(57)【要約】本発明は、スプライス部位選択、スプライシング、オルタナティブを調節する方法に関し、この方法は、細胞または細胞抽出物中の標的プレｍＲＮＡ分子にオリゴヌクレオチドタンパク質結合体をハイブリダイズする工程をからなり、オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体は、少なくとも２つの異なる配列エレメント：（i）標的プレｍＲＮＡ分子におけるスプライス部位の上流の特異的な領域に相補的である核酸配列；および（ii）タンパク質を共有結合的に結合するためのタンパク質結合部位配列エレメントを含む伸張、を含むオリゴヌクレオチド部分を含み；タンパク質部分は、タンパク質結合部位と結合する際にスプライス部位のスプライシングを調節し得るタンパク質からなる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スプライス部位選択およびそのスプライシングを調節する方法であって、細胞または細胞抽出物中の標的プレｍＲＮＡ分子にオリゴヌクレオチ−ドタンパク質結合体をハイブリダイズする工程を含み、該オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体は、タンパク質部分に結合し得るオリゴヌクレオチド部分を含み、このオリゴヌクレオチド部分は少なくとも２つの異なる配列エレメント：
（i）該標的プレｍＲＮＡ分子における該スプライス部位の上流の特異的な領域に相補的である核酸配列；および
（ii）タンパク質を共有結合的に結合するためのタンパク質結合部位配列エレメントを含む伸張；
を含み、そして、
該タンパク質部分は、該タンパク質結合部位と結合する際に該スプライス部位のスプライシングを調節し得るタンパク質を含む。
【請求項２】
前記タンパク質を前記結合する工程が、前記標的プレｍＲＮＡ分子に前記オリゴヌクレオチド部分がハイブリダイズする前に、またはその後に達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調節する工程が、スプライス部位の選択およびそのスプライシングを増加するまたは抑制する調節である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前期スプライス部位が、５’スプライス部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記スプライス部位が、３’スプライス部位である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が患者中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位と、該スプライス部位の上流の４６ヌクレオチドとの間の任意の箇所において見出される少なくとも８個のヌクレオチド配列に実質的に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位の上流の１６〜３６塩基対で開始する少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位の上流の２０〜２６塩基対で開始する少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質が、１本鎖または２本鎖の核酸分子に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が、ＳＲタンパク質、ｈｎＲＮＰタンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、リボヌクレオタンパク質、核酸結合タンパク質、および１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質が、ｈｎＲＮＰタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が、ｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、バクテオリオファージＭＳ２コートタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質部分が、タンパク質と相互作用し得る小さなＲＮＡ配列にハイブリダイズし得、そしてＲＮＡ／タンパク質複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記小さなＲＮＡ配列が、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、テロメラーゼのＲＮＡサブユニット、ｔＲＮＡ、および５Ｓ ＲＮＡからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記伸張がＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記伸張が１本鎖ＤＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記伸張がＤＮＡまたはＲＮＡの任意の修飾された形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸配列がＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡがＲＮＡの任意の修飾された形態である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴヌクレオチド部分が、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、およびホスホセレネート結合からなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチド部分が、少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記修飾された糖部分が、2’-O-メチル基または2’-O-メトキシエチル基である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、前記プレｍＲＮＡにおける潜在的なスプライス部位をブロックするために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチド部分が、配列番号１、配列番号２、配列番号１４、および配列番号１８〜配列番号３３からなる群より選択される配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
細胞または細胞抽出物に存在する標的プレｍＲＮＡ分子における、スプライス部位選択およびそのスプライシングを調節するためのオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体であって、タンパク質部分に共有結合的に付着されるオリゴヌクレオチド部分を含み、該オリゴヌクレオチド部分は、少なくとも２つの異なる配列エレメント：
（i）該標的プレｍＲＮＡ分子における該スプライス部位の上流の特異的な領域に相補的である核酸配列；および
（ii）タンパク質結合部位配列エレメントを含む伸張であって、この伸長においては該オリゴヌクレオチドのハイブリダイズが該標的ｍＲＮＡ分子における該スプライス部位のスプライシングを調節する；
を含み、
該タンパク質部分は、該スプライス部位のスプライシングを調節し得るタンパク質を含む。
【請求項３０】
前記伸張が、5’ CGU ACA CCA UCA GGG  UAC 3’（配列番号１）である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３１】
前記オリゴヌクレオチド部分が、配列番号１、配列番号２〜配列番号１４、および配列番号１８〜３３からなる群より選択される、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３２】
前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位と該スプライス部位の上流の４６ヌクレオチドとの間のいずれかで見出される少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３３】
前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位の上流の１６〜３６塩基対で開始する少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３４】
前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位の上流の２０〜２６塩基対で開始する少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３５】
前記タンパク質が、ＳＲタンパク質、ｈｎＲＮＰタンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、リヌクレオタンパク質、および１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質からなる群より選択される、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３６】
前記タンパク質が、ｈｎＲＮＰタンパク質である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３７】
前記タンパク質が、ｈｎＲＮＰ Ａ／Ｂタンパク質である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３８】
前記タンパク質が、バクテオリオファージＭＳ２コートタンパク質である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項３９】
前記タンパク質部分が、タンパク質と相互作用し得る小さなＲＮＡ配列にハイブリダイズし得、そしてＲＮＡ／タンパク質複合体を形成する、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４０】
前記小さなＲＮＡ配列が、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、テロメラーゼのＲＮＡサブユニット、ｔＲＮＡ、および５Ｓ ＲＮＡからなる群より選択される、請求項３９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４１】
前記伸張がＲＮＡ配列である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４２】
前記伸張が１本鎖ＤＮＡ配列である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチド部分の伸張がＤＮＡまたはＲＮＡの任意の修飾された形態である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４４】
前記核酸配列がＲＮＡ配列である、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４５】
前記ＲＮＡがＲＮＡの任意の修飾された形態である、請求項４４に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４６】
前記オリゴヌクレオチド部分が、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４７】
前記修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、およびホスホセレネート結合からなる群より選択される、請求項４６に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４８】
前記オリゴヌクレオチド部分が、少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項２９に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項４９】
前記修飾された糖部分が、2’-O-メチル基または2’-O-メトキシエチル基である、請求項４８に記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体。
【請求項５０】
ｍＲＮＡの代替の形態を作製する方法であって、細胞または細胞抽出物に、請求項２９〜４９のいずれかに記載の十分な量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を投与する工程を含む方法。
【請求項５１】
タンパク質の代替の形態を作製する方法であって、細胞または細胞抽出物に、請求項２９〜４９のいずれかに記載の十分な量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を投与する工程を含む方法。
【請求項５２】
前記タンパク質の代替の形態が優性ネガティブとして機能する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ｍＲＮＡ分子またはタンパク質の発現を減少させるおよび／または阻害する方法であって、請求項２９〜４９のいずれかに記載の十分な量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を細胞または細胞抽出物に投与する工程を含む方法。
【請求項５４】
神経分化を減少させるおよび／または阻害する方法であって、請求項２９〜４９のいずれかに記載の十分な量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を細胞または細胞抽出物に投与する工程を含む方法。
【請求項５５】
患者におけるウイルス感染を防止する方法であって、請求項２９〜４９のいずれかに記載の治療有効量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を、該患者に投与する工程を含む方法。
【請求項５６】
前記ウイルス感染がヒト免疫不全ウイルスによるものである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記患者が哺乳動物である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記投与が、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して行われる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.001〜50mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.01〜10mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.1〜5mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
患者において異常なスプライシングを導く変異から生じる疾患を処置するための方法であって、請求項２９〜４９のいずれかに記載の治療有効量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を、該患者に投与する工程を含む方法。
【請求項６３】
前記疾患が、β−サラセミア、嚢胞性線維症、血友病、網膜芽細胞腫、無アルブミン血症、レッシュ−ナイハン症候群、急性間欠性ポルフィリン症、乳および卵巣ガン、炭水化物欠損糖タンパク質症候群１ａ型、脳腱黄色腫症、エーレルス−ダンロー症候群ＶＩ型、ファンコーニ貧血、フロントテンポラーレ痴呆、ＨＰＲＴ不全、レイ脳脊髄障害、マルファン症候群、異染性白質萎縮症（Juvenlle形態）、神経線維腫症１型、ＯＣＴ不全、晩発性皮膚ポルフィリン症、サンドホフ病、重篤複合型免疫不全症、棘筋萎縮症、チロシン血症１型、およびデュシェンヌ筋ジストロフィーからなる群より選択される疾患である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記患者が哺乳動物である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記投与が、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して行われる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.001〜50mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.01〜10mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.1〜5mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
患者において細胞死を促進するための方法であって、請求項２９〜４９のいずれかに記載の有効量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を、該患者に投与する工程を含む方法。
【請求項７０】
前記細胞が新生物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記患者が哺乳動物である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記投与が、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して行われる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.001〜50mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.01〜10mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.1〜5mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７６】
患者において腫瘍細胞の増殖を防止するおよび／または減少させるための方法であって、請求項２９〜４９のいずれかに記載の治療有効量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を、該患者に投与する工程を含む方法。
【請求項７７】
前記腫瘍細胞が、肺ガン細胞、肝臓ガン細胞、すい臓ガン細胞、脳ガン細胞、結腸ガン細胞、腎臓ガン細胞、骨ガン細胞、乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、子宮ガン細胞、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、骨髄腫細胞、腺ガン細胞、胸腺腫細胞および形質細胞腫細胞からなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記患者が哺乳動物である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記投与程が、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して行われる、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.001〜50mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.01〜10mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
前記オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が、0.1〜5mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
薬学的に受容されるキャリアとともに、請求項２９〜４９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を含有する、組成物。
【請求項８５】
細胞または細胞抽出物に存在する標的プレｍＲＮＡ分子における、スプライス部位選択およびそのスプライシングを調節するためのオリゴヌクレオチド部分であって、少なくとも２つの異なる配列エレメント：
