technologies社(サンディゴ、CA)により調製された。DNA配列決定は、The Scripps Research InstituteのProtein and Nucleic Acid Core Facilityにおいて、ABI50自動シーケンサー上で行った。UV反応速度アッセイは、Cary 3 Bio UV-Vis分光計上で行った。曲線の当てはめは、KaleidaGraph(Abelbeck Software社)を用い、非線形最小二乗法により行った。全ての試薬は、最高の市販品質のものを購入し、特に記さない限りは更に精製することなく使用した。クロマトグラフィーにおいては、Merck社のシリカゲル60(230〜240メッシュ)を使用した。高解像度質量分析(HRMS)は、IONSPEC-FTMSスペクトロメーター(MALDI)上で、マトリックスとしてDHBを用い記録した。1H NMRおよび13C NMRスペクトルは、Bruker AMX-500装置上で行った。IRスペクトルは、Perkin-Elmer 1600シリーズFT-IR分光計で記録した。旋光は、Perkin-Elmer 241旋光計で記録した。
【００５２】
WT DERAのクローニング
大腸菌D-2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA, EC 4.1.2.4)遺伝子は、フォワードプライマー
2005520510.tif 000011
およびリバースプライマー
2005520510.tif 000012
を使用し、プラスミドpVH17(ATCC86963)からPCR増幅し、並びにpET30 LICベクター(Novagen社)にサブクローニングした。大腸菌D-2-デオキシリボース-5-リン酸アルドラーゼ(DERA, EC 4.1.2.4)遺伝子は、フォワードプライマー
2005520510.tif 000013
およびリバースプライマー
2005520510.tif 000014
を使用し、前記構築体、WN DERA pET30 LICからPCR増幅し、並びにpET30aベクター(Novagen社)にNcoIおよびHindIII制限部位を用いてサブクローニングした。
【００５３】
部位特異的突然変異誘発
下記クローニングプライマーを使用した：
2005520510.tif 000015
100mL DNAポリメラーゼ緩衝液中、dNTPを各20mM、10pMオリゴヌクレオチドプライマー、10ng鋳型および5U Taqポリメラーゼ(Stratagene社)を用いるPCRにより、810-bp断片を得た。両側オーバーラップ伸長PCRに使用した突然変異誘発プライマーは、以下であった：
2005520510.tif 000016
この混合物は、94℃で5分間を1サイクル、{94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒}を30サイクル、並びにその後72℃10分を1サイクルで、サーモサイクルした。
【００５４】
DERA変種のタンパク質発現および精製
プラスミドを、エレクトロコンピテントなBL21(DE3)に形質転換し、および1mL SOC培地中37℃で1時間の増殖を施した。これらの形質転換体(10〜200μL)を、LBkanプレート上に播種し、37℃で一晩インキュベーションした。開始培養物を、個々のコロニーを採取することにより調製し、10μg/mLカナマイシン(kan)を含有する100mLのLuria-Bertani(LB)開始培地に接種し、37℃、220rpmで一晩増殖した。開始培養物を用い、1LのLBkanに接種した。タンパク質発現を、最終濃度0.5mMまでのイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)の添加により、OD600＝0.6〜0.8に誘導した。細胞を、4℃、8000rpmで10分間の遠心により、誘導後6時間で収集し、-78℃で保存した。細胞ペレットを、氷上で冷却した100mMリン酸、200mM塩化ナトリウム(pH7.5)の25mL中に再浮遊した。これらの細胞を、3回、1500psi(103N/mm2)に加圧しその後周囲圧力に開放したFrenchプレス(SLM Instrument社、ウルバナ、IL)を通過させることにより溶解した。細胞デブリを、4℃、14,000rpmで1時間の遠心によりペレット化した。上清を、0.2μm酢酸セルロース膜フィルター(Corning社)を通して濾過し、100mMリン酸、200mM塩化ナトリウム、5mMイミダゾール、5mMβ-メルカプトエタノールのpH7.5緩衝液で予め平衡とした床容量2.5mLを有するNi2+-NTA-アガロースカラム上に負荷した。このカラムを、100mMリン酸、200mM塩化ナトリウム、20mMイミダゾール、5mMβ-メルカプトエタノールのpH7.5緩衝液40mLで洗浄した。その後結合した酵素を、100mMリン酸、200mM塩化ナトリウム、20mMイミダゾール、5mMβ-メルカプトエタノールのpH7.5緩衝液20mLで溶離し、並びに50mM塩酸トリエタノールアミン緩衝液(pH7.5)に対して4℃で透析した。溶離した酵素は、SDS-PAGEにより分析し、全ての場合において純度＞95％で認められた。酵素溶液はアリコートとし、液体窒素中で凍結し、使用前まで-78℃で貯蔵した。酵素濃度は、検量標準としてウシ血清アルブミンを用いるBradford法(Bio-Lad社)により決定した。
