(57)【要約】哺乳動物の肝臓系における核酸の発現を調節する方法を開示する。さらに、哺乳動物において、オリゴヌクレオチドを肝細胞に優先的にターゲティングする方法を開示する。また、遺伝子にコードされるタンパク質と関連する肝疾患または肝障害を有する動物を治療する方法を開示する。オリゴヌクレオチドを含有する組成物を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の肝臓系において、核酸の発現を調節する方法であって：
前記哺乳動物に、前記核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを投与して、前記核酸の発現を調節する
工程を含んでなり、
前記オリゴヌクレオチドが、それに共有結合した少なくとも2つのステロール部分を有する
前記方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス・ヌクレオチドである、請求項1の方法。
【請求項３】
少なくとも1つの前記ステロール部分がコレステリル部分である、請求項1の方法。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが2つのコレステリル部分を含んでなる、請求項1の方法。
【請求項５】
前記ステロール部分が、前記オリゴヌクレオチドの2'-O位、3'-O位または5'-O位で結合している、請求項1の方法。
【請求項６】
哺乳動物において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを肝細胞に優先的にターゲティングする方法であって：
前記オリゴヌクレオチドを、少なくとも2つのステロール部分に共有結合させて、ステロール-オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを形成し；そして
前記ステロール-オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを前記哺乳動物に投与して、前記哺乳動物において、前記オリゴヌクレオチドを前記肝細胞に優先的にターゲティングし、前記肝細胞における遺伝子の発現を調節する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項７】
前記肝細胞が内皮細胞である、請求項6の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス・ヌクレオチドである、請求項6の方法。
【請求項９】
前記ステロール部分の少なくとも1つがコレステリル部分である、請求項6の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドが2つのコレステリル部分を含んでなる、請求項6の方法。
【請求項１１】
前記ステロール部分が、前記オリゴヌクレオチドの2'-O位、3'-O位または5'-O位で結合している、請求項6の方法。
【請求項１２】
遺伝子にコードされるタンパク質と関連する肝疾患または肝障害を有する動物を治療する方法であって：
前記哺乳動物に、前記遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを投与する
工程を含んでなり、
前記オリゴヌクレオチドが、それに共有結合した少なくとも2つのステロール部分を有する
前記方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス・ヌクレオチドである、請求項12の方法。
【請求項１４】
少なくとも1つの前記ステロール部分がコレステリル部分である、請求項12の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドが2つのコレステリル部分を含んでなる、請求項12の方法。
【請求項１６】
前記ステロール部分が、前記オリゴヌクレオチドの2'-O位、3'-O位または5'-O位で結合している、請求項12の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドを含んでなる組成物であって、
前記オリゴヌクレオチドが、それに共有結合した少なくとも2つのステロール部分を有する
前記組成物。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドがアンチセンス・ヌクレオチドである、組成物。
【請求項１９】
前記ステロール部分の少なくとも1つがコレステリル部分である、請求項17の組成物。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドが2つのコレステリル部分を含んでなる、請求項17の組成物。
【請求項２１】
前記ステロール部分が、前記オリゴヌクレオチドの2'-O位、3'-O位または5'-O位で結合している、請求項17の組成物。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが、疾患または障害の経過中の肝組織において、過剰発現されているかまたは異常に発現されているタンパク質をコードする遺伝子にハイブリダイズする、請求項17の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本出願は、親油性部分を含むように官能性を持たせたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドに関する。官能性を持たせていない親化合物に比較して、こうした親油性オリゴヌクレオチド・コンジュゲートは、哺乳動物において、改善された生体安定性および改変された生体分布を有する。1つの態様において、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを肝組織にターゲティングして、そしてそれによって、哺乳動物の肝臓および関連組織において、遺伝子発現を優先的に調節する方法において、こうした親油性オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを用いる。
発明の背景
メッセンジャーRNA（mRNA）はタンパク質合成を指示する。アンチセンス方法論は、これらの細胞内核酸の正常で本質的な機能が破壊されるような、mRNAまたはDNAへの比較的短いオリゴヌクレオチドの相補的ハイブリダイゼーションである。ハイブリダイゼーションは、ワトソン-クリック塩基対を介した、RNAまたは一本鎖DNAへのオリゴヌクレオチドの配列特異的水素結合である。こうした塩基対は、互いに相補的であると言われる。
【０００２】
核酸機能破壊を提供する天然存在事象は、CohenによってOligonucleotides：Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Inc., フロリダ州ボカラトン（1989）に論じられ、こうした事象には2種類あると考えられる。第一のハイブリダイゼーション抑止は、オリゴヌクレオチド阻害剤がターゲット核酸に結合し、そしてこうして、単純な立体障害によって、必須タンパク質、最も頻繁にはリボソームが核酸に結合するのを妨げる、終結事象を意味する。メチルホスホネート・オリゴヌクレオチド（Millerら, Anti-Cancer Drug Design, 1987, 2, 117）およびα-アノマー・オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション抑止によって核酸機能を破壊すると考えられるアンチセンス剤の例である。
【０００３】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの終結事象の第二の種類は、細胞内RNアーゼHによる、ターゲティングされたRNAの酵素的切断を伴う。2'-デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体が、ターゲティングされたRNAにハイブリダイズし、そしてこの二重鎖がRNアーゼH酵素を活性化してRNA鎖を切断させ、こうしてRNAの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは、この種のアンチセンス終結事象によって機能するアンチセンス剤の最も重要な例である。
【０００４】
診断剤、研究試薬および潜在的な療法目的のためのアンチセンス剤としてのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の適用に、かなりの研究が向けられている。少なくとも療法目的では、そして細胞全体、組織または動物に関与する研究目的では、アンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、活性を示すために、細胞膜を渡って輸送されるか、または別の方式で細胞に取り込まれなければならない。膜または細胞輸送を一般的に増加させる1つの方法は、ペンダント親油基の付着によるものである。より具体的には、Ramirezら（J. Am. Chem. Soc., 1982, 104, 5483）は、二量体TpTに、3'位および5'位で独立に、リン脂質基、5'-O-（1，2-ジ-O-ミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホリル）を導入した。続いて、Sheaら（Nuc. Acids Res., 1990, 18, 3777）は、オリゴヌクレオチドの5'末端の5'-ホスフェートに連結された1，2-ジ-O-ヘキシルデシル-rac-グリセロール基を有するオリゴヌクレオチドを開示した。Sheaらの著者の何人かはまた、特許出願PCT／US90／01002において、これらの化合物および他の化合物も開示した。さらなるグルコシルリン脂質がGuerraら（Tetrahedron Letters, 1987, 28, 3581）に開示された。
【０００５】
他の研究では、オリゴヌクレオチドの第一のヌクレオチドおよび第二のヌクレオチド（3'末端から）の間のヌクレオチド間連結に、コレステリル基を付着させた。この研究は、米国特許第4，958，013号に、そしてさらに、Letsingerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6533）に開示される。Yamanaら（Bioconjugate Chem., 1990, 1, 319）に報告されるように、オリゴヌクレオチドの糖断片の2'位に芳香族挿入剤（intercalating agent）、アントラキノンを付着させた。この研究者らは、糖の2'位にピレン-1-メチルを配置した（Yamanaら, Tetrahedron Lett., 1991, 32, 6347）。
【０００６】
Lemairteら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, 84, 648）およびLeonettiら（Bioconjugate Chem., 1990, 1, 149）。オリゴヌクレオチドの3'末端は、各々、3'末端リボース糖部分を含む。この末端リボースを過ヨウ素酸酸化し、その後、還元して、そしてN-モルホリン環を通じてカップリングして、ポリ（L-リジン）をオリゴヌクレオチドに連結した。オリゴヌクレオチド-ポリ（L-リジン）コンジュゲートが欧州特許出願87109348.0に記載される。この例では、リジン残基が、オリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端ヌクレオチドの5'ホスフェートまたは3'ホスフェートにカップリングされた。オリゴヌクレオチドの3'末端ではまた、ジスルフィド連結を利用して、オリゴヌクレオチドにペプチドが連結されている（Coreyら, Science, 1987, 238, 1401；Zuckermannら, J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 1614；およびCoreyら, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 8524）。
【０００７】
Nelsonら（Nuc. Acids Res., 1989, 17, 7187）は、ビオチンをオリゴヌクレオチドの3'末端に付着させる連結試薬を記載する。この試薬、N-Fmoc-O-DMT-3-アミノ-1，2-プロパンジオールは、現在、3'-Amine onの名称で、Clontech Laboratories（カリフォルニア州パロアルト）から商業的に入手可能である。また、Glen Research Corporation（バージニア州スターリング）からも、3'-Amino-Modifier試薬の名称で商業的に入手可能である。この試薬はまた、Judyら（Tetrahedron Letters, 1991, 32, 879）に報告されるように、オリゴヌクレオチドにペプチドを連結するのにも利用された。オリゴヌクレオチドの5'末端に連結するための同様の商業的試薬（実際は、多様な長さのポリメチレン連結剤を有する、一連のこうしたリンカー）は、5'-Amino-Modifier C6である。これらの試薬は、Glen Research Corporation（バージニア州スターリング）から入手可能である。Kriegら（Antisense Research and Development, 1991, 1, 161）は、これらの化合物または類似の化合物を利用して、オリゴヌクレオチドの5'末端にフルオレセインを連結した。目的の他の化合物もまた、オリゴヌクレオチドの3'末端に連結されてきている。Asselineら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3297）は、ポリメチレン連結を介した、ポリ（Tp）オリゴヌクレオチドの3'末端リン酸基に対するアクリジンの連結を記載した。Haralambidisら（Tetrahedron Letters, 1987, 28, 5199）は、固体状態支持体上でペプチドを構築し、そしてその後、オリゴヌクレオチドの3'末端ヌクレオチドの3'ヒドロキシル基を介して、そのペプチドにオリゴヌクレオチドを連結したことを報告する。Chollet（Nucleosides ＆ Nucleotides, 1990, 9, 957）は、オリゴヌクレオチドの5'末端ホスフェートにAminolink2（Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー）を付着させた。その後、Cholletは、オリゴヌクレオチドにインターロイキンタンパク質を連結するのに、二官能性連結基SMPB（Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード）を用いた。
【０００８】
Dreyerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 968）に報告されるように、EDTA鉄複合体がピリミジンヌクレオシドの5位に連結されている。Haralambidisら（Nucleic Acid Research, 1987, 15, 4857）に報告されるのと同じ方式で、フルオレセインがオリゴヌクレオチドに連結され、そしてPCT出願PCT／US／02198に記載されるのと同じ方式で、ビオチンがオリゴヌクレオチドに連結されている。フルオレセイン、ビオチンおよびピレンはまた、Telserら（J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 6966）に報告されるのと同じ方式でも連結された。Glen Research Corporation（バージニア州スターリング）の商業的試薬、Amino-Modifier-dTを利用して、類似の連結基を持つピリミジンヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入することが可能である。
【０００９】
Betebennerら（Bioconjugate Chem., 1991, 2, 117）は、放射シンチグラフィー画像化研究で使用するための、EDTAに連結したコール酸を報告した；しかし、コール酸をヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに連結することは知られていない。これらの努力およびこの分野の他の研究にもかかわらず、アンチセンス化合物、すなわちヌクレオチド配列依存性アンチセンス機構を介して働く剤の薬力学特性を改変するのに親油性コンジュゲート化を使用することは当該技術分野に知られていない。
【００１０】
発明の目的
本発明の1つの目的は、親油性のオリゴヌクレオチド・コンジュゲートおよびオリゴヌクレオシド・コンジュゲートを産生するため、親油性部分を含むように官能性を持たせたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドであって、官能性を持たせていない親化合物に比較して、哺乳動物において、改善された生体安定性および改変された生体分布を有する、前記オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、本発明の親油性のオリゴヌクレオチド・コンジュゲートおよびオリゴヌクレオシド・コンジュゲートを用いて、哺乳動物の細胞、組織（単数または複数）または臓器（単数または複数）における遺伝子発現を調節する方法を提供することである。
【００１２】
本発明の特有の目的は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを肝組織にターゲティングし、そしてそれによって、哺乳動物の肝臓および関連組織において、遺伝子発現を優先的に調節するための組成物およびその方法を提供することである。
【００１３】
発明の簡単な説明
これらの目的および他の目的は、親油性部分を含むように官能性を持たせたオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを提供する本発明によって満たされる。1つの側面において、本発明は、塩基部分およびリボフラノシル糖部分を有するヌクレオシドを提供する。こうしたヌクレオシドは、式：
-RA-N（R1a）（R1b）
式中：
RAは1〜約10の炭素原子を有するアルキルであるか、またはRAは（CH2-CH2-Q-）xであり；
R1aおよびR1bは、独立に、H、RA、R2、またはアミン保護基であるか、あるいは式C（X）-R2、C（X）-RA-R2、C（X）-Q-RA-R2、C（X）-Q-R2を有し；
R2は、ステロイド分子、レポーター分子、親油性分子、レポーター酵素、ペプチド、タンパク質を含むか、または式-Q-（CH2CH2-Q-）x-R3を有し；
XはOまたはSであり；
各Qは、独立に、NH、O、またはSであり；
xは1〜約200であり；
R3は、H、RA、C（O）OH、C（O）ORA、C（O）R4、RA-N3、RA-NH2、またはRA-SHであり；そして
R4は、Cl、Br、I、SO2R5であるか、または構造：
【００１４】
【化１】
2005518452.tif 000002
【００１５】
を有し、
式中、mは2〜7であり；そして
R5は、1〜約10の炭素原子を有するアルキルである
を有する置換基を、2'-O位、3'-O位または5'-O位に所持する。
【００１６】
別の側面において、本発明は、複数の連結ヌクレオシドであって、各ヌクレオシドが、リボフラノシル糖部分および塩基部分を含み、そして少なくとも1つの（好ましくは1より多い）ヌクレオシドが、2'-O位、3'-O位、または5'-O位に、式-RA-N（R1a）（R1b）を有する置換基を所持する、前記連結ヌクレオシドを含んでなるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを提供する。
【００１７】
別の側面において、本発明は、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを調製する方法であって、本発明記載のヌクレオシドを、共有結合を形成するのに有効な時間、そして有効な反応条件下で接触させる工程を含んでなる、前記方法を提供する。好ましい態様において、少なくとも1つのヌクレオシドは、2'-O位または3'-O位に、ホスホロアミデート基を所持する。
【００１８】