（i）該標的プレｍＲＮＡ分子における該スプライス部位の上流の特異的な領域に相補的である核酸配列；および
（ii）タンパク質を共有結合的に結合するためのタンパク質結合部位配列エレメントを含む伸張；
を含むオリゴヌクレオチド部分。
【請求項８６】
前記伸張が、5’-CGU ACA CCA UCA GGG  UAC-3’（配列番号１）である、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項８７】
配列番号１、配列番号２〜配列番号１４、および配列番号１８〜３３からなる群より選択される配列を含む、請求項８３に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項８８】
前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位と該スプライス部位の上流の４６ヌクレオチドとの間のいずれかで見出される少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項８９】
前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位の上流の１６〜３６塩基対で開始する少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９０】
前記核酸配列エレメントが、前記スプライス部位の上流の２０〜２６塩基対で開始する少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９１】
前記タンパク質結合部位が、ＳＲタンパク質、ｈｎＲＮＰタンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、リボヌクレオタンパク質、および１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質からなる群より選択されるタンパク質と結合し得る、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９２】
前記タンパク質結合部位が、ｈｎＲＮＰタンパク質に結合し得る、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９３】
前記タンパク質結合部位が、ｈｎＲＮＰ Ａ／Ｂタンパク質に結合し得る、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９４】
前記タンパク質結合部位が、バクテオリオファージＭＳ２コートタンパク質に結合し得る、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９５】
前記伸張がＲＮＡ配列である、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９６】
前記伸張が１本鎖ＤＮＡ配列である、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９７】
前記伸張がＤＮＡまたはＲＮＡの任意の修飾された形態である、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９８】
前記核酸配列がＲＮＡ配列である、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項９９】
前記ＲＮＡがＲＮＡの任意の修飾された形態である、請求項９８に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項１００】
前記オリゴヌクレオチド部分が、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合を含む、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項１０１】
前記修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、およびホスホセレネート結合からなる群より選択される、請求項１００に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項１０２】
前記オリゴヌクレオチド部分が、少なくとも１つの修飾された糖部分を含む、請求項８５に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項１０３】
前記修飾された糖部分が、2’-O-メチル基または2’-O-メトキシエチル基である、請求項１０２に記載のオリゴヌクレオチド部分。
【請求項１０４】
ｍＲＮＡの代替の形態を作製する方法であって、細胞または細胞抽出物に、請求項８５〜１０３のいずれかに記載の十分な量のオリゴヌクレオチド部分を投与する工程、および該細胞または該細胞抽出物に、前記タンパク質結合部位と結合し得る精製されたタンパク質を投与する工程を含む、方法。
【請求項１０５】
タンパク質の代替の形態を作製する方法であって、細胞または細胞抽出物に、請求項８５〜１０３のいずれかに記載の十分な量のオリゴヌクレオチド部分を投与する工程、および該細胞または該細胞抽出物に、前記タンパク質結合部位と結合し得る精製されたタンパク質を投与する工程を含む、方法。
【請求項１０６】
前記タンパク質の代替の形態が、優性ネガティブとして機能する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
ｍＲＮＡ分子またはタンパク質の発現を減少させるおよび／または阻害する方法であって、細胞または細胞抽出物に、請求項８５〜１０３のいずれかに記載の有効な量オリゴヌクレオチド部分を投与する工程、および該細胞または該細胞抽出物に、前記タンパク質結合部位と結合し得る精製されたタンパク質を投与する工程を含む、方法。
【請求項１０８】
神経分化を減少させるおよび／または阻害する方法であって、細胞または細胞抽出物に、請求項８５〜１０３のいずれかに記載の有効な量のオリゴヌクレオチド部分を投与する工程、および該細胞または該細胞抽出物に、前記タンパク質結合部位と結合し得る精製されたタンパク質を投与する工程を含む、方法。
【請求項１０９】
患者におけるウイルス感染を防止する方法であって、請求項８５〜１０３のいずれかに記載の治療有効量のオリゴヌクレオチド部分、および前記タンパク質結合部位に結合し得る治療有効量の精製されたタンパク質を、該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１０】
前記感染がヒト免疫不全ウイルスによって引き起こされる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記患者が哺乳動物である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記投与が、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して行われる、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.001〜50mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１４】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.01〜10mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１５】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.1〜5mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１６】
患者において異常なスプライシングを導く変異から生じる疾患を処置するための方法であって、請求項８５〜１０３のいずれかに記載の治療有効量のオリゴヌクレオチド部分、および前記タンパク質結合部位に結合し得る治療有効量の精製されたタンパク質を、該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１１７】
前記疾患が、β−サラセミア、嚢胞性線維症、血友病、網膜芽細胞腫、無アルブミン血症、レッシュ−ナイハン症候群、急性間欠性ポルフィリン症、乳および卵巣ガン、炭水化物欠損糖タンパク質症候群１ａ型、脳腱黄色腫症、エーレルス−ダンロー症候群ＶＩ型、ファンコーニ貧血、フロントテンポラーレ痴呆、ＨＰＲＴ不全、レイ脳脊髄障害、マルファン症候群、異染性白質萎縮症（Juvenlle形態）、神経線維腫症１型、ＯＣＴ不全、晩発性皮膚ポルフィリン症、サンドホフ病、重篤複合型免疫不全症、棘筋萎縮症、チロシン血症１型、およびデュシェンヌ筋ジストロフィーからなる群より選択される疾患である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記患者が哺乳動物である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記投与が、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して行われる、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.001〜50mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２１】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.01〜10mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２２】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.1〜5mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２３】
患者において細胞死を促進するための方法であって、請求項８５〜１０３のいずれかに記載の有効量のオリゴヌクレオチド部分、および前記タンパク質結合部位と結合し得る治療有効量の精製されたタンパク質を、該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１２４】
前記細胞が新生物の細胞である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記患者が哺乳動物である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
前記投与が、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して行われる、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.001〜50mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２８】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.01〜10mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２９】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.1〜5mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３０】
患者において腫瘍細胞の増殖を防止するおよび／または減少させるための方法であって、請求項８５〜１０３のいずれかに記載の治療有効量のオリゴヌクレオチド部分、および前記タンパク質結合部位に結合し得る治療有効量の精製されたタンパク質を、該患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項１３１】
前記腫瘍細胞が、肺ガン細胞、肝臓ガン細胞、すい臓ガン細胞、脳ガン細胞、結腸ガン細胞、腎臓ガン細胞、骨ガン細胞、乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、子宮ガン細胞、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、骨髄腫細胞、腺ガン細胞、胸腺腫細胞および形質細胞腫細胞からなる群より選択される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記患者が哺乳動物である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記投与が、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して行われる、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３５】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.001〜50mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３６】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.01〜10mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３７】
前記オリゴヌクレオチド部分が、0.1〜5mg/kgにわたる範囲において投与される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３８】
薬学的に受容されるキャリアとともに、請求項８５〜１０３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド部分を含有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（ａ）発明の分野
本発明は、スプライス部位選択、異なるタンパク質をコードするｍＲＮＡを作製するために必要とされるプロセスに関する。
（ｂ）先行技術の記載
ショウジョウバエ、マウス、およびヒトゲノムについてのゲノム配列決定の取り組みの完了は、複雑な生物体は、タンパク質をコードする遺伝子の予測されたよりも小さなセットを有するという結論を導いた。対照的に、複雑な動物において見出されるタンパク質の十分な相補体は非常により多様である。転写後修飾はおそらく、タンパク質多様性の良好な機能を説明するが、タンパク質の多様性を作製するために使用される主な機構は、転写後的に作用するオルタナティブなプレｍＲＮＡスプライシング機構に起因するようである（Maniatis,TおよびTasic,B,(2002) Nature 418:236, Black,D.L.(2003),Annu.Rev.Biochem.72:291〜336）。
【０００２】
ｍＲＮＡに対応するExpressedSequenceTag（ＥＳＴ）の分析に基づく近年の評価は、全てのヒト遺伝子のうちの３５％が、オルタナティブにスプライスされることを予測する。ＥＳＴはｍＲＮＡ転写産物の一部分のみをカバーし、しばしば、ｍＲＮＡの非コード３’末端に対応することを考慮すると、この数は過小評価であるようである。第２２染色体の近年の解析は、オルタナティブにスプライスされる、発現される遺伝子の数は約５９％であると見積もる。
【０００３】
真核生物のｍＲＮＡは、前駆体として、またはプレｍＲＮＡとして転写され、これはイントロン配列を含む。これらのイントロン配列は切り出され、そしてエクソンが共にスプライスされて成熟ｍＲＮＡを形成する。スプライシングに関与される基本的な生化学的反応は、比較的よく知られる。転写されたプレｍＲＮＡは、５’エクソン−イントロン接合部位、またはスプライス部位（これはコンセンサス配列CAG／GTAAGT（ここで／はエクソン−イントロン接合部位である）によってマークされる）；コンセンサス配列YnCAG／（Ｙ＝ピリミジンおよびｎ＝３〜１２）によってマークされる３’スプライス部位；分岐点、３’スプライス部位の上流の約２５〜１００ヌクレオチド；およびポリピリミジントラックを含む。スプライシング事象自体は、スプレオソームを形成するためのいくつかのＲＮＡ結合タンパク質およびリボヌクレオタンパク質粒子（例えば、ｓｎＲＮＰ）の結合を必要とする。スプレオソームアセンブリ後、２つのエステル交換反応が生じ、これは２つのエクソン配列の融合、およびラリアット形状のイントロンの放出を生じる。
【０００４】
所与の遺伝子内のイントロンおよび潜在的なスプライス部位の数を考慮して、オルタナティブなスプライシングは、１つのプレｍＲＮＡ分子から多様なｍＲＮＡ産物を生成し得る。オルタナティブなスプライシングの結果は、停止コドンを切り出すこと、および包含することによるタンパク質発現の制御から、タンパク質産物の多様化を許容することまでおよぶ。オルタナティブなスプライシングは、より多くの転写産物、それゆえ単一の遺伝子からのタンパク質産物を許容することによって、任意の所与の種のタンパク質レパートリーを拡張するにおいて極めて重要な役割を有する。
【０００５】
単一のオルタナティブなスプライシング単位を含む遺伝子は、２つのスプライスされたイソ型を生じ得るが、１０個以上の異なるｍＲＮＡを作製するための複数のオルタナティブなスプライシング単位を催す遺伝子がまれなわけではない。例えば、トロポニンＴおよびＣＤ４４プレｍＲＮＡのオルタナティブなスプライシングは、６４個および２０００個を超えるイソ型をそれぞれ作製し得る。今日までに最も顕著な例は、ＤＳＣＡＭ、アクシオンガイダンスに関与されるタンパク質をコードするショウジョウバエ遺伝子のスプライシングである。４つのオルタナティブにスプライスされる領域中に分配される９５個の異なるエクソンに起因して、単一のＤＳＣＡＭ遺伝子は、３８，０１６個の異なるＤＳＣＡＭタンパク質を作製する可能性を有し、その数は、ショウジョウバエにおける遺伝子の総数の３倍である。本発明者らがオルタナティブにスプライスされる遺伝子あたり５つのイソ型の保存的な平均を推定する場合、ヒトタンパク質の全集合の８５％を超える同一性が、オルタナティブなプレｍＲＮＡスプライシングによって決定される。
【０００６】
オルタナティブなプレｍＲＮＡスプライシングは、哺乳動物におけるタンパク質多様性に対して強力な貢献者であるが、調節因子の同一性およびスプライス部位選択を制御する基本的な分子機構について比較的ほとんど知られていない。近年の前進は、スプライス部位認識をポジティブにまたはネガティブに影響し得る多様な非スプライス部位エレメントを同定した。さらに、スプライシングエンハンサー、ＲＮＡ結合タンパク質、およびサイレンサーエレメントはまた、オルタナティブなスプライシングの自然調節において役割を果たすことが示された。
【０００７】
オルタナティブに含まれるまたは排除されるエクソン、エクソンの部分、またはイントロンの効果は、タンパク質の構造および活性に対して広範な効果を有し得る。いくつかの転写産物について、全体の機能的ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン、転写活性化ドメイン、膜アンカードメイン、局在化ドメイン）は、オルタナティブなスプライシングによって付加または除去され得る。他の例において、停止コドンを保有するエクソンの包含は、長さが短かくおよび往々にして不活性なタンパク質を生じ得る。別の系において、初期の停止コドンの導入は、例えば、可溶性タンパク質に膜結合タンパク質を形質転換する、短縮されたタンパク質、または不安定なｍＲＮＡを生じ得る。スプライス部位の特異的な使用はしばしば、発達、細胞、組織、および性特異的様式において調節される。神経接続、毛髪細胞における電気調整、腫瘍進行、アポトーシス、およびシグナル伝達事象を含む多様な細胞プロセスにおけるオルタナティブなスプライシングの機能的な影響は、まさに実証され始めたばかりである。
【０００８】
オルタナティブなスプライシングにおける摂動は、ヒト遺伝子疾患およびガンと関連されてきた。ガンの多くの例があり、ここではオルタナティブにスプライスされたタンパク質のイソ型が増加されたリガンド親和性または腫瘍抑制活性の喪失を有し、これは新生物増殖に寄与する。例えば、Ｂ１Ｎ１ ｍＲＮＡにおけるエクソンの不適切な包含は、腫瘍抑制活性の喪失を生じる。
【０００９】
