(57)【要約】  単分散コロイドを積層法により多価電解質で被覆した。鋳型芯は内部に留まるか、または溶解することができる。種々の蛍光染料の所定量を多価電解質に共有結合する。染料の量は、標識含量を変化させるか、または未標識ポリマーを共沈させることによって制御する。異なる染料層は中間層によって互いに隔離され、その結果、不要な相互作用を抑制できる。従来、FRETシグナルは、短い距離(0−6nm)において適当な染料ペアの間で生じることができ、このシグナルは、中間層の数によって染料濃度を独立に制御することができる。カプセルコードは、励起および発光波長を変化させることにより解読される。溶液から補足物質を補足する高分子はカプセルに固定化できる。この方法でコートされた粒子または中空カプセルは、感受性中間層を導入した後に、センサーとして使用できる。中間層の寸法/構造の変化は、隣接する標識多価電解質層間で生じるFRETによって、または感受性層中の染料の自己消失/凝集蛍光によって検出できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００μｍ未満の粒径を有し、かつ少なくとも３個の多価電解質層を含み、これら３個の多価電解質層の少なくとも１個は少なくとも１個の染料で標識されている包膜を有するカプセル。
【請求項２】
３個の多価電解質層の２個は、各々の場合、少なくとも１個の異なる染料で標識されており、異なる染料で標識されている２個の多価電解質層は、染料類で標識されていない少なくとも第３の多価電解質層によって互いから隔離されていることを特徴とする請求項１に記載のカプセル。
【請求項３】
染料類で標識されていない第３の多価電解質層が、０．１ｎｍと１０ｎｍの間の厚さを有することを特徴とする請求項２に記載のカプセル。
【請求項４】
染料類で標識されていない第３の多価電解質層が、その環境条件が変化する時に膨潤または収縮し、かくてその厚さが変えられる、高感度層であることを特徴とする請求項２または３に記載のカプセル。
【請求項５】
環境条件が、ｐＨ、塩濃度、温度、吸着成分、酵素、物質の濃度、物理パラメーター、溶媒に影響しまたは高感度層と反応する成分、および混和可能な溶媒成分であることを特徴とする請求項４に記載のカプセル。
【請求項６】
異なる染料類が、高吸収エネルギーの染料（供与体）および低吸収エネルギーの染料（受容体）であることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項７】
異なる染料類間でフェルスター（蛍光）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こることを可能にするよう、異なる染料類がお互いに配位していることを特徴とする請求項２〜６のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項８】
染料類で標識されていない、さらなる多価電解質層が、染料類で標識されている多価電解質層間、および染料類で標識されていない第３の多価電解質層のそばに位置する、さもなければ染料類で標識されていない第３の多価電解質層が、それ自身、いくつかの多価電解質層からなることを特徴とする請求項２〜７のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項９】
高感度層が、有機多価電解質層であることを特徴とする請求項２〜８のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１０】
染料が、高濃度で高感度の材料に共有的に結合していることを特徴とする請求項１に記載のカプセル。
【請求項１１】
高感度材料が、その環境条件が変化する時に、膨潤または収縮し、かくてその容積が変えられる材料であることを特徴とする請求項１０に記載のカプセル。
【請求項１２】
環境条件が、ｐＨ、塩濃度、温度、吸着成分、酵素、物質の濃度、物理パラメーター、溶媒に影響しまたは高感度物質と反応する成分、および混和可能な溶媒成分であることを特徴とする請求項１１に記載のカプセル。
【請求項１３】
染料の濃度が高いので、染料が、二量体、それ自身の凝集体またはエキサイマー（励起二量体）を形成し、後者は蛍光の自己消光または新たな発光帯の生成に至らせることを特徴とする請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１４】
染料の濃度が、次の関係、即ち、
高感度材料の質量：染料の質量  ＜  ５００：１を満たすことを特徴とする請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１５】
染料−標識層が、１ｎｍ〜１μｍの厚さを有することを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１６】
染料類で標識されている多価電解質層が、染料類で標識されている有機多価電解質層であることを特徴とする請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１７】
