(57)【要約】ＲＲＰ遺伝子はｐ５３又はｐ２１経路のモジュレーターとして同定されており、したがってこれらは欠陥ｐ５３又はｐ２１機能に関連する疾患の治療上の標的である。ＲＲＰの活性を調節する作用剤を探すためにスクリーニングすることを含む、ｐ５３又はｐ２１のモジュレーターを同定する方法が提供される。本発明の方法を使用して同定された調節剤を使用して、ＲＲＰタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞の成長を特異的に阻害することができる。ｍＲＲＰ１ノックアウトマウスも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞に外因性ＲＲＰ結合剤を接触させることにより腫瘍細胞の成長を阻害することを含んでなる、ＲＲＰタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞の成長を特異的に阻害する方法。
【請求項２】
前記腫瘍細胞が、胸部、卵巣、肺、腎臓、及び大腸からなる群から選択される組織由来のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＲＰ結合剤が抗体又は前記抗体の断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体がヒト化されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がヒト定常領域残基及びロンボイド特異的マウス可変領域残基を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体が検出可能な標識に結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が細胞障害性標識に結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ａ）組換えＲＲＰポリペプチドを発現すること、
ｂ）組換えＲＲＰポリペプチドをＲＲＰ結合標的及び候補ＲＲＰ調節剤を用いてインキュベートすること、及び
ｃ）前記候補ＲＲＰ調節剤がＲＲＰポリペプチドとＲＲＰ結合標的との結合を調節するかどうかを決定すること
を含んでなる、ＲＲＰポリペプチドとＲＲＰ結合標的との相互作用を調節する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記結合標的が、ＴＧＦα、ＥＧＦ、及びアンフィレギュリンからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合標的がＴＧＦαである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補ＲＲＰ調節剤が抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補ＲＲＰ調節剤が小有機分子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍細胞におけるＲＲＰ発現レベルを測定することを含んでなる異常ｐ５３又はｐ２１経路シグナル伝達を有する腫瘍細胞の診断方法であって、腫瘍細胞と同一の組織又は器官の非腫瘍細胞と比較したときの腫瘍細胞におけるＲＲＰ発現レベルの増大が腫瘍細胞における欠陥ｐ５３又はｐ２１経路シグナル伝達を示唆するものである方法。
【請求項１４】
ａ）精製されたＲＲＰポリペプチド又は核酸、或いは機能的に活性な断片又はその誘導体を含むアッセイ系を提供すること、
ｂ）試験剤が存在しない場合にアッセイ系により対照活性がもたらされる条件下でアッセイ系を試験剤に接触させること、及び
ｃ）試験剤の影響を受けたアッセイ系の活性を検出し、試験剤の影響を受けた活性と対照活性との差により試験剤が候補ｐ５３又はｐ２１経路調節剤であることが同定される工程を含んでなる、候補ｐ５３又はｐ２１経路調節剤の同定方法。
【請求項１５】
アッセイ系がＲＲＰポリペプチドを発現する培養細胞を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
培養細胞が加えてｐ５３又はｐ２１機能を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
アッセイ系がＲＲＰポリペプチドを有するスクリーニングアッセイを含み、候補試験剤が小分子モジュレーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
アッセイがプロテアーゼアッセイである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アッセイ系が、アポトーシスアッセイ系、細胞増殖アッセイ系、血管形成アッセイ系、及び低酸素誘発アッセイ系からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
アッセイ系がＲＲＰポリペプチドを含む結合アッセイを含み、候補試験剤が抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
アッセイ系がＲＲＰ核酸を含む発現アッセイを含み、候補試験剤が核酸モジュレーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
核酸モジュレーターがアンチセンスオリゴマーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸モジュレーターがＰＭＯである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
（ｄ）（ｃ）で同定された候補ｐ５３又はｐ２１経路調節剤を、ｐ５３又はｐ２１機能に欠陥がある細胞を含むモデル系に投与し、ｐ５３又はｐ２１機能が修復されたことを示すモデル系における表現型の変化を検出するステップ
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
モデル系が欠陥ｐ５３又はｐ２１機能を有するマウスモデルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｐ５３又はｐ２１機能に欠陥がある細胞を、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＲＰポリペプチドと特異的に結合する候補モジュレーターと接触させることを含んでなり、それによりｐ５３又はｐ２１機能が修復される、細胞のｐ５３又はｐ２１経路を調節する方法。
【請求項２７】
ｐ５３又はｐ２１機能の欠陥に起因する疾病又は疾患を有することが事前に確定されている脊椎動物に候補モジュレーターを投与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
候補モジュレーターが抗体及び小分子からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
（ｅ）ＲＲＰを発現している非ヒト動物又は培養細胞を含む二次アッセイ系を提供すること、
（ｆ）二次アッセイ系を（ｂ）の試験剤又はそれから誘導した作用剤と、試験剤又はそれから誘導した作用剤が存在しない場合に二次アッセイ系により対照活性がもたらされる条件下で接触させること、及び
（ｇ）作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性を検出する工程
をさらに含んでなり、
（ｈ）作用剤の影響を受けた二次アッセイ系の活性と対照活性との差により試験剤又はそれから誘導した作用剤が候補ｐ５３又はｐ２１経路調節剤であることが同定され、
（ｉ）ここで二次アッセイが作用剤の影響を受けたｐ５３又はｐ２１経路における変化を検出する、請求項１４に記載の方法。
【請求項３０】
二次アッセイ系が培養細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
二次アッセイ系が非ヒト動物を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
非ヒト動物がｐ５３又はｐ２１経路の遺伝子をミスエクスプレスする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物の細胞をＲＲＰポリペプチド又は核酸と特異的に結合する作用剤と接触させることを含んでなる、哺乳動物細胞内のｐ５３又はｐ２１経路を調節する方法。
【請求項３４】
ｐ５３又はｐ２１経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に作用剤を投与する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
作用剤が小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、又は抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
（ａ）患者から生体試料を得ること、
（ｂ）試料をＲＲＰ発現用のプローブと接触させること、
（ｃ）工程（ｂ）の結果を対照と比較すること、及び
（ｄ）工程（ｃ）が疾病の可能性を示しているかどうかを決定する工程
を含んでなる、患者の疾病を診断する方法。
【請求項３７】
前記疾病が癌である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が、表１に＞２５％の発現レベルを有するとして示されている癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号４６に規定されたアミノ酸配列、又はその逆の補体を有するポリペプチドをコードする精製された核酸。
【請求項４０】
高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用して配列番号４５の核酸配列にハイブリダイズできる、請求項３９に記載の核酸分子。
【請求項４１】
ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を有する組換え発現系であって、前記発現系が適合性の宿主中に存在するとき、配列番号４６のアミノ酸配列を有するｍＲＲＰ１ポリペプチドの製造能を有する発現系。
【請求項４２】
請求項４１の発現系を有する宿主細胞。
【請求項４３】
前記ｍＲＲＰ１タンパク質の発現に適した条件下で請求項４２に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記タンパク質を回収することを含んでなる、ｍＲＲＰ１タンパク質製造方法。
【請求項４４】
請求項４１に記載の発現系を有する宿主細胞の形質転換又は形質移入を含んでなるｍＲＲＰ１タンパク質を製造する細胞の製造方法であって、宿主細胞が、適切な培養条件下でｍＲＲＰ１タンパク質を製造する方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法により製造されたタンパク質を発現する組換え宿主細胞。
【請求項４６】
ゲノムに内因性ＲＲＰ遺伝子の破損を有し、前記破損により前記内因性ＲＲＰ遺伝子の発現が減少又は不足する、遺伝子組換えマウス。
【請求項４７】
前記マウスが破損したＲＲＰ遺伝子とホモ接合性である、請求項４６に記載のマウス。
【請求項４８】
請求項４６に記載の遺伝子組換えマウスから単離された細胞。
【請求項４９】
ゲノムに内因性ＲＲＰ遺伝子の破損を有し、前記破損により前記内因性ＲＲＰ遺伝子の発現が減少又は不足する、マウス細胞。
【請求項５０】
ａ）ゲノムに内因性ＲＲＰ遺伝子の破損を有するように操作されている、第１及び第２の単離されたマウス細胞を提供し、前記破損により前記内因性ＲＲＰ遺伝子の発現が減少又は不足することになり、
ｂ）試験剤を前記第１の単離されたマウス細胞に投与すること、及び
ｃ）第１及び第２の細胞の増殖の量を測定し、第１と第２の細胞の増殖の量の差により、試験剤が細胞増殖を調節することが示されること
を含んでなる、細胞増殖を調節する試験剤の選択方法。
【請求項５１】
ａ）ＲＲＰ又はその抗原性断片を請求項４６に記載のマウスに注入すること、及び
ｂ）抗体を回収すること
を含んでなる、ヒトＲＲＰに対する抗体の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願への言及）
本出願は、２０００年７月１９日出願の米国特許仮出願第６０／２１９，２８９号、２００１年３月２１日出願の米国特許仮出願第６０／２７７，４８７号、２００１年３月２１日出願の米国特許仮出願第６０／２７７，４７１号、２００１年７月１２日出願の米国特許仮出願第６０／３０４，８６３号、２００１年６月５日出願の米国特許仮出願第６０／２９６，０７６号、２００１年７月１２日出願の米国特許仮出願第６０／３０５，０１７号、２００１年１０月１０日出願の米国特許仮出願第６０／３２８，６０５号、及び２００１年１０月１０日出願の米国特許仮出願第６０／３２８，４９１号の優先権を主張する、２００１年7月１８日出願の米国特許出願第０９／９０８，４１９号の部分継続出願である、２００２年１月２３日出願の米国特許出願第１０／０５６，７９０号の優先権を主張する。先行出願の内容は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
シグナル形質導入経路は、成長因子、そのレセプター、成長因子の上方制御及び下方細胞間キナーゼネットワークからなる。これらの経路は、増殖を含め多くの細胞プロセスを調節しており、腫瘍形成において重要な役割を果たしていると思われる。
【０００３】
最も広範囲に研究されているものに、上皮性成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）及びその経路メンバーがある。この経路を介したシグナル伝達は逆の生物学的反応を誘発し、その結果、有糸分裂生起又はアポトーシス、細胞運動性亢進、タンパク質分泌、及び分化及又は脱分化などが顕在化する。上方制御されたＥＧＦＲシグナル伝達は器官の形態形成、維持及び修復に関連付けられており、また多くの腫瘍の浸潤及び転移と相関している。様々な種類の腫瘍における上方制御されたＥＧＦ及びＥＧＦＲは、ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の発現増加を導き、よって細胞周期のＧ１段階を停止させる（Reddy KB他, (1999) Int. J. Cancer 15:301-306）。
【０００４】
ＥＧＦＲ経路などのシグナル形質導入経路は、種の中でも、寄生虫の線虫、ショウジョウバエの一種であるキイロショウジョウバエ、及び脊椎動物と同じくらい長い間進化的に保存されている（Duffy JB及びPerrimon N, Curr. Opin. Cell Biol. (1996) 8:231-238）。実際、Ｓｐｉｔｚとして知られるショウジョウバエＥＧＦＲ（ＤＥＲ）のリガンド（Rutledge B他、Genes Dev. (1992) 6:1503-1517）及びＧｕｒｋｅｎ（Neuman-Silberberg FS及びSchupback T, Cell (1993) 75:165-174）は、ともに、脊椎動物ＥＧＦＲのリガンドであるＴＧＦα（形質転換成長因子α）に類似している（Massague J, J Biol Chem. (1990) 265:21393-21396）。膜貫通タンパク質をコードするロンボイド遺伝子は、この経路の別の上方メンバーである（Bier E.他、Genes Dev. (1990) 4:190-203）。ショウジョウバエでは、ロンボイドタンパク質が膜貫通セリンプロテアーゼであって、Ｓｐｉｔｚを切断し、Ｓｐｉｔｚを膜結合型から分泌型へ転換し、よってＤＥＲシグナル伝達経路を始動させ、上方制御する（Wasserman JD他、Genes Devel (2000) 14:1651-1663; Lee JR他、(2001) Cell 107:161-171; Urban S他 (2001) Cell 107:173-182）。ロンボイドに関連するＤＮＡ配列は、線虫（Wasserman JD及びFreeman M, Trends Cell Biol (1997) 7:431-436）、及び哺乳動物（Pascall JC及びBrown KD, FEBS letters (1998) 429:337-340; 特にヒト：ＧＩ＃３２８７１９１及びＧＩ＃７０２０５３４；及びラット：ＧＩ＃３２９７９３６；）において同定されており、ロンボイド機能が進化的に保存されていることを示している。ＥＧＦレセプターに関連する活性を合成ペプチド又はヒト化モノクローナル抗体により調節することで、腫瘍の成長が抑制される（Baselga J他、(1998) Cancer Research 58:2825-2831; Park B-W他、(2000) Nature Biotechnology 18:194-197）。
【０００５】
ｐ５３遺伝子は、家族性及び自発性の癌を含めた５０種類を超える種類の異なるヒト癌にわたって変異しており、ヒト癌の中で最も広く変異した遺伝子であると考えられている（Zambetti及びLevine、FASEB、1993年、7:855〜865;Hollstein他、Nucleic Acids Res.、1994年、22:3551〜3555）。ｐ５３遺伝子中の変異のうち９０％を超えるものが、ｐ５３機能を不活性化させる、単一アミノ酸を変化させるミスセンス変異である。ヒトｐ５３の異常型は、予後不良、より活動性の高い腫瘍、転移、及び短期生存率に関連している（Mitsudomi他、Clin Cancer Res、2000年10月、6(10):4055〜63；Koshland、Science、1993年、262:1953）。
【０００６】
ヒトｐ５３タンパク質は通常、ＤＮＡ損傷、低酸素症、ヌクレオチド欠乏、及び発癌遺伝子活性化を含めたシグナルの中枢インテグレーター（ｃｅｎｔｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）として機能する（Prives、Cell、1998年、95:5〜8）。これらのシグナルに応答して、ｐ５３タンパク質レベルが大きく上昇し、その結果、蓄積したｐ５３がこれらシグナルの性質及び強度に応じて（ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１の活性化により）細胞周期抑止を、又は細胞死を活性化させる。実際、複数系統の実験的証拠により、腫瘍抑制因子としてのｐ５３の主要な役割が指摘された（Levine、Cell、1997年、88:323〜331）。例えば、ホモ接合性のｐ５３「ノックアウト」マウスでは、発生は正常であるが、生後１年のうちにほぼ１００％の新組織形成の発生率が示された（Donehower他、Nature、1992年、356:215〜221）。
【０００７】
正常細胞及び癌細胞内でｐ５３が機能する生化学的機構及び経路は完全には分かっていないが、ｐ５３機能の明らかに重要な一面は、遺伝子特異的な転写活性化因子としての活性である。既知のｐ５３応答エレメントを有する遺伝子の中には、ＧＡＤＤ４５、ｐ２１／Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１、サイクリンＧ、Ｂａｘ、ＩＧＦ−ＢＰ３、及びＭＤＭ２を含めた、細胞周期又は細胞死のいずれかの制御における役割がよく特徴づけられたものが、いくつか存在する（Levine、Cell、1997年、88:323〜331）。
【０００８】
腫瘍の成長及び進行に関わる調節シグナルの形質導入経路は、多くの癌の進行過程、ひいては癌治療を理解する上で最も重要な点である。ショウジョウバエなどモデル生物のゲノムを操作できると、顕著な進化的保存により複雑な脊椎動物との直接の関連性を有するシグナル形質導入経路を分析する、強力な手段が提供される。遺伝子及び経路の保存レベルが高いこと、細胞プロセスの類似性が高いこと、ならびにこれらモデル生物と哺乳動物との間で遺伝子の機能が保存されていることにより、特定の経路における新規遺伝子の関与及びこのようなモデル生物中におけるその機能の同定は、哺乳動物中における相関経路及びこれらを調節する方法を理解するのに直接寄与することができる（例えば、Mechler BM他、1985年、EMBO J、4:1551〜1557;Gateff E．、1982年、Adv.Cancer Res.、37:33〜74;Watson KL.他、1994年、J Cell Sci.、18:19〜33;Miklos GL及びRubin GM.、1996年、Cell、86:521〜529;Wassarman DA他、1995年、Curr Opin Gen Dev、5:44〜50;Booth DR.、1999年、Cancer Metastasis Rev.、18:261〜284参照）。例えば、目に見える表現型がもたらされる遺伝子の過少発現（例えばノックアウト）又は過剰発現（「遺伝的エントリーポイント（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｔｒｙ  ｐｏｉｎｔ）」と呼ばれる）を有する脊椎モデル生物で、遺伝子スクリーニングを行うことができる。追加の遺伝子を、無作為に又は標的を定めた方式で変異させる。ある遺伝子の変異によって遺伝的エントリーにおける変異により引き起こされた最初の表現型が変化する場合、この遺伝子は、遺伝的エントリーポイントと同じ又は重複する経路に関与する「モディファイヤー」として同定される。遺伝的エントリーポイントがｐ５３又はｐ２１などの疾病経路に関係づけられているヒト遺伝子のオルソログである場合、新規の治療薬の魅力的な候補標的となり得るモディファイヤー遺伝子を同定することができる。
