(57)【要約】筋萎縮性側索硬化症2形（ALS2）に関連するヒト遺伝子が提供される。この遺伝子は第2染色体q33領域に存在する。また、この遺伝子の変異体とともに、遺伝子に由来する単離された核酸およびそれにコードされているペプチドが提供される。さらには、ALS2の診断方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:84; およびSEQ ID NO:2のアミノ酸372-1657からなる群より選択された全てのアミノ酸配列に対して、少なくとも75%の同一性を有するペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項２】
選択された配列に対して約80%以上の配列同一性を有するペプチドをコードする請求項1の核酸。
【請求項３】
選択された配列に対して約85%以上の配列同一性を有するペプチドをコードする請求項1の核酸。
【請求項４】
選択された配列に対して約90%以上の配列同一性を有するペプチドをコードする請求項1の核酸。
【請求項５】
選択された配列に対して約95%以上の配列同一性を有するペプチドをコードする請求項1の核酸。
【請求項６】
選択された配列がSEQ ID NO:2である請求項1-5のいずれかの核酸。
【請求項７】
選択された配列がSEQ ID NO:3である請求項1の核酸。
【請求項８】
選択された配列がSEQ ID NO:5である請求項1の核酸。
【請求項９】
選択された配列がSEQ ID NO:84である請求項1の核酸。
【請求項１０】
SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:1のヌクレオチド124-5094; SEQ ID NO:1のヌクレオチド1225-5094; およびSEQ ID NO:4のヌクレオチド124-5076からなる群より選択されたヌクレオチド配列またはその相補配列のすべてに対して、少なくとも75%の同一性を有するヌクレオチド配列を必須として含む、単離された核酸。
【請求項１１】
選択された配列またはその相補配列に対して約80%以上の配列同一性を有する請求項10の核酸。
【請求項１２】
選択された配列またはその相補配列に対して約85%以上の配列同一性を有する請求項10の核酸。
【請求項１３】
選択された配列またはその相補配列に対して約90%以上の配列同一性を有する請求項10の核酸。
【請求項１４】
選択された配列またはその相補配列に対して約95%以上の配列同一性を有する請求項10の核酸。
【請求項１５】
選択された配列がSEQ ID NO:1である請求項10-14のいずれかの核酸。
【請求項１６】
選択された配列がSEQ ID NO:4である請求項10-14のいずれかの核酸。
【請求項１７】
選択された配列がSEQ ID NO:1のヌクレオチド124-5094である請求項10-14のいずれかの核酸。
【請求項１８】
選択された配列がSEQ ID NO:4のヌクレオチド124-5076である請求項10-14のいずれかの核酸。
【請求項１９】
請求項1-18のいずれかの単離された核酸とは自然には関連しない第二の核酸を連結した請求項1-18のいずれかの単離された核酸。
【請求項２０】
請求項1-19のいずれかの核酸を含む組換えベクター。
【請求項２１】
請求項19の核酸または請求項20のベクターを含む細胞。
【請求項２２】
請求項1-18のいずれかの核酸、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、6から75個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
約10個から約40個のヌクレオチドからなる請求項22のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
約15個から約30個のヌクレオチドからなる請求項22のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
約15個から約25個のヌクレオチドからなる請求項22のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
ストリンジェントな条件下において、SEQ ID NO:3の配列からなるペプチドをコードする核酸またはその相補核酸配列にはハイブリダイズするが、SEQ ID NO:2の配列からなるペプチドをコードする核酸またはまたはその相補核酸配列にはハイブリダイズしない請求項22-25のいずれかのオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
ストリンジェントな条件下において、SEQ ID NO:84の配列からなるペプチドをコードする核酸またはその相補核酸配列にはハイブリダイズするが、SEQ ID NO:2の配列かなるペプチドをコードする核酸またはその相補核酸配列にはハイブリダイズしない請求項22-25のいずれかのオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
標識を連結した請求項22-27のいずれかのオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項22-27のいずれかのオリゴヌクレオチドの異なる2個またはそれ以上を含む核酸増幅用のキット。
【請求項３０】
請求項1-19のいずれかの核酸、または請求項20の組換えベクターによりコードされるアミノ酸配列を含む単離ペプチド。
【請求項３１】
SEQ ID NO:2のアミノ酸1-46; SEQ ID NO:2のアミノ酸47-1657; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:3のアミノ酸43-49; SEQ ID NO:84; およびSEQ ID NO:84のアミノ酸476-545からなる群より選択された配列の少なくとも5個の連続するアミノ酸を必須として含むペプチド。
【請求項３２】
SEQ ID NO:3のアミノ酸43-49、またはSEQ ID NO:84のアミノ酸476-545の少なくとも5個の連続するアミノ酸を必須として含むペプチド。
【請求項３３】
請求項30-32のいずれかのペプチドに結合する抗体。
【請求項３４】
請求項30-32のいずれかのペプチドを抗原として調製した請求項33の抗体。
【請求項３５】
SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:5の全てに対して少なくとも75%の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異遺伝子を含む非ヒト哺乳動物。
【請求項３６】
タンパク質がSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2の全てに対して少なくとも85%の配列同一性を有する請求項35の哺乳動物。
【請求項３７】
変異遺伝子が生物学的活性を有するタンパク質を発現しない請求項35または36の哺乳動物。
【請求項３８】
変異遺伝子がタンパク質発現能を持たない請求項35、36または37の哺乳動物。
【請求項３９】
哺乳動物が齧歯類動物である請求項35-38のいずれかの哺乳動物。
【請求項４０】
哺乳動物がマウスである請求項39の哺乳動物。
【請求項４１】
患者の筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法であって、SEQ ID NO:2に対して少なくとも75%の配列同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子の変異を検出することを含む方法。
【請求項４２】
タンパク質がSEQ ID NO:2に対して少なくとも90%の配列同一性を有する請求項41の方法。
【請求項４３】
タンパク質がSEQ ID NO:2に対して少なくとも95%の配列同一性を有する請求項41の方法。
【請求項４４】
タンパク質がSEQ ID NO:2に対して少なくとも97%の配列同一性を有する請求項41の方法。
【請求項４５】
タンパク質が、変異の存在を除き、SEQ ID NO:2の配列を必須として有する請求項41の方法。
【請求項４６】
患者からの生物学的サンプル中における変異の存在を検出することを含む請求項41-45のいずれかの方法。
【請求項４７】
検出が、遺伝子、この遺伝子のRNA転写物、およびこのRNAより作成されたcDNA、あるいはヒト患者より得た遺伝子より発現されたタンパク質の配列と、SEQ ID NO:1との比較を含み、その際に配列の何らかの差異を変異の指標とする請求項41-46のいずれかの方法。
【請求項４８】
生物学的サンプルから得られた核酸またはその核酸から作成されたcDNAと、請求項22から28のいずれか一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドとの接触を含む請求項46の方法。
【請求項４９】
一以上のオリゴヌクレオチドが、前記核酸またはcDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするかを検出することを含む請求項46の方法。
【請求項５０】
2個以上の前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする核酸またはcDNAの増幅と、増幅産物の存在を決定することを含む請求項46の方法。
【請求項５１】
筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法であって、SEQ ID NO:2の全部に対して少なくとも85%の配列同一性を有するタンパク質の有無を患者において検出することを含む方法。
【請求項５２】
筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法であって、SEQ ID NO:2の全部に対して少なくとも95%の配列同一性を有するタンパク質の有無を患者において検出することを含む方法。
【請求項５３】
検出が、SEQ ID NO:2の全部に対して少なくとも85%の配列同一性を有するタンパク質が患者からの生物学的サンプル中に存在するかを決定することを含む請求項51の方法。
【請求項５４】
検出が、SEQ ID NO:2の全部に対して少なくとも95%の配列同一性を有するタンパク質が患者からの生物学的サンプル中に存在するかを決定することを含む請求項52の方法。
【請求項５５】
筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法であって、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:84の全部に対して少なくとも85%の配列同一性を有するタンパク質の有無を、患者からの生物学的サンプル中において検出することを含む方法。
【請求項５６】
筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法であって、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:84の全部に対して少なくとも95%の配列同一性を有するタンパク質の有無を、患者からの生物学的サンプル中において検出することを含む方法。
【請求項５７】
請求項33または34のいずれかの抗体を、患者からの生物学的サンプルに接触させ、その抗体がサンプル中のタンパク質に結合するかを決定することを含む請求項51-56のいずれかの方法。
【請求項５８】
筋萎縮性側索硬化症2型の治療方法であって、SEQ ID NO:2に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその断片を含むペプチド、このペプチドをコードする核酸、またはそのペプチドまたは核酸を含む薬理学的組成物をその必要がある患者に投与することを含む方法。
【請求項５９】
筋萎縮性側索硬化症2型の治療方法であって、SEQ ID NO:2に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列またはその断片を含むペプチド、このペプチドをコードする核酸、またはそのペプチドまたは核酸を含む薬理学的組成物をその必要がある患者に投与することを含む方法。
【請求項６０】
筋萎縮性側索硬化症2型の治療方法であって、SEQ ID NO.2のペプチドの生物学的活性を模倣する組成物をその必要がある患者に投与することを含む方法。
【請求項６１】
筋萎縮性側索硬化症2型の治療薬物の調製のための、SEQ ID NO:2に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列またはその断片を含むペプチド、このペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項６２】
筋萎縮性側索硬化症2型の治療薬物の調製のための、SEQ ID NO:2に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列またはその断片を含むペプチド、このペプチドをコードする核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は2001年2月12日出願の米国特許番号60/267,723、2001年4月16日出願の日本特許番号2001-116973、および2001年9月12日出願の米国特許番号60/318,352からの優先権を主張しており、これらの出願はここに参考文献として組み込まれている。
【技術分野】
【０００２】
この発明は筋萎縮性側索硬化症2型（"ALS2"）の遺伝的原因に関係する。
【背景技術】
【０００３】
筋萎縮性側索硬化症（"ALS"）は進行性の神経変性疾患であり、本疾患では遠位および近位運動ニューロンが選択的に変性する1。疾患の原因は不明瞭であり、疾患の大半が中年やそれ以後に発症する。疾患の発症率は100,000人あたりおよそ2-6例であり、発症は二次的ニューロン障害としての筋力低下や手首筋肉の筋萎縮を伴い、その結果として四肢の筋肉萎縮、舌の萎縮、構語障害、嚥下困難および呼吸困難などの延髄麻痺症候群が生じる。治療方法は確立されておらず、患者のほとんどは発症後5年以内に死亡する。
【０００４】
若年性筋萎縮性側索硬化症2型（"ALS2"; OMIM215100 2）は体細胞劣性型の遺伝病である。発症頻度は稀であるが、10代または20代の患者において四肢、顔および咽喉の筋痙攣が徐々に発現し、上述の如く延髄麻痺により慢性化する。
【０００５】
筋萎縮性側索硬化症2型は、ヒト染色体2q33上でD2S116とD2S2237に挟まれた1.7 cMの間隔にマッピングされている3,4。この間隔の中には、43個のオーバーラップしない転写産物に由来する、391個のエクソンおよびそれらのフランキング領域での変化が記録されている5,6。
【０００６】
ALSは非常に重篤な疾患であり、早期検出・診断および治療に関する手段を開発する必要がある。
【発明の要約】
【０００７】
現在我々は若年性筋萎縮性側索硬化症2型に関連する遺伝子を同定しており、ALS2またはALS2CR6遺伝子と名付けている。この遺伝子は脳内神経や脊髄を含む各種ヒト組織中で発現され、RanGEDおよびRhoGEFに対して相同性を持つ蛋白質をコードする。
【０００８】
この発明は、ここで哺乳類ALS2遺伝子およびその変異体、ならびにこのような遺伝子によりエンコードされるペプチド（蛋白質を含む）を提供する。またプライマおよび/あるいはプローブの増幅時の利用に適した、これらの遺伝子に由来する断片および核酸、対応するペプチドおよびオリゴヌクレオチドも含まれる。この発明のペプチドに対する抗体も提供される。
【０００９】
また、この発明ではALS2の診断方法も提供されるが、これにはリスクに瀕した患者における変性したALS2遺伝子または蛋白質の同定が含まれうる。患者を検査して、その遺伝子または産生された蛋白質中における1個以上の変異を特徴づけることができる。このような変異は本稿で記述するA261del変異またはAG1548del変異により構成されている。
【００１０】
また、この発明ではALS2遺伝子の領域に対応する核酸も提供されるが、この核酸は一般に、本稿で記述するALS2配列の最低約6、最低約10、最低約15、最低約20、あるいは最低約25個の連続するヌクレオチドに対して、あるいはこのような配列の相補物に対して、あるいは自然発生変異体またはその対立変異体に対してハイブリッド形成を行う。プローブまたはプライマを選択して（増幅またはハイブリッド形成などにより）本稿で記載したA261delまたはAG1548del変異体を含む対立変異体を識別可能にすることができる。このようなプローブまたはプライマにさらに検出可能な標識を含めることができる。またこの発明ではALS2疾患状態に関連する対立遺伝子を構成する遺伝子を含むALS2遺伝子を同定するためのキットも提供され、このキットは本稿で記述するようなプローブまたはプライマにより構成されうる。このキットは更にこのプローブまたはプライマを利用して、本稿で記述するような対立遺伝子を識別するための手引きを含むことがある。
【００１１】
また、この発明ではこの発明の核酸を含むベクターも提供されるが、これには、このような核酸を標的細胞または微生物の中で発現させるために適合させたベクターも含まれる。このようなベクターは、標的細胞または微生物の中でのその核酸の転写を指示する目的に適した転写調節要素により構成されうる。この発明の核酸およびペプチドは、微生物ならびに哺乳動物細胞を含む有核細胞の中で発現することができる。このようなベクターを変化させ、アンチセンス転写産物を生成する目的でこの発明の核酸を逆方向で発現させることができる。
【００１２】
また、この発明ではALS2遺伝子が欠失などにより変異している遺伝子より構成された、ヒトではない哺乳動物も提供される。このような哺乳動物は例えばマウスであり、ALS2ノックアウトマウスを産生するなどのマウスゲノムを変化させる方法が本稿で記述されており、技術的に既知である。
【００１３】
また、この発明では本稿で公開されたような核酸とペプチドを利用して、ALS2処置を目的とした、あるいはALS2治療に用いる薬剤を調製する利用法が提示される。
【００１４】
また、この発明ではALS2患者の治療方法が提示されるが、この方法はALS2の病態を診断または特徴付けるための患者の試験により構成されうる。患者はALS2治療を受けることが可能であり、これは例えば患者に対して薬剤投与を行うか、さもなくば本稿で記述したALS2ペプチドの天然形態または機能性断片または誘導体、あるいは患者体内の蛋白質機能を回復させるその他の治療薬を供与することにより実施できる。同様にこの発明に含まれるものは、遺伝子治療利用に適したベクター、および遺伝子治療の方法論であり、後者は患者体内での発現を目的とした機能性遺伝子の産生または作成により、患者が治療を受けてALS2機能を回復する場合の方法論である。遺伝子治療ベクターは、例えば技術的に既知のアデノ関連ベクターなどである。遺伝子治療の一般的方法も同じく技術的に既知である。
【００１５】
この発明にはヒトALS2遺伝子が含まれるが、この遺伝子はヒトの第2染色体q33領域に存在しており、GTPase調節因子をコードしている可能性がある。この遺伝子はSEQ ID NO:2のアミノ酸配列をエンコードしている可能性がある。この遺伝子により転写されうるmRNAより合成されたcDNAには、SEQ ID NO:1の塩基配列がある。
【００１６】
この発明にはヒトALS2変異遺伝子が含まれているが、この遺伝子は筋萎縮性側索硬化症2型に関係があり、上述のヒトALS2遺伝子の塩基が1個または2個欠失することにより変異した、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:84のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。
【００１７】
この発明にはゲノムDNA、mRNAまたはcDNAより精製された核酸類、ならびに合成された核酸が含まれている。
【００１８】
この発明にはALS2遺伝子とハイブリッドを形成するオリゴヌクレオチドと厳しい条件下において望ましいその変異体が含まれている。
【００１９】
この発明にはオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプライマセットから成るキットが含まれ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等により、これを用いてALS2がエンコードする核酸の増幅を実施することができる。
【００２０】
この発明にはオリゴヌクレオチドプローブが含まれ、これは厳しい条件下でALS2における塩基欠失部位（A261delおよびAG1548del）を含む領域とハイブリッド形成するものである。
【００２１】
この発明にはオリゴヌクレオチドプライマセットが含まれ、これは本稿で記述するようなALS2における塩基欠損部位を種組む領域のPCR増幅を行うものである。このプライマの具体例は、SEQ ID NO:6とNO:7の塩基配列を構成する一対の合成オリゴヌクレオチド、あるいはSEQ ID NO:8とNO:9の塩基配列を構成する一対の合成オリゴヌクレオチドである。
【００２２】
