(57)【要約】損傷または疾患の作用を緩和するために、ＣＮＳもしくはＰＮＳの神経再生を促進するためのまたは変性を低下もしくは抑制するための組成物であって、（ａ）ＣＮＳ特異的抗原から得られる自己ペプチドの修飾により得られるペプチド（ここで、この修飾は、異なるアミノ酸残基による自己ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の置換からなり、該修飾ＣＮＳペプチドは、低い親和性であるが自己ペプチドにより認識されるＴ細胞受容体をまだ認識することができる）（以後「修飾ＣＮＳペプチド」）；（ｂ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｃ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されるＴ細胞；および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せ、から選択される活性成分を含んでなる、上記組成物が提供される。ペプチドは好ましくは、ＭＢＰの自己ペプチドｐ８７−９９の修飾により得られ、さらに好ましくはリジン９１をグリシン（Ｇ９１）もしくはアラニン（Ａ９１）で置換することにより、またはプロリン９６をアラニン（Ａ９６）で置換することにより、得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷または疾患の作用を緩和するために、中枢神経系もしくは末梢神経系の神経再生を促進するためのまたは変性を低下もしくは抑制するための組成物であって、薬剤学的に許容される担体と、
（ａ）ＣＮＳ特異的抗原から得られる自己ペプチドの修飾により得られるペプチド（ここで、この修飾は、異なるアミノ酸残基による自己ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の置換からなり、該修飾ＣＮＳペプチドは、低い親和性であるが自己ペプチドにより認識されるＴ細胞受容体をまだ認識することができる）（以後「修飾ＣＮＳペプチド」）；
（ｂ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されるＴ細胞；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せ、
から選択される活性成分とを含んでなる、上記組成物。
【請求項２】
請求項１の組成物であって、（ａ）で定義される該ＣＮＳ特異的抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン乏突起神経膠芽細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオ脂質タンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連タンパク質（ＭＡＧ）、Ｓ−１００、β−アミロイド、Ｔｈｙ−１、Ｐ０、Ｐ２、および神経伝達物質受容体よりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項３】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＣＮＳ特異的抗原からのペプチドの修飾により得られ、このペプチドは、該抗原の免疫原性エピトープまたは潜在エピトープである、請求項１または２の組成物。
【請求項４】
ＣＮＳ特異的抗原はＭＢＰである、請求項２の組成物。
【請求項５】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ１１、ｐ５１−７０、ｐ８７−９９、ｐ９１−１１０、ｐ１３１−１５０、またはｐ１５１−１７０よりなる群から選択される自己ペプチドの修飾により得られる、請求項３の組成物。
【請求項６】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰの自己ペプチドｐ８７−９９の修飾により得られる、請求項４の組成物。
【請求項７】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ８７−９９のリジン残基９１をグリシン（Ｇ９１）で置換することにより得られる、請求項５の組成物。
【請求項８】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ８７−９９のリジン残基９１をアラニン（Ａ９１）で置換することにより得られる、請求項６の組成物。
【請求項９】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ８７−９９のプロリン残基９６をアラニン（Ａ９６）で置換することにより得られる、請求項６の組成物。
【請求項１０】
（ｃ）の活性化Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞、関連するドナー、ＨＬＡの一致したまたは部分的に一致した半同種のドナー、およびＨＬＡの一致したまたは部分的に一致した完全に同種のドナーからの同種のＴ細胞よりなる群から選択される、請求項１の組成物。
【請求項１１】
自己Ｔ細胞は、保存されているか、または自己の中枢神経系細胞から得られる、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
活性化Ｔ細胞は、半同種のＴ細胞である、請求項１０の組成物。
【請求項１３】
Ｔ細胞は、請求項２〜９のいずれか１項で定義される修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されている、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｔ細胞は、請求項７〜９のいずれか１項で定義される修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されている、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
活性成分は、静脈内、経口、鼻内、くも膜下、筋肉内、皮内、局所的、皮下、粘膜または頬経路で投与される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
損傷または疾患の作用を緩和するために、中枢神経系もしくは末梢神経系の神経再生を促進するためのまたは変性を低下もしくは抑制するための方法であって、必要な個体に、有効量の
（ａ）ＣＮＳ特異的抗原から得られる自己ペプチドの修飾により得られるペプチド（ここで、この修飾は、異なるアミノ酸残基による自己ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の置換からなり、該修飾ＣＮＳペプチドは、低い親和性であるが自己ペプチドにより認識されるＴ細胞受容体をまだ認識することができる）（以後「修飾ＣＮＳペプチド」）；
（ｂ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されるＴ細胞；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せ、
を投与することを含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
損傷は、脊髄損傷、鈍的外傷、穿通外傷、出血性卒中、または虚血性卒中である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
疾患は、糖尿病性神経症、老年痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベルの）痺痲、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症、非動脈炎視神経症、またはビタミン欠乏症である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
疾患は、自己免疫疾患でも新生物でもない、請求項１６の方法。
【請求項２０】
中枢神経系または末梢神経系の神経再生を促進することにより、変性を低下または抑制する、請求項１６の方法。
【請求項２１】
請求項１の組成物の有効量を必要な個体に投与し、かつ該個体を能動免疫して決定的に重要なＴ細胞応答を構成させることを含む、中枢神経系または末梢神経系の神経変性を低下または抑制する方法。
【請求項２２】
損傷または疾患の作用を緩和するために、中枢神経系もしくは末梢神経系の神経再生を促進するためのまたは変性を低下もしくは抑制するための医薬組成物の調製のための、
（ａ）ＣＮＳ特異的抗原から得られる自己ペプチドの修飾により得られるペプチド（ここで、この修飾は、異なるアミノ酸残基による自己ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の置換からなり、該修飾ＣＮＳペプチドは、低い親和性であるが自己ペプチドにより認識されるＴ細胞受容体をまだ認識することができる）（以後「修飾ＣＮＳペプチド」）；
（ｂ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されるＴ細胞；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せ、
から選択される活性成分の使用。
【請求項２３】
請求項２２の使用であって、（ａ）で定義される該ＣＮＳ特異的抗原は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン乏突起神経膠芽細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオ脂質タンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連タンパク質（ＭＡＧ）、Ｓ−１００、β−アミロイド、Ｔｈｙ−１、Ｐ０、Ｐ２、および神経伝達物質受容体よりなる群から選択される、上記使用。
【請求項２４】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＣＮＳ特異的抗原からのペプチドの修飾により得られ、このペプチドは、該抗原の免疫原性エピトープまたは潜在エピトープである、請求項２２または２３の使用。
【請求項２５】
ＣＮＳ特異的抗原はＭＢＰである、請求項２３または２４の使用。
【請求項２６】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ１１、ｐ５１−７０、ｐ８７−９９、ｐ９１−１１０、ｐ１３１−１５０、またはｐ１５１−１７０よりなる群から選択される自己ペプチドの修飾により得られる、請求項２５の使用。
【請求項２７】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰの自己ペプチドｐ８７−９９の修飾により得られる、請求項２６の使用。
【請求項２８】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ８７−９９のリジン残基９１をグリシン（Ｇ９１）で置換することにより得られる、請求項２７の使用。
【請求項２９】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ８７−９９のリジン残基９１をアラニン（Ａ９１）で置換することにより得られる、請求項２７の使用。
【請求項３０】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ８７−９９のプロリン残基９６をアラニン（Ａ９６）で置換することにより得られる、請求項２７の使用。
【請求項３１】
（ｃ）の活性化Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞、関連するドナー、ＨＬＡの一致したまたは部分的に一致した半同種のドナー、およびＨＬＡの一致したまたは部分的に一致した完全に同種のドナーからの同種のＴ細胞よりなる群から選択される、請求項２２の使用。
【請求項３２】
自己Ｔ細胞は、保存されているか、または自己の中枢神経系細胞から得られる、請求項３１の使用。
【請求項３３】
活性化Ｔ細胞は、半同種のＴ細胞である、請求項３１の使用。
【請求項３４】
Ｔ細胞は、請求項２〜９のいずれか１項で定義される修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されている、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
Ｔ細胞は、請求項７〜９のいずれか１項で定義される修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されている、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
医薬組成物は、静脈内、経口、鼻内、くも膜下、筋肉内、皮内、局所的、皮下、粘膜または頬経路で投与される、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
損傷は、脊髄損傷、鈍的外傷、穿通外傷、出血性卒中、または虚血性卒中である、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
疾患は、糖尿病性神経症、老年痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベルの）痺痲、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症、非動脈炎視神経症、またはビタミン欠乏症である、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾中枢神経系（ＣＮＳ）由来ペプチドを含む医薬組成物、およびＣＮＳと末梢神経系（ＰＮＳ）の神経再生を促進する方法に関する。本発明はまた、ワクチン接種のためのまたはＴ細胞活性化のためのこれらのペプチドの使用に関し、このＴ細胞は、次に受動移動のために使用することができる。
【０００２】
