(57)【要約】本発明は、微生物を使用してプロセス制御の目的のための環境条件の決定に関する。本発明は、外部刺激を適用後の微生物における固有の変化が、微生物が外部から受ける刺激の性質を特徴付けるという原理を使用する。これらの固有の変化を測定することによって、環境条件を決定するための、これらの環境条件の変化の程度を決定するための、刺激の性質及び力を決定するための及び様々なプロセスに対する多様な刺激の影響を測定し従ってこれらのプロセスを制御することを可能にするための特異的なセンサーとして微生物が使用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境条件にさらされた１つ又はそれ以上の微生物の生化学組成を測定することによって、前記環境条件を決定する方法。
【請求項２】
環境条件の変化にさらされた１つ又はそれ以上の微生物の生化学組成の変化を測定することによって、前記環境条件の変化を決定する方法。
【請求項３】
環境条件にさらされた１つ又はそれ以上の微生物の生化学組成を測定すること、前記１つ又はそれ以上の微生物を複数の環境条件へさらすことによって得られた前記１つ又はそれ以上の微生物の複数の生化学組成の予め決定された較正線と前記生化学組成を比較すること、及び前記較正線上の前記生化学組成の位置によって前記環境条件を決定することのステップを含む、環境条件を決定する方法。
【請求項４】
前記１つ又はそれ以上の微生物が、細菌、カビ及び／又は酵母を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記生化学組成が、微生物のトランスクリプトーム、プロテオーム及び／又はメタボロームを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記生化学組成が、トランスクリプトームである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記生化学組成が、マイクロアレイを使用して決定される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を含む、環境条件を制御し又は監視する方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法を含む、プロセスを制御する方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を使用して、食品調理プロセス、バイオフィルム形成プロセス、醗酵プロセス及び／又は生物転化プロセスの環境条件を決定する、前記使用する方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を使用して、空気及び／又は水性環境における化学的及び／又は生物学的物質を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境条件の決定に関する。特に、本発明は、微生物学的な微生物を使用してプロセス制御の目的のための環境条件の決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的なプロセス条件は決定することが容易でないために、多くの工業的及び天然のプロセス例えば食品の調理及び包装は適切に制御され得ない。一般的なプロセス条件に関連する知識のこの欠如の結果として、それらの制御は、非常に困難であり且つ大抵は不十分である。
【０００３】
多くの場合、プロセスは、微生物の望ましい又は望ましくない存在によって決定され又は非常に影響される。そのようなプロセスの例が、食品調理プロセス、食品包装、バイオフィルム形成プロセス、醗酵プロセス及び生物転化プロセスである。
【０００４】
これらのプロセスにおいて役割を果たす微生物の活性の制御例えば望ましくない微生物を殺すこと、又は逆に望ましい微生物の活性の刺激は、しばしば問題がある。例えば望ましくない微生物を死滅させるプロセスの有効性は、まだ生存している微生物の数を後で決定することによって伝統的に行われる。
【０００５】
目標有機体の特定の生物学的反応は、上記された例示的なプロセスにおいて及び多くの他のプロセスにおいて直接的に分析されない。これはしばしば、上記プロセスの効率的且つ有効な制御を非常に良く可能とするものではない。
【０００６】
環境条件、例えば我々を取り囲む環境、並びにある作業場例えばクリーン・ルーム設備、手術室、分析測定用の部屋、化学薬品用の貯蔵室などにおける（大気）圧力、温度、化学濃度、含水量及び／又は大気湿度、酸性度、光体制、騒音及び放射線を制御し又は監視することが、非常に望まれる。安全性の見地から、我々を取り囲む環境（我々を取り囲む大気、水塊、土地及び食物を含む）における健康を脅かす化学的又は生物学的物質を制御し又は監視することが、望まれる。毒性成分それら自身が知られていないために又は特定の組み合わせのみが望ましくない故に、そのような物質の測定が、不可能でないとしても、多くの場合厄介である。したがって、環境条件を制御し又は監視するための改善された可能性が利用可能になることがまた望まれる。
【０００７】
本明細書中では、用語「環境条件」は、広義の意味の環境の物理的及び／又は化学的条件を云うと意味される。より特定的には、本明細書中では、それは、環境における特定の化学薬品の存在に関する。
【０００８】
最近、多くの様々な環境条件が、この目的のために特に開発された機器で容易に測定されうる。また、多くの化学物質を測定するための特定のバイオセンサーが利用可能である。しかしながら、多くの化学物質は容易に測定され得ず又は全く測定され得ない。
