(57)【要約】多次元、高定量的な核および細胞質の密度の特徴（ＮＤＦおよびＣＤＦ）を用いて、対象とする細胞を高速に検出するためのシステムおよび方法は、細胞からの正確な密度情報を含んだ種々の光学投影画像（または射影）を生成することのできるフロー・オプティカル断層撮影（ＦＯＴ）装置、投影画像を分析かつ多次元のデータ・セットに再構成するためのコンピュータおよびソフトウェア、自動化された特徴の収集および物体分類器を備える。本発明のシステムおよび方法は、唾液から採取した気管検体または頬の剥離物を用いて肺癌などの癌を、および子宮頚部の剥離物を用いて子宮頚癌／卵巣癌を早期検出する際に特に有用であり、本発明のシステムを用いて血液を含む検体内で稀な細胞を検出することができる。
2005539209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞標本内の対象となる細胞（１）を検出する方法であって、
（ａ）細胞標本を採取し、該細胞（１）を溶液（１７）で懸濁する工程と、
（ｂ）必要に応じて、前記細胞標本の前記細胞（１）を溶液中で固定する工程と、
（ｃ）前記標本の各細胞（１）内で光学密度を発生させるために、前記細胞をマーキングする工程と、
（ｄ）少なくとも１つの点光源（２１）を用いて、前記細胞（１）に照明を当てる工程と、
（ｅ）デジタル・アレイ検出器（２３）を用いて、前記標本を介して少なくとも１つの投影画像を取得する工程と、
（ｆ）背景の照明の変動に対して、前記少なくとも１つの投影画像を補正する工程と、
（ｇ）前記少なくとも１つの投影画像を分析して、少なくとも１つの対象となる物体を検出する工程と、
（ｈ）少なくとも１つの対象となる物体に関する一次元（１Ｄ）の特徴値および二次元の特徴値（２Ｄ）を有する、特徴値（９４）のセットを算出する工程と、
（ｉ）前記特徴値（９４）のセットを少なくとも１つの分類器（９０）に提供する工程と、
（ｊ）前記細胞標本から前記少なくとも１つの対象となる物体を識別するために、前記特徴値（９４）のセットおよび前記少なくとも１つの分類器（９０）を用いる工程とから成る細胞標本内の対象となる細胞（１）を検出する方法。
【請求項２】
前記標本内の前記少なくとも１つの対象となる物体を分類するために用いられる前記特徴値（９４）のセットは、１Ｄおよび２Ｄの核密度の特徴値（ＮＤＦ）、細胞質密度の特徴値（ＣＤＦ）、面積、平均半径、光学密度（ＯＤ）の変動、ＯＤの歪み、ＯＤ範囲、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、点光源の密度、低いＤＮＡ領域、高いＤＮＡ領域、低いＤＮＡ量、高いＤＮＡ量、高い平均距離、中／高平均距離、相関、均質性、エントロピ、フラクタル寸法、ＤＮＡ指標、質感、斑点性、接続された構成要素、および空間密度周波数空間における種々の高調波から成るグループから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの分類器（９０）を用いる前記工程は、少なくとも１つの識別関数を有する分類器を用いる工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの識別関数は、１Ｄおよび２Ｄの核密度の特徴値（ＮＤＦ）、細胞質密度の特徴値（ＣＤＦ）、面積、平均半径、光学密度（ＯＤ）の変動、ＯＤの歪み、ＯＤ範囲、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、点光源の密度、低いＤＮＡ領域、高いＤＮＡ領域、低いＤＮＡ量、高いＤＮＡ量、高い平均距離、中／高平均距離、相関、均質性、エントロピ、フラクタル寸法、ＤＮＡ指標、質感、斑点性、接続された構成要素、および空間密度周波数空間における種々の高調波から成るグループから選択される識別のための特徴値のセットを使用する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞標本は、ヒト肺の検体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞標本は、ヒト子宮頚部の検体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞標本は、ヒト血液の検体を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞標本は、稀な細胞を含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標本にマーキングする工程は、化学量論的なＤＮＡ染色液、化学量論的なＲＮＡ染色液、比例的なＤＮＡ染色液、および比例的なＲＮＡ染色液から成るグループから選択された染色液を用いて染色する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標本にマーキングする工程は、Ｆｅｕｌｇｅｎ染色液、Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ染色液、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色液、Ｍｅｔｈｙｌ  Ｇｒｅｅｎ、およびチオニンから成るグループから選択された染色液を用いて染色する工程を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標本をマーキングする工程は、抗体マーカを用いて染色する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標本をマーキングする工程は、核酸シーケンス・マーカを用いて染色する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
癌を診断するために、前記少なくとも１つの対象とする物体を選択する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前浸潤癌細胞を含むために、前記少なくとも１つの対象とする物体を選択する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
浸潤癌細胞を含むために、前記少なくとも１つの対象とする物体を選択する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
患者の癌スクリーニングを行うために、前記少なくとも１つの対象とする物体を使用する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
患者が浸潤癌になるか否かを決定するために、前記少なくとも１つの対象とする物体を使用する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記前浸潤癌細胞は、上皮癌から採取される請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記上皮癌は、肺癌、咽喉癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、および胃腸管の癌からなるグループから選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記浸潤癌細胞は、上皮癌から採取される請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記上皮癌は、肺癌、咽喉癌、子宮頚癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、胃腸管の癌、リンパ腺癌、および骨肉腫からなるグループから選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記前浸潤癌細胞は、神経内分泌癌から採取される請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経内分泌癌は、肺癌および咽喉癌、子宮頚癌、乳癌、胃腸管の癌、リンパ腺癌および骨肉腫からなるグループから選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記浸潤癌細胞は、神経内分泌癌から採取される請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経内分泌癌は、肺癌、咽喉癌、子宮頚癌、乳癌、および胃腸管の癌、リンパ腺癌および骨肉腫からなるグループから選択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
多次元画像を生成するために、コンピュータ化された画像再構成方法を用いて少なくとも２つの投影画像を組み合わせる工程をさらに含んだ請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記コンピュータ化された画像再構成の方法は、扇状のビーム投影形状および円錐状のビーム投影形状から成るグループから選択される方法を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記多次元画像が次のように処理されるような、
（ａ）背景の照明の変動に関し、前記多次元画像を補正する工程と、
（ｂ）前記多次元画像を分析して、少なくとも１つの対象となる物体を検出する工程と、
（ｃ）対象となる各物体の境界になっている表面を算出する工程と、
（ｄ）対象となる各物体に対して、多次元の特徴値（９４）のセットを算出する工程と、
（ｅ）細胞標本内の対象となる細胞を識別し、かつ特徴付ける、少なくとも１つの分類器（９０）に、前記多次元の特徴値（９４）のセットを提供する工程とをさらに含んだ請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記標本内で対象とする細胞を分類するために用いられる、前記多次元の特徴値（９４）は、１Ｄの核密度の特徴値（ＮＤＦ）、２ＤのＮＤＦ、３ＤのＮＤＦおよび３Ｄ＋のＮＤＦ、１Ｄの細胞質密度の特徴値（ＣＤＦ）、２ＤのＣＤＦ、３ＤのＣＤＦおよび３Ｄ＋のＣＤＦ、面積、平均半径、容積、平均容積、光学密度（ＯＤ）の変動、ＯＤの歪み、ＯＤ範囲、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、点光源の密度、低いＤＮＡ容積、高いＤＮＡ容積、低いＤＮＡ量、高いＤＮＡ量、高い平均距離、中／高平均距離、相関、均質性、エントロピ、フラクタル寸法、ＤＮＡ指標、質感、斑点性、接続された構成要素、および空間密度周波数空間における種々の高調波から成るグループから選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記多次元の特徴値（９４）は、タイプ、成熟度、病態、定量的マーカの相対存在量および出現に関して、対象とする細胞を特徴付けるために、分類プログラムによって利用される１Ｄ、２Ｄ、３Ｄ、および３Ｄ＋の特徴を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記分類器は稀な細胞を含んだ対象とする細胞を検出かつ特徴付ける請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞の特徴付けに基づいて、前記細胞標本を診断する工程をさらに含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
