(57)【要約】本発明は、生物系で水ストレス寛容に有用なＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の３種の新規遺伝子（該遺伝子は渇水条件下において茶植物で特異的に発現される）、および水ストレス寛容性を獲得させるために上記遺伝子を生物系へ導入する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の遺伝子。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の遺伝子が長さ３１８ｂｐである、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の遺伝子が長さ２５１ｂｐである、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３の遺伝子が長さ３６１ｂｐである、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項５】
遺伝子が形として環状である、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項６】
遺伝子が、水不足ストレス条件下において茶植物（Camellia sinensis(L.)O.Kuntze）で特異的に発現される、請求項１に記載の遺伝子。
【請求項７】
水不足ストレス条件下において茶植物で特異的に発現されるＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の遺伝子を同定する方法であって、
（ｉ）正常および渇水双方の条件下で生育する上記植物から全ｍＲＮＡを単離する、
（ii）対応するｃＤＮＡを得るために、上記のｍＲＮＡを逆転写する、
(iii)上記のｃＤＮＡを配列決定する、および
（iv）上記のｃＤＮＡ配列を用いて、特異的に発現される遺伝子を同定する
ステップからなる方法。
【請求項８】
ジデオキシ鎖終結法によりｃＤＮＡを配列決定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
逆転写酵素を用いることにより、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子が茶植物の葉で特異的に発現される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
方法が、植物のｍＲＮＡ鎖の３′末端で特異的な発現を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
茶植物がCamellia sinensis(L.)O.Kuntzeである、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
特異的な発現がノーザンブロットにより確認される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の遺伝子を用いて植物系で水不足ストレス寛容性を導入する方法であって、
上記の系中へ上記遺伝子を移すステップからなる方法。
【請求項１５】
方法が、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の遺伝子を用いて、茶植物へ水不足ストレス寛容性を導入するために用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子が、Agrobacterium媒介形質転換およびBiolistic媒介形質転換からなる群より選択される技術を用いて形質転換される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
方法が、ストレス寛容性を調節するために用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子が、水不足ストレス条件下で生育しうる寛容性を備えた植物系を同定するためのプローブを開発するために用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子が、渇水条件下で寛容性を獲得するために用いられる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子が、渇水に対する寛容性を獲得するために用いられる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物系で水ストレス寛容に有用なＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の３種の新規遺伝子（該遺伝子は渇水条件下において茶植物で特異的に発現される）、および水ストレス寛容性（耐性）を獲得させるために上記遺伝子を生物系へ導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
収穫高はいくつかの生物および非生物ファクターに影響されやすく、渇水ストレスが重大な収穫制限決定要因となっている。渇水ストレスとは、本発明の関係において、植物中の水の量が植物の蒸散要求を満たせるほど十分でなく、葉のカールのような目に見える症状の変化を招く状況に関する。渇水は、重要な生理学的パラメーター、葉水ポテンシャル（葉組織内の水状態の尺度）でも定量しうる。水不足に対する植物応答は、喪失水量、喪失速度、渇水ストレスの期間、考慮中の植物変種／種、植物の発達段階、および温度、相対湿度などのような他の環境変動要因に依存する。
【０００３】
ストレスは多くの代謝経路および構造に影響を与えるが、これは一部の正または負調節された遺伝子の結果であるらしい。水不足誘導遺伝子の多くは、細胞機能を防御すると予想される遺伝子産物をコードしている。植物のよく知られた１つの応答は、多量のプロリン、グリシンベタイン、ピニトール、カルニチン、マンニトール、ソルビトール、ポリオール、トレハロース、スクロース、オリゴ糖およびフルクタンのような代謝適合性溶質の蓄積である。これらは化学的に非類似で、タンパク質の表面から排除され、こうしてタンパク質を優先的に水和させておく。これら化合物の蓄積は水ポテンシャルの減少を招くため、細胞内で水移動を促し、水不足から防御するためのメカニズム、膨圧を維持する上で役立つ。
【０００４】
これらの化合物は（ａ）膜および他の高分子、例えば核酸およびタンパク質を安定化させる能力を有し、ラジカルのスカンベンジャーとして機能しうる。確かに、これら化合物の合成に関与する遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物は、水不足の状況下で野生型と比較すると、より寛容性であることがわかった。古典的研究によると：（ａ)Bacillus subtilisからのＳａｃＢ遺伝子（レバン‐スクラーゼをコードする）を過剰発現するトランスジェニックタバコは、フルクタンを数倍多く蓄積し、渇水ストレスに対して有意に大きな成長および乾燥重量蓄積応答を示した（Pilon-Smits,E.A.H.,Ebaskamp,M.J.M.,Paul,M.J.,Jeuken,M.J.W.,Weisbeek,P.J.and Smeekens,S.C.M.(1995)Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress.Plant physiol.107:125-130）；（ｂ）モスビーン（Vigna aconitifolia）からのＰ５ＣＳ（Δ１‐ピロリン‐５‐カルボン酸シンテターゼ；その酵素はＬ‐グルタミン酸からΔ１‐ピロリン‐５‐カルボン酸を経るプロリン生合成に関与している）を過剰発現するトランスジェニックタバコは、プロリン含有量を１０〜１８倍増加させ、野生型と比較して水ストレス下で良い成長を示した（Kavi,K.P.B.,Hong,Z.,Miao,G-H.,Hu C.A.A.and Verma,D.P.S.(1995)Plant Physiol.108:1387-1394）；（ｃ）酵母からのＴＰＳ１遺伝子（トレハロース‐６‐リン酸シンターゼを合成する）を発現するトランスジェニックタバコはトレハロースを蓄積し、野生型と比較して良い渇水寛容性を示した（Holmstorm,K.O.,Mantyla,E.,Mandal,W.A.,Palva,E.T.,Tunnela,O.E.and Londesborough J.(1996)Drought tolerance in tobacco.Nature.379:683-684）；（ｄ）E.coliからのｂｅｔＢ遺伝子（ベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼを合成する）を過剰発現するトランスジェニックタバコは、浸透圧ストレス条件下で良い機能を示した（Holmstrom,K.O.,Welin,B.and Mandal,A.(1994)Production of the Escherichia coli betaine-aldehyde dehydrogenase an enzyme required for the synthesis of the osmoprotectant glycine betaine,in transgenic plants.Plant J.6:749-758）；（ｅ）Mesembryanthemum crystallinumからのｉｍｔ１遺伝子（ミオイノシトール‐ｏ‐メチルトランスフェラーゼを合成し、Ｄ‐オノニトール生合成に関与する）を発現するトランスジェニックタバコは水ストレスに高い順応性を示した（Sheveleva,E.,Chmara,W.,Bohnert,H.J.and Jensen,R.G.(1997)Increased salt and drought tolerance by D-Ononitol production in trangenic Nicotiana tabacum.Plant Physiol.5:1211-1219）；（ｆ）渇水ストレス下におけるこれらオスモプロテクタント（osmoprotectant）の一部の産生は、植物ホルモンのアブシジン酸（ＡＢＡ）により媒介されている。
【０００５】
最近、ＡＢＡ合成に関与する９‐シス‐エポキシカロテノイドジオキシゲナーゼ遺伝子（ＮＣＥＤ）は、８日齢カウピー植物において、水不足下で強く誘導されることがわかった（Iuchi,S.,Kobayashi,Yamaguchi-Shinozaki,K.and Shinozaki,K.(2000)A stress-inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase involved in abscisic acid biosynthesis under water stress in drought-tolerant cowpea.Plant Physiol.123:553-562）。ＮＣＥＤ  ｍＲＮＡは、トマトの葉および根の双方で、水ストレスに応答して増加することがわかった（Thompson,A.J.,Jackson,A.C.,Parker,R.A.,Morpeth,D.R.,Burbidge,A.and Taylor,I.B.(2000)Abscisic acid biosynthesis in tomato:regulation of dioxygenase mRNA by light/dark cycles,water stress and abscisic acid.Plant Mol.Biol.42:833-845）。
【０００６】
水和状態を維持する上で役立つオスモライト（osmolyte）とは別に、渇水または浸透圧ストレスをうけた植物は、細胞の水ポテンシャルを変えることで水不足から防御しうるアクアポリンファミリーの膜タンパク質のような水チャンネルタンパク質および水輸送タンパク質を産生する、いくつかの遺伝子を合成する（Chrispeels,M.J.and Agre,P.(1994)Water channel proteins of plants and animal cells,Trends in Biochem.Sci.19:421-425；Bohnert,H.J.and Jensen,R.G.(1996)）。
【０００７】
