(57)【要約】本発明は、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおけるＮａｖ１．９ナトリウムチャネルの安定なクローニングおよび発現、後根神経節ニューロンにおける自然電流に特徴的なナトリウムチャネル電流発生、ならびに組換えＮａｖ１．９ナトリウムチャネルを一時的または安定的に発現する株化細胞を企図している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質またはその断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、細胞にトランスフェクトされた場合にナトリウム電流を発生させる、発現ベクター。
【請求項２】
哺乳類Ｎａｖ１．９が、ヒト、ラットおよびマウスＮａｖ１．９からなる群より選択される、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
ラットＮａｖ１．９が、
（ａ）配列番号２のアミノ酸残基１〜１７６５、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１〜１７６５の断片を含むアミノ酸配列、および
（ｃ）少なくとも１つの保存性置換を含む、配列番号２のアミノ酸残基１〜１７６５
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ヒトＮａｖ１．９が、
（ａ）配列番号４のアミノ酸残基１〜１７９１、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸残基１〜１７９１の断片を含むアミノ酸配列、および
（ｃ）少なくとも１つの保存性置換を含む、配列番号４のアミノ酸残基１〜１７９１
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
マウスＮａｖ１．９が、
（ａ）配列番号６のアミノ酸残基１〜１７６５、
（ｂ）配列番号６のアミノ酸残基１〜１７６５の断片を含むアミノ酸配列、および
（ｃ）少なくとも１つの保存性置換を含む、配列番号６のアミノ酸残基１〜１７６５
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項６】
発現プラスミドである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
低コピー数発現プラスミドである、請求項６に記載の発現プラスミド。
【請求項８】
Ｎａｖ１．９配列に機能的に連結されたプロモーター配列を更に含む、請求項７に記載の発現プラスミド。
【請求項９】
プロモーター配列がＣＭＶプロモーターである、請求項８に記載の発現プラスミド。
【請求項１０】
第２のプロモーター配列の制御下にある選択可能マーカーを更に含む、請求項８に記載の発現プラスミド。
【請求項１１】
選択可能マーカーがネオマイシン耐性遺伝子である、請求項１０に記載の発現プラスミド。
【請求項１２】
Ｎａｖ１．９がラットＮａｖ１．９であり、ラットＮａｖ１．９が配列番号２０を含む、請求項７に記載の発現プラスミド。
【請求項１３】
前記配列番号２をコードするオープンリーディングフレームに隣接する５’末端において、配列番号１９のオープンリーディングフレームに対する５’側の非翻訳核酸残基のうち少なくとも約１〜１００個を更に含む、請求項１２に記載の発現プラスミド。
【請求項１４】
少なくとも約１〜５０の前記５’非翻訳核酸残基を含む、請求項１３に記載の発現プラスミド。
【請求項１５】
３８の前記５’非翻訳核酸残基を含む、請求項１４に記載の発現プラスミド。
【請求項１６】
発現プラスミドがｐｒＮａＮである、請求項１５に記載の発現プラスミド。
【請求項１７】
ｐｒＮａＮおよび請求項１２に記載のプラスミドからなる群より選択されるプラスミドを含む、組換え細胞。
【請求項１８】
ヒスチジンタグ配列をコードする核酸配列を更に含み、タグの発現が前記オープンリーディングフレームの発現を制御するのと同一のプロモーターの制御下にある、請求項１３に記載の発現プラスミド。
【請求項１９】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ラベルポリペプチドをコードする核酸配列を更に含み、ＧＦＰの発現が前記オープンリーディングフレームの発現を制御するのと同一のプロモーターの制御下にある、請求項１８に記載の発現プラスミド。
【請求項２０】
ｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰである、請求項１９に記載の発現プラスミド。
【請求項２１】
ｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰおよび請求項１９に記載のプラスミドからなる群より選択されるプラスミドを含む、組換え細胞。
【請求項２２】
哺乳類Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質またはその断片をコードする核酸配列を含む発現プラスミドであって、哺乳類Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質またはその断片が、９６２番目のアミノ酸におけるセリンからプロリンへの変化、１２８２番目のアミノ酸におけるロイシンからプロリンへの変化、および１０００〜１０１０番目のアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する配列番号２を含む、発現プラスミド。
【請求項２３】
発現プラスミドがｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮである、請求項２２に記載の発現プラスミド。
【請求項２４】
ｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮおよび請求項２２に記載のプラスミドからなる群より選択されるプラスミドを含む、組換え細胞。
【請求項２５】
Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネル依存性ナトリウム電流を発生させる細胞または株化細胞の作製方法であって、
（ａ）Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を提供する工程と、
（ｂ）Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質の発現がトランスフェクトされた細胞内でナトリウム電流を発生させる条件下で、前記細胞を培養する工程と
を含む方法。
【請求項２６】
哺乳類Ｎａｖ１．９がヒト、ラットおよびマウスＮａｖ１．９からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
発現ベクターが発現プラスミドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
発現プラスミドが、ｐｒＮａＮ、ｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰ、および配列番号１９を含むプラスミドからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
細胞内のナトリウム電流を調節する薬剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）請求項２５に記載の方法によって作製された細胞または株化細胞を当該薬剤に曝露すること、
（ｂ）薬剤への曝露後のナトリウム電流を測定すること、ここで、ナトリウム電流のレベルの変化が細胞内のナトリウム電流を調節できる薬剤の指標となる、
を含む、方法。
【請求項３０】
請求項１に記載の発現ベクターを含む、組換え細胞。
【請求項３１】
ベクターがウィルスベクターである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
ウィルスベクターが、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、およびバキュロウィルスからなる群より選択される、請求項３１に記載のウィルスベクター。
【請求項３３】
請求項３１に記載のウィルスベクターを含む、組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【関連出願データ】
【０００１】
本願は、米国仮出願第６０／３６５，５５０号（２００２年３月２０日出願）の利益を主張するものであり、参照によりその全体を本願に組み入れる。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、テトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルをコードする発現ベクター、組換えナトリウムチャネルタンパク質の発現、およびテトロドトキシン耐性ナトリウムチャネルを一時的かつ安定的に発現する株化細胞に関する。
【背景】
【０００３】
電位依存性ナトリウムチャネルは、興奮性細胞（ニューロンや筋線維）が電気インパルスを発生し伝達することを可能にする分子バッテリーとして作用する特化された一種のタンパク質分子である。ラット脳に由来する電位依存性ナトリウムチャネルは、３つのサブユニット、すなわち、ポア形成αサブユニット（２６０ｋＤａ）と、αサブユニットの特性を調節しうる２つの補助サブユニットであるβ１（３６ｋＤａ）およびβ２（３３ｋＤａ）と、から構成されており、αサブユニットは細胞膜を貫通するＮａ＋電流を発生する機能的チャネルを形成するのに充分である（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６，５００〜５０６頁；Ｉｓｏｍら（１９９４）Ｎｅｕｒｏｎ  １２，１１８３〜１１９４頁）。９つの異なる脊椎動物のαサブユニットが同定されており、これらは広範な遺伝子ファミリーのメンバーによってコードされており（Ｎｏｒｔｈ（１９９５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ（７３〜１００頁），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｋｏｐｉａｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３７９，２５７〜２６２頁；Ａｋｏｐｉａｎら（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４００，１８３〜１８７頁；Ｓａｎｇａｍｅｓｗａｒａｎら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，５９５３〜５９５６頁）、それらのうちの多くについてそれぞれのオーソログがヒトを含む様々な哺乳類の種からクローン化されている。特定のαサブユニットが組織および発生特異的な様式に発現される（Ｂｅｃｋｈら（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８，３６１１〜３６１６頁；Ｍａｎｄｅｌ（１９９２）Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１２５，１９３〜２０５頁）。電位依存性ナトリウムチャネルのαサブユニットの異常な発現パターンまたは変異が、多くのヒトおよび動物の疾患の根源となっている（Ｒｏｄｅｎら（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３，Ｈ５１１〜５２５頁；Ｐｔａｃｅｋ（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７，２５０〜２５５頁；Ｃａｎｎｏｎ（１９９７）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．７，２４１〜２４９頁；Ｃａｎｎｏｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９，３〜１０頁；Ｒｉｚｚｏら（１９９６）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３６，３〜１２頁）。
【０００４】
電位依存性ナトリウムチャネルのαサブユニットは、類似する予測構造を有するが内部の相同性が異なる４つのドメイン（Ｄ１〜４）で構成され、それらは３つの細胞内ループ（Ｌ１〜３）によって連結されている。これら４つのドメインは折り畳まれて、ポアを介して細胞質と細胞外空間の両方に開口するチャネルを形成する。このポアは細胞膜の生理的な状態に応じて開閉する。
【０００５】
各ドメインは、タンパク質を細胞内および細胞外リンカーによって膜内を進めるようにさせる、６つの膜貫通セグメント（Ｓ１〜６）からなる。４つのドメインのそれぞれのＳ５〜Ｓ６セグメントは、チャネルのポアを裏打ちする配列、およびフィルターとして機能する高度に保存されたアミノ酸のサブセットを含み、その高度に保存されたアミノ酸のサブセットはチャネルポアを介してナトリウムイオンを選択的に細胞質に移動させ、それにより膜電位を発生させる。４つのドメインのそれぞれにある両親媒性Ｓ４セグメントは、３つのアミノ酸毎に繰り返される塩基性残基に富んでおり、電位センサーとして機能し、細胞膜の内外の電位差の変化に伴ってコンフォメーションの変化を受ける。これが、今度はタンパク質のコンフォメーション変化を誘発して、細胞外ナトリウムイオン勾配に対してポアを開放させる。
【０００６】
既知の殆どの電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニットにおいて、チャネルは、ポアの開放（活性化）から数ミリ秒以内に迅速に閉じて非作動状態（不活性化）に変わる。その一方、ＳＮＳ型チャネルはゆっくりと不活性化するとともに、活性化するためにより大きな電圧変化を必要とする。Ｌ３は、ドメインＤ３とＤ４とを連結するループであり、活性化後にポアを閉じてチャネルを不活性化状態に誘導する細胞内の栓として機能するトリペプチドを含む。不活性化後、これらのチャネルは更なるコンフォメーション変化を受けて、自身の休止状態から回復し、活性化可能な状態になる。この期間を不活性化からの回復（リプライミング）と呼ぶ。様々なチャネルが、様々な速度でリプライムするが、ＳＮＳにおけるリプライミングは比較的に迅速である。
【０００７】
アミノ酸の類似性により、電位依存性ナトリウムチャネルファミリーは、更に２つのサブファミリーに分類されている（Ｆｅｌｉｐｅら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，３０１２５〜３０１３１頁）。クローン化された９つのチャネルのうち８つが、サブファミリー１に属する。それらは、とりわけＳ４膜貫通セグメントにおいて、多くの共通した構造的特徴を有している。それらのうちいくつかは、不活性化とリプライミングの異なる速度論的特性を有することが示されている。サブファミリー２（非典型的チャネルとも呼ばれる）の単一のチャネルが、ヒト、ラットおよびマウスの組織から同定されている。このサブファミリーの主たる特徴は、Ｓ４セグメントにおいて塩基性残基の数が少ないことであり、そのため、サブファミリー１とは異なる電位依存性を有すると予想される。サブファミリー２チャネルの生理学的機能は、その電気生理学的特性が未だ解明されていないために、現在のところ分かっていない。
【０００８】
また、神経毒の一種であるテトロドトキシンによる電位依存性ナトリウムチャネルの阻害により、上記チャネルを感受性表現型（ＴＴＸ−Ｓ）と耐性表現型（ＴＴＸ−Ｒ）とに機能的に分類することもできる。これまで、２つの哺乳類ＴＴＸ−Ｒチャネルが同定されている。一方は心筋細胞および非常に限定された領域の中枢神経系（ＣＮＳ）に特異的であり、もう一方であるＳＮＳは、後根神経節（ＤＲＧ）および三叉神経節の末梢ニューロン（ＰＮＳ）に限定されている。ＴＴＸに対する耐性または感受性を与える特異的アミノ酸残基は、チャネルポアのイオン選択性フィルターに限局されている。
【０００９】
Ｎａｖ１．９（ＮａＮ：Ｎｅｗ  ａｎｄ  Ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅとして知られていた）は電位依存性ナトリウムチャネルαサブユニットであり、当該サブユニットはＴＴＸ−Ｒであり、後根神経節（ＤＲＧ）および三叉神経節の小さな（＜３０μｍ）知覚神経細胞内で優先的に発現されるが、ＣＮＳニューロンおよびグリアまたは筋肉においては発現されない。大脳または網膜内では低レベルのＮａｖ１．９を検出することができるが、小脳、脊髄、またはＤＲＧ内の衛星細胞若しくはシュワン細胞においては、Ｎａｖ１．９を検出することができない。
【００１０】
電位依存性ナトリウムチャネルの関連する目印の配列のすべてが、Ｎａｖ１．９の予測される位置に存在しており、このことはＮａｖ１．９がナトリウムチャネルファミリーに属していることを示唆している。しかしながら、Ｎａｖ１．９は、これまでに同定されたすべての他のナトリウムチャネルとは異なっており、それぞれに対しての配列同一性が５３％未満である。また、Ｎａｖ１．９は、Ｎａｖ１．８（以前はＳＮＳ；ＰＮＳにおいて同定されている唯一の他のＴＴＸ−Ｒナトリウムチャネルサブユニットである）とは異なる。Ｎａｖ１．９の正常な発現の場合は、Ｎａｖ１．９の表面発現が細胞接着分子コンタクチン／Ｆ３に関連しているようであるが（Ｌｉｕら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４６５５３〜４６５６１頁）、これは、２つのタンパク質の共発現によってＮａｖ１．９の表面発現が増加したためである。この発現は、神経成長因子（ＮＧＦ）やグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などのニューロトロフィンによって調節することができる（Ｄｉｂ−Ｈａｊｊ（２００２）、レビュー中の原稿）。
【００１１】
