(57)【要約】本発明はカチオン性またはアニオン性ポリマーおよび磁性キャリヤによる細菌細胞の非特異的濃縮のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）細菌細胞を含有するサンプルを酸性ｐＨ値でカチオン性ポリマーと接触させるステップと、
ｂ）磁性キャリヤを添加するステップと、
ｃ）表面に細菌細胞が結合した磁性キャリヤをサンプルから分離するステップと
を含む、細菌の非特異的精製のための方法。
【請求項２】
ステップａ）および／またはステップｂ）の後に、インキュベーションするステップを挿入する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カチオン性ポリマーが、キトサンまたはポリリジンである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
キトサンを０．０５から１００μｇ／ｍｌ培養物の範囲の濃度で、およびポリリジンを１２．５から１５０μｇ／ｍｌ培養物の範囲の濃度で添加する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨ値をＨＣｌ／ＨＡｃで３以下に、またはギ酸で４以下に調整する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記磁性キャリヤが、磁性色素または磁性ポリスチレン・ビーズであり、特にはＮＨ2表面、ＣＯＯＨ表面、またはＯＨ表面を有する磁性色素または磁性ポリスチレン・ビーズである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記精製された細菌が、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種またはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はカチオン性またはアニオン性ポリマーおよび磁性キャリヤによる細菌細胞の非特異的濃縮のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんど全ての細胞成分の処理、分析または単離の出発点は、細胞の濃縮、「細胞収集」である。後者は通常遠心により実施する。対応するロボットに遠心を組み込むための高度な技術的努力に加えて、遠心の過程の出発および停止位置で非常に高度な精度が必要とされるので、この遠心工程は、プラスミドの精製のような方法の全自動化の主要な問題を提起する。従って細胞成分の処理、分析または単離における自動化の方法は、通常ロボットの外部で、すでに濃縮、遠心または沈殿されている細胞から出発する。しかし、そのための適切な方法の可能な全自動化が、例えば全ゲノムの迅速な分析、プロテオームに必須であるのみならず、高速大量処理方法における構造および機能の迅速な解決にも必須である。部分的な工程の自動化は、例えばゲノム分析ではすでに非常に進歩している。細菌の培養およびプラスミドの単離の双方を自動的に実施することができる。しかし、単純な、経費のかからない、そして完全な、細胞収集などの方法の自動化は今のところ実施可能ではない。
【０００３】
細胞収集の標準的な方法は細胞培養物の遠心である。このために、特に高速大量処理方法のために設計されている方法ではマイクロタイタープレート遠心が必要である。
【０００４】
代替の方法はフィルター膜による培養細胞の濃縮を利用する（例えば、国際公開公報第０１／５１２０６号、３Ｍ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｃｏ（米国）および米国特許第５，４６４，５４１号、Ｄｉａｇｅｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｆ．Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｅ）。しかしこの方法は、高度に濃縮された細胞懸濁液を使用する場合、および溶液の高い粘性の結果として、プラギングに関して非常に偶発性の影響を受けやすいようにみえる。同様にこれは濾過技術および真空技術と組み合わせた（国際公開公報第９２／０７８６３号、Ｑｉａｇｅｎ）多孔性マトリックスに対するイオン交換様結合に関しても真実である。これは特に自動化方法に関して主要な問題を提起し得る。
【０００５】
磁性粒子に基づく方法による微生物の濃縮は原理的に自動化に適している。これまでに、細菌の濃縮に関する３つの方法が記載されているが、株特異性およびその生成のための経費に関して明確な不利益性が示されている。
【０００６】
欧州特許第１  １１８６７６  Ａ２号、Ｃｈｅｍａｇｅｎ  ＡＧおよび国際公開公報第０１／５３５２５  Ａ２号、Ｇｅｎｐｏｉｎｔ  ＡＳは、固相に共有結合的または非共有結合的に固定された非特異的リガンドによる、固相での微生物の濃縮に関する方法を記載している。この方法に関しては、固相はポリビニルアルコール・ビーズであり、これは磁性でも磁性でなくてもよい。この方法の意味での分子はリガンドと見なされ、これを微生物のための栄養として提供することができる。この方法の不利益性は特定のリガンドを支持体に固定しなければならず、それによりその生成のための経費が有意に増加する事実に在る。さらなる不利益性は、恐らく異なるリガンドが異なる株に関して固定されなければならず、これは磁性ビーズ、そしてひいては方法が多目的用ではないということを意味しているという事実に在る。