染料類が、蛍光染料類またはナノ粒子を放出することを特徴とする上記請求項群のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１８】
それが中空であり、かつ巨大分子が、包膜によって境界が規定される内部空間に位置することを特徴とする上記請求項群のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１９】
包膜が、所定の寸法迄の分子に対して透過性であることを特徴とする上記請求項群のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項２０】
それが、包膜によって取り囲まれる固体芯部を有することを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項２１】
それが、１０μｍ未満の、好ましくは１μｍ未満の、平均粒径を有することを特徴とする上記請求項群のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項２２】
それが、一層毎の積層方法によって調製されることを特徴とする上記請求項群のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項２３】
それが、工業生成物、粒子、細胞、組織、器官、または生物起源の有機体を標識化または符号化するために使用されることを特徴とする上記請求項群のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の少なくとも２種の異なるカプセルを含むことを特徴とする物質類の同定用、または標識用の組成物。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の少なくとも３種の異なるカプセルを含むことを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、積層法によって調製される中空または内実の多価電解質のカプセルをベースとするコンビナトリアルライブラリーに関する。積層法により、ナノメーター規模での色素分子の個数、濃度および分子間距離が制御でき、このためその内部または表面に着色コード化された粒子（ビーズ、固体微粒子）が有するとされるよりも多量のコード化情報を壁（外皮）の中に保有することになる。更に、蛍光性色素は完全に表面に濃縮され、このことは均質な粒子の分析において蛍光共鳴エネルギー転移をベースとする検知にとって有利なことである。何故なら、粒子の内部に存在するため、蛍光共鳴エネルギー転移には関与しない色素の高い背景蛍光が全く存在しないからである。本発明の第二部は、小さな分子に対してはカプセルの透過性を維持しながら、異なった高分子をカプセルに充填できる可能性について述べる。このような性質を有し着色コード化したカプセルは、反応混合物から相当量の特定の物質を取出すことができるコンビナトリアル捕捉貯蔵体として使用できる。従って、種々のカプセルはその内部に種々の物質を含んでおり、その物質特定の蛍光シグナルを基準にして分類できる。これらのコンビナトリアルライブラリーは医学、生物学および化学の多くの分野で使用できる。
【背景技術】
【０００２】
分析容量を更に増加させる目的で分析や滴定の極板を微小化できる程度には限度がある。ビーズに基づくライブラリーは別法の可能性に道を開いている。フローサイトメトリーにおける新しい開発（例えば、ＣＯＰＡＳ（Ｒ）ビーズフロー分類）により１秒当たり１００，０００個までの粒子の処理が可能である。このため、ビーズに基づくライブラリーはスクリーニングや収集操作で、主要技術になる可能性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明者らは多価電解質から中空のカプセルを調製し、そのカプセルの壁に異なった着色の組合せを含ませた。着色コード化されたカプセルはビーズと同類に分類されるが、カプセルは中空であり、その壁面および内部に多くの結合サイトを有することができる。
【発明の効果】
【０００４】
これらのカプセルには、ビーズ技術に比較して種々の利点がある。
【０００５】
１．カプセルの質量が非常に小さいから、種々の密度の溶液からの沈殿速度がビーズに比べて実質的に小さい。
【０００６】
２．カプセルの壁が薄いこと、およびカプセルの内部に外部と同じまたは類似の物質が存在するため、光の散乱が非常に少ない。ビーズの場合はビーズと溶液（通常、水）の間の屈折率の差によって光の散乱の程度が大きく、このためフローサイトメーターでの分類プロセスに障害をきたす。
【０００７】
３．ビーズの場合、反応はその表面でのみ起こる。従って、ビーズが所有する結合サイトの数は非常に限定される。本発明のカプセルの場合、カプセルの壁の外表面、壁の内表面および全体積を反応に使用できる。直径が５μｍのカプセル（またはビーズ）の外表面は７８μｍ2であり、体積は６５μｍ3である。結合サイトの濃度を０．１Ｍと仮定すれば、ビーズには約９×１０4個の結合サイトしかないのに対し、カプセルには約５，０００倍の結合サイト、即ち４×１０8個の結合サイトがある。
【０００８】
