(57)【要約】本発明は可逆的で、平行的で及び／又は多数の仕事を行うことができるクローニング方法及びキットに関し、これはベクターや細胞の染色体の如き核酸構築物中での（好ましくは多数の）遺伝子要素のクローニングを改良し、インビトロ又はインビボでの前記遺伝子要素の正確な組込みを伴った構築物の迅速で効率的な選択を改良する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列（Ａ）についての挿入／欠失及び逆位のために好適な遺伝子構築物（１０）であって、以下のものを含む遺伝子構築物（１０）：
−  二つの異なる毒性分子をコードする第一及び第二のヌクレオチド配列（１，２）の上流に配置されたプロモーター／アクチベーター配列（１１）、又は
−  毒性分子をコードする第一のヌクレオチド配列（１）の上流に配置された第一のプロモーター／アクチベーター配列（１１）、及び前記第一の毒性分子とは異なる第二の毒性分子に対する解毒剤をコードする第二のヌクレオチド配列（２′）の上流に、前記第一のプロモーター／アクチベーター配列とは反対の方向に配置された第二のプロモーター／アクチベーター配列（１２）、又は
−  第一の毒性分子、及び前記第一の毒性分子とは異なる第二の毒性分子に対する解毒剤をそれぞれコードする第一及び第二のヌクレオチド配列（１，２′）の上流に配置されたプロモーター／アクチベーター配列（１１）。
【請求項２】
少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列（Ａ）の逆位のために好適な請求項１記載の遺伝子構築物（１０）であって、以下のものを含む遺伝子構築物（１０）：
−  毒性分子をコードする第一のヌクレオチド配列（１）及び前記第一の毒性分子とは異なる第二の毒性分子に対する解毒剤をコードする第二のヌクレオチド配列（２′）の上流に配置された第一のプロモーター／アクチベーター配列（１１）、及び
−  第一のプロモーター／アクチベーター配列（１１）の読み取り方向とは反対の方向に配列され、好ましくは第二のプロモーター／アクチベーター配列（１２）の制御下にある、前記第一の毒性分子に対する解毒剤をコードする第三のヌクレオチド配列（１′）。
【請求項３】
毒性分子又は毒性分子に対する解毒剤をコードする各ヌクレオチド配列（１，２，１′，２′）が毒性分子としての又は前記毒性分子に対する解毒剤としての活性を有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、前記融合タンパク質がいくつかの特異的クローニング部位及び細胞に対する毒性分子又は毒性分子に対する解毒剤をコードするヌクレオチド配列を含むコーディングヌクレオチド配列からなる請求項１又は２記載の核酸構築物。
【請求項４】
毒性分子をコードするヌクレオチド配列（１，２）及び／又は毒性分子に対する解毒剤をコードするヌクレオチド配列（１′，２′）の上流及び下流に配置された組換え部位をさらに含む請求項１〜３のいずれか一項記載の遺伝子構築物（１０）。
【請求項５】
毒性分子及び毒性分子に対する解毒剤をコードする配列（１，２，１′，２′）が毒物／解毒剤配列であり、好ましくは以下の毒物／解毒剤系からなる群から選択される請求項１〜４のいずれか一項記載の遺伝子構築物（１０）：ＣｃｄＢ／ＣｃｄＡ，Ｋｉｄ／Ｋｉｓ，Ｈｏｋ／Ｓｏｋ，Ｄｏｃ／Ｐｈｄ，ＲｅｌＥ／ＲｅｌＢ，ＰａｓＡ／ＰａｓＢ／ＰａｓＣ，ＭａｚＥ／ＭａｚＦ，ＰａｒＥ／ＰａｒＤ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項記載の遺伝子構築物（１０）の少なくとも一つを含むクローニングベクター。
【請求項７】
複製起点及び選択マーカー、好ましくは抗生物質耐性選択マーカーをさらに含む請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項記載の遺伝子構築物によってもしくは請求項６〜７のいずれか一項記載のベクターによって形質転換されたか、又は請求項１〜５のいずれか一項記載の遺伝子構築物の少なくとも一つを染色体ゲノム中に組込まれた細胞。
【請求項９】
原核細胞、植物細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む）及び真菌細胞（酵母細胞を含む）からなる群から選択される請求項８記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項記載の一以上の核酸構築物、請求項６又は７記載の一以上のベクター、及び前記構築物又はベクターによって形質転換されるべき細胞を含むクローニング及び選択キットであって、前記細胞が前記毒性分子の一つ以上に対して耐性又は感受性を有し、前記毒性分子の一つ以上又は前記毒性分子に対する解毒剤の一つ以上を発現するキット。
