(57)【要約】本発明は、組み換え型ウイルス、単離した核酸、ベクター、細胞、及びそれらを含む組成物を提供する。前記組み換え型ウイルス、単離した核酸、ベクター、細胞、及びそれらを含む組成物は、少なくとも一つの外来核酸の発現に加えて、変異したマトリクス・タンパク質（Ｍ）及び／又は変異した糖タンパク質（Ｇ）を含んでいるラブドウイルス・タンパク質を発現する。また、本発明は、それらを、インビボや抗癌（神経膠腫の治療など）の用途に使用する方法に関する。また、本発明に係る組み換え型ラブドウイルスは、遺伝子治療及びワクチンの用途にも有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含むことを特徴とする組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項２】
糖タンパク質（Ｇ）をエンコードする領域内に欠失又は変異をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項３】
調節因子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項４】
前記欠失又は変異は、前記マトリクス・タンパク質のＮ末端側半分をエンコードする領域内にあることを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項５】
前記欠失又は変異は、核局在配列をエンコードする前記マトリクス・タンパク質におけるＮ末端部分をエンコードする領域内にあることを特徴とする請求項４に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項６】
前記変異は、
（ａ）位置３３又は５１での、アラニン・アミノ酸残基によるメチオニン・アミノ酸残基の置換、又は
（ｂ）位置２２６での、グリシン・アミノ酸残基によるセリン・アミノ酸残基の置換をエンコードすることを特徴とする請求項５に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項７】
２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項８】
前記２番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項７に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項９】
前記２番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項７に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１０】
標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１１】
前記標識ポリペプチドは、緑色発光タンパク質、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ、ＤｓＲｅｄ発光タンパク質、βガラクトシダーゼ、又は発光酵素であることを特徴とする請求項１０に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１２】
自殺遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１３】
サイトカイン遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１４】
前記サイトカインは、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、又はインターフェロン−γであることを特徴とする請求項１３に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１５】
ラブドウイルス・Ｇステム・ポリペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１６】
遺伝子送達ベクター又はワクチンとして使用されることを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１７】
前記ラブドウイルスは、腫瘍細胞に対して選択的に細胞変性することを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１８】
前記ラブドウイルス・ゲノムは、水疱性口炎ウイルス・ゲノムであることを特徴とする請求項１に記載の組み換え型非細胞変性ラブドウイルス。
【請求項１９】
マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み換え核酸を含む非細胞変異性の組み換え型ラブドウイルスを作成する方法であって、
（Ａ）適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する３´及び５´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性ｃＤＮＡを挿入するステップと、
（Ｂ）前記細胞を、前記細胞の非細胞変性表現型のために選択された条件下で培養するステップと、
（Ｃ）前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスを作成可能な条件下で培養するステップと、
（Ｄ）前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記２番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記２番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離した非細胞変性組み換え型ラブドウイルスから、ゲノムＲＮＡを単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ゲノムＲＮＡを単離するステップは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して行われることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記適切な細胞は、齧歯類、霊長類及びヒト細胞から成る群より選択されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記欠損又は変異は、前記マトリクス・タンパク質のＮ末端領域に存在することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記マトリクス・タンパク質の前記Ｎ末端領域に存在している前記欠損又は変異は、核局在配列の一部であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記変異は、
（ａ）位置３３又は５１での、アラニン・アミノ酸残基によるメチオニン・アミノ酸残基のアミノ酸置換、又は
（ｂ）位置２２６での、グリシン・アミノ酸残基によるセリン・アミノ酸残基のアミノ酸置換であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、水疱性口炎ウイルスであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
マトリクス・タンパク質をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有する非細胞変性ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする単離した核酸分子。
【請求項３１】
前記非細胞変性ラブドウイルス・ゲノムは、遺伝子組み換えされた糖タンパク質（Ｇ）をさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の単離した核酸分子。
【請求項３２】
調節因子をさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の単離した核酸分子。
【請求項３３】
前記欠損又は変異は、前記マトリクス・タンパク質のＮ末端領域をエンコードする領域に存在することを特徴とする請求項３０に記載の単離した核酸分子。
【請求項３４】
前記マトリクス・タンパク質のＮ末端領域をエンコードする領域に存在する前記欠損又は変異は、核局在配列をエンコードすることを特徴とする請求項３３に記載の単離した核酸分子。
【請求項３５】
前記変異は、
（ａ）位置３３又は５１での、アラニン・アミノ酸残基によるメチオニン・アミノ酸残基の置換、又は
（ｂ）位置２２６での、グリシン・アミノ酸残基によるセリン・アミノ酸残基の置換をエンコードすることを特徴とする請求項３０に記載の単離した核酸分子。
【請求項３６】
２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の単離した核酸分子。
【請求項３７】
前記２番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項３６に記載の単離した核酸分子。
【請求項３８】
前記２番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項３６に記載の単離した核酸分子。
【請求項３９】
標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項３６に記載の単離した核酸分子。
【請求項４０】
前記標識ポリペプチドは、緑色発光タンパク質、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ、ＤｓＲｅｄ発光タンパク質、βガラクトシダーゼ、又は発光酵素であることを特徴とする請求項３９に記載の単離した核酸分子。
【請求項４１】
自殺遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の単離した核酸分子。
【請求項４２】
ラブドウイルス・Ｇステム・ポリペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項３０に記載の単離した核酸分子。
【請求項４３】
前記ゲノムは、水疱性口炎ウイルス・ゲノムであることを特徴とする請求項３０に記載の単離した核酸分子。
【請求項４４】
請求項３０に記載の単離した核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項４５】
ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含むことを特徴とする組み換え型ラブドウイルス。
【請求項４６】
前記変異は、
（ａ）アラニン・アミノ酸残基によるトリプトファン・アミノ酸残基の置換、
（ｂ）アラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン及び／又はフェニルアラニン・アミノ酸残基の置換、
（ｃ）アスパラギン酸及びアラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン・アミノ酸残基、或いはそれらの組み合わせの置換、又は
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせの置換をエンコードすることを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項４７】
前記変異は、
（ａ）アミノ酸残基４４９〜４６１をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損、又は
（ｂ）アミノ酸残基４４０〜４４９をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損をエンコードすることを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項４８】
前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜に近接している外部領域におけるセリンアミノ酸残基間への、崩壊促進因子のアミノ酸残基３１１〜３１９をエンコードするヌクレオチドの挿入であることを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項４９】
２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５０】
前記２番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項４９に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５１】
前記２番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項４９に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５２】
標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５３】
前記標識ポリペプチドは、緑色発光タンパク質、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ、ＤｓＲｅｄ発光タンパク質、βガラクトシダーゼ、又は発光酵素であることを特徴とする請求項５２に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５４】
自殺遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５５】
サイトカイン遺伝子をエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５６】
前記サイトカインは、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、又はインターフェロン−γであることを特徴とする請求項５５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５７】
マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内に欠失又は変異を有することを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５８】
前記遺伝子組み換えマトリクス・タンパク質は、該マトリクス・タンパク質のＮ末端領域に欠損を有することを特徴とする請求項５７に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項５９】
前記マトリクス・タンパク質の前記Ｎ末端領域に存在する前記欠損又は変異は、核局在配列の一部であることを特徴とする請求項７３に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項６０】
調節因子をさらに含むことを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項６１】
遺伝子送達ベクターとして使用されることを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項６２】
ワクチンとして使用されることを特徴とする請求項４５に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項６３】
前記ラブドウイルス・ゲノムは、水疱性口炎ウイルス・ゲノムであることを特徴とする請求項５６に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項６４】
ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み替え核酸を含む組み換え型ラブドウイルスを作成する方法であって、
（Ａ）適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する３´及び５´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性ｃＤＮＡを挿入するステップと、
（Ｂ）前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスの作成を作成可能な条件下で培養するステップと、
（Ｃ）前記組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項６５】
前記細胞内に、２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列を挿入するステップをさらに含むことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記２番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドであることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記２番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項６４に記載の組み換え型ラブドウイルス。
【請求項６８】
前記単離した非細胞変性組み換え型ラブドウイルスから、ゲノムＲＮＡを単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記ゲノムＲＮＡを単離するステップは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して行われることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記適切な細胞は、齧歯類、霊長類及びヒト細胞から成る群より選択されることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内の変異は、
（ａ）アラニン・アミノ酸残基によるトリプトファン・アミノ酸残基の置換、
（ｂ）アラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン及び／又はフェニルアラニン・アミノ酸残基の置換、
（ｃ）アスパラギン酸及びアラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン・アミノ酸残基、或いはそれらの組み合わせの置換、又は
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせの置換をエンコードすることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記変異は、
（ａ）アミノ酸残基４４９〜４６１をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損、又は
（ｂ）アミノ酸残基４４０〜４４９をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損であることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜に近接している外部領域におけるセリンアミノ酸残基間への、崩壊促進因子のアミノ酸残基３１１〜３１９をエンコードするヌクレオチドの挿入であることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、水疱性口炎ウイルスであることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでおり、該ポリヌクレオチド配列はラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有していることを特徴とする単離した核酸分子。
【請求項７６】
前記糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域の変異は、
（ａ）アラニン・アミノ酸残基によるトリプトファン・アミノ酸残基の置換、
（ｂ）アラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン及び／又はフェニルアラニン・アミノ酸残基の置換、
（ｃ）アスパラギン酸及びアラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン・アミノ酸残基、或いはそれらの組み合わせの置換、又は
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）の置換の任意の組み合わせの置換であることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項７７】
前記変異は、
（ａ）アミノ酸残基４４９〜４６１をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損、又は
（ｂ）アミノ酸残基４４０〜４４９をエンコードするヌクレオチド或いはそれらの断片の欠損であることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項７８】
前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜に近接している外部領域におけるセリンアミノ酸残基間への、崩壊促進因子のアミノ酸残基３１１〜３１９をエンコードするヌクレオチドの挿入であることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項７９】
非細胞変性ラブドウイルス・ゲノムは、遺伝子組み替えマトリクス・タンパク質をさらに含んでいることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８０】
前記欠損又は変異は、前記マトリクス・タンパク質のＮ末端をエンコードする領域内にあることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８１】
前記欠損又は変異は、核局在配列をエンコードする領域内にあることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８２】
前記変異は、
（ａ）位置３３又は５１での、アラニン・アミノ酸残基によるメチオニン・アミノ酸残基の置換、又は
（ｂ）位置２２６での、グリシン・アミノ酸残基によるセリン・アミノ酸残基の置換をエンコードすることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８３】
調節因子をさらに含むことを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８４】
２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８５】
前記２番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチド又は免疫原性のポリペプチドであることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８６】
標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８７】
前記標識ポリペプチドは、緑色発光タンパク質、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ、ＤｓＲｅｄ発光タンパク質、βガラクトシダーゼ、又は発光酵素であることを特徴とする請求項８６に記載の単離した核酸分子。
【請求項８８】
自殺遺伝子をエンコードする核酸配列の挿入をさらに含むことを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項８９】
融合促進ポリペプチド又は抗受容体をさらに含むことを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項９０】
前記ゲノムは、水疱性口炎ウイルス・ゲノムであることを特徴とする請求項７５に記載の単離した核酸分子。
【請求項９１】
請求項７５に記載の単離した核酸分子を含むベクター。
【請求項９２】
欠陥遺伝子に関連する病気に罹っている患者を治療する方法であって、
前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型非細胞変性ラブドウイルスを投与するステップを含んでおり、
前記ラブドウイルスのゲノムは、前記患者のマトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内における欠損又は変異と、標的細胞の内部で発現できる異種遺伝子とを有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法。
【請求項９３】
前記標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、免疫細胞、グリア細胞、前立腺細胞、膵島のα・β・γ細胞、又は腺房細胞であることを特徴とする請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
患者に病気に対する免疫性を与える方法であって、
前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、
前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子と有し、それによって病気に対する免疫性を与えることを特徴とする方法。
【請求項９５】
前記標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、前立腺細胞、強力な抗原提示細胞、リンパ球、又はＭ細胞であることを特徴とする請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
病気に罹っている患者を治療する方法であって、
前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、
前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子を有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法。
【請求項９７】
前記標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、前立腺細胞、強力な抗原提示細胞、リンパ球、又はＭ細胞であることを特徴とする請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
欠陥遺伝子に関連する病気に罹っている患者を治療する方法であって、
前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、
前記ウイルスは、前記患者のマトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる異種遺伝子とを有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法。
【請求項９９】
前記標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、又は前立腺細胞であることを特徴とする請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
癌細胞を溶解させる方法であって、
癌細胞に、（ａ）マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片を含む核酸と、（ｂ）非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ラブドウイルスを接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０１】
前記非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードすることを特徴とする請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
癌を治療する方法であって、
癌細胞に、（ａ）マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、（ｂ）非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ウイルスを接触させるステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０３】
前記非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードすることを特徴とする請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定する方法であって、
コロナ、黒質及び皮質組織のビブラトーム薄片を取得するステップと、
生存力を維持しつつ細胞分裂を抑制した条件下で、前記薄片をカバースリップ上で培養するステップと、
前記薄片培養物に標識された癌細胞を接種するステップと、
前記接種された細胞を、対象物質と共に培養するステップと、
癌細胞の生存度を測定するステップとを含み、
癌細胞の生存度の減少は前記対象物質が腫瘍細胞破壊性であることを示し、このことにより腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定することを特徴とする方法。
【請求項１０５】
前記癌細胞は、ニューロン由来であることを特徴とする請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ニューロン由来の癌細胞は、グリオーマ細胞であることを特徴とする請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ニューロン由来の癌細胞は、蛍光性、発光性、発色性、及び電子密度ラベルにより標識されることを特徴とする請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
前記薄片培養物に標識された組み換え型ラブドウイルスを接種するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
前記接種された薄片をサイトカインと共に培養するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１０】
前記サイトカインはインターフェロンであることを特徴とする請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
生存力を維持した条件下における、前記薄片のカバースリップ上での培養は、
Ｇｅｙのデキストロース溶液，プラズマ，トロンビン、Ｅａｇｌｅの基礎培地、Ｈａｎｋｓの平衡塩類溶液，Ｌ−グルタミン酸、又はそれらの任意の組み合わせを含む培地で行うことを特徴とする請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１２】
細胞分裂を抑制した条件下における、前記薄片のカバースリップ上での培養は、
シトシン−α−Ｄ−アラビノフラノシド、ウリジン、Ｇｅｙのデキストロース溶液，プラズマ，トロンビン、Ｅａｇｌｅの基礎培地、Ｈａｎｋｓの平衡塩類溶液，Ｌ−グルタミン酸、又はそれらの任意の組み合わせを含む培地で行うことを特徴とする請求項１０４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラブドウイルスに関し、特に、変異したマトリクス・タンパク質（Ｍ）及び／又は変異した糖タンパク質（Ｇ）などのラブドウイルス・タンパク質、さらにはそれらのゲノムに含まれる、少なくとも１つの外来の核酸の発現に関する。また、本発明は、それらを、インビボや抗癌（神経膠腫の治療など）の用途に使用する方法に関する。また、本発明に係る組み換え型ラブドウイルスは、遺伝子治療及びワクチンの用途にも有用である。
【背景技術】
【０００２】
治療用途での遺伝子送達に適切なベクターの開発が著しく進歩したのにもかかわらず、特に、遺伝子治療やワクチン開発に効果的な送達システムの発達や、それらの抗癌治療への影響において、多くの障害が残っている。
【０００３】
遺伝子治療ウイルス・ベクターは、一般的に、標的とする細胞には溶解しない。遺伝子治療に用いられるウイルス・ベクターは、治療上有効な量のＤＮＡを薬のように比較的安全に送達するために、人工的に作成される（例えば、D. T. Curielらによる米国特許第5,547,932号参照）。それらのベクターのいくつかは、標的細胞内でのみ、感染部で複製することができる（F. McConnickによる米国特許第5,677,178号）。他の、複製することができない遺伝子治療ベクターも人工的に作成される。複製しない遺伝子治療ベクターは、通常、ヘルパー・プラスミドを使用して（例えば、G. Natsoulisによる米国特許第5,622,856号、M. Mamounasによる米国特許第5,646,034号参照）、又は、ウイルスのゲノム内で欠いている遺伝因子を与える細胞をパッケージ化して生成される。
【０００４】
