(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ結合分子を同定するための方法であって、インシリコ方法によってＲＮＡフラグメントの構造を予測すること、好適な予測されたＲＮＡフラグメントを選択すること、該予測されたＲＮＡフラグメントに対応するｃＤＮＡフラグメントを合成すること、該ｃＤＮＡフラグメントをレポーターアッセイ遺伝子のすぐ上流に挿入すること、該レポーターアッセイ遺伝子は翻訳されるとシグナルを生産し、それによってレポーター構築物を形成する、そしてレポーター遺伝子アッセイを実施すること、該アッセイは、ＲＮＡ結合について試験すべき分子と、レポーター構築物のＲＮＡフラグメントの間の相互作用を監視する、の工程を含む方法に関する。さらに、本発明は、発明の方法における特異的ＲＮＡフラグメントの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ結合分子を同定する方法であって、
（ａ）ＲＮＡフラグメントの構造を予測すること、
（ｂ）工程（ａ）の好適な予測されたＲＮＡフラグメントを選択すること、ここで該ＲＮＡフラグメントは、少なくとも１つの個々のステムを含む、
（ｃ）工程（ｂ）のＲＮＡフラグメントに対応するＤＮＡフラグメントを合成すること、
（ｄ）工程（ｃ）のＤＮＡフラグメントを、レポーターアッセイ遺伝子のすぐ上流に挿入し、それによってレポーター構築物を形成すること、ここで該レポーターアッセイ遺伝子は翻訳されるとレポーターシグナルを生産する、および
（ｅ）レポーター遺伝子アッセイを実施すること、ここで該アッセイは、ＲＮＡ結合について試験すべき分子と、該レポーター構築物のＲＮＡフラグメントの間の相互作用を検出する、
ことを含む方法。
【請求項２】
該予測されたＲＮＡフラグメントの少なくとも１の個々のステムが、−５ｋｃａｌ／ｍｏｌより低い自由ギブスエネルギー示す、請求項１の方法。
【請求項３】
該予測されたＲＮＡフラグメントの少なくとも１の個々のステムが、−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌより低い自由ギブスエネルギー示す、請求項２の方法。
【請求項４】
該予測されたＲＮＡフラグメントの少なくとも１つの個々のステムが１００より少ないヌクレオチドを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
該予測されたＲＮＡフラグメントの少なくとも１つの個々のステムが、４より小さい塩基対あたりのヌクレオチドの数の間の比率を有する、請求項１の方法。
【請求項６】
該レポーター遺伝子アッセイが、生存細胞で実施される、請求項１の方法。
【請求項７】
請求項６の方法であって、該レポーター遺伝子アッセイが、
（ｉ）細胞を、レポーター構築物でトランスフェクトすること、
（ｉｉ）工程（ｉ）のトランスフェクトした細胞を培養すること、
（ｉｉｉ）ＲＮＡ結合について試験すべき分子を、培養された細胞に添加すること、および
（ｉｖ）該レポーターシグナルを監視すること、ここで該レポーターシグナルは、ＲＮＡ結合について試験すべき分子と、該ＲＮＡフラグメントの間の相互作用状態を指摘する、
を含む方法。
【請求項８】
該レポーターアッセイ遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子である、請求項１の方法。
【請求項９】
該ＲＮＡ結合について試験すべき分子が、１０ｎＭないし１０ｍＭの濃度で添加される、請求項１の方法。
【請求項１０】
該ＲＮＡフラグメントが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１の方法。
【請求項１１】
該ＲＮＡフラグメントが配列番号１９のヌクレオチド配列を含む請求項１の方法。
【請求項１２】
該ＲＮＡフラグメントが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、および配列番号１７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１の方法。
【請求項１３】
該ＲＮＡ結合について試験すべき分子が、非ペプチドまたは非ヌクレオチド分子である、請求項１の方法。
【請求項１４】
該レポーターアッセイ遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項７の方法。
【請求項１５】
該ＲＮＡ結合について試験すべき分子が、１０ｎＭないし１０ｍＭの濃度である、請求項７の方法。
【請求項１６】
該ＲＮＡフラグメントが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、および配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む請求項７の方法。
【請求項１７】
該ＲＮＡフラグメントが配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項７の方法。
【請求項１８】
該ＲＮＡフラグメントが、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、および配列番号１７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む請求項７の方法。
