(57)【要約】生物活性化合物又は化合物のファミリーが、多数の酵素活性を用いて細胞により生合成される。我々は、実質的に生物活性を欠くが、少なくとも１の第一の酵素活性（又は対応する酵素をコードする核酸）を有する宿主細胞を提供する。上記細胞は、上記細胞が生物活性化合物を産生することを可能にする少なくとも１の第二の酵素活性を提供するために発現可能である核酸で形質転換される。細胞のファミリーは多様な異なる核酸で形質転換されることができ、異なる生物活性産物を産生する細胞、及び生物活性産物を産生しない細胞を含む細胞ライブラリーをもたらす。形質転換された細胞は生物活性についてスクリーニングされうる。活性細胞は単離され、及び培養されることができ、及び生物活性化合物は単離されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の生物活性を有する生物活性化合物の製造方法であって、以下のステップ：
ａ）実質的に上記生物活性を欠くが、少なくとも１の第一の酵素活性又は上記生物活性を有する化合物をもたらす経路において機能的である少なくとも１の酵素をコードする核酸を有する宿主細胞を提供し；
ｂ）少なくとも１の第二の酵素活性を提供するために上記宿主細胞内において発現しうる核酸を上記宿主細胞に導入し；ここで、上記第一の及び第二の活性は共に、上記形質転換された宿主細胞が、潜在的に既知の生物活性を有する化合物を産生することを可能にし；そして
ｃ）上記生物活性についてスクリーニングする：
を含む前記方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｃ）が、全細胞培養物について行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｃ）が、前記培養細胞からの上清について行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｃ）が、前記細胞に由来する溶解産物又は抽出物について行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生物活性が、薬理学的活性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記生物活性が、抗微生物、抗真菌、抗癌、抗ウイルス、モチライド、殺虫、駆虫、除草、抗球虫、抗凝血、抗炎症、抗原生動物、抗血小板、抗高血圧、抗増殖、増殖、神経再生、毛髪成長促進、抗線維症、抗マラリア、抗プラズモディウム、抗脈管形成、抗コレステロール、細胞毒性、タンパク質阻害、タンパク質合成阻害、タンパク質活性化及び免疫抑制活性から選ばれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）上記スクリーニングにより同定された細胞を培養し；そして
（ｅ）前記生物活性化合物を単離する：
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞の一部が、それにより前記生物活性を有する１以上の化合物を産生することができるようになるように、多数の異なる核酸配列が、対応の多数の宿主細胞又は宿主細胞集団に導入され、前記スクリーニング・ステップは、前記細胞の同定をもたらす、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記の多数の形質転換された細胞が、多数の異なる生物活性化合物を産生することを可能にされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）１以上の生物活性物質の生合成に必要とされるタンパク質をコードする１以上の遺伝子を有するベクターを提供し；及び（ｂ）前記ベクター上の１以上の前記遺伝子を遺伝子操作して、前記１以上の遺伝子の異なって操作された変形を有する多数のベクターを作出することにより、前記多数の異なる核酸配列を製造するステップを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の中の少なくともいくつかが、対応の異なる活性化合物を産生することを可能にされるように、単一の核酸配列が、対応の異なる第一の酵素活性を含む又は提供する多数の細胞に導入される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１の第一の酵素活性が、二次代謝経路に寄与する活性である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１の第一の酵素活性及び／又は前記少なくとも１の第二の酵素活性が、グリコシル化、メチル化、酸化、ポリケタイド合成、異性化、エステル形成、エピ異性化、脱カルボキシル化、ラクトン化、アセチル化又は他のアシル化、アミン化、還元脱水素化、デオキシ糖合成、及び（例えば、ポリケタイド合成のための）スターター単位合成から選ばれる１以上の対応の活性を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第一の酵素活性及び第二の酵素活性が、グリコシル化及びポリケタイド合成を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１の第二の酵素活性は、生物活性物質の産生を引き起こす、前記少なくとも１の第一の酵素活性のための基質である物質の産生を引き起こす、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記の宿主細胞を提供するステップが前駆細胞を提供し、そしてそれを前記宿主細胞を作出するために遺伝子操作するステップを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物活性化合物が、ポリケタイド、非リボソームペプチド、混合されたポリケタイド−非リボソームペプチド、脂肪酸、テルペン、アルカロイド、アミノグリコシド、シキミ酸誘導体、フラボノイド、クマリン、ポリグリコシド、タンパク質、ポリサッカライド、フラボン及び他のフラボノイド、インドール及びピロールの如き窒素を含む化合物、アントラキノン、リグナン、クマリン、スチルベン、デプシペプチド、ペプチド及び核酸、ステロイド及び他のホルモンから選ばれる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物活性化合物が、ポリケタイドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂにおける前記核酸の導入が、クラスターのＰＫＳ遺伝子又はその誘導体を含むベクターを使用し；そして前記宿主細胞は、ベクターにコードされる生合成経路遺伝子と共に発現されたとき、所望の生物活性を与える生合成経路酵素を有する、相補的であるが特別に調製又は選択された宿主株の細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ベクターのＰＫＳ遺伝子が、遺伝子操作されている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞の前記酵素が遺伝子操作されている、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
事前決定された生物活性を実質的に欠くが、少なくとも１の第一の酵素活性又は上記生物活性をもたらす経路において機能的である少なくとも１の酵素をコードする核酸を有する宿主細胞に、核酸を導入することにより作出された組換え細胞であって；ここで、前記導入された核酸は、上記宿主細胞内で発現可能であり、少なくとも１の第二の酵素活性を提供し；ここで、前記第一の及び第二の活性は共に上記宿主細胞が、潜在的に既知の生物活性を有する化合物を産生することを可能にする、前記組換え細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、原核細胞及び真核細胞微生物並びに高等な真核生物の細胞から選ばれる、請求項２２に記載の組換え細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、原核細胞の、真菌の及び哺乳類の細胞から選ばれる、請求項２２に記載の組換え細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が放線菌細胞である、請求項２２に記載の組換え細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞はＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｏｆｌａｖｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｓａｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｃｈｅｉ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ Ｓｐ．、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｎｏｃａｒｄｉａ Ｓｐ．及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓから選ばれる、請求項２５に記載の組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は形質転換細胞の作出、検出及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
過去５０年間にわたり、製薬会社は、多くの重要な薬物の豊かな源として細菌、真菌、無脊椎動物及び植物により産生された天然産物のスクリーニングを使用してきた。これらの生物により産生された多くの化学物質は生物学的に活性であり、及び比較的高い割合がさらなる臨床試験制度を好結果で完了し及び商業的に売られている。実際、ワクチン及びモノクローナル抗体の如き生物製剤を無視した場合、認可された及び前ＮＤＡ候補薬物の６０％超が、天然産物である又はそれらに関連する。これらは、ヒトの健康用途においては；エリスロマイシン、テトラサイクリン、ペニシリン、プリスチナマイシン及びストレプトマイシンの如き抗菌剤、アムフォテリシン及びニスタチンの如き抗真菌剤、ＦＫ５０６、シクロスポリン及びラパマイシンの如き免疫抑制剤、タキソール、及びドキソルビシンの如き抗癌剤、ラミヴヂンの如き抗ウイルス剤及びロヴァスタチン及びプラヴィスタチンの如き抗コレステロール剤；農業用途においては；スピノシンの如き殺虫剤、アヴェルメクチンの如き抗寄生虫剤、バイアラフォスの如き除草剤及びモネンシン及びタイロシンの如き抗球虫成長促進剤を含む。企業は、新規生物学的活性のためにそれらの培養所蔵物及び天然産物ライブラリーをスクリーニングし続けているが、特に抗感染性の発見においては収穫逓減の感がある（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  （１９９７），  Ｅｄ．  Ｗ．  Ｒ  Ｓｔｒｏｈｌ）。活性を示す多くの新規化合物は広く同様の化学構造を有し、及び顕著に異なる活性スペクトルなしに現存の天然産物のクラスに属する（Ｂｉｎｄｓｅｉｌ  Ｋ．Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  ＤＤＴ，  ６，  ８４０）。より多くの天然産物又は天然分子に基づいた生成物を発見する必要があり、これは新規生物活性物質の発見を導くであろう（Ａｂｅｌ，  Ｕ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，  ６，  ４５３−４５８）。
【０００３】
最近の抗生剤支配に耐性な細菌株の出現は試験のためのより広い範囲の化合物を作出する必要性を増大させた。病原性細菌がこの耐性を獲得するスピードは商業的代替物の発展及び試験を大いにしのいでいる。同時に、薬物−タンパク質標的及び細胞プロセスについての私たちの理解における進歩は、製薬会社が自由に使える（多くの異なる生物活性にわたる）スクリーニングの数及び方法における指数関数的な増大をもたらした。典型的なスクリーニングプログラムはタンパク質標的又は全細胞分析若しくは全生物分析を含むであろう。薬物発見スクリーニングプログラムに加えて、同様の技術は農薬又はタンパク質を含むいくつかの他の商業的に有用な製品についても発展されてきた。ほとんどのこのスクリーニング研究はコンビナトリアルケミストリープログラムにおける調査により行われており、その多くは短期間に大量の化合物を作出する。しかしながら、今のところ、これらの化合物のほとんどは市場性の高い存在をもたらしていない。
【０００４】
伝統的なアプローチでは上記変化に遅れをとらないために天然産物の多様性を作出することは難しくなっている；コンビナトリアルケミストリープログラムは多数の化合物を作出しているが；天然産物発見グループはハイスループットスクリーニング装置を養うために必要とされる数を供給できていない。より大きな割合の天然産物候補物質が生物学的活性を示すであろうことがいつも認識されている一方で、科学者はコンビナトリアル化学者と同じようには数を作出することができていない。これらの企業により開発された勢力的な医薬スクリーニング系を利用するために天然産物ライブラリーにおいてより多くの化合物を作出する方法を開発する必要がある。さらに、天然産物はコンビナトリアルケミストリーを行うための鋳型に相当しうるので、それらは現存するコンビナトリアルケミストリープログラムにさらなる多様性の度合いを加えうる。
【０００５】
天然産物多様性の作出のための１のアプローチは地理学的及び生物学的なより広い範囲の源を研究することであった。例えば、植物により産生される天然産物の総数は５００，０００超であると見積もられ、その一部のみしか単離されていない。細菌及び無脊椎動物の両方である、海洋生物からの化合物もあまり提示されていない。しかしながら、これらの系から化合物生成についての条件を見つけることは困難であり、及び代替のアプローチが並行して必要とされる。現存の生物からより大きな範囲の物質の産生を誘発する媒体条件を操作することは、より多くの化合物数を作出するために使用されるもう一つの技術である。
【０００６】
これらの生物がなぜ研究室で培養されえないのかを決定する分子的相違は、異なるクラスの化合物を産生する可能性をも示しうるということを信じると、もう一つの鍵となる焦点は「培養不可能な」又は（海洋を含む）「環境の」生物の研究に基づいている。これらの化合物はより慣用の背景からのものとは異なる範囲の生物学的活性を示しうる。典型的に、上記プロセスはＤＮＡの大きな区画を抽出すること又は土壌若しくは他の環境又は異常なサンプルから抽出したＤＮＡの一部を増幅すること、及び培養されうる宿主内でそれらを発現させることを含む。これらの技術はいくつかの場合、元の生物の化合物生成を制御する制御カスケードを克服した。
【０００７】
しかしながら、生化学及び分子生物学における進歩、及び特に、天然産物産生を引き起こすｉｎ  ｖｉｖｏ生合成プロセスについての私たちの理解における進歩は、いくつかの新規薬物発見アプローチを導いてきた。二次代謝物生合成酵素の産生を担う遺伝子のクローニング及びシークエンシング、及び多くの場合これらの酵素は共にクラスターを形成するという発見は、新規構造を作出するために経路を操作する私たちの能力に広く影響し、及びしたがって、構造及び機能における多様性を増大させた。この仕事のほとんどはポリケタイド又は非リボソームペプチドの生合成に集中されてきた；これは部分的に、それらの広い範囲の生物学的活性とは別に、利害関係をもつ集団に強い収入の流れを提供し続ける、これらの化合物への商業的な興味を反映する。しかしながら、これらの特定の分野における研究者により開発された原理及び方法論は、原核細胞若しくは真核細胞微生物又はより高等な生物からの他の天然産物生合成系に同様に適用可能であることは明白である。
【０００８】
新規構造アナログ又は天然産物の多様性をもたらす、及びそのようにして作出された分子の多様性を製薬会社のスクリーニングプログラム及びハイスループット装置により利用されうる容易にスクリーニングできるフォーマットに移行しうる遺伝学的な理解及び方法論を利用しうる技術を開発する明白な必要性がある。私たちはポリケタイドの操作及びスクリーニングを本発明の背景にある原理の例示として使用するが、上記技術をこれらの系に限定することは意図されない。開示された方法論はいかなる種からのいかなる生合成経路にも適用可能である。
【０００９】
ポリケタイドはエリスロマイシン、テトラサイクリン、ラパマイシン、アヴェルメクチン、モネンシン、エポチロン及びＦＫ５０６の如き、抗生性または他の薬理学的特性を有する多くの化合物を含む天然産物の大きな及び構造的に多様なクラスである。特に、ポリケタイドはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及び関連する放線菌の如き土壌生物により豊富に産生される。それらは脂肪酸生合成のそれと類似の様式でアシルチオエステルの繰り返される段階的な縮合により合成される。天然ポリケタイドの間で見られる構造的多様性は、それぞれの縮合の後に形成されるβ−ケト基のプロセッシングの異なる程度からはもちろん、一部は「スターター」又は「エクステンダー」単位としての（通常）酢酸（マロニル−ＣｏＡ）又はプロピオン酸（メチルマロニル−ＣｏＡ）の選択から生ずる（他の型の単位の変形の１が場合により選択されうるが）。プロセッシング段階の例はβ−ヒドロキシアシル−への還元、還元後２−エノイル−への脱水、及び飽和アシル−チオエステルへの完全な還元を含む。これらのプロセッシング段階の立体化学的結果は鎖伸長のそれぞれのサイクルについても特定される。α−炭素での又は酸素置換基でのメチル化もときどき観察される。
【００１０】
