(57)【要約】本発明は新規PARポリペプチドとその使用に関する。本発明は特に、機能性の内因性活性化ペプチドを欠きかつ野生型PAR対応リガンドと相互作用しうるPARポリペプチドに関する。本発明はまた、該改変型PARポリペプチドを使用してPAR受容体調節化合物をスクリーニングする方法、ならびに特定された化合物の治療面への使用、特に炎症、アレルギー、CNSに影響を及ぼす疾患、神経変性、精神または循環器疾患の治療への使用、ならびにこの目的への使用が可能な方法および組成物に関する。本発明はまた、改変型PARをコードする核酸、該核酸を含むベクターおよび組換え細胞、およびそれらの、治療、診断またはスクリーニングなどへの使用をも主題とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内因性活性化ペプチドを非機能性にした、かつ野生型PAR受容体に対応する外因性リガンドと相互作用しうる改変型PARポリペプチドであって、該外因性リガンドの該改変型PARポリペプチドに対するED50が野生型PAR受容体に対するED50を著しく上回ることを特徴とする改変型PARポリペプチド。
【請求項２】
外因性リガンドの改変型PARポリペプチドに対するED50が野生型PAR受容体に対するED50を少なくとも5倍、10倍または50倍上回ることを特徴とする、請求項1に記載の改変型PARポリペプチド。
【請求項３】
PARポリペプチドの最初の N末端残基から内因性活性化ペプチドの最初の N末端残基とアミノ末端細胞外ドメインの最後のC末端残基の間の一残基に至るまでの領域を欠失する、請求項1または2に記載の改変型PARポリペプチド。
【請求項４】
PAR受容体がPAR-1、PAR-2、PAR-3またはPAR-4より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の改変型ポリペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、およびその機能性変異体および断片より選択される配列を有する、請求項4に記載の改変型ポリペプチド。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレチオド。
【請求項７】
(i) SEQ ID NO:4、5または6のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(ii) SEQ ID NO:1、2または3のポリヌクレオチド;
(iii) (i)または(ii)に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズしかつ請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(iv) (i)、(ii)または(iii)に記載のポリヌクレオチドと少なくとも75%の相同性を有しかつ請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; および
(v) 請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝暗号の縮重のためにポリヌクレオチド(i)、(ii)、(iii)または(iv)とは配列が異なるポリヌクレオチド:
より選択される、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項6または7に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項6〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項１０】
野生型PAR受容体をまったく発現しない、請求項9に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
改変型PARポリペプチドの活性を検出または測定するためのレポーター遺伝子をさらに発現する、請求項9または10に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドを調製するための方法であって、
a)  該改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを獲得するステップ;
b)  該ポリヌクレオチドをプロモーターと機能的に結合させて発現ベクターに挿入するステップ; および
c)  該ポリヌクレオチドから該改変型PARポリペプチドを産生させるステップ
を含む方法。
【請求項１３】
PAR活性調節化合物をスクリーンニング、選択または特定する方法であって、
a)  内因性活性化ペプチドを非機能性にしてありかつ野生型PAR受容体に対応する外因性リガンドと相互作用しうることを特徴とする改変型PARポリペプチドに、試験化合物を接触させるステップ; および
b)  該改変型PARポリペプチドに結合する化合物を選択するまたは該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ
を含む方法。
【請求項１４】
a)  試験化合物を請求項1〜5のいずれか1項に記載のPARポリペプチドに接触させるステップ; および
b)  該改変型PARポリペプチドに結合する化合物を選択するまたは該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ
を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
a)  試験化合物を請求項1〜5のいずれか1項に記載のPARポリペプチドに接触させるステップ; および
b)  該改変型PARポリペプチドに結合する化合物を選択するステップ
を含む、請求項13または14に記載の方法。
【請求項１６】
a)  試験化合物を請求項1〜5のいずれか1項に記載のPARポリペプチドに接触させるステップ; および
b)  該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ
を含む、請求項13または14に記載の方法。
【請求項１７】
a)  請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を適正な培地中に準備するステップ;
b)  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c)  ステップb)で得られた培地に基準リガンドを添加するステップ;
d)  該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ; および
e)  ステップd)で求めた該改変型PARポリペプチドの活性を、ステップb)を省略した場合の該改変型PARポリペプチドの活性と比較するステップ
を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
改変型PARポリペプチドの活性をカルシウム放出の測定を介して求める、請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
改変型PARポリペプチドの活性を直接測定する、請求項16または17に記載の方法。
【請求項２０】
a)  改変型PARポリペプチドと請求項11に記載のレポーター遺伝子を同時発現する組換え宿主細胞を準備するステップ;
b)  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c)  ステップb)で得られた培地に基準リガンドを添加するステップ;
d)  レポーター遺伝子の発現を測定するステップ; および
e)  ステップd)で求めたレポーター遺伝子の発現を、ステップb)を省]略した場合のレポーター遺伝子の発現と比較するステップ
を含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
組換え宿主細胞がCHO細胞株からなる、請求項16〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
レポーター遺伝子がβラクタマーゼ遺伝子である、請求項20または21に記載の方法。
【請求項２３】
βラクタマーゼ遺伝子がCa++イオン感受性NFATドメインを含むプロモーターの制御下に置かれる、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
改変型PARポリペプチドが改変型PAR-2ポリペプチドである、請求項13〜23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
改変型PARポリペプチドが、配列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、およびその機能性変異体および断片からなる群より選択される配列を有する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
基準リガンドがSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOおよびSFLLRからなる群より選択される、請求項24または25に記載の方法。
【請求項２７】
基準リガンドがSLIGRLである、請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
PAR活性調節化合物のin vitroスクリーニング、選択または特定のためのキットであって、
a)  請求項1〜5に記載のポリペプチドまたは請求項9〜11に記載の組換え宿主細胞;
b)  随意にPARポリペプチド活性の測定を実行するための試薬
を含むキット。
【請求項２９】
請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドの、少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する化合物の選択への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規の改変型PARポリペプチドとその使用に関する。本発明は特に、機能性の内因性活性化ペプチドを欠きかつ野生型PAR対応リガンドと相互作用しうるPARポリペプチドに関する。本発明はまた、該改変型PARポリペプチドを使用してPAR受容体調節化合物をスクリーニングする方法、ならびに特定された化合物の治療面への使用、特に炎症、アレルギー、CNSに影響を及ぼす疾患、神経変性、精神または循環器疾患の治療への使用、ならびにこの目的への使用が可能な方法および組成物に関する。本発明はまた、改変型PARをコードする核酸、該核酸を含むベクターおよび組換え細胞、およびそれらの、治療、診断またはスクリーニングなどへの使用をも主題とする。
【背景技術】
【０００２】
Gタンパク質共役受容体(GPCRs)は約400種存在する。これはそれ自体で400〜1000種と推定されるGタンパク質共役嗅覚受容体を除いた数字である。
【０００３】
GPCRはそのリガンドにより活性化されて構造変化を起こし細胞内Gタンパク質を活性化しうるようになる。すると、細胞内Gタンパク質は一連の膜結合型の(または細胞質中の細胞内)エフェクター(酵素、イオンチャンネル、輸送体など)をみな活性化する。これらのエフェクターはほぼ常に環状アデノシン-5-一リン酸(cAMP)、イノシトール三リン酸(IP3)、カルシウムおよびジアシルグリセロール(DAGs)などのような二次メッセンジャーの細胞内濃度を調節することができる。
【０００４】
最近、プロテアーゼ活性化型受容体という新ファミリーの受容体が開示されるようになった(McFarlane et al., 2001, Pharmacol. Rev. 53:245-282) 。それらは7つの膜貫通ドメインをもつGタンパク質共役受容体である。これらの受容体の主な特徴は、プロテアーゼによるN末端領域の切断に伴い活性化される点にある。そうした切断に伴いN末端領域内の内因性ペプチドは受容体の(おそらく第2細胞外ループの領域内にある)活性部位と相互作用しうるようになる。これらの受容体はプロテーゼによる切断前に内因性ペプチドまたはリガンドを配列中に潜在させている。内因性ペプチドを潜在させたN末端領域はこの切断に伴い、受容体の活性部位上で折り畳まれ(図1)、それによって受容体を活性化するのであろう。このファミリーの「プロテアーゼ活性化型受容体」(PARs)という名称はこれらの機能的な特徴に由来する。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の第1主題は改変型PARポリペプチドに関するが、該ポリペプチドは機能性の内因性活性化ペプチドを欠きかつ野生型PAR対応リガンドと相互作用しうることを特徴とする。本発明のポリペプチドは好ましい実施態様によれば、内因性活性化ペプチド配列の少なくとも一部分を含むN末端ドメインの全部または一部を欠失させたPARポリペプチドである。本発明による改変型PARポリペプチドはPAR-1、PAR-2、PAR-3またはPAR-4受容体特にヒト受容体に由来するのが好ましい。
【０００６】
本発明の別の主題は前記のような改変型PARポリペプチド(およびその機能性断片または変異体)をコードするポリヌクレオチドおよびその相補配列である。
【０００７】
本発明の別の主題は、そうしたポリヌクレオチドを含むベクター特に発現ベクターに、また本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む組換え宿主細胞にある。本発明はまた、そうした組換え宿主細胞を使用して樹立した安定または一過性発現株に関する。本発明はまた、本発明の改変型PARポリペプチドを発現するような、および/または本発明の組換え宿主細胞、ポリヌクレオチドまたはベクターを含むような、トランスジェニック(非ヒト)動物に関する。
【０００８】
本発明の別の主題は前記のような改変型PAR受容体またはその断片を生産する方法に関する。該方法は一般に前記のような核酸の、宿主細胞中での発現を基礎とする。
【０００９】
本発明の別の主題は、活性化合物をスクリーニング、選択または特定する方法であって、少なくとも
a)試験化合物を本発明の改変型PARポリペプチドに接触させるステップ、および
b)該ポリペプチドに結合する化合物を選択するステップ
を含むことを特徴とする方法である。
【００１０】
該方法は特に少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する活性化合物の選択を目的とするが、該調節は本発明のポリペプチドへの結合を特徴とする。
【００１１】
本発明はまた、活性化合物(たとえば少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する活性化合物)をスクリーニング、選択または特定する方法であって、少なくとも
a)試験化合物を本発明の改変型PARポリペプチドに接触させるステップ、および
b)該改変型PARポリペプチドの活性を測定または検出するステップ
を含むことを特徴とする方法である。
【００１２】
一般に本発明は、少なくとも1つのPAR受容体に結合する(および/または少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する)化合物の選択への、前記のようなポリペプチドまたは核酸の使用に関する。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、前記方法のいずれか1つにより選択されたPARポリペプチド調節化合物である。
【００１４】
本発明はまた、前記方法の1つにより選択された少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する1つまたは複数の化合物の使用を伴う製剤組成物の調製方法に関する。
【００１５】
本発明はまた次の請求項に関する:
1.  その内因性活性化ペプチドを非機能性にした、かつ野生型PAR受容体に対応する外因性リガンドと相互作用しうる改変型PARポリペプチドであって、該外因性リガンドの該改変型PARポリペプチドに対するED50が野生型PAR受容体に対するED50を著しく上回ることを特徴とする改変型PARポリペプチド。
【００１６】
2.  外因性リガンドの改変型PARポリペプチドに対するED50が野生型PAR受容体に対するED50を少なくとも5倍、10倍または50倍上回ることを特徴とする請求項1に記載の改変型PARポリペプチド。
【００１７】
3.  PARポリペプチドの最初の N末端残基から内因性活性化ペプチドの最初の N末端残基とアミノ末端細胞外ドメインの最後のC末端残基の間の一残基に至るまでの領域を欠失する、請求項1または2に記載の改変型PARポリペプチド。
【００１８】
4.  PAR受容体がPAR-1、PAR-2、PAR-3またはPAR-4より選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の改変型ポリペプチド。
【００１９】
5.  SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、およびその機能性変異体および断片より選択される配列を有する、請求項4に記載の改変型ポリペプチド。
【００２０】
6.  請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレチオド。
【００２１】
7.  (i) SEQ ID NO:4、5または6のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(ii) SEQ ID NO:1、2または3のポリヌクレオチド;
(iii) (i)または(ii)に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズしかつ請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(iv) (i)、(ii)または(iii)に記載のポリヌクレオチドと少なくとも75%の相同性を有しかつ請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; および
(v) 請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝暗号の縮重のためにポリヌクレオチド(i)、(ii)、(iii)または(iv)とは配列が異なるポリヌクレオチド:
より選択される、請求項6に記載のポリヌクレオチド。
【００２２】
8.  請求項6または7に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【００２３】