【請求項１１】
核酸構築物中へのターゲットヌクレオチド配列（Ａ）の挿入及び所望により欠失及び／又は逆位のための方法であって、好ましくは自動装置によって行われる以下の工程を含む方法：
−  所望により、エキソン−イントロン構造の同定及び発現遺伝子データベースとの比較によって前記ゲノム配列の分析を通してゲノムデータベースから前記ターゲットヌクレオチド配列を選択し、
−  所望により、前記ターゲット遺伝子配列の遺伝子増幅及びクローニングのために好適なプライマー配列を与え、
−  所望により、データベースに示されている前記核酸構築物の要素並びに前記核酸構築物によって形質転換されるべき細胞を選択し、
−  所望により、前記ターゲットヌクレオチド配列の組込みのために好適な核酸構築物の設計を与え、そして所望により、得られた仮想核酸構築物の設計をターゲットメモリーデーターベースに戻し、
−  所望により請求項６又は７のベクター中に組込まれた又は請求項８又は９に記載の細胞中に組込まれた請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸構築物を（所望により前記設計から）与え、そして毒性分子をコードするヌクレオチド配列の不活性化によって核酸構築物中への前記ターゲットヌクレオチド配列の挿入を得、そして
−  前記毒性分子に対して感受性の細胞中に前記ターゲットヌクレオチド配列が組込まれた核酸構築物を選択する。
【請求項１２】
前記ターゲット配列の挿入後に欠失された要素によって、又は逆転された読取り方向を有するターゲット配列の組込みによってターゲット配列の置換を行う工程をさらに含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ターゲット配列の組込み、ターゲット配列の置換又は逆位が、古典的な制限／ライゲーション、部位特異的組換え、ＴＯＰＯクローニング及び相同組換えによって得られる請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
多数の核酸構築物中へのいくつかのターゲットヌクレオチド配列（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ）の挿入／欠失及び／又は逆位の工程、及び前記ターゲット配列が正確に組込まれた、欠失された又は逆位された構築物を、同時に、好ましくは単一の細胞又は単一の反応管中で選択する工程を含む請求項１１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項記載の工程を行うためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。
【請求項１６】
プログラムがコンピュータで実行されたときに請求項１１〜１３のいずれか一項記載の方法の工程を行うための、コンピュータ読取り可能な媒体上のプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品。
【請求項１７】
請求項１１〜１３のいずれか一項記載の方法を行うための、コンピュータのデータベースに接続されかつ請求項１〜５のいずれか一項記載の核酸構築物又は請求項６〜７のいずれか一項記載のベクター又は請求項８〜９のいずれか一項記載の細胞又は請求項１０に記載のキットの要素及び所望により請求項１５又は１６のコンピュータプログラムを含む自動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は可逆的で、平行的で及び／又は多数の仕事を行うことができるクローニング方法及びキットに関し、これはベクターや細胞の染色体の如き核酸構築物中での（好ましくは多数の）遺伝子要素のクローニングを改良し、インビトロ又はインビボでの前記遺伝子要素の正確な組込みを伴った構築物の迅速で効率的な選択を改良する。
【背景技術】
【０００２】
多数の遺伝子要素を含む複雑な分子構築物を得るためには、前記遺伝子要素を正しい位置でかつ正しい配向で含むターゲット構築物の集成を起こさせる遺伝的事象（ＤＮＡ断片の挿入及び／又は欠失及び／又は逆位）は通常、時間のかかる手段である。
【０００３】
特に、様々な多数の遺伝的事象（核酸構築物中の遺伝子配列の挿入、欠失、逆位）を、ひょっとすると同一の反応管中で選択するという主要な問題に必然的に直面する。
【０００４】
それ故、分子生物学者は通常、遺伝的事象（核酸構築物中の遺伝子配列の挿入、欠失、逆位）を別個に得るべきであり、同一の反応管中で同時に得るべきではなく、前記遺伝子操作中のいかなる誤り（遺伝子配列が間違った方向に不正確に組込まれることなど）も回避すべきである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の第一の目的は上述の問題に対する解決を与える方法及び道具に関し、特に、分子生物学者がインビトロ又はインビボで遺伝子要素を挿入及び／又は除去することを、又はヌクレオチド配列中の前記遺伝子要素の読取り方向（ｌｅｃｔｕｒｅ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）の改変（逆位）を得ることを可能にする方法及び道具に関する。