【０００９】
参照したＧｅｎｂａｎｋ識別番号及びウェブサイトの参照を含めた本明細書中で引用するすべての参考文献は、その全体が本明細書中に組み込まれる。
【００１０】
（発明の概要）
本発明者らは、ショウジョウバエでｐ５３又はｐ２１経路を改変させる遺伝子を発見し、その哺乳動物オルソログを同定し、本明細書中では以降これをロンボイド関連タンパク質（ＲＲＰ）、さらに詳細にはＲＲＰ１〜ＲＲＰ８、及びマウスＲＲＰ１（ｍＲＲＰ１）と呼ぶ。本発明は、ＲＲＰタンパク質並びにその断片と誘導体をコードする核酸配列を有する単離された核酸分子を提供する。また、ＲＲＰ核酸分子を有するベクター及び宿主細胞を開示する。
【００１１】
本発明は、これらのｐ５３又はｐ２１モディファイヤー遺伝子及びポリペプチドを利用して、欠陥ｐ５３又はｐ２１機能に関連する疾患の治療に使用できる候補治療剤であるＲＲＰ調節剤を同定する方法を提供する。
【００１２】
一実施形態では、ＲＲＰポリペプチド又は核酸を含むアッセイ系を用いて候補ｐ５３又はｐ２１調節剤を試験する。対照と比べてアッセイ系の活性に変化を生じさせる候補作用剤は、候補ｐ５３調節剤として同定される。このアッセイ系は細胞に基づくものでも、細胞を含まないものでもよい。候補調節剤には、小分子モジュレーター、抗体、及び核酸モジュレーターが含まれる。特定の一実施形態では、プロテアーゼアッセイを用いて小分子モジュレーターを同定する。特定の実施形態では、スクリーニングアッセイは、アポトーシスアッセイ、細胞増殖アッセイ、血管形成アッセイ、及び低酸素誘発アッセイから選択される。
【００１３】
別の実施形態では、最初に同定した候補作用剤や最初の作用剤から誘導した作用剤によって生じた血管形成、細胞死、又は細胞増殖の変化など、ｐ５３又はｐ２１又はｐ２１経路における変化を検出する第２アッセイ系を使用して、候補ｐ５３又はｐ２１経路調節剤をさらに試験する。第２アッセイ系には、培養細胞又は非ヒト動物を使用することができる。特定の実施形態では、この二次アッセイ系は、血管形成、細胞死、又は細胞増殖の疾患（例えば癌）などｐ５３又はｐ２１経路に関係づけられた疾病又は疾患を有することが事前に確定されている動物を含めた、非ヒト動物を使用する。
【００１４】
本発明はさらに、哺乳動物細胞をＲＲＰポリペプチド又は核酸に特異的に結合する作用剤と接触させることによって、哺乳動物細胞中のｐ５３又はｐ２１経路を調節する方法を提供する。この作用剤は、小分子モジュレーター、核酸モジュレーター、又は抗体であってよく、ｐ５３又はｐ２１経路に関連する病状を有することが事前に確定されている哺乳動物に投与することができる。
【００１５】
本発明の方法を使用して同定された調節剤は、ＲＲＰタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞の成長を特異的に阻害するために使用できる。
【００１６】
本発明はまた、分裂したＲＲＰ遺伝子を有するトランスジェニックノックアウトマウスを提供する。分裂は、ＲＲＰの発現低下をもたらすヘテロ接合性である場合と、ＲＲＰ遺伝子の発現不測をもたらすホモ接合性である場合がある。分裂したＲＲＰ遺伝子を有する細胞だけでなく、マウス由来の細胞も提供される。本発明のマウスを使用してＲＲＰに対する抗体を製造する方法も提供される。
【００１７】
トランスジェニックノックアウトマウスを製造するための標的ベクターも提供する。好ましくは、ノックアウトマウスの生成において同じ細胞からベクター配列を連続的に削除できるような標的ベクターが提供される。
【００１８】
（発明の詳細な記載）
ショウジョウバエにおけるｐ５３又はｐ２１経路のモディファイヤーを同定するために、遺伝子スクリーニングを設計した。ｐ５３（Ollmann M他、Cell、2000年、101:91〜101）又はｐ２１（Bourne HR他、Nature (1990) 348(6297):125-132; Marshall CJ, Trends Genet (1991) 7 (3):91-95）を過剰発現しているものに、遺伝子モディファイヤーのスクリーニングを実施した。ショウジョウバエロンボイド遺伝子は、ｐ５３又はｐ２１経路のモディファイヤーとして同定された。したがって、本明細書でＲＲＰ遺伝子と呼ぶこれらモディファイヤーの脊椎動物のオルソログ（すなわち核酸及びポリペプチド）は、癌など欠陥ｐ５３又はｐ２１シグナル伝達経路に関連する病状の治療における魅力的な薬剤標的である。さらに、マウスにおける遺伝子ターゲッティングは、野生型及び病態における個別のタンパク質の機能を調査するために理想的な方法である。哺乳動物におけるＲＲＰ１機能を研究するため、マウスにおけるＲＲＰ１領域のゲノム配列を生成し、そのｃＤＮＡとタンパク質配列を推定し、次いで標的となるＲＲＰ１ノックアウト（ＫＯ）マウスを製造した。
【００１９】
本発明が提供するＲＲＰ機能を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの方法、並びに、ＲＲＰ又はその対応する結合パートナーの変調は、正常状態及び病態におけるｐ５３又はｐ２１経路とそのメンバーとの関連性を理解し、ｐ５３又はｐ２１に関連する病状の診断方法及び治療様式を開発するのに有用である。本発明で提供する方法を使用して、直接的又は間接的に、例えば酵素（例えば触媒）活性又は結合活性などのＲＲＰ機能に影響を与えてＲＲＰの発現を阻害又は亢進することによって作用するＲＲＰ調節剤を同定することができる。ＲＲＰ調節剤には、ＲＲＰ関連タンパク質（例えば優勢ネガティブ変異体、及び生物療法剤）；ＲＲＰ特異性抗体；ＲＲＰ特異的アンチセンスオリゴマー；及びＲＲＰに特異的に結合するか、ＲＲＰ結合標的と競合する化学薬品が含まれる。本発明は、ＲＲＰ調節剤を同定しそれを作成する方法と、診断、治療並びに製薬開発におけるそれらの使用法を提供する。
【００２０】
好ましいＲＲＰ調節剤はＲＲＰポリペプチドに特異的に結合し、ＲＲＰ機能を阻害又は亢進する。その他の好ましいＲＲＰ調節剤は、例えば対応する核酸（つまりＤＮＡ又はｍＲＮＡ）に結合してそれを阻害することにより、ＲＲＰ遺伝子の発現、又は産物の活性を抑制するＲＮＡｉ及びアンチセンスオリゴマーである。ＲＲＰ特異性調節剤は、ＲＲＰポリペプチド又は核酸との分子の相互作用について、任意の簡便なインビトロ又はインビボアッセイにより評価できる。
【００２１】
本発明の方法は、ＲＲＰ遺伝子産物を過剰発現する哺乳動物の悪性又は良性腫瘍の治療に有用である。
【００２２】
本発明の核酸及びポリペプチド
本発明で使用することができるＲＲＰ核酸（ＲＲＰ１：配列番号１、ＲＲＰ２：配列番号３、ＲＲＰ３：配列番号５、ＲＲＰ４：配列番号７、ＲＲＰ５：配列番号９、ＲＲＰ６：配列番号１１、ＲＲＰ７：配列番号１３、及びＲＲＰ８：配列番号１５）及びポリペプチド（ＲＲＰ１：配列番号２、ＲＲＰ２：配列番号４、ＲＲＰ３：配列番号６、ＲＲＰ４：配列番号８、ＲＲＰ５：配列番号１０、ＲＲＰ６：配列番号１２、ＲＲＰ７：配列番号１４、及びＲＲＰ８：配列番号１６）に関連する配列は、公共のデータベースから入手可能である（ＲＲＰ１については、ｃＤＮＡ：ＧＩ＃３２８７１９０、配列番号１８；タンパク質ＧＩ＃３２８７１９１、配列番号３６；ＲＲＰ２については、ｃＤＮＡ：ＧＩ＃１２７６２６８９（配列番号１９）、ＧＩ＃１２０９６４１５（配列番号２０）、ＧＩ＃６６５７０８０（配列番号２１）、ＧＩ＃７９４７７５６（配列番号２２）、ＧＩ＃３１１７０１０（配列番号２３）、ＧＩ＃９３３９８７０（配列番号２４）、ＧＩ＃７１５２４９６（配列番号２５）、ＧＩ＃１１３１７５１２（配列番号２６）、ＧＩ＃１１３１７５１３（配列番号２７）、及びＧＩ＃１１３１７５１１（配列番号２８）；タンパク質：ＧＩ＃８９２３４０９（配列番号３７）、ＧＩ＃１２７１９５２２（配列番号３８）、及びＧＩ＃１１４２１８１７（配列番号３９）；ＲＲＰ３については、ｃＤＮＡ：ＧＩ＃１０１９９６７３（配列番号２９）、及びＧＩ＃２００３９９２（配列番号３０）；ＲＲＰ４については、ｃＤＮＡ：ＧＩ＃１１０６６２４９（配列番号３１）、及びタンパク質：ＧＩ＃１１０６６２５０（配列番号４０）；ＲＲＰ５については、ｃＤＮＡ：ＧＩ＃１１９６７９８２（配列番号３２）及びタンパク質：ＧＩ＃１１９６７９８３（配列番号４１）；ＲＲＰ６については、ｃＤＮＡ：ＧＩ＃１０４３８６８５（配列番号３３）、及びタンパク質：ＧＩ＃１０４３８６８６（配列番号４２）；ＲＲＰ７については、ｃＤＮＡ：ＧＩ＃１０１９０７３３（配列番号３４）、及びタンパク質：ＧＩ＃１０１９０７３４（配列番号４３）；並びに、ＲＲＰ８については、ｃＤＮＡ：ＧＩ＃１１０７２１００（配列番号３５）、及びタンパク質：ＧＩ＃１１０７２１０１（配列番号４４）。ヒト及びラットＲＲＰ１の配列を、マウスＲＲＰ１（ｍＲＲＰ１）ｃＤＮＡ（配列番号４５）、ポリペプチド（配列番号４６）、及びゲノム（配列番号４７）配列を推論するために使用した。これを実施例７に記載する。ｍＲＲＰ１ｃＤＮＡ配列は、ヒトＲＲＰ１と６９％の同一性を、及びマウスＲＲＰ１のヌクレオチド８８４−１３４０についてラット部分ＲＲＰ１と８８％の同一性を共有する。ｍＲＲＰ１タンパク質は、ヒトＲＲＰ１と８０％の同一性を、及びｍＲＲＰ１のアミノ酸２９７−４４８についてラット部分ＲＲＰ１と８８％の同一性を共有する。
【００２３】
ＲＲＰは、推定上の膜貫通領域内に強力に保存された３つのヒスチジン残基と、５以上の膜貫通ドメインとを有する内在性膜タンパク質のファミリーである。好ましい実施形態において、本発明は、配列番号４、６、又は４６のアミノ酸配列、或いはその断片又は誘導体を含むか、それらから構成されるＲＲＰタンパク質を提供する。
【００２４】
用語「ＲＲＰポリペプチド」とは、完全長のＲＲＰタンパク質又はその機能的に活性のある断片又は誘導体を言う。「機能的に活性のある」ＲＲＰ断片又は誘導体は、抗原活性や免疫原性活性、酵素活性、天然の細胞基質に結合する能力など完全長の野生型ＲＲＰタンパク質に関連する機能活性を１つ又は複数示す。ＲＲＰタンパク質、誘導体及び断片の機能活性は、当業者に周知の様々な方法によって（Current Protocols in Protein Science、1998年、Coligan他編、John Wiley & Sons, Inc.、ニュージャージー州ソマーセット）また以下にさらに述べるようにアッセイすることができる。本発明の目的のために、機能的に活性のある断片には、プロテアーゼ又はロンボイドドメインや結合ドメインなどＲＲＰの構造ドメインを１つ又は複数含む断片も含まれる。触媒的ドメイン及びその他ドメインは、ＰＦＡＭプログラムを使用して同定することができる（Bateman A.他、Nucleic Acids Res、1999年、27:260〜2; pfam.wustl.edu）。ＲＲＰポリペプチドを得る方法も、以下にさらに記載する。好ましい断片は、機能的に活性であって、少なくとも２５、好ましくは少なくとも５０、さらに好ましくは少なくとも１００のアミノ酸が近接する一領域と、場合によっては配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、及び４６のいずれか１つの全長と、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性又は類似性を有するドメイン含有断片である。さらに好ましい実施形態では、断片はロンボイドドメイン（ＰＦＡＭ０１６９４）全体を含む。
【００２５】
ＲＲＰタンパク質誘導体は典型的には配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、又は４６、或いはその断片とある程度の配列同一性または配列類似性を有する。ＲＲＰ誘導体は当該分野で知られている様々な方法によって産生することができる。その生産を生じる操作は遺伝子またはタンパク質のレベルで生じうる。例えば、クローン化ＲＲＰ遺伝子配列を制限エンドヌクレアーゼ(群)を用いて適切な部位で切断し（Wells他, Philos. Trans. R. Soc. London SerA 1986年 317:415）、その後に所望ならばさらに酵素修飾し、単離し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで結合し、発現させて所望の誘導体を産生する。あるいは、ＲＲＰ遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで突然変異させ、翻訳、開始、および／または終結配列をつくりだしおよび／または破壊し、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼを生成し、または前から存在するものを破壊し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾をさらに容易にすることができる。様々な突然変異誘発法は、化学的突然変異誘発法、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Carter他, Nucl. Acids Res. 1986年 13:4331）、ＴＡＢ(登録商標)リンカーの使用（Pharmacia・Upjohn, Kalamazoo, MI）のように当該分野で知られている。
【００２６】
タンパク質レベルでは、操作には、翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合等々が含まれる。数多くの化学的修飾の任意のものを既知の方法（例えば臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツナカマイシンの存在下での代謝合成等々）によって実施することができる。誘導体タンパク質はまたペプチドシンセサイザーを用いて、例えば非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログを置換または付加としてＲＲＰタンパク質配列中に導入することにより、化学的に合成することもできる。
【００２７】
異なったタンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合を介してそのアミノまたはカルボキシ末端に結合せしめられてＲＲＰタンパク質またはその断片を含む（好ましくはＲＲＰタンパク質の一または複数の構造的または機能的ドメインを含む）キメラまたは融合タンパク質を作成することができる。キメラタンパク質は、（異なったタンパク質のコード化配列に読み枠を一致させて結合されたＲＲＰコード化配列を含む）タンパク質をコードする核酸の組換え発現；所望のアミノ酸配列をコード化する適切な核酸配列を正しいコード化フレームで互いに結合させ、キメラ産物を発現させる方法；および例えばペプチドシンセサイザーの使用によるタンパク質合成法を含む任意の既知の方法によって産生することができる。
【００２８】
主題のＲＲＰポリペプチドはまたＮおよび／またはＣ末端切断を含む軽微な欠失突然変異体を包含する。そのような欠失突然変異体はＲＲＰ競合またはドミナントネガティブ活性で直ぐにスクリーニングされる。
【００２９】
「ＲＲＰ核酸」という用語は、ＲＲＰポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。好適な実施態様では、核酸は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、及び４６からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。ある実施態様では、核酸は配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、及び４５からなる群から選択される配列を含む。特定の実施態様では、配列番号５に示されるヒトＲＲＰ３をコードする単離核酸と、配列番号４５に示されるマウスＲＲＰ（ｍＲＲＰ１）をコードする単離核酸とを提供する。
【００３０】
本発明は核酸の断片、例えば本発明の全長配列の一つの結合ドメインをコードする断片を含む。ＲＲＰ核酸配列の断片は様々な目的のために使用することができる。例として、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）断片、特に二重鎖(ｄｓ)ＲＮＡｉを用いて、機能喪失型表現型を産生することができ；それを次にはとりわけ遺伝子機能を決定するために使用できる。ある種の「アンチセンス」断片、つまりコード化および／または未翻訳領域（例えば５’ＵＴＲ）の部分の逆相補鎖であるものはＲＲＰタンパク質の機能を阻害する点に有用性を有する。断片は対応するＲＲＰ配列と特異的にハイブリダイズするのに充分な長さである。断片はＲＲＰの少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも３６、より好ましくは少なくとも９６の隣接ヌクレオチドからなるかこれを含む。断片に他の核酸が隣接している場合、組み合わされた核酸配列の全長は１５ｋｂ未満、好ましくは１０ｋｂ未満または５ｋｂ未満、より好ましくは２ｋｂ未満であり、ある場合には好ましくは５００塩基未満である。
【００３１】
他の特定の実施態様では、配列番号５の好適な断片は、およそヌクレオチド２４８−５９８、６６５−７９６、８６２−８７０、９３４−９４３、１００６−１１３８、１２０１―１２２５、および１２８９−１３３６に位置する細胞外または細胞内ドメインをコードする。配列番号４５のさらなる好適な断片は、およそヌクレオチド１−７１４、７７４−９１２、９７２−９８４、１０４４−１０８９、１１４９−１２１２、１２７２−１３０５、および１３６５−１４０８に位置する細胞外又は細胞内ドメインをコードする。好ましい断片は結合ドメイン又はＲＲＰモチーフ（例えばＰＦＡＭ０１６９４）を含んでもよい。これらのドメインはタンパク質の機能および／または結合パートナーを位置づけるために使用することができる。例えば、タンパク質の細胞外または細胞内ドメインをコードする核酸を用いて、タンパク質に関連する結合パートナーをスクリーニングすることができる。
【００３２】
主題の核酸配列はＲＲＰ核酸またはその断片のみからなりうる。あるいは、主題の核酸配列およびその断片は他の成分、例えばラベル、ペプチド、細胞膜を通る輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーション惹起切断剤またはインターカレーション剤に結合することができる。主題の核酸配列およびその断片は他の核酸配列に結合させることができ（すなわち、それらはより大きな配列の一部を含みうる）、合成／非天然配列であり、および／または単離され、および／または精製され、つまりその天然の状態では伴う材料の少なくとも幾らかが伴っていない。好ましくは、単離された核酸は与えられたフラクションで存在する全核酸の少なくとも約０．５％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成し、好ましくは組換えであり、これはそれらが天然の染色体上に結合しているもの以外のヌクレオチドに結合した非天然配列または天然配列を含むことを意味する。
【００３３】
主題の核酸には、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等々としての用途；ＲＲＰ遺伝子および遺伝子転写物の存在を検出し、またさらなるＲＲＰホモログ及び構造的アナログをコードする核酸を検出しまたは増幅する際の用途を含む広範な用途が見出される。診断では、ＲＲＰハイブリダイゼーションプローブは臨床および実験室試料中の野生型およびＲＲＰアレル変異体を同定する用途が見出される。アレル変異体を用いてハイスループットの臨床診断のためのアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブを産生する。治療では、治療用ＲＲＰ核酸を用いて活性なＲＲＰの利用性または細胞内濃度または細胞発現を調節する。好ましい実施形態では、マウスＲＲＰ１配列を使用してヘテロ接合性又はホモ接合性（つまりノックアウト）でＲＲＰ１を欠損するマウスを生産するための標的ベクターを生産する。
【００３４】
好適な一実施態様では、誘導体核酸は、配列番号６のＲＲＰ３アミノ酸配列、配列番号４６のｍＲＲＰ１アミノ酸配列、又はその断片或いは誘導体を含むポリペプチドをコードする。誘導体ＲＲＰ３核酸配列またはその断片は配列番号５又は４５と１００％配列同一性を有しうるが、塩基または糖部分、またはホスフェート骨格において一または複数の修飾を有するという意味でその誘導体でありうる。修飾の例は当該分野でよく知られている（Bailey, Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry 1998年, 6版 Wiley and Sons）。そのような誘導体を用いて改変された安定性または任意の他の所望の性質を提供することができる。
【００３５】
