(57)【要約】Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ−５）タンパク質を、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）や肥満症などのインスリン耐性に関わる障害を治療するのに有効な量で投与する。評価基準としてＤｋｋ−５を使用してインスリン耐性及び関連する障害を診断する方法、診断及び治療のためのキット、ならびにＤｋｋ−５に対する抗体を生成するハイブリドーマ、及びＤｋｋ−５を含む調剤も提供される。
2005506342.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
投与することが必要な哺乳類に、有効な量のＤｉｃｋｋｏｐｆ−５（Ｄｋｋ−５）を投与することを含んでなる、哺乳類のインスリン耐性障害を治療する方法。
【請求項２】
前記障害が、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）又は肥満症である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｄｋｋ−５のアミノ酸配列が、図２の配列番号５に対して少なくとも約８５％同一、又はＤｋｋ−５のアミノ酸配列が、配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列に対して少なくとも約８５％同一である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ｄｋｋ−５が、図２の配列番号５を含み、又は配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｄｋｋ−５が、配列番号５の残基２５と残基３４７との間の配列を含む、請求項１から６、８、９、又は１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｄｋｋ−５が、Ｎ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有し分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の内部切断タンパク質断片、又は配列番号５を含むＤｋｋ−５と前記内部切断タンパク質断片との混合物、又は配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含むＤｋｋ−５と前記内部切断タンパク質断片との混合物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
有効な量のインスリン耐性治療剤を投与することをさらに含んでなる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療剤が、インスリン、ＩＧＦ−１、又はスルホニル尿素である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）哺乳類からのサンプル中のＤｉｃｋｋｏｐｆ−５（Ｄｋｋ−５）の量を測定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された量と、標準サンプル中に存在するＤｋｋ−５の量とを比較するステップとを含んでなり、ステップ（ａ）におけるＤｋｋ−５の量が少ないレベルにある状態はインスリン耐性障害であることが示される、
哺乳類のインスリン耐性障害の存在又は発症を検出するための方法。
【請求項１０】
前記測定が、イムノアッセイで抗Ｄｋｋ−５抗体を使用して実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗Ｄｋｋ−５抗体が標識を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、蛍光標識、放射性標識、又は酵素標識からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インスリン耐性障害が、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）又は肥満症である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
Ｄｋｋ−５が、配列番号５を含んでなるＤｋｋ−５、又は配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含むＤｋｋ−５、又はＮ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有しかつ分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の内部切断タンパク質断片、又は前記切断生成物と、前記配列番号５を含むＤｋｋ−５又は前記配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含んでなるＤｋｋ−５の一方又は両方との組合せである、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
インスリン耐性障害の存在又は発症を検出するための診断キットであって、
（ａ）Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−５（Ｄｋｋ−５）と結合する抗体を含んでなる容器と、
（ｂ）Ｄｋｋ−５を含有する標準サンプルを含んでなる容器と、
（ｃ）障害を検出するための抗体及び標準サンプルを使用するための取扱説明書とを含んでなり、Ｄｋｋ−５に結合する抗体が検出可能に標識され、あるいは、検出可能に標識されてＤｋｋ−５に結合し又はＤｋｋ−５に結合する抗体に結合する第２の抗体を入れた別の容器をさらに含んでなる前記キット。
【請求項１６】
Ｄｋｋ−５に結合する前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記Ｄｋｋ−５が、配列番号５を含んでなるＤｋｋ−５、又は配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含んでなるＤｋｋ−５、又はＮ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有しかつ分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の内部切断タンパク質断片、又は前記切断生成物と、前記配列番号５を含むＤｋｋ−５又は前記配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含んでなるＤｋｋ−５の一方又は両方との組合せである、請求項１５又は１６に記載のキット。
【請求項１８】
インスリン耐性障害を治療するためのキットであって、
（ａ）Ｄｋｋ−５を含む容器と、
（ｂ）前記障害を治療するために前記Ｄｋｋ−５を使用するための取扱説明書とを含んでなる前記キット。
【請求項１９】
前記障害が、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）又は肥満症である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記容器がバイアルであり、前記取扱説明書が、すぐに注射できるようにシリンジ内に前記バイアルの内容物を入れることを明記している、請求項１８又は１９に記載のキット。
【請求項２１】
インスリン耐性治療剤を入れた容器をさらに含んでなる、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記Ｄｋｋ−５が、配列番号５を含んでなるＤｋｋ−５、又は配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含んでなるＤｋｋ−５、又はＮ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有しかつ分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の内部切断タンパク質断片、又は前記切断生成物と、前記配列番号５を含んでなるＤｋｋ−５又は前記配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含んでなるＤｋｋ−５の一方又は両方との組合せである、請求項１８から２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２３】
Ｎ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有しかつ分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の分離された内部切断タンパク質断片。
【請求項２４】
請求項２３に記載のタンパク質断片と担体とを含んでなる組成物。
【請求項２５】
配列番号５を含むＤｉｃｋｋｏｐｆ−５（Ｄｋｋ−５）、又は配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含むＤｋｋ−５をさらに含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記Ｄｋｋ−５が、配列番号５の残基２５と残基３４７の間の配列を含む、請求項２４又は２５に記載の組成物。
【請求項２７】
ＰＴＡ−３０９０、ＰＴＡ−３０９１、ＰＴＡ−３０９２、ＰＴＡ−３０９３、ＰＴＡ−３０９４、ＰＴＡ−３０９５、及びＰＴＡ−３０９６からなる群から選択されたＤｋｋ−５抗体を生成するハイブリドーマ。
【請求項２８】
請求項２７に記載のハイブリドーマのいずれか１つによって生成される抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、非インスリン依存型又はＩＩ型糖尿病などのインスリン耐性に関わる障害、及び肥満や加齢に伴うその他のインスリン耐性状態の、診断及び治療を提供する。より詳細には、本発明は、インスリン耐性障害の治療においてＤｋｋ−５を使用することに関する。また本発明は、特に、インスリン耐性又はそれに関連した障害、特に非インスリン依存性糖尿病であることが疑われる個体でのインスリン耐性障害の存在を診断するために、Ｄｋｋ−５レベルを使用する方法にも関する。
【０００２】
インスリン耐性は、所与の用量のインスリンに対する生体応答が期待されるよりも小さいものと定義され、肥満と広く関連している。実際に、肥満の結果生じる病態の多くは、インスリン耐性に関係があると考えられている。そのような病態には、高血圧症、高脂血症、及び最も際立つものとしてインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）が含まれる。ほとんどのＮＩＤＤＭ患者は肥満であり、ＮＩＤＤＭを発症させる非常に中心的で初期の構成要素とは、インスリン耐性である（Ｍｏｌｌｅｒ他、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２５：９３８（１９９１））。インスリン耐性の過程では、この疾患の初期段階で生じるインスリンレセプターのダウンレギュレーションの他に、ポストレセプター異常が発症することが実証されている（Ｏｌｅｆｓｋｙ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ、Ｒｉｆｋｉｎ及びＰｏｒｔｅ，Ｊｒ．編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第４版、１９９０）、第１２１〜１５３頁）。
【０００３】
そのようなポストレセプター欠陥の可能性がある部位としてのグルコース輸送系に関するいくつかの研究によれば、げっ歯類及びヒトのインスリン耐性状態では、インスリン感受性グルコース輸送体（Ｇｌｕｔ４）の量と機能の両方が不足していることが実証されている（Ｇａｒｖｅｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：６０（１９８９）；Ｓｉｖｉｔｚ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：７２（１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：７０（１９８９）；Ｋａｈｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８４：４０４（１９８９）；Ｃｈａｒｒｏｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：７９９４（１９９０）；Ｄｏｈｍ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６０：Ｅ４５９（１９９１）；Ｓｉｎｈａ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４０：４７２（１９９１）；Ｆｒｉｅｄｍａｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８９：７０１（１９９２））。インスリン感受性グルコース輸送体の正常なプールが不十分であると、理論的には個体がインスリン耐性になる（前掲のＯｌｅｆｓｋｙ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ）。しかし、いくつかの研究では、ヒトＮＩＤＤＭにおいて、特にグルコースが処分される主な部位である筋肉において、Ｇｌｕｔ４のダウンレギュレーションを示すことができなかった（Ｂｅｌｌ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４０：４１３（１９９０）；Ｐｅｄｅｒｓｏｎ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３９：８６５（１９９０）；Ｈａｎｄｂｅｒｇ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３３：６２５（１９９０）；Ｇａｒｖｅｙ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４１：４６５（１９９２））。
【０００４】
動物モデルでのｉｎ  ｖｉｖｏ研究及び臨床研究から得られた証拠によれば、ＩＩ型糖尿病のインスリン耐性は、インスリンシグナル伝達経路内の中間体の発現及び活性の変化、インスリン刺激グルコース輸送体の速度の変化、又はＧＬＵＴ４の原形質膜へのトランスロケーションの変化から生じる可能性があることが示されている（Ｚｉｅｒａｔｈ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、４３：８２１〜８３５（２０００））。動物を用いた研究から得られた証拠によれば、筋肉のインスリンシグナル伝達の欠陥によって全身のグルコースホメオスタシスが変化し（Ｓａａｄ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０：１８３９〜１８４９（１９９２）；Ｆｏｌｌｉ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：１７８７〜１７９４（１９９３）；Ｈｅｙｄｒｉｃｋ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９１：１３５８〜１３６６（１９９３）；Ｓａａｄ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：２０６５〜２０７２（１９９３）；Ｈｅｙｄｒｉｃｋ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６８：Ｅ６０４〜６１２（１９９５））；ＩＲ、ＩＲＳ−１、及びＰＩ３キナーゼを含めたインスリンシグナル伝達カスケードの中間体の欠陥によって、インスリン耐性及びＩＩ型糖尿病被験体からの骨格筋におけるグルコース輸送体が減少しかつインスリン刺激ＧＬＵＴ４トランスロケーションが減少することが示されている。いくつかの例では、ＩＲＳ−１（前掲のＳａａｄ他、１９９２；前掲のＳａａｄ他、１９９３；Ｇｏｏｄｙｅａｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９５：２１９５〜２２０４（１９９５））、ＰＩ３キナーゼ（Ａｎａｉ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４７：１３〜２３（１９９８））、又はＧＳＫ−３（Ｎｉｋｏｕｌｉｎａ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４９：２６３〜２７１（２０００））の発現が変化し、あるいはＰＫＣθ（Ｃｈａｌｆａｎｔ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４１：２７７３〜２７７８（２０００））、又はＰＴＰ１Ｂ（Ｄａｄｋｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２７４：５８３〜５８９（２０００））のレベルが低下したことが観察された。一部のＩＩ型糖尿病被験体の骨格筋では、ＩＲ（Ａｒｎｅｒ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３０：４３７〜４４０（１９８７）；Ｍａｅｇａｗａ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４４：８１５〜８１９（１９９１）；前掲のＳａａｄ他、１９９２；前掲のＳａａｄ他、１９９３；前掲のＧｏｏｄｙｅａｒ他）、ＩＲＳ−１（前掲のＳａａｄ他、１９９２；前掲のＳａａｄ他、１９９３；前掲のＧｏｏｄｙｅａｒ）、及びＡｋｔ（Ｋｒｏｏｋ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４７：１２８１〜１２８６（１９９８））のリン酸化の低減も観察された。さらに、ＰＩ３キナーゼ（前掲のＳａａｄ他、１９９２；前掲のＨｅｙｄｒｉｃｋ他、１９９５；前掲のＳａａｄ他、１９９３；前掲のＧｏｏｄｙｅａｒ他；前掲のＨｅｙｄｒｉｃｋ他、１９９３；Ｆｏｌｌｉ他、Ａｃｔａ  Ｄｉａｂｅｔｏｌ、３３：１８５〜１９２（１９９６）；Ｂｊｏｒｎｈｏｌｍ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４６：５２４〜５２７（１９９７）；Ａｎｄｒｅｅｌｌｉ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、４２：３５８〜３６４（１９９９）；Ｋｉｍ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０４：７３３〜７４１（１９９９）；Ａｎｄｒｅｅｌｌｉ，Ｆ．他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、４３：３５６〜３６３（２０００）；Ｋｒｏｏｋ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４９：２８４〜２９２（２０００））の活性の低下と、ＧＳＫ−３（Ｅｌｄａｒ−Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：１６６２〜１６６６（１９９９））、ＰＫＣ（Ａｖｉｇｎｏｎ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４５：１３９６〜１４０４（１９９６））、及びＰＴＰ１Ｂ（前掲のＤａｄｋｅ他）の活性の増大は、ＩＩ型糖尿病に伴うものであることも示された。さらに、糖尿病の動物の骨格筋ではＰＫＣアイソフォームの分布が変化し（Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｐｅｉｆｆｅｒ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４６：１６９〜１７８（１９９７））、ＰＫＣα、ＰＫＣβ、ＰＫＣε、及びＰＫＣδの含量は、非肥満型ゴトー／カキザキ（ＧＫ）糖尿病のラットのヒラメ筋の膜画分で増加し、サイトゾル画分で減少する（前掲のＡｖｉｇｎｏｎ他）。