【０００６】
本発明の別の目的はインビトロ又はインビボで多数の遺伝子要素の挿入、欠失及び／又は逆位を通して集成される遺伝子構築物（ベクター又は細胞の染色体など）の生成を可能にし、これらの遺伝子要素が正確に組込まれた（欠失された又は逆転された）前記遺伝子構築物の選択を可能にする方法及び道具を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は生物学者が方法の工程を平行的に行うこと及び同一の反応管で又は異なる反応管で同時に多数の仕事（多数の遺伝的事象の選択）を行うことを可能にする道具を提供することである。
【０００８】
本発明の最後の目的はいかなる核酸構築物も再循環可能な、即ち他の異なる核酸構築物の集成のために再使用されることができる一組の要素として見られることができるように、遺伝的事象（挿入及び欠失及び逆位）が可逆的であることを可能にする道具を提供することである。
【０００９】
発明の概要
以下に記述する方法及びキットにおいては、当業者は本発明によるクローニング及び選択方法を行うための道具である特定の遺伝子構築物を用いる。前記道具は様々な遺伝子要素の正確な集成のクローニング及び選択を得るために好適な細胞の染色体ゲノム中に又はベクター（プラスミド又はバクテリオファージを含むウイルス）中に組込まれることができる遺伝子構築物である。これらの方法及びシステムはすべて、前記核酸構築物ベクター又は細胞の染色体中の特定の部位に一以上の外来遺伝子要素（関心のあるターゲット配列）を集成することを可能にする。外来（好ましくは自己由来）遺伝子要素の本発明による核酸構築物中への組込みは、古典的な制限／ライゲーション、部位特異的組換え、ＴＯＰＯクローニング及び相同組換えの如き（しかしこれらに限定されない）、当業者には公知の技術によって行われることができる。遺伝子要素の集成はヌクレオチド配列の挿入、欠失及び／又は逆位を含むことができる。本発明による方法では、正確に挿入された配列の選択は特定のマーカーを用いることによって得られ、このマーカーは細胞にとって毒性である分子又はかかる毒性分子の阻害剤である分子及び／又は細胞中で発現されたかかる分子の毒性活性を阻止する分子をコードするヌクレオチド配列である。好ましくは、前記分子は毒物及び／又は毒物に対する阻害剤であり、好ましくは以下の毒物／解毒剤系からなる群から選択される（しかしこれらに限定されない）：ＣｃｄＢ／ＣｃｄＡ，Ｋｉｄ／Ｋｉｓ，Ｈｏｋ／Ｓｏｋ，Ｄｏｃ／Ｐｈｄ，ＲｅｌＥ／ＲｅｌＢ，ＰａｓＡ／ＰａｓＢ／ＰａｓＣ，ＭａｚＥ／ＭａｚＦ，ＰａｒＥ／ＰａｒＤ。
【００１０】
本発明による方法においては、前記外来ヌクレオチド要素は一以上のプロモーター／オペレーターヌクレオチド配列に（その３′端又は５′端又は両端で）結合されていることが有利であり、前記プロモーター／オペレーターヌクレオチド配列はそれらが好適なかつ要求された読取り方向に従って配置された場合に本発明による核酸構築物に組込れられたターゲットヌクレオチド配列の発現を可能にするような構成的プロモーターであることができる（しかし、これに限定されない）。
【００１１】
本発明による方法においては、当業者は組換え体を得るために及び選択するために前記毒性分子の一以上に対して耐性又は感受性を有する好適な細胞株（原核細胞及び／又は真核細胞）を用いる。細胞株の特性は例えば、毒物及び／又は解毒剤をコードしかつ細胞の染色体中に組込まれているか又はプラスミドの如きエピソーム配列中に表されている遺伝子の存在によることができる。
【００１２】
可逆的なクローニング及び選択方法及びキット
本発明の第一の側面は可逆的なクローニング方法及びキットに関し、それについていくつかの特定の好ましい実施例が図２〜５を参照して以下詳細に記述される。
【００１３】
本発明の方法で用いられる要素は特定の細胞、及び以下のいずれかのものを含む、好ましくは細胞の染色体又はベクター中に組込まれた遺伝子構築物である：
−  （図２の左側に示す毒物１及び毒物２の如き）二つの異なる毒性分子をコードする第一及び第二のヌクレオチド配列（１，２）の上流に配置されたプロモーター／アクチベーター配列（１１）、又は
−  （毒物１の如き）毒性分子をコードする第一のヌクレオチド配列（１）の上流に配置された第一のプロモーター／アクチベーター配列（１１）、及び（図３の左側に示す毒物２の如き）第二の毒性分子に対する解毒剤をコードする第二のヌクレオチド配列（２′）の上流に、前記第一のプロモーター／アクチベーター配列とは反対の読取り方向に配置された第二のプロモーター／アクチベーター配列（１２）、又は