また特に興味深いのは、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死の制御に対するオルタナティブなスプライシングの寄与である。抗アポトーシスタンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１）の過剰発現、またはプロ−アポトーシスタンパク質（例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ−ｘＳ、Ｂｃｌ−Ｇ）の発現をブロックすることは、死の刺激に対して細胞を防御する。対照的に、抗アポトーシス形態の発現を防止することは、死の刺激を促進するか、または細胞を死の刺激に対して感作し、状況はまた、プロ−アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーを過剰発現することによって観察される。従ってアポトーシス経路は、プロ−アポトーシス活性と抗−アポトーシス活性との間の精巧なバランスを介して制御され、ならびにオルタナティブなスプライシングは死シグナルに対する細胞応答の注意深い調節のために使用される１つの機構である。
【００１０】
多くのガンおよびガン細胞系統において、スプライスの改変体の比率は、抗アポトーシス形態の生成を有利に働くために、頻繁にシフトされる。例えば、Ｂｃｌ−ｘＬの過剰発現は、腫瘍中の減少されたアポトーシス、化学療法薬に対する耐性、および不十分な臨床結果と関連される。多くの遺伝子が、アポトーシスに対して反対の効果を伴うタンパク質を生成するようにオルタナティブスプライスされることを考慮すると、プロ−アポトーシス形態に向かってオルタナティブなスプライシングをシフトする摂動は、ガン細胞の悪性の表現型を逆転することを補助し得る。従って、プロ−アポトーシス改変体に有利であるようにスプライス部位選択をシフトする能力は、価値のある抗ガン戦略になり得る。
【００１１】
オルタナティブなスプライシングが多様な経路に関与される多くのタイプのタンパク質の産生および活性を制御するので、他方の競合する部位の利益に対して、一方の部位の使用を防止することにより、スプライス部位選択を再プログラムすることは、一般的な様式において、タンパク質の産生およびタンパク質の機能の操作を可能にする。それゆえ、細胞、組織、または器官の寿命の全ての局面は、特定のスプライシング部位の使用をブロックまたは影響する方法によって達成され得た。オルタナティブなスプライシングは、キナーゼ、転写因子、膜通過タンパク質および受容体、核酸結合タンパク質、代謝酵素、分泌タンパク質、細胞外マトリクスタンパク質、ならびに他のタンパク質について実証されている。従って、任意のこれらのタンパク質のオルタナティブなスプライシングを再プログラムすることは、これらのタンパク質のそれぞれの機能を影響する可能性を有する。
【００１２】
タンパク質機能の多様化においてオルタナティブなスプライシングが果たす極めて重要な役割を考慮すると、スプライス部位選択を制御または再プログラムし得る戦略は、個々のイソ型の機能を取り組む本発明者らの能力に対して、ならびに細胞プロセスを改変または再プログラムするための新規なおよび特異的な道具を提供することに対して莫大な影響力を有し得る。それゆえ、オルタナティブなスプライシングを標的するアプローチは、異なる活性を伴うスプライスされたイソ型の発現を調節する特異的な方法を提供し得る。ガンを処置することに加えて、スプライシング干渉戦略は、スプライス部位選択を影響する点変異によって引き起こされる広範な範囲の遺伝子病において潜在的な治療価値を有する。事実、全ての遺伝的欠陥（例えば、サラセミア、嚢胞性線維症、血友病、網膜芽細胞腫、無アルブミン血症、レッシュ−ナイハン症候群）のうちの１５％が、スプライス部位の変異によって引き起こされる。
【００１３】
スプライス部位選択を制御または再プログラムするための有効な方法についての必要性が依然あることが明らかである。このような戦略は、個々のタンパク質のイソ型の機能を取り組む本発明者らの能力に対して、ならびにヒト疾患の処置のためにアポトーシスのような細胞プロセスを調節または再プログラムするための新規なおよび特異的な道具を提供することに対して、莫大な影響を有する。
【００１４】
エクソンはヒトゲノムの約１％を示し、そして１〜1000ヌクレオチドの大きさにわたり、内部エクソンについての平均の大きさは１４５ヌクレオチドである。対照的にイントロンは私たちのゲノムの２４％を構成し、６０〜200000ヌクレオチドを超える範囲の大きさである。ヒトイントロンの平均の大きさは、3,300ヌクレオチドよりも大きく、そしてヒトイントロンの２０％近くが５ｋｂよりも長い。イントロンの効率的なおよび正確な除去は、機能的なｍＲＮＡの産生に重要である。長いイントロンについて、スプライス部位の対を、このような部位が数千のヌクレオチドによって分離される場合、見出すこと、および明言することに関連される困難さを想像することは容易である。スプライシングシグナルが類似するイントロン配列の存在はまた、正確なスプライス部位の対合の効率を減少する、多数のより弱いおよび非生産性の相互作用を促進し得る。最後に、これらのスプライシングパートナーを分離する長い距離は、これが異なる時に合成されることを意味する。従って、５’スプライス部位は、真性の３’スプライス部位が合成されるまで利用可能なままでなくてはならない。これらの潜在的な問題は、なぜ短いイントロンが、高度に発現される遺伝子においてより優性であるのかを説明し得る。長いイントロンの除去が効率的におよび正確にどのように生じるのかを理解することは、ほとんど実験的研究が達成されていない多大な挑戦を依然残す。ショウジョウバエにおいて、Ultrabithorax遺伝子の７４ｋｂ長のイントロンの除去は、首尾よい工程によって生じることが示され、完全なイントロンの除去が行われるまで、それぞれが、次の工程において使用される５’スプライス部位を作製する。哺乳動物において、イントロンの大きさは、オルタナティブなスプライシングを影響し得る（Bell,M.V.ら,(1998) Mol.Cell.Biol.18:5930〜5941）が、長いイントロンの効率的な除去を行使する機構はいまだ研究されていない。
【００１５】
長いイントロンの除去に関連される決定のいくつかは、オルタナティブなスプライス部位の選択の間のスプライシング機構によってなされる選択に類似する。オルタナティブなスプライシング単位においてスプライス部位の適切な対を選択することは、ＳＲおよびｈｎＲＮＰタンパク質を含むタンパク質の異なるクラスによって認識される多くのタイプのエレメントの寄与を必要とする。ｈｎＲＮＰ Ａ１は、５’スプライス部位選択アッセイにおいてＳＲタンパク質ＳＦ２／ＡＳＦの活性を拮抗するその能力に基づいて、スプライス部位選択における機能に起因するそのクラスの最初のタンパク質であった。多くの哺乳動物およびウイルスプレｍＲＮＡのオルタナティブなスプライシングにおけるＨｎＲＮＰ Ａ／Ｂタンパク質についての役割が現在実証されている（Chabotら,(2003), Regulation of Alternative Splicing, Springer-Verlag Gmby & Co. Heidelberg, 第31巻, 59〜88頁）。
【００１６】
スプライス部位選択を調節する方法が提供されることが非常に所望される。
【発明の要旨】
【００１７】
本発明は、スプライス部位選択を調節する方法を特徴とする。タンパク質結合部位およびスプライス部位の上流の（例えば、エクソンを先行する５’スプライス部位における）配列に相補的な配列を含むハイブリッドオリゴヌクレオチドを使用することは、スプライシングを特異的に阻害することができると本明細書に記載されている。特異的なスプライス部位選択を阻害することによって、それゆえ、任意の所与の遺伝子から作製されるｍＲＮＡおよびタンパク質産物を制御および改変し得る。遺伝子の大多数が、多数のｍＲＮＡを生成するためにオルタナティブなスプライス部位選択を使用することを考慮すると、本発明の有用性は、治療の目的のための、およびより一般的なツールとして、研究の目的のための両方で非常に広範囲に及ぶものである。
【００１８】
本発明によれば、スプライス部位選択およびそのスプライシングを調節する方法が提供され、この方法は、細胞または細胞抽出物中の標的プレｍＲＮＡ分子にオリゴヌクレオチ−ドタンパク質結合体をハイブリダイズする工程を含み、ここで該オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体は、タンパク質部分に結合し得るオリゴヌクレオチド部分を含み、このオリゴヌクレオチド部分は少なくとも２つの異なる配列エレメント：
（i）該標的プレｍＲＮＡ分子における該スプライス部位の上流の特異的な領域に相補的である核酸配列；および
（ii）タンパク質を共有結合的に結合するためのタンパク質結合部位配列エレメントを含む伸張；
を含み、そして、該タンパク質部分は、該タンパク質結合部位と結合する際に該スプライス部位のスプライシングを調節し得るタンパク質を含む。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様において、タンパク質を結合する工程は、標的プレｍＲＮＡ分子にオリゴヌクレオチド部分がハイブリダイズする前に、またはその後に達成される。
【００２０】
活性を調節することは、スプライス部位選択およびそのスプライシングを増加するまたは抑制することの一方である。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様において、細胞は、患者内の細胞であり、本発明のより好ましい実施態様において、患者は哺乳動物である。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様において、核酸配列エレメントは、スプライス部位の上流において見出される少なくとも８個のヌクレオチドに対して、少なくとも７０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、および最も好ましくはスプライス部位の上流に見られる少なくとも８個のヌクレオチドに９５％相補的であり、より好ましくは、スプライス部位の上流の１６〜３６塩基対で開始する少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的であり、および最も好ましくは、スプライス部位の上流の２０〜２６塩基対で開始する少なくとも８個のヌクレオチドに実質的に相補的である。
【００２３】
本発明の１つの実施態様おいて、タンパク質は、１本鎖または２本鎖核酸分子に結合するタンパク質である。
【００２４】
本発明の好ましい実施態様において、タンパク質は、ＳＲタンパク質、ｈｎＲＮＰタンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、リボヌクレオタンパク質、核酸結合タンパク質、および１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質からなる群より選択される。ｈｎＲＮＰタンパク質は好ましくは、ｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２タンパク質である。
【００２５】
本発明によれば、細胞または細胞抽出物に存在する標的プレｍＲＮＡ分子における、スプライス部位選択およびそのスプライシングを調節するためのオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体が提供され、これは、タンパク質部分に共有結合的に付着されるオリゴヌクレオチド部分を含み、該オリゴヌクレオチド部分は、少なくとも２つの異なる配列エレメント：
（i）該標的プレｍＲＮＡ分子における該スプライス部位の上流の特異的な領域に相補的である核酸配列；および
（ii）タンパク質結合部位配列エレメントを含む伸張であって、この伸長においては該オリゴヌクレオチドのハイブリダイズが該標的ｍＲＮＡ分子における該スプライス部位のスプライシングを調節する；
を含み、該タンパク質部分は、該スプライス部位のスプライシングを調節し得るタンパク質を含む。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体は、配列5’ CGU ACA CCA UCA GGG  UAC 3’（配列番号１）の伸張を有する。
【００２７】
本発明の別の実施態様において、オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体は、配列番号１、配列番号２〜１４、および配列番号１８〜３３からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチド部分を有する。
【００２８】
本発明によれば、細胞または細胞抽出物に、本発明の十分な量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を投与する工程からなる、ｍＲＮＡの代替の形態を作製する方法が提供される。
【００２９】
本発明によれば、細胞または細胞抽出物に、本発明の十分な量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を投与する工程からなるタンパク質の代替の形態を作製する方法が提供される。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様において、タンパク質の代替の形態は優性ネガティブとして機能する。
【００３１】
本発明によれば、ｍＲＮＡ分子の発現またはタンパク質を減少および／または阻害する方法が提供され、この方法は、細胞または細胞抽出物に、本発明の十分な量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を投与する工程からなる。
【００３２】
本発明によれば、神経分化を減少および／または阻害する方法が提供され、この方法は、細胞または細胞抽出物に、本発明の十分な量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を投与する工程をからなる。
【００３３】
本発明によれば、患者におけるウイルス感染を防止する方法が提供され、この方法は、本発明の治療有効量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を、患者に投与する工程からなる。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様において、ウイルス感染はヒト免疫不全ウイルスによって引き起こされる。
【００３５】
本発明によれば、患者において異常なスプライシングを導く変異から生じる疾患を処置するための方法が提供され、この方法は、本発明の治療有効量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を、患者に投与する工程からなる。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様において、疾患は、β−サラセミア、嚢胞性線維症、血友病、網膜芽細胞腫、無アルブミン血症、レッシュ−ナイハン症候群、急性間欠性ポルフィリン症、乳および卵巣ガン、炭水化物欠損糖タンパク質症候群１ａ型、脳腱黄色腫症、エーレルス−ダンロー症候群ＶＩ型、ファンコーニ貧血、フロントテンポラーレ痴呆、ＨＰＲＴ不全、レイ脳脊髄障害、マルファン症候群、異染性白質萎縮症（Juvenlle形態）、神経線維腫症１型、ＯＣＴ不全、晩発性皮膚ポルフィリン症、サンドホフ病、重篤複合型免疫不全症、棘筋萎縮症、チロシン血症１型、およびデュシェンヌ筋ジストロフィーからなる群より選択される。
【００３７】
本発明によれば、患者において細胞死を促進するための方法が提供され、この方法は、本発明の治療有効量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を、患者に投与する工程からなる。
【００３８】
本発明によれば、患者において腫瘍細胞の増殖を防止および／または減少するための方法が提供され、この方法は、本発明の治療有効量のオリゴヌクレオチド−タンパク質結合体を、患者に投与する工程からなる。
【００３９】
本発明の好ましい実施態様において、腫瘍細胞は、肺ガン細胞、肝臓ガン細胞、すい臓ガン細胞、脳ガン細胞、結腸ガン細胞、腎臓ガン細胞、骨ガン細胞、乳ガン細胞、前立腺ガン細胞、子宮ガン細胞、リンパ腫細胞、黒色腫細胞、骨髄腫細胞、腺ガン細胞、胸腺腫細胞および形質細胞腫細胞からなる群より選択される。
【００４０】
本出願において、細胞または細胞抽出物に存在する標的プレｍＲＮＡ分子における、スプライス部位選択およびそのスプライシングを調節するためのオリゴヌクレオチド部分が提供され、これは、少なくとも２つの異なる配列エレメント：
（i）標的プレｍＲＮＡ分子におけるスプライス部位の上流の特異的な領域に相補的である核酸配列；および
（ii）タンパク質を共有結合的に結合するためのタンパク質結合部位配列エレメントを含む伸張、を含む。
【００４１】
本発明のオリゴヌクレオチド部分を使用する、以前に記載される任意の方法がまた、本出願において含まれ、ここで方法はまた、タンパク質結合部位に結合し得る精製されたタンパク質を、細胞または細胞抽出物に投与する工程を包含する。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体の投与は、経口、非経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、局所、および鼻の経路からなる群より選択される経路を介して達成される。
【００４３】
本発明の好ましい実施態様において、オリゴヌクレオチド−タンパク質結合体は、0.001〜50mg/kg、好ましくは0.01〜10mg/kg、最も好ましくは0.1〜5mg/kgで変化する範囲において投与される。
【００４４】
本発明において使用されるオリゴヌクレオチドは好ましくは、以下の表から選択されるオリゴヌクレオチドである：
【００４５】
【表１】
2005535318.tif 000003
【００４６】
本発明の第１の局面は、ハイブリッドオリゴがスプライス部位に密接してハイブリダイズするのでスプライス部位認識を干渉するハイブリッドオリゴを利用するが、本発明の第２の局面は、スプライス部位からより大きな距離でハイブリダイズするハイブリッドオリゴを使用することによってスプライス部位の使用を変化するための方法を特徴とする。この第２の局面において、本発明者らは、オリゴによって結合される部位間の配列にループを作らせることを包含する機構によって、オルタナティブなスプライシング、および長いイントロンのスプライシングを影響するために、ｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２タンパク質によって結合されるハイブリッドオリゴを使用する。ハイブリッドオリゴの使用を介してＡ１／Ａ２を提供することは、従って、Ａ１／Ａ２を、大きなイントロンのスプライシングに対して、およびオルタナティブなスプライシングに対して作用するように、配置し得る。
【００４７】
本発明の別の実施態様において、伸張は、他のオリゴまたはオリゴヌクレオチドの二次構造に付着され得、２本鎖ＲＮＡに結合されるタンパク質についての結合部位を形成する。
【００４８】
本発明の目的のために、以下の略語および用語が以下において規定される。
【００４９】
用語「３’スプライス部位」は、３’イントロン／エクソン境界でのプレｍＲＮＡ配列を意味し、これは一般に配列YnCAG／（ここで／はイントロンエクソン境界であり、Ｙ＝ピリミジン、およびｎ＝３〜１２）を含む。スプライシング機構は、３’スプライス部位配列を認識し、そしてこれに結合する。
【００５０】
用語「５’スプライス部位」は、５’エクソン／イントロン境界でのプレｍＲＮＡ配列を意味することが意図され、これは一般に配列CAG/GTAGGT（ここで／は、エクソン／イントロン境界である）を含む。スプライシング機構は、５’スプライシング部位配列を認識し、そしてこれに結合する。
【００５１】
用語「ｍＲＮＡの代替の形態」は、優性スプライス部位以外の任意のスプライス部位の使用を介して生成されるｍＲＮＡの任意の形態を意味することが意図される。制限されない例としては、潜在的な３’または５’スプライス部位の使用、エクソンスキッピング、より長いまたはより短いエクソンを作製するための５’または３’スプライス部位のシフティング、およびエクソンとしてのイントロン配列の使用を介して生成されるｍＲＮＡの代替の形態が挙げられる。
【００５２】
用語「オルタナティブなスプライシング」は、単一遺伝子から複数のＲＮＡおよびタンパク質イソ型を作製するための、単一のプレｍＲＮＡ内の異なる５’または３’スプライス部位、イントロン、エクソンの使用を意味することが意図される。例えば、オルタナティブなスプライシングは、１つ以上のスキップされたエクソン、イントロンスプライシングの変動性の位置、またはイントロン保有の形態をとり得る。
