(57)【要約】この発明は、リバスチグミンを包含するＡＣhＥＩ薬物の使用を導くためのＡpoＥ遺伝子型判定によって、痴呆患者における認知機能の悪化を予防するためおよび／または行動問題を改善するための方法に関する。また、ＡpoＥ４状態および推奨される処置ストラテジーを決定するためのキットが包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
痴呆患者における認知機能の悪化を予防するための方法であって、
ａ）該患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型のの性質を決定すること、そこで
ｂ）該患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つまたは両方が、ε４アレルを含有するなら、該患者をＣhＥＩ薬物で処置すること、を含む方法。
【請求項２】
ＣhＥＩが表１に示される群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣhＥＩがリバスチグミンである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
患者が６mg/日またはそれ以上のリバスチグミンで処置される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
認知機能悪化の決定がＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアの使用による、請求項１記載の方法。
【請求項６】
痴呆がアルツハイマー型の痴呆(ＤＡＴ)である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
痴呆患者における行動問題の悪化を予防するための方法であって、
ａ）該患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定すること、そこで
ｂ）該患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つまたは両方が、ε４アレルを含有するなら、該患者をＣhＥＩ薬物で処置すること、を含む方法。
【請求項８】
痴呆がＤＡＴである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＣhＥＩが表１に示される群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
ＣhＥＩがリバスチグミンである、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
患者が６mg/日またはそれ以上のリバスチグミンで処置される、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
痴呆患者における認知機能障害を改善するための方法であって、
ａ）該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定すること、そこで
ｂ）該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つもしくは両方が、ε４アレルを含有するなら、該患者をＣhＥＩ薬物で処置すること、を含む方法。
【請求項１３】
痴呆がＤＡＴである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＣhＥＩが表１に示される群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ＣhＥＩがリバスチグミンである、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
患者が６mg/日またはそれ以上のリバスチグミンで処置される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
認知機能障害がＡＤＡＳ−ｃｏｇの使用によって測定される、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
改善がＡＤＡＳ−ｃｏｇスケールで４ポイント以上である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
痴呆患者における行動問題を改善するための方法であって、
ａ）該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定すること、そこで
ｂ）該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つもしくは両方が、ε４アレルを含有するなら、該患者をＣhＥＩ薬物で処置すること、を含む方法。
【請求項２０】
ＣhＥＩが表１に示されるリストから選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＣhＥＩがリバスチグミンである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
リバスチグミンの用量が６mg/日またはそれ以上の用量である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
行動問題が、鬱病、精神病、妄想、睡眠障害、徘徊、怒りの爆発、攻撃性、動揺、無気力、不安、疑い深さ、恐怖心および妄想症からなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
痴呆がＤＡＴである、請求項１９記載の方法。
【請求項２５】
痴呆に罹った個体のＣhＥＩ薬物による処置への応答性を決定する方法であって、
ａ）該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定すること、そこで
ｂ）該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つまたは両方が、ε４アレルを含有するなら、該患者を良好なレスポンダー群と位置づけること、または
ｃ）該患者のＡpoＥ遺伝子の２つのコピーどちらもε４アレルを含有しないなら、該患者を低いレスポンダー群と位置づけること、を含む方法。
【請求項２６】
痴呆が、ＤＡＴ、血管性痴呆、レビ小体（Lewy body）型痴呆、パーキンソン病型痴呆、ダウン症痴呆および軽度の認知障害からなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
痴呆がＤＡＴである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
近い将来、痴呆患者に必要とされるであろうケアのレベルを予測するための方法であって、
ａ）該患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定すること、そこで
ｉ）該患者に存在するＡpoＥ遺伝子の１つまたは両方の２つのコピーが、ε４アレルを含有するなら、該患者が、「安定状態でいるか、改善する」近い将来の処置群に分類される、
ｉｉ）ＣhＥＩ薬物による処置が、該患者の症候を安定させるか、または改善すると考えられ、該患者が近い将来に必要とされるケアのレベルにおける増加を必要としないと考えられる、そして
ｉｉｉ）該患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーどちらもε４アレルを含有しないなら、該患者が、「継続的に悪化する」近い将来の処置群に分類され、該患者の症候は悪化を示すと予測され、該患者が近い将来に必要なケアのレベルを増加させる必要があろうと予測されること、を含む方法。
【請求項２９】
ＣhＥＩが表１に示される群から選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項３０】
ＣhＥＩがリバスチグミンである、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
リバスチグミンが６mg/日またはそれ以上の用量で処置される、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
痴呆がＤＡＴである、請求項２４記載の方法。
【請求項３３】
患者におけるＡpoＥ４アレルの存在の有無を決定するためのキットであって、
ａ）ＡpoＥ４アレルの存在の有無を検出するための少なくとも１つの特異的な試薬、および
ｂ）ＡpoＥ４の状態を基にした推奨される処置選択のための指示書、を含むキット。
【請求項３４】
試薬が患者におけるＡpoＥ４アレルの検出のための核酸を含む、請求項３３記載のキット。
【請求項３５】
試薬が少なくとも１つの遺伝子特異的遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを含む、請求項３３記載のキット。
【請求項３６】
試薬が２つの遺伝子特異的遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載のキット。
【請求項３７】
試薬が少なくとも１つの遺伝子特異的遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを含有する少なくとも１つの遺伝子特異的遺伝子型判定用プライマー組成物を含む、請求項３３〜３６のいずれかに記載のキット。
【請求項３８】
遺伝子特異的遺伝子型判定用プライマー組成物が少なくとも２対のアレル特異的なプライマー対を含む、請求項３７記載のキット。
【請求項３９】
２つのアレル特異的遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドが、別々の容器に梱包されている、請求項３８記載のキット。
【請求項４０】
痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットであって、
（ａ）ＡpoＥ４遺伝子のポリペプチド発現産物を認識し、かつ結合し得る抗体、
（ｂ）該抗体と該個体からの体液サンプルを含有するための適当な容器、その中で、該抗体は、ＡpoＥ４ポリペプチドと、もしそれが存在するなら接触し得る、
（ｃ）該抗体とＡpoＥ４ポリペプチドとの組合せ物を検出するための手段、および
（ｄ）キットを使用するための指示書、を含むキット。
【請求項４１】
痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットであって、
（ａ）ＡpoＥ４遺伝子のｍＲＮＡ発現産物を認識し、結合し得るポリヌクレオチド、
（ｂ）該ポリヌクレオチドと該個体からの体液サンプルを含有するのに適当な容器、その中で、該ポリヌクレオチドはＡpoＥ４ｍＲＮＡと、もしそれが存在するなら接触し得る、
（ｃ）該ポリヌクレオチドとＡpoＥ４ｍＲＮＡとの組合せ物を検出するための手段、および
（ｄ）キットを使用するための指示書、を含むキット。
【請求項４２】
痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットであって、
（ａ）ＡpoＥ４遺伝子のＤＮＡ配列のある部分を認識し、結合し得るポリヌクレオチド、
（ｂ）該ポリヌクレオチドと該個体からの体液サンプルを含有するのに適当な容器、その中で、該ポリヌクレオチドは、ＡpoＥ４ＤＮＡ配列と、もしそれが存在するなら接触し得る、
（ｃ）ポリヌクレオチドとＡpoＥ４ＤＮＡ配列との組合せ物を検出するための手段、および
（ｄ）キットを使用するための指示書、を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の背景
（本発明の分野）
本発明は、薬理学および薬剤の分野に属しており、アルツハイマー型痴呆(ＤＡＴ)を包含する痴呆を処置するための方法を提供する。特に、この発明は、ゲノム分析を使用した、コリンエステラーゼ阻害剤(ＣhＥＩ)による処置に対する痴呆患者の応答性の決定に関し、また痴呆患者のための最良の処置ストラテジーを決定するための方法およびキットに関する。
【０００２】
関連技術の説明
痴呆は、異種そして複数原因的な疾患状態の群であって、記憶障害と少なくとも１つの次の認知障害；失語症、失行症、失認症または遂行機能における障害を包含する多発性認知欠陥を発症させることによって特徴付けられる。アルツハイマー病(ＡＤ)、すなわちＤＡＴは、高齢者における痴呆の主な原因であり、先進国における死亡の主な原因の第４番目である（心疾患、癌および卒中の次）。痴呆症例の７０％までがＡＤであり、第２番目の最も一般的な原因として血管疾患（卒中、アテローム硬化症）がある。６０歳でのＡＤの頻度は約１％である。その発病率は、ほぼ５年毎に２倍となり、６５歳で２％となり、７０歳で４％となり、７５歳で８％となり、８０歳で１６％および８５歳で３２％となる[Forsyth, Phys. Ther., Vol. 78, pp. 1325-1331 (1998); Evans et al., JAMA, Vol. 262, pp. 2551-2556 (1989)を参照されたい。]。９０歳代では３分の２程度が、何らかの形の痴呆に罹患していると見積もられている。［Merritt, Textbook of Neurology, 6th Edition, Lea & Febiger, pp. 484-489, Philadelphia, PA (1979);およびGilroy & Meyer, Medical Neurology, MacMillan Publishing Co., pp. 175-179 (1979)を参照されたい。]。ＡＤは、米国だけで１年に１０００億ドルのコストで推定４００万の人を苦しめている。[Schumock, J. Health Syst. Pharm., Vol. 55, No. 52, pp. 17-21 (1998);およびHay & Ernst, Am. J. Publi-ＣｈＥalth, Vol. 77, pp. 1169-1175 (1987)を参照されたい。]。
【０００３】
さらに、その疾患は、より低いレベルではあるが、若年層群で、時には３０代、まれに幼児期後期において開始することがわかっている[Adams & Victor, Principles of Neurology, pp. 401-407 (1977)を参照されたい。]。
ＡＤは不治の病である。診断後、平均して８年以内に死に至り、通常、最後の３年は施設で過ごす。記憶喪失に加えて、ＡＤ患者は、劇的な人格の変化、失見当識、身体調整の低下や自分自身の世話の不能、日常生活動作(ＡＤＬ)障害、進行性認知障害、行動障害、すなわち徘徊、動揺（agitation）、攻撃および、限定しないが、精神病、鬱病および不安を包含する精神的サイン/症候を示す。ＡＤにおける大鬱病、精神病および動揺の平均率は、およそ各々８％、２０％および２０％である［MayeuxおよびSano, NEJM, Vol. 341, pp. 1670-1679 (1999)を参照されたい。］。
【０００４】
ＡＤの遺伝学
ＡＤは、進行性認知機能低下によって特徴づけられる最も典型的な痴呆である[Bayles, Semin. Speech Lang., Vol. 22, No. 4, pp. 251-259 (2001)；およびStorey et al., Front Biosci., Vol. 7, pp. E155-E184 (2002)を参照されたい。]。ここ十年にわたって、ＡＤの病因の理解に実質的な進歩が為されており、遺伝的背景および年齢を包含する幾つかのリスクファクターが、ＡＤと関連づけられた。Tanzi et al., Neuron., Vol. 32, No. 2, pp. 181-184 (2001) Review; Myers et al., Curr. Opin. Neurol., Vol. 14, No. 4, pp. 433-440 (2001) Review; および Shastry, "Molecular and Cell Biological Aspects of Alzheimer Disease", J. Hum. Genet., Vol. 46, No. 11, pp. 609-618 (2001) Reviewを参照されたい。
【０００５】
ＡＤの正確な原因論は判っていないが、遺伝的関与についての証拠は、いくつかの重要な所見、例えば、家族性発病率、家系分析、一卵性および二卵性双生児の研究およびダウン症との関連から由来する。ＡＤ患者の家族における発病率および伝搬パターンに関する試験により、罹患患者の親戚が、一般集団と比較した場合にＡＤの発症の高いリスクを有することを示す。ＡＤに罹患した発病した一卵性の双生児（co-twins）内の一致率は、４０-６０％であり、すなわち、疾患に対する遺伝は絶対的ではないが、強いことを示唆するものである。一般的総説については、Baraitser, "The Genetics of Neurological Disorders", 2nd Edition, pp. 85-88 (1990)を参照されたい。
【０００６】
４つの遺伝子がＡＤと関連していた。これらの遺伝子は、染色体１、１４、１９および２１に位置する。染色体２１は、β-アミロイドの前駆体、すなわちアミロイド前駆体タンパク質(ＡＰＰ)をコードする遺伝子を担持する。この遺伝子は、成人まで生存し、ＡＤ様病因が剖検で存在するダウン症（21三染色体性）罹患患者において、痴呆が高比率で発生することが観察された後、１９８７年にクローンされた。早期発症家族性ＡＤを有する家族でのアミロイド前駆体タンパク質遺伝子における変異に関するその後の発見から、β-アミロイドの過剰産生がＡＤのいくつかの症例と関連することが示唆された。
【０００７】
染色体１４上のプレセニリン(ＰＳ１)遺伝子は、早期発症ＡＤの家族において、遺伝子連鎖ストラテジーを用いることによって、１９９２年に局在化された。タンパク質の様々な範囲にある、およそ２５の異なる変異は、白人、アシュケナジ系ユダヤ人（Ashkenazi Jewish）、スペイン人および日本人家族において見出されている。別の遺伝子、プレセニリン２(ＰＳ２)は、常染色体優性の早期発症ＡＤを有するいくつかの大きなVolga-German家系を評価した後に、染色体１に局在化していた。ＰＳ１変異を有する患者は、３５〜６０歳の間の特徴的な早期発症年齢を示す。ＰＳ２変異は、Volga-German家系において、ほぼ独占的に見出される。臨床背景で遭遇するほとんどの患者は、ＰＳ１試験は購入利用し得るが、おそらくプレセニリン変異試験についての候補ではないだろう。染色体１２に遅発発症ＡＤに対する原因性変異体が潜伏している可能性があるので、現在臨床試験中である。
【０００８】
アポリポタンパク質Ｅ（ＡpoＥ）の役割
近年、ＡpoＥがＡＤの病因において大きな役割を担っているということが研究から示唆されてきた。ＡpoＥは、コレステロール代謝における役割を包含する血漿リポプロテインのタンパク質構成成分として様々な機能を行う。ＡpoＥは、最初、肝臓から末梢組織にトリグリセリドを輸送する肝臓で合成される超低密度リポタンパク質(ＶＬＤＬ)の構成成分として同定された。
【０００９】
遅発発症ＡＤ患者の最も重要な遺伝情報は、ＡpoＥ遺伝子の多型性分析から由来する。Scarmeas et al., Neurology, Vol. 58, No. 8, pp. 1182-1188 (2002)を参照されたい。ＡpoＥ遺伝子は、３つの主なアイソホーム、ＡpoＥ２、ＡpoＥ３およびＡpoＥ４を含有し、これらは、１つのアミノ酸置換によってのみ異なる。Rosenberg, “The Molecular and Genetic Basis of Alzheimer's Desease: The End of the Beginning: The 2000 Wartenberg Lecture   Neurology, Vol. 54, No. 11, pp. 2045-2054 (2000)を参照されたい。。