−  （毒物１の如き）第一の毒性分子、及び前記第一の毒性分子とは異なる（毒物２の如き）第二の毒性分子に対する解毒剤をそれぞれコードする第一及び第二のヌクレオチド配列（１，２′）の上流に配置されたプロモーター／アクチベーター配列（１１）（図４の左側参照）。
用語「毒性分子又は毒性分子に対する解毒剤をコードするヌクレオチド配列」は、いくつかの同一の毒性分子をコードする多数のコーディング部分を含む配列も含む。
【００１４】
毒性分子要素をコードするヌクレオチド配列（１）「中」への又はかかるヌクレオチド配列（１）の「置換」としての外来ターゲットヌクレオチド配列（Ａ）の挿入は以下のいずれかのことを可能とするであろう：
−  第一の毒性分子をコードするヌクレオチド配列１の不活性化、及び第二の毒性分子をコードする配列２の活性化又は活性維持（図２）；又は：
−  第一の毒性分子をコードする第一のヌクレオチド配列１の不活性化、及び第二の毒性分子に対する解毒剤をコードするヌクレオチド配列２の不活性化（図３）；又は：
−  第一の毒性分子をコードする第一のヌクレオチド配列１の不活性化（図４）。
【００１５】
挿入される外来遺伝子要素（ターゲット配列）は制御配列又は関心のある遺伝子（所望により一以上のプロモーター／オペレーター配列に結合された）であることができる。
【００１６】
遺伝的事象（挿入）の選択は、第一の毒性分子１に対して感受性の細胞株で得られることができ（図２〜４）、及び所望により第二の毒性分子２に対して耐性の細胞株で得られることができる（図２）。
【００１７】
しかし、前記遺伝的事象（挿入又は置換）は、第一工程でなされた挿入及び組換え後に欠失された要素による、挿入された要素（ターゲット配列）の置換を通して可逆的である。ターゲット配列のこの可逆的反応欠失は、毒性分子１に対して耐性でありかつ毒性分子２に対して感受性である株中で（図２，３，４）、及び所望により毒性分子２を生産する株中で（図３及び４）選択される。
【００１８】
この可逆的クローニング及び選択方法は、組込まれた遺伝子要素の逆位を得るのにも好適である。特定の実施例が図５を参照して以下、詳細に記述される。実際、関心のある配列の配向は、本発明の方法を通して（好ましくは図４の挿入工程に続いて）、又は二つの異なる解毒剤配列（１′，２′）の間のターゲット配列の直接挿入を通して反転されることができる。プロモーター／オペレーターを（その３′又は５′端に）伴う前記遺伝子要素（ターゲット配列）は、二つの異なる毒性分子１及び２にそれぞれ対する二つの異なる解毒剤をコードする二つのヌクドオチド配列（１′，２′）の間にまず組込まれる。前記二つの異なる解毒剤をコードする二つのヌクレオチド配列（１′，２′）は対向する読取り方向に配置される（ターゲットヌクレオチド配列の上流及び下流に、対向する相互に異なる読取り方向に配置される）。この構築物は組換え事象を選択することを可能にし、この組換え事象は、関心のあるターゲットヌクレオチド配列及びそれに伴うプロモーターが、第一の毒性分子に対する第一の解毒剤をコードするヌクレオチド配列１′と同じ配向を有するようにさせるか（毒物１に対して感受性でありかつ毒物１を生産する株において行われた選択）、又は第二の毒性分子に対する第二の解毒剤をコードするヌクレオチド配列２′と同じ配向を有するようにさせる（毒物２に対して感受性でありかつ毒物２を生産する株において行われた選択）。（ここに参考文献として組入れるＷＯ  ０２／０６６６５７参照）
【００１９】
平行的及び／又は多数の仕事を行うことができるクローニング及び選択
上述の可逆的なクローニング及び選択方法及び要素（核酸構築物又はベクター及び特定の細胞株）は、以下に記述される（図１を参照して以下の実施例で詳細に記述される）平行的及び／又は多数の仕事を行うことができるクローニング及び選択方法で用いられることもできる。
【００２０】
ベクター又は細胞の染色体中への多数の外来遺伝子要素（異なるターゲット配列）の集成（インビトロ又はインビボでの）、及び正確な集成体の選択は、一以上の（異なる又は同じ）毒性分子及び／又はそれらの解毒剤をコードする配列を含む多数の核酸構築物の使用によって得られる。核酸構築物の種類及び（毒性分子及び／又は毒性分子に対する解毒剤をコードする）選択マーカーの種類によって、当業者は前記多数の遺伝子要素を用いて適用される好適な挿入、欠失及び／又は逆位の事象を選択することができる。
【００２１】
前記クローニング及び選択方法は、所望により同じ反応管の中で又は単一の細胞の内部で（連続して）行われる多数の工程を必要とするかもしれない。
【００２２】
前記方法は、（インビトロでの転写及び翻訳キットを用いる）インビトロでのタンパク質合成を行うための工程及び手段と組合されることができる。