他の態様において、本発明記載の化合物は、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、誘導体化試薬と接触させることによって調製される。例えば、2'-ヒドロキシ基、3'-ヒドロキシ基、または5'-ヒドロキシ基を所持するヌクレオシド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを、式L1-RA-N（R1a）（R1b）（式中、L1はハロゲンなどの脱離基であり、そしてR1aおよびR1bの少なくとも1つはアミン保護基である）を有する化合物と、塩基性条件下で接触させる。
【００１９】
本発明はまた、生物の細胞において、特定の遺伝子の発現を阻害する方法であって、該生物に本発明記載の化合物を投与することを含んでなる方法も提供する。本発明の化合物を生物に投与することによって、生物の細胞において、特定の遺伝子の転写および／または複製を阻害する方法、あるいは二本鎖DNAの特定の領域の分解を誘導する方法もまた、提供する。細胞またはウイルスを本発明の化合物と接触させることによって、前記細胞またはウイルスを殺す方法をさらに提供する。化合物は、化合物の不活性キャリアーをさらに含む組成物中に含まれることが可能である。
【００２０】
さらに別の側面において、本発明は、哺乳動物の肝臓系において、核酸の発現を調節する方法であって、該哺乳動物に、該核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与して、該核酸の発現を調節する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが、それに共有結合した少なくとも2つのステロール部分を含有する前記方法に関する。好ましくは、ステロール部分の少なくとも1つはコレステリル部分である。最も好ましくは、ステロール部分の両方がコレステリル部分である。さらに、ステロール部分が、オリゴヌクレオチドの2'-O位、3'-O位または5'-O位で結合していることが好ましい。
【００２１】
別の側面において、哺乳動物において、オリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンス・オリゴヌクレオチドを肝細胞、特に内皮細胞に優先的にターゲティングする方法であって、該オリゴヌクレオチドを、少なくとも2つのステロール部分に共有結合させて、ステロール-オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを形成し；そして該ステロール-オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを該哺乳動物に投与して、該哺乳動物において、該オリゴヌクレオチドを該肝細胞に優先的にターゲティングし、該肝細胞における遺伝子の発現を調節する工程を含む、前記方法に関する。好ましくは、ステロール部分の少なくとも1つはコレステリル部分である。最も好ましくは、ステロール部分の両方がコレステリル部分である。さらに、ステロール部分が、オリゴヌクレオチドの2'-O位、3'-O位または5'-O位で結合していることが好ましい。
【００２２】
さらに別の側面において、本発明は、遺伝子にコードされるタンパク質と関連する肝疾患または肝障害を有する動物を治療する方法であって、該哺乳動物に、該遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンス・ヌクレオチドを投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが、それに共有結合した少なくとも2つのステロール部分を有する前記方法に関する。好ましくは、ステロール部分の少なくとも1つはコレステリル部分である。最も好ましくは、ステロール部分の両方がコレステリル部分である。さらに、ステロール部分が、オリゴヌクレオチドの2'-O位、3'-O位または5'-O位で結合していることが好ましい。
【００２３】
別の側面において、本発明は、オリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンス・オリゴヌクレオチドを含有する組成物であって、該オリゴヌクレオチドが、それに共有結合した少なくとも2つのステロール部分を有する前記組成物に関する。好ましくは、ステロール部分の少なくとも1つはコレステリル部分である。最も好ましくは、ステロール部分の両方がコレステリル部分である。さらに、ステロール部分が、オリゴヌクレオチドの2'-O位、3'-O位または5'-O位で結合していることが好ましい。好ましくは、オリゴヌクレオチド、特にアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、疾患または障害の経過中の肝組織において、過剰発現されているかまたは異常に発現されているタンパク質をコードする遺伝子にハイブリダイズする。
【００２４】
本発明の多くの目的および利点は、付随する図を参照することによって、当業者によりよく理解される可能性がある。
発明の詳細な説明
本発明は、親油性のオリゴヌクレオチド・コンジュゲートおよびオリゴヌクレオシド・コンジュゲートを産生するため、親油性部分を含むように官能性を持たせたヌクレオシド、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドであって、官能性を持たせていない親化合物に比較して、哺乳動物において、改善された生体安定性および改変された生体分布を有する、前記ヌクレオシド、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドを提供する。ヌクレオシド・サブユニットは、「天然」または「合成」部分であることが可能である。各ヌクレオシドは、天然存在塩基または合成塩基および天然存在ペントフラノシル糖基または合成ペントフラノシル糖基から形成される。
【００２５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の連結ヌクレオチド単位から形成されるポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド単位は各々、ヌクレオシド単位を含む。本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオシド」は、ともに連結された複数のヌクレオシド単位を指す。一般的な意味において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオチド単位はその中にヌクレオシドを含むため、用語「オリゴヌクレオシド」は、オリゴヌクレオチド（すなわちリン酸連結基を介して、ともに連結されたヌクレオシド）を包括するとみなすことが可能である。さらなる意味において、用語「オリゴヌクレオシド」はまた、リン酸連結以外の連結を介して、ともに連結された複数のヌクレオシドも指す。したがって、用語「オリゴヌクレオシド」は、事実上、天然存在種、または天然存在サブユニットから形成される合成種を含む。簡潔に言うと、用語「オリゴヌクレオシド」は、リン酸連結ポリヌクレオシド種（オリゴヌクレオチド）および非リン酸連結ポリヌクレオシド種両方を含むものとして用いられるであろう。
【００２６】
本発明記載のオリゴヌクレオシドはまた、修飾サブユニットも含むことが可能である。代表的な修飾には、ヌクレオシドの複素環塩基部分の修飾またはヌクレオシドの糖部分の修飾が含まれる。典型的な修飾が、以下の米国特許出願に開示される：出願第07／835，932号、1992年3月5日出願、現米国特許第5，670，633号、表題“Sugar Modified Oligonucleotides That Detect And Modulate Gene Expression”；出願第558，663号、1990年7月27日出願、現米国特許第5，138，045号、表題“Novel Polyamine Conjugated Oligonucleotides”；出願第558，806号、1991年7月27日出願、表題“Nuclease Resistant Pyrimidine Modified Oligonucleotides that Detect and Modulate Gene Expression”および出願第PCT／US91／00243号、1991年1月11日出願、表題“Compositions and Methods for Detecting and Modulating RNA Activity”。特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する解説もまた、以下の米国特許または係属特許出願に見出すことが可能であり、これらは各々、本出願と同一の出願人に出願される：ポリアミンコンジュゲート化オリゴヌクレオチドに関する米国特許第5，138，045号および第5，218，105号；キラルリン連結を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーに関する米国特許第5，212，295号；修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第5，378，825号および第5，541，307号；主鎖修飾オリゴヌクレオチドおよび還元カップリングを通じたその調製に関する米国特許第5，386，023号；3-デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基およびその合成法に関する米国特許第5，457，191号；N-2置換プリンに基づく修飾核酸塩基に関する米国特許第5，459，255号；キラルリン連結を有するオリゴヌクレオチドの調製法に関する米国特許第5，521，302号；ペプチド核酸に関する米国特許第5，539，082号；□-ラクタム主鎖を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第5，554，746号；オリゴヌクレオチド合成のための方法および材料に関する米国特許第5，571，902号；ヌクレオシドの多様な位のいずれかに付着させる他の部分へのリンカーとして使用可能である、アルキルチオ基を有するヌクレオシドに関する米国特許第5，578，718号；高いキラル純度のホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第5，587，361号および第5，599，797号；2，6-ジアミノプリン化合物を含む、2'-O-アルキルグアノシンおよび関連化合物の調製法に関する米国特許第5，506，351号；N-2置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第5，587，469号；3-デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関する米国特許第5，587，470号；どちらもコンジュゲート化4'-デスメチルヌクレオシド類似体に関する米国特許第5，223，168号、1993年6月29日発行および米国特許第5，608，046号；主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体に関する米国特許第5，602，240号および第5，610，289号；並びに、とりわけ2'-フルオロ-オリゴヌクレオチドの合成法に関する、米国特許出願第08／383，666号、1995年2月3日出願、および米国特許第5，459，255号。
【００２７】
したがって、用語、オリゴヌクレオシドは、天然塩基および天然糖と同様に機能する修飾糖部分または修飾塩基部分である、修飾部分を含む構造を指す。代表的な修飾塩基には、天然プリンおよびピリミジン塩基の代わりに用いられる、デアザまたはアザプリンおよびピリミジン；5位または6位に置換基を有するピリミジン；並びに、2位、6位または8位で置換基の改変または置換を有するプリンが含まれる。代表的な修飾糖には、炭素環糖または非環糖、2'位に置換基を有する糖、および糖の1以上の水素原子の代わりに置換基を有する糖が含まれる。他の改変された塩基部分および改変された糖部分が、米国特許第3，687，808号およびPCT出願PCT／US89／02323号に開示される。
【００２８】
改変された塩基部分または改変された糖部分もまた、本発明の精神と一致した他の修飾に含まれる。こうしたオリゴヌクレオシドは、天然存在オリゴヌクレオチドまたは合成野生型オリゴヌクレオチドと構造的に区別可能であるが、機能的に交換可能であると説明するのが最適である。こうしたオリゴヌクレオシドはすべて、望ましいRNA鎖またはDNA鎖の構造を有効に模倣するように機能する限り、本発明に含まれる。
【００２９】
アンチセンス方法論で使用するため、本発明のオリゴヌクレオシドは、好ましくは、約10〜約30のサブユニットを含んでなる。こうしたオリゴヌクレオシドが、約15〜約25のサブユニットを含んでなることがさらに好ましい。理解されるであろうように、サブユニットは塩基および糖の組み合わせであって、例えばリン含有（例えばホスホジエステル）連結またはいくつかの他の連結部分を通じて、隣接するサブユニットに適切に結合される。ヌクレオシドは、共有結合されている限り、いかなる特定の方式で連結される必要もない。典型的な連結は、隣接するヌクレオシドの3'位および5'位または2'位および5'位の間の連結である。典型的な連結部分は以下の参考文献に開示される：Beaucageら, Tetrahedron, 1992, 48, 2223および該文献に引用される参考文献；並びに米国特許および出願：出願第07／703，619号、1991年5月21日出願（現米国特許第5，378，825号）；出願第07／903，160号、1992年6月24日出願（現米国特許第5，623，070号）；出願第039，979号、1993年3月20日出願（現在、一部係属出願第08／317，289号、1994年10月3日出願として係属中）；出願第08／039，846号、1993年3月30日出願および出願第08／392，675号、1995年2月23日出願（現米国特許第5，677，437号）；および出願第08／040，933号、1993年3月31日出願（現米国特許第5，618，704号）。前述の特許または出願は、各々、本発明の譲受人に譲渡され、そして各開示は本明細書に援用される。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオシドを用いて調節しようとするRNA部分またはDNA部分は、構造または活性を調節しようとするタンパク質をコードするDNA部分またはRNA部分を含んでなるようにあらかじめ選択することが好ましい。したがって、使用しようとする組成物のターゲティング部分を、DNAまたはRNAのあらかじめ選択した部分に相補的であるように、すなわちその部分のアンチセンス・オリゴヌクレオシドであるように選択する。
【００３１】
本発明の1つの好ましい態様にしたがって、本発明の化合物は、ICAM-1（細胞間接着分子1）をコードするmRNAにハイブリダイズする。ICAM-1は、LFA-1などの細胞表面抗原を発現する、好中球などの他の細胞に結合する内皮細胞で主に発現される、細胞表面糖タンパク質である（Kishimotoら, Adv. Immunol., 1989, 46, 149）。いくつかの種類の実験によって、ICAM-1が多様な炎症反応中、重要な役割を果たすことが示される（Bochnerら, J. Exp. Med., 1991, 173, 1553；Carlosら, Blood, 1991, 77, 2266）。本発明の組成物および方法にしたがってこうした反応を調節することによって、望ましくない炎症反応を仲介する。本発明の別の好ましい態様において、本発明の化合物は、ATPが駆動する流出ポンプとして機能する膜タンパク質（P-糖タンパク質）をコードするMDR1（多剤耐性）mRNAにハイブリダイズする。過剰増殖細胞は、1以上のこうしたMDRタンパク質をコードする1以上の核酸（すなわちmRNAまたはDNA）が過剰であるため、抗癌剤に耐性となる可能性がある。本発明の組成物および方法にしたがい、この耐性を調節することによって、耐性細胞は、こうした抗癌剤に再感作される。したがって、本発明の組成物および方法は、抗癌剤を用いた、異常な細胞増殖の治療および腫瘍形成の治療を増進するように作用する。本発明のさらなる態様において、本発明の化合物は、tatタンパク質をコードするHIV mRNA、またはHIV mRNAのTAR領域にハイブリダイズする。他の好ましい化合物は、ヘルペスウイルス、パピローマウイルスおよび他のウイルスの配列、あるいは細胞性発癌遺伝子、動物の免疫応答仲介因子および宿主がコードする他の機能に対応する配列に相補的である。
【００３２】
本発明のヌクレオシドおよびオリゴヌクレオシドは、診断剤、療法剤において、そして研究試薬およびキットとして使用可能である。これらは、適切な薬学的に許容しうる希釈剤またはキャリアーを含むことによって、薬剤組成物中で使用可能である。これらはさらに、タンパク質の望ましくない産生に特徴付けられる疾患を有する生物を治療するのに使用可能である。生物は、望ましくないタンパク質をコードする核酸鎖と特異的にハイブリダイズ可能な配列を有するオリゴヌクレオチドと接触させるべきである。この種の治療は、単細胞原核生物および単細胞真核生物から多細胞真核生物の範囲の多様な生物に実施可能である。遺伝、代謝または細胞管理の基本的なパーツとしてDNA-RNA転写またはRNA-タンパク質翻訳を利用する生物はいずれも、本発明記載の療法的および／または予防的治療に感受性である。細菌、酵母、原生動物、藻類、すべての植物、および温血動物を含む、すべてのより高次の動物型などの一見多様な生物を治療可能である。さらに、多細胞真核生物の各細胞は、細胞活性の不可欠な部分としてDNA-RNA転写およびRNA-タンパク質翻訳両方を含むため、これらの細胞を治療可能である。真核細胞の多くの細胞小器官（例えばミトコンドリアおよび葉緑体）はまた、転写機構および翻訳機構も含む。したがって、単一の細胞、細胞集団または細胞小器官もまた、療法オリゴヌクレオチドまたは診断オリゴヌクレオチドで治療可能な生物の定義内に含まれることが可能である。本明細書において、療法剤は、生物を殺すことによる、あるいは異常なまたは有害な細胞増殖または発現を調節することによる、疾患状態の根絶を含むことを意味する。本発明はまた、培養細胞、単離組織および臓器、並びに動物に、生物学的活性を有する、生物学的活性オリゴヌクレオチドを投与することにも関する。「生物学的に活性」であることによって、オリゴヌクレオチドが、培養細胞、単離組織または臓器、並びに／あるいは動物において、1以上の遺伝子の発現を調節するよう機能することを意味する。こうした調節は、限定されるわけではないが、転写抑止；RNAプロセシング（キャップ化、ポリアデニル化およびスプライシング）および輸送に対する影響；ターゲット核酸の細胞分解増進；並びに翻訳抑止を含む、当該技術分野に知られる多様な機構によって、アンチセンス・オリゴヌクレオチドにより達成可能である（Crookeら, Exp. Opin. Ther. Patents, 1996, 6：855）。
【００３３】
療法組成物の配合およびそれに続く投与は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。一般的に、療法のため、こうした療法が必要な患者に、通常は薬学的に許容しうるキャリアー中、患者の年齢および治療しようとする障害または疾患状態の重症度に応じて、体重kgあたり0.01μg〜100gの範囲の用量で、本発明記載のオリゴヌクレオチドを投与する。さらに、治療措置は、特定の疾患または障害の性質、その重症度および患者の全体の状態に応じて多様な期間、続くことが可能であり、そして1日1回〜20年ごとに1回までの範囲であることが可能である。治療後、患者の状態変化、および障害または疾患状態の症状の軽減に関して、患者を監視する。患者が現在の投薬レベルに有意に反応しない場合、オリゴヌクレオチドの投薬量を増加させることが可能であるし、あるいは、障害もしくは疾患状態の症状の軽減が観察されたら、または障害もしくは疾患状態が取り除かれたら、用量を減少させることが可能である。
【００３４】