この発明には上記の核酸を構成する組み換えベクターおよび当該組み換えベクターにより転写された細胞が含まれる。
【００２３】
この発明にはGTPase調節因子またはGEFが含まれ、これは本稿で記述するようなALS2遺伝子の発現産物であることを特徴とする。
【００２４】
このようなGEFのGTPase調節因子の実施例は、この発明に従って形質転換された形質転換細胞により産生された組み換え蛋白質である。
【００２５】
この発明にはSEQ ID NO:2の1番目から46番目までのアミノ酸配列のうち連続する5個以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を構成するペプチド、およびSEQ ID NO:2の47番目から1657番目までのアミノ酸配列のうち連続する5個以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を構成するペプチドが含まれる。これらのペプチドを用いて抗体を産生することができる。
【００２６】
またこの発明では、変異ヒトALS2遺伝子の発現産物になりうる、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を構成する修飾蛋白質が提供される。この修飾蛋白質の実施例は形質転換細胞により産生された組み換え蛋白質である。
【００２７】
この発明には本稿で開示されたペプチド（蛋白質を含む）を認識する抗体が含まれる。この抗体の実施例は、この発明に従ってペプチドを抗原として用いて調製した抗体であり、SEQ ID NO:2の1番目から46番目までのアミノ酸配列のうち連続する5個以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を構成するペプチドが含まれる。また、SEQ ID NO:2の47番目から1657番目までのアミノ酸配列のうち連続する5個以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を構成するペプチドを抗原として用いて調製された抗体も含まれる。
【００２８】
この発明はさらに筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法を提供しており、この方法はALS2変異遺伝子の検出を特徴とする。この診断方法の実施例は、SEQ ID NO:6およびNO:7の塩基配列を構成する一対の合成オリゴヌクレオチド、あるいはSEQ ID NO:8およびNO:9の塩基配列を構成する一対の合成オリゴヌクレオチドを構成するプライマセットを用いて、診断対象者の細胞のゲノムDNAをPCR増幅に供し、結果として得られたDNA断片を制限酵素NarIを用いて処理し、それぞれのDNA断片が2個の断片に分割された当該被験者を筋萎縮性側索硬化症2型の患者であると判断するものである。
【００２９】
またこの発明では筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法を提供しており、この方法はALS2遺伝子または変異遺伝子の転写産物が検出されることを特徴とする。この診断方法の実施例では、転写産物はALS2変異遺伝子のcDNAまたはその遺伝子のmRNA、あるいは当該変異遺伝子により発現された修飾蛋白質である。この修飾蛋白質の検出事例の実施例は蛋白質の検出を目的とした方法であり、この場合はSEQ ID NO:2の1番目から46番目までのアミノ酸配列を認識する抗体は反応するが、SEQ ID NO:2の47番目から1657番目までのアミノ酸配列を認識する抗体は反応しない。
【００３０】
さらにこの発明では、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を保有しうるマウスALS2遺伝子、ならびにそれより生じた核酸が提供されるが、この核酸にはマウス遺伝子のゲノムDNA、mRNAまたはcDNAまたはその相補配列を元に合成または精製した核酸が含まれる。
【００３１】
またこの発明では、遺伝子の欠損したヒト以外の哺乳類が提供されるが、これは例えば齧歯類動物などであり、マウスが望ましく、この動物ではALS2遺伝子の機能が実質的に欠如しているものである。同様にそのようなマウスの組織も提供される。
【００３２】
この発明によるヒトALS2遺伝子は、ゲノム遺伝子として33個のイントロンと34個のエクソンを有し、ヒト第二染色体q33領域中の多型DNAマーカーD2S2309に隣接する80.3kbのゲノムDNA中に存在しており（図1参照）、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するヒトGTPase調節因子をコードしている。このALS2遺伝子において、そのcDNAはSEQ ID NO:1の塩基配列を有している。
【００３３】
この発明では単離した核酸を提供するが、これはSEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:84; およびSEQ ID NO:2のアミノ酸372-1657より構成されるグループから選別された全てのアミノ酸配列に対して、少なくとも約75、80、85、90、95、97または100%の同一性を有するペプチドをコードしている。これらの核酸によりエンコードされたペプチドも同様に提供される。
【００３４】
またこの発明では単離した核酸を提供するが、本質的にその構成は、SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:1のヌクレオチド124-5094; SEQ ID NO:1のヌクレオチド1225-5094; およびSEQ ID NO:4のヌクレオチド124-5076より構成されるグループから選別された全てのヌクレオチド配列またはその相補配列に対して、少なくとも約75、80、85、90、95、97または100%の同一性を有するヌクレオチド配列である。これらの核酸によりエンコードされたペプチドも同様に提供される。
【００３５】
この発明の核酸は、この発明の核酸と天然には関係しない第二の核酸に結合させることが可能である。天然に関係しないということは、第二の核酸はALS2遺伝子の一部ではなく、哺乳類のゲノム中のALS2遺伝子に直接結合していないことを意味する。
【００３６】
またこの発明では6から75個のオリゴヌクレオチドを提供するが、これはそのオリゴヌクレオチドがこの発明の核酸あるいはその相補配列に対して厳しい条件下でハイブリッド形成するものである。この発明のオリゴヌクレオチドは標識に結合させることが可能であるが、この標識は検出可能な核酸のラベリングあるいは核酸を核酸以外の成分に結合させる目的に適合した任意の成分である。
【００３７】
またこの発明では、SEQ ID NO:2のアミノ酸1-46; SEQ ID NO:2のアミノ酸47-1657; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:3のアミノ酸43-49; SEQ ID NO:84; およびSEQ ID NO:84のアミノ酸476-545より構成されるグループから選別された配列をもとにした、少なくとも5個の連続するアミノ酸の配列を本質的に構成するペプチドを提供する。これらのペプチドは、例えばこの発明の抗体の作成や、ALS2蛋白質の機能の調査等において有用である。
【００３８】
またこの発明では変異遺伝子を保有するヒトではない哺乳動物も提供するが、ここではその変異だけに関連する遺伝子が、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:5の全てに対して少なくとも約75、80、85、90、95、97または100%の配列同一性を有する蛋白質をエンコードしている。
【００３９】
またこの発明では患者の筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法を提供するが、これは患者または患者由来の生物学的試料において、SEQ ID NO:2に対して少なくとも約75、80、85、90、95、97または100%の配列同一性を有する蛋白質をエンコードする遺伝子における、変異の存在を検出することによるものである。
【００４０】
またこの発明では患者の筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法を提供するが、これは患者または患者由来の生物学的試料において、SEQ ID NO:2全体に対して少なくとも約75、80、85、90、95、97または100%の配列同一性を有する蛋白質の存在の有無を検出することによるものである。
【００４１】
またこの発明では患者の筋萎縮性側索硬化症2型の診断方法を提供するが、これは患者または患者由来の生物学的試料において、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:84全体に対して少なくとも約75、80、85、90、95、97または100%の配列同一性を有する蛋白質の存在の有無を検出することによるものである。
【００４２】
この発明の診断法では、配列の比較を行い変異の存在を決定すること、オリゴヌクレオチドを用いて患者の核酸に対するハイブリダイゼーションを検出すること、患者の核酸を増幅すること、患者の蛋白質をこの発明の抗体に接触させること、または患者において産生された蛋白質についてALS2蛋白質の機能を評価すること等を行う場合がある。
【００４３】
またこの発明では筋萎縮性側索硬化症2型の治療方法を提供するが、これはペプチド、核酸、あるいはペプチドまたは核酸より成る薬理成分を当該疾患患者に対して投与する方法により構成されており、そこではそのペプチドがSEQ ID NO:2またはその断片に対して少なくとも約75、80、85、90、95、97または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列により構成されており、またその核酸は当該ペプチドをコードしているというものである。
【００４４】
またこの発明では筋萎縮性側索硬化症2型の治療方法を提供するが、これはある成分を当該疾患患者に対して投与する方法により構成されており、その成分はSEQ ID NO:2またはその断片の生物学的活性を模倣するというものである。
【００４５】
またこの発明では、ペプチドや核酸を用いて筋萎縮性側索硬化症2型の治療に用いる薬剤を調製する方法を提供するが、そこではそのペプチドがEQ ID NO:2またはその断片に対して少なくとも約75、80、85、90、95、97または100%の同一性を有するアミノ酸配列により構成されており、またその核酸が当該ペプチドをコードしているというものである。
【００４６】
