(57)【要約】  本発明は、インタクトな細胞中の、特異的細胞標的分子を検出および／または定量する方法を提供する。本発明はさらに、フローサイトメトリーにおいて使用するためのインサイチュハイブリダイゼーションを促進するために、インタクトな細胞を処理する方法を提供する。インタクトな細胞中の目的の特異的細胞標的分子を同定、検出または定量する方法。インタクトな細胞中の目的の特異的細胞標的分子を同定、検出または定量するためのキット。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インタクトな細胞中の目的の特異的細胞標的分子を同定、検出または定量する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）特異的細胞標的分子を含むかまたは含むことが疑われる該インタクトな細胞を、極性有機溶媒を含む溶液で処理する工程であって、該処理された細胞が固定される、工程；
（ｂ）工程（ａ）の極性有機溶媒から、該固定された細胞を取り出す工程；
（ｃ）該固定された細胞を水性緩衝液中に再水和する工程；
（ｄ）該再水和した固定された細胞を、ハイブリダイゼーション緩衝液に曝露する工程；
（ｅ）工程（ｄ）の細胞を、該目的の特異的細胞標的分子にハイブリダイズし得るプローブと接触させる工程；ならびに
（ｆ）該目的のハイブリダイズした標的分子を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記インタクトな細胞が、基材上に固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インタクトな細胞が、懸濁物中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記極性有機溶媒が、短鎖アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記短鎖アルコールが、メタノール、エタノールおよびアセトンからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ａ）の溶液が、水性成分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記溶液が、３：１のメタノール：酢酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記インタクトな細胞が、工程（ａ）の前に低張により膨張している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、低張塩溶液中で膨張される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記固定された細胞が、遠心分離によって工程（ｂ）にて取り出される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブが標識されるか、または標識された結合パートナーと接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、発光標識、光吸収標識、放射性標識および光散乱標識からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的の細胞標的分子が、タンパク質、核酸、脂質、リン脂質および炭水化物からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質がサイトカインである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記サイトカインが、腫瘍壊死因子、インターフェロンまたはヘモグロビン鎖のうちの１つである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記特異的細胞標的分子が核酸である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記プローブが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出する工程が、フローサイトメトリーと合わせて実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記検出する工程が、画像化フローサイトメトリーと合わせて実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出する工程が、顕微鏡法と合わせて実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
インタクトな細胞中の目的の特異的細胞標的分子を同定、検出または定量するためのキットであって、以下：
（ｉ）極性有機溶媒を含む溶液；
（ｉｉ）水性緩衝液；
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション緩衝液；
（ｉｖ）該目的の特異的細胞標的分子にハイブリダイズし得るプローブ；および
（ｖ）使用のための指示書、
を備える、キット。
【請求項２３】
前記プローブが標識されている、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記標識が、発光標識、光吸収標識、放射性標識および光散乱標識からなる群より選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記プローブが核酸である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２６】
前記プローブが抗体である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２７】
前記プローブに結合し得る、標識された結合パートナーをさらに備える、請求項２２に記載のキット。
【請求項２８】
インタクトな細胞中の目的の特異的細胞標的分子を同定、検出または定量する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）特異的細胞標的分子を含むかまたは含むことが疑われる該インタクトな細胞を、アルデヒド固定剤で処理する工程であって、該処理された細胞が固定される、工程；
（ｂ）該アルデヒド処理した細胞を、熱処理に曝露する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の細胞を、ハイブリダイゼーション緩衝液中に配置する工程；
（ｄ）工程（ｃ）の細胞を、該目的の特異的細胞標的分子に結合またはハイブリダイズし得るプローブと接触させる工程；ならびに
（ｅ）該目的の標的分子を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記インタクトな細胞が、基材上に固定化される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記インタクトな細胞が、懸濁物中にある、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルデヒド固定剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記工程（ｂ）の熱処理が、約５０℃〜７０℃の間の温度で実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記温度が約６５℃である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記工程（ｂ）の熱処理が、３０分間〜５時間の間実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記熱処理が、１〜４時間の間実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記プローブが標識されるか、または標識された結合パートナーと接触される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記標識が、発光標識、光吸収標識、放射性標識および光散乱標識からなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記目的の細胞標的分子が、タンパク質、核酸、脂質、リン脂質および炭水化物からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質がサイトカインである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記サイトカインが、腫瘍壊死因子、インターフェロンまたはヘモグロビン鎖のうちの１つである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記プローブが核酸である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記特異的細胞標的分子が核酸である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記プローブが抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出する工程が、フローサイトメトリーと合わせて実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出する工程が、画像化フローサイトメトリーと合わせて実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
前記検出する工程が、顕微鏡法と合わせて実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
請求項２８に記載の方法を実施するためのキットであって、該キットは、以下：
（ｉ）アルデヒド固定剤；
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション緩衝液；
（ｉｉｉ）前記目的の特異的細胞標的分子に結合またはハイブリダイズし得るプローブ；および
（ｉｖ）使用のための指示書、
を備える、キット。
【請求項４８】
特異的細胞表面抗原を有するかまたは有することが疑われる細胞上の該特異的細胞表面抗原を同定、検出または定量する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）細胞を、特異的細胞表面抗原に特異的な抗体と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、極性有機溶媒を含む溶液で処理する工程であって、該処理された細胞が固定される、工程；
（ｃ）該細胞を、工程（ｂ）の極性溶媒から取り出す工程；
（ｄ）該固定された細胞を、水性緩衝液中で再水和する工程；
（ｅ）該再水和した固定された細胞を、ハイブリダイゼーション緩衝液に曝露する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞を、目的の特異的細胞標的分子にハイブリダイズし得る相補的プローブと接触させる工程；ならびに
（ｇ）該特異的細胞表面抗原に結合した抗体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記工程（ｇ）が、前記抗体を、該抗体の標識された結合パートナーと接触させる工程を包含し、該検出する工程は、該抗体の該標識された結合パートナーを検出することによって実施される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