遺伝子治療ウイルス・ベクターの幅広い用途は、使用されるウイルス・ベクターに合っている野生型の宿主域は、多くの場合、容易に克服できないという事実によって妨げられている。近年、次のような、多数の遺伝子治療の特許が公開されている。アデノウイルス・ベクターを説明したもの（M. Cottenらによる米国特許第5,693,509号）、アデノ随伴ウイルス・ベクターについて（J. S. Lebkowskiらによる米国特許第5,589,377号）、レトロウイルス・ベクター（B. 0. Palssonらによる米国特許第5,616,487号）、キメラ融合糖タンパクを含むベクター（S. Kaymanらによる米国特許第5,643,756号）、ウイルスコート・タンパク質に対する抗体を含むベクター（Cottonら）、通常はＨＩＶ１に感染しない種類のサルに、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）を感染させることができるように人工的に作成された複合型ウイルス（J. Sodroskiらによる米国特許第5,654,195号）、及び水疱性口炎ウイルス（vesicular stomatitis virus：ＶＳＶ）のＧタンパク質を含むシュードタイプ・レトロウイルス・ベクター（J. C. Bumsらによる米国特許第5,512,421号及び米国特許第5,670,354号）。遺伝子治療に使用されるベクターの有効性を保ちつつ、個々のベクターに固有の宿主域を制限する問題を克服するために、遺伝子治療ベクターの多少の変更が試みられている。また、ウイルス送達媒体（細胞に送達された遺伝子の発現は永続的ではない）が、一時的な遺伝子治療のために作成される（I. H. Maxwellらによる米国特許第5,585,254号）。
【０００５】
ワクチン開発及び効果的な免疫反応の促進は、生物医学研究における新しい分野であり、特にウイルス送達媒体に関して、適切な遺伝子送達システムのより良い設計がもたらす利益を享受すると思われている。病原体又はワクチン製剤の侵入に対する免疫反応の初期段階に生成されたサイトカインは、抗原特異的Ｔｈ細胞の発達において重要な役割を果たすことが立証されている。いくつかの一連の証拠は、防御と関係する表現型に分化するＴヘルパー細胞の「決定」は、Ｔヘルパー細胞が発見されたサイトカイン環境によって強く影響されることを立証している（１）。さらに、様々なサイトカインが、治療用又は補助成分として投与された際に、細胞媒介性の抗原特異的免疫反応の発達を促進する免疫調節効果を有することが知られている。そのようなサイトカインの免疫調節性と補助特性を十分に活用するために、多くの研究者が、生体内に多量のそれらのサイトカインを送達するための、プラスミドＤＮＡ（２）、人工細胞（３、４）、又は組み換え型ウイルス（５）などのベクターの使用を評価しはじめている。
【０００６】
他の分野では、ウイルス・ベクターは、特に、腫瘍の治療（特に、脳腫瘍の治療）の用途に有望である。癌遺伝子治療の急速な進歩は、そのような技術が手術に対して優れた補助を提供するという望みを再びもたらす。これらの手段を用いた、癌を治療するための２つの治療方法が開発されている。一方の方法は、ウイルス療法（virotherapy, oncolytic therapy）と呼ばれ、瘍細胞を殺すために、細胞溶解性ウイルスに本来備わっている破壊的な能力を利用する。これらの、いわゆる腫瘍細胞破壊性ウイルスは、腫瘍細胞を特異的に標的とする、又は、正常な細胞での複製を制限するために遺伝子組み換えされており、それによって腫瘍を選択的に破壊する。複製が制限された腫瘍細胞破壊性ウイルスの一例は、ＯＮＹＸ−１５である。ＯＮＹＸ−１５は、ＥＩＢ遺伝子が除去されたアデノウイルスであり、野生型のｐ５３遺伝子を有する正常細胞内での複製を制限するが、ｐ５３の機能性を欠いている腫瘍細胞内では複製し、その細胞を殺す（６）。他方の方法は、治療性又は腫瘍細胞破壊性遺伝子を腫瘍細胞に送達することである。これらの遺伝子の産物は、腫瘍の成長を直接的又は間接的に抑制する。ヒト・サイトカイン遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、遺伝子（自殺遺伝子）をエンコードする細菌性又はウイルス性のプロドラッグ活性化酵素、及び放射線及び化学療法するために腫瘤の感受性を高める遺伝子などの、多種多様な遺伝子が、臨床前及び臨床研究でテストされた。
【０００７】
ラブドウイルスは細胞膜で覆われたウイルスであり、自然界に広くに分布し、脊椎動物、無脊椎動物及び植物に影響を及ぼす。水疱性口炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus: VSV）は、ラブドウイルス科のウイルスファミリ（６つの属に分類される）の一員である。ラブドウイルス科は、単一の、１１，０００〜１２，０００ヌクレオチドの負鎖ＲＮＡゲノムを有する（Rose and Whiff, 2001, Chapter 38, Rhabdoviridae: The viruses and their replication, in Fields Virology, 4tb edition, pp. 1221）。ウイルス粒子は、ゲノムＲＮＡ及びタンパク質から成る、らせん状のヌクレオカプシド・コアを含んでいる。一般に、Ｎ（ヌクレオカプシド、ゲノムを強固に覆う）、Ｐ（以前はＮＳと呼ばれた、本来は非構造性を示す）、及びＬ（大きい）と呼ばれる３つのタンパク質は、ヌクレオカプシドと関係があることが分っている。細胞膜外皮内には、恐らく細胞膜とヌクレオカプシ・コアとの両方に相互作用する、付加的なマトリクス（Ｍ）タンパク質が存在している。一種類の糖タンパク質（Ｇ）は、細胞膜を架橋し、ウイルス粒子の表面にスパイクを形成する。Ｇは、細胞と膜融合との結合に関与する。ゲノムは、マイナス・センスなので（即ち、ｍＲＮＡとして機能するＲＮＡ配列（プラス・センス）を補完し、エンコードされたタンパク質を直接的に作成する）、ラブドウイルスは、Ｐ及びＬタンパク質から成るビリオン（virion）内にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをエンコードし、パッケージ化する必要がある（Balti-naore et al., 1970, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 66: 572-576）。この酵素は、ゲノムＲＮＡを転写し、５〜６つのウイルスタンパク質をエンコードするサブゲノムｍＲＮＡを作成する。また、完全長のマイナス及びプラス・センスＲＮＡを複写する。遺伝子治療は、遺伝子の３´端から始めて、順次転写する。
【０００８】
ＶＳＶのマトリクス・タンパク質は、ウイルスのライフサイクルにおいて、２つの重要な機能を果たす。第１に、ウイルス集合、及び感染細胞からのウイルス粒子の放出にとって必須である。第２に、ホスト細胞の遺伝子発現の抑制に関与し、ウイルス・タンパク質を合成するための全てのホスト細胞翻訳機構にウイルスを利用することを可能にする。Ｍタンパク質によるホスト遺伝子発現の抑制は、ＶＳＶの感染と関係する、高度で急速な細胞変性効果に関与すると考えられている。Ｍタンパク質に誘発された細胞変性効果は、アポトーシスの惹起を引き起こし、一般的には、細胞は感染後１２〜１６時間後に死滅する。真核発現ベクターとは無関係な、Ｍタンパク質の一時的な発現は、ホスト細胞の細胞骨格の分解と細胞丸めなどの、典型的なＶＳＶ細胞変性効果を引き起こすのに十分であり、ＶＳＶに誘発された細胞変性効果には他のＶＳＶタンパク質は不要であることを実証する。
【０００９】
ＶＳＶ Ｇタンパク質は、ウイルスのホスト細胞への付着と、細胞の飲食作用後のウイルス外皮の細胞膜外部領域への融合を両方とも仲立ちする。Ｇタンパク質の１１８〜１３６残基の変異解析と、同様にＶＳＶの疎水性光標識実験の結果により、この領域は融合ペプチドの内部であり、酸性のｐＨ（９〜１４）で標的細胞膜に挿入されるという証拠が得られる。残基３９５〜４１８の領域での挿入又は置換は、Ｇタンパク質の細胞膜の融合活性に影響を及ぼすことが分っている（１５、１６）。融合ペプチドと残基３９５〜４１８の両方で置換された二重変異体は、融合抑制への相加効果を有しており（１７）、外部領域のＣ末端領域がＧの融合活性において特に重要な役割を果たすことを示す。
【００１０】
以上述べたように、前述した遺伝子送達、ワクチン開発、及び抗癌治療の用途に使用されるウイルス・ベクターを開発する必要性が認識されている。特に、細胞変性効果を有しておらず、広範囲の細胞間拡散を行わず、細胞質内でのみ複製し、ウイルス・ベクター治療（標的細胞染色体内での挿入突然変異に関係するものを含む）に関係するものを排除するＶＳＶベースのベクターの開発が求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のある実施形態は、マトリクス・タンパク質（Ｍ）、及び／又はラブドウイルス・タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域が変異した又は部分的に除去された組み換え型ラブドウイルスを開示する。また、本発明の他の実施形態は、前記組み換え型ラブドウイルスを、ワクチンや抗癌治療のような遺伝子導入方法に使用する方法を提供する。
【００１２】
ある実施形態では、前記組み換え型ラブドウイルスは非細胞変性であり、第２のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入をさらに含んでいる。前記第２のポリペプチドは、ある実施形態では治療用のポリペプチドであり、他の実施形態では免疫原性のポリペプチドである。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み換え核酸を含んでいる非細胞変異性の組み換え型ラブドウイルスを作成する方法を提供する。該方法は、（Ａ）適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する３´及び５´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性ｃＤＮＡを挿入するステップと、（Ｂ）前記細胞を、前記細胞の非細胞変性表現型のために選択された条件下で培養するステップと、（Ｃ）前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスを作成可能な条件下で培養するステップと、（Ｄ）前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含んでいる。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでおり、該ポリヌクレオチドはマトリクス・タンパク質をエンコードする遺伝子に変異又は欠失を有している単離した核酸分子を提供する。
【００１５】
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含んでいる組み換え型ラブドウイルスを提供する。他の実施形態では、ラブドウイルスのゲノムは、さらに、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有している。ある実施形態では、ラブドウイルスのゲノムは、さらに、２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列の挿入を含んでいる。ある実施形態では、前記２番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチドである。他の実施形態では、前記２番目のポリペプチドは、免疫原性のポリペプチド、自殺遺伝子、又はマーカーポリペプチドである。
【００１６】
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み替え核酸を含んでいる組み換え型ラブドウイルスを作成する方法を提供する。該方法は、（Ａ）適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する３´及び５´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性ｃＤＮＡを挿入するステップと、（Ｂ）前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスの作成を作成可能な条件下で培養するステップと、（Ｃ）前記組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含んでいる。
【００１７】
ある実施形態では、前記方法は、２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列を挿入するステップをさらに含んでいる。他の実施形態では、前記２番目のポリペプチドは、治療用のポリペプチド、又は免疫原性のポリペプチドである。
【００１８】
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでおり、該ポリヌクレオチド配列はラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有していることを特徴とする単離した核酸分子。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、欠陥遺伝子に関連する病気に罹っている患者を治療する方法を提供する。該方法は、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型非細胞変性ラブドウイルスを投与するステップを含んでおり、前記ラブドウイルスのゲノムは、前記患者のマトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内における欠損又は変異と、標的細胞の内部で発現できる異種遺伝子とを有し、それによって病気を治療する。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、患者に病気に対する免疫性を与える方法を提供する。該方法は、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子と有し、それによって病気に対する免疫性を与える。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、癌細胞を溶解させる方法を提供する。該方法は、癌細胞に、（ａ）マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片を含む核酸と、（ｂ）非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ラブドウイルスを接触させるステップを含んでいる。他の実施形態では、前記非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードする。
【００２２】
他の実施形態では、本発明は、ガンを治療する方法を提供する。該方法は、癌細胞に、（ａ）マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、（ｂ）非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ウイルスを接触させるステップを含む。他の実施形態では、前記非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードする。
【００２３】
他の実施形態では、本発明は、腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定する方法を提供する。該方法は、コロナ、黒質及び皮質組織のビブラトーム薄片を取得するステップと、生存力を維持しつつ細胞分裂を抑制した条件下で、前記薄片をカバースリップ上で培養するステップと、前記薄片培養物に標識された癌細胞を接種するステップと、前記接種された細胞を、対象物質と共に培養するステップと、癌細胞の生存度を測定するステップとを含む。癌細胞の生存度の減少は、前記対象物質が腫瘍細胞破壊性であることを示し、このことにより腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定する。他の実施形態では、前記癌細胞はニューロン由来である。他の実施形態では、前記癌細胞は、蛍光性、発光性、発色性及び電子密度レベルにより標識される。他の実施形態では、前記方法は、前記薄片培養物に標識された組み換え型ラブドウイルスを接種するステップ、及び／又は前記接種された薄片をサイトカインと共に培養するステップをさらに含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、組み換え型ウイルス、組み換え型ラブドウイルス、ベクター及びそれらを含む組成物を提供する。ある実施形態では、本発明に係るラブドウイルス核酸配列は、部分的な決失を有するマトリクス・タンパク質（Ｍ）及び／又は糖タンパク質（Ｇ）を含む。そのため、ラブドウイルス・ベースの遺伝子治療ベクター、ワクチンの作成及び／又は抗癌治療に使用できる。また、本発明の他の実施形態では、ここに開示される治療用途の組み換え型ラブドウイルス、ベクター及び組成物を作成する方法を提供する。
【００２５】
ある実施形態では、組み換え型ラブドウイルスは、外来遺伝子を送達する手段を提供する。前記遺伝子は、ヒトの体内で様々な細胞と感染するので、非常に用途が広い。他の実施形態では、それらの異種タンパク質を発現させる操作は、多様な細胞種類へ外来遺伝子を送達するシステムと、従来の多くの遺伝子送達に使用されるベクター（細胞親和性が低い）に欠けている用途を提供する。
【００２６】
従来の組み換え型ラブドウイルスの使用は、細胞タンパク質合成の減少により、外来タンパク質発現がわずかである細胞変性効果をもたらす。しかしながら、本発明のある実施形態では、Ｍタンパク質が変異又は削除された組み換え型ラブドウイルスは細胞と感染し、さらに非細胞変性である。異種タンパク質発現は、変異したウイルス内で機能強化されたタンパク質の発現により直ちに行われる。
【００２７】
Ｍタンパク質の変異は、宿主域を変えないので、複合型の細胞は感染し（実施例２）、すぐに元に戻せる（実施例３）。変異ウイルスに感染した島細胞は、細胞変性効果がわずかである高レベルの外来遺伝子発現をもたらす（実施例４）。さらに、Ｍ及びＧ糖タンパク質が削除されたステムによる感染は、８時間培養した後でも、高レベルの感染及び発現をもたらす。このように、Ｍタンパク質が変異又は削除された組み換え型ラブドウイルスは、Ｇタンパク質の変異又は欠失の同時発生の有無にかかわらず、非細胞変性の遺伝子送達／遺伝子治療ベクターを提供する。
【００２８】
ある実施形態では、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含む組み換え型ラブドウイルスを提供する（ある実施形態では、前記組み換え型ラブドウイルスは非細胞変性である）。
【００２９】
ここで使われる「組み換え型ラブドウイルス」という用語は、ラブドウイルスでは本来発現しないタンパク質を発現させるために、遺伝子組み替えにより人工的に作成されたウイルスのことを意味する。このようなウイルスの作成は、その後単離することができる「シュードタイプ」又は「キメラ」ウイルスを生成する。
【００３０】
ここで使われる「非細胞変性ラブドウイルス」という用語は、ウイルス集合において依然として機能するが、感染した細胞に対しては細胞変性ではない、ラブドウイルスの非細胞変性の変異を意味する。
【００３１】
ここで使われる「マトリクス・タンパク質（Ｍ）」という用語は、ラブドウイルス・ゲノムにエンコードされているタンパク質を意味する。マトリクス・タンパク質は、細胞膜外皮内に存在し、恐らく細胞膜とヌクレオカプシ・コアとの両方に相互作用する。ラブドウイルスのマトリクス・タンパク質は、ウイルスのライフサイクルにおいて、２つの重要な機能を果たす。第１に、ウイルス集合、及び感染細胞からのウイルス粒子の放出にとって必須である。第２に、ホスト細胞の遺伝子発現の抑制に関与し、ウイルス・タンパク質を合成するための全てのホスト細胞翻訳機構にウイルスを利用することを可能にする。Ｍタンパク質によるホスト遺伝子発現の抑制は、ＶＳＶの感染と関係する、高度で急速な細胞変性効果に関与すると考えられている。
【００３２】
ある実施形態では、本発明に係る組み換え型非細胞変性ラブドウイルスは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有する。他の実施形態では、前記欠失又は変異は、核局在配列（nuclear localization signal ：ＮＬＳ）をエンコードする領域を有するマトリクス・タンパク質のＮ末端側半分をエンコードする領域内にある。
【００３３】
ここで使われる「核局在配列」又は「ＮＬＳ」という用語は、ＮＬＳと関係する発現したペプチド、タンパク質、又は分子の、細胞の細胞質から核への細胞膜を経た輸送を指示するペプチド又はその派生物を意味する。
【００３４】
ある実施形態では、前記変異は、例えばマトリクス・タンパク質（Ｍ）の位置３３又は５１で、メチオニン残基の代わりにアラニン残基をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、例えば位置２２６での、グリシン残基によるセリン残基の置換をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、位置１３３での、アラニン酸残基によるトレオニン残基の置換をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、全てのＭタンパク質をコードしている領域で欠失を有する。ラブドウイルスの細胞変性効果の減少をもたらすＭタンパク質発現の任意の変更は、本発明の一部と見なされる。
【００３５】
他の実施形態では、Ｍタンパク質変異体は、SEQ ID NO：１、２、３、４又は５に対応するアミノ酸配列を有する。
【００３６】
本発明のある実施形態では、組み換え型非細胞変性ラブドウイルスは、糖タンパク質（Ｇ）をエンコードしている領域内に、さらに変異を有する。
【００３７】
ラブドウイルスにエンコードされた糖タンパク質（Ｇ）は、ウイルスの融合、感染力及びウイルスの出芽プロセスの全体的な効果に寄与する（Whitt M. A., (1998) The Journal of Microbiology 36: 1-8）。ラブドウイルスＧタンパク質、Ｇステムポリペプチドの断片は、細胞膜融合に関与する。ここで使われる「Ｇステムポリペプチド」という用語は、４２アミノ酸配列細胞膜に近接する外部領域、膜貫通型アンカー及び細胞質後部領域（成熟したＧタンパク質の）を含む、ラブドウイルスＧタンパク質のセグメントを意味する。
【００３８】
Ｇ糖タンパク質（Ｇ）は、細胞膜融合に関与するので、ラブドウイルス感染における細胞間核酸を促進する。ここでは、Ｇの細胞膜に近接する外部領域は、細胞膜融合に必須であると見なされている。Ｇの細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域における置換、欠又は挿入の変異は、Ｇ発現の減少をもたらさない（実施例５）。安定性、細胞表面に対する完全長Ｇタンパク質のオリゴマー化又は輸送、領域の欠失に影響された細胞膜近接領域内の変異は、どれも大いに抑制された融合をもたらさない（細胞膜固定領域とＧタンパク質との境界の間への９又は１０のアミノ酸の挿入は影響されるが）。Ｇ細胞膜近接外部領域由来の特異的残余の置換は、融合を減少させない。融合活性が完全に止められた、保存ＦＦＧＤＴＧモチーフを含むＦ４４０とＮ４４９との間の欠失だけが、このサブドメインがＧｎｏ融合活性に重要であることを示す。融合の特徴、欠失変異が伴うウイルスの成長は、ウイルスを成長させるためのＧ機能の補完を必要とする（実施例８）。また、細胞膜近接外部領域のアミノ酸残基（例えばＮ４４９−Ｋ４６２）は、減少した伝染力をもたらす。
【００３９】
ある実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域をエンコードする領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含んでいる組み換え型ラブドウイルスを提供する。
【００４０】
ある実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域内の変異は、アラニン・アミノ酸残基によるトリプトファン・アミノ酸残基の置換をエンコードする（SEQ ID NO：８、１０、１１、１２、１３又は１４）。他の実施形態では、前記変異は、アラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸（SEQ ID NO：６）、グリシン（SEQ ID NO：７）及び／又はフェニルアラニン・アミノ酸残基（SEQ ID NO：９）の置換をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、アスパラギン酸及びアラニン・アミノ酸残基による、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン・アミノ酸残基、或いはそれらの組み合わせの置換をエンコードする。他の実施形態では、前記変異は、前記したアミノ酸残基の置換をエンコードする変異の任意の組み合わせである。
【００４１】
他の実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域内の変異は、前記外部領域内のヌクレオチドの欠失をエンコードする。ある実施形態では、前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）のアミノ酸残基４４９〜４６１をエンコードするヌクレオチド（SEQ ID NO：２０）、又はその断片の欠損である。他の実施形態では、前記変異は、アミノ酸残基４４０〜４４９をエンコードするヌクレオチド（SEQ ID NO：１６）、又はそれらの断片の欠損である。
【００４２】
他の実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域内の変異は、外部領域へのヌクレオチドの挿入をエンコードする。ある実施形態では、前記変異は、ラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜近接外部領域におけるセリンアミノ酸残基間への、崩壊促進因子（decay acceleration factor ：ＤＡＴ）のアミノ酸残基３１１〜３１９をエンコードするヌクレオチドの挿入である（SEQ ID NO：２２）、
他の実施形態では、ラブドウイルス・糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域をエンコードしている領域内の変異は、SEQ ID NO：１５、１９、２０又は２２に対応するアミノ酸配列を有する変異となる。
【００４３】
他の実施形態では、ラブドウイルス・ゲノムは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に変異又は欠失をさらに含む。
【００４４】
ラブドウイルスＭタンパク質のように、ラブドウイルスＧタンパク質の細胞膜近接外部領域内での変異は、Ｇ細胞膜近接外部領域／Ｍタンパク質コード領域の部分的な決失又は完全な欠失をもたらし、本発明の一部と見なされることを理解されたい。同様に、Ｇ細胞膜近接外部領域内のＭタンパク質コード領域の挿入変異は、本発明の一部と想定される。同様に、ここでは、機能の喪失、又はラブドウイルスのＧ細胞膜近接外部領域／Ｍタンパク質の発現の変化をもたらす変異が考えられ、更なる実施形態を含む。
【００４５】
ある実施形態では、本発明は、ベシクロ・ウイルス属及びリッサ・ウイルス属の任意のウイルスの利用のために提供されるが、本発明に使用される組み換え型ラブドウイルスは、水疱性口炎ウイルス（vesicular stomatitis virus ：ＶＳＶ）に由来する。前記ベシクロ・ウイルス属は、ニュージャージー抗原型の水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶＮＪ）、インディアナ抗原型（ＶＳＶＩｎｄ）、アラゴアスＶＳＶストレーン、球菌ウイルス、Juronaウイルス、Carajasウイルス、Marabaウイルス、ピリウイルス、Calchaquiウイルス、Yug Bogdanovacウイルス、Isfahanウイルス、チャンディプラ・ウイルス、Perinetウイルス、及びPorton-Sウイルスである（Rose and Mitt. IN B. N. FIELDS' VIROLOGY 4th ED. VOL. 1 (2001)）。前記リッサ・ウイルス属は、狂犬病ウイルス（Rabies virus ：ＲＶ）、ラゴスコウモリ・ウイルス、Mokolaウイルス、Duvenhageウイルス、Obodhiangウイルス、及びKotonkanウイルスである。
【００４６】
他の実施形態では、本発明は、異種の融合促進ポリペプチドをエンコードする核酸配列をさらに含む組み換え型ラブドウイルスを提供する。他の実施形態では、融合促進ポリペプチドをエンコードする核酸配列は、分離転写ユニットから発現する。
【００４７】
ここで使用される「融合促進ポリペプチド」という用語は、標的水疱又は細胞を被覆している脂質二重層を有する水疱性細胞膜の水疱性細胞膜促進融合の表面で発現する任意のタンパク質（又はその融合促進ポリペプチド断片）を意味する。他の実施形態では、融合促進ポリペプチドは、（１）脂質エンベロープを有することを翌朝とするウイルスに由来する。（２）遺伝子改変ウイルス内で異種タンパク質として発現したとき、ウイルス・エンベロープの融合を促進し、関係する細胞膜間で、完全な二重層融合をもたらす。本発明に係る融合促進ポリペプチドは、非特異的に、野生型ウイルス接着タンパク質以外のウイルス・エンベロープへのタンパク質の接着を促進することができる。この融合促進ポリペプチドは、ある実施形態では、文献ではパラミクソウイルスのＳＶ５株の「Ｆタンパク質」として知られている、ウイルス・エンベロープ融合タンパク質である。ここでは、特別に、より一般的な「融合タンパク質」よりも「Ｆタンパク質」としてよぶ。
【００４８】
Ｆタンパク質由来のシミアン・ウイルス５（ＳＶ５）に加えて、融合促進ポリペプチドは、ＨＩＶエンベロープ・タンパク質から選択することができる。同様に、ＶＳＶ ＧＮＪ（ニュージャージー抗原型）又はＶＳＶ ＧＩｎｄ（インディアナ抗原型）タンパク質から選択することができる。また、上記した融合ペプチドと相同である少なくとも７０％アミノ酸配列を示すポリペプチドが含まれる。同様に、組み換え型ラブドウイルスと融合した標的細胞の刺激、及び本発明に係る核酸配列の発現に関して重要な機能相同を示すポリペプチドが含まれる。細胞膜形成を刺激する任意のタンパク質又はその断片の使用は、そのようなタンパク質（原核生物又は真核細胞に由来する）及びそれらの断片の相同物のように、本発明の範囲に含まれると見なされることを理解されたい。また、当該技術分野で公知のタンパク質創製法により生成されたタンパク質及びポリペプチドも想定され、本発明の更なる実施形態を示す。
【００４９】
ある実施形態では、組み換え型ラブドウイルスは、少なくとも１つの異種の（即ち、他の非ラブドウイルス）タンパク質において発現する。
【００５０】
他の実施形態では、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、調節因子をさらに含む。
【００５１】
ある実施形態では、遺伝子生成物（ここでは、調節因子と呼ぶ。例えば、プロモーター遺伝子又はエンハンサー配列）の発現を規制するヌクレオチド配列は、前記遺伝子生成物が発現する細胞の種類に基づいて選択される。他の実施形態では、本発明に係る組み換え型ラブドウイルスに感染する細胞内での、前記遺伝子生成物の望ましいレベルでの発現に基づいて選択される。本発明のこの見地によれば、ここで説明したように、遺伝子生成物は異種タンパク質に相当する。したがって、ある実施形態では、そのような異種タンパク質の調整された発現が実現される。
【００５２】
例えば、プロモーター遺伝子と結合した遺伝子の細胞型特異的発現を与えることで知られているプロモーター遺伝子を使用することができる。筋芽細胞遺伝子の発現に特異的なプロモーター遺伝子は、遺伝子生成物の筋肉特異性発現を与えることに関与する遺伝子に結合することができる。従来知られている筋肉特異性調整因子は、ジストロフィン遺伝子の上流領域を含む（Klatnut et al., (1989) Mol. Cell Biol.9: 2396）、クレアチン・キナーゼ（Buskin and Hauschka, (1989) Mol. Cell Biol. 9: 2627）、及びトロポニン遺伝子（Mar and Ordahl, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6404）。
【００５３】
従来、他の細胞型に対して特異的な調整因子（例えば、肝臓特異的発現のためのアルブミン・エンハンサー、膵島細胞特異的発現のためのインスリン調整因子、神経細胞特異的調整因子（神経ジストロフィン、神経エノラーゼ、及びＡ４アミロイド、プロモーター遺伝子を含む））が知られている。他の実施形態では、様々な細胞型で遺伝子の発現を直接的に構成する調整因子（例えば、ウイルス調整因子）を使用することができる。遺伝子発現を促進するのに一般に使用されるウイルス・プロモーター遺伝子は、ポリオーマ・ウイルス、アデノウイルス２、サイトメガロ・ウイルス及びシミアン・ウイルス４０、及びレトロウイルスＬＴＲである。
【００５４】
