(57)【要約】本発明は、アスペルギルス・オクラセウス胞子のｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡライブラリーより単離した、新規チトクロムＰ４５０様酵素（アスペルギルス・オクラセウス）に関する。１１アルファ水酸化酵素をコードするｃＤＮＡを、電子供与体としてヒト酸化還元酵素をコードするｃＤＮＡと、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ−９）昆虫細胞で同時発現すると、該水酸化酵素は、ＨＰＬＣ解析で測定されるように、ステロイド基質４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）から１１アルファ−ヒドロキシ−ＡＤへの変換を触媒するのに成功した。本発明はまた、相補体、相同体および断片を含む、これらのｃＤＮＡに関連するか、またはこれらに由来する核酸分子、並びにこれらの核酸分子を用いて、例えばそのポリペプチドおよび断片を生成する方法にも関する。本発明はまた、Ａ．オクラセウス１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素を認識する抗体の生成、並びにこれらの抗体を用いて、それぞれ非修飾および形質転換宿主細胞内の、これらの天然および組換えポリペプチドの存在を検出する方法にも関する。本発明はまた、異種宿主細胞において、ヒトまたはアスペルギルス酸化還元酵素と別個に、または該酵素と組み合わせて、アスペルギルス１１アルファ水酸化酵素遺伝子を発現して、ステロイド基質の１１アルファヒドロキシ対応物への生物変換を促進する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）１１アルファ水酸化酵素をコードする単離精製核酸。
【請求項２】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項３】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする単離ｃＤＮＡ。
【請求項４】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする単離遺伝子。
【請求項５】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする、遺伝子の単離対立遺伝子。
【請求項６】
核酸配列が配列番号１に示すとおりである単離精製核酸。
【請求項７】
ＤＮＡ配列が配列番号１に示すとおりである単離ＤＮＡ。
【請求項８】
ｃＤＮＡ配列が配列番号１に示すとおりである単離ｃＤＮＡ。
【請求項９】
遺伝子配列が配列番号１に示すとおりである単離遺伝子。
【請求項１０】
遺伝子配列が配列番号１に示すとおりである、遺伝子の単離対立遺伝子。
【請求項１１】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸配列を有する単離タンパク質。
【請求項１２】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸配列を有する、タンパク質の単離変異体。
【請求項１３】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質。
【請求項１４】
タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２に示すとおりである単離タンパク質。
【請求項１５】
タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２に示すとおりである、タンパク質の単離変異体。
【請求項１６】
アミノ酸配列が、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項１７】
アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも９９％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項１８】
アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも９５％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも９０％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項２０】
アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも７５％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項２１】
アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも５０％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項２２】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ酸化還元酵素をコードする単離精製核酸。
【請求項２３】
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項２４】
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離ｃＤＮＡ。
【請求項２５】
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離遺伝子。
【請求項２６】
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする、遺伝子の単離対立遺伝子。
【請求項２７】
核酸配列が配列番号５に示すとおりである単離精製核酸。
【請求項２８】
ＤＮＡ配列が配列番号５に示すとおりである単離ＤＮＡ。
【請求項２９】
ｃＤＮＡ配列が配列番号５に示すとおりである単離ｃＤＮＡ。
【請求項３０】
遺伝子配列が配列番号５に示すとおりである単離遺伝子。
【請求項３１】
遺伝子配列が配列番号５に示すとおりである、遺伝子の単離対立遺伝子。
【請求項３２】
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を有する単離タンパク質。
【請求項３３】
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を有する、タンパク質の単離変異体。
【請求項３４】
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質。
【請求項３５】
タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６に示すとおりである単離タンパク質。
【請求項３６】
タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６に示すとおりである、タンパク質の単離変異体。
【請求項３７】
アミノ酸配列が、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を持つ配列番号６を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項３８】
アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも９９％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項３９】
アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも９５％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項４０】
アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも９０％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項４１】
アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも７５％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項４２】
アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも５０％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項４３】
３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能な酵素をコードする、単離精製核酸。
【請求項４４】
前記酵素が、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない、請求項４３の単離精製核酸。
【請求項４５】
前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、請求項４３または請求項４４の単離精製核酸。
【請求項４６】
前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ
からなる群より選択される、請求項４５の単離精製核酸。
【請求項４７】
前記水酸化が、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである、請求項４６の単離精製核酸。
【請求項４８】
３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒可能なタンパク質を発現する方法であって；
（ａ）前記タンパク質をコードする核酸に操作可能であるように連結したプロモーターを含んでなる発現カセットで、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし、そして
（ｂ）前記宿主細胞において、前記タンパク質を発現する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項４９】
前記タンパク質を回収する工程をさらに含んでなる、請求項４８のタンパク質産生法。
【請求項５０】
前記タンパク質がアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素である、請求項４８または請求項４９の方法。
【請求項５１】
電子供与体タンパク質を発現することをさらに含んでなり、前記電子供与体タンパク質が、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒可能な前記タンパク質に、電子を供与することが可能である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
電子供与体タンパク質が、ヒト酸化還元酵素およびアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素からなる群より選択される、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記電子供与体タンパク質がアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である、請求項５１の方法。
【請求項５４】
前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素および前記電子供与体タンパク質をコードする核酸が、別個の発現カセット上にある、請求項５１の方法。
【請求項５５】
前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素および前記電子供与体タンパク質をコードする核酸が、同一発現カセット上にある、請求項５１の方法。
【請求項５６】
前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素がアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素であり、そして前記電子供与体タンパク質がヒト酸化還元酵素である、請求項５４または請求項５５の方法。
【請求項５７】
前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素がアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素であり、そして前記電子供与体タンパク質がアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である、請求項５４または請求項５５の方法。
【請求項５８】
前記発現カセットが発現ベクター上にある、請求項４８の方法。
【請求項５９】
前記発現ベクターがバキュロウイルスである、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記バキュロウイルスが、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルスおよびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多核体病ウイルスからなる群より選択される、核多核体病ウイルスである、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記核多核体病ウイルスがオートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルスである、請求項６０の方法。
【請求項６２】
前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項５８の方法。
【請求項６３】
前記昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、オートグラファ・カリフォルニカ、およびマンデュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）細胞からなる群より選択される、請求項６２の方法。
【請求項６４】
前記昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルダ細胞である、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素が配列番号２である、請求項４８〜６４のいずれか１項の方法。
【請求項６６】
前記ヒト酸化還元酵素が配列番号４である、請求項４８〜６４のいずれか１項の方法。
【請求項６７】
前記アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素が配列番号６である、請求項４８〜６４のいずれか１項の方法。
【請求項６８】
３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能である、単離精製ポリペプチド。
【請求項６９】
前記酵素が、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない、請求項６８の単離精製ポリペプチド。
【請求項７０】
前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、請求項６８または請求項６９の単離精製ポリペプチド。
【請求項７１】
前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ
からなる群より選択される、請求項７０の単離精製ポリペプチド。
【請求項７２】
前記水酸化が、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである、請求項７１の単離精製酵素。
【請求項７３】
３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能なポリペプチドをコードする単離精製核酸に、操作可能であるように連結したプロモーターを含んでなる、発現カセット。
【請求項７４】
前記ポリペプチドが、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない、請求項７３の発現カセット。
【請求項７５】
前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、請求項７３または請求項７４の発現カセット。
【請求項７６】
前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ
からなる群より選択される、請求項７５の発現カセット。
【請求項７７】
前記水酸化が、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである、請求項７６の発現カセット。
【請求項７８】
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離精製核酸に、操作可能であるように連結したプロモーターを含んでなる、発現カセット。
【請求項７９】
前記核酸が配列番号０６である、請求項７８の発現カセット。
【請求項８０】
シトステロールからエプレレノンへの合成の代謝経路由来の酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる発現カセットであって、前記酵素が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、少なくとも１つの変換を触媒し、そして異種ＤＮＡが、組換え宿主において、コードされる酵素を発現するのに必要な調節配列に、操作可能であるように連結されている、前記発現カセット。
【請求項８１】
異種ＤＮＡコード配列が、以下の属および種：アスペルギルス・オクラセウス、アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、ストレプトミセス・フラディエー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・クルシビエー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｒｕｃｉｖｉａｅ）、トリコテシウム・ロゼウム（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、リゾプス・アーヒズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、アブシディア・コイルラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｅｒｕｌａ）、アブシディア・グラウカ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｇｌａｕｃａ）、アクチノムコール・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アスペルギルス・フラビペス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ボーベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、ボトリオスフェーリア・オブツサ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｏｂｔｕｓａ）、カロネクトリア・デコラ（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ  ｄｅｃｏｒａ）、ケトミウム・コクリオデス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｃｏｃｈｌｉｏｄｅｓ）、コリネスポラ・カシコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）、カニングハメラ・ブラケスリーアナ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎａ）、カニングハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、カニングハメラ・エレガンス（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、カーブラリア・クラバタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ）、カーブラリア・ルナタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）、シリンドロカルポン・ラディシコラ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ）、エピコッカム・フミコラ（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ  ｂｕｔｌｅｒｉ）、ヒポミケス・クリソスペルマス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）、モノスポリウム・オリバセウム（Ｍｏｎｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｏｌｉｖａｃｅｕｍ）、モルティエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、ムコール・ムセド（Ｍｕｃｏｒ  ｍｕｃｅｄｏ）、ムコール・グリセオシアヌス（Ｍｕｃｏｒ  ｇｒｉｓｅｏｃｙａｎｕｓ）、ミロテシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）、ノカルディア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、パエシロミセス・カルネウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｎｅｕｓ）、ペニシリウム・パツルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ）、ピトミセス・アトルーリバセウス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、ピトミセス・シノドンティス（��ｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、ピクノスポリウム種（Ｐｙｃｎｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、サッカロポリスポラ・エリスレー（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅ）、セペドニウム・クリソスペルマム（Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｍ）、スタキリディウム・ビコロル（Ｓｔａｃｈｙｌｉｄｉｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・ヒクロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｑｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトミセス・パープラセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）、シンセファラストラム・ラセモザム（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ）、タムノスティルム・ピリフォルメ（Ｔｈａｍｎｏｓｔｙｌｕｍ  ｐｉｒｉｆｏｒｍｅ）、シエラビア・テリコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、およびバーティシリウム・テオブロメー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）、セファロスポリウム・アフィディコラ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）、コクリオボルス・ルナタス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａｓ）、ティエグヘメラ・オルキディス（Ｔｉｅｇｈｅｍｅｌｌａ  ｏｒｃｈｉｄｉｓ）、ティエグヘメラ・ヒアロスポラ（Ｔｉｅｇｈｅｍｅｌｌａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）、モノスポリウム・オリバセウム、アスペルギルス・ウスツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、バーティシリウム・グラウクム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、およびリゾプス・ニグリカンス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）からなる群より選択されることで特徴付けられる、請求項８０記載の発現カセット。
【請求項８２】
属および種が、アスペルギルス・オクラセウス、アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニダランス、リゾプス・オリゼー、リゾプス・ストロニファー、ストレプトミセス・フラディエー、巨大菌、シュードモナス・クルシビエー、トリコテシウム・ロゼウム、フザリウム・オキシスポルム、リゾプス・アーヒズス、およびモノスポリウム・オリバセウムからなる群より選択される、請求項８１記載の発現カセット。
【請求項８３】
属種がアスペルギルス・オクラセウスである、請求項８２記載の発現カセット。
【請求項８４】
請求項８０記載の少なくとも１つの発現カセットを含んでなる、組換え宿主細胞およびその子孫。
【請求項８５】
宿主が微生物である、請求項８４記載の組換え宿主細胞およびその子孫。
【請求項８６】
宿主が細菌である、請求項８５記載の組換え宿主細胞およびその子孫。
【請求項８７】
シトステロールからエプレレノンへの合成の代謝経路由来の１以上の酵素を作成する方法であって、異種ＤＮＡにコードされる１以上の酵素が発現され、そして集積する条件下、栄養培地中で、請求項８６の組換え宿主細胞をインキュベーションすることを含んでなる、前記方法。
【請求項８８】
化合物を水酸化産物に選択的に酸化する方法であって：（ａ）水酸化しようとする化合物を、該化合物が水酸化され、そして水酸化産物が集積する条件下、請求項８６の組換え宿主細胞の存在下でインキュベーションし、そして（ｂ）水酸化産物を回収する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項８９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、化合物を水酸化産物に選択的に水酸化する方法であって：（ａ）水酸化しようとする化合物を、該化合物が水酸化され、そして水酸化産物が集積する条件下、請求項８８の方法で産生した酵素の存在下でインキュベーションし、そして（ｂ）水酸化産物を回収する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項９０】
請求項７３〜８３のいずれか１項の発現カセットを宿する宿主細胞。
【請求項９１】
前記発現カセットが、前記宿主細胞の染色体に組み込まれている、請求項９０の宿主細胞。
【請求項９２】
前記発現カセットが発現ベクターに組み込まれている、請求項９０の宿主細胞。
【請求項９３】
クローニングした１１アルファ水酸化酵素の比活性を測定する方法であって；
（ａ）前記１１アルファ水酸化酵素をコードする核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、
（ｂ）前記宿主細胞において、前記１１アルファ水酸化酵素を発現し；
（ｃ）前記細胞から細胞成分膜分画を調製し、
（ｄ）ステロイド基質と前記細胞成分膜分画ミクロソームをインキュベーションし、そして
（ｅ）ステロイド基質の１１アルファヒドロキシステロイド対応物への変換を監視する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項９４】
酸化還元酵素をコードする発現ベクター核酸で宿主細胞を形質転換し、そして前記宿主細胞において、前記酸化還元酵素を発現することをさらに含んでなる、請求項９３の方法。
【請求項９５】
前記酸化還元酵素がヒトまたはアスペルギルス・オクラセウスである、請求項９４の方法。
【請求項９６】
前記酸化還元酵素がヒト酸化還元酵素である、請求項９５の方法。
【請求項９７】
前記酸化還元酵素がアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である、請求項９５の方法。
【請求項９８】
配列番号２に少なくとも９５％同一であり、そして３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒し、前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、配列番号２を有するタンパク質およびその変異体。
【請求項９９】
３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない、請求項９８のタンパク質。
【請求項１００】
アミノ酸配列が、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５からなる群より選択される、精製ポリペプチド。
【請求項１０１】
アミノ酸配列が配列番号２の少なくとも１０の連続する残基を含んでなる、精製免疫原性ポリペプチド。
【請求項１０２】
配列番号２に示すようなアミノ酸配列を有する１１アルファ水酸化酵素に結合特異性を有する、単離精製抗体。
【請求項１０３】
（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；
（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；
（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および
（ｅ）アミノ酸、配列番号２５
からなる群より選択されるタンパク質領域に結合する、請求項１０２の抗体。
【請求項１０４】
前記抗体がペプチドカラム上で精製され、前記ペプチドが：
（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；
（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；
（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および
（ｅ）アミノ酸、配列番号２５
からなる群より選択される、請求項１０２または請求項１０３の抗体。
【請求項１０５】
アミノ酸配列が配列番号２６からなる群より選択される、精製ポリペプチド。
【請求項１０６】
アミノ酸配列が配列番号６の少なくとも１０の連続する残基を含んでなる、精製免疫原性ポリペプチド。
【請求項１０７】
配列番号６に示すようなアミノ酸配列を有する１１アルファ水酸化酵素に結合特異性を有する、単離精製抗体。
【請求項１０８】
（ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および
（ｃ）アミノ酸、配列番号２６
からなる群より選択されるタンパク質領域に結合する、請求項１０７の抗体。
【請求項１０９】
前記抗体がペプチドカラム上で精製され、前記ペプチドが：
（ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および
（ｃ）アミノ酸、配列番号２６
からなる群より選択される、請求項１０７または請求項１０８の抗体。
【請求項１１０】
請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体、および有効なキャリアー、ビヒクル、または補助剤を含んでなる組成物。
【請求項１１１】
請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体および溶液を含んでなる組成物。
【請求項１１２】
ポリクローナル抗体である、請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体。
【請求項１１３】
モノクローナル抗体である、請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体。
【請求項１１４】
免疫親和性マトリックスにコンジュゲート化した、請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体。
【請求項１１５】
請求項１１４の免疫親和性マトリックスを用いて、生物学的液体または細胞溶解物からポリペプチドを精製する方法。
【請求項１１６】
前記免疫親和性マトリックスがＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ４Ｂである、請求項１１４の抗体。
【請求項１１７】
請求項１１６の免疫親和性マトリックスを用いて、生物学的液体または細胞溶解物からポリペプチドを精製する方法。
【請求項１１８】
ペプチドカラムを用いて抗体を精製する方法であって、前記ペプチドが：
（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；
（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；
（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および
（ｅ）アミノ酸、配列番号２５
からなる群より選択される、前記方法。
【請求項１１９】
ペプチドカラムを用いて抗体を精製する方法であって、前記ペプチドが：
（ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および
（ｃ）アミノ酸、配列番号２６
からなる群より選択される、前記方法。
【請求項１２０】
生物学的液体において、第一のポリペプチドを検出する方法であって、前記の第一のポリペプチドが１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素からなる群より選択され、以下の：
（ａ）前記液体を、前記の第一のポリペプチドに結合特異性を有する第二のポリペプチドと接触させ、そして
（ｂ）前記の第二のポリペプチドの存在をアッセイして、前記の第一のポリペプチドのレベルを決定する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１２１】
前記の第二のポリペプチドが抗体である、請求項１２０の方法。
【請求項１２２】
前記の第二のポリペプチドが放射標識されている、請求項１２０または請求項１２１の方法。
【請求項１２３】
６ｘＳＳＣおよび６５℃中で、配列番号１をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、そして配列番号１で検出した核酸を単離することを含んでなる、単離核酸を産生する方法。
【請求項１２４】
請求項１２３の方法にしたがって調製した、単離ＤＮＡ核酸。
【請求項１２５】
配列番号１に示す配列の相補体に、非常にストリンジェントな条件下で、特異的にハイブリダイズする、単離核酸。
【請求項１２３】
６ｘＳＳＣおよび６５℃中で、配列番号５をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、そして配列番号５で検出した核酸を単離することを含んでなる、単離核酸を産生する方法。
【請求項１２４】
請求項１２３の方法にしたがって調製した、単離ＤＮＡ核酸。
【請求項１２５】
配列番号５に示す配列の相補体に、非常にストリンジェントな条件下で、特異的にハイブリダイズする、単離核酸。
【請求項１２６】
細胞の染色体ＤＮＡに挿入した際、通常は細胞で発現されないステロイド１１アルファ水酸化酵素遺伝子の発現を改変する、ＤＮＡ構築物であって：
ａ）ターゲティング配列；
ｂ）制御配列；および
ｃ）ステロイド１１アルファ水酸化酵素の構造遺伝子
を含んでなる、前記ＤＮＡ構築物。
【請求項１２７】
請求項１２６のＤＮＡ構築物を宿する宿主細胞。
【請求項１２８】
心臓疾患、炎症、関節炎、または癌を治療する、療法適用の医薬品製造のための、クローニングした１１アルファ水酸化酵素を宿する宿主細胞の使用。
【請求項１２９】
約０．５−５００ｇ／ｌ糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）、０．５−５０ｇ／ｌトウモロコシ浸染（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ）液、０．５−５０ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、２．５−２５０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２．５−２５０ｇ／ｌグルコース、および０．０４−４ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ３．５−７を含んでなる組成物。
