(57)【要約】本発明は、バイオチップの製造のためにＤＮＡ又はタンパク質といった生物学的ポリマーをイオン性共有結合により固体支持体上に固定させるための方法、及び前記方法によって得られた結果物であるチップに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有す平面の固体支持体、並びにポリマーの遊離ホスフェート基及び当該金属との間のイオン性共有結合（ionocovalent bonding）により当該表面上で固定された当該遊離ホスフェート基ＯＰ(Ｏ)(ＯＨ)2を担持する少なくとも１のバイオポリマーを含んで成るバイオチップタイプの製品。
【請求項２】
前記バイオポリマーが５’位をリン酸化された核酸である請求項１に記載の製品。
【請求項３】
前記バイオポリマーが３’位をリン酸化された核酸である請求項１に記載の製品。
【請求項４】
前記核酸が前記核酸自体及びホスフェート基との間にポリグアニン（ポリＧ）スペーサー基を有することを特徴とする請求項２又は３のいずれかに記載の製品。
【請求項５】
前記バイオポリマーがリン酸化されたタンパク質である請求項１に記載の製品。
【請求項６】
前記バイオポリマーがリン酸化されたオリゴ糖又は多糖である請求項１に記載の製品。
【請求項７】
前記金属が、スペーサー分子を通じて前記支持体の表面へ結合する請求項１から６のいずれか１項に記載の製品。
【請求項８】
前記スペーサー分子が、イオン性共有結合により前記金属が結合するホスホネート基を担持する脂肪酸の鎖を含んで成る請求項７に記載の製品。
【請求項９】
前記金属がジルコニウムである請求項１から８のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１０】
前記スペーサー分子が、オクタデシルホスホン酸であり、且つ前記金属がジルコニウムである請求項８に記載の製品。
【請求項１１】
前記支持体がガラスである請求項１から１０のいずれか１項に記載の製品。
【請求項１２】
ジルコニウムオクタデシルホスホネートの単一層で覆われた表面を有すガラスシート、並びに核酸のホスフェート基及び前記ジルコニウム間のイオン性共有結合により前記表面上に固定された５’位にホスフェート基を担持する少なくとも１の核酸、を含んで成る請求項１に記載の製品。
【請求項１３】
ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有す固体支持体上での遊離ホスフェート基を担持する少なくとも１のバイオポリマーの固定化を含んで成り、ここで前記バイオポリマーは当該ポリマーの遊離ホスフェート基及び前記金属の間のイオン性共有結合により前記表面に固定化される、請求項１から１２のいずれか１項に記載のバイオチップタイプ製品の製造方法。
【請求項１４】
ホスフェート基を担持する前記バイオポリマーを得るステップも含んで成る請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、酵素的に５’位をリン酸化した核酸である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
以下の要素：
−ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有する固体支持体；
−ホスフェート基を担持する少なくとも１のバイオポリマー；
−任意に試薬、
を含んで成る請求項１から１２のいずれか１項に記載のバイオチップタイプ製品の調整のためのキット。
【請求項１７】
前記固定されたバイオポリマーに結合することができる化合物のスクリーニングを目的とする請求項１から１２のいずれか１項に記載のバイオチップタイプ製品の使用。
【請求項１８】