他の実施形態では、それに結合した遺伝子の誘導発現をもたらす調整因子を使用することもできる。誘導調整因子（例えば、誘導プロモーター）の使用は、細胞内での遺伝子生成物の生成の変調をもたらす。真核細胞に用いる潜在的に使用可能な誘導調整システムの例としては、ホルモン制御因子（例えば、Mader, S. and White, J.H. (1993) Proc. NatI. Acad. Sci. USA 90:5603-5607参照）、合成リガンド調整因子（例えば、Spencer, D.M. et al (1993) Science 262:1019-1024参照）、及び電離放射線調整因子（例えば、Manome, Y. Et al. (1993) Biochemistry 32:10607-10613; Datta, R. et, al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1014-10153参照）がある。本発明に使用するために、更なる組織特異性又は誘導調整因子が開発されるであろう。
【００５５】
ある実施形態では、異種タンパク質は治療に使用することができる。「治療用」という用語は、必要としている患者における異種タンパク質の発現が有益な効果を提供することを意味する。ある場合には、タンパク質は、患者内で、発現の欠損又はそのようなタンパク質の適切な欠損を元に戻す点において治療的である。いくつかの実施形態は、内生のヌル変異（null mutant）が外来タンパク質の発現により補償される場合などの、タンパク質の発現が欠けている場合を含んでいる。他の実施形態では、内生タンパク質は変異し、異種の機能的なタンパク質の発現により補償を行う、非機能的なタンパク質を生成する。他の実施形態では、異種タンパク質の発現は低内生レベルに添加され、所定のタンパク質の累積的に発現を促進する。
【００５６】
ある実施形態では、発現した治療用タンパク質は、インターフェロン又はインターロイキン、或いはそれらのレセプターなどのサイトカインを含む。サイトカインの発現の欠失は病気に対する感受性に関係し、多くの感染に対する抵抗をもたらすために、発現を促進する。サイトカインの発現パターンは、有益な効果（例えば、感染又は自己免疫疾患におけるＴｈ１型の発現パターン又はＴｈ２型パターンに対する免疫反応のバイアス）を得るために変更される。変更された発現パターンは、ホストに対する有益性を示す。
【００５７】
サイトカインの大きい定量化をもたらす単鎖ＩＬ−１２Ｆを発現及び分泌させるために、糖タンパク質（Ｇ）が削除された組み換え型ＶＳＶが遺伝子組み替えされた（実施例９）。ＶＳＶΔＧ−ＩＬ−１２Ｆとリステリア抗原の同時投与は、強力なリステリア特異的Ｔ細胞介在性反応をもたらす。それは、ＬＭＡｇ＋ｒＩＬ−１２の免疫を持つマウスに見られるのと同様の、超寿命の保護用のリステリア免疫を与える（実施例１０及び１１）。
【００５８】
ある実施形態は、サイトカインを発現させるために遺伝子組み替えされた、糖タンパク質（Ｇ）が削除された組み換え型ラブドウイルスを提供する。前記サイトカインは、インターロイキン又はインターフェロン又は化学誘引物質である。ある実施形態では、インターロイキン２、インターロイキン４、インターロイキン１２、又はインターフェロン−γである。
【００５９】
他の実施形態では、サイトカインを発現させるために遺伝子組み替えされた組み換え型ラブドウイルスは、マトリクス・タンパク質が変異又は削除されている。他の実施形態では、サイトカインを発現させるための組み換え型ラブドウイルスは、糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域が変異又は削除されている。本発明の組み換え型ラブドウイルスはどれも、サイトカインを発現させるためにさらに遺伝子組み替えすることができ、それは本発明の一部とみなされることを理解されたい。
【００６０】
他の実施形態では、発現した治療用タンパク質は、グリコーゲン貯蔵又は破壊に関与する酵素を含む。他の実施形態では、治療用タンパク質は、輸送体を含む。輸送体としては、イオン輸送体（例えば、ＣＦＴＲ）、ブドウ糖輸送担体、又は欠乏や不適切な発現が様々な病気をもたらす他の輸送体などの輸送体が挙げられる。
【００６１】
他の実施形態では、発現した治療用タンパク質は、細胞内のシグナツ伝達に関与するレセプターを含む。ある実施例は、上記したように、サイトカイン・レセプター、レプチン・レセプター、転移レセプター、又はその発現が欠失した任意のレセプターを含む。或いは、変化した発現は、不適切な又は不十分な細胞内のシグナツ伝達をもたらす。
【００６２】
他の実施形態では、発現した治療用タンパク質は、その発現が細胞内の癌の進行に関係する諸現象を変える、癌抑制遺伝子又はプロアポトーシス遺伝子を含む。例えば、初期腫瘍の諸現象を実証するｐ５３が細胞内で発現し、それによって癌の進行を抑制する。
【００６３】
他の実施形態では、発現した治療用タンパク質は、自然又は非自然のインスリン、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、グリコシル、トランスフェラーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、カルボキシペプチダーゼ、ホルモン、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、トリアシルグリセロール・リパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、エラスターゼ、アミラーゼ、血液凝固因子、ＵＤＰグルクロニル・トランスフェラーゼ、オルニチン・トランスカルバモイラーゼ、シトクロムｐ４５０酵素、アデノシン・デアミナーゼ、セラム胸腺因子、胸腺液性因子、サイモポイエチン、成長ホルモン、ソマトメジン、共刺激因子、抗体、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮細胞増殖因子、肝臓赤血球生成因子（hepatopoietin）、肝細胞成長因子、インターロイキン、インターフェロン、ネガティブ成長因子、線維芽細胞、βファミリーの形質転換成長因子、ガストリン、セクレチン、コレシストキニン、ソマトスタチン、セロトニン、Ｐ物質、及び転写因子から成る群より選択される。
【００６４】
他の実施形態では、本発明に係る組み換え型ラブドウイルスは、標識ポリペプチドをエンコードする異種核酸の挿入をさらに含む。標識ポリペプチドは、例えば、緑色発光タンパク質（green fluorescent protein: GFP）、分泌されたアルカリ・ホスフォターゼ（secreted alkaline phosphatase: SEAP）、ＤｓＲｅｄ発光タンパク質（赤色発光タンパク質）、βガラクトシダーゼ、発光酵素、又当業者に周知の他のレポーター・タンパク質である。
【００６５】
特定の細胞に対して特異的に標的にすることが望ましい。他の実施形態では、治療用タンパク質の発現に加えて、本発明の組み換え型ラブドウイルスが特定部位（標的タンパク質の発現が発生する部位）を直接的に標的とするように、標的タンパク質が発現する。
【００６６】
ある実施形態では、ここで説明した腫瘍細胞を標的とする。組み換え型ラブドウイルスは、例えば、表面マーカーｅｒｂＢ＋を発現する。そのようなｅｒｂＢ＋細胞は、組み換え型ラブドウイルスが最終的に融合する集団であるので、ここでは、「標的細胞」と呼ばれる。標的細胞は、多くの場合、隣接する細胞（腫瘍細胞由来せず、ｅｒｂＢを発現しない）とは対照的に、組み換え型ラブドウイルスを細胞に導くのに使用される表面マーカー（ここでは、「標的抗原」と呼ぶ）を発現する。
【００６７】
標的抗原はレセプターであってもよい。そのため、「抗原レセプター」は、前述したようにラブドウイルス・エンベロープ又は細胞表面上に表示されるタンパク質を意味する「接着タンパク質」とも呼ばれ、標的細胞の細胞膜上で、ウイルス粒子／改質された細胞の対応するレセプターへの接着に関与する。例えば、パラミクソウイルスＳＶ５の野生型抗原レセプターは、ホスト細胞の細胞膜上でシアル酸と結合する、ウイルス性のＨＮタンパク質である。
【００６８】
ここで使われる「接着」という用語は、抗原レセプター（ウイルス粒子の脂質エンベロープ上又は遺伝子組み替え細胞の表面で発現する）の作用を意味し、感染中は標的細胞表面の「レセプター」を認識し結合する。当業者は、接着させる細胞膜と標的細胞のプラズマ細胞膜との融合前に、接着が生じることを知っている。
【００６９】
他の実施形態では、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、細胞表面で発現したウイルスタンパク質と結合するアンチレセプターを介して、組み換え型ラブドウイルスをウイルス感染細胞に導くアンチレセプターを発現する。この場合、組み換え型ラブドウイルスのウイルス感染細胞との融合を促進するアンチレセプターは、ウイルス発現表面タンパク質を認識し結合する。例えば、ＨＩＶ−１感染細胞はｇｐ１２０のようなＨＩＶ付随タンパク質を発現する。そのため、組み換え型ラブドウイルスによるＣＤ４の発現は、ＣＤ４−ｇｐ１２０相互作用を介して、ＨＩＶ感染細胞のターゲティングを促進する。
【００７０】
アンチレセプター・タンパク質又はそのポリペプチド断片は、次のウイルス・ファミリーと感染した細胞との融合を増進することを目的とする。アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ポックスウイルス科、レトロウイルス科、及びラブドウイルス科。さらなるウイルス標的因子は次のグループから発生することができる。アフリカ豚コレラウイルス、ボーマ病ウイルス、肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、ヒトＴリンパ球ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）、ＨＴＬＶ−２、１５レンチウイルス、エプスタイン−バー・ウイルス、パピローマ・ウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ。
【００７１】
他の実施形態では、ウイルス感染細胞のターゲティングは、感染細胞との融合促進を強めるために、組み換え型ラブドウイルス／組み換え型ラブドウイルス・エンベロープさらなるウイルス・コレセプターの発現により実現される。ある実施形態では、例えばＣＸＣＲ４又はＣＸＣＲ５などのＨＩＶコレセプターをさらに発現させるために、組み換え型ラブドウイルス／組み換え型ウイルスは遺伝子組み替えされる。
【００７２】
細胞内感染中に発現する細菌タンパク質は、本発明の組み換え型ラブドウイルス／組み換え型ウイルスによる治療行為の目的とすることができる。細胞内細菌は、数ある中でも、赤痢菌、サルモネラ菌、レジオネラ菌、連鎖球菌、マイコバクテリウム、フランシセラ、クラミジアがある（G. L. Mandell, "Introduction to Bacterial Disease" IN CECIL TEXT1300K OF MEDICINE, (W.B. Saunders Co., 1996) 1556-7を参照）。これらのバクテリアは、組み換え型ラブドウイルス／組み換え型ウイルスが付着する感染細胞の表面で、バクテリア・タンパク質を発現すると期待されている。
【００７３】
他の実施形態では、他の実施形態では、ターゲティング部分は、強力な抗原提示細胞などの、感染細胞上で上方に調節するインテグリン又はＭＨＣのクラスＩＩ分子を含む。細胞内に存在する寄生性因子のタンパク質は、組み換え型ラブドウイルス／組み換え型ウイルスによる感染を意図するターゲットである。細胞内の寄生性因子は、例えば、原生動物を含む。細胞に感染させる原生動物は、プラスモディウム属の規制因子（例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、及び四日熱マラリア原虫など）、トキソプラズマ、リーシュマニア、及びクリプトスポリジウムを含む。
【００７４】
病気及び／又は異常細胞は、前述した方法により、本発明の組み換え型ラブドウイルスを使用してターゲティングされる。病気及び／又は異常細胞は、感染細胞、腫瘍細胞、前癌細胞、炎症性病巣、良性腫瘍又はポリープ、カフェオレ斑症、白板斑症、及び他の皮膚の斑を含む。
【００７５】
本発明の組み換え型ラブドウイルスは、その同属のレセプターを認識し結合するアンチレセプター、又は病気及び／又は異常細胞上で発現するリガンドを使用してターゲティングする。
【００７６】
他の実施形態では、病気及び／又は異常細胞は、組み換え型ラブドウイルスの影響を非常に受けやすく、侵入及び細胞溶解をもたらす。ある実施形態では、非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、病気及び／又は異常細胞だけに細胞変性である。ある実施形態では、非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、異種タンパク質を発現するために、さらに遺伝子組み替えされる。他の実施形態では、異種タンパク質は、上記に記載した実施形態を全て含む。他の実施形態では、非細胞変性組み換え型ラブドウイルスは、ラブドウイルス糖タンパク質又はその断片（Ｇの細胞膜近接外部領域など）の発現において、同時に起こる欠失の合併などのさらなる減衰を含む、上記に記載した実施形態を全て含む。
【００７７】
同様に、ラブドウイルス・ゲノムを発現させるために、細胞は周知の手法により遺伝子組み替えされる。ある実施形態では、欠失又は変異したマトリクス・タンパク質（Ｍ）を有する核酸ベクターは、Ｇの細胞膜近接外部領域にさらに欠失を有する。また、他の実施形態では、Ｇが削除されている。
【００７８】
他の実施形態では、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、それらの接着タンパク質として、抗体又はそのポリペプチド断片、二元機能抗体、Ｆａｂ、Ｆｅ、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を発現させるために、遺伝子操作される。そのような抗体断片は、同定するために作成され、特異的レセプターと結合する。これらの抗体は、ヒト化、ヒト、又はキメラ抗体である（詳細については、S. L. Morrison "Antibody Molecules, Genetic Engineering of," in MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY: A COMPREHENSIVE DESK REFERENCE 1995、S. D. Gillies et aL, (1990) Hum. Antibod. Hybridomas 1(1). 47-54、E. HARLOW AND D. LANE, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (1988) Cold Spring Harbor Press, NYを参照されたい）。ワクシニア・ウイルスを使用した、ウイルス表面の機能的単鎖抗体の発現が報告されている（M.C. Gah-niche et al., (1997) J. Gen. Virol. 78: 3019-3027）。融合促進タンパク質、抗体及び抗体断片を発現する組み換え型ラブドウイルスを作成するのに、同様の方法を使用することができる。細胞表面で発現する腫瘍関連抗原（tumor-associated antigen： TAA）をターゲティングするモノクローナル抗体をエンコードしている遺伝子は単離される。そして、望ましい組み換え型ラブドウイルスを作成するのに、又は適切な発現ベクターにサブクローニングするのに使用される。そして、当業者に周知の方法により、細胞表面で発現する。
【００７９】
抗体の例としては、悪性の前立腺被覆組織と反応し、良性の前立腺組織とは反応しない抗体（例えば、ATCC No. HB-9119; ATCC HB-9120; 及びATCC No. HB-1 1430）や、悪性の乳癌細胞と反応し、正常の乳房組織とは反応しない抗体（例えば、TCC No. HB-8691; ATCC No. HB-10807; 及び21BB-108011）が挙げられる。病気の組織と反応し、正常な組織とは反応しない他の抗体又はその断片は、当業者には明らかである。
【００８０】
他の実施形態では、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、少なくとも一つの免疫原性タンパク質を発現する。
【００８１】
ここで使用される「免疫原性」という単語は、免疫反応を誘導する能力を意味する。細胞媒介性の免疫反応、又は古典的には「体液性（体液性）」と呼ばれた免疫反応は、抗体を介した反応に属する。又は、両方は、本発明の組み換え型ラブドウイルスにより誘導される。
【００８２】
ある実施形態では、免疫原性タンパク質又はペプチドをさらにエンコードしている本発明の組み換え型ラブドウイルスは、本発明の方法として、ワクチンの目的で使用される。
【００８３】
一例では、ＶＳＶの組み換え型ラブドウイルスは、ワクチン・ベクターの有望な候補である。ＶＳＶは、５つの遺伝子だけを含んでいる単純なゲノムを有する。免疫調節タンパク質と同様に、異種抗原性タンパク質をエンコードする逆遺伝学の出現で、組み換え型ラブドウイルスの作成が可能になった。ＶＳＶゲノムは、ウイルスの複製又は集合する能力に影響を与えることなく、比較的多量の挿入に適合する。ＶＳＶの棒状形態に起因して、リボースヌクレオカプシド・コア、及びウイルス粒子自身は拡張可能である。例えば、ゲノムにさらなる遺伝子が追加されたように、前記粒子は単純に長くなる（１８）。第３に、多数のウイルス通過後、外来遺伝子を長期に発現させるために、ＶＳＶに挿入される外来遺伝子内での変異の蓄積は十分に小さい（１９）。第４に、ＶＳＶはセグメント化されていない負鎖ＲＮＡゲノムと、細胞質内でのみ生じＲＮＡ中間物を含むウイルス複製とを有していても、ウイルスゲノムがホスト細胞ＤＮＡと結合できる可能性はない。そのため、他のＤＮＡベース・ベクターと考えられる、挿入突然変異の恐れは取り除かれる。加えて、ＶＳＶは様々な種類の細胞型と増殖的に感染する。また、通常の複製サイクル中に、ホスト細胞タンパク質合成を効率的に停止する能力を有する（１８−２０）。動物では、ＶＳＶ感染は、ラブドウイルスによってエンコードされたタンパク質に対して特異的な強い免疫応答を誘導する。また、ヒトのＶＳＶ感染は、ほぼ世界中でまれである（２２）。そのため、既存の免疫性によるＶＳＶベース・ワクチンへの干渉はめったに起こらない。
【００８４】
非細胞変性ラブドウイルス、及び細胞間拡散能力が減少したラブドウイルスは、ワクチン送達ベクターして使用する魅力的な候補である。後者のラブドウイルスは、例えば、隣接細胞に感染しない、感染細胞から放出される後代ビリオンを作成する。
【００８５】
本発明のラブドウイルスＭタンパク質及びＧタンパク質又はその断片、及び／又はＧの細胞膜近接外部領域に変異又は欠失を有する組み換え型ラブドウイルスは、ウイルスを弱める働きをする。変異又は欠失を有するラブドウイルスの結合は、そのため、例えば、安全因子が増したウイルス・ベクターを作成する。また、ある実施形態では、遺伝子伝達担体又はワクチンとしてベクターを利用する用途で、免疫無防備状態の単体に使用される。
【００８６】
他の実施形態では、本発明の免疫原性タンパク質又はペプチドをさらにエンコードする組み換え型ラブドウイルスは、病気の進行を中断させる手段として、病気の重症度を減少させる治療用に使用される。
【００８７】
本発明の構造体に、さらなる減弱分子を組み入れることが望ましい。他の実施形態では、本発明が意図する組み換え型ラブドウイルスは、ここに記載した生成物を含む細胞内で、細胞を死に至らしめる自殺遺伝子を発現する。
【００８８】
ここで使用される「自殺遺伝子」という用語は、それ自身により又は他の化合物の存在下で細胞を死に至らしめる生成物をコードする核酸を意味する。自殺遺伝子の代表例は、単純ヘルペスウイルスのチミジン・キナーゼをコードするものである。さらなる例は、水痘ヘルペスウイルスのチミジン・キナーゼ、及び５−フルオロウラシルを高細胞傷害性化合物に変化させることができるバクテリア遺伝子シトシン・デアミナーゼである。
【００８９】
自殺遺伝子は、プロドラッグを細胞傷害性の生成物に変化させることにより、細胞毒性を作り出す。ここで使用される「プロドラッグ」という用語は、細胞にとって毒性の生産物に変化させることができる任意の化合物を意味する。そのようなプロドラッグの代表的なものは、ＨＳＶ−チミジン・キナーゼにより、インビボで毒性化合物に変化するガンシクロビルである。その後、ガンシクロビル派生物は、細胞にとって毒性を持つ。プロドラッグの他の代表例としては、アシクロビル、ＦＩＡＵ［1-(2-Deoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil］、ＶＺＶ−ＴＫ用の６−メトキシプリン・アラビノシド、及びシトシン・デアミナーゼ用のフルオロシトシンがある。
【００９０】
ある実施形態では、追加された安全因子は、本発明の構成物内への自殺遺伝子の組み込みにより提供される。他の実施形態では、細胞内への自殺遺伝子の組み込みは、標的細胞の溶解が望ましい場合に、治療方法を提供する目標とされた細胞毒性をもたらす。そのような結合は、他の実施形態では、抗癌用途に望ましい。その場合、癌細胞が本発明の組み換え型ラブドウイルスによって特異的にターゲティングされ、特異的に溶解する癌細胞は、自殺遺伝子の組み込みにより影響を受ける。
【００９１】
他の実施形態では、「ＴＨ２」反応が進んだ病気において、組み換え体が「Ｔｈ１」反応を誘発する免疫原性タンパク質又はポリペプチドをさらに発現する、本発明の組み換え型ラブドウイルスは、「Ｔｈ１」反応と呼ばれる発達が患者に有用であるとき使用される。免疫原性タンパク質、又はポリペプチドの導入は、Ｔｈ１型反応への転換をもたらす。
【００９２】
ここで使用される「Ｔｈ２型反応」という用語は、頑強な細胞性免疫の発達を支持する適応的免疫反応の一部としてヘルパーＴ細胞によって誘発されるサイトカイン発現のパターンを意味する。一般的なＴｈ１反応は、例えば、患者の蠕虫感染において有益である。一般的なＴｈ２反応は、例えば、インターロイキン４又はインターロイキン１０の生成により認識される。
【００９３】
ここで使用される「Ｔｈ１型反応」という用語は、頑強な細胞性免疫の発達を支持する適応的免疫反応の一部としてヘルパーＴ細胞によって誘発されるサイトカイン発現のパターンを意味する。一般的なＴｈ１反応は、例えば、患者の細胞間感染において有益である。一般的なＴｈ１反応は、例えば、インターロイキン２又はインターフェロン・ガンマの生成により認識される。
【００９４】
他の実施形態では、組み換え型ウイルス／ラブドウイルス、核酸、ベクター、又は本発明の組成物を介する免疫原性タンパク質又はポリペプチドの導入が、より有益なサイトカイン特性への転換を提供するという、患者により役立つ結果をＴｈ２型反応が提供したとき、Ｔｈ１型反応が発達するという反対のことが生じる。ある例では、Ｍハンセン菌からＴｈ１サイトカイン転換を刺激する抗原を発現する組み換え型ウイルス／ラブドウイルス、核酸、ベクター、又は本発明の組成物が、らい腫らいとは対称的に、より重症型のＴｈ２型反応と関係する病気である結核様らいをもたらすハンセン病で生じる。
【００９５】
本発明の、病気予防、及び／又は病気改善、及び／又は病気の進行を変更するために、患者に免疫性を与える目的の免疫原性タンパク質を発現する組み換え型ラブドウイルスの任意の使用は、本発明の一部と見なされることを理解されたい。
【００９６】
防御免疫反応を刺激する感染性ウイルスの好ましい例としては、次のものがある。レトロウイルス科（例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ或いはＨＴＬＶ−ＩＲ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩ、及び他の単離体（例えばＨＩＶ−ＬＰ）などのヒト免疫不全ウイルス）、ピコルナ・ウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロ・ウイルス、ヒト・コクサッキー・ウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす菌株）、トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）、コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス、ムンプス・ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ・ウイルス）、ブンガウイルス科（ハンターンウイルス、ブンガウイルス、フレボ・ウイルス、及びナイロウイルス）、アレナウイルス科（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス）、ビルナ・ウイルス科、ヘパドナ・ウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（パルボウイルス）、パポバウイルス科（パピローマ・ウイルス、ポリオーマ・ウイルス）、アデノウイルス科（アデノウイルス）、ヘルペス・ウイルス科（単純ヘルペス・ウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水疱瘡ウイルス、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペス・ウイルス）、ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、痘疹ウイルス、水痘ウイルス）、イリドウイルス科（アフリカ豚コレラウイルス）、及び分類されていないウイルス（例えば、海綿状脳症の原因菌、デルタ肝炎の原因菌（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥付随体と考えられている）、非Ａ、非Ｂ型肝炎ウイルスの原因菌（クラス１＝内面的に伝染、クラス２＝非経口的に伝染（すなわちＣ型肝炎））、ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス。
【００９７】
防御免疫反応を刺激する感染性細菌の好ましい例としては、次のものがある。ヘリコバクター・ピロリ、ライム病ボレリア、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア属ｓｐ（例えば、Ｍ.結核、Ｍ.結核菌、Ｍ.細胞内、M. kansaii、M. gordonae）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア菌、化膿連鎖球菌（Ａ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群ストレプトコッカス）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性ｓｐ）、肺炎連鎖球菌、病原カンピロバクターｓｐ、エンテロコッカス属ｓｐ、クラミジアｓｐ、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属ｓｐ、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、アイロゲネス腸内菌、肺炎桿菌、Pasturella multocida、バクテロイデス属ｓｐ、フゾバクテリウム属菌、モニリフォルミス連鎖杆菌、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ‐ペルテニュ、レプトスピラ属、イスラエル放線菌、及び野兎病菌。
【００９８】
防御免疫反応を刺激する菌類の好ましい例としては、次のものがある。クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミティス、ブラストミセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマチス、カンジダ・アルビカンス。他の感染性微生物（すなわち原生生物）としては、プラスモジウム属ｓｐ、リーシュマニア属ｓｐ、住血吸虫属ｓｐ、及びトキソプラズマ属ｓｐがある。
【００９９】
他の実施形態では、本発明の免疫原性タンパク質を発現する組み換え型ラブドウイルスは、さらなる免疫調節性タンパク質を発現する。
【０１００】
有用な免疫調節性タンパク質の例としては、サイトカイン、ケモカイン、補体成分、免疫系アクセサリー、接着分子、及びそれらのヒト又はヒト以外の動物に特異的なレセプターがある。また、有用な例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ（ｇｐ３４）、lymphotactin、ＣＤ４０、及びＣＤ４０Ｌがある。さらに、有用な例としては、インターロイキン１〜１５、インターフェロン・アルファ、ベータ又はガンマ、腫瘍壊死因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、好中球活性化タンパク（ＮＡＰ）のようなケモカイン、マクロファージ遊走因子及び活性因子（ＭＣＡＦ）、ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症性ペプチドＭＩＰ−ｌａ及びＭＩＰ−ｌｂ、補体成分及びそれらのレセプター、又はアクセサリー分子（Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＴＲＡＰ、ＩＣＡＭ−１・２・３、及びサイトカイン・レセプター。ＯＸ４０、及びＯＸ４０リガンド（ｇｐ３４）は、免疫調節タンパク質の例にとって、さらに有用である。
【０１０１】
他の実施形態では、免疫調節タンパク質は、ヒト又はヒト以外の動物に特異的であり、天然タンパク質と同程度の結合活性を有する細胞外ドメイン及び／又は他の断片を含んでいる。免疫調節タンパク質は、他の実施形態では記載した実施形態の突然変異型を含む、又は免疫グロブリン重鎖遺伝子定常領域などのポリペプチド配列を有する融合タンパク質を含む。複合的な免疫調節タンパク質は、単体の構成物、及び本発明のさらなる実施形態に表すものに組み込まれる。
【０１０２】
本発明の組み換え型ラブドウイルスは複合的な免疫調節タンパク質を発現することを理解されたい。ある実施形態では、該免疫調節タンパク質は、同一又は近縁種に由来する。
多重抗原のワクチン結合は、免疫原性を強めることが知られている。
【０１０３】
本発明の免疫原性タンパク質又はペプチド断片を発現する組み換え型ラブドウイルスは、構成物により刺激される様々な種類の免疫応答を引き起こす。前記免疫応答としては、非相同的に発現したタンパク質又はペプチド、バイスタンダー効果によって免疫原性を得る他の抗原、ホスト抗原などに対する応答がある。本発明の方法は、患者の細菌性、ウイルス性、寄生性、又は他の病態（腫瘍を含む）を予防又は治療するのに使用できることが想定される。
【０１０４】
ワクチンの組み合わせは、免疫原性の促進及び保護を提供することが知られている。そして、他の実施形態では、免疫原性タンパク質又はペプチドは、異なった種類から由来する。
【０１０５】
他の実施形態では、本発明は、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片の核酸を含んでいる組み換え型ウイルスを提供する。組み換え型ウイルス内のラブドウイルス・ゲノム又はその断片、及び欠損又は変異したマトリクス・タンパク質は、ここで記載したすべての実施形態を含む。
【０１０６】
他の実施形態では、本発明は、ラブドウイルスＭタンパク質の変異に加えて、糖タンパク質（Ｇ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片の核酸を含んでいる組み換え型ウイルスを提供する。他の実施形態では、本発明は、糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムの核酸を含んでいる組み換え型ウイルスを提供する。他の実施形態では、前記組み換え型ウイルスは、ラブドウイルスＭタンパク質の変異に加えて、糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域をエンコードする領域内に欠損又は変異を有する。ここで説明した組み換え型ウイルスは、本発明の組み換え型ラブドウイルスに関して記載した全ての実施形態を含む。
【０１０７】
他の実施形態では、本発明は、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有する非細胞変性ラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる単離した核酸分子を提供する。単離した核酸分子は、異種タンパク質の発現、Ｇステムポリペプチド及び融合促進ポリペプチドの発現、欠失を有する糖タンパク質（Ｇ）の発現及び細胞膜近接外部領域に欠失を有する糖タンパク質の発現をエンコードする配列を含んでいる（それらは、それぞれ本発明のさらなる実施形態に相当する）、ここで記載した全ての実施形態を含むことを理解されたい。他の実施形態では、本発明は、ここで説明した、単離した核酸分子を含んでいるベクターを提供する。
【０１０８】
他の実施形態では、本発明は、糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域をエンコードする遺伝子に欠失又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムをエンコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる単離した核酸分子を提供する。本発明のこの態様は、単離した核酸分子は、異種タンパク質の発現、融合促進ポリペプチドの発現、及び欠失を有するマトリクス・タンパク質の発現をエンコードする配列を含んでいる（それらは、それぞれ本発明のさらなる実施形態に相当する）、ここで記載した全ての実施形態を含む。他の実施形態では、本発明は、そのような単離した核酸分子を含んでいるベクターを提供する。