細胞標本から前記少なくとも１つの対象とする物体を識別する方法であって、
（ａ）細胞標本を採取し、該細胞（１）を溶液（１７）で懸濁する工程と、
（ｂ）必要に応じて、前記細胞標本の前記細胞（１）を溶液（１７）中で固定する工程と、
（ｃ）前記標本の各細胞（１）内で、光学密度を発生させるために、前記細胞をマーキングする工程と、
（ｄ）少なくとも１つの点光源を用いて、前記標本に照明を当てる工程と、
（ｅ）デジタル・アレイ検出器（２３）を用いて、前記標本を介して少なくとも１つの投影画像を取得する工程と、
（ｆ）背景の照明の変動に対して、前記少なくとも１つの投影画像を補正する工程と、
（ｇ）前記少なくとも１つの投影画像を分析して、少なくとも１つの対象となる物体を検出する工程と、
（ｈ）前記少なくとも１つの対象とする物体に対する一次元（１Ｄ）の特徴値および二次元（２Ｄ）の特徴値を有する特徴値（９４）のセットを算出する工程であって、前記標本内で前記少なくとも１つの対象とする物体を分類するために使用される該特徴値（９４）のセットは、１Ｄの核密度の特徴値（ＮＤＦ）、２ＤのＮＤＦ、１Ｄの細胞質密度の特徴値（ＣＤＦ）、２ＤのＣＤＦ、面積、平均半径、光学密度（ＯＤ）の変動、ＯＤの歪み、ＯＤ範囲、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、点光源の密度、低いＤＮＡ領域、高いＤＮＡ領域、低いＤＮＡ量、高いＤＮＡ量、高い平均距離、中／高平均距離、相関、均質性、エントロピ、フラクタル寸法、ＤＮＡ指標、質感、斑点性、接続された構成要素、および空間密度周波数空間における種々の高調波から成るグループから選択されるような工程と、
（ｉ）前記特徴値（９４）のセットを少なくとも１つの分類器（９０）に提供する工程と、
（ｊ）前記細胞標本から前記少なくとも１つの対象となる物体を識別するために、前記特徴値（９４）のセットおよび前記少なくとも１つの分類器（９０）を用いる工程とから成る細胞標本から前記少なくとも１つの対象とする物体を識別する方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの投影画像は、射影を含んでいる請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に投影画像システムおよび細胞分類に関し、特には、異常で悪性の細胞を検出し、かつ核および疾病に関与する細胞質密度の特徴（ＮＤＦおよびＣＤＦ）の高度な定量的測定に基づいて、稀な細胞を検出するための、フロー・オプティカル断層撮影（ＦＯＴ）などの投影画像化を用いる高スループット・フローベースの自動システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００１年８月１０日に出願された、Ａｌａｎ  Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎの、同時係属出願である米国特許出願番号第０９／９２７，１５１号の一部継続出願であり、また、２００１年３月２８日に出願された、出願番号６０／２７９２４４のＡｌａｎ  Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎの同時継続仮出願に関連するものであり、共に「光学断層撮影を用いて、フロー・ストリーム内の小さな物体を画像化するための装置および方法」と題されている。
【０００３】
患者において癌を診断する最も一般的な方法は、疑わしい組織の標本を採取し、明らかに悪性の細胞の存在を顕微鏡下で検査することである。この工程は、疑わしい組織の解剖学的な位置が分かっている場合には比較的容易であるが、すぐに同定可能な癌病変または前癌病変が存在しない場合には容易ではない。例えば、痰標本から肺癌の存在を検出するには、１つまたは複数の比較的稀な癌細胞が標本に存在している必要がある。したがって、標本が知覚できるほどに、かつ正確に肺癌の状態を反映していない場合、肺癌患者を適切に診断することができない。
【０００４】
診断に用いる細胞および悪性腫瘍が関与している変化のみられる細胞を検出するための、顕微鏡ベースのシステムおよび方法の一例が、Ｐａｌｃｉｃらの米国特許第６，０２６，１７４号には開示されている。Ｐａｌｃｉｃらのシステムは、従来の顕微鏡を有する自動分類器、カメラ、画像デジタイザ、これらの構成要素を制御かつインタフェース接続するコンピュータ・システム、一次細胞分類用の一次分類器、および二次細胞分類用の二次分類器を備えている。本方法は自動分類器を使用して、診断に用いる細胞および悪性腫瘍が関与する変化がみられる細胞を自動的に検出する。しかし、診断結果の品質は、染色密度の正確な測定ができない従来の顕微鏡を用いることにより制限される。Ｐａｌｃｉｃｓらの方法は、分子プローブの使用に対処しない。
【０００５】
抗体プローブおよび核酸ハイブリダイゼーション・プローブなどの分子プローブの出現によって、新たな病気に関連する問題は、これらの分子プローブに標識を付け、生体細胞および生物組織内のそれらの位置および濃度を測定することによって対処することができる。これらプローブの位置を正確に突き止め、かつ正確に定量する必要性があるが、これと同時に、プローブの密度を二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）で顕微鏡的に測定するための改善された技術の付随的な必要性もある。スライド・ガラスに置いた細胞を利用する従来の光学顕微鏡は、焦点面の深さ、サンプリング角度、および細胞プレパラートが、典型的には画像面内で細胞を重なり合わせるという問題に制限があるために、２Ｄおよび３Ｄの測定値を概算することしかできない。光学顕微鏡の別の欠点は、対物レンズを通して観察するという固有の制限であり、対物レンズでは狭い焦点面内の領域だけが分析のための正確なデータを提供する。
【０００６】
一般に、フロー・サイトメトリ法は、流動体の流れに細胞を１個ずつ流すことによって、細胞が重なるという問題を解決することができる。残念ながら、フロー・サイトメトリ・システムは、従来の光学顕微鏡と同じ品質の細胞の画像を発生することができず、どのような場合であっても、画像は三次元ではない。背景として、当業者は、１９９５年発行のＳｈａｐｉｒｏ，ＨＭによるＷｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社発行の「フロー・サイトメトリの実践（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」第３版を対象とする。
【０００７】
コンピュータを使った断層撮影の分野では、１９９５年３月２８日、Ｊｏｈｎｓｏｎらに発行された、「三次元マイクロ・トモグラフィ分析システム（Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）」と題する米国特許第５，４０２，４６０号が、Ｘ線発生器および検体を透過するＸ線ビームの減衰量を測定するＸ線検出器を用いた検体の高解像度の三次元画像を生成する、微細断層撮影システムを開示している。各々異なるエネルギーのＸ線ビームを使用する、標本の各視野の２つの投影画像は、Ｊｏｈｎｓｏｎらの微細断層撮影システムを用いて作られる。標本の１つの視野の２つの投影画像が作られた後、検体押さえ上の標本が回転され、投影画像の別のセットが作成される。検体から成る材料の位相−画分を定量的に表示するために、検体の各視野の投影画像が分析される。検体の三次元画像を提供するために、異なる視野の投影画像が組み合わされる。米国特許第５，４０２，４６０号が参照によって本願明細書に組み入れられている。米国特許第５，４０２，４６０号によって教示されるＸ線技術はいくつかの用途にとって有用であるが、これはフロー・サイトメトリにとって有用な、生体細胞内の分子密度の三次元分布を測定できる光学的解像度を提供しない。
【０００８】
前述の制限およびそのようなシステムにみられる他の制限を克服するために、本発明の動機は、フロー・サイトメトリの１個ずつの細胞の表示を、複数の点光源の投影からの光学コンピュータ断層撮影と組み合わせて、複数の投影画像からの細胞内の密度情報を再構成する。再構成された３Ｄの密度情報によって、核密度の特徴（ＮＤＦ）および細胞質密度の特徴（ＣＤＦ）の正確な測定が可能となる。
【０００９】
本明細書で言及したＮＤＦおよびＣＤＦは、狭い焦点面の外側の焦点の合っていない構造による固有の好ましくない不鮮明なアーチファクトを持ったレンズおよび焦点面の使用を必要としない、投影画像システムに固有のものである。投影画像システムはレンズおよび焦点面を必要とせず、むしろすべての構造がすぐに鮮明になる射影を生み出すため、密度特性の測定は、従来の顕微鏡システムに比して、より定量的で正確になるであろう。したがって、「ＮＤＦ」および「ＣＤＦ」をいう用語は、射影および射影を用いた断層再構成からの密度特性の測定値を意味する。ＮＤＦおよびＣＤＦは、癌組織に関与する細胞に起こることが知られている微小な変化である。これらの変化は常態からの偏差を示し、疾病過程に関与する分子の変化を反映している。
【特許文献１】米国特許出願番号第０９／９２７，１５１号
【特許文献２】出願番号６０／２７９２４４
【特許文献３】米国特許第６，０２６，１７４号
【非特許文献１】Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭ、「フロー・サイトメトリの実践（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社、１９９５年
【特許文献４】米国特許第５，４０２，４６０号
【非特許文献２】（例えば、１９７２年発行の雑誌「理論生物学（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３６号」の１０５〜１１７頁、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「投影画像からの物体の三次元再構成のための反復的方法（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｂｊｅｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）
【非特許文献３】１９７４年発行の、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＮＳ−２１：７２〜７７頁の、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ＢＥの「反復的三次元再構成のためのより正確なアルゴリズム（Ｍｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ３  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）」
