(57)【要約】本発明は、NHS-PEG-VS型のスペーサー化合物によって固体支持体にオリゴヌクレオチドプローブを共有結合固定するための活性バイオチップ作製法、およびその方法により作製されるバイオチップに関する。本発明はさらに、バイオチップを使用した、試料中の核酸を検出するための方法またはオリゴヌクレオチドプローブに特異的に結合できる化合物をスクリーニングするための方法に関する。本発明は同様に、バイオチップを含む、試料中の核酸を検出するためのまたは定量的にもしくは定性的に分析するための検出キット、ならびに核酸の精製のための、核酸をシークエンシングするための、遺伝子発現の定性的もしくは定量的分析のための、または遺伝子多型の研究および検出のための親和性基質としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドプローブを共有結合的に付着させるための活性バイオチップ作製法であって、該バイオチップは、チオールまたはアミン官能基であらかじめ官能性を持たせた固体支持体を含み、適当な条件の下で、式(I)のスペーサー化合物NHS-PEG-VSを、該官能性を持たせた支持体に共有結合的に付着させる段階を含むことを特徴とする方法：
2005517902.tif 000011
式（I）中、PEGは式HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OHのポリ(エチレングリコール)を示し、
上記式中のnは、式(I)の化合物NHS-PEG-VSの分子量が500〜5000、好ましくは200〜4000、より好ましくは約3400となるように選択される整数であり、
該スペーサー化合物は、該官能性を持たせた支持体のチオール官能基と式(I)のスペーサー化合物のVS(ビニルスルホン)官能基との間の相互作用から生じる、または該官能性を持たせた支持体のアミン官能基と式(I)のスペーサー化合物のNHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)官能基との間の相互作用から生じる共有結合を介して、該固体支持体に付着する。
【請求項２】
式(I)の化合物NHS-PEG-VSの分子量が約3400であることを特徴とする、請求項1記載の活性バイオチップ作製法。
【請求項３】
固体支持体が、ガラス製、プラスチック製、Nylon(登録商標)製、Kevlar(登録商標)製、シリコーン製、シリコン製、またはポリサッカライド製の、および好ましくはガラス製の、固体支持体から選択されることを特徴とする、請求項1または請求項2記載の活性バイオチップ作製法。
【請求項４】
シラン化によってガラス製の固体支持体に官能性を持たせることを特徴とする、請求項3記載のバイオチップ作製法。
【請求項５】
付着させるオリゴヌクレオチドプローブに末端のチオール官能基で官能性を持たせる場合には、固体支持体にはアミン官能基で官能性を持たせることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の活性バイオチップ作製法。
【請求項６】
アミノシラン、好ましくはN-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシランの存在下で、固体支持体に官能性を持たせることを特徴とする、請求項5記載の活性バイオチップ作製法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドプローブに末端のアミン官能基で官能性を持たせる場合には、固体支持体にはチオール官能基で官能性を持たせることを特徴とする、請求項6記載の活性バイオチップ作製法。
【請求項８】
メルカプトシラン、好ましくは(3-メルカプトプロピル)-トリメトキシシランの存在下で、固体支持体に官能性を持たせることを特徴とする、請求項7記載の活性バイオチップ作製法。
【請求項９】
以下の段階を含むことを特徴とする、末端のアミン官能基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブを共有結合的に付着させるための不活性バイオチップ作製法：
a) 請求項7または8記載の活性バイオチップ作製法により、バイオチップを活性化する段階；および
b) 固体支持体に付着させた式(I)のスペーサー化合物NHS-PEG-VSの遊離型NHS官能基を、水溶液、好ましくは精製水の存在下で加水分解する段階。
【請求項１０】
以下の段階を含むことを特徴とする、末端のアミン官能基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブを共有結合的に付着させるための再生バイオチップ作製法：
A) 請求項9記載の不活性バイオチップ作製法により、バイオチップを不活性化する段階；
B) 最初に存在していた遊離型NHS官能基を加水分解した後にスペーサー化合物の遊離末端に得られるカルボン酸基、1-エチル-3[3-(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびNHSの存在下でバイオチップを再生させる段階；および、必要に応じて、
C) 段階B)で得られたバイオチップを、好ましくは脱イオン水中で洗浄する少なくとも一段階。
【請求項１１】
得られたバイオチップを凍結、乾燥、または凍結乾燥させる段階を含むことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項記載の活性、不活性または再生バイオチップ作製法。
【請求項１２】
以下の段階を含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップの作製法であって、
α) 請求項1〜8のいずれか一項記載の方法により活性バイオチップを作製する、または請求項10記載の方法により再生バイオチップを作製する段階；
β) 固体支持体にアミン官能基で官能性を持たせている場合は、チオール官能基であらかじめ官能性を持たせた該オリゴヌクレオチドプローブを、または固体支持体にチオール官能基で官能性を持たせている場合は、アミン官能基であらかじめ官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブを、適当な条件の下で、共有結合によって堆積させかつ付着させる段階；および、必要に応じて、
γ) 支持体を適当な条件の下で、好ましくは脱イオン水中で洗浄する少なくとも一段階により、支持体に付着しなかったオリゴヌクレオチドプローブを除去する段階。
【請求項１３】
以下の段階をさらに含むことを特徴とする、チオール官能基であらかじめ官能性を持たせかつ請求項12記載のオリゴヌクレオチドプローブで被覆された固体支持体を含むバイオチップの作製法：
δ) オリゴヌクレオチドプローブのアミン官能基と相互作用しなかったスペーサー化合物のNHS官能基を、アミノ化合物の存在下、適当な条件の下で不活性化する段階。
【請求項１４】
段階δ)のスペーサー化合物のNHS官能基を不活性化するための化合物が、第一級アミンを有するアミノ化合物、好ましくはエタノールアミンまたはメトキシ-PEG-NH2から選択されることを特徴とする、請求項13記載のバイオチップ作製法。
【請求項１５】
以下の段階をさらに含むことを特徴とする、アミン官能基であらかじめ官能性を持たせかつオリゴヌクレオチドプローブで被覆された固体支持体を含む、請求項12記載のバイオチップの作製法：
δ) 陰イオン化合物、またはアミン基との共有結合を構築できかつ適当な条件の下で中性もしくは陰性の種を生成できる化合物の存在下、好ましくはアジピン酸メチルN-スクシンイミジル(MSA)の存在下、適当な条件の下で表面電荷を還元する段階。
【請求項１６】
得られるバイオチップを、乾燥した場所、暗所、および/または不活性雰囲気において保存する段階を含むことを特徴とする、請求項12〜15のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップの作製法。
【請求項１７】
ヌクレオチドプローブがDNAまたはRNAであることを特徴とする、請求項1〜16のいずれか一項記載の、活性、不活性、もしくは再生バイオチップ、またはプローブで被覆されたバイオチップの作製法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドプローブが、一本鎖DNAまたは一本鎖RNAであることを特徴とする、請求項17記載のバイオチップ作製法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドプローブが、15〜7000 bpのサイズのDNAまたはRNAであることを特徴とする、請求項17または18記載のバイオチップ作製法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドプローブが、直径20 μm〜500 μmのスポットの形で堆積することを特徴とする、請求項12〜19のいずれか一項記載のバイオチップ作製法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドプローブのスポット数が、2〜105個であることを特徴とする、請求項20記載のバイオチップ作製法。
【請求項２２】
チオールまたはアミン官能基であらかじめ官能性を持たせた固体支持体を含み、式(I)のスペーサー化合物NHS-PEG-VSを含むことを特徴とするバイオチップ：
2005517902.tif 000012
式（I）中、PEGは式HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OHのポリ(エチレングリコール)を示し、