【００２３】
本発明の別の側面は、本発明による方法の一以上の工程を行うことを補助することができるアルゴリスム、コンピュータプログラム、及びデータベース（所望によりコンピュータ読取り可能な媒体に記憶されたコード及び手段からなる）に関する。前記アルゴリスム、データベース及びプログラムコード手段は以下のものの正確な組合せを規定するために用いられる（しかし、これらに限定されない）：
−  好適なマーカー（毒性分子及び／又は前記毒性分子に対する解毒剤をコードするもの）；
−  好適な遺伝子事象を選択するための好適な細胞株；
−  好適な予備開始核酸構築物；
−  挿入、欠失及び／又は逆位されるべき好適な遺伝子要素（ターゲットヌクレイチド配列及び／又はそれらのオペレーター／プロモーター配列）；
−  分子構築物の集成／生産に必要な反応混合物（組換え混合物、緩衝液、培地、酵素などを含むことがこれらに限定されない）。
【００２４】
アルゴリスム、コンピュータプログラム、及びデータベースは本発明による方法の一以上の工程を制御することも可能であり、これは所望により自動装置によって行われる。
【００２５】
本発明の別の側面は、本発明による方法を行うための好適な要素を含む部品のキット（クローニング及び／又は選択キット）に関し、特に上述のコンピュータプログラム、核酸構築物、細胞株及び／又はクローニング及び選択技術で用いられる通常の生成物及び培地を含む部品のキットに関する。
【００２６】
本発明の別の側面は、本発明による方法を行うことを可能にしかつ上述の部品のキットを用いる自動装置に関する。前記部品のキット（適切な培地、細胞及びインビトロ転写及び翻訳キットに存在する培地と組合せられたクローニング及び選択キット）及び自動装置は、緩衝液、ピペッティング要素、遺伝子増幅のためのプライマー、細胞培養培地及び結果を記録してデータを記憶するための手段の如き他の要素も含むことができる。
【００２７】
本発明は、本発明の様々な側面を非限定的に示すものとして提示される添付の図面を参照して以下の実施例において詳細に記述されるであろう。
【００２８】
図面の簡単な記述
図１は本発明の方法によって行われる平行的なかつ多数の遺伝子事象によって得られる複雑な遺伝子構築物の一例である。
【００２９】
図２〜５は本発明による可逆的クローニング及び選択方法及びキットの例である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
発明の詳細な記述
本発明は（ｉ）同時及び（ｉｉ）平行的な事象（様々な組換え及び選択事象がほぼ同一の頻度で生ずる）の使用を通して複雑な遺伝子構築物を作成することを可能にする。本発明の「多数の仕事を行うことができる（ｍｕｌｔｉｔａｓｋ）」性質は以下のように規定される：例えば、本発明は遺伝子要素Ａ及びＣの挿入、遺伝子要素Ｅ及びＦの欠失、及び遺伝子要素Ｂ及びＤの逆位を行わせることを可能にし、いくつかの又は全ての事象（図１）は同時にインビトロで（即ち、同一の管で）行われるか、又はインビボで（即ち、同一の生物中で）行われる。上述の事象の最終生成物は遺伝子要素Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤが全て同じ配向で含まれる複雑な構築物である。いくつかの遺伝子事象（例えばここでは挿入、欠失、逆位、組換え）の同時選択は、各事象に対する異なる選択マーカー（ここでは例えば毒物及び解毒剤遺伝子）の使用を通して達成される。中実黒色矢印はプロモーターを示す。
【００３１】
プラスミド１は毒物１に対して耐性がある株で増幅される。プラスミド２は毒物６及び９に対して耐性がある株で増幅される。プラスミド３は以下の条件を満たす株で選択される：
−  毒物１及び６に対して感受性を有し（遺伝子要素Ａ及びＣの挿入の選択のため）、
−  毒物３及び５に対して感受性を有し（遺伝子要素Ｂ及びＤの逆位の選択のため）、
−  毒物７及び８に対して感受性を有し（遺伝子要素Ｅ及びＦの欠失の選択のため）、
−  毒物９に対して感受性を有し（プラスミド１から作られた構築物とプラスミド２から作られた構築物との間の組換え事象の選択のため）、かつ
−  毒物３、毒物５、毒物７及び毒物８を生成する。
【００３２】
各「組換え」事象の実現は、古典的な制限／ライゲーション、部位特異的組換え、又は相同組換えの如き技術（ただし、これらに限定されない）を通して行われることができる。各遺伝子事象（挿入、欠失、逆位など）の特異性は組換え事象の特異性によって保証される。例えば、挿入の特異性（挿入の位置及び挿入物（ターゲットヌクレオチド配列）の配向の両方）は、挿入部位及び挿入されるべき断片の両方に接する異なるＤＮＡ配列の使用によって達成される（これらのＤＮＡ配列は前記組換え事象を行わせるために当業者によって選択されることができる）。これらのフランキング配列は異なる部位特異的組換え要素（部位特異的な組換えの場合）、又は相同な異なる要素（相同組換えの場合）を形成する。いくつかの遺伝子事象（例えば挿入、欠失及び逆位）の同時選択は、各事象に対する異なる選択マーカーの使用を通して達成される。それぞれの遺伝子事象は天然には稀であるため、すべての事象の同時存在の選択は極めて効率的な選択マーカー（例えば解毒剤／毒物遺伝子であるか、これらに限定されない）の使用を必要とする。