略語：ＣＦＡ−完全フロイントアジュバント；ＣＮＳ−中枢神経系；ＥＡＥ−実験的自己免疫脳脊髄炎；ＩＦＡ−不完全フロイントアジュバント；ＩＳＣＩ−不完全脊髄損傷；ＭＢＰ−ミエリン塩基性タンパク質；ＭＰ−メチルプレドニソロン；ＮＳ−神経系；ＯＶＡ−オボアルブミン；ＰＮＳ−末梢神経系。
【背景技術】
【０００３】
神経系には、ＣＮＳとＰＮＳがある。ＣＮＳは、脳と脊髄からなる；ＰＮＳは、すべての他の神経成分（すなわち脳と脊髄以外の神経と神経節）からなる。
【０００４】
神経系への傷害は、例えば穿通外傷または鈍的外傷のような外傷、またはアルツハイマー病、パントテン酸キナーゼ、多発性硬化症、ハンチントン病、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、糖尿病性神経症、老年痴呆、および虚血のような疾患または障害から生じる。
【０００５】
ＣＮＳの完全性の維持は、免疫系との妥協が発生する複雑な「均衡作用」である。多くの組織において免疫系は、防御、修復、および治癒において基本的な役割を果たす。ＣＮＳでは、ユニークな免疫特権のために、免疫反応は比較的限定される。増加する証拠は、哺乳動物のＣＮＳが傷害後に機能的回復ができないことは、傷害された組織と免疫系との非効率的な対話を反映していることを示している。例えば、ＣＮＳと血液由来のマクロファージとの限定された連絡が、軸索切断された軸索が再増殖する能力に影響を与える。活性化マクロファージの移植は、中枢神経系の再増殖を促進することができる（ラパリノ（Rapalino）ら、１９９８）。
【０００６】
活性化Ｔ細胞は、抗原特異性に無関係にＣＮＳ実質に入ることが知られているが、ＣＮＳ抗原と反応できるＴ細胞のみがそこで存続できるようである。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のようなＣＮＳ白質の抗原に反応性のＴ細胞は、投薬経験の無い受容者ラットに接種した数日以内に、麻痺性疾患である実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導することができる（ベン・ヌン（Ben Nun）とコーエン（Cohen）、１９８２）。抗ＭＢＰ Ｔ細胞はまた、ヒトの疾患である多発性硬化症に関与している（オータ（Ota）ら、１９９０）。しかし、その病原性可能性にもかかわらず、健常者の免疫系に抗ＭＢＰ Ｔ細胞クローンが存在する（バーンズ（Burns）ら、１９８３）。通常は無傷のＣＮＳを巡視する活性化Ｔ細胞は、ＣＮＳ白質病変の部位に一過性に蓄積する（ヒルシュバーグ（Hirschberg）ら、１９９８）。
【０００７】
ＣＮＳ損傷の破滅的結果は、最初の傷害が、最初の傷害では見かけは傷害を受けていないかまたはわずかに傷害を受けただけの近くのニューロンが、徐々に２次的に無くなっていくことにより、しばしば悪化することである。１次病変は、細胞外イオン濃度の変化、フリーラジカル量の上昇、神経伝達物質の放出、増殖因子の枯渇、および局所的炎症を引き起こす。これらの変化は、１次損傷を逃れた近くのニューロンの破壊的イベントのカスケードを引き起こす（バザン（Bazan）ら、１９９５）。この２次損傷は、電圧依存性またはアゴニストゲーティッドチャネルの活性化、イオン漏れ、カルシウム依存性酵素（例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、およびヌクレアーゼ）の活性化、ミトコンドリア機能異常、およびエネルギー枯渇により仲介され、最終的にニューロン細胞が死滅する。１次損傷により直接引き起こされる喪失以上のニューロンの広範な喪失は、「２次変性」と呼ばれている。
【０００８】
ＣＮＳ傷害のもう１つの悲劇的な結果は、哺乳動物ＣＮＳ中のニューロンは、傷害後に自発的再生を受けないことである。すなわち、ＣＮＳ傷害は、運動機能と感覚機能の永久的な傷害を引き起こす。
【０００９】
脊髄病変は最初に、傷害の重症度に無関係に、脊髄ショックとして知られている完全な機能痺痲を引き起こす。脊髄ショックからの一部の自発的回復が観察されることがあり、傷害の数日後から始まって、３〜４週間かけて弱くなっていく。傷害が小さいほど、機能的結果は良好である。回復の程度は、傷害を受けていない組織の量から２次変性による喪失を引いたものの関数である。傷害からの回復は、２次変性を小さくする神経防御治療により改善されるであろう。
【００１０】
有効な自己免疫は、比較的新しい概念である。これは、傷害を受けたニューロンの維持と防御およびＣＮＳへの外傷後の回復の促進とに寄与する、良性の免疫応答に関する（モアレム（Moalem）ら、１９９９ａ；シュワルツ（Schwartz）とコーエン（Cohen）、２０００；およびシュワルツ（Schwartz）ら、１９９９）。種々の自己免疫症候群に至るＣＮＳ中の自己免疫の病理的側面は、充分解析されている。しかし最近の知見は、傷害関連の自己抗原に対する良性の免疫応答が、おそらく傷害された組織に栄養因子を提供することにより、組織の維持と創傷治癒のプロセスを促進する可能性があることを示唆している（モアレム（Moalem）ら、１９９９ａ；ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ；ハウベン（Hauben）ら、２０００ｂ；およびモアレム（Moalem）ら、２０００）。この応答は、免疫系の動員が必須と考えられる病原体攻撃により得られる応答を思い出させる。ＣＮＳへの傷害が非病原性である時は、防御を始める明らかな理由が無いため、適応性免疫系の動員が意味があるとは考えられない。しかし、驚くべきことに、ＣＮＳ傷害で起きているような非病原性傷害についても、その目的が進行性変性を止めることである抗自己免疫応答が誘発されることが見いだされた。
【００１１】
傷害の進行は、ＣＮＳ傷害の後に普通に起きることである。従って、脊髄損傷の結果は、傷害の直接作用から予測されるものよりはるかに重症である。これは、傷害が、直接傷害されたニューロンの１次変性を含むのみではなく、初期の傷害を逃れた近傍ニューロンの２次変性に至る自己破壊的プロセスを開始させるためである（バザン（Bazan）ら、１９９５）。２次変性の程度を制限して、部分的ＣＮＳ傷害からの機能的回復を改善するために、多くの研究が行われている（モアレム（Moalem）ら、１９９９ａ；ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ；バッソ（Basso）ら、１９９６；ベーマン（Behrmann）ら、１９９４；ブルーワー（Brewer）ら、１９９９）。
【００１２】
健常人の血液中に存在することが知られている自己反応性リンパ球の役割（バーンズ（Burns）ら、１９８３）は、不明である。脊髄挫傷後のミエリン反応性Ｔ細胞の数の増加が報告されているが、その機能は議論の余地がある（ポポビッチ（Popovich）ら、１９９８）。ルイス（Lewis）ラットでは、Ｔ細胞は、投薬経験の無い動物中に移動すると、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の症状を引き起こすため、破壊的であると主張されている（ポポビッチ（Popovich）、１９９６）。我々のグループおよび他のグループによる研究は、ＣＮＳ傷害後、内因性ミエリン関連Ｔ細胞は、生理学的ニューロン防御作用を示すことを示した（ハマーバーグ（Hammerbergら、２０００）。傷害の７日または１４日後に脊髄挫傷させたスプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）ラットから得られたＭＢＰ−刺激脾細胞の受動移動、または不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）に乳化したミエリン関連抗原を用いる傷害の７日前の活性免疫は、この生理学的な有用な自己免疫応答を増強し、機能的回復の改善につながることが証明された（ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、自己免疫の増強は、有益でもあり有害でもある。すなわち、免疫プロトコールの選択にあたって、選択された抗原もまた、自己免疫破壊の可能性があるという事実のために、適当な自己抗原の選択が複雑になる。生理学的な免疫神経防御応答を誘発する内因性抗原の本体は、不明である。さらに、この応答を促進する有効な抗原の探索において、大きな問題が生じる：神経防御的であるが、自己免疫疾患を引き起こさない自己免疫応答を増強するのに、そのような抗原をいかに使用できるか。同定された自己タンパク質から得られる非脳炎誘発性ペプチドが、有望な候補であることを示唆することが妥当のようである。しかし、ヒトのＨＬＡの多様性のために、普遍的に脳炎誘発性の自己タンパク質配列が見つかる可能性は低い。
【００１４】
本出願人によるＰＣＴ国際特許公報ＷＯ９９／６００２１号は、ＣＮＳまたはＰＮＳの変性を防止もしくは抑制するためのまたは傷害もしくは疾患の作用を緩和するための組成物であって、ＭＢＰまたはＮＳ特異的活性化Ｔ細胞のようなＮＳ特異的抗原を含む、組成物を記載している。この出願はまた、抗原配列内に含まれる配列を有するＮＳ特異的抗原から得られるペプチドについて言及している。
【００１５】
本明細書において文書の引用は、そのような文書が、本出願の請求項の特許性の関連する先行技術、または関連するものであると認めるものではない。文書の内容または日付の記載は、出願時に本出願人が入手できた情報に基づくものであり、そのような記載の正しさを認めるものではない。
【００１６】
発明の要約
本発明において、ＭＢＰのようなＣＮＳ特異的抗原の配列から得られる脳炎誘発性自己ペプチドが、その配列の修飾により非脳炎誘発性となり、それでもＴ細胞受容体を認識することが、わかった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
従って本発明は、損傷または疾患の作用を緩和するために、中枢神経系もしくは末梢神経系の神経再生を促進するためのまたは変性を低下もしくは抑制するための医薬組成物であって、薬剤学的に許容される担体と、
（ａ）ＣＮＳ特異的抗原から得られる自己ペプチドの修飾により得られるペプチド（ここで、この修飾は、異なるアミノ酸残基による自己ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基の置換からなり、該修飾ＣＮＳペプチドは、低い親和性であるが自己ペプチドにより認識されるＴ細胞受容体をまだ認識することができる）（以後「修飾ＣＮＳペプチド」）；
（ｂ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）（ａ）の修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されるＴ細胞；および
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組合せ、
から選択される活性成分とを含んでなる、上記組成物に関する。
【００１８】
好適な実施態様において、ＣＮＳ特異的抗原はＭＢＰであり、修飾ＣＮＳペプチド（改変ペプチドとも呼ぶ）は、ヒトＭＢＰ配列の残基８７−９９から得られ、さらに好ましくはリジン残基９１のグリシン（Ｇ９１）もしくはアラニン（Ａ９１）による置換により、またはプロリン残基９６のアラニン（Ａ９６）による置換により、得られる。
【００１９】
本発明はまた、本発明の組成物中の有効量の活性成分を、必要な被験体に投与することにより、ＣＮＳまたはＰＮＳ中の神経再生を促進するか、または神経変性を低下または抑制して、傷害または疾患の有害作用を緩和する方法を提供する。
【００２０】
ミエリン関連抗原による免疫は、傷害後に行われても、脊髄損傷からの機能回復を促進することが、本出願で示される。さらに、抗原とアジュバントの選択は、誘発される神経防御応答の効率を決定する。神経防御の利点を維持しながら、病原性自己免疫のリスクを低下する試みにおいて、我々は、脊髄損傷後のラットを、Ｔ細胞受容体結合部位中の１つのアミノ酸の置換により病原性を弱めたＭＢＰ由来ペプチドにより免疫した。脊髄挫傷直後のそのような改変ペプチドリガンドによる免疫は、オープンフィールドでの運動活性、赤核脊髄路の逆標識、および拡散異方性ＭＲＩにより評価すると、回復を大きく改善させた。非病原性ミエリン由来ペプチドのさらなる最適化により、脊髄損傷後の完全な痺痲を防止するための治療方策として、有効な免疫プロトコールが開発されると予測される。
【００２１】
図面の簡単な説明
図１。ＭＢＰに対するＴ細胞応答。脊髄挫傷の７日前に、ルイスラットを、ＩＦＡに乳化したＭＢＰ（１００μg／ラット）または５mg/mlの結核菌（M. tuberculosis）を含有する等量のＣＦＡで免疫した。損傷の３日または１４日後に、脾臓を切り出し、脾細胞を、ＭＢＰ、または非自己抗原オボアルブミン（ＯＶＡ）、または抗原無し、またはコンカナバリンＡとともに培養した。損傷の３日後（免疫から１０日後）に、ＭＢＰに対する増殖応答は、ＣＦＡ中のＭＢＰで免疫したラットの方が、ＩＦＡ中のＭＢＰで免疫したラットより、有意に強かった（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定）。両方のＭＢＰ免疫プロトコールに付したラットで脊髄挫傷の１４日後（免疫の２１日後）に切り出し培養した脾細胞中に、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞が検出されたが、その応答は、ＣＦＡをアジュバントとして使用した時に有意に強かった（ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定）。
【００２２】
図２Ａ−Ｂ。このタイプのアジュバントは、脊髄損傷の結果に影響を与える。（Ａ）０．５mg/mlのエム・ブチリカム（M. butyricum）を含有するＣＦＡに乳化した脊髄ホモジネートを免疫（挫傷の７日前）した７匹のメスのルイスラットは、同じアジュバント中のＰＢＳを注射した７匹の対照同腹子より、有意に良好に回復した（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ；* ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定）。（Ｂ）同じ免疫プロトコールは、より強いアジュバントで適用すると、反対の作用があった。５mg/mlの結核菌（M. tuberculosis）を含有するＣＦＡ中の脊髄ホモジネートで免疫したラットは、重症のＥＡＥ症状を発症し、同じアジュバント中のＰＢＳを注射した６匹の対照同腹子より、有意に悪い回復を示した（* ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ）。