【００１０】
ＡpoＥは、コレステロール輸送に関連のある血漿タンパク質であり、染色体１９上の遺伝子によりコードされる。これは、主に肝臓で合成され、損傷後の神経系の修復に関与すると考えられる。ＡpoＥ遺伝子型はＡＤの罹患率に対する重要な一因であるが、いくつかの他の神経変性疾患、例えば、ボクサー痴呆でも見出された。３つの共通のアレル、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４は、６つの表現型に対応する。ε４アレルは、ＡＤについてのリスクファクターとして同定されており、見積もられる寄与リスクは４５-６０％である。Ｅ４ホモ接合体は、Ｅ４ヘテロ接合体よりもリスクが大きい。ＡpoＥ４は、斑に存在し、脳中のアミロイド蓄積を促進し得る。
【００１１】
比較的高いリスクのＡpoＥ４アレルとＡＤの早期発症との関連性は、おそらく、他のアイソホームと比較して、β-アミロイドタンパク質に対するその高い親和性によるものであり、それがβ-アミロイドタンパク質のクリアランスを低下させる。Selkoe,“Translating Cell Biology into Therapeutic Advances inAlzheimer's Desease”，Nature, Vol. 399, Suppl. 6738, pp. A23-A31 (1999) Reviewを参照されたい。
【００１２】
ＡpoＥは、いくつかの方法においてリポタンパク質代謝の手段となる。Mahley et al., J. Lipid Res., Vol. 25, pp. 1277-1294 (1984)を参照されたい。それは、カイロミクロンおよびＶＬＤＬ残存物に対する肝細胞受容体を包含するいくつかの細胞性リポタンパク質受容体に対する認識部位である。Hui et al., J. Biol.-Chem., Vol. 259, pp. 860-869 (1984); and Shelburne et al., J. Clin. Invest., Vol. 65, pp. 652-658 (1980)を参照されたい。
【００１３】
ＡpoＥに富むリポタンパク質は、イン・ビトロおよびイン・ビボでのマイトジェン−または抗原−刺激性リンパ球増殖を阻害することによって、免疫系における機能を有すると説明されてきた。卵巣において、ＡpoＥは、ＬＨ−刺激された培養胞膜および間質性細胞のアンドロゲン産生を阻害する。Dyer et al., J. Biol.-Chem., Vol. 263, p. 10965 (1988)を参照されたい。
【００１４】
ＡpoＥおよびＡpoＢ含有リポタンパク質は、リンパ球機能の重要なレギュレーターであるというさらなる実証は、胎児臍帯血血漿リポプロテインの阻害特性試験から生じる。Curtiss et al., J. Immunol., Vol. 133, p. 1379 (1984)を参照されたい。これらの試験において、ＡpoＥと阻害との直接相関が確立された。
【００１５】
ＡpoＥ２、ＡpoＥ３およびＡpoＥ４と言われる３つの主なＡpoＥのアイソホームがあり、これらは１つの遺伝子座での３つのアレルの産物である。３つのホモ接合体表現型(ＡpoＥ２/２、Ｅ３/３およびＥ４/４)および３つのヘテロ接合体表現型(ＡpoＥ３/２、Ｅ４/３およびＥ４/２)は、３つのうちの任意の２つのアレルの発現から由来する。最も一般的な表現型はＡpoＥ３/３であり、もっとも一般的なアレルはＥ３である。Mahley, Science, Vol. 240, pp. 622-630 (1988)を参照されたい。
【００１６】
３つの型のアミノ酸配列は少し異なるだけである。ＡpoＥ４は、ＡpoＥ４ではアミノ酸残基１１２で通常存在しているシステインがアルギニンに置換されている点で、ＡpoＥ３とは異なる。もっとも一般的なＡpoＥ２の形態は、残基１５８でＡpoＥ３とは異なり、この場合、通常存在するアルギニンがシステインに置換されている。Mahley (1988), 上掲 を参照されたい。ＡpoＥの表現型および遺伝子型は、上記のように当分野で充分に説明されており、また充分知られている。確立された命名システム同様、ＡpoＥに対する表現型および遺伝子型は、例えば、Zannis et al., J. Lipid Res., Vol. 23, p. 911 et seq. (1982)で説明されており、出典明示により本明細書の一部とする。
【００１７】
ＡpoＥ４/４遺伝子型を有する対象は、ＡpoＥ２/３またはＡpoＥ３/３遺伝子型を有する対象と比べて、ＡＤに罹患する傾向が８倍程度高い。さらに、ＡＤ開始平均年齢および生存者平均年齢は、１つのＡpoＥ４アレルを有する対象では低く、また２つのＡpoＥ４アレルを有する対象では最も低い(U.S. Patent No. 5,508167を参照されたい。その全てを出典明示により本明細書の一部とする。）。すなわち、ＡＤについての対象者の予測は、対象がＡpoＥ４アレルを持つなら、比較的ネガティブな傾向にあり、対象が１以上のＡpoＥ４アレルを持つなら、最もネガティブな傾向にある。ネガティブの予測は、疾患が発症する見込みの増加、または発症年齢の早期化に関して考察され得る。
【００１８】
他のＡpoＥ関連疾患は、タイプＩＩＩの脂肪過剰血およびアテローム硬化症を包含する。他の証拠は、ＡpoＥプロモーターにおける多型性もＡＤの高いリスクと関連があることを示唆する。Lambert et al.,Human Mol. Gen., Vol. 7, p. 533 (1998);および Lambert et al., Human Mol. Gen., Vol. 7, p. 1511 (1998)を参照されたい。
【００１９】
試験から、５-２２ｋＤａの範囲のＡpoＥフラグメントが、コントロール患者およびＡＤ患者の両方の解剖した脳脊髄液中に存在することが示される。毒性と推定されるドメインを認識するモノクローナル抗体によって免疫沈降した唯一の主要バンドは、約２２ｋＤａの見かけの分子量と一致して泳動する。このフラグメントは、主要なＡpoＥスロンビン開裂産物と一致しているようであり、これはプロテアーゼ耐性であることを示した。Weisgraber et al., J. Biol.-Chem., Vol. 258, pp. 12348-54 (1983)を参照されたい。
【００２０】
ヒトＡpoＥにおけるアミノ酸１３０-１６９は、インターロイキン２-依存性Ｔ細胞に対して細胞増殖抑制および細胞毒性活性の両方を有する免疫調節ドメインを包含する。この発見は、ナイーブマイトジェン-活性化Ｔ細胞に対するＡpoＥの抗増殖効果において残基１４１-１５５を含む以前の試験結果と一致する。Cardin et al. (1988);および Dyer et al. (1991)を参照されたい。
【００２１】
痴呆の処置
ＡＤを包含する痴呆の処置は多様であり、各個体に対して調整され、疾患の進行と共に修飾される。処置は３つの区分に分け得る：痴呆の特異的異常生理学を標的とする薬理学的介入（可能なら）、特異的症候、例えば、妄想および睡眠異常を改善する薬理学的薬剤、そして特異的症候を改善し、また患者の日常生活動作を改善し得る行動介入（behavioral intervention）である。
【００２２】
ＡＤに対する処置ゴールは、
（１）症候的に−注意欠陥障害および遂行機能障害、行動症候および日常生活動作の能力を包含する認知障害の程度を改善すること、および／または
（２）疾患修飾−疾患の進行を遅延させ、さらにでき得る限り長い間、独立した機能を維持することである。
【００２３】
今日までＡＤの認知障害に関する上手くいった唯一の薬理学的処置はＣhＥＩ薬物である。これらは、タクリン、ドネペジル、リバスチグミンおよびガランタミンを包含する。Jacobsen, “Alzheimer's Desease: An Overview of Current and Emerging Therapeutic Strategies”, Curr. Top. Med.-Chem., Vol. 2, No. 4, pp. 343-352 (2002); and Giacobini, Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 920, pp. 321-327 (2000) Reviewを参照されたい。
【００２４】
ＡＤの処置のために使用されたＣhＥＩは下表に示される。
表１．        ＡＤの処置用ＣhＥＩ                                  
１        リバスチグミン(EXELON（登録商標）またはENA 713)
２        タクリン(COGNEX（登録商標）)
３        ドネペジル(ARICEPT（登録商標）)
４        ヒューペルジン-A
５        メトリホネイト
６        ガランタミン(REMINYL（登録商標）)
７        フィゾスチグミン
８        エプタスチグミン（Eptastigmine）
９        イベデノン(Ibedenone）
１０      ジフロシロン(Zifrosilone）
１１      キロスチグミン(Quilostigmine）                            
【００２５】
ＣhＥＩは、該疾患の異常生理を標的とする薬剤の唯一知られた有効な分類であり、ＡＤ患者の脳において低下することが見出されたアセチルコリンレベルを増加することによって働く。これらの薬物は、アセチルコリンエステラーゼのみを阻害し得るか、またはアセチルＣｈＥおよびブチリルＣｈＥの両方を阻害し得る。リバスチグミンは、アセチルおよびブチリルＣｈＥの両方を有効に阻害し、この両方の阻害からこの薬物の特異的な特性を説明し得る。
【００２６】
これらのＣhＥＩ薬物のうちのいくつかは、例えば、アルツハイマー疾患評価スケール（Alzheimer's Assessment Scale：ＡＤＡＳ）スコアによって測定すると、ＡＤ患者における認知障害の程度を改善することだけでなく、ＡＤ患者の神経心理障害、例えば、動揺、徘徊、闘争、無気力および不安を改善することの両方において有効であることを示している。さらに、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣhＥＩ）薬物のうちのいくつかは、悪化の進行を遅延させ、それによりある一定期間疾患進行を安定させることが可能である。これらの薬物がＡＤに見られる全ての利益を生み出す正確なメカニズムは完全に知られているわけではないが、コリン作用性の神経伝達における一次的増加をただ生み出す以上に良好に作用することが明らかであると思われる。
【００２７】
一般的に、ＣhＥＩ薬物は、コリン作用性欠損による痴呆を示す患者において有効であり、これは、ＡＤ、レビ小体（Lewy bodies）による痴呆およびパーキンソン病および痴呆を包含するが、これらに限定するものではない。一般的に、これらの薬物は、痴呆、特にＡＤの経過において初期に使用すべきである。
【００２８】
ヒトの脳は、ＡＣｈＥおよびブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）の２つの主要なタイプのＣｈＥを含有する。ＡＣｈＥの主要な役割は、コリン作用性のシナプスでのインパルス伝達をアセチルコリン(ＡＣｈ)の急速な加水分解によって終結させることである。Giacobini, 上掲 を参照されたい。
【００２９】
最近まで、ＡＣｈＥは、薬物設計の主な標的として考えられており、ＡＣｈレベルの調節に対するＢｕＣｈＥの相対的な寄与はほとんど無視されていた。しかし、一連の増加している事象は、ＡＣｈＥおよびＢｕＣｈＥの両方がＡＣｈレベルの調節における役割を持ち、ＡＤの発症および進行において重要であり得ることを示す。Greig et al., Curr. Med. Res. Opin., Vol. 17, No. 3, pp. 159-165 (2001)を参照されたい。
【００３０】
全てのＣhＥＩは、ＡＣｈＥ阻害の共通の効果を共有するが、リバスチグミンは、ＡＣｈＥおよびＢｕＣｈＥ両方の二重阻害剤であり、ＡＤ患者にとって有意でありかつ臨床上意味のある利益を示してきた。Bar-On et al.,“Kinetic and Structural Studies on the Interaction of Cholinesterases with the Anti-Alzheimer Drug Rivastigmine”, Biochem., Vol. 41, No. 11, pp. 3555-3564 (2002)を参照されたい。さらに、ドネペジル(ARICEPT（登録商標）)に対して応答しないか、もしくは認容性のない患者が、リバスチグミンに変更した場合に、処置に応答しおよび／または認容性を持つ頻度が高いことが判った。Auriacombe et al., Current Medical Research Opinion, Vol. 18, pp. 129-138 (2002)を参照されたい。
【００３１】
ＣhＥＩは好結果の薬物であるが、ＡＤ患者のただ１つのサブグループだけがそれらから利益を得る。Burns et al., Dement. Geriatr. Cogn. Disord., Vol. 10, No. 3, pp. 237-244 (1999);および Rosler et al., BMJ, Vol. 318, No. 7184, pp. 633-638 (1999)を参照されたい。一般的に、少なくとも１／３の患者はＣhＥＩによる処置に対して全く応答しない。すなわち、患者が薬物療法の利益を受けないなら、その薬物療法に患者を暴露することを回避するために、この薬物種に対する起こり得る患者の応答を時前に予測するための方法を確立する大きな必要性がある。患者の遺伝的プロファイルが、ＣhＥＩ治療に対する応答の予測因子を提供するために使用され得るなら、非常に臨床的価値があろう。しかし、ＣhＥＩに対する応答におけるＡpoＥ遺伝子型の影響に関する過去の試験では、矛盾する結果をもたらした。ＡpoＥ４表現型は、ＡＤ患者におけるタクリン処置の効力に対して、ネガティブな予測因子であるか、また影響がないかのいずれかであることが示されてきた。Sjogren et al., J. Neural. Transm. Vol. 108, No. 4, pp. 451-458 (2001); Farlow et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol. 802, pp. 101-110 (1996); Farlow et al., Neurology, Vol. 50, No. 3, pp. 669-677 (1998); Rigaud et al., Eur. J. Neurol., Vol. 7, No. 3, pp. 255-258 (2000); Poirier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, No. 26, pp. 12260-12264 (1995);and MacGowan et al., Int. J. Geriatr. Psychiatry, Vol. 13, No. 9, pp. 625-630 (1998) を参照されたい。
【００３２】
ＡpoＥ４表現型は、ＡＤにおいてガランタミン処置の効果に対して影響がないことも示されてきた。Aerssens et al., Geriatr. Cogn. Disord., Vol. 12, No. 2, pp. 69-77 (2001); and Wilcock et al., BMJ, Vol. 321, No. 7274, pp. 1445-1449 (2000)を参照されたい。
【００３３】
全てのＣhＥＩは、副作用、例えば、悪心、嘔吐、下痢、不眠症、筋肉の痙攣、疲労および食欲不振を引き起こし得る。これらの副作用は、軽度から重度に及び得る。さらに、ＡＤ患者の全員が、これらの薬物を摂取した場合に改善を示すか、あるいは低下の速度が遅くなることを示す訳ではない。すなわち、どの患者がＡＣhＥＩに応答するか、そしてどの患者が処置中に有害な副作用を発症するかを決定するための方法が必要とされる。
【００３４】
痴呆患者介護者にとって実際に最も高い関心の変数の１つは、その患者が将来必要とするケアのレベルを見積もることである。「ケアのレベル」とは、該患者が安全性を維持し、クオリティー・オブ・ライフおよび健康を最大にするために必要とする外部補助および監視の程度および強度を意味する。
【００３５】
痴呆患者に対するケアのレベルの変動は大きい。比較的高いケアのレベルの費用は、非常に高額の場合がある。レベルは次の範囲に及ぶ；まだ完全に自立的かつ独立して生活を行い得る非常に初期で軽度な疾患に罹患した患者を最小とするレベルから、徐々に激しさが増す家庭でのケアを経て、様々なレベルの個人的制約および看護補助の程度の施設に入れるまで。より重度な症例において、進行性認知機能低下に加えて、重度な行動問題が頻繁に生じる。これらの行動問題は、鬱病、攻撃または反復性の徘徊行動を包含するが、これらに限定しない、また、これらの行動問題だけでなく、該患者で頻繁に発生する同じ医療問題は、医療および／または精神病治療施設に対して非常に高額な入院費用を必要とし得る。
【００３６】
痴呆に罹患しているどのような患者にとっても、必要なケアのレベルは、時間と共に漸進的に増加するであろうことは予測される。これらの変化に対する時間推移は、月単位から年単位で測定される。しかし、この進行性の増加の速度と性質は、疾患プロセスそれ自身における多様性により、および、最も重要なことは、処置、特にＣhＥＩによる処置に対する患者の応答の多様性により正確に予測することは不可能である。すなわち、上記に加え、患者が必要とするケアのレベルは、例えば、６ヶ月、１年、３年以上、近い将来の予測または評価するための方法が必要である。かかる予測は、質を最大にすること、そしてかかるケアの出費を最小にするという計画における助けとなる。
【００３７】
本発明の要約
本発明は、ＡpoＥ遺伝子型の決定に基づくＣhＥＩ薬物による処置に対して、ＤＡＴを包含するがこれに限定しない痴呆患者の応答性を予測するための方法を提供することによって上記の問題を解決する。さらに、この発明は、近い将来の疾患に関する起こりそうな臨床的推移、すなわち、患者が必要となりそうなケアのレベル、を予測するための方法を提供する。さらに、本発明は、患者ＡpoＥ遺伝子型を決定し、上記臨床的推移およびケアのレベルを予測することができるキットを提供する。
【００３８】
すなわち、本発明の一態様は、ＤＡＴを含むがこれに限定しない痴呆患者における認知機能の低下を予防するための方法であり、これは、患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定することを含む。患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つまたは両方が、ε４アレルを含有するなら、該患者はＣhＥＩ、例えば、表１に示される群またはリバスチグミン（６mg/日以上のリバスチグミンによる処置を包含する）から選択される物質により処置される。
【００３９】
