(57)【要約】少なくとも２つのポリメラーゼを含む組成物が提供される。少なくとも２つのポリメラーゼを用いてプライマー伸長産物を生成するための方法がまた、提供される。少なくとも２つのポリメラーゼを含むプライマー伸長産物を生成するためのキットがまた、提供される。本発明はまた、キットを提供する。特定の実施形態において、キットは、この方法を実行するのに使用される２つ以上の成分を評価することによって、目的の方法の性能を高めるのに役立つ。特定の実施形態において、キットは、エンドユーザによる測定に必要とされる量を最小化するために予め測定された単位量の成分を含む。特定の実施形態において、キットは、１つ以上の方法を実行するための説明書を含む。特定の実施形態において、このキットの構成要素は、互いに一緒になって操作されるように最適化される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、以下：
ａ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４ポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つの第１のポリメラーゼ；ならびに
ｂ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つの第２のポリメラーゼ
を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、前記組成物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する、少なくとも１つの変異を含む、少なくとも１つのポリメラーゼを含む、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記組成物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する、少なくとも１つの欠損を含む、少なくとも１つのポリメラーゼを含む、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記少なくとも１つの第１のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼから選択される、組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物であって、前記少なくとも１つの第２のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｅ６８１ｌ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）変異体ポリメラーゼから選択される、組成物。
【請求項６】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４ポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４変異体ポリメラーゼから選択される、少なくとも２つのポリメラーゼを含む、組成物。
【請求項７】
請求項６の組成物であって、前記少なくとも２つのポリメラーゼのうちの少なくとも１つが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する、少なくとも１つの変異を含む、組成物。
【請求項８】
請求項６の組成物であって、前記少なくとも２つのポリメラーゼのうちの少なくとも１つが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する、少なくとも１つの欠損を含む、組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の組成物であって、前記少なくとも２つのポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼから選択される、組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物であって、前記少なくとも２つのポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）変異体ポリメラーゼである、組成物。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の組成物であって、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ変異体ポリメラーゼから選択される、少なくとも１つの第２のポリメラーゼをさらに含む、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、前記少なくとも１つの第２のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｅ６８１ｌ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）変異体ポリメラーゼから選択される、組成物。
【請求項１３】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｅ６８１ｌ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）変異体ポリメラーゼ、ならびに、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４ポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組成物であって、前記少なくとも１つのポリメラーゼのうちの少なくとも１つが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する、少なくとも１つの変異を含む、組成物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の組成物であって、前記少なくとも１つのポリメラーゼのうちの少なくとも１つが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する、少なくとも１つの欠損を含む、組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載の組成物であって、前記少なくとも１つのポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼから選択される、組成物。
【請求項１７】
標的核酸鋳型を配列決定する方法であって、以下：
（ａ）標的核酸鋳型；少なくとも１つのプライマー；少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチド；少なくとも１つのターミネーター；Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４ポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つの第１のポリメラーゼ；ならびにＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕｉｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕｉｔｉｃｕｓ変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つの第２のポリメラーゼを含む組成物を形成する工程；
（ｂ）該組成物を適切な条件下でインキュベートして、少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する工程；
（ｃ）少なくとも１つのプライマー伸長産物を分離する工程であって、ここで該分離する工程は、少なくとも１つの移動度依存性分析技術（ＭＤＡＴ）を含む、工程；
（ｄ）該少なくとも１つのプライマー伸長産物を検出する工程；ならびに
（ｅ）該標的核酸鋳型の配列を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記組成物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する、少なくとも１つの変異を含む少なくとも１つのポリメラーゼを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、前記組成物が、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を低減する、少なくとも１つの欠損を含む少なくとも１つのポリメラーゼを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１７に記載の方法であって、前記少なくとも１つの第１のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、前記少なくとも１つの第２のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｅ６８１ｌ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）変異体ポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項２２】
標的核酸鋳型を配列決定する方法であって、以下：
（ａ）標的核酸鋳型；少なくとも１つのプライマー；少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチド；Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４ポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも２つの第１のポリメラーゼを含む組成物を形成する工程；
（ｂ）該組成物を適切な条件下でインキュベートして、少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する工程；
（ｃ）少なくとも１つのプライマー伸長産物を分離する工程であって、ここで該分離する工程は、少なくとも１つの移動度依存性分析技術（ＭＤＡＴ）を含む、工程；
（ｄ）該少なくとも１つのプライマー伸長産物を検出する工程；ならびに
（ｅ）該標的核酸鋳型の配列を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記少なくとも２つの第１のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項２４】
