(57)【要約】ウイルス、バクテリア（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノ細菌、クラミディア、リケッチアなどの細胞間および細胞内のバクテリアを含む）、酵母、黴、真菌、プリオンまたは単独または組合せでＴＳＥの原因となる同様のもの、および単細胞もしくは多細胞の寄生生物など、１以上の活性な生物学的汚染物質または病原体のレベルを低下させるための消化酵素製剤を殺菌する方法が開示される。これらの方法は、トリプシン、ガラクトシダーゼおよびイデュロネート−２−スルファターゼなどの消化酵素製剤を照射により殺菌することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射線感受性の１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法であって、前記方法が前記放射線感受性の１以上の消化酵素の製剤を、前記１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間の間、前記１以上の消化酵素の製剤を殺菌しかつ前記１以上の消化酵素の製剤を前記放射線から保護するのに有効な割合で、放射線により照射する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
放射線感受性の１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記１以上の消化酵素の製剤に、前記１以上の消化酵素の製剤を前記放射線から保護するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を加える工程と、
（ｉｉ）前記１以上の消化酵素の製剤を、前記１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合で適当な放射線により照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
放射線感受性の１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を、前記１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまで減少させる工程と、
（ｉｉ）前記１以上の消化酵素の製剤を、前記１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合で適当な放射線により照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
放射線感受性の１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記１以上の消化酵素の製剤の温度を、前記１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまで低下させる工程と、
（ｉｉ）前記１以上の消化酵素の製剤を、前記１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合で適当な放射線により照射する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
放射線感受性の１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）（ａ）前記１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を減少させること、
（ｂ）前記１以上の消化酵素の製剤の温度を低下させること、および
（ｃ）前記１以上の消化酵素の製剤に少なくとも１種の安定剤を加えること
からなる群から選択される少なくとも１種の安定化方法を前記１以上の消化酵素の製剤に適用する工程と、
（ｉｉ）前記１以上の消化酵素の製剤を、前記１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合で適当な放射線により照射する工程と
を含み、前記少なくとも１種の安定化方法と照射の割合が共に、前記１以上の消化酵素の製剤を保護するのに有効であることを特徴とする方法。
【請求項６】
放射線感受性の１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法であって、前記方法が、
（ｉ）（ａ）前記１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を減少させること、
（ｂ）前記１以上の消化酵素の製剤の温度を低下させること、および
（ｃ）前記１以上の消化酵素の製剤に少なくとも１種の安定剤を加えること
からなる群から選択される少なくとも２種の安定化方法を１以上の消化酵素の製剤に適用する工程と、
（ｉｉ）前記１以上の消化酵素の製剤を、前記１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間の間、有効な割合で適当な放射線により照射する工程と
を含み、前記少なくとも２種の安定化方法と照射の割合が共に、前記１以上の消化酵素の製剤を保護するのに有効であり、さらに前記少なくとも２種の安定化方法を任意の順で実行してもよいことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記溶媒は水であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記残留水分量を有機溶媒の添加によって減少させることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶媒は有機溶媒であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記残留溶媒含有量を減少させた後、前記１以上の消化酵素の製剤を有機溶媒に懸濁させることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項１１】
前記有効な割合は約３．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１２】
前記有効な割合は約２．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１３】
前記有効な割合は約１．０ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１４】
前記有効な割合は約０．３ｋＧｙ／時間以下であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１５】
前記有効な割合は約３．０ｋＧｙ／時間より大きいことを特徴とする請求項２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１６】
前記有効な割合は少なくとも約６．０ｋＧｙ／であることを特徴とする請求項２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１７】
前記有効な割合は少なくとも約１８．０ｋＧｙ／であることを特徴とする請求項２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１８】
前記有効な割合は少なくとも約３０．０ｋＧｙ／であることを特徴とする請求項２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１９】
前記有効な割合は少なくとも約４５ｋＧｙ／であることを特徴とする請求項２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項２０】
前記１以上の消化酵素の製剤を低酸素雰囲気中に維持することを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項２１】
前記１以上の消化酵素の製剤を少なくとも１種の希ガス中に維持することを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項２２】
前記希ガスはアルゴンであるすることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１以上の消化酵素の製剤を真空中に維持することを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項２４】
前記残留溶媒含有量を凍結乾燥、乾燥、濃縮、溶質の添加、蒸発、化学抽出、噴霧乾燥およびガラス化からなる群から選択される方法によって減少させることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項２５】
前記残留溶媒含有量は、約１５％未満であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項２６】
前記残留溶媒含有量は、約１０％未満であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項２７】
前記残留溶媒含有量は、約３％未満であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項２８】
前記残留溶媒含有量は、約２％未満であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項２９】
前記残留溶媒含有量は、約１％未満であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項３０】
前記残留溶媒含有量は、約０．５％未満であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項３１】
前記残留溶媒含有量は、約０．０８％未満であることを特徴とする請求項３、５または６に記載の方法。
【請求項３２】
前記１以上の消化酵素の製剤に照射する前記工程の前に、少なくとも１種の増感剤を前記１以上の消化酵素の製剤に添加することを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項３３】
前記１以上の消化酵素の製剤は、ウイルス、バクテリア、酵母、カビ、真菌、プリオンまたは単独または組合せでＴＳＥの原因となる同様の作用因、および単細胞もしくは多細胞の寄生生物からなる群から選択される少なくとも１種の生物学的汚染物質または病原体を含むことを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種の安定剤は酸化防止剤であることを特徴とする請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１種の安定剤は遊離基捕捉剤であることを特徴とする請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１種の安定剤は組合せ安定剤であることを特徴とする請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１種の安定剤はリガンドであることを特徴とする請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項３８】
前記リガンドはヘパリンであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記少なくとも１種の安定剤は、反応性酸素種による損傷を低減させることを特徴とする請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１種の安定剤は、アスコルビン酸またはその塩もしくはエステル；グルタチオン；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸；尿酸またはその塩もしくはエステル；メチオニン；ヒスチジン；Ｎ−アセチルシステイン；リポ酸；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；没食子酸またはその誘導体；没食子酸プロピル、およびこれらの２種以上の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項４１】
前記２種以上の追加安定剤の前記混合物は、アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと尿酸またはその塩もしくはエステルの混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；アスコルビン酸またはその塩もしくはエステルと、尿酸またはその塩もしくはエステルと、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の混合物；尿酸またはその塩もしくはエステルの混合物；尿酸またはその塩もしくはエステル；リポ酸；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム；没食子酸またはその誘導体；没食子酸プロピル、および、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１種の安定剤は、ジペプチド安定剤であることを特徴とする請求項２、５または６に記載の方法。
【請求項４３】
前記ジペプチド安定剤は、グリシルグリシン（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）、カルノシンおよびアンセリンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記放射線は粒子線または電磁放射線またはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項４５】
前記電磁放射線は、電波、マイクロ波、可視および不可視光、紫外線、Ｘ線、γ線およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記放射線はγ線であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項４７】
前記放射線は電子ビーム線であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項４８】
前記放射線は可視光であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項４９】
