(57)【要約】本発明は、単離し、及び少なくとも部分的に精製したジカンバ分解酵素、ジカンバ分解酵素をコードする単離ＤＮＡ分子、ジカンバ分解酵素をコードするＤＮＡ構築物、ジカンバ分解酵素をコードするＤＮＡを含む遺伝子導入宿主細胞、ジカンバ分解酵素をコードするＤＮＡを含む１つ以上の細胞を含む遺伝子導入植物及び植物の一部を提供する。本発明は、そのようなジカンバ分解酵素を含むＤＮＡ構築物中に用いる、前記ジカンバ分解オキシゲナーゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へと輸送する輸送ペプチドをさらに提供する。ジカンバ分解酵素の発現により、ジカンバ耐性植物などのジカンバ分解性の生物体が生産される。本発明は、本発明の遺伝子導入ジカンバ耐性植物を含む畑で雑草を制御する方法、及び有効な量の本発明の遺伝子導入微生物またはジカンバ分解酵素を物質に適用する工程を含む、ジカンバ含有物質の除染方法をさらに提供する。最後に、本発明は形質転換された植物及び植物細胞をジカンバ耐性に基づいて選択する方法、ならびにジカンバの分解により生成する３，６−ジクロロサリチル酸の蛍光に基づいて形質転換された宿主細胞、生物体全体及び生物体の一部を選択またはスクリーニングする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号５を含むアミノ酸配列、
ｂ）酵素活性を有する配列番号５のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号５に少なくとも約６５％同一でありジカンバ分解フェレドキシン活性を有するアミノ酸配列、
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号５のアミノ酸配列を含むジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号４の核酸配列を含む請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
発現制御配列に機能的に連結された、請求項１に記載のジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項５】
配列番号５のアミノ酸配列を含むジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含む請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
配列番号４の核酸配列を含む請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
ａ）配列番号５を含むアミノ酸配列、
ｂ）酵素活性を有する配列番号５のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号５に少なくとも約６５％同一であって、ジカンバ分解フェレドキシン酵素活性を有するアミノ酸配列、
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、単離され少なくとも部分的に精製されたジカンバ分解フェレドキシン。
【請求項８】
配列番号５のアミノ酸配列を含む請求項８に記載のジカンバ分解フェレドキシン。
【請求項９】
ａ）配列番号７および配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列、
ｂ）酵素活性を有する前記ａ）のアミノ酸配列のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｃ）前記ａ）のアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一でありジカンバ分解レダクターゼ活性を有するアミノ酸配列、
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項１０】
配列番号７のアミノ酸配列を含むジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含む請求項９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】
配列番号９のアミノ酸配列を含むジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含む請求項９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１２】
配列番号６および配列番号８からなるグループから選択される核酸配列を含む請求項９に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１３】
発現制御配列に機能的に連結された、請求項９に記載のジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
配列番号７のアミノ酸配列を含むジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
配列番号９のアミノ酸配列を含むジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含む請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１６】
配列番号６および配列番号８からなるグループから選択される核酸配列を含む請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１７】
ａ）配列番号７および配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列、
ｂ）酵素活性を有する前記ａ）のアミノ酸配列のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｃ）前記ａ）のアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一であって、ジカンバ分解レダクターゼ酵素活性を有するアミノ酸配列、
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む、単離され少なくとも部分的に精製されたジカンバ分解レダクターゼ。
【請求項１８】
配列番号７のアミノ酸配列を含む請求項１７に記載のジカンバ分解レダクターゼ。
【請求項１９】
配列番号９のアミノ酸配列を含む請求項１７に記載のジカンバ分解レダクターゼ。
【請求項２０】
ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、発現制御配列と、前記ジカンバ分解オキシゲナーゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをコードする核酸配列とに機能的に連結され、前記ジカンバ分解オキシゲナーゼが
ａ）配列番号３、
ｂ）酵素活性を有する配列番号３のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号３に少なくとも約６５％同一でありジカンバ分解オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列、
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードする核酸配列は配列番号２を含む、請求項２０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
ジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、発現制御配列と、前記ジカンバ分解フェレドキシンを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをコードする核酸配列とに機能的に連結され、前記ジカンバ分解フェレドキシンが
ａ）配列番号５、
ｂ）生物学的活性を有する配列番号５のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｃ）配列番号５に少なくとも約６５％同一でありジカンバ分解フェレドキシン活性を有するアミノ酸配列、
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項２３】
ジカンバ分解フェレドキシンをコードする核酸配列は配列番号４を含む、請求項２２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２４】
ジカンバ分解フェレドキシンをコードする核酸配列は双子葉植物において最適に発現するために選択されたコドンを有する、請求項２２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２５】
ジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、発現制御配列と、前記ジカンバ分解レダクターゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをコードする核酸配列とに機能的に連結され、前記ジカンバ分解レダクターゼが
ａ）配列番号７および配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列、
ｂ）酵素活性を有する前記ａ）のアミノ酸配列のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｃ）前記ａ）のアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一でありジカンバ分解レダクターゼ活性を有するアミノ酸配列、
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項２６】
ジカンバ分解レダクターゼをコードする核酸配列は配列番号６および配列番号８からなるグループから選択される核酸配列を含む、請求項２５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
ジカンバ分解Ｏ‐メチラーゼをコードするＤＮＡ構築物であって、前記ジカンバ分解Ｏ‐メチラーゼは発現制御配列に機能的に連結されたＤＮＡ配列を含み、前記ＤＮＡ配列は
ａ）ｉ）配列番号３、
ｉｉ）酵素活性を有する配列番号３のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｉｉｉ）配列番号３に少なくとも約６５％同一でありジカンバ分解オキシゲナーゼ活性を有するアミノ酸配列、からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むジカンバ分解オキシゲナーゼと、
ｂ）ｉ）配列番号５、
ｉｉ）生物学的活性を有する配列番号５のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｉｉｉ）配列番号５に少なくとも約６５％同一でありジカンバ分解フェレドキシン活性を有するアミノ酸配列、からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むジカンバ分解フェレドキシンと、
ｃ）ｉ）配列番号７および配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列、
ｉｉ）酵素活性を有する前記ａ）のアミノ酸配列のフラグメントであるアミノ酸配列、および
ｉｉｉ）前記ａ）のアミノ酸配列に少なくとも約７５％同一でありジカンバ分解レダクターゼ活性を有するアミノ酸配列、からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むジカンバ分解レダクターゼと
をコードする、ＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
前記構築物は前記ジカンバ分解オキシゲナーゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項２０、２２、２５または２７のうちいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ構築物はベクターである、請求項４〜６、１３〜１６または２０〜２８のうちいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
請求項４〜６、１３〜１６または２０〜２８のうちいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ構築物は配列番号７および配列番号９からなるグループから選択されるアミ
ノ酸配列を有するジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項３１に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ構築物は前記ジカンバ分解レダクターゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをさらに含む、請求項３２に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項３４】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項３３に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項３５】
前記ＤＮＡ構築物は配列番号５のアミノ酸配列を有するジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項３１に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項３６】
前記ＤＮＡ構築物は前記ジカンバ分解フェレドキシンを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをさらに含む、請求項３５に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項３７】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項３６に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ構築物は、ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列であって発現制御配列と前記ジカンバ分解オキシゲナーゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをコードする核酸配列とに機能的に連結されるＤＮＡ配列を含み、前記ジカンバ分解オキシゲナーゼは配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項３９】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項３８に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ構築物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するジカンバ分解オキシゲナーゼと、配列番号５のアミノ酸配列を有するジカンバ分解フェレドキシンと、配列番号７および配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するジカンバ分解レダクターゼとをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項３１に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項４１】
前記ＤＮＡ構築物は、前記ジカンバ分解オキシゲナーゼ、前記ジカンバ分解フェレドキシン、および前記ジカンバ分解レダクターゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをさらに含む、請求項４０に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項４２】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項４１に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項４３】
植物細胞である、請求項３１に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項４４】
微生物である、請求項３１に記載の遺伝子導入された宿主細胞。
【請求項４５】
請求項４〜６、１３〜１６または２０〜２８のうちいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む１つ以上の細胞を含む、遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項４６】
前記ＤＮＡ構築物は、配列番号７および配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項４５に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項４７】
前記ＤＮＡ構築物は、前記ジカンバ分解レダクターゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをさらに含む、請求項４６に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項４８】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項４７に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項４９】
前記ＤＮＡ構築物は、配列番号５のアミノ酸配列を有するジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項４５に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５０】
前記ＤＮＡ構築物は、前記ジカンバ分解フェレドキシンを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをさらに含む、請求項４９に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５１】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項５０に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５２】
前記ＤＮＡ構築物は、ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列であって発現制御配列と前記ジカンバ分解オキシゲナーゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをコードする核酸配列とに機能的に連結されるＤＮＡ配列を含み、前記ジカンバ分解オキシゲナーゼは配列番号３のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５３】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項５２に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５４】
前記ＤＮＡ構築物は、配列番号３のアミノ酸配列を有するジカンバ分解オキシゲナーゼと、配列番号５のアミノ酸配列を有するジカンバ分解フェレドキシンと、配列番号７および配列番号９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するジカンバ分解レダクターゼとをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項４５に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５５】
前記ＤＮＡ構築物は、前記ジカンバ分解オキシゲナーゼ、前記ジカンバ分解フェレドキシン、および前記ジカンバ分解レダクターゼを対象として植物細胞の細胞内小器官へ輸送する輸送ペプチドをさらに含む、請求項５４に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５６】
前記輸送ペプチドは配列番号１９によりコードされる、請求項５５に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５７】
植物はジカンバ耐性の双子葉植物または単子葉植物である、請求項５６に記載の遺伝子導入された植物または植物の一部。
【請求項５８】
請求項４５に記載のジカンバ耐性の遺伝子導入植物を含む畑における雑草の制御方法であって、畑の雑草を制御するために有効な量のジカンバを畑に適用することを含む方法。
【請求項５９】
ジカンバを含む物質の除染を行う方法であって、物質中のジカンバの少なくとも一部を分解するために有効な量の請求項４４に記載のジカンバ分解性遺伝子導入微生物を該物質に適用することを含む方法。
【請求項６０】
ジカンバを含む物質の除染を行う方法であって、物質中のジカンバの少なくとも一部を分解するために有効な量の、請求項７に記載のジカンバ分解フェレドキシン、請求項１７に記載のジカンバ分解レダクターゼ、または請求項２７に記載のＤＮＡ構築物によりコードされるジカンバ分解Ｏ‐デメチラーゼを該材料に物質することを含む方法。
【請求項６１】
形質転換された植物細胞を選択する方法であって、
一群の植物細胞を提供することと、
該植物細胞群の少なくとも一部を、請求項４〜６、１３〜１６または２０〜２８のうちいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を用いて該細胞がジカンバ耐性となるように形質転換することと、
得られた植物細胞群を、形質転換された植物細胞は生育するが、形質転換されていない植物細胞は生育しないように選択された濃度のジカンバを含む培地で生育させることと、を含む方法。
【請求項６２】
形質転換された植物を選択する方法であって、
請求項４〜６、１３〜１６または２０〜２８のうちいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を用いてジカンバ耐性となるように形質転換された植物を含みうる一群の植物を提供することと、
該植物群に、形質転換された植物は生育するが、形質転換されていない植物の生育は阻害されるように選択された量のジカンバを適用することと、
を含む方法。
【請求項６３】
形質転換された宿主細胞、生物体全体、および生物体の一部を選択またはスクリーニングする方法であって、
請求項４〜６、１３〜１６または２０〜２８のうちいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を用いてジカンバを分解可能なように形質転換された宿主細胞、生物体全体、または生物体の一部を含みうる、一群の宿主細胞、生物体全体、または生物体の一部を提供することと、
該宿主細胞、生物体全体、または生物体の一部の群をジカンバと接触させることと、