本発明の別の態様は、鬱病、精神病、妄想、睡眠障害、徘徊、怒りの爆発（anger outbursts）、攻撃性、動揺、無気力、不安、疑い深さ、恐怖心および妄想症を包含するがこれに限定しない痴呆患者における行動問題の悪化を予防するための方法であり、これは、患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定し、そこで、該患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つまたは両方が、ε４アレルを含有するなら、該患者をＣhＥＩ薬物で処置することを含む。本発明のさらなる態様において、痴呆はＤＡＴであり、ＣhＥＩは、表１に示される群（６mg/日以上でのリバスチグミンによる処置を包含する）から選択される。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、痴呆患者における認知障害を改善するための方法であり、これは、個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥを遺伝子型の性質を決定し、そこで、該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つもしくは両方が、ε４アレルを含むなら、該患者をＣhＥＩ薬物で処置することを含む。さらなる態様は、痴呆がＤＡＴであって、ＣhＥＩが表１に示される群から選択される場合（６mg/日以上でのリバスチグミンによる処置を包含する）を包含する。
【００４１】
本発明のさらなる別の態様は、痴呆患者における認知障害の程度をＡＤＡＳ−ｃｏｇの使用によって測定して４ポイント以上の改善するための方法であり、これは、個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定し、そこで、該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つもしくは両方が、ε４アレルを含むなら、該患者をＣhＥＩ薬物で処置することを含む。別の態様は、痴呆がＤＡＴであって、ＣhＥＩが表１に示される群から選択される場合（６mg/日以上でのリバスチグミンによる処置を包含する）を包含する。
【００４２】
本発明のさらなる別の態様は、鬱病、精神病、妄想、睡眠障害、徘徊、怒りの爆発、攻撃性、動揺、無気力、不安、疑い深さ、恐怖心および妄想症を包含するがこれに限定しない痴呆患者における行動問題を改善するための方法であり、これは、個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定し、そこで、該個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つもしくは両方が、ε４アレルを含むなら、その患者をＣhＥＩ薬物で処置することを含む。さらに、患者は、例えば、表１に示されるリスト（６mg/日以上でのリバスチグミンによる処置を包含する）から選択されるＣhＥＩで処置され得る。さらに、痴呆のタイプは、ＤＡＴを包含し得るが、これに限定しない。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、ＡＣhＥＩ薬物による処置に対する痴呆に罹った個体の応答性を決定するための方法であり、これは、個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定すること、そこで、個体に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーのうちの１つもしくは両方が、ε４アレルを含むなら、該患者を良好なレスポンダー群と位置づける；または患者のＡpoＥ遺伝子の２つのコピーがε４アレルをどちらも含まないなら、該患者を応答性の低い群と位置づけることを含む。この態様において、痴呆は、ＤＡＴ、血管性痴呆、レビ小体（Lewy body）型痴呆、パーキンソン病痴呆、ダウン症痴呆および軽度の認知障害からなる群から選択される。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、痴呆患者に対して近い将来必要とされるケアのレベルを予測/評価するための方法であり、該方法は、患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの各々について、ＡpoＥ遺伝子型の性質を決定し、そこで、患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーの１つまたは両方が、ε４アレルを含有するなら、該患者は、「安定状態でいるか、改善する」近い将来の処置群に分類され、ＣhＥＩ薬物による処置は、患者の症候を安定させるか改善し、該患者は近い将来において必要なケアのレベルの増加を必要としないと考えられる、そして、患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーのどちらもε４アレルを含まないなら、該患者は、「継続的に悪化する」近い将来の処置群と分類され、該患者の症候は、悪化を示す可能性があり、該患者は近い将来においてより高いケアのレベルを必要とする可能性があると考えられる。本発明のこの態様は、６mg/日以上の用量でリバスチグミンを包含する表１に示される群から選択されたＣhＥＩ薬物の使用を包含し、該痴呆がＤＡＴであるものを含む。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、ＡpoＥ４の存在の有無を決定するためのキットであり、これはＡpoＥ４の存在の有無を検出するための少なくとも１つの特異的な試薬、およびＡpoＥ４の状態を基準にした推奨される処置選択のための指示書を含み、そしてそのキットに包含している該試薬はＡpoＥ４遺伝子の検出のための核酸を含む。
【００４６】
本発明のさらなる別の態様は、痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットであり、
ＡpoＥ４遺伝子のポリペプチド発現産物を認識し、結合し得る抗体、
該抗体と該個体からの体液サンプル抗体を含有するのに適当な容器、この中で、該抗体は、ＡpoＥ４ポリペプチドと、もし存在するなら接触し得る、
該抗体とＡpoＥ４ポリペプチドとの組合せ物を検出するための手段、および
キットを使用するための指示書、を包含する。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットであって、
ＡpoＥ４遺伝子のｍＲＮＡ発現産物を認識し、結合し得るポリヌクレオチド、
該ポリヌクレオチドと該個体からの体液サンプルを含有するのに適当な容器、この中で、該ポリヌクレオチドはＡpoＥ４ｍＲＮＡと、もし存在するなら接触し得る、
該ポリヌクレオチドとＡpoＥ４ｍＲＮＡとの組合せ物を検出するための手段、および
キットを使用するための指示書、を包含する。
【００４８】
本発明のさらなる別の態様は、痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットであり、
ＡpoＥ４遺伝子のＤＮＡ配列のいくつかの部分を認識し、結合し得るポリヌクレオチド、
該ポリヌクレオチドと該個体からの体液サンプルを含有するのに適当な容器、この中で、該ポリヌクレオチドはＡpoＥ４ＤＮＡ配列と、もし存在するなら接触し得る、
該ポリヌクレオチドとＡpoＥ４ＤＮＡ配列の組合せ物を検出するための手段、および、
キットを使用するための指示書、を包含する。
【００４９】
図面の簡単な説明
本発明の詳細な説明
本発明は、どの痴呆患者（ＡＤに限定しないがこれを包含する）が、ＣhＥＩ薬物（リバスチグミンに限定しないがこれを包含する）による処置に対して、認知機能の改善、行動問題の改善または臨床悪化の安定性を、該症候群のどちらかまたは両方においてもたらし、最もよく応答するかを、決定するための方法を提供する。明細書中で使用される用語「処置に対する応答」とは、疾患の症候を、発症から予防するか、またはある期間悪化を予防することによって、予防的または保護的効果の両方を包含することを意図するものであり、さらに、それ自身すでに明白となった症候が、強度、重症度または継続期間において改善されるか、または軽減される効果も包含することを意図している。
【００５０】
すなわち、本発明の一態様は、痴呆患者における認知障害および痴呆に関連した行動問題の発症および悪化を予防するための方法であり、これは、患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーについて、２つのアレルの性質を決定することを含む。１つまたは両方の遺伝子が、ε４アイソホームアレルを担持するなら、該患者は、ＣhＥＩにより処置され、これは６mg/日またはそれ以上の用量でのリバスチグミンによる処置を包含する。この用量レベルあるいはより高い用量レベルでのリバスチグミンによる処置は、ＡＤ患者の認知機能障害、日常生活動作および行動障害（behavioral deficits）を遅延させるか、悪化を予防することが期待されている。
【００５１】
本発明の別の態様は、ＡＤ患者において既存の認知機能障害および痴呆に関連した行動問題を改善するための方法であり、これは、患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーについて、２つのアレルの性質を決定することを含む。１つまたは両方の遺伝子が、ε４アイソホームアレルを担持するなら、該患者は、ＣhＥＩにより処置され、これは６mg/日またはそれ以上の用量でのリバスチグミンによる処置を包含する。この用量レベルまたはそれ以上の用量レベルでのリバスチグミンによる処置は、認知、日常生活動作および痴呆に関連した行動障害および行動問題を包含する痴呆に関連したすでに存在している症候における改善を生むことが期待される。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、予め、患者が、リバスチグミンによる処置を包含するＣhＥＩによる処置に対してどのような応答をするかを決定するための方法であり、この患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーについて、２つのアレルの性質を決定することを含む。１つまたは両方の遺伝子がε４アイソホームアレルを担持するなら、該患者は良好なリスポンダー群と位置づけ、６mg/日またはそれ以上の用量でのリバスチグミンによる処置を包含するＣhＥＩによる処置に対して応答することが期待される。ε４アレルがＡpoＥ遺伝子の両方のコピーに存在しないなら、該患者を低いレスポンダー群と位置づける。実際の処置の前にＣhＥＩによる処置に対する患者の応答性を決定することは、患者の最適な処置法を提供し、また副作用を最小にするように臨床医の助けとなる価値がある。
【００５３】
本発明のさらなる別の態様は、ＡＤに限定しないがこれを包含する痴呆患者が、近い将来必要としそうなケアのレベルを予測するか、または評価するための方法である。本明細書で使用する場合、用語「近い将来」とは、評価日から少なくとも２６週間、好ましくは１２ヶ月、より好ましくは２４ヶ月および最も好ましくは４８ヶ月をさす。
【００５４】
将来的なケアのレベルの推定は、患者に存在するＡpoＥ遺伝子の２つのコピーについて、２つのアレルの性質を決定することで開始するだろう。１つまたは両方の遺伝子がε４アレルを担持するなら、該患者がＣhＥＩにより処置される場合（６mg/日以上のリバスチグミンによる処置を包含する）、該患者は、近い将来、認知機能および行動問題があまり悪化しないか、あるいは全く悪化しないか、または改善を示す傾向がある。かかる患者は、「安定状態でいるか、改善する」近い将来の処置群に分類され、近い将来にケアのレベルにおける増加を必要とする傾向が少ない。
【００５５】
患者のＡpoＥ４遺伝子のコピーのどちらもε４アレルを担持していないなら、患者は「継続的に悪化する」近い将来の処置群に分類される。この群において、該患者は、特別な処置にもかかわらず、近い将来に、介護者の注意をさらに必要とするケアのレベルが増加することおよび高額な費用を必要とすることが予測される。この分類システムは、患者のケアに対して事前計画を可能とし、驚くほど高額な介護者費用の利用を至適化することを助ける。
【００５６】
ここで使用するように、用語「６mg/日以上のリバスチグミンによる処置」は、あらゆる手段で、２４時間の間に６mg以上のリバスチグミン酒石酸塩(EXELON（登録商標）)を患者に投与することを意味する。リバスチグミン酒石酸塩(EXELON（登録商標）)は、Novartis Pharmaceutical Corporation, East Hanover, NJより購入し得る。該リバスチグミンは、単回用量として投与され得るか、または別々に少ない用量の任意の数に分割され、２４時間の間投与され得る。該リバスチグミンは、無機または有機酸の塩としての形態を含めて、体に吸収され得る、全ての医薬的に許容し得る形態で存在し得るし、全ての許容し得る医薬賦形剤と組合されるか、製剤化され得る。該投与は、水溶液として、また即時放出または徐放または持続放出経口医薬製剤による、経口；筋肉内、静脈または髄膜内経路を包含する非経腸；鼻腔内；直腸；膣または経皮パッチ（TRANS DERMAL SYSTEM PATCH（登録商標）を包含するがこれに限定しない）による経皮吸収または拡散、を含むが、これらに限定されないあらゆるルートである。
【００５７】
痴呆に関する診断的特徴
ＡＤを包含するあらゆる痴呆に似たプロセスを示唆する臨床所見を有する患者では、その症候の全ての他の原因は、病歴、診察および適切な臨床検査により除外されるべきである。痴呆の特定の型において、臨床検査は非常に助けとなり得る。例えば、アミロイドタンパク質およびtauタンパク質についての脳脊髄液(ＣＳＦ)評価は、ＡＤの診断の見込みを増加させ得るが、それらはＡＤのスクリーニングまたは早期診断の際の慣例的な値とするには特異性に欠ける。定量的核磁気共鳴（ＭＲＩ）を組み合わせて、これらの試験における改善により、ついに早期の、特異的な試験を可能とした。ＡpoＥ４アレルの存在は、患者の痴呆がＡＤにより発生しているという可能性を高める。ＡpoＥ４の存在は、また血管性痴呆とも関連がある。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「ＡＤおよびＤＡＴ」は、同じ疾患を意味すると取り、互換的に使用され得る。
ＡＤに限定しないが、ＡＤを包含する全ての型の痴呆は、患者の機能における進行性の悪化をもたらし、認知機能における悪化と一致し、同じ疾患プロセスの一部である、絶え間なく悪化する行動問題をもたらす。痴呆患者によって示される典型的な行動問題には、鬱病、精神病、妄想、睡眠障害、徘徊、怒りの爆発、攻撃性、動揺、無気力、不安、疑い深さ、恐怖心および妄想症が包含されるが、これらに限定しない。ＡＤを包含する痴呆の大部分の最終段階において、罹病者は、寝たきりとなり、尿および腸の制御を失い、癲癇性の発作にかかる。死は、通常、肺炎または尿路感染症による。
【００５９】
例えば、ＡＤの明確な診断が、剖検または生検での組織試験を必要とする一方で、該診断は、臨床的基準を用いることによって高精度でなされ得る。ＡＤの臨床的顕在化は、かなり特徴的であり、記憶障害は疾患の早期に生じる；患者は、新しいマテリアルを学習および記憶することが困難である。空間的および一時的な失見当識もまた、早期に生じ得るし、患者がよく見知った環境において迷子になる。疾患が進行すると、失語症、失行症および計算不能を発症し、無気力または妄想症が生じ得る。患者は、窃盗の妄想および配偶者不信に頻繁におちいる。患者は、徘徊し、歩き回り、たんすを反復して開閉し、同じ質問を繰り返し得る。睡眠覚醒サイクルの異常は明白となり得る；例えば、患者は夜に目覚めることもあるが、それを日中であると考える。日常生活動作は、疾患全体にわたり低下する。患者は、食事をし、自分自身の身だしなみを整える能力を失い、衣服を整えることが困難となる。疾患の最終段階において、患者は、実質的に全ての知的領域における認知機能低下を示し、運動性異常は明白となり、尿や便両方の失禁を起こす。
【００６０】
あらゆる痴呆の主な特徴は、記憶障害および少なくとも次の１つの認知障害；失語症、失行症、失認症または遂行機能障害を包含する複数の認知機能障害の発症である。この認知機能障害は、職業的または社会的機能の障害を引き起こすために充分に重症であるに違いなく、以前のより高いレベルの機能からの低下を示すに違いない。
認知機能障害が、もっぱら譫妄状態の間に起こるなら、痴呆の診断は為されるべきでない。しかし、痴呆および譫妄状態は、譫妄が存在しない時に痴呆が存在するなら、両方が診断されてもよい。痴呆は、一般的な健康状態、物質使用(毒物暴露を包含する)の持続効果、これらのファクターの組合せと、病因的に関連し得る。
【００６１】
記憶障害は、痴呆の診断を為すために必要とされ、顕著な初期症候である(基準Ａ１)。痴呆罹患個体は、新しいマテリアルを学習する能力が障害されるか、あるいは彼らは以前学習したマテリアルを忘れる。時には、該障害の過程の初期に以前学習したマテリアルの消失を示すことが困難であることもあるが、ほとんどの痴呆罹患個体は、記憶障害の両方の形態を示す。彼らは、財布や鍵の様な貴重品類を紛失したり、コンロで調理中であることを忘れたり、あまり知らない近所で迷子になったりする。痴呆の進行段階において、記憶障害は非常に重度で、その患者は、自身の職業、学校、誕生日、家族および時には名前までも忘れる。
【００６２】
記憶は、個人に情報を、記憶し、保持し、思い出し、認識するように求めることによって、形式的に試験され得る。新しい情報を学習する能力は、個体に単語のリストを学習するよう求めることで評価され得る。個体は、その単語を反復し(記憶)、数分後にその情報を思い出し(保持、思い出す）、そして複数のリストからその単語を認識する（認識)ことが要求される。新しい情報を学習することが困難な個体は、最初にこのマテリアルを学習していないため、手がかりや助言、例えば多肢選択質問によっては助けられない。これに対して、主に再生障害の個体は、彼らの障害が彼らの記憶を呼び出す能力にあるため、手がかりや助言によって助けられ得る。遠い記憶は、個体情報を思い出すか、または個体が興味を持った過去のマテリアル、例えば、政治、スポーツ、エンターテイメントを再生するために、個体に質問することによって試験され得る。また、個体の機能、例えば、仕事、買物、調理、支払、迷子にならずに帰宅する能力に対する記憶障害の影響を(個体および情報提供者から）決定することは有用である。
【００６３】
言語機能の悪化（失語症)は、個体や物品の名前を言い出す困難性によって明らかにされるであろう（基準Ａ２ａ）。失語症に罹患した個体の話法は、長く回りくどいフレーズ、かつ不定指示、例えば「これ」および「それ」などという単語の過剰使用により、不確かまたは無意味となり得る。話した言葉、書いた言葉に関する理解および言葉の繰り返しも損なわれる。痴呆の進行段階において、個体は、口がきけないか、または反響言語、すなわち聞こえた言語を反復すること、または同語反復、すなわち音や言葉を繰り返すことによって特徴づけられる話法パターンの悪化を示す。言語は、個体が、室内にある物品、例えば、タイ、ドレス、机、ランプ；または体の部分、例えば、鼻、顎、肩の名前を呼ぶように求め、その後に指令に従うように；例えば、「ドアを指し、その後机を指す」；またはフレーズ、例えば、「もし、そして、また」を反復するように求めることによって試験される。
【００６４】