上記式中のnは、式(I)の化合物NHS-PEG-VSの分子量が500〜5000、好ましくは200〜4000、およびより好ましくは約3400となるように選択される整数であり、
該スペーサー化合物は、該官能性を持たせた支持体のチオール官能基と式(I)のスペーサー化合物のビニルスルホン官能基との間の相互作用から生じる、または該官能性を持たせた支持体のアミン官能基と式(I)のスペーサー化合物のNHS官能基との間の相互作用から生じる共有結合を介して、該固体支持体に付着する。
【請求項２３】
チオールまたはアミン官能基であらかじめ官能性を持たせ、式(I)のスペーサー化合物の遊離型NHS官能基とオリゴヌクレオチドプローブのアミン官能基との間の相互作用から生じる、または式(I)のスペーサー化合物の遊離型ビニルスルホン官能基とオリゴヌクレオチドプローブのチオール官能基との間の相互作用から生じる共有結合を介して該固体支持体に付着させた、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブをさらに含むことを特徴とする、請求項22記載のバイオチップ。
【請求項２４】
付着したオリゴヌクレオチドプローブが、一本鎖DNAまたは一本鎖RNAであることを特徴とする、請求項23記載のバイオチップ。
【請求項２５】
付着したオリゴヌクレオチドプローブが、15〜7000 bpのサイズのDNAまたはRNAであることを特徴とする、請求項23または24記載のバイオチップ。
【請求項２６】
オリゴヌクレオチドプローブが、直径20 μm〜500 μmのスポットの形で堆積しすることを特徴とする、請求項22〜25のいずれか一項記載のバイオチップ。
【請求項２７】
バイオチップに堆積したオリゴヌクレオチドプローブのスポット数が、2〜105個であることを特徴とする、請求項22〜26のいずれか一項記載のバイオチップ。
【請求項２８】
固体支持体が、ガラス製、プラスチック製、Nylon(登録商標)製、Kevlar(登録商標)製、シリコーン製、シリコン製の、および好ましくはシラン化ガラス製の、固体支持体から選択されることを特徴とする、請求項22〜27のいずれか一項記載のバイオチップ。
【請求項２９】
請求項1〜11のいずれか一項記載の方法により得られる活性、不活性、または再生バイオチップ。
【請求項３０】
請求項12〜21のいずれか一項記載の方法により得られる、オリゴヌクレオチドプローブまたはペプチドプローブで被覆されたバイオチップ。
【請求項３１】
試料中の核酸を検出するための、請求項22〜30のいずれか一項記載のバイオチップの使用。
【請求項３２】
請求項22〜30のいずれか一項記載のバイオチップを含むことを特徴とする、試料中の核酸を検出するための、または定性的にもしくは定量的に分析するためのキット。
【請求項３３】
以下を含むことを特徴とする、試料中の核酸を検出するための方法：
a) 検出が所望されている核酸を含む試料を、請求項22〜28および30のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチドプローブで被覆したバイオチップに、該オリゴヌクレオチドプローブとこれらの標的核酸とを特異的にハイブリダイズさせる条件下で堆積させる段階；
b) ハイブリダイゼーションにより捕捉されなかった試料中の核酸を除去するため、必要に応じて、適当な条件の下、段階a)で得られたバイオチップを洗浄する段階；および
c) ハイブリダイゼーションによりバイオチップに捕捉された核酸を検出する段階。
【請求項３４】
検出が所望されている核酸の、末端のうちの一端が、検出可能なシグナル、好ましくは蛍光により検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に発生できる標識によりあらかじめ標識されていることを特徴とする、請求項33記載の、試料中の核酸を検出するための方法。
【請求項３５】
検出が所望されている核酸の少なくとも2つが、異なる標識によりあらかじめ標識されることを特徴とする、請求項34記載の、核酸を検出するための方法。
【請求項３６】
標識がシアニン誘導体、好ましくはシアニンのスルホン化誘導体、特にCy5もしくはCy3化合物、ナノ結晶、またはナノ粒子から選択されることを特徴とする、請求項34または35記載の、核酸を検出するための方法。
【請求項３７】
親和性基質としての、請求項22〜28および30のいずれか一項記載のバイオチップの使用。
【請求項３８】
核酸を精製するための、請求項22〜28および30のいずれか一項記載のバイオチップの使用。
【請求項３９】
核酸をシークエンシングするための、請求項22〜30のいずれか一項記載のバイオチップの使用。
【請求項４０】
遺伝子多型、特にSNPを検出するおよび/または研究するための、請求項22〜30および39のいずれか一項記載のバイオチップの使用。
【請求項４１】
遺伝子発現を定性的にまたは定量的に分析するための、請求項22〜28および30のいずれか一項記載のバイオチップの使用。
【請求項４２】
以下を含むことを特徴とする、所定のオリゴヌクレオチドに特異的に結合できる化合物または細胞をスクリーニングするための方法：
a) バイオチップは、その固体支持体に付着した該所定のオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブのスポットを含み、必要に応じて、該化合物または該細胞は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に発生できる標識で標識されており、該所定のオリゴヌクレオチドと該試験化合物または該試験細胞との特異的な結合が起こり得る条件下、該試験化合物を請求項22〜28および30のいずれか一項記載のバイオチップと接触させる段階；
b) 該所定のオリゴヌクレオチドに特異的に結合しなかった試験化合物または細胞を、適当な条件下での少なくとも1回の洗浄段階により、除去する段階；および
c) 該所定のオリゴヌクレオチドを含有するスポットで化合物または該細胞のシグナルが検出され、必要に応じて、その化合物または該細胞を選別することによって、該所定のオリゴヌクレオチドに特異的に結合した化合物または該細胞を選別する段階。
【請求項４３】
請求項22〜30のいずれか一項記載のバイオチップを含む、診断用の機器または装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、NHS-PEG-VS型のスペーサー化合物により、固体支持体にオリゴヌクレオチドプローブを共有結合的に付着させるための活性バイオチップ（activated biotip）作製法、および同様に、そのような方法により得られるバイオチップに関する。本発明には同様に、本発明のバイオチップを使用した、試料中の核酸を検出するための方法またはオリゴヌクレオチドプローブに特異的に結合できる化合物をスクリーニングするための方法が含まれる。本発明は同様に、そのようなバイオチップを含む、試料中の核酸を検出するためのまたは定量的にもしくは定性的に分析するためのキットに関し、そして核酸を精製するための、核酸をシークエンシングするための、遺伝子発現を定性的にもしくは定量的に分析するための、または遺伝子多型を研究するおよび検出するための親和性基質としての後者の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生物試料を分析するための技術または装置が多数開発されており、特にゲノミクスまたはプロテオミクスの発展後は、とりわけ、膨大な数の核酸またはタンパク質を平行して分析するための技術または装置が開発されている。
【０００３】
これらの技術または装置のなかで、バイオチップまたはDNAチップ(マイクロアレイまたはマクロアレイとも呼ばれる)ような、核酸のハイスループット分析を行うための支持体が多くの研究の目的となっている。
【０００４】
これらのバイオチップは、一般に固体の、官能性を持たせた（functionalyzed）支持体から作製することができる。その支持体には、所定の核酸(核酸プローブ)が共有結合により付着かつ局在化しており、その支持体の核酸プローブに、生物試料中で検出または同定したい核酸が、対合(または特異的ハイブリダイゼーション)によって、または親和性部位の識別によって、それぞれ特異的に結合するものと思われる。
【０００５】
DNAバイオチップに関する技術について記述している文献のなかで、とりわけ、以下が言及されうる：
- DNAチップに関して主に知られた技術を要約した概要が述べられた、J. Wang(Nucleic Acids Research, 28, 16, 3011〜3016, 2000)による総論、およびこれらのチップの設計者が直面する問題の一覧が作成された、Schubhartら(Nucleic Acids Research, 28, 10, e47, 2000)の文献；
- メルカプトシラン化表面とのスルフヒドリルまたはジスルフィド基修飾核酸のグラフト化反応について記述した、米国特許第6,030,782号として付与された特許文献、および自己組織化単分子膜(SAM)への複合分子DNA-チオールの取り込みによる、DNA提示表面の作製ついて記述した、Bamdad(Biophysical Journal, 75, 1997〜2003, 1998)による論文；
-国際公開公報第00/43539号として公開されている国際特許出願。この出願には、グラフト化反応密度の増大を可能とする多機能性ポリマー(「ポリマーブラシ」)を用いた、オリゴヌクレオチドのような分子の固定化が提案されている。これらのポリマーは、ヒドロキシエチルメタクリル酸、アクリルアミドまたはビニルピロリドンから得られる；