宿主細胞、生物体全体、または生物体の一部においてジカンバの分解の結果生成される３，６−ジクロロサリチル酸による蛍光の存在またはレベルを確認することと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジカンバ（dicamba ）耐性を有するようにした遺伝子導入植物を含む、除草剤であるジカンバを分解することができる遺伝子導入生物体に関する。本発明はまたジカンバ分解酵素、ならびにジカンバ分解酵素をコードするＤＮＡ分子及びＤＮＡ構築物に関する。本発明はさらに、ジカンバ耐性遺伝子導入植物の畑における雑草の制御方法及びジカンバで汚染された物質からジカンバを除去する方法（生物治療）に関する。最後に、本発明はジカンバ耐性を基に、あるいはジカンバが分解した結果生成する３，６‐ジクロロサリチル酸の蛍光の検出を基に、形質転換体を選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
除草剤は農業生産において日常的に使用される。除草剤の効果はしばしば、作物畑での雑草の生育を止める能力及び換金作物の除草剤に対する耐性により決定される。換金作物がその除草剤に対し耐性を有しなければ、除草剤は換金作物の生産性を減少させ、あるいは換金作物を共に枯らしてしまうこととなる。逆に、除草剤の強さが十分でなければ、作物畑で雑草が成長しすぎ、これにより換金作物の生産性が減少してしまう。このため、除草剤に対し耐性のある、経済的に重要な植物を生産することが望ましい。農業用土地の水質及び環境的な質を守るため、除草剤の不測の流出が起きた場合あるいは容認できない高レベルの土壌もしくは水質汚染が起きた場合に除草剤を分解する技術を開発することも望ましい。
【０００３】
除草剤及び他のゼノフォビック化合物を不活性化する酵素をコードする遺伝子が、様々な原核生物及び真核生物から以前単離された。場合によっては、これらの遺伝子は植物における発現が成功するように遺伝子改変されている。この方法を介して、除草剤である２，４‐ジクロロフェノキシ酢酸( ストレバー（Streber ）及びウィルミッツァ（Willmitzer）( １９８９) 、Bio/Technology、第７巻、８１１−８１６ページ、２，４−Ｄ) 、ブロモキシニル( スタルカー（Stalker ）ら、( １９８８年) 、Science 、第２４２巻、４１９−４２３ページ；商標名バクトリル(Buctril))、グリフォセート（コマイ（Comai ）ら、（１９８５年）、Nature、第３１７巻、７４１−７４４ページ；商標名ラウンドアップ(Round-Up)）及びホスフィノトリシン（デブロック（De Block）ら、（１９８７年）、EMBO J. 、第６巻、２５１３−２５１８ページ；商標名バスタ(Basta) ）に耐性を持つ植物が開発されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ジカンバ（商標名バンベル(Banvel)）は、トウモロコシ、サトウモロコシ、小穀粒、牧草地、干草、放牧地、サトウキビ、アスパラガス、芝、およびイネ科種子作物における一年生及び多年生広葉雑草と幾つかのイネ科雑草とを抑制するための出芽前散布除草剤及び出芽後散布除草剤として使用される。クロッププロテクションレファレンス（Crop Protection Reference ）の１８０３−１８２１ページを参照のこと( ニューヨーク州ニューヨーク所在のケミカル＆ファーマスーティカルプレス社（Chemical & Pharmaceutical Press, Inc. ）、第１１版、１９９５年) 。不幸なことに、ジカンバは多くの商業用の作物( 豆、大豆、綿花、エンドウ、ジャガイモ、ひまわり、トマト、タバコ及び果樹を含む) 、観賞植物及び樹木、及び他の広葉植物と触れると、それらに損害を与える。同上のジカンバは化学的に安定であり、環境において分解されにくい場合もある。
【０００５】
ジカンバは安息香酸除草剤のクラスである。ジカンバを含む安息香酸除草剤に対し耐性を持つ植物は、１‐アミノシクロプロパン‐１‐カルボン酸（ＡＣＣ）シンターゼアンチセンス遺伝子、ＡＣＣオキシダーゼアンチセンス遺伝子、ＡＣＣ脱アミノ酵素遺伝子、あるいはこれらの組み合わせを植物内に組み入れることにより生産することができることが示唆されている。カナダ国特許出願第２，１６５，０３６号（１９９６年６月１６日に公表）を参照のこと。しかしながら、この出願では、このような耐性について立証をする実験的なデータは示されていない。
【０００６】
ジカンバを代謝する細菌が知られている。米国特許第５，４４５，９６２号；クルーガー（Krueger ）ら、J. Agric. Food Chem.、第３７巻、５３４−５３８ページ、１９８９年；コーク（Cork）及びクルーガー、Adv. Appl. Microbiol. 、第３８巻、１−６６ページ、１９９１年；コーク及びカリル（Khalil）、Adv. Appl. Microbiol. 、第４０巻、２８９−３２０ページ、１９９５年；を参照のこと。これらの細菌によるジカンバ代謝の原因となる特定の遺伝子を単離し、ジカンバ抵抗性の植物及び他の生物体を産出するのに使用することができることが示唆されている。同上及びヤン（Yang）ら、Anal. Biochem.、第２１９巻、３７−４２ページ、１９９４年を参照のこと。しかしながら、本発明以前では、そのような遺伝子は同定も単離もされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ分解Ｏ‐デメチラーゼ、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ分解オキシゲナーゼ、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ分解フェレドキシン、単離し少なくとも部分的に精製したジカンバ分解レダクターゼを提供するものである。これらは全て以下において規定、説明する。
【０００８】
本発明はまた、ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子、ジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子、およびジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子を提供するものである。本発明はさらに、ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列、ジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列、またはジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、各々のＤＮＡコード配列が発現制御配列と機能的に連結されているＤＮＡ構築物を提供するものである。加えて、本発明はジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列、ジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ配列、およびジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、各々のＤＮＡコード配列が発現制御配列と機能的に連結されているＤＮＡ構築物を提供するものである。
【０００９】
本発明は、ジカンバ分解酵素を対象として植物細胞または微生物の細胞内小器官（葉緑体および／またはミトコンドリア）へと輸送する輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列も含む上記に特定した任意のＤＮＡ構築物をさらに提供する。
【００１０】
本発明は、ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ、ジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ、またはジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡを含み、各々のＤＮＡが発現制御配列と機能的に連結されている遺伝子導入された宿主細胞をさらに提供する。加えて、本発明は、ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡおよびジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ、ジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ、またはジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡおよびジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡを含み、各々のＤＮＡが発現制御配列と機能的に連結されている遺伝子導入された宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、該ＤＮＡはジカンバ分解酵素を対象として植物細胞または微生物の細胞内小器官（葉緑体および／またはミトコンドリア）へと輸送する輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列も含みうる。遺伝子導入宿主細胞は植物細胞または原核もしくは真核微生物でありうる。
【００１１】
本発明は、ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡ、ジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ、またはジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡを含む１つ以上の細胞を含み、各々のＤＮＡが発現制御配列と機能的に連結されている遺伝子導入された植物または植物の一部も提供する。本発明は、ジカンバ分解オキシゲナーゼをコードするＤＮＡおよびジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡ、ジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡ、またはジカンバ分解フェレドキシンをコードするＤＮＡおよびジカンバ分解レダクターゼをコードするＤＮＡを含む１つ以上の細胞を含み、各々のＤＮＡが発現制御配列と機能的に連結されている遺伝子導入された植物または植物の一部をさらに提供する。一部の実施形態では、該ＤＮＡはジカンバ分解酵素を対象として植物細胞の細胞内小器官へと輸送する輸送ペプチドをコードするＤＮＡ配列をさらに含みうる。遺伝子導入植物または植物の一部は、ジカンバに耐性であるかジカンバ分解酵素の発現の結果ジカンバ耐性が増大していることが好ましい。
【００１２】
本発明は、ジカンバ耐性遺伝子導入植物を含む畑における雑草の制御方法も提供する。該方法は、雑草を制御するために有効な量のジカンバを畑に使用することを含む。
本発明は、ジカンバを含む物質の除染を行う方法をさらに提供する。１つの実施形態では、該方法は物質に有効な量のジカンバ分解性遺伝子導入微生物を適用することからなる。別の実施形態では、該方法は、有効な量のジカンバ分解Ｏ−デメチラーゼ、またはジカンバ分解オキシゲナーゼ、ジカンバ分解フェレドキシンおよびジカンバ分解レダクターゼの組合せを適用することからなる。
【００１３】
本発明は、選択マーカーとしてジカンバ耐性を用いて形質転換植物細胞および形質転換植物を選択する方法も提供する。１つの実施の形態では、この方法は、一群の植物細胞中の少なくとも一部の植物細胞を、それらがジカンバ耐性となるように形質転換することと、得られた植物細胞群を、形質転換植物細胞は増殖するが形質転換されていない植物細胞は増殖しないように選択された濃度のジカンバを含む培地で増殖させることとを含む。他の実施の形態では、この方法は、ジカンバ耐性となるように形質転換された植物を含むと推測される一群の植物にジカンバを適用することを含み、該ジカンバは、形質転換された植物は生育するが、形質転換されていない植物の生育は阻害されるように選択された量で適用される。
【００１４】
最後に、本発明は、形質転換された宿主細胞、生物体全体、及び生物体の一部についての選択方法あるいはスクリーニング方法を提供する。この方法は、ジカンバを分解可能なように形質転換された宿主細胞、生物体全体、もしくは生物体の一部を含むと考えられる一群の宿主細胞、生物体全体、あるいは生物体の一部を提供することと、その一群の宿主細胞、生物体全体、あるいは生物体の一部をジカンバと接触させることと、３，６−ジクロロサリチル酸による蛍光の存在またはレベルを確認することとを含む。３，６−ジクロロサリチル酸は、形質転換された宿主細胞、生物体全体、または生物体の一部において、ジカンバの分解の結果生成し、形質転換されていない宿主細胞、生物体全体、あるいは生物体の一部においては生成されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以前の研究（コークとクルーガー（Cork and Kreuger）、Adv. Appl. Microbiol. 、第３６巻、１−５６ページ及びヤン（Yang）ら（１９９４) 、Anal. Biochem.、第２１９巻、３７−４２ページ）では、土壌細菌であるシュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株は一段階反応でジカンバの除草活性を消失させることができることが示されている。この一段階反応では、ジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）は３，６−ジクロロサリチル酸（３，６−ＤＣＳＡ）に変換される。３，６−ＤＣＳＡは除草活性を有しておらず、植物に対しいかなる有害な影響も与えないことが示されている。さらに、３，６−ＤＣＳＡは土壌中に存在する通常の細菌叢により容易に分解される。
【００１６】
本明細書中で説明している実験により、シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株によりジカンバが３，６−ＤＣＳＡに変換されるのはＯ−デメチラーゼが原因であるというヤングらの仮説（同書物参照のこと）が確認され、Ｏ−デメチラーゼはレダクターゼと、フェレドキシンと、オキシゲナーゼとからなる三成分の酵素系であることが確立される。シュードモナス・マルトフィリアＯ−デメチラーゼ及びその三成分の単離、精製、特性分析について詳細に説明している実施例１および３を参照のこと。ジカンバＯ−デメチラーゼの三成分により触媒される反応についての反応スキームを図１に示す。図１に示されるように、ＮＡＤＨからの電子はレダクターゼとフェレドキシンとから構成される短い電子伝達鎖を介して末端のオキシゲナーゼまで往復し、このオキシゲナーゼがジカンバの酸化を触媒し、３，６−ＤＣＳＡが生成される。
【００１７】
第１の実施形態では、この発明により、単離されたジカンバ分解酵素および少なくとも部分的に精製されたジカンバ分解酵素が提供される。本明細書中で使用されている「単離（された）」という用語は、酵素がその生産細胞から少なくとも取り出された（すなわち、酵素は細胞溶解物中に含まれる）ことを意味する。本明細書中で使用されている「少なくとも部分的に精製された」とは、酵素が細胞溶解物の他の成分から少なくとも部分的に分離されていることを意味する。好ましくは、酵素の調製物が少なくとも７０％は均一であるように酵素が十分に精製されていることが好ましい。
【００１８】
特に、本発明は、単離され、少なくとも部分的に精製されたジカンバ分解Ｏ−デメチラーゼを提供する。「ジカンバ分解Ｏ−デメチラーゼ」は本明細書中では、ジカンバ分解オキシゲナーゼ、ジカンバ分解フェレドキシン及びジカンバ分解レダクターゼの組み合わせを意味するものと規定される。これらは全て以下に規定する通りである。
【００１９】
本発明は、単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバ分解オキシゲナーゼも提供する。「ジカンバ分解オキシゲナーゼ」は本明細書中では、シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株から精製されたオキシゲナーゼ、及びシュードモナス・マルトフィリアのオキシゲナーゼのアミノ酸配列に対し少なくとも約６５％相同（好ましくは同一）、より好ましくは少なくとも約７５％相同（好ましくは同一）、より好ましくは少なくとも約８５％が相同（好ましくは同一）、さらにより好ましくは少なくとも約９５％相同（好ましくは同一）なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わりうるオキシゲナーゼを意味するものと規定される。「ジカンバ分解オキシゲナーゼ」には、シュードモナス・マルトフィリアのオキシゲナーゼ配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアのオキシゲナーゼのアミノ酸配列を有する突然変異オキシゲナーゼが含まれる。そのようなオキシゲナーゼには、上記のオキシゲナーゼの酵素活性を有するフラグメント、並びにシュードモナス・マルトフィリアのオキシゲナーゼに対してある一定の割合の相同性または同一性を有するオキシゲナーゼがある。ジカンバ分解オキシゲナーゼの活性は実施例１および３に記載されているように測定することができる。
【００２０】
本発明は、単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバ分解フェレドキシンをさらに提供する。「ジカンバ分解フェレドキシン」は本明細書中では、シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株から精製されたフェレドキシン、及びシュードモナス・マルトフィリアのフェレドキシンのアミノ酸配列に対し少なくとも約６５％相同（好ましくは同一）、より好ましくは少なくとも約７５％相同（好ましくは同一）、より好ましくは少なくとも約８５％が相同（好ましくは同一）、さらにより好ましくは少なくとも約９５％相同（好ましくは同一）なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わりうるフェレドキシンを意味するものと規定される。「ジカンバ分解フェレドキシン」には、シュードモナス・マルトフィリアのフェレドキシン配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアのフェレドキシンのアミノ酸配列を有する突然変異フェレドキシンが含まれる。そのようなフェレドキシンには、上記のフェレドキシンの酵素活性を有するフラグメント、並びにシュードモナス・マルトフィリアのフェレドキシンに対してある一定の割合の相同性または同一性を有するフェレドキシンがある。ジカンバ分解フェレドキシンの活性は実施例１および３に記載されているように測定することができる。
【００２１】
最後に、本発明は、単離された、少なくとも部分的に精製されたジカンバ分解レダクターゼを提供する。「ジカンバ分解レダクターゼ」は本明細書中では、シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株から精製されたレダクターゼ、及びシュードモナス・マルトフィリアのレダクターゼのアミノ酸配列に対し少なくとも約６５％相同（好ましくは同一）、より好ましくは少なくとも約７５％相同（好ましくは同一）、より好ましくは少なくとも約８５％が相同（好ましくは同一）、さらにより好ましくは少なくとも約９５％相同（好ましくは同一）なアミノ酸配列を有し、ジカンバの分解に関わりうるレダクターゼを意味するものと規定される。「ジカンバ分解レダクターゼ」には、シュードモナス・マルトフィリアのレダクターゼ配列のアミノ酸において１以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアのレダクターゼのアミノ酸配列を有する突然変異レダクターゼが含まれる。そのようなレダクターゼには、上記のレダクターゼの酵素活性を有するフラグメント、並びにシュードモナス・マルトフィリアのレダクターゼに対してある一定の割合の相同性または同一性を有するレダクターゼがある。ジカンバ分解レダクターゼの活性は実施例１および３に記載されているように測定することができる。
【００２２】
アミノ酸配列の相同性の程度を決定する方法は当業者には周知である。例えば、Ｇｅｎｅｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウエアパッケージのＦＡＳＴＡプログラム（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン所在）を使用して、スイスタンパク質データベースなどの様々なタンパク質データベースにおける配列を比較することができる。
【００２３】
本発明のジカンバ分解酵素は、実施例１および３で説明しているように、シュードモナス・マルトフィリアまたはジカンバを分解する他の生物体から単離および精製することができる。好適な他の生物体としては、ジカンバを分解するシュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株以外の細菌が挙げられる。そのような細菌の幾つかの菌株が周知であり、該菌株には多くの土壌細菌並びに水生細菌がある。米国特許第５，４４５，９６２号；クルーガーら（Krueger et al.）、J.Agric.Food Chem.、第３７巻、５３４−５３８ページ( １９８９年) ；コーク及びクルーガー（Cork and Krueger）、Adv.Appl.Microbiol. 、第３８巻、１−６６ページ( １９９１年) ；コーク及びカリル（Cork and Khalil ）、Adv.Appl.Microbiol. 、第４０巻、２８９−３２０ページ（１９９５年）を参照のこと。ジカンバ分解細菌（すなわち唯一の炭素源としてジカンバを利用する細菌）は、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、アエロモナス属、キサントモナス属、アルカリゲネス属、およびモラクセラ属（これらに限定はされない）を含む多くの細菌の属に見出される。他のジカンバ分解細菌株は、当業者に周知の方法により上記の菌株が単離されたようにして単離することができる。
【００２４】
しかしながら、好ましくは、本発明のジカンバ分解酵素は組み換えＤＮＡ技術（以下を参照）を用いて調製される。特に、シュードモナス・マルトフィリアの配列のアミノ酸において１つ以上のアミノ酸が追加、欠失、または置換されているシュードモナス・マルトフィリアの酵素のアミノ酸配列を有する突然変異酵素が、同方法により、例えば、オリゴヌクレオチドへの直接的突然変異誘発（oligonucletide‐directed mutagenesis）、リンカースキャニング変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応を用いる変異誘発、などを用いて調製される。オースベル（Ausubel ）ら編集の「分子生物学における最近のプロトコル（Current Protocols In Molecular Biology）」( ワイリーインターサイエンス（Wiley Interscience）、１９９０年) 、及びマクファーソン（McPherson ）編集の「直接的突然変異誘発：実践的アプローチ（Directed Mutagenesis: A Practical Approach）」（ＩＲＬプレス、１９９１年）を参照のこと。
【００２５】