この明細書中での核酸またはペプチドを参照する「単離された」という用語は、核酸が細胞のゲノムより分離されていること、ペプチドが細胞から分離されていることを意味するが、対象物質がゲノムまたは細胞より取得されていることを意味するものではない。一部の事例では、この発明の核酸とペプチドは従来技術を用いて合成される場合もある。
【００４７】
2種類の核酸または蛋白質配列について、それらを最も適切に配置した場合にそれらが少なくとも約70%の配列同一性を共有する場合には、それらは実質的に同一であると見なされる。別の具体例では、シーケンス同一性は例えば少なくとも75%、少なくとも90%、あるいは少なくとも95%になる場合がある。同一性比較のための配列の最適な整列は様々なアルゴリズムを用いて実施することが可能であり、そのようなアルゴリズムは例えばSmith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482の局所同一性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol, 48:443の同一性整列アルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性検索法、およびこれらのアルゴリズムのコンピュータ化実装（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA等）が挙げられる。配列の整列はBLASTアルゴリズムを用いて実施することもできるが、これはAltschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10に説明されている（発表されたデフォルト設定を使用している）。
【００４８】
実質的に同一な遺伝子ターゲティング基質や標的配列などの一部の実施例において、この発明の核酸配列は実質的に同一になりうる。このような配列の実質的な同一性は、最適に整列した場合には同一性の比率に反映しうるが、この比率は例えば50%、80%から100%、少なくとも80%、少なくとも90%、あるいは少なくとも95%になる場合があり、またこの比率は遺伝子ターゲティング基質の事例において標的配列の比率に対する遺伝子ターゲティング基質の比率の同一性を指すこともあり、この場合には同一性の度合いによって相同性対合および組み換えおよび/あるいは修復が促進されることがある。2個の核酸配列が実質的に同一であるという別の指示は、中程度に厳しい、あるいは望ましい程度に厳しい条件下で、2個の配列が互いにハイブリッド形成を行うということと実質的に同義である。中程度に厳しい条件下でのフィルター結合配列に対するハイブリダイゼーションは、例えば65℃で0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1mM EDTAの条件で、洗浄は42℃で0.2 x SSC/0.1% SDSの条件で実施することができる（Ausubel, et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York、2.10.3ページを参照）。あるいは厳しい条件下でのフィルター結合配列に対するハイブリダイゼーションは、例えば65℃で0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、1mM EDTAの条件で、洗浄は68℃で0.1 x SSC/0.1% SDSの条件で実施することができる（Ausubel, et al. (eds), 1989、前掲書を参照）。ハイブリダイゼーション条件は、問題の配列によっては既知の方法に従って修正することができる（Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New Yorkを参照）。厳しい条件は一般的に、既定のイオン強度およびpHにおいて特定の配列の融点温度より約5℃低い条件するため選択される。
【００４９】
技術的に良く知られた事実として、実質的にそのペプチドの生物学的機能を変化させることなしに、ポリペプチド構造において何らかの修正や変更を施して、生物学的に等価なポリペプチドを得ることが可能である。発明の一側面として、LPL S447X治療法には保存的アミノ酸置換による野生型LPL配列の部分と異なるペプチドが含まれることがある。ここで用いられているように、用語「保存的アミノ酸置換」とは、ペプチド中の所与の位置において一つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換することで、その場合にその置換を機能消失せずに行うことが可能である場合を指す。このような変更を施すために、例えば大きさ、電荷、疎水性、親水性、類似性などについて側鎖置換基などの相対的類似性を基にして、類似アミノ酸残基の置換を行うことが可能であり、このような置換がペプチドの機能に対して及ぼす影響は、定型試験により分析可能である。
【００５０】
一部の実施例では、あるアミノ酸残基を類似した親水性値を有する（例えばプラスマイナス2.0の範囲内の値をもつ）他の残基に置換して保存的アミノ酸置換を行う場合があるが、この場合には次のような親水性値をアミノ酸残基に割り当てている（詳細は米国特許No. 4,554,101の通りであり、参考文献により本稿に取り入れられている）：Arg (+3.0); Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+3.0); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln (+0.2); Gly (0); Pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); Ile (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); およびTrp (-3.4)。
他の実施例では、あるアミノ酸残基を類似したハイドロパシー的指標を有する（例えばプラスマイナス2.0の範囲内の値をもつ）他の残基に置換して保存的アミノ酸置換を行う場合がある。このような実施例では疎水性および電荷特性に基づき、それぞれのアミノ酸残基に次のようなハイドロパシー的指標を割り当てている：Ile (+4.5); Val (+4.2); Leu (+3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); およびArg (-4.5)。
他の実施例では、あるアミノ酸残基を同一クラスの他の残基に置換して保存的アミノ酸置換を行う場合があり、この場合にはアミノ酸を次のように非極性、酸性、塩基性または中性のクラスに分けている：非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸性：Asp、Glu；塩基性：Lys、Arg、His；中性：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。
ヒト第二染色体q33領域のマイクロサテライトマーカーD2S116およびD2S2237により規定された1.7cM領域の遺伝子座に対するマッピングを行った3,4。発明者らはこれまでに図1の候補領域をカバーする3Mbのゲノム領域のYAC/BAC/PACを基にして物理的地図を作成している5,6。cDNAクローンおよびESTsのシーケンスが現在分析され、10個の新規遺伝子を含む42個の非複製転写ユニットがマッピングされている。ALS2家系の14例の人間と、この家系に血縁関係を有しない6例の正常人のゲノムDNAに基づいて411対のプライマが設計され、これをPCRにより増幅した。全てのPCR産物の配列を決定することにより、77個の塩基配列のイントロンまたはエクソンの多型性が判明した。これらの中から、ALS2の発症に関連した塩基欠失を有する遺伝子を同定した。
【００５１】
また、ALS2遺伝子には制限領域と調節領域（プロモーター/エンハンサー、サプレッサー等）が含まれており、これはそれによりコードされる蛋白質が発現する際に機能するものである。このような制限または調節領域は、GEFまたはGTPase調節因子などのALS2遺伝子産物の機能を解明するために有用である。
【００５２】
このALS2遺伝子は、例えばSEQ ID NO:1の塩基配列またはその部分配列を構成する純粋なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをプローブとして用いたヒトゲノムライブラリのスクリーニングにより、単離することが可能である。その結果得られたゲノム遺伝子は、一般的に利用される遺伝子増幅手法により増幅することが可能であるが、これらの技術は例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）法、NASBN（核酸配列に基づく増幅）法、TMA（転写媒介増幅）法またはSDA（鎖置換増幅）法などがある。
【００５３】
純粋なポリヌクレオチド（DNA断片およびRNA断片）も同様に、このALS2ゲノム遺伝子、この遺伝子より転写されたmRNA、あるいはmRNAより合成されたcDNAをもとに調製することが可能である。例えば、cDNAはヒト細胞より抽出したpoly(A) + RNAを鋳型として用いて合成できる。ヒト細胞は人体より手術などで切除したものであるか、培養細胞である。cDNAは既知方法により合成できる（Mol. Cell Biol., 2, 161-170, 1982; J. Gene, 25, 263-269, 1983; Gene, 150, 243-250, 1994）。オリゴヌクレオチドをプライマーに、ヒト細胞より単離したmRNAを鋳型として用いるRT-PCR法により、cDNAを合成することもできる。具体的にはそのようにして調製したcDNAは、SEQ ID NO:1の塩基配列を有している。これらのポリヌクレオチドを用いて、ヒトGTPase調節因子の遺伝子組み換え発現を行うことができる。
【００５４】
この発明のオリゴヌクレオチドはDNA断片またはRNA断片であり、上述のALS2または上述の核酸に対して、厳しい条件下でハイブリッド形成するものである。例えばそれはSEQ ID NO:1の塩基配列を有した、10-100bpの連続するDNA断片である。ここで厳しい条件とは、プローブに対する標的の特異的なハイブリッド形成が、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階時の塩濃度、有機溶媒（ホルムアミド等）の濃度、または温度条件により可能となる場合を示す。方法は米国特許No. 6,100,037に記述されている。
【００５５】
厳しいハイブリダイゼーション条件を作成するための一つの方法は［B&K挿入）