【０００５】
ＩＩ型糖尿病を持つ又は持たないインスリン耐性の被験体の骨格筋では、ＧＬＵＴ４の細胞内局在化が異常であることが観察されたが（Ｖｏｇｔ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３５：４５６〜４６３（１９９２）；Ｇａｒｖｅｙ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１：２３７７〜２３８６（１９９８））、これは、ＧＬＵＴ４のトラフィッキング及びトランスロケーションの欠陥によって、骨格筋にインスリン耐性が引き起こされた可能性があることを示している。ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によれば、一部のＩＩ型糖尿病被験体の骨格筋ではインスリン刺激グルコース輸送の速度が低下することが実証された（Ａｎｄｒｅａｓｓｏｎ他、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、１４２：２５５〜２６０（１９９１）；Ｚｉｅｒａｔｈ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、３７：２７０〜２７７（１９９４）；Ｂｏｎａｄｏｎｎａ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４５：９１５〜９２５（１９９６））。
【０００６】
症候性糖尿病の診断は難しくはないが、無症候性の疾患を発見するにはいくつかの問題が生じる可能性がある。診断は、通常、空腹時高血糖が示されることによって確認することができる。境界線上にある症例に関しては、周知のグルコース負荷試験を通常は利用する。しかし、いくつかの証拠によれば、経口グルコース負荷試験によって、糖尿病がかなり進行したという過剰診断が行われることが示されるが、これはおそらく、様々な原因のストレス（ホルモンであるエピネフリンの放出によって媒介される）によって異常な応答が引き起こされる可能性があるからである。これらの問題を明らかにするために、米国国立保健研究所の全国糖尿病データグループ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｄａｔａ  Ｇｒｏｕｐ）は、経口グルコースの投与後に糖尿病を診断するための基準を推奨している（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｄａｔａ  Ｇｒｏｕｐ：Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、２８：１０３９（１９７９））。
【０００７】
一般的な集団における糖尿病の発生率を確実に突き止めることは難しいが、その障害は１千万人以上の米国人に影響を及ぼしていると考えられる。一般に糖尿病が治癒することはなく、管理することができるだけである。近年、「糖尿病」という名の下に含まれる一連の異なる症候群があることが明らかにされてきた。これらの症候群は、臨床症状とその遺伝パターンの両方が異なるものである。糖尿病という用語は、上記及び以下に示される特徴を表す一連の血糖上昇状態に適用されると考えられる。
【０００８】
糖尿病は、２つの基本的なカテゴリー、すなわち原発性と続発性に分類されており、経口グルコース負荷後の異常に上昇した血糖値に伴う状態と定義することが可能な耐糖能異常が含まれるが、この上昇の程度は、糖尿病であると診断するのに不十分なものである。このカテゴリーに含まれる者は、グルコース負荷は正常な者よりも空腹時高血糖又は症候性糖尿病を発症するリスクが高いが、そのような進行は、個々の患者で予測することができない。実際、いくつかの大きな研究によれば、耐糖能異常であるほとんどの患者（約７５パーセント）が決して糖尿病を発症しないことが示されている（Ｊａｒｒｅｔｔ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ、１６：２５〜３０（１９７９））。
【０００９】
アテローム硬化性疾患に対する肥満及び高血圧という独立した危険因子も、インスリン耐性に関連している。インスリン／グルコースクランプ、トレーサーグルコース注入、及び間接熱量測定の組合せを使用することにより、本態性高血圧のインスリン耐性が末梢組織（主に筋肉）に位置付けられ、高血圧の重症度に直接相関することが実証された（ＤｅＦｒｏｎｚｏ及びＦｅｒｒａｎｎｉｎｉ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  １４：１７３（１９９１））。肥満の高血圧症では、インスリン耐性によって高インスリン血症が生じ、これが熱発生を介したさらなる体重増加を制限するメカニズムとして動員されるが、インスリンは、腎臓でのナトリウム吸収も増大させ、腎臓、心臓、及び脈管構造の交感神経系を刺激して、高血圧をもたらす。
【００１０】
インスリン耐性は、通常はインスリンがレセプターに結合した後の部位でのインスリンレセプターシグナル伝達系の欠損が原因であると、現在は理解されている。インスリンに応答する主な組織（筋肉、肝臓、脂肪）でのインスリン耐性を実証する蓄積された科学的証拠によれば、インスリンシグナル伝達の欠陥は、このカスケードの初期段階で、特にインスリンレセプターキナーゼ活性が低下するように見える段階で存在することが、強く示されている（Ｈａｒｉｎｇ、Ｄｉａｂｅｔａｌｏｇｉａ、３４：８４８（１９９１））。
【００１１】
その他の治療手段があるにも関わらず、インスリン療法が依然として多くのＩＩ型糖尿病患者、特に初期の食事療法に失敗し肥満ではない患者、又は初期の食事療法に失敗しかつその次の経口血糖低下にも失敗した患者に選択される治療法であることは、注目に値する。しかしインスリン療法は、食事の管理や生活の改善などで努力を継続させながら行わなければならず、これらに代わる方法は決して考えられないことも、同様に明らかである。最適な結果を得るために、インスリン療法は、自己血糖モニタリングとグリコシル化血液タンパク質の適切な評価を行いながら続けなければならない。インスリンは、様々な処置単独で、短、中、又は長時間持続するインスリンあるいはこれらの複数のタイプを混合したものを２回以上注射することによって、投与することができる。任意の患者に対する最良の処置は、個々の患者でモニタされた応答に合わせて調整されたインスリン療法の調整プロセスによって、決定しなければならない。
【００１２】
ＩＩ型糖尿病でインスリン療法を使用する傾向は、長期にわたる糖尿病の合併症を避ける上で厳密な血糖管理が重要であるとの現代の認識と共に、増加してきた。しかし二次的な経口血糖低下に失敗した非肥満性ＩＩ型糖尿病では、妥当な管理を行う上でインスリン療法を首尾良く用いることができるが、良好な応答は決して確認されない（Ｒｅｎｄｅｌｌ他、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．、９０：１９５〜１９７（１９７９））。ある研究では、経口血糖降下剤の最大用量で十分管理されなかった肥満ではない患者５８人のうちわずか３１パーセントにおいて、簡単なインスリン処置での管理について客観的に立証できる改善が見られた（Ｐｅａｃｏｃｋ他、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．、２８８：１９５８〜１９５９（１９８４））。二次処方に失敗した肥満型糖尿病の場合、その状態ではインスリンによってしばしば体重が増加し、それに伴ってしばしば管理がうまく行われないので、その病像はあまり明らかではない。
【００１３】
したがって、ＩＩ型糖尿病の治療に関する現況の知識及び実施状態は、決しで満足のいくものではないことが明らかであろう。患者の大多数は、時間が経つにつれて基本的な食事療法に失敗し、肥満性のＩＩ型糖尿病の大部分は、理想的な体重を実現することができない。経口血糖降下剤は、基本的な食事療法が失敗した場合に糖血症の程度を下げるのにしばしば首尾良く用いられるが、多くの専門家は、実現される血糖管理の程度が、長期にわたるＩＩ型糖尿病に伴うアテローム性疾患、神経障害、網膜障害、及び末梢血管疾患といった長期合併症の発症を回避するのに十分であるかどうか、懐疑的である。その理由は、最小限の耐糖能異常、すなわち空腹時血漿グルコースが５．５〜６．０ｍｍｏｌ／Ｌにほぼ等しい場合でさえ、心臓血管により死に至るリスクが増大することに関連するという現行の認識に照らして理解することができる（Ｆｕｌｌｅｒ他、Ｌａｎｃｅｔ、１：１３７３〜１３７８（１９８０））。またインスリン療法では、経口血糖降下剤を使用した治療よりも、長期にわたる結果に何らかの改善がもたらされるかどうかも明らかではない。このため、優れた治療方法が非常に有益であると理解することができる。
【００１４】
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（ｄｋｋ）ファミリーのタンパク質は、分泌Ｗｎｔ阻害剤のファミリーである（Ｋｒｕｐｎｉｋ他、Ｇｅｎｅ、２３８：３０１〜３１３（１９９９）；Ｍｏｎａｇｈａｎ他、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．、８７：４５〜５６（１９９９））。Ｄｋｋ−１（２０００年３月９日公開のＷＯ  ００／１２７０８、Ｄｋｋ−１をＰＲＯ１３１６で示し、コード化ＤＮＡをＤＮＡ６０６０８で示す）は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害によってアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚頭部形成の誘導物質であることがわかり（Ｇｌｉｎｋａ他、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：３５７〜３６２（１９９８））、その後、四肢の発生に関与することが示され（Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ他、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．、８９：１５１から１５３（１９９９））、Ｗｎｔ誘導形態変換を抑制することが示された（Ｆｅｄｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４：１９４６５〜１９４７２（１９９９））。Ｄｋｋ−１及びＤｋｋ−２は相互に拮抗作用を示し、Ｄｋｋ−２は、アフリカツメガエルの胚のＷｎｔ／βカテニンのシグナル伝達経路を阻害するのではなく活性化することがわかった（Ｗｕ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０：１６１１〜１６１４（２０００））。また、Ｄｋｋ−１がＷｎｔシグナル伝達を阻害するのに対し、Ｄｋｋ−１の分解産物はＷｎｔシグナル伝達を活性化することが報告されている（Ｂｒｏｔｔ及びＳｏｋｏｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２２：６１００〜６１１０（２０００））。
【００１５】
最近の研究によれば、Ｄｋｋは、Ｗｎｔシグナル伝達の補助レセプターとして働く低密度リポタンパク質関連のタンパク質ＬＲＰ６に結合することによって、作用することが示されている（Ｐｉｎｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、４０７：５３５〜５３８（２０００）；Ｔａｍａｉ他、Ｎａｔｕｒｅ、４０７：５３０〜５３５（２０００）；Ｗｅｈｒｌｉ他、Ｎａｔｕｒｅ、４０７：５２７〜５３０（２０００））。Ｄｋｋ−１は、Ｗｎｔ及びＦｒｉｚｚｌｅｄとの相互作用に関与するものとは異なるドメインでＬＲＰ６に結合することによってＷｎｔシグナル伝達と拮抗し、したがってＬＲＰ６媒介型のＷｎｔ／βカテニンシグナル伝達を阻害する（Ｂａｆｉｃｏ他、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３：６８３〜６８６（２００１）；Ｍａｏ他、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：３２１〜３２５（２００１）；Ｓｅｍｅｎｏｖ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１１：９５１〜９６１（２００１））。
【００１６】
Ｗｎｔシグナル伝達経路は、胚発生、様々な細胞型の分化、及び腫瘍形成で重要な役割を演じる（Ｐｅｉｆｅｒ及びＰｏｌａｋｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：１６０６〜１６０９（２０００））。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、分布Ｗｎｔとそのレセプター、ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質との相互作用によって活性化する（Ｈｌｓｋｅｎ及びＢｅｈｒｅｎｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１１３：３５４５〜３５４６（２０００））。これは、後でＡｘｉｎ−β−カテニン−ＧＳＫ３β−ＡＰＣに動員されるＡｋｔを活性化するＤｉｓｈｅｖｅｌｅｄ（Ｄｖｌ１）タンパク質の活性化につながる（Ｆｕｋｕｍｏｔｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：１７４７９〜１７４８３（２００１））。この後、ＧＳＫ３βのリン酸化及び不活性化が行われ、その結果、βカテニンのリン酸化及び分解が阻害される。蓄積されたβカテニンは核に移行し、リンパ系増強因子−Ｔ細胞因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）ファミリーの転写因子と相互に作用して、標的遺伝子の転写を誘発させる。
【００１７】
Ｗｎｔシグナル伝達の下流にある２種の物質、Ａｋｔ及びＧＳＫ３βは、インスリンシグナル伝達経路／グルコース代謝での重要な中間体である。Ｗｎｔシグナル伝達は、筋肉分化の調節（Ｂｏｒｅｌｌｏ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２６：４２４７〜４２５５（１９９９）；Ｃｏｏｋ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１５：４５２６〜４５３６（１９９６）；Ｃｏｓｓｕ及びＢｏｒｅｌｌｏ、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１８：６８６７〜６８７２（１９９９）；Ｒｉｄｇｅｗａｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：３２３９８〜３２４０５（２０００）；Ｔｉａｎ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２６：３３７１〜３３８０（１９９９）；Ｔｏｙｏｆｕｋｕ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：２２５〜２４１（２０００））、及び脂質生成（Ｒｏｓｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９：９５０〜９５３（２０００））に関与する。Ｗｎｔシグナル伝達の阻害によって、筋細胞から脂肪細胞への分化転換を刺激することができる（前掲のＲｏｓｓ他）。さらにＬＲＰ５は、遺伝的にＩ型糖尿病に関連している。この遺伝子は、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、すなわち染色体１１ｑ１３上の位置ＩＤＤＭ４（Ｈｅｙ他、Ｇｅｎｅ、２１６：１０３〜１１１（１９９８））に含まれ、ランゲルハンス島細胞、マクロファージ、及びビタミンＡ系細胞であってＩ型糖尿病の進行に関与する細胞型の内部で発現する（Ｆｉｇｕｅｒｏａ他、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、４８：１３５７〜１３６８（２０００））。ＬＲＰ５  ｍＲＮＡは肝臓で増加し、ＬＤＬＲ欠乏のワタナベ遺伝性高脂血症ウサギのアテローム硬化性病変部にあるコレステロールを多く蓄えた泡沫細胞に蓄積された（Ｋｉｍ他、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）、１２４：１０７２〜１０７６（１９９８））。
【００１８】
Ｄｋｋ−５分子はＷＯ  ０１／４０４６５（ＰＣＴ／ＵＳ００／３０８７３）に記載されており、Ｄｋｋ−５をＰＲＯ１０２６８で示し、コード化ＤＮＡをＤＮＡ１４５５８３−２８２０で示し、１／１１／００に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号はＰＴＡ−１１７９である。ＷＯ  ０１／４０４６５の分子に対して成熟領域でアミノ酸が変化した別のＤｋｋ−５分子が、２００１年１月１０日に公開されたＥＰ１０６７１８２−Ａ２で明らかにされている（ＰＳＥＣ０２５８で示す）。後者の出願は、ヒト分泌又は膜タンパク質とその抗体をコードするいくつかの核酸配列に関する。それらを使用する目的は、２つの例に包含されている。第１は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）を持つＮＴ細胞とＲＡ阻害剤を処理し、ニューロン分化するときに発見される遺伝子のサブセットのアップ／ダウンレギュレーションを観察することである。第２の例は、滑液膜組織からの一次細胞を、ＲＡに対するＴＮＦ−αで治療し、それらの遺伝子のサブセットのアップ／ダウンレギュレーションを観察することに関する。どちらの場合でも、ＥＰ１０６７１８２−Ａ２のＤｋｋ−５分子はヒット分子にならない。
【００１９】
ＮＩＤＤＭを含むインスリン耐性障害に罹患した個体の診断及び治療に使用することができる、効果的な治療剤が求められている。
【００２０】
タンパク質Ｄｋｋ−５は、培養した骨格筋細胞及び脂肪細胞におけるグルコース代謝のモジュレーターであることが明らかになった。Ｄｋｋ−５を持つ筋細胞を処理した結果、基礎的なまたインスリンで刺激されたグルコース取込みが増加した。この作用は、長期にわたる処理で観察され、Ｄｋｋ−５が、インスリンシグナル伝達経路におけるタンパク質の発現レベルと同様に筋肉分化にも影響を及ぼすことを示唆している。データは、Ｄｋｋ−５によって、基礎的なまたインスリンで刺激されたｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース代謝が刺激を受けることを示している。したがってＤｋｋ−５は、例えば肥満症、耐糖能異常、糖尿病、高血圧、及び大小血管の虚血性疾患を含めたインスリン耐性障害の治療に有用である。
【００２１】
本発明は、特許請求の範囲に記載した方法、キット、及び組成物からなる。詳細には本発明は、一実施形態において、必要な場合に有効な量のＤｋｋ−５を哺乳類に投与することを含む、哺乳類のインスリン耐性障害の治療方法を提供する。好ましくは、哺乳類はヒトであり、ＮＩＤＤＭ又は肥満である。また、全身投与も好ましい。さらに好ましい実施形態では、インスリン耐性障害を治療するために、Ｄｋｋ−５の他に別のインスリン耐性治療剤を投与する。
【００２２】