- 国際公開公報第00/36145号として公開されている国際特許出願。この出願には、その一部として、金属層タイプの基体上での、ピロールと官能化（functionalyzed）ピロールとのコポリマーの重合、官能化ピロールに対する架橋剤の結合、次いで生物学的プローブ(例えばオリゴヌクレオチド)の結合を含む、DNAチップを製造するための方法が記述されている。架橋剤は、二官能性としてもよく、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル官能基およびマレイミド官能基を有してもよい；
- 国際公開公報第98/20020号として公開されている国際特許出願。この出願には同様に、今度は、チオール基を含有する核酸を、このチオール基と反応する基を有する支持体と、選択的に架橋剤を用いて、接触させることによる、固体支持体上での核酸の高密度固定化が記述されている；
- 光の作用の下で反応する架橋剤を用いて、アミノ化ラテックスビーズ上にオリゴヌクレオチドを固定化するための方法について記述した、Penchovskyら(Nucleic Acids Research, 28, 22, e98, 2000)による論文；ならびに
- サーモディクス（Surmodics）社(この会社は、アミンで官能性を持たせたオリゴヌクレオチドを堆積させるためのスライドを製造している)の国際公開公報第99/16907号、国際公開公報第00/40593号および国際公開公報第00/44939号として公開されている国際特許出願。これらの出願には特に、ポリマーの一端に1つまたは複数の「光化学的に活性な」基(表面へのグラフト化反応のため)が、そしてもう一端に「熱化学的に活性な」基(官能性を持たせた核酸とのグラフト化反応のため)が付けられた、ポリマー骨格による、ガラスのような表面への核酸の付着が記述されている。
【０００６】
ヘテロ二官能性ポリ(エチレングリコール)(PEG)の使用に関しては、タンパク質に治療物質をグラフト化するためのスペーサー物質のようなその治療的利用について記述した、シェアウォーターポリマーズ（Shearwater Polymers）社(この会社はNektarとなった)の国際公開公報第95/13312号として公開されている国際特許出願には、注目すべきである。
【０００７】
既に作製されているまたは作製過程にあるバイオチップのなかで、化学的に合成できる、短い一本鎖配列(数十塩基)の核酸プローブでも、PCR産物に由来するもののような、二百〜数千塩基対に及ぶ、もっと長い二本鎖配列でも被覆できるようなものは、非常に興味深い対象である。
【０００８】
実際に、短い配列のオリゴヌクレオチドの場合、例えば、ポリリジンで覆われた支持体は、核酸が平面的な形でポリリジンに吸着されてしまい、堆積させる鎖が短いと、ハイブリダイゼーションの間に、配列への接近が困難となるかさらには不可能となるので、使用することができない。従って、次のハイブリダイゼーションにおいて、標的核酸による配列への接近を自由にさせるため、短いオリゴヌクレオチドを、その末端のうちの一端を介してグラフトできることが必要とされる。
【０００９】
数は少ないが、このグラフト化反応を共有結合によって可能とする、市販の支持体が存在する。一般に、これらのバイオチップで得られる結果は、以下のように完全に満足できるものではない：
- バックグラウンドノイズが大き過ぎる；
- ハイブリダイゼーションシグナルが弱すぎる；
- スミア(ハイブリダイゼーション後のスポット周辺の蛍光の輝線)がある；
- 表面湿潤特性が満足できるものではなく(堆積物は、あるスポットが別のスポットと重なり合うまで広がり、不均一性がリングの形となって現れる)、これによっては、グラフト化反応密度に基づいて反応することまたは(堆積時に、50〜200 μmの直径平均の)正確なサイズのスポットを得ることができない；
- グラフトされたプローブに可動性を与えるためのスペーサーアームがない。
【００１０】
このため、付着後、支持体による、三次構造(三次元立体構造)への影響がなく、かつ一本鎖核酸との間の特異的ハイブリダイゼーションを起こすのに十分な可動性が与えられるようなバイオチップが手に入ることはまた望ましい。
【００１１】
最後に、これらバイオチップ作製のための、ガラス等の支持体へオリゴヌクレオチドプローブを固定化するための手順が、単純(できれば、「光」化学による最小限の段階)、迅速(各「スポット」に使用される量が極めて少量であれば迅速に蒸発するので、この点はいっそう重要であり、それ故、迅速な共有結合グラフト化反応および過剰なプローブが表面から容易に除去され得る(輝線を残すことなく)その反応には必須である)および再現可能な手順であるようなバイオチップが手に入ることもまた望ましい。
【発明の開示】
【００１２】
既に刊行されている文献のなかで試験されかつ報告されているバイオチップに関して、これらのバイオチップのどれもが上記の基準に合致していないように思われる。
【００１３】
従って、これらの特性を有するバイオチップの必要性が依然として存在する。
【００１４】
これがまさに、本発明の目的である。
【００１５】
意外にも、下記式(I)のヘテロ二官能性スペーサー化合物NHS-PEG-VSを、あらかじめ官能性を持たせた固体支持体に共有結合により付着させて使用することで、この期待に合致するバイオチップを得ることが可能となることを本発明者らは証明した。
【００１６】
従って、本発明の目的は、オリゴヌクレオチドプローブを共有結合的に付着させるための活性バイオチップ作製法であって、バイオチップがチオールまたはアミン官能基であらかじめ官能性を持たせた固体支持体を含み、適当な条件の下で、式(I)のスペーサー化合物NHS-PEG-VSを官能性を持たせた支持体に共有結合的に付着させる段階を含むことを特徴とする。
2005517902.tif 000002
式（I）中、PEGは式HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OHのポリ(エチレングリコール)を示し、
上記式中のnは、式(I)の化合物NHS-PEG-VSの分子量が500〜5000、好ましくは2000〜4000、より好ましくは約3400となるように選択される整数である。
【００１７】
「活性バイオチップ（activated biotip）」という用語は、本明細書では、以下に定義されるような固体支持体であって、共有結合により、核酸プローブと相互作用可能な式(I)のスペーサー化合物を付着しているが、それらのプローブで被覆されることがない固体支持体を指すことを意図する。
【００１８】
「核酸」、「核酸プローブ」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書では区別なく使用され、核酸の断片または領域を定義することを可能とする、正確な一連の修飾または未修飾ヌクレオチドを指すことを意図し、それは、非天然ヌクレオチドを含んでいても含んでいなくてもよく、そして二本鎖DNA、一本鎖DNA、PNA(ペプチド性核酸に対して)またはLNA(ロックされた核酸)に相当していても、RNAのような、DNAの転写産物に相当していてもよい。
【００１９】
「オリゴヌクレオチドプローブ」または「核酸プローブ」という用語は、本明細書では、生物試料由来の、検出および同定したい標的核酸に向かい合うようにして、官能性を持たせた固体支持体上のスペーサー化合物に、共有結合により堆積され(またはスポットされ)かつ付着される、官能性を持たせたオリゴヌクレオチドを指すことを意図する。
【００２０】
好ましい態様として、本発明の活性バイオチップ作製法は、固体支持体が、ガラス製の、プラスチック製の、Nylon(登録商標)製の、Kevlar(登録商標)製の、シリコーン製の、シリコン製の、またはセルロースのような、ポリサッカライドもしくはポリ(ヘテロサッカライド)製の、および好ましくはガラス製の、固体支持体から選択されることを特徴とする。
【００２１】
この支持体は、いかなる形状(平面スライド、マイクロビーズなど)であってもよい。
【００２２】
特に好ましい態様として、本発明の活性バイオチップ作製法は、ガラス製の固体支持体にシラン化により官能性を持たせることを特徴とする。
【００２３】
同様に好ましい態様として、本発明の活性バイオチップ作製法は、付着させるオリゴヌクレオチドプローブに末端のチオール官能基で官能性を持たせる場合には、固体支持体にはアミン官能基で官能性を持たせることを特徴とする。
【００２４】
特にガラス製の固体支持体にアミン官能基で官能性を持たせる場合、この官能化はアミノシラン、好ましくはN-(2-アミノエチル)-3-アミノプロピルトリメトキシシランの存在下で行われることが好ましい。
【００２５】
同様に好ましい態様として、本発明の活性バイオチップ作製法は、付着させるオリゴヌクレオチドプローブに末端のアミン官能基で官能性を持たせる場合には、固体支持体にはチオール官能基で官能性を持たせることを特徴とする。
【００２６】
特にガラス製の固体支持体にチオール官能基で官能性を持たせる場合、この官能化はメルカプトシラン、好ましくは(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシランの存在下で行われることが好ましい。
【００２７】
本発明の目的は同様に、末端のアミン官能基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブを共有結合的に付着させるための、不活性バイオチップ（deactivated biotip）作製法であって、
a) 末端のアミン官能基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブを共有結合的に付着させるための活性バイオチップ作製法により、バイオチップを活性化する段階と、
