(57)【要約】以下の工程：（ｉ）ヒトから生体サンプルを採取すること、及び（ｉｉ）生体物質由来の遺伝物質において５番染色体のＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８マーカーに限定された位置に少なくとも１つのアレル変異の存在を同定すること、を含み、この存在は心血管疾患の素因を示す。この方法において、血栓事象を明示する心血管疾患の素因を測定するために、５番染色体のＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８マーカーに限定された位置に少なくとも１つのアレル変異を含むことが可能な生体サンプルが使用される。この方法はヒトにおいて心血管疾患の素因の検出を可能にし、その結果、好適な予防及び治療戦略をデザインすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒトから生体サンプルを採取し；そして
（ｉｉ）生体サンプルの遺伝物質において、５番染色体のＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８マーカーに限定された位置に少なくとも１つのアレル変異の存在を同定する、
ことを含み、この存在は心血管疾患の素因を示すことを特徴とする、ヒトにおいて少なくとも１つのアレル変異の存在を検出する方法。
【請求項２】
生体サンプルが血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アレル変異が第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子上にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、
（ｉｉａ）第ＸＩＩ因子タンパク質をコードするゲノム位置を同定し、そして
（ｉｉｂ）増幅断片上に少なくとも１つのアレル変異の存在を検出する、
ことを特徴とする、請求項１及び３に記載の方法。
【請求項５】
血栓事象を明示する心血管疾患の素因を測定するための、５番染色体のＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８マーカーに限定された位置に少なくとも１つのアレル変異を含むことが可能な生体サンプルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおいて心血管疾患の素因を検出するための新規方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患、特に動脈血栓症及び静脈血栓症は、工業国において最も高い死亡原因の１つである。
遺伝及び環境要因が血栓症の原因に関与している。血栓症の患者数の多さ及び公知の環境による影響（例えば経口避妊薬の使用）は、この疾患に対する感受性に多くの遺伝子が関与していることを示唆している。
【０００３】
実際、血栓の危険率増加をもたらすいくつかの遺伝的欠失が局在し、特徴付けられている（Ｌａｎｅ  ＤＡ，Ｍａｎｎｕｃｃｉ  ＰＭ，Ｂａｕｅｒ  ＫＡ，Ｂｅｒｔｉｎａ  ＲＭ，Ｂｏｃｈｋｏｖ  ＮＰ，Ｂｏｕｌｙｊｅｎｋｏｖ  Ｖ，Ｃｈａｎｄｙ  Ｍ，Ｄａｈｌｂａｃｋ  Ｂ，Ｇｉｎｔｅｒ  ＥＫ，Ｍｉｌｅｔｉｃｈ  ＪＰ，Ｒｏｓｅｎｄａａｌ  ＦＲ，Ｓｅｌｉｇｓｏｈｎ  Ｕ．Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ：Ｐａｒｔ  １．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １９９６；７６：６５１−６６２）。
【０００４】
しかしながら、一般に、集団の血栓症の危険率における遺伝的要因の相対的重要性について有用な情報はほとんどない。更に、相対的に頻度の低いこうした公知の突然変異は血栓症危険率の主な原因ではないようである。
【０００５】
近年、本発明の発明者らは血栓症に対する感受性の遺伝的要素及び関連する表現型を定量化し（Ｓｏｕｔｏ  ＪＣ，Ａｌｍａｓｙ  Ｌ，Ｂｏｒｒｅｌｌ  Ｍ，Ｇａｒｉ  Ｍ，Ｍａｒｉｎｅｚ  Ｅ，Ｍａｔｅｏ  Ｊ，Ｓｔｏｎｅ  ＷＨ，Ｂｌａｎｇｅｒｏ  Ｊ，Ｆｏｎｔｃｕｂｅｒｔａ  Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｆａｍｉｌｉｅｓ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１：１５４６−１５５１．