【０００７】
別の出願、すなわち国際公開公報第９８／５１６９３号では、磁性粒子上での細菌の濃縮のための、Ｇｅｎｐｏｉｎｔ、塩の混合物、アルコールおよびポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールに匹敵し得るポリマーについて記載している。国際公開公報第９８／５１６９３号に記載された方法は５分から２０分かかり、２から５０（重量／用量）％のポリマーを添加する。ポリエチレングリコールは３０％で非常に粘り気があるので、または高濃度の塩がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と干渉するので、これらの高濃度の塩またはポリマーは細菌の別の処理において問題となる。
【０００８】
国際公開公報第００／２９５６２号でＭｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨは、ａ）微生物の培養物の酸性化、固体表面材料（シリカ・磁性粒子）とのインキュベーションおよび混合、ならびにｂ）それに続くプラスミドの精製による微生物からのプラスミドＤＮＡの単離のための方法について記載している。しかしこの方法は、収率のある程度の大幅な喪失を伴うことなくできるわけではなく、全ての大腸菌株に適しているというわけでない。ビーズの費用は、細菌濃縮費用の中心を成し、そして特にシリカ・ビーズは比較的高価であるので、この方法のさらに不利な点は必要なビーズの量に在る。シリカ・ビーズは主としてＤＮＡに結合できるので、シリカ・ビーズでのプラスミドの単離の間の収率の損失もまた観察され得る。
【０００９】
国際公開公報第９１／１２０７９号でＡｍｅｒｓｈａｍは、非特異的にポリマー（細胞）に結合する磁性ビーズでの細胞の沈殿の方法について記載している。この方法では、必要な作用物質（アルコールおよび塩）および磁性ビーズの添加の順序を強制的に満たす必要がある。使用前の作用物質ならびに／または作用物質およびビーズの混合が不可能であり、そして従って、ロボットの最適な開発のための自動化に必要であろうピペッティング工程を分離することができない。さらに使用することができる磁性粒子はセルロース／酸化第一鉄の粒子に限定される。
【００１０】
米国特許第６，２８４，４７０号でＰｒｏｍｅｇａは、無傷細胞と磁性粒子との複合化について記載している。適用可能な磁性ビーズに関しては、この方法はシリカ粒子に限定される。この方法はアルコール１容量を細胞懸濁液１容量に添加しなければならないと記載しているので、収率の有意な損失なしにディープウェルプレートの細胞収集物に適用することは困難であると思われる。さらに高濃度のアルコールによりタンパク質の沈殿に至り得る。
【００１１】
多くの研究により、カチオン性ポリマーが細菌と相互作用し得ることが示された。例えば実験により、キトサン（キトサンは脱アセチル化キチン）様のカチオン性ポリマーが単一の細胞実験のための生存微生物細胞のカプセル化または「密閉」にうまく適していることが示された（例えばＭｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３５：２５９−２６８（１９８７）または米国特許第５，４８９，４０１号参照）。またキトサンは、ビーズ・ポリマー中の活性生体材料のカプセル化にも使用される（米国特許第４，６４７，５３６号および国際公開公報第０１／４６２６６号）。キトサンはまた、場合によっては修飾された形態で、物質のコーティングまたはイムノアッセイのための実験用キットにも用いられる（米国特許第５，２０８，１６６号）。
【００１２】
しかし、微生物細胞壁の疎水性に及ぼすカチオン性ポリマーの影響に関する刊行物によれば、３以上のｐＨ値で疎水性表面への付着が有意に増加するが、３未満のｐＨ値ではほぼ０％にまで減少することが示されている（参照：Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｄｏｙｌｅ，Ｒ．Ｊ．およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５６５０−５６５４（１９９０））。
【００１３】
単一のウェル、例えばディープウェルプレートでの別個の収集が可能になり、そして全プレートが完全に収集される必要はないので、磁性粒子に対応する方法を用いることによりさらなる利点が提供される。従って、発現研究の範囲内で時間依存的な収集を行うことができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
要約すると、現在、遠心工程を伴わず、そして同時に広範な種類の細菌のために用いることができる、有効で、迅速で、経費のかからない細菌細胞の濃縮のための簡単な方法はない。従って、遠心工程を伴わない細菌細胞の非特異的濃縮のための方法を提供することは本発明の課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この問題は特許請求の範囲により定義される主題により解決される。