b) 水溶液、好ましくは精製水の存在下で、固体支持体に付着した式(I)のスペーサー化合物NHS-PEG-VSの遊離型NHS官能基を加水分解させる段階とを含むことを特徴とする。
【００２８】
本発明の目的は同様に、末端のアミン官能基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブを共有結合的に付着させるための、再生バイオチップ（regenerated biotip）作製法であって、
A) 本発明の上記不活性バイオチップ作製法により、バイオチップを不活性化する段階と、
B) 最初に存在していた遊離型NHS官能基を加水分解した後にスペーサー化合物の遊離末端に得られるカルボン酸基、1-エチル-3[3-(ジメチルアミノ)プロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)、およびNHSの存在下で再生させる段階と、必要に応じて、
C) 段階B)で得られたバイオチップを、好ましくは脱イオン水中で洗浄する少なくとも一段階とを含むことを特徴とする。
【００２９】
好ましい態様として、本発明の活性、不活性、または再生バイオチップ作製法は、得られたバイオチップを凍結、乾燥、または凍結乾燥させる、好ましくは、不活性雰囲気下、例えば窒素下で乾燥させて、湿気から保護する段階を含むことを特徴とする。
【００３０】
別の局面として、本発明の目的は、オリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップを作製するための方法であって、
α) 本発明の方法により、活性または再生バイオチップを調製する段階と、
β) 適当な条件の下で、共有結合により、
- 固体支持体にアミン官能基で官能性を持たせる場合は、チオール官能基であらかじめ官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブを、
- または固体支持体にチオール官能基で官能性を持たせる場合は、アミン官能基であらかじめ官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブを、堆積させかつ付着させる段階と、必要に応じて、
γ) 支持体を適当な条件の下で、好ましくは脱イオン水中で洗浄する少なくとも一段階により、支持体に付着しなかったオリゴヌクレオチドプローブを除去する段階とを含むことを特徴とする。
【００３１】
本発明は同様に、チオール官能基であらかじめ官能性を持たせ、次いで式(I)のNHS-PEG-VSのスポッティングにより活性化され、そして本発明のオリゴヌクレオチドプローブで被覆された固体支持体を含むバイオチップを作製するための方法であって、
δ) オリゴヌクレオチドプローブのアミン官能基と相互作用しなかったスペーサー化合物のNHS官能基を、アミノ化合物の存在下、適当な条件の下で不活性化する段階をさらに含むことを特徴とする方法に関する。
【００３２】
好ましい態様として、段階δ)のスペーサー化合物のNHS官能基を不活性化するための化合物は、第一級アミンを有するアミノ化合物、好ましくはエタノールアミンまたはメトキシ-PEG-NH2(特に、後者の場合、シェアウォーターポリマーズ社(USA)から入手できるような)から選択される。
【００３３】
本発明は同様に、アミン官能基であらかじめ官能性を持たせ、次いで式(I)のNHS-PEG-VSのスポッティングにより活性化され、そしてオリゴヌクレオチドプローブで被覆された固体支持体を含むバイオチップを作製するための方法であって、
δ) 陰イオン化合物またはアミン基との共有結合を構築できかつ適当な条件の下で中性もしくは陰性の種を生成できる化合物の存在下、好ましくはアジピン酸メチルN-スクシンイミジル(MSA)の存在下、適当な条件の下で表面電荷を還元する段階をさらに含むことを特徴とする方法に関する。
【００３４】
本発明は同様に、本発明のオリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップを作製するための方法であって、得られるバイオチップを、乾燥した場所、暗所、および/または不活性雰囲気において保存する段階を含むことを特徴とする方法に関する。
【００３５】
オリゴヌクレオチドプローブは、一本鎖DNAまたは一本鎖RNAであることが好ましく、DNAまたはRNAはそのサイズが15〜7000 bp、好ましくは20〜1000 bp、20〜500 bp、20〜250 bp、20〜100 bp、20〜80 bp、または35〜80 bpであることが好ましい。
【００３６】
これらのプローブDNAまたはRNAは、化学合成により、または細胞から抽出されたゲノムDNA、RNAもしくはmRNA、またはその断片から得られ、特にcDNAの場合には、これらのRNAの逆転写後に、またはこれらのRNAからRT-PCR(「RT-PCR」は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応と称される方法を指す)により、またはこれらのゲノムDNAからPCRにより得られるPCR断片の形で得ることができる。
【００３７】
より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップを作製するための方法は、オリゴヌクレオチドプローブが、スポットの形で、そのスポットの平均直径が20 μm〜500 μm、好ましくは50 μm〜200 μmとなるように堆積されること、そして、必要に応じて、各オリゴヌクレオチドプローブのスポットの中心間の平均距離が80 μm〜400 μmとなることを特徴とする。
【００３８】
より好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップを作製するための方法は、オリゴヌクレオチドプローブのスポット数が、1 cm2当たり、2〜105個、好ましくは2〜104個、2〜103個、2〜4×102個、2〜102個、さらに好ましくは50〜103個および50〜4×102個であることを特徴とする。
【００３９】
新たな局面として、本発明の目的は、チオールまたはアミン官能基であらかじめ官能性を持たせた固体支持体を含むバイオチップであって、式(I)のスペーサー化合物NHS-PEG-VSを含むことを特徴とする。
2005517902.tif 000003
式（I）中、PEGは式HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OHのポリ(エチレングリコール)を示し、
上記式中のnは、式(I)の化合物NHS-PEG-VSの分子量が500〜5000、好ましくは200〜4000、および約3400となるように選択される整数であり、
スペーサー化合物は、官能性を持たせた支持体のチオール官能基と式(I)のスペーサー化合物のビニルスルホン官能基との間の相互作用から生じる、または官能性を持たせた支持体のアミン官能基と式(I)のスペーサー化合物のNHS官能基との間の相互作用から生じる共有結合を介して、固体支持体に付着する。
【００４０】
好ましくは、本発明のバイオチップは、チオールまたはアミン官能基であらかじめ官能性を持たせた少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブを、式(I)のスペーサー化合物の遊離型NHS官能基とオリゴヌクレオチドプローブのアミン官能基との間の相互作用から生じる、または式(I)のスペーサー化合物の遊離型ビニルスルホン官能基とオリゴヌクレオチドプローブのチオール官能基との間の相互作用から生じる共有結合を介して固体支持体に付着させるようにしてさらに含むことを特徴とする。
【００４１】
また好ましくは、本発明のバイオチップは、付着させるオリゴヌクレオチドプローブが、一本鎖DNAまたは一本鎖RNAであり、好ましくはDNAまたはRNAはそのサイズが15〜7000 bp、好ましくは20〜1000 bp、20〜500 bp、20〜250 bp、20〜100 bp、20〜80 bp、または35〜80 bpであることを特徴とする。
【００４２】
また好ましくは、本発明のバイオチップは、オリゴヌクレオチドプローブが、スポットの形で、そのスポットの直径が20 μm〜500 μm、好ましくは50 μm〜200 μmとなるように堆積されること、そして、必要に応じて、各オリゴヌクレオチドプローブのスポットの中心間の平均距離が80 μm〜400 μmとなることを特徴とする。
【００４３】
また好ましくは、本発明のバイオチップは、オリゴヌクレオチドプローブのスポット数が、1 cm2当たり、2〜105個、好ましくは2〜104個、2〜103個、2〜4×102個、2〜102個、さらに好ましくは50〜103個、および50〜4×102個であることを特徴とする。
【００４４】
また好ましくは、本発明のバイオチップは、固体支持体が、ガラス製の、プラスチック製の、Nylon(登録商標)製の、Kevlar(登録商標)製の、シリコーン製の、シリコン製の、ポリサッカライドまたはポリ(ヘテロサッカライド)製の、および好ましくはガラス製の、好ましくはシラン化された、固体支持体から選択されることを特徴とする。
【００４５】
本発明の目的は同様に、活性、不活性、もしくは再生バイオチップ、または本発明の方法を用いて得られるオリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップである。
【００４６】
さらに別の局面によれば、本発明には、試料中の核酸を検出するための、本発明のバイオチップの使用が含まれる。
【００４７】
さらに別の局面によれば、本発明は、本発明のバイオチップを含むことを特徴とする、試料中の核酸を検出するためのまたは定性的にもしくは定量的に分析するためのキットまたはセットに関する。