２０００；Ｓｏｕｔｏ  ＪＣ，Ａｌｍａｓｙ  Ｌ，Ｂｏｒｒｅｌｌ  Ｍ，Ｂｌａｎｃｏ−Ｖａｃａ  Ｆ，Ｍａｔｅｏ  Ｊ，Ｓｏｒｉａ  ＪＭ，Ｃｏｌｌ  Ｉ，Ｆｅｌｉｃｅｓ  Ｒ，Ｓｔｏｎｅ  Ｗ，Ｆｏｎｔｃｕｂｅｒｔａ  Ｊ，Ｂｌａｎｇｅｒｏ  Ｊ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ：Ｔｈｅ  ＧＡＩＴ  ｓｔｕｄｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６７：１４５２−１４５９，２０００）、第ＸＩＩ因子レベルが最も高い遺伝率の１つを示し（６７％）、有意に陽性の遺伝的相関（０．３５１）を示すことを観察した。これは、この生理学的危険因子の変化に影響する遺伝子のいくつかが血栓症の危険率にも影響することを示す。
【０００６】
一方、特に、病気は進行していないがある種の遺伝的変異が存在するために危険群に属する人々において、こうした疾患に関連する二次的合併症が回避できるため、この種の疾患の初期診断には多くの関心が寄せられている。
【０００７】
しかしながら、心血管疾患及び特に血栓症が進行する遺伝的危険率を有する個人を同定するのに好適な診断を行う場合、上記のように多重遺伝子疾患（いくつかの遺伝子が関与する疾患）であるために、血栓症に影響する遺伝的原因に関する知識不足により問題が生ずる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、心血管疾患が進行する遺伝的危険率を提示する個人を同定するために５番染色体のＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８マーカーに限定された位置に少なくとも１つのアレル変異を同定することを可能にする方法を提供することにより、心血管疾患の診断における課題を解決することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の説明
本発明の目的は、第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子上に少なくとも１つのアレル変異を検出することであり、変異アレルに関しヘテロ接合体又はホモ接合体の個人は心血管事象になる素因がより大きいため、この検出は遺伝子診断に非常に有用である。これは、特に心血管疾患の予防において注目に値する進展を意味する。
【００１０】
本発明はヒトにおいて少なくとも１つのアレル変異の存在を検出する方法に関するものであり、この方法は：
（ｉ）ヒトから生体サンプルを採取し；そして
（ｉｉ）生体サンプルの遺伝物質において、５番染色体のＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８マーカーに限定された位置に少なくとも１つのアレル変異の存在を同定する、
ことを含むものである。このアレル変異の存在は心血管疾患の素因を示す。
【００１１】
したがって、本発明は、疾患はまだ進行していないが、この染色体の位置に少なくとも１つのアレル変異が存在するために危険群に含まれる個人を同定することに係るものである。この変異はこうした個人を心血管疾患感受性にする。
【００１２】
本発明の１つの態様において、ヒトから採取される生体サンプルは、好ましくは血液である。
本発明において、「遺伝物質」という用語は、生体サンプルから抽出されるＤＮＡ配列を意味する。生理学的サンプルからのＤＮＡの抽出は、当該技術分野に公知のプロトコールを用いて行うことができる（例えば、文献、Ｍｉｌｌｅｒ  ＳＡ，Ｄｙｋｅｓ  ＤＤ，Ｐｏｌｅｓｋｙ  ＨＦ（１９８８）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓａｌｔｉｎｇ  ｏｕｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １６：１２１５に記載されているもの）。
【００１３】
好ましい態様において、本発明の方法は、第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子において少なくとも１つのアレル変異の同定を可能にする。
本発明において、「アレル変異」という用語は、第ＸＩＩ因子タンパク質をコードするＤＮＡ配列における遺伝的変異を意味する。この遺伝的変異は、機能の欠失又は獲得といった病理に関与する。特に、この遺伝的変異は心血管病理へのなりやすさに影響する。
【００１４】
ヒトの第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子配列は、多くのデータバンクに記載されており、例えばＯＭＩＭデータバンクでは、第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子配列の受入番号は２３４０００．００４である。