【００３３】
本発明の平行的なクローニングの性質は以下のように規定される：上述の多数の仕事を行うことができるプロセスを通して同一の反応混合物中で（即ち、同一の管で）生成されるＮ個の異なる遺伝子構築物は、それらの集成体（ここではプラスミド１から作られる構築物とプラスミド２から作られる構築物の集成体）が組換え事象を通して作成されることができるように予め設計されることができる。換言すれば、Ｎ−１個の遺伝子構築物がドナーとして、そして１個の構築物がレセプターとして見られることができる。例えば、Ｎ個の構築物はｎ−１個の組換え事象の選択のためにｎ−１個の選択マーカーの使用を通して組合せられることができる（図１）。
【００３４】
さらに、本発明は、多数の仕事を行うことができる／平行的なクローニング方法の生成物を、新しい反応の構成単位として使用することを可能にする。実際、本発明を通して生成された構築物は、新しい（そして異なる）構築物のために再使用されることができる構成単位の特異的な組合せである。即ち、本発明の方法は図２〜４に示されるように可逆的で拡張可能である。
【００３５】
図２では、挿入されるべきＤＮＡ断片は関心のあるターゲット配列及びその３′端に配置されたプロモーター配列をコードする。適切な挿入を含む核酸構築物は、毒物１に対して感受性を有するが毒物２に対して耐性を有する株において、毒物１をコードするヌクレオチド配列１の欠失によって選択される。構成単位の再使用のためのターゲット配列（ＤＮＡ断片Ａ）の欠失は、はじめに除去されたＤＮＡ断片（即ち、毒物１をコードし、その５′端にプロモーターを有するヌクレオチド配列１）の挿入を通して達成される。この反転事象は、毒物２に対して感受性を有しかつ毒物１に対して耐性を有する株において選択される。プラスミド１は、毒物１に対して耐性を有する株において増幅される。プラスミド２は、毒物２に対して耐性を有する株において増幅される。
【００３６】
図３では、ターゲット配列（ＤＮＡ断片Ａ）の挿入は、毒物１に対して感受性を有する株における、毒物１をコードするヌクレオチド配列１の欠失によって選択される。構成単位の再使用のためのＤＮＡ断片Ａの欠失は、はじめに除去されたＤＮＡ断片（即ち、毒物１をコードし、その５′端に二つのプロモーターを対向方向に有するヌクレオチド配列）の挿入を通して達成される。この反転事象は、毒物２に対して感受性を有しかつ毒物１に対して耐性を有する株であって毒物２の条件付き発現を可能にする株において選択される。プラスミド１は、毒物１に対して耐性を有する株において増幅される。プラスミド２は、生存性がプラスミド２の存在又は不在から独立しているいかなる株においても増幅される。
【００３７】
図４では、プラスミド１はオペロンとして組織化された毒物１及び解毒剤２の両方をコードする。ターゲット配列（ＤＮＡ断片Ａ）の挿入は、毒物１に対して感受性を有する株における、毒物１をコードするヌクレオチド配列の欠失によって選択される。構成単位の再使用のためのターゲット配列（ＤＮＡ断片Ａ）の欠失は、はじめに除去されたＤＮＡ断片（即ち、毒物１をコードし、その５′端にプロモーターを有するヌクレオチド配列）の挿入を通して達成される。この反転事象は、毒物２に対して感受性を有しかつ毒物１に対して耐性を有する株であって毒物２の条件付き発現を可能にする株において解毒剤２をコードするヌクレオチド配列の活性化を通して選択される。プラスミド１は、毒物１に対して耐性を有する株において増幅される。プラスミド２は、生存性がプラスミド２の存在又は不在から独立しているいかなる株においても増幅される。
【００３８】
図５では、ターゲット配列（ＤＮＡ断片Ａ）は、解毒剤の生成を可能にするプロモーターを含む。ＤＮＡ断片Ａの逆位は、毒物２に対して感受性を有する株であって毒物２の条件付き発現を可能にする株を用いて選択される。反転事象は、毒物１に対して感受性を有する株であって毒物１の条件付き発現を可能にする株において選択される。
【００３９】