Strategies for engineering water-stress tolerance in plants.TIBTECH.14:89-97;Johansson,I.,Larsson,C.,Ek B.and Kjellbom,P.(1996)。ホウレンソウ葉原形質膜の主要内在タンパク質は推定アクアポリン類であり、Ｃａおよびアポプラスチック(apoplastic)水ポテンシャルに応答してリン酸化される。The Plant Cell.8:1181-1191。ＬＥＡの高濃度蓄積も乾燥寛容性の獲得と同時に生じる。ＬＥＡタンパク質のグループ‐３のうち１つは、細胞脱水時に濃縮されるイオンの封鎖で役割を果たすと予想されている。ＬＥＡタンパク質の別なグループ‐５は、水の喪失時にイオンを封鎖すると予想されている。水不足に際する全水ポテンシャルの維持は、浸透圧調整で行える。２種のタンパク質、オスモチンおよび非特異的脂質輸送タンパク質はストレス誘導され、病原菌を抑制する上で役割を果たすと考えられている。非特異的脂質輸送タンパク質は渇水で誘導される（Plant,A.L.,Cohen,A.,Moses,M.S.and Bray,E.A.(1991)Nucleotide sequence and spatial expression pattern of a drought abscisic acid induced gene in tomato,Plant Physiol.97:900-906；Toress-Schumann,S.,Godoy,J.A.and Pintor-Toro,J.A.(1992)A probable lipid transfer protein is induced by NaCl in stems of tomato plants.Plant Mol.Biol.18:749-757）。
【０００８】
水不足で誘導される熱ショックタンパク質（Borkird,C.,Simoens,C.,Villarroel,R.and VanMontagu M.(1991)Gene associated with water-stress adaptation of rice cells and identification of two genes as hsp 70 and ubiquitin.Physiol.Plant.82:449-457；Almoguera,C.and Jordano,J.(1992)Developmental and environmental concurrent expression in sunflower dry-seed-stored low-molecular-weight heat shock protein and Lea mRNAs.Plant Mol.Biol.19:781-792）は、渇水に際して、それらの機能を回復するためにタンパク質の再折りたたみ、またはタンパク質凝集の防止に関与しているらしい（Vierling E.(1991)the roles of heat shock proteins in plants.Annual review of Plant Physiol.and Plant Mol.Biol.42:579-620）。
【０００９】
小さなＨＳＰは、植物乾燥寛容と関連した、もう１つのタイプのタンパク質である。小さなＨＳＰは、種子脱水および最初数日間の再水和時に、分子シャペロンとして作用する（Hoekstra,F.A.,Golovina,E.A.and Buitink,J.(2001)Mechanisms of plant desiccation tolerance.Trends in Plant Science.6(9):43-439）。ＯｓＨＳＰ１１０は、熱ショックとは別に、塩分、渇水および低温に応答してコメ苗の新芽に蓄積した。２種のｈｓｐ、即ちトウモロコシのｈｓｐ７０および大豆のｈｓｐ２７も、水ストレスにより誘導されうることが示された（Sachs,M.M.and David Ho,T.H.(1986).Alterations of gene expression during environmental stress in plants.Ann.Rev.Plant Physiol.37:363-376）。遺伝子発現における変化のほとんどは脱水時に生じ、そのため多くの脱水特異性遺伝子産物が単離されたが、再水和特異性タンパク質はほとんど知られていない（Bernacchia,G.,Schwall,G.,Lottspeich,F.,Salamini,F.,and Bartels,D.(1995)Molecular Characterization of the Rehydration process in the Resurrection Plant Craterostigma Plantagineum.EMBO J 14:610-618）。
【００１０】
複雑な調節およびシグナリングプロセスで、そのほとんどが理解されていないのであるが、水不足時に遺伝子の発現を制御している。２タイプのタンパク質分解メカニズム、プロテアーゼおよびユビキチンに関与する遺伝子は、水不足により誘導される。その遺伝子産物は、細胞水不足時に変性されるタンパク質の分解に関与しているのかもしれない。しかも、ストレスで変性されたタンパク質の分解に関与する酵素、チオールプロテアーゼが、水不足により誘導される（Guerrero,F.D.,Jones,J.T.and Mullet,J.E.(1990)Turgor-responsive gene transcription and RNA levels increases rapidly when pea shoots are wilted:sequence and expression of three inducible genes.Plant Mol.Biol.15:11-26）。
【００１１】
Neale,A.D.,Blomstedt,C.K.,Bronson,P.,Le,T.N.,Guthridge,K.,Evans,J.,Gaff,D.F.and Hamill,J.D.(2000.The isolation of genes from the resurrection grass Sporobolus stapfianus which are induced during severe drought stress.Plant,Cell and Environment.23:265-277）は、フッカツソウSporobolus stapfianusから渇水ストレス誘導遺伝子を単離した。検出された遺伝子は、ｅＩＦ１翻訳開始因子、２種の渇水ストレス誘導性のグリシンに富むタンパク質、即ちトノプラスト内在タンパク質（ＴＩＰ）および初期光誘導性タンパク質（ＥＬＩＰ）をコードすることがわかった。以前は、このような遺伝子産物が渇水ストレスに関連していることがわからなかった。これは、ｅＬＦ１翻訳開始因子をコードする遺伝子が植物の渇水ストレス応答で役割を有するらしいことを示唆した、最初の報告である。
【００１２】
いくつか異なるストレスが同一または類似のシグナル伝達経路を誘起しているのかもしれない。植物ホルモンＡＢＡも異なるストレスに起因する水喪失の物理的現象に応答して蓄積し、内在ＡＢＡ分の上昇はある水不足誘導遺伝子を誘導することが知られている。したがって、ＡＢＡ蓄積は水不足時に遺伝子を誘導するシグナル伝達経路の１つにおけるステップである。様々なタンパク質キナーゼが植物で報告されており、水ストレスおよびＡＢＡ応答を含めた様々なシグナル伝達経路のリン酸化プロセスで機能すると思われている。
【００１３】
ＡＢＡにより誘導されるタンパク質キナーゼに対応するｃＤＮＡ、ｐＫＡＢＡ１が単離された（Anderberg,R.J.and Walker-Simmons,M.K.(1992)Isolation of wheat cDNA clone for an abscisic acid-inducible transcript with homology to protein kinases.Proc.Natl.Acad.Sci,USA 89:10183-10187）。新たなホメオボックス含有遺伝子、Ａｔｈｂ‐１２およびＡｔｈｂ‐７は水不足および外来ＡＢＡ処理により誘導されるが、経時的実験ではこれら双方が別々に調節されることを示した（Lee,Y.H.and Chun,J.Y.(1998)A new homeodomain-leucine zipper gene from Arabidopsis thaliana induced by water stress and abscisic acid treatment.Plant Mol.Biol.37:377-384）。
【００１４】
入手しうる証拠によると、ストレス誘導応答がＡＢＡ媒介される、またはＡＢＡと無関係であることを示唆している（Shinozaki,K.and Yamaguchi-Shinozaki,K.(1997)Gene expression and signal transduction in water-stress response.Plant Physiol.115:327-334）。ＡＢＡ媒介遺伝子応答には、タンパク質合成を要したり、または要しないことがある。Vicia fabaの未同定種子タンパク質と相同性を示した、ＡＢＡによるｒｄ２２遺伝子のｍＲＮＡの誘導には、タンパク質合成を要したが、その理由はシクロヘキシミドが遺伝子の誘導を阻害したからである（Yamaguchi-Shinozaki,K.and Shinozaki,K.(1993)The plant hormone abscisic acid mediates the drought-induced expression but not the seed-specific expression of rd22,a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsis thaliana.Mol.Gen.Genet.238:17-25）。
【００１５】
その遺伝子の構造分析では、各々−４６３および−４４３位で調節配列（シス作用モチーフ）ａｓ１（ＴＧＡＣＧ）およびｓｐ１（ＧＧＧＣＧＧ）の存在を示した（Briggs,M.R.,Kadonaga,J.T.,Bell,S.P.and Tijan,R.(1986).Purification and Biochemical characterization of the promoter-specific transcription factor,Sp1.Science 234:47-52；Lam,E.,Benfey,P.M.,Fang,R.X.and Chua N-H.(1989).Site specific mutations alter in vitro factor binding and change promoter expression pattern in transgenic plants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:7891-7894）。ｍｙｂ（Ｔｒｐクラスターモチーフ含有転写因子のファミリー）認識要素ＴＧＧＴＴＡＧと−１４４および−６６６位で、２つのｂＨＬＨ（基本ヘリックス‐ループ‐ヘリックス；ＭＹＣ）認識要素（ＣＡＣＡＴＧ）と−２００および−１９１位で似た配列も存在していた。ＭＹＣ関連ＤＮＡ結合タンパク質をコードするｃＤＮＡ（ｒｄ２２ＢＰ１）が単離されたが、これはＭＹＣ関連転写因子に基本領域ヘリックス‐ループ‐ヘリックスロイシンジッパーモチーフの典型的ＤＮＡ結合ドメインを有した６８ｋＤタンパク質をコードすることがわかった。
【００１６】
そのタンパク質は確かにＭＹＣ認識部位と結合する（Abe,H.,Yamaguchi-Shinozaki,K.,Urao,T.,Iwasaki,T.,Hosokawa,D.and Shinozaki,K.(1997)Role of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and Abscisic Acid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.9:1859-1868）。ＭＹＢ関連タンパク質ＡＴＭＹＢ２をコードする渇水およびＡＢＡ誘導性遺伝子もクローン化された。ｒｄ２２ＢＰ１（ＭＹＣ）およびＡＴＭＹＢ２（ＭＹＢ）双方のタンパク質は、ｒｄ２２遺伝子の脱水およびＡＢＡ誘導発現で、転写アクチベーターとして機能することが示された（Abe,H.,Yamaguchi-Shinozaki,K.,Urao,T.,Iwasaki,T.,Hosokawa,D.and Shinozaki,K.(1997)Role of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and Abscisic Acid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.9:1859-1868）。
【００１７】
Arabidopsisのｒｄ２２と対照的に、大麦のＨＶＡ２２遺伝子は渇水およびＡＢＡに応答して誘導されるが、シクロヘキシミドの存在下でも誘導される。ＨＶＡ２２のプロモーター領域は、ＡＢＡ応答性複合ＡＢＲＥ３、ＣＥ１、およびＧ‐ボックスと他の未同定のカップリング要素との相互作用に依存する他のＡＢＡ応答性複合体を含有している。（Shen,Q.and Ho,T-H D.(1995)Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene Reveals Two Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing a G-Box and a novel cis-Acting Element.The Plant Cell.7:295-307）。
【００１８】