【０００９】
例えば、特定の化学薬品を測定するためのいくつかの微生物センサーが、文献から知られている。タウリアイネン（Tauriainen）等（Wat. Res.、2000年、第34巻、2661-2666頁）は、金属例えばカドミウム、水銀、鉛及びヒ素を測定するための微生物センサーを記載する。該微生物センサーは、挿入されたルシフェラーゼ遺伝子の発現が金属感受性の調節ユニットの制御下にあるところの大腸菌、枯草菌（B. subtilis）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞によって形成される。ベルキン（Belkin）等（Wat. Res.、1997年、第31巻、3009-3016頁）は、例えば、（毒性）物質及び環境ストレスを測定するための微生物センサーを記載する。そのような方法は、有機体が特定の環境条件に反応する導出経路又は様式が知られているところの組み換え細菌細胞からの生物発光の測定を含む。
【００１０】
国際特許出願WO 99/09202は、環境における毒性物質を検出するための方法を記載し、こここで環境における毒性物質の存在は、細胞性粘菌（Dictyostelium）細胞中のレポーター遺伝子の発現の結果としてベータ−ガラクトシダーゼタンパク質の検出によって決定される。この場合同様に、有機体内の変化がもたらされる様式は知られている。
【００１１】
しかしながら、多くの場合、導出経路は、完全に知られていず、従って先行技術に従う方法を使用して、種々の環境条件の少数のみが決定されうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
生化学組成の変化の故に、変化を導く導出経路が知られていることを原測として必要なしに、原則的に多くの環境条件がそれらから推定されうるという様式で微生物はそれらの環境に反応できるので、微生物が測定機器として使用されうることを驚くべきことに今発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、環境条件にさらされた１つ又はそれ以上の微生物の生化学組成を測定することによって、該環境条件を決定する方法を提供する。好ましくは、天然の生化学組成は、組み換え生化学組成に対する対照として測定される。
【００１４】
本発明は、環境状態の変化にさらされた１つ又はそれ以上の微生物の生化学組成の変化を測定することによって、該環境状態の変化を決定する方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、環境条件にさらされた１つ又はそれ以上の微生物の生化学組成の測定、前記１つ又はそれ以上の微生物を複数の環境条件へさらすことによって得られた１つ又はそれ以上の微生物の複数の生化学組成の予め決定された較正線と前記生化学組成を比較すること、及び前記較正線上の前記生化学組成の位置に基づき前記環境条件を決定することを含む、環境条件を決定する方法をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
該改善された方法は、本発明に従う方法によって環境条件を決定する目的のために、微生物がプロセス或いは（プロセス）環境中に既に存在するか又はそれらの中に導入されたかを問わず、微生物における固有の変化に基づくプロセスの監視及び制御を可能にする。
【００１７】
改善された方法は、以前に測定可能でなかった環境の非常に小さい変化を測定する可能性を提供する。
【００１８】
本発明は、微生物が外部の影響に強く反応するという原理を使用する。外部刺激を適用した後の微生物の固有の変化は、生体分子例えばRNA、タンパク質及び代謝物質の量及び性質の変化にある。そのような変化の合計は微生物が受ける外部刺激の性質を特徴付けることが今見つけられた。さらに、様々な条件下で微生物中のこれら生体分子の濃度を測定し且つ比較することによって、特定の刺激又は環境条件の影響下での微生物の反応の結果として特異的に変化する生体分子のグループが選択されうる。
【００１９】
このようにして、微生物は、環境上の条件を決定するために、これらの環境状態の変化の程度を決定するために、刺激の性質及びレベルを決定するために、及び様々なプロセスに対する多様な刺激の影響を測定し従ってこれらのプロセスを制御することを可能にするために特異的センサーとして使用され得る。
【００２０】
そのような方法の例は：
−微生物の成長及び／又は死に対する温度の影響を決定することあるいは温度に基づき保存する方法；
−微生物の生産性に対するプロセス特性の変化の性質の影響の研究；
−望ましくない毒性物質の微生物分解（生分解）；
−微生物の望ましくない成長及び耐性細菌の制御について耐微生物物質例えば抗生物質及び殺生剤の有効性を試験すること；
−表面上の微生物の望ましくない成長の予防について種々の物質の効果を試験すること
を含む。
【００２１】
発明に従う方法はなかんずく、微生物に対する抗生物質の影響を決定するための可能性を提供し、それは抗生物質のスクリーニング・アッセイを設定すること又は例えばバイオフィルムの形成に対する特定の処理プロセスの効果を評価すること及び必要な場合にそれを改善することを可能にする。バイオフィルム形成のこの分析及び制御は、例えばレジオネラ（Legionella）感染の予防に関連する。また、醗酵プロセス及び生物転化プロセスは、このようにして制御され且つ改善されうる。さらに、食品調理のためのあつらえのプロセス制御のための統合システム又は例えば長期保存寿命を有する安全食品の生産のための新規で穏やかな保存戦略を開発することが可能である。