換言すれば、本発明を通して生成される構築物は終端の生成物（即ち、それらが生成された用途のためのみに有用な生成物）ではない；それらは再使用されることができる。これは本発明のソフトウェア要素の重要性を強調する。なぜなら、それは構成単位のデータベースを作り出すことを可能にするのみならず、潜在的な将来の使用のために追跡されかつ記憶される（コンピュータ中に仮想的に、及び冷凍庫又は他の装置中に物理的に）生成物のデータベースをも作り出すことを可能にするからである。ソフトウェアは各構成単位及び生成物の特徴を追跡するため、それは将来のかつ新しい、多数の仕事を行うことができる／平行的な／可逆的なプロセスのための（ｉ）必要でかつ（ｉｉ）相互適合性の要素も同定する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の方法によって行われる並行的なかつ多数の遺伝子事象によって得られる複雑は遺伝子構築物の一例である。
【図２】本発明による可逆的クローニング及び選択方法及びキットの例である。
【図３】本発明による可逆的クローニング及び選択方法及びキットの例である。
【図４】本発明による可逆的クローニング及び選択方法及びキットの例である。
【図５】本発明による可逆的クローニング及び選択方法及びキットの例である。
【図１】
2005537016.tif 000003
【図２】
2005537016.tif 000004
【図３】
2005537016.tif 000005
【図４】
2005537016.tif 000006
【図５】
2005537016.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月7日(2004.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列（Ａ）についての挿入／欠失及び逆位のために好適な遺伝子構築物（１０）であって、以下のものを含む遺伝子構築物（１０）：
−  二つの異なる毒性分子をコードする第一及び第二のヌクレオチド配列（１，２）の上流に配置されたプロモーター／アクチベーター配列（１１）、及び／又は
−  毒性分子をコードする第一のヌクレオチド配列（１）の上流に配置された第一のプロモーター／アクチベーター配列（１１）、及び前記第一の毒性分子とは異なる第二の毒性分子に対する解毒剤をコードする第二のヌクレオチド配列（２′）の上流に、前記第一のプロモーター／アクチベーター配列とは反対の方向に配置された第二のプロモーター／アクチベーター配列（１２）、及び／又は
−  第一の毒性分子をコードする第一のヌクレオチド配列（１）、及び前記第一の毒性分子とは異なる第二の毒性分子に対する解毒剤をコードする第二のヌクレオチド配列（２′）の上流に配置されたプロモーター／アクチベーター配列（１１）。
【請求項２】
少なくとも一つのターゲットヌクレオチド配列（Ａ）の逆位のために好適な請求項１記載の遺伝子構築物（１０）であって、以下のものを含む遺伝子構築物（１０）：
−  毒性分子をコードする第一のヌクレオチド配列（１）及び前記第一の毒性分子とは異なる第二の毒性分子に対する解毒剤をコードする第二のヌクレオチド配列（２′）の上流に配置された第一のプロモーター／アクチベーター配列（１１）、及び
−  第一のプロモーター／アクチベーター配列（１１）の読み取り方向とは反対の方向に配列された前記第一の毒性分子に対する解毒剤をコードする第三のヌクレオチド配列（１′）。
【請求項３】
第三のヌクレオチド配列（１′）が第二のプロモーター／アクチベーター配列（１２）の制御下にある前記第一の毒性分子に対する解毒剤をコードする請求項２記載の核酸構築物。
【請求項４】
毒性分子又は毒性分子に対する解毒剤をコードする各ヌクレオチド配列（１，２，１′，２′）が毒性分子としての又は前記毒性分子に対する解毒剤としての活性を有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であり、前記融合タンパク質がいくつかの特異的クローニング部位及び細胞に対する毒性分子又は毒性分子に対する解毒剤をコードするヌクレオチド配列を含むコーディングヌクレオチド配列からなる請求項１〜３のいずれか一項記載の核酸構築物。
【請求項５】
毒性分子をコードするヌクレオチド配列（１，２）及び／又は毒性分子に対する解毒剤をコードするヌクレオチド配列（１′，２′）の上流及び下流に配置された組換え部位をさらに含む請求項１〜４のいずれか一項記載の遺伝子構築物（１０）。
【請求項６】
毒性分子及び毒性分子に対する解毒剤をコードする配列（１，２，１′，２′）が毒物／解毒剤配列である請求項１〜５のいずれか一項記載の遺伝子構築物（１０）。
【請求項７】
毒物／解毒剤配列が以下の毒物／解毒剤系からなる群から選択される請求項６記載の遺伝子構築物：ＣｃｄＢ／ＣｃｄＡ，Ｋｉｄ／Ｋｉｓ，Ｈｏｋ／Ｓｏｋ，Ｄｏｃ／Ｐｈｄ，ＲｅｌＥ／ＲｅｌＢ，ＰａｓＡ／ＰａｓＢ／ＰａｓＣ，ＭａｚＥ／ＭａｚＦ，ＰａｒＥ／ＰａｒＤ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の遺伝子構築物（１０）の少なくとも一つを含むクローニングベクター。
【請求項９】