【００１６】
以下の図面によりさらに詳細に本発明を説明する。
【００１７】
本明細書で用いる「精製」または「濃縮」なる用語は水性溶液、例えば細菌細胞または細胞の成分が配された培養培地からの細菌細胞または細胞の成分の分離を意味する。精製または濃縮は従って磁性粒子の使用により実施する。
【００１８】
本明細書で用いる「非特異的濃縮」なる用語は、選択された条件下での濃縮が、細菌の種、株、属等とは独立して実施されることを意味する。
【００１９】
本発明の１つの態様は、
ａ）細菌細胞を含有するサンプルを酸性ｐＨ値でカチオン性ポリマーまたは塩基性ｐＨ値でアニオン性ポリマーと接触させるステップと、
ｂ）磁性キャリヤを添加するステップと、
ｃ）細菌細胞が結合した該磁性キャリヤをサンプルから分離するステップと
を含む、細菌細胞の非特異的精製の方法の条件に関する。
詳細には本発明の方法は以下の工程を特徴とする。
【００２０】
細菌培養物を、カチオン性ポリマーまたはアニオン性ポリマー、特には分岐していないカチオン性ポリマー、好ましくはキトサン（例えばＦＬＵＫＡ  製品番号２２７４１、２２７４２または２２７４３、Ｓｉｇｍａ  Ｃ−３６４６またはＲｏｔｈ  ５３７５．１）、またはポリリジン（例えばＳｉｇｍａ  Ｐ２６３６）と混合する。好ましいアニオン性ポリマーは硫酸デキストラン、硫酸コンドロイチン、ポリグルタメート、ポリマレート、ポリガラクツロン酸、ポリリン酸および硫酸オリゴ糖である。
【００２１】
細菌培養物およびポリマーとの混合物は、各バッファーと組み合わせて、用いるポリマーに従って特定のｐＨ値を有していなければならない。ｐＨ値は、カチオン性ポリマーの場合、好ましくは３または４に等しいかまたはそれより低く、そしてアニオン性ポリマーの場合、好ましくは８に等しいかまたはそれより高い。ポリマーの添加前に緩衝溶液の添加により細菌培養物を調整することにより、または酸もしくは塩基の添加により直接的に、のいずれかにより、ｐＨ値を望ましい値に調整することができる。加えて、各バッファー溶液に、または酸もしくは塩基に直接ポリマーを溶解することによりｐＨ値を調整することができる。さらにポリマーの添加後に、バッファー溶液の添加、または酸もしくは塩基の直接添加により、細菌培養物およびポリマーの混合物を望ましいｐＨ値に調整することによりｐＨ値を調整することができる。カチオン性ポリマーを酸性バッファーに、または直接酸に溶解することができる。細菌培養物およびカチオン性ポリマーの混合物が結果的に望ましいｐＨ値に至るように、本発明に従って溶液を調整する。本発明による方法に関しては、細菌培養物およびポリマーの混合物のｐＨ値が酸性であるのが好ましい。いずれかのバッファーまたは酸により、好ましくは０．５ＭのＨＣｌ／２５％酢酸、０．５ＭのＨＣｌまたは０．５Ｍのギ酸でｐＨ値を調整することができる。どのバッファーを用いるかは、特にさらなる細菌処理の様式および続く方法に各々依存する。本発明による方法をプラスミドの精製に用いる場合、ＤＮＡは１．８以下のｐＨ値で加水分解するので、約２から約３の範囲のｐＨ値のバッファーＨＣｌ／ＨＡｃが好ましい。本発明による方法をタンパク質の精製に用いる場合、機能的なタンパク質の単離のためにはｐＨ値は約４から約９の範囲であるべきであるので、約４の範囲のｐＨ値のギ酸がバッファーとして好ましい。
【００２２】
細菌の十分な精製を確実にする濃度の範囲でカチオン性ポリマーが存在する。１２．５μｇ／ｍｌ培養物から１５０μｇ／ｍｌ培養物の範囲の濃度、優先的には２５μｇ／ｍｌから１５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、特に４０μｇ／ｍｌから７５μｇ／ｍｌの範囲の濃度、さらに好ましくは５０μｇ／ｍｌの濃度のポリリジンを沈殿に用いる。従って最適な濃度は細菌種および細菌株に各々依存するが、用いるポリリジンの供給源または分子量にも依存する。
【００２３】
０．０５μｇ／ｍｌ培養物から１００μｇ／ｍｌ培養物の範囲の濃度、優先的には０．２５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、特に０．５μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの範囲の濃度、さらに特には１μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌの濃度、さらに好ましくは２．５から５０μｇ／ｍｌの濃度のキトサンを沈殿に用いる。用いるバッファーに依存し得るさらに好ましい濃度は以下の表から得られる。従って最適な濃度は、細菌種および細菌株に各々依存するが、用いるキトサンの供給源または分子量およびキトサンの脱アセチル化の等級にも依存する。キトサンの好ましい濃度の概要を以下の表に見出すことができる。
【００２４】
【表１】
2005505300.tif 000002
【００２５】
ポリマーの添加の後、細菌培養物およびポリマーの溶液を上下のピペッティングまたは振とうにより混合する。混合により、関連する全成分を迅速におよび直接的に互いに接触させる。
【００２６】