好ましくは、ＲＲＰポリペプチド核酸、断片、オルソログ又はその誘導体は、ＲＲＰと少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。通常、異なる種のオルソログは、１つ以上のタンパク質モチーフの存在および／または３次元構造のために、同じ機能を保持している。対象配列または対象配列の特定の一部分に関して本明細書中で使用する「パーセント（％）配列同一性」とは、配列のアラインメントを行い、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な場合はすべての検索パラメータを初期値に設定したプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９（Altschul他、J.Mol.Biol.、1997年、215:403〜410; blast.wustl.edu/blast/README.html）によって作成されたギャップを導入した後の、対象配列（またはその特定の一部分）中のヌクレオチドやアミノ酸と同一である候補誘導体の配列中のヌクレオチドやアミノ酸の割合として定義される。ＨＳＰ  ＳおよびＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的値であり、プログラム自体により、具体的な配列の組成と、目的配列と比較して検索する個々のデータベースの組成とに応じて確定される。％同一性値は、一致する同一ヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、パーセント同一性が報告される対象となる配列の長さで割ることによって決定される。「パーセント（％）アミノ酸配列類似性」は、％アミノ酸配列同一性の決定と同じ計算を行うが、同一アミノ酸に加えて保存的アミノ酸置換を含めて算定することによって決定される。
【００３６】
保存的アミノ酸置換とは、タンパク質のフォールディングや活性が顕著に影響されないように、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換される置換である。互いに置換できる芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンであり、互換性のある疎水性アミノ酸はロイシン、イソロイシン、メチオニン、およびバリンであり、互換性のある極性アミノ酸はグルタミンおよびアスパラギンであり、互換性のある塩基性アミノ酸はアルギニン、リジンおよびヒスチジンであり、互換性のある酸性アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸であり、互換性のある小さいアミノ酸はアラニン、セリン、スレオニン、システインおよびグリシンである。
【００３７】
あるいは、核酸配列のアラインメントは、SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズムによって提供される（SmithおよびWaterman、1981年、Advances in Applied Mathematics、2:482〜489; SmithおよびWaterman、1981年、J.of Molec.Biol.、147:195〜197;Nicholas他、1998年、「A Tutorial on Searching Sequence Databases and Sequence Scoring Methods」(www.psc.edu)およびこれに引用される参考文献であるW.R.Pearson、1991年、Genomics、11:635〜650）。このアルゴリズムは、Dayhoffによって開発され（Dayhoff:Atlas of Protein Sequences and Structure、M.O.Dayhoff編、第5補遺、3:353〜358、National Biomedical Research Foundation、米国ワシントンD.C.）、Gribskovによって正規化された（Gribskov、1986年、Nucl.Acids Res.14(6):6745〜6763）スコアマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）を使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは、クエリ配列と類似の配列をデータベースで検索するために使用される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍｅｎは、クエリ配列とデータベース配列の間に最適なアラインメントを作る方法を決定するために、ダイナミックなプログラミングを使用する。このアラインメントは、クエリ配列がデータベース配列と一致するのに必要となる変換を決定することにより得られる。変換には、一文字を別の文字に置換すること、及び文字列を挿入又は削除することが含まれる。各文字対文字の比較にはスコアが割り当てられ、完全に一致する場合と特定の置換には正のスコアが、その他の置換、及び挿入／削除には負のスコアが割り当てられる。ギャップの挿入又は削除の最初の文字にはギャップ隙間ペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）のスコアが割り当てられ、次の文字にはギャップ伸張ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）が割り当てられる。スコアは統計的に得られたスコアリングマトリクスから取得される。高いスコアに繋がる変換の組み合わせは、クエリ配列とデータベース配列にアラインメントを生成するために使用される。スコアをつけるのに初期パラメータを用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる（たとえば、ギャップ隙間ペナルティー１２、ギャップ伸張ペナルティー２）。作成されたデータでは、「一致」値は「配列同一性」を反映している。
【００３８】
対象核酸分子から誘導した核酸分子には、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５又は４５の核酸配列とハイブリダイズする配列が含まれる。ハイブリダイゼーションの緊縮性は、温度、イオン強度、ｐＨ、ならびにハイブリダイズおよび洗浄中にホルムアミドなど変性剤を存在させることによって調節することができる。日常的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書に記載されている（たとえば、Current Protocol in Molecular Biology、第1巻、第2.10章、John Wiley & Sons, Publishers、1994年;Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。一部の実施形態では、本発明の核酸分子は、６×単位強度クエン酸（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ｃｉｔｒａｔｅ）（ＳＳＣ）（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０である）、５×デンハルト溶液、０．０５％のピロリン酸ナトリウムおよび１００μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを８時間〜終夜、６５℃でプレハイブリダイゼーションを行うこと；６×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡおよび０．０５％のピロリン酸ナトリウムを含む溶液中で、１８〜２０時間、６５℃でハイブリダイゼーションを行うこと、および；０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む溶液で、６５℃で１時間フィルターを洗浄することを含むストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、又は４５のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズすることができる。
【００３９】
他の実施形態では、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、核酸を含むフィルターを６時間、４０℃で前処理すること；３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、および１０％（重量／体積）のデキストラン硫酸を含む溶液中で、１８〜２０時間、４０℃でハイブリダイゼーションを行うこと；次いで、２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含む溶液で２度、１時間５５℃で洗浄することを含む、中程度の緊縮性のハイブリダイゼーション条件を使用する。
【００４０】
あるいは、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％のデキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、８時間〜終夜、３７℃でインキュベートすること；同じ緩衝液中で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行うこと、および；１×ＳＳＣで、約３７℃で１時間フィルターを洗浄することを含む、低い緊縮性の条件を使用することができる。
【００４１】
ＲＲＰ核酸及びポリペプチドの単離、生成、発現、及びミスエクスプレッション
ＲＲＰ核酸及びポリペプチドは、ＲＲＰ機能を調節する薬剤の同定及び試験、ならびにｐ５３又はｐ２１経路におけるＲＲＰの関与に関連する他の用途に有用である。ＲＲＰ核酸ならびにその誘導体及びオルソログは、利用可能な任意の方法を使用して得ることができる。例えば、ＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することによって、目的のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列を単離する技術が、当分野で周知である。一般的に、タンパク質の具体的な使用により、発現、生成、及び精製方法の詳細が規定される。例えば、スクリーニングして調節剤を探すために使用するタンパク質を生成するには、これらタンパク質の特異的生物活性を保存する方法が必要であるかもしれないが、抗体を産生するためのタンパク質を生成するには、特定のエピトープの構造的な完全性が必要であるかもしれない。スクリーニング又は抗体を産生するために精製すべきタンパク質を発現させるには、特定のタグの付加が必要であるかもしれない（例えば融合タンパク質の生成）。細胞周期制御や低酸素性応答の関与などＲＲＰ機能を評価するのに使用するアッセイのためのＲＲＰタンパク質を過剰発現させるには、これらの細胞活動が可能な真核細胞系中での発現が必要であるかもしれない。タンパク質を発現、生成、及び精製する方法は当分野で周知であり、したがって、任意の適切な手段を使用することができる（例えば、Higgins SJ及びHames BD編、Protein Expression:A Practical Approach、Oxford University Press Inc.、ニューヨーク、1999年;Stanbury PF他、Principles of Fermentation Technology、第2版、Elsevier Science、ニューヨーク、1995年;Doonan S編、Protein Purification Protocols、Humana Press、ニュージャージー、1996年;Coligan JE他、Current Protocols in Protein Science編、1999年、John Wiley&Sons、ニューヨーク; 米国特許第６，１６５，９９２号）。具体的な実施形態では、組換えＲＲＰは、欠陥ｐ５３又はｐ２１機能を有することで知られている細胞系（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能な、ｐ５３については特にＳＡＯＳ−２骨芽細胞、Ｈ１２９９肺癌細胞、Ｃ３３Ａ及びＨＴ３子宮頚癌細胞、ＨＴ−２９及びＤＬＤ−１大腸癌細胞、及びｐ２１については特にＨＣＴ１１６大腸癌細胞）中で発現される。この組換え細胞は、以下にさらに記載する本発明の細胞に基づくスクリーニングアッセイ系で使用する。
【００４２】
ＲＲＰポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、任意の適切な発現ベクター内に挿入することができる。プロモーター／エンハンサーエレメントを含めて必要な転写シグナル及び翻訳シグナルは、ネイティブＲＲＰ遺伝子及び／又はそのフランキング領域由来のものでよく、また異種性のものでもよい。ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、あるいはバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡで形質転換させた細菌などの微生物など、様々な宿主−ベクター発現系が利用できる。遺伝子産物の発現を変調させ、修飾し、及び／又は特異的にプロセッシングする宿主細胞系を使用することができる。
【００４３】
ＲＲＰ遺伝子産物を検出するために、発現ベクターは、ＲＲＰ遺伝子の核酸に発現可能に連結されたプロモーター、１つ又は複数の複製起点、及び１つ又は複数の選択可能なマーカー（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性など）を含むことができる。あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系（例えば免疫アッセイ）におけるＲＲＰタンパク質の物理的又は機能的特性に基づいてＲＲＰ遺伝子産物の発現をアッセイすることによって、組換え発現ベクターを同定することもできる。
【００４４】
例えば精製又は検出を促進するために、ＲＲＰタンパク質、断片、又はその誘導体を、任意選択で融合体又はキメラタンパク質産物（すなわち、ＲＲＰタンパク質が異なるタンパク質の異種タンパク質配列にペプチド結合を介して結合されている）として発現させることができる。標準の方法を使用して所望のアミノ酸をコードする適切な核酸配列を互いにライゲートさせ、キメラ産物を発現させることによって、キメラ産物を作製することができる。また、タンパク質合成技術、例えばペプチド合成機の使用（Hunkapiller他、Nature、1984年、310:105〜111）によってキメラ産物を作製することもできる。
【００４５】
ＲＲＰ遺伝子配列を発現する組換え細胞が同定された後は、標準の方法（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及びゲル排除クロマトグラフィー；遠心分離；溶解度差；電気泳動、精製の文献を引用）を使用して遺伝子産物を単離及び精製することができる。あるいは、標準の方法（例えば免疫親和性精製）によって、天然源からネイティブＲＲＰタンパク質を精製することができる。タンパク質を得た後は、免疫アッセイ、バイオアッセイ、又は結晶学など他の物理的特性の測定など適切な方法によってこれを定量し、その活性を測定することができる。
【００４６】
本発明の方法では、ＲＲＰ又はｐ５３又はｐ２１経路に関連する他の遺伝子の発現が変化するように（ミスエクスプレスされるように）操作した細胞を使用することもできる。本明細書中で使用するミスエクスプレッションとは、異所性発現、過剰発現、過少発現、及び無発現（例えば遺伝子のノックアウト又は通常は正常に引き起こされる発現の遮断による）を包含する。
【００４７】
遺伝子改変動物
候補ｐ５３又はｐ２１調節剤の活性を試験するため、又は細胞死や細胞増殖などｐ５３又はｐ２１経路のプロセスにおけるＲＲＰの役割をさらに評価するために、ＲＲＰの発現が変化するように遺伝子が改変された動物モデルを、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで使用することができる。好ましくは、変化したＲＲＰの発現により、正常なＲＲＰ発現を有する対照動物に比べて低減又は上昇した細胞増殖、血管形成、又は細胞死のレベルなど、検出可能な表現型がもたらされる。この遺伝子改変動物はさらに、ｐ５３又はｐ２１発現が変化していてもよい（例えばｐ５３又はｐ２１ノックアウト）。好ましい遺伝子改変動物は、霊長類、げっ歯類（好ましくはマウス）、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ及びネコなどの哺乳動物である。好ましい哺乳動物でない種には、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、及びショウジョウバエが含まれる。好ましい遺伝子改変動物は、染色体外エレメントとして存在する異種核酸をその細胞の一部分内に有するトランスジェニック動物、すなわちモザイク動物（例えば、Jakobovits、1994年、Curr.Biol.、4:761〜763によって記載されている技術参照）、又は異種核酸が生殖系列ＤＮＡ内（すなわち細胞のほとんど又はすべてのゲノム配列中）に安定に組み込まれているトランスジェニック動物である。異種核酸は、例えば宿主動物の胚又は胚性幹細胞を遺伝子操作することによって、このようなトランスジェニック動物の生殖系列内に導入される。
【００４８】
トランスジェニック動物を作製する方法は当分野で周知である（トランスジェニックマウスには、Brinster他、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、82:4438〜4442、1985年、どちらもLeder他による米国特許第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号、Wagner他による米国特許第４，８７３，１９１号、German他による米国特許第６，１２７，５９８号、ならびにHogan, B.、Manipulating the Mouse Embryo、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986年参照；パーティクルボンバードメントについては、Sandford他による米国特許第４，９４５，０５０号参照；トランスジェニックショウジョウバエについては、Rubin及びSpradling、Science、1982年、218:348〜53及び米国特許第４，６７０，３８８号参照；トランスジェニック昆虫については、Berghammer A.J.他、A Universal Marker for Transgenic Insects、1999年、Nature、402:370〜371参照；トランスジェニックゼブラフィッシュについては、Lin S.、Transgenic Zebrafish、Methods Mol Biol.、2000年、136:375〜3830参照）；魚、両生類卵及び鳥でのマイクロインジェクションについては、Houdebine及びChourrout、Experientia、1991年、47:897〜905参照；トランスジェニックラットについては、Hammer他、Cell、1990年、63:1099〜1112参照；胚性幹（ＥＳ）細胞を培養し、その後、電気穿孔、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈降、直接注入などの方法を使用してＤＮＡをＥＳ細胞に導入することによるトランスジェニック動物の作製には、例えばTeratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach、E.J.Robertson編、IRL Press、1987年参照）。利用可能な方法に従って非ヒトトランスジェニック動物を作製することができる（Wilmut, I.他、1997年、Nature、385:810〜813；ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９７／０７６６８号及びＷＯ９７／０７６６９号参照）。
【００４９】
一実施形態では、このトランスジェニック動物は、好ましくはＲＲＰ発現が検出不可能又は僅かとなるようにＲＲＰ機能の低下をもたらす、内因性ＲＲＰ遺伝子の配列中のヘテロ接合性又はホモ接合性の変化を有する「ノックアウト」動物である。ノックアウト動物は通常、ノックアウトする遺伝子の少なくとも一部分を有する導入遺伝子を含むベクターを用いた相同組換えによって作製される。通常、導入遺伝子を機能的に破壊するために、これに欠失、追加、又は置換を導入しておく。この導入遺伝子はヒト遺伝子（例えばヒトゲノムクローン由来）でもよいが、より好ましくは、トランスジェニック宿主種由来の、ヒト遺伝子のオルソログである。例えば、実施例８に示すように、マウスゲノム中の内因性ＲＲＰ遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構築するためには、マウスＲＲＰ遺伝子を使用する。マウスにおける相同組換えの詳細な方法が利用可能である（Capecchi、Science、1989年、244:1288〜1292;Joyner他、Nature、1989年、338:153〜156参照）げっ歯類でない哺乳動物及び他の動物のトランスジェニックを作製する手順も、利用可能である（Houdebine及びChourrout、上掲;Pursel他、Science、1989年、244:1281〜1288;Simms他、Bio/Technology、1988、6:179〜183）。好ましい実施形態では、特定の遺伝子がノックアウトされたマウスなどのノックアウト動物を使用して、ノックアウトされた遺伝子のヒトでの対応物に対する抗体を産生させることができる（Claesson MH他、1994年、Scand J Immunol、40:257〜264;Declerck PJ他、1995年、J Biol Chem.、270:8397〜8400）。