ポリケタイドの生合成はポリケタイド合成酵素として知られる一群の鎖形成酵素により行われる。上記用語「ポリケタイド合成酵素」（ＰＫＳ）は、本明細書中で使用されるとき、ポリケタイドの生合成を担う酵素活性の複合体をいう。これらの酵素活性はβ−ケトアシルＡＣＰ合成酵素（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）、β−ケト還元酵素（ＫＲ）、脱水酵素（ＤＨ）、エノイル還元酵素（ＥＲ）及びチオエステラーゼ（ＴＥ）を含むが、これらの活性に限定されない。ポリケタイド合成酵素（ＰＫＳ）の２の広範なクラスは放線菌において示されている。マクロライドエリスロマイシン、オレアンドマイシン、アヴェルメクチン、及びラパマイシンのためのＰＫＳｓにより及びポリエーテルモネンシンのためのＰＫＳにより代表される、Ｉ型ＰＫＳｓと呼ばれる１のクラスは、ポリケタイド鎖伸長のそれぞれのサイクルのための酵素の異なるセット又は「モヂュール」から成るマルチドメインタンパク質である。例えば、図１を参照のこと（Ｃｏｒｔｅｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：１７６−１７８；Ｄｏｎａｄｉｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９１）  ２５２３：６７５−６７９；  Ｓｗａｎ，  Ｄ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  （１９９４）  ２４２：３５８−３６２；  ＭａｃＮｅｉｌ，  Ｄ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  （１９９２）  １１５：１１９−１２５；  Ｓｃｈｗｅｃｋｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９５）  ９２：７８３９−７８４３；また、特許出願  ＷＯ  ９８／０１５４６）。多数のＩ型ＰＫＳｓをコードする遺伝子はシークエンスされ、及びこれらの配列はＧｅｎｂａｎｋ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ及びＥＭＢＬを含む、公に入手可能なＤＮＡ及びタンパク質配列データベース中に開示される。例えば、配列は、数ある中で、それぞれ、エリスロマイシン（Ｃｏｒｔｅｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）  ３４８：１７６−１７８；アクセス番号  Ｘ６２５６９、Ｄｏｎａｄｉｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９１）  ２５２：６７５−６７９；アクセス番号  Ｍ６３６７７又はＵＳ  ５８２４５１３）；ラパマイシン（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （１９９５）  ９２：７８３９−７８４３；アクセス番号  Ｘ８６７８０）；リファマイシン（Ａｕｇｕｓｔ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９８）  ５：６９−７９；アクセス番号  ＡＦ０４０５７０）及びタイロシン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ，  アクセス番号  Ｕ７８２８９）の合成を支配するＰＫＳｓについて入手可能である。
【００１１】
ＩＩ型ＰＫＳｓと呼ばれる第二のクラスのＰＫＳは芳香族化合物のための合成酵素により代表される。ＩＩ型ＰＫＳｓは鎖伸長のための単一のセットの酵素活性のみを含み、及びこれらは連続するサイクルにおいて適切に再使用される（Ｂｉｂｂ，  Ｍ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  （１９８９）８：２７２７−２７３６；Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｄ．  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  （１９８９）８：２７１７−２７２５；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，  Ｍ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９２）  ２６７：１９２７８−１９２９０）。ＩＩ型ＰＫＳｓについての「エクステンダー」単位は通常酢酸（マロニル−ＣｏＡ）単位であり、及び特定のサイクレースの存在は完了した鎖が環状化して芳香族生成物になるための好ましい経路を決定する（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，  Ｃ．  Ｒ．  及び  Ｆｕｊｉｉ，  Ｉ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  （１９９５）  ４９：２０１−２３８）。場合により、特にオキシテトラサイクリン、フレノリシン及びダウノルビシンの生合成において、異常なスターター単位がＩＩ型ＰＫＳにより導入され、及びこれらの場合、別々のＡＴがスターター単位を上記ＰＫＳに移すために使用される。ハイブリッドポリケタイドは、クローニングされたＩＩ型ＰＫＳ遺伝子を含むＤＮＡを異なるＩＩ型ＰＫＳ遺伝子クラスターを含む他の鎖へ組み込むことにより、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒからの青色−色素ポリケタイドである、アクチノロヂンについての遺伝子クラスターに由来するＤＮＡをＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇａｌｉｌｅｕｓのアントラキノンポリケタイド−産生鎖に導入することにより得られている（Ｂａｒｔｅｌ，  Ｐ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  （１９９０）  １７２：４８１６−４８２６）。
【００１２】
他の型のポリケタイド合成酵素は存在するが、あまりよく研究されていない、しかし、多くの同様の生合成機構原理が適用するように見え、及びそれらは同様に遺伝子操作に影響を受けやすいようである。これらは、酵母の６−メチルサリチル酸合成酵素又はこれらの分子のポリケタイド部分の合成に必要とされる活性のほとんどを含む単一のマルチ−ドメインポリペプチドから成るＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓのロヴァスタチンＰＫＳの如き、真菌のＰＫＳを含む（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃ．  Ｒ．  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｉ  Ｉ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （１９９５）  ４９：２０１−２３８）。ＩＩ型真菌ＰＫＳも知られる。細菌を含む、他の生物のうち植物において多くのポリケタイドの生合成を担う、ＩＩＩ型ポリケタイド合成酵素又はカルコン合成酵素も知られる。最近、ポリケタイド及び脂肪酸生合成の間の類似は、微生物及び真核生物において不飽和脂肪酸生合成を担うＰＫＳ様脂肪酸合成酵素の発見でさらに強められた（Ｍｅｔｚ  Ｊ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９３，  ２９０−２９３）。Ｌｉｕ，  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９７，  １１７０、Ａｌｈｅｒｔ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７，  １１７３及びＫｗｏｎ，  Ｈ．−Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７，  １３２７を含めて、さらなる型のＰＫＳが示されている。
【００１３】
グラミシヂン、プリスチナマイシン及びバチトラシンの如きペプチド抗生物質、及び免疫抑制シクロスポリンの多様な配列を産生する非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）はＩ型ポリケタイド合成酵素と概念的に同様である。それらはチオ鋳型機構をとおした共通のモードの生合成を共有する大きなマルチドメインタンパク質を含む。Ｉ型ＰＫＳについては、それらはモヂュールで配置され、それぞれのモヂュールは上記ペプチドの１のアミノ酸の活性化、縮合及びプロセッシング（例えば、エピ異性化）を担う。それぞれのモヂュールは最終ペプチド生成物についてのアミノ酸配列に対応する。数ある中で、Ｉ型ＰＫＳｓのものについて使用されるのと同様の様式でのＮＲＰＳの遺伝子工学によるモヂュールの操作は、産生される最終的なペプチドの改変をもたらした（Ｍａｒａｈｉｅｌ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ９７，  ２６５１−２６７３，  Ｍｏｏｔｚ，  Ｈ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  ＰＮＡＳ，  ９７，  ５８４８−５８５３）。ＮＲＰＳは広い範囲の原核生物及び真核生物において見られる。混合されたＮＲＰＳ−ＰＫＳ系（すなわち、ポリケタイド及び非リボソームペプチドの成分を含むもの）はエポチロン、ブレオマイシン及び典型遺伝子クラスターラパマイシンの１を含んで存在する。
【００１４】
他の生合成系は、数ある中で、アルカロイド、テルペン、アミノグリコシド、シキミ酸誘導体、ポリサッカライド、フラボン及び他のフラボノイド、インドール及びピロールの如き窒素を含む化合物、ステロイド及び他のホルモン、アントラキノン、リグナン、クマリン、スチルベン、デプシペプチド並びにペプチド及びタンパク質を含む。これらの及び他の天然産物生合成系は同様に本明細書中に示される技術の使用に影響を受けやすい。
【００１５】
多数の治療的に重要なポリケタイドが同定されているが、高められた特性を有する又は完全に新規な生物活性を有する新規ポリケタイドを得る必要性が残っている。Ｉ型ＰＫＳｓにより産生される複合体ポリケタイドは、それらが駆虫薬、殺虫剤、免疫抑制剤、抗真菌又は抗菌剤のような既知の利用性を有する化合物を含む点で、特に価値がある。それらの構造的な複雑さのために、上記新規ポリケタイドは全部化学合成により又は既知のポリケタイドの化学的改変により容易に入手することはできない。所望される特定の変化は、組み込まれたスターター／エクステンダー単位の性質を変化させることによる炭素骨格についての変化、鎖伸長の後に起こる一連の還元段階を変化させることによるβ−ケト炭素の酸化レベルについての変化及びそれゆえ酸素置換基のパターン及び又は立体化学の変化、及び一般的に、例えば、ポリケタイド分子の水酸化、メチル化又はグリコシル化を含むＰＫＳ後「改変」段階についての変化である。
【００１６】
元の天然産物の新規構造アナログを作出するためにＩ型ＰＫＳを操作するいくつかの方法が示されている。上記合成酵素により形成されるポリケタイド鎖の長さは、エリスロマイシン生合成の場合には、鎖放出チオエステラーゼ／サイクレース活性を含むエリスロマイシン産生ＰＫＳの酵素ドメインの遺伝子工学を用いた特定の再配置により変えられている（Ｃｏｒｔｅｓ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９５）  ２６８：１４８７−１４８９；  Ｋａｏ，  Ｃ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  （１９９５）  １１７：９１０５−９１０６）。
【００１７】
（６−デオキシエリスロノリド  Ｂ合成酵素、ＤＥＢＳとしても知られる）エリスロマイシ産生ＰＫＳのモヂュール５におけるケト還元酵素ドメインの部分をコードするＤＮＡのフレーム内欠失は、エリスロマイシンアナログ５，６−ヂデオキシ−３−オマイカロシル−５−オキソエリスロノリドＢ及び５，６−ヂデオキシ−５−オキソエリスロノリドＢの形成を引き起こすことが示されている（Ｄｏｎａｄｉｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９１）  ２５２：６７５−６７９）。同様に、対応するＰＫＳをコードするＤＮＡの遺伝子工学による、ＤＥＢＳにおけるモヂュール４のエノイル還元酵素ドメインにおける活性部位残基の変換及びそのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａへの導入は６，７−アンヒドロエリスロマイシンＣの産生を引き起こす（Ｄｏｎａｄｉｏ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９３）  ９０：７１１９−７１２３）。新規ポリケタイド構造を与えるポリケタイド合成酵素の工学の多くの他の例は公に入手可能な文献において示される。
【００１８】
特許公開ＷＯ  ９８／０１５４６及び米国特許第５８２４５１３号はＩ型ＰＫＳ酵素を操作するさらなる方法を示す。特許公開ＷＯ／００／０１８２７はＰＫＳを操作し、β−炭素の酸化状態を変化させるさらなる方法を示す。エリスロマイシン産生ＰＫＳのモヂュール２の還元ドメインをラパマイシンＰＫＳモヂュール１０及び１３由来のドメインで置換することはそれぞれ、Ｃ１０−Ｃ１１オレフィン−エリスロマイシンＡ及びＣ１０−Ｃ１１ヂヒドロエリスロマイシンＡの形成を引き起こす。米国特許第６２００８１３号はポリケタイド骨格を操作する方法を示す。特許公開ＷＯ  ００／００５００は特定のスターター単位でマクロライドを作出する新規方法を示す。特許公開ＷＯ  ０２／１４４８２は上記ＡＴドメインの基質特異性を変換する方法を示す。数ある中で、米国特許第５９９８１９４号、及びＧａｉｓｓｅｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ３６，  ３９１−４０１は完了したポリケタイド鎖をプロセスするさまざまな酵素の操作方法を開示する。生化学経路の同様の操作は非リボソームペプチド合成酵素系について示されている。
【００１９】
ＰＫＳの組換え作出及び続くポリケタイドの産生が示されている；多くの例が異種の又は天然の系において入手可能である。初期研究においては、エリスロマイシンＰＫＳのＤＥＢＳタンパク質のそれぞれはＥ．  ｃｏｌｉにおいて発現されたが、この場合、ＡＣＰは不活性であったようだ（Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｇ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２１４，  ３０５−３１１）。関連する方法が、上記ＡＣＰを活性化するためのホロ−ＡＣＰ合成酵素を伴う、全ての３のＤＥＢＳタンパク質の共発現、及び追加的に細胞を単純な前駆分子を提供するよう操作することにより、操作されたＥ．  ｃｏｌｉ細胞においてエリスロマイシンアグリコン６ＤＥＢを作出するために、最近使用されている（Ｐｆｉｅｆｅｒ，  Ｂ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１，  １７９０−１７９２）。米国特許第６０３３８８３号は細菌及び酵母における産生方法を示す。Ｋｅｎｎｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８４，  １３６８−７２）はロヴァスタチンＰＫＳの異種の産生及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓにおける生合成中間体の産生を示す。
【００２０】
指定突然変異及びクローニングされたＰＫＳ遺伝子の発現を許容する宿主ベクター系が開発されている（ＭｃＤａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９３，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１５４６−１５５０；Ｋａｏ  ｅｔ  ａｌ  １９９４  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：５０９−５１２）。このベクター系はａｃｔＩ／ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーター系の使用に頼り、及びＳ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおいて使用される。このベクター系はポリケタイド、特にＩＩ型ポリケタイドのより効率のよい作出方法を開発するために使用されている（米国特許第５６７２４９１号，特許公開ＷＯ９５／０８５４８，  米国特許第５７１２１４６号、米国特許第５８３０７５０号、米国特許第５８４３７１８号、米国特許第５９６２２９０号、米国特許第６０２２７３１号、米国特許第６０７７６９６号）。この系はＩ型ポリケタイド産生のために使用されている、しかしながら、それは（通常不活性な）ポリケタイド骨格の産生にのみ関与している。
【００２１】
ａｃｔＩ／ａｃｔＩＩ−ｏｒｆ４プロモーターは、ＷＯ９８／０１５４６及びＲｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｇｅｎｅ，  ２１６，  ２１５−２２３中に示されるように、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａにおいて異種でも使用されている。
【００２２】
特許公開ＷＯ  ９８／４９３１５、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０８７９２及びＷＯ  ００／６３３６１及びＸｕｅ，  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＰＮＡＳ，  ９６，  １１７４０−１１７４５は、ポリケタイド合成酵素遺伝子を操作してポリケタイドのコンビナトリアルライブラリーを作出する新規方法を示し、これもまた単に不活性なポリケタイド骨格の作出に関連する。これらの発現方法論の特定の欠点は、ほとんどの場合、単離されたＰＫＳ産物は生物学的に活性な種を作出するためにさらに形質転換されなければならないことである。
【００２３】
遺伝的に形質転換された生物の作出及びスクリーニングについてのいくつかの方法が開示されている。特許公開ＷＯ９９／６７３７４及びＳｏｓｉｏ，  Ｍ．  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８，  ３４３−３４５は天然宿主から代替の生物への、天然産物の産生を担う全遺伝子クラスターの移行と特に関連する。これは、二次代謝物を産生する能力を元の産生者から所望の特性、例えば、形質転換又は培養の容易さを有する他の産生宿主に移すことによる、天然産物の作出及び操作方法を開示する。上記発明は、便利な中性のクローニング宿主と産生宿主との間で往復しうるＢａｃｔｅｒｉａｌ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  （ＢＡＣｓ）（ＢＳＡＣｓと呼ばれる、Ｅ．  ｃｏｌｉ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）の使用に特に関連する。これらのベクターはＤＮＡの大きな（例えば、生合成クラスター全部の）断片を含む能力を有する。高分子量ゲノムＤＮＡのライブラリーがこれらの染色体において産生され、及びＥ．  ｃｏｌｉ及び天然産物の合成を方向付けるクローンについて選択するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ産生宿主の間で往復される。あるいは、天然産物の合成を方向付けるＤＮＡの大きなセグメントは人工染色体を利用してドナー生物のゲノムから再構築される。米国特許第５８２４４８５号、同第５７８３４３１号、及び同第６２４２２１１号（Ｃｈｒｏｍａｘｏｍｅ）は分子多様性を作出する及びスクリーニングするための薬物発見系を示す。上記特許は遺伝子発現ライブラリーを作出する及び操作する方法を示す。それらは薬物リード、特に天然では実質的な量で回収されえない又は研究室で培養されえない（「培養不可能な」）ものの、予想される源である生物の遺伝子材料の主にランダムな部分の捕獲及び分析に主に関連する。例えば、ランダムな連鎖又は再結合による、これらのライブラリーにおける多様性をバイアスさせる又は作出する方法も開示される。米国特許第５９５８６７２号、同第５９３９２５０号、同第６０５７１０３号、同第６０３０７７９号、及び同第６１７４６７３号はライブラリー構築、ＤＮＡ、またここでも主に培養不可能な生物に由来するゲノムＤＮＡのスクリーニング及び操作についての同様の技術を開示する。米国特許第５８３７４７０号、同第５７７３２２１号、及び同第５９０８７６５号は環境サンプルを用いて作出された組換え生物からの生物学的分子の回収方法を示す。Ｓｅｏｗ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １７９，  ７３６０−８は土壌ＤＮＡからのランダムＰＫＳ遺伝子のクローニング及び発現方法を議論する。