これまで、Ｎａｖ１．９は、ＳＮＳに基づいたまたはＳＮＳ特異的なプライマー若しくはプローブを用いることなくクローン化されていた（ＷＯ９７／０１５７７）。更に、すべてのサブファミリー１のメンバーに対してＮａｖ１．９の類似性が限られるのに匹敵して、Ｎａｖ１．９およびＮａｖ１．８は、それらの予測されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）において４７％の類似性しか有していない。既存のαサブユニットとの低い配列類似性から、Ｎａｖ１．９は単に既存のチャネルの変異体ではなく新しい遺伝子であることが明らかに確認された。Ｎａｖ１．９は、Ｎａｖｌ．８とは異なる特性を有しているかもしれない、新規で、これまでに同定されていない、３つめのクラスのＴＴＸ−Ｒチャネルのプロトタイプであり得ることが、他の電位依存性チャネルと比較しての配列の差異から示されている。Ｎａｖ１．９およびＮａｖ１．８は侵害受容ＤＲＧおよび三叉神経細胞に存在するが、それらは異なる様式で薬理学的介入に応答する可能性がある。知覚ＤＲＧおよび三叉神経細胞におけるＮａｖ１．９の優先的発現は、これらの神経細胞の挙動を選択的に改変するための標的を提供する一方、脳および脊髄内の他の神経細胞には影響を与えない。ＤＲＧ侵害受容ニューロンに特徴的であり、痛覚メッセージの伝達に寄与し、神経損傷後または他の疼痛状態における異常な発火パターンに寄与する、「ＴＴＸ−Ｒ」電流の機能を調節するように設計された薬物の効果をより完全に理解するために、Ｎａｖ１．９チャネルの特性を更に解明することは重要であろう。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、後根神経節または三叉神経節において優先的に発現される電位依存性ナトリウムチャネル（Ｎａｖ１．９チャネル）をコードする単離された核酸の配列の機能的発現、およびＮａｖ１．９によって一時的または安定的に形質転換され、Ｎａｖ１．９を発現する組換え細胞に関する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、哺乳類Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質またはその断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターを包含し、上記発現ベクターは、細胞にトランスフェクトされた場合にナトリウム電流を発生させる。好ましい実施形態では、哺乳類Ｎａｖ１．９は、ヒト、ラットまたはマウスＮａｖ１．９からなる群より選択される。ある実施形態では、ラットＮａｖ１．９は、配列番号２の１〜１７６５番目のアミノ酸残基、配列番号２の１〜１７６５番目のアミノ酸残基の断片を含むアミノ酸配列、および少なくとも１つの保存性置換を含む配列番号２の１〜１７６５番目のアミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、ヒトＮａｖ１．９は、配列番号４の１〜１７９１番目のアミノ酸残基、配列番号４の１〜１７９１番目のアミノ酸残基の断片を含むアミノ酸配列、および少なくとも１つの保存性置換を含む配列番号４の１〜１７９１番目のアミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
更に別の実施形態では、マウスＮａｖ１．９は、配列番号６の１〜１７６５番目のアミノ酸残基、配列番号６の１〜１７６５番目のアミノ酸残基の断片を含むアミノ酸配列、および少なくとも１つの保存性置換を含む配列番号６の１〜１７６５番目のアミノ酸残基からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは発現プラスミドである。好ましい実施形態では、発現プラスミドは低コピー数発現プラスミドである。より好ましい実施形態では、発現プラスミドはＮａｖ１．９配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含む。ある実施形態では、プロモーター配列はＣＭＶプロモーターである。更に好ましい実施形態では、発現プラスミドは第２のプロモーター配列の制御下にある選択可能マーカーを更に含む。ある実施形態では、選択可能マーカーはネオマイシン耐性遺伝子である。
【００１７】
本発明は、ラットＮａｖ１．９を含む発現プラスミドを包含する。好ましい実施形態では、ラットＮａｖ１．９は配列番号２０を含む。また、別の好ましい実施形態では、発現プラスミドは、配列番号２０をコードするオープンリーディングフレームに隣接する５’末端において、配列番号１９のオープンリーディングフレームに対する５’側の非翻訳核酸残基のうち少なくとも約１〜１００個を更に含む。いくつかの実施形態では、発現プラスミドは少なくとも約１〜５０個の上記５’非翻訳核酸残基を含むが、好ましい実施形態では、発現プラスミドは３８個の上記５’非翻訳核酸残基を含む。ある実施形態では、発現プラスミドはｐｒＮａＮである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明の発現プラスミドは、ヒスチジンタグ配列をコードする核酸配列を更に含み、上記タグの発現は上記オープンリーディングフレームの発現を制御するのと同一のプロモーターの制御下にある。更に別の実施形態では、本発明は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ラベルポリペプチドをコードする核酸配列を更に含む発現プラスミドを包含し、上記ＧＦＰの発現は上記オープンリーディングフレームの発現を制御するのと同一のプロモーターの制御下にある。好ましい実施形態では、発現プラスミドはｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰである。本発明は、本発明のプラスミドを含む組換え細胞も更に包含する。好ましい実施形態では、組換え細胞はｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰプラスミドを含む。
【００１９】
本発明は、哺乳類Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質またはその断片をコードする核酸配列を含む発現プラスミドを包含し、上記哺乳類Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質またはその断片は、トランスフェクトされた細胞でナトリウム電流を発生しない。いくつかの実施形態では、発現プラスミドは配列番号２をコードするオープンリーディングフレームを含むラットＮａｖ１．９である。別の実施形態では、配列番号２は、９６２番目のアミノ酸におけるセリンからプロリンへの変化、１２８２番目のアミノ酸におけるロイシンからプロリンへの変化、および１０００〜１０１０番目のアミノ酸残基の欠失からなる群より選択される少なくとも１つの変異を含む。好ましい実施形態では、発現プラスミドはｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮである。本発明は、ｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮを含む上記プラスミドのいずれかを含む組換え細胞も包含する。
【００２０】
本発明は、Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネル依存性ナトリウム電流を発生する細胞または株化細胞の作製方法も包含し、当該方法は、Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターによりトランスフェクトされた細胞を提供する工程と、Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質の発現がトランスフェクトされた細胞内でナトリウム電流を発生させる条件下で前記細胞を培養する工程とを含む。いくつかの実施形態では、哺乳類Ｎａｖ１．９はヒト、ラットおよびマウスＮａｖ１．９からなる群より選択される。別の実施形態では、上記方法における発現ベクターは発現プラスミドである。好ましい実施形態では、発現プラスミドはｐｒＮａＮ、配列番号１９を含むプラスミド、およびｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰからなる群より選択される。
【００２１】
本発明は、細胞内のナトリウム電流を調節する薬剤のスクリーニング方法を包含し、当該方法は、上記方法によって作製された細胞または株化細胞を当該薬剤に曝露すること、および薬剤への曝露後のナトリウム電流を測定すること、を含み、ナトリウム電流のレベルの変化が細胞内のナトリウム電流を調節できる薬剤の指標となる。
【００２２】
本発明は、本発明の発現ベクターのいずれかを含む組換え細胞も包含する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、トランスフェクトされた細胞内でナトリウム電流を発生させる哺乳類Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質またはその断片を一時的に発現する。他の実施形態では、前記細胞は、トランスフェクトされた細胞内でナトリウム電流を発生させる哺乳類Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルタンパク質またはその断片を安定的に発現する。ある実施形態では、発現ベクターはアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、およびバキュロウィルスからなる群より選択されるウィルスベクターである。
【発明の詳細な説明】
【００２３】
本発明は、Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルαサブユニットをコードする核酸配列を含む発現ベクターと、Ｎａｖ１．９を一時的または安定的に発現している株化細胞とに関し、上記αサブユニットは体（後根神経節すなわちＤＲＧ）および顔面（三叉神経節）を支配する知覚神経において優先的に発現される電位依存性のＴＴＸ−Ｒである。
【００２４】
定義
本明細書における「融合タンパク質」という用語は、あるタンパク質分子から別のタンパク質分子へのＣ末端とＮ末端との融合のことをいう。本発明の融合タンパク質は、典型的にはリンカーペプチド配列を利用した構築物を含む。タンパク質分子は、２つまたはそれ以上のタンパク質分子を含む単一の融合タンパク質を生成するように互いに融合される。
【００２５】
本明細書における「調節する」という用語は、特定の受容体、そのリガンドまたは電流の発現および／または活性の上方制御（アップレギュレーション）または下方制御（ダウンレギュレーション）のことをいう。例えば、ある薬剤は、ナトリウム電流を抑制（低下）または増強（上昇）することによって、ナトリウム電流を調節し得る。同様に、ある薬剤は、発現されるＮａｖ１．９チャネルの発現レベルまたはＮａｖ１．９チャネルの活性を調節し得る。
【００２６】
本明細書における「ナトリウム電流」または「Ｎａ＋電流」という用語は、細胞膜を通過するナトリウムイオンの流れをいい、通常、特定のイオン（本発明においては、ナトリウムイオン）を特異的に透過させるチャネル（特有のタンパク質分子）を介する流れである。
【００２７】
本明細書における「電位依存性」という用語は、細胞が一定の膜電位に達したときに開くイオンチャネルのことをいう。電位感受性ナトリウムチャネルは、膜が脱分極したときに開く。その後、上記チャネルはナトリウムイオンを細胞内に流れ込ませて、更なる脱分極を生み出す。これにより細胞に活動電位を与える。
【００２８】
本明細書における「ＴＴＸ−Ｒ」および「ＴＴＸ−Ｓ」という用語は、それぞれ、テトロドトキシン（ある特定の種が産生する神経毒）の存在に対して耐性または感受性である細胞膜を通過する電流のことをいう。
【００２９】
本明細書における「ナトリウム電流の調節剤」という用語は、ある薬剤が、当該薬剤に曝露されていない対照細胞と比較して、当該電流に変化させる場合のことを一般的にいう。好ましい調節剤は、他のナトリウムチャネルの電流に影響を与えることなく、当該電流を選択的に調節するか、または他のチャネルよりも目的チャネルにおいてナトリウム電流をはるかに大幅に調節する。
【００３０】
本明細書における「ナトリウム電流の阻害剤」という用語は、ある薬剤が、当該薬剤に曝露されていない対照細胞と比較して、当該電流を低下させる場合のことを一般的にいう。好ましい阻害剤は、他のナトリウムチャネルの電流に影響を与えることなく、当該電流を選択的に阻害するか、または他のチャネルよりも目的チャネルにおいてナトリウム電流をはるかに大幅に阻害する。
【００３１】
本明細書における「ナトリウム電流の増強剤」という用語は、ある薬剤が、当該薬剤に曝露されていない対照細胞と比較して、当該電流を上昇させる場合のことを一般的にいう。好ましい増強剤は、他のナトリウムチャネルの電流に影響を与えることなく、当該電流を選択的に増大させるか、または他のチャネルよりも関心チャネルにおいてナトリウム電流をはるかに大幅に増大させる。
【００３２】
本明細書における「特異的にハイブリダイズする」という用語は、厳密（ストリンジェント）な、好ましくは中程度に厳密な、またはより好ましくは高度に厳密な条件下で、Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルをコードする核酸、例えば配列番号１、３、５または１９のＤＮＡ配列、とハイブリダイズする核酸のことをいう。厳密な条件の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．）に記載されている。「中程度に厳密な条件」とは、本発明のＮａｖ１．９配列に対して少なくとも約７０％の同一性を有する核酸配列の同定を意味し、核酸分子のハイブリダイゼーションは、０．１％  ＳＤＳ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）からなるバッファ中で行われる。「高度に厳密な条件」とは、本発明のＮａｖ１．９配列に対して少なくとも約９０％の同一性を有する核酸配列の同定を意味し、核酸分子のハイブリダイゼーションは、０．１％  ＳＤＳ，１０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）からなるバッファ中で行われる。
【００３３】
本明細書における「優先的に発現した」という用語は、電位依存性ナトリウムチャネルが、所定の組織において、他の組織に比べて検出可能なほど多くの量が発現される場合のことをいう。例えば、後根神経節または三叉神経節において優先的に発現した電位依存性ナトリウムチャネルは、他の組織や細胞型の場合と比較して、後根神経節または三叉神経節において検出可能なほど多量に認められる。電位依存性ナトリウムチャネルの量は、特定のＲＮＡのレベルの検出や特異的抗体によるチャネルタンパク質の検出を含む、任意の利用可能な手段によって検出することができる。
【００３４】
本明細書における「Ｎａｖ１．９タンパク質」という用語は、後根神経節において優先的に発現し、テトロドトキシン耐性のナトリウム電流を発生させることができる、ナトリウムチャネルタンパク質をいう。例として、ヒト（配列番号４）、マウス（配列番号６）およびラット（配列番号２）のＮａｖ１．９タンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。本明細書における「Ｎａｖ１．９」という用語は、本発明の分野において周知の「ＮａＮ」という用語と同義である。
【００３５】
本明細書における「ベクター」という用語は、任意の遺伝要素、例えば、プラスミド、染色体、ウィルスであって、細胞内における自発的ポリヌクレオチド複製単位として挙動するものをいう。適当なベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、およびレトロウィルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞内にベクターをライゲーションまたは挿入するのに必要なポリヌクレオチド配列を含む。このような配列は、宿主生物によって異なり、転写を達成するためのプロモーター配列、転写を高めるためのエンハンサー配列、リボゾーム結合部位配列、および転写および翻訳終結配列を含む。
【００３６】
本明細書における「Ｎａｖ１．９ベクター」という用語は、任意のＮａｖ１．９タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターをいい、当該核酸配列の例として、ヒト（配列番号４）、マウス（配列番号６）およびラット（配列番号２）を挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＮａｖ１．９ベクターは、細胞内で発現された場合に、ナトリウム電流を発生できるＮａｖ１．９タンパク質の発現を達成するように改変されている。そのような改変としては、例えば、Ｎａｖ１．９タンパク質をコードする核酸配列における改変であって、ナンセンスまたはサイレント変異、Ｎａｖ１．９の発現またはＮａｖ１．９ベクターのコピー数に影響を及ぼすことのできる非翻訳上流配列の組込み、および／またはＮａｖ１．９の発現またはＮａｖ１．９ベクターのコピー数に影響を及ぼす任意のヌクレオチド配列のＮａｖ１．９ベクター内への組込み、が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書における「低コピー数組換え発現ベクター」という表現は、１細胞あたりに約１０〜２０コピー未満、好ましくは１細胞あたりに約５コピー、より好ましくは１細胞あたりに約２〜３コピーもしくはそれ未満の発現ベクターが存在する発現ベクターのことをいう。
【００３８】
本明細書における「宿主細胞」という用語は、原核もしくは真核生物または細胞のことを一般的にいい、タンパク質を発現することができ、かつ発現ベクターまたは他の転移されたＤＮＡのレシピエントとして用いることができる、もしくは用いられてきた任意のトランスフォーメーション可能なもしくはトランスフェクション可能な生物または細胞が含まれる。宿主細胞は、Ｎａｖ１．９の精製のためのタンパク質生産、または形質転換細胞を用いた膜電位測定のためのＮａｖ１．９の膜発現に用いることができる。好ましい真核宿主細胞としては、酵母、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、確立された神経株化細胞、褐色細胞腫細胞、神経芽細胞腫線維芽細胞、ＨａＬａ細胞、および横紋筋肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましい真核宿主細胞としては、ＨＥＫ２９３細胞および後根神経節細胞が挙げられる。
【００３９】