【請求項１３０】
約１０−２５０ｇ／ｌ糖蜜、１−２５ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、１−２５ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、５−１２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、５−１２５ｇ／ｌグルコース、および０．０８−２ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ４．５−６．５を含んでなる組成物。
【請求項１３１】
約２５−１００ｇ／ｌ糖蜜、２．５−１０ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、２．５−１０ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、１２．５−５０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１２．５−５０ｇ／ｌグルコース、および０．２−０．８ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ５．５−６．０を含んでなる組成物。
【請求項１３２】
５０ｇ／ｌ糖蜜、５ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、５ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２５ｇ／ｌグルコース、２０ｇ／ｌ寒天、および０．４ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ５．８を含んでなる組成物。
【請求項１３３】
約４−１００ｇ／ｌ寒天をさらに含んでなる、請求項１２９〜１３２のいずれか１項の組成物。
【請求項１３４】
約１０−４０ｇ／ｌ寒天をさらに含んでなる、請求項１２９〜１３２のいずれか１項の組成物。
【請求項１３５】
約２０ｇ／ｌ寒天をさらに含んでなる、請求項１２９〜１３２のいずれか１項の組成物。
【請求項１３６】
アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニダランス、リゾプス・オリゼー、リゾプス・ストロニファー、およびトリコテシウム・ロゼウム、フザリウム・オキシスポルム、リゾプス・アーヒズス、モノスポリウム・オリバセウム、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、およびアブシディア・コイルラからなる群より選択される微生物から胞子を産生する、請求項１２９〜１３５のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項１３６】
アスペルギルス・オクラセウスから胞子を産生する、請求項１２９〜１３５のいずれか１項の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
優先権
本出願は、米国特許法§１１９に基づいて、米国仮出願第６０／２４４，３００号、２０００年１０月３０日出願の優先権を請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）胞子のｍＲＮＡから生成したｃＤＮＡライブラリーより単離した、新規チトクロムＰ４５０様酵素（アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素）および酸化還元酵素（アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素）に関する。１１アルファ水酸化酵素をコードするｃＤＮＡを、電子供与体としてヒト酸化還元酵素をコードするｃＤＮＡと、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ−９）昆虫細胞で同時発現すると、該水酸化酵素は、ＨＰＬＣ解析で測定されるように、ステロイド基質４−アンドロステン−３，１７−ジオン（ＡＤ）から１１アルファ−ヒドロキシ−ＡＤへの変換を触媒するのに成功した。本発明はまた、相補体、相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）および断片を含む、これらのｃＤＮＡに関連するか、またはこれらに由来する核酸分子、並びにこれらの核酸分子を用いて、例えばそのポリペプチドおよび断片を生成する方法にも関する。本発明はまた、Ａ．オクラセウス１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素を認識する抗体の生成、並びにこれらの抗体を用いて、それぞれ非修飾および形質転換宿主細胞内の、これらの天然および組換えポリペプチドの存在を検出する方法にも関する。本発明はまた、異種宿主細胞において、ヒトまたはアスペルギルス酸化還元酵素と別個に、または該酵素と組み合わせて、アスペルギルス１１アルファ水酸化酵素遺伝子を発現して、ステロイド基質の１１アルファヒドロキシ対応物への生物変換を促進する方法も提供する。
【０００３】
発明の背景
微生物変換または生物変換反応は、非常に多様な薬剤製品の化学合成を促進するのに、長く使用されてきている。穏やかな酵素条件下で行う立体特異的反応は、しばしば、望ましくない副産物を生じる、同等の化学法に勝る利点を提供する。微生物はまた、基質分子に対して、同時に独立した、または連続する反応を行う能力も有し、合成における別個の工程数を最小限にし、そして望ましい中間産物および最終産物の総コストを減少させる。
【０００４】
有機化合物の変換に、生体触媒として用いられる微生物系の一般的な特徴が概説されている（例えばＧｏｏｄｈｕｅ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｔ．，  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｃｏｍｐｄ．，  １：９−４４，  １９８２を参照されたい）。生物変換は、例えば、連続培養またはバッチ培養中で行うことが可能である。微生物から分泌させた酵素を基質と反応させ、そして産物を培地から回収することが可能である。基質が能動または受動拡散過程によって細胞に進入可能であるならば、細胞内酵素もまた、基質と反応することが可能である。固定、乾燥、透過性、および休止細胞、並びに胞子もまた、微生物変換に用いられてきている。細胞抽出物および溶液中の精製酵素、またはキャリアー上に固定されたものの使用は、最終的に、伝統的な発酵法に勝る、かなりのコストまたは管理上の利点を提供する可能性がある。
【０００５】
生物変換反応は、ステロイドの分野で広く用いられてきている（Ｋｉｅｓｌｉｃｈ，  Ｋ．；Ｓｅｂｅｋ，  Ｏ．Ｋ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｐ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ３：２７５−３０４，  １９７９；Ｋｉｅｓｌｉｃｈ，  Ｋｌａｕｓ．  Ｅｃｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ５（Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｂｉｏｃｎｖｅｒｓ．）：３６９−４６５，  １９８０）。水酸化、エポキシ化、酸化、脱水素、環および側鎖分解、還元、加水分解、および異性化反応を含む、多様な反応が性質決定されてきている。例えば、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、放線菌属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のように広い種を含む、多様な種類の微生物もまた用いられてきている。
【０００６】
商業的に重要なステロイド化合物の合成で用いる中間産物の水酸化を促進するのに、多様なアプローチが用いられてきている。米国特許第４，５８８，６８３号は、例えば、１１ベータ水酸化を達成可能なカーブラリア属（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）の真菌培養を含んでなる培地中で、基質化合物をインキュベーションすることによって、１１ベータ、１７アルファ、２０，２１テトラヒドロキシステロイドを調製する方法を記載する。アスペルギルス・オクラセウス培養および菌糸体の調製はまた、プロゲステロンおよび他のステロイドを、対応する１１アルファヒドロキシ型に変換するのにも用いられてきている（Ｔａｎ，  Ｌ．およびＦａｌａｒｄｅａｕ，  Ｐ．，  １９７０；Ｔａｎ  Ｌ．，およびＦａｌａｒｄｅａｕ  Ｐ．，  Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １：２２１−２２７，  １９７０；Ｓａｍａｎｔａ，  Ｔ．Ｂ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １７６，  ５９３−５９４，  １９７８；Ｊａｙａｎｔｈｉ，  Ｃ．Ｒ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １０６：１２６２−１２６８，  １９８２）。
【０００７】
非常に多様な障害の治療のため、ステロイドの新規のそして拡大された臨床的使用が出現したことで、商業規模でのステロイド化合物およびその中間産物の改善された産生法に関する必要性が生まれた。米国特許第４，５５９，３３２号は、例えば、エプレレノン、メチル水素９，１１α−エポキシ−１７α−ヒドロキシ−３−オキソプレグン−４−エン−７α，２１−ジカルボキシレート，  γラクトン（エプレレノンまたはエポキシメクスレノンとも称される）および関連化合物の調製法を含む、ステロイド化合物の一連の２０−スピロキサンの調製法をいくつか記載する。ＷＯ  ９８／２５９４８および米国出願０９／３１９，６７３は、９，１１−エポキシステロイド化合物の新規調製法、特に一連の２０−スピロキサンおよびその類似体のもの、ステロイド化合物の調製に有用な新規中間産物、並びにこうした新規中間産物の調製法を記載する。米国特許第６，０４６，０２３号は、１０ｇ／ｌより高い濃度で、９７％未満でそして９０％を超える純度を有するステロイド基質を用い、アスペルギルス属、リゾプス属、およびペステロティア属（Ｐｅｓｔｅｌｏｔｉａ）の微生物を用いて、カンレノンまたはエストル−４−エン−３，１７−ジオンを１１α−ヒドロキシ類似体に微生物変換するための改善法を開示する。
【０００８】
特定のステロイド中間産物の生物変換を最適にするのに必要な、多くの現代の系統的なアプローチは、しばしば、合成および分解に関与する酵素の生化学的な知識が不十分であるため、妨害されている。真核チトクロムＰ４５０は、小胞体（ＥＲ）またはミトコンドリア膜と結合しているようである。ＥＲ結合チトクロムＰ４５０酵素の電子供与体は、しばしば、ＦＡＤ／ＦＭＮ依存ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０酸化還元酵素である。ミトコンドリアチトクロムＰ４５０における電子伝達は、通常、ＮＡＤＰＨ−フェレドキシン酸化還元酵素およびフェロドキシンによって仲介される。哺乳動物ステロイド生成に関与することが知られる特定の電子供与体はまた、それぞれ、アドレノドキシン還元酵素およびアドレノドキシンと呼ばれる。
【０００９】
真菌生物変換は、チトクロムＰ４５０酵素に仲介されることが知られるが、これらの酵素の多くは、酵素的に活性である型で精製するのが極端に困難である（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋら，  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３，  １−１７，  １９９８）。多くの真菌Ｐ４５０酵素は、小胞体と結合しているようである（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋら，  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３，  １−１７，  １９９８）。酵母は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、哺乳動物１１ベータ水酸化酵素とカップリングすることが示されたアドレノドキシン還元酵素相同体を有する（Ｌａｃｏｕｒら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３，  ２３９８４−２３９９２，  １９９８）。対照的に、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素とカップリングする電子供与体は、ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０酸化還元酵素であると予測された（ＳａｍａｎｔａおよびＧｈｏｓｈ，  Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２８，  ３２７−３２，  １９８７）。リゾプス・ニグリカンス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）におけるステロイド１１アルファ水酸化複合体もまた、ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０酸化還元酵素を必要とするようである（ＭａｋｏｖｅｃおよびＢｒｅｓｋｖａｒ，  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５７，  ３１０−６，  １９９８）。プロゲステロン誘導真菌菌糸体の調製における、チトクロムＲ．ニグリカンスＰ４５０およびＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素活性の増幅は、両酵素の生化学的性質決定を容易にすることが可能である（ＭａｋｏｖｅｃおよびＢｒｅｓｋｖａｒ，  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ−Ｅｕｒ  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４３９（Ｓｕｐｐｌ）：Ｒ１１１−Ｒ１１２，  ２０００）。
【００１０】
アスペルギルス・オクラセウス胞子は、プロゲステロンなどのステロイド基質の１１アルファ水酸化を触媒することが示されている（Ｄｕｔｔａ  ＴＫ，  Ｄａｔｔａ  Ｊ，  Ｓａｍａｎｔａ  ＴＢ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １９２：１１９−１２３，  １９９３）。Ａ．フミガツス（Ａ．  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）もまた、ステロイド１１アルファ水酸化酵素活性を示すことが知られる（Ｓｍｉｔｈら，  Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４９：９３−１００，  １９９４）。Ａ．フミガツス酵素は、非誘導性であるらしいＡ．オクラセウス水酸化酵素と異なり、１１アルファおよび１５ベータ水酸化に二重の部位特異性を持つチトクロムＰ４５０であるらしい点で、Ａ．オクラセウス酵素と区別される。
【００１１】
配列決定技術の最近の進歩にもかかわらず、ヌクレオチド配列データから拾い集めた真菌チトクロムＰ４５０の構造的関係に関する詳細な知識は、初歩的なままである。Ｂｒｅｓｋｖａｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９１；１７８，  １０７８−１０８３，  １９９１）は、プロゲステロンの１１α水酸化酵素をコードする、リゾプス・ニグリカンス由来の推定上のＰ−４５０のゲノムＤＮＡ配列を記載している。しかし、この配列は、予測されるアミノ酸配列が、ほぼすべての既知のチトクロムＰ−４５０酵素に共通の標準的なヘム結合モチーフＦｘｘＧｘｘｘＣｘＧを欠くため、完全でない可能性がある（Ｎｅｌｓｏｎら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１−４２，  １９９６）。
【００１２】
クロコウジカビのＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０酸化還元酵素（ｃｐｒＡ）遺伝子のクローニングおよび性質決定が記載されてきている（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ，  Ｊ．ら、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｚ２６９３８、ＣＡＡ８１５５０、１９９３、未公表）。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の一次構造もまた、クローニングされた遺伝子のヌクレオチド配列から推定されてきている（Ｙａｂｕｓａｋｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０３（６）：１００４−１０１０，  １９８８）。
【００１３】
ステロイド酵素のクローニングおよび解析を容易にするのに、いくつかの他のアプローチが用いられてきている。例えば、米国特許第５，４２２，２６２号、第５，６７９，５２１号、および欧州特許第ＥＰ  ０  ５２８  ９０６  Ｂ１号は、２型ステロイド５アルファ還元酵素の発現クローニングを記載する。米国特許第５，８６９，２８３号は、例えば、コレステロールのプレグネノロンへの変換；プレグネノロンのプロゲステロンへの変換；プロゲステロンの１７α−ヒドロキシ−プロゲステロンへの変換；１７α−ヒドロキシプロゲステロンのコルテキソロンへの変換；およびコルテキソロンのヒドロコルチゾンへの変換を含む、コレステロールのヒドロコルチゾンへの変換に関与する酸化工程を各々触媒する、２以上の酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる発現カセットを記載する。
【００１４】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびＡ．オクラセウス酸化還元酵素の配列は報告されてきていない。その配列に関する知識は、宿主株が部分的にしか性質決定されていないか、またはステロイド生成に関与する酵素の理解が不完全であることに関連する問題を伴わず、ステロイド中間産物のより効率的な生物変換および最終産物の商業規模での合成を実行可能な、発現ベクターおよび組換え宿主株の開発を非常に促進することが可能である。本発明は、ステロイドの１１アルファ水酸化を実行可能な酵素を同定することによって、上に論じる限界の多くを克服する。このアプローチは、１１アルファ水酸化の使用を非常に促進するだけでなく、他の真菌由来の類似酵素同定のための新規戦略の開発、アスペルギルス・オクラセウスおよび他の微生物由来の、ステロイド生成に関与する他の酵素のクローニング、並びに改善宿主株、あるいは生物変換反応において、遊離細胞または固定細胞または酵素を用いた改善法の開発も可能にする。類似のアプローチもまた、現在、大規模バイオリアクターにおける生物変換に通常用いられる野生型微生物より、増殖および管理がしやすい、発現ベクターおよび組換え宿主株の構築を補助するために、開発可能である。
【００１５】
発明の概要
最も広い側面において、本発明は、ステロイド代謝に関与する酵素をクローニングする方法、並びに新規ステロイド中間産物および最終産物を産生するためのこれらの酵素の使用を提供する。請求する本発明の１つの側面は、新規酵素１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素、並びにその核酸、タンパク質、ペプチド、断片、および相同体を提供することである。本発明はまた、ステロイド代謝に関与する他の酵素を同定し、そしてクローニングする方法にも関する。本発明はまた、新規ベクターおよび宿主細胞、上記ベクターを用いることによって異種タンパク質を作成する新規方法、並びにクローニングした酵素の基質特異性を同定する方法も含む。
【００１６】
本発明は、クローニングした１１アルファ水酸化酵素、その対立遺伝子変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）、および融合タンパク質の基質特異性を決定し、３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）を含む、多数のステロイド基質の評価を可能にする手段を提供する。試験のため好ましい基質には（ａ）カンレノン；（ｂ）アンドロステンジオン；（ｃ）アルドナ（ａｌｄｏｎａ）；（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）；（ｅ）メクスレノン；（ｆ）６ベータメクスレノン；（ｇ）９アルファメクスレノン；（ｈ）１２ベータメクスレノン；（ｉ）デルタ１２メクスレノン；（ｊ）テストステロン；（ｋ）プロゲステロン；（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンが含まれる。好ましくは、クローニングした１１アルファ水酸化酵素、その対立遺伝子変異体、突然変異タンパク質、および融合タンパク質は、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドからなる群より選択される基質の、１５アルファまたはベータ水酸化、６アルファまたはベータ水酸化、７アルファまたはベータ水酸化、９アルファまたはベータ水酸化、１２アルファまたはベータ水酸化、および１７アルファまたはベータ水酸化からなる群より選択される第二の水酸化もまた触媒することはない。最も好ましくは、クローニングした１１アルファ水酸化酵素、その対立遺伝子変異体、突然変異タンパク質、および融合タンパク質は、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドからなる群より選択される基質の１５ベータ水酸化を触媒しない。
【００１７】
本発明は、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする単離精製核酸を提供する。本発明はまた、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする単離ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子、および遺伝子の対立遺伝子もまた提供する。好ましくは、単離精製核酸は配列番号０１に示すとおりである。好ましくは、単離ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子、および遺伝子の対立遺伝子は、配列番号０１に示すとおりである。
【００１８】
本発明は、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸配列を有する単離タンパク質を提供する。本発明はまた、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素の単離変異体（ｖａｒｉａｎｔ）、およびこの水酸化酵素を含んでなる融合タンパク質もまた提供する。好ましくは、該タンパク質は配列番号２に示すとおりである。本発明はまた、配列番号２に示すタンパク質の変異体；少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２を含んでなるポリペプチド；配列番号２に少なくとも９９％、９５％、９０％、７５％、および５０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供する。
【００１９】
本発明は、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ酸化還元酵素をコードする単離精製核酸を提供する。本発明はまた、アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子、および遺伝子の対立遺伝子も提供する。好ましくは、単離精製核酸は配列番号５に示すとおりである。本発明はまた、配列番号５に示す単離ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子、および遺伝子の単離対立遺伝子も提供する。
【００２０】
本発明は、アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を有する単離タンパク質を提供する。本発明はまた、アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を有するタンパク質の単離変異体、およびアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質も提供する。好ましくは、単離タンパク質は配列番号６に示すアミノ酸配列を有する。本発明はまた、配列番号６に示すタンパク質の単離変異体；アミノ酸配列が、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を持つ配列番号６を含んでなる、精製ポリペプチド；およびアミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも９９％、９５％、９０％、７５％、および５０％同一であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドもまた提供する。
【００２１】
本発明は、３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能な酵素をコードする、単離精製核酸を提供する。好ましくは、該酵素は、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない。より好ましくは、該水酸化は：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトンからなる群より選択される。より好ましくは、該水酸化は：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤからなる群より選択される。最も好ましくは、該水酸化は、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである。
【００２２】
本発明はまた、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒可能なタンパク質を発現する方法であって；（ａ）前記タンパク質をコードする核酸に操作可能であるように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結したプロモーターを含んでなる発現カセットで宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし、そして（ｂ）前記宿主細胞において、前記タンパク質を発現することを含んでなる、前記方法も提供する。本発明はまた、前記タンパク質を回収する工程をさらに含んでなる、タンパク質産生法も提供する。好ましくは、このタンパク質はアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素である。より好ましくは、この方法は、電子供与体タンパク質を発現することをさらに含んでなり、前記電子供与体タンパク質は、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒可能な前記タンパク質に、電子を供与することが可能である。好ましくは、電子供与体タンパク質は、ヒト酸化還元酵素およびアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素からなる群より選択される。より好ましくは、電子供与体タンパク質はアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である。より好ましくは、前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素および前記電子供与体タンパク質をコードする核酸は、別個の発現カセット上にある。より好ましくは、前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素および前記電子供与体タンパク質をコードする核酸は、同一発現カセット上にある。さらにより好ましくは、ステロイド１１アルファ水酸化酵素はアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素であり、そして前記電子供与体タンパク質はヒト酸化還元酵素である。さらにより好ましくは、ステロイド１１アルファ水酸化酵素はアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素であり、そして前記電子供与体タンパク質はアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である。好ましくは、発現カセットは発現ベクター上にある。より好ましくは、発現ベクターはバキュロウイルスである。さらにより好ましくは、バキュロウイルスは、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルスおよびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多核体病ウイルスからなる群より選択される、核多核体病ウイルスである。最も好ましくは、核多核体病ウイルスはオートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルスである。好ましくは、宿主細胞は昆虫細胞である。より好ましくは、昆虫細胞はスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、オートグラファ・カリフォルニカ、およびマンデュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）細胞からなる群より選択される。最も好ましくは、昆虫細胞はスポドプテラ・フルギペルダ細胞である。本発明はまた、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素が配列番��２であり；ヒト酸化還元酵素が配列番号４であり；そしてアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素が配列番号６である、タンパク質発現法も提供する。
【００２３】
本発明はまた、３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能である、単離精製ポリペプチドも提供する。好ましくは、該ポリペプチドは、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない。より好ましくは、該水酸化は：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトンからなる群より選択される。より好ましくは、該水酸化は：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤからなる群より選択される。最も好ましくは、該水酸化は、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである。
【００２４】
本発明はまた、３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能なポリペプチドをコードする単離精製核酸に、操作可能であるように連結したプロモーターを含んでなる、発現カセットも提供する。より好ましくは、該水酸化は：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトンからなる群より選択される。より好ましくは、該水酸化は：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤからなる群より選択される。最も好ましくは、該水酸化は、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである。
【００２５】
本発明はまた、アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離精製核酸に、操作可能であるように連結したプロモーターを含んでなる、発現カセットも提供する。好ましくは、該核酸は配列番号６である。
【００２６】
本発明はまた、シトステロールからエプレレノンへの合成の代謝経路由来の酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる発現カセットであって、前記酵素が：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；および（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトンからなる群より選択される、少なくとも１つの変換を触媒し、そして異種ＤＮＡが、組換え宿主において、コードされる酵素を発現するのに必要な調節配列に、操作可能であるように連結されている、前記発現カセットも提供する。好ましくは、発現カセット中の異種ＤＮＡコード配列は、以下の属および種：アスペルギルス・オクラセウス、アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、ストレプトミセス・フラディエー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・クルシビエー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｒｕｃｉｖｉａｅ）、トリコテシウム・ロゼウム（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、リゾプス・アーヒズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、アブシディア・コイルラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｅｒｕｌａ）、アブシディア・グラウカ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｇｌａｕｃａ）、アクチノムコール・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アスペルギルス・フラビペス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ボーベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、ボトリオスフェーリア・オブツサ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｏｂｔｕｓａ）、カロネクトリア・デコラ（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ  ｄｅｃｏｒａ）、ケトミウム・コクリオデス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｃｏｃｈｌｉｏｄｅｓ）、コリネスポラ・カシコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ��ａｓｓｉｉｃｏｌａ）、カニングハメラ・ブラケスリーアナ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎａ）、カニングハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、カニングハメラ・エレガンス（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、カーブラリア・クラバタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ）、カーブラリア・ルナタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）、シリンドロカルポン・ラディシコラ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ）、エピコッカム・フミコラ（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ  ｂｕｔｌｅｒｉ）、ヒポミケス・クリソスペルマス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）、モノスポリウム・オリバセウム（Ｍｏｎｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｏｌｉｖａｃｅｕｍ）、モルティエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、ムコール・ムセド（Ｍｕｃｏｒ  ｍｕｃｅｄｏ）、ムコール・グリセオシアヌス（Ｍｕｃｏｒ  ｇｒｉｓｅｏｃｙａｎｕｓ）、ミロテシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）、ノカルディア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、パエシロミセス・カルネウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｎｅｕｓ）、ペニシリウム・パツルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ）、ピトミセス・アトルーリバセウス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、ピトミセス・シノドンティス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、ピクノスポリウム種（Ｐｙｃｎｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、サッカロポリスポラ・エリスレー（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅ）、セペドニウム・クリソスペルマム（Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｍ）、スタキリディウム・ビコロル（Ｓｔａｃｈｙｌｉｄｉｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・ヒクロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｑｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトミセス・パープラセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）、シンセファラストラム・ラセモザム（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ）、タムノスティルム・ピリフォルメ（Ｔｈａｍｎｏｓｔｙｌｕｍ  ｐｉｒｉｆｏｒｍｅ）、シエラビア・テリコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、およびバーティシリウム・テオブロメー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）、セファロスポリウム・アフィディコラ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）、コクリオボルス・ルナタス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａｓ）、ティエグヘメラ・オルキディス（Ｔｉｅｇｈｅｍｅｌｌａ  ｏｒｃｈｉｄｉｓ）、ティエグヘメラ・ヒアロスポラ（Ｔｉｅｇｈｅｍｅｌｌａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）、モノスポリウム・オリバセウム、アスペルギルス・ウスツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、バーティシリウム・グラウクム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、およびリ��プス・ニグリカンスからなる群より選択される。より好ましくは、属および種は、アスペルギルス・オクラセウス、アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニダランス、リゾプス・オリゼー、リゾプス・ストロニファー、ストレプトミセス・フラディエー、巨大菌、シュードモナス・クルシビエー、トリコテシウム・ロゼウム、フザリウム・オキシスポルム、リゾプス・アーヒズス、およびモノスポリウム・オリバセウムからなる群より選択される。最も好ましくは、属および種はアスペルギルス・オクラセウスである。