第２の実施の形態では、本発明は、本発明のジカンバ分解酵素をコードする単離されたＤＮＡ分子を提供する。「単離（された）」とは、本明細書中ではＤＮＡ分子がその本来の環境から取り出されていること、または天然に生成するＤＮＡ分子ではないことを意味するために使用される。これらのＤＮＡ分子の調製方法は当業者に周知である。例えば、マニアティスら（Maniatis et al. ）の「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８２年、サムブルックら（Sambrook et al. ）の「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８９年を参照のこと。
【００２６】
例えば、本発明のＤＮＡ分子は単離されたｃＤＮＡまたはゲノムクローンでよく、ＲＮＡ分子も含みうる。シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ‐６株のジカンバ分解酵素をコードするクローンの同定及び単離は実施例２及び実施例４‐５で説明されている。ジカンバ分解酵素をコードする他のクローンを同様の方法で得ることができる。単離クローン、あるいはそれらの一部をプローブとして使用して、最初にクローンを単離した生物体以外の生物体から別のクローンを同定、単離することができる。好適な生物体としては、ジカンバを分解する細菌が挙げられる。上述したように、シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株以外に、幾つかの細菌株がジカンバを分解することが知られている。クルーガーら（Krueger et al.）、J.Agric.Food Chem.、第３７巻、５３４−５３８ページ( １９８９年) ；コーク及びクルーガー（Cork and Krueger）、Adv.Appl.Microbiol. 、第３８巻、１−６６ページ( １９９１年) ；コーク及びカリル（Cork and Khalil ）、Adv.Appl.Microbiol. 、第４０巻、２８９−３２０ページ（１９９５年）を参照のこと。
【００２７】
本発明のＤＮＡ分子を、単離クローンの配列を用いて化学的に合成することもできる。そのような技術は当業者に周知である。例えば、ＤＮＡ配列を自動ＤＮＡ合成機でホスホアミダイト化学により合成してもよい。化学合成には多数の利点がある。特に、ＤＮＡ配列が発現される宿主により選択（優先）されるコドンを使用して発現を最適化することが可能なため、化学合成は望ましい。発現を改良するためにコドンの全てを変える必要はないが、好ましくは、少なくとも宿主においてほとんど使用されないコドンは宿主が選択するコドンに変更される。約５０％を超える、最も好ましくは少なくとも約８０％のコドンを宿主が選択するコドンに変更することにより、高レベルの発現を得ることができる。多くの宿主細胞のコドン選択性は周知である。例えば、「遺伝子発現の最大化（Maximizing Gene Expression）、２２５−８５ページ( レズニコフ及びゴールド（Reznikoff & Gold）編集、１９８６年) 、国際公開第９７／３１１１５号、国際公開第９７／１１０８６号、欧州特許第６４６６４３号、欧州特許第５５３４９４号、ならびに米国特許第５，６８９，０５２号、第５，５６７，８６２号、第５，５６７，６００号、第５，５５２，２９９号、および第５，０１７，６９２号を参照のこと。他の宿主細胞のコドン選択性は当業者に周知の方法により導き出すことができる。また、化学合成を用いて、ＤＮＡ分子の配列またはそれによりコードされるタンパク質を容易に変更し、例えば発現を最適化すること( 例えば、転写または翻訳を阻害するｍＲＮＡの二次構造を除去すること) 、好都合な地点に独自の制限部位を付加すること、プロテアーゼ開裂部位を削除すること、などが可能である。
【００２８】
第３の実施の形態では、本発明は、発現制御配列と機能的に連結されたジカンバ分解酵素をコードするＤＮＡ、または各々がジカンバ分解酵素をコードし各々が発現制御配列と機能的に連結されている複数のＤＮＡのコード配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。「ＤＮＡ構築物」とは、本明細書中では、宿主細胞にＤＮＡを導入するために有用な構築された（天然には生成しない）ＤＮＡ分子であると規定され、この用語にはキメラ遺伝子、発現カセット、およびベクターなどが含まれる。
【００２９】
本明細書中で使用されている「機能的に連結された」とは、コードされたタンパク質が発現されるような方法でＤＮＡの配列（配列の順序、配列の向き、及び様々な配列の相対的な距離を含む）を連結することを言う。発現制御配列をコード配列に機能的に連結する方法は当業者に周知である。例えば、マニアティスら（Maniatis et al. ）の「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８２年、サムブルックら（Sambrook et al. ）の「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８９年を参照のこと。
【００３０】
「発現制御配列」とは、原核生物及び真核生物における転写または翻訳の制御に何らかの関わりのあるＤＮＡ配列である。好適な発現制御配列及びそれらの作成方法及び使用方法は当業者に周知である。
【００３１】
発現制御配列にはプロモータが含まれなければならない。プロモータは選択された宿主細胞または生物体において転写活性を示すＤＮＡ配列であればどのようなものでもよい。プロモータは誘導性でも恒常的であってもよい。自然発生したものでもよく、様々な自然発生プロモータの一部から構成されてもよく、部分的にあるいは全体的に合成されたものでもよい。プロモータの設計の手引きは、ハーレイ及びレイノルド（Harley and Reynolds ）、Nucleic Acids Res.、第１５巻、２３４３−６１ページ（１９８７年）などのプロモータ構造の研究により提供されている。また、転写開始位置に対するプロモータの位置を最適化してもよい。例えば、ロバートら（Roberts et al.）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第７６巻、７６０−４ページ（１９７９年）を参照のこと。原核生物及び真核生物において使用するための多くの適したプロモータが当業者に周知である。
【００３２】
例えば、植物において使用するための好適な恒常的プロモータとしては、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓプロモータ( オデールら（Odell et al.）、Nature、第３１３巻、８１０−８１２ページ、１９８５年) 、ピーナッツクロロティックストリークウイルス由来の二重エンハンサードメインを有する完全長の転写プロモータ（メイティおよびシェファード（Maiti and Shepherd）、ＢＢＲＣ、第２４４巻、４４０−４４４ページ、１９９８年）、クロレラウイルスのメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモータ( 米国特許第５，５６３，３２８号) 、及びゴマノハグサモザイクウイルス由来の完全長転写プロモータ( 米国特許第５，３７８，６１９号) などの植物ウイルス由来のプロモータ；コメのアクチン( マクエルロイら（McElroy et al.）、Plant Cell、第２巻、１６３−１７１ページ、１９９０年) 、ユビキチン( クリステンセンら（Christensen et al.）、Plant Mol. Biol.、第１２巻、６１９−６３２ページ、１９８９年及びクリステンセンら（Christensen et al.）、Plant Mol. Biol.、第１８巻、６７５−６８９ページ、１９９２年) 、ｐＥＭＵ( ラストら（Last et al. ）、Theor. Appl. Genet. 、第８１巻、５８１−５８８ページ、１９９１年) 、ＭＡＳ( ベルテンら（Velten et al. ）、EMBO J. 、第３巻、２７２３−２７３０ページ、１９８４年) 、トウモロコシＨ３ヒストン( レペチットら（Lepetit et al.）、Mol. Gen. Genet.、第２３１巻、２７６−２８５ページ、１９９２年及びアタナッソバら（Atanassova et al. ）、Plant Journal 、第２巻( ３) 、２９１−３００ページ、１９９２年) 、アブラナ（B rassica napus）のＡＬＳ３（国際特許出願公開第９７／４１２２８号）などの遺伝子由来のプロモータ；及び様々なアグロバクテリウム属の遺伝子のプロモータ（米国特許第４，７７１，００２号、第５，１０２，７９６号、第５，１８２，２００号、第５，４２８，１４７号）が挙げられる。
【００３３】
植物において使用するのに適した誘導性プロモータとしては、銅に応答するＡＣＥ１系由来のプロモータ( メットら（Mett et al. ）、ＰＮＡＳ第９０巻、４５６７−４５７１ページ、１９９３年) 、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤に応答するトウモロコシＩｎ２遺伝子のプロモータ( ハーシェイら（Hershey et al.）、Mol. Gen. Genetics、第２２７巻、２２９−２３７ページ、１９９１年) 及びガッツら（Gatz et al. ）、Mol. Gen. Genetics、第２４３巻、３２−３８ページ、１９９４年) 、ならびにＴｎ１０由来のＴｅｔリプレッサのプロモータ（ガッツら（Gatz et al. ）、Mol. Gen. Genet.、第２２７巻、２２９−２３７ページ、１９９１年）が挙げられる。植物に使用するのに特に好ましい誘導性プロモータは、植物が通常応答しない誘導剤に応答するものである。このタイプの誘導性プロモータの例としては、その転写活性がグルココルチコステロイドホルモンにより誘導されるステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモータが挙げられる（シェーナ（Schena）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８８巻、１０４２１ページ、１９９１年）。植物に使用するための他の誘導性プロモータは欧州特許第３３２１０４号、国際特許出願公開第９３／２１３３４号、国際特許出願公開第９７／０６２６９号において説明されている。
【００３４】
細菌において使用するのに適したプロモータとしては、バチルス・ステアロサーモフィラスのマルトジェニック・アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスのα‐アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンスのＢＡＮアミラーゼ遺伝子、枯草菌のアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・パミラスのキシロシダーゼ遺伝子のプロモータ、ファージラムダのＰＲ及びＰＬプロモータ、ならびに大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモータが挙げられる。国際特許出願公開第９６／２３８９８号及び国際特許出願公開第９７／４２３２０号を参照のこと。
【００３５】
酵母宿主細胞において使用するのに適したプロモータとしては、酵母の解糖遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、及びＡＤＨ２−４ｃプロモータが挙げられる。国際特許出願公開第９６／２３８９８号を参照のこと。
【００３６】
糸状菌類において使用するのに適したプロモータとしては、ＡＤＨ３プロモータ、ｔｐｉＡプロモータ、コウジカビのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガーの中性α‐アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定性α‐アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、コウジカビのアルカリプロテアーゼ、コウジカビのトリオースリン酸イソメラーゼ、及びアスペルギルス・ニデュランスのアセトアミダーゼをコードする遺伝子のプロモータが挙げられる。国際特許出願公開第９６／２３８９８を参照のこと。
【００３７】
哺乳類細胞において使用するのに適したプロモータとしては、ＳＶ４０プロモータ、メタロチオネイン遺伝子のプロモータ、ネズミの乳房腫瘍ウイルスのプロモータ、ラウス肉腫ウイルスのプロモータ、及びアデノウイルス２の主要後期プロモータ（major late promoter ）が挙げられる。国際特許出願公開第９７／４２３２０号を参照のこと。
【００３８】
昆虫細胞において使用するのに適したプロモータとしては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）多角体病ウイルス塩基性タンパク質プロモータ、バキュロウイルスの前初期遺伝子１プロモータ及びバキュロウイルスの３９Ｋ遅延性初期遺伝子（del ayed-early gene）プロモータが挙げられる。国際特許出願公開第９６／２３８９８号を参照のこと。
【００３９】
最後に、他のプロモータの一部からなるプロモータ及び部分的あるいは全体的に合成した合成プロモータも使用することができる。例えば植物において使用するためのそのようなプロモータについて説明している、ニ（Ni）らのPlant J.、第７巻、６６１−６７６ページ（１９９５年）及び国際特許出願公開第９５／１４０９８号を参照のこと。
【００４０】
プロモータは１以上のエンハンサー要素を含んでもよく、あるいは１以上のエンハンサー要素を含むように修正されてもよい。プロモータは複数のエンハンサー要素を含むことが好ましいであろう。エンハンサー要素を含むプロモータは、エンハンサー要素を含まないプロモータに比べて高いレベルの転写を提供する。植物において使用するのに適したエンハンサーとしてはカリフラワーモザイクウイルス由来の３５Ｓエンハンサー要素（米国特許第５，１０６，７３９号及び第５，１６４，３１６号）及びゴマノハグサモザイクウイルス由来のエンハンサー要素（マイティ（Maiti ）ら、Transgenic Res. 、第６巻、１４３−１５６ページ、１９９７年）が挙げられる。他の細胞において使用するのに適した他のエンハンサーは周知である。国際特許出願公開第９６／２３８９８号及び「エンハンサーと真核生物の発現（Enhancers And Eukaryotic Expression ）」（コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）出版、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー、１９８３年）を参照のこと。
【００４１】
有効な発現のために、コード配列もまた３' 非翻訳配列に機能的に連結されていることが好ましい。３' 非翻訳配列は転写及び／または翻訳終止配列を含む。３' 非翻訳領域は細菌、植物あるいはその他の真核生物細胞由来の遺伝子のフランキング領域から得ることができる。原核生物において使用するためには、３' 非翻訳配列は転写終止配列を含む。植物及び他の真核生物において使用するためには、３' 非翻訳領域は転写終止配列及びポリアデニル化配列を含む。植物において使用するのに適した３' 非翻訳配列は、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ遺伝子、ファセオリン種子貯蔵タンパク質遺伝子、エンドウのリブロース二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットＥ９遺伝子、大豆７５貯蔵タンパク質遺伝子、オクトピンシンターゼ遺伝子、およびノパリンシンターゼ遺伝子の３' 非翻訳配列を含む。
【００４２】
植物及び他の真核生物においては、５' 非翻訳配列も用いられる。５' 非翻訳配列は、５' ＣＡＰ部位から翻訳開始コドンまで延在しているｍＲＮＡの部分である。このｍＲＮＡの領域は真核生物では翻訳の開始のために必要であり、遺伝子発現の制御において重要な役割を果たす。植物において使用するのに適した５' 非翻訳配列としては、アルファルファモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス外皮タンパク質遺伝子、タバコモザイクウイルスの５' 非翻訳配列が挙げられる。
【００４３】
上述したように、ＤＮＡ構築物はベクターでもよい。ベクターは１以上の複製システムを含んでもよく、これによりベクターが宿主細胞中で複製する。自己複製ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターが挙げられる。代替例として、ベクターは組み込み型（integrating ）ベクターでもよく、これにより本発明のジカンバ分解酵素をコードする配列を宿主細胞の染色体中へ組み込むことが可能となる。ベクターはまた、ＤＮＡ配列の挿入のための固有の制限酵素切断部位を有することが望ましい。ベクターが固有の制限酵素切断部位を有していない場合、ベクターを修正して制限酵素切断部位を導入または除去し、その後の操作により適したものとしてもよい。
【００４４】
本発明のＤＮＡ構築物を使用して様々な宿主細胞の形質転換を行うことができる( 下記参照のこと) 。形質転換された宿主細胞を選択するためには、遺伝マーカーを使用しなければならない( 「選択マーカー」) 。選択マーカーは、通常は、形質転換された細胞を負の選択により( すなわち、選択マーカーを含まない細胞の生育を阻害することにより)、または選択マーカーによりコードされた産物をスクリーニングすることにより、回収することができる。
【００４５】
植物の形質転換のための選択可能なマーカー遺伝子として最も普通に使用されるのは、Ｔｎ５から単離されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子であり、これを植物の調節シグナルの制御下に置くと、カナマイシンに対する抵抗性が付与される。フラリー（Fraley）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８０巻、４８０３ページ( １９８３年) 。他の普通に使用される選択可能なマーカー遺伝子は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であり、この遺伝子は抗生物質ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する。バンデン・エルゼン（Vanden Elzen）ら、Plant Mol. Biol.、第５巻、２９９ページ( １９８５年) 。
【００４６】
抗生物質に対する抵抗性を付与する細菌起源のその他の選択可能なマーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド−３' −アデニルトランスフェラーゼ、及びブレオマイシン抵抗性決定基が挙げられる。ヘイフォード（Hayford ）ら、Plant Physiol.、第８６巻、１２１６ページ( １９８８年) 、ジョーンズ（Jones ）ら、Mol. Gen. Genet.、第２１０巻、８６ページ( １９８７年) 、スバブ（Svab）ら、Plant Mol. Biol.、第１４巻、１９７ページ( １９９０年) 、ヒル（Hille ）ら、Plant Mol. Biol.、第７巻、１７１ページ( １９８６年) 。他の選択可能なマーカー遺伝子は、グリフォセート、グルホシネートまたはブロモキシニルなどの除草剤に対する抵抗性を付与する。コマイ（Comai ）ら、Nature、第３１７巻、７４１−７４４ページ( １９８５年) 、ゴルドン−カム（Gordon-Kamm ）ら、Plant Cell、第２巻、６０３−６１８ページ（１９９０年）及びスタルカー（Stalker ）ら、Science 、第２４２巻、４１９−４２３ページ( １９８８年) 。
【００４７】
植物の形質転換のための他の選択可能なマーカー遺伝子は細菌起源のものではない。これらの遺伝子としては、例えば、マウスのジヒドロフォレートレダクターゼ、植物の５‐エノールピルビルシキメート‐３‐リン酸シンターゼ及び植物のアセトラクテートシンターゼが挙げられる。アイヒホルツ（Eichholtz ）ら、Somatic Cell Mol. Genet.、第１３巻、６７ページ( １９８７年) 、サー（Shah）ら、Science 、第２３３巻、４７８ページ( １９８６年) 、チャレスト（Charest ）ら、Plant Cell Rep. 、第８巻、６４３ページ( １９９０年) 。
【００４８】
形質転換細胞と仮定される細胞のスクリーニングを行うために普通用いられる遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ( ＧＵＳ) 、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。ジェファーソン、アール．エイ．(Jefferson, R. A.)、Plant Mol. Biol. Rep. 、第５巻、３８７ページ( １９８７年) 、ティーリ（Teeri ）ら、EMBO J. 、第８巻、３４３ページ( １９８９年) 、コンクツ（Koncz ）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８４巻、１３１ページ( １９８７年) 、デブロック（De Block）ら、EMBO J. 、第３巻、１６８１ページ( １９８４年) 、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）( チャルフィー（Chalfie ）ら、Science 、第２６３巻、８０２ページ( １９９４年) 、ハセロッフ（Haseloff）ら、ＴＩＧ、第１１巻、３２８−３２９ページ（１９９５年）及び国際特許出願公開第９７／４１２２８号) が挙げられる。比較的まれな形質転換事象の同定への別の手法は、トウモロコシのアントシアニン色素沈着経路の優性の恒常的レギュレータをコードする遺伝子を使用するものである。ルードヴィヒ（Ludwig）ら、Science 、第２４７巻、４４９ページ( １９９０年) 。
【００４９】
原核生物及び植物以外の真核生物において使用するのに適した選択マーカーも周知である。例えば、国際特許出願公開第９６／２３８９８号及び国際特許出願公開第９７／４２３２０号を参照のこと。例えば、抗生物質（アンピシリン、カナマイシン、テトラシリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンまたはハイグロマイシン）に対する抵抗性を選択マーカーとして使用してもよい。
【００５０】
本発明の別の態様によれば、植物及び植物細胞のための選択マーカーとして、ジカンバに対する耐性を使用することができる。「耐性（tolerance ）」とは、形質転換された植物細胞が、形質転換されていない細胞の生育を妨害するレベルのジカンバを含む培養用培地に置かれた場合に生育する（生き残り、再生して植物になる）ことができることを意味する。「耐性」はまた、形質転換植物が、形質転換されていない植物の生育を阻害する量のジカンバを適用した後も成長することができることを意味する。
【００５１】
形質転換植物細胞の選択方法は当業者に周知である。簡単に説明すると、一群の植物細胞（例えば、外植片培養または胚懸濁培養）中の少なくとも一部の植物細胞が、ジカンバ分解を提供するＤＮＡ構築物またはＤＮＡ構築物の組合せを用いて形質転換される。得られた植物細胞群を、形質転換された植物細胞は生育するが、形質転換されていない植物細胞は生育しないように選択された濃度のジカンバを含む培地に置く。好適なジカンバ濃度は当業者に周知なように実験的に決定することができる。
【００５２】