【００４８】
本発明の目的は同様に、試料中の核酸を検出するための方法であって、
a) 検出が所望されている標的核酸を含む試料を、本発明のオリゴヌクレオチドプローブで被覆したバイオチップに、オリゴヌクレオチドプローブとこれらの標的核酸とを特異的にハイブリダイズさせる条件の下で堆積させる段階と、
b) ハイブリダイゼーションにより捕捉されなかった試料中の核酸を除去するため、必要に応じて、適当な条件の下、段階a)で得られたバイオチップを洗浄する段階と、
c) ハイブリダイゼーションによりバイオチップに捕捉された核酸を検出する段階とを含むことを特徴とする。
【００４９】
「オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とを特異的にハイブリダイズさせる条件」という表現には、好ましくは、特に以下に定義されるような、または限定されることはないが、以下の実施例に記述されるような、高いストリンジェンシー条件が含まれる。
【００５０】
高いストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションとは、DNAまたはRNA/DNAの2つの相補的な断片間で維持すべきハイブリダイゼーションが可能となるように、温度およびイオン強度の条件を選択することを意味する。上述のハイブリダイゼーション条件を定義するための、ハイブリダイゼーションの段階における高いストリンジェンシー条件は、実例として、以下の条件とするのが有利である。
【００５１】
DNA-DNA間のまたはDNA-RNA間のハイブリダイゼーションは、以下の2段階で行われる：(1) 5×SSC(1×SSCは、0.15 M NaCl + 0.015 M クエン酸ナトリウムの溶液に相当する)、50%ホルムアミド、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、10×デンハルト(Denhardt's)、5%デキストラン硫酸および1%サケ精子DNAを含有するリン酸緩衝液(20 mM、pH 7.5)中、42℃で3時間のプレハイブリダイゼーション； (2) プローブの長さに依存する温度(即ち：42℃、長さが100ヌクレオチドを超えるプローブの場合)で20時間の実際のハイブリダイゼーションに続いて、2×SSC + 2% SDS中、20℃で20分の洗浄を2回、0.1×SSC + 0.1% SDS中、20℃で20分の洗浄を1回。最後の洗浄は、長さが100ヌクレオチドを超えるプローブの場合、0.1×SSC + 0.1% SDS中、60℃で30分間行う。明確な長さのポリヌクレオチドに対する上述の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より長いまたはより短いオリゴヌクレオチドに対して、Sambrookら(1989、「Molecular cloning：a laboratory manual」、第2版、Cold Spring Harbor)の開示に従って、当業者により適合され得る。
【００５２】
本発明には同様に、検出が所望されている核酸は、その末端のうちの一端が、検出可能なシグナル、好ましくは蛍光により検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に発生できる標識によりあらかじめ標識されることを特徴とする、本発明の、試料中の核酸を検出するための方法が含まれる。
【００５３】
本発明には同様に、検出が所望されている核酸の少なくとも2つが、異なる標識によりあらかじめ標識されることを特徴とする、本発明の、核酸を検出するための方法が含まれる。
【００５４】
好ましくは、標識は、シアニン誘導体から選択される、シアニンのスルホン化誘導体、特にCy5もしくはCy3化合物、ナノ結晶(Migyong Hanら、Nature Biotechnology, 19, 631〜635, 2001)またはナノ粒子(Genicon Science社)から選択されることが好ましい。
【００５５】
本発明の目的は同様に、親和性基質としてのまたは核酸を精製するための、本発明のバイオチップの使用である。
【００５６】
本発明の目的は同様に、核酸をシークエンシングするための、遺伝子発現を定性的にもしくは定量的に分析するための、または遺伝子多型(「単一ヌクレオチド多型」を表すSNP、またはSNIPとも呼ばれる)を研究するおよび検出するための、本発明のバイオチップの使用である。
【００５７】
例えば、これに限定されるわけではないが、周知の遺伝子に相当するDNAプローブが本発明のバイオチップに堆積させる。各堆積物またはスポットには、同じ遺伝子に相当する数千のオリゴヌクレオチドプローブが含まれていてよく、そしてあるスポットから他のスポットにかけて、オリゴヌクレオチドプローブが、別の遺伝子に相当している、または異なる多型を有する遺伝子に相当していることもある。
【００５８】
研究目的の組織または細胞における、ゲノムDNA、もしくは伝令RNA、またはその断片を抽出し、蛍光色素で標識することができる(DNAまたはmRNAは、特に逆転写により相補的DNA(cDNA)に変換することができ、そして必要に応じて、PCRまたはRT-PCR法により倍化することができる)。
【００５９】
これらのDNA、cDNAまたはRNAは次に、オリゴヌクレオチドプローブで被覆したバイオチップに堆積させ、そして、適当な場合には、それらに対応する、あらかじめ堆積させておいたオリゴヌクレオチドプローブとの特異的ハイブリダイゼーションにより結合するものと思われる。従ってハイブリダイズした標的核酸の量(堆積する標的DNAが、転写されたmRNAに相補的なcDNAである場合は、特に、抽出されたmRNAの最初の量に比例すると思われる)に相当するシグナル量（特に蛍光の）が、各スポット上に検出されると思われる。このように、ある遺伝子について細胞の転写活性を測定することができる。
【００６０】
それ故、これらのDNAバイオチップには、転写研究、診断(突然変異の探索)、治療標的の探索、個人の遺伝子地図作成のような多くの用途がある。
【００６１】
これらのバイオチップの一般的な用途の場合、特に、この目的に関して既に刊行されている多くの文献に言及がなされている可能性があり、その文献に、これらの用途に対して、本発明のバイオチップのような、活性または再生バイオチップを利用して実施される方法が十分に説明されている。
【００６２】
さらに別の局面として、本発明は、所定のオリゴヌクレオチドに特異的に結合できる化合物または細胞をスクリーニングするための方法であって、
a) 本発明のバイオチップは、その固体支持体に付着された所定のオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプローブのスポットを含み、そして必要に応じて、化合物または細胞は、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に発生できる標識で標識されており、所定のオリゴヌクレオチドとの試験化合物とのまたは試験細胞との特異的な結合が起こり得る条件の下で、試験化合物をバイオチップと接触させる段階と、
b) 所定のオリゴヌクレオチドに特異的に結合しなかった試験化合物または細胞を、適当な条件下で少なくとも1回の洗浄段階により、除去する段階と、
c) 所定のオリゴヌクレオチドを含有するスポットで化合物または細胞のシグナルが検出され、必要に応じて、その化合物または細胞を選別することによって、所定のオリゴヌクレオチドに特異的に結合した化合物または細胞を選別する段階とを含むことを特徴とする方法に関する。
【００６３】
最後に、最終の局面として、本発明の目的は、本発明のバイオチップを含む、診断用のまたは検査用の機器または装置である。
【００６４】
本発明のその他の特徴および利点は、実施例および図面(その説明は後述する)による残りの説明のなかで明らかになる。
【００６５】
実施例1. アミン基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブに対する支持体：方法1
1. 原理
NHSおよびVS官能基を持つヘテロ二官能性PEGを使用する。
SH官能基(表面のチオール基)を得るように、表面を最初にシラン化(官能化)する。次に堆積させる(活性化)ヘテロ二官能性PEGのVS官能基が、表面のチオールと反応して共有結合を形成する。アミン官能基をその末端の一端に持つオリゴヌクレオチドを最後にスポットする。このアミン官能基が、ヘテロ二官能性PEGのNHS官能基と反応して共有結合を形成する。
【００６６】
2. 実験手順
a) シラン化
GOLD SEALガラススライドを使用する。これらのスライドから硫酸/過酸化水素(70/30、v/v(体積比))混合液(Piranha混合液)300 mlで15分間汚れを落とす。
スライドを精製水、さらにメタノールで洗浄する。
シラン化溶液槽は以下で構成される：
- 合成用精製メタノール60 ml(SDS参照番号：0930221)；
- 酢酸 510 μl；
- 精製水 2.55 ml；および
- (3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(SIGMA、EE番号224-588-5) 1.275 ml。
スライドをこの溶液槽に2時間浸す。
次いで、スライドを精製メタノールで洗浄しその後アルゴン乾燥させ、最後に94℃のインキュベーター中に15分間置く。
スライドはデシケーター中、真空下で保存する。
【００６７】
b) ヘテロ二官能性PEGの適用
ヘテロ二官能性PEG溶液を1×PBS緩衝液(リン酸生理食塩緩衝液)(pH 7)中で調製する。このpH値は、表面のチオールとPEGのVS官能基との間の反応に最適である。