特異的細胞表面抗原を有するかまたは有することが疑われるインタクトな細胞上の該特異的細胞表面抗原を同定、検出または定量する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）インタクトな細胞を、特異的細胞表面抗原に特異的な抗体と接触させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、アルデヒド固定剤で処理する工程であって、該処理された細胞が固定される、工程；
（ｃ）該アルデヒド処理した細胞を、熱処理に曝露する工程；
（ｄ）該熱処理した細胞を、ハイブリダイゼーション緩衝液中に配置する工程：ならびに
（ｅ）該特異的細胞表面抗原に結合した抗体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記インタクトな細胞が、基材上に固定化されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記インタクトな細胞が、懸濁物中にある、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記熱処理された細胞が、ハイブリダイゼーション緩衝液中に配置される前に単離される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、遠心分離によって単離される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記アルデヒド固定剤が、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドからなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記工程（ｃ）の熱処理が、約５０℃〜７０℃の間の温度で実施される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記温度が約６５℃である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記工程（ｃ）の熱処理が、３０分間〜５時間の間実施される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記熱処理が、１〜４時間の間実施される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記プローブが標識されるか、または標識された結合パートナーと接触される、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記標識が、発光標識、光吸収標識、放射性標識および光散乱標識からなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記プローブが抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
前記検出する工程が、フローサイトメトリーと合わせて実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出する工程が、画像化フローサイトメトリーと合わせて実施される、請求項５２に記載の方法。
【請求項６５】
前記検出する工程が、顕微鏡法と合わせて実施される、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
特異的細胞表面抗原を有するかまたは有することが疑われるインタクトな細胞上の該特異的細胞表面抗原を同定、検出または定量するためのキットであって、以下：
（ｉ）極性有機溶媒を含む溶液；
（ｉｉ）水性緩衝液；
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション緩衝液；
（ｉｖ）該特異的細胞標的抗原に結合し得るプローブ；および
（ｖ）使用のための指示書、
を備える、キット。
【請求項６７】
前記プローブが標識されている、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記標識が、発光標識、光吸収標識、放射性標識および光散乱標識からなる群より選択される、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記プローブが核酸である、請求項６６に記載のキット。
【請求項７０】
前記プローブが抗体である、請求項６６に記載のキット。
【請求項７１】
前記プローブに結合し得る標識された結合パートナーをさらに備える、請求項６６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づいて、その全体が本明細書中に参考として詳細に援用される、米国仮特許出願第号６０／３３４，４７９（２００１年１１月３０日出願）および同第６０／３７７，８７２（２００２年５月３日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、インタクトな細胞中の特異的細胞標的分子を検出および／または定量する方法に関する。本発明はさらに、インタクトな細胞を処理して、インサイチュハイブリダイゼーションを容易にする方法に関する。
【０００３】
（関連技術の記載）
インサイチュハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学は、細胞および／または細胞オルガネラ中の特定の核酸および／またはタンパク質を検出および／または定量するための強力な手段である。インサイチュハイブリダイゼーションの１つの特定の利点は、その非常に優れた感度であり、このことにより、１コピーの遺伝子を細胞において検出することが可能である。この広く使用される技術は、細胞および／または細胞オルガネラを処理して、標識プローブ（例えば、特定のヌクレオチド配列を有する核酸）を、細胞および／または細胞オルガネラの膜に透過させ、次いで、その細胞および／または細胞オルガネラに含まれる特定の核酸に結合させることに依存する。このことによるこの標識プローブのその特定の核酸への結合は、その特定の核酸の検出および／または定量を可能にする。同様に、免疫組織化学を使用すると、標識プローブ（すなわち、標識抗体）のインタクトな固定された細胞の特定の抗原への結合は、その抗原の検出および／または定量を可能にする。
【０００４】
インサイチュハイブリダイゼーションは、一般に、基材（例えば、顕微鏡スライド）上で行われ、インタクトな細胞の（例えば、メタノールのような極性有機溶媒での）固定を要する。しかし、この固定工程は、ハイブリダイゼーション前工程において使用される、固定されたアルコール脱水細胞を塩類クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液へ移すときに実質的な細胞損失が発生することおよび細胞が凝集することに起因して、懸濁液ハイブリダイゼーション（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に適合しない。実際に、３：１のメタノール：酢酸中で固定された細胞の９０％までが、２×ＳＳＣに直接移されるときに喪失し、ペレット状になり、その後ハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁される。さらに、この推移を生き抜いたその残りの細胞は、その凝集し、このことによって、ハイブリダイゼーションシグナルを明瞭に数えることが困難になる。フローサイトメトリーは、細胞が個々にレーザービームを通過するときに最適に機能するので、この細胞凝集は、正確な分析をさらに妨害する。従って、インタクトな固定細胞は、固定基材に容易にマウントされ得るのに対して、これまでは、極性有機溶媒で固定されたインタクトな細胞は、フローデバイスには扱いにくかった。
【０００５】
従って、懸濁液中で染色体インサイチュハイブリダイゼーションを行うための方法は、これまで、形態学的にインタクトな細胞（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  ＥｎｇｈおよびＴｒａｓｋ，米国特許第号４，７７０，９９２；Ｖａｎ  Ｄｅｋｋｅｎら（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １１：１５３−１６４）ではなく、単離された核を使用してきた。単離された核は、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）のような架橋剤で固定されて、染色体ＤＮＡの変性およびその後の目的のＤＮＡ配列に特異的な相補性ヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの前に、クロマチンが安定化される。あるいは、単離された核は、エタノールで固定されて、変性およびハイブリダイゼーション工程の間のそれらの完全性が維持され得る（Ｔｒａｓｋら（１９８８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７８：２５１−２５９）。何れの場合においても、核は、引き続きＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過性にされて、プローブの染色体ＤＮＡへの接近が容易にされる。この方法の別のバージョンにおいて、単離された核は、変性工程の前にパラホルムアルデヒドと架橋され、次いで、ハイブリダイゼーション工程（Ａｒｋｅｓｔｅｉｊｎら（１９９５）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １９：３５３−６０）の間にＴｗｅｅｎ−２０で透過性にされる。
【０００６】
インタクトな細胞ではなく単離された核に対してインサイチュハイブリダイゼーションを行うことにより、３：１のメタノール：酢酸から２×ＳＳＣへ細胞を移すことと関連する凝集の問題のいくつかが克服されるが、得られる情報は、より制限される。従って、細胞質内容物および細胞膜が除去されると、分析は、核の成分（例えば、クロマチンおよび核ＲＮＡ）に限定される。多くの場合において、ｍＲＮＡ、感染細胞中のウイルス核酸または細菌核酸のような細胞質核酸を分析することが望ましい。さらに、標識抗体によって同定され得る細胞質中および細胞表面上のタンパク質は、例えば、細胞質および細胞膜が維持される場合に、分析のために守られ得るに過ぎない。
【０００７】