この発明のプライマセットは、主としてALS2遺伝子または関連する核酸の増幅に使用する一対のオリゴヌクレオチドである。そのようなプライマセットはSEQ ID NO:1の塩基配列に基づいて設計されており、既知の方法により合成および精製されているであろう。プライマの大きさ（塩基数）は15-40塩基が望ましく、鋳型DNAと特異的にアニーリングする15-30塩基の大きさであることが更に望ましい。しかしながらLA（長く正確な）PCRを実施する場合には、30塩基を越えるプライマを用いることが有効である。センス鎖（5'末端側）とアンチセンス鎖（3'末端側）を構成する一対（2個）のプライマは相補的であってはならない。加えてプライマ内では自己相補的配列を避け、ヘアピン構造の形成を防ぐ必要がある。さらに、鋳型DNAに対して安定な結合が確実に生じるようにするため、GC含有量は約50%とし、プライマ中にGC豊富領域またはAT豊富領域が存在しないようにする必要がある。アニーリング温度はTm（溶解温度）に依存しているため、Tmが55-65℃であるプライマを選択して、高い特異性を有するPCR産物が調製されるようにする。PCRで使用するプライマの最終濃度は約0.1〜約1(Mにすべきである。Oligo TMソフトウェア［National Bioscience Inc.（アメリカ）販売］やGenetyx TMソフトウェア［Software Development KK（日本）販売］等のプライマ設計用の市販ソフトウェアを利用することも可能である。
【００５６】
厳しい条件下で変異（例えば塩基欠損部位など）を含む領域にハイブリッド形成するプローブを用いて、ALS2罹患が考えられる患者の細胞より調製したDNAライブラリをスクリーニングする方法により、変異したALS2遺伝子を取得することができる。純粋なポリヌクレオチド（DNA断片またはRNA断片）は、ALS変異遺伝子またはその相補配列のゲノムDNA、mRNAまたはcDNAより得られる。例えば、あるALS2変異遺伝子はSEQ ID NO:1の261番目の塩基aが欠損した核酸を構成している。このようなポリヌクレオチドを用いて、ALS2変更蛋白質の遺伝子組み換え産生を行ったり、ALS2の診断を行ったりすることができる。
【００５７】
変異ALS2における塩基欠損部位を有する各種領域等を含む、ALS2のPCR増幅に用いるプライマは、（例えば）SEQ ID NO:6およびNO:7の塩基配列を構成する一対の合成オリゴヌクレオチドである。このプライマセットにより、ALS2遺伝子中のエクソン3およびその前後のイントロンを含む領域（339bp）のPCR増幅を行うことができる。他のプライマセットは、SEQ ID NO:8およびNO:9の塩基配列を構成する合成オリゴヌクレオチドにより構成される場合があり、RNAを鋳型として用いて、ALS2遺伝子のエクソン2-4（302bp）のPCR増幅を行うことができる。制限酵素NarIによって切断されない任意のPCR産物が正常なALS2遺伝子より導出されるが、変異したALS2遺伝子に由来するPCR産物はNarIにより切断され、2個の断片を生じることがある（図2c）。
【００５８】
この発明の組み換えベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであることがある。ベクターの構築は、挿入物としてのポリヌクレオチドの型、あるいは使用目的によって実施されることになる。例えば、cDNAまたはそのORF領域を挿入物として使用し、ALS2蛋白質またはそれを修飾した蛋白質を製造する場合、Escherichia coliやBacillus subtilusのような原核細胞と、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞などの真核細胞にそれぞれ適した発現ベクターを用いて、in vitro転写または発現を行うことができる。ALS2遺伝子のゲノムDNAやその変異遺伝子を挿入物として用いる場合には、BAC（バクテリア人工染色体）ベクターやコスミドベクターを用いることも可能である。また、このような組み換えベクターは、例えば蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）等のハイブリダイゼーションを用いた染色体異常の診断に用いるプローブとしても有用である。さらに、正常なALS2遺伝子に由来する核酸をアデノウイルス等のウイルスベクター等の中で結合させ、その産物を用いて遺伝子治療を行うことが可能である。
【００５９】
ALS2ペプチド（蛋白質を含む）を製造する場合のこの発明での形質転換細胞は、Escherichia coliやBacillus subtilisのような原核細胞、または酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞などの真核細胞でありうる。さらに、ALS2に苦しむ患者に由来する細胞（血液幹細胞など）をこの発明のウイルスベクターにより形質転換させ、そのベクターには正常なALS2遺伝子に由来する核酸が組み込まれているような場合、これを利用してALS2の遺伝子治療を行うことが可能である。このような形質転換細胞の調製は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、リポソーム法やDEAEデキストラン法などの既知の方法を用いて、組み換えベクターを細胞内に導入することにより実施できる。
【００６０】
この発明のペプチドは正常なALS2遺伝子の発現産物、あるいは変異したALS2遺伝子の発現産物でありうる。正常な遺伝子産物はGTPase転写因子、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を有するGEFである。また、この発明のペプチドは抗体の調製に用いるための免疫抗原として、あるいはALS2の治療薬開発の標的分子などとして有用である。これらのペプチドは、健常者またはALS2罹患患者の細胞よりペプチドを単離する方法によっても調整できる。SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3等に由来する、目的のアミノ酸配列に基づき、（望ましい方法として）上述の形質転換細胞での産生・単離または精製による化学合成法。このような形質転換細胞をインキュベートし、培養物に対する単離および精製を、例えば尿素などの変性剤による処理により、あるいは界面活性剤、超音波処理、酵素消化、塩析による沈殿などを用いて、あるいは溶液、透析、遠心分離、超濾過、ゲル濾過、SDS-PAGE、等電点電気泳動、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによって行う。このような蛋白質には、他の任意の蛋白質との融合蛋白質が含まれる可能性がある。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）や緑蛍光蛋白質（GFP）との融合蛋白質が挙げられる。また細胞内で発現した蛋白質は、翻訳後に細胞内でさらに多様な種類の修飾を受ける可能性がある。従って、この発明の蛋白質の範囲には修飾蛋白質も含まれる。このような翻訳後修飾の事例には、N末端メチオニンの除去、N末端のアセチル化、糖鎖の付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化およびリン酸化などがある。
【００６１】
この発明の抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、この発明のペプチドを認識するものである。例としては、SEQ ID NO:2の最初から46番目までのアミノ酸配列の連続する5アミノ酸残基またはそれ以上のアミノ酸シーケンスを構成するペプチドを用いて調製した抗体や、SEQ ID NO:2の47番目から1657番目までのアミノ酸配列の連続する5アミノ酸残基またはそれ以上のアミノ酸シーケンスを構成するペプチドを用いて調製した抗体などが挙げられる。これら2種類の抗体を用いた場合、正常およびA261del変異蛋白質を検出および区別することが可能である。この発明の抗体には、ALS2蛋白質のエピトープやこの発明の他のペプチドに結合する能力を有する全ての分子、およびその分子の全てのFab、F(ab')2、Fvフラグメント等が含まれる。このような抗体は、ALS2由来の蛋白質またはペプチドを抗原として使用し、動物を免疫したあとで、血清より取得することができる。あるいは、上述の真核細胞に対する発現ベクターを、注射またはパーティクルガンにより動物の筋肉または皮膚内部に導入し、その後そこから血清を収集することができる。使用可能な動物の例はマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ニワトリなどである。免疫された動物の脾臓より収集されたB細胞をミエローマ細胞と融合させた場合には、モノクローナル抗体を産生することができる。
【００６２】
この発明の診断法は、ALS2変異を起こした遺伝子、またはALS2変異を起こした遺伝子の転写産物が検出され、それによってALS2発症のリスクが評価できるものである。特に既知のALS2家系の対象者について分析可能であるが、診断はそれに限定されるものではない。
【００６３】
上述のプライマセットのいずれか、またはこの発明の他のオリゴヌクレオチドを用いて、診断対象者のゲノムDNAをPCR増幅することができる。結果として得られたDNA断片は、NarI等の一つ以上の制限酵素で処理することができるが、そのDNA断片が切断されて、非ALS2患者より生じた切断産物と異なる断片なった場合には、そのALS2遺伝子に変異が存在しているという観点から、ALS2患者であるか何らかのALS2リスクを有する患者であることが示唆される。
【００６４】
同様にALS2変異遺伝子の検出は、（例えば）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ法、オリゴヌクレオチド連結測定法、PCR-SSCP法、PCR-CFLP法、PCR-PHFA法、インベーダー法、RCA（ローリングサークル増幅）法、およびプライマーオリゴ塩基伸長法等によって実施可能である。
【００６５】
ALS2変異遺伝子の転写産物を検出する場合には、診断対象者のmRNAまたはそのcDNAの配列を決定して診断を行うことができる。診断対象者のALS2遺伝子またはそのcDNAを発現ベクターに組み込み、細胞に形質移入し、その発現産物を測定するといった方法でその診断を実施することもできる。
【００６６】