【００５５】
DERA切断(逆アルドール)アッセイ
酵素活性を、グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ(α-GPD, EC 1.1.18)、およびトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI, EC 5.3.1.1)を使用する標準の共役活性アッセイによりモニタリングした。酵素活性は、GPD/TPI(1.6U/mL Sigma社G-1881)共役酵素システムを用い、50mM塩酸トリエタノールアミン緩衝液(pH7.5)中の0.01〜4mM D-2-デオキシリボース-5-リン酸(DRP)または5〜200mM D-2-デオキシリボースにより、25℃で、0.3mM NADH存在下、340nm、ε＝6220M-1cm-1でモニタリングしたNADH濃度の減少率を観察することにより、逆-アルドール分解方向においてアッセイした。
【００５６】
DERA付加(アルドール)アッセイ
DERA酵素活性を、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ(YADH, EC1.1.1.1)による共役エンドポイントアッセイにより、残留しているアセトアルデヒド濃度を決定することにより、アルドール合成方向においてアッセイした。N2で脱気した50mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.5)中の、嫌気性条件下で新たに蒸留した200mMアセトアルデヒド、200mM(±)-グリセルアルデヒドおよび0.2mg/mL DERAを、22℃のN2大気下でインキュベーションした。様々な時点で、50μLのアリコートを採取し、60％の過クロム酸15μLで反応停止した。氷上で5分間インキュベーションした後、1Mトリエタノールアミン緩衝液(pH7.5)890μLおよび4N NaOH 45μLを、この溶液が中和されるまで添加した。その後この溶液20μLを、残留しているアセトアルデヒドについてアッセイした。残留しているアセトアルデヒドの量を、消費されたNADHモル数と同等視し、0.3mM NADH、20μL前記反応停止した反応アリコート、および0.05mg/mL YADHを含有するトリエタノールアミン(pH7.5)緩衝液中で決定した。DR生成物形成も、酢酸エチルのランニング溶媒およびp-アニスアルデヒド発色染色剤によるシリカゲルTLCにより確認した。Rf：グリセルアルデヒド＝0.04(褐色染色) Rf：2-デオキシリボース＝0.1(青色染色)。
【００５７】
大腸菌SELECT株の構築
最初にDC81を、JC1552(aceF+ leu-)上で増殖したP1で形質導入し、および酢酸塩なしで増殖することができる形質導入体を、ロイシン存在下で選択した。DC119は、そのようなaceF+形質導入体の一つであり、これは、JC1552からleu突然変異も受け取りおよびその結果ロイシンを必要としている。次に、DC119を、DC34(ΔaceEF leu+)上で増殖したP1で形質導入し、ロイシンなしで増殖することができる形質導入体を、炭素源としてコハク酸塩(0.4％)＋酢酸塩(0.2％)を含有する最小培地E上で選択した。形質導入体は、コハク酸塩単独では増殖できないもの、すなわち、炭素源としてコハク酸塩(0.4％)＋酢酸塩(0.2％)を受け取るものについて、スクリーニングした。形質導入体は、酢酸塩単独では増殖できないもの、すなわち、Δ(aroP-aceEF)15欠失を受け取り、その結果外来性酢酸塩を必要とするものについて、スクリーニングした。DC489は、そのような形質導入体であった。次に大腸菌株SELECTを、Novagen社λDE3溶原化キット(69734-3)を製造業者の指示に従い用い、DC489のλDE3溶原菌を作成することにより、調製した。大腸菌株DC81、DC34、およびJC1552を、SELECT構築のために使用した。
【００５８】
液体選択条件の開発
プラスミドは、エレクトロコンピテントなSELECT細胞に形質転換し、0.1％酢酸ナトリウムを補充したSOC培地1mL中で、37℃で1時間増殖を施した。その後これらの細胞を、4℃で、3000rpm、10分間の遠心により収集した。上清を廃棄し、ペレットを、穏やかにM9 0.2％グルコース中に再懸濁した。これを2回繰り返した。その後細胞を、M9 0.2％グルコース、0.01mM IPTG、10μg/mLカナマイシン中に、OD600＝0.001となるように希釈した。その後割当て分(appropriation)補充した基質(酢酸ナトリウム、D-2-デオキシリボース-リン酸またはD-2-デオキシリボース)を、0.1質量％の濃度で添加した。37℃での適当な選択時間、典型的には24〜72時間の後、細胞を遠心により収集し、それらの増幅されたプラスミドを単離した。
【００５９】
分子モデリング