複製起点及び選択マーカー、好ましくは抗生物質耐性選択マーカーをさらに含む請求項８記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一項記載の遺伝子構築物によってもしくは請求項８〜９のいずれか一項記載のベクターによって形質転換されたか、又は請求項１〜７のいずれか一項記載の遺伝子構築物の少なくとも一つを染色体ゲノム中に組込まれた細胞。
【請求項１１】
原核細胞、植物細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む）及び真菌細胞（酵母細胞を含む）からなる群から選択される請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項記載の一以上の核酸構築物、請求項８又は９記載の一以上のベクター、及び前記構築物又はベクターによって形質転換されるべき細胞を含むクローニング及び選択キットであって、前記細胞が前記毒性分子の一つ以上に対して耐性又は感受性を有し、前記毒性分子の一つ以上又は前記毒性分子に対する解毒剤の一つ以上を発現するキット。
【請求項１３】
核酸構築物中へのターゲットヌクレオチド配列（Ａ）の挿入及び所望により欠失及び／又は逆位のための方法であって、好ましくは自動装置によって行われる以下の工程を含む方法：
−  請求項８又は９のベクター中に組込まれた又は請求項１０又は１１に記載の細胞中に組込まれた請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物を与え、そして毒性分子をコードするヌクレオチド配列の不活性化によって核酸構築物中への前記ターゲットヌクレオチド配列の挿入を得、そして
−  前記毒性分子に対して感受性の細胞中に前記ターゲットヌクレオチド配列が組込まれた核酸構築物を選択する。
【請求項１４】
以下の工程をさらに含む請求項１２記載の方法：
−  所望により、エキソン−イントロン構造の同定及び発現遺伝子データベースとの比較によって前記ゲノム配列の分析を通してゲノムデータベースから前記ターゲットヌクレオチド配列を選択し、
−  所望により、前記ターゲット遺伝子配列の遺伝子増幅及びクローニングのために好適なプライマー配列を与え、
−  所望により、データベースに示されている前記核酸構築物の要素並びに前記核酸構築物によって形質転換されるべき細胞を選択し、そして
−  所望により、前記ターゲットヌクレオチド配列の組込みのために好適な核酸構築物の設計を与え、そして所望により、得られた仮想核酸構築物の設計をターゲットメモリーデーターベースに戻す。
【請求項１５】
前記ターゲット配列の挿入後に欠失された要素によって、又は逆転された読取り方向を有するターゲット配列の組込みによってターゲット配列の置換を行う工程をさらに含む請求項１３又は１４記載の方法。
【請求項１６】
ターゲット配列の組込み、ターゲット配列の置換又は逆位が、古典的な制限／ライゲーション、部位特異的組換え、ＴＯＰＯクローニング及び相同組換えによって得られる請求項１３〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
多数の核酸構築物中へのいくつかのターゲットヌクレオチド配列（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ）の挿入／欠失及び／又は逆位の工程、及び前記ターゲット配列が正確に組込まれた、欠失された又は逆位された構築物を同時に選択する工程を含む請求項１３〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記ターゲット配列が正確に組込まれた、欠失された又は逆位された構築物を同時に選択する工程が単一の細胞又は単一の反応管中で行われる請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか一項記載の工程を行うためのプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム。
【請求項２０】
プログラムがコンピュータで実行されたときに請求項１３〜１８のいずれか一項記載の方法の工程を行うための、コンピュータ読取り可能な媒体上のプログラムコード手段を含むコンピュータプログラム製品。
【請求項２１】
請求項１３〜１８のいずれか一項記載の方法を行うための、コンピュータのデータベースに接続されかつ請求項１〜７のいずれか一項記載の核酸構築物又は請求項８〜９のいずれか一項記載のベクター又は請求項１０〜１１のいずれか一項記載の細胞又は請求項１２に記載のキットの要素及び所望により請求項１９又は２０のコンピュータプログラムを含む自動装置。
【国際調査報告】
2005537016.tif 000008
2005537016.tif 000009