【００２７】
好ましくは、組換え宿主細胞およびその子孫は、少なくとも１つの発現カセットを含んでなる。より好ましくは、宿主は微生物である。最も好ましくは、宿主は細菌である。本発明はまた、シトステロールからエプレレノンへの変換の代謝経路由来の１以上の酵素を作成する方法であって、異種ＤＮＡにコードされる１以上の酵素が発現され、そして集積する条件下、栄養培地中で、組換え宿主細胞をインキュベーションすることを含んでなる、前記方法も提供する。より好ましくは、該方法は：（ａ）水酸化しようとする化合物を、該化合物が水酸化され、そして水酸化産物が集積する条件下、組換え宿主細胞の存在下でインキュベーションし、そして（ｂ）水酸化産物を回収する工程を含んでなる。最も好ましくは、該方法は：（ａ）酸化しようとする化合物を、該化合物が水酸化され、そして水酸化産物が集積する条件下、産生した酵素の存在下でインキュベーションし、そして（ｂ）水酸化産物を回収する工程を含んでなる。本発明はまた、発現カセットを宿する宿主細胞も提供する。より好ましくは、該発現カセットは、前記宿主細胞の染色体に組み込まれている。より好ましくは、該発現カセットは発現ベクターに組み込まれている。
【００２８】
本発明はまた、クローニングした１１アルファ水酸化酵素の比活性を測定する方法であって；（ａ）前記１１アルファ水酸化酵素をコードする核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、（ｂ）前記宿主細胞において、前記１１アルファ水酸化酵素を発現し；（ｃ）前記細胞から細胞成分膜分画を調製し、（ｄ）ステロイド基質と前記細胞成分膜分画をインキュベーションし、そして（ｅ）ステロイド基質の１１アルファヒドロキシステロイド対応物への変換を監視する工程を含んでなる、前記方法も提供する。好ましくは、さらなるものは、酸化還元酵素をコードする発現ベクター核酸で宿主細胞を形質転換し、そして前記宿主細胞において、前記酸化還元酵素を発現することを含んでなる。より好ましくは、該酸化還元酵素はヒトまたはアスペルギルス・オクラセウスである。最も好ましくは、該酸化還元酵素はヒト酸化還元酵素である。最も好ましくは、該酸化還元酵素はアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である。
【００２９】
本発明はまた、配列番号２に少なくとも９５％同一であり、そして３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒し、前記水酸化が：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；および（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロンからなる群より選択される、配列番号２を有するタンパク質およびその変異体も提供する。好ましくは、該酵素は、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない。
【００３０】
本発明は、３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能であり、該水酸化が：（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；および（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロンからなる群より選択される、酵素をコードする単離精製核酸も提供する。好ましくは、該酵素は、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない。
【００３１】
本発明はまた、アミノ酸配列が、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５からなる群より選択される、精製ポリペプチドも提供する。
【００３２】
本発明は、アミノ酸配列が配列番号２の少なくとも１０の連続する残基を含んでなる、精製免疫原性ポリペプチドを提供する。
【００３３】
本発明は、配列番号２に示すようなアミノ酸配列を有する１１アルファ水酸化酵素に結合特異性を有する、単離精製抗体を提供する。好ましくは、該抗体は、（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および（ｅ）アミノ酸、配列番号２５からなる群より選択されるタンパク質領域に結合する。好ましくは、該抗体はペプチドカラム上で精製され、前記ペプチドは：（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および（ｅ）アミノ酸、配列番号２５からなる群より選択される。
【００３４】
本発明はまた、アミノ酸配列が配列番号２６からなる群より選択される、精製ポリペプチドも提供する。
【００３５】
本発明はまた、アミノ酸配列が配列番号６の少なくとも１０の連続する残基を含んでなる、精製免疫原性ポリペプチドも提供する。
【００３６】
本発明はまた、配列番号６に示すようなアミノ酸配列を有する１１アルファ水酸化酵素に結合特異性を有する、単離精製抗体も提供する。好ましくは、該抗体は（ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および（ｃ）アミノ酸、配列番号２６からなる群より選択されるタンパク質領域に結合する。より好ましくは、抗体はペプチドカラム上で精製され、前記ペプチドは：（ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および（ｃ）アミノ酸、配列番号２６からなる群より選択される。
【００３７】
本発明はまた、有効なキャリアー、ビヒクル、または補助剤中、上述の抗体を含んでなる組成物も提供する。本発明はまた、こうした抗体および溶液を含んでなる組成物も提供する。抗体はポリクローナル抗体であることが可能である。抗体はまた、モノクローナル抗体であることも可能である。抗体は、免疫親和性マトリックスにコンジュゲート化することが可能である。本発明はまた、免疫親和性マトリックスを用いて、生物学的液体または細胞溶解物からポリペプチドを精製する方法も提供する。好ましくは、免疫親和性マトリックスはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ４Ｂである。より好ましくは、免疫親和性マトリックスを用いて、生物学的液体または細胞溶解物からポリペプチドを精製する方法は、免疫親和性マトリックスとしてＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ４Ｂを用いる。より好ましくは、免疫親和性マトリックスを用いて、生物学的液体または細胞溶解物からポリペプチドを精製する方法は、免疫親和性マトリックスとしてＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ４Ｂを用いる。
【００３８】
本発明はまた、ペプチドカラムを用いて抗体を精製する方法であって、前記ペプチドが：（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および（ｅ）アミノ酸、配列番号２５からなる群より選択される、前記方法も提供する。
【００３９】
本発明はまた、ペプチドカラムを用いて抗体を精製する方法であって、前記ペプチドが：（ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および（ｃ）アミノ酸、配列番号２６からなる群より選択される、前記方法も提供する。
【００４０】
本発明はまた、生物学的液体において、第一のポリペプチドを検出する方法であって、前記の第一のポリペプチドが１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素からなる群より選択され、以下の：（ａ）前記液体を、前記の第一のポリペプチドに結合特異性を有する第二のポリペプチドと接触させ、そして（ｂ）前記の第二のポリペプチドの存在をアッセイして、前記の第一のポリペプチドのレベルを決定する工程を含んでなる、前記方法を提供する。好ましくは、第二のポリペプチドは抗体である。より好ましくは、第二のポリペプチドは放射標識されている。
【００４１】
本発明はまた、６ｘＳＳＣおよび６５℃中で、配列番号１をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、そして配列番号１で検出した核酸を単離することを含んでなる、単離核酸を産生する方法も提供する。本発明はまた、この方法にしたがって調製した単離ＤＮＡ核酸も提供する。
【００４２】
本発明はまた、配列番号１に示す配列の相補体に、非常にストリンジェントな条件下で、特異的にハイブリダイズする単離核酸も提供する。
【００４３】
本発明はまた、６ｘＳＳＣおよび６５℃中で、配列番号５をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、そして配列番号５で検出した核酸を単離することを含んでなる、単離核酸を産生する方法も提供する。本発明はまた、この方法にしたがって調製した単離ＤＮＡ核酸も提供する。
【００４４】
本発明はまた、配列番号５に示す配列の相補体に、非常にストリンジェントな条件下で、特異的にハイブリダイズする単離核酸も提供する。
【００４５】
本発明はまた、細胞の染色体ＤＮＡに挿入した際、通常は細胞で発現されない１１アルファ水酸化酵素遺伝子の発現を改変する、ＤＮＡ構築物であって：（ａ）ターゲティング配列；（ｂ）制御配列；および（ｃ）ステロイド１１アルファ水酸化酵素の構造遺伝子を含んでなる、前記ＤＮＡ構築物も提供する。本発明はまた、このＤＮＡ構築物を宿する宿主細胞も提供する。
【００４６】
本発明はまた、細胞の染色体ＤＮＡに挿入した際、通常は細胞で発現されない１１アルファ水酸化酵素遺伝子の発現を改変する、ＤＮＡ構築物であって：（ａ）ターゲティング配列；（ｂ）制御配列；および（ｃ）ステロイド酸化還元酵素の構造遺伝子を含んでなる、前記ＤＮＡ構築物も提供する。本発明はまた、このＤＮＡ構築物を宿する宿主細胞も提供する。
【００４７】
本発明はまた、心臓疾患、炎症、関節炎、または癌を治療する、療法適用の医薬品製造のための、クローニングした１１アルファ水酸化酵素を宿する宿主細胞の使用も提供する。
【００４８】
本発明はまた、約０．５−約５００ｇ／ｌ糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）、０．５−５０ｇ／ｌトウモロコシ浸染（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ）液、０．５−５０ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、２．５−２５０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２．５−２５０ｇ／ｌグルコース、および０．０４−４ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ３．５−７を含んでなる組成物も提供する。好ましくは、この組成物は、約１０−２５０ｇ／ｌ糖蜜、１−２５ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、１−２５ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、５−１２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、５−１２５ｇ／ｌグルコース、および０．０８−２ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ４．５−６．５で構成される。より好ましくは、該組成物は、約２５−１００ｇ／ｌ糖蜜、２．５−１０ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、２．５−１０ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、１２．５−５０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１２．５−５０ｇ／ｌグルコース、および０．２−０．８ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ５．５−６．０で構成される。最も好ましくは、該組成物は、約５０ｇ／ｌ糖蜜、５ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、５ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２５ｇ／ｌグルコース、２０ｇ／ｌ寒天および０．４ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ５．８を含んでなる。
【００４９】
本発明はまた、約４−１００ｇ／ｌ寒天をさらに含んでなる、上述のいずれかの組成物の半固形処方も提供する。好ましくは、寒天は約１０−４０ｇ／ｌ寒天の濃度である。より好ましくは、寒天は約２０ｇ／ｌ寒天である。
【００５０】
本発明はまた、アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニダランス、リゾプス・オリゼー、リゾプス・ストロニファー、およびトリコテシウム・ロゼウム、フザリウム・オキシスポルム、リゾプス・アーヒズス、モノスポリウム・オリバセウム、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、およびアブシディア・コイルラからなる群より選択される微生物から胞子を産生する、上述の組成物いずれかの使用も提供する。好ましくは、該組成物は、アスペルギルス・オクラセウスから胞子を産生するのに用いる。
【００５１】
定義
以下は、本明細書において交換可能に用いられるような、略語および対応する意味のリストである：
１１アルファヒドロキシカンレノン＝１１アルファヒドロキシ−４−アンドロステン−３，１７−ジオン（Ｃ22Ｈ28Ｏ4、ＭＷ  ３５６．４６）
ＡｃＮＰＶ＝オートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルス、昆虫ウイルスのバキュロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のメンバー
ＡＤ＝アンドロステンジオンまたは４−アンドロステン−３，１７−ジオン（Ｃ22Ｈ28Ｏ3、ＭＷ  ３４０．４６）
アルダジエン＝カンレノン
Ａｍｐ＝アンピシリン
ａｔｔＴｎ７＝Ｔｎ７の付着部位（細菌染色体へのＴｎ７挿入の優先部位）
バクミド＝大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）から単離した組換えバキュロウイルスシャトルベクター
Ｂｌｕｏ−ｇａｌ＝ハロゲン化インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
ｂｐ＝塩基対
Ｃａｍ＝クロラムフェニコール
ｃＤＮＡ＝相補ＤＮＡ
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ｄｓ＝二本鎖
エプレレノンまたはエポキシメクスレノン＝メチル水素９，１１α−エポキシ−１７α−ヒドロキシ−３−オキソプレグン−４−エン−７α，２１−ジカルボキシレート，  γ−ラクトン（ＭＷ  ４１４．５）
ｇ＝グラム
Ｇｅｎ＝ゲンタマイシン
ｈｏｘｒ＝ヒト酸化還元酵素
ＨＰＬＣ＝高性能液体クロマトグラフィー
ヒドロキシカンレノン＝１１アルファ−または１１ベータ−ヒドロキシカンレノン
ＩＰＴＧ＝イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
Ｋａｎ＝カナマイシン
ｋｂ＝キロ塩基、１０００ｂｐ
ｍｂ＝メガ塩基
Ｍｅ＝メチル
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｌまたはｍＬ＝ミリリットル
ｍｍ＝ミリメートル
ｍＭ＝ミリモル
ＮＭＲ＝核磁気共鳴
ｏｘｒ＝酸化還元酵素
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ｒ＝耐性のまたは耐性
ＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高性能液体クロマトグラフィー
ＲＴ＝室温
ＲＴ−ＰＣＲ＝逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応
ｓ＝感受性
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｓｐｃ／Ｓｔｒ＝スペクチノマイシン／ストレプトマイシン
Ｔｅｔ＝テトラサイクリン
Ｔｎ＝トランスポゾン
ｔｓ＝温度感受性
Ｕ＝単位
ｕｇまたはμｇ＝マイクログラム
ｕｌまたはμｌ＝マイクロリットル
Ｘ−ｇａｌ＝５−ブロモ−３−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
Ｘ−ｇｌｕｃ＝５−ブロモ−３−クロロ−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド
以下は、本明細書に用いる多様な用語の定義のリストである：
種「アスペルギルス・オクラセウスＮＲＲＬ  ４０５」は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から得た、糸状真菌アスペルギルス・オクラセウスＮＲＲＬ  ４０５、寄託番号１８５００を意味する。Ａ．オクラセウスＮＲＲＬ  ４０５およびＡ．オクラセウスＡＴＣＣ  １８５００は、カタログに異なって記載されているが、同一株である。
【００５２】
用語「アミノ酸」は、ノルロイシン、ノルバリン、ホモシステイン、およびオルニチンを含む、すべての天然存在Ｌアミノ酸を意味する。
【００５３】
用語「縮重」は、２つの核酸分子が、同一のアミノ酸配列をコードするが、異なるヌクレオチド配列を含んでなることを意味する。
【００５４】
用語「断片」は、配列が標的または同定される核酸分子より短く、そして標的または同定される核酸分子の少なくとも１０の隣接するヌクレオチドと同一の実質的な相補体、または実質的な相同体を有する核酸分子を意味する。
【００５５】
用語「融合タンパク質」は、タンパク質またはその断片であって、そのタンパク質に由来しない１以上のさらなるペプチド領域を含んでなるものを意味する。
【００５６】
用語「プローブ」は、分子、細胞、組織、または生物の特質または特徴（例えば存在または非存在、位置、相関など）を決定するのに利用される剤を意味する。
【００５７】
用語「プロモーター」は、ｍＲＮＡ産生を調節する制御配列を指す、拡大した意味で用いる。こうした配列には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位、エンハンサーなどが含まれる。
【００５８】
用語「タンパク質断片」は、ペプチドまたはポリペプチド分子であって、そのアミノ酸配列が、そのタンパク質のアミノ酸配列のサブセットを含んでなるものを意味する。
【００５９】
用語「組換え体」は、核酸分子のヒト操作であるかまたは該操作から生じるが、それが間接的である剤（例えばＤＮＡ、ペプチドなど）いずれかを意味する。
【００６０】
用語「選択可能またはスクリーニング可能マーカー遺伝子」は、形質転換細胞を同定するかまたは選択する手段としてのプローブによって、発現が検出可能な遺伝子を意味する。
【００６１】
用語「特異的に結合する」は、抗体またはペプチドの結合が、関連しない分子の存在によって競合的に阻害されないことを意味する。
【００６２】
用語「特異的にハイブリダイズする」は、２つの核酸分子が、逆平行二本鎖核酸構造を形成可能であることを意味する。
【００６３】
用語「実質的な相補体」は、核酸配列が相補体と少なくとも８０％の配列同一性を共有することを意味する。
【００６４】
用語「実質的な断片」は、少なくとも１００ヌクレオチドを含んでなる核酸断片を意味する。
【００６５】
用語「実質的な相同体」は、核酸分子が別のものと少なくとも８０％配列同一性を共有することを意味する。
【００６６】
用語「実質的にハイブリダイズしている」は、２つの核酸分子が、互いに９０％以上の配列同一性を示し、そして核酸分子の少なくとも隣接する約５０ヌクレオチドに関して、この同一性を示す配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件（例えば塩および温度）下で、逆平行二本鎖核酸構造を形成可能であることを意味する。
【００６７】
用語「実質的に精製された」は、標的分子を含有する天然存在調製に存在するかまたは存在することが可能である１以上の分子が、除去されているかまたはその濃度が減少しているであろうことを意味する。
【００６８】
以下は、本明細書において交換可能に用いられるような、ステロイド、対応する用語、およびその構造のリストである：
【００６９】
【表１】
2005512502.tif 000002
【００７０】
【表２】
2005512502.tif 000003
【００７１】
【表３】
2005512502.tif 000004
【００７２】
【表４】
2005512502.tif 000005
【００７３】
【表５】
2005512502.tif 000006
【００７４】
発明の詳細な説明
本発明は、ステロイド分子の生合成を促進する酵素、特に、チトクロムＰ４５０または酸化還元酵素活性を持つ酵素を含む。本発明は、部分的に、チトクロムＰ４５０酵素に対応する、非常に保存された残基に配列相同性を示す、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする核酸の単離に関する。本発明はまた、ヒトおよびアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする核酸の単離にも関する。本発明のクローニングした水酸化酵素および酸化還元酵素の生物学的活性は、組換えバキュロウイルス感染昆虫細胞から調製したミクロソームの存在下で、ステロイド基質をインキュベーションし、そして高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、１１アルファヒドロキシ対応物への変換を監視することを含む、多様なアッセイによって決定可能である。新規１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素核酸、タンパク質、ペプチド、相同体、およびいずれかの断片を含んでなる本発明は、ステロイド中間産物を１１アルファヒドロキシ対応物に変換する、新規でそして有利な方法を提供する。
【００７５】
本発明はまた、１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素をコードするＤＮＡ配列、実質的に類似であり、そして実質的に同一の機能を実行するＤＮＡ配列、並びに遺伝暗号の縮重によってのみ、本発明の水酸化酵素および酸化還元酵素をコードするＤＮＡと異なるＤＮＡ配列も含む。本発明にやはり含まれるのは、これらのＤＮＡの突然変異型を構築するのに用いるオリゴヌクレオチド中間産物、並びにこれらのオリゴヌクレオチドおよび突然変異体ＤＮＡにコードされるポリペプチドである。
【００７６】
本発明はまた、抗ペプチド抗体を含む、Ａ．オクラセウス１１アルファ水酸化酵素またはＡ．オクラセウス酸化還元酵素に特異的に結合する抗体、これらの抗ペプチド抗体を用いて、これらのおよび他の関連ポリペプチドを精製する方法、精製ポリペプチドを用いて、全長ポリペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成する方法、並びに全長ポリペプチドに対する抗体を用いて、組換えおよび非組換え宿主細胞におけるポリペプチドの存在を評価する方法も含む。抗体は、これらのポリペプチドと関連する生物学的活性を持つ、多様な宿主生物のいずれかにおいて、関連ポリペプチドを同定するのに使用可能である。
【００７７】
この水酸化工程で使用可能な好ましい生物の中には、アスペルギルス・オクラセウスＮＲＲＬ  ４０５、アスペルギルス・オクラセウスＡＴＣＣ  １８５００、クロコウジカビＡＴＣＣ  １６８８８およびＡＴＣＣ  ２６６９３、アスペルギルス・ニダランスＡＴＣＣ  １１２６７、リゾプス・オリゼーＡＴＣＣ  １１１４５、リゾプス・ストロニファーＡＴＣＣ  ６２２７ｂ、ストレプトミセス・フラディエーＡＴＣＣ  １０７４５、巨大菌ＡＴＣＣ  １４９４５、シュードモナス・クルシビエーＡＴＣＣ  １３２６２、およびトリコテシウム・ロゼウムＡＴＣＣ  １２５４３がある。他の好ましい生物には、フザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．セペー（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ  ｆ．ｓｐ．  ｃｅｐａｅ）ＡＴＣＣ  １１１７１およびリゾプス・アーヒズスＡＴＣＣ  １１１４５が含まれる。
【００７８】
この反応の活性を示した他の生物には、アブシディア・コイルラＡＴＣＣ  ６６４７、アブシディア・グラウカＡＴＣＣ  ２２７５２、アクチノムコール・エレガンスＡＴＣＣ  ６４７６、アスペルギルス・フラビペスＡＴＣＣ  １０３０、アスペルギルス・フミガツスＡＴＣＣ  ２６９３４、ボーベリア・バシアナＡＴＣＣ  ７１５９およびＡＴＣＣ  １３１４４、ボトリオスフェーリア・オブツサＩＭＩ  ０３８５６０、カロネクトリア・デコラＡＴＣＣ  １４７６７、ケトミウム・コクリオデスＡＴＣＣ  １０１９５、コリネスポラ・カシコラＡＴＣＣ  １６７１８、カニングハメラ・ブラケスリーアナＡＴＣＣ  ８６８８ａ、カニングハメラ・エキヌラタＡＴＣＣ  ３６５５、カニングハメラ・エレガンスＡＴＣＣ  ９２４５、カーブラリア・クラバタＡＴＣＣ  ２２９２１、カーブラリア・ルナタＡＣＴＴ  １２０７１、シリンドロカルポン・ラディシコラＡＴＣＣ  １０１１、エピコッカム・フミコラＡＴＣＣ  １２７２２、ゴングロネラ・ブトレリＡＴＣＣ  ２２８２２、ヒポミケス・クリソスペルマス、モルティエレラ・イサベリナＡＴＣＣ  ４２６１３、ムコール・ムセドＡＴＣＣ  ４６０５、ムコール・グリセオシアヌスＡＴＣＣ  １２０７Ａ、ミロテシウム・ベルカリアＡＴＣＣ  ９０９５、ノカルディア・コラリナ、パエシロミセス・カルネウスＡＴＣＣ  ４６５７９、ペニシリウム・パツルムＡＴＣＣ  ２４５５０、ピトミセス・アトルーリバセウスＩＦＯ  ６６５１、ピトミセス・シノドンティスＡＴＣＣ  ２６１５０、ピクノスポリウム種ＡＴＣＣ  １２２３１、サッカロポリスポラ・エリスレーＡＴＣＣ  １１６３５、セペドニウム・クリソスペルマムＡＴＣＣ  １３３７８、スタキリディウム・ビコロルＡＴＣＣ  １２６７２、ストレプトミセス・ヒクロスコピクスＡＴＣＣ  ２７４３８、ストレプトミセス・パープラセンスＡＴＣＣ  ２５４８９、シンセファラストラム・ラセモザムＡＴＣＣ  １８１９２、タムノスティルム・ピリフォルメＡＴＣＣ  ８９９２、シエラビア・テリコラＡＴＣＣ  １３８０７、およびバーティシリウム・テオブロメーＡＴＣＣ  １２４７４が含まれる。
【００７９】
１１α水酸化の活性を示すと予期することが可能なさらなる生物には、セファロスポリウム・アフィディコラ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６），  ４２（２），  ４１１−４１５）、コクリオボルス・ルナタス（Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５），  ４２（２），  １４５−１５０）、ティエグヘメラ・オルキディス（Ｋｈｉｍ．−Ｆａｒｍ．  Ｚｈ．（１９８６），  ２０（７），  ８７１−８７６）、ティエグヘメラ・ヒアロスポラ（Ｋｈｉｍ．−Ｆａｒｍ．  Ｚｈ．（１９８６），  ２０（７），  ８７１−８７６）、モノスポリウム・オリバセウム（Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｐｏｌ．，  Ｓｅｒ．  Ｂ．（１９７３），  ５（２），  １０３−１１０）、アスペルギルス・ウスツス（Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｐｏｌ．，  Ｓｅｒ．  Ｂ．（１９７３），  ５（２），  １０３−１１０）、フザリウム・グラミネアルム（Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｐｏｌ．，  Ｓｅｒ．  Ｂ．（１９７３），  ５（２），  １０３−１１０）、バーティシリウム・グラウクム（Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｐｏｌ．，  Ｓｅｒ．  Ｂ．（１９７３），  ５（２），  １０３−１１０）、およびリゾプス・ニグリカンス（Ｊ．  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７），  ２８（２），  １９７−２０１）が含まれる。
【００８０】
図１は、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列（それぞれ配列番号１、配列番号２）を示す。図２は、ヒト酸化還元酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列（それぞれ配列番号３、配列番号４）を示す。図３は、アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列（それぞれ配列番号５、配列番号６）を示す。
【００８１】
図４は、ｐＭＯＮ４５６２４にクローニングし、そしてＢＬＡＳＴを用いてＧｅｎＢａｎｋに見られる関連酵素と並列させたＡ．オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸相同性アラインメントを示す。図５は、この関係を図式的に示す系統樹である。図６は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＢｏｘｓｈａｄｅを用いて計算した、アスペルギルス・オクラセウス、ステロイド１１アルファ水酸化酵素およびＢＬＡＳＴを用いてＧｅｎＢａｎｋに見られる上位１０酵素の間のパーセント相同性を示す。
【００８２】
図７は、クロコウジカビ、マウス、およびＳ．セレビシエ（酵母）由来のＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素に対する、アスペルギルス・オクラセウスおよびヒト酸化還元酵素のアミノ酸相同性を示す。図８は、Ａ．オクラセウス、クロコウジカビ、およびＳ．セレビシエ酸化還元酵素のアミノ酸アラインメントを示す。図９は、クロコウジカビ、酵母、およびマウス由来の還元酵素に対する、アスペルギルス・オクラセウスおよびヒト酸化還元酵素の関連性を示す系統樹である。図１０は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＢｏｘｓｈａｄｅを用いて計算した、アスペルギルス・オクラセウス、ステロイド１１アルファ水酸化酵素、並びにクロコウジカビ、酵母、およびマウス由来の酸化還元酵素の間のパーセント相同性を示す。
【００８３】
図１１は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ由来の上位４ヒットとヒト酸化還元酵素のアラインメントである。図１２は、これらのヒットに対する、ヒト酸化還元酵素の遺伝的関連性を示す系統樹を示す。図１３は、ヒト酸化還元酵素およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ由来の上位４ヒットの間のパーセント同一性を示す。
【００８４】
図１４は、感染２５および４８時間後に採取したバキュロウイルス感染昆虫細胞における、アスペルギルス・オクラセウスＰ４５０  １１アルファ水酸化酵素の発現を例示する免疫ブロットを示す。ニトロセルロース膜は、コンジュゲート化合成ペプチド、１１ａＯＨペプチド２（配列番号２４）で免疫した２匹のウサギから調製した抗体の１：１混合物で探査した。
【００８５】
図１５は、感染２５および４８時間後に採取したバキュロウイルス感染昆虫細胞における、アスペルギルス・オクラセウスＰ４５０酸化還元酵素の発現を例示する免疫ブロットを示す。ニトロセルロース膜は、コンジュゲート化合成ペプチド、ｏｘｒペプチド１（配列番号２６）で免疫した２匹のウサギから調製した抗体の１：１混合物で探査した。
【００８６】
図１６は、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびヒト酸化還元酵素を発現するバキュロウイルス感染昆虫細胞から調製した細胞成分分画とＡＤをインキュベーションした後の、１１アルファヒドロキシ対応物へのアンドロステンジオン（ＡＤ）の変換を例示する、ＨＰＬＣ追跡を示す。
【００８７】
クローニング技術