４．Ｈ凝集体またはＪ凝集体の生成、自己消光またはフェルスター共鳴エネルギー転移のような相互作用を避けるのに適した間隔で色素標識を付着させることができる。固体相が種々の色素で標識化される時に、上記の相互作用は全て蛍光性信号と相互干渉する。この相互干渉が避けられればコンビナトリアル可能性が更に増加する。
【０００９】
５．商標の偽造防止コーディングをより確実にするため、即ち商標をつけた製品に標識を付けるために、フェルスター共鳴エネルギー転移信号を制御された手法で設定できる。
【００１０】
６．カプセルの内部空間には酵素、ＤＮＡ等のような非常に生物活性の強い化合物、または特別に機能化された多価電解質を充填できる。これらの化合物により、共反応体を生化学反応、物理吸着または化学吸着によって溶液から選択的に分離できる。かくて、コード化されたカプセルを分類できる。
【００１１】
７．コード化された情報を、色素の数、色素相互の関係によって、更に例えばフェルスター共鳴エネルギー転移のような距離に左右される色素間の相互作用によって設定できる。既知の蛍光ビーズ場合では、色素分子間の距離が制御できないからこのような相互作用は望ましくない。
【００１２】
８．コード化された中空カプセを調製することができ、高分子（多価電解質、蛋白質および酵素）を固定化するために、その内部空間が使用できる。機能化された高分子は、物理吸着、化学吸着または生物学的な結合によって反応溶液から補足的な化合物を取出し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、直径が１００μｍ未満のコロイド上に積層法によって構築され、化学物質または物理的パラメーターに反応するセンサーに関する。コロイドの鋳型を適宜、次の工程で浸出させることができ、中空のカプセルが形成される。
【００１４】
特別な材料から成り規定の厚みを有する層が、その接している溶液中のある物質の濃度変化または物理的パラメーターの変化に応じて膨潤または収縮することによって、センサー効果が発揮される。蛍光色素の発光がこのプロセスを検知するのに使われる。次の２種類の作用様式が可能である（図８）。
【００１５】
１．０．１ｎｍ乃至１０ｎｍの厚みの感知層が、多価電解質から成る二つの層の間に取付けられている。感知層の片面側の多価電解質層は、高い吸収エネルギーを有し、しっかりと結合している蛍光色素（供与体）を含んでおり、一方、他の側の多価電解質は、低い吸収エネルギーを有する蛍光色素（受容体）を含んでいる。蛍光色素の代わりに微粒子放射も使用できる。フェルスター（蛍光）共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が起こるように色素ペアが配位される。ＦＲＥＴの効率は二つの色素分子間の距離に鋭敏に影響される。ＦＲＥＴ信号は、供与体蛍光または受容体蛍光のどちらかを使用する静的な方法、または供与体蛍光を使用する時間依存性のある方法により分光法的に検知できる。
【００１６】
２．感知物質は比較的高濃度で蛍光色素に共有結合している（感知物質の質量：色素の質量＜５００：１）。色素は自ら容易にダイマー／凝集体を形成するという特徴がある。標識を付けた物質が、１ｎｍ乃至１μｍの厚さを有する少なくとも１層の均一な層としてのカプセル壁に導入されると、Ｊ凝集体またはエキサイマーが形成される時の低エネルギーの新しい発光帯が現れる反面、ダイマーまたはＨ凝集体の生成に関連して自己消光プロセスが起こり、色素モノマーの蛍光性がなくなることにつながる。カプセル壁の中の層が膨潤／収縮する時の信号を、モノマーの蛍光の強度または寿命によって、またはＪ凝集体またはエキサイマーの蛍光に対するモノマーの蛍光の比率によって検知できる。
【００１７】
本発明によるカプセルは、１００μｍ未満の直径を有するのが好ましく、一般に、少なくとも３層の多価電解質の層から成る外皮を有しており、この３層の多価電解質の層の内１層は少なくとも１種の色素で標識化されている。この色素は、蛍光色素であってもまたは放射性（蛍光性）の微粒子（好ましくは、粒径が１ｎｍ未満の粒子）であってもよく、例えばカプセルを識別するのに役立つ。この場合、カプセルは工業製品、粒子、および生物に由来する細胞、組織、器官または有機体に標識を付けまたはコード化するのに使用される。かくて上記後者の生物由来のものの起源が、色素の蛍光をベースに確定し識別できる。一方、カプセルは色素の蛍光を変更させることで、環境条件の変化に明確に反応するセンサーとしても使用できる。最後に、カプセルは溶液から物質を除去および／またはその物質を識別するための「捕捉性貯蔵体」としても使用できる。異なった色素の標識を付け、そして個々の場合に例えば特定の結合サイトによって異なった物質と特定的に反応するカプセルは、物質および／または標識プロセスを識別するための記録用粒子のライブラリーとして使用するのに適している。これらの用途を夫々組合せることは、本発明の範囲内である。
【００１８】
本発明の範囲内では、「多価電解質」は特に少なくとも２価の電荷、好ましくは３価の電荷を有する水溶性分子または凝集体であると理解される。多くの多価電解質では、実質的に更に多くの電荷も存在する。本発明の範囲内では、多価電解質には特に有機多価電解質、微粒子、多価両性電解質、および有機多価電解質と界面活性剤のような低分子量物質から成る化合物および複合体が挙げられる。