本明細書における「トランスフォーム（形質転換）された」という用語は、原核宿主細胞内に外来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を挿入するための、任意の公知の方法をいう。「トランスフェクト（形質移入）された」という用語は、真核宿主細胞内に外来ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を挿入するための任意の公知の方法のことをいう。このようなトランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞には、挿入されたＤＮＡが宿主細胞内で複製できるようにされた、安定的にトランスフォームまたはトランスフェクトされた細胞が含まれる。また、限られた期間だけ挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを発現する一時的発現細胞も含まれる。トランスフォームまたはトランスフェクションの方法は形質転換される宿主細胞に応じて異なる。そうした方法としては、細菌をバクテリオファージベクター、プラスミドベクター、またはコスミドＤＮＡでトランスフォームすること；酵母を酵母ベクターでトランスフェクトすること；昆虫株化細胞をウィルス（例えば、バキュロウィルス）に感染させること；および哺乳類株化細胞をプラスミドまたはウィルス発現ベクターあるいは組換えウィルスでトランスフェクトすることが挙げられるが、これらに限定されない。哺乳類細胞のトランスフェクションに適したウィルスベクターの例としては、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ポリオウィルス、ＳＶ４０、ワクシニア、レトロウィルス、ＨＩＶおよびエンベロープタンパク質（例えば、水疱性口内炎ウィルスＧタンパク質、ＶＳＶＧ）によりシュードタイプされたＢＩＶまたはバキュロウィルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。ウィルスベクターによるトランスフェクションは、複製を欠失した組換えウィルスベクターの全部または一部にトランス相補的なベクターである、ヘルパーウィルスの使用を含んでいてもよい。適切なプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２，ｐＡＣ１０５，ｐＶＡ５１，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＫＨ４７，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＢ１１０，ｐＭＢ９，ｐＢＲ３２５，Ｃｏｌ  Ｅｌ，ｐＳＣ１０１，ｐＢＲ３１３，ｐＭＬ２１，ＲＳＦ２１２４，ｐＣＲｌ，ＲＰ４，ｐＢＲ３２８などが挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクションは、ポリヌクレオチドの直接取り込みによるもの、例えばリポフェクションやマイクロインジェクションなどであってもよい。また、トランスフェクションは、微粒子銃トランスフェクションによるもの、例えば、ベクターを金粒子の表面にコーティングし、遺伝子銃を用いて宿主細胞に送達するようなものであってもよい。
【００４０】
トランスフォーメーションとトランスフェクションによって、挿入ＤＮＡが、宿主細胞のゲノム中に取り込まれるか、あるいは、挿入ＤＮＡがプラスミドの形で宿主細胞内に維持される。形質転換の方法は技術的に周知であり、ウィルス感染、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性直接取り込みなどが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本発明は同等の機能を果たすこれまでに知られている他の形態の発現ベクター、宿主細胞および形質転換技術も包含するものとする。
【００４１】
本明細書における「組換え体（リコンビナント）」という用語は、組換え体（例えば微生物または哺乳類）発現系から得られるタンパク質のことをいう。「微生物」は、細菌、真菌（例えば、酵母）または昆虫の発現系において生産される組換えタンパク質のことをいう。殆どの細菌培養において発現されるタンパク質は、グリカンを有しない。酵母において発現されるタンパク質は、哺乳類細胞において発現されるそれとは異なるグリコシル化パターンを有している可能性がある。
【００４２】
本明細書における「組換え発現ベクター」は、あるタンパク質をコードするＤＮＡを増幅または発現するために用いられる複製可能なＤＮＡ構築物をいう。組換え発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する一つまたは多数の遺伝的要素、例えばプロモーターやエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳される構造またはコード配列および、（３）適当な転写および翻訳の開始および終結配列からなる集合体よりなる転写単位を含む。酵母発現系において使用することを意図した構造要素は、好ましくは、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外への分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列を含まずに発現される場合、該タンパク質はＮ末端メチオニン残基を含むであろう。この残基は、その後、随意で発現された組換えタンパク質から切断されて最終産物を産生する。
【００４３】
組み換え型ＤＮＡ分子
本発明は、コード配列を含んだ組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）も更に提供する。ここで、ｒＤＮＡ分子とは、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて分子的操作がなされたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子の生成方法は、技術上周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。好ましいｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列および／またはベクター配列に機能的に連結されている。
【００４４】
本発明のタンパク質ファミリーをコードする配列の一つが機能的に連結されるベクターおよび／または発現制御配列の選択は、技術上周知のように、所望の機能的特性、例えば、タンパク質発現および形質転換すべき宿主細胞に直接依存する。本発明によって検討されるベクターは、少なくとも複製または宿主染色体への挿入を指示することができ、好ましくは、ｒＤＮＡ分子内に含まれる構造遺伝子の発現も指示することができる。
【００４５】
機能的に連結されたタンパク質コード配列の発現を調節するために用いられる発現制御要素は、技術上周知であり、誘導プロモーター、構成プロモーター、分泌シグナル、および他の調節要素が挙げられるが、これらには限定されない。好ましくは、誘導プロモーターは、宿主細胞の培地中の栄養素に応答するなど、容易に制御できるものである。
【００４６】
ある実施形態では、コード核酸分子を含むベクターは、原核レプリコンを含む。このレプリコンは、自己複製を、および原核宿主細胞、例えばトランスフォームされた細菌宿主細胞などに組換えＤＮＡ分子を染色体外に維持することを指示することのできるＤＮＡ配列である。このようなレプリコンは、技術上周知である。更に、原核レプリコンを含むベクターは、発現することによって薬剤耐性などの検出可能なマーカーを与えるような遺伝子を含んでいてもよい。典型的な細菌型薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子である。
【００４７】
原核レプリコンを含むベクターは、大腸菌などの細菌宿主細胞内でコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指示することのできる原核またはバクテリオファージプロモーターを更に含んでいてもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写が起こることを許可するＤＮＡ配列によって形成された発現制御要素である。細菌宿主と適合するプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡ断片の挿入に便利な制限部位を含むプラスミドベクター中で提供される。このようなベクタープラスミドの典型としては、市販のｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９（ＢｉｏＲａｄ）、ｐＰＬおよびＰＩＫ２２３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。
【００４８】
真核細胞に適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合する発現ベクターも、コード配列を含むｒＤＮＡ分子を作製するために用いることができる。ウィルスベクターを含む、真核細胞発現ベクターは技術上周知であり、数社から販売されている。典型的には、そのようなベクターは、所望のＤＮＡ断片の挿入に便利な制限部位を含んで提供される。そのようなベクターの典型的なものとして、本明細書に記載されたような、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−Ｌ／ｐＭＬ２Ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ）、ベクターｐＣＤＭ８、Ｒｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、プラスミドｐＬＧ３３８などの真核発現ベクターが挙げられる。哺乳類細胞のトランスフェクションに適したウィルスベクターの例としては、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ポリオウィルス、ＳＶ４０、ワクシニア、レトロウィルス、ＨＩＶおよびエンベロープタンパク質（例えば、水疱性口内炎ウィルスＧタンパク質、ＶＳＶＧ）によりシュードタイプ化されたＢＩＶまたはバキュロウィルスなどが挙げられるが、これらには限定されない。ウィルスベクターによるトランスフェクションは、複製を欠失した組換え型ウィルスベクターの全部または一部にトランス相補的なベクターである、ヘルパーウィルスの使用を含んでいてもよい。場合によっては、トランスフェクションは２つまたはそれ以上のベクターを使用することを含み、この場合、コード配列の重複するＮａｖ１．９セグメントが別々のベクター上に含まれる。別々のベクターが、宿主細胞内にトランスフェクトされて、セグメントは宿主細胞内で再結合されて、Ｎａｖ１．９を発現する宿主細胞内で完全長のコード配列を生成する。
【００４９】
本発明のｒＤＮＡ分子を構築するために用いられる真核細胞発現ベクターは、真核細胞において有効な選択可能マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを更に含んでいてもよい。好ましい薬剤耐性マーカーは、発現するとネオマイシン耐性を示す遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，３２７〜３４１頁）である。あるいは、選択可能マーカーは別のプラスミド上にあってもよく、宿主細胞の同時トランスフェクションによって２つのベクターを導入し、選択可能マーカーに対する適当な薬剤中で培養することによって選択してもよい。
【００５０】
組換え融合タンパク質
融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、タンパク質をコードする別個のＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中に結集させるための組換えＤＮＡ技術を用いることにより構築する。例えば、タンパク質をコードする一のＤＮＡ分子の３’末端を、配列のリーディングフレームがずれず、当該配列のｍＲＮＡが単一の生物学的に活性な融合タンパク質に翻訳されるよう、同一または実質的に類似したタンパク質をコードする第２のＤＮＡ分子の５’末端に連結する。ＤＮＡ分子同士は直列に連結され、これはＤＮＡ分子同士が前後に連続して連結されていることを意味する。ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写に関与する調節要素は、２つのＤＮＡ配列の最初の方の上に保持されるが、第２のＤＮＡ配列までの読み通しを防止する結合シグナルまたは終止コドンは除去される。逆に、第２のＤＮＡ配列では翻訳を終結するのに必要な終止コドンが保持されるが、調節要素が除かれている。
【００５１】
本明細書に記載するように、タンパク質分子を連結する手段、好ましくはリンカー配列を介する手段が提供される。リンカー配列は、タンパク質分子同士を、それぞれのタンパク質分子の適切な二次および三次構造への折り畳みを確保するのに十分な距離で隔てている。適切なリンカー配列は、（１）生物活性が高められた融合タンパク質を得るのに適したコンフォメーションをとり、（２）タンパク質分子の生物学的機能を低下させるおそれのある規則的な二次構造をもたらす性向を示さず、（３）Ｎａｖ１．９タンパク質の生物的機能を低下させるおそれのある疎水性または荷電特性を最小限とする。例えば、適切なリンカーは、タンパク質成分の相互作用が生物活性を高めるような融合タンパク質を生じさせる。リンカーのコンフォメーションは、生物活性を高めるために必要とされる融合物のコンフォメーションに応じて、フレキシブル（柔軟）またはリジッド（剛直）のいずれでもよい。リジッドのリンカーの例としては、連結されたタンパク質成分同士で自由な回転を許容しないαヘリックスを有するリンカーである。フレキシブルなタンパク質領域における典型的な表面アミノ酸としては、グリシン、アスパラギンおよびセリンが挙げられる。実際上は、グリシン、アスパラギンおよびセリンを含むアミノ酸配列のあらゆる順列が、リンカー配列に対する上記の基準を満足すると予想される。他のほぼ中性アミノ酸、例えばスレオニンやアラニンなどもリンカー配列中で用いることができる。
【００５２】
リンカー配列の長さは、融合タンパク質の生物活性に著しい影響を与えなければ変更してもよい。一般的に、Ｎａｖ１．９タンパク質は、約６個のアミノ酸から約２０個のアミノ酸長を有するリンカー配列によって分離されるが、より長いリンカー配列を用いてもよく、例えば全長ポリペプチドがリンカーを構成してもよい。好ましくは、リンカー配列の長さは約８アミノ酸である。本発明の最も好ましい態様では、リンカー配列は、Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ポリＨｉｓ配列（配列番号２１）である。このリンカー配列は、技術上周知の任意の方法を用いて融合タンパク質に組み込まれる。
【００５３】
本発明には、本明細書中に記載の天然に存在するタンパク質の生物学的に活性な断片、アナログ、突然変異体、変異体または誘導体を含む融合タンパク質も包含される。天然に存在するタンパク質の生物学的に活性な断片、誘導体、アナログ、変異体および突然変異体は、本明細書中では天然に存在するタンパク質と実質的に類似するタンパク質とも呼ぶ。しかしながら、天然に存在するタンパク質の断片、アナログ、突然変異体、変異体または誘導体の生物活性のレベルは、天然に存在するタンパク質（本明細書中では親タンパク質とも呼ぶ）の活性と同じでなくてもよい。例えば、Ｎａｖ１．９タンパク質の断片は、天然に存在するＮａｖ１．９タンパク質の活性の５０〜８０％しか示さなくてもよい。生物活性を判定するための試験は当業者にとって周知であり、例えば、ナトリウム電流、膜電位および受容体結合の程度を測定することが挙げられる。
【００５４】
本発明は、関連する天然タンパク質のグリコシル化を有するまたは有しない融合タンパク質も提供する。大腸菌などの細菌中での、融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現により、非グリコシル化分子が与えられる。不活性化されたＮグリコシル化部位を有する機能的変異アナログは、オリゴヌクレオチド合成およびライゲーションまたは部位特異的変異技術によって提供することができる。上記アナログタンパク質は、酵母発現系を用いて均一な、炭水化物がない形態で高い収率で提供することができる。真核タンパク質におけるＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ａ１−Ｚ（式中、Ａ１はプロリン以外の任意のアミノ酸、Ｚはセリンまたはスレオニン）を特徴とする。この配列において、アスパラギンは炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を与える。このような部位は、アスパラギン（Ａｓｎ）または残基Ｚを別のアミノ酸に置換することによって、あるいはアスパラギン（Ａｓｎ）またはＺを欠失することによって、あるいはＡ１とＺの間に非Ｚアミノ酸を挿入することによって、あるいは、アスパラギンとＡ１との間にアスパラギン以外のアミノ酸を挿入することにより、取り除くことができる。
【００５５】
誘導体およびアナログは、融合タンパク質の変異によって得ることができる。本明細書でいう誘導体またはアナログとは、該誘導体またはアナログが欠失、挿入および／または置換の要因となりうる１つまたはそれ以上のアミノ酸配列の相違を有することを除いては、野生型（つまり天然に存在するタンパク質）の全長配列との配列同一性または類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００５６】
タンパク質の生物学的に同等なアナログは、例えば、様々な残基または配列の置換を行うことによって構築することができる。例えば、システイン残基を欠失させるか他のアミノ酸に置換して、復元時の不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。突然変異誘発に対する他の手法としては、隣接する二塩基性アミノ酸残基を改変して、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を高めることが含まれる。一般的に、置換は保存的に行うべきである。すなわち、最も好ましい置換アミノ酸は、置換すべき残基と類似する物理化学的性質を持つものである。同様に、欠失または挿入の戦略を採用する場合にも、生物活性にたいするその当該欠失または挿入の潜在的効果を考慮すべきである。遺伝暗号の縮退により、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列内に重大な変化を起こるかもしれない。
【００５７】