Yamaguchi-Shinozaki,K.and Shinozaki,K.（1993.Characterization of the expression of dessication-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in trangenic plants.Mol.Gen.Genet.236:331-340）は、ＡＢＡ応答経路と無関係の脱水応答性遺伝子ｒｄ２９Ａをクローン化した。配列ＴＡＣＣＧＡＣＡＴは渇水条件下で誘導される遺伝子を調節することがわかり、他の脱水誘導性遺伝子のプロモーター領域でみられた。
【００１９】
A.thalianaにおいてｒｄ２９aプロモーターのコントロール下でＤＲＥＢ１Ａ（脱水応答要素結合タンパク質）の過剰発現により、いくつかのストレス寛容遺伝子が発現され、渇水およびいくつか他のストレス下で改善された寛容性をもたらした（Kasuga,M.,Liu,Q.,Miura,S.,Yamaguchi-Shinozaki,K.and Shinozaki,K.(1999)Improving plant drought,salt,and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor.Nature Biotechnology.17:287-291）。
【００２０】
ＤＲＥ結合タンパク質ＤＲＥＢ２の他の遺伝子の分析では、そのプロモーターがトランスジェニックarabidopsisにおいて水ストレス下で誘導されることを示した（Nakasimha,K.,Shinwari,Z.K.,Sakuma,Y.,Seki,M.,Miura,S.,Shinozaki,K.and Yamaguchi-Shinozaki,K.(2000)Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration and high salinity responsive gene expression.Plant Mol.Biol.42:657-665）。これらの遺伝子はそれらの発現にＡＢＡを必要としないが、外来ＡＢＡには応答する。
【００２１】
ＡＢＡ処理に応答しない渇水誘導性遺伝子もある。これらには、チオールプロテアーゼ、ＣＩｐプロテアーゼおよびチオールプロテアーゼを各々コードするｒｄ２１、ｅｒｄ１およびｒｄ１９がある（Shinozaki,K.and Yamaguchi-Shinozaki,K.(1997)Gene expression and signal transduction in water-stress response.Plant Physiol.115:327-334）。実際には、このような遺伝子に関する情報は非常に乏しい。
【００２２】
良い順応性が求められる新規渇水関連遺伝子の必要性およびサーチが常にある。表１に掲載された遺伝子および遺伝子配列とは別に、次のような新規の遺伝子配列が掲載される：
【００２３】
ＡＢＲＥ．ＡＢＡ応答要素（ＰｙＡＣＧＴＧＧＣ）（Shen,Q.and Ho.(1995)Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene Reveals Two Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing a G-Box and a novel cis-Acting Element.The Plant Cell.7:295-307）。
【００２４】
Ｇ‐ボックス．遍在性調節要素（ＣＡＣＧＴＧ）（Menkens,A.E.,Schindler,U.and Cashmore,A.R.(1995)The G-box:Ubiquitous regulatory DNA element in plants bound by GBF family of bZIP proteins.Trends in Biochem.Sci.20:506-510）。
【００２５】
ＤＲＥ．脱水応答要素（ＴＡＣＣＧＡＣＡＴ）（Shinozaki,K.and Yamaguchi-Shinozaki,K.(1996)Molecular responses to drought and cold stress.Current opinion in biotechnology.7:161-167）。
【００２６】
ＭＹＢＲＳ．ＭＹＢ認識配列（ＰｙＡＡＣＰｙＰｕ）（Urao,T,Yamaguchi-Shinozaki,K.,Urao,S,Shinozaki,K.(1993）.An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence.The Plant Cell 5:1529-1539)。
【００２７】
ＭＹＣＲＳ．ＭＹＣ認識配列（ＣＡＮＮＴＧ）（Abe,H.,Yamaguchi-Shinozaki,K.,Urao,T,Iwasaki,T.,Hosokawa,D.and Shinozaki,K.(1997）Role of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and Abscisic Acid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell 9:1859-1868）。
【００２８】
渇水または他のストレスに関連した遺伝子および遺伝子断片（本発明の関係で遺伝子断片とは、完全遺伝子の部分ヌクレオチド配列に関する）の操作では、以下の事項が可能である：
（ａ）遺伝子は下記表１で示されたようないくつかの経路でクローン化しうる：
【表１】
2005535295.tif 000002
【００２９】
（ｂ）生物からクローン化された遺伝子は他の生物で発現されうる：
ピロリン‐５‐カルボン酸シンテターゼ酵素がVigna aconitifoliaからクローン化され、トランスジェニック技術によりタバコで発現されたことが、Kishor,Kavi,P.B.R.,Hong,Z.,Miao,G.H.,Hu C.A.and Verma,D.P.S.(1995 Overexpression of pyrroline-5-carboxylate synthetase increases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants.Plant Physiol.108:1387-1394およびそこでの引用文献）により示されているように、トランスジェニックタバコ植物は水ストレス条件下においてより寛容性であった。
【００３０】
Pilon Smits,E.A.H.,Ebskamp,M.J.M.,Paul,M.J.,Jeuken,M.J.W.,Weisbeek,P.J.and Smeekens（Improved performance of transgenic fructan-accumulating tobacco under drought stress.Plant physiol.107:125-130）はBacillus subtilisからのＳａｃＢ遺伝子をタバコへ移し、渇水寛容性の増加を見い出した。
【００３１】
Holmstom,K.O.,Welin,B.and Mandal,A.（1994.Production of the Escherichia coli betaine-aldehyde dehydrogenase an enzyme required for the synthesis of the osmoprotectant glycine betaine in trangenic plants.Plant l.6:749-758）はEscherichia coli（微生物）からのベタイン‐アルデヒドデヒドロゲナーゼをタバコ（高等植物）へ移し、渇水寛容性であることを見い出した。
【００３２】
（ｃ）渇水ストレスに応答して発現される遺伝子は、他の環境変動要因でも発現されうる：
Iuchi,S.,Kobayashi,Yamaguchi-Shinozaki,K.and Shinozaki,Kazuo（2000.A stress-inducible gene for 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase involved in abscisic acid biosynthesis under water stress in drought tolerant compound.Plant Physical.123:553-662）は、水および塩ストレスに応答するＶｃＮＣＥＤ１の発現を報告した。
【００３３】
Pelloux,J.,Jolivet,Y.,Hontaine,V.,Banvoy,J.,and Dizengromel,P.（2001.Change in Rubieco and Rubisco activate gene expression and polypeptide expression）.
Richard,S.,Mordancy,M.,Drevet,C.,Jouanin,L.,and Seguin,S.（2000.Isolation and characterization of a dehydrin gene from white spruce induced upon wounding,drought and cold stress.Plant Mol.Biol.43:1-10）は、渇水、寒冷ストレスに応答しておよび傷で誘導される遺伝子ＰｇＤｈｎｌを報告した。
【００３４】
Nakashima,K.,Shinwari,Z.K.,Sakuma,Y.,Seki,M.,Miura,S.,Shinozaki,K.and Yamaguchi-Shinozaki,K.（2000.Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration and high salinity responsive gene expression.Plant Mol.Biol.42:657-665）は、脱水および高塩分ストレスに応答する渇水応答要素ＤＲＥＢ２遺伝子の発現を報告した。
【００３５】
Hirayama,T.,Ohto,C.,Mizoguchi,T.and Shinozaki,K.（1995.A gene encoding a phosphoinositol-specific phospholipase C induced by dehydration and salt stress in Arabidopsis thaliana.Proc.Natl.Acad.Sci.92:3903-3907）は、渇水、塩分および低温に応答するホスホイノシトール特異性ホスホリパーゼＣの発現を報告した。
【００３６】
Weretilnyk,E.A.and Hanson,A.D.（1990.Molecular cloning of a plant betaine aldehyde dehydrogenase,an enzyme implicated in adaptation to salinity and drought.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87:2745-2749）は、渇水および塩分に応答するベタイン‐アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現を報告した。
【００３７】
（ｄ）同定された遺伝子が調節要素を研究するために用いられる。本発明の関係で調節要素とは、遺伝子の発現を制御するプロモーター、転写因子および他の配列のような領域に関する：
ストレス調節遺伝子ＨＶＡ１を用いる。Straub,P.P.,Shen,Q.and Ho,Tuan-hua,D.（1994.Structure and promoter analysis of an ABA- and stress-regulated barley gene,HVA1.Plant Mol.Biol.26:617-630）はその遺伝子のプロモーターを分析した。Micchel,D.,Salamini,F.,Bartels,D.,Dale,P.,Baga,M.and Szalay,A.（1993.Analysis of a desiccation and ABA-responsive promoter isolated from the resurrection plant Craterostigma plantagineum.Plant Journal 4:29-40）は、渇水応答性遺伝子ＣｄｅＴ２７‐４６を選択し、そのプロモーター領域を分析した。
【００３８】