ポリマーおよび細菌の酸性混合物または塩基性混合物を即座に処理することができる。しかし、混合物を短時間、好ましくは３から１０分間、特に好ましくは５分間インキュベートすることもできる。インキュベーション温度は、室温から４０℃、好ましくは３７℃、特に好ましくは室温である。
【００２７】
ポリマーおよび細菌の酸性混合物または塩基性混合物を磁性キャリヤで固定する。好ましくは、磁性キャリヤは磁性粒子（以下では磁性ビーズとも称する）、例えば、ポリスチレン・ビーズまたは磁性色素である。本発明による方法の範囲では、その表面に化学的に官能性をもたせたポリスチレン・ビーズ、特にＮＨ2表面、ＣＯＯＨ表面またはＯＨ表面により化学的に官能性をもたせたポリスチレン・ビーズを用いることができ、ここではＮＨ2表面が好ましい。官能性をもたせた粒子として、好ましくは市販により入手可能なビーズ、例えばＥｓｔａｐｏｒ社のアミノ・ビーズ（ＥＭ２  １００／４０、直径１．４３μｍ）またはカルボキシ・ビーズ（ＥＭ１  １００／４０、（２３７１０）直径１．３μｍ）を用いる。磁性色素としては例えばＢａｙｆｅｒｒｏｘ  ３１８Ｍ、Ｂａｙｏｘｉｄ  Ｅ  ８７０６またはＢａｙｏｘｉｄ  Ｅ８７１３Ｈ（Ｂａｙｅｒ  ＡＧ）により市販で入手可能なビーズを用いることができる。ビーズの好ましい直径は、０．５μｍから２μｍの範囲にあり、好ましくは１μｍから５μｍの範囲の直径であり、特に好ましくは約１μｍである。
【００２８】
本発明による方法は、どのような種類の磁性粒子、例えばポリスチレン・ビーズまたは色素が組み込まれていても、細菌とポリマーのネットワークの形成を含む。それにより、磁場の適用によりネットに存在する磁性粒子により細菌を分離することができる。
【００２９】
従って本発明による方法は表面で官能性をもたせている磁性粒子の具体的な型に限定されず、例えば種々の表面を有するビーズまたは色素を用いることができることを意味している。異なる表面を有するマグネットの一般的な種類の概要を表Ａおよび表Ｂにまとめる。本発明による方法で磁性色素を用いる場合、これらの色素をアルコールに溶解することができるが、水性バッファーに溶解することもできる。
【００３０】
表Ａはこれまでに試験し、そして本発明による方法において機能的である全ての磁性粒子を表に表したものである。表Ａは、製造者により指標化された磁性色素であり、表Ｂは、製造者により指標化された異なる官能基を有する異なる塩基性マトリックスの磁性ビーズである。ＰＳはポリスチレンを、ｓｉｌｉｃａはシリカマトリックスを、ＰＶＡはポリビニルアルコールを表す。
【００３１】
【表２】
2005505300.tif 000003
【００３２】
細菌の十分な精製を確実にする濃度の範囲で磁性粒子が存在するが、精製の費用は正当な範囲内である。好ましくはポリスチレン・ビーズを細菌培養物の容量の約１／１０から１／７０の濃度で、１％のポリスチレン・ビーズ溶液と共に加える。特に好ましいのは約１／２０から１／５０の濃度、特に１／２０または１／５０の濃度である。従って濃度は細菌培養物の容量の大きさに依存する。細菌培養物の容量が例えば０．２、または１、または１．５ｍｌであると、１％のポリスチレン・ビーズ溶液の濃度は１／２０が好ましく、そして例えば細菌培養物の容量が１０ｍｌでは、１％のポリスチレン・ビーズ溶液の濃度は１／５０が好ましい。細菌培養物の容量が大きくなるほど、ポリスチレン・ビーズの濃度は低くなる。磁性色素は、細菌培養物の１／１０容量の濃度で５％溶液として用いられるのが好ましい。
【００３３】
磁性粒子の添加の後、細菌培養物、ポリマーおよび磁性粒子の溶液を、好ましくは上下のピペッティング、振とうによりまたはマグネチックスターラーで混合する。混合により関連する全成分を迅速におよび直接的に互いに接触させる。
【００３４】
混合物は、即座に処理することができる。しかし、混合物は短時間、好ましくは３から１０分間、特に好ましくは５分間インキュベートすることもできる。インキュベーション温度は、室温から４０℃、好ましくは３７℃、特に好ましくは室温である。
【００３５】
続いて磁性キャリヤに結合されている細菌をサンプルから分離する。それにより、細菌、ポリマーおよび磁性粒子の混合物を磁場に挿入し、そして複合体を沈殿させる。
【００３６】
本発明の方法の次の工程で、さらなる処理の種類、例えばプラスミド調製、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの調製に依存して、振とうすることにより、および廃棄することにより、細菌に結合している磁性粒子を細菌から分離することができるか、または磁性粒子を、細菌を伴う処理のさらなる工程で用いることができる。細菌を磁性粒子から分離する場合、サンプルからの分離の後、細菌、ポリマーおよび磁性粒子の混合物を再度各々のバッファー中で再懸濁し、そして除去し、そして例えば新たな反応チューブに移し、同時にマグネットにより磁性粒子を留めることができる。細菌、ポリマーおよび磁性粒子のネットワークから細菌を脱離させるために、優先的にはＴｒｉｓバッファー（２００ｍＭ、ｐＨ８から９．５）を用いる。脱離には、優先的には高速回転、例えば１２００ｒｐｍでの振とうさせるステップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆロータリー・シェ−カー）を実施する。