アナログ発現のために構築されたヌクレオチド配列における変異は、勿論、コード配列のリーディングフレームのフェースを保存するとともに、ハイブリダイズして、ｍＲＮＡの翻訳に悪影響を及ぼすおそれのあるループやヘアピンなどのｍＲＮＡの二次構造を生み出すような相補領域を作らないことが好ましい。あるいは、変異は、より高い翻訳効率を与えるような二次構造を導入するものであってもよい。変異部位は予め決めておいてもよいが、変異の性質自体を決定しておく必要はない。例えば、所与の位置における最適な特性を選択するために、標的コドンにおけるランダム突然変異誘発を行って、発現された変異体から所望の活性を有するものをスクリーニングしてもよい。
【００５８】
変異は、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位を両側にもつ変異体配列を含んだオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入することができる。ライゲーションにより得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換または欠失を有するアナログをコードしている。あるいは、オリゴヌクレオチド定方向部位特異的突然変異誘発法を用いて、置換、欠失または挿入に従って必要な変異がされた特定のコドンを有する変異遺伝子を提供することもできる。上述の変異を作製するための例示的方法は、Ｗａｌｄｅｒら（１９８６）  Ｇｅｎｅ  ４２，１３３〜１３４頁、およびＢａｕｅｒら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３７，７３〜７５頁に記載されている。
【００５９】
本発明は、哺乳類、微生物、ウィルス、または昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節要素に機能的に連結された２つまたはそれ以上のタンパク質をコードするＤＮＡを含む融合タンパク質をコードする、合成ＤＮＡ断片またはｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片を含んだ組換え発現ベクターも提供する。上記調節要素としては、後述するような、転写プロモーター、転写を制御するための随意選択可能なオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、転写および翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。宿主内での複製能は、通常、複製起点によって与えられるが、形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子を更に組み込んでもよい。機能的に連結されているとは、融合タンパク質をコードするＤＮＡの発現が当該調節要素によって制御されるように、成分同士が連結されていることをいう。一般的に、機能的に連結されているとは、近接すること（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）を意味する。
【００６０】
トランスフォームされた宿主細胞とは、感染または非感染方法によって融合タンパク質ベクターが導入された細胞のことである。トランスフォームされた宿主細胞は、通常、所望の融合タンパク質を発現するが、クローニングまたはＤＮＡ増幅を目的としてトランスフォームされた宿主細胞は、タンパク質を発現する必要はない。融合タンパク質の発現に適した宿主細胞としては、適当なプロモーターの制御下にある原核生物、酵母または高等真核細胞である。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば大腸菌などが含まれる。高等真核細胞には、本明細書に記載するような哺乳類由来の確立された株化細胞が含まれる。融合タンパク質を生産するために、本発明のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを用いた無細胞翻訳系を用いることもできる。
【００６１】
原核発現ベクターは一般的に、１つまたはそれ以上の表現型選択マーカー、例えば、抗生物質耐性を与えるか、独立栄養要求を与えるタンパク質をコードする遺伝子と、宿主によって認識されて宿主内での増幅を保証する複製起点とを含む。トランスフォームに適した原核宿主としては、限定はされないが、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、および、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌の様々な種が挙げられるが、選択肢として他のものも使用できる。
【００６２】
細菌に使用するための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ）の遺伝的要素を含む市販のプラスミド由来の、選択可能マーカーおよび細菌の複製起点を含んでいてもよい。上記のような市販のベクターとしては、限定はされないが、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。これらのｐＢＲ３２２の一部を適当なプロモーターおよび発現すべき構造配列と組み合わせる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含むため、トランスフォームされた細胞を同定するのに簡単な手段を与える。
【００６３】
組換え微生物発現ベクターにおいて、一般的に用いられるプロモーターとしては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５，６１５〜６１６頁およびＧｏｅｄｄｅｌら（１９７９）ＮＡＴＵＲＥ  ２８１，５４４〜５４５頁）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら（１９８０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８，４０５７〜４０５８頁）およびｔａｃプロモーター（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）が挙げられるが、これらには限定されない。
【００６４】
組み換え融合タンパク質は酵母宿主、好ましくは出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミセス属の種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）において発現させてもよい。他の属の酵母、ＰｉｃｈｉａまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓなどを用いてもよいが、これらに限定されない。酵母ベクターは、一般的に酵母プラスミドに由来する複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、融合タンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、ならびに選択遺伝子を含む。好ましくは、酵母ベクターは、複製起点と、酵母および大腸菌の両方のトランスフォーメーションを許容する選択可能マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔｒｐ１遺伝子（トリプトファン中での成長能力を欠失した酵母の変異株に対する選択マーカーを提供する）とを含み、更に、上記酵母ベクターは、下流の構造配列の転写を誘導するための、高度に発現される酵母遺伝子に由来するプロモーターを含む。酵母宿主ゲノム中におけるｔｒｐｌ部位の損傷により、トリプトファン非存在下での成長によってトランスフォームを検出するための効果的な環境が与えられる。
【００６５】
酵母ベクター中の適当なプロモーター配列としては、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５，２０７３〜２０７５頁）または他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓら（１９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７，１４９〜１５０頁、およびＨｏｌｌａｎｄら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７，４９００〜４９０１頁）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ、に対するプロモーターを含む。好ましい酵母ベクターは、大腸菌での選択および複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ遺伝子および複製起点）、およびグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーターとα因子リーダーとを含む酵母ＤＮＡ配列を用いて組み立てられる。上記α因子リーダーは、異種タンパク質の分泌を指示し、プロモーターと発現すべき構造遺伝子との間に挿入することができる（Ｋｕｒｊａｎら（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０，９３３〜９３４頁、およびＢｉｔｔｅｒら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，５３３０〜５３３１頁）。リーダー配列を、その３’末端付近に、リーダー配列を外来遺伝子に融合することを容易にするのにより有用な１つまたはそれ以上の制限部位を含むように改変してもよい。
【００６６】
適切な酵母トランスフォームプロトコールは、当業者にとって周知であり、例示的な技術がＨｉｎｎｅｎら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５，１９２９〜１９３０頁に記載されており、この技術では、０．６７％ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍＬアデニン、および２０μｇ／ｍＬウラシルからなる選択培地中で、Ｔｒｐ＋トランスフォーマントが選択される。ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによってトランスフォームされた宿主株は、８０μｇ／ｍＬアデニンおよび８０μｇ／ｍＬウラシルを添加した１％酵母エキス、２％ペプトンおよび１％グルコースからなる富栄養培地において発現のために培養することができる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地のグルコースの枯渇によって起こる。粗酵母上清をろ過によって回収し、４℃に保存してから更に精製する。様々な哺乳類または昆虫細胞の培養系を用いて組み換えタンパク質を発現させることができる。昆虫細胞中で異種タンパク質を生産するためのバキュロウィルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，４７〜４８頁によって論説されている。
【００６７】
適切な哺乳類宿主株化細胞の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３，１７５〜１７７頁に記載されるような、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系統、および、例えばＨＥＫ株化細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ株化細胞など適当なベクターを発現することのできる他の株化細胞が挙げられるが、これらには限定されない。哺乳類発現ベクターは、非転写要素（複製の起点、発現すべき遺伝子に連結された適当なプロモーターとエンハンサー、および他の５’または３’フランキング非転写配列など）および５’から３’への非翻訳配列（必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与部位およびスプライス受容部位、および転写終結配列）を含んでいてもよい。
【００６８】
脊椎動物細胞をトランスフォームするために用いられる発現ベクター内の転写および翻訳制御配列は、ウィルス起源により提供されてもよい。例えば、一般的に用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、ヒトサイトメガロウィルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位は、異種ＤＮＡ配列の発現に必要とされる他の遺伝的要素を提供するために用いてもよい。初期および後期プロモーターは、いずれもＳＶ４０のウィルスの複製起点を含む断片としてウィルスから容易に得られることから、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７３，１１３〜１１４頁）。また、ウィルスの複製起点内に位置するＨｉｎｄＩＩ部位からＢｇｌＩ部位へ伸びる約２５０ヌクレオチド配列が含まれているという条件で、より小さいまたは大きいＳＶ４０断片を用いることもできる。典型的なベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，２８０〜２８１頁）によって開示されたように構築することができる。
【００６９】
哺乳類ＤＮＡの発現のための、好ましい真核ベクターはとしては、ｐＩＸＹ３２１およびｐＩＸＹ３４４が挙げられ、いずれもｐＢＣ１０２．Ｋ２２（ＡＴＣＣ）由来の酵母発現ベクターであり、大腸菌および酵母における選択と複製のためのｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡ配列（Ａｐｒ遺伝子および複製起点）を含む。精製された哺乳類融合タンパク質またはアナログは、適当な宿主／ベクター系において培養してＮａｖ１．９タンパク質をコードするＤＮＡの組換え翻訳産物を発現させ、これを培地または細胞抽出物から精製することによって調製される。例えば、培地中に組換えタンパク質を分泌する系から得た上清は、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｏｌｌｉｃｏｎ限外ろ過装置を用いて濃縮することができる。濃縮工程に続いて、濃縮物を適当な精製マトリックスに流し込む。最終的に１つまたはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、例えば側鎖にメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いて、融合タンパク質組成物を更に精製することができる。上述の精製工程のいくつかあるいは全部は、様々な組み合わせで均一な組換えタンパク質を提供するために使用することができる。
【００７０】
細菌培養において生産された組み換えタンパク質は、通常、細胞ペレットから最初の抽出で単離され、その後、１回またはそれ以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行う。最後に、最終精製工程のために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を採用することができる。組換え融合タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結／融解サイクル、超音波処理、機械的粉砕または細胞溶解剤を含む任意の都合のよい方法によって破砕することができる。
【００７１】
融合タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製を大幅に簡略化する。大量発酵によって分泌された組換えタンパク質は、Ｕｒｄａｌら（１９８４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６，１７１〜１７２頁に記載されているのと同様の方法によって精製することができる。組換え培養において合成される融合タンパク質は、タンパク質を含む非ヒト細胞成分が、培養物から融合タンパク質を回収するために行われた精製工程に応じた量および性質で存在するという特徴を有する。通常、これらの成分は、酵母、原核またはヒト以外の高等真核起源のものであり、好ましくはデンシトメトリーまたはクロマトグラフィーによる走査により、約５％未満のオーダーの無害の混入物量で存在する。更に、組換え細胞培養物により、自然界においてはそれぞれの起源とする種、例えば細胞、細胞滲出物または体液中で認められるような、通常ＥＰＯに付随するであろうタンパク質を含まない融合タンパク質を生産することができる。
【００７２】
組換えタンパク質の製造
本発明は、本明細書中に記載する核酸分子を用いた本発明のタンパク質の製造方法も提供する。一般的な用語として、組換え型のタンパク質の製造は典型的には以下の工程を含む。
【００７３】
まず本発明のタンパク質をコードする核酸分子、例えば、配列番号１または配列番号１の５２〜５３４６（または５３４９）番目のヌクレオチドによって定義されるオープンリーディングフレームを含むか、実質的にこれで構成されるか、もしくはこれで構成される核酸分子、あるいは配列番号２をコードする核酸分子；配列番号３または配列番号３の３１〜５４０３（または５４０６）番目のヌクレオチドによって定義されるオープンリーディングフレームを含むか、実質的にこれで構成されるか、もしくはこれで構成される核酸分子、あるいは配列番号４をコードする核酸分子；配列番号５または配列番号５の１９〜５３１３（または５３１６）番目のヌクレオチドによって定義されるオープンリーディングフレームを含むか、実質的にこれで構成されるか、もしくはこれで構成される核酸分子、あるいは配列番号６をコードする核酸分子；あるいは、配列番号１９または配列番号１９の１〜５２９５（または５２９８）番目のヌクレオチドによって定義されるオープンリーディングフレームを含むか、実質的にこれで構成されるか、もしくはこれで構成される核酸分子、あるいは配列番号２０をコードする核酸分子などが得られる。
【００７４】
次に核酸分子を、好ましくは、上述のように、適切な制御配列と機能的に連結して、タンパク質のオープンリーディングフレームを含む発現単位を形成する。この発現単位を用いて適切な宿主をトランスフォームし、トランスフォームされた宿主を組換えタンパク質が生産されるような条件下で培養する。組換えタンパク質を培地または細胞から単離してもよく、タンパク質の回収と精製はある程度の不純が許容される場合には必要ではないかもしれない。