請求項２２または２３に記載の方法であって、前記組成物が、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つの第２のポリメラーゼをさらに含む、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記少なくとも１つの第２のポリメラーゼがＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｅ６８１ｌ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）変異体ポリメラーゼから選択される、方法。
【請求項２６】
キットであって、以下：
ａ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４ポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つの第１のポリメラーゼ；ならびに
ｂ）Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つの第２のポリメラーゼ
を含む、キット。
【請求項２７】
請求項２６に記載のキットであって、前記少なくとも１つの第１のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼから選択される、キット。
【請求項２８】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４ポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４変異体ポリメラーゼから選択される、少なくとも２つの第１のポリメラーゼを含む、キット。
【請求項２９】
請求項２８に記載のキットであって、前記少なくとも２つの第１のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）変異体ポリメラーゼから選択される、キット。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載のキットであって、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つの第２のポリメラーゼをさらに含む、キット。
【請求項３１】
請求項３０に記載のキットであって、前記少なくとも１つの第２のポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ）変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｅ６８１ｌ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）変異体ポリメラーゼから選択される、キット。
【請求項３２】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｅ６８１ｌ）変異体ポリメラーゼおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６７Ｙ；Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）変異体ポリメラーゼ、ならびに、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１変異体ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４ポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４変異体ポリメラーゼから選択される少なくとも１つのポリメラーゼを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、異なるポリメラーゼを含む組成物および、このような組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡ鎖および、鋳型ＤＮＡ鎖の部分にアニールする相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）からＤＮＡ分子を合成する酵素である。特定のＤＮＡポリメラーゼおよびその特徴の詳細な説明は、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  第２版，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ（１９８９）に見出され得る。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼは、分子生物学的技術における種々の用途を有する。このような技術としては、プライマー伸長反応、ＤＮＡ配列決定および核酸増幅技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））が挙げられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
特定の実施形態において、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される、少なくとも２つのポリメラーゼを含む組成物が提供される。
【０００５】
特定の実施形態において、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）を含む組成物が提供される。
【０００６】
特定の実施形態において、この組成物はさらに、少なくとも１つのプライマーを含む。特定の実施形態において、この組成物はさらに、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、この組成物はさらに、少なくとも１つのターミネーターを含む。
【０００７】
特定の実施形態において、少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する方法が提供される。特定の実施形態において、方法は、少なくとも１つの標的核酸鋳型、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチド、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される少なくとも２つのポリメラーゼを含む反応組成物を形成する工程；ならびにこの組成物を適切な条件下でインキュベートし、少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する工程を包含する。
【０００８】
特定の実施形態において、少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する方法は、少なくとも１つの標的核酸鋳型、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチドならびにＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）を含む反応組成物を形成する工程；ならびにこの組成物を適切な条件下でインキュベートして少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する工程を包含する。
【０００９】
特定の実施形態において、この方法はさらに、少なくとも１つのプライマー伸長産物を分離する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法はさらに、少なくとも１つのプライマー伸長産物を検出する工程を包含する。
【００１０】
特定の実施形態において、標的核酸鋳型を配列決定する方法が提供される。特定の実施形態において、標的核酸鋳型を配列決定する方法は、少なくとも１つの標的核酸鋳型、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチド、少なくとも１つのターミネーターならびに、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される少なくとも２つのポリメラーゼを含む反応組成物を形成する工程；この組成物を適切な条件下でインキュベートして少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する工程；この少なくとも１つのプライマー伸長産物を配列決定する工程；この少なくとも１つのプライマー伸長産物を検出する工程；ならびにこの標的核酸鋳型の配列を決定する工程を包含する。
【００１１】
特定の実施形態において、キットが提供される。特定の実施形態において、このキットは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）、およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される、少なくとも２つのポリメラーゼを含む。
【００１２】
特定の実施形態において、このキットは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）を含む。
【００１３】
特定の実施形態において、このキットはさらに、少なくとも１つのターミネーターを含む。特定の実施形態において、このキットはさらに、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、このキットはさらに、少なくとも１つのプライマーを含む。
【００１４】
（特定の例示的な実施形態の詳細な説明）
上記の一般的な説明と以下の詳細の説明の両方が、例示および説明のみであり、特許請求する本発明を限定しないことが理解されるべきである。この出願において、単数形の使用は、特に他に示さない限り、複数形を含む。この出願において、「または」の使用は、他に示さない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「含んでいる（包含している、〜が挙げられる）」ならびに他の形（例えば、「含む」および「含まれる」）は限定的でない。
【００１５】
本明細書中で使用される節の見出しは、構成上の目的のみのためであり、記載される対象内容を限定するように解釈されない。この出願に引用される全ての文書または文書の一部（特許、特許出願、文献、著作および条約が挙げられるがこれらに限定されない）は、任意の目的でその全体が本明細書中に参考として援用される。
