(57)【要約】本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｒｔｈｒａｃｉｓの検出に関する新規のＰＮＡプローブ、プローブセット、方法およびキットに関する。本発明は、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓあるいはそれらと関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出し、同定し、そして／または定量するのに有用なＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法およびキットに指向される。１つの実施形態において、本発明のＰＮＡオリゴマーは、プロービング核酸塩基配列を含み得、プロービング核酸塩基配列の少なくとも一部分は、以下からなる群から選択される核酸塩基配列またはその相補体に対して少なくとも９０％相同である：ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）およびＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロービング核酸塩基配列を含むＰＮＡオリゴマーであって、該プロービング核酸塩基配列の少なくとも一部分が、以下：
ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）；および
ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）
からなる群から選択される該核酸塩基配列、または該核酸塩基配列の相補体と少なくとも９０％相同である、ＰＮＡオリゴマー。
【請求項２】
前記プロービング核酸塩基配列が、配列番号１または配列番号２のうちの一方と１００％相同である、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項３】
前記オリゴマーが標識されていない、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項４】
前記オリゴマーが少なくとも１つの検出可能な部分で標識されている、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項５】
前記検出可能な部分が、デキストラン結合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物からなる群から各々独立して選択される、請求項４に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項６】
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼからなる群から選択される、請求項５に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項７】
前記ハプテンが、フルオレセイン、ビオチン、２，４−ジニトロフェニルおよびジゴキシゲニンからなる群から選択される、請求項５に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項８】
前記オリゴマーが、少なくとも２つの独立して検出可能な部分を用いて標識される、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項９】
前記２つ以上の独立して検出可能な部分が、独立して検出可能な発蛍光団である、請求項８に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１０】
前記オリゴマーが、非蛍光クエンチャー部分を含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１１】
前記オリゴマーが、エネルギー移動セットの標識を含む、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１２】
前記オリゴマーが、結合された支持体である、請求項１に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１３】
ＰＮＡオリゴマーであって、該ＰＮＡオリゴマーは、以下：
ａ）１つ以上の非天然の核酸塩基を含み；
ｂ）実質的に分子内または分子間で自己ハイブリダイズせず；そして
ｃ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸の領域に配列特異的にハイブリダイズする、
ＰＮＡオリゴマー。
【請求項１４】
前記非天然の核酸塩基が、２，６−ジアミノプリン、２−チオウラシルおよび２−チオチミンからなる群から各々独立して選択される、請求項１３に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１５】
前記オリゴマーが標識されていない、請求項１３に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１６】
前記オリゴマーが、少なくとも１つの検出可能な部分で標識されている、請求項１３に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１７】
前記検出可能な部分が、デキストラン結合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物からなる群から各々独立して選択される、請求項１６に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１８】
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼからなる群から選択される、請求項１７に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項１９】
前記ハプテンが、フルオレセイン、ビオチン、２，４−ジニトロフェニルおよびジゴキシゲニンからなる群から選択される、請求項１７に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２０】
前記オリゴマーが、少なくとも２つの独立して検出可能な部分で標識されている、請求項１３に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２１】
前記２つ以上の独立して検出可能な部分が、独立して検出可能な発蛍光団である、請求項２０に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２２】
前記オリゴマーが、非蛍光クエンチャー部分を含む、請求項１３に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２３】
前記オリゴマーが、エネルギー移動セットの標識を含む、請求項１３に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２４】
前記オリゴマーが、結合された支持体である、請求項１３に記載のＰＮＡオリゴマー。
【請求項２５】
２つ以上のオリゴマーを含むオリゴマーセットであって、該オリゴマーセットの少なくとも１つが、プロービング核酸塩基配列を含むＰＮＡオリゴマーであって、ここで、該プロービング核酸塩基配列は、以下：
ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）；および
ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）
からなる群から選択される核酸塩基配列または該核酸塩基配列の相補体と、少なくとも９０％相同である、オリゴマーセット。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーが、配列番号１または配列番号２のうちの１つと１００％相同であるプロービング核酸塩基配列を含む、請求項２５に記載のオリゴマーセット。
【請求項２７】
前記セットの全てのオリゴマーが標識されていない、請求項２５に記載のオリゴマーセット。
【請求項２８】
前記セットの少なくとも１つのオリゴマーが、少なくとも１つの検出可能な部分で標識されている、請求項２５に記載のオリゴマーセット。
【請求項２９】
前記検出可能な部分が、デキストラン結合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物からなる群から各々独立して選択される、請求項２８に記載のオリゴマーセット。
【請求項３０】
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼからなる群から選択される、請求項２９に記載のオリゴマーセット。
【請求項３１】
前記ハプテンが、フルオレセイン、ビオチン、２，４−ジニトロフェニルおよびジゴキシゲニンからなる群から選択される、請求項２９に記載のオリゴマーセット。
【請求項３２】
前記セットの１つ以上のオリゴマーが、２つ以上の独立して検出可能な部分で標識されている、請求項２５に記載のオリゴマーセット。
【請求項３３】
前記２つ以上の独立して検出可能な部分が、独立して検出可能な発蛍光団である、請求項３２に記載のオリゴマーセット。
【請求項３４】
前記セットの少なくとも１つのオリゴマーが、非蛍光クエンチャー部分を含む、請求項２５に記載のオリゴマーセット。
【請求項３５】
前記セットの少なくとも１つのオリゴマーが、エネルギー移動セットの標識を含む、請求項２５に記載のオリゴマーセット。
【請求項３６】
前記セットの少なくとも１つのオリゴマーが、結合された支持体である、請求項２５に記載のオリゴマーセット。
【請求項３７】
前記オリゴマーのセットが、オリゴマーのアレイを形成する、請求項３６に記載のオリゴマーセット。
【請求項３８】
前記オリゴマーのセットのうちの１つが、核酸塩基配列ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）を含むＰＮＡオリゴマーであり、そして該セットが、核酸塩基配列：ＴＴＣ−ＡＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号３）を含むＰＮＡブロッキングプローブをさらに含む、請求項２５に記載のオリゴマーセット。
【請求項３９】
サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出、同定および／または定量するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーであって、以下：
ｉ）    １つ以上の非天然の核酸塩基を含み；
ｉｉ）  実質的に分子内または分子間で自己ハイブリダイズせず；そして
ｉｉｉ）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｒＲＮＡ中で、標的配列に配列特異的にハイブリダイズする能力を有する、ＰＮＡオリゴマーと
該サンプルを、適切なハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程；ならびに
ｂ）該ＰＮＡオリゴマーのプロービング核酸塩基配列の、該標的配列ハイブリダイゼーションを検出、同定および／または定量し、該結果を、該サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの存在、非存在および／または量と相関させる工程；
を包含する、方法。
【請求項４０】
サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出、同定および／または定量するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）該サンプルを、プロービング核酸塩基配列を含む、少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーと、適切なハイブリダイゼーション条件下で接触させる工程であって、ここで、該プロービング核酸塩基配列は、前記核酸塩基配列または該核酸塩基配列の相補体と少なくとも９０％相同であり、該核酸塩基配列は、以下：
ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）；および
ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）
からなる群から選択される工程；ならびに
ｂ）該Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸における該ＰＮＡオリゴマーのプロービング核酸塩基配列の、標的配列へのハイブリダイゼーションを検出、同定および／または定量し、該結果を、該サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在、非存在および／または量と相関させる工程；
を包含する、方法。
【請求項４１】
前記アッセイが、前記プロービング核酸塩基配列ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）を含むＰＮＡオリゴマーを用いて実行される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＮＡオリゴマーが、前記プロービング核酸塩基配列ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）を含み、そして前記サンプルが、前記核酸塩基配列ＴＴＣ−ＡＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号３）を含むブロッキングプローブとさらに接触される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記アッセイが、ｒＲＮＡを変性させる条件下で実施される、請求項３９または請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーが、少なくとも１つの検出可能な部分で標識されている、請求項３９または請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記検出可能な部分が、デキストラン結合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物からなる群から各々独立して選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ハプテンが、フルオレセイン、ビオチン、２，４−ジニトロフェニルおよびジゴキシゲニンからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーが、２つ以上の独立して検出可能な部分で標識されている、請求項３９または請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記２つ以上の独立して検出可能な部分が、独立して検出可能な発蛍光団である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーが、非蛍光クエンチャー部分を含む、請求項３９または請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーが、エネルギー移動セットの標識を含む、請求項３９または請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーが、支持体結合である、請求項３９または請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記決定されるべき核酸が、固定化されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ生物内に含まれる、請求項３９または請求項４０のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸の存在、非存在および／または量を決定するために適切なキットであって、該キットは、以下：