【００２２】
また、環境条件例えば環境中の化学薬品の発生は、本発明に従う方法によって、１つ又はそれ以上の微生物の組成中の特異的な刺激導出された変化を決定することによって決定されうる。
【００２３】
本発明に従う方法で使用されうる微生物は、なかんずく、細菌、始原菌、カビ、酵母、原虫及び藻類である。好ましくは、細菌、酵母及び／又はカビが、本発明に従う方法で使用される
【００２４】
微生物は、単一微生物の純粋培養又は単一培養の形で使用されうるが、本発明に従う実施態様において、自然な混合集団及び人工的に構成された混合集団を含む、微生物の混合物を使用することもまた適切である。自然に又は全く異なる環境条件中の一つの環境条件のプロセス中で生じる単一培養又は混合された集団を使用することがまた可能である。
【００２５】
特定の微生物がその中で役割を果たすプロセスの制御では、好ましくはこれらのプロセスからの特定の微生物が本発明に従う方法において使用される。
【００２６】
プロセスが、微生物の不存在下で起こる場合、微生物はより短い又はより長い期間の間、例えば好ましくはプロセスの開始からそれらを処理室内に導入することによって又は処理室の外で（一部の）プロセス物質を微生物に接触させることによって、プロセス条件にさらされうる。
【００２７】
必要であれば、微生物は前もって成長されうる。ある実施態様では、均一化された又は標準化された又は定義された生理学的状態で微生物を使用することが好まれる。例えば（一部の）処理物質例えば可能性ある抗生物質又は水、空気、食品のサンプルに微生物をさらすことによって微生物が処理室の外でプロセス条件にさらされる場合、又は微生物が微生物の変化を決定する目的で短い又は長い期間の間あるプロセス条件にさらされる場合がこの例である。均一化された又は標準化された又は定義された生理学的状態まで微生物を育てることは、ここで述べた場合に妥当する。
【００２８】
本明細書中では、均一化された又は標準化された又は定義された生理学的状態とは、既知の生化学組成を提供する微生物の条件を云うと意味される。そのような生化学組成が繰り返し得られうる場合、それは標準であるとみなされうる。
【００２９】
しかしながら、微生物が、均一化された又は標準化された又は定義された生理学的状態で使用されることは必要とされない。事実、本発明に従う方法で使用される微生物の生化学組成の変化を測定することが、微生物の生化学組成の変化が特定の環境条件に関係づけられうるかぎり、環境の条件又はその変化を決定するには十分である。
【００３０】
好ましい実施態様では、本発明に従う方法は、少なくとも２つの環境条件すなわち標準条件と実験条件との間での比較を含み、その結果として、微生物の生化学組成の観察された変化は、本来的に実質的に相対的であるだろう。
【００３１】
本明細書中では、微生物の生化学組成とは、本発明に従う方法で使用される微生物の生体分子についての測定の結果である試験結果の集合を云うと意味される。特に、微生物の生化学組成は、微生物の複数の異なる生体分子を云うと意味される。
【００３２】
好ましくは、言及された生体分子についての測定は、定量的であるが、しかし（半）定量的測定がまた使用されうる。
【００３３】
測定結果の適切な集合は、細胞中に存在する種々のメッセンジャーRNA分子を測定することによって得られうる微生物の転写的発現特徴（トランスクリプトーム）によって形成される。その場合、それらから環境条件を推定するために測定される複数の異なる生体分子は、複数の異なるＲＮＡ分子を含む。測定結果の別の集合コレクションは、細胞に存在する種々のタンパク質分子（プロテオーム）を測定することによって得られる、微生物のタンパク質発現特性によって形成される。他の代替物は、代謝物質の集合（メタボローム）を測定することである。
【００３４】
従って、細胞の生物学的条件又は状況を反映する、微生物の生化学組成は、転写状態（RNA量の決定を含む、翻訳状態（タンパク質量の決定を含む）、活性状態（酵素活性の決定を含む）又は代謝経路の状態（代謝物量の決定を含む）、或いはそれらの組み合わせを決定することに基づいて非常に適切に測定されうる。事実、多くの異なる生体分子についての測定は、本発明に従う実施態様中で使用されうる微生物の生化学組成を提供できる。
【００３５】
そのような生体分子は、ポリヌクレオチド例えば核酸、（ポリ）ペプチド又はタンパク質、多糖類、脂質、リポ多糖類及び他の細胞性高分子体を包含することができる。本明細書では、また代謝的中間物例えば糖類、有機酸、アルコール、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチドなどが測定されうる。本発明に従う実施態様では、メッセンジャー、トランスファー、リボソームRNA又はそれらの組み合わせを含むRNAのような核酸が、非常に適切に測定されうる。
【００３６】
極めて好ましくは、本発明では、微生物の生化学組成は、細胞の転写的状態（すなわちメッセンジャーＲＮＡの形で測定される）を決定することによって決定される。
【００３７】
それらから環境条件を推定するために本発明に従う実施態様で使用されうる生化学組成を一緒に提供する測定結果の集合を形成するために使用されうる微生物の生体分子についての測定は、好ましくは並列の生化学分析方法の形式である。
【００３８】