【００１６】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド塩基」は、飽和または不飽和の芳香族環をいう。特定の実施形態において、この芳香族環は、少なくとも１つの窒素原子を含む。特定の実施形態において、ヌクレオチド塩基は、適当に相補的なヌクレオチド塩基とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合および／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合を形成し得る。例示的なヌクレオチド塩基およびそのアナログとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：天然に存在するヌクレオチド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン）および天然に存在するヌクレオチド塩基のアナログ（例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、Ｎ６−Δ２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−Δ２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、イノシン、ネブラリン（ｎｅｂｕｌａｒｉｎｅ）、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、シュードウリジン、シュードシトシン、シュードイソシトシン、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミン、４−チオウラシル、Ｏ６−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｏ４−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、ピラゾロ［３，４−Ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許第６，１４３，８７７号および同６，１２７，１２１号ならびにＰＣＴ公開出願ＷＯ  ０１／３８５８４を参照のこと）、エテノアデニン、インドール（例えば、ニトロインドールおよび４−メチルインドール）、およびピロール（例えば、ニトロピロール）。特定の例示的なヌクレオチド塩基は、例えば、Ｆａｓｍａｎ、１９８９、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐｐ．３８５〜３９４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．ならびにこれに引用される参考文献に見出され得る。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、糖（例えば、リボース、アラビノース、キシロースおよびピラノース）およびそれらの糖アナログのＣ−１’炭素に結合するヌクレオチド塩基を含む化合物をいう。ヌクレオチドという用語はまた、ヌクレオチドアナログを含む。これらの糖は、置換されても置換されなくてもよい。置換リボース糖としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：１つ以上の炭素原子（例えば、２’炭素原子）が、１つ以上の同じかまたは異なるＣｌ、Ｆ、−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲ２またはハロゲン基で置換されるリボースであって、ここで各Ｒが独立してＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ５〜Ｃ１４アリールである。例示的なリボースとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：２’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース、２’−ドキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、リボース、２’−デオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’−ハロリボース、２’−フルオロリボース、２’−クロロリボース、ならびに２’−アルキルリボース（例えば、２’−Ｏ−メチル）、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド、２’−４’−結合および３’−４’−結合ならびに他の「ロックされた」または「ＬＮＡ」二環の糖改変（例えば、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ９８／２２４８９、ＷＯ  ９８／３９３５２；およびＷＯ９９／１４２２６を参照のこと）。ポリヌクレオチド内の例示的なＬＮＡ糖アナログとしては、以下の構造が挙げられるが、これらに限定されない：
【００１８】
【化１】
2005517413.tif 000002
ここでＢは任意のヌクレオチド塩基である。
【００１９】
リボースの２’位または３’位での改変体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：水素、ヒドロキシ、メトキシ、エトキシ、アリールオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモ。ヌクレオチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：天然のＤ光学異性体ならびにＬ光学異性体形態（例えば、Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：４１５９〜６５；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：７４３５；Ｕｒａｔａ，（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒ．Ｎｏ．２９：６９〜７０を参照のこと）。ヌクレオチド塩基がプリン（例えば、ＡまたはＧ）である場合、リボース糖がヌクレオチド塩基のＮ９位に結合される。ヌクレオチド塩基がピリミジン（例えば、Ｃ、ＴまたはＵ）である場合、ペントース糖がヌクレオチド塩基のＮ１位に結合される。但し、ペントース糖がウラシルヌクレオチド塩基のＣ５位に結合されるシュードウリジンは除く（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、（１９９２）ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡを参照のこと）。
【００２０】
ヌクレオチドの１つ以上のペントース炭素が、以下の式を有するリン酸エステルで置換され得る：
【００２１】
【化２】
2005517413.tif 000003
ここで、αは０〜４の整数である。特定の実施形態において、αは２であり、そしてリン酸エステルがペントースの３’炭素または５’炭素に結合される。特定の実施形態において、ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基がプリン、７−デアザプリン、ピリミジンまたはこれらのアナログであるものである。「ヌクレオチド５’−リン酸」は、５’位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドをいい、これは時々、特に、リボース糖の構造特性を示すために、「ＮＴＰ」または「ｄＮＴＰ」および「ｄｄＮＴＰ」と表される。三リン酸エステル基は、種々の酸素の硫黄置換体（例えば、α−チオ−ヌクレオチド５’−三リン酸）が挙げられ得る。ヌクレオチド化学の総説については、例えば、Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．およびＢｏｇｄａｎｏｖ，Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチドアナログ」は、ペントース糖および／またはヌクレオチド塩基および／またはヌクレオチドの１つ以上のリン酸エステルが、そのそれぞれのアナログで置換され得る実施形態をいう。特定の実施形態において、例示的なペントース糖アナログは、上記のものである。特定の実施形態において、ヌクレオチドアナログは、上記のようなヌクレオチド塩基アナログを有する。特定の実施形態において、例示的なリン酸エステルアナログとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルキルホスホネート、メチルスホネート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなど。そして、例示的なリン酸エステルアナログは、関連の対イオンを含み得る。
【００２３】
「ヌクレオチドアナログ」の定義内に含まれるものはまた、ポリヌクレオチドアナログに増幅され得るヌクレオチドアナログモノマーであり、ここで、ＤＮＡ／ＲＮＡリン酸エステルおよび／または糖リン酸エステル骨格が、異なる型の内部ヌクレオチド結合で置換される。例示的なポリヌクレオチドアナログとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ポリペプチドの糖リン酸骨格がペプチド骨格で置換される、ペプチド核酸。
【００２４】