9.  請求項6〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む組換え宿主細胞。
【００２４】
10.  野生型PAR受容体をまったく発現しない、請求項9に記載の組換え宿主細胞。
【００２５】
11.  改変型PARポリペプチドの活性を検出または測定するためのレポーター遺伝子をさらに発現する、請求項9または10に記載の組換え宿主細胞。
【００２６】
12.  請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドを調製するための方法であって、
a)  該改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを獲得するステップ;
b)  該ポリヌクレオチドをプロモーターと機能的に結合させて発現ベクターに挿入するステップ; および
c)  該ポリヌクレオチドから該改変型PARポリペプチドを産生させるステップ
を含む方法。
【００２７】
13.  PAR活性調節化合物をスクリーンニング、選択または特定する方法であって、
a.  内因性活性化ペプチドを非機能性にしてありかつ野生型PAR受容体に対応する外因性リガンドと相互作用しうることを特徴とする改変型PARポリペプチドに、試験化合物を接触させるステップ; および
b.  該改変型PARポリペプチドに結合する化合物を選択するまたは該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ
を含む方法。
【００２８】
14.  a.  試験化合物を請求項1〜5のいずれか1項に記載のPARポリペプチドに接触させるステップ; および
b.  該改変型PARポリペプチドに結合する化合物を選択するまたは該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ
を含む、請求項13に記載の方法。
【００２９】
15.  a.  試験化合物を請求項1〜5のいずれか1項に記載のPARポリペプチドに接触させるステップ; および
b.  該改変型PARポリペプチドに結合する化合物を選択するステップ
を含む、請求項13または14に記載の方法。
【００３０】
16.  a.  試験化合物を請求項1〜5のいずれか1項に記載のPARポリペプチドに接触させるステップ; および
b.  該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ
を含む、請求項13または14に記載の方法。
【００３１】
17.  a.  請求項1〜5のいずれか1項に記載の改変型PARポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を適正な培地中に準備するステップ;
b.  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c.  ステップb)で得られた培地に基準リガンドを添加するステップ;
d.  該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ; および
e.  ステップd)で求めた該改変型PARポリペプチドの活性を、ステップb)を省略した場合の該改変型PARポリペプチドの活性と比較するステップ
を含む、請求項16に記載の方法。
【００３２】
18.  改変型PARポリペプチドの活性をカルシウム放出の測定を介して求める請求項16または17に記載の方法。
【００３３】
19.  改変型PARポリペプチドの活性を直接測定する請求項16または17に記載の方法。
【００３４】
20.  a.  改変型PARポリペプチドと請求項11に記載のレポーター遺伝子を同時発現する組換え宿主細胞を準備するステップ;
b.  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c.  ステップb)で得られた培地に基準リガンドを添加するステップ;
d.  レポーター遺伝子の発現を測定するステップ; および
e.  ステップd)で求めたレポーター遺伝子の発現を、ステップb)を省略した場合のレポーター遺伝子の発現と比較するステップ
を含む、請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法。
【００３５】
21.  組換え宿主細胞がCHO細胞株からなる請求項16〜20のいずれか1項に記載の方法。
【００３６】
22.  レポーター遺伝子がβラクタマーゼ遺伝子である請求項20または21に記載の方法。
【００３７】
23.  βラクタマーゼ遺伝子がCa++イオン感受性NFATドメインを含むプロモーターの制御下に置かれる、請求項22に記載の方法。
【００３８】
24.  改変型PARポリペプチドが改変型PAR-2ポリペプチドである、請求項13〜23のいずれか1項に記載の方法。
【００３９】
25.  改変型PARポリペプチドが、配列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、およびその機能性変異体および断片からなる群より選択される配列を有する、請求項24に記載の方法。
【００４０】
26.  基準リガンドがSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOおよびSFLLRからなる群より選択される、請求項24または25に記載の方法。
【００４１】
27.  基準リガンドがSLIGRLである、請求項24〜26のいずれか1項に記載の方法。
【００４２】
28.  PAR活性調節化合物のin vitroスクリーニング、選択または特定のためのキットであって、
a.  請求項1〜5に記載のポリペプチドまたは請求項9〜11に記載の組換え宿主細胞;
b.  随意にPARポリペプチド活性の測定を実行するための試薬
を含むキット。
【００４３】
29.  請求項1〜5のいずれか1項に記載のポリペプチドの、少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する化合物の選択への使用。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明の詳細な説明
本発明は新規の改変型PARポリペプチドとその使用に関する。本発明は特に、機能性の内因性活性化ペプチドを欠きかつ野生型PAR対応リガンドと相互作用しうるPARポリペプチドに関する。本発明はまた、該改変型PARポリペプチドを使用してPAR受容体調節化合物をスクリーニングする方法、ならびに特定された化合物の治療面への使用、特に炎症、アレルギー、CNSに影響を及ぼす疾患、神経変性、精神または循環器疾患の治療への使用、ならびにこの目的への使用が可能な方法および組成物に関する。本発明はまた、改変型PARをコードする核酸、該核酸を含むベクターおよび組換え細胞、およびそれらの、治療、診断またはスクリーニングなどへの使用をも主題とする。
【００４５】
4つのセリンプロテアーゼ活性化型受容体すなわちPAR-1、PAR-2、PAR-3およびPAR-4がすでに同定、解析されている。これらの受容体はN末端ドメイン中の切断部位が異なり、また内因性ペプチドが異なる。そのためPAR-1とPAR-3はトロンビン、Xa因子およびキモトリプシンが優先的に活性化し、またPAR-2は肥満細胞トリプターゼおよびトリプシンが選択的に活性化し、さらにPAR-4はトロンビンとトリプシンの両方が活性化する。これらの受容体の内因性ペプチドの配列は次のとおりである:
【００４６】
【表１】
2005531311.tif 000002
【００４７】
これらの受容体はその生理学的な活性化機構のために、利用が、特にリガンド探索への利用が困難である。具体的には、その活性化はタンパク質分解による切断を必要とするが、タンパク質分解酵素の使用はたとえ低用量でも、特異性が低いため微妙である。それどころか、タンパク質分解酵素は諸々の生体物質に無差別に作用することにより、無用のタンパク質分解を、あるいは高用量の場合には細胞溶解さえも引き起こしかねない。
【００４８】
この問題を避けるために、各受容体の内因性ペプチドと配列が同じであるかまたは類似し、従ってそれに類似した作用を及ぼすことができる外因性合成ペプチドをPAR-1、PAR-2、PAR-3およびPAR-4受容体のin vitro活性化に使用することが提案されてきた。
【００４９】
こうしてSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、trans-シンナモイル-LIGRLOおよびSFLLRなどのような種々の合成ペプチドが開示され、PAR-2受容体を、タンパク質分解による切断に依存することなく、人為的に活性化するために使用されるようになった[Al-Ani et al. (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 290:753-760]。
【００５０】
こうした外因性合成ペプチドの使用には、高濃度で使用しないと受容体を活性化することができないという大きな難点がある。たとえばPAR-2受容体を活性化するには、10〜30μMの外因性合成ペプチドが必要である。こうした高濃度での使用が必要となるのは、今日までの説明では、通常ならタンパク質の酵素的切断により生成される内因性リガンドの付着によって可能となる共有結合固定の欠如を埋め合わせる必要があるためと説明されている。従って、この固定の欠如は外因性合成ペプチドの、その受容体への結合を脆くすると考えられる。
【００５１】
本願は前記先行技術の難点の克服を可能にする。本発明は実際、これらの受容体の調節物質の効果的なスクリーニング方法の開発を特に可能にするような特質を備えた新規PAR受容体を提供する。
【００５２】
大変有利なことに本発明は、機能性の内因性活性化ペプチドを欠きかつ事実上プロテアーゼの不存在下に活性化させうるようなPAR受容体を提供する。
【００５３】
本発明者は実際、意外にも、遊離の外因性合成ペプチドに対する受容体の低アフィニティーが活性部位の低アクセシビリティーに少なくとも部分的には関係することを解明した。本発明者の作成になる受容体の3次元表示により、受容体の活性部位の、不活性状態にあるときの、すなわち内因性ペプチドがプロテアーゼの作用により機能性をおびるに至っていないときの、立体障害を視覚化することが可能になった。それによれば、非活性化状態のPAR-2受容体ではN末端ドメインの内因性ペプチドを含む部分が結合部位(第2細胞外ループ)に十分に近接していて、遊離の外因性ペプチドの通過を邪魔し、また結合部位に完全に到達するのを妨げる。
【００５４】
本発明者はまた、遊離の外因性合成ペプチドの低アクセシビリティー(従って高濃度使用)の問題が、内因性ペプチドを含むN末端部分を改変したPAR受容体を本発明に従って使用することにより、特に有利な仕方で解決しうることを明らかにした。特に本発明ではPAR受容体の構造を改変して遊離の外因性合成ペプチドに対するPAR受容体のアフィニティーを高めるようにすることができる。従って、そうした改変型PAR受容体はPAR調節化合物のスクリーニングに、またPAR受容体の特性の研究に、特に有用である。
【００５５】
従って本発明の第1の主題は、機能性の内因性活性化ペプチドを欠きかつ野生型PAR対応リガンドと相互作用しうることを特徴とする改変型PARポリペプチドに関する。本発明のポリペプチドは好ましい実施態様によれば、内因性活性化ペプチド配列の少なくとも一部分を含むN末端ドメインの全部または一部を欠失させたPARポリペプチドである。本発明の改変型PARポリペプチドはPAR-1、PAR-2、PAR-3またはPAR-4受容体特にヒト受容体に由来するのが好ましい。
【００５６】
本発明の別の主題は、前記のような改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５７】
本発明の別の主題は、そうしたポリヌクレオチドを含むベクター特に発現ベクターに、また本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む組換え宿主細胞にある。本発明はまた、そうした組換え宿主細胞を使用して樹立した安定または一過性発現株に関する。本発明はまた、本発明の改変型PARポリペプチドを発現するような、および/または組換え宿主細胞、ポリヌクレオチドまたはベクターを含むような、トランスジェニック(非ヒト)動物に関する。
【００５８】
本発明の別の主題は、前記のような改変型PAR受容体またはその断片を産生する方法に関する。該方法は一般に前記のような核酸の宿主細胞中での発現を基礎とする。
【００５９】
本発明の別の主題は、活性化合物をスクリーニング、選択または特定する方法であって、少なくとも
a)試験化合物を本発明の改変型PARポリペプチドに接触させるステップ、および
b)該ポリペプチドに結合する化合物を選択するステップ
を含むことを特徴とする方法である。
【００６０】
該方法は特に少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する活性化合物の選択を目的とするが、該調節は本発明のポリペプチドへの結合を特徴とする。
【００６１】
本発明はまた、活性化合物(たとえば少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する活性化合物)をスクリーニング、選択または特定する方法であって、少なくとも
a)試験化合物を本発明の改変型PARポリペプチドに接触させるステップ、および
b)該改変型PARポリペプチドの活性を測定(たとえば検出)するステップ
を含むことを特徴とする方法である。
【００６２】
一般に本発明は、少なくとも1つのPAR受容体に結合する(および/または少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する)化合物の選択への、前記のようなポリペプチドまたは核酸の使用に関する。
【００６３】
本発明の受容体、ベクター、細胞、細胞株、トランスジェニック動物および方法はPAR受容体の異常活性に関連する病態−特に炎症、アレルギー、中枢神経系(CNS)疾患、神経変性、または精神または循環器疾患−の治療を意図した化合物の特定、選択、解析または改良に使用することができる。
【００６４】
たとえばPAR-2は組織治癒/修復、侵害刺激および神経性炎症のメディエーターとして大きな役割を果たす。PAR-2はまた、非神経性炎症反応のメディエーターとしての役割を秘めている可能性もある。PAR-2は一般に、活性化後に急速な脱感作を示すGタンパク質共役受容体として、急性炎症反応のメディエーターと考えられている。しかし、PAR-2はリウマチ様関節炎などのような慢性炎症反応のメディエーターでもあることが最近の報告で証明された[Schmidlin et al., November 2002, The Journal of Immunology, 5316-5321; Coughlin et al., 2003, J. Clin. Invest., 111:25-27; Vergnolle et al., 2001, TRENDS in pharmacological sciences, 22(3):146-152]。
【００６５】
本発明はまた、本発明の方法を使用して特定される化合物の、PAR受容体活性のin vivo調節(特に炎症、アレルギー、CNS疾患、神経変性、精神または循環器疾患の治療)を意図した組成物の生産への使用に関する。
【００６６】
用語の定義
本願では「内因性活性化ペプチド」は野生型PARの構造中に含まれていて、酵素的切断の後に該PARの活性部位(活性化部位)に結合することができる任意のペプチドを意味するものとする。
【００６７】
「野生型PAR対応リガンド」は、野生型PAR受容体の活性部位に、好ましくは選択的に、結合しうる内因性または外因性の任意の分子を意味するものとする。この用語は特に内因性活性化ペプチドおよび外因性ペプチドを含む。そうした外因性ペプチドは結合相手のPAR受容体の配列には含まれていない(すなわち内因性ではない)が、PAR受容体の結合および/または活性評価試験時に付加される。それらの外因性ペプチドは一般に、内因性活性化ペプチドと同一また類似の配列を有する合成ペプチド(すなわち人為的に作製されるペプチド)である。この用語は好ましくは、野生型PAR受容体の活性部位に結合しうる外因性ペプチドを意味する。
【００６８】
用語「基準リガンド」は、本発明の改変型PARポリペプチドまたは野生型受容体にそれぞれ結合する、または結合してそれらを活性化するリガンドを意味するものとする。基準リガンドは外因性合成ペプチド、抗体などでもよい。改変型PARポリペプチドがPAR-2ならば、基準リガンドはSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOまたはSFLLRであるのが好ましい。
【００６９】
「PARポリペプチド」は、GPCRファミリーの受容体でありかつプロテアーゼにより活性化されてN末端に存在する内因性リガンドがその活性部位と相互作用することを可能にしうる、好ましくは哺乳動物特にヒトまたはげっ歯類に由来する任意のポリペプチド、その変異体、アナログ、オーソログ、ホモログおよび誘導体、ならびにその断片を意味するものとする。
【００７０】
PAR受容体のアミノ酸配列の、説明に役立つ非限定的な例はすでに公表済みおよび/またはGenseq、Swissprot、Genbank、EmblまたはPIRなどのような配列データベース上で閲覧可能である。
【００７１】
「基準ポリヌクレオチドと少なくともx%の相同性を有するポリヌクレオチド」および「基準ポリペプチドと少なくともx%の相同性を有するポリペプチド」という表現は、(それぞれヌクレオチドまたはアミノ酸)残基の配列がx%以上の相同率(後述)を示すポリヌクレオチドまたはポリペプチドをそれぞれ意味するものとする。
【００７２】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と比較した場合の相同率は、比較ウィンドウ内での2つの最適アラインメント配列の比較により求める。この比較ウィンドウ内では両配列のアラインメントを最適化するために、両アラインメント配列の一方または他方に残基の挿入および/または欠失を組み込むことができる。次いで比較ウィンドウで特定数の位置を比較するが、位置総数はウィンドウのサイズに対応する。ウィンドウの各位置は次の3つの配置をとりうる:
No.1:  アラインメントの第1配列上のこの位置には(ヌクレオチドまたはアミノ酸)残基が存在し、またアラインメントの第2配列上のこの同じ位置には異なる(ヌクレオチドまたはアミノ酸)残基が存在する、言い換えればアラインメントの第2配列は第1配列と比較してこの位置に置換を有する。
【００７３】
No.2:  アラインメントの第1配列上のこの位置には(ヌクレオチドまたはアミノ酸)残基が存在し、またアラインメントの第2配列上のこの同じ位置には同じ(ヌクレオチドまたはアミノ酸)残基が存在する。