正常および変異ALS2遺伝子の発現産物は、分子量測定により評価できる。例えば正常なALS2遺伝子中の1個の塩基の欠如によりフレームシフトが生じ、その場合には、修正された蛋白質がSEQ ID NO:2の1番目から46番目のアミノ酸残基を構成する低分子蛋白質（SEQ ID NO:3）に変化し、またそのフレームシフトにより3個のアミノ酸残基（Pro-Ser-Glu）が新しくコードされ、その結果として天然に生じた正常なALS2遺伝子の遺伝子産物に対して容易に比較可能な分子量を有する産物が得られる。さらにこの発明により提供される上述の抗体を用いて診断を実施することもできるが、この場合にはALS2修正蛋白質は（例えば）SEQ ID NO:2の1番目から46番目までのアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:3のアミノ酸43-49より成る領域を認識する抗体と反応するが、SEQ ID NO:2の47番目から1657番目までのアミノ酸配列を認識する抗体とは反応しない。SEQ ID NO:2の任意のアミノ酸と比較して、SEQ ID NO:84のアミノ酸476から545に特異的である抗体を同じように用いれば、AG1548delの診断を行うことも可能であろう。抗体を用いた診断は、例えばELIZA法を用いて実施することもできる。
【００６７】
この発明のマウスALS2遺伝子は、ヒトALS2遺伝子の相同体として単離されたマウスゲノム遺伝子であり、SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を構成するマウスALS2蛋白質をコードしている。そのcDNAはSEQ ID NO:4の塩基配列を有している。この遺伝子を用いて「ノックアウト」マウスを作成することができる。
【００６８】
このような「ノックアウト」マウスの調製は、既知の遺伝子ターゲティング法（Science, 244: 1288-1292, 1989）または一般的に以下の事例に従って行うことができる。
【００６９】
まず、遺伝子中に開始コドンを含むマウスALS2遺伝子のDNA断片を修正し、ALS2遺伝子の発現が欠如した欠陥DNA断片を得る。この欠陥DNA断片を用いて、ターゲティングベクターを調製し、既知の方法（Science 244, 1288-1292, 1989に記述された方法等）を用いてその習性をマウス全能細胞（ES細胞）中に導入する。例えば、ALS2遺伝子を構成するゲノム遺伝子に細胞毒素に対する抵抗性を有する遺伝子を置換または挿入して、欠損遺伝子がALS2遺伝子のゲノムDNAに対する相同配列を両末端に有するように処理を行った組み換えプラスミドDNAを調製する（ターゲティングベクター）。また、抵抗性遺伝子をPGK1プロモーターやPGK1ポリアデニル化シグナルなどの配列に結合させて、発現の調節を行うことも可能である。抵抗性遺伝子により置換または挿入されるALS2CR6遺伝子のゲノムDNA部位を、開始コドンを含むエクソン領域を含むゲノムDNA領域とする方法が望ましい。
【００７０】
このような標的ベクターに関しては、ALS2遺伝子のゲノムDNAに相同性を持つ配列と、セルソーティングに利用できる抵抗性配列または他の配列（例えばジフテリア毒素A遺伝子やヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子など）を有することを除いて、特に制限は存在しない。プロモーターおよびエンハンサーを適切に結合し使用することができる。その後、既知の方法（Nature, 292:154-156等）を用いてターゲティングベクターをES細胞（胚性幹細胞）内部に導入する。このような方法には電気パルス法、リポソーム法およびリン酸カルシウム法などがある。導入遺伝子の組み換え効率が問題となる場合には電気パルス法が好まれる。遺伝子が導入された各ES細胞中のDNAを抽出し、サザンブロット分析またはPCR分析により、野生型ALS2遺伝子と導入された欠陥ALS2遺伝子断片との間で相同遺伝子組み換えが生じ、その結果染色体内部に欠損遺伝子断片が配置された細胞を選択する。
【００７１】
上記で調製した欠損遺伝子を有するES細胞を、野生型動物の胞胚内部に注入し、キメラ胚を得て、仮親の子宮に移植することができる。得られた子孫をALS2欠損遺伝子について選別し繁殖させる。選択の実施は毛の色の違いを調ベたり、身体の一部（尾部末端など）よりDNAを抽出し、DNA抽出後のサザンブロット分析やPCRアッセイにより行うことができる。野生型動物と、ALS2欠損遺伝子が性細胞中に存在しているキメラ動物との交雑により得られた子孫について、サザンブロット分析またはPCRアッセイなどを身体の一部（尾部末端など）より抽出したDNAに対して実施し、ALS2欠損遺伝子が導入されたヘテロ接合体を同定するための材料にすることができる。全ての性細胞および体細胞において安定しているALS2欠損遺伝子を保有するヘテロ接合体を繁殖させて、ALS2遺伝子が完全に「ノックアウト」された子孫を作成することができる。
【００７２】
このようにして作成した動物をALS2モデル動物として利用し、ALS2発症時のALS2遺伝子の機能分析や、治療薬のスクリーニング、あるいは治療方法の開発を行うことができる。
【００７３】
このALS2遺伝子のクローニングおよびその機能分析の手順の方法と結果を示す。
【００７４】
1.  方法
1-1.  ALS2家系
この疾患に罹患した8例の個人を含む、チュニジアの血縁ALS2家系より得た16例の事例（文献2）を分析した。ALS2の特徴は四肢および顔面の進行性の筋痙攣であり、手足の末梢性筋障害を伴う。発症年齢は3歳から10歳までの間である（文献2）。神経と筋肉の生検、また筋電図検査によれば、末梢運動ニューロンの欠失が確認された（文献2）。臨床試験データと共に多型DNAマーカーの遺伝子型を分析すると、ALS2は明らかに常染色体劣性遺伝であった。
【００７５】
1-2.  転写地図
ゲノムデータベース（GDB）（http://www.gdb.org）および全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）は公開されており、これを用いて目標領域内部にマッピングされた転写DNAのシーケンスを識別することができるため、これらを検索した。ALS2の目標領域にオーバーラップするゲノムDNA配列はGenBankの「nr」または「htgs」データベースより検索され、これをdbESTデータベースに対するBLAST検索を実施する場合の検査目標として利用した。全長の転写物を単離するために、RT-PCR、5'-RACEおよびcDNAライブラリスクリーニングを実施した。加えてResearch GeneticsよりESTクローンを購入し、DNAsの配列決定をし、クローン全体の挿入を評価した。二重鎖DNAの配列決定は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit（ABI）およびAB1377DNAシーケンサを用いて、ジデオキシ配列分析の実施により実施した。cDNAクローンより得たESTデータ、PCR産物およびDNAの全配列を決定し、推定された独立転写ユニットを確立した。次にPCR法を用いてそれぞれのユニットを物理的マップ上にマッピングした。
【００７６】
1-3.  エクソンの同定
転写DNAのイントロンとエクソンの構造を決定するため、Sequencer Version 3.0（Gene Codes Corporation）プログラムを用いて、BLAST（文献28）および文献（5と6）の記述に従って、GenBankデータベースにて公開されているゲノムDNAシーケンスデータをcDNA配列と比較した。
【００７７】
1-4.  PCR
エクソンとイントロン/エクソン境界をPCR増幅に供した。ExTaqポリメラーゼ（Takara）を用いて、95℃で15秒、60℃で30秒および72℃で30秒のサイクルを35回繰り返し、約50mgのゲノムDNAがPCRにより増幅された。転写DNAの欠損型を検出するために、RT-PCRを実施した。ALS2家系ｓの患者4例とキャリア2例のリンパ球より得た総RNAを単離した。健常なヒト脳より抽出した総RNAはClontechより購入した。メーカーのプロトコルに従ってSuperScriptプレ増幅システム（Gibco-BRL）を用いることにより、RT-PCRを実施した。このようなPCRに用いるオリゴヌクレオチドプライマは、Primer 3.0（http://www.genome.wi.mit.edu）を用いて設計した。表1に、ALS2（ALS2CR6）増幅のために用いたプライマをリストアップする。
【００７８】
【表１】
2005525079.tif 000002
1-5.  変異の分析
DNA配列のエクソンまたはイントロン/エクソン境界における変異を検出するため、エクソンのPCR産物のDNAシーケンスを決定した。エクソンのPCR産物のDNA配列は、プライマと同じオリゴヌクレオチドを用いて分析した。公開されたデータベース中の配列を、患者、キャリアおよび健康人より得たDNA配列と比較し、ヌクレオチド中の変化を区別した。
【００７９】
同様にエクソン2-4のRT-PCR増幅またはエクソン3のPCR増幅によって、NarI処置後に新しいNarI部位が形成されている（A261del）ことが確認された。エクソン3-PCRのプライマとして、ここでは5'-CCTAGTCATCCATGTGCTGG-3'（SEQ ID NO:6）および5'-TCCCATACCTGACCTTCCAC-3'（SEQ ID NO:7）を用いた。エクソン2-4のRT-PCR用のプライマとして、ここでは5'-CTTGATAGACTTTCTGTAAAGAAG-3'（SEQ ID NO:8）および5'-GGCTACTTGGACAAATCTCCACTG-3'（SEQ ID NO:9）を用いた。NarIの分解産物は1.5%アガロースゲルにより分離した。
【００８０】
1-6.  ノーザンブロット分析
多数のヒト成人組織のノーザン（MTN）ブロット（Clontech）を、Perfect Hybハイブリッド形成液（Toyobo）中で、ALS2CR6を32P-dCTPで標識したエクソン4、またはヒト(アクチンcDNAを用いてハイブリッド形成した。膜は1%のSDSを含む0.1 x SSCを用いて洗浄し、X線フィルム（Bio-MAX, Kodak）に供した。
【００８１】
1-7.  mRNA in situハイブリダイゼーション
アンチセンスおよびセンスcRNAプローブを、2種類のマウスcDNAクローンm2-asおよびm2-sから調製した。これらのマウスcDNAクローンはマウスmALS2CR6 cDNAの一部（SEQ ID NO:4の1732番から2685番目の塩基；954bp）をカバーし、pCR2.1（Invitrogen）中に逆方向で挿入された。プローブの調製はメーカー（Roche Molecular Biochemicals）のプロトコルに従って、ジゴキシゲニン標識化UTPおよびT7ポリメラーゼを混合するin vitro転写反応により行った。試料調製およびin situハイブリダイゼーションは文献（29）に従った。