【非特許文献４】１９９０年発行のＳｃｉｅｎｃｅ  ２４８号（４９５８）、９９０〜９９３頁、Ｓｉｎｇｅｒ、ＪＲ，Ｇｒｕｎｂａｕｍ，ＦＡ，Ｋｏｈｎ，ＰとＺｕｂｅｌｌｉ，ＪＰの「放射を拡散する物体内部の画像再構成（Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｏｆ  Ｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ）」
【非特許文献５】２００１年発行のＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  １９号（１２）、１２２７〜１２３７頁、Ｍｕｅｌｌｅｒ，ＫとＹａｇｅ，Ｒの「２Ｄテクスチャ・マッピング・ハードウェアを用いた同時的代数的再構成法（ＳＡＲＴ）による高速３Ｄの円錐状ビーム再構成（Ｒａｐｉｄ  ３−Ｄ  Ｃｏｎｅ−ｂｅａｍ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＡＲＴ））を参照すること」
【非特許文献６】ＡＲＴ（１９７１年発行の雑誌、「理論生物学（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３２号」の２０５〜２１６頁、ＳＨ，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｒ，Ｇｏｒｄｏｎ，ＲとＲｏｗｅ，ＪＥの「ＡＲＴは、三次元電子顕微鏡のための代数的再構成法の防御であるという科学である（Ａｒｔ  ｉｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｂｅｉｎｇ  Ａ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  ｏｆ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」に考察されているような、代数的再構成法）
【非特許文献７】ＳＩＲＴ（例えば、同文献＃１４９３の、Ｇｉｌｂｅｒｔにより考察された、同時的反復的再構成法）
【非特許文献８】ＭＬ−ＥＭ（例えば、１９８９年発行の同誌１３８２号、Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３４号（１２）：１９４７〜１９５７頁で、Ｍａｎｇｌｏｓ，ＳＨ，Ｊａｓｚｃａｋ，ＲＪとＦｌｏｙｄ，ＣＥの「円錐状ビームによる単光子放出コンピュータ断層撮影のための最尤再構成：開発と初期テスト（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｅ  Ｂｅａｍ  ＳＰＥＣＴ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｔｅｓｔｓ）」により考察されたような、最尤推定期待値最大化法）
【非特許文献９】ＯＳＥＭ（例えば、１９９５年同誌４３８９号、Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０号（７）、１２２５〜１２４１頁で、Ｍａｎｇｌｏｓ，ＳＨ，Ｇａｇｎｅ，ＧＭ，Ｋｒｏｌ  Ａ，Ｔｈｏｍａｓ，ＦＤとＮａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ，Ｒの「円錐状ビームＣＴのためのサブセット化を用いた、伝達最尤再構成（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｓｕｂｓｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｅ  Ｂｅａｍ  ＣＴ）」によって考察されたような、サブセット化による期待値最大化法）
【非特許文献１０】２００１年、マグローヒル社発行の、編集責任者Ｂｌａｓｓ，Ｍによる「光学ハンドブック：繊維光学と非線形光学（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）」、第２版第４巻
【非特許文献１１】１９８８年、ニューヨークのＩＥＥＥプレス発行の、Ｋａｋ，ＡＣとＳｌａｎｅｙ，Ｍの「コンピュータ断層撮影の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ）」
【非特許文献１２】１９８０年、ニューヨークのアカデミックプレス社発行の、Ｈｅｒｍａｎ，Ｇの「投影からの画像再構成：コンピュータ断層撮影の基本（Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）」）
【非特許文献１３】１９９５年発行、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２２号（６９１〜７０１頁）の、Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＪｉａｎｇ，Ｈの「有限要素拡散方程式の近似化を用いた空間的に変動する光学特性の再構成（Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｆｉｎｉｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ）」
【非特許文献１４】１９９８年発行、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２５号（Ｉ）、９２〜１０１頁の、Ｈａｍｐｅｌ，ＵとＦｒｅｙｅｒ，Ｒの「放射対照状の境界を有する媒体における光吸断層撮影のための高速画像再構成（Ｆａｓｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉａｌｌｙ  Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ）」
【非特許文献１５】１９９８年発行、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２５号（２）、１８３〜１９３頁の、Ｊｉａｎｇ，Ｈ，Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＯｓｔｅｒｂｅｒｇ，ＵＬの「周波数ドメインの近赤外光の拡散画像化：マルチターゲットの組織様ファントムの初期評価（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ  Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｈｏｔｏ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ  Ｐｈａｎｔｏｍｓ）」
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、ＮＤＦおよびＣＤＦは、測定の方法が十分な精度および／またはスループットを出していないために、患者が癌であるか、または癌になるかを判定するためのスクリーニング法としてまだ広範には受け入れられていない。従来、ＮＤＦおよびＣＤＦは、癌病変または前癌病変に近い部位から入念に細胞標本を選択し、比較的高い倍率で顕微鏡下で細胞を観察することによって検出された。しかし、特に、典型的には病理学者は定量的測定をしないために、細胞内で起こるＮＤＦおよびＣＤＦの変化は非常に微小であり、従来の顕微鏡機器を用いて作業するヒトの病理学者によって確実に検出することができない可能性があると考えられている。例えば、ＮＤＦの変化は、細胞核の形のわずかな変化と結び付いた細胞核内のＤＮＡの分布および密度によって示されてよい。人間の観察者はそのような細胞の微小な変化を簡単に観察することができないため、どの細胞がＮＤＦの変化を呈しているかを判断するのは困難である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一実施形態では、本発明は細胞標本内の対象の細胞を検出する方法を提供するものであり、細胞標本を採取し、溶液内でその細胞を懸濁する工程と、必要に応じて、細胞標本の細胞を溶液内に固定する工程と、標本の各細胞内の原子核分子または他の構造に関連する光学密度を生成するために、細胞を染色しかつ／または細胞に標識を付ける工程と、「点」光源を用いて標本に照明を当て、デジタル・アレイ検出器を用いて、標本を介して１つまたは複数の投影画像（例えば、射影）を得る工程と、背景照明の変化に対して投影画像を補正する工程と、投影画像を分析して対象物を検出する工程と、各対象物に関する一次元（１Ｄ）および二次元（２Ｄ）の特徴値のセットを算出する工程と、細胞標本内の対象の細胞を識別し、かつ特徴付ける、少なくとも１つの分類器（９０）に、特徴値のセットを提供する工程から構成される。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は細胞標本内のＮＤＦおよびＣＤＦを自動的に検出するシステムを提供する。この好ましいシステムは、コンピュータ・システムによって制御され、かつコンピュータ・システムとインタフェース接続されたフロー・オプティカル断層撮影（ＦＯＴ）装置を備えている。ＦＯＴによって捉えられた投影画像は、一次元および二次元のＮＤＦおよびＣＤＦの存在を検出するために、画像処理ボードに格納され、コンピュータ・システムによって操作される。それらに関連するＮＤＦおよびＣＤＦを有する三次元（３Ｄ）およびより高い次元（３Ｄ＋）画像を生成するために、複数の投影画像がコンピュータによって再構成され得る。
【００１３】
ＮＤＦおよびＣＤＦを測定するために、細胞標本を採取し、懸濁液で染色し、次いでＦＯＴによって画像化する。この染色工程は、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡに関連するタンパク質、あるいは細胞質を含む細胞内の他の対象の分子に対して化学量論的および／または比例的である。次に、コンピュータ・システムは投影画像を直接分析し、かつ／またはまた分析される３Ｄ再構成を計算する。この投影画像は、画像取得システムの不均一な照明およびその他の欠陥について補正される。すべての画像を補正した後、対象物の端部、表面、容積、および密度が算出される。すなわち、どの画素またはボクセルが対象とする物体または構造に属しているか、およびどの画素またはボクセルが背景に属しているかを決定する境界が算出される。
【００１４】