【００５３】
用語「相補的な」は、ＤＮＡまたはＲＮＡの２つの異なる鎖におけるヌクレオチド／塩基対の関係を意味することが意図され、ここでは塩基対が対合される（グアニンとシチジン、アデニンとチミン（ＤＮＡ）またはウラシル（ＲＮＡ））。具体的には、配列の相補性は、オリゴヌクレオチドが、特定のプレｍＲＮＡ配列を認識すること、および特定のプレｍＲＮＡへのオリゴヌクレオチドの結合を指向することを可能にするのに十分であるべきである。オリゴヌクレオチドの領域は、少なくとも７０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、および最も好ましくは９５％の配列相補性を、標的されるプレｍＲＮＡに対して示し得る。
【００５４】
用語「潜在的なスプライス部位」は、変異によって活性化されるか、またはそうでなければスプライシングエレメントとして作用し得る、通常は潜伏性の５’または３’スプライス部位を意味することが意図される。例えば、変異は、ネイティブなまたは優性の５’スプライス部位の下流である５’スプライス部位を活性化し得る。この「潜在的な」スプライス部位の使用は、ネイティブなまたは優性のスプライス部位の使用によって生成されない異なるｍＲＮＡスプライス産物の生成を生じる。
【００５５】
用語「優性ネガティブな」は、タンパク質の天然のまたは内因性の形態の機能を阻害し得るタンパク質の任意の異なるイソ型を意味することが意図される。
【００５６】
用語「発現」は、技術水準の公知の方法による遺伝子産物またはタンパク質の検出を意味することが意図される。例えば、タンパク質発現はしばしば、ウェスタンブロッティングによって検出され、およびＲＮＡ発現は、ノーザンブロッティングによって、またはＲＮアーゼ保護アッセイによって検出される。「発現を減少または阻害する」ことは、
上述のアッセイによって検出されるｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルにおける２０％以上の、好ましくは３０％以上の、より好ましくは４０％以上の、および最も好ましくは５０％以上の減少を意味する。
【００５７】
用語「ｈｎＲＮＰ」は、異種性の核リボヌクレオタンパク質粒子のファミリーに属する任意のタンパク質を意味する。ｈｎＲＮＰタンパク質は、核においてプレｍＲＮＡと会合され、そしてプレｍＲＮＡプロセシング、ならびにｍＲＮＡ代謝および輸送の他の局面を影響するようである。ヒト細胞において、２０を超えるこのようなｈｎＲＮＰタンパク質がある。
【００５８】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド単量体またはその核酸アナログの、ＤＮＡおよびＲＮＡのようなポリマーを意味することが意図され、２本鎖および１本鎖デオキシリボ核酸、リボ核酸、そのα−アノマー形態などを包含する。通常単量体は、リン酸ジエステル結合によって連結され、ここでは用語「リン酸ジエステル結合」は、リン酸ジエステル結合、または会合される対イオン、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋を含む、そのリン酸アナログを含む結合をいう。オリゴヌクレオチドはまた、モルホリノ骨格またはペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格のような修飾された骨格を含み得、ここではデオキシリボースリン酸骨格はペプチドオリゴマーにより置換されている。オリゴヌクレオチドは典型的に、数モノマー単位、例えば５〜４０から、数百のモノマー単位までの大きさにおよぶ。オリゴヌクレオチドが「ATGCCTG」のような文字の配列によって示される場合はいつも、そうでないと記載されない限り、ヌクレオチドは左側から右側まで５’から３’の順序にあり、「Ａ」がアデノシンを示し、「Ｃ」はシチジンを示し、「Ｇ」はグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、そして「Ｕ」はウラシルを示すことが理解される。本明細書中で使用されるように、これは、その生理学的におよび薬学的に受容される塩：すなわち、親化合物の所望される生物学的活性を保持し、およびそれに対する所望されない毒物学的な影響を与えない塩を含む。このような塩の例は（ａ）ナトリウム、カリウム、ＮＨ４＋、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンのようなポリアミン；（ｂ）無機酸と共に形成される酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など；（ｃ）例えば、酢酸、オキサル酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フタル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクトウロン酸などのような有機酸とともに形成される塩；ならびに（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素のような元素のアニオンから形成される塩である。
【００５９】
用語「薬学的に受容されるキャリア」は、これがともに投与される化合物の治療的特性を保持しながら、処置される哺乳動物に生理学的に受容されるキャリアを意味する。１つの例示的な薬学的に受容されるキャリア物質は、生理学的食塩水である。他の生理学的に受容されるキャリアおよびそれらの処方物は、当業者に公知であり、例えば、Remingtonis Pharmaceutical Sciences(第20版) A.Gennaro編, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Phlladelphia, PAにおいて記載されている。
【００６０】
用語「タンパク質結合配列エレメント」は、１本鎖または２本鎖核酸分子と相互作用し得るタンパク質についての結合部位を含む核酸配列エレメントを意味することが意図される。タンパク質結合部位配列エレメントはまた、ＲＮＰとして公知の大きなＲＮＡ／タンパク質複合体を形成するために１つ以上のタンパク質と相互作用する公知の小さなＲＮＡに実質的に同一である任意のＲＮＡ配列を包含し得る。このような小さなＲＮＡの例としては、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、または任意の他の小さなＲＮＡ配列（例えば、ｔＲＮＡ、５ＳＲＮＡ、テロメアーゼのＲＮＡサブユニット）が挙げられる。
【００６１】
用語「小さなＲＮＡ」は、タンパク質合成に直接的に関与されない任意の短いＲＮＡを意味することが意図される。一般に、小さなＲＮＡは、５０〜５００ヌクレオチドの大きさにおよぶが、いくつかは１０００塩基対ほどの長さであり得る。小さなＲＮＡは代謝的に安定であり、およびＲＮＡ結合タンパク質と会合し得る。
【００６２】
用語「ｓｎＲＮＡ」は、小さな核ＲＮＡを意味することが意図される。ｓｎＲＮＡは一般にＲＮＡプロセシングに関与する。ｓｎＲＮＡの例としては、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５、およびＵ６が挙げられ、これはタンパク質と会合して小さな核リボヌクレオタンパク質（ｓｎＲＮＰ）を形成する。
【００６３】
用語「ｓｎｏＲＮＡ」は、小さな核ＲＮＡを意味することが意図される。ｓｎｏＲＮＡは、６０〜３００ヌクレオチドの大きさにおよび得、代謝的に安定であり、タンパク質のセットと会合して小さな核リボヌクレオタンパク質（ｓｎｏＲＮＰ）を形成する。ｓｎｏＲＮＡは一般に、ＲＮＡ合成およびプロセシングにおいて役割を果たす。数百の異なるｓｎｏＲＮＡがあり、これは一般に２つの主要なクラスに分類される：ｂｏｘＣ（ＲＵＧＡＵＧＡ）およびＤ（ＣＵＧＡ）モチーフ、ならびにボックスＨ（ＡＮＡＮＮＡ）モチーフおよびＡＣＡエレメント。ボックスＣ／Ｄ ｓｎｏＲＮＡの例としては、Ｕ３、Ｕ８、Ｕ１４、およびＵ２２ ｓｎｏＲＮＡが挙げられる。ボックスＨ／ＡＣＡ ＲＮＡの例としてはｓｎＲ３０およびテロメラーゼのＲＮＡサブユニットが挙げられる。
【００６４】
用語「スプライス部位選択」は、プレｍＲＮＡ分子においていくつかの潜在的な５’または３’スプライス部位のうちの１つを使用することの、細胞による決定を意味することが意図される。
【００６５】
用語「ＳＲタンパク質」は、セリン−アルギニン（ＳＲ）ファミリーのスプライシング因子として公知のスプライスに重要であるタンパク質の任意のファミリーを意味することが意図される。これらのタンパク質は、ｍＲＮＡといくつかの他のタンパク質因子との間の架橋として機能する。
【００６６】
用語「実質的に同一な」は、参照される核酸配列に、少なくとも５０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、および最も好ましくは９５％の同一性を示す核酸を意味することが意図される。比較配列の長さは一般に、少なくとも８〜１００ヌクレオチド、より好ましくは１０〜５０ヌクレオチド、および最も好ましくは１０〜２５ヌクレオチドである。
【００６７】
配列同一性は典型的に、そこに特定されるデフォルトパラメーターを備える配列解析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group, Wisconsin Biotechnology Center、1710, University Avenue, Madison, WI53705の配列ソフトウェアパッケージ）を使用して測定される。このソフトウェアプログラムは、種々の置換、欠失、および他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることによって類似の配列を適合する。
【００６８】
本発明の処方物は、水性キャリアのような生理学的におよび薬学的に受容されるキャリア中にオリゴヌクレオチドを含む。従って、本発明における使用のための処方物は、経口投与、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、および動脈内投与を含む非経口投与、ならびに局所投与（すなわち、嚢胞性線維症に罹患される患者の肺に呼吸に適する粒子のエアロゾル化処方物の投与）が挙げられるが、これらに制限されない。処方物は、単位投薬量形態において簡便に示され得、および当該分野において周知の任意の方法によって調製され得る。任意の所与の場合において投与の最も適切な経路は、被験体、処置される症状の性質および重篤度、ならびに使用される特定の活性な化合物に依存し得る。
【００６９】
本発明の他の特徴および特徴は、その好ましい実施態様の以下の記載から、および請求の範囲から明白である。
【００７０】
本明細書中の全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
発明の詳細な記載
本発明によれば、スプライス部位選択を干渉するおよび影響するための新規な方法が提供される。スプライス部位選択を調節するまたは干渉する能力は、オルタナティブなスプライシングを研究するためのツールとしてのみでなく、オルタナティブなスプライシングが疾患の病因と関連されるガンのような疾患のための治療剤としてもまた有用である。
【００７１】
一般に、本発明は、タンパク質結合部位伸張およびスプライス部位の上流の（すなわち、エクソンを先行する５’スプライス部位における）配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが、このスプライス部位でのスプライシングをブロックし得るという発見に基づく。さらに、ｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２についての結合部位を含有するオリゴは、長いイントロンの除去を促進するような、あるいは、オルタナティブなスプライス部位の使用に影響をおよぼすような、イントロンおよびプレｍＲＮＡを再モデリングを行う手段となりうる。これらの方法は、異なるタンパク質イソ型の機能を研究するため、異常なスプライス部位の使用を防止するため、および、オルタナティブなプレｍＲＮＡスプライシングを再プログラムするための手段となりうる。
オリゴヌクレオチド
本発明は、スプライス部位選択を干渉するためのオリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。オリゴヌクレオチドは一般に２つの異なる領域：（i）標的されるプレｍＲＮＡの領域に相補的である核酸配列エレメント、および（ii）１本鎖または２本鎖核酸分子に結合するタンパク質により認識されるタンパク質結合部位配列エレメントを含む伸張、から構成される。この方法において、オリゴヌクレオチドは、タンパク質またはタンパク質／核酸複合体の結合を、スプライス部位の近傍に指向し得る。オリゴヌクレオチドはまた、スプライス部位に対するスプライシング因子の結合をブロックし、そしてこの様式においてスプライシングを阻害するように作用し得る。
【００７２】
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして任意の修飾を含む。このような修飾は、オリゴヌクレオチドを、改善された安定性、エキソ−およびエンドヌクレアーゼによる分解に対する耐性、または細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を含む多様な方法において改善し得る。修飾されたオリゴヌクレオチドの例としては、メチルホスホネート、メチルホスホノチオエート、ホスホロモルホリデート、ホスホロピペラジデート、およびホスホロアミデートのようなリン酸骨格への修飾を包含する。１つの例において、ヌクレオチド内を結合するリン酸残基のひとつおきが、記載されるように修飾され得る。別の制限されない例において、各オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの少なくとも１つ、または全てが２’低級アルキル部分（例えば、メチル、エチル、エテニル、プロピル、１−プロペニル、２−プロペニル、およびイソプロペニルのような、Ｃ１〜Ｃ４の、鎖状または分岐状の、飽和化または不飽和のアルキル）を含むオリゴヌクレオチドである。修飾されたオリゴヌクレオチドはまた、モルホリノ骨格またはペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格のような修飾された骨格を含み得、ここではデオキシリボースリン酸骨格がペプチドオリゴマーによって置き換えられている（米国特許第5,142,047号;同第5,185,444号;同第5,539,082号;同第5,977,296号;同第6,316,595号;同第5,719,262号;同第5,766,855号;同第5,714,331号;同第5,705,333号;同第5,034,506号;および国際特許第WO92/20703号を参照のこと）。
【００７３】
本明細書中に記載されるさらなる修飾としては、少なくとも１つの糖部分の修飾が挙げられる。修飾された糖部分の例としては、2’-O-メチルおよび2’-O-メトキシエチル基が挙げられるがこれらに制限されない。キメラオリゴヌクレオチド、または化学的性質（例えば、2’-O-メチルホスホロチオエート）の混合物を含有するオリゴヌクレオチドがまた包含される。また包含されるのは、いわゆるＣｐＧ効果を減少するために５’−メチルシチジンで置き換えられる、グアノシンに対して５’のシチジンを伴うオリゴヌクレオチドである。
【００７４】
オリゴヌクレオチドの相補的な部分は、標的されるプレｍＲＮＡの領域に実質的に相補的である配列を含む。オリゴヌクレオチドのこの部分はＲＮＡまたはその修飾物（例えば、2’-O-メチルホスホロチオエート、2’-O-メトキシエチルホスホロチオエート、モルホリノ、およびＰＮＡ骨格）であることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、標的されるプレｍＲＮＡの領域におけるヌクレオチドに対して、少なくとも７０％相補的であり、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは９０％、および最も好ましくは９５％相補性を示すものである。一般に、オリゴヌクレオチドはこの相補的な部分を介して、スプライス部位の上流の少なくとも８塩基対長の領域に指向される。この領域は、好ましくはスプライス部位の上流の１〜４６塩基対で開始し、より好ましくは上流の１６〜３６塩基対、および最も好ましくはスプライス部位の上流の２０〜２６塩基対で開始する。スプライス部位は任意の所与のイントロン／エクソン境界の５’または３’スプライス部位であり得；５’スプライス部位は好ましい標的である。
【００７５】
オリゴヌクレオチドの第２の部分は１本鎖核酸分子を結合し得るタンパク質についての結合部位を含む伸張である。この伸張は、１本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または任意のその修飾物（例えば、2’-O-メチルホスホロチオエート、2’-O-メトキシエチルホスホロチオエート、モルホリノ、およびＰＮＡ骨格）であり得る。タンパク質結合部位配列エレメントは、任意の当該分野において公知の１本鎖または２本鎖核酸結合タンパク質から選択されるタンパク質を結合する。このようなタンパク質の多くの例があり、このいくつかとしては、タンパク質のＳＲファミリー、ｈｎＲＮＰタンパク質、およびＵ２ＡＦおよびＴＡＲタンパク質のようなＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。伸張が特定のタンパク質を結合する能力は、オリゴヌクレオチドの放射活性に標識された形態を使用する、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）のような標準的なタンパク質−核酸結合アッセイによって決定され得る。
【００７６】
さらに、伸張は、任意の公知のｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、または他の小さなＲＮＡのＲＮＡ配列を包含し得、これはタンパク質と相互作用し、そしてＲＮＡ／タンパク質複合体を形成することが知られる。制限されない例としては、Ｕ１〜Ｕ６、Ｕ８、Ｕ１４、Ｕ２２、ｓｎＲ３０、５ＳＲＮＡ、およびテロメアーゼのＲＮＡサブユニットが挙げられる。この方法において、伸張は、スプライス部位の上流の配列へのＲＮＰの結合を指向し、これは次いでスプライシングを干渉する。
【００７７】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの修飾された形態の合成のための方法は、生化学、酵素学、および化学の手段を使用する当業者に周知である。例えば、１つの好ましい合成の方法は、以下の米国特許において記載される固相合成であり、それぞれは本明細書中に参考として援用される：米国特許第5,539,082号;同第5,373,053号;同第5,258,454号;同第4,507,230号;および同第4,631,211号。
【００７８】
タンパク質を結合するカスタムメイドのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、Dharmacon Research Inc.(Lafayette,CO,USA)から購入された。オリゴＵＡまたはＵＢの上流の３’半分は、それぞれ、ラムダインサートＡまたはＢの５’末端、５’スプライス部位から４２ヌクレオチド下流でのイントロン配列に相補的である。これらのオリゴは、ＣＥ１ａエレメント配列を５’末端部分にて有する。他方、オリゴＵＯＡおよびＵＯＢは、同じ相補的配列を含むが、ＣＥ１ａエレメントは、３’末端に位置される。下流のオリゴＤａおよびＤｂは、それぞれアデノウイルスエクソンＬ２の上流の２０ヌクレオチドから６７ヌクレオチドに、およびＢｃｌ−Ｘエクソンの上流の１２２ヌクレオチドにそれぞれ相補的である。これらのオリゴは、それらの３’末端部分においてＣＥ１ａエレメント配列を含む。上流のオリゴＵＢ１は、インサートＢ、エクソンの５’スプライス部位の下流の４８９ヌクレオチド、における２０ヌクレオチド領域に相補的であり、およびその５’末端部分においてＣＥ１ａエレメントを含む。オリゴＵＢ２は、３’末端部分においてＣＥ１ａエレメントを有し、および５’スプライス部位から下流の５５９ヌクレオチドであるインサートＢにおける配列に相補的である２０ヌクレオチドを保有する。オリゴＵＢｎは、オリゴＵＢとその少なくとも１９ヌクレオチドを共有するが、非ＡＢＳの２５ヌクレオチド長の尾部をその５’末端にて有する。オリゴＵＳＴは、ＲＮＡ５３における遠位の５’スプライス部位と近位の５’スプライスとの間のイントロン配列に相補的な２０ヌクレオチドを、３’末端にて有するが、このオリゴの５’部分はＣＥ１ａエレメントを含む。オリゴＤＳＴは、アデノウイルス３’スプライス部位の３’スプライス部位の上流の１２５ヌクレオチドをハイブリダイズし、そしてＣＥ１ａエレメントを保有する。スプライシングにおいて使用される全てのオリゴの配列は表２において示される。表２において、相補的な配列は下線され、一方ＣＥ１ａエレメントは太字である。ＵＢおよびＵｓｎの非ＡＢＳ伸張は小文字において示される。