【００２３】
図３。赤核中の細胞体の逆標識。脊髄挫傷の３ヶ月後に、ＣＦＡ（０．５mg/mlの細菌を含有）中に乳化した脊髄ホモジネートによる免疫、または同じアジュバント中のＰＢＳを注射した（図２Ａ）７日後に、各群の２匹のラットを再度麻酔し、色素ローダミンデキストランアミン（フルオロ−ルビー（Fluoro-ruby））を、挫傷部位の下に適用した。５日後、ラットを死滅させ、その脳を切り出し、処理し、凍結切片を作成した。赤核から取った切片を調べ、蛍光と共焦点顕微鏡により定量的および定性的に分析した。免疫ラット（右）（ＢＢＢスコア＝８）からの切片では、ＰＢＳ処理したラット（左）（ＢＢＢスコア＝５．５）からの切片より、有意に強く標識された赤核脊髄が見られた。
【００２４】
図４。挫傷した脊髄の拡散異方性を示す地図。ラットを深く麻酔させ、その脊髄を切り出し、直ちに固定し、５mmのＮＭＲ管中に入れた。この図は、Ｔ８で挫傷後の、脊髄ホモジネートで免疫したラット、および対照ラットの脊髄の代表的地図を示す。色は、異方性比に対応する。地図は、免疫ラットの病変部位の縦に並んだ組織の保存を示す。対照中の傷害部位が、免疫群からのラットよりはるかに大きいことに注意されたい。最も低い異方性値を有する切片により測定した、傷害部位の中心（免疫ラットの２９０任意単位［ＢＢＢ＝８．５］および対照ラットで１６７単位［ＢＢＢ＝６］）。
【００２５】
図５。ＥＡＥ耐性株の脊髄挫傷の機能的結果は、能動免疫により改善することができる。５匹のオスのＳＰＤラットを、ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌を含有）に乳化した脊髄ホモジネート（ＳＣＨ）で免疫し、５匹に、同じアジュバント中のＰＢＳを注射した。１２日後、ラットを脊髄挫傷させ、オープンフィールドでの運動行動を、指定の時間にスコアをつけた。免疫ラットでは、ＰＢＳ処理対照より、有意に良好な回復が観察された（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ；* ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定）。
【００２６】
図６。ミエリン関連タンパク質による免疫は、非傷害繊維および部分的に傷害した繊維の神経防御を促進する。完全な脊髄切開の７日前に、５匹のメスのルイスラットを、ＩＦＡ中の脊髄ホモジネートで免疫し、５匹の同腹子に、ＩＦＡ中のＰＢＳを注射した。５匹のメスの同腹子は、切開の直後に免疫した。傷害後４ヶ月まで試験した時、これらのラットのいずれも、有意な運動機能を示さないため、脊髄ホモジネートによる能動免疫は、軸索に対して、直接の傷害から生き延びる神経防御作用を有するが、完全に切開された軸索の再生には至らないことを示唆する。
【００２７】
図７。「安全な」、非脳炎誘発性の修飾ＭＢＰペプチドによる免疫は、脊髄挫傷からの回復を促進することができる。５匹のメスのルイスラットを、脊髄挫傷の直後に、ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌を含有）に乳化したＧ９１ペプチド（１００μg／ラット）で免疫した。５匹のメスの同腹子を脊髄挫傷させ、直ちに、同じアジュバント中のＰＢＳを注射した。免疫ラットでは、ＰＢＳ処理対照より、有意に良好な機能回復が観察された（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ；* ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定）。
【００２８】
図８Ａ−Ｂ。脊髄損傷後の修飾ＭＢＰペプチド（Ａ９６）による免疫は、ＥＡＥ耐性ＳＰＤラットの機能回復を促進する。（Ａ）６匹のＳＰＤのオスラットを、脊髄挫傷直後に、ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌を含有）中のＡ９６ペプチド（１００μg／ラット）で免疫し、６匹の同腹子に、同じアジュバント中のＰＢＳを注射した。Ａ９６で免疫したラットは、ＰＢＳ注入対照より、有意に良好に回復した（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ；* ｐ＜０．、両側スチューデントｔ検定）。（Ｂ）ＳＰＤのオスラット（ｎ＝５）における脊髄挫傷直後の、ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌を含有）中のＡ９６ペプチド（５００μg／ラット）による免疫は、機能回復に対して有意な負の作用を有した（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ）。
【００２９】
図９ａ−ｄ。メチルプレドニソロン（ＭＰ）は、Ａ９１免疫により誘導される神経防御作用を排除する。この図は、ＣＦＡ＋ＰＢＳ（三角）、ＣＦＡ＋Ａ９１（四角）、ＭＰ＋Ａ９１（菱形）またはＭＰ単独（丸）で処理した、ルイスラット（ａ）とスプラーグ−ドーレイラット（ｂ）についての、オープンフィールド運動スコアを示す。*、Ｐ＝０．０５、繰り返しのあるＡＮＯＶＡ、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。ルイスラット（ｃ）とＳＰＤラット（ｄ）の赤核中の細胞体の逆標識。*、Ｐ＝ルイスについて０．０５、ＳＰＤについて０．００４、スチューデントｔ検定、Ａ９１対Ａ９１＋ＭＰ、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。Ａ９１とＭＰの組合せで処理したラットでは、運動回復と神経生存の有意な低下が観察された。
【００３０】
図１０ａ−ｂ。Ａ９１免疫ラットの脊髄中のＴ細胞とＥＤ１陽性細胞の動員は、ＭＰにより低下した。ａ．ルイスラット（黒の棒）とスプラーグ−ドーレイラット（白の棒）中の傷害部位におけるＴ細胞の蓄積。*、Ｐ＝０．０５、スチューデントｔ検定、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。ｂ．ルイスラット（黒の棒）とスプラーグ−ドーレイラット（白の棒）中の傷害部位へのＥＤ−１陽性細胞の移動。*、Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。ＭＰは、Ａ９１免疫ラット中の傷害部位における動員細胞の数を有意に低下させた。
【００３１】
図１１ａ−ｃ。Ａ９１による即時または遅延ワクチン化は、ＭＰにより促進されるものより、良好に運動回復を促進する。ａ〜ｃ、傷害後、即時（０）または４８ｈに、ＰＢＳ（０）＋ＣＦＡ（４８ｈ）（三角）；ＰＢＳ（０）＋Ａ９１（４８ｈ）（長方形）；ＭＰ単独（０）（丸）；ＭＰ（０）＋Ａ９１（４８ｈ）（菱形）；またはＡ９１単独（０）（四角）で、処理したスプラーグ−ドーレイラットのオープンフィールド運動スコア。明確にするために、５群を、３つのパネルで２回以上示す。*、Ｐ＜０．０５、Ａ９１対ＣＦＡ；**、Ｐ＝０．０５、ＰＢＳ（０）＋ＣＦＡ（４８ｈ）対ＭＰ；***、Ｐ＝０．０５、ＭＰ単独対ＭＰ（０）＋Ａ９１（４８ｈ）；スチューデントｔ検定、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。たとえＭＰが傷害直後に投与されても、ワクチンの治療ウィンドウは明らかに、運動回復の促進を可能にするのに充分である。ＭＰにより誘導される変化は、傷害後４８時間に部分的に可逆的であるようである。
【００３２】
図１２ａ−ｄ。シクロスポリン−Ａ（Ｃｓ−Ａ）はＭＰのように、Ａ９１による免疫で誘発される神経防御作用を排除する。ａ〜ｂ、ＣＦＡ（三角）、Ａ９１（四角）、またはＭＰ＋ＣｓＡ（丸）で処理した、ルイスラット（ａ）とスプラーグ−ドーレイラット（ｂ）のオープンフィールド運動スコア。*、Ｐ＜０．０５、繰り返しのあるＡＮＯＶＡ、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。ｃ〜ｄ、ルイスラット（ｃ）とＳＰＤラット（ｄ）の赤核における、細胞体の逆標識。*、Ｐ＝０．０１、スチューデントｔ検定、Ａ９１対Ａ９１＋ＣｓＡ、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．。抗炎症剤により治療的ワクチン化の利点が消失すると、ＩＳＣＩ後の免疫応答の抑制よりも、調節が必要である。
【００３３】
発明の詳細な説明
脊髄損傷の結果は、傷害の直接的作用から予測されるものよりはるかに重症である。これは、衝撃を受けたニューロンの１次変性のみでなく、最初の傷害を逃れた周りのニューロンの２次変性に至る自己破壊プロセスにより、損傷が広がるためである。しかし興味深いことに、２次変性の発症と同時に、自発的シグナルが全身の免疫系に伝達され、そこで神経防御と維持に関連する適応性免疫応答が誘発される。
【００３４】
この応答は、免疫系の動員は必須であると考えられる病原体の攻撃により誘発されるものと非常によく似ている。ＣＮＳ中の非病原性損傷において、防御を開始する必要性は無いようであるため、適応性免疫系の動員は問題であるとは考えられていない。しかし驚くべきことに本発明者らは、ＣＮＳ外傷で起きるような非病原性傷害でさえ、傷害の進行を止めることを目的として、抗自己免疫応答が誘発されることを見いだした。体内に通常存在する自己抗原による受動および能動免疫は、傷害に対する内因性免疫応答を増強することにより、治療作用を有することができる。
【００３５】
本発明者らの研究室は最近、ＣＮＳ特異的ミエリン抗原またはペプチドに由来するこれらに対するＴ細胞を用いる受動または能動免疫が、傷害後の傷害の拡散を低下させることを発見した（モアレム（Moalem）ら、１９９９ａ、１９９ｂ；ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ、２０００ｂ）。
【００３６】
自己免疫神経防御の利点を最大に〜充分に享受するためには、免疫に使用される活性化抗自己Ｔ細胞は「安全」でなければならず、すなわち自己免疫疾患の付随するリスク無しで防御の利点を付与できなければならない。全身の免疫抑制からの免疫逸脱、または耐性、または応答に基づく自己免疫疾患の治療法と異なり、免疫神経防御療法は、自然の型では作用が不充分であり、従って増強が必要な活性化Ｔ細胞の抗自己応答に基づくことを強調することが重要である。
【００３７】
本発明の概念は、理想的なアプローチは、免疫原性であるが脳炎誘発性ではない修飾ペプチドの使用のようであるという知見に基づく。この目的に最も適したペプチドは、脳炎誘発性自己ペプチドが、ＭＨＣ結合部位ではなくＴ細胞受容体（ＴＣＲ）部位で修飾されているものであり、従って免疫応答が低下するのではなく活性化されるものである（カリン（Karin）ら、１９９８；フェーゲリ（Vergelli）ら、１９９６）。
【００３８】
すなわち本発明は、神経系変性を引き起こす損傷または疾患の作用を低下または抑制するための、または神経系、特にＣＮＳの神経再生を促進するための、合成修飾ＣＮＳペプチドである抗原を含む医薬組成物を提供する。さらに、これらの修飾ＣＮＳペプチドは、Ｔ細胞のインビボまたはインビトロ活性化に使用される。
【００３９】
別の実施態様において、神経再生を促進するための、またはＣＮＳもしくはＰＮＳの損傷もしくは疾患の作用を低下または抑制するための方法は、合成修飾ＣＮＳペプチド抗原を投与してインビボでＴ細胞を活性化し、こうしてＣＮＳまたはＰＮＳの傷害または疾患部位に蓄積するＴ細胞集団を産生させることを含む。
【００４０】
修飾ＣＮＳペプチドは、ＣＮＳ特異的抗原（特に限定されないが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン乏突起神経膠芽細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオ脂質タンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連タンパク質（ＭＡＧ）、Ｓ−１００、β−アミロイド、Ｔｈｙ−１、Ｐ０、Ｐ２、およびそのＴＣＲ結合部位中の１つ以上のアミノ酸が変化した任意の他の神経系特異的タンパク質を含む）から得られる自己ペプチドの修飾により産生される。修飾タンパク質は、９〜２０、好ましくは９〜１３のアミノ酸残基を有する。
【００４１】
好適な実施態様において、ＣＮＳ特異的抗原はＭＢＰであり、自己ペプチドは、ＭＢＰのペプチドｐ１１、ｐ５１−７０、ｐ８７−９９、ｐ９１−１１０、ｐ１３１−１５０、またはｐ１５１−１７０から選択される。
【００４２】
より好適な実施態様において本発明の修飾ＣＮＳペプチドは、特に限定されないが、リジン残基９１がグリシンにより置換されたもの（Ｇ９１）（配列番号２）またはアラニンで置換されたもの（Ａ９１）（配列番号３）、またはプロリン残基９６がアラニンで置換された（Ａ９６）（配列番号４）、ヒトＭＢＰの残基８７−９９（配列番号１；ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号３０７１６０；カムホルツ（Kamholz）ら、１９８６）から得られるペプチドがある。９１位、９５位または９７位の変化によりヒトＭＢＰの残基８５〜９９から得られるペプチド類似体が、多発性硬化症の治療用に、ＵＳ５，９４８，７６４号に開示されている。
【００４３】
さらに、ＭＨＣ結合部位ではなくそのＴＣＲ結合部位中の決定的に重要なアミノ酸が変化した任意の脳炎誘発性エピトープは、それらが、非脳炎誘発性であり、それでもＴ細胞受容体を認識する限り、本発明に包含される。
【００４４】
本発明の修飾ＣＮＳペプチドを有する活性化Ｔ細胞はまた、神経系変性を引き起こすＣＮＳまたはＰＮＳの傷害または疾患の作用を低下または抑制するために、または神経系、特にＣＮＳの再生を促進するために、使用することができる。