ａ）プロービング核酸塩基配列を含む１つ以上のＰＮＡオリゴマーであって、該プロービング核酸塩基配列が、以下：
ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）；
ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）；および
ＴＴＣ−ＡＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号３）
からなる群から選択される核酸塩基配列または該核酸塩基配列の相補体と、少なくとも９０％相同である、ＰＮＡオリゴマー；ならびに
ｂ）前記アッセイを実施するのに有用な、他の試薬、説明書または組成物；
を備える、キット。
【請求項５５】
前記キットのオリゴマーが標識されていない、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
、前記オリゴマーのプロービング核酸塩基配列の、目的の生物の核酸へのハイブリダイゼーションが、１つ以上の抗体または抗体フラグメントを用いて検出され、ここで、少なくとも１つ以上の該抗体または抗体フラグメントが、ＰＮＡ／核酸複合体に特異的に結合する、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
検出可能な部分で標識された少なくとも１つの抗体を備える、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
少なくとも１つのオリゴマーが、検出可能な部分で標識されている、請求項５４に記載のキット。
【請求項５９】
前記検出可能な部分が、デキストラン結合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステルおよび化学発光化合物からなる群から選択される、請求項５７または請求項５８のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、微生物のプローブベースの検出、分析および／または定量の分野に関する。より詳細には、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの検出、同定および／または計数に関する新規のＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
核酸ハイブリダイゼーションは、分子生物学の基礎的なプロセスである。プローブベースのアッセイは、核酸の検出、定量および／または分析に有用である。核酸プローブは、細菌、真菌、ウイルスまたは他の生物由来の核酸の存在についてサンプルを分析するために長い間使用され、そしてまた、目的の遺伝に基づく疾患状態または臨床的状態の試験に有用である。にもかかわらず、プローブベースのアッセイは、商業的な成功をおさめていない。商業的な成功が存在しないのは、少なくとも部分的に、特異性、感度および信頼性に関連する困難性の結果である。
【０００３】
その名前にもかかわらず、ペプチド核酸（ＰＮＡ）はペプチドでもなく、核酸でもなく酸でもない。ＰＮＡは、配列特異性を有する核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズし得る非天然のポリアミドである（米国特許第５，５３９，０８２号およびＥｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６５：５６６−５６８（１９９３）を参照のこと）。非天然の分子である未改変のＰＮＡは、ペプチドまたは核酸を分解することが公知の酵素の基質であることは公知でない。従って、ＰＮＡは、生物学的サンプル中で安定であり、そして有効期間が長いはずである。イオン強度に大いに依存する核酸ハイブリダイゼーションと異なり、核酸とＰＮＡとのハイブリダイゼーションは、イオン強度にほとんど依存せず、そして低いイオン強度（核酸への核酸のハイブリダイゼーションを強く嫌う条件）を好む（Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ，ｐ．５６７）。ＰＮＡ複合体の安定性およびコンフォメーションに対するイオン強度の効果は、広範に研究されている（Ｔｏｍａｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：５５  ４４−５５５２（１９９６））。配列区別は、ＤＮＡを認識するＤＮＡよりＤＮＡを認識するＰＮＡについてより有効である（Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ，ｐ．５６６）。しかし、ＰＮＡプローブを用いる点変異区別における利点は、ＤＮＡプローブと比較して、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、いくらか配列依存性であるようである（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ８：５３−６５，（１９９３）およびＷｅｉｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２７９２−２７９９  （１９９７））。
【０００４】
ＰＮＡが配列特異性を有する核酸にハイブリダイズする（Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ，ｐ．５６７を参照のこと）にもかかわらず、ＰＮＡは、費用、溶解性および自己凝集に関する配列特異的性質／問題（Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｆ．，−Ｂａｎｎｗａｒｔｈ，Ｗ．およびＴａｍ，Ｓ．，Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６８２３−６８２６（１９９５），Ｈａａｉｍａ，Ｇ．，Ｌｏｈｓｅ，Ａ．，Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：１９３９−１９４２（１９９６）ならびにＬｅｓｎｉｋ，Ｅ．，Ｈａｓｓｍａｎ，Ｆ．，Ｂａｒｂｅａｕ，Ｊ．，Ｔｅｎｇ，Ｋ．およびＷｅｉｌｅｒ，Ｋ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １６：１７７５−１７７９（１９９７），ｐ  ４３３，第１欄，２８行〜第２欄，３行を参照のこと）ならびに細胞のような複雑な系において生じ得る非特異的相互作用に関する不確実さ（Ｇｏｏｄ，Ｌ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７：４３１−４３７（１９９７）を参照のこと）に少なくとも部分的に依存して、商業的な成功を達成しにくい。しかし、安定性および自己凝集に関する問題は、減少するかまたは除去され得る（Ｇｉｌｄｅａら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３９：７２５５−７２５８（１９９８）を参照のこと）。それにもかかわらず、それらの独特の特性の理由で、ＰＮＡは、構造または機能のいずれかにおいて、明らかに核酸の等価物ではない。従って、ＰＮＡプローブは、実行および最適化について評価されるべきであり、それによって、特に、標的配列が細胞、組織または生物のような複合体サンプル中に存在する場合、特定の核酸標的配列を特異的かつ迅速に検出するのに使用され得るかどうか確認される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（１．要旨）
本発明は、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓあるいはそれらと関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを検出し、同定し、そして／または定量（計数）するのに有用なＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法およびキットに指向される。
【０００６】
従って、１つの実施形態において、本発明は、ＰＮＡオリゴマーに関する。本発明のＰＮＡオリゴマーは、プロービング核酸塩基配列を含み得、プロービング核酸塩基配列の少なくとも一部分は、以下からなる群から選択される核酸塩基配列またはその相補体に対して少なくとも９０％相同である：ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）およびＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）。このＰＮＡオリゴマーは、１つ以上の非天然ヌクレオ塩基を含み得、その結果、オリゴマーは、実質的に分子内または分子間で自己ハイブリダイズしない。ＰＮＡオリゴマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸あるいはそれに関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ内で標的配列に配列特異的にハイブリダイズし得る。前述の特性は、相互排除的でないことが理解されるべきである。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、ＰＮＡオリゴマーセットに関する。例えば、オリゴマーセットは、２つ以上のオリゴマーを含み得、これらのオリゴマーのうちの少なくとも１つは、以下からなる群から選択される核酸塩基配列またはその相補体に少なくとも９０％相同であるプロービング核酸塩基配列を含むＰＮＡオリゴマーである：ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）およびＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）。オリゴマーセットは、２つ以上のＰＮＡオリゴマーを含むセットであり得、これらのオリゴマーのうちの少なくとも１つは、１つ以上の非天然のヌクレオ塩基を含み得、その結果、オリゴマーは、実質的に分子内または分子間で自己ハイブリダイズしない。ＰＮＡオリゴマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸あるいはそれに関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ内で標的配列に配列特異的にハイブリダイズし得る。前述の特性は、相互排除的でないことが理解されるべきである。
【０００８】
なお別の実施形態において、本発明は、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓあるいはそれらと関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡを測定する方法に関する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸の測定を使用して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ胞子またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ生物を、検出し、同定し、そして／または定量（計数）し得る。例えば、この方法は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｒＲＮＡ内で標的配列に配列特異的にハイブリダイズし得る少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーとサンプルを接触する工程を包含する。ＰＮＡオリゴマーは、１つ以上の非天然のヌクレオ塩基を含み得、その結果、ＰＮＡオリゴマーは、実質的に分子内または分子間で自己ハイブリダイズしない。本方法に従って、標的配列へのプロービング核酸塩基配列のハイブリダイゼーションは、検出され、同定され、そして／または定量され得る。ハイブリダイゼーションは、標的配列とＰＮＡオリゴマーとの間の配列特異的複合体形成を必要とするので、この結果は、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在、非存在および／または定量と相関し得る。複合体の形成の決定を使用して、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在、非存在および／または低量を測定し得るので、この相関は可能である。
【０００９】
なお別の実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを測定する方法は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、以下からなる群から選択される核酸塩基配列またはその相補体に少なくとも９０％相同であるプロービング核酸塩基配列を含む少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーと、サンプルを接触する工程を包含する：ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）およびＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸あるいはそれらに関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ内での、標的配列へのＰＮＡのプロービング核酸塩基配列のハイブリダイゼーションは、検出され、同定され、そして／または定量され得る。ハイブリダイゼーションは、標的配列とＰＮＡオリゴマーとの間の配列特異的複合体形成を必要とするので、この結果は、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓあるいはそれらと関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの存在、非存在および／または定量と相関し得る。
【００１０】
