(57)【要約】  赤外線を検出する装置及び方法であって、電極のような導電性媒体上に被着させた導電性フィルム又はゲルに組み込まれた温度検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質、例えばTIpＡ、ＣＣ１、コラーゲン又はミオシンと、赤外線が存在することによって生じる該導電性フィルム又はゲルの導電率又は抵抗の変化及び前記温度検知タンパク質に対する赤外線の影響を記録する手段と、赤外線によって生じた導電性フィルムの導電性又は抵抗の変化を分析して赤外線が存在するか否かを決定するための手段とから構成される赤外線を検出する装置及び方法が提供される、本発明により、“バイオミメティック”赤外線センサーであって、低コスト、軽量、満足し得且つ場合によっては廃棄可能な赤外線検出装置であって高感度及び優れたダイナミックレンジを有する赤外線検出装置が最初に得られるように、導電性重合体マトリックス、例えばフィルム又はゲル中で組換え生成した感熱性タンパク質組み込むことができる“バイオミメティック”赤外線センサーが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
−15℃〜60℃の範囲内で可逆的コンホメーション変化が可能な温度検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質を内部に含有する導電性フィルム又はゲルと、前記タンパク質に対する赤外線の影響によって生じる前記の導電性フィルム又はゲルの導電率又は抵抗の変化を検出する手段と、前記の導電性フィルム又はゲルの導電率又は抵抗の変化に基づいて赤外線の存在を決定するための手段とから構成される赤外線検知装置。
【請求項２】
前記のタンパク質に対する赤外線の影響によって生じる導電性フィルムの導電率又は抵抗の変化を検出する手段が導電率又は抵抗の変化を検知できるマルチメーターからなるものである請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記の導電性フィルムの導電率又は抵抗の検出された変化に基づいて赤外線の存在を決定するための手段がコンピューターからなるものである請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記タンパク質がTIpA、コラーゲン、ミオシン及びＣＣ１などのタンパク質の群の中から選択されるものである請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記タンパク質がTIpA8である請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列をもつものである請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記の導電性フィルム又はゲルが温度検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質を含有する導電性重合体からなるものである請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記の導電性フィルム又はゲルがその内部に導電性材料が組み込まれている重合体からなるものである請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記重合体がポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアルコール)、
ポリ(酢酸ビニル)、ゼラチン、アラビアゴム及びポリ(ビニルアルコール)からなる群の中から選択されるものである請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記重合体に組み込まれる導電性材料がカーボンブラック、銀フレーク、金粒子、及び金属被覆セラミックスからなる群の中から選択されるものである請求項８に記載の装置。
【請求項１１】
前記の温度検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質を内部に含有する導電性フィルム又はゲルが、検知配列で配置された複数のフィルム又はゲルからなるものである請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
−15℃〜60℃の範囲内で可逆的コンホメーション変化が可能な温度検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質を内部に組み込んだ導電性重合体マトリックスからなる赤外線検出デバイスに使用するのに適した導電性フィルム又はゲル。
【請求項１３】
前記タンパク質がTIpA、コラーゲン及びミオシンからなる群の中から選択されるものである請求項12に記載の導電性フィルム。
【請求項１４】
前記タンパク質がTIpA8である請求項12に記載の導電性フィルム。
【請求項１５】
TIpA8からなる単離されたタンパク質。
【請求項１６】
配列番号１のアミノ酸配列を有する請求項15に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１７】
さらにHis標識を含有する請求項15に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１８】
赤外線の検出方法であって、請求項１に記載の装置を、赤外線を受け取ることができるように配置し、該装置内の温度検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質のコンホメーション変化によって生じる電気信号によって赤外線の存在を検出する工程からなる赤外線の検出方法。
【請求項１９】
赤外線の検出方法であって、−15℃〜60℃の範囲内で可逆的コンホメーション変化が可能な温度検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質を導電性重合体マトリックスに配合し、前記マトリックスを、適当な電機デバイスであって前記の温度検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質のコンホメーション変化によって該導電性マトリック中で生じた導電率又は抵抗の変化を検出できる電気デバイスに接続し、次いで前記導電性マトリックス中の導電率又は抵抗の変化に基づいて赤外線の存在を測定する工程からなる赤外線の検出方法。
【請求項２０】
前記タンパク質がTIpA、TIpA8、コラーゲン、ミオシン及びＣＣ１などのタンパク質の群の中から選択されるものである請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記のフィルム又はゲルがシルクスクリーニングで使用するのに適したものである請求項12に記載の導電性フィルム又はゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2002年６月25日出願の米国仮出願第60/391,089号及び2001年12月６日出願の米国仮出願第60/336,145号の特典を主張する。
【０００２】
政府の利害関係の陳述
本発明は、米国空軍との共同研究開発契約の遂行においてなされたものである。米国政府は本発明を使用する一定の権利を有する。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、一般に、温度の変化を検知及び検出でき、従って種々の検知システムに使用できるデバイスに熱スイッチングタンパク質(thermally switching protein)を利用する方法に関し、さらに詳しくはIRの検出を必要とする広範な用途に有用であり得る効率的で、安価で、しかも高感度で温度と赤外線とを監視する検出デバイスを得ることを目的とした、導電性重合体マトリックス中で特定の温度でコンホメーション(conformation)変化をするヘリカルコイルドコイルタンパク質、例えば熱スイッチングタンパク質TIpA及びその変性タンパク質TIpA8を利用する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
赤外線検知デバイスは周知であり、現在、暗視装置、高められた航空視覚システム、火災感知装置、監視及び防犯装置、探索及び救命装置、並びに場合によっては医療用画像作成及び診断などの種々様々な用途で利用されている。この分野の現在の最新式デバイスとしては、活性成分として酸化バナジウムを使用する半導体からなるボロメーターが挙げられる。これらのデバイスは、８〜15μ範囲の感度で効果的な室温赤外線の検出を提供できる。現在市場に出回っている赤外線検出技術を扱うデバイスとしては、テキサスインフラレッド社（Texas Infrared Inc.）製のSpectrum/RM、FLIR Systems社製のThermacam（登録商標）、及びレイセオン(Raytheon)社製のPalmIR PRO が挙げられる。この分野のさらに別のデバイスとしては、PtSiを利用し且つキャパシタンスの変化によって赤外線を測定するデバイス、並びにPbSe及びInSbを利用するデバイスであって１℃当たり約20％の応答変化を有する室温で作動する光導電検出器であるデバイスが挙げられる。
【０００５】
あいにく、現在の赤外線デバイスの可能性(potential)ある有用性及び利用性についての大きな制約は、このデバイスが極めて高価なことである。現在、この分野のカメラ、例えば前記に挙げたカメラは、数万ドルの価格をもち、典型的にはレンジ及び検出感度に応じて約＄10,000〜＄50,000の範囲の価格をもつ。赤外線検出の潜在的利点、例えば医療用画像及び検査及び救護デバイスが提供できるようになり、従って 一般の人々がかかる装置から恩恵を被ることができるようにより普通に入手できるようになり得るように、赤外線検出の低価格システムを得ることができる技術を提供する必要があることは明らかである。また、光重合であって、高められた光反射率を可能にし且つ広範なバイオセンサー及びその他の検知デバイスを形成するのに使用できるホログラフ又はその他の光学格子
(grating)の作成を可能にさせる光重合を利用して、改良されたハイブリッド有機／無機ナノ構造物を提供する必要があることも明らかである。
【０００６】
従来、ある種のタンパク質が、一組の条件が存在する場合に特定の機能を与えるコンホメーション形状、異なる機能を提供する種々の条件又は刺激下の別の形状を有するために形成されることが、天然で認められている。このコンホメーションを変える形状の例は、種々様々な機能を付与する“コイルドコイル”型のタンパク質、例えば筋細胞に関連した収縮装置及び非筋肉構造に関連した収縮装置で機能することを可能にするミオシンのようなタンパク質である。一つのかかるコンホメーションを変えるタンパク質は、サルモネラ菌の病原性プラスミドによってコードされたTIpAタンパク質であると思わる。このタンパク質は細長いコイルドコイルホモ二量体を形成するα-ヘリカルタンパク質である。このタンパク質に関する多数の研究は、このタンパク質が細菌内で温度検知(temperature-