次に、コンピュータ・システムは各対象または構造について、１Ｄ、２Ｄ、３Ｄおよび３Ｄ＋の特徴値のセットを算出する。いくつかの特徴値を計算する場合、１つまたは複数の画素（あるいはボクセル）によって端部（あるいは表面）を膨張させるか、または破壊するかのいずれかによって、最も高い勾配値が補正される。この工程は、各特徴が物体のクラス間でより際立った力を得るように、したがって物体固有であるように行われる。続いて、これら特徴値は、特徴値を用いて物体がアーチファクトであるか、対象となる細胞核または細胞構造であるかどうかを決定する分類器によって分析される。この物体が対象とする細胞核または細胞構造であると思われる場合、物体が疾病であることを示すＮＤＦおよびＣＤＦを呈しているか否かを決定するために、特徴値は分類器によってさらに分析される。重要なＮＤＦおよびＣＤＦの疾病に関連する変化を有していると思われる、標本内の物体の数に基づいて、細胞標本を採取した患者が健康であるか、または悪性腫瘍を持っているかについて、統計学的決定が行われ得る。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、細胞標本内の上皮細胞を検出する方法および上皮細胞の間で疾病と相関するＮＤＦおよびＣＤＦを持つ細胞を検出する方法を提供する。別の実施形態では、患者が癌になるか否かを予測する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
生体細胞に関連する特定の例に関して本発明をここに解説するが、これらの例は本発明の原理を例証するためのものであり、本発明はそのように限定されるものでないことが理解されよう。一例では、微小な容積内の点密度および発光強度の三次元分布を構成することによって、微小な容積内の任意の位置で密度および蛍光性を測定し、対象となる構造、分子または分子プローブの位置を決定することが可能となる。標識を付けた分子プローブを用いることによって、微小な物体内の特定の構造に付くプローブの量を測定することができる。説明のために、生体細胞などの物体に少なくとも１つの標識分子プローブで標識を付けてよく、このプローブの測定された量および位置は、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頚癌および卵巣癌などの種々の癌を含むがこれに限定されない、細胞の病態に関する重要な情報を生み出してよい。
【００１７】
フロー・サイトメトリのために調整かつ染色した、または特定の疾病診断用の標識が付けられた分子プローブを付けた生体細胞は、細胞の流れのベクトルに対してほぼ垂直な投影光線路から投影画像の収集を行い、２Ｄおよび３Ｄ密度情報の再構成を可能にする装置を流される。軸に沿って流れる細胞の速度を制御することによって、再構成の垂直な２Ｄ平面が、細胞全体の３Ｄ画像を作成するために細胞の軸に沿って正確に位置決め（または重ね合わせ）され得るか、あるいは細胞の３Ｄ画像は、２Ｄの光学的通過または光学的発光の投影画像から直接計算されてよい。
【００１８】
フロー・サイトメトリは、以下の理由から画像再構成に非常に適している。
・細胞の重なり合いおよび不鮮明さが最小限になるように、細胞は導管を一列で流れる。
・導管を流れる細胞の速度は直接検出することができ、一定である。
・細胞は導管の中心軸を辿り、構造的に放射対称性になる傾向がある。
・細胞の固定および懸濁の調整に応じて、細胞は柔軟性を保持することができ、導管内の速度勾配に反応してｚ軸に沿って細長い形をとる。
本発明は上記の特徴を利用して、点光源投影画像化および断層画像再構成のためのシステムを提供することにある。
【００１９】
ここで図１を参照すると、本発明の一実施形態によって熟考されるようにフロー・サイトメトリ・システムの例図が概略的に示されている。本システムは、ｘ、ｙおよびｚ軸方向に座標を有する座標系１１の方向に向けられている。動作中、細胞１が知られている注入装置４を用いて注入管３に注入される。導管は注入の端部５でよりも幅が広く、圧力キャップ６を備えている。導管２内で層流を作るために、シース液７が管８にて注入される。従来のフロー・サイトメトリに特徴的なのは、調整され溶液で懸濁された細胞１は、点線９により示されるように、細胞は流れの軸によって細長くなり、かつ導管２の中心軸のほぼ下方に動くように、導管２を強制的に流され得るということである。有利には、細胞は、円筒形の導管の中心軸に沿って一列で、軸対称および等速１０で流されてよい。
【００２０】
ここで図２を参照すると、本発明の一実施形態によって熟考されるように、１個の細胞のためのフロー工程の例図が概略的に示されている。細胞１は、速度ベクトル１０で示した等速（Ｖ）で導管２を移動する。細胞１は細胞質１２の壁および細胞核１３の壁を含んでいる。導管２を流れる過程で、細胞１は、説明のために、それぞれ第１、第２および第３再構成面である１４ａ、１４ｂ、１４ｃについて表した複数の再構成面を通過する。細胞質の壁を通る第１の平面の切片１５ａは、再構成面１４ａ内にある。同様に、細胞質および細胞核の壁を通る第２の平面の切片１５ｂは、第２の再構成面１４ｂ内にあり、第３の平面の切片１５ｃは、第３の再構成面１４ｃ内にある。本発明の重要な特徴は、波長が選択可能である多数の点光源が、導管の円周に配設され、導管と同心円状になっていることである。点光源は、光スペクトルの選択可能な部分と反応し易い、対向する光センサ・アレイと関連して動作するので、細胞を通過する光の投影を取得することが可能となる。取得された投影画像は、細胞内の密度および／または発光強度の分布の立体的な地図または画像を提供するために、直接分析されてよいか、あるいは断層画像再構成アルゴリズムを用いて処理されてよい。実際には、システムに表示されている物体の必要な画像解像度に応じて、再構成平面の数は数面から数百面以上に変化してよいことが理解されよう。再構成された平行な平面スライス画像のグループは、細胞内の密度および発光強度の三次元（３Ｄ）画像を生成するために、ソフトウェアを用いて組み合わされてよいか、あるいは重ね合わされてよい。さらに、線形（１Ｄ）の光センサ・アレイの代わりに平面（２Ｄ）を、扇状の照射光パターンの代わりに円錐状のパターンを用いることによって、流れる細胞の連続する複数の平面スライスの投影画像が同時に取得されてよい。結果として、細胞の容積内の密度および発光強度の分布の三次元（３Ｄ）画像が、円錐状のビーム再構成アルゴリズムを用いて、２つの二次元（２Ｄ）投影画像から直接算出され得る。択一的には、無限の被写界深度を持つ２Ｄの点光源の投影画像が、直接分析され得る。
【００２１】
生体細胞の場合、再構成面間の距離（ｄ）は、数ミクロン以下であってよい。細胞１内のポイントは、時間間隔で各再構成面と一致するであろう。ここで時間間隔（ｔ）は以下の関係に従って説明されてよい。
ｔ＝ｄ＋Ｖ      （式１）
【００２２】
ここで図３Ａおよび図３Ｂを共に参照すると、本発明の一実施形態によって熟考されるように再構成の断面１６の一例が概略的に示されている。その断面を通る光投影からの細胞内の点密度の再構成は、流れる細胞の軸対称および中心であることから利益を受ける。さらに、投影によってサンプリングされている空間は、以下の３つの離れた区画を有するように作成することができる。
１．細胞１７の外側の流動体（すなわち、シース液および細胞懸濁培地）
２．細胞質１８、および
３．細胞核１９
【００２３】
上記３つの区画の光密度または分子プローブの分布を定量的に知ることは、細胞生物学および疾病診断における多数の重要な問題に対処するのに十分である。さらに、ある分子プローブが２つの境界面と選択的に結合している場合、細胞質または細胞壁１２および核壁１３を含む２つの境界面を計算することは有用であろう。別の場合には、これらの壁を異なる３つの区画の移行面として特徴付けることが十分であろう。
【００２４】
再構成された細胞のスライスを組み合わせることによって、あるいはらせん状の容積測定方法により再構成することによって、３Ｄの形態学および容積情報が生成され得るが、絶対容積（相対容積の反対）は、細胞の位置の正確な情報に左右される。細胞の位置は流速の関数である。しかし、いくつかの場合、密度または分子プローブの相対濃度は、診断上の問題に対処するには十分である。つまり、背景の流動体内の非結合プローブに対して、細胞核に関連する細胞質の中にどれだけプローブがあるかということである。あるいは、プローブは主に、細胞膜または隔膜表面にあるかということである。
【００２５】
導管を通る細胞は構造的に放射対称になってよいが、少なくとも１つの結合分子プローブの核または細胞質の区画内の分布は、そのような軸対称でなくてよい。したがって、十分な空間分解能を提供して結合した蛍光分子プローブの容積を、上記の３つの区画分析のために提供するのに必要な目盛りよりも細かい目盛り上に置くことは、画像システムおよび（特には、放出）再構成アルゴリズムには好ましい。本システムが、２つの細胞内区画において非対称に分布したプローブの濃度に関する定量的情報を提供することは、さらに好ましい。特定の細胞小器官の区画、構造または細胞質あるいは細胞核の細胞小器官とのプローブの関係は、サブミクロンな空間分解能によって促進される。
【００２６】
より特定的な例は、リスクのある患者において早期に癌を検出することに関する。このような例では、ある遺伝子は、細胞が癌化に推移している場合、その機能を過剰に発現するか、または過小に発現することがある。背景の懸濁液の非結合プローブのために正常化しながら、細胞核に対して細胞質内の遺伝子産物（多くの場合、タンパク質）の関連する過剰発現または過小発現を測定することは、診断上重要である。遺伝子産物がタンパク質である場合、遺伝子産物であるタンパク質を局限化しかつ／または定量することによって、細胞の病態を評価するために標識抗体プローブを用いてよい。故に、３つの区画を分析することは、これを病態の判定とするのに十分であり得る。
【００２７】
ここで図４を参照すると、本発明の一実施形態によって熟考されるように、流れる細胞１を含む流管２を取り囲んでいる、再構成円筒の一例が概略的に示されている。再構成円筒２０は、例えば、所定のらせん勾配、らせん角θで配置された、点光源２１のらせん２４を含む。点光源２１の各々は、光子２２のビームを生成するが、ここで光子２２のビームは典型的には、円錐状または扇状である。図４の例に示した点光源の配置はらせん状であるが、部分的には、電子機器の速度、細胞の速度、およびセンサ（検出器）にて重なり合わない投影の信号を達成する幾何学的形状に応じて、点光源のアレイは様々な幾何学的形状をとってよい。点光源からの光を受け取るために、センシング要素２３が配設されている。
【００２８】