【００７５】
上記工程のそれぞれは、様々な用法で行うことができる。例えば、所望のコード配列をゲノム断片から取り出し、適当な宿主内で直接用いるようにしてもよい。普通に得られない場合には、適当な制限部位をコード配列の端部に追加して、上記ベクターに挿入するための切除可能な遺伝子を提供するようにしてもよい。当業者であれば、組換えタンパク質を製造するために本発明の核酸分子とともに用いる任意の周知の宿主／発現系を容易に適用することができるであろう。
【００７６】
結合パートナーの同定方法
本発明の別の実施形態は、組換えにより発現されたＮａｖ１．９を用いて結合パートナーを単離および同定するために用いる方法を提供する。一般的に、Ｎａｖ１．９タンパク質を、本発明のタンパク質が潜在的結合パートナーと会合できるような条件下において、潜在的結合パートナーまたは細胞の抽出物または画分と混合する。混合後、Ｎａｖ１．９タンパク質と会合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質または他の分子を混合物から分離する。本発明のタンパク質に結合した結合パートナーを取り出して更に分析することができる。結合パートナーを同定および単離するために、全Ｎａｖ１．９タンパク質、例えば、配列番号２、４、６または２０の全アミノ酸配列を含むタンパク質を用いることができる。あるいは、タンパク質の断片、好ましくは配列番号２、４、６または２０のアミノ酸配列の全部または一部を含む断片を用いることもできる。
【００７７】
本明細書において、細胞抽出物とは、溶解または破砕された細胞から作製される調製物または画分のことをいう。細胞抽出物の好ましい供給源は、ヒト皮膚組織から得られる細胞またはアレルギー性過敏症を患った患者からのヒト肺組織のバイオプシー試料から得られるヒト気道または細胞である。あるいは、細胞抽出物は正常な組織または市販の株化細胞、特に顆粒球株化細胞から調製してもよい。
【００７８】
様々な方法を用いて、細胞の抽出物を得ることができる。細胞は、物理的または化学的破砕方法によって破砕することができる。物理的破砕方法の例としては、限定はされないが、超音波処理または機械的剪断が挙げられる。化学的溶解方法の例としては、限定はされないが、界面活性剤溶解および酵素溶解が挙げられる。当業者は、本発明の方法において用いるための抽出物を得るために、細胞抽出の調製方法を容易に適応させることができるであろう。
【００７９】
細胞の抽出物が調製された後で、タンパク質と結合パートナーとの会合が起こりうる条件下において、この抽出物を本発明のタンパク質と混合する。様々な条件を用いることができるが、最も好ましい条件は、ヒト細胞の細胞質に見られるものと非常によく似た条件である。浸透圧、ｐＨ、温度および使用する細胞抽出物の濃度などの特徴は、タンパク質の結合パートナーとの会合を最適化するために変更することができる。
【００８０】
適切な条件下で混合した後、結合した複合体を混合物から分離する。混合物を分離するために様々な技術を用いることができる。例えば、本発明のタンパク質に特異的な抗体を用いて、結合したパートナー複合体を免疫沈降させてもよい。あるいは、クロマトグラフィーや密度／沈殿物遠心分離などの標準的な化学分離技術を用いてもよい。
【００８１】
抽出物中の会合しなかった細胞構成要素を除去した後、結合パートナーを従来の方法を用いて複合体から解離させることができる。例えば、解離は、混合物の塩濃度またはｐＨを変えることにより行える。会合した結合パートナー対を混合抽出物から分離するのを助けるために、本発明のタンパク質を固体支持体上に固定化することもできる。例えば、タンパク質をニトロセルロースマトリックスまたはアクリルビーズに固定することができる。固体支持体にタンパク質を固定することにより、ペプチド／結合パートナー対を抽出物中に見られる他の構成要素から分離することが助けられる。同定された結合パートナーは、単一のタンパク質であっても、２つまたはそれ以上のタンパク質で構成される複合体であってもよい。
【００８２】
あるいは、結合パートナーは、Ｔａｋａｙａｍａら（１９９７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９，１７１〜１８４頁またはＳａｕｄｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７，９９１〜９９６頁の手順に従って、ファーウェスタンアッセイを用いて同定してもよいし、あるいは、エピトープタグを付けたタンパク質またはＧＳＴ融合タンパク質を用いて同定してもよい。あるいは、本発明の核酸分子は、酵母ツーハイブリッド系で用いることもできる。酵母ツーハイブリッド系は、他のタンパク質パートナー対を同定するために用いられてきたが、本明細書中に記載する核酸分子に対して応用することもできる。
【００８３】
発現を調節する薬剤の同定方法
本発明の別の実施形態は、配列番号２、４、６または２０のアミノ酸配列を有するタンパク質などの、組換えＮａｖ１．９タンパク質をコードする核酸の発現を調節する薬剤を同定するための方法を提供する。そのようなアッセイでは、本発明の、核酸の発現レベルの変化をモニターする利用可能なあらゆる手段を用いることができる。本明細書において、ある薬剤は、それが細胞内における核酸の発現をアップまたはダウンレギュレートすることができる場合に、本発明の核酸の発現を調節する薬剤という。
【００８４】
１つのアッセイ形式において、配列番号１の５２〜５３４６番目のヌクレオチド、配列番号３の３１〜５４０３番目のヌクレオチド、配列番号５の１９〜５３１３番目のヌクレオチドまたは配列番号１９の１〜５２９５番目のヌクレオチドによって定義されるオープンリーディングフレームと、任意の必要な５’および３’調節要素との間のレポータ遺伝子融合体と、任意のアッセイ可能な融合パートナーとを含む株化細胞を調製することができる。ホタルルシフェラーゼ遺伝子やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（Ａｌａｍら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８，２４５〜２５４頁）など、これらには限定されないが、多数のアッセイ可能な融合パートナーが知られおり、入手可能である。次に、レポータ遺伝子融合体を含む株化細胞を、適当な条件下および時間、被験薬剤に曝露する。薬剤に曝露された試料と、対照試料の間のレポータ遺伝子の発現の差異から、本発明の核酸の発現を調節する薬剤が同定される。
【００８５】
別のアッセイ形式を用いて、ある薬剤が、配列番号００を有するＮａｖ１．９タンパク質などの、Ｎａｖ１．９タンパク質をコードする核酸の発現を調節することができるかどうかをモニターしてもよい。例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸へのハイブリダイゼーションによって直接モニターしてもよい。株化細胞を適当な条件および時間において、被験薬剤に曝露し、全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されるような、標準的な手順によって単離する。
【００８６】
薬剤に曝露した細胞と対照細胞との間のＲＮＡ発現レベルの差を検出するためのプローブは、本発明の核酸から調製することができる。高度に厳密な条件下で標的核酸とのみハイブリダイズするプローブを設計することが好ましいが、必須ではない。高度に厳密な条件下では高度に相補的な核酸ハイブリッドのみが形成される。したがって、アッセイ条件の厳密度が、ハイブリッドを形成するための２本の核酸鎖間に存在すべき相補性の量を決定する。厳密度は、プローブ：標的ハイブリッドとプローブ：非標的ハイブリッドの間の、安定性の違いが最大になるように選ぶべきである。
【００８７】
プローブは、技術上周知の方法によって本発明の核酸から設計してもよい。例えば、プローブのＧ＋Ｃ含量およびプローブの長さは、標的配列に対するプローブの結合に影響を及ぼしうる。プローブの特異性を最適化するための方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．の中で一般的に知ることができる。
【００８８】
ハイブリダイゼーション条件は、ＳａｍｂｒｏｏｋらやＡｕｓｕｂｅｌらによって記載されているような公知の方法を、各プローブに応じて変更する。全細胞ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡに富むＲＮＡのハイブリダイゼーションは、任意の利用可能な形式で達成することができる。例えば、全細胞ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡに富むＲＮＡは固体支持体上に固定することができ、この固体支持体は、プローブが特異的にハイブリダイズするような条件下で、本発明の配列の少なくとも１つまたは１つのうちの一部を含む少なくとも１つのプローブに曝される。あるいは、Ｎａｖ１．９タンパク質をコードする配列のうちの少なくとも１つ、または１つのうちの一部を含む核酸断片を、シリコンチップや多孔性ガラスウェハーなどの固体支持体に固定することもできる。その後、このガラスウェハーを、固定された配列が特異的にハイブリダイズするような条件下で、試料から得た全細胞ＲＮＡまたはポリＡ  ＲＮＡに曝す。このような固体支持体およびハイブリダイゼーション方法は、例えばＷＯ９５／１１７５５に開示されているように、広く知られている。所与のプローブが、非処理細胞集団からのＲＮＡ試料および薬剤に曝された細胞集団からの試料に特異的にハイブリダイズできるかどうかを調べることにより、配列番号２、４、６または２０の配列を有するＮａｖ１．９タンパク質をコードする核酸の発現をアップまたはダウンレギュレートする薬剤が同定される。
【００８９】
ｍＲＮＡの定量的および定性的分析のためのハイブリダイゼーションを、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（すなわちＲＰＡ，Ｍａら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０，２７３〜２３８頁を参照のこと）を用いて行ってもよい。簡潔に言えば、遺伝子産物をコードするｃＤＮＡを含む発現ビークルおよびファージ特異的ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）を、ファージプロモーターから下流の、ｃＤＮＡ分子の３’末端において線状化し、続いてそのような線状化分子をインビトロ転写によるｃＤＮＡの標識されたアンチセンス転写物の合成のための鋳型として用いる。次に、標識された転写物を、８０％ホルムアミド、４０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ（ｐＨ６．４）、０．４Ｍ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むバッファ中、４５℃で一晩インキュベーションすることにより、単離されたＲＮＡ（すなわち、全または分画されたｍＲＮＡ）の混合物にハイブリダイズさせる。得られたハイブリッドを、４０μｇ／ｍＬリボヌクレアーゼＡおよび２μｇ／ｍＬリボヌクレアーゼを含むバッファ中で消化する。外来性のタンパク質を不活性化し抽出した後、試料を尿素／ポリアクリルアミドゲル上に負荷して分析を行う。
【００９０】
別のアッセイ方式においては、Ｎａｖ１．９タンパク質を生理学的に発現する細胞または株化細胞をまず同定する。このように同定された細胞および／または株化細胞は、適当な表面伝達機構および／または細胞質内カスケードによって、転写装置の調節の厳密度が、薬剤の外来的な接触に関して維持されるように、必要な細胞装置を含むと予想されるであろう。更に、このような細胞または株化細胞は、当該遺伝子産物に固有の１つまたはそれ以上の抗原性断片に融合された、Ｎａｖ１．９タンパク質をコードする構造遺伝子の末端を含む機能性非翻訳５’プロモーターを含む発現ビークル（例えばプラスミドまたはウィルスベクター）構築物を用いてトランスデュースまたはトランスフェトされるが、上記断片は、上記プロモーターの転写制御下にあり、天然に存在するポリペプチドとは分子量が区別できるか、免疫学的に異なるタグまたは他の検出可能なマーカーを更に含んでいてもよいポリペプチドとして発現される。このようなプロセスは技術上周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００９１】
次に、上に概説したようにトランスデュースまたはトランスフェクトされた細胞または株化細胞を、適当な条件下において薬剤と接触させる。例えば、薬学的に許容される賦形剤中の薬剤を、水性の生理学的バッファ、例えば、生理学的ｐＨにあるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理学的ｐＨにあるイーグル平衡塩溶液（ＢＳＳ）、血清を含むＰＢＳまたはＢＳＳ、ＰＢＳまたはＢＳＳおよび／または血清を含む３７℃でインキュベートされた調整培地中で、細胞に接触させる。上記条件は、当業者によって必要と認めれば変更してもよい。細胞を薬剤に接触させた後、上記細胞は破砕され、溶解物のポリペプチドは、ポリペプチド画分がプールされて更に処理されるように、例えば抗体と接触させ免疫学的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降またはウェスタンブロット）ができるように、分画される。「薬剤に接触させた」試料から単離されたタンパク質のプールは、賦形剤のみが細胞と接触させる対照試料と比べ、薬剤と接触させた試料から発生される免疫学的シグナルの増加または減少が、薬剤の効力を識別するために用いられることになる。
【００９２】
活性を調節する薬剤の同定方法
本発明は、配列番号２、４、６または２０の配列を含む組み換えＮａｖ１．９タンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定するための方法を提供する。そのような方法またはアッセイは、所望の活性をモニターまたは検出する任意の手段を用いることができる。
【００９３】
ある実施形態では、本発明は、ＮａＮ媒介電流を調節する薬剤を同定するための方法を包含する。ＮａＮナトリウムチャネルを介してＮａ＋電流を調節する（すなわち阻害または増大させる）ことのできる薬剤を同定するためにいくつかの手法を用いることができる。一般的に、そのような薬剤を同定するために、ＮａＮナトリウムチャネルを発現するモデル培養株化細胞が用いられ、Ｎａ＋電流を測定するために１つまたはそれ以上の従来のアッセイが用いられる。そのような従来のアッセイとしては、例えば、パッチクランプ法、［Ｎａ＋］ｉのレシオメトリック撮影、および上述のような２２Ｎａおよび８６Ｒｂの使用が挙げられる。
【００９４】
本発明のある実施形態では、候補化合物のＮａ＋電流調節活性を評価するために、薬剤をＮａＮを発現する適当な形質転換宿主細胞と接触させる。混合または適当な時間インキュベーションした後、Ｎａ＋電流を測定して、当該薬剤がＮａ＋電流を阻害または増強したかどうかを判定する。
【００９５】
このようにして、Ｎａ＋電流を阻害または増強する薬剤が同定される。当業者であれば、ある薬剤がＮａ＋電流を調節するかどうかを判定するために様々な当該分野において周知の技術を容易に用いることができる。
【００９６】
Ｎａ＋は疼痛信号発生細胞において優先的に発現されるので、上記薬剤で処理された実験動物の急性または慢性の疼痛に対する反応を測定することにより、Ｎａ＋チャネル機能を阻止、阻害または強化する薬剤を設計することもできる。本発明の本態様のある実施形態において、ラットなどの実験動物を、例えばＮａｖ１．９を阻止または阻害する（あるいは阻止または阻害すると考えられる）薬剤などの薬剤で処理する。次に、様々な疼痛刺激に対する反応を、テイルフリック試験や四肢逃避反射などの試験を用いて測定し、未処理の対照と比較する。これらの方法は、Ｗａｌｌら（１９９４）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｉｎ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１５章を参照のこと）に記載されている。本発明の本態様の別の実施形態において、ラットなどの実験動物に対して、ホルマリン（Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎら（１９７７）Ｐａｉｎ  ４，１６１〜７４頁）、フロインドアジュバンド（Ｉａｄａｒｏｌａら（１９８８）Ｐａｉｎ  ３５，３１３〜２６頁）またはカラギーナンなどの疼痛を生み出す炎症剤を局所注射するか、あるいは、持続性の疼痛を生み出す、神経緊縛（Ｂｅｎｎｅｔｔら（１９８８）  Ｐａｉｎ  ３３，８７〜１０７頁；Ｋｉｍら（１９９２）Ｐａｉｎ  ５０，３５５〜３６３頁）または神経切断（Ｓｅｌｔｚｅｒら（１９９０）Ｐａｉｎ  ４３，２０５〜２１８頁）を行う。その後、様々な普通の刺激および疼痛刺激に対する反応を、例えば温刺激または高温刺激からの逃避までにかかる時間を測定することにより測定して（Ｗａｌｌら（１９９４）Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｉｎ，ＣＨＵＲＣＨＩＬＬ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、Ｎａｖ１．９を改変すると考えられる薬剤で処理された動物と対照動物とを比較する。
【００９７】
Ｎａｖ１．９の好ましい阻害剤または増強剤は、好ましくはＮａｖ１．９ナトリウムチャネルに選択的である。これらは完全特異的であるか（ナトリウムチャネルを阻害するが、他のどのチャネルまたは受容体にも結合または直接作用しない、テトロドトキシン、ＴＴＸのように）、比較的特異的である（いくつかのタイプのイオンチャネルに結合してそれらを阻止するが、ナトリウムチャネルに対して偏向を有するリドカインなど）。阻害剤または増強剤が効力を発するために完全特異性は要求されない。ナトリウムチャネル対他のチャネルおよび受容体の効果の比率は、標的とするチャネルに加えていくつかのチャネルに対する効果を決定することがあり、有効なＳｔｙｓら（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．６７，２３６〜４０頁であるかもしれない。
【００９８】