sensing)遺伝子レギュレーターとして働くことを明らかにしているように思われる。しかし、このタンパク質又はその活性断片を、熱を赤外線の形で監視し且つ検出できる装置に利用できることは、記載されていないし、示唆もされていない。従って、この分野では、赤外線を検出するようにタンパク質、例えばTIpＡ及びその活性断片における熱コンホメーションシフトを使用できる装置を開発する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の要約
従って、このように本発明の目的は、赤外線を検出できるデバイスであって、効率的でしかも安価であり、従って種々の用途に使用できるデバイスを創作することにある。
【０００８】
さらに、本発明の目的は、コンホメーション変化タンパク質を利用でき且つ温度変化を電導度に変換でき、従って熱又は赤外線を検出できるデバイスを提供することにある。
【０００９】
さらにまた、本発明の目的は、かかるコンホメーション変化を利用して熱及び／又は赤外線を検出するデバイスに有用であるように、可逆的コンホメーション変化を達成できるタンパク質及びタンパク質断片を開発することにある。
【００１０】
さらにまた、本発明の目的は、熱特性に応じてコンホメーションを可逆的に変化する能力をもつタンパク質を含有する導電性重合体マトリックスを使用して赤外線を検出する方法を提供することにある。
【００１１】
さらにまた、本発明の目的は、本発明の赤外線検出器に利用し得且つ本発明のコイルドコイルタンパク質と統合して広範囲のバイオセンサーを形成できるホログラフ又はその他の光学格子を作成するために高められた光反射率を有するハイブリッド有機／無機ナノ構造物を提供することにある。
【００１２】
さらにまた、本発明の目的は、装置現在入手し得るデバイスから数オーダーの程度まで製造コストを低減し、製造が容易であり且つ容易に入手し得る材料を利用し、多数の高感度IR検出装置に必要であるような全ての冷却要件を減らし且つもしかすると排除し、極めて軽量であり且つ必要ならば廃棄し得、しかも優れダイナミックレンジと高感度閾値を有する赤外線検出デバイスを開発することにある。
【００１３】
これらの目的及びその他の目的は、電極のような導電性媒体に被着させた導電性フィルム又はゲル中に含まれるTIpA、コラーゲン又はミオシンなどのヘリカル温度検知コイルドコイル(CC)タンパク質と、赤外線の存在及びCCタンパク質に対する赤外線の影響によって生じる前記導電性フィルム又はゲルの導電率又は抵抗の変化を記録する手段と、赤外線が存在する場合に赤外線によって生じた導電性フィルム中の導電率又は抵抗の変化を分析し測定する手段とから構成される赤外線を検知する方法及び装置を提供する本発明によって達成される。
【００１４】
前記で説明したような本発明のこれらの特徴及びその他の特徴は、以下に示す好ましい態様についての詳細な説明から明らかになるであろう。
【００１５】
好ましい態様の詳細な説明
本発明に従って、種々の検知システムにおいて赤外線を検出するための装置であって、導電性重合体マトリックス中に埋め込まれたコンホメーション変化タンパク質を使用することからなる赤外線検出装置が提供される。好ましい態様において、これらのコンホメーションを変るタンパク質は、−15℃〜60℃の範囲内の温度変化によって誘導される顕著で且つ可逆的コンホメーション変化が可能なタンパク質からなり、またこれらのコンホメーションを変るタンパク質としては、アルブミンのようなタンパク質、及び温度によって誘導されるかかる可逆的コンホメーション変化が可能な及びオリゴマータンパク質又は断片が挙げられる。さらにまた、本発明のこれらの型のコンホメーションを変えるタンパク質としては、−15℃〜60℃の範囲内の温度変化によって誘導される可逆的コンホメーション変化が可能なヘリカルコイルドコイル(CC)タンパク質が挙げられる。ヘリカルコイルドコイルタンパク質とは、可逆的な温度依存性コンホメーション変化を行うタンパク質又はペプチドを意味し、従ってコイルドコイルタンパク質又はその誘導体由来のタンパク質断片であって完全なコイルドコイルタンパク質のコンホメーション変化を維持するタンパク質断片を包含する。これらのコイルドコイルタンパク質としては、TIpA、CC１、コラーゲン及びミオシンが挙げられ、これらは全て同様のスイッチングメカニズムを有し、且つ以下の記載において、本発明はTIpAタンパク質について具体的に説明するが、前記の特性をもつその他のコイルドコイルタンパク質が本発明で使用できる。
【００１６】
本発明に従って、ヘリカルコイルドコイルTIpAタンパク質、例えばサルモネラ菌に認められる種類の熱スイッチングTIpAタンパク質、又はその活性断片であって温度の変化に依存するコンホメーション変化をすることができる能力を維持する活性断片が使用される。従って、“TIpAタンパク質”とは、サルモネラ菌、例えばサルモネラ・チフィムリウム
(Salmonella typhimurium)において発現されるようなTIpＡタンパク質に認められる型のコンホメーション変化を受けるタンパク質(1)、例えば以下に記載のTIpA8のようなTIpＡタンパク質から単離されるタンパク質断片、又は完全なTIpAタンパク質のコンホメーション変化を維持する誘導体、あるいは同様のスイッチングパターンを有する別のタンパク質を意味する。本発明に従って、以下にさらに詳しく説明するように、好ましい装置は、赤外線の検出を利用する種々の検知システムに有用であるように、TIpAタンパク質又はその活性断片の導電性重合体マトリックス中への組み込みを含む。本発明により、低コスト、軽量、適合性、場合によってはおそらくは廃棄可能な、高感度及び優れたダイナミックレンジを有する赤外線検出装置を初めて提供するように、組換えにより生成される感熱性TIpAタンパク質を導電性重合体マトリックス、例えばフィルム又はゲルに組み込むことができる“バイオミメティック(biomimetic)”赤外線センサーが提供される。
【００１７】
赤外線検出の現場では、１〜15μの波長範囲内で照射に敏感に反応し且つ多数の商業用途及び政府用途（例えば軍及び法執行機関）を有する赤外線検出素子が存在する。これらの用途としては、暗視装置、兵器照準、高められた航空視覚システム、監視／防犯、消火活動、火災感知、探索及び救護装置、予知保全、プロセスコントロール、研究開発、運転者の視覚エンハンサ並びに医療用画像処理及び診断用の装置が挙げられるが、これらに限定されない。これらの高感度検出システムは、一般的に用途で要求される感度に応じた３つの温度依存フォーマット、すなわち室温、極低温及び近室温冷却検出装置（near room temperature cooled detector）で使用される。公共の利用できる情報は、米国内のこれらの技術の現在の市場は約10億ドルであり、毎年７％の割合で成長していることを示している。上記の市場は、現在、高感度画像処理システムが極めて高価なこと（通常、それぞれ10〜50K）により制限されている。従って、本発明は、これらの高価な赤外線検出装置のより安価な代替品を提供することを目的とするものであり、従って赤外線検出デバイスの恩恵を一般の人々でもよりよく利用できることを可能にする。
【００１８】
動物界では、自然で発生する温度又は熱検出システムの例があるが、本発明よりも前には、かかるシステムは市販の製品に使用できるであろう赤外線検出システムの作成には使用できなかった。例えば、ある種のヘビ、例えばニシキヘビや他の毒ヘビが熱の近距離の検出のみに使用される赤外線検知構造をもっているらしいということが知られている。しかし、このシステムは、組換え法(2)を使用して製造することが困難であるヘビの孔器の複雑なタンパク質に基づいていると思われる。本発明は、細菌において熱検出に結びついていることが明らかにされているTIpAタンパク質のようなヘリカルコイルドコイルタンパク質を利用する。多くの細菌では、このような感熱性分子スイッチ、例えば熱検知反応やショックタンパク質の発現に関わる感熱性分子スイッチが存在する。細菌においては、熱検知TIpAタンパク質が単離されているし、今では組換え法によって製造できるし、本発明に有用であるように発現させることができる。図１は、温度に対する２種類の細菌性の熱検知タンパク質、例えば本発明のTIpAタンパク質の光学分散プロットを例示する。他の研究では、TIpAタンパク質の熱スイッチ特性が観察された(3)。その後に、より大きい安定性、より小さいサイズ及び高められた溶解度特性をもつ変性タンパク質TIpA8が、首尾よく製造され、以下に詳細に記載する本発明の赤外線デバイスに組み込まれた。
【００１９】
TIpAタンパク質は、その活性断片又は誘導体と共に、図２に概略を示すようにコイルドコイルヘリカル相互作用によっておそらくは室温で二量体を形成するヘリカルタンパク質である。文献 Koski et al., J. Biol. Chem., 267: 12258-12265 (1992)（本明細書に参考文献として組み込まれる）で認められているように、TIpAタンパク質の最後の300個の残基はらせん状であり、従ってこの領域は本発明の活性な熱スイッチを含むと思われる。さらに下記に挙げるように、この領域由来の一つのかかる誘導体は(TIpA8)は、このタンパク質の適切なスイッチ部分を維持しており、従って本発明に従って利用できる。TIpAの熱スイッチ能を維持するこの領域由来のさらに別の誘導体もまた、以下にさらに記載するように本発明に利用できる。37℃よりも低い温度では、前記のコイルドコイル二量体は、細菌ゲノム配列の特定の調節配列と会合し、一連のタンパク質の転写及びその後の発現を抑制する。宿主において又は37℃よりも高い温度では、前記二量体はDNAから単量体に解離し、前記遺伝子が転写されてタンパク質を生成することを可能にする。従って、TIpAの本質的な機能は、熱遺伝子調節スイッチとして作用することである。本発明に従って、TIpAタンパク質又はその活性断片又は誘導体は、このようにして、前記熱スイッチングがTIpAタンパク質を含有する重合体フィルムの導電性に影響を及ぼす赤外線検出デバイスに利用され、その導電率が測定されて赤外線の存在を決定する。
【００２０】
本発明に従って、本発明者らは、高められた安定性、溶解性及びTIpAタンパク質のような感熱性タンパク質の波長選択性(tunability)を有する改良されたヘリカルコイルドコイルタンパク質を開発した。この点で、TIpAタンパク質の少なくとも１個の活性部分を含有するTIpAタンパク質断片、すなわち前記のコンホメーション変化をするタンパク質のセクションを製造することができる。本発明に従って、これらの断片の一つはTIpA8と命名され、そのタンパク質配列が図８及び配列番号１に示される。この配列は、完全なTIpAタンパク質のアミノ酸257-299に相当し、その配列は先行技術文献、例えばHurme et al., J. Biol. Chem., 271: 12626-12631 (1996) 及び Koski et al., J. Biol. Chem., 267: 12258-12265 (1992)に記載されている。これら二つの文献は本明細書に参考文献として組み込まれる。TIpA8タンパク質はまた、精製において補助としてＮ末端に付加される１個又はそれ以上のヒスチジンからなるであろう“His”標識を用いて組み立て得る。本発明は、このように単離及び／又は精製TIpA8タンパク質を本発明の赤外線検出デバイスに優先的に利用することを期待する。