【請求項１９】
該ＲＮＡ結合について試験すべき分子が非ペプチドまたは非ヌクレオチド分子である、請求項７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ結合分子を同定するための方法、並びに該方法における特異的ＲＮＡ分子の使用（用途）に関する。
【０００２】
背景
ＲＮＡ（リボ核酸）は、以前は、特異的構造特性を有しない、線形情報を有する分子としてみられた。徐々に、ＲＮＡはヘアピンのような複雑かつ強い３次元構造を有し得ることが理解されてきた。さらに、いくつかの構造モチーフは、高親和性で種々の小分子を結合し得ることが示された。さらに、強い２次ＲＮＡ構造は翻訳効率を低下させることが示された（Werstruck, G. & Green, M. R.(1998) Science 282:296-298)。
【０００３】
最近、強い３次元内部構造でのその小分子結合特性のため、薬物標的としてＲＮＡを使用することが提唱された（Ecker DJ & Griffey RH (1999)Drug Discovery Today 4; 420-430)。さらに、興味のもたれるＲＮＡ構造に結合する分子を見出すための方法であって、（ａ）所定の配列からの１またはいくつかのＲＮＡ構造を、インシリコで予測すること、（ｂ）選択されたＲＮＡ構造を精製すること、および（ｃ）マススペクトロメトリーによって小分子への結合を監視すること、の工程に関係する方法が提示された（Hofstadler & Griffey, (2000)Curr. Opin. Drug Discovery & Development 3: 423-431）。しかし、この生化学的分析方法は、相互作用が生理学的環境、すなわち生存細胞または生物で研究されていない点で欠点を有する。従って、この方法によって見出された分子は、体で十分に適用可能でない、例えば膜透過性でないかもしれない。
【０００４】
よって、前記欠点を制限する、小分子とＲＮＡ構造の間の相互作用についてスクリーニングする方法の必要性が存在する。
本発明の目的は、前に示す必要性を満たす方法を提供することである。
【０００５】
発明の要約
この目的は、ＲＮＡ結合分子を同定するための方法であって、
（ａ）ＲＮＡフラグメントの構造を、好ましくはインシリコ方法によって予測すること、
（ｂ）工程（ａ）の、好適な予測されたＲＮＡフラグメントを選択すること、ここで該ＲＮＡフラグメントは少なくとも１つ個々のステムを含む、
（ｃ）工程（ｂ）のＲＮＡフラグメントに対応するＤＮＡフラグメントを合成すること、
（ｄ）レポーターアッセイ遺伝子のすぐ上流に、ステップ（ｂ）のＤＮＡフラグメントを挿入し、ここで該レポーターアッセイ遺伝子は翻訳されるとシグナルを生産し、それによってレポーター構築物を形成すること、そして
（ｅ）レポーター遺伝子アッセイを実施し、該アッセイは、ＲＮＡ結合について試験されるべき分子と、該レポーター構築物のＲＮＡフラグメントの間の相互作用を監視する、
の工程を含む方法によって履行される。
【０００６】
ここに、強いＲＮＡ構造によって生じる、翻訳阻害または潜在化効果を使用し、ＲＮＡ結合薬物分子をスクリーニングする。前記工程（ａ）に従うインシリコ予測は、好ましくは、「Zuker & Mathews」アルゴリズムまたは「van Batenburg」アルゴリズムによって実施される（引用文献参照）。さらに、同定は好ましくは、生存細胞において実施し、該物質が通常の膜透過性を有するという結果となり、これは薬理学的観点から有利である。さらに、個々のループについての自由ギブス（Gibbs）エネルギーは、−５ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも低い、好ましくは−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌよりも低いべきである。これらのパラメーターは、前記予測アルゴリズムによって計算できる。ステムループの最大強度は、もしすべてのヌクレオチドが塩基対形成に関係する、すなわち塩基対形成あたりのヌクレオチドの数の比率が、２であるならば取得される。よって、薬物ターゲティングのための、任意の所定の構造における塩基対形成あたりの、ヌクレオチドの比率は、できるだけ低い、理想的には４より低いべきである。ステム（配列）の長さは好ましくは、１００ヌクレオチドよりも短いべきである。具体的には、レポーターアッセイ遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子であり得、これによって容易に検出可能方法を提供する。
【０００７】
好ましい実施態様では、レポーター遺伝子アッセイは、
（ｆ）レポーター構築物で細胞をトランスフェクトする、
（ｇ）工程（ｆ）のトランスフェクトされた細胞を培養する、
（ｈ）ＲＮＡ結合について試験すべき分子を、該培養細胞に添加する、そして
（ｉ）該レポーターシグナルを監視し、該シグナルは、ＲＮＡ結合について試験すべき分子と該ＲＮＡフラグメントの間の相互作用状態を指摘する、
工程を含む。
【０００８】