【０１０９】
本明細書において、「核酸」分子という用語は、限定するものではないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ、原核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば哺乳類）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得る。またこの用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体（base analogs）の任意のものを含む配列も指す。
【０１１０】
本明細書で開示される核酸配列は、配列を細胞内に導入する所望の方法に応じて、特定のベクター内にサブクローニングすることができる。核酸断片が特定のベクター内にサブクローニングされると、それは組み替え型ベクターとなる。本発明における核酸構成物を生成するため、関心のある配列をエンコードするポリヌクレオチド断片を、哺乳類細胞の形質導入／形質転換及び形質導入された細胞内における組み替え生成物の発現を導くのに適した商業的に入手可能な発現ベクター系中に結合することができる。そのような商業的に入手可能なベクター系は、既存のプロモーター又はエンハンサー配列の置換、複製又は変異及び／又は、例えば付加的な選択マーカーをエンコードする配列やレポーターポリペプチドをエンコードする配列のような付加的なポリヌクレオチド配列の導入のために、広く用いられている組み替え技法を介して容易に改変できることを理解されたい。
【０１１１】
本発明の細胞に上述の組み替え型ベクターを導入するための本分野で公知の方法は数多くあり、限定するものではないが、例えば、直接ＤＮＡ取り込み法、及びウイルス、プラスミド、直鎖状ＤＮＡ又はリポソーム媒介形質導入、レセプター媒介取り込み及びリン酸カルシウム媒介及びＤＥＡＥデキストラン媒介導入法を採用した磁気穿孔法（magnetoporation methods）、電気穿孔法（electroporation）、リポソーム媒介トランスフェクション、直接注入、及びレセプター媒介取り込みがある（より詳しくは、例えば、「Methods in Enzymology」 Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989)、及び、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)又は他の標準的な実験室マニュアルを参照されたい）。
【０１１２】
細胞に核酸を導入する特定の発現ベクター系及び方法の効力は本分野で日常的に行われている標準的な方法で評価することができる。例えば、細胞に導入されたＤＮＡをフィルターハイブリダイゼーション法（例えばサザンブロッティング）で検出することができ、導入されたＤＮＡの転写によって生成されるＲＮＡを、例えば、ノザンブロッティング、ＲＮａｓｅプロテクション法又は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出することができる。遺伝子生成物は適切なアッセイ、例えば、特定の抗体を用いるような産生タンパク質の免疫学的検出或いは酵素法のような遺伝子生成物の機能活性を検出する機能アッセイによって検出することができる。細胞によって発現されるべき関心のある遺伝子生成物が容易にアッセイできない場合、まず、使用されるベクター及び調節要素に関連したレポーター遺伝子を用いて発現系の最適化を行うことができる。レポーター遺伝子は、容易に検出可能であり従って系の効力の評価に用いることが可能な遺伝子生成物をエンコードする。本分野で用いられている標準的なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチル・転移酵素、発光酵素及びヒト成長ホルモン、又は本明細書に列挙されるマーカータンパク質の任意のものをエンコードする遺伝子が含まれる。
【０１１３】
別の実施形態では、更なる減弱（attenuation）手段として働き得る、ラブドウイルスＭタンパク質において変異又は欠失を含むｃＤＮＡを含む、パッケージングシステムが構成される。
【０１１４】
パッケージングシステムは、核酸をキャプシッドに包み、それをビリオン生成細胞から移送し、標的細胞へ送り、標的細胞内で導入遺伝子発現を促進することができるビリオンを生成するのに必要な遺伝情報のすべてを発現可能な形態で集合的に提供する複数のベクター、又は、単一のベクターからなる。しかしながら、パッケージングシステムはそれ自身をパッケージ化する、即ち、減弱する手段を提供する能力が実質的にあってはならない。なぜなら、標的細胞内に導入された後、ビリオンの生成が妨げられるからである。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明は、本明細書で開示される組み替え型ラブドウイルス、ウイルス、ベクター又は核酸を含む細胞を提供する。一実施形態では、細胞は原核細胞であり、別の実施形態では真核細胞である。組み替え型ラブドウイルス、ウイルス、ベクター及び／又は核酸に対し本明細書において挙げた各実施態様は、細胞中に組み込むことが可能であり、本発明の考えられる形態の一部を表し得ることを理解されたい。組み替え型ラブドウイルス粒子又はウイルス粒子も同様に本発明の追加的な実施態様であり、本明細書中に列挙した任意の置換（permutation）を含み得る。
【０１１６】
このように、組み替え型ラブドウイルス及び／又は粒子を用意し、組み立て、単離することができる。一実施形態では、こうして用意された組み替え型ラブドウイルス及び／又は粒子は細胞変異性（cytopathic）でない。
【０１１７】
別の実施形態では、ラブドウイルスＭタンパク質における変異又は欠失は、高度に悪性の細胞においてのみ細胞変性効果を有するウイルスを生成する。そのようなラブドウイルス株の使用により、隣接する細胞に影響を与えることなく、特定の悪性細胞を選択的に溶解する手段を提供することができる。別の実施形態では、ラブドウイルスＭタンパク質中への変異又は欠失の組み込みは、細胞障害性効果を高度に悪性の細胞のみに制限するため、ラブドウイルス・ゲノムを組み込んだ構成物を更に減弱する手段となる。
【０１１８】
組み替え型ラブドウイルスの生成方法は、ｃＤＮＡ及びミニウイルス（Minivirus）又はヘルパー細胞株（Helper Cell Line）の使用を伴い得る。この場合、「ミニウイルス」と「ヘルパー細胞」（「ヘルパー細胞株」としても知られている）の両方とも、ラブドウイルス・タンパク質の遺伝子をエンコードするトランスフェクションされたＤＮＡから産生されない、ラブドウイルスビリオンの組み上げのためのラブドウイルス・タンパク質のソースを提供する。
【０１１９】
組み替え型ラブドウイルスの生成は、（１）ｃＤＮＡ単独、（２）様々な組み合わせでヘルパー細胞へトランスフェクションされたｃＤＮＡ、或いは、（３）ｃＤＮＡの細胞へのトランスフェクションを、さらに、感染性又は非感染性の組み替え型ラブドウイルスを生成するのに必要とされる残りの要素又は活性を途中で（in trans）提供するミニウイルスに感染させたもの、を用いることによって達成することができる。これらの方法（例えば、ミニウイルス、ヘルパー細胞株、又はｃＤＮＡトランスフェクションのみ）のいずれかを用いる場合、必要な最小限の要素は、（１）ゲノム（又はアンチゲノム）ＲＮＡをラブドウイルスＮタンパク質によりキャプシッドに包む、及び（２）ゲノム又はアンチゲノム（複製中間体）ＲＮＡ等価物を複製するためのシス作用性シグナルを含むＲＮＡ分子である。組み替え型ラブドウイルスの生成に必要なＤＮＡ：感染性のラブドウイルスの生成に「必要なｃＤＮＡ」との用語は、変異したマトリックスタンパク質（Ｍ）を発現する感染性組み替え型ラブドウイルス粒子を生成するのに必要な核酸分子を意味する。
【０１２０】
「ミニウイルス」なる用語は、Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｌ、Ｎ−Ｐ−Ｌ、Ｎ−Ｐ−Ｇ−Ｌ、Ｍ−Ｇ、Ｇのみ、Ｍのみ、或いは４以下のラブドウイルス遺伝子の任意の組み合わせをエンコードするポリシストロン性核酸分子を含む不完全なウイルス粒子を含むものである。この不完全なウイルス粒子は、ウイルス複製、即ち、ゲノムの完全なコピー作製を含むラブドウイルスのライフサイクルプロセスを行う能力がない。
【０１２１】
ラブドウイルス・ゲノムのコピー作製（「ラブドウイルス複製」と呼ばれる）には、複製要素又はレプリコンの存在が必要である。レプリコンは、ここでは、最低限５′及び３′末端にラブドウイルスのリーダ配列及びトレーラ配列を含むＲＮＡのストランドを意味する。ゲノム的意味では、リーダは３′末端にあり、トレーラは５′末端にある。これら２つの複製シグナルの間に位置するＲＮＡは全て複製される。リーダ及びトレーラ領域は更に、ラブドウイルス転写及び複製の開始に必要なポリメラーゼ結合及びＮタンパク質によるキャプシッド被覆のための最小限のシス作用性要素を含まなければならない。
【０１２２】
いくつかの異なるＶＳＶ由来レプリコンが生成され、培養細胞中で長期間、異種の（非ＶＳＶ）タンパク質を複製及び発現することが示されている。そのようなレプリコンは遺伝子治療ベクターの理想的な候補である。なぜなら、それらは細胞質においてのみ複製し、他の遺伝子治療ベクターのように標的細胞の染色体中に挿入突然変異生成を起こす心配がないからである。更に、感染した細胞において何らかの再結合を記録しようとする試みが広範囲になされているにも関わらず、ＶＳＶに基づくレプリコンが同種（又は異種）の再結合をし得るとの証拠はこれまでにない。再結合能力がないことは、レプリコンを含む細胞が他の負鎖ＲＮＡウイルスに感染され複製及び感染能力が再生される懸念をなくす。
【０１２３】
本発明の組み替え型ラブドウイルスを生成するためには、上記した改変されたラブドウイルス・ゲノムをエンコードするｃＤＮＡを、採用されたベクターの発現を促進する条件下で細胞に接触させ、組み替え型ラブドウイルスの生成を可能にしなければならない。尚、上記した３つの方法の任意の一つで組み替え型ラブドウイルスの組み立てを可能とする細胞は、本発明の一部として含まれると理解されるべきである。
【０１２４】
ウイルス生成のための細胞の培養：トランスフェクションされた細胞は通常少なくとも２４時間、所望の温度（通常約３７℃）でインキュベートされる。感染性ウイルス粒子の生成では、組み替え型ウイルスを含む上清が採取され、新しい細胞に移される。Ｇタンパク質を過渡的又は定常的なトランスフェクションを介して発現するこれらの新しい細胞は約４８時間インキュベートされ、上清が集められる。
【０１２５】
組み替え型ラブドウイルスの精製：「単離」又はラブドウイルスを「単離する」との用語は、非常に僅かの細胞の破片しか残らないようにウイルス粒子を培養及び精製するプロセスを意味する。一例は、ビリオンを含む上清を集め、それを濾過して（０．２μ小孔サイズ）（例えば、Millex-GS、Millipore）、ワクシニアウイルス及び細胞破片を除去することである。或いは、例えばショ糖勾配法のような勾配法を用いてビリオンを浄化することができる。その後組み替え型ラブドウイルスはペレット化され、所望の賦形剤又はキャリア中に再懸濁される。ウイルス力価は細胞への感染に用いられる上清の連続的な希釈によって特定することができ、ウイルス・タンパク質の発現後、感染された細胞は例えば抗Ｍ（２３Ｈ１２）又は抗Ｎ（１０Ｇ４）タンパク質特異的抗体（L. Lefrancois et al., (1982) Virology 121: 157-67）を用いて間接的な免疫蛍光法により計量される。従って、組み替え型ラブドウイルス粒子もまた本発明の一部と考えられることを理解されたい。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明は、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み換え核酸を含む非細胞変異性の組み換え型ラブドウイルスを作成する方法であって、（Ａ）適切な細胞内に、マトリクス・タンパク質（Ｍ）内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する３´及び５´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性ｃＤＮＡを挿入するステップと、（Ｂ）前記細胞を、前記細胞の非細胞変性表現型のために選択された条件下で培養するステップと、（Ｃ）前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスを作成可能な条件下で培養するステップと、（Ｄ）前記非細胞変性組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含むことを特徴とする方法を提供する。
【０１２７】
一実施形態では、この方法は、本発明の単離した組み換え型ラブドウイルスから、ゲノムＲＮＡを単離するステップを有する。別の実施形態では、ゲノムＲＮＡを単離するステップは、ＲＴ−ＰＣＲを介して行われる。別の実施形態では、本方法で用いられる細胞は、齧歯類、霊長類及びヒト細胞から成る群より選択される。
【０１２８】
別の実施形態では、Ｇ糖タンパク質に変異又は欠損を有する非細胞変異性の組み替え型ラブドウイルスが、本明細書で開示される方法によって生成される。本発明のこの側面に基づくと、糖タンパク質（Ｇ）内に変異又は欠損を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列が細胞中に挿入される。一実施形態では、糖タンパク質中の変異又は欠損は糖タンパク質の細胞膜近接外部領域にある。
【０１２９】
別の実施形態では、２番目のポリペプチドをエンコードする異種核酸配列を更に発現する非細胞変異性の組み替え型ラブドウイルスが、本明細書中に開示される方法によって生成される。本発明のこの側面に基づくと、少なくとも一つの異種ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列が細胞中に挿入される。一実施形態では、２番目のポリペプチドは治療用のポリペプチドである。別の実施形態では、２番目のポリペプチドは、免疫原性である。
【０１３０】
別の実施形態では、本発明は、糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域内に欠失又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子組み替え核酸を含む組み換え型ラブドウイルスを作成する方法であって、（Ａ）適切な細胞内に、糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜近接外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド配列、標識ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド配列、及びラブドウイルスを複製するためのシス作用シグナルを有する３´及び５´のラブドウイルス・リーダ及びトレーラ領域を少なくとも含んでいるポリシストロン性ｃＤＮＡを挿入するステップと、（Ｂ）前記細胞を、前記組み換え型ラブドウイルスの作成が可能な条件下で培養するステップと、（Ｃ）前記組み換え型ラブドウイルスを単離するステップとを含むことを特徴とする方法を提供する。
【０１３１】
細胞（例えば、組織培養細胞又はバイオプシーのような組織サンプルからの細胞など）に感染させるため、単離された組み替え型ラブドウイルスは本分野で公知の技法を用いて細胞とともにインキュベートされる。組み替え型ラブドウイルスによる感染の検出は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような、レポーター遺伝子の存在を特定することで、又は、上記したように、間接的な免疫蛍光法によって特定されるウイルス・タンパク質の発現の評価を通じて行われ得る。
【０１３２】
感染性のウイルス粒子を用意するため、まず、適切な細胞株（例えば、ＢＨＫ細胞）にワクシニアウイルスｖＴＦ７−３（T.R. Fuerst et al., (1986) Proc.Natl Acad. Sci. USA 3. 8122-26）、又は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ又は他の適切なバクテリオファージ・ポリメラーゼ（例えばＴ３又はＳＰ６ポリメラーゼ）をエンコードする等価物を感染させる（Usdin et al., (1993) BioTechniques14:222-224又はRodriguez et al. (1990) J. Virol. 64:4851-4857参照）。或いは、ＲＮＡポリメラーゼを提供する、ワクシニアを含まない系を用いることもできる。続いて、Ｎ、Ｐ、Ｇ及びＬラブドウイルス・タンパク質をエンコードする遺伝子を含む個々のｃＤＮＡで細胞をトランスフェクションする。これらのｃＤＮＡは組み替え型ラブドウイルス粒子を組み立てるためのタンパク質を提供する。細胞は本分野で知られている任意の方法でトランスフェクションすることができる（例えば、リポソーム法、電気穿孔法など）。
【０１３３】
本発明は更に、上記した本発明のベクター、ウイルス又は組成物からなる要素の１又は複数が充填された１又は複数のコンテナを含む診断用及び製薬用パック及びキットに関する。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明は、細胞又は多細胞生物への投与のため、本明細書に開示された組み換え型ウイルス、ラブドウイルス、核酸、又はベクターを含む組成物を提供する。本発明のベクターは、別の実施形態では、個体への投与に適した製剤用キャリアのような、細胞、組織、生物への投与のための非滅菌又は滅菌済みの１乃至複数のキャリアとともに用いることができる。このような組成物は、例えば、媒質添加剤（media additive）又は治療上有効な量の本発明の組み替え型ウイルス及び薬剤的に許容可能なキャリア又は賦形剤を含む。そのようなキャリアは、限定するものではないが、塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、及びそれらの組み合わせを含み得る。
【０１３５】
本発明の組み替え型ウイルス、ベクター又は組成物は単独で用いることも、あるいは、付加的な治療化合物のような他の化合物とともに用いることもできる。
【０１３６】
医薬化合物は任意の効果的な従来方法で投与することができ、それには、血管内投与（ｉ．ｖ．）、筋肉内投与（ｉ．ｍ．）、鼻腔内投与（ｉ．ｎ．）、皮下投与（ｓ．ｃ．）、口腔、直腸、膣内送達を通じた投与、或いは、組み替え型ウイルス／組成物を組織へ送達可能な任意の手段（例えば、針やカテーテル）による投与が含まれる。或いは、上皮細胞への挿入に対しては局所的投与が望まれ得る。他の投与方法に、吸引又はエアゾール形成を介したものがある。
【０１３７】
哺乳類、特にヒトへの投与では、特定の個人の年齢、体重及び反応によって変化し得る個人に最適な実際の適用量及び治療期間を医者が決定することが期待される。
【０１３８】
組み替え型ラブドウイルスに対して用いられる投与経路は、ウイルスの周期、吸着及び感染を促進し、それによってエンコードされるタンパク質のウイルス発現を可能とする。発現したタンパク質は組み替え型ラブドウイルス内にレポーター・タンパク質を組み込むことでアッセイすることができる。ラブドウイルス投与後、（例えば、レポーター・タンパク質の検出によって特定される）ウイルス・タンパク質の発現が２４時間以内に、確実には３６時間以内に発生することが期待される。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明は、患者に病気に対する免疫性を与える方法であって、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子とを有し、それによって病気に対する免疫性を与えることを特徴とする方法を提供する。
【０１４０】
ここで、「標的細胞への接触」という用語は、本発明のウイルス、核酸、ベクター又は組成物に対する標的細胞の直接的な暴露と間接的な暴露の両方を指す。一実施形態では、細胞への接触は、例えばマイクロインジェクションのような本分野で公知の任意の手段による細胞の直接注射を含むことができる。また、別の実施形態では、細胞への供給を、細胞を周囲する培養基への供給を介するような、間接的なものとすることも考えられる。
【０１４１】
標的細胞への本発明のウイルス、核酸又はベクターの導入のためのプロトコルには、例えば、直接ＤＮＡ取り込み法、ウイルス、プラスミド、直鎖状ＤＮＡ又はリポソーム媒介形質導入、又はトランスフェクション、リン酸カルシウム媒介及びＤＥＡＥデキストラン媒介導入法を採用した磁気穿孔法（magnetoporation methods）、電気穿孔法、直接注入、及びレセプター媒介取り込みがある（より詳しくは、例えば、「Methods in Enzymology」 Vol. 1-317, Academic Press, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989)及びMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Sambrook et al. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)又は他の標準的な実験室マニュアルを参照されたい）。尚、本発明のウイルス、核酸又はベクターの細胞内アクセスのどのような直接的又は間接的な手段も本明細書中で考慮されており、本発明の実施形態を表すことを理解されたい。
【０１４２】
別の実施形態では、本発明は、病気に罹っている患者を治療する方法であって、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子とを有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法を提供する。
【０１４３】
本発明のこの側面に基づくと、更なる実施形態において、標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、前立腺細胞、強力な抗原提示細胞、リンパ球、又はＭ細胞である。
【０１４４】
別の実施形態において、本発明は、欠陥遺伝子に関連する病気に罹っている患者を治療する方法であって、前記患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型の非細胞変異性ラブドウイルス、或いは、ラブドウイルス・ゲノム又はラブドウイルス・ゲノムをエンコードする核酸配列を含む本発明の組み替え型ウイルス、ベクター又は細胞を接触させるステップを含んでおり、前記ラブドウイルスのゲノムは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するとともに、標的細胞の内部で発現できる異種遺伝子を有し、それによって病気を治療することを特徴とする方法を提供する。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明のこの側面に基づくと、組み替え型の非細胞変異性ラブドウイルスは更にラブドウイルス・糖タンパク質の細胞膜に近接している外部領域内に変異又は欠損を有することができる。
【０１４６】
このように用いられる組み替え型ラブドウイルス、ウイルス、ベクター又は細胞は、本明細書中に列挙した任意の実施形態又はそれらの組み合わせを含み得ることを理解されたい。
【０１４７】
本発明のこの側面に基づくと、限定するものではないが、患者が治療される病気には、筋ジストロフィー、癌、心血管疾患、高血圧、感染症、腎疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルト−ヤコブ病のような神経変性、狼瘡、リウマチ様関節炎のような自己免疫疾患、心内膜炎、グレーヴズ病又はＡＬＤ、喘息のような呼吸疾患又は嚢胞性繊維症、骨粗鬆症のような骨疾患、関節疾患、肝疾患、乾癬や湿疹のような皮膚病、眼病、耳鼻咽喉疾患、タレット症候群（Turret syndrome）、精神分裂病、鬱病、自閉症又はストーク（stoke）のような他の神経疾患、糖原貯蔵症や糖尿病のような代謝疾患が含まれ得る。本発明の組み替え型ラブドウイルス、ウイルス、ベクター又は細胞或いは組成物の使用によって実現し得る特定のタンパク質の発現が求められるどのような病気も本発明の一部と考えられることを理解されたい。
【０１４８】
一実施形態では、本発明のこの側面に基づく標的細胞は、上皮細胞、肺細胞、腎細胞、肝細胞、星状細胞、グリア細胞、前立腺細胞である。本発明のこの側面に基づく方法は、各々本発明の追加的な実施態様を表す更に開示される治療への応用のいずれを提供することもできる。開示される組み替え型ウイルス、細胞、ベクター、核酸又は組成物のどのような治療への応用のための使用も本発明の一部であり実施態様として考慮されていることを理解されたい。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明は、患者に病気に対する免疫性を与える方法であって、患者の標的細胞に、治療上有効な量の組み換え型ウイルスを接触させるステップを含んでおり、前記ウイルスは、マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、標的細胞の内部で発現できる免疫原性タンパク質又はペプチド断片をエンコードする異種遺伝子とを有し、それによって病気に対する免疫性を与えることを特徴とする方法を提供する。
【０１５０】
本発明の組み替え型ラブドウイルス及び本明細書に開示するウイルス、ベクター、細胞及び組成物は、別の実施形態において、効果的な抗癌治療として働き得る。様々な量のｒＶＳＶに感染されたＣ６グリオーム細胞のような癌細胞は、７２時間以内に約９０％が細胞死する結果となった（例１２）。しかしながら、ＶＳＶ感染の結果、培養物内の健康な細胞の損傷が明らかだった。これに関し、Ｇに対して欠損を有する組み替え型ＶＳＶはグリオーム細胞に対して特異的にウイルス溶解効果を有し、隣接する健康な細胞には影響を与えなかった。
【０１５１】
本発明の別の側面に基づくと、別の実施形態では、癌細胞を溶解させる方法であって、癌細胞に、（ａ）マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノムを含む核酸と、（ｂ）非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ラブドウイルスを接触させるステップを含むことを特徴とする方法が提供される。
【０１５２】
インターフェロン−βで前処理することで特定のグリオーム細胞の溶解を生じる結果となったが（図３６）、ＶＳＶによる感染後、薄片内の正常な神経細胞は非常に僅かしか感染されなかった。
【０１５３】
他の実施形態では、非ラブドウイルス核酸は、サイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードする。別の実施形態では、本発明の組み替え型ラブドウイルスによる感染前、感染中、又は感染後に、細胞に付加的な治療化合物を接触させる。一実施形態では、治療化合物はヌクレオシドアナログ（nucleoside analog）である。別の実施形態では、治療化合物は例えば微小管阻害剤のような細胞骨格阻害剤である。
【０１５４】
一実施形態では、癌細胞はびまん（diffuse）型であり、或いは、別の実施形態では、塊状（solid）癌組織細胞型である。別の実施形態では、癌細胞は腫瘍形成のどの段階にあってもよく、また、どのような起源でもよい。
【０１５５】
更に、Ｇ発現（ΔＧ）が欠損したＶＳＶ株は、ウイルスの感染後、インビボにおいて腫瘍の大幅な減量を示したが、薄片培養物内の正常細胞の感染は発生したとしてもほとんどなかった（例１３、図３９Ｄ）。
【０１５６】
本発明は、別の実施形態では、癌を治療する方法であって、癌細胞に、（ａ）マトリクス・タンパク質（Ｍ）をエンコードする領域内及び／又は糖タンパク質（Ｇ）の細胞膜に近接している外部領域をエンコードする領域内に欠損又は変異を有するラブドウイルス・ゲノム又はその断片と、（ｂ）非ラブドウイルス核酸とを含んでいる組み換え型ウイルスを接触させるステップを含むことを特徴とする方法を提供する。他の実施形態では、非ラブドウイルス核酸はサイトカイン又は自殺遺伝子をエンコードする。
【０１５７】
別の実施形態では、本発明は、神経組織における腫瘍形成を研究するためのモデルであって、コロナ、黒質及び皮質組織のビブラトーム薄片を取得するステップと、生存力を維持しつつ細胞分裂を抑制した条件下で、前記薄片をカバースリップ上で培養するステップと、前記薄片培養物に標識された癌細胞を接種するステップと、前記標識された癌細胞の最終結果（fate）を測定するステップとを含むことを特徴とするモデルを提供する。
【０１５８】
一実施形態では、前記モデルは薄片培養物に組み換え型ラブドウイルスを接種するステップを更に有する。別の実施形態では、組み換え型ラブドウイルスはラブドウイルスＭタンパク質に対し変異又は欠損が発生している。別の実施形態では、ラブドウイルスＭタンパク質をエンコードする核酸配列に対し変異又は欠損を有する組み替え型ラブドウイルスは、ラブドウイルスＧタンパク質をエンコードする核酸配列に対し更に変異又は欠損が発生している。別の実施形態では、組み替え型ラブドウイルスは、ラブドウイルスＧタンパク質の細胞膜に近接している外部領域に対し変異が生じている。
【０１５９】
別の実施形態では、前記モデルは、蛍光性、発光性、発色性、及び高電子密度材料により標識された癌細胞を用いる。別の実施形態では、前記モデルは標識された組み替え型ラブドウイルスを用いる。別の実施形態では、腫瘍形成を促進する又は阻害すると考えられる作用因子（agent）が培養物に供給され、標識された癌細胞への影響が特定される。
【０１６０】
一実施形態では、作用因子はサイトカイン、ケモカイン、炎症誘発性分子、血管形成因子、血管形成阻害剤、イオノフォア（ionophore）、微小管阻害剤、又は細胞周期阻害剤である。
【０１６１】
別の実施形態では、本明細書中で開示されるモデルに基づいて、腫瘍形成に変化を生じさせる又は腫瘍形成に変化を生じさせると思われる作用因子の評価がなされる。本発明のこの側面によると、作用因子は、癌細胞の付加の後又は同時に薄片培養物中に供給される。一実施形態では、癌細胞の生存能力（viability）への影響が特定される。別の実施形態では、癌細胞の増殖に与える影響が特定される。別の実施形態では、癌細胞の表面マーカー発現又は細胞周期ステージに与える影響が特定される。そのような影響は、本分野において当業者に公知の方法によって容易に測定することができ、限定するものではないが、そのような方法には、例えばトリパンブルー排除法のような生存能力測定としての色素取り込みの測定がある。細胞増殖の測定は、例えば３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することにより行うことができ、細胞表面マーカー発現及び細胞周期ステージは、ＦＡＣＳ又は本分野で当業者に公知のプロトコルに基づく他の方法によって特定することができる。
【０１６２】
別の実施形態では、本発明のこの側面に基づき、薄片は、Ｇｅｙのデキストロース溶液、プラズマ、トロンビン、Ｅａｇｌｅの基礎培地、Ｈａｎｋｓの平衡塩類溶液、Ｌ−グルタミン、又はそれらの任意の組み合わせを含む培地において、生存力を維持した条件下で、カバースリップ上で培養される。別の実施形態では、本発明のこの側面に基づき、薄片は、シトシン−α−Ｄ−アラビノフラノシド、ウリジン、５−フルロ−２′−デオキシウリジン、Ｇｅｙのデキストロース溶液、プラズマ、トロンビン、Ｅａｇｌｅの基礎培地、Ｈａｎｋｓの平衡塩類溶液、Ｌ−グルタミン、又はそれらの任意の組み合わせを含む培地において、細胞分裂を抑制した条件下で、カバースリップ上で培養される。
【０１６３】
このモデルは、一実施形態では、正常細胞に対する毒性及び潜在的な腫瘍治療の有効性の分析を可能とする。これらは同時に行うことができ、また別の実施形態では、リアルタイムに調べることができる。この器官薄片培養は、一実施形態では、本モデルを用いた任意の調査の間、通常インビボで存在する解剖学的な接続に関し適切なニューロン構造の保存を可能とし、従って、インビボの脳の生理的、構造的及び細胞に関する側面を現実的に近似する（２３−３２）。本モデルは、別の実施形態では、脳組織の薬理学的、生理学的及び構造的調査が求められる研究に用いることができ、別の実施形態では、インビボで行われる類似の研究との比較のよりどころとして用いることができる。
【０１６４】
別の実施形態では、このモデルの培養系は短期間の研究に用いることができる。或いは別の実施形態では、細胞の健常性又は電気生理学的反応性を損なうことなく、長期の研究に用いることもできる。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定する方法であって、コロナ、黒質及び皮質組織のビブラトーム薄片を取得するステップと、生存力を維持しつつ細胞分裂を抑制した条件下で、前記薄片をカバースリップ上で培養するステップと、前記薄片培養物に標識された癌細胞を接種するステップと、前記接種された細胞を、候補物質と共に培養するステップと、癌細胞の生存度を測定するステップとを含み、癌細胞の生存度の減少は前記候補物質が腫瘍細胞破壊性であることを示し、このことにより腫瘍細胞破壊作用を有する物質を同定することを特徴とする方法を提供する。