DERA酵素S238D突然変異を、プログラムO1および通常の回転異性体位置に配置された側鎖を用い、作成した。図5A-Dに示された生成物分子は、InsightII(2000)(Accelr s社)のBuilderモデルおよび最小化されたエネルギーを用いて作成した。これらは、存在するシッフ塩基結晶構造(PDBコード1JCJ )を基に酵素活性部位に手作業により、配置した。タンパク質残基上の水素原子および関連する水の酸素原子を、Biopolmerモジュールを用いて加えた。エネルギー極小化のために、CVFF力場を使用した。全ての極小化は、距離依存した誘電率を使用し、Discoverモジュールで行った。極小化の第一ラウンドにおいて、全ての非水素原子は、固定された位置に拘束され、最急勾配法および共役勾配法によるエネルギー極小化を、100回のイテレーションの各々について行った。その後、生成物分子およびAsp238の拘束を解放し、および極小化法を繰り返した。
【００６０】
連続不斉アルドール反応
3-アジドプロピン(propin)アルデヒド(600mg, 6.0mmol)を含有する混合物へ、変種S238D DERA(DRPを基質として使用するアッセイを基に約200U)を含む緩衝液(36mL、pH＝7.5)を添加した。得られた溶液を、暗所でアルゴン下6日間攪拌した。この反応を、2容量のアセトンで反応停止した。その後混合物を、0℃で1時間攪拌し、遠心し、沈殿した酵素を除去した。水相を、真空下で濃縮し、その残渣を、短いシリカカラムを通過させEtOAcで溶離した。溶離液を、濃縮し、粗生成物(560mg, 3.0mmol)を得た。
【００６１】
H2O(20mL)中の前記ラクトール(560mg, 3.0mmol)およびBaCO3(0.8g, 4.0mmol)の混合物へ、0℃で、新たに開封したBr2(180μL, 3.4mmol)をゆっくり添加した。この混合液を、暗所で一晩攪拌した。濾過後、水を真空で除去した。フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、1:1ヘキサン／BtOAc)による残渣の精製は、生成物(391mg, 2工程について35％)を生じた。
2005520510.tif 000017
【００６２】
実施例2
新規ピラノースシントンのアルドラーゼ-触媒した不斉合成
一般的方法
全ての反応は、特に記さない限りは、アルゴン大気下、無水条件下で乾燥した新たに蒸留した溶媒を用い行った。テトラヒドロフラン(THF)およびジエチルエーテルを、ナトリウム-ベンゾフェノンから、並びにジクロロメタン(CH2Cl2)およびトルエンは、水素化カルシウムから蒸留した。全ての試薬は、最高の市販品質を購入し、並びに特に記さない限りは、更に精製することなく使用した。Merck社のシリカゲル60(230〜240メッシュ)を、クロマトグラフィーにおいて使用した。
【００６３】
高解像度質量分析(HRMS)を、マトリックスとしてNBAを用いる高速原子衝撃(FAB)条件下のVG ZAB-ZSE装置で、またはマトリックスとしてDHBを用いるIONSPEC-FTMS分光計(MALDI)で、記録した。1H NMRスペクトルおよび13C NMRを、Bruker AMX-500、またはAMX-600装置で行った。IRスペクトルは、Perkin-Elmer 1600シリーズのFT-IR分光計で記録した。旋光は、Perkin-Elmer 241旋光計で記録した。
【００６４】
DERAにより触媒された一般的酵素反応：0.1Mアクセプターアルデヒドおよび0.3Mドナー(アセトアルデヒドまたはアセトン)を含有する100mL緩衝液(0.1M, KH2PO4, pH＝7.5)に、DERA 3000ユニットを添加した。得られた溶液は、アルゴン下、暗所で3〜6日間攪拌した。この反応を、2容量のアセトンの添加により、停止した。その後この混合物を、0℃で1時間攪拌し、遠心し、沈殿した酵素を除去した。水相を、真空下で濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、EtOAc:ヘキサン1:2〜4:1)により精製した。
【００６５】
2005520510.tif 000018
【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
2005520510.tif 000023
【００７１】
ヒドロピロリジン8の調製：メタノール10ml中の化合物3b(57mg, 0.36mmol)の溶液に、Pd/Cの5mgを添加した。この混合物を、50psi(0.34N/mm2)のH2下で一晩水素化した。セライトを通して濾過した後、この混合物を真空で濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、2:1 EtOAc：ヘキサン)により精製し、化合物8(35mg、85％)を生じた。
2005520510.tif 000024
【００７２】
2005520510.tif 000025
【００７３】
ラクトン9の調製：H2O(6.0ml)中の化合物2b(60mg, 0.44mmol)およびBaCO3(140mg, 0.71mmol)の0℃の混合液に、新たに開封したBr2(30μl, 0.57mmol)をゆっくり添加した。得られた混合物を、暗所で一晩攪拌した。濾過後、水を真空で除去した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、2:1 EtOAc:ヘキサン)による精製は、透明な油状物として化合物9(44mg、75％)を生じた。
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【００７４】
2005520510.tif 000027