【００７９】
スプライスされた産物のＲＴ−ＰＣＲ増幅のために使用されるＤＮＡプライマーは、２０ヌクレオチド長のＥ−ＡｄおよびＢｃｌＸ３であり、これはそれぞれ、第２のエクソンとしてアデノウイルスまたはＢｃｌ−Ｘを保有する産物のＲＴ工程およびＰＣＲ増幅のための下流のプライマーとして使用された。Ｅ−Ａｄ（5’-GAGTTTGTCCTCAACCGCGA-3’（配列番号１５）は、アデノウイルスエクソンＬ２の５’末端に相補的である。ＢｃｌＸ３（5’-TCGGCTGCTGCATTGTTCCC-3’（配列番号１６））は、Ｂｃｌ−Ｘエクソン３の５’末端の下流の２１ヌクレオチド領域に相補的である。全ての増幅における上流プライマーは、２１ヌクレオチド長のオリゴＴ３−５’（5’-GGGAACAAAAGCTGGGTACCG-3’（配列番号１７））であり、これはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから合成される全ての転写産物の５’末端領域にハイブリダイズする。
【００８０】
【表２】
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【００８１】
タンパク質の精製
本発明のオリゴヌクレオチドは、相補的な部分およびタンパク質結合部位伸張を含む。このタンパク質結合部位配列エレメントは、使用される細胞または細胞抽出物に存在することが知られるタンパク質の結合を指向し得る。さらに、タンパク質は細胞または細胞抽出物において見出されないタンパク質であり得、および外因的にスプライスされなくてはならない。この変化は、タンパク質がスプライス部位干渉が所望される場合にのみ添加され得るので、スプライス部位干渉のより大きな制御を可能にする。
【００８２】
本出願において、タンパク質はタンパク質産生および精製の当該分野において公知の方法を使用して精製される。このような方法の例としては、タンパク質の産生のための細菌または昆虫細胞（例えば、それぞれ、Ｅ．ＣｏｌｉおよびＳｆ９細胞）、およびインビトロ系における使用についての精製のためのアフィニティークロマトグラフィーの使用が挙げられる。共通の技術としては、ＧＳＴタンパク質精製、Ｈｉｓタグ化タンパク質精製、およびバキュロウイルスタンパク質産生および精製が挙げられ、これらの全ては当業者に公知の方法である。
【００８３】
近年の進歩は、哺乳動物培養物への、または哺乳動物への、直接的に精製されたタンパク質の送達についてなされた。これらの技術としては、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）の使用が挙げられ、これは目的のタンパク質に融合され得る。タンパク質形質導入ドメインは、細胞質および核膜の両方を横切る能力を有する小さなペプチドフラグメントであり、細胞への、タンパク質の直接的な導入を可能にする。タンパク質形質導入ドメインを含むタンパク質の例としては、ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質、ＨＳＶ ＶＰ２２タンパク質、ショウジョウバエAntennapediaホメオドメインタンパク質、およびポリリジンまたはポリアルギニンペプチドのような非常に塩基性のペプチドが挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、ＰＴＤは任意の上記のタンパク質または異種タンパク質の転移を促進することが示される任意のさらなるタンパク質のの短いセグメントである。例えば、ＴＡＴタンパク質の４７〜５７アミノ酸は、ＰＴＤタグをタンパク質に直接連結することによって、マウス細胞にフルオレセインおよびβ−ガラクトシダーゼを効率的に形質導入するために使用された。別の、市販される例において、ショウジョウバエantennapediaホメオドメインのＤＮＡ結合ドメインに対応する１６アミノ酸ペプチドが、生存細胞の細胞質および核にタンパク質を形質導入するために使用される（TransVector System,Qbiogene、Inc）。
【００８４】
本発明について、所望されるタンパク質は細菌発現ベクターを使用するＰＴＤに連結される。融合タンパク質は、可溶性または変性化条件のいずれかを使用して、細菌細胞から精製される。精製された融合タンパク質は、哺乳動物細胞株に添加されるか、またはインビボで動物に注入される。タンパク質形質導入は、濃度依存性的におこり、また５分間程度かかる。ＰＴＤ−タンパク質融合タンパク質を生成するためのさらなる方法は、所望される融合タンパク質のペプチド合成、または融合タンパク質の発現のために組換えベクターを使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトすることを包含する。次いで、融合タンパク質は一次トランスフェクトされた細胞から周囲の細胞に形質導入される。
細胞へのオリゴヌクレオチドの導入
多様な方法が、哺乳動物細胞へのオリゴヌクレオチドの、トランスフェクション、または導入に利用可能である。今日までに公知である最も効率的な送達系は、陽イオン脂質である。いくつかの市販のトランスフェクション試薬がまたある。これらとしては、例えば、TranslT-TKO（商標）（Mirus、カタログ番号MIR2150）、Transmessenger（Qiagen、カタログ番号301525）、およびOligofectamine（商標）（Invitrogen、カタログ番号MIR12252-011）が挙げられる。各トランスフェクション試薬についてのプロトコルは、製造業者から入手できる。
【００８５】
レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、または細胞について所望される向性を伴う他のウイルスベクターが、本発明の方法のための遺伝子導入送達系として使用され得る。この目的のために有用な多数のベクターが一般に知られる。
プラスミド
短いイントロンプレｍＲＮＡ基質７−Ａｄおよび７Ｂ−Ａｄは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを使用して、それぞれ、プラスミドｐ０１［７−Ａｄ−（−）］およびｐ４５．１［７Ｂ−Ａｄ（−）］から転写された。ｐ０１は、ｐ１０４．２［Ｃ３’（−／−）］から１８８ヌクレオチドのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを欠失し、続いてＫｌｅｎｏｗ酵素を使用した平滑末端形成により生成された。ｐ１０４．２（Blanchettle and Chabot (1999) EMBO J. 18:1939-1952）およびｐ４５．１の構築は、以前に記載されている。Ｂｃｌ−Ｘエクソン３の３’スプライス部位を含有する短いイントロンのプレｍＲＮＡは、ｐ２３２［７−ＢｃｌＸ（−）］およびｐ２０３［７Ｂ−ＢｃｌＸ（−）］から同様に作製された。ｐ２０３およびｐ２３２は、５１７ヌクレオチドのｐ４５．１およびｐ０１のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮａｅＩフラグメントを、それぞれ、ヒトＢｃｌ−Ｘプラスミドからの３４５ヌクレオチドのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩフラグメントで置き換えることによって生成された。
【００８６】
３つのλＤＮＡフラグメント、約１ｋｂ長は、長いイントロンを作製するためのスペーサーとして使用された。これらのフラグメントは、以下のように、中間体クローンｐＮＳＬ５．１およびｐＮＳＬ６．１から得られた。ｐＮＳＬ５．１およびｐＮＳＬ６．１は、２２６３塩基対長のＮｒｕＩ−ＳｃａＩ（ヌクレオチド１６４２３〜１８６８６）または３６５３塩基対長のＮｒｕＩ−ＳｃａＩ（ヌクレオチド２８０５２〜３１７０５）λＤＮＡフラグメントのいずれかを、逆方向に、それぞれ、Ｋ＋ベクター骨格のＥｃｏＲＶ部位に挿入することによって構築された。次いで、ｐＮＳＬ５．１はＢｓａＡ１およびＰｖｕＩＩを使用して消化されて、１０１５塩基対のフラグメント（インサートＡ）を作製するか、またはＮａｅＩおよびＨｉｎｃＩＩを使用して消化されて、１０３８塩基対のフラグメント（インサートＣ）を得た。ｐＮＳＬ６．１は、ＥｃｏＲＶおよびＳｓｐＩを使用して消化されて、９４３塩基対のフラグメントを得た（インサートＢ）。
【００８７】
ｐ１８９［７−ＡｄＡ（−．−）］は、ｐ４５の１４２塩基対のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、１０１５塩基対のλインサートＡで置き換えることにより得られた。ｐ１９０［７−ＡｄＡ（＋．＋）］を生成するために、同じフラグメントが中間体ｐ３６．２ＢＲＬのＥｃｏＲＶ部位にクローン化された。ｐ３６．２ＢＲＬの構築は、２６９塩基対のＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部分の欠失、続く２つの相補的なＢおよびＲオリゴから構成される１８塩基対のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩリンカー（ＢＲＬ）アダプターの挿入を包含した。オリゴＢ（5’-GATCCGGCCGATATCGCG-3’（配列番号３０））は、ＢａｍＨＩ部位に相補的な４ヌクレオチドの突出を有し、一方オリゴＲ（5’-AATCGCGATATCGGCCG-3’（配列番号３１））は、ＥｃｏＲＩ部位に相補的な４ヌクレオチドの突出を有する。ｐ１９１［７−ＡｄＡ（→．←）］は、ｐ１５３（Ｎａｓｉｍら、２００２）の１４２塩基対のＳｍａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、１０１５塩基対のインサートＡで置き換えることによって生成された。９４３塩基対のインサートＢまたは１０３８塩基対のインサートＣの取り込みは、それぞれ、ｐ１８６［７−ＡｄＢ（−．−）］、ｐ１８７［７−ＡｄＢ（＋．＋）］、ｐ１８８［７−ＡｄＢ（→．←）］、およびｐ１７４［７−ＡｄＣ（−．−）］、ｐ１７５［７−ＡｄＣ（＋．＋）］、ｐ１７６［７−ＡｄＣ（→．←）］を生じた。
【００８８】
ｐ２０５［７Ｂ−ＡｄＢ（−．−）］、およびｐ２０６［７Ｂ−ＡｄＡ（−．−）］は、それぞれ、ｐ４５．１のＥｃｏＲＶ部位に９４３塩基対のインサートＢまたは１０１５塩基対のインサートＡを取り込むことによって達成された。ｐ２０９［７Ｂ−ＡｄＢ（＋．＋）］およびｐ２１０［７Ｂ−ＡｄＡ（＋．＋）］は、２工程の戦略を介して得られた。第１の工程において、中間体プラスミドｐ２０２［７Ｂ−Ａｄ（＋．＋）ＢＲＬ］は、ｐ３６．２ＢＲＬの１０５塩基対のＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＳｍａＩフラグメントを、ｐ４５．１からの１５７ｂｐ ＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＥｃｏＲＶフラグメントで置き換えることによって構築された。ｐ２０９を作製するためにｐ１８７からの９９５塩基対のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントでのｐ２０２の５１塩基対のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの置き換え、または、ｐ２１０を得るためにｐ２０２のＥｃｏＲＶ部位おける１０１５塩基対のインサートＡの取り込みのいずれかがこれに続いた。
【００８９】
ｐ１９４［７−ＢｃｌＢ（−．−）］およびｐ１９８［７−ＢｃｌＢ（＋．＋）］は、ｐ１８６およびｐ１８７の１９５塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩフラグメントは、それぞれ、ｐＫ＋ｂｃｌｘ  ５’／３’短縮からの３８７塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩフラグメントで置き換えることによって構築された。他方、ｐ１９５［７−ＢｃｌＡ（−．−）］およびｐ１９９［７−ＢｃｌＡ（＋．＋）］は、ｐＫ＋ｂｃｌｘ  ５’／３’短縮の５７２塩基対のＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、それぞれ、ｐ１８９からの１１２６塩基対のＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、およびｐ１９０からの１１８４塩基対のＥｃｏＯ１０９Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントで置き換えることによって構築された。
【００９０】
ｐ２１１［７Ｂ−ＢｃｌＢ（−．−）］およびｐ２１２［７Ｂ−ＢｃｌＡ（−．−）］を構築するために、ｐ２０５およびｐ２０６における５１９塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮａｅＩフラグメントは、ｐＫ＋ｂｃｌｘ ５’／３’短縮からの２８８塩基対のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮａｅＩフラグメントで置き換えられた。対応するＡＢＳを含有するプラスミドｐ２１４［７Ｂ−ＢｃｌＢ（＋．＋）］およびｐ２１５［７Ｂ−ＢｃｌＡ（＋．＋）］は、以下のように構築された。ｐ２０３における１１７塩基対のＥｃｏＲＶ−ＳｐｈＩフラグメントは、ｐ２１４を得るためにｐ１９８の１１３６塩基対のＳｍａＩ−ＳｐｈＩフラグメントで置き換えられ、一方ｐ２１５の構築は、２つの工程において達成された。先ず、ｐ２０４の９２塩基対のＸｈｏＩ−ＳｍａＩ部分が、ｐ４５．１からの１４８塩基対のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントで置き換えられて、中間体ｐ２１３［７Ｂ−ＢｃｌＸ（＋／＋）ＢＲＬ］を作製した。次に、１０１５塩基対のインサートＡが、ｐ２１３のＥｃｏＲＶ部位にサブクローン化されて、ｐ２１５を生成した。
【００９１】
ｐ１８６およびｐ１８７からの９５３塩基対および９９５塩基対のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、それぞれ、交換されて、３’スプライス接合部位近くに単一のＡ１結合部位（ＡＢＳ）を含むｐ１８６．２［７−ＡｄＢ（−．＋）］、およびｐ１８６．３［７−ＡｄＢ（＋．−）］、５’スプライス接合部位近くに単一のＡＢＳを含有するプラスミドを作製した。同様に、ｐ１８９．２［７−ＡｄＡ（−．＋）］およびｐ１８９．３［７−ＡｄＡ（＋．−）］は、ｐ１８９の７６９塩基対のＥａｇｌ−ＢｓａＡ１フラグメントおよびｐ１９０の７９８塩基対のフラグメントを互いに交換することによって構築された。
転写およびスプライシングアッセイ
アデノウイルスエクソンＬ２を含有する構築物が、ＳｃａＩで線状化され、一方Ｂｃｌ−Ｘエクソン３を含有する構築物が、ＢｇｌＩを使用して線状化され、そしてインビトロ転写のための鋳型として使用された。一般に、最小に標識されたプレｍＲＮＡ基質は、以前に記載されるように、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで合成され、そしてゲル精製された。標識化は、定量化の目的のためのみに行われた。次いで、公知の量のプレｍＲＮＡが、標準的なスプライシング条件下、３０℃にて、ＨｅＬａ核抽出物中でインキュベートされた。次いで、ＲＮＡ材料がＰＣＡ抽出され、そしてエタノール沈殿された。スプライシングに対するタンパク質を結合するＲＮＡオリゴの効果を研究するために、プレｍＲＮＡ分子は、スプライシングの前に個々のオリゴまたはオリゴの混合物のいずれかとともに混合された。スプライシング後に得られたＲＮＡ種は定量化され、そして１μｌ当たり５〜１０ａｔｏｍｏｌｅの濃度に、滅菌水中に再懸濁された。次いで、この溶液の等価な量がＲＴ−ＰＣＲ増幅に供された。オルタナティブなｍＲＮＡスプライシングを解析するために、前記のとおりに均一に標識されたプレｍＲＮＡが合成され、そしてプロセスされた。
ＲＴ−ＰＣＲ
プレｍＲＮＡは、使用されるプレｍＲＮＡの量が正確に定量化され、そしてＰＣＡ抽出およびエタノール沈殿後まで続くように最小に標識された。多くの実験において、短いイントロンのプレｍＲＮＡは試験プレｍＲＮＡとともに同時インキュベートされ、異なるサンプル間の等価なプロセシングおよび負荷を保証した。いくつかの実験において、ＲＮＡコントロールは、ＲＴ−ＰＣＲ反応の前にのみ添加された。増幅プロトコルは、以前に記載されるように、調製済みのＲＴ−ＰＣＲビーズ（Amersham Pharmacia Biotech）を使用した。いくつかの実験において、増幅は、３２Ｐ−標識化ｄＣＴＰの存在下で行われた。増幅後の反応混合物は、ＲＮアーゼＡで処置され、そして産物は、そうでないと言及されない限り、５％非変性アクリルアミドゲル上に溶解された。ゲルは、エチジュームブロミドで染色され、ＵＶ光下で撮影され、そしてQuantityOneソフトウェア（Bio-Rad）を使用して定量された。増幅された産物が３２Ｐ標識される場合、産物はInstantimager（Canberra-Packard）において定量化され、次いでオートラジオフラフィーによりフィルムに露光された。
使用
本発明の方法は一般に、（１）オルタナティブなスプライシングによって作製される異なるタンパク質のイソ型の機能を取り組むために、（２）異常なスプライス部位の使用を防止するために、および（３）オルタナティブなプレｍＲＮＡスプライシングを再プログラムするために、使用される。
【００９２】
本発明の方法は、発達的におよび／または組織的に調節されるヒトまたは動物の遺伝子におけるスプライシングを試験するための、インビトロまたはインビボでのツールとして有用である。
【００９３】
本発明の方法はまた、所与のタンパク質の種々のイソ型の機能を試験するための道具として有用である。１つの例において、方法は、優性ネガティブな様式において挙動するタンパク質のイソ型を作製するために使用される。次いで、この優性ネガティブなタンパク質は、タンパク質の機能を阻害し得る。例えば、ヒトテロメラーゼ遺伝子産物のオルタナティブなイソ型の発現は、テロメラーゼポジティブ細胞におけるテロメラーゼの活性を阻害し得る。
【００９４】
本発明の方法はまた、異常なスプライシングを含む疾患の処置において、治療剤として有用である。このような疾患の例としては、サラセミア、血友病、網膜芽細胞腫、嚢胞性線維症、無アルブミン血症、レッシュ−ナイハン症候群が挙げられるがこれらに制限されない。表３は、CaceresおよびKornblihttによる近年の概論から採用され、オルタナティブなスプライシングを影響するエクソン点変異によって引き起こされる遺伝性の異常の例をまとめる（Trends in Genetics,18:186〜193,2002）。
【００９５】
【表３】
2005535318.tif 000005
【００９６】
上記の遺伝子疾患の処置のための本発明の治療的使用に加えて、本発明は、ガンの処置として使用され得る。オリゴヌクレオチドは、抗アポトーシスタンパク質の代わりにプロアポトーシスタンパク質をコードするｍＲＮＡイソ型の生成に対して、スプライス部位利用をシフトするために、およびそのようにして細胞死を促進するために、使用され得る。例えば、Ｆａｓ受容体プレｍＲＮＡにおけるエクソン６の包含は、アポトーシスエフェクターとして作用する膜結合形態を生成する。対照的に、エクソン６を省略することは、プログラム細胞死を阻害する可溶性の形態を生じる。同様に、Ｂｃｌ−ｘはオルタナティブにスプライスされてＢｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳを生成し、これはそれぞれ、アポトーシスを阻害および活性化する。類似の例が、Ｍｃｌ−１、Ｂｏｋ、ＣＣ３、およびカスパーゼ１、２、６、および７で実証されている。プレｍＲＮＡのオルタナティブなスプライシングは、これらの形態の生成に応答可能である。タンパク質結合部位伸張を保有するオリゴヌクレオチドで、抗アポトーシス形態の生成を担うスプライス部位を標的化することは、プロアポトーシス形態の生成にシフトすることを許容する。このアプローチは、細胞死を促進し、およびガン細胞を殺傷するために使用され得る。