そのような測定は例えば、本発明に従い使用される微生物の細胞性生体分子を分離し、それらを集団的に又は別々にマーク付けし、及びそれらを質的に又は定量的に検出することによって実行されうる。本明細書において、生体分子を分離するとは、同一の生体分子の分離された量を検出でき且つ必要であれば定量化できる目的のために、特定の生化学的特性に基づく同一の分子のグループの空間分離を云うと意味される。しかしながら、同一の生体分子の異なるグループを空間的に分離することは必ずしも要求されない。本明細書中で、生体分子をマーク付けするとは、このようにマーク付けされた生体分子を検出し且つ必要であれば定量化する目的のために、特定のマーカーを有する生体分子の特異的又は非特異的なマーク付けを云うと意味される。
【００３９】
この目的のために、１つ又はそれ以上の技術が使用できる。例えば、
−イン・シチュー（in situ）測定技術例えば核酸プローブ技術及び／又は免疫学的測定技術；ここで、種々の細胞成分は特異的又は非特異的な検出技術を使用することによって、それらの実際の分離を生じること無しに、別々に測定され得、その適応性は検出されるべき成分に依存する；
−電気泳動的及び／又はまたはクロマトグラフィー的測定技術；ここで、細胞成分は、なかんずくサイズ、重量、荷電、変性に対する感受性に基づき分離され得、その後検出が特異的又は非特異的な検出技術を使用して行われ、その適応性は検出されるべき成分に依存する；
−マイクロアレイ及び／又はバイオチップ技術；ここで、生化学成分は、担体上に固定化された結合パートナーとアフィニティに基づき分離され、及び検出が、特異的又は非特異的な検出技術を使用して行われ、その適応性は検出されるべき成分に依存する。
【００４０】
上記技術に関連して使用されうる適切な検出技術はなかんずく、オートラジオグラフィー検出技術、蛍光、ルミネセンス又は燐光に基づく検出技術及び発色体検出技術である。これらの技術は、生体分子の検出の分野で周知である。
【００４１】
好ましくは、本発明では、微生物の転写状態が、核酸プローブ又は核酸模倣プローブのアレイへのハイブリダイゼーションに関与した技術を使用することによって測定される。
【００４２】
微生物の転写の状況を決定するために、RNA（トータルRNA及びmRNAの両方）が微生物の１つ又はそれ以上の細胞から分離されうる。mRNAの分離に反して選択しない任意のＲＮＡ分離方法が、そのようなRNAの分離に使用されうる（参照、例えば、アウスベル（Ausubel）等、1987-1993年、Current Protocols in Molecular Biology、JohnWiley & Sons. Inc.、ニューヨーク）。さらに、大量のサンプルが、当業者に知られている方法例えばコムジンスキ（Chomczynski）の単一ステップ分離プロセス（1989年、米国特許第4,843,155号）を使用することによって処理されうる。
【００４３】
転写物（DNAのRNA転写物）は、差示的に発現された遺伝子（differentially expressed genes）のRNAを表し、そして当業者に知られている種々の方法を使用することによって種々のRNAサンプルにおいて識別されうる。この目的のためになかんずく、差別的スクリーニング(テダー（Tedder）等、1988年、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第85巻: 208-212頁)、減法ハイブリダーゼーション（subtractive hybridization）(ヘドリック（Hedrick）等、1984年、Nature、第308巻: 149-153頁; リー（Lee）等、1984年、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、第88巻: 2825頁)、差別的表示（differential display） (リアン（Liang）及びパルディー（Pardee）、1992年、Science、第257巻: 967-971頁; 米国特許第5,262,311号)、発現された配列タグ（expressed sequencetag）(EST) (アダムス（Adams）等、1991年、Science、第52巻: 1656年)、遺伝子発現の連続分析（serial analysis of gene expression）(SAGE) (キンツラー（Kinzler）等, 米国特許第5,695,937号)、又はcDNA AFLP (ボス（Vos）等、1995年、Nucleic Acids Res. 、第23巻、4407-14頁)技術が使用できる。
【００４４】
そのように差別的に発現された遺伝子の同定は、微生物の特定の環境条件の迅速に決定を可能にする特定のマーカーを設計するためにさらに使用されうる。
【００４５】
微生物の異なるｍＲＮＡ分子を測定するために、mRNAは好ましくは最初に相補DNA（cDNA）に変換され、その目的にために当業者に知られた方法例えば酵素逆転写酵素を使用してcDNAへのmRNAの逆転写が利用可能である。