スライド1枚につき以下の溶液とする：
- NHS-PEG-VS、分子量3400 (Shearwater Polymers) 2 mg；および
- 1×PBS 2 ml。
この溶液を、処理されるスライド表面に45分間堆積させる。
次いで、スライドを脱イオン水で洗浄し、アルゴン乾燥させる。
【００６８】
実施例2. チオール基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブに対する支持体：方法2
1. 原理
ここでは、スライド表面がアミン官能基でシラン化されること以外、方法1と同じ原理である。従って、PEGのNHS官能基がこれらの表面基と反応し、そして残るVS基が、末端にチオール官能基を有するオリゴヌクレオチドと反応することができる。
【００６９】
2. 実験手順
a) シラン化
スライドを、実施例1の実験手順と同様、Piranha混合液で洗浄する。
シラン化溶液槽内の組成を以下に変える：
- 合成用精製メタノール60 ml(SDS参照番号：0930221)；
- 酢酸 510 μl；
- 精製水 2.55 ml；
- シラン：N-[3-(トリメトキシシリル)-プロピル]ジエチレントリアミン、97%(ALDRICH 10、488-4) 1.275 ml。
この溶液を、処理されるスライド表面に45分間堆積させる。
次いで、スライドを脱イオン水で洗浄し、アルゴン乾燥させる。
【００７０】
b) ヘテロ二官能性PEGの適用
溶液の組成(スライド1枚につき)：
- NHS-PEG-VS、分子量3400 (Shearwater Polymers) 2 mg；
- 炭酸-重炭酸(CB)緩衝液(pH 8.4) 2 ml。
pH 8.4は、PEGのNHS官能基とシラン化表面のNH2官能基との間の化学反応に最適である。
この溶液を、処理されるスライド表面に45分間堆積させる。
次いで、スライドを脱イオン水で洗浄し、アルゴン乾燥させる。
【００７１】
実施例3. アミン基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドまたはペプチドプローブに対する不活性化され後に再生される支持体
1. 原理
NHS官能基は、湿気に弱く、数日で不活性化する。これを改善するため、官能基を安定な形で不活性化させて、その後、オリゴヌクレオチドプローブをスポットする時にこれを再生する方法を開発した。
【００７２】
2. 実験手順
a) 不活性化
まず、スライドを方法1のように調製する。次いで、不活性化されるまで、スライドを精製水の溶液槽中に浸すことにより、NHS官能基を加水分解する。NHS官能基は、カルボン酸基(COO-)に変換される。
【００７３】
b) 再生
ここでは、Patelらの手順(Langmuir, 13：06485〜6490, 1997)を適用する。
簡単に述べると、精製水中で、以下から構成される溶液を調製する：
- 好ましくはあらかじめDMSOに溶解した、15 mM NHS(Fluka) (NHSの代わりに、水に可溶のスルホ-NHSを使用することも可能である)；
および
- 5 mM EDC。
次いで、スライドを溶液に10分間浸す。
次いで、スライドを精製水で洗浄し、アルゴン乾燥させる。
【００７４】
実施例4. 方法1のプローブと相互作用しなかったスペーサー化合物の、活性なNHS基を提示している支持体領域のキャッピング
1. 原理
オリゴヌクレオチドをスポットした後、これらのスポットの周辺領域にはまだ、使用する方法に応じて、NHSまたはVS型の活性基がある。特に、活性なNHS基はアミン基と反応するので、これは、実施例1に記載の方法1に対する障害となる。これらのアミン基は、ある種のヌクレオチド塩基に見られる。特に塩基に関し、これらのアミン基は、オリゴヌクレオチドの付着性官能基として機能する第一級アミン基よりも反応性ははるかに低い。従って、スポッティングの間、塩基のアミンは官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブの末端アミンとは競合しない(または僅かに競合する)。一方、ハイブリダイゼーションの間、支持体上に堆積されるcDNAのような標的核酸は、アミンをその塩基の構成要素としてのみ有する。従って、標的核酸の塩基のアミンとオリゴヌクレオチドプローブのスポット周辺に残存するNHSとの間では反応の危険性があり、その結果、バックグラウンドノイズが高くなる。従って、活性なままである、これらのNHS部位を不活性化することが好ましい。
【００７５】
2. 実施例1に記載の、方法1の支持体をキャッピングするための手順
2.1 プローブと相互作用しなかったNHS基を不活性化するための物質としてエタノールアミンを用いる手順1
キャッピング溶液：
- 150 mMリン酸(HPO4/H2PO4)緩衝液(pH = 8.2) 40 ml；
- エタノールアミン 1 ml；
- 10% SDS 2 ml；および
- ミリQ水で体積を200 mlまで増やす。
洗浄液：
- 20×SSC 100 ml；
- 10% SDS 5 ml；および
- ミリQ水で体積を500 mlまで増やす。
スライドを50℃のブロッキング溶液中に15分間入れる：
- ミリQ水での4分間洗浄；
- 洗浄液での15分間洗浄；
- ミリQ水での6分間洗浄；および
- 800 rpm (50 g)での3分間の遠心。
【００７６】
2.2 プローブと相互作用しなかったNHS基を不活性化するための物質として単官能性PEGを用いる手順2
この第2の手順の場合、その末端のうちの一端にアミン基を有する単官能性PEGを使用する。このアミノ基は、共有結合を形成することによりNHSと反応する。次いで、プローブがスポットされたスポット周辺の表面をPEGで被覆する。
以下を含む、溶液を調製する：
- 150 mMリン酸(HPO4/H2PO4)緩衝液(pH 8.2) 2 ml；および
- メトキシ-PEG-NH2 (Shearwater Polymers) 2 mg。
スライドをこの溶液中に45分間浸し、その後精製水で洗浄し、アルゴン乾燥させる。
【００７７】
実施例5. 方法2のプローブと相互作用しなかった、スペーサー化合物の活性なVS基を提示している支持体領域のスポッッティング
DNAのような核酸の構成要素である塩基にチオール官能基は存在していないので、それ故、オリゴヌクレオチドプローブのスポッティングに関して遊離型VS部位を不活性化する必要はない。この場合には、グラフト化されなかったオリゴヌクレオチドを除去するために、精製水による洗浄のみを行う。
【００７８】
一般に、任意のチオール化された化合物、および例えば、N-エチルマレイミド、ヨード酢酸誘導体(四チオン酸ナトリウム、エルマン試薬)、アジリジンまたはアクリロイル誘導体を使用することができる。
【００７９】
しかし、方法2の表面電荷を絶縁するまたは還元するために、プローブをスポットする前に、陰イオン化合物またはアミン基との共有結合を構築できかつ適当な条件の下で中性もしくは陰性の種を生成できる化合物を、例えば、本明細書における、アジピン酸メチルN-スクシンイミジル(MSA)使用後の手順に従うような、適当な条件の下で、堆積させることが好ましい。
【００８０】
手順としては、MSAを方法2の表面電荷を中和するための物質として使用する。
1×PBS(pH 7.4)のMSA溶液(PBS 1 ml当たりMSA 1 mg)を表面に堆積させる。表面をプラスチック・スライドで覆う。MSA溶液を表面と1時間接触させておく。次いで、表面を精製水で洗浄し、窒素乾燥させる。
【００８１】
実施例6. スライドをオリゴヌクレオチドプローブ溶液とハイブリダイズさせる実験：オリゴヌクレオチドのグラフト化反応に対するpHの影響
1. 実験の原理
スペーサー化合物NHS-PEG-VSがあらかじめ付着されている官能性を持たせたガラススライド上に、マウスの遺伝子断片に相当する50塩基のオリゴヌクレオチドプローブを堆積させた。以下の3つのヌクレオチド配列を使用した：
2005517902.tif 000004
各プローブ配列に対し、以下の3種類のオリゴヌクレオチドを堆積させた：
- 3'位のNH2官能化オリゴヌクレオチド；
- 3'位のSH官能化オリゴヌクレオチド；および
- 非官能化オリゴヌクレオチド。
このようにして得られたスライドを、種々の会社のスライドと比較した。
【００８２】
2. 材料
オリゴヌクレオチドは、ジーンマシーンズ（GeneMachines）社の「スポッター」(OmniGrid)を用いて堆積させる。このスポット部は、数mlのスポットを作製可能とするピンスポッター(Majer Precision)である。各スポットの間において、あるスポットから別のスポットへのコンタミ(汚染)を防ぐため、ピンを洗浄する。
次いで、ハイブリダイゼーション後、スライドをスキャナー(ScanArray 3000 GSI)で読み込み、その画像をImagene 4.1ソフトウェア(Biodiscovery)により解析する。
【００８３】
3. アミノ化オリゴヌクレオチドに対するスライドにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる実験
a) スライドの調製
方法1および方法2に従い、本発明のスライドを調製する。これらのスライドを用いて得られた結果を、遊離型アミン官能基を有するNH2官能化ヌクレオチドプローブを付着できる活性スライド(「アミン結合スライド」)である、「3D-LINK(商標)活性スライド」(バッチDN01B058パケット番号19)を参照として、サーモディクス社が販売しているスライド(SurModics Inc., Eden Prairie, MN)で使うのと同じ条件の下で得られた結果と比較した。サーモディクス社のスライドは、現在入手可能な市販用スライドのなかで最高の性能水準を与えるスライドであることが知られている。ガラススライドにオリゴヌクレオチドを共有結合的に固定化するための化学的方法を比較する場合、例えば、一定数の商品化されたスライドを含む、8つの異なる方法を比較した、Lindroosらの論文(Nucleic Acids Research, 29, 13, e69, 2001)に言及されている可能性がある。