本発明の調節剤は、一例として、ペプチド、小分子、天然に存在する毒素および他の毒素ならびにビタミン誘導体、そして炭水化物であってもよい。当業者であれは、本発明の調節剤の構造的性質については一切の限定がないことを容易に認識するであろう。分子のライブラリのスクリーニングにより、Ｎａｖ１．９またはこれを介する電流を調節する薬剤が明らかになるかもしれない。同様に、天然に存在する毒素（ある種の魚類、両生類、無脊椎動物によって生産されるような）をスクリーニングすることもできる。そのような薬剤は、ナトリウムチャネルを発現する形質転換宿主細胞または他の細胞を、当該薬剤に曝露して、ナトリウムイオン電流において起こるあらゆる変化を測定することによって、ルーチンに同定することができる。
【００９９】
更に説明しなくとも、当業者であれば、上記説明と下記の説明的な例を用いて、本発明の化合物を作製して利用し、クレームされた方法を実施することができる違いない。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指し示すものであって、開示の残りの部分を何ら限定することはないものとする。
【０１００】
実施例１
低コピー数非発現プラスミドへのｒＮａｖ１．９のクローニング
【０１０１】
全ラットＮａｖ１．９（ｒＮａｖ１．９またはｒＮａＮとも呼ぶ）をまず低コピー数の非発現プラスミドｐＬＧ３３８にクローニングした。これはまず、ベクターをＡｆｌＩＩで処理し、末端をクレノウ断片で平滑化し、再度ライゲーションすることにより唯一のＡｆｌＩＩ部位を除去するようにｐＬＧ３３８を改変して、ｐＬＧ３３８ΔＡｆｌＩＩを作製した。部分的ｒＮａＮｃＤＮＡクローン、Ｌ９（ｐＴａｒｇｅＴ内）（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、唯一の５’ＡｆｌＩＩ部位と、３８の５’非翻訳配列と、ラットＮａＮ／ＳＮＳ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド１〜２９６４とを含む。ＮａＮ  Ｌ９をＸｈｏＩ（ポリリンカー内、インサートに対して５’）消化し、クレノウで平滑化し、ＮｏｔＩ（ポリリンカー内、インサートに対して３’）で消化した。約３ｋｂの５’ＮａＮ断片をゲル精製し、ＳｍａＩおよびＮｏｔＩで消化しておいたｐＬＧ３３８ΔＡｆｌＩＩにクローン化した（ｐＬＧ３３８−５’ｒＮａＮ）。残りの３’ｒＮａＮ配列は、マラソンｒＮａＮ  ｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲ増幅によって得た。フォワードプライマー（５’−ｇｃａａｇａａａｔｇｃａｇｇａｇｇａａａａａｃ−３’；配列番号７）はヌクレオチド２５６５においてアニールする。リバースプライマー（５’−ａｔａａｇａａｔ［ｇｃｇｇｃｃｇｃ］ｃａａｃｃｔｇ  ｔｃａｃｃｔｃｇｔｔｃａｇｃｃ−３’；配列番号８）は、末端スペーサ（下線部）と、唯一のＮｏｔＩ部位（括弧内）とを含み、１３３ｂｐの３’非翻訳ヌクレオチドを含むと推測される。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩで消化し、約２．６ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片をゲル精製し、同様に消化してゲル精製したｐＬＧ３３８−５’ｒＮａＮにクローン化して、ラットＮａｖ１．９オープンリーディングフレーム（ｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ，図１）を完成させた。
【０１０２】
実施例２
発現プラスミドへのｒＮａｖ１．９のクローニング
【０１０３】
発現ベクターへのニューロンのナトリウムチャネルのクローニングは、技術的に困難であることが知られているが、これはクローン化されたインサートがクローニング手順の終了時に欠失または変異によって不完全になるためである。哺乳類株化細胞でｒＮａＮを発現する低コピー数ベクターを提供するために、ベクターｐＲｃ／ＣＭＶから得た配列を付加することにより、ｐＬＧ３３８ΔＡｆｌＩＩを改変した。ＣＭＶプロモーターと、マルチクローニングサイトと、ＢＧＨポリＡと、ＳＶ４０プロモーターと、ネオマイシン耐性遺伝子と、ＳＶ４０ポリＡ配列とを含む断片を、ｐＬＧ３３８ΔＡｆｌＩＩに挿入した。これらの構築物中にネオマイシン耐性遺伝子が存在することにより、トランスフェクトされたクローンを選択的に増幅する手段が与えられるとともに、ｒＮａｖ１．９を安定して発現する株化細胞の生成と維持が可能になる。すなわち、ｐＲｃ／ＣＭＶをＭｌｕＩおよびＳａｌＩ酵素で消化した。上述のすべての成分を含む３．１ｋＢの断片をゲル単離し、同様にＭｕｌＩおよびＳａｌＩ酵素で消化し、ゲル精製しておいたｐＬＧ３３８ΔＡｆｌＩＩにクローニングした。マルチクローニングサイトは、ＮｏｔＩ部位の５’にＡｆｌＩＩ部位を含むリンカーを付加することによって改変した（ｐＬＧ３３８ＸＭ，図２）。
【０１０４】
ベクターｐＬＧ３３８ＸＭおよびｐＬＧ３３８−ｒＮａＮの両方を、ＡｆｌＩＩおよびＮｏｔＩ酵素で消化し、ｐＬＧ３３８−ｒＮａＮからのｒＮａＮオープンリーディングフレームをｐＬＧ３３８ＸＭにクローニングして、哺乳類発現構築物ｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮを作製した（図３）。
【０１０５】
ｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮの配列解析から、公表されているｒＮａｖ１．９配列からの逸脱が明らかになった。具体的には、ドメイン２とドメイン３とをつなぐ細胞質ループであるＬ２には９６２番目のアミノ酸においてＳｅｒ→Ｐｒｏの変化があり、ＤＩＩＩ−Ｓ６内の１２８２番目のアミノ酸においてＬｅｕ→Ｐｒｏの変化が見られた。更に、Ｌ２には１１のアミノ酸欠失（１０００〜１０１０番目）も検出されたが、これは、おそらく、イントロン１５Ｂの選択的３’スプライシング部位の利用によるものであろう。非発現バージョンのｐＬＧ３３８−ｒＮａＮの対応領域の配列を決定したところ、同じ変化を含んでいたことから、これらはｍＲＮＡ鋳型の最初のプール中に存在していたものと考えられる。
【０１０６】
ｒＮａＮの発現および非発現バージョンの両方に存在する全部で３つの逸脱は、唯一のＢｇｌＩＩ部位およびＢｓｕ３６Ｉ部位に隣接する領域内に存在している。この領域全体にわたって、更なる非発現クローンの配列決定を行ったところ、（アミノ酸レベルで）いずれの変化も含まないクローンが同定された。この非変異断片を用いてｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮ内に変異を含む領域を置換したところ、構築物は不安定になった。この非発現バージョンでは（ｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ）、配列解析の結果、細菌内での増幅後に修復がうまく行われていて安定であることが確認された（ｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ２）。
【０１０７】
実施例３
ＨＥＫ２９３細胞でのクローン化ｒＮａｖ１．９の発現
【０１０８】
ＨＥＫ２９３細胞での、ｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮ（３つの配列の逸脱を有する）からのｒＮａｖ１．９の発現をＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで確認した（図４）。ＨＥＫ２９３細胞を、標準的なリン酸カルシウム沈殿法を用いてｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮプラスミドでトランスフェクトした。１８時間後、対照細胞およびトランスフェクト細胞を回収した。全ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）ミニカラムを用いて製造者の推奨に従って単離した。ＲＮＡはＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、そのＲＮＡをＲｎｅａｓｙカラムで再度精製した。第一鎖ｃＤＮＡを、上述のようにランダムヘキサマープライマーを用いて調製した。フォワードプライマー５’−ｇａａｃａａａｔｇｔｃａａｇｃｃｔｔｔｇｔｇｔｔ−３’（配列番号９）とリバースプライマー５’−ｃａｇｃｃａｔｃａｔｇａｔａａｔｃａｔａｔｔｔａａｇａｃ−３’（配列番号１０）は、３１８ヌクレオチドのアンプリコンを増幅する。ＲＴ−ＰＣＲからは、予想される大きさの産物が、ラットＤＲＧ鋳型とｒＮａＮ構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３とによって得られることがわかる（図４Ａ）。この産物はトランスフェクトされていないＨＥＫ２９３鋳型、（−）ＲＴトランスフェクトＨＥＫ２９３鋳型またはＨ２Ｏを用いた反応中では検出されなかった（図４Ａ）。
【０１０９】
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における、クローン化されたｒＮａｖ１．９のタンパク質レベルでの発現を、ウェスタンブロット分析によって実証した。対照およびトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの１８時間後に回収した。標準的な方法を用いて、細胞を溶解し、膜画分を調製した。ラットＤＲＧからの膜画分を同様に処理し、陽性対照とした。各試料の１０μｇの膜タンパク質を、５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのウェルに負荷し、電気泳動を行った。タンパク質は、ニトロセルロース膜上に電気ブロットした。ｒＮａｖ１．９特異的抗体を用いたイムノブロッティングおよびＥＣＬ化学発光検出から、ＤＲＧ組織およびトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞のいずれにおいても約２１０ｋＤａのタンパク質シグナルが存在するが、非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞には存在しないことがわかる（図４Ｂ）。
【０１１０】
実施例４
培養ＤＲＧニューロンでのクローン化ｒＮａｖ１．９の発現
【０１１１】
培養マウスＤＲＧニューロンにおけるｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮの発現についても、微粒子銃によるこれらの細胞のトランスフォーメーションを用いて構築物を導入した後に、調べた。ＤＲＧニューロンをＳＮＳヌルマウスから単離し、微粒子銃によるトランスフェクション（ビオリスティックトランスフェクション）前の３〜４日間培養しておいた。ＳＮＳヌルＤＲＧニューロンは、持続的にＴＴＸ−Ｒナトリウム電流を発現するが、培養の数日後にはＮａＮ／ＳＮＳ２／Ｎａｖ１．９の転写物およびタンパク質を欠失することが分かっている。ビオリスティックトランスフェクションの直前に、ペトリ皿から培地を取り除いた。遺伝子銃を細胞の上部１センチメートルに保持し、１２０ＰＳＩの圧力を用いて細胞内に金粒子を送達した。金粒子をより均一に分布させるために、ヘリオス遺伝子銃バレルライナーのすぐ前方に７０マイクロメートルのナイロンメッシュ（Ｓｍａｌｌ  Ｐａｒｔｓ，Ｉｎｃ）を配置した。２４時間以内に、通常、細胞は、ビオリスティックトランスフェクションの成功を指し示す、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を見せる。
【０１１２】
ヘリオス遺伝子銃システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）は、金粒子にコートしたＤＮＡでニューロンをビオリスティックトランスフェクションするために用いた。１０μｇのｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮと５μｇのＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ＤＮＡの混合物を含むポリアニオン  スペルミジンの５０ｍＭ溶液を、製造者の推奨にしたがって、塩化カルシウムを用いて１マイクロメートルの金粒子上に沈殿させる。ＤＮＡ金懸濁液を１００％エタノール中で２回洗浄し、０．０５％  ＰＶＰのエタノール溶液に再懸濁し、１０インチに切ったテフゼルチューブの内壁をコーティングするために用いた（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。このチューブを超高純度窒素を用いて乾燥させ、ヘリオス遺伝子銃のために０．５インチのカートリッジに裁断した。この製法により、１発あたり金粒子１ｍｇの密度と、１カートリッジあたり全ＤＮＡ０．７５μｇとなった。
【０１１３】
遺伝子銃処理によりｒＮａＮ構築物でトランスフェクトされたニューロンを有するカバーガラスに対して、以下のようにして免疫細胞化学処理を行った。（１）完全生理食塩水ｍ、２回、各１分間；（２）０．１４Ｍソレンセン  リン酸バッファーに溶解した４％パラホルムアルデヒド、１０分間；（３）ＰＢＳ、３回、各３分間；（４）５％健常ヤギ血清、２％ウシ血清アルブミンおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ（遮断溶液）、１５分間；（５）一次抗体（遮断溶液中にＮａＮ／ＳＮＳ２／Ｎａｖ１．９，１：５００）、４℃、一晩；（６）ＰＢＳ、６回、各５分間；（７）二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｃｙ３，１：３０００；Ａｍｅｒｓｈａｍ）；および（８）ＰＢＳ、６回、各５分間。明視野と、ノマルスキー微分干渉顕微鏡と、落射蛍光光学系とを備えたライツ・アリストプラン（Ｌｅｉｔｚ  Ａｒｔｉｓｔｏｐｌａｎ）光学顕微鏡を用いて試料を観察した。ＩＰＬａｂスペクトルプログラム（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ）を用いて画像の取り込みおよび解析を行った。蛍光ラベルされたニューロンの画像は、ライカ（Ｌｅｉｃａ）フィルタブロックＮ２．１（Ｃｙ３）およびＬ３（緑色蛍光タンパク質）を用いて取り込んだ。
【０１１４】
ラットＮａＮ／ＳＮＳ２／Ｎａｖ１．９特異的抗体を用いて、この構築物が、ｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮによって形質転換されたＤＲＧニューロン中でラットＮａｖ１．９タンパク質を生産するが、同じ視野内の金粒子を受け取っていない他の細胞はこのタンパク質を生産しないことが実証される（図５）。
【０１１５】
実施例５
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞内におけるｒＮａＮ電流の特徴づけ
【０１１６】
ＨＥＫ２９３細胞を、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、ｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮおよびＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で同時トランスフェクションし、４８時間後、緑色蛍光を発している細胞を電気泳動解析のために選択した。
【０１１７】
ホールセルパッチクランプ記録を、ＥＰＣ−９増幅器を用いて室温（約２１℃にて行い、データをＰｕｌｓｅプログラム（ｖ７．８９，ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、マッキントッシュＱｕａｄｒａ９５０コンピュータに取り込んだ。ファイアポリッシュ電極（０．８〜１．５ＭΩ）は、ＳｕｔｔｅｒＰ−９７プラー（Ｎｏｖａｔｏ，カリフォルニア州）を用いてコーニング７０５２キャピラリーガラス１．６５ｍｍから作製した。空間クランプの問題を最小限に抑えるために、２５μｍ未満の体細胞径を有する単離細胞のみを記録のために選択した。初期のシール耐性が５ＧΩ未満であるか、または高い漏れ電流（−８０ｍＶにおける保持電流＞０．１ｎＡ）、膜胞、または４ＭΩを超えるアクセス耐性を持っている場合には、それらの細胞は分析の考慮に入れなかった。以前の研究において、平均アクセス耐性は、ｈＮＥチャネルを発現している細胞に対しては、２．３±０．６ＭΩ（平均±標準偏差、ｎ＝１１６）であり、ｈＳｋＭ１チャネルを発現している細胞に対しては、２．３±０．６ＭΩ（ｎ＝５２）であると観測されている。電圧誤差は、８０％系列耐性補償によって最小化し、容量アーチファクトはパッチクランプ増幅器のコンピュータ制御回路を用いて相殺した。全ての電圧クランプ記録に対して、脱分極試験電位の前に与えられる４〜５の過分極化パルスからの耐性評価に基づいて線形漏れの減算を行った。膜電流を２．５ｋＨｚでフィルターし、１０ｋＨｚでサンプリングした。ピペット溶液は、１４０ｍＭ  ＣｓＦ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を含んでいた。標準浴溶液は、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシウムおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を含んでいた。これらの溶液に対する液絡電位は、＜８ｍＶであり、このオフセットを説明するためのデータ補正は行わなかった。すべての溶液の浸透圧は、３１０ｍＯｓｍ（Ｗｅｓｃｏｒ５５００浸透圧計）に調節した。オフセット電位は、細胞をパッチする前にゼロにし、各記録の後にドリフトをチェックし、もし、ドリフトが１時間あたり１０ｍＶをこえた場合、その記録は放棄した。
【０１１８】
１６のトランスフェクト細胞において、ｒＮａＮチャネルに起因するであろう検出可能なＴＴＸ−Ｒ電流は全く見られなかった。したがって、ｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮ構築物はトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞内でタンパク質に翻訳されているものの、検出可能なラットＮａＮ／ＳＮＳ２／Ｎａｖ１．９電流は発生しない。
【０１１９】
実施例６
非変異ラットＮａｖ１．９発現ビークルの開発
【０１２０】
（アミノ酸レベルで）非変異の非発現ｒＮａＮクローンｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ２を、ｒＮａＮに対する非変異発現ベクターの構築のための基礎とした。ポリアデニル化（ポリＡ）配列と、それに続くネオマイシン耐性配列とをｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ２のｒＮａＮオープンリーディングフレームの３’側に挿入した。