前記放射線は紫外線であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項５０】
前記放射線はＸ線であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項５１】
前記放射線は多色の可視光であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項５２】
前記放射線は赤外線であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項５３】
前記放射線は可視光および紫外線の１つ以上の波長の組合せであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項５４】
前記照射は周囲温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、５または６に記載の方法。
【請求項５５】
前記照射は周囲温度より低い温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項５６】
前記照射は前記１以上の消化酵素の製剤の凝固点より低い温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項５７】
前記照射は前記１以上の消化酵素の製剤の共融点より低い温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６に記載の方法。
【請求項５８】
前記照射は周囲温度より高い温度で行われることを特徴とする請求項１、２、３、５または６に記載の方法。
【請求項５９】
１以上の消化酵素の少なくとも１種の製剤と、放射線による殺菌の後にその意図した使用のために前記１以上の消化酵素の製剤を保存するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項６０】
１以上の消化酵素の少なくとも１種の製剤を含む組成物であって、前記１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量が、放射線による殺菌の後にその意図した使用のために前記１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効なレベルであることを特徴とする組成物。
【請求項６１】
前記残留溶媒含有量は、約１５％未満であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項６２】
前記残留溶媒含有量は、約１０％未満であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項６３】
前記残留溶媒含有量は、約５％未満であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項６４】
前記残留溶媒含有量は、約２％未満であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項６５】
前記残留溶媒含有量は、約１％未満であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項６６】
前記残留溶媒含有量は、約０．５％未満であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項６７】
前記残留溶媒含有量は、約０．０８％未満であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項６８】
前記１以上の消化酵素の製剤はガラス質またはガラス化されていることを特徴とする請求項５９または６０の組成物。
【請求項６９】
前記１以上の消化酵素の製剤は、トリプシン、グリコシダーゼおよびスルファターゼからなる群から選択される少なくとも１種の消化酵素を含むことを特徴とする請求項５９または６０の組成物。
【請求項７０】
前記１以上の消化酵素の製剤の全タンパク質濃度は少なくとも約０．５％であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項７１】
前記１以上の消化酵素の製剤の全タンパク質濃度は少なくとも約１％であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項７２】
前記１以上の消化酵素の製剤の全タンパク質濃度は少なくとも約５％であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項７３】
前記１以上の消化酵素の製剤の全タンパク質濃度は少なくとも約１０％であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項７４】
前記１以上の消化酵素の製剤の全タンパク質濃度は少なくとも約１５％であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項７５】
前記１以上の消化酵素の製剤の全タンパク質濃度は少なくとも約２０％であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項７６】
前記１以上の消化酵素の製剤の全タンパク質濃度は少なくとも約２５％であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項７７】
前記１以上の消化酵素の製剤の全タンパク質濃度は少なくとも約５０％であることを特徴とする請求項６０の組成物。
【請求項７８】
請求項１、２、３、４、５または６の方法によって殺菌された前記１以上の消化酵素の製剤の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを特徴とする哺乳動物中の消化酵素欠乏症を治療する方法。
【請求項７９】
哺乳動物はヒトであることを特徴とする請求項７８の方法。
【請求項８０】
前記消化酵素欠乏症はファブリー病であることを特徴とする請求項７８の方法。
【請求項８１】
前記消化酵素欠乏症はハンター症候群であることを特徴とする請求項７８の方法。
【請求項８２】
前記消化酵素欠乏症はゴーシェ病であることを特徴とする請求項７８の方法。
【請求項８３】
前記１以上の消化酵素の製剤はα−ガラクトシダーゼを含むことを特徴とする請求項７８の方法。
【請求項８４】
前記１以上の消化酵素の製剤はイズロン酸−２−スルファターゼを含むことを特徴とする請求項７８の方法。
【請求項８５】
前記リガンドは前記１以上の消化酵素の製剤に含まれる少なくとも１種の消化酵素の基質または基質の類似体であることを特徴とする請求項３７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化酵素製剤を殺菌し、その中に存在する、ウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような）細胞間−および細胞内細菌）、酵母、カビ、真菌、プリオンもしくはＴＳＥに対して単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因および／または単細胞もしくは多細胞の寄生生物のような活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させる方法に関する。本発明は、特に、トリプシン、α−ガラクトシダーゼおよびイズロン酸−２−スルファターゼ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）のような消化酵素製剤を照射により殺菌する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのような生物が生き残るための主な食物は、炭水化物、脂肪およびタンパク質として広く分類されうる。しかし、これらの物質は、食物を分解する消化のプロセスがなければ栄養素として役に立たない。
【０００３】
炭水化物の消化は、口および胃で開始される。唾液は、酵素プチアリン（α−アミラーゼ）を含有しており、この酵素は澱粉をマルトースと他のグルコースの小さなポリマーに加水分解する。膵臓のα−アミラーゼは、唾液のプチアリンと同様であるが、数倍強力である。したがって、糜汁が十二指腸へ移動して、膵液と混合された後すぐに、実際上、澱粉は全て二糖およびグルコースの小さなポリマーに転化される。これらの二糖およびグルコースの小さなポリマーは腸管上皮酵素によって単糖に加水分解される。
【０００４】
タンパク質の消化は胃で開始される。胃で産生される酵素ペプシンは、コラーゲン、すなわち食肉の細胞間結合組織を消化する。この酵素反応は、他の消化酵素が食肉に浸透し、細胞タンパク質を消化するために不可欠なものである。したがって、胃の消化活性を欠く人では、摂取した食肉が、これらの他の消化酵素によってよく浸透されず、そのため吸収が不十分となる。
【０００５】
タンパク質の消化のほとんどは、膵臓のタンパク質分解酵素の作用により起こる。プロテオース、ペプトンおよび大きなポリペプチドの形態で胃から出て行くタンパク質は、膵臓のタンパク質分解性酵素またはポリペプチダーゼによって、ジペプチド、トリペプチドなどに消化される。トリプシンおよびキモトリプシンは、特徴的なペプチド結合でタンパク質分子をより小さなポリペプチドに分解し、一方、カルボキシポリペプチダーゼはペプチドのカルボキシ末端からアミノ酸を開裂するプロエラスターゼはエラスターゼを生じ、これは次に、ほとんどの食肉に結合しているエラスチン繊維を消化する。
【０００６】
ポリペプチドの更なる消化は、腸管内腔で起こる。アミノポリペプチダーゼおよび幾つかのポリペプチダーゼは、大きなポリペプチドをジペプチド、トリペプチドおよびアミノ酸に分解し、これらは腸絨毛内を覆う腸細胞に輸送される。腸細胞内では、他のポリペプチダーゼが、残りのペプチドをそれらの構成アミノ酸に分解し、これらは次に血液中に入る。
【０００７】
脂肪の消化は、まず、胆汁およびレシチンによる乳化を必要とし、これは脂肪の表面積を１０００倍まで増加させる。リパーゼは脂肪小球の表面のみに結合することができる水溶性消化酵素であるので、この乳化プロセスは、脂肪の完全な消化にとって重要である。トリグリセリドの消化で最も重要な消化酵素は膵臓リパーゼであり、これはトリグリセリドを遊離脂肪酸と２−モノグリセリドに分解する。これらの遊離脂肪酸とモノグリセリドは、腸細胞に入り込んだ後、一般に新たなトリグリセリドに再結合される。しかし、多少のモノグリセリドは細胞内リパーゼによって更に遊離脂肪酸に消化される。
【０００８】
したがって、身体の種々の細胞への栄養素の分解および取り込みの後、消化が継続する。細胞内リパーゼのような細胞内酵素は、種々の場所および時に生物の細胞によって必要とされ、且つ利用可能な形態に栄養素を、取り込むこと、分解すること、輸送すること、貯蔵すること、放出すること、代謝することおよび異化することに関与する。これには脂質およびそれらの代謝物のエネルギー源への貯蔵、並びに、他の有用な化合物への異化および合成が含まれる。消化はまた、組織の生成、および分解された、損傷を受けた、または異常な組織もしくは分子を再生または修復する、生物の正常なプロセスの一部として起こる。これはまた、アポトーシス、免疫反応、感染、新生物および生物の他の異常な状態もしくは疾患状態の特徴またはこれらから起こるものであり得る。
【０００９】
したがって、消化酵素製剤は、ヒトおよび動物の治療にしばしば提供される。
【００１０】
例えば、膵炎および膵臓の分泌の欠如の場合、リパーゼ、プロテアーゼおよびアミラーゼ（例えば、Ｃｒｅｏｎ（商標）、Ｃｏｔａｚｙｍ（商標）、Ｄｏｎｎａｚｙｍｅ（商標）、Ｋｕ−Ｚｙｍｅ（商標）ＨＰ、Ｐａｎｃｒｅａｓｅ（商標）およびＰａｎｃｒｅａｓｅ（商標）ＭＴ、Ｕｌｔｒａｓｅ（商標）およびＵｌｔｒａｓｅ（商標）ＭＴ、Ｖｉｏｋａｓｅ（商標）、ならびにＺｙｍａｓｅ（商標））の組み合わせ、および、リパーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼ（例えば、Ｋｕ−Ｚｙｍｅ（商標）およびＫｕｔｒａｓｅ（商標））の組み合わせを含めた、一定の膵臓の酵素製剤を、患者の妥当な栄養素を確保するために投与する。したがって、例えばヒトおよび動物の代償療法において特に注目される消化酵素には、トリプシンおよびキモトリプシン、およびそれらの機能的変異体、異型および誘導体のような膵臓の消化酵素が含まれる。
【００１１】
トリプシンはタンパク質を分解する機能を持つ酵素であり、これはしばしば、消化酵素、またはプロテイナーゼと称される。消化過程では、トリプシンは他のプロテイナーゼと共に作用して、食事性タンパク質分子をそれらの成分ペプチドとアミノ酸に分解する。トリプシンは、わずかにアルカリ性の環境（約ｐＨ８）がその最大の酵素活性を促進する小腸内で消化（これは胃で開始される）の過程を継続する。膵臓によって不活性な形で産生されたトリプシンは、化学的な組成および他の主要な膵臓プロテイナーゼであるキモトリプシンに対する構造において著しく類似している。両酵素はまた、同様の作用機序を有しているように思われる。すなわち、ヒスチジンおよびセリンの残基が両者の活性部位に見出される。この２種類の分子間の主要な差は、それらの特異性であると思われる。すなわち、どちらも一定のアミノ酸によって供与されるカルボキシル基を有するタンパク質分子のペプチド結合に対してのみ活性である。トリプシンについては、これらのアミノ酸はアルギニンおよびリジンであり、キモトリプシンについては、これらはチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、およびロイシンである。トリプシンは、それが攻撃する化学結合の数を制限することによって消化酵素全てのうちで最も識別性がある。
【００１２】
グリコシダーゼのような他の消化酵素製剤もまた、ヒト患者に治療用として投与される。例えば、ファブリー病は、リソソーム酵素であるα−ガラクトシダーゼＡの欠損によって引き起こされる、Ｘ−染色体に連鎖した劣勢の糖脂質蓄積症である。ファブリー病の臨床的徴候には、通常生後４０年から６０年のうちに起こる死を伴う、再発性症状の発現、重篤な痛み、および進行性の腎臓、心臓および脳血管の悪化が含まれれる。α−ガラクトシダーゼＡ製剤の注入による酵素代償療法が試されており、この症状に対する有望な潜在的治療であることが見出されている（非特許文献１）。
【００１３】
グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（酸性マルターゼ欠乏症またはポンペ病としても知られる）は、他の遺伝性の蓄積症である。ＧＳＤ−ＩＩでは、患者は筋肉細胞内のグリコーゲンを分解する酸性マルターゼ酵素の欠乏症に罹患している。ＧＳＤ−ＩＩの臨床的徴候には、最終的に呼吸器不全および／または心不全を引き起こす、筋肉組織内でのグリコーゲンの蓄積による進行性の筋肉の脆弱化が含まれる。したがって、グリコシダーゼ、またはこれらの機能的変異体もしくは異型もしくは誘導体の製剤もまた、治療用途に特に注目を集めている。
【００１４】
ニーマン−ピック病もまた遺伝性の代謝障害であり、これは有害な量の脂肪性物質であるスフィンゴミエリンが、脾臓、肝臓、肺、骨髄および脳に蓄積するものである。患者は、スフィンゴミエリンの生体内分解を開始させるスフィンゴミエリナーゼの欠乏症に罹患している。臨床的徴候には、脾臓および肝臓の拡大が含まれ、特に小児患者では、しばしば死に至る。
【００１５】
ゴーシェ病は、多少類似した遺伝性障害であり、有害な量の他の脂肪性物質であるグルコセレブロシダーゼが、脾臓、肝臓、肺、骨髄および脳に蓄積する。患者は、古い赤血球および白血球細胞の生体内分解から生じるグルコセレブロシドの生体内分解の最初の段階を触媒するβ−グルコセレブロシダーゼの欠乏症に罹患している。臨床的徴候には、脾臓および肝臓の拡大、血小板の減少、疲れ、および、ある形態では進行性の脳損傷が含まれる。アルグセラーゼ（Ｃｅｒｅｄａｓｅ（商標））として知られているグルコセレブロシダーゼの修飾型の製剤の注入による酵素代償療法が試されており、この症状に対する有望な潜在的治療法であることが見出されている（非特許文献２）。
【００１６】
ムコ多糖症は、ムコ多糖、すなわち身体の結合組織および器官を構築するのに使用される長鎖の糖分子を分解するために必要なリソソーム酵素の欠損によって引き起こされる遺伝性の代謝障害のグループである。これらの１以上の酵素が欠乏すると、身体内に過剰量の蓄積が起こり、進行性の損傷を引き起こし、最終的には死に至る。これらの障害の中には、フルラー、シャイエおよびフルラー／シャイエ症候群（最も重篤な形態は幼年期に起こり、年齢１０歳前に死亡する。症状は、α−Ｌ−イズロニダーゼの欠損によって引き起こされる角膜の混濁および進行性の身体的および精神的能力障害が含まれる）、ハンター症候群（若年者を襲い、年齢１５歳までに通常起こる死を伴う。症状には、イズロン酸−２−スルファターゼの欠損によって引き起こされる、関節の剛直、精神の衰退、発育不良（dwarfing）および進行性難聴が含まれる）、サンフィリポ症候群（１０代後半までに通常死が訪れる。症状には、ヘパランＮ−スルファターゼ、α−Ｎ−アセチルグルコサミナダーゼ、アセチル−ＣｏＡ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼおよび／またはＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼの欠損により引き起こされる、幼児期における進行性の痴呆および精神の衰退が含まれる）、モルキオ症候群（幼年期に現れ、症状には、ガラクトサミン−６−スルファターゼおよび／またはβ−ガラクトシダーゼの欠損により引き起こされる、重篤な発育不良および角膜混濁が含まれ、心臓もしくは呼吸器疾患により生後３０から４０歳での死が引き起こされる）、マロトーズ−ラミー（Ｍａｒｏｔｅａｕｚ−Ｌａｍｙ）症候群（フルラー症候群に類似。幼年期に始まるが、精神的能力障害はない。生後２０から３０歳で通常死に至る。アリールスルファターゼＢの欠損により引き起こされる）、およびスライ症候群（症状には、β−グルクロニダーゼの欠損により引き起こされる、角膜混濁、骨格の不揃い、および、肝臓および脾臓の拡大が含まれる）がある。ハンター症候群は、ヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の分解を触媒するイズロン酸−２−スルファターゼの欠損に特に関連しており、この症状はこの酵素の異型の投与により治療されうることが示唆されている（特許文献１）。したがって、例えばヒトおよび動物の治療で特に注目される消化酵素は、イズロン酸−２−スルファターゼおよびその機能的変異体、異型および誘導体も含まれる。
【００１７】
多発性スルファターゼ欠乏症（Ｃｏｎｆｉｃａｔｉｏｎ  １３の障害またはムコスルファチドーシスとしても知られる）は、公知の全てのスルファターゼ酵素（アリールスルファターゼＡ、ＢおよびＣ、２種のステロイドスルファターゼ、ならびに４種の他のスルファターゼを含む）の欠損により特徴づけられる他の遺伝性の代謝障害である。臨床的症状は、粗い顔つき、難聴、拡大した肝臓および脾臓、骨格の異常（腰椎後弯を含む）、および乾燥した落屑性皮膚（魚鱗癬）が含まれる。
【００１８】
同様に、消化酵素製剤は、栄養素を向上させるためにヒトおよび動物に投与される。
【００１９】
例えば、ラクトース不耐性の場合、ラクターゼの製剤（例えばＬａｃｔａｉｄ（商標））を、それが必要なヒトに投与する。ラクトース不耐性は、乳製品または乳含有製品を摂取した後の、ガス、鼓脹、痙攣（ｃｒａｍｐｌｓ）および下痢を含む胃腸内の不快によって特徴づけられる。したがって、例えばヒトおよび動物の治療で特に注目される消化酵素は、ラクターゼおよびその機能的変異体、異型および誘導体も含まれる。
【００２０】
同様に、ガラクトシダー製剤（例えばＢｅａｎｏ（商標）またはＮｕｔｒｉｔｅｋ（商標）Ａｌｐｈａ  Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）は、これを必要とするヒトに投与される。このような製品は、豆果およびアブラナ科の野菜を含めた食品中に見出される糖の消化を改善し、ガスおよび鼓脹のような、一般に食物に関連した影響を減少する。
【００２１】
ヒト、獣医学、診断および／または実験の用途で調製された消化酵素製剤には、不要であり、潜在的に危険な生物学的汚染物または病原体、例えば、ウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような細胞外および細胞内の細菌を含む）、酵母、カビ、真菌、プリオン、またはＴＳＥおよび／または単細胞しくは多細胞寄生生物に単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因が含有される。したがって、生物学的材料中の任意の生物学的汚染物または病原体を、その製品を使用する前に不活性化することが最も重要である。例えば輸血、血液因子の置換治療、器官の移植、並びに、静脈内、筋肉内または注射もしくは導入の他の形態によって矯正されるかまたは治療されるヒトの治療の他の形態で、患者にその製品を直接投与することになっている場合、これは特に重大である。さらに、これは、様々な種類の血漿および／または血漿誘導体または他の生物学的材料を含有し、かつマイコプラズマ、プリオン、細菌性、ウイルス性および他の生物学的汚染物もしくは病原体にさらされうる細胞または組み換え細胞の培地で、またはこれらの培養物を介して調製される、様々な製剤にとって重要なことである。
【００２２】
消化酵素製剤を製造するほとんどの方法は、この材料から１以上の汚染物または１以上の病原体を除去または不活性化するのではなく、むしろこの材料を特定の生物学的汚染物についてスクリーニングまたは試験する方法を含む。生物学的汚染物または病原体について陽性の試験結果が出る製剤は単に使用しない。スクリーニングの手順の例には、血液提供者から得られたヒト血液中の特定のウイルスについて試験することが含まれる。しかしながら、かかる手順には必ずしも信頼性があるとは限らず、特に非常に数が少ない一定のウイルスの存在を検出することはできない。このことは、偽陰性結果に関連する結果を考慮すれば、試験の評価または確実性を下げる。偽陰性の結果は、ある場合、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の場合には、生命にかかわり得る。さらに、一部の事例では、製品が汚染されているか否かを検出するのに、数か月ではないにしても、数週間かかることがある。したがって、消化酵素製剤を製造する間および／またはその製造後に汚染物または病原体を殺すかまたは不活性化する技術を適用することが望まれるであろう。
【００２３】
ウイルスを不活性化する技術の可能性を判定する実験を行う場合、関係がある実際のウイルスはほとんど利用されない。これは、試験を行う者に対する安全性への配慮と、封じ込めの設備および廃棄物処理に関連する困難性と経費が主因である。それらのかわりに、同一のファミリーおよびクラスのモデルウイルスを使用する。
【００２４】
一般に、不活性化するのが最も困難なウイルスは、タンパク質からできている外部シェルをもつものであり、しかも、それらの中で、不活性化するのが最も困難なものは、最小サイズのものであることが認められている。このことは、それらウイルスの小型サイズが、これらの小さなゲノムに起因しているので、γ線照射および他のほとんどの照射の形態において真実であることが明らかとなっている。分子に対する放射線の直接的効果の規模は、分子のサイズに正比例し、標的分子が大きくなるほど、効果が大きくなる。推論のとおり、γ線照射は、ウイルスゲノムが小さいほど、ウイルスを不活性化するのに必要な放射線量は高くなることが明らかとなった。
【００２５】
ヒトおよび動物に由来する製剤について懸念すべきウイルスのうち、最小であり、そのため最も不活性化が困難であるものは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）のファミリーと、わずかに大きいタンパク質で被覆された肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）に属するものである。ヒトにおいては、パルボウイルスＢ１９とＡ型肝炎は重要な病原体である。ブタ由来の材料では、対応する最小のウイルスはブタパルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）である。このウイルスはヒトに無害であるので、ヒトＢ１９パルボウイルスとＡ型肝炎のモデルウイルスとして選択されることが多い。このモデルパルボウイルスの不活性化の実証が、用いられている方法がヒトＢ１９ウイルスとＡ型肝炎を死滅させる適切な証拠となり、さらに、拡大解釈すると、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、その他のものなどの大型で、それほど耐久性がないウイルスを死滅させる適切な証拠となると考えられる。
【００２６】
より最近の取り組みでは、製品中の汚染物を除去または不活性化する方法に的が絞られてきた。かかる方法には、熱処理、濾過、ならびに製品への化学不活性化剤または化学増感剤の添加が含まれる。
【００２７】
熱処理は、感受性のある製品に損傷を与えることができる、最小で約１０時間、約６０℃まで製品を加熱することが必要である。ある場合には、熱不活性化は、製品の５０％以上の生物活性を実際に無効化する可能性がある。
【００２８】
濾過には、物理的に汚染物を除去するために製品を濾過することが含まれる。残念ながら、またこの方法により、高分子量を有する製品も除去されるかもしれない。さらに、ある場合には、小型ウイルスおよび、プリオンのような同様のサイズの汚染物および病原体はフィルタによって除去されないかもしれない。
【００２９】
化学増感の方法には、ウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡに結合する有害な薬剤、および、ＵＶまたは放射線のいずれかによって活性化される有害な薬剤の添加が含まれる。この放射線は、ウイルスのＤＮＡ／ＲＮＡに結合する、ＤＮＡ／ＲＮＡバックボーン中の化学結合を切断する、および／または、ウイルスがもはや自己複製することができないようにこれを架橋結合もしくは複合体化する、反応性中間体および／または遊離基を生じさせる。この手順では、増感剤が有毒であり、変異原性または発癌性でなくとも、患者に投与することができないので、製剤から未結合の増感剤を洗浄する必要がある。
【００３０】
製品へのγ線照射は、製品を殺菌する別の方法である。γ線は、高い総線量で与えられる場合、ウイルスと細菌を死滅させるのに有効である（非特許文献３および非特許文献４）。しかしながら、この分野の刊行された文献には、γ線が、血液、血液製剤、タンパク質およびタンパク質含有製品などの放射線感受性製品に損傷を与え得ることが報告されている。特に、高放射線量が赤血球、血小板および顆粒球にとって有害であることが示されている（非特許文献４）。特許文献２には、タンパク質製品は、タンパク質製品の効力（viability）を保持するためには、照射前に凍結しなければならないことを開示している。この特許は、「もしタンパク質材料が、例えば、周囲温度である間に、γ線が照射された場合、その材料は完全に損なわれ、すなわち、材料の活性が実質的には効果がないほど低くなる」と推断している。しかし、残念ながら、もし、照射目的で凍結し、次いで患者への投与前に解凍させたならば、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）のような感受性生物学的材料の多くは効力と活性を失う可能性がある。
【００３１】
上で論じた問題から、製剤に悪効果を及ぼすことなく、活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させるために有効な消化酵素製剤を殺菌する方法が求められている。
【００３２】
【特許文献１】
米国特許第６，１５３，１８８号明細書
【特許文献２】
米国特許第４，６２０，９０８号
【非特許文献１】
Schiffmann, et al. "Enzyme Replacement Therapy in Fabry Disease:A Randomized Controlled Trial." JAMA, June 6, 2001, Vol. 285, No. 21, pp.2743-2749
【非特許文献２】
Barton, et al., "Replacement Therapy for Enzyme Deficiency: Macrophage-targeted Glucocerebrosidase for Gaucher's Disease."New Engl. J. Med., May 23, 1991)
【非特許文献３】
Keathly et al., "Is There Life After Irradiation? Part 2," BioPharm July-August, 1993
【非特許文献４】
Leitman, "Use of Blood Cell Irradiation in the Prevention of Post Transfusion Graft-vs-Host Disease," Transfusion Science 10: 219-239 (1989)