【００２１】
完全なTIpAタンパク質と同様に、TIpA8はこの分野で周知の慣用の方法を使用して組換えにより発現させ且つ有用生成物の商業開発を支持するように、この物質を十分な量及び品質で製造できることを実証する大きな規模で精製し得る。本発明に従って、TIpA8は、シグナル伝達手段、例えば以下に詳しく説明するような導電性フィルムであって室温で作動する赤外線検出器に基づいた半導体について50mKの感度の理論限界に合致し得且つ感度３mKで作動する検出器におそらくは使用でき、従って現在市販されている検出器の感度を向上させる導電性フィルムに組み込み得る。
【００２２】
本発明に従って、２つの基本的な試みが、本発明の熱検知TIpAタンパク質のようなヘリカルコイルドコイルタンパク質を組み込むことができるシグナル伝達システムの作成に利用し得る。最初にかかる首尾よく開発されたシステムは、前記タンパク質を組み込んだ薄膜であってその上に回折格子を精密レーザー及び同様の新規に開発された技術を使用して作成できる薄膜からなる。かかる回折格子の製造例は、Brottらの文献(4) 及び Naikらの文献(5)に記載されており、これらの文献は、あたかもその全部が説明されるかのように本明細書に組み込まれる。また、二光子誘導の光重合を使用してホログラフパターンやその他の三次元光貯蔵（optical storage）に有用な装置、例えばKirkpatrickらの文献(6)及び、2000年９月７日出願の継続中の米国特許出願第09/657,169号明細書（これらの文献は本明細書に参考文献として組み込まれる）に記載のデバイスを作製し得、しかも光シグナル伝達を使用するこれらの装置はまた本発明の赤外線検出システムに基板(substrate）として利用し得る。本発明に従ってホログラフパターニングを使用して、前記フィルムを本発明の電子デバイスに組み込むための別のおそらくはより小型の光学距離（光路）を提供するフレスネルレンズを形成できることも可能である。
【００２３】
本発明の好ましい態様においては、導電性高分子フィルムであってその中に組み込まれた前記の熱検知TIpAタンパク質のようなヘリカルコイルドコイルタンパク質を有する導電性重合体フィルムからなる赤外線検知デバイスが提供される。このフィルムはそれ自体が、電極又はは商業的に入手し得る電子チップのような導電性媒体上に被着される。好ましい装置においては、このようにして、本発明のコイルドコイルタンパク質の感熱性コンホメーション変化によって生じる重合体フィルムの導電率又は抵抗の変化を測定することによって、温度の変化が記録される。好ましい態様において、導電性重合体フィルムは、このように、適当な重合体、導電性重合体、及び／又は導電性粒子、例えばカーボンブラックがドープされている高分子材料、及び前記のような本発明のTIpAのような感熱性タンパク質からなる。また、任意の界面活性剤及び可塑剤を所望ならば必要に応じて添加してもよい。カーボンブラックのオリゴマー化の調節はタンパク質を加えることによって達成されることから、本発明のタンパク質は新規な可塑剤として機能する。最後に、導電性、熱検知タンパク質含有フィルムは、導電率及び／又は抵抗の変化を測定し且つ翻訳して本発明の検出デバイスの標的領域において赤外線の存在を検出できるように、適当な電気手段、例えば電極又は電気チップ、及び適当なシグナル伝達手段を介して、適当な手段、例えばマルチメーター及び／又はコンピューターに接続される。好ましい態様においては、前記のフィルム又はゲルの電気特性は、マルチメーターのような標準の電気読取装置を使用して読み取ることができ、信号もまたコンピューターで変換してデバイスの使用者が容易に理解できる読み取りを提供できる。この検知の概念は、単一の検出素子を使用してもよいし又は以下に示され且つ記載されるような配列フォーマットで使用してもよい。懸垂ブリッジ熱検知素子を読み取る集積回路に基づくかかる配列は、カメラ、暗視装置などの画像処理装置を形成するために存在する安価な要素から製作し得る。
【００２４】
好ましい態様では、本発明の感熱性タンパク質を含有する導電性重合体フィルムに使用される重合体は、タンパク質を溶解するために使用される溶媒と混和性の溶媒に溶解する重合体であり得る、また該溶媒がタンパク質の機能性に悪影響を及ぼさない適当な重合体であり得る。有用な溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル及び水が挙げられ、これらに限定されないが、当業者により熟慮されるような多数の別の溶媒も使用し得る。本発明に従って、多数の適当な重合体、例えばそれ自体が導電性を有する重合体、又はその中にカーボンブラックのような導電性材料を添加し得る重合体が、本発明の導電性フィルムを形成するのに使用し得る。かかる適当な導電性炭素含有重合体は、例えば、米国特許第6,290,911号明細書（本明細書に参考文献として組み込まれる）に記載されている。適当な重合体の別の例としては、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアルコール)、ポリ(酢酸ビニル)、ゼラチン、アラビアゴム又はポリ(ビニルアルコール)が挙げられる。本発明の赤外線デバイスにおける前記フィルムの適当な機能について必ずしも必要ではないが、幾つかの用途では前記重合体が架橋用の官能基を有することが望ましいものであり得る。従って、本発明の導電性フィルムに使用される重合体はまた、架橋を有していてもよいし、従って架橋は多数の適当な手段、例えば化学的、光化学的手段によって、γ線照射によって、又は簡単に重合体の側基全体の強い水素結合によって達成できる。
【００２５】
前記のように重合体フィルム全体に測定可能な抵抗を作り出してコンホメーション熱検知タンパク質の作用を電気信号に翻訳することが望ましいことから、前記重合体フィルムは導電性材料がマトリックス中に組み込まれるように構成されることが好ましい。前記のようにカーボンブラックを使用する他に、本発明に有用な導電性粒子の別の適当な例としては、導電性の銀フレーク、金粒子、及び金属被覆セラミックスが挙げられる。導電性材料の量は、導電性粒子間距離の僅かな変化でさえも抵抗の大きな変化をもたらすように重合体マトリックス系のパーコレーション閾値範囲内に好ましくはあるべきでる。
【００２６】
前記のように、本発明の導電性フィルムは熱検知ヘリカルコイルドコイルタンパク質を含有し、またこのタンパク質はタンパク質の機能を阻害しない溶媒に溶解することによって使用されることが好ましい。さらにまた、使用する溶媒が水である場合には、緩衝溶液ではなく蒸留水を使用することが望ましい。本発明の導電性重合体マトリックスにおいて別の考慮すべき事項としては、該マトリックスのガラス転移(Tg)温度が前記デバイスの操作温度よりも低いという好ましい要件が挙げられる。重合体宿主のTgが前記操作温度よりも高い場合には、それは可塑剤を使用することにより下げることができるし又は活性温度調節の適当な手段を用いて調節できる。適当な可塑剤の例としては、ポリ(エチレングリコール)、グリセロール又はプロピレングリコールが挙げられる。
【００２７】
また、導電性粒子は、重合体マトリックスに均一に分散させることが好ましい。カーボンブラックを使用する場合には、導電性粒子の分散物を安定化させるために非イオン性界面活性剤を使用してもよい。界面活性剤の典型的な例は、トリトンX-100として市販されているポリエチレン(10)イソオクチルシクロヘキシルエーテルである。
【００２８】
一般的に、本発明の赤外線検出デバイスは、TIpAタンパク質のような感熱性コイルドコイルタンパク質を含有する本発明の導電性フィルムを組立てることができるように、種々の適当な方法で組立てることができる。一つの適当な態様においては、前記の導電性フィルムは、適当な重合体、例えばポリ(ビニルアルコール)を蒸留水に溶解し、次いで適当な温度（例えば、約90〜100℃）で数時間加熱し、攪拌することによって得られる。別のフラスコで、適量のカーボンブラック（例えば、Vulcan XC-72、Cabot社製)を水に懸濁し、適当な界面活性剤 (例えば、トリトン X-100) を加える。次に、前記のカーボンブラックと界面活性剤を前記重合体に、例えば前記ガラス瓶（フラスコ）を水浴超音波装置中に10分間置き、次いでその内容物を前記重合体溶液に加えることによって添加し得、そして一般的に十分に加熱して全水分量を適量、例えば25 mlまで蒸発させる。次に、任意の可塑化成分、例えばグリセロールを重合体マトリックスに添加してもよく、これを再度加熱下でさらにある一定の時間攪拌する。最後に、本発明の導電性重合体マトリックスが、該マトリックスを加熱源から取り出し、室温まで冷却させることによって得られる。
【００２９】
本発明の感熱性導電性高分子フィルムを調製する次の工程では、前記で得られたような重合体マトリックスをガラス瓶に秤量し、適量の感熱性タンパク質溶液 (例えば水溶液) を加え、均質になるまで混合する。次いで、このタンパク質重合体混合物の適当な湿潤フィルム層を形成させ、また適当な導電性材料、例えば電極上に被着させてもよいし、一夜乾燥させて完成した熱検出器を作成してもよい。さらにまた、本発明の感熱性タンパク質を含有するタンパク質重合体混合物は、光信号を受信し、翻訳するのに使用できる別の適当なデバイス、例えば文献Brott et al., Nature 413: 291-293 (2001)(本明細書に参考文献として組み込まれる)に記載されているようなナノパターン化ペプチド／シリカハイブリッド構造物上に被着させることができる。別の態様においては、検出システムにおいて能動素子として使用するタンパク質及び無定形シリコンチップとの重合体フィルム又はゲル複合材料が得られる。
【００３０】
本発明の一つの好ましい態様においては、前記で得られるような熱検出装置は、複数の検出器が一つのデバイス、例えばサスペンド(suspended)ブリッジ熱検知素子を読み取る集積回路に利用されている画像処理装置にセンサーアレイとして使用し得る。好ましい態様においては、この受信手段は、熱検出器に連結される２探触子マルチメーターと、該マルチメーターからの出力を受け取るコンピューターとから構成し得る。好ましい態様においては、コンピューターは、温度の変動をリアルタイムで監視できるか又は検出パターンのその後のレビューについて記録できるように、検出器の抵抗を時間の関数としてグラフ化できる。本発明の適当な装置は、多数のソースから赤外線を検出するのに利用し得、本発明の見本を使用することにおいて行われる懐中電灯試験において、該見本は約20フィート離れて小型電池で作動される懐中電灯からの赤外線を明確に検出した。このように、高感度赤外線検出器は、前記のような種々様々な用途で有用である。また、本発明の導電性フィルムは、別のデバイス及び用途、例えばシルクスクリーニングを伴う新たに開発された電子機器製造法における用途に使用し得る。