【００２４】
これらの方法は「超宿主」法と呼ばれうるものに頼っており、そこでは生合成クラスター全部が産生のための代替の、ときには（例えば、代替のクラスターの除去により）遺伝的に「きれいにされた」株に移される。上記株の使用は培養不可能な生物からの全経路の発現を多いに助ける又は競合する化合物の産生を減少させる。上記宿主細胞は単に導入された遺伝子材料が機能しうる「バッグ」として使用され、上記細胞は主要な代謝経路から共因子又は単純な前駆分子を提供しうるが、上記活性分子の生合成にはあまり参加しない。
【００２５】
宿主細胞へのＤＮＡのランダムクローニングを利用した、開示された技術は欠点を有する。天然産物クラスターの大きさはしばしば最近のクローニング／発現ベクターの天然の限界を超え、そのため、系の開発は、より大量のＤＮＡを有しうる細菌の人工染色体を利用する。しかしながら、例えば、独特の制限酵素部位がまれであるために、それらの全体の大きなサイズが上記経路の容易な遺伝子操作を阻害するので、上記分野において開発された技術を利用した多くの所望の生合成経路操作は上記ベクターにおいて可能ではない。さらに、いくつかの生合成経路は宿主細胞におけるゲノムＤＮＡの単一の断片からの完全にクラスター化された除外再構成ではない。それゆえ、活性生成物を作出するが単一のベクター上の全生合成経路の挿入に頼らない薬物発見又はスクリーニング方法はかなりの利点がある。
【発明の開示】
【００２６】
発明の要約
本発明は、生合成経路からの遺伝情報を利用した、新規でありうる生物活性物質の調製及び検出方法に関する。
【００２７】
（それが生物活性物質を発現するために）所望の生物活性を有する細胞を作出するために、所望の生物活性を有しない（又は少なくとも、実質的な程度で有しない）が、少なくとも１の所望の生物活性の作出に寄与しうる第一の活性を有する細胞が選択される又は調製される。この第一の活性は上記細胞が所有する核酸の発現から生じうる。上記第一の活性は、例えば、グリコシル化活性でありうる。少なくとも１の第二の活性をコードする遺伝子材料は上記細胞を形質転換するために使用され、それによりそれが上記第二の活性を獲得する。上記第二の活性は直接的に又は間接的に上記第一の活性の基質である材料の産生を引き起こし、（直接的に又は間接的に）前記生物活性物質をもたらしうる。細胞は生物活性について直接的にスクリーニングされうる。上記宿主細胞は標的生物活性を全く有しないことが好ましいが、形質転換の効果（すなわち、上記第二の活性の導入）が明らかに区別可能である場合は低いバックグラウンド値は許容可能でありうる。
【００２８】
上記第二の活性は生物活性物質又はその前駆体の構成部分（例えば、ペプチド又はタンパク質成分）である種の産生を直接的に引き起こしうる。あるいは、それは１以上の（例えば、ポリケタイド合成酵素又はその部分である）酵素活性を有する種の産生を引き起こすことができ、その酵素活性は構成部分又は前駆体の産生に関連する。もちろん、既に上記細胞が所有する活性及び導入された活性の役割は逆にされうる。
【００２９】
典型的に、１以上の天然に産生される物質の生合成を担うタンパク質をコードするいくつかの（又は全ての）遺伝子は単一のベクター上におかれる。その後上記経路を遺伝子操作する及びそれを又は操作された誘導体を他の系に移すことが可能である。導入された遺伝子材料と共にはたらきうる生合成経路酵素をコードする遺伝子を有する相補的な宿主への移行は生物学的に活性な物質の産生を引き起こす。そうでなければ上記生物学的活性を有する物質を産生しない相補的な宿主細胞の使用は、形質転換された細胞が直接的にこの生物学的に活性な物質の産生についてスクリーニングされることを許容する。この方法論は新規化学種を作出するための多くの型の天然産物の生合成又は他の生合成経路の操作、分析及びスクリーニング、及び特にさまざまな分子生物学的方法により生合成クラスターに導入されうる多様性のスクリーニングのために適用可能である。上記多様性を生合成経路に導入する新規方法も提供される。
【００３０】
天然産物の新規構造アナログをもたらす及び上記方法により作出される分子的多様性をさまざまなバイオテクノロジー又は製薬会社により開発されているスクリーニングプログラム及びハイスループット装置を利用しうる容易にスクリーニングできるフォーマットに移行しうる、遺伝的理解及び方法論を利用しうる技術を開発する必要性がある。実際に、これは顕著なさらなる操作なしに、直接的に遺伝子操作された細胞からの生物学的に活性な化合物の作出及び分析を意味する。これは生合成経路を遺伝子操作すること、操作された経路を導入された経路酵素と一斉にはたらく細胞に導入すること、及び新規生物活性について形質転換された細胞を直接的にスクリーニングすることにより容易に達成されうる。
【００３１】
天然産物生合成の領域においては、特に遺伝学的又は分子生物学的技術を用いて新規分子を作出する方法が開発されている領域、及び特に非リボソームペプチド及びポリケタイドの生合成においては、新規生物活性を作出する及びスクリーニングするための新規方法を開発するこの必要性は急激である。この場合、全ての又は大きな断片のハイブリッドＰＫＳ遺伝子が生存可能であり、及び所望の完全にプロセスされた及びそれゆえさらなる形質転換の必要性なしに形質転換された細胞において直接的にスクリーニング可能な活性産物を産生するように、実際に個々のモヂュールを展開させる信頼できる及び特定の方法を開発する必要性がある。特に背景の分野において示されるような組換えＤＮＡ技術及びｄｅ  ｎｏｖｏ生合成を利用した、これらのハイブリッドＰＫＳｓを作出するためのさまざまな及び多くの策が示されている。しかし、通常、これらの技術を用いて作出される化合物は伝統的な発酵及び化学的／可視的分析を用いて分析されている；化合物の活性を評価する生物学的分析は上記プロセスのもっと後に行われる。したがって、本発明はこれらの技術における新規改良及び特に実用可能な様式で上記分野においてこれらの大きな進歩を利用する方法を示す。（ランダムに又はそうではなく）操作されたＰＫＳ又は他の生合成経路を含む何百、何千もの株を含む全ライブラリーを発酵させる及び化学的にスクリーニングすることは実行可能ではない。活性産物の直接的な産生について設計された系は、真正のコンビナトリアル様式で作出された経路が容易な及び速い様式で分析されることを可能にする。活性種にするためのさらなる生物形質転換の段階を必要としないで、操作された生成物の直接的なスクリーニングを許容する方法を開発する必要性が特にある。多くのポリケタイドは、例えば、プロセッシング酵素により改変されるまでは生物学的に活性ではない。ポリケタイド生合成機構の理解又は「コンビナトリアル生合成」と呼ばれているものをとおした新規ポリケタイド構造の開発における多くの発展は、さらなる精製及び生物形質転換を伴わない活性についてのそれらのスクリーニングを効果的に除外する、不活性なマクロライド核のみを利用して又はあるいは形質転換体を発酵させること及びバイオアッセイ及びＬＣＭＳ分析のための粗い抽出物を作出することにより行われてきた（Ｔａｎｇ  Ｌ．  ａｎｄ  ＭｃＤａｎｉｅｌ  Ｒ．  （２００１）  ９７，  １−９）ということに特に注目すべきである。これらの方法との特別な相違は、本発明がＰＫＳ産物の直接的なｉｎ  ｖｉｖｏ改変を許容し、活性化合物を与え、したがって細胞の直接的なスクリーニングを許容する点である。スクリーニングの容易さは使用可能なコンビナトリアルライブラリーの死活に関わる特性である。それらが産生後に生物活性を与えるために生物形質転換されなければならない場合、可能ではあるが、株ライブラリーからの大量の化合物をスクリーニングすることはあまり実行可能ではない。直接的な活性スクリーニングは既に開発されているハイスループット法を利用して、新規に作出された株が標準のフォーマットで分析されることを許容する。生物学的スクリーニングは伝統的な化学分析法より敏感でありうる。
【００３２】
さらに、上記アプローチの他の利点がある。例えば、遺伝子置換は困難である及び時間を費やすものである又はありうるので、どの所望の変化のためにも遺伝子置換を必要としない様式でＰＫＳ／ハイブリッドＰＫＳｓを作出する及び発現する方法を開発する必要性が特にある。活性についての直接的なスクリーニング形質転換体は、上記形質転換体を選択するために使用されるマーカーに加えて、さらに遺伝子構築物を実証する方法を提供する。それは変異を蓄積した又は組換え若しくは欠失を経験した遺伝子構築物、ＰＫＳ又はＮＲＰＳ遺伝子クラスターにおいて遭遇されるような高い反復性のＤＮＡを用いるときの特別な問題の速い検出を許容する。直接的に形質転換体をスクリーニングすることは、生物活性産物を単離するための発酵の前に、よりよく産生する細胞又はコロニーがより不十分な生産者からスクリーニングされることを許容する利点を有する。形質転換の多くの方法（特に、プロトプラスティング）は追加の遺伝子破壊及びその結果としての生成物収率における減少又は実際に増大を引き起こしうるということが一般的に認識されているので、これは、例えば、放線菌の分野において特に有用性がある。したがって、多くの操作された形質転換体からの産生値についての速い生物学的スクリーニングを許容する方法は、問題のある株をスクリーニングアウトするのを助けうるので、大きな有用性がある。
【００３３】
本発明は、ＤＮＡの全部又は大部分が相補的な宿主−ベクター対系の使用によるスクリーニングのために代替の、しばしば遺伝的にきれいにされた株に移される点で、「超宿主」型技術とは異なる。私たちの系では、上記ベクターは一般的に上記経路又は操作された誘導体の一部を含み、及び上記株はスクリーニングされうる生物活性化合物を産生する生合成経路の化学生成物を活性化することができるよう特異的に選ばれる。さらに、本発明の特に好ましい態様においては、導入されたＤＮＡの性質についてのより高いレベルの情報が知られているであろうということが予見される、すなわち、単にランダムなゲノムＤＮＡ又はバイアスされたゲノムライブラリーでなく。例えば、多くの場合、上記導入された経路の遺伝子材料は、それが宿主細胞中で活性であるために選択される特異的なプロモーターの後ろに設計されているであろう。それは指定された様式で、例えば、ドメインの置換又は部位特異的突然変異により又はランダムな様式で、例えば、エラーしやすいＰＣＲ、トランスポゾン等を用いたランダム突然変異の導入により、しかしこれらの技術に限定されないで、いくつかの方法で操作されたものでありうる。多くの場合、上記ＤＮＡ配列の多くは既知であるようである。さらに、導入された材料が宿主細胞中に含まれる生合成酵素と一斉にはたらくことの必要性は、導入されたＤＮＡのもっともらしい機能についてのより大きなレベルの知識を意味する。また、本発明の必須事項ではないが、いくつかの態様において上記ＤＮＡは染色体統合により導入される。転写産物又は下流の極性効果との問題を避けるために、シングルクロスによりＤＮＡを導入するときは、実験設計においてかなりの注意が払われなければならないことは当業者に周知である。挿入するＤＮＡ上にホモロジー領域を提供する必要性もある。逆に、本発明においては、宿主細胞は活性化合物の産生において役割を果たすよう特異的に選ばれる；「超宿主」技術を利用して研究者により最近使用されているよりも、非常に広い範囲の宿主細胞が利用されるであろうということが予見される。本発明に必要なことは、宿主細胞が少なくとも１の酵素活性をスクリーニングされる生物活性に寄与させることである。この必要性は、クローニングベクターの大きさの限界又は生合成経路が２の遺伝子座にわたって分かれている状況を克服することを助けるのみでなく、操作された経路がそれぞれ異なる調節酵素（単数）又は酵素（複数）を有するある範囲の細胞に導入されうることが意図されるので、本発明を用いた多様性についての可能性を多いに増大させる。それゆえ、生合成経路の一部を含む多様なライブラリーは上記ライブラリーをある範囲の細胞に移すことによりさらに多様性を与えられることができ、その細胞のそれぞれのセットは活性について直接的にスクリーニングされうる。
【００３４】
したがって、第一の局面において、本発明は核酸を細胞に移し、及び直接的に生物活性についてその細胞をスクリーニングすることにより、生物学的に活性な生成物を作出する方法：
ａ）標的生物活性を欠くが、その活性を示すであろう分子の生合成に寄与するであろういくつかの酵素活性を有する宿主細胞の選択又は創出
ｂ）この細胞への、生合成経路の一部をコードするＤＮＡの導入
ｃ）上記細胞の生育及び標的生物活性についてのスクリーニング
ｄ）場合により、例えば、化学分析のための、生産的な又は問題の細胞からの標的生物活性の単離
を含む方法を提供する。
【００３５】
さらなる局面において、本発明は生物活性についてスクリーニングされうる核酸で形質転換された宿主細胞を提供し、ここで、移された核酸上にコードされる生合成経路構成成分は生物活性を有する化学構造の１部分を産生する、及び上記宿主細胞内にコードされる生合成経路構成成分は上記化学構造の代替の部分を産生する。宿主細胞は生物活性分子の生合成に寄与する特定の酵素活性の存在について選択される。好ましい宿主細胞はユーバクテリア及び古細菌の如き原核細胞微生物、真菌、藻類及び原生動物の如き下等な真核細胞微生物、及び植物及び動物の如き高等な真核生物を含む。宿主細胞は単細胞の又は多細胞の生物に由来しうる。ｉｎ  ｖｉｖｏで培養され又は遺伝子操作された細胞を含むどんな細胞型も使用されうるが、ただし、上記細胞は所望の生物活性の生合成に寄与する酵素活性を有しなければならない、及び標的生物活性を欠いていなければならない。特に好ましい細胞は原核生物又は真菌細胞又は哺乳類細胞である。好ましい宿主細胞は原核生物、より好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅ．  ｃｏｌｉ．の如き宿主細胞株である。さらにより好ましくは、上記宿主細胞は放線菌、さらにより好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｏｆｌａｖｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｓｐｉｎｏｓａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｓａｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｃｈｅｉ、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ Ｓｐ．、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｎｏｃａｒｄｉａ Ｓｐ．及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓの如き株である。好ましい宿主細胞の代替のシリーズは真核生物であり、特に好ましい宿主は哺乳類、植物、酵母又は真菌細胞である。さらにより特に好ましい真核宿主細胞は真菌株、より好ましくはＡ．  ｔｅｒｒｅｕｓ及びＡ．  ｎｉｄｕｌａｎｓの如き株である。
【００３６】
宿主細胞が有する酵素活性を考慮すると、典型的にマロニル−ＣｏＡ又はアミノ酸の如き前駆分子、主要な又は中心的な代謝の酵素により典型的に作出される成分の産生を引き起こす酵素活性を含むことは意図されない。私たちは、典型的に二次代謝経路に寄与する活性、例えば、グリコシル化、酸化、デオキシ糖生合成等、しばしば、しかし必然的ではなく、その経路の他の成分とクラスター化される活性に関与する。これはポリケタイドの異常なスターター単位生合成又は異常なエクステンダー単位の活性（すなわち、メトキシマロニルＣｏＡ合成）を含むであろう。
【００３７】
さらに宿主細胞選択プロセスは、さらに上記宿主細胞内の遺伝子を欠失する若しくは不活性化する又は追加する若しくは操作する任意の段階を含む。これらの遺伝子はいくつかの生物活性の産生に関与し又は所望の生物活性のプロセッシングに関与しうる。
【００３８】
さらなる局面において、本発明は生物活性を産生するプロセスを提供し、そのプロセスは上記に定義されるプロセスにより同定された形質転換された宿主細胞を培養すること及びそのようにして産生された生成物を単離することを含む。好ましい生物活性は生物学的にスクリーニングされうる活性である。特に好ましい生物活性は、数ある中で、抗細菌、抗真菌、抗癌、抗ウイルス、モチライド、殺虫、駆虫、除草、抗球虫、抗凝血、抗炎症、抗原生動物、抗血小板、抗高血圧、抗増殖、増殖、神経発生、毛髪成長促進、抗線維症、抗マラリア、抗プラスモディウム、抗脈管形成、抗コレステロール、細胞毒性、タンパク質阻害、タンパク質合成阻害及び免疫抑制を含む。
【００３９】
さらなる局面において、本発明は本明細書中に開示されるプロセスのいずれかにより得られうる新規生物活性生成物を提供する。これらの新規生物活性分子は生物学的にスクリーニングされうる生物学的に活性な分子を含む。特に好ましい生物学的に活性な分子は小分子又は巨大分子である。好ましい小分子は天然産物、さらにより好ましくは二次代謝物である。特に好ましい二次代謝物はポリケタイド、非リボソームペプチド、混合されたポリケタイド−非リボソームペプチド、脂肪酸、テルペン、アルカロイド、アミノグリコシド、シキミ酸誘導体、フラボノイド、クマリン、タキソール、ステロイド及び他のホルモンを含む。好ましいポリケタイドはＩ型若しくはＩＩ型又は真菌のポリケタイド合成酵素により産生されるものである。Ｉ型ＰＫＳにより産生されるポリケタイドの例はエリスロマイシン又はピクロマイシンの如き１４−員のマクロライド、タイロシンの如き１６−員のマクロライド又はアヴェルメクチン、ラパマイシン、リファマイシン、ソラフェン、スピノシン、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ボレリヂン、ジェルダナマイシン、アンサミトシン、メイタンシン、ハービマイシンの如きマクロライド又はアムフォテリシン、ニスタチン若しくはピマリシンの如きエポチロンポリエン、モネンシン若しくはサリノマイシンの如きポリエーテルを含む。ＩＩ型ＰＫＳにより産出されるポリケタイドの例はダウノルビシン、オキシテトラサイクリン又はミトマイシンを含む。真菌のＰＫＳにより産生されるポリケタイドの例はロヴァスタチンを含む。好ましい巨大分子はタンパク質、酵素、ペプチド、ポリサッカライド、ポリグリコシド、核酸を含む。強調のために、本発明の必要事項は、宿主細胞及び形質転換ＤＮＡの両方が最終的な生物学的活性に寄与することである。巨大分子の場合、これは、例えば、グリコシル化、メチル化、リン酸化、アセチル化又はサブユニットの追加により達成されうる。これらの活性は上記細胞にあり、及び上記巨大分子は挿入されるＤＮＡの発現により導入されうる又はその逆でありうる。