in vitroでの診断具としての請求項１から１２のいずれか１項に記載のバイオチップタイプ製品の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオチップの製造のためにＤＮＡ、タンパク質、又はオリゴ糖もしくは多糖を固体支持体上に固定させる方法、及び本方法により得られたチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日では、ＤＮＡチップの製造のために様々な方法が用いられている。第一の方法によると、オリゴヌクレオチドは前駆物質の共有結合的固定化後、支持体上で直接合成され（Affymetrix system,Niemeyer and Blohm Angew;Chem.Int.Ed.1999,38,2865-2869）、高価なチップとなる。更に、供給業者は固定されたオリゴヌクレオチドの全ての配列の詳細は供給しない。
【０００３】
第二のアプローチによると、オリゴヌクレオチドは前もって合成され、ビオチン化され、そしてその後、プレート上に沈着され、ストレプトアビジン層により活性化される。カップリングは、特異的な非共有結合的なビオチン−ストレプトアビジンとの相互作用（タンパク質であるストレプトアビジンは並の安定性しか有さないという欠点がある）によって達成される。チップがｃＤＮＡフラグメントにより構成されている場合、これらのフラグメントは一般にアミノシラン又はポリリシンの層上に吸着することによって固定される。最後に述べたストラテジーは、しばしばポリリシンフィルムの品質制御の難しさに関連した反復可能性、及び表面上の均質性、並びにそのための安定性の問題を強いる。
【０００４】
第三の方法によると、有機化学結合によって、オリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡが共有結合的カップリングによって支持体へ固定される。これは（ａ）反応性末端（例えば活性化されたカルボン酸基）を有す鎖による表面の官能化（ｂ）上記末端と反応できる官能基（例えば第一アミン）によるオリゴヌクレオチド、又はｃＤＮＡの５’位での修飾を要求する。これらは“契約により提供される”製品であり、比較的高価であり、適宜修飾されたオリゴヌクレオチドの購入を必要とする。これらのアプローチは特許出願WO01/42 495に詳細に記載されている。 
【０００５】
ＤＮＡチップ技術は、Wang,Nucleic Acids Res.,2000,28(16):3011-3016の論文中でも検討されている。
【０００６】
同時に、チップはＤＮＡ以外のバイオポリマー、例えば、固定化タンパク質又はペプチド、が開発された。
【０００７】
当該技術は、ＤＮＡチップ技術（例えば、Affymaxの出願WO 93/22 680を参照）を応用することを主として開発された。
【０００８】
共有結合によりタンパク質を固定する方法は、例えば、MacBeath及びSchreiber, Science,2000,289:1760-1763, Mitchell, Nature Biotechnology,2002,20,225-229 及び<<Protein microarray technology>>, Trends in Biotechnology,2002,20(4),160-166に報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の著者等は、現存する技術をもしのぐ新規のバイオチップタイプ製品の製造方法をここに開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本方法は、一般にＤＮＡ、タンパク質、オリゴ糖又は多糖といった公知配列を有し、及び遊離ホスフェート基（ＯＰ(Ｏ)(ＯＨ)2）の担体であるバイオポリマーを、ホスフェート基との配位結合を可能とする金属で覆った表面を有する固体支持体（好適には表面上に金属ホスホネート層を有する固体支持体といった)へ固定化する方法に関する。固定化官能基としての働きをするホスフェート基は、ポリマー中に自然に存在することができ、酵素的又は化学的な修飾により導入することができる。
【００１１】
固定化は、ポリマーの遊離ホスフェート基及び金属の間のイオン性共有結合（ionocovalent bonding）により達成される。
【００１２】