現在、当該技術分野で標準的な遺伝子操作技術（米国特許第４，９３５，２３３号およびＳａｍｂｒｏｏｋら，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８９）が、本発明のＤＮＡ配列の構築に使用可能である。こうした方法の１つは、プラスミド中のコード配列の一部を、２つの制限部位の間の遺伝子部分で、望ましいアミノ酸置換をコードする合成オリゴヌクレオチドと交換する、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら，  Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３，  １９８５）である。
【００８８】
望ましい遺伝子をコードする相補合成オリゴヌクレオチド対を作成し、そして互いにアニーリングさせることが可能である。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、配列から置換され、そして／または欠失されるものを除いて、望ましい遺伝子のアミノ酸の配列をコードするであろう。
【００８９】
選択した制限エンドヌクレアーゼでプラスミドＤＮＡを処理し、その後、アニーリングしたオリゴヌクレオチドに連結することが可能である。適切な抗生物質に耐性を与えるであろう、連結した混合物を用いて、コンピテント大腸菌細胞を形質転換することが可能である。単一コロニーを摘み取り、そして制限解析またはＤＮＡ配列決定によってプラスミドＤＮＡを調べ、望ましい遺伝子を持つプラスミドを同定することが可能である。
【００９０】
新規タンパク質および融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列のクローニングは、中間産物ベクターの使用によって達成可能である。リンカーおよびアダプターを用いて、ＤＮＡ配列を連結し、そして失われた配列を交換することが可能であり、この場合、制限部位が目的の領域の内部にある。単一タンパク質または融合タンパク質（第一のポリペプチド、ペプチドリンカー、および第二のポリペプチドを含んでなる）をコードするＤＮＡを、適切な発現ベクターに挿入し、これをその後、適切な細菌、真菌、昆虫、または哺乳動物宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションする。標準的技術によって、形質転換生物または宿主細胞株を増殖させ、そして組換えタンパク質を単離する。組換え融合タンパク質は、リンカー領域によって、第二のタンパク質のすべてまたは部分に連結した、第一のタンパク質のすべてまたは部分を有する。
【００９１】
ハイブリダイゼーション
１１アルファ水酸化酵素または酸化還元酵素をコードする核酸分子および核酸分子断片は、他の核酸分子と特異的にハイブリダイズすることが可能である。２つの核酸分子は、逆平行二本鎖核酸構造を形成可能である場合、互いに特異的にハイブリダイズ可能であると言う。核酸分子は、完全相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であると言う。分子は、一方の分子のヌクレオチドがすべて、他方の分子のヌクレオチドに相補的である場合、「完全相補性」を示す。２つの分子は、少なくとも慣用的な「低ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニーリングしつづけることを可能にするのに十分な安定性で、互いにハイブリダイズ可能であるならば、「最小限に相補的」である。同様に、分子は、慣用的な「高ストリンジェンシー」条件下で、互いにアニーリングしつづけることを可能にするのに十分な安定性で、互いにハイブリダイズ可能であるならば、「相補的」である。慣用的なストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）、およびＨａｙｍｅｓら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  ワシントンＤＣ，  １９８５に記載される。したがって、分子が二本鎖構造を形成する能力が、こうした逸脱によって完全に妨げられない限り、完全相補性からの逸脱は許容しうる。
【００９２】
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は、当業者に公知であるか、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク，  ６．３．１−６．３．６，（１９８９）に見出すことが可能である。基本的条件には、例えば、約４５℃の６Ｘクエン酸ナトリウム塩溶液（ＳＳＣ）、その後、５０℃、２ＸＳＳＣでの洗浄が含まれるであろう。ストリンジェンシーは、例えば、洗浄工程の塩濃度を、５０℃、約２ＸＳＳＣ（中程度に低いストリンジェンシー）から５０℃、約０．２ＸＳＳＣ（高ストリンジェンシー）に改変することによって、変化させることが可能である。ストリンジェンシーはまた、洗浄工程の温度を、室温、約２２℃（低ストリンジェンシー条件）から約６５℃（高ストリンジェンシー条件）に変化させることによっても、改変可能である。温度および塩を両方変化させることが可能であるし、あるいは温度または塩濃度を一定に保持させつつ、他方の変数を変化させることが可能である。
【００９３】
発現ベクター
本発明の別の側面は、これらの新規水酸化酵素および酸化還元酵素の発現に使用するためのプラスミドＤＮＡベクターを含む。これらのベクターは、本発明の新規のポリペプチドをコードする上述の新規ＤＮＡ配列を含有する。水酸化酵素および酸化還元酵素を発現可能な微生物または細胞株を形質転換することが可能な適切なベクターには、用いる宿主細胞に応じて選択される、転写および翻訳制御配列に連結された、水酸化酵素および酸化還元酵素をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターが含まれる。
【００９４】
上述のような修飾配列を取り込んだベクターが本発明に含まれ、そしてこうしたベクターは、水酸化酵素および酸化還元酵素の産生に有用である。該方法に使用するベクターはまた、本発明のＤＮＡコード配列と操作可能な関連にあり、そして選択した宿主細胞における複製および発現を指示することが可能な、選択した制御配列も含有する。
【００９５】
水酸化酵素および酸化還元酵素を産生する方法が、本発明の別の側面である。本発明の方法は、新規水酸化酵素および酸化還元酵素をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターで形質転換されている、適切な細胞または細胞株を培養することを伴う。適切な細胞または細胞株は、細菌細胞であることが可能である。例えば、バイオテクノロジーの分野で、大腸菌の多様な株が宿主細胞として公知である。こうした株の例には、大腸菌株ＤＨ５アルファ、ＤＨ１０ＢおよびＭＯＮ１０５（Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚら，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５８：１５１１−１５２３，  １９９２）が含まれる。本発明にやはり含まれるのは、バクテリオファージＭｕに基づく、大腸菌の染色体発現ベクターを利用した、水酸化酵素および酸化還元酵素の発現である（Ｗｅｉｎｂｅｒｇら，  Ｇｅｎｅ  １２６：２５−３３，  １９９３）。腸内細菌（例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む、細菌の多様な他の株もまた、本方法で使用可能である。
【００９６】
大腸菌細胞質で発現した際、本発明のタンパク質をコードする遺伝子はまた、タンパク質のＮ末端で、Ｍｅｔ-2−Ａｌａ-1、Ｍｅｔ-2−Ｓｅｒ-1、Ｍｅｔ-2−Ｃｙｓ-1、またはＭｅｔ-1をコードするため、遺伝子の５’端でコドンが付加されるように構築可能である。大腸菌の細胞質で作成されるタンパク質のＮ末端は、メチオニンアミノペプチダーゼ（Ｂｅｎ  Ｂａｓｓａｔら，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９：７５１−７５７，  １９８７）、およびおそらく他のペプチダーゼによって翻訳後プロセシングされることによって影響を受け、したがって発現に際して、メチオニンはＮ末端から切断される。本発明のタンパク質は、Ｎ末端に、Ｍｅｔ-1、Ａｌａ-1、Ｓｅｒ-1、Ｃｙｓ-1、Ｍｅｔ-2−Ａｌａ-1、Ｍｅｔ-2−Ｓｅｒ-1、またはＭｅｔ-2−Ｃｙｓ-1を有するポリペプチドを含むことが可能である。これらの突然変異タンパク質はまた、Ｎ末端に分泌シグナルペプチドを融合することによって、大腸菌で発現することも可能である。このシグナルペプチドは、分泌過程の一部としてポリペプチドから切断される。
【００９７】
酵母
当業者に知られる酵母細胞の多くの株もまた、本発明のポリペプチドを発現するための宿主細胞として利用可能である。別の態様下で、本発明のタンパク質またはその断片は、酵母細胞、好ましくはサッカロミセス・セレビシエで発現される。本発明のタンパク質またはその断片は、ＵＲＡ３、ＣＹＣ１またはＡＲＧ３遺伝子（ＧｕａｒｅｎｔｅおよびＰｔａｓｈｎｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８：２１９９−２２０３（１９８１）；Ｒｏｓｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８：２４６０−２４６４（１９８１）；およびＣｒａｂｅｅｌら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：２０５−２１２（１９８３））のＮ末端に該タンパク質を融合させることによって、Ｓ．セレビシエで発現することが可能である。あるいは、本発明のタンパク質またはその断片は、ＰＧＫまたはＴＲＰ１遺伝子（Ｔｕｉｔｅら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １：６０３−６０８（１９８２）；およびＤｏｂｓｏｎら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  １１：２２８７−２３０２（１９８３））いずれかに融合させることが可能である。より好ましくは、本発明のタンパク質またはその断片は、成熟タンパク質として発現させる（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９３：７１７−７２２（１９８１）；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：３４７−３５０（１９８２）；およびＤｅｒｙｎｃｋら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １１：１８１９−１８３７（１９８３））。
【００９８】
本発明で使用するのに適した天然および操作酵母プロモーターがＲｏｍａｎｏｓら，  Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８（１９９２）に概説されている。最も好ましくは、本発明のタンパク質またはその断片は、酵母細胞によって分泌される（ＢｌｏｂｅｌおよびＤｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ６７：８３５−８５１（１９７５）；ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３（１９８２）；Ｂｏｓｔｉａｎら，  Ｃｅｌｌ  ３６：７４１−７５１（１９８４）；ＲｏｔｈｍａｎおよびＯｒｃｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：４０９−４１５（１９９２）；Ｊｕｌｉｕｓら，  Ｃｅｌｌ  ３２：８３９−８５２（１９８３）；およびＪｕｌｉｕｓら，  Ｃｅｌｌ  ３６：３０９−３１８（１９８４））。
【００９９】
哺乳動物
哺乳動物細胞において、外来性の（ｆｏｒｅｉｇｎ）遺伝子を発現させる一般的な方法が概説されてきている（Ｋａｕｆｍａｎ，  Ｒ．Ｊ．，  １９８７，“Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”，  Ｖｏｌ．  ９，  Ｊ．Ｋ．  Ｓｅｔｌｏｗ監修，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク；Ｃｏｌｏｓｉｍｏら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：３１４−３３１，  ２０００）。組換えタンパク質は、一般的に、宿主細胞内の天然の位置（例えば細胞質、核、または多様な膜区画）にターゲティングされるか、またはシグナルペプチドが存在する場合、分泌される。哺乳動物細胞で操作可能な強いプロモーターが、望ましいタンパク質のコード領域に翻訳的に連結される、真核分泌シグナルペプチドコード領域の転写を駆動する発現ベクターを構築する。例えば、ｐｃＤＮＡ、Ｉ／Ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、およびｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サンディエゴから得る）などのプラスミドが使用可能である。真核分泌シグナルペプチドコード領域は、遺伝子自体に由来してもよいし、または別の分泌される哺乳動物タンパク質に由来してもよい（Ｂａｙｎｅ，  Ｍ．Ｌ．ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：２６３８−２６４２，  １９８７）。該遺伝子を含有するベクターを構築した後、ベクターＤＮＡは、ＣＯＳ７、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、またはマウスＬ株などの哺乳動物細胞にトランスフェクションする。細胞は、例えばＤＭＥＭ培地（ＪＲＨ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養することが可能である。細胞のトランスフェクション後、２４−７２時間、一過性発現させた後、または抗生物質耐性に関する選択後に安定細胞株を樹立した後、培地に分泌されたポリペプチドは、標準的生化学的アプローチによって回収可能である。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニングおよび産物産生および精製法が当該技術分野に知られる。例えば、ＧｅｔｈｉｎｇおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２９３：６２０−６２５，  １９８１、またはあるいは、Ｋａｕｆｍａｎら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５（７）：１７５０−１７５９，１９８５またはＨｏｗｌｅｙらおよび米国特許第４，４１９，４４６号を参照されたい。他の適切な哺乳動物細胞株はサルＣＯＳ−１細胞株およびＣＶ−１細胞株である。
【０１００】
哺乳動物細胞はまた、本発明の核酸分子を発現するのにも使用可能である。本発明の核酸分子は、適切なレトロウイルスベクター（例えばＤｕｎｂａｒら，  Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５７（１９９５）；Ｂａｕｍら，  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．  ５：３２３−３２９（１９９６）；Ｂｒｅｇｎｉら，  Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４１８−１４２２（１９９２）；Ｂｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｄｅｖ．  ３：１０２−１０９（１９９３）；Ｂｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，  Ａｎｎａｌ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７１６：５９−７１（１９９４）；Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：１−２４（１９９２）を参照されたい）、アデノウイルスベクター（Ｂｅｒｋｎｅｒ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２９（１９８８）；Ｂｅｒｋｎｅｒ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：３９−６６（１９９２）；ＢｒｏｄｙおよびＣｒｙｓｔａｌ，  Ａｎｎａｌ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７１６：９０−１０３（１９９４）；Ｂａｌｄｗｉｎら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ４：１１４２−１１４９（１９９７））、ＲＳＶ、ＭｕＳＶ、ＳＳＶ、ＭｕＬＶ（Ｂａｕｍら，  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ．  ５：３２３−３２９（１９９６））、ＡＡＶ（Ｃｈｅｎら，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：５０−５８（１９９８）；Ｈａｌｌｅｋら，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ２：６９−７９（１９９６））、ＡＥＶ、ＡＭＶ、またはＣＭＶ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２４１：３１３−３２４（１９８７））にクローニング可能である。
【０１０１】
形質転換およびトランスフェクション
別の側面において、本発明は、細胞中で、ｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすよう機能する外因性プロモーター領域であって、構造核酸分子に連結した前記領域を含んでなる核酸分子を有する形質転換細胞を提供し、ここで構造核酸分子は１１アルファ水酸化酵素または酸化還元遺伝子あるいはその断片をコードする。この核酸分子は、細胞中で、転写の終結およびｍＲＮＡ分子の３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を引き起こすよう作用する、３’非翻訳配列に連結される。
【０１０２】
真核細胞、細菌および他の微生物を形質転換するための方法および組成物が当該技術分野に知られる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）；Ｃｏｌｏｓｉｍｏら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：３１４−３３１，  ２０００を参照されたい）。
【０１０３】
細胞にＤＮＡを導入するための技術は、当業者に公知である。細胞に遺伝子を搬送する４つの一般的な方法が記載されてきている：（１）化学的方法（Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５４：５３６−５３９（１９７３））；（２）マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，  Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８（１９８０））、エレクトロポレーション（ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍａｎｎ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １０７：５８４−５８７（１９８２）；Ｆｒｏｍｍら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８２：５８２４−５８２８（１９８５）；米国特許第５，３８４，２５３号）；および遺伝子銃（ＪｏｈｎｓｔｏｎおよびＴａｎｇ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４３：３５３−３６５（１９９４）などの物理的方法；（３）ウイルスベクター（Ｃｌａｐｐ，  Ｃｌｉｎ．  Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ．  ２０：１５５−１６８（１９９３）；Ｌｕら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７８：２０８９−２０９６（１９９３）；ＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ６：６０８−６１４（１９８８））；並びに（４）受容体仲介機構（Ｃｕｒｉｅｌら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎ．  Ｔｈｅｒ．  ３：１４７−１５４（１９９２），Ｗａｇｎｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：６０９９−６１０３（１９９２））。当該技術分野に公知の他の方法もまた、使用可能である。
【０１０４】
形質転換は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、およびこれらの処理の組み合わせに基づく方法を用いて、達成可能である（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０５：１９３−２００（１９８６）；Ｌｏｒｚら，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９９：１７８（１９８５）；Ｆｒｏｍｍら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１９：７９１（１９８６）；Ｕｃｈｉｍｉｙａら，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２０４：２０４（１９８６）；Ｍａｒｃｏｔｔｅら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４５４−４５７（１９８８）を参照されたい）。
【０１０５】
クローニングした核酸構築物の一過性発現に基づく遺伝子発現のアッセイは、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、または粒子銃によって細胞に核酸分子を導入することにより、発展してきている（Ｍａｒｃｏｔｔｅら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４５４−４５７（１９８８）；ＭｃＣａｒｔｙら，  Ｃｅｌｌ  ６６：８９５−９０５（１９９１）；Ｈａｔｔｏｒｉら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ６：６０９−６１８（１９９２）；Ｇｏｆｆら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ９：２５１７−２５２２（１９９０））。一過性発現系を用いて、操作可能であるように連結した遺伝子要素を含んでなる発現カセットの制御および構造的特徴を機能的に分析することが可能である。
【０１０６】
昆虫細胞発現
昆虫細胞を宿主細胞として用いて、本発明の組換えタンパク質を発現することが可能である（例えば、Ｌｕｃｋｏｗ，  Ｖ．Ａ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｌ．  Ｃｌｅｌａｎｄ．，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク：１８３−２１８，  １９９６、および該文献に引用される文献を参照されたい）。バキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞において、外来性の遺伝子を発現するための一般的な方法が記載されてきている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｌ．Ｋ．  Ｍｉｌｌｅｒら，  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ニューヨーク，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９２；並びにＫｉｎｇ，  Ｌ．Ａ．およびＲ．Ｄ．  Ｐｏｓｓｅｅ，  Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，  ロンドン，  Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ）。
【０１０７】
バキュロウイルス発現ベクターは、相同組換えによってバキュロウイルスゲノムに組換え可能であるバキュロウイルストランスファーベクターに、望ましい遺伝子（例えば１１アルファ水酸化酵素または酸化還元酵素）を挿入することによって、構築可能である。多くのトランスファーベクターは、望ましい遺伝子の転写を駆動するのに、強いバキュロウイルスプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）を用いる。いくつかのベクターは、融合タンパク質の発現を可能にするか、または望ましい遺伝子のコード領域に真核分泌シグナルペプチドコード領域を融合させることによって、細胞からのタンパク質の分泌を指示する。プラスミドｐＶＬ１３９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サンディエゴから得る）を用いて、例えば、バキュロウイルス感染昆虫細胞において、融合していない外来性の遺伝子の転写を指示することが可能である。望ましい遺伝子を含有するバキュロウイルストランスファーベクターを、環状または直線化ゲノムバキュロウイルスＤＮＡと共に、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）昆虫細胞にトランスフェクションし、そして組換えバキュロウイルスを精製し、そして１以上のプラークアッセイ後に増幅する。
【０１０８】
組換えバキュロウイルスはまた、現在、Ｂａｃ−Ｔｏ−ＢａｃTM発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）として販売されている、バキュロウイルスシャトルベクター系（Ｌｕｃｋｏｗ，  Ｖ．Ａ．ら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７（８）：４５６６−４５７９，  １９９３；米国特許第５，３４８，８８６号）を用いて生成可能である。ミニＴｎ７カセットにおいて、望ましい遺伝子をポリヘドリンプロモーターの下流に挿入し、このミニＴｎカセットを、大腸菌で増殖させたバキュロウイルスシャトルベクターゲノムにｉｎ  ｖｉｖｏで置き換える。相同組換えに頼る方法に共通の、多数周期の単調なプラーク精製の必要を伴わず、複合（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）ウイルスＤＮＡを大腸菌から単離し、そしてＳｆ９細胞にトランスフェクションして、そして組換えバキュロウイルスのストックを迅速に調製する。
【０１０９】
組換えバキュロウイルスはまた、バクテリオファージラムダの部位特異的組換えおよび切除に関与する、修飾遺伝子要素（付着部位）および修飾タンパク質（例えばｉｎｔ、ＩＮＦ、ｘｉｓ）を用いて、ベクターからベクターへ遺伝子をシャトルする、Ｇａｔｅｗａｙ組換えクローニング系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いても生成可能である。
【０１１０】
１１アルファ水酸化酵素または酸化還元酵素遺伝子を持つ、純粋な組換えバキュロウイルスを用いて、例えばＥｘｃｅｌｌ  ４０１血清不含培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カンザス州レネクサ）またはＳｆ９００−ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養した細胞を感染させる。膜に局在する水酸化酵素または酸化還元酵素は、ミトコンドリアまたはミクロソーム分画中の酵素を分画し、そして濃縮する標準的プロトコル（ＥｎｇｅｌおよびＷｈｉｔｅ，  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  １４０：１９６−２０８，  １９９０）を用いて調製可能である。培地中に分泌されるかまたは漏洩する水酸化酵素または酸化還元酵素もまた、標準的生化学的アプローチによって、回収可能である。
【０１１１】
バキュロウイルス感染昆虫細胞における２以上の組換えタンパク質の同時発現は、２つの一般的なアプローチによって実行可能である。最も単純なアプローチは、ポリヘドリンまたはｐ１０プロモーターなどの、強いバキュロウイルスプロモーターの調節下にある単一の異種遺伝子を宿する組換えバキュロウイルスの力価測定した（ｔｉｔｒａｔｅｄ）ストックで、昆虫細胞を同時感染させることである。これらのプロモーターは、大部分の宿主細胞タンパク質合成が停止している、感染後期中に、高く転写される。より初期のバキュロウイルスプロモーターあるいは他の昆虫または真核細胞プロモーターもまた、他の時点での合成を指示するのに使用可能であるが、これは一般的により低い発現レベルを生じる。同時感染に用いる２以上の組換えウイルスの比を変化させるか、または組換えタンパク質の発現を駆動するのに異なるプロモーターを用いるウイルスを選択すると、当業者が望ましい組換えタンパク質の最適発現に適した条件を選択するのが可能になるであろう。
【０１１２】
二重または多重発現ベクターの構築もまた、バキュロウイルス感染昆虫細胞における２以上の組換えタンパク質の発現を可能にするであろう。一般的に、これらのベクターは、バキュロウイルスゲノムにおける単一遺伝子座に、２以上の遺伝子カセットを導入することを可能にする。多様な二重発現ベクターの構造が記載されてきている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｌ．Ｋ．  Ｍｉｌｌｅｒら，  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ニューヨーク，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９２；並びにＫｉｎｇ，  Ｌ．Ａ．およびＲ．Ｄ．  Ｐｏｓｓｅｅ，  Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，  ロンドン，  Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ）。
【０１１３】
材料および方法
一般的な方法
タンパク質をクローニングし、発現し、そして性質決定する一般的な方法は、本明細書に援用される、Ｔ．  Ｍａｎｉａｔｉｓら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８２および該文献に引用される参考文献；並びに本明細書に援用される、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８９および該文献に引用される参考文献に見出される。多様なクローニングおよび発現ベクターの一般的な特徴およびマップもまた、公表されてきている（Ｇａｃｅｓａ，  ＰおよびＲａｍｊｉ，  Ｄ．Ｐ．，  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｄａｔａ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９４）。哺乳動物細胞において遺伝子をクローニングし、そして発現するための一般的方法もまた、Ｃｏｌｏｓｉｍｏら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９：３１４−３３１，  ２０００に見られる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の構築、操作および単離のための、一般的なおよび特定の条件および方法は、当該技術分野に公知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８８を参照されたい）。
【０１１４】
別に記載しない限り、すべての特殊化学薬品は、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から得た。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４  ＤＮＡリガーゼは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州ロックビル）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（マサチューセッツ州ビバリー）、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（インディアナ州インディアナポリス）、またはＰｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から得た。別に記載しない限り、すべての部分は重量により、そして温度はセ氏温度（℃）である。
【０１１５】
株、プラスミドおよび配列クロス表
これらの研究に用いる細菌株は、表１に列挙する。本研究のために用いるかまたは構築したプラスミドは、表２に列挙する。適切なオリゴヌクレオチド配列、遺伝子またはタンパク質の簡単な説明は、表３に列挙する。
【０１１６】
表１：株
【０１１７】
【表６】
2005512502.tif 000007
【０１１８】
表２：プラスミド
【０１１９】
【表７】
2005512502.tif 000008
【０１２０】
【表８】
2005512502.tif 000009
【０１２１】
表３：配列表
【０１２２】
【表９】
2005512502.tif 000010
【０１２３】
【表１０】
2005512502.tif 000011
【０１２４】
【表１１】
2005512502.tif 000012
【０１２５】
【表１２】
2005512502.tif 000013
【０１２６】
【表１３】
2005512502.tif 000014
【０１２７】
具体的方法
大腸菌株の形質転換
ＤＨ５アルファおよびＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）などの大腸菌株は、連結反応の形質転換に日常的に用い、そして哺乳動物細胞をトランスフェクションするためのプラスミドＤＮＡ調製に用いる宿主である。ＤＨ１０ＢおよびＭＯＮ１０５（Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚら，  Ａｐｐｌ．  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ．  Ｍｉｃｒ．，  ５８：１５１１−１５２３，  １９９２）などの大腸菌株は、細胞質または細胞膜周辺腔において、本発明のタンパク質を発現するのに使用可能である。
【０１２８】
ＤＨ１０ＢおよびＤＨ５アルファサブクローニング効率細胞は、コンピテント細胞として購入し、そして製造者のプロトコルを用いた形質転換にすぐ使用可能である。他の大腸菌株は、ＣａＣｌ2法を用いて、ＤＮＡを取り込むのに適格にする。典型的には、２０から５０ｍｌの細胞を、ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母エキス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で、Ｂａｕｓｈ  ＆  Ｌｏｍｂ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ分光光度計（ニューヨーク州ロチェスター）で測定した際、６００ナノメートルでおよそ１．０吸光度単位の密度（ＯＤ６００）まで、増殖させる。細胞は遠心分離によって収集し、そして培養体積の５分の１のＣａＣｌ2溶液［５０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（１０ｍＭ  ２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）１，３−プロパンジオール塩酸）、ｐＨ７．４］に再懸濁し、そして４℃に３０分間保持する。細胞を再び遠心分離によって収集し、そして培養体積の１０分の１のＣａＣｌ2溶液に再懸濁する。連結したＤＮＡをこれらの細胞０．１ｍｌに添加し、そして試料を４℃で３０−６０分間保持する。試料を４２℃に４５秒間移し、そして試料を３７℃で１時間震蘯する前に、１．０ｍｌのＬＢを添加する。これらの試料由来の細胞を、アンピシリン耐性形質転換体に関して選択する際にはアンピシリン（１００マイクログラム／ｍｌ、ｕｇ／ｍｌ）、またはスペクチノマイシン耐性形質転換体に関して選択する際にはスペクチノマイシン（７５ｕｇ／ｍｌ）いずれかを含有するプレート（ＬＢ培地に１．５％バクト寒天を加えたもの）上に延展する。プレートを３７℃で一晩インキュベーションする。コロニーを摘み取り、そして適切な抗生物質（１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンまたは７５ｕｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を加えたＬＢに接種し、そして震蘯しながら３７℃で増殖させる。