【非特許文献５】
Meyer and Boyd, Analytical Chem., 31, 215-219, 1959
【非特許文献６】
May, et al., J. Biol. Standardization, 10, 249-259, 1982
【非特許文献７】
Centers for Biologics Evaluation and Research, FDA, Docket No.89D-0140,. 83-93 ; 1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
したがって、本発明の目的は、消化酵素製剤に悪効果を及ぼすことなく活性な生物学的汚染物または病原体のレベルを低下させることによって、消化酵素製剤を殺菌する方法を提供することである。本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な記述に記載されており、一部は、その記載から明白になるか、あるいは本発明の実施により理解することができる。本発明のこれらの目的および利点は、記載した記述において特に指摘した組成物と方法、ならびにこれについての特許請求の範囲によって実現され達成される。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
これらの目的および他の目的に従って、本発明の第１の実施形態は、放射線に感受性の１以上の消化酵素の製剤を殺菌するための方法であって、１以上の消化酵素の製剤を放射線で、該材料を殺菌し、且つ放射線から該材料を保護するのに有効な割合で、該材料を殺菌するのに有効な時間、照射することを含む方法に向けられる。
【００３５】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線から保護するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を、消化酵素製剤に添加することと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線により該材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまで消化酵素製剤の残留溶媒含有量を低下させることと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線により１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００３７】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまで１以上の消化酵素の製剤の温度を低下させることと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を放射線により、１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００３８】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）（ａ）１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）１以上の消化酵素の製剤に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）１以上の消化酵素の製剤の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程を１以上の消化酵素の製剤に適用することと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線により１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程および照射の割合が、共に放射線から１以上の消化酵素の製剤を保護するのに効果的である、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００３９】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）（ａ）１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）１以上の消化酵素の製剤に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）１以上の消化酵素の製剤の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程を１以上の消化酵素の製剤に適用することと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線により１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程が任意の順序で行われ、共に放射線から１以上の消化酵素の製剤を保護するのに効果的である、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００４０】
また、本発明は、少なくとも１種の、１以上の消化酵素の製剤と、放射線による殺菌後、それの企図する使用のためにこの１以上の消化酵素の製剤を保存するのに有効な量の少なくとも１種の安定剤を含む生物学的組成物を提供する。
【００４１】
本発明はまた、残留溶媒含有量が、放射線による殺菌後、それの企図する使用のためにこの１以上の消化酵素の製剤を保存するのに有効な量まで低下された生物学的組成物を提供する。
【００４２】
本発明はまた、少なくとも１種の、１以上の消化酵素の製剤と、少なくとも１種の安定剤を含有する生物学的組成物であって、残留溶媒含有量が低下されており、安定剤の量および残留溶媒含有量のレベルが共に、放射線による殺菌後、それの企図する使用のためにこの１以上の消化酵素の製剤を保存するのに有効である生物学的組成物を提供する。
【００４３】
本発明はまた、製剤の全タンパク質濃度が、放射線による殺菌後、それの企図する使用のために１以上の消化酵素の製剤を保存するのに有効である、少なくとも１種の、１以上の消化酵素の製剤を含む生物学的組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
Ａ．定義
他に特に定めがない限り、本明細書において用いられているすべての技術的および科学用語は、当該技術分野の技術者によって一般に理解されているのと同一の意味を有することを意図している。
【００４５】
本明細書で使用する用語、単数形を示す「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」には、文脈に他に特段の明らかな指示がない限り、複数の言及を含んでいる。
【００４６】
本明細書で使用する、用語「１以上の消化酵素の製剤」は、一の物質を第二の物質、特に１以上のタンパク質、１以上の脂質および／または１以上の炭水化物へ分解または転化した際に含まれる１以上の酵素を含有する、生きた生物から誘導されるかまたはそれから得られる任意の製剤を意味することを意図している。消化酵素の実例（これらに限定されない）には、任意の生きた生物の消化管に存在するかもしくはその中に導入されることによって産生される細胞内および細胞間酵素、または、外来もしくは内部で誘導された栄養素の代謝、異化、蓄積および可動化に関与するか、または組織の分解産物および／または細胞の修復、再生もしくは除去に関与する細胞内および細胞間酵素が含まれ、これらは例えば以下のものがある：トリプシンおよびキモトリプシン、膵臓リパーゼおよび膵臓アミラーゼのような膵臓タンパク質分解性酵素を含めた膵臓の酵素；プチアリンのような唾液の酵素；腸ペプチダーゼ、腸アミラーゼおよび腸リパーゼを含めた腸の酵素；α−ガラクトシダーゼのようなグリコシダーゼ；およびイズロン酸−２−スルファターゼのようなスルファターゼ。
【００４７】
本明細書では、「殺菌」という用語は、本発明にしたがって処理される製剤中に見出される少なくとも１種の生物学的汚染物または病原体のレベルの低減を意味することを意図している。
【００４８】
本明細書では、「生物学的汚染物または病原体」という用語は、１以上の消化酵素の製剤と直接的にまたは間接的に接触した際に、消化酵素、またはその受容者に悪効果を及ぼし得る汚染物または病原体を意味することを意図する。かかる生物学的汚染物または病原体には、一般に、消化酵素製剤中で発見されるか、あるいは前記製剤を感染させることが当業者に知られているウイルス、細菌（マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ナノバクテリア、クラミジア、リケッチアのような細胞間および細胞内の細菌を含む）、酵母、カビ、真菌、プリオン、またはＴＳＥおよび／または単細胞しくは多細胞寄生生物に単独もしくは組み合わせて応答しうる同様の作用因が含有される。生物学的汚染物または病原体の例としては、以下のものが含まれるがこれに限定されない。ヒト免疫不全ウイルスおよび他のレトロウイルス、ヘルペスウイルス、フィロウイルス、シルコウイルス、パラミクソウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、）、ポックスウイルス、トーガウイルス、エプスタインバーウイルスおよびパルボウイルスのようなウイルス；エシェリヒア属、バチルス属、カンピロバクター属、ストレプトコッカス属およびスタファロコッカス属のような細菌；トリパノゾーマ属とマラリア原虫（プラズモディウム種を含む）のような寄生生物；酵母；カビ；真菌；マイコプラズマおよびウレアプラズマ；クラミジア；Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｔｉのようなリケッチア；並びに、プリオンおよび動物の伝達性海綿状脳症として知られる１以上の疾患状態、例えば、スクラピー、ミンクの伝染性脳症、慢性消耗病（ミュールジカおよびヘラジカで一般に観測される）、ネコの海綿状脳症、ウシの海綿状脳症（狂牛病）、クロイツフェルト−ヤコブ病（変異型または新しい変異型のクロイツフェルト−ヤコブ病を含む）、致命的な家族性不眠症、Ｇｅｒｓｔｍａｎｎ−Ｓｔｒａｅｕｓｓｌｅｒ−Ｓｃｈｅｉｎｋｅｒ症候群、クールー；およびアルパーズ症候群に対して、単独または組み合わせて応答しうる同様の作用因。本明細書では、「活性な生物学的汚染物または病原体」という用語は、単独でまたは他の因子、例えば第２の生物学的汚染物もしくは病原体または天然のタンパク質（野生型または突然変異体）または抗体と組み合わせて、消化酵素製剤および／またはその受容者に悪効果を及ぼす可能性がある生物学的汚染物または病原体を意味することを意図する。
【００４９】
本明細書では、「生物学的適合溶液」という用語は、１以上の消化酵素の製剤が、例えば、懸濁または溶解されることによって暴露され、かつ、生存可能に維持されている溶液、すなわち、それらの本質的な生物学的および生理学的特性を保持する溶液を意味することを意図する。
【００５０】
本明細書では、「生物学的適合緩衝溶液」という用語は、材料の完全性を維持するのに適切なｐＨ特性および浸透圧特性（例えば、張性、オスモル濃度および／またはコロイド浸透圧）を有する生物学的適合溶液を意味することを意図する。好適な生物学的適合緩衝溶液は、一般に、４から８．５のｐＨ値を有しており、等張性であるか、あるいは、ほんのわずか低張性または高張性である。生物学的適合緩衝溶液は知られており、当業者によって容易に利用され得る。
【００５１】
本明細書では、「安定剤」という用語は、照射される生物学的材料への損傷を、該材料の安全性と有効な利用を妨げるのには不十分なレベルまで低下させる化合物または材料を意味することを意図する。安定剤の実例には、これに限定されるものではないが、以下の物が含まれる。抗酸化剤；スピントラップ剤を含めた遊離基補足剤；組み合わせ型安定剤、すなわちタイプＩおよびタイプＩＩの両方の光力学的反応を消光する際に有効な安定剤；および結合している分子を安定化する、ヘパリンのようなリガンド。安定剤の好ましい例には以下のものが含まれるがこれらに限定されない。エタノール；アセトン；６，８−ジメルカプトオクタン酸（リポ酸）およびその誘導体および類似体（アルファ、ベータ、ジヒドロ、ビソノルおよびテトラノルリポ酸）、チオクト酸、６，８−ジメルカプトオクタン酸、ジヒドロロポエート（ＤＬ−６，８−ジチオールオクタン酸メチルエステル）、リポアミド、ビソノルメチルエステルおよびテトラノルジヒドロリポ酸、フラン脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、およびそれらの塩類および誘導体を含めた脂肪酸；ケルセチン、ルチンおよびその誘導体、アピゲニン、アミノフラボン、カテキン、ヘスペリジン、およびナリンギンのような、フラボノイド、フェニルプロパノイドおよびフラベノール；β−カロチンを含めたカロチン；Ｃｏ−Ｑ１０；キサントフィル；グリセロール、マンニトールのような多価アルコール；キシロース、グルコース、リボース、マンノース、フルクトースおよびトレハロースのような糖；ヒスチジン、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、グルタミン酸、トリプトファン、カプリル酸ナトリウム、Ｎ−アセチルトリプトファン、およびメチオニンのようなアミノ酸およびその誘導体；アジ化ナトリウムなどのアジ化物；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）およびカタラーゼのような酵素；１，３−ジメチル尿酸およびジメチルチオ尿素のような尿酸およびその誘導体；アロプリノール；グルタチオンおよび還元グルタチオンおよびシステインのようなチオール；セレンのような微量元素；ビタミンＡ、ビタミンＣ（アスコルビン酸ナトリウムおよびパルミトイルアスコルビン酸のようなその誘導体および塩類を含む）、ならびにビタミンＥ（および酢酸トコフェロールとα−トコトリエノールのようなその誘導体および塩類）のようなビタミン；クロマノール−アルファ−Ｃ６；６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマ−２  カルボン酸（トロロクス）および誘導体；ゼラチンおよびアルブミンのような外来タンパク質；トリス−３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン（ＭＣＩ−１８６）；シチオロン；プエルセチン；クリシン；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）；イミダゾール；メトキシソラレン（ＭＯＰＳ）；１，２−ジチアン−４，５−ジオール；ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような還元物質；コレステロール；プロブコール；インドール誘導体；チメロサール；ラザロイドおよびチリラザドメシレート（tirilazad mesylate）；プロアンテノール；プロアントシアニジン；硫酸アンモニウム；ペゴルゴテイン（ＰＥＧ−ＳＯＤ）；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−アルファ−フェニルニトロン（ＰＥＮ）；４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（Ｔｅｍｐｏｌ）；アスコルビン酸塩、尿酸塩およびトロロクスＣの混合物（Ａｓｃ／ｕｒａｔｅ／Ｔｒｏｌｏｘ  Ｃ）；グリシルグリシンおよびカルノシンのようなタンパク質およびペプチドであって、各アミノ酸がそのＤまたはＬ形態であり得るもの；ジオスミン；ププロガリン（ｐｕｐｕｒｏｇａｌｉｎ）；これに限定されるものではないが、没食子酸プロピルを含めた没食子酸とその誘導体；ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウムおよびシリマリン。特に好ましい例には、タイプＩおよびタイプＩＩの両方の光力学的反応を消光する際に効果的な単一安定剤または安定剤の組み合わせ、および、気体として適用できおよび／またはエバポレーション、低圧および同様な方法で容易に除去可能である揮発性安定剤が含まれる。