さらに、本発明は、前記方法の使用によって小分子を同定するための、標的領域に対応する、ＲＮＡ配列配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１８のいずれか、より具体的には、５’ＵＴＲ領域に対応するＲＮＡ配列配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７のいずれかの使用に関する。
【０００９】
よって、本発明は、生存細胞または生存細胞の抽出物（インビトロ翻訳）において実施される方法を提供し、かつ該方法は、その性質のために、特異的ＲＮＡ構造ヘの小分子の多数の結合についてスクリーニングするために使用するのが急速である。加えて、この概念は、古典的薬物発見と比較してある数の利点を有し：ｉ）任意の遺伝子ファミリーから標的遺伝子を修飾することが可能である（タンパク質レベルで２、３のタンパク質クラスのみが「ターゲティング可能」と考えられる）、ｉｉ）該概念は、該ＲＮＡ標的が他の配列へ低い相同性を有する転写物の領域中に選択され得るから、選択性の問題を排除する、およびｉｉｉ）下方および上方調節が可能であり得る。
【００１０】
特記しない限り、ここに使用するすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載のものと類似または均等の方法および材料を、本発明の実施化または試験のため使用できるが、好適な方法および材料は、以下に記載する。すべての刊行物、特許出願、特許およびここに引用の他の引用文献は、引用によりここにそれらの全体を含める。用語法の抵触の場合は、本明細書が制御する。加えて、記載の材料および方法は、例示的のみであって、限定を意図しない。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載およびクレームから明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流の代わりに配列番号１９の配列を含むベクターを示す。
【図２】図２は、「ｍＬＰＬ構造」を有するｍＲＮＡに及ぼす特異的影響を有した化学物質を示す。
【図３】図３は、「ｍＬＰＬ構造」を有するｍＲＮＡに及ぼす特異的影響を有した化学物質を示す。
【００１２】
定義
「ＲＮＡに結合する分子」によって、ある種のＲＮＡ構造に結合し、それによって安定化する任意の分子を意味する。
「ＲＮＡフラグメント」によって、ＲＮＡ配列の任意のストレッチまたは部分を意味する。
「個々のステム（individual stem）」によって、ＲＮＡ分子中のある構造を意味し、ここに配列の少なくとも最初および最後のヌクレオチドが塩基対相互作用を介して相互作用することを意味する。例えば、いわゆるヘアピンは、個々のステムの例として供し得る。理想的には、個々のループ中のヌクレオチドの大部分は、塩基対形成に関係する。
【００１３】
「自由ギブス（Gibbs）エネルギー」によって、特定のステムが全構造のエネルギーに加えるエネルギーを意味する。
「インシリコ方法によって予測する」によって、分子のモデル化構造を達成するため、分子モデル化アルゴリズムのいくつかの種類を使用することを意味する。
「好適な予測された」ＲＮＡフラグメントによって、別の分子の結合のための良好な潜在性を有することを指摘する構造的特徴を示すＲＮＡフラグメントを意味する。
【００１４】
「レポーターアッセイ遺伝子のすぐ上流」によって、該レポーターアッセイ遺伝子の５’側の位置であって、該レポーターアッセイ遺伝子に近い位置、好ましくはいわゆる５’非翻訳領域を意味する。
「レポーターアッセイ」によって、レポーターアッセイ遺伝子転写物の、翻訳されるとまたは翻訳されないとシグナルを生産する任意のアッセイを意味する。
「相互作用状態を指摘する」によって、ＲＮＡ結合について試験されるべき分子とＲＮＡフラグメントの間の可能な結合を決定できることを意味する。
「非ペプチドおよび／または非ヌクレオチド分子」によって、大分子であるが、配列としてアミノ酸または核酸から完全には構成されていないものを意味する。
【００１５】
発明の開示
第１側面では、発明は、前記の、ＲＮＡ結合分子を同定するための方法を提供する。該方法の幾つかの工程を、いくつかのやり方で変化させ得る。しかし、発明方法の主な特徴は、（ａ）ＲＮＡ構造を、インシリコ予測法、例えばvan BatenbergまたはZurker & Mathewsの方法によって予測すること、（ｂ）該予測されたＲＮＡ構造に対応するｃＤＮＡを合成すること、および（ｃ）生存細胞についてのレポーターアッセイを使用し、潜在的ＲＮＡ結合分子と選択されたＲＮＡ構造の間の相互作用を監視すること、である。
【００１６】
本発明に従う薬物ターゲティングのための好適なＲＮＡ構造は、以下の特徴を示す：（ｉ）それは十分な安定性を有し、種々の配列状況(context)内でそのインテグリティを維持する、すなわちそれは高い安定性を有する、（ｉｉ）それは人工的合成を可能とするのに十分短い配列フラグメント内に含まれる、および（ｉｉｉ）それは独特である配列を表し、選択性供給物を防止する。原理の案内として、以下の基準が、好適なＲＮＡ配列を選択するために使用された：
（ａ）個々のステムは−５ｋｃａｌ／ｍｏｌより低い、好ましくは−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌより低い自由ギブスエネルギーを有するべきであり、
（ｂ）個々のステムは、４より小さい、塩基対あたりのヌクレオチドの数の間の比率を有するべきであり、