痴呆患者は、失行症を示し得、すなわち運動能力がそのままであるにもかかわらず、運動活動を実行するための能力、知覚機能および要求された仕事の理解が障害されている（基準Ａ２ｂ）。彼らは、物品の使用、例えば髪をすく；または既知の運動行動を執行する、例えば、さようならと手を振る身振りの能力が損なわれる。失行症は、調理する、衣服を着る、書いたりすることの欠損に寄与し得る。運動スキル障害は、運動機能を遂行する、例えば、どのように歯を磨くか、五角形を模写するか、ブロックを組み立てるか、または特定の形に棒を整列させるかを示すことを、該個体に求めることによって試験され得る。
【００６５】
痴呆患者は、失認症を示し得、すなわち感覚機能がそのままであるにもかかわらず、物品を認識し、または識別できない（基準Ａ２ｃ)。例えば、該個体は正常な視覚的鋭敏性を持っているが、物品、例えば、イスまたは鉛筆を認識する能力を失っている。時に、彼らは、家族、またはさらに彼ら自身の鏡に写った鏡像を認識できないこともある。同様に、彼らは、正常な触感覚を持ち得るが、触るだけでは、彼らの手の中に置かれた物品、例えば、コインまたは鍵を識別することができない。
【００６６】
遂行機能における障害は、痴呆に共通した顕在（基準Ａ２ｄ)であり、前頭葉または関連のある皮質下経路の障害に特異的に関連し得る。遂行機能（functioning）は、抽象的に考え、そして複雑な行動を計画し、開始し、順序付けし、追跡し、そして中止する能力を包含する。抽象的に考える際の障害は、新しい仕事に対処することに困難性を示す、および新しくかつ複雑な情報処理を必要とする状況を回避する個体によって明示され得る。抽象化する能力は、関連のある単語間の類似性と差違点を見出すことを、その人に質問することによって形式的に評価され得る。遂行障害は、心構えを変える、新しい言語的または非言語的情報を生みだす、そして連続的な運動活動を実行する能力の低下も明白である。
【００６７】
遂行機能についての試験は、１０まで数えること、アルファベットを暗唱すること、連続して７を除減すること、１分間にできる限り多くの動物名をいうこと、もしくはm'sおよびn'sを交互に連続して書くこと、を求めることを包含する。個体の日常生活、例えば、仕事をする、活動を計画する、予算を立てる能力における遂行機能の障害の影響を(その個体および通知者から)決定するためにも有用である。
【００６８】
基準Ａ１（記憶障害）および基準Ａ２の両方の項目(失語症、失行症、失認症または遂行機能における障害)は、社会的または職業的機能、例えば、学校に通う、働きに行く、買い物に行く、衣服を着用する、入浴する、資金を取扱う、およびその他日常生活動作において顕著な障害を引き起こすに充分重症であるに違いない；そして以前の機能レベルからの低下（基準Ｂ）を示すにちがいない。障害の性質および程度は変わり得るし、個体の社会的背景によるところが多い。同レベルの認知障害は、複雑な仕事を行う個々の能力では顕著に障害され得るが、要求が低い仕事ではならない。身体維持、例えば個人衛生；知的機能、手段またはツール、例えば、電話、洗濯機を使用する能力を測定する標準化された公開評価スケールは、機能障害の重症度を測定するのに使用され得る。
【００６９】
これらの症候が譫妄状態の期間中にもっぱら生じる場合、痴呆とは診断されない。しかし、譫妄状態は、予め存在した痴呆と重なることもあり、この場合両方の診断が与えられ得る。
【００７０】
関連特徴および障害
関連のある記述的特徴および精神障害
痴呆患者は、空間的見当識をなくすようになり、空間的作業が困難となる。空間視覚の機能は、個体に絵図、例えば、円、重なった五角形および立方体を模写するように求めることによって評価され得る。貧困な判断および貧困な洞察力が痴呆に共通する。個体は、記憶喪失を全く示さないか、あるいは記憶喪失の認知または他の認知異常の意識をほとんどまたは全く示さない可能性がある。彼らは、彼らの能力に関する非現実的評価をなし得るし、彼らの欠損および予後と一致しない計画、例えば、新規ビジネスの開始計画をたてること、をなす。彼らは、活動、例えば運転に関連するリスクを過小評価する。時に、彼らは暴力的となり、他人に害となり得る。自滅的行動は、特に初期段階、個体が活動の計画をより多く実施し得る場合に生じ得る。痴呆は、時々、転倒を導く歩行不調を伴う。
【００７１】
痴呆に罹患したある個体は、不適当なジョークを言うこと、個人衛生を無視すること、見知らぬ人との過度な親密性を示すこと、あるいは社会的行為の従来ルールを無視することを包含する反抑制行動を示す。早口で不明瞭に言う話法は、皮質下の病理学的に関連のある痴呆、例えば、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病および血管性痴呆のいくつかの症例で生じうる。痴呆の複数の認知障害は、不安、気分および睡眠障害と関連することが頻繁にある。妄想、特に、例えば、置き間違えた所持品が盗難にあったというような迫害の主題が関与した妄想は、一般的である。幻覚は、全ての知覚様相で生じうるが、視覚的妄想は最も一般的なものである。譫妄状態が頻繁に痴呆と重なるのは、進行中の脳疾患が、薬物療法またはその他の併発する一般的健康状態によって起こりうる混乱状態に対する感受性を増加させうるためである。痴呆患者は、身体的ストレスファクター、例えば、病気または軽度の手術、および精神的社会的ストレスファクター、例えば、通院、死別（bereavement）に対して特に脆弱であり得、彼らの知的欠損および他の関連のある問題を悪化させ得る。
【００７２】
関連のある検査所見
痴呆の型に特異的関連のある検査所見に関する議論は、各痴呆に対する参考書類に包含される。必ず、認知および記憶機能において異常があるものは、精神状況試験（mental status examination）と神経心理学的試験を用いて評価され得る。神経画像は、痴呆の様々な診断における助けとなりうる。コンピューター断層撮影（ＣＴ）またはＭＲＩは、大脳の萎縮、病巣脳損傷（皮質の卒中、腫瘍、硬膜下の血腫)、水頭症または脳室周囲虚血脳損傷を明らかにする。機能のイメージング、例えば、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）またはシングルフォトン断層法（ＳＰＥＣＴ）は、痴呆の評価に慣例的に使用されるが、ＣＴまたはＭＲＩスキャンの構造的変化に関する事象がない個体において、有用な様々な診断情報、例えば、ＡＤにおける頭頂葉前頭葉の変化または前頭葉の変性における前頭葉の変化を提供し得る。
【００７３】
関連のある身体検査所見および一般的健康状態
痴呆に関連のある身体検査所見は、基礎的な病理の性質、場所および進行の段階に依存する。最も一般的な痴呆の原因はＡＤ、続いて血管性疾患、および次いで複数病因による。痴呆の他の原因は、ピック（Pick）病、正常圧水頭症、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、外傷性脳損傷、脳腫瘍、無酸素、感染性疾患、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、梅毒；プリオン疾患、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病；内分泌疾患、例えば、甲状腺機能不全、カルシウム過剰血症、低血糖症；ビタミン欠乏症、例えば、チアミン、ナイアシン、ビタミンＢ１２不足；免疫障害、例えば、リウマチ性多発筋痛症、全身性エリテマトーデス；肝臓疾患、代謝疾患、例えば、成人型セロイドリポフスチン症（Kufs病）、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィーおよび成人および子供の他の蓄積症；および他の神経病学疾患、例えば多発性硬化症である。
【００７４】
ＤＡＴの診断基準
Ａ．下記の両方によって明白になる多発性認知機能障害の発生：
（１）記憶障害（新しい情報を学習するまたは以前学んだ情報を思い出す能力障害);および
（２）下記の認知障害のうちの１つ(またはそれ以上)：
（ａ）失語症（言語障害)
（ｂ）失行症（運動機能がそのままにもかかわらず運動活動を実施するための能力の欠損)
（ｃ）失認症（感覚機能がそのままにもかかわらず物品を認識不能または識別不能）および／または
（ｄ）遂行機能障害、すなわち計画、組織化、順序付け、抽象化における障害。
Ｂ．各基準Ａ１およびＡ２における認知機能障害は、社会的または職業的機能における顕著な障害を引き起こし、そして以前の機能のレベルの顕著な低下を示す。
Ｃ．この推移は、漸進的開始および連続的認知機能低下によって特徴づけられる。
Ｄ．基準Ａ１およびＡ２における認知機能障害は、次のいずれかによるものではない：
（１）進行性の記憶および認知障害をひきおこす他の中枢神経系疾患、例えば、脳血管性疾患、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、硬膜下血腫、正常圧水頭症、脳腫瘍；
（２）痴呆を引き起こすと知られている全身性疾患、例えば、甲状腺機能不全、ビタミンＢ１２または葉酸不足、ナイアシン不足、カルシウム過剰血症、神経性梅毒、ＨＩＶ感染、または
（３）物質誘発状態。
Ｅ．欠損は譫妄状態の推移中に独占的に生じない。
Ｆ．該障害が別の第Ｉ軸障害（Axis I disorder）、例えば、主な抑鬱性障害または統合失調症によって上手く説明されない。
【００７５】
ＤＡＴについての(開始の型および優勢な特徴に基づく)コード番号
早期発症−もし開始が６５歳またはそれ以下の年齢である場合：
２９０．１１  譫妄状態を有する：譫妄状態が痴呆と重なる場合。
２９０．１２  被害妄想を有する：被害妄想が目立った特徴である。
２９０．１３  憂鬱を有する：憂鬱（大鬱病エピソード（Major  Depressive Episode）に対する正規の症候基準と一致する所見を包含する）が優勢な特徴である場合。一般的な健康状態による気分障害（General Medical Condition）の別の診断は示されない。
２９０．１０  併発症を伴わない：現行の臨床的表示において上記の目立った点がない場合。
【００７６】
遅発発症−開始が６５年以後の場合：
２９０．３    譫妄状態を有する：譫妄状態が痴呆と重なる場合。
２９０．２０  妄想を有する：妄想が目立った特徴である場合。
２９０．２１  憂鬱を有する：憂鬱（大鬱病エピソードに対する正規の症候基準と一致する所見を包含する）が優勢な特徴である場合。一般的な健康状態による気分障害の別の診断は示されない。
２９０．０    併発症を伴わない：現行の臨床的表示において上記の目立った点がない場合。
【００７７】
次の場合に特定する：
行動障害を有する；
“Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders”，4th Edition (DSM-IV), American Psychiatric Association, Washington, DC (1994)を参照されたい。
【００７８】
痴呆の重症度の評価
痴呆における症候の重症度の評価は、診察により経験をつんだ臨床医によって評価され得る。この評価を助け、標準化し、かつ測定し得るスコアを可能にするために、多様な臨床評価スケールを使用し得る。臨床医により、認知を評価するために共通して使用されるこのスケールは、the Mini-Mental Status、the Dementia Symptom Assessment Scaleおよびthe ADASを包含するが、これに限定するものでない。ＰＤＳ−Progressive Deterioration Scale、ＡＤＣＳ−ＡＤＬおよびＤＡＤは、日常生活動作を評価する。The Neuropsychiatric Inventory(ＮＰＩ)およびＢＥＨＡＶＥ−ＡＤは行動を評価する。ＣＩＢＩＣ−ＰＬＵＳおよびＣＧＩＣは全般的な機能評価である。
【００７９】
ＡＤＡＳ
ＡＤについてのリサーチおよび潜在的治療的介入および臨床的評価のために、ＡＤ患者の認知および非認知行動特徴における主な機能不全の重症度を特異的に測定するために一般的に使用される一つの標準化された評価がＡＤＡＳである。
２１項目のＡＤＡＳは、動作を基にしたスケールであり、これには認知機能、例えば記憶および見当識を評価するための１１項目(ＡＤＡＳ−ｃｏｇ)、そして非認知機能、例えば、気分状態および行動変化を評価するための１０項目(ＡＤＡＳ−Ｎｏｎｃｏｇ)が包含される(表２)。０〜７０の評点が、スケールの認知ファクターに対しておこり得、ここで０は、患者のエラーが全くなかったことを意味し、および７０は患者が深刻な痴呆に罹患していることを意味する。しかし、実際には、健康な個体は、おそらく５〜１０の評点であろう。そのため、そのスケールは正常〜最終的に痴呆になったという全範囲の認知を明確に測定する。Rosen et al., Amer. J. Psych., Vol. 141, pp. 1356-1364 (1984)を参照されたい。
表２．ＡＤＡＳの構造
症候エリア      項目の数          ポイント数
全ての認知        １１              ７０
記憶                ３              ２７
見当識              １              ８
言語                ５              ２５
練習                ２              １０
非認知の全体      １０              ５０
【００８０】
１１の認知項目には、音声言語能力、音声言語の理解、試験指示の思い出し、自発話法における喚語困難性、口頭命令に従う、物品を呼称して指さす、構成行為、観念運動、見当識、単語思い出し課題および単語認識課題を包含する。単語再認課題が、最初に与えられ、その１０分後に様々な言語の他の態様を評価するために制限のない会話に費やす。その後に、残りの認知課題が施行される。
表３．ＡＤＡＳ項目の特徴
最大ポテンシャル評点
ＡＤＡＳ−ｃｏｇ(ＡＤＡＳの認知要素)
単語再認          １０
見当識              ８
観念運動            ５
素描                ５
指示                ５
呼称                ５
単語再認          １２
試験指示の思い出し  ５
表現的言語          ５
言語理解            ５
喚語困難性          ５
ＡＤＡＳ−Ｎｏｎｃｏｇ(ＡＤＡＳの非認知要素)
震え                ５
徘徊                ５
運動不安            ５
涙もろさ            ５
鬱病                ５
被害妄想            ５
幻覚                ５
食欲                ５
集中                ５
非協力度            ５
【００８１】
実施例１
患者ＡpoＥε４遺伝子型のＣhＥＩ、リバスチグミンに対する応答への効果に関する薬理遺伝学試験を行った。リバスチグミン酒石酸塩は、ＡＣｈＥおよびＢｕＣｈＥの両方の阻害剤であり、Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJ.の商品名EXELON（登録商標）として購入できる。治験中の個体を、彼らが摂取する用量、すなわち、＜６mg/日のリバスチグミン、６-１２mg/日のリバスチグミンおよびプラセボによって各処置群に分けた。各処置群を別々に分析した。各処置群における個体を、遺伝子型データを基にＡpoＥε４担持または非担持として分類した。ＡpoＥε４担持者と４ポイント以上の改善度の間の有意な関連性(Ｐ＝０.００７１)を６−１２mg群に見出した。対照的に、試験において、ＡpoＥε４アレルと非悪化との関連性は、同じ群では有意でなかった(Ｐ＝０.１１７２)。６mgよりも多いか、同量のリバスチグミンの用量で処置された場合、非ＡpoＥε４の４８.７％と比較して、ＡpoＥε４担持者の６５％で処置に対する応答を観察した(表７)。
【００８２】
ＡpoＥε４担持者と非担持者の間で様々な処置の間に有意差があるかどうかを決定するためにデータを分析した。３つの処置群間の高い有意差は、非ＡpoＥε４担持者(非悪化ｐ=０.１１３７，４ポイント改善、Ｐ＝０.７９１６)ではなく、ＡpoＥε４担持者(非悪化p=０.０００００１５１，４ポイント改善、Ｐ＝０.０００００１７５)で見出した。非ＡpoＥε４担持者のうち、非ＡpoＥε４の担持者が、ＡpoＥε４担持者ほど応答速度が劇的ではないが(表６)、リバスチグミン処置に応答するということを示す差は統計学的に有意(Ｐ＝０.０４３４)であった。非ＡpoＥ担持者に対する４ポイント改善基準による応答における傾向はなかった(Ｐ＝０.７１０６)。
【００８３】
ベースラインのＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアからの変化とＡpoＥε４アレルに関する関連は、６-１２mg群において有意(ｐ=０.０３５７)であった。有意な関連が他の処置群において見出されなかった。ＡpoＥε４アレルを担持する個体のＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアにおけるベースラインからの平均変化は、＞６mg/日のリバスチグミンで処置した場合の非ε４担持者の０.３３５と比較して−１.７２である。これは、ε４担持者がリバスチグミン処置に対して、より良好なレスポンダーであるということを示す。
【００８４】
方法
サンプル
フェーズＩＩＩ臨床試験ＥＮＡ７１３Ｂ３５２およびＥＮＡ７１３Ｂ３５１は、ＡＤに罹患する可能性のある外来患者におけるリバスチグミンの効果を試験するための複数の医療機関にまたがった、二重盲検、プラセボ-コントロール、並行群間比較試験である。両方の試験を、２６週間にわたって行った。ＥＮＡ７１３Ｂ３５１は、リバスチグミン３mg/日、リバスチグミン６mg/日、リバスチグミン９mg/日またはプラセボからなる４つの処置選択枝を持つ。初期用量タイトレーションフェーズ(１-１２週間)の後に、２６週間の全てランダム化した二重盲検処置期間を、固定用量フェーズ（１３-２６週間）に供した。ＥＮＡ７１３Ｂ３５２は、リバスチグミン１-４mg/日、リバスチグミン６-１２mg/日およびプラセボからなる３つの処置選択枝を持つ。初期用量タイトレーションフェーズ(１-７週間)の後に、２６週間の全てランダム化した二重盲検処置期間を、固定用量フェーズ（８-２６週間）に供した。該血液サンプルは、the Roskamp Institute, University of South Floridaで扱った。
【００８５】
遺伝子型判定
ＡpoＥ多型性に対する遺伝子型判定を、the Roskamp Institute, University of South Floridaによって行った。使用した遺伝子型判定法は、次の文献に記載のような１ステップＰＣＲを用いた；Wenham PR, et al., Lancet. 1991 May 11;337(8750):1158-9。ＡpoＥの多型性を表４に要約した。
表４．ＡpoＥ配列中のアミノ酸変化を基にしたＡpoＥ遺伝子型分類

ＡpoＥ分類          アミノ酸位置１１２            アミノ酸位置１５８    
ε２                  Ｃｙｓ                        Ｃｙｓ
ε３                  Ｃｙｓ                        Ａｒｇ
ε４                  Ａｒｇ                        Ａｒｇ            
【００８６】
統計分析
応答における４ポイント改善