【００５０】
別の実施形態では、このトランスジェニック動物は、例えばＲＲＰの追加のコピーを導入することによって、又はＲＲＰ遺伝子の内因性コピーの発現を変化させる制御配列を動作可能に挿入することによって、ＲＲＰ遺伝子の発現の変化（例えば発現の増大（異所性の増大を含む）及び低減）をもたらす変化をそのゲノム中に有する「ノックイン」動物である。このような制御配列としては、誘発性であり、組織特異的で構成的なプロモーター及びエンハンサーエレメントが含まれる。このノックインは、ホモ接合性又はヘテロ接合性であることができる。
【００５１】
導入遺伝子の発現を制限可能にする選択された系を含む非ヒト動物のトランスジェニックも、作製することができる。作製し得るこのような系の一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である（Lakso他、PNAS、1992、89:6232〜6236；米国特許第４，９５９，３１７号）。導入遺伝子の発現を制御するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要となる。このような動物は、例えば、一方が選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方がリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２匹のトランスジェニック動物を交配させることによって「ダブル」トランスジェニック動物を作製することによって、提供することができる。リコンビナーゼ系の別の例は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のＦＬＰリコンビナーゼ系である（O'Gorman他、1991年、Science、251:1351〜1355；米国特許第５，６５４，１８２号）。好ましい実施形態では、実施例８に示すように、導入遺伝子の発現を制御するため、また同一細胞内でのベクター配列が順次削除されるように、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ及びＦｌｐ−Ｆｒｔの両方が同一系内で使用される。
【００５２】
遺伝学の研究において欠陥ｐ５３又はｐ２１機能に関係する疾病及び疾患の動物モデルとして、また以下に記載するスクリーニングで同定されたものなど候補治療剤のｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、遺伝子改変動物を使用してｐ５３又はｐ２１経路をさらに解明することができる。マウスにおける遺伝子ターゲッティングは、野生型及び病態における個別のタンパク質の機能を調査するために理想的な方法である。さらに、ロンボイドＲＲＰ配列及び機能に欠陥を有する動物モデルは、特に、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の調節、ＲＲＰに対する候補化合物の効果の試験、及びヒトＲＲＰに対する抗体の製造の理想的なツールである。この候補治療剤をＲＲＰ機能が変化した遺伝子改変動物に投与し、表現型の変化を、偽薬による処置を与えた遺伝子改変動物及び／又は候補治療剤を与えたＲＲＰ発現が変化していない動物などの適切な対照動物と比較する。
【００５３】
ＲＲＰ機能が変化した上述の遺伝子改変動物に加えて、欠陥ｐ５３又はｐ２１機能（及びそれ以外は正常なＲＲＰ機能）を有する動物モデルを本発明の方法において使用することができる。例えば、以下に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのうち１つで同定された候補ｐ５３又はｐ２１調節剤の活性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、ｐ５３又はｐ２１ノックアウトマウスを使用することができる。ｐ５３又はｐ２１ノックアウトマウスは文献に記載されている（ｐ５３については、Jacks他、Nature、2001年;410:1111〜1116、1043〜1044;Donehower他、上掲; ｐ２１については、Umanoff H他、Proc Natl Acad Sci USA 1995 Feb 28;92(5):1709-13）。
【００５４】
調節剤
本発明は、ＲＲＰの機能及び／又はｐ５３又はｐ２１経路と相互作用し及び／又はこれを調節する作用剤を同定する方法を提供する。このような作用剤は、ｐ５３又はｐ２１経路に関連する様々な診断及び治療用途、ならびにＲＲＰタンパク質及びｐ５３又はｐ２１経路におけるその寄与のより詳しい分析に有用である。したがって、本発明はまた、ＲＲＰ相互作用剤又は調節剤を投与することによってＲＲＰ活性を特異的に調節するステップを含む、ｐ５３又はｐ２１経路を調節する方法も提供する。
【００５５】
好ましい実施形態では、ＲＲＰ調節剤は、ＲＲＰ活性を阻害又は増強させることによって、あるいはその他の方法によって、転写、タンパク質発現、タンパク質の局在化、細胞活性又は細胞外活性を含めた正常なＲＲＰ機能に影響を与える。さらに好ましい実施形態では、候補ｐ５３又はｐ２１経路調節剤はＲＲＰの機能を特異的に調節する。表現「特異的調節剤」、「特異的に調節する」などは、本明細書中では、ＲＲＰポリペプチド又は核酸に直接結合し、好ましくはＲＲＰの機能を阻害、増強、又は他の形で変化させる調節剤を言うために使用する。また、この用語は、（例えば、ＲＲＰの結合パートナーと、又はタンパク質／結合パートナー複合体と結合して機能を阻害することによって）ＲＲＰと結合パートナー又は基質との相互作用を変化させる調節剤も包含する。
【００５６】
好ましいＲＲＰ調節剤には、小分子化合物；ＲＲＰ相互作用タンパク質；及びアンチセンスやＲＮＡ阻害剤などの核酸調節剤が含まれる。調節剤を、例えば組合せ療法などにおけるような他の活性成分及び／又は適切な担体や賦形剤を含んでもよい組成物として、薬剤組成物中に配合してもよい。化合物を配合又は投与する技術は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、ペンシルベニア州イーストン、第１９版に出ている。
【００５７】
小分子モジュレーター
小分子は多くの場合、酵素機能を有し及び／又はタンパク質相互作用ドメインを含むタンパク質の機能を調節することが好ましい。当分野で「小分子」化合物と呼ばれる化学剤は通常、分子量が１０，０００未満、好ましくは５，０００未満、より好ましくは１，０００未満、最も好ましくは５００未満である有機非ペプチド分子である。このクラスのモジュレーターには、化学的に合成した分子、例えばコンビナトリアル化学ライブラリからの化合物が含まれる。合成化合物は、既知又は推定ＲＲＰタンパク質の特性に基づいて合理的に設計又は同定する、あるいは化合物ライブラリをスクリーニングすることによっても同定することができる。このクラスの代わりの適切なモジュレーターは、天然産物、特に、やはり化合物ライブラリをスクリーニングしてＲＲＰ変調活性を探すことによって同定することができる、植物や真菌類など生物由来の二次代謝産物である。化合物を作製して得る方法は、当分野で周知である（Schreiber SL、Science、2000年、151:1964〜1969;Radmann J及びGunther J、Science、2000、151:1947〜1948）。
【００５８】
以下に記載するスクリーニングアッセイから同定された小分子モジュレーターをリード化合物として使用することができ、それから候補臨床化合物を設計し、最適化し、合成することができる。このような臨床化合物は、ｐ５３又はｐ２１経路に関連する病状を処置するのに有用であるかもしれない。候補小分子調節剤の活性は、以下にさらに記載する反復性の二次的な機能検証、構造決定、及び候補モジュレーターの改変及び試験によって、数倍改善されるかもしれない。さらに、候補臨床化合物は、臨床的及び薬理的特性に特に注意を払って作製される。例えば、活性を最適化し、製薬開発における毒性を最小限に抑えるために、試薬を誘導体化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して再スクリーニングすることができる。
【００５９】
タンパク質モジュレーター
特異的なＲＲＰ相互作用タンパク質は、ｐ５３又はｐ２１経路及び関連疾患に関連する様々な診断上及び治療上の用途、ならびに他のＲＲＰ調節剤の検証アッセイにおいて有用である。好ましい実施形態では、ＲＲＰ相互作用タンパク質は、転写、タンパク質の発現、タンパク質の局在化、細胞活性又は細胞外活性を含めた正常なＲＲＰ機能に影響を与える。別の実施形態では、ＲＲＰ相互作用タンパク質は、癌などｐ５３又はｐ２１に関連する疾患に関連性があるので、ＲＲＰタンパク質の機能に関する情報を検出及び提供するのに有用である（例えば診断上の手段用）。
【００６０】
ＲＲＰ相互作用タンパク質は、ＲＲＰ発現、局在化、及び／又は活性を調節するＲＲＰ経路のメンバー、ＴＧＦα、ＥＧＦ、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）など内因性のもの、すなわちＲＲＰと自然に遺伝学的又は生化学的に相互作用するものであってよい。ＲＲＰモジュレーターには、ＲＲＰ相互作用タンパク質及びＲＲＰタンパク質自体のドミナントネガティブの形が含まれる。酵母２ハイブリッド及び変異体スクリーニングにより、内因性ＲＲＰ相互作用タンパク質を同定する好ましい方法が提供されている（Finley, R.L.他、1996年、DNA Cloning-Expression Systems:A Practical Approach、Glover D.及びHames B.D編、Oxford University Press、英国オックスフォード、ページ169〜203;Fashema SF他、Gene、2000年、250:1〜14;Drees BL、Curr Opin Chem Biol、1999、3:64〜70;Vidal M及びLegrain P、Nucleic Acids Res、1999年、27:919〜29；米国特許第５，９２８，８６８号）。タンパク質複合体を解明するための好ましい代替方法は、質量分析である（例えば、Pandley A及びMann M、Nature、2000年、405:837〜846;Yates JR 3rd、Trends Genet、2000年、16:5〜8の総説）。
【００６１】
ＲＲＰ相互作用タンパク質は、ＲＲＰに特異的な抗体やＴ細胞抗原受容体などの外因性タンパク質でよい（例えば、Harlow及びLane、1988年、Antibodies, A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory参照）。ＲＲＰ抗体については以下でさらに論じる。
【００６２】
好ましい実施形態では、ＲＲＰ相互作用タンパク質はＲＲＰタンパク質に特異的に結合する。好ましい代替実施形態では、ＲＲＰ調節剤はＲＲＰ基質、結合パートナー、又はコファクターと結合する。
【００６３】
抗体
別の実施形態では、このタンパク質モジュレーターはＲＲＰに特異的な抗体アゴニスト又はアンタゴニストである。この抗体は治療上及び診断上の用途を有しており、ＲＲＰモジュレーターを同定するスクリーニングアッセイで使用することができる。例えば、抗体の使用例には、生物学的試料中でのＲＲＰタンパク質検出、及びＲＲＰ活性の阻害、例えば発癌性疾患進行の妨害が含まれる。また、様々な細胞応答ならびにＲＲＰの通常のプロセッシング及び成熟を担当するＲＲＰ経路の部分の分析においても、この抗体を使用することができる。
【００６４】
周知の方法を使用してＲＲＰポリペプチドと特異的に結合する抗体を作製することができる。好ましくは、この抗体はＲＲＰポリペプチドの哺乳動物オルソログ、より好ましくはヒトＲＲＰに、特異的である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化又はキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ＦＡｂ発現ライブラリによって産生された断片、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、及び上記のうちいずれかのエピトープ結合断片であってよい。記載の標準手順によって、１０８Ｍ−１、好ましくは１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１、又はそれより強力な親和性を有するモノクローナル抗体を作製することができる（Harlow及びLane、抗体: A Laboratory Manual, CSH Laboratory (1988); Goding、1986年、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版)、Academic Press、ニューヨーク；米国特許第４，３８１，２９２号；米国特許第４，４５１，５７０号；米国特許第４，６１８，５７７号）。ＲＲＰの粗細胞抽出物又は実質的に精製されたその断片に対する抗体を作製することができる。ＲＲＰ断片を使用する場合は、これらは、好ましくはＲＲＰタンパク質の少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＲＲＰに特異的な抗原及び／又は免疫原は、免疫応答を刺激する担体タンパク質に結合している。例えば、対象ポリペプチドはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体に共有結合しており、このコンジュゲートは免疫応答を増強させるフロイント完全アジュバント中で乳化されている。従来のプロトコルに従って実験ウサギやマウスなど適切な免疫系を免疫化する。好ましい実施形態では、マウス及びヒト由来のＲＲＰ配列が非常に似ているため、ＲＲＰを欠損するか、ＲＲＰノックアウトのトランスジェニックマウス、例えば前述の実施形態（実施例８）において生成されたマウス、を使用して、ヒトＲＲＰに対する抗体を生産する。
【００６５】
固定した対応するＲＲＰポリペプチドを使用した固相酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）など適切なアッセイによって、ＲＲＰに特異的な抗体の存在をアッセイした。ラジオイムノアッセイや蛍光アッセイなど他のアッセイを使用することもできる。
【００６６】
異なる動物種由来の異なる部分を含む、ＲＲＰポリペプチドに特異的なキメラ抗体を作製することができる。例えば、抗体の生物活性はヒト抗体由来であり、その結合特異性はネズミ断片由来となるように、ヒト免疫グロブリン定常領域をネズミｍＡｂの可変領域に連結させてもよい。それぞれの種由来の適切な領域をコードする遺伝子を継ぎ合わせることによってキメラ抗体を作製する（Morrison他、Proc.Natl.Acad.Sci.、1984、81:6851〜6855;Neuberger他、Nature、1984、312:604〜608;Takeda他、Nature、1985、31:452〜454）。キメラ抗体の一形態であるヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術によって（Riechmann LM他、1988年、Nature、323:323〜327）マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域及び定常領域のバックグラウンドに移植することによって（Carlos, T.M.、J.M.Harlan、1994年、Blood、84:2068〜2101）作製することができる。ヒト化抗体は約１０％のネズミ配列及び約９０％のヒト配列を含み、それにより、抗体特異性を保持したままで免疫原性がさらに低下又は排除される（Co MS及びQueen C.、1991年、Nature、351:501〜501;Morrison SL.、1992年、Ann.Rev.Immun.、10:239〜265）。ヒト化抗体及びそれらを産生させる方法は当分野で周知である（米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１８０，３７０号）。
【００６７】
アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖断片と軽鎖断片とを連結させて形成した組換え単鎖ポリペプチドであるＲＲＰ特異的単鎖抗体を、当分野で周知の方法によって産生することができる（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird、Science、1988年、242:423〜426;Huston他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1988年、85:5879〜5883;Ward他、Nature、1989、334:544〜546）。
【００６８】
抗体を産生するための他の適切な技術は、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで、抗原ポリペプチド、又は代わりにファージや類似のベクター中の選定抗体ライブラリに曝すことを含む（Huse他、Science、1989年、246:1275〜1281）。本明細書中で使用するＴ細胞抗原受容体は、抗体モジュレーターの範囲内に含まれる（Harlow及びLane、1988年、上掲）。
【００６９】
本発明のポリペプチド及び抗体は、改変して又は改変せずに使用することができる。多くの場合、検出可能なシグナルをもたらす基質又は標的タンパク質を発現する、細胞にとって毒性である基質を共有結合又は非共有結合のどちらかによって結合させることによって抗体を標識する（Menard S他、Int J.Biol Markers、1989、4:131〜134）。幅広い種類の標識及びコンジュゲーション技術が知られており、科学文献及び特許文献のどちらにも広く報告されている。適切な標識には、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光部分（ｍｏｉｅｔｙ）、蛍光発光ランタニド金属、化学発光部分、生物発光部分、磁気粒子などが含まれる（米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号；第４，３６６，２４１号）。また、組換え免疫グロブリンを産生させてもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。膜貫通毒素タンパク質とコンジュゲートさせることによって細胞質ポリペプチドに対する抗体をその標的に送達し到達させることができる（米国特許第６，０８６，９００号）。
【００７０】
患者で治療的に使用する場合は、可能な場合は標的部位に非経口的投与によって、又は静脈投与によって本発明の抗体を投与する。臨床研究によって治療上有効な用量及び投与計画を決定する。通常、投与する抗体の量は患者の重量１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。非経口投与には、薬学的に許容されるベヒクルを含む単位用量の注射可能な形態（例えば溶液、懸濁液、乳濁液）で抗体を配合する。このようなベヒクルは本質的に無毒性で治療作用がない。例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、及び５％のヒト血清アルブミンである。また、不揮発性油、オレイン酸エチル、又はリポソーム担体などの非水性ベヒクルを使用してもよい。ベヒクルには、等張性や化学的安定性を高める又は他の形で治療の可能性を高める緩衝剤や保存料など少量の添加剤が含まれ得る。このようなベヒクル中の抗体濃度は、通常約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌである。免疫療法的な方法は文献にさらに記載されている（米国特許第５，８５９，２０６；国際公開公報ＷＯ００７３４６９号）。
【００７１】
治療法に適切な抗体のサブクラスの選択は、腫瘍抗原の性質によって決まる。例えば、腫瘍標的について抗原の特異性が高く正常細胞に起こることがまれである場合、ＩｇＭが好ましい。しかしながら、腫瘍関連抗原が低いレベルであっても正常組織にも発現している場合は、ＩｇＧサブクラスが好ましい。抗体と結合して細胞抗原に対する防護を形成する血清タンパク質である補体を活性化するために、近接する少なくとも２つのＩｇＧ分子が結合することが必要である。したがって、発現する抗原の量がもっと小さく、結合するＩｇＧ分子の数がもっと少ない正常組織は、補体が媒介する損傷を発生する場合が少ない。さらに、ＩｇＧはＩｇＭより小さいので、腫瘍組織に局在することがさらに容易である。
【００７２】