なお別の実施形態において、本発明は、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｌｉｒａｃｉｓあるいはそれらと関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ、ならびに／またはサンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｌｉｒａｃｉｓあるいはそれらと関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの存在、非存在および／または数を測定するためのキットに関する。キットは、１つ以上のＰＮＡオリゴマーを含み得る。少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーは、以下からなる群から選択される核酸塩基配列またはそれらの相補体に少なくとも９０％相同であるプロービング核酸塩基配列を含み得る：ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−  ＤＴＣ（配列番号１）、ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）およびＴＴＣ−ＡＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号３）。キットはまた、アッセイを実行するために必要な他の試薬、指示書および／または組成物を含み得る。別の実施形態において、キットは、１つ以上の非天然のヌクレオ塩基を含むＰＮＡオリゴマーを含み得、その結果、ＰＮＡオリゴマーは、実質的に分子内または分子間で自己ハイブリダイズしない。
【００１１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓは、生物兵器の病原体であり得るので、本発明のＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットは、空気、食品、飲料、水、医薬品、パーソナルケア製品、乳製品、環境サンプル、郵便物および／または包装物中の、ならびに前述のいずれかの加工、貯蔵、および／または取り扱いに使用される装置中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの決定に有用であり得る。さらに、本発明のＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットは、臨床サンプルおよび／または臨床環境におけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの決定のために有用であり得る。非限定的な例のために、本発明のＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットは、培養サンプルまたはその継代培養の分析に有用であり得る。臨床的サンプルの他の非限定的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：痰、喉頭のスワブ、胃洗浄、気管支洗浄、生検、吸引液、喀出、体液（例えば、脊髄、胸膜、心膜、滑液、血液、膿、羊膜および尿）、骨髄ならびに／または組織切片、あるいは培養物またはその継代培養物。ＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットはまた、ヒトおよび／または動物を処置するのに使用される臨床的試料、装置、備品および／または製品の分析のために有用であり得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｌｉｒａｃｉｓについての分析を行うのに使用されるアッセイは、例えば、インサイチュアッセイおよび／または核酸増幅（例えば、ＰＣＲ）が行われるアッセイを含む。
【００１２】
（２．発明の考察）
（Ｉ．定義）
ａ．本明細書中で使用される場合、「核酸塩基」は、核酸技術を使用するか、またはペプチド核酸技術を使用して、それによって、核酸に配列特異的に結合し得るポリマーを生成する、通常知られているそれらの天然に存在するヘテロ環式部分および天然には存在しないヘテロ環式部分を意味する。適切な核酸塩基の非限定的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２−チオウライシル、および２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８アザ−アデニン）。適切な核酸塩基の他の非限定的な例としては、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（米国特許第６，３５７，１６３号またはＷＯ９２／２０７０２またはＷＯ９２／２０７０３、本明細書中に参考として援用される）の図２（Ａ）および図２（Ｂ）において例示される核酸塩基が挙げられる。
【００１３】
ｂ．本明細書中に使用される場合、「核酸塩基配列」は、核酸塩基含有サブユニットを含むポリマーの、任意のセグメントまたは２以上のセグメントの凝集体を意味する。適切なポリマーの非限定的例は、オリゴデオキヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡオリゴマー、核酸アナログ、および／または核酸模倣物を含む。
【００１４】
ｃ．本明細書中で使用される場合、「標的配列」は、決定することが求められるポリ核酸塩基鎖の核酸塩基配列である。この標的配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｒＲＮＡの部分列であり得る。
【００１５】
ｄ．本明細書中で使用される場合、「ポリ核酸塩基鎖」は、核酸塩基含有サブユニットを含む完全な単一のポリマー鎖を意味する。ポリ核酸塩基鎖の例は、単一の核酸鎖である。
【００１６】
ｅ．本明細書中で使用される場合、「核酸」は、ヌクレオチドまたはそのアナログから形成された骨格を有する、核酸塩基配列含有ポリマー、またはポリマーセグメントである。好ましい核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡである。いずれの疑いも回避するために、ＰＮＡは核酸模倣物であって、核酸または核酸アナログではない。
【００１７】
ｆ．本明細書中で使用される場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、２つ以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含有している任意のオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントを意味し、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、および同第６，１０７，４７０号（これらの全てが本明細書中で参考として援用されている）の中でペプチド核酸として言及されているか、またはこれらの中でペプチド核酸として特許請求されている、任意のオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」はまた、以下の刊行物中で記載されている核酸模倣物の２つ以上のサブユニットを含有している任意のオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントに対しても適用されるべきである：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、６：７９３−７９６（１９９６）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３７：４７５−４７８（１９９６）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６３７−６２７（１９９７）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７−６９０（１９９７）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３６：６９４１−６９４４（１９９５）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０８１−１０８２（１９９４）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７：１７４３−１７４６（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１、（１９９７）１：５３９−５４６；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５４７−５５４（１９９７）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１１：５５５−５６０（１９９７）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５４４１−５４５０（１９９７）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７：１１１９−１１２２（１９９７）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、８：１６５−１６８（１９９８）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、３７：３０２−３０５（１９９８）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．、３８：４２１１−４２１４（１９９７）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５３：１１６７−１１７６（１９９７）；Ｌａｇ���ｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、３：９１２−９１９（１９９７）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３（９）：１２６９−１２７２（２００１）およびＷＯ９６／０４０００号に開示されているＳｈａｈらのＰｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｉｍｉｃｓ（ＰＥＮＡＭ）。
【００１８】
特定の実施形態においては、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、以下の式の２つ以上の共有結合したサブユニットを含有しているオリゴマーセグメントまたはポリマーセグメントである：
【００１９】
【化１】
2005520554.tif 000002
ここで、Ｊはそれぞれ同じであるかまたは異なり、そしてＨ、Ｒ１、ＯＲ１、ＳＲ１、ＮＨＲ１、ＮＲ１２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩからなる群より選択される。Ｋはそれぞれ同じであるかまたは異なり、そしてＯ、Ｓ、ＮＨ、およびＮＲ１からなる群より選択される。Ｒ１はそれぞれ同じであるかまたは異なり、そして必要に応じてヘテロ原子または置換アリール基もしくは未置換のアリール基を含み得る、１個から５個の炭素原子を有しているアルキル基である。Ａはそれぞれ、単結合、式：−（ＣＪ２）ｓ−の基、および式：−（ＣＪ２）ｓＣ（Ｏ）−の基からなる群より選択され、ここで、Ｊは上記で定義されており、そしてｓはそれぞれが１個から５個までの自然数である。ｔはそれぞれ１または２であり、そしてｕはそれぞれ１または２である。Ｌはそれぞれ同じであるかまたは異なり、そしてアデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８（７−デアザ−８−アザ−アデニン）、他の天然に存在する核酸塩基アナログまたは他の天然には存在しない核酸塩基からなる群より独立して選択される。
【００２０】
特定の他の実施形態においては、ＰＮＡサブユニットは、Ｎ−［２−（アミノエチル）］グリシン骨格のＮ−α−グリシン窒素に対してメチレンカルボニル結合を介して結合された天然に存在する核酸塩基または天然に存在しない核酸塩基からなり；これは、最近、ペプチド核酸サブユニットの最も一般に使用される形態である。
【００２１】
ｆ．本明細書中で使用する場合、用語「標識」および「検出可能な部分」は、交換可能であるべきであり、そして核酸塩基ポリマー（例えば、ＰＮＡプローブ）、抗体または抗体フラグメントに結合され得、それによって核酸塩基ポリマー、抗体または抗体フラグメントを、機器または方法によって検出可能な部分をいう。
【００２２】
ｇ．本明細書中で使用する場合、「配列特異的に」は、水素結合を介した塩基対形成によるハイブリダイゼーションを意味する。標準的な塩基対形成の非限定的な例としては、チミンまたはウラシルとのアデニンの塩基対形成、およびシトシンとのグアニンの塩基対形成が挙げられる。塩基対形成モチーフの他の非限定的な例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、２−チオウラシルもしくは２−チオチミンのいずれかとのアデニンの塩基対形成；５−メチルシトシンもしくはプソイドイソシトシンのいずれかとのグアニンの塩基対形成；ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）もしくはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）のいずれかとのシトシンの塩基対形成；Ｎ９−（２−アミノプリン）、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）もしくはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）［本明細書中でときどき１文字コード「Ｄ」を用いて特定される］のいずれかとのチミンもしくはウラシルの塩基対形成；Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）との２−チオウリジンおよび２−チオチミジンの塩基対形成、ならびに、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、プソイドイソシトシン、２−チオウラシル［本明細書中でときどき１文字コード「Ｓ」を用いて特定される］および２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）もしくはＮ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）のいずれかのような他の核酸塩基との、汎用塩基（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂａｓｅ）であるＮ８（７−デアザ−８−アザ−アデニン）の塩基対形成（Ｓｅｅｌａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ、Ｒｅｓ．：２８（１７）：３２２４−３２３２（２０００）を参照のこと）。
【００２３】
ｈ．本明細書中で使用する場合、「クエンチング」は、その機構に関わらず、クエンチャー部分に関連するエネルギー移動によって引き起こされる、蛍光レポーター部分の蛍光の減少を意味する。