【００４５】
神経損傷後の２次損傷を最小にするために、患者は、本発明の少なくとも１つの修飾ＣＮＳペプチドに感作させた自己または半同種のＴリンパ球を投与することにより、治療することができる。機会のウィンドウはまだ正確には規定されていないため、成功の確率を最大にするために、治療は１次損傷後できるだけ速く、好ましくは約１週間以内に行うべきである。
【００４６】
活性化に必要な時間と治療に必要な時間とのギャップを埋めるために、ＣＮＳ損傷の場合に２次変性に対する神経防御治療法で将来使用するために調製される、自己Ｔリンパ球の個人の値を有するバンクを樹立することができる。Ｔリンパ球は、血液から分離され、次に修飾ＣＮＳペプチド抗原に感作される。次に細胞は凍結され、患者名、識別番号、および血液型で、必要とされるまで細胞バンク中で適切に保存される。
【００４７】
さらに、ＣＮＳの傷害疾患（例えば、虚血または機械的損傷）の場合に個々の患者による使用のために、ならびにアルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経変性状態を治療するために、ＣＮＳの自己幹細胞を処理し保存することができる。あるいは、Ｔ細胞の供給源とＭＨＣII型分子を共有する個人による使用のためのバンクに、半同種のまたは同種のＴ細胞を凍結保存することができる。
【００４８】
修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されるＴ細胞は、好ましくは自己であり、最も好ましくはＣＤ４および／またはＣＤ８表現型であるが、これらはまた、関連するドナー（例えば、兄弟姉妹、両親、子）、またはＨＬＡの一致したまたは部分的に一致した半同種または完全に同種のドナーでもよい。
【００４９】
被験体から単離される自己Ｔ細胞の使用以外に、本発明はまた、神経防御のための半同種Ｔ細胞の使用を企図する。これらのＴ細胞は、短期または長期系統として調製され、融解し、直ちにまたは１〜３日間培養後、中枢神経系の傷害がある被験体およびＴ細胞神経防御の必要のある被験体に投与するために、従来の凍結保存法により保存される。
【００５０】
半同種Ｔ細胞の使用は、ＡＰＣが、Ｔ細胞により認識される抗原エピトープとともに、それに対して特異的応答性Ｔ細胞集団が限定されるＭＨＣ分子（クラスＩまたはクラスII）を発現するなら、Ｔ細胞は、外来抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される特異抗原エピトープを認識することができるという事実に基づく。すなわち、被験体のＭＨＣ分子（好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱ、または他のＨＬＡ分子）の少なくとも１つの対立遺伝子産物を認識することができ、かつ修飾ＣＮＳペプチド抗原エピトープに特異的なＴ細胞の半同種集団は、被験体のＣＮＳ傷害領域のそのような抗原を認識することができ、必要な神経防御作用を生じることができるであろう。Ｔ細胞が傷害領域に移動し、そこで蓄積し、活性化を受けるのに、接着分子、白血球移動分子、および付属分子には、ほとんどまたはまったく多型は無い。従って、半同種Ｔ細胞は、神経防御が必要な場合にＣＮＳ部位に移動し蓄積することができ、活性化されて所望の作用を生じることができるであろう。
【００５１】
半同種Ｔ細胞は、被験体の免疫系により拒絶されるが、この拒絶が進行するのに約２週間が必要であることが公知である。従って、半同種Ｔ細胞は、神経防御をするのに必要とされる２週間の機会のウィンドウがある。２週間後、半同種Ｔ細胞は、被験体の体から拒絶されるが、この拒絶は、被験体から外来Ｔ細胞を除去し、活性化Ｔ細胞の好ましくない結果を防止するため、被験体にとって有利である。従って、半同種Ｔ細胞は重要な安全因子であり、好適な実施態様である。
【００５２】
集団中の多くの個体が、比較的少数のＨＬＡクラスII分子を共有することが公知である。例えば、約５０％のユダヤ人集団は、ＨＬＡ−ＤＲ５遺伝子を発現する。すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ５に限定されたＡＰＬ抗原エピトープに反応性の特異的Ｔ細胞のバンクは、この集団の５０％に有用であろう。全集団は、数個の他のよくあるＨＬＡ分子（例えば、ＤＲ１、ＤＲ４、ＤＲ２など）に限定された数個の追加のＴ細胞株により、基本的にカバーされる。すなわち、ある集団中のほとんどすべての人がすぐ使用できるように、均一なＴ細胞株の機能的バンクを調製し保存することができる。そのようなＴ細胞のバンクは、治療のオープンウィンドウ中に、神経防御の必要のある被験体から充分な数の特異的Ｔ細胞を得るための、技術的問題を克服するであろう。半同種Ｔ細胞は、その神経防御の役割後に、安全に拒絶されるであろう。本発明のこの態様は、本明細書に記載の自己Ｔ細胞の使用に矛盾するものではなく、これに追加するものである。
【００５３】
本発明の活性化Ｔ細胞は、好ましくは弱毒化されていないものであるが、弱毒化されたＡＰＬ特異的活性化Ｔ細胞を使用してもよい。Ｔ細胞は、当該分野で公知の方法、特に限定されないが、例えば１．５〜１０．０ラドのγ線照射（ベン・ヌン（Ben Nun）とコーエン（Cohen）、１９８２）；および／または圧力処理、例えば米国特許第４，９９６，１９４号に記載のもの；および／または、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどの物質を用いる化学的架橋、例えば、米国特許第４，９９６，１９４号に記載のもの；および／または光と光活性化ソラーレン化合物を用いる架橋と光活性化、例えば米国特許第５，１１４，７２１号に記載のもの；および／または、サイトカルシンやコルヒチンのような細胞骨格破壊物質、例えば米国特許第４，９９６，１９４号に記載のものにより弱毒化される。好適な実施態様において、ＡＰＬ特異的活性化Ｔ細胞は、後述のように単離される。Ｔ細胞は、当該分野で公知の方法に従って単離され精製される（モー（Mor）とコーエン（Cohen）、１９９５）。
【００５４】
ＭＢＰまたは他のＣＮＳ抗原（例えば、アミロイド前駆体タンパク質）を認識する被験体の循環Ｔ細胞は、公知の方法を使用して単離され拡張される。活性化Ｔ細胞を得るために、Ｔ細胞が単離され、次に、修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されるＴ細胞が、公知の方法により拡張される（バーンズ（Burns）ら、１９８３）。
【００５５】
単離したＴ細胞は、種々の合成ＣＮＳ特異的抗原またはエピトープの１つ以上に細胞を暴露することにより活性化される。Ｔ細胞のエクスビボ活性化の間、少なくとも１つの適当な増殖促進因子を加えた培地中で、細胞を培養することにより活性化される。この目的に適した増殖促進因子には、特に限定されないが、サイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−２またはＩＬ−４がある。
【００５６】
ある実施態様において活性化Ｔ細胞は、ＣＮＳの傷害または疾患の作用を緩和する物質を、内因性に産生する。
【００５７】
別々に実施態様において活性化Ｔ細胞は、特に限定されないが、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子３（ＮＴ−３）、神経栄養因子４／５（ＮＴ−４／５）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＴ）；インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む、他の細胞を刺激する物質を産生し、ここで、他の細胞は、直接または間接に、損傷または疾患の作用を緩和する。
【００５８】
インビトロでの増殖後に、Ｔ細胞は哺乳動物被験体に投与される。好適な実施態様において、Ｔ細胞はヒト被験体に投与される。Ｔ細胞拡張は、好ましくは非病原性の修飾ＣＮＳペプチド特異的自己タンパク質中の配列に対応するペプチドを使用して行われる。
【００５９】
被験体はまず、自己タンパク質の非病原性ペプチドを使用して、ＣＮＳ特異的抗原を用いて免疫される。そのような免疫被験体の血液からＴ細胞調製物が調製され、好ましくは修飾ＣＮＳペプチド特異抗原に対する特異性について選択されたＴ細胞から調製される。選択されたＴ細胞は、次に刺激され、そしてＣｏｈｅｎ，１９８２。
【００６０】
本発明の活性化Ｔ細胞は、直ちに使用されるか、または後の使用のために、後述するように凍結保存により保存してもよい。該活性化Ｔ細胞はまた、すでに凍結保存したＴ細胞を使用して、例えば細胞を融解後、Ｔ細胞を修飾ＣＮＳペプチドとともにインキュベートし、最適には胸腺細胞とともにインキュベートして、得てもよい。
【００６１】
当業者に公知のように、Ｔ細胞は、培養の前または後に、例えば凍結保存により保存することができる。
【００６２】
使用可能な凍結保存物質には、特に限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、ショ糖、エチレングリコール、ｉ−エリトリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、グリセロールモノアセテート、無機塩、およびヒドロキシエチルデンプンやヒト血清アルブミンと組合せたＤＭＳＯがある。
【００６３】
プログラム可能な凍結装置は、最適冷却速度の測定を可能にし、標準的な再現性のある冷却を促進する。例えば、クリオメド（Cryomed）またはプラナー（Planar）のようなプログラム可能な速度調節フリーザーは、凍結法を、所望の冷却速度曲線に調整することを可能にする。
【００６４】
完全に凍結後、細胞は迅速に、長期凍結保存容器に移すことができる。ある実施態様において、試料は機械的フリーザー（例えば、約−８０℃または約−２０℃の温度を維持するフリーザー）で凍結保存することができる。好適な実施態様において、試料は、液体窒素（−１９６℃）またはその蒸気中で凍結保存することができる。そのような保存は、極端に低い真空と内部の超絶縁を有する大きい魔法瓶に似た、効率の高い液体窒素冷蔵庫の利用により促進され、その結果、熱漏れと窒素の喪失は最小に抑えられる。生きた細胞の凍結保存の他の方法またはその修飾は、利用可能であり、例えば低温金属ミラー法の使用が企図される。
【００６５】
凍結細胞は、好ましくは急速に融解（例えば、３７〜４７℃に維持した水浴中）され、融解後直ちに冷却される。融解により細胞が凝集することを防ぐために、細胞を処理することが好ましい。凝集を防ぐために、種々の方法が使用され、特に限定されないが、凍結前または後の、ＤＮＡａｓｅ、低分子量デキストラン、およびクエン酸、クエン酸、ヒドロキシエチルデンプン、または酸性クエン酸デキストロースの添加がある。
【００６６】
凍結保護剤が、ヒトに毒性があるなら、融解Ｔ細胞の治療的使用の前に除去すべきである。凍結保存剤を除去する１つの方法は、無視できる濃度までの希釈がある。
【００６７】
凍結Ｔ細胞がいったん融解され回収されると、これらは、非凍結Ｔ細胞について本明細書に記載のように、神経再生を促進するのに使用される。いったん融解されると、凍結前に活性化されたと仮定して、Ｔ細胞は直ちに使用される。しかし好ましくは、非生存細胞を排除するために、融解された細胞は培養してから患者に注入される。さらに、この約１〜３日間の培養の過程で、適切な活性化剤を加えて、凍結細胞が休止Ｔ細胞であっても細胞を活性化することができるか、または凍結前に活性化されていても、より高い活性化速度を達成することを助けることができる。通常、損傷後１週間の長期間またはそれ以上にＴ細胞が投与され、それでもその神経再生および神経防御作用を維持するような、培養工程を可能にする時間がある。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、神経再生を促進するために、または１次ＣＮＳ傷害（例えば、鈍的外傷、穿通外傷、出血性卒中、虚血性卒中、または腫瘍切除のような手術により引き起こされる傷害）後に本来なら起きる２次変性を低下または抑制するのに使用される。さらに、そのような組成物は、変性プロセスを引き起こす疾患（例えば、種々の疾患または障害の結果として灰白質または白質（またはその両方）に起きる変性、例えば特に限定されないが、糖尿病性神経症、老年痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、顔面神経（ベルの）痺痲、緑内障、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側策硬化症（ＡＬＳ）、非動脈炎視神経症、椎間円板ヘルニア、ビタミン欠乏症、プリオン疾患（例えば、クロイツフェルト−ヤコブ病）、手根管症候群、種々の疾患に起因する末梢神経疾患、特に限定されないが、尿毒症、ポルフィリン症、低血糖症、シェーグレン−ラルソン症候群、急性感覚神経症、慢性失調性神経症、胆汁性肝硬変、原発性アミロイドーシス、閉塞性肺疾患、末端肥大症、吸収不良症候群、真性赤血球増加症、ＩｇＡおよびＩｇＧ免疫グロブリン異常症、種々の薬剤（例えば、メトロニダゾール）や毒素（例えば、アルコールまたは有機リン酸塩）の合併症、シャルコー−マリー−ツース症候群、血管拡張性失調症、フリートライヒ運動失調、アミロイド多発性神経炎、副腎脊髄神経障害、巨大神経線維神経症、レフサム病、ファブリ病、リポ蛋白症など）の作用を緩和するのに使用される。
【００６９】
好適な実施態様において、本発明の修飾ＣＮＳペプチド、これをコードするヌクレオチド配列、またはこれに活性化されるＴ細胞、またはこれらの任意の組合せは、神経再生の促進または２次神経変性の低下または抑制が適応となる、自己免疫疾患または新生物ではない疾患または障害を、治療するのに使用される。好適な実施態様において本発明の組成物は、ヒト被験体に投与される。
【００７０】