いくつかの場合、治療措置の有効性を増加させるため、他の伝統的な療法様式と組み合わせて、本発明のオリゴヌクレオチドで患者を治療することがより有効である可能性がある。本発明の文脈において、用語「治療措置」は、療法、緩和および予防様式を含むことを意味する。治療の成功後、患者に疾患状態の再発を防ぐ維持療法を受けさせることが望ましい可能性があり、ここで、オリゴヌクレオチドは、毎日1回以上〜20年ごとに1回、体重1kgあたり0.01μg〜100gの範囲の維持用量で投与される。
【００３５】
本発明の薬剤組成物は、局所または全身治療が望ましいかどうかに応じて、そして治療しようとする領域に応じて、いくつかの方式で投与可能である。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮を含む）、経口または非経口であることが可能である。非経口投与は、静脈内滴注、皮下注射、腹腔内注射または筋内注射、あるいはくも膜下腔内投与または脳室内投与を含む。
【００３６】
局所投与のための配合は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末を含むことが可能である。慣用的な薬剤キャリアー、水性、粉末または油性基剤、増粘剤（thickener）等が必要であるか、または望ましい可能性がある。被覆コンドーム、手袋等もまた、有用である可能性がある。
【００３７】
経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁物または溶液、カプセル、サシェー剤（sachet）または錠剤が含まれる。増粘剤、フレーバー剤（flavoring agents）、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい可能性もある。
【００３８】
非経口投与、くも膜下腔内投与または脳室内投与のための組成物は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加物もまた含有可能な、無菌水性溶液を含むことが可能である。
投薬は、治療しようとする疾患状態の重症度および反応性次第であり、治療過程は数日〜数ヶ月、あるいは治癒が達成されるまでまたは疾患状態の軽減が達成されるまで持続する。最適投薬計画は、患者の体内の薬剤蓄積の測定値から計算可能である。一般の当業者は、容易に最適投薬、投薬方法論および反復率を決定することが可能である。最適投薬は、個々のオリゴヌクレオチドの相対強度に応じて異なる可能性があり、そして一般的にin vitroおよびin vivo動物モデルで有効であることが見出されたEC50に基づいて、概算可能である。一般的に、投薬は体重1kgあたり0.01μg〜100gであり、そして毎日、毎週、毎月または毎年1回以上、あるいは2〜20年ごとに1回、投与可能である。
【００３９】
1つの側面において、本発明は、位に少なくとも1つのアミン含有置換基を所持するヌクレオシドおよびオリゴヌクレオシドに関する。こうした置換基は、好ましくは、式-RA-N（R1a）（R1b）を有し、そして2'-O位、3'-O位、および／または5'-O位に付加される。
【００４０】
本発明にしたがった各RAは、1〜約10の炭素原子を有するように独立に選択されるアルキル部分であるか、あるいはRAはポリエーテル、ポリチオエーテルまたはポリアルキルアミンである。用語「アルキル」は、直鎖炭水化物および分枝炭化水素を含むと意図される。これらの炭化水素の好ましい長さは、1〜約7炭素原子である。
【００４１】
本発明にしたがったR1aおよびR1bは、H、RA、R2、アミン保護基であるか、または式C（X）-R2、C（X）-RA-R2、C（X）-Q-RA-R2、C（X）-Q-R2を有する。保護基は、アミン基など、それ自体、官能性に選択的に付加し、そしてそこから取り除くことが可能な化学的官能基として知られる。これらの基は、化学的化合物に存在して、こうした官能性を、化合物が曝露される化学的反応条件に不活性にする。例えばGreeneおよびWuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第2版, John Wiley ＆ Sons, ニューヨーク, 1991を参照されたい。多くのアミン保護基が当該技術分野に知られ、こうした基には、限定されるわけではないが：フタルイミド（PHTH）、トリフルオロアセテート（トリフレート）、アリルオキシカルボニル（Alloc）、ベンジルオキシカルボニル（CBz）、クロロベンジルオキシカルボニル、t-ブチルオキシカルボニル（Boc）、フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）、およびイソニコチニルオキシカルボニル（i-Noc）基が含まれる（例えば、VeberおよびHirschmannら, J. Org. Chem., 1977, 42, 3286およびAthertonら, The Peptides, GrossおよびMeienhofer監修, Academic Press；ニューヨーク, 1983；Vol.9 pp.1-38）。
【００４２】
R2は、ステロイド分子、レポーター分子、親油性分子、レポーター酵素、ペプチド、タンパク質（すなわち本質的に同じものからなる置換基）、または式-Q-（CH2CH2-Q-）x-R3を有する分子を含むことが可能である。本発明の目的のため、用語「レポーター分子」および「レポーター酵素」は、ゲル、液体、全細胞系、破壊細胞系等において、分光法、放射能、比色アッセイ、蛍光、および特異的結合などの物理的特性を利用して同定されることを可能にする、物理的特性または化学的特性を有する分子または酵素を含む。ステロイドには、ペルヒドロ-1，2-シクロペンタノフェナントレン環系を含有する化学的化合物が含まれる。タンパク質およびペプチドは、アミノ酸のポリマーとしての通常の意味で使用する。
【００４３】
通常、ペプチドは、単位分子あたり、タンパク質よりも少数のアミノ酸を含有するポリマーを含んでなる。親油性分子には、脂肪酸、エステル、アルコールおよび他の脂質分子、ジニトロフェニル基などの置換芳香族基、アダマンタンおよびバックミンスターフラーレンなどのかご構造、並びにベンゼン、ペリレン、フェナントレン、アントラセン、ナフタレン、ピレン、クリセン、およびナフタセンなど、天然存在および合成の芳香族部分および非芳香族部分が含まれる。
【００４４】
ステロイド分子として特に有用なのは、コール酸、デオキシコール酸およびデヒドロコール酸を含む胆汁酸；コルチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロンおよびコレステロールを含むステロイドであり、そしてコルチゾン環の3位での二重結合を介して付着するトリメチルアミノメチルヒドラジド基を有するコルチゾンなどの陽イオンステロイドでも有用である。
【００４５】
レポーター分子として特に有用なのは、ビオチン、ジニトロフェニル、およびフルオレセイン色素である。親油性分子として特に有用なのは、脂環式炭化水素、飽和および不飽和脂肪酸、ワックス、テルペン、並びにアダマンタンおよびバックミンスターフラーレンを含むポリ脂環式炭化水素である。レポーター酵素として特に有用なのは、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビ（horseradish）ペルオキシダーゼである。ペプチドおよびタンパク質として特に有用なのは、配列特異的ペプチド、並びにホスホジエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼおよびヌクレアーゼタンパク質を含むタンパク質である。こうしたペプチドおよびタンパク質には、SV40ペプチド、RNアーゼA、RNアーゼHおよびスタフィロコッカスヌクレアーゼが含まれる。テルペノイドとして特に有用なのは、ビタミンA、レチノイン酸、レチナールおよびデヒドロレチノールである。
【００４６】
親油性分子、特にステロイドに付着するいくつかの好ましい位には、3'末端ヌクレオチドの糖の3'位、5'末端ヌクレオチドの糖の5'位およびヌクレオチドいずれかの糖の2'位が含まれる。プリンヌクレオチドのN6位もまた、ヌクレオチドにステロイドを連結するのに使用可能である。
【００４７】
R2はまた、式-Q-（CH2CH2-Q-）x-R3（式中QはO、S、またはNHである）を有することも可能である。下付き文字xは、1〜約200、好ましくは約20〜約150、より好ましくは約10〜約50であることが可能である。好ましくは、R2がポリ（エチレングリコール）（PEG）基（すなわちR3＝H）、または官能性を持たせたその誘導体（例えばR3＝C（O）Cl）を構成するように、QがOであるように選択する。R3は、H、RA、C（O）OH、C（O）ORA、C（O）R4、RA-N3、RA-NH2、またはRA-SHであることが可能であり、式中、R4は、F、Cl、Br、I、SO2R5であるか、または構造：
【００４８】
【化２】
2005518452.tif 000003
【００４９】
式中、mは2〜7である
を有する小さいチオ含有複素環である。代表的なPEG含有R2基は、Ouchiら, Drug Design and Discovery, 1992, 9, 93、Ravasioら, J. Org. Chem., 1991, 56, 4329、およびDelgardoら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1992, 9, 249に開示される。
【００５０】
本発明記載のオリゴヌクレオチドを溶液中で組み立てるか、または本発明記載のヌクレオシドおよび／または標準的ヌクレオチド前駆体を利用して、例えば適切なDNA合成装置上で、固相反応を通じて組み立てることが可能である。ヌクレオシドおよびヌクレオチド前駆体は、すでにアルキルアミノ基を所持していることが可能であるし、またはこうした基を所持するように後で修飾することが可能である。
【００５１】
前者の場合、例えば少なくとも1つの未結合（free）2'-、3'-、または5'-ヒドロキシル基を所持するヌクレオシドを、式L1-（CH2）n-N（R1a）（R1b）（式中、L1は脱離基であり、そしてR1aおよびR1bの少なくとも1つはアミン保護基である）を有する化合物と、塩基性条件下で反応させることによって、本発明記載の化合物を調製する。酸素陰イオンの求核攻撃を通じて脱離基を置換して、望ましいアミン誘導体を産生する。本発明にしたがった脱離基には、限定されるわけではないが、ハロゲン、アルキルスルホニル、置換アルキルスルホニル、アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、ヘテロシクロスルホニルまたはトリクロロアセトイミデートが含まれる。より好ましい基には、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、p-（2，4-ジニトロアニリノ）ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニル、メチルスルホニル（メシレート）、p-メチルベンゼンスルホニル（トシレート）、p-ブロモベンゼンスルホニル、トリフルオロメチルスルホニル（トリフレート）、トリクロロアセトイミデート、アシルオキシ、2，2，2-トリフルオロエタンスルホニル、イミダゾールスルホニル、および2，4，6-トリクロロフェニルが含まれ、ブロモが好ましい。
【００５２】
適切に保護されたヌクレオシドを、既知の技術にしたがってオリゴヌクレオシドに組み立てることが可能である。例えばBeaucageら, Tetrahedron, 1992, 48, 2223を参照されたい。
【００５３】
本発明記載のオリゴヌクレオシドはまた、オリゴヌクレオシドおよびそれに付随するアルキルアミノ官能性を組み立てることによっても調製可能である。例えば、未結合ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオシドを既知の技術にしたがって組み立て、そしてその後、式L1-（CH2）n-N（R1a）（R1b）を有する試薬と反応させることが可能である。しかし、認識されるであろうように、上に論じるように、選択したヌクレオシド上にアルキルアミノ官能性を導入し、そしてその後、選択したヌクレオシドおよび他のヌクレオシド両方を用いてオリゴヌクレオシドを構築することによって、オリゴヌクレオシド内のアルキルアミノ官能性の配置に関して達成することが可能である。
【００５４】
組み立てられたならば、式-RA-N（R1a）（R1b）（式中、R1aおよびR1bの少なくとも1つが保護基である）を有する1以上の基を所持するオリゴヌクレオシドを、保護基を取り除くのに有効な試薬で処理する。脱保護されたならば、オリゴヌクレオシドを、例えばC（＝O）-O-スクシンイミドおよびC（＝O）-O-ペンタフルオロフェニル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、ハルアセトアミド、リン脂質炭素環酸活性エステル、o-フェナントロリン-5-ヨードアセトアミド、フルオレセイン・イソチオシアネート、1-ピレン酪酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびPNAのカルボン酸誘導体（ペプチド核酸のカルボン酸誘導体）を含む、スクシンイミジルエステルおよび他の活性化カルボン酸などの求電子性部分と接触させることが可能である。好ましい求電子性部分には、コレステリル-3-ヘミスクシネート-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ピレン-1-酪酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびポリエチレングリコール-プロピオン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルが含まれる。
【００５５】
したがって、本発明はまず、DNA合成装置上、通常の方式で、望ましい連結ヌクレオシド配列を構築する。その後、親油性ステロイド、レポーター分子、親油性分子、レポーター酵素、ペプチドまたはタンパク質を用いて、1以上（好ましくは2以上）の連結ヌクレオシドに官能性を持たせるか、または誘導体化する。
【００５６】
以下の実施例は本発明を例示し、そして本発明を限定することを意図しない。当業者は、本明細書に記載する特定の物質および方法に多くの同等物があることを認識するか、または日常的な実験を通じて確かめることが可能であろう。こうした同等物は、本発明の範囲内にあるとみなされる。例えば、当業者は、Glen Research（バージニア州スターリング；例えばAgrawal, 第3章：Methods in Molecular Biology, Vol.26：Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Agrawal監修, Humana Press Inc., ニュージャージー州トトワ（1994）中、93-120ページ）から入手可能なものなどの、商業的に入手可能な修飾アミダイトおよび調節孔ガラス（CPG）製品を調製するのに、本出願の最も早い優先日に続いて入手可能となった、修飾アミダイトを用いることによって、例えばコレステロール-コンジュゲート化オリゴヌクレオチドなどの、本発明の方法で使用するのに適した修飾オリゴヌクレオチドを合成することも可能であると認識するであろう。
【実施例】
【００５７】
実施例1：2'保護アミン終結連結基を有するオリゴヌクレオチドの調製
A. 5'-ジメトキシトリチル-2'-（O-ペンチル-N-フタルイミド）-2'-デオキシアデノシンホスホロアミダイトの調製
望ましいオリゴヌクレオチド配列内のヌクレオチドの2'位に官能性を導入するため、5'-ジメトキシトリチル-2'-（O-ペンチル-N-フタルイミド）-2'-デオキシアデノシンホスホロアミダイトを利用して、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド構成要素の2'位に付着する連結基を提供した。アデノシンから出発して、概してPCT出願WO91US00243および米国特許第6，262，241号の方法にしたがって、この化合物を合成した。簡潔には、この方法は、アデノシンをジメチルホルムアミド（DMF）中のNaHで処理して、その後、N-（5-ブロモペンチル）フタルイミドで処理する。（CH3）3SiCl、Ph-C（O）-ClおよびNH4OHでさらに処理して、N6-ベンジル保護2'-ペンチル-N-フタルイミド官能化アデノシンを得る。DIPAおよびCH2Cl2で処理すると、5'位にDMTブロッキング基が付加される。最後にホスフィチル化（phosphitylation）によって、望ましいホスホロアミダイト化合物が生じる。この化合物を、無水CH3CN中の0.09M溶液として、DNA合成装置中で利用した。ABI390BまたはABI394合成装置いずれかにおいて、オリゴヌクレオチド配列への化合物2のカップリング中、カップリング時間を10分間に延長して、標準的合成周期を使用し、オリゴヌクレオチド合成を行った。98％より高いカップリング効率が観察された。
【００５８】
B. 2'保護アミン連結基を含有するホスホジエステル・オリゴヌクレオチド
ホスホジエステル・ヌクレオチド間連結を有する、以下のオリゴヌクレオチドを合成した（本開示全体で、別に示さない限り、すべてのオリゴヌクレオチド配列を、左から右へ、標準的な5'から3'方向で列挙する）：
【００５９】
【化３】
2005518452.tif 000004
【００６０】
ここで、A＊は、ペンチル-N-フタルイミド官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す。オリゴマー12およびオリゴマー13は、ウシ・パピローマウイルス-1（BPV-1）のE2領域に対するアンチセンス化合物である。オリゴマー12およびオリゴマー13は、2'修飾以外は、米国特許第6，265，558号のオリゴマー3と同じ配列を有する。「トリチル-オン」モードで、10μmol規模または3x1μmol規模いずれかで、オリゴヌクレオチドを合成した。標準的脱保護条件（30％NH4OH、55℃、24時間）を使用した。逆相HPLC（Waters Delta-Pak C4 15μm、300A、25x100mmカラム、同じ材料のガードカラムを装備）によってオリゴヌクレオチドを精製した。これらを脱トリチル化し、そしてSephadex G-25カラムを用いたサイズ排除によってさらに精製した。プロトンおよびリンNMR両方によるNMR分析によって、オリゴマー9およびオリゴマー10が期待される構造であることが確認された。
【００６１】
C. 2'保護アミン連結基を含有するホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド
ホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結を有する、以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【００６２】
【化４】
2005518452.tif 000005
【００６３】
ここで、A＊は、ペンチル-N-フタルイミド官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表し、そして下付き文字「s」はホスホロチオエート・ヌクレオチド間主鎖連結を表す。オリゴマー14は、ウシ・パピローマウイルス-1（BPV-1）のE2領域に対して向けられるアンチセンス化合物である。オリゴマー15およびオリゴマー16は、ICAMに対するアンチセンス化合物である。オリゴマー14は、2'修飾以外は、米国特許第6，265，558号のオリゴマー3と同じ配列を有し、一方、オリゴマー15およびオリゴマー16は、2'修飾以外は、米国特許第6，265，558号のオリゴマー4と同じ配列を有する。合成中、ホスファイト部分を酸化するため、無水CH3CN溶媒中の0.24M溶液として、Beaucage試薬（すなわち3H-1，2-ベンゾジチオエート-3-オン1，1-ジオキシド；Radhakrishnanら, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 1253）を用いたことを除いて、実施例1（B）の方法と同様に、これらのオリゴヌクレオチドを合成した。「トリチル-オン」モードで、オリゴヌクレオチドを合成し、そして実施例1（B）の精製法を利用して、逆相HPLCによって精製した。