【００５２】
本明細書では、「残留溶媒含有量」という用語は、１以上の消化酵素の製剤中の遊離している液体の量または割合を意味することを意図する。遊離している液体（freely available liquid）は、製剤の１種以上の非液体成分と結合しないかもしくは複合体を形成しない、殺菌される製剤中に存在する、水または有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ポリエチレングリコールなど）のような液体を意味する。遊離している液体には細胞内の水が含まれる。本明細書で記載されている水のような関連のある残留溶媒含有量は、ＦＤＡ承認の変法カールフィッシャー法（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）によって決定されたレベルを意味する。他の溶媒の残留レベルの定量は、どの溶媒を使用するかに応じて、当技術分野でよく知られている手段によって決定することができる。また、溶質と残留溶媒の比率は、溶媒内の溶質の濃度を反映したものであると考えることができる。そのように表現されている場合、溶質の濃度が高いほど、残留溶媒の量は低い。
【００５３】
本明細書では、「増感剤」という用語は、ウイルス性汚染物、細菌性汚染物、プリオン汚染物、および／または寄生生物汚染物を選択的に標的とし、放射線による不活性化に対するそれらの感受性をより高めるようにし、その結果、増感剤非含有の場合よりも、照射率もしくは線量を低くして使用する、および／または、照射時間を短くして使用することができる物質を意味することを意図する。好適な増感剤を説明する例としては、これに限定されるものではないが、以下の物が含まれる：ソラレンおよびその誘導体および類似体（３−カルボエトキシソラレンを含む）；イナクチンおよびその誘導体および類似体；ハロゲン置換基および、第四級アンモニウムイオンまたはホスホニウムイオンのような水可溶化成分を含有するアンゲリシン、ケリンおよびクマリン；核酸結合化合物；臭素化ヘマトポルフィリン；フタロシアニン；プルプリン；ポルホリン；ジヘマトポルフィリンエステルのハロゲン化誘導体または金属原子置換された誘導体、ヘマトポルフィリン誘導体、ベンゾポルフィリン誘導体、ヒドロジベンゾポルフィリンジマレイミド、ヒドロジベンゾポルフィリン、ジシアノジスルホン、テトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリン、およびテトラカルボエトキシヒドロジベンゾポルフィリンジプロピオンアミド；ハロゲンまたは金属原子で修飾されていてもよいドキソルビシンおよびダウノマイシン；ネトロプシン；ＢＤペプチド、Ｓ２ペプチド；Ｓ−３０３（ＡＬＥ化合物）；ヒペリシン、メチレンブルー、エオシン、フルオレセイン（およびそれらの誘導体）、フラビン、メロシアニン５４０のような色素；ベルガプテンのような光活性化合物；ならびにＳＥペプチド。  本明細書では、「放射線」という用語は、照射される消化酵素製剤の少なくとも数種類の成分を殺菌するのに十分なエネルギーの放射線を意味することを意図する。放射線の種類は、これに限定されるものではないが、以下のもの、すなわち、（ｉ）微粒子（ニュートロン、電子および／または陽子のような亜原子粒子の流れ）；および（ｉｉ）電磁気（電波、可視光線（単色および多色）および不可視光線、紫外線、Ｘ線、γ線、ならびにそれらが混ぜ合わさったもののような種々の電磁界から発生するもの）が含まれる。かかる放射線は、γ線ようなイオン化（照射された材料中でイオンを生じうる）放射線として、および、可視光線のような非イオン化放射線として記載されていることが多い。かかる放射線源はいろいろであるが、一般に、十分な放射線が、殺菌を行うのに適切な時間かつ適切な割合で与えられる限り、特定の照射源の選択は、重要ではない。実際には、γ線は通常、コバルトまたはセシウムのアイソトープにより発生するが、一方、Ｘ線は、Ｘ線を放射する装置により発生され、そして、電子は、機械による発生が含まれる「電子ビーム」照射として知られている方法で材料を殺菌するために用いられることが多い。
【００５４】
本明細書では、「保護する」という用語は、照射される１以上の消化酵素の製剤に対する任意の損傷（さもなければ、その材料の照射によって起こるであろう任意の損傷）を、照射後の材料の安全性と有効な使用を妨げるのには不十分なレベルまで、低下させることを意味することを意図する。言い換えれば、物質または実行するプロセスの存在が、その物質またはプロセスが存在しない場合よりも照射による材料の損傷を低下させるのであれば、その物質またはプロセスは、照射から１以上の消化酵素の製剤を「保護」する。したがって、１以上の消化酵素の製剤は、その材料を保護する物質の存在下で照射を行った後、またはその材料を保護するプロセスの実行後に照射を行った後では、安全且つ有効に使用できるが、同一の条件下であるがその物質の非存在下またはそのプロセスを実行しないで、照射した後では安全且つ有効に使用することはできない。
Ｂ．特に好ましい実施形態
本発明の第１の実施形態は、放射線に感受性である１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法であって、該材料を殺菌し、且つ該材料を放射線から保護するのに有効な割合で、該材料を殺菌するのに有効な時間、放射線により１以上の消化酵素の製剤を照射することを含む方法に向けられる。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、（ｉ）１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効な量で少なくとも１種の安定剤を、１以上の消化酵素の製剤に添加することと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線によりこの材料を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５６】
本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまで１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を低下させることと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線により１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５７】
本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効なレベルまで１以上の消化酵素の製剤の温度を低下させることと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を放射線により１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含む、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５８】
本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）（ａ）１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）１以上の消化酵素の製剤に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）１以上の消化酵素の製剤の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程を１以上の消化酵素の製剤に適用することと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線により１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程および照射の割合が、共に放射線から１以上の消化酵素の製剤を保護するのに効果的である、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００５９】
本発明の他の好ましい実施形態は、（ｉ）（ａ）１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を低下させること、（ｂ）１以上の消化酵素の製剤に少なくとも１種の安定剤を添加すること、および（ｃ）１以上の消化酵素の製剤の温度を低下すること、より成る群から選択される安定化の工程を１以上の消化酵素の製剤に適用することと、（ｉｉ）１以上の消化酵素の製剤を、放射線により１以上の消化酵素の製剤を殺菌するのに有効な時間、有効な割合で照射することとを含み、該安定化の工程が任意の順序で行われ、共に放射線から１以上の消化酵素の製剤を保護するのに効果的である、放射線感受性の、１以上の消化酵素の製剤を殺菌する方法に向けられる。
【００６０】
本発明の特定の方法に従えば、安定剤は１以上の消化酵素の製剤を放射線で照射する前に１以上の消化酵素の製剤に添加される。この安定剤は、放射線から１以上の消化酵素の製剤を保護するのに有効な量で添加される。安定剤の適切な量は、使用される本発明の特定の方法の特定の特徴、例えば特定の１以上の消化酵素の製剤の性質および特性および／または使用される特定の安定剤および／または照射される特定の１以上の消化酵素の製剤の意図した使用に依存して変動し得、その量は当業者によって経験的に決定することができる。
【００６１】
本発明の方法によれば、１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量は、放射線による１以上の消化酵素の製剤の照射前に低下させることができる。残留溶媒含有量は、１以上の消化酵素の製剤を放射線から保護するのに有効レベルまで低下される。好適なレベルの残留溶媒含有量は、特定の１以上の消化酵素の製剤の性質および特性および／または使用される安定剤および／または照射される特定の１以上の消化酵素の製剤の意図した使用に依存して変動し得、その含有量は、当業者によって経験的に決定することができる。具体的な値よりも、特定の範囲内に残留溶媒含有量を維持することが望ましい製剤が存在しうる。これは、例えば、溶媒または混合物中の少なくとも１種の溶媒が安定剤（例えばアルコール（例えばエタノール）またはジアルキルケトン（例えばアセトン））でもある場合である。
【００６２】
溶媒が水である場合、そして特に１以上の消化酵素の製剤が固相である場合、残留溶媒含有量は一般に約１５％未満、典型的には約１０％未満、より典型的には約９％未満、更に典型的には約８％未満、通常は約５未満、好ましくは約３．０％未満、さらに好ましくは約２．０％未満、よりさらに好ましくは約１．０％未満、更に好ましくは約０．５％未満、更に好ましくは約０．２％未満、最も好ましくは０．０８未満である。
【００６３】
溶媒は非水性溶媒であることが好ましく、照射の際に遊離基を形成する傾向のない非水性溶媒あることがより好ましく、照射の際に遊離基を形成する傾向がなく、且つ溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない非水性溶媒であることが最も好ましい。揮発性非水性溶媒が特に好ましく、安定剤である非水性溶媒、例えばエタノールおよびアセトンが特に好ましい。
【００６４】
本発明の特定の実施形態では、溶媒は、水と非水性溶媒の混合物またはエタノールおよび／またはアセトンのような溶媒であり得る。このような実施形態では、非水性溶媒は照射の際に遊離基を形成する傾向のない非水性溶媒であることが好ましく、照射の際に遊離基を形成する傾向がなく、且つ溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない非水性溶媒であることが最も好ましい。揮発性非水性溶媒が特に好ましく、安定剤である非水性溶媒、例えばエタノールおよびアセトンが特に好ましい。
【００６５】
好ましい実施形態では、残留溶媒が水である場合、生物学的材料の残留溶媒含有量は、水を溶解することができる非水性溶媒に生物学的材料を溶解するかまたは懸濁することによって低下させることができる。好ましくは、このような非水性溶媒は、溶解された、酸素または照射の際に遊離基を形成する傾向のある１または複数の他のガスがほとんどないかあるいは全く存在しない非水性溶媒である。
【００６６】
生物学的材料が液相である場合、残留溶媒含有量の低下は、溶質の濃度を高めることによるなどの、多くの手段のいずれかによって達成することができる。この手段では、溶媒に溶解された生物学的材料内のタンパク質の濃度を、一般には少なくとも約０．５％、典型的には少なくとも約１％、通常は少なくとも約５％、好ましくはすくなくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１５％、更に好ましくは少なくとも約２０％、更により好ましくは少なくとも約２５％、最も好ましくは少なくとも約５０％に増加することができる。