先行技術において活性化Ｔ細胞は、自己免疫疾患の治療において自己免疫抗原に対する耐性を生じる治療の過程で、またはＣＮＳ新生物の治療において免疫療法の過程で使用されているが、本発明はまた、これが、先行技術の方法により示唆されない方法で使用される限り、自己免疫疾患または新生物により引き起こされる変性プロセスを緩和するのに使用することができる。すなわち、例えば自己免疫疾患抗原により活性化されるＴ細胞は、自己免疫疾患抗原について耐性を作成するのに、従って自己免疫疾患を緩和するのに、使用される。しかしそのような治療は、自己免疫疾患抗原に対する耐性を誘導しない修飾ＣＮＳペプチドにより活性化されるＴ細胞の使用、または耐性の作成を避けるように投与されるＴ細胞の使用を、示唆していない。同様に例えば、本発明の作用は、例えば新生物には現れないＡＰＬ抗原を使用して、先行技術により示唆される免疫療法プロセスを使用することなく、得られる。そのような抗原で活性化されるＴ細胞は、腫瘍自体の免疫療法として機能しないが、神経変性の部位で蓄積、変性の抑制を促進する。
【００７１】
本発明で使用される医薬組成物は、１つ以上の薬剤学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来法で製剤化される。担体は、組成物の他の成分と適合し、かつその受容体に有害ではないという意味で、「許容され」なければならない。
【００７２】
「担体」という用語は、治療薬とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する。医薬組成物中の担体は、結合剤、例えば、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガカントゴム、ゼラチン、デンプン、乳糖、または乳糖１水和物；崩壊剤、例えばアルギン酸、トウモロコシデンプンなど；滑沢剤または界面活性剤、例えばステアリン酸マグネシウム、またはラウリル硫酸ナトリウム；直打用滑沢剤、例えばコロイド二酸化ケイ素；甘味剤、例えばショ糖またはサッカリン；および／または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味がある。
【００７３】
投与法には、特に限定されないが、非経口、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、経口、鼻内、頬、膣、直腸、眼内）、くも膜下、局所および皮内経路がある。投与は、全身性でも局所的でもよい。
【００７４】
経口投与では、薬剤調製物は、液体型、例えば液剤、シロップ剤または懸濁剤でもよく、または水または他の適当なビヒクルで使用前に復元するための薬剤生成物として提供されてもよい。そのような液体調製物は、従来法により、薬剤学的に許容される添加剤、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体、または水素化食用油）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、または分画植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸、またはソルビン酸）とともに調製される。医薬組成物は、従来法により、薬剤学的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはナトリウムデンプングリコレート）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）とともに調製される例えば錠剤またはカプセル剤の形を取ってもよい。錠剤は、当該分野で公知の方法により被覆される。
【００７５】
経口投与のための調製物は、活性化合物の制御放出を与えるように適当に調製される。
【００７６】
頬投与のために、組成物は、従来法で調製される錠剤またはトローチ剤の形でもよい。
【００７７】
組成物は、注射（例えば、ボラス注射または連続注入）による非経口投与のために製剤化される。注射用製剤は、単位投与型、例えばアンプルまたは多回投与容器（保存剤が添加されている）中で提供される。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤、または乳剤の形でもよく、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤のような製剤を含有してもよい。あるいは活性成分は、使用前に適当なビヒクル（例えば、無菌パイロジェンフリー水、）で復元するための粉末型でもよい。
【００７８】
組成物はまた、直腸組成物、例えば坐剤または保持浣腸（例えばカカオバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤ベースを含有する）で製剤化される。
【００７９】
吸入による投与のために、本発明で使用される組成物は、適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアゾル剤噴霧調製物の形で、送達されることが便利である。加圧エアゾル剤の場合、投与単位は、計量された量を供給する弁を提供することにより決定される。吸入器または吹き入れ器で使用される例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と適当な粉末ベース（例えば、乳糖デンプン）の粉末混合物を含有するように製剤化される。
【００８０】
好適な実施態様において、本発明の修飾ＣＮＳペプチド、これにより活性化されるＴ細胞、またはそのようなペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む組成物は、ヒトへの静脈内または腹腔内投与用の医薬組成物として、ルーチンの方法に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要であれば、組成物はまた、可溶化剤および、注射部位の疼痛を緩和するために局所麻酔剤（例えば、リドカイン）を含有してもよい。一般的に成分は、別々にまたは混合して供給される。組成物が注入により投与される場合、無菌の薬剤学的グレードまたは食塩水を含有する注入ビンで供給される。組成物が注射により投与される場合、成分が投与前に混合されるように、注射用無菌水または食塩水のアンプルが提供される。
【００８１】
修飾ＣＮＳペプチドを含む医薬組成物は、随時アジュバントとともに投与されてよい。
【００８２】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。
【００８３】
好適な実施態様において本発明の医薬組成物は、哺乳動物好ましくはヒトに、ＣＮＳの損傷または変性病変の検出の少し後に投与される。本発明の治療法は、修飾ＣＮＳペプチド、そのようなペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはこれに活性化されるＴ細胞、またはこれらの任意の組合せの投与を含む。併用療法を使用する時は、ペプチドは、活性化Ｔ細胞のまたはそのようなペプチドをコードするヌクレオチドの投与の前、同時または後に投与される。
【００８４】
ある実施態様において本発明の組成物は、以下の１つ以上と組合せて投与される：（ａ）その能力を増強して神経再生を促進するように刺激されている単核食細胞、好ましくは培養した単球（ＰＣＴ公報ＷＯ９７／０９９８５号に記載、これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）；（ｂ）酸性繊維芽細胞増殖因子のような神経栄養因子。
【００８５】
別の実施態様において、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／０９９８５号と米国特許出願第０９／０４１，２８０号（１９９８年３月１１日出願）の単核食細胞は、本発明の修飾ＣＮＳペプチド、ヌクレオチド配列または活性化Ｔ細胞の投与と同時、前、または後に、ＣＮＳ内の損傷部位または病変中に注入される。
【００８６】
さらなる実施態様において本発明の修飾ＣＮＳペプチド、ヌクレオチド配列または活性化Ｔ細胞は、単一の用量としてまたは繰り返して、好ましくは２週間間隔で、次にさらに長い間隔（例えば、月１回、６ヶ月毎に１回など）で投与される。治療の経過は、治療される症状または疾患に応じて、数ヶ月、数年または個人の一生の間続くこともある。ＣＮＳ傷害の場合、治療は、症状が安定し、２次変性のリスクが無いかまたは小さくなるまで、数日〜数ヶ月または数年の範囲である。慢性のヒトの疾患またはパーキンソン病では、本発明の治療は一生続くこともある。
【００８７】
当業者には明らかなように、治療効果は、治療される症状または疾患、個人の年齢および健康状態、個人の他の肉体的パラメータ（例えば、性、体重など）、ならびに種々の他の因子（例えば、その個人は他の薬剤を服用しているかなど）に依存する。
【００８８】
本発明の活性化Ｔ細胞を含む治療用組成物の最適用量は、ＣＮＳ傷害または治療される部位の、疾患により傷害された神経繊維の数に比例する。好適な実施態様において用量範囲は、例えばラット視神経の完全な切開のように、約１０5の神経繊維を冒した病変を治療するには、約５×１０6〜約１０7であり、ヒト視神経の完全な切開のように、約１０6〜１０7の神経繊維を冒した病変を治療するには、約１０7〜１０8である。当業者には明らかなように、Ｔ細胞の用量は、治療される病変または傷害部位の冒されたと考えられる神経繊維の数に比例して、スケールアップまたはスケールダウンしてもよい。
【００８９】
本発明を一般的に説明したが、これは、以下の例を参照することによりさらに容易に理解されるであろう。以下の例は、例示のためにのみ提供されるものであり、決して本発明を限定するものではない。
【００９０】
例
材料と方法
動物。近交系の成体ルイス（Lewis）ラットまたはスプラーグ−ドーレイ（Sprague-Dawley）（ＳＰＤ）ラット（１０〜１２週齢、２００〜２５０ｇ、または１３〜１４週齢、１８０〜２２０ｇ）は、ワイズマン科学研究所の動物飼育センター（the Animal Breeding Center of The Weizmann Institute of Science）（レホボット（Rehovot）、イスラエル）により供給された。各実験でラットは年齢と体重が一致しており、明暗制御および温度制御室に入れた。
【００９１】
抗原。既に記載されている（モアレム（Moalem）ら、１９９９ａ））ように、モルモットの脊髄からＭＢＰを調製したか、またはシグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）にホモジナイズした自己ラット脊髄から、脊髄ホモジネートを調製した（vol/vol）。修飾（非脳炎誘発性）ＭＢＰペプチドは、脳炎誘発性ペプチドであるＭＢＰのアミノ酸８７−９９から、リジン残基９１をグリシンで置換（Ｇ９１、スタインマン(L. Steinman)教授から供与された）、またはアラニンで置換（Ａ９１）、またはプロリン残基９６をアラニンで置換して得られた（Ａ９１と９６Ａは、ワイズマン科学研究所（The Weizmann Institute of Science）（レホボット（Rehovot）、イスラエル）により合成された）。この試験で使用されたすべてのペプチドは、逆相ＨＰＬＣにより純度が＞９５％であることが確認された。抗原は等量のＩＦＡ（ディフコ（Difco）、デトロイト、ミシガン州）、５mg/mlの結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（ディフコ（Difco）、デトロイト、ミシガン州）（傷害されていないラットで重症のＥＡＥ症状を引き起こす量）、または少量の細菌を有するＣＦＡ（０．５mg/mlのエム・ブチリカム（M. butyricum）、ディフコ（Difco））に乳化した。
【００９２】
脊髄挫傷または切開。一群のラットを、ロンプン（Rompun）（キシラジン、１０mg/kg；ビタメッド（Vitamed）、イスラエル）とベタラー（Vetalar）（ケタミン、５０mg/kg；フォートドッジ・ラボラトリーズ（Fort Dodge Laboratories）、フォートドッジ（Fort Dodge）、アイオワ州）の腹腔内注入により麻酔し、レベルＴ８の椎弓切除により脊髄を露出させた。別の群のラットをチャナジン（Chanazine）（キシラジン、１０mg/ml；チャネレ・ファーマシューチカルズ（Chanelle Phamaceuticals）、ロングレア（Longhrea）、アイルランド）とベタラー（Vetalar）で上記のように麻酔し、レベルＴ９の椎弓切除により脊髄を露出させた。麻酔誘導の１時間後、椎弓切除した脊髄の上に、ＮＹＵインパクター（脊髄の充分較正された挫傷を与えることが証明されている装置）（バッソー（Basso）ら、１９９６）を使用して、１０ｇの棒を５０mmの高さから落とした。別の群のラットの脊髄は、既に記載されている（ラパリノ（Rapalino）ら、１９９８））ように、完全に切開した。
【００９３】
薬剤。ＩＳＣＩ後に、１回または数回、コハク酸ナトリウムＭＰ（３０mg/kg、ソル−メドロール（Solu-Medrol）、ファルマシアアンドアップジョン（Pharmacia and Upjohn）、プース（Puurs）、ベルギー）を尾静脈に注射した。シクロスポリン−Ａ（３mg/kg）（ノバルティス（Novartis）、バーゼル、スイス）を、損傷直後、および１２時間間隔でさらに２回、腹腔内注射した。対照ラットには、食塩水のみを注射した。
【００９４】
能動免疫。ラットの皮下に、ランダムに、それぞれ等量の、５mg/mlの結核菌（M. tuberculosis）を含有するＣＦＡ、０．５mg/mlの結核菌（M. tuberculosis）を含有するＣＦＡ、またはＩＦＡに乳化した、ＭＢＰ、脊髄ホモジネート、または修飾ＭＢＰペプチドで免疫したか、またはＰＢＳを注射した。免疫は、挫傷後１時間以内または７日前に行った。対照ラットを、シャム手術（椎弓切除したが挫傷させていない）し、免疫し、ＥＡＥの症状について毎日調べ、１〜５までのスケールでスコアをつけた（バッソー（Basso）ら、１９９５）。
【００９５】