【００８２】
1-8.  データベースの検索
各DNAおよびアミノ酸配列は、BLASTNおよびBLASTPを用いて、互いにオーバーラップしないヌクレオチドおよび蛋白質配列のデータベースに関して比較した。蛋白質のドメインおよびモチーフは、Genome Net JapanのMOTIFサーバー（http://www.genome.ad.jp）、BCMの検索ランチャー（http://www.hgse.hem.tmc.edu/Search.launcher）およびNCBIのCD検索（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）により同定した。
【００８３】
2.  結果
発明者はYAC/BAC/PACを基に、ALS2の候補領域（文献5および6）全体をカバーする3Mbのゲノム領域の物理的地図を作製した。ESTおよびcDNAクローンの配列分析は広い領域内部で実施し、同時にこの物理的地図を用いて、すでに分析された18個の遺伝子（KIAA0005、CLK1、PP1L3、ORC2L、NDUFB3、CFLAR、CASP10、CASP8、FZD7、NOP5、UBL1、BMPR2、FLJ10881、LOC57404、AIP-1、CD28、CTLA4およびAILIM）を含む43個の独立した転写ユニット、および10個の新しい全長転写産物（ALS2CR1、ALS2CR2、ALS2CR3、ALS2CR4、ALS2CR5/MPP4、ALS2CR6、ALS2CR7、ALS2CR8、ALS2CR9およびALS2CR12）のマッピングを行った。これらの遺伝配列はALS2の座に存在している（図1）。
【００８４】
若年性ALS2は稀であり、十代または二十代において手足、顔面および咽頭の筋痙攣が徐々に発現するという徴候を有する。ALS2は劣性遺伝性であるため、このALS2疾患は機能性変異の消失により生じる可能性が予測されている。ALS2遺伝子座における大きな欠失または転座について、PCRおよびサザンブロット分析ベースでSTS/EST内容をマッピングすることにより調査されたが、これは検出されなかった。その後にエクソンまたはイントロン-エクソン境界における小さな欠失または塩基置換が調査された。これらの変異を検出するために、各遺伝子の分析が行われ、そのイントロン/エクソン境界が決定された。現時点では42個の遺伝子より395個のエクソンが同定されている。スプライシングドナーとアクセプターにあたるコンセンサス配列を含んだ、エクソンおよびその側面配列を増幅するため、合計411個のプライマを設計し、これらのプライマを用いて、PCRにより、ALS2家系（図2a）の14例とは無関係な正常対照被験者10例のゲノムDNAを増幅した。これらの各PCR産物の配列を決定し、そこでは合計77個のイントロンまたはエクソンの配列多型が明らかになった。これら77個の多型のうち、4個の異なる遺伝子に含まれる8個の変異がALS2に関連していた（表2）。
【００８５】
【表２】
2005525079.tif 000003
これらの配列変異のうち、ALS2CR6のエクソン3中に記録された一つのヌクレオチド欠失（A261del）がリーディングフレームを壊しており、このような変異が蛋白質を変異させていることが示唆される。疑わしいヘテロ接合性キャリアは全て複製された配列パターンを示しており、これは不完全部位の後にある最初のヌクレオチドより始まっている（図2b）。この欠失は明らかにALS2発現型と共に移動しており（図2c）、様々な人種の正常対照個体533例においては記録されていない（データは示さず）。他の変異の中には、ALS2CR9遺伝子のエクソン4において、1個の塩基がCからTへ置換されている状態がある（C873T）。しかしこの変異は3番目のコドンに対応しており、そのためアミノ酸残基を変化させない。他の配列変異により潜在化または顕在化するスプライシングエラーを検出するため、患者と健常対照者のリンパ球より抽出した総RNAを用いてRT-PCRを実施したが、mRNAの配列変異は検出されなかった（データは示さず）。従って、イントロンまたはエクソン領域に関連する変異はスプライシングエラーを生じない。これらの結果から、ALS2CR6のエクソン3における1個の塩基の欠失（A261del；表1）がALS2に関連する変異であることが確認されている。
【００８６】
ALS2CR6遺伝子は33個のイントロンと34個のエクソンを含み、多型DNAマーカーD2S2309に隣接する80.3kbのゲノムDNA中に存在している（図1）。ALS2CR6遺伝子の転写極性はテロメアから中央体に向かう方向である。ALS2CR6転写産物（mRNA）は全長6394bp（SEQ ID NO:1）でヌクレオチド4974個の長さ（124-5,097 nt）の単一のオープンリーディングフレーム（ORF）を有しており、1,657個のアミノ酸残基より成る184kDaの蛋白質をコードしている。ポリアデニル化推定シグナル（AATAAA: 6,375-6,380 nt）およびpoly(A)領域が明らかである。また、短いALS2CR6転写産物として全長2,651bp、1,191bpのORFを有し、396個のアミノ酸配列をコードするものが同定された。この短い変異体はエクソン4の後にある5'-ドナー部位をスプライスし、結果としてイントロン4の25個のアミノ酸残基の後にストップコドンが形成される。これらの結果に対応して、ノーザンブロット分析により多くの成人の組織中に、約6.5kbと2.6kbの2個の転写産物が同定された（図3a）。肝臓では主に短い転写産物が発現される点を例外として、両方の転写産物が同様な発現パターンを示した。6.5kbの大きな転写産物は2.6kbの転写産物よりわずかに高レベルで発現しており、小脳において最も大量に発現していることが確認されている。この遺伝子はALS2患者の細胞内でも発現していることが確認されている。
【００８７】
さらにマウスのALS2CR6相同体が単離され、mALS2CR6と命名された。mALS2CR6の転写産物は全長6,349bp（SEQ ID NO:4）であり4,956bp（124-5,076 nt）のORFを有し、1651個のアミノ酸（SEQ ID NO:5）より成る183kDaの蛋白質をコードしている。全体としてこのORFは、ヒトとマウスの間でDNAレベル（87%同一）および蛋白質レベル（91%同一；94%類似；図4）で良く保存されており、ALS2CR6遺伝子は哺乳類で良く保存された遺伝子であることが示唆される。
【００８８】
mALS2CR6転写産物の発現がマウス脳および脊髄において局在化する性質を調べるため、mALS2CR6 cDNAの一部に対応するリボプローブを用いたin situハイブリダイゼーションを実施した。その結果、図5に示すように、mALS2CR6転写産物は脳から脊髄に至る神経細胞中で、様々なレベルで発現しており、特に海馬および歯状回のニューロン、小脳プルキンエ細胞、大脳皮質のニューロンおよび前角細胞を含む脊髄の灰白質に著しかった。加えて嗅球、基底核および脳神経核においても顕著な発現が記録された。
【００８９】
ヒトALS2CR6蛋白質は多くの興味深い性質を示した（図6a）。第一の性質はALS2CR6のA-末端側領域に現れ、それはRCC1（染色体濃縮の調節因子；文献7）およびRPGR（色素性網膜炎に関連するGTPase；文献8）に対して高い相同性を示した（図8）。RCC1およびRPGR蛋白質はRanの如きGTPaseに対してグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）として作用する。第二の性質は、ALS2CR6にはDb1相同性（DH）ドメインとプレクストリン相同性（PH）ドメインが存在し、いずれのドメインもRhoGEF蛋白質として記録されている典型的なドメインである点である（文献9および10）。加えて、VPS9ドメインはC末端領域中に存在することも記録されている。VPS9ドメインはVps9（文献11）やRabex-5（文献12）等の多数のGEF中に記録されており、それぞれは液胞蛋白質の分泌や食細胞の輸送を媒介すると言われている。14個のアミノ酸より構成される2個のMORNモチーフ（文献14）が同様に記録されている。MORNモチーフを含むジャンクトフィリンに関する最近の研究によれば、このモチーフが原形質膜の結合に寄与していることが示されている（文献13）。GEFはGTPaseのGDP結合形態に関連しており、GDPの分離とGTPの結合を促進し、これによってGTPaseが活性化されることが知られている。多くのシグナル伝達カスケード（文献14）、ニューロン形成（文献15）、膜輸送（文献16）およびアクチン細胞骨格の形成（文献17）等において、GEFが重要な役割を果たすことが知られているため（文献18および19）、Ranに関連したGTPaseに対する調節因子/活性化因子としてALS2CR6が作用し、膜形成を調節し、ニューロンを含む細胞の（膜）輸送において作用するということも十分考えられる。
【００９０】
RT-PCR分析によれば、変異したALS2CR6遺伝子の転写産物は患者の染色体から転写されており（図2c）、49個のアミノ酸より構成され、C末端に3個の新しい残基（Pro-Ser-Glu）を有する修正された蛋白質を産生している（図6a）。この修正された蛋白質はALS2CR6蛋白質に対応する機能性ドメインを持たないため、その固有の機能が失われていると思われる。従って、ALS2CR6において記録されたこのA261del変異はALS2が劣性遺伝性を有するという事実に関連している。
【００９１】
近年の知見では、ALSは軸索の輸送と細胞骨格形成に関する血管に関連しているとされるが（文献20、21および22）、そこからALS2CR6遺伝子がALS2に対応しており、膜構造Ran関連GTPaseの調節機能の欠如に起因する膜構造の欠陥により、ALS2が発生するという仮説が導出される。
【００９２】
ALS2CR6遺伝子は銅-亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（SDS-1）がALSにおいて果たす役割が決定された後につづく、2番目のALS遺伝子である。SOD-1の変異は晩発性の常染色体優性の形態に関連している（文献23）。
【００９３】
上記の発明は、明快な理解を図るために図式と事例により幾分詳しく記述されているが、当該発明の教授内容に照らし合わせて、変化と改訂が付属の請求の意図や範囲を離れることなく、それに対して為されているであろうことが専門家には容易に理解できるであろう。全ての特許、特許出願書類およびここで参照された出版物はここで参照により含まれている。
【非特許文献１】Siddique, T. et al.  Neurology 47, S27-S35 (1996).