（ｃ）個々のステムは、もとの配列の４００までのヌクレオチドの状況(context)においてこれらの構造を維持することが予測されるべきであり、
（ｄ）ステム／構造は、１００ヌクレオチドよりも短い配列フラグメント内に含まれ、
（ｅ）１次構造（配列）は、例えばＢＬＡＳＴ相同性比較によって決定されるような、任意の他の既知の配列に７０％より小さい相同性を有するべきである。
【００１７】
スクリーニングの目的のため、ＲＮＡのストレッチは、定義されたサブドメインを構成するように選択される。ＲＮＡにおける機能的サブドメインは、より大きいＲＮＡから除去されそして単離されて研究されるとき、その生物学的／インシリコ形状を保持するフラグメントである。よって、当初分析においてＲＮＡの大部分をコンピューター援助予測のために使用し得る。２０塩基対より大きいかつ分岐（枝）を欠く折り畳みを、予測ソフトウェアで再分析する。もしそのような折り畳みがそのより大きい状況(context)でその構造を保持すると予測されるならば、それは好適な標的ＲＮＡ構造と考えられる。
【００１８】
具体的ｍＲＮＡ中の予測される構造に対応する定義された二本鎖ｃＤＮＡフラグメントを、典型的に２０−２００ヌクレオチド長で典型的に合成し得る。ｃＤＮＡを、定義される制限切断部位、例えばＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ等に対応する隣接する突出部分を有して合成する。簡便には、該二本鎖合成ｃＤＮＡを、好適なレポーターベクターに、好ましくはレポーター遺伝子の５’ＵＴＲ領域にライゲートし得る。そのようなベクターの１例は、ｐＧＬコントロール(Promega, USA)であることができ、これはレポーター遺伝子としてルシフェラーゼをコードする（インサートは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲートし得る）。原理的には、検出可能タンパク質をコードする任意の遺伝子は、この目的のため、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、アルカリフォスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ等のため原理的には利用し得る。よって該「ＲＮＡ構造」は該レポーター転写物の５’末端に含まれる。そのような構造に結合し、かつその翻訳に影響する小分子は、レポーター遺伝子発現のシフトを引き起こす。
【００１９】
プラスミド構築物を、実質的に任意の哺乳動物細胞型、例えばCaco-2、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３等にトランスフェクトできる。さらに、昆虫細胞または種々の菌株のコウボを使用することもまたもっともらしい。トランスフェクションは、いくつかの種々のプロトコル、例えばリン酸カルシウムで、リポソームで、またはエレクトロポレーション等での処理によって達成し得る。安定的細胞株は、このレポーターアッセイスクリーニングプロトコルのため有用であることができることがまた予測可能である。トランスフェクション後、細胞を多重ウェルプレート、普通は９６または３８４ウェルプレート中に配置することができる。接着後、種々の試験薬物を該ウェルに適用でき、定義された期間の曝露後（典型的に2-24時間）該レポーター遺伝子発現を、標準的手法を使用して評価できる。陽性ヒット、すなわちレポーター遺伝子の発現を有意に影響した化合物をまた、「ＲＮＡ構造インサート」を欠くプラスミド、すなわちコントロールベクターでトランスフェクトされた細胞でアッセイする。該「ＲＮＡ構造インサート」を含むレポーター遺伝子の発現を有意に調節し、一方該「ＲＮＡ構造インサート」を欠くレポーター遺伝子に影響を有しないする化合物は、「真のヒット」として考えられる。そのようなスクリーニング手法によって、規定されたＲＮＡ構造によって仲介される、特異的影響、すなわち活性化および阻害を有する化合物を、同定することが可能であることを、仮定し得る。
【００２０】
スクリーニング目的のため、適当な宿主細胞を、この発明に従うＲＮＡフラグメントの制御下のレポーター遺伝子を有するベクターで形質転換できる。レポーター遺伝子の発現を、既知の活性を有する剤（すなわち標準剤）または推定活性（すなわち「試験剤」または「候補剤」）の存在または不存在下で測定できる。試験剤の存在下のレポーター遺伝子の発現のレベルの変化を、標準剤によって影響されるものと比較する。このやり方では、活性剤を同定し、そしてこのアッセイでのそれらの相対的潜在力を実証する。
【００２１】
トランスフェクションアッセイは、有効な剤を同定するための特に有用なスクリーニングアッセイであることができる。トランスフェクションアッセイにおいて、遺伝子、たとえば好適なプロモーターに作動可能に連結されるレポーター遺伝子を含む核酸、またはその活性フラグメントを、望まれる細胞型内にトランスフェクトする。レポーター遺伝子発現の試験レベルを、候補剤の存在下でアッセイし、そして発現のコントロールレベルと比較する。有効な剤を、レポーター遺伝子発現のコントロールレベルと異なる発現の試験レベルを生じる剤として同定する。これは、該剤の不存在下で決定される発現のレベルである。細胞をトランスフェクトするための方法、および種々の簡便なレポーター遺伝子は、当業界で周知である（例えばGoeddel(ed), Methods Enzymol.,Vol. 185, San Diego: Academic Press, Inc. (1990)参照;またSambrook前掲参照）。