動物飼育。挫傷したラットで、少なくとも１日２回マッサージ（特に、損傷の最初の４８時間、１日に３回行った）して排尿を助け、第２週の最後まで行い、この時までに、ＳＰＤラットで自動的排尿が回復されていた。ルイスラットは、実験の間中この操作が必要であった。すべてのラットを、尿路感染症の証拠、または全身性疾患の他の兆候について追跡した。挫傷後の最初の週、およびこの期間後も血尿の場合はいつも、スルファメトキサゾール（４００mg/ml）とトリメトプリム（８mg/ml）（レスプリム（Resprim）、テバラボラトリーズ（Teva Laboratories）、イスラエル）を、ツベルクリンシリンジ（１日０．３mlの溶液）を用いて経口投与した。日々の観察は、椎弓切除部位の感染の証拠についての観察と、自咬症または圧力の兆候についての後足の評価を含んだ。
【００９６】
増殖測定法。脊髄挫傷の７日前に、ルイスラットを、等量のＩＦＡまたは５mg/ml結核菌（M. tuberculosis）を含有するＣＦＡに乳化したＭＢＰ（１００μg／ラット）で免疫した。傷害の３日または１４日後に脾臓を取り出し、細いワイアのメッシュで押した。洗浄した脾細胞（２×１０6細胞／ml）を、三重測定で平底マイクロタイターウェルで、Ｌ−グルタミン（２mM）、２−メルカプトエタノール（５×１０-5Ｍ）、ピルビン酸ナトリウム（１mM）、ペニシリン（１００IU/ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）、非必須アミノ酸、および自己のラット血清１％（vol/wol）を補足したダルベッコー改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）０．２ml中で、培養した。細胞を、３７℃で２時間、９０％相対湿度で、７％ＣＯ2 中で照射胸腺細胞（２０００rad、２×１０6細胞/ml）の存在下で、ＭＢＰ（１５μg/ml）または非自己抗原ＯＶＡ（１５μg/ml）またはコンカナバリンＡ（１．２５μg/ml）とともに、または抗原無しで、培養した。別の実験では、リンパ節細胞を切り出し、ＩＳＣＩの１０日後にプール（ｎ＝３）し、４重測定で、上記のＤＭＥＭ  ０．２ml中で培養した。細胞（２×１０5細胞／ウェル）を、単独（抗原無し）で、またはＭＢＰ（１５μg/ml）、ＯＶＡ（１５μg/ml）、Ａ９１（１５μg/ml）またはＣｏｎＡ（１．２５μg/ml）とともに培養した。増殖応答は、７２時間培養の最後の１６時間に加えた［3Ｈ］チミジン（１μCi/ウェル）の取り込みにより測定した。刺激指数は、実験ウェルの平均値（cpm）を培地単独で培養した細胞の平均（値cpm）で割ることにより計算した。
【００９７】
脊髄挫傷からの回復の評価。行動回復は、バッソー（Basso）、ビーティー（Beattie）、およびブレスナハン（Bresnahan）移動評価スケール（ＢＢＢ）（バッソー（Basso）ら、１９９５）を使用して、オープンフィールドでスコアを付け、ここでスコア０は、完全な痺痲であり、スコア２１は完全な運動性である（ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ；ハウベン（Hauben）ら、２０００ｂ；およびバッソー（Basso）ら、１９９６）。ブランドスコア法により、観察者が、個々のラットが受ける処理がわからないようにした。ほぼ１週間に１回、胴体、尾、後足の運動活性を、オープンフィールドで、平滑な滑らない床を有する、鋳型プラスチックで作成した円形の囲い（直径９０cm、壁の高さ７cm）の中心に、４分間各ラットを入れることにより評価した。各評価の前に、ラットを、会陰感染、後足の傷、および尾と足の自咬症について、注意深く観察した。
【００９８】
赤核脊髄ニューロンの逆標識。ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌）に乳化した脊髄ホモジネートで免疫または同じアジュバント中のＰＢＳを注射した後の、脊髄挫傷の３ヶ月後、各群からの２匹のラットを再度麻酔し、色素ロダミンデキストランアミン（フルオロルビー（Fluoro-ruby）、モレキュラープローブズ（Molecular Probes）、ユージーン（Eugene）、オレゴン州）を、Ｔ１２で挫傷部位の下に適用した。５日後、ラットを再度深く麻酔し、脳を切り出し、処理し、凍結切片を作成した。赤核から取った切片を調べ、蛍光および共焦点顕微鏡で定性的および定量的に分析した。各脳からのすべての切片で標識細胞の総数を数えた。各ラットの標識ニューロンの数は、その２つの赤核で数えた細胞の平均数として示す。統計解析では、補正係数を使用して、切片の厚さ、単一の核のサイズを考慮して、同じ細胞の再計測について補正した（スモレン（Smolen）ら、１９８３）。
【００９９】
拡散異方性磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）。拡散異方性は、ブルーカー（Bruker）ＤＭＸ４００ワイドボア分光計で、５mmのヘルミホルツコイルのついた顕微鏡プローブとアクティブシールドした磁界勾配を使用して測定した。観察者は、各ラットの正体についてはブランドとした。マルチスライスエコーイメージングを、９ｅアクシャルスライスで、中央のスライスを脊髄損傷の中心に置いた。ＴＥ  ３１ms、ＴＲ  ２０００ms、拡散時間１５ms、拡散勾配持続３ms、視界０．６mm、マトリックスサイズ１２８×１２８ピクセル、スライス厚０．５mm、およびスライス分離１．１８mmで、画像を得た。左から右への画像は、頭から足への軸に沿った切片を示す。４つの拡散勾配値（０、２８、４９、および７１g/cm）を、読み方向（横断方向拡散）またはスライス方向（縦の拡散）に沿って適用した。各ピクセルについて指数当てはめを使用して、我々は、横（Ｔ）および縦（Ｌ）の見かけの拡散計数（ＡＤＣ）地図を得て、そこから異方性比マトリックスを得た。各スライスで蓄積した異方性を、積分した。各ラットについて、スライス異方性積分の最も低い値を、病変部位とした。
【０１００】
免疫組織化学。ＩＳＣＩの７日後に、各ラットを心臓内潅流し、既に記載されている（ブトブスキー（Butovsky）ら、２００１）ように、免疫染色試験のために調製した。簡単に説明すると、脊髄を潅流後に取り出し、一晩、後固定し、ショ糖３０％に移して３日間凍結保存した。損傷部位を中心にして、脊髄の２０mmブロックを切り出し、ティシュテック（Tissue-Tek）（マイルズ（Miles）、エルクハート（Elkhart）、インディアナ州）に包埋した。凍結した縦の２０mmブロックを切片にした（２０μm）。各ラットからおよび各染色について、末端から２つの組織切片（各側について１つ）と中心から１つを、モノクローナル抗体ＥＤ−１（１：２００；セロテック（Serotec）、オックスフォード、英国）で１時間インキュベートし、活性化マクロファージおよび小グリア細胞、または抗ラットＴ細胞受容体（ＴＣＲ−α／β、１：５０、セロテック（Serotec）、英国）を標識して、Ｔ細胞を検出した。洗浄後、切片を２次抗体でインキュベートし、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス（１：２００；ジャクソン・イムノリサーチ（jackson ImmunoResearch）、ウェストグローブ（West Grove）、ペンシルバニア州）と室温で１時間インキュベートさせた。次にこれらを、ツァイスレーザー走査共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）および／またはツァイスアクシオプレーン（Zeis Axioplane）１００蛍光光学顕微鏡で観察できるように、調製した。結果は、ラットが受けた処理についてブランドの観察者が分析した。
【０１０１】
例１．強力なＣＦＡで免疫後のＭＢＰに対するＴ細胞応答
我々は、ＩＦＡ中に乳化したＭＢＰによる、脊髄挫傷の７日間前の能動免疫は、ルイスラットの神経組織の損傷後の喪失を低下させ、従って機能回復を改善することを、すでに証明した（ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ）。このアジュバントは、細胞介在免疫応答を促進するであろうが、疾患は引き起こさないという仮定で選択した（キレン（Killen）ら、１９８２；ナミカワ（Namikawa）ら、１９８２）。本実験において、我々はまず、挫傷前ではなくその直後の、ＭＢＰによる能動免疫が、挫傷の７日間前に適用したＭＢＰによる能動免疫を、有効に代替できるかどうかを調べた。重症の脊髄挫傷後に直接行ったＩＦＡに乳化したＭＢＰによる免疫は、ＩＦＡ中のＰＢＳを同様に注入した対照ラットで見られたものより、優れた回復を見せた。しかしこの損傷後免疫は、傷害前７日の同じ乳剤による免疫ほど有効ではなかった（表１）。我々は、この差は、脊髄挫傷後の神経防御について治療ウィンドウに対する、ＭＢＰへの応答の開始が遅延しているためであると考えた（ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ）。従って我々は、ある実験を行って、免疫のアジュバントとして使用した、ＩＦＡと強力ＣＦＡの、ＭＢＰに対する特異的Ｔ細胞応答に及ぼす作用を比較した。ルイスラットを、ＩＦＡまたはＣＦＡ（５mg/ml結核菌（M. tuberculosis））に乳化したＭＢＰで免疫した。傷害の３日後（免疫の１０日後）、ＣＦＡ免疫ラットでＭＢＰに対する応答が検出されたが、ＩＦＡ免疫ラットでは検出されなかった（図１）。傷害の１４日後（免疫の２１日後）、ＣＦＡとＩＦＡ免疫ラットの両方でＭＢＰに対する応答が検出されたが、ＣＦＡ免疫ラットの応答の方がはるかに大きかった。すべての調べたラットで、非選択的抗原オボアルブミンに対する応答は、バックグランド（抗原無し）応答と同様であった（図１）。これらの知見は、強力なＣＦＡが、ＩＦＡよりも早期かつ強いＴ細胞応答を誘導することを示唆する。
【０１０２】
例２．ＣＦＡに乳化した脊髄ホモジネートによる能動免疫
能動免疫の有効性が、プロトコールの変更により上昇させられるかどうかを調べるために、我々は、ＭＢＰ単独ではなく、一連のミエリンタンパク質を含有する脊髄ホモジネートによる免疫の作用を調べた。図１に示した結果を考慮して、以下の実験で選択されたアジュバントは、２つの異なる細菌濃度を有するＣＦＡである。脊髄挫傷の７日前に、メスのルイスラット（ｎ＝７）を、ＣＦＡ（０．５mg/ml結核菌（M. tuberculosis））に乳化した脊髄挫傷で免疫した。対照群のメスのルイスラット（ｎ＝７）に、同じアジュバントに乳化したＰＢＳを注入した。同じプロトコールで免疫した損傷していない３匹のメスのラットは、ＥＡＥの検出可能な症状を示さなかった。別の実験で、メスのラット（各群、ｎ＝６）を、脊髄挫傷の７日前に、５mg/ml細菌を含有するＣＦＡに乳化した脊髄ホモジネートで免疫した。
【０１０３】
低細菌含有（０．５mg/ml）アジュバントに乳化した脊髄ホモジネートでメスのルイスラットを免疫すると、ＰＢＳ処理対照で得られたものより、有意に良好な回復が得られた（図２Ａ；ＢＢＢスケールで最大スコア５．５±０．２に対して８．２±０．２［平均±ＳＥ］（繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。ＢＢＢスコア８．２は、すべての３つの後足関節と足底の広範な運動を示す（３匹の動物は、時々体重付加と足底ステップを示した）が、５．５のスコアは、２つの後足関節のわずかな動きと第３関節の広範な動きで、足底ステップまたは強打、体重付加が無いことを示す。より強力なアジュバント（５mg/ml細菌を含有する、図２Ｂ）に乳化した脊髄ホモジネートで免疫後、脊髄挫傷させたラット（ｎ＝６）は、対照に対して回復の兆候を示さず、３匹の損傷していない同腹子は、極端に重症のＥＡＥ症状を示した。２つの異なるアジュバント中のＰＢＳで免疫した対照群は、おそらく、細菌によるある程度の増強により、傷害に対する免疫応答の全身作用を反映する差を示した。有利な作用の観察された喪失は、細菌投与量が多い時、重症の脳炎誘発の症状とともに、有効な自己免疫と自己免疫疾患の発症の関係について疑問が発生する。防御性および病原性自己免疫に至る機序は同様であり、２つの型の自己免疫応答は、同じ型のＴ細胞により仲介されることは可能であり、これは、その投与量に応じて防御的または破壊的に作用する。あるいは、２つの型の自己免疫応答が、制御性および病原性Ｔ細胞の異なる集団により仲介されて、その比率が損傷の結果を決定することは可能である。いずれの場合も、この結果は、自己免疫応答が、病原性を避け神経防御を促進するために厳密に制御されなければならないことを示唆する。
【０１０４】
例３．赤核脊髄ニューロンの逆標識と拡散異方性ＭＲＩにより確認される能動免疫による脊髄提示
上記の行動結果は、脊髄挫傷部位の下に神経トレーサー色素フルオロルビー（Fluoro-ruby）の投与後に、脳の赤核中の赤核脊髄ニューロンの逆標識により得られた結果と相関した。ＣＦＡ（０．５mg/ml）中の脊髄ホモジネートで免疫したか、または同じアジュバント中のＰＢＳを注入したラットの赤核からの切片を、図３に示す。すでに報告されている（ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ）ように、染色赤核脊髄ニューロンの数は、ＢＢＢスコアで測定した行動結果と相関した。
【０１０５】
拡散異方性ＭＲＩ分析では、ＣＦＡ（０．５mg/ml）中の脊髄ホモジネートで免疫したラットの脊髄から取った軸スライスの異方性地図は、脊髄の全長さに沿って拡散異方性の領域を示し、すべての脊髄は、連続的な縦の構造を示した（図４）。これに対して、ＰＢＳ注入対照から取ったスライスは、病変部位の中心に整った構造の喪失を示し、ほとんどの分析したスライスの拡散異方性の領域は、比較的小さかった（図４）。脊髄ホモジネートで免疫したラットでは、異方性の平均和（ＳＡＩ）（傷害部位の異方性値を示す（最も小さいＳＡＩを有するスライス））は、ＰＢＳ注入対照から取った同じスライスのＳＡＩよりほぼ２倍高かった（１６７任意単位に対して２９０）。行動結果は、ＭＲＩ結果とよく相関した；行動スコアが高いほど、病変部位に存在する拡散異方性の領域は大きかった。
【０１０６】
例４．能動免疫はＥＡＥ耐性ＳＰＤラットの機能回復を促進する