【０１２１】
簡潔に言えば、ｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ２を、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化し、ＮｏｔＩ／ＸｂａＩ突出部を有する以下のＳａｌＩリンカー（ＪＤＧ０８（配列番号１１）およびＪＤＧ０９（配列番号１２））をプラスミド内に挿入した。ＮｏｔＩ部位とＸｂａＩ部位のいずれも保持しておいた。
【０１２２】
【化１】
2005520540.tif 000002
【０１２３】
プラスミドＲｃ／ＣＭＶを、ＮｏｔＩ，ＳａｌＩおよびＰｖｕＩで消化し、約２．４ｋｂのＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、およびＳＶ４０ポリＡを含む断片をゲル精製し、予めＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、ゲル精製しておいたｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ２中にクローン化した。このクローン（ｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ−ＢＧＨｎｅｏ、図６）は制限分析によって安定であった。
【０１２４】
ｒＮａＮオープンリーディングフレームのカルボキシ末端に融合されたＧＦＰは、トランスフェクトされた哺乳類細胞を同定する手段として望ましいと考えられる。したがって、ｒＮａＮ−ＧＦＰ融合構築物を２段階で作製した。まずｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ−ＢＧＨｎｅｏ内の３’ｒＮａＮ配列を、ベクター内のｒＮａＮ終止コドンとＵＴＲ配列を除いてＮｏｔＩ部位のすぐ５’側にＣｌａＩ部位を導入したＰＣＲ産物で置換した。次に、６つのタンデムヒスチジン残基［Ｈｉｓ（６）］、その次にＧＦＰを、ｒＮａＮの３’末端に挿入した。この６つのヒスチジン残基は、ｒＮａＮとＧＦＰとのオープンリーディングフレームの間のスペーサを提供し、ニッケルカラム上で融合タンパク質を精製するための手段を提供するために組み込まれたものである。
【０１２５】
簡潔に言えば、ｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ２−ＢＧＨｎｅｏをＰＣＲ反応における鋳型として利用し、ｒＮａＮ内の唯一のＢｓｕ３６Ｉ部位の上流にアニールする５’プライマー（３ＡＰ２Ｆ２；配列番号１３）、およびｒＮａＮの最後の１９個のヌクレオチドにアニールする（ただし、ＴＧＡ終止コドンにはアニールしない）３’プライマー（ＪＤＧ１３；配列番号１４）、ならびにｒＮａＮのＯＲＦの３’末端における操作したＮｏｔＩおよびＣｌａＩ制限酵素部位を用いてＰＣＲ反応を行った。
【０１２６】
【化２】
2005520540.tif 000003
【０１２７】
このＰＣＲ増幅の産物を、Ｂｓｕ３６ＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製して、ｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ２−ＢＧＨｎｅｏ内の対応するＢｓｕ３６Ｉ／ＮｏｔＩ配列を置換するために用いた。ＧＦＰは、ＪＤＧ１４（配列番号１５）およびＪＤＧ１５（配列番号１６）プライマーを用いてプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅した。
【０１２８】
【化３】
2005520540.tif 000004
【０１２９】
いずれの増幅のためのＰＣＲ反応も、９５℃１分間、５５℃１分間、７２℃３分間のサイクルを３５サイクル、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ、１ｎｇ鋳型、０．２μＭ各オリゴプライマー、および１μＬ（２．５ユニット）Ｐｆｕポリメラーゼを用いて行った。
【０１３０】
ＧＦＰのＰＣＲ産物をＣｌａＩおよびＮｏｔＩで消化し、ゲル精製し、予めＣｌａＩ／ＮｏｔＩで消化してゲル精製しておいたｒＮａＮ構築物中にクローン化した。その結果、ｒＮａＮ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（６）−ＧＦＰ融合体に続いて、ＢＧＨポリＡおよびネオマイシン耐性遺伝子を有した、プロモーターを含まないプラスミドが得られた。このプラスミド（ｐＬＧ／ｒＮａＮ−ＧＦＰ）は、ラットＮａｖ１．９−Ｈｉｓ（６）−ＧＦＰ融合体に隣接するＡｆｌＩＩおよびＮｏｔＩ部位を有している（図７）。
【０１３１】
低コピー数ｐＬＧ３３８に基づいたプラスミド（ｐＬＧ３３８ＸＭ、図２）の発現バージョンがすでに構築されているので、ｐＬＧ／ｒＮａＮ−ＧＦＰからのＡｆｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片をこの発現ベクターにサブクローニングすることにした。したがって、いずれのクローンもＡｆｌＩＩ／ＮｏｔＩで消化し、適当な断片をゲル精製して、それらを互いにライゲーションした。
【０１３２】
制限分析によりコロニーをスクリーニングし、安定に見えるもののうちの１つに対して配列決定を行い、公表されているｒＮａＮ配列からアミノ酸レベルでの変化がないことを確認した（ｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰ，図８）。
【０１３３】
このクローンの安定性は、プラスミドとこの構築物において使用した遺伝子配列の組み合わせ、構築物に安定化作用を発揮するＨｉｓ（６）−ＧＦＰ配列の存在、および３’非翻訳配列の除去に起因すると考えられる。
【０１３４】
実施例７
ｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰからのＴＴＸ−Ｒ電流の電気生理学的記録
【０１３５】
実施例５に記載した方法を用いて、ｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰでトランスフェクトした細胞の電気生理学的測定を行い、正常なラットＤＲＧニューロンと比較した。図９に示したように、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞およびマウスＳＮＳヌルＤＲＧニューロンは、正常なラットＤＲＧニューロンと同じ電流サインを有していた。
【０１３６】
実施例８
Ｈｉｓ（６）−ＧＦＰを含まないｒＮａｖ１．９発現ベクター
【０１３７】
ｒＮａＮのａｔｇ開始コドンの５’側の３８ヌクレオチドの非翻訳配列と、これに続く、オープンリーディングフレームの末端に翻訳終止シグナル（終止コドン）を有した全ｒＮａＮオープンリーディングフレームとで構成される発現ベクターの構築。ｒＮａＮのカルボキシ末端に終止コドンを含んだ非融合型のｒＮａＮを発現用に構築した。この目的を達成するために以下の戦略を用いた。
【０１３８】
簡潔に言えば、３’ｒＮａＮ配列をプライマー５ＸＤ４Ｆ６とＪＤＧ２３とを用いてＰＣＲ増幅した。５ＸＤ４Ｆ６（配列番号１７）は、ＮａＮ内の唯一のＢｇｌＩＩ部位の上流（５’）にアニールするシーケンシングプライマーである。ＪＤＧ２３（配列番号１８）はリバースプライマーであり、ｒＮａＮの最後の６つのアミノ酸（１８ヌクレオチド）にアニールし、その５’末端には２つの終止コドン（ＴＧＡＴＡＡ）とこれに続くＢｓｐＤＩ（ＣｌａＩのアイソシゾマー）およびＮｏｔＩ部位が形成されている。ＰＣＲ反応は上述のようにして実施した。
【０１３９】
【化４】
2005520540.tif 000005
【０１４０】
このＰＣＲの産物を用いて、ｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰ内のＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩ断片を置換したところ、Ｈｉｓ（６）−ＧＦＰ配列が削除され、ｒＮａＮオープンリーディングフレームのカルボキシ末端に、２つの終止コドンとそれに続くＢｓｐＤＩとＮｏｔＩ制限酵素部位が配置された。
【０１４１】
この一連のクローニング実験によって得られたプラスミド（ｐｒＮａＮ、図１０）は、制限分析によって正しくかつ安定であると思われたので、配列決定を行った。配列決定の結果、ｒＮａＮ配列は、アミノ酸レベルでは公表されている配列のものと同一であることが分かった。
【０１４２】
実施例９
ナトリウム電流の測定方法
【０１４３】
ナトリウム電流は、Ｒｉｚｚｏら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ７２，２７９６〜２８１５頁およびＤｉｂ−Ｈａｊｊら（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１６，１１〜１４頁）に記載されているように、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞において、パッチクランプ法（Ｈａｍｉｌｌら（１９８１）Ｐｆｌuｅｇｅｓ  Ａｒｃｈ．３９１，８５〜１００頁）を用いて測定する。これらの記録のために、Ｐｕｌｓｅ（ｖ７．５２）（ＨＥＫＡ）などのプログラムを用いて、データをマッキントッシュＱｕａｄｒａ９５０または類似のコンピュータ上に取得する。ファイアポリッシュ電極（０．８〜１．５ＭＷ）は典型的には、ＳｕｔｔｅｒＰ−８７プラーなどの機器を用いてガラス毛細管から作製される。最も厳密な分析においては、通常、細胞は、初期シール耐性が５ＧΩ未満であり、高い漏れ電流（−８０ｍＶにおける保持電流が０．１ｎＡ未満）、膜胞、および５ＭΩ未満のアクセス耐性を有する場合にのみ、分析の対象となる。通常、アクセス耐性は、実験の間を通してモニターされ、耐性に変化が生じるとデータは用いられない。電圧誤差は、系列耐性補償を用いて最小化し、容量アーチファクトはパッチクランプ増幅器のコンピュータ制御回路または他の類似の方法を用いて相殺する。活性化および不活性化の電圧依存性を比較するために、補償後に最大の電圧誤差である±１０ｍＶを有する細胞を用いる。通常、電圧クランプ記録に対しては、線形漏れ減算を用いる。膜電流は、典型的には５ｋＨｚにおいてフィルターし、２０ｋＨｚにおいてサンプリングする。ピペット溶液は、１４０ｍＭ  ＣｓＦ、２ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１０ｍＭ  Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）などの標準溶液を含む。標準浴溶液は、通常、１４０ｎＭ塩化ナトリウム、３ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭグルコースを含む（ｐＨ７．３）。
【０１４４】
細胞内パッチクランプ記録などの方法を用いた、トランスフェクト細胞またはＤＲＧニューロンに対する電圧クランプ実験によって、ナトリウム電流密度の定量的測定値（および細胞内のナトリウムチャネルの数）と、チャネルの生理的特性とを得ることができる。ナトリウムチャネルなどのイオンチャネルを通過する電流を測定するこれらの技術は、Ｒｉｚｚｏら（１９９５）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．２，８７〜８９頁に記載されている。あるいは、ナトリウムチャネル機能の阻止または増強は、ナトリウム感受性色素または同位体標識Ｎａによる光学的画像化を用いて測定することができる。Ｒｏｓｅら（１９９７）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．７８，３２４９〜３２５８頁によって記載されたこれらの方法では、ナトリウムチャネルが開いているときに起こるナトリウムイオンの細胞内濃度の増加を測定する。
【０１４５】
実施例１０
細胞内ナトリウム（［Ｎａ＋］ｉ）の測定
【０１４６】
Ｎａ＋を発現する細胞に対する様々な薬剤の効果は、［Ｎａ＋］ｉのレシオメトリックイメージングを用いて、ＳＢＦＩまたは他の同様のイオン感受性色素を用いて判定することができる。この方法において、Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，２４６４〜２４７５頁に記載されるように、細胞質遊離Ｎａ＋を、Ｎａ＋に対する指示薬、例えばＳＢＦＩ（ナトリウム結合性ベンゾフランイソフタレート（Ｈａｒｏｏｔｕｎｉａｎら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１９４５８〜１９４６７頁））または同様の色素を用いて測定する。まず、細胞に、膜透過性アセトキシメチルエステル型の色素（１０ｍＭのストック濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解されている）を取り込ませる。レシオメトリックイメージング装置（例えば、Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いて、顕微鏡の台上で記録を得る。適当な波長（例えば、３４０／３８５ｎｍ）の励起光を与える。二色性リフレクター（４００ｎｍ）を介して励起光を細胞に受け渡し、４５０ｎｍを超える放射光を回収する。蛍光シグナルは例えばイメージ増強管（ＧｅｎＩＩＳｙＳ）によって増強し、フレーム取り込み器につながれたＣＣＤカメラまたは同様の装置によって回収する。蛍光の衰退を考慮するために、細胞質遊離Ｎａ＋のアッセイには、蛍光比３４０：３８５を用いる。
【０１４７】
ＳＢＦＩの蛍光を較正するために、それぞれの実験の後で、細胞に、既知濃度のＮａ＋（典型的には０および３０ｍＭまたは０、３０および５０ｍＭ［Ｎａ＋］）を含む較正溶液と、グラミシジンやモネンシン（上記参照）などのイオノフォアをしみ込ませる。ＲｏｓｅおよびＲａｎｓｏｍ（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４９１，２９１〜３０５頁）によって報告されているように、細胞内ＳＢＦＩの蛍光比３４５／３９０ｎｍは、［Ｎａ＋］ｉの変化とともに単調に変化する。典型的には、対照細胞およびナトリウム電流を阻止、阻害または増強する可能性のある様々な濃度の薬剤に曝した細胞において、統計的に有意な細胞内ナトリウムの測定値を与える、複数（典型的には少なくとも４つ）の異なるカバースリップ上で実験を繰り返す。
【０１４８】
実施例１１
２２Ｎａまたは８６Ｒｂの測定によってＮａ＋流入を測定するための方法
【０１４９】
２２Ｎａは、ガンマ線発生源であり、Ｎａ＋フラックスを測定するために用いることができ（ＫｉｍｅｌｂｅｒｇとＷａｌｔｚ（１９８８），Ｂｏｕｌｔｏｎ，Ｂａｋｅｒ，およびＷａｌｚ，Ｅｄｓ．）、８６Ｒｂ＋は、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ活性（Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４，２４６４〜２４７５頁）を測定するために用いることができる。８６Ｒｂ＋イオンは、ＮＡ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ様Ｋ＋イオンによって取り込まれるが、４２Ｋ＋よりもはるかに長い半減期を有するという利点を有している（ＫｉｍｅｌｂｅｒｇとＭａｙｈｅｗ（１９７５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０，１００〜１０４頁）。したがって、一方向のウワバイン感受性８６Ｒｂ＋の取り込みの測定は、神経細胞の電気的発火の別の指標となるＮＡ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼ活性をアッセイするための定量的方法を与える。Ｎａｖ１．９を発現している細胞を、放射性同位体２２Ｎａ＋とともにインキュベートした後、同位体の細胞含量を液体シンチレーション計測法または類似の方法によって測定し、例えば、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ法（Ｓｍｉｔｈら（１９８５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０，７６〜８５頁）にＧｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔとＫｉｍｅｌｂｅｒｇ（１９８９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７７，４１〜４５頁に記載される培養細胞に対する改変を施した方法、などの方法を用いて細胞タンパク質を決定する。２２Ｎａまたは８６Ｒｂ＋フラックスは、Ｎａｖ１．９を阻止、阻害または増強する薬剤の存在下および非存在下において判定する。これにより、当該薬剤のＮａｖ１．９に対する作用を判定することができる。
【０１５０】
実施例１２
Ｎａｖ１．９に対する安定な株化細胞の確立
【０１５１】
標準的なリン酸カルシウムプロトコール（Ｗａｔａｎａｂｅら（１９９９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３，７１〜７８頁）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞（１０ｃｍのプレートに、５０％の細胞密集度）を、１０μｇのｐＣＭＶ  ｒＮａＮ−２×Ｓｔｏｐでトランスフェクションした。この構築物は、ＧＦＰタンパク質に融合されていない、チャネルの全オープンリーディングフレームをコードしている。２日後、細胞を選択培地（１０％のＦＣＳと０．６ｍｇ／ｍＬのＧ４１８とを含んだＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２の完全培地）を入れた２枚の皿に分割した。培地は４〜５日おきに交換した。孤立コロニーができたところで、これらを２４ウェルプレートにまき、選択培地中で培養した。
【０１５２】
