(57)【要約】本発明は、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけ変異型ＲＥＴキナーゼ関連甲状腺癌の処置のための４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは医薬上許容されるその塩の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患の処置用医薬の製造のための、式
【化１】
2005535675.tif 000006
で示される４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項２】
変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患の処置における４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは医薬上許容されるその塩の使用。
【請求項３】
変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患が甲状腺癌、褐色細胞腫、粘膜神経腫、副甲状腺機能亢進症、副甲状腺過形成、ヒルシュスプルング病または皮膚苔蘚アミロイドーシスを含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
甲状腺癌が甲状腺髄様カルシノーマおよび甲状腺乳頭様カルシノーマから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
甲状腺髄様カルシノーマが遺伝性多発性内分泌腫瘍２型である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
遺伝性多発性内分泌腫瘍２型がＭＥＮ２Ａ、ＭＥＮ２ＢまたはＦＭＴＣである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患を患うヒトを含む温血動物の処置方法であって、かかる処置を必要としている温血動物に、当該疾患に有効な用量の４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドまたは医薬上許容されるその塩を投与することを含んでなる方法。
【請求項８】
１０〜１０００ｍｇの１日用量の式Ｉの４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドを成体に投与することを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドのモノメタンスルホン酸塩が投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドがメシル酸塩の形態かつβ結晶形態である、請求項１〜９のいずれかに記載の使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけＲＥＴキナーゼ中に少なくとも１つの変異を有する甲状腺癌の処置用医薬の製造のための４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（以下、「化合物Ｉ」という）または医薬上許容されるその塩の使用、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけＲＥＴキナーゼ中に少なくとも１つの変異を有する甲状腺癌の処置における化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩の使用、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけＲＥＴキナーゼ中に少なくとも１つの変異を有する甲状腺癌を患う哺乳類を含む温血動物、とりわけヒトの処置方法であって、かかる処置を必要としている動物に、有効量の化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩を投与することを含んでなる方法に関する。
【０００２】
クロモソーム１０ｑ１１.２に局在するヒトＲＥＴ遺伝子は、タンパク質ＲＥＴキナーゼ、レセプターチロシンキナーゼをコードする２１エキソンを含む（Takahashi M. and G.M. Cooper, 1987, Mol. Cell. Biol. 3: 1378-1385）。レセプターチロシンキナーゼは、細胞成長、生存およびプログラム細胞死、分化および遊走といった多様なプロセスの細胞外シグナルを変換する。成熟したグリコシル化タンパク質は、１７０ｋＤのサイズであり、そして３つの主要なドメインを含む：カドヘリン様領域およびシステインに富む領域（cysteine-rich region）からなるリガンド結合に関与する細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン；および２７個のアミノ酸挿入により分けられたチロシンキナーゼドメイン（ＴＫ）を含む細胞内部分。