【００９７】
あるいは、オリゴヌクレオチドは、ガンに関与されるタンパク質の種々の発ガン性にスプライスされた改変体の生成をブロックするために使用され得る。例えば、膠芽細胞腫におけるαエクソンの増加する省略は、リガンドについての高い親和性を伴う線維芽細胞増殖因子受容体を生成する。別の例において、ＢＩＮ１ ｍＲＮＡにおけるエクソンの不適切な包含は、いくつかの黒色腫サンプルにおいて腫瘍抑制活性の喪失を生じる。オルタナティブなスプライシングはまた、テロメラーゼポジティブ細胞において発現される場合、テロメラーゼ活性を阻害するヒトテロメアーゼｈＴＥＲＴの近年発見されたイソ型の場合のように、ほとんど活性でないか、またはさらに優性ネガティブな活性を示すガン原遺伝子のイソ型を生成し得た。他の例は、Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡにおける代替のＩＤＸエクソンの包含を促進して減少された発ガン活性を伴うｒａｓ発ガンタンパク質を生じる天然に存在する変異、および複雑なオルタナティブなスプライシングを受けて広範に多様な生物学的特性を伴うタンパク質を生じるｐ５３ホモログのｐ６３を包含する。本発明の方法は、ガンに関与されるこれらのおよび任意の他のタンパク質より発ガン性の形態の生成を阻害するために使用され得る。
【００９８】
本明細書に記載される方法および組成物についての別の潜在的な使用は、神経タンパク質の異なってスプライスされる形態の生成における不均衡と関連される多様な神経学的異常の処置についてである。このような異常の例としては、統合失調症、フロントテンポラーレ痴呆、および筋萎縮性側索硬化症が挙げられる。
【００９９】
神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）は、複数のイソ型として発現され得るタンパク質の特定の例であり、そして各イソ型の発現の相対的なレベルにおける変化は、統合失調症を含む神経学的異常と関連される。ＮＣＡＭはオルタナティブにスプライスされて、短いおよび長い形態（ＮＣＡＭ１４０およびＮＣＡＭ１８０）を生成する。ＮＣＡＭ１８０は、エクソン１８の特異的な包含から生じる。ＮＣＡＭ１８０は、神経細胞の分化（樹状突起形成）に必須である。それゆえ、本発明のオリゴヌクレオチドは、エクソン１８の包含を防止するために使用され得、従ってＮＣＡＭのイソ型の発現を調節し、そして潜在的に神経分化をブロックする。
【０１００】
本発明の方法はまた、ウイルス感染を制御するために有用である。例えば、ＨＩＶは４０個以上の異なるｍＲＮＡをオルタナティブなプレｍＲＮＡのスプライシングを介して生成する。正確なおよび効率的なスプライシングがＨＩＶ感染の最初の段階で重要である。それゆえ、ＨＩＶスプライス部位を標的化し、そして正確なおよび効率的なスプライス部位利用を防止することは、感染の進行を防止し得る。
【０１０１】
本発明は、上述で考察されたような異常なスプライシングによって引き起こされる異常で罹患された患者において遺伝子の発現を調節するための医薬の調製のために、上記された特徴を有するオリゴヌクレオチドの使用を提供する。本発明に従う医薬の製造において、オリゴヌクレオチドは、典型的に、特に受容されるキャリアとともに混合される。もちろん、キャリアは処方物中の任意の他の成分と適合性であるという意味において受容されなくてはならず、および患者に有害であってはならない。キャリアは、固体または液体であり得る。１つ以上のオリゴヌクレオチドが本発明の処方物中に取り込まれ得、これは成分を混合することから本質的になり、製薬学の任意の公知の技術によって調製され得、必要に応じて１つ以上の補助的な治療成分を含む。
【０１０２】
処方物において、オリゴヌクレオチドは、リポソームまたは微小結晶のような、脂質粒子または小胞中に含まれ得、これは非経口投与に適切であり得る。粒子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがそこに含まれる限り、単層または複層のような任意の適切な構造であり得る。Ｎ−［１−（２，３−ジオールエオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート、または「ＤＯＴＡＰ」のような、正に荷電された脂質は、このような粒子およびベシクルについてとくに好ましい。このような脂質粒子の調製は周知である。（例えば、米国特許第4,880,635号;同第4,906,477号;同第4,911,928号;同第4,917,951号;同第4,920,016号;および同第4,921,757号を参照のこと、これらの全ては本明細書に参考として援用される）。
【０１０３】
投与されるオリゴヌクレオチドの投薬量は、行われる特定の方法に依存し、そしてこれは被験体に投与される場合、疾患、被験体の症状、特定の処方物、および投与の経路に依存する。一般に0.005〜50 μM、またはより好ましくは0.02〜5 μMにおよぶオリゴヌクレオチドの細胞内濃度が所望される。ヒトのような被験体への処方について、毎日の投薬量は約0.001〜50mg/kg、より好ましくは0.01〜10mg/kg、および最も好ましくは0.1〜5mg/kgが用いられる。
【実施例１】
【０１０４】
オリゴヌクレオチド対タンパク質の結合を使用する、スプライス部位干渉の効果
スプライス部位選択を干渉するための、オリゴヌクレオチドの結合対指向されるタンパク質結合の相対的な能力を決定するために、インビトロスプライシングアッセイがＨｅＬａ細胞抽出物において開発された。このアッセイは、ｈｎＲＮＰ  Ａ１ エクソン７およびエクソン７Ｂから採用された拮抗する５’スプライス部位を含有するモデルプレｍＲＮＡ基質（以後「５５３またはＣ５’−／−プレｍＲＮＡ」という）を利用した。５５３プレｍＲＮＡは３２Ｐで放射活性に標識され、そして２時間、ＨｅＬａ核抽出物中でインキュベートされ、次いで全ＲＮＡが単離され、そしてアクリルアミド／尿素ゲル上で分画された。オリゴヌクレオチドは水中に再懸濁され、そして抽出物および標的プレｍＲＮＡを示された濃度で含有するスプライシング混合物に添加された。通常、プレｍＲＮＡは、エクソン７Ｂの内部の（近位の）５’スプライス部位に優先的にスプライスされた。しかし、近位の５’スプライス部位がいくらかブロックされる場合、エクソン７から遠位の部位が使用された。遠位のラリアート分子はプレｍＲＮＡの上位に移動し、一方近位のラリアート分子は、プレｍＲＮＡの下位に移動した。このアッセイは、所与のオリゴヌクレオチドのブロッキング能力を測定するために使用された。
【０１０５】
出願人は先ず、５’スプライス部位の上流の２６〜４６ヌクレオチドの配列に結合されるオリゴヌクレオチドは、５’スプライス部位を直接的に標的化するオリゴヌクレオチドほどは効率的にスプライシングを抑制しないことを決定した（図１、オリゴＡおよびオリゴＢを比較のこと）。オリゴヌクレオチドの配列は以下のようであった：Ａ：5’-UAC CUA CCA CUA CCA CCG-3’（配列番号３２）およびＢ：5’-CCU CCU CCG UUG UUA UAG-3’（配列番号３３）。オリゴヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅ誘導体であった。
【０１０６】
出願人はまた、５’スプライス部位の上流の２６と４６ヌクレオチドとの間の配列に、タンパク質の結合を標的化することは、５’スプライス部位の使用を減少するのに、この領域にオリゴヌクレオチドを標的するよりも効果的であったことを決定した（図１、レーン５）。この実験において、近位の５’スプライス部位の近傍において、バクテリオファージコートタンパク質、ＭＳ２についての結合部位を含むモデルプレｍＲＮＡは、精製ＧＳＴ−ＭＳ２の存在下、ＨｅＬａ核抽出物中でインキュベートされた。ＭＳ２コートタンパク質はその同起源の部位に非常に強い親和性を有した（Ｋｄ＝１ｎＭ）。重要なことに、タンパク質でプレｍＲＮＡの−２０領域を標的化することは、オリゴヌクレオチドで同じ領域を標的化するよりも効果的であり、おそらくタンパク質がＵ１  ｓｎＲＮＰによる５’スプライス部位認識を防止したからである。対照的に、オリゴヌクレオチドは、スプレオソームアセンブリの後期の段階でのみ阻害した。従って、近位の５’スプライス部位からの２０ヌクレオチドを結合する指向されるタンパク質は、遠位の５’スプライス部位に有利なシフトを導いた。
【実施例２】
【０１０７】
異なる位置でのタンパク質結合の効果
５’スプライス部位の近傍において、立体障害を介してその使用を干渉する目的でタンパク質の結合を標的化する効果がまた、試験された。このタイプのスプライシング制御のいくつかの天然の場合が存在するが、２つの拮抗する５’スプライス部位を含むプレｍＲＮＡを使用して、このような効果と関連されるパラメーターを確認することが意図された。ｈｎＲＮＰ Ａ１遺伝子に由来するＣ’５ −／−プレｍＲＮＡを使用して、近位の５’スプライス部位に近接するバクテリオファージＭＳ２コートタンパク質の結合を標的化する効果が試験された。非常に高親和性のＭＳ２結合部位が、近位の５’スプライス接合部位の上流または下流の種々の位置（−４６、−３７、−２６、−１７、＋１５、＋２３、および＋３１）に挿入され（図２Ａ）、そして得られるプレｍＲＮＡのインビトロスプライシングが、組換えＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質の存在下または不在下で補充されたＨｅＬａ抽出物において行われた。図２Ｂにおいて見られるように、近位の５’スプライス部位の上流の２６ヌクレオチドにＧＳＴ−ＭＳ２結合を配置することは、近位の５’スプライス部位の使用の減少および遠位の５’スプライス部位の使用の強力な増加を促進した（レーン３とレーン４とを比較のこと）。ＧＳＴ−ＭＳ２はＭＳ２結合部位がその相補的な配列に置き換えられた場合（図２Ｂ、レーン１とレーン２とを比較のこと）、またはＭＳ２結合部位が３０００倍まで結合を減少する単一の点変異を含んだ場合（図２Ｂ、レーン５とレーン６とを比較のこと）、５’スプライス部位利用を影響しなかった。種々の位置での効果の比較は、図２Ｃにおいて示され、ここでは遠位／近位の使用の相対的なレベルのＧＳＴ−ＭＳ２媒介性の変化がプロットされる。最も大きな効果は、ＭＳ２結合部位が５’スプライス接合部位の上流の２６および３７ヌクレオチドに配置された場合に観察された。５’スプライス接合部位から下流の類似の距離でのＭＳ２結合部位の挿入は、何の効果も有しなかった。従って、５’スプライス部位の近傍におけるＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質の結合は、その部位でのスプライシングを減少し得る。ＧＳＴ−ＭＳ２によるスプライシング干渉は、標的される５’スプライス部位の上流の４２〜１６ヌクレオチドを結合することがスプライス部位使用を影響し、一方結合がスプライス接合部位の下流の１７〜４２ヌクレオチドで生じた場合、本質的に何の効果も検出できなかったので、位置依存性である。ＭＳ２についての結合部位の周囲の局所的な構造は、ＧＳＴ−ＭＳ２の親和性を変化し得る。それゆえ、ＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質は、５’スプライス部位の上流を結合する因子の活性を、その使用を妨害するために、再現し得る。スプライセオソームがスプライス接合部から下流の類似の空間を占有するので、なぜ５’スプライス部位から下流の等価な位置でのＧＳＴ−ＭＳ２の結合がスプライス部位選択に対して何の効果も有しなかったのかは明らかでない。５’スプライス部位近くに結合するタンパク質の非対称性の影響は、スプライセオソームが構造的障害を扱う能力における本来の優先性を反映し得る。
【０１０８】
インビトロにおいて検出された干渉がまた、インビボでも観察されるか否かを確認するために、β−グロブリンＤＵＰ５．１レポータープラスミドが使用された。ＤＵＰ５．１における内部エクソン２は、その小さな大きさのために優先的に排除され、その包含レベルはＧＳＴ−ＭＳ２の同時発現の際に変化しなかった（図３Ｂ、レーン１〜２）。５’スプライス接合部位の２６ヌクレオチド上流のＭＳ２結合部位またはスペーサーエレメントの挿入は、中心エクソンの大きさを増加し、中心エクソンのほとんど完全な包含に導いた（図３Ｂ、レーン３および５）。ＧＳＴ−ＭＳ２発現プラスミドとの同時トランスフェクションは、ＤＵＰ５．１がＭＳ２結合部位を含んだ場合にのみ、エクソン２包含の頻度の減少を促進した（図３Ｂ、レーン６）。この結果は、５’スプライス部位の上流のタンパク質の結合を標的化することは、インビボでスプライスを干渉し得ることを示す。
【実施例３】
【０１０９】
インビトロにおけるスプライス部位干渉に対する、標的されるトランスのタンパク質結合の効果
出願人はまた、干渉を促進するためにタンパク質結合を標的化することは、結合部位がシス（すなわち、プレｍＲＮＡ自身）に存在することを必要としないことを決定した。実際、結合部位は、タンパク質結合部位および標的配列に相補的な部分を含むオリゴヌクレオチドを使用してトランスで提供される場合に有効であった。近位の５’スプライス部位の上流の−４から−２３のＣ５’−／−プレｍＲＮＡの部分に相補的な一連のアンチセンスオリゴ（図４Ａ）が設計された。Ｃ５−Ｍ４Ａ１オリゴは、ＤＮＡから作製される１６ヌクレオチド長のハイブリダイズしない５’伸張を含み、そしてｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２タンパク質（ＴＡＧＧＧＡ）についての１つの高い親和性の結合部位を保有する。Ｃ５−Ｍ４Ａ１Ｗは、至適なｈｎＲＮＰ Ａ１結合についての勝者ＲＮＡ配列を含む。２つのＧＧＧに対するＣＧＣ変異を保有するオリゴ（Ｃ５−Ｍ４Ａ１Ｍ）の変異されたバージョンが、コントロールとして使用された。未関連の１６ヌクレオチド長の尾部を保有するオリゴ（Ｃ５−Ｍ４ＣＴ）または尾部を欠損するオリゴ（Ｃ５−Ｍ４）がまた、コントロールとして使用された。全てのオリゴは、ＵＰ１タンパク質、ｈｎＲＮＰ Ａ１の短縮された誘導体による結合について試験された（図４Ｂ）。ネイティブなゲルにおける複雑な構成は、ＵＰ１はＣ５−Ｍ４Ａ１Ｗに最も良好に、続いてＣ５−Ｍ４Ａ１に結合したことを示した。変異されたＣ５−Ｍ４Ａ１Ｗは、ＵＰ１によって結合されず、コントロールオリゴＣ５−Ｍ４およびＣ５−Ｍ４ＣＴも結合されなかった。次にスプライシングアッセイが、これらのオリゴの干渉する能力を研究するために行われた。Ｃ５−Ｍ４オリゴのハイブリダイゼーションは、近位の５’スプライス部位の使用における減少を無効にするのに十分であり、スプライス部位選択は、近位優先から各５’スプライス部位のほとんど等価な使用にシフトした（図４Ｃ、レーン２〜４）。類似の効果が、Ｃ５−Ｍ４ＣＴおよびＣ５−Ｍ４Ａ１Ｍオリゴで得られた（図４Ｃ、それぞれ、レーン８〜１０および１４〜１６）。Ｃ５−Ｍ４、Ｃ５−Ｍ４ＣＴ、およびＣ５−Ｍ４Ａ１Ｍについて、近位産物に対する遠位産物の比率は、0.25〜1.3にシフトされた。従って、５’スプライス接合部位に比較して、−４位にて出現する核酸伸張の存在は、−４〜−２３位を覆う２重鎖よりも大きな阻害活性を提示しない。より強力なシフトがＣ５−Ｍ４Ａ１で得られた（図４Ｃ、レーン５〜７および図４Ｄ）。最も強力なシフトがＣ５−Ｍ４Ａ１Ｗオリゴで観察され、これは近位の５’スプライス部位使用の最も大きな減少、および遠位の５’スプライス部位使用の最も大きな増加を誘引した（図４Ｃ、レーン１１〜１３、および図４Ｄ）。この場合において得られたシフトの大きさは、Ｃ５−Ｍ４Ａ１Ｗオリゴの最も高い濃度にて３０倍であった。これらの結果は、Ａ１／Ａ２結合部位を保有する５’尾部がオリゴの干渉する能力をかなり増大し、拮抗する遠位の５’スプライス部位のより効率的な使用を導くことを示す。Ａ１結合尾部を保有する、干渉するオリゴの活性はまた、近位の５’スプライス部位（Ｃ５−５）に直接的に相補的なオリゴの活性と比較された。驚くべきことに、Ｃ５−Ｍ４Ａ１Ｗオリゴは、遠��の５’スプライス部位に対するシフトを誘引するにおいて、Ｃ５−５オリゴよりも効果的であった（図４Ｅ、レーン１２〜１６とレーン２〜６とを比較のこと）。最終的に、Ａ１をさらに上流に配置する効果が、エクソン７Ｂの５’スプライス部位の上流の−２６〜−４５ヌクレオチドをハイブリダイズするオリゴ（Ｃ５−Ｍ２６Ａ１）を使用することによって試験された。この領域と２重鎖を形成するのみのオリゴ（Ｃ５−Ｍ２６）に比較して、タンパク質が結合されるＣ５−Ｍ２６Ａ１オリゴは、５’スプライス部位選択に対して、Ｃ５−Ｍ４Ａ１よりも小さな影響を有した（図４Ｆ、レーン１１〜１３とレーン５〜７とを比較のこと）。従って、５’スプライス部位に比較されるＡ１の位置は、活性に重要である。
【実施例４】
【０１１０】
細胞における、タンパク質を結合するオリゴによるＢｃｌ−Ｘのオルタナティブなスプライシングの調節
いくつかの場合において、Ｂｃｌ−ｘプレｍＲＮＡは２重鎖形成オリゴによるスプライス部位調節についての標的であった。２つのタイプのオリゴヌクレオチドが使用された：Ｂｃｌ−ｘＬの近位の５’スプライス部位を直接的に調節するオリゴヌクレオチド（５’スプライス接合部位に比較して＋２〜−１６の位置）、他方は、同じ５’スプライス部位の上流の１６〜３５ヌクレオチドの位置に相補的であった。各オリゴはＢｃｌ−ｘＬスプライシングをブロックしたことが報告され、イソ型の相対的な量が、ほとんど排他的なＢｃｌ−ｘＬから優先的なＢｃｌ−ｘＳにシフトした。タンパク質を結合するオリゴの調節する効率を決定するために、一連の２’Ｏ−Ｍｅオリゴヌクレオチドが細胞中にトランスフェクトされた。使用されたオリゴは表１において列挙される。Ｘ−５はＢｃｌ−ｘＬのスプライス部位（＋７〜−１３）に相補的であり；Ｘ−Ｍ４は、ＢｃＬ−ｘＬ部位の上流の−４〜−２３領域に相補的である。他の２つのオリゴは、同じ相補的な領域を含み、そしてｈｎＲＮＰ Ａ１または変異されたバージョンについての２つの高い親和性の結合部位を保有する５’尾部を保有した（それぞれ、Ｘ−Ｍ４Ａ１ＷおよびＸ−Ｍ４Ａ１Ｍ）。図５Ａは、Ｂｃｌ−ｘプレｍＲＮＡのスプライシングマップを示し、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳ  ｍＲＮＡ生成を導くスプライシング事象を説明する。これらの２’Ｏ−ＭｅオリゴのＡ１結合能力が、ゲルシフトアッセイによって確認された（図５Ｂ）。最も良好なＵＰ１結合体は、Ｘ４−Ａ１Ｗであり（レーン７〜９）、一方Ｘ−Ｍ４Ａ１Ｗ、Ｘ−Ｍ４、およびＸ−５を使用して結合は何も検出されなかった。個々のオリゴのトランスフェクションは、前立腺ガン細胞株ＰＣ−３、結腸ガン細胞株ＨＣＴ１１６、および乳ガン細胞株ＭＣＦ−７において異なる濃度（２５、５０、および１００ｎＭ）にて三連で行われ、コントロールとしてオリゴフェクタミン単独での、または未関連のオリゴ（Ｃ−ＲＮＡ）でのトランスフェクションを使用した。トランスフェクションの２４時間後、ＲＮＡは抽出され、そしてＲＴ−ＰＣＲによって解析された、Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳ ｍＲＮＡの相対的な量における変化をモニターした。コントロールと比較して、Ｘ−５オリゴはＰＣ３、ＨＣＴ１１６、およびＭＣＦ−７細胞において試験された全ての濃度にてほとんど活性を有しなかった（図５Ｃ、レーン２；図５Ｄ、レーン３、および図５Ｅ、レーン３）。２重鎖を形成するＸ−Ｍ４オリゴは、全ての細胞株において中程度のシフト活性を示した（図５Ｃ、レーン３；図５Ｄ、レーン４、および図５Ｅ、レーン４）。Ｘ−Ｍ４Ａ１Ｗオリゴは、Ｂｃｌ−ｘＳ形態の産生に対してもっとも強力なシフトを誘引し、全ての細胞株においてＸ−Ｍ４で観察される効果に明らかに優れた効率をともなった（図５Ｃ、レーン４；図５Ｄ、レーン５、および図５Ｅ、レーン５）。シフトのこのレベルは、ＢＣｌ−ｘについて報告された中で最も強力であった。予期されたとおり、Ｘ−Ｍ４Ａ１Ｍオリゴは著しくほとんど効果的ではなかった（図５Ｃ、レーン５；図５Ｄ、レーン６、および図５Ｅ、レーン６）、従って、Ａ１／Ａ２結合が、オリゴを干渉する活性に重要であることを支��する。残余の活性は、Ａ１／Ａ２による低い親和性の結合を反映し得るか、または５’尾部がインビボでの本来の干渉活性を表し得ることを示し得る。
【０１１１】