【００３７】
全ての一般的な反応チューブで、優先的には、全種類のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ反応チューブで、またはマイクロタイタープレートで本発明による方法を実施することができる。
【００３８】
本発明による方法により濃縮することができる細菌は全ての種類の細菌、優先的には真正細菌および古細菌、特に大腸菌、特にＢＬ２１、ＪＭ１０９、大腸菌Ｂ、ＤＨ１、ＬＥ３９２、大腸菌Ｋ１２株、ＤＨ５α、ＮＭ５２２、大腸菌Ｃ、ＤＨ１０ｂ、Ｓｕｒｅ、ＧＭ２１６３、ＴＧ２、ＨＢ１０１、Ｔｏｐ１０、ＩｎｖａＦ’、ＸＬ１Ｂｌｕｅ、ＪＭ８３でよいが、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種、特にＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ種、特にＰｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、特にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ種、特にＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓでもよい。
【００３９】
本発明による方法は、遠心の代替として用いられ、そして従って細菌細胞の自動精製を促進することができる。かかる方法を用いて約５分から１０分以内で培養物から細菌を非特異的に濃縮することができる。用いたカチオン性ポリマーの濃度は非常に低く、１％以下であるので、当分野の現状の手順による経費よりもかなり低い経費で濃縮手順を実施することができる。さらに本発明による方法では、例えば、国際公開公報第００／２９５６２号に記載される細菌あたり３０から５０ビーズの代わりに、細菌あたり１から１５ビーズのかなり低量のビーズを用いる。
【００４０】
以下の実施例は説明のために提供するものであり、そしていかなる観点でも本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４１】
１．キトサン溶液の調製
キトサンの重量を測定し、０．５ＮのＨＣｌ／２５％ＨＡｃに再懸濁し、そしてキトサンが完全に溶解するまで溶液を加熱（約８０から９０℃）した。続いて溶液を希釈し、そして０．５ＮのＨＣｌ／２５％ＨＡｃ（＝作業溶液Ｈ）で２５μｇ／ｍｌに、または０．５Ｎのギ酸（＝作業溶液Ａ）で１２５μｇ／ｍｌに調整した。作業溶液（２５μｇ／ｍｌ）は室温で溶液であって、安定なままであり、そのままで保存した。
【００４２】
２．ポリリジン溶液の調製
ポリリジンの重量を測定し、０．５ＮのＨＣｌに再懸濁し、そして０．５ＮのＨＣｌ（＝作業溶液）で０．５ｍｇ／ｍｌに調製した。作業溶液を使用時まで−２０℃で保存した。
【００４３】
３．培養物０．２ｍｌの規模での細菌の収集：ネットワークの形成
０．５ｍｌの９６ウェル・ポリプロピレン・マイクロタイタープレート中で、１ウェルあたり培養物０．２ｍｌと共に大腸菌ＨＢ１０１の培養を一晩行った。各々キトサンを含まない対照サンプル中、キトサン作業溶液Ａ  ２０μｌおよび０．５Ｍのギ酸２０μｌ、ならびにＰＢＳ中磁性色素Ｂａｙｏｘｉｄ  Ｅ８７０６の５％溶液２０μｌを培養物に加え、そして上下のピペッティングにより混合した。室温で５分間のインキュベーション時間の後、サンプルを顕微鏡観察してネットワークの形成を調べた（図７）。
【００４４】
４．培養物１．５ｍｌの規模での細菌の収集：ＤＮＡの単離
９６ＤＷＰ中で、各ウェルあたり培養容量１．２５ｍｌで、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを伴うＬＢ培地中、プラスミドｐＵＣ１９で形質転換した大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅの培養を実施した。キトサン作業溶液Ｈ  １２５μｌおよび５％色素ビーズ溶液（イソプロパノール中Ｂａｙｆｅｒｒｏｘ  ３１８Ｍ）１２５μｌを培養物に一晩添加し、そして上下のピペッティングにより混合した。室温で５分間のインキュベーション時間の後、細菌／ビーズ複合体を磁気分離器（Ｂｉｌａｔｃ  ＡＧ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で分離した。上澄を完全に除去し、そしてＤＮＡ単離キットＷｉｚａｒｄ  ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）プラスミド精製システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）を用いて、製造者のプロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを細胞沈降物から単離した（図１０）。
【００４５】
５．培養物１０ｍｌの規模での細菌の収集