【０００３】
ＲＥＴプロトオンコジーンは、神経堤起原細胞の増殖、生存、分化および遊走の調節に関与する。ＲＥＴキナーゼの４つのリガンド：グリア細胞株由来神経栄養因子、ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ、ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ、およびａｒｔｅｍｉｎが同定されている。リガンド結合の後、ＲＥＴキナーゼは二量体化を誘導し、これは、レセプターのキナーゼ活性の活性化、選択的なチロシン残基の自己リン酸化、およびレセプターの特異的なチロシン−リン酸化ドメインとのエフェクターの相互作用を介する細胞内シグナル伝達の開始をもたらす。甲状腺髄様癌または甲状腺乳頭様癌の発生に関与するＲＥＴ遺伝子の変異は、活性化を制御する重要な調節機能の１つが反転する構成的に活性なレセプターをコードする。特発性甲状腺乳頭様カルシノーマにおいて、チロシンキナーゼ機能の構成的活性化をもたらすＲＥＴの再配置（ＲＥＴ／ＰＴＣ）が観察される。この癌遺伝子ヒット（oncogenic hit）は、サイログロブリン遺伝子プロモーターにより甲状腺におけるＲＥＴ／ＰＴＣの標的化された発現を有するマウスの乳頭様カルシノーマの発生により証明されるように、疾患の原因に関与しているようである。
【０００４】
約１８,０００の甲状腺癌の新規ケースが、米国において毎年診断されている。これらのうち約９０％が、甲状腺濾胞細胞から起こる甲状腺乳頭様カルシノーマ（ＰＴＣ）である。甲状腺髄様カルシノーマ（ＭＴＣ）はカルシトニン分泌傍濾胞Ｃ細胞に由来し、そしてすべての甲状腺癌の５〜１０％を示す。
【０００５】
さまざまな比率の特発性および放射線誘導性甲状腺乳頭様カルシノーマ（ＰＴＣ）が、チロシンキナーゼ（ＴＫ）を含むＲＥＴキナーゼの３'側部分および他の遺伝子の５'端に関与する体細胞転座（somatic translocation）を有することが見いだされた。これらの再配置に由来する融合タンパク質は、通常、ＰＴＣの形成をもたらすＲＥＴチロシンキナーゼを構成的に活性化する。
【０００６】
すべての甲状腺髄様カルシノーマの７５％が特発性であり、そして甲状腺髄様カルシノーマの約２５％が、多発性内分泌腫瘍２型（ＭＥＮ２）または家族性甲状腺髄様カルシノーマ（ＦＭＴＣ）のいずれかの一部として、家族性である。ＲＥＴプロトオンコジーンの生殖細胞系列突然変異は、常染色体優性様式の伝達を介して、すべての遺伝型のＭＴＣに素因を与える。
【０００７】
遺伝形態のＭＴＣ、ＭＥＮ２は、関与する器官に依存して３つのサブタイプに分かれる。多発性内分泌腫瘍は、ＭＴＣ、その場合の約５０％の褐色細胞腫（ＰＣ）およびその場合の１５〜３０％の副甲状腺機能亢進症を含む。ＭＥＮ２Ａ型は、すべてのＭＥＮのケースの９０％以上を占めることが多いようである。ＭＥＮ２ＡおよびＦＭＴＣの家族のＲＥＴ分析により、感染した個体において生殖細胞系列突然変異が見られたが、非感染個体または正常対照においては見られなかった。それぞれの場合において、エキソン１０の５つの特定のシステインコドン（Ｃ６０９、Ｃ６１１、Ｃ６１８、Ｃ６２０、Ｃ７９０）またはＶ８０４またはエキソン１１（Ｃ６３４）の１つが変異していることが見いだされた。変異は、無関係の伝統的ＭＥＮ２Ａ家族の９８％において検出され、そしてＦＭＴＣ家族の８５％において見いだされた。ＭＥＮ２Ｂにおいて、単一点変異（single point mutation）が同定された：当該ケースの９５％においてエキソン１６のアミノ酸９１８、アミノ酸８８３またはアミノ酸９２２。
【０００８】
４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミド（以下、「化合物Ｉ」と称する。）は、以下の式
【化１】
2005535675.tif 000002
を有する。
化合物Ｉの遊離塩基およびその許容される塩は欧州特許出願０５６４４０９において開示されている。
【０００９】
化合物Ｉの医薬上許容される塩は、たとえば無機酸、たとえば塩酸、硫酸またはリン酸との、あるいは適当な有機カルボン酸またはスルホン酸、たとえば脂肪族モノ−またはジ−カルボン酸、たとえばトリフルオロ酢酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸もしくはシュウ酸、またはアミノ酸、たとえばアルギニンもしくはリジン、芳香族カルボン酸、たとえば安息香酸、２−フェノキシ−安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、芳香族−脂肪族カルボン酸、たとえばマンデル酸もしくは桂皮酸、ヘテロ芳香族カルボン酸、たとえばニコチン酸もしくはイソニコチン酸、脂肪族スルホン酸、たとえばメタン−、エタン−もしくは２−ヒドロキシエタン−スルホン酸、または芳香族スルホン酸、たとえばベンゼン−、ｐ−トルエン−もしくはナフタレン−２−スルホン酸との塩のような、医薬上許容される酸付加塩である。