【００６７】
本発明の特定の実施形態では、特定の生物学的材料の残留溶媒含有量は具体的な点よりもむしろ所定の範囲内にあることが見出され得る。特定の生物学的材料の好ましい残留溶媒含有量に対するこのような範囲は当業者によって経験的に決定され得る。
【００６８】
いかなる操作性の理論に拘束されるものではないが、残留溶媒含有量の低下は、１以上の消化酵素の製剤の自由度を下げること、遊離基を生成する標的数を減少すること、およびこれらの遊離基の溶解性を制限しうることが考えられる。したがって、同様の結果は、その共融点未満またはその凝固点未満に、１以上の消化酵素の製剤の温度を下げることによって、または、１以上の消化酵素の製剤の自由度を同じように下げるためにガラス化することによって達成することができるであろう。これらの結果は、他の場合で許容されるものよりも高い割合および／または線量の放射線の使用を可能にし得る。したがって、本明細書に開示された方法は、製剤に許容できないレベルの損傷を生じない任意の温度で実施することができる。好ましくは、本明細書に開示された方法は、周囲温度または周囲温度未満、例えば照射される１以上の消化酵素の製剤の共融点もしくは凝固点未満で行われる。
【００６９】
本発明の方法によれば、損傷の「許容できるレベル」は、使用される本発明の特定の方法の特定の特徴、例えば１以上の消化酵素の製剤の性質および特性、および／または使用される安定剤、および／または照射される１以上の消化酵素の製剤の意図した使用、に依存して変化し得、これは当業者によって経験的に決定することができる。したがって、損傷の「許容できないレベル」は、殺菌される１以上の消化酵素の製剤の安全で有効な使用を妨げる損傷のレベルをである。所与の１以上の消化酵素の製剤の損傷の特定のレベルは、当業者に公知の方法および技術のいずれかを用いて決定することができる。
【００７０】
１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量は、この製剤に許容できないレベルの損傷を生じさせることなく、１以上の消化酵素の製剤から溶媒を減少させるための、当業者に公知の方法および技術のいずれかによって低下させることができる。このような方法には、エバポレーション、濃縮、遠心による濃縮、ガラス化、溶質の添加、凍結乾燥（アスコルビン酸塩の事前の添加を伴うものまたは伴わないもの）、および噴霧乾燥が含まれるがこれらに限定されない。
【００７１】
１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を低下させるための特に好ましい方法は、凍結乾燥であり、更に好ましくは、アスコルビン酸塩の添加後の凍結乾燥である。
【００７２】
１以上の消化酵素の製剤の残留溶媒含有量を低下させるための他の好ましい方法は、ガラス化である。この方法は、当業者に公知に方法および技術のいずれかで実現することができ、これには例えば、１以上の消化酵素の製剤の共融点を上げるために溶質および／または追加の溶質（例えば蔗糖）を添加し、これに続いて水のような残留溶媒を除去するために生物学的材料に減圧を徐々に適用することが含まれる。得られたガラス状材料は、残留溶媒含量が低下される。
【００７３】
本発明の方法によれば、殺菌される１以上の消化酵素の製剤は、当業者によく知られておりその者に利用可能な手段によって、固体表面上に固定化することができる。例えば、殺菌された１以上の消化酵素の製剤は、生物学的または非生物学的基材上のコーティングとしてまたはその上の表面として存在しうる。
【００７４】
本発明の方法で使用される放射線は、処理される１以上の消化酵素の製剤の１以上の生物学的汚染物または病原体不活性化するのに有効な任意の放射線であり得る。放射線は電子ビームを含めた微粒子であり得る。好ましくは、放射線は、可視光線、赤外線、ｘ−線、紫外線、および様々な波長の電磁放射線の混合物を含めた電磁放射線である。特に好ましい放射線の形態はγ線である。
【００７５】
本発明の方法によれば、殺菌される１以上の消化酵素の製剤は、製剤の１以上の生物学的汚染物または病原体を不活性化するのに有効な割合で、放射線を用いて照射される。適切な照射の割合は、使用される本発明の方法の特定の特徴、例えば照射される１以上の消化酵素の製剤の性質および特性、関係のある放射線の特定の形態、および／または不活性化される特定の生物学的汚染物または病原体、に依存して変化し得る。照射の適切な割合は、当業者によって経験的に決定され得る。照射の割合は殺菌手順の継続期間中一定であることが好ましい。これが実行できないか、さもなければ望まれない場合、可変または断続的な照射を用いてもよい。
【００７６】
本発明の方法によれば、照射率は、生成物回収と操作を完了するのに必要な時間との最も有利な組み合わせを得るために最適化することができる。低い割合（＜３ｋＧｙ／時間）および高い割合（＞３ｋＧｙ／時間）の両方が、そのような結果を達成するために、本明細書に記載した方法に利用することができる。
【００７７】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、照射率は、約３．０ｋＧｙ／時間以下、さらに好ましくは約０．１ｋＧｙ／時間から３．０ｋＧｙ／時間の間、よりさらに好ましくは約０．２５ｋＧｙ／時間から２．０ｋＧｙ／時間の間、より一層好ましくは、約０．５ｋＧｙ／時間から１．５ｋＧｙ／時間の間、最も好ましくは、約０．５ｋＧｙ／時間から１．０ｋＧｙ／時間の間である。
【００７８】
本発明の別の特に好ましい実施形態によれば、照射率は、少なくとも約３．０ｋＧｙ／時間、さらに好ましくは、少なくとも約６ｋＧｙ／時間、さらにより好ましくは、少なくとも約１６ｋＧｙ／時間、より一層好ましくは、少なくとも３０ｋＧｙ／時間、最も好ましくは、少なくとも４５ｋＧｙ／時間以上である。
【００７９】
本発明の方法によれば、殺菌される１以上の消化酵素の製剤は、１以上の消化酵素の製剤の１以上の生物学的汚染物または病原体の不活性化に有効な時間、放射線により照射される。照射率と組み合わせた適当な照射時間により、１以上の消化酵素の製剤に適用される適切な照射の線量が得られる。好適な照射時間は、関連する放射線の特定の形態および照射率、照射されている特定の１以上の消化酵素の製剤の性質および特性、および／または不活性化される特定の生物学的汚染物または病原体に依存して変動し得る。好適な照射時間は、当業者によって経験的に決定することができる。
【００８０】
本発明の方法によれば、殺菌される１以上の消化酵素の製剤は、その材料に許容できないレベルの損傷ををもたらさないが、該材料中の１以上の活性な生物学的汚染物または病原体の不活性化に有効な総線量までの放射線で照射される。放射線の好適な総線量は、使用される本発明の方法の特定の特徴、例えば照射される１以上の消化酵素の製剤の性質および特性、関係のある放射線の特定の形態、および／または不活性化される特定の活性な生物学的汚染物または病原体、に依存して変化し得る。照射の適切な割合は、当業者によって経験的に決定され得る。放射線の総線量は、好ましくは少なくとも２５ｋＧｙ、より好ましくは少なくとも４５ｋＧｙ、よりさらに好ましくは少なくとも７５ｋＧｙ、より一層好ましくは、少なくとも１００ｋＧｙ以上、例えば１５０ｋＧｙまたは２００ｋＧｙ以上である。
【００８１】
厚さおよび放射線源からの距離のような、照射される１以上の消化酵素の製剤の特定の寸法は、当業者によって経験的に決定されうる。
【００８２】
本発明の特定の方法によれば、１以上の消化酵素の製剤への照射の有害な影響を最小にするために本明細書に記載された方法を使用すると共に、例えば１以上の消化酵素の製剤中の１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体に関する照射の効率を高めるために、有効量の少なくとも１つの増感剤化合物を照射の前に１以上の消化酵素の製剤に、任意に添加することができる。好適な増感剤は、当業者に公知であり、それにはソラレンおよびその誘導体および類似体、並びにイナクチンおよびその誘導体および類似体が含まれる。
【００８３】
本発明の方法によれば、１以上の消化酵素の製剤の照射は、殺菌される１以上の消化酵素の製剤に対して有害ではない任意の温度で行うことができる。好ましい一実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤は周囲温度で照射される。代替の好ましい実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤は、低い温度、すなわち０℃、−２０℃、−４０℃、−６０℃、−７８℃または−１９８℃のような周囲温度未満の温度で照射される。本発明この実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤の凝固点または共融点で、またはそれ未満で照射されることが好ましい。別の代替の好ましい実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤は高い温度、すなわち３７℃、６０℃、７２℃または８０℃のような周囲温度を超える温度で照射される。何れの理論にも拘束されることを望むものではないが、高温での使用は、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体への照射の効果を高め、したがってより低い総線量の放射線を用いることを可能にする。
【００８４】
最も好ましくは、１以上の消化酵素の製剤の照射は、照射からこの製剤を保護する温度で行う。好適な温度は当業者により経験的に決定されうる。
【００８５】
本発明の特定の実施形態では、照射が行われる温度は、具体的な点ではなく所定の範囲内にあることが見出され得る。特定の１以上の消化酵素の製剤の照射のために好ましいこのような温度範囲は、当業者により経験的に決定され得る。
【００８６】
本発明の方法によれば、１以上の消化酵素の製剤は、殺菌される１以上の消化酵素の製剤に有害でない任意の圧力で行われ得る。好ましい一実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤は、高い圧力で照射される。より好ましくは、１以上の消化酵素の製剤は、音波の適用または揮発性物質の使用、圧縮または当業者に公知の他の手段により高い圧力で照射される。何れの理論に拘束されることを望むものではないが、高い圧力の使用は、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体への照射の効率を高め、および／または１以上の安定剤によってもたらされる保護を増強し、これによってより低い総線量の放射線を使用することを可能にする。適切な圧力は、当業者によって経験的に決定され得る。
【００８７】
一般に本発明の方法によれば、殺菌を受ける１以上の消化酵素の製剤のｐＨは約７である。しかし、本発明の幾つかの実施形態では、１以上の消化酵素の製剤は７未満のｐＨ、好ましくは６以下のｐＨ、より好ましくは５以下のｐＨ、より一層好ましくは、４以下のｐＨ、最も好ましくは３以下のｐＨを有し得る。本発明の代替の実施形態では、１以上の消化酵素の製剤は、７を超えるｐＨ、好ましくは８以上のｐＨ、より好ましくは９以上のｐＨ、より一層好ましくは１０以上のｐＨ、最も好ましくは１１以上のｐＨを有し得る。本発明の特定の実施形態によれば、殺菌を受ける製剤のｐＨは、この製剤に含まれる１または複数の酵素の等電点またはその近傍である。本発明の他の実施形態によれば、殺菌を受ける製剤のｐＨは、製剤中の少なくとも１種の酵素がその基質に対して最大の親和性を有するｐＨまたはその近傍のｐＨである。好適なｐＨレベルは、当業者によって経験的に決定され得る。
【００８８】
同様に、本発明の方法によれば、１以上の消化酵素の製剤の照射は、処理される１以上の消化酵素の製剤に有害でない任意の雰囲気下で行うことができる。１つの好ましい実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤は、低酸素雰囲気下または不活性雰囲気に保たれる。不活性雰囲気が使用される場合、その雰囲気は、ヘリウムまたはアルゴンのような希ガス、より好ましくは、より高分子量の希ガス、最も好ましくはアルゴンである。他の好ましい実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤は照射されている間真空下に保たれる。本発明の特に好ましい実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤（凍結乾燥されたもの、液体または凍結されたもの）は照射前には、真空下または不活性雰囲気（好ましくはヘリウムもしくはアルゴンのような希ガス、より好ましくはより高分子の希ガス、最も好ましくはアルゴン）で貯蔵される。本発明の代替の好ましい実施形態によれば、液体の１以上の消化酵素の製剤は、凍結乾燥のような溶媒を減少させる事前のステップを用いても、用いなくても、照射の前には、この液体に溶解されている気体、特に酸素の量を低下させるために低圧下に保持される。このような脱気処理は当業者に公知のいずれかの方法を用いて行われ得る。
【００８９】
他の好ましい実施形態では、１以上の消化酵素の製剤が、酸素を含有するか、または、該製剤中に溶解されているかもしくは該製剤に付随した他のガスを含有する場合、製剤内または製剤に付随したこれらのガスの量は、当業者に公知であるかまたは当業者に利用可能な方法および技術のいずれか、例えば処理される製剤を保存する容器（硬いかもしくは軟らかいもの）内を制御された減圧にすること、または製剤をほぼ同じ容積の容器に収容することによって低下させることができる。
【００９０】
本明細書に記載されている１以上の特徴を組み合わせて用いることによって、１以上の生物学的汚染物または１以上の病原体に対する照射プロセスの適切な有効性を保持しながら、照射によって引き起こされる１以上の消化酵素の製剤に対する望まない効果をさらに最小限にすることができることが理解されよう。例えば、安定剤の使用に加えて、特定の１以上の消化酵素の製剤はまた、照射前に凍結乾燥され、低い温度に保持され、真空下に保持されて、望まない効果を更に最小にすることができる。
【００９１】
放射線に対する特定の生物学的汚染物または病原体の放射線に対する感受性は、Ｄ３７値として知られる、試料中の３７％のその作用因を除く全てを不活化または死滅させるのに必要な線量を決定することにより一般に計算される。１以上の消化酵素の製剤の所望の成分も、３７％のこれらの所望の生物学的および生理学的特性を除く全てを排除するのに必要な照射線量に等しいＤ３７値を有すると考えることができる。
【００９２】