【００７５】
ラクトン10の調製：H2O(600ml)中のラクトール5b(14.5g, 0.11mol)およびBaCO3(30g, 0.15mol)の0℃の混合液に、新たに開封したBr2(5.8ml, 0.11mol)をゆっくり添加した。得られた混合物を、暗所で一晩攪拌した。濾過後、水を真空で除去した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、2:1 EtOAc:ヘキサン)による精製は、透明な油状物としてラクトン10(7.9g、62％)を生じた：
2005520510.tif 000028
【００７６】
2005520510.tif 000029
【００７７】
化合物11aの調製：無水THF(50ml)中のジイソプロピルアミン(4.7ml, 33.5mmol)の攪拌溶液に、n-ブチルリチウム(21.1ml, ヘキサン中1.6N, 33.7mmol)を0℃で添加した。この混合液を、20分間攪拌し、その後-78℃に冷却し、THF(50ml, 2x10ml THFで洗浄)およびHMPA(14.1ml)中の化合物10(1.88g, 14.5mmol)の溶液を、ゆっくり添加した。この溶液を、2時間攪拌し、その後n-ブチルリチウム(17.6ml, 28.2mmol)の第二の部分を添加し、得られた混合物を更に30分間攪拌した。新たに蒸留した臭化アリル(6.5ml, 75mmol)をゆっくり添加した。この反応混合液の色は、透明から、緑色、褐色、黒色と変化し、および最後には透明に戻った。36時間後、AcOH(3.8ml, 66mmol)を添加し、反応を停止した。その後水(100ml)を添加した。ほとんどのTHFを除去した後、この混合液を、CH2Cl2(4x150ml)で抽出した。一緒にした有機相を、Na2SO4上で乾燥し、真空で濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、3:1 ヘキサン:EtOAc)により精製し、アルキル化されたラクトン11a(1.88g, 85％)を得た。出発ラクトン0.22g(12％)を回収した。
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【００７８】
2005520510.tif 000031
【００７９】
2005520510.tif 000032
【００８０】
ジオール酸14の調製：200ml無水メタノール中の化合物11a(1.0g, 6.5mmol)の溶液に、MeONa(3.0ml, 25％, 13mmol)を-35℃で添加した。この混合液を、-30℃で15時間攪拌した。Dowex(H+型)でpHを7.0に調節した後、濾過し、メタノールを蒸発させた。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、透明油状物として化合物14(0.79, 60％)および出発材料(0.14g, 14％)を生じた。
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【００８１】
2005520510.tif 000034
【００８２】
化合物25の調製：3mlの無水DMF中の化合物14(195mg, 0.97mmol)およびPMBジメチルアセタール(0.6ml, 2.5mmol)の混合液に、カンファースルホン酸(7mg)を0℃で添加した。この反応液を、一晩攪拌し、飽和NaHCO3溶液0.2mlで反応停止した。溶媒を真空で除去した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、トルエン)により精製し、メチルエステル25(294mg, 95％)を得た。
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【００８３】
2005520510.tif 000036
【００８４】
化合物26の調製：無水エーテル(130ml)中のLiAlH4(550mg, 95％, 14mmol)の懸濁液に、エーテル20ml(10ml+10mlで洗浄)中の化合物25(1.27g, 3.70mmol)の溶液を0℃でゆっくり添加した。この混合液を、室温で2時間攪拌し、水1mlおよび1N NaOHの2mlで反応停止した。この混合物を、100mlエーテルで希釈し、およびエーテル(3x200ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、真空で濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、3:2ヘキサン：EtOAc)により精製し、透明な油状物として化合物26(0.98g, 90％)を得た。
2005520510.tif 000037
【００８５】
2005520510.tif 000038
【００８６】
化合物27の調製：メタンスルホニルクロリド(0.5ml, 6.5mmol)を、トリエチルアミン(1.2ml, 8.4mmol)を含有する無水CH2Cl2(100ml)中の化合物26(0.95g, 3.2mmol)の攪拌溶液に、アルゴン下0℃で、ゆっくり添加した。この溶液を、室温で一晩攪拌し、飽和NaHCO3溶液50mlで反応停止した。その後この混合液を、CH2Cl2(3x200ml)で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、真空で濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、3:2 ヘキサン：EtOAc)で精製し、メシル化された化合物27(1.13, 94％)を得た。