【００６４】
D. 2'-O-メチル誘導体化した、2'保護アミン連結基を含有するRNAオリゴヌクレオチド
2'保護アミン官能化で官能性を持たせていない各ヌクレオチド上に、2'-O-メチル基を有する、以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【００６５】
【化５】
2005518452.tif 000006
【００６６】
ここで、A＊は、ペンチル-N-フタルイミド官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表し、そして3'末端ヌクレオチド以外の残ったヌクレオチドは各々、2'-O-メチル誘導体化ヌクレオチドである。オリゴマー17およびオリゴマー18両方の3'末端ヌクレオチドは、2'-デオキシヌクレオチドである。オリゴマー17およびオリゴマー18はどちらも、HIV-1 TAR領域に対するアンチセンス化合物である。ペンチル-N-フタルイミド官能性を含有するヌクレオチド、および残りのRNAヌクレオチド用のChemgenes Inc.（マサチューセッツ州ニーダム）の適切な2-O-メチルホスホロアミダイト・ヌクレオチドを導入するため、米国特許第6，265，558号の実施例6（その化合物2を利用する）の方法と同様に、オリゴヌクレオチドを合成した。3'末端の末端2'-デオキシヌクレオチドは、DNA合成装置用に利用される標準的なホスホロアミダイトであった。実施例1（B）の方法と同様に、オリゴヌクレオチドを脱保護し、そして精製した。
【００６７】
実施例2：2'位でのオリゴヌクレオチドの官能化
A.ビオチンでの官能化
1.単一部位修飾
オリゴマー12の約10O.D.単位（A260）（1.6756x105と計算される消光計数に基づいて、およそ60nmol）を微量遠心管中で乾燥させた。オリゴヌクレオチドを200μlの0.2M NaHCO3緩衝液に溶解し、そしてD-ビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（2.5mg、7.3μmol）（Sigma、ミズーリ州セントルイス）を添加した後、40μl DMFを添加した。溶液を一晩放置した。溶液をSephadex G-25カラム（0.7x15cm）に適用し、そしてオリゴヌクレオチド分画を合わせた。分析用HPLCは、ほぼ85％が産物に変換されたことを示した。HPLC（991検出装置を備えたWaters 600E、Hamilton PRP-1カラム0.7x15cm；溶媒A：50mM TEAA pH7.0；B：80％アセトニトリルを含む45mM TEAA：流速1.5ml：勾配：最初の5分間は5％B、その後、毎分、Bの直線（1％）増加）で産物を精製し、そしてさらに、Sephadex G-25上で脱塩して、オリゴヌクレオチド：
【００６８】
【化６】
2005518452.tif 000007
【００６９】
ここで、A＊は、示したヌクレオチドの2'位に、2'-O-ペンチル-アミノ連結基を介して連結されたビオチン官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す
を得た。HPLC保持時間を以下の表1に示す。
【００７０】
2.多部位修飾
300μlの0.2M NaHCO3緩衝液／50μl DMF中のD-ビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（5mg）を用い、米国特許第6，265，558号の実施例8（A）（1）の方法を利用して、オリゴマー13の約10O.D.単位（A260）（およそ60nmol）を処理した。分析用HPLCは、65％が二重標識オリゴヌクレオチド産物であり、そして30％が単一標識産物（2つの利用可能な反応部位由来）であることを示した。HPLCおよびSephadex G-25精製によって、オリゴヌクレオチド：
【００７１】
【化７】
2005518452.tif 000008
【００７２】
ここで、A＊は、示したヌクレオチドの2'位に、2'-O-ペンチル-アミノ連結基を介して連結されたビオチン官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す
を得た。この産物（およびそれに付随する単一標識産物）のHPLC保持時間を以下の表1に示す。
【００７３】
B.フルオレセインでの官能化
1.単一部位修飾
1M Na2CO3に1M NaHCO3を添加することによって、1M Na2CO3／1M NaHCO3緩衝液（pH9.0）を調製した。この緩衝液200μl分を、微量遠心管中、オリゴマー12の10O.D.単位に添加した。500μl DMF中のフルオレセイン-イソシアネートの10mg分を添加して、0.05M溶液を得た。フルオレセイン溶液の100μl分を、微量遠心管中のオリゴヌクレオチド溶液に添加した。遠心管をアルミニウムホイルで覆い、そして一晩放置した。水中の25％（v／v）エチルアルコールで平衡化させておいたSephadex G-25カラム（0.7x25cm）に反応混合物を適用した。同じ溶媒でカラムから溶出させた。産物移動は、過剰なフルオレセイン試薬の暗黄色バンドからよく分離された黄色バンドとして見ることが可能である。260nmおよび485nmで吸光を示す分画を合わせて、そして実施例2（A）（1）の精製法と同様に、HPLCによって精製した。分析用HPLCによって、81％が、望ましい二重官能化オリゴヌクレオチドであることが示された。産物を凍結乾燥し、そしてSephadex上で脱塩して、オリゴヌクレオチド：
【００７４】
【化８】
2005518452.tif 000009
【００７５】
ここで、A＊は、示したヌクレオチドの2'位に、2'-O-ペンチル-アミノ連結基を介して連結されたフルオレセイン官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す
を得た。HPLC保持時間を以下の表1に示す。
【００７６】
2.多部位修飾
10O.D単位（A260）分のオリゴマー13（実施例1由来）を、実施例2（B）（1）の1M Na2HCO3／1M Na2CO2緩衝液300μlに溶解して、そして実施例2（B）（1）のフルオレセイン-イソチオシアネート・ストック溶液200μlを添加した。分析用HPLCは、61％が二重標識産物であり、そして38％が単一標識産物であることを示した。反応を行って、オリゴヌクレオチド：
【００７７】
【化９】
2005518452.tif 000010
【００７８】
ここで、A＊は、示したヌクレオチドの2'位に、2'-O-ペンチル-アミノ連結基を介して連結されたフルオレセイン官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す
を得た。HPLC保持時間を以下の表1に示す。
【００７９】
C.コール酸での官能化
1.単一部位修飾
10O.D.単位（A260）分のオリゴマー12を、200μlの0.2M NaHCO3緩衝液／40μl DMF中のコール酸-NHSエステル（米国特許第6，265，558号中の化合物1、5mg、9.9μmol）で処理した。反応混合物を45℃で16時間加熱した。実施例2（B）（1）の方法と同様に産物を単離した。分析用HPLCは、85％より多く、産物が形成されたことを示した。反応を行って、オリゴヌクレオチド：
【００８０】
【化１０】
2005518452.tif 000011
【００８１】
ここで、A＊は、示したヌクレオチドの2'位に、2'-O-ペンチル-アミノ連結基を介して連結されたコール酸官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す
を得た。HPLC保持時間を以下の表1に示す。
【００８２】
2.多部位修飾
10O.D.単位（A260）分のオリゴマー13（実施例1を参照されたい）を、300μlの0.2M NaHCO3緩衝液／50μl DMF中のコール酸-NHSエステル（米国特許第6，265，558号中の化合物1、10mg、19.8μmol）で処理した。反応混合物を45℃で16時間加熱した。実施例2（A）（1）の方法と同様に産物を単離した。分析用HPLCは、58％が二重標識産物であり、17％が第一の単一標識産物であり、そして24％が第二の単一標識産物であることを明らかにした。実施例2（A）（1）と同様に反応を行って、オリゴヌクレオチド：
【００８３】
【化１１】
2005518452.tif 000012
【００８４】
ここで、A＊は、示したヌクレオチドの2'位に、2'-O-ペンチル-アミノ連結基を介して連結されたコール酸官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す
を得た。HPLC保持時間を以下の表1に示す。
【００８５】
D.ジゴキシゲニンでの官能化
1.単一部位修飾
10O.D.単位（A260）分のオリゴマー12（実施例1を参照されたい）を、200μlの0.1Mホウ酸pH8.3緩衝液／40μl DMF中のジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロイックN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer Mannheim Corporation、インディアナ州インディアナポリス）で処理した。反応混合物を一晩放置した。実施例2（A）（1）の方法と同様に産物を単離した。反応を行って、オリゴヌクレオチド：
【００８６】
【化１２】
2005518452.tif 000013
【００８７】
ここで、A＊は、示したヌクレオチドの2'位に、2'-O-ペンチル-アミノ連結基を介して連結されたジゴキシゲニン官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す
を得た。HPLC保持時間を以下の表1に示す。
【００８８】
2.多部位修飾
10O.D.単位（A260）分のオリゴマー13（実施例1を参照されたい）を300μlの0.1Mホウ酸pH8.3緩衝液／50μl DMF中のジゴキシゲニン-3-O-メチルカルボニル-ε-アミノカプロイックN-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Boehringer Mannheim Corporation、インディアナ州インディアナポリス）で処理した。反応混合物を一晩放置した。実施例2（A）（1）の方法と同様に産物を単離した。実施例2（A）（1）と同様に反応を行って、オリゴヌクレオチド：
【００８９】
【化１３】
2005518452.tif 000014
【００９０】
ここで、A＊は、示したヌクレオチドの2'位に、2'-O-ペンチル-アミノ連結基を介して連結されたコール酸官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドを表す
を得た。HPLC保持時間を以下の表1に示す。
【００９１】
【表１】
2005518452.tif 000015
【００９２】
条件：991検出装置を備えたWaters 600E、Hamilton PRP-1カラム0.7x15cm；溶媒A：50mM TEAA pH7.0；B：80％アセトニトリルを含む45mM TEAA：流速1.5ml：勾配：最初の5分間は5％B、その後、毎分、Bの直線（1％）増加；
a単一コンジュゲート化された少量の産物；
b二重コンジュゲート化された主要な産物；
1親オリゴヌクレオチド-2'官能化なし；
22'ビオチン官能化；
32'フルオレセイン官能化；
42'コール酸官能化；および
52'ジゴキシゲニン官能化
実施例3：  官能性を持たせたオリゴヌクレオチドの性質決定
方法A：束縛された2'-アミノ部分を含有する、官能性を持たせたオリゴヌクレオチドの構造の確認
本発明のオリゴヌクレオチドを、ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよびウシ腸アルカリホスファターゼで消化して、個々のヌクレオシドにした。消化後、ヌクレオシド組成物をHPLCによって分析した。HPLC分析によって、束縛された2'-アミノ部分を有する、官能性を持たせたヌクレオチド化合物がオリゴヌクレオチドに正しく取り込まれたことが立証された。
【００９３】
Tris-HCl緩衝液（pH7.2、50mM）中の、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ［Boehringer-Mannheimカタログ番号108260、1mg（1.5単位）／0.5ml］およびウシ腸由来のアルカリホスファターゼ（1単位／マイクロリットル、Boehringer-Mannheimカタログ番号713023）を用いて、オリゴヌクレオチドを消化して、構成要素ヌクレオシドにした。50μl緩衝液（20量体ではほぼ40μM最終濃度）中の0.5O.D.単位のオリゴヌクレオチドに、5μlのヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ほぼ0.3単位／ml、最終濃度）および10μlのアルカリホスファターゼ（およそ150単位／ml、最終濃度）を添加した。反応混合物を37℃で3時間インキュベーションした。インキュベーション後、逆相分析用カラム（ほぼ30x2.5cm）を用いて、HPLCによって、反応混合物を分析した；溶媒A：50mM TEAA pH7；溶媒B：アセトニトリル；勾配100％10分間、その後、5％B15分間、その後、10％Bそしてその後、洗浄。代表的なオリゴヌクレオチドに関して、これらの消化の結果を表2に示す。
【００９４】
【表２】
2005518452.tif 000016
【００９５】
＊付着した2'-O-リンカーを有するヌクレオシド；および
＊＊整数に補正
オリゴマー構造（実施例1を参照されたい）と表2の結果を比較すると明らかであるように、試験オリゴヌクレオチドの構成要素ヌクレオチドに関して、正しいヌクレオシド比が観察される。
【００９６】
方法B：コール酸オリゴヌクレオチド・コンジュゲートの融点（Tm）の測定
オリゴヌクレオチドおよびその相補鎖のハイブリダイゼーション複合体の融点を決定することによって、オリゴヌクレオチドが相補鎖に結合する相対的な能力を比較する。二重らせんの特徴的な物理的特性である融点（Tm）は、50％らせん対コイル（未ハイブリダイズ）型が存在する摂氏温度を示す。UVスペクトルを用いて、ハイブリダイゼーションの形成および分解（融解）を測定することによって、Tmを測定する。ハイブリダイゼーション中に起こる塩基スタッキングには、UV吸収の減少（淡色効果）が付随する。その結果、UV吸収の減少は、Tmがより高いことを示す。Tmがより高ければ、鎖の結合強度がより高くなる。非ワトソン-クリック塩基対形成は、Tmに強い不安定化効果を有する。その結果、ターゲティングされたRNAへのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの最適な結合を得るには、塩基対形成の絶対忠実が必要である。
【００９７】
1.末端コンジュゲート
a.合成
標準的合成法（官能性を持たないオリゴヌクレオチド用）、または5'末端アミノリンカー所持オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド用の米国特許第6，265，558号の実施例3（A）の方法、または5'末端コール酸所持オリゴヌクレオチド用の米国特許第6，265，558号の実施例3（B）の方法を利用して、一連のオリゴヌクレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチドは、以下の5-LOアンチセンス配列を有した：5'-TCC-AGG-TGT-CCG-CAT-C-3'（配列番号6）。1.0μmol規模でヌクレオチドを合成した。オリゴマー32は、通常のホスホジエステル・ヌクレオチド間連結を有する親化合物であった。オリゴマー33は、塩基性オリゴヌクレオチド配列中にホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結を取り込んだ。オリゴマー34は、塩基性オリゴヌクレオチド配列の5'末端で、5'アミノ連結を有する中間体オリゴヌクレオチドであり、そしてオリゴマー35は、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結を取り込んだ類似の5'アミノ連結化合物であった。オリゴマー36は、基本的ホスホジエステル・オリゴヌクレオチド配列の5'末端コール酸コンジュゲートであり、一方、オリゴマー37は、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結を取り込んだ、類似の5'コール酸コンジュゲートである。オリゴマー32およびオリゴマー33を「トリチル-オン」モードで合成し、そしてHPLCによって精製した。Beaucage試薬処理を伴わず、または伴って、米国特許第6，265，558号の実施例3（A）と同様にオリゴマー34およびオリゴマー35を合成して、それぞれ、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結を得た。米国特許第6，265，558号の実施例3（B）と同様に、DMFに溶解したコール酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（化合物1）1の溶液を利用して、それぞれ、オリゴマー34およびオリゴマー35の試料から、オリゴマー36およびオリゴマー37を調製した。HPLCによってオリゴマー36およびオリゴマー37を精製した。Sephadex G-25カラム中で産物を濃縮し、そして脱塩した。ゲル電気泳動解析によって、純粋なコンジュゲートが、親オリゴヌクレオチドまたは5'アミノ官能化オリゴヌクレオチドより遅く移動することから、この解析からもまた、産物が純粋であることを確認した。
【００９８】
b.融解解析
試験オリゴヌクレオチド（本発明のまたは別のホスホジエステル、ホスホロチオエート、コール酸コンジュゲート化ホスホジエステル、コール酸コンジュゲート化ホスホロチオエートまたは5'アミノ連結中間体ホスホジエステルまたはホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド）および相補的DNAまたはRNAオリゴヌクレオチドいずれかを、緩衝液（100mM NaCl、10mMリン酸Na、pH7.0、0.1mM EDTA）中の各オリゴヌクレオチド4μMの標準的濃度でインキュベーションした。試料を90℃に加熱し、そしてGuilford Response II分光光度計（Corning, Inc.、ニューヨーク州コーニング）を用いて最初の吸光度を測定した。その後、試料をゆっくりと15℃に冷却し、そしてその後、熱変性進行中、260nmでの吸光度の変化を監視した。温度を吸光度の読み取りあたり1℃上昇させて、そして融解曲線の一次導関数を得ることによって、変性プロフィールを解析した。2状態直線回帰解析を用いてもデータを解析して、Tmを決定した。これらの試験の結果を表3に示し、いくつかの試験化合物のHPLC保持時間も示す。
【００９９】
【表３】
2005518452.tif 000017
【０１００】
＊HPLC条件：Walters Delta Pak C-18 RP 2.5uカラム；0分で100％ 0.1 TEAA；30分で50％ TEAAおよび50％アセトニトリル：流速1.0ml／分。
＊＊直線傾斜ベースラインを含む2状態モデルに、二つ組（duplicate）融解曲線を適合させて得られる、各鎖4μMでのTm。条件：100mM NaCl、10mMホスフェート、0.1mM EDTA、pH7.0。
【０１０１】
ND＝未測定
表3に示すデータから明らかであるように、オリゴヌクレオチド末端でのコール酸のコンジュゲート化は、オリゴヌクレオチドのTmに影響を及ぼさない。
【０１０２】
2. 2'-O-ペンチルアミノリンカーを取り込んだ鎖
a.合成
実施例1（B）の方法を利用して、配列GGA＊-CCG-GA＊A＊-GGT-A＊CG-A＊G（オリゴマー38、配列番号7）（A＊は、2'位でペンチルアミノ官能性を取り込んで官能性を持たせたヌクレオチドに相当する）のオリゴヌクレオチドを1マイクロモル規模で合成した。逆相HPLCによってオリゴヌクレオチドを精製し、脱トリチル化し、そしてSephadex G-25上で脱塩した。PAGEゲル解析によって、単一のバンドが示された。同じ配列を有するが、いかなる2'-O-アミノリンカーも持たない、さらなるオリゴヌクレオチド、オリゴマー39を標準的方式で合成した。配列5'-CCT-GGC-CTT-CCA-TGC-TCの相補的DNAオリゴヌクレオチド（オリゴマー40、配列番号8）もまた、標準的方式で合成し、配列5'-CCU-GGC-CUU-CCA-UGC-UCの相補的RNAオリゴヌクレオチド（オリゴマー41、配列番号9）も合成した。