さらに別の好ましい実施形態で、治療に使用されるＤｋｋ−５ポリペプチドは、関連するシグナルペプチドが存在してもしなくても、図２の配列番号５に対して少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％同一のアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、Ｄｋｋ−５は、Ｎ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有し分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の内部切断型タンパク質断片、又は配列番号５のＤｋｋ−５と、Ｎ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有し分子量が約１６ｋＤａである内部切断型タンパク質断片との混合物、又は関連するシグナルペプチドが不足している配列番号５を有するＤｋｋ−５と、Ｎ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有し分子量が約１６ｋＤａである内部切断型タンパク質断片との混合物である。より好ましくは、Ｄｋｋ−５は、配列番号５を含むＤｋｋ−５、又は配列番号５の残基２０から残基３０までと残基３４７（末端）との間の配列を含むＤｋｋ−５、好ましくは配列番号５の残基２５と３４７との間の配列を含むＤｋｋ−５、又はＮ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有し分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の内部切断型タンパク質断片、あるいは、前記切断産物と、配列番号５を含み又は配列番号の残基２０から残基３０までと残基３４７との間の配列を含むＤｋｋ−５の一方又は両方との組合せである。
【００２３】
本発明の別の実施形態では、哺乳類におけるインスリン耐性障害の存在又は発症を検出するための方法が提供される。この方法は、
（ａ）前記哺乳類からのサンプル中のＤｋｋ−５の量を測定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で決定された量を、標準サンプル中に存在するＤｋｋ−５の量と比較するステップと
を含み、ステップ（ａ）でのＤｋｋ−５の量が低レベルである場合は障害があることを示している。哺乳類はヒトであることが好ましい。また測定は、イムノアッセイでモノクローナル抗体などの抗Ｄｋｋ−５抗体を使用して行うことも好ましい。また、抗Ｄｋｋ−５抗体などは標識を含むことも好ましく、より好ましくは蛍光標識、放射性標識、又は酵素標識であり、例えば生物発光標識又は化学発光標識などである。またイムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、沈殿アッセイ、免疫放射性アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、又は免疫電気泳動アッセイも好ましい。また、インスリン耐性障害がＮＩＤＤＭである状態も好ましい。
【００２４】
別の実施形態で、本発明は、哺乳類のインスリン耐性障害の存在又は発症を検出するための診断キットを提供し、前記キットは、
（ａ）Ｄｋｋ−５に結合する抗体が入っている容器と、
（ｂ）Ｄｋｋ−５を含有する標準サンプルが入っている容器と、
（ｃ）哺乳類からのサンプルの異常を検出するために抗体と標準サンプルを使用するための取扱説明書と
を含み、Ｄｋｋ−５に結合する抗体は検出可能に標識されており、あるいはキットはさらに、検出可能に標識されてＤｋｋ−５に結合し又はＤｋｋ−５に結合する抗体に結合する第２の抗体を含んだ別の容器を含む。Ｄｋｋ−５に結合する抗体はモノクローナル抗体であり、哺乳類はヒトであることが好ましい。
【００２５】
別の実施形態で、本発明は、哺乳類のインスリン耐性障害を治療するためのキットを提供し、前記キットは、
（ａ）Ｄｋｋ−５を含む容器と、
（ｂ）障害を治療するためにＤｋｋ−５を使用するための取扱説明書と
含む。好ましい実施形態で、障害はＮＩＤＤＭであり、容器はバイアルであり、取扱説明書は、すぐに注射できるよう、注射器にバイアルの内容物を入れることを明記している。また好ましくは、キットがインスリン抵抗治療剤を含む容器をさらに含み、哺乳類はヒトである。
【００２６】
別の実施形態で、本発明は、Ｎ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有し分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の単離された内部切断型タンパク質断片を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、このタンパク質断片及び担体を含んだ組成物を提供し、より好ましくはこの組成物は、それに関連するシグナルペプチドがあり又は欠けている配列番号５を含んだＤｋｋ−５をさらに含む。配列番号５を含むＤｋｋ−５が、それに関連するシグナルペプチドに欠けている場合、一般に残基２０あたりから残基３０あたりまでと配列番号５の末端との間の配列を含み、より好ましくは配列番号５の残基２５から３４７までを含む。
【００２８】
本発明はさらに、ＰＴＡ−３０９０、ＰＴＡ−３０９１、ＰＴＡ−３０９２、ＰＴＡ−３０９３、ＰＴＡ−３０９４、ＰＴＡ−３０９５、及びＰＴＡ−３０９６から選択されたＤｋｋ−５抗体を産生するハイブリドーマを提供する。また、これらハイブリドーマのいずれか１つによって産生された抗体も提供される。
【００２９】
本発明はさらに、候補医薬品が哺乳類のインスリン耐性障害に及ぼす作用を評価する方法であって、ｄｋｋ−５  ｃＤＮＡを過発現するトランスジェニック非ヒト動物モデルに前記薬品を投与すること、及び前記モデルの血液からのグルコースクリアランスに薬品が及ぼす影響を決定することを含む方法を提供する。動物モデルはげっ歯類であることが好ましく、マウス又はラットであることがより好ましく、マウスモデルであることが最も好ましい。別の好ましい実施形態では、このモデルによって過発現したｄｋｋ−５  ｃＤＮＡは、筋肉に特異的なプロモーターの制御下にあり、ｃＤＮＡは筋組織で過発現する。
【００３０】
定義
本明細書で使用する「Ｄｋｋ−５」又は「Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−５」又は「Ｄｋｋ−５ポリペプチド」は、図２に示すＤｋｋ−５ポリペプチドの完全長アミノ酸配列（配列番号５）に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列が同一であるポリペプチドを指し、又は関連するシグナルペプチドが欠けている図２に示すＤｋｋ−５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号５）に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列が同一であるポリペプチド、又はＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−１１７９として寄託されたＤＮＡの完全長コード化配列によってコードされたアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列が同一であるポリペプチド、又は本明細書に開示する完全長ポリペプチド配列番号５の任意のその他の断片を指すが、ここで定義するＤｋｋ−５ポリペプチドがインスリン耐性傷害を治療する能力を有することを前提とする。
【００３１】
本明細書で定義するＤｋｋ−５は、ヒトの様々な組織や別の天然の供給源など、様々な供給源から単離することができ、あるいは、組換え又は合成方法によって調製することができる。「Ｄｋｋ−５」という用語は特に、特定のペプチドの自然に生ずる切断又は分泌形（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に生ずる変種形（例えば選択的スプライス形）、及びポリペプチドの天然に生ずる対立遺伝子変種を包含する。本発明の様々な実施形態で、Ｄｋｋ−５ポリペプチドは、図２に示す配列番号５の完全長アミノ酸配列含む、成熟又は完全長未変性配列のポリペプチドである。しかし、配列番号５として添付した図２に開示されるＤｋｋ−５ポリペプチドは、最初にメチオニン残基を示しているが、図２の配列番号５の最初のアミノ酸位置の上流又は下流に位置付けられたその他のメチオニン残基を、Ｄｋｋ−５ポリペプチドの開始アミノ酸残基として使用できることが考えられかつ可能である。
【００３２】
Ｄｋｋ−５ポリペプチドは、例えば、配列番号５の完全長未変性アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端で、１つ又は複数のアミノ酸残基が付加され又は失われたポリペプチドを含む。Ｄｋｋ−５ポリペプチドは、インスリン耐性傷害を治療する能力があることを条件として、本明細書に開示される配列番号５、又は本明細書に開示されるシグナルペプチドが欠けた配列番号５に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性、あるいは１００％のアミノ酸配列が同一を有する。
【００３３】
通常、Ｄｋｋ−５ポリペプチドは、インスリン耐性傷害を治療する能力があるならば、長さが少なくとも約１０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約２０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約３０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約４０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約５０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約６０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約７０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約８０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約９０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約１００アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約１５０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約２００アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約３００アミノ酸、又はそれ以上である。
【００３４】
分子量が約１６ｋＤａの、図２の配列番号５において逆向きの矢印でマークされた、内側の部位での切断により形成された単離済みの内部切断型産物（ＭＡで始まる）は、ほとんどが成熟タンパク質及び／又はシグナル配列含有するタンパク質である組換え調剤と全く同じように、筋細胞での基礎的及びインスリン刺激によるグルコース取込みを高める上で活性がある。
【００３５】
配列番号５に対して、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列が同一であることが好ましい。さらに、本明細書の図２の配列番号５のポリペプチド、ＷＯ０１／４０４６５（ＰＣＴ／ＵＳ００／３０８７３）のＰＲＯ１０２６８で示されるポリペプチド、及び２００１年１月１０日公開のＥＰ１０６７１８２−Ａ２でＰＳＥＣ０２５８として示されるポリペプチドが、より好ましい。さらに、本明細書の図２の配列番号５及びＷＯ０１／４０４６５のＰＲＯ１０２６８を有するポリペプチドと、そこから得られた成熟ポリペプチド、ならびにＮ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有し分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の内部切断型タンパク質断片、及びこれらとその関連するシグナルペプチドが存在し又は存在しない配列番号５を有するＤｋｋ−５との混合物が、より好ましい。最も好ましいのは、その関連するシグナルペプチドの有無に関わらず、本明細書の図２の配列番号５を含むポリペプチド、及び／又はＮ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有し分子量が約１６ｋＤａである配列番号５の内部切断型タンパク質断片である。
【００３６】
本明細書に開示されるポリペプチドの「シグナルペプチド」のおよその位置は、図２の配列番号５の位置１のメチオニンから位置２４のアラニンまでであり、その切断部位は、図２の配列番号５の位置２４のアラニンと位置２５のグリシンの間である。しかし、シグナルペプチドのＣ末端の境界は様々に変化する可能性があるが、本明細書で最初に明らかにされたように、シグナルペプチドＣ末端境界の両端の約５以下のアミノ酸で最も生じ易く、その場合シグナルペプチドのＣ末端境界は、アミノ酸配列要素のタイプを識別する技術分野で日常的に使用される基準に従って明らかにされることに留意されたい（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ他、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．、１０：１〜６（１９９７）及びｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１４：４６８３〜４６９０（１９８６））。さらに、場合によっては、分泌されたポリペプチドからのシグナル配列の切断が完全に均一ではなく、複数の分泌種が生ずることも理解される。これらの成熟ポリペプチド、すなわち本明細書で明らかにされたシグナルペプチドのＣ末端境界の両端にある約５以下のアミノ酸の範囲内でシグナルペプチドが切断され、それらをポリヌクレオチドがコード化する成熟ポリペプチドが、本発明によって企図される。
【００３７】
本明細書で明らかにされるＤｋｋ−５ポリペプチド配列に対して「〜パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、これらの配列のアライメントを行って、必要な場合は配列の同一性が最大限になるようギャップを導入した後、配列同一の一部としていかなる同類置換も考慮することなく、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。同一アミノ酸配列のパーセントを決定するためのアライメントは、当業者の範囲内の様々な方法で行うことができ、例えばＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの公に利用可能なコンピュータソフトウェア使用して行うことができる。当業者なら、比較する配列の完全長全体にわたって最大限のアライメントを実現するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし本発明では、％アミノ酸配列同一性は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して得られるが、このＡＬＩＧＮ−２プログラムの完全なソースコードは、２００１年３月８日公開のＷＯ０１／１６３１９及び２０００年１２月７日公開のＷＯ００／７３４５２の表１に示されている。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、２０５５９、ワシントンＤ．Ｃ．の米国著作権庁のユーザドキュメンテーションに提出され、米国著作権登録Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、カリフォルニア州南サンフランシスコのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．を通して公に利用可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄ上で使用されるように編集すべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されない。
【００３８】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２を使用する状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、又は所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（所与のアミノ酸配列Ｂへの、又は所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列に対するある特定のアミノ酸配列同一％を有し又は含んだ所与のアミノ酸配列Ａとして代わりに表現することができる）を、以下のように
分数Ｘ／Ｙの１００倍
として計算することができ、上式でＸは、ＡとＢのプログラムアライメントにおいて配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により同一マッチであると記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一％に等しくならないことが理解されよう。ＡＬＩＧＮ−２を使用したアミノ酸配列同一性の計算例は、２００１年３月８日公開のＷＯ０１／１６３１９及び２０００年１２月７日公開のＷＯ００／７３４５２の表２及び３に記載されている。
【００３９】
他に特に指示しない限り、本明細書で使用するアミノ酸配列同一％の全ての値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落で述べたように得られる。しかしアミノ酸配列同一％の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラムを使用することによって以下に述べるように得ることもできる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：４６０〜４８０（１９９６））。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータのほとんどを、デフォルト値に設定する。デフォルト値に設定しないもの、すなわち調節可能なパラメータは、以下の値で設定する：オーバラップスパン＝１、オーバラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２を使用する場合、アミノ酸配列同一％の値は、（ａ）未変性Ｄｋｋ−５ポリペプチドから得られた配列を有する問題のＤｋｋ−５ポリペプチドのアミノ酸配列と、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定された問題の比較アミノ酸配列（すなわち問題のＤｋｋ−５ポリペプチドと比較される配列）との間でマッチした同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）問題のＤｋｋ−５ポリペプチドのアミノ酸残基の総数で割ることによって求める。例えば「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列が同一であるアミノ酸配列Ａを含むポリペプチド」というステートメントでは、アミノ酸配列Ａは、問題の比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂは、問題のＤｋｋ−５ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００４０】