随意的に、RNAのcDNAへの変換は、PCR（ムリス（Mullis）、1987年、米国特許番号第4,683,195号、第4,683,202号及び第4,800,159号)、随意的に所謂「入れ子になった」（nested）、「多重化した」（multiplex）、又は「非対称の」（asymmetric）設計で、−又はリガーゼ連鎖反応（（Barany）、1991年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第88巻: 189-193頁; 欧州特許出願番号第320,308号）、自己維持されたシーケンス複製（3SR(a self sustained sequence replication)） (グアテリ（Guatelli）等、1990年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第87巻: 1874-1878頁)、ストランド置換増幅（SDA(a strand displacement amplification)） (米国特許番号第5,270,184号及び第5,455,166号)、転写増幅システム(コー（Kwoh）等、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第86巻: 1173-1177頁)、Q-ベータ・レプリカーゼ(リザルディ（Lizardi）等、1988年、Bio/Technology、第6巻: 1197年)、回転サークル増幅（RCA(Rolling Circle Amplification)）又は核酸の増幅のための他の方法によってcDNAの増幅と結合されうる。代替方法では、RNAが直接的にまた使用され得若しくは最初にこの目的の為に利用可能なRNA増幅方法例えば"Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA) " (エル  マレック（L. Malek）等、1994年、Meth. Molec. Biol.、第28巻、Ch. 36、Isaac PG 編,、Humana Press, Inc.、トトワ、ニュージャージー)によって又はTMAによって増幅されうる。
【００４６】
核酸アレイを使用することによって遺伝的情報を得る方法は、当業者に知られている（参照、特にチー（Chee）等、1996年、Science、第274巻(5287）: 610-614頁）。
【００４７】
本発明に従う方法では、ＤＮＡアレイの使用が好ましい。オリゴヌクレオチドのそのようなアレイは、遺伝的マーカーに特異的である配列を含み且つ本発明のまた一部でもある。
【００４８】
本発明に従うオリゴヌクレオチドアレイの製造は、当業者に知られた方法を使用して実行されうる。特定の核酸配列の検出のための固体担体核酸アレイの製造及び使用は、(米国特許番号第5,571, 639号；サポルスキー（Sapolsky）等、1999年、Genet.Anal.-Biomolecular Eng.、第14巻、187-192頁；シェナ（Shena）等、1995年、Science、第270巻、467-470頁；シェルドン（Sheldon）等、1993年、Clinical Chem.、第39巻、718-719頁；フォドル（Fodor）等、1991、Science、第251巻、767-773頁)に頻繁に記載されている。
【００４９】
当業者は、彼ら自身の設計及び専門の供給者（例えばDNAアレイのためのアフィメトリックス（Affymetrix）社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国及びプロテイン・チップ・アレイのためのチフェルゲン  バイオシステムズ（Ciphergen Biosystems）、フリーモント、カリフォルニア州、米国）からの対応するアレイ読み取り装置後に、アレイを獲得することが可能であろう。
【００５０】
この環境条件にさらされた１つ又はそれ以上の微生物の生化学組成を測定することによる環境条件の決定は、単一の測定として実行されうる。また、微生物の生化学組成は、１つの特定の、定義された環境パラメータが異なる値でセットされているところの複数の環境条件にさらされた後に、測定されうる。このようにして、この変化する環境パラメータの結果としてこれらの微生物の生化学組成の特定の変化が、決定されうる。
【００５１】
１つの特定の、定義された環境パラメータが種々の値にセットされているところの複数の既知の環境条件にさらされた微生物の生化学組成を測定する場合、較正測定を得ることが可能でありそれによって仮想の較正線が描かれることができ、そこでは変数の１つが、環境パラメータがセットされているところの種々の値によって形成され、及び他の変数が微生物の変化する生化学組成によって形成される。
【００５２】
そのような測定は、種々の解析技術例えば統計解析、例えば多変量解析、又は例えば現在存在する又は例えば本発明に従う実施態様における使用のために開発されうるような他の解析技術を使用して、解析されうる。本発明に従う方法では、解析方法例えば自己組織化マップ（self-organizing maps）、階層的クラスタリング、多次元スケーリング、主成分分析、監視下の学習（supervised learning）、k-最近傍推定（k-nearest neighbors）、サポート・ベクトル・マシン（support vector machines）、判別式分析及び部分最小二乗法（partial least square methods）の使用が好ましい。変化する、定義された環境条件の結果として微生物の生化学組成の変化をともに記載する測定結果の集合の解析は、環境パラメータ及び従って環境条件の値を生じる。
【００５３】
本発明に従う方法による未知の環境条件の決定では、未知の環境条件の決定の前に、言及された較正測定を実行することが好まれる。その後、未知の環境条件にさらされた１つ又はそれ以上の微生物の該測定された生化学組成は、較正線上の生化学組成の位置に基づき、その環境条件の値を与える。
【００５４】