【００１０】
化合物Ｉのメシル酸塩（以下、「塩Ｉ」という）および化合物Ｉのメシル酸塩のαおよびβ結晶形は、１９９９年１月に公開された国際特許出願ＷＯ ９９／０３８５４において開示されている。
【００１１】
驚くべきことに、今回、化合物Ｉ、たとえば塩Ｉが、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけＲＥＴキナーゼ中に少なくとも１つの突然変異を有する甲状腺癌の処置用治療剤として使用され得ることが見いだされた。
【００１２】
化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、たとえば塩Ｉは、変異型ＲＥＴキナーゼ形質転換線維芽細胞の増殖をインビトロで阻害する。ＲＥＴキナーゼ−融合タンパク質（ＲＥＴ／ＰＴＣ１およびＲＥＴ／ＰＴＣ３のようなＲＥＴ再配置）の自己リン酸化およびホスホリパーゼＣガンマ（ＲＥＴキナーゼのＰＬＣガンマ下流エフェクター）のリン酸化は、化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、たとえば塩Ｉにより阻害される。
【００１３】
それゆえ、本発明は、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけＲＥＴキナーゼ中に少なくとも１つの変異を有する甲状腺癌を患う温血動物の処置方法であって、かかる処置を必要としている動物に、有効量の化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩を投与することを含んでなる方法に関する。
【００１４】
本発明は、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけＲＥＴキナーゼ中に少なくとも１つの変異を有する甲状腺癌を患うヒト対象に、化合物Ｉまたはその酸付加塩および好ましくは４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）フェニル］−ベンズアミドのモノメタンスルホン酸塩を投与する方法に関する。
【００１５】
ＲＥＴ再配置は、特に特発性甲状腺乳頭様カルシノーマにおいてよく見られる。
【００１６】
１つの実施態様において、本発明は特に特発性甲状腺カルシノーマの処置方法を提供する。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、放射線への曝露により引き起こされる甲状腺癌の処置方法を提供する。
【００１８】
本明細書において使用される「変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患」なる語は、以下の疾患：
＊ 甲状腺癌
＊ 乳癌
＊ ＲＥＴオンコジーンの活性化に関係する他の新生物、たとえば副腎髄質の種様（褐色細胞腫（ＰＣ））および粘膜神経腫
＊ 副甲状腺機能亢進症（ＨＰＴ）および副甲状腺過形成、
＊ ヒルシュスプルング病
＊ 皮膚苔蘚アミロイドーシス（Cutaneous Lichen amyloidosis）
を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００１９】
本明細書において使用される「甲状腺癌（thyroid cancer）」なる用語は、たとえば、２型の多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ２）、甲状腺髄様カルシノーマまたは甲状腺乳頭様カルシノーマおよび甲状腺未分化癌を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２０】
好ましくは、化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩は、２型の多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ２）、甲状腺髄様カルシノーマまたは甲状腺乳頭様カルシノーマの処置に使用される。
【００２１】
本発明にしたがって、化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩は、甲状腺未分化癌ではない甲状腺癌の処置のために使用される。
【００２２】
「処置」なる用語は、腫瘍を治すか、または腫瘍縮退もしくは疾患の進行遅延に効果を有することを目的として、処置を必要としている温血動物への、化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、たとえば塩Ｉの投与を含む。