アミノ酸配列同一％は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を使用して求めることもできる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２（１９９７））。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードすることができ、又は別の方法でＭＤ、Ｂｅｔｈｅｓｄａの国立保健研究所から得ることができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２はいくつかの検索パラメータを使用し、これら検索パラメータの全てを、例えばアンマスク＝イエス、ストランド＝オール、予測事象＝１０、最小限に低い複雑度の長さ＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパス定数＝２５、最終ギャップアライメントに対するドロップオフ＝２５、よびスコアリングマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含めたデフォルト値に設定する。
【００４１】
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を使用する状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、又は所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（所与のアミノ酸配列Ｂへの、又は所与のアミノ酸配列Ｂとの、又は所与のアミノ酸配列に対するある特定のアミノ酸配列同一％を有し又は含んだ所与のアミノ酸配列Ａとして代わりに表現することができる）を、以下のように
分数Ｘ／Ｙの１００倍
として計算することができ、上式でＸは、ＡとＢのプログラムアライメントにおいて配列アライメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２により同一マッチであると記録されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一％に等しくならないことが理解されよう。
【００４２】
本明細書で使用する「治療する」とは、インスリン耐性障害を根治させるための患者の管理及びケアを表し、症状又は合併症の発症を予防し、症状又は合併症を軽減し、又はインスリン耐性疾患、状態、又は障害を無くすための薬物投与を含む。本発明において、有益な又は所望の臨床結果には、インスリン耐性に伴う症状の緩和、インスリン耐性の症状の程度の軽減、インスリン耐性の症状の安定化（すなわち悪化させないこと）（例えばインスリン要求量の低下）、島細胞の破壊を予防するためのインスリン感受性及び／又はインスリン分泌の増加、インスリン耐性の進行、例えば糖尿病の遅延又は緩和含まれるが、これらに限定されない。当業者に理解されるように、本発明による治療に従う特定の症状は、治療するインスリン耐性障害のタイプに左右されることになる。「治療が必要な」ものには、すでに障害を持っている哺乳類、ならびに障害を持ち易い哺乳類であって、その障害を予防すべき哺乳類が含まれる。
【００４３】
治療及び診断を目的とした「哺乳類」という用語は、ヒト、競争用の動物、動物園、ペット、家畜用、又は農業用の動物であって例えばイヌやネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、サルなどの霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳類として分類された、任意の動物を指す。哺乳類はヒトが好ましい。
【００４４】
「インスリン耐性障害」は、外因性インスリンの作用に対して抹消組織の正常な代謝反応ができないこと（非感受性）から生じた疾患、状態、又は障害であり、すなわちインスリンの存在によって生体応答が正常レベルより下になる状態である。臨床的には、インスリン耐性は、インスリンレベルが正常か又は高いにも関わらず、血糖レベルが正常か又は高くあり続ける場合を言う。これは本質的に、基礎的な又はインスリン刺激を受けたグリコーゲン合成、あるいはその両方が、正常なレベルよりも下がるグリコーゲン合成阻害であることを表す。インスリンに対する末梢組織の感受性を回復させるのに見かけ上は十分な食餌療法又は減量によってＩＩ型糖尿病で生じる高血糖がときどき逆戻りすることで実証されるように、インスリン耐性は、ＩＩ型糖尿病で主な役割を演じる。この用語には、耐糖能異常、ならびにインスリン耐性が重要な役割を演じる数多くの障害、例えば肥満症や糖尿病、卵巣高アンドロゲン症、高血圧症などが含まれる。
【００４５】
「糖尿病」は、慢性高血糖症状態、すなわち血液中の糖が過剰であり、その結果インスリンの作用が相対的に又は絶対的に不足する状態を指す。糖尿病には３つの基本的なタイプがあり、Ｉ型すなわちインスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、ＩＩ型すなわちインスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、及びＡ型インスリン耐性であるが、Ａ型は比較的まれである。Ｉ型又はＩＩ型糖尿病の患者は、様々なメカニズムによって外因性インスリンの作用に対して非感受性になる可能性がある。Ａ型インスリン耐性は、インスリンレセプター遺伝子の変異、又はグルコース代謝に極めて重要な働きをするポストレセプター部位の欠陥によって生じる。糖尿病に罹患している者は、医師によって容易に認めることができ、高血糖症、グルコース寛容減損、グリコシル化ヘモグロビン、及び場合によっては外傷又は疾病に伴うケトアシドーシスを特徴とする。
【００４６】
「インスリン非依存型糖尿病」又は「ＮＩＤＤＭ」は、ＩＩ型糖尿病を指す。ＮＩＤＤＭ患者は、絶食させ、食事後又はグルコース負荷試験と呼ばれる診断試験の後のグルコースの細胞取込みを止め又は遅らせたとき、血糖濃度が異常に高い。ＮＩＤＤＭは、認められた基準に基づいて診断される（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ（Ｔｙｐｅ  Ｉ）Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９８８；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｎｏｎ−Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ（Ｔｙｐｅ  ＩＩ）Ｄｉａｂｅｔｅｓ、１９８８）。
【００４７】
本明細書で定義される障害として治療する糖尿病の症状及び合併症には、高血糖症、満足のいかない血糖管理、ケトアシドーシス、インスリン耐性、高レベルの成長ホルモン、高レベルのグリコシル化ヘモグロビン、及び糖化終末産物（ＡＧＥ）、暁現象（ｄａｗｎ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）、満足の行かない脂質プロファイル、血管性疾患（例えばアテローム性硬化症）、微小血管性疾患、網膜性疾患（例えば増殖性糖尿病網膜症）、腎臓障害、ニューロパシー、妊娠合併症（例えば中絶や先天異常）などが含まれる。治療の定義には、例えばインスリン感受性の増大、血糖管理を維持した状態でのインスリン用量の低下、ＨｂＡ１ｃの低下、血糖管理の改善、血管、腎臓、神経、網膜、及びその他の糖尿病合併症の低減、「暁現象（ｄａｗｎ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）」の予防又は低減、脂質プロフィルの改善、妊娠合併症の低減、及びケトアシドーシスの低減などの指標が含まれる。
【００４８】
本明細書で使用する「治療組成物」又は「組成物」は、Ｄｋｋ−５と、医薬品として許容される担体、例えば水やミネラル、タンパク質、及び当業者に知られるその他の賦形剤などを含むと定義される。
【００４９】
本明細書の「抗体」という用語は、広い意味で使用され、特に、本明細書で述べる所望の生物学的活性、例えば診断アッセイにおけるＤｋｋ−５との結合などを示す限り、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を包含する。
【００５０】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわちこの集団を構成する個々の抗体が、少量だけ存在する可能性のある自然に存在し得る変異体以外は同一であるものから得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一の抗原性部位に向けられる。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対して向けられた種々の抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。
【００５１】
そのような特異性の他、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されない状態で合成できる点が有利である。修飾因子「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を表し、任意の特定の方法によって抗体を生成する必要があると解釈するものではない。例えば、本発明により使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、又は組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）記載されている技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから分離してもよい。
【００５２】
本明細書のモノクローナル抗体には、特に「キメラ抗体」が含まれるが、これは本明細書に記載する所望の生物学的活性が示される限り、Ｈ及び／又はＬ鎖の一部が、特定の種から得られた抗体か又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体内の対応する配列に同一か又は同種のものであり、一方、Ｈ及び／又はＬ鎖の残りの部分は、別の種から得られた抗体か又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片内の、対応する配列に同一か又は同種のものである（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。本明細書で問題となるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（旧世界ザル（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｏｎｋｅｙ）、類人猿など）から得られた可変ドメイン抗原−結合配列、及びヒト定常部配列を含んだ「霊長類化した（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれる。
【００５３】
「抗体断片」は、無傷な抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線形抗体；１本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００５４】
「無傷」の抗体は、抗原結合可変領域ならびにＬ鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びＨ鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含むものである。定常ドメインは、未変性の配列定常ドメイン（例えばヒト未変性配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変種でよい。
【００５５】
本明細書で使用する「サンプル」という用語は、Ｄｋｋ−５を含有し又は含有すると推測される生物学的サンプルを指す。このサンプルは、任意の供給源から得られるものでよく、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトから得られるものでよい。そのようなサンプルには、水性流体、例えば血清、血漿、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、乳、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、組織培養液、組織抽出物、及び細胞抽出物が含まれる。
【００５６】
「インスリン耐性治療剤」又は「低血糖剤」（本明細書では同義として使用する）は、インスリン耐性障害の治療に使用される、Ｄｋｋ−５以外の薬剤であり、例えばインスリン（１つ又は複数の異なるインスリン）や、小分子インスリンなどのインスリン模擬体であって例えばＬ−７８３，２８１、インスリン類似体（例えばＬＹＳＰＲＯ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  Ｃｏ．）、ＬｙｓＢ２８インスリン、ＰｒｏＢ２９インスリン、又はＡｓｐＢ２８インスリン、又は例えば米国特許第５，１４９，７７７号及び第５，５１４，６４６号に記載されているもの）又はその生理学的に活性な断片、インスリン関連のペプチド（Ｃペプチド、ＧＬＰ−１、ＩＧＦ−１、又はＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３複合）又はその類似体又はその断片、エルゴセット、プラムリンタイド、レプチン、ＢＡＹ−２７−９９５５、Ｔ−１０９５、インスリンレセプターチロシンキナーゼ阻害剤に対するアンタゴニスト、ＴＮＦ−α機能に対するアンタゴニスト、成長ホルモン放出剤、アミリン又はアミリンの抗体、米国特許第５，７５３．６８１号に記載されているものも含むグリタゾンファミリーの化合物などのインスリン感作物質であって、例えばトログリタゾン、ピオグリタゾン、エングリタゾン、及び関連化合物、ＬＩＮＡＬＯＬ（商標）単独又はビタミンＥとの混合物（米国特許第６，１８７，３３３号）など、インスリン分泌増強剤であって、例えばナテグリニド（ＡＹ−４１６６）、（２Ｓ）−２−ベンジル−３−（ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−イソインドリニルカルボニル）プロピオン酸カルシウム二水和物（ミチグリニド、ＫＡＤ−１２２９）、レパグリニド、及びスルホニル尿素剤であって、例えばアセトヘキサミド、クロロプロパミド、トラザミド、トルブタミド、グリクロピラミド、及びそのアンモニウム塩、グリベンクラミド、グリボルヌリド、グリクラジド、１−ブチル−３−メタニリル尿素、カルブタミド、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリブチアゾール、グリブゾール、グリヘキサミド、グリミジン、グリピンアミド、フェンブタミド、トルシクラミド、グリメピリドなど、ならびにビグアナイド（例えばフェンホルミン、メトホルミン、ブフォルミンなど）及びα−グルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ボグリボース、ミグリトール、エミグリテートなど）、及び膵臓移植や自己免疫試薬などの治療である。
【００５７】
本明細書で使用する「インスリン」は、インスリン作用のある任意の物質及び全ての物質を指し、例えばウシ又はブタの膵臓から抽出した動物インスリン、ブタの膵臓から抽出したインスリンから酵素で合成された半合成ヒトインスリン、一般には大腸菌又は酵母菌などを使用した遺伝子組換え技法によって合成したヒトインスリンとして具体的に示される。さらにインスリンは、亜鉛を約０．４５〜０．９（ｗ／ｗ）％含有するインスリン−亜鉛錯体、塩化亜鉛、硫酸プロタミン、及びインスリンから生成されたプロタミン−インスリン−亜鉛などを含むことができる。インスリンは、その断片又は誘導体の形でよく、例えばＩＮＳ−１がある。インスリンは、Ｌ８３２８１やインスリンアゴニストなどのインスリン様物質を含んでもよい。インスリンは、超速効型、又は速効型、二峰性作用型、中間型、あるいは長時間作用型などの様々なタイプで入手可能であるが、これらのタイプは、患者の状態に応じて適切に選択することができる。
【００５８】
本明細書で使用する「導入遺伝子」は、その導入遺伝子が導入されるトランスジェニック動物と部分的に又は全体的に異なる核酸配列、すなわち外来の核酸配列を指し、あるいはその導入遺伝子が導入されるトランスジェニック動物の内因性遺伝子と相同の核酸配列を指すが、導入遺伝子が挿入される細胞のゲノムが変化するような方法で動物のゲノムに挿入されるように設計され又は挿入されるものである（例えば生来の遺伝子の場合とは異なる位置に挿入される）。導入遺伝子は、１つ又は複数の転写制御配列と任意のその他の核酸であって例えばイントロンなど選択された核酸の最適な発現に必要とされるものに、動作可能に結合することができる。ここで導入遺伝子はＤｋｋ−５をコードする。
【００５９】
本明細書の「トランスジェニック非ヒト動物」は全て、その複数の細胞内にＤｋｋ−５コード化導入遺伝子を含み、血液中のグルコースクリアランスに対して宿主細胞の表現型を変化させる。
【００６０】
本明細書に開示される様々なポリペプチド及びタンパク質断片について述べる場合の「単離した」とは、その自然環境の構成要素から識別され分離されかつ／又は回収されたポリペプチド又はタンパク質を意味する。その自然環境の汚染物質成分は、一般に、ポリペプチド又はタンパク質の診断又は治療での用途を妨げない物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク様又は非タンパク様溶質を含んでよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドを、（１）スピニングカップ配列決定装置によって少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで精製し、又は（２）クーマシーブルー染色又は好ましくは銀染色を用い、非還元又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるよう精製する。単離されたポリペプチドは、Ｄｋｋ−１自然環境の少なくとも一成分が存在しないので、組換え細胞内のもとの位置にポリペプチドを含む。しかし通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００６１】
本発明を実施するための形態
Ｌ６筋細胞に対するＤｋｋ−５の作用に関する本明細書での発見とその他のデータに基づき、Ｄｋｋ−５を使用してインスリン耐性障害を診断し治療するための新規な方法を開示する。したがって本発明は、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ診断及び治療状態に有用な方法を提供する。
【００６２】
治療目的の使用
Ｄｋｋ−５は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、及び腹膜内（ＩＰ）、ならびに経皮的、口内、舌下、直腸内、鼻腔内、及び吸入経路などであるがこれらに限定されない非経口投与経路を含めた任意の適切な経路によって、哺乳類に投与する。ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、及びＩＰ投与は、ボーラスで又は注入によって行うことができ、ＳＣの場合は、ポンプ、徐放性製剤、及び機械式装置を含むがこれらに限定されない徐放性埋込み型装置によって行ってもよい。好ましくは投与を全身に行い、インスリン耐性の低下は、患者のグルコース及び／又はインスリンの循環レベルの低下によって明らかにされる。