【００７４】
No.3:  アラインメントの第1配列上のこの位置には(ヌクレオチドまたはアミノ酸)残基が存在し、またアラインメントの第2配列上のこの同じ位置には(ヌクレオチドまたはアミノ酸)残基が存在しない、言い換えればアラインメントの第2配列は第1配列と比較してこの位置に欠失を有する。
【００７５】
前記カテゴリーNo.1に属する比較ウィンドウ内の位置数はR1という。
前記カテゴリーNo.2に属する比較ウィンドウ内の位置数はR2という。
前記カテゴリーNo.3に属する比較ウィンドウ内の位置数はR3という。
相同率(%id)は特に次のうちいずれかの式で計算する:
%id=R2/(R1+R2+R3)×100;
%id=(R2+R3)/(R1+R2+R3)×100;
%id=R2/基準配列の全長×100;または
%id=(R2+R3)/基準配列の全長×100。
【００７６】
特定の実施態様では相同率を次の式で計算する: %id=R2/基準配列の全長×100。
別の特定の実施態様では相同率を次の式で計算する: %id= (R2+R3)/基準配列の全長×100。
【００７７】
比較対照配列のアラインメントは技術上周知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムをを使用して生成してよい。そうした配列比較アルゴリズム/プログラムの非限定的な例はTBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、FASTDBおよびWU-BLAST (Pearson and Lipman; Karlin and Altschul; Altschul et al. 1990, 1993, 1997; Thompson et al.; Higgins et al.; Brutlag et al.)、ならびにGapped-BLASTおよびPSI-BLASTなどである。
【００７８】
特定の実施態様では、BLASTプログラム(特にBLSTP、BLAST3、BLASTN、BLASTX、TBLASTN、TBLSTXなど)を使用し、パラメーターはデフォルト値とするか、またはユーザーが指定する。BLASTはBLOSUM62比較マトリックスと併用するのが好ましい(Gonnet et al.; Henikoff and Henikoff)が、PAMおよびPAM250マトリックスを使用してもよい(Schwartz and Dayoff)。
【００７９】
別の実施態様ではFASTDBプログラムを使用し、DNA配列に関するパラメーターを次のとおりとする(あらかじめUをTに変換することによりRNA配列を使用してもよい): マトリックス=ユニタリー、k-タプル=4、ミスマッチペナルティー=1、結合ペナルティー=30、無作為化群長=0、カットオフスコア=1、ギャップペナルティー=5、ギャップサイズペナルティー=0.05、ウィンドウサイズ=500またはもっと短い場合にはオブジェクト長。別の実施態様ではFASTDBプログラムを使用し、タンパク質配列に関するパラメーターを次のとおりとする: マトリックス=PAM、k-タプル=2、ミスマッチペナルティー=1、結合ペナルティー=20、無作為化群長=0、カットオフスコア=1、ギャップペナルティー=5、ギャップサイズペナルティー=0.05、ウィンドウサイズ=500またはもっと短い場合にはオブジェクト長。
【００８０】
別の実施態様では、Smith-Waterman法をPAMまたはPAM250比較マトリックスまたは好ましくはBLOSUM60またはBLOSUM62などのようなBLOSUMマトリックスと併用し、デフォルト値のパラメーター(ギャップ開始ペナルティー=10、ギャップ延長ペナルティー=1)またはデフォルト値を上回るユーザー指定パラメーターを使用する。
【００８１】
本願では「活性化合物」は少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する化合物を意味するものとする。従って、本願では「活性化合物」、「PARポリペプチド調節物質」、「PARポリペプチド調節化合物」、「PAR調節物質」、「PAR調節化合物」は同義である。
【００８２】
本願では「試験化合物」は任意のPAR受容体の活性を調節することがまだ知られていない化合物を意味するものとする。「(を)調節する化合物」はPAR受容体を活性化または阻害する任意の化合物特にPAR受容体の任意の作用薬または拮抗薬を意味するものとする。これらは選択的調節物質、すなわち別の特定の膜受容体には有意の直接作用を及ぼさない調節物質であるのが好ましい。試験化合物はペプチド、核酸、有機または無機化学分子、脂質、糖質、化合物の集まりなどでもよい。
【００８３】
本願では、「PAR前駆体」または「前駆体」は天然シグナルペプチドをもつ野生型(WT) PARポリペプチドを意味するものとする。従って本願では、「成熟PARポリペプチド」、「成熟ポリペプチド」、「成熟野生型(WT) PAR」および「成熟PARタンパク質」はシグナルペプチド切断後に得られる野生型PARを意味するものとする。
【００８４】
本願では「PAR」、「PARポリペプチド」および「PAR受容体」は同義とする。
【００８５】
本願では「ED50」または「ED50」は最大PAR活性の50%を実現するために必要なリガンド濃度とする。本願では「外因性リガンドの、本発明の改変型PARポリペプチドに対するアフィニティーは野生型(WT) PAR受容体に対するアフィニティーを著しく上回る(しのぐ)」という事実は、該外因性リガンドの、該改変型PARポリペプチドに関するED50が野生型PARに関するED50を著しく上回ることを意味するものとする。
【００８６】
著しく上回るED50は本願では少なくとも5倍、10倍または50倍上回るED50を意味するものとする。
【００８７】
改変型PARポリペプチド
野生型PARポリペプチドは一般に7つの膜貫通αヘリックスをもつ構造とされる。このポリペプチドのアミノ末端は細胞外に位置し、内因性ペプチドの配列を含む。そのカルボキシル末端は細胞内に位置する(図No.1を参照)。3つのループが細胞外に、また他の3つのループが細胞内に、それぞれ位置する。これらのポリペプチドはNグリコシル化、脂質化合物によるアシル化(場合によっては擬似第4細胞内ループの形成)、2システイン残基の側鎖間でのジスルフィド架橋の形成などのような翻訳後修飾を受ける。これらの受容体は多様な生体/生理過程に関与しており、その機能障害は種々の病態を伴う。
【００８８】
本発明の第1の態様は、PAR受容体では活性化やリガンドへの結合に関わる特性の改良をはかるための構造の改変が可能であることの証明にある。特に本発明の主題は、機能性の内因性活性化ペプチドを欠きかつ野生型PAR対応リガンドと相互作用しうることを特徴とする改変型PARポリペプチドである。
【００８９】
本発明では改変を受けるのは内因性ペプチドを含む細胞外アミノ末端ドメインである。本発明のPARポリペプチドは特に、該PARポリペプチドのN末端細胞外ドメインの全部または一部の改変により内因性活性化ペプチドを非機能性にすることを特徴とする。この改変は1つまたは複数の残基の1つまたは複数の欠失および/または変異を含んでもよい。用語「欠失」は1つまたは複数の隣接アミノ酸の喪失を意味するものとする。用語「変異」は一般に、点変異すなわちアミノ酸1個の追加または置換を意味するものとする。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様では、該改変は内因性活性化ペプチドの配列の少なくとも一部分を含むN末端細胞外ドメインの全部または一部の欠失を含む。特に好ましい実施態様では、該欠失は成熟PARポリペプチドの最初の(N末端)残基から内因性活性化ペプチドの最初の(N末端)残基と第1膜貫通ドメインの上流に位置するN末端細胞外ドメインの最後の(C末端)残基の間の一残基に至るまでの領域に関する。なお膜貫通ドメインの位置は使用する予測アルゴリズム次第で若干異なる場合もあるので、該ドメインの実際位置との関係で、また複数の予測間で、アミノ酸数個分異動が生じうるものとする。
【００９１】
本発明の特に好ましい改変型PARポリペプチドは内因性活性化ペプチドを完全に欠く、すなわち該内因性ペプチドの配列の全体にわたる欠失を含む。それらのポリペプチドは、該内因性ペプチドの少なくとも最初の残基から最後の残基に至るまでN末端領域の欠失を特徴とするのが有利である。従って、本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基から内因性活性化ペプチドの最後の残基とアミノ末端細胞外ドメインの最後の残基の間の一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型PAR受容体にある。本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基から内因性活性化ペプチドの最後の残基に至るまでの欠失を特徴とする改変型PAR受容体にある。
【００９２】
本願は、そうした欠失は受容体の機能性に影響を及ぼすことなく外因性リガンドのアフィニティーを改善し、プロテアーゼの使用を無用にしうることを示す。従って、そうした受容体はPAR受容体の活性を調節する化合物のスクリーニングに特に好適である。
【００９３】
本発明の特定の実施態様によれば、改変型PAR受容体は哺乳動物好ましくはヒトのPAR受容体である。該PAR受容体はPAR-1、PAR-2、PAR-3およびPAR-4、またはプロテアーゼによって活性化しうる任意の受容体より選択するのが好ましく、PAR-2であるのが好ましい。
【００９４】
PAR-1受容体はトロンビン受容体または凝固因子II受容体とも呼ばれるが、次の動物で発見されている: ヒト[Vu et al. (1991) Cell 64: 1057-1068; Bahou et al. (1993) Blood 82:1532-1537]、サル[Swissprot P56488]および種々のげっ歯類[Rasmussen et al. (1991) FEBS Lett. 288:123-128; Kahn et al. (1996) Mol. Med. 2:349-357; Xue et al. (1996) Genome 7:625-626, Swissprot P30558; Zhong et al.(1992) J. Biol. Chem. 267: 16975-16979]。ヒトPAR-1受容体の前駆体のアミノ酸配列はSwissprotで閲覧できる(登録番号P25116)。このSwissprotエントリーでは、PAR-1対応の内因性リガンドは該前駆体のアミノ酸42〜47に対応しており、また予測では第1膜貫通(TM)ドメインは残基103から始まる。
【００９５】
本発明の一主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基からその前駆体の残基42と残基102の間の両残基を含む一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型ヒトPAR-1受容体にある。本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基からその前駆体の残基47と残基102の間の両残基を含む一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型PAR-1受容体にある。本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの残基1からその前駆体の残基47に至るまでの欠失を特徴とする改変型PAR-1受容体にある。
【００９６】
PAR-2受容体は次の動物で発見されている: ヒト[Nystedt et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232:83-89; Boehm et al. (1996) Biochem J. 314:1009-1016; 前掲Kahn et al. (1996)]、ラット[Saiffedine et al. (1996) Br. J. Pharmacol. 118:521-530]およびマウス[Nysted et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:5950-5955]。PAR-2の前駆体のアミノ酸配列はSwissprotで閲覧できる(登録番号P55085)。このSwissprotエントリーでは、PAR-2対応の内因性リガンドは該前駆体のアミノ酸37〜42に対応しており、また本発明者の予測では第1膜貫通(TM)ドメインはアミノ酸80から始まる。
【００９７】
本発明の好ましい主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基からその前駆体の残基37と残基79の間の両残基を含む一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型ヒトPAR-2受容体にある。本発明の別の特に好ましい主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基からその前駆体の残基42と残基79の間の両残基を含む一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型ヒトPAR-2受容体にある。本発明の個別実施例は、図2に示される残基1〜42(Par2Mut-2)、1〜56(Par2-Mut3)または1〜77(Par-2Mut4)の欠失(欠失のC末端は前駆体配列の付番に従って計算)を含むPAR-2ポリペプチドにある。この点で本発明は特に、配列SEQ ID NO:4(PAR-2Mut-2)、SEQ ID NO:5(PAR-2Mut-3)およびSEQ ID NO:6(PAR-2Mut-4)からなる群より選択される配列を含む改変型ヒトPAR-2ポリペプチドにある。これらのポリペプチドをコードするのはSEQ ID NOS:1〜3の核酸配列である。
【００９８】
本発明のもっと好ましい実施態様では、改変型ヒトPAR-2ポリペプチドは配列SEQ ID NO:4(PAR-2Mut-2)とSEQ ID NO:5(PAR-2Mut-3)からなる群より選択される配列を含む。本発明の最も好ましい実施態様では、改変型ヒトPAR-2ポリペプチドは配列SEQ ID NO:4(PAR-2Mut-2)とSEQ ID NO:5(PAR-2Mut-3)からなる群より選択される配列を有する。
【００９９】
PAR-3受容体はヒトとマウスで発見されている[Ishihara et al. (1997) Nature 386:502-506]。ヒトPAR-3の前駆体のアミノ酸配列はSwissprotで閲覧できる(登録番号O00254)。このSwissprotエントリーでは、PAR-3対応の内因性リガンドは該前駆体のアミノ酸39〜44に対応しており、また予測では第1膜貫通(TM)ドメインはアミノ酸95から始まる。
【０１００】
本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基からその前駆体の残基39と残基94の間の両残基を含む一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型ヒトPAR-3受容体にある。本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基からその前駆体の残基44と残基94の間の両残基を含む一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型ヒトPAR-3受容体にある。本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの残基1からその前駆体の残基44に至るまでの欠失を特徴とする改変型ヒトPAR-3受容体にある。
【０１０１】
PAR-4受容体は次の動物で発見されている: ヒト[Xu et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6642-6646; Kahn et al. (1998) Nature 394:690-694; Nakanishi-Matsui et al. (2000) Nature 404:609-613]およびマウス[Kahn et al. (1998) J. Biol. Chem. 273 (36):23290-6 and Nature 394(6694):690-4]。ヒトPAR-4の前駆体のアミノ酸配列はRefSeqで閲覧できる(登録番号NP_003941)。このエントリーでは、PAR-4対応の内因性リガンドは該前駆体のアミノ酸48〜53に対応しており、また予測では第1膜貫通(TM)ドメインはアミノ酸79から始まる。
【０１０２】
本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基からその前駆体の残基48と残基78の間の両残基を含む一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型ヒトPAR-4受容体にある。本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの最初の残基からその前駆体の残基53と残基78の間の両残基を含む一残基に至るまでの領域の欠失を含む改変型ヒトPAR-4受容体にある。本発明の別の主題は、成熟ポリペプチドの残基1からその前駆体の残基53に至るまでの欠失を特徴とする改変型ヒトPAR-4受容体にある。
【０１０３】
別の実施態様では、本発明のPARポリペプチドは1つまたは複数の変異を含む。該変異は欠失との組合せでもよい。
【０１０４】
そうした改変は、それがどんなものであれ、内因性ペプチドを非機能性にする(すなわち受容体の活性部位に結合することおよび外因性リガンドの結合を著しく妨げることを不可能にする)効果がある。そうした非機能性の内因性ペプチドは従って、それを含んでいるPAR受容体の活性化物質としての生理的役割を果たすことができない。
【０１０５】
本発明の受容体の特に有利な特徴は、PAR受容体に対応する(外因性合成ペプチドを含めた)リガンドに、より強いアフィニティーで結合することができる点にある。従って、本発明の改変型受容体はリガンドによって活性化することができ、プロテアーゼまたはごく高濃度の外因性リガンドを使用する必要がない。
【０１０６】
