(57)【要約】本発明は、口腔組織を処置するための方法、オーラル・ケア製品およびキットを提供する。具体的には、本発明は、口腔組織の炎症を軽減させ、活性酸素種（ＲＯＳ）によってこのような組織に与えられる損傷を軽減させ得る特定の金属結合ペプチド、ペプチド誘導体およびペプチド２量体を含む方法、オーラル・ケア製品ならびにキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｐ１−Ｐ２
［式中、
Ｐ１は、
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓまたは
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であり、
Ｐ２は（Ｘａａ４）ｎであり、
Ｘａａ１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、イソグルタミン酸、グルタミン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、またはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ２は、グリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、またはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ３は、グリシン、アラニン、バリン、リジン、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンであり、
Ｘａａ４は任意のアミノ酸であり、
ｎは０〜１００である］
を有するペプチドあるいは生理学的に許容可能なその塩からなるオーラル・ケア製品。
【請求項２】
Ｘａａ１がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、スレオニン、またはα−ヒドロキシメチルセリンである、請求項１に記載の製品。
【請求項３】
Ｘａａ２がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、セリン、アスパラギン、メチオニン、ヒスチジンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである、請求項１に記載の製品。
【請求項４】
Ｘａａ３がリジンである、請求項１に記載の製品。
【請求項５】
Ｘａａ１がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、スレオニン、またはα−ヒドロキシメチルセリンであり、Ｘａａ２がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、セリン、アスパラギン、メチオニン、ヒスチジンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、Ｘａａ３がリジンである、請求項１に記載の製品。
【請求項６】
Ｘａａ１がアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２がアラニン、グリシン、バリン、スレオニン、セリン、ロイシン、またはα−ヒドロキシメチルセリンである、請求項５に記載の製品。
【請求項７】
Ｘａａ２がアラニン、スレオニン、ロイシン、またはα−ヒドロキシメチルセリンである、請求項６に記載の製品。
【請求項８】
Ｘａａ１がアスパラギン酸であり、Ｘａａ２がアラニンである、請求項７に記載の製品。
【請求項９】
ｎが０〜１０である、請求項１に記載の製品。
【請求項１０】
ｎが０〜５である、請求項９に記載の製品。
【請求項１１】
ｎが０である、請求項１０に記載の製品。
【請求項１２】
Ｐ２が金属結合配列からなる、請求項１に記載の製品。
【請求項１３】
Ｐ２が以下の配列：
（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ３  Ｈｉｓ  Ｘａａ２  Ｘａａ５、
（Ｘａａ４）ｍ  Ｈｉｓ  Ｘａａ２  Ｘａａ５、
（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３、または
（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ
［式中、Ｘａａ５は遊離側鎖−ＮＨ２を有するアミノ酸であり、ｍは０〜５である］
の１つからなる、請求項１２に記載の製品。
【請求項１４】
Ｘａａ５がＯｒｎまたはＬｙｓである、請求項１３に記載の製品。
【請求項１５】
Ｐ２が以下の配列：
［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２ＨｉｓＸａａ３］ｒ、
［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２Ｈｉｓ］ｒ、
［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２ＨｉｓＸａａ３（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２Ｈｉｓ］ｒ、または
［（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２Ｈｉｓ（Ｘａａ４）ｍＸａａ５Ｘａａ２ＨｉｓＸａａ３］ｒ
［式中、Ｘａａ５は遊離側鎖−ＮＨ２を有するアミノ酸であり、ｍは０〜５であり、ｒは２〜１００である］
の１つからなる、請求項１２に記載の製品。
【請求項１６】
Ｐ２がＣｕ（Ｉ）を結合する配列からなる、請求項１２に記載の製品。
【請求項１７】
Ｐ２が以下の配列：
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｍｅｔ、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｍｅｔ、
Ｃｙｓ  Ｃｙｓ、
Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号７］、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号８］、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ［配列番号９］、または
γ−Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ
の１つからなる、請求項１６に記載の製品。
【請求項１８】
Ｐ２がＧｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ［配列番号９］である、請求項１７に記載の製品。
【請求項１９】
Ｐ２が、前記ペプチドの細胞膜を貫通する能力を増強させる配列からなる、請求項１に記載の製品。
【請求項２０】
Ｐ２が疎水性またはアルギニン・オリゴマーである、請求項１９に記載の製品。
【請求項２１】
Ｐ１のβ−アラニン（存在する場合）以外の前記アミノ酸のうち少なくとも１つがＤ−アミノ酸である、請求項１に記載の製品。
【請求項２２】
Ｘａａ１がＤ−アミノ酸であるか、ＨｉｓがＤ−アミノ酸であるか、またはＸａａ１およびＨｉｓのいずれもＤ−アミノ酸である、請求項２１に記載の製品。
【請求項２３】
Ｐ１のβ−アラニン（存在する場合）以外の前記アミノ酸すべてがＤ−アミノ酸である、請求項２２に記載の製品。
【請求項２４】
Ｐ２の前記アミノ酸のうち少なくとも５０％がＤ−アミノ酸である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の製品。
【請求項２５】
Ｐ１の少なくとも１つのアミノ酸、Ｐ２の少なくとも１つのアミノ酸、またはＰ１の少なくとも１つのアミノ酸およびＰ２の少なくとも１つのアミノ酸が、（ａ）Ｐ１が金属イオンを結合する能力を変化させずに前記ペプチドの親油性を増大させる置換基、（ｂ）Ｐ１が金属イオンを結合する能力を変化させずに前記ペプチドをタンパク質分解酵素から保護する置換基、あるいは（ｃ）前記ペプチドが金属イオンを結合する前記能力を増大させる非ペプチド性の金属結合官能基である置換基、で置換されている、請求項１に記載の製品。
【請求項２６】
ｎが０であり、Ｐ１が以下の式：
【化１】
2005517636.tif 000006
【化２】
2005517636.tif 000007
［式中、
Ｒ１は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ２は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＲ１、またはＲ１であり、
Ｒ３は、Ｈ、非ペプチド性の金属結合官能基、または２つのＲ３基が一緒になって非ペプチド性の金属結合官能基を形成する］
のうち１つを有する、請求項２５に記載の製品。
【請求項２７】
オーラル・ケア・デバイスである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の製品。
【請求項２８】
オーラル・ケア組成物である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の製品。
【請求項２９】
前記デバイスが縫合糸またはデンタル・フロスである、請求項２７に記載の製品。
【請求項３０】
前記デバイスがストリップである、請求項２７に記載の製品。
【請求項３１】
前記ストリップが歯のホワイトニング剤からさらになる、請求項３０に記載の製品。
【請求項３２】
前記組成物がゲル、ペースト、軟膏、クリーム、散剤、洗浄剤、洗口剤、うがい薬、スプレー、液剤、錠剤、ガム、ロゼンジ、ミント、フィルム、またはパッチである、請求項２８に記載の製品。
【請求項３３】
前記組成物が歯のホワイトニング組成物である、請求項２８に記載の製品。
【請求項３４】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の製品からなるキット。
【請求項３５】
前記製品がオーラル・ケア・デバイスである、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記製品がオーラル・ケア組成物である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
前記デバイスがストリップである、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
前記ストリップが歯のホワイトニング剤からさらになる、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記キットが歯のホワイトニング組成物からさらになる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記キットが第２のストリップからさらになり、該第２ストリップが歯のホワイトニング剤からなる、請求項３７に記載のキット。
【請求項４１】
前記組成物が歯のホワイトニング組成物である、請求項３６に記載のキット。
【請求項４２】
前記キットが、歯のホワイトニング剤からなるストリップからさらになる、請求項３６に記載のキット。
【請求項４３】
動物の口腔組織を請求項１〜２８のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織を処置する方法。
【請求項４４】
前記組織を予防的に処置する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
予防的オーラル療法の一部として前記組織を処置する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
手術前、手術中、手術後、またはこれらの組合せで前記組織を処置する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
抜歯前、抜歯中、抜歯後、またはこれらの組合せで前記組織を処置する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記組織がすべてまたは実質的にすべての前記口腔組織である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
動物の口腔組織を請求項１〜２８のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織の疾病または状態を処置する方法。
【請求項５０】
前記疾病または状態が歯周組織の疾病または状態である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾病または状態が歯肉炎または歯周炎である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾病または状態が感染症である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
動物の口腔組織を請求項１〜２８のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織の炎症を処置する方法。
【請求項５４】
前記炎症が歯周組織の炎症である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
動物の口腔組織を請求項１〜２８のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該動物の１つまたは複数の歯をホワイトニングする方法。
【請求項５６】
前記組織がすべてまたは実質的にすべての口腔組織である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記歯のホワイトニング前、前記歯のホワイトニング中、前記歯のホワイトニング後、またはこれらの組合せで前記組織を前記製品と接触させる、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
動物の口腔組織を請求項１〜２８のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、活性酸素種によって該組織に与えられた損傷を軽減させる方法。
【請求項５９】
動物の口腔組織を請求項１〜２８のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織中または該組織上の金属の濃度を低減させる方法。
【請求項６０】
非ペプチド性の金属結合官能基が結合した金属結合ペプチドからなるオーラル・ケア製品。
【請求項６１】
前記ペプチドが２〜１０個のアミノ酸を含む、請求項６０に記載の製品。
【請求項６２】
前記ペプチドが３〜５個のアミノ酸を含む、請求項６１に記載の製品。
【請求項６３】
前記ペプチドの前記アミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項６０に記載の製品。
【請求項６４】
第２の金属結合化合物からさらになる、請求項６０に記載の製品。
【請求項６５】
請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の製品からなるキット。
【請求項６６】
動物の口腔組織を請求項６０〜６４のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織を処置する方法。
【請求項６７】
式Ｐ３−Ｌ−Ｐ３
［式中、
各Ｐ３は、同一でも異なっていてよく、金属イオンを結合する能力を有し、
Ｌは、該２つのＰ３ペプチドをそれらのＣ末端アミノ酸を介して接続する化学基である］
の金属結合ペプチド２量体からなるオーラル・ケア製品。
【請求項６８】
各Ｐ３が２〜１０個のアミノ酸を含む、請求項６７に記載の製品。
【請求項６９】
少なくとも１つのＰ３がＰ１であって、Ｐ１が、
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ、または
Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であり、
Ｘａａ１は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、イソグルタミン酸、グルタミン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、またはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ２は、グリシン、アラニン、β−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、オルニチン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、またはα−ヒドロキシメチルセリンであり、
Ｘａａ３は、グリシン、アラニン、バリン、リジン、アルギニン、オルニチン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはトリプトファンである、
請求項６７に記載の製品。
【請求項７０】
Ｘａａ１がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、スレオニン、またはα−ヒドロキシメチルセリンである、請求項６９に記載の製品。
【請求項７１】
Ｘａａ２がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、セリン、アスパラギン、メチオニン、ヒスチジンまたはα−ヒドロキシメチルセリンである、請求項６９に記載の製品。
【請求項７２】
Ｘａａ３がリジンである、請求項６９に記載の製品。
【請求項７３】
Ｘａａ１がアスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、スレオニン、またはα−ヒドロキシメチルセリンであり、Ｘａａ２がグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、セリン、アスパラギン、メチオニン、ヒスチジンまたはα−ヒドロキシメチルセリンであり、Ｘａａ３がリジンである、請求項６９に記載の製品。
【請求項７４】
Ｘａａ１がアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、Ｘａａ２がアラニン、グリシン、バリン、スレオニン、セリン、ロイシン、またはα−ヒドロキシメチルセリンである、請求項７３に記載の製品。
【請求項７５】
Ｘａａ２がアラニン、スレオニン、ロイシン、またはα−ヒドロキシメチルセリンである、請求項７４に記載の製品。
【請求項７６】
Ｘａａ１がアスパラギン酸であり、Ｘａａ２がアラニンである、請求項７５に記載の製品。
【請求項７７】
Ｐ１のβ−アラニン（存在する場合）以外の少なくとも１つのアミノ酸がＤ−アミノ酸である、請求項６９に記載の製品。
【請求項７８】
Ｐ１のβ−アラニン（存在する場合）以外の前記アミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸である、請求項７７に記載の製品。
【請求項７９】
いずれのＰ３ペプチドもＰ１である、請求項６９に記載の製品。
【請求項８０】
Ｐ３の少なくとも１つのアミノ酸が、（ａ）Ｐ３が金属イオンを結合する能力を変化させずに前記ペプチド２量体の親油性を増大させる置換基、（ｂ）Ｐ３が金属イオンを結合する能力を変化させずに前記ペプチド２量体をタンパク質分解酵素から保護する置換基、
または（ｃ）前記ペプチド２量体が金属イオンを結合する前記能力を向上させる非ペプチド性の金属結合官能基である置換基、で置換されている、請求項６７に記載の製品。
【請求項８１】
Ｐ３が、Ｐ３の金属結合能力を提供するために、非ペプチド性の金属結合官能基で置換されたアミノ酸からなる、請求項６７に記載の製品。
【請求項８２】
Ｌが中性である、請求項６７に記載の製品。
【請求項８３】
Ｌが１〜１８個の炭素原子を含む直鎖もしくは分枝鎖状のアルカンまたはアルケン残基である、請求項６７に記載の製品。
【請求項８４】
Ｌが２〜８個の炭素原子を含む、請求項８３に記載の製品。
【請求項８５】
Ｌが２〜８個の炭素原子を含む環状アルカン残基である、請求項６７に記載の製品。
【請求項８６】
Ｌが３〜５個の炭素原子を含む、請求項８５に記載の製品。
【請求項８７】
Ｌが窒素含有複素環状アルカン残基である、請求項６７に記載の製品。
【請求項８８】
Ｌがピペラジドである、請求項８７に記載の製品。
【請求項８９】
Ｌがグリセリルエステルである、請求項６７に記載の製品。
【請求項９０】
オーラル・ケア・デバイスである、請求項６７〜８９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項９１】
オーラル・ケア組成物である、請求項６７〜８９のいずれか１項に記載の製品。
【請求項９２】
請求項６７〜９１のいずれか１項に記載の製品からなるキット。
【請求項９３】
前記製品がオーラル・ケア・デバイスである、請求項９２に記載のキット。
【請求項９４】
前記製品がオーラル・ケア組成物である、請求項９２に記載のキット。
【請求項９５】
前記デバイスがストリップである、請求項９３に記載のキット。
【請求項９６】
前記ストリップが歯のホワイトニング剤からさらになる、請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
前記キットが歯のホワイトニング組成物からさらになる、請求項９５に記載のキット。
【請求項９８】
前記キットが第２のストリップからさらになり、前記第２ストリップが歯のホワイトニング剤からなる、請求項９５に記載のキット。
【請求項９９】
前記組成物が歯のホワイトニング組成物である、請求項９４に記載のキット。
【請求項１００】
前記キットが、歯のホワイトニング剤からなるストリップからさらになる、請求項９４に記載のキット。
【請求項１０１】
動物の口腔組織を請求項６７〜９１のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織を処置する方法。
【請求項１０２】
前記組織を予防的に処置する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
予防的オーラル療法の一部として前記組織を処置する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
手術前、手術中、手術後、またはこれらの組合せで前記組織を処置する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
抜歯前、抜歯中、抜歯後、またはこれらの組合せで前記組織を処置する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組織がすべてまたは実質的にすべての口腔組織である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
動物の口腔組織を請求項６７〜９１のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織の疾病または状態を処置する方法。
【請求項１０８】
前記疾病または状態が歯周組織の疾病または状態である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記疾病または状態が歯肉炎または歯周炎である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記疾病または状態が感染症である、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
動物の口腔組織を請求項６７〜９１のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織の炎症を処置する方法。
【請求項１１２】
前記炎症が歯周組織の炎症である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
動物の口腔組織を請求項６７〜９１のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該動物の１つまたは複数の歯をホワイトニングする方法。
【請求項１１４】
前記組織がすべてまたは実質的にすべての口腔組織である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記歯のホワイトニング前、前記歯のホワイトニング中、前記歯のホワイトニング後、またはこれらの組合せで前記組織を前記製品と接触させる、請求項１１３または１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
動物の口腔組織を請求項６７〜９１のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、活性酸素種によって該組織に与えられる損傷を軽減させる方法。
【請求項１１７】
動物の口腔組織を請求項６７〜９１のいずれか１項に記載の製品と接触させることからなる、該組織中または該組織上の金属の前記濃度を低減させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔組織を処置するための方法、オーラル・ケア製品およびキットに関する。具体的には、本発明は、口腔組織の炎症を軽減させ、活性酸素種（ＲＯＳ）によってこのような組織に与えられる損傷を軽減させ得る特定の金属結合ペプチド、ペプチド誘導体およびペプチド２量体を含む方法、オーラル・ケア製品ならびにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素種（ＲＯＳ）には、フリーラジカル（たとえば、スーパーオキシド・アニオンおよびヒドロキシル・ラジカル、ペルオキシル・ラジカル、アルコキシル・ラジカル）ならびに非ラジカル種（たとえば、一重項酸素および過酸化水素）が含まれる。ＲＯＳは、分子、細胞および組織の大規模な損傷を引き起こすことが可能であり、また、様々な疾病や状態において主要な役割を果たすと報告されている。実際、ＲＯＳは１００種を超える疾病および発病状態に関連づけられており、ＲＯＳがヒトの疾病すべてに関与する共通の発病機構を構成しているかもしれないことが推測されている。非特許文献１。ＲＯＳ、その形成、ＲＯＳが分子、細胞および組織の損傷を引き起こす機構、ならびに数々の疾病および疾患におけるそれらの関与について記載している総説は、非特許文献１〜６を参照されたい。
【０００３】
金属イオン、主に遷移金属イオンは、ＲＯＳの生成および蓄積を引き起こし得る。具体的には、貯蔵部位から放出される銅および鉄イオンは、虚血／再灌流傷害ならびに高温、低温、外傷、過剰の運動、毒素、放射線、および感染による傷害を含めた傷害後のＲＯＳ生成の主な原因の１つである。非特許文献６。銅および鉄イオン、ならびに他の遷移金属イオン（たとえば、バナジウムおよびクロムイオン）が、ＲＯＳの生成を触媒すると報告されている。たとえば、非特許文献１および非特許文献７〜９を参照。他の遷移金属イオン（たとえばカドミウム、水銀、およびニッケルイオン）ならびに他の金属イオン（たとえばヒ素および鉛イオン）は、天然の抗酸化防御系の一部の分子を枯渇させ、それによってＲＯＳの蓄積を増大させると報告されている。たとえば、非特許文献１参照。遊離銅イオンは、本質的に全てのタンパク質のアミノ基に非特異的に結合すると報告されているが（非特許文献１０）、それでもなお、タンパク質に結合した銅イオンは、少なくとも該銅イオンが結合したタンパク質に損傷を与えるＲＯＳの生成を引き起こし得る。たとえば、非特許文献８〜１０参照。
【０００４】
ＲＯＳは、様々な理由により口腔内に存在し得る。たとえば、ＲＯＳは、タバコ製品の使用、環境要因への曝露、放射線への曝露、および活性酸素または過酸化水素を遊離する歯のホワイトニング剤からなるオーラル・ケア製品を使用した結果として、口腔内に存在する。たとえば、特許文献１〜３参照。ＲＯＳはまた、歯肉炎、歯周炎、負傷、手術、抜歯、口唇ヘルペス、口内糜爛および潰瘍を含めた炎症および／または感染に関与する疾病ならびに状態の結果として口腔内に存在し得る。たとえば、特許文献２〜３参照。最後に、唾液の通常のｐＨは７．２であるが、たとえば食物、特に炭水化物が分解された結果、口腔内はしばしば酸性状態になる。たとえば、特許文献４参照。酸性状態によって、銅イオンが結合しているタンパク質からの銅の放出が促進され、上述のように遊離銅イオンがＲＯＳの生成を引き起こし得る。口腔内に存在するＲＯＳは、口腔組織に損傷を与え得る。たとえば、炎症性歯周病では、ＲＯＳならびにレベルが上昇した遊離鉄イオンおよび銅イオンが歯周ポケット内に見つかっており、これは、歯周組織の破壊におけるＲＯＳの重大な役割を示唆している。たとえば、非特許文献１１参照。
【０００５】
アルブミンは、細胞外の抗酸化剤として特徴づけられている。たとえば、非特許文献１
および非特許文献１２〜１４参照。アルブミンの抗酸化性質は、アルブミンの、金属（特に銅イオン）を結合する能力、脂肪酸を結合する能力、ステロイドを結合してそれを輸送する能力、ビリルビンを結合してそれを輸送する能力、ＨＯＣｌを捕捉（ｓｃａｖｅｎｇｅ）する能力などを含めた、アルブミンの数多くの生理学的機能のいくつかに起因すると考えられている。たとえば、非特許文献１２、１５、１、１４参照。アルブミンは、Ｎ末端の部位を含めていくつかの金属結合部位を含む。ヒト、ラットおよびウシの血清アルブミンを含めたいくつかのアルブミンのＮ末端金属結合部位は、Ｃｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）に対して高い親和性を示し、これら金属イオンの高親和性の結合に関与しているアミノ酸が同定されている。非特許文献１６〜１８参照。高親和性Ｎ末端部位以外の金属結合部位でアルブミンに結合している銅が、その「緩い」金属結合部位の位置によって決まる部位でアルブミンに大規模な損傷を引き起こすフリーラジカルを生成することが報告されており、これにより、アルブミンが「犠牲的抗酸化剤」として特徴づけられている。非特許文献８、７、１２、９参照。
【０００６】
前述にもかかわらず、脳虚血の処置としてアルブミンを使用する試みは、混在した結果を示している。アルブミンは、脳虚血の動物モデルにおいて神経保護性であるとも、そうでないとも報告されている。非特許文献１９および非特許文献２０を、非特許文献２１および非特許文献２２と比較されたい。
【０００７】
切除した心臓を保存するための心停止液中にアルブミンを使用した場合も、混在した結果が得られている。非特許文献１４に報告されているように、切除した心臓を保存するための標準的な心停止液にアルブミンを加えても、この溶液で２４時間灌流した心臓の機能は改善されなかった。アルブミンおよび数種のエンハンサー（インスリン、ＡＴＰ、コルチコステロン、およびピルビン酸）を含む心停止液で灌流した場合は、心臓で機能の改善が実証された。エンハンサーのみ、ならびにアルブミンのみでは心臓の機能は有意に改善されなかったので、これは相乗効果であった。アルブミンを含む心停止液を使用した場合に心臓機能が改善するという初期の報告も、エンハンサーとアルブミンとの間の相乗作用に起因していた。非特許文献１４の最終段落およびそれに引用されている非特許文献２３を参照のこと。別の研究では、アルブミンを含む心停止液で灌流した心臓では、アルブミンを含まない溶液と比較して、用量依存的な様式で再灌流傷害が増大した。スーザーら（Ｓｕｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）の非特許文献２４。スーザーらは、自身の研究および他の研究に基づいて、アルブミンは心臓の保護に有効でないと結論づけた。彼らはさらに、潜在的なアレルギー反応および血液製剤の使用に伴うリスクにより、心停止液中にアルブミンを使用することは安全でないかもしれないことに言及した。
【０００８】
最後に、アルブミンは抗酸化剤として特徴づけられているが、小膠細胞によるスーパーオキシド・アニオンの生成を増強させるとも報告されている（非特許文献２５）。この結果により、著者らは、ある種の疾患において破壊された血液脳関門から漏れるアルブミンが小膠細胞によるスーパーオキシド・アニオンの生成を増強し、この増大したスーパーオキシド・アニオンの生成が、脳の虚血／再灌流およびいくつかの神経変性病における神経損傷の病因の原因であると推測した。
【０００９】