【００３１】
本発明の好ましい装置の要素の概要を概略図３に示す。この図に示されるように、装置10は一般に図の右側にあり且つ３つの一般的な単位装置、すなわち赤外線を本発明の検出器又は検出器アレイで受け取り、焦点を合わせ、検出するイメージャー12と、前記イメージャーから標準的電気読み取りを得るマルチメーター14と、コンピューター16であってこの場合には装置の使用者が、赤外線が熱源20から検出されたことを決定できるように、マルチメーターからの電気信号を解釈するの利用でき且つ適切な読み取りをデジタル手段、グラフィック手段又は可視手段によって提示できるコンピューター16とに分けられる。図３に示されるように、本発明のイメジャー12は、レンズ15、例えば図に示されるようなゲルマニウムレンズを用いて組立てることができ、該レンズは熱源20からの赤外線を、本発明の導電性重合体マトリックスからなり且つ前記の感熱性コイルドコイルタンパク質を含むサーモチップ17上に集中できる。イメージャー12はまた、“ブレッドボード”19又は電極型デバイス、例えば電気信号、すなわち前記の導電性マトリックス中の感熱性タンパク質上で赤外線によって生じる伝導性又は抵抗の変化を送る、標準的な商業的に入手できる電気チップを含む。この“ブレッドボード”19は、このようにして、信号を適当な電気的読取デバイス、例えばマルチメーター14に送ることができ、マルチメーターは次いでその信号を、適当な分析デバイス、例えば赤外線が電気信号に基づいて検出されたことを決定するコンピューターに送る。イメージャー12、マルチメーター14、コンピューター16、熱検知チップ17を熱源20と共に含む本発明の要素の実際のバージョンを図４に示す。
【００３２】
前記のように、熱検知チップ17、例えば導電性重合体マトリックス中に組み込まれた熱検知タンパク質は、単独で使用できるし又は同様の検出器の幅広いアレイで使用できる。これらの態様において、図５に示されるように、熱チップ17は単一要素（左側）を構成することができるし、又は複数の検出器を使用する任意の個数の適当なアレイ、例えば１×７パターンのアレイ(図５、中央)及び４×４検知チップのパターン(右側)を使用するアレイで使用できる。さらにまた、８×８などのような別のアレイも使用し得る。当業者が認めるように、使用されるであろう具体的なアレイは、検出すべきソースの性質や、個々の用途で使用されているデバイスの性質や型に左右されるであろう。当業者によって容易に理解されるように、一つのアレイに利用される検出チップが多ければ多いほど、IRの検出がより正確になる。同時に、複数のチップのより大きいアレイは、分析装置の出力及び範囲の増大を必要とする場合が多いであろう、すなわち、より大きなメモリーを有するコンピューターが検出チップの幅広いアレイを有する用途に必要とされ得る。
【００３３】
本発明の熱タンパク質の一般的な機能及びその導電性フィルムに対する影響を図６の概略図に示す。この図面に示されるように、低い温度(左側)では、重合体と熱生体分子が導電性材料(この場合には、カーボンブラック)を所定の位置で緊密に結合する。しかし、それよりも高い温度(右側)では、重合体と熱生体分子が膨張し、それによって導電性カーボンブラックを再配列させ且つ凝集させ、その結果として導電率が増大する。本発明の導電性重合体マトリックス中のこの導電率又は抵抗の変化は、前記デバイスを前記のような高感度赤外線検出器として使用することを可能にする。
【００３４】
また、本発明により、α-ヘリカルコイルドコイル(ＣＣ)構造モチーフを含有するペプチド又はタンパク質、すなわち、“a”及び“d”の位置に非極性又は又は疎水性のアミノ酸を優先的に有するヘプタペプチド反復モチーフ（共通配列）a-b-c-d-e-f-g (Pauling, L. and Corey, R.B., 1953, Nature, 171, 59-61) を有するタンパク質又はペプチドが提供される。これらのペプチド又はタンパク質もまた本発明に有用であり得る。これらのペプチド及びタンパク質に関して、前記の“a-b-c-d-e-f-g”反復モチーフの残基“a”及び“d”は、αらせんの対同士の間でコイルドコイル相互作用を誘導し、安定化させる疎水性の主鎖構造を形成する。ＣＣタンパク質は、天然に至る所に存在し、コラーゲン、ミオシン、TIpA、及びsの他の多数のものが挙げられる。この場合、超らせんコイルの形成に関与する残基“a”及び“d”の直接操作により改変されるそれぞれの感度及び波長応答を有し得ることが理解されるであろう。CCモチーフをさらに高い温度まで熱安定化させる“a”及び“d”で置換された残基は、感度を低下させ且つスペクトル応答をより短い波長にシフトする。これに対して、超らせんコイルを増大する温度まで不安定化する“a”及び“d”で置換された残基は、感度を高め且つスペクトル応答をより長い波長にシフトするであろう。また、同じ位置のCCタンパク質の長さを縮小することにより、オリゴマー状超らせん相互作用 (感度を高め且つスペクトル応答をより長い波長にシフトする)が不安定化し、反対にCC構造の長さを大きくすると感度を低下させ且つスペクトル応答をより短い波長にシフトすることが理解されるであろう。
【００３５】
本発明の別の要旨によれば、本発明の基板（substrate）は、ポリカチオン性ペプチド〔例えば、シリンドロテカ・フシフォルミス（C. fusiformis）シラフィン-１タンパク質から誘導されるポリカチオン性ペプチド〕を、二光子誘導の光重合によって作製される重合体ホログラムに組みこむことによって得られるシリカ球が整列したハイブッリド有機／無機ナノ構造からなり得る。この構造において、文献 Brott et al., Nature 413, 
291-293, (2001)（参考文献として組み込まれる）に記載されているように、本発明の熱検知コイルドコイルタンパク質は、高感度赤外線検出装置に組み込み、利用し得る。
【００３６】
本発明に従って、本発明のナノ構造体は、珪藻植物を使用して調製してポリカチオン性ペプチド〔シリンドロテカ・フシフォルミス（C. fusiformis）シラフィン-１タンパク質から誘導される〕を二光子誘導の光重合によって作製される重合体ホログラムに組みこむことによって得られるシリカ球からなる複雑なシリカが整列したナノ構造物を形成し得る。これらのペプチドナノパターン化ホログラフ構造物がケイ酸に暴露されると、整列したシリカナノ球が透明な重合体支持体上に被着される。これらの構造物は、シリカが存在しない相当する重合体ホログラムに対して回折効率でほぼ50倍の増大を示す。従って、有機重合体の加工し易さと無機材料の改良された機械特性及び光学特性とを組み合わるたこの試みは、前記の現在の赤外線検出デバイス及びその他の光デバイスに有用である。
【００３７】
文献 S.M. et al., Appl. Phys. A, 69, 461-464 (1999)（本明細書に参考文献として組み込まれる）に記載のホログラフ二光子誘導光重合（H-TPIP）法を利用して、前記の熱検知コイルドコイルタンパク質を組み込むことができる本発明のシリカが整列したホログラムを調製し得る。紫外線レーザーを使用することによって形成される慣用のホログラムと異なり、二光子法により作成されるホログラムは、超高速赤外線レーザーを使用する。赤外線の波長は、典型的には生物学的化合物の機能性を変えないので、ペプチドを含有するモノマー配合物を、生物活性に影響を及ぼすことなく重合させ得る。本発明者らは、バイオシリフィケーション(biosilification)を招くことが最近明らかにされたペプチドを、該ペプチドが低い架橋密度の領域に分離されるであろうという期待をもって、ホログラフ二光子誘導光重合によって硬化させられるべき配合物に配合した。小さな液晶分子を重合体系ホログラム中で相分離させるために紫外線レーザーを使用するアプローチは広く使用されており、この技法もまたH-TPIP法に適用し得る。本発明者らが予測したように、前記ペプチド含有構造物を液状シランに暴露すると、シリカをホログラフナノパターンで形成させ、このハイブリッド有機／無機デバイスは、インジウム−酸化スズ(ITO)被覆ガラス上のシリカがランダムに整列した単分子層に比べて優れたデバイスをもたらすより高度の整列(order)を有する。
【００３８】
シリンドロテカ・フシフォルミス（C. fusiformis）由来のシラフィン-１前駆体ポリペプチドの短い19-アミノ酸Ｒ5ペプチド単位（SSKKSGSYSGSKGSKRRIL）（配列番号：２）を使用してケイ酸に中性pH及び周囲温度まで加えると数分以内にシリカナノ球の形成を触媒することができる。化学合成されたＲ5ペプチドであってそのリシン残基の翻訳後修飾を欠くＲ5ペプチドをこの研究で使用した。リシン残基の翻訳後修飾は、酸性pH条件下でのシリカ形成に必要とされる。しかし、この場合には、リシン残基の修飾は必要がなかった。従って、前記のプロセスはこのペプチド (例えば、水中で) をモノマー配合物に配合することによって開始した。この配合物は、サートマー(Sartomer)社から得られる、SR-9035すなわちトリメチロールプロパントリアクリレート、及びSR-399すなわちジペンタエリスリトールペンタアクリレート（これらは阻害剤を除去せずに使用した）、並びにトリエタノールアミン及びイソプロピルチオキサントンからなり；次いで全混合物を、溶解を促進させるために加熱した。トリアクリレートが、その多数のエチレングリコール単位による高い水混和性のために、好ましく、またペンタアクリレーが高架橋系を作成するために使用された。トリエタノールアミンは共同開始剤として機能し、またチオキサントンは開始剤として機能する。典型的には、二光子で開始させた重合において、蛍光発色団もまた近赤外線レーザー光の二光子を吸収するのに必要とされる。励起発色団はそのエネルギーを、重合プロセスを開始させる開始剤に受け渡す。しかし、本発明者らは、この配合物に使用したチオキサントンは高着色した発色団を必要とせず、従って極めて大きい硬化深度及び極めて透明且つ無色の重合体が製造されることを見出した。
【００３９】
単量体／ペプチド配合物の薄層(例えば、約178μm)をスライドガラス上に被着させ、次いでこれをガラス窓を備えた小型の大気圧の部屋に入れ、窒素を満たした。試料を790nmのチタン-サファイアレーザー（500 Hzの繰返し数で90-fsパルス幅) を30秒間使用して、二光透過(transmission)ホログラフ配置で硬化させた。体積ホログラムの強度分布は、局部重合速度を局部場強度の関数として駆動し(drive)、高架橋密度及び低架橋密度の交互の領域をもたらす。試料のある一定の領域が他の領域よりも早く硬化するので、より小さい分子（すなわち、水及びペプチド）の相が高い架橋密度の領域から分離し、低密度の領域に移動する。この現象は、液晶を小さな分子として使用する同様の系で観察された。この相分離の別の説明は、親水性のモノマーがより疎水性の重合体に転化するに連れて、ペプチドがモノマーに富む領域に追いやられるということである。結果として、ペプチドに富むドメインが、重合体試料中にホログラムの周期性をもって作成される。硬化プロセスの後に、試料を簡単に水洗して未硬化モノマーを除去した。原子間力顕微鏡 (AFM) により、ホログラムは1.33μmの周期性を有することが明らかにされた。