Ｘ−Ｍ４Ａ１Ｗオリゴの活性におけるｈｎＲＮＰ  Ａ１／Ａ２タンパク質の役割を評価するために、ｈｎＲＮＰＡ１／Ａ２に対してｓｉＲＮＡを使用するＲＮＡ干渉実験が、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞において行われた（図６Ａ〜Ｂ）。ｓｉＲＮＡおよび干渉するＲＮＡオリゴが同時トランスフェクトされ、そして全ＲＮＡが２４時間後に抽出された。平行トランスフェクションが、９６時間継続され、その時間にタンパク質は抽出され、そしてウェスタンブロッティングによって分析された。Ａ１／Ａ２タンパク質のレベルは減少され、模擬処置された細胞において観察されたレベルの２５％未満を示した。Ｂｃｌ−ｘ発現レベルのＲＴ−ＰＣＲ解析は、Ｘ−Ｍ４Ａ１ＷオリゴがＨｅＬａ Ｓ３細胞においてＢｃｌ−ｘＳの産生に対してスプライシングをシフトしたことを示した（図６Ｂ、レーン１とレーン５とを比較のこと）。２重鎖を形成するＸ−Ｍ４オリゴは、ほとんど活性を有しなかった（図６Ｂ、レーン３）。顕著なことに、Ｘ−Ｍ４Ａ１Ｗオリゴの活性は細胞がＡ１／Ａ２に対してｓｉＲＮＡで同時トランスフェクトされた場合に損なわれ（図６Ｂ、レーン６）、ｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２タンパク質が、Ｘ−Ｍ４Ａ１Ｗオリゴのインビボ活性に必要とされることを示す。
【０１１２】
５’スプライス部位の近傍においてタンパク質を、直接的にまたはアンチセンスオリゴの使用を介してのいずれかで配置することは、スプライシングをこの部位にて減少する。この効果は、スプライス部位認識またはスプライセオソームアセンブリの干渉によって引き起こされることが推測される。この作用の機構を確認するために、オリゴヌクレオチド媒介性のＲＮアーゼＨ切断アッセイが行われた。このアッセイにおいて、標的される５’ヌクレオチド部位に相補的なＤＮＡオリゴは、ＲＮＡ／ＤＮＡ２重鎖のＲＮＡ部分を分解するＲＮアーゼＨとともにスプライシング混合物に添加される。保護時間０は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ結合の指標であり、一方３０℃でのインキュベーション後に観察された保護は、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ依存性のスプライセオソーム複合体が、５’スプライス部位上にアセンブリされたことを示す。保護アッセイは、エクソン７Ｂの５’スプライス部位に相補的なＤＮＡオリゴを使用して、Ｃ５−Ｍ２６ＳおよびＣ５’−／−プレｍＲＮＡに対して行われた（それぞれ、図７Ａおよび図７Ｂ）。ＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質または干渉するオリゴの不在下で、保護は、０時間にて観察され、そしてこの保護は３０℃でのインキュベーションの際に増加された（図７Ａおよび図７Ｂ、レーン１〜３）。この保護の大部分は、アッセイがＵ１  ｓｎＲＮＡの５’末端が以前に分解された抽出物中で行われた場合に保護が非常に減少されたので、Ｕ１ ｓｎＲＮＰ依存性であった（図７Ａ、レーン７〜９）。ＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質の添加は、０時間および３０℃でのインキュベーション後のより後の時点にて保護を減少し（図７Ａ、レーン４〜６）、Ｕ１ ｓｎＲＮＰとＵ１−ｓｎＲＮＰ依存性の複合体の結合が弱められたことを示唆する。Ｃ５−Ｍ４オリゴは０時間にて観察された保護に対してほとんど効果を有しなかったが、３０℃でのインキュベーション後の保護に対してより強力な効果を有したことが注目され（図７Ｂ、レーン４〜６）、オリゴがＵ１ ｓｎＲＮＰ依存性のスプライシング複合体のアセンブリを主に干渉したことを示す。対照的に、Ｃ５−Ｍ４Ａ１Ｗオリゴはほとんど完全に、初期および後期の保護を排除し（図７Ｂ、レーン７〜９）、このオリゴがＵ１ ｓｎＲＮＰの最初の結合を防止するという結論に一致する。
【０１１３】
従って、このアプローチがインビトロおよびインビボで効果的であることが示された。インビトロにおいて、タンパク質を結合するＲＮＡオリゴを用いて５’スプライス部位の使用をシフトすることは、ｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２タンパク質についてのいくつかの結合部位を含むオリゴを用いて最も良好に作用した。これらの部位は、２重鎖タンパク質から出現するべきであり、および５’スプライス部位認識を直接的に干渉するべきである。驚くべきことに、Ａ１／Ａ２結合部位を保有するタンパク質を結合するオリゴを用いて得られたスプライシングシフトは、５’スプライス部位自身に相補的なオリゴを用いて得られたシフトよりもなお重要であった。インビトロで、Ａ１／Ａ２についての結合部位を保有するタンパク質を結合する２’Ｏ−Ｍｅオリゴはまた、Ｂｃｌ−ｘプレｍＲＮＡに対して非常に活性であり、および５’スプライス部位に対して相補的なオリゴまたは５’スプライス部位の上流で２重鎖を形成するのみであるオリゴよりも活性において非常に優れた。同様に活性であったさらなる尾部は、ｍＢＢＰ／ＳＦ１またはＵ２ ｓｎＲＮＰによって結合され得る分岐部位領域を保有した。５’スプライス部位に直接的に相補的なオリゴに比較して尾部がつけられたオリゴのこのより優れた活性は、顕著である。５’スプライス部位がコンセンサスに適合するので、これらの結果は少なくとも部分的に、５’スプライス部位に相補的なオリゴが他のプレｍＲＮＡにおける５’スプライス部位にいくらか親和性を有する場合、それによって意図される標的についてのオリゴの効果的な濃度が減少されることが説明され得た。さらにこの場合、他の関連される５’スプライス部位へのこのオリゴのハイブリダイゼーションは、二次的効果を有し得る。実際、β−グロブリン  プレｍＲＮＡの５’スプライス部位に相補的なオリゴが、多くの遺伝子の発現を変化し得るが、この効果が、スプライスの変化を介してどの程度生じるのかは知られていない。従って、エクソン配列に相補的なオリゴの使用は、それらの作用の特異性を改善し得るが、５’スプライス部位に近いがこれを含まない２重鎖の形成は、それらが５’スプライス部位から遠位にあるのでほとんど活性でないべきである。本明細書中で、その領域における２重鎖の形成は、５’スプライス部位へのＵ１ ｓｎＲＮＰの最初の結合を防止しないが、後のＵ１依存性の複雑なアセンブリを減少することが示された。しかし、有効性は、ｈｎＲＮＰ  Ａ１／Ａ２タンパク質についての結合部位を構成する伸張を提供することによって、非常に増加され得る。このような尾部は、標的５’スプライス部位への最初の結合を減少する。
【０１１４】
これらの結果は、精製されたタンパク質の添加についての必要性を回避することにより、スプライス部位選択の干渉について、この方法のより一般的な適用を示した。さらに、この方法は、ＳＲファミリータンパク質、ｈｎＲＮＰタンパク質、Ｕ２ＡＦ、おおびＴＡＲタンパク質を含むがこれに制限されない、１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ結合タンパク質を含む、任意の多様なタンパク質についての結合部位を保有するオリゴヌクレオチドを用いて使用され得る。
【実施例５】
【０１１５】
高親和性のＡ１／Ａ２結合部位は、長いイントロンのスプライシングを刺激する
ｈｎＲＮＰ   Ａ／Ｂ結合部位（ＡＢＳ）の寄与を研究するための実験系のように、アデノウイルスＬ２エクソンと対合されたｈｎＲＮＰ Ａ１遺伝子のエクソン７またはエクソン７Ｂの部分を含有するモデルプレｍＲＮＡ（７Ａｄおよび７Ｂ−Ａｄ：図８Ａ）が使用された。ＨｅＬａ核抽出物において異なった期間短いイントロンを保有するこれらの２つのモデルプレｍＲＮＡの（それぞれ、８０ｐＭの濃度での）同時インキュベーションは、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって決定されるように、それらが類似の効率を伴ってスプライスされたことを示した（図８、レーン１〜６）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、広い範囲のインプットＲＮＡ濃度にわたって、インプットＲＮＡの量と増幅された産物の量との間で線形の関係を示す条件下で行われた（アッセイにおいて使用された量よりも１０倍少ないから少なくとも６倍多いまで）。スプライス効率に対するイントロンの長さの効果を試験するために、１０１５ヌクレオチド長のラムダフラグメント、インサートＡが、両方のモデルプレｍＲＮＡのイントロンに挿入された。これらのプレｍＲＮＡ（７−ＡｄＡおよび７Ｂ−ＡｄＡ）のインキュベーション後、ＲＴ−ＰＣＲアッセイがスプライシング産物を増幅するために行われた。短いイントロンの７−Ａｄおよび７Ｂ−ＡｄプレｍＲＮＡと比較して、長いイントロンのプレｍＲＮＡのスプライシング効率は約８倍減少された（図８Ｂ、レーン７〜１２、および添付のグラフ）。２つの異なるλ配列がまた、７−ＡｄプレｍＲＮＡの情況において試験された（それぞれ、９４３ヌクレオチドおよび１０３８ヌクレオチドインサートを伴う７−ＡｄＢおよび７−ＡｄＣプレｍＲＮＡ）。この実験において、短いイントロンの７Ｂ−Ａｄ  プレｍＲＮＡは、長いイントロンのプレｍＲＮＡのそれぞれと同時インキュベートされた。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、長いイントロン基質からのスプライスされた産物の生成がまた損なわれたことを示した（図８Ｃ、レーン２〜６）。従って、λ配列を伴って増加するイントロンの大きさは強力にスプライシング効率を減少する。
【０１１６】
高親和性のＡ／Ｂ結合部位（ＡＢＳ）が長いイントロンのスプライシングを刺激し得るか否かを決定するために、ＡＢＳが長いイントロンのプレｍＲＮＡ基質中に挿入された。ＣＥ１ａエレメントに対応するＡＢＳ部位が、マウスｈｎＲＮＰ Ａ１ プレｍＲＮＡにおいて同定された。１つのＡＢＳは５’スプライス部位接合部位から２６ヌクレオチド下流に挿入され、そして第２のＡＢＳは３’スプライス接合部から８８ヌクレオチド下流に挿入された（図８Ａ）。７−ＡｄＡおよび７Ｂ−ＡｄＡプレｍＲＮＡにおけるＡＢＳの存在は、約４倍スプライシングを刺激した（図８Ｂ、レーン１３〜１８および添付のグラフ）。同様に、７−ＡｄＢおよび７−ＡｄＣプレｍＲＮＡにおけるＡＢＳの存在は、スプライシングを３〜５倍刺激した（図８Ｃ、レーン７〜１１）。逆転された反復が、５’スプライス部位選択アッセイにおいてＡＢＳの活性を模倣したことが以前に示され、Ａ１作用のループ形成モデルについての支持を提供する。ＡＢＳの代わりに２０ヌクレオチド長の逆転された反復の挿入はまた、インビトロで長いイントロンのスプライシングを刺激した（図８Ｃ、レーン１２〜１６）。逆転された反復を用いて得られた刺激のレベルは一般にＡＢＳを用いて得られたレベルに優れた。
【０１１７】
それゆえ、ＡＢＳは異なるイントロン配列および異なる５’スプライス部位を保有するプレｍＲＮＡのスプライシングを刺激する。ＡＢＳがまた異なる３’スプライス部位に対して作用するか否かを試験するために、３’スプライス部位およびＢｃｌ−Ｘエクソン３の部分を保有するプレｍＲＮＡ（７−ＢｃｌＡおよび７Ｂ−ＢｃｌＡ）が使用された。ＡＢＳの存在は、７−ＢｃｌＡのスプライシングを強力に刺激した（図８Ｄ、レーン１〜７における７／Ｂｃｌ産物とレーン８〜１２とを比較のこと）。類似の、しかしほとんど重要でない刺激が、７Ｂ−ＢｃｌＡプレｍＲＮＡで顕著であった。１つのみのＡＢＳを挿入する効果がまた試験された。顕著なことに、上流または下流の位置での１つのＡＢＳは、７−ＡｄＡプレｍＲＮＡについての刺激の中間のレベルを生じた（図９、レーン９〜１６）。対照的に、７−ＡｄＢ プレｍＲＮＡにおける上流の単一のＡＢＳは、下流の位置でのＡＢＳよりも活性であった。
【０１１８】
長いイントロンスプライシングの刺激におけるｈｎＲＮＰ Ａ／Ｂタンパク質についての役割を確認するために、Ａ１およびＡ２について高親和性の結合部位を示す脊椎動物テロメア配列（５ｎＭを下回る見かけのＫｄ）を保有する増加する量のＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＴＳ１０）がＨｅＬａ核抽出物に添加された。過剰なＴＳ１０は、５’スプライス部位選択アッセイにおいてＡＢＳの活性を無効にする。過剰なＴＳ１０の添加は同様に、７−ＡｄＢの長いイントロンにおけるＡＢＳの存在と関連されるスプライシングの刺激を無効にし、短いイントロンのプレｍＲＮＡのスプライシング効率を影響しなかった（図１０Ａ、レーン６〜１０）。顕著なことに、ＴＳ１０の添加はまた、ＡＢＳを欠損する長いイントロンのプレｍＲＮＡについてのスプライシングの基本レベルを減少し（レーン１〜５）、Ａ／Ｂタンパク質が、添加されたＡＢＳの不在下であっても、この長いイントロンのスプライシングに寄与することを示す。この結論は、組換えＧＳＴ−Ａ１タンパク質を使用して抽出物中のｈｎＲＮＰ  Ａ１のレベルを増加することによって確認された。Ａ１の添加は短いイントロンの７Ｂ−ＡｄプレｍＲＮＡのスプライシング効率を変化しなかったが、これは７−ＡｄＢプレｍＲＮＡのスプライシングを刺激した（図１０Ｂ、レーン１〜４）。組換えＡ１はまた、ＡＢＳを保有する長いイントロンのプレｍＲＮＡのスプライシング効率を刺激したが（図１０Ｂ、レーン５〜８）、Ａ１が長いイントロンプレｍＲＮＡに添加された場合、刺激はなんら観察されず、これはすでに、逆転された反復の使用を介して効率的にスプライスされた（レーン９〜１２）。ＧＳＴ部分がタンパク質２量体化を助成し得るので、Ｈｉｓタグ化Ａ１は、補充実験を行うために頼りになった。図１０Ｃにおいて示されるように、Ｈｉｓ−Ａ１は、長いイントロンのスプライシングを刺激する際に、ＧＳＴ−Ａ１と同じくらいの活性であった。これらの結果は、結合されるＡ１分子がイントロンの部分をループ形成して、遠位のスプライシングパートナー間のかかわり合いを刺激するという意見と一致する。
【実施例６】
【０１１９】
ＡＢＳを保有するタンパク質を結合するオリゴヌクレオチドは、長いイントロンスプライシングをインビトロで刺激する
結合されたｈｎＲＮＰ Ａ／Ｂタンパク質間の相互作用がＡＢＳの活性を担う場合、タンパク質を結合するオリゴヌクレオチドを使用して、ＡＢＳをトランスで提供することは、活性と適合性であり得る。このことを試験するために、イントロン領域に相補的な部分およびＡＢＳによって形成される非ハイブリダイズ部分を保有するＲＮＡオリゴヌクレオチド（図１１Ａ）が設計された。ＨｅＬａ抽出物において、７−ＡｄＡおよび７Ｂ−ＡｄＢプレｍＲＮＡがＲＮＡオリゴヌクレオチドの対：ＵＡおよびＤａ、それぞれ、ＡＢＳ、ならびに７−ＡｄＡおよび７Ｂ−ＡｄＡプレｍＲＮＡにおけるイントロンの上流部分および下流部分に相補的な配列を含む、とともにインキュベートされた。顕著なことに、オリゴヌクレオチドの混合物の添加（１６０ｎＭの各オリゴヌクレオチド）は、７／Ａｄおよび７Ｂ／Ａｄスプライシングを刺激した（それぞれ、図１１Ｂ、レーン１〜６およびレーン１０〜１２）。７−ＡｄＢプレｍＲＮＡに添加されたオリゴヌクレオチドの同じ混合物は、スプライシングを刺激しなかった（レーン８）。一般に、０．０８〜１６０ｎＭの間で変化するオリゴヌクレオチドの濃度は、スプライシングの刺激を観察するのに十分であった（プレｍＲＮＡに比較して１０〜２０００倍のモル過剰を示す）。刺激のレベルは、異なる実験間で２〜８倍の間で変化した。１６０ｎＭよりも上の濃度は通常、短いイントロンスプライシングを影響することなく、大きなイントロンのスプライシング効率の減少を促進し、おそらく、過剰のオリゴヌクレオチドによるｈｎＲＮＰ Ａ／Ｂタンパク質の滴定のためである。
【０１２０】
タンパク質を結合するオリゴヌクレオチドを使用して、上流または下流の位置にて単一のＡＢＳを提供する効果がまた試験された。７−ＡｄＡプレｍＲＮＡを使用して、上流のＵＡオリゴヌクレオチド単独は、両方のＡＢＳがトランスで提供される場合とほとんど同じくらい活性であったことが注目された（図１１Ｃ、レーン６とレーン２とを比較のこと、および定量のための添付のグラフを参照のこと）。対照的に、下流のＤａオリゴヌクレオチドはスプライシングを刺激しなかった（図１１Ｃ、レーン５）。顕著なことに、上流オリゴヌクレオチドにおけるＡ／Ｂ結合伸張の位置は、オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に位置されるＡＢＳ尾部が等しく効果的であるので、重要ではなかった（図１１Ｃ、レーン２および３）。プレｍＲＮＡに対する相補性を欠損する上流のオリゴヌクレオチドは、長いイントロンのスプライシングを刺激しないが（図１１Ｃ、レーン４）、このプレｍＲＮＡの７−ＡｄＢプレｍＲＮＡにハイブリダイズする同じオリゴヌクレオチドは、このプレｍＲＮＡのスプライシングを刺激した（図１１Ｄ、レーン２）。さらに、７−ＡｄＢにおいて同じ部位にハイブリダイズするが、ＡＢＳ伸張を保有しないオリゴヌクレオチドは、スプライシングを刺激せず（図１１Ｄ、レーン３を参照のこと）、５’スプライス部位の近くでの２重鎖形成はスプライシングを刺激しないことを実証する。
【０１２１】
タンパク質を結合するオリゴヌクレオチドによるスプライシングの刺激はまた、他のプレｍＲＮＡでも観察された。７Ｂ−ＢｃｌＡにおける場合、オリゴヌクレオチドＵＡおよびＤｂの対のみが活性であり（図１１Ｅ、レーン２〜６）、そして上流または下流の位置単独でハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドは、スプライシングを刺激しなかった（それぞれ、レーン７および９）。対照的に、オリゴヌクレオチド上流単独（ＵＢ）は、対と同じくらい効果的に７−ＢｃｌＢプレｍＲＮＡのスプライシングを刺激したが、下流のオリゴヌクレオチドＤｂは、刺激を提示しなかった（図１１Ｆ）。予測されるように、オリゴヌクレオチドＵＡおよびＤａは、７−ＡｄＡプレｍＲＮＡスプライシングを刺激し、７−ＢｃｌＢプレｍＲＮＡで不活性であった（図１１Ｆ、レーン８）。従って、アデノウイルスＬ２エクソンの３’スプライス部位を保有するプレｍＲＮＡのスプライシングは常に、上流のオリゴヌクレオチド単独によって刺激されたが、Ｂｃｌ−Ｘ３’スプライス部位を保有するプレｍＲＮＡにおけるこの挙動は、イントロン配列の性質とともに変化した。
【実施例７】
【０１２２】
Ａ１／Ａ２結合部位を保有するタンパク質を結合するオリゴヌクレオチドはまた、代替のスプライシングを促進し得る
イントロン高親和性ＡＢＳは、５’スプライス部位選択を影響し得るとして最初に特徴づけされた。タンパク質を結合するオリゴヌクレオチドがまた、５’スプライス部位利用におけるシフトを促進するか否かを試験するために、アデノウイルスエクソンＬ２の独特の３’スプライス部位についての拮抗においてエクソン７および７Ｂの５’スプライス部位を保有するモデルプレｍＲＮＡが使用された。類似のプレｍＲＮＡにおいて、両方の５’スプライス部位の下流のシス作用性ＡＢＳが、５’スプライス利用を、ほとんど排他的に近位（内部）から、ほとんど排他的に遠位（外部）にシフトし得ることが以前に示された。一方の５’スプライス部位の一方の下流に挿入される単一のＡＢＳはまた、より少ない程度であるが、遠位部位にスプライシングをシフトした。遠位の５’スプライス部位から下流のおよび３’スプライス部位から上流の領域に相補的なタンパク質を結合するＲＮＡオリゴヌクレオチドの混合物の添加はまた、この部位の使用に対して強力なシフトを促進した（図１２、レーン２〜６）。顕著なことに、上流オリゴヌクレオチド単独の添加はまた、対と同じくらい効果的であり（図１２、レーン７）、そして下流のオリゴヌクレオチド単独は活性を有しなかった（図１２、レーン９）。ＡＢＳ尾部を保有しない上流のオリゴヌクレオチドの添加は、スプライシングを刺激しなかった（図１２、レーン８）。同様に、ＡＢＳを含むが、プレｍＲＮＡにハイブリダイズし得ないオリゴヌクレオチドの混合物の添加は、５’スプライス部位使用を変化しなかった（図１２、レーン１０）。これらの結果は、オルタナティブなスプライシングにおけるＡＢＳの役割を確認し、さらに、Ａ／Ｂタンパク質が、遠位の５’スプライス部位の使用に好都合なようにプレｍＲＮＡの構造を再モデリングするという見解を支持する。
【０１２３】