【０１２９】
ＤＮＡ単離および性質決定
プラスミドＤＮＡは、いくつかの異なる方法によって、そして当業者に知られる商業的に入手可能なキットを用いて、単離可能である。プラスミドＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＷｉｚａｒｄTM  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ウィスコンシン州マディソン）、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｗｅｌｌプラスミド単離キット（カリフォルニア州チャツワース）またはＱｉａｇｅｎプラスミドＭｉｄｉまたはＭｉｎｉキットを用いて単離する。これらのキットは、プラスミドＤＮＡ単離のための同一の一般的な方法にしたがう。簡潔には、細胞を遠心分離（５０００ｘｇ）によってペレットにし、連続ＮａＯＨ／酸処理でプラスミドＤＮＡを遊離させ、そして遠心分離（１００００ｘｇ）によって細胞破片を除去する。上清（プラスミドＤＮＡを含有）を、ＤＮＡ結合樹脂を含有するカラム上に装填し、カラムを洗浄し、そしてプラスミドＤＮＡを溶出させる。目的のプラスミドを含むコロニーに関してスクリーニングした後、適切な抗生物質を加えたＬＢ  ５０−１００ｍｌ中に大腸菌細胞を接種し、震蘯しながら、空気インキュベーター中で、３７℃で一晩増殖させる。精製プラスミドＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定、さらなる制限酵素消化、ＤＮＡ断片のさらなるサブクローニング、および大腸菌、哺乳動物細胞、または他の細胞種へのトランスフェクションに用いる。
【０１３０】
ＤＮＡ配列決定プロトコル
精製プラスミドＤＮＡは、ｄＨ2Ｏに再懸濁し、そしてその濃度は、Ｂａｕｓｈ  ａｎｄ  Ｌｏｍｂ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ６０１  ＵＶ分光計で２６０／２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定する。ＤＮＡ試料は、製造者が示唆するプロトコルにしたがって、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭTM  ＤｙｅＤｅｏｘｙTMターミネーター配列決定化学反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州リンカーンシティー）キット（部品番号４０１３８８または４０２０７８）を用いて配列決定する。場合によって、反復実験において、混合物に５％  ＤＭＳＯを添加して、困難なテンプレートの配列決定を容易にする。
【０１３１】
配列決定反応は、推奨される増幅条件にしたがって、ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、コネティカット州ノーウォーク）中で行う。典型的には、薄壁０．２ｍｌ  ＰＣＲ試験管に、テンプレートＤＮＡ  ５００ｎｇおよび選択したプライマー１００ｎｇを含有し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｍｉｌｌｉ−Ｑ（ｍＱ）品質の水で１２μｌにしたＤＮＡ試料を調製した。２ｕｌの２ｍＭ  Ｍｇ++を各試験管に添加した。試験管は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００サーマルサイクラー中で９６℃で５分間変性した。変性後、サーマルサイクラーによって、試験管を４℃の温度に冷却した。６ｕｌのＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット６μｌを各試験管に添加した。試料をサーマルサイクラーに戻し、そして以下のプログラムを用いて周期配列決定した：（１）９６℃３０秒間；（２）５０℃５秒間；（３）６０℃４分間、その後、工程（１）に戻ってさらに２４周期、そしてその後、４℃に保持。周期配列決定は、約２．５時間後に完了した。
【０１３２】
Ｃｅｎｔｒｉ−ＳｅｐTMスピンカラム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、ニュージャージー州アデルフィア）を用いて試料を精製して、過剰な色素ターミネーターを除去するか、またはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０極細樹脂２５ｕｌおよびｍＱ水３００ｕｌを充填した、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＨＶ  Ｎ４５  ５０  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶろ過プレートを通じて精製する。ろ過プレート上に試料を装填する前に、遠心分離装置中、プレートを７５０ｘｇで２分間プレ回転させ、過剰な水を除去した。試料を樹脂上に装填し、そしてプレートを再び７５０ｘｇで４分間回転させた。回転中、Ｓｅｐｈａｄｅｘ充填プレートの直下に置いた９６ウェルプレート中に、精製試料を収集した。９６ウェルプレート中の液体は、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ中、室温で乾燥させた。４５−６０分後、ＤＮＡは乾燥し、そしてプレート底部でペレットとなっていた。３ｕｌのホルムアミド／ブルーデキストラン装填色素に試料を再懸濁し、そして２分間加熱した（装填緩衝液レシピに関しては、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅマニュアルのｐ．３３を参照されたい）。試料を、ウェルから読み取りの長さが４８ｃｍの４．５％アクリルアミドゲル上に装填し、そしてＡＢＩ自動化ＤＮＡ配列決定装置を用いて、７時間、配列決定した（典型的には、ランモジュールＳｅｑ  Ｒｕｎ  ４８Ｅ−１２００および色素セットＤＴ、Ｐｒｏｇｒａｍ  ＢＤ、Ｓｅｔ  Ａｎｙ−Ｐｒｉｍｅｒ）。
【０１３３】
重複するＤＮＡ配列断片を解析し、そしてＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ＤＮＡ解析ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州アナーバー）またはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒデータ収集および配列解析プログラムを用いて、収集したデータに塩基を割り当て、マスターＤＮＡコンティグに組み立てる。
【０１３４】
Ｂｌａｓｔ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、およびＢｏｘｓｈａｄｅ相同性並列ツール  多様なプログラムを用いて、ヌクレオチドまたはペプチド配列を互いに並列し、そして大きな配列データベースにおいて、相同性検索を容易にすることが可能である。ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，  １９９０；Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，  １９９３）による統計的マッチング理論を実行するＢＬＡＳＴ（基本的局所並列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））は、既定のクエリー配列とマッチする、ギャップのないヌクレオチドまたはペプチド下位配列を迅速に検出するため、広く用いられるプログラムである（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖより入手可能）。ＢＬＡＳＴは、全体的なアラインメントでなく、局所を探し、そしてしたがって分離された領域でしか類似性を共有しない配列間で関連を検出することが可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０，  １９９０）。
【０１３５】
ＢＬＡＳＴ検索結果の感度および量を改変する２つのパラメーターを変化させることが可能である。パラメーターＢ（デフォルト値１０）は、結果に報告される高スコアセグメント対（アラインメント）の数を制御する。パラメーターＶ（デフォルト値１０）は、１行の説明が報告されるであろう、データベース配列（ヒット）の最大数である。マッチは、高スコアセグメント対（ＨＳＰ）に基づく。２つの配列は、ＨＳＰがギャップによって分離されているならば、１より多いＨＳＰを共有する可能性がある。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列中のあいまいさに感受性であり、そして多くのギャップを含有する配列には適していない。
【０１３６】
プログラムｂｌａｓｔｐは、タンパク質配列データベースに対して、アミノ酸クエリー配列を比較する。ｂｌａｓｔｎはヌクレオチド配列データベースに対して、ヌクレオチドクエリー配列を比較する。ｂｌａｓｔｘはタンパク質配列データベースに対して、すべての読み枠で翻訳したヌクレオチドクエリー配列を比較する。未知のヌクレオチド配列の潜在的な翻訳産物を見出すのに、このオプションが使用可能である。ｔｂｌａｓｔｎは、すべての読み枠で動的に翻訳されるヌクレオチド配列データベースに対して、タンパク質クエリー配列を比較する。ｔｂｌａｓｔｘは、ヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳に対して、ヌクレオチドクエリー配列の６フレーム翻訳を比較する（ＢＬＡＳＴ、関連プログラム、およびパターンマッチングアルゴリズムに関するさらなる情報には、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照されたい）。
【０１３７】
ＢＬＡＳＴ、スコア＝９８−５５７、ワード長５１４文字を用いて行うヌクレオチド検索を用いて、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得た。タンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＰ、スコア＝５０、ワード長３で行い、参照ポリペプチド（例えば配列番号２）に相同なアミノ酸配列を得る。
【０１３８】
多数のＤＮＡまたはタンパク質配列のアラインメント用の異なるアルゴリズムを実行するＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ、バージョン１．７４もまた用いて、異なる配列間のアラインメントを用意し、そしてパーセント同一性を割り当てた。このプログラムは、配列加重、位特異的ギャップペナルティおよび加重マトリックス選択を通じて、進行性多数配列アラインメントの感度を改善する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２２（２２）：４６７３−４６８０，  １９９４）。バージョン１．７４のデフォルトパラメーターを用いて、２つの配列間のアラインメントを容易にし、そしてパーセント同一性を割り当てた。入力は、ＦＡＳＴＡ形式での配列からなり、そして出力は、図に示すアラインメントである。核酸配列に関しては、ｉｕｂ  ＤＮＡ加重マトリックスを用いた。アミノ酸配列に関しては、ｂｌｏｓｕｍタンパク質加重マトリックスを用いた（ＢＬＡＳＴ、関連プログラム、およびパターンマッチングアルゴリズムに関するさらなる情報には、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／を参照されたい）。
【０１３９】
Ｂｏｘｓｈａｄｅ  ｖ  ３．３１は、多数アラインメントタンパク質またはＤＮＡ配列からよく形式を整えたプリントアウトを生成するためのパブリックドメインプログラムである。Ｂｏｘｓｈａｄｅはそれ自体ではアラインメントを生成しないが、他の配列アラインメントプログラムによってあらかじめ用意されたファイルにシェーディングまたはカラーリングを適用する。Ｂｏｘｓｈａｄｅへの入力は、ＣｌｕｓｔａｌＷによって生成したアラインメントおよびカラーリングまたはシェーディングしようとする残基の閾値である。明記した場合を除き、大部分の場合では、５０％同一性値を用いた。この設定では、位が、同一残基を共有する配列を半分以上有すれば、シェーディングされる。Ｂｏｘｓｈａｄｅは、ｆｔｐからｆｔｐによって、あるいはＫａｙ  Ｈｏｆｍａｎｎ（ｋｈｏｆｍａｎｎ＠ｉｓｒｅｃ−ｓｕｎ１−ｕｎｉｌ．ｃｈ）またはＭｉｃｈａｅｌ  Ｄ．  Ｂａｒｏｎ（ｍｉｃｈａｅｌ．ｂａｒｏｎ＠ｂｂｓｒｃ．ａｃ．ｕｋ）から電子メールによって、入手可能である。
【０１４０】
タンパク質精製および性質決定
タンパク質精製は：イオン交換、ゲルろ過または疎水性クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣなどの多様なクロマトグラフィー法のいずれかを用いて、達成可能である。ある場合、適切にフォールディングしたタンパク質は、適切なマトリックスに付着したモノクローナル抗体または受容体サブユニットなどの親和性試薬を用いて、アフィニティー精製することが可能である。これらのおよび他のタンパク質精製法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  第１８２巻，  “Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”  Ｍｕｒｒａｙ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  カリフォルニア州サンディエゴ，  １９９０に詳細に記載される。
【０１４１】
精製タンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、エレクトロスプレー質量分析、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析可能である。タンパク質定量化は、アミノ酸組成、ＲＰ−ＨＰＬＣ、および／またはブラッドフォードタンパク質色素結合アッセイによって行う。ある場合、エレクトロスプレー質量分析と組み合わせてトリプシンペプチドマッピングを行って、タンパク質の同一性を確認する。
【０１４２】
【実施例】
以下の実施例は、本発明をより詳細に例示するであろうが、本発明はこれらの特定の実施例に限定されないことが理解されるであろう。本開示を読んだ後、当業者には、本発明の精神および範囲から逸脱しない、多様な他の例が明らかであろう。すべてのこうした他の例を、付随する請求項の範囲内に含むと意図する。
【０１４３】
実施例１−ＲＮＡ抽出用のＡ．オクラセウス胞子の調製
アスペルギルス・オクラセウスＡＴＣＣ  １８５００ストック培養（５０ｕｌ）は、胞子形成培地：５０ｇ／ｌ糖蜜、５ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、５ｇ／ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２５ｇ／ｌグルコース、２０ｇ／ｌ寒天、および０．４ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ５．８を含有するプレート上で、３−４日間増殖させた。ステロイド１１α水酸化酵素を誘導するため、培地にプロゲステロンを含んだ。５から７ｍｌの生理食塩水中に、胞子をプレートから掻き取り、生理食塩水中で洗浄し、遠心分離によって収集し、そして１５％グリセロールを含有する生理食塩水中に懸濁した。胞子をドライアイス上で凍結し、そして−８０℃で保存した。４００ｍｌの１％グルコース、５０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、および０．１ｇカンレノン、ｐＨ７．０を含有する１リットルフラスコ中で、およそ０．８ｇの胞子を３０℃でインキュベーションした。胞子破壊前にこの処理を行うのには、３つの利点がある：（１）カンレノンでのインキュベーションによって、ステロイド１１α水酸化酵素を誘導し；（２）胞子がカンレノンの１１α水酸化を触媒したかどうか決定し；（３）そして胞子壁をやわらかくする。よりよい通気を提供するため、３０℃で震蘯しながらおよそ２６時間インキュベーションした後、遠心分離によって胞子を収集した。顕微鏡の補助での視覚的検査によって、非常にわずかしか発芽し始めていないことが示された。胞子ペレットを液体窒素中で瞬間凍結し、そして−８０℃で保存した。ＨＰＬＣによって１１アルファヒドロキシカンレノンの存在に関して培地を解析して、ライブラリー構築に用いた胞子が望ましい活性を示したかどうかを決定した。
【０１４４】
実施例２−Ａ．オクラセウス胞子はカンレノンの１１α水酸化を触媒する
胞子誘導からおよそ１６０ｍｌの培地を７０ｍｌ酢酸エチルで３回抽出し、ステロイド基質および産物を収集した。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過し、そして蒸発乾固した。残渣を８ｍｌのメタノールに溶解し、したがって、カンレノンの最終濃度はおよそ１５ｍＭ（定量的回収と仮定して）であった。ＨＰＬＣ解析のため、培地抽出物は、５０％メタノールで１０から１５倍に希釈した。カンレノンおよび１１α−ヒドロキシカンレノンのストック溶液は、メタノール中で調製した。ＨＰＬＣ解析の標準は、５０％メタノールで、７５０ｕＭの最終濃度に希釈することによって、これらのストック溶液から調製した。培地抽出物および標準は、Ｃ−４逆相ＨＰＬＣカラム上でクロマトグラフィーした。培地は、２５４ｎｍで監視すると、１１α−ヒドロキシカンレノン標準と同じ保持時間で、構成要素を示した（データ未提示）。
【０１４５】
実施例３−ＲＮＡ抽出用のＡ．オクラセウス菌糸体の増殖
アスペルギルス・オクラセウス菌糸体の液体培養は、２０ｇ／ｌカンレノンを含有する、１０ｇ／ｌペプトン、１０ｇ／ｌ酵母エキスおよび１０ｇ／ｌグルコース中、１６０ｍｌの体積で、２８℃で２４から７２時間、増殖させた。細胞１０ｍｌ試料をろ過し、冷水で洗浄し、凍結し、そして−８０℃で保存した。
【０１４６】
実施例４−誘導胞子からの総ＲＮＡの抽出
およそ０．４ｇの胞子を、Ｍｉｎｉ−ＢｅａｄｂｅａｔｅｒTMモデル３１１０（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オクラホマ州バートルズビル）を用いて、４０ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）中で破壊した。簡潔には、胞子−Ｔｒｉｚｏｌ混合物は、低速で４回の３０秒パルスに供した。パルス間では、胞子を含有する試験管を氷上で冷却した。顕微鏡の補助での視覚的検査によって、胞子の大部分がこの処理によって破壊されたことが示された。破片を低速遠心分離によってペレットとし、そしてＴｒｉｚｏｌと共に使用するのに製造者が推奨するプロトコルにしたがって、上清中の総ＲＮＡを抽出した。簡潔には、１１ｍｌのポリプロピレン遠心分離試験管中の各１０ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌに、２ｍｌのクロロホルムを添加した。３分間タンパク質を抽出した後、遠心分離によって相分離を行い、そして等体積のイソプロパノールで沈殿させるため、ＲＮＡを含有する水性相をきれいな試験管に移した。沈殿したＲＮＡは、遠心分離によって回収し、そして７０％エタノールで洗浄した。ＲＮＡは、１０ｍｌの水に再懸濁し、クロロホルムで再抽出し、そしてエタノールで、−２０℃で一晩沈殿させた。総ＲＮＡ（３ｍｇ）を遠心分離によって回収し、そして２ｍｌの水中で再水和し、そして等体積の冷４Ｍ塩化リチウムを添加することによって、氷上で沈殿させた。この沈殿は、ＤＮＡ、炭水化物、ヘム、およびグアニジン法から持ち越した可能性がある他の不純物を除去するために行った。ＲＮＡは２５分間の遠心分離によって回収した。
【０１４７】
実施例５−誘導菌糸体からの総ＲＮＡ抽出
およそ０．５ｇ湿重量細胞は、液体窒素下、ドライアイス中であらかじめ冷却した乳鉢および乳棒を用いて微粉砕して細かい粉末にした。この粉末を１０ｍｌ  Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加し、そしてＫｉｎｅｍａｔｉｃａポリトロン（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ  ＡＧ、スイス・ルツェルン）を設定＃４で用いてホモジナイズした。クロロホルム抽出前に、細胞破片を遠心分離によって除去した。核酸を含有する水性相は、室温で１０分間、イソプロパノールで沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって収集し、そして７０％エタノールで洗浄した。ＲＮＡを水で再水和し、そしてクロロホルムで再抽出していかなる残渣タンパク質も除去した。水性相を、１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５体積の無水エタノールで、−２０℃で沈殿させた。最終収量は４２４ｕｇであった。およそ４ｕｇおよび１６ｕｇの総ＲＮＡは、１．２％アガロースゲルを通じた遠心分離によって分離し、そしてエチジウムブロミド中での染色によって視覚化した。染色体ＤＮＡが、少量の混入物質として存在した。
【０１４８】
実施例６−ＨｅｐＧ２細胞からの総ＲＮＡの抽出
肝細胞性ヒト肝臓癌腫細胞（ＨｅｐＧ２）、ＡＴＣＣ  ＨＢ−８０６５は、Ｐｅｎｓｔｒｅｐ、グルタメート、および１０％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）を補ったＤＭＥＭ高グルコース培地中で維持した。細胞は、０．０５％エタノールで一晩誘導し、そしてトリプシン処理によってＲＮＡ抽出用に採取した。簡潔には、細胞ペレットは、＞１０Ｘ体積の４Ｍグアニジンイソチオシアネート、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（溶液Ｄ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁し、そしてその後、ボルテックスした。酢酸ナトリウムの最終濃度が０．１Ｍであるように、水および酢酸ナトリウム、ｐＨ４．１を添加した。ＲＮＡ溶液を１／２体積のクロロホルムで抽出し、そして氷上に１５分間置いた。水性相をクロロホルムで再抽出し、そしてイソプロパノールで一晩沈殿させた。総ＲＮＡを溶液Ｄに再懸濁し、そしてイソプロパノールで再沈殿させ、その後、０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５を含有する水および２．５体積のエタノールで２回沈殿させた。ポリＡ+選択は、以下に記載するように、２回行った。
【０１４９】
実施例７−ｍＲＮＡのポリＡ+選択
ポリＡ+  ＲＮＡは、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．キット（コロラド州ボールダー）を用いて、総ＲＮＡから選択した。簡潔には、各１ｍｇの総ＲＮＡを、オリゴｄＴセルロースを含有するカラム上で、２回選択した。カラムスラリーは、穏やかに遠心分離し、そして０．５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化することによって、充填した。ＲＮＡは、室温で１５分間、ｄＴセルロースに結合させた。カラムは、０．５Ｍ  ＮａＣｌで１回、そして０．１Ｍ  ＮａＣｌで２回、洗浄した。ポリＡ+  ＲＮＡは、０．５ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中で溶出させた。オリゴｄＴセルロースによる選択は、２回行った。ｍＲＮＡは、キャリアーとして添加したグリコーゲンを含む、５０％エタノール中の０．３Ｍ酢酸ナトリウムを用いて−２０℃で沈殿させた。
【０１５０】
実施例８−ｃＤＮＡ合成およびライブラリー構築
ｃＤＮＡ合成およびライブラリー構築のため、ｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニング用ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔTMプラスミド系キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素は、２０ｕｌ反応中、４２℃で１時間、ｃＤＮＡの第一鎖を触媒した。最終組成は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＤＴＴ、各５０ｕＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、５０ｕｇ／ｍｌの５’端でリン酸化されたオリゴｄＴ−ＮｏｔＩプライマー−アダプター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０，０００単位／ｍｌ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素であった。
【０１５１】
【化１】
2005512502.tif 000015
【０１５２】
放射標識トレーサー（［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ）は添加しなかった。ｃＤＮＡの第二鎖は、１５０ｕｌの反応体積中で合成した。第一鎖反応を含む、この混合物の最終組成は、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、０．１５ｍＭ  Ｂ−ＢＡＤ+、各２５０ｕＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、１．２ｍＭ  ＤＴＴ、６５単位／ｍｌ大腸菌ＤＮＡリガーゼ、２５０単位／ｍｌ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、並びに１３単位／ｍｌ大腸菌ＲＮアーゼＨであった。１６℃で２時間インキュベーションした後、１０単位のＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを添加し、そして１６℃で５分間インキュベーションした。反応は、１０ｕｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡで停止し、そしてＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩ（ＢＩＯ  １０１  Ｉｎｃ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて、３００塩基対より小さいｃＤＮＡ、プライマー−アダプターおよびデオキシヌクレオチドから、ｃＤＮＡを分離した。５’平滑端でリン酸化し、アニーリングしたＳａｌＩアダプター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１６℃で一晩、ｃＤＮＡに連結した。
【０１５３】
【化２】
2005512502.tif 000016
【０１５４】
ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩを用いて、アダプターを除去した。その後、ｃＤＮＡをＮｏｔＩで消化した。ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（ＱＩＡＧＥＮ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、ｃＤＮＡから小さいＤＮＡ断片を除去し、ｃＤＮＡをエタノール沈殿した。
【０１５５】
実施例９−ｃＤＮＡのサイズ分画
ＴＡＥ緩衝液中、０．８％Ｓｅａ−Ｐｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、メイン州ロックランド）を通したゲル電気泳動によって、およそ１．５ｋｂ以上の種に関してｃＤＮＡを濃縮した。分離用ゲルは、ＤＮＡサイズマーカーのレーンを有し、電気泳動後、このレーンをゲルから切除し、そして適切な領域のｃＤＮＡをゲルから回収することが可能であるように、定規に並べて紫外光下で可視化するため、エチジウムブロミドで染色した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ  ＩＩを用いて、ｃＤＮＡを抽出し、これを２０ｕｌの水中に溶出した。
【０１５６】
実施例１０−ベクターｐＳｐｒｏｔ１におけるライブラリー構築および大腸菌へのエレクトロポレーション
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＡＴＰ、５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ  ８０００、１ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｕｇ／ｍｌ  ｐＳｐｏｒｔ１、およそ０．５ｕｇ／ｍｌのｃＤＮＡ、および５０単位／ｍｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含有する２０ｕｌ反応中で、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩであらかじめ消化したｐＳｐｏｒｔ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル）と、サイズ選択したｃＤＮＡのアリコットを４℃で一晩連結した。連結混合物は、１２．５ｕｌ  ７．５Ｍ酢酸アンモニウム、５ｕｌ酵母ｔＲＮＡキャリアーおよび７０ｕｌ無水エタノールを添加することによって沈殿させた。連結ｃＤＮＡは、室温で２０分間遠心分離することによって回収し、そして５ｕｌの滅菌水中で再水和した。１ｕｌの連結ｃＤＮＡは、エレクトロポレーションによって、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ大腸菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入した。１ｍｌ  ＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、３７℃で１時間、細胞を回復させた後、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ上にアリコットを蒔いた。アスペルギルス・オクラセウス胞子ライブラリー（ＬＩＢ３０２５と命名）の力価は、ＳＯＣ中で細胞懸濁物の連続希釈を調製することによって、決定した。細胞懸濁物の１ｕｌ、０．１ｕｌおよび０．０１ｕｌ試料の同等物を蒔き、そしてその結果、力価は、１．７５ｘ１０6／ｍｌコロニー形成単位であると計算された。
【０１５７】
実施例１１−ＤＮＡ配列解析によるチトクロムＰ４５０酵素をコードするクローンの同定およびアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードするプラスミドｐＭＯＮ４５６２４の構築
アスペルギルス・オクラセウスからの１１アルファ水酸化酵素のクローニング
１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上でおよそ２，０００のコロニーを選択し、そして配列決定用にミニプレッププラスミドＤＮＡ試料を調製した。ｃＤＮＡ合成に用いたポリｄＴプライマーの一部を含むＮｏｔＩ部位から始めて、発現配列タグ（ＥＳＴ）の３’端から、一方向性配列決定を行った。２つのユニバーサルプライマーを用いて、配列決定を容易にした。
【０１５８】
【化３】
2005512502.tif 000017
【０１５９】
大部分の既知のチトクロムＰ４５０は、停止コドンのおよそ５０アミノ酸残基（１５０ヌクレオチド）上流の保存されるヘム結合領域を含有する（Ｎｅｌｓｏｎら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１−４２，  １９９６）。標準的ヘム結合モチーフに関して水酸化酵素であるとスコア付けされた配列のＢＬＡＳＴＸおよび視覚的検査を用いて、適切な領域に、標準的ヘム結合モチーフ（ＦＸＸＧＸＸＸＣＸＧ、「Ｘ」はいかなるアミノ酸でもよい）をコードする配列に関して、２，０００のＥＳＴをスクリーニングした。１５のＥＳＴのみがヘム結合モチーフを有した。１つのＥＳＴがユニークであり、そして他の１４は、重複配列であるようであった。その後、推定上のチトクロムＰ４５０酵素をコードする７つのクローン由来のｃＤＮＡ挿入物を完全に配列決定した。７つすべてが同一の酵素をコードした。
【０１６０】
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素の遺伝子増幅
１１アルファ水酸化酵素のコード領域は、テンプレートとして、Ａ．オクラセウスｃＤＮＡ胞子ライブラリー（ＬＩＢ３０２５）由来のユニーククローンを用いたＰＣＲによって増幅した。プライマーは、ｐＦａｓｔｂａｃ１に方向性クローニングするため、ＥｃｏＲＩ（順方向）およびＸｂａＩ（逆方向）の認識部位を含んだ。増幅は、ＰＣＲコアキット（Ｒｏｃｈｅ）および各５０ｐｍｏｌのプライマーを用いて、３２周期行った。１周期は、９４℃４５秒間の変性工程、６０℃４５秒間のアニーリング工程、および７２℃６０秒間の伸長工程からなった。
【０１６１】
【化４】
2005512502.tif 000018
【０１６２】
ｐＭＯＮ４５６２４の構築
上述の増幅断片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を通じて精製し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断したｐＦａｓｔＢａｃ１に連結する前に、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化した。生じたプラスミドは、ｐＭＯＮ４５６２４と名づけ、そしてベクター配列に基づくプライマーおよび１１アルファ水酸化酵素配列に基づく内部プライマー（以下に示す）を用いて、ＤＮＡ配列を確認した。
【０１６３】
【化５】
2005512502.tif 000019
【０１６４】
クローニングした１１アルファ水酸化酵素のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１および配列番号２として、図１に示す。
【０１６５】
図４は、ｐＭＯＮ４５６２４にクローニングし、そしてＢＬＡＳＴを用いてＧｅｎＢａｎｋに見出される関連酵素と並列した、Ａ．オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸相同性アラインメントを示す。図５は、この関連を図式的に示す系統樹である。図６は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＢｏｘｓｈａｄｅを用いて計算した、アスペルギルス・オクラセウス、ステロイド１１アルファ水酸化酵素、およびＢＬＡＳＴを用いてＧｅｎＢａｎｋに見出される上位１０酵素の間のパーセント相同性を示す。
【０１６６】
実施例１２−ヒトＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素をコードするｃＤＮＡの増幅、並びにプラスミドｐＭＯＮ４５６０３、ｐＭＯＮ４５６０４、およびｐＭＯＮ４５６０５へのクローニング
ヒト酸化還元酵素の遺伝子増幅
ＨｅｐＧ２細胞由来のおよそ１ｕｇのポリＡ+  ｍＲＮＡを、１１ｕｌ反応中、１００ｎｇランダム六量体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）と共に、６５℃で１０分間加熱した。混合物を氷上で冷却し、その後、１ｕｌ  ＲＮアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）、０．０１Ｍ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ｄＮＴＰ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｕｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する２０ｕｌ反応中、４２℃で７５分間インキュベーションした。逆転写酵素は、９５℃で２分間加熱することによって不活性化した。第一鎖ｃＤＮＡは、−２０℃で保存した。順方向および逆方向プライマーは、寄託番号Ｓ９０４６９（チトクロムＰ４５０還元酵素をコードするヒト胎盤部分的ｍＲＮＡ（配列番号４９））のヌクレオチド配列に基づいた。対応するタンパク質配列の寄託番号はＡＡＢ２１８１４（配列番号５０）である。ヒト酸化還元酵素は、２つの断片でクローニングし、これを内部ＨｉｎｃＩＩ部位での連結によって、ｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で組み立てた。プライマーは、ｐＦａｓｔＢａｃ１に方向性サブクローニングするための制限部位を含んだ。
【０１６７】
【化６】
2005512502.tif 000020
【０１６８】