本発明はまた、前記のような改変型PAR受容体の任意の断片に関する。用語「断片」は一般に、改変型PARポリペプチド配列の少なくとも5個の連続残基を含む、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸を含む、さらに好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、350または400個のアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。本発明の断片は、野生型PARに対応する外因性リガンドとの相互作用能を保持する断片であるのが有利である。そうした断片は酵素的、化学的または物理的切断および/または遺伝子組換え/化学合成により作製することができる。
【０１０７】
本発明はまた前記のような改変型PARポリペプチドの任意の機能性変異体に関する。「本発明の改変型PARポリペプチドの機能性変異体」という表現は本発明では、該改変型PARポリペプチドの配列とは異なる配列(変異、欠失など)を有する任意のポリペプチドであって、機能性の内因性活性化ペプチドを欠き、かつ野生型PARに対応する外因性リガンドと相互作用しうるポリペプチドを意味するものとする。それらは特に、1つまたは複数の多型を示すポリペプチド、種々のスプライシング産物に由来するポリペプチド、異なる種に由来するホモログなどでもよい。また、本発明のPARポリペプチドであって、活性部位へのリガンドの結合に著しい影響を及ぼさないような領域(細胞質内ドメイン; C末端ドメインなど)に1つまたは複数の追加的な欠失および/または変異を含むポリペプチドでもよい。機能性変異体は基準の改変型PARポリペプチドに対し少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有するのが好ましい。本発明の改変型PARポリペプチドおよびその機能性変異体は追加の残基たとえばターゲティング用配列(シグナルペプチドなど)または標識(受容体発現の場となる細胞または膜断片を特定するためのタグなど)を含んでもよい。
【０１０８】
本発明の改変型PARポリペプチドおよびその機能性変異体には翻訳時または翻訳後にさらなる改変を、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、保護基の付加、プロテアーゼによる切断、抗体又は他の細胞リガンドへの結合、安定性を高めるための化学基への結合、ポリペプチドの検出や単離を可能にするための標識分子への結合などにより、加えることができる。
【０１０９】
本発明のポリペプチドは技術上周知の任意の技法により、特に遺伝子組換え法、化学合成法、酵素的消化法またはこれらの方法の組合せにより、生産することができる。
【０１１０】
核酸と発現ベクター
本発明の別の主題は、前記のような(機能性断片または変異体を含む)改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびその相補配列に関する。そうしたポリヌクレオチドはDNAまたはRNA、特にゲノムDNA(gDNA)、相補的DNA(cDNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)などであろう。一般に該ポリヌクレオチドはcDNAである。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチドは当業者には周知の種々のやり方で獲得および調製することができる。たとえば種々のPAR受容体をコードする核酸配列は種々の配列データバンクで入手することができる。その登録番号は特にRefSeq NM_001992(PAR1); RefSeq NM_005242(PAR2); RefSeq NM_004101(PAR3)およびRefSeq NM_003950(PAR4)である。これらの配列は公開もされている(前記のPAR-1〜PAR-4ポリペプチドのデータベースを参照)。本発明のポリヌクレオチドは野生型PAR受容体をコードする入手可能な核酸配列から、技術上周知の種々の技法たとえば化学合成、酵素的消化、突然変異誘導、ハイブリダイゼーション、PCRなどにより調製することができる。野生型PAR-2をコードするポリヌクレオチドの突然変異誘発による本発明のポリヌクレオチドの調製については本願の実施例で詳しく説明する。
【０１１２】
本発明は一実施態様によれば、
(i) 本発明の改変型PARポリペプチド好ましくはSEQ ID NO:4、5または6のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(ii) SEQ ID NO:1、2または3のポリヌクレオチド;
(iii) (i)または(ii)に記載のポリヌクレオチドと、好ましくは高ストリンジェンシー条件下で、ハイブリダイズし、かつ本発明の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(iv) (i)、(ii)または(iii)に記載のポリヌクレオチドと少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99%の相同性を有し、かつ本発明の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; および
(v) 本発明の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝暗号の縮重のためにポリヌクレオチド(i)、(ii)、(iii)または(iv)とは配列が異なるポリヌクレオチド
より選択されるポリヌクレオチドに関する。
【０１１３】
cDNAクローンまたはゲノムクローンをハイブリダイズする技法は技術上周知である[たとえばSambrook and Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 6:33-6:58 and 7:21-7:45を参照]。簡単に言えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件を加減れば、本発明の改変型PARポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドをプローブとして使用し、該プローブに対してある程度高い相同性を示すポリヌクレオチドを特定することが可能である。本発明では、高ストリンジェンシー条件すなわちプローブとの相同性の高いポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容するような条件が好ましい。技術上周知の様々なハイブリダイゼーション条件を使用して、高ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄温度、高イオン強度のバッファー、および/またはハイブリダイゼーションおよび/または洗浄バッファーへのホルムアミドの添加などにより、高ストリンジェンシーを実現することができる。たとえば約20ヌクレオチドの核酸分子なら下記のような条件が高ストリンジェンシーであると考えられる:
・   非特異的部位のブロッキングを目的に、65℃、6xSSCバッファー、5x Denhardt液、0.5% SDSおよび100μg/mlサケ精子DNA中で行うプレハイブリダイゼーション
・   標識(好ましくはたとえば放射性標識)をしたプローブを添加して同じバッファー中で行う12〜16時間のハイブリダイゼーション
・   好ましくは65℃、2x SSCバッファー+0.1% SDS中での5分間の洗浄×2
・   好ましくは65℃、2x SSCバッファー+0.1% SDS中での30分間の洗浄
・   好ましくは65℃、0.1 x SSCバッファー+0.1% SDS中での10分間の洗浄
【０１１４】
もちろん、これらの条件は使用プローブの長さに応じて調節するのがよい。
本発明はまた、前記のような改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター、たとえばクローニングまたは発現ベクターを包摂する。本発明に使用しうるベクターはプラスミド、ウイルス、ファージ、人工染色体などであろう。
【０１１５】
以下、本発明に使用しうる特定の発現プラスミドを例示する: pQE70、pQE60、pQE-9 (Quiagen); pD10、phagescript、psiX174、p.Bluescript SK、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A (Stratagene); pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG (Stratagene); pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIA express)。
【０１１６】
使用可能な他の組換えベクターはP1バクテリオファージ、バキュロウイルス(昆虫細胞株または細胞中で増殖可能)、および特にSF9細胞株へのトランスフェクションに使用するバキュロウイルスpVL(ATCC No. CRL 1711)である。
【０１１７】
本発明の発現ベクターはアデノウイルスに由来してもよい。本発明の好ましい組換えアデノウイルスはヒトアデノウイルス2型または5型(Ad2またはAd5)または動物起源のアデノウイルスである(国際公開WO 95/02697およびWO 94/26914号明細書)。
【０１１８】
in vitroまたはex vivo遺伝子導入に好適なレトロウイルス、特にモロニーウイルス(MoMuLV)、マウス肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびレンチウイルス(HIVなど)より選択されるレトロウイルスもまた使用可能である。
【０１１９】
使用可能な別のウイルスベクターはAAVウイルスである。
使用するウイルス由来ベクターは本発明との関連では一般に複製欠損型ウイルスである。それらは、技術上周知の技法により、たとえばキャプシド形成株を使用して作製することができる。
【０１２０】
本発明の一主題は、本発明のPARポリペプチド(およびその機能性変異体または断片)をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関するが、該核酸分子はプロモーター配列と機能的に結合させてある。
【０１２１】
該プロモーター配列(またはプロモーター)はウイルス、細胞、合成のいずれに由来してもよい。その作用の仕方は構成的でも調節的でもよい。このプロモーターは強くても弱くてよいし、また遍在的でも組織特異的でもよい。好適なプロモーターは特にSV40、ラウス肉腫ウイルス(RSV)、チミジンキナーゼ(TK)またはサイトメガロウィルス(CMV)などのウイルス性プロモーターから、テトラサイクリンプロモーターなどのような真核生物プロモーターから、およびpLac、pTrp、T7などのような細菌プロモーターから、選択することができる。好ましいプロモーターはCMVまたはSV40プロモーターである。本発明は特定プロモーターの選択に限定されず、細胞性プロモーター特にハウスキーピングまたは強発現遺伝子のプロモーターの使用を包含するものとする。
【０１２２】
該ベクターは他の調節配列(たとえば分泌、膜局在化、転写終結、複製起点などのための配列)および/またはマーカー遺伝子(たとえばその発現産物がベクターを含む細胞の特定を可能にするような遺伝子)を含んでもよい。
【０１２３】
改変型PARポリペプチドを発現する宿主細胞および動物
本発明の別の主題は前記のような改変型PARポリペプチドを発現する任意の組換えまたは遺伝子改変宿主細胞に関する。用語「組換え宿主細胞」は前記のようなポリヌクレオチドまたはベクター特に組換え発現ベクターを含む任意の宿主細胞を意味するものとする。
宿主細胞は多様な性質および起源とすることができ、特に原核、真核いずれでもよい。本発明の好ましい宿主細胞は:a)たとえばE. coli株(例:DH5-α株)、Bacillus subtilis、Salmonella typhimurium、Pseudomonas、StreptomycesまたはStaphylococcusに由来する原核宿主細胞; b)真核動物宿主細胞特に哺乳動物細胞、昆虫細胞、両生動物細胞(たとえば卵母細胞); 酵母細胞; 植物細胞より選択される。真核細胞では、本発明に使用しうる細胞の例は次のとおりである: T細胞株(ECACC U937, 85011440; ECACC J. CaM1.6, 96060401; ECACC Jurkat E6.1, 88042803およびECACC J45.01, 930311459)、Hela細胞(ATCC No. CCL2; No. CCL2.1; No. CCL2.2)、Cv 1細胞(ATCC No. CCL70)、COS細胞(ATCC No. CRL 1650; No. CRL 1651)、Sf-9細胞(ATCC No. CRL 1711)、C127細胞(ATCC No. CRL-1804)、3T3細胞(ATCC No. CRL-6361)、CHO細胞(ATCC No. CCL-61)、ヒト腎HEK293細胞(ATCC No. 45504; No. CRL-1573)、BHK(ECACC No. 84100501; No. 84111310)、PC12(ATCC No. CRL-1721)、NT2、SHSY5Y(ATCC No. CRL-2266)、NG108(ECACC No. 88112302)およびF11、SK-N-SH(ATCC No. CRL-HTB-11)、SK-N-BE(2)(ATCC No. CRL-2271)、IMR-32(ATCC No. CCL-127)、KNRK細胞(Al-Ani et al., 1999, J. Pharmacol exp therap, Vol. 290, Issue 2, 753-760)。
【０１２４】
関心のある核酸の宿主細胞への導入は、技術上周知の任意の手段特にトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、関心のある配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージの使用によるインフェクションにより、染色体または微小細胞を媒介にした細胞融合または遺伝子導入により、またはスフェロプラスト化などにより、行うことができる。
【０１２５】
好ましい細胞株または細胞集団は大量のPARまたはその断片の発現を許すような細胞株または細胞集団である。
本発明の好ましい実施態様では、本発明の改変型PAR受容体に対応する野生型PAR受容体を自然には発現しないような宿主細胞を使用する。本発明の核酸分子を発現させうる好ましい細胞系は細菌または哺乳動物の細胞を、特にKNRK、CHO、COSまたはHEK細胞株を含む。本発明の最も好ましい宿主細胞はCHO細胞である。
【０１２６】
本発明はまた、前記のような核酸またはベクターを安定的または一過性に導入した樹立細胞株すなわち互いに均質な細胞の集団に関する。好ましくは、該細胞株は内因性の野生型PAR受容体をまったく発現しない。
【０１２７】
本発明の別の主題は、PAR受容体の活性を検出または測定するためのレポーター系をさらに含む、前記のような細胞または細胞株に関する。
【０１２８】
該レポーター系は一般にレポーター遺伝子を含むが、該遺伝子の発現は任意の技法(栄養要求性、蛍光、発光、耐性など)により検出、観測または測定することができるし、またその活性がPAR受容体の活性により直接または間接に調節しうるような調節領域の制御を受ける。従って、本発明との関連ではレポーター遺伝子は本発明の改変型PAR受容体の活性の検出または測定を可能にする。
【０１２９】
該レポーター遺伝子は(たとえば蛍またはウミシイタケ由来の)ルシフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチル転移酵素(CAT)、ヒト成長ホルモン(hGH)またはβグルクロニダーゼ(Gluc)などをコードする任意の核酸でよい。好ましいレポーター遺伝子は(たとえば蛍またはウミシイタケ由来の)ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、アセチル転移酵素(CAT)またはβグルクロニダーゼ(Gluc)をコードする核酸である。
【０１３０】
生物抽出物中の活性または存在を容易に測定しうるような技術上周知の任意の遺伝子は一般に、本発明を実施するためのレポーター遺伝子として使用してよい。特に好ましいレポーター遺伝子はβラクタマーゼ遺伝子である。レポーター遺伝子は、PAR受容体の活性化または不活化によって生成される1つまたは複数のシグナル(カルシウム、IP3、カルモジュリンなど)に対する感受性を付与する1つまたは複数の領域を含むプロモーターの制御を受ける。これらのプロモーターはさらに、エンハンサー、転写因子結合部位などのような調節領域を含むこともある。
【０１３１】
本発明に使用する特に好ましいレポーター系は、Ca++イオン感受性のNFATドメインを含むプロモーターの制御下にあるβラクタマーゼ遺伝子を含む。
【０１３２】
本発明はまた本発明の改変型PAR受容体を発現する細胞を作製する方法を包含するが、該方法は本発明の改変型PARポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドまたはベクターを好適な宿主細胞に導入する少なくとも1つのステップを、また随意に該ポリペプチドを発現する細胞を選択するステップを含むことを特徴とする。
【０１３３】
該細胞は任意の好適な培地および器具(ディッシュ、ボトル、バッグ、フラスコ、チューブなど)を用いて培養することができる。この培地は細胞培養用の任意の培地たとえば市販培地(RPMI、HAMなど)でよい。該細胞は本発明の改変型PARポリペプチドの産生、その活性試験、およびPAR活性調節物質の特定に使用することができる。
【０１３４】
本発明の別の主題は本発明の改変型PARポリペプチドを発現するトランスジェニック(非ヒト)動物に関する。本発明の好ましい動物は人間以外の、たとえばげっ歯類動物である。そうした宿主動物は本発明の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはベクター、本発明の組換え宿主細胞、あるいは相同組換えによりゲノム中に導入された改変型PARポリペプチドをコードするPAR遺伝子を含んでもよい。
【０１３５】
そうしたトランスジェニック動物の作製は技術上周知の技法を用いて行う(たとえばトランスジェニックマウスの作製に関しては米国特許第4,873,191号、第5,464,764号及び第5,789,215号の各明細書を参照)。その方法は一般に、本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを胚細胞または幹細胞に導入し、該ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを組み込んだ細胞を選択し、次いで該細胞を未分化胚芽細胞中に注入しまたは組み込み、該胚芽細胞ごと雌に導入してトランスジェニック動物を誕生させるというステップを伴う。