【００２４】
ｉ．本明細書中で使用する場合、「固体支持体」または「固体キャリア」は、オリゴマーが合成されるか、結合されるか、連結されるか、またはさもなければ固定化される、任意の固相材料を意味する。固体支持体は、「樹脂」、「固相」、「表面」および「支持体」のような用語を包含する。固体支持体は、有機ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド）ならびにコポリマーおよびその移植体から構成され得る。固体支持体はまた、無機物（例えば、ガラス、シリカ、制御された孔隙ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ−ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、または逆相シリカ）であり得る。固体支持体の構成は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲルまたは表面の形態であり得る。表面は、平面か、実質的に平面か、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性でも非多孔性でもよく、そして膨張特性を有しても非膨張特性を有してもよい。固体支持体は、ウェルの形態、凹部の形態で構成され得るか、または他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、特徴または位置で構成され得る。複数の固体支持体は、試薬のロボット送達のためにアドレス可能であるか、またはレーザー照射および共焦点顕微鏡または倒立光学顕微鏡による走査を含む検出手段によってアドレス可能な、種々の位置でアレイ中に構成され得る。
【００２５】
ｊ．本明細書中で使用する場合、「支持体結合」は、固体支持体上または固体支持体への固定化を意味する。固定化は、例えば、以下を含む任意の手段によって生じ得ることが理解される：共有結合、静電的固定化、リガンド／リガンド相互作用を介した結合、接触または表面上の堆積。
【００２６】
ｋ．「アレイ」または「マイクロアレイ」は、固体支持体上または容器の配置中に存在するオリゴマーの、予め決定された空間的配置を意味する。特定のアレイ様式が、「チップ」または「バイオチップ」として好まれる（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ  Ｂｏｏｋｓ、
Ｅａｔｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ（２０００））。アレイは、低密度数（例えば、２〜約１２）の位置、中間の密度（例えば、約１００以上）の位置、または高密度数（例えば、１０００以上）の、アドレス可能な位置を含み得る。代表的には、このアレイ形式は、製造、取り扱い、配置、保管、試薬導入、検出および／または保存を可能にする、幾何学的に規則正しい形状である。このアレイは、各位置の間に一定の間隔を有する行および列の形式で構成され得る。あるいは、これらの位置は、同等化処理またはサンプリングのために、束にされるか、混合されるか、または均質に混和され得る。アレイは、構成された複数のアドレス可能な位置を含み得、その結果、各位置は、高スループットの取り扱い、ロボット送達、マスキングまたは試薬のサンプリングのために空間的にアドレス可能であるか、またはレーザー照射および共焦点顕微鏡または倒立光学顕微鏡による走査を含む検出手段によって空間的にアドレス可能である。
【００２７】
（ＩＩ．一般的に適用可能な対象）
（ＰＮＡ合成）
ＰＮＡの化学的なアセンブリのための方法は周知である（米国特許同第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７１８，２６２号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、同第５，７６６，８５５号、同第５，７８６，４６１号、同第５，８３７，４５９号、同第５，８９１，６２５号、同第５，９７２，６１０号、同第５，９８６，０５３号、同第６，１０７，４７０号、同第６，２０１，１０３号、同第６，２２８，９８２号および同第６，３５７，１６３号；これらの全てが本明細書中で参考として援用されている（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅもまた参照のこと）。ＰＮＡ合成方法論についての一般的参考文献としては、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）もまた参照のこと。
【００２８】
ペプチド核酸の支持体結合自動化化学的アセンブリのための化学物質および機器は、現在は市販されている。標識ＰＮＡオリゴマーおよび未標識ＰＮＡオリゴマーの両方が同様に、特注ＰＮＡオリゴマーの商業的販売業者から入手可能である。ＰＮＡの化学的アセンブリは、固相ペプチド合成と類似しており、ここで、オリゴマーは、アセンブリのそれぞれのサイクルで伸長中のポリマーに添加される次の合成要素（ｓｙｎｔｈｏｎ）と縮合される反応性アルキルアミノ末端を有する。
【００２９】
ＰＮＡは、マイクロモル未満からミリモルまたはそれ以上の、任意のスケールで合成され得る。簡便には、ＰＮＡは、ＸＡＬ、ＰＡＬもしくは多くの他の市販のペプチド合成支持体を用いたＥｘｐｅｄｉｔｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、Ｆｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）保護基モノマーを使用して、２μモルのスケールで合成され得る。あるいは、適切な固体支持体（例えば、ＭＢＨＡ支持体）と共にＭｏｄｅｌ  ４３３Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が使用され得る。さらに、多くの他の自動合成器および合成支持体が利用可能である。合成は、連続フロー法および／またはバッチ法を用いて行われ得る。
【００３０】
使用される合成方法にかかわらず、標準的なペプチド化学が利用されるので、天然または天然には存在しないアミノ酸は、ＰＮＡオリゴマー中に慣用的に取り込まれ得る。ＰＮＡはポリアミドなので、ＰＮＡは、Ｃ末端（カルボキシル末端）およびＮ末端（アミノ末端）を有する。（好ましい配向の）標的配列に逆並行に結合するのに適切なハイブリダイゼーションプローブの設計の目的のために、ＰＮＡプローブの探索核酸塩基配列のＮ末端は、等価なＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル末端の等価物である。
【００３１】
（ＰＮＡ標識／改変）
ＰＮＡを標識するための非限定的な方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、同第６，２８０，９６４号、同第６，３３５，４２１号、同第６，４８５，９０１号、同第６，３６１，９４２号、および同第６，４４１，１５２号（これらの全ては、本明細書中に参考として援用される）に記載されている（本明細書の実施例の節に記載されている）か、またはさもなければ、ＰＮＡ合成およびペプチド合成の分野で周知である。ＰＮＡを標識するための方法は、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｒｆｏｌｋ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）においても議論される。ＰＮＡオリゴマーを標識するための非限定的な方法は、以下に議論される。
【００３２】
アセンブリの合成化学は本質的に同じであるので、ペプチドを標識するために一般に使用される任意の方法は、しばしば、ＰＮＡオリゴマーの標識化をもたらすように適合され得る。一般に、ポリマーのＮ末端は、カルボン酸基または活性化カルボン酸基を有する部分との反応によって標識され得る。１以上のスペーサー部分が、標識部分と核酸塩基含有オリゴマーサブユニットとの間に、必要に応じて導入され得る。一般に、スペーサー部分は、標識化反応を実施する前に取り込まれ得る。所望の場合、スペーサーは、標識内に包埋され、それによって標識化反応の間に取り込まれ得る。
【００３３】
代表的には、ポリマーのＣ末端は、標識された部分または官能基部分を、ＰＮＡオリゴマーがアセンブリされる支持体と最初に縮合することによって標識され得る。次に、ＰＮＡオリゴマーの合成要素を含む第一の核酸塩基は、標識された部分または官能基部分と縮合され得る。あるいは、１以上のスペーサー部分（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸；「Ｏ−リンカー」）が、標識部分または官能基部分とオリゴマーの第一の核酸塩基サブユニットとの間に導入され得る。一旦、調製されるべき分子が完全に構築され、標識されそして／または改変されると、これは、脱保護された支持体から切断され得、そして標準的な方法論を使用して精製され得る。
【００３４】
例えば、標識された部分または官能基部分は、リジン誘導体であり得、ここで、ε−アミノ基は、保護もしくは脱保護された官能基であるか、またはさもなければレポーター部分で改変される。レポーター部分は、発蛍光団（例えば、５（６）−カルボキシフルオレセイン）または蛍光もしくは非蛍光のクエンチャー部分（例えば、４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル（ｄａｂｃｙｌ）））であり得る。合成支持体とのリジン誘導体の縮合は、標準的な縮合（ペプチド）化学を使用して達成され得る。次いで、このリジン誘導体のα−アミノ基は、脱保護され得、そして核酸塩基配列アセンブリは、第一のＰＮＡ合成要素とリジンアミノ酸のα−アミノ基との縮合によって開始される。上記で議論したように、スペーサー部分は、適切なスペーサー（例えば、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）を第一のＰＮＡ合成要素の縮合の前にリジンアミノ酸と縮合させることによって、リジンアミノ酸と第一のＰＮＡ合成要素との間に必要に応じて挿入され得る。
【００３５】
あるいは、アセンブリされたかまたは部分的にアセンブリされたポリマー上の官能基は、オリゴマーがなお支持体に結合したままで導入され得る。次いで、官能基は、任意の目的のために利用可能である（例えば、オリゴマーを支持体に結合させるため、またはさもなければレポーター部分と反応させるため（連結後の反応を含む（連結後によって、本発明者らは、１以上の縮合／連結反応の実施によってオリゴマーが完全に形成された後の時点を意味する））のいずれかのために使用することを含む）。しかし、この方法は、適切に保護された官能基が、アセンブリの間にオリゴマーに取り込まれることを必要とし、その結果、アセンブリが完了した後に、反応性の官能基が作製され得る。従って、保護された官能基は、オリゴマー内の任意の位置（オリゴマーの末端、オリゴマーに対して内側の位置を含む）で結合され得るか、またはリンカーにとって内側の位置で連結され得る。
【００３６】
例えば、リジンのε−アミノ基は、４−メチル−トリフェニルメチル（Ｍｔｔ）、４−メトキシ−トリフェニルメチル（ＭＭＴ）または４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）保護基で保護され得る。Ｍｔｔ、ＭＭＴまたはＤＭＴ基は、穏やかな酸性条件下で合成樹脂処理することによって、（市販のＦｍｏｃ  ＰＮＡモノマーおよびＰＡＬリンカーを有するポリスチレン支持体（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を使用してアセンブリされた）オリゴマーから除去され得る。結果として、ドナー部分、アクセプター部分または他のレポーター部分は、次いで、ポリマーがなお支持体結合したままで、例えば、リジンアミノ酸のε−アミノ基と縮合され得る。アセンブリおよび標識化が完了した後、次いでこのポリマーは、周知の方法論を使用して支持体から切断され得、脱保護され得、そして精製され得る。
【００３７】
なお別の方法によって、レポーター部分は、完全にアセンブリされ、そして支持体から切断された後で、オリゴマーに結合され得る。この方法は、この標識が、オリゴマーを製造するために一般に使用される切断レジメン、脱保護レジメンまたは精製レジメンと互換性がない場合に有用である。この方法によって、ＰＮＡオリゴマーは、ポリマー上の官能基と標識上の官能基との反応によって、一般に溶液中で標識される。当業者は、カップリング溶液の組成が、オリゴマーおよび標識（例えば、ドナー部分またはアクセプター部分）の性質に依存することを認識する。この溶液は、有機溶媒、水またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。一般に、この有機溶媒は、極性の非求核溶媒である。適切な有機溶媒の非限定的例としては、アセトニトリル（ＡＣＮ）、テトラヒドロフラン、ジオキサン、メチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）が挙げられる。
【００３８】
標識されるべきポリマー上の官能基は、求核剤（例えば、アミノ基）であり得、そして標識上の官能基は、求電子剤（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）であり得る。しかし、これが逆転され得ることもまた意図され、その結果、ポリマー上の官能基は、求電子剤（例えば、カルボン酸または活性化カルボン酸）であり得、そして標識上の官能基は、求核剤（例えば、アミノ酸基）であり得る。活性化カルボン酸官能基の非限定的な例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが挙げられる。水溶液中で、ＰＮＡまたは標識のいずれかのカルボン酸基は、（選択された成分の性質に依存して）水溶性カルボジイミドを用いて活性化され得る。水性アミド形成縮合反応について特異的な試薬（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ））は、販売される市販の試薬である。このような縮合反応は、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）または１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｚｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）（ＨＯＢｔ）がＥＤＣと混合される場合に改善され得る。
【００３９】
水溶液のｐＨは、縮合反応の間に緩衝液を用いて調節され得る。例えば、縮合の間のｐＨは、４〜１０の範囲であり得る。一般に、非水性反応の塩基性は、非求核有機塩基の添加によって調節される。適切な塩基の非限定的な例としては、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミンおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが挙げられる。あるいは、ｐＨは、生物学的緩衝液（例えば、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）もしくは４−モルホリンエタン−スルホン酸（ＭＥＳ））または無機緩衝液（例えば、重炭酸ナトリウム）を使用して調節され得る。