治験中の個体を、彼らのベースラインＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアからの最終変化が−４ポイントより低いか同じである場合に、レスポンダーであると分類した。フィッシャーの直接検定法（Fisher's Exact）を用いてＡpoＥ遺伝子型と応答との関連を見出した。
【００８７】
ＡＤＡＳ−ｃｏｇの非悪化
治験中の個体を、彼らのベースラインＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアからの最終変化が０ポイントより低いか同じである場合に、レスポンダーであると分類した。フィッシャーの直接検定法を用いて、ＡpoＥ遺伝子型と応答との間の関連を見出した。
ＡpoＥε４および非ＡpoＥε４担持者における処置の差違も分析した。処置の差違は４ポイントの悪化と非悪化分類を測定した。傾向についてコクラン・アーミテージ検定（Cochran-Armitage）を用いて、各遺伝子型群のなかのリバスチグミンの用量と共にレスポンダーの数が増加するかどうかを決定した。
【００８８】
試験群を、彼らが受けた処置に基づいて３つの群に分けた。この３つの群は、プラセボ、リバスチグミン＜６mg/日およびリバスチグミン＞６mg/日である。全ての分析を、各群別々に行った。ＡpoＥに対する遺伝子型データを、ε４アレルの存在の有無について記録した。この記録された遺伝子型データを、カテゴリー変数として用いた。この記録した値を表５に示した。
表５．ＡpoＥ遺伝子型の再分類

ＡpoＥ遺伝子型          記録された遺伝子型      
ε２／ε３                非ε４担持者
ε２／ε３                                      
ε２／ε４
ε３／ε４                ε４担持者
ε４／ε４                                      
【００８９】
分散モデルの非パラメーター分析(ＡＮＯＶＡ)を分析に用いた。ＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアにおけるベースラインの変化を従属変数として用いた。
明細書で使用する用語、「ε２、ε３およびε４」と「Ｅ２、Ｅ３およびＥ４」なる用語は、各々互換的に使用される。
行った関連試験に加えて、遺伝子型集団における人口統計学的表示(年齢、性別および人種)を分析し、様々な遺伝子型および処置群（表１１参照）において任意の集団の表示を越えるか、越えないかについてチェックした。また、差違がもしあれば、遺伝子型と非遺伝子型の集団との間の人口統計をチェックした（表１２を参照）。
【００９０】
結果
該結果は、表６で見られるように、＞６mg/日のリバスチグミンの用量による処置群において４ポイント改善群において高度に有意（Ｐ＝０.００７１）であった。表６で見られ得るような、有意な遺伝子型の効果はプラセボまたはリバスチグミン＜６mg/日群について見られなかった。
表６．処置応答の比較（様々な処置群での、ＡpoＥε４アレル担持者および非担持者間のＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアで４ポイントまたは比較的大きな改善を測定した場合)
【表１】
2005534710.tif 000002
【００９１】
非悪化試験において、遺伝子型（ＡpoＥε４対非ＡpoＥε４）は、処置に対する応答について有意な効果（Ｐ＝０.１１７２）を持つと考えらていない。表７で見られるような、リバスチグミン＜６mg/日およびプラセボ処置患者における遺伝子型の効果は、観察されなかった。
【００９２】
表７．処置応答の比較（様々な処置群での、ＡpoＥε４アレル担持者および非担持者間のＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアで非悪化を測定した場合)
【表２】
2005534710.tif 000003
【００９３】
表８および９から、ＡpoＥε４アレルの担持者が、少なくとも６mg/日のリバスチグミンを投与された場合に特により高い応答比率を示すことが明白である。これは、特に非悪化基準における真実である。一方、非ＡpoＥε４担持者の中で、３つの処置群間で有意差はなかった。
ＡＤＡＳ−ｃｏｇスケール基準での４ポイント改善で測定した場合の処置への応答における差違は、ＡpoＥε４担持者間では、表８に示したように有意であることがわかった(Ｐ＝０.０００００１７５)。
【００９４】
表８．処置応答の比較(ＡpoＥε４の担持者および非担持者の間で、様々な処置群間でＡＤＡＳ−ｃｏｇにおける４ポイント改善基準を測定した場合)
【表３】
2005534710.tif 000004
【００９５】
非悪化基準によって測定した場合にＡpoＥε４担持者の間での処置に対する応答の差違は、表９に示したように有意であることがわかった(Ｐ＝０.０００００１５１)。
表９．ＡpoＥε４担持者および非担持者の間で、様々な処置群間で処置応答の比較(ＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアにおける非悪化によって測定した場合)
【表４】
2005534710.tif 000005
【００９６】
非パラメーターＡＮＯＶＡモデルから、ＡpoＥε４担持者は、６mg/日またはそれより高い１日用量で処置された場合にＡpoＥε４アレルの非担持者と比較して、リバスチグミン処置に対して良好に応答することを示す有意な結果(Ｐ＝０.０３５７)を得た。非パラメーターＡＮＯＶＡモデルからの結果を表１０に示した。
表１０．非パラメーターＡＮＯＶＡモデルの結果(試験終了時のＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアにおけるベースラインからの変化の平均)
【表５】
2005534710.tif 000006
【００９７】
表１０から判るように、＞６mgの用量群におけるε４アレルの担持者は、それらのＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアの低下(−１.７４)を示す。一方、非ε４担持者に対するベースラインからの変化は最小（０.３９)であった。遺伝子型に関する効果は、低用量群またはプラセボ群では見られず、遺伝子型の効果がリバスチグミンの用量に依存することを示す。表１１に見られるような遺伝子型と非遺伝子型集団間との人口統計学的情報の間に有意な差違はない。様々な処置群の中でのＡpoＥε４遺伝子型の頻度およびそれらの分布は、表１２にも示されている。
表１１．遺伝子型および非遺伝子型集団の人口統計学的情報

ＡpoＥ                    人種                    性別                      
アジア人/                              年齢(ＳＤ)
白人  黒人  東洋人    その他        男性  女性                  
非遺伝子型    926    75      4        19          410    614      74.4(8.04)
遺伝子型      363     8      2         5          174    204      74.03(7.6)  
多様な処置群における遺伝子型および非遺伝子型の個体の分布：

遺伝子型状態          プラセボ        ０−６mg/日          ６−１２mg/日      
非遺伝子型          293 (28.61%)*      275 (26.86%)*        456 (44.53%)*
遺伝子型            116 (30.69%)*      134 (35.45%)*        128 (33.87%)*     
*（）内の数は列全部の％を示す。
【００９８】
表１２．様々な遺伝子型群における人口統計学的情報

ＡpoＥ                  人種              性別                  ＡＰＯＥε４
アジア人/                      年齢(ＳＤ)      の分類
白人  黒人  東洋人  その他    男性  女性                              
ε2/ε3    15      1      0      0      12      4    76.4(10.8） ε4なし(121)*
ε3/ε3    102     2      0      1      52     53    73.9(9.0)
ε2/ε4    13      1      0      0       6      8    74.4(7.6) 
ε3/ε4    169     2      2      2      79     96    74.4(6.9)   ε4(246)*
ε4/ε4    53      2      0      2      20     37    72.5(5.4)                 
*（）内の数は、そのカテゴリー内の個体数を示す。
【００９９】
多様な処置群のなかのＡpoＥε４担持者の状態分布：

遺伝子型状態          プラセボ    ０−６mg/日*      ６−１２mg/日          
ＡpoＥε４担持者      ７１          ９５              ８０
ＡpoＥε４非担持者    ４４          ３６              ４１                
*０と６ｍｇ用量は、このカテゴリーに包含されない。
【０１００】
遺伝子型判定法
ＡpoＥ表現型および遺伝子型は、充分に説明されており、当業者にはよく知られている。確立された命名システムと同様に、ＡpoＥの表現型および遺伝子型が、例えば、Zannis et al., J. Lipid. Res., Vol. 23, p. 911 et seq. (1982) に説明されており、これを出典明示により本明細書の一部とする。U.S. Patent No. 5,508,167を参照されたい、ここに全体および全目的のために引例を含める。
【０１０１】
ＡpoＥ４またはこのようなアイソホーム（ＡpoＥ４のアレルの数を包含する）をコードするＤＮＡの存在の有無を検出するステップを、何らかの適切な手段によって直接または間接的に実施し得る。多様な技術は当業者には既知である。一般的に、全ての方法は、対象からのＤＮＡまたはＡpoＥのいずれかを含む生物学的試料のサンプルを回収し、次いでその対象が、サンプルから該アイソホームをコードするＤＮＡまたはＡpoＥ４を所有するかどうかを決定する、ステップを包含する。例えば、その検出するステップは、対象からのＡpoＥサンプル（例えば、脳脊髄液、または任意の他のＡpoＥを含有する体液または組織）を回収すること、次いで、ＡpoＥサンプルのなかのＡpoＥ４アイソホームの存在の有無を(例えば、等電点電気泳動法またはイムノアッセイによって)決定することによって実施され得る。
【０１０２】
ＡpoＥの単離および特徴分析は、例えば、Rall et al., Method in Enzymology, Vol. 128, pp. 273-287 (1986); Davignon et al., Arteriosclerosis, Vol. 8, pp. 1-21 (1988);and Warnick et al., Clin.-Chem., Vol. 25, pp. 279-284 (1979)に説明されており、それら全てを出典明示により本明細書の一部とする。等電点電気泳動法は、連続するｐＨグラジエントに従い分子の等電点(ｐＩ)に基づいて分離される電気泳動技術である。購入できる参照タンパク質(例えば、Sigmachemical Company, St. Louis, MO)を用いて、それらのｐＨがそれらのｐＩと、どこで一致するかに従ってサンプルタンパク質と一致するグラジエントを提示する。Warnick et al.において、超低密度ＡpoＥを、血漿サンプルから単離し、等電点電気泳動ゲルに流し、該ＡpoＥアイソホーム等電点電気泳動パターンを得た。Warnick らの方法に従うと、ＡpoＥアイソホームであるＥ２、Ｅ３およびＥ４のｐＩ値は、４℃で８Ｍ尿素において、各々約５.９、６.０および６.１であった。また、Pagnan et al., J. Lipid. Res., Vol. 18, pp. 613-622 (1977);and Utermann et al., FEBS Lett., Vol. 56, pp. 352-355 (1975)を参照し、出典明示により本明細書の一部とする。
【０１０３】
多様な等電点電気泳動タイプの技術は、Rall et al.,上掲においても示されており、等電点電気泳動、システアミン処置、ノイラミニダーゼ処置、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、同様にアミノ酸分析および核酸配列分析が包含され、またキャピラリー等電点電気泳動法は、Swartz, Biotechnology, Vol. 12, pp. 408-409 (1994) に説明されている。
【０１０４】
別の方法では、検出ステップは、対象からのＤＮＡを含有する生物学的サンプルを採取し、次いで生物学的サンプル中のＡpoＥ４アイソホームをコードするＤＮＡの存在の有無を決定することによって実施しうる。対象のＤＮＡを含有する全ての生物学的サンプルを用いることができ、これは組織サンプルおよび血液サンプルも包含され、血液細胞は特に便利な供給源である。ＡpoＥ２、ＡpoＥ３およびＡpoＥ４についてのアミノ酸配列および核酸配列は既知であり、説明されている。例えば、ＡpoＥ３およびＡpoＥ４の核酸配列についてはPaik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, pp. 3445-3449 (1985)；およびアミノ酸配列情報についてはMahley (1988)（上掲）を参照されたい。これらを出典明示により本明細書の一部とする。
【０１０５】
ＡpoＥ４アイソホームをコードするＤＮＡの存在の有無を決定するために、適当な検出し得る基で標識したオリゴヌクレオチドプローブ、または増幅反応の手段、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）によって実施し得る(すなわち、増幅反応の産物を、標識したオリゴヌクレオチドプローブまたは多数の他の技術により検出し得る。)。さらに、該検出ステップは、ＡpoＥ４アイソホームをコードする遺伝子について、対象がヘテロ接合体またはホモ接合体であるかどうかを検出するステップを包含し得る。数多くの様々なオリゴヌクレオチドプローブアッセイ形式は、よく知られており、これらを本発明の実施に用い得る。例えば、U.S. Patent No. 4,302,204 to Wahl et al.; U.S. Patent No. 4,358,535 to Falkow et al.; U.S. Patent No. 4,563,419 to Ranki et al.；and U.S. Patent No. 4,994,373 to Stavrianopoulos et al.(出願人は、特に本明細書中で引用した全てのU.S. Patentの文献が出典明示により本明細書の一部とすることを意図するものである）を参照されたい。
【０１０６】
選択されたまたは標的とする核酸配列の増幅は、どのような適当な手段で実施してもよい。一般的には、Kwoh et al., Am. Biotechnol. Lab., Vol. 8, pp. 14-25 (1990) を参照されたい。適当な増幅技術の例には、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ストランド置換増幅（ＳＤＡ法）（一般的には、Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 392-396 (1992); and Walker et al., Nuc. Acids Res., Vol. 20, pp. 1691-1696 (1992)を参照されたい); 転写を基にした増幅(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 1173-1177 (1989)を参照されたい);自己保持（self-sustained）配列複製 (３ＳＲ)(Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 87, pp. 1874-1878 (1990)を参照されたい);Ｑ．β.リプリカーゼ・システム(Lizardi et al., BioTechnology, Vol. 6, pp. 1197-1202 (1988)を参照されたい)；核酸配列を基にした増幅(ＮＡＳＢＡ) (Lewis, Genetic Engineering News, Vol. 12, No. 9, p. 1 (1992)を参照されたい);修復鎖反応（the repair chain reaction）(ＲＣＲ) (Lewis,上掲を参照されたい);およびブーメランＤＮＡ増幅(ＢＤＡ)(Lewis, 上掲を参照されたい)を包含するが、これに限定するものでない。現在ではＰＣＲが好ましい。
【０１０７】
前述のようなＤＮＡ増幅技術は、プローブ、一組のプローブ、あるいはＡpoＥ４をコードするＤＮＡに特異的に結合するが、同じハイブリダイゼーション条件下でＡpoＥ２やＡpoＥ３をコードするＤＮＡには結合しない２組のプローブの使用を包含し、これらはＡpoＥ４ＤＮＡの増幅のためのプライマーまたはプライマー対として、または増幅反応におけるその一部として働く（同様に、ＡpoＥ２をコードするＤＮＡに特異的に結合するが、同じハイブリダイゼーション条件下ではＡpoＥ３やＡpoＥ４をコードするＤＮＡには結合しない、プローブ、一組のプローブまたは２組のプローブを用いることができ、そしてこれらは、増幅反応において、ＡpoＥ２ＤＮＡまたはその一部の増幅のためのプライマー（複数を含む）として働く；そして、ＡpoＥ３をコードするＤＮＡに特異的に結合するが、同じハイブリダイゼーション条件下ではＡpoＥ２やＡpoＥ４をコードするＤＮＡには結合しない、プローブ、一組のプローブまたは２組のプローブを用いることができ、そしてこれらは、増幅反応におけるＡpoＥ３ＤＮＡまたはそれらの一部の増幅のためのプライマー（複数を含む）として働く。)。
【０１０８】
一般的に、ＡpoＥ４をコードするＤＮＡを検出するために使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、ＡpoＥ４をコードするＤＮＡに結合するが、同じハイブリダイゼーション条件下でＡpoＥ２またはＡpoＥ３をコードするＤＮＡに結合しないオリゴヌクレオチドプローブである。該オリゴヌクレオチドプローブは、適切に検出し得る群、例えば抗体と関連した下記に記載したもので標識される。同様に、ＡpoＥ２をコードするＤＮＡを検出するために使用したオリゴヌクレオチドプローブは、同じハイブリダイゼーション条件下で、ＡpoＥ２をコードするＤＮＡに結合するが、ＡpoＥ３またはＡpoＥ４をコードするＤＮＡに結合しないオリゴヌクレオチドプローブであり、そしてＡpoＥ３をコードするＤＮＡを検出するのに使用されたオリゴヌクレオチドプローブは、同じハイブリダイゼーション条件下で、ＡpoＥ３をコードするＤＮＡに結合するが、ＡpoＥ２またはＡpoＥ４をコードするＤＮＡに結合しないオリゴヌクレオチドプローブである。
【０１０９】