【０１３６】
改変型PARポリペプチドの調製
本発明はまた、本発明の改変型PARポリペプチドの調製方法に関する。該方法は基本的に組換え法、酵素的消化法、化学合成法、またはそれらの方法の組合せによるポリペプチドの産生を含む。本発明の改変型PARポリペプチドは単離体または精製体として産生することができる。
【０１３７】
本発明は従って本発明の改変型PARポリペプチドを調製する方法に関するが、該方法は少なくとも
a)  該改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを獲得するステップ;
b)  該ポリヌクレオチドをプロモーターと機能的に結合させて発現ベクターに挿入するステップ; および
c)  該ポリヌクレオチドから該改変型PARポリペプチドを産生させるステップ; および
d)  随意に、産生された該改変型PARポリペプチドを単離および/または精製するステップ
を含むことを特徴とする。
【０１３８】
ステップc)で本発明の改変型PARポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの効果的な発現を確実なものとするために、該ポリヌクレオチドは、該PAR受容体の細胞膜への移動を促すようなシグナルを、機能性形態で内部に含んでもよい。そうしたシグナルはPAR遺伝子の配列中に天然に存在するが、他の膜結合タンパク質に由来する異種シグナルたとえばプロオピオメラノコルチン(POMC)中に存在するシグナルペプチドなどで置換および/または補強してもよい。
【０１３９】
該PARポリペプチドの産生はin vitroまたは細胞系内で行われよう。in vitro転写翻訳系は技術上周知である。該ポリヌクレオチドの転写は好適なバッファー中で、たとえば該ポリヌクレオチドがSP3、T3またはT7プロモーターの制御下に発現ベクター中に挿入されている場合にはそれぞれSP3、T3またはT7などのような細菌性RNAポリメラーゼを使用して行うことができる[前掲Sambrook and Russell, (2001), 9:87-9:88]。翻訳は技術上周知の翻訳系たとえば小麦胚芽ライセートまたはウサギ網状赤血球ライセートを使用して行うことができる。
【０１４０】
該ポリペプチドの発現は、好適な発現ベクターへの宿主細胞の導入後に細胞系内で行うこともできるが、該導入には技術上周知の任意の手段、特にトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、関心のある配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージの使用によるインフェクションにより、染色体または微小細胞を媒介にした細胞融合または遺伝子導入により、またはスフェロプラスト化などを用いることができる。
【０１４１】
単離または精製ステップd)はin vitro発現系、宿主細胞または該宿主細胞の細胞膜調製品(たとえば宿主細胞のライセートを使用)を使用して行うことができる。産生されたポリペプチドは技術上周知の技法により単離、精製または解析することができる。そうした技法はたとえば(化学的、物理的、機械的等の)溶解とそれに続く遠心分離処理、PARポリペプチドまたはその断片に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を予め固定化しておいたアフィニティークロマトグラフィーカラムによる精製である。
【０１４２】
本発明の改変型PARポリペプチドまたはその断片の精製にはニッケルまたは銅アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用してもよい。これはたとえばPAR-ニッケル融合タンパク質の場合である。本発明の別の実施態様では、得られたPARポリペプチドまたはペプチド断片の精製を逆相HPLCおよび/または陽イオン交換により精製する。改変型PAR調製方法の別の実施態様では、該受容体の配列はその検出または精製を容易にする「タグ」領域を含む。
【０１４３】
スクリーニング
本発明の別の主題は、活性化合物のスクリーニングへの本発明のPARポリペプチド(およびその断片)の使用である。スクリーニングはin vitroまたはin vivoで、細胞系、動物、細胞膜調製品、精製ポリペプチドなどを対象に行うことができる。本発明の改変型PARポリペプチドまたはその断片は、(ファージディスプレイの)キメラタンパク質などのように精製体で、または細胞膜、インタクト細胞またはトランスジェニック(非ヒト)動物系の調製品の形で、使用することができる。
【０１４４】
本発明はまた一般に、前記のようなポリペプチドまたはその断片の、または本発明のポリヌクレオチドの、少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する化合物のin vitro、ex vivoまたはin vivo選択への使用に関する。
種々のスクリーニング方法が使用可能であり、それは結合評価試験を伴うスクリーニング方法でも機能性スクリーニング方法でもよい。
【０１４５】
●  結合評価試験を伴うスクリーニング方法
第1変法によれば本発明は活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法に関し、該方法は少なくとも
a)  少なくとも1つの試験化合物を本発明の改変型PARポリペプチドに接触させるステップ、および
b)  該改変型PARポリペプチドに結合する試験化合物を選択するステップ
を含むことを特徴とする。
【０１４６】
この実施態様では、該化合物は本発明の改変型PARポリペプチドに対する、特に該改変型PARポリペプチドの活性部位に対する、結合能に基づいて選択される。この結合は技術上周知の種々の技法たとえば蛍光、光学密度(O.D.)、発光等の測定により検出または測定することができる。この検出はFRET(蛍光共鳴エネルギー移動; 国際公開WO 00/37077号明細書を参照)法、シンチレーション近接アッセイ(SPA)法、バイオチップの使用、免疫学的方法、アフィニティークロマトグラフィーなどで行ってもよい。
【０１４７】
一般的な実施態様では、前記の接触は野生型PAR受容体の基準リガンドの存在下に行い、本発明の受容体に対する試験化合物の結合能を基準リガンド結合の置換によって検出または測定する。基準リガンドは外因性合成ペプチド、抗体などでもよい。
【０１４８】
一実施態様では、試験化合物(または基準リガンド)はその結合(またはその置換)の測定を可能にする標識の対象でもよい。これはフルオレセイン、Oregon Green、Rhodamine、Texas Red、BodipyまたはCyanineまたはその誘導体の使用による蛍光標識でもよい。あとは蛍光測定器で、受容体に結合した標識化合物またはリガンドを検出することができる。蛍光偏光法によっても結合化合物(またはリガンド)と遊離化合物(またはリガンド)を分離しないままで識別することができる。前者のほうが後者よりも移動度が低いからである。試験化合物(または基準リガンド)は、たとえば予めヨウ化した反応性基の付加かまたはチロシン残基上での該化合物(またはリガンド)の直接ヨウ化により、ヨウ素125で標識することも可能である。標識はトリチウムの使用、Bolton and Hunter試薬の使用、またはサイズの小さい有機基の付着によっても行うことができる。
【０１４９】
この第1変法では、単離体または精製体の改変型PARポリペプチドを遊離状態で、または随意に基材(たとえばカラム、ビーズ、ディッシュ、リポソーム)表面に固定して、使用することができる。またそうした改変型PARポリペプチドを発現するインタクト細胞、またはそうした細胞の調製品または細胞膜抽出液を使用することもできる。改変型PARポリペプチドは細胞に発現させるか、または細胞抽出液または細胞膜断片、または両者の混合物に含ませるのが好ましい。
【０１５０】
本発明の特に好ましい実施態様では、試験化合物は、配列SEQ ID NO:4(PAR-2Mut2)、SEQ ID NO:5(PAR-2Mut3)およびSEQ ID NO:6(PAR-2Mut4)からなる群より選択される配列を含む改変型PARポリペプチド(またはPARポリペプチドを発現する細胞または細胞膜調製品)と接触させる。そうした改変型PARポリペプチドの機能性変異体または断片を使用することも可能である。
【０１５１】
この第1変法の一実施態様では、本発明は、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
(a)  本発明の改変型PARポリペプチドを試験化合物と接触させるステップ;
(b)  放射性標識した基準リガンドを、ステップ(a)で得られた混合物に添加するステップ;
(c)  放射能を測定するステップ; および
(d)  ステップ(c)で得られた放射能測定値を、該試験化合物の不存在下に得られた放射能測定値と比較するステップ
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０１５２】
この実施態様では、改変型PARポリペプチドがPAR-2ポリペプチドである場合には、基準リガンドはSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOまたはSFLLRであるのが好ましく、プロピオニル-tcであるのがなお好ましい。基準リガンドは[3H]プロピオニル-tc-NH2であるのが最も好ましい。
【０１５３】
一実施態様では、改変型PARポリペプチドは細胞膜断片中に含まれている。
【０１５４】
この第1変法の第2の実施態様では、本発明は、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
(a)  本発明の改変型PARポリペプチドを所望量、準備するステップ;
(b)  ステップ(a)で準備された所望量のポリペプチドを、所望量の試験化合物を含むバッファーに添加するステップ;
(c)   放射性標識した基準リガンドを、ステップ(b)で得られた混合物に添加するステップ; および
(d)  ステップ(c)で得られた放射能測定値を、該試験化合物の不存在下に得られた放射能測定値と比較するステップ
を含むことを特徴とする方法を包摂する。
【０１５５】
この実施態様では、改変型PARポリペプチドがPAR-2ポリペプチドである場合には、基準リガンドはSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOまたはSFLLRであるのが好ましく、プロピオニル-tcであるのがなお好ましい。基準リガンドは[3H]プロピオニル-tc-NH2であるのが最も好ましい。
【０１５６】
一実施態様では、改変型PARポリペプチドは細胞膜断片中に含まれている。
この第1変法の第3の実施態様では、本発明は、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
(a)   放射性標識した基準リガンドを準備するステップ;
(b)  ステップ(a)で準備された所望量の基準リガンドを、所望量の試験化合物を含むバッファーに添加するステップ;
(c)  本発明の改変型PARポリペプチドを、ステップ(b)で得られた混合物に添加するステップ; および
(d)  ステップ(c)で得られた放射能測定値を、該試験化合物の不存在下に得られた放射能測定値と比較するステップ
を含むことを特徴とする方法を包摂する。
【０１５７】
この実施態様では、改変型PARポリペプチドがPAR-2ポリペプチドである場合には、基準リガンドはSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOまたはSFLLRであるのが好ましく、プロピオニル-tcであるのがなお好ましい。基準リガンドは[3H]プロピオニル-tc-NH2であるのが最も好ましい。
【０１５８】
一実施態様では、改変型PARポリペプチドは細胞膜断片中に含まれている。
さらなる実施態様では、本発明は、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
(a)   放射性標識した基準リガンド、試験化合物および本発明の改変型PARポリペプチドを接触させるステップ;
(b)  基準試験管または基準マイクロプレートウエル中に、放射性標識した基準リガンド、高濃度のPAR基準リガンド(非特異的結合用)または無化合物(全シグナル用)および本発明の改変型PARポリペプチドを接触させるステップ;
(c)  結合放射性リガンドを遊離放射性リガンドから、急速ろ過により分離するステップ; 
(d)  フィルター上にシンチレーションカクテルを添加し、放射能を測定するステップ;
(e)  試験化合物の不存在下に得られたで特異的シグナル[(全シグナル)−(非特異的シグナル)]を試験化合物の存在下に得られた特異的シグナル[(ステップa)の条件下でのシグナル)−(非特異的シグナル)]と比較するステップ
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０１５９】
この実施態様では、改変型PARポリペプチドがPAR-2ポリペプチドである場合には、基準リガンドはSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOまたはSFLLRであるのが好ましく、プロピオニル-tcであるのがなお好ましい。基準リガンドは[3H]プロピオニル-tc-NH2であるのが最も好ましい。
【０１６０】
一実施態様では、改変型PARポリペプチドは細胞膜断片中に含まれている。
【０１６１】
●  機能性スクリーニング方法
第2変法によれば本発明は、試験化合物の(単独での、または随意にリガンドとの競合)結合後にPAR受容体の活性を測定する機能性スクリーニング方法に関する。従って本発明はまた、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、少なくとも
a)  試験化合物を本発明の改変型PARポリペプチドと接触させるステップ、および
b)  該改変型PARポリペプチドの活性を検出するステップ
を含むことを特徴とする方法に関する。
【０１６２】
この実施態様では、改変型PARポリペプチドを発現するのは一般に(培養)細胞またはトランスジェニック動物である。従って、前記の接触はin vivoまたはex vivoで細胞と試験化合物のインキュベーションにより、またはin vivoでトランスジェニック動物への試験化合物の投与により、行わせるのが好都合である。
【０１６３】
特に好ましい実施態様によれば試験化合物は、改変型PARポリペプチドを発現するような、好ましくは配列SEQ ID NO:4(PAR-2Mut2)、SEQ ID NO:5(PAR-2Mut3)およびSEQ ID NO:6(PAR-2Mut4)からなる群より選択される配列によってコードされる改変型PARポリペプチドおよびそれらの機能性変異体および断片を発現するような、細胞、細胞膜調製品またはトランスジェニック動物と接触させる。
【０１６４】
この第2変法の一実施態様では、本発明は活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
a)  本発明の改変型PARポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を適正な培地中に準備するステップ;
b)  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c)  該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０１６５】
別の実施態様では本発明は、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
a)  本発明の改変型PARポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を適正な培地中に準備するステップ;
b)  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c)  ステップb)で得られた培地に基準リガンドを添加するステップ;
d)  該改変型PARポリペプチドの活性を測定するステップ; および
e)  ステップd)で求めた該改変型PARポリペプチドの活性を、ステップb)を省略した場合の該改変型PARポリペプチドの活性と比較するステップ
を含むことを特徴とする方法を包摂する。
【０１６６】
一般に、機能性スクリーニング方法のステップa)で培養する宿主細胞は前記のような任意の培養適性宿主細胞特に哺乳動物由来の宿主細胞でよい。前記スクリーニング方法の第1の好ましい実施態様では、組換え宿主細胞はCHO細胞株からなる。
【０１６７】
前記の機能性スクリーニング方法に使用する最も好ましい組換え宿主細胞は、配列SEQ ID NO:4(PAR-2Mut2)、SEQ ID NO:5(PAR-2Mut3)およびSEQ ID NO:6(PAR-2Mut4)からなる群より選択される配列によってコードされる改変型PARポリペプチド、それらの機能性変異体および断片を発現する。
【０１６８】
改変型PARポリペプチドがPAR-2ポリペプチドである場合には、基準リガンドはSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOまたはSFLLRであるのが好ましく、SLIGRLであるのが最も好ましい。
【０１６９】
改変型PAR受容体の活性は、該受容体に結合した1つまたは複数のGタンパク質の活性を、または酵素、イオンチャンネル、輸送体などに作用する該Gタンパク質の二次エフェクターたとえばcAMP、IP3、カルシウム、ジアシルグリセロール(DAGs)などの活性を、明示することによって示すことができる。これらの二次エフェクターはそれ自体、前述と同様の標識の対象となりうる。この方法に使用される、改変型PAR受容体を発現する細胞は、該受容体の活性を測定するための前記のようなレポーター系をさらに含むのが好都合である。
【０１７０】
本発明との関係では、二次エフェクターはカルシウムであるのが好ましい。本発明の最も好ましい実施態様では、該スクリーニング方法は蛍光アッセイである。
【０１７１】
−レポーター遺伝子アッセイ
本発明の一実施態様では、本発明の機能性スクリーニング方法はPARポリペプチド活性の間接測定を可能にするレポーター遺伝子アッセイである。
【０１７２】
別の実施態様では本発明は、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
a)  本発明の改変型PARポリペプチドと前記のようなレポーター遺伝子とを同時発現する組換え宿主細胞を適正な培地中に準備するステップ;
b)  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c)  レポーター遺伝子の発現を測定するステップ