【非特許文献２】Ben Hamida, M. et al.  Brain 113, 347-363 (1990).
【非特許文献３】Hentati, A. et al.  Nature Genet. 7, 425-428 (1994).
【非特許文献４】Hosler, B. A. et al.  Neuro genetics 2, 34-42 (1998).
【非特許文献５】Hadano, S. et al.  Genomics 55, 106-112 (1999).
【非特許文献６】Hadano, S. et al.  Genomics 71, 200-213 (2001).
【非特許文献７】Lerman-Sagie, T. et al.  J. Child Neurol. 11, 54-57 (1996).
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【非特許文献１１】Carazo-Salas, R. E. et al.  Nature 400, 178-181 (1999).
【非特許文献１２】Soisson, S. M. et al.  Cell 95, 259-268 (1998).
【非特許文献１３】Hama, H. et al.  J. Biol. Chem. 274, 15284-15291 (1999).
【非特許文献１４】Horiuchi, H. et al.  Cell 90, 1149-1159 (1997).
【非特許文献１５】Takeshima, H. et al.  Mol. Cell 6, 11-22 (2000).
【非特許文献１６】Barrett, K. et al.  Cell 91, 905-915 (1997).
【非特許文献１７】Martijn, F. B. G. et al.  J. Cell. Biol. 137, 1603-1613 (1997).
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【非特許文献２２】Collard, J. -F. et al.  Nature 375, 61-64 (1995).
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【非特許文献２４】Rosen, D. R. et al.  Nature 362, 59-62 (1993).
【非特許文献２５】Chance, P. F. et al.  Am. J. Hum. Genet. 62, 633-640 (1998).
【非特許文献２６】Blair, I. P. et al.  Neurogenetics 3, 1-6 (2000).
【非特許文献２７】Hentati, A. et al.  Neurogenetics 2, 55-60 (1998).
【非特許文献２８】Hosler, B. A. et al.  JAMA 284, 1664-1669 (2000).
【非特許文献２９】Altschul, S. F. et al.  Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997).
【非特許文献３０】Matsumoto, K. et al.  Mol. Repod. Dev. 54, 103-111. (1999).
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ALS2候補領域を含んだヒト染色体2q33の3Mb領域に対する転写地図である。白い中抜き長方形はD2S116からD2S2237の区間である2,3。7カ所のSTSマーカー、12個の多型性DNAマーカーおよび42個の独立した転写ユニットの位置が示されている。38カ所の転写ユニットの極性は矢印により示されている。ALS2遺伝子の位置は「ALS2CR6」と呼ばれており、この用語は以下のALS2と同義で用いる場合がある。
【図２】ALS2に関連した変異を検出するためのプロセスを示す。「a」はチュニジアおよびクウェートのALS2家系の一例である。家族構成員の遺伝子型は過去の報告結果に基づいて示されている3,4。「b」にはチュニジアのALS2家系におけるゲノムDNA中の変異（A261del）の配列決定結果を示す。患者10797はホモ接合型のA261delであり、キャリア10784はヘテロ接合型である。配列決定はPCR産物に対して実施された。「c」にはクウェートのALS2家系におけるゲノムDNA中の変異（AG1548del）の配列決定結果を示す。問題の領域にあるエクソン5の逆鎖の配列が示されている。個人18279は健常な同胞であり、ALS2による影響を受けず、2個の正常ハプロタイプを保有している。この配列中のボックスは、発病患者において欠失している塩基の部位を示す。個人18281は1個の疾患ハプロタイプを保有する非発病患者である。オーバーラップしている正常配列および変異配列が示されている。個人18275は発病しており、図にはエクソン5の逆鎖におけるホモ接合性のCT欠失が示されている。欠失した塩基の部位は矢印により示されている。対応するフォワード配列およびコードされた正常アミノ酸、およびフレームシフトにより生じた新規アミノ酸が示されている。「d」にはチュニジアのALS2家系におけるA261del変異の分離を示す。欠失の存在はNarIを用いた消化により測定されたが、これは変異遺伝子産物のみを切断するものである。エクソン-PCR産物については、正常な対立遺伝子を表す339bpの断片が、変異した対立遺伝子では開裂して2個の断片（225bpと113bp）となった。RT-PCR産物については、正常な対立遺伝子を表す302bpの断片が、変異した対立遺伝子では開裂して2個の断片（195bpと106bp）となった。
【図３】ALS2（ALS2CR6）mRNAのノーザンブロット分析を示す。「a」では、多数の成人ヒト組織のポリA+ mRNAを2(g含有するノーザンブロットを、ALS2 cDNAのエクソン4を用いてハイブリッド形成させた。下図では同じブロットをヒト(アクチンcDNAとハイブリッド形成させ、RNAの性質と対照負荷を確認した。左図ではALS2転写物のサイズが示されている。「b」では、正常な全脳より得た総RNA10(gと、患者と健常人（10788例）のリンパ球より得た総DNA20(gを、ALS2 cDNAのエクソン4に対してハイブリッド形成させた。右部分にはRNA試料のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図４】ヒトALS2CR6とマウスの相同対mALS2CR6におけるアミノ酸配列の比較である。同一の残基は枠で示されている。ここには、チュニジア例の変異体蛋白質における追加された3個のアミノ酸残基部位（47番目のアミノ酸残基より開始）、ALS2遺伝子の短い変異部分における25個のアミノ酸残基部位（372番目の残基より開始）、およびクウェート例の変異体蛋白質における追加された70個のアミノ酸残基部位（476番目の残基より開始）が示されている。
【図５】成熟したマウスの脳および脊髄におけるALS2 mRNAの発現である。「a」はアンチセンスALS2リボプローブを用いたRNA/RNA in situハイブリッド形成の矢印状の全体画像であり、「b」はセンス鎖プローブを用いた対照画像である。顕著な発現が記録されたのは、海馬および歯状回のニューロン（cおよびg）、小脳のプルキンエ細胞（dおよびh）、大脳皮質のニューロン（eおよびi）、および前角細胞を含む脊髄の灰白質（fおよびj）である。スケールバーは10(m長を示す。
【図６】アミノ酸配列分析の結果である。「a」は正常および変異ALS2蛋白質のドメインとモチーフの模式図である。RCC1は染色体濃縮のための調節因子であり、DHはDb1に対する相同ドメイン、PHはプレクストリン相同ドメインであり、MORNは膜構造および認識ネクサスであり、VPS9は9ドメインを区別するための液胞蛋白質である。「b」はヒトALS2（hALS2CR6）、マウスALS2（mALS2CR6）、ヒト（h）RCC1、ヒト（h）RPGRおよびマウス（m）RPGRについて、RCC1反復を含む領域のアミノ酸配列を比較したものである。開いた枠で示されたアミノ酸残基は同一である。保存されたアミノ酸残基も同様に豊富に含まれている。RCC1に対応する7個のブレードの位置は文献に従って示されている30。
【図７】野生型ヒト、マウス、およびALS2蛋白質の短縮型ヒト変異種と、A261del（チュニジア）およびAG1548del（クウェート）変異種のコーディング産物を比較した図である。
【配列表】
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2005525079.tif 000041
2005525079.tif 000042
【図１】
2005525079.tif 000043
【図２ａ】
2005525079.tif 000044
【図２ｂ】
2005525079.tif 000045
【図２ｃ】
2005525079.tif 000046
【図２ｄ】
2005525079.tif 000047
【図３】
2005525079.tif 000048
【図４ａ】
2005525079.tif 000049
【図４ｂ】
2005525079.tif 000050
【図５】
2005525079.tif 000051
【図６ａ】
2005525079.tif 000052
【図６ｂ】
2005525079.tif 000053
【図７】
2005525079.tif 000054
【図７−１】
2005525079.tif 000055
【国際調査報告】
2005525079.tif 000056
2005525079.tif 000057
2005525079.tif 000058
2005525079.tif 000059
2005525079.tif 000060