ＰＣＲは、既知の技術に従って実施され得る。例えば、U.S. Patent Nos. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159;および4,965,188 を参照されたい。一般的に、ＰＣＲは、まず核酸サンプル（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で）を、ハイブリダイズする条件下で検出すべき特異的配列の各ストランドについて、１つのオリゴヌクレオチド・プライマーで処理し、その結果、各核酸ストランドに相補的な各プライマーの伸張産物が、ハイブリダイズする特定配列の各ストランドと充分相補的なプライマーを用いて合成され、その結果、各プライマーから合成した伸張産物は、その相補鎖から分離したとき、他のプライマーの伸張産物の合成のための鋳型として働き、次いで変性条件下でサンプルを処理し、検出される配列または複数の配列が存在する場合には、それらの鋳型からプライマー伸張産物を分離する。これらのステップは、所望の程度の増幅が得られるまで周期的に繰り返されることを包含する。増幅配列の検出は、反応産物（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ）にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプローブに添加して実施し、該プローブは検出し得る標識を担持し、既知の技術に従って標識を検出するか、ゲル上で直接的な視覚化により標識を検出することによって実施され得る。
【０１１０】
ＰＣＲ条件が全てのＡpoＥアレル型の増幅を可能にする場合、該型をアレルに特異的なプローブでハイブリダイゼーション、制限エンドヌクレアーゼ消化、変性グラジエントゲル上の電気泳動によって、あるいは他の技術によって区別し得る。ＡpoＥ遺伝子型を決定するためのＰＣＲプロトコルは、Wenham et al., The Lancet, Vol. 337, pp. 1158-1159 (1991) に説明されており、出典明示により本明細書の一部とする。ＡpoＥアイソホームの増幅および同定のために有効なプライマーの例がそこで説明されている。ＡpoＥ多型領域（ＡpoＥ４、Ｅ３またはＥ２かどうか）に特異的なプライマーを用いうる。Wenhamでは、例えば、ＡpoＥ多型部位(ヌクレオチド３７４５および３８８３を含有するコドン１１２および１５８)にわたるＤＮＡの２２７個のbp領域を増幅するＰＣＲプライマーを用いた。次いで、増幅されたフラグメントは、電気泳動ゲル上で認識し得る６つの可能なＡpoＥ遺伝子型からの様々な制限フラグメントを提供する制限エンドヌクレアーゼＣｆｏＩに供した(また、Hixon et al., J. Lipid Res., Vol. 31, pp. 545-548 (1990); Houlston et al., Hum. Genet., Vol. 83, pp. 364-365 (1989); 別の方法についてはWenham et al., Clin.-Chem., Vol. 37, pp. 241-244 (1991);and Konrula et al., Vol. 36, pp. 2087-2092 (1990) を参照されたい。これらは出典明示により本明細書の一部とする。）。
【０１１１】
２つの別個の制限酵素の同時使用によるＰＣＲを基にしたアッセイの使用によるＡpoＥ多型性を遺伝子判定用の、特に好ましい改良された方法については、Zivelin et al., Clin.-Chem., Vol. 43, No. 9, pp. 1657-1659 (1997) を参照されたい。
また、ＬＣＲは既知の技術に従って実施され得る。例えば、Weiss, Science, Vol. 254, p. 1292 (1991) を参照されたい。一般的に、該反応は、２組の対になったオリゴヌクレオチドプローブを用いて行い得る：１組の対は、検出されるべきこの配列の１本のストランドに結合する；もう一方の対は、検出されるべき配列のもう一方のストランドに結合する。各対は、一緒にそれに対応するストランドを完全に包含する。該反応は、まず、検出されるべき配列のストランドを変性（例えば、分離）し、次いで熱安定性リガーゼの存在下で、該ストランドと２対のオリゴヌクレオチドプローブと反応させ、その結果、オリゴヌクレオチドプローブの各対を一緒につなぎ、次いで該反応産物を分離し、次いでこれらの配列が所望の程度にまで増幅されるまでこのプロセスを周期的に反復する。その後の検出は、ＰＣＲに関して上記と同様の方法で実施されうる。
【０１１２】
本明細書に記載の検出ステップが直接または間接的に実施されることは容易に認められるであろう。すなわち、例えば、ＡpoＥ２またはＡpoＥ３のいずれかが対象において検出されるなら、対象がＡpoＥ４についてホモ接合体でないと決定する；そしてＡpoＥ２およびＡpoＥ３の両方が対象において検出されるなら、対象がＡpoＥ４についてホモ接合体またはヘテロ接合体のいずれでもないと決定する。アレル型を間接的に決定する他の手段は、ＶＮＴＲ(variable number tandem repeats) で示されるようにＡｐｏＢアレルとＡpoＥアレルに結合する多型マーカーを測定することによって可能である（Decorter et al., DNA & Cell Biology, Vol. 9, No. 6, pp. 461-469 (1990) を参照されたい。）。
【０１１３】
等電点電気泳動およびアレル検出のための技術の代わりとして、サンプルにおけるＡpoＥ４アイソホームの存在の有無を決定するステップを、選択的にＡpoＥ４に結合する抗体、すなわち、ＡpoＥ４に結合するが、同じ結合状態では主にＡpoＥ２またはＡpoＥ３に結合しないことを示す抗体を用いる抗体アッセイによって実施し得る。正確な患者のＡpoＥ補体を決定することを望む場合、患者がＡpoＥ４についてホモ接合体またはヘテロ接合体であるかそうでないかを決定することを望む場合、次にＡpoＥ２およびＡpoＥ３に選択的に結合する抗体、すなわち、ＡpoＥ２に結合するが、主に同じ結合状態ではＡpoＥ３またはＡpoＥ４と結合しない抗体；ＡpoＥ３に結合するが、同じ結合状態ではＡpoＥ２またはＡpoＥ４に主に結合しないことを示す抗体を用いうる。
【０１１４】
ＡpoＥ２、ＡpoＥ３およびＡpoＥ４に選択的または特異的に結合するのに使用される抗体は、あらゆる適当な技術によって産生され得る。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, Vol. 265, pp. 495-497 (1975) の技術に従ってハイブリドーマ細胞系で産生され得る。ＡpoＥ２、ＡpoＥ３またはＡpoＥ４は、ホモ接合体であると決定されたヒト患者から得られ、次に、Rall et al., Method in Enzymol., Vol. 128, p. 273 (1986) に記載の技術によって精製し、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生のための免疫源として使用され得る。精製ＡpoＥアイソホームは、生物学的に活性なアイソホームを発現する組換え手段によって生成され得るか、またはその免疫源性フラグメントであっても免疫源として使用され得る。モノクローナルＦａｂフラグメントを、当業者には既知の組換え技術によって既知の配列からEscherichia coliにおいて産生し得る。例えば、Huse, Science, Vol. 246, pp. 1275-1281 (1989) （組み換え体Ｆａｂ技術）；およびWenham et al., Lancet, Vol. 337, p. 1158 (1991) (ＡpoＥ ＰＣＲプライマー）を参照されたい。ＡpoＥの一つのサブタイプをコードするＤＮＡを得、そして部位特異的変異によって他のものに変換することもできる。例えば、Kunkel et al., Method in Enzymol., Vol. 154, pp. 367-382 (1987);and Kunkel, U.S. Patent No. 4,873,192を参照されたい。
【０１１５】
本明細書中で使用する用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを包含するイムノグロブリンの全ての型を意味する。該抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルを意味し、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマまたはヒトを包含する起源のあらゆる種であり得るか、またはキメラ抗体であり得る、そして抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ’)２およびＦｖフラグメントを包含し、ＩｇＧ以外の抗体から得られた対応するフラグメントも包含する。
【０１１６】
この発明について、ＡpoＥまたは特定のＡpoＥアイソホーム(リガンド)に選択的または特異的に結合する抗体は、かかるリガンドと反応し得るか、またはそれを認識し得るか、結合し得る分子を一般的に意味する。それは標準的な抗体−抗原またはリガンド-レセプターアッセイ、例えば、競合アッセイ、飽和アッセイまたは標準的イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって、測定されるか決定される場合、抗体はリガンドに対して結合親和性をもつか、該抗体が結合する場合にリガンドに特異的であるか、または該リガンドに結合し得る。特異性のこの定義は、それらがリガンド単独または組み合わせで結合する場合、リガンドに対して特異的である１つの重鎖および／または軽鎖、ＣＤＲ、融合タンパク質または重鎖および／または軽鎖のフラグメントに適用する。
【０１１７】
抗体アッセイ（イムノアッセイ）は、一般的に、均一系アッセイまたは不均一系アッセイである。均一系アッセイにおいて、免疫応答は、特異的抗体、標識したアナライトおよび目的のサンプルを包含するのが普通である。標識から生じるシグナルは、該抗体が標識したアナライトに結合すると直接的または間接的に修飾される。その範囲の免疫応答および検出の両方は均一溶液で実施した。用い得る免疫標識には、フリーラジカル、ラジオアイソトープ、蛍光染色、酵素、バクテリオファージ、補酵素およびその他が包含され得る。
【０１１８】
不均一系アッセイアプローチにおいて、該試薬は、試験片、本発明の抗体および検出し得るシグナルを産生するためのシステムまたは手段であるのが普通である。上記と同様の試験片を用い得る。該抗体を、一般的に、支持体、例えば、ビーズ、プレートまたはスライド上で固定し、そして液体相中で抗原を含有していると考えられる試験片と接触させる。次に、該支持体を液体相から分離し、そして支持相または液体相のいずれかは、かかるシグナルを産生するための手段を用いて、検出し得るシグナルを試験した。このシグナルは、試験片中のアナライトの存在と関連する。検出し得るシグナルを産生するための手段は、放射活性標識、蛍光標識、酵素標識およびその他のものの使用を包含する。例えば、検出されるべき抗原が第二結合部位を含有するなら、その部位に結合する抗体は、検出し得る基と結合でき、分離ステップの前に液体相反応溶液に添加し得る。固体支持体上で検出し得る基の存在は、試験サンプル中の抗原の存在を示す。適当なイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ、免疫螢光法、酵素結合イムノアッセイなどである。
【０１１９】
当業者は、本明細書に開示した方法を実施するために有用であり得る非常に多くの特異的なイムノアッセイ形式およびその変化に熟知している。一般的には、Maggio, Enzyme-imunoassay, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1980)を参照されたい。また、U.S. Patent No. 4,727,022 to Skold et al., “Method for Modulating Ligand-Receptor Interactions and their Application”; U.S. Patent No. 4,659,678 to Forrest et al.; U.S. Patent No. 4,376,110 to David et al.; U.S. Patent No. 4,275,149 to Litman et al.; U.S. Patent No. 4,233,402 to Maggio et al.; and U.S. Patent. No. 4,230,767 to Boguslaski et al., を参照されたい。ここにある、その全ての引例を出典明示により本明細書の一部とする。
【０１２０】
ＡpoＥアイソホームに選択的に結合する抗体、すなわち、ＡpoＥ２、ＡpoＥ３またはＡpoＥ４の１つに結合するが、同じ結合条件下で基本的にその他のものと結合しないことを示す抗体は、既知の技術（例えば沈殿）に従う診断アッセイに適当な固体支持体（例えば、ラテックスまたはポリスチレンなどから形成されたビーズ、プレート、スライドまたはウェル）と結合され得る。同様に、ＡpoＥアイソホームに結合する抗体は、既知の技術に従って検出し得る基、例えば、放射性標識、例えば３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ；酵素標識、例えば西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ；および蛍光標識、例えば蛍光と結合され得る。
【０１２１】
ＡpoＥ４の存在の有無を決定し、それによってＡchＥＩ薬物による予測された処置に対する応答を決定するためのキットは、本発明の態様であり、ＡpoＥ４の存在の有無を検出するために特異的な少なくとも１つの試薬およびＡpoＥ４状態を基にした推奨される処置選択のための指示書を包含する。該キットは、所望により、ＡpoＥ４遺伝子の検出のための核酸を包含し得る。好ましくは、該キットは、ＡpoＥ４遺伝子の検出のための少なくとも２つの異なる核酸を含み得る。本発明の別の好ましい実施態様に従って、該キットは、ＡpoＥ４アレルの存在の有無を検出するために、少なくとも１つの遺伝子特異的遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを含み得る。好ましくは、該キットは、２つの遺伝子特異的遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを含む。別の実施態様において、該キットは、少なくとも１つの遺伝子特異的遺伝子型判定用プライマー組成物を含み得る。該プライマー組成物は、少なくとも１つの遺伝子特異的遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを含むのが好ましい。もっとも好ましくは、該組成物は、少なくとも２つのアレル特異的プライマーの対を含む。該２つのアレル特異的遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを、別々の容器に梱包し得る。
別の実施態様において、該キットは、所望により、ＡpoＥ４を検出するための等電点電気泳動法の指示書を包含し得る。
【０１２２】
抗体アッセイを実施するための類似の診断キットを、数多くの方法で製造し得る。一実施態様において、該診断用キットは、（ａ）固体支持体と結合したＡpoＥ２、ＡpoＥ３またはＡpoＥ４を結合する抗体および（ｂ）検出し得る基と結合したＡpoＥ２、ＡpoＥ３またはＡpoＥ４を結合する２次抗体、を含む。該試薬は、補助剤、例えば、緩衝液のための剤およびタンパク質安定化剤、例えば、ポリサッカライドなどを包含し得る。該診断キットは、必要な場合には、シグナル産生系の他のメンバーをさらに包含し、この系の検出し得る基はメンバー（例えば、酵素基質）であり、試験中のバックグラウンドの干渉を低下させるための剤、コントロール試薬、試験を行うための器具などを包含し得る。試験キットの第二実施態様は、（ａ）上記のような抗体、（ｂ）検出し得る基に結合した抗体に対する特異的結合パートナーを含む。上記のような補助剤を同様に包含し得る。該試験キットは、あらゆる適当な方法で梱包され、典型的には、試験を実施するための印刷した指示書のシートと共に１つの容器に全ての要素を梱包し得る。
【０１２３】
本発明の一態様は、痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットを提供し、そのキットは、（ａ）ＡpoＥ４遺伝子のポリペプチド発現産物を認識し、結合し得る抗体、（ｂ）該抗体と個体からの体液サンプルを含有するための適当な容器、そのなかで、該抗体は、ＡpoＥ４ポリペプチドと、もし存在するなら、接触し得る、（ｃ）該抗体と該ＡpoＥ４ポリペプチドの組合せ物を検出する手段および（ｄ）キットを使用するための指示書を含む。
【０１２４】
別の態様に従って、痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットは、（ａ）ＡpoＥ４遺伝子のｍＲＮＡ発現産物を認識し、結合し得るポリヌクレオチド、（ｂ）該ポリヌクレオチドと患者からの体液サンプルを含有するための適当な容器、そのなかで、該ポリヌクレオチドは、ＡpoＥ４ｍＲＮＡと、もし存在するなら、接触し得る、（ｃ）該ポリヌクレオチドと該ＡpoＥ４ｍＲＮＡの組合せ物を検出するための手段および（ｄ）キットを使用するための指示書を含む。
【０１２５】
本発明の別の態様は、痴呆患者のための処置ストラテジーを決定する際に使用するためのキットであり、そのキットは（ａ）ＡpoＥ４遺伝子のＤＮＡ配列の一部を認識し、結合し得るポリヌクレオチド、（ｂ）該ポリヌクレオチドと個体からの体液サンプルを含有するための適当な容器、そのなかで、該ポリヌクレオチドはＡpoＥ４ＤＮＡ配列と、もし存在するなら、接触し得る、（ｃ）該ポリヌクレオチドと該ＡpoＥ４ＤＮＡ配列の組合せ物を検出するための手段および（ｄ）キットを使用するための指示書を含む。
【０１２６】
ＡpoＥ４を検出するための免疫化学的方法
免疫化学アッセイは、所望により（しかし、好ましくは)、サンプル、例えば、対象から回収した血液サンプルを還元剤と合せて、それから該サンプルを、反応性メルカプト基群に特異的に結合する固体支持体と接触させ、次に該サンプルを該固体支持体から分離すること、そしてイムノアッセイによって次のいずれかを検出することを含む；（ｉ）該サンプル中のＡpoＥの存在の有無、すなわち、該サンプル中のＡpoＥ４の存在は、対象がＡpoＥ４について少なくとも１つのアレルを持つことを示し、該サンプル中のＡpoＥ４の非存在は、該対象がＡpoＥ４のアレルを持たないことを示す、または（ｉｉ）固体支持体上に固定されたＡpoＥの存在の有無、すなわち、該固体支持体上に固定されたＡpoＥ２またはＡpoＥ３の存在は、該対象がＡpoＥ４に対するアレルを１つ持つかあるいは持たないことを示し、固体支持体上に固定化されたＡpoＥ２およびＡpoＥ３の非存在は、該対象がＡpoＥ４について２つのアレルを持つことを示す。
【０１２７】
体液サンプルに限定しないがそれを包含する、ＡpoＥを含有する生物学的マテリアルのあらゆるサンプルを用いうる。例えば、そのサンプルを、対象由来の、血液、血清、血漿、脳脊髄液またはあらゆる他のＡpoＥを含有する体液または組織から採取し得る。
【０１２８】