【００２２】
ここで使用するように、用語「レポーター遺伝子」は、単純な、高価でない方法または試薬を使用して同定できる遺伝子産物をコードする、かつ発明のＲＮＡフラグメントに作動可能に連結できる遺伝子、またはその活性フラグメントを意味する。レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子を使用し、発明のスクリーニングアッセイにおける転写活性を決定できる（例えばGoeddel (ed.), Methods Enzymol., Vol. 185, San Diego:Academic Press, Inc.(1990)参照;またSambrook前掲参照）。よって「レポーターシグナル」は、任意の種類の、前記レポーター遺伝子によって生産されるシグナルであって監視が可能であるものであり得る。
【００２３】
発明に従う細胞を培養するため、実施例セクションに記載の方法を使用し、並びに任意の他の簡便に使用される方法を使用し得る。
本発明にしたがって、強いＲＮＡ構造は、小分子に結合すると、転写阻害および潜在化の両方を引き起こすことが示された。これはＲＮＡが発展された３次元構造を採用し得るという事実のためである。もしこれらの構造が５’ＵＴＲ（５’非翻訳領域）に存在するならば、これらは転写を阻害し得る。通常は、これらの構造は、ヘリカーゼによって分解されるが、該３次元構造に結合しそしてさらに安定化させる分子が付加されると、ヘリカーゼはこれらの構造を分解できず、これは翻訳の阻害につながる。通常は、−３０ｋｃａｌ／ｍｏｌより小さい結合エネルギーは翻訳の完全な阻害を引き起こす。一方、増加された発現が、翻訳開始を安定化する、またはその一部へのそれが結合することによって大構造の全体の安定性を脱安定化する小分子によって、引き起こされ得ることを仮定し得る。よって、小分子を、翻訳に影響する薬物として使用し得る。
【００２４】
ＲＮＡの構造の最も強い型は、塩基対形成例えばヘアピンに起因する。ＲＮＡ（アプタマーの）中の小分子への結合部位はしばしば、不完全なヘアピン中のキャビティである。配列、二次構造および三次元構造に関連するＲＮＡウェブ資源上のリストは、Suehnel, J. (1997)Views of RNA on the World Wide Web. Trends in Genetics 13: 206-207中に見出すことができる。ｍＦＯＬＤおよびＳＴＡＲ（以下参照）は、所定のＲＮＡ配列からの強いヘアピンを、等しくよく予測し得る。よって、これらのヘアピンは、潜在的薬物標的をあらわし得る。
【００２５】
前記のように、本発明の1実施態様にしたがって、ＲＮＡ構造の分子モデル化を、Zuker & Mathews(例えばｍＦＯＬＤ）またはvan Batenberg(例えばＳＴＡＲ）のアルゴリズムのいずれかによって実施し得る。
該ｍＦＯＬＤアルゴリズム(D. H. Mathews, T.C. Amdre, J. Kim, D.H.Turner and M. Zuker(1998)An Updated Recursive Algorithem for RNA Secondary Structure Prediction with Improved Free Energy Parameters. American Chemical Society Symposium Sries 682:246-257; Zuker M. (2000)Calculating nucleic acid secondary structure. Current Opinion in Structural Biology 10:303-310)であって、これは最も広く使用されるシステムであるものは、最小自由エネルギーの状態についてのサーチに基づく。mfold3.1ソフトウェアは、最近隣（nearest neighbor）エネルギー則と呼ばれるものを使用する。すなわち、自由エネルギーを、塩基対によりもむしろループに割り当てる。これらはまた、ループに依存のエネルギー則と呼ばれた。
【００２６】
ＳＴＡＲ(http://wwwbio.leidenuniv.nl/〜Batenburg/STAR.html;Gultyaev A.P.,van Batenburg F.H.D.and Pleij C.W.A.(1995)The Computer Simulation of RNA Folding Pathways Using a Genetic Algorithem. J. Mol. Bipol. 250:37-51)は、ソフトウェア製品であって、これはいくつかのアルゴリズムに基づいて二次構造の予測を可能とするものである。Batenburg, Gultyaev & Pleij(J Theor Biol 1995:174:269-280)によって開発されたいわゆる「遺伝的アルゴリズム」は、最も適合な構造の段階的選択を使用する。遺伝的アルゴリズムシミュレーションは、ステム形成およびステム破壊の両方を含む。
【００２７】