「伸長可能なヌクレオチド」は、ヌクレオチドであり、これは：（ｉ）ポリヌクレオチド鎖の終末に酵素的にかまたは合成的に組込まれ得、かつ（ｉｉ）さらなる酵素的伸長または合成的伸長を支持し得る。伸長可能なヌクレオチドは、すでに酵素的にかまたは合成的にポリヌクレオチド鎖に組み込まれており、さらなる酵素的伸長もしくは合成的伸長のいずれかを支持しているヌクレオチド、または、さらなる酵素的伸長もしくは合成的伸長を支持し得るヌクレオチドを含む。伸長可能なヌクレオチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヌクレオチド５’三リン酸（例えば、ｄＮＴＰおよびＮＴＰ）、ポリヌクレオチドの化学合成に適するホスホラミダイトおよび、すでに酵素的にかまたは化学的に組み込まれているポリヌクレオチド鎖内のヌクレオチド単位。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチドターミネーター」または「ターミネーター」は、酵素的に組み込み可能なヌクレオチドをいい、これは、プライマー伸長反応において連続するヌクレオチドの組み込みを支持しない。従って、ターミネーターは、伸長可能なヌクレオチドではない。特定の実施形態において、ターミネーターは、ヌクレオチドがプリン、７−デアザ−プリン、ピリミジン、またはヌクレオチドアナログであり、糖部分が、ペントースであるものである。このペントースとしてはさらなる合成をブロックする３’−置換体（例えば、ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ））が挙げられる。特定の実施形態において、さらなる合成をブロックする置換体としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アミノ，デオキシ，ハロゲン、アルコキシおよびアリールオキシ基。例示的なターミネーターとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：糖−リン酸エステル部分が３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース−５’三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース−５’三リン酸、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース−５三リン酸，２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース−５’三リン酸，２’−デオキシ−３’−ハロリボース−５’三リン酸，２’−デオキシ−３’−アミノリボース−５’三リン酸，２’，３’−ジデオキシリボース−５’−三リン酸または２’，３’−ジデヒドロリボース−５’三リン酸であるもの。ターミネーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ｄｄＴＴＰおよびｄＵＴＰを含むＴターミネーター（これは、鋳型中のアデニンまたはアデニンアナログに対して組み込まれる）；ｄｄＡＴＰを含むＡターミネーター（これは、鋳型中のチミン、ウラシルまたはチミンもしくはウラシルのアナログに対して組み込まれる）；ｄｄＣＴＰを含むＣターミネーター（これは、鋳型中のグアニンまたはグアニンアナログに対して組み込まれる）；およびｄｄＧＴＰおよびｄＧＴＰを含むＧターミネーター（これは、鋳型中のシトシンまたはシトシンアナログに対して組み込まれる）。
【００２６】
用語「標識」は、分子に結合され得る任意の部分をいい、これれは：（ｉ）検出可能なシグナルを提供し；（ｉｉ）２次標識と相互作用して２次標識（例えば、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔａｎｓｆｅｒ））により提供される検出可能なシグナルを変更し；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーションを安定化させ（例えば、二重鎖形成）；または（ｉｖ）結合複合体または親和性セットのメンバー（例えば、抗体／抗原、イオン性複合体形成、ハプテン／リガンド（例えば、ビオチン／アビジン））を提供する。標識は、公知の標識、結合、連結基、試薬、反応条件および分析および精製方法を用いる公知の技術のいずれか１つを用いて達成され得る。標識としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：検出可能な蛍光シグナル、化学発光シグナル、または生物発光シグナルを生成またはクエンチする光放射化合物または光吸収化合物（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９２），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．３〜２８を参照のこと）。生体分子を標識するのに有用な蛍光レポーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号；同６，００８，３７９号；および同６，０２０，４８１号を参照のこと）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号；同５，８４７，１６２号；同５，９３６，０８７号；同６，０５１，７１９号；および同６，１９１，２７８号を参照のこと）、ベンゾフェノキサジン（米国特許第６，１４０，５００号を参照のこと）、１対のドナーとアクセプターを含むエネルギー−転換蛍光染料（ＥＴＦＤ）（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同５，８００，９９６号；および同５，９４５，５２６号を参照のこと）、およびシアニン（例えば、Ｋｕｂｉｓｔａ，ＷＯ９７／４５５３９を参照のこと）、ならびに検出可能なシグナルを生成し得る任意の他の蛍光標識。フルオレセイン染料の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：６−カルボキシフルオレセイン：２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセイン。標識としてはまた以下が挙げられるがこれらに限定されない：半導体ナノ結晶、または量子ドット（例えば、米国特許第５，９９０，４７９号および同第６，２０７，３９２号Ｂ１；Ｈａｎら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：６３１〜６３５を参照のこと）。
【００２７】
標識の分類は、二重鎖のハイブリダイゼーションを増強、安定化またはそれに影響を与えるのに役立つハイブリダイゼーション安定化部分（例えば、インターカレーター、小溝結合剤、および架橋官能基（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．およびＧａｉｔ，Ｍ．編「ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、（１９９６）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．１５〜８１を参照のこと））である。標識のなお別の分類は、特異的または非特異的な捕捉により分子の分離または固定化をもたらす（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、および他のハプテン（例えば、Ａｎｄｒｕｓ，Ａ．「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ５’ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ」（１９９５）ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ｐｐ．３９〜５４を参照のこと））。非放射活性標識の方法、技術および試薬は、Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｇａｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．（１９９７）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏに総説される。
【００２８】
標識は、「検出可能に異なり」得、これは、標識が、少なくとも１つの検出方法により互いに識別可能であることを意味する。検出可能な異なる標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：異なる波長の光を放射する標識、異なる波長の光を吸収する標識、異なる蛍光崩壊寿命を有する標識、異なるスペクトル特性を有する標識、異なる放射活性崩壊特性を有する標識、異なる電荷の標識および異なるサイズの標識。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「標識されたターミネーター」とは、物理的に標識に結合されたターミネーターをいう。この標識への結合は、ポリメラーゼによるポリヌクレオチドへのターミネーターの組み込みを阻害しないターミネーターの部位である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「標的核酸鋳型」は、プライマー伸長反応の鋳型として働く核酸配列をいう。標的核酸鋳型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ゲノムＤＮＡ（ミトコンドリアＤＮＡおよび核ＤＮＡを含む）ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、酵母人工染色体ＤＮＡ（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ＤＮＡ（ＢＡＣ）、および他の染色体外ＤＮＡおよびプライマー伸長産物。標的核酸鋳型としてはまた、以下が含まれるがこれらに限定されない：ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡの両方のアナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））。
【００３１】
異なる標的核酸鋳型は、単一の連続した核酸の異なる部分であり得るか、または異なる核酸上であり得る。単一の連続した核酸の異なる部分は、重複し得る。
【００３２】
本明細書中で使用される「プライマー」とは、ポリメラーゼによって触媒されるプライマー伸長反応において、少なくとも１つのヌクレオチドによって伸長され得る、遊離した３’−ＯＨ（またはその機能的等価物）を有するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいう。特定の実施形態において、プライマーは、実質的にいかなる長さでもあり得る。但し、これらは、プライマー伸長が行われる環境において目的のポリヌクレオチドにハイブリダイズするのに十分長い。特定の実施形態において、プライマーは少なくとも１４ヌクレオチド長である。プライマーは、特定の配列に特異的であり得るか、あるいは縮重し得（例えば、あるセットの配列に特異的であり得）る。
【００３３】
用語「プライマー伸長」および「プライマー伸長反応」とは、互換可能に使用され、ポリメラーゼ、鋳型、および１つ以上のヌクレオチドを使用して、核酸プライマーまたはプライマー伸長産物に１つ以上のヌクレオチドを付加するプロセスをいう。
【００３４】