【０１０３】
b.融解解析
方法B（1）（b）の方法と同様に融解解析を行った。結果を表4に示す。
【０１０４】
【表４】
2005518452.tif 000018
【０１０５】
＊直線傾斜ベースラインを含む2状態モデルに、二つ組融解曲線を適合させて得られる、各鎖4μMでのTm。条件：100mM NaCl、10mMホスフェート、0.1mM EDTA、pH7.0。
1DNA相補鎖、オリゴマー40に対して
2RNA相補鎖、オリゴマー41に対して
表4から明らかであるように、RNA相補鎖に対して、2'アミノリンカーを有する鎖および未修飾鎖の間のTmの変化は、1.1度である（修飾あたり0.22の変化）。DNA鎖に対して、変化は-6.1度である（修飾あたり-1.2の変化）。親未修飾オリゴヌクレオチドに比較した際、2'アミノリンカー含有鎖は、RNAとのハイブリダイゼーションに際して安定化効果、およびDNAとのハイブリダイゼーションに際して不安定化効果を有する。
【０１０６】
細胞取り込みを増加させる能力に関して、本発明の化合物を試験した。ウシ・パピローマウイルス-1（BPV-1）発現を阻害する能力、またはルシフェラーゼ産生を伴うアッセイ（HIV-1用）のいずれかで判断することによって、決定した。
【０１０７】
方法C： E2トランス活性化アッセイによって測定した際のウシ・パピローマウイルス-1（bpv-1）発現の阻害によって判断される、細胞取り込みの測定
この試験のため、配列5'-CTG-TCT-CCA-TCC-TCT-TCA-CTのホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド類似体（オリゴマー42、配列番号72）を基本配列として用いた。この配列は、1型ウシ・パピローマウイルス（BPV-1）のE2遺伝子の翻訳開始領域に相補的であるように設計されている。オリゴマー42は、アッセイの陽性対照および標準として働いた。オリゴマー3（米国特許第6，265，558号の実施例4由来）は、第二の試験化合物として働いた。オリゴマー3は、オリゴマー42と同じ核酸塩基配列を有するが、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドであり、そしてさらに、オリゴヌクレオチドの3'端にコンジュゲート化されたコール酸部分を有する。オリゴマー2（米国特許第6，265，558号の実施例2由来）は、第三の試験化合物として働いた。オリゴマー2もまた、同じ配列であり、そしてホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドであるが、5'端にコンジュゲート化されたコール酸部分を有する。オリゴマー5（米国特許第6，265，558号の実施例5由来）は、第四の試験化合物として働いた。オリゴマー5もまた、同じ核酸塩基配列を有し、そしてホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドであるが、3'端および5'端両方にコンジュゲート化されたコール酸部分を有する。化合物5、6、および7は、アッセイの陰性対照として働いた。第五の試験化合物は、BPV-1と有意な配列相同性をまったく持たないホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドであった。第六の試験化合物は、BPV-1と有意な配列相同性をまったく持たない、さらなるホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドであった。第七の試験化合物は、3'端にコンジュゲート化されたコール酸部分を持つが、BPV-1と有意な配列相同性をまったく持たないホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドであった。
【０１０８】
各試験のため、60mmペトリ皿中、5x104細胞／cm2で、I-38細胞を蒔いた。蒔いて8時間後、培地を吸引して、そして試験オリゴヌクレオチドを含有する培地と交換し、そして一晩インキュベーションした。インキュベーション後、培地を吸引し、そしてオリゴヌクレオチドを含まない新鮮な培地と交換し、そして1時間インキュベーションした。その後、2μgのpE2RE-1-CATを用いて、CaPO4法によって、細胞をトランスフェクションした。4時間のインキュベーション期間後、細胞に1分間、グリセロールショック（15％グリセロール）を与え、その後、PBSで2回洗浄した。培地を、元来の濃度でオリゴヌクレオチドを含有するDMEMと交換した。細胞を48時間インキュベーションして、そして採取した。標準法によって、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼに関して、細胞溶解物を解析した。薄層クロマトグラフィーによって、アセチル化および非アセチル化14C-クロラムフェニコールを分離して、そして液体シンチレーションによって定量化した。結果をアセチル化パーセントとして表す。
【０１０９】
2つのロットの陽性対照化合物は、29％および30％のレベルでアセチル化することが見出された。陰性対照、試験化合物5、6および7は、それぞれ、59％、58％および47％アセチル化することが見出された。3'コール酸コンジュゲート試験化合物、オリゴマー3は、23％アセチル化することが見出され、5'コール酸コンジュゲート試験化合物、オリゴマー2は、36％アセチル化することが見出され、そして3'端および5'端両方でコンジュゲート化された試験化合物、オリゴマー5は、27％アセチル化することが見出された。
【０１１０】
この試験の結果によって、オリゴヌクレオチドの3'末端にコール酸部分を配置すると、活性が増加すると示唆される。この結果によって、次に、活性増加は、細胞膜輸送が増加した結果であることが示唆される。
【０１１１】
方法D：コール酸連結2'-O-メチル置換オリゴヌクレオチドでのpHIVlucの阻害によって判断される、細胞取り込みの測定
この試験のため、試験ウェル中のオリゴヌクレオチドの非存在が対照として働いた。すべてのオリゴヌクレオチドを2'-O-メチル類似体として試験した。この試験のため、配列5'-CCC-AGG-CUC-AGAであって、そのヌクレオチド各々が2'-O-メチル置換基を含むオリゴヌクレオチド（オリゴマー43、配列番号10）が基本的試験化合物として働いた。
【０１１２】
5'-CHA-CCC-AGG-CUC-AGAであって、CHAがコール酸に相当し、そしてそのヌクレオチド各々が2'-O-メチル置換基を含む、第二の試験化合物（オリゴマー44、配列番号10）もまた、第一の試験化合物と同じ配列のものであった。この第二の試験化合物は、その5'端にコンジュゲート化されたコール酸を含み、そして実施例1（C）に同定されるような2'-O-メチルホスホロアミダイト中間体を利用して、米国特許第6，265，558号の実施例3の方法と同様に調製された。
【０１１３】
5'-CCC-AGG-CUC-AGA-3'-CHAであって、CHAがコール酸に相当し、そしてそのヌクレオチド各々が2'-O-メチル置換基を含む、第三の試験化合物（オリゴマー45、配列番号10）もまた、第一の試験化合物と同じ配列のものであった。この第三の試験化合物は、その3'端にコンジュゲート化されたコール酸を含み、そして実施例1（C）に同定されるような2'-O-メチルホスホロアミダイト中間体を利用して、米国特許第6，265，558号の実施例4の方法と同様に調製された。
【０１１４】
第四の試験化合物は、第二の配列、5'-GAG-CUC-CCA-GGCの2'-O-Meオリゴヌクレオチド（オリゴマー46、配列番号11）であり、該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド各々は2'-O-メチル置換基を含む。
【０１１５】
第五の試験化合物は、配列5'-CHA-GAG-CUC-CCA-GGC（オリゴマー47、配列番号11）であり、CHAはコール酸に相当し、そして該オリゴヌクレオチドのヌクレオチド各々は2'-O-メチル置換基を含む。第五の試験化合物は、第四の試験化合物と同じ配列のものであった。この試験化合物は、その5'端にコンジュゲート化されたコール酸を含み、そして実施例1（C）に同定されるような2'-O-メチルホスホロアミダイト中間体を利用して、米国特許第6，265，558号の実施例3の方法と同様に調製された。
【０１１６】
第六の試験化合物は、配列5'-CAU-GCU-GCA-GCCの無作為化オリゴヌクレオチド（オリゴマー48、配列番号12）であった。
6ウェル培養プレートに、ウェルあたり4x105細胞でHeLa細胞を植え付けた。試験オリゴヌクレオチドを3つ組ウェルに1μMで添加して、そして37℃で20時間インキュベーションした。その後、培地およびオリゴヌクレオチドを取り除き、細胞をPBSで洗浄し、そして細胞をCaPO4トランスフェクションした。簡潔には、それぞれルシフェラーゼcDNAおよびHIV LTRを含有するプラスミド、pT3／T7lucおよびpHIVpap（NAR19（12））のKpnI／KindIII制限断片を連結することによって構築した、HIV LTRの転写調節下にルシフェラーゼcDNAを発現するプラスミド、pHIVluc 5μg、およびSV40プロモーターの調節下でHIV tatタンパク質を発現するプラスミド、pcDEBtat 6μgを500μlの250mM CaCl2に添加して、その後、500μlの2xHBSを添加して、その後、ボルテックスした。30分後、プレート6ウェルにCaPO4沈降物を均等に分配し、これをその後、4時間インキュベーションした。その後、培地および沈降物を取り除き、細胞をPBSで洗浄し、そして新鮮なオリゴヌクレオチドおよび培地を添加した。インキュベーションを一晩続けた。翌朝、各ウェルに関してルシフェラーゼ活性を測定した。培地を取り除き、その後、細胞をPBSで2回洗浄した。その後、200μlのLB（1％ TritX-100、25mMグリシルグリシンpH7.8、15mM MgSO4、4mM EGTA、1mM DTT）を用いてプレート上で細胞を溶解した。その後、75μlのアッセイ緩衝液（25mMグリシルグリシンpH7.8、15mM MgSO4、4mM EGTA、15mM KPO4、1mM DTT、2.5mM ATP）とともに、各ウェルから75μlのアリコットを96ウェルプレートのウェルに添加した。その後、75μlのルシフェリン緩衝液（25mMグリシルグリシンpH7.8、15mM MgSO4、4mM EGTA、4mM DTT、1mMルシフェリン）を各ウェルに注入して、直ちに発光（光単位）を読み取る、Dynatecマルチウェル照度計でプレートを読み取った。
【０１１７】
無作為配列化合物（オリゴマー48）および他の非コール酸コンジュゲート化試験化合物（オリゴマー43およびオリゴマー46）は匹敵する活性を有した。第一の配列の5'コンジュゲート（オリゴマー44）もまた、非コンジュゲート化化合物に匹敵する活性を有した。第二の配列の5'コンジュゲート（オリゴマー47）は、非コンジュゲート化化合物に比較して、3倍の活性増加を示し、そして第一の配列の3'コンジュゲート（オリゴマー45）は、オリゴマー47に比較して、さらに3倍の活性増加を示した。
【０１１８】
すべての試験コール酸所持オリゴヌクレオチドは、非コール酸所持オリゴヌクレオチドに比較して、有意なルシフェラーゼ産生阻害を示した。これによって、活性の増加が、コール酸所持試験化合物の細胞膜輸送の増加の結果であったことが示唆される。
【０１１９】
実施例4：修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチド、並びにそのホスホロアミダイトおよび調節孔ガラス（CPG）誘導体の調製
A. 5'-O-［ジメトキシトリチル］-2'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミド）アミノ］ウリジンおよび5'-O-［ジメトキシトリチル］-3'-O-［ヘキシル（Ω-N-フタルイミドアミノ）］ウリジンの調製
Wagnerら（J. Org. Chem., 1974, 39, 24）の方法にしたがって、2'，3'-O-ジブチルスタンニレン-ウリジンを合成した。この化合物を真空下、P2O5上で12時間乾燥させた。200mlの無水DMF中のこの化合物の溶液（29g、42.1mmol）に、6-ブロモヘキシルフタルイミド（16.8g、55mmol）および4.5gのヨウ化ナトリウムを添加して、そして混合物をアルゴン下、130℃で16時間加熱した。反応混合物を蒸発させ、トルエンと1度、同時蒸発させ、そしてゴム状タール残渣をシリカカラム（500g）に適用した。2lの酢酸エチル（EtOAc）でカラムを洗浄した後、10％メタノール（MeOH）：90％EtOAcで溶出させた。産物である、O-ヘキシル-Ω-N-フタルイミドウリジンの2'異性体および3'異性体は、分離不能な混合物として溶出された（EtOAc中の10％MeOH中、Rf＝0.64）。13C NMRによると、異性体比は、2'異性体が約55％、そして3'異性体が約45％であった。合わせた収量は9.2g（46.2％）であった。この混合物を真空下で乾燥させ、そしてピリジンとともに、2度、再蒸発させた。これを150mlの無水ピリジンに溶解し、そして7.5gの塩化ジメトキシトリチル（22.13mmol）および500mgのジメチルアミノピリジン（DMAP）で処理した。2時間後、薄層クロマトグラフィー（TLC；6：4 EtOAc：ヘキサン）によって、出発物質が完全に消失し、そして2'異性体および3'異性体がよく分離される（2'異性体はRf＝0.29、そして3'異性体は0.12）ことが示された。5mlのCH3OHを添加することによって、反応混合物の反応を停止し、そして減圧下で蒸発させた。残渣を300ml CH2Cl2に溶解し、飽和NaHCO3、その後、飽和NaCl溶液で連続して洗浄した。Mg2SO4上で乾燥させ、そして蒸発させて、15gの茶色い泡状物質を得て、これをシリカゲル（500g）上で精製して、6.5gの2'異性体および3.5gの3'異性体を得た。
【０１２０】
B. 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミド）アミノ］ウリジン-3'-O-（2-シアノエチル-N，N-ジイソプロピル）-ホスホロアミダイトの調製
5'-ジメトキシトリチル-2'-［O-ヘキシル-（Ω-N-フタルイミド）-アミノ］ウリジン（4g、5.2mmol）を40mlの無水CH2Cl2に溶解した。この溶液に、ジイソプロピルアミンテトラゾリド（0.5g、2.9mmol）を添加して、そして一晩攪拌した。TLC（1：1EtOAc／ヘキサン）は、出発物質が完全に消失したことを示した。反応混合物をCH2Cl2とともに移し、そして飽和NaHCO3溶液（100ml）で洗浄し、その後、飽和NaCl溶液で洗浄した。有機層を無水Na2SO4上で乾燥させ、そして蒸発させて、6.4gの未精製産物を得て、1：1ヘキサン／EtOAcを用いてシリカカラム（200g）中でこの産物を精製し、4.6g（4.7mmol、90％）の望ましいホスホロアミダイトを得た。
【０１２１】
C. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-3'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミド）アミノ］ウリジン-2'-O-スクシニル-アミノプロピル調節孔ガラスの調製
スクシニル化しそしてキャップ化したアミノプロピル調節孔ガラス（CPG；500Å孔直径、アミノプロピルCPG、1.0グラム、Damhaら（Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3813）にしたがって調製）を、100ml丸底フラスコ中、12ml無水ピリジンに添加した。1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチル-カルボジイミド（DEC；0.38グラム、2.0mmol）、トリエチルアミン（TEA；100μl、CaH2上で蒸留）、ジメチルアミノピリジン（DMAP；0.012グラム、0.1mmol）およびヌクレオシド5'-O-ジメトキシトリチル-3'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミドアミノ）］ウリジン（0.6グラム、0.77mmol）をアルゴン下で添加して、そして混合物を機械的に2時間震蘯した。さらにヌクレオシド（0.20グラム）を添加して、そして混合物をさらに24時間震蘯した。CPGをろ過して落とし、そしてジクロロメタン、トリエチルアミン、およびジクロロメタンで、連続して洗浄した。その後、CPGを真空下で乾燥させ、10mlピペリジンに懸濁し、そして15分間震蘯した。CPGをろ過して落とし、ジクロロメタンで徹底的に洗浄して、そして再び真空下で乾燥させた。装填の度合い（498nmで、0.3M p-トルエンスルホン酸中のジメトキシトリチル陽イオンの分光光度アッセイによって測定）は、およそ28μmol／gであった。5'-O-（ジメトキシトリチル）-3'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミドアミノ）］ウリジン-2'-O-スクシニル-アミノプロピル調節孔ガラスを用いて、ホスホロアミダイト化学反応の標準的な条件を用い、ABI 380B DNA合成装置において、オリゴマー、5'-GACU＊-3'および5'-GCC-TTT-CGC-GAC-CCA-ACA-CU＊-3'（配列番号13、＊は誘導体化ヌクレオチドを示す）を合成した。2回および3回の1μmolの合成から、RP-HPLCによる精製および脱塩後、それぞれ45O.D.および200O.Dの4量体および20量体を得た。
【０１２２】
オリゴマー、5'-GACU＊-3'を用いて、NMRによって、オリゴヌクレオチドに導入された3'-O-ヘキシルアミン束縛の構造を確認した。予期されるように、1H NMR中、1.0〜1.8ppmの間に、多重項シグナルが観察された。オリゴマー、5'-GCC-TTT-CGC-GAC-CCA-ACA-CU＊-3'（配列番号13）は、HCV配列に属し、そしてこれを用いて、3'-O-アミノ束縛のヌクレアーゼ耐性特性を示した（実施例5を参照されたい）。
【０１２３】
D. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミド）アミノ］3'-O-スクシニル-アミノプロピル調節孔ガラスの調製
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミドアミド）アミノ］ウリジンを装填過程で用いたことを除いて、実施例4（C）の方法を反復した。
【０１２４】
E. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-（ヘキシルアミノ）-ウリジンの調製
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミドアミノ）］ウリジン（4.5グラム、5.8mmol）を、500mlフラスコ中、200mlメタノールに溶解した。ヒドラジン（1ml、31mmol）を攪拌中の反応混合物に添加した。油槽中で、混合物を60〜65℃に加熱し、そして14時間還流した。溶媒を真空中で蒸発させた。残渣をジクロロメタン（250ml）に溶解し、そして等体積のNH4OHで2回抽出した。有機層を蒸発させて、4.36グラムの未精製産物を得て、そしてNMRによって、この産物が完全には純粋でないことが示された。100％酢酸エチル中、Rf＝0。さらなる精製なしに、続く反応中、この産物を用いた。
【０１２５】
F. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-3'-O-［ヘキシルアミノ］ウリジンの調製