管の円周に配置された対向する検出器２３と共に、固定された点光源２１は、細胞が点光源を越えて流れるときに、細胞１全体を通る複数の投影角をサンプリングすることができる。光源の放出または読み出しあるいはその両方、減衰して伝達されるおよび／または散乱されるおよび／または放出される光の時間を調整することによって、それぞれ検出された信号は、流れる細胞のｚ軸方向の軸に沿って特定の知られている位置と一致するであろう。この方法で、同期的方法で放出させられるか、または検出される光源に垂直な、知られている軸に沿って知られている速度で流れる細胞１は、ｘ−ｙ平面の２Ｄスライスを形成するために再構成することのできる細胞を通る投影によって、光学的に切り取られ得る。連続するスライスを重ね合わせるか、または数学的に組み合わせることによって、細胞の３Ｄ画像が現れるであろう。細胞の３Ｄ画像を作成するために、例えば、らせん状で再構成できるデータを生成するために、細胞の動きを流軸周囲の光源（または複数の光源）の位置決めと組み合わせることも可能である。扇状のビーム再構成アルゴリズムを用いて、線形（１Ｄ）の投影画像から再構成された連続的な平面画像を重ね合わせること、あるいは直接、平面（２Ｄ）投影画像から円錐状のビーム再構成アルゴリズムを用いることのいずれかによって、再構成が可能になる。この細胞の３Ｄ画像は、細胞小器官の構造、および診断に用いられる情報を提供する標識分子プローブの位置および量に関する定量的な測定値を生み出す。
【００２９】
前述のように、断面または容積内の２Ｄまたは３Ｄの密度構造を再構成するためには、細胞断面を通る２つ以上の投影が重要である。従来のｓｌｉｃｅ−ｂｙ−ｓｌｉｃｅ医用Ｘ線コンピュータ断層撮影では、複数の投影はヒト患者を動かないように保持することによって行われるが、患者から複数の投影角を生成するために、Ｘ線源および対向する検出器は円周に沿って移動する。類推すると、本発明のフロー・オプティカル断層撮影システムは、細胞が点光源を越えて流れるときに、細胞からの複数の投影画像を生成するために、導管の円周に沿って異なる角度で位置決めされた複数の点光源を越えて、細胞を所定の速度（Ｖ）で移動させる。これら点光源は、細胞を通過し、点光源に対向するセンサの列によって検出される光子を放出する。細胞が点光源の列を通過するときに、細胞内の各地点が多数の角度からサンプリングされるように、点光源は、導管の円周上で、らせん２４に沿って、あるいは他の適切な幾何学的形状パターンで配置され得る。好ましいサンプリング形状としては、これらの点光源は円周の少なくとも１８０°をカバーしてよい。角度の範囲未満（すなわち、サンプリング角度より下の角度）では、いくつかの場合、実施可能であるが、付加的に放射状にカバーすることで、精度および計算された再構成の信号対雑音比は改善するであろう。幾何学的形状に応じて、円錐状ビームまたは扇状ビームの画像再構成のために従来の分析アルゴリズム、反復アルゴリズム、あるいは統計アルゴリズムを付加的に適用することが有利であってよい（例えば、１９７２年発行の雑誌「理論生物学（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３６号」の１０５〜１１７頁、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「投影画像からの物体の三次元再構成のための反復的方法（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｂｊｅｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）、１９７４年発行の、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＮＳ−２１：７２〜７７頁の、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ＢＥの「反復的三次元再構成のためのより正確なアルゴリズム（Ｍｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｆｏｒ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ３  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）」、１９９０年発行のＳｃｉｅｎｃｅ  ２４８号（４９５８）、９９０〜９９３頁、Ｓｉｎｇｅｒ、ＪＲ，Ｇｒｕｎｂａｕｍ，ＦＡ，Ｋｏｈｎ，ＰとＺｕｂｅｌｌｉ，ＪＰの「放射を拡散する物体内部の画像再構成（Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｉｏｒ  ｏｆ  Ｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ）」、２００１年発行のＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  １９号（１２）、１２２７〜１２３７頁、Ｍｕｅｌｌｅｒ，ＫとＹａｇｅ，Ｒの「２Ｄテクスチャ・マッピング・ハードウェアを用いた同時的代数的再構成法（ＳＡＲＴ）による高速３Ｄの円錐状ビーム再構成（Ｒａｐｉｄ  ３−Ｄ  Ｃｏｎｅ−ｂｅａｍ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｇｅ���ｒａｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＡＲＴ）」を参照すること）。関連する方法は、ＡＲＴ（１９７１年発行の雑誌、「理論生物学（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３２号」の２０５〜２１６頁、ＳＨ，Ｂｅｎｄｅｒ，Ｒ，Ｇｏｒｄｏｎ，ＲとＲｏｗｅ，ＪＥの「ＡＲＴは、三次元電子顕微鏡のための代数的再構成法の防御であるという科学である（Ａｒｔ  ｉｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｂｅｉｎｇ  Ａ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  ｏｆ  Ａｌｇｅｂｒａｉｃ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」に考察されているような、代数的再構成法）、ＳＩＲＴ（例えば、同文献＃１４９３の、Ｇｉｌｂｅｒｔにより考察された、同時的反復的再構成法）、ＭＬ−ＥＭ（例えば、１９８９年発行の同誌１３８２号、Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３４号（１２）：１９４７〜１９５７頁で、Ｍａｎｇｌｏｓ，ＳＨ，Ｊａｓｚｃａｋ，ＲＪとＦｌｏｙｄ，ＣＥの「円錐状ビームによる単光子放出コンピュータ断層撮影のための最尤再構成：開発と初期テスト（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｅ  Ｂｅａｍ  ＳＰＥＣＴ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｔｅｓｔｓ）」により考察されたような、最尤推定期待値最大化法）、およびＯＳＥＭ（例えば、１９９５年同誌４３８９号、Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０号（７）、１２２５〜１２４１頁で、Ｍａｎｇｌｏｓ，ＳＨ，Ｇａｇｎｅ，ＧＭ，Ｋｒｏｌ  Ａ，Ｔｈｏｍａｓ，ＦＤとＮａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ，Ｒの「円錐状ビームＣＴのためのサブセット化を用いた、伝達最尤再構成（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｄｅｒｅｄ  Ｓｕｂｓｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｅ  Ｂｅａｍ  ＣＴ）」によって考察されたような、サブセット化による期待値最大化法）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
方法
フロー・サイトメータ
図５を参照すると、本発明の一実施形態として熟考されるように、フロー・オプティカル断層撮影システム（ＦＯＴ）の一例が概略的に示されている。このフロー・オプティカル断層撮影システムは、フロー・サイトメータを備えており、再構成円筒２０が導管２の周囲に設けられている。光子２５の源および光子センサ２６は、波高分析器２７と共に働いてトリガ装置として動作する。波高分析器２７は、細胞の開始に対して第１のトリガ地点２８を、細胞の終わりに対して第２のトリガ地点２９を提供するために、知られている原理に従って動作する。波高分析器２７は、各細胞の開始および終わりに対応するトリガ信号３０を出力するが、このトリガ信号は再構成円筒２０によって受け取られる。
【００３１】
コンピュータ４０は信号ライン４１〜４３によって、データに送信するように、制御信号およびタイミング信号と点光源２１、センシング要素２３、および波高分析器２７に結合されている。このコンピュータは、知られているコンピュータまたは複数のコンピュータ、および画像取得および画像再構成処理に適したアレイ・プロセッサを備えてよい。
【００３２】
市販のフロー・サイトメータは、基本的な３種類のフロー構成を備えている。すなわち、円筒形の流管、長方形の流管、およびエア・システム内のフローである（１９９５年発行のＳｈａｐｉｒｏ，ＨＭによるＷｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ社発行の「フロー・サイトメトリの実践（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」第３版を参照）。フロー・ハードウェア（図１を参照）による何らかの半径方向依存性を最小限にするために、再構成アルゴリズムのための最適な円筒形状を保持することが重要であるので、好適な構成は円筒形の流管である。さらには、円筒形の流管は、導管の断面に対して均一の薄壁を有してよい。
【００３３】
付加的には、データ収集を開始し、次に細胞が最適に入って、続い再構成円筒から現れるときにデータ収集を終了するためのタイミング信号を提供するために、トリガ装置は再構成モジュールの上方に位置してよい。有利には、このタイミング装置は、レーザ・ダイオード、ＣＣＤ、ＰＭＴ、光検出器の組合せ、固体光検出器、およびこれら要素を組み合せたものを含んでいる。このトリガ装置は、流れる細胞の存在を感知する閾値が設定されており、これによって、知られている細胞の速度と共に、下方の再構成円筒が対象となる特定の細胞のデータ収集を開始してもよいときに、計算するのに用いることのできるトリガ信号を生成する。さらに、再構成円筒への細胞の流入および再構成円筒からの細胞の流出に対応する、第１および第２のトリガ地点間の時間間隔は、付加的な投影データの各々が、点光源２１を発光し、かつセンサ・アレイ２３を読み出すことによって取得されてよい間に、等しいあるいは等しくない増分に分割されてよい。
【００３４】
流速は正確に制御かつ測定される必要がある。この能力は、１ｍ／秒〜１０ｍ／秒の範囲にある速度を使用する市販のハイエンドのシステムに提供されている。最もよい細胞の速度は、次に考察されるように、データ収集および信号対雑音比の考察の速度によって決定されるであろう。
【００３５】
再構成モジュール