免疫反応は、抗腫瘍治療の達成又は効率を補助できる。補体の活性が炎症性反応及びマクロファージ活性化を引き起こすという証拠がある（Uananue and Benecerraf, Textbook of Immunology, 第２版、Williams & Wilkins, p.218 (1984)）。活性化されたマクロファージは正常細胞より腫瘍細胞を優先的に破壊する（Fidler及びPoste, Springer Semin. Immunopathol. 5, 161(1982)）。また、炎症を伴う血管拡張の増加は、化学療法剤又は放射標識抗体などの抗癌剤の局在化能力を増大させる場合がある。標準的化学療法又は放射線治療が健康な細胞に損傷を与えるという大きな欠点を有する一方、本発明で特定する抗原−抗体の組合せは、腫瘍細胞の集合の異種性により通常引き起こされる問題の多くを回避できる。加えて、異なる個体の同じエピトープ中の過度の分散を認識する精製された抗原（Hakomori, Ann. Rev. Immunol. (1984) 2:103）、又は関連する抗イディオタイプ抗体（Nepom他、Proc. Natl. Acad. Sci, (1985) 81:2864）を使用して、ヒト癌患者に活性の免疫反応を誘発することができる。このような反応は、ヒト補体を活性化できる抗体の形成、及び抗体依存性細胞媒介性細胞毒性の媒介を含み、このようなメカニズムにより腫瘍破壊を引き起こす。
【００７３】
特異的バイオ治療薬
好適な実施態様では、ＲＲＰ相互作用タンパク質はバイオ治療用途を持ちうる。製薬的に許容可能な担体に処方されるバイオ治療薬と用量はシグナル伝達経路を活性化または阻害するために使用できる。この調節はリガンドに結合し、それによって経路の活性を阻害することによって；あるいはレセプターに結合し、レセプターの活性を阻害するか、または活性化することによって、達成されうる。あるいは、バイオ治療薬そのものがレセプターを活性化または阻害可能なリガンドでありうる。バイオ治療薬およびそれを製造する方法は米国特許代６，１４６，６２８号に詳細に記載されている。
【００７４】
ＲＲＰはレセプターであるので、そのリガンド(群)、リガンド(群)またはＲＲＰ自体に対する抗体をバイオ治療薬として用いて、ｐ５３又はｐ２１経路におけるＲＲＰの活性を調節することができる。
【００７５】
核酸モジュレーター
他の好ましいＲＲＰ調節剤としては、一般的にＲＲＰ活性を阻害するアンチセンスオリゴマーや二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などの核酸分子が含まれる。
【００７６】
好ましいアンチセンスオリゴマーは、ＤＮＡの複製、転写、タンパク質翻訳部位へのＲＲＰ  ＲＮＡの転位、ＲＲＰ  ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、ＲＲＰ  ＲＮＡをスプライシングして１つまたは複数のｍＲＮＡ種を得ること、またはＲＲＰ  ＲＮＡに関与しまたはそれによって促進され得る触媒活性など、ＲＲＰ核酸の機能を妨げる。二本鎖ＲＮＡ阻害（ｄｓＲＮＡｉ）は別の好ましいＲＲＰ相互作用剤である。簡便性のため、本明細書で使用する「アンチセンスモジュレーター」という用語は、アンチセンスオリゴマー及びｄｓＲＮＡｉを含む。
【００７７】
一実施形態では、このアンチセンスオリゴマーは、好ましくは５’非翻訳領域に結合することによってＲＲＰ  ｍＲＮＡと結合して、翻訳を阻止するのに十分相補的なオリゴヌクレオチドである。ＲＲＰに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも６〜約２００個の範囲のヌクレオチドである。一部の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１０、１５、または２０ヌクレオチド長である。他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは５０未満、４０、または３０ヌクレオチド長である。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはそのキメラ混合物や誘導体またはそれを改変した変形であり得る。このオリゴヌクレオチドの塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格を改変してもよい。このオリゴヌクレオチドは、ペプチド、細胞膜を横切る輸送を促進する作用剤、ハイブリダイゼーションによってトリガーされる切断剤、インターカレーション剤など他の付属基を含んでいてもよい。
【００７８】
別の実施形態では、このアンチセンスオリゴマーはホスホチオエートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）である。ＰＭＯは、それぞれがモルフォリンの六員環に結合している４種の遺伝子塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）のうちの１つを含む、４種の異なるモルフォリノサブユニットから組み立てられている。これらサブユニットのポリマーは、非イオン性のホスホジアミデートサブユニット間の連結によって結合されている。ＰＭＯおよび他のアンチセンスオリゴマーの詳細な作成方法および使用方法は、当分野で周知である（たとえば、国際公開公報ＷＯ９９／１８１９３号；Probst JC、Antisense Oligodeoxynucleotide and Ribozyme Design, Methods.、2000年、22(3):271〜281;Summerton JおよびWeller D.、1997年、Antisense Nucleic Acid Drug Dev.、7:187〜95；米国特許第５，２３５，０３３号；米国特許第５，３７８，８４１号参照）。
【００７９】
アンチセンスオリゴマーは一般的に、探索試薬、診断薬、治療薬として使用される。たとえば、遺伝子の発現を厳密な特異性で阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば特定の遺伝子の機能を解明するのに使用される（たとえば、米国特許第６，１６５，７９０号参照）。また、アンチセンスオリゴマーは、たとえば生体経路の様々なメンバーの機能を識別するためにも使用される。アンチセンスオリゴマーは、病態の動物および人の処置における治療的部分として利用されてきており、安全かつ効果的であることが数々の臨床治験で実証されてきた（Milligan JF他、Current Concepts in Antisense Drug Design、J Med、Chem.、1993年、36:1923〜1937;Tonkinson JL他、Antisense Oligodeoxynucleotides as Clinical Therapeutic Agents、Cancer Invest.、1996年、14:54〜65）。したがって、本発明の一態様では、ｐ５３又はｐ２１経路におけるＲＲＰの役割、および／またはＲＲＰとこの経路の他のメンバーとの関係をさらに解明するためのアッセイで、ＲＲＰに特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。本発明の別の態様では、ｐ５３又はｐ２１に関連する病態を処置する治療剤として、ＲＲＰに特異的なアンチセンスオリゴマーを使用する。
【００８０】
好ましい代替ＲＲＰ調節剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する二本鎖ＲＮＡ種である。ＲＮＡｉは、動物および植物における配列特異的な翻訳後の遺伝子サイレンシングプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と相同の配列をもつ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。線虫、ショウジョウバエ、植物、およびヒトにおいて遺伝子をサイレンシングするためのＲＮＡｉの使用に関する方法は、当分野で周知である（Fire A他、1998年、Nature、391:806〜811;Fire, A.、Trends Genet.、15、358〜363、1999年;Sharp, P.A.、RNA interference 2001. Genes Dev.、15、485〜490、2001年;Hammond, S.M.他、Nature Rev.Genet.、2、110〜1119、2001年;Tuschl, T.Chem.Biochem.、2、239〜245、2001年;Hamilton, A.他、Science、286、950〜952、1999年;Hammond, S.M.他、Nature、404、293〜296、2000年;Zamore, P.D.他、Cell、101、25〜33、2000年;Bernstein, E.他、Nature、409、363〜366、2001;Elbashir, S.M.他、Genes Dev.、15、188〜200、2001年；国際公開公報ＷＯ０１２９０５８号；国際公開公報ＷＯ９９３２６１９号；Elbashir SM他、2001年、Nature、411:494〜498）。
【００８１】
アッセイ系
本発明は、ＲＲＰ活性の特異的なモジュレーターを同定するアッセイ系を提供する。本明細書中で使用する「アッセイ系」とは、具体的な事象を検出及び／又は測定するアッセイを実施してその結果を分析するのに必要なすべての構成要素を包含する。一般的に、一次アッセイを使用して、ＲＲＰ核酸又はタンパク質に関するモジュレーターの特異的な生化学的効果又は分子効果を同定又は確認する。一般的に、二次アッセイでは、一次アッセイによって同定されたＲＲＰ調節剤の活性がさらに評価され、この調節剤がｐ５３又はｐ２１経路に関連する方式でＲＲＰに影響を与えることが確認されることもある。場合によっては、ＲＲＰモジュレーターを直接二次アッセイで試験する。
【００８２】
好ましい実施形態では、スクリーニング方法は、候補剤が存在しなければスクリーニング方法で検出される特定の分子事象に基づく対照活性（例えば酵素活性）が系によってもたらされる条件下で、ＲＲＰポリペプチドを含む適切なアッセイ系を候補剤と接触させることを含む。作用剤の影響を受ける活性と対照活性との統計的に有意な差により、この候補剤がＲＲＰ活性を、したがってｐ５３又はｐ２１系を調節することが示される。
【００８３】
一次アッセイ
一般的に、試験するモジュレーターの種類によって一次アッセイの種類が決まる。
【００８４】
小分子モジュレーター用の一次アッセイ
小分子モジュレーターには、候補モジュレーターを同定するためにスクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイは、細胞に基づくものでもよく、またこの標的タンパク質に関連する生化学的反応を再度引き起こさせる又は保持する無細胞系を使用してもよい（Sittampalam GS他、Curr Opin Chem Biol、1997年、1:384〜91及び付随の参考文献に総説がある）。本明細書中で使用する用語「細胞に基づく」とは、生細胞、死滅細胞、又は膜分画、小胞体分画、ミトコンドリア分画など特定の細胞分画を使用したアッセイを言う。用語「無細胞」とは、実質的に精製されたタンパク質（内因性又は組換えによって生成された）、部分的に精製した細胞抽出物又は粗細胞抽出物を使用したアッセイを包含する。スクリーニングアッセイでは、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば受容体−リガンド結合）、転写活性（例えばレポーター遺伝子）、酵素活性（例えば基質の特徴を介するもの）、セカンドメッセンジャーの活性、免疫原性、及び細胞形態や他の細胞性特徴の変化を含めた様々な分子事象を検出することができる。適切なスクリーニングアッセイでは、蛍光、放射活性、比色、分光光度、及び電流滴定を含めた広範囲の検出方法を使用して、検出する具体的な分子事象の読出しを行うことができる。
【００８５】
好適な実施態様では、スクリーニングアッセイは、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動を含めた蛍光技術を使用する。これらの系は、色素で標識した分子から放出されたシグナルの強度がそのパートナー分子との相互作用に依存する、タンパク質-タンパク質又はＤＮＡ-タンパク質相互作用をモニターする手段を提供する（例えば、Selvin PR, Nat Struct Biol (2000) 7:730-4; Fernandes PB, Curr Opin Chem Biol (1998) 2:597-603; Hertzberg RP及びPope AJ, Curr Opin Chem Biol (2000) 4:445-451）。
【００８６】
通常、細胞に基づくスクリーニングアッセイには、ＲＲＰを組換えによって発現する系及び個々のアッセイで要求される任意の補助タンパク質が必要である。無細胞アッセイでは、組換えにより生産した、精製されたか又は実質的に精製されたタンパク質を使用することが多い。組換えタンパク質を生じさせる適切な方法では、関連する生物活性を保持しており、活性を最適化してアッセイの再現性を保証するのに十分な純度のタンパク質が、十分な量で生成される。酵母２ハイブリッドスクリーニング、変異体スクリーニング及び質量分析は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定し、タンパク質複合体を解明する好ましい方法を提供する。ある種の用途では、小分子モジュレーターを同定するスクリーニングにＲＲＰ相互作用タンパク質を使用する場合、ＲＲＰタンパク質に対する相互作用タンパク質の結合特異性を、基質による処理（例えば候補ＲＲＰに特異的に結合する作用剤の、ＲＲＰ発現性細胞におけるネガティブエフェクターとして機能する能力）、結合平衡定数（通常少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）、免疫原性（例えばマウス、ラット、ヤギ又はウサギなどの異種宿主中でＲＲＰに特異的な抗体を誘発する能力）など様々な周知の方法によってアッセイすることができる。酵素及び受容体について、結合はそれぞれ基質及びリガンドによる処理によってアッセイすることができる。
【００８７】
スクリーニングアッセイでは、ＲＲＰポリペプチド、その融合タンパク質、又はこのポリペプチドもしくは融合タンパク質を含む細胞又は膜に特異的に結合する、あるいはその活性を調節する、候補剤の能力を測定することができる。ＲＲＰポリペプチドは、完全長のものでも、また機能的なＲＲＰ活性を保持しているその断片でもよい。ＲＲＰポリペプチドは、検出又は固定用のペプチドタグあるいは別のタグなど別のポリペプチドに融合させてもよい。ＲＲＰポリペプチドは、好ましくはヒト又はマウスＲＲＰ、あるいは上記のようなそのオルソログ又は誘導体である。好ましい実施形態では、スクリーニングアッセイで、ＲＲＰと内因性タンパク質、外因性タンパク質、又はＲＲＰに特異的な結合活性を有する他の基質などの結合標的との相互作用の候補剤に基づく変調を検出し、これを使用して正常なＲＲＰ遺伝子機能を評価することができる。
【００８８】
ＲＲＰモジュレーターを探すためのスクリーニングに適合させることのできる適切なアッセイ様式は、当分野で周知である。好ましいスクリーニングアッセイは高スループット又は超高スループットであり、したがって、リード化合物用の化合物ライブラリをスクリーニングする、自動化された費用効果の高い手段を提供する（Fernandes PB、1998年、上掲; Sundberg SA、Curr Opin Biotechnol、2000年、11:47〜53）。
【００８９】
候補ＲＲＰ及びｐ５３又はｐ２１経路モジュレーターを同定するために様々な適切なアッセイ系を使用することができる（例えば、米国特許第６，０２０，１３５号（ｐ５３の変調）、米国特許第６，１１４，１３２号（ホスファターゼ及びプロテアーゼアッセイ））。好ましい特異的なアッセイを以下に詳述する。
【００９０】
プロテアーゼアッセイ。プロテアーゼは、タンパク質基質を特定の部位で切断する酵素である。例示的アッセイでは、プロテアーゼ媒介切断時に起こる、人工基質のスペプトル特性の変化を検出する。１つの例では、合成カスパーゼ基質は、２つの異なる蛍光タグを分離する４つのアミノ酸のタンパク質分解認識配列を有する；蛍光共鳴エネルギー遷移によって、これらフルオロフォアの近傍が検出され、それによって、基質が切断さるのか否かが示される（Mahajan NPら, Chem Biol (1999)6:401-409）。
【００９１】
内因性プロテアーゼ抑制因子はプロテアーゼ活性を阻害する。１又は複数のプロテアーゼの抑制因子のために開発された一例示的アッセイでは、ビオチン標識した基質をタイタープレートにコーティングし、プロテアーゼで加水分解する。アルカリ性ホスファターゼ−ストレプトアビジン複合体と反応させ、反応産物を検出することにより加水分解されない基質を定量化する。プロテアーゼ抑制因子の活性は、アルカリ性ホスファターゼ指標酵素と相関する（Gan Z他、Anal Biochem 1999） 268:151-156）。
【００９２】
アポトーシスアッセイ。細胞死用のアッセイは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼに媒介されたジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰニックエンド標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイによって実施することができる。ＴＵＮＥＬアッセイは、フルオレセイン−ｄＵＴＰの取り込み（Yonehara他、1989、J.Exp.Med.、169、1747）を追跡することによって細胞死に特徴的な核ＤＮＡの断片化を測定すること（Lazebnik他、1994、Nature、371、346）に使用される。組織培養細胞のアクリジンオレンジ染色によって細胞死をさらにアッセイすることができる（Lucas, R.他、1998、Blood、15:4730〜41）。アポトーシスアッセイ系は、ＲＲＰを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ｐ５３又はｐ２１機能を有する（例えば、野生型細胞に比べてｐ５３又はｐ２１が過剰発現又は過少発現されている）ものを含むことができる。このアポトーシスアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞死の誘発における変化により、候補ｐ５３又はｐ２１調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞系を使用して最初に同定された候補ｐ５３又はｐ２１調節剤を試験する二次アッセイとして、アポトーシスアッセイを使用することができる。また、ＲＲＰ機能が細胞死において直接役割を果たすかどうかを試験するためにアポトーシスアッセイを使用することもできる。例えば、野生型細胞に比べてＲＲＰを過剰発現又は過少発現する細胞でアポトーシスアッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した細胞死応答の差により、ＲＲＰが細胞死応答において直接役割を果たすことが示唆される。アポトーシスアッセイは、米国特許第６，１３３，４３７号にさらに記載されている。
【００９３】
細胞増殖及び細胞周期アッセイ。細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取り込みを介してアッセイすることができる。このアッセイでは、新しく合成されたＤＮＡにＢＲＤＵが取り込まれることにより、ＤＮＡが合成されている細胞集団が同定される。その後、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて（Hoshino他、1986年、Int.J.Cancer、38、369;Campana他、1988年、J.Immunol.Meth.、107、79）、又は他の手段によって、新しく合成されたＤＮＡを検出することができる。
【００９４】
また、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを使用して細胞増殖を検査することもできる（Chen, J.、1996年、Oncogene、13:1395〜403;Jeoung, J.、1995年、J.Biol.Chem.、270:18367〜73）。このアッセイにより、Ｓ期のＤＮＡ合成の定量的な特徴づけが可能になる。このアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞が新しく合成されるＤＮＡ中に［３Ｈ］−チミジンを取り込む。その後、シンチレーション計数器（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ  ３８００液体シンチレーション計数器）による放射性同位元素の計数など標準の技術によって取り込みを測定することができる。
【００９５】
また、軟寒天中のコロニー形成によって細胞増殖をアッセイすることもできる（Sambrook他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor、1989年）。例えば、ＲＲＰで形質転換させた細胞を軟寒天プレートに播種し、２週間インキュベートした後コロニーを測定して計数する。
【００９６】
フローサイトメトリーによって細胞周期における遺伝子の関与をアッセイすることができる。ＲＲＰで形質移入させた細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手可能）で評価することができる。
【００９７】