第二鎖は、１５０ｕｌ反応あたり、４００ｕＭ  ｄＮＴＰおよび各１６７ｎＭのプライマーを用いて合成した。増幅は、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を用いて行った。セグメント２（酸化還元酵素ｃＤＮＡの３’半分）用の反応は、５％  ＤＭＳＯに調整した。増幅は、９４℃９０秒間の変性、その後、６２℃２分間のアニーリング、および７２℃２分間の伸長の最初の周期を含んだ。この後、４５秒間の変性工程、４５秒間のアニーリング工程、および６０秒間の伸長工程からなる３０周期が続いた。伸長工程は、最終周期で５分間に延長した。
【０１６９】
ｐＭＯＮ４５６０３、ｐＭＯＮ４５６０４、ｐＭＯＮ４５６０５の構築
酸化還元酵素ｃＤＮＡの５’半分のＰＣＲ断片は、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化した。酸化還元酵素ｃＤＮＡの３’半分のＰＣＲ断片は、ＨｉｎｃＩＩおよびＫｐｎＩで消化し、そして配列決定のため、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）に連結した。生じたプラスミドは、ｐＭＯＮ４５６０３（５’セグメント）およびｐＭＯＮ４５６０４（３’セグメント）と命名した。ｐＭＯＮ４５６０３由来のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｃＩＩ断片およびｐＭＯＮ４５６０４由来のＨｉｎｃＩＩ／ＫｐｎＩ断片を、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断したｐＦａｓｔｂａｃ１に連結して、ｐＭＯＮ４５６０５を生成した。
【０１７０】
配列決定プライマーは、チトクロムＰ４５０還元酵素をコードするｃＤＮＡ［ヒト、胎盤、ｍＲＮＡ部分的、２４０３ｎｔ］である、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｓ９０４６９（配列番号４９）の配列に基づいた。同族（ｃｏｇｎａｔｅ）タンパク質配列は：ＡＡＢ２１８１４（配列番号５０）チトクロムＰ４５０還元酵素｛ＥＣ  １．６．２．４｝［ヒト、胎盤、ペプチド部分的、６７６ａａ］［ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］である。ｐＭＯＮ４５６０３のｃＤＮＡ挿入物は、プライマーｏｘｒｅｄ１Ｃを用いて配列決定し、そしてｐＭＯＮ４５６０４のｃＤＮＡ挿入物は、プライマーｏｘｒｅｄ２Ｃおよび２Ｄを用いて配列決定した。ｃＤＮＡ挿入物に隣接するベクター配列にアニーリングする、ユニバーサルＴ７（配列番号４１）およびＭ１３逆方向（配列番号４０）プライマーもまた、配列決定に用いた。
【０１７１】
【化７】
2005512502.tif 000021
【０１７２】
クローニングしたヒト酸化還元酵素のヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３および配列番号４として、図２に示す。図１１は、ヒト酸化還元酵素とＳｗｉｓｓＰｒｏｔ由来の上位４ヒットのアラインメントを示す。図１２は、これらのヒットに対するヒト酸化還元酵素の遺伝的関連性を示す系統樹を示す。図１３は、ヒト酸化還元酵素およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ由来の上位４ヒットの間のパーセント同一性を示す。
【０１７３】
実施例１３−Ａ．オクラセウス由来のＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素をコードするｃＤＮＡの増幅、並びにプラスミドｐＭＯＮ４５６３０、ｐＭＯＮ４５６３１、およびｐＭＯＮ４５６３２へのクローニング
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素の遺伝子増幅
クロコウジカビｃｐｒＡ遺伝子、寄託番号Ｚ２６９３８由来の配列（配列番号６５）およびアスペルギルス・フミガツス由来の部分的ｃＤＮＡクローン８０４５６１６３９Ｆ１（ＰａｔｈｏＳｅｑ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のアラインメントを視覚的にスキャンして、ＰＣＲ用のプライマーの設計のため、高い相同性の領域を選択した。ｃｐｒＡ遺伝子産物のコード領域、アミノ酸２０３から６９３に渡る、プライマー組を選択した。
【０１７４】
プライマーは、アミノ酸配列が両方の間で同一であり、そして核酸配列が第三のコドン位で２位異なる、最も５’の重複する領域から選択した。３’プライマーに関しては、核酸は、停止コドン、最後の７アミノ酸残基、およびクロコウジカビではＡＲＧ、そしてＡ．フミガツスではＳＥＲをコードする（ＣＧＣ対ＡＧＣ）、停止コドンからアミノ酸残基８位のコドンの第二および第三の位に対応する２つのさらなる塩基をコードした。クロコウジカビおよびＡ．フミガツス配列間に相違があるコドンの第三の塩基をイノシンと交換した。
【０１７５】
【化８】
2005512502.tif 000022
【０１７６】
Ａ．オクラセウス菌糸体から抽出した総ＲＮＡおよそ５ｕｇから部分的ｃＤＮＡクローンを増幅した。第一鎖合成前に、ＲＮＡを、１１ｕｌ反応混合物中、１００ｎｇランダム六量体（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）と共に、６５℃で１０分間加熱した。混合物を氷上で冷却し、その後、１ｕｌ  ＲＮアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０１Ｍ  ＤＴＴ、５ｍＭ  ｄＮＴＰ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１ｕｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＬＴＩ）を含有する２０ｕｌ反応中、４２℃で７５分間インキュベーションした。逆転写酵素は、９５℃で２分間加熱することによって不活性化した。第一鎖ｃＤＮＡは、−２０℃で保存した。第二鎖は、テンプレートとして第一鎖５ｕｌを用いて合成した。該反応は、５００ｎＭプライマー、各２００ｕＭのｄＮＴＰ、並びにＰＣＲコアキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）に供給されるようなＴａｑポリメラーゼおよび緩衝液を含んだ。増幅は、９４℃３０秒間の変性工程、６０℃３０秒間のアニーリング工程、および７２℃６０秒間の伸長工程の３２周期を用いて行った。増幅したＤＮＡ産物をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）にクローニングし、そしてユニバーサルＴ７（配列番号４１）およびＳＰ６（配列番号５７）プライマーを用いて配列決定した。
【０１７７】
【化９】
2005512502.tif 000023
【０１７８】
クロコウジカビｃｐｒＡ遺伝子との配列のアラインメントによって、Ａ．オクラセウスクローンが、クロコウジカビ遺伝子のイントロンと同じ位置にイントロンを有することが明らかになった。これは、Ａ．オクラセウスＰＣＲ産物が、総ＲＮＡのゲノムＤＮＡ混入物質から増幅されている可能性があることを示した。Ａ．オクラセウス配列に基づく逆プライマーを設計して、開始メチオニンを含むおよそ６００の欠けているｂｐを増幅した。その後、Ａ．オクラセウスｃＤＮＡライブラリーは、ＰＣＲのテンプレートとして用いた。順方向プライマーは、ベクターｐＳｐｏｒｔ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の塩基２９９から３２６の逆相補体に基づいた。他方のプライマー、Ａ．ｏｘｒｅｄ−ｒｅｖ２は、残基３２６−３３３をコードするＡ．オクラセウス配列に基づいた。
【０１７９】
【化１０】
2005512502.tif 000024
【０１８０】
その後、サイズ＞１．５ｋｂのゲル精製断片から作成したＡ．オクラセウス胞子ライブラリーを、コード領域の最後の２００塩基を増幅するためのテンプレートとして用いた。Ａ．ｏｘｒｅｄ配列から２つの新規逆方向プライマーを設計し、そしてｐＳｐｏｒｔ１（塩基２９５−３２８）に基づく新規順方向プライマーもまた、用いた。
【０１８１】
【化１１】
2005512502.tif 000025
【０１８２】
増幅は、伸長酵素ポリメラーゼキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ロックビル）を用いて、９４℃３０秒間の変性工程、６３℃３０秒間のアニーリング工程、および６８℃５分間の伸長工程からなる３５周期、行った。ＰＣＲ産物を、ｐＣＲＩＩ  ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に直接クローニングした。１２のクローンを配列決定し、そして複合配列は、最初のメチオニンの２３２塩基上流に伸長し、そして２つのインフレーム停止コドンを含んだ（データ未提示）。
【０１８３】
発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１への連結用に、５’ＳａｌＩ部位および３’ＸｈｏＩ部位を含む、Ａ．ｏｘｒｅｄの完全コード領域を取り込むプライマーを設計した。
【０１８４】
【化１２】
2005512502.tif 000026
【０１８５】
これらのプライマーおよび伸長酵素キットと共に、ＰＣＲのテンプレートとしてＡ．オクラセウス総ＲＮＡを用いた。増幅は、９４℃３０秒間の変性工程、６４℃３０秒間のアニーリング工程、および６８℃５分間の伸長工程を含む、３５周期からなった。反応由来のｃＤＮＡアリコットは、およそ２．１ｋｂの単一バンドとして泳動された。
【０１８６】
ｐＭＯＮ４５６３０の構築
ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）に直接クローニングした。すべてのクローンは、先に記した内部イントロンを含有した。１つのクローンは、ｐＭＯＮ４５６３０と称した。
【０１８７】
ｐＭＯＮ４５６３１およびｐＭＯＮ４５６３２の構築
５’スプライシング部位からおよそ１７０ｂｐ上流の内部ＢａｍＨＩ部位からの２工程ＰＣＲに基づく戦略を使用して、イントロンを欠くクローンを生成した。
【０１８８】
【化１３】
2005512502.tif 000027
【０１８９】
プライマーＡ．ｏｘｒｅｄ−ｆｏｒ４およびｒｅｖ６は、相補的であり、そしてイントロンに隣接した。第一のＰＣＲ反応は、テンプレートとして、内部ＢａｍＨＩ部位で直線化したＡ．ｏｘｒｅｄクローンを用いた。ポリメラーゼおよび緩衝液は、ＰＣＲコアキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）によって供給された。プライマーおよびｄＮＴＰ濃度は、それぞれ、５００ｎＭおよび２００ｕＭであった。Ａ．ｏｘｒｅｄ−ｆｏｒ３とＡ．ｏｘｒｅｄ−ｒｅｖ６、およびＡ．ｏｘｒｅｄ−ｆｏｒ４とＡ．ｏｘｒｅｄ−ｒｅｖ５の組み合わせを用いて、２つの反応を行った。２分間の最初の変性後、２８周期のＰＣＲ増幅を行った。１周期は、９４℃４５秒間の変性、６２℃４５秒間の変性工程および７２℃４５秒間の伸長工程を含んだ。各反応１ｕｌは、プライマーＡ．ｏｘｒｅｄ−ｆｏｒ３およびＡ．ｏｘｒｅｄ−ｒｅｖ５と共に伸長酵素および緩衝液を用いた第二のＰＣＲ増幅のテンプレートとして働いた。増幅は、９４℃３０秒間の変性工程、６２℃３０秒間のアニーリング工程、および６８℃５分間の伸長工程を含む３０周期からなった。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯに直接クローニングした。ＤＮＡ配列決定は、イントロンが除去されていることを立証した。このクローンは、ｐＭＯＮ４５６３１と命名した。
【０１９０】
プラスミドｐＭＯＮ４５６３２は、ｐＭＯＮ４５６３０由来のＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片とｐＭＯＮ４５６３１由来のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片、並びにＳａｌＩおよびＸｈｏＩで切断し、そして望ましい挿入物を含むベクターの回収を増進するために脱リン酸化した、ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１を連結することによって、三方向連結で構築した。
【０１９１】
クローニングしたアスペルギルス・オクラセウス１１酸化還元酵素のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５および配列番号６として、図３に示す。図７は、クロコウジカビ、マウス、およびＳ．セレビシエ由来のＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素に対する、アスペルギルス・オクラセウスおよびヒト酸化還元酵素のアミノ酸相同性を示す。図８は、Ａ．オクラセウス、クロコウジカビ、およびＳ．セレビシエ酸化還元酵素に関するアミノ酸アラインメントを示す。図９は、クロコウジカビ、酵母、およびマウス由来の還元酵素に対する、アスペルギルス・オクラセウスおよびヒト酸化還元酵素の関連性を示す系統樹である。図１０は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＢｏｘｓｈａｄｅを用いて計算した、アスペルギルス・オクラセウス、ステロイド１１アルファ水酸化酵素、並びにクロコウジカビ、酵母、およびマウス由来の酸化還元酵素の間のパーセント相同性を示す。
【０１９２】
実施例１５：アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびアスペルギルス・オクラセウスＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素を認識するポリクローナル抗体の生成
抗１１α水酸化酵素抗体の生成
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素に対するポリクローナル抗体は、以下の予測されるタンパク質配列のいくつかの領域に対応する合成ペプチド（Ｓｉｇｍａ／Ｇｅｎｏｓｉｓ、テキサス州ウッドランズにより調製）に対して、ウサギにおいて作成した：
【０１９３】
【化１４】
2005512502.tif 000028
【０１９４】
１１ａＯＨペプチド２（配列番号２４）は、ＷａｎｇおよびＬｕ（Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｐｏｓ．  ２５（６），  ７６２−７６７，  １９９７）に記載されるＣＹＰ３Ａ４に対応する配列を含む、１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸配列のアラインメントに存在する、Ｇらせん、Ｇ／Ｈループ、およびＨらせん領域に対応する。１１ａＯＨペプチド３（配列番号２５）は、ヘム結合ドメイン由来のペプチド断片に対応した。
【０１９５】
免疫学的等級ペプチドは、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、純度に関して監視した。各ペプチドは、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲート化し、そして完全フロイトアジュバントに懸濁した。その後、コンジュゲート化ペプチドを、ウサギの多数の部位に皮下注射した。各コンジュゲート化ペプチドは、２匹のウサギに注射した。続くすべての免疫は、不完全フロイントアジュバント中で投与した。一般的に、続く５回の注射は、最初の免疫後、２週間間隔で投与した。ＩｇＧ分画は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−プロテインＡカラムを用いてアフィニティー精製した。各ペプチドを注射した２匹のウサギ由来の分画を１：１比で合わせた。プールした抗１１アルファ水酸化酵素（ウサギＧＮ１１８７／１１８８）は、０．３４ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧであった。プールした抗ｏｘｒｅｄ（ウサギＧＮ２０２３／２０２４）は、０．２６ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧであった。合わせたＩｇＧは、どの希釈がウェスタンブロットを探査するのに最適であるかを決定するパイロット実験用に、各々、１：１０、１：１００および１：１，０００に希釈した。１：１０希釈が最も優れた結果を生じ、そして続くウェスタンを探査するのに用いた。
【０１９６】
実施例１６−昆虫細胞感染および異種発現
タンパク質は、バキュロウイルスシャトルベクター（Ｌｕｃｋｏｗら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７：４５６６−４５７９，  １９９３）を用いてＳｆ９昆虫細胞中で発現した。バキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）は、細菌細胞中で発現するためのミニ−Ｆレプリコン、選択用のカナマイシン耐性マーカー、およびｌａｃＺα配列内のａｔｔＴｎ７（細菌Ｔｎ７トランスポゾンの標的部位）を含有する。これらの要素は各々、オートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ、天然バキュロウイルス）ゲノムのポリヘドリン遺伝子座に挿入する。ドナープラスミド（ｐＦａｓｔＢａｃ１、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、発現しようとする遺伝子を搬送し、そして細菌Ｔｎ７遺伝子転位要素を介して、バクミドに挿入した。ｐＦａｓｔＢａｃ１は、ポリヘドリンプロモーターに隣接するＴｎ７左および右端、ポリリンカークローニング配列、ＳＶ４０ポリＡ転写終結配列、および選択用のゲンタマイシン耐性遺伝子を含有する。組換えウイルスは、単一１１アルファ水酸化酵素または酸化還元酵素ｃＤＮＡを含有するｐＦａｓｔＢａｃ１プラスミドの、バクミドおよびヘルパープラスミドを含有するＤＨ１０Ｂａｃ大腸菌細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）への形質転換後、生成した。
【０１９７】
トランスフェクションは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）細胞用の製造者のプロトコルにしたがって、ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎTM試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。細胞は、６ウェル組織培養プレートに、ＳＦ−９００血清不含培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ウェルあたり９ｘ１０5細胞で蒔き、そして少なくとも１時間付着させた。トランスフェクション混合物は、２００ｕｌのＳＦ−９００培地を含有するポリスチレン試験管に、５ｕｌミニプレップＤＮＡおよび５μｌ  Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎを添加して作成した。混合物を室温で１５−３０分間インキュベーションさせた。トランスフェクション前に、８００ｕｌのＳＦ−９００培地を各試験管に添加した。細胞を２ｍｌのＳＦ−９００培地で１回洗浄し、そしてＤＮＡ混合物を細胞に添加した。培養を２７℃で５時間インキュベーションさせた。５時間のインキュベーション期間後、トランスフェクション混合物を除去し、そして培養に、１０％ウシ胎児血清を補充したＩＰＬ−４１培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ウェルあたり３ｍｌ補充した。３日間のインキュベーション期間後、細胞を採取し、遠心分離し、そして組換えウイルスを含有する上清（継代１またはＰ１ストックと命名）を除去して、そして４℃で保存した。より大きいウイルスストックは、０．５ｍｌのＰ１培地を用いて、ｍｌあたり５ｘ１０5細胞の新鮮なＳｆ９細胞１００ｍｌを感染させることによって、作成した。その後、このより大きい（Ｐ２）ストックは、プラークアッセイプロトコル（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９２）を用いて力価測定し、そして別個に、または互いに組み合わせて、１１アルファ水酸化酵素または酸化還元酵素の産生に用いた。
【０１９８】
図１４は、感染２５および４８時間後に採取したバキュロウイルス感染昆虫細胞におけるアスペルギルス・オクラセウスＰ４５０  １１アルファ水酸化酵素の発現を例示するイムノブロットを示す。ニトロセルロース膜は、コンジュゲート化合成ペプチド１１ａＯＨペプチド２（配列番号２４）で免疫した２匹のウサギから調製した抗体の１：１混合物で探査した。
【０１９９】
図１５は、感染２５および４８時間後に採取したバキュロウイルス感染昆虫細胞におけるアスペルギルス・オクラセウスＰ４５０酸化還元酵素の発現を例示するイムノブロットを示す。ニトロセルロース膜は、コンジュゲート化合成ペプチドｏｘｒペプチド１（配列番号２６）で免疫した２匹のウサギから調製した抗体の１：１混合物で探査した。
【０２００】
実施例１７：アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびヒト酸化還元酵素を発現するバキュロウイルスの同時感染
Ｓｆ９細胞は、ステロイド１１アルファ水酸化酵素ｃＤＮＡを含有するウイルス粒子およびヒトＮＡＤＰＨ  Ｐ４５０酸化還元酵素を含有する別個のウイルスに同時感染させた。両ウイルスは、感染効率（ＭＯＩ）比０．１：０．０１（１１ａＯＨ対ｏｘｒ）で添加した。感染１日後、０．９μｇ／ｍｌ塩化ヘミンを培養に添加した。細胞は、感染３日後、遠心分離によって採取し（異なって明記しない限り）、そして洗浄した細胞ペレットを細胞成分分画用にプロセシングするまで、凍結した。
【０２０１】
実施例１８：アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素を発現するバキュロウイルスの同時感染
Ｓｆ９細胞は、ステロイド１１アルファ水酸化酵素ｃＤＮＡを含有するウイルス粒子およびＡ．オクラセウスＮＡＤＰＨ  Ｐ４５０酸化還元酵素を含有する別個のウイルスに同時感染させる。両ウイルスは、感染効率（ＭＯＩ）比０．１：０．０１（１１ａＯＨ対ｏｘｒ）で添加する。感染１日後、０．９μｇ／ｍｌ塩化ヘミンを培養に添加する。細胞は、感染３日後、遠心分離によって採取し（異なって明記しない限り）、そして洗浄した細胞ペレットを細胞成分分画用にプロセシングすることを要する、続く実験で必要になるまで、凍結する。
【０２０２】
実施例１９：バキュロウイルス感染昆虫細胞からの細胞成分分画の調製
感染ｓｆ９細胞および未感染対照細胞由来の細胞ペースト１／２グラムを融解し、そしてｐＨ７．４に調整した１０ｍＭ  ＫＨＰＯ４を含む０．２５Ｍスクロース４０ｍｌに懸濁した。懸濁物は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ、モデル３００プローブ超音波処理装置（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ミズーリ州セントルイス）を用いてホモジナイズした。試料を円錐状遠心分離試験管（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）に移し、そして５℃で１５分間、５００ｘｇの遠心分離に供した。ペレットを同体積の新鮮な緩衝液に再懸濁し、そして顕微鏡下で可視化して、完全な溶解を確認した。全細胞は、ほとんどまたはまったく観察されなかった。その後、上清を５℃で３０分間、１０，０００ｘｇの遠心分離に供して、ミトコンドリア、ゴルジおよび他の細胞下器官を収集した。ペレットを新鮮な緩衝液に再懸濁し、そして５℃で３０分間、７，８００ｘｇの遠心分離に供して、ミトコンドリアを収集した。
【０２０３】
ミトコンドリアペレットを、上述のように緩衝液に再懸濁し、そして遠心分離を反復した。ミトコンドリアペレットを２ｍｌの緩衝スクロース溶液に再懸濁し、そして１００ｕｌアリコット中、−８０℃で保存した。
【０２０４】
最初のミトコンドリア分画由来の上清を、５℃で１時間、２００，０００ｘｇの遠心分離に供した。ミクロソームペレットを２ｍｌの緩衝スクロース溶液に再懸濁し、そして１００ｕｌアリコット中、−８０℃で保存した。
【０２０５】
ミクロソームインキュベーション
インキュベーション混合物は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４または１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４中の、Ｓｆ９ミクロソーム（１．０ｍｇタンパク質／ｍｌ最終濃度）、ＮＡＤＰＨ生成系および２５０ｕＭ基質（ＡＤ）からなった。ＮＡＤＰＨ生成系は、示した最終濃度の以下で構成された：ＭｇＣｌ2（７．５ｍＭ）、Ｄ−グルコース−６−リン酸（７．５ｍＭ）、ＮＡＤＰ（０．８０ｍＭ）、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（１．０単位／ｍｌ）。インキュベーションは、水槽中、３７℃で示した時間行った。インキュベーション後、反応は、０．３ｍｌメタノールの添加によって終結させた。試料を２秒間３回ボルテックスし、そして氷上に置くか、または後の解析のため、−７０℃で保存した。
【０２０６】
実施例２０：水酸化対応物へのステロイド基質の変換を測定するＨＰＬＣアッセイ
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
アンドロステンジオンから１１α−ヒドロキシアンドロステンジオンのように、ステロイド基質から水酸化ステロイド化合物を分離するのに用いるＨＰＬＣ法は、Ｓｏｎｄｅｒｆａｎら，  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２５５：２７−４１，  １９８７に記載される、テストステロン水酸化酵素アッセイの修飾型である。アンドロステンジオンおよび１１−ベータ−ヒドロキシアンドロステンジオンの標準は、Ｓｉｇｍａから得た。１１−アルファ−ヒドロキシアンドロステンジオン（８９．５％純粋、主要な不純物はアンドロステンジオン）は、Ｓｅａｒｌｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙに提供された。ＨＰＬＣ等級の水およびメタノールは、Ｂｕｒｄｉｃｋ  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎから得た。
【０２０７】
ＨＰＬＣ系は、モデル１０５０シリーズのポンプ、自動注入装置および可変波長検出装置（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、イリノイ州ネーパービル）およびモデルＴＣ−５０温度調節装置およびモデルＣＨ−３０カラム加熱装置（どちらもＥｐｐｅｎｄｏｒｆ、ウィスコンシン州マディソン）からなった。
【０２０８】
１１水酸化酵素および相補的電子輸送タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスでトランスフェクションした昆虫細胞由来の細胞膜分画は、最終体積２００ｕｌ中に、８０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４、８ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および０．９ｍＭ  ＮＡＤＰ+を含有する反応混合物中で、１１水酸化酵素活性に関して解析した。同等物が減少する適切な供給源を保証するため、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（１．５Ｕ／ｍｌ）および８ｍＭグルコース−６−リン酸を添加することによって、ＮＡＤＰＨ再生系を提供した。ステロイド基質（例えばアンドロステンジオン）は、最終濃度０．３ｍＭで提供した。反応混合物は、３７℃で３０分間インキュベーションした。反応は、２００ｕｌメタノールの添加によって終結させ、そしてその後、氷上に置いた。試料は、遠心分離によってペレットにして、沈殿したタンパク質を除去した。
【０２０９】
ある場合、インキュベーションは、シリコン処理ポリプロピレン１．５ｍｌ微量遠心分離試験管中、０．５ｍｌの体積で、３７℃で１２０分間行った。ミクロソームまたはミトコンドリア分画から調製した酵素を添加し、そして基質を２５０μＭ（例えばＡＤの２５ｍＭメタノールストック溶液）の濃度で添加した。補助因子緩衝液は、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．４、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、７．５ｍＭグルコース−６−リン酸、０．８０ｍＭ  ＮＡＤＰ、および１．０単位／ｍｌグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼであった。ＨＰＬＣ試料は、０．３ｍｌメタノールの添加によって、０．５ｍｌ反応混合物を終結させ、２秒間３回ボルテックスして、そして氷上に保存することによって調製した。試験管は、微量遠心分離装置中、〜２０，０００ｘｇで５分間回転させ、そして自動試料収集バイアルに試料を移し、そしてふたをした。
【０２１０】
反応混合物および培地抽出物に存在するステロイド構成要素は、２５０ｍｍ  ｘ  ４ｍｍ  Ｖｙｄａｃ分析Ｃ−４カラムを用いた逆相ＨＰＬＣによって、分離してそして解析した。クロマトグラムは、１０分間の期間に渡る、４０％から１００％メタノールの溶媒勾配を用い、そして最初の条件に再平衡化する前に、１００％メタノールで５分間維持して、展開した。カラム溶出物は、２５４および２２０ｎｍ両方でＵＶ吸光度に関して監視した。
【０２１１】
アンドロステンジオン、テストステロンおよび一水酸化アンドロステンジオン代謝産物は、４０℃および１．０ｍｌの移動相／分で、０．２２ミクロンＲｈｅｏｄｙｎｅプレカラムフィルターを備えた、Ｎｏｖａ−ｐａｋ  Ｃ１８カラム、４ミクロン、３．９ｘ１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、マサチューセッツ州ミルフォード）上で分離した。移動相溶媒Ａとして水を、そして溶媒Ｂとしてメタノールを用いる、段階的勾配を利用した。溶媒Ｂの最初の濃度は、４２％で６分間であった。Ｂの割合は、４分間に渡って、直線的に４５％に増加させ、そしてその後、３分間保持した。その後、Ｂの割合は、１０分間に渡って、直線的に８０％に増加させ、そしてそこでさらに２分間保持し、総運転時間は２５分間であった。紫外検出波長は２４７ｎｍであり、そして注入体積は２００ｕｌであった。
【０２１２】
「ミトコンドリア」試料および「ミクロソーム」試料はどちらも、１１α−ヒドロキシアンドロステンジオン標準のＨＰＬＣ保持時間と一致するピークを生じ、一方、他の分画は、該ピークを生じなかった。これらの「ミトコンドリア」および「ミクロソーム」ピークは、それぞれ、２４７ｎｍで定量化した総ピーク面積の３．２および２．３％であった。また、１１α−ヒドロキシアンドロステンジオン標準を、５．０μｇ／ｍｌの濃度で、ブランクミクロソームインキュベーション試料にスパイクした。「ミトコンドリア」および「ミクロソーム」１１α−ヒドロキシアンドロステンジオンピークの濃度は、標準の純度を訂正（８９．５％）した後、１．７５および１．３１μｇ／ｍｌであった。これらの濃度は、２５０μＭの基質濃度を用いて、２．３および１．７％の基質が１１α−ヒドロキシアンドロステンジオンに変換されたのに相当した。
【０２１３】
図１６は、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびヒト酸化還元酵素を発現する、バキュロウイルス感染昆虫細胞から調製した細胞成分分画とＡＤをインキュベーションした後の、１１アルファヒドロキシ対応物へのアンドロステンジオン（ＡＤ）の変換を例示するＨＰＬＣ追跡を示す。
【０２１４】
実施例２１：合成ペプチドに対して生成したポリクローナル抗体を用いた免疫ブロッティングによる、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびアスペルギルス・オクラセウスＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素の認識
Ｓｆ９細胞溶解物由来のタンパク質（未感染および組換えバキュロウイルス感染細胞から得た）を、等濃度（ウェルあたり１０μｇ）で、１０％勾配アクリルアミドミニゲル（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュルス）のレーンに装填した。タンパク質は、０．１％ＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含有するＴｒｉｓ−グリシン緩衝液でおよそ１時間、１６ｍＡｍｐ定電流の電気泳動によって分離した。タンパク質は、７０ｍＡｍｐ定電流で、４０分間、ニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、ニューハンプシャー州キーン）に移した。一次抗体を１：１０に希釈し（抗１１アルファ水酸化酵素のＩｇＧ（ペプチド１１ａＯＨペプチド２  ＣＲＱＩＬＴＰＹＩＨＫＲＫＳＬＫＧＴＴＤ（配列番号２４）から調製した抗体ＧＮ−１１８７およびＧＮ−１１８８）０．３４ｍｇ／ｍｌ、および抗ｏｘｒｅｄのＩｇＧ（ｏｘｒペプチド１  ＣＴＹＷＡＶＡＫＤＰＹＡＳＡＧＰＡＭＮＧ（配列番号２６）から調製した抗体ＧＮ−２０２３およびＧＮ−１２０２４）０．２６ｍｇ／ｍｌのストック濃度から）、そしてニトロセルロース膜を探査するのに用いた。抗原は、製造者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）に推奨されるように、抗ウサギセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）連結二次抗体を用いて検出した。化学発光は、販売者に提供されるプロトコルにしたがって、ルミノールおよびペルオキシド試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）を用いて検出した。光放出は、Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク州ロチェスター）を用いて記録した。画像は、Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｄｉｍａｇｅ  Ｖデジタルカメラ（Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州ラムゼイ）を用いて記録した。
【０２１５】
実施例２２：１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素をコードするアスペルギルス・オクラセウス・ゲノムＤＮＡの性質決定
上述のアプローチを用いて、アスペルギルス・オクラセウス、並びにクロコウジカビおよびアスペルギルス・ニダランスを含む、緊密に関連する微生物のゲノム内でステロイド水酸化酵素および酸化還元酵素をコードする遺伝子の同定を容易にすることが可能である。他の好ましい生物は、リゾプス・オリゼー、リゾプス・ストロニファー、ストレプトミセス・フラディエー、巨大菌、シュードモナス・クルシビエー、トリコテシウム・ロゼウム、フザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．セペー、リゾプス・アーヒズス、およびモノスポリウム・オリバセウムである。ステロイド１１アルファ水酸化酵素活性を有することが知られる、他の好ましい生物が、上の、本発明の詳細な説明に記載される。
【０２１６】
簡潔には、ゲノムＤＮＡを調製し、そして細菌中で増殖する低コピー人工染色体にショットガンクローニングする。多数のクローンを配列決定して、全ゲノムの統計的提示を確実にし、そして重複クローンの配列を統合して、ゲノムの最終マップおよび配列を生じる。オープンリーディングフレームの解析は、ＢＬＡＳＴ  、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ、およびＢｏｘＳｈａｄｅなどの、ヌクレオチドおよびタンパク質配列データの多数の配列アラインメントを容易にするよう設計されたプログラムを用いて、本発明のステロイド水酸化酵素および酸化還元酵素遺伝子に相同な領域、並びにこれらの酵素に相同な、翻訳されるオープンリーディングフレームの領域を明らかにするであろう。これらのタンパク質をコードする遺伝子を、人工染色体から得て、そしてｐＦａｓｔＢａｃ１などの発現ベクターに再度クローニングし、適切な宿主細胞に形質転換し、これを、酸化対応物へのステロイド基質の変換を実行可能な酵素の存在に関してアッセイする。
【０２１７】