Ｎａｖ１．９を発現している安定な細胞系からの全細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。１ｍＭランダムヘキサマー（Ｒｏｃｈｅ）と、５００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、１００ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、最終体積５０μＬ中で第一鎖ｃＤＮＡを逆転写した。バッファの組成は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ｄＮＴＰとした。この反応は、３７℃で９０分間、４２℃で３０分間進行させ、その後９５℃で５分間加熱することにより終結させた。逆転写酵素を省く以外は同様にして、対照の鋳型を調製した（−ＲＴ）。
【０１５３】
ＰＣＲ増幅は、公表されているｒＮａｖ１．９配列の塩基２０〜４２および５３３５〜５３１４の範囲のプライマーを用いて、５８℃でのアニーリングと８分間の伸長を３５サイクルにより実施した。５．３ｋｂの予想サイズを有する単一の増幅産物が、選択したクローンから得られた（図１１Ａ）。−ＲＴ鋳型を用いた対照ＰＣＲ反応からは、増幅産物は得られなかった。増幅は、プログラム可能なサーマルサイクラー（ＰＴＣ−１００，ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）により行った。
【０１５４】
ｒＮａｖ１．９ｃＤＮＡによって安定的にトランスフェクトされた４つのＨＥＫ２９３株化細胞（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ５およびＳ６）について、全長ｒＮａｖ１．９チャネルタンパク質を生産するかどうかを調べた。細胞を掻き取りにより１００ｍｍの皿から回収し、ガラスダウンス中、３０μＬ／ｍｇ組織となるように氷冷溶菌バッファ中でホモジナイズした。溶菌バッファ（０．３Ｍスクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１），２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に、プロテーゼ阻害剤（１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１０μｇ／ｍＬ  アプロチニン，１０μｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ベンズアミジン，１ｍＭ  ペプスタチン，８μｇ／ｍＬ  カルパインＩ、８μｇ／ｍＬ  カルパインＩＩ）を添加した。ホモジネートは、１時間氷上に保持してから、１０００×ｇ（低速スピン）にて４℃で７分間遠心分離して、核および無傷細胞を除去した。ペレットを再びホモジナイズし、同一の条件で再度スピンした。２回の低速スピンによって得られた上清を合わせて、１２０，０００×ｇにて４℃で１時間遠心分離した。全膜画分を含んだペレットを０．２Ｍ  ＫＣｌ，１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中に懸濁した。
【０１５５】
膜画分を可溶化するために、等体積の５％  Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００，１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を試料に加え、懸濁液を氷上で１時間保持した。可溶化しなかった物質は、１０，０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離することによりペレット化し、上清中の可溶物質は更なる操作のために回収した。タンパク含量は、高界面活性剤試料用のＢｉｏＲａｄ  ＤＣアッセイを用いて決定した。
【０１５６】
抗Ｎａｖ１．９ポリクローナル抗体は、Ｃ末端アミノ酸ペプチドＣＮＧＤＬＳＳＬＤＶＡＫＶＫＶＨＮＤ（配列番号２０のアミノ酸１７４８〜１７６５）に対してウサギにおいて産生させ、特異的ペプチドカラム（Ｆｊｅｌｌら（２０００）Ｎｅｕｒｏ  ｒｅｐｏｒｔ  １１，１９９〜２０２頁）によりアフィニティ精製した。抗Ｎａｖ１．９抗体は、最終濃度０．２μｇ／ｍＬで使用した。
【０１５７】
イムノブロットアッセイは以前に記載されているように行った（Ｔｙｒｒｅｌｌら（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１，９６２９〜９６３７頁）。簡潔に言えば、試料（１０〜２０μｇ）をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファ中、３７℃で２０分間変性させた。タンパク質は、５％または４〜１５％グラジエントのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌｓ（ＢｉｏＲａｄ）を用いたＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分画し、続いてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に２２ｍＶ、４℃で一晩、電気的に転移させた。ブロットを室温で１時間、ＴＢＳに溶解した１０％ドライミルクによりブロックしてから、ＴＢＳ中５％ＢＳＡに希釈した一次抗体とともに、室温で２時間インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴ（０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＴＢＳ）中でよく洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ）を、１．２５％ＢＳＡに１：１０，０００で希釈したものと一緒に、室温で１時間インキュベートすることにより、免疫反応性タンパク質を検出した。シグナルは、製造者の推奨（ＮＥＮ）に従って、ルネッサンス化学発光によって検出した。約２１０ｋＤａの予測サイズを有する堅牢な免疫反応性タンパク質が、４つの株化細胞のそれぞれにおいて検出される（図１１Ｂ）。
【０１５８】
安定にトランスフェクトされた細胞を用いたホールセルパッチクランプ記録を、ＥＰＣ−９増幅装置を用いて室温（２１℃）で実施した。データは、Ｐｕｌｓｅプログラム（ｖ８．３１）（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて、Ｐｅｎｔｉｕｍ−ＩＩＩコンピュータ上で取得した。ファイアポリッシュ電極（０．８〜１．５ＭΩ）は、Ｓｕｔｔｅｒ  Ｐ−９７プラーを用いて、１．７ｍｍキャピラリーガラス（ＶＷＲ）より作製した。初期のシール耐性が２ＧΩ未満であるか、または４ＭΩを超えるアクセス耐性を持つ場合、それらの細胞は分析の考慮に入れなかった。全ての電圧クランプ記録に対して、脱分極試験電位の前に与えられる４〜５の過分極化パルスからの耐性評価に基づいた線形漏れの減算を行った。膜電流を２．５ｋＨｚでフィルターし、１０ｋＨｚでサンプリングした。ピペット溶液は、１４０ｍＭ  ＣｓＦ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を含んでいた。標準浴溶液は、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシウムおよび１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を含んでいた。カルシウム電流を阻止するために浴溶液にはカドミウム（１００μＭ）を添加し、内在性テトロドトキシン感受性ナトリウム電流を阻止するために５００ｎＭテトロドトキシンを添加した。すべての溶液の浸透圧は、３１０ｍｏｓＭ（Ｗｅｓｃｏｒ５５００浸透圧計）前後に調整した。持続的ＴＴＸ耐性ナトリウム電流は、Ｓ２株化細胞において安定に発現されたＮａｖ１．９ナトリウムチャネル（図１１Ｃ）によって示されたが、非処置のＨＥＫ２９３細胞中では観察されなかった（データ示さず）。
【０１５９】
実施例１３
ｒＮａｖ１．９を含むウィルス発現ベクター
【０１６０】
アデノウィルスＡｄ５は、Ｎａｖ１．９に対するウィルス発現ベクターを作製するために用いることができる。Ａｄ５のアーリーリージョン１（Ｅｌ）とアーリーリージョン３（Ｅ３）の配列をＣＭＶプロモーター並びにそれに続くクローン化Ｎａｖ１．９遺伝子に交換する。Ｅ１トランス相補的なＨＥＫ２９３細胞を、Ａｄ５−Ｎａｖ１．９ウィルス発現ベクターでトランスフェクトする。安定した発現する細胞を、抗Ｎａｖ１．９抗体を用いて選択する。
【０１６１】
実施例１４
ヒトおよびマウスＮａｖ１．９発現構築物
【０１６２】
標準的なリン酸カルシウムプロトコールを用いて（Ｗａｔａｎａｂｅら（１９９９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３，７１〜７８頁）、ＨＥＫ２９３細胞（１０ｃｍのプレートに７０％の細胞密集度）を、１０μｇのヒトおよびマウスｐＣＭＶ−ＮａＮで別々にトランスフェクトした。これらの構築物は、チャネルの完全なオープンリーディングフレームをコードしている。細胞は、１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ−Ｈａｍ'ｓＦ１２の完全培地中で培養した。
【０１６３】
ＮａＮ／Ｎａｖ１．９を発現している安定な株化細胞から、全細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。１ｍＭランダムヘキサマー（Ｒｏｃｈｅ）と、５００ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、１００ユニットのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、最終濃度５０μＬ中で第一鎖ｃＤＮＡを逆転写した。バッファの組成は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および５ｍＭ  ｄＮＴＰとした。この反応は、３７℃で９０分間、４２℃で３０分間進行させ、その後９５℃で５分間加熱することにより終結させた。逆転写酵素を省く以外は同様にして、対照の鋳型を調製した（−ＲＴ）。
【０１６４】
ＰＣＲ増幅は、１μＭプライマー（表１）を用いて、５８℃でのアニーリングと１キロベースあたり１分間の伸長からなるサイクルを３５サイクル行って実施した。−ＲＴ鋳型を用いた対照ＰＣＲ反応では、増幅産物は産生されなかった。増幅は、ＰＴＣ−１００プログラム可能なサーマルサイクラ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）内で行った。
【０１６５】
抗Ｎａｖ１．９ポリクローナル抗体は、ウサギにおいて、ヒト（ＣＮＧＤＬＳＳＦＧＶＡＫＧＫＶＨ，配列番号２２）およびマウス（ＣＮＧＤＬＳＳＬＤＶＡＫＶＫＶＨＮＤ，配列番号２３）のＮａｖ１．９チャネルのＣ末端ペプチドに対して産生させ、特異的ペプチドカラムでアフィニティ精製した。抗Ｎａｖ１．９抗体は最終濃度２μｇ／ｍＬで用い、ヒトまたはマウスＮａｖ１．９構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を染色した。
【０１６６】
【表１】
2005520540.tif 000006
【０１６７】
【表２】
2005520540.tif 000007
【０１６８】
本発明について上記の実施例を参照しながら詳細に説明してきたが、本発明の精神から逸脱しない限りにおいて様々な変更を行うことができる。したがって、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書中で参照したすべての引用特許、特許出願および出版物は、その全体をあらゆる目的で参照によって本願に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】改変ｐＬＧ３３８ベクターに挿入されたｒＮａＮを含む非発現プラスミドｐＬＧ３３８−ｒＮａＮを示す図である。
【図２】低コピー数発現プラスミドｐＬＧ３３８ＸＭを示す図である。
【図３】哺乳類発現構築物を作製するためにｐＬＧ３３８−ｒＮａＮからｒＮａＮのＯＲＦをｐＬＧ３３８ＸＭにクローニングすることにより構築された発現プラスミドｐＬＧ３３８ＸＭ−ｒＮａＮを示す図である。
【図４】ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析を用いた、ＨＥＫ２９３細胞でのｒＮａＮ発現の分析を示す図である。（Ａ）ＲＴ−ＰＣＲ分析。ラットＤＲＧおよびトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から、ｒＮａＮ増幅の予想される産物（３１８ｂｐ）が（＋）ＲＴ鋳型が検出される（それぞれ、レーン１および４）。（＋）ＲＴ非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（レーン２）、（−）ＲＴトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（レーン３）または対照鋳型（レーン５）においては増幅シグナルが検出されない。「Ｍ」レーンは、１キロベースのラダーである。（Ｂ）ウェスタンブロット分析。非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（レーン１）、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（レーン２）およびラットＤＲＧ組織（レーン３）からの膜画分について、Ｎａｖ１．９シグナルの存在を分析した。約２１０ｋＤａのタンパク質種が、天然のＤＲＧ組織およびトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞において観察されるが、対照ＨＥＫ２９３細胞には見られない。タンパク質のサイズは、予測される分子量である２０１ｋＤａと一致している。
【図５】インビトロのＤＲＧニューロンで発現させたＧＦＰ−ＮａＮ構築物を示す図である。ＧＦＰ（Ａ）およびＮａｖ１．９（Ｂ）は、スモールＤＲＧユーロンで同時発現している。ＧＦＰでトランスフェクトされていないＤＲＧニューロンは、ＮａＮ／ＳＮＳ２／Ｎａｖ１．９免疫反応性を示さない（矢印）。（Ｃ）は（Ａ）および（Ｂ）に示した視野のノマルスキー画像。スケールバー：２５μｍ。
【図６】プロモーターのないｒＮａＮ２とＢＧＨｎｅｏとのクローンｐＬＧ３３８−ｒＮａＮ−ＢＧＨｎｅｏを示す図である。
【図７】プロモーターのないｒＮａＮ−６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ融合クローンを示す図である。
【図８】ｒＮａＮ−６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ融合構築物に対する発現ベクターを示す図である。
【図９】（Ａ）はＨＥＫ２９３細胞の電流サインを示す図であり、（Ｂ）はｐＣＭＶ−ｒＮａＮ−ＧＦＰ構築物でトランスフェクトされ、電流発生の特性を示すマウスＳＮＳヌルＤＲＧニューロンの電流サインを示す図である。ＤＲＧ細胞の自然電流の電流サイン特性（Ｃ）を検出および測定した。
【図１０】アミノ酸レベルでｒＮａＮの完全に正しい配列（配列番号２０）を発現する発現ベクターｐｒＮａＮを示す図である。
【図１１】ｒＮａｖ１．９でトランスフェクトされた、安定なＨＥＫ２９３に由来する株化細胞におけるＲＮＡ、タンパク質およびナトリウム電流の発現を示す図である。（Ａ）Ｓ２およびＳ６株化細胞の鋳型からＲＴ−ＰＣＲによって増幅した完全長ｒＮａｖ１．９ｃＤＮＡ。（Ｂ）安定な株化細胞Ｓ１、Ｓ２、Ｓ５およびＳ６の膜画分中のＮａｖ１．９タンパク質を検出するイムノブロットアッセイ。（Ｃ）ホールセルパッチクランプにおいて記録される、Ｎａｖ１．９ナトリウムチャネルを安定に発現しているトランスフェクトＨＥＫ２９３株化細胞の代表的な単一細胞電流サイン。
【図１２】ヒトＮａＮ／Ｎａｖ１．９でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＮａｖ１．９チャネルの発現を示す図である。（Ａ）ヒトＮａＮ／Ｎａｖ１．９ｃＤＮＡの完全長（レーン１）または重複セグメント（レーン２〜４）を、表２に記載のプライマー対（ａ−ｄ）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。レーン１は、プライマー対（ａ）の反応の単一の増幅産物を示し、５４００塩基の増幅産物と矛盾しない。レーンＭは、１ｋｂｐの分子量マーカーを含む。レーン２〜４は、それぞれプライマー対（ｂ〜ｄ）の増幅産物を示し、これらはそれぞれ予測されるアンプリコンの長さ１９３６、１９７０および１５３９塩基と矛盾しない。
【図１３】マウスＮａｖ１．９でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＮａｖ１．９チャネルの発現を示す図である。マウスＮａＮ／Ｎａｖ１．９ｃＤＮＡの全長にわたる重複セグメントを、表２に記載のプライマー対（ｅ〜ｆ）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。レーンＭは、１ｋｂｐ分子量マーカーを含む。レーン１〜３は、それぞれプライマー対（ｅ〜ｆ）の増幅産物を示し、これらはそれぞれ予測されるアンプリコンの長さ１８１３ｂｐ、２０３４ｂｐ、および１５８４ｂｐと矛盾しない。
【図１４】ＨＥＫ細胞におけるナトリウムチャネルのヒトおよびマウスＮａｖ１．９免疫染色を示す図である。（Ａ）ＨＥＫ細胞をヒトＮａｖ１．９構築物でトランスフェクトし、抗ヒトＮａｖ１．９抗体と反応させた。トランスフェクト細胞は、強いＮａｖ１．９免疫蛍光を示しているが、隣接する非トランスフェクト細胞は、Ｎａｖ１．９免疫標識を示していない。（Ｂ）ＨＥＫ細胞をマウスＮａｖ１．９構築物でトランスフェクトし、抗マウスＮａｖ１．９抗体と反応させた。トランスフェクト細胞は、強いＮａｖ１．９免疫蛍光を示しているが、隣接する非トランスフェクト細胞は、Ｎａｖ１．９免疫標識を示していない。（Ａ）’および（Ｂ）’は、それぞれ（Ａ）および（Ｂ）内の視野のノマルスキー明視野画像であり、多くの非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の存在を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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2005520540.tif 000022
2005520540.tif 000023
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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