したがって、細胞増殖又は細胞周期アッセイ系は、ＲＲＰを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ｐ５３又はｐ２１機能を有する（例えば、野生型細胞に比べてｐ５３又はｐ２１が過剰発現又は過少発現されている）ものを含むことができる。このアッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した細胞増殖又は細胞周期の変化により候補ｐ５３又はｐ２１調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、無細胞キナーゼアッセイ系など別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３又はｐ２１調節剤を試験する二次アッセイとして、細胞増殖又は細胞周期アッセイを使用することができる。また、ＲＲＰ機能が細胞増殖又は細胞周期において直接役割を果たすかどうかを試験するために細胞増殖アッセイを使用することもできる。例えば、野生型細胞に比べてＲＲＰを過剰発現又は過少発現する細胞で細胞増殖又は細胞周期アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した増殖又は細胞周期の差により、ＲＲＰが細胞増殖又は細胞周期において直接役割を果たすことが示唆される。また、細胞増殖アッセイを使用して細胞増殖を調節する候補剤を同定することもできる。例えば、ＲＲＰの発現が低減した細胞、又はＲＲＰノックアウトである細胞、例えば前述の実施例（実施例８）において生成されたマウス細胞を候補剤で処理する。薬剤を添加しない対照細胞に対し、細胞増殖に変化が生じた場合、候補剤が細胞増殖を調節することが示唆される。
【００９８】
血管形成。臍帯、冠動脈、又は真皮細胞など様々なヒト内皮細胞系を用いて血管形成をアッセイすることができる。適切なアッセイには、増殖を測定するアラマーブルーに基づいたアッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能）；血管形成エンハンサー又はサプレッサーが存在する又は存在しない場合の細胞が膜を通り抜ける遊走を測定するＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｌｃｏｎ  ＨＴＳ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋセルカルチャーインサートの使用など蛍光分子を用いた遊走アッセイ；Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上の内皮細胞による管状構造の形成に基づいた細管形成アッセイが含まれる。したがって、血管形成アッセイ系は、ＲＲＰを発現する細胞、及び任意選択で欠陥ｐ５３又はｐ２１機能を有する（例えば、野生型細胞に比べてｐ５３又はｐ２１が過剰発現又は過少発現されている）ものを含むことができる。この血管形成アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した血管形成の変化により候補ｐ５３又はｐ２１調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３又はｐ２１調節剤を試験する二次アッセイとして、血管形成アッセイを使用することができる。また、ＲＲＰ機能が細胞増殖において直接役割を果たすかどうかを試験するために血管形成アッセイを使用することもできる。例えば、野生型細胞に比べてＲＲＰを過剰発現又は過少発現する細胞で血管形成アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した血管形成の差により、ＲＲＰが血管形成において直接役割を果たすことが示唆される。
【００９９】
低酸素誘発。転写因子である低酸素誘発性因子−１（ＨＩＦ−１）のαサブユニットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで低酸素に曝した後に腫瘍細胞中で上方制御される。低酸素条件下では、ＨＩＦ−１は、糖分解酵素やＶＥＧＦをコードする遺伝子など腫瘍細胞の生存に重要であることで知られている遺伝子の発現を刺激する。低酸素条件によるこのような遺伝子の誘発は、ＲＲＰで形質移入させた細胞を（例えばＮａｐｃｏ７００１インキュベーター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発生させた０．１％のＯ２、５％のＣＯ２、及び残りはＮ２を用いた）低酸素条件下及び正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）条件下で増殖させ、その後Ｔａｑｍａｎ（登録商標）によって遺伝子の活性又は発現を評価することによってアッセイすることができる。例えば、低酸素誘発アッセイ系は、ＲＲＰを発現する細胞、及び任意選択で変異したｐ５３又はｐ２１を有する（例えば、野生型細胞に比べてｐ５３又はｐ２１が過剰発現又は過少発現されている）ものを含むことができる。この低酸素誘発アッセイ系に試験剤を加えることができ、試験剤を加えない対照と比較した低酸素応答の変化により候補ｐ５３又はｐ２１調節剤が同定される。本発明の一部の実施形態では、別のアッセイ系を使用して最初に同定された候補ｐ５３又はｐ２１調節剤を試験する二次アッセイとして、低酸素誘発アッセイを使用することができる。また、ＲＲＰ機能が低酸素応答において直接役割を果たすかどうかを試験するために低酸素誘発アッセイを使用することもできる。例えば、野生型細胞に比べてＲＲＰを過剰発現又は過少発現する細胞で低酸素誘発アッセイを実施することができる。野生型細胞と比較した低酸素応答の差により、ＲＲＰが低酸素誘発において直接役割を果たすことが示唆される。
【０１００】
細胞接着。細胞接着アッセイでは、候補調節剤が存在する又は存在しない場合の、細胞と精製した接着タンパク質との接着、又は細胞の相互接着を測定する。
【０１０１】
細胞−タンパク質接着アッセイでは、細胞が精製したタンパク質に接着することを調節する作用剤の能力を測定する。例えば、組換えタンパク質を生成し、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングするのに使用する。陰性対照で使用するウェルはコーティングしない。その後、コーティングしたウェルを洗浄し、１％のＢＳＡで遮断し、再度洗浄する。化合物を２×最終試験濃度まで希釈し、ブロッキングした、コーティングしたウェルに加える。その後、細胞をウェルに加え、結合しなかった細胞を洗い流す。カルセイン−ＡＭなど膜透過性蛍光色素を加えることによって保持された細胞をプレート上で直接標識し、蛍光マイクロプレート読取装置でシグナルを定量する。
【０１０２】
細胞−細胞接着アッセイでは、ネイティブリガンドとの細胞接着タンパク質の結合を調節する作用剤の能力を測定する。これらのアッセイには、自然に又は組換えによって選択した接着タンパク質を発現する細胞を使用する。例示的なアッセイでは、細胞接着タンパク質を発現している細胞をマルチウェルプレートのウェル内に植え付ける。リガンドを発現している細胞をＢＣＥＣＦなど膜透過性蛍光色素で標識し、候補剤の存在下で単層に接着させる。結合しなかった細胞を洗い流し、蛍光プレート読取装置を使用して結合した細胞を検出する。
【０１０３】
ハイスループット細胞接着アッセイも記載されている。このようなアッセイの１つでは、マイクロアレイスポッターを使用して小分子リガンド及びペプチドを顕微鏡スライドの表面に結合させ、その後、未処置の細胞をスライドと接触させ、結合しなかった細胞を洗い流す。このアッセイでは、細胞系に対するペプチド及びモジュレーターの結合特異性が決定されるだけでなく、付着した細胞の機能的細胞シグナル伝達も、マイクロチップ上で免疫蛍光技術をｉｎ  ｓｉｔｕで使用して測定される（Falsey JR他、Bioconjug Chem.、2001年5-6月、12(3):346〜53）。
【０１０４】
抗体及び核酸モジュレーターを試験するために、特定のスクリーニングアッセイを使用することもできる。核酸モジュレーターの適切なアッセイ系はＲＲＰ  ｍＲＮＡ発現を含む。
【０１０５】
抗体モジュレーターの一次アッセイ
抗体モジュレーターでは、適切な一次アッセイ試験は、ＲＲＰタンパク質に対する抗体の親和性及び特異性を試験する結合アッセイである。抗体の親和性及び特異性を試験する方法は当分野で周知である（Harlow及びLane、1988年、1999年、上掲）。ＲＲＰに特異的な抗体を検出する好ましい方法は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である。他の方法には、ＦＡＣＳアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び蛍光アッセイが含まれる。
【０１０６】
核酸モジュレーターの一次アッセイ
核酸モジュレーターでは、一次アッセイにより核酸モジュレーターがＲＲＰ遺伝子の発現、好ましくはｍＲＮＡの発現を阻害又は増強する能力を試験し得る。一般的に、発現分析には、核酸モジュレーター存在下又は非存在下の細胞の類似集団（例えば、内因的に又は組換えによってＲＲＰを発現する２種の細胞プール）中のＲＲＰ発現を比較することが含まれる。ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を分析する方法は当分野で周知である。例えば、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを使用）、又はマイクロアレイ分析を使用して、核酸モジュレーターで処置した細胞中でＲＲＰ  ｍＲＮＡの発現が低減していることを確認することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;Blohm DH及びGuiseppi-Elie、A Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。タンパク質の発現をモニターすることもできる。タンパク質は、最も一般的にはＲＲＰタンパク質又は特異的なペプチドのどちらかに対する特異的な抗体又は抗血清を用いて検出される。ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ｉｎ  ｓｉｔｕ検出を含めた様々な手段が利用可能である（Harlow E及びLane D、1988年及び1999年、上掲）。
【０１０７】
二次アッセイ
調節剤がｐ５３又はｐ２１経路に関連する様式でＲＲＰに影響を与えることを確認するために、二次アッセイを使用して上記の任意の方法によって同定したＲＲＰ調節剤の活性をさらに評価することができる。本明細書中で使用するＲＲＰ調節剤は、以前に同定した調節剤から誘導した候補臨床化合物又は他の作用剤を包含する。また、二次アッセイを使用して、特定の遺伝的又は生化学的経路におけるモジュレーターの活性を試験するために、あるいはモジュレーターがＲＲＰと相互作用する特異性を試験することもできる。
【０１０８】
二次アッセイでは一般的に、候補モジュレーター存在下又は非存在下において、細胞や動物の類似集団（例えば、内因的に又は組換えによってＲＲＰを発現する２種の細胞プール）を比較する。一般的に、このようなアッセイでは、候補ＲＲＰ調節剤を用いて細胞や動物を処置することにより、処置しない（あるいはモック処置又は偽薬で処置した）細胞や動物と比較してｐ５３又はｐ２１経路に変化がもたらされるかどうかを試験する。特定のアッセイでは、「感作させた遺伝的バックグラウンド」を使用する。本明細書中で使用する「感作させた遺伝的バックグラウンド」とは、ｐ５３又はｐ２１又は相互作用する経路における遺伝子の発現が変化するように操作した細胞や動物を表す。
【０１０９】
細胞に基づいたアッセイ
細胞に基づいたアッセイでは、欠陥ｐ５３又はｐ２１機能を有することで知られている様々な哺乳動物細胞系（例えば、ｐ５３については、特にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、バージニア州マナサスから入手可能であるＳＡＯＳ−２骨芽細胞、Ｈ１２９９肺癌細胞、Ｃ３３Ａ及びＨＴ３子宮頚癌細胞、ＨＴ−２９及びＤＬＤ−１大腸癌細胞、及び、ｐ２１については、特に同様に入手可能なＨＣＴ１１６大腸癌細胞）を使用してもよい。細胞に基づいたアッセイでは内因性ｐ５３又はｐ２１経路活性を検出するか、あるいはこれはｐ５３又はｐ２１経路構成要素の組換えによる発現に依存し得る。前述の任意のアッセイをこの細胞に基づいた形式で使用することができる。候補モジュレーターは、通常は細胞培地に加えるが、細胞に注入する又は任意の他の有効な手段によって送達してもよい。
【０１１０】
動物アッセイ
候補ＲＲＰモジュレーターを試験するために、正常又は欠陥のあるｐ５３又はｐ２１経路の様々な非ヒト動物のモデルを使用することができる。通常、欠陥ｐ５３又はｐ２１経路のモデルでは、ｐ５３又はｐ２１経路に関与する遺伝子がミスエクスプレスされる（例えば過剰発現又は発現が欠けている）ように操作された遺伝子改変動物を使用する。一般的に、アッセイには、経口投与、注入などによって候補モジュレーターを全身に送達する必要がある。
【０１１１】
好ましい実施形態では、新血管新生及び血管形成をモニターすることによってｐ５３又はｐ２１経路の活性を評価する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）アッセイにおける、ＲＲＰに対する候補モジュレーターの影響を試験するために、欠陥のあるｐ５３又はｐ２１及び正常なｐ５３又はｐ２１を有する動物モデルを使用する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は基底膜タンパク質の抽出物であり、主にラミニン、コラーゲンＩＶ、及びヘパリン硫酸プロテオグリカンから構成される。これは、４℃の無菌的な液体として提供されるが、３７℃で迅速にゲルを形成する。液体のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）を、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦなど様々な血管形成剤、又はＲＲＰを過剰発現するヒト腫瘍細胞と混合する。その後、激しい血管性応答をサポートするためにこの混合物を雌の無胸腺ヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）に皮下注入する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを有するマウスに、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）、又は静脈内（ＩＶ）経路で候補モジュレーターを投薬してもよい。注入後５〜１２日にマウスを安楽死させ、ヘモグロビン分析のためにＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ペレットを回収する（Ｓｉｇｍａ  ｐｌａｓｍａ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｋｉｔ）。ゲルのヘモグロビン含有量は、ゲル中の新血管新生の程度と相関していることが判明した。
【０１１２】
別の好ましい実施形態では、ＲＲＰにおける候補モジュレーターの効果を腫瘍形成アッセイによって評価する。一例では、異種移植ヒト腫瘍を皮下注入（ＳＣ）で、既存の腫瘍由来又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物由来のいずれかの単一細胞懸濁液として、６〜７週齢の雌の無胸腺マウスに移植する。内因的にＲＲＰを発現する腫瘍を、マウス１匹あたり１×１０５〜１×１０７個の細胞を１００μＬの体積で、２７ゲージの針を用いて脇腹に注入する。その後、マウスの耳に札をつけ、週２回腫瘍を測定した。平均腫瘍重量が１００ｍｇに達した日に候補モジュレーターによる処置を開始した。候補モジュレーターは、ボーラス投与によって静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、又は経口（ＰＯ）投与で送達される。それぞれの独特な候補モジュレーターの薬理動態（ＰＫ）に応じて、１日に複数回投薬を行うことができる。腫瘍の重量を、カリパーを用いて垂直直径を測定することによって評価し、２つの次元の直径の測定値を掛け合わせることによって計算した。実験の最後に、切除した腫瘍をさらなる分析用のバイオマーカーの同定に利用することができる。免疫組織化学染色では、異種移植腫瘍を４％のパラホルムアルデヒド、０．１Ｍのリン酸、ｐＨ７．２で６時間、４℃に固定し、ＰＢＳ中３０％のショ糖に浸し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で迅速に凍結させる。
【０１１３】
診断及び治療上の使用
特異的なＲＲＰ調節剤は、疾病又は疾病予後が血管形成、細胞死、又は増殖疾患などｐ５３又はｐ２１経路の欠陥に関連している様々な診断及び治療用途に有用である。したがって、本発明は、ＲＲＰ活性を特異的に調節する作用剤を細胞に投与するステップを含む、細胞、好ましくは欠陥ｐ５３又はｐ２１機能を有することが事前に確定されている細胞におけるｐ５３又はｐ２１経路を調節する方法も提供する。
【０１１４】
ＲＲＰがｐ５３又はｐ２１経路に関係しているという発見により、ｐ５３又はｐ２１経路の欠陥に関与する疾病及び疾患の診断及び予後評価、ならびにこのような疾病及び疾患の素因を有する対象の同定に使用可能な様々な方法が提供される。
【０１１５】
特定の試料でＲＲＰが発現されるかどうかを診断するために、ノーザンブロッティング、スロットブロッティング、ＲＮＡ分解酵素保護、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、及びマイクロアレイ分析など様々な発現分析方法を使用することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、1994年、Ausubel FM他編、John Wiley&Sons, Inc.、第4章;Freeman WM他、Biotechniques、1999年、26:112〜125;Kallioniemi OP、Ann Med、2001年、33:142〜147;Blohm及びGuiseppi-Elie、Curr Opin Biotechnol、2001年、12:41〜47）。ＲＲＰを発現する欠陥ｐ５３又はｐ２１シグナル伝達に関係づけられている疾病又は疾患を有する組織は、ＲＲＰ調節剤を用いた処置を受け入れることが同定されている。好ましい用途では、ｐ５３又はｐ２１欠陥組織は正常組織に比べてＲＲＰを過剰発現する。例えば、完全又は部分ＲＲＰ  ｃＤＮＡ配列をプローブとして使用した、腫瘍及び正常細胞系由来、又は腫瘍及び同一患者からの対応する正常組織試料由来のｍＲＮＡのノーザンブロット分析により、具体的な腫瘍がＲＲＰを発現又は過剰発現するかどうかを決定することができる。あるいは、細胞系、正常組織及び腫瘍試料中のＲＲＰ発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）を使用する（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１１６】
例えばＲＲＰオリゴヌクレオチドなどの試薬、及びＲＲＰに対する抗体を利用して、上に記載した（１）ＲＲＰ遺伝子変異の存在の検出、又は疾患でない状態と比較したＲＲＰ  ｍＲＮＡの過剰発現又は過少発現のいずれかの検出、（２）疾患でない状態と比較したＲＲＰ遺伝子産物の過剰存在又は過少存在のいずれかの検出、ならびに（３）ＲＲＰに媒介されたシグナル伝達経路における摂動又は異常の検出のために、様々な他の診断方法を実施することができる。
【０１１７】
したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ａ）患者から生体試料を得ること、（ｂ）試料をＲＲＰ発現用のプローブと接触させること、（ｃ）ステップ（ｂ）からの結果を対照と比較すること、及び（ｄ）ステップ（ｃ）が疾病の可能性を示しているかどうかを決定することを含む、患者の疾病を診断する方法を対象としている。好ましくは、この疾病は癌であり、最も好ましくは表１に示す癌である。プローブは、ＤＮＡ又は抗体を含めたタンパク質のどちらであってもよい。
【実施例】
【０１１８】
以下の実験セクション及び実施例は、限定ではなく例示のために提供するものである。
【０１１９】
Ｉ．ショウジョウバエｐ５３及びｐ２１のスクリーニング
痕跡翅マージンクアドラントエンハンサー（ｖｅｓｔｉｇｉａｌ  ｍａｒｇｉｎ  ｑｕａｄｒａｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）を用いて、ショウジョウバエのｐ５３又はｐ２１遺伝子を翅中に特異的に過剰発現させた。ショウジョウバエのｐ５３又はｐ２１の量を増加させることにより（様々な強度のトランスジェニックインサートを１又は２コピー使用して力価を測定）、翅毛のパターン及び極性が破壊されること、翅脈が短縮及び肥厚されること、翅に進行的なしわが寄ること、翅翼（ｗｉｎｇ  ｂｌａｄｅ）に暗色の「死」の封入体が現れることを含む表現型を伴う、正常な翅形態の中程度から強度の劣化が引き起こされた。ショウジョウバエのｐ５３又はｐ２１のエンハンサー及びサプレッサーを同定するために設計されたスクリーニングでは、ｐ５３又はｐ２１を２コピー保有しているホモ接合性の雌を、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンの無作為なインサートを含む５６６３雄と交配させた（Fraser M他、Virology、1985年、145:356〜361）。ｐ５３又はｐ２１表現型の亢進又は抑制について、インサートを含む子孫をインサートを含まない兄弟子孫（ｓｉｂｌｉｎｇ  ｐｒｏｇｅｎｙ）と比較した。ｐｉｇｇｙＢａｃ挿入部位の周囲の配列情報を使用してモディファイヤー遺伝子を同定した。翅の表現型のモディファイヤーはｐ５３経路のメンバーとして同定された。