本発明に従う実施態様で使用される較正線は、絶対的な較正線と考えられなければならないとは限らない。仮想の較正線は、本発明における適切な用途をまた見つける。例えば種々の遺伝子発現レベルの組み合わせが、データベース中に結果として単に格納されることができ、測定の結果と前の測定の結果の比較を可能にする。それによって、この仮想の較正線又はデータベースは、サイズ及び詳細さを増加し、更に多くの新しい結果に基づいて結果ますます根拠の十分にする。
【００５５】
実施例
【実施例１】
【００５６】
シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のＲＮＡ発現を測定することによる環境温度の決定
このテスト設計では、シュードモナス・プチダS12株が、異なる温度（35℃、39℃及び41℃）で温度ショックにさらされた。該細胞は固定化され、その後RNAが該細胞から分離された。分離されたRNAは、シュードモナス・プチダS12由来のゲノムDNAフラグメントで覆われたアレイ上でハイブリダイゼーションされた。データ分析は、主成分分析(PCA)に従い正規化及び解析を含んだ。該テストは、２重に行なわれ且つ１回繰り返された。
【００５７】
細菌株及び成長条件
シュードモナス・プチダは、食品製品の品質に影響する重要な腐食有機体である。この観点から、この有機体が選択された。流動食の組成をシミュレートするために、研究が、トリプトン大豆ブロス(TSB、Oxoid社)の栄養素に富んでいる培養培地中で行われた。シュードモナス・プチダ S12純粋培養は、トリプトン大豆寒天(TSA、Oxoid社)上に播き、引き続き30℃で20時間のインキュベーションによって得られた。この後に、株は、前蓄積（pre-accumulation）を得るために30℃で1日間、TSB中で培養された。
【００５８】
温度ショック
温度ショックの結果として特定の生理学的状態にあるシュードモナス・プチダS12培養は、シュードモナス・プチダS12の一晩中の蓄積（35℃）を三角フラスコ中の50mlの新鮮なTSB培地中で20倍希釈することによって得られた。このようにして、50 mlの4個の同時培養が生成され、それは35℃でほぼ0.5のOD660に成長するためにほぼ7時間割り当てられた。これは、30分毎に1つの培養のOD660を測定することによって検証された。OD660が0.5であるとき、２つの他の培養は、39℃及び41℃のインキュベーション温度に夫々移された。他の培養は、35℃でインキュベーションを維持された。10分間後に、３つのインキュベーションされた培養由来の細胞は、RNA分離のためにクエンチングされ且つ収穫された。
【００５９】
RNA分離
培養中の代謝活性のクエンチングは、-40℃に維持された冷60%メタノール水溶液の撹拌された溶液中に10ml培養をスプレイすることによって達成された（W. de Koning & K. van Dam、1992年、Anal. Biochem.、第204巻: 118-123頁に基本的に記載されている）。その後、該細胞は4500g、-20℃で10分間の遠心分離によってペレット化された。該ペレットは、-45℃でさらに処理され又は-80℃で保存された。RNAが、Chin-Yi & Wilkins（1994年、Anal. Biochem.、第223巻: 7-12頁）によって記載されているように本質的に分離された。2 mlのねじ蓋エッペンドルフチューブが、0.4グラムのジルコニウムビーズ及び500μlトリゾール（Invitrogen社、GibcoBRL）を0℃で充たされた。該細胞ペレット(-45℃)は、450μlホウ酸塩バッファ中で37℃で再懸濁され（Chin-Yi & Wilkins、1994年）、その後ビーズ及びトリアゾールを有する上記エッペンドルフチューブに加えられ、手動で混合されそして氷上に置かれた。該細胞は、ビードビーター（Beadbeater）(Biospec社製品)中で60秒間それらをビートすることによって破壊された。該懸濁物は氷上に置かれ、その後100μlのクロロホルムが添加され、ボルテックスされ、その後室温で12,000gで遠心分離された。純粋な水相を得るために、水相が、500μl フェノール/クロロホルム(l/l)を使用し、その後中間の遠心分離を伴いクロロホルムを使用して抽出された。水相に、0.4容量のイソプロパノールが添加され、そして0.4容量の0.8M クエン酸ナトリウム、1.2M 食塩が混合され10分間氷上で冷却された。その後、RNAは、4℃で20,000 gで遠心分離によってペレット化された。該ペレットは、-20℃の70%エタノールで洗浄され、そして遠心分離（4℃で20,000 g）後、真空下で乾燥された。該ペレットは、100 μl 水中に溶解された。
【００６０】
マイクロアレイの構築
シュードモナス・プチダS12の遺伝子発現のゲノムワイド解析を可能にするために、この有機体のゲノム・バンクが作成された。この目的のために、ゲノムDNAの50マイクログラムが、20% グリセロールを有するTEバッファー中に取り込まれ、そしてネビュライザー中、1バールで30秒間剪断された。平均フラグメント・サイズは、ゲル電気泳動によって2-3kbと見積もられた。沈殿後に、末端は、T4 DNAポリメラーゼ、クレノウ（Klenow）ポリメラーゼ及びdNTPの存在下でブラントされた。酵素の熱不活性化後に、末端は、T4ポリヌクレオチド・キナーゼを使用して、ホスホリル化された。熱不活性化後に、混合物がアガロースゲル上で再び分離され、そして2〜3kbの間のフラグメントがゲルからカットされ且つQiagenゲル抽出キットを使用して精製された。このようにして得られたフラグメントは、"Clone Smart Blunt cloning kit"プロトコル（Lucigen社）に従うベクター pSMART中でライゲーションされた。このライゲーション混合物の一部は、大腸菌 ElectroMax DH10B細胞（Invitrogen社）中で形質転換され、そしてアンピシリン・プレート上に播かれた。コロニーピッカーを使用して、これらのコロニーは96ウェル・マイクロタイター・プレートへ移された。37℃で一晩成長後、グリセロールが、最終濃度15 %に添加され、そして該グリセロール・ストックが、-80℃で保存された。