【００４０】
（標識）
本発明の実施において使用されるＰＮＡオリゴマーまたは抗体の標識に適切な検出可能部分（標識）の非限定的な例としては、デキストラン結合体、分枝核酸検出系、発色団、発蛍光団、スピン標識、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジニウムエステル、および化学発光化合物が挙げられ得る。他の適切な標識試薬および結合方法は、ＰＮＡ、ペプチド、または核酸合成の当業者によって認識されている。
【００４１】
ハプテンの非限定的な例としては、５（６）−カルボキシフルオレセイン、２，４−ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンが挙げられる。
【００４２】
蛍光色素（発蛍光団）の非限定的な例としては、以下が挙げられる：５（６）−カルボキシフルオレセイン（Ｆｌｕ）、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）、シアニン２（Ｃｙ２）色素、シアニン３（Ｃｙ３）色素、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）色素、シアニン５（Ｃｙ５）色素、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）色素、シアニン７（Ｃｙ７）色素、シアニン９（Ｃｙ９）色素（シアニン色素２、３、３．５、５、および５．５は、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬからＮＨＳエステルとして入手され得る）またはＡｌｅｘａ色素系列（Ｍｏｌｅｃｉｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）。
【００４３】
酵素の非限定的な例としては、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ  ＰＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ１およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ダイズペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼが挙げられる。
【００４４】
（エネルギー移動）
１つの実施形態において、ＰＮＡオリゴマーは、エネルギー移動セットを用いて標識され得る。ハイブリダイゼーションの決定において有用であるエネルギー移動のために、少なくとも１つのエネルギー移動ドナー部分および少なくとも１つのエネルギー移動アクセプター部分を含むエネルギー移動セットが存在するべきである。しばしば、このエネルギー移動セットは、単一のドナー部分および単一のアクセプター部分を含むが、限定ではない。エネルギー移動セットは、１つより多くのドナー部分および／または１つより多くのアクセプター部分を含み得る。ドナー部分およびアクセプター部分は、１つ以上のアクセプター部分が１つ以上のドナー部分から移動されるエネルギーを受容するようにか、またはさもなければ、ドナー部分からのシグナルを消滅させるように、作動する。従って、１つの実施形態において、ドナー部分およびアクセプター部分の両方は、発蛍光団である。先に列挙した発蛍光団（適切な場合、適切なスペクトル特性を有する）もまたエネルギー移動アクセプターとして作動し得るが、アクセプター部分もまた、４−（（−４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル（ｄａｂｃｙｌ））のような非蛍光クエンチャー部分であり得る。エネルギー移動セットの標識は、オリゴマー末端で連結されるか、またはオリゴマー内の部位で連結され得る。１つの実施形態において、エネルギー移動セットの２つの標識の各々は、オリゴマーの最遠位末端において連結され得る。
【００４５】
ドナー部分とアクセプター部分との間のエネルギー移動は、任意のエネルギー移動プロセスにより（例えば、エネルギー移動セットに近接して結合した部分の衝突により、または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のような無放射プロセスにより）起こり得る。ドナー部分とアクセプター部分との間のエネルギー移動は、今なお定義されたメカニズムを介して起こり得る。
【００４６】
ＦＲＥＴが起こるために、エネルギー移動セットのドナー部分とアクセプター部分との間のエネルギーの移動は、これらの部分が空間的に近いこと、およびドナーの発光スペクトルが、アクセプターの吸収スペクトルとの実質的な重なりを有していることを必要とする（Ｙａｒｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−２３５（１９７９）および特に２３２頁第１欄〜２３４頁第１欄を参照のこと）。あるいは、衝突媒介（無放射）エネルギー移動は、ドナー部分の発光スペクトルがアクセプター部分の吸収スペクトルと実質的な重なりを有していてもいなくても、非常に近接して結合したドナー部分とアクセプター部分との間で起こり得る（（Ｙａｒｏｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５：２２８−２３５（１９７９）および特に２２９頁第１欄〜２３２頁第１欄を参照のこと）。このプロセスは、分子内衝突といわれる。なぜなら、消光は、ドナー部分とアクセプター部分の直接接触により引き起こされると考えられるからである（Ｙａｒｏｎら参照）。本出願におけるエネルギー移動に対する任意の言及は、これらの機構の異なる現象の全てを包含することが理解されるべきである。エネルギー移動が、１つより多くのエネルギー移動プロセスにより同時に起こり得ること、および検出可能なシグナルの変化が、２つ以上のエネルギー移動プロセスの活性の尺度であり得ることもまた理解されるべきである。従って、エネルギー移動の機構は、本発明の限定事項ではない。
【００４７】
（自己指示（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ）ＰＮＡオリゴマーにおけるエネルギー移動の検出）
エネルギー移動セットを用いて標識される場合、ＰＮＡオリゴマーが自己指示されるという。１つの実施形態において、自己指示オリゴマーは、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｋｉｔｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｐｅｒｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｏ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ」の米国特許第６，４７５，７２１号およびＷＯ９９／２１８８１として現在公開もされている関連ＰＣＴ出願（これらの両方は、本明細書に参考として援用される）に記載される様式で標識され得る。
【００４８】
自己指示オリゴマーと標的配列との間のハイブリッド形成は、エネルギー移動セットの少なくとも１つのメンバーの少なくとも１種の物理的特性を測定することによりモニタリングされ得、この物理的特性は、そのオリゴマーが非ハイブリダイズ状態で存在する場合と比較した場合に、ハイブリダイゼーション複合体が形成される場合に検出可能に異なる。本発明者らは、この現象を、オリゴマーの自己指示特性と呼ぶ。検出可能シグナルにおけるこの変化は、ドナー部分とアクセプター部分との間のエネルギー移動効率の変化から生じ、この変化は、オリゴマーの標的配列へのハイブリダイゼーションにより引き起こされる。
【００４９】
例えば、検出手段は、エネルギー移動セットのドナー発蛍光団またはアクセプター発蛍光団の蛍光を測定することを含み得る。１つの実施形態において、エネルギー移動セットは、ドナー発蛍光団の蛍光の測定を使用して、標的配列へのオリゴマーのハイブリダイゼーションを検出、同定、または定量し得るように、少なくとも１つのドナー発蛍光団および少なくとも１つのアクセプター（蛍光性または非蛍光性）クエンチャーを含み得る。例えば、標的配列へのオリゴマーのハイブリダイゼーションの際にドナー発蛍光団の蛍光は、測定可能に増加し得る。
【００５０】
別の実施形態において、エネルギー移動セットは、少なくとも１つのドナー部分または少なくとも１つのアクセプター部分のいずれかまたは両方の蛍光の測定を使用して、標的配列に対する組み合わせオリゴマーのハイブリダイゼーションを検出、同定および／または定量し得るように、少なくとも１つのドナー発蛍光団および少なくとも１つのアクセプター発蛍光団を含む。
【００５１】
自己指示されるＰＮＡオリゴマーは、インサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。しかし、自己指示されるＰＮＡオリゴマーは、リアルタイムまたはエンドポイントのいずれかにおける分析核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）に、特に十分に適合される（例えば：米国特許６，４８５，９０１号を参照のこと）。
【００５２】
（検出複合体におけるエネルギー移動の検出）
別の実施形態において、本発明のＰＮＡオリゴマーは、クエンチャー部分のみで標識され得、そして検出複合体における成分オリゴマーとして使用され得る（表題：「Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｋｉｔｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｐｅｒｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」の米国特許第６，３６１，９４２号およびＷＯ９９／４９２９３として現在も公開されている関連ＰＣＴ出願（両方とも本明細書中に参考として援用される）により充分に説明される）。この検出複合体が形成される場合、１つの成分ポリマー中の少なくとも１つのドナー部分は、第２の成分ポリマーの少なくとも１つのアクセプター部分に空間的に十分近くにされる。このセットのドナー部分およびアクセプター部分は空間的に近くに位置しているので、エネルギー移動は、エネルギー移動セットの部分間で起こる。例えば、検出複合体の成分ポリマーの１つが標的配列にハイブリダイズする際に、検出複合体が解離する場合、ドナー部分およびアクセプター部分は、エネルギー移動セットのドナー部分およびアクセプター部分からのエネルギーの実質的な移動を生じるほど十分には相互作用せず、そしてエネルギー移動セットのドナー部分および／またはアクセプター部分からの検出可能なシグナルにおける相関する変化がある。結果として、検出複合体形成／解離は、エネルギー移動セットの少なくとも１つのメンバーの少なくとも１種の物理的特性を測定することにより決定され得、この物理的特性は、この検出複合体の成分ポリマーが独立してかつ解離せずに存在する場合と比較して複合体が形成される場合に、検出可能に異なる。
【００５３】
（検出可能な部分／マルチプレックス分析および独立して検出可能な部分／マルチプレックス分析）
本発明の特定の実施形態において、マルチプレックスハイブリダイゼーションアッセイが実行される。マルチプレックスアッセイにおいて、目的の多数の条件が、同時にまたは連続して試験される。マルチプレックス分析は、そのアッセイの間またはアッセイが完了した後に、サンプル成分またはそのサンプル成分に関連したデータをソートする能力に依存する。マルチプレックスアッセイを行う際に、１つ以上の個々の独立して検出可能な部分を使用して、アッセイに使用されるべき２つ以上の異なるオリゴマーを標識し得る。独立して検出可能により本発明者らは、他の標識と独立してかつ他の標識の存在下で１つの標識を検出することが可能であることを意味する。独立して検出可能な部分の各々を区別し、そして／または定量する能力は、ハイブリダイゼーションアッセイを多重化する手段を提供する。なぜなら、このデータは、サンプル中で検出しようとする特定の標的配列と個々の独立して標識されたオリゴマーの各々とのハイブリダイゼーションと相関するからである。結果として、本発明のマルチプレックスアッセイを使用して、例えば、同じサンプル中の２つ以上の標的配列の存在、非存在、数、位置および／またはアイデンティーを同じアッセイにおいて同時にまたは連続的に検出し得る。例えば、オリゴマーセットのＰＮＡオリゴマーは、オリゴマーが独立して検出可能な場合（例えば、独立して検出可能な発蛍光団で標識される）であって、且つ異なるプロービングの核酸塩基配列を含む場合（各プローブは、同時にまたは連続的に同一のサンプルを取り出すために使用され得る）、目的の、異なる標的配列について、マルチプレックスアッセイで使用され得る。
【００５４】
（スペーサー／リンカー部分）
一般的に、スペーサーを使用して、嵩高い標識試薬がプローブのハイブリダイゼーション特性に対して有し得る不利な影響を最小にする。リンカーは、プローブに自由度および無作為性を導入し得るか、さもなければプローブもしくは成分ポリマーの２つ以上の核酸塩基配列を連結し得る。本発明の核酸塩基ポリマーのために好ましいスペーサー／リンカー部分は、１つ以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸の側鎖（例えば、リジンもしくはオルニチンの側鎖）、天然アミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）、アルキル二酸（例えば、コハク酸）、アルキルオキシ二酸（例えば、オキシニ酢酸）またはアルキルジアミン（例えば、１，８−ジアミノ−３，６−ジオキサオクタン）からなる。スペーサー／リンカー部分はまた、プローブの水溶性を改善するように、偶発的または意図的に構築され得る（例えば、Ｇｉｌｄｅａら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．３９：７２５５−７２５８（１９９８）を参照のこと）。好ましくは、スペーサー／リンカー部分は、以下の式を有する１つ以上の連結された化合物を含む：−Ｙ−（Ｏｍ−（ＣＷ２）ｎ）ｏ−Ｚ−。群Ｙは、以下からなる群から選択される：単結合、−（ＣＷ２）ｐ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＷ２）ｐ−、−Ｃ（Ｓ）（ＣＷ２）ｐ−および−Ｓ（Ｏ２）（ＣＷ２）ｐ。群Ｚは、式ＮＨ、ＮＲ２、ＳまたはＯを有する。各Ｗは、独立してＨ、Ｒ２、−ＯＲ２、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり；ここで、各Ｒ２は、−ＣＸ３、−ＣＸ２ＣＸ３、−ＣＸ２ＣＸ２ＣＸ３、−ＣＸ２ＣＸ（ＣＸ３）２、および−Ｃ（ＣＸ３）３からなる群から独立して選択される。各Ｘは、独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。各ｍは、独立して０または１である。各ｎ、ｏおよびｐは、独立して０〜１０の整数である。