【００４０】
さらなる局面において、本発明は本発明を行うのに好適なベクター系を提供する。上記ＤＮＡを上記細胞に導入するために好ましい宿主ベクター系及び方法は当業者に知られる。これらは数ある中で、プラスミドベクター、ＢＡＣｓ及びコスミドを含む。ベクター系は上記宿主と融和性でなければならない。複数の生物において維持されうるシャトルベクターの使用は有益でありうる。１以上の遺伝子が前記宿主細胞において発現されることが必要とされるとき、どのようにして全ての必要とされる遺伝子産物の調和した発現を引き起こす方法でこの目的を達成するかについて、多くの方法が当業者に容易に生ずるであろう。これらのベクターに挿入される好ましい核酸は、ポリケタイド合成酵素、非リボソームペプチド合成酵素、グリコシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、チトクロームＰ４５０、デオキシ糖生合成経路、テルペンサイクレース及びシキミ酸経路酵素をコードする遺伝子の如き、生合成経路に参加する酵素をコードする核酸である。
【００４１】
さらなる局面において、本発明はライブラリーを作出する及びそれを１以上の所望の生物活性についてスクリーニングする方法：
ａ）その又はそれぞれの標的生物活性を欠くが、その活性の生合成に寄与するであろういくつかの酵素活性を有する宿主細胞の選択又は創出
ｂ）核酸ライブラリーの作出
ｃ）それぞれ異なる核酸を含む多数の細胞を作出するための、核酸の上記細胞への導入
ｄ）上記細胞の生育及びその又はそれぞれの標的生物活性についてのスクリーニング
ｅ）場合により、上記細胞の培養及び標的生物活性を産生する細胞からの生物活性産物の単離
を含む方法を提供する。
【００４２】
好ましい態様において、上記ライブラリーは、一般的にそれぞれの異なる細胞又は細胞集団から、少なくとも２の生物活性産物、より好ましくは少なくとも１０の生物活性産物、より好ましくは少なくとも５０の生物活性産物及びさらにより好ましくは少なくとも１００の生物活性産物を産生する。上記ライブラリーにおける細胞は生物活性の量、強度又は型においても異なりうる。
【００４３】
プロセスは所望の生物活性を産生する宿主細胞を単離すること及びそれをさらに上記生成物が大量に作出されうるように処理する（例えば、上記細胞を培養する及び産生された生成物を単離する）ことを含む。
【００４４】
特に好ましい型の態様において、本発明は組換え合成によりケタイド、特に１２−、１４−、１６−又はより大きな員の環状マクロライドの如き新規ポリケタイド、ポリエーテル又はポリエンを調製する及び検出するための（酵素系、核酸、宿主細胞、ベクター及び培養物を含む）プロセス及び材料に、及びそのようにして作出される新規ポリケタイドに関する。異なるポリケタイド生合成遺伝子クラスターに由来しうる、ポリケタイド生合成クラスター遺伝子又はその部分は、通常予想される構造の、及び生物学的活性を与えるようにポリケタイド鎖を作出する又は調節することのできる株において発現される１２−、１４−及び１６−員のマクロライドの如き、特定の新規ポリケタイドの産生を許容するように操作される。
【００４５】
１の好ましい型の態様において、本発明は（ａ）クラスター又は誘導体のＰＫＳ遺伝子を含むベクター及び（ｂ）上記ベクターにコードされた生合成経路遺伝子と共に発現されたとき、所望の生物活性を与えるであろう、生合成経路酵素を有する相補的であるが特異的に調製された又は選択された宿主株の使用に関する。しかしながら、いくつかの他の潜在的な組み合わせは当業者に容易に起こるであろう。例えば、一般的にポリケタイド鎖形成の後にはたらく酵素、例えば、１以上のグリコシルトランスフェラーゼ、ＴＤＰ−糖への経路、チトクロームＰ４５０、及びメチラーゼを含むベクターは、それらがはたらくであろうポリケタイドを産生するＰＫＳを発現する宿主株と共に使用されうる。あるいは、逆の場合、上記株はポリケタイド合成酵素又は操作された誘導体を作出することができ、及び上記ベクターは一般的にポリケタイド骨格形成の後にはたらく生合成経路酵素を含む。あるいは、株はＰＫＳの一部を、及び上記形質転換ベクターは上記ＰＫＳの他の部分を有しうる。これはいくつかの形態をとりうる；上記株は１以上のＰＫＳオープンリーディングフレームにおいて欠失し、及びベクターはこれらのリーディングフレーム（又は誘導体）を発現するために使用されうる。上記株はＰＫＳの退化した部分、あるいは不完全な部分を有し、及び上記ベクターは上記ＰＫＳの残りの部分を発現するために使用されうる。あるいは、上記株は上記形質転換ＰＫＳに改変されない又は関与されないこともありうる。リーディングフレームを維持する、並びに転写を維持する及び極性効果を避けるために、上記株及び導入される遺伝子材料の正確な設計の必要性はしばしば特定の細胞型に因るであろう、上記考慮は当業者に知られるであろう。
【００４６】
本発明のある態様において、上記株は上記ベクター上の領域に対するホモロジー領域を有し、染色体統合を許容しうる。例えば、このホモロジー領域は上記ＰＫＳの小部分、例えば、チオエステラーゼドメインでありうる。あるいは、上記挿入されたＤＮＡは上記染色体上の中間部位又は結合部位に方向付けられうる。あるいは、上記株が許容する場合、上記ベクターは自己複製可能でありうる。ＰＫＳをコードするベクターがこの株に移され、及び上記ＰＫＳが発現される場合、ポリケタイド生成物は完全にプロセスされて生物学的に活性な材料を与えることができ、形質転換体が新規活性について又は生成物収率について直接的にスクリーニングされることを許容する。あるいは、反対の場合、（例えば、グリコシル化又は水酸化により）そのＰＫＳを含む細胞により産生されるポリケタイドを活性化することのできるベクターでの、ＰＫＳを含む株の形質転換は生物学的に活性な材料の産生を引き起こす。
【００４７】
この株の特別な特徴は、それが上記生合成経路により形質転換されるまでは生物学的活性を有しないということである。例えば、紫外線又は化学突然変異及び上記活性をもはや示さない生物についてのスクリーニングを用いて、ランダム突然変異を含む株の使用の前に、いくつかの方法が「不要の生物学的活性」を除去するために使用されうることは本分野において周知である。いくつかの場合、生物活性生成物をもたらす生合成経路はより正確に欠失されることができ（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅ，  ２１６，  ２１５−２２３  又は  ＭｃＤａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６２，  １５４６）、上記目的が操作された経路を元の宿主に再結合することである場合、それは遺伝子置換による実験を行う必要性を除去しうるので、これは必要であり及び有益でありうる。媒体開発技術は競合する活性の産生を引き起こす経路を閉ざす条件を見つけるために使用されうる。全ての場合、導入された経路酵素の生成物を作出する又は活性化する、上記株の能力に影響しないよう注意を払わなければならない。上記株が標的生物活性を全く示さないことが所望されるが、低いバックグラウンド値は上記発現された生物活性が上記バックグラウンドに対して容易に区別されうる限りは許容可能である。形質転換プロトコール及び生物活性生成、例えば、形質転換体について選択するために使用される抗生物質により影響されない分析の使用又は上記形質転換体を上記選択媒体から除去するための追加の単純な段階の使用と矛盾しない条件を決定することが必要でありうる。しかしながら、９６ウェルプレートに取る複製プレーティング又は生育及び上記生物活性の発現のための同様の方法を行うことは本発明の範囲内である。このことは、いくつかの場合、上記生物活性スクリーニングに影響しうる、上記形質転換体の選択に使用される抗生物質を除去する追加の利点有しうる。上記段階は現存のハイスループットスクリーニング系における本明細書中に示される本発明の使用をもかなり助けうる。
【００４８】
さらに、本発明は、単一のベクター上で全ＰＫＳ又はその部分をとること、及び標的化された方法を利用して今般上記分野の研究者によりよく確立されている慣用の方法により上記ＰＫＳを操作することが可能であることを教示する。例えば、便利な制限酵素部位は選択されたドメインを交換するために使用されうる又はランダム法は、例えば、方向付けられた進化に使用しうる。したがって、上記全ＰＫＳは、活性生成物を与えるよう操作されたＰＫＳの化学生成物を改変するために特に選択された／設計された株を形質転換するために使用される。通常、上記選択された株は上記ポリケタイドが有しうる特定の生物活性を有しないであろう。このことは形質転換体（上記ベクター上に含まれる抗生物質耐性によりはじめに選択されたクローン）が直接的に生物活性についてスクリーニングされることを許容する。例えば、特定の生物活性を有する組換えコロニーは、上記プレートを影響されやすい生物で覆うことにより新規抗微生物活性について上記プレート（又は複製）上で選択されうる。本発明を、上記形質転換された細胞又は複製物が直接的に試験生物で覆われうる、抗微生物スクリーニングに限定することは意図されない。抽出物は形質転換プレート又は同様のもの上で生育する形質転換コロニーから取られ、及びバイオアッセイに使用されうることは当業者に周知である−これはタンパク質に基づいた分析スクリーニングに特に適用しうる。
【００４９】
本発明の他の使用が構想されうる。例えば、より高い収率のコロニーは形質転換の後直接的に選択されうる；これは、放線菌形質転換の多くの慣用の方法（特にプロトプラスト形成を利用するもの）はおそらく二次的な有害な突然変異のために収率において顕著な下落をもたらすので、特に有用である。これらの突然変異は高い産生値をもたらしうる、及び産業的なスケールアッププロセスに特に有益でありうる、より高い産生株は開示された方法論により直接的に検出されうる。
【００５０】
特に好ましい態様において、操作されたＰＫＳを含むベクターは、上記株自体が、例えば、元のポリケタイドの産生を担うオープンリーディングフレーム及び改変されるべきベクター上に置かれる遺伝子又は改変された変形のほとんどの欠失により、操作された後、上記ＰＫＳが由来した株に戻されるであろう。しかしながら、これは必須ではないが、上記株が有する酵素活性（すなわち、この場合ＰＫＳ後酵素）が上記ベクターが有するタンパク質の化学生成物にはたらく触媒能力を有しやすいことを確実にすることを助ける。さらに、上記株は所望の分子を構築するための好適な基質供給をより有しやすい。しかしながら、本発明は、ベクターにコードされたＰＫＳ／遺伝子操作されたＰＫＳに関連する株の使用に限定されない。例えば、上記ＰＫＳは特定の生物形質転換能力を有するように特に選択された株に挿入され、上記ポリケタイドの不活性形を活性、及びそれゆえ直接的にスクリーニングできる化合物に変換しうる。上記株により寄与される酵素活性を考慮して、本発明を上記生成物を活性化して生物活性を与える生合成活性、例えば、活性エリスロマイシンを与えるためのエリスロノリドのグリコシル化に限定することは意図されない。反対の場合が適用しうる：上記株が有する生合成活性はＰＫＳそれ自体であり、及び導入された遺伝子材料はグリコシルトランスフェラーゼ又は代替物又は改変された糖経路でありうる。本発明の鍵となる局面は、生ずる株が上記株の形質転換後生物活性について直接的にスクリーニングされることである。強調のために、示される多くの態様において、私たちはＰＫＳを株に導入する及び上記細胞内の生合成酵素の活性により上記ポリケタイド上に与えられた活性についてスクリーニングする例を使用するが、それぞれの場合において、反対のこと、すなわち、生合成酵素をＰＫＳを有する株に導入する及びその活性により上記細胞上に与えられる生物活性についてスクリーニングすることが適用しうる。
【００５１】
本発明は、同じプロモーター領域下の単一のベクター上での改変されたＰＫＳ若しくは生合成経路又はＰＫＳ若しくは生合成経路の部分の調製を許容する。全ＰＫＳが通常同じプロモーターから転写される場合、このことは特に有用である。しかしながら、これはより複雑でありうるが、同様の技術が同じ転写産物から発現されないＰＫＳｓについて使用されうることが当業者に周知であろう。あるいは、上記遺伝子は単一のプロモーターの制御下にあるように操作されうる。可能な方法は当業者に知られるであろう、Ｇａｉｓｓｅｒ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ３６，  ３９１−４０１は遺伝子が１のプロモーターの制御下に置かれうる代替の方法を例示する。本発明の特別な利点は、改変された／異種のＰＫＳを調製するために必要とされる全ての変化は宿主株への移行及び続くスクリーニングの前に、Ｅ．  ｃｏｌｉにおいて作出されうることである。本発明の利点は、形質転換体が生物活性についてスクリーニングされるため、操作されたプラスミド構築物（又は他のベクター）が正確であり及び機能的であることは容易な検査であるということである。これは、プラスミド忠実度についての慣用のスクリーニング方法が困難である又は包括的である、上記プラスミドが非常に大きい又は本質的に組換えに不安的である系において特別な利点である。この状況は特に上記モヂュールの反復性の高い性質が欠失又は再配置を引き起こしうるＰＫＳ又はＮＲＰＳを含む構築物に適用する。本発明のさらなる利点は、それが、時間がかかり及び困難であり、実際にいくつかの株では特にＰＫＳ領域において不可能でありうるプロセスである、二重クロスオーバーによる経路における全ての遺伝子置換実験を行う必要性を効果的に避けることである。変化は本分野において使用される標準の分子生物学的方法を用いてＥ．  ｃｏｌｉにおいて作出され、最終的なベクターは上記宿主に移され、及び生物活性についてスクリーニングされうる。移行ベクターを設計する／選択することにおける考慮は、染色体に統合されたベクターを含む組換え株は特にラージスケールの発酵において、自己複製ベクターを含む株に優って、顕著な利点を有することが医薬産業における多くの者により考えられているという点である。しかしながら、染色体統合に関連する系にのみ本発明を限定することは意図されない。研究目的のために、自己複製ベクターがその宿主株について使用可能である場合は、導入されたＤＮＡが自己複製ベクター上に導入されうる場合、速さ及び使用の容易さにおけるかなりの利益がありうる。あるいは、上記ＤＮＡは、選択の範囲がある結合部位にしばしば方向付けられた結合により導入されうる。このことは当業者に周知であろう。自己複製ベクターの使用はしばしば極性効果又は転写産物への変化のための染色体統合の効果を考慮する必要性を避ける。実際に、本発明の多くの態様において、操作されたクラスターを含むベクターは元の株の誘導体に戻されるので、商業的に関連する利益がある。しばしば医薬産業は、生成物収率を最適化すること及び副生成物、分路代謝物等を制限することの両方について、特定の株を発酵させることにおける広範囲な経験を有する。形質転換��容易さ又は他の好ましい特性を利用するために、元の実験は研究室の株において行われうることが構想されるが、多くの場合、上記大きなベクター系は続いて最小限の追加の努力で産業生成株の誘導体に適用されうることが意図される。ＤＮＡを宿主に導入する可能性のある方法は宿主に因る及び、当業者に知られるであろう。
【００５２】
他の局面において、本発明はその産生を担う遺伝子を操作することによりポリケタイド鎖に変化を作出する方法を提供する。上記遺伝子は通常、しかし必然的にではないが同じ転写産物上の、１以上のプロモーターの下で単一のベクター上に置かれる。変化は便利な生物、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉにおけるＰＫＳ遺伝子の所望の領域に作出され、及び最終的なベクターは一回の統合により宿主株に移される。上記宿主はその後活性についてスクリーニングされる。この方法は、通常、一回の統合によるよりも苦労して遺伝子置換により作出されなければならない変化である、プロモーター領域／終末領域から離れたところにあるＰＫＳモヂュールにおける変化を作出するために特に有用である。ＰＫＳへの変化は、例えば：ローディングモヂュール交換、エクステンダーモヂュール交換、ドメイン交換（アシルトランスフェラーゼ、還元ドメイン）、複数ドメイン交換、部分的ドメイン交換、欠失又は挿入、切除又は伸長、部位特異的突然変異を含む交換を含む。
【００５３】
他の局面において、本発明は特異的にＰＫＳのオープンリーディングフレーム全体を欠いた宿主株を提供する。通常、残る部分がホモロジー領域としてはたらきうるので、ＰＫＳ全体を欠くことは有益ではない。いくつかのシナリオが構想されうる、ｉ）オープンリーディングフレーム全体の欠失、及びｉｉ）オープンリーディングフレームの全体より少ない欠失。これらの株は上記特定のポリケタイドを産生することができないが、ＰＫＳ後プロセッシング活性を保持する及びしたがって上記株が上記ＰＫＳの欠失した部分を置換するよう設計された構築物で形質転換されたとき産生される分子をプロセスすることができる。ＰＫＳの大きな部分の欠失はベクター及び染色体上の相同領域間の所望されない組換えの危険性を避け又は減少させ、したがって、所望の組換え事件に方向付ける。ＰＫＳの欠失は株の生物学的活性を除去する効果をも有し、上記生物が直接的にスクリーニングされることを許容しうる。これらの株は、例えば、上記ポリケタイドにスクリーニング可能な活性を与えるようにはたらくであろう特定の所望のＰＫＳ後活性を高める又は与えるために、オープンリーディングフレーム（単数又は複数）の欠失の後さらに改変されうる。
【００５４】
他の局面において、本発明は、新規グリコシル化又は酸素化誘導体を作出するための異なるグルコシルトランスフェラーゼ又はチトクロームＰ４５０の操作の如き、代替のＰＫＳ後プロセッシング経路を利用するためにＰＫＳを１の宿主から他に移動させることの効果を分析する単純な方法を提供する。さらに、この方法論は、操作されたＰＫＳにより産生されたポリケタイドの構造が、通常ＰＫＳ後プロセッシング酵素により利用されるものと顕著に異なる場合、重要でありうる。
【００５５】
他の局面において、本発明は、効率／改善された酵素機能／特異性又は生成物収率について、（例えば、これらの技術に限定されないが、コンビナトリアル生合成又は方向付けられた進化／遺伝子シャッフリングにより産生された）ランダムに産生されたＰＫＳ酵素を速くスクリーニングする方法を提供する。ランダムな変化は、おそらく１のヌクレオチドのみ異なる又は全く異なるモヂュール、ドメイン若しくはオープンリーディングフレーム若しくは挿入若しくは欠失等を有する、異なるＰＫＳ遺伝子のライブラリーを作出するためにＰＫＳを含むベクターに作出される。このライブラリーは宿主株に移され、ベクターを含む宿主は耐性マーカーにより選択され、及び形質転換体は生物活性について直接的にスクリーニングされる。そのようにして作出された分子を活性化しうる株への移行後の直接的な生物活性についてのスクリーニングは、生産的な変化についてスクリーニングする。上記ライブラリーを作出する新規方法は以下に概略される。異なる調節酵素を有するある範囲の異なる宿主株への上記ライブラリーの移行は、異なる活性を有する、異なってプロセスされた分子を産生する。
【００５６】