形質転換された植物を選択する方法は当業者に周知である。簡単に説明すると、ジカンバ分解を提供するＤＮＡ構築物またはＤＮＡ構築物の組合せを含むと思われる一群の植物にジカンバを適用する。ジカンバの量は、形質転換された植物は生育するが、形質転換されていない植物の生育は阻害されるように選択される。阻害レベルは、形質転換された植物とそうでない植物とが容易に識別できる（すなわち、阻害は統計学上、有意なものでなければならない）ように十分なものでなければならない。そのような量は当業者に周知なように実験的に決定することができる。
【００５３】
さらに、ジカンバの分解の結果生成する３，６−ＤＣＳＡを使用して選択、スクリーニングすることができる。３，６−ＤＣＳＡの生成はこの化合物の蛍光を観測することにより簡単に確認することができ、これにより、形質転換された宿主細胞、生物体全体、および生物体の一部（例えば、微生物、植物、植物の一部、及び植物細胞）を選択、スクリーニングすることが可能となる。この点に関しては、この発明により、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に関するのと同じ方法で、形質転換された宿主細胞、生物体全体、及び生物体の一部を選択及びスクリーニングすることが可能である。米国特許第５，１６２，２２７号、第５，４９１，０８４号、及び国際特許出願公開第９６／２７６７５号、第９７／１１０９４号、第９７／４１２２８号、第９７／４２３２０号を参照のこと。これらは全て引用により本明細に組み込まれる。特に、３，６−ＤＣＳＡは、形質転換された宿主細胞、生物体全体、及び生物体の一部において、従来の分光測光法を用いて検出することができる。例えば、顕微鏡を、蛍光の励起及び検出のための適当なフィルタの組合せを用いて適合させることができる。ベンチトップ作業または野外作業では携帯用のランプを使用してもよい( 実施例１を参照のこと) 。蛍光により活性化された細胞を区別することも使用することができる。３，６−ＤＣＳＡは３１２−３１３ｎｍの波長で励起され、極大発光波長は４２４ｎｍである。
【００５４】
生物体の「一部」とは器官、組織、またはその他の全ての部分を含む。「植物の一部」とは種子、花粉、胚芽、花、果実、苗条、葉、根、茎、外植片などを含む。
ジカンバ耐性植物またはジカンバ分解微生物の生産においては、ジカンバ耐性またはジカンバ分解を基にした選択を使用することができる。いずれの場合も、他の選択マーカーの使用は必要ない。ジカンバ耐性またはジカンバ分解を基にした選択はまた、他の興味のある遺伝子が発現する遺伝子導入細胞または遺伝子導入生物の生産に使用することもできる。多くのそのような遺伝子は周知であり、そのような遺伝子としては、経済価値のあるタンパク質をコードする遺伝子、植物に改良された農学的特性を付与する遺伝子が挙げられる( 例えば、国際特許出願公開第９７／４１２２８号を参照のこと。その開示内容は全て引用により本明細書中に組み込まれる) 。
【００５５】
本発明のＤＮＡ構築物を使用して、原核生物や真核生物を含む様々な宿主細胞の形質転換を行うことができる。別個の選択マーカーを使用する場合、ジカンバ分解酵素及び選択マーカーをコードするＤＮＡ配列は、同じまたは異なるＤＮＡ構築物上にあってよい。好ましくは、該配列はすべてのコード配列が共に発現されるように転写単位として単一のＤＮＡ構築物上に配列される。また、関心のある遺伝子及びジカンバ分解酵素をコードするＤＮＡ配列は、ジカンバ耐性またはジカンバ分解を選択マーカーとして使用する場合、同じまたは異なるＤＮＡ構築物上にあってもよい。そのような構築物は上記に説明したのと同じ方法で調製される。
【００５６】
好適な宿主細胞としては、原核微生物及び真核微生物、例えば細菌( アグロバクテリウム・ツメファシエンス及び大腸菌を含む) 、酵母（サッカロミセス・セレビシエを含む）及び他の真菌( アスペルギルス種を含む))、植物細胞、昆虫細胞、ならびに哺乳類細胞が挙げられる。宿主細胞は通常ジカンバを分解しないものであることが好ましい。しかしながら、本発明はまた、通常ジカンバを分解する宿主細胞におけるジカンバ分解レベルを増加させるために使用することもできる。
【００５７】
このように、本発明の「遺伝子導入」細胞及び生物体には、通常ジカンバを分解しない細胞及び生物体が含まれるが、これらの細胞及び生物体は本発明によりこの除草剤を分解することができるように形質転換される。本発明の「遺伝子導入」細胞及び生物体には、通常ジカンバを分解する細胞及び生物体も含まれ、これらの細胞及び生物体は本発明によりこの除草剤をより多く分解またはより効果的に分解することができるように形質転換される。
【００５８】
原核生物及び真核生物の宿主細胞の形質転換方法は当業者に周知である。例えば、マニアティスら（Maniatis et al. ）の「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８２年、サムブルックら（Sambrook et al. ）の「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、１９８９年、国際特許出願公開第９６／２３８９８号、国際特許出願公開第９７／４２３２０号を参照のこと。
【００５９】
例えば、生物学的及び物理学的形質転換プロトコルを含む、多くの植物形質転換方法が開発されている。例えば、グリック、ビー．アール．(Glick, B.R.) 及びトンプソン、ジェイ．イー．(Thompson J. E.)編集の「植物分子生物学及びバイオテクノロジーにおける方法（Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology）」（ボカラトン（Boca Raton）所在のＣＲＣ出版（CRC Press, Inc. ）、１９９３年）６７−８８ページにおけるミキ（Miki）らの「異種ＤＮＡを植物に導入するための手順」を参照のこと。さらに、植物細胞または組織の形質転換及び植物の再生のためのベクターと生体外（in vitro）培養法とが有効である。例えば、グリック、ビー．アール．(Glick, B.R.) 及びトンプソン、ジェイ．イー．(Thompson J. E.)編集の「植物分子生物学及びバイオテクノロジーにおける方法（Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology）」（ボカラトン（Boca Raton）所在のＣＲＣ出版（CRC Press, Inc. ）、１９９３年）８９−１１９ページにおけるグルバー（Gruber）らの「植物形質転換のためのベクター」を参照のこと。実施例６は、本発明の植物の形質転換の具体例を示すものである。
【００６０】
発現ベクターを植物に導入するための最も広く使用されている方法は、アグロバクテリウムの天然の形質転換システムに基づくものである。例えば、ホルシュ（Horsh ）ら、Science 、第２２７巻、１２２９ページ（１９８５年）を参照のこと。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスは、遺伝学的に植物細胞の形質転換を行う植物の病原性土壌細菌である。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスのＴｉ及びＲｉプラスミドはそれぞれ、植物の遺伝的形質転換を起こす遺伝子を有している。例えば、カド、シー．アイ．(Kado C. I.)、Crit. Rev. Plant Sci. 、第１０巻、１ページ（１９９１年）を参照のこと。アグロバクテリウムのベクターシステムの説明及びアグロバクテリウムを介する遺伝子伝達の方法は多くの参考文献において示されている。例えば、グルバー（Gruber）ら( 前述) 、ミキら( 前述) 、モロニー（Moloney ）ら、Plant Cell Reports、第８巻、２３８ページ( １９８９年) 、及び米国特許第４，９４０，８３８号及び第５，４６４，７６３号などである。
【００６１】
一般に適用できる植物の形質転換方法は、ＤＮＡがマイクロプロジェクタイルの表面に乗って運ばれるマイクロプロジェクタイルを介する形質転換である。発現ベクターは、植物の細胞壁及び細胞膜を通過するのに十分な速度までマイクロプロジェクタイルを加速する微粒子銃装置を用いて植物組織内に導入される。サンフォード（Sanford ）ら、Part. Sci. Technol. 、第５巻、２７ページ( １９８７年) 、サンフォード、ジェイ．シー．（Sanford J. C. ）、Trends Biotech. 、第６巻、２９９ページ( １９８８年) 、サンフォード、ジェイ．シー．、Physiol. Plant、第７９巻、２０６ページ( １９９０年) 、クライン（Klein ）ら、Biotechnology 、第１０巻、２６８ページ( １９９２年) 。
【００６２】
ＤＮＡを植物まで物理的に運ぶための別の方法は標的細胞の超音波処理である。ツァング（Zhang ）ら、Bio/Technology、第９巻、９９６ページ( １９９１年) 。代替例として、リポソームまたはスフェロプラストの融合を使用して発現ベクターが植物内に導入されている。デシャエス（Deshayes）ら、EMBO J. 、第４巻、２７３１ページ( １９８５年) 、クリストウ(Christou)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第８４巻、３９６２ページ( １９８７年) 。ＣａＣｌ2 沈澱、ポリビニルアルコールまたはポリ−Ｌ−オルニチンを用いたＤＮＡのプロトプラストへの直接的取り込みも報告されている。ヘイン（Hain）ら、Mol. Gen. Genet.、第１９９巻、１６１ページ（１９８５年）及びドラパー（Draper）ら、Plant Cell Physiol. 、第２３巻、４５１ページ( １９８２年) 。プロトプラスト及び、全細胞及び全組織のエレクトロポレーションについても説明されている。ドン（Donn）ら、植物細胞及び組織培養に関する第７回国際会議ＩＡＰＴＣ要旨集、Ａ２−３８、５３ページ( １９９０年) ；ドハルイン（D'Halluin ）ら、Plant Cell、第４巻、１４９５−１５０５ページ（１９９２年）及びスペンサー（Spencer ）ら、P lant Mol. Biol.、第２４巻、５１−６１ページ( １９９４年) 。
【００６３】
本発明によれば、任意のタイプの遺伝子導入ジカンバ耐性植物を生産することができる。特に、現在のところジカンバの被害を受けていることが知られている広葉植物（インゲン豆、大豆、綿花、エンドウ、ジャガイモ、ヒマワリ、トマト、タバコ、果樹及び観葉植物及び観葉樹木を含む）の形質転換を行い、それらの植物が同除草剤に対し耐性を有するようにすることができる。現在ジカンバに対し耐性があると考えられている他の植物（例えば、トウモロコシ、サトウモロコシ、小穀粒、サトウキビ、アスパラガス及びイネ科植物）も形質転換し、同除草剤に対する耐性を増大させることができる。特に、任意の双子葉または単子葉植物を本発明のＤＮＡ構築物で形質転換することができる。「耐性（がある）」とは、形質転換された植物が、形質転換されていない植物の生育を阻害する量のジカンバの存在下で生育可能であることを意味する。
【００６４】
本発明のジカンバ分解オキシゲナーゼが、遺伝子導入された宿主細胞および生物体の内在性のレダクターゼおよびフェレドキシンとともにジカンバを分解するように機能しうることが期待される。植物の葉緑体は特にレダクターゼおよびフェレドキシンが豊富である。従って、ジカンバ耐性の遺伝子導入植物を生産するための好適な実施形態は、ジカンバ分解オキシゲナーゼを葉緑体の中へと導くペプチド（例えば輸送ペプチド）をコードする配列（「葉緑体ターゲティング配列」）を使用することである。葉緑体ターゲティング配列をコードするＤＮＡはジカンバ分解オキシゲナーゼをコードする配列の上流（５’）に配置されることが好ましいが、同コード配列の下流（３’）、または同コード配列の上流と下流の両方に配置されてもよい。任意の好適な葉緑体ターゲティング配列を使用可能である。典型的な葉緑体ターゲティング配列には、トウモロコシのｃａｂ‐ｍ７シグナル配列（ベッカー（Becker）ら、Plant Mol. Biol.、第２０巻、４９ページ（１９９２年）および国際特許出願公開第９７／４１２２８号を参照のこと）、エンドウのグルタチオンレダクターゼシグナル配列（クライセン（Creissen）ら、Plant J.、第２巻、１２９ページ（１９９１年）および国際特許出願公開第９７／４１２２８号を参照のこと）およびエンドウのリブロース１，５‐二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットシグナル配列（配列番号１９で表される核酸配列）（フルーア（Fluhr ）ら、EMBO J. 、第５巻、２０６３‐２０７１ページ、１９８６年）が挙げられる。代替となる好適な実施形態は、葉緑体中で機能するプロモータを含む構築物を用いて葉緑体を直接形質転換し、葉緑体中で該オキシゲナーゼを発現させることである。国際特許出願公開第９５／２４４９２号および米国特許第５，５４５，８１８号を参照のこと。もちろん、選択された遺伝子導入宿主細胞または生物体が十分な内在性レダクターゼ、フェレドキシン、またはその両方を生産しない場合は、該宿主細胞または生物体を、これらの酵素のうちの一方または両方ならびにオキシゲナーゼを生産するように形質転換することが可能である。
【００６５】
更に別の実施形態では、本発明は、ジカンバ耐性の遺伝子導入植物が生育している畑での雑草の制御方法を提供する。この方法は、有効な量のジカンバを畑に適用して雑草を制御することを含む。ジカンバの適用方法及び様々なタイプの雑草を制御するのに有効なジカンバの量は周知である。Crop Protection Reference 、１８０３−１８２１ページ（ニューヨーク州ニューヨーク所在のケミカル＆ファーマスーティカルプレス社（Chemical & Pharmaceutical Press, Inc. ）、第１１版、１９９５年）を参照のこと。
【００６６】
他の実施形態では、本発明は土壌、水、あるいはジカンバ製造設備の老廃物などの物質中に存在するジカンバを分解する方法を提供する。そのような分解は、本発明のジカンバ分解酵素を用いて達成することができる。酵素は、酵素を自然に発現している微生物から精製することができ( 実施例１および３を参照のこと) 、または酵素を生産する形質転換宿主細胞から精製することができる。酵素をそのような方法に用いる場合、適当な補助因子も提供しなければならない( 実施例１を参照のこと) 。有効な量は当業者に知られているように実験的に決定することができる( 実施例１を参照のこと) 。代替例として、遺伝子導入された原核微生物及び真核微生物を使用して、そのような物質中のジカンバを分解することもできる。遺伝子導入された原核微生物及び真核微生物は上記に説明したように生産することができ、有効な量は当業者に知られているように実験的に決定することができる。
【００６７】
ジカンバは大量に、連続的に環境に導入される。ジカンバの除去は、地球の土壌及び水中に存在する微生物中で見出された酵素系の作用に大部分を依存している。ジカンバ分解Ｏ−デメチラーゼ及びその３つの成分を含むこれらの酵素系を理解することが、汚染された土壌、水及び他の物質の生物治療及び回復のために自然のまたは遺伝的に修正した微生物を開発しようとする場合、重要である。このように、本発明のジカンバ分解酵素、ＤＮＡ分子、ＤＮＡ構築物などはジカンバ分解及び生物治療の研究のための調査ツールとして使用することができる。
【００６８】
最後に、本発明のジカンバ分解酵素をジカンバの分析に使用することができる。ジカンバを含むと考えられるサンプルを、ジカンバ分解Ｏ−デメチラーゼ、またはジカンバ分解オキシゲナーゼとジカンバ分解フェレドキシンとジカンバ分解レダクターゼとの組合せ、と共に混合する。好適な分析が実施例１および３で説明されている。特に、３，６−ＤＣＳＡの生成による蛍光の検出または定量は、操作性の良い分析に役立つ。
【実施例１】
【００６９】
シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼの成分の精製と特性分析
（方法と材料）
（細菌と成長条件）
シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株（クルーガー（Kreuger ）ら、１９８９年、J. Agric. Food Chem.、第３７巻、５３４−５３８ページ）を、ジカンバに持続的に汚染された土壌の場所から単離した。細菌はイリノイ州シカゴ所在のイリノイ技術研究所（Illinois Institute of Technology）のダクラス  コーク（Douglas Cork）博士により提供され、ジカンバ（２ｍｇ／ｍｌ）またはグルコース（２ｍｇ／ｍｌ）とカザミノ酸（２ｍｇ／ｍｌ）との混合物のいずれかを追加した還元塩化物培地で維持した( クルーガー、ジェイ．ピー. （Kreuger, J. P.）、１９８９年、学位論文、イリノイ州シカゴ所在のイリノイ技術研究所) 。炭素源をフィルターで滅菌して加圧蒸気滅菌後の培地に添加した。固体培地は１％（重量／容量）のゲルライト（Gelrite 、登録商標）（ロードアイランド州ウエストウォリック所在のスコット研究所）を添加することにより調製した。
【００７０】
（化学物質及び試薬）
ジカンバ、３，６−ＤＣＳＡ、および［１４Ｃ］ジカンバ（Ｕ−フェニル−１４Ｃ、４２．４ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、放射化学的純度は９８％を超える）はサンドアグロ社（Sandoz Agro, Inc. ）（イリノイ州デスプレイネス所在）から供給された。溶解性を増大させるため、ジカンバ及び３，６−ＤＣＳＡ保存溶液を、ＫＯＨを用い滴定してｐＨ７．０に調製した。特に記載の無いかぎり、化学物質は全てシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)（ミズーリ州セントルイス所在）から購入した。ＦＰＬＣ（中高圧液体クロマトグラフィー）用のＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２、Ｍｏｎｏ  Ｑ（登録商標）、Ｑ‐セファロース（ファストフロー）およびフェニルセファロース（ＣＬ−４Ｂ）カラム充填材はファルマシア（Pharmacia ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー所在) から得た。両性電解質ｐＨ４−６と両性電解質ｐＨ４−９はセルバ（Serva ）( ドイツ連邦共和国ハイデルベルグ所在) から購入した。アクリルアミド、β−メルカプトエタノール、Ｎ，Ｎ，Ｎ' ，Ｎ' −テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）及び過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）はバイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）（カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）から購入した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートはＵＶ２５４指示薬を含むシリカゲル（厚さ２５０μｍ）であり、ジェイ．ティ．ベイカーケミカル社（J. T. Baker Chemical Co.）（ニュージャージー州フィリプスバーグ所在）から購入した。
【００７１】
（酵素分析）
ジカンバＯ−デメチラーゼ活性は［１４Ｃ］ジカンバからの［１４Ｃ］３，６−ＤＣＳＡの形成を測定することにより分析した。簡単に説明すると、酵素成分の混合物中の活性を、３０℃において、２５ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 と、０．５ｍＭのＮＡＤＨ（β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型）と、０．５ｍＭの硫酸鉄（ＩＩ）と、５０μＭの冷ジカンバと、２．５μＭの［１４Ｃ］ジカンバ（放射性ジカンバの最終比活性は１．９ｍＣｉ／ｍｍｏｌであった）と、様々な量の細胞溶解物または部分的に精製した酵素とを含む標準的な３００μｌの反応混合物中で測定した。最終精製工程中の全ての酵素分析はリン酸緩衝液中で行った。なぜならジカンバＯ−デメチラーゼ活性の最適ｐＨはリン酸緩衝液の中域にあることが見出され、ｐＨ７．０のトリス−ＨＣｌ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロリド］に比ベリン酸緩衝液を用いるとより高い酵素活性が観察されたからである。反応は基質であるジカンバを添加することにより開始した。所定の時間で、５０μｌの５％（容量／容量）のＨ２ＳＯ４を添加して反応を止めた。その後、ジカンバ及びジカンバ代謝物を１容量のエーテルで２度抽出し、抽出物を蒸発させ乾燥させた。抽出手順の回収効率（平均±標準偏差）はジカンバで８７％±２％、３，６−ＤＣＳＡで８５％±３％であった( ヤン（Yang）ら、Anal. Biochem.、第２１９巻、３７−４２ページ、１９９４年) 。
【００７２】
［１４Ｃ］ジカンバ及び［１４Ｃ］標識代謝物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離した。エーテル抽出されたジカンバ及びその代謝物を５０μｌのエーテルに再溶解し、ＴＬＣプレート上にスポットとしてつけた。ＴＬＣを展開する溶剤系はクロロホルム−エタノール−酢酸（８５：１０：５［容量／容量／容量］）とした。分離した反応生成物は、ＴＬＣプレートを蛍光スクリーンに２４時間曝し、その後そのスクリーンをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）ＳＦ（モレキュラーダイナミクス（Molecular Dynamics）、カリフォルニア州サニーベール所在）において走査することにより可視化し、定量した。ＴＬＣプレート上の特定のスポット中の放射能の量の推定は、そのスポット内の総画素数を既知量の［１４Ｃ］ジカンバを含む同じプレート上の１つのスポットと比較することにより決定した。活性の１単位を、３０℃において１分間あたりにジカンバから１ｎｍｏｌの３，６−ＤＣＳＡの形成を触媒する酵素の量として規定した。比活性は分析混合物の総タンパク質濃度を基にした。
【００７３】
ジカンバデメチラーゼのレダクターゼ成分の活性は、日立のＵ−２０００分光光度計を用いて２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）の還元を測定することにより分析した。反応には、総体積１ｍｌ中に、０．５ｍＭのＮＡＤＨ、０．２ｍＭのＦＡＤ( フラビンアデニンジヌクレオチド) 、５０μＭのＤＣＩＰ、２０ｍＭのトリス緩衝液( ｐＨ８．０) 、１０−１００μｌの酵素サンプルを含めた。時間経過に伴う６００ｎｍでの吸光度の変化を室温で測定した。比活性を、還元ＤＣＩＰの６００ｎｍにおける減衰係数２１．０ｍ・Ｍ−１・ｃｍ−１を用いて計算した。比活性は還元ＤＣＩＰのｎｍｏｌ／分・タンパク質ｍｇで表した。
【００７４】
さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕのＤＣＩＰ分析を使用して、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル上で分離したタンパク質試料中のレダクターゼ活性を検出し、位置を確認した。ＩＥＦゲル上でのタンパク質の電気泳動後、ゲルから切り取ったレーンを２０ｍｌの冷２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液( ｐＨ８．０) で洗浄した。低融点アガロースを１０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液( ｐＨ８．０) 中で加熱することにより溶解し、終濃度１．５％（ｗ／ｖ）とした。アガロースを室温付近の温度まで冷却すると、０．２ｍＭのＦＡＤと、５０μＭのＤＣＩＰと、０．５ｍＭのＮＡＤＨとを追加した。分析混合物をガラスプレート上に注ぎ、固化させた。ゲル片を固化させた反応混合物上に置き、室温で１５分間静置した。ゲル薄片がレダクターゼ活性を有するタンパク質を含んでいれば、還元ＤＣＩＰの無色バンドがＤＣＩＰの青色バックグラウンド中に生成した。