本発明の特定の好ましい実施形態によれば、１以上の消化酵素の製剤の殺菌は、１以上の消化酵素の製剤のＤ３７値を同時に低下させることなく、生物学的汚染物または病原体のＤ３７値を低下させる条件下で行われる。本発明の他の好ましい方法によれば、１以上の消化酵素の製剤の殺菌は、１以上の消化酵素の製剤のＤ３７値の増加をもたらす条件下で行われる。本発明の最も好ましい方法によれば、１以上の消化酵素の製剤の殺菌は、生物学的汚染物および病原体のＤ３７値の低下をもたらし、同時に１以上の消化酵素の製剤のＤ３７値を高める条件下で行われる。
（実施例）
以下の例は本発明を例示するものであるが、それを限定するものではない。他の適当な修正や適応は、当業者が通常遭遇する種類のものであり、完全に本発明の精神および範囲内にある。特に断らない限り、照射はすべて６０Ｃｏ源を使用して行った。
【実施例１】
【００９３】
この実験では、凍結乾燥したトリプシンを、単独でまたは安定剤（アスコルビン酸ナトリウム１００ｍＭ）の存在下において、種々のレベルの残留溶媒含有量で照射した（１．９ｋＧｙ／時間で４５ｋＧｙ）。
【００９４】
方法
トリプシン１ｍｌアリコートを、単独で、または１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（１０ｍｇ／ｍｌ）とともに、３ｍｌバイアルに入れた。試料は３通り調製し、第１乾燥サイクル（２２時間、試料温度０〜１０℃、保存温度３５℃、１０ｍＴ）または第１乾燥サイクルと第２乾燥サイクル（６０時間、試料温度４０℃、保存温度４０℃、１０ｍＴ）の組合せにより凍結乾燥した。
【００９５】
試料はすべて１ｍｌの水中に再懸濁させ、次いで、アッセイ用に１：１０に希釈した。アッセイ条件：ウェル当たり５０単位／ｍｌのトリプシン＋ＢＡＰＮＡ基質を３０００μｇ／ｍｌから始めて、９６穴プレート上に３倍ずつ連続希釈した。アッセイは、２枚の９６穴プレートで行い、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を読み取った。６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収を４０５ｎｍの値から差し引いて、補正した吸収値を得た。反応時間５分と１５分の間この値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式を使用しシグマプロット（Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ）においてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
【００９６】
結果
安定剤が存在しない状態で総線量４５ｋＧｙのγ線照射に暴露した凍結乾燥トリプシンは、高い残留溶媒含有量レベル、すなわち、水約２．４％では対照活性の７４％の回収を示し、より低い残留溶媒含有量レベル、すなわち、水約１．８％では対照活性の８５％の回収を示した。
【００９７】
安定剤存在下で総線量４５ｋＧｙのγ線照射に暴露した凍結乾燥トリプシンは、高い残留溶媒含有量レベル、すなわち、水約３．７％では対照活性の９７％の回収を示し、より低い残留溶媒含有量レベル、すなわち、水約０．７％では対照活性の８６％の回収を示した。
【００９８】
この実験の結果を図１Ａ〜１Ｂにグラフとして示す。
【実施例２】
【００９９】
この実験では、トリプシンを液体製剤または凍結乾燥製剤のいずれかとして、安定剤（アスコルビン酸ナトリウム２００ｍＭ）存在下、種々のｐＨレベルで照射した（４℃、１．６ｋＧｙ／時間で４５ｋＧｙ）。
【０１００】
方法
３５ｍＭリン酸塩バッファーおよび２００ｍＭアスコルビン酸ナトリウムの存在下、１ｍｇ／ｍｌ（約３０００Ｉ単位／ｍｌ）のトリプシンの１ｍｌアリコートをｐＨ５と８．５の間（端点を含む）の種々のｐＨレベルで調製した。各溶液４００μｌを３ｍｌのバイアルに入れ、次いで、凍結乾燥しγ線照射した。各溶液の残りの部分は液体としてγ線照射した。凍結乾燥試料および液体試料は、下記条件下で、同時にアッセイした。アッセイ条件：ウェル当たり５Ｕのトリプシン（５０Ｕ／ｍｌ）＋ＢＡＴＮＡ基質（１ｍｇ／ｍｌ）を、９６穴プレート上に３倍ずつ連続希釈した。アッセイは、２枚の９６穴プレートで行い、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を読み取った。６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収を４０５ｎｍの値から差し引いて、補正した吸収値を得た。反応時間５分と１５分の間この値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式を使用しシグマプロットにおいてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
【０１０１】
結果
総線量４５ｋＧｙのγ線照射に暴露した液体トリプシン試料は、試験したｐＨ範囲全域にわたって対照活性の約７０〜７５％の回収を示した。凍結乾燥したトリプシン試料は同じｐＨ範囲にわたって対照活性の約８６〜９７％の回収を示した。より具体的には、以下の結果が観察された。
2005505324.tif 000002
この実験の結果を図２にグラフとして示す。
【実施例３】
【０１０２】
この実験では、凍結乾燥したトリプシンを、単独でまたは安定剤（アスコルビン酸ナトリウム２００ｍＭ）の存在下で照射した（４℃、２．６５ｋＧｙ／時間で４２．７〜４４．８ｋＧｙ）。
【０１０３】
方法
トリプシン１ｍｌアリコートを、単独でまたは２００ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム（１ｍｇ／ｍｌ）とともに３ｍｌバイアルに入れ、−７０℃で一夜凍結した。試料は４通り調製し、第１および第２の乾燥サイクル（合計２０時間）を利用して凍結乾燥を施した。
【０１０４】
試料はすべて１ｍｌの水中に再懸濁させ、次いで、アッセイ用に１：１０に希釈した。アッセイ条件：ウェル当たり５０単位／ｍｌのトリプシン＋ＢＡＴＮＡ基質を３０００μｇ／ｍｌから始めて、９６穴プレート上に３倍ずつ連続希釈した。アッセイは、２枚の９６穴プレートで行い、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を読み取った。６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収を４０５ｎｍの値から差し引いて、補正した吸収値を得た。反応時間５分と１５分の間この値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式を使用しシグマプロット（Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ）においてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
【０１０５】
結果
安定剤が存在しない状態でγ線照射に暴露した凍結乾燥したトリプシンは対照活性の６３％の回収を示した。安定剤の存在下でγ線照射に暴露した凍結乾燥したトリプシンは、対照活性の８８％の回収を示した。この実験の結果を図３Ａ〜３Ｂにグラフとして示す。
【実施例４】
【０１０６】
この実験では、凍結乾燥しておいたトリプシン（含水量０．７％）を、単独でまたは安定剤（アスコルビン酸ナトリウム１００ｍＭ）の存在下で、種々のレベルの残留溶媒含有量で照射した（３．２℃、１．８６７ｋＧｙ／時間で４５ｋＧｙ）。
【０１０７】
方法
トリプシン１ｍｌアリコートを、単独で、または１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（１０ｍｇ／ｍｌ）とともに、３ｍｌバイアルに入れ、−７０℃で一夜凍結した。試料は４通り調製し、凍結乾燥した（全実行時間６９．５時間、保存温度３５℃）。
【０１０８】
試料はすべて１ｍｌの水中に再懸濁させ、次いで、アッセイ用に１：１０に希釈した。アッセイ条件：ウェル当たり５０単位／ｍｌのトリプシン＋ＢＡＰＮＡ基質を３０００μｇ／ｍｌから始めて、９６穴プレート上に３倍ずつ連続希釈した。アッセイは、２枚の９６穴プレートで行い、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を読み取った。６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収を４０５ｎｍの値から差し引いて、補正した吸収値を得た。反応時間５分と１５分の間この値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式を使用しシグマプロット（Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ）においてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
【０１０９】
結果
安定剤が存在しない状態で総線量４５ｋＧｙのγ線照射に暴露したトリプシン（水３．９％）は、対照活性の７７％の回収を示した。安定剤の存在下で総線量４５ｋＧｙのγ線照射に暴露したトリプシン（水０．７％）は、対照活性の８６％の回収を示した。この実験の結果を図４Ａ〜４Ｂにグラフとして示す。
【実施例５】
【０１１０】
この実験では、凍結乾燥トリプシンを、単独でまたは安定剤（アスコルビン酸ナトリウム１００ｍＭ）の存在下で、種々のレベルの残留溶媒含有量で照射した（１．９ｋＧｙ／時間で４５ｋＧｙ）。
【０１１１】
方法
トリプシン１ｍｌアリコートを、単独で、または１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（１０ｍｇ／ｍｌ）とともに、３ｍｌバイアルに入れた。試料は３通り調製し、第１乾燥サイクル（２５時間、試料温度０〜１０℃、保存温度３５℃、１０ｍＴ）または第１乾燥サイクルと第２乾燥サイクル（６５時間、試料温度４０℃、保存温度４０℃、１０ｍＴ）の組合せにより凍結乾燥した。
【０１１２】
試料はすべて１ｍｌの水中に再懸濁させ、次いで、アッセイ用に１：１０に希釈した。アッセイ条件：ウェル当たり５０単位／ｍｌのトリプシン＋ＢＡＴＮＡ基質を３０００μｇ／ｍｌから始めて、９６穴プレート上に３倍ずつ連続希釈した。アッセイは、２枚の９６穴プレートで行い、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を読み取った。６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収を４０５ｎｍの値から差し引いて、補正した吸収値を得た。反応時間５分と１５分の間この値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式を使用しシグマプロット（Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ）においてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
【０１１３】
結果
安定剤が存在しない状態で総線量４５ｋＧｙのγ線照射に暴露したトリプシンは、高い残留溶媒含有量レベル、すなわち、水約５．８％では対照活性の７４％の回収を示し、より低い残留溶媒含有量レベル、すなわち、水約５．４％では対照活性の７７％の回収を示した。
【０１１４】
安定剤の存在下で総線量４５ｋＧｙのγ線照射に暴露したトリプシンは、高い残留溶媒含有量レベル、すなわち、水約２．８％では対照活性の９７％の回収を示し、より低い残留溶媒含有量レベル、すなわち、水約１．１％では対照活性の９０％の回収を示した。
【０１１５】
この実験の結果を図５Ａ〜５Ｂにグラフとして示す。
【実施例６】
【０１１６】
この実験では、ポリプロピレングリコール４００中に懸濁されたトリプシンを、種々のレベルの残留溶媒（水）含有量でγ線照射にさらした。
【０１１７】
方法
トリプシンを、約２０，０００Ｕ／ｍｌの濃度でポリプロピレングリコール４００中に懸濁させ、複数の試料に分割した。固定量の水（０％、１％、２．４％、４．８％、７％、９％、１０％、２０％、３３％）を各試料に加えた。ＰＰＧ４００を含まない１００％の水試料も調製した。
【０１１８】
１．９ｋＧｙ／時間の割合および温度４℃で、総線量４５ｋＧｙで試料を照射した。照射後、各試料を遠心分離して、不溶トリプシンをペレットとした。ＰＰＧ／水可溶画分は除去し、ペレットは水だけに再懸濁させた。
【０１１９】
アッセイ条件：ウェル当たり５Ｕ（５０Ｕ／ｍｌ）のトリプシン＋ＢＡＰＮＡ基質（０．５ｍｇ／ｍｌ）を、９６穴プレート上に３倍ずつ連続希釈した。アッセイは、２枚の９６穴プレートで行い、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を読み取った。６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収を４０５ｎｍの値から差し引いて、補正した吸収値を得た。反応時間５分と１５分の間この値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式を使用しシグマプロットにおいてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
【０１２０】
結果
ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ４００）と水（３３％以内の水）の混合物を含む照射試料は、非照射トリプシン対照の約８０％の活性、すなわち同一の条件下で照射した乾燥（凍結乾燥）トリプシン対照と同等の活性を保持した。４５ｋＧｙで照射した１００％の水試料では活性は検出されなかった。この実験の結果を図６にグラフとして示す。
【実施例７】
【０１２１】
この実験では、種々の濃度の安定剤（アスコルビン酸ナトリウム、単独でまたは１．５ｍＭ尿酸との組合せ）でトリプシン水溶液にγ線照射を施した。
【０１２２】
方法
トリプシン試料（５単位／試料）は、アスコルビン酸ナトリウムの濃度を変え、単独でまたは１．５ｍＭ尿酸と組み合わせて調製した。試料は、４℃において１．９ｋＧｙ／時間の割合で、総線量４５ｋＧｙで照射した。
【０１２３】