上で言及したように、いくつかのアルブミンのＮ末端金属結合部位は、Ｃｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）に高い親和性を示す。これらの部位は鋭意研究されており、一般的なアミノ末端Ｃｕ（ＩＩ）−およびＮｉ（ＩＩ）−結合（ＡＴＣＵＮ）モチーフが同定されている。たとえば、非特許文献２６参照。ＡＴＣＵＮモチーフは、Ｎ末端に遊離−ＮＨ２を有し、第３位にヒスチジン残基を有し、２つの介在ペプチドの窒素を有するタンパク質またはペプチド内に存在すると定義することが可能である。たとえば、非特許文献２６参照。したがって、ＡＴＣＵＮモチーフは、ペプチド配列Ｘａａ  Ｘａａ  Ｈｉｓ（ただし、Ｘａａはプロリン以外の任意のアミノ酸である）で与えられる。たとえば、非特許文献２
６参照。Ｃｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）は、ＡＴＣＵＮモチーフの３つのアミノ酸によって提供される４つの窒素（遊離−ＮＨ２の窒素、２つのペプチドの窒素、およびヒスチジンのイミダゾール窒素）によって結合され、若干歪んだ正方形の平面配置となっている。たとえば、非特許文献２６参照。ＡＴＣＵＮモチーフを構成する３つのアミノ酸の側鎖は、Ｃｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）の結合に関与している可能性があり、これら３つのＮ末端アミノ酸に近接するアミノ酸も、これらの金属イオンの結合に影響を与えるかもしれない。たとえば、非特許文献２６〜２７参照。たとえば、ヒト血清アルブミンのＮ末端金属結合部位の配列はＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］であり、Ｎ末端Ａｓｐの遊離の側鎖カルボキシルおよびＬｙｓ残基は、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓにより提供される４つの窒素に加えて、Ｃｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）の結合に関与していると報告されている。非特許文献２６、１６、２８参照。
【００１０】
ＡＴＣＵＮモチーフはアルブミン以外にも天然に存在する他のタンパク質で見つかっており、またＡＴＣＵＮモチーフを含む天然に存在しないペプチドおよびタンパク質が合成されている。たとえば、非特許文献２６、２７、２９参照。ＡＴＣＵＮ含有ペプチドおよびタンパク質のＣｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）の錯体は、スーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）活性を示すと報告されている。非特許文献３０、３１参照。そのＳＯＤ活性が報告されているにもかかわらず、これらの錯体はそれでもＤＮＡ、タンパク質および他の生体分子に損傷を与えるフリーラジカルを生成する。非特許文献２６、２７、３２、３１、３０参照。その結果、銅およびニッケルのｉｎ  ｖｉｖｏにおける有害効果（たとえば癌および先天性異常をもたらすこと）の少なくとも一部は、傷害性フリーラジカルの生成をもたらす、Ｃｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）のＡＴＣＵＮ含有タンパク質への結合に起因し得ると仮定されてきた。非特許文献２６、２７、３０参照。Ｃｆ．非特許文献３３。ＡＴＣＵＮ含有ペプチドのＣｕ（ＩＩ）錯体とアスコルビン酸との組合せによって生じる傷害効果が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌細胞を死滅させるため、およびｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を生じさせるために利用されている。非特許文献２６参照。
【特許文献１】米国特許第５，９０６，８１１号
【特許文献２】米国特許第６，２２８，３４７号
【特許文献３】米国特許第６，２７０，７８１号
【特許文献４】米国特許第６，１７７，０９７号
【非特許文献１】ストーズ（Ｓｔｏｈｓ）、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第６巻、２０５〜２２８ページ、１９９５年
【非特許文献２】マンソー（Ｍａｎｓｏ）、Ｒｅｖ．Ｐｏｒｔ．Ｃａｒｄｉｏｌ、第１１巻、９９７〜９９９ページ、１９９２年
【非特許文献３】フローレンス（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ）、Ａｕｓｔ．Ｎ  Ｚ  Ｊ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．、第２３巻、３〜７ページ、１９９２年
【非特許文献４】ナイト（Ｋｎｉｇｈｔ）、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．、第２５巻、１１１〜１２１ページ、１９９５年
【非特許文献５】ケールら（Ｋｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｈｅａｒｔ＆Ｌｕｎｇ、第２５巻、２００〜２０９ページ、１９９６年
【非特許文献６】ロス（Ｒｏｔｈ）、Ａｃｔａ  Ｃｈｉｒ．Ｈｕｎｇ．、第３６巻、３０２〜３０５ページ、１９９７年
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【非特許文献８】マークスら（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２３６巻、３９７〜４００ページ、１９８５年
【非特許文献９】クインランら（Ｑｕｉｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．、第８１巻、６１１〜６１４ページ、１９９２年
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【非特許文献１５】ハリウェルおよびガターリッジ（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、第２４６巻、５０１〜５１４ページ、１９８６年
【非特許文献１６】ローサックら（Ｌａｕｓｓａｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２３巻、２８３２〜２８３８ページ、１９８４年
【非特許文献１７】プレッキーら（Ｐｒｅｄｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２８７巻、２１１〜２１５ページ、１９９２年
【非特許文献１８】マスオカら（Ｍａｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、２１５３３〜２１５３７ページ、１９９３年
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【非特許文献２０】レマーズら（Ｒｅｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、第８２７巻、２３７〜２４２ページ、１９９９年
【非特許文献２１】リトルら（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ、第９巻、５５２〜５５８ページ、１９８１年
【非特許文献２２】ボーリューら（Ｂｅａｕｌｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ．Ｍｅｔａｂ．、第１８巻、１０２２〜１０３１ページ、１９９８年
【非特許文献２３】ヒサトミら（Ｈｉｓａｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、第５２巻、７５４〜７５５ページ、１９９１年
【非特許文献２４】スーザーら（Ｓｕｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．、第３７巻、９７〜１０１ページ、１９９８年
【非特許文献２５】サイら（Ｓｉ  ｅｔ  ａｌ．）、ＧＬＩＡ、第２１巻、４１３〜４１８ページ、１９９７年
【非特許文献２６】ハーフォードおよびサーカー（Ｈａｒｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｓａｒｋａｒ）、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、第３０巻、１２３〜１３０ページ、１９９７年
【非特許文献２７】バルら（Ｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第１０巻、９０６〜９１４ページ、１９９７年
【非特許文献２８】サドラーら（Ｓａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２２０巻、１９３〜２００ページ、１９９４年
【非特許文献２９】ムリナルツら（Ｍｌｙｎａｒｚ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ９８：要旨集、http://www.jate.u-szeged.hu/〜spec98/abstr/mlynar.html
【非特許文献３０】コテールら（Ｃｏｔｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第４６巻、７〜１５ページ、１９９２年
【非特許文献３１】ウエダら（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５５巻、１２３〜１３０ページ、１９９４年
【非特許文献３２】ウエダら（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第１８巻、９２９〜９３３ページ、１９９５年
【非特許文献３３】コッホら（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．、第４巻、５４９〜６０ページ、１９９７年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、口腔組織を処置するための方法、オーラル・ケア製品およびキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、動物の口腔組織を処置する方法を提供する。この方法は、有効量の、式Ｐ１−Ｐ２を有する金属結合ペプチドまたは生理学的に許容可能なその塩を、該組織に接触させることからなる。本発明はまた、ペプチドＰ１−Ｐ２または生理学的に許容可能なその塩からなるオーラル・ケア製品、およびオーラル・ケア製品からなるキットも提供する。オーラル・ケア製品は、オーラル・ケア・デバイスおよびオーラル・ケア組成物を含む。
【００１３】
式Ｐ１−Ｐ２中、
Ｐ１は、Ｘａａ１  Ｘａａ２  ＨｉｓまたはＸａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であり、かつ
Ｐ２は（Ｘａａ４）ｎ
である。
【００１４】
Ｘａａ１は、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（すなわち、そのγ−カルボキシルによってＸａａ２に結合しているＡｓｐ、本明細書中では以降「ｉｓｏＡｓｐ」）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソグルタミン酸（すなわち、そのγ−カルボキシルによってＸａａ２に結合しているＧｌｕ、本明細書中では以降「ｉｓｏＧｌｕ」）、グルタミン（Ｇｌｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）またはα−ヒドロキシメチルセリン（ＨＭＳ）である。さらに、Ｘａａ１は、別のアミノ酸またはペプチドが結合したδ−アミノ基（たとえば、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ）からなるアミノ酸（たとえば、Ｇｌｙ（δ）−Ｏｒｎ）であり得る。Ｘａａ１は、好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＨＭＳである。より好ましくは、Ｘａａ１はＡｓｐまたはＧｌｕである。最も好ましくは、Ｘａａ１はＡｓｐである。
【００１５】
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、β−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、ＭｅｔまたはＨＭＳである。Ｘａａ２は、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、ＨｉｓまたはＨＭＳである。より好ましくは、Ｘａａ２はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＨＭＳである。さらにより好ましくは、Ｘａａ２はＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、またはＨＭＳである。最も好ましくは、Ｘａａ２はＡｌａである。
【００１６】
Ｘａａ３は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、またはＴｒｐ、好ましくはＬｙｓである。
Ｘａａ４は任意のアミノ酸である。
【００１７】
最後に、ｎは、０〜１００、好ましくは０〜１０、より好ましくは０〜５、最も好ましくは０である。
Ｐ１および／またはＰ２の１つもしくは複数のアミノ酸は、（ａ）Ｐ１が金属イオンを結合する能力を変化させずに該ペプチドの親油性を増大させる置換基、（ｂ）Ｐ１が金属
イオンを結合する能力を変化させずに該ペプチドをタンパク質分解酵素から保護する置換基、または（ｃ）ペプチドが金属イオンを結合する能力を向上させる非ペプチド性の金属結合官能基である置換基で置換され得る。
【００１８】
本発明は、動物の口腔組織を処置する別の方法を提供する。この方法は、有効量の、非ペプチド性の金属結合官能基が結合した金属結合ペプチド（ＭＢＰ）を、該組織に接触させることからなる。金属結合ペプチドＭＢＰは、Ｐ１−Ｐ２だけでなく任意の金属結合ペプチドであってよい。本発明はまた、非ペプチド性の金属結合官能基が結合した金属結合ペプチドＭＢＰからなるオーラル・ケア製品、および該オーラル・ケア製品からなるキットも提供する。
【００１９】
本発明は、動物の口腔組織を処置するさらに別の方法を提供する。この方法は、有効量の、式Ｐ３−Ｌ−Ｐ３（式中、それぞれのＰ３は、同一でも異なっていてもよく、金属イオンを結合する能力のあるペプチドであり、Ｌは、２つのＰ３ペプチドをそれらのＣ末端アミノ酸を介して結合させる化学基である）の金属結合ペプチド２量体を、該組織に接触させることからなる。好ましい実施形態では、２つのＰ３ペプチドのうち１つまたはどちらもがＰ１である。本発明はまた、式Ｐ３−Ｌ−Ｐ３の金属結合ペプチド２量体からなるオーラル・ケア製品、および該オーラル・ケア製品からなるキットも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
式Ｐ１−Ｐ２では、Ｐ１は、Ｘａａ１  Ｘａａ２  ＨｉｓまたはＸａａ１  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３であり、式中、Ｘａａ１、Ｘａａ２、およびＸａａ３は上に定義した通りである。Ｐ１は、元素周期表の１ｂ〜７ｂ族または８族の遷移金属イオン（Ｖ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｍｏ、Ｍｎ、Ｂａ、Ｚｎ、Ｈｇ、Ｃｄ、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｕを含む）および他の金属イオン（Ａｓ、Ｓｂ、Ｐｂを含む）を結合する金属結合ペプチド配列である。Ｐ１が金属イオンに結合することによって、これらの金属イオンによるＲＯＳの生成およびＲＯＳの蓄積のうち少なくとも一方が阻害される（すなわち軽減もしくは抑制される）、かつ／または、該ペプチド自体に結合した金属イオンによって依然として生じ得るＲＯＳによって与えられる損傷が標的となる。その結果、Ｐ１が金属イオンを結合しない場合にＲＯＳによって生じ得る損傷が軽減される。具体的には、Ｐ１は高い親和性でＣｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）、Ｃｏ（ＩＩ）、およびＭｎ（ＩＩ）を結合する。したがって、Ｐ１は、銅およびニッケルによるＲＯＳの生成および蓄積によって引き起こされる損傷を軽減させるのに特に有効であるはずである。さらに、Ｐ１による金属イオンの結合は、炎症を阻害し（実施例１０、１２および１３参照）、細胞による代謝およびエネルギー利用の阻害に対して保護的に作用する（実施例１１参照）。
【００２１】
Ｐ１では、Ｘａａ１は最も好ましくはＡｓｐであり、Ｘａａ２は最も好ましくはＡｌａであり、Ｘａａ３は最も好ましくはＬｙｓである（上記参照）。したがって、Ｐ１の好ましい配列はＡｓｐ  Ａｌａ  ＨｉｓおよびＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］である。Ｐ１の最も好ましい配列はＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］である。Ａｓｐ  Ａｌａ  ＨｉｓはＣｕ（ＩＩ）およびＮｉ（ＩＩ）の高親和性結合に必要なヒト血清アルブミンのＮ末端金属結合部位の最少配列であり、Ｌｙｓは、これらの金属イオンがこの部位に結合するのに寄与すると報告されている。また、質量分析によって、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］がＦｅ（ＩＩ）を結合することが判明している。Ｐ１の他の好ましい配列には、Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ（ヒトα−フェトプロテインのＮ末端配列）、Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｈｉｓ（ヒト精子プロタミンＨＰ２のＮ末端配列）およびＨＭＳ  ＨＭＳ  Ｈｉｓ（銅と非常に安定な錯体を形成すると報告されている合成ペプチド；ムリナルツら（Ｍｌｙｎａｒｚ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ９８：要旨集、http://www.jate.u-szeged.hu/spec98/abstr/mlynar.html、４／２１／９８参照）が含まれる。
【００２２】
Ｐ２は（Ｘａａ４）ｎであり、式中、Ｘａａ４は任意のアミノ酸であり、ｎは０〜１００である。ｎが大きい場合（ｎ＞約２０）、該ペプチドは、ＲＯＳにより与えられた損傷を細胞外で軽減させる。より小さなペプチドは細胞内により入りやすく、したがって、より小さなペプチドを使用して、細胞内および細胞外のどちらにおいてもＲＯＳにより与えられた損傷を軽減させ得る。また、より小さなペプチドはタンパク質分解の対象となりにくい。したがって、Ｐ２では、ｎは好ましくは０〜１０であり、より好ましくはｎは０〜５であり、最も好ましくはｎは０である。Ｐ２は任意の配列を有していてよいが、Ｐ２は、好ましくは、（１）遷移金属を結合する配列、（２）該ペプチドが細胞膜を貫通する能力を増強させる配列、または（３）そうでなければ該ペプチドを安定させる、もしくは性能を増強させる配列からなる。Ｐ２およびＰ１は、ヒト、ラットもしくはウシの血清アルブミンなど、銅およびニッケルに対する親和性が高いＮ末端金属結合部位を有するタンパク質のＮ末端配列であってもよい。ｎ＝１００である場合、該ペプチドはこれらのアルブミンのほぼドメイン１である配列を有するであろう。
【００２３】
遷移金属イオン結合部位からなる多くのペプチドの配列が知られている。たとえば、米国特許第４，０２２，８８８号、同第４，４６１，７２４号、同第４，６６５，０５４号、同第４，７６０，０５１号、同第４，７６７，７５３号、同第４，８１０，６９３号、同第４，８７７，７７０号、同第５，０２３，２３７号、同第５，０５９，５８８号、同第５，１０２，９９０号、同第５，１１８，６６５号、同第５，１２０，８３１号、同第５，１３５，９１３号、同第５，１４５，８３８号、同第５，１６４，３６７号、同第５，５９１，７１１号、同第５，１７７，０６１号、同第５，２１４，０３２号、同第５，２５２，５５９号、同第５，３４８，９４３号、同第５，４４３，８１６号、同第５，５３８，９４５号、同第５，５５０，１８３号、同第５，５９１，７１１号、同第５，６９０，９０５号、同第５，７５９，５１５号、同第５，８６１，１３９号、同第５，８９１，４１８号、同第５，９２８，９５５号、および同第６，０１７，８８８号、国際出願国際公開公報第９４／２６２９５号パンフレット、同第９９／５７２６２号パンフレットおよび同第９９／６７２８４号パンフレット、欧州特許出願第３２７２６３号、ラピンら（Ｌａｐｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、第１７巻、１６３０〜３４ページ、１９７８年、ボスーら（Ｂｏｓｓｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、第１７巻、１６３４〜４０ページ、１９７８年、チャクラバルティ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、第４巻、５７〜６３ページ、１９９０年、アドマン（Ａｄｍａｎ）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４２巻、１４５〜９７ページ、１９９１年、コテールら（Ｃｏｔｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第４６巻、７〜１５ページ、１９９２年、カンタースら（Ｃａｎｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＥＢＳ、第３２５巻、３９〜４８ページ、１９９３年、レーガン（Ｒｅｇａｎ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．、第２２巻、２５７〜２８１ページ、１９９３年、ウエダら（Ｕｅｄａ
ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第５５巻、１２３〜３０ページ、１９９４年、ウエダら（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第１８巻、９２９〜３３ページ、１９９５年、レーガン（Ｒｅｇａｎ）、ＴＩＢＳ、第２０巻、２８０〜８５ページ、１９９５年、ウエダら（Ｕｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、第４３巻、３５９〜６１ページ、１９９５年、バルら（Ｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第１０巻、９０６〜９１４ページ、１９９７年、バルら（Ｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、第１０巻、９１５〜２１ページ、１９９７年、コッホら（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、第４巻、５４９〜６０ページ、１９９７年、コワリク−ヤンコフスカら（Ｋｏｗａｌｉｋ−Ｊａｎｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第６６巻、１９３〜９６ページ、１９９７年、ハーフォードおよびサーカー（Ｈａｒｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｓａｒｋａｒ）、Ａｃｃ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｒｅｓ．、第３０巻、１２３〜１３０ページ、１９９７年、プリンスら（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．）、ＴＩＢＳ、第２３巻、１９７〜９８ページ、１９９８年、ムリナルツら（Ｍｌｙｎａｒｚ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｐｅｃｉａｔｉｏｎ９８：要旨集、http://www.jate.u-szeged.hu/~spec98/abstr/mlynar.html ならびにエイトケン（Ａｉｔｋｅｎ）、Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１２巻、２４１〜５３ページ、１９９９年、ウィッタールら（Ｗｈｉｔｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第９巻、３３２〜３４３ページ、２０００年参照。Ｐ２は、これらのペプチドの１つまたは複数の金属結合部位の配列からなっていてよい。
【００２４】
Ｐ２が金属結合部位からなる場合、Ｐ２は、Ｐ１およびＰ２の金属結合部位が潜在的に、協同的に金属イオンを結合し得るように（２：１のペプチド：金属の錯体に類似；実施例８参照）、Ｐ１とＰ２の金属結合部位との間に短いスペーサー配列を含む配列を有することが好ましい。好ましくは、スペーサー配列は、１〜５個、好ましくは１〜３個の中性アミノ酸から構成される。したがって、スペーサー配列はＧｌｙ、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ、Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙなどであってよい。
【００２５】
具体的には、Ｐ２が金属結合部位からなる場合、Ｐ２は、好ましくは以下の配列：（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３または（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓの１つからなる。Ｘａａ２、Ｘａａ３およびＸａａ４は上に定義されており、ｍは０〜５、好ましくは１〜３である。存在する場合は、１または複数のＸａａ４アミノ酸は、Ｐ１およびＰ２の金属結合部位が協同的に金属イオンを結合し得るように、Ｐ１とＰ２の金属結合部位との間に短いスペーサー配列を形成し、かつＸａａ４は、好ましくは中性アミノ酸である（前段落を参照）。Ｘａａ５は、δ−アミノ基を有し、該δ−アミノ基によって１または複数のＸａａ４アミノ酸（存在する場合）またはＰ１が結合されているアミノ酸（好ましくはＯｒｎまたはＬｙｓ、より好ましくはＯｒｎ）である。ハーフォードおよびサーカー（Ｈａｒｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｓａｒｋａｒ）、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．、第３０巻、１２３〜１３０ページ、１９９７年ならびにシュレンバーガーら（Ｓｈｕｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１５巻、１１０３８〜１１０３９ページ、１９９３年（この結合手段によって、Ｘａａ５のα−アミノ基は依然としてＡＴＣＵＮモチーフによる金属の結合に関与し得る）参照。したがって、たとえば、Ｐ１−Ｐ２はＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  （δ）−Ｏｒｎ  Ａｌａ  Ｈｉｓ［配列番号２］であり得る。
【００２６】
さらに、Ｐ２は以下の配列：［（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３］ｒ、［（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ］ｒ、［（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３  （Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ］ｒ、および［（Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  （Ｘａａ４）ｍ  Ｘａａ５  Ｘａａ２  Ｈｉｓ  Ｘａａ３］ｒ（配列中、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５およびｍは上に定義かつ記載されており、ｒは２〜１００である）の１つからなっていてもよい。この方法で、金属結合ポリマーを形成し得る。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、Ｐ２は、Ｃｕ（Ｉ）を結合し得るペプチド配列からなる。以下に詳細に議論するように、Ｃｕ（ＩＩ）はアスコルビン酸または他の還元剤の存在下でＣｕ（Ｉ）に変換され、このＣｕ（Ｉ）は酸素と反応してＲＯＳを生じる（実施例８および９の等式を参照）。Ｐ１はＣｕ（ＩＩ）を密接に結合することが可能であり、単独で、銅によるＲＯＳの生成を阻害するのに非常に有効である（実施例参照）。しかし、実施例８および９の等式から見受けられ得るように、Ｃｕ（Ｉ）を結合することが可能なＰ２も使用することが望ましいであろう。
【００２８】
Ｃｕ（Ｉ）を結合し得るペプチド配列は、当分野で知られている。たとえば、ピッカリ
ングら（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１５巻、９４９８〜９５０５ページ、１９９３年；ウィングら（Ｗｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、「銅の生物無機化学（Bioinorganic Chemistry Of Copper）」、１１０〜１２３ページ（カーリンおよびタイクラー（Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔｙｅｋｌａｒ）編、チャップマン・アンド・ホール（Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ）、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在、１９９３年）；コッホら（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ＆Ｂｉｏｌ．、第４巻、５４９〜５６０ページ、１９９７年；コバインら（Ｃｏｂｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、「銅の輸送とその障害（Copper Transport And Its Disorders）」、１５３〜１６４ページ（レオーネおよびメルサー（Ｌｅｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｒｃｅｒ）編、クルワー・アカデミック／プレナム出版（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在、１９９９年）参照。これらの配列には、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｍｅｔ、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｍｅｔ、
Ｃｙｓ  Ｃｙｓ、
Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号７］、
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号８］、および
Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ［配列番号９］