「プライマー伸長産物」は、プライマー伸長反応において１つ以上のヌクレオチドがプライマーに付加された場合に産生される。プライマー伸長産物は、引き続く伸長反応において標的核酸鋳型として働き得る。プライマー伸長産物は、ターミネーターを含み得る。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、互換可能に使用され、ヌクレオチドモノマー（ヌクレオチド内ホスホジエステル結合連鎖により結合される２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）またはヌクレオチド内アナログを含む（これらは、対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋など）を同伴する）の一本鎖および二本鎖のポリマーをいい、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドから完全に構成され得るか、またはそれらのキメラ混合物をから構成され得る。ヌクレオチドモノマー単位は、本明細書中に記載される任意のヌクレオチドを含み得、これらとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ。ポリヌクレオチドは、代表的には数モノマー単位（例えば、５〜４０）（時々、当該分野でオリゴヌクレオチドと呼ばれる場合）〜数千モノマーヌクレオチド単位のサイズの範囲である。他に示されない限り、ポリヌクレオチド配列がどこで示されようとも、他に示されない限り、このヌクレオチドは、左から右に、５’から３’の順序であり、そして、「Ａ」はデオキシアデノシンまたはそのアナログを示し、「Ｃ」はデオキシシトシンまたはそのアナログを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンまたはそのアナログを示し、そして「Ｔ」は、チミジンまたはそのアナログを示すことが理解される。
【００３６】
ポリヌクレオチドは、単一型の糖部分（例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡの場合におけるように）、または異なる糖部分の混合物（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラの場合のように）から構成され得る。特定の実施形態において、核酸は、以下の構造式に従うリボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドであり：
【００３７】
【化３】
2005517413.tif 000004
ここで、各Ｂは独立してヌクレオチドの塩基部分（例えば、プリン、７−デアザプリン、ピリミジンまたはそれらのアナログ）であり；各ｍは、それぞれの核酸の長さを規定し、そして、０〜１，０００、１０，０００またはそれ以上の範囲であり得；各Ｒは、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロゲン、−Ｒ’’、−Ｏ’’、および−ＮＲ’’Ｒ’’からなる群から選択され、ここで各Ｒ’’は独立して（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルもしくは（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールであるか、または２つの近接したＲが一緒になって結合を形成し得、結果としてこのリボース糖は、２’，３’−ジデヒドロリボースであり、そして各Ｒ’が独立してヒドロキシルまたは
【００３８】
【化４】
2005517413.tif 000005
であり得、ここでαは０、１または２である。
【００３９】
上記で例示されるリボポリヌクレオチドおよび２’−デオキシリボポリヌクレオチドの特定の実施形態において、ヌクレオチド塩基Ｂは、以前に記載した糖部分のＣ１’炭素に共有結合される。
【００４０】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はまた、核酸アナログ、ポリヌクレオチドアナログおよびオリゴヌクレオチドアナログを含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「核酸アナログ」、「ポリヌクレオチドアナログ」および「オリゴヌクレオチドアナログ」は、互換可能に使用され、少なくとも１つのヌクレオチドアナログ、および／または少なくとも１つのリン酸エステルアナログおよび／または少なくとも１つのペントース糖アナログを含むポリヌクレオチドをいう。リン酸エステルおよび／または糖リン酸エステル結合が他の型の結合（例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンアミドおよび他のアミド（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７〜１５００；ＷＯ  ９２／２０７０２；米国特許第５，７１９，２６２号；米国特許第５，６９８，６８５号を参照のこと）；モルホリノ（例えば、米国特許第５，６９８，６８５号；米国特許第５，３７８，８４１号；米国特許第５，１８５，１４４号を参照のこと）；カルバメート（例えば、ＳｔｉｒｃｈａｋおよびＳｕｍｍｅｒｔｏｎ，１９８７，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２を参照のこと）；メチレン（メチルイミノ）（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒら、１９９２，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６を参照のこと）；３’−チオホルムアセタール（例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９９３，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３を参照のこと）；スルファメート（例えば、米国特許第５，４７０，９６７号を参照のこと）；２−アミノエチルグリシン（一般にＰＮＡと呼ばれる）（例えば、Ｂｕｃｈａｒｄｔ，ＷＯ  ９２／２０７０２；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７〜１５００を参照のこと）；およびその他（例えば、米国特許第５，８１７，７８１号；ＦｒｉｅｒおよびＡｌｔｍａｎ，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４４２９ならびに本明細書中に引用される参考文献を参照のこと））で置換されているポリヌクレオチドもまた、ポリヌクレオチドアナログの定義に含まれる。リン酸エステルアナログとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）Ｃ１〜Ｃ４アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート）；（ｉｉ）ホスホラミデート；（ｉｉｉ）Ｃ１〜Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオエート；および（ｖ）ホスホロジチオエート。
【００４１】
用語「アニーリング」および「ハイブリダイゼーション」は、互換可能に使用され、二重鎖、三重鎖または他のより高いオーダーの構造の形成を生じる、１つの核酸と別の核酸との塩基対形成相互作用を意味する。特定の実施形態において、主要な相互作用は、塩基特異的（例えば、Ｗａｔｓｏｎ／ＣｒｉｃｋおよびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の水素結合によるＡ／ＴおよびＧ／Ｃ）である。塩基スタッキングおよび疎水性相互作用もまた、二重鎖の安定性に寄与し得る。
【００４２】
本明細書中で使用される様に、用語「改変体」とは、タンパク質の任意の変更をいい、これらとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸配列の変化、１つ以上のアミノ酸の置換、１つ以上のアミノ酸の付加、１つ以上のアミノ酸の欠失、およびアミノ酸自体の変化。特定の実施形態において、これらの変化は、保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸と、例えば、同様の疎水性、親水性、電荷または芳香性を有する別のアミノ酸で置換することを包含し得る。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換は、同様のヒドロパシー指数に基づいてなされ得る。ヒドロパシー指数は、アミノ酸の疎水性特徴および電荷特徴を考慮し、特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換の選択のためのガイドとして使用され得る。ヒドロパシー指数は、例えば、Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）において議論される。保存的アミノ酸置換が、上記の特徴のいずれかに基づいてなされ得ることが、当該分野で理解される。
【００４３】
アミノ酸への変化としては以下が含まれ得るが、これらに限定されない：グリコシル化、メチル化、リン酸化、ビオチン化、および、アミノ酸配列の変化を生じないタンパク質への任意の共有結合的および非共有結合的付加。本明細書中で使用される場合、「アミノ酸」とは、酵素的にかまたは合成的にかのいずれかにより、ポリペプチドまたはタンパク質に組み込まれ得る、天然または非天然の任意のアミノ酸をいう。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「熱安定性」とは、約３７℃よりも高い温度で活性を保持するポリメラーゼをいう。特定の実施形態において、本発明の核酸ポリメラーゼは、約４２℃よりも高い温度で活性を保持する。特定の実施形態において、本発明の核酸ポリメラーゼは、約５０℃よりも高い温度で活性を保持する。特定の実施形態において、本発明の核酸ポリメラーゼは、約６０℃よりも高い温度で活性を保持する。特定の実施形態において、本発明の核酸ポリメラーゼは、約７０℃よりも高い温度で活性を保持する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、ポリメラーゼの「単位」とは、７４℃にて３０分間で、酸不溶性形態に合計１０ｎｍｏｌのヌクレオチドの組み込みを触媒するポリメラーゼの量として定義される。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、組成物における１つのポリメラーゼの別のポリメラーゼに対する「比率」は、このポリメラーゼが単独で使用される場合のポリメラーゼの単位の割合に基づいて決定される。従って、非限定的な例として、比率が６０：４０である場合、ポリメラーゼＡおよびポリメラーゼＢの量を、以下のようにして計算する。この例において、組成物における唯一のポリメラーゼとして使用される場合、ポリメラーゼＡは、２０μｌの反応あたり１０単位の濃度で使用される。この例において、組成物における唯一のポリメラーゼとして使用される場合、ポリメラーゼＢは、２０μｌの反応あたり２０単位の濃度で使用される。ポリメラーゼＡおよびポリメラーゼＢが６０：４０の比率で２０μｌの組成物中で共に用いられる場合、この組成物は共に６単位のポリメラーゼＡ（１０単位の６０％）および８単位のポリメラーゼＢ（２０単位の４０％）を含む。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「移動度依存性分析技術」すなわち「ＭＤＡＴ」は、異なる分析物の型の間での、差次的な移動速度に基づく分析技術を意味する。特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、例えば、移動度、分子量、長さ、配列および／または電荷に依存して分離され得る。例えば、移動度、長さ、分子量、配列および／または電荷に依存して混合物中の２つ以上の核酸配列が区別されることを可能にする任意の方法は、本発明の範囲内である。例示的な移動度依存性の分析技術としては、限定することなく、以下が挙げられる：電気泳動（ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動を含む）；クロマトグラフィー（ＨＰＬＣのようなものを含む）；質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む）；沈降（勾配遠心分離法を含む）；ゲル濾過；視野−流体分画；多段階抽出技術；など。特定の実施形態において、ＭＤＡＴは、電気泳動またはクロマトグラフィーである。