本発明の範囲は、付随する請求項を参照することによって決定することを意図する。現在記載されているような本発明に、本発明の利点のいずれも危うくすることなく、本発明の範囲および精神から逸脱しない、いくつかの変動を加えることが可能であると認識される。これらには、ステロイド基質の１１アルファ水酸化を実行することが知られる微生物、好ましくは真菌および細菌由来の相同遺伝子の単離が含まれる。本発明はまた、類似の構成要素のいかなる置換にも向けられる。これには、限定されるわけではないが、コア分子の他の部位で作用する水酸化酵素を含む、ステロイド生成に関与する他のＰ４５０を単離するための、これらの技術の使用、および修飾宿主微生物におけるステロイド中間産物の生物変換を容易にするための、これらの酵素の使用が含まれる。
【０２１８】
本明細書に引用するすべての参考文献、特許、または出願は、本明細書に記載されるかのように、その全体が本明細書に援用される。
【０２１９】
参考文献
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Ｙａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ａｏｙａｍａ，  Ｔ．，  ＭｃＢｒｉｄｅ，  Ｏ．Ｗ．，  Ｈａｒｄｗｉｃｋ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｇｅｌｂｏｉｎ，  Ｈ．Ｖ．およびＧｏｎｚａｌｅｚ，  Ｆ．Ｊ．  ヒトＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０酸化還元酵素：相補ＤＮＡクローニング、配列およびワクシニアウイルス仲介発現およびＣＹＰＯＲ遺伝子の染色体７への位置決定。  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３６（１），  ８３−８８（１９８９）［Ａ６０５５７］
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【図面の簡単な説明】
【図１】  アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列。
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列（それぞれ配列番号１、配列番号２）を示す。
【図２】  ヒト酸化還元酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列。
ヒト酸化還元酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列（それぞれ配列番号３、配列番号４）を示す。本明細書に開示するように、ヒトＨｅｐＧ２細胞由来のＲＮＡをテンプレートとして用いたＲＴ−ＰＣＲによって調製したｃＤＮＡライブラリーから独立にクローニングしたヒト酸化還元酵素の予測されるアミノ酸配列は、３つの異なる研究室によって先に報告されたものとマッチする。これらの遺伝子座のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号には、Ａ６０５５７（ＮＡＤＰＨ−−フェリヘモタンパク質還元酵素（ＥＣ１．６．２．４）−ヒト）；ＡＡＧ０９７９８（ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素［ホモ・サピエンス］）、およびＰ１６４３５（ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）（Ｐ４５０Ｒ））が含まれる。
ＡＡＢ２１８１４のアミノ酸配列（チトクロムＰ４５０還元酵素｛ＥＣ１．６．２．４｝［ヒト、胎盤、ペプチド部分的、６７６ａａ］）は、４残基で、ヒト酸化還元酵素Ａ６０５５７およびＰ１６４３５と異なる；５００でＡ→Ｖ、５１８でＦ→Ｌ、５３７でＶ→Ｗ、および５３８でＡ→Ｈ。ＡＡＢ２１８１４には、最初のメチオニンも欠けている。ＡＡ２１８１４の同族核酸（Ｓ９０４６９［チトクロムＰ４５０還元酵素［ヒト、胎盤、ｍＲＮＡ部分的、２４０３ｎｔ］］）は、最初のメチオニンのＡＴＧコドンを欠き、そして１４９６でのＣ→Ｔ変化、１５５１でのＣ→Ａ変化、および１６１６でＴが付加されることで回復する１６０５でのＧの欠失によるフレームシフトを含む。
これらの遺伝子座に関する参考文献は以下のとおりである：Ａ６０５５７［Ｙａｍａｎｏ，  Ｓ．，  Ａｏｙａｍａ，  Ｔ．，  ＭｃＢｒｉｄｅ，  Ｏ．Ｗ．，  Ｈａｒｄｗｉｃｋ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｇｅｌｂｏｉｎ，  Ｈ．Ｖ．およびＧｏｎｚａｌｅｚ，  Ｆ．Ｊ．  ヒトＮＡＤＰＨ−Ｐ４５０酸化還元酵素：相補ＤＮＡクローニング、配列およびワクシニアウイルス仲介発現およびＣＹＰＯＲ遺伝子の染色体７への位置決定  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３６（１），  ８３−８８（１９８９）］；ＡＡＧ０９７９８［Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ，  Ｍ．，  Ｓａｈｎｉ，  Ｍ．，  Ｍａｄａｎ，  Ａ．およびＰａｒｋｉｎｓｏｎ，  Ａ．  ヒトＣＹＰＯＲの多型：新規対立遺伝子の発現。未公表、直接提出］；およびＰ１６４３５［Ｈａｎｉｕ，  Ｍ．，  ＭｃＭａｎｕｓ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｂｉｒｋｅｔｔ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｔ．Ｄ．およびＳｈｉｖｅｌｙ，  Ｊ．Ｅ．  ヒト肝臓由来のＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素の構造的および機能的解析：ヒト酵素の完全配列およびＮＡＤＰＨ結合部位。  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８（２１），  ８６３９−８６４５（１９８９）］；ＡＡＢ２１８１４［Ｓｈｅｐｈａｒｄ，  Ｅ．Ａ．，  Ｐａｌｍｅｒ，  Ｃ．Ｎ．，  Ｓｅｇａｌｌ，  Ｈ．Ｊ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｉ．Ｒ．  ヒト組織におけるチトクロムＰ４５０還元酵素遺伝子発現の定量化。  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２９４（１），  １６８−１７２（１９９２）］；Ｓ９０４６９［Ｓｈｅｐｈａｒｄ，  Ｅ．Ａ．，  Ｐａｌｍｅｒ，  Ｃ．Ｎ．，  Ｓｅｇａｌｌ，  Ｈ．Ｊ．およびＰｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｉ．Ｒ．  ヒト組織におけるチトクロムＰ４５０還元酵素遺伝子発現の定量化。  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ２９４（１），  １６８−１７２（１９９２）］。
【図３】  アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列。
アスペルギルス・オクラセウス１１酸化還元酵素のヌクレオチドおよびタンパク質配列（それぞれ配列番号５、配列番号６）を示す。
【図４】  Ａ．オクラセウス１１アルファ水酸化酵素と、ＧｅｎＢａｎｋ由来の上位１０ＢＬＡＳＴヒットのアミノ酸相同性並列。
プラスミドｐＭＯＮ４５６２４（配列番号０１）にクローニングしたアスペルギルス・オクラセウス、ステロイド１１アルファ水酸化酵素（配列番号０２）は、ヒューリスティックマッチングアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｏｃｔ  ５；２１５（３）：４０３−１０，  １９９０）を実行するＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋに見出される関連酵素と並列した。上位１０マッチのＧｅｎＢａｎｋ寄託番号（そのありうる機能、［属および種］）は以下のとおりである：ＣＡＡ７５５６５（チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ［ジベレラ・フジクロイ］）；ＣＡＢ９１３１６（おそらくチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ｌｏｖＡ）［アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）］）；ＣＡＢ５６５０３（チトクロムＰ４５０［ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ）］）；ＡＡＢ９４５８８（ＣＹＰ７１Ｄ１０ｐ［ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）］）；ＣＡＡ７５５６６（チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ［ジベレラ・フジクロイ］）；ＡＡＤ３４５５２（チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ［アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）］）；ＣＡＡ７５５６７（チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ［ジベレラ・フジクロイ］）；ＣＡＡ７６７０３（チトクロムＰ４５０［ジベレラ・フジクロイ］）；ＣＡＡ５７８７４（未命名タンパク質産物［フザリウム・オキシスポルム］）；ＣＡＡ９１２６８（チトクロムＰ４５０〜ｃＤＮＡに類似  ＥＳＴ  ｙｋ４２３ｂ１１．３がこの遺伝子から得られる［線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）］）。
これらの遺伝子座の参考文献は以下のとおりである：ＣＡＡ７５５６５［Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，  Ｂ．およびＨｏｌｔｅｒ，  Ｋ．，  ジベレラ・フジクロイにおけるジベレリン生合成経路：遺伝子クラスターの証拠。  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２５（３），  １５７−１７０（１９９８）］；ＣＡＢ９１３１６［Ｓｃｈｕｌｔｅ，  Ｕ．，  Ａｉｇｎ，  Ｖ．，  Ｈｏｈｅｉｓｅｌ，  Ｊ．，  Ｂｒａｎｄｔ，  Ｐ．，  Ｆａｒｔｍａｎｎ，  Ｂ．，  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｒ．，  Ｎｙａｋａｔｕｒａ，  Ｇ．，  Ｍｅｗｅｓ，  Ｈ．Ｗ．およびＭａｎｎｈａｕｐｔ，  Ｇ．、未公表］；ＣＡＢ５６５０３［Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，  Ｇ．，  Ｕｎｔｅｒｂｕｓｃｈ，  Ｅ．，  Ｋａｌｔｅｎｂａｃｈ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｊ．，  Ｓｔｒａｃｋ，  Ｄ．およびＳｃｈｒｏｅｄｅｒ，  Ｊ．  インドールアルカロイド生合成における光誘導チトクロムＰ４５０依存酵素：タバーソニン１６−水酸化酵素。  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４５８，  ９７−１０２（１９９９）］；ＡＡＢ９４５８８［Ｓｉｍｉｎｓｚｋｙ，  Ｂ．，  Ｃｏｒｂｉｎ，  Ｆ．Ｔ．，  Ｗａｒｄ，  Ｅ．Ｒ．，  Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，  Ｔ．Ｊ．およびＤｅｗｅｙ，  Ｒ．Ｅ．  酵母およびタバコにおいて、ダイズ・チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼｃＤＮＡの発現は、フェニル尿素除草剤の代謝を増進する。  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９６（４），  １７５０−１７５５（１９９９）］；ＣＡＡ７５５６６［Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，  Ｂ．およびＨｏｌｔｅｒ，  Ｋ．  ジベレラ・フジクロイにおけるジベレリン生合成経路：遺伝子クラスターの証拠。  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２５（３），  １５７−１７０（１９９８）］；ＡＡＤ３４５５２［Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｊ．，  Ａｕｃｌａｉｒ，  Ｋ．，  Ｋｅｎｄｒｅｗ，  Ｓ．Ｇ．，  Ｐａｒｋ，  Ｃ．，  Ｖｅｄｅｒａｓ，  Ｊ．Ｃ．およびＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，  Ｃ．Ｒ．  ロバスタチン生合成中、アクセサリータンパク質がポリケチドシンターゼ活性を変調する。  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）印刷中］；ＣＡＡ７５５６７［Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，  Ｂ．およびＨｏｌｔｅｒ，  Ｋ．  ジベレラ・フジクロイにおけるジベレリン生合成経路：遺伝子クラスターの証拠。  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２５（３），  １５７−１７０（１９９８）］；ＣＡＡ７６７０３［Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，  Ｂ．およびＨｏｅｌｔｅｒ，  Ｋ．  ジベレラ・フジクロイ由来のＰ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子の性質決定。未公表］；ＣＡＡ５７８７４［Ｍｏｕｙｎａ，  Ｉ．およびＢｒｙｇｏｏ，  Ｙ．  フザリウム・オキシスポルムｆ．ｓｐ．エレーディス・チトクロムＰ４５０遺伝子の反復配列による破壊。未公表］；およびＣＡＡ９１２６８［著者なし。線虫Ｃ．エレガンスのゲノム配列：生物学研究のプラットホーム。Ｃ．エレガンス配列決定コンソーシアム。  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２（５３９６），  ２０１２−２０１８（１９９８）［公表正誤表は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９  Ｊａｎ  １；２８３（５３９８）：３５および１９９９  Ｍａｒ  ２６；２８３（５４１０）：２１０３および１９９９  Ｓｅｐ  ３；２８５（５４３３）：１４９３に見られる］］］。
【図５】  ＧｅｎＢａｎｋ由来の上位１０ＢＬＡＳＴヒットに対する、アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素の関連性を示す系統樹。
プラスミドｐＭＯＮ４５６２４にクローニングしたアスペルギルス・オクラセウス、ステロイド１１アルファ水酸化酵素の遺伝的関連性を示す系統樹を、ＧｅｎＢａｎｋに見られる関連酵素と並列させた。ＢＬＡＳＴを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ内の関連酵素を見出し、そしてＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、多数配列並列およびこの図に示す系統樹を生成した。この図の表示として用いたＧｅｎＢａｎｋ寄託番号の説明は、図４のレジェンド用に、上述したものと同一である。
【図６】  アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびＧｅｎＢａｎｋ由来の上位１０ＢＬＡＳＴヒットの間のパーセント相同性。
アスペルギルス・オクラセウス、ステロイド１１アルファ水酸化酵素、およびＢＬＡＳＴを用いてＧｅｎＢａｎｋに見られる上位１０酵素の間のパーセント相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １０：１９−２９，  １９９４）を用いて計算した。
【図７】  クロコウジカビ、マウス、およびＳ．セレビシエ由来のＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素に対する、アスペルギルス・オクラセウスおよびヒト酸化還元酵素のアミノ酸相同性並列。
プラスミドｐＭＯＮ４５６３２（配列番号０５）にクローニングしたアスペルギルス・オクラセウス、ステロイド酸化還元酵素のアミノ酸配列（配列番号０６）、およびプラスミドｐＭＯＮ４５６０５（配列番号０４）にクローニングしたヒト酸化還元酵素（配列番号０３）は、上述のように、クロコウジカビ、マウス、およびＳ．セレビシエ由来の関連酵素と並列させた。ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号（ありうる機能、［属および種］）は以下のとおりである：ＢＡＡ０２９３６（ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素前駆体［サッカロミセス・セレビシエ］）；ＣＡＡ８１５５０  ＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０酸化還元酵素［クロコウジカビ］；Ｐ１６４３５（ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）（Ｐ４５０Ｒ）［ヒト］）；ＢＡＡ０４４９６（ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０酸化還元酵素［マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）］）。
これらの遺伝子座の参考文献は以下のとおりである：ＢＡＡ０２９３６［Ｙａｂｕｓａｋｉ，  Ｙ．，  Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｈ．およびＯｈｋａｗａ，  Ｈ．  クローニングした遺伝子のヌクレオチド配列から推定した、サッカロミセス・セレビシエＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素の一次構造。  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０３（６），  １００４−１０１０（１９８８）］；ＣＡＡ８１５５０［ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｉｎｋ，  Ｊ．，  ｖａｎ  Ｚｅｉｊｌ，  Ｃ．，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，  Ｃ．およびｖａｎ  Ｇｏｒｃｏｍ，  Ｒ．  クロコウジカビのＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０酸化還元酵素（ｃｐｒＡ）遺伝子のクローニングおよび性質決定。未公表］；Ｐ１６４３５［Ｈａｎｉｕ，  Ｍ．，  ＭｃＭａｎｕｓ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｂｉｒｋｅｔｔ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｔ．Ｄ．およびＳｈｉｖｅｌｙ，  Ｊ．Ｅ．  ヒト肝臓由来のＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素の構造的および機能的解析：ヒト酵素の完全配列およびＮＡＤＰＨ結合部位。  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８（２１），  ８６３９−８６４５（１９８９）］；ＢＡＡ０４４９６［Ｏｈｇｉｙａ，  Ｓ．，  Ｓｈｉｎｒｉｋｉ，  Ｎ．，  Ｋａｍａｔａｋｉ，  Ｔ．およびＩｓｈｉｚａｋｉ，  Ｋ．  マウスＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０酸化還元酵素：分子クローニングおよび酵母における機能的発現。  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１８６（１−２），  １３７−１４１（１９９４）］。
【図８】  クロコウジカビ、マウス、およびＳ．セレビシエ由来のＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素に対する、Ａ．オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸相同性並列。
プラスミドｐＭＯＮ４５６３２（配列番号０５）にクローニングしたアスペルギルス・オクラセウス、ステロイド酸化還元酵素のアミノ酸配列（配列番号０６）は、上述のように、クロコウジカビおよびＳ．セレビシエ由来の関連真菌酵素と並列させた。この図の表示として用いたＧｅｎＢａｎｋ寄託番号の説明は、上の図７のレジェンド用に、上述したものと同一である。
【図９】  クロコウジカビ、酵母、およびマウス由来の還元酵素に対する、アスペルギルス・オクラセウスおよびヒト酸化還元酵素の関連性を示す系統樹。
プラスミドｐＭＯＮ４５６３２（配列番号０５）にクローニングしたアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素（配列番号０６）の遺伝的関連性を示す系統樹を、関連酵素と並列させた。ＢＬＡＳＴを用いて、ＧｅｎＢａｎｋ内の関連酵素を見出し、そしてＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、多数配列並列およびこの図に示す系統樹を生成した。この図の表示として用いたＧｅｎＢａｎｋ寄託番号の説明は、上の図７のレジェンド用に、上述したものと同一である。
【図１０】  アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素、並びにクロコウジカビ、酵母、およびマウス由来の還元酵素の間のパーセント同一性。
アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素、並びにクロコウジカビ、酵母、およびマウス由来の酸化還元酵素の間のパーセント同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＢｏｘｓｈａｄｅを用いて計算した。
【図１１】  ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ由来の上位４ヒットとヒト酸化還元酵素の並列。
以下にＰ１６４３５に関して報告する訂正配列のアミノ酸配列に対応する、プラスミドｐＭＯＮ４５６０５（配列番号０３）にクローニングしたヒトステロイド酸化還元酵素のアミノ酸配列（配列番号０４）は、上述のように、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質配列データベース由来の上位４ヒットに並列させた。ＳＷＩＳＳプロット寄託番号｛遺伝子座｝［通称］および種］）ありうる機能）は以下のとおりである：Ｐ１６４３５｛ＮＣＰＲ＿ＨＵＭＡＮ｝［ヒト］ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素；Ｐ００３８９｛ＮＣＰＲ＿ＲＡＢＩＴ｝［ウサギ］ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素；Ｐ００３８８｛ＮＣＰＲ＿ＲＡＴ｝［ラット］ＮＡＤＰＨチトクロムＰ４５０還元酵素；Ｐ３７０４０｛ＮＣＰＲ＿ＭＯＵＳＥ｝［マウス］ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素；Ｐ０４１７５｛ＮＣＰＲ＿ＰＩＧ｝［ブタ］（ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素。
これらの遺伝子座の参考文献は以下のとおりである：Ｐ１６４３５［Ｈａｎｉｕ，  Ｍ．，  ＭｃＭａｎｕｓ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｂｉｒｋｅｔｔ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｔ．Ｄ．およびＳｈｉｖｅｌｙ，  Ｊ．Ｅ．  ヒト肝臓由来のＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素の構造的および機能的解析：ヒト酵素の完全配列およびＮＡＤＰＨ結合部位。  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８（２１），  ８６３９−８６４５（１９８９）］；Ｐ００３８９［Ｋａｔａｇｉｒｉ，  Ｍ．，  Ｍｕｒａｋａｍｉ，  Ｈ．，  Ｙａｂｕｓａｋｉ，  Ｙ．，  Ｓｕｇｉｙａｍａ，  Ｔ．，  Ｏｋａｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｙａｍａｎｏ，  Ｔ．およびＯｈｋａｗａ，  Ｈ．  ウサギ肝臓ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素ｍＲＮＡの全長ｃＤＮＡの分子クローニングおよび配列解析。  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １００（４），  ９４５−９５４（１９８６）］；Ｐ００３８８［Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｔ．Ｄ．およびＫａｓｐｅｒ，  Ｃ．Ｂ．  ラットＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０酸化還元酵素ｃＤＮＡのコードヌクレオチド配列およびフラビン結合ドメインの同定。  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８２（４），  ９７３−９７７（１９８５）］；Ｐ３７０４０［Ｏｈｇｉｙａ，  Ｓ．，  Ｓｈｉｎｒｉｋｉ，  Ｎ．，  Ｋａｍａｔａｋｉ，  Ｔ．およびＩｓｈｉｚａｋｉ，  Ｋ．  マウスＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０酸化還元酵素：分子クローニングおよび酵母における機能的発現。  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １１８６（１−２），  １３７−１４１（１９９４）］；Ｐ０４１７５［Ｈａｎｉｕ，  Ｍ．，  Ｉｙａｎａｇｉ，  Ｔ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｐ．，  Ｌｅｅ，  Ｔ．Ｄ．およびＳｈｉｖｅｌｙ，  Ｊ．Ｅ．  ブタ肝臓ミクロソーム由来のＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ−４５０還元酵素の完全アミノ酸配列。  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５（２４），  ７９０６−７９１１（１９８６）］。
【図１２】  ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ由来の上位４ヒットとヒト酸化還元酵素の関連性を示す系統樹。
プラスミドｐＭＯＮ４５６０４（配列番号０３）にクローニングしたヒト酸化還元酵素（配列番号０４）の遺伝的関連性を示す系統樹を、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴに見られる関連酵素と並列させた。ＢＬＡＳＴを用いて、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ内の関連酵素を見出し、そしてＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、多数配列並列およびこの図に示す系統樹を生成した。この図の表示として用いたＳＷＩＳＳＰＲＯＴ寄託番号の説明は、上の図１１のレジェンド用に、上述したものと同一である。
【図１３】  ヒト酸化還元酵素およびＳｗｉｓｓＰｒｏｔ由来の上位４ヒットの間のパーセント同一性。
ヒト酸化還元酵素およびＳＷＩＳＳＰＲＯＴに見られる上位４ヒットの間のパーセント同一性は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ＷおよびＢｏｘｓｈａｄｅを用いて計算した。
【図１４】  トランスフェクションしたＳｆ９昆虫細胞におけるアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素の発現。
アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素を発現しているバキュロウイルス感染昆虫細胞は、感染２５および４８時間後に採取し、そしてミクロソーム膜分画を調製し、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ゲル中のタンパク質は、０．２ｕｍニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｇｒｉｍｓｅｈｌｓｔｒａｓｓｅ  ２３  ３７５７４  Ｅｉｎｂｅｃｋ  ドイツ）に電気的にトランスファーし、そしてペプチド１１ａＯＨペプチド２  ＣＲＱＩＬＴＰＹＩＨＫＲＫＳＬＫＧＴＴＤ（配列番号２４）から調製した抗体ＧＮ−１１８７およびＧＮ−１１８８で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。
【図１５】  トランスフェクションしたＳｆ９昆虫細胞におけるアスペルギルス・オクラセウスＰ４５０酸化還元酵素の発現。
アスペルギルス・オクラセウス１１酸化還元酵素を発現しているバキュロウイルス感染昆虫細胞は、感染２５および４８時間後に採取し、そしてミクロソーム膜分画を調製し、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ゲル中のタンパク質は、０．２ｕｍニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｇｒｉｍｓｅｈｌｓｔｒａｓｓｅ  ２３  ３７５７４  Ｅｉｎｂｅｃｋ  ドイツ）に電気的にトランスファーし、そしてｏｘｒペプチド１  ＣＴＹＷＡＶＡＫＤＰＹＡＳＡＧＰＡＭＮＧ（配列番号２６）から調製した抗体ＧＮ−２０２３およびＧＮ−１２０２４で探査した。
【図１６】  ＨＰＬＣで監視した、アンドロステンジオンの１１アルファヒドロキシアンドロステンジオンへの変換。
ミクロソームおよびミトコンドリア細胞成分分画は、組換えアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素およびＨｅｐＧ２細胞ＲＮＡからクローニングしたヒト酸化還元酵素を発現する組換えバキュロウイルスに同時感染させた昆虫細胞から調製した。細胞成分分画は、ＮＡＤＰＨ生成系の存在下、２５０μＭアンドロステンジオンと１２０分間インキュベーションし、そして生じた産物をＨＰＬＣによって分離し、そして２４７ｎｍの紫外検出によって監視した。水酸化酵素活性は、予期されるとおり、ミクロソーム分画に見出されたが、ミトコンドリア分画にも現れた。これらの結果は、１１アルファ水酸化酵素が、破壊細胞において、膜に貼り付く傾向を有する可能性があるか、またはこの実験において、細胞成分分画の分離が不十分であったことを示唆する。パネルＡは、ミトコンドリア分画から調製した酵素を用いて行った反応を例示する。ＡＤの後で溶出するパネルＡ中のピークは、テストステロンであるようである。ミクロソーム分画を用いた場合、ほぼ同量のＡＤが１１アルファヒドロキシＡＤに変換されたが、比較的より多くのテストステロンもまた、産生された。パネルＢは、酵素供給源なしで、１２０分間行った、同一の反応を例示する。パネルＣは、インキュベーション緩衝液に添加した１１α−ヒドロキシアンドロステンジオン標準を用いたＨＰＬＣ追跡を例示する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年10月25日(2004.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】    アスペルギルス・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）１１アルファ水酸化酵素をコードする単離精製核酸。
【請求項２】    アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項３】    アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする単離ｃＤＮＡ。
【請求項４】    アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする単離遺伝子。
【請求項５】    アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素をコードする、遺伝子の単離対立遺伝子。
【請求項６】    核酸配列が配列番号１に示すとおりである単離精製核酸。
【請求項７】    ＤＮＡ配列が配列番号１に示すとおりである単離ＤＮＡ。
【請求項８】    ｃＤＮＡ配列が配列番号１に示すとおりである単離ｃＤＮＡ。
【請求項９】    遺伝子配列が配列番号１に示すとおりである単離遺伝子。
【請求項１０】    遺伝子配列が配列番号１に示すとおりである、遺伝子の単離対立遺伝子。
【請求項１１】    アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸配列を有する単離タンパク質。
【請求項１２】    アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸配列を有する、タンパク質の単離変異体。
【請求項１３】    アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質。
【請求項１４】    タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２に示すとおりである単離タンパク質。
【請求項１５】    タンパク質のアミノ酸配列が配列番号２に示すとおりである、タンパク質の単離変異体。
【請求項１６】    アミノ酸配列が、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を持つ配列番号２を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項１７】    アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも９９％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項１８】    アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも９５％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項１９】    アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも９０％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項２０】    アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも７５％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項２１】    アミノ酸配列が、配列番号２に少なくとも５０％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項２２】    アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ酸化還元酵素をコードする単離精製核酸。
【請求項２３】    アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離ＤＮＡ。
【請求項２４】    アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離ｃＤＮＡ。
【請求項２５】    アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離遺伝子。
【請求項２６】    アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする、遺伝子の単離対立遺伝子。
【請求項２７】    核酸配列が配列番号５に示すとおりである単離精製核酸。
【請求項２８】    ＤＮＡ配列が配列番号５に示すとおりである単離ＤＮＡ。
【請求項２９】    ｃＤＮＡ配列が配列番号５に示すとおりである単離ｃＤＮＡ。
【請求項３０】    遺伝子配列が配列番号５に示すとおりである単離遺伝子。