イオン性共有結合タイプの本固定化方法は、水素結合タイプ又は静電気タイプ（例えばポリリシンの場合のような）の相互作用へともたらされるシステムよりも強力である。
【００１３】
従って、本発明はバイオチップタイプの製品を製造する方法に関するものであって、ホスフェート基との配位結合を可能とする金属で覆われた表面を有す固体支持体上に遊離ホスフェート基を担持する少なくとも１のバイオポリマーの固定化を含んで成る。“金属で覆われた表面を有す固体支持体”とは、一般に金属を表面上に有す支持体を意味し、金属は金属単一層のフォームで存在することが好ましい。好適には当該支持体は、金属ホスホネート層で覆われた固体支持体である。本発明の方法によれば、バイオポリマーはポリマーの遊離ホスフェート基と支持体表面に近づくことができる金属の間のイオン性共有結合により支持体の表面に固定される。
【００１４】
本発明は、その方法により得られる製品にも関する。すなわち、バイオチップタイプの製品は、ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有す平面の固体支持体、及びイオン性共有結合により前記表面上で固定されるホスフェート基を担持する少なくとも１のバイオポリマーを含んで成る。
【００１５】
上記の通り製品の調整キットも発明の一部を構成する。本キットは以下の構成要素：
−ホスフェート基と配位結合できる金属で覆われた表面を有する固体支持体；
−遊離ホスフェート基を担持する少なくとも１のバイオポリマー；
−任意に試薬、
を含んで成る。ホスホン酸の溶液は、例えば、仮に標的でない領域上の配位サイトを飽和することが所望される場合に有用である。ホスホン酸（例：Ｃ4Ｈ9ＰＯ3Ｈ2）１ｍＭ溶液は特に有用だろう。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液も都合よく用いられる（典型的にＢＳＡ溶液の１質量％，3.5Ｘ ＳＳＣ中の３％ＳＤＳ）。
【００１６】
本発明は上記の通りに固定されたバイオポリマーへ結合できる化合物をスクリーニングする目的のため、又はin vitroでの診断具としてのバイオチップタイプの製品の使用にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
バイオポリマーの調整
“バイオポリマー”とは、一般的に公知の配列に従って互いに接続された単量体ユニットを基礎とし、且つ生物学的活性を有し、又は生物学的活性を有する化合物と反応する化合物を意味する。
【００１８】
特にＲＮＡ又はＤＮＡ（特にｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド）といった核酸；ペプチド、タンパク質、オリゴ糖又は多糖が挙げられ得る。天然には存在しない合成単量体は、バイオポリマーを構築するために任意に用いることができる。この観点から、例えば、カルバメート、ホスホネート、スルホンアミド、及びスルホキシドを使用することができる。
【００１９】
ＰＮＡｓ（ペプチド核酸）及びアプタマーもバイオポリマーの他の例として挙げられ得る。
【００２０】
一般にコンビナトリアル技術によって形成され得るオリゴヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、又はペプチドを固定化することは可能であり、それは検出に関する分子ついての認識領域を備える。
【００２１】
ホスフェート基とポリマー体との間にスペーサー基を有すバイオポリマーを都合よく調整すること、又は得ることが可能である。ポリマーが核酸である場合、特にポリＡ、ポリＣ、ポリＴ、又はポリＧタイプのスペーサーを用いることが可能であり（一般的におよそ１０量体であり、例えば７から９量体である）、合成装置によるそれらの挿入は容易である。好適にはポリマーがＤＮＡといった核酸である場合、スペーサー基は、ポリグアニン ポリＧモチーフである（すなわちグアニンユニットの一連、及び好適には７から９のグアニンユニットの一連）。
【００２２】