【００４８】
（本発明の特定の例示的な実施形態）
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成するための組成物および方法に関する。特定の実施形態に従って、本発明は、少なくとも２つのポリメラーゼを用いてプライマー伸長産物を生成するための方法を提供する。特定の実施形態において、この方法は、少なくとも１つの標的核酸鋳型、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも２つのポリメラーゼを含む組成物を使用する。特定の実施形態において、二重鎖（二本鎖のポリヌクレオチド）が、組成物中で、標的核酸鋳型とプライマーとの間で形成される。特定の実施形態において、プライマーは、標的核酸鋳型の所定の位置にハイブリダイズする。
【００４９】
次いで、この組成物は、適切な反応条件下でインキュベートされ、結果として、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドがプライマーの３’末端上に連続して組み込まれる。特定の実施形態において、プライマー伸長反応により生成されたプライマー伸長産物は、次いで、サイズに基づいて分離され得る。
【００５０】
ポリメラーゼは、熱安定性であっても熱安定性でなくてもよい。特定の実施形態において、ポリメラーゼは、ヌクレオチド三リン酸と比較して３’−ジデオキシヌクレオチドターミネーターに対する識別能を低減する変異を有する。特定の実施形態において、これらの変異を１つ以上保有するポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼが組み込むよりも高い効率で３’−デオキシヌクレオチドターミネーターを組み込み得る（例えば、米国特許第５，８８５，８１３号および米国特許第６，２６５，１９３号（これらは、任意の目的で、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。特定の実施形態において、３’−ジデオキシヌクレオチドターミネーターに対する識別能を低減する変異は、ポリメラーゼのヌクレオチド結合領域に存在する。特定の実施形態において、このヌクレオチド結合領域は、ポリメラーゼのアミノ酸約５２０〜アミノ酸約８３２に位置する。
【００５１】
特定の実施形態において、ポリメラーゼは、蛍光標識したヌクレオチドに対する識別能を低減する変異を有する。特定の実施形態において、これらの変異の１つ以上を保有するポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼが組み込むよりも高い効率で蛍光標識したヌクレオチドを組み込み得る（例えば、米国特許第５，８８５，８１３号および米国特許第６，２６５，１９３号（これらは、任意の目的で、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。特定の実施形態において、蛍光標識したヌクレオチドに対する識別能を低減する変異は、ポリメラーゼのヌクレオチド結合領域内にある。
【００５２】
特定の実施形態において、ポリメラーゼは、ＥＴＦＤ標識したターミネーターに対する識別能を低減する変異を有する。
【００５３】
特定の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、組み込まれた３’−デオキシヌクレオチドターミネーターを除去することを可能にし得るエキソヌクレアーゼ活性を保有する。特定の実施形態において、１つ以上の変異または欠失を保有するポリメラーゼは、減少した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有し得る。特定の実施形態において、このような変異または欠失は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ末端領域に作成される。このような変異の特定の例は、例えば、米国特許第４，７９５，６９９号；米国特許第５，５４１，０９９号；および米国特許第５，４８９，５２３号（これらは、任意の目的で、本明細書中に参考として援用される）に記載される。特定の実施形態において、このような変異または欠失は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を与える、ＤＮＡポリメラーゼの領域に存在する。特定の実施形態において、この領域は、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸約１〜アミノ酸約２７２に位置する。
【００５４】
特定の実施形態において、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼの６６７位のフェニルアラニンは、チロシンで置換される。この変異の詳細な説明は、例えば、米国特許第５，６１４，３６５号（これは、任意の目的で、本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。この変異体ポリメラーゼは、簡便に、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  Ｆ６６７Ｙまたはａｑ  Ｆ６６７Ｙと呼ばれ得る（なぜなら、６６７位のフェニルアラニン（Ｆ）がチロシン（Ｙ）で置換されているからである）。
【００５５】
特定の実施形態において、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼの４６位のグリシンは、アスパラギン酸で置換される。この変異体ポリメラーゼは、簡便に、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  Ｇ４６ＤまたはＴａｑ  Ｇ４６Ｄと呼ばれ得る。
【００５６】
特定の実施形態に従って、ポリメラーゼとしては以下が含まれるがこれらに限定されない：ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４。
【００５７】
ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳは、例えば、米国特許第５，６１４，３６５号（これは、あらゆる目的で本明細書中に参考として援用される）に記載される。ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳは、４６位の変異（ここで、グリシンがアスパラギン酸に置換されている（Ｇ４６Ｄ））および６６７位の変異（ここで、フェニルアラニンがチロシンに置換されている（Ｆ６６７Ｙ））を有する。特定の実施形態は、変異体ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳを含み、これは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳの変異Ｇ４６ＤおよびＦ６６７Ｙを有し、さらに６８１位の変異（ここでグルタミン残基がイソロイシンで置換されている）を有する。この変異ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）と呼ばれる。特定の実施形態は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳのＧ４６ＤおよびＦ６６７Ｙ変異を有し、以下のような２つのさらなる変異を有する変異ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳを含む：６６４位のスレオニン残基がアスパラギンと置換され、かつ、６６０位のアルギニン残基が、グリシンで置換されている。このＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳの変異体は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）と呼ばれる。
【００５８】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８は、例えば、米国特許第５，７８９，２２４号（これは、あらゆる目的で、本明細書中に参考として援用される）に記載される。特定の実施形態は、以下のように３つの変異を有する、変異体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８を含む：１８位のアスパラギン酸がアラニンで置換され；６６９位のフェニルアラニン残基がチロシンで置換され；そして、６８３位のグルタミンがアルギニンで置換される。この変異体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）と呼ばれる。
【００５９】
特定の実施形態は、タンパク質の最初の２７１アミノ酸を除去するアミノ末端の欠損を有する、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８を含み、これは、以下のように２つの変異体を有する：６６９位のフェニルアラニン残基がチロシンで置換され、６８３位のグルタミンがトリプトファンで置換される。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８の変異体は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）と呼ばれる。
【００６０】