【００８４】
3つのオリゴヌクレオチドプローブ配列、およびこれらのプローブ配列のそれぞれに対する、3種類の修飾(NH2官能化、SH官能化、非官能化)オリゴヌクレオチドを、種々のpH値(6.8、7.7および8.3)の各オリゴヌクレオチド溶液で、堆積させた。各試料を2回スポットする。従って、各スライドには、オリゴヌクレオチドのスポットを3×3×3×2 = 54個堆積させる。
このスポット行列をスライドに2回堆積させた。
さらに、コンタミ(汚染)のあらゆる危険性を排除するために、それぞれのオリゴヌクレオチドごとに、緩衝液を2回堆積させる。
【００８５】
b) オリゴヌクレオチドの調製
オリゴヌクレオチドを濃度0.5 mMとして精製水(ミリQ)に再懸濁させる。
オリゴヌクレオチド溶液の濃度を、150 mMリン酸緩衝液の、pH値6.8、7.7および8.3に対して、総量12 μlで、5 μMに調整する。
【００８６】
c) オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション溶液の調製
このようにしてオリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップを、堆積するオリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を有する標的オリゴヌクレオチドを含む溶液とハイブリダイズさせる。
従って、スポットされたオリゴヌクレオチドプローブに相補的な配列を有する、3つの標的オリゴヌクレオチドを混ぜた：
2005517902.tif 000005
これらの標的オリゴヌクレオチドは、5'位に蛍光色素(Cy5)を持つ。
これらの相補的な標的オリゴヌクレオチドをまず、精製水に濃度50 μMとして懸濁させる。
次いで、以下の混合液を調製する：
- 精製水497 μl；および
- 相補的な標的オリゴヌクレオチドそれぞれを1 μl(即ち、計3 μl)。
標的オリゴヌクレオチドは各濃度0.1 μMで、5'位に蛍光色素(Cy5)を持ち、これら3つの標的オリゴヌクレオチドを混合して標的オリゴヌクレオチドの混合液を得る。
次いで、以下のハイブリダイゼーション溶液を調製する：
- 相補的な標的オリゴヌクレオチドのそれぞれが0.1 μMの溶液1 μl；
- 精製水15.8 μl；
- 20×SSC (pH 7) 3.6 μl；および
- 10% SDS 0.6 μl。
即ち、相補的な標的オリゴヌクレオチド当たり濃度5 nMの溶液である。
【００８７】
d) ハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチドプローブで被覆されたバイオチップを、上述の相補的な標的オリゴヌクレオチドの溶液とハイブリダイズさせる。
標的オリゴヌクレオチドの溶液12 μlを各バイオチップに堆積させる。各バイオチップをプラスチックカバースリップで覆い、バイオチップをハイブリダイゼーションチャンバー(GeneMachines)内に入れる。
チャンバーを60℃の湯浴中に一晩保持する。
【００８８】
e) 洗浄
溶液1：
- 20×SSC 50 ml；
- 10% SDS 5 ml；および
- ミリQ水を適量500 ml
溶液2：
- 20×SSC 5 ml；および
- ミリQ水を適量500 ml
溶液3：
- 20×SSC 2.5 ml；および
- ミリQ水を適量500 ml
【００８９】
ハイブリダイゼーション後、スライドを以下のように洗浄する。
カバー・スリップを外すため、スライドをまず4×SSC溶液に入れ、その後以下の通りに洗浄する：
- 溶液1で5分間×2回；
- 溶液2で1分間；および
- 溶液3で1分間。
【００９０】
4. ハイブリダイゼーション実験の結果
4.1 スキャナーの設定
使用するスキャナーには、読み込みのための以下の2つの設定がある：
- 励起(LASER)強度の設定；および
- 光電子増倍管(PMT、蛍光強度を測定するために使用される)の出力設定。
これらの2つの設定の強度は、任意単位で表される。最大で、2つの値は、100である。
何枚ものスライドの場合、これらの最大値では、蛍光シグナルが飽和状態となる；そのため、LASERおよび/またはPMTの強度を減少させる必要がある。
【００９１】
4.2 アミノ基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブに対するスライド：方法1
LASER/PMTの設定が100/100の場合、得られるシグナルは、堆積しているオリゴヌクレオチドプローブのスポットの全てで飽和状態となる(65000を超えるシグナル)。従って、これらの設定値を75/68に減らした。
実験結果を下記表1に示す。
【００９２】
【表１】
2005517902.tif 000006
表1の説明：方法1に従って調製したバイオチップでのハイブリダイゼーションを本質とする実験：pH試験
【００９３】
NH2官能化オリゴヌクレオチドプローブ(「オリゴNH2」)および非官能化オリゴヌクレオチドプローブを種々のpHで堆積させた。チップを、堆積したプローブに相補的な蛍光標識標的オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズさせた。54スポットを2列、堆積させた。
【００９４】
官能化および非官能化オリゴヌクレオチドプローブに関して得られた蛍光強度比より、共有結合でグラフトさせる官能化オリゴヌクレオチドプローブに対し、支持体の選択性が非常に良好であることが明らかとなった。
【００９５】
バックグラウンドノイズが非常に低いため、シグナル対ノイズ比が優れている(5000)。
【００９６】
スポットサイズは、アミノ基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブに対しては特に、直径の拡散が非常に小さく(低湿潤性)、非常に良好である。
【００９７】
最後に、グラフト化反応は特に、塩基性pH(8.3)で効果的である。
【００９８】
4.3 チオール基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブのスライド：方法2
スキャナーを100/100に設定した。実験結果を下記表2に示す。
【００９９】
【表２】
2005517902.tif 000007
表2の説明：方法2に従って調製したチップでのハイブリダイゼーション実験：pH試験
【０１００】
SH基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブ(「オリゴSH」)および非官能化オリゴヌクレオチドプローブ(「非官能化オリゴ」)を種々のpH値の溶液中で堆積させた。チップを、堆積したプローブに相補的な蛍光標識標的オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズさせた。
【０１０１】
SH基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブは、非官能化オリゴヌクレオチドプローブよりも良好に付着するが、支持体の選択性は、方法1で得られるスライドに対する選択性よりも低い。pHは、グラフト化反応にほとんど影響を及ぼさない。
【０１０２】
シグナル対ノイズ比は、かなり良好である。
【０１０３】
4.4 アミノ基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブに対する、供給元サーモディクスから入手したスライド
スキャナーの設定を100/100とする。
結果：下記表3を参照されたい。
【０１０４】
【表３】
2005517902.tif 000008
表3の説明：サーモディクスのスライドにスポットしたバイオチップでのハイブリダイゼーション実験：pH試験
【０１０５】
アミノ基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブ(「オリゴNH2」)および非官能化オリゴヌクレオチドプローブ(「非官能化オリゴ」)を種々のpH値の溶液中で堆積させた。バイオチップを、堆積したプローブに相補的な蛍光標識標的オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズさせた。
【０１０６】
2つの実験に対するスキャナーの設定がかなり異なっているためますますそうなるが、蛍光強度は、本発明のスライドで測定された強度に比べて低い。
【０１０７】
アミノ基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブに対する支持体の選択性は、良好であるように思われ、非官能化オリゴヌクレオチドプローブの付着がほとんどない。
【０１０８】
グラフト化反応は、塩基性媒体(pH 8.3)でいっそう効果的であるように思われる。
【０１０９】
シグナル対ノイズ比は、許容可能であるように思われるが、方法1により得られる本発明のスライドよりもかなり低い(7倍低い)。蛍光シグナルが良好であることの利点は、これにより、励起および検出のためのLASER強度を減少させることができ、従って、バックグラウンドノイズを減らすことが可能となることにある。
【０１１０】