【０１２０】
サイクリン依存キナーゼインヒビターであるｐ２１と相互作用する遺伝子を同定するため、ショウジョウバエにおいて過剰発現スクリーニングを行った（Bourne HR他、Nature, 1990年、348(6297):125-132; Marshall CJ, Trends Genet, 1991年、7(3):91-95）。ｐ２１遺伝子が眼に発現したことにより、正常な眼形態に劣化が生じた。眼表現型のモディファイヤーはｐ２１経路のメンバーとして同定された。
【０１２１】
ＩＩ．ハイスループットのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ蛍光偏光アッセイ
蛍光標識したＲＲＰペプチド／基質を、試験緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６）中の試験剤と共に９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ  ＦＰＭ−２  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いて決定した蛍光偏光の対照値に対する変化により、試験化合物がＲＲＰ活性の候補モディファイヤーであることが示される。
【０１２２】
ＩＩＩ．ハイスループットのＩｎ  Ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
３３Ｐ標識のＲＲＰペプチドを、試験剤と共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の反応混液）中で、Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ−アビジンでコーティングしたアッセイプレートに加え、２５℃で１時間インキュベートした。その後、ビオチン標識した基質を各ウェルに加え、１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄することによって反応を停止させ、シンチレーション計数器で計数した。試験剤を用いない対照に比べて活性に変化を引き起こさせる試験剤が、候補ｐ５３又はｐ２１調節剤として同定された。
【０１２３】
ＩＶ．免疫沈降及び免疫ブロッティング
形質移入させたタンパク質の共沈では、ＲＲＰタンパク質を含む３×１０６個の適切な組換え細胞を１０ｃｍのディッシュに植え付け、発現用コンストラクトを用いて次の日に形質移入させた。空ベクターを加えることによって、それぞれの形質移入で総ＤＮＡ量を一定に保った。２４時間後、細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのグリセロホスフェート、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、５ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸、２ｍＭのジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤（ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、及び１％のノニデットＰ−４０を含む溶解緩衝液１ｍｌ中、氷上で２０分間溶解させた。１５，０００×ｇ、１５分間の遠心分離２回によって、細胞細片を取り除いた。細胞溶解物を２５μｌのＭ２ビーズ（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間、４℃で緩やかに揺り動かしながらインキュベートした。
溶解緩衝液でよく洗浄した後、ＳＤＳ試料緩衝液中で煮沸することによってビーズに結合したタンパク質を溶解させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画し、ポリ二フッ化ビニリデン膜に移し、標識した抗体を用いてブロットした。適切な二次抗体に結合した西洋わさびペルオキシダーゼ及び高感度化学発光（ＥＣＬ）ウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって、反応性のあるバンドを可視化させた。
【０１２４】
Ｖ．発現分析
以下の実験で使用したすべての細胞系はＮＣＩ（米国立癌センター）の系であり、ＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション、バージニア州マナサス、２０１１０〜２２０９）から入手可能である。正常組織及び腫瘍組織は、Ｉｍｐａｔｈ、ＵＣ  Ｄａｖｉｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、及びＡｍｂｉｏｎから得た。
【０１２５】
様々な試料中における開示した遺伝子の発現レベルを評価するために、ＴａｑＭａｎ分析を使用した。
【０１２６】
Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）のＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔを使用し、製造者のプロトコルに従って各組織試料からＲＮＡを抽出して最終濃度５０ｎｇ／μｌにした。その後、ランダムの六量体及び各反応５００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／）のプロトコル４３０４９６５に従ってＲＮＡ試料を逆転写させることによって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【０１２７】
ＴａｑＭａｎプロトコルならびに以下の基準に従って、ＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用した発現分析用のプライマーを調製した。その基準は、ａ）ゲノムの混入を排除するために、イントロンにまたがるようにプライマーの対を設計すること、及びｂ）各プライマーの対が１つの産物のみを生成することである。
【０１２８】
製造者のプロトコルに従って、３００ｎＭのプライマー及び２５０ｎＭのプローブならびに約２５ｎｇのｃＤＮＡを、９６ウェルプレートでは２５μｌの全体積、３８４ウェルプレートでは１０μｌの全体積で使用して、Ｔａｑｍａｎ反応を実施した。標的が大量に存在する可能性が高くなるように広範囲の組織由来のｃＤＮＡを含む混合物である、ヒトｃＤＮＡ試料のユニバーサルプール（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｏｏｌ）を使用して結果分析用の標準曲線を作成した。１８ＳのｒＲＮＡ（すべての組織及び細胞中で普遍的に発現される）を使用して生データを正規化した。
【０１２９】
それぞれの発現分析について、腫瘍組織試料を、同一患者からの対応する正常組織と比較した。対応する正常試料と比べて腫瘍中の遺伝子発現レベルが２倍以上高い場合に、ある遺伝は腫瘍中で過剰発現されているとみなされる。正常組織が入手可能でない場合は、ｃＤＮＡ試料のユニバーサルプールを代わりに使用する。これらの場合では、腫瘍試料と同じ組織タイプからのすべての正常試料の平均との発現レベルの差が、すべての正常試料の標準偏差（すなわち、腫瘍−平均（すべての正常試料）＞２×ＳＴＤＥＶ（すべての試料））の２倍を超える場合に、遺伝子は腫瘍試料中で過剰発現されているとみなされる。
【０１３０】
結果を表１に示す。太字で表したデータは、第１列に示した組織タイプの試験した腫瘍試料のうち５０％を超えるものが正常試料に比べて列１に記載した遺伝子を過剰発現したことを示す。下線を引いたデータは、試験した腫瘍試料のうち２５％〜４９％が過剰発現を示したことを示す。遺伝子が過剰発現されている腫瘍に投与することによって、本明細書中に記載したアッセイによって同定されたモジュレーターの治療上の効果をさらに検証することができる。腫瘍増殖の低下により、モジュレーターの治療上の有用性が確認される。患者から腫瘍試料を得、モジュレーターが標的としている遺伝子の発現をアッセイすることによって、モジュレーターを用いて患者を処置する前に患者が処置に応答する可能性を診断することができる。この遺伝子（又は複数の遺伝子）の発現データも、疾病の進行を診断する上でのマーカーとして使用することができる。このアッセイは、上記の発現分析によって、遺伝子標的に対する抗体によって、又は任意の他の利用可能な検出方法によって実施することができる。
【０１３１】
表１
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【０１３２】
ＶＩ．細胞生物学及び機能的特徴
ＲＲＰ局在化。ショウジョウバエにおいて、ロンボイドは細胞表面タンパク質である。しかしながら、ヒトＲＲＰの局在化はこれまでに起こっていない。さらに、ヒトにおいては、ロンボイドの各終端が細胞内であるのか、細胞外であるのかは知られていない。これらの疑問に答えるため、製造者のプロトコルに従って、ｃ末端にｍｙｃ−ｈｉｓタグを有するフレームにおいてｐｃＤＮＡ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にＲＲＰ１をサブクローニングした。その結果得られた発現ベクターを、リポフェクトアミンプラス試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてヒト胚性腎臓ＨＥＫ−２９３細胞中に形質移入した。次いで細胞に抗ｍｙｃ抗体を使用した免疫蛍光染色法を行い、ＲＲＰ１を局在化させた。この実験の結果により、ＲＲＰ１が細胞表面に発現することが示された。さらに、透過化処理した細胞（ＰＢＳ中０．１％のトリトン）と透過化処理していない細胞は同じ染色パターンを示し、タンパク質のｃ末端が外側に、Ｎ末端が内側にあることが示された。ＲＲＰ２〜ＲＲＰ８も各タンパク質の局在化のためにｃ末端にサブクローニングしてタグを付し、それぞれについてタンパク質末端の方向を評価した。
【０１３３】
ＥＧＦＲシグナル伝達経路におけるＲＲＰの関与。ショウジョウバエのロンボイドはＥＧＦＲ経路に必須であるが、ヒトＲＲＰの機能はこれまで評価されて来なかった。ＥＧＦＲシグナル伝達経路におけるヒトＲＲＰの役割を評価するため、ＣａＰＯ４形質移入キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、内因性ＥＧＦＲ活性を有するＨｅｌａ細胞内にＲＲＰ１を安定的に形質移入した。安定的な細胞をプールし、以下のようなアッセイで試験した。
【０１３４】
チロシンリン酸化により測定したＥＧＦＲ活性。
抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いた抗ホスホチロシンに対する免疫ブロットにより、ＲＲＰ１を過剰発現するＨｅｌａ細胞と親Ｈｅｌａ細胞をＥＧＦＲチロシンリン酸化について試験した。ＲＲＰ１を過剰発現する細胞では、対照である親Ｈｅｌａと比較して、ＥＧＦＲチロシンリン酸化が２倍増大した。
【０１３５】
ＲＲＰ１過剰発現細胞におけるＥＧＦＲ発現。
ＲＲＰ１を過剰発現している細胞中ダイレクト細胞ライセートに対して抗ＥＧＦＲ抗体を使用する免疫ブロット法により試験した場合、ＥＧＦＲの発現は増大した。さらに、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析をおこなったとき、ＥＧＦＲの発現はＲＲＰ１を過剰発現している腫瘍試料においても増大した。ＥＧＦＲ及びＲＲＰ１の過剰発現の一致についてインビトロ及びインビボ双方の結果の相関性が有する有意性は高く、任意の腫瘍試料又は細胞系における２つのタンパク質の機能的関係を評価するためのツールを提供するものであった。
【０１３６】
細胞増殖及び移動
Ｐｒｏｃｈｅｃｋ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）及びアラマーブルー（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）化学発光アッセイにより測定したところ、ＲＲＰ１を過剰発現しいているＨｅｌａ細胞では、Ｈｅｌａ親細胞と比較して細胞増殖が２倍増大した。加えて、Ｆｌｕｒｏｂｌｏｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）分析により、Ｈｅｌａ親細胞と比較してＲＲＰ１を過剰発現している細胞では若干の運動性増大が示された。
【０１３７】
総合すると、上記の結果は、進化に亘るロンボイドの強い機能保存を示すものである。さらに、腫瘍試料及び細胞系におけるＲＲＰ１発現の増大、それに伴うＥＧＦＲ発現の増大、並びにＲＲＰ１を発現している細胞の増殖及び運動性の増大は、様々な癌にＲＲＰ１が関わっていることを示す。したがって、ＲＲＰ１の発現レベルを使用してＥＧＦＲ経路の不全を有する腫瘍をスクリーニングし、本発明の方法により同定された化合物及び抗体を用いた治療の影響を受ける腫瘍を同定することができる。上述と同じ実験をＲＲＰ２〜ＲＲＰ８に実施して、ＥＧＦＲシグナル伝達経路におけるそれらの関与を評価した。
【０１３８】
ＲＲＰ１結合標的。ショウジョウバエでは、ロンボイドは、Ｓｐｉｔｚ（ヒトＴＧＦ−αの相同体）を膜結合型から分泌型へ形質変換し、よってＤＥＲ（ショウジョウバエＥＧＦＲ）経路を誘発及び上方制御する。ヒトロンボイドにはこれまでそのような機能は示されていなかった。ＨＥＫ２９３細胞をＲＲＰ１及びＴＭ−ＴＧＦ−α膜貫通結合ＴＧＦで過渡的に同時形質変換し、次いで抗ｍｙｃ抗体を用いて（ＲＲＰ１について）免疫沈降し、抗ＴＧＦ−αを用いて免疫ブロットした。ベクターのみ、ＲＲＰ１のみ、又はＴＭ−ＴＧＦ−αのみで形質移入した細胞を対照群として使用した。ＴＧＦ−αの大きさに対応する帯域が抗ＴＧＦ−α抗体により同定されたが、一方対照レーンにおいては帯域は検出されなかった。このデータは、ＲＲＰ１が物理的にＴＧＦ−αと相互作用することを示す。同じ実験をＲＲＰ２〜ＲＲＰ８に実施し、それらの結合パートナーを決定した。
【０１３９】
ＨＢ＿ＥＧＦ及びＥＲＫリン酸化に対するＲＲＰ１の影響。ＲＲＰ１をＨＥＫ２９３胚性腎臓細胞に形質移入し、ＨＢ＿ＥＧＦ（ＥＧＦＲリガンド）及びＥＲＫリン酸化に対するＲＲＰ１の影響を調査した。製造者のプロトコルに従って、Ｎ末端ＦＬＡＧを有する哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＲＲＰ１完全長クローンを挿入した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルのプレートに１ウェル当たり６００，０００の密度で播種し、ペニシリン／ストレプトマイシン反応混液及びウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％のＤＭＥＭ中で成長させた。播種した細胞は３７℃及びＣＯ２５％で２４時間成長させた。製造者のプロトコルに従って、リポフェクトアミンプラス試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してウェル当たりＲＲＰ１プラスミド２μｇで細胞を形質移入した。形質移入の３時間後、ＦＢＳ濃度を１０％に引き上げ、ＤＭＥＭにより総容量を４ｍｌまで増加して、細胞をインキュベーターに戻し、４８時間置いた。次いで形質移入した細胞にウェスタン分析を実施した。プロテアーゼ及びホスホターゼインヒビターを含むＮＰ４０溶解緩衝液中に溶解した。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイ試薬によりタンパク質の濃度を測定し、１０％のＮＵＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上の各レーンにタンパク質２０μｇを添加し、ＮＵＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ指示書に従って取り扱い、ニトロセルロース紙に移した。ブロックのため、ブロットを０．５％の脱脂乳１０ｍｌに２時間浸し、洗浄した。次いで適当に希釈した（結合緩衝液中で希釈）一次抗体を加えた：マウスα―ＦＬＡＧ：:１：１０００；マウスα−ＨＢＥＧＦ：１：１０００（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ウサギα−総ＥＲＫ：１：１０００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；ウサギα−リン酸化ＥＲＫ：１：１０００（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）。ブロットをすすぎ、二次抗体を添加した：ロバα−ラビット：１：１００００（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）；ロバα−マウス：１：１００００（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）。次いでブロットをすすぎ、指示に従ってスーパーシグナルＷｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄｅ溶液とルミノール／エンハンサー溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）１：１で５分間インキュベートし、フィルムに露出した。これらの実験では、ＲＲＰ１形質移入ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞はＨＢ−ＥＧＦのレベル上昇、及びＥＲＫリン酸化の上昇を示した。
【０１４０】
ショウジョウバエでは、ＲＲＰ１が、活性化したＥＧＦＲリガンド（spitz；上掲）の切断及び解放によりＥＧＦＲシグナル伝達を増大させることが示されている。本発明の発見はこれらの報告と一貫性を有する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトＲＲＰ１の過渡的な形質移入は、明らかにＥＧＦＲ活性の下流におけるシグナル伝達イベントであるＥＲＫリン酸化を誘発した。加えて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＲＲＰ１とＨＢ−ＥＧＦ（ヒトのＥＧＦＲリガンドの１つ）を同時に形質移入すると、ＨＢ−ＥＧＦ形質移入だけの場合より、ＨＢ−ＥＧＦタンパク質レベルが高かった。これは、ＲＲＰ１が細胞内のＥＧＦＲリガンドの全体的なレベルを上昇させることができることを示す。総じて、これらの実験により、ヒトＲＲＰ１がＥＧＦＲシグナル伝達を増大させることが示された。
【０１４１】
ＥＧＦＲ及びＨＢ−ＥＧＦインヒビターを用いたＲＲＰ１形質移入細胞の治療。この実験の目的は、ＲＲＰ１形質移入細胞におけるリン酸化ＥＲＫレベルに対するＥＧＦＲ及びＨＢ−ＥＧＦインヒビターの影響を試験することであった。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を上述のように成長させ、形質移入した。形質移入後２４時間及び４４時間経過した時点で、次のようにＥＧＦＲ又はＨＢ−ＥＧＦインヒビターをウェルに添加した：ＨＢ＿ＥＧＦについては、ＨＢ−ＥＧＦマウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；１０μｇ／ｍｌ）、及びＣＲＭ１９７（１０μｇ／ｍｌ）。ＥＧＦＲについては、Ａｂ２２５マウスモノクローナル抗体（ＡＴＣＣ；５μｇ／ｍｌ）及び１６８３９３小分子インヒビター（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；２．７μＭ）。形質移入後４８時間で細胞ライセートを回収し、上述のように、ウェスタン分析により分析した。両方のＥＧＦＲインヒビター（Ａｂ２２５及び１６８３９３）がＲＲＰ１形質移入細胞のｐＥＲＫレベルを低下させた。抗ＨＢＥＧＦ抗体もＲＲＰ１形質移入細胞のｐＥＲＫレベルを低下させることができた。ＨＢＥＧＦインヒビターＣＲＭ１９７は影響を持たなかった。この結果は、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードに影響を与える抗体／化合物を試験するためのアッセイの設計に利用できるかもしれない。観察された結果に基づき、本発明は次の仮説を提案する：ヒトＲＲＰ１はＨＢ−ＥＧＦの切断／削減によりＥＧＦＲ／Ｅｒｋシグナル伝達を増大させる。ＥＧＦＲシグナル伝達は腫瘍形成において中心的な要因であり、ＨＢ−ＥＧＦは自己分泌及びその他メカニズムにより腫瘍を発達させる最も重要な成長因子の１つである。従って、ＲＲＰ１は、癌及びＥＧＦＲシグナル伝達の異常に関するその他疾病に重要な役割を果たしている可能性がある。