【００５５】
（ハイブリダイゼーション条件／ストリンジェンシー）
ハイブリダイゼーションの当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを負うかまたは制御するために一般的に使用される因子としては、ホルムアミド濃度（または他の化学的変性試薬）、塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨおよびカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在または非存在が含まれることを認識する。オリゴマー／標的配列の組み合わせについての最適なストリンジェンシーは、しばしば、前述のストリンジェンシー因子のいくつかを固定し、次いで単一のストリンジェンシー因子を変化させる効果を決定する周知の技術により見出される。ＰＮＡのハイブリダイゼーションは、イオン強度とほとんど独立しているということを除いて、同じストリンジェンシー因子を調節して、それにより核酸へのＰＮＡのハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御し得る。アッセイに最適または適切なストリンジェンシーは、所望の程度の識別が達成されるまで各ストリンジェンシー因子を試験することにより実験的に決定され得る。
【００５６】
（適切なハイブリダイゼーション条件）
一般的に、核酸混入を引き起こすバックグラウンドが標的配列に密接に関連しているほど、より注意深くストリンジェンシーを制御しなければならない。ブロックプローブはまた、ストリンジェンシー因子の単なる最適化により起こり得る限界を超えて識別を改善するための手段として使用され得る。従って、適切なハイブリダイゼーション条件は、アッセイが、正確で（アッセイに所望の許容範囲内）かつ再現可能な結果を生じるように、所望の程度の識別が達成される条件を含む。しばしば、このことは、プローブおよび標的配列の配列特異的ハイブリダイゼーションが達成されるまで、ストリンジェンシーを調節することにより達成される。本発明において、変性条件下でアッセイを行うことが好ましくあり得る。例えば、アッセイは、低塩濃度下（例えば、１００ｍＭ未満の総イオン強度）、ホルムアミドの存在下、熱変性の直後、または前記の任意の組み合わせで実行され得る。それにもかかわらず、慣用の実験および本明細書中に提供される開示内で補助されて、当業者は、本明細書中に記載される方法および組成物を利用するアッセイを実行するための適切なハイブリダイゼーション条件を決定することができる。
【００５７】
（ブロッキングプローブ）
ブロッキングプローブは、非標的配列へのオリゴマーのプロービング核酸塩基配列の結合を抑制するために使用され得る、核酸オリゴマーまたは非核酸オリゴマー（例えば、ＰＮＡオリゴマー）である。好ましいブロッキングプローブは、ＰＮＡプローブである（Ｃｏｕｌｌら、米国特許第６，１１０，６７６号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
【００５８】
代表的には、ブロッキングプローブは、プロービング核酸塩基配列に密接に関連しており、そして好ましくは、これらは、アッセイにおいて検出しようとする標的配列と比較して、１つ以上の一点変異を含む。ブロッキングプローブは、非標的配列に対するハイブリダイゼーションにより作動して、それによりプロービング核酸塩基配列と非標的配列との間のハイブリダイゼーションにより形成される複合体より熱力学的に安定な複合体を形成すると考えられる。より安定で好ましい複合体の形成は、プロービング核酸塩基配列と非標的配列との間のより不安定な好ましくない複合体の形成をブロックする。従って、ブロッキングプローブは、本発明の方法および組成物と共に使用されて、アッセイに存在し得、それによりアッセイの性能を妨害し得る非標的配列に対する核酸または非核酸オリゴマー（例えば、ＰＮＡプローブ）の結合を抑制し得る。（Ｆｉａｎｄａｃａら、「ＰＮＡ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  Ｉｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙｓ」、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１２９〜１４１頁、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，ＵＫ，１９９９を参照のこと）。例えば、配列番号３（ＴＴＣ−ＡＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ）のＰＮＡオリゴマーが、ブロッカープローブとして配列番号２（ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ）のＰＮＡオリゴマーと組み合わせられ（例えば、キットまたはセット中で）、これによって、アッセイの精度を増大させ得る（参照：実施例１）。
【００５９】
（プロービング核酸塩基配列）
ＰＮＡオリゴマーのプロービング核酸塩基配列は、構築物の特異的配列認識部分である。従って、このプロービング核酸塩基配列は、標的配列に配列特異的にハイブリダイズするように設計されたＰＮＡサブユニットの配列である。ここで形成する標的配列／ＰＮＡオリゴマー複合体の存在、非存在および／または量は、サンプル中の目的のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの生物または芽胞の存在、非存在および／または数を決定するために使用され得る。結論として、選択されたアッセイフォーマットについてのＰＮＡオリゴマーの必要条件を考慮すると、ＰＮＡプローブのプロービング核酸塩基配列の長さは、概して、安定な複合体が、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的配列とともに形成されるように選択される。
【００６０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを決定するために適切なプロービング核酸塩基配列は、１８以下のＰＮＡサブユニットの長さを有し得る。このプロービング核酸塩基配列は、以下のうちのいずれかに少なくとも９０％相同である核酸塩基配列を含む：ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）またはＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）。このＰＮＡオリゴマーは、配列番号１または配列番号２に１００％相同であるか、またはまさに正確に配列番号１または配列番号２である、正確な核酸塩基配列が含まれ得る。上記で同定されるプロービング核酸塩基配列の相補体が含まれる。なぜなら、標的配列のコピーを調製または増幅することが可能であり、ここでこのコピーは、標的配列の相補体であり、従って、配列番号１または配列番号２の相補体に結合するからである。
【００６１】
本発明のＰＮＡプローブは、概して、標的配列に相補性のプロービング核酸塩基配列を有する。あるいは、実質的に相補性のプロービング核酸塩基配列が使用され得る。なぜなら、より大きな配列識別能が、プローブ（ここでこのプローブと標的配列との間に１以上の点変異（塩基ミスマッチ）が存在する）を利用する場合に得られ得ることが示されたからである（Ｇｕｏら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：３３１−３３５（１９９７）を参照のこと）。
【００６２】
本発明は、配列番号１または配列番号２におけるバリエーションが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの特異的検出に適切なＰＮＡオリゴマーを提供し得ることを企図する。一般的なバリエーションとしては、欠失、挿入およびフレームシフトが挙げられる。本明細書中に記載されるパラメーター内のプロービング核酸塩基配列のバリエーションは、本発明の実施形態であると考えられる。
【００６３】
（オリゴマープローブ複合体）
なお別の実施形態において、２つのプローブは、検出しようとする標的配列にハイブリダイズするように設計され、それにより、検出可能なシグナルを生成する。このことによって、各プローブのプロービング核酸塩基配列は、このアッセイにおいて検出しようとする生物の完全標的配列の半分または約半分を含む。従って、一実施形態において、このプロービング核酸塩基配列は、２つの異なるオリゴマー間、または組み合わせオリゴマーの２つのオリゴマーブロック間に分配される。非限定的例として、この２つのオリゴマーのプロービング核酸塩基配列は、米国特許第６，０２７，８９３号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるようなアッセイを用いて設計され得る。この方法論を用いると、標的配列にハイブリダイズするプローブは、標識されていても、標識されていなくてもよい。しかし、これは、検出される隣接するプローブのアニーリングによって形成されるプローブ複合体である。もっぱらＰＮＡから構成される類似の組成物は、同時係属中の米国特許第６，２８７，７７２号（本明細書中に参考として援用される）に記載された。別の非限定的例として、このプロービング核酸塩基配列は、同時係属中の２００２年３月９日出願の米国特許出願第１０／０９６，１２５号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるような組み合わせオリゴマーのオリゴマーブロックの間に分配され得る。
【００６４】
（ＰＮＡオリゴマーの固体支持体または表面への固定化）
本発明の１以上のオリゴマーは、標的配列を検出するために、表面または固体支持体に必要に応じて固定化され得る。固定化は、例えば、捕獲アッセイにおいて使用され得るか、またはアレイを調製するために使用され得る。
【００６５】
このオリゴマーは、ＵＶ架橋の周知のプロセスを使用して表面に固定化され得る。このオリゴマーはまた、脱保護に適切であるが、合成支持体から切断されない様式で表面上で合成され得る（Ｗｅｉｌｅｒ，Ｊ．ら，Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＰＮＡ）  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ａｒｒａｙｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，１４：２７９２−２７９９（１９９７年７月）を参照のこと）。なお別の実施形態において、１以上のオリゴマーは、オリゴマー上の適切な官能基と、表面の官能基との反応によって、表面に共有結合され得る（以下を参照のこと：Ｌｅｓｔｅｒ，Ａ．ら，「ＰＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ａｎｎａｐｏｌｉｓ（１９９７年１０月）で発表）。この方法は、他の方法のうちのいくつかと比較して、有利である。なぜなら、固定化のために表面に沈着したオリゴマーは、非常に精製され得、規定の化学を用いて結合され得、これによって非特異的相互作用をおそらく最小にするかまたは排除するからである。
【００６６】
ＰＮＡオリゴマーの表面への化学的結合のための方法は、固定化されるプローブの求核性基（例えば、アミンまたはチオール）と、改変される支持体上の求電子性基との反応を包含し得る。あるいは、この求核剤は、支持体上に存在し得、求電子剤（例えば、活性化カルボン酸）は、オリゴマー上に存在し得る。ネイティブのＰＮＡは、アミノ末端を有するので、ＰＮＡは、表面へＰＮＡを固定化する改変が求められてもよいし、求められなくてもよい（Ｌｅｓｔｅｒら，標題「ＰＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」のポスターを参照のこと）。
【００６７】
オリゴマーの表面への固定化に適切な条件は、一般に、ポリマーの標識に適切な条件に類似である。この固定化反応は、本質的に、標識の等価物である。このことによって、標識は、ポリマーが連結される表面で置換される（上記を参照のこと）。
【００６８】
アミノ基、カルボン酸基、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎｔｅ），  イソチオシアネートおよびマレイミド（ｍａｌｉｍｉｄｅ）基で誘導体化した、多くの型の固体支持体は、市販されている。適切な固体支持体の非限定的例としては、膜、硝子、制御孔硝子、ポリスチレン粒子（ビーズ）、シリカおよび金ナノ粒子が挙げられる。固定化の上記方法の全ては、如何様にも、限定であるとは意図されず、単に例示として提供されるに過ぎない。
【００６９】
（ＰＮＡオリゴマーまたはオリゴマーセットのアレイ）
アレイは、２つ以上のオリゴマーが、特定の位置に各々固定化されている表面である。固定化オリゴマーのプロービング核酸塩基配列は、１以上の標的生物を含み得るサンプルを取り出すように慎重に選択され得る。各固定化プローブの位置および組成は、既知であり得るので、アレイは、サンプル中に存在し得る、２以上の生物の核酸の同時検出、同定および／または定量に有用であり得る。さらに、ＰＮＡプローブのアレイは、各アッセイの後に、ハイブリダイズした核酸をストリップし、それによって同じアレイを使用して複数のサンプルを反復して分析する手段を提供することによって再生され得る（例えば、本明細書中に参考として援用されるＵＳ６，４７５，７２１を参照のこと）。従って、ＰＮＡオリゴマーまたはＰＮＡオリゴマーセットのアレイは、目的の標的生物についてサンプルを反復スクリーニングするための使用を含め、アレイを調製するために有用であり得る。
【００７０】
（ＩＩＩ．本発明の実施形態）
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、またはこれと関連するｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡを検出、同定、および／または定量する（数える）ために有用なＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットに関する。
【００７１】
（ａ．ＰＮＡオリゴマー）
一実施形態において、本発明は、ＰＮＡオリゴマーに関する。本発明のＰＮＡオリゴマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、またはこれと関連するｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡを検出、同定、および／または定量するために使用され得る。本発明のＰＮＡオリゴマーは、プロービング核酸塩基配列を含み得、ここでプロービング核酸塩基配列の少なくとも一部は、ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）およびＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）からなる群より選択される核酸塩基配列またはその相補体に対して少なくとも９０％相同である。これらの配列は、他の生物と比較して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの２３Ｓ  ｒＲＮＡのわずか２つの既知の点変異の差異を標的とする（Ａｓｈら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，９４：７５−８０（１９９２）を参照のこと）。