Urao,T,Yamaguchi-Shinozaki,K.,Urao,S,Shinozaki,K.（1993.An Arabidopsis myb homolog is induced by dehydration stress and its gene product binds to the conserved MYB recognition sequence.The Plant Cell 5:1529-1539)は、脱水応答性遺伝子Ａｔｍｙｂ２で転写因子をコードする配列を同定した。Yamaguchi-Shinozaki,K.and Shinozaki,K.（1997.Characterization of the expression of dessication-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in trangenic plants.Mol.Gen.Genet.236:331-340）は、渇水誘導性遺伝子ｒｃ２９のプロモーター領域を分析した。
【００３９】
Abe,H.,Yamaguchi-Shinozaki,K.,Urao,T.,Iwasaki,T.,Hosokawa,D.and Shinozaki,K.（1997.Role of Arabidopsis MYC and MYB Homologs in Drought-and Abscisic Acid-Regulated Gene Expression.The Plant Cell.9:1859-1868）は、調節因子に関して渇水誘導性遺伝子ｒｃ２９を分析した。
【００４０】
Shen,Q.and Ho,T.D.（1995.Functional Dissection of an Abscisic Acid(ABA)-Inducible gene Reveals Two Independent ABA-Responsive Complexes Each Containing a G-Box and a novel cis-Acting Element.The Plant Cell.7:295-307）は、調節要素に関してＨＶＡ２２遺伝子を分析し、新規カップリング要素を報告した。
【００４１】
（ｅ）ある系から単離された遺伝子または遺伝子断片が、他の植物系で類似遺伝子を研究するためにプローブとして用いられる：
Roberts,J.K.and Key,J.L.（1991.Isolation and characterization of a soybean hsp70 gene.Plant molecular biology,16:671-683）は、大豆からの類似遺伝子をクローン化するために、Drosophilaからクローン化されたｈｓｐ７０遺伝子を用いた。
【００４２】
Singia,S.L.,Pareek,A.and Grover.（1997.Yeast HSP104 homologue rice HSP110 is developmental- and stress regulated Plant science,125:211-219）は、酵母ｈｓｐＫＭおよびコメｈｓｐ１１０が非常に似ていることを示した。これらは乾燥、塩分、低温および高温に応答して発現される。
【００４３】
Shen,Q.,Chen,C.N.,Brands,A.,Pan,S.M.and Ho,T.D.（2001.The stress-and abscisic acid-induced barley gene HVA22:developmental regulation and homologues in diverse organisms,Plant Molecular Biology.45:327-340）は、いくつかの生物、例えば穀類、arabidopsis、Caenorhabitis elegans、ヒト、マウスおよび酵母における渇水誘導性遺伝子ＨＶＡ２２を報告した。
【００４４】
（ｆ）ある器官で発現された遺伝子が、下記表２で示されたような器官でも発現されうる：
【表２】
2005535295.tif 000003
【００４５】
（ｇ）Ausubel,F.M.,Brend,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A.,Struhl,K.1987.Current protocols in molecular biology.Publisher John Wiley and Sons.New York；Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.1989.Molecular cloning: a laboratory manual,Second edition.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.で詳述されているような標準プロトコールを用いることにより、全鎖長ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡをクローン化することが可能である。
【００４６】
様々な渇水関連遺伝子のまとめが下記表３で示されている。
【表３】
2005535295.tif 000004
2005535295.tif 000005
2005535295.tif 000006
2005535295.tif 000007
2005535295.tif 000008
2005535295.tif 000009
2005535295.tif 000010
【００４７】
渇水ストレス関連遺伝子のクローニングに関する知識状況が、特に以下で示されている。
モデル植物Arabidopsisからの渇水、低温または高塩分ストレス応答に関与する新規シス作用要素の同定について記載された、Yamaguchi-Shinozaki,K.and Shinozaki,K.(1994)The Plant Cell.6:251-264による文献（１）が参考にされる。
【００４８】
Xenopus oocytesで冷却寛容に関与することが示された新規水チャンネルタンパク質がコメからクローン化された、Li,L.G.,Li,S.F.,Tao,Y.and Kitagawa,Y.(2000)Plant Science.154:43-51による文献（２）が参考にされる。
【００４９】
エンドキチナーゼ遺伝子ファミリーの２種の浸透圧ストレスおよびＡＢＡ応答部分が、渇水ストレスLycopersicon chilense植物の葉から単離および同定された、８月１２日（１９９７年）付のTabaeizadeh,Zohrer,Yu,Long-Xi,Chen,Ri-Dong,ＵＳ特許５，６５６，４７４による文献（３）が参考にされる。
【００５０】
植物でアブシジン酸応答要素と結合するアブシジン酸応答要素結合因子２（ＡＢＦ２）をコードする核酸分子が単離された、６月２１日（２００１年）付のKim,Soo Young，ＵＳ特許６，２４５，９０５による文献（４）が参考にされる。
【００５１】
植物でアブシジン酸応答要素と結合するアブシジン酸応答要素結合因子３（ＡＢＦ３）をコードする核酸分子が単離された、４月１７日（２００１年）付のKim,Soo Young，ＵＳ特許６，２１８，５２７による文献（５）が参考にされる。
【００５２】
植物で低温および脱水寛容性を促進する遺伝子の発現を調節する領域と結合する、タンパク質ＣＢＦ１をコードする、ＣＢＦ１と称される遺伝子がクローン化された、１９９９年４月６日付のThomshow,Michael F,Stockinger,Eric J,ＵＳ特許５，８９２，００９による文献（６）が参考にされる。
【００５３】
水不足およびアブシジン酸により誘導される新規遺伝子がクローン化された、１９９９年１１月９日付のChun,Jong-Yoon,Lee,Yong-Hun,ＵＳ特許５，９８１，７２９による文献（７）が参考にされる。
【００５４】
先行技術の欠点は以下である：
ａ．モデル植物系、主に１年生植物を中心とした、渇水ストレスに関連した遺伝子をクローン化する初期の研究。茶のような多年生常緑植物は、それらのライフサイクルを通して数回の渇水ストレスをうける。したがって、植物は渇水への寛容性を付与する新規遺伝子を有しうると予想される。
【００５５】
ｂ．更なる渇水寛容植物を作製するために利用する目的での新規遺伝子のサーチが常にある。Arabidopsis thalianaのようなモデル植物および表１で記載されたような他の在来植物が、渇水関連遺伝子をクローン化するために用いられた。新規遺伝子はこれまで未研究の植物から期待しうる。
【００５６】
ｃ．渇水関連遺伝子をクローン化することが報告された方法は、ｃＤＮＡライブラリーのデファレンシャルスクリーニング、デファレンシャルｃＤＮＡライブラリーの分析およびサブトラクティブハイブリダイゼーションに依存していた（表１、２および３）。これらは分析に際して２サンプルを同時に用いるという固有の制限を有している。したがって、特異的に発現される遺伝子の同定およびクローニング後に、回復に際するおよび／または塩ストレス／ＡＢＡ処理などのような他の変動要因に応答するそれらの発現分析について試験した。したがって、望ましい遺伝子に集中するために、初めに適切な技術が適用されることを要する。
【００５７】
上記の欠点は、当業者に明白でない、本発明による簡単で信頼しうる手法で、初めて解消されたのである。
【発明の目的】
【００５８】
本発明の主目的は、渇水ストレスをうけた茶植物の葉で発現される新規遺伝子のクローニングである。
【００５９】
本発明の他の主目的は、なお全植物に属していながら、渇水ストレスをうけた茶植物の葉で発現される、新規遺伝子のクローニングである。
【００６０】
本発明の更に他の目的は、渇水ストレスをうけた茶植物の葉で発現される新規遺伝子の同定である。
【００６１】
本発明の更に他の目的は、渇水ストレスをうけた茶植物の葉で抑制される新規遺伝子のクローニングである。
【００６２】
本発明の更に他の目的は、特異的に発現される遺伝子の同定およびその後のクローニングの目的のために、渇水ストレス vs.豊水をうけた茶植物の葉で発現および抑制される遺伝子のスペクトルを作製することである。
【００６３】
本発明の更に他の目的は、特異的に発現される遺伝子の同定およびその後のクローニングの目的のために、渇水ストレス、ＡＢＡ処理をうけた、回復に際して、および豊水条件下（豊水条件とは、植物にその水ポテンシャルを維持させられる給水量を意味する）で、茶の第四葉で発現および抑制される遺伝子のスペクトルを作製することである。
【００６４】
本発明の別な目的は、水ポテンシャルに関するストレスを定量することである。本発明の更に他の目的は、渇水ストレスに応答した生理活性の変化を研究することである。
【００６５】
本発明の更に他の目的は、渇水寛容茶植物でゲノムの様々な領域の位置を決定することである。
【００６６】
本発明の更に他の目的は、豊水茶植物と比較して、渇水ストレスをうけた茶植物の葉で特異的な発現を証明するための、特異的に発現される遺伝子の同定３′末端の確認である。
【００６７】
本発明の別な目的は、アブシジン酸に応答するおよび回復に際する、同定遺伝子の発現研究である。本発明の関係で回復とは、渇水ストレス植物が潅水されて、それらの水ポテンシャルが豊水コントロール植物の場合に相当したときに関する。
【００６８】
本発明の更に他の目的は、特異的に発現される遺伝子の同定３′末端のクローニングである。
【００６９】
本発明の更に他の目的は、クローン化遺伝子の同定３′末端の配列決定である。
【００７０】
本発明の更に他の目的は、遺伝子データバンクからのクローン化遺伝子の配列の比較である。
【００７１】
本発明の別な目的は、上記３種の新規遺伝子を用いて生物系で水ストレス寛容性を導入する方法を開発することである。
【００７２】
本発明の更に他の目的は、上記３種の新規遺伝子を用いて茶植物で水ストレス寛容性を導入する方法を開発することである。
【本発明の要旨】
【００７３】
本発明は、生物系で水ストレス寛容に有用なＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の３種新規遺伝子（該遺伝子は渇水条件下において茶植物で特異的に発現される）、および水ストレス寛容性を獲得させるために上記遺伝子を生物系へ導入する方法に関する。
【本発明の詳細な説明】
【００７４】
したがって、本発明は、生物系で水ストレス寛容に有用なＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の３種新規遺伝子（該遺伝子は渇水条件下において茶植物で特異的に発現される）、および水ストレス寛容性を獲得させるために上記遺伝子を生物系へ導入する方法に関する。
【００７５】
本発明の一態様において、特異的発現を示す３種の新規遺伝子は次の通りである：
ＤＳ３１（Ｔ１１Ｇ、ＡＰ６５）‐ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１
ＤＳ６１（Ｔ１１Ａ、ＡＰ１）‐ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２
ＤＳ１０３（Ｔ１１Ａ、ＡＰ６５）‐ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３
遺伝子をクローン化するために用いられた様々なプライマー組合せが括弧内に記されている。これらプライマーの詳細は例４で述べられている。
【００７６】
ＤＳ３１（Ｔ１１Ｇ、ＡＰ６５）は基本的に遺伝子の３′末端領域であって、図７のようなノーザンブロットで１．５キロ塩基サイズの転写物とハイブリッド形成した。