【０１６６】
一実施形態では、癌細胞はニューロン由来であり、例えばグリオーマ細胞由来である。別の実施形態では、本発明のこの側面に基づくと、癌細胞は、蛍光性、発光性、発色性、又は高電子密度ラベルにより標識される。別の実施形態では、上記方法は薄片培養物に標識された組み換え型ラブドウイルスを接種するステップをさらに含む。
【０１６７】
別の実施形態では、本発明のこの側面に基づく方法は、接種された薄片をサイトカインと共に培養するステップをさらに含む。一実施形態では、サイトカインはインターフェロン、インターロイキン、マクロファージ炎症性タンパク質又は遊走阻止因子又は腫瘍壊死因子のような化学誘引物質（chemoattractant）である。
【０１６８】
組み替え型ラブドウイルス及び薄片モデルに対して本明細書中に列挙したどの実施形態も、腫瘍破壊作用を有する物質の同定方法の更なる実施形態を表すことを理解されたい。
【０１６９】
別の実施形態では、異種タンパク質を発現する本発明の組み替え型ウイルス、核酸又はベクターをタンパク質発現系として用いることができる。細胞内にこれらの構成物（constructs）を安定的に導入することで、発現されるタンパク質を高効率に生産する手段を与えることができる。
【０１７０】
以下の例は、本発明の実施形態のいくつかについてより良い理解が得られるように提供されるものである。これらの例は、本発明の範囲を制限するものと考えられるべきではない。
【実施例】
【０１７１】
《実施例１》
ＶＳＶのＭタンパク質中の変異は、感染性であるが非細胞変性ウイルスを作製する
〈材料及び方法〉
ＧＦＰ遺伝子を発現するＶＳＶの部位定方向突然変異誘発が行われた。その後、ＢＨＫ−２１細胞は変異したＶＳＶに感染した。ウイルス粒子は、超遠心分離によって細胞培養上清から濃縮され、ウイルス性ＲＮＡは単離された。逆転写ＰＣＲは、ＮＣＰ−１２変異体の完全長ｃＤＮＡを得るために使用された。Ｍ遺伝子及びｃＤＮＡは、自動配列分析された。
【０１７２】
感染した、培養されたＢＨＫ−２１（ＭＯＩ＝１０）細胞の感染力及び形態は、蛍光顕微鏡検査法により、表示された回数で測定された。円形細胞は、培養液から吸引され、培養液は丁寧なピペット操作により数回洗浄される。その後、培養され、周期的に検査された。７日後、培養液は、感染を示すＧＦＰ陽性細胞の存在を検査され、培養上清は、未感染の細胞を感染させるのに用いるべく、アリコートでハーベストされた。細胞は、培養上清と感染した２４時間後、ＧＦＰの発現について検査された。また、細胞は、感染を示す証拠のために、３%のパラホルムアルデヒドにより固定され、１%のトリトンＸ１００により透過された。そして、感染を証明するため、Ａｌｅｘａ５６９染料（プローブ分子）と結合したＮタンパク質特異的モノクローナル抗体（１０Ｇ４、Lefrancois and Lyles (1982) Virology 121:157〜167）でＮタンパク質をプローブした。
【０１７３】
ＢＨＫ−２１細胞はまた、カバーグラス上で成長させられ、Optimem（Gibco BRL製）に溶かした１０μｌのリポフェクタミン（Gibco BRL製）を用いて、２μｇのpCAGGS-M wt、pCAGGS-NCP-12.1、またはｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳプラスミドを一時的に形質移入された。形質移入後２４時間で、３%のパラホルムアルデヒドで細胞を固定し、１%のトリトンＸ−１００で透過して、ローダミン抱合ヤギ抗マウス二次抗体で標識されるＭ特異モノクローナル抗体（２３Ｈ１２）を有するＭタンパク質の発現を調査した。
【０１７４】
ＭＮＣＰ１２．１、ｃＤＮＡは４つの同定変異体を含むＭ遺伝子のために複製され、回収されたウイルスの表現型を顕微鏡的に検するような標準的な手順によって組換え型ウイルスのリカバリーを判定するために、突然変異体遺伝子は野生型Ｍ遺伝子に置き替えられた。
【０１７５】
〈結果〉
前記証拠は、Ｎ末端に欠失を有する２つのＭタンパク質（Ｍ２及びＭ３と呼ばれる）がＶＳＶ感染細胞中に見られる細胞変性効果（ＣＰＥ）に寄与することを示唆している。ＶＳＶ  Ｍタンパク質突然変異体の単離は、図１のスキームに従って行われた。
【０１７６】
２つの翻訳開始コドンを除去することにより、Ｍ２及びＭ３タンパク質は生成されず、変異ウイルスに感染した細胞は、ＶＳＶ・ＣＰＥの顕著な特徴である細胞円形化に遅れを示した（図２）。単離された組換え型ウイルスは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のためにさらにエンコードされ、これによってどの細胞が複製ウイルスに感染したかが示された。２４時間後、３０％以下の細胞は、ＶＳＶ・ＣＰＥの明らかな徴候を示さなかった。しかし、残りの７０％以下の細胞は、円形化され、さらに培養され、コンフルエントになった時にはＧＦＰ陽性であり、これは細胞が複製したウイルスを含むことを示すものであり、さらに、感染によって死滅することなく成長を続けた。細胞が感染性ウイルスを作製するかどうかを判定するために、培養上清はハーベストされ、アリコートを用いて未感染の細胞を感染した。２４時間経過後、新たに感染した細胞はＣＰＥの徴候を示さなかったが、発現した全てのＧＦＰは、感染性ウイルスが作製されかつ未処置の細胞に移入されうることを示した。さらに、これらの細胞もまた感染性ウイルスを作製し、非細胞変性（ＮＣＰ）表現型は維持された。
【０１７７】
どのドメインがＭタンパク質に誘発された細胞変性効果に関与しているかを特定するために、いくつかの異なるＭタンパク質突然変異体が生成された。得られた個々の分離株６つのうち、全てに同じ変異があった。変異は、結果的に、位置３３（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１）でメチオニン残基をアラニン残基に置換し、位置５１（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：２）でメチオニンをアラニン残基に置換した。さらには、位置１３３（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：３）ではアラニン残基はトレオニン残基に置換され、位置２２６（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：４）ではグリシン残基がセリン残基に置換された（図３）。
【０１７８】
ＮＣＰ表現型が排他的にＭタンパク質中の変異に起因していること（及びＮＣＰウイルスゲノムにおける他の変異に応じたものではないこと）を判定するために、ＭＮＣＰ１２．１に指定された突然変異遺伝子で野生型Ｍ遺伝子を置換することにより、ｃＤＮＡは、４つの同定変異体（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：５）を含むＭ遺伝子のために複製された。組換え型ウイルスは、標準的な手順を用いて回収され、回収されたウイルスの表現型が検査された（図４）。組換え型ウイルスは感染性であるが、感染したＢＨＫ−２１細胞中において細胞の細胞変性効果を媒介しなかった（図５Ｂ及び５Ｄ）。細胞は、複製突然変異ウイルスを感染させたにもかかわらず、典型的な細胞形態を維持した（図５Ｃ）。対照的に、ｗｔ−ＶＳＶを感染させた細胞は、致命的なＶＳＶ感染に関連する典型的な細胞円形化を示した（図５Ａ）。
【０１７９】
ＢＨＫ−２１細胞はまた、野生型Ｍタンパク質またはｗｔ，ＮＣＰ−１２．１突然変異体を有するＶＳＶを一時的に形質移入した。突然変異Ｍタンパク質の発現は、Ｍタンパク質とＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性発現との干渉による野生型Ｍタンパク質合成阻害機能として、野生型Ｍ（図６Ｅ）に比べて著しく向上した（図６Ｆ及び６Ｇ）。野生型Ｍタンパク質により媒介される細胞の細胞変性効果は、細胞の円形化において明らかであったが（図６Ａ）、ＮＣＰ突然変異体を発現する細胞は、外観的に平らかつ正常なままであった（図６Ｂ及び６Ｃ）。
【０１８０】
《実施例２》
ＶＳＶのＭタンパク質における変異は細胞親和性に影響しない
〈材料及び方法〉
以下の細胞型即ちＢＨＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞またはヒーラ細胞は、多重度１０でｒＶＳＶ／ＭＮＣＰｌ２．１に感染した。細胞は、３７℃で１２時間若しくは２４時間培養され、３%のパラホルムアルデヒドに固定され、５０ｍＭのグリシンを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄された。そして、細胞は、蛍光顕微鏡（西ドイツのＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ製）によってＧＦＰ発現を検査され、細胞形態は位相差顕微鏡によって評価された。
【０１８１】
〈結果〉
非細胞変性のｒＶＳＶ／ＭＮＣＰｌ２．１が細胞親和性を変更したかどうかを判定するために、ＢＨＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ベロ細胞及びヒーラ細胞が多重度１０で感染し（図７）、感染は、ＧＦＰ発現の関数として判定された。細胞型にかかわらず、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１は、細胞変性効果を示す証拠なしに、細胞内での感染及び複製が可能であった。
【０１８２】
《実施例３》
遺伝子治療に適用するための優れたベクターの開発
〈材料及び方法〉
組換え型ＶＳＶのＭ突然変異体は、上述したように生成された。突然変異ウイルスは、ＢＨＫ−２１細胞の感染中に、Ｎ、Ｐ、及びＬタンパク質を発現するプラスミドとの共発現によって成長及び回収した。突然変異ウイルスは、ＭＮＣＰｌ２．１を発現する細胞中で増殖された。ｒＶＳＶ−ΔＭ（ＶＳＶレプリコン）に感染した細胞から得られた上清は、５μｇのｐｃ−ＭＮＣＰｌ２．１プラスミドを２４時間前に形質移入された細胞に投与された。細胞は形質移入から２４時間後に固定され、ローダミン抱合ヤギ抗マウス二次抗体（Jackson Immuno Research Laboratories製）で標識されたＮ特異モノクローナル抗体でプローブされた。
【０１８３】
〈結果〉
これまで、Ｍタンパク質が変異または欠失したＶＳＶ（ΔＭ−ＶＳＶ）を回収しようと試みられてきたが成功しなかった。それはおそらく、Ｍタンパク質の毒作用が細胞を死滅させ、そのために、発現されたＭタンパク質の量に限界があったためである。容易に回収可能なベクターを上述の方法及び菌株が提供するかどうかを判定するために、回収スキーム（図８）が利用された。このスキームは、ＭＮＣＰ１２．１が最初のウイルス回収中にＮ、Ｐ、及びＬ支持プラスミドと共発現され、続いてＭＮＣＰ１２．１を発現する細胞（または細胞株）から得られたウイルスが増殖される点を除いて、組換え型ＶＳＶを回収するために用いられる標準的な方法に類似している。
【０１８４】
ΔＭ−ＶＳＶは、これらの条件下で容易に回収可能であった（図９）ので、優れた遺伝子送達／遺伝子治療ベクターの候補である。ΔＭ−ＶＳＶは、細胞質中で排他的に複製され、レトロウイルス遺伝子治療ベクターなどの他の典型的な遺伝子送達ベクターを使用する際の副産物である挿入性突然変異生成及び導入遺伝子サイレンシングの潜在的な問題を排除する。
【０１８５】
《実施例４》
Ｍ及びＧタンパク質のために除去された組換え型ＶＳＶは島細胞に感染し細胞変性ではない
〈材料及び方法〉
テネシー大学の膵島ラボで、参加する患者からインフォームド・コンセントが得られた。島細胞の標本が準備され、Ｍタンパク質（ＮＣＰ１２）の欠失した複製適格性ＶＳＶ、またはＭ及びＧタンパク質（ΔＧ−ＮＣＰ１２）の欠失した複製制限的ＶＳＶのいずれかに感染した。細胞は、１２ウェルプレートに７５０ｕｌの培地中に維持された。感染に続いて、ウイルス接種材料は取り除かれず、小島は、感染後３日目及び８日目にイメージング及びフローサイトメトリー分析のためにハーベストされた。少量の島細胞がプレートから取り除かれ、１５００ｒｐｍで５分間回転された。ペレットは、１００ｕｌのＰＢＳ中で再懸濁され、グラス・プレート上に懸濁液として加えられ、カバーグラスが被せられ、４０Ｘの対物レンズ下で観察された。アポトーシスの島細胞の割合を決定するために、残りはアネキシンＶで染色された。
【０１８６】
〈結果〉
サンプル番号１７６及び１６３の２つのサンプルが試験された。両サンプルにおいて、Ｍタンパク質のために除去された組換え型ＶＳＶをＭＯＩ＝５で感染させると、感染細胞における高水準の発現（それぞれ図１０、１１）が最小の細胞変性効果で得られた。Ｇ糖タンパク質の欠失は、感染レベルへの明らかな効果を有さないが、一般的なサンプル１７６では、より効率的に感染した。ＭＯＩ＝２５での感染は、感染後３日目に、感染率または細胞変性効果のいずれにも認識可能な増加を生じさせなかった（それぞれ図１２及び１３）。
【０１８７】
感染は、ＭＯＩとは関係なく、発現が認識可能に減少することなく培養液中で８日残存した（図１４〜１７）。ＭＯＩとは関係なく、感染後３日目及び８日目に高水準の発現が検出された。したがって、島細胞はＶＳＶ構成物に効率的に感染し、感染は認識できる細胞変性効果にもたらさず、遺伝子伝達手段としてのそのような構成物の有用性をさらに強調する。
【０１８８】
《実施例５》
ＶＳＶ・Ｇ外部ドメインの膜近位領域における変異はＧタンパク質の発現または安定性に影響しない
〈材料及び方法〉
プラスミド及びオレゴヌクレオチド定方向突然変異誘発
ＶＳＶのＧタンパク質をエンコードする遺伝子、血清型インディアナ、菌株サンジュアン（SanJuan）は、前述（１４）のようなプラスミドｐＸＭ−Ｇを生成するために真核性発現ベクターｐＸＭに複製された。突然変異体Ｅ４５２Ａ（ＳＢＱ・ＩＤ・ＮＯ：６）、Ｇ４５６Ｄ（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：７）、Ｗ４５７Ａ（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：８）、Ｆ４５８Ａ（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：９）、及びＷ４６１Ａ（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１０）は、オレゴヌクレオチド定方向突然変異誘発により構成され（１４）、変異領域はｐＸＭ  Ｇ（ＡＸＢ）（３２）に複製された。二重変異体及び三重変異体即ちＧ４５６ＤＷ４５７Ａ（ＤＡ）（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１１）、Ｗ４５７ＡＷ４６１Ａ（ＷＷ−ＡＡ）（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１２）、Ｗ４５７ＡＦ４５８ＡＷ４６１Ａ（ＡＡＡ）（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１３）、及びＧ４５６ＤＷ４５７ＤＷ４６１Ａ（ＤＡＡ）（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１４）は、高速交換部位定方向突然変異誘発キット（Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit）を製造業者（カナダのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のインストラクションに従って使用することにより産出された。テンプレートとしてｐＸＮ４−Ｇ（ＡＸＢ）プラスミドが使用された。所望の変異を含む２つの相補合成オリゴヌクレオチドプライマー（マクマスター大学中心施設（McMaster University Central Facilities）から入手）は、ターボＰｆｕ・ＤＮＡポリメラーゼを使用する突然変異誘発に用いられた。欠失および突然変異体は、前述（３２）のように構成された。構成物ＧＤ９及びＤＦ４４０〜Ｎ４４９は、ＶＳＶ・Ｇ外部ドメインのアミノ酸４５３〜４６１（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１５）及び４４０〜４４９（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１６）を欠失させることにより作られた。構成物Ｇ１０ＤＡＦ及びＧＤ９〜１０ＤＡＦは、崩壊促進因子（ＤＡＦ）（７）の膜近傍領域からの９つのアミノ酸（残基３１１〜３１９）をそれぞれＶＳＶ・Ｇ（ＡＸＢ）（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１７）とＧＤ９（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１８）のアミノ酸４６４と４６５との間に挿入することにより作られた。これらの構成物を「１０−ＤＡＦ」と呼ぶ理由は、ベクターＧ（ＡＸＢ）が、制限酵素認識部位の挿入によりＴＭ接合部で追加のセリンを含むからである。キメラＧ（＋９）ｇＢＧは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）糖タンパク質ｇＢのアミノ酸７２１〜７２６及び７７３〜７９５をＶＳＶ・Ｇの外部ドメインのアミノ酸４６４と細胞質尾部のアミノ酸の４８３との間に挿入することにより構成され、それによって、ＶＳＶ・Ｇの膜固着（ＴＭ）ドメイン（残基４６５〜４８２）はＨＳＶ１・ｇＢタンパク質（３８）の第３ＴＭ領域によって置換された。このキメラは、ＶＳＶ・Ｇタンパク質の読み枠を維持するために、ｅｃｔｏ−ＴＭドメイン接合部で余分なセリン残基を含む。
【０１８９】
構成物Ｗ４５７−Ａ（Ｗ１Ａ）、Ｗ４６１−Ａ（Ｗ２Ａ）、Ｗ４５７Ｗ４６１−ＡＡ（ＷＷ−ＡＡ）、ＧΔ１３、ＧＳｒｅｖ１１、ＧＳｒｅｖ１１−ＡＡは、テンプレートとしてプラスミドｐＶＳＶ９．１（＋）（３４）を用いてオーバーラップＰＣＲ法を使って作られた。プライマーの配列は、要求に応じて利用可能である。オーバーラップＰＣＲ生成物は、次に、６％のポリアクリルアミドゲルで浄化され、電解溶出され、固有の制限酵素ＫｐｎＩ及びＮｈｅＩで消化され、予め同じ酵素で消化されたｐＶＳＶ−ＦＬ（＋）２（３４）にサブクローニングするために使用された。配列は、その後、ジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法によって確認された。所望の変異を有するＧ遺伝子もまた、ＭｌｕＩ及びＮｈｅＩ断片として改良型の真核性発現ベクターｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳにサブクローニングされた。構成物ｐＶＳＶ−ＤＡＡ、−ＡＡＡ、−Ｇ１０ＤＡＦ、−Ｇ（＋９）ｇＢＧ、−ＧΔ９、−ＧΔ９−１０ＤＡＦ、及び−ＤＦ４４０−Ｎ４４９は、テンプレートとして突然変異Ｇ遺伝子含む対応するｐＸＭプラスミドを用いてＫｐｎＩ部位と３’末端との間のＧ遺伝子の領域を増幅し、この領域をｐＶＳＶ−ＦＬ（＋）２にサブクローニングすることにより生成された。
【０１９０】
ウイルスの回収は、若干改良して既述（３３〜３５）のように行われた。簡潔に言えば、３５ｍｍプレート中のＢＨＫ−２１細胞のコンフルエント単分子層は、３１℃で１時間、多重度５で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ｖＴＦ７−３）（３６）をエンコードする組換え型牛痘ウイルスに感染した。細胞は、その後、５ｍｇのｐＶＳＶ（＋）−Ｇ＊（＊は変異体を有するＧ遺伝子を示す）と、ＶＳＶＩＮＤから得られるＮ、Ｐ、Ｌ、Ｇ遺伝子を含むそれぞれ３ｍｇ、５ｍｇ、１ｍｇ、８ｍｇのプラスミドと、９０ｍｌのトランスフェクトＡＣＥ（Transfect ACE）（３６、３７）とからなるＤＮＡ：リポソーム懸濁液を形質移入された。３時間後、トランスフェクション混合体は、ＤＮＭＭ＋１０％ＦＢＳと取り替えられ、細胞は３７℃で培養された。上清は、４８時間の培養後に収集され、牛痘ウイルスを取り除くために０．２ｍフィルタ（ミリポア社のマイレクス−ＧＳ）でろ過された。濾液は、２４時間前に２ｍｇのｐＣＡＧＧＳ−ＧＩＮＤを形質移入されたＢＨＫ−２１細胞に与えられた。ウイルスの回収は、２４〜３６時間後にＶＳＶ感染の典型である細胞変性効果を検査することにより評価された。回収したウイルスはその後プラーク精製され、継代され、そのＲＮＡは単離された。Ｇ遺伝子における変異は、ＲＴ−ＰＣＲ塩基配列決定法によって確認された。
【０１９１】
〈結果〉
ＶＳＶ  Ｇの膜近位領域においていずれの残基が膜融合活性に重要となり得るかを判定するために、異なる小胞ウイルスからの膜近位ドメインの配列アラインメントが行われた（図２０）。アラインメントは、この領域が、密接に関連する小胞ウイルス全体でよく保存され、これらのサブドメインにおいて保存された残基の数に基づいてＡ及びＢとして標識される２つの別のドメインが画定されたことを示している。最大の保存（９０％以上）は、残基Ｅ４３７とＷ４６１との間の領域（ドメインＢ）にあった。残基Ｅ４３７とＦ４２１との間（ドメインＡ）のアミノ酸配列は、ＶＳＶインディアナ血清型の２つの菌株（サンジュアン（San Juan）及びオルセー（Ｏｒｓａｙ））に一致した。一方、球菌ウイルスでは、保存は８０％以上であった。球菌ウイルスは、インディアナ−２血清型及び他の２つのインディアナ−２血清型ウイルスとして分類される、より関係の薄いウイルスである。しかし、ドメインＡは、試験した他のウイルスの中ではよく保存されなかった。位置４５７及び４６１のトリプトファン（Ｗ）残基は、試験した全ての小胞ウイルス全体で保存された。トリプトファン残基以外では、いくつかの他のアミノ酸（Ｈ４２３、Ｐ４２４、Ｔ４４４、Ｇ４４５、Ｎ４４９、及びＰ４５０）も、試験した小胞ウイルスの配列全体で保存された。ドメインＢの始まりに近くかつ残基４４０〜４４５から延在するＦＦＧＤＴＧ（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１９）モチーフは、試験した全ての小胞ウイルス全体で不変異体であるＴＧ残基を有する、密接に関連するメンバーのほとんどで保存された。
【０１９２】
Ｇタンパク質の膜融合活性におけるこれら保存された領域の役割を判定するため、この領域で、置換、欠失、及び挿入を行った（図２１）。位置４５７及び４６１の２つの不変異体トリプトファン（Ｗ）残基は、アラニンと置換された。同様に、保存されたグルタミン酸（Ｅ４５２）、グリシン（Ｇ４５６）、及びフェニルアラニン（Ｆ４５８）は、個別にアラニンと、若しくはアスパラギン酸及びアラニンと置換された。Ｗ４５７及びＷ４６１をアラニンで、Ｇ４５６及びＷ４５７をアスパラギン酸及びアラニンでそれぞれ置換することにより、２つの二重変異体も構成された。さらに、Ｗ４５７Ａ、Ｆ４５８Ａ、Ｗ４６１Ａをアラニンで置換し、Ｇ４５５、Ｗ４５７、Ｗ４６１をアスパラギン酸及びアラニンでそれぞれ置換することにより、２つの三重変異体も産出された。変異体Ｅ４５２Ａ、Ｇ４５６Ｄ、Ｗ４５７Ａ、Ｆ４５８Ａ、Ｗ４６１Ａ、Ｗ４５７Ｗ−４６１−ＡＡ、変異体Ｇ４５６Ｄ−Ｗ４５７Ａ、変異体Ｇ４５６Ｄ−Ｗ４５７Ａ−Ｗ４６１Ａ、及び変異体Ｗ４５７Ａ−Ｆ４５６Ａ−Ｗ４６１Ａは、それぞれＥ−Ａ、Ｇ−Ｄ、Ｗ１Ａ、Ｆ−Ａ、Ｗ２Ａ、ＷＷ−ＡＡ、ＤＡ、ＤＡＡ、及びＡＡＡとも呼ばれる。
【０１９３】
上記の点変異に加えて、欠失変異体（アミノ酸４５３〜４６１（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１５）の欠失であるＧΔ９、残基４４９〜４６１（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：２０）の欠失であるＧΔ１３、及びアミノ酸４４０〜４４９（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：１６）の欠失であるΔＦ４４０〜Ｎ４４９）と、いくつかの挿入変異体が調製された。構成物Ｇ（ＡＸＢ）は、Ｋ４６２とＳ４６３との間に２つの付加的なセリンを導入する（（３８）に記載されている）。一方、Ｄ１０ＤＡＦ及びＧΔ９〜１０ＤＡＦは、Ｇ（ＡＸＢ）のａａ Ｓ４６４とＳ４６５、及びＧΔ９の間にそれぞれ挿入された崩壊促進因子（ＤＡＦ）から９つのａａ（残基３１１〜３１９）を含む。変異体Ｇ（＋９）ｇＢＧは、Ｇ（ＡＸＢ）の外部ドメインとＧｇＢ３Ｇ（３９）（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：２１）の膜貫通ドメインとの間に９つの残基が挿入されている。試験された残りの変異体は、反転した膜貫通ドメインに隣接する１１ ａａの配列（Ｇｓｒｅｖ１１）（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：２２）を有する。変異体ＧＳｒｅｖ１１−ＡＡは、同一の反転した１１ ａａを有し、アラニンに変化した２つのＷ残基（ＳＥＱ・ＩＤ・ＮＯ：２３）も有する。
【０１９４】
突然変異体遺伝子は、ｐＸＭベクターを用いてＣＯＳ−１細胞において発現され（１１）、タンパク質は、［３５Ｓ］−メチオニンで標識され、その後、ポリクローナル抗Ｇ抗体での免疫沈降とそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された（図２３）。全ての置換変異体は野生型Ｇタンパク質と共に移動し、野生型及び変異体に対応したバンドの強度は類似していた。これは、Ｇタンパク質との関連で、保存された残基の置換及び余分な残基の欠失または挿入は、タンパク質の発現または安定性に影響しなかったことを示唆している。
【０１９５】
変異体Ｇタンパク質をエンコードする組換え型ウイルスの回収は、初期の回収及び後続の増幅ステップ中にＷＴ・Ｇタンパク質共発現によって達成された。これは、Ｇタンパク質突然変異体が膜融合的に欠陥があったか否かに関係なく、すべてのウイルスが回収され得ることを確実にした。
【０１９６】
《実施例６》
変異Ｇタンパク質の移送及び細胞表面発現
〈材料及び方法〉
間接的な免疫蛍光検分析は、様々なＧタンパク質の表面発現を検査するために使用される。細胞は形質移入され、３％のパラホルムアルデヒドにより固定された後、Ｇ特異的モノクローナル抗体（mAb I1）（４０）、続いてローダミン結合ヤギ抗マウス（又は抗ラビット）の２次抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.）により調べられた。Ｇタンパク質の表面発現を定量化するため、ウイルス感染した細胞のフローサイトメトリー分析、又は形質移入されたＣＯＳ−１細胞のラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化が行われた（１５）。フローサイトメトリーには、３５ｍｍプレート内のＢＨＫ−２１細胞（５ｘ１０５）は、野生型ＶＳＶ、又は適切な多重度１０のＧ補完された変異ウイルスのいずれかに感染した。細胞は、感染後６時間で、５０ｍＭのＥＤＴＡが含まれるＰＢＳを使用してプレートから取り出され、１２５０ｘｇで５分間、遠心分離によりペレット化された。細胞は、その後、３％のパラホルムアルデヒドを使用して、懸濁液中に室温で２０分間固定された。細胞は、固定液を除去するために、ＰＢＳ−グリシンにより２回洗浄された。そして細胞は、ＰＢＳグリシン＋０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma-Aldrich）中で、室温で３０分間培養された。ＢＳＡでブロックした後、細胞は、主要な抗体及びローダミン結合ヤギ抗マウス抗体としてのＩ１ｍＡｂにより調べられた。その後、様々な突然変異体Ｇタンパク質の表面発現レベルを計るために、細胞はフローサイトメトリーにより分析された。
【０１９７】
〈結果〉
細胞間融合とウイルス出芽は両方とも、原形質膜に対するウイルス・タンパク質の局在を必要とする。ウイルス・タンパク質が細胞表面へ移送されたかどうか判定するために、フローサイメトリーとラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化の両方が行われた。変異Ｇタンパク質は、野生型Ｇタンパク質の８０〜１００％の間のレベルで、細胞表面上に発現した（表１）。
【０１９８】
【表１】
2005537802.tif 000002
【０１９９】
ａ：ＣＯＳ細胞は、指標Ｇタンパク質をエンコードするｐＸＭベクターにより形質移入された。前記細胞は、表面がヨウ素化され、表面発現の相対量は前述したようにして計算された（１５）。ｂ：ＢＨＫ−２１細胞はＧ補完ウイルス（G-complemented viruses）に感染し、感染後６時間固定された。そして、前記細胞は、Ｇ特異的モノクローナル抗体Ｉ１とローダミン標識第２抗体により染色された後、フローサイメトリーによって分析された。相対的な表面発現は、次の式を使用して計算した。（変異の蛍光強度である、変異個体群ｘ中の陽性細胞：％）／（蛍光強度である、ＷＴ陽性細胞ｘ：％）。ｃ：形質移入されたＣＯＳ細胞は、ｐＨ５．６に緩衝された融合培地に入れられ、細胞間融合は〈材料及び方法〉の欄で説明したようにして測定された。ｄ：ＨＫ−２１細胞は、各ウイルス変異体に感染し、前述したようにしてｐＨ５．９に緩衝された融合培地で培養された。数値は１００％に設定されたＷＴ融合活性の百分率として表される。Ｎ．Ｄ．（not done）は不実施である。
【０２００】
細胞膜近傍領域内の変異が細胞内移送又はＧタンパク質の細胞表面局在化に影響されるかどうかを判断するために、ＣＯＳ−１とＢＨＫ−２１細胞の両方で、野生型及び変異体Ｇタンパク質を発現させた。小胞体（ＥＲ）からゴルジ複合体までの移送は、エンドＨ耐性獲得を試験することにより評価された。１５分のパルスの後、すべての変異はエンドＨに感受性があったので、前記変異はＮ結合したオリゴ糖によりグリコシル化されたことが実証された。１時間の追跡後、前記変異はエンドＨ消化に対して耐性を示したので、すべての変異Ｇタンパク質は、同様の動態で、ＥＲからゴルジまで移送されたことが分った。ＢＨＫ−２１細胞内で発現した変異の代表例を図２４に示す。
【０２０１】
《実施例７》
Ｇタンパク質欠失変異体は、膜融合を促進する能力が低い。
【０２０２】
〈材料及び方法〉
ウイルス感染したＢＨＫ−２１細胞及びプラスミドが形質移入されたＣＯＳ−１細胞は、合胞体形成を測定する分析に利用される。ウイルスに感染した細胞では、培地は感染した６時間後に除去される。その後、前記細胞は、融合培地（［１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）］、ＨＣｌにより指標ｐＨ（５．９、５．５、又は５．２）に滴定されている）により１回洗浄され、室温で１分間、未使用の融合培地に浸けられた。１分後、融合培地は、５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含んでいる未使用のダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium: DMEM）と交換され、細胞は３７℃で３０分培養された。細胞は、その後、３％のパラホルムアルデヒドにより固定され、前述したようにして、免疫蛍光のために処理された。形質移入されたＣＯＳ−１細胞は、前述したようにして処理された（１１）。
【０２０３】
〈結果〉
膜融合活性における変異体の影響を検査するため、細胞間融合分析が行われた。ＷＴ或いは各Ｇ変異を発現する細胞は、ｐＨ５．９〜４．８に緩衝された融合培地で処理された。一時的に形質移入されたＣＯＳ−１細胞を分析した場合、全ての置換変異体は、膜融合活性が、野生型の活性の７０％から５％の範囲で、減少することを示した（表１）。
【０２０４】
一方、ウイルス感染したＢＨＫ細胞を分析した場合、これら突然変異体の多く（Ｗ１Ａ、Ｗ２Ａ、ＷＷ−ＡＡ、ＤＡＡ、及びＡＡＡ）が、大きさと範囲が野生型ＶＳＶに感染した細胞と類似する、広範囲に及ぶ合胞体を生成した。この違いの根拠は、完全には理解されていない。しかし、それは単に、一時的に形質移入された細胞に感染したウイルス中のＧタンパク質発現レベルのためだと思われる。
【０２０５】
置換変異体とは対照的に、欠失及び挿入変異体の膜融合活性は、ＣＯＳとウイルス感染ＢＨＫ細胞の両方において、検知できないほど非常に低い。変異体ＧΔ９、ＧΔ１３、及びＧΔ９−１０ＤＡＦは、細胞がｐＨ５．９に暴露されたとき、３つ又は４つの核だけを有する合胞体を極僅かながら生成した（図２５Ａ、矢印で示す）。これらのタンパク質を発現する細胞がｐＨ５．５、５．２、または４．８に緩衝された培地に入れられたとき、合胞体の大きさも数も増大しない（データは示さず）。このことは、合胞体形成の欠損は、ｐＨ閾値の変動が原因でないことを示す。さらに、低ｐＨトリガへの暴露後の、長時間の培養は、見られた合胞体の数又は大きさを増大させなかった（データは示さず）。９つ又は１０のアミノ酸が、膜固着領域と外部領域｛変異体Ｇ（＋９）ｇＢ及びＧ１０ＤＡＦ｝との境界の間に挿入されたとき、及び残基Ｆ４４０〜Ｎ４４９が欠失したときに、膜融合活性は完全に喪失する（図２５Ｂ）。これらのデータは、膜近傍領域における配列の前後関係は、融合活性に重要であることを意味している。これら全てのケースでは、酸性ｐＨに暴露する時間の増加、又は融合培地のｐＨの減少、膜融合活性を促進しない。
【０２０６】