【００６３】
Ｄｋｋ−５を投与する１つの特に好ましい方法は、皮下注入であり、特にポンプなどの計量式輸液用器具を使用したものである。そのようなポンプは再使用可能であり又は使い捨て可能であり、また埋込み可能であり又は外付けすることが可能である。この目的で有効に用いられる投薬用輸液ポンプには、例えば米国特許第５，６３７，０９５号；第５，５６９，１８６号；及び第５，５２７，３０７号に開示されているポンプが含まれる。組成物は、そのような器具から連続的に、又は断続的に投与することができる。
【００６４】
貯蔵に適したＤｋｋ−５の治療用製剤は、所望の程度の純度を有するタンパク質と医薬品として許容される担体、賦形剤、又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０））との混合物であって、凍結乾燥製剤又は水溶液の形をとるものを含む。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに無毒であり、リン酸緩衝液やクエン酸緩衝液、及びその他の有機酸の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミンやゼラチン、イムノグロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びその他の炭水化物であって例えばグルコース、マンノース、又はデキストリンなど；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロースやマンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。好ましい凍結乾燥Ｄｋｋ−５製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に記載されている。これらの組成物は、好ましくは可溶性の形態で、活性Ｄｋｋ−５を約０．１〜９０重量％、より一般的には約１０〜３０重量％含有するＤｋｋ−５を含む。
【００６５】
活性成分は、例えばコアセルベーション技法によって又は界面重合によって調製された、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルなどのマイクロカプセルに閉じ込めることができ、又はコロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミン微小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に閉じ込めることができ、又はマクロエマルジョンに閉じ込めることもできる。そのような技法は、前掲のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。
【００６６】
本明細書に開示されるＤｋｋ−５は、イムノリポソームとして配合してもよい。Ｄｋｋ−５を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号；及び１９９７年１０月２３日公開のＷＯ９７／３８７３１など、当技術分野で知られている方法によって調製する。循環時間が長いリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【００６７】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物と共に、逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、孔径が画定されているフィルタを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。
【００６８】
持効性調剤を調製することができる。持効性調剤の適切な例には、Ｄｋｋ−５を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、例えばフィルムやマイクロカプセルなどの成形物品の形をとる。持効性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）やポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌグルタミン酸とγエチルＬグルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマーであって例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸とグリコール酸のコポリマーと酢酸リュープロライドからなる注入可能な微小球体）など、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００６９】
Ｄｋｋ−５を担体タンパク質と一緒にして、その血清半減期を長くすることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、滅菌状態でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に実現される。
【００７０】
本明細書の製剤は、治療する特定の徴候に必要な場合、好ましくは悪影響を互いに及ぼさない相補的な活性を有する複数の活性化合物を含有してもよい。また、そのような活性化合物は、治療する哺乳類に別々に投与することもできる。そのような別の薬物は、一般的に用いられている経路及び量で、Ｄｋｋ−５と同時に又は順次投与することができる。Ｄｋｋ−５を１つ又は複数の別の薬物と同時に使用する場合、そのような別の薬物をＤｋｋ−５の他に含有する医薬品単位剤形が好ましい。したがって本発明の医薬品組成物は、Ｄｋｋ−５の他に１つ又は複数の活性成分も含有するものを含む。Ｄｋｋ−５と組み合わせることができ、別々に又は同じ医薬品組成物として投与することができるインスリン耐性治療剤又は血糖降下剤の例には以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
ａ）（ｉ）ＰＰＡＲ−γアゴニストであって、例えばグリタゾン（例えば、トログリタゾン（Ｎｏｓｃａｌ又はＲｅｓｉｌｉｎｅ）やピオグリタゾンＨＣＬ、エングリタゾン、ＭＣＣ−５５５、ＢＲＬ−４９６５３、ＡＬＲＴ２６８、ＬＧＤ１０６９、ピコリン酸クロム、ＤＩＡＢ  ＩＩ（商標）（Ｖ−４１１）、ＧＬＵＣＡＮＩＮ（商標）などの、米国特許第５，７５３，６８１号に記載されているものを含む）や、ＷＯ９７／２７８５７、ＷＯ９７／２８１１５、ＷＯ９７／２８１３７、及びＷＯ９７／２７８４７に開示されている化合物、及び（ｉｉ）メトホルミンやフェンホルミンなどのビグアナイドを含む、インスリン感作物質；
（ｂ）インスリン（１つ又は複数の異なるインスリン）、小分子インスリンなどのインスリン模擬体であって、例えばＬ−７８３，２８１など、インスリン類似体（例えばＬＹＳＰＲＯ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  Ｃｏ．）、ＬｙｓＢ２８インスリン、ＰｒｏＢ２９インスリン、又はＡｓｐＢ２８インスリン、又は例えば米国特許第５，１４９，７７７号及び第５，５１４，６４６号に記載されているもの）又はその生理学的に活性な断片、インスリン関連のペプチド（Ｃペプチド、ＧＬＰ−１、ＩＧＦ−１、又はＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３錯体）又はその類似体又はその断片；
（ｃ）アセトヘキサミドやクロルプロパミド、トラザミド、トルブタミド、グリベンクラミド、グリボルヌリド、グリクラジド、グリピジド、グリキドン、グリミジンなどのスルホニル尿素；
（ｄ）αグルコシダーゼ阻害剤（アカルボースなど）、
（ｅ）（ｉ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（ロバスタチン、シンバスタチン及びプラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、及びその他のスタチン）、（ｉｉ）金属イオン封鎖剤（コレスチラミン、コレスチポール、及び架橋デキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体）、（ｉｉｉ）ニコチルアルコールニコチン酸又はその塩、（ｉｖ）フェノフィブリン酸誘導体（ゲムフィブロジル、クロフィブラート、フェノフィブラート、及びベンザフィブラート）などの増殖因子−活性化因子レセプター−αアゴニスト、（ｖ）βシトステロール及び（アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ）阻害剤などのコレステロール吸収阻害剤であって、例えばメリナミド、（ｖｉ）プロブコール、（ｖｉｉ）ビタミンＥ、及び（ｖｉｉｉ）甲状腺模擬体などのコレステロール低下剤；
（ｆ）ＷＯ９７／２８１４９に開示されているようなＰＰＡＲ−δアゴニスト；
（ｇ）フェンフルラミンやデキスフェンフルラミン、フェンテルミン、シブトラミン、オーリスタット、及びその他のβ３アドレナリンレセプターアゴニストなどの抗肥満化合物；
（ｈ）ニューロペプチドＹアンタゴニスト（例えばニューロペプチドＹ５）などの摂食行動修正剤であって、例えばＷＯ９７／１９６８２、ＷＯ９７／２０８２０、ＷＯ９７／２０８２１、ＷＯ９７／２０８２２、及びＷＯ９７／２０８２３に開示されているもの；
（ｉ）ＷＯ９７／３６５７９に記載されているようなＰＰＡＲ−αアゴニスト；
（ｊ）ＷＯ９７／１０８１３に記載されているようなＰＰＡＲ−γアンタゴニスト；
（ｋ）フルオキセチンやセルトラリンなどのセロトニン再取込み阻害剤；
（ｌ）経口摂取インスリン、注射されたインスリン、スルホニル尿素、ビグアナイド、又は米国特許第６，２９１，４９５号に記載されているようなαグルコシダーゼ阻害剤の１つ又は複数と合わせた、１つ又は複数のインスリン感作物質；
（ｍ）自己免疫試薬；
（ｎ）インスリンレセプターチロシンキナーゼ阻害剤のアンタゴニスト（米国特許第５，９３９，２６９号）；
（ｏ）ＩＧＦ−１／ＩＧＦＢＰ−３複合（米国特許第６，０４０，２９２号）；
（ｐ）ＴＮＦ−α機能に対するアンタゴニスト（米国特許第６，０１５，５５８号）；
（ｑ）成長ホルモン放出剤（米国特許第５，９３９，３８７号）；及び
（ｒ）アミリンに対する抗体（米国特許第５，９４２，２２７号）。
その他の薬剤については、上記定義で特定され又は当業者に知られている。
【００７１】
そのような追加の分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて適切に存在し又は投与されるが、一般には、Ｄｋｋ−５なしで単独で投与される場合よりも少ない量である。これらを一緒に配合する場合、例えば被験体、被験体の年齢及び体重、現在の臨床状態、投与時間、剤形、投与方法などに合わせて決定された量で配合することができる。例えば併用剤は、本明細書のＤｋｋ−５  １重量部に対して約０．０００１〜１０，０００重量部の割合で使用することが好ましい。
【００７２】
血糖降下剤は、非経口、鼻腔内、経口、又は任意のその他の有効な経路を含めた任意の適切な技法によって哺乳類に投与する。投与は、注射によって（インスリンの）又は経口経路によって行うことが最も好ましい。例えば、錠剤濃度１．２５ｍｇ、２．５ｍｇ、及び５ｍｇとしてＵｐｊｏｈｎから販売されているＭＩＣＲＯＮＡＳＥ（商標）錠剤（グリブリド）は、経口投与に適している。この療法に組み込まれるＩＩ型糖尿病用の通常の維持量は、一般に、１日当たり約１．２５〜２０ｍｇの範囲内であり、これを１回分の用量として与えることができ、又は必要と思われる場合には１日に数回に分けて与えることができる（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、２５６３〜２５６５（１９９５））。処方箋に利用可能なグリブリドを主成分とした錠剤のその他の例には、ＧＬＹＮＡＳＥ（商標）ブランドの薬剤（Ｕｐｊｏｈｎ）及びＤＩＡＢＥＴＡ（商標）ブランドの薬剤（Ｈｏｅｃｈｓｔ−Ｒｏｕｓｓｅｌ）が含まれる。ＧＬＵＣＯＴＲＯＬ（商標）（Ｐｒａｔｔ）は、５ｍｇと１０ｍｇの両方の強さで入手可能なグリピジド（１−シクロヘキシル−３−［ｐ−［２−（５−メチルピラジンカルボキサミド）エチル］フェニル］スルホニル尿素）錠剤の商標であり、食事制限の後に血糖降下療法を必要とするＩＩ型糖尿病又はその他のスルホニル尿素に対する応答が無くなった患者用にも処方される（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９０２〜１９０３（１９９５））。
【００７３】
インスリンと合わせてＤｋｋ−５を使用することにより、インスリンだけを投与したときの用量に比べてインスリンの用量を少なくすることができる。したがって、いずれも大量のインスリン投与に伴う問題である血管合併症及び低血糖症が誘発されるリスクが低下する。例えば成人の糖尿病患者（体重約５０ｋｇ）にインスリンを投与する場合、１日当たりの用量は通常約１０〜１００Ｕ（Ｕｎｉｔ）であり、好ましくは約１０〜８０Ｕであるが、医師によって決定される場合にはこれより少なくてよい。例えばインスリン分泌増強剤を同じタイプの患者に投与する場合、１日当たりの用量は約０．１〜１０００ｍｇが好ましく、より好ましくは約１〜１００ｍｇである。例えば同じタイプの患者にビグアナイドを投与する場合、１日当たりの用量は好ましくは約１０〜２５００ｍｇであり、より好ましくは約１００〜１０００ｍｇである。例えば同じタイプの患者にαグルコシダーゼ阻害剤を投与する場合、１日当たりの用量は好ましくは約０．１〜４００ｍｇであり、より好ましくは約０．６〜３００ｍｇである。そのような患者に対するエルゴセット、プラムリンタイド、レプチン、ＢＡＹ−２７−９９５５、又はＴ−１０９５の投与は、好ましくは約０．１〜２５００ｍｇ、より好ましくは約０．５〜１０００ｍｇの用量で行うことができる。上記用量の全ては、１日当たり１回から数回で投与することができる。
【００７４】
Ｄｋｋ−５は、膵臓移植などのインスリン耐性障害に適切な非薬物治療と合わせて投与してもよい。
【００７５】
インスリン耐性哺乳類に投与されるＤｋｋ−５の投与量は、哺乳類の状態及び選択された投与経路も含めた関連する状況に照らし、医師によって決定される。本明細書に示す投与量の範囲は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定しようとするものではない。本明細書における「治療上有効な」量は、上記の要素によって決定するが、一般に約０．０１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日である。好ましい用量は、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であり、より好ましくは約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ／日である。Ｄｋｋ−５を毎日投与する場合、ヒトの静脈内又は筋肉内の用量は、１日当たり体重１ｋｇにつき約０．３〜１０ｍｇであることがさらにより好ましく、約０．５〜５ｍｇ／ｋｇがより好ましい。皮下投与の場合の用量は、静脈内又は筋肉内に与えられる用量と治療上同等な用量よりも多いことが好ましい。ヒトに毎日投与される皮下用量は約０．３〜２０ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、より好ましくは約０．５〜５ｍｇ／ｋｇである。
【００７６】
本発明は、様々な投薬スケジュールを企図するものである。本発明は、実質的に中断することなくＤｋｋ−５を規則的に（用量及び剤形に応じて毎日、毎週、又は毎月）投与する連続投薬スケジュールを包含する。好ましい連続投薬スケジュールには、毎日、連続的に注入すること、すなわちＤｋｋ−５を毎日注入すること、及び連続的なボーラス投与スケジュール、すなわちＤｋｋ−５を１日当たり少なくとも１回注射によって、又は吸入によって、又は鼻腔内経路によって投与することが含まれる。また本発明は、断続的（例えば間欠的及び維持）投与スケジュールも包含する。そのような断続的投与スケジュールの確かなパラメータは、製剤、送達方法、及び治療する哺乳類が臨床上求めるものに応じて異なる。例えばＤｋｋ−５を輸液によって投与する場合、投与スケジュールは、第１の投与期間の後に、第１の期間よりも長く、又は等しく、又は短いＤｋｋ−５を投与しない第２の期間を含めることができる。
【００７７】
投与がボーラス注射による場合、特に徐放性製剤のボーラス注射による場合、その投薬スケジュールは、Ｄｋｋ−５を毎日投与するように連続的であってもよく、あるいは上述のように第１の期間と第２の期間があるなど断続的であってもよい。
【００７８】
任意の方法による連続的及び断続的な投与スケジュールは、第１の期間全体を通して用量を変えることも含み、したがって例えば、第１の期間の最初の用量を少なくして第１の期間が終わるまでにその用量を増やすような投薬スケジュールと、最初に用量を多くして第１の期間中に少なくしていくスケジュール、さらに、用量を最初は少なくしてピークレベルまで増加させ、次いで第１の期間の終わりまでに少なくしていくスケジュール、及びこれらの任意の組み合わせも含む。
【００７９】
Ｄｋｋ−５の投与の効果は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって測定することができる。最も一般的には、糖尿病の影響が緩和されると、血糖管理（血糖値の連続試験によって測定される）が改善され、良好な血糖管理を維持するインスリンの要件が低くなり、血清インスリンレベルが低くなり、グリコシル化ヘモグロビンが減少し、糖化終末産物（ＡＧＥ）の血中レベルが低下し、「暁現象（ｄａｗｎ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）」が低減し、ケトアシドーシスが低減し、脂質プロフィルが改善されることになる。あるいはＤｋｋ−５を投与すると、血糖レベルの低下、インスリン要件の低下、血清インスリンレベルの低下、グリコシル化ヘモグロビン及び血液ＡＧＥの低下、血管、腎臓、神経、及び網膜の合併症の低減、妊娠合併症の低減、脂質プロフィルの改善によって示されるように、糖尿病の症状が安定する。
【００８０】
Ｄｋｋ−５の作用による血糖低下は、投与の前後に被験体の静脈血血漿中のグルコース又はＨｂ（ヘモグロビン）Ａ１ｃの濃度を求め、次いで投与前後で得られた濃度を比較することによって、評価することができる。ＨｂＡ１ｃは、グリコシル化ヘモグロビンを意味し、血糖濃度に応じて徐々に産生される。したがってＨｂＡ１ｃは、糖尿病患者の急速な血糖変化によって容易に影響を受けない血糖管理の指標として重要と考えられる。
【００８１】
また本発明は、インスリン耐性障害を治療するためのキットも提供する。本発明のキットは、インスリン耐性障害、好ましくは糖尿病を治療するためのＤｋｋ−５の使用及び投薬量に関する一組の取扱説明書、一般には書面形式の取扱説明書と組み合わせて、所定量のＤｋｋ−５の１つ又は複数の容器を含む。キットに含まれる取扱説明書は、一般に、インスリン耐性障害を治療するための投薬量、投薬スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。Ｄｋｋ−５の容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば複数回分の用量パッケージ）、又はサブ単位用量でよい。
【００８２】
Ｄｋｋ−５は、任意の都合良い適切なパッケージングで包装することができる。例えば、Ｄｋｋ−５が凍結乾燥製剤の場合、容器としては、弾性の栓を備えたアンプル又はバイアルが通常使用され、したがって薬物は、その弾性の栓を通して流体を注入することにより、容易に元に戻すことができる。非弾性の取外し可能なクロージャ（例えばシールガラス）又は弾性の栓を備えたアンプルは、注射可能な形のＤｋｋ−５に最も都合良く使用される。この場合、取扱説明書は、すぐに注射できるように、シリンジ内にバイアルの内容物を入れることを明示することが好ましい。吸入器や鼻腔内投与器具（例えばアトマイザ）、ミニポンプなどの輸液用器具など、特定の機器と組み合わせて使用するパッケージも考えられている。