ＤＳ６１（Ｔ１１Ａ、ＡＰ１）は基本的に遺伝子の３′末端領域であって、図７のようなノーザンブロットで７５０塩基サイズの転写物とハイブリッド形成した。
ＤＳ１０３（Ｔ１１Ａ、ＡＰ６５）は基本的に遺伝子の３′末端領域であって、図７のようなノーザンブロットで１．９キロ塩基サイズの転写物とハイブリッド形成した。
【００７７】
各クローンはM/s.Amersham Pharmacia Biotech,USAのＴ７配列バージョン２配列決定キットを用いて人為的に配列決定した。用いられた配列決定プライマーは〔Ｌｇｈ（５′‐ＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＴＡＡＴＣ‐３′）またはＲｇｈ（５′‐ＧＡＣＧＣＧＡＡＣＧＡＡＧＣＡＡＣ‐３′）〕であった。
【００７８】
本発明の別な態様で、上記３種遺伝子の配列は次の通りである：
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
(iii)配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１
遺伝子番号および詳細：ＤＳ３１（Ｔ１１Ｇ、ＡＰ６５）。括弧内に記された事項はプライマー組合せを表わしている。これらプライマーの詳細は例４で記されている。
【化１】
2005535295.tif 000011
【００７９】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：２５１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
(iii)配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２
遺伝子番号および詳細：ＤＳ６１（Ｔ１１Ａ、ＡＰ１）。括弧内に記された事項はプライマー組合せを表わしている。これらプライマーの詳細は例４で記されている。
【化２】
2005535295.tif 000012
【００８０】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３の情報
（ｉ）配列特徴：
（Ａ）長さ：３６１塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：環状
（ii）分子型：ｃＤＮＡ
(iii)配列番号：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３
遺伝子番号および詳細：ＤＳ１０３（Ｔ１１Ａ、ＡＰ６５）。括弧内に記された事項はプライマー組合せを表わしている。これらプライマーの詳細は例４で記されている。
【化３】
2005535295.tif 000013
【００８１】
本発明の一態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の遺伝子である。
【００８２】
本発明の他の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１の遺伝子は長さ３１８ｂｐである。
【００８３】
本発明の更に他の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２の遺伝子は長さ２５１ｂｐである。
【００８４】
本発明の更に他の態様において、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３の遺伝子は長さ３６１ｂｐである。
【００８５】
本発明の更に他の態様において、上記の遺伝子は形が環状である。
【００８６】
本発明の更に他の態様において、上記の遺伝子は水不足ストレス条件下において茶植物（Camellia sinensis(L.)O.Kuntze）で特異的に発現される。
【００８７】
本発明の別な態様は、水不足ストレス条件下において茶植物で特異的に発現されるＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の遺伝子を同定する方法である。
【００８８】
本発明の更に他の態様は、正常および渇水双方の条件下で生育する上記植物から全ｍＲＮＡを単離することである。
【００８９】
本発明の更に他の態様は、上記のｍＲＮＡを逆転写して対応するｃＤＮＡを得ることである。
【００９０】
本発明の更に他の態様は、上記のｃＤＮＡを配列決定することである。
【００９１】
本発明の更に他の態様は、上記のｃＤＮＡ配列を用いて、特異的に発現される遺伝子を同定することである。
【００９２】
本発明の更に他の態様は、ジデオキシ鎖終結法によりｃＤＮＡを配列決定することである。
【００９３】
本発明の更に他の態様は、逆転写酵素を用いることにより、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することである。
【００９４】
本発明の更に他の態様において、上記の遺伝子は茶植物の葉で特異的に発現される。
【００９５】
本発明の更に他の態様において、上記の方法は上記植物のｍＲＮＡ鎖の３′末端で特異的な発現を示す。
【００９６】
本発明の更に他の態様において、茶植物はCamellia sinensis(L.)O.Kuntzeである。
【００９７】
本発明の更に他の態様において、上記の特異的な発現はノーザンブロットにより確認される。
【００９８】
本発明の別な態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の遺伝子を用いて植物系で水不足ストレス寛容性を導入する方法であり、該方法は上記の系中へ上記遺伝子を移すステップからなる。
【００９９】
本発明の別な態様において、上記の遺伝子はAgrobacterium媒介形質転換およびBiolistic媒介形質転換からなる群より選択される技術を用いて導入される。
【０１００】
本発明の別な態様において、上記の方法は上記のストレス寛容性を調節するために用いられる。
【０１０１】
本発明の更に他の態様において、上記の遺伝子は水不足ストレス条件下で生育しうる寛容性を備えた植物系を同定するためのプローブを開発するために用いられる。
【０１０２】
本発明の更に他の態様において、上記の遺伝子は渇水条件下で寛容性を獲得するために用いられる。
【０１０３】
本発明の更に他の態様において、上記の遺伝子は渇水に対する寛容性を獲得するために用いられる。
【０１０４】
本発明の別な態様は、植物で水ストレス寛容性に関与する、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の３種の新規遺伝子である。該遺伝子は、植物で渇水寛容性を導入するために、独立してまたは組合せで用いられる。該遺伝子は茶植物の葉から単離される。
【０１０５】
本発明の他の態様において、上記の遺伝子は植物系で安定である。該遺伝子は、そのプロモーターおよび調節要素の助けを借りて、全植物系で自らを発現させることがわかった。該遺伝子は全植物系で渇水寛容性を導入しうる。渇水寛容性は、その遺伝子が組み込まれた茶植物で特にみられる。
【０１０６】
本発明の更に他の態様において、上記の遺伝子は２／３世代の植物系でそれらの均一な発現が観察される。該遺伝子の発現は２／３世代で均一なことがわかった。
【０１０７】
本発明の別な態様において、上記の遺伝子は該遺伝子で形質転換された植物系の正常機能に悪影響を与えないことがわかった。
【０１０８】
本発明の別な態様は、渇水ストレスをうけたCamellia sinensis(L.)O.Kuntze（以下茶と称される）の葉で発現される新規遺伝子のクローニングである。特に、本発明は、特異的に発現される遺伝子を同定およびクローン化するという観点から、水ストレス下で生育する２年齢茶植物vs.豊水茶植物の第四葉における遺伝子発現パターンの比較に関する。特に、本発明は、渇水ストレスをうけた茶植物の第四葉で発現される遺伝子〔本発明の範囲内に属する遺伝子とは、メッセンジャーリボ核酸（以下ｍＲＮＡと称される）を生じるデオキシリボ核酸（以下ＤＮＡと称される）の一部に関する〕の新規３プライム（以下３′と称される）末端の同定、クローニングおよび分析に関する。３′末端とは、ｍＲＮＡのポリＡ尾部と非常に近い末端に関する。
【０１０９】
本発明の他の態様において、本発明は：
・渇水ストレスをうけた茶植物の第四葉で発現される新規遺伝子配列
・渇水ストレスをうけた茶植物の第四葉で抑制される新規遺伝子配列
・特異的に発現される遺伝子の同定およびその後のクローニングの目的のための、茶植物の第四葉で発現および抑制される遺伝子の３′末端のスペクトル
・茶植物で特異的な発現を証明するための、特異的に発現される遺伝子の同定３′末端の確認、および
・特異的に発現される遺伝子のクローン化３′末端の配列情報
からなる、茶（Camellia sinensis(L.)O.Kuntze）において渇水ストレス条件下で調節される３新規遺伝子のクローニングを提供する。
【０１１０】
本発明の別な態様では、Institute of Himalayan Bioresource Technology,Palampur（３２°０６′３２″Ｎ；７６°３３′４３″Ｅ；海抜１３００ｍ）の実験農場で生育する２年齢茶植物クローンＴＶ７８が選択された。すべての植物は同一母植物から栄養繁殖させて、研究中の全植物の遺伝的均質性を保証した。そのため、処理に応答して観察された遺伝子発現の変化は、遺伝的不均質性というより、むしろ処理の効果を反映している。植物はプラスチックポット（高さ１４．５ｃｍ×上部直径１５ｃｍ×下部直径９ｃｍ）で育てた。１ポットは１植物のみを有していた。
【０１１１】
更に他の態様では、全植物が温室に置かれ、温度および相対湿度の均一性を保証した。上から第四節の位置で十分に伸びた葉（平均長さ９．５±０．１９ｃｍ；平均幅３．６５±０．１ｃｍ）が全実験で用いられた。第一、第二および第三葉は実験期間中に葉部分に変化を示して、遺伝子発現で成長関連変化を呈したが、第四葉の葉部分は実験期間中ずっと９．５±０．１９ｃｍの平均長さおよび３．６５±０．１ｃｍの平均幅で一定のままであった。そのため、第四節位置の葉が本発明で選択された。第五節位置の葉は第四節位置の葉と比較して古かった。本発明の全戦略は、比較的若く、成長関連変化が無視しうる／最少である節の位置で、葉を選択することであった。
【０１１２】
更に他の態様では、コントロール植物へは規則的に給水し、その一方で処理ポットでは水を止めることにより渇水させた。ＡＢＡ（５ｍＭ）がコットンの助けで向軸および背軸双方の表面へ２日目毎に適用され、ＡＢＡ処理用とされた植物の根にも（２ｍｌ）適用した。これらはコントロール植物として規則的に給水された。回復実験の場合、渇水は１４日間続けられ、その後で給水された。
【０１１３】
更に他の態様では、様々なパラメーターのデータ記録が処理後０、７、１４および１８日目に行われた。デファレンシャルディスプレーおよびノーザン分析用の葉サンプルは、１４日目（コントロール、渇水およびＡＢＡの場合）および１８日目（回復実験の場合）に集めた。葉はジエチルピロカーボネート（以下ＤＥＰＣと称される）処理水〔ＤＥＰＣ処理水を調製するために、ＤＥＰＣが０．１％の最終濃度まで蒸留水に加えられ、次いで一夜インキュベート後にオートクレーブ処理（即ち、１．１ｋｇ／平方ｃｍの圧力下１２１℃で加熱）された〕で洗浄し、採取し、直ちに液体窒素へ浸して細胞成分を凍結させ、細胞活性を止めた。
【０１１４】
更に他の態様において、本発明は、渇水ストレスをうけた茶の第四葉で発現される遺伝子の新規３プライム（以下３′と称される）末端の同定、クローニングおよび分析に関する。
【０１１５】
更に他の態様において、本発明は、渇水ストレスをうけた茶の第四葉で抑制される遺伝子の新規３′末端の同定、クローニングおよび分析に関する。
【０１１６】
本発明の別な態様では、ＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ葉から全ＲＮＡが単離され、“デファレンシャルディスプレー技術”（Liang,P.,Zhu,W.,Zhang,X.,Guo,Z.,O’Connell,R.,Averboukh,L.,Wang,F.and Pardee,A.B.(1994).Differential display using one-base anchored oligo-dT primers.Nucleic Acids Res.22(25):5763-5764）がＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ葉で発現および抑制される遺伝子の３′末端のスペクトルを得るために用いられた。
【０１１７】
本発明の別な態様では、茶のＤＳ芽における発現遺伝子の３′末端が組み換えプラスミドを得るためにベクターと連結され、適切なE.coli宿主中への導入でクローンを生じた。本発明でベクターとは、外来ＤＮＡを受け取れ、所定抗生物質への耐性を示す環状プラスミドＤＮＡの形態をとる、ＤＮＡの配列に関する。
【０１１８】
本発明の有利な態様では、茶のＤＳ芽における抑制遺伝子の３′末端が組み換えプラスミドを得るためにベクターと連結され、適切なE.coli宿主中への導入でクローンを生じた。