さらに、ＲＮＡ結合について試験されるべき分子を、典型的には１０ｎＭないし１０ｍＭの濃度で添加する。簡便には、ほとんどの化合物スクリーニングライブラリーは、１００ないし７００Ｄａの分子範囲の試験分子を含む。
【００２８】
本発明の第２側面にしたがって、配列配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１８のいずれか、好ましくは配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７のいずれかを有するＲＮＡフラグメントを、前記方法においてＲＮＡフラグメントに結合する分子を同定するために使用する。これらの配列は標的領域および興味の持たれるＲＮＡフラグメントの５’ＵＴＲ領域、すなわち興味の持たれる構造特性を示すフラグメントに対応する。
【００２９】
本発明のこの側面で使用できるＲＮＡフラグメントの例は、例えば以下に列挙のものである。しかし、発明は、これらのフラグメントに限定されないが、これらのフラグメントの興味の持たれるステム構造／配列の組み合わせをまた、本発明にしたがって使用し得る。第１例として、Ｃ／ＥＢＰ−アルファのＲＮＡフラグメント(Gen Bank3受託番号ＮＭ００４３６４）（配列番号１および２）を開示し、これは糖尿病の指摘が示された。さらに、ＤＧＡＴ（アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロール−アセチルトランスフェラーゼ）(GenBank3受託番号ＮＭ０１２０７９）（指摘肥満）（配列番号３および４）、ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）(GenBank3受託番号Ｕ１３７１０）（指摘：糖尿病）（配列番号５および６）、ＦＡＢＰ−２（脂肪酸結合タンパク質２）(GenBank3受託番号Ｍ１８０７９）（指摘糖尿病）（配列番号７および８）、ＦＡＴＰ４（脂肪酸輸送体タンパク質４）(GenBank3受託番号ＡＦ０５５８９９）（指摘肥満）（配列番号９および１０）、レプチンレセプター（GenBank3受託番号ＮＭ００２３０３）（指摘肥満）（配列番号１１および１２）、ＭｙｏＤ（GenBank3受託番号ＮＭ００２４７８）（肥満／カヘキシー指摘）（配列番号１３および１４）、ＦＯＸＣ２（GenBank3受託番号ＮＭ  ００５２５１）（指摘肥満）（配列番号１５および１６）およびＳＲＥＢＰ−１ｃ（血清応答性エレメント結合タンパク質１ｃ）(GenBank3受託番号ＮＭ００４１７６）（指摘糖尿病／肥満）（配列番号１７および１８）はまた、本発明の一部である。具体的ＲＮＡフラグメントに関連する前記指摘は、例として考慮されるべきのみである。他の指摘はまた十分可能である。
【００３０】
なおさらなる、本発明の実施態様にしたがって、使用されたＲＮＡフラグメントは、マウスリポタンパク質リパーゼ転写物である。このフラグメントは、強い５’ＵＴＲ構造を示し、それはタンパク質の急速な回転を有し、そして商業的抗体は利用可能である。さらに、それは酵素活性を示し、そして血液血漿マーカー血漿マーカーである。ｍＬＰＬのためのＲＮＡ配列（配列番号１９）は、
【化１】2005506051.tif 000002
である（これは「試験アッセイ」に含まれるＲＮＡ配列である）。
本発明をここで例の目的で記載し、これは例示目的のみで含まれ、そしていかなる点でも限定として見るべきでない。
【００３１】
発明の例
実施例１
ヒトＦＯＸＣ２ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）（配列番号１５）を、インシリコ２次構造予測でのテンプレートとして使用した。van Batenberg et al.,(van Batenberg, J. Theor Biol., 1995:174(3):269-280)によって開発された構造予測アルゴリズムを使用するとき、ヒトＦＯＸＣ２ｍＲＮＡの仮説開始コドンより数えて−９４位ないし−１４位の間に、強い構造が展開した。計算を、ＳＴＡＲ４．４ソフトウェアを使用して実施した。開始コドン（ＡＵＧ）を含む完全な５’−ＵＴＲ配列を、試験配列に含め、そして計算を、変化なく３回繰り返した後停止した（デフォルトセッティング）。修飾され得るすべての変数を、製造者によって導入されたデフォルトセッティングにしたがって使用した。強い構造を形成すると予測された、８１ヌクレオチドの定義されたＲＮＡセグメントを、表ＩＸの座標によって表す。
【００３２】
実施例２
レポーターに基づくアッセイを使用することの可能性を、パイロット実験によって実証し、ここでマウスリポタンパク質リパーゼ転写物に対応する、７２塩基対（配列番号１９）長フラグメントを、レポーターベクター（ｐＧＬ３コントロール；Promega, USA)に挿入した。該フラグメントを、ルシフェラーゼ遺伝子の５’−ＵＴＲに挿入し、すなわち、この構築物でトランスフェクトされた細胞は、５’−ＵＴＲ中の「ｍＬＰＬ構造」を含む転写物を発現した（原理的ベクター組成について、図１参照）。この構築物を使用して以下のトランスフェクションおよびアッセイプロトコルを使用した：
【００３３】
組織培養