他の局面において、本発明は生物活性のライブラリーを作出する新規方法を提供する。この方法は、特に上記タンパク質／ドメインの順序がそのクラス内で同様であるとき、ポリケタイド、非リボソームペプチド及び多くの他の二次代謝物又は天然産物に適用可能である。上記方法は特に、特定のオープンリーディングフレームのＮ−末端及びＣ−末端を除いては、ＰＫＳクラスターのオープンリーディングフレームの全部又は一部を特異的に欠く又はあるいはドメインの全部／一部において欠失する一連の株の作出に関する。これらのドメイン間での、異種の源に由来する同等の部位のクローニングによる、１又は多数のモヂュール又はドメインを含むＤＮＡによる失われた部分の特定の補完は、オープンリーディングフレームを再形成し、その結果として活性を回復する。上記株における活性は直接的にスクリーニングされうる。複数の断片又は断片のライブラリーは最も有効なものを決定するためにスクリーニングされうる。これらの断片の源はある範囲の既知のクラスターから又は未知の源、例えば、環境サンプルからでありうる。有用な断片は他の関係においてはあまり効果的にはたらかない場合があるので、ある範囲の断片を速く及び容易に試験する能力は研究者にかなりの利点を与えるということが当業者に知られる。この局面の延長において、ライブラリーを作出する他の方法として、未知のＰＫＳのランダムな断片は強いホモロジー領域を用いて及び好適な制限酵素部位を導入して作出された変性したプライマーを用いた増幅によりクローニングされうる。上記変性した断片を上記系に置くことにより、新規ポリケタイドは作出され、及び直接的にスクリーニングされうる。ＰＫＳに関連して、上記増幅された生成物はドメイン、モヂュール又は複数のモヂュールであることができ、及び実際に上記遺伝子構成が維持される場合は、置換された断片が単一のリーディングフレームでないかどうかは問題ではない。本発明に係るベクター−宿主株の組み合わせの方法論は、研究者が生物学的活性により成功の形質転換体を速くスクリーニングすることを可能にし、及びそれゆえ、研究者に最も効果的な交換を決定させる道具である。最も適切な交換を決定することは不正確な科学であるということは本分野において周知である；多くの場合、異なる置換は異なる収率を与える。生物学的活性の直接的なスクリーニングは、本発明が形質転換されたコロニーから直接的に、複数の（原則として何千もの）交換をスクリーニングするために使用され、新規活性／生成物収率について形質転換されたコロニーをスクリーニングすることにより交換の成功を判断しうることを意味する。
【００５７】
本発明は広い潜在的な有用性を有し、及びポリケタイドに又は実際に微生物天然産物に限定されない。上記方法は生物学的にスクリーニングされうる生成物を産生する複数の段階の生合成経路に適用可能である。多くの生物活性代謝物の産生を担う生合成装置をコードする遺伝子は急速に発見されており、多くは共にクラスター化されることがわかったという事実により作業はより簡単にされた。しかしながら、全ゲノムのシークエンシング又はＳａｎｔｉ  Ｄ．Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｇｅｎｅ，  ２４７，  ９７−１０２により示されるような遺伝子発見法を含む、ハイスループットＤＮＡスクリーニング法における進歩は、クラスター化されない生合成装置でさえも容易に同定されうることを意味する。いったん同定されたら、私たちがＰＫＳについて例示したように、これらの遺伝子をベクター上に、おそらく発現レベルを高める又はよりよく制御するためにより強いプロモーターを利用してカセット内へ置くことは可能である。しかしながら、問題の生合成装置がクラスター化されないときでさえも、上記遺伝子を単一のベクター上に置くための入手可能な方法はある。ｉ）それらがベクターにコードされるタンパク質と共に産生される所望の新規生物活性産物の生合成に参加しうる（おそらく上記宿主細胞は同定された遺伝子とクラスターを形成しない上記クラスターの残りのものを有する）ために、及びｉｉ）それらが特定の生物活性を（又は実質的な程度では）有しないので、形質転換された細胞が直接的にスクリーニングされることを許容するために選択された宿主細胞に、このベクターは移されうる。私たちがＰＫＳについて例示したように、上記宿主細胞ははじめに特定の生合成装置を除去するよう操作されうる。このことは生物学的活性をも除去しうる。あるいは、上記細胞は特定の所望の経路酵素を含むよう操作されうる。これらの細胞を元の遺伝子（又はその操作された誘導体）を含むベクターで形質転換することは生物学的活性を復帰させ、上記細胞が生成事件及び生物活性についてスクリーニングされることを許容する。
【００５８】
本発明の範囲を「伝統的な」天然産物に限定することは意図されない。本発明の背景にある原理は非常に広いクラスの生合成生成物に適用する。これらは、例えば、タンパク質ライブラリーを含みうる。私たちは、所望のタンパク質の発現がベクターの制御の下に置かれ、そのベクターは続いて、形質転換体から直接的にスクリーニングされうる生合成タンパク質を産生する導入されたコードされたタンパク質のグリコシル化又はアセチル化を担う酵素を含む宿主株に移される方法を構想しうる。あるいは、上記宿主株はタンパク質の第二のサブユニットを合成することができ、プラスミド上の他のサブユニットの発現はスクリーニング可能な生物活性産物を与えうる。
【００５９】
本発明の態様は添付の図を引用して、例として及び限定なしに、示されるであろう。
【実施例】
【００６０】
実施例１
プラスミドｐＨＰ０２０の構築
プラスミドｐＨＰ０２０はａｃｔＩプロモーターの制御の下にＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２及びＤＥＢＳ３を含むｐＣＪＲ２４を基礎としたプラスミドである。ＤＥＢＳ２（モヂュール４）のＡＴドメインはラパマイシンモヂュール２のＡＴドメインと交換されている。プラスミドｐＨＰ０２０は以下のようにいくつかの中間体プラスミドにより構築された。ＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２及びＤＥＢＳ３を含むプラスミドｐＩＢ０２３をＭｓｃＩで消化し、及び４．７ｋｂ断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した（ＭｓｃＩ部位はｄｃｍ感受性ではない）。［プラスミドｐＩＢ０２３は、ｐＣＪＲ６５を含む株Ｓａｃｃｈ，  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＣＪＲ６５のゲノムＤＮＡから単離されたＥｃｏＲＩ断片のプラスミドレスキューにより作出された（ＤＥＢＳ１ＴＥ  ｉｎ  ｐＣＪＲ２４，  Ｒｏｗｅ  Ｃ．  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）Ｇｅｎｅ  ２１６  ２１５−２２３）。プラスミドｐＨＰ０１０は（ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩクローニングされた）ＴＥドメインの下流からの１ｋｂ配列を含むこのプラスミドの誘導体であり、Ｓａｃｃｈ，  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＪＣ２内への形質転換のための追加のホモロジーを提供する。］上記ＭｓｃＩ断片を、ＳｍａＩで直鎖にされ、及びアルカリフォスファターゼで処理されたプラスミドｐＵＣ１９にライゲーションした。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂへの形質転換及びプラスミドｐＨＰ００１の同定の後、４．７ｋｂ断片をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断し、及びｐＣＪＲ２４のＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩの消化により形成された３．３ｋｂ断片とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＨＰ００５についてチェックした。
【００６１】
ｐＨＰ００１を鋳型として用いて、２のオリゴヌクレオチドプライマー、５’−ＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＧ−３’及び５’−ＴＴＴＴＴＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＡＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＧＧＣＧ−３’を、ヌクレオチド２７２２７〜２８４９３までのＳａｃ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ｅｒｙＡＩＩ遺伝子からＤＮＡを増幅するために使用した。上記プライマーの設計は、上記ヌクレオチド２７２３１にＭｓｃＩサイト及びＭｓｃＩサイトの直前に位置されたＰｓｔＩサイト並びにＳｆＩＩサイトにわたってプライミングする第二のＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入した。上記１２７６ｂｐＰＣＲ産物をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、及び同じ酵素で消化されたｐＵＣ１９にライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＨＰ００４の存在についてチェックした。プラスミドｐＨＰ００４を制限酵素パターンにより同定し、及び配列分析により確認した。
【００６２】
２のオリゴヌクレオチドプライマー、５’−ＴＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＣＧＴＣＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＣＴＣＧＧ−３’及び５’−ＴＴＴＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＧＧＡＣＧＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＣ−３’をヌクレオチド２６２６９〜２５７５１までのＳａｃ． ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ｅｒｙＡＩＩ遺伝子からＤＮＡを増幅するために使用した。上記プライマーの設計はヌクレオチド２６２７３にＡｖｒＩＩサイト及びＡｖｒＩＩサイトの直前に位置するＰｓｔＩサイトを導入し、及び第二にＥｃｏＲＩサイトを２５７４９で上記ヌクレオチド配列に加えた。上記５４５ｂｐＰＣＲ産物をＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、及び同じ酵素で消化されたｐＵＣ１９とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＨＰ００３の存在についてチェックした。プラスミドｐＨＰ００３を制限酵素分析及び配列分析により同定した。
【００６３】
プラスミドｐＨＰ００３をＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで直鎖状にし、及びゲル電気泳動により精製した。〜３ｋｂの断片をアルカリフォスファターゼで処理し、及びＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＨＰ００４の〜１．２ｋｂ断片とライゲーションし、及びゲル精製した。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＨＰ００７の存在についてチェックした。プラスミドｐＨＰ００７を制限酵素パターンにより同定した。プラスミドｐＨＰ００７をＳｆｉＩで消化し、及び２．２ｋｂ断片をゲル電気泳動により精製し、及びゲルから精製した。この断片をｐＨＰ００５からのＳｆｉＩ断片を置換するために使用し、及び生ずるベクターはＡＴ４の存在を伴わない置換カセットである、ｐＨＰ０１２と呼ばれる。代替のＡＴｓは独自のＭｓｃＩ及びこのプラスミドの操作の間に導入されたＡｖｒＩＩサイトに導入されうる。
【００６４】
マロン酸エクステンダー単位を特定するラパマイシンＡＴ２をＳａｃ． ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ｅｒｙＡＩＩ遺伝子からのＡＴ４を置換するために使用した。プラスミドｐＣＪＲ２６はラパマイシンＡＴ２の源であった（Ｒｏｗｅ  Ｃ．Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｇｅｎｅ  ２１６  ２１５−２２３）。脱メチル化ＤＮＡを、Ｅ．  ｃｏｌｉ株ＥＴ１２５６７をプラスミドｐＣＪＲ２６で形質転換することにより作出した。このＤＮＡをＭｓｃＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、及びラパマイシンＡＴ２を含む〜０．９ｋｂ断片をゲル電気泳動により精製し、及び事前に同じ酵素で消化され、アルカリフォスファターゼで処理され、及びゲル電気泳動で精製された脱メチル化ｐＨＰ０１２とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＨＰ０１４についてチェックした。プラスミドｐＨＰ０１４を制限酵素パターンにより同定した。
【００６５】
プラスミドｐＨＰ０１４をＳｆｉＩで消化し（ｄｃｍ非感受性）、及び２．２ｋｂ断片をゲル電気泳動により単離し、及びゲルから精製した。この断片を、事前にＳｆｉＩで消化されて直鎖状にされ、アルカリフォスファターゼで処理され、及びフェノール抽出及びエタノール沈殿により精製されたｐＨＰ０１０とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを制限酵素分析により所望のプラスミドｐＨＰ０２０の存在についてチェックした。
【００６６】
実施例２
Ｓａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２  （ｐＨＰ０２０）の構築及び新規生物活性エリスロマイシンの産生についてのそのスクリーニング
プラスミドｐＨＰ０２０を標準の技術を用いてＳａｃｃｈ． ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２プロトプラストを形質転換するために使用した。Ｓａｃｃｈ． ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２はＰＫＳプラスミドの統合のためのホモロジー領域としてＴＥを残して、事前にＤＥＢＳ１＋２＋３全体について欠失されていた（Ｒｏｗｅ  Ｃ．  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅ  ２１６  ２１５−２２３）。上記形質転換混合物をＲ２Ｔ２０プレート上に置き、及び２４時間回復させ、その後４０μｇ／ｍｌチオストレプトンで覆った。コロニーを約７〜１０日間生育させ、胞子形成させ、その後胞子を回収し、及び希釈物を４０μｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０アガー上に置き、３０℃で７日間生育させた。個々のチオストレプトン耐性コロニーを大きな（２５×２５ｃｍ）正方形のＲ２Ｔ２０アガープレート（アガーの深さが同じであることを確実にするために水平な面で注がれた）上で１ｃｍ2領域で、それぞれのパッチの間に妥当な間隔を残してパッチにし、及び約５日間生育させ、二次代謝物の産生を許容した。この段階で、アガーの小さなプラグをそれぞれのパッチから取り、及びインジケーター生物Ｍ．  ｌｕｔｅｕｓ．の培養物で覆われた（２５×２５ｃｍ）ＬＢプレート上に等間隔で置いた。ＪＣ２のパッチをコントロールとして使用した。上記ＬＢプレートをその後４℃で４時間置き、プラグからＬＢアガーへの天然産物の拡散を許容し、その後上記プレートを３７℃に移し、スクリーニング生物の生育を許容した。個々のプラグを阻害領域の大きさによりスクリーニングし、非生産者対生産者生物のスクリーニング、しかし追加的によりよく産生するコロニーについてのスクリーニングを許容した。
【００６７】
正しい構築物の導入をさらに実証するために、生産者クローンを、ラパマシイシンＡＴ２の〜１ｋｂ  ＭｓｃＩ／ＡｖｒＩＩ断片を含むＤＩＧ標識されたＤＮＡでのそれらのゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションにより、ＴＥ領域内に統合されたｐＨＰ０２０の存在について試験した。試験された全ての生産者クローンは、生物活性産物の形成により予想されうるように、ｐＨＰ０２０の正しく統合されたコピーを含むことがわかった。上記スクリーニング方法により同定された活性産物の正確な化学的性質を実証するために、２の試験が行われた。はじめに、複製物の残余物を利用して、上記スクリーニング生物のためのプラグを作出するために使用されたコロニーをまいた。第二のプラグ（〜０．５ｃｍ2）を取り、及び〜ｐＨ９（アンモニア）に調節された２×１ｍｌ酢酸エチルで抽出した。これらの抽出物からの溶媒を蒸発により除去し、及び残留物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。ピークは６−デスメチルエリスロマイシンＤについての分子マスｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６９０で観察された。第二に、Ｓ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ  ２３３８（ｐＨＰ０２０）を５μｇ／ｍｌチオストレプトンを含む５ｍｌ  ＴＳＢを接種するために使用した。３日間の生育後、１．５ｍｌのこの培養物を２５０ｍｌフラスコ内の５μｇ／ｍｌにチオストレプトンを含む３０ｍｌのＥｒｙＰ培地を接種するために使用した。上記フラスコを３０℃、２５０ｒｐｍで６日間インキュベートした。このとき、上清をアンモニアでｐＨ９に調整し、及び等量の酢酸エチルで２回抽出した。上記溶媒を蒸発により除去し、及び残留物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。ピークは６−デスメチルエリスロマイシンＤについての分子マスｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋＝６９０で観察された。さらなる分析は不完全なＰＫＳ後プロセッシングのための産物、Ｂ、Ｃ及びＡ形、及び生成物崩壊のための化合物の存在を示した。６−デスメチルエリスロマイシンＤに対応するピークの定量は、上記生成物が使用されたフラスコ条件の下で約１ｍｇ／Ｌで産生されたことを示した。
【００６８】
実施例３
Ｓａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２（ｐＨＰ０２０）の発酵によるポリケタイドの産生