懸濁液中のインタクトな細胞に対してインサイチュハイブリダイゼーションを行うための方法は、Ｔｉｍｍら（１９９５）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２２：２５０−２５５、ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＴｉｍｍ，米国特許第５，４３６，１４４号により記載されている。１つの場合において、特定の染色体配列に相補的なオリゴヌクレオチドプローブは、固定細胞に導入され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により標的配列を増幅するために使用される。細胞は、まず、ホルムアルデヒド中で固定され、７０％  エタノール中で再懸濁され、次いで、１×ＳＳＣ＋ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中でインキュベートされる。次いで、細胞は、ペレット状にされ、ＰＣＲ緩衝液に再懸濁される。標的染色体配列のＰＣＲ増幅後に、標的配列に相補的な標識プローブは、増幅ＤＮＡにハイブリダイズされる。次いで、その結合した標識プローブは、フローサイトメトリーによって検出される。同様の方法が、予め増幅させることなく、相補的プローブを豊富な細胞質ｍＲＮＡにハイブリダイズさせるために使用されてきた（ＢａｕｍａｎおよびＢｅｎｔｖｅｌｚｅｎ（１９９８）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ９：５１７−５２４；ＴｉｍｍおよびＣａｒｌｅｔｏｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：３６２−３６７）。プライムされたインサイチュハイブリダイゼーション（ＰＲＩＮＳ）はまた、細胞質中の特定のｍＲＮＡ（Ｂａｉｎｓら（１９９３）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０８：３２１−３２６）、ならびにウイルスＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９７６−９７９）を検出するために、懸濁液中でインタクトな細胞において使用されてきた。
【０００８】
しかし、インサイチュハイブリダイゼーションを行う前に、標的核酸を増幅させることには、多くの欠点がある。第１に、そのプロセスに複雑さを付加し、かつ分析を行うためにさらなる時間を要するさらなる工程を含むことである。さらに、増幅工程により、標的核酸分子の本来の濃度を定量することが困難になる。さらに、非特異的核酸増幅は、しばしば、アーチファクトをもたらす。さらに、細胞を増幅プロセスの間に高温インキュベーションの反復サイクルに供することにより、標的核酸の過剰な変性および細胞の損失が引き起こされ得る。最後に、この増幅プロセスは、染色体係数に必要な空間的相違の損失を生じ得る。
【０００９】
テロメア蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、細胞全体を有する懸濁液中で行われている（Ｒｕｆｅｒら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７４３−７４７；Ｄｒａｇｏｗｓｋａら（１９９８）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｓｕｐｐｌ．）９：５１；Ｈｕｌｔｄｉｎら（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：３６５１−３６５６）。
【００１０】
免疫表現型決定（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）は、ＦＩＳＨと組み合わせて、スライドに固定された細胞について使用されてきた（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９１）Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６４：３２３−３２８；Ｗｅｂｅｒ−Ｍａｔｔｈｉｅｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４０：１７１−１７５；Ｗｅｂｅｒ−Ｍａｔｔｉｅｓｏｎら（１９９３）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６３：１２３−１２５；Ｃａｌｌｅｔ−Ｂａｕｃｈｕら（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９９：５３１−５３６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の簡単な要旨）
しかし、これまで、標的核酸が豊富な細胞質ｍＲＮＡまたはテロメア配列でなければ、標的核酸を予め増幅することなしの、懸濁液中でのインタクトな細胞における直接インサイチュハイブリダイゼーションについての方法は、記載されていない。従って、予め増幅することなしの懸濁液中でのインタクトな固定細胞における直接インサイチュハイブリダイゼーションを可能にする新たな一般的方法論が必要である。また、懸濁液中でインタクトな固定細胞における直接免疫組織化学分析を可能にする新たな一般的方法論が必要である。インサイチュハイブリダイゼーションと関連して、懸濁液中の単一のインタクトな固定細胞の特定の細胞構成成分（細胞表面抗原を含む）の同定を可能にする新たな方法論がさらに必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の局面において、本発明は、インタクトな細胞における目的の特異的細胞標的分子を同定または定量する方法を特徴とし、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）特異的細胞標的分子を含むか、またはこの分子を含むことが疑われるインタクトな細胞を、極性有機溶媒を含む溶液で処理する工程（ここで、この処理された細胞は、固定される）；（ｂ）その固定細胞を極性有機溶媒から取り出す工程；（ｃ）水性緩衝液中でその細胞を再水和する工程；（ｄ）その再水和細胞をハイブリダイゼーション緩衝液に曝す工程；（ｅ）工程（ｄ）の細胞を、目的の特異的細胞標的分子にハイブリダイズし得るプローブと接触させる工程；ならびに（ｆ）目的のハイブリダイズされた標的分子を検出する工程。本発明の方法は、基材（例えば、固体支持体、顕微鏡スライド、マイクロタイターウェル、または膜に固定化されたインタクトな細胞（すなわち、懸濁液中のインタクトな細胞））を用いて行われ得る。
【００１３】
１つのこのような実施形態において、極性有機溶媒は、短鎖アルコールである。本発明の特定の実施形態において、この極性溶媒は、メタノール、エタノール、またはアセトンである。
【００１４】
１つの実施形態において、この溶液は、水溶性成分をさらに含む。好ましい実施形態において、この溶液は、３：１のメタノール：酢酸である。
【００１５】
特定の実施形態において、このインタクトな細胞は、固定される前に、低張的に膨張される。特定の実施形態において、その細胞は、約２５℃〜３７℃の温度で約１０〜２０分間にわたって低張塩類溶液（例えば、以下に例示される０．５６％  ＫＣｌ）中で膨張される。
【００１６】
１つの実施形態において、その固定細胞は、遠心分離によって工程（ｂ）から取り出されるが、当該分野で公知の、細胞を単離する任意の手段が使用され得る。特定の実施形態において、再水和工程は、１×塩類クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）＋０．０５％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中、約２０分〜１時間またはそれ以上の間、２５℃で固定細胞を再水和することによって行われる。次いで、その再水和細胞を、ハイブリダイゼーション緩衝液に類似の水性緩衝液中に入れる。以下の実施例１において、再水和細胞は、２×ＳＳＣ、５０％  ホルムアミド、１０％  硫酸デキストランのハイブリダイゼーション緩衝液に入れる前に、２×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡ中に約５〜２０分間入れられる。次いで、その再水和細胞は、その水性緩衝液から取り出され、ハイブリダイゼーション緩衝液に曝される。特定の実施形態において、そのハイブリダイゼーション緩衝液は、２×ＳＳＣ（５０％  ホルムアミド、および１０％  硫酸デキストラン含有）である。別の実施形態において、再水和工程は、段階的なプロセスにおいて行われ、そのプロセスにおいて、その細胞は、１×ＳＳＣ緩衝液、続いて２×ＳＳＣ緩衝液中に入れられる。
【００１７】
１つの実施形態において、再懸濁細胞は、細胞に入り得、かつ目的の特異的細胞標的分子に結合またはハイブリダイズし得るプローブと接触される。あるいは、そのプローブは、特異的細胞表面抗原とに結合されてもよいが、細胞表面抗原は、好ましくは、細胞の固定後よりもむしろ固定化前に標識される。いずれにしても、そのプローブは、これを検出可能にすることによって、特異的細胞標的分子の同定を容易にする。次いで、その固定化細胞の特異的細胞標的分子は、検出および／または定量され、このことによって、特異的細胞標的分子の同定および／または検出および／または定量が可能になる。
【００１８】
１つの実施形態において、そのプローブは、標識される。別の実施形態において、その方法は、標識を含む結合パートナーにプローブを接触させる工程をさらに包含する。特定の実施形態において、この標識は、発光標識、光吸収標識、放射活性標識、または光散乱標識である。本発明の方法は、細胞および／またはその構成成分に直接的にも間接的にも結合されない過剰なプローブおよび／または標識を除去するために必要な、任意のおよび／または全ての洗浄工程を包含する。
【００１９】
１つの実施形態において、目的の特異的細胞標的分子は、特定のタンパク質である。より具体的な実施形態において、このタンパク質は、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子αもしくはインターフェロンγ）またはヘモグロビン鎖（例えば、胎児ヘモグロビン鎖もしくは成体ヘモグロビン鎖）である。別の実施形態において、この目的の特異的細胞標的分子は、核酸である。さらに具体的な実施形態において、この目的の特異的細胞標的分子は、脂質、リン脂質、糖脂質または糖質である。
【００２０】
１つの実施形態において、そのプローブは、核酸である。特定の実施形態において、プローブおよび特異的細胞標的分子の両方が核酸である。別の実施形態において、そのプローブは、抗体である。この型のより具体的な実施形態において、その特異的細胞標的分子はタンパク質であり、プローブは抗体である。
【００２１】
第二の局面では、本発明は、インタクトな細胞中の目的の特異的細胞標的分子を検出する方法であって、（ａ）特異的細胞標的分子を含むかまたは含むことが疑われるインタクトな細胞を、極性有機溶媒を含む溶液で処理する工程であって、処理された細胞は固定される、工程；（ｂ）固定された細胞を極性有機溶媒から取り出す工程；（ｃ）水性緩衝液中で細胞を再水和する工程；（ｄ）再水和した細胞をハイブリダイゼーション緩衝液に曝露する工程；（ｅ）工程（ｄ）の細胞を、目的の特異的細胞標的分子にハイブリダイズし得るプローブと接触させる工程；および（ｆ）目的のハイブリダイズした標的分子を検出する工程を包含する、方法を特徴とする。本発明の方法は、基材（例えば、固体支持体、顕微鏡スライド、マイクロタイターウェル、もしくは膜）上で固定化されたインタクトな細胞、または懸濁物中のインタクトな細胞を用いて実施され得る。
【００２２】