【００１９】
多価電解質の層は、特に、対応する多価電解質の約１単分子層の厚みを実質的に有する層である。このような多価電解質の層は、例えば積層法によって積重ねられる。この方法では、極性が交互に変わる多価電解質を、既存の層上の電荷が飽和するまで順次積み重ねていく。
【００２０】
異種の多価電解質層から成る多価電解質の多層カプセルも、例えば、ドイツ特許１９８  １２  ０８３Ａ１号、ドイツ特許１９９  ０７  ５５２Ａ１号、欧州特許９８  １１３  １８１号、ＷＯ／４７２５２号および米国特許６，４７９，１４６号に記載される積層法に従って調製でき、これらの特許の開示された内容全体を本明細書に参考として載せてある。
【００２１】
カプセルがセンサーとして使用される限り、３層の外皮層の内の２層は、例えば夫々異なった色素で標識化され得る。蛍光色素の標識を付けていない第３の多価電解質層は従って標識を付けた２層の多価電解質層の間に位置する。この結果、後者の２層は、標識を付けていない中央の第３の層の厚み、例えば０．１ｎｍ乃至１０ｎｍにおよそ相当する距離だけ相互に隔たっている。ここで、多価電解質層の厚みは、なかんずく使用される多価電解質に依る。使用される色素は個々の色素が異なった発光帯および吸収帯を呈するよう、そして、一つの色素の発光帯が他の色素の吸収帯に少なくとも部分的に重なり合うように選ばれる。この結果、放射のない転移、即ちＦＲＥＴが色素間で起こり得る。この方法によって、高い吸収エネルギーを有する色素（受容体）は、自身が発する蛍光は観測されずに、その励起状態を他の色素（低い吸収エネルギー有する色素；供与体）に伝え得る。従って、放射のない転移は供与体色素の励起に繋がり、その発する蛍光を測定できる。例えば受容体が青色で吸収し緑色で蛍光を発するならば、供与体色素は緑色で吸収し、例えば赤色で蛍光を発する。従って、青色光での励起の結果、色素間の放射のない転移に関連して、緑色ではなく赤色での蛍光が観察される。色素分子間の放射のない転移の効率は、分子間距離に強く依存し、この距離は標識を付けていない第３の多価電解質層の厚さによって決まる。例えば環境条件の変化に反応して、この厚さが変化すれば、色素分子間の結合の強さが変ってくる。従って、この層に感度がある（センサー中間層）と考えることも可能である。色素分子間の距離が短い時は、実質的に放射のない転移がおこる、即ち受容体色素の蛍光が殆どなく、供与体色素の比較的高い蛍光を検知できる。距離が長くなると、受容体色素の蛍光が増加する一方、供与体色素の蛍光が減少する。このような変化は測定でき、層厚さの変化を知る尺度の役目をする。標識を付けていない層の厚さに変化を及ぼす環境条件としては、ｐＨ、塩濃度、温度、吸着される成分、酵素、物質の濃度、物理的パラメータ、溶媒に作用するかまたは感知層と反応する成分、および混和性の溶媒成分が挙げられる。特に有機多価電解質は環境条件変化に鋭敏に反応する。例えば、温度変化により、有機多価電解質の水を取込む能力が変化し、この結果、層の厚さが変化する。この種の例にＰＡＨがある。
【００２２】
標識が付いていない多価電解質層に加えて、更なる多価電解質層を色素の標識を付けた多価電解質層の間に入込むことができ、更には標識が付いていない多価電解質層自身がいくつかの多価電解質層から成ることも可能である。
【００２３】
しかし、センサーカプセルは１種の色素で標識を付けられるに過ぎない。この場合、色素は多価電解質層の中で感知性材料と高濃度で結合し、この感知性材料は環境条件の変化に対して体積の増減によって反応できる。色素の濃度が高いことが、例えば二量体生成の結果としての自己消光に繋がり、またはエキサイマーが生成する時の新しい発光帯の生成に繋がる。この場合もまた、これらのプロセスは色素分子間距離に大きく依存しており、層厚の変化が色素分子間距離の変化に繋がってもいる。
【００２４】
カプセルが「捕捉性貯蔵体」として使用される時には、捕捉される分子のための特定の結合サイトがカプセルに備わっている。結合サイトはカプセルの内部または外皮上に存在できる。異なった結合サイトを有するカプセルには、のちに蛍光をベースにしてカプセルを分類できるように、異なった色素の標識を付け得る。このように、溶液から物質、例えば蛋白質を選択的に分離できる。
【００２５】
実験の説明
多価電解質に色素で標識を付ける
ＰＡＨに、色素誘導品であるフルオレセインイソチオシアネートおよびテトラメチルローダミンイソチオシアネートおよびＣＹ５の誘導品で標識を付けた。これらの構造式は図１に示されている。標識化反応は蛋白質を標識化する時の一般的な方法に従って行われた。ＰＡＨ基の約３０％を活性化するために、炭酸水素塩の緩衝液の代わりにＮａＯＨを使用した。反応混合物を水から透析した。標識を付けたＰＡＨの溶液のｐＨを４〜５に調整するためにＨＣｌを加えた後に、この溶液を凍結乾燥した。標識が付けられた含有量はＵＶ／Ｖｉｓ分光分析によって測定し、ＰＡＨ−Ｆｌの場合は５３：１、ＰＡＨ−Ｒｈｏの場合は５８０：１、ＰＡＨ−Ｃｙ５の場合は５００：１であった（ＰＡＨ単位：標識を付けられた分子の数の比）。標識化の収率はフルオレセインの場合で約８０％、ローダミンの場合で約２０％、そしてＣｙ５の場合で約４０％であった。個々のＰＡＨは一つの色素で標識を付けられたに過ぎなかったが、これは、ＰＡＨ鎖に同時に標識を付けることが自己消光やフェルスター共鳴エネルギー転移を生じさせるという欠点を潜在的に有していることに依る。