好適には、バイオポリマーは、５’位をリン酸化（すなわちホスフェート基ＯＰ(Ｏ)(ＯＨ) 2を担持する）した核酸、都合よくはＤＮＡであり、好適にはホスフェート基はポリグアニン基（ポリＧ）により核酸自体から分離される。
【００２３】
このリン酸化は、キナーゼタイプの酵素、例えばＡＴＰの存在下におけるＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４キナーゼは、慣習的にＰＣＲ反応において用いられる）によって容易に実行することができる。
【００２４】
バイオポリマーは３’位をリン酸化（すなわち、ＯＰ(Ｏ)(ＯＨ) 2基を担持する）した核酸、例えばＤＮＡであってもよく、ホスフェート基は、好適にはポリグアニン基（ポリＧ）により核酸自体から分離される。３’位のリン酸化は、ホスホラミジット（phosphoramidites）の化学に関連した標準技術により化学的に実行することができる。
【００２５】
好適には使用される核酸は、オリゴヌクレオチド用に２５から７０量体（ここでは塩基対をいう）、好適には４０から５０量体、及びｃＤＮＡ用に１００から２０００塩基対により構成される。
【００２６】
他の態様によれば、バイオポリマーは、ホスフェート基により官能化又は修飾されたタンパク質、オリゴ糖もしくは多糖、又はペプチドである。本修飾は既にリン酸化されたペプチド、タンパク質、及びオリゴ糖又は多糖の場合のような自然界において当然遊離ホスフェート基が存在するケースを除外し、化学的又は酵素的な方法により実行され得る。
【００２７】
支持体の調整
選定される平面の固体支持体は、本発明に従いチップタイプ製品の製造のために適した任意の材料で構成することができる。特にガラス、シリコーン、雲母、石英、もしくはプラスチックの支持体、又は様々な合成ポリマーに基づく支持体を使用することができる。当該支持体は薄金層で覆われたものも使用してよい。ガラス支持体は好適であり、例えばマイクロスコープスライド、及びより一般的には、任意のガラス、石英、もしくはシリコーンのプレート又はシートも使用することができる。支持体の形状は重要ではない。
【００２８】
本発明によれば、当該支持体は金属（一般的には陽イオン性）で覆われた表面を有す。当該金属はホスフェート基による配位結合が可能になるように選定する。ジルコニウムは特に適しているが、チタン、バナジウム、錫といった他の４価の金属；アルミニウム、鉄、クロム、ガリウムといった３価の金属；亜鉛、マンガン、銅、コバルト、ニッケルといった一連の２価の金属；モリブデン、ウラン、タングステンといった６価の金属の少数のケースも例として挙げられている。最近の金属ホスホネートの検討では、それらの可能性について手短に述べている（A.Clearfield in Progress in Inorganic Chemistry,Vol47, (Ed.:K.D.Karlin),John Wiley & Sons,Inc.,New York,1998,pp.371-510）。
【００２９】
好適には、当該金属は単一層（好ましくは前記金属ホスホネートの単一層）の形状にある支持体の表面上に沈着される。
【００３０】
従って当該金属は特にスペーサー分子又はアームを通じて支持体の表面へ結合させることができる。後者は、例えばイオン性共有結合によって金属が結合するホスホネート基を担持する脂肪酸の鎖（例えば、オクタデシルホスホン酸）であって良い。
【００３１】
本発明の詳細な態様によると、スペーサー分子はオクタデシルホスホン酸であり、金属はジルコニウムである。
【００３２】
ガラスシート上にジルコニウムホスホネートに基づくラングミュアーブロジェット(Langmuir-Blodgett)タイプのフィルムが載っているものが、都合よく使用され、当該シートはBenitez等J.Am.Chem.Soc.,2002,124:4363-4370に発表されたような工程で様々な水性溶液における液浸によって調整される。この場合フィルムは、疎水性−疎水性相互作用を経由してガラス支持体上に固定される。
【００３３】