ポリプロピレンチューブ中、培養物容量１０ｍｌで一晩、大腸菌ＪＭ８３の培養を実施した。１ｍｌ（１／１０容量）のキトサン作業溶液Ｈを培養物に一晩添加し、そして上下に２回ピペッティングすることにより混合した。この後、１％のアミノ・ポリスチレン・ビーズ溶液  ０．２ｍｌを加えた。続いて溶液を上下にピペッティングすることにより混合した（２回）。その後、続いて室温で５分間インキュベーションを行った。細菌／ビーズ複合体を沈降させるために、チューブを永久磁石（Ｂｉｌａｔｅｃ  ＡＧ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）の磁場に１０分間挿入した。上澄を廃棄し、そして細菌細胞を直接的に処理した。
【００４６】
６．大腸菌培養物の培養
ＬＢ、２ｘＹＴ、ＳＯＢまたはＳＯＣのような標準的な培地中で、大腸菌培養物を培養した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、（１９８７））。一晩培養物２００μｌを各々キトサン作業溶液Ｈ  ２０μｌおよびアミノ・ポリスチレン・ビーズで留め、そして十分に混合した。５分間のインキュベーションの後、細菌・ビーズ複合体の分離を磁気分離器で行った。記載した培地を用いる場合、作業溶液およびビーズの濃度の調整が必要であろう。
【００４７】
７．培養物０．２ｍｌの規模での細菌の収集
９６ウェル・マイクロウェル・プレート中、３７℃で一晩、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓの培養物０．２ｍｌの培養を行った。９６ウェル・マイクロウェル・プレート中、３０℃で一晩、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ、の培養物０．２ｍｌの培養を行った。キトサン作業溶液Ｈ  ２０μｌ（１／１０容量）を一晩培養物に添加した。この後、１％のアミノ・ポリスチレン・ビーズ溶液  １０μｌを加えた。続いて溶液を上下にピペッティングすることによりウェル中で混合した（１または２回）。続いて室温で５分間インキュベーションを行った。細菌／ビーズ複合体を沈降させるために、マイクロタイタープレートを磁気分離器（Ｂｉｌａｔｅｃ  ＡＧ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で５分間インキュベートした。上澄を廃棄し、そして細菌細胞を直接的に処理した。
【００４８】
８．生存細菌の収集
０．５ｍｌの９６ウェルＰＰマイクロタイタープレート中、キトサン作業溶液Ａを３０μｌおよび５％色素・ビーズ溶液（ＰＢＳ中、Ｂａｙｆｅｒｒｏｘ  ３１８Ｍ）３０μｌを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の一晩培養物３００μｌに加え、そして上下にピペッティングすることにより十分に混合した。この後、インキュベーション工程を室温で各々３分間および５分間実施した。続いて、適当な磁気分離器（Ｂｉｌａｔｅｃ  ＡＧ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で、各々３分間および５分間インキュベートすることにより細菌／ビーズ複合体を沈降させた。上澄を廃棄し、そして細菌／ビーズペレットを各々２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）２００μｌに再懸濁した。対照に関しては、一晩培養物３００μｌを遠心し、そしてペレットをまた２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）２００μｌに再懸濁した。寒天プレートでの平板希釈シリーズにより細胞の生存性を調べ、そして一晩インキュベートした後にコロニーを計数した。細胞の活性および生存性に関するさらなるアッセイとして、細胞の独自のβ−ガラクトシダーゼ（Ａｐｔｅら、Ｗａｔ．Ｒｅｓ．２９：１８０３−１８０６（１９９５））の酵素活性を測定した（図８）。
【００４９】
９．タンパク質単離
本発明による方法により収集した細菌からのタンパク質単離のために、Ｓｔｒｅｐタグシステムを用いた。分子生物学の標準的な方法を用いて、ｐ１２（Ｓｅｌｉｖａｎｏｖ，Ｎ．Ａ．ら、「バクテリオファージＴ４遺伝子１２のヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｓ．１６（５）：２３３４（１９８８））をＮ末端Ｓｔｒｅｐタグ（米国特許第５，５０６，１２１号）に融合させ、そしてＢｕｒｄａ，Ｍ．Ｒ．およびＭｉｌｌｅｒ，Ｓ．により記載されるように（Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５：７７１−７７８（１９９９））発現させた。９６ディープウェルプレート中、ウェルあたり培養物１．２５ｍｌと共にＮ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔ４−ｐ１２発現大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＮＳ−Ｔ４−ｐ１２ｐ５７株の培養を実施した。約０．５の細胞密度ＯＤ600で、３時間、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導を行った。