第三の局面では、本発明は、インサイチュハイブリダイゼーションを実施する前に、特異的細胞表面抗原を有するかまたは有することが疑われる細胞上の特異的細胞表面抗原を同定、検出、または定量する方法を特徴とする。１つのこのような方法は、特異的細胞表面抗原に結合する抗体と、インタクトな細胞を接触（例えば、インキュベートする）させ、細胞が特異的細胞表面抗原を含む場合に、抗体が細胞の特異的細胞表面抗原に結合するようにする、工程を包含する。この細胞は、次いで、極性有機溶媒を含む溶液で処理される。このような処理により、細胞は固定される。この固定された細胞は、次いで、溶液から単離（取り出し）され、そして単離された細胞は、水性緩衝液中でインキュベートされる。得られた再水和細胞は、次いで、ハイブリダイゼーション緩衝液中に接触（例えば、曝露されるか、または配置される）され、そして目的の特異的細胞標的分子（すなわち、染色体または遺伝子配列）にハイブリダイズし得る相補的プローブと接触される。インサイチュハイブリダイゼーション後、細胞表面抗原に結合された抗体は、検出および／または定量される。特異的細胞表面抗原は、次いで、抗体が検出および／または定量される場合、同定／検出および／または定量される。特定の実施形態では、抗体は、標識を含む。代替の実施形態では、この方法は、ハイブリダイゼーション緩衝液中に細胞を配置した後、抗体を、標識を含む結合パートナーと接触させる工程をさらに包含する。この場合、抗体の検出は、抗体の標識された結合パートナーの標識を検出することにより実施される。特定の実施形態では、細胞は、基材上に固定化されるか、または懸濁物中にある。
【００２３】
第四の局面では、本発明はまた、インサイチュハイブリダイゼーション前に、抗体を用いて、インタクトな細胞中の細胞内位置の特異的細胞標的分子を同定／検出および／または定量する特定の方法を提供する。１つのこのような方法は、極性有機溶媒を含む溶液で細胞を処理し、これにより細胞が固定される、工程を包含する。固定された細胞は、次いで、溶液から単離（取り出し）され、そして水性緩衝液中でインキュベートされる。得られた再水和細胞は、次いで、水性緩衝液から単離され、そして特定の細胞内標的分子の細胞内部位を認識する抗体は、細胞と接触（例えば、細胞に添加）され、抗体が細胞に侵入し、特定の細胞内標的分子に結合することを可能にする。それにより、抗体は、その抗体を検出可能とすることにより、特異的細胞標的分子の同定を容易にする。単離された再水和細胞は、次いで、ハイブリダイゼーション緩衝液中に配置され、そして特異的細胞標的分子（すなわち、染色体または遺伝子配列）に対する相補的プローブと接触される。インサイチュハイブリダイゼーション後、再懸濁した細胞の特定の細胞内標的分子に結合された抗体は、同定／検出および／または定量され、それにより、特異的細胞標的分子が同定／検出および／または定量されることを可能にする。
【００２４】
特定の実施形態では、抗体は、標識を含む。代替の実施形態では、この方法は、ハイブリダイゼーション緩衝液に細胞を曝露した後に、抗体を、標識を含む結合パートナーと接触させる工程をさらに包含する。この場合、抗体の検出は、抗体の標識された結合パートナーの標識を検出することにより実施される。特定の実施形態では、インタクトな細胞は、基材上に固定化されるか、または懸濁物中にある。
【００２５】
本発明は、さらに、懸濁物中でのインサイチュハイブリダイゼーション前に、インタクトな細胞中の標的分子を検出する方法であって、アルデヒド固定剤で細胞を処理する工程、続いて制限された熱処理の工程を包含する、方法を特徴とする。架橋固定剤（例えば、アルデヒド）は、細胞凝集を引き起こさない。従って、アルデヒド固定細胞は、フローサイトメトリーによって分析され得るが、アルデヒド固定は、通常、染色体ＤＮＡを、核酸プローブとのハイブリダイゼーションに接近不能とする。しかし、染色体ＤＮＡと核タンパク質との間のアルデヒド誘導架橋を取り消す、熱処理工程を併用した制限された固定工程の使用は、染色体ＤＮＡをプローブに接近可能とすることが見出された。
【００２６】
従って、第五の局面では、インタクトな細胞中の目的の特異的細胞標的分子を同定、検出、または定量する方法であって、（ａ）特異的細胞標的分子を含むかまたは含むことが疑われるインタクトな細胞をアルデヒド固定剤で処理する工程であって、処理された細胞は固定される、工程；（ｂ）アルデヒド処理細胞を熱処理に曝露する工程；（ｃ）細胞をハイブリダイゼーション緩衝液中に配置する工程；（ｄ）工程（ｃ）の細胞を、目的の特異的細胞標的分子にハイブリダイズし得るプローブと接触させる工程；および（ｅ）ハイブリダイズした目的の標的分子を検出する工程を包含する、方法を特徴とする。
【００２７】
本発明の方法のインタクトな細胞は、基材上に固定化され得るか、または懸濁物中にあり得る。特定の実施形態では、アルデヒド固定剤は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドからなる群から選択される。
【００２８】
別の実施形態では、工程（ｂ）の熱処理は、約５０℃〜７０℃の間の温度で実施される。より特定の実施形態では、温度は、約６５℃である。アルデヒド誘導架橋を取り消すのに必要な時間の長さは、固定のために使用されるアルデヒドのタイプおよび割合、ならびに固定時間の長さに依存する。１つの実施形態では、工程（ｂ）の熱処理は、３０分から５時間の間で、より特定の実施形態では、１〜４時間の間で実施される。
【００２９】
１つの実施形態では、スライド上でインサイチュハイブリダイゼーションを実施することが所望され得る場合、アルデヒドおよび熱で処理される細胞は、メタノール中で再懸濁され得、従来のインサイチュハイブリダイゼーションのためにスライド上に滴下され得る。
【００３０】
１つの実施形態では、単離された細胞は、細胞に侵入し、目的の特異的細胞標的分子に結合またはハイブリダイズし得るプローブと接触される。あるいは、プローブは、特異的細胞表面抗原に結合し得るが、細胞表面抗原は、細胞の固定の後よりもむしろ前に標識され得る。いかなる場合においても、このプローブは、このプローブを検出可能にすることによって、特異的細胞標的分子の同定を容易にする。固定された細胞の特異的細胞標的分子は、次いで、検出および／または定量され、特異的細胞標的分子が同定および／または検出および／または定量されることを可能にする。
【００３１】
１つの実施形態では、プローブは、標識される。別の実施形態では、この方法は、プローブを、標識を含む結合パートナーに接触させる工程をさらに包含する。特定の実施形態では、標識は、発光標識、光吸収標識、放射性標識、または光散乱標識である。本発明の方法は、細胞および／またはそれらの構成要素に直接的または間接的のいずれでも結合されない過剰なプローブおよび／または標識を除去するために、必要な洗浄工程のいずれかおよび／または全てを包含する。
【００３２】
１つの実施形態では、目的の特異的細胞標的分子は、特定のタンパク質である。より特定の実施形態では、タンパク質は、サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子αもしくはインターフェロンγ、またはヘモグロビン鎖（例えば、胎児ヘモグロビン鎖または成体ヘモグロビン鎖）である。別の実施形態では、目的の特異的細胞標的分子は、核酸である。さらなる特定の実施形態では、目的の特異的細胞標的分子は、脂質、リン脂質、糖脂質、または炭水化物である。
【００３３】
１つの実施形態では、プローブは、核酸である。特定の実施形態では、プローブおよび特異的細胞標的分子の両方が、核酸である。別の実施形態では、プローブは、抗体である。このタイプのより特定の実施形態では、特異的細胞標的分子はタンパク質であり、そしてプローブは抗体である。
【００３４】
第六の局面では、本発明は、特異的細胞表面抗原を有するかまたは有することが疑われる細胞上の特異的細胞表面抗原を同定、検出、または定量する方法を特徴とする。１つのこのような方法は、細胞を、特異的細胞表面抗原に結合する抗体と接触（例えば、インキュベート）し、細胞が、特異的細胞表面抗原を含む場合、抗体は、細胞の特異的細胞表面抗原に結合する工程を包含する。細胞は、次いで、アルデヒド固定剤で処理され、その結果、細胞が固定され、続いて所定の条件下で、制限された熱処理を行う。熱処理された細胞は、ハイブリダイゼーション緩衝液中に配置され、そして細胞標的分子（すなわち、染色体または遺伝子配列）は、相補的プローブと接触される。次いで、特異的細胞表面抗原は、抗体が検出および／または定量される場合、同定、検出、および／または定量される。本発明のこの方法は、基材上に固定化されているか、または懸濁物中にある、インタクトな細胞と共に使用され得る。特定の実施形態では、抗体は、標識を含む。代替の実施形態では、この方法は、インサイチュハイブリダイゼーション後に、抗体を、標識を含む結合パートナーと接触させる工程をさらに包含する。この場合、抗体の検出は、抗体の標識された結合パートナーの標識を検出することにより実施される。
【００３５】
本発明はまた、細胞内位置中の特異的細胞標的分子を認識する抗体を用いて、インタクトな細胞中の特異的細胞標的分子を同定、検出、および／または定量する特定の方法を提供する。１つのこのような方法は、アルデヒド固定剤で細胞を処理する工程、続いて透過化処理工程を包含する。固定され、透過化処理された細胞は、次いで、抗体が細胞に侵入し、特異的細胞標的分子に結合することを可能にする条件下で、特定の細胞内標的分子を認識する抗体と接触される。それにより、抗体は、その抗体を検出可能にすることにより、特定の細胞内標的分子の同定を容易にする。抗体標識細胞は、次いで、メタノールで処理され、抗体を細胞内標的分子に固定する。細胞は、次いで、熱処理に供されて、染色体ＤＮＡと核タンパク質との間の架橋を取り消す。単離された細胞は、次いで、ハイブリダイゼーション緩衝液中に配置され、インサイチュハイブリダイゼーションに供される。インサイチュハイブリダイゼーション後、再懸濁された細胞の特異的細胞標的分子に結合された抗体は、同定／検出および／または定量され、それにより、特定の細胞内標的分子が同定／検出および／または定量されることを可能にする。本発明のこの方法は、基材上に固定化されたか、または懸濁物中にあるインタクトな細胞と共に使用され得る。
【００３６】
特定の実施形態では、抗体は、標識を含む。代替の実施形態では、この方法は、ハイブリダイゼーション緩衝液中の細胞の再懸濁後に、抗体を、標識を含む結合パートナーと接触させる工程を包含する。この場合、抗体の検出は、抗体の標識された結合パートナーの標識を検出することにより実施される。
【００３７】
本発明はまた、本発明の種々の方法を実施するためのキットを提供する。特定の実施形態では、キットは、本発明の方法の１つ以上を実施するために必要な試薬を備える。好ましい実施形態では、このキットはまた、インタクトな細胞中の特異的細胞標的分子を同定および／または検出および／または定量するために、試薬を用いるための、プロトコル（例えば、指示書）を備える。別の好ましい実施形態では、キットはまた、インタクトな細胞中の特異的細胞標的分子に結合し得るプローブを含む。このタイプの特定の実施形態では、プローブは標識を含む。
【００３８】
１つの特定の実施形態では、キットは、懸濁物中の細胞のインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイにおいて、直接的に標識されたプローブと共に使用されるように設計される。別の実施形態では、キットは、固体基材上の細胞のＩＳＨアッセイにおいて、直接的に標識されたプローブと共に使用されるように設計される。なお別の実施形態では、キットは、懸濁物中の細胞のＩＳＨアッセイにおいて、間接的に標識されたプローブと共に使用されるように設計される。さらに別の実施形態では、キットは、固体基材上の細胞のＩＳＨアッセイにおいて、間接的に標識されたプローブと共に使用されるように設計される。好ましい実施形態では、キットは、ＦＩＳＨを実施するためのキットであり、そして標識は、発蛍光団である。
【００３９】