を含むことを特徴とする方法に関する。
【０１７３】
別の実施態様では本発明はまた、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
a)   本発明の改変型PARポリペプチドと前記のようなレポーター遺伝子とを同時発現する組換え宿主細胞を適正な培地中に準備するステップ;
b)  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c)  ステップb)で得られた培地に基準リガンドを添加するステップ;
d)  レポーター遺伝子の発現を測定するステップ; および
e)  ステップd)で求めたレポーター遺伝子の発現を、ステップb)を省略した場合のレポーター遺伝子の発現と比較するステップ
を含むことを特徴とする方法を具体化する。
【０１７４】
一般に、前記ステップa)で培養する宿主細胞は前記のような任意の培養適性宿主細胞特に哺乳動物由来の宿主細胞でよい。前記スクリーニング方法の第1の好ましい実施態様では、組換え宿主細胞はCHO細胞株からなる。
【０１７５】
前記の機能性スクリーニング方法に使用する最も好ましい組換え宿主細胞は、配列SEQ ID NO:4(PAR-2Mut2)、SEQ ID NO:5(PAR-2Mut3)およびSEQ ID NO:6(PAR-2Mut4)からなる群より選択される配列によってコードされる改変型PARポリペプチド、それらの機能性変異体および断片を発現する。
【０１７６】
改変型PARポリペプチドがPAR-2ポリペプチドである場合には、基準リガンドはSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOまたはSFLLRであるのが好ましく、SLIGRLであるのが最も好ましい。
【０１７７】
好ましい実施態様ではレポーター遺伝子アッセイはCa++の測定を可能にする。本発明の好ましい実施態様では該スクリーニング方法は前記のようなレポーター遺伝子を使用する。本発明の好ましい実施態様ではレポーター遺伝子はβラクタマーゼ遺伝子である。
【０１７８】
最も好ましい実施態様では、レポーター遺伝子はCa++イオン感受性NFATドメインを含むプロモーターの制御下にあるβラクタマーゼ遺伝子である[たとえばZlokarnik et al., 1998, Science, 279(5347): 84-8を参照)。
【０１７９】
蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)遺伝子レポーターベースのアッセイの原理
HTSに好適な細胞ベースのアッセイが、安定導入CHO細胞株とAurora Biosciencesのβラクタマーゼレポーター遺伝子技術とを使用して確立された。この技術は遺伝子レポーターの使用による第2メッセンジャー細胞内濃度の変動の検出をベースとする。この場合、ICRACカルシウムチャンネル刺激は振動性の細胞内Ca2+流入を招き、それがβラクタマーゼ分子の合成を導くNFATプロモーターの活性化の引き金となる。その酵素活性を、切断時に青色光(460nm)を放出するβラクタマーゼ環を含む蛍光基質(CCF2-AM、蛍光535nm)を使用してモニターする。460nmで測定した蛍光ユニット(F.U.)/535nmでの蛍光ユニットの比はβラクタマーゼ分子数に左右されるが、細胞数には左右されない。
【０１８０】
−直接PARポリペプチド活性測定アッセイ
本発明の別の実施態様では、本発明の機能性スクリーニング方法は直接PARポリペプチド活性測定を許容するアッセイである。好ましい実施態様では、直接PARポリペプチド活性アッセイはCa++の測定を可能にする。本発明の最も好ましい実施態様では、機能性スクリーニング方法はFLIPR(蛍光測定画像解析用プレートリーダー)技術を使用する。FLIPR (Molecular Devices Corporation; 米国カリフォルニア州サニーベール)は細胞ベース蛍光アッセイ用のスクリーニングツールとして開発された[Sullivan et al., Methods in molecular biology, vol 114: calcium signaling protocols, David Lambert, ed. Humana Press (1999), pp. 125-133]。それは96個の細胞サンプルの同時的な刺激および測定を可能にする。従って細胞内カルシウムの放出といった過渡シグナルの同時並行的な、リアルタイムでの定量が可能になる。
【０１８１】
FLIPR技術は、約350〜530nmの範囲に並んだ離散スペクトル線をもたらすアルゴンレーザーを特色とする。蛍光Ca++色素のFluo-3、Fluo-4およびCalcium Green-1などとの併用では、該レーザーの488nm線を使用する。本発明の好ましい実施態様では、550nmでの読みを取る。FLIPRは細胞内カルシウムの放出をリアルタイムで定量し、蛍光を90秒間に測定する。
【０１８２】
前記の直接PARポリペプチド活性測定スクリーニング方法の第1の好ましい実施態様では組換え宿主細胞はCHO細胞株からなる。前記のアッセイに使用する最も好ましい組換え宿主細胞は、配列SEQ ID NO:4(PAR-2Mut2)、SEQ ID NO:5(PAR-2Mut3)およびSEQ ID NO:6(PAR-2Mut4)からなる群より選択される配列によってコードされる改変型PARポリペプチド、それらの機能性変異体および断片を発現する。
【０１８３】
改変型PARポリペプチドがPAR-2ポリペプチドである場合には、基準リガンドはSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOまたはSFLLRであるのが好ましく、SLIGRLであるのが最も好ましい。
【０１８４】
本発明の別の実施態様では、直接細胞内カルシウム測定をFLIPRと同等のシステム[たとえば浜松ホトニクス(株)のFDSS(創薬スクリーニングシステム)、またはもっと古典的な分光蛍光計など]を使用して行う。
【０１８５】
レポーター遺伝子アッセイよりも直接カルシウム放出測定を可能にする機能性スクリーニング方法のほうが好ましい。
【０１８６】
どのような変法を追及しようが、改変型PAR受容体(および該受容体を発現する細胞または動物)に試験化合物を、その効果、濃度、細胞の性質などに応じて種々の時間にわたり、接触させることができる。
【０１８７】
該接触は任意の好適な基材を用いて、特にプレート上、チューブまたはボトル内で、実現させることができる。一般にin vitroまたはex vivoアッセイでは該接触を、多数の種々のアッセイが同時並行的に行えるようなマルチウェルプレートを用いて行う。一般的な基材の例はマイクロタイタープレートであり、特に48穴、96穴または384穴(以上)のプレートである。
【０１８８】
前記の方法を実行するときは基材および試験化合物の性質次第で種々の量の細胞を使用することができる。通常、1種類の試験化合物に103〜106個の細胞を、好ましくは104〜105個の細胞を好適な培地中で接触させる。
【０１８９】
本発明の方法では同時並行的に、数種の試験化合物を一ポリペプチドで、一試験化合物を数種のポリペプチドで、または数種の試験化合物を数種のポリペプチドで、試験することができる。
【０１９０】
一般に本発明のスクリーニング方法は試験化合物の不存在下および/または試験化合物の存在下に同時並行的に行い、得られた結果を比較することにより、試験化合物の効果の評価を可能にする。
【０１９１】
さらに、選択された試験化合物は二次アッセイで、たとえば野生型PAR受容体および/または動物を用いて、さらに評価することができる。
本発明の前述のような様々なスクリーニング方法は独立に行うこともできるが、二次アッセイに使用することもできる。
【０１９２】
こうして前述のような本発明の一スクリーニング方法[機能性スクリーニング方法または結合評価試験によるスクリーニング方法(結合評価方法)]で評価選択された試験化合物は、前述のような本発明の別のスクリーニング方法でさらに試験される場合もあろう。従って本発明はまた、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
a)  本発明の結合評価方法を試験化合物に対して実行するステップ; および該試験化合物がPARポリペプチド活性を調節することが判明した場合には
b)  ステップa)で選択された活性調節化合物に対して本発明の機能性スクリーニングを実行するステップ
を含むことを特徴とする方法に関する。
【０１９３】
本発明はまた、活性化合物のスクリーニング、選択または特定方法であって、
a)  本発明の機能性スクリーニング方法を試験化合物に対して実行するステップ; および該試験化合物がPARポリペプチド活性を調節することが判明した場合には
b)  ステップa)で選択された活性調節化合物に対して結合評価方法を実行するステップ
を含むことを特徴とする方法を包摂する。
【０１９４】
また本発明によれば、前記のスクリーニング、選択または特定方法のいずれか1つで選択されたPARポリペプチド活性調節物質はPAR亜型ポリペプチド選択的であって、他のPARsまたは他のタンパク質には作用しないようにすることができる。
【０１９５】
こうして、本発明はまた特定のPARポリペプチドの活性を選択的に調節する化合物を選択する方法であって、
a)  本発明のスクリーニング方法を実行することによりPARポリペプチド活性を調節する化合物を選択するステップ; および
b)  選択した活性調節化合物について、少なくとも1つの他PARポリペプチドの活性を阻害する能力を欠くものを求めるアッセイを行うステップ
を含むことを特徴とする方法に関する。
【０１９６】
本発明のスクリーニング方法を使用すればPAR受容体の作用薬または拮抗薬をスクリーニング、選択または特定することができる。
本発明はまた、化合物がPAR作用薬であるかどうかを決定する方法であって、
a)  本発明のスクリーニング方法を試験化合物に対して実行するステップ、および該試験化合物がPARポリペプチド活性を調節することが判明した場合には、
b)  次のステップを含む本発明の選択方法を実行するステップ:
c)  本発明の改変型PARポリペプチドを所望量、準備するステップ;
d)  所望量の該試験化合物を含む溶液に該改変型PARポリペプチドを添加するステップ; および
e)  Ca2+放出の有無を判定して、本発明のスクリーニング方法により評価選択された該試験化合物がPAR受容体の作用薬であることを確認するステップ
を含むことを特徴とする方法に関する。
【０１９７】
実際、カルシウム放出があれば、本発明のスクリーニング方法により評価選択された該試験化合物はPAR受容体の作用薬である。
【０１９８】
本発明のさらなる目的は、前記のうちいずれか1つの方法で選択されるPARポリペプチド活性調節化合物である。
【０１９９】
本発明の方法は好ましくは少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節する1つまたは複数の活性化合物の選択を可能にする。「(を)調節する化合物」という表現は、PAR受容体を活性化または阻害しうる任意の化合物特にPAR受容体の任意の作用薬または拮抗薬を意味するものとする。そうした化合物は選択的調節物質すなわち別の特定膜受容体には有意の直接作用を及ぼさないような調節物質であるのが好ましい。試験化合物はペプチド、核酸、有機または無機化学分子、脂質、糖質、化学化合物の集まりなどでよい。
【０２００】
本発明はまた、前記の方法で選択される少なくとも1つのPAR受容体の活性を調節するような1つまたは複数の化合物の使用を伴う製剤組成物の調製方法に関する。
【０２０１】
本発明は特に、製剤組成物の調製方法であって、(i)前記のうちの一方法により活性化合物を選択するステップ、および(ii)該化合物またはそのアナログを、製薬上許容可能な賦形剤または基剤で状態調節するステップを含む方法に関する。
【０２０２】
PARポリペプチドおよび/またはそのリガンドの使用
本発明の別の主題は、本発明のポリペプチドまたは核酸分子の、PAR受容体活性をin vivoで調節または回復するための組成物の調製への使用に関する。
【０２０３】
本発明はまた、本発明の方法を使用して特定された化合物の、PAR受容体の活性をin vivoで調節するための、特に炎症、アレルギー、CNSに影響を及ぼす疾患、神経変性、精神または循環器疾患を治療するための、組成物の生産への使用に関する。
本発明の他の態様および利点は、例示的、非限定的と見なされるべき以下の実施例を読めば明らかとなろう。
【実施例】
【０２０４】
A)  短縮型PAR-2受容体の構築
A1)  短縮型PAR-2受容体(PAR-2Mut2)の構築
a)  ベクターPAR-2Bamの構築
発現ベクターPOMC-tag-PAR-2-12CA15(図3)はpcDNA3ベクターであり、ヒトPAR-2タンパク質の前駆体のアミノ酸31〜397をコードするcDNAを含み、またN末端タグエピトープを含み [Bohm et al. (1996b) J. Biol. Chem. 271:22003-22016]、さらに宿主細胞の膜への適正な挿入が確実に行われるようにするためのプロオピオメラノコルチンのシグナル配列(アミノ酸1〜26)をも含む。このベクターを次の要領で改変した:
【０２０５】
部位指定突然変異誘発法でPOMC-tag-PAR-2-12CA15にBamHI制限部位を挿入し、もってPOMC-tag-PAR-2をコードする配列中のアデニンをグアニンに変えた(図3参照)。この変化には(PAR-2前駆体配列の位置31における)アミノ酸レベルでのアルギニンのグリシンへの変化をも伴った。突然変異誘発にはStratageneキット(クイックチェンジ部位指定突然変異誘発キットCat#200519)および配列SEQ ID NOS:7および8プライマー(Eurogentec)を、メーカーの説明書に従って使用した。突然変異産物をE.coli DH5αコンピテント細胞(Life Technologies Cat#18258012)にトランスフェクションした後、配列解析(Applied Biosystems 373シークエンサーを使用)によるスクリーニングを行って、期待されるBamHI変異を発現するクローンを特定した。こうして変異させたプラスミドはPAR-2Bamと命名した。
次にPAR-2BamをBamHIおよびSfiI制限酵素で消化した(図3参照)。こうして6400bpと260bpの2個の断片が生成した。6400bp断片は後でベクターPAR-2Mut2の構築に使用したが、その前に1%アガロースを含むゲル上での電気泳動による分離と臭化エチジウムを使用したUV照射下での視覚化の後に、Quiaquickキット(Quiagen Cat# 28704)を用いて精製した。
【０２０６】
b)  ベクターPAR-2Mut2の構築
次に短縮型受容体PAR-2Mut2を次の要領で得た。ヒトPAR-2の前駆体のアミノ酸43〜121をコードする230bp断片を増幅するためにプラスミドPAR-2BamのPCR増幅を2個のプライマー[センスBamHI(SEQ ID NO:9)とアンチセンスSfi(SEQ ID NO:10)]により実施した(図2および3参照)。SEQ ID NO:9のプライマーはその5’位に追加のBamHI制限部位をさらに含む。SEQ ID NO:10のプライマーはPAR-2のSfiI部位を含む領域にハイブリダイズする。PCR条件は次のとおりであった: 94℃30秒間、56℃30秒間、72℃1分間を、「ハイフィデリティー」Taqポリメラーゼ(Roche Cat# 1732641)の存在下に30サイクル。
【０２０７】
こうして増幅した230bp BamHI-SfiI断片をプラスミド中に、PCR-Bluntキット(Invitrogen Cat# K270020)を使用して、クローニングした。230bpインサートを含むポジティブクローンをBamHIとSfiIで消化し、次いでT4 DNAリガーゼ(Roche Cat# 0799009)を使用して、前記と同じ制限酵素群で消化しておいたベクターPAR-2Bam中にライゲートし、14℃に一晩維持し、前記のようにして精製した。
【０２０８】
次にDH5α細胞をライゲーションにより形質転換した。次いでPAR-2Mut2の配列を解析した。その配列は期待された短縮型受容体にぴったり対応し、内因性リガンドペプチドをもはや含まず、ヒトPAR-2の前駆体のアミノ酸43〜397を確かに含んでいた(図2および3、それにSEQ ID NO:4を参照)。
【０２０９】
A2)  短縮型PAR-2受容体(PAR-2Mut3)の構築
次に短縮型受容体PAR-2Mut3を次の要領で得た。ヒトPAR-2の前駆体のアミノ酸57〜121をコードする203bp断片を増幅するためにプラスミドPAR-2BamのPCR増幅を2個のプライマー[センスBamHI(SEQ ID NO:11)とアンチセンスSfi(SEQ ID NO:10)]により実施した。SEQ ID NO:11のプライマーはその5’位に追加のBamHI制限部位をさらに含む。SEQ ID NO:10のプライマーはPAR-2のSfiI部位を含む領域にハイブリダイズする。PCR条件は次のとおり: 94℃30秒間、56℃30秒間、72℃1分間を、「ハイフィデリティー」Taqポリメラーゼ(Roche Cat# 1732641)の存在下に30サイクル。
【０２１０】
こうして増幅した187bp BamHI-SfiI断片をプラスミド中に、PCR-Bluntキット(Invitrogen Cat# K270020)を使用して、クローニングした。187bpインサートを含むポジティブクローンをBamHIとSfiIで消化し、次いでT4 DNAリガーゼ(Roche Cat# 0799009)を使用して、前記と同じ制限酵素群で消化しておいたベクターPAR-2Bam中にライゲートし、14℃に一晩維持し、前記のようにして精製した。
【０２１１】
次にDH5α細胞をライゲーションにより形質転換した。次いでPAR-2Mut3の配列を解析した。その配列は期待された短縮型受容体にぴったり対応し、内因性リガンドペプチドをもはや含まず、ヒトPAR-2前駆体のアミノ酸57〜397を確かに含んでいた(SEQ ID NO:5を参照)。
【０２１２】
B)  安定細胞株の樹立
B1)  CHO-NFAT-PAR-2Mut2
CHO-NFAT-WT細胞(NFAT調節配列の制御を受けるβラクタマーゼ遺伝子を安定的に導入したCHOs; Aurora)を、ウシ胎仔血清10%およびゲンタマイシン100μg/mlを添加したGlutamax I DMEM培地(4.5g/lグルコースを含む; LifeScience, Gaithersburg, MD, ref. # 61965-026)中で培養した。培地にゼオマイシン250μg/mlとヒグロマイシン150μg/mlを加えて、細胞の安定増殖をはかるようにした。