【００８３】
キットは、所定量でインスリン耐性治療剤が入っている容器を含んでもよい。
【００８４】
診断目的の使用
対照サンプルに対するサンプル中のＤｋｋ−５の量を検出するために、多くの異なるアッセイ及びアッセイフォーマットを使用することができる。これらのフォーマットは、本発明の診断アッセイにも有用であり、哺乳類のインスリン耐性障害の存在又は発症を検出するのに使用される。
【００８５】
本発明を実施するには、可溶性分析物を測定する技術分野で知られる任意の手順を使用することができる。そのような手順には、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、沈殿反応、ゲル拡散反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射性アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、免疫電気泳動アッセイなどの技法を使用する競合的でありまた非競合的なアッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。好ましいイムノアッセイ法に関しては、米国特許第４，８４５，０２６号及び第５，００６，４５９号を参照されたい。
【００８６】
一実施形態では、抗Ｄｋｋ−５抗体の１つ又は複数を使用して、サンプル中のＤｋｋ−５の量を測定する。診断の用途で、抗Ｄｋｋ−５抗体を検出に使用する場合、抗体には一般に検出可能な部分で標識する。そのような抗体は、イムノアッセイで使用することが好ましい。標識の一態様では、使用される抗Ｄｋｋ−５抗体の１つ又は複数を標識し、別の態様では、第１の抗体を標識せず、標識した第２の抗体を使用して、第１の抗体に結合したＤｋｋ−５を検出し又は第１の抗体を検出する。
【００８７】
一般に下記のカテゴリーに分類することができる非常に数多くの標識が利用可能である。
（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉなどの放射性同位体が利用可能である。抗体は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１及び２巻、Ｃｏｌｉｇｅｎ他編（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）記載されている技法を使用して、これらの放射性同位体又は放射性核種で標識することができ、放射能は、シンチレーション計数を使用して測定することができる。
（ｂ）希土類キレート（ユウロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体（イソチオシアン酸フルオレセインなど）、ローダミン及びその誘導体、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレサミン、ダンシル、リサミン、及びテキサスレッドなどの蛍光標識が利用可能である。蛍光標識は、例えば前掲のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに開示されている技法を使用して抗体に結合することができる。蛍光は、蛍光測定器を使用して定量することができる。検出する抗体は、１５２Ｅｕ又はランタニド系列のその他の元素などの蛍光放出金属を使用して、検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート群を使用して抗体に取着することができる。
（ｃ）様々な酵素−基質標識はＥＩＡで利用可能であり、これらのいくつかの概説が米国特許第４，２７５，１４９号に示されている。酵素は一般に、様々な技法を使用して測定することができる色素原性基質の化学変化を触媒する。例えば酵素は、基質における色の変化を触媒することができ、これは分光光度計で測定することができる。あるいは酵素は、基質の蛍光、化学発光、又は生物発光を変化させることができる。蛍光の変化を定量するための技法は上述の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子で励起されるようになり、次いで測定可能な光を放出することができ（例えば化学発光測定器を使用して）、又は蛍光レセプターにエネルギーを与える。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えばホタルのルシフェラーゼや細菌ノルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６）、ルシフェリン、エクオリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、αグリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、アスパラギナーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼやキサンチンオキシダーゼなど）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。酵素を抗体に結合するための技法は、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ，、ｅｄ．Ｌａｎｇｏｎｅ及びＶａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）７３：１４７〜１６６（１９８１）に記載されている。
【００８８】
酵素−基質の組合せの例には、
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）であって、水素ペルオキシダーゼが色素前駆体（例えばオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化するもの；
（ｉｉ）色素原基質としてリン酸ｐ−ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）であって、色素原基質（例えばｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）を有するもの、又は蛍光原基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
が含まれる。
【００８９】
当業者なら、数多くのその他の酵素−基質の組合せを利用可能である。これらの概説に関しては、米国特許第４，２７５，１４９号及び第４，３１８，９８０号を参照されたい。
【００９０】
ときどき、標識を抗体に直接結合する。当業者なら、これを実現するための様々な技法に気付くであろう。例えば、抗体をビオチンに結合することができ、上記大きく３つに分類したもののいずれかをアビジンに結合することができ、又はその逆も可能である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、したがって標識は、この直接的な方法で抗体に結合することができる。あるいは、標識と抗体との間接的な結合を実現するため、抗体を小ハプテン（例えばジゴキシン）に結合し、上記種々のタイプの１つを抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）に結合する。このように、標識と抗体との間接的な結合を実現することができる。
【００９１】
本発明の別の実施形態では、抗Ｄｋｋ−５抗体を標識する必要がなく、その存在は、Ｄｋｋ−５抗体に結合する標識抗体を使用して検出することができる。
【００９２】
本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接及び間接的なサンドイッチアッセイ、免疫沈降アッセイなどの、任意の知られているアッセイ法で用いることができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１４７〜１５８頁（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）。
【００９３】
本発明のアッセイでは、抗原Ｄｋｋ−５又はその抗体が、固相支持体又は担体に結合することが好ましい。「固相支持体又は担体」とは、抗原又は抗体に結合することができる任意の支持体を意味する。周知の支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の場合、ある程度可溶性であり又は不溶性でよい。支持体の材料は、結合した分子が抗原又は抗体に結合できる限り、事実上任意の可能な構造的構成を有することができる。したがって支持体の構成は、ビーズのように球体でよく、あるいは試験管の内面又は棒の外面のように円筒形でよい。あるいは表面は、シートや試験片などのように平らでよい。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者なら、抗体又は抗原に結合するための多くのその他の適切な担体がわかるであろうし、又は日常的な実験を使用することによってそのような担体を確認することができるであろう。
【００９４】
好ましい実施形態では、抗体−抗原−抗体サンドイッチイムノアッセイを行い、すなわち、第１の抗体を抗原に結合し第２の抗体を抗原に結合すること、及び第１の抗体と第２の抗体の両方に免疫特異的に結合した抗原を検出し又は測定することを含む方法によって、抗原を検出し又は測定する。特定の実施形態では、第１及び第２の抗体はモノクローナル抗体である。この実施形態では、抗原が、モノクローナル抗体によって認識される反復エピトープを含有しない場合、第２のモノクローナル抗体は、第１の抗体とは異なる部位に結合しなければならない（例えば、抗原に結合するための２つの抗体間の競合阻害の欠如によって反映されるように）。別の特定の実施形態では、第１又は第２の抗体がポリクローナル抗体である。さらに別の特定の実施形態では、第１の抗体と第２の抗体の両方がポリクローナル抗体である。
【００９５】
好ましい実施形態では、以下に概略的の述べるように、「正（ｆｏｒｗａｒｄ）」サンドイッチ酵素イムノアッセイを使用する。Ｄｋｋ−５に向けた抗体（捕捉抗体、Ａｂ１）を、固相マトリックス、好ましくはマイクロプレートに取着する。サンプルを、Ａｂ１で被覆したマトリックスに接触させ、Ａｂ１が特異的になるサンプル中の全てのＤｋｋ−５が、固相Ａｂ１に結合するようにする。結合していないサンプル成分は、洗浄によって除去する。抗原の第２のエピトープを対象とする酵素結合した第２の抗体（検出抗体、Ａｂ２）を、Ａｂ１によって捕捉された抗原に結合し、サンドイッチを完成させる。結合していないＡｂ２を洗浄によって除去した後、酵素の色素原性基質を加え、サンドイッチ構造に含まれる酵素の量に比例した割合で着色産物を形成するが、これはサンプル中の抗原の量を反映するものである。停止溶液を加えることによってこの反応を停止させる。色は、分光光度計を使用して、適切な波長での吸光度として測定する。既知の濃度の抗原から標準曲線を作成し、そこから未知のサンプルの値を決定することができる。
【００９６】
その他のタイプの「サンドイッチ」アッセイは、いわゆる「同時」及び「逆」アッセイである。同時アッセイは、固体支持体に結合した抗体と標識抗体との両方が、試験されるサンプルに同時に加えられることから、単一のインキュベーションステップを含む。インキュベーション終了後、固体支持体を洗浄して、流体サンプルの残留物と複合していない標識抗体を除去する。次いで固体支持体に関連付けられた標識抗体の存在は、従来の「正」サンドイッチアッセイの場合と同様に決定する。
【００９７】
「逆」アッセイでは、段階的な添加が行われ、最初に標識抗体の溶液を流体サンプルに添加し、その後、適切なインキュベーション期間を経た後に、固体支持体に結合している標識されていない抗体を添加する。２回目のインキュベーション後、固相を従来の手法で洗浄し、そこから、試験をするサンプルの残留物及び未反応の標識抗体の溶液を除去する。次いで固体支持体に関連付けられた標識抗体の量を、「同時」アッセイ及び「正」アッセイの場合と同様に決定する。
【００９８】
本発明のアッセイを実施するための成分を入れた１つ又は複数の容器又はバイアルを含んだキットも、本発明の範囲内である。そのようなキットは、所定量の試薬と、診断アッセイを実施するための取扱説明書とを組み合わせてパッケージしたものである。例えばそのようなキットは、Ｄｋｋ−５抗原に対する１つ又は複数の抗体、好ましくは１対の抗体であって、好ましくは抗原上の同じ結合部位で競合しないものを含むことができる。特定の実施形態で、Ｄｋｋ−５は、固相マトリックスに事前に吸着されている。キットは、当技術分野で周知のその他の必要な洗浄試薬を含むことが好ましい。ＥＩＡでは、キットは、色素原性基質、ならびに発色が生じたときに酵素反応を停止するための試薬を含む。このキットに含まれる基質は、抗体調剤の１つに酵素結合するのに適切なものである。これらは当技術分野で周知であり、そのいくつかを以下に例示する。キットは、任意選択でＤｋｋ−５標準物質を含むこともでき、すなわち標準サンプル中の通常の量のＤｋｋ−５に対応した量の精製済みのＤｋｋ−５を含むこともできる。
【００９９】
抗体を酵素で標識する場合、キットは、基質及び酵素に必要な補助因子を含むことになる（例えば検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体）。さらに、安定剤や緩衝液（例えばブロック緩衝液や溶解緩衝液）などの、その他の添加剤を含むことができる。様々な試薬の相対的な量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液の濃度が得られるように、広く変えることができる。特に試薬は、溶解することによって適切な濃度を有する試薬溶液を提供することになる賦形剤も含んだ乾燥粉末として、すなわち通常は凍結乾燥した乾燥粉末として、提供することができる。
【０１００】
特定の一実施形態で、インスリン耐性障害の存在又は発症を検出するための診断キットは、（１）Ｄｋｋ−５に結合する抗体を含んだ容器と、（２）Ｄｋｋ−５を含有する標準サンプルを含んだ容器と、（３）障害を検出するのに抗体及び標準サンプルを使用するための取扱説明書とを含み、Ｄｋｋ−５に結合する抗体が検出可能に標識され、あるいはこのキットがさらに、検出可能に標識されてＤｋｋ−５に結合し又はＤｋｋ−５に結合する抗体に結合した第２の抗体を含んだ別の容器を含む。Ｄｋｋ−５に結合する抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【０１０１】
別の特定の実施形態で、本発明のキットは、１つ又は複数の容器内に、（１）第１の抗体で被覆されたマイクロタイタープレートなどの固相担体、（２）検出可能に標識された第２の抗体、及び（３）第１及び第２の抗体によって認識されたＤｋｋ−５分子の標準サンプル、ならびに適切な取扱説明書を含む。
【０１０２】
トランスジェニック動物を使用したスクリーニング
筋細胞内でｄｋｋ−５  ｃＤＮＡを過発現するトランスジェニック非ヒト動物は、インスリン耐性障害の治療を示す血液からのグルコースクリアランスの増加における効力に関して候補薬物（タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、小分子など）をスクリーニングするのに使用することができる。
【０１０３】
一実施形態で、トランスジェニック動物は、非ヒト動物の生殖系列にｄｋｋ−５導入遺伝子を導入することによって発生させる。導入遺伝子を導入するには、様々な発生段階における胚性標的細胞を使用することができる。この胚性標的細胞の発生段階に応じて種々の方法を使用する。本発明を実施するために使用される任意の動物の特定の系統は、一般的に良好な健康状態であること、胚収率が良好であること、胚の中に前核が良く見えること、生殖適応度が良好であるように選択される。さらに、ハプロタイプは重要な因子である。例えばトランスジェニックマウスを作製する場合、Ｃ５７ＢＬ／６又はＦＶＢ系統などの株をしばしば使用する。本発明を実施するのに使用される系統は、それ自体がトランスジェニックでよく、かつ／又はノックアウトでよい（すなわち、部分的に又は完全に抑制された１つ又は複数の遺伝子を有する動物から得られたもの）。
【０１０４】
導入遺伝子構成体は、単一段階胚に導入することができる。接合体は、マイクロインジェクションに最良の標的である。遺伝子導入のため標的として接合体を使用すると、ほとんどの場合、注入されたＤＮＡは最初の分割の前に宿主遺伝子に組み込まれることになり、これは大きな利点である（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４４３８〜４４４２（１９８５））。その結果、トランスジェニック動物の全ての細胞は、組み込まれた導入遺伝子を運ぶことになる。これは一般に、生殖細胞の５０％が導入遺伝子を収容することになるので、創始個体の子孫に対する効率的な導入遺伝子の伝達にも反映されることになる。
【０１０５】
通常は、受精した胚を、前核が現れるまで適切な培地でインキュベートする。ほぼこの時期になったら、導入遺伝子を含むヌクレオチド配列をメス又はオスの前核に導入する。マウスなどの一部の種では、オスの前核が好ましい。卵核又は接合体メス前核で処理する前に、接合体のオスＤＮＡ補体に外因性遺伝物質を付加することができる。
【０１０６】
このように、オスとメスの前核が十分に分離して共に細胞膜の近くに位置すると場合、メス前核の影響を受ける前に、外因性遺伝物質をＤＮＡのオス補体又はＤＮＡの任意のその他の補体に付加することができる。あるいは、非凝縮を受けるようになされた後に、外因性遺伝物質を精子の核に加えることができる。次いで外因性遺伝物質を含有する精子を卵に加えることができ、又は非凝縮した精子を、その後できる限り早く加えられる導入遺伝子構成体と共に卵に加えることができる。
【０１０７】
細胞、核膜、あるいはその他の既存の細胞又は遺伝子構造体を破壊するものでない限り、外因性遺伝物質を核遺伝物質に加えることが可能な任意の技法を利用することができる。胚に対する導入遺伝子ヌクレオチド配列の導入は、例えばマイクロインジェクションやエレクトロポレーション、リポフェクションなどの当技術分野で知られている任意の手段によって行うことができる。外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションによって核遺伝物質に優先的に挿入される。細胞及び細胞構造体のマイクロインジェクションは知られており、当技術分野で使用される。マウスでは、オス前核が直径約２０マイクロメートルのサイズに達し、１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液を再現可能に注入することができる。胚に導入遺伝子ヌクレオチドを導入した後、様々な時間でその胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションを行うことができ、又は胚を代替宿主に再移植することができ、あるいはこの両方を行うことができる。成熟するまでｉｎ  ｖｉｔｒｏインキュベーションすることは、本発明の範囲内である。１つの一般的な方法は、種に応じて胚を試験管内で約１〜７日間インキュベートし、次いでその胚を代替宿主に再移植することである。
【０１０８】
接合体に加えられる導入遺伝子構成体のコピーの数は、加えられる外因性遺伝物質の総量に応じて異なり、遺伝子の形質転換を引き起こすことができる量になる。理論的には１つのコピーしか必要ではないが、一般には数多くのコピーを利用し、例えば１，０００〜２０，０００個の導入遺伝子構成体のコピーを利用して、１つのコピーが確実に機能するようにする。本発明では、その表現型発現を高めるために、挿入された外因性ＤＮＡ配列の複数の機能コピーを有することが有利と考えられる。