なお別の実施形態において、このキットは、溶液中のインタクトな特異的細胞表面抗原を検出するために、抗体とともに使用されるように設計される。なお別の実施形態において、このキットは、固体基材上の特異的細胞表面抗原を検出するために、抗体と共に使用するように設計される。なお別の実施形態において、このキットは、溶液中のインタクトな細胞における、特定の細胞内標的分子を検出するために、抗体と共に使用されるように設計される。なお別の実施形態において、このキットは、固体基材上の特定の細胞内表面分子の細胞内部位を検出するために、抗体と共に使用されるように設計される。好ましい実施形態において、この抗体は、標識された抗体である。より好ましくは、標識された抗体の標識は、発蛍光団である。
【００４０】
特定の実施形態において、同定、検出、または定量は、フローサイトメトリーと組み合わせて実施される。特定の実施形態において、特異的細胞標的分子は、画像化フローサイトメトリーを用いて検出される。別の特定の実施形態において、特異的細胞標的分子は、時間遅延積分（ＴＤＩ）画像化フローサイトメトリーによって検出される。最も好ましい実施形態において、ＴＤＩ画像化フローサイトメーターは、米国特許第６，２１１，９５５号および／または米国特許第６，２４９，３４１号（これらの内容は、その全体が具体的に本明細書中に参考として援用される）に記載されるものである。別の実施形態において、特異的細胞標的分子は、従来のフローサイトメトリー、光学顕微鏡検査法、または蛍光顕微鏡検査法によって、検出される。
【００４１】
他の目的および利点は、引き続く詳細な説明の再検討から明らかになる。
【００４２】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法および組成物を記載する前に、本発明は、記載される特定の方法、組成物、および実験条件に限定されないことが理解されるべきである。なぜなら、このような方法および化合物は、変化し得るからである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のみであり、そして限定することを意図されないこともまた、理解されるべきである。なぜなら、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみに限定されるからである。
【００４３】
本明細書中および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、そうではないことを文脈が明白に示さない限り、複数の言及を包含する。従って、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」または「方法（ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ）」に対する言及は、１つ以上の細胞もしくは方法、ならびに／あるいは本明細書中に記載される型の工程および／または本開示を読む際に当業者に明らかになる型の工程を含む、などである。
【００４４】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似であるかまたは等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物は、本明細書中に明白に援用される。
【００４５】
（一般的な説明）
本発明は、インサイチュでハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学を実施する、新規な方法を提供する。本発明の好ましい局面は、細胞の集塊を必要とせずに、そして／または細胞の有意な損失なしで、固定された細胞が、細胞懸濁液中でインサイチュでハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学を受けることを可能にする、処理工程を包含する。本発明の方法の１つの実施形態において、処理工程は、従来のインサイチュでのハイブリダイゼーションおよび免疫組織学的分析の、変性工程およびハイブリダイゼーション工程の前に、固定された細胞を再水和することによって実施される。
【００４６】
従って、１つの実施形態において、本発明は、形態学的にインタクトな細胞に含まれる既知の標的核酸配列を、この細胞が表面に固定されるのではなく濁物中に維持される条件下で同定する方法を提供し、これによって、細胞中の標的核酸配列の存在の決定が可能になる。
【００４７】
本発明の特定の実施形態は、極性有機溶媒（すなわち、メタノール、エタノール、もしくはアセトン）または極性有機溶媒と水溶液との混合物（例えば、メタノール：酢酸溶液）を使用して、インタクトな細胞を固定し、そしてこれらの細胞を、核酸および／または抗体プローブに対して浸透性にする。調製された細胞は、例えばスライド上での、従来のインサイチュハイブリダイゼーションまたは免疫化学のために使用され得るか、あるいはこれらの細胞は、懸濁液中で、インサイチュハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学的分析のためにさらに処理され得る。
【００４８】
固体基材上で実施される従来のインサイチュハイブリダイゼーションにおいて、固定された細胞は、エタノールの一連の段階的な濃度の増加によって、細胞が１００％エタノール中にあるようになるまで、脱水される。次いで、これらの細胞は、２×ＳＳＣで洗浄され、その後、核酸プローブを含む２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド緩衝液中でハイブリダイゼーションされる。
【００４９】
本発明は、懸濁液中でインサイチュでのハイブリダイゼーションを実施する、新規な方法を提供する。１つの実施形態において、これらの細胞は、１×ＳＳＣ＋ＢＳＡ、次いで２×ＳＳＣ＋ＢＳＡで段階的に再水和され、その後、２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド緩衝液中でハイブリダイゼーションされる。本発明によって提供される、段階的な再水和は、メタノール、エタノール、またはアセトンで脱水された細胞が２×ＳＳＣのような水溶液に直接移動される場合に被る細胞の損失および集塊を排除する。従って、本発明は、フローサイトメトリーに適合性の単一の細胞懸濁液中に、固定された細胞を維持する方法を提供する。
【００５０】
懸濁液中でインサイチュハイブリダイゼーションを実施する、本発明の第二の方法において、これらの細胞は、アルデヒド固定液に曝露され、次いで熱処理され、その後、インサイチュハイブリダイゼーションのために再懸濁される。本発明のこの方法は、再水和工程を必要とせず、そして細胞の集塊を生じない。アルデヒド固定および制限された熱処理を包含する、本発明の方法はまた、細胞表面抗原標識プロトコルおよび細胞内抗原標識プロトコルと共に使用され得る。
【００５１】
（定義）
本明細書中において使用される場合、「特異的細胞標的分子」とは、直接的にか、または結合パートナー（例えば、レセプターに対するリガンド、抗体、もしくは相補的核酸）へのその結合を介して間接的にかのいずれかで検出されることに耐えられる、特定の細胞成分である。特異的細胞標的分子としては、細胞内成分および細胞膜成分（例えば、細胞表面抗原）が挙げられる。特定の実施形態において、特異的細胞標的分子は、特定のタンパク質（例えば、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）またはヘモグロビン鎖）である。好ましい実施形態において、特異的細胞標的分子は、特定の核酸（例えば、特定の遺伝子または染色体に独特のヌクレオチド配列（例えば、胎児性ヘモグロビンをコードする遺伝子のみに見出されるヌクレオチド配列）を含む核酸）である。
【００５２】
本明細書中において使用される場合、「特異的細胞標的分子の細胞内部位を認識する抗体」とは、細胞外膜の内部および／または表面とは対照的に、細胞の内側にある特異的細胞標的分子の抗原性部位を認識する抗体である。
【００５３】
本明細書中において使用される場合、（例えば、極性有機溶媒と共にインキュベーションすることによって）脱水された細胞は、この細胞が水溶液に入れられ、そしてハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後洗浄液において使用される水性緩衝液中に容易に再懸濁され得る場合に、「再水和」される。一般に、再水和緩衝液はまた、１種以上のタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはウシ胎仔血清（ＦＢＳ））を含有して、チューブへの細胞の固着の低下を補助する。
【００５４】
本明細書中において使用される場合、「ハイブリダイゼーション緩衝液」とは、緩衝剤を含有し、そしてインタクトな細胞内の、対応する特異的細胞標的分子に対するプローブの結合のために適切な溶液である。以下の実施例を参照のこと。好ましくは、ハイブリダイゼーション緩衝液はまた、ブロッキング剤を含有して、非特異的結合を減少させる。さらに、ハイブリダイゼーション緩衝液は、カオトロピック剤を含有して、例えば、ハイブリダイゼーションのための融解温度（Ｔｍ）を低下させ得る。ハイブリダイゼーション緩衝液はまた、標的特異的プローブを含有し得る。
【００５５】
本発明の１つの方法において、極性有機溶媒（例えば、アセトンまたは短鎖アルコール（例えば、メタノールおよびエタノール））ならびに極性有機溶媒と水溶液との混合物（例えば、３：１のメタノール：酢酸）が使用される；別の実施形態において、アルデヒド固定液が使用され、次いで、熱処理されて、染色体ＤＮＡへのアクセスを可能にするために、染色体ＤＮＡと核タンパク質とを逆に架橋させる。さらに特定の用途のために、他の固定液（特定の塩溶液（例えば、硫酸ナトリウムまたは酢酸セシウム）が挙げられる）が使用される。好ましくは、固定溶液は、沈澱作用によって、細胞成分を固定する。より好ましくは、固定された細胞の細胞形態が維持され、この細胞の細胞成分の抗原性が維持され、核酸が、細胞の適切な位置に保持され、そして核酸が、それらのハイブリダイズする能力を維持する。
【００５６】
メタノール、エタノール、およびアセトンのような、極性有機溶媒は、タンパク質の親水性残基に結合した水分子を除去することによって、タンパク質を変性すると考えられる。極性有機溶媒はまた、膜および構造脂質のいくらかを除去して、その細胞をより浸透性にし得る（抗体分子が細胞に入ることを可能にすることを含む）。細胞内抗原および細胞膜抗原は、通常、極性有機固定液中に良好に保存される。しかし、メタノール、エタノール、および／またはアセトンで細胞を処理すると、段階的なプロセスで細胞が次第に再水和されない限り、引き続いて、水性緩衝液中で細胞の凝塊を生じる。
【００５７】
アルデヒドは、タンパク質の変性および化学修飾によって、すなわち、例えば、リジン残基の遊離アミノ基と共有結合反応することによって、細胞を固定すると考えられる。固定は、頻繁に、細胞内タンパク質のペプチド鎖抗原を変化させ、一方で、細胞膜グリコカリックス（ｇｌｙｃｏｃａｌｉｘ）の糖抗原は、さほど影響を受けないままである。タンパク質の架橋が起こるので、細胞は剛性になり、そしてその結果、細胞は、良好に懸濁する。しかし、インタクトな細胞の細胞膜は、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはサポニンのような界面活性剤で浸透性化されない限り、大きい分子（例えば、抗体）に対して比較的非浸透性のままである。さらに、染色体ＤＮＡは、熱で処理されて、染色体ＤＮＡと核タンパク質との間のアルデヒド誘導架橋を逆にされない限り、核酸プローブでのハイブリダイゼーションにアクセス不可能である。
【００５８】