（配列中、Ｘａａ４は上に定義されている）が含まれる。グルタチオン（γ−Ｇｌｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ）が、Ｃｕ（Ｉ）を結合することも知られている。さらなるＣｕ（Ｉ）結合ペプチド配列は、たとえば国際出願国際公開公報第００／３６１３６号パンフレットに記載のように、メタロペプチド・コンビナトリアル・ライブラリを使用して同定し得る。好ましくは、Ｃｕ（Ｉ）結合ペプチドは、配列Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ（たとえば、Ｇｌｙ  Ｍｅｔ  Ｘａａ４  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号７］、より好ましくはＧｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｘａａ４  Ｘａａ４  Ｃｙｓ［配列番号８］、最も好ましくはＧｌｙ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｃｙｓ［配列番号９］）の配列からなる。
【００２９】
Ｐ１−Ｐ２ペプチドが細胞膜を貫通する能力を増強させるために、Ｐ２は、疎水性であるか、またはアルギニン・オリゴマーであることが好ましい（ルーヒ（Ｒｏｕｈｉ）、Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ、４９〜５０ページ（２００１年１月１５日）参照）。Ｐ２が疎水性である場合、Ｐ２は１〜３個の疎水性アミノ酸（たとえば、Ｇｌｙ  Ｇｌｙ）、好ましくはＤ−アミノ酸を含むことが好ましい。アルギニン・オリゴマーは、好ましくは６〜９個のＡｒｇ残基、最も好ましくは６〜９個のＤ−Ａｒｇ残基を含む（ルーヒ（Ｒｏｕｈｉ）、Ｃｈｅｍ．＆Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ．、４９〜５０ページ（２００１年１月１５日）参照。Ｐ１−Ｐ２を局所投与する場合は、アルギニン・オリゴマーであるＰ２の使用が特に望ましいかもしれない。
【００３０】
ペプチドのアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはそれらの組合せであってよい。β−Ａｌａ（存在する場合）を除いて、Ｐ１のアミノ酸の少なくとも１つがＤ−アミノ酸であることが好ましい（好ましくはＸａａ１および／またはＨｉｓ）。最も好ましくは、β−Ａｌａ（存在する場合）を除いて、Ｐ１のすべてのアミノ酸がＤ−アミノ酸である。また、Ｐ２のアミノ酸の約５０％がＤ−アミノ酸であることが好ましく、Ｐ２のアミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸であることが最も好ましい。Ｄ−アミノ酸が好ましい理由は、Ｄ−アミノ酸を含むペプチドが、タンパク質分解酵素、たとえば動物（ヒトを含む）の口腔内で遭遇するであろうタンパク質分解酵素に耐性があるからである。また、Ｄ−ア
ミノ酸を使用しても、ペプチドが高い親和性で銅を結合する能力を含めた、ペプチドが金属イオンを結合する能力は変化しない。
【００３１】
本発明のペプチドは、当分野で周知の方法によって作製し得る。たとえば、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはＬ−およびＤ−アミノ酸の組合せのいずれを含むペプチドも、標準の固相ペプチド合成方法によって合成し得る。適切な技法が当分野で周知であり、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、「ポリペプチド化学（Chem. Polypeptides）」、３３５〜６１ページ（カツォヤニスおよびパナヨティス（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｐａｎａｙｏｔｉｓ）編、１９７３年）；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第８５巻、２１４９ページ、１９６３年；デイビスら（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ’ｌ、第１０巻、３９４〜４１４ページ、１９８５年；ステュワートおよびヤング（Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ）、「固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis ）」、１９６９年；米国特許第３，９４１，７６３号および同第５，７８６，３３５号；フィンら（Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「タンパク質（The Proteins）」、第３版、第２巻、１０５〜２５３ページ、１９７６年；ならびにエリックソンら（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「タンパク質（The Proteins）」、第３版、第２巻、２５７〜５２７ページ、１９７６年に記載のものが含まれる。また、ポーランド国特許第３１５４７４号（ＨＭＳ含有ペプチドの合成）およびシュレンバーガーら（Ｓｈｕｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１５巻、１１０３８１１０３９、１９９３年（（δ）−Ｏｒｎ含有ペプチドの合成）も参照されたい。あるいは、ペプチドがＬ−アミノ酸のみを含む場合は、組換えＤＮＡ技法によって合成してもよい。組換ＤＮＡ方法ならびにそれに使用する適切な宿主細胞、ベクターおよび他の試薬は、当分野で周知である。たとえば、マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual ）」、米国ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ）、１９８２年、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．）、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual ）」、米国ニューヨーク所在のコールドスプリングハーバー、１９８９年を参照されたい。
【００３２】
本発明はさらに、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはＬ−およびＤ−アミノ酸の組合せのいずれで構成されるものであれ、タンパク質分解酵素により耐性が高いか、より脂質に溶解しやすいか（ペプチドが細胞膜にさらに貫通しやすくさせるため）、またはその両方であるペプチドＰ１−Ｐ２の誘導体からなる。図１Ａに例示したように、Ｐ１の金属結合機能を変化させずに矢印で示した領域でＰ１の改変を行い得る。具体的には、Ｐ１は、炭素１または２をＲ１で置換可能であり、Ｐ１の末端−ＣＯＯＨは保護基Ｒ２で置換可能である（図１Ｂ〜Ｄ）。Ｐ２にタンパク質分解酵素へのさらなる耐性を持たせるため、脂質溶解性を高めるため、またはその両方を目的として、Ｐ１について記載した方法と類似の方法でＰ２を改変し得る。
【００３３】
Ｒ１は１〜１６個の炭素原子を含む直鎖または分枝状のアルキルでありうるが、用語「アルキル」にはＲおよびＳ異性体が含まれる。Ｒ１はまた、１個もしくは２個の環を含むアリールまたはヘテロアリールでもあり得る。用語「アリール」とは、少なくとも１つの芳香環（たとえばフェニル、ナフチル、およびジフェニル）を含む化合物を意味する。用語「ヘテロアリール」とは、環の少なくとも１つが１個もしくは複数のＳ、ＮまたはＯ原子を含むアリールを意味する。このような置換は、Ｐ１が金属イオンを結合する能力を実質的に低下させない。特に、Ｐ１が高い親和性で銅を結合する能力は、このような置換によって低下しない。たとえば、炭素２に結合しているｎ−ブチル（図１Ｃ参照、Ｒ１はｎ−ブチルである）など一部の置換基は、アルキル基の誘起効果によって銅などの金属イオンに対するペプチドの親和性を増大させるはずである。アリール、ヘテロアリール、また
は長鎖アルキル（約６〜１６個の炭素原子）を用いた炭素２の置換（図１Ｃ）は、脂質膜を横切るペプチド輸送を増強させるはずである。
【００３４】
上で言及したように、固相合成によるペプチドの合成方法は周知である。これらの方法は、図１Ｂ〜Ｃの誘導体を調製するために改変し得る。たとえば、図１Ｃに例示したＰ１の誘導体（Ｒ１はオクチル）は、図２Ａに例示したように調製し得る。図２Ａでは、楕円形の要素はポリマー樹脂を表し、Ｒｐは標準のカルボキシ保護基である。図２Ａに例示したように、オクタン酸（新たに蒸留したもの）を乾燥臭素、次いで三塩化リンで処理する。混合物を約１００℃まで加熱し、この温度で４時間維持する。蒸留後、α−ブロモオクタン酸が無色液体として得られる。ブロモ酸のアミノ化は、この酸とアンモニア溶液とを４０〜５０℃で３０時間静置することによって成される。アミノ酸のオクチル誘導体は、メタノール洗浄で臭化アンモニウムを除去することによって得られる。標準的な分割方法によって、所望の光学的に純粋なＤ−型が得られる。Ｒ１がアルキル、アリールまたはヘテロアリールである他の誘導体は、図２Ａに例示した方法で調製し得る。
【００３５】
さらに、図１Ｂに例示したＰ１の誘導体（Ｒ１はフェニル）は、図２Ｂに例示したように調製し得る。図２Ｂでは、ポリマーは樹脂であり、ｔ−Ｂｕはｔ−ブチルであり、Ｂｚはベンジルである。Ｒ１がアルキル、アリールまたはヘテロアリールである他の誘導体は、図２Ｂに例示した方法で調製し得る。
【００３６】
Ｒ２は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−Ｎ（Ｒ１）２、−ＯＲ１、またはＲ１でありうるが（図１Ｄ参照）、Ｒ１は上に定義されている。これらの誘導体は、当分野で周知の方法によって樹脂からペプチドを取り外す前の、固相ペプチド合成の最終工程として調製し得る。Ｒ２での置換は、Ｐ１が金属イオンを結合する能力を実質的に低下させない。
【００３７】
さらに、Ｐ１およびＰ２は、金属イオンを結合する非ペプチド性の官能基で置換し得る。これらの金属結合官能基を、ペプチドの１つまたは複数の側基に結合することが可能であり、生じるペプチド誘導体は、Ｐ１により提供される結合部位および場合によってはＰ２により提供される結合部位に加えて、金属イオンを結合しうる１つまたは複数の部位を有することとなる。その結果、このようなペプチド誘導体が金属イオンを結合する能力は、対応する非改変ペプチドと比較して改善される。たとえば、該ペプチド誘導体が１つではなく２つの同種の金属イオン（たとえば２つのＣｕ（ＩＩ））を結合し得るか、該ペプチド誘導体が１種の金属イオンではなく２種の異なる金属イオン（たとえば１つのＣｕ（ＩＩ）と１つのＦｅ（ＩＩＩ））を結合し得るか、またはペプチド誘導体が対応する非改変ペプチドよりも良好に（たとえばより高い親和性で）１つの金属イオンを結合し得る。
【００３８】
金属結合官能基にはポリアミン（たとえばジアミン、トリアミンなど）が含まれる。適切なジアミンには、１，２−アルキルジアミン、好ましくは、アルキルが２〜１０個の炭素原子を含むアルキルジアミン（たとえば、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、式中ｎ＝２〜１０）が含まれる。適切なジアミンにはまた、１，２−アリールジアミン、好ましくはベンゼンジアミン（たとえば、１，２−ジアミノベンゼン）も含まれる。適切なジアミンにはさらに、１，２−環状アルカンジアミンが含まれる。「環状アルカン」とは、それぞれ５〜７個の炭素原子を含む１〜３個の環を含む化合物である。環状アルカンジアミンは１，２−ジアミノシクロヘキサン（シクロヘキサンジアミン）であることが好ましい。
【００３９】
特に好ましいジアミンは、１，２−ジアミノシクロヘキサンである（図３Ａ〜Ｂ）。ラオ＆ピー  ウィリアムズ（Ｒａｏ＆Ｐ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ）が実施した以前の研究（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、第６９３巻、６３３ページ、１９９５年）により、シクロヘキサンジアミン誘導体（図３Ａ、式中ＰＹＲはピリジンである）が様々な金属イオンを結合することが示されている。生じた金属キレート剤を使用してアミノ酸とペプチ
ドとを分離することに成功し、この分子がα−アミノ酸に対して非常に高い親和性を有し、多くの観点から独特である非常に安定な配位錯体を形成することが示された。１，２−ジアミノシクロヘキサンは、本発明のペプチドが結合し得る反応性アミノ官能基を有する。図３Ｂ（Ｍは金属イオンであり、少なくとも１つのＲ４が−アルキル−ＣＯ−ペプチド、−アリール−ＣＯ−ペプチド、−アリール−アルキル−ＣＯ−ペプチド、または−アルキル−アリール−ＣＯ−ペプチドである）を参照されたい（図３Ｃ〜Ｄも参照）。他のＲ４は、同じであってもよいし、または−アルキル−ＣＯＯＨ、−アリール−ＣＯＯＨ、−アリール−アルキル−ＣＯＯＨ、もしくはアルキル−アリール−ＣＯＯＨであってよい。図３Ｂに示す種類の誘導体はいくつかの金属結合部位を有することになり、したがって、非置換のペプチドより容易に金属イオンを結合し得ると期待できる。さらに、シクロヘキサン官能基の存在により、この化合物は自身が脂質膜を横切って輸送されるのを補助する脂質様の特徴を有するであろう。
【００４０】
本発明のペプチドのシクロヘキサンジアミン誘導体は、２つの異なる経路によって調製可能である。第１経路は、最初にアルデヒドとの縮合、次いで還元を要する（図３Ｃ参照；図３Ｃでは、Ｂｚはベンジルである）。いくつかのアルデヒド（アルキルおよびアリール）がシクロヘキサンジアミンと室温で容易に反応し、オキシムが形成される。オキシムを、無酸素条件下、水素化ホウ素ナトリウムで還元して２酸誘導体を得ることが可能である。その後、カルボキシル部分を、カルボキシで保護されたＰ１中に存在する遊離アミノ基と反応させて、ペプチドのシクロヘキサンジアミン誘導体を得る。第２経路は、図３Ｄに例示した直接アルキル化する方法である。たとえば、シクロヘキサンジアミンをブロモ酢酸で処理して２酢酸誘導体を得る。その後、カルボキシル部分を、カルボキシで保護されたＰ１中に存在する遊離アミノ基と反応させて誘導体を得る。図３Ｄでは、Ｒ５はＨまたは別のペプチドである。Ｒ５がＨである場合、当分野で周知の方法によって誘導体をさらに反応させて、エステルなどの典型的なカルボン酸誘導体を生成し得る。金属結合実験により、この基の有無は分子全体の金属結合能力に関係しないことが示された。しかし、これらの基は、置換基次第で分子を疎水性にも親水性にもするので、このことが、膜を横切る分子の送達に影響を与えるかもしれない。これら２つの合成経路は、上述の他のジアミンを使用したジアミンペプチド誘導体の合成に使えるであろう。
【００４１】
さらなる適切なポリアミンおよびポリアミン誘導体、ならびにこれらをペプチドに結合させる方法は、その開示の全体を本願明細書に援用する米国特許第５，１０１，０４１号および同第５，６５０，１３４号に記載されている。ペプチドへの結合に適した他のポリアミンキレート剤が知られている。たとえば、米国特許第５，４２２，０９６号、同第５，５２７，５２２号、同第５，６２８，９８２号、同第５，８７４，５７３号、および同第５，９０６，９９６、ならびに国際出願国際公開公報第９７／４４３１３号パンフレット、同第９７／４９４０９号パンフレット、および同第９９／３９７０６号パンフレット参照。
【００４２】
近接する２酸は金属イオンを結合し、銅に対する親和性が特に高いことは周知である。したがって、近接する２酸官能基を有するペプチドが、金属結合において非常に有効であることが予想される。適切な近接する２酸には、２酢酸（コハク酸）など任意の１，２−アルキル２酸、および任意の１，２−アリール２酸が含まれる。
【００４３】
ペプチドのアミノ基を２酢酸と反応させて２酸誘導体を生成し得る（図４参照）。これは、樹脂に結合したペプチドのアミノ基を、ハロゲン化した酢酸（たとえば、ブロモ酢酸やクロロ酢酸）またはハロゲン化した酢酸誘導体（たとえば、ベンジルオキシエステル）と反応させることによって、便利に成し得る。固相合成手法であるため、溶媒で洗浄することによって未反応の物質を除去することが可能である。最終生成物は、加水分解切断によって樹脂から放出される。本発明のペプチドの他の２酸誘導体を、同じ様式で作製し得
る。
【００４４】
ポリアミノポリカルボン酸は、銅や鉄などの金属を結合することで知られている。本発明のペプチドの誘導体を作製するために適したポリアミノポリカルボン酸、ならびにこれらをペプチドに結合させる方法は、その開示の全体を本願明細書に援用する米国特許第５，８０７，５３５号および同第５，６５０，１３４号、ならびに国際出願国際公開公報第９３／２３４２５号パンフレットに記載されている。また、米国特許第５，７３９，３９５号も参照されたい。
【００４５】
近接するポリヒドロキシル誘導体も、本発明に含まれる。適切な近接するポリヒドロキシルには、単糖類および多糖類（すなわち、２糖類、３糖類など）が含まれる。本発明で好ましいのは単糖類である。図７参照。単糖類は２つの主要な分類、すなわちフラノースおよびピラノースに分けられる。フラノース環系の主要な例の１つはグルコースである。グルコースのヒドロキシル基を、ベンジル官能基または不安定なｔ−ブチルオキシ官能基として保護し、一方で、アルデヒドをテトラペプチドのアミン基（たとえばリジンのアミノ基）と反応するために遊離させておくことが可能である。穏やかな還元／加水分解により、単糖ペプチド誘導体が生じる。他の単糖ペプチド誘導体をこの方法で調製し得る。
【００４６】
ビスピリジルエチルアミン誘導体は、２価金属イオンと強力な錯体を形成することが知られている。ペプチドに結合させた場合、この官能基は、銅を含めた金属イオンの追加のキレート化部位を提供するであろう。テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のビスピリジルエチル誘導体を図５に示す。このテトラペプチド誘導体の金属結合能力は、誘導体化していないペプチドに比べて少なくとも３倍増大されることが期待される。このビスピリジルエチルアミン誘導体の調製は、２酸誘導体の合成と一部類似性を共有する。テトラペプチドの２つのアミノ基（一方はＡｓｐ、他方はＬｙｓのもの）を２−ブロモエチルピリジンと反応させて、テトラ置換のペプチド誘導体を得る。この反応は、樹脂結合のテトラペプチドとブロモエチルピリジンとを反応させ、次いで、樹脂から生成物を切断することによって達成される。
【００４７】
フェナントロリンは、２価金属イオンを結合する能力を有する別の複素環化合物である。ペプチドのフェナントロリン誘導体は、ビスピリジルエチルアミン誘導体と同じ方法で合成し得る。
【００４８】
ポルフィリンは、すべての生物に見出される化合物群であり、金属を結合する能力を有するテトラピロール系大環状構造を含む。この種類の化合物の主要例は、ヘム、クロロフィルおよびコリンであり、それぞれ鉄、マグネシウムおよびコバルトを含む。メソポルフィリンＩＸ（図６Ａ〜Ｂ、Ｍは金属イオンである）はヘムから誘導され、銅に対する特異的な親和性を有することが観察されている。本発明のペプチドにこの構造を付加することにより、銅を結合するためのいくつかの部位を有するポルフィリン−ペプチド誘導体が生じるであろう（図６Ｃ参照）。金属結合におけるその役割に加えて、図６Ｃに示すテトラペプチドの３位および３’位のイミダゾール残基は、銅以外の金属の結合部位を提供することによりポルフィリン−金属錯体を安定化する可能性がある。具体的には、シアノコバラミン（ビタミンＢ−１２）は、ポルフィリン核中の金属としてコバルトを含み、錯体はイミダゾール基によって安定化されている。このアナロジーに基づいて、ポルフィリン−テトラペプチド誘導体が、通常の生理的条件下で、ポルフィリン核内にコバルト（または他の金属）を結合し、かつこの錯体がＨｉｓイミダゾール基によって安定化されることが期待される。
【００４９】
図６Ｃに示したポルフィリン−ペプチド誘導体を調製するために、メソポルフィリンＩＸのカルボキシル基を活性化させ、標準の固相ペプチド合成を使用してペプチドのアミノ
基と結合させ得る。通常、樹脂に結合したペプチドのリジン残基の遊離アミノ基を、カルボキシを活性化したポルフィリン核と結合させ得る。標準的な方法を使用して、縮合生成物を樹脂から切断して外し得る。この方法は、本発明のペプチドの他のポルフィリン誘導体を合成するために使用し得る。
【００５０】
他の適切なポルフィリンおよび大環状キレート剤ならびにこれらをペプチドに結合させる方法は、その開示の全体を本願明細書に援用する米国特許第５，９９４，３３９号および同第５，０８７，６９６号に記載されている。ペプチドに結合させ得る他のポルフィリンおよび大環状キレート剤が知られている。たとえば、米国特許第５，４２２，０９６号、同第５，５２７，５２２号、同第５，６２８，９８２号、同第５，６３７，３１１号、同第５，８７４，５７３号、および同第６，００４，９５３号、国際出願国際公開公報第９７／４４３１３号パンフレットおよび同第９９／３９７０６号パンフレット参照。
【００５１】
様々なさらなる金属キレート剤およびこれらをタンパク質に結合させる方法は、その開示の全体を本願明細書に援用する米国特許第５，６８３，９０７号に記載されている。
ジチオカルバメートは、鉄を含めた金属を結合することが知られている。本発明のペプチドの誘導体を作製するための適切なジチオカルバメートは、その開示の全体を本願明細書に援用する米国特許第５，３８０，７４７号および同第５，９２２，７６１号に記載されている。
【００５２】
ヒドロキシピリドンが鉄キレート剤であることも知られている。本発明のペプチドの誘導体を作製するための適切なヒドロキシピリドンは、その開示の全体を本願明細書に援用する、米国特許第４，９１２，１１８号および同第５，１０４，８６５号ならびに国際出願国際公開公報第９８／５４１３８号パンフレットに記載されている。
【００５３】
さらなる非ペプチド性の金属キレート剤が、当分野で知られているか、今後開発されるであろう。タンパク質およびペプチドに化学物質を結合させる方法は当分野で周知であり、本発明のペプチドに非ペプチド性の金属キレート剤を結合させることは、当分野の範囲内にある。たとえば、このような結合方法を記載している、上に引用した特許文献を参照されたい。
【００５４】
非ペプチド性の金属結合官能基を、ペプチドＰ１−Ｐ２に結合させるのと同じ方法で別の金属結合ペプチド（ＭＢＰ）に結合させることが可能なことは理解されよう。生じるペプチド誘導体は、ＭＢＰの金属結合部位に加えて１つまたは複数の金属結合官能基を含む。好ましくは、ＭＢＰは２〜１０個、より好ましくは３〜５個のアミノ酸を含む。好ましくは、ＭＢＰは１つまたは複数のＤ−アミノ酸を含み、最も好ましくはＭＢＰのアミノ酸のすべてがＤ−アミノ酸である。上述のように、多くの金属結合ペプチドの配列が知られている。これらのペプチドおよび同ペプチドの金属結合部位からなるペプチドは、ペプチドＰ１−Ｐ２について上に記載した方法と同じ方法で調製し得る。１つまたは複数の金属結合官能基がペプチドに結合したこれらペプチドの誘導体は、ペプチドＰ１−Ｐ２の誘導体について上に記載した方法と同じ方法で調製し得る。
【００５５】
本発明はまた、式：
Ｐ３−Ｌ−Ｐ３
の金属結合ペプチド２量体も提供する。
【００５６】
Ｐ３は、金属イオンを結合する能力を有する任意のペプチドであり、それぞれのＰ３は同一であっても異なっていてもよい。各Ｐ３は、好ましくは２〜１０個、より好ましくは３〜５個のアミノ酸を含む。上述のように、金属結合ペプチドが知られており、各Ｐ３はこれらペプチドの１つまたは複数の金属結合部位の配列からなっていてよい。各Ｐ３は非
ペプチド性の金属結合官能基による置換を含めてＰ１およびＰ２について上に記載したように置換されていてもよいが、いずれのＰ３ペプチドも置換されていないことが好ましい。Ｐ３はまた、Ｐ３の金属結合能力を提供するために、上述のように非ペプチド性の金属結合官能基で置換された任意のアミノ酸配列からなっていてもよい。好ましくは、各Ｐ３は非置換の金属結合ペプチド（すなわち、金属イオンを結合するペプチド配列からなる非置換のペプチド）である。最も好ましくは、Ｐ３基のうち１つまたは両方がＰ１である（すなわち、該２量体が配列Ｐ３−Ｌ−Ｐ１、Ｐ１−Ｌ−Ｐ３、または最も好ましくはＰ１−Ｌ−Ｐ１を有する）。Ｐ１は上に定義されている。
【００５７】
Ｌは、各Ｐ３のＣ末端アミノ酸に結合しているリンカーである。Ｌは、２つのＰ３ペプチドを、それらのＣ末端アミノ酸を介して連結させることが可能な任意の生理学的に許容可能な化学基であってよい。「生理的に許容可能」とは、リンカーＬをペプチド２量体に含めた結果、リンカーＬを含むペプチド２量体が、該ペプチド２量体を投与される動物（ヒトを含む）または器官に対して毒性がないことを意味する。Ｌは、２つのＰ３基を、これらが協同的に金属イオンを結合し得るように連結させる（２：１のペプチド：金属の錯体に類似；実施例８参照）ことが好ましい。また、Ｌは中性であることが好ましい。最も好ましくは、Ｌは、１〜１８個、好ましくは２〜８個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖状のアルカンまたはアルケン残基（たとえば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２（ＣＨ３）ＣＨ２−、−ＣＨＣＨ−など）、あるいは３〜８個、好ましくは５〜６個の炭素原子を含む環状アルカンまたはアルケン残基であり（図１２Ａ、化合物Ｄ１参照）、アミド結合によってＰ３に結合していることが好ましい。このようなリンカーは、ペプチド２量体に疎水性を与えるので特に好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｌは窒素含有複素環状アルカン残基（図１２Ａ、化合物Ｄ２、Ｄ３およびＤ４参照）、好ましくはピペラジド（図１２Ａ、化合物Ｄ２参照）である。別の好ましい実施形態では、Ｌはグリセリルエステルである（図１２Ａ、化合物Ｄ５参照；式Ｄ５中では、Ｒは、好ましくは１〜６個の炭素原子を含む、含むアルキルまたはアリールである）。最後に、Ｌは金属結合ポルフィリンであり得る（図６Ｃ参照）。これらの好ましいリンカーＬにより、２つのペプチドＰ３が協同的に金属イオンを結合し、かつ生体適合性であることが可能になるであろうし、これら好ましいリンカーを含むペプチド２量体は、容易に大量作製し得る。「生体適合性」とは、リンカーＬを含むペプチド２量体が、ペプチド２量体を投与された動物（ヒトを含む）において、リンカーＬに起因する望ましくない副作用を全く生じないことを意味する。
【００５８】
ペプチド２量体を合成する方法を図１２Ｂ〜Ｄに例示する。一般に、２つのＰ３基のＣ末端アミノ酸（当分野で周知の方法および保護基によって保護されている）がＬに結合され、生じたアミノ酸２量体を使用して標準のペプチド合成方法でペプチド２量体を作製する。
【００５９】
たとえば、各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］を有するペプチド２量体は、保護されたリジンを、酸塩化物として、またはペプチド合成で使用される標準のカップリング剤を使用することによって、遊離ジアミン官能基にカップリングさせることで合成し得る（図１２Ｂ〜Ｃ参照）。多くの適切なジアミンが市販されており、あるいは、適切なジアミンは当分野で知られている方法によって容易に合成することが可能である。
【００６０】
たとえば、リジン２量体「２」（図１２Ｂ）は、以下のように調製し得る。乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；１００ｍＬ；乾燥アルゴンでフラッシュしたもの）中の、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）とｔ−ベンジルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）とで保護したＤ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）（２０ミリモル）の攪拌溶液に、ブタン−１，４−ジアミン「１」および２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾ
ール−１−イル）−１，２，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＢＴＵ；０．５ミリモル）を加える。溶液を室温で３６時間攪拌する。シリカによるフラッシュ・クロマトグラフィーで、酢酸エチル／メタノールの混合液で溶出させて、ビス保護されたリジン「２」を単離する。その後、標準的なペプチド合成方法を使用して、保護されたリジン２量体「２」からペプチド２量体「３」を調製する（図１２Ｂ参照）。
【００６１】
各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］を有する別のペプチド２量体は、以下のように合成し得る。まず、ピペラジン「５」の２つのアミノ中心をアシル化することによって、別の保護されたリジン２量体「４」を合成する（図１２Ｃ参照；シャンブリアーら（Ｃｈａｍｂｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９６巻、１０８２４〜１０８２９ページ、１９９９年も参照）。その後、標準のペプチド合成方法を使用して残りのアミノ酸残基を付加し、ペプチド２量体「６」を得る（図１２Ｃ参照）。
【００６２】
各ペプチドが配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］を有し、Ｌがグリセリルエステルであるペプチド２量体は、以下のように合成し得る。Ｒがアルキルまたはアリールである、図１２Ｄの式７の３−置換型プロパン−１，２−ジオールは、市販されている。Ｒがメチルであるリジンジエステル「８」は、以下のように調製し得る（図１２Ｄ参照）。乾燥トルエン（１００ｍＬ；乾燥アルゴンでフラッシュしたもの）中の、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（２０ミリモル）の攪拌溶液に、３−メトキシプロパン−１，２−ジオール（２００ミリモル）およびイミダゾール（１５ミリモル）を加える。溶液を室温で３６時間攪拌する。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶かす。この溶液を、クエン酸溶液（２％）、水、０．５ＮのＮａＨＣＯ３溶液、そして再度水で洗浄し、その後、有機層を硫酸マグネシウムで完全に脱水する（溶媒の除去により淡黄色の残渣が得られる）。シリカによるフラッシュ・クロマトグラフィーで、酢酸エチル／メタノールの混合液で溶出させて、ビス保護されたリジン「８」を単離する。その後、標準的なペプチド合成方法を使用して、保護されたリジン２量体「８」からペプチド２量体「９」を調製する（図１２Ｄ参照）。
【００６３】
金属結合化合物の生理学的に許容可能な塩も、本発明に含まれる。生理学的に許容可能な塩には、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸など）または塩基（製薬上許容可能な金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩もしくは炭酸水素塩など）由来の塩等、慣用の無毒性の塩が含まれる。塩は、従来の方法、たとえば、遊離塩基型の化合物を酸で中和することにより調製する。
【００６４】
本発明はまた、本発明の１つまたは複数の金属結合化合物からなるオーラル・ケア製品も提供する。オーラル・ケア製品には、オーラル・ケア組成物およびオーラル・ケア・デバイスが含まれる。
【００６５】
本発明のオーラル・ケア組成物には、洗浄剤、洗口剤、うがい薬、液剤、ドロップ、乳濁液、懸濁液、リキッド剤、ペースト、ゲル、軟膏、クリーム、スプレー、散剤、錠剤、ガム、ロゼンジ、ミント、フィルム、パッチ、および歯のホワイトニング組成物が含まれる。本発明のオーラル・ケア組成物には、消費者および患者による使用を意図する組成物、ならびに歯科の専門家（たとえば歯科衛生士、歯科医および口腔外科医）による使用を意図する組成物が含まれる。
【００６６】
本発明のオーラル・ケア組成物は、本発明の１つまたは複数の金属結合化合物を活性成分として、１つまたは複数の製薬上許容可能な担体との混合物として含むであろう。本発
明のオーラル・ケア組成物は一般に、約０．００１重量％〜約２０重量％の本発明の金属結合化合物または金属結合化合物の組合せからなる。本発明のオーラル・ケア組成物はまた、オーラル・ケア組成物中で従来使用されている他の活性化合物および／または他の成分を含めた１種または複数種の他の許容可能な成分からなっていてもよい。各担体および成分は、配合物の他の成分と適合性があり、動物に有害でないという点で「許容可能」でなければならない。