【０１０９】
任意の適切な方法によって、導入遺伝子の存在及び／又は発現に関して代替宿主のトランスジェニック子孫をスクリーニングすることができる。スクリーニングは、導入遺伝子の少なくとも一部に相補的なプローブを使用して、しばしばサザンブロット又はノーザンブロット分析によって行われる。導入遺伝子でコードされたＤｋｋ−５に対する抗体を使用するウェスタンブロット分析は、導入遺伝子産物の存在に関してスクリーニングするための代替法として、又は追加の方法として、使用することができる。典型的な場合、ＤＮＡは尾部組織から調製し、導入遺伝子に関してサザンブロット分析又はＰＣＲによって分析する。あるいは、最高レベルで導入遺伝子を発現すると考えられる組織又は細胞について、サザン分析又はＰＣＲを使用して導入遺伝子の存在及び発現に関して試験をするが、この分析には、任意の組織又は細胞型を使用することができる。
【０１１０】
導入遺伝子の存在を評価するための代替又は追加の方法には、酵素及び／又は免疫学的アッセイなどの適切な生化学アッセイ、特定のマーカー又は酵素活性に対する組織学的染色、フローサイトメトリー分析などが含まれるが、これらに限定されない。血液の分析は、血液中に導入遺伝子産物が存在するかどうかを検出すること、ならびにグルコースなど血液成分のレベルに対する導入遺伝子の影響を評価することにも役立てることができる。
【０１１１】
トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物を適切なパートナーと交配させることによって、あるいはトランスジェニク動物から得られた卵及び／又は精子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精によって、得ることができる。パートナーとつがわせる場合、そのパートナーは、トランスジェニック及び／又はノックアウトでよく、又はそうでなくてもよいが、トランスジェニックの場合は、同じか又は異なる導入遺伝子あるいはその両方を含有する可能性がある。あるいは、パートナーは親系統でよい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精を行う場合は、受精した胚を代替宿主に再移植することができ、又は試験管内でインキュベートすることができ、あるいはその両方を行うことができる。いずれかの方法を使用することにより、上述の方法を使用し又は適切な方法を使用して、子孫が導入遺伝子を持っているかどうか評価することができる。
【０１１２】
本発明により作製したトランスジェニック動物は、外因性遺伝物質、すなわちＤｋｋ−５を生成するＤＮＡ配列を含むことになる。この配列は、転写調節要素、例えばプロモーターに動作可能に取着され、特定のタイプの細胞において導入遺伝子産生の発現が可能になることが好ましい。本明細書で最も好ましいそのような調節要素は、筋組織でのｄｋｋ−５  ｃＤＮＡの過発現が可能な、筋肉に特異的なプロモーターである。そのようなプロモーターの例は、ミオシンＬ鎖プロモーター（Ｓｈａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２８３〜６（１９８５））、あるいはスムーゼリンＡ又はＢの発現を推進するもの、あるいは例えば２００１年３月１５日公開のＷＯ  ０１／１８０４８に記載されているものの同様のプロモーターである。
【０１１３】
非ヒト動物に導入遺伝子を導入するには、レトロウイルス感染を使用することもできる。発生する非ヒト胚は、胚盤胞段階まで試験管内で培養することができる。この期間中、割球を、レトロウイルス感染の標的にすることができる（Ｊａｅｎｉｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３：１２６０〜１２６４（１９７６））。割球の効率的な感染は、透明帯が除去されるよう酵素処理することによって行われる（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、Ｈｏｇａｎ編（コールド  スプリング  ハーバー研究所出版、 コールド  スプリング  ハーバー、ニューヨーク、１９８６））。導入遺伝子を導入するのに使用されるウイルスベクター系は、典型的な場合、導入遺伝子を運ぶ複製欠陥レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：６９７２〜６９３１（１９８５）；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：６１４８〜６１５２（１９８５））。トランスフェクションは容易であり、ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することによって効率的に行われる（前掲のＶａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ他；Ｓｔｅｗａｒｔ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３８３〜３８８（１９８７））。あるいは感染は、より後の段階で行うことができる。ウイルス又はウイルス産生細胞は、胞胚腔に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２９８：６２３〜６２８（１９８２））。創始個体のほとんどは導入遺伝子に関してモザイクになるが、その理由は、組込みが、トランスジェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセットのみで生じるからである。さらに創始個体は、一般に子孫で分離することになるゲノムの種々の位置で、導入遺伝子の様々なレトロウイルス挿入を含んでよい。さらに、妊娠中期の胚の子宮内レトロウイルス感染によって、生殖系統に導入遺伝子を導入することも可能である（前掲のＪａｈｎｅｒ他（１９８２））。
【０１１４】
導入遺伝子を導入するための第３のタイプの標的細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、試験管内で培養して胚と融合させた着床前の胚から得られる（Ｅｖａｎｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：１５４〜１５６（１９８１）；Ｂｒａｄｌｅｙ他、Ｎａｔｕｒｅ、３０９：２５５〜２５８（１９８４）；Ｇｏｓｓｌｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：９０６５〜９０６９（１９８６）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：４４５〜４４８（１９８６））。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションによって、又はレトロウイルス媒介性の形質導入によって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。そのような変換されたＥＳ細胞は、その後、非ヒト動物からの胚盤胞と組み合わせることができる。その後、ＥＳ細胞は胚をコロニー化し、得られたキメラ動物の生殖系統に関与する。概説に関しては、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１４６８〜１４７４（１９８８）を参照されたい。
【０１１５】
そのような動物に、測定されるグルコースクリアランス又は取込み能力に適した量の候補薬物を与えることによって（例えば吸入、消化、注射、埋込みなどによって）、その候補薬物がインスリン耐性障害を治療できるかどうかをスクリーニングする。グルコースクリアランス又は取込みの増加は、その薬物が糖尿病及びその他のインスリン耐性障害を治療できることを示す。
【０１１６】
Ｄｋｋ−５による遺伝子治療
Ｄｋｋ−５は、糖尿病を治療するための遺伝子療法に使用することができる。皮膚遺伝子治療やレトロウイルスベクター遺伝子治療などの様々な手法をとることにより、ヒトにおける還元脂肪細胞及びインスリン耐性ならびに先天性肥満症及び糖尿病の表現型を生成するレプチン欠損症を治療することができる（Ｌａｒｃｈｅｒ他、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１５：１５２９〜１５３８（２００１））。遺伝子療法によってインスリン感受性を回復させる別の方法は、Ｕｅｋｉ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０５：１４３７〜１４４５（２０００）に記載されているようなアデノウイウル媒介性の遺伝子療法を使用することである。別の方法は、Ｏｔａｅｇｕｉ他、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１１：１５４３〜１５５２（２０００）に記述されるように、Ｄｋｋ−５コード化ＤＮＡを発現する骨格筋を設計製作することによって、糖尿病性高血糖症を打ち消す遺伝子療法を使用することである。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために述べるものであり、当然ながら、本明細書に記述し特許請求の範囲に記載される本発明を特に限定するものと解釈すべきではない。そのような本発明の変形例は、現在知られており又は後に開発される全ての均等物の代替例も含めて当業者の範囲内であり、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内に包含されるものと考えるべきである。本明細書の全ての引例の開示を参照により援用する。
【実施例１】
【０１１８】
Ｄｋｋ−５の効果
材料と方法
Ｌ６細胞の培養
Ｌ６筋芽細胞を、ＭＥＭα（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に１０％ウシ胎児血清を加えたものからなる増殖培地で増殖させた。集密状態に達する前に、細胞をトリプシンで分散させ、新しい増殖培地に再び接種した。筋芽細胞の融合は、集密時にこの培地から分化培地に変えることによって誘発させた（２％のウシ胎児血清を加えたＭＥＭα）。この培地で細胞を３〜９日間増殖させ、２８時間よりも長い処理の場合は、この培地にＤｋｋ−５を添加した。２８時間よりも短い処理は、ＭＥＭαに０．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたもので行った。
【０１１９】
組換えＤｋｋ−５の発現
Ｄｋｋ−５のヒト相同体（ｈＤｋｋ−５）（本明細書の図２の配列番号５参照）を、Ｃ末端８Ｘ  Ｈｉｓタグ融合としてバキュロウイルス感染昆虫細胞で発現させ、ニッケルアフィニティカラムクロマトグラフィにより精製した（ＷＯ  ０１／４０４６５及びＷＯ  ０１／１６３１９）。精製したタンパク質の同一性を、Ｎ末端配列分析によって確認した。精製したタンパク質は、内毒素レベルが０．３ＥＵ／ｍｌ未満であった。
【０１２０】
ＤＯＧ取込み
対照細胞とＤｋｋ−５で処理した細胞を、０．５μＭのインスリンが存在し又は存在しない状態で、３７℃で２０分間、０．５μＣｉの２−デオキシ［１４Ｃ］グルコースを含有するＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒリン酸ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＫＲＨＢ）（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）でインキュベートした。細胞をＫＲＨＢで２回洗浄し、１００ｍＭ  ＮａＯＨに溶解し、細胞溶解産物中の細胞内２−デオキシ［１４Ｃ］グルコースの量を液体シンシレーション（ＬＳＣ）によって測定した。
【０１２１】
グリコーゲンの合成
グリコーゲンの合成は、グリコーゲンへの［１４Ｃ］グルコースの取込みとして決定した。対照Ｌ６細胞とＤｋｋ−５で処理した細胞を、０．５μＭのインスリンと共に又はそのようなインスリンなしで、［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（５ｍＭグルコース；１．２５μＣｉ／ｍｌ）を含有し血清を含まないＭＥＭαで２時間インキュベートした。この実験を終了させるため、培地を除去し、氷冷したＰＢＳで細胞を素早く３回洗浄し、その細胞を２０％（ｗ／ｖ）ＫＯＨで溶解し、そこに１Ｍ  ＨＣｌを添加することによって１時間後に中和させた。溶解産物を５分間沸騰させ、遠心分離によって透明にし、担体として１ｍｇ／ｍｌの低温グリコーゲンを使用して、上澄み中の細胞グリコーゲンを０℃のイソプロパノールで２時間かけて沈澱させた。沈澱したグリコーゲンを遠心分離によって分離し、７０％エタノールで洗浄し、水に再度溶解し、グリコーゲンへの［１４Ｃ］グルコースの取込みをＬＳＣによって決定した。
【０１２２】
脂質へのグルコースの取込み
対照及び処理済みの３Ｔ３  Ｌ１脂肪細胞を、０．５μＭのインスリンが存在し又は存在しない状態で、Ｄ−［Ｕ−１４Ｃ］グルコース（０．２μＣｉ／ｍｌ）と共に、血清を含まないＭＥＭαで３７℃で２時間インキュベートした。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１００ｍＭ  ＮａＯＨに溶解した。溶解産物を、１００ｍＭ塩酸で中和した。溶解産物中の細胞脂質をｎ−ヘプタンに抽出し、抽出された脂質への［１４Ｃ］グルコースの取込みを、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）によって測定した。
【０１２３】
実時間定量ＰＣＲ
Ｇｉｂｓｏｎ他、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、６：９９５〜１００１（１９９６）及びＨｅｉｄ他、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、６：９８６〜９９４（１９９６）に記載されているように、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（商標）配列決定システムの機器及びソフトウェア（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、ＲＴＱ−ＰＣＲを実施した。
【０１２４】
分析
他に特に指定しない限り、全てのデータは、平均±標準偏差として表す。対照細胞と処理した細胞との比較、トランスジェニックマウスと野生型マウスとの比較は、対応のないステューデントｔ検定を使用して行った。
【０１２５】
３Ｔ３／Ｌ１脂肪細胞の培養
３Ｔ３／Ｌ１線維芽細胞を集密状態になるまで増殖させ、脂肪細胞に分化させた（Ｒｕｂｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３：７５７０〜７５７８（１９７８））。分化の誘発から７２間後に、分化した細胞をＤｋｋ−５で処理した。
【０１２６】
動物
全てのプロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認される。他に特に指定しない限り、マウスは、温度及び湿度が制御された環境において、標準的な実験室の食餌で維持される。１２時間（６．００ｐｍ／６．００ａｍ）の光サイクルを使用する。
【０１２７】
トランスジェニックマウス
ヒトｄｋｋ−５  ｃＤＮＡは、ミオシンＬ鎖プロモーターによって始まるｐＲＫスプライス供与体／レセプター部位の３’側にライゲートさせた（Ｓｈａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３〜６（１９８５））。ｄｋｋ−５  ｃＤＮＡの後には、ヒト成長ホルモン遺伝子の第４のエキソンと第５のエキソンとの間に存在するスプライス供与体／レセプター部位が続いた（Ｓｔｅｗａｒｔ他、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３０：４０５〜４１４（１９９２））。発現断片全体を精製してベクター配列の汚染の無い状態にし、ＦＶＢ  Ｘ  ＦＶＢの交配から得られた一細胞マウス卵に注入した。尾部生検から抽出されたＤＮＡのＰＣＲ分析によって、トランスジェニックマウスを確認した。
【０１２８】
結果
Ｄｋｋ−５は、タンパク質のｄｉｃｋｋｏｐｆファミリーに非常に関連付けられた分泌タンパク質である。図１及び２を参照されたい。放射線ハイブリッドマッピングを使用して、本発明者等は、Ｄｋｋ−５の遺伝子を、ＤＩＳ４３４（３２．２ｃＭ）とＤＩＳ２８４３（４８．８ｃＭ）との間の染色体１に局在化させた。この位置は、公表されている配列データベースのＢＬＡＳＴ分析によって決定されるように、他の配列決定作業から得たデータによって確認される（下記参照）。
ＨＳ３３０Ｏ１２  ホモサピエンス  染色体１  クローン  ＲＰ３−３３０Ｏ１２マップ  ｐ．３６．１１〜３６．２３
＊＊＊進行中の配列決定（ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＩＮ  ＰＲＯＧＲＥＳＳ）＊＊＊、オーダーされた種において、１１９９６９ｂｐ
ＤＮＡ、ＨＴＧ  ２８−ＪＵN−２００１
ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＬ０３１７３１
ＶＥＲＳＩＯＮ  ＡＬ０３１７３１．３６  ＧＩ：１４５７５５２６
ＳＯＵＲＣＥ  ヒト
ＯＲＧＡＮＩＳＭ  ホモサピエンス
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ  １（塩基１〜１１９９６９）
ＡＵＴＨＯＲＳ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．
ＴＩＴＬＥ  直接提出
ＪＯＵＲＮＡＬ  提出（２００１年６月２６日）Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｈｉｎｘｔｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、ＣＢ１０１ＳＡ、ＵＫ
ＣＯＭＭＥＮＴ  ２００１年６月２８日、この配列バージョンをｇｉ：１４４２２２０１に代えた。
【０１２９】
Ｄｋｋ−５は、図３に示すように、成人組織で広く発現することがわかった。これは、上述の実時間定量ＰＣＲによって決定した。
【０１３０】
Ｄｋｋ−５は、マウス胚の発生中に差次的に発現した。マウス胚の実時間定量ＲＴ−ＰＣＲ分析によれば、Ｄｋｋ−５の発現は１０日ｐ．ｃ．で始まって１６日ｐ．ｃ．まで続き、そのピークが１２日ｐ．ｃ．になることが明らかにされた。図４を参照されたい。全胚のＩｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析では、この発現が中脳−菱脳接合部でかつ屋根板に沿って生じ、すなわち中胚葉の特定化に重要な領域で生じることが示された。図５を参照されたい。
【０１３１】
これらの結果は、Ｌ６筋細胞の分化中にＤｋｋ−５の発現が調節されたことを示す。実時間定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定した転写レベルは、分化後３日で増加し始め、分化後７日で低下し始めた。図６を参照されたい。この図は、第１日目から第８日目までのＬ６細胞分化中の、Ｄｋｋ−５の相対的発現レベルを示している。この発現パターンは、Ｌ６細胞がＤｋｋ−５に応答する時間に対応し、またＬ６細胞へのＤｋｋ−５結合が検出可能な時間にも対応する。
【０１３２】