当該工程では、一度水性相の表面上に沈着させた両親媒性分子であるオクタデシルホスホン酸（その極性頭部ＰＯ3Ｈ2を水側に向け、その炭素鎖を空気側に向ける）を使用する。それらの分子を圧縮することにより、疎水性にするための処理を行ったガラスシート（例えば、オクタデシルクロロシランによる処理）へ転写することができるラングミュアーブロジェット単一層がその後形成される。この段階では、表面上に存在するのがホスホン酸基であるから、当該シートは親水性になる。これらの基は、金属−ＰＯ3イオン性共有結合を形成するためにジルコニウムといった金属イオンに強い親和性を持つ。
【００３４】
一般的に単一層の形態にある特性が金属性であり、且つ規則正しく並んだジルコニウム原子により構成される表面はこのようにして得られ、ラングミュアーブロジェット層はその後、厚さ２．４ｎｍに測定される。
【００３５】
本発明の通りに使用される当該支持体は、時間が経過しても安定であり、及び事前活性化の必要性が要求されないという利点を有す。それらは単に水中で保存してもよい。
【００３６】
ジルコニウムホスホネートフィルムは、Katz等.,Chem.Mater.,1991,3:699-703に発表された通り進行させることによって、共有結合的方法において支持体に固定させることもできる。最初の可能性は、表面に３−アミノプロピルトリメトシキシランを結合させることによってガラス表面を官能化し、その後、その末端ＮＨ2を、ジルコニウム層を容易に受け入れるＰＯ3Ｈ2基を鎖のその末端に導入するためＰＯＣｌ3及び塩基により処理することである。他の可能性は、金の層で覆われた雲母、もしくはシリコーンのシートを得ること、及びチオール／金カップリングにより結合される８−メルカプトオクチルホスホン酸（ＨＳ−(ＣＨ2)8−ＰＯ3Ｈ2）によりそれらを処理することである。
【００３７】
金の薄層で覆われたホウケイ酸のシートは、Brochsztain等,J.Mater.Chem.,2002,12: 1250-1255によれば、一連の２−メルカプトエタノール（ＨＳ−Ｃ2Ｈ5−ＯＨ）及び溶液（ＰＯＣｌ3＋コリジン）で処理し、ＰＯ3Ｈ2末端により官能化させることもできる。
【００３８】
バイオポリマーの固定化
バイオポリマーは、スポッティングにより簡単に支持体上に沈着させることができる。微小滴定（例えばおよそ５０ピコリットル）又はロボットによるスポット（例えばマイクロタイタープレートのウェルからサンプルをとる）で沈着させる操作が普通含まれる。
【００３９】
ポリマーは、支持体の表面上の金属とのイオン性共有結合タイプの配位結合により固定される。
【００４０】
当該スポットは、好適には組織化されたネットワーク（又はアレイ）の形成において調整される。本明細書中で用いられる用語ネットワーク又はアレイは、列又は行の行列としてのバイオポリマースポットの秩序のとれた配列である。典型的には、およそ直径１５０μ、及び間隔３００μのスポットのため、当該スポットの密度は５００／ｃｍ2オーダーである。好適には、当該ネットワークは、１以上の固定化バイオポリマーを含む。
【００４１】
本発明に関連して、“バイオチップタイプの製品又はデバイス”という表現は、少なくとも１の固定されたバイオポリマーを有すいかなる固体支持体も含むと解される。
【００４２】
実質的に支持体に対して垂直であるバイオポリマーの定位のために、任意に高密度でそれらのポリマーを固定することが可能であり、特に平方センチあたり１０10−１０12の密度までのポリマーを固定することが可能である。
【００４３】
本発明は特に、ジルコニウムオクタデシルホスホネートの単一層で覆われた表面を有すガラスシート、並びに核酸のホスフェート基及びジルコニウム間のイオン性共有結合により前記表面上に固定された５’位にホスフェート基を担持する少なくとも１の核酸、を含んで成るバイオチップタイプの製品に関する。
【００４４】
製造した製品の使用
本発明により製造されたバイオチップタイプの製品は、多くの用途を有す。例えば、生物学的分析、及び固定されたポリマーへ結合することができる化合物のスクリーニングに用いることができる。