保存されている細胞膜近傍の芳香族残基（トリプトファン及びフェニルアラニン）及びグリシン残基は、そのため、ウイルス感染細胞では、ＶＳＶＧが誘発した膜融合に重要ではない。しかし、ＣＯＳ−１細胞で一時的に発現した場合、いくらかの活性の低下が見られた。１１細胞膜近傍の残基配列の反転は、同様に、融合活性に重要な影響を与えない。９細胞膜近傍のアミノ酸の線形順序は膜融合活性に影響を与えるようには見えないが、これらの残基の欠失は融合活性を減少させるので（by>99%）、これら残基は重要である。さらに、１３アミノ酸の欠失は、Ｇタンパク質に仲介された細胞間融合について、同様の効果があった。しかしながら、保存されているＦＦＧＤＴＧ（SEQ・ED・NO： ）モチーフ（融合活性を完全に停止している）を含んでいるＦ４４０とＮ４４９との間の領域における欠失は、このサブドメインがＧの融合活性に重要であることを示している。挿入変異体Ｇ１０ＤＡＦ及びＧ（＋９）ｇＢＧについての結果は、これらの挿入は表面発現に影響を与えないことを示すが、それらが融合活性を完全に停止させることは、膜貫通領域から細胞膜近傍領域の間隔が、膜融合活性にとって非常に重要であることを示す。この考えに従って、Ｇ１０ＤＡＦ内の膜近傍領域の長さが、９細胞膜近傍残基（ＧＤ９−１０ＤＡＦ）の欠失により減少したとき、膜融合活性は部分的に回収された。これらの結果を総合すれば、膜固着領域に直接に隣接する領域は、例えばＨＩＶ−１ ｇｐ４１（４１）では、ＶＳＶ Ｇ内の保存されている細胞膜近傍Ｗ残基は、ウイルス中へのＧタンパク質の取り込み又は膜融合活性にとって重要ではないのとは違って、ＶＳＶ Ｇタンパク質の膜融合活性にとって不可欠であることを示す。
【０２０７】
《実施例８》
変異Ｇタンパク質の安定性
〈材料及び方法〉
オリゴマー状態の発現Ｇタンパク質は、（１５、１７）で説明したような、ショ糖密度勾配遠心分離法によって測定された。エンドグリコシダーゼＨ分析は、（１５）に記載したように形質移入された細胞の溶解液で、（１０）に記載したようにウイルス感染した細胞の溶解液で、若干の変更を伴って行われた。３５ｍｍプレートで成長したＢＨＫ−２１細胞は、多重度１０で、適切なＧ補完変異ウイルスに感染した。感染してから６時間、細胞はメチオニンフリーのＤＭＥＭ（ＭｅｔフリーＤＭＥＭ）によって一度洗浄され、その後２ｍｌのＭｅｔフリーＤＭＥＭ内で２０分間培養された。その培地は、指示された回数だけ、５５ｍＣｉの［３５Ｓ］メチオニン（Translabel protein labeling mix, New England Nuclear）を含んでいる２ｍｌのＭｅｔフリーＤＭＥＭと交換された。パルス周期後、細胞は、１ｍｌの洗浄溶解緩衝液［１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４、６６ｍＭのＥＤＴＡ、１％ＴＸ−１００、０．４％デオキシコール酸、０．０２％アジ化ナトリウム）にすぐに溶解される、又は２ｍＭの過剰の非放射性メチオニンを含んでいるＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で追跡された。核と細胞残屑は、卓上マイクロ遠心分離機（IEC Centra）上で、１４，０００ｒｐｍ、１分間の遠心分離によって除去された。免疫沈降は、post-nuclear上澄みが０．３％ナトリウム・ドデシル硫酸塩（ＳＤＳ）のために作成し、原抗体複合体を３７℃で１時間形成するとき以外は、基本的に前述した（４２）のようにして抗Ｇテール・ラビット・ポリクローナル抗体（ペプチドＡｂ＃３２２６）によって行われる。免疫沈降の２分の１は、製造業者の指示に従って、エンドＨ（New England Biolabs）によって消化された。
【０２０８】
野生型及び変異タンパク質のトリプシン感受性は、（３８、４３）で説明したようにして測定された。簡単に言えば、形質移入された細胞は［３５Ｓ］メチオニンによって標識され、２Ｘ ＭＮＴ［４０ｍＭ ２−（Ｎ−モルフォリン）エタンスルホン酸、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ］中で、指示されたｐＨで、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００によって溶解された。溶解液は、１４，０００ｇで５分間遠心分離され、同等量の上澄みは、１０ｍｇのＴＰＣＫ−トリプシンが存在しない又は存在する状態で、３７℃で３０分間培養された。消化は、アプロチニン（１００ユニット）を添加することによって止められた。そして、混合物は、どの不溶性物質も取り除くため、１４，０００ｒｐｍで２５分間、再び遠心分離された。上澄みはアンチG（Indiana）抗体によって免疫沈降され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。
【０２０９】
感染したウイルスの滴定量はプラーク測定法により測定された。６枚のウェルプレート内のＢＨＫ−２１細胞（５ｘ１０５）は、１０フォルドの連続希釈法でウイルスと感染した。感染１時間後、接種材料は除去され、細胞は、０．９％の寒天及び５％のＦＢＳを含んでいるＤＮＭＭによってオーバーレイされ、３７℃で３６時間培養された。培養期間後、プラークの数はカウントされ、少なくとも２回の希釈を平均した。ウイルス滴定量はプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌとして表される。プラークは、７５−２００Ｎｉｋｏｎレンズを用いたＮｉｋｏｎデジタル・カメラで撮影された。デジタル映像は、その後、拡大され、４ｘ８インチのＫｏｄａｋ写真用紙にプリントされた。ウイルス当たり、少なくとも１５のプラークの大きさが測定され、平均化された。
【０２１０】
〈結果〉
細胞表面上に発現する全ての変異タンパク質は、原型質膜に移送されるべく、ＥＲ内で十分に折りたたまれ、オリゴマー形成することを示している。しかし、いくつかの変異体は、移送に影響を及ぼすことなく、ショ糖密度勾配のトリマー安定性に影響を与えることが知られている（４３、４４）。膜融合活性が減少された細胞膜近傍領域の変異が、トリマー安定性に影響を与えるかどうか判定するために、酸性及び中性のｐＨでショ糖密度勾配遠心分離を行った。試験された変異体は、すべて、野生型Ｇ（ｐＨ５．６に緩衝された勾配中で遠心分離するには若干安定性が足りないＧ（＋９）ｇＢＧを除く）に類似する沈降パターンを示した（表２）。
【０２１１】
【表２】
2005537802.tif 000003
【０２１２】
ＢＨＫ−２１細胞のコンフルエント単分子層は、多重度１０で、ＷＴ又は変異ウイルスのいずれかに感染した。感染した６時間後、細胞を放射活性物質で標識し、〈材料と方法〉の欄で説明したようにして追跡した。トリマーを分析するために、細胞は、ｐＨ５．６まで緩衝された２ｘＭＮＴ中に溶解された。その後、溶解物は、同じｐＨに緩衝された５〜２０％のショ糖密度勾配によって遠心分離された。破片は底部から採取され、Ｇタンパク質はポリクローナル・アンチＶＳＶ抗血清と共に免疫沈降した。トリプシン感受性を分析するために、細胞は、表示されたｐＨに緩衝された１ｘＭＮＴ中に溶解された。細胞残屑と核を除去すべく、溶解物は遠心分離によって清澄された。上清は、その後、ＴＰＣＫトリプシンを用いて又は用いないで処理され、Ｇタンパク質はポリクローナル・アンチＶＳＶ抗体と共に免疫沈殿した。免疫沈殿したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、蛍光写真撮影法によって視覚化され、デンシトメトリー走査法により定量化された。（＋＋＋）＝９５％〜１００％抵抗性、（＋＋）＝５０％〜９５％抵抗性、（＋）＝１０％〜５０％抵抗性、（−）＝＜１０％抵抗性。
【０２１３】
おそらくは酸性ｐＨによって誘発された構造変化によって、低いｐＨではＧタンパク質はトリプシン消化に対する抵抗力を持つようになるため（４２）、細胞膜近傍の変異体の融合誘導活性は、低いｐＨに誘発される構造変化に起因するかどうかを判定することが重要である。変異体及び野生型Ｇタンパク質のトリプシン消化に対するｐＨに依存する抵抗性を試験した（表２）。ほとんどの変異体は、野生型Ｇタンパク質に観察されたのと類似するトリプシン抵抗特性を示した。例えば、ｐＨ６．５では、約７５〜８０％の変異体及び野生型Ｇタンパク質がトリプシン消化に対する抵抗性を有する。変異体Ｇ（＋９）ｇＢＧは、劇的な抵抗性パターンの変化を示し、ｐＨ６．５では消化に対して全面的に感受性で、ｐＨ５．６では部分的にのみ抵抗性を示す。しかし、２つの変異体、ＧＤ９及びＧ１０ＤＡＦは、ｐＨ６．５では、トリプシン消化に対する抵抗性は少々低かった（それぞれ４８％と４０％）。
【０２１４】
細胞間融合分析結果に基づいて、野生型Ｇ融合活性を示す変異体をエンコードする組み換え型ウイルスは、野生型ＶＳＶと同じように成長し、検知不能な膜融合活性を有するものは、野生型Ｇを使用した補完なしに成長できないであろうと予測される。予測されたように、点変異、挿入変異（Ｇ（ＡＸＢ））、及び逆転配列変異（ＧＳｒｅｖ１１、ＧＳｒｅｖ１１−ＡＡ）はすべて、ＢＥＫ−２１細胞に成長したとき、野生型のＶＳＶに類似する力価を示す。しかし驚くことに、細胞間融合活性において＞９９％の減少を示すウイルスのいくつかは（例えばＧΔ９、ＧΔ１３及びＧΔ９−１０ＤＡＦ）、低い力価にもかかわらず、補完のためのＧタンパク質の発現を必要することなく、ＢＨＫ−２１細胞上で成長し、拡散することができた（図２６）。欠質変異体ＧΔ９は、常に、野生型ウイルスよりも１００フォルド低い力価を与える。一方、欠質変異体ＧΔ１３は、約１００フォルド低い力価を有する。ＧΔ９−１０ＤＡＦの力価は、野生型ＶＳＶの力価より約１０，０００フォルド低かった。野生型のＶＳＶ及び他の変異体は感染後２４〜３０時間でプラークが生じるのにもかかわらず、ウイルス力価が減少するのに一致して、これらの変異体によるプラーク形成は４９〜６０時間かかった（表３）。
【０２１５】
【表３】
2005537802.tif 000004
【０２１６】
回収又はその後の若しくは後に続く増殖中に（検知可能な膜融合活性が見かけ上存在しない状態で成長する能力を示す）、ＧΔ９、ＧΔ１３又はＧΔ９−１０ＤＡＦのＧ遺伝子内に、補償する変異が生じたかどうか判定するために、これらのウイルスのＧ遺伝子全体で配列決定するＲＴ−ＰＣＲを行なった。特異的に導入されたもの以外の他の変異は検知されなかった。このことは、ウイルスの表現型は、意図された変異が原因であることを示す。
【０２１７】
Ｇ１０ＤＡＦ、Ｇ（＋９）ｇＢＧ、及びＡＦ４４０−Ｎ４４９などの残りの変異体は、非感染性であり、それらの細胞間融合活性の欠如と一致する野生体Ｇタンパク質の共発現なしでは、ＢＨＫ−２１細胞中で成長することができなかった。すべての変異Ｇタンパク質はＷＴタンパク質のレベルと同様のレベルで組込まれたので、感染力の欠如はウイルス粒子に組み込まれたＧタンパク質の量の差が原因ではない（図２７）。
【０２１８】
《実施例８−２》
細胞へのウイルス結合
〈材料及び方法〉
出芽性分析は、基本的には（４６）で説明したようにして行われた。３５ｍｍプレート中のコンフルエントＢＨＫ−２１細胞は、多重度１０で、各変異体ウイルスに感染した。そして、吸着した後、残留した接種材料は、それぞれ３７度で５分間攪拌しながら、無血清ＤＭＥＭ（ＳＦ−ＤＭＥＭ）でプレートを２回洗浄し、振動を備えたＳＦ−ＤＭＥＭ中で２回洗浄することにより除去された。その後、細胞は、３７度で、２ｍｌのＳＦ−ＤＭＥＭ中で培養された。培養した１６時間後、上清は採取され、１，２５０Ｘｇで１０分間遠心分離することにより清澄された。プラーク測定法によってウイルス力価を測定するために、上清のアリコートを使用した。ウイルス粒子は、残った１．５ｍｌの上清から、２０％のショ糖クッション遠心分離（２４５，０００ｒｐｍ、３５分間）によってペレット化された。ウイルスのペレットは、５０ｍｌの減少するサンプル緩衝液中で再懸濁された。各サンプルの５分の１（１０ｍｌ）は、１０％のポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって分離された。ゲルは、製造業者の指定通りに、クーマシー（GELCODE-blue, PIERCE Co.）により染色された。ゲルは脱染され、３５−８０ｍｍのニコン・レンズを使用したＮｉｋｏｎデジタル・カメラを使用して撮影された。ウイルス・タンパク質の数量化は、Image Quant分析ソフトウェア（Molecular Dynamics）を使用して行われた。ウイルス生成は、Ｎタンパク質バンドの強度を測定することにより測定された。
【０２１９】
〈結果〉
膜融合活性の減少または欠如、同様に、ある変異体中のウイルス感染力の欠乏の説明の１つとして、変異はＧタンパク質の細胞へ結合する能力に影響を与えたかもしれない。変異がウイルスの結合に影響したかどうか判定するために、放射性標識ウイルス粒子が培養され、ｐＨ７．０又はｐＨ５に緩衝された結合用培地中で、ＢＨＫ−２１細胞と共に培養された。ウイルス粒子のエンドサイトーシスを防止するために、同様に、低いｐＨへの暴露後に細胞膜を備えたウイルス・エンベロープの融合を防ぐために、結合は氷上で行われた。ＶＳＶ結合は、酸性ｐＨで促進される（８、４７）。ＧΔ１３及びＡＦ４４０−Ｎ４４９以外は、試験した全ての変異体は、ｐＨ７．０及びｐＨ５．９の両方で野生型ＶＳＶと類似する細胞へ結合した（図２９）。ＧΔ１３及びＡＦ４４０−Ｎ４４９は両方とも、ｐＨ７．０では、一貫して、ＷＴと比較して２フォルド良い結合を与えた。しかし、ｐＨ５．９では、ＧΔ１３結合は野生型ＶＳＶより約１０％少なかった。一方、ΔＦ４４０−Ｎ４４９結合は、野生型ウイルスと比較して５０％減少した（図２８）。これらのデータは、Ｆ４４０とＶ４５４との間の領域の残基がウイルス結合に寄与し、減少した結合量がこれらの変異体で見られた膜融合活性における欠如に部分的には原因となりうることを示す。ＤＡＦ（Ｇ１０ＤＡＦ、ＧΔ９−１０ＤＡＦ）からの１０ａａ、又はＨＳＶｇＢからの９ａａの挿入は、結合に影響を与えない。このことは、ＴＭと外部ドメインとの間の残基の間隔は、結合にとって重要ではないことを示す。これらの結果に基づいて、Ｇ１０ＤＡＦ、Ｇ（＋９）ｇＢＧ、及びＧΔ９−１０ＤＡＦへの、融合活性及びウイルス感染力の欠如は、結合後の段階にある可能性が高いことは明らかである。
【０２２０】
膜融合活性への影響に加えて、変異は、細胞から放出されたウイルス量を減少させることができる。ＧΔ９、ＧΔ１３又はＧΔ９−１０ＤＡＦで観測されたウイルス力価の減少が、減少したウイルス出芽が原因であるかどうかを判定するために、各ウイルスの特異的感染力を測定した。前記測定は、ウイルス力価の、放出されたウイルスの相対量に対する比率として計算される（ＷＴウイルスと比べて）。ＷＴから作られるウイルス量の６０％から９０％で生産され、低下したウイルス力価を与える３つ変異体は全て、細胞を感染させた。したがって、これらの変異体が培養液中で拡散する能力の欠如は、ウイルスの出芽が原因ではなく、主として膜融合活性の欠如によるものである。
【０２２１】
《実施例９》
ＩＬ−１２Ｆを発現する組み換え型ＶＳＶ−ΔＧ
〈材料及び方法〉
逆遺伝学によって組み換え型ＶＳＶ−ΔＧを作成するために、次のプラスミドを使用した。ｐＢＳ−Ｎ、ｐＢＳ−Ｐ、ｐＢＳ−Ｌ、及びｐＢＳ−Ｇ（表示されたＶＳＶタンパク質をエンコードする、pBluescriptベースのプラスミド（４８））。プラスミドｐＶＳＶΔＧ−ＰＬは、Ｇタンパク質のコーディング領域がポリリンカーと置換されたＶＳＶ−ΔＧのアンチ・ゲノムＲＮＡを発現するBluescriptBベースのプラスミドである（４９）。プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＧＩＮＤは、ＶＳＶ Ｇタンパク質（ＧＩＮＤ）のインディアナ血清型をエンコードする、ｐＣＡＧＧＳベースのくプラスミドである。ＩＬ−１２Ｆ構成物は、pSFG-m1Ll2.p4O.L.Δ.p35の構成物としてDr. Richard Mulligan（ハーバード大学）から得られた（５０）。ＩＬ−１２Ｆ構成物は、親プラスミドから取り出され、SmaI/SmaI断片としてBluescript SK（Strategene、 La Jolla、  CA）にクローン化した。そして、その後、pVSVΔG-IL12Fを作成するために、XhoI/EagI断片としてpVSVΔG-PLにクローン化した。
【０２２２】
ＩＬ−１２Ｆタンパク質を発現する組み換え型ＶＳＶ−ΔＧの回収は、前述した逆転遺伝学的方法［Takada,1997年#1055、Robison,2000年#1057］を使用して行なわれた。この回収システムは、適切な宿主細胞内でのＶＳＶを構成するタンパク質の発現と関連する組み換え型アンチ・ゲノムＲＮＡの合成に基づく。ＶＳＶ（Ｎ、Ｐ、Ｌ、及びＧ）の各必須構成タンパク質と、組み換え型アンチ・ゲノムの配列とをエンコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターの管理下で、個々のBluescriptベースのプラスミド上でエンコード化され、組み換え型アンチ・ゲノム・プラスミドはｐＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆにデザインされる。簡単に言えば、ＢＨＫ−２１細胞（Ｔ７ポリメラーゼ（ｖＴＦ７−３）を発現する組み換え型vaccimiaウイルスに既に感染している）は、ＶＳＶのＮ、Ｐ、Ｌ、及びＧタンパク質をエンコードするBluescriptベースのプラスミドを同時形質移入された。３：５：１：８：５の比率で、アンチ・ゲノム（pVSVΔG-IL12F）をエンコードするプラスミドも同様である。形質移入された細胞は、無血清ＤＭＥＭ（ＤＮＭＭ−０）中で５時間培養され、その後１０％のＦＣＳ（ＤＮＥＭ−１０）が補充されたＤＮＭＭ中で４８時間培養された。培養上清は、牛痘ウイルス粒子を取り出すために収集され、ろ過された（０．２μｍ）。そして、その後、ｐＣＡＧＧＳ−ＧＩＮＤを既に形質移入された未感染のＢＨＫ−２１細胞上にオーバーレイされた。組み換え型ウイルスはＧタンパク質を作成しないので、新しく出芽するウイルス粒子が感染性であるように、途中で供給されなければならない。そして、組み換え型ウイルスはプラーク精製され、増殖され、Ｇ補完ＢＥＫ−２１細胞上に滴定された。
【０２２３】
ＢＨＫ−２１細胞はＧ補完ＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆ（ＭＯＩ＝５）に感染し、３７℃で１７時間、ＤＭＥＭ−０中で培養された。ΔＧウイルス粒子を取り出すために、Ｍ−１２Ｆタンパク質を含んでいる培養上清が収集され、２０％を超えるショ糖、１００，０００Ｘｇで遠心分離された。清澄された上清は、無菌のＰＢＳ（滅菌されたフィルタ）の３つの変更に対して透析され、−８５℃で保管された。
【０２２４】
精製したウイルス・プレパラートと同様に、ＶＳＶΔＧ−ＩＬ−１２Ｆに感染したＢＨＫ細胞培養上清のタンパク質成分は、前述の手順を修正したものを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）によって単離された（５１）。単離されたタンパク質は、クーマシー・ブリリアント・ブルー（Sigma Chemical Co、 St Louis、 MO）で染色することにより視覚化された。
【０２２５】
ウエスタン分析は（５２）に前述した手順を修正したものを用いて行なわれた。簡潔に言えば、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離されたタンパク質は、ニトロセルロース膜に電気泳動的に移送され、その後ＩＬの特定のｍＡｂ（ＣＩ７．８．２０．１５）でプローブされた。ＴＢＳＴで数回洗浄した後、膜はアンチ・マウスＩｇペルオキシダーゼ（Sigma Chemical Co）でプローブされた。非結合性の第２ＡｂはＴＢＳＴで洗浄することにより取り出され、膜へ結合する第２抗体は、ルネッサンス・ウエスタンブロット・ケミルミネサンス試薬システム（Renaissance Western Blot Chemiluminescence）（NEN Life Science Products Co、 Boston、MA）を使用して検出された。
【０２２６】
〈結果〉
逆遺伝学アプローチを使用して、その複製サイクル中に大量のｖＩＬ−１２Ｆを発現する複製が制限された水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−ΔＧ）を構成した。ＩＬ−１２ＦをエンコードするｃＤＮＡは、図２８Ａに図示するようにDr. Richard Mulligan及び同僚（５０）によって最初に構成された。組み換え型ＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆの作成は、組み換え型ＶＳＶのアンチ・ゲノムをエンコードするプラスミドと同様に、ＶＳＶ Ｎ、Ｐ、Ｇ、及びＬタンパク質（全てＴ７プロモーター管理下）をエンコードするプラスミドを有するＢＨＫ細胞と共に、組み換え型牛痘ウイルス（Ｔ７を発現する）に感染したＢＨＫ細胞の同時形質移入によって行われた。図２８Ｂは、アンチ・ゲノム・プラスミドのＧコード領域がＩＬ−１２Ｆコード領域と置換された、組み換え型ＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆの構成を示す。同時形質移入されたＢＨＫ細胞から回収された組み換え型ＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆは、プラーク精製され、増殖され、Ｇタンパク質を発現するＢＨＫ細胞上に滴定された。結果として生じたＧ補完ウイルスは、細胞を感染させて複製することができるが、Ｇタンパク質が途中で供給されない場合、非感染性の「むき出しの（bald）」ウイルス粒子を生成する。
【０２２７】
ｖＩＬ−１２Ｆを作成するために、ＢＨＫ細胞をＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆ（ＭＯＩ＝５）に感染させ、タンパク質フリーの培地で１７時間培養した。その後、培養上清は収集され、遠心分離（ウイルス粒子は２０％のショ糖クッション遠心分離によりペレット化された）によって清澄された。感染したＢＨＫ細胞からのｖＩＬ−１２Ｆ分泌を評価するために、清澄前及び清澄後の上清及びウイルス・ペレットのサンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、続いてクーマシー・ブルーで染色され（図２９Ａ）、ＩＬ−１２ｐ４０固有のｍＡｂでウエスタンブロット分析が行われた（図２９Ｂ）。ＶＳＶΔＧ−ＩＬ−１２Ｆに感染した細胞からの事前に清澄化された上清（図２９Ａ、レーン１）は、ｖＩＬ−１２Ｆの予想されたサイズ（およそ７０ｋＤａ）に相当する追加のバンド（ダブレット）と同様に、Ｇタンパク質以外の全てのＶＳＶタンパク質の存在を明らかにする。ウエスタン分析は、この顕著な７０ｋＤａのバンドが確かにｖＩＬ−１２Ｆ（図２９Ｂ、レーン１）であることを確認した。上清からウイルス（図２９Ａ，レーン２及び３、図２９Ｂ，レーン２）を取り除かれると、清澄された上清に残る唯一の検知可能なタンパク質はＩＬ−１２Ｆであった。ウイルス・ペレットの分析は、組み換え型ＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆゲノム（Ｌ、Ｎ及びＰ、及びＭ）によってエンコードされたウイルスタンパク質のそれぞれが容易に検知できることを明らかにしたが（図２Ａ、レーン４）、ｖＩＬ−１２Ｆ（図２９Ａ、レーン４、及び図２９Ｂ、レーン３）の検知できる量はない。予想通りに、ＶＳＶ Ｇタンパク質（ウイルスの感染力に必要となる表面の糖タンパク質）に対応するバンドが検知できなかったことはさらに指摘されるべきである。これらの結果は、大量のｖＩＬ−１２ＦがＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆに感染したＢＨＫ細胞から生産、分泌され、清澄された培養上清のタンパク質含有量の＞９５％が、ｖＩＬ−１２Ｆであったことを明白に示す。
【０２２８】
《実施例１０》
ＩＬ−１２Ｆを発現する組み換え型ＶＳＶ−ΔＧは、リステリア感染に対する抗原特異反応を促進する。
【０２２９】
〈材料及び方法〉
雌のＣ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウスは、ジャクソン研究所（Bar Harbour, ME）から得られた。各実験では、マウスの年齢を一致させ、８〜１６週齢のマウスを使用した。マウスは、食事と水を備えた、任意の市販されている実験用のマイクロ・アイソレーター・ケージに収容した。
【０２３０】
抗体に対する特異性およびソースは次の通りである。ＰＥと複合したアンチ・ＣＤ５（クローン５３．７．３、ｒｅｆ（５３）参照）及びアンチ・ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、ｒｅｆ（５４）参照）、ＦＩＴＣを複合したアンチ・ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２、（５５）参照）、アンチ・ＴＣＲβ鎖（クローンＨ５７−５９７、ｒｅｆ（５６）参照）、アンチ・γδ ＴＣＲ（クローンＧＬ３、ｒｅｆ（５７、５８）参照）、アンチ・ＣＤ４（クローンＲＭ４−５、ｒｅｆ（５９）参照）、及びアンチ・ＣＤ８（クローン５３−６．７、６０参照）抗体。全てのアイソタイプの対照抗体は、商業的に得られた（Pharmingen、 San Diego、 CA）。また、アンチ−ＩＦＮ−γ ハイブリドーマ Ｒ４−６Ａ２（American Type Culture Collection又はATCC、Rockville、MD、ATCC #HB170）、Rockville、ＭＤ（６１）及びＸＭＧ１．２（６２）は、ＤＮＡＸ社（Palo Alto、 CA）によって提供された。また、アンチ・マウスＩＬ−１２ハイブリドーマＣ１７．８．２０．１５は、Dr. G. Trinchieri（Wistar Institute、 Philadelphia、 PA）によって提供された。研究所のセル・ラインで作成されたｍＡｂは、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇアフィニティー・クロマトグラフィー（６３）によって、培養上清から精製された。精製された抗体は、ＥＬＩＳＡ分析に使用するために、標準的な技術を用いて、ビオチンと直接的に結合された（６３）。
【０２３１】
個々の抗原／サイトカイン混合物の成分、及び使用された免疫付与スケジュールは、結果の欄に記載する。全ての注入量は、エンドトキシンフリーのＰＢＳを使用して、総体積が１ｍｌとなるように準備され、腹腔内に投与された。これらの研究で使用されるラットのｒＩＬ−１２はGenetics Institute（Andover, MA）から受け取ったものであった。
【０２３２】
実験用のリステリア・モノサイトゲネスを感染させるのは、亜致死量（目標投与量：６×１０３）の生存Ｌモノサイトゲネス菌株４３２５１（ＡＴＣＣ）を、複腔内注入することによって行った。マウスは、生菌のＬモノサイトゲネス（Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪラットに対して、目標投与量：４〜６ｘ１０５、約１０ｘＬＤ５０）を複腔内注入により大量投与することによって感染する。注入に使用されるリステリア菌は、通気を備えた３７℃の脳心臓注入（brain heart infusion: BHI）培養液（Difco Laboratories、 Detroit、 MI）中で一晩培養された。バクテリアは、ＰＢＳ中で３回洗浄され、濃度はＢＦ１１寒天プレート上のコロニー数をカウントする光学濃度法によって測定された。加熱死菌されたリステリア菌（Heat-killed Listeria monocytogenes: HKLM）は、バクテリアを８０℃で１時間培養することにより作成された。加熱死菌された試料は、ＢＨＩ寒天プレート上で、生存していないことが検査された。バクテリアは、死滅させる前に３回洗われ、ＬＰＳフリーのＰＢＳ中で再懸濁された。
【０２３３】
溶解性リステリア・タンパク質（Soluble listerial protein: SLP）は、前述した（６４）のようにして作成された。簡単に言えば、Ｌモノサイトゲネスは、ＢＨＩ培養液中で、３７℃で一晩培養された。そして、バクテリアは遠心分離によってペレット化され、ＰＢＳ中で洗浄され、少量のＰＢＳ中で再懸濁された。その後、懸濁液は超音波処理され、微粒子は遠心分離によってペレット化された後廃棄され、上澄みは、ＰＢＳに対して透析された。その後、上澄みは、等密度勾配遠心分離によって塩化セシウム上に結合され、破片を含むタンパク質は同定され、収集され、ＰＢＳに対して透析された。
【０２３４】
腹腔滲出細胞（ＰＥＣ）は、０．０６％ＢＳＡ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝溶液（Irvine Scientific, Santa Anna, CA）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを追加したＢＢＳＳでの腹腔洗浄によりマウスから得られた。免疫化群の全てのマウスからの細胞は、プールされた。マクロファージは、３７℃で２時間、１００ｍｍの組織培養処置されたプレート（Coming Inc., Corning, NY）内でＰＢＣ（４ｘ１０６／ｍｌ／ウェル）を培養することによって単離された。非接着細胞は、除去及びプールされ、形成性非接着腹腔滲出細胞（ＰＮＡ）と呼ばれる細胞集団になった。腹腔洗浄に続いて、無菌解剖によって脾臓が除去された。
【０２３５】
ＰＮＡは、培養培地（１０％ＦＣＳ、５ｘ１０−５Ｍの２−ＭＥ、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝溶液、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０）中に懸濁され（１．５ｘ１０６／ｍｌ）、種々のインビトロ刺激薬が２４ウェルプレート（Corning Inc., Corning, NY）に所定の最適用量（図の説明に示されている）で加えられた。刺激薬インビトロとして用いられる試薬には、シグマケミカル社（Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO））から購入できるＣｏｎ Ａ（２μｇ／ｍｌ）と、ＢＫＬＭ（１０７／ｍｌ）と、ＳＬＰ（８μｇ／ｍｌ）とがある。細胞培養物は、３７℃で２４時間培養され、その後、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ定量分析で使用するために上清が冷凍され（−２０℃）、保存された。
【０２３６】
ＩＬ−２は、上述のバイオアッセイ（６５，６６）を用いてＰＮＡ培養上清で定量された。簡単に言えば、ＰＮＡ培養物からの上清は、全量２００μｌの培養培地において１ｘ１０４ＨＴ−２細胞（ＩＬ依存Ｔ細胞株）と共に９６ウェル組織培養プレートに移され、３７℃で培養された。培養の２４時間後に［３Ｈ］チミジン（１μｇＣｉ／ウェル）が加えられ、細胞は、Filtermateセルハーベスター（Packard Instrument Co., Inc., Downers Grove., IL）を使用してガラス繊維フィルタに６〜１８時間後に採取され、マトリックス９６００直読型ベータカウンタ（Matrix 9600 Direct Beta counter）（Packard Instrument Co.）を使用してカウントされた。上清のＩＬ−２濃度は、種々の濃度のＩＬ−２を含むウェルから作成される標準曲線に関連がある。ＩＬ−２標準物質の源はＰ８１５−ＩＬ−２（６７）培養物から得られる上清であり、この上清のＩＬ−２濃度は、ヒトのｒＩＬ−２の既知の濃度（ワシントン州シアトルのイミュネクス社（Immunex. Corp）提供）と比較して前述の分析を用いて測定された。通常、この分析は約５００Ｕ／ｍｌに対して線形であり、検出下限界は約５Ｕ／ｍｌであった。全ての分析は３回実施され、結果は三重反復サンプルの平均（＋／−ＳＤ）として報告された。
【０２３７】
Cherwinskiらの文献（６２）に記載されているように、ＩＦＮ−γはサンドイッチＥＬＩＳＡ分析を用いてＰＮＡ培養上清で測定された。Ｒ４−６Ａ２は捕獲抗体として働き、ビオチン化ＸＭＧ１．２は検出抗体として働く。ビオチンシグナルを増幅するためにストレップアビジン−ペルオキシダーゼ（StrepAvidin-peroxidase）（Sigma Chemical Co.）が用いられ、分析を現像するために現像緩衝溶液（６００μｇのＡＢＴＳ及び０．０２％の過酸化水素を含む５０ｍＭクエン酸緩衝溶液）が用いられた。４０５ｍｎでの吸光度は、SpectraMax３４０自動プレート読取器（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を用いて読み取られた。上清中のＩＦＮ−γ濃度は、種々の濃度のマウスｒＩＦＮ−γ（Genzyme Corp., Cambridge, MA）が捕獲されるウェルから作成される標準曲線に関連がある。通常、分析は約１２０Ｕ／ｍｌに対して線形であり、検出下限界は約８Ｕ／ｍｌであった。全ての分析は３回実施され、結果は三重反復サンプルの平均（＋／−ＳＤ）として報告された。
【０２３８】
フローサイトメトリーは、前述のように実施された（６８，６９）。簡単に言えば、ＰＮＡ（１〜５ｘ１０５）は、２５μｌの所定最適濃度の蛍光色素抱合ｍＡｂを用いて氷上で３０分間培養され、３％ＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳで２回洗浄され、ＰＢＳ中で１％パラホルムアルデヒドを用いて固定された。サンプルは、分析のためにリンパ球集団を選択するべくゲーティングする前方散乱／側方散乱を用いてＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA）で分析された。各テスト抗体に対する背景免疫蛍光レベルを決定するために、アイソタイプ対応対照Ｉｇが用いられた。
【０２３９】
〈結果〉