【００７２】
本発明のＰＮＡオリゴマーは、１以上の非天然核塩基を含むＰＮＡオリゴマーであり得、その結果、このＰＮＡオリゴマーは、分子内または分子間で実質的には自己ハイブリダイズしない。このＰＮＡオリゴマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸、またはそれと関連するｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡ内の標的配列に配列特異的にハイブリダイズし得るように設計され得る。前述の特徴は、互いに排他的ではないことを理解すべきである。
【００７３】
本発明のＰＮＡオリゴマーは、（本明細書中に先に記載したように）プロービング核酸塩基配列のみを含んでもよいし、さらなる部分を含んでいてもよい。さらなる部分の非限定的例としては、検出可能な部分（標識）、リンカー、スペーサー、天然アミノ酸もしくは非天然アミノ酸、ペプチド、酵素および／または他のＰＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡのサブユニットが挙げられる。さらなる部分は、アッセイにおいて機能的であっても機能的でなくてもよい。しかし、概して、さらなる部分は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの決定のためのアッセイの設計内で機能的であるように選択される。
【００７４】
例えば、ＰＮＡオリゴマーは、１以上の検出可能な部分で標識され得る。特に、複数のプローブを含むセットで使用される場合、１以上のオリゴマーは、２以上の独立して検出可能な部分で標識され得る。ここで各ＰＮＡオリゴマーが、多重アッセイにおいて使用される場合、独特の標識を含むことは重要である。この独立して検出可能な部分は、独立して検出可能な蛍光剤（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）であり得る。
【００７５】
本発明のオリゴマーは、インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイおよび蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイにおいて使用され得る。ＩＳＨアッセイまたはＦＩＳＨアッセイにおいて使用される過剰なプローブは、サンプルを、プローブと一定時間インキュベートした後に洗浄することによって除去され得、その結果、特異的に結合したオリゴマープローブのその検出可能な部分が、任意のなお存在するが、ハイブリダイズしていないオリゴマープローブから生じるバックグラウンドシグナルを上回って検出され得る。しかし、自己指示（ｓｅｌｆ−ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ）プローブは、この要件を最小にするかまたは避けるために使用され得る。なぜなら、過剰の自己指示オリゴマーは、最小限の検出可能なバックグラウンドシグナルが、ハイブリダイズしていないオリゴマーから生じるように、自己指示オリゴマーが、標的配列にハイブリダイズするまで、本質的に蛍光を発しないように設計され得る。
【００７６】
（非標識非核酸プローブ）
本発明のＰＮＡオリゴマーは、本発明の方法内で操作可能であるように検出可能な部分で標識される必要はない。従って、本発明のＰＮＡオリゴマーは、非標識であり得る。
【００７７】
本発明のＰＮＡオリゴマーを使用する場合、オリゴマーのプロービング核酸塩基配列の標的配列へのハイブリダイゼーションによって形成されるプローブ／標的配列複合体を検出することが可能である。例えば、プロービング核酸塩基配列の標的配列へのハイブリダイゼーションによって形成されるＰＮＡ／核酸複合体は、抗体結合条件下で、この複合体と特異的に相互作用する抗体または抗体フラグメントを使用して検出され得る。ＰＮＡ／核酸複合体に適切な抗体、ならびに調製および使用のための方法は、ＵＳ５，６１２，４５８（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００７８】
α−ＰＮＡ／核酸抗体とＰＮＡ／核酸複合体との相互作用によって形成される抗体／ＰＮＡ／核酸複合体は、いくつかの方法によって検出され得る。例えば、α−ＰＮＡ／核酸抗体は、検出可能な部分で標識され得る。適切な検出可能な部分は、本明細書中で先に記載されている。従って、この検出可能な部分の存在、非存在および／または量は、抗体／ＰＮＡ／核酸複合体および検出しようとするＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓまたはこれと関連するｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの存在、非存在および／または量と相関され得る。
【００７９】
あるいは、抗体／ＰＮＡ／核酸複合体は、１以上の二次抗体を使用して検出され得、そのうちの少なくとも１つは、検出可能な部分で標識される。代表的には、この二次抗体は、抗体結合条件下で、α−ＰＮＡ／核酸抗体に特異的に結合する。従って、二次抗体のうちの少なくとも１つの検出可能な部分の存在、非存在および／または量が、決定しようとする抗体／抗体／ＰＮＡ／核酸複合体およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、またはこれと関連するｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの存在、非存在および／または量と相関され得る。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、他の抗体または他の抗体フラグメントに特異的に結合する抗体フラグメントを含むものとする。
【００８０】
（ｂ．ＰＮＡプローブセット）
別の実施形態において、本発明は、オリゴマーセットに関する。例えば、オリゴマーセットは、２以上のオリゴマーを含み得、そのうちの少なくとも１つは、ＰＮＡオリゴマーであり、これは、ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）およびＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）からなる群より選択される核酸塩基配列またはその相補体に少なくとも９０％相同であるプロービング核酸塩基配列を含む。このＰＮＡオリゴマーセットは、２以上のＰＮＡオリゴマーを含むセットであり得、そのうちの少なくとも１つは、ＰＮＡオリゴマーであり、これは、ＰＮＡオリゴマーが、実質的に分子内でも分子間でも自己ハイブリダイズしないように、１以上の非天然核塩基を含む。このＰＮＡオリゴマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸、これと関連するｒＲＮＡまたはｒＤＮＡ内の標的配列に配列特異的にハイブリダイズし得るように設計され得る。生物の特定の群について特徴付けられるセット内のＰＮＡオリゴマーの分類は、本発明の非常に有用な実施形態であり得る。従って、本発明のＰＮＡオリゴマーは、酵母のような他の生物に対するプローブと組み合わされ得る。例えば、ＰＮＡプローブを用いた酵母の分析は、米国特許第６，２８０，９４６号（本明細書中に参考として援用される）に記載されており、ここで酵母および細菌両方のための多重アッセイは、ＰＮＡプローブセットを用いて記載されている。従って、例示的プローブセットは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの決定のためのプローブ、ならびに細菌または酵母のための他のプローブを含み得る。
【００８１】
本発明のプローブセットは、少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーを含むが、ＰＮＡオリゴマーのみを含む必要はない。例えば、本発明のオリゴマーセットは、ＰＮＡオリゴマーおよび核酸オリゴマーの混合物を含み得るが、ただしセットが、本明細書中に記載の少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーを含む。
【００８２】
オリゴマーのセットは、全てが、決定される生物の標的配列にもっぱら指向される必要はない。例えば、セットの１以上のオリゴマーは、ブロッキングプローブであり得る。この点で、オリゴマーのセットのうちのいくつかは、標的生物（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のインサイチュ決定のために標識オリゴマーと組み合わせて非標識ブロッキングプローブが使用される場合のような、他が標識されていない一方で、標識され得る。
【００８３】
オリゴマーのセットは、全てが同じ長さである必要はない。オリゴマーのセットは、代表的には、アッセイを行うために選択されることが理解されるべきである。従って、オリゴマーのセットの特徴は、それによりアッセイを最適化するように選択され得る。従って、オリゴマーの物理的特徴は、応じて選択され得る。
【００８４】
（ｃ．方法）
なお別の実施形態において、本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、またはこれと関連するｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡを決定するための方法に関する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓに特徴的な核酸の決定は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの芽胞および／または生物を検出、同定および／または定量する（数える）ために使用され得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの検出、同定および／または定量に適したＰＮＡプローブの特徴は、本明細書中に先に記載されている。
【００８５】
一実施形態において、この方法は、サンプルと、適切なハイブリダイゼーション条件下で、１以上の非天然核塩基を含む少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーとを接触させ、その結果、このＰＮＡオリゴマーが、分子内でも分子間でも実質的に自己ハイブリダイズしない工程を包含する。このＰＮＡオリゴマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸内の標的配列に配列特異的にハイブリダイズし得るように設計され得る。この方法によれば、プロービング核酸塩基配列の標的配列へのハイブリダイゼーションが、検出、同定および／または定量される。ハイブリダイゼーションは、標的配列とＰＮＡオリゴマーとの間の配列特異的複合体形成を要するので、その結果が、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在、非存在および／または量と相関され得る。標的配列とＰＮＡオリゴマーとの間の特異的複合体形成の決定が、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、またはこれと関連するｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの存在、非存在および／または量と相関されるので、この相関が可能である。
【００８６】
分子内相互作用および分子間相互作用を不安定にし得る非天然核塩基を含むＰＮＡオリゴマーが記載されている（Ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｏｎ−Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｊｅｓｐｅｒ  Ｌｏｈｓｅ，Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎを参照のこと；Ｌｏｈｓｅら，ＰＮＡＳ，９６（２１）：１１８０４−１１８０８（１９９９）もまた参照のこと）。従って、この非天然核塩基は、２−チオチミン、２−チオウリジン（本明細書中で使用される場合、一文字コードＳ）またはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）（本明細書中で使用される場合一文字コードＤ）から選択され得る。これらの核塩基を含むオリゴマーは、実質的に分子内相互作用も分子間相互作用もしないが、これらは、相補的核酸にハイブリダイゼーションし得、ここで２−チオチミンまたは２−チオウリジンが、アデニンとの塩基対形成し、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）は、チミンまたはウラシルと塩基対形成することが実証された。
【００８７】
２−チオチミンもしくは２−チオウリジンおよび／またはＮ９−（２，６−ジアミノプリン）を含むＰＮＡオリゴマーは、非常に有利なことには、変性条件下で使用され得る。低イオン強度の条件下のような変性条件下で、標的化されるべき核酸は、これが非常に自己相補的である場合ですら、実質的に自己アニールしない。これは、変性されるので、ＰＮＡオリゴマーは、存在する場合、標的配列に非常に容易にハイブリダイズし得る（Ｓｔｅｆａｎｏら，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，＃９４８  ＩＢＣ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，１９−３７（１９９７）を参照のこと）。
【００８８】
なお別の実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｒＲＮＡを決定するための方法は、サンプルを、適切なハイブリダイゼーション条件下で、ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）およびＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）からなる群より選択される核酸塩基配列、またはそれらの相補体に少なくとも９０％相同なプロービング核酸塩基配列を含む、少なくとも１つのＰＮＡオリゴマーと接触させる工程を包含し得る。ＰＮＡオリゴマーのプロービング核酸塩基配列の、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓのｒＲＮＡ内の標的配列への配列特異的ハイブリダイゼーションが、検出、同定および／または定量され得る。ハイブリダイゼーションは、標的配列とＰＮＡオリゴマーとの間の配列特異的複合体形成を要するので、その結果は、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在、非存在および／または量と相関され得る。