【００７５】
（細胞溶解物）
細胞を、回転振とう培養機（３０℃で２５０ｒｐｍ）で、グルコースとカザミノ酸との混合物を含む液体還元塩化物培地中で、５５０ｎｍで１．３〜１．５の光学密度が得られるまで増殖させた。細胞を遠心分離によりハーベストし、冷１００ｍＭのＭｇＣｌ2 で２度洗浄し、再び遠心分離にかけた。細胞のペーストは直ちに使用するか、液体窒素中で急速冷凍して−８０℃で保存した。酵素精製時に、２５ｇの冷凍細胞を解凍して、２５ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2 と、０．５ｍＭのＥＤＴＡとを含む５０ｍｌの単離緩衝液中に再懸濁させた。フェニルメチルスルホニルフルオリド及びジチオスレイトールを、それぞれ終濃度が０．５ｍＭ及び１ｍＭとなるまで添加した。１０ｍｇのリゾチームと１ｍｇのＤＮアーゼを添加した後、細胞を１０分間氷上で撹拌し、氷上で、２０秒の照射と４０秒の静止間隔とを１２回行う中度のセッティング（セッティング５）で超音波処理（モデルＸＬ２０２０超音波装置；ヒートシステムズ（Heat Systems））することにより粉砕した。得られた細胞溶解物を単離緩衝液を用いて９０ｍｌとなるまで希釈し、４℃、７６，０００×ｇで１時間遠心分離にかけた。上清を用いて清澄細胞溶解物源とした。
【００７６】
（酵素の精製）
特に記載がなければ、全ての手順は４℃で行った。常に撹拌しながら、固体硫酸アンモニウムを９０ｍｌ容の清澄細胞溶解物にゆっくりと添加し、４０％（重量／容量）飽和とした。１５分間の撹拌後、混合物を１５，４００×ｇで１５分間遠心分離にかけ、沈澱を廃棄した。上清を常に撹拌しながら、追加の固体硫酸アンモニウムを添加し７０％（重量／容量）飽和とした。１５分間の撹拌の後、混合物を前記条件下で遠心分離にかけた。上清を廃棄し、沈澱を最小体積の緩衝液Ａ（２０ｍＭのトリス[ ｐＨ８．０] 、２．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、５％（容量／容量）のグリセロール、１ｍＭのジチオスレイトール）中に再懸濁させた。
【００７７】
その後、４０−７０％の範囲の硫酸アンモニウムに溶解したものを、ＦＰＬＣ装置（ファルマシア）に接続されたフェニルセファロースカラム（２．５ｃｍ×１０ｃｍ）上に負荷し、１０％（ｗ／ｖ）から０％（ｗ／ｖ）までの（ＮＨ４）２ＳＯ４の減少直線勾配を用いて溶離した。カラムは１０％（重量／容量）硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａを用いて予め平衡させた。流速は１ｍｌ／分とした。カラム溶離中にＡ２８０でタンパク質濃度を連続的にモニタした。ベースラインのＡ２８０測定値が得られるまで、カラムを１２０ｍｌの１０％（重量／容量）硫酸アンモニウムを含む緩衝液Ａで洗浄した。結合タンパク質は緩衝液Ａ中の減少勾配の（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ［総体積２１０ｍｌ中で１０〜０％（重量／容量）の（ＮＨ４）２ＳＯ４］を用いて溶離した。２ｍｌの画分を収集した。非放射性ジカンバを基質として使用した場合を除き、１０μｌのアリコットを各画分から取りだし、標準ジカンバＯ−デメチラーゼ分析混合物（上記を参照のこと）に添加した。ジカンバＯ−デメチラーゼ活性を、暗室で携帯用のＵＶランプ（３１２ｎｍ、フォトダイン（Fotodyne））を用いてジカンバの高蛍光性の反応生成物３，６−ＤＣＳＡへの変換をモニタすることにより検出した。
【００７８】
この手順により、ジカンバＯ−デメチラーゼを個別の成分（成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩとする）を含む３つの集まり（プール）に分離することができた。各成分はジカンバＯ−デメチラーゼ活性に必須なものである( 以下を参照のこと) 。単一成分を分析する場合は、他の２つの成分を過剰に供給した。１つのタイプの活性を含む画分をプールした( 成分Ｉ、画分１２８−１４５；成分ＩＩ、非結合画分１２−３３；成分ＩＩＩ、画分６２−９２) 。
【００７９】
（ｉ）成分Ｉの精製
成分Ｉの活性を含む画分（０Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４でフェニルセファロースカラムから溶離、画分１２８−１４５）をプールし、総体積３４ｍｌとした。このプールサンプルをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）−１０装置（アミコン(Amicon)）により１０ｍｌまで濃縮し、その後、緩衝液Ａで平衡したＱ−セファロース（ファストフロー）ＦＰＬＣカラム（ファルマシア）( ２．５ｃｍ×６ｃｍ) にアプライし、８０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。カラムに結合したタンパク質を、緩衝液Ａ中の０〜０．６Ｍの直線勾配のＫＣｌを１００ｍｌ用いて流速１ｍｌ／分で溶離した。画分を１．５分間隔で収集した。成分Ｉの活性を示すそれらの画分（画分２９−３７）をプールし、４℃で一晩緩衝液Ａに対して透析し、緩衝液Ａ中のＭｏｎｏＱ（登録商標）ＨＲ５／５ＦＰＬＣ陰イオン交換カラムにアプライした。ＫＣｌ濃度が増大する（０から０．５Ｍ）勾配５０ｍｌを用いて１ｍｌ／分でタンパク質を溶離した。成分Ｉの活性を示す画分（画分１９から２５まで）をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）−１０装置で遠心分離により０．４ｍｌまで濃縮した。濃縮サンプルはその後、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２ＦＰＬＣカラム（１．６×５．０ｃｍ）上で、流速０．２ｍｌ／分、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａを用いるクロマトグラフィーに供した。成分Ｉの活性を示す画分７−１０をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）−１０装置における遠心分離により濃縮した。
【００８０】
部分的に精製した成分Ｉを１％（ｗ／ｖ）の冷グリシンで希釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）−１０装置で遠心分離によりさらに３回濃縮して脱塩し、ＩＥＦ電気泳動用に準備した。脱塩、濃縮サンプルをその後６％（ｗ／ｖ）ＩＥＦ（ｐＨ４−６）ゲルに供し、４℃で１．５時間電気泳動を行った( 下記参照) 。電気泳動の後、ゲルを２５ｍＭの冷リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で５分間洗浄し、次いでゲルレーンの各薄片を小片（６ｍｍ×４ｍｍ）に切断した。切断ゲル片を１０μｌの２５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の存在下ピペット用チップを用いてすりつぶすことにより、該切断ゲル片からタンパク質を溶離した。各部分由来のタンパク質を過剰量の成分ＩＩおよび成分ＩＩＩと混合し、ジカンバＯ−デメチラーゼ活性の分析を行った。成分Ｉの活性を示したゲル部分（これもまた赤茶色であった）を１２．５％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、サンプル純度を確認した。
【００８１】
（ｉｉ）成分ＩＩの精製
フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーにより得られた成分ＩＩを緩衝液Ａに対して４℃で一晩透析し、ＦＰＬＣ  Ｑ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）に供した。サンプル溶離条件は、溶離勾配を緩衝液Ａ中０から１ＭのＫＣｌとしたことを除き、成分Ｉについて以上で説明した条件と同一とした。成分ＩＩの活性を示す画分（画分３０−３７）をプールし、緩衝液Ａに対し透析し、０．４ｍｌに濃縮し、ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２カラム（１．６×５０ｃｍ）に供した。サンプルを供し溶離する手順は成分Ｉについて以上で説明したものと同一であった。成分ＩＩの活性を示す画分（画分３−６）をプールし、同量の緩衝液Ａで希釈し、ＦＰＬＣ  ＭｏｎｏＱ（登録商標）カラムに供した。成分Ｉの場合と同じＫＣｌ勾配を用いてカラムからタンパク質を溶離した。画分２０−２５は成分ＩＩの活性を示した。部分的に精製した成分ＩＩをさらに、成分Ｉについて説明したのと同じ条件を用いてＩＥＦ（ｐＨ４−６）電気泳動により精製した。成分ＩＩの活性を示すゲル部分を１２．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、さらに分析した。
【００８２】
（ｉｉｉ）成分ＩＩＩの精製
フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーにより得られた成分ＩＩＩを緩衝液Ａに対して４℃で一晩透析し、ＦＰＬＣ  Ｑ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）に供した。条件は、成分Ｉについて以上で説明した条件と同一とした。成分ＩＩＩの活性を示す画分（画分２６−３８）を緩衝液Ｂ［１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ( ｐＨ７．５) 、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１ｍＭのジチオスレイトール］に対して透析し、５ｍｌに濃縮した。青色色素親和性マトリクス［シバルコンブルー（Cibarcon Blue ）３ＧＡ型３０００( シグマ) ］をＦＰＬＣカラム（１×５ｃｍ）に充填し、２０ｍｌの緩衝液Ｂを用いて平衡化した。濃縮された成分ＩＩＩを青色色素カラムに供し、カラム流出液のＡ２８０がベースラインレベルに到達するまで、流速０．２ｍｌ／分で２０ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄した。その後、結合タンパク質を緩衝液Ｂ中の５ｍＭのＮＡＤＨを用いて溶離した。レダクターゼ活性を含む画分を、過剰の成分Ｉ及び成分ＩＩの存在下でのジカンバＯ−デメチラーゼ活性分析を用いて、またＮＡＤＨの存在下での各画分のＤＣＩＰ還元能力も用いて検出した。両方の分析において強いレダクターゼ活性を有する画分をプールし、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａに対し透析し、０．２ｍｌに濃縮し、ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２カラムに供した。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）カラムの操作には、成分Ｉについて説明したのを同一の条件を使用した。ＤＣＩＰ還元を触媒したタンパク質を含む画分をプールし、緩衝液Ａに対し透析し、ＦＰＬＣ  ＭｏｎｏＱ（登録商標）カラムに供した。成分Ｉに対するのと同じ条件を用いてタンパク質を溶離した。部分的に精製した成分ＩＩＩを、ＩＥＦ（ｐＨ４−６）ゲル電気泳動によりさらに精製した。ＩＥＦゲル内のタンパク質のレダクターゼ活性を、上記で説明したように、アガロースゲル上に置いてＤＣＩＰの還元について分析することにより検出した。成分ＩＩ活性を示したゲルセグメントを１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に供してさらに分析した。
【００８３】
（ＮＨ2 −末端アミノ酸配列の決定）
タンパク質のバンドをＩＥＦゲルから切り出し、１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのウェルに入れた。電気泳動後、精製したタンパク質を含むゲル薄片をＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）セル（バイオラッド（Bio-Rad ）、カリフォルニア州リッチモンド所在）中でＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）膜（ミリポア）上に、２５ボルトで１６時間ブロットした。ブロッティング緩衝液は、１０ｍＭのＣＡＰＳ［３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸］、ｐＨ１０．０を含む２０％（ｖ／ｖ）のメタノール溶液とした。配列決定は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems Inc. ）の４２０Ｈ機器を用いて、エドマン分解（エス．ビー．ニードルマン（S. B. Needleman ）編集、「タンパク質配列決定（Protein sequence determination）」、第２版、ニューヨーク所在のスプリンガー−ベルラージ(Springer-Verlarge) 中のエドマン（Edman ）及びヘンシェン（Henschen）、１９７５年、２３２−２７９ページ、）により実行した。
【００８４】
（タンパク質濃度の決定）
タンパク質濃度はウシ血清アルブミンを標準に用い、ブラッドフォード（Bradford）１９７６年、Anal. Biochem.、第７２巻、２４８−２５４ページ、の方法により決定した。
【００８５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
レムリ（Laemmli ）の改良法（レムリ（１９７０年）、Nature、第２２７巻、６８０−６８５ページ）に従い、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。８５×６５×０．７５ｍｍの１２．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳゲルを以下の様に作製した。泳動ゲルは２．５ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス溶液( ３７：５：１) 、１ｍｌの泳動緩衝溶液[ ３Ｍのトリス−ＨＣｌ( ｐＨ８．８) 、０．８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ] 、４．５ｍｌのＨ２Ｏ、５μｌのＴＥＭＥＤ、４０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳとした。スタッキングゲルは、０．５ｍｌの４０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス、０．５ｍｌのスタッキング緩衝溶液[ １Ｍのトリス−ＨＣｌ( ｐＨ６．８) 、０．８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ] 、３ｍｌのＨ２Ｏ、５μｌのＴＥＭＥＤ、１２．５μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳとした。泳動緩衝液の組成は２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、０．２Ｍのグリシン及び０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳとした。サンプル緩衝液は、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール中に、０．２５ｍｌのスタッキング緩衝液、０．６ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．２ｍｌのβ−メルカプトエタノール、及び０．９５ｍｌの０．１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）を含んだ。電気泳動を、バイオラッド（Bio-Rad ）のミニゲル（Mini Gel）装置で８０ボルトで、先導色素がゲルの陽極端から０．５ｃｍの所に移動するまで実施した。タンパク質は、３：６：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比のイソプロパノールと水と酢酸との混合物中の０．１％（ｗ／ｖ）のクマシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue）Ｒ−２５０により染色した。脱色は７：８３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の比のメタノールと水と酢酸との混合物中で行った。標準タンパク質（ギブコ（Gibco ）ＢＲＬ）は、ミオシン( ２１４．２ｋＤａ) 、ホスホリラーゼＢ( １１１．４ｋＤａ) 、ウシ血清アルブミン( ７４．２５ｋＤａ) 、卵白アルブミン( ４５．５ｋＤａ) 、炭酸脱水素酵素( ２９．５ｋＤａ) 、β−ラクトグロブリン( １８．３ｋＤａ) 、及びリゾチーム（１５．４ｋＤａ）を含むものであった。
【００８６】
（分子量の決定）
変性条件下でのペプチドの分子量（Ｍｒ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて評価した。本来の成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの分子量を、１００ｍＭのＫＣｌを含む緩衝液Ａ中、０．２ｍｌ／分の流速で、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２ＨＲ１０／３０ＦＰＬＣカラム（ファルマシア）を介したゲル濾過により評価した。基準タンパク質はバイオラッドのゲル濾過用標準品とした。基準タンパク質は、ウシチログロブリン( ６７０ｋＤａ) 、ウシガンマグロブリン( １５８ｋＤａ) 、ニワトリ卵白アルブミン( ４４ｋＤａ) 、ウマミオグロビン（１７ｋＤａ）及びビタミンＢ−１２（１．３５ｋＤａ）とした。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２カラムの空隙容量はブルーデキストラン（Blue Dextran、Ｍｒは２，０００，０００、シグマ）を用いて計算した。
【００８７】
（ＩＥＦ）
Ｃ．Ｂ．Ｓ．サイエンティフィック社（C. B. S. Scientific Co. 、カリフォルニア州デルマー所在）の垂直式ミニゲル装置（モデル番号ＭＧＶ−１００）で等電点（ＩＥＦ）ゲル電気泳動を行った。６％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドを含むＩＥＦゲル（７０×９０×１ｍｍ）を、以下のものを混合することにより作製した：１．６ｍｌの３０％（ｗ／ｖ）アクリルアミド／ビス（３７：５：１）と、０．８ｇのグリセロールと、０．３２ｍｌの両性電解質ｐＨ４−６（セルバ：Serva ）と、０．０８ｍｌの両性電解質ｐＨ４−９（セルバ）と、５．２ｍｌのＨ２Ｏと、１０μｌのＴＥＭＥＤと、８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＡＰＳ。陰極緩衝液は１００ｍＭのβ−アラニン、陽極緩衝液は１００ｍＭの酢酸とした。約１〜１０μｌの１％（ｗ／ｖ）グリシン中のタンパク質サンプルは等量のサンプル緩衝液［５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１．６％（ｖ／ｖ）の両性電解質ｐＨ４−９、２．４％（ｖ／ｖ）の両性電解質４−６］と混合した。サンプルはゲルの陰極端に供し、２００ボルトで１．５時間、４００ボルトで更に１．５時間、移動させた。タンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに対し以上で説明した手順を用い、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。ＩＥＦ用マーカー（シグマ）は、アミログルコシダーゼ、ｐＩ３．６；グルコースオキシダーゼ、ｐＩ４．２；トリプシン阻害因子、ｐＩ４．６；β−ラクトグロブリンＡ、ｐＩ５．１；炭酸脱水素酵素ＩＩ、ｐＩ５．４；炭酸脱水素酵素ＩＩ、ｐＩ５．９および炭酸脱水素酵素Ｉ、ｐＩ６．６とした。
【００８８】
（速度論的分析）
ジカンバＯ−デメチラーゼにより触媒される脱メチル化反応の速度論について、一定濃度の酵素の存在下、基質であるジカンバの濃度を増加させ、反応の初速度を分析することにより研究した。反応混合物は、２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と、１０ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．５ｍＭのＮＡＤＨと、０．５ｍＭのＦｅＳＯ４と、２５μｇの部分的に精製したＯ−デメチラーゼ酵素［清澄細胞溶解物由来の４０％−７０％（ｗ／ｖ）( ＮＨ４) ２ＳＯ４画分］と、様々な濃度（０．５〜５０μＭ）のジカンバと、様々な濃度（０．０２５〜２．５μＭ）の［１４Ｃ］ジカンバ（Ｕ−フェニル−１４Ｃ、４２．４ｍＣｉ／ｍｍｏ１）とを、総体積３００μｌ中に含んだものである。０．５μＭと１μＭのジカンバ濃度を用いて分析するために、反応体積を９００μｌまで増加させ、十分な量の放射性ジカンバとその代謝物とを存在させ検出可能なようにした。これらの反応では、反応内の他の全ての成分の量を３倍にした。各ジカンバ濃度について様々な時点で、ＴＬＣプレートに２４時間曝された蛍光スクリーン上の放射能を走査するためにＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）ＳＦを用い、［１４Ｃ］ジカンバの[ １４Ｃ] ３，６−ＤＣＳＡへの変換の定量を行った。活性の１単位を、３０℃において１分あたりに１ｎｍｏｌの３，６−ＤＣＳＡを形成する酵素量と規定した。各反応の初速度は、各基質濃度において反応速度対時間をプロットすることにより決定した。データはミカエリス−メンテンの速度論をモデルとし、Ｋｍ及びＶｍａｘの値は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）( ジャンデルサイエンティフィック(Jandel Scientific) 、カリフォルニア州コルトマデラ所在) を用いて、ラインウィーバー−バークのプロットにフィッティングさせることにより決定した。
【００８９】
（酸素の必要性）
クラーク型酸素電極を用いた予備実験により、基質にジカンバを用いた標準ジカンバＯ−デメチラーゼ分析中に酸素が消費されることが示唆された。ジカンバＯ−デメチラーゼによるジカンバのＯ−脱メチル化における酸素の必要性を証明するために、反応を１ｐｐｍ未満の酸素を含む嫌気性チャンバ内で行った。反応混合物から酸素を排除する手順は４℃で行った。酵素を含まない反応混合物をバイアル中に入れ、ゴム栓で密閉した。酸素を排除するために、バイアルを２度減圧により排気し、その都度窒素でフラッシングした。３度目の排気後、バイアルを９０％の窒素と１０％の水素を用いてフラッシングした。同様に、酵素溶液から酸素を除去した( 酵素溶液に気泡が入らないように注意して) 。反応混合物及び酵素溶液の両方を嫌気性チャンバ内（９５％のＮ２−５％のＨ２雰囲気）に移した。２４０μｌの清澄細胞溶解物を微量注射器を用いてゴム栓を通して注入し、９６０μｌの酸素を含まない反応混合物と静かに混合した。反応は３０℃で行った。