【００６１】
このバンクからのゲノム挿入物は、96ウェルPCRプレートでPCR増幅を使用して増幅された。この目的のために、次の成分が一緒にされた：5マイクロリットル 1O×SuperTaqバッファー；5マイクロリットル 2 mM dNTP(Roche Diagnostics社)；1マイクロリットル プライマーL1；1マイクロリットル プライマーR1；37マイクロリットル MQ水；1マイクロリットル グリセロール・ストック；1.5 U SuperTaqポリメラーゼ。プライマーL1 は、次の塩基配列を有する：5'-CAG TCC AGT TAC GCT GGA GTC-3'。プライマーR1 は、次の塩基配列を有する：5'-CTT TCT GCT ATG GAG GTC AGG TAT G-3'。両方のプライマーは、5'-エンドで、フリーのNH2基を及び引き続きC6リンカーを含む。次のPCRプログラムが増幅のために使用された： 94 ℃で4 分；（94 ℃で30 秒、50 ℃で30 秒、72 ℃で3 分)を30回； 72 ℃で10 分；4 ℃。
【００６２】
上記反応に引き続いて、生成物は丸底の96-ウェルプレートに移され、そしてイソプロパノールを使用して沈殿された。このようにして精製されたPCR生成物は、384-ウェルプレートに移され、その中で乾燥するまで蒸発した後に、該DNAが10マイクロリットルの3×SSCに入れられた。これらのスポット・プレートは、それらが規則的且つ順序づけられたパターンでスポットされているマイクロアレイスライドに、合計5500個のPCR生成物を移すために使用された。スポット後に、これらのマイクロアレイはブロックされ、その後それらはハイブリダイゼーション実験でのさらなる使用のために準備完了である。
【００６３】
RNAにラベルを付けること
総RNAの蛍光ラベリングのために、12.5マイクログラムのRNAが使用された。このRNAに、0.5マイクロリットル RNAsin、1.25 マイクログラムのランダムプライマー（p(dN)6;Roche Diagnostics社)及び水が、5マイクロリットルの最終容量まで加えられた。この混合物が、70 ℃で10 分間、その後20 ℃で10 分間の間インキュべーションされ、そしてその後氷上に置かれた。その後、次の成分が添加された： 0.5マイクロリットルのRNAsin、3マイクロリットル 5×第1ストランドバッファー(SuperScriptII; Life Technologies社)、1.5マイクロリットル 0.1M DTT、3マイクロリットル ヌクレオチド・ミックス(2.5 mM のdATP、dCTP、dGTP、1 mM の dTTP)、1マイクロリットル Cy5-dUTP又はCy3-dUTP(Amersham Biosciences社)及び1マイクロリットル SuperScriptII酵素(Life Technologies社)。混合後に、該反応成分が、42℃で2時間の間インキュベーションされた。その後、RNAは、95 ℃で2 分間サンプルを加熱し、それらを簡単にスピン・ダウンし、1.5 マイクロリットルの新鮮な2.5M NaOHを添加し、そして56 ℃で10 分間これをインキュベーションすることによって分解された。1.46マイクロリットルの2.5M HAc添加によって、反応混合物は中和される。該反応混合物は、付属指示書に従い、Autoseq G50カラム（Amersham Biosciences社)での精製によって精製された。この精製後に、ラベルを付された物質の1/10部が、分光測光分析のために別途保存される。
【００６４】
プレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション／洗浄
ハイブリダイゼーションの準備では、スライドが、20ml プレハイブリダイゼーション溶液(0.45-マイクロメートルフィルタを通してろ過された、1% BSA、5x SSC、0.1% SDS)中のペトリディッシュ中に置かれ、そして42℃で、45分間回転された。その後、該スライドは、フィルター滅菌されたミリ（milli）Q水中に5回浸された。その後、純粋なミリQ水中でスライドが再び洗浄され。その後該スライドはイソプロパノール中に５回浸された。その後、スライドは、N2銃を使用して乾燥され、そしてその後ハイブリダイゼーションのために準備完了である。
【００６５】
1つのハイブリダイゼーションで比較されたCy5-dUTPで及びCy3-dUTPでラベル付けされたサンプルが、1個のカップ中で一緒にされた。これに、4マイクロリットル 酵母 tRNA(25マイクログラム/マイクロリットル)が添加され、その後該混合物が乾燥するまで蒸発された。乾燥後、該ペレットは、30マイクロリットル EasyHyb（Roche Diagnostics社)中に取り込まれ、そして簡単に回転後に変性された(95℃、1.5 分間）。その後、該混合物は、プレハイブリダイゼーションされたスライド上でピペッティングされ、カバースリップで覆われ、そしてコーニング・ハイブリダイゼーション・ルーム（Corning Hybridization room)内に導入され及び42 ℃で一晩インキュベーションされた。