ここで図６を参照すると、本発明の一実施形態によって熟考されるように、再構成円筒２０内に扇状ビームの投射光線の一例が概略的に示されている。再構成円筒の目的は、小さな円周に沿って円筒形の導管に向けて、複数の固定された点光源２１ａ〜２１ｃから光を投射する手段を提供することである。点光源から放出された光子は、扇状または円錐状などの知られている投影形状であり、センシング要素２３ａ、２３ｂまたは２３ｃの列によって検出されことになっており、場合によっては対応する点光源に対向するより大きな円周に沿って設置されるべき導管を通過する。扇状のビーム透過照明に適した曲線状の線形（１Ｄ）センサ・アレイを説明のために示しているが、円錐状のビーム照明に適した直線状の線形（１Ｄ）センサ・アレイまたは平面（２Ｄ）センサ・アレイが同様に採用されてよいことが理解されるべきである。この方法で、投影光線のセットが生成され得るが、投影光線は点光源と個々のセンシング要素とを接続する直線として示すことができる。光線３１などの特定の投影光線に沿って点光源を去る光子の数と、特定のセンシング要素にて受け取られる光子の数との間の差は、細胞および投影光線路に沿った流管の他の内容との相互作用によって失われる、あるいは減衰される光子の数と関連している。
【００３６】
しかし、問題は光の散乱、光子のエネルギー・シフト、不完全な形状および不充分な照準から発生することがあり、複数の点光源が同時に付勢されている場合は、異なる点光源からの光子は特定のセンシング要素に到達することがある。例えば、点光源のパターンのための形状、および本願明細書に記載したようなそれらの対向する検出器を思慮深く選択することによって、かつ複数の点光源およびセンサ・アレイの読み出し起動を適切に時間調整しかつ多重化することによって、再構成円筒を入念に構成すれば、これらの問題による光子の汚染は、最小限に抑えられるが、除去されるわけではない。
【００３７】
光子の汚染は、例えば、細胞が存在していない状態でシステムを較正することによって解決することができる。すなわち、各点光源は順番に照射されてよく、各センサへのその影響が測定され得、これによってシステムを正常化するために用いられるオフセット・データが提供される。付加的な較正工程は、例えば、光学特性が知られている、ラテックス高分子のビーズまたは他の微小な球体あるいは偏球を画像化する工程を必要としてよく、また細胞画像化のための対象となる密度範囲に及んでよい。蛍光プローブから放射された光子は、以下に示すように検出器にあるスペクトル帯域フィルタを用いて、点光源から発射される光子と識別されてよい。
【００３８】
光源
各光源は同じ一般的な特性を有してよく、好適には以下の通りである。
・光源は小さな円形の点光源に近いものであってよい。
・光源は、知られているスペクトル容量を用いて明るいものであってよい。
・光源から放出される光子は、円錐ビームまたは扇状ビームなどの知られている形状であってよい。
各光源は１つの投影角についてのデータを作成する。軸が流管の中心軸であるらせんに沿って配置された複数の光源は、細胞がモジュールを流れるときに、それぞれ連続する平面（または再構成断面）を通る複数の投影角からデータを作成する。センサ形状に応じて、センサにおいて投影が重なり合わないように、いくつかの点光源が同じ円周上に共線形的に配置されてよい。小さい角度範囲が、いくつかの場合には堪えることができるが、１８０°のらせんに沿って等距離で光源を設置することによって、良いサンプリング形状を得ることができ、信号対雑音比を改善するために、３６０°を使用してよい。所望の点光源の数は、各平面再構成（ｘ−ｙ平面）または容積再構成内の必要な解像度の関数である。らせん状の構成が照明のために用いられるが、種々の幾何学的パターンが点光源構成に使用されてよいことが理解されるべきである。さらに、点光源の波長は、種々のダイオードまたは他のレーザを、あるいは白色のまたは他の広帯域の源、例えば、水銀灯またはキセノン・アーク灯である帯域通過フィルタいずれかを用いることによって選択可能である。
【００３９】
ここで図７を参照すると、本発明の一実施形態によって熟考されるように、図６に示したような再構成円筒の上面図が概略的に示されている。第１の点光源２１ａおよびセンサ・アレイ２３ａが示されており、二次元で再構成３２の円周を構成し、一時的に交互に取得されても、すべての投影が重なり合い、すべての細胞がそこに含まれた点光源の軌跡の投影内のページに対して垂直に流れる細胞核１９を有する細胞を有している。第２の点光源２１ｂおよび第２のセンサ・アレイ２３ｂが、らせんの周囲に約３０°で設けられている。第３の点光源２１ｃおよび第３のセンサ・アレイ２３ｃが、らせんの周囲に約９０°で設けられている。
【００４０】
データの収集は、細胞の「厚い」平面の軸断面内の細胞の速度と共時的にゲートされる。所望の平面の厚さは、ｚ軸方向の必要な解像度の関数である。典型的には、軸方向（ｚ軸）の解像度は、平面の横断軸方向の解像度よりも小さい。また、再構成の最適な円周は、点光源が頂点にあり、かつセンシング・アレイの幅がそれらの基部にある投影の扇の重なり合う交点によって定められてよい。再構成円筒の形状は、流れる細胞の断面が再構成の円周に完全に含まれる形をとることが好ましい。
【００４１】
最適な点光源を作成するために採用することができる、いくつかの選択肢がある。
・レーザまたは他の高強度の光子源の前のピンホール。
・断面が小さな光ファイバ。
・光子源の前の短焦点レンズ。
・リン光面体上に光点を照射する電子ビーム（ＣＲＴの形態）。
・上記を種々組み合わせたもの。
【００４２】
幾何学的形状は、点光源が対象物（細胞）に近付くほど、点光源により近接する物体によって範囲が定められるより広い幾何学的角度のために、倍率はより高くなるようになっている。反対に、本システムの設計の前に必要な解像度が知られている場合、幾何学的形状はその特定の解像度に対して最適化され得る。背景として、当業者は、２００１年、マグローヒル社発行の、編集責任者Ｂｌａｓｓ，Ｍによる「光学ハンドブック：繊維光学と非線形光学（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）」、第２版第４巻を対象とする。
【００４３】
ここで図８を参照すると、図８は、本発明の一実施形態によって熟考されるように、細胞再構成時に使用される直線状の線形アレイ２３が概略的に示されている。例えば、細胞の断面１２および細胞核１９が直径３０ミクロンの再構成の円周内に含まれ、所望の解像度が０．５ミクロンであると仮定した場合、ナイキスト・サンプリング（すなわち、２倍のオーバー・サンプリング）は、点光源２１の各々に対して、少なくとも１２０個のセンシング要素３３が必要になると決定する。頂点にある点光源２１および基部にある線形アレイ長３４は、本例の直径３０ミクロンの細胞が点光源２１にできるだけ近く三角形３５に収まるように、三角形３５を形成する。この例では、（例えば、ＣＣＤ）アレイの各要素は幅２０ミクロン、アレイ長が２４００ミクロンの場合、細胞の中心は、点光源と線形アレイとの間の距離が８ｍｍで、倍率８０倍を提供するときは、点光源から約１００ミクロン（導管の直径の半分）に位置してよい。
【００４４】
第２の例として、直径３０ミクロンの円形の再構成および画素サイズが４ミクロンである相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センシング・アレイを考えてみる。この例では、アレイは幅４８０ミクロンに対して１２０画素を含んでよく、点光源と細胞との間の距離が１００ミクロンで、倍率を１６倍にするときには、点光源から１．６ｍｍに位置決めされてよい。
【００４５】
センシング要素
各点光源は、再構成の円を通過する光子線を受け取るために、ＣＣＤなどの対応するセンシング要素のアレイを、点光源の反対側でいくつかの直線状または曲線状構成で有していなければならない。典型的には、線形アレイは、そのセンシング要素のアレイの中心は、点光源と流れの中心軸との間の線上にあってよく、またその流れの軸に対して垂直に並んでいてよい。２Ｄアレイ内の要素の各ラインのサブセットのみが、再構成の入力のために読み出される２Ｄアレイを使用することが可能である。ある２Ｄアレイでは、点光源のらせん構成に沿った異なる点光源の各々と適切に一直線になるように、要素の連続するサブセットの各々は、適切な数の要素によって交互に置かれてよい。
【００４６】
０．５ミクロンの解像度を得るために、扇１つ当たり１２０個のセンシング要素を有する円周が３０ミクロンの再構成の例を用いたｓｌｉｃｅ−ｂｙ−ｓｌｉｃｅの扇状ビーム再構成の場合、２０ミクロンの２０００×２０００個の要素を有する２Ｄアレイは、放射角１°の増分当たり１３６個の点光源を感知するのに有効であり、ここで、連続するビュー間の平均的なオフセット量は３００ミクロンであり、すなわち１５個のセンシング要素に等しい。（アレイの中心では、オフセット量は１４０ミクロンあるいは７個の要素であってよく、他方、アレイの端部では、ビュー間の放射角１°のスイープは、相当より大きなオフセット量を必要としてよい。）１つのスライスに対する投影データを提供するために、センサ・アレイの１５列のグループが平均化された場合、細胞画像内のｚ軸方向の分解能は、３．７５ミクロンであってよいが、各投影に対して２列が平均化された場合、物体空間における軸分解能は、軸方向の解像度に等しい０．５ミクロンであってよい。
【００４７】
本発明の好適な実施形態では、２Ｄアレイは、再構成円筒と同心円であってよい円筒形の円周に沿って曲線になっているので、光路長はすべて等しくなる。再構成の円周が３０ミクロンの場合、点光源のらせん状の軌跡と対向するために、必要な要素のみを持った曲線状の２Ｄアレイは、１２０個のらせん状の帯の要素の幅に、上記例に対して高さ（長さ）が一部の複数の１３６個の要素をかけたものであってよい。
【００４８】
上記の説明のために平面のあるいは「厚い」扇状の照明を記載してきたが、円錐状ビームのアルゴリズムを用いた３Ｄ再構成を提供する、真に非平行な円錐状ビームの照明が、２Ｄ平面の検出器と共に採用されてよいことが理解されるべきである。例えば、細胞の病態または転移状態に関する情報を取得するために、２Ｄ投影画像が直接分析されてよい。直接的に、円錐状のビームの容積を再構成するために、複数の点光源からの照射は、点光源および検出器の幾何学的構成を考えた場合、異なる点光源からの照射の円錐が、センサ・アレイ上で重なり合わないような方法で多重化される。
【００４９】
さらに、細胞が速度１ｍ／秒（または１，０００，０００ミクロン／秒）で流れ、２Ｄアレイ内の各要素が２０ミクロンの幅である場合、２０マイクロ秒毎に読み出されるラインは、細胞の０．２５ミクロンのスライス内のデータを迅速に取り込んでよい。３．７５ミクロンのスライスに対するデータを提供するためにセンサの１５列が平均化される場合、読み出しは３００マイクロ秒毎に起こるであろう。再構成画像の品質の著しい改善は、より大きな２Ｄアレイを用いて達成される。
【００５０】