【０１１９】
本発明の更に他の態様では、クローン化された遺伝子が、該クローン化遺伝子と渇水ストレスとの関連を解明するために、茶のＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ葉でその発現または抑制について試験された。
【０１２０】
本発明の他の態様では、遺伝子の唯一性を明らかにするために、ジデオキシ鎖終結法（Sanger,F.S.,Nicklen,and A.R.,Coulson(1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467）を用いて遺伝子が配列決定された。
【０１２１】
本発明の別な態様は、植物で水ストレス寛容に関与する、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜３の３種新規遺伝子である。該遺伝子は、植物で渇水寛容性を導入するために、独立してまたは組合せで用いられる。該遺伝子は茶植物の葉から単離される。
【０１２２】
本発明の他の態様において、上記の遺伝子は植物系で安定である。該遺伝子は、そのプロモーターおよび調節要素の助けを借りて、全植物系で自らを発現させることがわかった。該遺伝子は全植物系で渇水寛容性を導入しうる。渇水寛容は、その遺伝子が組み込まれた茶植物で特にみられる。
【０１２３】
本発明の更に他の態様において、上記の遺伝子は２／３世代の植物系でそれらの均一な発現が観察される。該遺伝子の発現は２／３世代で均一なことがわかった。
【０１２４】
本発明の別な態様において、上記の遺伝子は該遺伝子で形質転換された植物系の正常機能に悪影響を与えないことがわかった。
【０１２５】
本発明は、下記例で更に詳細に説明される。これらの例は説明目的のみで示されており、請求項で適正に記された本発明の制限と解釈すべきでない。
例
例１
ＡＢＡ（ＡＢ）処理、止水による渇水ストレス（ＤＳ）、次いで１４日目の再給水(ＲＣ)に付された茶植物の２年齢苗の第四葉の水ポテンシャル、光合成速度およびＦｖ／Ｆｍ比：
水ポテンシャル（以下Ψと称される）は乾湿計（露点ミクロ電圧計；モデルＨＲ３３Ｔ,Wescor,USA）を用いて測定した。鋭利なペーパーパンチを用いて葉片（直径０．５ｃｍ）を切り抜き、サンプル室（Ｃ‐５２；Wescor,USA）へ直ちに入れた。３０分間の平衡化後、冷却係数（単位＝マイクロボルト）に関する値を得た。その値を０．７５（得られた値をΨの単位“バール”へ変換するための比例定数）で割り、Ψの値を得た。乾湿計の完全単位は２５℃に換算する。２５℃以外の温度で行われた測定の場合、下記式を用いて温度補正した：
新温度時の冷却係数＝０．７（新温度℃−２５℃）＋２５℃における冷却係数の標準値（製造業者により示される）
光合成速度はポータブル光合成システム（Li-6400,Li-COR,Lincoln,NE,USA）を用いて測定した。光強度は製造業者供給の青‐赤色ＬＥＤ機器を用いて１０００μＥｍ−２ｓ−１で一定に保ち、室温はその機器と一緒に供給されるようなPeltier冷却および加熱機器を用いて２５℃で維持した。
【０１２６】
植物ストレス計（PSM Mark II,Biomonitor,Sweden）を用いてクロロフィル蛍光誘導動態パラメーターを測定した。暗所順応クリップを用いて葉を３０分間暗所順応させた後、５００ｎｍピークの化学線を用いてクロロフィルを励起させた。フォトシステムIIの光化学効率を示すＦｖ／Ｆｍ比を製造業者の説明通りに記録した。
【０１２７】
表現型として、ＣＯおよびＲＣ植物の葉は平らで開いていたが、ＤＳおよびＡＢ植物の葉は、渇水に対する植物応答の特徴である、部分的な葉のカールを示した。Ψ、ＡおよびＦｖ／Ｆｍのようなパラメーターは、コントロール葉で実験期間中ずっと一定のままであった（図１）。第四葉の葉部分もコントロール植物で実験期間中未変化であった。
【０１２８】
給水を止めたポットでは、Ψが７日目に２３．４％下がり、１４日目には値が８７．２％下がった。上記の日に、Ａの値は１５．５および６２．９％下がり、Ｆｖ／Ｆｍでは値が０．５６および５２．５％下がった。ＡＢＡ処理の場合、Ψは７および１４日目に各々１６．５および５２．５％下がった。上記の日に、Ａでは値が２２．５および５７．７％下がり、Ｆｖ／Ｆｍでは値が１．８および４４．２％下がった。上記すべての場合で、値の低下はゼロ日目の値に対して表わされた（図１）。
【０１２９】
回復実験では、Ψ、ＡおよびＦｖ／Ｆｍの値がコントロール植物の場合と全く類似していた。
【０１３０】
このように、実験では、Ψがそのゼロ日目の値のわずか１２．８％である厳しい渇水ストレスにもかかわらず、Ａ、Ｆｖ／ＦｍおよびΨ特徴に関してその正常機能に戻りうる、茶の著しい能力を示した。しかも、データはあるΨで遺伝子発現パターンを定量していた。
【０１３１】
例２
ＲＮＡ単離、ＤＮアーゼ１によるＲＮＡの切断、ＲＮＡの定量およびゲル電気泳動：
茶のＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ葉からのリボ核酸（以下ＲＮＡと称される）の高品質を保証するために、ＲＮｅａｓｙ植物ミニキット（M/s.Qiagen,Germanyから購入）を用いた。製造業者の説明に従い、ＲＮＡを単離した。２６０ｎｍの吸光度を測定することによりＲＮＡを定量し、２６０および２８０ｎｍで測定された吸光度の比率を計算することにより純度をモニターした。２６０／２８０ｎｍで＞１．８の値が、本研究の目的には理想的と考えられた。ＲＮＡ濃度および収量を計算するために用いられた式は次の通りであった：
ＲＮＡの濃度（μｇ／ｍｌ）＝Ａ２６０（２６０ｎｍの吸光度）×４０×希釈倍率
総収量(μｇ)＝濃度×ストックＲＮＡサンプルの容量
【０１３２】
ＲＮＡの完全性を調べるために、ＤＥＰＣ処理オートクレーブ水４．５μＬ中ＲＮＡ５〜６μｇをＭ１溶液（５×ＭＯＰＳ緩衝液２μＬ、ホルムアルデヒド３．５μＬおよびホルムアミド１０μＬ〔５×ＭＯＰＳ緩衝液：３００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ（３‐（Ｎ‐モルホリノ）プロパンスルホン酸、０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）〕）１５．５μＬで希釈し、６５℃で１５分間インキュベートした。ホルムアルデヒド‐ゲル添加緩衝液〔５０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．２５％ブロモフェノールブルー、０．２５％キシレンシアノールＦＦ〕２μＬを加えた後でＲＮＡを１．５％ホルムアルデヒドアガロースゲル上に載せ、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,and Maniatis,T.1989.（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY）に従い、１×ＭＯＰＳ緩衝液（６０ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ  ＭＯＰＳ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中７２ボルトで電気泳動した。
【０１３３】
残留ＤＮＡを除去するために、１×反応用緩衝液〔１０×反応用緩衝液：１００ｍＭトリス‐Ｃｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチン〕中１０単位のＤＮアーゼＩを用いて３７℃で３０分間かけてＲＮＡ（１０〜５０μｇ）を切断した（M/s.GenHunter Corporation,USAのMessage Clean Kit）。ＰＣＩ（比率２５：２４：１のフェノール、クロロホルム、イソアミルアルコール）を加えることによりＤＮアーゼＩを沈降させ、０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下で３倍容量のエタノールを加えることにより水相中に存在するＲＮＡを沈降させた。−７０℃で３時間インキュベート後、ＲＮＡをペレット化し、冷７０％エタノールですすぎ、最後に無ＲＮアーゼ水１０μＬに溶解させた。こうして得られたＤＮＡフリーＲＮＡを定量し、完全性を上記のように調べた。ＲＮＡの特質は図２で示されている。
【０１３４】
多量のＲＮＡが必要なとき、我々は修正塩酸グアニジンベース操作を用いた（Lal,L.,Sahoo,R.,Gupta,P.K.,Sharma,P.and Kumar,S.Plant Molecular Biology Reporter.19:181a-181f）。
【０１３５】
これら２法とは別に、他の操作も用いて茶の第四葉からＲＮＡを単離しうる。
【０１３６】
例３
逆転写（以下ＲＴと称される）による相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡと称される）へのｍＲＮＡの変換：
逆転写酵素として知られる酵素を用いて、ＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢサンプルからのＤＮＡフリーＲＮＡ０．２μｇを別々の反応で逆転写し、ｃＤＮＡを得た。反応は０．２μＭのＴ１１Ｍプライマー（Ｔ１１ＭのＭとしてＴ１１Ａ、Ｔ１１ＣまたはＴ１１Ｇがある）、２０μＭのｄＮＴＰ、ＲＮＡおよびＲＴ緩衝液〔２５ｍＭトリス‐Ｃｌ（ｐＨ８．３）、３７．６ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５ｍＭ  ＤＴＴ〕を用いて行った。本発明において、ｄＮＴＰはデオキシヌクレオシド三リン酸に関し、デオキシアデノシン三リン酸（以下ｄＡＴＰと称される）、デオキシグアノシン三リン酸（以下ｄＧＴＰと称される）、デオキシシチジン三リン酸（以下ｄＣＴＰと称される）およびデオキシチミジン三リン酸（以下ｄＴＴＰと称される）からなる。３種のＲＴ反応を対応するＴ１１ＭプライマーでＲＮＡサンプル毎に行った。反応はサーモサイクラー（M/s Perkin-Elmer,USAのモデル４８０）で行った。逆転写に選択されたサーモサイクラーパラメーターは６５℃で５分間→３７℃で６０分間→７５℃で５分間→４℃（サンプルが除去されるまで）であった。３７℃で１０分間のインキュベート後に１００単位の逆転写酵素を各反応液へ加え、次いで反応を残り５０分間にわたり続けた。４種の異なるＲＮＡを３種のＴ１１Ｍプライマーと組み合わせて全部で１２種の反応を行い、１２クラスの異なるｃＤＮＡを得た。Ａ、ＣまたはＧのアンカー塩基Ｍに応じて、３種の異なるＴ１１Ｍプライマーの使用により全ＲＮＡ群を３つのサブクラスに分けた（逆転写系はM/s.GenHunter Corporation,USAのＲＮＡイメージキットの成分であった）。
【０１３７】
例４
特異的に発現される遺伝子の同定のための、ｍＲＮＡのデファレンシャルディスプレーによる特異的発現遺伝子のスペクトルの作製：
例２で得られるようなＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ  ＲＴ産物からのｃＤＮＡの異なるサブクラスを、ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと称される：ＰＣＲプロセスはHoffman-La Roche Inc.の特許で記載されている）により、増幅産物を標識するための放射線標識ｄＡＴＰの存在下で増幅させた。放射性ＰＣＲは、（１）反応用緩衝液〔１０ｍＭトリス‐Ｃｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン〕、（２）２μＭ  ｄＮＴＰ、（３）０．２μＭ  Ｔ１１Ｍおよび（４）０．２μＭ任意プライマー（化学品１〜４は、ＲＮＡイメージキットの一部として、M/s.GenHunter Corporation,Nashville,USAから購入した）、α〔３３Ｐ〕ｄＡＴＰ（〜２０００Ｃｉ／mmol、JONAKI Center,CCMB campus Hyderabad,Indiaから購入）０．２μＬおよび１．０単位のThermus aqueticus（以下Ｔａｑと称される）ＤＮＡポリメラーゼ（M/S.Qiagen,Germanyから購入）を含有した反応混合液２０μＬ中で行った。オートクレーブ処理鉱油３０μＬを各反応液の上に載せ、蒸発による容量の変化を避けた。各反応のＴ１１Ｍプライマーは、ｃＤＮＡを合成するために用いられたものと同一であった。選択されたパラメーターは：４０サイクルにわたる９４℃で３０秒間→４０℃で４分間→７２℃で３０秒間；１サイクルの７２℃で５分間および４℃で最終インキュベートであった。
【０１３８】