【００１５】
遺伝マーカーＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８も、ゲノムデータバンク又はヒトゲノムデータバンクなどのいくつかのデータバンクに記載されている。これらのマーカーは、５番染色体の１６８．５７６．６６７ｂｐ（Ｄ５Ｓ４００）の位置及び１８０．０１５．９９７（Ｄ５Ｓ４０８）の位置（５番染色体の初めから塩基対（ｂｐ）をナンバーリング）に焦点を当てている。
【００１６】
本発明の他の好ましい態様において、生体サンプルの遺伝物質における少なくとも１つのアレル変異の同定は以下の工程：
（ｉｉａ）第ＸＩＩ因子タンパク質をコードするゲノム位置を同定すること；及び
（ｉｉｂ）増幅断片上に少なくとも１つのアレル変異の存在を検出すること、
を含む。
【００１７】
第ＸＩＩ因子タンパク質のコード部位の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）のような公知の技術により行われる。
増幅断片における少なくとも１つのアレル変異の存在の検出は、当該技術分野に公知のプロトコールにより行われる。例えばＰＣＲで得られるＤＮＡ断片を制限酵素で消化することにより行われ、これにより、正常な個人、ヘテロ接合体キャリア及びホモ接合体キャリアにおいて異なるパターンの電気泳動バンドが生ずる。
【００１８】
また、本発明は、血栓事象を明示する心血管疾患の素因を検出するための、５番染色体のＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８マーカーに限定された位置に少なくとも１つのアレル変異を含むことが可能な生体サンプルの使用に関する。
【００１９】
血栓事象を明示する心血管疾患には、急性心筋梗塞、虚血性脳血管障害事故、深部静脈血栓症、肺塞栓症等、かなり多様性がある。
本発明の１つの有益な点は、特別な又は複雑な技術を必要としないことである。実際、使用する技術は当業者に一般に公知である。本発明の主な態様は、そのような疾患がまだ進行していない個人に心血管疾患の素因があるかどうかを測定するために、５番染色体のＤ５Ｓ４００及びＤ５Ｓ４０８マーカーに限定された位置に少なくとも１つのアレル変異を検出することである。
【００２０】
更に、本発明の方法を用いて、心血管疾患、特に血栓事象を有する心血管疾患に関し分子ベースでの理解をもたらす遺伝因子を同定することが可能である。これは、より有効な予防的及び治療的方法を開発するための主な態様である。
【００２１】
更に、個人が第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子中にアレル変異を有するとして同定されかつ病理はまだ進行していない場合、予防的及び治療的戦略をデザインすることができるため、第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子配列において１つ以上のアレル変異を同定することはヘルスケア利益に関わる。
【００２２】
したがって、本発明は、血栓症及びその中間の表現型に対する感受性に影響する遺伝子座の同定を可能にする。疾患の初期段階における診断を可能にすることにより、血栓症に関連する死亡率及び罹患率を減少させることができる点で更に有益である。
【００２３】
最近、分子遺伝学分野の研究者のあいだで、心血管事象の進行に寄与する全ての遺伝的要因のリストを作成することにかなり関心が寄せられている。理想的には、このリストは、異なる多様な環境における血栓形成のメカニズムに関する知識の増加、並びに個人の遺伝的プロファイルに特異的な治療及び予防戦略のデザインに役立つであろう（Ｈｏｌｔｚｍａｎ  ＮＡ，Ｍａｒｔｅａｕ  ＴＭ．Ｗｉｌｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｚｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ？．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０００  Ｊｕｌｉｏ１３；３４３（２）：１４１−４）。本発明は、心血管疾患の診断及び予防を進展させる重要な工程を構成する。
【００２４】
以下に非限定的な例により態様例を記載する。
【実施例】
【００２５】
次に、第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子においてアレル変異を測定する例を開示する。