【０２１３】
Fugene法(Roche, Cat# 181443)を使用して発現ベクターPAR-2Mut2を10μg、CHO-NFAT-WT細胞に導入した。次いでこの導入の24時間後に、ジェネティシン(Life Technologies Cat# 11811049; 500μg/ml)とゼオマイシン(500μg/ml)を選択試薬として安定導入株を選択した。
【０２１４】
3週間にわたる選択後、CCF4/βラクタマーゼレポーター系(AURORA Technology)を使用して、またSLIGRLペプチド(30μM)による刺激後に、細胞をFACSで選別した(図4A参照)。NFATを活性化するカルシウムの産生を誘発するPAR２受容体の活性化の後に続くβラクタマーゼの産生がこうして、βラクタマーゼによる切断の有無に応じて異なる蛍光発光を生じるCCF4/AM蛍光プローブによって検出される(国際公開WO 96/30540号明細書)。
次に、βラクタマーゼシグナルを放出する細胞を、非構成的βラクタマーゼを選択試薬として単離、培養および選別して、モノクローを得るようにした(図4B参照)。
【０２１５】
B2)  CHO-NFAT-PAR-2Mut3
B1)の場合と同様のプロトコールを使用して、Fugene法(Roche, Cat# 181443)により発現ベクターPAR-2Mut3を10μg、CHO-NFAT-WT細胞に導入した。
【０２１６】
B3)  CHO-NFAT-PAR-2-WT
PAR2WTをコードするcDNAを含むプラスミドはサンフランシスコ大学ですでに獲得されているが、そこではCHO-NFAT-WTとB1)の場合と同様のプロトコールとが使用された。
【０２１７】
C)  βラクタマーゼアッセイ
C1)  CHO-NFAT-PAR-2Mut2細胞株試験
SLIGRL-NH2合成リガンド(Neosysteeme, France)を使用して、野生型PAR-2受容体を発現するCHO-NFAT細胞(CHO-NFAT-PAR-2WT)またはPAR-2Mut2受容体を発現するCHO-NFAT細胞(CHO-NFAT-PAR-2Mut2)を刺激した。この刺激は、96穴または384穴マイクロプレートを使用して、96穴プレートでは4×104個、384穴プレートでは1×104個の細胞を対象に、37℃で4時間にわたり、5% CO2を含む雰囲気下、ゲンタマイシン100μg/mlを添加した改良ダルベッコ培地(Lifetech, Gaithersburg, MD)中で行った。次いで細胞を12μMのCCF4-AM(Aurora Biosciences, San Diego, CA)と共に周囲温度で暗所に1時間おいた。蛍光をFluostar蛍光測定器(BMG, Germany)で測定した。励起は405nmで起こり、発光は460nmと535nmの両方で記録される。バックグラウンドノイズ(無細胞の培地)を除去した後の蛍光比(460nm/535nm)を推定する。ED50は最大蛍光比の50%の実現に必要なSLIGRL-NH2濃度であると考えられる。
【０２１８】
前記培地にはSLIGRL-NH2で刺激したCHO-NFAT-βラクタマーゼ細胞(4×104細胞/ウェル)を対照として使用した。特に断らない限り、諸々の試薬は活性化物質(化学または基準化合物)と共に添加した。
【０２１９】
結果
逓増濃度のSLIGRL-NH2(0.1μM〜1000μM)で刺激したCHO-NFAT-PAR2WT細胞で得られた蛍光をCHO-NFAT-PAR-2Mut2細胞で得られた蛍光と比較した(図5参照)。CHO-NFAT-PAR-2WT細胞で得られたED50は10±5μM(n=5)である。この値は文献とも合致する[前掲Al-Ani et al., (1996)]。CHO-NFAT-PAR-2Mut2細胞で得られた用量効果曲線は左にシフトしており、ED50はずっと低いと考えられる(0.2±0.05μM; n=5)。
対照のCHO-NFAT-PAR2WT細胞と異なり、CHO-NFAT-PAR-2Mut2細胞はCHO-NFAT細胞と同様に、トリプシンによる活性化を受けない(図6参照)。これは、そうしたPAR-2受容体のミュータントがプロテアーゼ消化による切断によって活性化されるような付属リガンドをまったくもたないことを裏付ける。
【０２２０】
C2)  最適化βラクタマーゼ試験
CCF4-AMの取扱、貯蔵および調製の明細、それに蛍光測定器の技術的な明細(フィルター)については、蛍光バイオアセッイ系技術移転マニュアル(Fluostar蛍光測定器)を参照。
細胞培養: 225mlフラスコを使用して、CHO-NFAT-PAR2Mut2を10%ウシ胎仔血清+ジェネティシン(500μg/ml, ref. 10131-019, Invitrogen)+ゼオシン(250μg/ml, ref. 10131-027, Invitrogen)添加のDMEM完全Glutamax培地(ref. 61965-026, Invitrogen)に播いた(4000万個/200ml)。古典的に50プレート/日のペースを保つために、毎日20本のフラスコの播き込みと継代を行った。細胞の継代にはベルセン(ref. 15040-033, Invitrogen)を使用した。
【０２２１】
実験:
実験前日、384穴プレート(COSTAR # 3712)のDMEM完全培地(50μl)に25000個/ウェルの細胞を(手でマルチチャンネルピペットを使用して)播いた。インキュベーションを37℃、5%CO2で行った。
【０２２２】
実験当日、培地を(プレートを裏返しにし、軽く叩いて)捨てた。各ウェルにDMEM血清45μlを加えた。Minitrak IV(Packard)を使用して、試験化合物(250μM, 25%DMSO)1.4μlと10.5μM SLIGRL (Neosystem, ref. SP001568C) 20μlを加えた。プレートを37℃、湿度90%、5% CO2で4時間インキュベートした。次いで各ウェルにCCF4/AM (Panvera ref. K1030) 14μlを(手でマルチチャンネルピペットを使用して)加えた。室温で3時間インキュベーション後にC1)の要領で読み取りを行った(LJL AnalystまたはBMG Fluostar)。
【０２２３】
対照: ブランク対照(無細胞、1.4μl DMSO 25% + 20μl DMEM)、MIN対照(無SLIGRL、1.4μl DMSO 25% + 20μl DMEM)およびMAX対照(1.4μl DMSO 25% + 20μl SLIGRL 10.5μM)を使用した。
10.5μM SLIGRL溶液の調製: ペプチド2mg + 滅菌蒸留水16.66ml + DMEM 141.43mlを混合する。
CCF4/AM溶液の調製: 1mM CCF4/AM 700μlをB液(Aurora) 7mlおよびC液(Aurora) 108mlと混合した。
【０２２４】
このスクリーニング方法で評価選択された化合物を次に、同じ方法を用いて確認した。
前記のβラクタマーゼスクリーニング方法で評価選択された確認済み化合物がPAR-2受容体に特異的効果を及ぼすかどうかを見極めるために、FLIPRに基づく3つのアッセイと1つの酵素アッセイを開発した。
【０２２５】
D)  カルシウム放出直接測定(FLIPRアッセイ)
これらのアッセイは、前記のβラクタマーゼスクリーニング方法で評価選択された確認済み化合物を再確認するための二次アッセイとして使用したが、一次アッセイとしての使用も可能である。これらの試験に使用した細胞はCHO-NFAT-PAR-2-MUT2、CHO-NFAT-PAR-2-MUT3、CHO-NFAT-PAR2-WTおよびCHO-NFTA-WTである。
【０２２６】
D1)  SLIGRL 3μM/CHO-NFAT-PAR2-MUT2の使用によるPAR2の活性化
実験前日、細胞を384穴プレートのDMEM Glutamax培地(ref. 61965-026, Invitrogen)+ウシ胎仔血清10%(ref. 10270-106, Invitrogen)+ゲンタマイシン50mg/ml 0.25%(ref. 15750-037, Invitrogen)に25000個/ウェル/50μL播いた。
【０２２７】
実験当日、培地を(プレートを裏返しにして)捨てた。各ウェルに50μlのHBSS(Invitrogen ref. 14025-050), HEPES(Invitrogen ref. 15630-056, 20mM)を加え、次いでプレートを裏返しにしてHBSSを捨てた。カルシウムキットのローディング液10ml、10mlのHBSS, HEPES 20mMおよび200μlのプロベネシド250μMを混合し、この溶液をウェルあたり30μl加えた。次いでプレートを37℃、4%CO2で2時間インキュベートした。1.2μlの250μM試験化合物/25% DMSOおよび3.8μlのHBSS, HEPES 20mMを(Minitrak IV、Packardにより)加え、プレートをFLIPRに移して、25μlの7.2μM SLIGRLを加えた。
【０２２８】
カルシウムキットのローディング液に含まれる色素はCa++への結合時に蛍光発光強度の増大を示すので、細胞内カルシウム濃度の上昇の検出に使用される。該色素はアルゴンレーザーの488nm励起線で励起すると550nmで蛍光発光する。FLIPRは細胞内カルシウム放出をリアルタイムで定量し、蛍光を90秒間に測定する。
【０２２９】
対照: MIN対照(CHO-NFAT-WT + 30μlカルシウムローディング液+1.2μl HBSS, HEPES 20mM/25% DMSO + 3.8μl HBSS, HEPES 20mM + 25μl 7.2μM SLIGRL)およびMAX対照(CHO-NFAT-PAR2-Mut2 + 30μlカルシウムローディング液+ 1.2μl HBSS, HEPES 20mM/25% DMSO+3.8μl HBSS, HEPES 20mM + 25μl 7.2μM SLIGRL)を使用した。
【０２３０】
カルシウムキットのローディング液の調製(Molecular Devices ref. R8033):
カルシウムキットのボトルに10ml HBSS, HEPES 20mMを加え、混合した。90ml HBSS, HEPES 20mMを加え、この溶液を10ml単位に等分した。これをカルシウムキットのローディング液とした。
【０２３１】
7.2μM SLIGRL液の調製(Neosystem ref. SP001568C):
1mgのSLIGRLを8.355mlのHBSS, HEPES 20mMと混合した。次いで107.68mlのHBSS, HEPES 20mMを加えた。
【０２３２】
D2)  トリプシン30nM/CHO-PAR2-WTの使用によるPAR2の活性化
実験前日、細胞を384穴プレートの完全培地に25000個/ウェル/50μL播いた。
実験当日、培地を(プレートを裏返しにして)捨てた。各ウェルに50μlのHBSS, HEPES 20mMを加え、次いでプレートを裏返しにしてHBSSを捨てた。これを2回実行した。
【０２３３】
カルシウムキットのローディング液(前記の要領で調製)10ml、10mlのHBSS, HEPES 20mMおよび200μlのプロベネシド250μMを混合し、この溶液をウェルあたり30μl加えた。次いでプレートを37℃、5%CO2で2時間インキュベートした。
【０２３４】
1.2μlの試験化合物(250μM, 25% DMSO)および3.8μlのHBSS, HEPES 20mMを(Minitrak IV、Packardにより)加えた。FLIPRを使用して25μlの7.2μM SLIGRLを加えた。FLIPRにより前記の要領で蛍光を測定した。
【０２３５】
対照: MIN対照(CHO-NFAT-WT+30μlカルシウムローディング液+1.2μl HBSS, HEPES 20mM/25% DMSO+3.8μl HBSS, HEPES 20mM+25μl 7.2μM SLIGRL)およびMAX対照(CHO-NFAT-PAR2-WT+30μlカルシウムローディング液+1.2μl HBSS, HEPES 20mM/25% DMSO+3.8μl HBSS, HEPES 20mM+25μl 7.2μM SLIGRL)を使用した。
【０２３６】
72nMトリプシン溶液の調製:
1mgのトリプシン(Sigma ref. T8802)と41.6ml HBSS, HEPES 20mMを混合した。この溶液7mlを90ml HBSS, HEPES 20mMに加え、72nMトリプシン溶液とした。
【０２３７】
D3)  FLIPR/カルバコール5μM/JURKAT M1試験
このアッセイはカルバコール5μM/JURKAT M1細胞株によるムスカリンM1受容体(カルバコール活性化型GqPCR)の活性化を基礎とするものであり、D1)およびD2)アッセイで評価選択された化合物がGq共役受容体を非特異的に遮断しないことをチェックするために実施した。
【０２３８】
細胞を500ml遠心チューブに移し、2000rpmで5分間遠心処理した。滅菌パスツールピペットを使用して上清を捨てた。10mlのHBSS, HEPES 20mMをチューブに加え、混合し、細胞をMalassez細胞計数器で数えた。
【０２３９】
蛍光プローブを調製した: 50μgのFluo 3-Am(Interchim F-1242) + 22μL DMSO + 22μl C液(Aurora) + 10ml HBSS, HEPES 20mM; この溶液を2000万個の細胞に加え、37℃、5%CO2で1時間、随時インキュベーション培地を振とうしながら、インキュベートした。細胞を2000rpmで5分間、遠心処理した。滅菌パスツールピペットを使用して上清を捨てた。100mlのHBSS, HEPES 20mMを加え、細胞を2000rpmで遠心処理した。滅菌パスツールピペットを使用して上清を捨て、この細胞に6mlのHBSS, HEPES 20mMを加え333万個/mlの細胞懸濁液とした。
【０２４０】
1.2μLの試験化合物と3.8μLのHBSS, HEPES 20mMをウェルに加えた。各ウェルに30μLの細胞懸濁液(333万個/ml)を加え、次いでプレートを900rpmで5分間、遠心機にかけた。
次いでFLIPR上で実験を行い、すべてのウェルに5μMカルバコール25μLを加えた。C1)の要領で蛍光を測定した。
【０２４１】
対照: MIN対照(30μl Jurkat M1細胞懸濁液 + 2μl 150μMアトロピン/6% DMSO + 3μl HBSS, HEPES 20mM/6% DMSO + 25μl 5μMカルバコール)およびMAX対照(30μl Jurkat M1細胞懸濁液 + 5μl HBSS, HEPES 20mM/6% DMSO + 25μl 5μMカルバコール)を使用した。
【０２４２】
カルバコール溶液の調製: 蒸留水547.6μlにカルバコール1mgを溶解した。この溶液108μlを90ml HBSS, HEPES 20 mMと混合して12μMカルバコール溶液とした。
【０２４３】
D4)  結果
逓増濃度のSLIGRL-NH2(0.1μM〜100μM)で刺激したCHO-NFAT-PAR2WT細胞からの蛍光測定値をCHO-NFAT-PAR-2Mut2およびCHO-NFAT-PAR2-Mut3細胞からの測定値と比較する。CHO-NFAT-PAR-2Mut2細胞の蛍光測定値はCHO-NFAT-PAR2WT細胞のそれを上回る。同様の観測はCHO-NFAT-PAR2-Mut3細胞でも得られる。
【０２４４】
CHO-NFAT-PAR-2Mut2およびCHO-NFAT-PAR2-Mut3細胞はCHO-NFAT細胞と同様に、CHO-NFAT-PAR2WTと違ってトリプシンによる活性化を受けない。このことは、そうした細胞が酵素的な切断によって活性化される可能性のある付属リガンドを含むような受容体をまったくもたないことを裏付ける。
【０２４５】
E)  酵素アッセイ
酵素試験は、βラクタマーゼアッセイおよびD1)とD2)に記載のアッセイで評価選択された化合物ならびにD3)に記載のアッセイで排除選択された化合物がトリプシンの調節物質ではないことを確認するために、実施した。実施ではメーカーの説明書(Roche Kit Cat # 108073)に従った。この試験はトリプシン(Sigma # T-7418) 250ngを使用して37℃で30分間行い、574nmでODを測定した。
【０２４６】
F)  試験化合物の作用薬または拮抗薬効果の確認
βラクタマーゼアッセイおよびD1)とD2)に記載のアッセイで評価選択された化合物ならびにD3)とE)に記載のアッセイで排除選択された化合物が受容体に対し作用薬または拮抗薬効果を及ぼすことを確認するために2つの三次試験法が開発された。
【０２４７】
F1)  SLIGRL 3μM/CHO-NFAT-PAR2-Mut2の使用によるPAR-2の活性化
実験前日、細胞を384穴プレートのDMEM培地(50μl)に25000個/ウェル播いた。
実験当日、培地を(プレートを裏返しにして)捨てた。各ウェルに50μlのHBSS, HEPES 20mMを加え、次いでプレートを裏返しにしてバッファーを捨てた。
【０２４８】
カルシウムキットのローディング液(前記の要領で調製)10ml、10mlのHBSS, HEPES 20mMおよび200μlのプロベネシド250μMを混合し、この溶液をウェルあたり30μl加えた。次いでプレートを37℃、5%CO2で2時間インキュベートした。
【０２４９】
次いで行われる実験は2つの試薬を急ぎ連続して添加するため2部に分かれた:
−FLIPRを使用してまず5μlの試験化合物を細胞に加え、蛍光を90秒間に測定した。
−実験の第2部ではFLIPRを使用して25μlの7.2μM SLIGRLを加え、蛍光を再び90秒間に測定した。
【０２５０】
拮抗薬化合物の効果:
拮抗薬化合物は曲線の第1部で測定される蛍光に何の効果も及ぼさず、また実験の第2部で測定される蛍光の、SLIGRLだけで測定した曲線と比較した場合の増大を阻む。
【０２５１】
作用薬化合物の効果:
作用薬化合物は曲線の第1部で測定される蛍光の増大を導き(カルシウム放出に起因)、また実験の第2部で測定される蛍光の増大を阻む(受容体の同種脱感作に起因)。
【０２５２】
対照:
MIN対照(CHO-NFAT-WT + 30μlカルシウムローディング液 + 5μl HBSS, HEPES 20mM/6% DMSO、および実験の第2部ではさらに+ 25μl 7.2μM SLIGRL)およびMAX対照(CHO-NFAT-PAR2-Mut2 + 30μlカルシウムローディング液 + 5μl HBSS, HEPES 20mM/6% DMSO、および実験の第2部ではさらに+25μl 7.2μM SLIGRL)を使用した。
【０２５３】
試験化合物の調製:
ポリプロピレン製384穴プレートを使用して試験化合物をHBSS, HEPES 20mMで希釈した。ウェル中のDMSOの終濃度は6%以下とするのがよい。
【０２５４】