バキュロウイルス感染昆虫細胞で発現する場合、完全長Ｄｋｋ−５タンパク質の内部が切断され、それによってサイズが１６ｋＤａ〜２０ｋＤａにわたる３つの切断生成物が得られた。図７に示すゲルでは、バンド「ｂ」が完全長タンパク質に対応する。シグナル配列を含む完全長タンパク質のＮ末端配列は、ＭＡＧＰＡＩＨＴＡＰＭＬ（配列番号６）である。成熟タンパク質はＧＡＬＡＰＧＴＰ（配列番号７）で始まり、したがってシグナルペプチド切断部位は、配列番号５の位置２４のアラニンと位置２５のグリシンの間にある。「ａ」として分類されたバンドは内部切断型タンパク質に対応し、全てはＮ末端配列ＭＡＬＦＤＷＴＤＹＥＤＬＫ（配列番号８）を有する。タンパク質はダイマーを形成し（図７のバンドｃ、レーン１）、これが還元条件下でモノマー形態に変換される。１６ｋＤａ切断型タンパク質は、ＭＯＮＯ−Ｑ（商標）ブランドのカラムを使用して陰イオン交換クロマトグラフィによって組換え生成された完全長Ｄｋｋ−５の調剤からその大部分を精製した後は（約９０％の純度）、筋細胞での基礎的なグルコース取込み及びインスリン刺激を受けたグルコース取込みが高まった。以下の実験で示されるＤｋｋ−５は、完全長タンパク質と内部切断型タンパク質との混合物であって、切断型タンパク質を約５％含有するものとして特徴付けられる調剤であった。
【０１３３】
切断型タンパク質断片は、イオン交換クロマトグラフィに限定することなく、任意の従来からのタンパク質化学技法を用いて、完全長組換えタンパク質及び任意のその他の望ましくないタンパク質から精製することができる。さらに、限られたタンパク質分解で、大量の完全長Ｄｋｋ−５タンパク質を発現することができ、それによってほとんどが切断された物質が得られる。分子内のＡｒｇ−Ａｒｇ部位も切断され、その結果得られた所望の切断生成物は、サイズ排除技法又は当業者に周知のその他の従来のタンパク質精製技法によって精製した。
【０１３４】
Ｌ６筋細胞をＤｋｋ−５で処理することにより、グルコース（２−ＤＯＧ）の取込みが増加した。図８を参照されたい。Ｄｋｋ−５の影響は、４８時間以内に見ることができ（図８Ａ）、これは細胞の分化状態に左右される。インスリン依存性のグルコース取込みの増加に対するＤｋｋ−５による処理の影響は、９６時間でさらに著しくなるが（ｐ＝０．００１）（図８Ｂ）、その影響は４８時間でも見られる（ｐ＝０．０５）。
【０１３５】
Ｌ６筋細胞をＤｋｋ−５で処理した結果、グリコーゲンへのグルコースの取込みが増加した。図９を参照されたい。図９Ａに示すように、Ｄｋｋ−５の影響は４８時間で見ることができ（ｐ＝０．００３）、またいかなる理論にも拘泥するものではないが、この作用は、いずれもＷｎｔ及びインスリンシグナル伝達経路での中間体であるＡｋｔ及び／又はＧＳＫ−３βの活性の調節によって媒介される可能性がある。
【０１３６】
Ｄｋｋ−５は、Ｌ６細胞の筋形成に影響を与えた。Ｄｋｋ−５の影響は、長期にわたる処理の後に観察されたので、いかなる理論にも拘泥するものではないが、タンパク質は、Ｌ６細胞の分化に影響を及ぼすことによって作用することが可能である。ＴＡＱＭＡＮ（商標）ＰＣＲを使用したＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して、Ｄｋｋ−５で処理したＬ６細胞中のミオシンＨ鎖（ＭＨＣ）やミオシンＬ鎖（ＭＬＣ）、ミオゲニン、Ｐａｘ３、Ｍｙｆ５、ＭｙｏＤなどの筋形成に関与した遺伝子の発現レベルを決定した。図１０Ａ〜Ｇは、Ｄｋｋ−５による処理の結果、分化してから第４日目と第６日目の間でミオゲニン及びＭｙｏＤの発現が変化し、ＭＬＣ２、Ｍｙｆ５、及びＰａｘ３に関しては分化してから第２日目と第４日目の間で変化したことを示す。
【０１３７】
Ｄｋｋ−５は、筋細胞のインスリンシグナル伝達経路での遺伝子の発現を調節した。ＲＴ−ＰＣＲ分析（ＴＡＱＭＡＮ（商標））を実施して、グルコース代謝に関与する遺伝子の発現レベルにＤｋｋ−５が影響を及ぼすかどうかを決定した。図１１に示すように、Ｄｋｋ−５による処理では、９６時間後にＡｋｔ（２倍）、グリコーゲン合成酵素（４倍）、及びＩＲＳ−１（２倍）の発現が増加し、ＩＲＳ−２（４８時間の処理後、０．２倍）及びＧｌｕｔ−１及びＰＤＫ−１（９６時間後）の発現が低下した。
【０１３８】
Ｄｋｋ−５に対するポリクローナル抗体及びＨｉｓ８エピトープタグに対するモノクローナル抗体と共にＦＡＣＳ分析を行うことによって、分化して第２日目から第５日目までにＤｋｋ−５がＬ６細胞に結合すること、しかしこの結合は第６日目までに減少し／失われることが実証された。Ｌ６へのＤｋｋ−５の結合は、タンパク質の変性によって破壊される可能性があり、過剰なＦｃ−タグＤｋｋ−５を使用することによって競合する可能性があり、過剰な無関係のＨｉｓタグタンパク質の影響を受けないが、これは特異的な相互作用であることを示している。図１２を参照されたい。したがってＤｋｋ−５は、筋細胞の表面に、特異的なレセプターを有する。いかなる理論にも拘泥するものではないが、関係するタンパク質Ｄｋｋ−１はＬＲＰ６に結合し、Ｄｋｋ−５もこのレセプターを通して作用する可能性があると考えられる。本発明者等によれば、これらのレセプターは、Ｌ６細胞の表面に発現することがわかり、またその他の者によれば、これらのレセプターは、マウス及びヒトの正常な筋肉で発現することがわかった（Ｈｅｙ他、Ｇｅｎｅ、２１６：１０３〜１１１（１９９８）；Ｂｒｏｗｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２４８：８７９〜８８８（１９９８））。
【０１３９】
Ｄｋｋ−５による処理では、脂肪細胞での基礎的なグルコース取込み及びインスリン刺激を受けたグルコース取込みが低下した。具体的には、Ｄｋｋ−５で処理した３Ｔ３  Ｌ１細胞は、基礎的な、またインスリン刺激を受けたグルコース取込みのレベルが増加したことを示し（図１３Ａ及び１３Ｂ）、それと共に、イスリン刺激によって脂質へのグルコースの取込みが増加したことを示した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。４８時間の処理で見られるインスリン依存性のグルコース取込みの増加は、９６時間の処理の後でより著しいものであり、これと同様の状態が、インスリン依存性の脂質へのグルコースの取込みでも観察された。
【０１４０】
生体内でのＤｋｋ−５の影響は、筋肉に特異的なプロモーターの制御下でＤｋｋ−５  ｃＤＮＡを発現するトランスジェニックマウスのグルコース代謝を分析することによって決定した（前掲のＳｈａｎｉ）。予備的な結果によれば、これらの特定のトランスジェニック動物は、グルコース代謝に全く変化がないことが示された。いかなる理論にも拘泥するものではないが、この結果は、これらの動物におけるタンパク質の発現が少なく、タンパク質の切断が不適正であり又は不十分であり、あるいは筋細胞から隣の細胞へのタンパク質の分泌が不十分であることに起因すると考えられ、それによって、グルコース代謝に対する目に見える効果が全くないことが説明される。異なるプロモーター又はその他の発現系、例えばｄｋｋ−５  ＤＮＡの両端にある異なるスプライス供与体／レセプター部位を使用することによって、より高次の発現に至ることが予測される。さらに、適正なスタートコドン及び当業者に明らかな発現構成体中のその他の要素を使用した、１６−ｋＤａ内部切断生成物などのＤｋｋ−５の活性切断生成物のみコードするｃＤＮＡの発現は、これらのトランスジェニック動物におけるグルコース代謝に及ぼすその影響の決定を可能にする。
【０１４１】
概要及び考察
Ｄｋｋ−５は、筋細胞及び脂肪細胞でのグルコース取込みに明らかな作用があった。Ｄｋｋ−５で処理した筋細胞は、インスリンによる処理に対してより感受性があった。筋細胞では、Ｄｋｋ−５による処理で、グリコーゲンへのグルコースの取込みのわずかな増加を刺激したが、これは、いかなる理論にも拘泥するものではないが、グリコーゲン合成酵素の発現レベルに対するその作用に起因すると考えられる。Ｄｋｋ−５は、インスリンシグナル伝達経路でのタンパク質の発現レベルに影響を及ぼすことによって、筋肉内のグルコース代謝にその効果を発揮する可能性がある。さらに、Ｄｋｋ−５は、インスリンシグナル伝達経路でのタンパク質の活性にも影響を及ぼし、かつ／又はＬ６細胞でのインスリン誘導性グルコース輸送体（ＧＬＵＴ−４）のトランスロケーションを調節する傾向もある。
【０１４２】
脂肪細胞では、Ｄｋｋ−５の処理によって、９６時間後に、基礎的なグルコース取込みとインスリン刺激を受けたグルコース取込みが増加し、かつ脂質へのグルコースの取込みが増加した。グルコースの取込み及び脂肪細胞内での脂質の蓄積は、細胞の分化状態に左右され、脂肪細胞の分化は、Ｗｎｔシグナル伝達によって調節される。活性Ｄｋｋ−５過発現マウスは、グルコース負荷が高まることが予測される。
【０１４３】
結論
Ｄｋｋ−５は、Ｌ６筋細胞でのグルコース代謝に影響を及ぼし、上述のものと同様の発現系を使用して筋肉内にタンパク質を過発現するトランスジェニックマウスで同じ働きをすることが予測される。完全長及びその１６ｋＤａ部分の両方又は注入された１６ｋＤａ部分のみ含有する図７のゲルで述べた注入型の組換えＤｋｋ−５タンパク質調剤を使用することも、哺乳類のインスリン耐性の治療に役立つことが予測される。Ｄｋｋ−５（完全長及び内部切断型の１６ｋＤａ生成物）で筋細胞を処理した結果、基礎的なグルコース取込みとインスリン刺激を受けたグルコース取込みが増加した。この作用は長期にわたる処理で観察され、Ｄｋｋ−５は、いかなる理論にも拘泥するものではないが、筋肉分化とインスリンシグナル伝達経路でのタンパク質の活性ならびに発現レベルの両方に影響を及ぼすことを示している。上記観察は、Ｄｋｋ−５がインスリン感受性を誘導することを実証している。インスリン耐性は、ほとんどの形態のＮＩＤＤＭの重要な特徴である。したがってＤｋｋ−５はインスリン耐性障害の治療に有用と考えられ、またＤｋｋ−５は、そのような状態のアッセイにおける診断マーカーとして有用である。またＤｋｋ−５は、例えば米国特許第６，１８７，９９１号に開示されるようにトランスジェニック動物モデルでの糖尿病表現型の進行を阻害することも予測され、またインスリン耐性障害を治療する新しい薬物を特定し、かつ前掲のＬａｒｃｈｅｒ他、前掲のＵｅｋｉ他、及び前掲のＯｔａｅｇｕｉ他で述べられている技法を使用した遺伝子療法にも有用であることが予測される。
【実施例２】
【０１４４】
抗Ｄｋｋ−５モノクローナル抗体の開発
バキュロウイルス感染昆虫細胞で発現させた、精製済みの組換えポリヒスチジンタグ付き（ＨＩＳ８）のヒトＤｋｋ−５を、ＲＩＢＩ（商標）アジュバント（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＯ）で希釈したものを用いて、５匹のメスのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を高度免疫化した。これらの動物を、１週間当たり２回免疫化したが、各動物に対して５０μｌを使用し、足しょを介して投与した。５回注射した後、抗Ｄｋｋ−５抗体の力価が高いことが示される５匹のマウスのリンパ節からのＢ細胞を、前掲のＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎとＨｏｎｇｏ他、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１４：２５３〜２６０（１９９５）に記載されているプロトコルを使用して、マウス骨髄腫細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション、マナッサス、 バージニア）と融合させた。１０〜１４日後、上澄みを回収し、直接ＥＬＩＳＡによって抗体産生に関してスクリーニングした。限界希釈によるサブクローニングの２回目が終了した後に最高の免疫結合を示す７つの陽性クローンを、ＰＲＩＳＴＡＮＥ（商標）でプライム処理したマウス（Ｆｒｅｕｎｄ及びＢｌａｉｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２９：２８２６〜２８３０（１９８２））に注射して、モノクローナル抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ生成に供した。前掲のＨｏｎｇｏ他により記述されるように、腹水を貯めて、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ（商標）高速プロテイン液体クロマトグラフィ［ＦＰＬＣ］；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）により精製した。精製した抗体調剤を滅菌ろ過し（０．２μｍ孔径；Ｎａｌｇｅｎｅ、ロチェスター、 ニューヨーク）、リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）中４℃で保存した。
【０１４５】
以下に述べる寄託済みのハイブリドーマから調製されたこれらの抗体は、上述の技法を使用して、本明細書で述べる診断方法に使用することができる。
【０１４６】
物質の寄託
以下の物質を、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、マナッサス、 バージニア  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した。
2005506342.tif 000003
【０１４７】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定及びその規則の下に行った。これにより、寄託日から３０年間にわたり、寄託された生存可能な培養物の維持が確実になる。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下、ＡＴＣＣによって利用可能になり、またＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間で合意が得られ、その結果、直接関係のある米国特許が発行されあるいは任意の米国特許出願又は外国特許出願が公開されることにより、そのどちらが最初になされようと、寄託された培養物の子孫を永久にかつ制約なく公に利用することが確実になり、さらに、米国特許商標庁長官によって、３５ＵＳＣセクション１２２及びそれに関系する特許商標庁長官の規則に従い資格があると決定されたものの子孫を利用できることが可能になる（８８６  ＯＧ ６３８に関する３７ＣＦＲ １．１４章）。
【０１４８】
本願の譲受人は、適切な条件下で培養したときに寄託物質の培養物が死に又は失われ又は破壊された場合、通知があり次第その物質を直ちに別の同等物に代えることに同意している。寄託された物質が利用可能であることは、その特許法に従って任意の政府当局により付与された権利に違反して本発明を実施できるものと解釈すべきではない。
【０１４９】
これまで記述してきた明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。寄託された実施形態は、本発明のある特定の態様を単に例示するものであり、機能的に均等な任意の構成体は本発明の範囲内にあるので、本発明は、寄託された構成体によってその範囲を限定するものではない。本明細書の寄託物質は、本明細書に含まれる記載された事項が、本発明の最良の形態を含めた本発明の任意の態様を実施するのに不適切であると認めるものではなく、特許請求の範囲をそれが表す特定の例示に限定するものであると解釈されるものではない。実際に、本明細書に図示され記述されるものの他、本発明の様々な変形例が、前述の記述から当業者に明らかにされ、かつ添付の特許請求の範囲に包含される。
【０１５０】
本発明の原理、好ましい実施形態、及び操作形態は、前述の明細書で述べてきた。しかし本明細書で保護されるべき本発明は、限定的なものではなく例示的なものとみなされるので、開示される特定の形態に限定されると解釈すべきではない。当業者なら、本発明の精神から逸脱することなく、変形及び変更を加えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】ヒトＤｋｋファミリーのタンパク質（ｈＤｋｋ−１、ｈＤｋｋ−２、ｈＤｋｋ−４、ｈＤｋｋ−３、及びｈＤｋｋ−５）の概略的な構造を開示する図である。
【図２】ヒトＤｋｋファミリーのタンパク質、Ｄｋｋ−１（配列番号１）、Ｄｋｋ−２（配列番号２）、Ｄｋｋ−３（配列番号３）、Ｄｋｋ−４（配列番号４）、及びＤｋｋ−５（配列番号５）の配列アライメントを示す図である。四角で囲んだ領域は、システインに富むドメインを示し、逆三角形は、このファミリーのタンパク質に関する内部切断部位の位置を示す。
【図３】様々な成人組織でのＤｋｋ−５の相対発現レベルを示す図である。
【図４】マウス胚でのＤｋｋ−５発現の相対レベルを示す図である。
【図５】異なる発生日での全マウス胚のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析を示す図であり、図５Ａは８．５〜９日目ｐ．ｃ．、図５Ｂは１０日目ｐ．ｃ．、図５Ｃは１０日目（クローズアップ）ｐ．ｃ．、図５Ｄは１１日目ｐ．ｃ．、及び図５Ｅは１２．５日目（頭部）である。
【図６】第１日目から第８日目までのＬ６細胞分化中の、Ｄｋｋ−５の相対発現レベルを示す図である。
【図７】バキュロウイルスで発現したｈＤｋｋ−５のＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシーブルー染色ゲル及びそのクリッピングを示す図であり、レーン１は非還元条件を、レーン２は還元条件の場合を示す。
【図８】４８時間処理（図８Ａ）と９６時間処理（図８Ｂ）を行った場合について、Ｌ６筋細胞における基礎的な、またインスリン刺激を受けたグルコース取込みに対し、Ｄｋｋ−５が及ぼす影響を示す図である。低い棒グラフはインスリンを使用していない状態を示し、高い棒グラフは３０ｎＭのインスリンを使用した状態を示す。
【図９】４８時間処理（図９Ａ）と９６時間処理（図９Ｂ）を行った場合について、Ｌ６筋細胞中のグリコーゲンへの基礎的な、またインスリン刺激を受けたグルコースの取込みを示す図である。低い棒グラフはインスリンを使用しない状態を示し、高い棒グラフは３０ｎＭのインスリンを使用した状態を示す。
【図１０】Ｌ６筋細胞中の筋形成に関与する種々の遺伝子の発現レベルにＤｋｋ−５が及ぼす影響を示す図である。図１０Ａは、ミオシンＬ鎖（ＭＬＣ−２）発現に及ぼす影響を示し；図１０ＢはＭｙｆ５発現に及ぼす影響を示し；図１０Ｃはミオゲニン発現に及ぼす影響を示し；図１０ＤはＰａｘ３発現に及ぼす影響を示し；図１０ＥはＭＬＣ１／３発現に及ぼす影響を示し；図１０ＦはＭｙｏＤ発現に及ぼす影響を示し；図１０ＧはミオシンＨ鎖（ＨＣ）発現に及ぼす影響を示す。ダイヤ形は未処理の細胞を表し、三角形はＤｋｋ−５で処理した細胞を表す。
【図１１】インスリンシグナル伝達経路に関与（グルコース代謝に関与）する遺伝子の発現にＤｋｋ−５が及ぼす影響を示す。それぞれ対になっている棒グラフのうち左側は第５日目のＤｋｋ５であり、それぞれ対になっている棒グラフの右側は第７日目のＤｋｋ−５である。
【図１２】Ｄｋｋ−５のＬ６細胞への結合に関するＦＡＣＳ分析と、何がその結合を破壊することができるかを示す。
【図１３】４８時間処理（図１３Ａ）と９６時間処理（図１３Ｂ）を行った場合の、脂肪細胞における基礎的な、またインスリン刺激を受けたグルコース取込みに対してＤｋｋ−５が及ぼす影響を示す図である。低い棒グラフはインスリンを使用しない状態を表し、高い棒グラフは３０ｎＭのインスリンを使用した状態を表す。
【図１４】４８時間処理（図１４Ａ）と９６時間処理（図１４Ｂ）を行った場合の、脂肪細胞中の脂質への基礎的な、またインスリン刺激を受けたグルコースの取込みに対し、Ｄｋｋ−５が及ぼす影響を示す図である。低い棒グラフはインスリンを使用しない状態を表し、高い棒グラフは３０ｎＭのインスリンを使用した状態を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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