【００９０】
ＴＬＣプレート上の反応生成物を調べると、嫌気性条件下で［１４Ｃ］ジカンバから［１４Ｃ］３，６−ＤＣＳＡを生成する速度は、同量の酵素を用いた好気性条件下での反応速度を大きく下回った。嫌気性条件下では、１時間以内では、ジカンバから３，６−ＤＣＳＡへの変換は実質的には起こらなかった。しかしながら、同等の反応混合物を３０分後に嫌気性チャンバから取りだし空気とともにインキュベートすると、かなりの量の、Ｏ−デメチラーゼ酵素複合体の成分の１つはオキシゲナーゼであった。
【００９１】
［１４Ｃ］ジカンバから［１４Ｃ］３，６−ＤＣＳＡへの試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）変換は以前に報告された生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）変換経路（コーク及びクルーガー（Cork and Kreuger）、Adv. Appl. Microbiol. 、第３６巻、１−６６ページ( １９９１年) ；ヤン（Yang）ら、Anal. Biochem.、第２１９巻、３７−４２ページ( １９９４年) ）によく似ていることに注意すべきである。これらの研究では、ＴＬＣ及びキャピラリー電気泳動の両方によりＤＣＳＡが反応生成物であると同定された。生体内及び試験管内の両方でジカンバ分解の第１主生成物がＤＣＳＡであるという厳密な同定は、ガスクロマトグラフィー−質量分析により得られている。
【００９２】
（成分と補助因子の必要性）
フェニルセファロースカラムクロマトグラフィーによるジカンバＯ−デメチラーゼの３成分を最初に分離した後、部分的に精製した調製物を、個々にＱ−セファロースカラム（２．５×６ｃｍ）でさらに１回精製することにより得た。サンプルを、緩衝液Ａ中でＱ−セファロース（ファストフロー）高速タンパク質液体クロマトグラフィーカラム（ファルマシア）に供し、１００ｍｌの０〜０．６ＭのＫＣｌ直線勾配（オキシゲナーゼ成分用）、または０〜１．０ＭまでのＫＣｌ（フェレドキシン及びレダクターゼ成分用）を用いて、１．５ｍｌの画分として溶離した。オキシゲナーゼ精製用の分離カラムから適切にプールした画分( 画分２９から３７まで) 、フェレドキシン精製からの画分( 画分３０から３７まで) 、またはレダクターゼ精製からの画分（画分２６から３８まで）を使用して、成分及び補助因子の必要性の決定を行った。
【００９３】
３成分を、成分の必要性を決定するために様々な組み合わせでＯ−デメチラーゼ活性分析を実施した。
補助因子の必要性を決定するために、３成分と［１４Ｃ］ジカンバとの混合物を用いて、３０℃で３０分間、Ｏ−デメチラーゼ活性の分析を行った。反応混合物中の、（最適比率の）部分的に精製されたタンパク質の量は、８５μｇのオキシゲナーゼと、５５μｇのフェレドキシンと、５０μｇのレダクターゼであった。反応混合物中で使用した補助因子の濃度は０．５ｍＭのＮＡＤＨと、０．２ｍＭのＦＡＤと、０．５ｍＭのＦｅＳＯ４と、１０ｍＭのＭｇＣｌ２と、０．５ｍＭのＮＡＤＰＨと、０．２ｍＭのＦＭＮであった。
（結果）
（成分Ｉ）
フェニルセファロースカラムに最も強く結合したジカンバＯ−デメチラーゼの成分（最初成分Ｉと称し、後にオキシゲナーゼであることが同定された）は際立った赤茶色を示した。これにより、鉄−硫黄クラスターまたはヘム基を含むタンパク質の存在の可能性が示唆された。フェニルセファロースカラムからの成分Ｉ活性を有する画分について、Ｑ−セファロース（ファストフロー）及びＭｏｎｏＱクロマトグラフィーにより更に精製し、次いでＳｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２サイズ排除カラムに供した。その後ＩＥＦゲル上で成分Ｉタンパク質を更に精製した。
【００９４】
ＩＥＦゲル上の主要バンドのタンパク質（見かけのｐＩが約４．６である）を切り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより残りの微量不純物から分離した。ＩＥＦにより精製した後に得られた主成分Ｉタンパク質の純度は、クマシーブルーで染色した上記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの濃度分析から判断すると、９０％を超えた。
【００９５】
見かけの分子量が約４０，０００ダルトンの主要タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。アミノ酸配列決定の結果から、Ｎ−末端領域の最初の２９アミノ酸が以下の配列で存在していることが示唆された( 括弧内の残基が最も良い推測である) ：
Thr Phe Val Arg Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Leu Pro Glu Glu Leu Ser Glu Lys Pro
Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp （Asp またはThr ）（Pro ）  「配列番号１」
様々なデータベース中のアミノ酸配列と比較すると、他のモノオキシゲナーゼまたはジオキシゲナーゼについて報告されているＮＨ２−末端配列とほとんどまたは全く相同性がないことが示唆された。
【００９６】
（成分ＩＩ）
フェニルセファロースカラムに結合しなかったタンパク質画分を成分ＩＩと称した。この黄色がかった画分は、分析を成分Ｉと成分ＩＩＩとの組合せで実行した場合に、クロストリジウム・パストリアヌム（Clostridium pasteurianum）由来のフェレドキシンと置換することができた（しかし、反応速度は遅くなる）ので、仮にフェレドキシン−含有画分と称した。クロストリジウムのフェレドキシンは明らかに成分ＩＩの代わりに機能したが、これらの実験で使用した成分ＩＩの不純性が高いとすると、クロストリジウムの酵素の効率は、ＤＩ−６株由来の推定フェレドキシンの効率よりもかなり低いものであった。具体的には、５５μｇの部分的に精製した成分ＩＩを過剰量の成分Ｉ及び成分ＩＩＩと混合したものは、ジカンバの３，６−ＤＣＳＡへの変換を約５ｎｍｏｌ／分・ｍｇの速度で触媒したのに対し、１００μｇのクロストリジウム由来の高度に精製されたフェレドキシンではわずか０．６ｎｍｏｌ／分・ｍｇの活性にすぎなかった。
【００９７】
Ｑ−セファロース（ファストフロー）クロマトグラフィー、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２ゲル濾過及びＭｏｎｏＱ（登録商標）クロマトグラフィーを含む精製工程により、最初の２５ｇの細胞ペーストから約１ｍｇの精製タンパク質が得られた。この画分をオキシゲナーゼ成分と同様の方法でＩＥＦゲルで電気泳動を行い、その後活性ＩＥＦ画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することにより精製した。
【００９８】
ＩＥＦゲルの切片から溶離したタンパク質中の成分ＩＩの活性の分析により、約３．０のｐＩを有する画分が成分ＩＩ中の活性タンパク質を含んでいることが示唆された。このゲル薄片からのタンパク質を溶離しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをクマシーブルーで染色すると、低分子量のスメアな（しみ状の）タンパク質とともに１つの顕著なタンパク質のバンド（分子量約２８，０００ダルトン）が現れた。
【００９９】
（成分ＩＩＩ）
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩＩは高濃度の（ＮＨ４）２ＳＯ４中のフェニルセファロースカラム上に保持され、約４％（ｗ／ｖ）の（ＮＨ４）２ＳＯ４で溶離された。この明るい黄色の画分は、酸化チトクロームｃ及びＤＣＩＰをＮＡＤＨの存在下で還元する能力から、及び成分Ｉと成分ＩＩを用いた分析でブタの心臓からのチトクロームｃレダクターゼ（タイプＩ、シグマ）により置換することができるため、レダクターゼ含有画分であると仮に同定された。これらの反応では、５０μｇの部分的に精製した成分ＩＩＩを使用し、過剰の成分Ｉ及びＩＩと混合すると、約５ｎｍｏｌ／分・ｍｇの反応速度が得られた。高度に精製されたチトクロームｃレダクターゼは反応において約２．５ｎｍｏｌ／分・ｍｇの比活性を示したが、この活性は、これらの分析で使用した粗成分ＩＩＩの不純性を考えると、成分ＩＩＩにより得られる活性よりもかなり低いものであった。さらに、成分ＩＩＩは、ＮＡＤＨの存在下、チトクロームｃまたは２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール（ＤＣＰＩＰ）と共にインキュベートするとレダクターゼ活性を示した。成分Ｉ及び成分ＩＩのどちらも、これら２つのレダクターゼ分析のいずれにおいても活性を示さなかった。
【０１００】
Ｑ−セファロース( ファストフロー) 、青色色素親和性マトリクス、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ（登録商標）１２、及びＭｏｎｏＱ（登録商標）充填材を含むカラムでのクロマトグラフィーにより、この画分をさらに精製すると、レダクターゼ活性を有する画分中の少量のタンパク質が得られた。成分ＩＩＩタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離及びクマシーブルーによる染色の後の活性タンパク質画分の濃度分析により判断すると、約７０％であった。
【０１０１】
さらに成分ＩＩＩの精製を厳しくするために、ＭｏｎｏＱ（登録商標）カラムの工程由来の２つの異なるタンパク質画分は、フェレドキシン成分とオキシゲナーゼ成分とを用いて分析すると、レダクターゼ活性を含むことを見出した。ＩＥＦゲルでの電気泳動によりこれらの２つの画分をさらに精製すると、この２つの画分のレダクターゼ活性は明確に異なる等電点を有することが明らかになった。このことは、２つのレダクターゼ画分のそれぞれを含むレーンをＩＥＦゲルから切り出し、この薄片をＤＣＩＰ反応混合物を含む低融点アガロースのパッド上に置くことにより証明した。どちらのゲル薄片におけるレダクターゼ活性も、ＤＣＩＰのその無色の還元型へのＮＡＤＨ−依存的な還元により同定した。画分３５中のレダクターゼの見かけのｐＩは約５．６であったが、画分２７のレダクターゼの見かけのｐＩは約４．８であった。
【０１０２】
ＩＥＦゲル薄片から単離したレダクターゼ活性はどちらも不安定で、その量は少なかった。実際、ＭｏｎｏＱカラムの分画による画分３５由来のレダクターゼのみが、更に精製及び特性分析を可能にするのに十分なタンパク質濃度と活性とを有していた。このレダクターゼ活性を含むＩＥＦゲル由来の薄片を溶離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより不純タンパク質から分離した。このゲル中の優先タンパク質は分子量が約４５，０００ダルトンのタンパク質であった。サイズ排除クロマトグラフィーにより、成分ＩＩＩの分子量は、自然状態で約５０，０００ダルトンであることが示唆された。
【０１０３】
（ジカンバＯ−デメチラーゼの生物化学的特性）
ジカンバＯ−デメチラーゼ活性を、温度が２０℃から５０℃、ｐＨ値が約６から９の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのインキュベーションの際に測定した。活性のピークは３０℃で鋭く、ｐＨ６．５から７．５では幅広いものとなった。酵素活性は用いたｐＨ緩衝液のタイプに依存した。ｐＨ７では、例えば、活性はリン酸含有緩衝液の場合に比べトリス含有緩衝液の場合の方が約４０％低かった。
【０１０４】
ジカンバＯ−デメチラーゼについてのＫｍ及びＶｍａｘの値は、２度の実験のデータのミカエリス−メンテン及びラインウィーバー−バークプロットから最もフィッティングの良い曲線を生成するようにＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）を用いて評価した。ジカンバのＫｍは約９．９±３．９μＭ、反応のＶｍａｘは約１０８±１２ｎｍｏｌ／分／ｍｇであると判断した。
【０１０５】
３成分について、様々な組合せでジカンバＯ−デメチラーゼ活性の分析を行った。どの成分も単独で分析すると酵素活性を示さなかった。実際、３成分全てを組み合わせた場合にのみ、有意の量のＯ−デメチラーゼ活性を検出することができた。成分Ｉと成分ＩＩの混合物は少量の触媒活性を示した。おそらく、微量の成分ＩＩＩが成分Ｉ画分に混入していたためであろう。
【０１０６】
ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨはいずれも酵素活性を補助し、ＮＡＤＨはＮＡＤＰＨよりも著しく効果的であった。酵素活性にはＭｇ２＋が必要であった。Ｆｅ２＋、フラビンアデニンジヌクレオチド( ＦＡＤ) 、及びフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）は、これらの実験における部分的に精製したタンパク質調製物を用いた酵素活性をほとんどあるいは全く促進しなかった。最も高い活性は、ＮＡＤＨ、Ｆｅ２＋、Ｍｇ２＋及びＦＡＤの組み合わせを用いた場合に得られた。
（考察）
シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ−６株由来のジカンバＯ−デメチラーゼは、除草剤であるジカンバ（２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸）を３，６−ジクロロサリチル酸（３，６−ＤＣＳＡ：２−ヒドロキシ−３，６−ジクロロ安息香酸）へ変換する能力を持つ、３成分のオキシゲナーゼである（ワン、エックス‐ゼット(Wang, X-Z) 、１９９６年、学位論文、ネブラスカ大学リンカーン校、ネブラスカ州リンカーン所在）。３成分のそれぞれを均一状態または均一に近い状態で単離することができる精製スキームを発明した。
【０１０７】
３成分の最初の分離はフェニルセファロースカラムでのクロマトグラフィーにより達成した。部分的に精製した成分の酵素活性及びその他の特性により、それらの成分がレダクターゼ、フェレドキシン及びオキシゲナーゼとして仮に同定することができた。すなわち、多くの他の以前に研究されたヘム含有及びノンヘム含有多成分オキシゲナーゼに見出されたのと同様の組成である（エフ．ミュラー（F. Mueller）編集、「フラボ酵素の化学と生化学（Chemistry and biochemistry of flavoenzymes）」、第ＩＩＩ巻、ボカラトン所在のＣＲＣプレス、に記載のバチー（Batie ）ら、１９９２年、５４３−５６５ページ；ハラヤマ（Harayama）ら、１９９２年、Annu. Rev. Microbiol. 、第４６巻、５６５−６０１ページ；メイソンとカマック（Mason and Cammack ）、１９９２年、A nnu. Rev. Microbiol. 、第４６巻、２７７−３０５ページ；ロシュ（Rosche）ら、１９９５年、Biochem. Biophys. Acta、第１２５２巻、１７７−１７９ページ）。フェニルセファロースカラムから単離した成分ＩＩＩはチトクロームｃと染料ＤＣＩＰの両方のＮＡＤＨ依存的還元を触媒した。さらに、成分Ｉ及び成分ＩＩと組み合わせるとジカンバの３，６−ＤＣＳＡへの変換を助けることができる能力は、チトクロームｃレダクターゼにより部分的に置換可能であった。成分ＩＩは、成分Ｉと成分ＩＩＩを含む反応に対し、クロストリジウム・パストリアヌム由来のフェレドキシンを添加することにより置換可能であった。Ｏ−脱メチル反応を補助するには分子状酸素が絶対に必要であることから、残りの成分はオキシゲナーゼであることが示唆された。
【０１０８】
（オキシゲナーゼＤＩＣ）
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分Ｉ（オキシゲナーゼＤＩＣと称す）を精製して均一とし、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行った。得られた２９のアミノ酸残基の配列では、様々なデータバンク中の他のタンパク質の配列との有意な相同性は見られなかった。しかしながら、このアミノ酸配列から得られた情報により、縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計が可能となり、このプローブは成分Ｉの遺伝子を検出しクローニングするのに使用することができた( 実施例２参照) 。さらに、このクローンのヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列を、データベース中のタンパク質配列のアミノ酸配列と比較すると、他のオキシゲナーゼに対する強い相同性が見られた( 実施例２参照) 。
【０１０９】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中の移動度から評価したオキシゲナーゼＤＩＣの見かけの分子量は約４０，０００ダルトンである。オキシゲナーゼの精製調製物はクマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で唯一の主バンドを示し、そのバンドに含まれるタンパク質のエドマン分解により唯一のＮ末端種の存在が示唆された。サイズ排除カラム上での天然のオキシゲナーゼＤＩＣの挙動から導かれる評価により、分子サイズは約９０，０００ダルトンであることが示唆される。これらの結果から、天然のオキシゲナーゼはホモダイマーとして存在することが示唆される。
【０１１０】
多くの多成分系のオキシゲナーゼ／ヒドロキシラーゼ成分は（αβ）ｎ型サブユニット構成から成り、このサブユニット構成では、大きなαサブユニットのサイズは約５０，０００ダルトン、小さなβサブユニットの分子量は約２０，０００ダルトンであった( ハラヤマ（Harayama）ら、１９９２年、Annu. Rev. Microbiol. 、第４６巻、５６５−６０１ページ) 。これとは対照的に、ジカンバＯ−デメチラーゼのオキシゲナーゼ成分は分子量が約４０ｋＤａの単一サブユニットを有し、これが自然状態ではダイマーとして存在すると考えられる。この（α）ｎ型サブユニット構成は、他の良く特性分析の行われているオキシゲナーゼ、例えば、シュードモナス属菌群のＣＢＳ株由来の４−クロロフェニルアセテート３，４−ジオキシゲナーゼ( マーカス（Markus）ら、１９８６年、J. Biol. Chem.、第２６１巻、１２８８３−１２８８８ページ) 、シュードモナス・セパシア由来のフタレートジオキシゲナーゼ( バチー（Batie ）ら、１９８７年、J. Biol. Chem.、第２６２巻、１５１０‐１５１８ページ) 、コマモナス・テストステロニ由来の４‐スルホベンゾエート３，４‐ジオキシゲナーゼ（ロッチャー（Locher）ら、１９９１年、Biochem. J. 、第２７４巻、８３３−８４２ページ）、シュードモナス・プチダ８６由来の２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン８−モノオキシゲナーゼ( ロシュ（Roche ）ら、１９９５年、Biochem. Biophys. Acta、第１２５２巻、１７７−１７９ページ) 、シュードモナス・シュードアルカリゲネス由来の４−カルボキシジフェニルエーテルジオキシゲナーゼ( デーメル（Dehmel）ら、１９９５年、Arch. Microbiol.、第１６３巻、３５−４１ページ) 、及びシュードモナス・プチダ由来の３−クロロ安息香酸３，４−ジオキシゲナーゼ( ナカツ（Nakatsu ）ら、１９９５年、Microbiology（読物）、第１４１巻、４８５−４９５ページ) 、において見出されたオキシゲナーゼと同様である。
【０１１１】
（フェレドキシンＤＩＣ）
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩ（フェレドキシンＤＩＣ）を、カラムクロマトグラフィとＩＥＦの複数の工程により精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる最終精製により、１つの主要なタンパク質のバンド（Ｍｒは約２８，０００）とそれよりもわずかに小さなタンパク質のスメアが生じた。
【０１１２】
見かけの分子量が約２８，０００ダルトンのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列を決定した。このアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプローブの調製が可能となり、これらのプローブをこのタンパク質をコードするゲノムクローンの単離に使用した。このクローンから生じるタンパク質はフェレドキシン（フェレドキシン２８ｋＤａ）であったが、その後、ジカンバＯ−デメチラーゼの他の２つの成分と組み合わせたときにジカンバの分解において活性がないことが確認された（データは示さない）。
【０１１３】
その他の証拠はフェレドキシン２８ｋＤａがジカンバＯ−デメチラーゼのフェレドキシン成分ではないという考察を支持している。第１に、このタンパク質の分子量（２８ｋＤａ）は細菌由来の多成分オキシゲナーゼにみられる他のフェレドキシンの分子量（すなわち８‐１３ｋＤａ）（エフ．ミュラー（F. Mueller）編集、「フラボ酵素の化学と生化学（Chemistry and biochemistry of flavoenzymes）」、第ＩＩＩ巻、ボカラトン所在のＣＲＣプレス、に記載のバチー（Batie ）ら、１９９２年、５４３−５６５ページ；ハラヤマ（Harayama）ら、１９９２年、Annu. Rev. Microbiol. 、第４６巻、５６５−６０１ページ）よりも著しく大きい。
【０１１４】
第２に、フェレドキシン２８ｋＤａから得た２０アミノ酸残基のＮ末端配列を、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）ソフトウェアパッケージ（ウィスコンシン州マディソン所在のウィスコンシン大学）を用いて種々のタンパク質データバンクの他のアミノ酸配列と比較することにより、多くの細菌のダイクラスター型フェレドキシン（シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・プチダ、ロドバクター・カプスラタスおよびアゾトバクター・ビネランジ（Azotobacter vinelandii））に対する強い相同性（ほとんどフェレドキシン２８ｋＤａのＮ末端配列に対して８０〜８５％同一）が明らかとなった。フェレドキシン２８ｋＤａに対し強い相同性を示す上記４つのダイクラスター型フェレドキシンは、タンパク質のＮ末端で、［３Ｆｅ−４Ｓ］クラスター及びこれに続く［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスターを有する。このことから、フェレドキシン２８ｋＤａは、通常は非ヘムの多成分オキシゲナーゼと関連する［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスターを有するフェレドキシン成分とは明確に異なることが示唆される( ハラヤマ（Harayama）ら、１９９２年、Annu. Rev. Microbiol. 、第４６巻、５６５−６０１ページ；メイソンとカマック（Mason and Cammack ）、１９９２年、Annu. Rev. Microbiol. 、第４６巻、２７７−３０５ページ；ロシュ（Rosche）ら、１９９５年、Biochem. Biophys. Acta、第１２５２巻、１７７−１７９ページ) 。
【０１１５】
（レダクターゼＤＩＣ）