増幅産物を６％変性ポリアクリルアミドゲルで分別した。その目的のため、各増幅産物３．５μＬを添加色素〔９５％ホルムアミド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０９％キシレンシアノールＦＦおよび０．０９％ブロモフェノールブルー〕２μＬと混合し、８０℃で２分間インキュベートし、６％変性ポリアクリルアミドゲル〔変性ポリアクリルアミドゲル：アクリルアミド（比率２０：１のアクリルアミドおよびビスアクリルアミドの４０％ストック）１５ｍｌ、１０×ＴＢＥ１０ｍｌ、蒸留水４０ｍｌおよび尿素５０ｇ〕上に載せた。キシレンシアノール（徐移動色素）がガラスプレートの下端に達するまで、６０ワットでランニング緩衝液として１×ＴＢＥ緩衝液〔１０×ＴＢＥ：トリス塩基１０８ｇ、ホウ酸５５ｇおよび０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）４０ｍｌ〕を用いて電気泳動を行った。配列決定ゲル機器の大きな方のプレートのサイズは１３×１６インチ（約３３×４１ｃｍ）であった。電気泳動後、１枚のガラスプレートを取除き、ゲルを３ＭＭ Whattmanフィルターペーパー上に移した。ゲルを真空下８０℃で一夜乾燥させ、Kodak Ｘ線フィルムに２〜３日間曝した。Ｘ線フィルムに曝す前、乾燥ゲルのコーナーを更なるアライメントのために放射性インキでマークした。図３〜４は、フィルムを現像した後でみられるような、茶のＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ第四葉における特異的発現遺伝子のスペクトルを示している。ゲルを展開した後、フィルムをＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢシグナル間の特異的発現バンドについて分析した。
【０１３９】
デファレンシャルディスプレーに用いられたプライマーの配列は次の通りであった（ＲＮＡイメージキットの一部として、M/s.GenHunter Corporation,USAから購入した）：
Ｔ１１Ｍ（アンカー）プライマー                  プライマー配列
Ｔ１１Ａ                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡ‐３′
Ｔ１１Ｃ                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣ‐３′
Ｔ１１Ｇ                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ‐３′
任意プライマー                                プライマー配列
ＡＰ１                          ５′‐ＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＧＣＣ‐３′
ＡＰ３６                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＣＧＡＣＧＣＴ‐３′
ＡＰ３７                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＧＧＧＣＣＴＡ‐３′
ＡＰ６５                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣ‐３′
ＡＰ６６                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＧＣＣＴＴＴＡ‐３′
ＡＰ６７                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＴＡＴ‐３′
ＡＰ６８                        ５′‐ＡＡＧＣＴＴＣＴＴＴＧＧＴ‐３′
【０１４０】
例５
ｃＤＮＡプローブの再増幅：
特異的発現バンドのクローニングには、クローニングの目的のために実質量のＤＮＡを得る上で、変性ポリアクリルアミドゲルからその溶出と、更なる増幅とを要した。放射能写真（現像Ｘ線フィルム）を放射性インキの助けで乾燥ゲルと照らし合わせた。同定された特異的発現バンドを（ゲルおよびフィルターペーパーと一緒に）鋭利な無菌カミソリの助けで切り出した。エッペンドルフ管内の無菌ｄＨ２Ｏ１００μＬ中でＤＮＡを１０分間インキュベートし、次いで１０分間煮沸することにより、それらをゲルおよびフィルターペーパーから溶出させた。ペーパーおよびゲルデブリを１０，０００ｒｐｍで２分間スピンさせることによりペレット化し、ＤＮＡ含有上澄を新たな管へ移した。ＤＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５  １０μＬ、グリコーゲン（ストックの濃度：１０ｍｇ／ｍｌ）５μＬおよびエタノール４５０μＬで沈降させた。−７０℃で一夜インキュベート後、遠心を４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間行い、ペレット化されたＤＮＡを８５％エタノールですすいだ。ＤＮＡペレットを無菌蒸留水１０μＬに溶解させた。
【０１４１】
例４のようにデファレンシャルディスプレーを行う目的で用いられたものと同じＴ１１Ｍおよび任意プライマーの組合せを用いて、溶出ＤＮＡを増幅させた。しかも、ｄＮＴＰ濃度が２μＭではなく２０μＭであり、アイソトープが加えられなかったこと以外は、ＰＣＲ条件が同一であった。反応を４０μＬに規模拡大し、ＰＣＲの終了後、ＰＣＲサンプル３０μＬを臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌの最終濃度）含有のＴＡＥ緩衝液（ＴＡＥ緩衝液：０．０４Ｍトリス‐酢酸塩、０．００２Ｍ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．５）中１．５％アガロースゲルでランさせた（図５参照）。残りの増幅産物はクローニング目的に−２０℃で貯蔵した。
【０１４２】
例６
再増幅ＰＣＲ産物のクローニング：
例４で得られるような再増幅ＰＣＲ産物を、１×連結用緩衝液（１０×リガーゼ緩衝液：５００ｍＭトリス‐Ｃｌ，ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＡＴＰ、５００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中２００単位のＴ４ＤＮＡ‐リガーゼを用いて、ＰＣＲ‐ＴＲＡＰＲベクターと称されるインサート準備のできたベクター３００ｎｇと連結させた。必要なベクターおよび他の化学品は、ＰＣＲ‐ＴＲＡＰＲクローニング系として、M/s.GenHunter Corporation,Nashville,USAから購入した。連結は、M/s Perkin-Elmer,USAのサーモサイクラーモデル４８０において１６℃で１６時間かけて行った。上記のようなベクターへのＰＣＲ産物の連結で、環化プラスミドを得た。本発明におけるＰＣＲ‐ＴＲＡＰＲベクターのような適切なベクターへの、本発明のＰＣＲ産物のような外来ＤＮＡの連結のプロセスは、クローニングとして知られている。ＰＣＲ産物のクローニング操作と適合することから用いうる、市販されたまたはそうではない、ある範囲の他のベクターがある。プラスミドは、定義によると、染色体ＤＮＡとは無関係のEscherichia coli（以下E.coliと称される）のような適切な宿主細胞に存在する閉鎖環状ＤＮＡ分子であり、抗生物質に対する耐性を付与しうる。ＰＣＲ‐ＴＲＡＰＲベクターからのプラスミドは、テトラサイクリンに対する耐性を付与する。
【０１４３】
連結させた産物またはプラスミドは、形質転換と称されるプロセスでその増殖および複製のために、適切なE.coli宿主へ入れる必要がある。上記のような連結産物（１０μＬ）を用いて、コンピテントE.coli細胞（ＰＣＲ‐ＴＲＡＰＲクローニング系の一部として、M/s.GenHunter Corporation,USAから購入）１００μＬを形質転換させた。コンピテントとは、プラスミドＤＮＡを受容しうるE.coli細胞を意味する。この目的のために、連結産物およびコンピテント細胞を混合し、氷上に４５分間保ち、熱ショックを２分間与え、ＬＢ培地（ＬＢ培地：最終容量１Ｌで蒸留／脱イオン水中トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇ）０．４ｍｌ中で４時間培養した。形質転換細胞２００μＬをＬＢ‐テトラサイクリン（１Ｌ当たり：トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム１０ｇおよび２０μＬ／ｍｌの最終濃度まで加えられたテトラサイクリン）プレート上に置き、３７℃で一夜増殖させた。コロニーをマークし、単一の単離コロニーをＬＢ‐テトラサイクリンプレート上で再ストリークして、同一種のコロニーを得た。E.coli細胞へのテトラサイクリン耐性の付与は、ＰＣＲ産物、即ち同定遺伝子がクローン化されたことを、見掛け上示唆している。
【０１４４】
上記プロセスの全体から、Ｔ１１Ｍプライマーの選択によりｍＲＮＡのポリＡ尾部領域を増幅させる。ポリＡ尾部は遺伝子の３′末端へ常に付着され、こうしてＴ１１Ｍプライマーは任意プライマーと組み合わされて遺伝子の３′領域を常に形成することになる。
【０１４５】
例７
ＰＣＲ産物のサイズの測定
遺伝子がクローン化され、E.coliが形質転換されたら、プラスミドが正しいサイズのＰＣＲ産物を受容しているかどうかを調べることが必要になる。これはコロニーＰＣＲを行うことにより行われ、そこではコロニーが溶菌されてから、適切なプライマーを用いてＰＣＲを行うために、テンプレート含有溶菌物が用いられる。次いで、増幅産物がアガロースゲルで分析される。
【０１４６】
コロニーを再ストリークされたプレート（例６）から取出し、コロニー溶菌用緩衝液〔コロニー溶菌用緩衝液：０．１％ Tween20含有ＴＥ（１０ｍＭトリス‐Ｃｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）〕５０μＬ中で１０分間煮沸することにより溶菌させた。細胞デブリをペレット化し、テンプレートＤＮＡを含有した上澄またはコロニー溶菌物をＰＣＲに用いた。ＰＣＲ成分は例４と本質的に同一であったが、但しＴ１１Ｍおよび任意プライマーの代わりに、Ｌｇｈ（５′‐ＣＧＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＴＡＡＴＣ‐３′）およびＲｇｈ（５′‐ＧＡＣＧＣＧＡＡＣＧＡＡＧＣＡＡＣ‐３′）プライマー（クローニング部位に隣接するベクター配列に特異的）を用い、コロニー溶菌物２μＬを溶出ＤＮＡの代わりに用いた。しかも、反応液容量を２０μＬに減らした。コロニーＰＣＲに用いられたＰＣＲ条件は、３０サイクルにわたる９４℃で３０秒間→５２℃で４０秒間→７２℃で１分間、次いで１サイクルの７２℃で５分間の伸長、最後に４℃の浸漬であった。増幅産物を分子量マーカーと一緒に１．５％アガロースゲル上でランし、インサートの正しいサイズについて分析した。ＬｇｈおよびＲｇｈフランキングプライマーを用いた場合、クローン化ＰＣＲ産物のサイズはフランキングベクター配列が増幅されたせいで１２０ｂｐ大きかった（図６参照）。
【０１４７】
例８
ノーザンブロットによる特異的発現の確認
上記でクローン化されたＰＣＲ産物は、特異的に発現される遺伝子の３′末端を表わしている。本発明の範囲内で、ＤＮＡのこれらクローン化断片が遺伝子と称される。デファレンシャルディスプレーでは例外なく偽陽性、即ち見掛け上特異的に発現される遺伝子を呈することから（Wan,J.S.and Erlander,M.G.1997.Cloning differentially expressed genes by using differential display and subtractive hydridization.In Methods in Molecular Biology.Vol.85: Differential display methods and protocols.Eds.Liang,P.and Pardee,A.B.Humana press Inc.,Totowa,N.J.,pp.45-68）、ノーザン分析による確認試験が茶のＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ第四葉間の特異的な発現を確かめる上で必須である。ノーザン分析では、放射線標識プローブの調製に次いで、膜上にブロットされた変性ＲＮＡとのそのハイブリダーゼーションとを要する。
【０１４８】
例７のような増幅産物をノーザン分析でプローブとして用いた。増幅産物を１．５％アガロースゲル上で視覚化させた後、これらをゲルから切出し、製造業者の説明に従いM/s.Qiagen,GermanyのQIAEX IIゲル抽出キットを用いてＤＮＡをゲルから溶出させた。
【０１４９】
M/s.GenHunter Corporation,Nashville,USAのHotPrime Kitを用いて彼らの説明に従い、精製断片をα〔３２Ｐ〕ｄＡＴＰ（４０００Ｃｉ／mmol）で放射線標識した。ＱＩＡ quick nucleotide Removal Kit（QIAGEN,Germany）を用いて放射線標識プローブを精製し、非取込み放射性ヌクレオチドを除去した。