リステリア症のマウスモデルは、十分に確立されており、細胞仲介性の免疫反応のメカニズムを研究するために利用可能な最もよく知られているシステムである。致死量以下の生存可能なリステリアに感染したマウスが迅速に感染をクリアし、長寿命の防御リステリア免疫が残されることは文献にも示されている（７０−７２）。対照的に、マウスに高投与量の生存可能なリステリアを接種すると、結果的に、２〜４日間で脾臓及び肝臓における細菌の無制御複製によって特徴付けられるような全身感染が生じ、感染後４〜１０日の間に死に至る（７１，７３）。脾臓及び肝臓における細菌の数はマウスの免疫状態と、反比例しているので、感染から２〜４日後にこれらの器官でリステリアを数え上げることは、リステリア感染に対するマウスの感受性を決定する一般的に認められた方法である（７４）。リステリアに対する特異的後天免疫は、感受性が高いマウスにおいて観察される細菌負荷と比較して、脾臓又は肝臓における細菌負荷における２〜４ｌｏｇ１０減少によって特徴付けられる。ＨＫＬＭ（及び他のリステリアサブユニット製剤）は単独で投与されたときに免疫抗原性が十分でないことが知られているが（７５，７６）、そのような抗原を有効なアジュバントと同時投与すれば防御免疫反応を生じさせ得ること（６８，６９，７７）に留意することも重要である。従って、細胞性免疫の研究のためのモデルとしての有用性に加えて、リステリア症のマウスモデルは、ワクチン製剤又は免疫療法の有効性を評価するための優れたモデルでもある。
【０２４０】
ｖＩＬ−１２Ｆのアジュバント活性を高めるために、PBS、109 HKLM/10μg SLP (LMAg) + PBS、LMAg + 0.5μg rIL12、LMAg + 0.5μg vIL-12F、又はLMAg + 5.0μg vIL-12Fのいずれかで、０、５、及び１５日目にC3HeB/FeJマウス（５／群）を免疫化した。２０日目に、マウスは屠殺処分され、分析のために組織が収集された。ＰＥＣが洗浄によって収集され、プールされ、ＰＮＡ集団が調製され、ＰＮＡが所定の最適用量で３７℃、２４時間、一連の刺激（培養培地：それ以上の刺激なし、Ｃｏｎ Ａ：多クローン性Ｔ細胞刺激装置、ＢＫＬＭ又はＳＬＰ：リステリア抗原調製）によってインビトロ再刺激された。免疫反応性の１つの指標として、これらの培養物から得られた細胞不含上清が分析され、示されたインビトロ刺激に反応してＴ細胞によって産出されるＩＬ−２（図３０Ａ）及びＩＵＮ−γ（図３０Ｂ）が定量された。
【０２４１】
以前の研究（６８，６９，７７）において観察されたように、LMAg + rIL-12（陽性対照）で免疫されたマウスは、致死「免疫」量以下の生存可能なリステリアに感染したマウスによって産出されるものに類似したリステリア抗原特異的Ｔ細胞を産出した。また予想通りに、ＰＩＢＳ単独又はLMAg + PBS（陰性対照）で免疫されたマウスは検出可能なリステリア特異Ｔ細胞反応を開始できなかった。LMAg + 0.5μg vIL-12F又はLMAg + 5.0μg vIL-12Fのいずれかのワクチン製剤を受容したマウスからのＴ細胞の反応性のパターンは、LMAg + rIL-12（陽性対照）群からのＴ細胞によって産出されるパターンに酷似していた。それに加えて、これら２つのテスト群によって引き起こされる反応は、いくらかｖＩＬ−１２Ｆ投与量に依存しているように見えた。高投与量のｖＩＬ−１２Ｆと共にＬＭＡｇを受容したマウスから得られるＴ細胞は、リステリア抗原による刺激インビトロに続いて大量のＩＬ−２及びＩＦＮ−γを産出した。これらの発見は、各免疫化群からのマウスの相対的な脾臓サイズによって示唆される免疫刺激の一般状態と関連していた。２つの陰性対照処置群（ＰＢＳ、LMAg + PBS）と比較して、ＬＭＡｇ及びｖＩＬ−１２Ｆで免疫された各マウスのみならず、陽性対照マウス（LMAg + rIL-12）の各々に脾臓サイズの劇的な増加が観察された（データ表示せず）。さらに、ＬMAg + 5.0μg vIL-12Fを受容したマウスにおいて観察された脾腫が低用量のｖＩＬ−１２Ｆ（LMAg + 0.5μg vIL-12F）を受容したマウスよりさらにはっきりしていたので、ｖＩＬ−１２Ｆ投与量依存反応は明白であった。これらの結果は、非免疫抗原性抗原鉱物油への免疫反応性を促進する能力の点でｖＩＬ−１２Ｆが天然のｒＩＬ−１２と類似していることを示す。
【０２４２】
ＬＭＡｇ及びｖＩＬ−１２Ｆで免疫されたマウスの免疫状態の更なる尺度として、フローサイトメトリー分析が実施され、各免疫された動物の腹腔キャビティ（ＰＮＡ）における細胞集団レジデントを特徴付けた。抗ＣＤ５及び抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０で二重染色されたＰＮＡの分析は、ＬＭＡｇ、及びｒＩＬ−１２又はｖＩＬ−１２Ｆのいずれかで免疫されたマウスにおいてCD45R/B220+（Ｂ細胞）及びCD5lo/B220lo（Ｂ１ Ｂ細胞）の減少と同時に起きるＣＤ５＋細胞（Ｔ細胞）の細胞周期の著しい増加（３〜４倍）を明らかにした（陰性対照免疫化群から得られるマウスにおいて観察される細胞周期と比較して；図３１Ａ及び３１Ｃ）。これらの動物のＣＤ３＋腹腔細胞集団をさらに特徴付けるため、ＰＮＡは、抗ＣＤ３と、抗αβＴＣＲ、抗γδＴＣＲ、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８のいずれかで二重染色され、フローサイトメトリー分析が行われた（図３１Ｂ）。ＣＤ５染色パターンに観察されたのと同様に、ＬＭＡｇ、及びｒＩＬ−１２又はｖＩＬ−１２Ｆのいずれかを受容した動物においては、陰性対照製剤（図３１Ｂ及び３１Ｄ）を受容したマウスにおけるものと比べて、腹腔リンパ球集団内のＣＤ３＋細胞周期が劇的に高かった（３〜４倍）ことをＣＤ３染色パターンは明らかにした。それに加えて、ＬＭＡｇ、及びｒＩＬ−１２又はｖＩＬ−１２Ｆのいずれかを受容したマウスは、αβTCR+/CD4+細胞の腹腔細胞周期の選択的増加を経験した（それぞれ図３１Ｅ、３１Ｆ）。ここで報告された結果は、ＬＭＡとｖＩＬ−１２Ｆの同時投与によって誘発される腹腔細胞周期の変化がLMAg + rIL-12処置によって誘発される変化をそっくりに真似ることを明らかにした。さらに、最近のレポートにおいて、LMAg + rIL-12（陽性対照）を受容したマウスが直面する腹腔細胞周期の変化は、以前観察及び報告されたもの（６８，６９，７７）と一致する。
【０２４３】
《実施例１１》
LMAg + vIL-12Fと比較した長寿命の防御リステリア免疫の投与。
【０２４４】
〈材料及び方法〉
免疫化／感染宿受容者からの無菌除去の後、各脾臓／肝臓は、すりガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズされた。細胞は、細胞内細菌を放出するために、０．５％のトリトンＸ−１００（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を含む全量１０ｍｌのＰＢＳで処置することによって分裂された。各サンプルの連続１０倍希釈溶液が作られ、各希釈溶液の１００μｌがＢＨＩプレート上に均一に拡散され、これらの器官における生リステリアを定量した。
【０２４５】
〈結果〉
ＡＬ−１２Ｆを典型的な非免疫抗原性抗原と同時投与することで防御免疫反応をｃｏｎｆｅｒすることが可能かを決定するために、０、５、１５日目に、Ｃ３Ｈｅｂ／ＦｅＪマウス（５／群）が、ＰＢＳ単独、LMAg + PBS、5.0μg VIL-12F + PBS、LMAg + 0.5μg vIL-12F、又はLMAg + 5.0μg vIL-12Fのいずれかで免疫された。追加された群のマウスは、単回投与の致死量以下（６ｘ１０３／マウス、又は０．１２ｘＬＤ５０）の生存可能なリステリア（リステリア感染した；陽性対照）を０日目に受容した。この群のマウスは、その後のリステリア症から回収する典型的な後天免疫に対するベンチマークに用いられた。４５日目に、マウスは致死量の生存可能なリステリア（６．４ｘ１０５又は１２．９ｘＬＤ５０）で（腹腔内の）感染した。マウスは４９日目に殺処分され、各マウスの脾臓（図３２Ａ）及び肝臓（図３２Ｂ）での細菌負荷が決定された。LMAg + 5.0μg vIL12Fを受容したマウスの器官に観察された細菌負荷は、ＰＢＳ対照群と比較して劇的に減少した（脾臓及び肝臓でそれぞれ２．７２、４．１２ ｌｏｇ１０減少）。実際、これらの結果は、動物の脾臓及び肝臓における細菌負荷がそれぞれ３．９８、２．９３ ｌｏｇ１０減少を経験したような免疫量の生存可能なリステリア（陽性対照群）を受容した動物において観察されるものと類似していた。これらの結果は、LMAg + 5.0μg VIL-12Fで免疫化されたマウスが防御リステリア特異免疫反応を引き起こすことを示す。LMAg + 0.5μg vEL-12Fでの免疫化は、各動物の脾臓及び肝臓における細菌負荷の中程度の減少（それぞれ１．４１、２．９０ ｌｏｇ１０減少）によって証明されるように、部分的に防御免疫反応を促進するようにみえる。予想通り、LMAg + PBS（それぞれ０．３７、０．４５ ｌｏｇ減少）又はvIL-12F + PBS（それぞれ０．０８、０．５６ ｌｏｇ１０減少）で免疫化されたマウスの脾臓及び肝臓では、細菌負荷の減少は殆ど又は全く見られなかった。この実験において観察される防御免疫（及びｖＩＬ−１２Ｆ投与量依存反応）は、LMAg + vIL-12Fで免疫されたマウスにおけるリステリア特異Ｔ細胞の存在（再刺激された腹腔リンパ球インビトロによるＩＬ−２及びＩＦＮ−γ産出によって示される；図３１）とよく関連していた。
【０２４６】
LMAg + vIL-12Fでの免疫化によって与えられた防御免疫が長寿命であったかを決定するために、０、５、１５日目に、C3Heb/FeJマウス（５／群）がLMAg + 5.0μg v1L-12F又は適切な対照製剤で免疫された。追加群のマウスは、単回投与の免疫量（６ｘ１０３／マウス又は０．１２ｘＬＤ５０）の生存可能なリステリア菌（リステリア感染した；陽性対照）を０日目に受容した。最後の追加免疫が投与されてから３カ月又はそれ以上後で（１２０日目）、各マウスは（腹腔内の）、大量感染（３．８ｘ１０５／マウス又は７．６ｘＬＤ５０）の生存可能なリステリアを受容した。その４日後（１２４日目）、マウスは処分され、リステリア菌に対する感受性の１つの指標として各マウスの脾臓及び肝臓における細菌負荷が定量された。上述の短期的防御免疫試験（図３３）で観察された結果と同様に、LMAg + vIL-12F（それぞれ１．８４、２．２３ ｌｏｇ１０減少）又は免疫量の生存可能なリステリア（それぞれ２．５５、１．６１ ｌｏｇ１０減少）のいずれかで免疫されたマウスの脾臓及び肝臓で細菌負荷の劇的な減少（ＰＢＳ処置群と比較して）が観察されたが、ＬＭＡｇ又はｖＩＬ−１２Ｆのいずれか単独で免疫されたマウスの場合には観察されなかった（図３３）。これらの結果は、致死量以下のリステリアでの感染により誘発されたものと同様に、LMAg + vIL-12Fでの免疫化が長寿命の防御免疫を与えることを実証する。
【０２４７】
《実施例１１》
ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄは、インビトロでＣ６グリオーマに対して強い細胞毒性活性を示す。
【０２４８】
〈材料及び方法〉
Ｃ６グリオーマ細胞株（American Type Culture Collection, Manassas, VA）は、１５％の熱失活したウマ血清と、２．５％の熱失活したウシ胎児血清と、１００ｉ．ｕ．／ｍｌのペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンとを補充したＨａｍｓ／Ｆ１２において３７℃、５％のＣＯ２で単層培養として維持された。Ｃ６グリオーマ細胞株は、増強された視覚分析を可能にするべく緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するｐＦＢレトロウイルス（Stratagene, La Jolla, CA）で安定に形質導入された。ＧＦＰで安定に形質導入された細胞は、高レベルのＧＦＰを均一に発現する細胞集団を作成すべくフローサイトメトリーを用いて選別された。スライス培養物への接種のための細胞を作成するために、指数関数的に成長する細胞は、ＥＤＴＡ／トリプシンによって３７℃で５分間採取された。トリプシン処理は上述の完全培地で終了され、細胞は１，０００ＲＰＭで５分間遠心された。ペレットは、無菌リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁され、トリパンブルー染色法を用いて計数された。ペレットはその後３ｘ１０４細胞／μｌの濃度でＰＢＳ中に再懸濁され、スライス培養物に接種するで氷上に置かれた。
【０２４９】
ウイルス感染をリアルタイムで追跡するため、有色イソギンチャク（sea anemone-Discosoma sp.（BD Biosciences-Clontech））由来の市販されている色素タンパク質である赤色蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄに対してｃＤＮＡを発現するようなｒＶＳＶを作成した。ＤｓＲｅｄタンパク質のためのｃＤＮＡは、親プラスミドから切除され、前述（３）のpVSV-ΔG-GSHA/GFPへの親ベクターである、pVSV-MCS 2.6の複数のクローニング部位にサブクローニングされた。結果として得られる組換えウイルスｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄは、我々の実験室で予め確立され他に記載された標準手順（７８）を用いて回収され、特徴付けられた。ｒＶＳＶ−ΔＧ−ＤｓＲｅｄを構成するために、Ｌ遺伝子の上流に位置するpVSV-ΔG-PL 31の複数のクローニング部位にＤｓＲｅｄに対するｃＤＮＡをサブクローニングした。組換えウイルスrVSV-ΔG-DsRedは、先に述べた方法論（３）を用いて回収された。ΔＧ−ＤｓＲｅｄはウイルス性糖タンパク質をエンコードしないので、ウイルスは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を過渡的に発現する細胞内で増殖される。従って、細胞の感染は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質補充ウイルスを利用する。
【０２５０】
Ｃ６グリオーマ細胞は、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μｇのストレプトマイシン、１５％のウマ血清と、２．５％のウシ胎児血清とを補充した全量１００μｌのＨａｍｓ／Ｆ１２培地において、３０％、６０％、９０％の密集度で９６ウェル平底プレートに３通りにプレーティングされた。細胞は、付着を可能にするために３７℃で一晩培養された。培養物は、種々の量（１０１〜１０５ｐｆｕ）のｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄを接種された。ウイルス接種材料の追加に続いて、感染から４、８、２４、３６、４８、７２、９６時間後に細胞価９６Ｒ非放射性細胞増殖分析（CellTiter 96R Non-Radioactive Cell Proliferation assay（G5421, Prornega, Madison, WI））を用いて細胞死が分析された。この分析では、化合物ＭＴＳ［（４，５−ジメチルチアゾ−ル−２−ｙｌ） （３−カルボキシメトキシフェニル） （４−スルホンフェニル） ２Ｈ Tetrozolium］は２０：１の比で電子結合試薬フェナジンメトサルフェートと混合され、９６ウェルプレート培養物に加えられる。ＭＴＳ試薬は、代謝的に活性な細胞においてデヒドロゲナーゼ酵素によって生細胞によって水溶性ホルマザンに変えられる。従って、生細胞の数は、４９０ｎｍで読み取られるホルマザン生成量に正比例する。各時点で培養物に存在する生細胞の割合は、Lab Systems Multiskan Biochromatic Elisaプレートリーダー（Vienna, Virginia）を用いて、各条件に対するＭＴＳ分析からの４９０ｎｍでの絶対値を未処置の対照細胞と比較することによって計算された。記載されている全ての値は、３つのデータポイントの平均を表す。
【０２５１】
〈結果〉
Ｃ６−ＧＦＰグリオーマ細胞が、ＤｓＲｅｄをエンコードするｒＶＳＶ−ｗｔによる感染に感受性が高いことを確認するために、６ウェルディッシュで成長させた細胞を１０１〜１０５ｐｆｕの量のウイルスに感染させた。図３３は、１０５ｐｆｕでのＣ６グリオーマの感染の経時変化を示す。殆どの細胞は、ＶＳＶ感染の特徴的な細胞変性効果、即ち感染後２４時間以内の細胞ラウンディング（cell rounding）及び細胞死を示した。９５％以上の細胞は４８時間以内にディッシュを外した。より低いウイルス性の接種材料に感染しても類似の細胞変性効果が生じるが、速度は遅い（データ表示せず）。これらの結果は、Ｃ６グリオーマ細胞がｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄによる感染に感受性があることを示している。
【０２５２】
Ｃ６グリオーマに対するＶＳＶの細胞毒性の程度をよりよく定量化し、経時変化をより特異的に画定するために、インビトロ細胞毒性分析を用いた。Ｃ６−ＧＦＰグリオーマ細胞は、３０％、６０％、９０％の密集度で９６ウェル平底プレートにプレーティングされ、１０１〜１０５ｐｆｕの種々の量（１０１〜１０５ｐｆｕ）のｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄに感染させられた。接種から４、８、２４、３６、４８、７２、９６時間後に細胞価非放射性細胞増殖分析を用いて細胞死が分析された。図３３に示されるように、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄは、ウイルス価とは関係なく７２時間以内におよそ９０％の細胞死となった。結果は、細胞が３０％及び６０％の密集度でプレーティングされたときと同様であった（データ表示せず）。要約すれば、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄは、細胞密度及びウイルス接種材料の量とは関係なく、ラットＣ６−ＧＦＰグリオーマに対して良好なインビトロ細胞溶解活性を示した。
【０２５３】
《実施例１３》
ＶＳＶベースの抗グリオーマ治療の有効性及び毒性を研究するための器官型スライスＣ６−ＧＦＰ共培養系
〈材料及び方法〉
器官型脳スライス培養法は、Plenz and Kitai（７９）によって紹介された方法を改変したものである。１〜２日齢のＳＤラットの幼体が断頭され、脳が迅速に除去され、０．５％デキストロースを含むゲイ緩衝塩類溶液（G9779, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）中に４℃で維持された。ゲイ／デキストロース溶液内で、線条体及び黒質では５００μｍ、皮質では４００μｍの冠状薄片がビブラトーム上で作製された。関心のある領域を有する薄片は、解剖顕微鏡下で切断された。皮質、線条体及び黒質緻密部の領域は、０．５〜１ｍｍのサイズに解剖され、ミリセル培養インサート（PICM03050, Millipore Corp., Billerica, MA）上に引き続いて載置され、カバーグラス上で１０μｌのニワトリ血漿（P3266, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）に浸された。インサート上に注意深く組織を並べた後、１０μｌのゲイ／デキストロース溶液に溶解した０．５ユニットのウシトロンビン（T6634, Sigraa-Aldrich Corp St. Louis, MO）を加えてカバーグラス上でニワトリ血漿と混合した。組織を載置したカバーグラスは、次に培養チューブ（156758, Nalge Nunc International, Rochester, NY）内に入れられ、各チューブに７５０μｌの培養用培地が加えられた。この培養用培地の成分は（全てInvitrogen Corp., Carlsbad, CAから得られる）、５０％のイーグルの基礎培地（ＢＭＥ）（２１０１０−０４６）、２５％のハンクス液（ＨＢＳＳ）（２４０２０−１２５）、２５％のウマ血清（２６０５０−０７０）、１ｍＭのＬグルタミン（２５０３０−０８１）、及び０．５％のデキストロース（１５０２３−０２１）である。チューブは次に、０．５ＲＰＭの速度で回転させられる回転ラック上で３５℃で培養された。培養物から７２時間後、培養培地に、各々４．４μＭのシトシン−α−Ｄ−アラビノフラノシド（arabinofaranoside）と、ウリジンと、５−フルロ−２’−デオキシウリジンとからなる細胞分裂阻害混合物が加えられた。これは２４時間後に取り除かれ、７５０μｌの新鮮な培地と交換された。培養培地は、その後、週に２回、完全に交換された。薄片は、３週間後に、培養液中で実験に用いられた。スライスＣ６−ＧＦＰグリオーマ共培養を作成するために、１５０，０００ＧＦＰ陽性Ｃ６ラットグリオーマ細胞が５μｌ、無菌条件下で薄片に接種された。培養チューブは、培地なしでインキュベータ内に水平に３０分間置かれた。培養培地は次に交換され、チューブはさらに２時間水平位置に残され、その後、回転ラック上での回転が再開された。培養物中のＧＦＰ陽性Ｃ６グリオーマ細胞の成長はオリンパス蛍光顕微鏡を用いて可視化され、画像はデジタル・カメラを用いて収集された。
【０２５４】
少なくとも３週間培養物中で成長した、Ｃ６−ＧＦＰグリオーマ細胞を有するか或いは有しない脳スライス培養物は、１０４プラーク形成単位（ｐｆａ）のｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄ又は１０６感染単位（ＩＵ）の感染性ＡＧ−ＤｓＲｅｄウイルスに感染した。ウイルスは、回転ラック上で３７℃、５時間、薄片に吸着された。接種材料はｔｈｅｎ取り除かれ、薄片は培地内で洗浄され、新鮮な培地が薄片に加えられた。薄片は、その後さらに３日間培養された。ＩＦＮ−βを受容する薄片の場合、薄片は、ウイルス感染の１８〜２０時間前に１，０００ＵのラットＩＦＮ−βで前処置された。ウイルスはその後、上述したようにＩＦＮ−βの存在下で吸着された。接種材料は、５時間後に、１，０００ＵのＩＦＮ−βを含む新鮮な培地と交換された。
【０２５５】
薄片は、２時間、リン酸緩衝溶液中で４％パラホルムアルデヒドを用いて固定され、組織がスライドグラスに載せられる前にリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄された。培養された組織は、高温のプレート上で短時間に乾かされ、後で使用するために４℃で保存した。免疫組織化学は、以下の手順で実施された。スライドグラスは、ＰＢＳ中で短時間に洗浄され、３％水素ペルオキシダーゼ及び１０％メタノールで２０分間処置された後、ＰＢＳで３回洗浄され、ＰＢＳ中で２％脱脂乳及び０．３％トリトン−Ｘ中で１時間培養され、室温で一晩、３％のロバ血清及び０．１％のトリトン−Ｘを用いてマウス抗微小管関連タンパク質２（MAP-2, 1:500, M-4403, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）又はマウス抗チロシンヒドロキシラーゼ（TH, 1:1,000, NLkB318, Chernicon International, Temecula, CA）中で培養され、ＰＢＳで３回洗浄され、暗所にて室温で４時間、２％ロバ血清及び０．１％のトリトン−Ｘを用いてＣｙＴＭ２又はＣｙＴＭ３抱合AffiniPureロバ抗マウスＩｇＧ（1:250, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA）中で培養され、ＰＢＳで３回洗浄され、エタノールを用いて脱水され、キシレンで除去され、ＤＰＸマウンティング培地（445 8 1, Fluka Biochemika）内でカバーグラスに載置された。ＭＡＰ−２及びＴＨ免疫活性はＢｉｏ−Ｒａｄ共焦点顕微鏡を用いて可視化され、デジタル画像は関連する共焦点ソフトウェアを用いて収集された。薄片におけるウイルス感染の範囲は、蛍光顕微鏡を用いて以下のＤｓＲｅｄ発現により可視化された。
【０２５６】
〈結果〉
器官型脳スライスグリオーマ共培養（図３４）は、３週間定着させたものであるが、薄片（図３４Ｂ）における成熟した黒質神経細胞を示す実証可能なＴＨ免疫染色によってプレーティングしてから６〜８週間後まで生存可能である。図３５Ｃは、この器官型スライス培養モデルにおけるベースラインＭＡＰ−２免疫活性を実証し、神経細胞の完全性の高感度指標である非特異神経細胞マーカとして働く（８０）。ＧＦＰを安定に発現しているグリオーマ細胞は、薄片組織において自然に成長し、３〜４日間経過後、Ｃ６グリオーマ接種材料サイズ及び腫瘍細胞成長速度に依って、腫瘍退行に対する治療薬の効果及び薄片の完全性を含む薄片グリオーマ細胞生物学の種々の面が研究され得るような蛍光顕微鏡検査（図３４Ｄ及びＥ）がリアルタイムで行われた。
【０２５７】
野生型ＶＳＶは、スライス培養系における正常な組織への毒性がある。ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄは、赤色蛍光タンパク質を発現し、従って、Ｃ６グリオーマ細胞と識別できるＧＦＰ（緑色）蛍光からのシグナルを作成する。これは、リアルタイムでスライス培養物のウイルス感染中に続けて起こった。ＤｓＲｅｄに対する遺伝子は、ＶＳＶゲノムにおいてＧ遺伝子とＬ遺伝子の間に導入された。Ｇ遺伝子とＬ遺伝子の間に追加の異種遺伝子を挿入しても、ウイルスの細胞溶解性、特性又は複製効率に何ら影響を与えなかった（８１）。感染に続き、ＭＡＰ−２発現に対する免疫組織化学的染色によってスライス培養物が検査された。ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄは薄片を容易に感染し、３日目までに薄片の殆どの細胞は、組織に見られる赤色蛍光によって示されるように感染した（図３５Ａ）。驚くことではないが、感染した薄片に対するＭＡＰ−２免疫染色は不良であって、これは神経細胞組織の完全性が失われたことを示している（図３６Ａ）。従って、複製コンピテント野生型ＶＳＶは神経細胞組織にかなり細胞変性であり、それゆえ、腫瘍細胞破壊性因子として適用する際にはその毒性から正常な組織を保護するために抗ウイルス性因子の使用を必要とすることになる。
【０２５８】
ＶＳＶは、ＩＦＮ−βの抗ウイルス性効果に高い感受性があることが知られている。種々の系列の悪性細胞は、ＩＦＮシグナル伝達経路に１若しくは複数の欠損を有する（８２，８３）。これは最近、ＶＳＶ仲介性の細胞溶解活性によって特異腫瘍細胞ターゲティングのために活用されてきており、一方で正常な組織は影響されない（８４，８５）。器官型スライス共培養系は、従って、ＩＦＮ−βによりＶＳＶ感染から保護された正常な神経細胞組織が、培養物においてグリオーマ細胞への毒性を有するかを決定するのに利用された。スライス培養物は、ＶＳＶ感染前に、２つの異なる濃度のＩＦＮ−β（１００Ｕ又は１，０００Ｕ）で２４時間前処置された。１，０００ＵのＩＦＮ−βで前処置された培養物は、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄへの感染が防止された（図３６）。ＭＡＰ−２染色パターンもまた、感染前にＩＦＮ−β処置に続いて劇的に向上したが、これは正常な組織へのＶＳＶ仲介性の細胞毒性の著しい減少を示し（図３７Ｂ）、ＩＦＮ−βの抗アポトーシス機能と一致する（８６）。１００ＵのＩＦＮ−βでの前処置は、高投与量がより保護的ではあるが（データ表示せず）、有益であった。ＩＦＮ−β単独では薄片に対する毒性はなく、複製コンピテント野生型ＶＳＶ（図３７Ｄ）と併せて魅力的な前処置方法を提供する。
【０２５９】
成熟したスライス培養物上で成長したグリオーマ細胞は、かなり大きな腫瘤に成長した。１，０００ＵのＩＵＮ−βで２４時間前処置し、続けてｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄ感染すると、結果的に、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄ（図３６）による正常な組織の感染なしにＣ６−ＧＰＰグリオーマ腫瘍負荷が減少した。従って、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄは、Ｃ６−ＧＦＰ腫瘍を選択的に破壊するようにみえた。興味深いことに、ＩＦＮ−β前処置された共培養においてＶＳＶへの薄片の明らかな感染が殆どないにもかかわらず、異常なＭＡＰ−２染色パターン（図３７Ｃ）によって示されるように薄片は尚も著しくダメージを受けた。このことは、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄは腫瘍細胞を除去するのに効果的であるが、一般的にウイルス性感染に関連するもの以外のメカニズムによって仲介される薄片組織への十分なダメージが尚もあることを示している。
【０２６０】
複製制限的ＶＳＶ−ΔＧは、腫瘍細胞溶解活性における野生型ＶＳＶに類似しているが、器官型スライスグリオーマ共培養系における毒性に関して優れている。ｒＶＳＶ−ΔＧは、第２世代の複製制限的ＶＳＶである。ｒＶＳＶ−ΔＧには、ウイルスのエンベロープタンパク質のためにエンコードする糖タンパク質（Ｇ）遺伝子が欠乏している。ＶＳＶの糖タンパク質（Ｇタンパク質）は、ウイルスのエンドサイトーシスに続くウイルスの細胞への付着及びウイルス性エンベロープのエンドソーム膜との融合を仲介し、そのようなものとしてＶＳＶ感染力が必要とされる。従って、ｒＶＳＶ−ΔＧベクターを増殖するため、ウイルスは、野生型Ｇタンパク質を過渡的に発現する細胞内で成長しなければならない。産出される子孫ウイルスは、ウイルス性エンベロープ（感染性ΔＧウイルス）中に過渡的に発現されたＧタンパク質を含み、正常に細胞に感染することができる。しかし、これらのウイルスのゲノムにはＧタンパク質コード領域が欠乏しているので、Ｇタンパク質を発現しない細胞から放出される子孫ビリオンは非感染性であり、隣接する細胞を再感染できない。従って、ｒＶＳＶ−ΔＧベクターは、単回複製される（即ち複製制限的である）。ｒＶＳＶ−ΔＧを用いる利点は、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄなどの複製コンピテントウイルスによって時間と共に生成されるウイルス粒子の指数関数的増加が回避できることである。スライス培養系における複製制限的ＶＳＶ−ΔＧの毒性をテストするために、ＤｓＲｅｄをエンコードする改良ΔＧウイルス（ΔＧ−ＤｓＲｅｄ）を培養物に接種し、３日後にスライス培養物を検査した。培養物は、感染後の神経細胞の完全性を決定するべくＭＡＰ−２に固定及び染色された。感染性ΔＧ−ＤｓＲｅｄが、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄで見られたのと同様の方法で、２日目までに薄片を容易に感染したことがわかった（図３９Ａ）。興味深いことに、ΔＧ−ＤｓＲｅｄに起因する著しい感染にもかかわらず、ＭＡＰ−２免疫活性は比較的損なわれていなかった（図４０Ａ）。予測したように、薄片がＩＦＮ−βで前処置されたとき（図３９Ｂ）にΔＧ−ＤｓＲｅｄによる感染は殆ど又は全く見られず、ＭＡＰ−２染色は感染していない培養物に見られるものと類似していた（図４０Ｂ）。
【０２６１】
成熟した薄片上で４日間Ｃ６−ＧＦＰグリオーマ細胞を成長させると、大きな腫瘤を産出した。しかし、１，０００Ｕの濃度で２４時間、ＩＦＮ−βで前処置し、その後１０６ＩＵの感染性ΔＧ−ＤｓＲｅｄウイルスを接種すると、ΔＧ−ＤｓＲｅｄウイルスでのｉ培養から３日後に腫瘍負荷が著しく減少することが実証された（図３９）。腫瘍に対する優れた細胞溶解活性にもかかわらず、スライス培養物自体において正常な細胞の感染はあるとしてもほんの僅かであった（図３９Ｄ）。従って、ＩＦＮ−β前処置とその後の感染性ΔＧ−ＤｓＲｅｄへの感染は、正常な組織に感染することなくＣ６−ＧＦＰグリオーマを選択的に破壊した。このことは、ＭＡＰ−２免疫活性の結果（図３９Ｃ）によってさらに実証された。従って、複製制限的ΔＧ−ＶＳＶとＩＦＮ−β前処置を併用することは、グリオーマの処置のための魅力的な併用療法である。
【０２６２】
《実施例１４》
ＶＳＶベースの抗グリオーマ治療の有効性
〈材料及び方法〉
細胞及びウイルスは、刺入可能なガイドスクリューシステム（８７）を用いて適切な解剖学的頭蓋内領域に注入される。５〜７週齢、体重２５０〜３５０グラム、成体、メスのＳＤラットが用いられる。動物は、体重１０ｇ当たり０．１５ｍｇの用量でケタミン／キシラジン溶液（１７ｍｌの生理食塩溶液中にケタミン２００ｍｇ、キシラジン２０ｍｇ）を用いて腹腔内に麻酔される。各ラットの頭部ａｒｅａは、剃毛し、ポビジンヨード（povidine-iodine）で清潔にした。動物は、定位フレームに固定化される。球欠縫合及びブレグマ縫合を位置決めするために動かされた頭蓋外組織によって、長さ約５ｍｍの正中線切開が行われた。ブレグマ縫合に沿って正中線から横向きに３ｍｍの小さな骨孔がドリルで作製される。骨孔に小型カニューレ（Plastics One）が挿入される。リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）単独、又は体積１０μｌのＰＢＳ中に再懸濁された１ｘ１０５ＧＦＰ陽性Ｃ６グリオーマ細胞は、ハミルトンシリンジを用いて５ｍｍの深さに５分間以上注入される。適当な位置に、穴を塞ぐためにカニューレストッパが挿入される。動物は、感染の徴候又は腫瘍成長の結果としての神経欠損がないか毎日観察される。
【０２６３】