【請求項３１】    遺伝子配列が配列番号５に示すとおりである、遺伝子の単離対立遺伝子。
【請求項３２】    アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を有する単離タンパク質。
【請求項３３】    アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を有する、タンパク質の単離変異体。
【請求項３４】    アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素のアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質。
【請求項３５】    タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６に示すとおりである単離タンパク質。
【請求項３６】    タンパク質のアミノ酸配列が配列番号６に示すとおりである、タンパク質の単離変異体。
【請求項３７】    アミノ酸配列が、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を持つ配列番号６を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項３８】    アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも９９％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項３９】    アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも９５％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項４０】    アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも９０％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項４１】    アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも７５％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項４２】    アミノ酸配列が、配列番号６に少なくとも５０％同一である配列を含んでなる、精製ポリペプチド。
【請求項４３】    ３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能な酵素をコードする、単離精製核酸。
【請求項４４】    前記酵素が、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない、請求項４３の単離精製核酸。
【請求項４５】    前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、請求項４３または請求項４４の単離精製核酸。
【請求項４６】    前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ
からなる群より選択される、請求項４５の単離精製核酸。
【請求項４７】    前記水酸化が、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである、請求項４６の単離精製核酸。
【請求項４８】    ３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒可能なタンパク質を発現する方法であって；
（ａ）前記タンパク質をコードする核酸に操作可能であるように連結したプロモーターを含んでなる発現カセットで、宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションし、そして
（ｂ）前記宿主細胞において、前記タンパク質を発現する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項４９】    前記タンパク質を回収する工程をさらに含んでなる、請求項４８のタンパク質産生法。
【請求項５０】    前記タンパク質がアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素である、請求項４８または請求項４９の方法。
【請求項５１】    電子供与体タンパク質を発現することをさらに含んでなり、前記電子供与体タンパク質が、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒可能な前記タンパク質に、電子を供与することが可能である、請求項５０の方法。
【請求項５２】    電子供与体タンパク質が、ヒト酸化還元酵素およびアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素からなる群より選択される、請求項５１の方法。
【請求項５３】    前記電子供与体タンパク質がアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である、請求項５１の方法。
【請求項５４】    前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素および前記電子供与体タンパク質をコードする核酸が、別個の発現カセット上にある、請求項５１の方法。
【請求項５５】    前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素および前記電子供与体タンパク質をコードする核酸が、同一発現カセット上にある、請求項５１の方法。
【請求項５６】    前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素がアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素であり、そして前記電子供与体タンパク質がヒト酸化還元酵素である、請求項５４または請求項５５の方法。
【請求項５７】    前記ステロイド１１アルファ水酸化酵素がアスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素であり、そして前記電子供与体タンパク質がアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である、請求項５４または請求項５５の方法。
【請求項５８】    前記発現カセットが発現ベクター上にある、請求項４８の方法。
【請求項５９】    前記発現ベクターがバキュロウイルスである、請求項５８の方法。
【請求項６０】    前記バキュロウイルスが、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多核体病ウイルスおよびカイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多核体病ウイルスからなる群より選択される、核多核体病ウイルスである、請求項５９の方法。
【請求項６１】    前記核多核体病ウイルスがオートグラファ・カリフォルニカ核多核体病ウイルスである、請求項６０の方法。
【請求項６２】    前記宿主細胞が昆虫細胞である、請求項５８の方法。
【請求項６３】    前記昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、オートグラファ・カリフォルニカ、およびマンデュカ・セクスタ（Ｍａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ）細胞からなる群より選択される、請求項６２の方法。
【請求項６４】    前記昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペルダ細胞である、請求項６３の方法。
【請求項６５】    前記アスペルギルス・オクラセウス１１アルファ水酸化酵素が配列番号２である、請求項４８〜６４のいずれか１項の方法。
【請求項６６】    前記ヒト酸化還元酵素が配列番号４である、請求項４８〜６４のいずれか１項の方法。
【請求項６７】    前記アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素が配列番号６である、請求項４８〜６４のいずれか１項の方法。
【請求項６８】    ３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能である、単離精製ポリペプチド。
【請求項６９】    前記酵素が、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない、請求項６８の単離精製ポリペプチド。
【請求項７０】    前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、請求項６８または請求項６９の単離精製ポリペプチド。
【請求項７１】    前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ
からなる群より選択される、請求項７０の単離精製ポリペプチド。
【請求項７２】    前記水酸化が、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである、請求項７１の単離精製酵素。
【請求項７３】    ３ケトデルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ４ステロイド）；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ４デルタ６ステロイド）；３ケトデルタ６，７ステロイド（３ケトデルタ６ステロイド）；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイド（３ケトデルタ１デルタ４ステロイド）の１１アルファ水酸化を触媒可能なポリペプチドをコードする単離精製核酸に、操作可能であるように連結したプロモーターを含んでなる、発現カセット。
【請求項７４】    前記ポリペプチドが、３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない、請求項７３の発現カセット。
【請求項７５】    前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、請求項７３または請求項７４の発現カセット。
【請求項７６】    前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；および
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ
からなる群より選択される、請求項７５の発現カセット。
【請求項７７】    前記水酸化が、カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノンである、請求項７６の発現カセット。
【請求項７８】    アスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素をコードする単離精製核酸に、操作可能であるように連結したプロモーターを含んでなる、発現カセット。
【請求項７９】    前記核酸が配列番号０６である、請求項７８の発現カセット。
【請求項８０】    シトステロールからエプレレノンへの合成の代謝経路由来の酵素をコードする異種ＤＮＡを含んでなる発現カセットであって、前記酵素が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、少なくとも１つの変換を触媒し、そして異種ＤＮＡが、組換え宿主において、コードされる酵素を発現するのに必要な調節配列に、操作可能であるように連結されている、前記発現カセット。
【請求項８１】    異種ＤＮＡコード配列が、以下の属および種：アスペルギルス・オクラセウス、アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、リゾプス・オリゼー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・ストロニファー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ）、ストレプトミセス・フラディエー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス・クルシビエー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｒｕｃｉｖｉａｅ）、トリコテシウム・ロゼウム（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、リゾプス・アーヒズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ）、アブシディア・コイルラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｏｅｒｕｌａ）、アブシディア・グラウカ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｇｌａｕｃａ）、アクチノムコール・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アスペルギルス・フラビペス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｐｅｓ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ボーベリア・バシアナ（Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ）、ボトリオスフェーリア・オブツサ（Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｏｂｔｕｓａ）、カロネクトリア・デコラ（Ｃａｌｏｎｅｃｔｒｉａ  ｄｅｃｏｒａ）、ケトミウム・コクリオデス（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｃｏｃｈｌｉｏｄｅｓ）、コリネスポラ・カシコラ（Ｃｏｒｙｎｅｓｐｏｒａ  ｃａｓｓｉｉｃｏｌａ）、カニングハメラ・ブラケスリーアナ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎａ）、カニングハメラ・エキヌラタ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｃｈｉｎｕｌａｔａ）、カニングハメラ・エレガンス（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｅｌｅｇａｎｓ）、カーブラリア・クラバタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｃｌａｖａｔａ）、カーブラリア・ルナタ（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ  ｌｕｎａｔａ）、シリンドロカルポン・ラディシコラ（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ  ｒａｄｉｃｉｃｏｌａ）、エピコッカム・フミコラ（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ  ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ  ｂｕｔｌｅｒｉ）、ヒポミケス・クリソスペルマス（Ｈｙｐｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｓ）、モノスポリウム・オリバセウム（Ｍｏｎｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｏｌｉｖａｃｅｕｍ）、モルティエレラ・イサベリナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）、ムコール・ムセド（Ｍｕｃｏｒ  ｍｕｃｅｄｏ）、ムコール・グリセオシアヌス（Ｍｕｃｏｒ  ｇｒｉｓｅｏｃｙａｎｕｓ）、ミロテシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）、ノカルディア・コラリナ（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｃｏｒａｌｌｉｎａ）、パエシロミセス・カルネウス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｎｅｕｓ）、ペニシリウム・パツルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ）、ピトミセス・アトルーリバセウス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ａｔｒｏｏｌｉｖａｃｅｕｓ）、ピトミセス・���ノドンティス（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ  ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ）、ピクノスポリウム種（Ｐｙｃｎｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）、サッカロポリスポラ・エリスレー（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅ）、セペドニウム・クリソスペルマム（Ｓｅｐｅｄｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｅｒｍｕｍ）、スタキリディウム・ビコロル（Ｓｔａｃｈｙｌｉｄｉｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・ヒクロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｑｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）、ストレプトミセス・パープラセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓ）、シンセファラストラム・ラセモザム（Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ  ｒａｃｅｍｏｓｕｍ）、タムノスティルム・ピリフォルメ（Ｔｈａｍｎｏｓｔｙｌｕｍ  ｐｉｒｉｆｏｒｍｅ）、シエラビア・テリコラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｉｃｏｌａ）、およびバーティシリウム・テオブロメー（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ）、セファロスポリウム・アフィディコラ（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ  ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ）、コクリオボルス・ルナタス（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ  ｌｕｎａｔａｓ）、ティエグヘメラ・オルキディス（Ｔｉｅｇｈｅｍｅｌｌａ  ｏｒｃｈｉｄｉｓ）、ティエグヘメラ・ヒアロスポラ（Ｔｉｅｇｈｅｍｅｌｌａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）、モノスポリウム・オリバセウム、アスペルギルス・ウスツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓｔｕｓ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、バーティシリウム・グラウクム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｇｌａｕｃｕｍ）、およびリゾプス・ニグリカンス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）からなる群より選択されることで特徴付けられる、請求項８０記載の発現カセット。
【請求項８２】    属および種が、アスペルギルス・オクラセウス、アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニダランス、リゾプス・オリゼー、リゾプス・ストロニファー、ストレプトミセス・フラディエー、巨大菌、シュードモナス・クルシビエー、トリコテシウム・ロゼウム、フザリウム・オキシスポルム、リゾプス・アーヒズス、およびモノスポリウム・オリバセウムからなる群より選択される、請求項８１記載の発現カセット。
【請求項８３】    属種がアスペルギルス・オクラセウスである、請求項８２記載の発現カセット。
【請求項８４】    請求項８０記載の少なくとも１つの発現カセットを含んでなる、組換え宿主細胞およびその子孫。
【請求項８５】    宿主が微生物である、請求項８４記載の組換え宿主細胞およびその子孫。
【請求項８６】    宿主が細菌である、請求項８５記載の組換え宿主細胞およびその子孫。
【請求項８７】    シトステロールからエプレレノンへの合成の代謝経路由来の１以上の酵素を作成する方法であって、異種ＤＮＡにコードされる１以上の酵素が発現され、そして集積する条件下、栄養培地中で、請求項８６の組換え宿主細胞をインキュベーションすることを含んでなる、前記方法。
【請求項８８】    化合物を水酸化産物に選択的に酸化する方法であって：（ａ）水酸化しようとする化合物を、該化合物が水酸化され、そして水酸化産物が集積する条件下、請求項８６の組換え宿主細胞の存在下でインキュベーションし、そして（ｂ）水酸化産物を回収する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項８９】    ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、化合物を水酸化産物に選択的に水酸化する方法であって：（ａ）水酸化しようとする化合物を、該化合物が水酸化され、そして水酸化産物が集積する条件下、請求項８８の方法で産生した酵素の存在下でインキュベーションし、そして（ｂ）水酸化産物を回収する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項９０】    請求項７３〜８３のいずれか１項の発現カセットを宿する宿主細胞。
【請求項９１】    前記発現カセットが、前記宿主細胞の染色体に組み込まれている、請求項９０の宿主細胞。
【請求項９２】    前記発現カセットが発現ベクターに組み込まれている、請求項９０の宿主細胞。
【請求項９３】    クローニングした１１アルファ水酸化酵素の比活性を測定する方法であって；
（ａ）前記１１アルファ水酸化酵素をコードする核酸を含んでなる発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、
（ｂ）前記宿主細胞において、前記１１アルファ水酸化酵素を発現し；
（ｃ）前記細胞から細胞成分膜分画を調製し、
（ｄ）ステロイド基質と前記細胞成分膜分画ミクロソームをインキュベーションし、そして
（ｅ）ステロイド基質の１１アルファヒドロキシステロイド対応物への変換を監視する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項９４】    酸化還元酵素をコードする発現ベクター核酸で宿主細胞を形質転換し、そして前記宿主細胞において、前記酸化還元酵素を発現することをさらに含んでなる、請求項９３の方法。
【請求項９５】    前記酸化還元酵素がヒトまたはアスペルギルス・オクラセウスである、請求項９４の方法。
【請求項９６】    前記酸化還元酵素がヒト酸化還元酵素である、請求項９５の方法。
【請求項９７】    前記酸化還元酵素がアスペルギルス・オクラセウス酸化還元酵素である、請求項９５の方法。
【請求項９８】    配列番号２に少なくとも９５％同一であり、そして３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；３ケトデルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ１，２デルタ４，５ステロイドの１１アルファ水酸化を触媒し、前記水酸化が：
（ａ）カンレノンから１１アルファヒドロキシカンレノン；
（ｂ）アンドロステンジオンから１１アルファヒドロキシアンドロステンジオン；
（ｃ）アルドナから１１アルファヒドロキシアルドナ；
（ｄ）ＡＤＤ（１，４アンドロステンジエンジオン）から１１アルファヒドロキシＡＤＤ；
（ｅ）メクスレノンから１１アルファヒドロキシメクスレノン；
（ｆ）６ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ６ベータメクスレノン；
（ｇ）９アルファメクスレノンから１１アルファヒドロキシ９アルファメクスレノン；
（ｈ）１２ベータメクスレノンから１１アルファヒドロキシ１２ベータメクスレノン；
（ｉ）デルタ１２メクスレノンから１１アルファヒドロキシデルタ１２メクスレノン；
（ｊ）テストステロンから１１アルファヒドロキシテストステロン；
（ｋ）プロゲステロンから１１アルファヒドロキシプロゲステロン；
（ｌ）メクスレノン６，７−ビス−ラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン６，７−ビス−ラクトン；および
（ｍ）メクスレノン７，９−ビスラクトンから１１アルファヒドロキシメクスレノン７，９−ビスラクトン
からなる群より選択される、配列番号２を有するタンパク質およびその変異体。
【請求項９９】    ３ケトデルタ４，５ステロイド；３ケトデルタ４，５デルタ６，７ステロイド；または３ケトデルタ６，７ステロイドの１５ベータ水酸化を触媒しない、請求項９８のタンパク質。
【請求項１００】    アミノ酸配列が、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５からなる群より選択される、精製ポリペプチド。
【請求項１０１】    アミノ酸配列が配列番号２の少なくとも１０の連続する残基を含んでなる、精製免疫原性ポリペプチド。
【請求項１０２】    配列番号２に示すようなアミノ酸配列を有する１１アルファ水酸化酵素に結合特異性を有する、単離精製抗体。
【請求項１０３】    （ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；
（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；
（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および
（ｅ）アミノ酸、配列番号２５
からなる群より選択されるタンパク質領域に結合する、請求項１０２の抗体。
【請求項１０４】    前記抗体がペプチドカラム上で精製され、前記ペプチドが：
（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；
（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；
（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および
（ｅ）アミノ酸、配列番号２５
からなる群より選択される、請求項１０２または請求項１０３の抗体。
【請求項１０５】    アミノ酸配列が配列番号２６からなる群より選択される、精製ポリペプチド。
【請求項１０６】    アミノ酸配列が配列番号６の少なくとも１０の連続する残基を含んでなる、精製免疫原性ポリペプチド。
【請求項１０７】    配列番号６に示すようなアミノ酸配列を有する１１アルファ水酸化酵素に結合特異性を有する、単離精製抗体。
【請求項１０８】    （ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および
（ｃ）アミノ酸、配列番号２６
からなる群より選択されるタンパク質領域に結合する、請求項１０７の抗体。
【請求項１０９】    前記抗体がペプチドカラム上で精製され、前記ペプチドが：
（ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および
（ｃ）アミノ酸、配列番号２６
からなる群より選択される、請求項１０７または請求項１０８の抗体。
【請求項１１０】    請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体、および有効なキャリアー、ビヒクル、または補助剤を含んでなる組成物。
【請求項１１１】    請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体および溶液を含んでなる組成物。
【請求項１１２】    ポリクローナル抗体である、請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体。
【請求項１１３】    モノクローナル抗体である、請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体。
【請求項１１４】    免疫親和性マトリックスにコンジュゲート化した、請求項１０２、１０３、１０４、１０７、１０８、または１０９の抗体。
【請求項１１５】    請求項１１４の免疫親和性マトリックスを用いて、生物学的液体または細胞溶解物からポリペプチドを精製する方法。
【請求項１１６】    前記免疫親和性マトリックスがＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ４Ｂである、請求項１１４の抗体。
【請求項１１７】    請求項１１６の免疫親和性マトリックスを用いて、生物学的液体または細胞溶解物からポリペプチドを精製する方法。
【請求項１１８】    ペプチドカラムを用いて抗体を精製する方法であって、前記ペプチドが：
（ａ）配列番号２のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号２の最後の１０のＣ末端アミノ酸；
（ｃ）アミノ酸、配列番号２３；
（ｄ）アミノ酸、配列番号２４；および
（ｅ）アミノ酸、配列番号２５
からなる群より選択される、前記方法。
【請求項１１９】    ペプチドカラムを用いて抗体を精製する方法であって、前記ペプチドが：
（ａ）配列番号６のＮ末端アミノ酸１−１０；
（ｂ）配列番号６の最後の１０のＣ末端アミノ酸；および
（ｃ）アミノ酸、配列番号２６
からなる群より選択される、前記方法。
【請求項１２０】    生物学的液体において、第一のポリペプチドを検出する方法であって、前記の第一のポリペプチドが１１アルファ水酸化酵素および酸化還元酵素からなる群より選択され、以下の：
（ａ）前記液体を、前記の第一のポリペプチドに結合特異性を有する第二のポリペプチドと接触させ、そして
（ｂ）前記の第二のポリペプチドの存在をアッセイして、前記の第一のポリペプチドのレベルを決定する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１２１】    前記の第二のポリペプチドが抗体である、請求項１２０の方法。
【請求項１２２】    前記の第二のポリペプチドが放射標識されている、請求項１２０または請求項１２１の方法。
【請求項１２３】    ６ｘＳＳＣおよび６５℃中で、配列番号１をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、そして配列番号１で検出した核酸を単離することを含んでなる、単離核酸を産生する方法。
【請求項１２４】    請求項１２３の方法にしたがって調製した、単離ＤＮＡ核酸。
【請求項１２５】    配列番号１に示す配列の相補体に、非常にストリンジェントな条件下で、特異的にハイブリダイズする、単離核酸。
【請求項１２６】    細胞の染色体ＤＮＡに挿入した際、通常は細胞で発現されないステロイド１１アルファ水酸化酵素遺伝子の発現を改変する、ＤＮＡ構築物であって：
ａ）ターゲティング配列；
ｂ）制御配列；および
ｃ）ステロイド１１アルファ水酸化酵素の構造遺伝子
を含んでなる、前記ＤＮＡ構築物。
【請求項１２７】    請求項１２６のＤＮＡ構築物を宿する宿主細胞。
【請求項１２８】    心臓疾患、炎症、関節炎、または癌を治療する、療法適用の医薬品製造のための、クローニングした１１アルファ水酸化酵素を宿する宿主細胞の使用。
【請求項１２９】    約０．５−５００ｇ／ｌ糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅｓ）、０．５−５０ｇ／ｌトウモロコシ浸染（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ）液、０．５−５０ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．５−２５０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２．５−２５０ｇ／ｌグルコース、および０．０４−４ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ３．５−７を含んでなる組成物。
【請求項１３０】    約１０−２５０ｇ／ｌ糖蜜、１−２５ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、１−２５ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５−１２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、５−１２５ｇ／ｌグルコース、および０．０８−２ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ４．５−６．５を含んでなる組成物。
【請求項１３１】    約２５−１００ｇ／ｌ糖蜜、２．５−１０ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、２．５−１０ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１２．５−５０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１２．５−５０ｇ／ｌグルコース、および０．２−０．８ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ５．５−６．０を含んでなる組成物。
【請求項１３２】    ５０ｇ／ｌ糖蜜、５ｇ／ｌトウモロコシ浸染液、５ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、２５ｇ／ｌグルコース、２０ｇ／ｌ寒天、および０．４ｇ／ｌプロゲステロン、ｐＨ５．８を含んでなる組成物。
【請求項１３３】    約４−１００ｇ／ｌ寒天をさらに含んでなる、請求項１２９〜１３２のいずれか１項の組成物。
【請求項１３４】    約１０−４０ｇ／ｌ寒天をさらに含んでなる、請求項１２９〜１３２のいずれか１項の組成物。
【請求項１３５】    約２０ｇ／ｌ寒天をさらに含んでなる、請求項１２９〜１３２のいずれか１項の組成物。
【請求項１３６】    アスペルギルス・オクラセウス、クロコウジカビ、アスペルギルス・ニダランス、リゾプス・オリゼー、リゾプス・ストロニファー、およびトリコテシウム・ロゼウム、フザリウム・オキシスポルム、リゾプス・アーヒズス、モノスポリウム・オリバセウム、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、およびアブシディア・コイルラからなる群より選択される微生物から胞子を産生する、請求項１２９〜１３５のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項１３７】    ６ｘＳＳＣおよび６５℃中で、配列番号５をゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、そして配列番号５で検出した核酸を単離することを含んでなる、単離核酸を産生する方法。
【請求項１３８】    請求項１３７の方法にしたがって調製した、単離ＤＮＡ核酸。
【請求項１３９】    配列番号５に示す配列の相補体に、非常にストリンジェントな条件下で、特異的にハイブリダイズする、単離核酸。
【請求項１４０】    アスペルギルス・オクラセウスから胞子を産生する、請求項１２９〜１３５のいずれか１項の組成物の使用。
【国際調査報告】
2005512502.tif 000107
2005512502.tif 000108
2005512502.tif 000109
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