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【００８７】
2005520510.tif 000040
【００８８】
化合物15の調製：エーテル30ml中の前記化合物27(635mg, 1.71mmol)の溶液を、LiAlH4(391mg, 95％, 10mmol)により、0℃で処理した。この懸濁液を、室温で2時間攪拌し、水(1ml)および1N NaOH(2ml)で反応停止した。得られた混合物を、更に30分間攪拌し、水(20ml)を添加した。これを、エーテル(3x50ml)で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、真空で濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)で精製し、透明な油状物15(416mg, 88％)を得た。
2005520510.tif 000041
【００８９】
2005520510.tif 000042
【００９０】
化合物28の調製：0℃のトルエン10ml中の化合物15(201mg, 0.73mmol)の溶液に、DIBAL(1.5M, 1.05mmol)0.7mlを添加した。混合物を、室温で一晩攪拌した。その後反応を、水により停止し、EtOAc(4x30ml)で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、真空で濃縮した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、7.3ヘキサン:EtOAc)で精製し、化合物28(187mg, 93％)を得た。
2005520510.tif 000043
【００９１】
2005520510.tif 000044
【００９２】
化合物16の調製：150mlのCH2Cl2中の前記化合物28(1.0g, 3.59mmol)の溶液に、ピリジン(0.63ml, 7.8mmol)を0℃で添加した。その後Dens-Martinペルヨージナン(2.8g, 6.5mmol)を添加した。次に氷浴を取り外し、この混合液を室温で3時間攪拌した。反応を、Na2S2O3/NaHCO3(1:1)100mlで停止し、CH2Cl2(3x200ml)で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、化合物16(953mg, 96％)を生じた。
2005520510.tif 000045
【００９３】
2005520510.tif 000046
【００９４】
化合物17の調製：無水THFの2.5ml中のNaH(24mg、60％分散体、0.6mmol)の懸濁液に、THFの1.2ml中のt-ブチルβ-ケトエステル(99.4mg, 0.53mmol)を0℃で滴下した。この混合液を、10分間その温度で攪拌し、その後n-ブチルリチウム(0.35ml, 1.6M, 0.56mmol)を添加した。黄色溶液を、更に10分間0℃で攪拌した。2mlのTHF(追加の0.5mlで洗浄)中の化合物16(159mg, 0.58mmol)の溶液を、滴下した。得られた混合液を、攪拌しながら室温までゆっくり温めた。この反応を、20分後に飽和NH4Cl(10ml)で停止し、CH2Cl2(3x30ml)で抽出した。一緒にした有機相をブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過しおよび真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、16:1から4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、透明な油状物として縮合生成物17(186mg, 70％, 8:1dr.)を生じた。
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【００９５】
2005520510.tif 000048
【００９６】
化合物29の調製：3mlのCH3CN中のテトラメチルアンモニウムトリアセトキシボロヒドリド(1.28g, 4.87mmol)の溶液に、AcOHを3ml添加し、この混合液を室温で30分間攪拌し、-30℃に冷却し、3mlのCH3CN(1mlで洗浄)中の化合物17(280mg, 0.61mmol)の溶液で処理した。この反応液を、-30℃で28時間攪拌し、飽和NaHCO3溶液30mlで反応停止した。混合物を、CH2Cl2(3x100ml)で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、6:1ヘキサン：EtOAc)による精製は、ジオール29(233mg, 83％, 10:1dr.)を生じた。
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【００９７】
2005520510.tif 000050
【００９８】