１０日間間隔を空けた後、ラットは、無菌ＰＢＳ又はｒＶＳＶ−ＲＦＰを１回して処置される。ｒＶＳＶ−ＲＦＰを投与する時点は、頭蓋内腫瘍の予測サイズを基に選択される。これは、神経画像処理によって腫瘍が検出可能な時であるが重大な神経欠損が生じる前の時点を表すべきである。ラットは、頭蓋内ウイルス投与の前に麻酔される。カニューレを配置するために、以前の切開は再度開かれ、頭蓋外組織は動態化される。ストッパが取り除かれ、１０μｌの量のＰＢＳ又はＶＳＶが投与される。これは、ウイルスを直接腫瘍のベッドに配置する。インビボのＩＦＮ−βは、また、内因性毒性及びＶＳＶ毒性の鈍化の両方に関連して評価される。
【０２６４】
〈結果〉
ＧＦＰ陽性Ｃ６グリオーマ細胞は、予め埋め込まれたカニューレを介してラットの前頭葉へ送られる。所定の培養期間後、腫瘍ベッドにウイルスを送るためにカニューレが用いられる。動物は、分析のための処置後、選択された時点で屠殺される。組織病理学研究は、ウイルスによって引き起こされるＣＮＳ毒性及び腫瘍細胞減量（cytoreduction）の度合いを決定する。さらに、神経欠損や生存などのパラメータは結果を画定するための基準として用いられる。従って、正常な組織に大きなダメージを与えることなく、生きているＣＮＳバックグラウンドにおいて癌細胞を破壊するＶＳＶの能力が実証される。
【０２６５】
腫瘍細胞が感染しかつ子孫ウイルスを放出する際にウイルス負荷の指数関数的増加を引き起こし得るような複製コンピテントウイルスのおかげで、腫瘍を処置するのに１回の投与で十分であることもあり得る。このサイクルは、殆どの腫瘍が破壊されるまで、即ち免疫系が残りのウイルスを無くなる時点まで続き得る。カニューレシステムは、ある期間に複数の投与を可能にするが、それゆえ再投与は腫瘍の根絶のための実行可能な別の行動計画である。
【０２６６】
異なる群間で６０〜１００％の範囲を以って８０％の成功率が報告されているので、ラット頭蓋内グリオーマモデルは一定でない結果を与える可能性がある。免疫不全動物（即ちヌードラット）の使用することで「腫瘍摘出」の成功率を１００％近くまで上げることができ、またその使用を試みることもできるが、一方で、免疫系がこれらの研究に重要な構成要素であり、従って単独では適切な研究モデルにはならないことに留意されたい。免疫担当ＳＤラットを用いた頭蓋内グリオーマモデルの大きなサンプルサイズを用いれば、結果の正確な解釈が可能になるはずである。
【０２６７】
動物は、表４に示すグループに従って割り当てられた。
【０２６８】
【表４】
2005537802.tif 000005
【０２６９】
＊用量又は時点が決定されることになる。＝は腫瘍細胞の初回接種からの時間を示す。∋は分析が行われる時点を示す。Ｈ腫瘍細胞、コントロール Ｒｘ、及びＶＳＶ Ｒｘは１０μＬの量を脳内に投与されることになる。φ IFN α／β前処置を用いたＶＳＶ防御（即ち投与の用量及び時点）が評価され、結果の関数として用量及び時点が得られる。Ｘは、対照群の処置の日数を示し、動物によって示めされる病気の症状に依ることになる。
【０２７０】
脳への直接注入に続くＶＳＶ効果は、ＰＢＳのみの対照と比較される。動物は、脳炎のサイン（嗜眠、栄養不足、体重減、等）をモニターされ、試験的研究の結果から決定された特定の時間の後で屠殺される。組織は、標準手順に従って作成されることになる。ラットは、ヘパリン化生理食塩溶液、続いて４％パラホルムアルデヒドによって、深い麻酔下で経心腔的に灌流される。脳は除去され、４％パラホルムアルデヒドに４℃で２時間  固定された。脳は、クリオスタット上で２０μｍ区域に区切られる。ＶＳＶ感染には直接蛍光顕微鏡検査（Ｎタンパク質特異抗体を用いたＲＦＰ蛍光又は免疫組織化学染色のモニタリング）、基礎神経病理学にはヘマトキシリン＆エオシン染色、腫瘍及び周囲の実質における細胞死にはアポトーシス研究など、脳部分に毒性の徴候がないかを検査するために異なる技術が用いられることになる。著しい腫瘍量を含む対照ラットから得られたデータの例を図４１に示す。
【０２７１】
最初の腫瘍接種から１７日間の培養に続き（ウイルスの投与から７日後）、各研究群内の動物が屠殺され、腫瘍及び周囲の組織の組織病理学的特性が分析される。腫瘍の大きさ、正中線偏位の存在又は不存在、腫瘍ベッドにおける壊死の存在又は不存在などの重要なパラメータが分析される。さらに、周囲の正常な組織は、ウイルスに関連する毒性の徴候がないか詳しく調べられる。腫瘍成長の証拠がないか脳部分の検査が行われるが、これにはＧＦＰのための直接蛍光マイクロコピー、基礎神経病理学のためのヘマトキシリン＆エオシン染色、特異腫瘍抗原に対する免疫細胞化学、及び腫瘍及び周囲の実質における細胞死に対するアポトーシスの研究が含まれ得る。Ｃ６グリオーマ細胞におけるＧＦＰ標識化は、腫瘤の非常に高感度検出及び分析と、接種の原発部位から取り除いた細胞の微生物集団とを可能にする（図４２）。
【０２７２】
本研究の重要な側面は、腫瘍の原発部位を回避した細胞の微生物集団に接近し標的にするＶＳＶの能力である（図４２）。本研究に用いられるＣ６グリオーマ細胞によって行われるＧＦＰ標識は、レーザ走査共焦点顕微鏡を用いて組織部分全体で非常に小さい集団の細胞でさえも検出できるようにし、ラットグリオーマモデルにおけるｒＶＳＶの投与の効果の包括的な実態を示す。
【０２７３】
ｒＶＳＶ投与後のラット生存もまた決定される。ラットは、表５に従ってＰＢＳ又はＶＳＶのいずれかで処置される。
【０２７４】
【表５】
2005537802.tif 000006
【０２７５】
＊用量又は時点は決定されることになる、パイロット実験の,結果。＝は腫瘍細胞の初回接種からの時間を示す。∋は分析が行われる時点を示す。Ｈ腫瘍細胞、コントロール Ｒｘ、及びＶＳＶ Ｒｘは１０μＬの量を脳内に投与されることになる、φ IFN α／β前処置を用いたＶＳＶ防御のための手順はパイロットの結果に基づき進展されることになる。
【０２７６】
動物は、腫瘍が動物を制覇するとき又は動物が生存することが明らかにになるときまでずっと生き残る。そのとき、上述のように全ての動物は屠殺されかつ腫瘍の残遺物が存在するか分析される。ＶＳＶで処置された動物の全体的な生存は、対照と比較して、著しく増加している。
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
【図１】非細胞変性ＶＳＶ変異体を単離するために用いられる方法の概要を示す。
【図２】（Ａ）は、野生型（Ｗｔ）ＶＳＶに感染した細胞の位相差画像を示す。（Ｂ）は、Ｍ遺伝子に変異を含むようなＶＳＶ（ｔｓＯ８２）の温度感性変異体に感染した細胞の位相差画像を示す。（Ｃ）は、ＮＣＰ変異体のために選択に用いられるＭ３３；５１Ａ組換えウイルスに感染した細胞の位相差画像を示す。（Ｄ）は、プラーク精製されたＮＣＰ変異体（ＮＣＰ−１２）の１つに感染した細胞の位相差画像を示す。ＮＣＰ−１２に感染した細胞が集密に成長し、感染していないＢＨＫ細胞（図示せず）と区別不能な形態を有することに留意されたい。
【図３】ＮＣＰ変異体（ＮＣＰ−１２）の１つをクローン化及び配列するために用いられる方法の概要を示す。
【図４】ＮＣＰ変異体をエンコードする組換えウイルスを回収するために用いられる概要を示す。
【図５】（Ａ）は、ｗｔ−ＶＳＶ変異体に感染したＢＨＫ−２１細胞の免疫蛍光及び位相差画像である。（Ｂ）は、ｗｔ−ＶＳＶ変異体に感染したＢＨＫ−２１細胞の免疫蛍光及び位相差画像である。（Ｃ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１変異体に感染したＢＨＫ−２１細胞の免疫蛍光及び位相差画像である。（Ｄ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１変異体に感染したＢＨＫ−２１細胞の免疫蛍光及び位相差画像である。（Ｅ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１変異体に感染したＢＨＫ−２１細胞の免疫蛍光及び位相差画像である。細胞単層の拡大図である。
【図６】真核性発現ベクターから得られるＭＮＣＰ１２．１変異タンパク質の発現レベル分析を示す。ＢＨＫ−２１細胞は、２μｇのｐＣＡＧＧＳ−Ｍ  ｗｔ（左パネル）、ｐＣＡＧＧＳ−ＮＣＰ１２．１（中央の２つのパネル）、またはｐＣＡＧＧＳ−ＭＣＳプラスミド（右パネル）を過渡的に形質移入された。細胞は、Ｍ特異モノクローナル抗体（２３Ｈ１２）及びローダミン抱合ヤギ抗マウス二次抗体を用いて分析された。
【図７】（Ａ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１による異なる細胞型の感染の位相差を示す。（Ｂ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１による異なる細胞型の感染の位相差を示す。（Ｃ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１による異なる細胞型の感染の位相差を示す。（Ｄ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１による異なる細胞型の感染の位相差を示す。（Ｅ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１による異なる細胞型の感染の蛍光分析を示す。（Ｆ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１による異なる細胞型の感染の蛍光分析を示す。（Ｇ）は、ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１による異なる細胞型の感染の蛍光分析を示す。（Ｈ）ｒＶＳＶ／ＭＮＣＰ１２．１による異なる細胞型の感染の蛍光分析を示す。
【図８】Ｍタンパク質が欠失したプロトタイプのＶＳＶ遺伝子送達／遺伝子治療ベクターを回収するために用いられる方法の概要を示す。
【図９】ｒＶＳＶＡＭ（ＶＳＶレプリコン）の回収及び継代の方法及び分析を示す。分析は、Ｎ特異モノクローナル抗体及びローダミン抱合ヤギ抗マウス二次抗体を用いて行われた。
【図１０】ＭＯＩ＝５で、Ｍタンパク質と、Ｇ及びＭタンパク質が欠失したＶＳＶに感染した膵島細胞サンプル１７６の蛍光（上パネル）及び位相差（下パネル）を示す。
【図１１】ＭＯＩ＝５で、Ｍタンパク質と、Ｇ及びＭタンパク質が欠失したＶＳＶに感染した膵島細胞サンプル１６３の蛍光（上パネル）及び位相差（下パネル）を示す。
【図１２】感染から３日後、ＭＯＩ＝２５に感染した膵島細胞サンプル１７６の蛍光（上パネル）及び位相差（下パネル）を示す。
【図１３】感染から３日後、ＭＯＩ＝２５に感染した膵島細胞サンプル１６３の蛍光（上パネル）及び位相差（下パネル）顕微鏡写真を示す。
【図１４】感染から８日後、ＭＯＩ＝５に感染した膵島細胞サンプル１７６の蛍光（上パネル）及び位相差（下パネル）顕微鏡写真を示す。
【図１５】感染から８日後、ＭＯＩ＝２５に感染した膵島細胞サンプル１７６の蛍光（上パネル）及び位相差（下パネル）顕微鏡写真を示す。
【図１６】感染から８日後、ＭＯＩ＝５に感染した膵島細胞サンプル１６３の蛍光（上パネル）及び位相差（下パネル）顕微鏡写真を示す。
【図１７】感染から８日後、ＭＯＩ＝２５に感染した膵島細胞サンプル１６３の蛍光（上パネル）及び位相差（下パネル）顕微鏡写真を示す。
【図１８】ＭＯＩ＝５または２５に感染して３日後の膵島細胞サンプル１７６の蛍光分析を示す（それぞれ上パネル、下パネル）。
【図１９】ＭＯＩ＝５または２５に感染して３日後の膵島細胞サンプル１６３の蛍光分析を示す（それぞれ上パネル、下パネル）。
【図２０】ベシクロ・ウイルス糖タンパク質の膜近位ドメインの配列アラインメントを示す。示されている配列は、ニュージャージー型ＶＳＶ（１８）、インディアナ型ＶＳＶのサンジュアン（Ｓａｎ  Ｊｕａｎ）菌株（３７）及びオルセー（Ｏｒｓａｙ）菌株（１９）、球菌ウイルス（２）、チャンディプラ・ウイルス（２８）、ピリウイルス（４）、コイウイルス（ＳＶＣＶ）の春季ウイルス血症（３）から得られたものである。淡灰色地に黒色フォントの残基は、全てのベシクロ・ウイルスに保存される。黒地に白色フォントの残基は、検査されたウイルス配列が同一の残基である。濃灰色地に黒色フォントの残基は、同様の特性を有する残基を示す。配列の下部の星印は、検査された配列全体での不変残基を表す。
【図２１】ＶＳＶ  Ｇの膜近位「ステム」領域における変異の概要を示す。完全長Ｇタンパク質の線形図は、外部ドメイン、膜近傍のＧステム（ＧＳ）領域、膜貫通（ＴＭ）ドメイン及び細胞質ドメインが区分されて上部に示されている。４２アミノ酸ステム領域の配列も示されている。配列の最初及び最後の番号は、ＶＳＶ  ＧＩＮＤ（サンジュアン菌株）のＮ末端から得られたアミノ酸残基の位置を示す。アミノ酸Ｋ４６２は、ＴＭドメインと外部ドメインとの境界である。保存トリプトファン（Ｗ）残基（位置４５７及び４６１）、グルタミン酸（Ｅ４５２）、グリシン（Ｇ４５６）、及びフェニルアラニン（Ｆ４５８）における変異が示されている。挿入、欠失、及び逆方向配列変異体の配列もまた示されている。タンパク質Ｇ（ＡＸＢ）は、外部ドメインＴＭ結合で２つの追加セリンを導入する。
【図２２】変異タンパク質の発現及び安定性を示す。ＣＯＳ−１細胞は、指示されたＧタンパク質をエンコードするプラスミドを形質移入され、タンパク質は［３５Ｓ］メチオニンで標識され、その後ポリクローナル抗Ｇ抗体を用いた免疫沈降及びそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。（Ａ）置換変異体及び野生型Ｇタンパク質（ＷＴ−Ｇ）。（Ｂ）欠失変異体及び挿入変異体。ＶＳＶ標識されたレーンは、野生型ＶＳＶに感染しかつ［３５Ｓ］メチオニンで標識された細胞から得られる免疫沈降されたタンパク質である。Ｇタンパク質及びＮタンパク質の位置が示されている。
【図２３】野生型及び変異Ｇタンパク質の輸送動態を示す。野生型Ｇタンパク質または変異タンパク質を発現するＢＨＫ−２１細胞は、３５Ｓ−メチオニンで１５分間標識された。培地は取り除かれ、過剰な未標識メチオニンを含む培地が、０、１０、３０または６０分間加えられた。Ｇタンパク質は、抗Ｇ末端ペプチド抗体を用いて細胞溶解産物から免疫沈降された。免疫沈降の２分の１はエンドグリコシダーゼＨにより分解された。タンパク質は、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離され、フルオログラフィーによって可視化された。タンパク質のエンドＨ抵抗性及び感受性型の量は、Image Quantソフトウェア（Molecular Dynamics  ．Co）を用いて定量化された。（Ａ）野生型（ＷＴ）；ＧＡ１３、及びＧｓｒｅｖ１１を検査する実験の結果。（Ｂ）ＷＴ、Ｇ１０ＤＡＦ、ΔＦ４４０−Ｎ４４９、及びＧΔ９−１０ＤＡＦを比較する別々の実験から得られた結果。
【図２４】ＷＴ及び変異ウイルスに感染した細胞シンチウム形成を示す。約５×１０５のＢＨＫ−２１細胞は、３７℃で１時間、多重度１０で感染した。感染後１６時間、細胞はｐＨ５．９、５．５または５．２に緩衝された融合培地で１分間室温で処置された。培地はＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳで置換され、培養物は３７℃で２０分間から１時間培養された。細胞はその後、固定化され、Ｇ特異ｍＡｂ（Ｉ１）を用いて間接免疫蛍光のために処理された。二次Ａｂとしてローダミン抱合ヤギ抗マウス抗体が用いられた。蛍光及び位相差画像は、１０Ｘの水浸可能なセラミック対物レンズを備えたZeiss Axiophot顕微鏡に取り付けられたZeiss Axiocamを用いてデジタル化され収集された。画像は、明るさ及びコントラストを調整するためにアドビ・フォトショップ（Adobe Photoshop）を用いて処理された。（Ａ）ｐＨ５に緩衝された融合培地で処置後、ｒＶＳＶ−ｗｔ、ＧＡ９、ＧＡ１３、ＧＡ９−１０ＤＡＦに感染した細胞において誘発されたシンシチウム形成。矢印は、変異体に感染した細胞における小さなシンシチウムを指している。（Ｂ）ｐＨ５で処置後、ｒＶＳＶ−ΔＦ４４０−Ｎ４４９、−Ｇ１０ＤＡＦ、及び−Ｇ（＋９）ｇＢＧに感染した細胞。
【図２５】ＷＴ及び変異ウイルス感染力を示す。ＢＨＫ−２１細胞は、多重度１０で１時間、ＷＴまたはＧ相補変異ウイルスのいずれかに感染し、その後細胞は成長培地で３回洗浄された。感染から１６時間後に上清のアリコートが採取され、ＢＨＫ−２１細胞でプラークアッセイを用いてウイルス価を決定するために用いられた。感染から３６時間後、プラークの数が数えられ、価を決定するために少なくとも２つの希釈間で平均された。示されているウイルス価は、少なくとも３つの独立した実験から得られた平均である。
【図２６】ビリオンでのＷＴ及び変異Ｇタンパク質の取り込みを示す。ＢＨＫ−２１細胞は、図５の説明文中で述べたように、多重度１０で野生型または変異タンパク質をエンコードするウイルスに感染した。感染後１６時間、上清に放出されたウイルスは、２０％ショ糖クッションによってペレット化された。ウイルス性ペレットはサンプル緩衝溶液中に再懸濁され、ウイルス性ペレットの５分の１から得られたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離された。タンパク質は、クーマシー・ブルーによる染色によって可視化された。ゲルのデジタル画像は、３５〜８０ｍｍのＮｉｋｋｏｒレンズを備えたニコン（Ｎｉｋｏｎ）のカメラを用いて得られた。タンパク質の量は、Image Quantソフトウェア（Molecular Dynamics、 Co）を用いて定量化された。ビリオンに取り込まれたＧタンパク質の相対量は、Ｇタンパク質とＮタンパク質の比を計算することによって決定された。結果は、野生型ＶＳＶ対照に見られるＧ：Ｎ比に関連してパーセンテージで表される。
【図２７】ＷＴ及び変異ウイルス性結合を示す。放射性標識ビリオン（〜８０，０００ｃｐｍ）は、ｐＨ７．０または５．９に緩衝された結合培地中で再懸濁され、室温で３０分間培養された。懸濁液はその後氷上で１０分間冷却され、それからＢＨＫ−２１細胞の予め冷却されたコンフルエント単層に加えられた。氷上で３時間、ウイルス結合が行われた。培地が除去され、放射能の量が決定された。これは、非結合ウイルス画分を示していた。細胞は次に、結合に用いられたのと同じｐＨを持つよく冷えた結合緩衝溶液で３回洗浄され、洗浄液は定量のために回収された。細胞は、１％のＴＸ−１００を含むＰＢＳ中で溶解され、溶解産物（結合画分）における放射能の量が決定された。ウイルス結合は、全体に対する結合ウイルスの割合として表された。
【図２８】ＩＬ−１２融合タンパク質を発現する組換え型複製制限的ＶＳＶの構成を示す。生理活性マウスのＩＬ−１２融合構成物は、ｐ４０サブユニットの停止コドンを除去し、ｐ３５サブユニットの最初の２２個のコドンを除去し、パネルＡに図示されたようなＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー領域に対する配列コーディングを挿入することによって産出された。ＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆの組換え型抗ゲノムの図は、パネルＢに示されている。抗ゲノムは、ヌクレオカプシド（Ｎ）、ポリメラーゼ（Ｐ及びＬ）及びＶＳＶのマトリクス（Ｍ）タンパク質をエンコードする。それに加えて、エンベロープ糖タンパク質（Ｇ）をエンコードする代わりに、Ｇコード領域全体が除去され、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）に置換された。ＩＬ−１２融合構成物をエンコードするｃＤＮＡは、このＭＣＳに挿入された。ＶＳＶ抗ゲノムＲＮＡの正確な３’末端を産出するために、デルタ型肝炎ウイルスから得られるリボザイム（ＲＢＺ）はＶＳＶトレーラの直ぐ後に配置された。この抗ゲノムＲＮＡはpBluescriptバックグラウンドから発現され、その転写はＴ７プロモーターから促進される。
【図２９】ＶＳＶ−ΔＧ−ＩＬ１２Ｆに感染した細胞におけるＩＬ−１２Ｆの産出及び分泌を示す。ＢＥＫ−２１細胞はＶＳＶΔＧ−ＩＬ１２Ｆ（ＭＯＩ＝５）に感染し、血清不含培地中で１７時間培養された。上清はハーベストされ、プレートから離されたＢＨＫ細胞は低速遠心によって除去された（事前清澄化された上清）。ビリオンは、２０％ショ糖クッション（清澄化された上清）に対して100,000 x gでペレット化することによって事前清澄化された上清から除去された。ｖＩＬ−１２Ｆの産出を判定するために、事前清澄化及び清澄化された上清のサンプルは、ペレット化されたビリオンと同様に、１０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥが行われた。分離されたタンパク質は、クーマシー・ブルー染色によって可視化された（Ａ）。サンプル組成は以下の通りである。レーン１）１００μｌの事前清澄化された上清、レーン２）５０μｌの清澄化された上清、レーン３）１００μｌの清澄化された上清、レーン４）５００μｌの上清からペレット化されたウイルス。並行して、ＩＬ−１２−ｐ４０特異モノクローナル抗体試料を用いてウェスタン・ブロット法を行うために類似のゲルがニトロセルロースに移された（Ｂ）。サンプル組成は以下の通りである。レーン１）１００μｌの事前清澄化された上清、レーン２）１００μｌの清澄化された上清、レーン３）５００μｌの上清からペレット化されたウイルス。ウイルス性に発現されたタンパク質の同一性が各々示されている。
【図３０】リステリア抗原への抗原特異Ｔ細胞反応のｖＩＬ−１２Ｆ強化作用を示す。Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウス（５／群）は、ＰＢＳ（溶媒）、ＬＭＡｇ（１０９ＨＫＬＭ＋８μｇの可溶性リステリアタンパク質）＋ＰＢＳ、ＬＭＡｇ＋０．５μｇのｒＩＬ−１２Ｆ、０．５μｇのｖＩＬ−１２Ｆ、またはＬＭＡｇ＋５．０μｇのｖＩＬ−１２Ｆのいずれかで、０、５、１５日目に免疫された。２０日目にマウスは屠殺され、腹腔滲出細胞が潅注によって収集され、プールされ、形成性非接着細胞集団（ＰＮＡ）が作成された。ＰＮＡ（１．５×１０６／ｍｌ）は、所定の最適濃度の培養培地（刺激なし）、Ｃｏｎ  Ａ（２μｇ／ｍｌ；多クローン性刺激物質）、ＢＫＬＭ（１０７／ｍｌ）、またはＳＬＰ（８μｇ／ｍｌ）のいずれかでｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激（３７℃で２４時間）された。細胞不含上清中のＩＬ−２（Ａ）及びＩＦＮ−β（Ｂ）は、抗原特異Ｔ細胞反応性の１つの指標として定量された。全てのアッセイは３通りに実行され、結果は平均±ＳＤとして表された。
【図３１】リステリア抗原とｖＩＬ−１２Ｆの同時投与の際の、特徴的な常在細胞集団プロフィールの誘発を示す。Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウス（５／群）は、ＰＢＳ（溶媒）、ＬＭＡｇ（１０９ＨＫＬＭ＋８μｇの可溶性リステリアタンパク質）＋ＰＢＳ、ＬＭＡｇ＋０．５μｇのｒＩＬ−１２Ｆ、ＬＭＡｇ＋０．５μｇのｖＩＬ−１２Ｆ、またはＬＭＡｇ＋５．０μｇのｖＩＬ−１２Ｆのいずれかで、０、５、１５日目に免疫にされた。２０日目にマウスは屠殺され、腹腔滲出細胞が潅注によって収集され、プールされ、形成性非接着細胞集団（ＰＮＡ）が作成された。ＰＮＡ（５×１０５／ｍｌ）は、指示された蛍光色素抱合抗体試料で染色された。アイソタイプ対照抗体試料での染色は非特異抗体結合を評価するためにも行われた。各サンプル（前方散乱／側方散乱ゲーティングによって選択された）のリンパ球集団のフローサイトメトリー分析が行われた。（Ａ）細胞は、抗ＣＤ５  ＰＥ及び抗ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０  ＦＩＴＣ（またはアイソタイプ対照としてのラットＩｇＧ２ａ  ＰＥ及びラットＩｇＧ２ａ  ＦＩＴＣ）により二重染色され、フローサイトメトリー分析が行われた。リンパ球集団内でのＴ細胞の頻度が各テストパネルに対して示されている。（Ｂ）細胞は、抗ＣＤ３  ＰＥ及び抗αβＴＣＲ  ＦＩＴＣ、抗γδＴＣＲ  ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４  ＦＩＴＣ、または抗ＣＤ８  ＦＩＴＣのいずれかにより二重染色され、フローサイトメトリー分析が行われた。ＣＤ３＋細胞におけるＴＣＲまたはＣＤ４／ＣＤ８発現を特徴付けるために、サンプルはＣＤ３＋集団でさらにゲーティングされた。リンパ球集団内での指示された細胞型の頻度は、以下のようにグラフ形式で示されている。（Ｃ）Ｔ細胞、通常のＢ細胞及びＢ１  Ｂ細胞、（Ｄ）ＣＤ３＋細胞。αβ及びγδＴＣＲ発現（Ｅ）の頻度もまた、ＣＤ３＋集団内でのＣＤ４及びＣＤ８発現（Ｆ）と同様に、グラフ形式で示されている。
【図３２】リステリア抗原とｖＩＬ−１２Ｆの同時投与に続く防御リステリア免疫の誘発を示す。Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウス（５／群）は、ＰＢＳ（溶媒）、ＬＭＡｇ（１０９ＨＫＬＭ＋８μｇの可溶性リステリアタンパク質）＋ＰＢＳ、５．０μｇのｖＩＬ−１２Ｆ＋ＰＢＳ、ＬＭＡｇ＋０．５μｇのｖＩＬ−１２Ｆ、またはＬＭＡｇ＋５．０μｇのｖＩＬ−１２Ｆのいずれかで、０、５、１５日目に免疫にされた。０日目に、追加群の５匹のマウスは、致死量以下の生存可能なリステリアを（腹腔内）接種された（６×１０３／マウスまたは０．１２×ＬＤ５０）。４５日目に、各マウスは、負荷用量の生存可能なリステリア（６．４×１０５または１２．９×ＬＤ５０）を（腹腔内）受容した。マウスは４日後（４９日目）に殺処分され、各マウスの脾臓（Ａ）及び肝臓（Ｂ）における細菌負荷が定量された。
【図３３】リステリア抗原及びＩＬ−１２Ｆでの免疫化によって与えられた長寿命の防御免疫を示す。Ｃ３ＨｅＢ／ＦｅＪマウス（５／群）は、ＰＢＳ（溶媒）、５．０μｇのｖＩＬ−１２Ｆ＋ＰＢＳ、ＬＭＡｇ（１０９ＨＫＬＭ＋８μｇの可溶性リステリアタンパク質）＋ＰＢＳ、またはＬＭＡｇ＋５．０μｇのｖＩＬ−１２Ｆのいずれかで、０、５、１５日目に免疫にされた。０日目に、追加群の５匹のマウスは、致死量以下の生存可能なリステリアを（腹腔内）接種された（６×１０３／マウスまたは０．１２×ＬＤ５０）。１２０日目に、各マウスは、負荷用量の生存可能なリステリア（３．８×１０５または７．６×ＬＤ５０）を（腹腔内）受容した。マウスは４日後（１２４日目）に殺処分され、各マウスの脾臓（Ａ）及び肝臓（Ｂ）における細菌負荷が定量された。
【図３４】Ｃ６グリオーマのＶＳＶ−ｗｔ感染を示す。６ウェルディッシュ中で成長したＣ６−ＧＦＰ細胞は、１０５ｐｆｕのｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄに感染した。（Ａ）時間０、（Ｂ）感染後１０時間、（Ｃ）感染後２４時間、及び（Ｄ）感染後４８時間での細胞の位相差画像が示されている。画像は、１０Ｘ対物レンズを備えたZeiss Axioskop顕微鏡に搭載されたZeiss Axiocamデジタルカメラを用いて収集された。
【図３５】Ｃ６−ＧＦＰグリオーマ細胞に対するｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄの細胞毒性を示す。Ｃ６−ＧＦＰグリオーマ細胞は、９６ウェルプレート中で９０％の密集度で蒔かれ、１０、１，０００、または１０，０００ｐｆｕのｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄに感染した。培養物は、細胞価ＭＴＳアッセイを用いて、最大９６時間、細胞生存度をモニターされた。細胞生存度は、用いられたウイルスの用量とは無関係に、感染から３０時間後までに５０％まで減少し、７２時間後までには代謝活性が殆どまたは全く検出されなかった。
【図３６】ラット器官型脳薄片培養物及び脳スライスＣ６−ＧＦＰグリオーマ共培養を示す。培養物は、ラット脳の３つの部位（黒質、線条、皮質）を用いて（Ａ）に示されているように定着された。培養から２週間後の薄片のＴＨ及びＭＡＰ−２免疫活性は、それぞれパネルＢ、Ｃに示されている。（Ｄ）はＣ６−ＧＦＰ細胞の低倍率（４Ｘ）の顕微鏡写真を、（Ｅ）は蛍光顕微鏡を用いて細胞の高倍率（４０Ｘ）画像を示す。
【図３７】３日間の培養期間中の正常及びスライスグリオーマ共培養のｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄ感染を示す。（Ａ）１０４ｐｆｕのｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄ接種後、正常な薄片組織の感染。（Ｂ）ＩＦＮ−βで薄片培養物を事前培養後、正常な薄片組織の１０４ｐｆｕのｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄへの感染。（Ｃ）ＩＦＮ−βでスライスグリオーマ共培養を事前培養後、１０４ｐｆｕのｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄの接種によるＣ６−ＧＦＰグリオーマ細胞の破壊。（Ｄ）ＩＦＮ−βでスライスグリオーマ共培養を事前培養し、続けて１０４ｐｆｕのｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄを接種後、薄片組織における赤色蛍光（例えばｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄ感染）の可視化。これらのデータは、正常な薄片組織の野生型ＶＳＶ感染がＩＦＮ−βによって有意に遮断されることと、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄが薄片培養物におけるＣ６−ＧＦＰグリオーマ成長を効率的に破壊できることを示している。
【図３８】感染後３日目の、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄを接種された薄片のＭＡＰ−２免疫活性を示す。（Ａ）ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄに感染後３日目の、正常な薄片培養物のＭＡＰ−２免疫活性。（Ｂ）ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄを接種される２４時間前に１，０００ＵのＩＦＮ−βで培養後、感染後３日目の正常な薄片培養物のＭＡＰ−２免疫活性。（Ｃ）ＩＦＮ−βでの前処置及びそれに続くｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄでの感染後のスライスグリオーマ共培養のＭＡＰ−２免疫活性。赤色染色は感染した細胞を同定し、緑色染色はＣ６−ＧＦＰ細胞を同定し、青色はＭＡＰ−２千色を表す。（Ｄ）ＩＦＮ−βで３日間培養後の正常な薄片培養物の免疫反応性におけるＭＡＰ−２免疫活性。これらのデータは、ＩＦＮ−βでの事前培養は、ｒＶＳＶ−ＤｓＲｅｄ単独の場合に見られるがスライスグリオーマ共培養には見られないような毒性効果を低減し得ることを示している。これらのデータはまた、ＩＦＮ−β単独では薄片組織に直接的に毒性があるように見えないことも示している。
【図３９】３日間の培養期間中の正常及びスライスグリオーマ共培養のｒＶＳＶ−ΔＧ感染を示す。（Ａ）Ｄｓ−Ｒｅｄ（例えば赤色蛍光）の発現によって示されるような１０６感染単位の感染性ΔＧ−ＤｓＲｅｄの接種後、正常な薄片組織におけるウイルス複製の経時変化。（Ｂ）ＩＦＮ−βでの薄片培養物の事前培養は、１０６感染単位のΔＧ−ＤｓＲｅｄの接種に続く正常な細胞の感染を防止する。（Ｃ）１，０００ＵのＩＦＮ−βでの前処置に続く１０６感染単位のΔＧ−ＤｓＲｅｄの接種によるＣ６−ＧＦＰグリオーマの破壊。（Ｄ）ＩＦＮ−βでのスライスグリオーマ共培養の前処置は、１０６感染単位のΔＧ−ＤｓＲｅｄの接種に続く正常な細胞の感染を防止する。これらのデータは、正常な薄片組織のΔＧ−ＤｓＲｅｄ感染がＩＦＮ−βによって有意に遮断されることと、ΔＧ−ＤｓＲｅｄが薄片培養物におけるＣ６−ＧＦＰグリオーマ成長を効率的に破壊できることを示している。
【図４０】ΔＧ−ＤｓＲｅｄを接種された正常な薄片培養物及びスライスグリオーマ共培養におけるＭＡＰ−２免疫活性を示す。（Ａ）ΔＧ−ＤｓＲｅｄを接種後３日の正常な薄片培養物のＭＡＰ−２免疫活性。（Ｂ）１，０００ＵのＩＦＮ−βで前処置され、ΔＧ−ＤｓＲｅｄを接種された正常な薄片培養物のＭＡＰ−２免疫活性。（Ｃ）ＩＦＮ−βで前処置され、ΔＧ−ＤｓＲｅｄを接種されたスライスグリオーマ共培養のＭＡＰ−２免疫活性。これらのデータは、ＶＳＶ−ΔＧはＶＳＶ−ｗｔよりも毒性が低く、ＶＳＶ−ΔＧの全体の毒性はＩＦＮ−βでの事前培養によって低減されることを示している。
【図４１】インビボラット脳腫瘍モデルの顕微鏡写真を示す。ラットは、Ｃ６−ＧＦＰ腫瘍細胞を注入され、２週間で屠殺された。Ａ．右半球に中心壊死を伴う大きな腫瘍を示すラット脳冠状冷凍断面のＨ＆Ｅ染色。Ｂ．蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現に対して可視化された隣接部分であって、それぞれ（ｃ）４Ｘ、（Ｄ）１０ＸでのＧＦＰ蛍光腫瘍細胞。
【図４２】インビボラットＣ６グリオーマの中央（Ａ）及び辺縁（Ｂ）から採取した冷凍断面のＩＴＧＡ−３（611045,BD Transduction Laboratories）免疫活性の顕微鏡写真を示す。ＧＦＰ  Ｃ６細胞は、グリオーママーカＩＴＧＡ−３によって赤色に対比染色された。予測通り、蛍光共焦点顕微鏡検査を用いて腫瘍細胞は免疫活性であることが示された（それぞれ１０Ｘ、４０Ｘ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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