送信または放出された多数の波長域のマルチスペクトル画像に特に適した本発明の一実施形態は、有利には、直列で配置された２つ以上の再構成モジュールを備えてよい。このような複数の再構成円筒は、導管の断面に介在することにより分離されてよく、各モジュールは導管を流れる物体の完全に再構成された画像を生成するのに適した投影データを提供する。いくつかの再構成モジュールの各々に対する点光源および／またはセンサ・アレイは、特定のスペクトル帯に対して最適化されてよい。上記に続けて記載したように、例えば、第１の再構成モジュールは、物体の光学密度、吸収または散乱係数のマップを再構成するように設定された完全な投影データを提供するために、強力な白色灯の照明およびろ波されない検出を採用してよく、他方、第２の再構成モジュールは、放出再構成アルゴリズムを用いて、標識タンパク質の分布濃度のマッピングを行うのに有効な、第２の完全な投影データのセットを提供するための、５２０ｎｍの放出に反応するろ波されたセンサ・アレイと共に、免疫蛍光検査のためのタンパク質を標識する蛍光プローブを励起するために、アルゴン・イオン・レーザ（４８８ｎｍ）などの、約４９５ｎｍに集中する狭いスペクトル帯の照明を採用してよい。しかし第３の再構成モジュールは、倍数性の試験のために赤色（６１７ｎｍ）の放出を最適に検出するように、化学量論的にＤＮＡに結合したヨウ化プロピジウムおよびろ波されたセンサ・アレイを励起するために、約５３５ｎｍおよび／または３４２ｎｍに集中する狭い帯域の照明を用いてよい。上記の例は説明を目的としたものであり、一般にこの方法は、照明およびセンシングのための任意の波長の組合せに適用されることが理解されよう。
【００５１】
画像再構成
フィルタ処理背投影方法として知られている最も一般的で簡単に実施される再構成アルゴリズムは、円錐状のビーム形状または扇状のビーム形状を用いるコンピュータＸ線断層撮影（ＣＴ）における同様のパラダイムから導かれる。（例えば、次の参照文献を参照すること。１９８８年、ニューヨークのＩＥＥＥプレス発行の、Ｋａｋ，ＡＣとＳｌａｎｅｙ，Ｍの「コンピュータ断層撮影の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ）」および１９８０年、ニューヨークのアカデミックプレス社発行の、Ｈｅｒｍａｎ，Ｇの「投影からの画像再構成：コンピュータ断層撮影の基本（Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）」。）これらの方法は、点光源および／または検出器構成の特定の幾何学的形状および照射ビーム内の光路を反映する変形例と共に、ラドン変換の定理に基づいたものである。しかし、臨床用のＸ線ＣＴの場合、ｓｌｉｃｅ−ｂｙ−ｓｌｉｃｅの取得のために、所定のスライス内の複数の投影角からデータを収集するために、Ｘ線源および検出器アレイが患者の周りの弧に沿って移動するかもしれない間に、通常ヒト被験者は動かないように保持される。次に、ヒト被験者はｚ軸に沿って再度位置決めされ、別のスライスのデータなどが収集される。択一的には、より現代的な臨床らせんＣＴにおいては、らせん状の投影データを収集するために点光源−検出器のアセンブリが連続的に回転する間、患者は連続的にｚ軸方向に動かされてよく、続いて、このデータは患者のｚ軸と直交する投影画像を提供するために補間される。フロー・オプティカル断層撮影では、被験体（細胞）は、固定された点光源および検出器アレイに対して等速で移動され、複数の点光源および／または検出器システムは、所定のスライスまたは容積内で複数の投影角のデータを生成するような方法で、細胞の速度ベクトルに沿って特定のゲート時間の地点と同期してデータを取得する。ｓｌｉｃｅ−ｂｙ−ｓｌｉｃｅで走査する場合、再構成アルゴリズムは、動きの軸に垂直な平面の２Ｄ画像を計算し、複数のスライスの連続的な重なり合いが、被検体の３Ｄ画像を生成するが、この３Ｄ画像は、コントラストがＸ線減衰係数またはそれぞれＣＴあるいはフロー・オプティカル断層撮影のための、被検体内の光学密度の変化の関数である。容積を円錐状に走査する場合、再構成アルゴリズムは、細胞または他の物体内の容積の３Ｄ画像を平面的な透過型または放出型の光学的投影から直接的に計算するが、この場合コントラストはそれぞれ、画像化された物体内の光学密度および／または標識プローブ密度の分布の関数である。
【００５２】
細胞密度再構成を生成するための送信データ、または標識プローブの分布を再構成するための放出データ、あるいはその両方のいずれかのために、フィルタ処理された背投影以外の画像再構成アルゴリズムを採用することが好ましいと考えられる。反復的再構成アルゴリズムとして知られている一般的なクラスは、いくつかの場合、特には、放出型断層撮影の場合、あるいは、軸線対称または３区画（ｔｒｉｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ）の性質を持った物体であることが知られている本発明の場合のように、再構成の品質を向上するために、先験的な情報を再構成アルゴリズムに組み入れることができるときには、より有効的である（例えば、１９７２年発行の雑誌「理論生物学（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３６号」の１０５〜１１７頁、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「投影画像からの物体の三次元再構成のための反復的方法（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｂｊｅｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）」および前述した参照文献を参照のこと）。
【００５３】
同様に、有利には、ある方法は有限要素モデリング・ベース（ＦＥＭ）の、統計学的再構成アルゴリズムを用いてよい。ＦＥＭアルゴリズムは、線形輸送理論から導かれるが、画像化された物体の吸収、散乱、屈折率および異方性因子の特性を種々組み合わせた二次元または三次元マップを作成するために、ここで光子の拡散／移動の式は、要素のすべての境界において解決される。このような方法の例は、１９９５年発行、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２２号（６９１〜７０１頁）の、Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＪｉａｎｇ，Ｈの「有限要素拡散方程式の近似化を用いた空間的に変動する光学特性の再構成（Ｓｐａｔｉａｌｌｙ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｆｉｎｉｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｅｑｕａｔｉｏｎ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ）」、１９９８年発行、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２５号（Ｉ）、９２〜１０１頁の、Ｈａｍｐｅｌ，ＵとＦｒｅｙｅｒ，Ｒの「放射対照状の境界を有する媒体における光吸断層撮影のための高速画像再構成（Ｆａｓｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  Ｒａｄｉａｌｌｙ  Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ）」、および１９９８年発行、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ２５号（２）、１８３〜１９３頁の、Ｊｉａｎｇ，Ｈ，Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＯｓｔｅｒｂｅｒｇ，ＵＬの「周波数ドメインの近赤外光の拡散画像化：マルチターゲットの組織様ファントムの初期評価（Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ  Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｈｏｔｏ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ  Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ  Ｐｈａｎｔｏｍｓ）」に教示されている。
【００５４】
染色の分離
多染性の点光源を用いる場合（例えば、白色光）、所定の細胞内の多数の分子プローブと構造上の特徴とを識別するために、異なる染色液（例えば、ｃｈｒｏｍａｐｈｏｒ）を用いてよい。ここで、点光源あるいはセンシング・アレイ（またはその両方）にある一連の帯域通過フィルタは、波長データを分離し、個々に染色された分子の再構成および空間的位置決めを可能にする。複数のプローブを画像化することによりロバストな方法は、センサ・アレイ内に強力な白色灯源、および複数のろ波された帯域幅を同時に収集する工程を含み、これによって、画像再構成アルゴリズムは、各ｃｈｒｏｍａｐｈｏｒに対して空間的な画像スライスを算出することができる。これらはカラー画像として表示されてよい。
【００５５】
蛍光、リン光、化学発光、およびナノ粒子放出
特別な場合のフロー・オプティカル断層撮影システムとして、ある分子プローブに、光子の一次源によって刺激を受けたときに、波長（より長い）の異なる光を放出する「レポーター」という標識を付けることができる。一次源の光子と二次的な放出光子とを分離するために、レポーターからの二次放出は、標準的な光フィルタを用いてろ波され得る。しかし、二次的な光子は点光源からの直接的な光路に必ずしも出現するというわけではないため、二次的な放出光子の画像再構成アルゴリズムは、さらに複雑なものである。二次的な光子が二次的な点光源から均一な球形パターンで放射すると仮定した場合、いずれかのセンシング要素に到達する二次的な光子の強度は、センシング要素との距離の関数になろう。点光源に対する、再構成スライス内の二次的な光子の空間的分布のモデルを提供することによって、二次的な点光源からの光子の非球形分布がさらに改善されよう。いずれかの方法は、再構成スライスまたは容積内の二次的な点光源の位置を算出する手段を提供するであろう。画像化された物体と検出器アレイとの間の照準は、画像再構成を向上するであろう。
【００５６】
一時的な光子の強度および二次的な光子の強度は、光学的なろ波によって同時に測定され、一次的な光子の強度からの、高解像度の密度の再構成は、局限化されたプローブの濃度と共に画像の形が単一の再構成された画像内で利用可能であるように、二次的な点光源の再構成にスーパーインポーズされ得るか、あるいは二次的な点光源の再構成と融合され得る。強度、信号対雑音比により、また光源および／またはセンサにおける光子の狭帯域をろ波または発生させる能力により、それぞれが異なる標識分子プローブに対応する複数の二次的光源を採用することは有利である。
【００５７】