【００４０】
シラン前駆物質(１Mテトラヒドロキシシラン)は、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)を１mM HClに溶解することによって合成された。次いで、この生成物をリン酸ナトリウム−クエン酸ナトリウム緩衝液 (pH 8)に加えて最終濃度113 mMを得、この希釈溶液は２時間を越えて安定性を保持し、その後に徐々に透明無定形ゲルに転化した。新たに調製した加水分解シランを前記ホログラムに徐々に加え、ホログラム中に埋め込まれたＲ５ペプチドと10分間反応させ、その後に水洗して未反応シランを除去した。Ｒ５ペプチドを欠く対照ホログラムもまたテトラヒドロキシシラン溶液で処理したが、ナノ球の形成を示さなかった。しかし、前記ペプチドを含有し且つシランで処理された試料を、電子顕微鏡を走査することによって分析すると、シリカ球がホログラムの周期性をもつ規則正しい２次元配列を形成したことが判明した。このシリカ球の寸法分布を調べると、ナノ球の平均直径が
452 nm(±81 nm)であることが判明する。この球のシリカ含有量を、電子分散型分光分析法(EDS)を使用して確認した。さらに、AFMを使用する分析により、表面レリーフパターンのトラフ(trough)に埋め込まれたシリカ球が1.60μmの周期性を有することが示された。テトラヒドロキシシラン溶液を用いて処理したホログラムと、該溶液を使用せずに処理したホログラムとの間の間隔の相違は、対照格子は水の蒸発により乾燥するのにつれて収縮し、これに対してハイブリッドホログラムの収縮はシリカ球の付加された機械的強度により抑制され、ホログラムの稜線（リッジ）が間隔を詰めて移動することを防止することにより説明できる。従って、未処理格子は処理格子よりもほぼ17％多い収縮を示した。また、シリカ球はこのホログラムの最も顕著な特徴であり、その構造のトラフは実際に重合体のピークである。
【００４１】
最後に、この技法が光学デバイスに付加できる改善を試験するために、処理ホログラムの一次回折効率を、未処理試料のホログラムの一次回折効率と比較した。これらの測定は、ヘリウム−ネオンレーザーをそれぞれの試料に透過させ、遠距離場の回折パターンを測定することによって行った。一次回折スポットの入射及び透過力（power）の測定は、指数及び収縮の差から予期されるように、シリカを用いた場合の格子が、シリカを用いない場合の格子に対し回折効率において相当な増大を示した。未処理の格子は約0.02％の回折効率を示し、これに対してシリカ球を用いた格子は約0.95％の回折効率を示した。この大きな増大は、前記の球がホログラムの谷に沿ってシリカのほぼ連続した線を形成し、高い充填比を達成するという事実によるものであり得る。
【００４２】
本発明者らは、このようにして、バイオシリフィケーション(biosilification)を招くペプチドをH-TPIPを使用して微細加工(microfabricated)構造に組み込むと、シリカを使用しない対応する重合体デバイスの性能と比べて著しく向上した光学性能及び優れた機械的特性を有する異例の複合材料有機／無機デバイスをもたらし得ることを明らかにした。本発明者らは、重合体／シリカハイブリッド構造物を使用したが、この技法は、重合体に組み込み得る触媒又は結合剤にについて普遍的に適用し得る。例えば、種々の触媒が特定されるように、種々の形状及び機械的特性を有する種々様々な独特なハイブリッド構造物が可能である。さらに、抗体をホログラムに組み込むことができ、もしかすると特異抗原を光学的に同定するのに使用できる。従って、この技法は単純でしかも一般的で且つ容易に部分変更できるナノパターン化方法を可能にし、従って本発明の感熱性タンパク質を組み込むための基板（substrate）を提供できる。
【００４３】
このように、前記の種々の態様は、本発明を単に例示するだけのものであり、本発明を限定するものではなく、しかも前記で具体的に挙げていない当業者に自明の別の態様は本発明の範囲に入ることが述べられる。
【００４４】
参考文献
前記の詳細な説明で利用した下記の文献は、前記明細書に全部を挙げたかのように参考文献として組み入れられる：
1.  R. Hurme, K.D. Berndt, S.J. Normark, and M. Rhen,“A Proteinaceous Gene 
Regulatory Thermometer in Salmonella,”Cell 90, 55-64 (1997). 
2.  A.L. Campbell, T.J. Bunning, M.O. Stone, D. Church, and M.S. Grace, 
“Surface Ultrastructure of Pit Organ, Spectacle, and Non Pit Organ Epidermis of Infrared Imaging Boid Snakes: A Scanning Probe and Scanning Electron Microscopy Study”, Journal of Structural biology, 126, 105-120 (1999).
3.  R.R. Naik, S.M. Kirkpatrick and M.O. Stone, “The Thermostability of 
an Alpha-helical coiled coil Protein and Its Potential use in Sensor 
Applications”, Biosensors & Bioelectronics, 16, 1051-1057 (2001).
4.  L.L. Brott, R.R. Naik, D.J. Pikas, S.M. Kirkpatric, D.W. Tomlin, P.W.
Whitlock, S.J. Clarson, and M.O. Stone,“Ultrafast Holographic Nanopatterning 
of Biocatalytically Formed Silica”, Nature, 413, 291-293, (2001).
5.  R.R. Naik, L.L. Brott,S. M. Kirkpatrick and M.O. Stone,“Functional 
Biomimetic Optical Devices”, SPIE meeting in Australia December 17-19 (2001).
6.  S.M. Kirkpatrick et al.,“Holographic Recording Using Two-photon-induced 
Photopolymerization”, App. Phys. A., 69, 461-464 (1999).
【実施例】
【００４５】
以下の実施例は本発明又は本発明を実施するための方法の例示として示すものであり、本発明の範囲を制限又は限定するものではない。
【００４６】
実施例
実施例１：  本発明の検知デバイスの製造
図７に示すような本発明のデバイスの見本を、次のようにして製造した：ポリ(ビニルアルコール)(3.750g、98〜99％加水分解したもの、平均ＭＷ＝85,000〜146,000、Aldrich社製) を蒸留水(25 ml)に96℃に加熱し、３時間攪拌することにより溶解した。別のフラスコで、0.563gのカーボンブラック (Vulcan XC-72、Cabot製) を水(15 ml) 及び界面活性剤(21.0μl、トリトンX-100)に、前記フラスコを水浴超音波装置中に10分間置くことによって懸濁させ、次いで前記の重合体溶液に加え、十分に加熱して全水分量を25 mlまで蒸発させた。次いで、グリセロール（1.419g、Aldrich社製）を前記重合体マトリックスに加えさらに15分間攪拌した。得られた重合体マトリックスを、熱源から取り出し、室温まで冷却した。
【００４７】
前記の重合体マトリックス (0.666g) をガラス瓶に秤量し、感熱性タンパク質溶液 (３μg/μlの水に溶解したTIpA 335μl) を加え、均質になるまで混合した。このタンパク質重合体混合物の254μmの湿潤層を２つの電極上に被着させ、一夜乾燥させて完成熱検出器を製造した。
【００４８】
次いで、コンピューターに出力を供給する前記検出装置に、２探触子マルチメーターを接続した。チップの抵抗を時間の関数としてグラフ化することによって、温度の変動を監視できる。実験室で行った懐中電灯試験において、アルファ見本(prototype)(８×８検知アレイ) は、実験室の向こう側約20フィートで小型バッテリーで作動させた懐中電灯からの赤外線を明確に検出し、画像処理した。別の試験では、検出器の前を横切って振り動かした手が明確に検出され、赤外線をそのまま画像化した。
【００４９】
アルファ見本の性能の明細
本発明のアルファ見本の性能の明細は次の通りである：
スペクトル応答：３〜５ミクロン、
熱感度：約50 mK 
応答時間：100 ミリ秒 (目下、プロトタイプの電子機器によって限定される) 
作動範囲：−16℃〜65℃（ガラス相転移温度Ｔgにより限定される) 
ダイナミックレンジ: 15％信号変化/Ｋ
光学素子及び読み取り：標準
【００５０】
実施例２：  TIpAタンパク質の単離及び試験
概要：
コイルドコイルタンパク質は、平行又は逆平行様式で一緒に密集する２〜４個のαらせんの集合である。コイルドコイル構造は、種々様々な機能をもつことができ、筋肉細胞及び非筋肉細胞の収縮装置で機能することができるミオシンのようなタンパク質を含有することができる。サルモネラ菌の病原性プラスミドによってコードされるTIpAタンパク質は、細長いコイルドコイルホモ二量体を形成するαらせん状タンパク質である。多数の研究によりTIpAの役割が温度検知遺伝子レギュレーターであることが明確に確立されているが、生物以外のサーモセンサー用途におけるTIpAの可能な使用はこれまでなされていなかった。以下の実施例において、本発明者らは、TIpAがαヘリカルコイルドコイルに共通の幾つかの特徴をもち且つその熱による折りたたみ(foldong)及び変性(unfolding)が可逆的であり且つ早いことを例証する。TIpAは温度変化に対して極めて感受性である。また、本発明者らは、TIpAの熱安定性とその他の構造類似のタンパク質の熱安定性とを比較した。本発明者らは、TIpAが緑色蛍光タンパク質(GFP)とのＣ末端融合として発現される折りたたみリポーター(a folding reporter)を使用して、融合タンパク質の折りたたみ及び変性の指標として蛍光を使用できた。TIpAに固有の迅速なコンホメーション変化に関する本発明者らの結果は、従来の知見を裏づけ、本発明者らはGFP-TIpA融合タンパク質の温度センサーとしての使用に関する予備的データをここに示す。
【００５１】
序論：