【００６６】
ハイブリダイゼーション後に、該スライドはハイブリダイゼーションル・ルームから取出され、そして37℃の20 ml 1×SSC/0.2 % SDS溶液内に直接に導入された。その後、該スライドは、37℃の新鮮な 1×SSC/0.2 % SDS溶液に移された。カバースリップは第１の洗浄溶液中にそのまま残る。激しい撹拌後に、該スライドは、37 ℃の0.5xSSC洗浄液に移され、そして再度十分に撹拌された。その後、該スライドは、0.2x SSC洗浄バッファーに移され、そして300 rpmの回転プラットフォーム上で20 ℃、10 分間混合された。洗浄バッファーを交換した後に、このステップが繰り返された。その後、該スライドはN2銃を使用し残余の溶液を吹き飛ばすことによって乾燥された。
【００６７】
スキャンニング及びイメージ解析
洗浄後に、該スライドは暗所で保存され、又はスキャンニングのために直ちに使用された。30マイクロメートルの解像度を備えたクイックスキャンは、最適なスキャンニングセッティングの選択を導いた(ScanArray 4000、パーキン・エルマー社)。Cy5及びCy3シグナルの最適なスキャンは、10マイクロメートルの解像度で生じ、そして得られたイメージが電子的に保存された。スライドに対応する該イメージは、ソフトウェア・パッケージImaGene(バージョン4.2、BioDiscovery社)で開かれた。グリッド（それはスライド上のDNAサンプルのスポット・パターンを表わす）及びスポット認識を配置した後に、シグナル及び背景が、スポット当たり計算された。得られたデータは電子ファイル中に保存され、そして更なるデータ処理のために使用された。
【００６８】
データ前処理
M及びA値の計算（ロバーツ（Roberts）等、2000年、Science、第287巻、873-880頁; デュドイット（Dudoit）等、2000年、Statistics、UC Berkeley、Technical reports#578）後、該生データは、ロエス（Loess）正規化（クリーブランド（Cleveland）等、1991年、Statistics and Computing、第1(1)巻、47-62頁）を使用して正規化され、アカウントのうち次のスポットを残した：1)オーバーロード(１つ又は両方のチャンネル中のシグナル強度が64000よりも大きい)を有するスポット；2)シグナルよりも大きな背景を有するスポット；3) 対照スポット；4)イメージ解析パッケージによって0とは異なるフラグを割り当てられたスポット。
【００６９】
この実験では、全ての実験のために良いシグナルを有することが見つけられているスポットのみが、アカウントに入れられた。ロエス正規化後に、個々のアレイは、単位（面積の合計が１に等しい）へと正規化された。
【００７０】
データ解析
合計データセットが、検証目的のためにトレーニング・セット及びテスト・セットに分けられた。次に、データセットは主成分分析(PCA)を使用して解析され、平均が、選択されたスケーリング方法として平均中心化（mean centering）を用いた。そのクラスタの中に異なるサンプルが存在する情報を使用して又は使用せずに、匹敵可能な結果が、他のスケーリング方法を使用して又は使用せずに他の多変数方法を使用して得られうる。
【００７１】
結果
シュードモナス・プチダ株S12は、インキュベーション温度に依存してTSB中で良く成長し又は成長しないことがわかった。図１は、成長曲線に対する温度の影響を示す。35 ℃で、最適な成長が観察された。41 ℃で、殆ど成長しない。温度ストレス下で細胞応答を測定するために、35 ℃でのマイクロアレイ上の遺伝子発現パターンと39 ℃及び41 ℃でのそれらとの比較が選択された。この目的のために、温度ショックの10 分後に、細胞がクエンチンングされ、収穫され、そしてマイクロアレイ解析の為に更に処理された。
【００７２】
図1は、その中でデータ sPP01-33からsPP01-39がトレーニング・セット実験を表わし及びデータsPpO1-03からsPpO1-08（sPpO1-08を含む）がテスト・セット実験を表わすスコアプロット示す。図は、3つの温度セッティング35℃、39℃及び41℃で実行された実験間の明らかな違いを示す。2つの軸は、データセット中の全分散の72%の合計をともに記載する主成分を示す。トレーニング・セットからの実験  Train-1からTrain-6（Train-6を含む）が、PCAモデルを計算するために使用された。実験  テスト-1からテスト-6（テスト-6を含む）がモデル中に置かれ、図１は、テストデータセットが、トレーニングデータセットを使用して記載されているように多変数空間中にどの程度適合するかを示す。ここで、テスト・セットのポイントは、トレーニング・セットのポイントのまさに近隣にあることは明らかである。両方のセット内の繰り返し間の相違は、他の実験条件（温度差）で処理されたサンプル間の相違よりも小さい。培地の加熱温度は、培地中に存在するシュードモナス・プチダのRNA発現（生化学組成）を測定することによって決定されえた。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、スコアプロットを示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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