最後に、スポットの直径がかなり大きい(「SURMODICS」のスライドの湿潤性は、本発明のスライドの湿潤性よりも大きい)。
【０１１１】
湿潤性が低いと、スポットの鮮明度が良くなるだけでなく、2つのスポット間の平均距離を縮めることも可能となり、これにより特に、1 cm2当たりに堆積させるプローブのスポット数を増加させることができる。
【０１１２】
実施例7. スライドをオリゴヌクレオチドプローブの溶液とハイブリダイズさせる実験：オリゴヌクレオチド濃度の影響
1. 実験の原理
この実験では、実施例6と同じ配列を使用する。これらの実験では、これらの配列の濃度を堆積時に変化させる。
【０１１３】
2. 材料
実施例6に示したものと同じ材料を使用する。
【０１１４】
3. アミノ化オリゴヌクレオチドに対するスライドにオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる実験
a) スライドの調製
スライドを、方法1に従って調製し、サーモディクスのスライドと比較する。3つのオリゴヌクレオチド配列(実施例6と同じ)、および各配列に対する2種類の修飾オリゴヌクレオチド(NH2官能化および非官能化)を堆積させる。各オリゴヌクレオチドを、5つの濃度値(2、5、10、20および40 μM)で堆積させる。各試料を2回スポットする。従って、各スライドには、オリゴヌクレオチドの2×3×5×2 = 45個のスポットが2列、堆積されることになる。
さらに、コンタミ(汚染)のあらゆる危険性を排除するために、それぞれのオリゴヌクレオチドごとに、緩衝液を2回堆積させる。
【０１１５】
b) オリゴヌクレオチドの調製
堆積させる溶液のpHを、150 mMリン酸緩衝液によって8.2に固定する。
ミリQ水を加えて混合液の体積を補うことにより、オリゴヌクレオチドプローブの濃度を5つの濃度値に調整する。
【０１１６】
c) ハイブリダイゼーション溶液の調製
実施例6と同じ溶液および同じ手順とする。
【０１１７】
d) ハイブリダイゼーション
実施例6と同じ手順とする。
【０１１８】
4. 実験結果
4.1 アミノ基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブに対するスライド：方法1
スキャナーを90/95に設定する。
実験結果を下記表4に示す。
【０１１９】
【表４】
2005517902.tif 000009
表4の説明：方法1に従って調製したバイオチップでのハイブリダイゼーション実験：濃度試験
【０１２０】
NH2官能化オリゴヌクレオチドプローブ(「オリゴNH2」)および非官能化オリゴヌクレオチドプローブを種々の濃度で堆積させた。チップを、堆積したプローブに相補的な蛍光標識標的オリゴヌクレオチドの混合物とハイブリダイズさせた。45スポットを2列、堆積させた。
【０１２１】
この実験から、オリゴを堆積させる最適濃度は、5〜10 μMであることが示される。非官能化オリゴの付着が少なかった(強度比率2)ため、スライドの選択性が非常に良好であることが、これらの濃度で見受けられる。
【０１２２】
これらの最適濃度では、シグナル対ノイズ比はかなり良好である(1000)。
【０１２３】
スポットはサイズが均一である。
【０１２４】
4.2 アミノ基で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドプローブに対する、供給元サーモディクスから入手したスライド
スキャナーを90/95に設定する。
実験結果を下記表5に示す。
【０１２５】
【表５】
2005517902.tif 000010
表5の説明：サーモディクスのスライドにスポットしたバイオチップでのハイブリダイゼーション実験：濃度試験
【０１２６】
強度は、方法1のスライドに対する強度よりも低い。
【０１２７】
最良のシグナル対ノイズ比は、最高濃度で得られ、265に等しい。
【０１２８】
サーモディクスのスライドと比較すると、本発明のスライドは、8倍低いオリゴヌクレオチド濃度(5 μM)で、4倍大きな蛍光シグナル(31000 対 7200)および5倍大きなシグナル対ノイズ比を示す。
【０１２９】
従って、本発明のスライドはシグナル強度が大きいため、サーモディクスのスライドよりもオリゴヌクレオチドの使用を少量とすることが可能である。
【０１３０】
サーモディクスのスライドのスポットサイズは、拡散が極めて小さい本発明のスライドにおけるスポットサイズよりも大きい。
【０１３１】
本発明の、とりわけ方法1の作製方法で得られるバイオチップは、その他の市販の支持体に比べ、とりわけ当技術分野において基準となる「サーモディクス」型の支持体に比べ、特に有効であることが分かる。
【０１３２】
最後に、本発明の、とりわけ方法1の方法で得られるスライドで行われた実験により、以下のことが実証される。
- グラフト化反応が非常に効率的である(ハイブリダイゼーションシグナルが非常に強い)、
- バックグラウンドノイズが非常に低い、
- 湿潤特性が優れている(スポットが均質かつ均一である)、
- サーモディクスのスライドよりもオリゴヌクレオチドプローブの使用が少量である。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】アミノ基(NH2末端)で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドのグラフト化反応。図1A：ガラス表面(シラノール Si-OH)。図1B：メルカプトシランで官能性を持たせたガラス表面(SH末端)。図1C：ヘテロ二官能性PEG(NHS-PEG-VS)のグラフト化反応。NHS末端は遊離型かつ反応性のままである。図1D：アミノ基(NH2末端)で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドの付着。
【図１】
2005517902.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月1日(2004.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
【図１】アミノ基(NH2末端)で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドのグラフト化反応。
図1A：ガラス表面(シラノール Si-OH)。
図1B：メルカプトシランで官能性を持たせたガラス表面(SH末端)。
図1C：ヘテロ二官能性PEG(NHS-PEG-VS)のグラフト化反応。NHS末端は遊離型かつ反応性のままである。
図1D：アミノ基(NH2末端)で官能性を持たせたオリゴヌクレオチドの付着。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
Institut Curie
<120> Novel method for production of DNA biochips and applications 
thereof
<130> CR-A0421
<140> JP   2003-567847
<141> 2003-02-13
<150> FR   02/01 791
<151> 2002-02-13
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene fragment from Mus musculus
<400> 1
gtgcctcacg gtggttgcca tcactgtctt catgttcgag tatttcagcc                50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene fragment from Mus musculus
<400> 2
ttttgagatc tggcttcatt tcgacgctga cggaagtggt tacctggaag                50
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene fragment from Mus musculus
<400> 3
aacgcccatc ttaaaatcga cgcctgtctc tcccccattg ctcttaccag                50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene fragment from Mus musculus
<400> 4
ggctgaaata ctcgaacatg aagacagtga tggcaaccac cgtgaggcac                50
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene fragment from Mus musculus
<400> 5
cttccaggta accacttccg tcagcgtcga aatgaagcca gatctcaaaa                50
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gene fragment from Mus musculus
<400> 6
ctggtaagag caatggggga gagacaggcg tcgattttaa gatgggcgtt                50
【国際調査報告】
2005517902.tif 000014
2005517902.tif 000015
2005517902.tif 000016
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