凍結した細胞のバイアルを、液体窒素から、ちょうど融解するまで３７℃までウォーターバスに移した。浸透圧ショックを防止し、細胞生存を最大化するため、以下を実施した：１ｍｌの完全培地を、管に添加した。混合物を１５ｍｌ管に移した。１０ｍｌの完全培地を添加し、そして穏やかに混合した。混合物を、１２５ｘｇで１０分間遠心分離し、それによって上清を除去した。細胞を完全培地中に再懸濁した。細胞を、Ｔ−７５あたり３−５ｘ１０５で配置し、そして７０−８０％コフルエンシーに達したとき２−３日ごとに分割した。細胞を以下のように分割した：培地を除去し、そして細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液で３７℃で１−２分間洗浄した。８ｍｌの完全培地を添加した。細胞を、ピペッティングによって穏やかに再懸濁した。細胞を、１：１０までの比率で分割した。
【００３４】
トランスフェクション
トランスフェクト１日前に、細胞をトリプシン処理し、そしてカウントし、これにより細胞を以下の密度で完全培地中に配置した（表Ｉ）。
【表１】2005506051.tif 000003
【００３５】
６ウェルプレート（細胞が９０−９５％コフルエンシーであるとき、１日）
・ＤＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地中に希釈した。
・０．５−３μｇを１１０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地を含む管にピペッティングした。
・リポフェクタミン２００試薬を、ＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地中で希釈した。
・８μｌのリポフェクタミン２０００を、１１０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地を含む管にピペッティングした。２０分間安定である。
・希釈したＤＮＡ（工程Ｉ）およびＬｉｐｏ試薬（工程２）を、穏やかな混合によって合わせた。混合物を、２０分間室温でインキュベートした。６時間安定化した。
・培地を、ウェルから除去した。
・新しいトランスフェクション培地を、添加した（２．５ｍｌ／ウェル）。
・ＤＮＡ−ＬＦ２０００試薬複合体をそれぞれのウェルに直接添加し、そしてプレートを後および前にロックすることによっておだやかに混合した。
・プレートを細胞インキュベーターで２４時間インキュベートした。
【００３６】
化合物調製
・化合物プレートを、２ｍＭないし４１０μＭで希釈した（推定化合物は、最終濃度で１０μＭであろう）。３５μｌ／ウェルの滅菌水を、Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐを使用してピペッティングした。
・５μｌの希釈された化合物を、９６ウェルアッセイプレートに移動し、または２μｌを３８４ウェルプレートにロボットを使用して移動した。
【００３７】
アッセイ
・６ウェルプレート中のトランスフェクトされた細胞を含むウェルにおいて、培地を吸引した。
・２ｍｌのPBSを添加した。
・ＰＢＳを吸引した。
・１ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。
・トリプシン−ＥＤＴＡを添加した。
・５０μｌのトリプシン−ＥＤＴＡを添加した。
・プレートを２分間細胞インキュベーターでインキュベートした。
・２ｍｌのトランスフェクト培地を添加した。
・細胞を除去し、そして５０ｍｌ管に移動した。
・８ｍｌのトランスフェクト培地を添加した。
・２００μｌのトランスフェクトした細胞を（４−６ｘ１０４細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートに、または希釈した化合物を含む、８０μｌのトランスフェクト細胞（１．５−２ｘ１０４細胞／ウェル）を、Ｍｌｔｉｄｒｏｐを使用して、ピペッティングした。
【００３８】
・プレートを、２４時間細胞インキュベーターでインキュベートした。
・培地を、Ｂｉｏ−Ｔｅｋプレートウォッシャーを使用して除去した。
・２５または５０μｌ／ウェルＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬を、Ｍｕｔｉｄｒｏｐを使用して添加した。
・プレートを、室温で５分間インキュベートした。
・蛍光をＰａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐ−ＣｏｕｎｔまたはＬＪＬで読んだ。
・％阻害を、コントロールに基づいて計算した。%阻害＝（１−（Ｘ−ＢＧ）／（ＰＣ−ＢＧ））＊１００．
【００３９】
１９０００化合物をスクリーニング後、ルシフェラーゼ活性の発現する有意に影響を受けた、９００より多い化合物を同定した。加えて、ある分画（３０より多い）のこれらの化合物は、「ｍＬＰＬ−構造」が挿入されたとき、ルシフェラーゼ発現ヘの有意な影響を有し、一方この挿入を欠くコントロールベクターでは影響は観察されなかった。したがって、そのようなスクリーニング手法によって、特異的効果、すなわち定義されたＲＮＡ構造を介して仲介された、活性化および阻害の両方を有する化合物を同定することが可能であることを、推定し得る。ＲＮＡにおいて「ｍＬＰＬ−構造」を有するｍＲＮＡへの特異的影響を有する化学物質を、図２および３に示す。
【００４０】
実施例３
表ＩＩないしＸにおいて、最初の４コラムは、配列の５’末端から数えて配列中のステムの位置を指摘する。コラム５−７は、ｋｃａｌ／ｍｏｌにおける自由ギブスエネルギーを特定する。