上記プレートスクリーニング手順により同定された生成物の化学的性質をさらに実証するために、私たちはラージスケールで上記培養物を生育させた。−８０℃で貯蔵された、Ｓａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＪＣ２／ｐＨＰ０２０のグリセロールワーキングストックを５μｇ／ｍｌチオストレプトンを伴う５０ｍｌ  ＴＳＢを含む源を有する２の２５０ｍｌフラスコを接種するために使用し、及び２インチの振りで２日間シェーカー上で３０℃及び２４０ｒｐｍで生育させた。この種培養物を５％ｖ／ｖで、５μｇ／ｍｌを伴う３００ｍｌ  ＴＳＢを含む源を有する３の２Ｌフラスコを接種するために使用した。これらの培養物は２インチの振りでさらなる２日間シェーカー上で３０℃及び２４０ｒｐｍで生育され、発酵器のための種培養物を提供した。上記種培養物を５％ｖ／ｖで、２０Ｌ  Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ系内の１２Ｌ  ＥｒｙＰ培地を接種するために使用した。
【００６９】
ＥｒｙＰ  培地（Ｐａｃｅｙ，  Ｍ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ５１，  １０２９−１０３４）。
【００７０】
グルコース                    ５０ｇ／Ｌ
Ｎｕｔｒａｓｏｙ  ｆｌｏｕｒ  ３０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム              ３ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム                ５ｇ／Ｌ
カルシウムカーボネート        ６ｇ／Ｌ
ＰＰＧ  抗泡立ち剤            ０．１ｇ／Ｌ
ＮａＯＨを用いてｐＨ７．０に調整。１２３℃で３０分間滅菌。
【００７１】
上記培養液を２００ｒｐｍで攪拌し、発酵の間最大３５０ｒｐｍまで増大させながら、６Ｌ／分の通気速度で３０℃でインキュベートした。発酵を約１２０時間続けた。このとき、所望の化合物、６−デスメチルエリスロマイシンＤの存在を、培養液サンプルのｐＨをアンモニアでｐＨ９．０に調節すること及び等量の酢酸エチルで抽出することにより確認した。上記溶媒を蒸発により除去し、及び残留物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。細胞材料を１０Ｌの透明な上清を残す遠心分離により除去した。
【００７２】
実施例４
６−デスメチルエリスロマイシンＤの精製及び特徴付け
上記上清（１０Ｌ）を水酸化ナトリウムでｐＨ１０に調節し、及びＡｍｂｅｒｌｉｇｈｔ  ＸＡＤ−１６樹脂（１００ｇ）と共に室温で３０分間攪拌した。上記樹脂をろ過により単離し、水（２００ｍｌ）で洗浄し、及び化合物をメタノール（３×２００ｍｌ）で溶離した。この段階を２回繰り返し、及び生ずるメタノール抽出物を混合し、及び上記溶媒を水性残留物（〜５０ｍｌ）を残すためにｉｎ  ｖａｃｕｏで除去した。上記抽出物を水で希釈し、及び酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出した。上記抽出物を混合し、及び溶媒を油（６．９ｇ）を与えるためにｉｎ  ｖａｃｕｏで除去した。上記油を酢酸／酢酸塩（１：１、１００ｍｌ、ｐＨ５）及び酢酸エチル（１００ｍｌ）の間で分割した。上記水相のｐＨを水性アンモニアでｐＨ９．５に調整し、及び酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出しなおした。上記溶媒を濃縮された抽出物（〜０．５ｇ）を与えるために除去した。顕著な損失は純度を確実にするためにこの段階では許容された。上記抽出物をさらにＧｉｌｓｏｎ  ３１５系及び２１ｍｍ×２５０ｍｍ  ５μｍ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＢＤＳ  Ｃ１８カラムを利用して逆相（Ｃ１８）調製済みＨＰＬＣにより精製した。２１ｍｌ／分の流速で１９分にわたる２５％〜７５％アセトニトリル／２０ｍＭ酢酸アンモニウムの直線勾配溶離を使用した。画分を６−デスメチルエリスロマイシンＤを含むものを同定するためにＬＣＭＳにより分析し、集め及び溶媒をｉｎ  ｖａｃｕｏで除去した。他の６−デスメチルエリスロマイシンは他の画分において同定された。上記６−デスメチルエリスロマイシンＤを含む残留物を等溶離ＥＮＶ＋カートリッヂ（２００ｍｇ）に結合させ、緩衝液を除去するために水で洗浄し、及びメタノール（６ｍｌ）で溶離し、６−デスメチルエリスロマイシンＤ（４．２ｍｇ）を作出した。６−デスメチルエリスロマイシンＤの構造はＮＭＲスペクトロスコピーにより確認された（表Ｉを参照のこと）。
【００７３】
【表１】
2005505301.tif 000002
【００７４】
実施例５
プラスミドｐＬＳ０２５及びｐＳＧＫ０４７の構築
プラスミドｐＬＳ０２５はＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２及びＤＥＢＳ３を含むｐＣＪＲ２４を基礎としたプラスミドであり、ここでＤＥＢＳ１のローディングドメインはアヴェルメクチン生合成クラスターのローディングドメインにより置換されている。プラスミドｐＳＧＫ０４７は同じ遺伝子を含むＳＣＰ２を基礎としたプラスミドである。
【００７５】
プラスミドｐＬＳ０２５を以下のように構築した。プラスミドｐＩＧ１（Ｍａｒｓｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９，  １９９−２０２）をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、及び〜１２ｋｂのＰＫＳを含む断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記断片をゲルから精製した。この断片を、同じ酵素で消化され、及び同じ方法で精製されたｐＣＪＲ２４とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＬＳ００５の存在についてチェックした。プラスミドｐＬＳ００５を制限酵素パターンにより同定した。プラスミドｐＬＳ００５をＳｃａＩで消化し、及び〜１０ｋｂ断片をゲル電気泳動により単離し、及びゲルから精製した。プラスミドｐＨＰ０１０をＳｃａＩでさらに消化して直鎖状にし、及び上記断片が再ライゲーションすることができないように脱リン酸化した。この段階で、ＤＮＡの全ての移行をＤＮＡのシアリングを避けるために広い穴のチップで行った。消化されたｐＨＰ０１０をｐＬＳ００５に由来する断片とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＬＳ０２５の存在についてチェックした。１のＳｃａＩサイトは断片の方向があらかじめ定められるアンピシリン耐性遺伝子内に位置されるので、プラスミドｐＬＳ０２５を制限酵素パターンにより同定し、及び確認した。
【００７６】
プラスミドｐＳＧ０４７は以下のように構築された。プラスミドｐＬＳ０２５をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、及び上記断片が再ライゲーションすることができないように脱リン酸化した。プラスミドｐＣＪＲ２９（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｇｅｎｅ  ２１６，  ２１５）を、ポリリンカーを除去するためにＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、ゲル電気泳動で単離し、及びゲルから精製した。消化されたｐＬＳ０２５をこの断片とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ０４７の存在についてチェックした。プラスミドｐＳＧＫ０４７を制限酵素パターンにより同定し、及び確認した。
【００７７】
実施例６
Ｓａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２  （ｐＬＳ０２５）の構築並びに新規エリスロマイシンを作出するためのその使用及びスクリーニング
プラスミドｐＬＳ０２５を標準の技術を用いてＳａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２プロトプラストを形質転換するために使用した。上記形質転換混合物をＲ２Ｔ２０プレート上におき、及び２４時間回復させ、その後４０μｇ／ｍｌチオストレプトンで覆った。コロニーを約７〜１０日間生育させて胞子形成させ、その後胞子を回収し、及び希釈物を４０μｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０アガー上におき、及び３０℃で７日間生育させた。この追加の段階はＳ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａを形質転換するときに観察されるいくつかの擬陽性コロニーを避けるが、上記活性スクリーニングもこれらのコロニーをスクリーニングアウトとするであろうから省かれうる。個々のチオストレプトン耐性コロニーを１０μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む大きな（２５×２５ｃｍ）正方形のＲ２Ｔ２０アガープレート上に、それぞれのパッチの間に妥当な間隔を残して、１ｃｍ2領域でパッチにし、及び約５日間生育させ、二次代謝物産生を許容した。この段階で、アガーの小さなプラグをそれぞれのパッチから取り、及びインジケーター生物Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓのチオストレプトン耐性株の培養物で覆った（２５×２５ｃｍ）ＬＢプレート上に等間隔でおいた。ＪＣ２のパッチをコントロールとして使用した。上記ＬＢプレートをその後４℃で４時間おき、プラグからＬＢアガーへの天然産物の拡散を許容し、その後上記プレートを３７℃に移し、スクリーニング生物の生育を許容した。個々のプラグを阻害の領域の大きさによりスクリーニングし、非生産者対生産者生物のスクリーニング、しかし追加的に、よりよく産生するコロニーのスクリーニングを許容した。
【００７８】
上記生物活性産物の正確な化学的性質を実証するために、Ｓ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａＮＲＲＬ  ２３３８（ｐＬＳ０２５）の（生物活性スクリーニングにより決定された）最もよく産生するコロニーを５μｇ／ｍｌチオストレプトンを含む５ｍｌのＴＳＢを接種するために使用した。３日間の生育の後、１．５ｍｌのこの培養物を２５０ｍｌのフラスコ内の５μｇ／ｍｌのチオストレプトンを含む３０ｍｌのＥｒｙＰ培地を接種するために使用した。上記フラスコを３０℃、２５０ｒｐｍで７日間インキュベートした。このとき、上清をアンモニアでｐＨ９．０に調節し、及び等量の酢酸エチルで２回抽出した。上記溶媒を蒸発により除去し、及び上記残留物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。ピークは、１３−イソプロピルエリスロマイシンＢ及び１３−第二ブチルエリスロマイシンＢについて予想されるマスと一致する分子マスｍ／ｚ（Ｍ＝Ｈ）＝７３２及び７４６で観察された。他のエリスロマイシンを観察することができた。
【００７９】
実施例７
Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＧＫ−ＤＥＬＯ／ＨＰ２７５の構築
Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ株ＳＧＫ−ＤＥＬＯは抗微生物活性を示さない（おそらくオリゴマイシン産生の欠落のために）。ＳＧＫ−ＤＥＬＯを以下のように作出した。Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ３１２７２の株の胞子を紫外光を用いて慣用的に突然変異させた。上記胞子の希釈物を単一のコロニーのために広げ、パッチ化し、及び１０日間生育させ、その後パッチの近くにＭ．  ｌｕｔｅｕｓを置き、及び３０℃で２４時間生育させた。１９の単一のコロニーを、それらが上記試験生物の生育を阻害しないように見えたので、選択した。これらのコロニーをガラスピペットを用いて取り、及び１００μｇ／ｍｌナリヂクス酸を含むＹＥＭＥアガー上に置いた。３日間の生育後、上記株を、追加の形態学的変化についてチェックするために胞子形成培地を含むある範囲の培地上に再び置いた。液体培地を用いたさらなる試験を、抗微生物活性が存在しないことを確認するために使用した。株Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＧＫ−ＤＥＬＯをさらなる操作のために選択した。この株を、ＷＯ  ０１／７９５２０中に示されるようにＸｂａＩ（メチル化された）−ＸｂａＩ技術を用いて、ピクロマイシンクラスターからのデソアミン生合成遺伝子ＤｅｓＩ−ＶＩＩＩ及びＤｅｓＲがＡｃｔＩ−ＡｃｔＩＩ−Ｏｒｆ４プロモーター−アクチベーター系の後ろにタンデムに挿入されたｐＳｅｔ１５２の誘導体である、脱メチル化（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７）ｐＨＰ２７５で形質転換した。株を標準の技術を利用して形質転換し、及び１００μｇ／ｍｌアプラマイシンを含むＲＭ１４培地上で選択した。
【００８０】
実施例８
Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＤＥＬＯ／ＨＰ２７５  ＋ｐＳＧＫ０４７の構築及び新規エリスロマイシンを作出する及びスクリーニングするためのその使用
プラスミドｐＳＧＫ０４７を脱メチル化ＤＮＡを与えるためにＥ．  ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７から調製し、及び標準の技術を利用してＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ−ＤＥＬＯ／ＨＰ２７５を形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを１０μｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲＭ１４培地上で選択した。個々のチオストレプトン耐性コロニーを大きな（２５×２５ｃｍ）正方形アガープレート上に１ｃｍ2領域でパッチにし、約６日間生育させ、二次代謝物産生を許容した。この段階で、アガーの小さなプラグをそれぞれのパッチから取り、及びインジケーター生物Ｍ．  ｌｕｔｅｕｓの培養物を注いだ（２５×２５ｃｍ）ＬＢプレート上に等間隔で置いた。Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＤＥＬＯのパッチをコントロールとして使用した。上記ＬＢプレートをその後４℃で４時間置き、プラグからＬＢアガーへの天然産物の拡散を許容し、その後上記プレートを３７℃に移して上記スクリーニング生物の生育を許容した。個々のプラグを阻害領域の大きさによりスクリーニングした。
【００８１】
阻害領域の大きさにより判断される最もよく産生するコロニーを活性産物の化学的性質を実証するために使用した。上記株を６ｍｌ  ＹＥＭＥ培地を接種するために使用し、及び３０℃で２日間生育させた。１．５ｍｌのこの培養物をＹＥＭＥ培地を接種するために使用し、及びさらなる７日間生育させた。細胞を遠心分離により除去し、及び上清を酢酸エチルで３回抽出した。上記抽出物を混合し、及び乾燥するまで蒸発させた。上記抽出物のＨＰＬＣ−ＭＳ分析は５−Ｏ−デソアミニル−１３−イソプロピル−６−デオキシエリスロノリド、５−Ｏ−デソアミニル−１３−（第二ブチル）−６−デオキシエリスロノリドの予想されたマスに一致するピークを示し、５−Ｏ−デソアミニル−１３−メチル−６−デオキシエリスロノリド及び５−Ｏ−デソアミニル−６−デオキシエリスロノリドについて予想されるマスに一致するものを含むマイナーピークが観察された。
【００８２】
実施例９
Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＫ−Ｌの構築
Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＫ−Ｌは、ＡＶＥＳ１及びＡＶＥＳ２をコードする遺伝子が正確に欠失した、Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＤＥＬＯの誘導体である。
プラスミドｐＳＧＫ２４６はａｖｅｓ１遺伝子の５’末端及びａｖｅＣを含むｐＣＪＲ２４を基礎としたプラスミドである。２の合成オリゴヌクレオチド、５’−ＴＣＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＧＧＣＣ−３’及び５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＧＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＧ−３’をａｖｅＦ及びａｖｅＤ及びａｖｅｓ１の１７０ｎｔ５’末端にわたり増幅するために使用した。２の合成オリゴヌクレオチド、５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＡＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧ−３’及び５’−ＧＴＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＣＧ−３’をａｖｅＣ及びａｖｅＥ及びａｖｅｓ２の４０ｎｔ３’末端にわたり増幅するために使用した。増幅された生成物をキナーゼで処理し、及びＮｈｅＩで一晩消化した。上記生成物を電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。上記２の断片をスリーウェイライゲーションとして、ＳｍａＩで消化され及びアルカリフォスファターゼで処理されたｐＵＣ１９と共にライゲーションした。上記ライゲーションをエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ内に導入し、及びクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ２４０の存在についてチェックした。プラスミドｐＳＧＫ２４０を広範な制限酵素消化により同定し、及びエラーが増幅の間に導入されていないこと及び内部のＮｈｅＩサイトが正しく形成されたことを確認するためにシークエンスした。プラスミドｐＳＧＫ２４０をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで消化し、及び〜５ｋｂ断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。この断片を以前に示されたｐＣＪＲ２４の〜３．３ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＳｐｅＩ断片とライゲーションした。上記ライゲーションをエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ内に導入し、及びクローンを制限酵素消化により所望のプラスミドｐＳＧＫ２４６の存在についてチェックした。