【００８９】
（ｄ．キット）
なお別の実施形態において、本発明は、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの存在、非存在および／または数を決定するためのキットに関する。このキットは、１以上のＰＮＡオリゴマーを含み得る。このＰＮＡオリゴマーは、ＣＣＡ−ＳＳＧ−ＧＴＡ−ＴＣＤ−ＤＴＣ（配列番号１）、ＴＴＣ−ＡＡＡ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号２）およびＴＴＣ−ＡＡＴ−ＧＧＣ−ＴＣＣ−ＣＧＣ（配列番号３）からなる群より選択される核酸塩基配列、またはそれらの相補体に少なくとも９０％相同なプロービング核酸塩基配列を含み得る。このキットは、アッセイを行うために必要な他の試薬、説明書または組成物を含み得る。このキットは、１以上の非天然核塩基を含むＰＮＡオリゴマーを含み得、その結果、このＰＮＡオリゴマーは、分子間でも分子内でも実質的に自己ハイブリダイズしない。このＰＮＡオリゴマーは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの核酸（これと関連するｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡを含む）内の標的配列に配列特異的にハイブリダイズするように設計され得る。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの検出、同定および／または定量に適したＰＮＡオリゴマーの他の特徴は、本明細書中で先に記載されている。
【００９０】
このキットは、例えば、インサイチュアッセイのため、または核酸増幅技術との使用のために使用され得る。核酸増幅技術の非限定的例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、Ｑ−βレプリカーゼ増幅（Ｑ−β）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）。従って、一実施形態において、他の試薬は、インサイチュアッセイまたは核酸増幅ベースのアッセイを行うための緩衝液、酵素、および／またはマスターミックスを含み得る。
【００９１】
本発明のキットは、１以上のＰＮＡオリゴマーおよびアッセイを行うために、そうでなければ、アッセイの実施を単純にするために選択される他の試薬または組成物を含む。プローブのセットを含むキット（ここでそのセットの少なくとも２つのプローブの各々が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ以外の少なくとも１つの標的生物を検出するために使用される）において、このセットのプローブは、１以上の独立して検出可能な部分（例えば、独立して検出可能な蛍光剤）で標識され得、その結果、各特定の標的生物は、単一のアッセイにおいて、個々に検出、同定および／または定量され得る。
【００９２】
（ｅ．例示的アッセイフォーマット）
本発明のプローブ、プローブセット、方法および／またはキットは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの検出、同定、および／または定量のために使用され得る。例えば、インサイチュハイブリダイゼーションは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを検出、同定、および／または定量するためのアッセイフォーマットとして使用され得る。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨまたはＰＮＡ−ＦＩＳＨ）は、アッセイフォーマットであり得る。特異的ＰＮＡプローブを実験的に試験するために使用される特定のＰＮＡ−ＦＩＳＨ法は、本明細書の実施例１に見出され得、それによって、標識ＰＮＡオリゴマーが、サンプル中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを非常に特異的に決定するために使用され得ることを実証する。実施例において使用される実験条件により、約３〜４時間以内に結果が得られる。
【００９３】
インサイチュハイブリダイゼーションのために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ生物は、スライド上で固定され得、そしてフィルム、カメラ、顕微鏡またはスライドスキャナで可視化され得る。あるいは、この生物は、溶液中で固定され得、次いで、フローサイトメーターで分析され得る。スライドスキャナおよびフローサイトメーターは、目的のサンプル中に存在する標的微生物の数を迅速に定量するために特に有用である。
【００９４】
本発明のプローブ、プローブセット、方法および／またはキットは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの分析のための方法に基づいた大部分の任意のプローブとともに使用され得る。例えば、本発明のプローブは、同時係属中の米国特許出願第号１０／０１７４４５（２００１年１２月１４日出願、現在では、ＷＯ０２／５７４９３として公開）により詳細に記載されるような洗浄不要方法において使用され得る。
【００９５】
（ｆ．本発明を使用するための例示的適用）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓは、生物兵器の病原体であり得るので、本発明のＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットは、空気、食品、飲料、水、医薬品、パーソナルケア製品、乳製品、環境サンプル、郵便物および／または包装物中の、ならびに前述のいずれかの加工、貯蔵、および／または取り扱いに使用される装置中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの決定に有用であり得る。さらに、本発明のＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットは、臨床サンプルおよび／または臨床環境におけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの決定のために有用であり得る。非限定的例によって、本発明のＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットは、培養サンプルの分析において有用であり得る。臨床サンプルの他の非限定的例としては、以下が挙げられる：隔膜、喉頭スワブ、胃洗浄物、気管支洗浄液、生検、吸引液、喀出物、体液（例えば、脊髄液、胸膜液、心膜液、滑液、血液、膿、羊水、および尿）、骨髄および組織切片ならびにその培養物。このＰＮＡオリゴマー、オリゴマーセット、方法および／またはキットはまた、ヒトまたは動物を処置するために使用される臨床標本、装置、設備または製品の分析のために有用であり得る。
【００９６】
（本発明の様式）
本発明は、以下の実施例によってここに例示されるが、いかなる方法において限定されることが意図されない。
【実施例】
【００９７】
（実施例１：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓの２３Ｓ  ｒＲＮＡに特異的なＰＮＡプローブを使用する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）
【００９８】
【化２】
2005520554.tif 000003
（注意：Ｓ＝２−チオウラシル、Ｄ＝Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）；ＰＮＡオリゴマーの末端を図示するのに使用される簡便なペプチド命名法、Ｏ＝８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸）
（参照株）
参照株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡおよびｔｈｅ  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。各株の培養物を、トリプシンのダイズブロスまたは市販の血液培養ボトル（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｈａｚｅｌｗｏｏｄ，ＭＯ）を使用して調製した。
【００９９】
（スメアの調整）
１滴のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を、テフロン（登録商標）コート化顕微鏡スライドのウェル（Ｃｌｅａｒ  Ｃｏａｔ，Ｅｒｉｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ）に配置し、そして２０μＬの培養物を添加し、混合し、そしてウェル全体に広げた。スメアを、熱固定化またはメタノール固定化によって固定化した。次いで、このスライドを５〜１０分間９５％のエタノール中に浸し、そして空気乾燥した。
【０１００】
（ＰＮＡプローブを使用する蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＰＮＡ  ＦＩＳＨ））
スメアを、１０％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、３０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）、０．１％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（Ｓｉｇｍａ）、０．２％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）ならびに２５０ｎＭ  Ｂａｎｔ２３Ｓ０２／Ｆｌｕまたは１０００ｎＭ  Ｂａｎｔ２３Ｓ０３／ＢＬＫと２５０ｎＭ  Ｂａｎｔ２３Ｓ０３／Ｆｌｕとの混合物のいずれかを含有する約２０μＬのハイブリダイゼーション溶液でカバーした。カバースリップを、スメア上に配置し、ハイブリダイゼーション溶液を用いて均等な適用範囲を保証し、そしてスライドを、湿度チャンバーを備えるスライド加湿器（Ｓｌｉｄｅｍｏａｔ，Ｂｏｅｃｋｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に配置し、そして９０分間５５℃にてインキュベートした。ハイブリダイゼーションに次いで、カバースリップを、水浴中、５５℃にて、約２０ｍｌ／スライドの予め温めた５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０）、１５ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、０，１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ａｌｄｒｉｃｈ）中にスライドを浸すことによって除去し、そして３０分間温めた。次いで、このスライドを空気乾燥した。各スメアを、１滴のＩＭＡＧＥＮ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｆｌｕｉｄ（ＤＡＫＯ，Ｅｌｙ，ＵＫ）を使用して完全に取り付け、そしてカバースリップでカバーした。顕微鏡検査は、蛍光顕微鏡を使用して、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ二重バンドフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）を使用して行った。
【０１０１】
（結果）
（表１．系統学的関連性を示す参照株および単離物ならびに臨床的に関連する細菌および酵母種のパネルを使用する結果）
【０１０２】
【表１】
2005520554.tif 000004
単一のＰＮＡオリゴマー（Ｂａｎｔ２３Ｓ０２／Ｆｌｕ）またはＰＮＡオリゴマーの混合物（セット）（Ｂａｎｔ２３Ｓ０３／Ｆｌｕ  ＆  Ｂａｎｔ２３Ｓ０３／ＢＬＫ）の各々を、１２のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ複合体の全ての他の株、すなわち、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂ．ｗｅｉｈｅｎｓｔｅｐｈａｎｉｅｎｓｉｓおよびＢ．ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓならびに血液培養物中に一般的に見出される３つの他の細菌種を含む）を示す参照株のパネルで試験した。結果を表１に要約する。Ｂａｎｔ２３０２／Ｆｌｕは、１００％感受性および１００％特異性を示したのに対して、Ｂａｎｔ２３Ｓ０３／Ｆｌｕ：Ｂａｎｔ２３Ｓ０３／ＢＬＫは、１００％感受性および７１％特異性を示した。図１Ａおよび１Ｂに示されるイメージ（これらは、得られた結果の例である）を参照して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（図１Ａ）は、蛍光標識化ＰＮＡオリゴマープローブの存在のために緑に染色されるが、Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓは、同じ条件下で緑に染色されず、そしてかすかに赤に変わる；おそらく自己蛍光に起因する。
【０１０３】
種々の臨床的生検（血液培養物を含む）由来のさらなる参照株および単離物を含む研究を、２つのプローブを用いる並行ハイブリダイゼーション反応において行った。その結果、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの同定は、両方のプローブによるポジティブ反応に起因する。これらのデータを表２に要約する。表２は、１００％（２／２）感受性および９３．３％（４２／４５）特異性を示した。
【０１０４】
（表２．種々のＢａｃｉｌｌｕｓ種の参照株および臨床的単離物のパネルの結果）
【０１０５】
【表２】
2005520554.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、Ｂａｎｔ２３Ｓ０２／Ｆｌｕを使用して、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによって分析したＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ（１Ａ）およびＢ．ｐｓｅｕｄｏｓｎｙｃｏｉｄｅｓ（１Ｂ）のカラー画像である。生物Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓは、蛍光標識化ＰＮＡプローブによって同定され、従って図１Ａにおいて明るい緑蛍光が現われているが、図１Ｂにおける生物Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓは、かすかな赤が現われている。
【配列表】
2005520554.tif 000006
2005520554.tif 000007
【図１Ａ】
2005520554.tif 000008
【図１Ｂ】
2005520554.tif 000009
【国際調査報告】
2005520554.tif 000010