【００４５】
一般に、当該チップ及びアレイの分析は、当業界における当業者に周知である様々な技術（例えば、蛍光、放射能、質量分光、表面プラスモン共鳴、ＩＲ、化学発光）によって実施され得る。
【００４６】
バイオポリマーが核酸である場合、本発明の製品は多くの数の遺伝子、又はＤＮＡもしくはＲＮＡ配列の並行分析のためのハイパフォーマンスツールを構成する。それらの操作の原理は、ＤＮＡ２重らせんを再構築するための相補性配列の２つの成分のハイブリダイゼーション又は対合の特性に基づく。詳細な態様によれば、公知配列のオリゴヌクレオチドのプローブ（支持基質上で固定されるプローブ）は、分析される生物学的サンプルから抽出された標的と一緒にされ、そして蛍光ラベルを用いてラベル化される。
【００４７】
詳細な態様によると、ハイブリダイゼーションがどこで起こるかを知るために、当該チップは共焦点顕微鏡上で後にスキャンされ、その後、提供された配列とそれぞれ一致する様々なスポット上の蛍光強度を定量することにより分析される。
【００４８】
本発明の製品は、例えばｍＲＮＡ発現プロファイル、核酸配列、又は遺伝子ＤＮＡの多型もしくは遺伝子ＤＮＡ中の変異の探索について研究するために特に適している。
【００４９】
一般に、本発明の製品は、特に感染性又は遺伝性の疾患を検出するための、簡単で実用的な診断具を構成する。
【００５０】
以下の図、及び実施例はその範囲に限定されないで本発明を説明する。
【実施例１】
【００５１】
オリゴヌクレオチドの固定化
１．１  支持体の獲得
図１で説明されたような、及びBenitez等.,J.Am.Chem.Soc.,2002,124:4363-4370で発表されたような、ジルコニウムホスホネートに基づくＬＢフィルムで覆われたガラスシートを使用する。
【００５２】
当該ガラスシートを、その後、超純性水（ultrapure water）中で貯蔵する（およそ１８ＭΩ／ｃｍの抵抗性）。使用前、ロボットによりスポットされる前に当該シートを遠心分離により乾燥させる。シートの２つの面は、同じように使用することができる。
【００５３】
１．２  予備試験
最初の実行可能性試験では、３’位がリン酸化され、及び５’位がＣＹ３蛍光プローブによりラベル化された３５塩基のオリゴヌクレオチドは、それ自体が自発的にスポッティングによって簡単にジルコニウムホスホネートに基づきラングミュアーブロジェットフィルムへ固定されることが示された。同一のスポッティング条件下で３’位がリン酸化されていない同一のオリゴヌクレオチドについて固着されるプローブの量がより少ない（５分の１）ことから、フィルムへの固定に責任を負うのは、確かに末端のホスフェートであるようだ。この“非特異的”固着は、おそらくヌクレオチドユニットを結ぶホスホジエステル基とジルコニウムの相互作用によって引き起こされる。更に、当該固着は、ＤＮＡチップを洗浄するための標準条件下において安定である。従って、リン酸化されていない相同体と比較して、リン酸化されたオリゴヌクレオチドの効率的なカップリングが観察された。
【００５４】
１．３  使用されるオリゴヌクレオチド
固定された４つのタイプのオリゴヌクレオチド、すなわち：
−３５量体オリゴヌクレオチド（１と呼ぶ）；
−５’位がリン酸化されたその類似体（２と呼ぶ。２＝１−５’−ＯＰＯ3Ｈ2）；
−オリゴヌクレオチド及び末端ホスフェート基の間の１１アデニンユニットのスペーサー基を含んで成る２の類似体、（３と呼ぶ。３＝１−(Ａ)11−５’−ＯＰＯ3Ｈ2）；及び
−リン酸化されていない３の類似体（４と呼ぶ。４＝１−(Ａ)11）、である。
【００５５】
１．４  オリゴヌクレオチドの固定化
１Ｘ ＳＳＣ（ＨＣｌを付加することによりｐＨを６に調整）の溶液中のオリゴヌクレオチドを、５０μＭ、２０μＭ、及び５μＭの濃度でこれらのシート上にスポットした。
【００５６】
スポッティングの後、当該シートを空気中で乾燥させ、閉じた箱の中で２４時間放置した。当該シートはその後４回継続して溶液中で２分間洗浄した（２Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、１Ｘ ＳＳＣ、その後、０．２Ｘ ＳＳＣで２回）。遠心分離による乾燥後、当該シートでのハイブリダイゼーションの準備をした。