１．第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子におけるアレル変異の同定
第１に、血液サンプルを対象被験者（２５０人の健常な個人）及び患者（診断される２５０人の個人）から採取する。血液を採取後、公知の標準プロトコール（Ｍｉｌｌｅｒ  ＳＡ，Ｄｙｋｅｓ  ＤＤ，Ｐｏｌｅｓｋｙ  ＨＦ（１９８８）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓａｌｔｉｎｇ  ｏｕｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １６：  １２１５）でＤＮＡを抽出する。標準条件でＰＣＲ技術を用いることにより、解析される特定のゲノム断片が得られる。
【００２６】
第２に、得られた断片において少なくとも１つのアレル変異を同定する。当該技術分野に公知のプロトコール、例えば、増幅断片の直接塩基配列決定法、（上記のような）制限酵素による消化又は蛍光標識した特異的ハイブリダイゼーションプローブによるものをこの目的に用いることができる。
【００２７】
特に、具体例として、第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子において、転写開始に関連する位置であるため、４６  Ｃ／Ｔとして公知のアレル変異が測定されるであろう。
【００２８】
診断は、４６番目のヌクレオチドＣ／Ｔを含有する３６９塩基対のゲノム断片をＰＣＲで増幅し、変異配列を認識する制限酵素ＳｆａＮＩで消化することによるＤＮＡ分子の解析に基づく。変異アレルの増幅断片はＳｆａＮＩで２４７及び１２２ｂｐの断片に消化される（Ｋａｎａｊｉ  Ｔ，Ｏｋａｍｕｒａ  Ｔ，Ｏｓａｋｉ  Ｋ，Ｋｕｒｏｉｗａ  Ｍ，Ｓｈｉｍｏｄａ  Ｋ，Ｈａｍａｓａｋｉ  Ｎ，Ｎｉｈｏ  Ｙ（１９９８）Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（４６  Ｃ  ｔｏ  Ｔ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）ｉｎ  ｔｈｅ  ５’−ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｆａｃｔｏｒ  ＸＩＩ  ｌｅｖｅｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９１：２０１０−２０１４）。
【００２９】
ＰＣＲによる増幅：３６９ｂｐの断片
【００３０】
【表１】
2005515791.tif 000002
【００３１】
検出：酵素ＳｆａＮＩによる消化
第１に、制限酵素ＳｆａＮＩで消化するのに必要な試薬を解凍する。次に以下をチューブに加える。
【００３２】
【表２】
2005515791.tif 000003
【００３３】
混合物を振盪し、１４０００ｒｐｍで５秒間遠心し、３７oＣのオーブンに一晩放置する。
最後に、４℃の温度で反応を停止させ、１４０００ｒｐｍで５秒間遠心する。
【００３４】
結果
結果の表示：
３６９ｂｐの増幅断片を得る必要がある。
【００３５】
正常アレル及びアレル変異４６  Ｃ／Ｔを有するアレル（変異アレル）を酵素ＳｆａＮＩで消化したバンドの同定を、φマーカーのバンドパターンと比較することにより行う。
【００３６】
【表３】
2005515791.tif 000004
【００３７】
アレル変異４６  Ｃ／Ｔの結果の解釈：
３６９塩基対のバンド１本が観察される個人は正常アレルのホモ接合体である。即ち、２本のＣアレルのキャリアである（第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子が局在する２本の５番染色体のそれぞれにある）。
【００３８】
３６９塩基対のバンド１本と２４７／１２２塩基対の他の２本のバンドが観察される個人は、それぞれ正常アレルと変異アレルのヘテロ接合体である。即ち、５番染色体の一方がＣアレル（正常）のキャリア及び５番染色体の他方がＴアレル（変異）のキャリアである。
【００３９】
一方は２４７塩基対、他方は１２２塩基対（３６９塩基対のバンドがない）の２本のバンドのみが観察される個人は変異アレルのホモ接合体である。即ち、２本のＴアレル（変異）があるキャリアであり、第ＸＩＩ因子タンパク質をコードする遺伝子が局在する５番染色体のそれぞれにある。
【配列表】
2005515791.tif 000005
【国際調査報告】
2005515791.tif 000006
2005515791.tif 000007
2005515791.tif 000008
2005515791.tif 000009