【００６７】
オーラル・ケア組成物中で使用するための、製薬上許容可能な担体を含めた適切な成分、およびオーラル・ケア組成物を作製かつ使用する方法は、当分野で周知である。たとえば、すべての開示の全体を本願明細書に援用する、米国特許第４，８４７，２８３号、同第５，０３２，３８４号、同第５，０４３，１８３号、同第５，１８０，５７８号、同第５，１９８，２２０号、同第５，２４２，９１０号、同第５，２８６，４７９号、同第５，２９８，２３７号、同第５，３２８，６８２号、同第５，４０７，６６４号、同第５，４６６，４３７号、同第５，７０７，６１０号、同第５，７０９，８７３号、同第５，７３８，８４０号、同第５，８１７，２９５号、同第５，８５８，４０８号、同第５，８７６，７０１号、同第５，９０６，８１１号、同第５，９３２，１９３号、同第５，９３２，１９１号、同第５，９５１，９６６号、同第５，９７６，５０７号、同第６，０４５，７８０号、同第６，１９７，３３１号、同第６，２２８，３４７号、同第６，２５１，３７２号、および同第６，３５０，４３８号、国際出願国際公開公報第９５／３２７０７号パンフレット、同第９６／０８２３２号パンフレットおよび同第０２／１３７７５号パンフレット、ならびに欧州特許出願第４７１，３９６号参照。オーラル・ケア組成物中で使用されている慣用の成分には、水、アルコール、湿潤剤、界面活性剤、増粘剤、研磨剤、香味剤、甘味剤、抗微生物剤、抗う蝕剤、抗歯垢剤、抗歯石剤、ｐＨ調節剤、および多くの他のものが含まれる。
【００６８】
オーラル・ケア組成物中で使用される水は、好ましくは低イオン含量であるべきである。またその水は、有機不純物も含まないべきである。
アルコールは無毒性でなければならない。好ましくは、アルコールはエタノールである。エタノールは溶媒であり、抗菌剤および収斂剤としても作用する。
【００６９】
オーラル・ケア組成物中での使用に適した湿潤剤には、グリセロール、ソルビトール、キシリトール、ブチレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、マンニトール、およびラクチトールなどの食用の多価アルコールが含まれる。湿潤剤は、ペーストなどのオーラル・ケア組成物が空気に曝された際に硬化するのを防ぐのに役立ち、オーラル・ケア組成物に口腔において湿った感触を与え、また望ましい甘味を与えることもできる。
【００７０】
界面活性剤には、陰イオン性、非イオン性、両性（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ）、双イオン性、および陽イオン性の合成洗剤が含まれる。陰イオン性界面活性剤には、アルキル基に８〜２０個の炭素原子を有する硫酸アルキルの水溶性塩（硫酸アルキルナトリウムなど）、８〜２０個の炭素原子を有する脂肪酸のスルホン化モノグリセリドの水溶性塩（ラウリル硫酸ナトリウムおよびココナツモノグリセリド硫酸ナトリウムなど）、ザルコシン酸塩（ラウロイルザルコシン酸、ミリストイルザルコシン酸、パルミトイルザルコシン酸、ステアロイルザルコシン酸、オレオイルザルコシン酸のナトリウム塩およびカリウム塩など）、タウリン酸塩、高級アルキルスルホ酢酸塩（ラウリルスルホ酢酸ナトリウムなど）、イセチオン酸塩（ラウロイルイセチオン酸ナトリウム）、ラウレスカルボン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ならびに前述のものの混合物が含まれる。ザルコシン酸塩は、口腔内において炭水化物の分解による酸の形成を阻害するので、好ましい。非イオン性界面活性剤には、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）として販売されている）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎの名称の下で販売
されている）、脂肪族アルコールエトキシレート、アルキルフェノールの酸化ポリオキシエチレン縮合物、酸化エチレンと脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族アミド、多価アルコール、およびポリプロピレンオキシドとの縮合由来の生成物、脂肪族アルコールの酸化エチレン縮合物、長鎖第３級酸化アミン、長鎖第３級酸化ホスフィン、長鎖ジアルキルスルホキシド、ならびにこのような物質の混合物が含まれる。両性界面活性剤には、ベタイン（コカミドプロピルベタインなど）、脂肪族基が直鎖または分枝鎖状であり得るとともに脂肪族置換基の１つが約８〜１８個の炭素原子を含み、１つが陰イオン性水溶性化基（カルボン酸基、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ホスホン酸基など）である脂肪族第２級および第３級アミンの誘導体、ならびにこのような物質の混合物が含まれる。双イオン性界面活性剤には、脂肪族基が直鎖または分枝状であり得るとともに脂肪族置換基の１つが約８〜１８個の炭素原子を含み、１つが陰イオン性水溶性化基（カルボキシ、スルホン酸基、硫酸基、リン酸基、ホスホン酸基など）を含む、脂肪族第４級アンモニウム、ホスホニウムおよびスルホニウム化合物の誘導体が含まれる。陽イオン性界面活性剤には、約８〜１８個の炭素原子を含む１つのアルキル長鎖を有する脂肪族第４級アンモニウム化合物（塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ジイソブチルフェノキシエチルジメチルベンジルアンモニウム、亜硝酸ココナツアルキルトリメチルアンモニウム、フッ化セチルピリジニウムなど）が含まれる。ある種の陽イオン性界面活性剤は抗微生物剤としても作用し得る。
【００７１】
増粘剤には、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、カラゲナン、セルロース誘導体（たとえば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース）、ラポナイト、セルロースエーテルの水溶性塩（カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびカルボキシメチルヒドロキシエチルセルロースナトリウムなど）、天然ガム（カラヤ・ガム、キサンタン・ガム、アラビア・ガム、トラガカント・ガムなど）、ポリエーテル化合物のポリマー（ポリ酸化エチレンおよびポリ酸化プロピレンなど）、ペンタエリスリトールのアルキルエーテルと架橋結合したアクリル酸のホモポリマー、ショ糖のアルキルエーテル、カルボマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）として販売されている）、デンプン、ラクチドとグリコライドモノマーとのコポリマー（平均分子量約１，０００〜１２０，０００を有するコポリマー）、コロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムおよび細かく分割されたシリカが含まれる。増粘剤は、オーラル・ケア組成物に所望の稠度を与えるのに十分な量を加える。
【００７２】
研磨剤には、シリカ（ゲルおよび沈殿物を含む）、アルミナ、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸ジカルシウム、リン酸トリカルシウム、ヒドロキシアパタイト、ピロリン酸カルシウム、トリメタリン酸塩、不溶性ポリメタリン酸塩（不溶性のポリメタリン酸ナトリウムおよびポリメタリン酸塩カルシウムなど）、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、樹脂性研磨剤物質（尿素とホルムアルデヒドとの粒子状縮合生成物など）、粒子状熱硬化性ポリマー樹脂（適切な樹脂には、メラミン樹脂、フェノール樹脂、尿素樹脂、メラミン−尿素樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−尿素−ホルムアルデヒド樹脂、架橋結合したエポキシドおよび架橋結合したポリエステルが含まれる）、ならびに前述のものの組合せが含まれる。シリカ研磨剤は、歯のエナメル質または象牙質を過度に磨耗させずに優れた歯の清掃および磨き性能をもたらすので、好ましい。
【００７３】
香味剤には、ペパーミント油、スペアミント油、ウィンターグリーン油、クローブ、メンソール、ジヒドロアネトール、エストラゴール、サリチル酸メチル、ユーカリプトール、カッシア、酢酸１−メンチル、セージ、ユージノール、パセリ油、メントン、オキサノン、α−イリソン、α−イオノン、アニス、マジョラム、レモン、オレンジ、プロペニルグアエトール、シナモン、バニリン、エチルバニリン、チモール、リナロール、リモネン
、イソアミル酢酸、ベンズアルデヒド、酪酸エチル、フェニルエチルアルコール、レンタカンバ（ｓｗｅｅｔ  ｂｉｒｃｈ）、ケイ皮アルデヒド、ケイ皮アルデヒドグリセロールアセタール（ＣＧＡとして知られる）、および前述のものの混合物が含まれる。
【００７４】
甘味剤には、ショ糖、グルコース、サッカリン、デキストロース、レブロース、乳糖、マンニトール、ソルビトール、フルクトース、マルトース、キシリトール、サッカリン塩、タウマチン、アスパルテーム、Ｄ−トリプトファン、ジヒドロカルコン、アセスルファム、シクラミン酸塩、および前述のものの混合物が含まれる。
【００７５】
香味剤および甘味剤に加えて、オーラル・ケア組成物は、任意選択の成分として冷却剤、唾液分泌促進剤（ｓａｌｉｖａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、加温剤および局部麻酔剤（ｎｕｍｂｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含んでいてもよい。冷却剤には、カルボキサミド、メンソール、パラメンタンカルボキサミド、イソプロピルブタンアミド、ケタール、ジオール、３−１−メントキシプロパン−１，２−ジオール、メントングリセロールアセタール、乳酸メンチル、およびこれらの混合物が含まれる。唾液分泌促進剤には、Ｊａｍｂｕ（登録商標）（タカサゴ（Ｔａｋａｓａｇｏ）社により製造されている）が含まれる。加温剤には、トウガラシおよびニコチン酸エステル（ニコチン酸ベンジルなど）が含まれる。局部麻酔剤には、ベンゾカイン、リドカイン、クローブ芽油およびエタノールが含まれる。
【００７６】
抗菌剤および抗歯垢剤には、トリクロサン、サンギナリンおよびサンギナリア、第４級アンモニウム化合物、塩化セチルピリジニウム、塩化テトラデシルピリジニウムおよびＮ−テトラデシル−４−エチルピリジニウム塩化物、塩化ベンズアルコニウム、ビスクアニド（ｂｉｓｑｕａｎｉｄｅ）、クロルヘキシジン、ジグルコン酸クロルヘキシジン、ヘキセチジン、オクテニジン、アレキシジン、ハロゲン化したビスフェノール化合物、２，２’−メチレンビス−（４−クロロ−６−ブロモフェノール）、５−クロロ−２−（２，４−ジクロロフェノキシ）−フェノール、サリチルアニリド、臭化ドミフェン、デルモピノール（ｄｅｌｍｏｐｉｎｏｌ）、オクタピノール（ｏｃｔａｐｉｎｏｌ）、その他のピペラジノ誘導体、ナイシン、亜鉛スズ・イオン剤、抗生物質（オーグメンチン、アモキシシリン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、およびメトロニダゾールなど）、前述のものの類似体および塩、ならびに前述のものの混合物が含まれる。
【００７７】
抗う蝕剤には、フッ化ナトリウム、フッ化スズ、フッ化カリウム、フッ化アミン、フッ化インジウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、乳酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、ストロンチウム塩、およびポリアクリル酸ストロンチウムが含まれる。
【００７８】
抗歯石剤には、二アルカリ金属（ｄｉａｌｋａｌｉ  ｍｅｔａｌ）のピロリン酸塩および四アルカリ金属（ｔｅｔｒａａｌｋａｌｉ  ｍｅｔａｌ）のピロリン酸塩（たとえば、水和形および無水形のピロリン酸二水素二ナトリウム、ピロリン酸四ナトリウム、ピロリン酸四カリウム）などのピロリン酸塩が含まれる。ピロリン酸塩の代わりに、またはそれに加えて使用し得る他の抗歯石剤には、合成陰イオン性ポリマー（ポリアクリレートおよび無水マレイン酸またはマレイン酸とメチルビニルエーテルとのコポリマーなど）、スルホン酸ポリアミノプロパン、クエン酸亜鉛三水和物、ポリリン酸（トリポリリン酸およびヘキサメタリン酸など）、ポリホスホネート（エタン−１−ヒドロキシ−１，１−二リン酸二ナトリウム（ＥＨＤＰ）、メタン二ホスホン酸、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸など）、ならびにポリペプチド（ポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸など）が含まれる。
【００７９】
本発明の口腔組成物のｐＨは酸性であってはならない。というのも、酸性条件によって本発明の金属結合化合物の有効性が低減されるからである。したがって、本発明のオーラル・ケア組成物のｐＨは約６．５より高く、好ましくは約７．０〜約８．５、より好まし
くは約７．２〜約７．６であるべきである。したがって、１または複数のｐＨ調節剤および／もしくは緩衝剤をオーラル・ケア組成物中に含める必要があるかもしれない。ｐＨ調節剤は、所望のｐＨをもたらす任意の化合物または化合物の混合物であってよい。適切なｐＨ調節剤には、安息香酸、クエン酸、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムなど、有機および無機の酸および塩基が含まれる。所望のｐＨをもたらし維持するために必要なものとして、緩衝剤には、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、重炭酸塩（たとえば、重炭酸ナトリウム（重曹としても知られている）などのアルカリ金属重炭酸塩）、グルコン酸塩、酒石酸塩、硫酸塩、クエン酸塩（クエン酸ナトリウムなど）、安息香酸塩、硝酸塩（硝酸ナトリウムおよび硝酸カリウムなど）、リン酸塩（リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムなど）、ならびに前述のものの組合せが含まれる。
【００８０】
本発明のオーラル・ケア組成物は、本発明の金属結合化合物（上述のように、これらは金属イオンを結合することに加えて、抗炎症性であり、ＲＯＳによって与えられた損傷を軽減させる）に加えて、１種もしくは複数種の抗酸化剤、抗炎症化合物、および／または金属結合化合物をさらに含んでいてもよい。
【００８１】
適切な抗炎症剤には、イブプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、アスピリン、ケルトロラック（ｋｅｒｔｏｒｏｌａｃ）、ナプロキセン、インドメタシン、ピロキシカム、メクロフェナム酸、ステロイド、および前述のものの混合物が含まれる。
【００８２】
適切な抗酸化剤には、スーパーオキシド・ジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、エブセレン、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、ペニシラミン、アロプリノール、オキシプリノール、アスコルビン酸、α−トコフェロール、Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）（水溶性α−トコフェロール）、ビタミンＡ、β−カロテン、脂肪酸結合タンパク質、フェノザン（ｆｅｎｏｚａｎ）、プロブコール、シアニダノール−３（ｃｙａｎｉｄａｎｏｌ−３）、ジメルカプトプロパノール、インダパミド、エモキシピン（ｅｍｏｘｉｐｉｎｅ）、ジメチルスルホキシドなどが含まれる。たとえば、ダスら（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２３３巻、６０１〜６１０ページ、１９９４年；ストーズ（Ｓｔｏｈｓ）、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｃｌｉｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第６巻、２０５〜２２８ページ、１９９５年参照。
【００８３】
適切な金属結合化合物には、金属結合ペプチドおよび／または非ペプチド性のキレート剤が含まれる。金属結合ペプチドおよび非ペプチド性キレート剤は上に記載されており、当分野で他のものも知られている。たとえば、Ｃｕ（ＩＩ）を密接に結合するペプチドＰ１（すなわち、Ｐ２の式中ｎ＝０であるペプチドＰ１−Ｐ２）は、Ｃｕ（Ｉ）を結合するのに適した別個のペプチドと組み合わせて与え得る（適切なＣｕ（Ｉ）結合ペプチドは上に記載されている）。別の例として、ペプチドＰ１は、鉄を結合する能力を有する別のペプチドまたは非ペプチド性キレート剤と組み合わせて与え得る。適切な鉄結合ペプチドおよび非ペプチド性キレート剤は上に記載されており、当分野で他のものも知られている（たとえばメシル酸デフェロキサミン）。
【００８４】
本発明のオーラル・ケア組成物は、本発明の金属結合化合物の分解を阻止するため、かつ／または追加の治療効果のためにプロテアーゼ阻害剤を有利に含んでいてもよい（ある種のプロテアーゼは炎症プロセスに関与しており、また他のプロテアーゼは口腔内の組織崩壊に関連づけられている）。適切なプロテアーゼ阻害剤には、その開示の全体を本願明細書に援用する、米国特許第６，４０３，６３３号、同第６，３５０，４３８号、同第６，０６６，６７３号、同第５，６２２，９８４号および同第４，４５４，３３８号に記載されているものなど、メタロプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ阻害剤が含まれる。
【００８５】
オーラル・ケア組成物中に組み込んでもよい多くの他の成分が知られている。これらには、懸濁剤（多糖類、米国特許第５，４６６，４３７号参照）、活性成分の送達を増強し得るポリマー化合物（ポリビニルメチルエーテルと無水マレイン酸とのコポリマーならびにドイツ連邦共和国第９４２，６４３号および米国特許第５，４６６，４３７号に記載されている送達を増強させるポリマーなど）、オーラル・ケア組成物が口腔組織に強力かつ継続的に接着することを可能し、それにより持続的な局所的治療効果をもたらす物質（天然ガム、植物抽出物、動物抽出物（たとえばゼラチン）、天然および合成ポリマー、ならびにデンプン誘導体など；たとえば、米国特許第５，０３２，３８４号、同第５，２９８，２３７号、および同第５，４６６，４３７号参照）、油、ワックス、シリコン、着色料（ＦＤ＆Ｃ色素など）、色換え系、保存料（メチルパラベン、プロピルパラベン、および安息香酸ナトリウムなど）、乳化剤（二酸化チタンなど）、植物抽出物、可溶化剤（プロピレン・グリコールなど；たとえば米国特許第５，４６６，４３７号参照）、酵素（デキストラナーゼおよび／またはミュータナーゼ（ｍｕｔａｎａｓｅ）、アミログルコシダーゼ、グルコースオキシダーゼとラクトペルオキシダーゼ、およびノイラミニダーゼ）、合成および天然ポリマー、歯のホワイトニング剤（約０．１重量％〜約１０重量％の過酸素化合物など；歯のホワイトニング組成物についての以下のさらなる論述参照）、アルカリ金属重炭酸塩（重炭酸ナトリウム（重曹としても知られている）、一般に約０．０１重量％〜約３０重量％とする）、減感剤（カリウム塩（たとえば、硝酸カリウム、クエン酸カリウム、塩化カリウム、酒石酸カリウム、重炭酸カリウム、シュウ酸カリウム）、およびストロンチウム塩など）、鎮痛剤（リドカインまたはベンゾカインなど）、抗真菌剤、抗ウイルス剤などが含まれる。
【００８６】
大量の銅および鉄の塩が存在するのを避けるのが好ましい。オーラル・ケア組成物中に大量の銅および鉄イオンが存在することにより、本発明の金属結合化合物が口腔内で見つかる銅および鉄イオンを結合する能力が低減される可能性がある。
【００８７】
上述の成分および当分野で知られているまたは今後開発されるであろう他の成分を利用して、広範囲の様々なオーラル・ケア組成物を調製し得ることを理解されたい。適切な成分および成分の組合せを選択し、あるオーラル・ケア組成物中に含める有効量の１または複数の本発明の金属結合化合物を決定することは、当分野の知識および本明細書中に提供する指針を前提とすれば、当分野の技術範囲内にある。
【００８８】
以下に、本発明の金属結合化合物または金属結合化合物の組合せを組み込み得るオーラル・ケア組成物の数例を示す。当業者には、さらなる種類のオーラル・ケア組成物、ならびに異なる成分および異なる量の成分を有するさらなるオーラル・ケア組成物は、当分野の知識および本明細書中に提供する指針を利用して調製し得ることが、理解されよう。
【００８９】
歯磨剤には、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉および液体歯磨剤が含まれる。練り歯磨きおよび歯磨きジェルは一般に、歯科用研磨剤、界面活性剤、増粘剤、湿潤剤、香味剤、甘味剤、着色料および水を含む。また、練り歯磨きおよび歯磨きジェルは、乳白剤、抗う蝕剤、抗歯石剤、歯のホワイトニング剤、および他の任意選択の成分を含んでいてもよい。典型的には、練り歯磨きまたは歯磨きジェルは、約５％〜約７０％、好ましくは約１０％〜約５０％の研磨剤、約０．５％〜約１０％の界面活性剤、約０．１％〜約１０％の増粘剤、約１０％〜約８０％の湿潤剤、約０．０４％〜約２％の香味剤、約０．１％〜約３％の甘味剤、約０．０１％〜約０．５％の着色料、約０．０５％〜約０．３％の抗う蝕剤、約０．１％〜約１３％の抗歯石剤、および約２％〜約４５％の水を含む。もちろん、歯磨き粉は実質的にすべての液体でない成分を含み、典型的には約７０％〜約９９％の研磨剤を含む。液体歯磨剤は、水、エタノール、湿潤剤、界面活性剤、増粘剤、研磨剤（研磨剤が含まれる場合は、懸濁剤（たとえば、高分子量多糖）を含めなければならない；米国特許第５，４６６，４３７号参照）、抗菌剤、抗う蝕剤、香味剤および甘味剤からな
り得る。代表的な液体歯磨剤は、約５０％〜約８５％の水、約０．５％〜約２０％のエタノール、約１０％〜約４０％の湿潤剤、約０．５％〜約５％の界面活性剤、約０．１％〜約１０％の増粘剤を含むものとなり、約１０％〜約２０％の研磨剤、約０．３％〜約２％の懸濁剤、約０．０５％〜約４％の抗菌剤、約０．０００５％〜約３％の抗う蝕剤、約０．１％〜約５％の香味剤、および約０．１％〜約５％の甘味剤を含んでいてもよい。
【００９０】
ゲルには、歯磨剤ゲル（上記説明参照）、非研磨剤ゲルおよび歯肉縁下用ゲルが含まれる。非研磨剤ゲルおよび歯肉縁下用ゲルは一般に、増粘剤、湿潤剤、香味剤、甘味剤、着色料、および水を含む。また、このようなゲルは、１種もしくは複数種の抗う蝕剤および／または抗歯石剤を含んでいてもよい。典型的には、このようなゲルは、約０．１％〜約２０％の増粘剤、約１０％〜約５５％の湿潤剤、約０．０４％〜約２％の香味剤、約０．１％〜約３％の甘味剤、約０．０１％〜約０．５％の着色料、およびバランス用の水を含む。また、このようなゲルは、約０．０５％〜約０．３％の抗う蝕剤および約０．１％〜約１３％の抗歯石剤も含んでいてよい。
【００９１】
一般に、クリームは増粘剤、湿潤剤および界面活性剤を含み、香味剤、甘味剤、着色料を含んでいてもよい。典型的には、クリームは、約０．１％〜約３０％の増粘剤、約０％〜約８０％の湿潤剤、約０．１％〜約５％の界面活性剤、約０．０４％〜約２％の香味剤、約０．１％〜約３％の甘味剤、約０．０１％〜約０．５％の着色料、および約２％〜約４５％の水を含む。
【００９２】
口腔での使用に適した軟膏は、たとえば、その開示の全体を本願明細書に援用する米国特許第４，８４７，２８３号、同第５，８５５，８７２号、および同第５，８５８，４０８号に記載されている。一般に、軟膏は以下の１つまたは複数を含む：脂肪、油、ワックス、パラフィン、シリコン、プラスチベース、アルコール、水、湿潤剤、界面活性剤、増粘剤、タルク、ベントナイト、酸化亜鉛、アルミニウム化合物、保存料、抗ウイルス化合物、および他の成分。たとえば、軟膏は、約８０％〜約９０％のペトロラタムおよび約１０％〜約２０％のエタノールまたはプロピレン・グリコールからなり得る。別の例として、軟膏は、約１０％のペトロラタム、約９％のラノリン、約８％のタルク、約３２％のタラ肝油、および約４０％の酸化亜鉛からなり得る。第３の例として、軟膏は、約３０％〜約４５％の水、約１０％〜約３０％の油（たとえばペトロラタムまたは鉱物油）、約０．１％〜約１０％の乳化剤（たとえば、ワックスＮＦ）、約２％〜約２０％の湿潤剤（たとえばプロピレン・グリコール）、約０．０５％〜約２％の保存料（たとえばメチルパラベンおよびプロピルパラベン）、および約１０％〜約４０％のステロールアルコールからなり得る。
【００９３】
口腔洗浄剤、洗口剤、うがい薬およびスプレーは、一般に、水、エタノール、および／または湿潤剤を含み、好ましくは、界面活性剤、香味剤、甘味剤、および着色料も含み、増粘剤ならびに１種または複数種の抗う蝕剤および／または抗歯石剤を含んでいてもよい。典型的な組成物は、約０％〜約８０％の湿潤剤、約０．０１％〜約７％の界面活性剤、約０．０３％〜約２％の香味剤、約０．００５％〜約３％の甘味剤、約０．００１％〜約０．５％の着色料を含み、バランスは水である。別の典型的な組成物は、約５％〜約６０％、好ましくは約５％〜約２０％のエタノール、約０％〜約３０％、好ましくは約５％〜約２０％の湿潤剤、約０％〜約２％乳化剤、約０％〜約０．５％の甘味剤、約０％〜約０．３％の香味剤、およびバランス用の水を含む。さらなる典型的な組成物は、約４５％〜約９５％の水、約０％〜約２５％のエタノール、約０％〜約５０％の湿潤剤、約０．１％〜約７％の界面活性剤、約０．１％〜約３％の甘味剤、約０．４％〜約２％の香味剤、および約０．００１％〜約０．５％の着色料を含む。また、これらの組成物は、約０．０５％〜約０．３％の抗う蝕剤および約０．１％〜約３％の抗歯石剤も含みうる。
【００９４】
液剤は一般に、水、保存料、香味剤、および甘味剤を含み、増粘剤および／または界面活性剤を含んでいてよい。典型的には、液剤は、約８５％〜約９９％の水、約０．０１％〜約０．５％の保存料、約０％〜約５％の増粘剤、約０．０４％〜約２％の香味剤、約０．１％〜約３％の甘味剤、および約０％〜約５％の界面活性剤を含む。使用し得る別の単純な液剤は、任意選択で保存料、増粘剤および／もしくは界面活性剤を含む、生理食塩水、緩衝溶液、または緩衝生理食塩水である。
【００９５】
一般に、ロゼンジおよびミントは、基剤、香味剤および甘味剤を含む。基剤は、キャンディ・ベース（硬い砂糖菓子）、グリセリン・ゼラチンまたは、形状を与えるのに十分な粘質を有する糖の組合せであってよい。米国特許第６，３５０，４３８号およびレミングトン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）、「調剤の科学と実践（The Science And Practice Of pharmacy）、第１９版、１９９５年参照。ロゼンジ組成物も、通常１種または複数種の充填剤（たとえば圧縮糖（ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｌｂｌｅ  ｓｕｇａｒ））および潤滑剤を含む。
【００９６】
チューインガム、咀嚼錠および咀嚼ロゼンジは、その開示の全体を本願明細書に援用する、米国特許第６，４７１，９９１号、同第６，２９６，８６８号、同第６，１４６，６６１号、同第６，０６０，０７８号、同第５，８６９，０９５号、同第５，７０９，８７３号、同第５，４７６，６４７号、および同第５，３１２，６２６号、国際出願国際公開公報第８４／０４４５３号パンフレットおよび第９９／０２１３７号パンフレット、ならびにリーバーマンら（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、「医薬の投与形態（Pharmaceutical Dosage Forms ）、第２版、１９９０年に記載されている。
【００９７】
１例として、圧縮咀嚼錠は、水で崩壊しない圧縮可能な炭水化物（マンニトール、ソルビトール、マルチトール、デキストロース、ショ糖、キシリトール、乳糖およびそれらの混合物など）、結合剤（セルロース、セルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、デンプン、加工デンプンおよびそれらの混合物など）、ならびに任意選択で潤滑剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、およびワックスなど）、甘味剤、着色剤および香味剤、界面活性剤、保存料、および他の成分からなる。本発明の１または複数の金属結合化合物を含めたすべての成分を、乾式混合して錠剤に圧縮する。
【００９８】
別の例として、咀嚼錠は、外層に覆われて囲まれたコアからなっていてよい。このコアは、本発明の１または複数の金属結合化合物と、任意選択でゼリー基剤または咀嚼性基剤中の他の活性成分からなっていてもよい。外層は咀嚼性基剤であってよい。ゼリー基剤は、ペクチン、ソルビトール、マルチトール、イソマルト、液状ブドウ糖、糖、クエン酸および／または香味剤からなっていてよい。コアまたは外層の咀嚼性基剤は、ガム、ソフト・キャンディ、ヌガー、キャラメルまたはハード・キャンディであってよい。錠剤は、コアおよび外層を押出し形成してロープ状物を形成し、次いで該ロープ状物を錠剤に切断することによって形成される。
【００９９】
チューインガム組成物は一般に、ガム基剤（ガムベース）、香味剤および甘味剤を含む。適切なガム基剤には、望ましくは従来の可塑剤または軟化剤と一緒に、ジェルトン、ゴム、ラテックス、チクル、およびビニライト樹脂が含まれる。可塑剤には、トリアセチン、クエン酸アセチルトリブチル、セバシン酸ジエチル、クエン酸トリエチル、セバシン酸ジブチル、コハク酸ジブチル、フタル酸ジエチルおよびアセチル化モノグリセリドが含まれる。通常、チューインガム組成物は、約５０％〜約９９％ガム基剤、約０．４％〜約２％の香味剤および約０．０１％〜約２０％の甘味剤を含む。本発明の１または複数の金属結合化合物および他の活性成分を、たとえばこれらを暖かいガム基剤中に撹拌することによって、またはガム基剤の外表面上にコーティングすることによって、ガム基剤に取り込ませてよい。
【０１００】
ラクチド／グリコライド・コポリマーから作製される、フィルムおよびシート、ならびに口腔内で固体を形成するゲルが、米国特許第５，１９８，２２０号、同第５，２４２，９１０号および同第６，３５０，４３８号に記載されている。口腔内での使用に適した別のポリマー・フィルムが、国際出願国際公開公報第９５／３２７０７号パンフレットに記載されている。歯および義歯などの硬い歯性表面に接着し、口腔内で分解するパッチは、米国特許第６，１９７，３３１号に記載されている。これらの物はすべて、それに含まれている活性要素を口腔内に徐放する。活性剤の徐放をもたらす他の組成物（ペースト、ゲル、軟膏、リキッド剤およびフィルムを含む）も知られている。たとえば、米国特許第５，０３２，３８４号、同第５，２９８，２３７号、同第５，４６６，４３７号、同第５，７０９，８７３号、および同第６，２７０，７８１号参照。
【０１０１】
歯のホワイトニング組成物は、歯のホワイトニング剤からなる。歯のホワイトニング剤には、アルカリ金属およびアルカリ土類金属の過酸化物、過炭酸塩および過ホウ酸物、または過酸化水素を含む複合化合物が含まれる。歯のホワイトニング剤はまた、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の過酸化塩も含む。最も一般的に使用されている歯のホワイトニング剤は過酸化カルバミドである。他の一般的に使用されている歯のホワイトニング剤は、過酸化水素、ペルオキシ酢酸および過ホウ酸ナトリウムである。これらの歯のホワイトニング剤は、活性酸素および過酸化水素を遊離する。歯のホワイトニング剤は、約０．１％〜約９０％の濃度で歯のホワイトニング組成物中に存在し得る。通常、歯のホワイトニング組成物中の過酸化カルバミドの濃度は約１０％〜約２５％である。
【０１０２】
多くの歯のホワイトニング組成物が当分野で知られており、水溶液、ゲル、ペースト、リキッド剤、フィルム、ストリップ、１部構成システム、２部構成システム、歯のホワイトニング剤の活性化を必要とする組成物（たとえば、実質的に共役炭化水素などの、照射された際に脱色剤を活性化させる放射エネルギーまたは熱エネルギー吸収物質を含めることによる）などが含まれる。たとえば、その開示の全体を本願明細書に援用する、米国特許第５，３０２，３７５号、同第５，７８５，８８７号、同第５，８５８，３３２号、同第５，８９１，４５３号、同第５，９２２，３０７号、同第６，３２２，７７３号、同第６，４１９，９０６号、ならびに国際出願国際公開公報第９９／３７２３６号、第０１／８９４６３号および第０２／０７６９５号参照。また、多くの他のオーラル・ケア組成物（たとえば、練り歯磨き）およびデバイス（たとえば、デンタル・フロス）が歯のホワイトニング剤を含む。