【００８３】
プラスミドｐＳＧＫ２４６を脱メチル化ＤＮＡを与えるためにＥ．  ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７から調製し、及び標準の技術を利用してＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＤＥＬＯを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを５μｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲＭ１４培地上で選択した。コロニーを正しい統合事件を有するものについてサザンハイブリダイゼーションによりチェックした。１のコロニーを遺伝子置換を完了するために選択した。この株の胞子をチオストレプトンを有しないＹＥＭＥ培地に接種し、及び３日間の４回をとおしてサブ培養した。このとき、細胞を標準の技術を用いてプロトプラスト化し、及び単一のコロニーのために胞子形成培地上においた。約３千コロニーをチオストレプトン感受性について取り上げた。感受性を示すコロニーをマーカーの欠失を実証するために再び取り上げ、及びサザンハイブリダイゼーションにより正しい置換事件についてスクリーニングした。Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓはこの様式でなされる遺伝子置換の間にクラスターの一部を容易に欠失するということが留意されるので、他のａｖｅ  ＰＫＳ及びクラスタープローブを利用したサザンブロッティングを上記クラスターの残余が完璧であることを実証しようとするために使用した。Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＫ−Ｌと呼ばれる１のクローンをさらなる形質転換のために選択した。この株を生育させ、ＨＰＬＣ分析によりアヴェルメクチン産生の欠損を確認した。
【００８４】
実施例１０
プラスミドｐＳＧＫ３７５及びｐＳＧＫ３７６の構築
プラスミドｐＳＧＫ３７５はアヴェルメクチンポリケタイド合成酵素の第一の２のタンパク質（ＡＶＥＳ１及びＡＶＥＳ２）をコードする遺伝子及びＡｖｅＣを含むｐＣＪＲ２４を基礎としたプラスミドである。プラスミドｐＳＧＫ３７６は同じ遺伝子を含むｐＣＪＲ２９（ＳＣＰ２を基礎としたプラスミド）である。
【００８５】
プラスミドｐＳＧＫ３７５を以下のように構築した。２のオリゴヌクレオチドプライマー、５’−ＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＡＴＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＡＣＧＧＣＧＧ−３’及び５’−ＴＣＣＡＡＡＧＣＧＴＣＡＣＣＡＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＧＴ−３’をヌクレオチド９１から伸びるＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＡＶＥＳ１遺伝子からＤＮＡを増幅するために使用した。上記オリゴヌクレオチドの設計は開始コドンにＮｄｅＩサイトを導入し、及び内部のＭｌｕＩサイトにわたり伸びた。上記増幅された生成物を、ＳｍａＩ切断され及び脱リン酸化されたｐＵＣ１８内にクローニングし、及びエラーが増幅の間に導入されていないことを確認するためにシークエンスした。上記増幅された生成物をＮｄｅＩ及びＭｌｕＩでの消化によりｐＵＣから除去し、ゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した（断片Ｏ）。オリゴヌクレオチドの第二のペア、５’−ＣＣＧＡＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＧＡＣＧＣＧＴＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＧＣ−３’及び５’−ＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＧＴＣＴＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＣ−３’を、内部のＭｌｕＩサイト〜ＡｖｅＣの末端を越えて伸びるヌクレオチド２８０２３〜３１８６３まで伸びるＡＶＥＳ２及びＡｖｅＣのＤＮＡを増幅し、及びＸｂａＩサイトを導入するために使用した。再び、上記増幅された生成物を、ＳｍａＩ切断され及び脱リン酸化されたｐＵＣ１８内にクローニングし、及びエラーが増幅の間導入されなかったことを確認するためにシークエンスした。上記増幅された生成物をＭｌｕＩ及びＸｂａＩでの消化によりｐＵＣから除去し、ゲル電気泳動により単離し、及びゲルから精製した（断片Ｐ）。プラスミドｐＣＪＲ２４をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、及びゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した（断片Ｑ）。断片Ｏ、Ｐ及びＱをＤＮＡライゲースを用いてライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ３７４の存在についてチェックした。プラスミドｐＳＧＫ３７４を制限酵素パターンにより同定した。
【００８６】
プラスミドｐＳＧＫ３７４をＭｌｕＩで消化し、及びアルカリフォスファターゼで処理し、及びコスミドｃｏｓＡＶＥ１５−２をＭｌｕＩで消化することにより作出された２７５２１ｂｐ断片とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂを形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ３７５の存在及び正しい方向について制限酵素消化によりチェックした。
【００８７】
プラスミドｐＳＧＫ３７５をＮｄｅＩ及びＸｂａＩで消化し、ＡＶＥ１及びＡＶＥ２並びにａｖｅＣを含む約３０ｋＢの断片を放出した。この消化からの断片を、再ライゲーションを止めるために脱リン酸化し、及び同じ酵素で消化され及びゲル電気泳動により精製されたＳＣＰ２を基礎としたプラスミドｐＣＪＲ２９とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及びかなりの数の個々のクローンを制限酵素消化により所望のプラスミドｐＳＧＫ３７６の存在についてチェックした。広範な制限酵素消化は上記構築物を実証した。
【００８８】
実施例１１
プラスミドｐＳＧＫ３９０、ｐＳＧＫ３９１及びｐＳＧＫ３９２の構築
プラスミドｐＳＧＫ３９０、ｐＳＧＫ３９１及びｐＳＧＫ３９２はアヴェルメクチンポリケタイド合成酵素のローディングモヂュール及びモヂュール１〜６をコードするＡＶＥ１及びＡＶＥ２に基づいたハイブリッドポリケタイド合成酵素を含むｐＣＪＲ２４を基礎としたプラスミド（すなわち、非複製）である。プラスミドｐＳＧＫ３９０、ｐＳＧＫ３９１及びｐＳＧＫ３９２において、モヂュール２の還元ループは、それぞれ、ＤＥＢＳモヂュール４並びにＲＡＰＳモヂュール１及び１３の還元ループで置換されている。
【００８９】
プラスミドｐＳＧＫ３８１はヌクレオチド１０１〜１２４８０のＡＶＥ１ポリケタイド合成酵素全体を含むｐＵＣ１９を基礎としたプラスミドである。ｐＵＣ１９についての新規ポリリンカー領域は２のリン酸化されたオリゴヌクレオチド、５’−ＴＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧ−３’及び５’−ＡＡＴＴＣＴＴＣＧＡＡＣＡ−３’を共にゆっくりアニーリングすることにより作出された。上記オリゴヌクレオチドの設計はクローニングを許容するＢｓｔＢＩサイト並びにＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩの「粘着性末端」を導入した。ｐＵＣ１９をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、及び大きな断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。この断片を新規ポリリンカー領域と共にライゲーションした。上記ライゲーション混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを制限酵素消化及び挿入されたオリゴヌクレオチドの正確さを確認するためのシークエンス分析により所望のプラスミドｐＳＧＫ３８０の存在についてスクリーニングした。
【００９０】
プラスミドｐＳＧＫ３８０をＮｄｅＩ及びＢｓｔＢＩで消化し、及び大きな断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。プラスミドｐＳＧＫ３７５をＮｄｅＩ及びＢｓｔＢＩで消化し、ＡＶＥ１を含む約１２ｋＢの断片を放出させた。この断片をゲル電気泳動により単離し、上記ゲルから精製し、及びｐＳＧＫ３８０から単離したｐＵＣに基づいた断片と共にライゲーションした。上記ライゲーション混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ３８１の存在についてスクリーニングした。プラスミドｐＳＧＫ３８１の同一性を広範な制限酵素分析により確認した。
【００９１】
２の合成オリゴヌクレオチド、５’−ＣＡＣＧＧＣＡＧＧＴＡＣＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＡＴＣＧＣＧＧＡＣＡＣＣＧＡＡＣＧＧＣ−３’及び５’−ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＴＡ−３’をｐＳＧＫ３７５を鋳型として用いてヌクレオチド５８６０〜９０３０のＡＶＥ１  ＤＮＡを増幅するために使用した。上記オリゴヌクレオチドの設計はＳｇｆＩサイトにわたり増幅し、及びクローニングのためのＫｐｎＩ及びＸｂａＩサイトを導入し、及び還元ループのはじめにＢｇｌＩＩサイトを導入した。上記増幅された断片をＫｐｎＩ及びＸｂａＩで消化し、ゲル電気泳動により単離し、上記ゲルから精製し、及び同じ酵素で消化されたｐＵＣ１８とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ３８２の存在についてスクリーニングした。オリゴヌクレオチドの第二のペア、５’−ＴＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＧＣＴＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＡＣＡＣＡＣＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣ−３’及び５’−ＴＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＣＴＧＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＧＧＴＴＴＣＧ−３’をヌクレオチド１１５０７〜１２４９０のＡＶＥ  ＤＮＡを増幅するために使用し、これらのオリゴヌクレオチドの設計はクローニングのためのＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩサイト、及び還元ループの末端にＮｈｅＩサイトを導入した。上記増幅された断片をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、ゲル電気泳動により単離し、上記ゲルから精製し、及びＨｉｎｄＩＩＩ、及びＸｂａＩで消化され及びゲル電気泳動により単離され及び上記ゲルから精製された以前の構築物ｐＳＧＫ３８２内にライゲーションした。上記ライゲーション混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ３８３の存在についてスクリーニングした。ｐＳＧＫ２８２の同一性を制限酵素分析及びエラーが増幅の間に導入されていないことを確認するためのＤＮＡ配列分析により確認した。
プラスミドｐＳＧＫ３８３をＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩで消化し、及びゲル電気泳動により単離し、及び大きな断片を上記ゲルから精製した。プラスミドｐＪＬＫ４１、ｐＪＬＫ１４１、ｐＪＬＫ２８（特許ＧＢ９９／０２１５８を参照のこと）は、それぞれ、ＤＥＢＳモヂュール４並びにＲＡＰＳモヂュール１及び１３からの還元ループ交換を含む。これらのプラスミドをＢｇｌＩＩ及びＮｈｅＩで消化し、及び〜３ｋｂ断片をゲル電気泳動により単離し、上記ゲルから精製し、及びそれぞれの断片をｐＳＧＫ３８３から単離された断片と共にライゲーションした。ｐＪＬＫ１４１は内部のＮｈｅＩサイトのために部分消化として処理された。個々のライゲーション混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ３８４及びｐＳＧＫ３８５及びｐＳＧＫ３８６の存在についてスクリーニングした。これらのプラスミドの同一性を制限酵素消化により確認した。プラスミドｐＳＧＫ３８４及びｐＳＧＫ３８５及びｐＳＧＫ３８６をＳｇｆＩ及びＢｓｔＢＩで消化し、及び上記断片をライゲーションによりｐＳＧＫ３８１における相当する断片を置換するために使用した。個々のライゲーション混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ３８７及びｐＳＧＫ３８８及びｐＳＧＫ３８９の存在についてスクリーニングした。これらのプラスミドの同一性を制限酵素分析により確認した。これらのプラスミドは還元ループＤＨ−ＥＲ−ＫＲにより置換されたモヂュール２の還元ループを伴うＡＶＥ１全体を含む。
【００９２】
二タンパク質ＰＫＳを再生するために、プラスミドｐＳＧＫ３８７、ｐＳＧＫ３８８及びｐＳＧＫ３８９をＮｄｅＩ及びＢｓｔＢＩで消化し、及び大きな断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。プラスミドｐＳＧＫ３７５をＮｄｅＩ及びＢｓｔＢＩで消化し（完全な消化を確実にするために注意が払われた）、及び大きな断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。ＤＮＡのシアリング又は精製樹脂への不可逆的な結合を避けるためにゲル精製の間、かなりの注意が払われた。この断片をｐＳＧＫ３８７、ｐＳＧＫ３８８及びｐＳＧＫ３８９から単離した断片と共にライゲーションした。上記ライゲーション混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＳＧＫ３９０、ｐＳＧＫ３９１及びｐＳＧＫ３９２の存在についてスクリーニングした。これらのプラスミドの同一性を広範な制限酵素分析により確認した。
【００９３】
実施例１２
プラスミドｐＳＧＫ３９３、ｐＳＧＫ３９４及びｐＳＧＫ３９５の構築
プラスミドｐＳＧＫ３９３、ｐＳＧＫ３９４及びｐＳＧＫ３９５は、アヴェルメクチンポリケタイド合成酵素のローディングモヂュール及びモヂュール１〜６をコードする、ＡＶＥ１及びＡＶＥ２に基づいたハイブリッドポリケタイド合成酵素を含むｐＣＪＲ２９を基礎としたプラスミドである（すなわち、複製する）。プラスミドｐＳＧＫ３９３、ｐＳＧＫ３９４及びｐＳＧＫ３９５において、モヂュール２の還元ループは、それぞれ、ＤＥＢＳモヂュール４並びにＲＡＰＳモヂュール１及び１３の還元ループで置換されている。
複製するＰＫＳを再生するために、プラスミドｐＳＧＫ３８７、ｐＳＧＫ３８８及びｐＳＧＫ３８９をＮｄｅＩ及びＢｓｔＢＩで消化し、及び大きな断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。プラスミドｐＳＧＫ３７６をＮｄｅＩ及びＢｓｔＢＩで消化し（完全な消化を確実にするために注意が払われた）、及び大きな断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。再び、ＤＮＡのシアリング又は精製樹脂への不可逆的な結合を避けるためにゲル精製の間、かなりの注意が払われた。この断片をｐＳＧＫ３８７、ｐＳＧＫ３８８及びｐＳＧＫ３８９から単離された断片と共にライゲーションした。上記ライゲーション混合物をＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを導入されたサイトを利用して所望のプラスミドｐＳＧＫ３９３、ｐＳＧＫ３９４及びｐＳＧＫ３９５の存在についてスクリーニングした。これらのプラスミドの同一性を制限酵素分析により確認した。
【００９４】
実施例１３
Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＫ−Ｌ／ｐＳＧＫ３７５、ｐＳＧＫ３７６、ＰＳＧＫ３９０、ｐＳＧＫ３９１、ｐＳＧＫ３９２、ｐＳＧＫ３９３、ｐＳＧＫ３９４、ｐＳＧＫ３９５の構築及び新規アヴェルメクチン産生のための駆虫活性についての使用及びスクリーニング
プラスミドｐＳＧＫ３７５、ｐＳＧＫ３７６、ｐＳＧＫ３９０、ｐＳＧＫ３９１、ｐＳＧＫ３９２、ｐＳＧＫ３９３、ｐＳＧＫ３９４、及びｐＳＧＫ３９５をＥ．  ｃｏｌｉ  ＥＴ１２５６７から調製し、脱メチル化ＤＮＡを与え、及び標準の技術を利用してＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ  ＳＫ−Ｌを形質転換するために使用した。チオストレプトン耐性コロニーを５〜１０μｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲＭ１４培地上で選択した。耐性コロニーは駆虫分析のためにマイクロタイタープレート上に複製を置かれた。Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ及びＳ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ−ＳＫ−Ｌをコントロールとして使用した。それぞれのウェルは１リットル当たりデンプン８０ｇ、炭酸カルシウム７ｇ、Ｐｈａｒｍａｍｅｄｉａ  ５ｇ、リン酸水素二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム１ｇ、グルタミン酸０．６ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水化物０．０１ｇ、硫酸亜鉛０．００１ｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）０．００１ｇ、ｂａｃｔｏａｇａｒ  １５ｇを含む産生培地を含んだ。最終容積を水道水で１リットルに調節し、ｐＨを７．２に調整し、及び上記培地を１２１℃で２５分間オートクレーブし、その後上記マイクロタイタープレートに等分した。複製物を分析前に湿度を制御した静止インキュベーター内で３０℃で２週間生育させた。１週齢のＣａｅｎｏｒｈａｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓに対する駆虫活性をＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、  （１９７９）  ７９、  １９中でＳｉｍｐｋｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｅｓにより示されるスクリーニング試験の改変を用いてアガープレート上で直接的に評価した。麻痺／死の程度を解剖顕微鏡を用いて分析した。この分析は、私たちに、統合がさらなる再配置／増幅なしに正しい位置で起こり、及び生物活性化合物の産生の成功をもたらしたかどうかを評価することを許容し、私たちに最も効果的な還元ループ交換を決定することを許容した。形質転換体の全てが生産者であったわけではない。続いての慣用のＨＰＬＣによる陽性産生コロニーのスクリーニングは、駆虫標準との比較による通常のアヴェルメクチンに加えて予想されたＣ−２２−Ｃ２３脱水素アヴェルメクチンシリーズの産生を確実にした。