出発物質として5'-O-（ジメトキシトリチル）-3'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミド-アミノ）］ウリジンを用いたことを除いて、実施例4（E）の方法を反復した。
【０１２６】
G. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレンプロピルカルボニル）アミノ］ウリジンの調製
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-（ヘキシルアミノ）ウリジン（0.5g、0.78mmol）を無水DMF（15ml）に溶解した。1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.16グラム、1.17mmol）および1-ピレン-酪酸ペンタフルオロフェニルエステル（0.53g、1.17mmol）を反応混合物に添加した。混合物を室温で2時間、アルゴン下で攪拌し、その後、真空中で濃縮した。残渣DMFをトルエンと同時蒸発させた。残渣をジクロロメタン（50ml）に溶解し、そして等体積の飽和NaHCO3で洗浄した。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機抽出物を等体積の飽和NaClで洗浄した。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮した。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中、50％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させた。望ましい産物（0.83グラム、58％）が100％酢酸エチルで溶出した（薄層クロマトグラフィー（TLC）によるRf、0.46）。
【０１２７】
H. 5'-O-［ジメトキシトリチル］-2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレンプロピルカルボニル）アミノ］ウリジン-3'-O-（2-シアノエチル-N，N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの調製
5'-O-［ジメトキシトリチル］-2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレンプロピルカルボニル）アミノ］ウリジン（0.80グラム、0.87mmol）を20mlの乾燥ジクロロメタンに溶解した。2-シアノエチルN，N，N'，N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（Sigma Chemical Coより購入；800μl、2.4mmol）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（0.090グラム、0.52mmol）を混合物に添加し、これをアルゴン下で20時間攪拌した。その後、反応混合物を真空中で濃縮し、そして残渣をジクロロメタン（75ml）に溶解した。溶液を、等体積の飽和NaHCO3で洗浄した。水性層をジクロロメタン（20ml）で洗浄し、そして合わせた有機層を等体積の飽和NaClで洗浄した。水性層をジクロロメタン（20ml）で洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮した。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中の50％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させた。望ましい産物（750mg、78％収率、100％酢酸エチル中のTLCによるRf、0.54）が100％酢酸エチルで溶出した。
【０１２８】
G. 2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレン-プロピル-カルボニル）アミノ］ウリジンの調製
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレン-プロピル-カルボニル）アミノ］ウリジン（1.0g）を20mlのCH2Cl2に溶解し、そして氷槽中に10分間置いた。冷溶液に、水中の80％酢酸5mlを添加し、そして溶液を30分間放置した。その後、蒸発乾固し、そしてシリカカラムに装填し、そして塩化メチレン中の10％メタノールで溶出して、2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレン-プロピル-カルボニル）アミノ］ウリジンを得た。
【０１２９】
J. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレンプロピルカルボニル）アミノ］ウリジン-3'-O-［スクシニルアミノプロピル］-調節孔ガラスの調製
スクシニル化／キャップ化アミノプロピル調節孔ガラスを、使用直前、真空下で3時間乾燥させた。一部（0.3g）を、50ml丸底フラスコ中、3mlの無水ピリジンに添加した。DEC（0.12グラム、0.63mmol）、TEA（25μl、CaH2上で蒸留）、DMAP（0.005グラム、mmol）および5'-O-（ジメトキシトリチル）-3'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレンプロピルカルボニル）アミノ］ウリジン（0.21グラム、0.22mmol）をアルゴン下で添加して、そして混合物を機械的に19時間震蘯した。さらにヌクレオシド（0.025グラム）を添加して、そして混合物をさらに5.5時間震蘯した。ペンタクロロフェノール（0.045グラム、mmol）を添加して、そして混合物を18時間震蘯した。CPGをろ過して落とし、そしてジクロロメタン、トリエチルアミン、およびジクロロメタンで、連続して洗浄した。その後、生じたCPGを真空下で乾燥させ、15mlピペリジンに懸濁し、そして30分間震蘯した。CPGをろ過して落とし、ジクロロメタンで徹底的に洗浄して、そして再び真空下で乾燥させた。装填の度合い（498nmで、0.3M p-トルエンスルホン酸中のジメトキシトリチル陽イオンの分光光度アッセイによって測定）は、およそ27μmol／gであった。続いて、産物である固体支持体を用いて、オリゴマーを合成した。
【０１３０】
K. 5'-O-ジメトキシトリチル-3'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレンプロピルカルボニル）アミノ］ウリジン-2'-O-（スクシニルアミノプロピル）調節孔ガラスの調製
5'-O-ジメトキシトリチル-3'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレンプロピルカルボニル）アミノ］ウリジンを用いることを除いて、実施例4（J）の方法を反復する。
【０１３１】
L. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（5-チオカルボニル-3，6-ジピボリル-フルオレセイン）アミノ］ウリジンの調製
フルオレセイン・イソチオシアネート（Cal Biochem、カリフォルニア州ラホヤから入手可能なIsomer I）を、Et3N／THF中の12等量の塩化ピボリルで処理して、ジ-O-ピボリル・フルオレセイン・イソチオシアネートを得た。3：1ヘキサン：酢酸エチルを用いて、シリカゲルカラム中で、この化合物を精製した。その後、ヌクレオシド、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-（ヘキシルアミノ）ウリジンを、CH2Cl2／ピリミジン中、ジピボリル・フルオレセイン・イソチオシアネートと縮合した。その後、シリカカラムにおいて、100％酢酸エチルを用いることによって、生じた化合物、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（5-チオカルボニル-3，6-ジピボリル-フルオレセイン）アミノ］ウリジンを精製する。
【０１３２】
M. 5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［ヘキシル-N-（5-チオカルボニル-3，6-ジ-ピボリルフルオレセイン）アミノ］ウリジン-3'-O-（2-シアノエチル, N-N-ジイソプロピルホスホロアミダイトの調製
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（5-チオカルボニル-3，6-ジピボリルフルオレセイン）アミノ］ウリジン（0.75グラム、0.672mmol）を乾燥ジクロロメタン（20ml）中に溶解した。2-シアノエチルN，N，N'，N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（700μl、2.2mmol）およびジイソプロピルアミンテトラゾリドを混合物に添加し、これをアルゴン下で16時間攪拌した。その後、反応混合物を真空中で濃縮し、そして残渣をジクロロメタン（75ml）に溶解し、その後、等体積の飽和NaHCO3で洗浄した。水性層をジクロロメタン（50ml）で洗浄し、そして合わせた有機層を等体積の飽和NaClで洗浄した。水性層をジクロロメタン（50ml）で洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮した。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中の25％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させた。望ましい産物（670mg、77％収率、TLCによるRf、0.79）が100％酢酸エチルで溶出した。
【０１３３】
N. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（5-チオカルボニル-3，6-ジ-ピボリルフルオレセイン）アミノ］ウリジン-3'-O-（スクシニルアミノプロピル）調節孔ガラスの調製
スクシニル化しそしてキャップ化したアミノプロピル調節孔ガラス（CPG）を、使用直前、真空下で3時間乾燥させる。CPG（0.3グラム）を、50ml丸底フラスコ中、3mlの無水ピリジンに添加する。DEC（0.12グラム、0.63mmol）、TEA（25μl、CaH2上で蒸留）、DMAP（ジメチルアミノピリジン）（0.005グラム、0.04mmol）および5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［ヘキシル-N-（5-チオカルボニル-3，6-ジ-ピボリルフルオレセイン）アミノ］ウリジン（0.21グラム、0.19mmol）をアルゴン下で添加して、そして混合物を機械的に19時間震蘯する。さらにヌクレオシド（0.025グラム）を添加して、そして混合物をさらに5.5時間震蘯する。ペンタクロロフェノール（0.045グラム、0.17mmol）を添加して、そして混合物を18時間震蘯する。CPGをろ過して落とし、そしてジクロロメタン、トリエチルアミン、およびジクロロメタンで、連続して洗浄する。その後、CPGを真空下で乾燥させ、15mlピペリジンに懸濁し、そして30分間震蘯する。CPGをろ過して落とし、ジクロロメタンで徹底的に洗浄して、そして再び真空下で乾燥させる。その後、498nmで、0.3M p-トルエンスルホン酸中のジメトキシトリチル陽イオンの分光光度アッセイによって、装填の度合いを測定する。
【０１３４】
O. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（3-オキシカルボニル-コレステリル）アミノ］ウリジンの調製
ヌクレオシド、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシルアミノ］-ウリジン（3.85g、6.0mmol）を無水ピリジン／ジクロロメタン50／50（v／v）（20ml）に溶解した。クロロギ酸コレステリル（Fluka、3.0g、6.68mmol）を無水ジクロロメタン（20ml）に溶解し、そしてシリンジを用いて、アルゴン下で、攪拌中の反応混合物にゆっくり添加した。混合物を室温で2時間、アルゴン下で攪拌し、その後、真空中で濃縮した。残渣DMFをトルエンと同時蒸発させた。残渣をジクロロメタン（50ml）に溶解し、そして等体積の飽和NaHCO3で洗浄した。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機抽出物を等体積の飽和NaClで洗浄した。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮した。ヘキサン中の25％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配を用いて、残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフした。望ましい産物（3.78g、60％）が100％酢酸エチルで溶出した（TLCによるRf、0.41）。
【０１３５】
P. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（3-オキシカルボニル-コレステリル）アミノ］ウリジン-3'-O-［2-シアノエチル-N，N-ジイソプロピル］ホスホロアミダイトの調製
ヌクレオシド、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（3-オキシカルボニル-コレステリル）アミノ］ウリジン（3.44グラム、3.3mmol）を乾燥ジクロロメタン（75ml）に溶解した。2-シアノエチルN，N，N'，N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（Sigma、2.1ml、6.6mmol）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（0.29g、1.7mmol）を混合物に添加し、これをアルゴン下で16時間攪拌した。ジクロロメタン（75ml）を溶液に添加し、これを等体積の飽和NaHCO3で洗浄した。水性層を等体積のジクロロメタンで洗浄した。水性層をジクロロメタン（30ml）で洗浄し、そして合わせた有機層を等体積の飽和NaClで洗浄した。水性層をジクロロメタン（30ml）で洗浄し、そして合わせた有機層をMg2SO4上で乾燥させ、そして真空中で濃縮した。ヘキサン中の25％酢酸エチル〜70％酢酸エチルの勾配を用いて、残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフした。望ましい産物（3.35g、82％収率、ヘキサン中の50％酢酸エチル中のTLCによるRf、0.71）が50％酢酸エチルで溶出した。
【０１３６】
Q. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（3-オキシカルボニル-コレステリル）アミノ］ウリジン-3'-O-（スクシニルアミノプロピル）-調節孔ガラスの調製
スクシニル化しそしてキャップ化した調節孔ガラス（0.3グラム）を、15ml梨型フラスコ中、2.5mlの無水ピリジンに添加する。DEC（0.07グラム、0.36mmol）、TEA（100μl、CaH2上で蒸留）、DMAP（0.002グラム、0.016mmol）および5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（3-オキシカルボニル-コレステリル）アミノ］ウリジン（0.25グラム、0.23mmol）をアルゴン下で添加して、そして混合物を機械的に16時間震蘯する。さらにヌクレオシド（0.20グラム）を添加して、そして混合物をさらに18時間震蘯する。ペンタクロロフェノール（0.03グラム、0.11mmol）を添加して、そして混合物を9時間震蘯する。CPGをろ過して落とし、そしてジクロロメタン、トリエチルアミン、およびジクロロメタンで、連続して洗浄する。その後、CPGを真空下で乾燥させ、10mlピペリジンに懸濁し、そして15分間震蘯する。CPGをろ過して落とし、ジクロロメタンで徹底的に洗浄して、そして再び真空下で乾燥させる。装填の度合いは、498nm、0.3M p-トルエンスルホン酸中のジメトキシトリチル陽イオンの分光光度アッセイによると、およそ39μmol／gと測定される。
【０１３７】
R. 5'-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（2，4-ジニトロフェニル）アミノ］ウリジンの調製
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-（ヘキシルアミノ）ウリジン（0.88グラム、1.37mmol）をメタノール（20ml）に溶解した。2，4-ジニトロフルオロベンゼン（DNFB、0.25グラム、1.37mmol）を添加して、そして混合物を機械的震蘯装置上で震蘯した。反応をTLCによって監視した。90分後、さらに0.25グラムのDNFBを添加して、そして反応混合物をさらに30分間震蘯し、その後、さらに0.25グラムのDNFBを添加した。2.5時間震蘯した後、混合物を真空中で濃縮し、そしてシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中、25％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させた。望ましい産物（0.51グラム、46％）が100％酢酸エチルで溶出した（TLCによるRf、0.85）。
【０１３８】
S. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（2，4-ジニトロフェニル）アミノ］ウリジン-3'-O-（2-シアノエチル-N，N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの調製
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（2，4-ジニトロフェニル）アミノ］ウリジン（0.45グラム、0.55mmol）を乾燥ジクロロメタン（12ml）に溶解した。2-シアノエチルN，N，N'，N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（380μl、1.2mmol）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（0.041グラム、0.024mmol）を混合物に添加し、これをアルゴン下で16時間攪拌した。その後、反応混合物を真空中で濃縮し、そして残渣をジクロロメタン（75ml）に溶解し、その後、等体積の飽和NaHCO3で洗浄した。水性層をジクロロメタン（25ml）で洗浄し、そして合わせた有機層を等体積の飽和NaClで洗浄した。水性層をジクロロメタン（25ml）で洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮した。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中の20％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させた。望ましい産物（510mg泡状物質、93％収率、TLCによるRf、0.70）が100％酢酸エチルで溶出した。31PNMR（CDCl3）：150.56および150.82ppm。
【０１３９】
T. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（2，4-ジニトロフェニル）アミノ］ウリジン-3'-O-［スクシニルアミノプロピル］調節孔ガラスの調製