【００２３】
本明細書において使用される「進行遅延」なる用語は、腫瘍増殖または一般に疾患の進行が処置により少なくとも遅くなるかまたは阻害されることを意味し、そして患者が、処置されていない患者またはプラセボで処置された患者よりも高い生存率を示すことを意味する。
【００２４】
「変異型ＲＥＴキナーゼ」なる用語は、コドン内に少なくとも１つの点変異を有するか、または融合タンパク質もしくは脱調節性発現をもたらす遺伝子再配置を有するＲＥＴキナーゼタンパク質を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２５】
本発明の医薬組成物は自体公知の方法で製造され得、そしてヒトを含む温血動物のへの経腸的、たとえば経口的または経直腸的、および非経腸的投与に適し、かつ単独または１もしくはそれ以上の医薬上許容される担体、とりわけ経腸もしくは非経腸適用に適したものと組み合わせて、少なくとも１つの薬理活性成分の治療上有効量を含むものである。本発明の投与形態の投与の好適な経路は経口である。
【００２６】
当業者であれば、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけＲＥＴキナーゼ中に少なくとも１つの変異を有する甲状腺癌に対する本明細書に記載の有利な効果を証明するための適当な試験モデルを選択することが十分に可能である。かかる化合物の薬理活性は、たとえば下記の実施例により、インビトロ試験およびヌードマウスもしくはトランスジェニックマウスにおけるインビボ試験または適当な臨床試験において証明され得る。適当な臨床試験は、たとえば、転移性甲状腺髄様カルシノーマを有する患者におけるオープンラベル非無作為化、用量漸増試験である。処置の効果は、これらの試験において、たとえば、適当な血清腫瘍マーカーによる６週ごとの腫瘍サイズの評価により、または活性成分と適合させたプラセボで達成される対照を用いるシンチグラフィー腫瘍検出により測定される。
【００２７】
化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、たとえば塩Ｉの有効用量は、使用される特定の化合物または医薬組成物、投与様式、処置される甲状腺癌の種類または処置される甲状腺癌の重度に依存して変動し得る。投薬レジメンは、患者の腎および肝機能を含む種々のさらなる因子にしたがって選択される。通常の知識を有する医師（physician）、臨床医（clinician）または獣医であれば、病状の進行を予防、対抗または阻止するのに必要な化合物の有効量を容易に決定し、そして処方することができる。
【００２８】
種、年齢、個々の状態、投与様式、および問題の臨床像に依存して、化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩、たとえば塩Ｉの有効用量、たとえば約１０〜１０００ｍｇの活性化合物（遊離塩基）、好ましくは５０〜６００ｍｇ、とりわけ１００〜４００ｍｇに相当する１日用量が、体重約７０ｋｇの温血動物に投与される。甲状腺癌または関係する疾患を有する成体患者のために、１日２００または４００ｍｇの開始用量が推奨され得る。年少者のための１日用量は、１００〜４００ｍｇ／ｍ２（体表面）、最も好ましくは３４０ｍｇ／ｍ２である。治療に対する応答の評価後に不十分な応答を示す患者のために、用量漸増を安全に考慮することが可能であり、そして患者が処置から利益を受け、そして制限的な毒性が存在しない限り患者は処置され得る。
【００２９】
本発明は、また、変異型ＲＥＴキナーゼ関連疾患、とりわけＲＥＴキナーゼ中に少なくとも１つの変異を有する甲状腺癌を患うヒト対象に、化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩を投与する方法であって、化合物Ｉまたは医薬上許容されるその塩の医薬有効量を、当該ヒト対象に、たとえば１日１回、たとえば３ヶ月を超える期間投与することを含んでなる方法に関する。本発明は、とりわけ５０〜６００ｍｇ、好ましくは１００〜４００ｍｇの１日用量を成体に投与し、そして２００〜４００ｍｇ／ｍ２（体表面）、最も好ましくは３４０ｍｇ／ｍ２（体表面）の用量を年少者に投与する方法に関する。
【００３０】
実施例