本明細書中に開示される方法論に対して必須ではないが、特定の型の細胞（例えば、羊膜細胞）は、好ましくは、固定プロセスの前に低張性に膨潤される。細胞を低張性に膨潤させることによって、細胞核が拡大され、例えば、インサイチュハイブリダイゼーションにおける標識がより容易に認識されることを可能にする。細胞は、低張性生理食塩水溶液に入れられ、これによって低張性膨潤に供される場合に、低張性に膨潤される。
【００５９】
（細胞供給源）
本発明のための細胞は、任意の供給源から、そして／または任意の生物、もしくは任意の生物の組織から得られ得、そして生存していても死んでいてもよい。好ましい実施形態において、細胞は、ヒト細胞である。適切な供給源の例としては、胎盤、皮膚、または骨髄から得られた細胞、任意の体液（血液、尿、痰、羊水、滲出液、および乳汁）由来の細胞、組織生検（例えば、腎臓、肝臓または脳の生検）、腫瘍生検、ならびに洗浄から得られた細胞（例えば、管、槽、または腹膜）が挙げられる。組織培養のために適合された任意の組織由来の細胞もまた、使用され得る。
【００６０】
本明細書中に開示される手順にわたって、使用される細胞（固定された細胞を含む）を、１つの溶液から別の溶液に移す必要が生じる。この移動は、最初、細胞を第二の溶液に入れる前に、特定の溶液から細胞を単離／除去することを包含し得る。本発明によって使用される細胞（固定された細胞を含む）は、多数の手段によって溶液から単離され得、この手段としては、以下に例示されるような遠心分離、細胞選別（例えば、ＦＡＣＳ）、凍結乾燥、および濾過（例えば、細胞を保持するが溶媒を保持しない膜を用いる）が挙げられる。
【００６１】
さらに、固定された細胞は、例えば、磁気分離によって、固定溶液から単離され得る。従って、特異的細胞標的分子（例えば、細胞表面抗原または細胞内抗原部位を有する細胞法的分子）は、磁気ビーズと結合体化した抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ：Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ，またはＤｙｎａｌ：Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によって結合され得る。細胞表面分子への抗体結合は、抗体：抗原相互作用に依存して、固定の前または固定の後に起こり得る。細胞内抗体結合は、細胞の固定および浸透化に続いて起こり、そして好ましくは、これらの小さいサイズに起因して、Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズを使用する。食細胞特性を有する特定の細胞型はまた、固定の前に磁気粒子またはビーズを包み込み得る。次いで、磁気標識された細胞が、強力磁石を使用して溶液から分離され、そして磁気標識を失うことなく、洗浄され得、そして水性ハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁され得る。
【００６２】
（顕微鏡法およびフローサイトメトリー）
固定した基材上の細胞は、酵素的染色（例えば、ペルオキシダーゼ）にとって特に有用な明視野顕微鏡によって検出され得る。あるいは、蛍光顕微鏡は、蛍光標識のために使用され得る。さらに、デジタル画像化が使用され得、そして優れた分解能と、より正確な定量的測定を得る能力との両方を提供する。
【００６３】
溶液中の個々の細胞は、フローサイトメトリー（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒまたはＦＡＣＳ−ＶａｎｔａｇｅまたはＣａｌｉｂｕｒ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によってモニタリングされ得る。標準的なフローサイトメトリーにおいて、細胞は、光源（好ましくはレーザービームである）を通って一列で通り過ぎる。特異的細胞標的分子に結合した標識プローブは、光（紫外線、可視光および／または赤外線）を吸収し得、次いで、標識プローブ上の光の効果は、例えば、単一の吸収および／またはその後の蛍光放射および／または化学発光／生物発光としてモニタリングされ得る。例えば、標識プローブの吸収がモニタリングされる場合、光電子増倍管が光源と整列され、この標識プローブに起因する吸収が決定され得る。特定の実施形態において、標識プローブの蛍光がモニタリングされる場合、光電子増倍管は光源に対して垂直であり、標識プローブに起因する発光を、最初の光源から最少の干渉で検出し得る。
【００６４】
最近、フローサイトメトリーにおける重要な進歩が、細胞の画像化および分析において開示されている。この方法論は、時間遅延および細胞の画像に応じて出力シグナルを生じる統合検出器（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）と組み合わせた光学分散系を使用し、これらは、時間遅延および統合検出器に関する（米国特許第６，２１１，９５５号および同第６，２４９，３４１号）。本発明の方法は、この新しい技術、ならびにより慣用的なフローサイトメトリー方法論および顕微鏡方法論で用いるために適合性である。
【００６５】
（プローブ）
本発明のプローブは、任意の特異的細胞標的分子についての結合パートナーを含む。特定のプローブとしては、ヌクレオチドプローブ（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド核酸（すなわち、ＰＮＡ））、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、および特異的リガンド（タンパク質リガンドを含む）が挙げられる。これらのプローブは、直接的に標識されても、間接的に標識されてもよい。核酸プローブについて、プローブのサイズは、単一のミスマッチを検出するように調節され得る（例えば、１２〜５０塩基）が、さらに大きなプローブもまた使用され得る。一旦特異的細胞標的分子が選択されると、当業者は容易に適切なプローブを調製し得、これは、タンパク質に対する抗体、または特定の核酸に対する核酸プローブである。
【００６６】
（標識）
本発明のプローブ（タンパク質（抗体）、および核酸を含む）は、全て標識され得る。適切な標識としては、酵素、発蛍光団（例えば、フルオレセイン、またはそれらの誘導体（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、フィコエリトリン（ＰＥ）、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（ＴＲ）、Ｃｙ  Ｄｙｅ、ローダミン、アレクサ色素（ａｌｅｘａ  ｄｙｅ）、遊離もしくはキレートされたランタニド系列の塩（特にＥｕ３＋）、発色団、放射性同位体、キレート化剤、染料、金粒子、ラテックス粒子、リガンド（例えば、ビオチン）ならびに化学発光剤が挙げられる。
【００６７】
標識が酵素である例において、検出は、現在利用されている、当該分野で公知の比色分析技術、分光光度技術、蛍光分光光度技術、電流滴定技術またはガス分析技術のいずれかによって達成され得る。
【００６８】
直接標識は、本発明に従って使用され得る標識の１つの例である。直接標識は、その天然の状態で実体として規定されており、肉眼、あるいは光学的フィルタおよび／もしくは蛍光を助長する刺激（例えば、紫外線）、または赤外分析法の適用の助けでかのいずれかによって、容易に可視化される。有色標識（本発明に従って使用され得る）の例としては、金属ゾル粒子（例えば、Ｌｅｕｖｅｒｉｎｇ（米国特許第４，３１３，７３４号）によって記載されるような金ゾル粒子）；Ｇｒｉｂｎａｕら（米国特許第４，３７３，９３２号）およびＭａｙら（ＷＯ８８／０８５３４）によって記載されるような染料単独の粒子；Ｍａｙ（前出）、Ｓｎｙｄｅｒ（ＥＰ−Ａ  ０  ２８０  ５５９および０２８１  ３２７）によって記載されるような染色されたラテックス；またはＣａｍｐｂｅｌｌら（米国特許第４，７０３，０１７号）によって記載されるようなリポソーム中にカプセル化された染料が挙げられる。他の直接的な標識としては、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、蛍光部分または発光部分が挙げられる。これらの直接的な標識デバイスに加えて、酵素を含む間接的標識もまた、本発明に従って使用され得る。酵素結合イムノアッセイの種々の型（例えば、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ、リボザイム、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ）は、当該分野に周知である。これらおよび他の型については、Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  ＥＭＩＴ（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７０：４１９−４３９、および米国特許第４，８５７，４５３号によって詳細に考察されている。さらに、細胞タンパク質（膜タンパク質を含む）は、例えば、米国特許第５，６２５，０４８号、ＷＯ  ９７／２６３３３、およびＷＯ  ９９／６４５９２（これらの内容は、その全体において本明細書中で参考として援用される）に記載されるような緑蛍光タンパク質のようなマーカータンパク質を含むように改変され得る。
【００６９】
放射活性標識（例えば、同位体（３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅ）が使用され得る例において、現在利用可能な公知の計数手順が利用され得る。タンパク質（抗体を含む）は、代謝的標識によって標識され得る。代謝的標識は、代謝的標識（例えば、［３５Ｓ］−メチオニンまたは［３２Ｐ］−オルトホスフェート）を補充した培養培地の存在下でタンパク質を発現する細胞のインビトロインキュベーションの間に生じる。［３５Ｓ］−メチオニンでの代謝的（または生合成）標識に加えて、本発明はさらに、［ｌ４Ｃ］−アミノ酸および［３Ｈ］−アミノ酸（非標識位置においてトリチウムが置換される）を用いる標識を企図する。
【００７０】
本発明の使用のための他の標識としては、磁気ビーズまたは磁気共鳴画像化標識が挙げられる。別の実施形態において、例えば、欧州特許第０３７２７０７号、米国特許第５，４５９，２４０号または同第５，９８６，０６１号に記載されるように、リン酸化部位が、３２Ｐでの標識のために本発明の抗体上に作製され得る。
【００７１】
（キット）
本発明はまた、本発明の方法を実行するためのキットを提供する。概して、このようなキットは、本発明の方法を実施するために必要とされる試薬を備える。好ましい実施形態において、このキットはまた、試薬の使用についてのプロトコル（例えば、指示書）を含む。このましくは、このキットは、容易に使用され得る濃度の試薬を提供し、そしてこれは、以下の方法に関して最適化されている。好ましい実施形態において、インタクトな細胞における特異的細胞標的分子と結合および／または反応するプローブが含まれる。より好ましくは、このプローブは標識プローブである。
【００７２】
本発明のキットは、一般的用途のためのものであり得る。すなわち、１つより多くのアッセイ型（すなわち、固体支持体上または溶液中で細胞を試験し得るアッセイ）において使用される。あるいは、本発明は、特定の適用について以下の実施例に記載されるような、特定の試薬を使用する特別のキットを提供する。
【００７３】