α-ヘリカルコイルドコイルモチーフは、1953年に初めて筋肉タンパク質及び転写因子を含めて多数のタンパク質の主な構成要素として報告された(Pauling and Corey, 1953; 
Lupas, 1996)。コイルドコイルとヘリカル束は、天然タンパク質に認められる２つの共通のα-ヘリカルモチーフである。コイルドコイルタンパク質は、左巻超らせんに巻かれている２個以上のαらせんからなる(Lupas, 1996)。これらのαらせんは互いに平行又は逆平行の向きで密集している。コイルドコイルの形成は、[abcdefg]で示される７個の配列の反復により示され、aの位置及びdの位置は疎水性残基によって占められ、その他の位置は極性残基によって占められる。タンパク質のコイルドコイル構造は、種々の機能を付与する：これらは大きな硬質構造(ケラチン)、分子ストーク(キネシン)、レバー(ミオシン)を形成し且つ骨格(トロポミオシン)としても機能する(Lupas, 1996)。
【００５２】
サルモネラ菌のTIpA遺伝子は、コイルドコイルモチーフを、温度変化を検知し、その後に転写を調節するのに利用する自己調節リプレッサータンパク質をコードする (Hurme et al., 1997)。TIpAは、N-末端DNA-結合領域と大きなコイルドコイルドメインとを含有しており且つホモ二量体を形成する傾向をもつ(Koski et al., 1992)。TIpAにおける熱検知のための分子的基序は、温度の差異に直接に連結されるモノマー構造転移に対する動的コイルドコイルであると仮定されている。37℃よりも低い温度では、TIpA は配列特異的DNAに結合できるコイルドコイルを形成すると考えられる。37℃よりも高い温度は、TIpAの変性を促進し、これらのランダムコイルモノマーはDNAに結合されたままであることができない(Hurme et al., 1996)。TIpA は、コイルドコイルモチーフを機能；温度の合図に応答してその転写活性をタンパク質の折りたたみに結びつける機能に適合させた分子の新規な種に相当する。大腸菌でのTIpAの過剰産生は、整列した中間体フィラメント様構造の形成をもたらし、これはTIpAがより高次構造に凝集できることを示唆する (Hurme et al., 1994)。
【００５３】
TIpAの他に、多数の天然タンパク質及びデノボ(de novo)デザインされたコイルドコイルペプチドが、種々様々な刺激、例えばpH、イオン強度などに応答して劇的なコンホメーション変化をすることができる。多数の論文が、バイオテクノロジー及び材料科学研究におけるコイルドコイルペプチドの使用を実証している (Cho et al., 1998; Peak et al., 1998; Wang et al., 1999)。例えば、合成重合体とタンパク質とから組立てられたハイブリッドヒドロゲルは、生物工学用途、例えば細胞カプセル化及び制御された試薬送達系に可能性を有する。合成重合体とコイルドコイルタンパク質ドメインとから組立てられたハイブリッドヒドロゲルは、刺激に対して応答することが明らかにされているが、遅い回復時間によって妨げられる(Wang et al., 1999)。多数の設計原理がペプチドのデノボ合成で使用されているが、天然タンパク質の折りたたみ相互作用、安定性及びトポロジーから多くのことを学ぶことができることは極めて明らかである。本明細書において、本発明者らは、TIpAの温度依存性の可逆的な折りたたみ／変性が迅速であり、しかもタンパク質は折りたたみ／変性について同様の動力学をほとんど示さないことを例証する。また、
GFP-TIpA融合タンパク質を使用して、本発明者らは構造転移の指示剤としての蛍光の使用を例証する。本明細書に示した結果は、本発明者らが将来、可逆的且つ迅速な温度依存性ゲル構造転移を示すハイブリッドヒドロゲルを組み立てることを可能にし、さもなければこれは合成重合体単独のヒドロゲルを使用して達成することが困難であろう。
【００５４】
材料及び方法：
菌株及び生育条件
大腸菌株は、Luria Broth培地で培養した；プラスミド選別のために、アンピシリン
(100mg/ml) を加えた(Sambrook et al., 1989)。組換えタンパク質は大腸菌BL21 (DE3) 株(Novagen製、Madison, WI)で発現させた。
【００５５】
標準DNA法
プラスミドの単離、制限酵素消化、連結、ゲル精製及び細菌の形質転換のための標準的な方法を、文献(Sambrook et al., 1989)に記載のようにして行った。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、標準法を使用してPerkin-Elmer Thermal Cyclerで行った。DNA配列分析は、ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer Applied Biosystems製、 Foster 
City CA)を用いて行った。
【００５６】
発現ベクターの組み立て
TIpA及びTarのコイルドコイルドメイン(CC1)を、慣用のPCRでサルモネラ・チフィムリウム(S. typhimurium)及び大腸菌ゲノムDNAそれぞれから増幅させた。サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium) TIpA遺伝子の読み取り枠の側面と大腸菌Tar遺伝子のコイルドコイルドメインの側面に置いてあるプライマーは、公表されている配列
(Genbank accession numbers：IM88208 及びP07017)を使用して合成した。得られた増幅生成物を直接TOPOベクター (Invitrogen、 Carlsbad、 CA)にクローン化した。次いで、得られた断片をTOPOベクターから適当な制限酵素を用い切り出し、発現ベクター pET21 b (Novagen製、Madison、WI)にクローン化した。GFP-TIpA発現プラスミドを、pET21 bの
TIpAの上流側のGFP (cycle ３突然変異体) 読み取り枠の枠内に挿入することによって組立てた。DNA配列分析をGFP-TIpA及び全てのその他の発現プラスミドについて行った。
【００５７】
タンパク質の発現及び精製
pET21 b.DNA配列分析をGFP-TIpA及び全てのその他の発現プラスミドについて行った。ヒスチジン標識組換えタンパク質を、１mMイソプロピル R-チオガラクトシダーゼ(IPTG)を用いて30℃で３〜４時間誘導した後に 大腸菌 BL21 (DE3) 中で発現させた。得られた細胞ペレットをNovagen社製結合用緩衝液に再懸濁し、マイクロピペットを用いて次の設定で、すなわち30％負荷サイクルで２〜３の出力レベルで10秒間超音波処理した。細菌溶解液を25,000×gで20分間予備浄化し、Ni-NTA金属親和性樹脂上に直接に加えた。ヒスチジン標識は、ニッケル-キレート樹脂を用いて標準法を使用する組換えタンパク質の精製を可能にする。精製タンパク質を10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）に対して広範囲にわたって透析し、−20℃で貯蔵した。タンパク質純度は、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で測定することによって決定されるように、90％よりも高かった。タンパク質濃度は、Bradfordの方法により市販のキット(Pierce、Rockford、IL)を使用して測定した。
【００５８】
円偏光二色性分光分析法
CDスペクトルを、温度制御単位装置を備えた分光施光計Jasco J-720を用いて180〜250 nmの範囲で測定した。楕円率と波長を、L-10 カンホスルホン酸の標準溶液を用いて較正した。測定は、示した温度で0.1cmの光路長の水ジャケット石英キュベットを使用して行った。生データは１nmの間隔及び２nmの帯域幅で得られ、３連続スキャンを走査速度120 nm/分で蓄積し、平均した。
【００５９】
蛍光分光分析法
OD500で測定される同数の細胞から調製した細胞溶解液の蛍光測定は、分光蛍光光度計
Perkin-Elmer LS50Bを用いて１cm石英キュベットを使用して行った。励起及び発光波長は395nm及び509 nmそれぞれに設定し、スリット幅は５〜12 nmに設定した。
【００６０】
結果及び討論：
コイルドコイルタンパク質の円偏光二色性分析
サルモネラ菌由来のTIpAを大腸菌中で発現させ、前記のようにして精製した(材料及び方法参照)。TIpAの円偏光二色性(CD)スペクトルは、222nm及び208 nmに負の楕円率ピークを有するα-ヘリカルコイルドコイルタンパク質の特徴を有する。TIpAのαらせん含有量（85％)及びコイルドコイルモチーフの証拠は、Hurmeら(1996)により既に十分に論文で証明されている。TIpAは、温度が25℃から55℃まで高くなるにつれて、顕著な構造転移を示す。TIpAの55℃までの加熱は、222 nmでαらせん構造の完全な喪失をもたらす。これは、折りたたまれたコイルドコイルタンパク質が変性されたランダムコイルへコンホメーション変化をすることを示している。
【００６１】
大腸菌中でアスパラギン酸受容体をコードするTar遺伝子は、温度自動調節応答に関与するが、温度検知メカニズムは十分に理解されていない(Mizuno and Imae, 1984; Nara 
et al., 1996)。本発明者らは、TIpAのように、TarのＮ末端コイルドコイルドメインが同様の温度検知機能を果たし得ると推測した。本発明者らは、コイルドコイルドメイン（アミノ酸残基34-190)を、大腸菌中でヒスチジン標識融合タンパク質として発現させ、精製した。精製CC1の遠紫外CDスペクトルは、208nm及び222nmで負の楕円率を有する同様のヘリカルコイルドコイル構造を示している。CC1は、55℃に加熱するとランダムコイルに変性することができる。本発明者らは、折りたたまれたコイルドコイルから変性ランダムコイルコンフォメーションへのTIpAの構造転移は２態平衡（a two-state equilibrium）であると考える。20℃から65℃への温度の段階的な上昇は、222nmでαらせん構造の消失によって示されるようにTIpAの共同変性を招く。種々の温度で得られたスペクトルにおける約203 nmでのisodichroic pointの存在は、二態（a two-state）α-ヘリカルのランダムコイルへの転移を示す(Hurme et al., 1997)。
【００６２】
本発明者らは、TIpA又はCC1の熱による変性によって誘導される構造転移(αらせんからランダムコイルへ) が可逆的であるか否かを調べることによって、分析をさらに一歩進めた。本発明者らの研究は、熱変性タンパク質の冷却の後に初期DE222nmの回復によって例示されるように、構造転移(αらせんＨランダムコイル)の可逆性を明らかにした。先の研究は、変性TIpAが55℃に加熱の直後に完全に折りたたむことができることを示唆している(Hurme et al., 1997)。本発明者らは、TIpAが55℃〜65℃に加熱の直後に完全に回復