続いて、ウェルあたりキトサン作業溶液Ａ  １２５μｌおよび５％色素ビーズ溶液（ＰＢＳ中、Ｂａｙｏｘｉｄ  Ｅ８７０６）１２５μｌを加え、上下にピペッティングすることにより十分に混合し、そして室温で５分間インキュベートした。この後、適当な磁気分離器（Ｂｉｌａｔｅｃ  ＡＧ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で５分間インキュベートすることにより細菌／ビーズ複合体を沈降させた。上澄を完全に除去し、そしてペレットをバッファーＡ（２００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）１５０μｌに再懸濁した。続いて振とう工程（１２００ｒｐｍで５分間、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社（ドイツ）の振とう器）により細菌を細菌／ビーズ・ネットから脱離させた。磁気分離器でのインキュベーションを繰り返すことにより、ここで上澄に存在する細胞からビーズを分離し、そして上澄を、０．５ｍｌの９６ウェルＰＰマイクロタイタープレートの新たなウェルに移した。続いてリゾチーム（１．６ｍｇ／ｍｌ）を添加し、７５０ｒｐｍで２分間振とうし、そして室温で１５分間のインキュベートすることにより細胞を溶解し、そして５μｇ／ｍｌのＤＮアーゼの添加によりＤＮＡを消化した。５％のＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ・ビーズ（ＩＢＡ社、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）１０μｌを添加し、そして速やかに振とうしながら２０分間のインキュベートすることにより、異種性に発現されたＮ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔ４−ｐ１２をＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎビーズに結合し、そしてライゼートから濃縮した。５ｍＭのビオチンを添加することによりＮ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔ４−ｐ１２をビーズから溶出した（図９）。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】異なる磁性粒子を用いた大腸菌ＬＥ３９２（明色の棒グラフ）およびＴＧ２（暗色の棒グラフ）の細胞収集の収量の結果を図解する。値は上澄の濁度および用いた細胞懸濁液の光学密度の比率により決定される収量を％で示す。略語は：Ｓｉｌｉｃａ：ＭａｇＰｒｅｐシリカ・ビーズ（Ｆａ．ＭＥＲＣＫ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）、ＮＨ2：アミノ・ポリスチレン・ビーズ（Ｆａ．Ｅｓｔａｐｏｒ、ＭＥＲＣＫ−Ｅｕｒｏｌａｂ）；ＣＯＯＨ：カルボキシ−ポリスチレン・ビーズ（Ｆａ．Ｅｓｔａｐｏｒ、ＭＥＲＣＫ−Ｅｕｒｏｌａｂ）；ＰＳ：ポリスチレン・ビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、イリノイ、米国）；ＰＶＡ：ポリビニルアルコール・ビーズ（Ｃｈｅｍａｇｅｎ、Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、ドイツ）を表す。
【図２】シリカ・ビーズ（暗色の棒グラフ）およびキトサン／アミノ・ポリスチレン・ビーズ（明色の棒グラフ）を用いた酸性ｐＨ値での細胞収集の収量の結果を示す。図２では、本発明による方法の細胞収集の収量（明色の棒グラフ）を国際公開公報第００／２９５６２号（暗色の棒グラフ）の結果と比較する。本発明による方法の細胞の収量を１００％に設定し、国際公開公報第００／２９５６２号による収量をこれに対する比率で決定した。全ての値は標準偏差を伴ういくつかの実験からの平均値である。本発明による方法の細胞収集を実施例５に記載するように実施した。国際公開公報第００／２９５６２号（ＭＥＲＣＫ）に関しては製造者のプロトコルに従った。
【図３】溶解キトサン（明色の棒グラフ）およびビーズに固定されたキトサン（キトサン・ビーズ、Ｆａ．Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ、Ｂｅｒｌｉｎ、ドイツ）（暗色の棒グラフ）を用いた、大腸菌ＤＨ５αおよびＨＢ１０１株の細胞収集の収量の結果を図示する。値は上澄および用いた細胞懸濁液の光学密度の比率から決定される収量を％で示す。
【図４】種々の大腸菌クローニング株による細胞収集（実施例５と同様に実施）の収量の効率の結果を表す図を示す。上澄および用いた細胞懸濁液の光学密度の比率により決定される収量を％（いくつかの実験からの平均値、ｎ＝２７）でプロットする。