化合物30の調製：無水CH2Cl2の70ml中の化合物29(310mg, 0.668mmol)の溶液を、2,6-ルチジン(170ul、1.5mmol)に添加し、この混合物を-78℃に冷却し、その後TBSOTf(190u1, 0.83mmol)を滴下した。30分後、飽和NaHCO3(30ml)を添加した。この混合物を、CH2Cl2(3x100ml)で抽出した。有機相をブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、5:1ヘキサン:EtOAc)で精製し、透明な油状物としてTBSシリルエーテル30(386mg, 100％)を得た。
2005520510.tif 000051
【００９９】
2005520510.tif 000052
【０１００】
フラグメントAの調製：CH2Cl2の40ml中の前記化合物30(386mg, 0.67mmol)の溶液に、ピリジン(1.3ml, 16mmol)を0℃で添加した。その後Dess-Martinペルヨージナン(0.56g, 1.3mmol)を添加した。氷浴を取り外し、この混合液を室温で3時間攪拌した。反応を、Na2S2O3/NaHCO3(1:1)100mlで停止し、CH2Cl2(3x60ml)で抽出した。有機相を一緒にし、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、表題化合物(343mg, 90％)を生じた。
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【０１０１】
2005520510.tif 000054
【０１０２】
ビス-酢酸エステル31の調製：CH2Cl2の700ml中の化合物13(12.2g, 103mmol)およびピリジン(27ml, 0.33mol)を含有する溶液に、AcCl(22ml, 0.31mol)を0℃で添加した。氷浴を取り外し、この混合液を室温で30分間攪拌した。水(300ml)を添加し、混合液をCH2Cl2(3x500ml)で抽出した。有機相を一緒にし、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、3:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、ビス-酢酸エステル(19.8g, 95％)を生じた。
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【０１０３】
2005520510.tif 000056
【０１０４】
化合物32の調製：CH3CN(250ml, 1ml H2O)中のビス酢酸エステル31(2.19g, 11mmol)の冷却した溶液(0℃)に、BF3・Et2O(2.1ml, 17mmol)を添加した。2.5時間後、反応を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(300ml)で停止した。ほとんどの有機溶媒を除去した後、残基をEtOAc(3x300ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過しおよび真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、ヘミアセタール32(1.45g, 84％)を生じた。
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【０１０５】
2005520510.tif 000058
【０１０６】
ジチアン(dithane)19の調製：その後ラクトール32(138mg, 0.86mmol)を、CH2Cl2の10ml中に溶解し、次にこの溶液に1,3-プロパンジチオール(200μl, 2.0mmol)を添加した。得られた混合液を、-73℃に冷却した。TiCl4(123μl, 1.12mmol)を添加した。30分後、この反応を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(5ml)により停止した。混合液を、CH2Cl2(3x50ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過しおよび真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、アルコール19(222mg, 97％)を生じた。
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【０１０７】
2005520510.tif 000060
【０１０８】
ケトン20の調製：150mlのCH2Cl2中の(COCl)2(1.5ml, 17mmol)の冷却した溶液(-78℃)に、DMSO(0.6ml, 8.5mmol)をゆっくり添加した。混合物を30分間攪拌した。10mlのCH2Cl2(追加の2x5mlで洗浄)中の化合物19(1.2g, 4.8mmol)の溶液を、前述の反応溶液に加えた。3時間後、トリエチルアミン(2.5ml, 18mmol)を添加し、混合液を室温までゆっくり温めた。その後水(100ml)を添加した。この混合物を、CH2Cl2(3x200ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、6:1〜5:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、化合物20(1.07g, 95％)を生じた。