（recover）できることを実証した。さらに、この回復は、10℃に冷却して戻した際にそのαらせん性の復元によって認められるように迅速であった(１分未満)。これに対して、CC1 は熱変性タンパク質を10℃まで冷却した直後には回復できなかった。細菌が機能することができる生理学的温度範囲(37℃〜42℃)を考慮すると、本発明者らは、42℃を越える温度に加熱した直後にはCC1の変性の回復はほとんど認められなかった。構造類似のタンパク質が高温で不可逆的に変性するか又ははるかに遅い速度(knetics)を回復することから、65℃に加熱した直後のTIpAのその固有のコイルドコイルコンフォメーションへの迅速な回復は顕著である。加熱直後のTIpAのその固有のコイルドコイルコンフォメーションへの迅速な回復は、加熱中のαらせん性の消失は可逆的であることによってさらに裏付けられる。温度が上昇するにつれて、TIpAのαらせん含有量の顕著な消失が認められる。αらせん構造は、温度が低下すると復帰する。本発明者らの結果は、再生の速度論が変性の速度論に重ね合わせることができたことを示した。Hurme et al., (1997) の結果と組み合わせたこれらの結果は、TIpAがそのコイルドコイルドメインの性質に基づいて活性な熱検知デバイスとして役目を果たし得ることを確認する。温度変化に対するTIpAの迅速な応答は、TIpAを理想的なタンパク性温度計とする。
【００６３】
CC1の構造転移の不可逆性は、N-末端コイルドコイルドメインがサーモセンサーとしてばかりではなくアスパラギン酸の認識部位としても働き得ることを示唆している。これは、おそらくは種々の研究が生体内で温度検知に必須であるべき細胞質コイルドコイルドメインに関係している(Nishiyama et al., 1999)ことから、最もありそうな原因である。本発明者らは、現在、Tarの細胞質コイルドコイルドメインが温度検知デバイスとして役立ち得るか否かを研究している。また、デノボタンパク質デザインを使用して、本発明者らは、TIpAの同じ熱力学的性質の幾つかを示した小さい16アミノ酸コイルドコイルペプチドを組み立てることができた。その結果は他で公表されるであろう。
【００６４】
構造転移の指標としてのGFP-TIpA融合タンパク質
緑色蛍光タンパク質(GFP)は、細胞生物学において重要なツールなっており、生物学においてリポーター分子として広く使用されている(Misteli and Spector, 1997)。
【００６５】
De Angelisらは(1998)、GFPを用いたタンパク質の標識がタンパク質のコンホメーション状態について情報を提供し得ることを実証した。２個のGFP分子を 極めて接近させると、395 nm又は475 nmの光を用いて励起させた場合に蛍光強度の変化が生じる。この現象は、近接画像化(proximity imaging)(PRIM)と呼ばれる。彼らは、アミノ末端又はカルボキシ末端でGFPに融合される候補タンパク質のホモ二量体化が、395 nmで励起された場合には蛍光の消光を生じることを実証した。Waldoらは(1999)、タンパク質折りたたみの蛍光指標としてGFPを使用した。GFPの蛍光強度はGFPに融合されたタンパク質モジュールの豊富な折りたたみに関係することが示された。タンパク質モジュールの凝集は、GFP発色団の蛍光強度の低下を招く。本発明者らは、TIpAに対するGFPの融合が温度変化に応じて生じる構造転移の蛍光指標として作用するか否かを試験することを決定した。先に述べたように、TIpAは、熱変化に応じてコイルドコイルからランダムコイルコンホメーションへの変化を介して二量体から単量体へと構造転移をすることができる。
【００６６】
本発明者らは、GFPがTIpAとのＮ末端融合として発現されるGFP-TIpA折りたたみリポーターベクターを組み立てた。GFP-TIpAプラスミドを大腸菌 BL21 (DE3)中で形質転換し、発現させた。IPTGを用いて誘導すると、液体培地中で４時間以内に蛍光細胞の出現をもたらした。興味深いことに、より長いインキュベーション時間は蛍光の低下を招き、これはおそらく過剰産生した融合タンパク質の凝集によると思われる(Naik and Stone, 2000)。本発明者らは、より低い温度では、TIpA二量体の形成は融合GFPモジュールの蛍光消光をもたらすであろうと仮定した。より高い温度では、TIpAのコイルドコイルドメインの変性は、TIpA二量体の単量体への解離を招き、GFPの蛍光を強める。本発明者らの結果は、395 nmで励起した場合のGFP-TIpA融合ンパク質の蛍光強度は、温度が10℃から55℃に上昇するのに連れて約30％まで増大することを示した。これに対して、GFP単独の温度を10℃から55℃に上げると、本発明者らは395 nmで励起した場合に蛍光強度の変化はほとんどないことを認めた。事実、本発明者らは、GFP単独の蛍光は55℃で約10％の低下を示したことを認めた。温度の関数としてのGFP-TIpAの蛍光強度の変化は、おそらくはTIpAの下流側コイルドコイルドメインの構造コンホメーションによると思われる。GFP-TIpA融合タンパク質の蛍光強度に対する温度の影響についての別の分析は、温度を10℃から37℃に上げると、395nmの光で励起させた場合に蛍光強度の中間的な増大を招くことを実証している。蛍光強度のさらなる増大は、試料をさらに55℃まで加熱した場合に認められる。このプロセスは、温度を10℃まで下げるにつれてGFP-TIpA融合タンパク質の蛍光強度の低下により示されるように可逆的である。単一サイクルが示されるが、応答は多数のサイクルにわたって安定であり、再現可能であった。GFP-TIpA融合タンパク質の蛍光強度が温度と共に直線的に増大することを調べるために、本発明者らは温度に対する蛍光強度をプロットした。融合タンパク質の蛍光強度は、試験した温度範囲内で直線的に増大する。これらの結果は、明らかに、GFPがTIpAにおける構造転移の指標として機能することを示している。10℃におけるGFP-TIpA融合タンパク質の低い蛍光は、おそらくはTIpA二量体の凝集性によるものであろう(Hurme et al., 1994)。TIpA二量体は室温又は氷上では非交換性であり、これに対して37を超える温度では動的な鎖交換構造であることが知られている(Hurme et al., 1994)。GFP-TIpA融合タンパク質の蛍光強度の穏やか増大は、二量体から単量体への転移によることがほぼ間違いがないといえるかもしれない。何故ならば、GFP-TIpA融合タンパク質試料に対する還元剤の添加は、蛍光を温度変化に反応しなくさせる(データは示していない)。しかし、温度の上昇に応答するコイルドコイルドメインの変性は上流GFPモジュールの構造に間接的に影響を及ぼし得るらしい。本発明者らは、現在、これらの２つの可能性の間を識別する実験を設計している。これらの実験の結果に関わらず、GFPの蛍光が温度変化に応答してTIpAの構造転移の指標として作用することは、本明細書に示した結果から極めて明らかである。
【００６７】
結論：
ここで、本発明者らは、α-ヘリカルコイルドコイルバクテリアルサーモセンサーの熱安定性について本発明者らの結果を示す。TIpAは高度な熱安定性と例外的な可逆的再生能を示す。TIpAの折りたたみ及び／又は変性の速度論は迅速であり、別のコイルドコイルタンパク質の速度論と異なる。温度を上げると、コイルドコイルドメインの変性ランダムコイルへの協同変性を招く。TIpAの変性は、温度の上昇と極めてよく相互関係があり、該タンパク質は55℃よりも高い温度では完全なランダムコイルコンフォメーションであると思われる。タンパク質折りたたみの蛍光指標としてGFPの使用に関する先の結果（Waldo et al., 1999; De Angelis et al., 1998）に基づいて、本発明者らは、温度変化に応答するGFP-TIpA融合タンパク質を組み立てた。本発明者らは、TIpAの構造コンフォメーションの変化の直接手段であるべきGFPの蛍光の変化を認める。低い温度では、GFP-TIpAは蛍光消失を招く二量体を形成する。温度を上昇させると、部分的にはTIpAのコイルドコイルドメインの変性による二量体の解離と、蛍光強度の増強をもたらす。
【００６８】
シグナル伝達がおそらくはバイオセンサー開発に対する最も大きい障害であるので、本発明のTIpAタンパク質は、この問題の克服に極めて有用である。生物学的シグナル伝達は、通常、分子認識及び特異的な一組の工程にパッケージされた結合の極めて複雑な配列を伴う。TIpAタンパク質を利用することにより、本発明者らは初期検知分子すなわち、“トリガー”を単離し、このようにしてこのタンパク質を伝達プロセスの手段として光学的読み取りの達成に使用できる。
【００６９】
従来、タンパク質系生物学的センサーの一つの欠点は、特に熱プロセスにおける応答速度であった。何故ならば、タンパク質はほとんどの場合に長時間にわたる変性−再生サイクル、すなわち数分間にわたる変性−再生サイクルを示し、これはほとんどの検知用途には遅すぎるからである。しかし、本発明のTIpAタンパク質を使用すると、信じられないほど変性／再生サイクルが早いことから、これらの問題が克服される。TIpAが熱刺激に対して厳密にはどのように迅速に応答できるかについて不明のままであるが、該タンパク質は、本発明者らが温度を変化し且つ熱平衡を生じ得るよりも早く応答した。GFP-TIpA融合タンパク質の応答時間がTIpA単独の応答時間よりも遅かったことにも拘らず、２つの異なる方法（CD分光分析と蛍光分光分析）を、温度変化に対する応答を測定するのに使用した。
【００７０】
本発明に従って、TIpAタンパク質は、このようにして重合体ヒドロゲルに組み込んで従来得られなかった方法でTIpAの熱力学的性質を利用でき、しかもこれらのハイブリッドヒドロゲルは合成重合体とTIpAから組み立てられるであろう。温度の上昇によるTIpAのコイルドコイル凝集物の解離は、ゲルネットワークの解離を生じ、より多孔性の状態へのもどりを生じる。かかる材料又は本発明のハイブリッドヒドロゲルは、このようにしてヒドロゲルを埋め込んだ分子の制御された放出を必要とする多数のバイオセンサー用途に可能性を有する。
【００７１】
参考文献
前記の実施例で利用される下記の参考文献は、前記明細書に全部を挙げたかのように参考文献として組み込まれる：
Chao, H., D.L. Bautista, J. Litowski, R.T. Irvin, and R.S. Hodges. 1998. Use 
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J. Biol. Chem. 269: 10675-10682.
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Wang, C., R.J. Stewart, and J. Kopecek. 1999. Hybrid hydrogels assembled from synthetic polymers and coiled-coil protein domains. Nature. 397: 417-420.