我々は、ＥＡＥの誘導に耐性であることが知られているスプラーグ−ドーレイ（ＳＰＤ）ラットにおいて、脊髄挫傷が、内因性の有利な免疫応答を誘発することを、最近観察した。ＥＡＥ感受性のルイスラットではこのような応答は観察されなかったため、この自己免疫性神経防御応答は、ＥＡＥ耐性株に存在するが、ＥＡＥ感受性株には存在しないことが示唆された。従って、能動免疫が、おそらく自発的な有利な応答を増強することにより、ＥＡＥ耐性株の機能回復をさらに改善するかどうかを調べることは興味深い。脊髄挫傷の１２日前に、５匹のオスのＳＰＤラットに、ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌含有）に乳化した脊髄ホモジネートで免疫し、５匹に、同じアジュバント中のＰＢＳを注入した（図５）。免疫したラットは、挫傷後の１２日目からスタートして、以後のすべての記載の時点で、ＰＢＳ注入対照より有意に良好な機能回復を示した（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ）。この知見は、脊髄損傷後の機能的結果はＥＡＥ耐性ＳＰＤラットでさえ、ＭＢＰ反応性脾細胞の受動的移動により改善することができるという我々の以前の観察結果とともに、ミエリン関連自己抗原による免疫は、おそらく神経喪失の拡散を防ぐことにより、ＥＡＥ耐性およびＥＡＥ感受性ラットの両方で脊髄損傷後の回復の改善を引き起こすことを示唆する。
【０１０７】
例５．脊髄ホモジネートによる能動免疫は完全な脊髄切開後は無効である
我々の以前の研究は、免疫神経防御が、脊髄への部分的傷害後の完全な痺痲を防止することができることを示唆した。従って、脊髄損傷後の能動免疫が、完全な切断後も有効であるかどうかを調べることは興味深い。完全な脊髄切開の７日前に、５匹のメスのルイスラットをＩＦＡに乳化した脊髄ホモジネートで免疫し、５匹を、ＩＦＡ中のＰＢＳを注入した。さらに５匹を、切開直後に免疫した。これらのラットはいずれも、切開後４ヶ月まで毎週調べた時、有意な運動機能を示さなかった（図６）。３つの実験群で差は検出されず、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞による受動免疫の場合（ハウベン（Hauben）ら、２０００ａ）のように、脊髄ホモジネートによる能動免疫は、直接の傷害は逃れたエキソンへの神経防御作用を有するが、完全に切開された軸索の再生は引き起こさないことを示唆する。
【０１０８】
例６．改変ペプチドリガンドによる損傷後免疫：疾患のリスクが低下した神経防御
脊髄損傷後の完全な痺痲は、ミエリン関連抗原を使用する損傷後能動免疫により防止できることを確立したので、次に我々は、安全な（すなわち、非病原性）ペプチドを用いて免疫する方法について調査した。損傷を受けた脊髄にとって有益でかつ感受性株と耐性株の両方で安全な免疫法を開発する１つの方法は、抗原提示細胞により提示されるがもう病原性ではない（ガウル（Gaur）ら、１９９７；フェーゲリ（Vergelli）ら、１９９６）ように、改変ペプチドリガンド、例えばＴ細胞受容体結合部位で修飾された脳炎誘発性自己ペプチドを使用することである。可能なアプローチは、ＴＣＲ結合部位中の決定的に重要なアミノ酸が修飾されているペプチドを使用する。適当な抗原を産生するために、我々は、脳炎誘発性ＭＢＰペプチド（アミノ酸８７−９９）（ここで、残基９１（リジン）はグリシン（Ｇ９１）またはアラニン（Ａ９１）により置換されるか、または残基９６（プロリン）はアラニン（Ａ９６）により置換された）を使用した。ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌）に乳化したこれらの明らかに非病原性の改変ペプチドリガンドのいずれかによる、損傷直後の免疫は、この試験でルイスラットとＳＰＤラットで見られる運動活性の最適な回復を引き起こした。重症の脊髄挫傷直後に、５匹のメスのルイスラットを、ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌）中の改変ペプチドリガンドＧ９１（１００μg／ラット）で皮下免疫し、５匹の同腹子（対照）には、同じアジュバント中のＰＢＳを注入した（図７）。Ｇ９１免疫ラットでは、挫傷後の４８日目からスタートして、以後のすべての記載の時点で、対照より有意に良好な運動機能が観察された（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ）。ＣＦＡ中のＧ９１で免疫した３匹の損傷していない同腹子は、ＥＡＥ症状は示さなかった。第２の実験では、オスのＳＰＤラット（各群ｎ＝６）を、脊髄挫傷直後に、ＣＦＡ（０．５mg/ml細菌）中のＡ９６（１００μg／ラットまたは５００μg／ラット）で免疫した。１００μgのＡ９６で免疫したラットは、挫傷後の１５日目からスタートして、以後のすべての記載の時点で、ＰＢＳ注入対照より有意に良好であった（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ；図８Ａ）。しかし、１００μｇではなく５００μｇのＡ９６で免疫したラットは、ＰＢＳ注入対照より有意に悪かった（ｐ＜０．０５、繰り返しのある２元配置ＡＮＯＶＡ；図８Ｂ）。
【０１０９】
例７．メチプレドニソロン（ＭＰ）は、ＥＡＥ感受性およびＥＡＥ耐性ラットの両方でＡ９１免疫により誘導される神経防御作用を排除する
上記したように、Ａ９１による損傷後ワクチン化は、ＥＡＥ感受性およびＥＡＥ耐性ラットの両方でＩＳＣＩ後の運動回復を改善する。また、高用量のＭＰの投与は、ＥＡＥ感受性株の能動免疫後のＥＡＥの発症を防止しない（スタイナー（Steiner）ら、１９９１）。これらの知見を考慮して、我々はまず、Ａ９１免疫を高用量ＭＰと組合せ、ＩＳＣＩを受けたＥＡＥ感受性ラットの運動回復への共同作用を調べた。防御性自己免疫は遺伝的に制御されている（キプニス（Kipnis）ら、２００１）ようであるため、我々は、ＥＡＥ耐性ラットを使用して実験を繰り返した。麻酔したメスのルイス（感受性）またはＳＰＤ（耐性）ラットに、制御された損傷を与えた。損傷後、各株から一群のラットにＭＰを注入（ＭＰ）し、第２の群をＡ９１で免疫し、第３の群は、ＭＰ注入とＡ９１免疫の両方を行い（Ａ９１＋ＭＰ）、対照群は、ＣＦＡ中のＰＢＳで免疫した（ＣＦＡ）。各群は５匹のラットを含有した。損傷の１０分後に３０mg/kgの単一投与としてＭＰを投与した（これは、損傷した脊髄を有するラットの病変容量を大きく低下させることが報告されているプロトコールである（ユーン（Yoon）ら、１９９９））。免疫は、挫傷の１ｈ以内に行った。
【０１１０】
Ａ９１単独による免疫は、予測されたように、ＣＦＡ処理対照で得られたものより、有意に良好な運動回復を示した。ＭＰ単独の投与は、運動回復に有意な作用はなかった。Ａ９１ワクチン化群によりＢＢＢスケール（方法を参照）で得られた最も高い行動スコア（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）は、７．３±０．５（ルイスラット）と８．０±０．７（ＳＰＤラット）であり、これと比較してＭＰ処理ラットではそれぞれ５．６±０．３と４．５±１（ルイスラットとＳＰＤラットの両方についてｐ＜０．０５；両側ｔ検定）で、ＣＦＡ処理ラットではそれぞれ５±０．５または５±０．７（ルイスラットとＳＰＤラットの両方についてｐ＜０．０５；両側ｔ検定）であった。しかし、Ａ９１による処理をＭＰと組合せると、ルイスラットとＳＰＤラットの両方でワクチン化の有効な作用がなくなった（図９ａとｂ）。この場合、ＢＢＢスコアは、ルイスラットとＳＰＤラットについてそれぞれ５．４±０．３と４．９±０．９であった（両方で、Ａ９１単独と比較した時、ｐ＜０．０５；両側ｔ検定）。これらの行動結果は、脳の赤核中の赤核脊髄ニューロンの逆標識により得られる形態学的知見と相関した。形態学的結果は、Ａ９１による免疫のニューロン生存への防御作用は、ＭＰにより確かに排除されたことを確認した：Ａ９１処理ラット中の生存している赤核細胞の数は、１０４±１９．９と１４３±１７（それぞれルイスとＳＰＤ）であり、これと比較して、Ａ９１＋ＭＰによる処理後はそれぞれ４５±１２と２３±８であった（それぞれｐ＜０．０５と＜０．００４；両側ｔ検定）。これらの結果はまた、ＭＰ自体は、２次変性から赤核ニューロンを防御できなかったことを示す：ＭＰ処理ラット中の生存細胞の数（ルイスラットとＳＰＤラットについて、それぞれ２８±９と４３±２３；Ａ９１単独と比較してｐ＜０．０５；両側ｔ検定）は、ＣＦＡ処理対照ラット中のものと同様であり、Ａ９１処理ラット中のものより有意に低かった（図９ｃとｄ）。
【０１１１】
ＭＰは抗炎症剤であるため、これは、おそらくＡ９１への免疫応答のＭＰ誘導性抑制を反映するため、ワクチン化誘導回復の排除は、驚くべきことではない。しかし、以前の知見は、ＭＰが、能動誘導したＥＡＥの発症を抑制しないだけでなく、ＭＰが疾患誘導の前またはその最中に投与されると、疾患が悪化することがあることを示した（スタイナー（Steiner）ら、１９９１）。これらの知見は、我々が、ＭＰが実際にＡ９１への免疫応答を抑制するかどうかを調べることを促進した。メスのルイスラットとＳＰＤラットに重症の脊髄挫傷を与え、次にＣＦＡ、Ａ９１、Ａ９１＋ＭＰ、またはＭＰ単独（各群ｎ＝３）で処理した。損傷の１０日後に単離したリンパ節細胞を、Ａ９１、ＭＢＰ、ＯＶＡ、ＣｏｎＡの存在下で、または抗原無しで培養した。これらの抗原に対する増殖性応答の測定は、Ａ９１ワクチン化とＭＰで同時に処理したルイスラットとＳＰＤラットの両方で、Ａ９１について特異的増殖応答を防止することを示した。ルイスラットでは、抗原の無い培地中の増殖に対してＡ９１の存在下での増殖として計算された刺激指数（ＳＩ、方法を参照）は、Ａ９１＋ＭＰによる処理については１．３であり、Ａ９１単独による処理については２．１であった（ｐ＜０．０５、両側ｔ検定）（表２）であった。ＳＰＤラットでは、Ａ９１＋ＭＰによる処理についてのＳＩはまた、Ａ９１による処理で得られたもの（２．８；ｐ＜０．０５、両側ｔ検定）より有意に低かった（１．２）（表２）。これらの結果は、Ａ９１誘導性の有効な自己免疫へのＭＰの作用は、ワクチン化により誘発される免疫応答の抑制により生じることを確認した。
【０１１２】
ＭＰがまた、損傷部位でＴ細胞とマクロファージ／マクログリアの利用可能性に影響を与えるかどうかを調べるために、我々は、ルイスラットとＳＰＤラットを重症のＩＳＣＩに付し、これらを、損傷直後にＡ９１単独またはＡ９１＋ＭＰで処理した。７日後に切り出した脊髄の形態学的分析は、両方の株でＡ９１により誘導される炎症反応が、ＭＰにより有意に低下することを示した。Ａ９１＋ＭＰによる処理後、損傷部位に動員された１平方ミリメートル当たりのＴ細胞の数は、ルイスラットとＳＰＤラットについてそれぞれ３８±３と３３±３であり、これと比較してＡ９１単独による処理後はそれぞれ６３±１２と４６±５であった（ｐ＜０．０５；両側ｔ検定）。ワクチン化以外に、ＭＰによる処理はまた、損傷部位のＥＤ１陽性細胞の数を有意に低下させた（ルイスラットとＳＰＤラットについて、それぞれ８３４±１１と８１７±９、これと比較してＡ９１単独による処理後はそれぞれ５７８±５４と５８０±２５であった（ルイスラットについてｐ＜０．０５、およびＳＰＤラットについてｐ＜０．００１；両側ｔ検定）（図１０）。
【０１１３】
例８．ＩＳＣＩ直後のメチルプレドニソロンの注入はＡ９１による遅延ワクチン化による回復の促進を防止しない
上記知見は、ＭＰ（３０mg/kg）の単回投与が、運動回復に対してそれ自体有意な作用は無く、さらに、この薬剤の公知の抗炎症活性から予測されるように、これは、同時に投与されたＡ９１により誘発される免疫応答を抑制する。それだけが投与された時に運動回復に対してＭＰの少なくとも一部有効な作用を得るために、およびワクチン化の作用への妨害を避けるために、我々は、上記実験を繰り返して、より多くのＭＰを投与し、治療的ワクチン化を遅らせた。ＳＰＤラットを重症のＩＳＣＩに付し、次に５つの治療群に分けた（各群ｎ＝６）：（ａ）損傷直後ＰＢＳ、および４８ｈ後にＣＦＡ-ＰＢＳ；（ｂ）直後にＰＢＳ、および４８ｈ後にＣＦＡ-Ａ９１；（ｃ）直後にＭＰ、および４８ｈ後にＣＦＡ-Ａ９１；（ｄ）損傷直後にＭＰのみ；および（ｅ）損傷直後にＣＦＡ−Ａ９１のみ。すべての場合に、ＭＰ（３０mg/kg）またはＰＢＳ（０．１ml）による処理を、３回投与した（損傷後５分、２ｈ、および４ｈ）。結果は、用量の増加にもかかわらず、ＭＰ投与は、損傷ラットの運動回復を改善しなかった（達成された最も高いＢＢＢ運動スコアは、４．７±０．６、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．；図１１）。さらに、損傷後４０日にスタートして、ＭＰ処理ラットはすべての群で最も低いオープンフィールド運動スコアを得た（４．３±０．３、これに対してＰＢＳ処理ラットでは５．８±０．４）。最も固体運動スコア（７．５±０．７）は、損傷後にＡ９１で免疫したラットで得られた。試験の最後まで、損傷後４８ｈに免疫したラットでさえ、ＣＦＡ単独（５．２±０．５）またはＭＰ単独（４．２±０．４）で処理したラットより、良好な運動回復（６．４±０．８）を示した。興味深いことに、ＭＰ処理に対して４８ｈまで免疫を遅延させると、ＭＰの抑制作用を避けるようであった：ＭＰと遅延免疫の両方で処理したラットの運動回復スコア（６．５±０．７）は、遅延免疫のみで処理したラット（６．４±０．８）と非常によく似ていた。これらの結果は、ＭＰ自体が、量が増えても、ＩＳＣＩのモデルには有効ではないことを、強く示唆する。このデータはさらに、ＭＰは、損傷後４８ｈに行った治療ワクチン化の作用を妨害しないことを示す。
【０１１４】
例９．Ａ９１による免疫で誘導さ．０れた神経防御は、ＥＡＥ感受性およびＥＡＥ耐性ラットの両方でシクロスポリン−Ａにより抑制される
運動回復のＭＰ誘導性抑制は、Ａ９１に対する増殖応答の抑制に相関することが、本発明によりわかった（表２と３を参照）。シクロスポリン−Ａ（ＣｓＡ）は、Ｔ細胞の機能を阻害する抗炎症剤である。さらにＣｓＡは、ＥＡＥの治療で成功している。しかし興味深いことに、ＥＡＥ発症は、低用量のこの薬剤により抑制されない。損傷部位でのＴ細胞とＡＰＣとの対話（神経防御の必須の条件）が、ＣｓＡにより抑制される可能性がある。
【０１１５】