【図５】異なる細菌種の収集の結果を示す。図５は、本発明による細胞収集のための系をいくつかの群の広範な細菌スペクトル（グラム陰性およびグラム陽性細菌の双方）に関して用いることができることを示している。各々の場合での細胞収集の収量をプロットする。実施例７で表すように細胞を収集した。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ：Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｂ．ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖａｌｌｉｓｍｏｒｔｉｓ、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ：Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ：Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ：Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ。
【図６】０．５ＭのＨＣｌ中のポリリジンおよびポリリジンを含まない０．５ＭのＨＣｌの各々を用いた大腸菌ＪＭ８３株の細胞収集の収量の結果を図解する。値は上澄および用いた細胞懸濁液の光学密度の比率から決定される収量を％で示す。ＰＬ／ＨＣｌは０．５ＭのＨＣｌ中のポリリジンを、ＨＣｌは０．５ＭのＨＣｌのみ（ポリリジンを含まない対照）。
【図７】大腸菌細胞、キトサンおよび磁性ビーズのネットワーク形成を示す。０．５Ｍのギ酸に溶解した遊離のキトサンの大腸菌懸濁液（ＨＢ１０１株）への投与によりこのネットの形成を誘起する（ＣおよびＤ）。キトサンを含まない対照（０．５Ｍのギ酸のみ）ではネットワークは作製されない（ＡおよびＢ）。細菌は、依然単一の細胞として表される。ＡおよびＣ：明色の視野の写真、Ａでは単一の細胞および磁性色素、ならびにＣでは凝集物が見られる。ＢおよびＤ：大腸菌細胞をＰｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ／Ｓｙｔｏ９（ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）バイアビリティー・キット、分子プローブ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン、米国）で染色した後の蛍光画像。Ｂでは蛍光の単一の細胞が見られ、Ｄはネット構造に包埋された細胞の蛍光を示す。
【図８】各々、本発明による細胞収集の後および遠心による収集の後の大腸菌のβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を図示する。収集した細胞（％において）３００μｌからなる、アッセイに用いた細胞の分画に対する相対単位で酵素活性の値をプロットする。白抜きの菱形は遠心された細胞に関する値を表す。三角および四角は本発明による方法により収集された細菌に関する値を表す。三角：０．５Ｍのギ酸中１２５μｇ／ｍｌのキトサン  ３０μｌの添加の後、細胞を３分間インキュベートし、そしてさらに３分間磁性分離手順により分離した。四角：細菌を５分間インキュベートし、そして溶液の添加の後さらに５分間磁場で分離した。
【図９】本発明による方法により異種性に発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の収集の後、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズ（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）によるＮ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔ４−ｐ１２タンパク質の濃縮の結果を示す。Ａ：細胞を含まない。Ｂ：細胞を含む。１：粗製ライゼート。２：Ｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔ４−ｐ１２を結合した後のｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎビーズ。３：溶出された元来の三量体形態のＮ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔ４−ｐ１２タンパク質。４：溶出された単量体形態のＮ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔ４−ｐ１２タンパク質（９５℃で沸騰後）。５：溶出後のｓｔｒｅｐ−ｔａｃｔｉｎビーズ。６：標準（精製されたＮ−Ｓｔｒｅｐ−Ｔ４−ｐ１２タンパク質）。
【図１０】本発明による方法により（実施例４に表すように）収集された大腸菌ＸＬ１ＢｌｕｅからのプラスミドＤＮＡの単離の結果を示す。１：本発明による方法による細菌の収集。２：遠心による細菌の収集。ａ：ＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９。ｂ：未消化プラスミド。Ｍ：ＤＮＡ標準（ラムダＤＮＡ  ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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