【実施例２】
【００５７】
ＤＮＡチップを用いたハイブリダイゼーション試験
ハイブリダイゼーション試験は、固定化した４つのタイプのオリゴヌクレオチドを実施例１の通りに調整したガラスシートにより実施した。
【００５８】
その目的のため、５’位をＣＹ３モチーフでラベル化した相補性３５量体オリゴヌクレオチドの溶液２０μＬを、カバーガラス下で沈着させた。相補性オリゴヌクレオチドの選定された濃度は、０．００２ＯＤユニット／μＬと同等の数値を有し（すなわち、この場合およそ５μＭ）、慣例的なハイブリダイゼーションに使用される溶媒混合物には、ホルムアミド、ｐＨ８のトリスＥＤＴＡ緩衝液〔トリス＝トリス(ヒドロシキメチル)アミノメタン〕、１０％ＳＤＳ〔ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム塩〕、及び２０Ｘ ＳＳＣ緩衝液〔３Ｍ ＮａＣｌ及び０．３Ｍクエン酸ナトリウム塩〕を含む。当該ハイブリダイゼーションを４２℃で<<Arrayit>>タイプのハイブリダイゼーション設備（chamber）中で一晩かけて実施した。ハイブリダイゼーションが完了した時に、当該シートは２分間４回継続して溶液（２Ｘ ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ、１Ｘ ＳＳＣ、その後、０．２Ｘ ＳＳＣを２回）で洗浄した。遠心分離による乾燥後、様々な蛍光スポットを考慮に入れて、収集したイメージをスキャナーで分析した。イメージの分析は、様々なスポットの蛍光強度の定量を可能にする。同様に５’位をＣＹ３モチーフでラベル化した非相補性３５量体のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを同一の手順で実施した。
【００５９】
非相補性オリゴヌクレオチドを用いた場合に蛍光は検出されなかった。相補性オリゴヌクレオチドを用いた場合、以下の特徴と共に、全てのスポット上に蛍光シグナルが観察された：
１. スポット周辺のグランドノイズが弱い（dark ground）。
２. １及び４に一致するスポットの蛍光強度は、同一の沈着濃度での５’位をリン酸化したそれらの相同体よりも６倍弱い。それは、支持体へのオリゴヌクレオチドのカップリングのため、ホスフェート基の存在が非常に好適であるという明確な効果を証明する。
３. ３に一致するスポットの蛍光強度が、同一の沈着濃度でのオリゴヌクレオチド２よりも１．６倍強い〔レーザーパワー８０％、光電子増倍管パワー７０％：強度４８０００〕。それは、オリゴヌクレオチド及びホスフェート基の間のスペーサー基（１１アデニンユニット）の存在が非常に好適であるという明確な効果、オリゴヌクレオチドを支持体表面から除去することの可能化、及びこのようなハイブリダイゼーションの容易化を証明する。
【００６０】
４. ２及び３のオリゴヌクレオチドの、沈着濃度５０、２０、及び５μＭのそれぞれの蛍光強度は、２／２／１であり、最適な沈着濃度は、２０から５μＭであることを示す。
【実施例３】
【００６１】
５’位がリン酸化されたオリゴヌクレオチドを含むチップ、及び５’末端遊離ホスフェート基及びオリゴヌクレオチド間でのスペーサー基の担体。
オリゴヌクレオチドを実施例１で記載した条件と同一の条件下で固定し、ハイブリダイゼーション前にＢＳＡ溶液（ウシ血清アルブミン：１％ＢＳＡ、３．５Ｘ ＳＳＣ中の０．３％ＳＤＳ）によりチップ上で表面処理も実施し、シグナル／ノイズ率を改善させるため、引き続き洗浄し乾燥させた。固定化は、異なる配列を有し、且つ５’末端がリン酸化された３３量体オリゴヌクレオチド（５，６及び７と呼ばれるもの、それぞれについて）、並びに５’末端遊離ホスフェート、並びに(Ａ)11−５、(Ａ)11−６、及び(Ａ)11−７；(Ｃ)11−５、(Ｃ)11−６、及び(Ｃ)11−７；(Ｇ)11−５、(Ｇ)11−６、及び(Ｇ)11−７；(Ｔ)11−５、(Ｔ)11−６、及び(Ｔ)11−７と呼ばれるオリゴヌクレオチド間のポリアデニン（１１量体）、ポリシトシン（１１量体）、ポリグアニン(１１量体)もしくはポリチミン(１１量体)タイプのそれぞれのスペーサーを担持する類似体についても実施した。