2005520510.tif 000061
【０１０９】
2005520510.tif 000062
【０１１０】
化合物21の調製：THF(15ml)中のホスフィンオキシド(621mg, 2.0mmol)の冷却した溶液(-78℃)に、n-ブチルリチウム(1.5ml, 1.6M, 2.4mmol)を添加した。15分後、THFの5ml(2mlx2で洗浄)中の化合物20(372mg, 1.5mmol)の溶液を、ゆっくり添加した。冷却用ドライアイス浴を取り外し、反応混合物を、室温に温めた。飽和NH4Cl(20ml)溶液を添加し、反応を停止した。ほとんどのTHFを蒸発させた後、混合物をEtOAc(3x50ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、3:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、化合物21(452mg, 88％)を生じた。
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【０１１１】
2005520510.tif 000064
【０１１２】
フラグメントBの調製：ジチアン(dithane)21(268mg, 0.78mmol)の溶液を、CaCO3(105mg, 1.05mol)および水性Hg(ClO4)2(H2O中0.2M, 4.8ml, 0.96mmol)で処理した。この反応混合液を、室温で2時間攪拌し、エーテル30mlで処理し、10分間攪拌した。沈殿を濾過により除去し、濾液をH2O(30ml)で希釈し、エーテル(3x50ml)で抽出し、MgSO4上で乾燥した。溶媒を蒸発させ、残渣を生じた(220mg)。THF(3ml)中の(Ph3P+CH2I)I-(138mg, 2.6mmol)の溶液を、室温で、NaN(TMS)2(2.1ml, THF中1M溶液, 2.1mmol)に加えた。-78℃で、混合液を、HMPA(0.3ml, 1.8mmol)および前記粗アルデヒド残渣(3mlのTHF中220mg)で処理した。反応混合物を、室温に温め、1時間攪拌した。飽和NH4Cl(20ml)で反応停止した後、混合液を、エーテル(3x50ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、フラグメントB(175mg, 60％)を生じた。
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【０１１３】
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【０１１４】
化合物22の調製：1.0mlのTHF中のフラグメントA(58mg, 0.1mmol)の溶液に、9-BBN(THF中0.5M、0.4ml、0.2mmol)を添加した。3時間後、水(0.1ml)を反応混合液に添加した。分液フラスコにおいて、フラグメントB(48mg、0.13mmol)を、DMF(1.0ml)中に溶解した。激しく攪拌した後、CsCO3(60mg, 0.18mol)、Ph3As(5.6mg,0.018mmol)およびPdCl2(dppf)2(15mg, 0.018mmol)を、順次添加した。2分間攪拌した後、反応停止したフラグメントA溶液を、フラグメントBのDMF溶液に迅速に加えた。8時間後、反応混合液を、飽和NH4Cl溶液に注ぎ、CH2Cl2(3x50ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、Suzukiカップリング生成物22(54mg, 65％)を生じた。
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【０１１５】
2005520510.tif 000068
【０１１６】
化合物33の調製：1.5mlのMeOH中の化合物22(10mg, 0.012mmol)の溶液に、MeONaの触媒量を0℃で添加した。氷浴を取り外し、溶液を室温で2時間攪拌し、NH4Clの10mlで反応停止した。混合物を、CH2Cl2(3x30ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)による精製は、アルコール33(8.1mg, 85％)を生じた。
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【０１１７】
2005520510.tif 000070
【０１１８】
化合物23の調製：1mlのCH2Cl2中の化合物33(8mg, 0.01mmol)および2,6-ルチジン(35μl, 0.3mmol)の混合物に、-78℃で、TMSOTf(35μl, 0.2mmol)を滴下した。ドライアイス浴を取り外し、混合液を室温で一晩攪拌した。飽和炭酸水素ナトリウム溶液(3ml)を添加した。混合物を、CH2Cl2(3x30ml)で抽出し、一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。粗生成物を、短いシリカパッドを通過させ(1:1ヘキサン:EtOAc)、並びに溶離液を濃縮した。2mlのMeOH中の残渣(6.6mg, 0.019mmol)を、1N NaOHの3滴で処理した。3時間後、1N HClの3滴を添加し、この溶液を中性に調節した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、4:1ヘキサン:EtOAc)により精製し、化合物23(5.7mg, 78％)を生じた。