アッセイ条件：ウェル当たり５Ｕ（５０Ｕ／ｍｌ）のトリプシン＋５０μｌＢＡＰＮＡ基質（１ｍｇ／ｍｌ）。アッセイは、２枚の９６穴プレートで行い、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を読み取った。６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収を４０５ｎｍの値から差し引いて、補正した吸収値を得た。反応時間５分と１５分の間この値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式を使用しシグマプロットにおいてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
【０１２４】
結果
少なくとも２０ｍＭアスコルビン酸塩を含む照射試料は、非照射対照に匹敵する種々のレベルのトリプシン活性を保持した。１２５ｍＭ以上のアスコルビン酸塩を含む試料は、非照射対照のトリプシン活性の約７５％を保持した。同様の結果は、アスコルビン酸塩を尿酸と組み合わせて含む試料でも観察された。この実験の結果を、図７にグラフとして示す。
【実施例８】
【０１２５】
この実験では、２種類の異なる凍結酵素製剤（グリコシダーゼおよびスルファターゼ）に対する、アスコルビン酸塩（２００ｍＭ）およびアスコルビン酸塩（２００ｍＭ）とＧｌｙ−Ｇｌｙ（２００ｍＭ）との組合せの保護効果を評価した。
【０１２６】
方法
ガラスバイアル中で、３００μｇの酵素（１ｍｇ／ｍｌ）を含む全量３００μｌを、安定剤なしまたは問題とする安定剤とともにで調製した。試料をγ線照射し（１．６１６ｋＧｙ／時間および−２１．５℃または５．３５ｋＧｙ／時間および−２１．９℃の線量率および温度で総線量４５ｋＧｙ）、次いで、構造の完全性についてアッセイした。
【０１２７】
構造の完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。３つの１２．５％のゲルを次の調合処方に従い調製した。すなわち、アクリルアミド４．２ｍｌ；４×−トリス（ｐＨ８．８）２．５ｍｌ；水３．３ｍｌ；１０％ＡＰＳ溶液１００μｌ；およびＴＥＭＥＤ１０μｌ。次いで、この溶液を電気泳動ユニットに置き、１×泳動用バッファー（水１ｌ中トリス塩基１５．１ｇ；グリシン７２．０ｇ；ＳＤＳ５．０ｇを、５倍希釈したもの）を用いた。照射した試料および対照試料（１ｍｇ／ｍｌ）をＥｐｐｉｎｄｏｒｆチューブ中、試料バッファー（＋／−ベータ−ＭＥ）で希釈し、次いで数分間遠心分離した。各希釈試料（約１０μｇ）２０μｌを分析した。
【０１２８】
結果
安定剤が存在しない状態で４５ｋＧｙまで照射された液体酵素試料は、顕著な材料の損失が見られ、凝集および断片化の両方の証拠を示した。アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸塩とＧｌｙ−Ｇｌｙとの組合せを含む照射試料からは、はるかに大きな材料の回収が得られた。この実験の結果を図８Ａ〜８Ｂに示す。
【実施例９】
【０１２９】
この実験では、凍結グリコシダーゼ製剤に対する、アスコルビン酸塩（２００ｍＭ）およびアスコルビン酸塩（２００ｍＭ）とＧｌｙ−Ｇｌｙ（２００ｍＭ）の組合せの保護効果を評価した。
【０１３０】
方法
各々グリコシダーゼ溶液（５．７ｍｇ／ｍｌ）５２．６μｌを含み、かつ、問題とする安定剤を含むかまたは安定剤を含まない２ｍｌガラスバイアルで、試料の全量が３００μｌとなるように十分な水を加えて試料を調製した。試料をγ線で照射し（１．６１６ｋＧｙ／時間および−２１．５℃または５．３５ｋＧｙ／時間および−２１．９℃の線量率および温度で総線量４５ｋＧｙ）、次いで、構造の完全性についてアッセイした。
【０１３１】
構造の完全性は逆相クロマトグラフィーによって決定した。試料１０μｌを９０μｌの溶媒Ａで希釈し、次いでＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １３０Ａ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｉｃｒｏｂｏｒｅ  ＨＰＬＣに装着されたＡｑｕａｐｏｒｅ  ＲＰ−３００（ｃ−８）カラム（２．１×３０ｍｍ）にそれを注入した。溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸；溶媒Ｂ：７０％アセトニトリル、３０％水、０．０８５％トリフルオロ酢酸。
【０１３２】
結果
安定剤が存在しない状態で４５ｋＧｙまで照射された酵素試料は、ブロードになり低くなったピ−クを示した。対照と比較したピークサイズの著しく小さな減少（図９）によって実証されるように、アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸塩とＧｌｙ−Ｇｌｙの組合せを含む照射試料からは、はるかに大きな材料の回収が得られた。
【実施例１０】
【０１３３】
この実験では、トリスバッファー（ｐＨ７．６）またはリン酸塩バッファー（ｐＨ７．５）存在下で凍結乾燥トリプシンを照射した（４℃において１．９ｋＧｙ／時間で総線量４５ｋＧｙ）。
【０１３４】
方法
１０００ＩＵ／ｍｌトリプシン溶液アリコートを３ｍｌのバイアルに入れ、次いで、凍結乾燥し、γ線照射した。各溶液の残りの部分は液体としてγ線照射した。試料は下記条件下でアッセイした。アッセイ条件：ウェル当たり５Ｕ（５０Ｕ／ｍｌ）のトリプシン＋ＢＡＴＮＡ基質（１ｍｇ／ｍｌ）を、９６穴プレート上に３倍ずつ連続希釈した。アッセイは、２枚の９６穴プレートで行い、４０５ｎｍおよび６２０ｎｍで５分および２０分後に吸収を読み取った。６３０ｎｍ（バックグラウンド）の吸収を４０５ｎｍの値から差し引いて、補正した吸収値を得た。反応時間５分と１５分の間この値の経時変化をプロットし、双曲線矩形方程式を使用しシグマプロットにおいてＶｍａｘおよびＫｍを決定した。
【０１３５】
結果
総線量４５ｋＧｙのγ線照射に暴露した凍結乾燥トリプシン試料は、トリスバッファーおよびアスコルビン酸ナトリウム存在下で、本質的に全トリプシン活性の回収を示し、リン酸塩バッファーおよびアスコルビン酸ナトリウム存在下でトリプシン活性の８８％の回収を示した。
【実施例１１】
【０１３６】
この実験では、凍結乾燥した酵素製剤（グリコシダーゼおよびスルファターゼ）を、安定剤（１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム）が存在しない状態でまたはその存在下で照射した。
【０１３７】
方法
１ｍｇの酵素を含むガラスバイアルを準備し、安定剤なしでまたは１００ｍＭアスコルビン酸ナトリウム（２Ｍ溶液５０μｌ）の存在下で、十分な水を用いて１ｍｌの試料を作成した。試料を以下の含水量レベルに凍結乾燥した。安定剤添加グリコシダーゼ：３．４％；安定剤無添加グリコシダーゼ：３．２％；安定剤添加硫酸塩：１．８％；安定剤無添加硫酸塩：０．７％。凍結乾燥試料をγ線照射し（４℃において１．８ｋＧｙ／時間で総線量４５ｋＧｙ）、次いで、構造の完全性についてアッセイした。
【０１３８】
構造の完全性はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。電気泳動ユニット中において、レーン当たり６μｇの各試料を、４．５％アクリルアミドスタッカーを有する７．５％〜１５％のアクリルアミド勾配ゲル上で、非還元条件下に１２０Ｖで泳動させた。
【０１３９】
結果
安定剤が存在しない状態で４５ｋＧｙに照射した凍結乾燥グリコシダーゼ試料は、若干の断片化のみを伴っていたが、完全な酵素の顕著な回収を示した。断片化は安定剤の添加によって低減された。
【０１４０】
同様に、安定剤が存在しない状態で４５ｋＧｙ照射した凍結乾燥スルファターゼ試料は、完全な酵素の良好な回収を示したが、わずかに多い断片化を伴った。重ねて、断片化は安定剤の添加によって低減された。
【０１４１】
この実験の結果を図１０に示す。
【実施例１２】
【０１４２】
この実験では、凍結乾燥したグリコシダーゼ製剤を、安定剤（２００ｍＭアスコルビン酸ナトリウムまたは２００ｍＭアスコルビン酸塩と２００ｍＭグリシルグリシンの組合せ）が存在しない状態またはその存在下で照射した。
【０１４３】
方法
ガラスバイアル中で試料を調製した。各々は、３００μｇの凍結乾燥グリコシダーゼと、安定剤なしまたは問題とする安定剤のいずれか、とを含有する。試料に総線量を変えたγ線を照射し（０．６ｋＧｙ／時間および−６０℃の割合および温度で総線量１０ｋＧｙ、３０ｋＧｙおよび５０ｋＧｙ）、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して構造の完全性についてアッセイした。
【０１４４】
試料は水で再構成して１ｍｇ／ｍｌの濃度とし、２×試料バッファー（４×上部トリスＳＤＳバッファー（ｐＨ６．８）１５．０ｍｌ；ドデシル硫酸ナトリウム１．２ｇ；グリセリン６ｍｌ；全量３０ｍｌとするのに十分な水；ジチオトレイトール０．４６ｇ、またはジチオトレイトールなし）で１：１に希釈し、次いで、８０℃で１０分間加熱した。各試料１０μｌ（酵素５μｇを含む）を、１０％ポリアクリルアミドゲルの各レーンに導入し、１２５Ｖで約１．５時間電気泳動ユニット上を泳動させた。
【０１４５】
結果
安定剤を含まない試料は照射後、酵素の約８０％が回収されたが、図１１Ａ〜１１Ｃに示すように若干の分解を伴っていた。安定剤としてアスコルビン酸塩のみを含む試料では分解の低下が観測され、安定剤としてアスコルビン酸塩とグリシルグリシンの組合せを含む試料では分解はさらに低下することが観察された。
【０１４６】
本発明について十分な説明を行ってきたが、本発明の範囲またはその任意の実施形態から外れることなく、広範囲の等価な条件、処方および他のパラメーターで本発明の方法が実施できることが、当業者には理解されるであろう。
【０１４７】
本願で引用した特許および刊行物はすべて、参照によってその全体が本願に完全に組み込まれる。任意の刊行物の引用は出願日に先立つその開示のためにあり、そのような刊行物が先行技術であるという承認として解釈されてはならず、また、本発明が先の発明によるそのような刊行物に先立つ資格がないとして解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１Ａ】安定剤の非存在下または存在下および種々のレベルの残留溶媒含有量でガンマ線照射語の凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図１Ｂ】安定剤の非存在下または存在下および種々のレベルの残留溶媒含有量でガンマ線照射した後の凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図２】安定剤の存在下および種々のｐＨレベルでガンマ線照射した後の、液体または凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図３Ａ】安定剤の非存在下または存在下でガンマ線照射した後の凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図３Ｂ】安定剤の非存在下または存在下でガンマ線照射した後の凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図４Ａ】安定剤の非存在下または存在下および種々のレベルの残留溶媒含有量でガンマ線照射した後の凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図４Ｂ】安定剤の非存在下または存在下および種々のレベルの残留溶媒含有量でガンマ線照射した後の凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図５Ａ】安定剤の非存在下または存在下および種々のレベルの残留溶媒含有量でガンマ線照射した後の凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図５Ｂ】安定剤の非存在下または存在下および種々のレベルの残留溶媒含有量でガンマ線照射した後の凍結乾燥されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図６】種々のレベルの残留溶媒含有量でガンマ線照射した後の、ポリプロピレングリコールに懸濁されたトリプシンの活性を示すグラフである。
【図７】種々の濃度の安定剤の水溶液中でガンマ線照射した後のトリプシンの活性を示すグラフである。
【図８Ａ】２種類の異なる凍結酵素製剤（グリコシダーゼおよびスルファターゼ）に関するアスコルビン酸塩（２００ｍＭ）、および、アスコルビン酸塩（２００ｍＭ）とＧｌｙ−Ｇｌｙ（２００ｍＭ）の組み合わせの保護効果を示すゲルである。
【図８Ｂ】２種類の異なる凍結した酵素製剤（グリコシダーゼおよびスルファターゼ）に関するアスコルビン酸塩（２００ｍＭ）、および、アスコルビン酸塩（２００ｍＭ）とＧｌｙ−Ｇｌｙ（２００ｍＭ）の組み合わせの保護効果を示すゲルである。
【図９】凍結したグリコシダーゼ製剤に関する安定剤の保護効果を示すグラフである。
【図１０】２種類の異なる凍結乾燥した酵素製剤（グリコシダーゼおよびスルファターゼ）に関するアスコルビン酸塩の保護効果を示す。
【図１１Ａ】凍結乾燥したグリコシダーゼ製剤に関するアスコルビン酸塩（２００ｍＭ）、および、アスコルビン酸塩（２００ｍＭ）とＧｌｙ−Ｇｌｙ（２００ｍＭ）の組み合わせの保護効果を示すゲルである。
【図１１Ｂ】凍結乾燥したグリコシダーゼ製剤に関するアスコルビン酸塩（２００ｍＭ）、および、アスコルビン酸塩（２００ｍＭ）とＧｌｙ−Ｇｌｙ（２００ｍＭ）の組み合わせの保護効果を示すゲルである。
【図１１Ｃ】凍結乾燥したグリコシダーゼ製剤に関するアスコルビン酸塩（２００ｍＭ）、および、アスコルビン酸塩（２００ｍＭ）とＧｌｙ−Ｇｌｙ（２００ｍＭ）の組み合わせの保護効果を示すゲルである。
【図１Ａ】
2005505324.tif 000003
【図１Ｂ】
2005505324.tif 000004
【図２】
2005505324.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2005505324.tif 000009
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
2005505324.tif 000017
【図１１Ａ】
2005505324.tif 000018
【図１１Ｂ】
2005505324.tif 000019
【図１１Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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2005505324.tif 000022
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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