【００２６】
色素の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルは、夫々図２ａおよび２ｂに示されている。標識を付けられた３種のＰＡＨポリマーの吸収極大値の測定値は４９５、５５７および６４８ｎｍであった。励起に吸収波長を使用した場合の蛍光極大値の測定値は５２０、５８２および６６５ｎｍであった。
【００２７】
カプセルの調製
粒径が３μｍのシリカ製鋳型にポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＨ、分子量６０，０００ｇ／ｍｏｌ）およびポリスチレンスルホン酸塩（ＰＳＳ、分子量７０，０００ｇ／ｍｏｌ）を交互に合計１０層コーティングした。識別し得る壁を得るために、コーティングには異なった標識を付けたＰＡＨポリマーを使用した。コーティングされたＰＡＨの１層のみをカプセルの着色に使用した。Ｃｙ５の場合のみ標識付けに２層を用いたが、これは蛍光の量子収率が低いことおよび色素含有量が低いことによる。フェルスター共鳴エネルギー転移を避けるために、異なった色素層の間に一定の間隔を維持するように努めた。次に示すカプセルを調製した。
【００２８】
【表１】
2005534931.tif 000003
表１：種々の型のＰＡＨ−色素層を含む色素コード化されたカプセル
【００２９】
フッ化水素酸を用いてシリカ鋳型を浸出させ、水洗して中空のカプセルを得た。
【００３０】
共焦点レーザ走査顕微鏡法で、同時に３チャンネル（図３ａ〜ｃ）を使用してカプセルを調べた。レーザの励起波長は、フルオレセインの場合は４８８ｎｍ、ローダミンの場合は５４３ｎｍ、そしてＣｙ５の場合は６３３ｎｍであった。色素の発光を最大にし、その蛍光発光の重なりを最小にするように検出器を設定した。個々のチャンネルについて信号の強さが略等しくなるように、レーザ強度および検知器感度を調整した。３チャンネルが重合さって、７種の異なった着色のカプセルを示した(図３ｄ)。
【００３１】
カプセル内の縦断面に沿って蛍光強度を分析することは、種々のカプセルを識別する定量的で信頼性の高い方法である。同一カプセルの異なったチャンネルの蛍光強度の分布が縦断面に現れる。例えば、カプセル２、７、１および５の縦断面が図４ａに示される。
【００３２】
１色素層あたりの蛍光強度は、着色が異なるカプセルで異なっており、これは共鳴エネルギー効果のためであり、吸着されている物質の含有量が異なるためである。色素層の間に数層を挿入することで、共鳴エネルギー転移を著しく減少させ得る。間隔が６ｎｍ（約４層）を超えると、色素分子間の相互作用は実質的になくなる。
【００３３】
制御されたフェルスター共鳴エネルギー転移
商標が偽造されるのを防ぐ目的で、色素分子間の一定の間隔を使用するために、色素間の間隔は異なるが、色素の含有量は同じカプセルを調製した。図５に調製された層の組合せを示す。
【００３４】
２種の色素によってカプセル内にコード化された情報は、異なった２種の励起波長を使用し、異なった２種の波長で蛍光を測定することによって読取ることができる。ローダミン／フルオレセイン系の場合、このことは次の３項のことを意味する。
【００３５】
１．励起光波長５４０ｎｍ、発光の測定波長５７６ｎｍ：読取られる情報はローダミンの絶対濃度である。
【００３６】
２．励起光波長４９５ｎｍ、発光の測定波長５２０ｎｍ：読取られる情報はフルオレセインの濃度から、ローダミンへのエネルギー転移をしている分子の濃度を差引いたものである。
【００３７】
３．励起光波長４９５ｎｍ、発光の測定波長５７６ｎｍ：読取られる情報はＦＲＥＴの強度または色素分子間の平均間隔である（偽造の検知）。
【００３８】
調製された個々の型のカプセルから信号１：信号２：信号３の特定の比率が得られる。信号強度のわずかの相違も測定できるから、多くのコード化の将来性を実現するために、この二つの色素だけで既に十分である。しかし、カプセル内の色素の数は７まで可能である。
【００３９】
フェルスター共鳴エネルギー転移をセンサー用途に使用する
表１のカプセル２と３がセンサー用途に使用された。分子鎖長によっては、ＰＡＨ／ＰＳＳ層は第四アルキルアンモニウム塩の溶液が添加されると強く膨潤または収縮することがわかった。（ＰＡＨ／ＰＳＳ）5カプセルは臭化ドデシルトリメチルアンモニウム（ＤＯＤＡＢ）の０．０５Ｍ溶液を添加すると、３μｍから５．７〜６．０μｍまで強く膨潤することが見られた。層が等方的に膨潤すれば、カプセルの直径が２倍になると色素層間の間隔も２倍になり、一方、層の体積は８倍に増加する。
【００４０】
カプセル２を実験１で使用した。カプセル壁内のローダミン濃度とフルオレセイン濃度を、膨潤工程の前後にＵＶ／ＶＩＳ分光法で測定した。二つの色素層間の平均間隔は処理前で約４．５ｎｍであり、処理後は９ｎｍに近かった。ＦＲＥＴ信号（λexc＝４９５ｎｍ、λem＝５７８ｎｍ）の変化は、膨潤工程の間、蛍光分光計で監視した（図９）。層の膨潤の結果、ＦＲＥＴ信号の強度は０．０５ＭのＤＯＤＡＢ溶液との反応で８６％だけ減少した。