ジカンバＯ−デメチラーゼの成分ＩＩＩ（レダクターゼＤＩＣと称す）は、３成分中最も精製が困難な成分であった。これは一部には、ＤＩ−６株の溶解物中におけるこの成分の見かけの不安定さと量が少ないこととによる。にもかかわらず、十分なタンパク質が精製され、その分子量は４５，０００と仮定された。これはサイズ排除クロマトグラフィーから得られた約５０，０００ダルトンの分子量に近く、レダクターゼＤＩＣが自然状態ではモノマーとして存在することが示唆される。レダクターゼ成分の精製は、ＭｏｎｏＱカラムでのクロマトグラフィー及びＩＥＦにより精製レダクターゼ調製物が明らかに異なるｐＩ値を有する２つの活性に分割されるという事実により、さらに複雑となった。ＭｏｎｏＱカラム由来の画分はいずれも精製フェレドキシンＤＩＣ及びオキシゲナーゼＤＩＣとの組み合わせにおいて機能し、ジカンバＯ−デメチラーゼ活性を生じた。スフィンゴモナス属細菌ＲＷ１株に、３成分ジベンゾフラン４，４ａ−ジオキシゲナーゼ中でレダクターゼ成分として同等によく機能する２つの類似のフラボタンパク質が存在するということが、最近ブンツ及びクックにより報告されている( ブンツ及びクック（Buenz and Cook）、１９９３年、J. Bacteriol. 、第１７５巻、６４６７−６４７５ページ) 。興味深いことに、どちらのレダクターゼもその分子量は４４，０００ダルトンであり、４５，０００ダルトンのレダクターゼＤＩＣの分子量と非常に良く類似している。レグヘモグロビンレダクターゼの複数の成分もまた、等電点電気泳動技術を用いてルピナスの根の根粒において観察されている( トプノブ（Topunov ）ら、１９８２年、Biokhimiya (英語版) 、第１６２巻、３７８−３７９ページ) 。この場合、ＩＥＦにより、ＮＡＤＨ−依存的レダクターゼ活性を有する４つの別個の成分が明らかになった。ＤＩ−６株に２つの型で存在する単一のレダクターゼＤＩＣが存在するのか、それとも２つの別個のレダクターゼが存在するのかという疑問の答えは、より大量のタンパク質を単離するための改良方法の開発及び／または関係する遺伝子のクローニングと配列決定とにかかっている（実施例３および５を参照のこと）。
【０１１６】
（ジカンバＯ−デメチラーゼの特性）
以上で述べた個々の成分の物理的及び生化学的性質の他に、酵素活性の分析により、Ｏ−デメチラーゼ系がその基質に対し強い親和性を有し( Ｋｍ＝約１０μＭ) 、Ｖｍａｘは約１００〜１１０ｎｍｏｌ／分／ｍｇであることが示された。温帯気候帯で収集した土壌細菌について予測されるように、最大酵素活性は３０℃付近の温度で観察された。酵素系の最適ｐＨはｐＨ６．５からｐＨ７．５までの範囲にあったが、ある酵素調製物を用いて測定した活性は使用したｐＨ緩衝系のタイプに強く影響された。トリス緩衝液の存在下での活性は、同じｐＨでリン酸緩衝液を用いた場合に比べ少なくとも４０％低かった。
【０１１７】
ジカンバＯ−デメチラーゼの３成分により触媒される反応の反応スキームを図１に示す。ＮＡＤＨからの電子は、レダクターゼとフェレドキシンからなる短い電子連鎖を介して、ジカンバの酸化を触媒する末端のオキシゲナーゼのところまで往復する。ジカンバＯ−デメチラーゼと幾つかの多成分ジオキシゲナーゼとの間の類似性から、ジカンバＯ−デメチラーゼが、隠れたジオキシゲナーゼ活性を有する可能性が示唆される。しかしながら、この酵素が、Ｏ２を分割し、酸素の一方の原子を主要基質内に組み込み、他方をα−ケトグルタル酸塩などの小さな有機物の基質に組み込むジオキシゲナーゼのクラスのものではないことは、明らかである( フクモリ及びハウシンガー（Fukumori and Hausinger）、１９９３年、J. Biol. Chem.、第２６８巻、２４３１１−２４３１７ページ) 。実際、高度に精製されたレダクターゼＤＩＣ、フェレドキシンＤＩＣ及びオキシゲナーゼＤＩＣの組合せが活性を示すのに必要とするのはＯ２、ＮＡＤＨ、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋及びジカンバのみである。
【実施例２】
【０１１８】
（シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼのオキシゲナーゼをコードするクローンの同定と配列決定）
実施例１で述べたように、オキシゲナーゼＤＩＣのＮ末端アミノ酸配列の最初の２９アミノ酸は以下のように決定された( 括弧（）内の残基は最も良い推測である) ：
Thr Phe Val Arg ［Asn Ala Trp Tyr Val Ala ］Ala Leu Pro Glu Glu Leu Ser Glu Lys
Pro Leu Gly Arg Thr Ile Leu Asp （Asp またはThr ）（Pro ）  「配列番号１」
この配列により、カリフォルニア州アラメダ所在のオペロン社（Operon）により合成された縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計が可能となった。具体的には、それぞれが長さ１７ヌクレオチドで、上記で［］で囲んで強調したアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列の全てを含む３２プローブの混合物を使用した。該オリゴヌクレオチドプローブを、インディアナ州インディアナポリス所在のベーリンガーマンハイム (Boehringer Mannheim)により提供された説明書に従ってジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いて３' 末端を標識した。
【０１１９】
様々な組合せの制限酵素で切断し、１％のアガロースゲル上で分離し、ナイロンフィルタにブロットしたシュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のゲノムＤＮＡに、ＤＩＧ標識プローブをまずハイブリッド形成させた。これらの結果を基に、大きさで分画したゲノムライブラリーをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＫＳ＋ベクター内に構築し、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換した。ゲノムライブラリーには１〜２ｋｂのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含めた。ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブは、ナイロンフィルタ上に画線状に塗り広げられた細菌のコロニー列とハイブリッド形成させた。プラスミドＤＮＡを陽性コロニーから単離しサブクローニングした。各サブクローンの両方の鎖について、配列決定を、ネブラスカ大学リンカーン校（University of Nebraska-Lincoln）のＤＮＡ配列決定設備を用いて実施した。ＤＩＧ標識プローブのハイブッド形成及び検出は、べーリンガーマンハイムが提示したプロトコルに従って行った。
【０１２０】
オキシゲナーゼＤＩＣをコードするゲノムＤＮＡクローンを同定した。ヌクレオチド配列及び導き出した全オキシゲナーゼＤＩＣのアミノ酸配列を、配列表にそれぞれ配列番号２及び配列番号３として示す。
【０１２１】
このクローンのヌクレオチド配列から導き出したアミノ酸配列と、スイスタンパク質データベース（Swiss Protein Database）のタンパク質配列のアミノ酸配列との比較から、他のオキシゲナーゼに対する相同性が見られた。相同性はＧＣＧソフトウェアパッケージのＦＡＳＴＡプログラムを用いて決定した。最も強い相同性はバニレートデメチラーゼ（シュードモナス属細菌のＡＴＣＣ株１９１５１由来）のオキシゲナーゼ成分との間にあり、３３．８％の同一性を示した。
【実施例３】
【０１２２】
（シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６のジカンバＯ−デメチラーゼの他の成分の精製と特性分析）
（細菌の培養と清澄細胞溶解物の調製）
シュードモナス・マルトフィリアＤＩ−６株を、グルコース（２．０ｍｇ／ｍｌ）とカザミノ酸（２．０ｍｇ／ｍｌ）とを炭素源として加えた１リットルの還元塩化物培地（クルーガー、ジェイ．ピー. （Kreuger, J. P.）、１９８９年、学位論文、イリノイ州シカゴ所在のイリノイ技術研究所）の入った６つの２リットル容三角フラスコに接種した。培養物を回転式振とう機でインキュベートした（３０℃で２２５ｒｐｍ）。Ａ６００が１．５〜２．０の範囲のときにＪＬＡ‐１０．５００ローターを用いてベックマン（Be ckman ）のＡｖａｎｔｉ（登録商標）Ｊ‐２５Ｉ遠心分離機で４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、細胞をハーベストした。ペレット化した細胞を−８０℃で保存した。凍結された細胞を４０ｍｌの１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２に再懸濁し、上記と同じ条件を用いて再度ペレット化し、次いで細胞の湿重量１グラムあたり２ｍｌの破壊用緩衝液（１００ｍＭ  ３‐［Ｎ‐モルフォリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）（ｐＨ７．２）、１ｍＭジチオスレイトール、５％グリセロール）の比率で破壊用緩衝液に再懸濁した。リゾチームを細胞１グラムあたり８０μｌの割合で添加し、同時に細菌抽出物用プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ、Ｐ８４６５）を細胞の湿重量２０グラムあたり５ｍｌの割合で添加した。最後に、フェニルメチルスルホニルフルオリド（１００％エタノールに溶解した０．１Ｍ保存溶液）を破壊用緩衝液５０ｍｌあたり２５０μｌの割合で添加した。超音波処理器（ソニックスアンドマテリアルズ社（Sonics and Materials Inc. ）、モデルＶＣＸ６００）を用いて、９．０秒間破砕し３．０秒間休止しながら３０分間、５０％の振幅で細胞を破砕した。溶解した細胞をベックマン（Beckman ）のＡｖａｎｔｉ（登録商標）Ｊ‐２５Ｉ遠心分離機のＪＡ‐２５．５０ローターで４℃、５６，０００×ｇで７５分間遠心分離した。上清（清澄細胞溶解物）を、容器を傾けることにより回収し、終濃度１５％となるようにグリセロールを添加してから−８０℃で保存した。
【０１２３】
（ジカンバＯ−デメチラーゼ成分の最初の精製）
約２．７グラムのタンパク質を含む清澄細胞溶解物のアリコットを、２５ｍｌのＤＥＡＥセファロースファストフローを含み、５０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１ｍＭジチオスレイトール、および１５％（ｖ／ｖ）グリセロールの緩衝液Ａで平衡化したファルマシア（Pharmacia ）のＸＫ２６／６０カラムに供した。このカラムをＢｉｏＣＡＤ（登録商標）パーフュージョンクロマトグラフィワークステーション（ＵＳＤＡ  ＮＲＩＣＧＰ助成番号９５０４２６６）に接続し、流速５．０ｍｌ／分で実施した。カラムに試料を供した後、２８０ｎｍにおける吸光度の読み取り値が０．１より下に低下するまで緩衝液Ａで洗浄した。ジカンバＯ−デメチラーゼ３つの成分全てがこれらの条件下でＤＥＡＥカラムに結合した。該カラムを緩衝液Ａ中の０〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配を用いて展開した。その結果フェレドキシンは４００ｍＭのＮａＣｌで溶出し、レダクターゼ成分とオキシゲナーゼ成分は２５０ｍＭのＮａＣｌで共に溶出した。
【０１２４】
（フェレドキシンＤＩＣの精製）
ＤＥＡＥセファロースカラムから溶出したフェレドキシンＤＩＣを含む画分をプールし、緩衝液を交換して５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、５％グリセロール（ｖ／ｖ）および２００ｍＭ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｂ）とした。次いでこの画分をＹＭ１０膜を備えたアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）のセル濃縮器（Cell Concentrator ）とＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）１０濃縮器とを用いて約２ｍｌまで濃縮した。このサンプルを次に緩衝液Ｂで平衡化したファルマシア（Pharmacia ）のＨｉＰｒｅｐ（登録商標）２６／６０セファクリルＳ−１００プレパックカラムに供し、ファルマシアのＦＰＬＣ装置で流速０．５ｍｌ／分で実施した。活性を示した画分をプールし、緩衝液を交換して５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．２）、１ｍＭジチオスレイトールおよび５％グリセロール（ｖ／ｖ）（緩衝液Ｃ）とした。該画分を濃縮して２ｍｌとし、次いで緩衝液Ｃで平衡化したファルマシアのＭｏｎｏＱ（登録商標）ＨＲ５／５カラムに供した。同カラムを緩衝液Ｃ中の０〜２．０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で展開した。フェレドキシン活性を含む画分をタンパク質含量について分析し、−８０℃で保存した。
【０１２５】
（レダクターゼＤＩＣの精製）
最初のＤＥＡＥセファロースカラム由来のオキシゲナーゼ／レダクターゼ成分を含む画分をプールし、硫酸アンモニウムを添加して終濃度１．５Ｍとした。４℃で１．５時間インキュベートした後、サンプルをベックマン（Beckman ）のＡｖａｎｔｉ（登録商標）Ｊ‐２５Ｉ遠心分離機のＪＡ‐２５．５０ローターで４℃、５６，０００×ｇで７５分間遠心分離した。上清を、１．５Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む緩衝液Ａで平衡化した２５ｍｌのフェニルセファロース６ファストフロー（high sub）を含むファルマシア（Pharmacia ）のＸＫ２６／２０カラムに流速５．０ｍｌ／分で供した。レダクターゼ成分を含む画分をプールし、緩衝液を交換して緩衝液Ｂとし、ＹＭ３０膜を備えたアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）の濃縮器とＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）１０濃縮器とを用いて約２ｍｌまで濃縮した。この２ｍｌのサンプルを緩衝液Ｂで平衡化したファルマシア（Pharmacia ）のＨｉＰｒｅｐ（登録商標）２６／６０セファクリルＳ−１００プレパックカラムに供し、流速０．５ｍｌ／分で実施した。レダクターゼ活性を含む画分をプールし、緩衝液を交換して緩衝液Ｃとし、約２ｍｌまで濃縮した。この２ｍｌのサンプルを緩衝液Ｃで平衡化したファルマシアのＭｏｎｏＱ（登録商標）ＨＲ５／５プレパックカラムに供した。同カラムを緩衝液Ｃ中の０〜２．０Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で流速０．５ｍｌ／分で展開した。レダクターゼ活性を示した画分をタンパク質含量について分析し、−８０℃で保存した。
【０１２６】
（迅速酵素分析）
３つの個別成分の各々の活性を、他の２つの成分を過剰に含む反応物中に１４Ｃ標識したジカンバを用いた反応においてモニターした。各反応について、２４ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｉ）緩衝液（ｐＨ７．０）、０．４８ｍＭのＮＡＤＨ、０．４８ｍＭのＦｅＳＯ４および９．６ｍＭのＭｇＣｌ２で構成される緩衝液を、３０μｌのマスターミックス（５６２．４μｌ滅菌水、１２．０μｌの５０ｍＭジカンバおよび２５．６μｌの１４Ｃジカンバ保存溶液［１．２８μＣｉ］）とともに２００μｌのタンパク質サンプルに添加して総容量３１１μｌで１４Ｃジカンバ比活性を４．１２μＣｉ／ｍｌとした。６０分後、５０μｌの５％Ｈ２ＳＯ４（ｖ／ｖ）と５００μｌのエーテルとを添加することにより各反応を停止させた。反応用チューブを渦流撹拌し、微量遠心機（エッペンドルフ（Eppendorf ）、モデル５４１５Ｃ）で１４，０００×ｇで２分間遠心分離した。酵素活性を迅速に視覚的に評価するため、各反応チューブを携帯用ＵＶライト（フォトダイン社（Fotodyne Inc. ）、モデル３‐６０００）の下に置いて反応産物であるＤＣＳＡの蛍光を検出した。酵素活性をより正確に準定量的に測定するためには、反応産物を実施例１に記載したように薄層クロマトグラフィを用いて分離した。
【０１２７】
（タンパク質濃度の測定）
精製プロトコルの種々の段階で得られた画分を、ブラッドフォード法（標準プロトコル；バイオラッド（Bio-Rad ）；実施例１を参照のこと）を用いてタンパク質濃度について分析した。
【実施例４】
【０１２８】
（フェレドキシンＤＩＣをコードするクローンの同定と配列決定）
精製されたフェレドキシンタンパク質（実施例３に記載の精製）から得られたＮ末端配列は長さ２９アミノ酸であった（タンパク質の配列決定はネブラスカ大学リンカーン校のタンパク質中心設備により標準的なエドマン分解法を用いて実施した；実施例１を参照のこと）。この配列をＧｅｎｂａｎｋのデータベースを比較したところ、アドレノドキシンファミリーの細菌の［２Ｆｅ‐２Ｓ］フェレドキシンである、シュードモナス属細菌由来のテルプレドキシン（terpredoxin ）に対して２６アミノ酸の重複部分において３５％同一であることが示された。この配列情報を用いて３つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した（２つはフォワードで１つがリバース）。２つの１７ｍｅｒのフォワードプライマーの配列は精製されたフェレドキシンタンパク質から得られたＮ末端配列に基づくものとした。１７ｍｅｒのリバースプライマーは以前に配列決定されている６つの細菌のアドレノドキシン型フェレドキシンのＣ末端に近い６アミノ酸の保存配列に基づくものとした。これらのプライマーをネスティド（nested）ＰＣＲ反応に使用し、シュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡから１９１ｂｐの産物を増幅した。産物をｐＧＥＴ（登録商標）‐Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ（Pro mega ）、ウィスコンシン州マディソン所在）にクローニングして配列を決定した。ＤＮＡの配列決定はネブラスカ大学リンカーン校のＤＮＡ配列決定中心設備により標準的なジデオキシ介在鎖終結法を用いて実施した。このクローンの予測されるアミノ酸配列の分析から、精製されたフェレドキシンタンパク質から以前得られたＮ末端および内部のアミノ酸配列に一致することが確認された。さらに、導き出されたアミノ酸配列は、その全長にわたりロドバクター・カプスラタス由来の［２Ｆｅ‐２Ｓ］フェレドキシンと４８％同一であった。クローニングされた断片を、標準的なＰＣＲプロトコル（ＤＩＧ／Ｇｅｎｉｕｓ（登録商標）システム使用説明書）ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）（ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics ））で標識し、多数の制限酵素で切断済みのシュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡにサザンブロット法によりハイブリッド形成させた。該遺伝子の周囲の制限酵素地図を、プローブとハイブリッド形成した制限酵素切断断片の大きさに基づいて作成した。この最初の実験から、該遺伝子が長さ約１ｋｂのＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ断片に含まれることが示された。その後、シュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡをＸｈｏＩおよびＰｓｔＩで切断し、該制限酵素切断断片をゲルで分離した。長さ０．５〜１．５ｋｂの断片をゲルから切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＫＳ＋ベクター（ストラタジーン社（Stratagene Inc. ））に連結し、ＤＨ５α細胞（ギブコ（Gibco1）ＢＲＬ社）を形質転換した。大きさで分画したライブラリーを含む細菌のコロニーをＤＩＧ標識したプローブでスクリーニングし、９００ｂｐのＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ断片を同定した。配列の分析から、このクローンが１０５アミノ酸残基から構成される１１．４ｋＤａのタンパク質［配列番号５］をコードする全長３１８ｂｐのフェレドキシン遺伝子［配列番号４］を含むことが示された。クローニングされた遺伝子から予��されるアミノ酸配列は、精製されたフェレドキシンタンパク質から以前得られたＮ末端および内部のアミノ酸配列に一致した。さらに、その予測されたアミノ酸配列は、その全長にわたり［２Ｆｅ‐２Ｓ］細菌フェレドキシンのアドレノドキシンファミリーの５つの他のメンバーに相同性を有し、その範囲はロドバクター・カプスラタス由来のフェレドキシンについての４２％の同一性から、シュードモナス由来のフェレドキシンについての３５％の同一性までであった（実施例２を参照のこと）。他の３つのフェレドキシンはコーロバクター・クレセンタス、ロドコッカス・エリスロポリス、およびシュードモナス・プチダ由来であった。このファミリーのタンパク質は単一の２Ｆｅ‐２Ｓ鉄‐硫黄クラスターに結合し、３つの保存モチーフを有する。モチーフ１は２Ｆｅ‐２Ｓリガンドである３つの保存されたシステインを含む。モチーフ２は負に荷電した残基のクラスターを含む。モチーフ３は２Ｆｅ‐２Ｓクラスターの４つの保存されたシステインを含む。
【実施例５】
【０１２９】
（レダクターゼＤＩＣをコードするクローンの同定と配列決定）
フェレドキシン遺伝子をクローニングするために実施例４において使用したのと同じ手法により２つのレダクターゼ遺伝子をクローニングした。精製（実施例３に記載した精製）されたレダクターゼタンパク質から得られたＮ末端配列は長さが２５アミノ酸であった。この配列をＧｅｎｂａｎｋのデータベースと比較することにより、この配列が、スフィンゴモナス属細菌ＲＷ１株から以前単離された３成分酵素であるダイオキシンジオキシゲナーゼのシトクロムＰ４５０型のレダクターゼ成分に対して２０アミノ酸の重複部分において９０％同一であることが示された。内部の配列１０アミノ酸残基も精製タンパク質のトリプシン消化から得られた。この内部の配列は、スフィンゴモナス属細菌ＲＷ１株由来の同じシトクロムＰ４５０型のレダクターゼの残基６２〜６９と８７．５％同一であった。この配列情報を用いて３つの縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計した（２つはフォワードで１つがリバース）。２つの１７ｍｅｒのフォワードプライマーの配列はＮ末端アミノ酸配列に基づくものとし、１７ｍｅｒのリバースプライマーの配列は内部のアミノ酸配列に基づくものとした。同プライマーをネスティド（nested）ＰＣＲ反応に使用し、シュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡから１８０ｂｐの産物を増幅した。産物をｐＧＥＴ（登録商標）‐Ｔ  Ｅａｓｙベクターにクローニングして配列を決定した。このクローンの予測されるアミノ酸配列の分析から、該産物が精製されたレダクターゼタンパク質から得られたＮ末端および内部のアミノ酸配列に一致するタンパク質をコードすることが確認された。さらに、予測された配列は、その全長にわたりスフィンゴモナス属細菌ＲＷ１株由来のダイオキシンジオキシゲナーゼのシトクロムＰ４５０型のレダクターゼ成分と８０％同一であった。