本発明の１つのキットは、以下を備える：（ｉ）固定溶液（例えば、３：１のメタノール：酢酸）、（ｉｉ）再水和緩衝液（例えば、１×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡ）、および（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション緩衝液（例えば、２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン）。
【００７４】
関連キットにおいて、前ハイブリダイゼーション（ｐｒｅ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）緩衝液はまた、例えば、２×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡを補充される。さらに別のキットにおいて、洗浄溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））もまた含まれる。さらに、細胞を低張により膨化する低張溶液（例えば、０．５６％  ＫＣｌ）もまた含まれる。核の対比染色剤（例えば、ＤＡＰＩまたはＰＩ）もまた含まれ得る。好ましい実施形態において、このキットは、プローブを備える。１つのこのような実施形態において、このプローブは標識プローブである。あるいは、このプローブは、間接的に標識されたプローブである。この場合、二次標識もまた含まれることが好ましい。染色緩衝液（例えば、ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ）もまた、キットに含まれ得る。さらに、特定のキットにおいて、架橋固定剤（例えば、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド）が含まれ得る。さらに、透過剤（例えば、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはサポニン））もまた、本発明のキットの一部分であり得る。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法についての完全な開示および記載を当業者に提供するために記載され、これは、発明者らが本発明とみなしている範囲を限定することを意図しない。使用される数（例えば、量、温度など）に関する正確性を確実にするための努力がなされているが、いくつかの実験的誤差および偏差が考慮されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧かまたはその付近である。
【００７６】
（実施例１  直接的標識蛍光プローブを使用する、非極性有機溶媒で固定された細胞における蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）
細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄し、次いで０．５６％  ＫＣｌ中に、２×１０７個／ｍｌ以下で再懸濁し、そして約２５℃と３７℃との間で１０〜２０分間インキュベートし、細胞を低張により膨化する。低張による膨化のために使用される最適な温度および持続時間は、細胞の型に依存し得る。従って、リンパ球または造血細胞を膨化させるために好ましい方法は、３７℃で２０分間である。より大きな細胞（例えば、上皮腫瘍細胞）を膨化させるために好ましい方法は、２５℃で１０分間である。ＫＣｌ  １ｍｌあたり、新たに作製した０．４ｍｌのＣａｒｎｏｙｓ（３：１  メタノール：酢酸）を添加することによって、細胞を予め固定し、そして穏やかな遠心分離条件（すなわち、６００×ｇで５分間）を使用してペレット化する。上清を除去し、そして細胞を、新たなＣａｒｎｏｙｓの１ｍｌあたり１０８個以下で再懸濁する。低張膨張工程を飛び越えて進むことが可能であり得、これらの細胞を、Ｃａｒｎｏｙｓ、メタノールまたはアセトンにおいて直接固定し得る。固定した細胞は、４℃で一晩（Ｏ．Ｎ．）または−２０℃で長期間保存され得る。この時点で、細胞を、慣用的な蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のためにスライド上に滴下してもよいし、懸濁液中でのＦＩＳＨのために処理してもよい。
【００７７】
懸濁液中のＦＩＳＨのために、１０７個以下の細胞を微量遠心管に移し、そして遠心分離（すなわち、６００×ｇで５分間）によってペレット化する。シリコンで覆った管の使用は細胞の損失を最少にするが、必須ではない。上清を除去し、細胞を１×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡ中に再懸濁し、そして２０分間〜１時間にわたって２５℃で再水和する。細胞は、損害なしに、１×ＳＳＣ中に数時間放置するか、または４℃に一晩置くことができる。次いでこれらの細胞を、遠心分離（すなわち、６００×ｇで５分間）によってペレット化し、２×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡとともに５〜２０分間インキュベートし、次いで遠心分離（すなわち、６００×ｇで５分間）によってペレット化する。上清を注意深く除去し、そして細胞をハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン中に再懸濁する。５〜５０ｎｇの標識プローブを添加し、そしてプローブ混合物中に何も存在しない場合、１０μｇのブロッキングＤＮＡ（すなわち、ニシンまたはサケの精子ＤＮＡ）を添加する。最終容積を、細胞ペレットの体積に依存して、ヌクレアーゼを含まない水で１０〜２０μｌに調節する。
【００７８】
染色体ＤＮＡおよびプローブを、７５℃で５分間または８０℃で４５秒間で一緒に変性し、次いでプローブに依存して、３７℃〜４２℃でハイブリダイズさせる。例えば、Ｘ動原体プローブおよびＹα−サテライトプローブは、３７℃または４２℃でハイブリダイズする。第１３染色体および第２１染色体の遺伝子座に特異的なプローブ、ならびに第１８染色体の動原体プローブは、３７℃で特異的にハイブリダイズする。直接的に標識されたプローブが、商業的に調製され、そして予め変性されて供給される場合、このプローブは、染色体ＤＮＡと一緒に変性することによって悪影響を受けることは通常ない。ハイブリダイゼーションは、プローブに依存して、３０分間〜一晩進行する。ハイブリダイゼーション後、細胞をペレット化し（すなわち、６００×ｇ）、そしてハイブリダイゼーション緩衝液を除去する。細胞を、１００〜５００μｌの２×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡで洗浄し、次いで従前どおりペレット化する。上清を除去し、そして細胞を、１００〜５００μｌの２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド中に再懸濁する。細胞を、４２℃で１５〜３０分間インキュベートして、過剰のプローブを溶出する。過剰なプローブが、５μｌのサンプルを等量の抗退色剤（ａｎｔｉｆａｄｅ）または抗退色剤＋核対比染色剤（すなわち、ＤＡＰＩまたはＰＩ）と混合することによって除去されたか否かを決定するために、１アリコートを蛍光顕微鏡で試験し得る。必要であれば、溶出を続ける。シグナルは、４２℃で数時間安定である。一旦過剰なプローブが溶出されると、細胞を従来どおりペレット化し、そして２×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡ中で洗浄する。この段階で、ＦＩＳＨシグナルを、画像化フローサイトメトリー、慣用的なフローサイトメトリー、または蛍光顕微鏡によって評価し得る。この方法は、単一コピーの遺伝子座（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）の検出について十分な感度を有する。
【００７９】
（実施例２）
（間接標識プローブを使用する、非極性有機溶媒で固定した細胞のインサイチュハイブリダイゼーション）
インサイチュハイブリダイゼーションを、間接標識プローブ（すなわち、ビオチン標識プローブ、ジゴキシゲニン標識プローブ、または他のリガンド標識プローブもしくはハプテン標識プローブ）を使用し、その後、二次標識（すなわち、蛍光基質標識または発色性基質標識を含む、アビジンまたは抗ジゴキシゲニン）を使用して、実施し得る。細胞を、直接標識蛍光プローブのために上記実施例１において記載した通りに調製する。しかし、ハイブリダイゼーション工程およびハイブリダイゼーション後の工程は、相応して変化する。例えば、この間接標識プローブが熱変性に対して感受性である（すなわち、ジゴキシゲニン標識プローブ）場合、そのプローブを添加する前に染色体ＤＮＡを変性させる。細胞を上記のハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁し、７５℃で５分間かまたは８０℃で４５秒間変性させ、その後、プローブを添加する。このプローブをハイブリダイゼーション緩衝液中で予め希釈して供給する場合、その予め希釈したプローブを添加する前に、細胞をペレットにして過剰なハイブリダイゼーション緩衝液を除去することが必要であり得る。ハイブリダイゼーションは、上記実施例１に記載した通り進行し得る。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを溶出させ、上記実施例１に記載したように細胞を洗浄する。最終的な２×ＳＳＣ洗浄工程の後、抗ジゴキシゲニン結合体化発蛍光団、ストレプトアビジン結合体化発蛍光団または発色性基質を用いる二次検出のために、細胞を適切な緩衝液（すなわち、４×ＳＳＣ）中に再懸濁する。この方法は、単一遺伝子座を検出するために十分に感度が高い。
【００８０】
（実施例３）
（直接標識抗体または間接標識抗体を使用する、非極性有機溶媒で固定した細胞上の細胞表面抗原の標識、およびその後の懸濁物中でのインサイチュハイブリダイゼーション）
生細胞を固定する前に、標準的免疫染色法に従って、細胞表面抗原に対する望ましい抗体とともにインキュベートする。例えば、細胞を、染色緩衝液（例えば、ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡまたは１％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ））中の直接標識蛍光抗体または間接標識抗体（すなわち、ビオチン結合体化抗体）のいずれかとともにインキュベートする。抗体を直接標識した場合、その抗体は、例えば、化学的固定および熱変性に耐える発蛍光団（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））で標識されなければならない。その後、抗体で標識した細胞を、メタノールまたはアセトンのいずれかで固定する。細胞を、上記実施例１に記載したように再水和しハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後の洗浄の後に、細胞を染色緩衝液中に再懸濁する。間接標識抗体を、標準的検出方法に従って、二次試薬（すなわち、ストレプトアビジン結合体化発蛍光団）で検出する。
【００８１】
（実施例４）
（非極性有機溶媒で固定した細胞中の細胞内抗原の標識、およびその後のインサイチュハイブリダイゼーション）
極性有機固定剤（例えば、メタノール、エタノール、またはアセトン）により、抗体分子ならびにＩＳＨプローブに対して細胞を透過性にするが、固定後の細胞凝集から問題が生じる。本明細書中に開示されるような抗体およびＩＳＨとのインキュベーションの前に再水和工程を加えると、細胞を再懸濁してその細胞をフローサイトメトリーによる分析に適切であるようにすることが可能である。
【００８２】