【０１０３】
歯のホワイトニング組成物、または歯のホワイトニング剤を含む多くのオーラル・ケア組成物およびデバイスのうち１つを使用することにより、ＲＯＳの生成がもたらされ、口腔組織の炎症を引き起こし得る。本発明の１または複数の金属結合化合物を歯のホワイトニング組成物または歯のホワイトニング剤を含む他のオーラル・ケア組成物およびデバイスに組み込むことにより、炎症および／またはＲＯＳの生成が軽減される。また、本発明の１または複数の金属結合化合物をこのような組成物に組み込むことで、より効果的なホワイトニングがもたらされるかもしれない。というのも、過酸化水素型のホワイトニング剤による歯の白色化を司っている過酸化水素がヒドロキシル・ラジカルに変換されず（実施例８および９参照）、したがって、より長く活性が保たれるからである。あるいは、本発明の１または複数の金属結合化合物からなるオーラル・ケア組成物またはデバイスを、歯のホワイトニング組成物または歯のホワイトニング剤からなるオーラル・ケア組成物もしくはデバイスの前あるいは後で使用して炎症および／またはＲＯＳの生成を軽減または阻止することができる。
【０１０４】
たとえば、一般的に、歯科用のトレイまたはトラフ（ｔｒｏｕｇｈ）を用いて歯のホワイトニング組成物を歯に施用することによって、歯をホワイトニングする。本発明の１または複数の金属結合化合物を、該トレイまたはトラフ内で使用する歯のホワイトニング組
成物に組み込ませることができよう。代替方法では、歯のホワイトニング組成物の施用が完了した後、本発明の１または複数の金属結合化合物からなる別の組成物を、清浄にしたまたは別のトレイもしくはトラフ内で歯に施用することができよう。さらなる代替方法では、本発明の１または複数の金属結合化合物からなる洗浄剤または洗口剤を使用して、歯のホワイトニング組成物を施用する前および／または後に口腔をすすぐこともできよう。
【０１０５】
最近開発された、歯のホワイトニング組成物を歯に施用するための製品は、可撓性のストリップである。たとえば、米国特許第５，８９１，４５３号および同第６，４１９，９０６号参照。本発明の１または複数の金属結合化合物をこのようなストリップに組み込ませることもできよう。たとえば、１または複数の金属結合化合物を歯のホワイトニング組成物に取り込ませておいてこれをストリップに塗布することもできるし、ストリップの製造中または患者が使用する直前に、１または複数の金属結合化合物からなる溶液、ゲルまたは他の組成物を個別にストリップに塗布することもできる。さらに別の代替方法では、歯のホワイトニング組成物からなるストリップおよび１または複数の金属結合化合物からなるストリップのいずれも患者に供給してこれらが順次使用されてもよい。
【０１０６】
本発明のオーラル・ケア組成物は、単一または複数の相からなりうる。複数の相は、たとえば一部の成分が不適合性である場合、一部の成分が不安定である場合、または使用時に成分を混合することが最もよい場合に用いられよう。したがって、相の１つが一部の成分を含み、残りの成分は１つまたは複数の追加相に含まれることになる。複数の相は複数の個別の組成物であってよく、この場合は複数の相を複数の個別の容器または単一容器の複数の区画内に提供し、使用時に複数の相を混合することになる。代替方法として、一部の成分を被包することによって複数の相を形成してもよく、この場合は複数の相をすべて単一容器に含めてもよい。複数相のオーラル・ケア組成物は、たとえば、米国特許第５，３０２，３７５号、同第５，９０６，８１１号、同第５，９７６，５０７号、同第６，２２８，３４７号および同第６，３５０，４３８号ならびに国際出願国際公開公報第９９／３７２３６号パンフレットに記載されている。
【０１０７】
本発明はまた、１または複数の金属結合化合物からなるオーラル・ケア・デバイスも提供する。本発明のオーラル・ケア・デバイスには、消費者および患者による使用が意図されるデバイスならびに歯科の専門家（たとえば、歯科衛生士、歯科医および口腔外科医）による使用が意図されるデバイスが含まれる。
【０１０８】
本発明のオーラル・ケア・デバイスには、本発明の１または複数の金属結合化合物を接着、吸収、結合、付着、混入、コーティング、または他の方法で取り込ませた、外科材料（縫合糸およびスポンジなど）、フロス、テープ、チップ、ストリップ、繊維、爪楊枝またはラバー・チップ、人工歯根ならびにデンタル器具（歯および任意選択で歯周組織の上に装着されてそれらを覆うトレイおよびトラフなど）が含まれる。たとえば、このようなオーラル・ケア・デバイスおよび同デバイスに化合物を取り込ませる方法を記載している、米国特許第５，７０９，８７３号、同第５，８６３，２０２号、同第５，８９１，４５３号、同第５，９６７，１５５号、同第５，９７２，３６６号、同第５，９８０，２４９号、同第６，０２６，８２９号、同第６，０８０，４８１号、同第６，１０２，０５０号、同第６，３５０，４３８号、同第６，４１９，９０６号、国際出願国際公開公報第０２／１３７７５号パンフレット、および欧州特許出願第７５２８３３号（これらの特許すべての開示の全体を本願明細書に援用する）参照。たとえば、本発明の１または複数の金属結合化合物を結合剤（たとえばワックスもしくはポリマー）に取り込ませてデンタル・フロスにコーティングすることが可能であり、デンタル・フロスを本発明の１または複数の金属結合化合物を含む液体の槽に浸してフロスに該化合物を含浸またはコーティングすることが可能であり、固体（たとえば凍結乾燥）形態の本発明の１または複数の金属結合化合物を歯への施用に適したポリマー・フィルムに取り込ませることが可能であり、溶液ま
たはゲル状の本発明の１または複数の金属結合化合物を歯への施用に適した可撓性のストリップに塗布することが可能であり、あるいは、縫合糸または他の外科材料を、本発明の１または複数の金属結合化合物を含む溶液に浸し、次いで該化合物が縫合糸または外科材料と会合（結合、混入、コーティングされるなど）するように溶媒を除去することが可能である。たとえば、米国特許第５，８９１，４５３号、同第５，９６７，１５５号、同第５，９７２，３６６号、同第６，０２６，８２９号、同第６，０８０，４８１号、同第６，１０２，０５０号、および同第６，４１９，９０６号参照。
【０１０９】
食品、咀嚼製品、および玩具などの動物用のオーラル・ケア製品も本発明の範囲内に含まれる。適切な製品は米国特許第６，３５０，４３８号に記載されている。
動物の口腔組織を処置するために、本発明の１または複数の金属結合化合物を使用し得る。本明細書中で使用する「口腔」とは、外部境界が口唇であり、内部境界が舌、歯茎および歯を囲む咽頭である腔を意味する。したがって、口腔組織には、口唇、舌、歯茎、頬側組織、口蓋および歯が含まれる。単一の組織、複数の組織、１つもしくは複数の組織の一部分、すべてもしくは実質的にすべての口腔組織、または前述の組合せを、本発明によって処置し得る。本明細書中で使用する「処置」およびその変形は、疾病もしくは状態、またはその症状もしくは作用の少なくとも一部を治療、寛解、緩和、阻害、阻止し、起こり得る可能性を軽減し、あるいは重篤度を軽減させることを意味する。
【０１１０】
口腔組織を処置するために、組織を本発明の１または複数の金属結合化合物と接触させる。たとえば、組織を該金属結合化合物からなるオーラル・ケア組成物と接触させてもよい。口腔組織をオーラル・ケア組成物と接触させる方法は当分野で周知である。適切な方法には、組織を液剤（たとえば口腔洗浄剤、洗口剤、スプレー、液体歯磨剤、または他の液剤）ですすぐこと、歯を歯磨剤（たとえば練り歯磨き、歯磨きジェル、または散剤）でブラッシングすること、非研磨剤溶液、ゲル、ペースト、クリームまたは軟膏を（施用具を使用して、または使用せずに）組織に直接塗布すること、ガムを噛むこと、ロゼンジ、ミントまたは錠剤を咀嚼もしくは舐めること、ならびに多くの他の局所施用手段が含まれる。液剤、ゲル、ペースト、クリームおよび軟膏などのオーラル・ケア組成物を組織に施用するのに適した施用具には、スワブ、スティック、プラスチック製パドル、点滴器、注射器、ストリップ（米国特許第５，８９１，４５３号および同第６，４１９，９０６号に記載されているものなど）、指、あるいは、たとえばゲルまたは溶液中で、歯および任意選択で歯周組織の浸漬を可能にするデンタル・トレイもしくは器具（米国特許第５，８６３，２０２号および同第５，９８０，２４９号ならびに欧州特許出願第７５２８３３号に示されているものなど）が含まれる。さらに、口腔組織を処置するために、組織を該金属結合化合物からなるオーラル・ケア・デバイスと接触させてよい。口腔組織をオーラル・ケア・デバイスと接触させる方法は当分野で周知である。たとえば、外科的創傷または抜歯により生じる創傷を閉じるために縫合糸を使用することが可能であり、歯をフロスするためにデンタル・フロスを使用することが可能である。
【０１１１】
組織の処置は、予防的処置であり得る。たとえば、予防的オーラル・ケア療法の一部として組織を処置してもよい。このような療法で使用され、好ましくは少なくとも１日１回、より好ましくは１日２回もしくは３回使用されることになるオーラル・ケア組成物もしくはデバイス（練り歯磨き、歯磨きジェル、口腔洗浄剤もしくは洗口剤、またはデンタル・フロスなど）に、本発明の１または複数の金属結合化合物を取り込ませることが可能である。別の代替方法では、本発明の１または複数の金属結合化合物を、予防的オーラル・ケア療法で使用する他の組成物およびデバイスとは別に使用する別のオーラル・ケア組成物もしくはデバイス中に含めてもよい。たとえば、本発明の１または複数の金属結合化合物を、好ましくは少なくとも１日１回、より好ましくは少なくとも１日２回もしくは３回使用される口腔洗浄剤または洗口剤、ガム、ロゼンジあるいは咀嚼錠に取り込ませることが可能である。タバコ製品を利用する患者については、そのような製品によって口腔組織
に与えられた損傷の寛解を試みるために、本発明の１または複数の金属結合化合物を予防的オーラル・ケア療法の一部として用いることが特に有益であるかもしれない。
【０１１２】
練り歯磨きおよび他のオーラル・ケア組成物に、一般に抗菌剤、抗歯垢剤、抗う蝕剤、および抗歯肉炎剤として金属塩、特に銅の塩を含めることが知られている。たとえば、米国特許第５，２８６，４７９号、同第５，２９８，２３７号、および同第６，３５５，７０６号、欧州特許出願第６５８，５６５号、国際出願国際公開公報第９２／０８４４１パンフレット、日本特許出願特開昭４１‐５９２１１号公報（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ４１  ５９２１１）、ワールハーグら（Ｗａｅｒｈａｕｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．、第１１巻：１７６〜１８０ページ、１９８４年参照。遊離銅イオンはＲＯＳの形成を触媒するので、銅の塩を含むオーラル・ケア組成物の使用は、口腔組織に有害である可能性がある。したがって、銅含有組成物を使用した後の適切な時間（すなわち、銅の塩がその活性を発揮するのに十分な時間）に本発明のオーラル・ケア組成物を使用することは、これらの製品を使用した結果口腔内に存在する銅イオンにより生じるＲＯＳによって与えられる損傷を軽減させるのに非常に有益であり得る。たとえば、該金属結合化合物を、銅含有組成物を使用した後に咀嚼または舐めるガム、ロゼンジ、もしくは咀嚼錠中に、便利に供給し得る。
【０１１３】
また、組織を、手術および抜歯を含めた様々な歯科的措置に関連して予防的に処置してもよい。たとえば、手術が行われている１または複数の組織、手術が行われている領域の近辺の組織、または、処置を容易にするために全口腔組織もしくは実質的にすべての口腔組織を、手術前、手術中、手術後、またはこれらの組合せで処置し得る。同様に抜歯についても、抜くべき歯の周辺の１または複数の組織、隣接する組織、または、処置を容易にするために全口腔組織もしくは実質的にすべての口腔組織を、抜歯前、抜歯中、抜歯後、またはこれらの組合せで処置し得る。たとえば、手術または抜歯の前に口腔を１または複数の金属結合化合物からなる溶液ですすぐことが可能であり、手術または抜歯により生じた１または複数の創傷を、１または複数の金属結合化合物を取り込ませた縫合糸で閉じることが可能であり、ならびに／あるいは、手術もしくは抜歯の直後、またはその後の一定間隔のうち少なくともいずれかの時期に、口腔を１または複数の金属結合化合物からなる溶液ですすぐことが可能である。
【０１１４】
また、組織を、歯科用Ｘ線などの放射線に関連して予防的に処置し得る。最後に、上述のように、動物の歯のホワイトニングに関連して組織を予防的に処置してもよい。
本発明の１または複数の金属結合化合物は、動物の口腔組織の疾病または状態を処置するために使用し得る。本発明によって処置可能な疾病および状態には、感染症（細菌感染、ウイルス感染および真菌感染）、任意の原因による炎症、ならびに金属イオンおよび／またはＲＯＳに関与するもしくはこれらにより引き起こされた任意の疾病または状態が含まれる。本発明によって処置可能な特定の疾病および状態には、歯肉炎および歯周炎など歯周組織の疾病、潰瘍、口唇ヘルペス、口内糜爛、他のウイルス感染、細菌感染ならびに酵母菌および真菌の感染が含まれる。
【０１１５】
当業者には、動物の口腔組織を処置するために必要な本発明の１または複数の金属結合化合物の用量が、使用する特定の金属結合化合物、処置が予防的であるか疾病または状態の処置のためか、処置する疾病または状態が何であるか、疾病または状態の重篤度、使用するオーラル・ケア組成物の種類、処置期間、該動物に投与する他の薬物があればそれが何であるか、動物の年齢、大きさおよび種、ならびに医学および獣医学分野で知られている同様の因子に応じて変動することが理解されよう。一般に、本発明の化合物の適切な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最も低い用量の化合物量である。上で言及したように、約０．００１％〜約２０％の本発明の１または複数の金属結合化合物からなるオーラル・ケア組成物を１日１回または複数回使用することにより、有効な１日用量がもたら
されることが予想される。しかし、使用する実際の１日用量、１日あたりの処置回数、および処置の期間は、正しい医療判断に沿って主治医または獣医によって決定されるであろう。
【０１１６】
本発明はまた、本発明によるオーラル・ケア製品からなるキットも提供する。オーラル・ケア製品がオーラル・ケア組成物である場合、キットには、オーラル・ケア組成物を動物の口腔組織に施用するための施用具、たとえばスワブ、スティック、プラスチック製パドル、点滴器、注射器、ストリップ（米国特許第５，８９１，４５３号および同第６，４１９，９０６号に記載されているものなど）または、ゲルもしくは溶液中で、歯および任意選択で歯周組織の浸漬を可能にするデンタル・トレイもしくは器具（米国特許第５，８６３，２０２号および同第５，９８０，２４９号ならびに欧州特許出願第７５２８３３号に示されているものなど）なども含んでいてよい。キットはまた、意図する使用に必要な本発明のオーラル・ケア組成物の量を分注かつ／または測るためのカップ、バイアルあるいは他のデバイスも含み得る。もちろん、キットは、本発明のオーラル・ケア組成物およびオーラル・ケア・デバイスの両方を含み得る。本発明のオーラル・ケア組成物および／またはデバイスに加えて、キットは、歯のホワイトニング組成物、歯のホワイトニング剤からなるストリップ、オーラル・ケア組成物を施用するための施用具など、別の種類のオーラル・ケア組成物またはデバイスも含み得る。また、本発明によるキットは、本発明のキットおよび／またはオーラル・ケア製品を使用するための指示書も含むであろうし、任意の他の所望される物品を含んでいてよい。
【０１１７】
あるものについては、１つまたは複数のものを指すことに注意されたい。たとえば、「細胞」とは、１つまたは複数の細胞を指す。
本願明細書は、参照により２００２年６月２７日出願の米国特許出願第１０／１８６，１６８号；２００２年２月１３日出願の米国特許出願１０／０７６，０７１号；２００１年２月１３日出願の米国特許仮出願第６０／２６８，５５８号；２００１年３月２２日出願の米国特許仮出願＿＿＿＿＿（以前は第０９／８１６，６７９号）；２００１年４月４日出願の米国特許仮出願第６０／２８１，６４８号；２００１年４月１１日出願の米国特許仮出願第６０／２８３，５０７号；２０００年９月２９日出願の米国特許出願第０９／６７８，２０２号；１９９９年１０月１日出願の米国特許仮出願第６０／１５７，４０４号；２０００年６月１３日出願の米国特許仮出願第６０／２１１，０７８号；２００１年１１月１９日出願の米国特許仮出願第６０／３３１，６６５号；および２００２年２月２７日出願の米国特許仮出願第６０／３６０，７３６号を援用する。
【実施例１】
【０１１８】
（テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の合成）
本実施例では、標準の固相合成技法を使用した、すべてＬ−アミノ酸から構成されるテトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の合成について述べる。まず、Ｗａｎｇ樹脂（０．６ミリモル；ノババイオケム（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍ））上の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護されたＡｓｐ（ν  ＣＯＯ−エステル；トルスルホニル（Ｔｏｌｓｕｌｆｏｎｙｌ））を、ピペリジン／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４０％ｖ／ｖ；３ｍｌ）の溶液中で３０分間、時々攪拌しながら懸濁させた。この期間の後、溶媒を排出し、樹脂を順次ＤＭＦおよびジクロロメタン（ＤＣＭ；５×３ｍｌ）で洗浄した。ニンヒドリン試験を用いて反応をモニターした。樹脂をＤＭＦ（〜１ｍｌ）で膨潤させた。ＤＭＦ中の、アラニンとＣが保護されたｔ−ベンジルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）とのエステルを加え、次いで、ジイソプロピルアミン（８当量）および２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，２，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸（ＴＢＴＵ−）（４当量）の混合物を加えた。樹脂を約２４時間振盪し、ニンヒドリン試験によって反応をモニターした。この期間の後、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。溶液を排出し、ビーズをＤＣＭ（
３×２ｍｌ）で洗浄した。ジペプチド−樹脂の保護基を除去し、ビーズをＤＭＦに懸濁させた。ヒスチジン（４ミリモル）のアミノ保護（ベンジルオキシ）誘導体を加え、次いでジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）との混合物を加えた。樹脂を約２４時間振盪し、ニンヒドリン試験によって反応をモニターした。この期間の後、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。トリペプチド−樹脂を穏やかな窒素流で簡単に乾燥させ、窒素飽和のＤＭＦに懸濁させた。保護されたリジンを加え、次いでジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）との混合物を加えた。樹脂を約２４時間振盪し、ニンヒドリン試験によって反応をモニターした。この期間の後、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。Ｂｏｃ保護基を丁寧に除去して、樹脂に結合したテトラペプチド（標準的な積載量は５ミリモル／ｇ）を得た。樹脂に結合したテトラペプチド（０．２５グラム；５ｍＭ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、２４時間振盪した。この期間の後、ニンヒドリン試験によって青色が示されたが、これは樹脂からのテトラペプチドの放出を示している。一部の状況では、５％（Ｖ／Ｖ）のＤＭＦをＴＦＡに加えることによって、樹脂からのペプチドの放出速度が加速された。減圧下でＴＦＡを除去することにより、テトラペプチド（すべてＤ）がＴＦＡ塩として得られ、これを真空下、５℃で２４時間乾燥させた。残渣は白色粉末であり、これを分光分析法によって特徴づけた。
【０１１９】
この様式で、テトラペプチドのいくつかの鏡像異性体を調製し得る。たとえば、ペプチド合成にＤ−アミノ酸を使用することにより、すべてＤ−アミノ酸を含むテトラペプチドが形成される。また、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の組合せも使用し得る。
【実施例２】
【０１２０】
（Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のシクロヘキサンジアミン誘導体の調製）
シス／トランス１，２−ジアミノシクロヘキサン（アルドリッチ−シグマ（Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ））を酒石酸塩として分割することによって、トランス−ジアミノシクロヘキサンを調製した。Ｒ−トランス異性体は７５℃で融解し、Ｓ−トランス異性体は４３〜４５℃で融解する（ピー  ディー  ニューマン（Ｐ．Ｄ．Ｎｅｗｍａｎ）、博士号論文、ユニバーシティー・カレッジ・カーディフ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃａｒｄｉｆｆ）、英国、１９９４年）。その後、トランス−ジアミノシクロヘキサン（１０ｇｍ）を無水トルエン（３０ｍＬ）に懸濁させ、氷浴中で５℃まで冷却し、トルエン（２５ｍＬ）中のブロモ酢酸（８グラム）を滴下した。加え終わった後、反応温度を３０℃まで上昇させ、この温度でさらに５時間維持した。トルエンを蒸発させ、Ｒ−トランス１，２−ジアミノシクロヘキサン二酢酸をヘキサン／トルエンから結晶化させて白色固体を得た（収率７０％）。該生成物を分光分析法によって特徴づけた。
【０１２１】
実施例１で調製した樹脂結合のテトラペプチド（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に懸濁させ、Ｒ−トランス１，２−ジアミノシクロヘキサン二酢酸（２０ｍｇ）で処理し、次いでジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）の混合物を加えた。ローラー上で樹脂を約２４時間振盪した。その後、樹脂をＤＭＦ、次いでＤＣＭ（５×３ｍＬ）で洗浄し、部分的に乾燥させた。樹脂との連結の加水分解は、樹脂に結合した反応生成物をＴＦＡ（５ｍＬ；５時間）で処理することによって行った。樹脂を分離し、ＤＣＭで洗浄した。洗浄液をＴＦＡと合わせ、真空下で濃縮した。残渣（シクロヘキサンジアミン・テトラペプチド；式は図３Ｄに示す、ただしＲ５はＨである）を、分光分析法によって特徴づけた。
【実施例３】
【０１２２】
（テトラペプチド四酢酸の調製）
実施例１で調製した樹脂結合のテトラペプチド（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に懸濁
させ、過剰（１０倍）のクロロ酢酸で処理した。樹脂を室温で４８時間振盪し、次いでさらに１時間６０℃まで加熱した。濾過によりＤＭＦを除去し、樹脂をＤＭＦ、次いでＤＣＭ（５×３ｍＬ）で洗浄した。部分的に乾燥させた樹脂は、さらに処理せずに次の段階で使用した。樹脂との連結の加水分解は、樹脂に結合した反応生成物をＴＦＡ（５ｍＬ；５時間）で処理することによって行った。樹脂を分離し、ＤＣＭで洗浄した。洗浄液をＴＦＡと合わせ、真空下で濃縮した（収率３０％）。生成物（式は図４に示す）を、分光分析法によって特徴づけた。
【実施例４】
【０１２３】
（メソポルフィリンＩＸテトラペプチドの調製）
実施例１で調製した樹脂結合のテトラペプチド（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に懸濁させ、メソポルフィリンＩＸジカルボン酸（１０μモル；式は図６Ａに示す）で処理し、次いで、ジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−（４当量）の混合物を加えた。暗室に置いたローラー上で樹脂を約２４時間振盪した。樹脂をＤＭＦ、次いでＤＣＭ（５×３ｍＬ）で洗浄し、部分的に乾燥させた。樹脂との連結の加水分解は、樹脂に結合した反応生成物をＴＦＡ（５ｍＬ；５時間）で処理することによって行った。樹脂を分離し、ＤＣＭ／ＴＦＡの混合物（１：１．５ｍＬ）で洗浄した。洗浄液を合わせ、真空下で濃縮した。ポルフィリンテトラペプチド（式は図６Ｃに示す）を、準分取ＨＰＬＣによって精製した（収率６０％）。構造を分光分析法によって確認した。
【０１２４】
この手順は、メソポルフィリンＩおよび関連分子など他のポルフィリン−ペプチドの合成に使用し得る。
【実施例５】
【０１２５】
（テトラビスピリジルエチル・テトラペプチドの調製）
実施例１で調製した樹脂結合のテトラペプチド（２０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に懸濁させ、ブロモエチルピリジン（２０μｍｏｌ）で処理した。次いで、ピリジン（０．５ｍＬ）を加えた。ローラー上で樹脂を約４８時間振盪した。すべての未反応モノマーを除去するために、樹脂をＤＭＦ、次いでＤＣＭ（５×３ｍＬ）で洗浄し、その後、真空下で３０分間乾燥させた。樹脂との連結の加水分解は、樹脂に結合した反応生成物をＴＦＡ（５ｍＬ；５時間）で処理することによって行った。樹脂を分離し、ＤＣＭ／ＴＦＡの混合物（１：１．５ｍＬ）で洗浄した。洗浄液を合わせ、真空下で濃縮した。ピリジルエチル・テトラペプチド誘導体（式は図５に示す）を、準分取ＨＰＬＣによって精製した（収率５０％）。構造を分光分析法によって確認した。
【０１２６】
この手順は、フェナントロリンおよび関連分子など他の複素環にも使用し得る。
【実施例６】
【０１２７】
（Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のアリール誘導体の調製）
図１Ｂに示す式（式中、Ｒ１はフェニルである）を有する誘導体を調製した。無水エタノール（１００ｍＬ）中のアセトアミドマロン酸ジエチル（１０ｇ）を、エタノール中のナトリウムエトキシド（５ｇ；５０ｍＬ）のスラリーに加え、３０分間加熱還流させた。生成物を冷却し（１０℃）、α−ブロモフェニル酢酸エチル（５ｇ）と反応させた。反応が完了するまで進行させ（２４時間）、希酸を用いて過剰のナトリウムエトキシドを中和した。トリエステルを酢酸エチル中に抽出し、溶媒を除去した後、粘性のある液体が得られた。該粗生成物を塩酸（１００ｍＬ）で加水分解し、脱炭酸を行って、フェニル置換のアスパラギン酸（１０ｇ）を得た。標準の一連の反応を使用して、Ｎ−ベンゾイルオキシｔ−ブチル誘導体を調製した。ＤＭＦ中の、実施例１に記載のように調製した樹脂結合のペプチド（Ｌｙｓ  Ｈｉｓ  Ａｌａ）（２０ｍｇ）に、Ｎ−ベンゾイルオキシ−ｔ−ブチルアスパラギン酸誘導体を加え、次いで、ジイソプロピルアミン（８当量）とＴＢＴＵ−
（４当量）の混合物を加えた。樹脂を約２４時間振盪し、ニンヒドリン試験によって反応をモニターした。この期間の後、ＤＭＦを排出し、樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。溶液を排出し、ビーズをＤＣＭ（３×２ｍｌ）で洗浄した。丁寧な加水分解によってテトラペプチド誘導体を単離した。テトラペプチドの立体異性体を、分取スケールのＨＰＬＣによって分離した。
【実施例７】
【０１２８】
（テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］によるＲＯＳの発生の阻害）
配列Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］を有するテトラペプチド（Ｌ−テトラペプチド）は、アンシンス・サービス（Ａｎｓｙｎｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、キュー・シー・ビー（ＱＣＢ）、ジェノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）およびボウマン・リサーチ（Ｂｏｗｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含めた、ペプチドカスタム合成を提供する１つまたは複数の企業から得た。ペプチドは標準の固相合成方法によって調製されたものである（実施例１も参照されたい）。
【０１２９】
Ｌ−テトラペプチドがＲＯＳの発生を阻害する能力は、ガターリッジおよびウィルキンス（Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第７５９巻、３８〜４１ページ、１９８３年ならびにチーズマンら（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、第２５２巻、６４９〜６５３ページ、１９８８年に記載されているように試験した。手短に述べると、Ｃｕ（ＩＩ）およびＨ２Ｏ２を混合し、フェントン型反応におけるヒドロキシル・ラジカルの発生を引き起こした。ヒドロキシル・ラジカルは、糖２−デオキシ−Ｄ−リボース（ＤＮＡの糖残基）を攻撃して断片を生じさせる。この断片を低ｐＨで加熱することにより、２−チオバルビツール酸を加えると５３２ｎｍでの分光光度測定で測定し得るピンク色の色素原を生じるマロンアルデヒドが生じる。したがって、５３２ｎｍでの吸光度は、２−デオキシ−Ｄ−リボースに対する損傷の尺度である。
【０１３０】
アッセイは、Ｌ−テトラペプチドを用いるアッセイと用いないアッセイを行った。結果を表１に要約した。表１から見受けられ得るように、Ｃｕ（ＩＩ）：テトラペプチドの比を１：１．２および１：２としてＬ−テトラペプチドが存在する場合、２−デオキシ−Ｄ−リボースの分解はそれぞれ３８％および７３％阻害された。明らかに、Ｌ−テトラペプチドは、ヒドロキシル・ラジカルによる２−デオキシ−Ｄ−リボースの分解を阻害した。
【０１３１】
【表１】
2005517636.tif 000002
すべてがＤ−アミノ酸から構成される配列Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓを有するテトラペプチド（Ｄ−テトラペプチド）を使用して、類似のアッセイを行った。Ｄ−テトラペプチドは、アンシンス・サービス（Ａｎｓｙｎｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）およびキュー
・シー・ビー（ＱＣＢ）を含めた、ペプチドカスタム合成を提供している１つまたは複数の企業から得た。該ペプチドは標準の固相合成方法（実施例１参照）によって調製されたものである。
【０１３２】
Ｄ−テトラペプチドがＲＯＳの発生を阻害する能力は、チャオおよびユング（Ｚｈａｏ
ａｎｄ  Ｊｕｎｇ）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ、第２３巻（３）、２２９〜４３ページ、１９９５年に記載されているように試験した。手短に述べると、Ｃｕ（ＩＩ）およびアスコルビン酸を混合し、フェントン型反応におけるヒドロキシル・ラジカルの発生を引き起こした。過酸化水素の代わりにアスコルビン酸を使用する利点は、アスコルビン酸が他のアッセイ（たとえばＬＤＨアッセイ）を妨害しないことである（同アッセイは過酸化物では妨害される）。ヒドロキシル・ラジカルは、糖２−デオキシ−Ｄ−リボースを攻撃して断片を生じさせる。この断片を低ｐＨで加熱することにより、２−チオバルビツール酸を加えると５３２ｎｍでの分光光度測定で測定し得るピンク色の色素原が得られるマロンアルデヒドが生じる。したがって、５３２ｎｍでの吸光度は、２−デオキシ−Ｄ−リボースに対する損傷の尺度である。
【０１３３】