コラム５：スタッキングエネルギーの獲得。
コラム６：封入されたループの脱安定化エネルギー。
コラム７：特定のステムが、成長する構造のエネルギーに加えるエネルギー。
コラム８は、ステム配列を示す。
コラム７は、それぞれコラム５および６のエネルギーの合計を指摘する。構造の全エネルギーを計算するため、コラム７の全ての値を加える。ステム内のそれぞれの構造についての自由ギブスエネルギーの合計は、その構造安定性の基準である。よって、低自由ギブスエネルギー値は、好適な薬物結合部位についての好適な前提条件である。
【００４１】
表ＩＩＩ
Ｃ／ＥＢＰ−アルファ（配列番号１および２）についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表２】2005506051.tif 000004
【００４２】
表ＩＩＩ
ＤＧＡＴ（アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ）（配列番号３および４）についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表３】2005506051.tif 000005
【表４】2005506051.tif 000006
【００４３】
表ＩＶ
ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）（配列番号５および６）についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表５】2005506051.tif 000007
【表６】2005506051.tif 000008
【００４４】
表Ｖ
ＦＡＢＰ−２（脂肪酸結合タンパク質２）（配列番号７および８）についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表７】2005506051.tif 000009
【００４５】
表ＶＩ
ＦＡＴＰ−４（脂肪酸輸送体タンパク質４）（配列番号９および１０についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表８】2005506051.tif 000010
【００４６】
表ＶＩＩ
レプチンレセプター（配列番号１１および１２）についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表９】2005506051.tif 000011
【表１０】2005506051.tif 000012
【００４７】
表ＶＩＩＩ
ＭｙｏＤ（配列番号１３および１４）についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表１１】2005506051.tif 000013
【表１２】2005506051.tif 000014
【００４８】
表ＩＸ
ＦＯＸＣ２（配列番号１５および１６）についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表１３】2005506051.tif 000015
【００４９】
表Ｘ
ＳＲＥＢＰ−１ｃ（血清応答性エレメント結合タンパク質１ｃ）（配列番号１７および１８）についてのＲＮＡ配列および折り畳み座標
【表１４】2005506051.tif 000016
【図１】
2005506051.tif 000017
【図２】
2005506051.tif 000018
【図３】
2005506051.tif 000019
【国際公開パンフレット】
2005506051.tif 000020
2005506051.tif 000021
2005506051.tif 000022
2005506051.tif 000023
2005506051.tif 000024
2005506051.tif 000025
2005506051.tif 000026
2005506051.tif 000027
2005506051.tif 000028
2005506051.tif 000029
2005506051.tif 000030
2005506051.tif 000031
2005506051.tif 000032
2005506051.tif 000033
2005506051.tif 000034
2005506051.tif 000035
2005506051.tif 000036
2005506051.tif 000037
2005506051.tif 000038
2005506051.tif 000039
2005506051.tif 000040
2005506051.tif 000041
2005506051.tif 000042
2005506051.tif 000043
2005506051.tif 000044
2005506051.tif 000045
2005506051.tif 000046
2005506051.tif 000047
2005506051.tif 000048
2005506051.tif 000049
【国際調査報告】
2005506051.tif 000050
2005506051.tif 000051
2005506051.tif 000052
2005506051.tif 000053
2005506051.tif 000054