タンパク質を結合するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、長いイントロンのスプライシングを刺激するためのみでなく、５’スプライス部位選択を調節するためにもまた使用され得る。相補的なオリゴヌクレオチドは、標的スプライス部位またはその中間の周辺領域を直接的に覆うことにより、スプライス部位使用を防止することを目的とする戦略において、ここしばらくの間使用されてきた。より近年になって、二官能性のＲＮＡまたはＰＮＡオリゴヌクレオチドが、ＳＲタンパク質を補充するために（Skordis, 2003）、または機能の直接的な活性化機能を提供するために（Cartegni, 2003）、それぞれ使用された。本明細書に記載されるアプローチは、オルタナティブなスプライシングを影響するための戦略の選択においてさらなる柔軟性を提供する。このアプローチは、目的がエクソン省略化を促進すること、または異常な５’スプライス部位の使用を防止することである状況に適用可能であり得る。これらの場合において、標的スプライス部位の各側にＡＢＳを提供することは、その使用を減少し得る。他方、オルタナティブなエクソンを近接するイントロンの大きさを増加することは、エクソン省略化に好都合であり（Bell, 1998）、そしてオルタナティブなエクソンの隣の長いイントロン中にＡＢＳを提供することは、エクソン包含を促進するべきである。これらのアプローチはまた、スプライスされたイソ型の機能を理解する目的を伴った、インビボでのオルタナティブなスプライシングの調節に対して適用され得る。ｈｎＲＮＰ Ａ／Ｂ結合されるオリゴヌクレオチドを使用するさらなる戦略はまた、ヒト疾患と関連される異常なスプライシングを影響または補正するために開発され得る。
【０１２４】
本発明は、その特定の実施態様に関連して記載されたが、これはさらなる改変が可能であることことが理解されるものである。そして、本出願は、一般に本発明の原理に従うものであれば、本発明に関連する技術分野内の公知のまたは習慣的な実施の範囲内にあるものであって、および上記の本質的な特徴に適用可能であって、および添付の請求の範囲内に従うものであれば、本発明の開示内容からのこのような逸脱を含む、本発明の任意の変化、使用、または適合をもその発明の範囲として意図されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】スプライス部位利用に対するオリゴヌクレオチド対タンパク質結合の効果を説明する。オリゴヌクレオチドまたは精製されたＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質が、インビトロスプライスアッセイに添加され、そして近位対遠位のスプライス部位利用が決定された。精製タンパク質を含有するサンプルについて、近位の５’スプライス部位の近傍におけるＭＳ２についての結合部位を含有するモデルプレｍＲＮＡが、ＧＳＴ−ＭＳ２の存在下または不在下、ＨｅＬａ細胞抽出物中でインキュベートされ、そしてスプライシングが上記のようにアッセイされた。
【図２】２Ａ〜Ｃは、５’スプライス部位近くのＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質結合による、スプライシング干渉を説明する。（Ａ）Ｃ５’−／−は、マウスｈｎＲＮＰ Ａ１エクソン７およびエクソン７Ｂの拮抗する５’スプライス部位を含有するモデルプレｍＲＮＡ基質である。Ｃ５’−／−プレｍＲＮＡは、エクソン７Ｂの内部（近位）５’スプライス部位に、優先的にスプライスされる。本発明者らは、近位の５’スプライス接合部位の上流または下流の種々の位置（−４６、−３７、−２６、−１７、＋１５、＋２３、および＋３１）にて、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質についてのステム−ループ結合部位を保有する誘導体を構築した。別のセットの誘導体は、同じ位置にて挿入されるＭＳ２結合部位の変異されたバージョンを含んだ（ＡＳ誘導体）。本発明者らはまた、ＭＳ２結合部位の変異されたバージョンを含む誘導体を構築した（Ｃ５−Ｍ２６ＳΔ）。（Ｂ）標識されたプレｍＲＮＡは、ＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質の存在下または不在下、ＨｅＬａ核抽出物中で２時間、３０℃にてインキュベートされた。抽出されたＲＮＡは１１％アクリルアミド変性ゲル上に分画された。プレｍＲＮＡおよびスプライシング中間体および産物の位置が示される。（Ｃ）スプライス部位選択に対する５’スプライス部位近くのＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質の配置の効果の編集。近位のスプライシングを超える遠位のスプライシングのレベルが、各転写産物について編集され、そしてＧＳＴ−ＭＳ２の存在または不在の間の差異が、算定され、ヒストグラム中にプロットされた。
【図３】３Ａ〜Ｂは、ヒト２９３細胞におけるＧＳＴ−ＭＳ２によるスプライシング干渉を説明する。（Ａ）ヒトβグロブリンミニ遺伝子（ＤＵＰ５．１）が、中心エクソンにおいて、５’スプライス部位の２６ヌクレオチド上流に、ＭＳ２結合部位または類似の大きさのスペーサーエレメントを挿入することによって改変された。各プレｍＲＮＡの構造が示され、ならびにスプライシングプロフィールおよび得られるｍＲＮＡは、産物Ａ＊、Ｂ＊、Ｃ＊、およびＤ＊として同定される。（Ｂ）グロブリン構築物が、２９３細胞においてトランスフェクション後、インビボで発現された。発現プラスミドｐＧＳＴ−ＭＳ２は、ＣＭＶプロモーターを介してＧＳＴ−ＭＳ２タンパク質を発現するようにプログラムされる。ＧＳＴ−ＭＳ２発現は、ＲＴ−ＰＣＲ解析によって確認された（示されず）。トランスフェクションの４８時間後、全ＲＮＡが抽出されそしてＲＴ−ＰＣＲアッセイが、エクソン１およびエクソン３に特異的なプライマーのセットを使用して行われた。増幅された産物の位置、およびｍＲＮＡ産物に比較されるそれらの同一性が示される。いくつかの分子量マーカーおよび増幅された産物の予測される大きさが示される。
【図４】４Ａ〜Ｆは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびタンパク質結合ＲＮＡオリゴヌクレオチドでのインビトロスプライシング干渉を説明する。（Ａ）Ｃ５’−／−プレｍＲＮＡにおけるアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの位置が示される。オリゴＣ５−５は、エクソン７Ｂの５’スプライス部位に相補的であり、一方Ｃ５−Ｍ４シリーズは、エクソン７Ｂの５’スプライス部位の上流−４〜−２３配列に相補的なオリゴである。オリゴＣ５−Ｍ４Ａ１はｈｎＲＮＰ Ａ１結合部位ＴＡＧＡＧＴを伴うＤＮＡ尾部を含み（下線される）、一方オリゴＣ５−Ｍ４Ａ１Ｗは、Ａ１についての２つのＲＮＡ結合部位を含む（下線される）。オリゴＣ５−Ｍ４ＣＴは、未関連の５’伸張を含み、一方オリゴＣ５−Ｍ４Ａ１Ｍは、変異されたＡ１結合部位を含む。Ｃ５−Ｍ２６は５’スプライス部位の上流２６〜４５ヌクレオチドに位置される配列に相補的である。Ｃ５−Ｍ２６Ａ１は、Ａ１結合部位を保有するさらなる５’ＤＮＡ尾部を含む（下線される）。（Ｂ）オリゴヌクレオチドに結合するＡ１のネイティブなゲル解析。組換えｈｎＲＮＰ Ａ１（ＧＳＴ−ＵＰ１）の短縮されたバージョンが、結合親和性を試験するために使用された。各標識されたオリゴが、増加する量のＧＳＴ−ＵＰ１（０．５および１μｇ）とともにインキュベートされた。ＴＳ１０オリゴは、９個の高い親和性のＡ１結合部位を含む６０ヌクレオチドのテロメアＤＮＡオリゴである。複合体が、５％アクリルアミドゲル中に分画された。遊離オリゴおよび複合体の位置が示される。（Ｃ）プレｍＲＮＡが、ＨｅＬａ抽出物中で２時間、増加する量のオリゴヌクレオチド（１２．５μｌ反応中、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５ｐｍｏｌ）の存在下でインキュベートされた。ＲＮＡは変性１１％アクリルアミドゲル上に分画された。プレｍＲＮＡ、スプライシング中間体、および産物の位置が示される。（Ｄ）パネルＣにおいて得られた結果に基づいて、近位および遠位スプライシングの相対的な使用が編集され、百分率の比率として表され、使用されたオリゴの量に比較してプロットされる。（Ｅ）標識されたプレｍＲＮＡは、増加する量のオリゴヌクレオチド（１２．５μｌ反応中、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５ｐｍｏｌ）の存在下、上記のようにインキュベートされた。ＲＮＡは抽出され、そして変性１１％アクリルアミドゲル上に分画された。プレｍＲＮＡ、スプライシング中間体、および産物の位置が示される。（Ｆ）標識されたプレｍＲＮＡは、増加する量のオリゴヌクレオチド（１２．５μｌ反応中、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５ｐｍｏｌ）とともにインキュベートされた。変性アクリルアミドゲル上に分画されたプレｍＲＮＡ、スプライシング中間体、および産物の位置が示される。
【図５】５Ａ〜Ｅは、インビボでの、タンパク質を結合するアンチセンスオリゴにより媒介されるスプライシング干渉を説明する。（Ａ）Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳ  ｍＲＮＡ産生を導くスプライス事象を示す、Ｂｃｌ−ｘ プレｍＲＮＡのスプライシングマップ。インビボで使用された２’Ｏ−Ｍｅオリゴの位置および配列が示される。（Ｂ）オリゴヌクレオチドに結合するＵＰ１のネイティブなゲル解析。ＴＳ１０ ＤＮＡオリゴ（６０ｎｔ）は９個のＡ１結合部位を含む。各標識されたオリゴは、組換えｈｎＲＮＰ Ａ１（ＧＳＴ−ＵＰ１）の短縮されたバージョンの増加する量とともにインキュベートされた。複合体は、５％アクリルアミドゲル中に分画された。遊離オリゴおよび複合体の位置が示される。パネルＣ、Ｄ、およびＥにおいて、ＰＣ−３、ＨＣＴ１１６、およびＭＣＦ−７細胞は、増加する量のオリゴでトランスフェクトされた。全ＲＮＡが４８時間後に抽出され、そしてＲＴ−ＰＣＲアッセイが、Ｂｃｌ−ｘＳおよびＢｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡイソ型の相対的な量を評価するために行われた。これらの増幅された産物の比率は各グラフに記載され、そして１００ｎＭ濃度にて得られたＲＴ−ＰＣＲの結果のみが、エチジュームブロミドで染色されたゲルにおいて示される。
【図６】６Ａ〜Ｂは、ＨｅＬａ細胞における干渉するアンチセンスオリゴの活性におけるｈｎＲＮＰ Ａ１／Ａ２の役割を説明する。トランスフェクションの１つのセットは、偽処理の、または１００ｎＭのＲＮＡオリゴＸ−Ｎ４およびＸ−Ｍ４Ａ１Ｗで処理されたＨｅＬａ細胞を含んだ。トランスフェクションの別のセットは、同じオリゴで行われたが、ヒトｈｎＲＮＰ Ａ１およびｈｎＲＮＰ Ａ２に特異的であるｓｉＲＮＡ分子と同時トランスフェクトされた。（Ａ）Ｂｃｌ−ｘＬ／Ｂｃｌ−ｘＳの増幅された産物の比率が、ヒストグラムにおいてプロットされた。これらの増幅された産物の比率は、ヒストグラム中に記載される；（Ｂ）全ＲＮＡが２４時間後に抽出され、そしてＲＴ−ＰＣＲアッセイがＢｃｌ−ｘ−特異的プライマーを使用して行われた。典型的な結果が、右側パネルにおいて示される。
【図７】７Ａ〜Ｂは、オリゴ指向性ＲＮアーゼＨタンパク質アッセイを使用して、近位の５’スプライス部位に結合するＵ１ ｓｎＲＮＰをモニタリングすることを説明する。（Ａ）Ｃ５−Ｍ２６ＳプレｍＲＮＡは、偽処理された抽出物、またはＵ１ ＲＮＡの５’末端に相補的なＤＮＡオリゴおよびＲＮアーゼを使用した切除によってＵ１を失った抽出物（Ｕ１Δ）中でインキュベートされた。スプライシング混合物は、示された時間（分において）インキュベートされ、そして保護アッセイがエクソン７Ｂの５’スプライス部位に相補的なＤＮＡオリゴを用いて行われた。（Ｂ）Ｃ５’−／−ＲＮＡは、示された時間（分において）、ＨｅＬａ核抽出物中で干渉するＲＮＡオリゴ（Ｃ５−Ｍ４またはＣ５−Ｍ４Ａ１Ｗ）とともにインキュベートされた。インキュベーション後、エクソン７Ｂの近位の５’スプライス部位に相補的なオリゴがＲＮアーゼＨとともに添加された。十分に保護されたプレｍＲＮＡおよびエクソン７Ｂの５’スプライス部位での切断に由来する分子の位置が示される。
【図８】８Ａ〜Ｄは、Ａ１／Ａ２についての高親和性の結合部位が、長いイントロンのインビトロでの除去を刺激することを示す。（Ａ）モデルプレｍＲＮＡの構造。７−Ａｄおよび７Ｂ−ＡｄプレｍＲＮＡにおける短いイントロンの大きさが、ヌクレオチド中に示される。λインサートＡ、Ｂ、およびＣの大きさはそれぞれ、１０１５、９４３、および１０３８ヌクレオチドである。これらのインサートは、配列UAGGGU/AまたはUAGAGU/Aを適合する推定のＡ／Ｂ結合部位を含まない。長いイントロン基質は、エクソン７またはエクソン７Ｂのいずれかを第１のエクソンとして、そしてアデノウイルスＬ２またはＢｃｌ−Ｘエクソンのいずれかを第２のエクソンとして含む。他のエレメントが挿入されない場合、プレｍＲＮＡは（−．−）バージョンに対応する。（＋．＋）バージョンは、５’スプライスの下流の２６ヌクレオチドおよび３’スプライス部位の上流の８８ヌクレオチドに挿入されたＡＢＳを含み、ここでは（→．←）バージョンは同じ位置での逆転された反復を含む。（Ｂ）７−Ａｄおよび７Ｂ−ＡＤプレｍＲＮＡは、示された時間（分において）、ＨｅＬａ核抽出物中で同時インキュベートされた（レーン１〜６）。さらなる混合物が、ＡＢＳを欠損する（レーン７〜１２）およびＡＢＳを含む（レーン１３〜１８）１０１５ヌクレオチド長のλ配列Ａ（７−ＡｄＡおよび７Ｂ−ＡｄＡ）を保有するプレｍＲＮＡを用いて調製された。各プレｍＲＮＡの最終濃度は８０ｐＭであった。ＲＮＡ抽出後、混合物からのｍＲＮＡ産物は、プライマーの共通のセット（アデノウイルス配列に相補的な逆方向プライマーおよびエクソン７および７Ｂ特異的配列の上流において見出されるＴ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターから下流のプラスミド配列に対応する正方向プライマー）を使用してＲＴ−ＰＣＲによって増幅された。グラフは、異なる時間インキュベートされたスプライシング反応から増幅されたスプライシング産物の量を示す。（Ｃ）λインサートＢまたはＣを保有する長いイントロン７−ＡｄプレｍＲＮＡのそれぞれ（７−ＡｄＢまたはＡ−ＡｄＣ；８０ｐＭ）が、短いイントロン７Ｂ−ＡｄプレｍＲＮＡ（８ｐＭ）とともにインキュベートされた。ＡＢＳを欠損する（−．−）または含む（＋．＋）、および逆転された反復を含む（→．←）バージョンが使用された。異なる時間のインキュベーション後、スプライスされた産物はプライマーの共通のセットを使用するＲＴ−ＰＣＲにより増幅された。同時インキュベートされた短いイントロンのコントロールは、７−ＡｄＣプレｍＲＮＡについてのみ示される。Ｍ＝分子量マーカー。（Ｄ）ＡＢＳを欠損する（−．−）または含有する（＋．＋）長いイントロンプレｍＲＮＡ ７ＢｃｌＡおよび７Ｂ−ＢｃｌＡ（それぞれ８０ｐＭ）は、示された時間、ＨｅＬａ抽出物中で同時インキュベートされた。Ｍ＝分子量マーカー。
【図９】長いイントロンスプライシングに対する単一のＡＢＳの活性を示す。ＡＢＳを欠損する（（−．−）、レーン１〜４）、２つのＡＢＳを含有する（（＋．＋）、レーン１３〜１６）、または下流（（−．＋）レーン５〜８）もしくは上流（（＋．−）、レーン９〜１２）のＡＢＳのいずれかのみを含む、７−ＡｄＡおよび７−ＡｄｂプレｍＲＮＡが、短いイントロン７Ｂ−ＡｄプレｍＲＮＡ（コントロール プレｍＲＮＡ）とともに混合され、そして示された時間、ＨｅＬａ細胞中でインキュベートされた。全ての基質からのｍＲＮＡが、３２Ｐ−ｄＣＴＰの存在下、共通のプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅された。短いイントロン７Ｂ−ＡｄコントロールプレｍＲＮＡは、７−ＡｄＡについてのみ示される。グラフは、異なるインキュベーション時間での、７−ＡｄＡ プレｍＲＮＡに由来する増幅された産物の量を示す。
【図１０】１０Ａ〜Ｃは、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質が長いイントロンをスプライシングすることを説明する。（Ａ）ｈｎＲＮＰ Ａ／Ｂタンパク質の除去は、長いイントロンスプライシングを影響する。テロメアオリゴヌクレオチドＴＳ１０の増加する量の存在下（それぞれ、０、８０、１６０、３２０、６４０ｎＭ）、９０分間、ＨｅＬａ抽出物中で、ＡＢＳ（−．−）を欠損する、またはＡＢＳ（＋．＋）を含有する長いイントロン基質７−ＡｄＢは、短いイントロン７Ｂ−ＡｄコントロールプレｍＲＮＡとともに同時インキュベートされた（それぞれ、８０および８ｐＭ）。（Ｂ）スプライシング混合物は、組換えＧＳＴ−Ａ１タンパク質の増加する量（０、０．８、１．６、および３．２μＭ）とともにインキュベートされた。逆転された反復を保有する７−ＡｄＢプレｍＲＮＡ（→．←）がまた使用された。（Ｃ）スプライシング混合物は、組換えＧＳＴ−Ａ１タンパク質またはＨｉｓタグ化Ａ１タンパク質（それぞれ１μｇ）とともにインキュベートされた。
【図１１】１１Ａ〜Ｆは、ＡＢＳを保有するタンパク質を結合するオリゴヌクレオチドは長いイントロンのスプライシングを刺激することを説明する：（Ａ）モデルの長いイントロンプレｍＲＮＡ、ならびにＲＮＡオリゴヌクレオチドの位置および構造の模式的な表示。（Ｂ）ＡＢＳを欠損する（−．−）またはＡＢＳを含有する（＋．＋）７−ＡｄＡプレｍＲＮＡは、ＵＡおよびＤａオリゴヌクレオチド（８および２０ｎＭの各オリゴヌクレオチド）の不在下（それぞれ、レーン１および４）または存在下（それぞれレーン２〜３、および５〜６）、ＨｅＬａ抽出物中でインキュベートされた。７−ＡｄＢプレｍＲＮＡ（−．−）はまた、ＵＡおよびＤａオリゴヌクレオチドの存在下でインキュベートされた（各２０ｎＭ）。レーン１〜８において、短いイントロン７Ｂ−ＡｄプレｍＲＮＡは、内部スプライシングコントロールとして、全ての７−Ａｄ長いイントロンプレｍＲＮＡとともに同時インキュベートされた。レーン９〜１３において、ＡＢＳを欠損する７Ｂ−ＡｄＡプレｍＲＮＡは、種々の濃度のＵＡおよびＤａオリゴヌクレオチド（０、８、８０および８００ｐＭの各オリゴヌクレオチド）またはＵＡオリゴ単独（８００ｐＭ）の存在下で、短いイントロン７−Ａｄとともに同時インキュベートされた。ＨｅＬａ抽出物中でのインキュベーションは６０分間であった。（Ｃ）７−ＡｄＡプレｍＲＮＡは、ＨｅＬａ核抽出物中で９０分間、３０℃にて、短いイントロン７Ｂ−ＡｄプレｍＲＮＡとともに同時インキュベートされた。各オリゴヌクレオチドは、１６０の濃度にて使用された。Ｃｉｓ（レーン７）は、７−ＡｄＡプレｍＲＮＡが２つのＡＢＳを含有する（＋．＋）バージョンであったことを示す。各レーンについての結果の定量は、ヒストグラムにおいて提供される。（Ｄ）７−ＡｄＢプレｍＲＮＡは、７Ｂ−ＡｄコントロールプレｍＲＮＡ、およびＵＢまたはＵＢｎオリゴヌクレオチド（それぞれ４０ｎＭ）のいずれかとともに同時インキュベートされた。ＵＢｎは非ＡＢＳ尾部を保有する。インキュベーションはＨｅＬａ抽出物中で６０分間であった。（Ｅ）７Ｂ−ＢｃｌＡは、１００倍少ない短いイントロン７−ＡｄコントロールプレｍＲＮＡ、ならびにＵＢおよびＤｂオリゴヌクレオチド混合物の増加する量（０、２、４、１０、２０、および４０ｎＭ）とともに、または４０ｎＭの種々のオリゴヌクレオチドの個々または混合物とともに、同時インキュベートされた。（Ｆ）７−ＢｃｌＢプレｍＲＮＡは、１００倍少ない短いイントロン７Ｂ−ＡｄプレｍＲＮＡとともに、６０分間、増加する量のＵＢおよびＤｂオリゴヌクレオチド（それぞれ、０、０．８、８、４０、および８０ｎＭ）、または８０ｎＭの各オリゴヌクレオチドの存在下、６０分間３０℃にて、同時インキュベートされた。Ｃｉｓ（レーン９）は、７ＢｃｌＢプレｍＲＮＡは２つのＡＢＳを伴う（＋．＋）バージョンであることを示す。ヒストグラムは、７−ＢｃｌＢプレｍＲＮＡを用いて得られるスプライシングの定量の結果を示す。
【図１２】ＡＢＳを保有するタンパク質を結合するオリゴヌクレオチドは、インビトロでオルタナティブなスプライシングを調節し得ることを説明する。マウスｈｎＲＮＰ Ａ１遺伝子からのエクソン７およびエクソン７Ｂの拮抗する５’スプライス部位を保有する均一に標識されたプレｍＲＮＡがＨｅＬａ核抽出物中で９０分間、３０℃にて、タンパク質を結合するオリゴヌクレオチドの不在下または存在下で、インキュベートされた。ＵＳＴおよびＤａオリゴヌクレオチドの増加する量が使用された（それぞれ、０、０．０８、０．８、８、８０、および１６０ｎＭ）。１６０ｎＭの各オリゴヌクレオチドはその残りについて使用された。プレｍＲＮＡの構造、およびオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの位置は上部に示される。スプライシング反応の産物は、１０％アクリルアミド／８Ｍ 尿素ゲル中で解明された。プレｍＲＮＡの上位に移動し、そして近位（７Ｂ）または遠位（７）の５’スプライス部位の使用に由来するラリアート産物の位置が示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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