細胞株：ＰＣＣＬ３、ラット甲状腺細胞株を、Ｃｏｏｎ’ｓ培地／５％ＦＢＳ添加Ｆ１２高亜鉛、０.３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、１ｍＵ／ｍｌのＴＳＨ、１０μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのアポ−トランスフェリン、１０ｎＭのヒドロコルチゾン、およびペニシリン／ストレプトマイシンからなるＨ４完全培地中で維持する。ドキシサイクリンとのE. coli tet リプレッサー−オペレーターの相互作用の高い特異性に基づくドキシサイクリン−誘導性発現を送達するために使用される発現系がブジャード（Bujard）および協力者により開発された。安定トランスフェクションを、トランスアクチベーターｒｔＴＡ（ｒｔｅｔＲ ＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ１６活性ドメインの融合体からなる）を構成的に発現するクローン株を確立するために最初に行う。次いで、個々のｒｔＴＡ−発現クローンを、ｔｅｔ−オペレーターの制御下、ルシフェラーゼレポーター構築物での一過性トランスフェクションによりドキシサイクリン誘導性発現について調べる。非常に低いかまたは検出不可能な基底ルシフェラーゼ活性を示し、そしてドキシサイクリンによる顕著な誘導（すなわち＞１００倍）を示すｒｔＴＡのクローンを、ＲＥＴ／ＰＴＣ１またはＲＥＴ／ＰＴＣ３のいずれかのｃＤＮＡの上流にクローン化されたｔｅｔ−オペレーター配列を含む最小ＣＭＶプロモーターからなる構築物での二次的安定トランスフェクションのための宿主として選択する。
【００３１】
ＲＥＴ／ＰＴＣ１およびＲＥＴ／ＰＴＣ３は、無関係の遺伝子のプロモーターを、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを欠くＲＥＴキナーゼのＣ末端フラグメントに結合させる染色体再配置（chromosomal rearrangement）に由来する。この再配置は、構成的に活性化されたＲＥＴキナーゼのトランケート形の産生をもたらす。
【００３２】
ＲＥＴキナーゼの最もありふれた生殖細胞系列突然変異は、アミノ酸６３４−システイン変異であり、これは、構成的二量体化およびレセプターの活性化をもたらす。
【００３３】
実施例１：インビトロキナーゼ反応
ドキシサイクリンを添加して、または添加せずに２４時間インキュベートしたＲＥＴ／ＰＴＣ３（ＰＣＣＬ３）細胞のコンフルエントＴ−７５フラスコを、０.２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム含有氷冷ＰＢＳで洗浄する。細胞を、４℃で２０分間撹拌しながら、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（２０ｍＭトリス（Tris）ｐＨ ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１％Ｔｗｅｅｎ ２０、２０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、０.２ｍＭ ＰＭＳＦおよびシグマプロテアーゼ（Sigma Protease）インヒビターミックス）で溶解させる。細胞溶解物を、大きい凝集塊を分散させるために２６ゲージ針を通過させ、そして４℃にて１０,６００×ｇで２０分間遠心分離し、総細胞溶解物を得る。透明な上清を抗−ＲＥＴキナーゼ抗体（Santa Cruz goat polyclonal）で４℃にて２時間インキュベートし、次いで予めＲＩＰＡバッファーで洗浄したプロテイン（Protein）ＡＧアガロース（Santa Cruz）とともにインキュベートし、続いて４℃にてさらに９０分間インキュベートする。免疫複合体を、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７.２、２０ｍＭ ＭｎＣｌ２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２回、およびキナーゼバッファー（洗浄バッファー＋０.５ｍＭジチオトレイトール）で１回洗浄する。キナーゼアッセイを２０μｌのＤＭＳＯ（０.５％）含有インキュベーションバッファーまたはＤＭＳＯで希釈したインヒビター中で行う。反応を、１４０ｎＣｉ／ｐｍｏｌの比放射能を有するγＰ３２−ＡＴＰ（Perkin-Elmer >6000 Ci/mmol）含有ＡＴＰミックスの添加によりデュプリケートで行い、そして室温にて２５分間インキュベートする。反応を、ＳＴＯＰバッファー（１０ｍＭリン酸バッファー、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０.１％デスオキシコレートナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５μｇ／ｍｌ アプロチニン）で２回洗浄することにより止める。２回目の洗浄後に、反応液を３５μｌのＬａｅｍｍｌｉバッファー中で１０分間沸騰させ、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７.５％）に付し、そしてそれらのリン酸化を、ニトロセルロース膜に移した後にホスホイメージャー（PhosphoImager）デンシトメトリー（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）により測定する。次いで、タンパク質負荷を、ヤギポリクローナル抗−ＲＥＴキナーゼ抗体（Santa Cruz）またはマウスモノクローナル抗体（University of Cincinnati）を用いるウエスタンブロット分析により測定した総ＲＥＴキナーゼタンパク質に対して標準化する。