最適なＣｕ（ＩＩ）およびアスコルビン酸の濃度の確立は、本プロトコルを開発するにあたって最初の工程であった。まず、一定のＣｕ（ＩＩ）濃度（１０μＭ）を使用したが、この濃度は、このレベルが身体に見出される生理的な濃度（結合型および非結合型Ｃｕ（ＩＩ））であることに基づいている。直線範囲を確立するためにアスコルビン酸濃度を変化させた。選択したアスコルビン酸の濃度は５００μＭであったが、これは、５３２ｎｍでの吸光度がこの濃度で最も高く、かつ直線範囲内に収まっていたからである。興味深いことに、５００μＭより高いアスコルビン酸濃度ではヒドロキシル・ラジカルが着実に減少したが、これは、アスコルビン酸が低濃度ではヒドロキシル・ラジカル発生剤として、高濃度では抗酸化剤として２重の効果を示すことが原因であると推定される。
【０１３４】
前述のＣｕ（ＩＩ）およびアスコルビン酸濃度を使用して、Ｄ−テトラペプチドについて滴定曲線を確立した。手短に述べると、Ｄ−テトラペプチドをＣｕ（ＩＩ）と共に１５分間室温でプレインキュベーションしてからアスコルビン酸を加えた。これは、Ｄ−テトラペプチドをＣｕ（ＩＩ）と結合させ、それによりＲＯＳの発生を阻害させるために行った。表から見受けられ得るように、Ｃｕ（ＩＩ）：Ｄ−テトラペプチドの比が４：１〜４：７の場合、ヒドロキシル・ラジカルの発生はほとんど、または全く阻害されなかった。比が１：２以上の場合は、ヒドロキシル・ラジカルの生成は全体的に阻害された。
【０１３５】
【表２】
2005517636.tif 000003
【実施例８】
【０１３６】
（ＲＯＳの発生の阻害）
テトラペプチドＬ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］ならびに他のペプチドおよび化合物がＲＯＳの生成を阻害する能力を試験した。試験した他のペプチドは、Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ  Ｌ−Ｓｅｒ  Ｌ−Ｇｌｕ  Ｌ−Ｖａｌ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ａｒｇ  Ｌ−Ｐｈｅ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号３］；Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ  Ｌ−Ｓｅｒ  Ｌ−Ｇｌｕ  Ｌ−Ｖａｌ
Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ａｒｇ  Ｌ−Ｐｈｅ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号４］；Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ  Ｌ−Ｓｅｒ  Ｌ−Ｇｌｕ  Ｌ−Ｖａｌ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ａｒｇ  Ｌ−Ｐｈｅ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号５］；およびアセチル化Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ  Ｌ−Ｓｅｒ  Ｌ−Ｇｌｕ  Ｌ−Ｖａｌ  Ｌ−Ａｌａ
Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ａｒｇ  Ｌ−Ｐｈｅ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号６］であった。ペプチドは、アンシンス・サービス（Ａｎｓｙｎｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、キュー・シー・ビー（ＱＣＢ）、ジェノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）およびボウマン・リサーチ（Ｂｏｗｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含めた、ペプチドカスタム合成を提供している１つまたは複数の企業から得た。試験した他の化合物は、ヒスチジン（シグマ・ケミカルズ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））、カタラーゼ（シグマ・ケミカルズ社）、およびスーパーオキシド・ジスムターゼ（シグマ・ケミカルズ社）であった。
【０１３７】
１．ヒドロキシル・ラジカル生成の阻害
ヒドロキシル・ラジカルはおそらく、最も反応性の高い酸素由来の分子種である。ヒドロキシル・フリーラジカルはエネルギー性が非常に高く、短命で、有毒である。
【０１３８】
一部の研究者は、過酸化水素およびスーパーオキシド・ラジカルの毒性は、これらがヒドロキシル・フリーラジカルに変換されることが原因であろうと示唆している。スーパーオキシド・ラジカルは、ハーバー−ワイス反応によって直接ヒドロキシル・ラジカルに変換され得る。あるいは、これが過酸化水素に変換され、ひいてはフェントン反応によってヒドロキシル・ラジカルに変換され得る。どちらの経路でも銅などの遷移金属が必要とされる（アックワースおよびベイリー（Ａｃｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｉｌｅｙ）、Ｔｈｅ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、（イー・エス・エー社（ＥＳＡ，Ｉｎｃ．）、１９９７））。
【０１３９】
銅がアスコルビン酸の存在下でヒドロキシル・ラジカルを生じさせることも知られている。以下の反応スキーム、
アスコルビン酸＋２Ｃｕ２＋→２Ｃｕ＋＋デヒドロアスコルビン酸＋２Ｈ＋（等式１）
Ｃｕ＋＋Ｏ２→Ｏ２・−＋Ｃｕ２＋  （等式２）
Ｃｕ＋＋Ｏ２・−＋２Ｈ＋→Ｃｕ２＋＋Ｈ２Ｏ２  （等式３）
Ｃｕ＋＋Ｈ２Ｏ２→ＯＨ−＋ＯＨ・＋Ｃｕ２＋  （等式４）
が提唱されている（バイアグロウら（Ｂｉａｇｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第２２巻（７）：１１２９〜１１３８ページ、１９９７年。
【０１４０】
上記に列挙した化合物がヒドロキシル・ラジカルの発生を阻害する能力は、ガターリッジおよびウィルキンス（Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第７５９巻：３８〜４１ページ、１９８３年に記載されているように試験した。手短に述べると、Ｃｕ（ＩＩ）およびアスコルビン酸を混合し、ヒドロキシル・ラジカルの発生を引き起こした。次いでデオキシリボースを加えるが、ヒドロキシル・ラジカルが存在する場合はこれがデオキシリボースを攻撃して断片を生じさせた。この断片を低ｐＨで加熱することにより、２−チオバルビツール酸（ＴＢＡ）を加えると５３２ｎｍでの分光光度測定で測定されるピンク色の色素原が得られるマロンア
ルデヒドが生じる。したがって、５３２ｎｍでの吸光度は、デオキシリボースに対する損傷および、従ってヒドロキシル・ラジカル形成の尺度である。
【０１４１】
アッセイを行うために、緩衝液（２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ７．４）中のＣｕＣｌ２と、緩衝液中のいずれか１種の試験化合物または緩衝液のみとを試験管に加えた（ＣｕＣｌ２の最終濃度は１０μＭ）。試験管を室温で１５分間インキュベーションした。その後、緩衝液中の０．５ｍＭのアスコルビン酸および緩衝液中の１．９ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−リボースを各試験管に加え、試験管を３７℃で１時間インキュベーションした。最後に、５０ｍＭのＮａＯＨ中の１％（ｗ／ｖ）ＴＢＡ  １ｍｌおよび１ｍｌの濃酢酸を各試験管に加え、試験管を沸騰水中で１５分間インキュベーションした。試験管を１５分間冷却した後、５３２ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１４２】
このアッセイにおいて、テトラペプチド／銅の比が２：１以上のとき、テトラペプチドＬ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］によりヒドロキシル・ラジカルの形成が完全に阻害されることが判明した。テトラペプチド／銅の比が２：１未満では有効でなかった。
【０１４３】
経時変化の結果を図８Ａに示す。図８Ａに見られるように、銅およびアスコルビン酸（ペプチド非添加）では迅速にＴＢＡ反応性物質を生じ、３０分で最大値に達した。テトラペプチド／銅の比が２：１のときのテトラペプチドは、ＴＢＡ反応性物質の形成を完全に阻止した。興味深いことに、テトラペプチド／銅の比が１：１のときのテトラペプチドは、ＴＢＡ反応性物質の生成を遅延させた。これらのデータは、テトラペプチド／銅の比が１：１のときのテトラペプチドが、テトラペプチドに対する部位特異的なヒドロキシルの攻撃をもたらす銅を結合することによって、ヒドロキシル・ラジカルからのある程度の保護を提供することを示唆している。十分なテトラペプチドがひとたび破壊されると、銅が放出され、これによりデオキシリボースを攻撃するヒドロキシル・ラジカルが生成される。
【０１４４】
テトラペプチド／銅の比が２：１のテトラペプチドをより長い時間インキュベートした場合は、ＴＢＡ反応性物質の形成を阻止する能力がゆっくりと消滅した。図８Ｂ参照。図８Ｂに見られるように、ＴＢＡ反応性物質の生成は、インキュベーションの最初の４時間の間は９５％阻害された。２４時間までに阻害のレベルは５０％まで低下し、４８時間までに阻害のレベルは２０％まで低下した。これらのデータは、テトラペプチドの存在下でも依然としてＴＢＡ反応性物質が生成されていることを示唆している。これらのデータはまた、実験の経時変化の間にテトラペプチドが分解されていることを示唆している。この分解は、銅の放出を伴ってテトラペプチドを攻撃かつ分解するフリーラジカルがテトラペプチド／銅の錯体の近傍で形成することが原因である可能性が高い。ヒドロキシル・ラジカルなどのフリーラジカルは反応性が非常に高いので、最初に接触する電子に富んだ分子を攻撃するが、この場合、その分子はテトラペプチドとなる。
【０１４５】
テトラペプチドによるヒドロキシル・ラジカル形成の阻害に対するｐＨの効果を、テトラペプチド／銅の比を２：１として試験した。この比では、テトラペプチドはｐＨ７．０〜８．５で、ＴＢＡ反応性分子種の形成を＞９５％阻害した。これらは生理的なｐＨレベルであり、虚血時に予想されるｐＨレベルである（虚血性組織内でアシドーシスが起こる）。ｐＨ６．０では、テトラペプチドはＴＢＡ反応性分子種の形成の阻止に有効でなく、これは、ヒスチジンの銅を結合する能力が低下することが原因である可能性がある。ヒスチジンのイミダゾール環上の窒素原子は、ｐＫａ６．０で銅の結合に関与する。したがって、ｐＨ６．０では、ヒスチジンは銅の５０％しか結合することができない。銅の残りの５０％は結合されていないか、または他のアミノ酸によってテトラペプチドに緩く結合しており、したがって、ＴＢＡ反応性分子種の生成に関与することが可能となる。
【０１４６】
ヒスチジンおよび様々な位置にヒスチジンを有するいくつかのペプチドを、そのヒドロキシ・ラジカル生成を阻害する能力について、ペプチド：銅の比を１：１および２：１として試験した。また、Ｎ末端アミノ酸としてアセチル化アスパラギン酸（Ａｃ−Ａｓｐ）を有するペプチドも試験した。結果を表３に示した。表３において阻害（％）とは、緩衝液のみの場合の吸光度で割ることにより緩衝液のみの場合と比較した吸光度の減少率（％）である。
【０１４７】
表３の結果から見受けられ得るように、第２位および第３位にヒスチジンを有するペプチドでは、ペプチド：銅の比２：１で＞９５％の阻害が示されたが、ペプチド：銅の比１：１の同ペプチドは有効でなかった。興味深いことに、ペプチド：銅の比２：１では、第１位にヒスチジンを有するペプチドおよびアセチル化アスパラギン酸をＮ末端アミノ酸として有するペプチドが、ある程度の保護をもたらしたが（それぞれ約４７％および約２８％阻害）、この保護は、これらペプチドのそれぞれ第７位および第９位のヒスチジンに起因しているかもしれない。ヒスチジン単独でヒスチジン：銅の比が２：１の場合、ある程度の保護がもたらされた（約２０％阻害）。
【０１４８】
カタラーゼがヒドロキシル・ラジカル形成を阻止することが示されている。ガターリッジおよびウィルキンス（Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第７５９巻：３８〜４１ページ、１９８３年；ファッチネッティーら（Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、第１８巻（６）：６６７〜６８２ページ、１９９８年；サムニら（Ｓａｍｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１３７巻：１１９〜１２４ページ、１９８３年。したがって、カタラーゼ（０〜８０ｎＭ）を本アッセイで試験し、これがピンク色の色素原の形成を阻止することが判明した（データ示さず）。この発見は、本アッセイで過酸化水素が形成されることを示唆している。というのも、カタラーゼは過酸化水素を水へと分解し、このことは上記の等式３および４と一致しているからである。カタラーゼはまた、Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］のテトラペプチドがテトラペプチド／銅の比１：１で存在する場合に、ピンク色の色素原の形成も阻止する（データ示さず）。上に示すように、この比では銅は依然として酸化還元反応に関与してヒドロキシル・ラジカルを生じる。これらの実験は、過酸化水素がヒドロキシル・ラジカルの形成における重要な前駆物質であることを示している。
【０１４９】
【表３】
2005517636.tif 000004
【０１５０】
Ｂ．スーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）活性のアッセイ
スーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）という酵素は、体内におけるスーパーオキシドから過酸化水素への分解（等式３に類似）を司っている天然に存在する酵素である。その後、過酸化水素はカタラーゼによって解毒され得る。
【０１５１】
前のセクションで記載したアッセイにおいてＳＯＤ活性をアッセイしたところ、同活性は見出されなかった（データ示さず）。ＳＯＤは事実スーパーオキシド・ラジカルを過酸化水素へと変換するのであるから、この結果は予想通りである。その後、過酸化水素は還元された銅によってヒドロキシル・ラジカルに変換され得る。
【０１５２】
銅錯体がＳＯＤ活性を有するという報告が文献にある。アタールら（Ａｔｈａｒ  ｅｔ
ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．、第３９巻（４）：８１３〜８２１ページ、１９９６年；チウフィーら（Ｃｉｕｆｆｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌ  Ｒｅｓ．、第３８巻（４）：２７９〜２８７ページ、１９９８年；ポグニら（Ｐｏｇｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｉｎｏｒｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７３巻：１５７〜１６５ページ、１９９９年；ウィリンガムおよびソレンソン（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｓｏｒｅｎｓｏｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第１５０巻（１）：２５２〜２５８ページ、１９８８年；コンスタンチノヴァら（Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｓ．、１２〜１３：２１５〜２２０ページ、１９９１年；ゴールドスタインら（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１１２巻：６４８９〜６４９２ページ、１９９０年。ＳＯＤ自体がその活性部位に銅を有するので、この結果は予想通りである。
【０１５３】
テトラペプチドＬ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］の銅錯体のＳＯＤ活性をアッセイした。ボーシャンプおよびフリドビッチ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ  ａｎｄ  Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第４４巻：２７６〜２８７ページ、１９７１年のキサンチン・オキシダーゼ・アッセイを使用してスーパーオキシド・ラジカルを生成させた。キサンチン・オキシダーゼはキサンチンを尿酸に変換し、その際、酸素が電子受容体として働く。これにより、スーパーオキシド・ラジカルの生成が引き起こされる。スーパーオキシド・ラジカルは、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（ＮＢＴ）を還元することが可能である。還元されたＮＢＴは５６０ｎｍのλｍａｘ（最大吸収波長）を有する。銅がキサンチン・オキシダーゼ活性を阻害することが知られているので（コンスタンチノヴァら（Ｋｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｓ．、１２〜１３：２１５〜２２０ページ、１９９１年）、銅を含むすべての実験に、周知の銅キレート剤であるエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）も含めた。ＥＤＴＡ−銅の錯体についてＳＯＤ活性を試験し、ＳＯＤ活性を全く有さないことが示された（データ示さず）。
【０１５４】
ＳＯＤ活性についてのアッセイを行うために、０．１ｍＭのキサンチン（シグマ・ケミカルズ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））、２５μＭのＮＢＴ（シグマ・ケミカルズ社）、５０ｍＭの炭酸ナトリウム、および１．２μＭのＥＤＴＡ（シグマ・ケミカルズ社）をキュベット中で混合した（すべて最終濃度を示し、最終ｐＨは１０．２である）。反応は、様々な量のテトラペプチド−銅の錯体（テトラペプチド／銅の比は１：１および２：１）および２０ｎＭのキサンチン・オキシダーゼ（シグマ・ケミカルズ社）を加えることによって開始させた。テトラペプチド−銅の錯体は、テトラペプチドと銅（ＣｕＣｌ２として）とを混合し、キュベットに加える直前に該混合物を室温で１５分間インキュベーションすることによって調製した。試料を時間０および６０秒間毎に５分間、５６０ｎｍで読み取った。
【０１５５】
１：１の比のテトラペプチドと銅との錯体は、ＮＢＴ還元の阻害から証明されるように、ＳＯＤ活性を有することが示された（図９参照）。しかし、本アッセイにおけるＩＣ５０値（５０％阻害する量）に基づくと、この錯体はＳＯＤ自体と比較して約５００倍有効性が低かった。２：１の比のテトラペプチドと銅との錯体は、ＳＯＤ活性を全く有さないことが示された（データ示さず）。
【０１５６】
１：１のテトラペプチド−銅の錯体がキサンチン・オキシダーゼ活性を妨害しなかったことを確認するために、尿酸の生成を２９５ｎｍで測定した。アタールら（Ａｔｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．、第３９巻（４）：８１３〜８２１ページ、１９９６年；チウフィーら（Ｃｉｕｆｆｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ．、第３８巻（４）：２７９〜２８７ページ、１９９８年。このアッセイはＳＯＤアッセイに類似しているが、ただしＮＢＴは存在しない。代わりに、尿酸を２９５ｎｍで６０秒間毎に５分間アッセイする。１：１のテトラペプチド−銅の錯体は
、６００ｎＭの濃度で尿酸の生成を１１％しか阻害しないことが判明した（データ示さず）。したがって、１：１のテトラペプチド−銅の錯体は真のＳＯＤ活性を有する。この錯体によってスーパーオキシドは過酸化水素へと変換されるので、このことは、該錯体がヒドロキシル・ラジカルの生成を阻止するのに有効でない理由を説明する手助けになるかもしれない。
【０１５７】
１：１または２：１のテトラペプチド−銅の錯体を含む溶液中でスーパーオキシド・ラジカルの生成を測定した。このアッセイでは、ＴＢＡアッセイおよびキサンチン・オキシダーゼ・アッセイの技法を組み合わせた。スーパーオキシド・ラジカルによるＮＢＴの還元を定量するために、ＮＢＴをすべての試験管に加えた。試料にはアスコルビン酸および銅も含め、３７℃でインキュベーションした。５、１５、３０および６０分で試料をインキュベータから取り出し、５６０ｎｍで読み取った。結果を図１０に示す。２：１のテトラペプチド−銅の錯体を含む試料では、ＮＢＴの還元が経時的に増加し、３０分で最大に達した。１：１のテトラペプチド−銅の錯体を含む試料でもＮＢＴの還元が経時的に増加し、６０分で低い最大値に達した。これらのデータは、２：１のテトラペプチド−銅の錯体を含む試料ではスーパーオキシドが蓄積するのに対し、１：１のテトラペプチド−銅の錯体はスーパーオキシド・ジスムターゼを模倣することを示唆している。
【０１５８】
ヒドロキシル・ラジカル生成において起こる可能性の高い一連の現象は以下の
Ｏ→Ｏ２・−→Ｈ２Ｏ２→ＯＨ・  （等式５）
である。１：１のテトラペプチド−銅の錯体がスーパーオキシド・ラジカル（Ｏ２・−）を過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）へと変換し得ることは既に示されている。これは、同錯体のＳＯＤ活性である。テトラペプチドの分子２つが銅の６つの配位結合を埋めるので、２：１のテトラペプチド−銅の錯体はこの変換を促進し得ない。これは、還元された銅と反応してフェントン反応によってヒドロキシル・ラジカルを生じ得る過酸化水素の形成を阻害することで、２：１のテトラペプチド−銅の錯体が何故これほど有効であるかを説明するものである。１：１のテトラペプチド−銅の錯体も、スーパーオキシド・ラジカルを排除することによって価値ある役割を果たす。該錯体は過酸化水素を生成させるとはいえ、ヒトの身体のほとんどの区画は、過酸化水素を排除し得る酵素カタラーゼを十分な量有している。しかし、脳内では、カタラーゼ活性が最も低いと報告されている。ハリウェルら（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１８６巻：１〜８５ページ、１９９０年。したがって、虚血に付随して起こるアシドーシスによって銅が放出されるので、虚血の間中、脳は特に脆弱な器官である。
【０１５９】
Ｃ．ＤＮＡの保護
アサウミら（Ａｓａｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．、第３９巻（１）：７７〜８６ページ、１９９６年の方法に従って、ＤＮＡ鎖の切断（ｂｒｅａｋ）を測定した。手短に述べると、１７μｇ／ｍｌのプラスミドｐＢＲ３２２  ＤＮＡを、室温で１５分間、５０μＭのＣｕＣｌ２および０〜２００μＭの濃度のテトラペプチドと共にプレインキュベーションした。その後、２．５ｍＭのアスコルビン酸を各反応物に加え、混合物を３７℃で１時間インキュベーションした。混合物の総体積は１６μＬとした。次に、０．２５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノール・ブルー、０．２５％（ｗ／ｖ）のキシレンシアノールＦＦ、および４０％（ｗ／ｖ）のショ糖を水に溶解したローディング緩衝液３μＬを加えた。０．８％のアガロースゲルを用いて９０分間、７０ボルトで電気泳動することによって、試料を分離した。２μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む１×ＴＢＥ（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ緩衝液）で３０分間ゲルを染色した。その後、ゲルを写真撮影する前にゲルを１×ＴＢＥで５分間脱染した。
【０１６０】
結果は、テトラペプチドがＤＮＡ鎖の切断の形成を阻止するのに非常に有効であることを示した。図１１参照。最適の保護テトラペプチド：銅の比は２：１以上であった。とい
うのも、これらの比では超らせん環状ＤＮＡが依然としてゲル上に見えたからである。１：１以下のテトラペプチド：銅の比では、ニックの入った環状ＤＮＡ、直鎖状のＤＮＡ、およびさらに破損したＤＮＡ（スメア）が見えた。
【実施例９】
【０１６１】
（ＲＯＳによってＤＮＡに与えられる損傷の低減）
ＲＯＳは、鎖の切断、塩基の改変、点変異、メチル化パターンの変更、およびＤＮＡ−タンパク質の架橋結合を引き起こすことによってＤＮＡに損傷を与える（マーネット（Ｍａｒｎｅｔｔ）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻：３６１〜３７０ページ、２０００年；セルダら（Ｃｅｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．、第３８６巻：１４１〜１５２ページ、１９９７年）。還元剤の存在下において、銅、鉄、および他の遷移金属は、ハーバー−ワイス反応およびフェントン反応のいずれをも介して、スーパーオキシド（Ｏ２・）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）およびヒドロキシル・ラジカル（ＯＨ・）などのＲＯＳの生成を触媒する（ストーウェら（Ｓｔｏｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第３巻：９７〜１０５ページ、１９８７年）。ＯＨ・は、最も反応性が高く最も障害を与えるＲＯＳであるとみなされており、上記のＤＮＡ傷害のすべてを引き起こすことが可能である（マーネット（Ｍａｒｎｅｔｔ）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻：３６１〜３７０ページ、２０００年）。以前の調査により、ＯＨ・が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける部位特異的な銅イオン反応ならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおける過剰な銅への曝露の際に、１本鎖および２本鎖ＤＮＡの切断を誘発させたことが報告されている（チウら（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；第３４巻：２６５３〜２６６１ページ、１９９５年；キムら（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．、第３３巻：８１〜８９ページ、２０００年；ハヤシら（Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、第２７６巻：１７４〜１７８ページ、ｄｏｉ：１０．１００６／ｂｂｒｃ．２０００．３４５４、２０００年）。
【０１６２】
ヘキサヌクレオチドＴＴＡＧＧＧの反復であるテロメアがＤＮＡの末端に存在して、分解、染色体再編成に対する「保護キャップ」を形成し、遺伝情報を損失しないＤＮＡ複製を可能にする（レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻：４７７〜４８４ページ、２０００年）。細胞の加齢または老化の古典的な理論は、テロメア末端の複製問題に関与している（オロフニコフ（Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ）、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．、第４１巻：１８１〜１９０ページ、１９７３年）。ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの複製中にラギング鎖の終末末端を複製することができないので、３０〜５００塩基対の損失が生じる（ハーレーら（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３４５巻：４５８〜４６０ページ、１９９０年；フォン・ズグリニッキら（ｖｏｎ  Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、第２２０巻：１８６〜１９３ページ、ｄｏｉ：１０．１００６／ｅｘｃｒ．１９９５．１３０５、１９９５年）。体細胞はこれらの失われたテロメア反復を取り替えることができないので、細胞が生きて複製する間に漸進的なテロメアの短縮がもたらされる。テロメアの長さが臨界の閾値に達すると、老化が現れる（レッデル（Ｒｅｄｄｅｌ）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻：４７７〜４８４ページ、２０００年）。酸化的ストレスに曝されたヒト線維芽細胞における早期老化が立証されている（チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻：４１３０〜４１３４ページ、１９９４年）。高い酸化的ストレス条件下において線維芽細胞群を数回倍化した後に該細胞のテロメア長を観察することにより、通常の条件下における老化に類似したテロメア長の短縮が明らかとなる（フォン・ズグリニッキら（ｖｏｎ  Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、第２２０巻：１８６〜１９３ページ、ｄｏｉ：１０．１００６／ｅｘｃｒ．１９９５．１３０５、１９９５年）。これらのデータは、ＲＯＳに誘発されたテロメア配列内のＤＮＡ損傷が、テロメアの短縮において重要な役割を果た
すかもしれないことを示唆している。
【０１６３】
本研究では、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］が、アスコルビン酸とカップリングした銅により誘発されるＲＯＳ損傷からＤＮＡおよびテロメアを保護する能力を調査した。
【０１６４】
Ａ．材料および方法
試薬：  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓの合成Ｄ−類似体（Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ）は、ボウマン・リサーチ社（Ｂｏｗｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄ．）［英国ウェールズ、ニューポート（Ｎｅｗｐｏｒｔ）所在］から入手した。Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧテロメア長アッセイ（Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ａｓｓａｙ）およびＸ線フィルムは、ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）［ドイツ連邦共和国マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）所在］から購入した。ＤＮｅａｓｙ（登録商標）ゲノム単離キットは、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）［米国カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）所在］から購入した。Ｈｙｂｏｎｄ（登録商標）−Ｎ＋ナイロン膜は、アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）［米国ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）所在］に注文した。他の化学薬品はすべて、シグマ（Ｓｉｇｍａ）［米国モンタナ州セント・ルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］から得た。
【０１６５】