本明細書に記載の検出ステップを、直接的にまたは間接的に実施し得るということは容易に認識されるであろう。すなわち、例えば、ＡpoＥ２またはＡpoＥ３のいずれかが、該対象において検出されるなら、該対象はＡpoＥ４についてホモ接合体でないと決定する；そしてＡpoＥ２およびＡpoＥ３の両方が対象において検出されるなら、該対象がＡpoＥ４についてホモ接合体またはヘテロ接合体のいずれでもないことが決定される。ＡpoＥ２またはＡpoＥ３のいずれかが存在するなら、その個体がＡpoＥ４についてヘテロ接合体であるという可能性が存在する。ＡpoＥ４についてのヘテロ接合性は、カラムに結合したＡpoＥの量がカラムから溶出される量の約２倍であることが決定された場合を示す。一方、別の区別を行うために、本発明のアッセイは、初期スクリーンとして使用され得、ＡpoＥ２、ＡpoＥ３およびＡpoＥ４間を区別し得る別のアッセイ、例えば、イムノアッセイ、等電点電気泳動法またはＡpoＥ２、ＡpoＥ３およびＡpoＥ４をコードするＤＮＡのＰＣＲ分析と組合せることができる。
【０１２９】
反応性メルカプト群を特異的に結合するあらゆる固体支持体を、本発明の実施の際に用いうる。具体的には、固体支持体は、競合基、例えば、アミノ、ヒドロキシルおよびカルボキシレートの存在下で、メルカプト基群を共有結合することを意味する。これらの固体支持体には、次のものが包含されるが、これらに限定するものではない；tresyl-Chemistryを用いる固体支持体(Nilsson, Method Enzymol., Vol. 63, p. 56 (1984)を参照されたい);ピリジルジスルフィドを有する活性化ゲル(Egoroy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72, p. 171 (1975)を参照されたい)；またはジスルフィド結合を生成するジチオ-５-ニトロ安息香酸成分およびＴＮＢ−チオール(５-チオ-２-ニトロ安息香酸)アガロースゲル(例えば、Pierce-Chemical Co., PO Box 117, Rockford, IL 61105から購入し得るPierce製品番号20409G)。好ましい固体支持体は、一般式、Ｒ−ＣＯＣＨ2Ｘ（式中、Ｒは固体基質、例えばゲルであり、Ｘはハロゲン、例えばＣｌ、Ｂｒ、Ｉ、好ましくはＩである。）によって示されるものである。特に好ましいものは、Pierce, PO Box 117, Rockford, IL  61105から製品番号44895G、20405G、20401G、20402Gおよび20403Gとして購入できるSULFOLINK.RTM（登録商標）カップリングゲルである。
【０１３０】
システイン残基のジスルフィド結合と対応する反応性メルカプト基群に還元し得る剤は、本発明を実施するための還元剤として使用し得る。好ましい還元剤は、低分子量チオールであり、より好ましくはメルカプトエタノール、ジチオストレイトルおよびメルカプトエチルアミンである。システイン中のジスルフィド結合の還元は、弱アルカリおよび変性条件、例えば、８Ｍ尿素または６ＭグアニジンＨＣｌ下で通常実施される。
【０１３１】
一旦サンプルを固体支持体と接触させてから、あらゆる既知の手段によって固体支持体から分離し、必要であれば、別の試験のために回収した。
イムノアッセイステップを、ＡpoＥに特異的に結合する抗体とＡpoＥとを特異的に結合させて実施した。抗体は、上記したようなあらゆる既知の適当な方法によって産生されるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを包含する全ての型のイムノグロブリンを包含する。
【０１３２】
前記技術の利点は、１以上の他のアイソホームに結合せずに１つのＡpoＥアイソホームに特異的に結合する抗体を用いる必要がないことである。しかし、このようなアイソホーム-特異的抗体を、必要であれば用いてもよい。ＡpoＥに特異的な抗体は、容易に構築でき、またよく知られている。
イムノアッセイは、一般的に、上記のような均一系アッセイかまたは非均一系アッセイであり得る。上記のように、ＡpoＥを特異的に結合する抗体は、適当な既知の技術に従って診断アッセイ(例えば、マテリアル、例えば、ラテックスまたはポリスチレンから形成されたビーズ、プレート、スライドまたはウェル)に適当な固体支持体と結合でき、それらは、同様に検出し得る群にも結合し得る。
【０１３３】
免疫化学アッセイを実施し得るための診断キットは、多くの方法で製造され得る。一実施態様において、キットは、（ａ）反応性メルカプト基群を特異的に結合する固体支持体、(ｂ）ＡpoＥ２、ＡpoＥ３および／またはＡpoＥ４に結合する抗体および（ｃ）所望により還元剤、を包含する。別の実施態様において、該診断キットは、（ａ）固体支持体に結合したＡpoＥ２、ＡpoＥ３および／またはＡpoＥ４を結合する抗体、および（ｂ）検出し得る基に結合したＡpoＥ２、ＡpoＥ３および／またはＡpoＥ４に結合する二次抗体、を含む。
【０１３４】
また、試薬は、補助剤、例えば、緩衝化剤およびタンパク質安定化剤、例えば、ポリサッカリドなどを包含する。診断キットは、さらに、必要な場合、検出し得る基がメンバー(例えば、酵素基質)であるシグナル産生系のその他のメンバー、試験中のバックグラウンドの干渉を低下するための剤、コントロール試薬、試験を行うための器具などをさらに含んでもよい。試験キットの第二態様は、（ａ）上記のような抗体および（ｂ）検出し得る基に結合する抗体に特異的に結合するパートナー、を含む。上記のような補助剤も、同様に包含され得る。該試験キットは、あらゆる適当な様式で、通常、試験を実施し、結果の解釈について印字した指示書と共に、１つの容器内の全ての要素と共に梱包され得る。
【０１３５】
簡単にいうと、本発明の特定の実施態様において、血液を採取し、凝固させて血清を除去する。血清のアリコートは、還元剤（例えば、ジチオストレイトルまたはβ-メルカプトエタノール）中に置き、システインを還元し、それによって反応性メルカプト基群を製造する。次に、還元された血清を、メルカプト基群と、特異的かつ定量的に反応する活性化された支持体（この支持体の例は、Pierce Inc.によって製造されたSULFOLINK.RTM(商標登録)カップリングゲル)とインキュベートする。そうして、この活性化された支持体と還元された血清とのインキュベーションは、システインを含有する全てのＡpoＥ分子を結合させるだろう。インキュベーション後、未結合タンパク質を含有する血清を、その結合タンパク質（沈降分離または遠心分離のいずれかによって）をもつ活性化された支持体から分離した。次に、この血清を、ＥＬＩＳＡ様式、いくつかある内の可能な検出スキームの１つ、例えば比色定量を用いてＡpoＥに対する抗体特異性によってＡpoＥの存在の有無についてアッセイした。ＡpoＥ２またはＡpoＥ３を活性化された支持体に定量的に結合させると、遊離のＡpoＥは、ＥＬＩＳＡにおいて該血清では検出されない。ＡpoＥ４は、活性化された支持体に結合せず、ＥＬＩＳＡアッセイで検出される。ホモ接合体のＡpoＥ４患者（ＡpoＥ４アイソホームのみを含有する)の血清は、インキュベーション前と、活性化された支持体とインキュベーション後の血清中のほぼ同量のＡpoＥを有する。ヘテロ接合体のＡpoＥ４患者（ＡpoＥ４および別のＡpoＥアイソホームの両方を含有する）からの血清は、インキュベーション前と、活性化された支持体と共にインキュベーション後に検出されるＡpoＥのおよそ半分量を有する。
特定の遺伝子型分析の例を下記に示す。
【０１３６】
実施例２
患者について遺伝子型分析は、各患者から採血した全血液（５mL）から単離した高分子量ＤＮＡあるいはＲＮＡを用いて行い得る。ＡpoＥ遺伝子型を、アレル-特異的プライマー伸張法を用いて決定した。Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨと標識したプライマーを、Main et al., J. Lipid Res., Vol. 32, pp. 183-187 (1991)で提供されたプライマー配列を用いてGenosys Biotech (The Woodland, Tex.)によって合成した。
反応は、ＤＮＡ（１μg）を含有する５０μLの容量で行った；デオキシアデノシントリホスフェート、デオキシシチジントリホオスフェート、デオキシチミジン・トリホスフェートおよびデオキシグアノシントリホスフェートを各々０.２mmol/L；１０％ジメチルスルホキシド；１２.５pmolのプライマーＤ、Ｅ、ＦまたはＧのいずれか；２５pmolのプライマーＨ；および１０μLの１０ｘＰＣＲ反応緩衝溶液(Vector Biosystem, Toronto, ONT.)。反応混合物中のＤＮＡを、９６℃で１０分間変性させ、次に４℃に冷却した。その後、１ユニットのＴａｑポリメラーゼ(Vector Biosystem, Toronto, ONT.)を、各サンプルに加えた。各サンプルを、２分間、９６℃で再加熱し、９６℃で１０秒の変性、５８℃で３０秒のアニーリングおよび６５℃で１分間の伸張からなる各サイクルによるサーマルサイクラーで３０サイクルに供した。該反応産物を、ＴＰＥ緩衝溶液(0.08 mol/L Trisリン酸緩衝液, 0.002 mol/L EDTA, Sigma, St-Louis, MO)およびエチジウムブロマイド(0.15 μg/mL）を含有する１％アガロースゲルにおいて、１時間、６７vで、反応混合物（１０μL）の電気泳動によって視覚化した。次に、ゲルを写真にし、バンドのプロファイルを既知の標準物と比較した。
【０１３７】
実施例３
一方、ＡpoＥ表現型を、血清または脳脊髄液サンプルを用いる該患者において決定し得る。タンパク質を、２５cmのＳＤＳポリアクリルアミドゲル(１０％)上でサイズ分離し、BIORAD（登録商標）Trans-blot cellを用いるニトロセルロースフィルター上に移し、そしてヒトＡpoＥタンパク質に対して生じるポリクローナル抗体を用いてＡpoＥタンパク質の検出を行った(International Immunology Corp., CA, Dil. 1:2000)。抗体特異性をコントロールするために、精製ヒトＡpoＥタンパク質（MW ３４−３６ｋＤａ）を用いる抗-ＡpoＥ抗体の吸収を、ＡpoＥ検出を特異的に遮断するかどうかの判断をするために行った。分子量マーカー(Rainbow markers, Amersham)を、隣接ウェルに流し、一方でバンドの視覚的を化学ルミネセンス検出キット(Amersham, Cat. No. RPN 2100)を用いて行った。オートラジオグラフィーのシグナルの定量を、１Ｄ−ゲル分析ソフトウエアを装備したＭＣＩＤイメージ分析システム(Ste-Catherine, ONT.)を用いて行った（Published U.S. Patent Application No. US20020086290A1; Application Nos. 09/548540および09/829113; U.S. Patent No. 6,391,553を参照されたい。ここで挙げられた引例を出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１３８】
一般的なＳＮＰ同定技術を用いるＡpoＥ遺伝子型判定の他の方法
ＡpoＥ遺伝子型判定を、ＳＮＰを同定するための一般的な方法によっても完成し得る。変性化高速液体クロマトグラフィー(ＤＨＰＬＣ)、直接的ＤＮＡ配列決定およびコンピュター計算法によって一本差高次構造多型(ＳＳＣＰ)分析、ヘテロ二重分析を包含するＳＮＰを同定し、特徴分析するために、多くの様々な技術を用いることができる。Shi, Clin.-Chem., Vol. 47, pp. 164-172 (2001)を参照されたい。豊富な公的なデータベース配列情報のおかげで、コンピューター計算ツールを使用して、与えられた遺伝子(ｃＤＮＡあるいはゲノム配列のいずれか)について無関係に提示された配列を並べることによって、コンピューターによる計算でＳＮＰを同定することができる。実験的およびコンピューターによる計算法で得られるＳＮＰの比較は、ＳＮＰFinder(http://Ipgws.nci.nih.gov:82/perl/snp/snp_cgi.pl)によって見出された候補ＳＮＰの５５％がすでに実験的に発見されているということを示した。Cox et al., Hum. Mutal., Vol. 17, pp. 141-150 (2001)を参照されたい。しかし、これらのin silico法は、２７％の真のＳＮＰを見出しただけであった。
【０１３９】
最も一般的なＳＮＰ型タイピングの方法は、現在、ハイブリダイゼーション、プライマー伸張および開裂方法を包含する。これらの各方法は、適当な検出システムと繋げられるべきである。検出技術は、蛍光分極［Chan et al., Genome Res., Vol. 9, pp. 492-499 (1999)を参照されたい。］；ピロホスファターゼ放出の発光定量検出（ピロシークエンシング)(Ahmadiian et al., Anal. Biochem., Vol. 280, pp. 103-110 (2000)を参照されたい)；蛍光励起エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）を基にした開裂アッセイ、ＤＨＰＬＣおよび質量分析法（Shi, 上掲；およびU.S. Patent No. 6,300,076 B1を参照されたい）を包含する。ＳＮＰの検出および特徴分析の他の方法は、U.S. Patent Nos. 6,297,018 B1および6,300,063 B1で開示されるものである。上記引例の開示は、それらの全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【０１４０】
一実施態様において、多型性の検出は、いわゆるINVADER(登録商標)技術(Third Wave Technologies Inc. Madison, WIから入手可能)の手段によって達成され得る。このアッセイにおいて、特定上流の「インベーダー（invader）」オリゴヌクレオチドおよび部分的にオーバーラップする下流プローブは、共に、相補的ＤＮＡテンプレートに結合する場合に特異的な構造を形成する。この構造を、Cleavase酵素によって特異的な部位で認識して切断し、プローブオリゴヌクレオチドの５’フラップの放出を生じる。次に、このフラグメントは、合成二次標的に関する「インベーダー」オリゴヌクレオチドとして働き、二次蛍光標識シグナルプローブは反応混合物中に含む。これは、開裂酵素による二次シグナルプローブの特異的な開裂を生じる。蛍光シグナルは、蛍光励起エネルギー移動を起こし得る染色分子で標識した２次プローブが開裂した時に生じる。開裂は、オーバーラップするＤＮＡ配列またはフラッップ（flaps）によって形成した構造に対してストリンジェントな要件を持ち、そのため、下流のＤＮＡ鎖上の開裂部位の直ぐ上流の単一塩基対のミスマッチを特異的に検出するために用いうる。Ryan et al., Molecular Diagnosis, Vol. 4, No 2, pp. 135-144 (1999);およびLyamichev et al., Nature Biotechnol., Vol. 17, pp. 292-296 (1999)を参照されたい。また、U.S. Patent Nos. 5,846,717および6,001,567も参照されたい。その全ての挙げられた文献は出典明示により本明細書の一部とする。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、組成物は、２以上の多型部位でのヌクレオチドの同定を同時にプローブするために２以上異なる標識をした遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを含む。また、プライマー組成物が２以上の対のアレル-特異的なプライマー対を含有でき、標的化および多型部位を含有する２以上の領域を同時に増幅することを可能にすることを熟考した。
【０１４２】
また、本発明のＡpoＥ遺伝子型オリゴヌクレオチドは、固体表面上、例えば、マイクロチップ、ビーズまたはガラススライド(例えば、WO 98/20020およびWO 98/20019を参照されたい)に、固定化するか合成し得る。このような固定化した遺伝子型オリゴヌクレオチドを、種々の多型性検出アッセイ、プローブハイブリダイゼーションおよびポリメラーゼ伸張アッセイを含むがこれらに限定しないアッセイで使用し得る。本発明の固定化したＡpoＥ遺伝子型オリゴヌクレオチドは、同じ部位で多重遺伝子における多型性について、ＤＮＡサンプルを迅速にスクリーンするために設計した順に並んだオリゴヌクレオチドのアレイを含み得る。
【０１４３】
本発明のアレル-特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、３’の末端ヌクレオチド、あるいは好ましくは３’の二番目のヌクレオチドを持ち、それらは特定のＳＮＰのただ１つのヌクレオチドに相補的であり、そのため、該ヌクレオチドを含有するアレルが存在する場合にのみ、ポリメラーゼを媒介した伸張のためのプライマーとして作用する。コードしているかコードしていないストランドのいずれかにハイブリダイズするアレル-特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを、本発明に含む。ＡpoＥ遺伝子の多型性を検出するためのＡＳＯプライマーは、当業者には既知の技術を用いて開発される。
【０１４４】
本発明の他の遺伝子型オリゴヌクレオチドは、本発明で同定した新規多型部位の１つの１〜数個のヌクレオチド下流に位置する標的領域にハイブリダイズする。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書に記載の新規多型性の１つを検出するためのポリメラーゼ媒介プライマー伸張方法において有用である、そのため、このような遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドは、「プライマー伸張オリゴヌクレオチド」として本明細書中で引用される。好ましい実施態様において、３’末端のプライマー伸張オリゴヌクレオチドは、多型部位に最も近接するヌクレオチドに相補的なデオキシヌクレオチドである。
【０１４５】
別の実施態様において、本発明は、別々の容器につめられた少なくとも２つの遺伝子型判定用オリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。また、該キットは、他の成分、例えば、別々の容器につめられたハイブリダイゼーション緩衝溶液（オリゴヌクレオチドがプローブとして使用される場合）を含有する。一方、オリゴヌクレオチドが標的領域を増幅するのに使用される場合、該キットは、別々の容器につめられたポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸張、例えばＰＣＲを至適化されたポリメラーゼおよび反応緩衝溶液、を含有し得る。
【０１４６】
上記のオリゴヌクレオチド組成物およびキットは、個体においてＡpoＥ遺伝子を遺伝子判定および／またはハプロタイプ決定法において有用である。ここで使用するように、用語「ＡpoＥ遺伝子型」および「ＡpoＥハプロタイプ」は、ヌクレオチド対またはヌクレオチドの複数対を各々含有する遺伝子型またはハプロタイプを意味し、これは、明細書に記載の１以上の多型部位で存在し、所望によりヌクレオチド対も包含し得、またヌクレオチドは、ＡpoＥ遺伝子において１以上の追加の多型部位で存在する。さらなる多型部位は、現在知られている多型部位またはその後に発見された部位である。
【０１４７】