【０１５０】
ブロットのために、ＲＮＡ２０μｇを本質的に例２で記載されているように１．０％ホルムアルデヒドアガロースゲル上でランさせた。ランが終了したら、ゲルをＤＥＰＣ処理オートクレーブ水で２回各々２０分間にわたり振盪しながら洗浄した。次いで、ゲルを１０×ＳＳＰＥ（１０×ＳＳＰＥ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、１１５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回各々２０分間にわたり振盪しながら洗浄した。わずかな時間でナイロン膜（Boehringer mannheim cat.no.#1209272）をＤＥＰＣ水で湿潤させ、次いで１０×ＳＳＰＥに５分間穏やかに振盪しながら浸した。次いで、移送用媒体としてＤＥＰＣ処理１０×ＳＳＰＥを用いて、ゲルからのＲＮＡをナイロン膜上に（４０ミリバールの圧力で）真空ブロットした。移送は４時間で行った。圧力を１５分間で７０ミリバールに上げてから、真空ブロッターからゲルを出した。移送後ゲルを取出し、ＲＮＡマーカーの位置をＵＶ光源下でナイロン表面上にマークした。膜を乾燥させ、８０℃で４５分間焼いた。５×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ：３Ｍ塩化ナトリウム、２３０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ）で軽くすすいだ後、膜をプレハイブリダイゼーション用溶液（５０％ホルムアミド、０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ Ficoll-400、０．１％ＢＳＡ、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ＳＤＳ溶液および１５０μｇ／ｍｌ新鮮煮沸サケ精子ＤＮＡ）中へ５時間浸した。
【０１５１】
先に合成された放射線標識プローブを１０分間煮沸して変性させ、次いでブロット化膜を浸したプレハイブリダイゼーション用溶液へ加えた。ハイブリダイゼーションは１６時間行った。溶液を除去し、０．１％ＳＤＳを含有した１×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウム二水和物，ｐＨ７．０）で２回各々１５分間かけて室温で膜を洗浄した。０．１％ＳＤＳを含有した前加温０．２５×ＳＳＣを用いて最終洗浄を５０℃で１５分間行った。膜を取出し、サランラップで包み、シグナルの強度に応じて１２〜２４０時間にわたりＸ線フィルムへ曝した。
【０１５２】
ノーザンハイブリダイゼーションを行う場合、ＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ第四葉からのＲＮＡを膜上にブロットし、選択のプローブについて試験した。図７はこのような３種プローブの結果を示しており、ＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ第四葉間の特異的な発現を証明している。確認された特異的発現を示した３種の遺伝子は次のように称される：
ＤＳ３１（Ｔ１１Ｇ、ＡＰ６５）
ＤＳ６１（Ｔ１１Ａ、ＡＰ１）
ＤＳ１０３（Ｔ１１Ａ、ＡＰ６５）
遺伝子をクローン化するために用いられた様々なプライマー組合せが括弧内に記されている。これらプライマーの詳細は例４で述べられている。
【０１５３】
ＤＳ３１（Ｔ１１Ｇ、ＡＰ６５）は基本的に遺伝子の３′末端領域であって、図７のようなノーザンブロットで１．５キロ塩基サイズの転写物とハイブリッド形成した。
ＤＳ６１（Ｔ１１Ａ、ＡＰ１）は基本的に遺伝子の３′末端領域であって、図７のようなノーザンブロットで７５０塩基サイズの転写物とハイブリッド形成した。
ＤＳ１０３（Ｔ１１Ａ、ＡＰ６５）は基本的に遺伝子の３′末端領域であって、図７のようなノーザンブロットで１．９キロ塩基サイズの転写物とハイブリッド形成した。
【０１５４】
上記転写物のサイズは、M/S. Sigma chemical company,USAから購入されたＲＮＡマーカー（Ｃａｔ＃Ｒ７０２０）の助けを借りて測定した。
【０１５５】
例９
すべての配列を、ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴはBasic Local Alignment Search Toolを表わす）を用いて、ＵＲＬ www.ncbi.nlm.nih.gov.から入手しうる遺伝子データベースで唯一性について調べた。配列ＩＤ１の結果から明らかなように、３１８塩基のうち最大ビット値が１０７であり、最大同一数も１０７塩基（３３．６％）であった。既知配列とのこのような低い配列同一数は、クローン化配列に新規性を付与している。ｄｒ３１は（１）Vitis vinifera、Glycine maxおよびNicotiana tabacumからのタウマチン様タンパク質（ＴＬＰ）；（２）N.tabacum ｍＲＮＡからの病原関連（ＰＲ）タンパク質Ｒ主要型（Ｅ値，１ｅ‐１７）；および（３）Fagus sylvaticaからのオスモチン様タンパク質（ＯＬＰ）の部分的ｏｌｐ２遺伝子（Ｅ値，８ｅ‐１９）に関する遺伝子の３′末端と非常に有意なスコア（８ｅ‐２２〜３ｅ‐９の範囲）を示すことを、分析で更に明らかにした（付録１）。（ＢＬＡＳＴプログラムの用語解説で定義されているようなＥ値または期待値は、次の通りである：偶然にデータベースサーチで生じることが期待される、Ｓと等しいかそれより良いスコアを有する、異なるアライメントの数。Ｅ値が低いほど、スコアは有意に高くなる。）ＴＬＰ、Ｒ主要型のＰＲタンパク質およびＯＬＰは、その３種すべてがＰＲタンパク質のＰＲ‐５ファミリーに属するが、真菌攻撃に応答しておよび浸透圧ストレスに際して誘導されることが知られている（Singh N.K.,Bracker C.A.,Hasegawa P.M.,Handa A.K.,Buckel S.,Hermodon M.A.,Pfankoch E.,Regnier F.E.,Bressan R.A.1987.Characterization of osmotin.A thaumatin-like protein associated with osmotic adaptation to plant cells.Plant Physiology 85,529-536；Yun D.J.,Bressan R.A.,Hasegawa P.M.1997.Plant antifungal proteins.Plant Breeding Reviews 14:39-88）。ＰＲ‐５ファミリー、ひいてはこれらの遺伝子は、真菌攻撃および渇水に対する防御の付与に関与している。そのため、茶が渇水の有害作用から防御されるメカニズムの１つは、ＰＲ‐５様遺伝子の過剰産生による。
【０１５６】
配列ＩＤ２の結果から明らかなように、２５１塩基のうち最大ビットスコアが５２であり、最大同一数が２６塩基（１０．４％）であった。既知配列とのこのような低い配列同一数は、クローン化配列に新規性を付与している。配列相同性サーチでは、ニワトリカルセケストリンｍＲＭＡの３′末端と、ＩＤ２配列の有意なスコア（３ｅ‐４）を示した。カルセケストリンはカルシウム結合タンパク質であって、動物系で非常に多く報告され、心臓および骨格筋でみられる（Cala,SE,Jones,LR.1983.Rapid purification of calsequestrin from cardiac and skeletal muscle sacroplasmic reticulum vesicles by Ca2+-dependent elution from phenyl-sepharose.Journal of Biological Chemistry 258,11932-11936）。そのタンパク質は、カルシウム貯蔵タンパク質としてのその役割とは別に、細胞内Ｃａ＋＋ホメオスタシスの調節に関与している。赤カブおよびキュウリ細胞での免疫研究によると、５５ｋＤａポリペプチドがウサギ骨格筋のカルセケストリンに対するモノクローナル抗体と交差反応することを示した。これらのカルセケストリン様タンパク質は細胞Ｃａ＋＋調節に関与していた。
【０１５７】
一方、渇水／浸透圧ストレスはサイトゾルＣａ＋＋の増加を媒介し、これは防御機能のある渇水誘導遺伝子を誘起することが知られている（Knight H,Brandt S,Knight MR.1998.A history of stress alters drought calcium signaling pathways in Arabidopsis.The Plant Journal.16,681-687；Knight H,Trewavas AJ,Mnight MR.1997.Calcium signaling in Arabidopsis thaliana responding to drought and salinity.The Plant Journal.125,1067-1078）。カルセケストリンの抑制はサイトゾルＣａ＋＋レベルの増加につながり、こうして一連の渇水誘導遺伝子を誘起する。このようにデータは、カルセケストリンが茶において渇水状況下でシグナル伝達経路に関与するらしいことを示唆している。
【０１５８】
配列ＩＤ３の結果から明らかなように、３６１塩基のうち最大ビットスコアが４０であり、最大同一数が２３（１１．１％）であった。既知配列とのこのような低い配列同一数は、クローン化配列に新規性を付与しているが、しかしながら、Ｅ値は（プラスで）高いほど注意を要し、そのため完全遺伝子がクローン化および配列決定されるまで、その配列の役割を決定することが困難である。
【０１５９】
これらの配列は、それらの相同率が２００２年３月まで公に入手しうるデータベースに付されたいずれの配列とも３５％以下であることがわかったため、本発明の関係では新規と言える。
【０１６０】
本発明の主な利点は以下である：
・植物で水ストレス寛容性を促す３種の新規遺伝子
・特に茶植物で渇水寛容性を促す新規遺伝子
・渇水ストレス関連の新規遺伝子をクローン化する方法
・特異的に発現される遺伝子の同定のために、茶のＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢ葉における発現および抑制遺伝子の３′末端のスペクトルが提供された。
・渇水ストレスをうけた茶の葉で特異的発現を証明するための、特異的発現遺伝子の同定３′末端の確認
・特異的発現遺伝子のクローン化３′末端の配列決定により、今までデータバンクに寄託されなかった新規配列という点で、唯一性を示した。
・植物系で渇水寛容性を導入する方法
・茶植物で渇水寛容性を導入する方法
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】ＡＢＡ（ＡＢ）処理、止水による渇水ストレス（ＤＳ）、次いで１４日目の再給水（ＲＣ）に付された茶植物の２年齢苗の第四葉の水ポテンシャル（Ａ）、光合成速度（Ｂ）およびＦｖ／Ｆｍ比（Ｃ）を表わしている。データは別々な４回測定の平均±ｓｄである。
【図２】茶植物の第四葉から単離された全ＲＮＡを表わしている。図で用いられた略語は次の意味を有する：ＣＯ，豊水コントロール植物から単離されたＲＮＡ；ＤＳ，渇水ストレス植物から単離されたＲＮＡ；ＲＣ，回復植物から単離されたＲＮＡ；ＡＢ，ＡＢＡ処理植物から単離されたＲＮＡ。ＭはＲＮＡマーカーを表わす。
【図３】各列の最下部に記載されたようなプライマー組合せを用いた、ＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢに応答する第四葉における発現および抑制遺伝子の３′末端のスペクトルを表わしている。矢印は特異的な発現を示す。
【図４】各列の最下部に記載されたようなプライマー組合せを用いた、ＣＯ、ＤＳ、ＲＣおよびＡＢに応答する第四葉における発現および抑制遺伝子の３′末端のスペクトルを表わしている。矢印は特異的な発現を示す。
【図５】変性ポリアクリルアミドゲルから溶出後における、遺伝子の特異的発現３′末端の増幅を表わしている。ＭはＤＮＡサイズマーカーを表わす。
【図６】図５で記載されたような遺伝子の溶出特異的発現３′末端のクローニング後における増幅を表わしている。ＭはＤＮＡサイズマーカーを表わす。
【図７】遺伝子のクローン化３′末端のノーザンハイブリダイゼーションによる特異的発現の証拠を表わしている。
【図１】
2005535295.tif 000014
【図２】
2005535295.tif 000015
【図３】
2005535295.tif 000016
【図４】
2005535295.tif 000017
【図５】
2005535295.tif 000018
【図６】
2005535295.tif 000019
【図７】
2005535295.tif 000020
【国際調査報告】
2005535295.tif 000021
2005535295.tif 000022
2005535295.tif 000023
2005535295.tif 000024
2005535295.tif 000025