【００７２】
実施例３：  本発明で使用する生体触媒形成されるシリカのホログラフナノパターンの調製
本発明に従って、本発明の熱検知タンパク質を用いて使用される構造物を、天然の別の形態：珪藻植物から開発した。
【００７３】
珪藻植物は、その生理学的条件下で高度に複雑で込み入ったシリカ構造物を作ることができる能力のために、材料研究団体にとって重要である：これらの単一細胞生物が天然でそのように優雅に達成することは、複製する(duplicate)のに極端な実験室条件を必要とする１、２ − 最も単純な構造でも真実である。珪藻植物シリンドロテカ・フシフォルミス（Cylindrotheca fusiformis）由来のポリカチオン性ペプチドを同定した後に、単純なシリカナノ球が生体外（in vitro）でシランからほぼ中性のpH、周囲温度及び圧力３、４で合成できる。ここで、本発明者らは、ポリカチオン性ペプチド〔シリンドロテカ・フシフォルミス（Cylindrotheca fusiformis）のシラフィン-1タンパク質から誘導される〕を２光子誘導の光重合によって作成された重合体ホログラムに組みこむことによってシリカ球のハイブリッド有機／無機整列ナノ構造を作成する方法を説明する。これらのペプチドナノパターン化ホログラフ構造物はケイ酸に暴露されると、シリカナノ球の整列したアレイが透明な重合体基材上に被着する。これらの構造物は、シリカを存在させない相当する重合体ホログラムのほぼ50倍の回折効率の増大を示す。有機重合体の加工容易性と無機材料の改良された機械的及び光学的性質とを組み合わせるこのアプローチは、光デバイスの作製に実用性があり得る。
【００７４】
本発明者らは、最近、ホログラフ２光子誘導光重合(H-TPIP)法５を開発した。ここで本発明者らは、この技法を使用してどのようにして本発明のTIpAタンパク質のような生物学的巨大分子を含有するナノパターン化構造物を調製できるかを説明する。紫外線レーザーを使用することによって形成された慣用のホログラムと異なり、２光子法によって作製されたホログラムは超赤外線レーザーを使用する。赤外線波長は、典型的には生物学的化合物の機能性を変化させないので、ペプチドを含有する単量体配合物を、生物学的活性に影響を及ぼすことなく重合させることができる。本発明者らは、最近バイオシリフィケーション(biosilification)を招くことが明らかにされたペプチドを、該ペプチドは低架橋密度の領域に分離されるであろうという期待をもって、ホログラフ２光子誘導の光重合により硬化させるべき配合物に組み込んだ。紫外線レーザーを使用して小さい液晶分子を重合体系ホログラムに相分離させるアプローチが広く使用されており６、本発明者らは、この技法もまたH-TPIP法に適用できるであろうと仮定した。本発明者らは、前記のペプチド含有構造物を液状シランに暴露するとシリカを生じてホログラフナノパターンを形成すること及びこのハイブリッド有機／無機デバイスが、インジウム−酸化スズ(ITO)被覆ガラス７上にシリカがランダムに整列した単分子層に比べて優れたデバイスをもたらす高度の整列を有することを予測した。
【００７５】
シリンドロテカ・フシフォルミス（C. fusiformis）由来のシラフィンシリ-1前駆物質ポリペプチドの短い19-アミノ酸R5ペプチド単位（SSKKSGSYSGSKGSKRRIL）(配列番号２)は、ケイ酸に中性pH及び周囲温度３まで加えた際に数分以内にシリカナノ球の形成を触媒することができる。そのリシン残基の翻訳後修飾を欠く化学合成R5ペプチドを、本研究で使用した。リシン残基の翻訳後修飾は、酸性pH条件下でのシリカの形成に必要である３、８。しかし、本発明者らの研究は僅かに塩基性の条件下で行われたので、リシン残基の修飾は不必要であった。その結果、研究はこのペプチド(水18μl中に0.8mg)を単量体配合物に配合することによって開始した。この配合物は、160μlのSR-9035、0.022gのSR-399
（SR-9035はトリメチロールプロパントリアクリレートであり、SR-399はSartomer社から得られたジペンタエリスリトールペンタアクリレートであり、これらは阻害剤を除去せずに使用した)、0.006 gのトリエタノールアミン及び0.005gのイソプロピルチオキサントンからなる；全混合物を50℃で15分間加熱して溶解を促進させた。前記トリアクリレートが、エチレングリコール単位が多いことによりその水混和性が高いことから、選択され、前記ペンタアクリレートが高架橋系を作製するのに使用された。トリエタノールアミンは共開始剤として機能し、またチオキサントンは開始剤として機能する。典型的には、２光子誘導の光重合において、蛍光発色団もまた近赤外線レーザー光の２光子を吸収するのに必要とされる。励起発色団は、そのエネルギーを、前記重合法を開始させる開始剤に伝達する。しかし、本発明者らは、この配合物に使用されるチオキサントンは高着色発色団を必要とせず、従って極めて大きい硬化深度及び極めて透明且つ無色の重合体が製造されることを見出した９、10。
【００７６】
単量体／ペプチド配合物の薄層(178μm)をきれいなスライドガラス上に被着させ、次いでこれをガラス窓を取り付け小型大気室に入れ、窒素を流したた。この試料を790nm チタン-サファイアレーザー (500ヘルツの繰返し数で90-fsパルス幅)を30秒間使用して二光発信ホログラフ配置で硬化させた。体積ホログラムの強度分布は、局部重合速度を局部場強度の関数として駆動し、これは高架橋密度と低架橋密度の交互の領域をもたらす。試料のある一定の領域が他の領域よりも早く硬化するので、より小さい分子（すなわち水及びペプチド）がより高い架橋密度の領域から相分離し、より低い架橋密度の領域に移動する。この現象は液晶を小分子として使用する同様の系で認められた。この相分離の別の説明は、親水性の単量体がより疎水性の重合体に転化すると共に、前記ペプチドが単量体に富む領域に追い込まれるというものであり得る。結果として、ペプチドに富むドメインが、重合体試料中にホログラムの周期性をもって作製される。硬化プロセスの後に、試料を簡単に水洗し未硬化単量体を除去した。原子間力顕微鏡 (AFM) により、ホログラムが1.33 μmの周期性をもつことが明らかにされた。
【００７７】
シラン先駆物質(１Mテトラヒドロキシシラン)は、オルトケイ酸テトラメチル(TMOS)を１mMのHClに溶解することによって合成した。次いで、この生成物をリン酸ナトリウム-クエン酸ナトリウム緩衝液(pH８)に加えて、113mMの最終濃度を得た。本発明者らは、この希釈溶液は２時間を越えて安定であり、その後に徐々に透明無定形ゲルに転化することを認めた。新たに調製された加水分解シランを、ホログラムに徐々に加え、ホログラム中に埋め込まれたR5ペプチドと10分間反応させ、その後に水洗して未反応シランを除去した。R5ペプチドを欠いた対照ホログラムもまた、テトラヒドロキシシラン溶液で処理したが、ナノ球の形成を示さなかった。しかし、ペプチドを含有し且つシラン処理された試料を電子顕微鏡を走査することによって分析すると、シリカ球がホログラムの周期性をもって規則正しい二次元配列を形成したことが明らかにされた。このシリカ球の寸法分布の研究により、平均ナノ球直径が452 nm(±81nm)であることが判明する。この球のシリカ含有量は、電子分散分光法(EDS)を試用して確認した。さらに、AFMを用いる分析により、ホログラムが表面レリーフパターンの谷に埋め込まれたシリカ球について1.60μmの周期性をもつことが示された。テトラヒドロキシシラン溶液処理ホログラムとテトラヒドロキシシラン溶液未処理ホログラムの間の間隔の差は、対照格子が、水が蒸発することによって乾燥すると共に収縮するということによって説明でき、これに対してハイブリッドホログラムの収縮はシリカ球の付加された機械的強度により阻害され、ホログラムの稜線が密集して移動することを防止する。従って、未処理格子は、処理光子よりも約17％多い収縮を示した。また、シリカ球はホログラムの最も重要な特徴であり、この構造の谷は実際に重合体のピークである。
【００７８】
最後に、この技法が光学デバイスに付与できる改良を試験するために、処理ホログラムの一次回折効率を、未処理試料の一次回折効率と比較した。これらの測定は、ヘリウム-ネオンレーザーをそれぞれの試料に透過し、遠視野場の回折パターンを測定することによって行った。一次回折スポットの入射力及び透過力の測定は、指数及び収縮の差から期待されるように、シリカを有する格子はシリカを有していない格子に比べて回折効率実質的な増大を示した。未処理格子は約0.02％の回折効率を示し、これに対してシリカ球を有する格子は約0.95％の回折効率を示した。この大きな増加は、球がホログラムの谷に沿ってシリカのほぼ連続した線を形成し、高充填率を達成するとことに寄与し得る。
【００７９】
本発明者らは、このようにしてH-TPIPを使用するバイオシリフィケーションを招くペプチドの微細加工構造への組み込みは、シリカが存在しない対応する高分子デバイスに比べて著しく向上した光学的性質及び優れた機械的性質を有する独特な複合材料有機／無機デバイスをもたらし得ることを明らかにした。本発明者らは重合体／シリカハイブリッド構造物を使用したが、この技法は重合体に組み込むことができる触媒又は結合剤に普遍的に適用できる。例えば、種々の触媒が同定されるように、異なる形状及び機械的性質を持つ種々様々な独特なハイブリッド構造物がここで可能である。さらに、抗体をホログラムに組み込むことができ、もしかすると特異抗原を光学的に同定するのに使用できる。従って、この技法はナノパターン化方法を簡単にしかも一般的にし且つ容易に修正可能になり、このようにして本発明の感熱性TIpAタンパク質を組み込むための基材を提供できる。
【００８０】
参考文献
前記の実施例で利用される下記の参考文献は、前記明細書に全部を挙げたかのように参考文献として組み込まれる：
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【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】種々の温度における本発明の熱検知タンパク質の楕円率の変化を表すグラフである。
【図２】本発明のヘリカルコイルドコイルTIpAタンパク質のコンホメーション変化の概略図である。
【図３】本発明の赤外線検出装置の概略図である。
【図４】本発明の赤外線検出装置の写真図である。
【図５】本発明の検知素子及びプリントアウトの写真図である。
【図６】本発明の重合体マトリックスの導電率に対する本発明の感熱性タンパク質の影響についての概略図である。
【図７】８×８画像作成アレイを含む本発明の赤外線検出装置の見本である。
【図８】本発明のTIpA8タンパク質のアミノ酸配列(配列番号１)を表す。
【００８２】
[配列表]
SEQUENCE LISTING
<110>  BROTT, Lawrence L.
<120>  METHOD AND APPARATUS FOR USE OF THERMALLY SWITCHING PROTEINS
<130>  P074100S01/BAS
<150>  60/391,089 
<151>  2002-06-26
<150>  60/336,145
<151>  2001-12-06
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  43
<212>  PRT
<213>  Salmonella typhimurium
<400>  1
Thr Arg Glu Thr Leu Gln Gln Arg Leu Glu Gln Ala Ile Ala Asp Thr
1               5                  10                  15
Gln Ala Arg Ala Gly Glu Ile Ala Leu Glu Arg Asp Arg Val Ser Ser 
20                  25                  30
Leu Thr Ala Arg Leu Glu Ser Gln Glu Lys Ala
35                  40
<210>  2
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Cylindrotheca fusiformis
<400>  2
Ser Ser Lys Lys Ser Gly Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Gly Ser Lys Arg 
1               5                   10                  15
Arg Ile Leu
【配列表】
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【図１】
2005512087.tif 000003
【図２】
2005512087.tif 000004
【図３】
2005512087.tif 000005
【図４】
2005512087.tif 000006
【図５】
2005512087.tif 000007
【図６】
2005512087.tif 000008
【図７】
2005512087.tif 000009
【図８】
2005512087.tif 000010
【国際調査報告】
2005512087.tif 000011
2005512087.tif 000012
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