ＤＮＡの処理：  修正したアサウミの方法を使用して、ＤＮＡ鎖の切断を測定した（アサウミら（Ａｓａｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．、第３９巻：７７〜８６ページ、１９９６年）。バーキットリンパ腫由来の細胞系であるＲａｊｉ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）［米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在］より入手、登録番号ＣＣＬ−８６）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中、１０％のＣＯ２および３７℃で増殖させた。ＤＮｅａｓｙ（登録商標）スピン・カラム（キアゲン）を使用して、製造者のプロトコルに従ってゲノムＤＮＡを単離した。その後、１反応あたり１μｇのゲノムＤＮＡを、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中で、ＣｕＣｌ２、アスコルビン酸、および／またはテトラペプチドと共にインキュベートした。最終濃度は、ＣｕＣｌ２＝１０μＭ、２５μＭ、および５０μＭ；アスコルビン酸＝２５μＭ、５０μＭ、および１００μＭ；Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ＝５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭであった。０．２ｍｌのＰＣＲチューブ中の反応全体積２０μｌを、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、すぐに５μｌのローディング色素［０．２５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノール・ブルーおよび４０％（ｗ／ｖ）のショ糖］を加え、０．５％のトリス酢酸ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）アガロースゲルに載せることによって、鎖の切断を可視化した。その後、７０Ｖで９０分間ゲルを流し、２μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを３０分間使用して染色した。写真撮影の前に、ゲルをＴＡＥで１０分間洗浄した。
【０１６６】
細胞の処理：  Ｒａｊｉ細胞をＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸緩衝生理食塩水；１３８ｍＭのＮａＣｌ；２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。その後、１．５×１０６個の細胞を、ＣｕＣｌ２、アスコルビン酸、および／またはＤ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓを含む５ｍｌのＰＢＳ中に入れた。最終濃度は、ＣｕＣｌ２＝１０μＭ、２５μＭ、および５０μＭ；アスコルビン酸＝１００μＭ、２５０μＭ、および５００μＭ；Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ＝５０μＭ、１００μＭ、および２００μＭであった。その後、細胞を３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）カラムを使用してゲノムＤＮＡを単離した。０．５％のＴＡＥアガロー
スゲル電気泳動によってＤＮＡの損傷を可視化した。
【０１６７】
テロメア長アッセイ：  テロメアの損傷を調査するために、Ｔｅｌｏ  ＴＡＧＧテロメア長アッセイ（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））を製造者の推奨に従って、すなわち１反応あたり１μｇのゲノムＤＮＡをＨｉｎｆ  ＩおよびＲＳＡ  Ｉで消化して使用した。その後、試料を０．８％のＴＡＥアガロースゲルで、７０Ｖで２時間泳動した。サザン・ブロットを行い、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識したテロメア特異的オリゴヌクレオチドを用いて探査した。細胞処理試料では、ゲノムＤＮＡを上述のように使用した。ＤＮＡ処理試料では、上記のように反応を準備し、ＰＢＳで２００μｌにし、制限消化の前にＤＮｅａｓｙ（登録商標）カラムを用いて単離した。
【０１６８】
Ｂ．結果および考察
クロマチンの重要な部分である銅イオン（ダイクウェルら（Ｄｉｊｋｗｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．、第８４巻：５３〜６７ページ、１９８６年）は、ＤＮＡ中に存在し（ワッカーら（Ｗａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２３４巻：３２５７〜３２６２ページ、１９５９年）、酸化的ＤＮＡ損傷に関与する可能性がある（チウら（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３４巻：２６５３〜２６６１ページ、１９９５年；ハヤシら（Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、第２７６巻：１７４〜１７８ページ、ｄｏｉ：１０．１００６／ｂｂｒｃ．２０００．３４５４、２０００年；カガワら（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６６巻：２０１７５〜２０１８４ページ、１９９１年）。アスコルビン酸または他の還元剤の存在下では、銅は、以下の反応：
１）２Ｃｕ２２＋＋アスコルビン酸→２Ｃｕ＋＋デヒドロアスコルビン酸＋２Ｈ＋
２）Ｃｕ＋＋Ｏ２→Ｏ２・−＋Ｃｕ２＋
３）Ｃｕ＋＋Ｏ２・−＋２Ｈ＋→Ｃｕ２＋＋Ｈ２Ｏ２
４）Ｃｕ＋＋Ｈ２Ｏ２→ＯＨ−＋ＯＨ・＋Ｃｕ２＋
を触媒することによってＲＯＳの生成をもたらし得る（バイアグロウら（Ｂｉａｇｌｏｗ
ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第２２巻：１１２９〜１１３８ページ、１９９７年）。生理的には鉄がより高い濃度で見つかっているが、銅およびＨ２Ｏ２による酸化は鉄に比べて５０倍速い（ストーウェら（Ｓｔｏｅｗｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第３巻：９７〜１０５ページ、１９８７年；ハリウェル（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、第５９巻：１６０９〜１６２３ページ、１９９２年）。糖リン酸主鎖の陰性電荷により、陽イオンはＤＮＡに緩く結合し得る。塩基対内における銅イオンの部位特異的結合は、ＤＮＡの生合成の調節に重要であるかもしれない（ミンチェンコヴァら（Ｍｉｎｃｈｅｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、第５巻：６１５〜６２５ページ、１９６７年）。鉄に触媒される反応とは異なり、ＯＨ・捕捉剤は銅に媒介される酸化的損傷を阻止せず、このことは酸化的ＤＮＡ損傷が銅イオンの近傍で起こることを示唆している（オイカワら（Ｏｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１３９９巻：１９〜３０ページ、１９９８年）。ＯＨ・の反応性は非常に高いので、おそらくＯＨ・の相互作用がＯＨ・の生成部位またはその近くでのみ起こるのであろう（マーネット（Ｍａｒｎｅｔｔ）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻、３６１〜３７０ページ、２０００年）。オイカワら（Ｏｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）（オイカワら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、第１３９９巻：１９〜３０ページ、１９９８年）は、以下の銅に媒介されるＲＯＳ反応：
Ｃｕ＋＋Ｈ２Ｏ２→Ｃｕ＋ＯＯＨ＋Ｈ＋
も起こり、その結果生じるＤＮＡ−銅−過酸化物の錯体がＯＨ・よりもさらにＤＮＡに損傷を与えることを示している。
【０１６９】
予想通り、上述の実験の結果から、銅およびアスコルビン酸は単独では鎖の切断を引き起こすことが不可能であることが示された。ＣｕＣｌ２とアスコルビン酸を組み合わせた場合は、２本鎖の切断の結果である、低分子量ＤＮＡ断片の用量依存的な蓄積が見られた。これらの２本鎖の切断は、Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓによって用量依存的な様式で軽減された（図１３）。１：１（５０μＭの銅に対して５０μＭのＤ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ）および１：２のモル比では、ある程度の鎖の切断が見られた。比を１：４まで上げると、鎖の切断は全く検出されなかった。銅およびアスコルビン酸で処理したＲａｊｉ細胞でも同様の結果が観察された（図１４）。より低い１：２（銅対Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ）の比で、細胞試料中におけるＤＮＡの完全な保護がもたらされた。ＤＮＡ試料では、銅獲得のためＤＮＡと競合することや近傍のＯＨ・による攻撃が原因で、より高いＤ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓレベルが必要であろうと予想するのが妥当である。Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓの増加の必要が余儀なくされるこれらの試料においては、ＤＮＡと銅との分離が重要である。細胞試料では、損傷はＨ２Ｏ２に起因するであろう。Ｈ２Ｏ２は自由に拡散可能であり、核まで貫通可能であり、線維芽細胞中でＤＮＡに損傷を与えることが示されている（チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ
ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９１巻：４１３０〜４１３４ページ、１９９４年；フォン・ズグリニッキら（ｖｏｎ  Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第２８巻：６４〜７４ページ、２０００年）。細胞中にＨ２Ｏ２が入ることにより、ＤＮＡ過酸化物と天然金属との錯体の形成、または封鎖された貯蔵金属の放出のいずれかがもたらされる可能性があり、貯蔵金属の放出が内在性還元剤（還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、還元ニコチンアミド・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、およびアスコルビン酸）と組み合わさるとＯＨ・の生成が駆動されるであろう。Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓの保護機構の１つの可能性は、銅イオンのキレート化であり、このキレート化によりＯＨ・およびＨ２Ｏ２の生成が阻止されるのであろう。別の保護様式はＤ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ−過酸化銅の錯体の形成であり、この錯体がＤＮＡの代わりにＯＨ・の損傷を吸収し、過酸化物を「掃除」し、かつおそらく細胞試料中ではＨ２Ｏ２を細胞外に維持するのであろう。
【０１７０】
以前の報告により、酸化的ＤＮＡ損傷は、テロメアを含めたＧ−Ｃに富んだ領域を対象としているかもしれないことが示唆されている。ロドリゲスら（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，ｅｔ  ａｌ．）は、銅誘発性のＲＯＳ損傷は主にＤＮＡのグアニンを標的とすると報告している（ロドリゲスら（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５７巻：２３９４〜２４０３ページ、１９９７年）。Ｃｕ（ＩＩ）のＧ−Ｃ対への強力かつ優先的な結合は、グアニン塩基のＮ−７およびＯ−６ならびにシトシン塩基のＮ−３について報告されている（カガワら（Ｋａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６６巻：２０１７５〜２０１８４ページ、１９９１年）。これらの位置で形成されたＤＮＡ過酸化物の錯体は、ＯＨ・攻撃を隣接塩基へ向けると考えられている（オイカワら（Ｏｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、第１３９９巻：１９〜３０ページ、１９９８年）。さらに、テロメアＤＮＡ中のＧＧＧは、銅に媒介されるＲＯＳ損傷に感受性があることが示されている（オイカワら（Ｏｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、第４５３巻：３６５〜３６８ページ、１９９９年）。
【０１７１】
本研究におけるゲノムＤＮＡ試料中のテロメアの調査により、酸化的ストレスに応答した２本鎖の切断が示された。サザン・ブロットによって調査したＤＮＡ試料により、ひどく消耗され短くなったテロメア配列が示された（図１５）。細胞を処理した場合には、使用した最も高い銅およびアスコルビン酸のレベルでも配列がある程度保存されたテロメア損傷が示されたが（図１６）、このことは、ＤＮＡが核内で守られ、ＲＯＳの生成が細胞外で行われることに起因しているかもしれない。Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓは、これらの試料中でテロメアを銅に媒介される損傷から保護した。
【０１７２】
実験で検出された２本鎖の切断に加えて、他のＤＮＡ傷害がＲＯＳの疾病プロセスに関与しているかもしれない。リン酸主鎖に緩く結合している、銅を含めた一部の陽イオンは、鎖の切断に関わっており、一方で、ヘリックス中に配位している陽イオンは塩基の変化を引き起こす（マーネット（Ｍａｒｎｅｔｔ）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻：３６１〜３７０ページ、２０００年；ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５７巻：２３９４〜２４０３ページ、１９９７年）。銅の増加および酸化的ストレスという事象により、ＤＮＡの損傷がＧ−Ｃに富んだ領域に向けられるかもしれない。テロメアに加えて、Ｇ−Ｃに富んだ領域は多くの遺伝子の５’末端に存在しており（バード（Ｂｉｒｄ）、Ｎａｔｕｒｅ、第３２１巻：２０９〜２１３ページ、１９８６年）、遺伝子調節に関与する酸化的損傷の部位を暗示している。８−オキソ−デオキシグアノシン（８−ｏｘｏ−ｄＧ）は、変異発癌遺伝子で広く見られるＧ→Ｔの点変異をもたらし得る、ＲＯＳによって生成される一般的なＤＮＡ付加体である（マーネット（Ｍａｒｎｅｔｔ）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻：３６１〜３７０ページ、２０００年）。心筋虚血の際のアシドーシスまたはセルロプラスミンの変化などの状態が遊離銅を移動させて、組織およびＤＮＡの局所的で酸化的な損傷を起動させることが示されている（キムら（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．、第３３巻：８１〜８９ページ、２０００年；シェビオンら（Ｃｈｅｖｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻：１１０２〜１１０６ページ、１９９３年）。８−ｏｘｏ−ｄＧのレベルは、虚血性のラットの心臓のＤＮＡでは対照と比べて３〜４倍高いと報告されている（ユーら（Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．、第３２巻：１０５３〜１０５９ページ、ｄｏｉ：１０．１００６／ｊｍｃｃ．２０００．１１４２、２０００年）。さらに、慢性炎症は局所的な酸化的損傷の領域を生じ得る。マクロファージや好中球などの炎症性細胞はＲＯＳを放出するが、このＲＯＳは近隣細胞のＤＮＡに損傷を与えることが示されている（シャクターら（Ｓｈａｃｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第９巻：２２９７〜２３０４ページ、１９８８年）。活性白血球から放出される一酸化窒素およびスーパーオキシドは過酸化亜硝酸の生成をもたらし得るが、この過酸化亜硝酸は未改変の塩基よりも８−ｏｘｏ−ｄＧとの反応性が高く、損傷を悪化させる可能性がある（マーネット（Ｍａｒｎｅｔｔ）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２１巻：３６１〜３７０ページ、２０００年）。
【０１７３】
Ｃ．要約
ＤＮＡおよびテロメア配列のいずれも、銅に媒介されるＲＯＳ損傷、特にヒドロキシル・ラジカルに起因する損傷を受けやすい。本研究では、ＲＯＳ誘発性のＤＮＡ２本鎖の切断およびテロメアの短縮が、銅およびアスコルビン酸への曝露によって生じた。ヒト・アルブミンのＮ末端の銅をキレートするテトラペプチドのＤ類似体であるＤ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓが、用量依存的な様式でＤＮＡ鎖の切断を軽減させた。該Ｄ−テトラペプチドは、４：１（ペプチド：Ｃｕ）の比では単離ＤＮＡの完全な保護をもたらし、２：１（ペプチド：Ｃｕ）の比では、銅／アスコルビン酸に曝されたＲａｊｉバーキット細胞のＤＮＡを完全に保護した。銅／アスコルビン酸で処理したＤＮＡのサザン・ブロットでは、テロメア配列がある程度保存された、テロメアの激しい消耗および短縮が示された。Ｄ−テトラペプチドは、２：１（ペプチド：Ｃｕ）の比で完全なテロメア長の保護をもたらした。ＲＯＳのＤＮＡ損傷の正確な機構はまだ完全に解明されていないが、Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓは、ゲノムＤＮＡおよびテロメア配列のどちらについても、ＲＯＳによる銅誘発性のＤＮＡ２本鎖の切断を阻害した。
【実施例１０】
【０１７４】
（ＩＬ−８の放出の阻害）
インターロイキン８（ＩＬ−８）は炎症誘発性のサイトカインであり、好中球の強力な
化学誘引物質かつ活性化物質である。ＩＬ−８はまた、Ｔリンパ球および好酸球の化学誘引物質および活性化物質であるとも報告されている。ＩＬ−８は、免疫細胞（リンパ球、好中球、単球およびマクロファージを含む）、線維芽細胞および上皮細胞によって産生される。報告により、ＩＬ−８が、呼吸性ウイルス感染症、喘息、気管支炎、肺気腫、嚢胞性繊維症、急性呼吸窮迫症候群、敗血症、多臓器不全症候群、および他の炎症性疾患の病因に重要な役割を果たしていることが示されている。
【０１７５】
銅およびアスコルビン酸に曝露（ＲＯＳを生成するため‐実施例７、８および９参照）したジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）［米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在］）によって放出されたＩＬ−８を調査した。これを行うために、１×１０６個のジャーカット細胞を３７℃、５％のＣＯ２で、インスリン・トランスフェリン亜セレン酸溶液（ＩＴＳＳ；シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含む０．５ｍｌのＩＭＤＭ培地（ＡＴＣＣ）（血清含まず）中で、以下の添加剤と共に２４時間インキュベートした。
【０１７６】
実験１：
ａ．なし（対照）；
ｂ．Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］（「ＤＡＨＫ」）−２００μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｃ．ＣｕＣｌ２−１０μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｄ．ＣｕＣｌ２−２５μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｅ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｆ．ＣｕＣｌ２−１００μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｇ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびＤＡＨＫ−５０μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｈ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびＤＡＨＫ−１００μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；ならびに
ｉ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびＤＡＨＫ−２００μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ。
【０１７７】
実験２：
ａ．なし（対照）；
ｂ．ＣｕＣｌ２−１００μＭ；
ｃ．ＤＡＨＫ−２００μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｄ．ＣｕＣｌ２−２５μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｅ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｆ．ＣｕＣｌ２−１００μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｇ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびＤＡＨＫ−５０μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；
ｈ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびＤＡＨＫ−１００μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ；ならびに
ｉ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびＤＡＨＫ−２００μＭおよびアスコルビン酸−５００μＭ。
【０１７８】
実験３：
ａ．なし（対照）；
ｂ．ＣｕＣｌ２−１００μＭ；
ｃ．ＤＡＨＫ−４００μＭおよびアスコルビン酸−２５０μＭ；
ｄ．ＣｕＣｌ２−２５μＭおよびアスコルビン酸−２５０μＭ；
ｅ．ＣｕＣｌ２−５０μＭおよびアスコルビン酸−２５０μＭ；
ｆ．ＣｕＣｌ２−１００μＭおよびアスコルビン酸−２５０μＭ；
ｈ．ＣｕＣｌ２−１００μＭおよびＤＡＨＫ−２００μＭおよびアスコルビン酸−２５０μＭ；ならびに
ｉ．ＣｕＣｌ２−１００μＭおよびＤＡＨＫ−４００μＭおよびアスコルビン酸−２５０μＭ。
【０１７９】
２４時間のインキュベーションの後、上清を採取し、各上清中のＩＬ−８の濃度を、ヒトＩＬ−８用に適合したペア抗体（エンドゲン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）［米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）所在］）を用いたＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡは、エンドゲン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）［米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）所在］のＥＬＩＳＡキットを使用して、次の例外：（１）抗体を１μｇ／ｍｌでコーティング（２）検出抗体３０ｎｇ／ｍｌ；ストレプトアビジンＨＰＲは１：３２，０００に希釈：以外は製造者の指示に従って行った。
【０１８０】
結果を図１７Ａ（実験１）、図１７Ｂ（実験２）、および図１７Ｃ（実験３）に示す。銅およびアスコルビン酸が、用量依存的な様式で細胞からのＩＬ−８の放出を引き起こしたことが見受けられ得る。また、ＤＡＨＫがＩＬ−８の放出を阻害し、最も良好な結果が８：１のＤＡＨＫ：Ｃｕ比で得られたことも見受けられ得る。
【実施例１１】
【０１８１】
（ＣｏＡの酸化の阻害）
補酵素Ａ（ＣｏＡ）は、体内におけるアセチル化反応に必須であり、その結果、炭水化物および脂肪酸の代謝において重大な役割を果たしている。ＣｏＡは、アセチル化反応に関与し得ないジスルフィドへと酸化され得る。その結果、代謝およびエネルギーの利用が阻害される。
【０１８２】
本実施例では、Ｃｕ（ＩＩ）がＣｏＡを酸化可能かどうか、また、もし酸化可能な場合は、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］（ボウマン・リサーチ社（Ｂｏｗｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．）［英国所在］）がＣｕ（ＩＩ）による酸化からＣｏＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を保護可能かどうか調査した。実験条件および結果を以下の表４に示した。すべての成分を同時に加え、１５分間のインキュベーションの後、４１２ｎｍでの吸光度（Ａ４１２）を測定した。ＤＴＮＢを使用して遊離チオール基を測定した。ＤＴＮＢとは、ジチオニトロ安息香酸（シグマ（Ｓｉｇｍａ））である。
【０１８３】
表４から見受けられ得るように、Ｃｕ（ＩＩ）はＣｏＡを酸化した。また、１：１のテトラペプチド：Ｃｕ（ＩＩ）の比のテトラペプチドはある程度のＣｏＡの保護を提供し、２：１のテトラペプチド：Ｃｕ（ＩＩ）の比のテトラペプチドは１００％の保護を提供したことも見受けられ得る。
【０１８４】
【表４】
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【実施例１２】
【０１８５】
（ｄ−ＤＡＨＫによるＩＬ−８の分泌の阻害）
全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）は、重篤な外傷、敗血症、または大きな手術の後に起こる可能性があり、多くの場合、手術の集中治療室における最も多い死因である多臓器不全症に進行する。血管の内側を覆っている血管内皮細胞は、多臓器不全症および重篤な外傷後の死亡のリスク増加に関連している強力な炎症誘発性のサイトカインであるインターロイキン−８（ＩＬ−８）を過剰量分泌することによって、初期のＳＩＲＳに不利に寄与することが示されている。ミクギルら（ＭｃＧｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｓｕｒｇ、第２２巻、１７１ページ、１９９８年；パトリックら（Ｐａｔｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、第１７２巻、４２５ページ、１９９６年。興味深いことに、内在性の銅は、虚血再灌流後の傷害において中心的な役割を果たすと報告されており（パウエルら（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第２７７巻（３Ｐｔ２）、Ｈ９５６、１９９９年）、虚血再灌流後の傷害は、高レベルのＩＬ−８および内皮機能不全にも関連している。しかし、ヒト内皮細胞からのＩＬ−８分泌を活性化させる銅の役割はこれまでに同定されておらず、ＳＩＲＳおよび多臓器不全症の病因において重要であるかもしれない。
【０１８６】
この実施例は、内皮細胞が、生理学的に適切な濃度の銅に曝された後に、著しく高いレ
ベルのＩＬ−８を分泌することを示すデータを初めて提示する。さらに、高い親和性でＣｕ（ＩＩ）を結合するペプチドを加えることにより、内皮細胞からの銅誘発性のＩＬ−８分泌が有意に阻害される。
【０１８７】
銅は、恒常性維持の状態および正常なｐＨにおいて、セルロプラスミンおよびアルブミンなどの血漿タンパク質によって綿密に調節されている必須のヒト微量元素である。大きな外傷または敗血症により、組織が必要とする酸素の増大、酸素抽出の障害、血流の不均等分布、およびエネルギー貯蔵の減少が原因でｐＨが低下し、微小血管および組織のアシドーシスが生じ得る。ミゾックら（Ｍｉｚｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ
Ｍｅｄ．、第２０巻、８０ページ、１９９２年。その後、酸性の環境によりＣｕ（ＩＩ）イオンが担体タンパク質から放出可能となり（ラムら（Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３３８、１２２、１９９４年）、酸化的ストレス、活性化プロテインＣの不活性化、内皮の一酸化窒素合成酵素の阻害など様々な生化学的経路に自由に関与できるようになる。バール−オアら（Ｂａｒ−Ｏｒ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２９０巻、１３８８ページ、２００２年；ビアンチニら（Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７４巻、２０２６５ページ、１９９９年。
【０１８８】
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（５．０×１０４個の細胞）を、無血清でアスコルビン酸を含まずＩＴＳを添加した内皮細胞基本培地２（ＥＧＭ２）の培地（バイオウィッタカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ））中で、（ｉ）銅、（ｉｉ）ヒト・アルブミンのＮ末端の高親和性Ｃｕ（ＩＩ）結合部位のテトラペプチド類似体（Ｄ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓすなわちｄ−ＤＡＨＫ）、または（ｉｉｉ）これらの両方と共にインキュベートした（ｎ＝３、２連）。ＩＬ−８は、ＥＬＩＳＡによって測定した（実施例１０参照）。２５μＭのＣｕＣｌ２と共に２４時間インキュベートしたＨＵＶＥＣは、水と共にインキュベートした対照と比較して５．５倍よりも高いＩＬ−８の分泌を示した（Ｐ＜０．００７、ｔ検定）（図２５）。１：１および２：１のモル比（ｄ−ＤＡＨＫ：銅）のテトラペプチドｄ−ＤＡＨＫは、２４時間のインキュベーション後に、ＩＬ−８の分泌をそれぞれ８６．１％（Ｐ＝０．００７）および１０２．４％（Ｐ＝０．００２）阻害した（図１８）。２４時間のインキュベーション後の、１００μＭのｄ−ＤＡＨＫ単独によるＩＬ−８の分泌の減少は対照と比較して有意ではなかった（Ｐ＝０．１６）（図１８）。視覚的調査では、２４時間ではすべての細胞が生存しているように見えた。ヒト肺微小血管内皮細胞およびヒト腸骨動脈内皮細胞をいずれも用いた予備実験では、銅およびｄ−ＤＡＨＫへの曝露後に類似の結果が実証された。さらなるＨＵＶＥＣのデータでは、銅に３時間曝露した後に、銅に誘発された腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、プロスタグランジンＥ２またはプロスタサイクリンの分泌、およびＩＬ−８レベルの上昇は全く示されなかった（データ示さず）。後者の結果は、銅に誘発されるＩＬ−８の増加が、既存の貯蔵部位からのＩＬ−８の放出ではなく、ＩＬ−８の合成により生じることを示している。
【０１８９】
細胞を含めず、銅およびｄ−ＤＡＨＫに単独または一緒に曝露させた培地の分析により、主にＣｕ（ＩＩ）および＜７％のＣｕ（Ｉ）が検出された。これは、以下のように測定した。塩化第二銅（ＩＩ）（１０〜５０μＭ）およびｄ−ＤＡＨＫ（６．２５〜１００μＭ）を、単独または一緒にＥＧＭ２培地中で２４時間、５％のＣＯ２でインキュベートし、その後濾過して４００μＭのビシンコニン酸と共に１時間合わせた（すべて３７℃）。Ｃｕ（Ｉ）が優性であることを保証するために、塩化第一銅（Ｉ）標準物質（０．５〜５０μＭ）を、２０ｍＭのアスコルビン酸を含む１ｍＭのＣｕＣｌストックから水で作製した。Ｃｕ（Ｉ）を５６２ｎｍで２連で読み取った（島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）分光光度計、モデルＵＶ１６０Ｕ）。