SLIGRL溶液(Neosystem ref. SP001568C)の調製:
SLIGRL 1mgを8.355ml HBSS, HEPES 20mMに加え、次いで107.68ml HBSS, HEPES 20mMを加えて、7.2μMのSLIGRL溶液とした。
【０２５５】
IC50の計算
実験の第2部では、実測蛍光の、試験化合物の不存在下での実測蛍光と比較した場合の阻害が観測された。これは拮抗薬、作用薬どちらでも観測された。そこで、この曲線の第2部で試験した化合物濃度ごとの阻害率を次式から求めた:
【０２５６】
[(UF拮抗薬/作用薬)−(UF min)／(UF CHO-NFAT-PAR2-mut2)−(UF min)]×100
【０２５７】
ただし、
UF拮抗薬/作用薬: 化合物の存在下に測定した蛍光ユニット;
UF min: CHO-NFAT-WT細胞の存在下に測定した蛍光ユニット(=min);
【０２５８】
UF CHO-NFAT-PAR2-mut2: CHO-NFAT-PAR2-mut2の存在下、試験化合物の不存在下に測定した蛍光ユニット(=max)。
【０２５９】
曲線[%阻害=f(化合物濃度)]を描き、次いで50%阻害に至る化合物濃度すなわちIC50を導き出した。
【０２６０】
F2)  トリプシン30nM/CHO-NFAT-PAR2-WTの使用によるPAR-2の活性化
実験前日、細胞を384穴プレートのDMEM培地(50μl)に25000個/ウェル播いた。
実験当日、培地を(プレートを裏返しにして)捨てた。各ウェルに50μlのHBSS, HEPES 20mMを加え、次いでプレートを裏返しにしてバッファーを捨てた。
カルシウムキットのローディング液(前記の要領で調製)10ml、10mlのHBSS, HEPES 20mMおよび200μlのプロベネシド250μMを混合し、この溶液をウェルあたり30μl加えた。次いでプレートを37℃、5%CO2で2時間インキュベートした。
【０２６１】
次いで行われる実験は2部に分かれた:
−FLIPRを使用してまず5μlの試験化合物を細胞に加え、蛍光を90秒間に測定した。
−実験の第2部ではFLIPRを使用して25μlの72nMトリプシンを加え、蛍光を再び90秒間に測定した。
【０２６２】
拮抗薬化合物の効果:
拮抗薬は曲線の第1部で測定される蛍光に何の効果も及ぼさず、また実験の第2部で測定される蛍光の、トリプシンだけで測定した曲線と比較した場合の増大を阻む。
【０２６３】
作用薬化合物の効果:
作用薬は曲線の第1部で測定される蛍光の増大を導き(カルシウム放出に起因)、また実験の第2部で測定される蛍光の増大を阻む(受容体の同種脱感作に起因)。
【０２６４】
対照:
MIN対照(CHO-NFAT-WT + 30μlカルシウムローディング液 + 5μl HBSS, HEPES 20mM/6% DMSO、および実験の第2部ではさらに+ 25μl 72nMトリプシン)およびMAX対照(CHO-NFAT-PAR2-WT + 30μlカルシウムローディング液 + 5μl HBSS, HEPES 20mM/6% DMSO、および実験の第2段階ではさらに+25μl 72nMトリプシン)を使用した。
【０２６５】
試験化合物の調製:
ポリプロピレン製384穴プレートを使用して試験化合物をHBSS, HEPES 20mMで希釈した。ウェル中のDMSOの終濃度は6%以下とするのがよい。
【０２６６】
トリプシン溶液の調製:
トリプシン1mgを41.6ml HBSS, HEPES 20mMに加え、次いでこの溶液7mlを90ml HBSS, HEPES 20mMを加えて、72nMのトリプシン溶液とした。
【０２６７】
IC50の計算
実験の第2部では、実測蛍光の、試験化合物の不存在下での実測蛍光と比較した場合の阻害が観測された。これは拮抗薬、作用薬どちらでも観測された。そこで、この曲線の第2部で試験した化合物の濃度ごとの阻害率を次式から求めた:
【０２６８】
[(UF拮抗薬/作用薬)−(UF min)／(UF CHO-NFAT-PAR2-mut2)−(UF min)]×100
【０２６９】
ただし、UF拮抗薬/作用薬: 化合物の存在下に測定した蛍光ユニット;
【０２７０】
UF min: CHO-NFAT-WT細胞の存在下に測定した蛍光ユニット(=min);
【０２７１】
UF CHO-NFAT-PAR2-mut2: UF CHO-NFAT-PAR2-mut2の存在下、試験化合物の不存在下に測定した蛍光ユニット(=max)。
【０２７２】
曲線[%阻害=f(化合物濃度)]を描き、次いで50%阻害に至る化合物濃度すなわちIC50を導き出した。
【０２７３】
F3)  結果
IC50が10μM未満の拮抗薬化合物がいくつか発見された。IC50が0.2μM未満の作用薬化合物もまた種々発見された。
【０２７４】
G)  結合評価試験
G1)  改変型PAR-2を使用する結合評価試験
約85%コンフルエンスまで増殖させた細胞を含EDTA生理食塩水中で解離させ、低速度遠心分離で回収し、25mM HEPES+0.1% (w.v)BSA添加のEarle’s平衡バッファーpH 7.5中に約3.5×106個/mlの濃度に懸濁させた。逓増濃度の無標識競合ペプチドの不存在下または存在下に分取量(終容量0.2ml)の細胞懸濁液3セットを106 cpm [3H]プロピオニル-tc-NH2(約3.5nM)と共に、4℃で1時間、インキュベートする。インキュベーション後、予め0.5% PEIで処理しておいたPackardフィルタープレート(GF/B)による結合反応液の急速ろ過により反応を終了させる。フィルタープレートをバッファーで2回洗浄し、フィルター上の残留放射能をPackard Topcountで計数する。特異的結合の大きさは、競合リガンドの不存在下での放射性リガンドの総結合量から過剰量(100μM)の無標識tc-NH2の存在下での放射能結合量を差し引いて求める。
【０２７５】
G2)  改変型PAR-1を使用する結合評価試験
本発明の改変型PAR-1を使用する結合評価試験は前掲Ahn et al., 1997に記載のプロトコールに従って行うことができる。
【０２７６】
H)  選択性評価試験
細胞内カルシウム濃度の上昇を測定する機能性評価試験はPAR-1またはPAR-4の刺激後に行う。これにより、発見された調節物質がPAR-2特異的であることを確認することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
【図１】図1:  酵素的切断によるPAR活性化機構。原形質膜中のPARタンパク質の7膜貫通ドメインの構成、およびそのGタンパク質(長円体)との会合を示す。プロテアーゼによる切断で放出された内因性リガンドはブラックボックスで示す。EC、ICおよびTMはそれぞれ細胞外、細胞内および膜貫通を意味する。
【図２】図2:  短縮型PAR-2受容体の例。CSはプロテアーゼ切断部位であり、TMIとTMIIは最初の2膜貫通ドメインである。センスBamHIプライマーとアンチセンスSfiプライマーはベクターMut2、Mut3およびMut4の構築に使用することができる。Mut2、Mut3およびMut4コンストラクトは本発明の改変型PAR-2ポリペプチドである。  Mut2: 内因性活性化リガンドの欠失。Mut2は成熟野生型PAR-2のアミノ酸1〜12の欠失に対応する。  Mut3: N末端領域の最初の20アミノ酸の欠失。これはベクター構築の最初のアミノ酸から計算したものである。Mut3は成熟野生型PAR-2のアミノ酸1〜26の欠失に対応する。  Mut4: TM1に先立つN末端領域の最初の20アミノ酸の欠失。これはベクターの最初のアミノ酸から計算したものである。Mut4は成熟野生型PAR-2のアミノ酸1〜37の欠失に対応する。  本願では、特に断らない限り、アミノ酸の番号とアミノ酸の範囲はPAR前駆体の最初のアミノ酸から起算している。
【図３】図3: ベクターPAR-2Mut2構築戦略。元々のベクターPOMC-Flag-PAR-2-12CA5はプロオピオメラノコルチン(POMC)のシグナルペプチド(黒で表示)をコードし、Flagエピトープ(白で表示)、PAR-2前駆体のpre-pro領域の一部(四角)、および成熟PAR-2タンパク質(内因性リガンド)(点)、アミノ酸43〜120(波線)および121〜397(ハッチ)を含む。CSはプロテアーゼ切断部位である。天然のSfiI制限部位と突然変異誘発で形成されたBamHI制限部位も示している。センス(BAM-HI S)およびアンチセンス(SfiI AS) PCRプライマーは、PAR-2のアミノ酸43〜120をコードしかつ5’位にBam HI制限部位を、3’位にSfiI制限部位を含む領域(Mut2 PCR断片)を増幅するために使用した。
【図４Ａ−Ｂ】図4: 改変型PAR受容体の活性。  図4A: CHO-PAR-2Mut2細胞上に作製した標識を代表する点の概要。非刺激CHO-PAR-2Mut2細胞は左手の表に、また刺激細胞(30μmの合成リガンドSLIGRL-NH2で刺激)は右手の表に、それぞれ出ている。  図4B: CHO-PAR-2Mut2細胞上に作製した標識を代表する点の概要。  図4Aおよび4Bでは、モノクローンの獲得を目的に非構成的βラクタマーゼを選択試薬として、βラクタマーゼシグナルを発する細胞を単離、培養、回収する(右手の表のR3領域)。
【図５】図5: CHO-NFAT-PAR-2WTおよびCHO-NFAT-PAR-2Mut2細胞中の、外因性ペプチドSLIGRL-NH2による刺激後の蛍光発光: 濃度効果曲線。各点は、同じモノクローンに由来する5つの複製細胞サンプルに関する蛍光反応の平均比(±SEM、バー)を表わす。
【図６】図6: CHO-NFAT-PAR-2WTおよびCHO-NFAT-PAR-2Mut2細胞中の、トリプシンによる刺激後の蛍光発光: 濃度効果曲線。各点は、同じモノクローンに由来する5つの複製細胞サンプルに関する蛍光反応の平均比(±SEM、バー)を表わす。
【図１】
2005531311.tif 000003
【図２】
2005531311.tif 000004
【図３】
2005531311.tif 000005
2005531311.tif 000006
【図５】
2005531311.tif 000007
【図６】
2005531311.tif 000008
【配列表】
2005531311000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月11日(2004.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型PAR-2受容体に関するSLIGRL外因性リガンドと相互作用することができる修飾PAR-2ポリペプチド及びその機能性変異体であって、その成熟ポリペプチドの最初の残基からその内因性活性化ペプチドの最後のC末端残基までにわたる領域が欠失されており、かつ、当該外因性リガンドは、野生型PAR-2受容体についてのED50よりも少なくとも5、10又は50倍低い上記修飾PAR-2ポリペプチドについてのED50を有し、ここで、当該ED50は、最大蛍光比の50％を達成するために必要なSLIGRL-NH2の濃度により定められ、当該蛍光は、フルオスター（Fluostar)(商標）蛍光計を用いて計測され、励起は、405nmにおいて生じ、そして放射は、460nmと535nmの両者において記録され、当該蛍光比（460nm／535nm）は、バックグラウンド・ノイズ（細胞のない媒質）を差し引いた後に推定される、前記修飾PAR-2ポリペプチド及びその機能性変異体。
【請求項２】
SEQ ID NO:4より選択される配列を有する、請求項1に記載の改変型ポリペプチドおよびその機能性変異体。
【請求項３】
請求項1または2に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレチオド。
【請求項４】
(i) SEQ ID NO:4のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(ii) SEQ ID NO:1のポリヌクレオチド;
(iii) (i)または(ii)に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、かつ、請求項1または2に記載の修飾PAR-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
(iv) (i)、(ii)または(iii)に記載のポリヌクレオチドと少なくとも75%の同一性を有し、かつ、請求項1または2に記載の修飾PAR-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド; および
(v) 請求項1または2に記載の修飾PAR-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、遺伝暗号の縮重のためにポリヌクレオチド(i)、(ii)、(iii)または(iv)とは配列が異なるポリヌクレオチド:
より選択される、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項3または4に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項3〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項７】
野生型PAR受容体を発現しない、請求項6に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記修飾PAR-2ポリペプチドの活性を検出または測定するためのレポーター遺伝子をも発現する、請求項6または7に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
請求項1または2に記載の修飾PAR-2ポリペプチドの製造方法であって、
a)  前記修飾PAR-2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得するステップ;
b)  当該ポリヌクレオチドをプロモーターと機能的に結合させて発現ベクターに挿入するステップ; および
c)  当該ポリヌクレオチドから前記修飾PAR-2ポリペプチドを産生させるステップ
を含む前記方法。
【請求項１０】
PAR-2活性調節化合物をスクリーンニング、選択または特定する方法であって、
a)  試験化合物を、請求項1または2に記載のPAR-2ポリペプチドと接触させるステップ; および
b)  前記修飾PAR-2ポリペプチドに結合する化合物を選択するまたは前記修飾PAR-2ポリペプチドの活性を測定するステップ
を含む前記方法。
【請求項１１】
a)  試験化合物を請求項1または2に記載のPAR-2ポリペプチドに接触させるステップ; および
b)  前記修飾PAR-2ポリペプチドに結合する化合物を選択するステップ
を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
a)  試験化合物を請求項1または2に記載の修飾PAR-2ポリペプチドに接触させるステップ; および
b)  当該修飾PAR-2ポリペプチドの活性を測定するステップ
を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
a)  請求項1または2に記載の修飾PAR-2ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を好適な培地中に準備するステップ;
b)  当該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c)  ステップb)で得られた培地に基準リガンドを添加するステップ;
d)  前記修飾PAR-2ポリペプチドの活性を測定するステップ; および
e)  ステップd)で求めた前記修飾PAR-2ポリペプチドの活性を、ステップb)を省略した場合の前記修飾PAR-2ポリペプチドの活性と比較するステップ
を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記修飾PAR-2ポリペプチドの活性を、カルシウム放出の測定を介して計測する、請求項12または13に記載の方法。
【請求項１５】
前記修飾PAR-2ポリペプチドの活性を直接測定する、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
a)   修飾PAR-2ポリペプチドと請求項8に記載のレポーター遺伝子を同時発現する組換え宿主細胞を準備するステップ;
b)  該培地に所望濃度の試験化合物を添加するステップ;
c)  ステップb)で得られた培地に基準リガンドを添加するステップ;
d)  レポーター遺伝子の発現を測定するステップ; および
e)  ステップd)で求めたレポーター遺伝子の発現を、ステップb)を省略した場合のレポーター遺伝子の発現と比較するステップ
を含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換え宿主細胞がCHO細胞株からなる、請求項12〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記レポーター遺伝子がβラクタマーゼ遺伝子である、請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
前記βラクタマーゼ遺伝子がCa2+イオン感受性NFATドメインを含むプロモーターの制御下に置かれる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記基準リガンドがSLIGRL、SLIGKV、SLIGR、プロピオニル-tc、trans-シンナモイル-LIGRLOおよびSFLLRからなる群より選択される、請求項10〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記基準リガンドがSLIGRLである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
PAR-2活性調節化合物のin vitroにおけるスクリーニング、選択または特定のためのキットであって、
a)  請求項1または2に記載のポリペプチドまたは請求項6〜8のいずれか1項に記載の組換え宿主細胞;
b)  場合により、前記PAR-2ポリペプチド活性の測定を実施するために必要な試薬
を含む前記キット。
【請求項２３】
少なくとも1つのPAR-2受容体の活性を調節する化合物の選択のための、請求項1または2に記載のポリペプチド使用。
【国際調査報告】
2005531311.tif 000009
2005531311.tif 000010
2005531311.tif 000011
2005531311.tif 000012
2005531311.tif 000013
2005531311.tif 000014