この可能性を調べるために我々は、重症の挫傷直後に、ラットをＣＦＡ、Ａ９１単独、またはＡ９１＋ＣｓＡで処理した。ルイスラットとＳＰＤラットの両方で、Ａ９１による免疫で誘導される防御作用は、ＣｓＡによりなくなり、Ａ９１＋ＣｓＡによる処理後の運動回復（ＢＢＢスコア、ルイスラットについて４．１±１、およびＳＰＤラットについて４．１±０．５）は、Ａ９１のみによる免疫後に観察されたものより有意に低かった（ルイスラットについて７．２±０．４、およびＳＰＤラットについて６．７±０．６；両方の場合にｐ＜０．０５、両側ｔ検定）（図１２ａとｂ）。結果は、これらのラットの赤核中のニューロン生存の形態学的試験により支持された（図１２ｃとｄ）。
【０１１６】
考察
上記結果はまた、ミエリン誘導性の修飾ペプチドによる動物の免疫は、損傷の前ではなく直後に行っても、重症の脊髄挫傷の症例において有効であることを示す。この利点は、運動性の改善された回復により証明され、自己免疫疾患を発症しやすいラットならびに発症しやすくないラットで、達成される。株の間の脊髄損傷からの回復速度の観察された差は、Ｔ細胞依存性の有効な自己免疫応答を維持する能力の差であると考えられる。
【０１１７】
本発明の知見は、有効な自己免疫は、損傷に対する生理学的応答であり、これは増強を受けやすいという我々の考えを支持する。ＥＡＥ感受性株は、生理学的に有効な自己免疫応答を促進する制御機構が欠如し、この応答は、抗原とアジュバントの選択によるが、免疫により誘導することができるようである。耐性株では、傷害に対する自発的免疫応答は限定されているかも知れない。
【０１１８】
「安全な」（非病原性）抗原が内因性応答を増強するための、ＣＮＳ損傷関連タンパク質の検索において、我々は、元々は脳炎誘発性であるが、ＴＣＲ結合部位の単一のアミノ酸の置換（病原性作用を弱くした操作）により修飾されたペプチドの外傷後作用を調べた。使用したペプチドは、ＭＢＰのアミノ酸配列８７−９９であり、９１位のリジンの代わりにグリシンまたはアラニン（それぞれ、Ｇ９１とＡ９１）が置換され、９６位でプロリンの代わりにアラニン（Ａ９６）が置換された。これらのペプチドは、ＣＦＡのような強力なアジュバントに乳化した後に注入した時でさえ、感受性株でＥＡＥを引き起こさなかった（ガウル（Gaur）ら、１９９７；フェーゲリ（Vergelli）ら、１９９６）。我々は、これらのペプチドが、ＣＦＡ中で乳化された時、脊髄挫傷直後の単一のワクチン化に、神経防御作用を示すことを見いだした。従って、感受性株でさえ、自己免疫疾患のリスクを伴わない、有効な自己免疫を設計できる可能性が有るようである。最近の研究は、これらのペプチドが高用量で、病原性自己免疫になりやすい患者に投与されると、ＭＢＰとの交差反応性の結果としてこの疾患を悪化しやすいため、多発性硬化症患者でのそのような修飾ペプチドの治療的使用が、安全ではない可能性を警告している（ビエレコバ（Bielekova）ら、２０００；カポス（Kappos）ら、２０００）。しかし、自己免疫疾患患者では、免疫偏移（おそらく有効ではあろうが）はあまり安全ではないため、選択される治療法は免疫抑制であることを強調したい。免疫神経防御は、能動的免疫応答を必要とし、従って、自己ペプチドまたは改変自己ペプチドを使用して脳炎誘発性または非脳炎誘発性ペプチドで免疫を増強することにより（免疫抑制によってではない）、治療作用を示すことができる。我々は、免疫抑制を引き起こすのに充分に高い用量の修飾ＭＢＰペプチドでラットをワクチン化しても、神経防御作用は無く、内因性の有用な応答が喪失されるため負の作用さえあることを見いだした。
【０１１９】
本発明の結果は、脊髄挫傷を有するラットで、完全な痺痲が防止され、ＭＢＰ由来合成類似体ペプチドによる外傷後免疫により、回復が促進されることを示す。これらはまた、感受性株と耐性株の両方とも、外傷後免疫により恩恵を受け、この神経防御への有効な作用は、ペプチドとアジュバントの両方の選択により影響されることを示した。
【０１２０】
非脳炎誘発性ペプチドによるワクチン化は、ＩＳＣＩを有するラットで有望な結果を示した。我々は、ワクチン化アプローチを、神経組織の迅速な防御を提供する処理と組合せると、ＩＳＣＩ後の神経的結果がさらに改善される可能性を考えた。従って我々は、防御性自己免疫ワクチン化をメチルプレドニソロン（ＭＰ）（現在、ＩＳＣＩについて臨床的に唯一認可されている）の組合せ作用を調べた。
【０１２１】
ＭＰは、脊髄への傷害後の神経回復を改善することが証明されている。ＭＰの観察された抗酸化作用および抗炎症作用は、損傷直後に誘発される破壊的イベントの一部を防止するために選択される薬剤をしている。治療的ワクチン化がＩＳＣＩの治療のための臨床的に認可されると予測することが非現実的ではないため、ＭＰ治療とＡ９１ワクチン化の組合せの効果を調べることは興味深いことであった。しかし我々は、ＭＰの抗炎症作用が、能動ワクチン化（これは炎症を誘発する）の有利な作用を妨害する可能性があると考えた。この可能性を調べるために、我々はまず、高用量のＭＰをＡ９１免疫と同時に投与した。予測されたように、ＭＰは、機能的結果に及ぼすＡ９１ワクチン化の有効な作用を抑制した。この抑制は、ＥＡＥ感受性およびＥＡＥ耐性ラットの両方において、Ａ９１に対する免疫応答の大きな低下、ならびにワクチン化動物の脊髄中の免疫細胞の蓄積と相関した。この治療的ワクチン化の有効作用は、ＣｓＡにより同様になくなった。
【０１２２】
一方、Ａ９１によるワクチン化を損傷後４８ｈに遅延させると、損傷直後に注入されたＭＰの抗炎症作用による、その作用の妨害はなかった。この知見は、ＭＰ作用の機構が何であっても、その作用は一過性であり、この治療が免疫関連であっても、後の治療を妨害しないことを示唆する。すなわち、これらの知見は、２つの重要なメッセージを伝える：Ａ９１によるワクチン化は、損傷後４８ｈに行われても神経防御であること；およびＭＰはたとえ数回の高用量で投与されても、神経防御を付与しないこと。
【０１２３】
本研究において、損傷部位で動員される免疫細胞の数は、ＭＰとＡ９１の組合せで治療されたＥＡＥ感受性およびＥＡＥ耐性ラットの両方で大幅に低下した。本明細書において、抗炎症剤によるこの応答の抑制は、治療的ワクチン化により誘導される機能的利点の喪失を引き起こすことが証明される。これらのデータは、Ｔ細胞の蓄積と活性化、ならびに損傷部位での他の免疫細胞とのその相互作用は、防御性自己免疫における重要な要素であるという我々の現在の示唆を支持している。さらに、一般的な意見とは反対に、この研究は、脊髄損傷後の機能回復における炎症の重要な役割についてのさらなる証拠を提供し、炎症応答を妨害するのではなくこれを調節するとしている。
【０１２４】
ＭＰの臨床的使用が広く行われているため、脊髄損傷後の炎症は、有害作用しか無いと考えられている；しかし、この広く信じられている見解は、問題がある。損傷後の神経組織の防御および再増殖の誘導における、免疫系の主要な役割について、研究は説得力のある証拠を提供している（ラパリノ（Rapalino）ら、１９９８）。さらに、炎症細胞が損傷部位から有効に除去された時でも、初期の組織喪失の容量は低下しない（バルトルディ（Bartholdi）とシュワブ（Schwab）、１９９５）。これらの知見は、ＩＳＣＩ後の抗炎症剤の使用は、注意深く再評価すべきであることを示唆する。
【０１２５】
いくつかの他の最近の研究がその有用性を問題にしているように、ＩＳＣＩの治療のためのＭＰの使用は問題になっている。さらに、ある場合にＭＰは、有効であるより有害であるようである。上記したように、ＭＰによる治療は、単一の高用量としてもまたはほとんど増加しない用量であっても、形態学的かつ機能的に評価すると、運動回復を改善しなかった。ＭＰのみ（数回の投与で）で処理したラットは、対照ラットより低いＢＢＢ運動スコアを得た（ただし、差は有意ではない）。高用量ＭＰ治療法は、重症の副作用を伴うため、および神経回復に及ぼすその有効作用は、明確に確認はされていないため、この治療法の予測される利点は、そのリスクの可能性より重要であるかどうかを再検討する時期が来ていると思われる。
【０１２６】
非脳炎誘発性ペプチドによる治療的ワクチン化は、ヒトのＩＳＣＩの有望な治療法と思われる；しかし、ＭＰがルーチンに処方され続けていても、ワクチン化の有効作用は無効にする必要は無いようである。この研究で証明されるように、治療的ワクチン化は、損傷の４８ｈ後という遅い時に投与されても、運動結果を改善するのにまだ有効である。この時間ウィンドウは、損傷直後にＭＰを投与しても、遅延ワクチン化の治療効果を及ぼすことを可能にするという利点を有する。この知見は、ＭＰにより誘導される変化が、少なくとも一部は、投与後４８ｈまで可逆的であることを示唆する。
【０１２７】
要約すると、我々の研究は、損傷直後に投与される抗炎症剤は、治療的ワクチン化と同時に投与されても、ワクチン化の利点を無効にすることを示す。我々はまた、ＭＰが神経防御を促進しないことも証明した。しかし、機能活性と神経生存へのＭＰの作用の見かけの欠如は、ＭＰの即時的な一過性の有効作用（これは免疫細胞に対するニーズの方が重要である）と適合しないわけではないことに注意されたい。この示唆は、充分調節された防御免疫の機序は、神経の喪失という点で、全体の利益のために組織が犠牲になるという段階を含むことを示す、我々のグループの最近の観察結果に基づく（ネボ（U. Nevo）ら、未発表観察結果）。これらの結果は、まとめると、その全体の抑制ではなく、免疫応答の特異的調節は、ＩＳＣＩの治療法として考えるべきであることを強く示唆する。
【０１２８】
本発明を詳細に説明したが、これは、広範囲の同等のパラメータ、濃度、および条件内で、本発明の精神を範囲を逸脱することなく、かつ不当に実験することなく、行われることは、当業者により理解されるであろう。
【０１２９】
本発明を、具体例に関連して記載したが、これはさらなる修飾が可能であることを理解されたい。本出願は、一般的に発明の原理に従って、かつ本発明が関連する技術の公知のまたは慣用の実施内にあるような、および添付の請求の範囲に記載される基本的な特徴のような、本開示からのそのような逸脱を含み、発明の変更態様、用途、または適合をカバーするものである。
【０１３０】
雑誌論文、抄録、公表されたまたは対応する米国もしくは外国特許出願、発行された米国特許または外国特許、または他の任意の文献を含む、本明細書に引用されたすべての文献は、そのすべてのデータ、表、図、および引用文献に記載されている本文を含み、参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに、引用された文献内の全内容は、また参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
既知の方法工程、従来法の工程、既知の方法または従来法への言及は、本発明の態様、記載または実施態様が、その関連技術に開示、教示または示唆されていることを認めるものではない。
【０１３２】
具体例の前記説明は、不当な実験をすることなく、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、当該分野の技術内の知識（本明細書に引用される文献の内容を含む）を応用して、そのような具体例を種々の応用について容易に修飾および／または適合させることができるという、本発明の一般的性質を完全に明らかにするであろう。従って、そのような適合および修飾は、本明細書に記載の教示および指針に基づき、開示された実施態様の意味および相当物の範囲内にあると考えられる。本明細書の用語または専門語は、説明を目的とするものであり、限定するものではなく、本明細書の専門語または用語は、当業者の知識と組合せて、本明細書に記載の教示や指針を考慮して当業者により理解されるものであることを理解されたい。
【０１３３】
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【０１３４】
メスのルイスラットを、ＩＦＡ中のミエリン塩基性タンパク質で免疫したか、またはＩＦＡ中のＰＢＳを注入した。免疫の直前または７日後に、ラットを深く麻酔し、椎弓切除、そしてＴ８で脊髄挫傷に付した。オープンフィールドの運動挙動をスコアにした。両側スチューデントｔ検定により明らかになった最大値と統計的差を示す。両方のワクチン化プロトコールは、ＰＢＳ処理対照に対する運動性の改善を引き起こしたが、神経防御自己免疫応答は、損傷の７日前にワクチン化投与することにより有効に改良された。
【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ＭＢＰに対するＴ細胞応答。
【図２Ａ−Ｂ】このタイプのアジュバントは、脊髄損傷の結果に影響を与える。
【図３】赤核中の細胞体の逆標識。
【図４】挫傷した脊髄の拡散異方性を示す地図。
【図５】ＥＡＥ耐性株の脊髄挫傷の機能的結果は、能動免疫により改善することができる。
【図６】ミエリン関連タンパク質による免疫は、非傷害繊維および部分的に傷害した繊維の神経防御を促進する。
【図７】「安全な」、非脳炎誘発性の修飾ＭＢＰペプチドによる免疫は、脊髄挫傷からの回復を促進することができる。
【図８Ａ−Ｂ】脊髄損傷後の修飾ＭＢＰペプチド（Ａ９６）による免疫は、ＥＡＥ耐性ＳＰＤラットの機能回復を促進する。
【図９ａ−ｄ】メチルプレドニソロン（ＭＰ）は、Ａ９１免疫により誘導される神経防御作用を排除する。
【図１０ａ−ｂ】Ａ９１免疫ラットの脊髄中のＴ細胞とＥＤ１陽性細胞の動員は、ＭＰにより低下した。
【図１１ａ−ｃ】Ａ９１による即時または遅延ワクチン化は、ＭＰにより促進されるものより、良好に運動回復を促進する。
【図１２ａ−ｄ】シクロスポリン−Ａ（Ｃｓ−Ａ）はＭＰのように、Ａ９１による免疫で誘発される神経防御作用を排除する。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図９ａ−ｄ】
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【図１０ａ−ｂ】
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【図１１ａ−ｃ】
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【図１２ａ−ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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