【００４１】
カプセル３を実験２で使用した。一つのＰＡＨ層の中の高濃度のフルオレセインにより消光プロセスが効率的に進む。０．０５ＭのＤＯＤＡＢ溶液を添加した後にＰＡＨ層の体積が約８倍に増加する。色素の自己消光が減少するため、カプセルの蛍光は２９０％だけ増加する(図１０)。
【００４２】
カプセルに反応性高分子を充填する
カプセル内部に高分子を固定化するには三つの方法がある。
【００４３】
１．カプセル内でのポリマーの「封じ込め状態」での合成（図６）12。
【００４４】
２．塩またはｐＨ変化を利用して、対応する高分子に対する、特定のカプセルの透過性を変化させる（図７）11。
【００４５】
３．高分子および補助物質から成る不安定錯体の沈殿をコロイド鋳型上に形成し、次いで慣例的な積層法によってこの物質をカプセルに封じ込め、芯物質および高分子錯体を溶解する8。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によるカプセルおよびその用途の、他の有利な態様が下記に例として引用されており、これら全ての態様は相互に任意に組合せることが可能である。
【００４７】
＊積層法によって多層の多価電解質から調製され、コード化およびセンサー／診断／分析の用途に使用される１００μｍ未満のカプセルで、
ａ）色素の標識を付けた多価電解質の所定の層番号への割振り、
ｂ）色素を含まない多価電解質の所定の層番号への割振り、
ｃ）センサー用多価電解質またはセンサー用反応性コーティング成分
の所定の層番号への割振り、
ｄ）異なった層の標識間の相互作用の所定の割振り
を含むカプセル。
【００４８】
＊芯物質の有無を問わず、異なった組成の溶剤または溶液を含む外皮としてのカプセル。
【００４９】
＊少なくとも２層に１種以上の蛍光色素を含むカプセルで、この蛍光色素により所定の方法で蛍光色とその強度、および相互作用または自己作用を調整することが可能となる。
【００５０】
＊フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に代わって相互に結びついている少なくとも２種の蛍光色素を異なった層に保有するカプセル。
【００５１】
＊ＦＲＥＴの能力があり蛍光色素の標識を付けた供与体および受容体の両層の間に挟まれ、且つ例えば、ｐＨ、塩濃度、温度、吸着成分、酵素、および溶液に作用しまたは中間層と反応する混和性溶媒構成成分のような媒体の性質変化に適応して、適度にＦＲＥＴ信号に影響を及ぼし、この性質変化を捉えるセンサーとして使用できる少なくとも１層のセンサー中間層を含むカプセル。
【００５２】
＊その相互の間隔がフェルスター共鳴エネルギー転移を抑制する少なくとも２種の蛍光色素を含むカプセル。
【００５３】
＊層内での自己作用（自己消光）をもたらすことができ、且つ媒体または環境での成分または条件の変化の影響を適度に受ける能力を有し、これらの成分または条件のセンサーとして役立つ蛍光色素を一定密度で含む少なくとも１層を有するカプセル。
【００５４】
＊１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満のカプセル。
【００５５】
＊センサー機能またはコード化に適した性質を備えた修正された芯物質を有するカプセル。
【００５６】
＊物質および／または標識プロセスを識別するために、記録用粒子またはコード化された着色粒子のライブラリーとしてカプセルを使用すること。
【００５７】
＊医療診断、コンビナトリアルケミストリー、遺伝子分野や蛋白質分野、生物学や生体工学および工業でカプセルを使用すること。
【００５８】
＊工業製品をコード化するのにカプセルを使用すること。
【００５９】
＊生物に由来する粒子、細胞、組織、器官および組織体に標識を付けるのにカプセルを使用すること。
【００６０】
＊１００μｍ未満の直径を有する少なくとも２種の型のカプセルを含む物質識別用組成物であって、ここでカプセルが芯物質および外皮を有し、この外皮が少なくとも３層あり、その内の少なくとも１層が色素で標識を付けられている組成物。
【００６１】
＊少なくとも３種の型のカプセルを含む組成物。
【００６２】
＊カプセルの平均直径が１０μｍ未満、好ましくは１μｍ未満である組成物。
【００６３】
＊外皮が多価電解質の層から成る組成物。
【００６４】
＊少なくとも一つのカプセルの型が、異なった色素で標識を付けられている少なくとも２層から成る外皮を有しているカプセルによって限定される組成物であって、ここで、この異なった色素で標識を付けられている層が、色素で標識を付けられていない少なくとも１層によって相互に分離されている組成物。
【００６５】
引例
１．Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ、Ｂｒｏｎｗｙｎ  Ｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ、２０００年６月出願ＷＯ００／３２５４２号