【０１３０】
クローニングされた断片をＤＩＧで標識し、多数の制限酵素で切断済みのシュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡにサザンブロット法によりハイブリッド形成させた。サザンブロット法により、ＤＩＧ標識プローブがシュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡの種々の制限酵素切断物中の２つの異なる遺伝子座を認識することが示された。この所見から、シュードモナス・マルトフィリアのゲノムの異なる場所に位置する２つのレダクターゼ遺伝子の存在が示唆された。この２つの遺伝子が同一のレダクターゼタンパク質をコードする同一の重複物である可能性があった。そうでなければ、遺伝子のうちの一方が活性のない短いタンパク質または我々のジカンバＯ‐デメチラーゼアッセイにおいて活性の低い完全長のタンパク質をコードするものであった可能性がある。最適な活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする必要があったので、ＤＩＧ標識プローブを用いて両方のレダクターゼ遺伝子を回収した。
【０１３１】
シュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡをＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断した場合、ＤＩＧ標識プローブは、長さ約４．０ｋｂの１つの制限酵素切断断片と、大きさ約２０ｋｂのもう１つの大きな断片とにハイブリッド形成した。４．０ｋｂのＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ断片に位置する遺伝子を囲む多数の制限酵素切断部位の地図を、該プローブとハイブリッド形成した種々の制限酵素切断断片の大きさに基づいて作成した。この制限酵素地図から、遺伝子全体がこの４．０ｋｂの断片に位置するはずであることが示唆された。続いて、シュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡをＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断し、制限酵素切断断片をゲルで分離した。長さ３．０〜５．０ｋｂの断片をゲルから切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＫＳ＋ベクターに連結し、ＤＨ５α細胞を形質転換した。大きさで分画したライブラリーを含む細菌のコロニーをＤＩＧ標識プローブでスクリーニングし、４．３ｋｐのＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ断片を同定した。配列の分析から、このクローンが全長１２２４ｂｐのレダクターゼ遺伝子［配列番号６］を含み、４０８アミノ酸から構成される４３．７ｋＤａのタンパク質［配列番号７］をコードすることが示された。クローニングされた遺伝子から予測されるアミノ酸配列は、精製されたレダクターゼタンパク質から以前得られたＮ末端および内部のアミノ酸配列に一致した。さらに、その予測されたアミノ酸配列は、その全長にわたって少なくとも４つの他のＦＡＤ依存性ピリジンヌクレオチドレダクターゼに相同性を有し、その範囲はスフィンゴモナス属細菌ＲＷ１株由来のダイオキシンジオキシゲナーゼのシトクロムＰ４５０型のレダクターゼ成分に対する６９％の同一性から、シュードモナス属細菌由来のテルプレドキシンに対する３６％の同一性にわたった（実施例３を参照のこと）。他の２つのＦＡＤ依存性ピリジンヌクレオチドレダクターゼはロドコッカス・エリスロポリスおよびシュードモナス・プチダ由来であった。このＦＡＤ依存性ピリジンヌクレオチドレダクターゼのファミリーのタンパク質は５つの保存モチーフを有する。モチーフ１およびモチーフ３は、それぞれＦＡＤおよびＮＡＤ（Ｐ）のＡＤＰ結合部位に相当する保存された３つのグリシン残基を含む。モチーフ５はＦＡＤフラビン部分を結合する部位に相当する。
【０１３２】
第２の遺伝子をクローニングするため、シュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡをＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断し、得られた制限酵素切断断片をアガロースゲルで分離した。大きさ約２０ｋｂの断片をゲルから切り出し、多数の制限酵素で切断し、次いでサザンブロット法によりＤＩＧ標識プローブとハイブリッド形成させた。第２の遺伝子を囲む制限酵素切断部位の地図を、該プローブとハイブリッド形成した制限酵素切断断片の大きさに基づいて作成した。これらの実験から、完全長の第２のレダクターゼ遺伝子が長さ約３．０ｋｂのＡｐａＩ断片に含まれることが示された。続いて、シュードモナス・マルトフィリアの全ＤＮＡをＡｐａＩで切断し、制限酵素切断断片をゲルで分離した。長さ２．０〜４．０ｋｂの断片をゲルから切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＫＳ＋ベクターに連結し、ＤＨ５α細胞を形質転換した。大きさで分画したライブラリーを含む細菌のコロニーをＤＩＧ標識プローブでスクリーニングし、３．０ｋｐのＡｐａＩ断片を同定した。配列の分析から、この３．０ｋｐのクローンが１２２７ｂｐの翻訳領域（open reading frame）［配列番号８］を含み、４０９アミノ酸から構成される４３．９ｋＤａのタンパク質［配列番号９］をコードすることが示された。この第２の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、第１の遺伝子の配列とほとんど同一（９８．８％の同一性）である。
【実施例６】
【０１３３】
（植物の形質転換）
ジカンバＯ‐デメチラーゼの成分をコードする３つの各遺伝子を個別に植物での発現に適したカセット内に置くため、以下の工程を実施した。ＰＣＲ増幅により３つの各遺伝子の５’末端にＮｃｏＩ部位と３’末端にＸｂａＩ部位を生じるようにオリゴヌクレオチドプローブを設計した。得られたＰＣＲ産物の信頼性を配列決定により確認し、次いで各遺伝子を個別にｐＲＴＬ２ベクター（ネブラスカ州リンカーン所在のネブラスカ大学植物形質転換中心研究設備（Plant Transformation Core Research Facility ）トム・クレメンテ（Tom Clemente）博士提供）にクローニングした。このベクターはポリリンカーの５’末端にタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）由来の１４４ｂｐの翻訳エンハンサー配列（キャリントンおよびフリード（Carrington and Freed）、J. Virology 、第６４巻、１５９０‐１５９７ページ、１９９０年）を含む。各々が５’の翻訳エンハンサーを備えたオキシゲナーゼ、レダクターゼ、およびフェレドキシンの遺伝子を次いで植物の発現ベクターｐＫＬＰ３６（ケンタッキー州レキシントン所在のケンタッキー大学のインデュ・マイティ氏より入手）（マイティおよびシェパード（Maiti and Shepard ）、Biochem. Biophys. Res. Commun.、第２４４巻、４４０‐４４４ページ、１９９８年）にＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断片として個別にクローニングした。このバイナリーベクターは、植物において恒常的に発現する二重エンハンサードメインを有するピーナッツクロロティックウイルス由来の完全長のプロモータ（ＰＣｌＳＶ  ＦＬｔ３６）と効率的に転写を終結させるエンドウのｒｂｃＳ  ３’配列とを含む（マイティおよびシェパード（Maiti and Shepard ）、Biochem. Biophys. Res. Commun.、第２４４巻、４４０‐４４４ページ、１９９８年）。３つの遺伝子を種々の順序および方向で組み合わせることにより１つのバイナリーベクターに３つの遺伝子全てを備えた構築物を作製することも可能である。
【０１３４】
以下の方法を用いてオキシゲナーゼ、フェレドキシン、およびレダクターゼ構築物を個別にアグロバクテリウム・ツメファシエンス内へ移動し、各構築物でシロイヌナズナおよびタバコを形質転換した。３つの構築物を、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＣ５８Ｃ１株内ヘ植物形質転換中心研究設備（Plant Transformation Core Research Facility ）で日常的に使用されるトリパレンタル（triparental ）な改良交配手順により移動した。この手順は、各構築物を有する大腸菌細胞を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞とヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（プラスミドの移動用）を有する大腸菌との混合物と共にインキュベートすることを含む。次に各構築物を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞を用いて植物形質転換中心研究設備の支援のもとタバコおよびシロイヌナズナを形質転換した。タバコについては、葉の外植片を、各構築物を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞の懸濁物とともにインキュベートし、苗条をカナマイシンを含む固体培地で再生させた（ホルシュ（Horsch）ら、Science 、第２２７巻、１２２９‐１２３１ページ、１９８５年）。タバコの形質転換プロトコルの詳細を以下に示す。
【０１３５】
（タバコ外植片の調製）
３〜４インチの葉を１ヶ月齢の植物から選択した（最上部の２葉）。これは３０〜４０の外植片に十分な量である。この葉を大きなビーカーの中に置き、ｄＨ２Ｏで２０〜３０分間覆う。水を捨て、葉を１０％のＣｈｌｏｒｏｘ（登録商標）にＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を加えたもの（５０ｍｌあたり１滴）で覆う。１５分間葉を浸しておき、滅菌したｄＨ２Ｏで３回〜５回すすいだ。先端部と葉柄に加えて葉の外端部分を切り取り、主脈を切除し、残った組織を０．５×０．５ｃｍ四方の薄片にした。この外植片を、プレートあたり３０片、軸側を上にして、接種前に１日予備培養した。
【０１３６】
（アグロバクテリウムの種菌の調製）
アグロバクテリウムの２ｍｌ培養を、適当な抗生物質を加えたＹＥＰ培地（１０ｇ／ｌペプトン、１０ｇ／ｌ  ＮａＣｌおよび５ｇ／ｌ酵母抽出物、ｐＨ７．０）中で開始した。培養は飽和状態まで実施した。この２ｍｌ培養を５０ｍｌのＹＥＰ培地に継代し、６〜８時間（２８℃で常に振とうしながら）生育させた。細胞を遠心分離（３，０００〜４，０００ｒｐｍ）によりハーベストした。細胞のペレットを、共培養用培地に最終的にＯＤ６６０＝０．３〜１．０となるように再懸濁した。
【０１３７】
調製済みのアグロバクテリウムの種菌をペトリ皿に移した。予備培養した外植片に３０分間接種した。この外植片を滅菌済みの濾紙にのせて水分を除き、０．８％寒天で固化させて滅菌済みの濾紙で覆った共培養用培地の上に置いた（プレートあたり１０片の外植片）。外植片を３日間共培養させた。共培養の期間の後、外植片を再生用培地で簡単に洗浄した。
【０１３８】
洗浄した外植片を滅菌済みの濾紙にのせて水分を除き、組織（プレートあたり１０片の外植片）を、０．８％寒天で固化させて適当な選択剤（カナマイシン１５０ｍｇ／ｌ）を加えた再生用培地の上に移した。外植片を、軸側を上にして培養した。この組織を２週間ごとに新しい再生用培地に移し、苗条を切除し（＞３ｃｍ）、発根用培地に継代した。発根した苗条を次に土壌に順化させた。
【０１３９】
（試薬）
予備培養用培地（ＰＭ）：
ビタミンＢ５を含むＭＳ塩と、１ｍｇ／ｌのＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび８μｇ／ｌのｐＣＰＡ（ｐ‐クロロフェノキシ酢酸）を加えた３％スクロース、ｐＨ５．７（注意：全ての成長調節物質をフィルター滅菌すること）。
共培養用培地（ＣＭ）：
３％スクロース、１．０ｍｇ／ｌのＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび８μｇ／ｌのｐＣＰＡを加えた１／１０のＭＳ／Ｂ５培地。
再生用培地（ＲＭ）：
１．０ｍｇ／ｌのＢＡＰ、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび３％スクロースを加えたＭＳ／Ｂ５培地、ｐＨ５．７。抗生物質カルベニシリン（carbenicillin ）（５００ｍｇ／ｌ）およびセフォタキシム（cefotaxime）（１００ｍｇ／ｌ）を使用する。
発根用培地：
０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび１％スクロースを加えた、ビタミンＢ５を十分強化したＭＳ塩。培地を０．８％寒天で固化する。抗生物質抗生物質カルベニシリン（carbenicillin ）（５００ｍｇ／ｌ）およびセフォタキシム（cefotaxime）（１００ｍｇ／ｌ）を維持する（ｎｐｔＩＩ７５ｍｇ／ｌを用いる場合）。
【０１４０】
３種の形質転換実験の各々から１０個の苗条を選択し、発根用培地上に数週間置き、次に温室内の鉢に移動する。シロイヌナズナについては、花を付けた植物の鉢を、各構築物を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞の懸濁物とともにインキュベートし、次に植物に種子を作らせた（ベヒトールド（Bechtold）ら、C. R. Acad. Sci. Paris、Science de la vie/Life sciences 、第３１６巻、１１９４‐１１９９ページ、１９９３年；クローおよびベント（Clough and Bent ）、Plant J.、第１６巻、第６号、７３５‐７４３ページ、１９９８年）。種子を回収し、カナマイシンを含む培地上で発芽させた。苗が適切な根系を発生させた後、各形質転換実験からいくつかの植物を選択し、グロースチャンバ内の鉢に移した。
【０１４１】
形質転換された植物における各遺伝子の発現を評価するために、いくつかの形質転換植物の葉の溶解物のウェスタンブロットを調製してジカンバＯ‐デメチラーゼの３つの成分を検出するポリクローナル抗体で探査した。植物抽出物中の各酵素の酵素活性を測定するため、方法としては、オキシゲナーゼ、フェレドキシンまたはレダクターゼのタンパク質を発現している形質転換植物由来の葉の溶解物を、シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ‐６株から精製された他のＯ‐デメチラーゼの成分の過剰量と混合した。これらの混合物を、標準的な１４Ｃ標識ジカンバ分析（実施例１および３を参照のこと）および放射活性のないジカンバを基質として用いるＨＰＬＣ分析（ジカンバおよび３，６‐ＤＣＳＡはＨＰＬＣから異なる時点で溶出し、定量可能である）の両方を用いてジカンバＯ‐デメチラーゼ活性について試験した。
【０１４２】
葉緑体分画（葉緑体コンパートメント）における遺伝子産物の発現を試験するため、オキシゲナーゼ、フェレドキシン、およびレダクターゼの遺伝子の５’末端に輸送ペプチドの配列を用いて構築物を作製した。このような方法により、タバコ植物にスルホニルウレア系除草剤に対する耐性を導入することに成功した（オキーフ（O'Keefe ）ら、Plant Physiol.、第１０５巻、４７３‐４７８ページ、１９９４年）。より具体的には、エンドウのリブロース１，５‐二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの輸送ペプチド（シグナル）配列（配列番号１９により表される核酸配列）を、オキシゲナーゼ、フェレドキシン、またはレダクターゼの遺伝子をそれぞれの発現制御配列（上記参照）とともに含む中間ベクターｐＲＴＬ２内へ遺伝子改変により組み込む。このことはオリゴヌクレオチドプライマーとＰＣＲプロトコールとを用いて輸送ペプチドの両端にＮｃｏＩ部位を作製することにより達成される。ＮｃｏＩ部位により、ｐＲＴＬ２ベクターのＴＥＶリーダー配列とレポーター遺伝子（オキシゲナーゼ、フェレドキシン、またはレダクターゼ）との間に輸送ペプチドを導入することが容易になる。カセット全体（ＴＥＶリーダー、輸送ペプチドおよびレポーター遺伝子）を次いでｐＲＴＬ２ベクターからＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断片として切り出し、ＰＣｌＳＶ  ＦＬｔ３６プロモータとｒｂｃＳ３’ターミネーターとを含むバイナリーベクターｐＫＬＰ３６内へ導入した。
【０１４３】
細菌のフェレドキシン遺伝子の使用コドンが植物細胞での効率的な翻訳にとって十分最適ではないという可能性を試験するために、シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ‐６株のフェレドキシンと同じアミノ酸配列をコードするが双子葉植物用に最適化された傾向のコドンを備えた合成フェレドキシン遺伝子を、エンテレヒオン社（Entelechon, GmbH）（ドイツ連邦共和国レーゲンスベルク所在）により合成した。使用コドンの変化が植物細胞における細菌のＢ．ｔ．毒遺伝子の最適な発現にとって極めて重要であることはすでによく立証されている（ディーン（Diehn ）ら、Genetic Engineering 、第１８巻、８３‐９９ページ、１９９６年を参照のこと）。
【実施例７】
【０１４４】
（植物への散布）
遺伝子導入されたタバコ植物のジカンバ耐性を試験するため、上記の実施例６に記載したＴ０世代由来の種子を発芽させて１０〜１２葉の段階まで成長させた。農学部門の援助のもと、これらの植物をＩＳＣＯ製造の特注の散布器（バーンサイド（Burnside）、Weed Science
第１７巻、第１号、１０２‐１０４ページ、１９６９年）を用いて「定速散布」に供した。同散布器はＴＥＥＪＥＴノズルとスクリーンとを備え、散布速度は１．８７ｍｐｈ（０．８３６ｍ／秒）で圧力は４２ＰＳＩ（２７９ｋＰａ）である。ノズル高は天蓋の上方「８」にセットする。ジカンバ（市販物の純度）を、非イオン性界面活性剤と混合し、圧縮空気下で１エーカー（４０４６．８平方メートル）あたり２０ガロン（７５．７リットル）の速度（１８．７ｍｌ／平方メートル）で種々の濃度で植物に散布した。
【０１４５】
初期の殺傷曲線を確立するため、野生型のタバコ植物を０〜０．５ｌｂｓ／エーカー（５６ｍｇ／平方メートル）の範囲で濃度を増大させたジカンバで処理した。野生型の植物が０．５ｌｂｓ／エーカー（５６ｍｇ／平方メートル）のジカンバに対して１００％の感度を有することを立証してから、輸送ペプチドを備えたまたは備えていないオキシゲナーゼ遺伝子のみを含む遺伝子導入植物を０．５ｌｂｓ／エーカー（５６ｍｇ／平方メートル）〜５ｌｂｓ／エーカー（５６０ｍｇ／平方メートル）の範囲で濃度を増大させたジカンバで処理した。オキシゲナーゼ遺伝子の構築物を有するが輸送ペプチドのコード配列を欠く遺伝子導入植物は、少なくとも２．５ｌｂｓ／エーカー（２８０ｍｇ／平方メートル）のジカンバ処理に耐性であった（すなわち生育し健康であった）。輸送ペプチドを備えたオキシゲナーゼ遺伝子の構築物を有する遺伝子導入タバコ植物は、５ｌｂｓ／エーカー（５６０ｍｇ／平方メートル）に達するジカンバ濃度で散布された場合に生育し健康であった。すなわち、輸送ペプチドのコード配列を備えたまたは備えていないオキシゲナーゼ遺伝子を含む遺伝子導入植物は、少なくとも記載の量のジカンバまでは未処理の対照の植物と同様と思われたが、同じ量のジカンバで処理された非遺伝子導入植物は生育が悪く、しおれて、ひどい壊死を示した。
【０１４６】
同様の実験において、３つの遺伝子構築物（オキシゲナーゼ、フェレドキシンおよびレダクターゼの遺伝子）を含む遺伝子導入植物に、０．１２５ｌｂｓ／エーカー（１４ｍｇ／平方メートル）のジカンバを散布した。３つの遺伝子構築物を含む遺伝子導入植物は上記濃度のジカンバを散布した場合に生育し健康であったが、同じ量のジカンバで処理された非遺伝子導入植物は生育が悪く、しおれて、ひどい壊死を示した。オキシゲナーゼ遺伝子の構築物のみを有する遺伝子導入植物が２．５ｌｂｓ／エーカー（２８０ｍｇ／平方メートル）に達するジカンバに対してジカンバ耐性を示したので、３つの遺伝子構築物を含む遺伝子導入植物が２．５ｌｂｓ／エーカー（２８０ｍｇ／平方メートル）またはそれ以上に対して同様の抵抗性を示すであろうことが予測される。
【０１４７】
これらの結果は、ジカンバ分解オキシゲナーゼまたは本発明の３つの遺伝子構築物で形質転換された遺伝子導入植物がジカンバに対する後天的な抵抗性を有することを明らかに証明するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】ジカンバＯ‐デメチラーゼの電子伝達スキームを示す図。ＮＡＤＨからの電子はレダクターゼＤＩＣからフェレドキシンＤＩＣまで、そしてオキシゲナーゼＤＩＣまで逐次伝達される。酸素と基質であるジカンバとから３，６‐ジクロロサリチル酸が形成する反応はオキシゲナーゼＤＩＣにより触媒される。ここで、ｏｘは酸化状態、ｒｅｄは還元状態である。
【図２】ジカンバＯ‐デメチラーゼのフェレドキシン成分の得られたアミノ酸配列とフェレドキシンのアドレノドキシンファミリーのメンバーのアミノ酸配列との比較を示す図。図２においては、ｆｅｒｒ  ｄｉ６＝シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ‐６株由来のジカンバＯ‐デメチラーゼのフェレドキシン成分（配列番号５）；ｆｅｒ６  ｒｈｏｃａ＝ロドバクター・カプスラタス由来のフェレドキシン（配列番号１０）；ｆｅｒ  ｃａｕｃｒ＝コーロバクター・クレセンタス由来のフェレドキシン（配列番号１１）；ｔｈｃｃ  ｒｈｏｃｒ＝ロドコッカス・エリスロポリス由来のフェレドキシン（配列番号１２）；ｐｕｔｘ  ｐｓｅｐｕ＝シュードモナス・プチダ由来のフェレドキシン（配列番号１３）；ｔｅｒｐ  ｐｓｅｓｐ＝シュードモナス属細菌由来のフェレドキシン（配列番号１４）；である。同様に図２において、番号１〜３は細菌のフェレドキシンのアドレノドキシンファミリーの３つの保存モチーフを示す。
【図３】ジカンバＯ‐デメチラーゼの２つのレダクターゼ成分の得られたアミノ酸配列とＦＡＤ依存性ピリジンヌクレオチドレダクターゼのファミリーのメンバーのアミノ酸配列との比較を示す図。図３においては、ｒｅｄ１  ｄｉ６＝シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ‐６株由来のジカンバＯ‐デメチラーゼのレダクターゼ成分（配列番号７）；ｒｅｄ２  ｄｉ６＝シュードモナス・マルトフィリアのＤＩ‐６株由来のジカンバＯ‐デメチラーゼのレダクターゼ成分（配列番号９）；ＡＪ００２６０６＝スフィンゴモナス属細菌由来のレダクターゼ（配列番号１５）；ｔｈｃｄ  ｒｈｏｅｒ＝ロドコッカス・エリスロポリス由来のレダクターゼ（配列番号１６）；ｃａｍａ  ｐｓｅｐｕ＝シュードモナス・プチダ由来のレダクターゼ（配列番号１７）；ｔｅｒａ  ｐｓｃｓｐ＝シュードモナス属細菌由来のレダクターゼ（配列番号１８）；である。同様に図３において、番号１〜５はＦＡＤ依存性ピリジンヌクレオチドレダクターゼの５つの保存モチーフを示す。
【図１】
2005506043.tif 000002
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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