特定の実施形態は、以下のように２つの変異を有する変異体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８を含む：１８位のアスパラギン酸残基がアラニンで置換され、かつ６６９位のフェニルアラニン残基がチロシンで置換される。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８の変異体は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）と呼ばれる。
【００６１】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉは、例えば、米国仮出願第６０／３３４，７９８号（２００１年１１月３０日出願）（これは、あらゆる目的で本明細書中に参考として援用される）に記載される。特定の実施形態は、以下のように２つの変異を有する変異体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉを含む：４３位のグリシン残基がアスパラギン酸で置換され、６６５位のフェニルアラニンがチロシンで置換される。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉの変異体は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）と呼ばれる。
【００６２】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１は、例えば、米国仮出願第６０／３３６，０４６号（２００１年１１月３０日出願）（これはあらゆる目的で本明細書中に参考として援用される）に記載される。特定の実施形態は、以下のように２つの変異を有する変異体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１を含む：４６位のグリシン残基がアスパラギン酸で置換され、かつ６６９位のフェニルアラニン残基がチロシンで置換される。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１の変異体は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）と呼ばれる。
【００６３】
Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓは、例えば、米国仮出願第６０／３３４，４８９号（２００１年１１月３０日出願）（これは、あらゆる目的で本明細書中に参考として援用される）に記載される。本発明の特定の実施形態は、以下のように２つの変異を有する変異体Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓを含む：４６位のグリシン残基がアスパラギン酸で置換され、かつ６６８位のフェニルアラニンがチロシンで置換される。このＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓの変異体は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）と呼ばれる。
【００６４】
特定の実施形態において、組成物は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択された少なくとも２つのポリメラーゼを含む。
【００６５】
特定の実施形態において、少なくとも２つのポリメラーゼは、２つのポリメラーゼである。２つのポリメラーゼは、組成物中に任意の比率で存在し得る。特定の実施形態において、２つのポリメラーゼは、組成物中に１：９９の比率で存在する。特定の実施形態において、この比率は１０：９０である。特定の実施形態において、この比率は、２０：８０である。特定の実施形態において、この比率は３０：７０である。特定の実施形態において、この比率は４０：６０である。特定の実施形態において、この比率は５０：５０である。
【００６６】
特定の実施形態において、組成物は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）を含む。
【００６７】
特定の実施形態において、組成物は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ），ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される、少なくとも３つのポリメラーゼを含む。特定の実施形態において、少なくとも３つのポリメラーゼは、３つのポリメラーゼである。この３つのポリメラーゼは、任意の比率で組成物中に存在し得る。
【００６８】
特定の実施形態において、これの３つのポリメラーゼは、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）、ＡｍｐｌｉＴｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）ならびに、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（＃２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕＳ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）から選択される少なくとも１つのポリメラーゼである。
【００６９】
特定の実施形態において、このＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）との組み合せが、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧと呼ばれ、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、任意の比率であり得る。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、２：１である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は９９：１である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、９０：１０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、８０：２０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、７０：３０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、６０：４０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、５０：５０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、４０：６０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、３０：７０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、２０：８０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、１０：９０である。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧにおけるＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）とＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）の比率は、１：９９である。
【００７０】
特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）から選択される、少なくとも１つのポリメラーゼと組合される。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）から選択される１つのポリメラーゼと組合される。
【００７１】
ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧと、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ１Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）から選択されるポリメラーゼは、任意の比率で組合され得る。特定の実施形態において、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧと、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）から選択されるポリメラーゼは、１：９９の比率で組合される。特定の実施形態において、この比率は１０：９０である。特定の実施形態において、この比率は２０：８０である。特定の実施形態において、この比率は３０：７０である。特定の実施形態において、この比率は４０：６０である。特定の実施形態において、この比率は５０：５０である。特定の実施形態において、この比率は６０：４０である。特定の実施形態において、この比率は７０：３０である。特定の実施形態において、この比率は８０：２０である。特定の実施形態において、この比率は９０：１０である。特定の実施形態において、この比率は９９：１である。
【００７２】
特定の実施形態において、組成物は、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）を含む。特定の実施形態において、組成物は、ＦＳ−Ｉ／ＦＳ−ＮＧおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）を含む。
【００７３】
特定の実施形態において、組成物は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される３つ以上のポリメラーゼを含む。
【００７４】
特定の実施形態において、核酸の配列は、プライマー伸長産物を生成することによって決定され得る。例えば、特定の実施形態において、Ｓａｎｇｅｒ法を使用し得る（例えば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７４：５４６３−５４６７（１９７７）を参照のこと）。特定の実施形態に従って、本発明は、少なくとも２つのポリメラーゼを用いて標的核酸鋳型を配列決定するための方法を提供する。特定の実施形態において、この方法は、少なくとも１つの標的核酸鋳型、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチド、少なくとも１つのターミネーターおよび少なくとも２つのポリメラーゼを含む組成物を使用する。特定の実施形態において、二重鎖（二本鎖ポリヌクレオチド）は、組成物において標的核酸鋳型とプライマーとの間に形成される。特定の実施形態において、このプライマーは、標的核酸鋳型の所定の位置にハイブリダイズする。