スクシニル化しそしてキャップ化した調節孔ガラス（0.3グラム）を、50ml丸底フラスコ中、3mlの無水ピリジンに添加する。DEC（0.12グラム、mmol）、TEA（25μl、CaH2上で蒸留）、DMAP（0.005グラム、0.041mmol）および5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（2，4-ジニトロフェニル）アミノ］ウリジン（0.21グラム、0.26mmol）をアルゴン下で添加して、そして混合物を機械的に19時間震蘯する。さらにヌクレオシド（0.025グラム）を添加して、そして混合物をさらに5.5時間震蘯する。ペンタクロロフェノール（0.045グラム、0.16mmol）を添加して、そして混合物を18時間震蘯する。CPGをろ過して落とし、そしてジクロロメタン、トリエチルアミン、およびジクロロメタンで、連続して洗浄する。その後、CPGを真空下で乾燥させ、15mlピペリジンに懸濁し、そして15分間震蘯する。CPGをろ過して落とし、ジクロロメタンで徹底的に洗浄して、そして再び真空下で乾燥させる。装填の度合いは、498nm、0.3M p-トルエンスルホン酸中のジメトキシトリチル陽イオンの分光光度アッセイによると、およそ29μmol／gと測定される。
【０１４０】
U. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（Nα-ニミド-ジ-FMOC-L-ヒスチジル）アミノ］ウリジンの調製
ヌクレオシド、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-（ヘキシルアミノ）ウリジン（0.97g、1.51mmol）をジクロロメタン（25ml）に溶解し、そして氷槽中で0℃に冷却した。Nα，ニミド-ジ-FMOC-L-ヒスチンペンタフルオロフェニルエステル（2.4g、3.1mmol、Sigmaから購入）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.32g、0.24mmol、Flukaから購入）をアルゴン下で攪拌中の攪拌反応混合物に添加した。15分後、氷槽を取り除き、そして混合物を室温で72時間、アルゴン下で攪拌した。混合物を真空中で濃縮し、そしてシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中、50％酢酸エチル〜70％酢酸エチルの勾配で溶出させた。望ましい産物（0.53g、28％）が70％酢酸エチルで溶出した（100％酢酸エチル中のTLCによるRf、0.53）。
【０１４１】
V. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（Nα-ニミド-ジ-FMOC-L-ヒスチジル）-アミノ］-ウリジン-3'-O-［2-シアノエチル-N，N-ジイソプロピル］ホスホロアミダイトの調製
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［ヘキシル-N-（Nα-ニミド-ジ-FMOC-L-ヒスチジル）アミノ］ウリジン（1.9g、1.6mmol）を乾燥ジクロロメタン（20ml）に溶解する。2-シアノエチルN，N，N'，N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（800μl、2.4mmol）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（0.090グラム、0.52mmol）を混合物に添加し、これをアルゴン下で20時間攪拌する。その後、反応混合物を真空中で濃縮し、そして残渣をジクロロメタン（75ml）に溶解する。溶液を、等体積の飽和NaHCO3で洗浄する。水性層をジクロロメタン（20ml）で洗浄し、そして合わせた有機層を等体積の飽和NaClで洗浄する。水性層をジクロロメタン（20ml）で洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮する。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中の50％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させる。望ましい産物が100％酢酸エチルで溶出する。
【０１４２】
W. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（Nα-ニミド-ジ-FMOC）-L-ヒスチジル）アミノ］ウリジン-3'-O-［スクシニルアミノプロピル］調節孔ガラスの調製
スクシニル化しそしてキャップ化した調節孔ガラス（使用直前、真空下で3時間乾燥；0.3グラム）を、50ml丸底フラスコ中、3mlの無水ピリジンに添加する。DEC（0.12グラム、0.63mmol）、TEA（25μl、CaH2上で蒸留）、DMAP（0.005グラム、0.04mmol）および5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（Nα-ニミド-ジ-FMOC）-L-ヒスチジル］アミノ］ウリジン（0.21グラム、0.17mmol）をアルゴン下で添加して、そして混合物を機械的に19時間震蘯する。さらにヌクレオシド（0.025グラム）を添加して、そして混合物をさらに5.5時間震蘯する。ペンタクロロフェノール（0.045グラム、0.17mmol）を添加して、そして混合物を18時間震蘯する。CPGをろ過して落とし、そしてジクロロメタン、トリエチルアミン、およびジクロロメタンで、連続して洗浄する。その後、CPGを真空下で乾燥させ、15mlピペリジンに懸濁し、そして15分間震蘯する。CPGをろ過して落とし、ジクロロメタンで徹底的に洗浄して、そして再び真空下で乾燥させる。装填の度合いは、498nm、0.3M p-トルエンスルホン酸中のジメトキシトリチル陽イオンの分光光度アッセイによると、およそ27μmol／gと測定される。
【０１４３】
X. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（Ω-メチル-ポリエチレングリコール-プロピオノイル）アミノ］ウリジンの調製
ヌクレオシド、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシルアミノ］ウリジン（1g、1.55mmol）を無水DMF（15ml）に溶解する。1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.24グラム、1.75mmol）およびポリエチレングリコール-プロピオン酸-NHS-エステル（1.23g、1.75mmol）を反応混合物に添加する。混合物を室温で2時間、アルゴン下で攪拌し、その後、真空中で濃縮する。残渣DMFをトルエンと同時蒸発させる。残渣をジクロロメタン（50ml）に溶解し、そしてその後、等体積の飽和NaHCO3で洗浄する。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機抽出物を等体積の飽和NaClで洗浄する。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮する。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中、50％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させる。望ましい産物（1.08g、58％）が100％酢酸エチルで溶出した。
【０１４４】
Y. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（Ω-メチル-ポリエチレングリコール-プロピオノイル）アミノ］ウリジン-3'-O-（2-シアノエトキシ-N，N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの調製
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（Ω-メチル-ポリエチレングリコール-プロピオノイル）アミノ］ウリジン（1.04グラム、0.87mmol）を乾燥ジクロロメタン（20ml）に溶解する。2-シアノエチルN，N，N'，N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（800μl、2.4mmol）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（0.090グラム、0.52mmol）を混合物に添加し、これをアルゴン下で20時間攪拌する。その後、反応混合物を真空中で濃縮し、そして残渣をジクロロメタン（75ml）に溶解する。溶液を、等体積の飽和NaHCO3で洗浄する。水性層をジクロロメタン（20ml）で洗浄し、そして合わせた有機層を等体積の飽和NaClで洗浄する。水性層をジクロロメタン（20ml）で洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮する。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中の50％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させる。望ましい産物が100％酢酸エチルで溶出する。
【０１４５】
Z. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（Ω-メチル-ポリエチレングリコール-プロピオノイル）アミノ］ウリジン-3'-O-［スクシニル-アミノプロピル］調節孔ガラスの調製
スクシニル化しそしてキャップ化した調節孔ガラス（CPG）を、使用直前、真空下で3時間乾燥させる。調節孔ガラス（0.3グラム）を、50ml丸底フラスコ中、3mlの無水ピリジンに添加する。DEC（0.12グラム、0.67mmol）、TEA（25μl、CaH2上で蒸留）、DMAP（0.005グラム、mmol）および5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（w-メチル-ポリエチレングリコール-ピロピオノイル）アミノ］ウリジン（0.21グラム、0.175mmol）をアルゴン下で添加して、そして混合物を機械的に19時間震蘯する。さらにヌクレオシド（0.025グラム）を添加して、そして混合物をさらに5.5時間震蘯する。ペンタクロロフェノール（0.045グラム、0.17mmol）を添加して、そして混合物を18時間震蘯する。CPGをろ過して落とし、そしてジクロロメタン、トリエチルアミン、およびジクロロメタンで、連続して洗浄する。その後、CPGを真空下で乾燥させ、15mlピペリジンに懸濁し、そして15分間震蘯する。CPGをろ過して落とし、ジクロロメタンで徹底的に洗浄して、そして再び真空下で乾燥させた。装填の度合いは、498nm、0.3M p-トルエンスルホン酸中のジメトキシトリチル陽イオンの分光光度アッセイによると、およそ18μmol／gと測定される。
【０１４６】
AA.マクロサイクル誘導体化ヌクレオシドの調製
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-（ヘキシルアミン）ウリジンを、マクロサイクル4-｛1，4，8，11-テトラアザ-［トリ-（トリフルオロアセチル）シクロテトラデック-1-イル］｝メチル安息香酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（Simon Jonesら（Bioconjugate Chem. 1991, 2, 416）にしたがって調製）で、実施例3の方法と同様に処理して、産物を得る。
【０１４７】
AB.マクロサイクル誘導体化ウリジンホスホロアミダイトの調製
実施例4（AA）のヌクレオシド産物を実施例4（B）の方法と同様に処理して、産物を得る。
【０１４８】
AC.マクロサイクル誘導体化ヌクレオシドで誘導体化したCPGの調製
実施例4（AA）のヌクレオシド産物を実施例4（C）の方法と同様に処理して、産物を得る。
【０１４９】
AD. 5'-O-（ジメトキシルトリチル）-2'-O-（ヘキシル-N-（フォレート）アミノ）ウリジンの調製
葉酸ペンタフルオロフェニルエステル（イソブチリル保護基で保護）で、実施例4（A）の方法と同様に、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-（ヘキシルアミン）ウリジンを処理して、産物を得る。
【０１５０】
AE. 5'-O-（ジメトキシルトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（フォレート）アミノ］ウリジン-3'-O-（2-シアノエトキシ-N，N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの調製
実施例4（AB）のヌクレオシド産物を実施例4（B）の方法と同様に処理して、産物を得る。
【０１５１】
AF. 5'-O-（ジメトキシルトリチル）-2'-O-（ヘキシル-N-（フォレート）アミノ）ウリジンヌクレオシドの調製
実施例4（AE）のヌクレオシド産物を実施例4（C）の方法と同様に処理して、産物を得る。
【０１５２】
AG. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-｛ヘキシル-N-［2-メトキシ-6-クロロ-9（Ω-アミノ-カプロイル）アクリジン］アミノ｝ウリジンの調製
6，9-ジクロロ-2-メトキシアクリジン（Adlrich、10g、36mmol）およびフェノール（2.5g）を、攪拌バーを入れた丸底フラスコにともに入れ、そしてこれに6-アミノ-ヘキサン酸（9.3g、71mmol）を添加して、そしてフラスコを100℃（油槽）に2時間加熱した。TLC（塩化メチレン中10％メタノール）によって、出発物質が完全に消失したことが示された。反応混合物を冷却し、そして200mlのメタノールに注いだ。産物を黄色固体（約10g）として単離する。その後、この化合物をペンタフルオロフェノールエステルに変換した。
【０１５３】
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-（ヘキシルアミノ）ウリジン（0.5g、0.78mmol）を無水DMF（15ml）に溶解する。1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（0.16グラム、1.17mmol）および2-メトキシ-6-クロロ-9-（Ω-カプロイル-アミノ）アクリジンペンタフルオロフェニルエステル（0.53グラム、1.17mmol）を反応混合物に添加する。混合物を室温で2時間、アルゴン下で攪拌し、その後、真空中で濃縮する。残渣DMFをトルエンと同時蒸発させる。残渣をジクロロメタン（50ml）に溶解し、そして等体積の飽和NaHCO3で洗浄する。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機抽出物を等体積の飽和NaClで洗浄する。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮する。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中、50％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させる。望ましい産物が100％酢酸エチルで溶出する。
【０１５４】
AH. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-｛ヘキシル-N-［2-メトキシ-6-クロロ-9-（Ω-アミノ-カプロイル）アクリジン］アミノ｝ウリジン-3'-O-（2-シアノエチル-N-N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイトの調製
5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-｛ヘキシル-N-［2-メトキシ-6-クロロ-9-（w-アミノ-カプロイル）アクリジン］アミノ｝ウリジン（0.80グラム、0.77mmol）を乾燥ジクロロメタン（20ml）に溶解する。2-シアノエチルN，N，N'，N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイト（800μl、2.4mmol）およびジイソプロピルアミンテトラゾリド（0.090グラム、0.52mmol）を混合物に添加し、これをアルゴン下で20時間攪拌する。その後、反応混合物を真空中で濃縮し、そして残渣をジクロロメタン（75ml）に溶解する。溶液を、等体積の飽和NaHCO3で洗浄する。水性層をジクロロメタン（20ml）で洗浄し、そして合わせた有機層を等体積の飽和NaClで洗浄する。水性層をジクロロメタン（20ml）で洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮する。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中の50％酢酸エチル〜92％酢酸エチルの勾配で溶出させる。望ましい産物が100％酢酸エチルで溶出する。
【０１５５】
AI. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-｛ヘキシル-N-［2-メトキシ-6-クロロ-9-（Ω-アミノカプロイル）アクリジン］アミノ｝ウリジン-3'-O-［スクシニルアミノプロピル］調節孔ガラスの調製
スクシニル化しそしてキャップ化した調節孔ガラス（0.3グラム）を、50ml丸底フラスコ中、3mlの無水ピリジンに添加する。DEC（0.12グラム、0.67mmol）、TEA（25μl、CaH2上で蒸留）、DMAP（0.005グラム、0.04mmol）および5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-｛ヘキシル-N-［2-メトキシ-6-クロロ-9-（Ω-アミノカプロイル）アクリジン］アミノ｝ウリジン（0.21グラム、0.17mmol）をアルゴン下で添加して、そして混合物を機械的に19時間震蘯する。さらにヌクレオシド（0.025グラム）を添加して、そして混合物をさらに5.5時間震蘯する。ペンタクロロフェノール（0.045グラム、0.17mmol）を添加して、そして混合物を18時間震蘯する。CPGをろ過して落とし、そしてジクロロメタン、トリエチルアミン、およびジクロロメタンで、連続して洗浄する。その後、CPGを真空下で乾燥させ、15mlピペリジンに懸濁し、そして15分間震蘯する。CPGをろ過して落とし、ジクロロメタンで徹底的に洗浄して、そして再び真空下で乾燥させる。装填の度合いは、498nm、0.3M p-トルエンスルホン酸中のジメトキシトリチル陽イオンの分光光度アッセイによると、およそ27μmol／gと測定される。
【０１５６】
AJ. 5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［（ヘキシル-N，N-ジメチル）アミノ］ウリジンの調製
5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-（ヘキシルアミノ）ウリジン（0.19グラム、0.29mmol）を4mlメタノールに溶解する。酢酸ナトリウムpH4.0（2ml）、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（0.02グラム、0.3mmol）および水中の37％ホルムアルデヒド（300μl）を反応混合物に添加し、これを2時間攪拌し、その後、真空中で濃縮する。残渣をジクロロメタン（50ml）に溶解し、そして等体積の飽和NaHCO3で洗浄する。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機抽出物を等体積の飽和NaClで洗浄する。水性層をジクロロメタンで洗浄し、そして合わせた有機層をMgSO4上で乾燥させ、そして濃縮する。残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフし、ヘキサン中、50％酢酸エチル〜100％酢酸エチルの勾配で溶出させる。望ましい産物（0.15グラム、80％）が10％メタノール-90％酢酸エチルで溶出する。
【０１５７】
実施例5：3'-アルキルアミノ基を有するオリゴヌクレオチド
実施例4（C）の3'-O-ヘキシル-（N-フタルイミド）-アミノウリジン-CPG、すなわち5'-O-ジメトキシトリチル-3'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミドアミノ）］-ウリジン-2'-O-（スクシニル-アミノプロピル）調節孔ガラスを用いて、以下のオリゴヌクレオチドを合成した：
【０１５８】
【化１４】
2005518452.tif 000019
【０１５９】