２００１年３月１３日Ｂａｓｉｊｉらに発行された、「高スループット光学スキャナ（“Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｃａｎｎｅｒ”）」と題された米国特許第６，２０１，６２８号は、基体の蛍光性、光学密度またはリン光の自動化された、高速で感度の高い走査像を得るためのスキャナ装置を開示している。このスキャナは、高速で走査するために移動するビームとノイズ低減のための位相弁別検出とを組み合わせることを可能にする、一定の路長の光学縦列を使用し、光源と、光源からの光を受けてステアリング・ミラーでその光を集めるためのスキャニング・ミラーと、スキャン・アークに沿って基体で光が吸収される、スキャニング・ミラーからの光を受けてその光を基体に反射させるためのステアリング・ミラーと、基体から放出されたか、または散乱された光を受け取るための光検出器と、光源から光検出器までの光路長が基体を介した光の収集を通して実質的に一定になっている。この光学縦列は、基体から放出された、または散乱された光を収集し、その光を光検出器に導くための導波路または鏡をさらに備えてよい。位相弁別検出のために、光源は強度が調整され、検出器は位相弁別検出用の電子機器に接続されている。基体翻訳機を使用するスキャナも設けられている。二次元画像化のために、基体がある次元で翻訳され、他方では走査鏡が第２の次元でビームを走査する。高スループットのスキャナのために、基体を重ねたものが、トレイ・フィーダのコンベヤ・ベルト上に積まれる。米国特許第６，２０１，６２８号が参照によって組み入れられている。しかし、これら特許のいずれも光学的投影画像を生成することができず、その結果、そのような画像無しでは断層再構成は不可能である。
【００５８】
上記のように、本発明は、患者から採取した細胞の光学投影および断層再構成から、細胞核のＮＤＦおよび細胞質のＣＤＦを自動的に検出するシステムである。疾病に関連するＮＤＦおよびＣＤＦの有無から、患者に悪性腫瘍があるか否かの決定を行うことができる。
【００５９】
ここで図９を参照すると、本発明の一実施形態によって熟考されるように、細胞再構成データを用いた分類方法の一例が概略的に示されている。本システムは、特定の細胞標本が、疾病に関与するＮＤＦおよびＣＤＦを有する、対象となる細胞および診断に用いる細胞を含んでいるか否かを決定するために、共に働くことのできるいくつかの分類器をそなえてよい。分類器は、ある特徴値９４に基づいて物体を分析するコンピュータ・プログラムである。本発明の自動分類器システムは、例えば、基本的なスクリーニング機能を実行し、対象となる物体を選択する一次分類器９０を備えてよい。二次分類器９２は、細胞の物体を、形態学的に異常または形態学的に正常で、疾病に関連するＮＤＦおよびＣＤＦを有していると分類するか、あるいは正常で疾病に関連するＮＤＦおよびＣＤＦを呈していないと分類する。レポート９３が、分類器のいずれか１つまたはすべての分類結果を詳述するように設けられてよい。用途に応じて、数多くの種々の分類器が使用されてよいことが理解されるであろう。
【００６０】
上記のように、本発明の自動システムは一次および二次分類器を備えてよいが、単一の分類器を用いて、本発明によって達成される分類を連続的に取得することが可能である。統計学的な方法に基づいて分類関数の生成に用いられるソフトウェア・パッケージは、一般的に市販されている。
【００６１】
好適には、本発明の自動分類器は、それらの分類関数の実行において直接算出されたＮＤＦおよびＣＤＦに基づいて、あいまいな二分決定またはベイズの統計学的決定を利用する分類器を備える。この分類器は、例えば、形態学的特徴、測光的な特徴、個々の質感的特徴、マルコフの質感的特徴、非マルコフの質感的特徴、フラクタルな質感的特徴、およびラン・レングスの質感的特徴などの多数の特徴値を含むように構成され得る。
【００６２】
典型的には、一次分類器は対象となる物体を次の３つのクラスにさらに分類するように機能する。（１）診断に使用する細胞を含んだ上皮細胞および疾病に関与するＮＤＦおよびＣＤＦを含んでよい細胞、（２）炎症細胞、および（３）アーチファクトの３種類である。この一次分類器は、特徴値の選択を組み入れた二分決定木を介して、細胞ごとの分類に影響を及ぼし得る。
【００６３】
上記のように、アーチファクトから細胞核を、他の細胞タイプから上皮細胞を、かつ他の正常な上皮細胞から、疾病に関与するＮＤＦおよびＣＤＦを有する細胞を識別する本発明のシステムの能力は、計算された特徴の値に基づいて識別を行う分類器の能力に左右される。例えば、異常な上皮細胞（すなわち、診断に用いる細胞）から正常な上皮細胞を識別するために、本発明は、各々が特定のタイプの物体および特定のＮＤＦおよびＣＤＦの変化を識別するようにトレーニングされた、いくつかの異なる識別機能を適用してよい。
【００６４】
二次分類器は、一次分類器によって選択された細胞標本内の上皮細胞を分類し、また、その分類機能の実行の際に二分決定木と特徴値も使用する。標本ごとの分類器であると考えることができる二次分類器は、一次分類器によって分類された上皮細胞を分析し、これらの細胞を、正常で疾病に関与するＮＤＦまたはＣＤＦが陰性であると分類するか、あるいは正常で疾病に関与するＮＤＦまたはＣＤＦが陽性であると分類する。一次分類器と同様に、二次分類器は、好ましいＮＤＦおよびＣＤＦの特徴値のセットに基づいて細胞を識別するように構成されている。
【００６５】
各分類器によって使用される特徴値のセットは、細胞核および／または細胞質の定量的な密度の特徴値を分析する識別機能から作成され、好ましくは、最小数の特徴値を含む。理想的には、最小数の最適な核の特徴値を選択することで、結果的には、効率的かつロバストな分類器が得られる。すなわち、分類器は好適には、細胞または細胞タイプを正確に分類するのに効率的であること、および種々の細胞および標本プレパラートを確実に分類するのにロバストであることの両方を備えている。
【００６６】
分類器は少なくとも１つの識別機能を備えてよく、この識別機能は、１Ｄおよび２Ｄの核密度の特徴（ＮＤＦ）および細胞質密度の特徴（ＣＤＦ）、ならびに面積、平均半径、光学密度（ＯＤ）の変動、ＯＤの歪み、ＯＤ範囲、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、点光源の密度、低いＤＮＡ領域、高いＤＮＡ領域、低いＤＮＡ量、高いＤＮＡ量、高い平均距離、中／高平均距離、相関、均質性、エントロピ、フラクタル寸法、ＤＮＡ指標、質感、斑点性、接続された構成要素、および空間密度周波数空間における種々の高調波から成るグループから選択される特徴を含むがこれらに限定されない、射影からの特徴値を使用して、対象となる細胞を分類する。
【００６７】
細胞標本は、ヒトの肺癌検体、ヒトの子宮頚癌検体、または血液検体であってよく、稀な細胞を含んでよい。一例では、ＮＤＦおよびＣＤＦを識別するための標本の染色には、化学量論的または比例的なＤＮＡおよびＲＮＡ染色液を用いた染色工程を含む。ＤＮＡ染色液は、Ｆｅｕｌｇｅｎ染色液、Ｒｏｍａｎｏｗｓｋｉ染色液、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色液、Ｍｅｔｈｙｌ  Ｇｒｅｅｎ、およびチオニンから成るグループから選択してよい。別の例では、ＮＤＦおよびＣＤＦを識別するために、標本は抗体マーカによって染色してよい。別の例では、有利には、標本を染色するために核酸のシーケンス・マーカを用いてよい。
【００６８】
本発明のシステムは、種々のタイプの生体細胞を分析するのに有用である。一例では、対象とする細胞を選択して、癌の診断用にすることができ、かつ／または、対象とする細胞は有利には、前浸潤癌細胞であってよい。対象とする細胞は浸潤癌細胞を含んでよく、この場合対象とする細胞は、患者を癌スクリーニングする際に利用される。対象とする細胞は、患者が浸潤癌になるか否かを判定する際にも利用されてもよい。浸潤癌細胞は上皮癌から採取することができる。択一的、または付加的には、前浸潤癌細胞は、上皮癌から採取することができる。有利には、上皮癌は、肺癌および咽喉癌、子宮頚癌および卵巣癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、胃腸管の癌から成るグループから選択されてよい。
【００６９】
例えば、３Ｄ画像およびより高次元（３Ｄ＋）の画像などの多次元画像の分析に用いられる一実施形態では、標本内の対象とする細胞を分類するのに使用される特徴は、１Ｄ、２Ｄ、３Ｄ、および３Ｄ＋の核密度の特徴値（ＮＤＦ）および細胞質密度の特徴値（ＣＤＦ）、ならびに面積、平均半径、容積、平均容積、光学密度（ＯＤ）の変動、ＯＤの歪み、ＯＤ範囲、ＯＤ平均値、ＯＤ最大値、点光源の密度、低いＤＮＡ容積、高いＤＮＡ容積、低いＤＮＡ量、高いＤＮＡ量、高い平均距離、中／高平均距離、相関、均質性、エントロピ、フラクタル寸法、ＤＮＡ指標、質感、斑点性、接続された構成要素、および空間密度周波数空間における種々の高調波から成るグループから選択される特徴を含むがこれに限定されない。例えば、高ＤＮＡ容積は、正常細胞の母集団において測定されるような基準を超えていてよい。
【００７０】
特許法に準拠し、本発明の新規な原理を適用するのに必要な情報を当業者に提供し、かつ必要とされるような模範的かつ特別な構成要素を構成かつ使用するために、本願明細書において本発明を非常に詳細に記載してきた。しかし、本発明は、特定的な異なる機器、装置および再構成アルゴリズムによって実施されてよく、また機器の詳細および操作手順の両方に関して、種々の変形例が本発明の精神および範囲から逸脱することなく達成されてよいことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の一実施形態によって熟考されるような、フロー・サイトメトリ・システムの例図の略図である。
【図２】本発明の一実施形態によって熟考されるような、単一の細胞のためのフロー工程の例図の略図である。
【図３】本発明の一実施形態によって熟考されるような、細胞の一例および再構成の断面の一例を示す略図である。
【図４】本発明の一実施形態によって熟考されるような、再構成円筒の一例を示す略図である。
【図５】本発明の一実施形態によって熟考されるような、フロー・オプティカル断層撮影（ＦＯＴ）の一例を示す略図である。
【図６】本発明の一実施形態によって熟考されるような、再構成円筒内の投影光線の一例を示す略図である。
【図７】本発明の一実施形態によって熟考されるような、再構成円筒の上面の一例を示す略図である。
【図８】本発明の一実施形態によって熟考されるような、細胞再構成に用いられる点光源／線形アレイ構成の形状の一例を示す略図である。
【図９】本発明の一実施形態によって熟考されるような、投影画像および断層撮影再構成からＮＤＦおよびＣＤＦを分析する場合に用いられる分類方法の一例を示す略図である。
【図１】
2005539209.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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