【００７５】
組成物は、適切な反応条件下でインキュベートされ、その結果、１つ以上の伸長可能なヌクレオチドがプライマーの３’末端に連続して組み込まれる。特定の実施形態において、ターミネーターは、プライマー伸長産物に組み込まれ得、一旦組み込まれると、ポリメラーゼによるプライマーの３’末端へのさらなる組み込みを妨げる。特定の実施形態において、プライマー伸長反応によって生成されたプライマー伸長産物は、次いで、サイズに基づいて分離され得る。特定の実施形態において、核酸鋳型の配列は、この産物の特定のサイズおよび各産物のターミネーターの同一性から決定され得る。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、少なくとも２つのポリメラーゼ、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチドおよび少なくとも１つのターミネーターを含む。特定の実施形態において、この少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰおよびｄｄＴＴＰから選択される。特定の実施形態において、この組成物は、伸長可能なヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰおよびｄＵＴＰを含む。特定の実施形態において、この組成物は、伸長可能なヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰおよびｄＴＴＰを含む。特定の実施形態において、この少なくとも１つのターミネーターは、Ａターミネーター、Ｃターミネーター、ＧターミネーターおよびＴターミネーターから選択される。特定の実施形態において、この少なくとも１つのターミネーターはさらに、標識を含む。特定の実施形態において、この少なくとも１つのターミネーターはさらに、エネルギー転移蛍光染料（ＥＴＦＤ）標識を含む。特定の実施形態において、この組成物は、Ａターミネーター、Ｃターミネーター、ＧターミネーターおよびＴターミネーターを含む。特定の実施形態において、この異なるターミネーターの各々が、検出可能に異なる標識をさらに含む。特定の実施形態において、異なるターミネーターの各々は、検出可能に異なるＥＴＦＤ標識をさらに含む。特定の実施形態において、この組成物は、４つの異なるＥＴＦＤ標識化ターミネーター（例えば、ＥＴＦＤ標識化Ａターミネーター、ＥＴＦＤ標識化Ｃターミネーター、ＥＴＦＤ標識化ＧターミネーターおよびＥＴＦＤ標識化Ｔターミネーターをさらに含み、ここで各ＥＴＦＤは、検出可能に異なる。
【００７７】
特定の実施形態において、組成物はさらに、少なくとも１つの緩衝化剤を有する。特定の実施形態において、この少なくとも１つの緩衝化剤は、トリスおよびトリシンから選択される。特定の実施形態において、組成物はさらに、少なくとも１つの型の二価のカチオンを含む。特定の実施形態において、この少なくとも１つの型の二価のカチオンは、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋から選択される。特定の実施形態において、組成物はさらに、少なくとも１つの添加物を含む。特定の実施形態において、この少なくとも１つの添加物は、グリセロ−ルおよびＤＭＳＯから選択される。
【００７８】
特定の実施形態において、組成物は、２０μｌの反応容積中に、８〜９の範囲のｐＨを有する８０ｍＭのトリス；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０〜１０％  グリセロール；２００μＭ  ｄＡＴＰ；２００μＭ  ｄＣＴＰ；３００μＭ  ｄＩＴＰ；２００μＭ  ｄＵＴＰ；各々２５μＭ〜１２２５ｎＭのＥＴＦＤ標識化Ａターミネーター、ＥＴＦＤ標識化Ｃターミネーター、ＥＴＦＤ標識化ＧターミネーターおよびＥＴＦＤ標識化Ｔターミネーター；ならびに各々１．５〜６０単位の少なくとも２つのポリメラーゼを含む。特定の実施形態において、この組成物はさらに、サーモプラズマ乳酸菌無機ピロホスフェート（ＴＡＰ）を含む。特定の実施形態において、緩衝液、伸長可能なヌクレオチドおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖ．３．０  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号４３９０２３６）からのターミネーターを使用し、このキットのポリメラーゼを、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される少なくとも２つのポリメラーゼと置換する。
【００７９】
特定の実施形態において、標的核酸鋳型を配列決定するための方法が提供される。特定の実施形態において、このような方法は、以下の工程を包含する：標的核酸鋳型、少なくとも１つのプライマー、少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチド、少なくとも１つのターミネーター、および、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される少なくとも２つのポリメラーゼを含む組成物を形成する工程；ならびに適切な条件下で組成物をインキュベートして少なくとも１つのプライマー伸長産物を生成する工程。
【００８０】
特定の実施形態において、この方法は、サイクルシーケンシングを含み、この後、プライマー伸長反応および終止が続き、プライマー伸長産物が標的核酸鋳型から放出され、新しいプライマーがアニール、伸長および終止する。サイクルシーケンシングは、プライマー伸長産物の増幅のほんの１例である。特定の実施形態において、サイクルシーケンシングは、サーマルサイクラー装置を用いて実施される。特定のサイクルシーケンシング反応は、例えば、米国特許第５，７４１，６４０号；米国特許第５，７４１，６７６号；米国特許第５，７５６，２８５号；米国特許第５，６７４，６７９号；および米国特許第５，９９８，１４３号；に記載され、これらは、任意の目的で、本明細書中に参考として援用される。
【００８１】
サイクルシーケンシングにおいて、インキュベーションサイクルは、２つ以上のインキュベーションを含み、各インキュベーションが特定の時間の特定の温度を含む。特定の実施形態において、このようなインキュベーションサイクルの１つは、９５℃で２０秒間、それに続く５０℃で１５秒間、それに続く６０℃で４分間を含む。特定の実施形態において、サイクルシーケンシングは、２５回のインキュベーションサイクルを繰り返す工程を包含する。
【００８２】
特定の実施形態において、プライマー伸長産物は、移動度依存性分析技術、すなわちＭＤＡＴにより分離され得る。特定の実施形態において、このＭＤＡＴは、電気泳動である。特定の実施形態において、プライマー伸長産物を分離することによって、各産物のサイズおよびその３’末端にあるターミネーターの同一性に基づいて、鋳型核酸の配列を決定し得る。特定の実施形態において、ターミネーターが標識化ターミネーターである場合、３’末端にあるターミネーターの同一性は、標識の同一性によって決定される。
【００８３】
（キット）
本発明はまた、キットを提供する。特定の実施形態において、キットは、この方法を実行するのに使用される２つ以上の成分を評価することによって、目的の方法の性能を高めるのに役立つ。特定の実施形態において、キットは、エンドユーザによる測定に必要とされる量を最小化するために予め測定された単位量の成分を含む。特定の実施形態において、キットは、１つ以上の方法を実行するための説明書を含む。特定の実施形態において、このキットの構成要素は、互いに一緒になって操作されるように最適化される。
【００８４】
特定の実施形態において、キットは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｒ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ（Ｇ４３Ｄ；Ｆ６６５Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Δ２７１；Ｆ６６９Ｙ；Ｅ６８３Ｗ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８（Ｄ１８Ａ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６８Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  １Ｂ２１（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＧＫ２４（Ｇ４６Ｄ；Ｆ６６９Ｙ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｅ６８１Ｉ）、およびＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（Ｔ６６４Ｎ；Ｒ６６０Ｇ）から選択される、少なくとも２つのポリメラーゼを含む。
【００８５】
特定の実施形態において、このキットは、少なくとも１つの標的核酸鋳型を配列決定するために使用され得る。特定の実施形態において、このキットはさらに、少なくとも１つのターミネーターを含む。特定の実施形態において、少なくとも１つのターミネーターは、標識されたターミネーターである。特定の実施形態において、少なくとも１つのターミネーターは、ＥＴＦＤ標識化Ａターミネーター、ＥＴＦＤ標識化Ｃターミネーター、ＥＴＦＤ標識化ＧターミネーターおよびＥＴＦＤ標識化Ｔターミネーターから選択される。特定の実施形態において、キットは、さらなる成分を含み得、これらとしては、以下が挙げあれるがこれらに限定されない：少なくとも１つのプライマーおよび／または少なくとも１つの伸長可能なヌクレオチド。特定の実施形態において、キットはまた、コントロール反応を実施するための試薬を含み得、この試薬は、１つ以上の上記の成分および少なくとも１つの標的核酸鋳型を含み得る。
【００８６】
本発明のほかの実施形態は、本明細書中に開示される本発明の明細書および実施の理解から、当業者に明らかである。明細書および実施例が、例示のみとしてであり、添付の特許請求の範囲により示される本発明の真の範囲および精神を有する。
【国際調査報告】
2005517413.tif 000006
2005517413.tif 000007