【００９５】
実施例１４
新規生物活性ポリケタイドのための改変されたＰＫＳライブラリーの作出及びスクリーニング
マロニル−ＣｏＡ特異的エクステンダーＡＴｓをＳ．  ｆｒａｄｉａｅ、Ｓ．  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、及びＳ．  ｖｅｎｅｚｕｌａｅ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、及びＳ．  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓを含むさまざまな生物のある範囲のＰＫＳから増幅した。それぞれの場合、ゲノムＤＮＡ又は利用可能な場合コスミドを鋳型として使用した。それぞれのエクステンダーについてのオリゴヌクレオチドの設計は実施例１及びＯｌｉｙｎｙｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  （１９９６）  ３，  ８３３−８３９）において例示されるように正確にＭｓｃＩ及びＡｖｒＩＩサイトを導入した。増幅された生成物をＭｓｃＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、ゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから適切なバンド（〜１ｋｂ）を切断した。いくつかの場合、上記バンドは代替のサイトで結合する設計されたオリゴヌクレオチドとの混合物であることが明らかであった。いくつかの場合、これはＳｍａＩ切断したｐＵＣ１８内に増幅された生成物をライゲーションし、及び上記生成物をシークエンスすることにより確認され、いくつかの場合、上記生成物はクラスター内のどこかからのＡＴを示し、他の場合、増幅されたＡＴは未知であった。上記増幅された生成物を上記ゲルから精製し、及び濃度（〜１０ｎｇ／μｌ）について正規化し、その後増幅された生成物の全てを混合してエクステンダーＡＴｓのライブラリーを形成した。ｐＨＰ０１２を脱メチル化し、及びＭｓｃＩ及びＡｖｒＩＩで消化し、及びゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。この断片（〜２０ｎｇ）を２０ｎｇのＡＴライブラリーと共にライゲーションした。上記ライゲーション混合物全体（５μｌ）をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ内に導入した（５形質転換）。それぞれの場合、形質転換体全部をＬＢプレート（１００μｌ／プレート）上に広げ、コロニーを３７℃で一晩生育させた。コロニーを０．５ｍｌ  ＬＢ培養液をそれぞれのプレート上にピペッティングし、及び上記プレートからコロニーを洗浄することにより回収した。ＤＮＡをこれらの菌コロニーから直接的に調製し、ＳｆｉＩで消化し、及び（ライブラリーから成る）〜２．２ｋｂ断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。この断片を、事前にＳｆｉＩで消化されて直鎖状にされ、アルカリフォスファターゼで処理され、及びフェノール抽出及びエタノール沈殿により精製されたｐＨＰ０１０とライゲーションした。広範なコントロールはこのベクターが完全に消化され、及びバックグラウンドコロニー形成は本質的にゼロであることを確認するために行われた。上記ライゲーション混合物を以前のようにエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用した。形質転換後に上記細胞を室温で２時間回復させ、及び３０℃で一晩生育させることが重要である。いったん、コロニーが妥当な大きさまで生育したら、それらを以前のように回収し、及び混合した。以前のようにこれらのコロニーから直接的にＤＮＡを調製することはうまくいったが、顕著な数のコロニーを与えるためのＳａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  Ｊ���２への形質転換のための十分なＤＮＡは必ずしもなかった。したがって、上記ライブラリーを増幅することが必要であった。１００ｍｌ  ＬＢ＋アンピシリンを含む５のフラスコを上記プレートから洗浄された１ｍｌの混合された培養物で接種し、及び約６時間生育させた。細胞を回収し、及びＤＮＡを  Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｐ１００カラムを用いて調製した。ＤＮＡを混合し、及びスペクトロフォトメーターにより定量した。このＤＮＡはＤＥＢＳ１＋２＋３のライブラリーを含み、ここで、ＡＴ４は全てａｃｔプロモーターの制御の下で代替のＡＴにより置換されている。
【００９６】
標準の条件下で及び標準の技術を用いてプロトプラスト化されたとき３０ｍｌ  Ｓ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＪＣ２の成長から生ずるプロトプラストを形質転換するために約６０μｇのＤＮＡを使用し、プロトプラスト化されないままの細胞を最小限にすることを確実にするために注意を払ったが、ＪＣ２は抗微生物物質を産生しないので、これらの細胞のための擬陽性（すなわち、チオストレプトンを含むプレート上で生育する非耐性コロニー）は生物学的スクリーニングを妨害しない。形質転換された細胞を複数の（４０）Ｒ２Ｔ２０プレート上におき、及び２４時間回復させ、その後４０μｇ／ｍｌチオストレプトンで覆った。これらのプレートを３０℃で十分な胞子形成及び概して個々の形質転換されたコロニー（プレート当たり約５０）が視認できるまで生育させた。１０μｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０上にコロニーの複製をおき、及び二次代謝物産生を確実にするためにさらなる７日間生育させた。これらのプレートをチオストレプトン耐性Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓの１ｍｌの希釈された培養物で覆い、その後上記プレートを３７℃に移し、スクリーニング生物の生育を許容した。コロニーを最も効果的なＡＴ交換を決定するために阻害領域の大きさによりスクリーニングした。特に上記コロニーが近すぎるときに観察される不明確さは上記複製プレートから再パッチ化し、及び再スクリーニングすることにより解決された。このスクリーニング段階の後、所望の６−デスメチル化合物よりもむしろ、天然エリスロマイシンのみを産生するものに対して区別するために、産生された化合物の化学的性質をチェックすることが必要であった。私たちは、おそらく私たちがこの実験において使用した特定のＡＴライブラリーにおける過剰（すなわち、マロニル−又はメチルマロニル−ＣｏＡのためのエクステンダーＡＴｓの混合物）のためである、天然エリスロマイシンＡのいくらかの産生を観察した。
【００９７】
実施例１５
プラスミドｐＬＳＢ１３６はａｃｔＩプロモーターの制御の下でＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２及びＤＥＢＳ３を含むｐＣＪＲ２４を基礎としたプラスミドである。ＤＥＢ１のＡＴドメイン（モヂュール１）はラパマイシンモヂュール２のＡＴドメインと交換されている。プラスミドｐＬＳＢ１３６は以下のようにいくつかの中間体プラスミドにより構築された。ＤＥＢＳ１−ＴＥのモヂュール１の天然ＡＴドメインの代わりにラパマイシンＰＫＳのモヂュール２からのマロニル−ＣｏＡ−特異的ＡＴドメインを含むプラスミドｐＣＪＲ２６（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅ  ２１６，  ２１５−２２３）をＮｄｅＩ及びＢｓｔＢＩで消化し、ｒａｐ  ＡＴ２を含む４５９６ｂｐ断片を作出した。この断片をＮｄｅＩ及びＢｓｔＢＩで消化されたｐＨＰ０１０からの〜１９ｋｂ断片とライゲーションした（実施例１を参照のこと）。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンを所望のプラスミドｐＬＳＢ１３４の存在についてチェックした。ｐＨＰ０１０をＢｓｔＢＩで消化し、及び〜１４．４ｋｂ断片をゲル電気泳動により単離し、及び上記ゲルから精製した。この断片を、ＢｓｔＢＩで消化され及びアルカリフォスファターゼで処理されたｐＬＳＢ１３４とライゲーションした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ細胞を形質転換するために使用し、及び個々のクローンをＢｓｔＢＩ断片の正しい方向について及びそれゆえ所望の最終的なプラスミドｐＬＳＢ１３６の存在についてチェックした。
【００９８】
実施例１６
Ｓａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２（ｐＬＳＢ１３６）の構築及び新規生物活性エリスロマイシンの作出のためのそのスクリーニング
プラスミドｐＬＳＢ１３６を標準の技術を用いてＳａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２プロトプラストを形質転換するために使用した。Ｓａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２はＰＫＳプラスミドの統合のためのホモロジー領域としてＴＥを残してＤＥＢＳ１＋２＋３全体を正確に欠いている（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅ  ２１６，  ２１５−２２３）。上記形質転換混合物をＲ２Ｔ２０プレート上におき、及び２４時間回復させ、その後４０μｇ／ｍｌチオストレプトンで覆った。コロニーを約７〜１０日間生育させ、胞子形成を許容し、その後胞子を回収し、及び希釈物を４０μｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０アガー上におき、及び３０℃で７日間生育させた。個々のチオストレプトン耐性コロニーを、それぞれのパッチの間に妥当な空間を残して、大きな（２５×２５ｃｍ）正方形のＲ２Ｔ２０アガープレート上に１ｃｍ2領域でパッチ化し、及び約５日間生育させ、二次代謝物産生を許容した。この段階で、アガーの小さなプラグをそれぞれのパッチから取り、及びインジケーター生物Ｍ．  ｌｕｔｅｕｓの培養物を注いだ（２５×２５ｃｍ）ＬＢプレート上に等間隔でおいた。ＪＣ２のパッチをコントロールとして使用した。上記ＬＢプレートをその後４℃で４時間置き、プラグからＬＢアガーへの天然産物の拡散を許容し、その後上記プレートを３７℃に移し、スクリーニング生物の生育を許容した。個々のプラグを阻害領域の大きさによりスクリーニングした。活性産物の生成から、私たちは、上記ベクター構築が正しかったこと、及び特に最後の段階（ＢｓｔＢＩ断片）が正しい方向に挿入されたことを確認した。
【００９９】
上記スクリーニングにより同定された活性産物の正確な化学的性質を実証するために、Ｓ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ  ２３３８（ｐＬＳＢ１３６）を５μｇ／ｍｌチオストレプトンを含む５ｍｌのＴＳＢを接種するために使用した。単離物のうち、私たちは生物活性により判断される最もよい生産者を選択した。３日間の生育の後、０．５ｍｌのこの培養物を２５ｍｌのフラスコ内の５μｇ／ｍｌチオストレプトンを含む１０ｍｌのＥｒｙＰ培地を接種するために使用した。上記フラスコを３０℃、２５０ｒｐｍで６日間インキュベートした。このとき、１ｍｌの上清をアンモニアで〜ｐＨ９に調整し、及び等量の酢酸エチルで抽出した。上記溶媒を蒸発により除去し、及び上記残留物をＨＰＬＣ／ＭＳにより分析した。顕著なピークは１２−デスメチルエリスロマイシンＢについての分子マスｍ／ｚ  ［Ｍ＋Ｈ］＋＝７０４で観察された。
【０１００】
実施例１７
上記ＧＰＳ−ＬＳリンカースキャニングシステムはｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスポゾンを標的ＤＮＡ内にランダムな位置で置くことにより１５ｂｐ挿入物を作出するための道具としてＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓにより市販される。上記キットはタンパク質構造を研究するための道具として市販される「埋まっている又は活性部位の一部であるセグメントは一般的に上記挿入に耐性でない一方で、三次元構造の表面に又は連結領域内に位置するタンパク質配列のセグメントはしばしば数アミノ酸の挿入に耐性であり、機能的なままであろう」。私たちは、私たちがこのキットを、ＤＥＢＳ遺伝子内に１５ｂｐ挿入物を含むエリスロマイシンＰＫＳのランダムライブラリーを作出するために使用しうると考えた。これらの挿入物のうち、あるサブセットはフレーム内であり、及び機能的なＰＫＳをもたらすであろう、及びあるサブセットはＰＫＳ全体は機能的なままである一方で、上記ドメインを非機能的にするドメイン中に挿入物を有するであろう。この特許に示される技術を用いて、なおも活性産物を産生する改変されたＰＫＳ（すなわち、挿入物を含む）について上記ライブラリーをスクリーニングすることが可能である。本明細書中に示される実施例において、ＬＣＭＳにより調べられた全ての活性であるが、改変されたＰＫＳは、いくつかは通常よりも非常に低い値であるが、新規エリスロマイシンよりもむしろエリスロマイシンＡを産生する。この実験はＰＫＳの挿入に耐える能力を示す。しかしながら、私たちがより多くの数の活性産物を生成することがわかっているＰＫＳをスクリーニングするなら、私たちが新規エリスロマイシンを産生するＰＫＳを発見するであろうことは当業者に明らかであろう。例えば、ケト還元酵素の機能性の（挿入のための）破壊のために変化された酸化状態を有する又はあるいはアシルトランスフェラーゼ特異性の（挿入による）破壊のために変化された側鎖を有するエリスロマイシン。
【０１０１】
上記トランスポゾンライブラリーは供給されるプロトコールに密接にしたがって作出された。標的ＤＮＡはｐＨＰ０１０（実施例１、ａｃｔプロモーターの制御の下でＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２及びＤＥＢＳ３を含むｐＣＪＲ２４誘導体）であった。約１００ｎｇの標的ＤＮＡを３７℃で２０μｌの反応（すなわち、２μｌ  ＧＰＳ緩衝液、３０ｎｇ  ｐＧＰＳ５、１μｌ  ＴｎｓＡＢＣ*  トランスポゼース、１μｌ  開始溶液）内で使用した。１時間後、上記反応を７５℃でインキュベートすることにより停止した。上記反応混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ内に導入し、及びアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢアガー上で選択し、及び３０℃で一晩生育させた。これらのコロニーの一晩の培養物を５ｍｌのスケールで生育させ、及びＤＮＡをそれぞれから調製し、及びＰｍｅＩで消化し、トランスポゾンを除去した。ＰｍｅＩを６５℃で不活性化し、及び上記反応混合物を５倍希釈し、及びＤＮＡライゲースで処理して再び環状にした。上記ライゲーション混合物をエレクトロコンピテントＥ．  ｃｏｌｉ細胞内に導入し、及びＬＢプラスアンピシリン上にまいた。耐性コロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ上にすじ状にすることにより、カナマイシンマーカーの欠損についてチェックした。これらのコロニーからのＤＮＡ（それぞれ〜２−５μｇ）を標準の技術を用いてＳａｃｃｈ．  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ２３３８  ＪＣ２プロトプラストを形質転換するために使用した。上記形質転換混合物をＲ２Ｔ２０プレート上にまき、及び２４時間回復させ、その後４０μｇ／ｍｌチオストレプトンで覆った。コロニーを約７〜１０日間生育させ、胞子形成を許容し、その後胞子を回収し、及び希釈物を４０μｇ／ｍｌチオストレプトンを含むＲ２Ｔ２０アガー上にまき、及び３０℃で７日間生育させた。個々のチオストレプトン耐性コロニーをＲ２Ｔ２０アガー上に１ｃｍ2領域でパッチ化し、及び約５日間生育させ、二次代謝物産生を許容した。この段階で、アガーの小さなプラグをそれぞれのパッチから取り、及びインジケーター生物Ｍ．  ｌｕｔｅｕｓの培養物を注いだ（２５×２５ｃｍ）ＬＢプレート上に等間隔でまいた。上記ＬＢプレートをその後４℃で２時間おき、プラグからＬＢアガーへの天然産物の拡散を許容し、その後上記プレートを３７℃に移し、スクリーニング生物の生育を許容した。少量の挿入物は（ＰＫＳの妨害として）上記ベクター系内に含まれることができ、これらの多くは非機能的プラスミド／プロモーター／耐性機能をもたらし、及び最終的なライブラリーまで持ちこされないであろうが、このこのことは機能性を維持する（すなわち、生物活性産物を産生する）トランスポゾン挿入物を含むＰＫＳの同定を許容した。上記ＰＫＳにより産生された生成物の性質を実証するために、いくつかの生物活性培養物の小さなプラグを酢酸エチル（ｐＨ９）を用いて抽出し、及びＬＣＭＳにより分析した。それぞれの場合、上記抽出物は（ライブラリーのごく小部分が分析されたのみであるが、新規エリスロマイシンよりむしろ）エリスロマイシンＡを含むことが示された。上記���ＫＳが改変されていることを確認するために、ＪＣ２を形質転換するために使用されたいくらかのＤＮＡのサンプルをキット中に供給されるプライマーＮを用いてシークエンスした。約７０％はエリスロマイシンＰＫＳのそれに対応する配列を与えた（例えば、私たちは、トランスポゾンがこれらの領域内に又はその近くに挿入されたことを示す、ＫＳ２、ＡＴ０、ＴＥ及びＫＲ２に対応する配列を得た）。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、エリスロマイシンＡの前駆体である、６−デオキシエリスロノリドＢを産生する６−デオキシエリスロノリド合成酵素（ＤＥＢＳ）モヂュラーＰＫＳのはたらきの図式である。
【図２】図２は、６−デオキシエリスロノリドＢをエリスロマイシンＡに変換する酵素段階を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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