【００６２】
ハイブリダイゼーション試験は、実施例２で記載したプロトコールの通り、それらのオリゴヌクレオチドにより実施した。
−オリゴヌクレオチド５、及びその類似体：化合物５と相補的な３３量体オリゴヌクレオチドの溶液であり、且つＣＹ３モチーフにより５’がラベル化された；
−オリゴヌクレオチド６、及びその類似体：化合物６と相補的な３３量体オリゴヌクレオチドの溶液であり、且つＣＹ３モチーフにより５’がラベル化された；
−オリゴヌクレオチド７、及びその類似体：化合物７と相補的な３３量体オリゴヌクレオチドの溶液であり、且つＣＹ３モチーフにより５’がラベル化された。
【００６３】
オリゴヌクレオチド５、６又は７の試験とは関係なく、（１１量体）ポリグアニンスペーサー〔(Ｇ)11−５、(Ｇ)11−６、及び(Ｇ)11−７〕により提供されたプローブと一致するスポットの蛍光強度は、それらの相同体（スペーサー基を含まない、又は(１１量体)ポリアデニン、(１１量体)ポリシトシン、もしくは(１１量体)ポリチミンスペーサー基を担持する）より同一の沈着濃度において２倍以上強い。添付した図３は、オリゴヌクレオチド及びホスフェート基の間のポリグアニンスペーサー基の存在が非常に都合がよいという明確な特徴を証明する。
【実施例４】
【００６４】
５’位がリン酸化されたオリゴヌクレオチドを担持するチップの領域、及び遊離ホスフェート基を末端に担持しないオリゴヌクレオチドを含むデバイスの領域との比較。
【００６５】
本実施例は、実施例３の(Ｇ)11−５、(Ｇ)11−６、及び(Ｇ)11−７、並びにそれぞれ８、９、及び１０と呼ばれる非修飾類似体（ポリグアニンスペーサー、又は末端の遊離ホスフェート基がない）との比較を通して、当該オリゴヌクレオチドを使用した。
【００６６】
それらのオリゴヌクレオチドは、実施例１の条件下で支持体に固定した。いずれのオリゴヌクレオチドもリットル当り、１０μＭの濃度でスポットし、その後当該シートを閉じた箱の中で２４時間放置した。
【００６７】
ハイブリダイゼーションの前に、且つ予備洗浄なしで、実施例３の通り当該シートをＢＳＡ溶液により処理した。それらのいずれも１００ｎＭ濃度を除き、実施例３で述べたように同一の相補性オリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションを、その後４時間かけて実施した。試験された〔(Ｇ)11−５、(Ｇ)11−６、及び(Ｇ)11−７〕のオリゴヌクレオチドとは関係なく、測定したスポットの蛍光強度は、観察した非修飾類似体化合物８、９、又は１０より１０００倍強く、特に５’位が末端遊離ホスフェート基を経由して特異的に固定されることが説明された。更に、オリゴヌクレオチド(Ｇ)11−５、(Ｇ)11−６、及び(Ｇ)11−７のスポットの強度は、実施例３に観察された通りであり（リットル当り、５μＭでのハイブリダイゼーション）、特にチップの感度の高さが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】長鎖ホスホン酸から出発するラングミュアーブロジェットフィルム（ＬＢ）の形成を示す模式図である。当該ＬＢフィルムはガラスシートの両面上に置かれた。
【００６９】
【図２】ジルコニウムホスホネート層を担持するプレートへオリゴヌクレオチドを固定する図、及びハイブリダイゼーション試験のために得られた製品の使用の図を示す。
【００７０】
【図３】本明細書中で述べた実施例３の条件下において実施された試験で観察された蛍光強度を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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