２．Ｐａｙａｎ、Ｄｏｎａｌｄ  ２００１年７月出願米国特許２００１０００６７８７号、Ａ１
３．Ｓｔｉｌｌ、ｅｔ  ａｌ．、１９９６年１０月出願米国特許５，５６５，３２４号；Ｓｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９年３月出願米国特許６，００１，５７９号
４．Ｎｏｒｒｍａｎ、Ｎｉｌｓ、４．２００２年３月出願欧州特許１１９０２５６号
５．Ｔｒａｕ、Ｍａｔｈｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９年５月出願ＷＯ９９／２４４５８号
６．Ｄｏｎａｔｈ、Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、１９９９年３月出願ＷＯ９９／４７２５２号
７．Ｓｐｉｒｏ、Ａ．；Ｌｏｗｅ、Ｍ．；ＢｒｏｗｎｍＤ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６６、２０００、４２５８
８．Ｇａｐｏｎｉｋ、Ｎ．、Ｒａｄｔｃｈｅｎｋｏ、Ｉ．Ｌ．、Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ、Ｇ．Ｂ．、Ｗｅｌｌｅｒ、Ｈ．、Ｒｏｇａｃｈ、Ａ．Ｌ．  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．１４、２００２、８７９
９．Ｅ．Ｄｏｎａｔｈ、Ｇ．Ｂ．  Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ、  Ｆ．Ｃａｒｕｓｏ、  Ｓ．Ａ．Ｄａｖｉｓ、Ｈ．Ｍoｈｗａｌｄ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  Ｅｄ．１９９８、  ３７、２００２．
１０．Ｒ．Ｓｔｅｉｔｚ、  Ｖ．Ｌｅｉｎｅｒ、  Ｒ．Ｓｉｅｂｒｅｃｈｔ、  Ｒ．  ｖ．  Ｋｌｉｔｚｉｎｇ、  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａ．  Ｓｕｒｆ．  Ａ、２０００、１６３、６３．
１１．Ｇ．Ｉｂａｒｚ、  Ｌ．Ｄaｈｎｅ、  Ｅ．Ｄｏｎａｔｈ、  Ｈ．Ｍoｈｗａｌｄ「貯蔵、輸送および放出用の巧妙なマイクロ−およびナノ容器」、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１３（２００１）１３２４−１３２７．
１２．Ｌ．Ｄaｈｎｅ、Ｅ．Ｄｏｎａｔｈ、  Ｓ．Ｌｅｐｏｒａｔｔｉ、  Ｈ．Ｍoｈｗａｌｄ、「定められた化学的性質を有するマイクロ反応ケージの合成」、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３（２００１）５４３１−５４３６．
１３．Ｈ．  Ｈaｒｍa、「診断における粒子技術」、ＴＥＫＥＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗ、１２６／２００２．
【図面の簡単な説明】
【００６６】
本発明の種々の態様が図１〜１０に示されている。
【図１】図１は使用される蛍光色素の構造を示す。
【図２】図２ａ）はＰＡＨ−Ｆｌ、ＰＡＨ−ＲｈｏおよびＰＡＨ−Ｃｙ５の吸収スペクトル（正規化強度）を示し、図２ｂ）はそれらの蛍光スペクトル（正規化強度）を示す。
【図３】図３は着色コード化されたカプセルの混合体の共焦像を図示している。３ａ）はフルオレセインのチャンネル、即ちフルオレセインの蛍光を示し、一方３ｂ）はローダミンのチャンネルを、３ｃ）はＣｙ５のチャンネルを夫々示し、３ｄ）は三つのカラーチャンネルを重合せたものを示している。
【図４】図４は着色されたカプセル２、７、１および５の混合体を示す。撮影には共焦点蛍光顕微鏡を使用した。蛍光顕微鏡の三つのカラーチャンネルの重合せ像を図４ａ）に見ることができ、一方、図４ａ）の白線に沿った蛍光強度のプロファイルを図４ｂ）に見ることができる。
【図５】図５は調製された組合せ層の構造の仕組みを明示しており、図ａ〜ｃ）は色素濃度が同じ場合にＦＲＥＴ信号強度が異なっていることを示し、図５ｄ〜ｆ）は色素濃度が異なる場合にＦＲＥＴ信号強度が異なっていることを示している。尚、図ａ）は上段の左の図であり、図ｆ）は下段の右の図である。
【図６】図６はカプセル内でのポリマーのいわゆる「封じ込め」合成の各段階の仕組みを図示している。多価電解質でコーティングするための鋳型として使用された芯物質を溶解除去した後に、モノマーが外皮を通過してカプセル内部に到達する。適切に選択された条件下でモノマーは重合し、もはや外皮を通過できなくなっている。最終の洗浄工程で、カプセルの外側にあるポリマーは溶液から除去される。カプセル内にモノマーが閉込められて残る。
【図７】図７は特別なカプセルの対応する高分子に対する透過性を変化させるために塩またはｐＨを使用することによって、ＭＦカプセル（８層）を充填する仕組みを示している。塩含有量および／またはｐＨを変更することにより、外皮の細孔を拡大ができ、それによって透過性が増大する。これにより比較的大きな高分子でもカプセル内部に浸透できる。最後に、ｐＨおよび／または塩含有量を再び最初の値に戻すと、細孔は再度閉じて小さくなる。カプセル内に浸透した高分子は、もはや外皮を通過することができなくなっている。