遺伝子型判定法のある実施態様は、２つのコピーのＡpoＥ遺伝子、または各個体に存在するそのフラグメントを含む核酸混合物を個体から単離すること、そして２つのコピーにおける１以上の多型部位でヌクレオチド対の同一性を決定し、個々にＡpoＥ遺伝子型を割り当てることを包含する。当業者には容易に理解されるであろうが、各個体における２つの遺伝子の「コピー」は、同じアレルであるか、異なるアレルであってもよい。特に好ましい実施態様において、遺伝子型判定法は、各多型部位でのヌクレオチド対の同一性を決定することを含む。
【０１４８】
通常、核酸混合物またはタンパク質を、個体から採取した体液サンプル、例えば、血液サンプルまたは組織サンプルを包含する生物学的サンプルから単離する。適当な組織サンプルは、全血液、精液、ＣＳＦ、唾液、涙、尿、糞便類、汗、頬軟膏、皮膚および特異的な臓器組織の生検、例えば、筋肉または神経組織および髪を含むが、これらに限定するものではない。核酸混合物は、後者２つの症例において、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを含み得る。生物学的サンプルは、ＡpoＥ遺伝子が発現する臓器から得られる。さらに、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ調製物がイントロンまたは５’および３’非翻訳領域に位置する多型性を検出するのに使用されないといういことが当業者には理解されるであろう。ＡpoＥ遺伝子フラグメントが単離されるなら、遺伝子型判定されるべき多型部位を含有すべきであろう。
【０１４９】
ハプロタイプ決定法のある実施態様は、個体からＡpoＥ遺伝子の２つのコピーのうち１つのみ、あるいはそのフラグメントを含有する核酸分子を単離し、そこで、そのコピーの１以上の多型部位でのヌクレオチドの同一性を決定し、そのコピーの個体のハロタイプを割り当てることを含む。核酸は、ＡpoＥ同質遺伝子を製造するための上記方法のうちの１つに限定しないが、それを含む２つのコピーのＡpoＥ遺伝子またはフラグメントを分離し得るあらゆる方法を用いて単離し得、標的イン・ビボ・クローニングが好ましい方法である。
【０１５０】
当業者には容易に認識されるであろうが、あらゆる個々のクローンは、各個体において存在する２つのＡpoＥ遺伝子複製物の１つに対してハプロタイプの情報を提供するのみである。ハプロタイプの情報が、個体の他のコピーについて所望される場合、別のＡpoＥクローンが試験されるために必要である。通常、個体においてＡpoＥ遺伝子の両コピーをハプロタイプ決定の確率が９０％以上となるために少なくとも５つのクローンが試験されるべきである。特に好ましい実施態様において、各多型部位でのヌクレオチドが同定される。
【０１５１】
好ましい実施態様において、ＡpoＥハプロタイプの対は、ＡpoＥ遺伝子の１以上の多型部位でのヌクレオチドの段階的な配列同定によって個体について決定した。特に好ましい実施態様において、ハプロタイプ決定法は、ＡpoＥ遺伝子の各コピーにおいて各多型部位でのヌクレオチドの段階的な配列同定を含む。両方の遺伝子複製物のハプロタイプを決定する場合、同一工程を、別々の容器にある遺伝子の各コピーで行うのが好ましい。しかし、２つのコピーが異なるタグで標識されるか、あるいは別々に区別または同定し得る場合、ある場合には、同じ容器内で実施することも起こりうることも想像される。例えば、第一番目および第二番目のコピーの遺伝子が、各々異なる一次および二次蛍光染色で標識される場合、そして別の第３番目の異なる蛍光染色で標識したアレル-特異的なオリゴヌクレオチドは、多型部位(群)をアッセイするために使用され、次に第一番目と第二番目の染色物の組合せを検出することにより、第一遺伝子コピーにおいて多型性が同定され、これら第二番目および第三番目の染色体の組合せを検出しながら、これらの第二番目の遺伝子コピーにおいて多型性を同定する。
【０１５２】
遺伝子型判定法およびハプロタイプ決定法の両方において、多型部位でのヌクレオチド(またはヌクレオチド対または複数対)の同一性は、従来法によって決定された１つまたは両方のコピーのＡpoＥ遺伝子、またはそれらのフラグメントおよびこれらの増幅領域の配列から直接的に多型部位を含有する標的領域を増幅することによって決定し得る。唯一１つのヌクレオチドは、個体がその部位でヘテロ接合体であるなら、２つの異なるヌクレオチドが検出されるが、個体がその部位でホモ接合体であるなら、各多型部位で検出されることは、当業者には容易に認められる。多型性は、ポジティブ型の同定として知られている直接的に、またはネガティブ型の同定と呼ばれる推論により同定され得る。例えば、ＳＮＰが、参照集団においてグアニンおよびシトシンであることが知られる場合、その部位での病気の個体のホモ接合体についてグアニンまたはシトシンのいずれかであるか、その部位で個体がヘテロ接合体であれば、グアニンおよびシトシンの両方であるとポジティブに決定され得る。一方、該部位が、グアニン(すなわち、シトシン/シトシン)でない、またはシトシン(すなわち、グアニン/グアニン)でないとネガティブに決定し得る。
【０１５３】
さらに、本明細書中に記載されている全ての新規多型部位で存在するアレルの同一性は、目的とする多型性部位と連鎖不均衡である本明細書中に記載されていない多型部位を遺伝子判定することによって間接的に決定し得る。２つの部位は、もし１つの部位で特定の変異体の存在が、２番目の部位で別の変異体である予測を強めるなら、連鎖不均衡であるといわれる。Stevens, Mol. Diag., Vol. 4, pp. 309-317 (1999)を参照されたい。現在開示される多型部位と連鎖不均衡な多型部位は、本明細書中で試験されていない遺伝子の領域に位置し得るか、他のゲノム領域に位置し得る。本明細書に記載の新規多型部位と連鎖不均衡な多型部位の遺伝子型判定は、多型部位でのアレルの同一性を検出するためのあらゆる上記方法（を包含するが、これに限定するものではない）によって実施され得る。
【０１５４】
標的領域は、あらゆるオリゴヌクレオチド-直接増幅方法、これに限定しないが、ＰＣＲ(U.S. Patent No. 4,965,188を参照されたい)；ＬＣＲ(Barany et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 88, pp. 189-193 (1991)およびWO 90/01069を参照されたい)；およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(Landegren et al., Science, Vol. 241, pp. 1077-1080 (1988)を参照されたい)を包含する方法を用いて増幅される。このような方法でプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドは、多型部位を含むか隣接する核酸の領域に特異的にハイブリダイズするであろう。典型的に、オリゴヌクレオチドは、１０〜３５個のヌクレオチド長であり、好ましくは１５〜３０個のヌクレオチド長である。もっとも好ましくは、オリゴヌクレオチドは、２０〜２５個のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドの正確な長さは、当業者によって、日常的に考慮され、実施される多くのファクターに依存する。
【０１５５】
その他の既知の核酸増幅方法は、転写を基にした増幅系(U.S. Patent Nos. 5,130,238および5,169,766; EP 329,822;およびWO 89/06700を参照されたい);および等温方法(Walker et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 89, pp. 392-396 (1992)を参照されたい)を包含する標的領域を増幅するのに使用される。
【０１５６】
また、標的領域における多型性は、いくつかのハイブリダイゼーションを基にした当業者には既知の方法の１つを用いて、増幅前後にアッセイされ得る。通常、アレル-特異的なオリゴヌクレオチドは、そのような方法を行う際に利用できる。アレル-特異的なオリゴヌクレオチドは、異なった標識されたプローブ対として使用され得、その対の一つのメンバーは標的配列の一つの変異体と完全一致を示し、もう一方の別のメンバーは異なる変異体との完全一致を示す。いくつかの実施態様において、１以上の多型部位は、一組のアレル-特異的オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド対の一組を用いると、一度で検出し得る。好ましくは、これらのメンバーは、検出されている各多型部位にハイブリダイズする場合以外、各々５℃以内、より好ましくは２℃以内の融点を持つ。
【０１５７】
アレル-特異的なオリゴヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、溶液中の両方の構成要素を用いて行うか、あるいはこのようなハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのいずれかが固体支持体に共有または非共有結合される場合に実施され得る。結合は、例えば、抗体−抗原相互作用、ポリ-Ｌ−Ｌｙｓ、ストレプトアビジンまたはアビジン−ビオチン、塩架橋、疎水相互作用-化学結合、ＵＶ交差結合焼成などにより媒介し得る。アレル-特異的なオリゴヌクレオチドは、固体支持体上で直接合成し得るか、または固体支持体に結合した後に合成し得る。本発明の検出方法において使用するための適当な固体支持体は、シリコン、ガラス、プラスチック、紙などから成る基質を含み、それらは例えば、ウェル(９６-ウェルプレートにおいて)、スライド、シート、膜、ファイバー、チップ、ディシュおよびビーズに形成される。固体支持体を、アレル-特異的なオリゴヌクレオチドまたは標的核酸の固定化を可能にするように、処理、被覆または誘導され得る。
【０１５８】
また、個体のＡpoＥ遺伝子について遺伝子型またはハプロタイプは、核酸アレイおよびサブアレイに対する１つまたは両方の遺伝子のコピーを含有する核酸サンプルのハイブリダイゼーションによって決定され得る。例えば、ＷＯ95/11995に記載されている。該アレイは、遺伝子型またはハプロタイプにおいて包含されるべきそれぞれの多型部位を示すアレル-特異的な一連のオリゴヌクレオチドを含有する。
【０１５９】
また、多型性の同定は、これに限定しないが、リボプローブを(Winter et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p. 7575 (1985);Meyers et al., Science, Vol. 230, p. 1242 (1985)を参照されたい)およびヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質、例えば、E.coli mutS タンパク質(Modrich, Ann. Rev. Genet., Vol. 25, pp. 229-253 (1991)を参照されたい)を用いるＲＮａｓｅ保護方法を包含するミスマッチ検出技術を用いて決定され得る。あるいは、変異体アレルは、ＳＳＣＰ分析(Orita et al., Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989);and Humphries et al., “Molecular Diagnosis of Genetic Diseases”, Elles, Ed., pp. 321-340 (1996)を参照されたい)または変性グラジエントゲル電気泳動(Wartell et at., Nucl. Acids Res., Vol. 18, pp. 2699-2706 (1990);およびSheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, pp. 232-236 (1989)を参照されたい)によって同定され得る。
【０１６０】
また、ポリメラーゼ-媒介プライマー伸張方法を使用し、多型性を同定する。いくつかのこのような方法は、特許文献および化学文献に記載されており、“Genetic Bit Analysis”方法(WO 92/15712)およびリガーゼ/ポリメラーゼ媒介した遺伝子的bit分析（Genetic Bit Analysis）を包含する。U.S. Patent No. 5,679,524を参照されたい。関連方法はWO 91/02087、WO 90/09455、WO 95/17676、U.S. Patent Nos. 5,302,509および5,945,283で開示されている。多型性を含有する伸張プライマーは、U.S. Patent No. 5,605,798に記載されたように質量分析によって検出され得る。別のプライマー伸張方法は、アレル-特異的ＰＣＲである。Ruafio et al., Nucl. Acids Res., Vol. 17, p. 8392 (1989); Ruafio et al., Nucl. Acids Res., Vol. 19, pp. 6877-6882 (1991)；WO 93/22456; and Turki et al., J. Clin. Invest., Vol. 95, pp. 1635-1641 (1995)を参照されたい。さらに、複数多型部位は、Wallace et al., WO 89/10414に記載のようなアレル-特異的なプライマーの対を用いて、核酸の複数領域を同時に増幅することによって調査し得る。
【０１６１】
好ましい実施態様において、各民族地理的学(ethnogeographic)群に対するハプロタイプの頻度データについて、ハーディ・ワインベルグ平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)と一致するかどうかを決定するために試験した。ハーディ・ワインベルグ平衡(Hartl et al., “Principles of Population Genomics”, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 3rd Edition (1997)を参照されたい)は、ハプロタイプ対Ｈ1/Ｈ2を見出す頻度が、Ｈ1≠Ｈ2の場合はｐＨ−Ｗ(Ｈ1/Ｈ2)＝２ｐ(Ｈ１)ｐ（Ｈ2)、そしてＨ1＝Ｈ2の場合はｐＨ−Ｗ(Ｈ1/Ｈ2)＝ｐ(Ｈ1)ｐ(Ｈ2)と等しいと仮定する。観察したハプロタイプ頻度と予測したハプロタイプ頻度との統計学的差違は、個体群において、遺伝子型判定プロセスにおいて、著しい近親交配、遺伝子に対する強力な選択的圧力、サンプリングのバイアスおよび／またはエラーを包含する１以上のファクターを理由とすることができる。ハーディ・ワインベルグ平衡からの大きな偏差が民族地理的学群で観察される場合、各個体の数は、該偏差がサンプリングのバイアスによるかどうかを知るために増やされ得る。より大きなサンプルサイズが、観察されたハプロタイプの対の頻度と予測されたハプロタイプの対の頻度との差違を低下させない場合、次に直接的なハプロタイプ方法、例えば、CLASPER SYSTEM（登録商標）技術(U.S. Patent No. 5,866,404)、ＳＭＤまたはアレル-特異的な長期のＰＣＲを用いて、個体のハプロタイプを決定することを考えることが望まれる。Michalotos-Beloin et al., Nucl. Acids Res., Vol. 24, pp. 4841-4843 (1996)を参照されたい。
【０１６２】
ＡpoＥハプロタイプの対を予測するための方法の一実施態様において、割り当てステップは、次の分析を行うことを包含する。第一に、可能性のあるハプロタイプの各対を、参照集団においてハプロタイプの対と比較する。一般的に、参照集団におけるハプロタイプの対のうちの１つのみが、可能性のあるハプロタイプの対に一致し、その対は、各個体に割り当てる。ときには、参照ハプロタイプの対において示される１つのハプロタイプのみが、個体について可能性のあるハプロタイプの対と一致し、このような場合には、個体は、可能性のあるハプロタイプの対からこの既知のハプロタイプおよび新規ハプロタイプを含有するハプロタイプの対を割り当てる。まれな場合において、参照配列においてハプロタイプが可能性のあるハプロタイプの対と一致しないか、あるいは複数の参照ハプロタイプの対が可能性のあるハプロタイプの対と一致する。このような場合には、個体は、直接的な分子ハプロタイプ決定法（a direct molecular haplotyping）、例えば、CLASPER SYSTEM（登録商標）技術(U.S. Patent No. 5,866,404)、ＳＭＤまたはアレル特異的なlong-rangeＰＣＲを用いて、ハプロタイプ決定するのが好ましい。Michalotos-Beloin et al., 上掲, を参照されたい。)。
【０１６３】
用語解説
明細書中で使用する「抗体」なる用語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ、一本鎖およびヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他のイムノグロブリン発現ライブラリーの産物を包含するＦａｂフラグメントを包含する。
「ポリヌクレオチド」は、一般的に、あらゆるポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ)またはポリデオキシリボヌクレオチド(ＤＮＡ)を示し、これは、修飾されないか、または修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖部分の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡならびに一本鎖および二本鎖部分の混合物であるＲＮＡ、一本鎖またはより一般的には二本鎖もしくは一本鎖および二本鎖部分の混合物であるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するが、これに限定しない。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖部分を示す。また、用語「ポリヌクレオチド」は、安定性あるいは他の理由のために修飾されたバックボーンを有する１以上の修飾された塩基およびＤＮＡまたはＲＮＡを含有する、ＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。
【０１６４】
引用文献
本明細書に引用した全ての文献を出典明示により本明細書の一部とし、個々の刊行物または特許または特許出願が具体的にまた個別に示した全てを文献として、出典明示により本明細書の一部とする。さらに、本明細書に引用した全てのGenBank 受託番号、Unigene Cluster番号およびタンパク質受託番号は、具体的、また個別に、全ての目的のためにその全ての番号を、出典明示により本明細書の一部とする。
本発明は、本出願において特定の態様に関して限定するものではなく、本発明の個々の態様の１つの説明として示唆される。この発明に関する多くの修飾および改変は、本発明の考えや範囲から逸脱することなく、なし得るものであると当業者には明白であろう。本発明の範囲内で機能的かつ等価な方法および器具は、本明細書中に挙げたものに加えて、前述の説明と添付の図面から、当業者には明白であろう。このような修飾および改変は、添付した請求の範囲の項目と共に、かかる請求の範囲と等価である全ての範囲にのみ限られる。
【国際調査報告】
2005534710.tif 000007
2005534710.tif 000008
2005534710.tif 000009
2005534710.tif 000010