【００３４】
１００ｎＭの塩Ｉは、ＲＥＴ／ＰＴＣ３の自己リン酸化を４０％阻害する。
【００３５】
実施例２：構成的に活性なＲＥＴ ＭＥＮ２Ａを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖に対する塩Ｉの効果
ＲＥＴＣ６３４変異は、多発性内分泌腫瘍２Ａ型の８５％に起こるＲＥＴキナーゼの最もありふれた生殖細胞系列突然変異である。構成的活性形のＲＥＴキナーゼ（ＲＥＴＣ６３４変異）を安定に発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞の成長に対する塩Ｉの効果を調べる。
構成的に活性なＲＥＴ ＭＥＮ２Ａを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞を、６ウェルプレートに一夜まく。次いで、それらを、塩Ｉ（５００ｎＭ）またはビヒクル溶媒（対照）の入った１または５％血清の存在下で、３日ごとに培地を交換しながら、９日間成長させる。処置開始後第９日目に、ＥＤＴＡ／トリプシン溶液で回収した後に細胞を計数する。
【表１】
2005535675.tif 000003
【００３６】
塩Ｉは、ＲＥＴキナーゼ−形質転換ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の成長を阻害する。
【００３７】
実施例３：ＲＥＴ／ＰＴＣによる（ホスホリパーゼＣ）ＰＬＣγの活性化に対する塩Ｉの効果
ＲＥＴキナーゼは、ＰＬＣγと結合し、そしてリン酸化する。ＲＥＴキナーゼ活性に対する塩Ｉの効果をさらに調べるために、ＰＬＣγのリン酸化に対する塩Ｉでの前処理を調べる。
【００３８】
Ｒｅｔ−ＰＴＣ３細胞を、６ウェルＣｏｒｎｉｎｇプレート中で１０５細胞／ウェルにて播種する。３日後、細胞を、ドキシサイクリンとともに、またはドキシサイクリンなしで２５０ｎＭの塩Ｉの存在下にて２４時間処置する。細胞を、０.１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム含有冷（リン酸緩衝性生理食塩水）ＰＢＳで２回すすぎ、そして４℃にて緩やかに振盪しながら氷冷ＲＩＰＡバッファー中で２０分間置く。細胞溶解物を、４℃にて１０,６００×ｇで２０分間遠心分離することにより集める。タンパク質アッセイを、クーマシーブルーアッセイ（Pierce, Rockford, IL）により上清のアリコートで行う。ウエスタンブロット分析を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（５％）上で１００μｇのタンパク質を泳動させ、ニトロセルロース膜に移し、そして標準化のために最初に抗−ホスホＰＬＣγ抗体（Cell Signaling）、次いで抗−ＰＬＣγ（Cell Signaling）でプロープ化することにより行う。
【００３９】
２５０ｎＭの塩Ｉの存在下で、ＰＬＣγのリン酸化の阻害は、塩Ｉを含まない試料と比較して２８％である。
【００４０】
実施例４：４−［（４−メチル−１−ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］ベンズアミド メタンスルホン酸塩、β−結晶形を有するカプセル
活性物質として１００ｍｇの化合物Ｉ（遊離塩基）に相当する１１９.５ｍｇの塩Ｉを含有するカプセルを、以下の組成で製造する：
【表２】
2005535675.tif 000004
【００４１】
成分を混合し、そして混合物をサイズ１の硬ゼラチンカプセルに充填することにより、カプセル剤を製造する。
【００４２】
実施例５：４−［（４−メチル−１−ピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］ベンズアミド メタンスルホン酸塩、β−結晶形を有するカプセル
活性物質として１００ｍｇの化合物Ｉ（遊離塩基）に相当する１１９.５ｍｇの塩Ｉを含有するカプセルを、以下の組成で製造する：
【表３】
2005535675.tif 000005
【００４３】
成分を混合し、そして混合物をサイズ１の硬ゼラチンカプセルに充填することにより、カプセル剤を製造する。
【国際調査報告】
2005535675.tif 000007
2005535675.tif 000008
2005535675.tif 000009
2005535675.tif 000010
2005535675.tif 000011