【０１４２】
ヒトロンボイドに対する抗体。本明細書においてペプチド１と呼ぶペプチド抗体（配列番号１７）をＲＲＰ１のＮ末端に対して作成した。この抗体は、ホルマリンで固定した細胞又はウェスタンブロット上のタンパク質などにおいて、変性ＲＲＰ１に強い親和性を示した。加えて、透過化処理した細胞を、（ＲＲＰ１のｃ末端について）抗ｍｙｃ抗体及びペプチド１で同時染色した時、染色パターンは依然として同じであった。これは、ペプチド１がＲＲＰ１を認識しないことを示す。さらに、細胞は、透過化処理しないときのみ強く免疫染色された。これは、ＲＲＰ１のＮ末端が細胞内にあることを意味する。この結果は、Ｃ末端に抗ｍｙｃ抗体を使用した前述の染色パターンと相関している。
【０１４３】
腫瘍におけるＲＲＰ１タンパク質の発現を、ペプチド１を使用した免疫組織化学（ＩＨＣ）により実験した。免疫前血清の背景染色と比較して、大腸腺癌組織の部分の上皮細胞にポジティブな染色が観察された。これは、抗体が、ある大腸癌細胞におけるその標的、即ちＲＲＰ１に特性であることを示す。さらに、結腸直腸腺癌の染色の上昇が、ペプチド１抗体を使用する一致する正常組織と比較して観察された。総合すると、これらの結果により、腫瘍試料においてＲＲＰ１の発現レベルを評価するためにペプチド１抗体が強力なツールとなることが示された。腫瘍における残りのＲＲＰの発現を評価するために、それらのＲＲＰに対する抗体も生産された。
【０１４４】
ＶＩＩ．マウスＲＲＰ１（ｍＲＲＰ１）遺伝子構造
ＢＡＣショットガン配列決定法（参考文献としてGreen ED.(2001) Nature Review Genetics 2:573-583を参照）を使用してマウスＲＲＰ１遺伝子のイントロン／エキソン構造を決定した。部分的ラットｃＤＮＡ及びヒト遺伝子構造のｇｅｎｂａｎｋ入力に基づき、マウスゲノムＤＮＡ由来のマウスＲＲＰ１遺伝子の一部を増幅することができるＰＣＲプライマーの一対を設計した。（ＲＲＰ１（配列番号４８）：５‘−ＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＡＣＴＧＧＴＣ；ＲＲＰ８（配列番号４９）：５’−ＧＡＧＣＡＧＣＴＡＧＧＧＴＴＣＡＡＴＧ、９５℃で１２０秒、９５℃で４５秒、６０℃で４５秒、７２℃で４５秒、４０回、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）。次いで、このＰＣＲプライマーの組を使用してＩｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（米国セントルイス）から市販されているＥＳ−１２９ＳｖＪ  ＢＡＣライブラリをスクリーニングした。２つのＰＣＲポジティブクローンが同定された（クローンアドレス１７８／Ｏ１５及び１９５／Ｄ１５）。標準的手順に従ってショットガン配列決定ライブラリを構築するために、クローン１９５／Ｄ１５を選択した（ＴＯＰＯショットガンサブクローニングキット、＃Ｋ−７０００−０１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。配列アセンブリに基づき、ｍＲＲＰ１遺伝子全体を含む３０キロベース（ｋｂ）の隣接するゲノム配列が同定された。続いて、遺伝子ターゲッティング法に使用されるｍＲＲＰ１ゲノム領域を増幅させるためのＰＣＲテンプレートとして１９５／Ｄ１５  ＢＡＣ由来のＤＮＡを機能させた。ｍＲＲＰ１遺伝子は、少なくとも２．６ｋｂのゲノム領域に亘る８つのエキストンを有する。翻訳は、エキソン１と定義された配列範囲における翻訳の開始は同定されておらず、よってさらに５‘エキソンが存在する可能性がある。
【０１４５】
ＶＩＩＩ．マウスの生成
ターゲッティング戦略
本発明では、同一細胞においてベクター配列を連続削除できるターゲッティング戦略を利用した。ｍRRP1標的ＥＳ細胞の注入により生成したキメラを使用して、ｉ）Ｃｒｅ−ｄｅｌｅｔｅｒマウスへのブリーディングにより不活性化したｍＲＲＰ遺伝子を有するＫＯマウス（後述）、並びに、ｉｉ）ＦＬＰ−ｄｅｌｅｔｅｒマウスへのブリーディングにより組織特異的又は時間特異的に削除できる機能的ｍＲＲＰ１を有するマウス(後述)を生成することができた。
【０１４６】
この戦略は、両方のキメラにおいてＮＥＯ選択カセットが除去され、よって選択マーカーのハイポモルフ的影響の可能性が回避されるという利点を有する。
【０１４７】
ターゲッティングベクター
野生型（ＷＴ）ゲノム配列に組み込まれるヌクレオチド配列を有するターゲッティングベクター、及び１以上の選択可能マーカー（図１）を、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓから入手したマウス種１２９ＳｖＪバックグラウンド由来のＢＡＣゲノムクローンに基づいて作成した。相同的置換後にｍＲＲＰ１遺伝子のエキソン２〜８がＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（ｌｏｘＰ部位）と隣接するようにｍＲＲＰ１ターゲッティングベクターを設計した。マウスＲＲＰのエキソン２．８はタンパク質活性を与えるロンボイドドマインをコードするので、エキソン２〜８を削除すると対立遺伝子が０になる。３つのゲノム断片をＰＣＲにより増幅し、基本ベクターｐＥａｓｙｆｌｏｘＦＲＴＧＫ１２（図１）にそれぞれ逆方向にクローニングした。この基本ベクターは：アンピシリン耐性遺伝子：複製の起源：ｐｇｋ  ｎｅｏの供給源として使用されるｐｇｔＮ２９プラスミド（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）：ＴＫ読込みフレームの供給源として使用されるｐＧＴ６０ｍｃｓプラスミド（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）：並びに、合成オリゴヌクレオチドにより導入されるＬｏｘＰ及びＦＲＴ部位を有する。オリゴ１６４（配列番号６２）及びオリゴ１４４（配列番号５０）により増幅された相同性の５‘領域は、ｐＥａｓｙｆｌｏｘＦＲＴＧＫ１２の第２のｌｏｘＰ部位の上流に位置するＰａｃＩ／ＰｍｅＩ部位に挿入された３．５ｋｂの断片に亘っていた。エキソン２〜８を包含し、オリゴ１４５（配列番号５１）及び１４６（配列番号５２）で増幅した２．５ｋｂの３’断片（断片Ｂ）を、第２のｌｏｘＰ部位の下流及び第２のＦＲＴ部位の上流に位置するＡｓｃＩ／ＦｓｅＩ  Ｉ部位と、ｐＥａｓｙｆｌｏｘＦＲＴＧＫ１２のＰＧＫ−ｎｅｏカセットとにクローニングした。１．０ｋｂのさらなる３‘断片（断片Ｃ）をオリゴ１４７（配列番号５３）及び１４８（配列番号５４）で増幅し、第１のＦＲＴの下流に位置するＮｏｔＩ／ＳｇｆＩ部位、並びにｐＥａｓｙｆｌｏｘＦＲＴＧＫ１２の第１のｌｏｘＰ部位に挿入した。ＲＲＰ遺伝子のエキソン２〜８の下流に位置し、ｌｏｘＰ及びＦＲＴに隣接するネオマイシン耐性カセットは相同性置換のゲノム選択を可能にし、構築物の５’末端に挿入されたＰＧＫ−チミジンキナーゼ遺伝子カセット（ＰＧＫ−ＴＫ）を使用してランダムな組み込みイベントに対する選択を行うことができた。
【０１４８】
相同性置換イベントを示すＥＳ細胞クローン上のＰＣＲスクリーンの陽性対照を確立するため、さらに１．２５ｋｂの断片を、オリゴ１４７（配列番号５３）及びオリゴ１４９（配列番号５５）を用いて増幅し、ｐＥａｓｙｆｌｏｘＦＲＴＧＫ１２のＮｏｔＩ／ＳｇｆＩ部位にクローニングした。この断片は最終ターゲッティングベクターの３’相同性領域を２５０塩基対分伸張し、ターゲッティングベクターに対して３’外部に位置するＲＲＰ遺伝子特異的オリゴ１６９（配列番号６３）及びベクター特異的オリゴ１７４（配列番号６４）を用いたＰＣＲスクリーニングを確立することができた。
【０１４９】
標的ＥＳ細胞の生成
３つの胚幹（ＥＳ）細胞系Ｂ６−２（ＥＵＲＯＧＥＮＥＴＥＣ，Ｒｅｆ：ＴＧ−ＥＳ０１−０２、マウス種Ｃ５７ＢＬ／６  Ｎ  ＴａｃｆＢｒ由来）、ＳｖＥｖ（ＥＵＲＯＧＥＮＥＴＥＣ，Ｒｅｆ：ＴＧ−ＥＳ０１−０１、マウス種１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃｆＢｒ由来）、及びＥ−１４（Hooper他、(1987) Nature (London) 326, 292-295）；マウス種１２９Ｐ２／ＯｌａＨｓｄ由来）を使用してｍＲＲＰ１座位をターゲッティングした。
【０１５０】
全てのＥＳ細胞系を、Torres, R. M..及びKuehn, R. Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford, New York, Tokyo: 1997に記載の条件下で培養及び電気穿孔した。簡潔に述べると、電気穿孔のため、１×１０７個の細胞を総容量８００μｌの形質移入緩衝液中においてＳｆｉＩ直線化ターゲッティングＤＮＡ３０μｇと混合し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（０．２４ｋＶ，５００μＦ、電極距離０．４ｃｍ）を用いて電気穿孔した。選択耐性マウス胚性繊維芽細胞フィーダー細胞（標的とするマウス種ＩＬ４ｐｅｐｎｅｏから調整；Mueller他、(1992) Eur. J. Immunol. 21:921-25）を含む細胞を、プレート当たり２．５×１０６個の密度で１０ｃｍの組織培養皿に再度播種した。薬剤の選択（Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ＃１０１３１−０１９）、２００ｍｇ／ｍｌ）を１日後に開始した。電気穿孔から３日後、抗生物質Ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ（Ｃｙｍｅｖｅｎ，Ｒｏｃｈｅ）２μＭを用いてＥＳ細胞クローンをネガティブに選択した。８日後、耐性コロニーをランダムに選び、個別に拡大させた。正確に、本実験に使用した３つのＥＳ細胞系全てについて標的とされたＥＳクローンを取得した。
【０１５１】
プライマーオリゴ１７４（配列番号６４）及びオリゴ１６９（配列番号６３）を用いたＰＣＲスクリーニングにより、耐性ＥＳクローンにおいてｍＲＲＰ遺伝子のターゲッティングが成功したことが検出された。オリゴ２００（配列番号６５）及びオリゴ２０１（配列番号６６）を用いることにより、末端のｌｏｘＰ部位の同時置換が検出された。オリゴ１５２（配列番号５６）及び１５３（配列番号５７）により増幅した５’外部ブローブを使用するサザンハイブリダイゼーション及びＥｃｏＲＩ／ＳｆｉＩ制限酵素消化によりＰＣＲ陽性クローンを拡張及び確認した。相同性置換をすると、野生型１０．０ｋｂ帯域が７．５ｋｂに減少した（図２）。オリゴ１６０（配列番号６０）及び１６２（配列番号６１）により増幅した３’外部プローブ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて相同性組換え型における第２のｌｏｘＰ部位の同時置換を確認した（図２）。第２のｌｏｘＰ部位の同時置換により、野生型の４．３ｋｂの帯域が５．８ｋｂに増加した（図２）。１回のターゲッティングベクターの組み込みが、オリゴ１５４（配列番号５８）及び１５５（配列番号５９）を用いて増幅した内部プローブを使用するサザンハイブリダイゼーション及びＨｉｎｄＩＩＩ消化により確認された（図２）。
【０１５２】
表２にこれら実験の結果を示す。
表２：異なるＥＳ細胞におけるＲＲＰ−１ターゲッティング構築物の相同性置換
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【０１５３】
ｍＲＲＰ１キメラの生成
標的としたＥＳ細胞をＢａｌｂ／Ｃ宿主の胚に注入することによりキメラを生成した（Hogan, B., Beddington, R., Costantini, F.及びLacy, E.編Manipulating the Mouse Embryo, a Laboratory Manual. 第２版 Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1994）。Ｃ５７ＢＬ／６雌にキメラマウスをブリーディングすることにより生殖系列の伝達を得た結果、純正Ｃ５７ＢＬ／６種バックグラウンド及びハイブリッド（Ｃ５７Ｂ／Ｌ６×１２９ＳｖＥｖ）Ｆ１及び（Ｃ５７Ｂ／Ｌ６×１２９Ｐ２／Ｏｌａ）Ｆ１バックグラウンドにｍＲＲＰ１ヘテロ接合性動物を得た。
【０１５４】
３’外部プローブを用いたＨｉｎｄＩＩＩによる消化後、末尾のＤＮＡ上のサザンブロットハイブリダイゼーションにより結果として得られた動物のタイプを決定した。標的対立遺伝子のヘテロ接合体では、４．３ｋｂの野生型帯域が５．８ｋｂに増大した。
【０１５５】
表３にこれらの実験の結果を示す。
表３：キメラ製造及び標的対立遺伝子の生殖系列伝達
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【０１５６】
インビボ削除によるヘテロ接合性動物
Ｃｒｅ志向型削除を行った標的対立遺伝子
インビボ削除法を実行し、ｍＲＲＰ１からＣｒｅ指向型の削除を行った標的対立遺伝子を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを生成した。この方法を使用すると、Cre導入遺伝子がＬｏｘＰ部位に隣接する配列の除去を導き、よって動物の全細胞にＲＲＰ１ノックアウトを生成する（図３）。
Ｂ６−２クローンであるＧ−Ｄ５及びＥ−Ｄ９（表２）からのｍＲＲＰ１標的対立遺伝子を有するヘテロ接合性マウスを、遺伝子組換えＣ５７ＢＬ／６−Ｃｒｅ−Ｄｅｌｅｔｅｒマウスを用いてブリーディングした（Schwenk他、NAR (95) Vol. 23, No. 24, 5080-5081）。このdeleterマウスは１０世代に亘る交雑によりＢ６に戻り、類遺伝子性Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに導入遺伝子を確立した。これは、ｍＲＲＰ１標的対立遺伝子のインビボ削除後にＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドを維持するために行われた。ｍＲＲＰ１のＣｒｅ指向型削除を行った標的対立遺伝子の有無についてサザンブロットハイブリダイゼーションを、及びＣｒｅ導入遺伝子の有無についてＰＣＲを行うことにより、結果として得られた子の遺伝子型をＤＮＡ末尾上で決定した。
【０１５７】
末尾のＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、３’外部プローブでハイブリダイズした。ヘテロ接合性動物において、標的対立遺伝子の５．８ｋｂの帯域が１．３ｋｂに減少した。別の方法として、動物の型をＰＣＲにより決定した。
【０１５８】
Ｆｌｐ志向型削除による標的対立遺伝子
インビボ削除法を実行し、ｍＲＲＰ１からＦｌｐ指向型のＮｅｏマーカーの削除を行った標的対立遺伝子を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを生成した。この場合、ｍＲＲＰ１遺伝子は全細胞において依然として機能性であるが、動物はその後、ＬｏｘＰに隣接する配列の組織特異的又は時間特異的削除のために条件付Ｃｒｅ  ｄｅｌｅｔｅｒマウスと交雑され、条件付ｍＲＲＰ１ノックアウトマウスを生成する。
【０１５９】
ハイポモルフの影響を受ける可能性を完全に排除するため、Ｆｌｐ置換によりＦｒｔ隣接Ｎｅｏ選択マーカーをインビボで除去した。Ｂ６−２クローンであるＧ−Ｄ５及びＥ−Ｄ９（表２）由来のｍＲＲＰ１標的対立遺伝子を有するヘテロ接合性マウスを、純正のＢ６バックグラウンドにおいてＣＡＡＧＳ−ＦＬＰｅ導入遺伝子にヘテロ接合性の遺伝仕組み化Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いてブリーディングした（ＦＬＰｅの説明はRodriguez他、(2000) Nat Genet 25:139-140を参照のこと）。結果として得られた子の遺伝子型を、標的対立遺伝子の有無についてサザンブロットハイブリダイゼーションを、及びＣＡＡＧＳ−Ｆｌｐ導入遺伝子の有無についてＰＣＲを行うことにより、末尾ＤＮＡで決定した。
【０１６０】
末尾ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、３’外部プローブでハイブリダイズした。ヘテロ接合体動物において、Ｆｒｔ隣接Ｎｅｏマーカーの除去後４．３ｋｂの標的対立遺伝子帯域が３．８ｋｂ帯域に減少した（図４）。別の方法として、動物の型をＰＣＲにより決定した。
【０１６１】
ホモ接合型動物
Ｃｒｅ指向型削除を行った標的対立遺伝子
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドにおいてｍＲＲＰ１ノックアウト対立遺伝子にホモ接合性のマウスを生成するため、インビボ削除クローンであるＧ−Ｄ５及びＥ−Ｄ９から得られたヘテロ接合性動物を交雑した。この交雑から、１７腹の合計１０６の子が生まれた。これらの子のうち２８が離乳前に死亡した。これらのうち２つの子を回収し、ＰＣＲにより遺伝子型をホモ接合性完全ＫＯと決定した。生存する動物４９個を離乳させ、ＨｉｎｄＩＩＩによる消化の後３’外部プローブを用いて１４個の遺伝子型を末尾ＤＮＡにおいて決定した。ホモ接合性の動物において、最初４．３ｋｂあった野生型帯域が１．３ｋｂ帯域に減少した。別の方法として、動物の型をＰＣＲにより決定した。
【０１６２】
１４個の動物の内訳は、３個がホモ接合性突然変異体、７個がヘテロ接合性突然変異体、及び４個が野生型であった。これらの数は予想されたメンデルの配分と一致するものであった。ホモ接合性動物は正常に思われる。それらとは別腹の野生型の兄弟と比較した場合、大きな差異は検出されなかった。
【０１６３】
ホモ接合性突然変異体の繁殖性を試験するため、及びコロニーをさらに増大させるため、インビボ削除したクローンであるＧ−Ｄ５から得られたｍＲＲＰ１のホモ接合性突然変異動物を交雑した。これまで、このような交雑から１４個の子が生まれ、４個が離乳しており、ホモ接合性ｍＲＲＰ１ＫＯマウスの繁殖性が実証されている。
【０１６４】
ホモ接合性ｍＲＲＰ１ＫＯマウス及び細胞を使用して哺乳動物におけるｍＲＲＰ１機能を分析した。実施例６のデータは、ＨｅＬａ細胞におけるヒトＲＲＰ１の過剰発現の結果、ＥＧＦＲのリン酸化が亢進されることを示す。従って、ｍＲＲＰ１遺伝子機能の不活性化により、ｍＲＲＰ１ＫＯマウスから採取した組織中のＥＧＦＲ及び／又はＭＡＰＫのリン酸化は弱まる。
【０１６５】
ＥＧＦ、ＰＤＧＦのような成長因子は繊維芽細胞の細胞培養において増殖を誘起する。ショウジョウバエロンボイド及び哺乳動物のＲＲＰは切断により膜結合成長因子を解放すると考えられているので、細胞周期進行及び増殖に関するＲＲＰ機能はｍＲＲＰ１ＫＯマウスから単離された胚性及び成熟繊維芽細胞を用いて分析される。
【０１６６】
腫瘍成長に対するＲＲＰ機能の直接的な影響を、ヒト大腸癌のモデルとしてｍＲＲＰ１ＫＯマウスとＡＰＣＭｉｎマウスを交雑することにより分析した。ｍＲＲＰ１ＫＯ種及びＡＰＣｍｉｎ（Moser AR他、(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:8977-81）種は共にＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドを持ち、腫瘍形成を純正遺伝子バックグラウンドで分析することができた。よって、混合遺伝子バックグラウンドから生じる副作用を排除することができた。ｍＲＲＰ１−／−、ＡＰＣＭｉｎ＋／−マウス対ＡＰＣＭｉｎ＋／−マウスにおいて小腸腫瘍に強い縮小が予想され、ｍＲＲＰ１が抗癌剤開発の強力な標的であることが実証された。
【０１６７】
ＲＲＰは細胞表面に位置しており、よって抗体療法の標的である。マウス及びヒトＲＲＰタンパク質の細胞外ループは高度に保存されているため、マウスはヒトＲＲＰを自分自身と認識してしまい、マウスにヒトＲＲＰに対する抗体を生成するのは困難である。従って、ＲＲＰ  ＫＯマウスを使用してヒトＲＲＰタンパク質に対するモノクローナル抗体を製造する。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】ターゲッティングベクター、ｐＥａｓｙｆｌｏｘＦＲＴＧＫ１２ｍＲＲＰ１を示す。
【図２】ｍＲＲＰ１マウスターゲッティングベクター、ｍＲＲＰ１野生型（ＷＴ）ゲノム領域とベクターがターゲッティングされる位置、及び相同的組換え（ＨＲ）後のｍＲＲＰ１標的対立遺伝子を示す。５’外部プローブ、内部プローブ、及び３’外部プローブの位置を下線で示す。示された制限酵素による消化及びサザンハイブリダイゼーション後のゲノムフラグメントに予想される大きさも示されている。
【図３】ＨＲ後及びＣｒｅ誘起型削除後の標的対立遺伝子を示す。制限酵素による消化及びサザンハイブリダイゼーション後のゲノム断片に予想される大きさが、ＷＴ、ＨＲ、及びＣｒｅ削除それぞれの状態の標的対立遺伝子について示されている。
【図４】ＨＲ後、ＦＬＰ誘起型削除後、及びＣｒｅ指向型削除後の標的対立遺伝子を示す。示された制限酵素による消化及びサザンハイブリダイゼーション後のゲノム断片に予想される大きさが、ＷＴ、ＨＲ、ＦＬＰ削除、及びＣｒｅ削除それぞれの状態の標的対立遺伝子について示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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