細胞を７０〜１００％メタノール中に固定し、その後、ペレットにし、そしてブロックタンパク質を含む染色緩衝液（すなわち、ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡまたはハンクス緩衝化塩溶液（ＨＢＳＳ）＋１％  ＦＢＳ）中に再懸濁する。細胞を染色緩衝液中に１０分間〜２０分間再水和し、その後、ペレットにし、そして少量の染色緩衝液（すなわち、５０μｌ〜１００μｌ）中に再懸濁する。標識抗体を添加し、細胞を室温にて３０分間〜６０分間インキュベートする。非標識抗体もまた使用し得、その後、二次試薬を用いて検出し得る。好ましくは、直接標識抗体を使用して、非特異的結合および工程数を減少させる。抗体インキュベーションの後、細胞をＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ中で洗浄し、その後、１×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡ中に再懸濁する。その後、細胞をペレットにし、そして２×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡ中に再懸濁する。その後、細胞を、上記実施例１に記載したように懸濁物中でのＩＳＨのために使用し得る。好ましくは、細胞内抗原を、熱変性に耐える発蛍光団（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ染料またはＡｌｅｘａ染料）で標識する。タンパク質ベースの蛍光色素（例えば、ＰＥまたはＰＥ結合体）は、熱変性に耐えないが、ＩＳＨ後に細胞内抗原を検出するための二次試薬として使用し得る。細胞表面標識はまた、上記実施例３に記載した通り、メタノールによる固定の前に実施し得る。細胞表面抗原に対する抗体は、細胞内抗原標識のために使用する蛍光色素と異なる蛍光色素で標識すべきである。この方法により、細胞表面抗原、細胞内抗原および染色体ＤＮＡの同時分析が可能になる。
【００８３】
（実施例５）
（直接標識蛍光プローブを使用する、アルデヒド固定／熱処理細胞のインサイチュハイブリダイゼーション）
細胞を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄および再懸濁する。選択したアルデヒド固定剤（すなわち、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、またはグルタルアルデヒド）を、細胞型に依存して、最終濃度０．２５〜１％に添加する。細胞を室温または４℃にて１５分間〜１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄する。固定した細胞を、この段階で４℃にて保存し得る。懸濁物中でのＩＳＨの前に、細胞をペレットにし、２×ＳＳＣ中に再懸濁し得る。その後、細胞を６５℃まで１時間〜４時間加熱して、染色体ＤＮＡと核タンパク質との架橋を逆転させる。架橋を逆転するために必要な時間の長さは、固定に使用するアルデヒドの型および割合、ならびに固定時間の長さに依存する。好ましい場合、０．２５ｍｌ容量の２％パラホルムアルデヒドを、ＰＢＳ中に再懸濁した０．７５ｍｌの細胞に、最終濃度０．５％パラホルムアルデヒドまで添加する。細胞を３０分間固定させ、その後、ＰＢＳで２回洗浄する。細胞をペレットにし、２×ＳＳＣ中に再懸濁し、その後、６５℃での熱処理に１時間供する。
【００８４】
その後、細胞を、上記のように懸濁物中でのＩＳＨに供し得る。スライドガラス上でＩＳＨを実施することが望ましい場合、細胞をメタノール中に再懸濁し得、従来のＩＳＨのためにこの時点でスライドガラス上に滴下し得る。
【００８５】
懸濁物中でのＩＳＨのために、細胞を微量遠心管に移し、遠心分離（すなわち、６００×ｇにて５分間）によりペレットにする。上清を注意深く除去し、細胞を、ハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、５０％ホルムアルデヒド、１０％硫酸デキストラン）中に再懸濁する。５ｎｇの標識プローブを添加し、１０μｇのブロッキングＤＮＡ（すなわち、ニシン精子ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡ）を、プローブ混合物中に存在しない場合は添加する。最終容量を、細胞ペレット容積に依存して、１０μｌ〜２０μｌへと、ヌクレアーゼを含まない水を用いて調整する。
【００８６】
染色体ＤＮＡおよびプローブを一緒に、７５℃で５分間または８０℃で４５秒間変性し、その後、使用するプローブに依存して、３７℃〜４２℃でハイブリダイズさせる。例えば、蛍光標識Ｘ動原体プローブおよび蛍光標識Ｙ  α−サテライトプローブは、３７℃または４２℃のいずれかでハイブリダイズする。第１３染色体遺伝子座特異的プローブおよび第２１染色体遺伝子座特異的プローブと、第１８染色体動原体プローブは、３７℃で特異的にハイブリダイズする。直接標識プローブが商業的に調製されておりかつ予め変性して供給される場合、そのプローブを染色体ＤＮＡと一緒に変性することによって通常は有害な影響を受けない。ハイブリダイゼーションは、プローブに依存して、３０分間〜一晩進行する。ハイブリダイゼーション後、細胞をペレットにし（すなわち、６００×ｇ）、ハイブリダイゼーション緩衝液を除去する。細胞を、１００μｌ〜５００μｌの２×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡで洗浄し、その後、上記のようにペレットにする。上清を除去し、細胞を、１００μｌ〜５００μｌの２×ＳＳＣ／５０％ホルムアミド中に再懸濁する。細胞を４２℃にて１５分間〜３０分間インキュベートして、過剰なプローブを溶出させる。アリコートを、蛍光顕微鏡にて試験して、５μｌサンプルを等容量のアンチファド（ａｎｔｉｆａｄｅ）またはアンチファド＋核対比染色剤（すなわち、ＤＡＰＩまたはＰＩ）と混合することによって、過剰なプローブが除去されたか否かを決定し得る。必要な場合は溶出を継続する。シグナルが４２℃にて数時間安定であることを確立している。高いバックグラウンドが観察される場合、細胞を０．２５×ＳＳＣ中で再懸濁し得、そして６８℃まで１分間〜２分間加熱して過剰なプローブを除去し得る。一旦過剰なプローブが溶出されると、細胞を上記のようにペレットにし、２×ＳＳＣ＋０．０５％  ＢＳＡ中で洗浄する。この段階で、ＦＩＳＨシグナルを、画像化フローサイトメトリー、従来のフローサイトメトリー、または蛍光顕微鏡検査法によって評価し得る。この方法は、単一コピー遺伝子座（例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）の検出のために十分な感度を有する。
【００８７】
（実施例６）
（間接標識プローブを使用する、アルデヒド固定／熱処理細胞のインサイチュハイブリダイゼーション）  
細胞を、直接標識蛍光プローブについてと同じ様式で調製する。ハイブリダイゼーション工程およびハイブリダイゼーション後の工程は、以下に従って変化する。間接標識プローブが熱変性に対して感受性である場合（すなわち、ジゴキシゲニン標識プローブ）、そのプローブを添加する前に染色体ＤＮＡを変性させる。細胞を、上記のようにハイブリダイゼーション緩衝液中に再懸濁し、７５℃にて５分間または８０℃にて４５秒間変性させ、その後、プローブを添加する。プローブをハイブリダイゼーション緩衝液中に予め希釈して供給する場合、予め希釈したプローブを添加する前に、細胞をペレットにして過剰なハイブリダイゼーション緩衝液を除去することが必要である。ハイブリダイゼーションは、上記のように進行する。ハイブリダイゼーション後、過剰なプローブを溶出し、細胞を上記のように洗浄する。最終的な２×ＳＳＣ洗浄工程の後、細胞を、抗ジゴキシゲニン結合体化発蛍光団、ストレプトアビジン結合体化発蛍光団、または発色性基質を用いる二次検出のために、適切な緩衝液（すなわち、４×ＳＳＣ）中に再懸濁する。この方法もまた、単一遺伝子座を検出するために十分に感度が高い。
【００８８】
（実施例７）
（直接標識抗体または間接標識抗体を使用する、アルデヒド固定／熱処理細胞の細胞表面抗原の標識、およびその後のインサイチュハイブリダイゼーション）
生細胞を固定する前に、標準的免疫染色法に従って、細胞表面抗原に対する望ましい抗体とともにインキュベートする。例えば、細胞を、染色緩衝液（例えば、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡまたは１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））中の直接標識蛍光抗体または間接標識抗体（すなわち、ビオチン結合体化抗体）のいずれかとともにインキュベートする。抗体を直接標識する場合、その抗体は、化学的固定および熱変性に耐える発蛍光団（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Ｃｙ染料、またはＡｌｅｘａ染料）で標識されなければならない。フィコエリトリン（ＰＥ）は、熱変性に絶えず、ＩＳＨ後の二次試薬としてのみ使用し得る。その後、抗体標識細胞を、選択したアルデヒド中に固定し、上記実施例５に記載したように処理する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後の洗浄の後、細胞を染色緩衝液中に再懸濁し、間接標識抗体を、標準的検出方法に従って二次試薬（すなわち、ストレプトアビジン結合体化発蛍光団）で検出する。
【００８９】
（実施例８）
（アルデヒド固定／熱処理細胞における細胞表面抗原および／または細胞内タンパク質の標識、ならびにその後のインサイチュハイブリダイゼーション）
まず、生細胞を、望ましい場合は細胞表面抗原に対する抗体とともにインキュベートする。その抗体は、熱変性および化学的固定に耐えることが可能な蛍光色素で直接標識されるべきである。細胞を、選択したアルデヒド固定剤で１５分〜６０分間固定し、その後、界面活性剤（すなわち、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはサポニン）を３０分間〜６０分間用いて透過性にして、細胞中への抗体の侵入を容易にする。市販の固定および透過化製品（例えば、Ｃａｌｔａｇ  ＦｉｘおよびＰｅｒｍまたはＯｒｔｈｏ  Ｐｅｒｍｅａｆｉｘ）を使用し得る。細胞を、望ましい抗体とともに室温または４℃にてインキュベートして、サポニンベースの透過化緩衝液を使用する場合は透過化工程の間に、またはＴｗｅｅｎ−２０もしくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用する場合は透過化工程の後のいずれかに、細胞内タンパク質を標識する。直接標識蛍光抗体は、最小量の非特異的染色しか伴わない最適な結果を与える。蛍光標識は、熱変性および化学的固定に耐性でなければならない。その後、細胞内抗体−抗原結合体を、メタノール添加によって安定化させる。細胞を、４℃にて１時間〜一晩メタノール中に固定し、その後、ペレットにし、そして２×ＳＳＣ中に再懸濁する。その後、細胞を６５℃にて１時間〜４時間インキュベートし、懸濁物中でのＩＳＨの前にアルデヒド誘導性架橋を逆転させる。懸濁物中でのＩＳＨを、上記のように実施する。細胞表面抗原および核酸プローブについては、別個の標識を使用することが好ましい。細胞内タンパク質が核から排出される場合、細胞内標識は、核酸プローブに対して使用される標識と同一であり得る。
【国際調査報告】
2005515408.tif 000002
2005515408.tif 000003