【図８】図８は上記された２種の異なったセンサーカプセルの構造と作用様式を図示している。図８の上段はカプセル２を、下段はカプセル３を図示している。ＤＯＤＡＢを添加すると、標識を付けられていない中間層（感知層）の厚さが増加し、標識を付けられた２層の間隔が増加する。これにより色素間の結びつきが減少し、その結果ＦＲＥＴが弱くなる。従って、５７８ｎｍで登録されている供与体色素の蛍光が弱くなる。
【図９】図９はａ）水中の、およびｂ）０．０５ＭのＤＯＤＡＢ溶液の効果が現れてからのカプセルＮｏ．２の信号強度を図示している（４９５ｎｍでのフルオレセインの緑色の吸収、５５３ｎｍでのローダミンの赤色の吸収、およびλexc＝４９５ｎｍ,λem＝５７８ｎｍでの青色のＦＲＥＴ信号）。
【図１０】比較のため、０．０５ＭのＤＯＤＡＢを添加した後のカプセルＮｏ．３の蛍光強度が図１０に図示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年5月18日(2005.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１００μｍ未満の粒径を有し、かつ
少なくとも３個の多価電解質層を含む包膜を有するカプセルであって、
前記包膜は１つの染料を含むのみであり、および前記３個の多価電解質層の少なくとも１個はこの染料で標識されており、この染料は高濃度で高感度材料に共有結合しており、この高感度材料は、その容積を増加または減少させることにより、変化した環境条件に応答でき、
染料の濃度が高いので、染料が、二量体、それ自身の凝集体またはエキサイマー（励起二量体）を形成し、後者は蛍光の自己消光または新たな発光帯の生成に至らせる、前記カプセル。
【請求項２】
高感度材料は、その環境条件が変化する時に膨潤または収縮し、かくてその容積が変化する材料であることを特徴とする請求項１に記載のカプセル。
【請求項３】
環境条件が、ｐＨ、塩濃度、温度、吸着成分、酵素、物質の濃度、物理パラメーター、溶媒に影響しまたは高感度材料と反応する成分、および混和可能な溶媒成分であることを特徴とする請求項２に記載のカプセル。
【請求項４】
染料の濃度が、次の関係、
高感度材料の質量：染料の質量  <  ５００：１を満たすことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項５】
染料標識層が、１ｎｍ〜１μｍの厚さを有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項６】
染料類で標識されている多価電解質層が、染料類で標識されている有機多価電解質層であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項７】
染料が、蛍光染料類または放射ナノ粒子であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項８】
中空のカプセルであり、かつ巨大分子が、包膜によって境界が規定される内部空間に位置することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項９】
センサーまたは配位する性質を備えた修正された芯物質を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１０】
包膜が、所定の寸法迄の分子に対して透過性であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１１】
カプセルが、包膜によって取り囲まれる固体芯部を有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１２】
カプセルが、１０μｍ未満の、好ましくは１μｍ未満の、平均粒径を有することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１３】
カプセルが、一層毎の積層方法によって調製されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１４】
カプセルが、工業生成物、粒子、細胞、組織、器官、または生物起源の有機体を標識化または符号化するために使用されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１５】
物質および／または標識プロセスを識別するために、記録用粒子またはコード化された着色粒子のライブラリーとして使用されるための請求項１〜１３のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１６】
医療診断、コンビナトリアルケミストリー、遺伝子分野や蛋白質分野、生物学や生体工学および工業で使用されるための請求項１〜１３のいずれか１項に記載のカプセル。
【国際調査報告】
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