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【０１１９】
2005520510.tif 000072
【０１２０】
化合物24の調製：THF(400μl)中の化合物23(5.7mg, 0.0078mmol)の溶液に、トリエチルアミン(21μl, 0.015mmol)および2,4,6-トリクロロベンゾイルクロリド(19μl, 0.012mmol)を添加した。この混合物を、室温で20分間攪拌し、トルエン(0.6ml)で希釈し、4時間かけて、10mlトルエン中のDMAP(64mg, 0.53mmol)の溶液へゆっくり添加した。添加が完了した後、この混合物を更に1時間攪拌し、溶媒を真空で蒸発させた。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、6:1〜3:1ヘキサン:EtOAc)により精製し、化合物24(4.7mg, 85％)を生じた。
2005520510.tif 000073
【０１２１】
2005520510.tif 000074
【０１２２】
化合物34の調製：ジクロロメタン(5％H2O含有、2ml)中の化合物24(4.7mg, 0.0066mmol)に、DDQ(4.0mg, 0.018mmol)を室温で添加した。3時間後、混合液を飽和NaHCO3溶液で反応停止した。混合物を、CH2Cl2(3x20ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、5:1〜3:2ヘキサン:EtOAc)による精製は、アルコール34(3.9mg, 99％)を生じた。
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【０１２３】
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【０１２４】
エポチロンCの調製：プラスチック製バイアル中の無水THF中の化合物34(3.9mg, 0.0066mmol)の溶液に、HF・ピリジン錯体0.5mlを0℃で添加した。この混合物を、室温で一晩攪拌し、次にCHCl3 0.3mlで希釈し、これを予め冷却した飽和NaHCO3溶液(10ml)にゆっくり加えた。反応停止した混合物を、CHCl3(3x30ml)で抽出した。一緒にした有機相を、ブラインで洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、および真空で濃縮した。残渣のフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、3:1〜7:3ヘキサン:EtOAc)による精製は、アルコールエポチロンC(3.1mg, 95％)を生じた。
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【０１２５】
2005520510.tif 000078
【０１２６】
エポチロンAの調製：1mlのCH2Cl2中のエポチロンC(3.0mg, 0.0064mol)の溶液に、新たに調製した3,3-ジメチルジオキシラン(アセトン中0.5ml、0.045mmol)を添加した。得られた溶液を、-30℃で3時間冷却した。その後アルゴン流れを、この溶液を通して泡立て、過剰なDMDOを除去した。残渣を、フラッシュクロマトグラフィー(シリカ、6:4〜1:1ヘキサン:EtOAc)で精製し、エポチロンA(1.4mg, 45％)を生じた。
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【０１２７】
本発明は、前記実施例を参照して説明されているが、その修飾および変更は、本発明の精神および範囲内に包含されることは理解されると思われる。従って本発明は、前記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図1は、D-2-デオキシリボース-5-リン酸を生成するための、天然のドナーアセトアルデヒドとアクセプターD-グリセルアルデヒド-3-リン酸の間の、DERAが触媒したアルドール反応の機序を図示している。
【図２】図2は、シッフ塩基形成のためのLys残基を示す、8種の公知のアルドラーゼαβバレルを重ねて図示している。
【図３】図3は、DERAカルビノールアミン複合体の立体視を図示している。
【図４】図4A〜Dは、シッフ塩基錯体構造(PDBコード1JCJ)を基にしたDERA生成物を図示している。
【図５】図5は、デザインされた基質のDERA触媒した合成を図示している。
【図６】図6は、代謝が操作されたSELECT(Δace、adhC、DE3)大腸菌株が、細胞増殖に2-炭素補充を必要とすることを図示している。
【図７】図7は、SELECTを使用する選択プロトコールの概念の証明を概略的に図示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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