【０１９０】
Ｃｕ（Ｉ）イオンは活性酸素分子種の発生を触媒する結果、他の細胞種からのＩＬ−８分泌をもたらす。しかし、本明細書中に提示する結果は、Ｃｕ（ＩＩ）イオンが酸化的ストレスに依存せずにヒト内皮細胞からのＩＬ−８の分泌を刺激する証拠を提供する。さらに、高い親和性でＣｕ（ＩＩ）を結合する化合物が、銅誘発性の内皮細胞のＩＬ−８分泌を有意に阻害する。これらのデータは、結合していないＣｕ（ＩＩ）イオンの封鎖が、ヒトの治療における潜在性を有し得ることを示唆している。
【０１９１】
Ｃｕ（ＩＩ）に誘発されて内皮がＩＬ−８を分泌する機構の可能性としては、ヒト線維芽細胞において報告されている、セリン−スレオニン・キナーゼＡｋｔ（プロテインキナーゼＢ）の活性化がありうる。オストラコヴィッチら（Ｏｓｔｒａｋｈｏｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、第３９７巻、２３２ページ、２００２年。類似の経路がｉｎ  ｖｉｖｏでヒト内皮細胞において刺激された場合、銅は、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化することにより全身性炎症の発生に主として貢献する可能性がある。ＮＦ−κＢとは、血管性および細胞性の炎症反応を有意に増強する高レベルのサイトカインを刺激することでよく知られている炎症性転写因子である。さらに、虚血再灌流後の傷害の持続または再発、および最初の負傷後の時間におけるアシドーシスが、持続的なＣｕ（ＩＩ）誘発性のＩＬ−８分泌をもたらす可能性がある。
【０１９２】
Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］がｉｎ  ｖｉｖｏで分解されてＡｓｐ
Ａｌａジケトピペラジン（ＤＡ−ＤＫＰ）を生じる証拠があることにも注意されたい（データ示さず）。ＤＡ−ＤＫＰは抗炎症性であることが示されており（その開示の全体を本願明細書に援用する、２００１年８月２日出願の米国特許出願第０９／９２２，２３４号、および国際出願国際公開公報第０２／１１６７６号パンフレット参照）、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］が分解されてＤＡ−ＤＫＰを生じた結果、さらなる抗炎症性効果を引き起こすかもしれない。
【実施例１３】
【０１９３】
（歯肉溝滲出液における、Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  ＬｙｓによるＩＬ−８の阻害）
歯肉溝滲出液（ＣＧＦ）を、正常な対照者（１１人）ならびに歯肉炎患者（７人）および歯周炎患者（９人）から得た。
【０１９４】
Ｃｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐｓ（商標）を、パッケージの指示に従って正常対照者のうち５人の歯に施用した。以下に示すように、Ｃｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を歯に施用した後の様々な時間にＣＧＦ試料を得た。
【０１９５】
別の実験では、４ｍＭ溶液のテトラペプチドＬ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］（本明細書中ではＤＡＨＫ−１１９９と呼ぶ）をリン酸緩衝生理食塩水（０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で調製し、ｐＨを７．４に調整した。その後、０．１ｍｌのこのＤＡＨＫ溶液を各Ｃｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）の表面上に均一に塗布した。その後、このＣｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を、パッケージの指示に従って正常対照者のうち３人の歯に施用した。ＤＡＨＫ−１１９９を塗布したＣｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を歯に施用する前、および以下に示すようにその後の様々な時間にＣＧＦ試料を得た。
【０１９６】
ＣＧＦは、歯科用のウィック（ｗｉｃｋ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）［米国モンタナ州セント・ルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］）を使用して採取した。ＣＧＦを含む歯科用ウィックを、１５０μｌの貯蔵緩衝液（４％のウシ血清アルブミン（シグマ［米国モンタナ州セント・ルイス所在］）、０．１ｍｇ／ｍｌのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ；シグマ［米国モンタナ州セント・ルイス所在］）、および０．１ｍｇ／ｍｌのアプ
ロチニン（シグマ［米国モンタナ州セント・ルイス所在］を含むリン酸緩衝生理食塩水（０．１Ｍのリン酸ナトリウムおよび０．１５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２））に入れ、使用時まで−２０℃で凍結した。
【０１９７】
凍結したＣＧＦ試料を氷上で解凍し、４℃に維持した。その後、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、および可溶性腫瘍壊死因子−α受容体（ｓＴＮＦＲ７５）の量を決定するためにＥＬＩＳＡアッセイを行った。すべての試料ですべてのＥＬＩＳＡアッセイを行うのに十分なＣＧＦは得られていなかった；アッセイした試料の数を後述する。
【０１９８】
ＩＬ−８のＥＬＩＳＡを以下のように実施した。抗ヒトＩＬ−８抗体（ピアース・エンドゲン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）［米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在］；カタログ番号Ｍ８０１−Ｅ、ロット番号ＣＫ４１９５９）を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２〜７．４）で１μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの希釈抗体をヌンク（Ｎｕｎｃ）のＭａｘｉｓｏｒｂ（登録商標）ＥＬＩＳＡストリップ・プレートの各ウェルに加えた。プレートを室温で終夜インキュベートした。ウェルから液体を吸引し、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。その後、２００μｌのアッセイ緩衝液（４％のウシ血清アルブミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）［米国モンタナ州セント・ルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在］；ＥＬＩＳグレード＝低脂肪酸および低ＩｇＧ）を含むリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２〜７．４）を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。液体をウェルから吸引し、ウェルを洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．９〜８．１）で３回洗浄し、ついでペーパー・タオル上で液体を吸い取らせた。標準物質およびＣＧＦ試料（５０μｌ／ウェル；標準物質は貯蔵緩衝液で希釈した）をウェルに加え、プレートを室温で１時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。液体を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。次に、アッセイ緩衝液で６０ｎｇ／ｍｌに希釈した１００μｌのビオチン標識抗ヒトＩＬ−８（ピアース・エンドゲン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）［米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在］；カタログ番号Ｍ８０２−Ｅ、ロット番号ＣＥ４９５１３）を各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、液体を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。その後、アッセイ緩衝液中の、１００μｌのＨＲＰにコンジュゲートしたストレプトアビジン（ピアース・エンドゲン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）［米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在］；カタログ番号Ｎ１００）を各ウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートし、液体を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。最後に、１００μｌのＴＭＢ基質溶液（ピアース・エンドゲン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）［米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在］；カタログ番号Ｎ３０１）を各ウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの０．１８ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させた。４５０ｎｍおよび５３０ｎｍにおける光学密度をＥＬＩＳＡプレート・リーダーで読み取り、差（ＯＤ４５０−ＯＤ５３０）を計算した。
【０１９９】
ＴＮＦα  ＥＬＩＳＡを以下のように実施した。抗ヒトＴＮＦα抗体（ピアース・エンドゲン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）［米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在］；カタログ番号Ｍ３０３−Ｅ、ロット番号０１８３３４）を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２〜７．４）で２μｇ／ｍｌに希釈し、１００μｌの希釈抗体をヌンク（Ｎｕｎｃ）のＭａｘｉｓｏｒｂ（登録商標）ＥＬＩＳＡストリップ・プレートの各ウェルに加えた。プレートを室温で終夜インキュベートした。ウェルから液体を吸引し、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。その後、２００μｌのアッセイ緩衝液を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。ウェルから液体
を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。標準物質およびＣＧＦ試料（５０μｌ／ウェル；標準物質は貯蔵緩衝液で希釈した）をウェルに加え、プレートを室温で１時間、穏やかに振盪しながらインキュベートした。液体を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、その後、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。次に、アッセイ緩衝液で２５０ｎｇ／ｍｌに希釈した１００μｌのビオチン標識抗ヒトＴＮＦα（ピアース・エンドゲン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ）［米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在］；カタログ番号Ｍ３０２−Ｅ、ロット番号０１７００５）を各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、液体を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。その後、アッセイ緩衝液中のＨＲＰにコンジュゲートしたストレプトアビジン１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートし、液体を吸引し、ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ペーパー・タオル上でプレートから液体を吸い取らせた。最後に、１００μｌのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに加えた。プレートを室温で３０分間インキュベートした。１００μｌ／ウェルの０．１８ＭのＨ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させた。４５０ｎｍおよび５３０ｎｍにおける光学密度をＥＬＩＳＡプレート・リーダーで読み取り、差（ＯＤ４５０−ＯＤ５３０）を計算した。
【０２００】
ｓＴＮＦＲ７５  ＥＬＩＳＡアッセイは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ｓＴＮＦＲ７５  ＥＬＩＳＡキット（アール・アンド・ディー・システムス（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）［米国ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）所在］）を使用して、製造者の指示に従って実施した。手短に述べると、各標準物質および各ＣＧＦ試料５０μｌを、抗ｓＴＮＦＲ７５抗体でコーティングしたプレートのウェルに加え、このプレートを室温で２時間インキュベートした。その後、各ウェルから液体を吸引し、ウェルを４００μｌ／ウェルの供給された洗浄緩衝液で３回洗浄した。次に、２００μｌのｓＴＮＦＲ７５コンジュゲート溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。再度、各ウェルから液体を吸引し、ウェルを４００μｌ／ウェルの供給された洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄が完了した後、２００μｌの供給された基質溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で２０分間インキュベートした。最後に、５０μｌの停止溶液を各ウェルに加え、４５０ｎｍでの光学密度から５３０ｎｍでの光学密度を減算した値を決定した。
【０２０１】
Ｃｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を施用せずに採取したＣＧＦ試料に関しては、ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡをすべての試料について実施し（１１人の正常対照者、９人の歯周炎患者および７人の歯肉炎患者からの試料）、ＴＮＦα  ＥＬＩＳＡを正常対照者のうち２人、歯周炎患者のうち１人、および歯肉炎患者のうち３人からのＣＧＦ試料について実施し、ｓＴＮＦＲ７５  ＥＬＩＳＡを１人の正常対照者、５人の歯周炎患者、および３人の歯肉炎患者からのＣＧＦ試料について実施した。ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡは、Ｃｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を歯に施用した５人の正常対照者から採取したＣＧＦ試料すべて、およびＤＡＨＫ  １１９９を塗布したＣｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を歯に施用した３人の正常対照者から採取したＣＧＦ試料すべてについて実施した。全試料を２連でアッセイした。
【０２０２】
結果を図１９Ａ〜Ｅに示した。図１９Ａ〜Ｃで見られ得るように、正常対照者と比較して、歯肉炎および歯周炎の患者ではＩＬ−８およびｓＴＮＦＲ７５が上昇し、ＴＮＦαが減少した。Ｃｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を用いた処置により、処置の６時間後までには、正常対照者のＣＧＦ中のＩＬ−８量が増加した（図１９Ｄ参照）。ＤＡＨＫ−１１９９を塗布したＣｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を用いた処置により、ＤＡＨＫ−１１９９を塗布しなかったＣｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）と比較して、６時間後における正常対照者のＣＧＦ中のＩＬ−８量が減少した（図１９Ｅを図
１９Ｄと比較されたい）。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１Ａ】可能な置換位置を示す、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｂ】可能な置換位置を示す、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｃ】可能な置換位置を示す、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図１Ｄ】可能な置換位置を示す、テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の式。
【図２Ａ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の、図１Ｃの式の範囲に入る誘導体の合成の概略図。
【図２Ｂ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の、図１Ｂの式の範囲に入る誘導体の合成の概略図。
【図３Ａ】シクロヘキサンジアミン誘導体の式。
【図３Ｂ】シクロヘキサンジアミン誘導体の式。
【図３Ｃ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の、シクロヘキサンジアミン誘導体の合成の概略図。
【図３Ｄ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の、シクロヘキサンジアミン誘導体の合成の概略図。
【図４】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］の四酢酸誘導体の式。
【図５】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のビスピリジルエチルアミン誘導体の式。
【図６Ａ】金属イオンＭが結合していないメソポルフィリンＩＸの式。
【図６Ｂ】金属イオンＭが結合したメソポルフィリンＩＸの式。
【図６Ｃ】テトラペプチドＡｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ［配列番号１］のメソポルフィリンＩＸ誘導体の式。
【図７】単糖類の式。
【図８Ａ】ヒドロキシル・ラジカル生成のアッセイにおける、インキュベーション時間に対する５３２ｎｍでの吸光度（Ａ５３２）のグラフ。図中、（黒塗りの四角）＝アスコルビン酸のみ、（黒塗りの菱形）＝銅およびアスコルビン酸、（黒塗りの三角）＝テトラペプチド（Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］）、銅およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比は１：１）、×＝テトラペプチド、銅およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比は２：１）である。
【図８Ｂ】ヒドロキシル・ラジカル生成のアッセイにおける、インキュベーション時間に対する５３２ｎｍでの吸光度（Ａ５３２）のグラフ。図中、（黒塗りの菱形）＝銅およびアスコルビン酸、（黒塗りの四角）＝テトラペプチド、銅およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比は２：１）である。
【図９】スーパーオキシド・ジスムターゼ活性に関するキサンチン・オキシダーゼ・アッセイにおける、テトラペプチド／銅の比が１：１のテトラペプチド（Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］）−銅の錯体の濃度に対する阻害（％）のグラフ。
【図１０】スーパーオキシド・ラジカル生成のアッセイにおける、時間に対する５６０ｎｍでの吸光度（Ａ５６０）のグラフ。図中、（黒塗りの四角）＝アスコルビン酸のみ、（黒塗りの菱形）＝銅およびアスコルビン酸、（白抜きの三角）＝テトラペプチド（Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］）、銅およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比は１：１）、×＝テトラペプチド、銅およびアスコルビン酸（テトラペプチド／銅の比は２：１）である。
【図１１】様々な方法で処理したＤＮＡを電気泳動した後のゲルの写真。レーン１‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ（無処理対照）；レーン２‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡおよび５０μＭのＣｕＣｌ２；レーン３‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡおよび２．５ｍＭのアスコルビン酸；レーン４‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭのアスコルビン酸、５０μＭのＣｕＣｌ２、および２００μＭのテトラペプチド（Ｌ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］）（テトラペプチド／銅の比は４：１）；レーン５‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭのアスコルビン酸、５０μＭのＣｕＣｌ２、および１００μＭのテトラペプチド（テトラペプチド／銅の比は２：１）；レーン６‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭのアスコルビン酸、５０μＭのＣｕＣｌ２、および５０μＭのテトラペプチド（テトラペプチド／銅の比は１：１）；レーン７‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭのアスコルビン酸、５０μＭのＣｕＣｌ２、および２５μＭのテトラペプチド（テトラペプチド／銅の比は１：２）；レーン８‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭのアスコルビン酸、５０μＭのＣｕＣｌ２、および１２．５μＭのテトラペプチド（テトラペプチド／銅の比は１：４）；レーン９‐  １７μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡ、２．５ｍＭのアスコルビン酸、および５０μＭのＣｕＣｌ２（陽性対照）；ならびにレーン１０‐  ＤＮＡラダー。
【図１２Ａ】本発明によるペプチド２量体の式。
【図１２Ｂ】本発明によるペプチド２量体の合成を例示する図。
【図１２Ｃ】本発明によるペプチド２量体の合成を例示した図。
【図１２Ｄ】本発明によるペプチド２量体の合成を例示した図。
【図１３】Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓによる、ＲＯＳ誘発性のゲノムＤＮＡ中のＤＮＡ２本鎖切断の軽減を示す、臭化エチジウムで可視化したＴＡＥ（トリス  酢酸  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸））アガロースゲルの写真。レーン１‐  無処理；レーン２‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ；レーン３‐  アスコルビン酸、１００μＭ；レーン４‐  Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、２００μＭ；レーン５‐  ＣｕＣｌ２、１０μＭ＋アスコルビン酸、５０μＭ；レーン６‐  ＣｕＣｌ２、２５μＭ＋アスコルビン酸、５０μＭ；レーン７‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、５０μＭ；レーン８‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、２５μＭ；レーン９‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、１００μＭ；レーン１０‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、１００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、５０μＭ；レーン１１‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、１００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、１００μＭ；レーン１２‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、１００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、２００μＭ。
【図１４】Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓによる、ＲＯＳ誘発性のゲノムＤＮＡ中のＤＮＡ２本鎖切断の軽減を示す、臭化エチジウムで可視化したＴＡＥアガロースゲルの写真。レーン１‐  無処理；レーン２‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ；レーン３‐  アスコルビン酸、５００μＭ；レーン４‐  Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、２００μＭ；レーン５‐  ＣｕＣｌ２、１０μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ；レーン６‐  ＣｕＣｌ２、２５μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ；レーン７‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ；レーン８‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、１００μＭ；レーン９‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、２５０μＭ；レーン１０‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、５０μＭ；レーン１１‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、１００μＭ；レーン１２‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、２００μＭ。
【図１５】Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓによる、ＲＯＳ誘発性のテロメアＤＮＡ中のＤＮＡ２本鎖切断の軽減を示すサザン・ブロット。レーン１‐  無処理；レーン２‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ；レーン３‐  アスコルビン酸、１００μＭ、レーン４‐  Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、２００μＭ；レーン５‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、１００μＭ；レーン６‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、１００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、２００μＭ。
【図１６】Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓによる、ＲＯＳ誘発性のテロメアＤＮＡ中のＤＮＡ２本鎖切断の軽減を示すサザン・ブロット。レーン１‐  無処理；レーン２‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ；レーン３‐  アスコルビン酸、５００μＭ；レーン４‐  Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、２００μＭ；レーン５‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、１００μＭ；レーン６‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、２５０μＭ；レーン７‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ；レーン８‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、５０μＭ；レーン９‐  ＣｕＣｌ２、５０μＭ＋アスコルビン酸、５００μＭ＋Ｄ−Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｌｙｓ、１００μＭ。
【図１７】ジャーカット細胞の様々な処理（「なし」および「銅のみ」の処理を除くすべての処理には、グラフに示す他の添加剤に加えてアスコルビン酸を含めた）に対する、インターロイキン−８（ＩＬ−８）の濃度を示すグラフ。
【図１８】ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からのインターロイキン８（ＩＬ−８）の分泌に対する、銅およびＤ−Ａｓｐ  Ｄ−Ａｌａ  Ｄ−Ｈｉｓ  Ｄ−Ｌｙｓ（ｄ−ＤＡＨＫ）（それぞれ単独または組み合わせて使用）の効果を示すグラフ。ＣＴＬ＝対照。値は、平均値±標準誤差である。
【図１９Ａ】正常な対照者ならびに歯肉炎患者および歯周炎患者についてのＩＬ−８濃度を示す棒グラフ。
【図１９Ｂ】正常な対照者ならびに歯肉炎患者および歯周炎患者についての腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）濃度を示す棒グラフ。
【図１９Ｃ】正常な対照者ならびに歯肉炎患者および歯周炎患者についての可溶性腫瘍壊死因子−α受容体（ｓＴＮＦＲ７５）濃度を示す棒グラフ。
【図１９Ｄ】５人の正常な対照者（患者Ｄ、Ｏ、Ｈ、ＫおよびＹ）の歯にＣｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を施用する前（白抜きの棒）、０．５時間後（灰色の棒）、６時間後（黒塗りの棒）、２４時間後（横線の入った棒）、および７２時間後（斜線の入った棒）のＩＬ−８濃度を示す棒グラフ。
【図１９Ｅ】３人の正常な対照（患者Ｒ、ＢＭおよびＷ）の歯に、テトラペプチドＬ−Ａｓｐ  Ｌ−Ａｌａ  Ｌ−Ｈｉｓ  Ｌ−Ｌｙｓ［配列番号１］（ＤＡＨＫ−１１９９とも呼ばれる）を塗布してあるＣｒｅｓｔ  Ｗｈｉｔｅｓｔｒｉｐ（商標）を施用する前（白抜きの棒）、０．５時間後（灰色の棒）および６時間後（黒塗りの棒）のＩＬ−８濃度を示す棒グラフ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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