ここで、「＊」は3'-O-ヘキシルアミノ修飾ヌクレオシドを表す。380B ABI装置（Applied Biosystems）において、製造者に明記される合成周期数で、標準的な商業的ホスホロアミダイトを用いた。
【０１６０】
3'末端で3'-O-アルキルアミン所持オリゴヌクレオチドの構造を確認するのにオリゴマー49を用いた。スペクトルにおいて、期待される3つの31P NMRシグナル（-0.5ppm、-0.25ppm、-0.2ppm）および1H NMR中、微量芳香族塩基領域に7つの線が示された。
【０１６１】
このアルキルアミノ基が提供するヌクレアーゼ耐性を立証するのに、オリゴマー51を用い、そしてまた、このオリゴマーをさらなるコンジュゲート化にも用いた。このオリゴマーを、0.2M NaHCO3緩衝液／DMF中のピレン-酪酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルで処理した。この産物、コンジュゲート1をHPLCおよびサイズ排除法によって精製した。HPLC保持時間（5％CH3CNで10分間、その後、5％〜40％CH3CNで50分間の勾配で溶出）は以下のとおりであった：オリゴマー50、25.99分；オリゴマー51、25.91分；およびコンジュゲート1、49.35分。
【０１６２】
HeLa細胞質抽出物／核抽出物中、オリゴマー50に対して、オリゴマー51およびコンジュゲートのヌクレアーゼ安定性を試験した。細胞抽出物を1.4倍希釈した。オリゴヌクレオチドの最終濃度は20μMであった。オリゴヌクレオチドの半減期は以下のとおりであった：オリゴマー50、1.0時間；オリゴマー51、3.5時間；およびコンジュゲート1、3.6時間。
【０１６３】
ホスホジエステルオリゴマー50の半減期は、3'端を自身のヘキシルアミノ基で修飾する、単純な修飾によって、3〜4倍増加し、この特性は、さらなるコンジュゲート化には影響を受けなかった。
【０１６４】
実施例6：2'-O-修飾オリゴヌクレオチド
A. GCGTGU＊CTGCG（U＊はヘキシル-（Ω-N-フタルイミド）アミノ）-ウリジンである）
実施例4（B）のホスホロアミダイト、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-（Ω-N-フタルイミド）アミノ］-ウリジン-3'-O-［（2-シアノエチル）-N，N-ジイソプロピル］ホスホロアミダイトを、無水CH3CN中の0.2M溶液として作成し、そしてABI DNA合成装置、モデル380Bにおいて、以下のオリゴヌクレオチドを合成するのに用いた。修飾アミダイトカップリング中、反応時間を10分間に増加させた。カップリング効率がおよそ90％であることが観察された。濃縮水酸化アンモニウムで脱保護した（55℃、16時間）後、逆相HPLCおよび脱塩カラム（Sephadex G-25）によって精製した：
【０１６５】
【化１５】
2005518452.tif 000020
【０１６６】
B. GCGTGTU'CTGCG（U'は2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレン-プロピル-カルボニル）アミノウリジン］である）、コンジュゲート2（オリゴマー52-ピレン酪酸コンジュゲート）
エッペンドルフ試験管中、200μlの0.2M NaHCO3緩衝液中の20O.D.のオリゴマー52に、5mlのピレン-酪酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加し、その後、200μlのDMFを添加した。試験管を一晩震蘯した。サイズ排除およびHPLCによって、反応を精製して、18O.D.の産物を得た。
【０１６７】
C. GCGTGTU”CTGCG（U”は2'-O-［6-ブロモアセチミド-ヘクス-1イル］-ウリジンである）、コンジュゲート3（オリゴマー52-ブロモアセテートコンジュゲート）
100μlの0.2M NaHCO3緩衝液中の12O.D.のオリゴマー52に、2mgのブロモ酢酸-NHSエステル（N-ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテート）を添加した。反応を一晩放置した後、サイズ排除およびHPLCによって精製して、7.5O.D.の産物を得た。
【０１６８】
D. GCGTGTU＾CTGCG（U＾は2'-O-［ヘキシル-N-（ポリエチレングリコール）-プロピオノイル］アミノウリジンである）、コンジュゲート4（オリゴマー52-PEGコンジュゲート）
200μlの0.2M NaHCO3緩衝液中、24O.D.のオリゴマー52に、20mgのポリエチレングリコールプロピオン酸-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを添加した。反応を機械的に一晩震蘯し、そしてSephadex G-25サイズ排除およびクロマトグラフィーによって精製して、22O.D.の産物を得た。
【０１６９】
HPLC保持時間（C-18 Delta-Pak逆相カラムにおいて、5％CH3CNで10分間、その後、5％〜40％CH3CNで50分間の勾配で溶出）は以下のとおりであった：オリゴマー52、24.05分；コンジュゲート2、40.80分；コンジュゲート3、26.04分；およびコンジュゲート4、55.58分。
【０１７０】
DNAおよびRNA両方に対して、ピレンコンジュゲート化によるTm変化を評価した。4μMの鎖濃度で、100mM Na＋、10nMホスフェート、0.1mM EDTA、pH7において、Tmを測定した。
結果は以下のとおりであった：
【０１７１】
【表５】
2005518452.tif 000021
【０１７２】
括弧内の値は、対照としてのオリゴマー52のアミノリンカーに比較した、Tmの変化である。
実施例7：2'-O-ヘキシルアミノ官能化ウリジンホスホロアミダイトを用いたオリゴヌクレオチド合成
A. 2'-O-ヘキシルアミノ（ピレンブチレート）ウリジンホスホロアミダイト
アミダイト、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（1-ピレンプロピルカルボニル）アミノ］ウリジン-3'-O-（2-シアノエチル-N，N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（無水アセトニトリル中、0.2M）を用いて、ともにNMR研究用である、以下のオリゴマーを合成した：
【０１７３】
【化１６】
2005518452.tif 000022
【０１７４】
ここで、U＊は2'-O-修飾ホスホロアミダイトである。
これらのオリゴマーをトリチル-オンで逆相HPLC精製し、80％酢酸中で1時間、脱トリチル化し、そしてその後、RP-HPLCで再精製し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーで脱塩した。NMR分析によって、ピレンピークの存在を示した。
【０１７５】
B. 2'-O-ヘキシルアミノ（ジニトロフェニル）ウリジンホスホロアミダイト
アミダイト、5'-O-（ジメトキシトリチル）-2'-O-［ヘキシル-N-（2，4-ジニトロフェニル）アミノ］ウリジン-3'-O-（2-シアノエチル-N，N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（無水アセトニトリル中、0.18M）を用いて、オリゴヌクレオチド、オリゴマー56〜63を合成した。すべて、ICAMアンチセンス配列の類似体である。これらのオリゴマーをトリチル-オンでRP-HPLC（Waters Delta-Pak C18カラム、300Å、7.8mmx30cm、0.05M TEAA pH7.3中、5〜60％アセトニトリルの直線50分間勾配）によって精製し、80％酢酸中で1時間、脱トリチル化し、そしてその後、RP-HPLCで精製し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーで脱塩した。データを以下の表6に要約する：
【０１７６】
【表６】
2005518452.tif 000023
【０１７７】
＃＝非ヌクレオシド6炭素アミノリンカー（Glen Research）であり、そして太字は2'-O-メチル置換を有するヌクレオチドを示す
C. 2'-O-［ヘキシルアミノ-（コレステロール）］ウリジンホスホロアミダイトを用いたオリゴヌクレオチド合成
アミダイト、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［ヘキシル-N-（3-オキシカルボニル-コレステリル）アミノ］ウリジン-3'-O-［2-シアノエチル-N，N-ジイソプロピル］-ホスホロアミダイト（無水アセトニトリル／ジクロロメタン2：1、v／v中、0.2M）を用いて、オリゴマー67〜74を合成した。これらのオリゴマーをトリチル-オンで逆相HPLC（Waters Delta-Pak C18カラム、300Å、7.8mmx30cm、0.05M TEAA pH7.3中、5〜80％アセトニトリルの直線55分間勾配）によって精製し、80％酢酸中で1時間、脱トリチル化し、そしてその後、RP-HPLCで再精製し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーで脱塩した。データを以下の表7に要約する。
【０１７８】
【表７】
2005518452.tif 000024
【０１７９】
（Fl-U＝フルオレセインでのU2'修飾；実施例8（A）を参照されたい）
D. 2'-O-［ヘキシルアミノ-（フルオレセイン）］アミダイトを用いたオリゴヌクレオチド合成
アミダイト、5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-［ヘキシル-N-（5-チオカルボニル-3，6-ジピボリルフルオレセイン）アミノ］ウリジン-3'-O-（シアノエチル-N，N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイト）（無水アセトニトリル中、0.2M）を用いて、1x105μmol規模（オリゴマー75）または1x102μmol規模（残りのオリゴマー）で、オリゴマー74（上記）およびオリゴマー75〜82を合成した。これらのオリゴマーをトリチル-オンで逆相HPLC（Waters Delta-Pak C18、300Å、7.8mmx30cm、0.05M TEAA pH7.3中、アセトニトリルの直線勾配）によって精製し、80％酢酸中で1時間、脱トリチル化し、そしてその後、RP-HPLCで再精製し、そしてサイズ排除クロマトグラフィーで脱塩した。
【０１８０】
【表８】
2005518452.tif 000025
【０１８１】
実施例8：誘導体化チミジンホスホロアミダイトの調製
A. 3-ベンジルオキシメチル-3'-ベンジルオキシメチル-5'-O-tert-ブチルジフェニルシリルチミジン
機械的に攪拌している、塩化メチレン中の5'-O-tertブチルジフェニルシリルチミジン（170g、350mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（200g、1547mmol）の溶液に、一滴ずつベンジルクロロメチルエーテル（171g、1092mmol）を添加した。穏やかな発熱が完了したら、反応を40℃に16時間加熱した。加熱したら、反応を冷5％HCl、H2O、飽和NaHCO3で洗浄し、乾燥させ（MgSO4）、そして真空中で濃縮した。生じた油をシリカゲルでクロマトグラフして（EtOAc／ヘキサン、8／2）、粘性油、251g（71％）として産物を得た。
【０１８２】
【化１７】
2005518452.tif 000026
【０１８３】
B. 3-ベンジルオキシメチル-3'-ベンジルオキシメチルチミジン
THF（200ml）中の3-ベンジルオキシメチル-3'-ベンジルオキシメチル-5'-O-tert-ブチルジフェニルシリルチミジン（20g、28mmol）の溶液をtert-ブチルアンモニウムフロリド1M／THF（40ml、40mmol）で、室温で16時間処理した。溶液を真空中で濃縮して、そして生じた油をシリカゲルでクロマトグラフして（EtOAc／ヘキサン、7／3→8／2）、産物10g（75％）、融点83〜84℃を得た。
【０１８４】
【化１８】
2005518452.tif 000027
【０１８５】
C. 3-ベンジルオキシメチル-3'-ベンジルオキシメチルチミジン-5'-アルデヒド
DMSO（200ml）中の3-ベンジルオキシメチル-3'-ベンジルオキシメチルチミジン（14.5g、30mmol）の溶液をDCC（33g、160mmol）およびリン酸85％（2.0g）で16時間処理した。反応混合物をろ過し、そして真空中で濃縮した。生じた油をシリカゲルでクロマトグラフして（EtOAc／ヘキサン、7／3）、粘性油、11g（76％）として産物を得た。
【０１８６】
【化１９】
2005518452.tif 000028
【０１８７】
D. 3-ベンジルオキシメチル-3'-O-ベンジルオキシメチル-5'-デオキシ-5'-N-（オクタ-デシルアミノ）チミジン
テトラヒドロフラン（250ml）中の3-ベンジルオキシメチル-3'-ベンジルオキシメチルチミジン-5'-アルデヒド（11g、23mmol）および分子ふるい-4a（12g）の懸濁物を、オクタデシルアミン（8g、30mmol）で、室温で16時間処理した。その後、混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウム（95％、2.2g、33mmol）で処理し、そしてさらに16時間攪拌した。反応混合物をろ過し、真空中で濃縮し、EtOAc／H2O間で分配し、分離し、乾燥させ、そして真空中で再濃縮した。生じたゴム状物質をシリカゲルでクロマトグラフして、白色粉末を得た。再結晶化（MeOH）によって、産物、3.8g（23％）、融点60〜62℃を得た。
【０１８８】
【化２０】
2005518452.tif 000029
【０１８９】
E. 3-ベンジルオキシメチル-3'-O-ベンジルオキシメチル-5'-デオキシ-5'-N-（オクタ-デシルアミノトリフルオロアセチル）チミジン
CH2CH2（150ml）中の3-ベンジルオキシメチル-3'-O-ベンジルオキシメチル-5'-デオキシ-5'-N-（オクタデシルアミノ）チミジン（5.8g、79mmol）およびTEA（4.0ml、28mmol）の溶液に無水トリフルオロ酢酸（1.2ml、85mmol）を添加した。2時間後、TLCによって反応が完了したことが示された。反応を＜40℃、真空中で濃縮し、そしてMeOH（2x25ml）と同時蒸発させた。シリカゲルのクロマトグラフィー（EtOAc／ヘキサン、1／1）によって、産物、6.4g（98％）を得た。
【０１９０】
【化２１】
2005518452.tif 000030
【０１９１】
F. 5'-デオキシ-5-N-（オクタデシルアミノトリフルオロ-アセチル）チミジン
メタノール（250ml）、アセトン（35ml）、酢酸（0.5ml）および水酸化パラジウム／炭素（パールマンの触媒、5.5g）中の3-ベンジルオキシメチル-3'-O-ベンジルオキシメチル-5'-デオキシ-5-N-（オクタデシルアミノトリフルオロアセチル）チミジン（5.5g、66mmol）の懸濁物を、梨型ビン中、50psiで48時間水素化した。触媒をセライトベッド上にろ過して落とし、そしてセライトを熱アセトン（4x200ml）で注意深く洗浄した。ろ過物を合わせ、真空中で濃縮して固体にし、そして再結晶化（MeOH）して、産物、3.2g（82％）、融点170〜172℃を得た。
【０１９２】
【化２２】
2005518452.tif 000031
【０１９３】
G. 5'-デオキシ-5'-N-（オクタデシルアミノトリフルオロ-アセチル）チミジン-3'-O-（2-シアノエチルN，N-ジイソプロピル）ホスホロアミダイト
乾燥THF（1000ml）中の5'-デオキシ-5'-N-（オクタデシルアミノトリフルオロアセチル）チミジン（5.9g、10mmol）の溶液をビス-N，N-ジイソプロピルアミノシアノエチルホスファイト（8.0g、mmol）およびN，N-ジイソプロピルアミノテトラゾリド（0.5g、触媒量）で、室温で16時間処理した。反応を真空中で濃縮し、そして残渣をシリカゲルでクロマトグラフして（ヘキサン／EtOAc、6／4）、泡状物質として産物を得た（5.1g）。
【０１９４】
【化２３】
2005518452.tif 000032
【０１９５】
実施例9：MDR1をターゲティングするコレステロール-オリゴヌクレオチド・コンジュゲートの合成
特定の抗腫瘍薬剤に対する耐性に関して選択される哺乳動物細胞は、しばしば、見かけ上は関連しない他の薬剤に交差耐性を示し、そしてしたがって多剤耐性（MDR）表現型を示すと言われる（Bradleyら, Cancer Metastasis Rev., 1994, 13, 223）。MDRの1種類は、ATP駆動薬剤排出ポンプとして働く膜タンパク質（P-糖タンパク質）ファミリーの1以上のメンバーの過剰発現に基づく（Bradleyら, Cancer Metastasis Rev., 1994, 13, 223；Gottesmanら, J. Biol. Chem., 1988, 263, 12163；Roninson, Biochem. Pharmacol., 1992, 43, 95）。ヒトMDR（P-糖タンパク質）遺伝子ファミリーは2つのメンバーを有し、細胞傷害性薬剤に対する耐性に関与するのは、このうち1つ（P170、MDR1遺伝子にコードされる）のみであるらしい（Roninson, Biochem. Pharmacol., 1992, 43, 95）。非常に薬剤耐性である細胞において、P-糖タンパク質メッセージおよびタンパク質レベルは、その薬剤感受性対応細胞におけるより、数倍高い可能性がある。P-糖タンパク質が仲介する抗腫瘍薬剤排出を競合的に阻害する多様な剤を用いることによって、MDRを調節可能である（Kajiら, Biochem., 1994, 33, 5041）が、これらの剤のいくつかは、臨床試験において、理想的ではないことが立証されている（Chabnerら, J. Clin. Oncol., 1991, 9, 4）。
【０１９６】
A.合成
MDR1配列に対する5'-コレステロール・コンジュゲート化オリゴヌクレオチド（Chenら, Cell, 1986, 47, 381；Genbank寄託番号第AF016535号）を以下のように合成した。コレステロール-3-カルボキシアミノヘキシル-B-シアノエチル-N，N-ジイソピロピル-ホスホロアミダイトを、MacKellarら（Nucl. Acids Res., 1992, 20, 3411）が報告する方法にしたがって合成した。7.25グラムのこのアミダイトを無水ジクロロメタンに溶解して、濃度を0.1Mにした。この溶液を用い、標準的ホスホロアミダイト化学反応によって、ISIS5995の5'コレステロール・コンジュゲート化型であるISIS11073を合成して、ホスホロチオエート主鎖を持つオリゴマーを作成した。コレステロールアミダイトカップリング工程のため、反応時間を45分間に伸長した。これによって、コレステロールアミダイトの85％のカップリングが生じた。標準的脱保護後、C-4逆相HPLCカラム（Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651）上で、オリゴヌクレオチド-コレステロール・コンジュゲートを精製した。ISIS10221の5'コレステロール・コンジュゲート化型であるISIS12064を合成し、そして同じ方式で精製した。
【０１９７】
3'-O-アルキルアミノコレステロール部分を含んでなるオリゴヌクレオチドを以下の方式で調製した：3'-O-（ペンチルフタルイミド）-シチジンを生成するため、N-（3-ブロモプロピル）フタルイミドの代わりに、N-（5-ブロモペンチル）フタルイミドを用いたことを除いて、WO 95／06659（PCT／US94／10131、1995年3月9日公開）の実施例75および実施例104に本質的にしたがって、3'-O-（プロピルフタルイミド）-シチジンを調製した。メタノール溶媒中でヒドラジンと還流することによって、この化合物から、5'-O-［ジメトキシトリチル］-3'-O-［ペンチルアミノ］-シチジンを調製した。98％メタノール／水酸化アンモニウム2％溶媒を用いて、シリカカラム中で産物を精製した。その後、5'-O-［ジメトキシトリチル］-3'-O-［ペンチルアミノ］-シチジン（1.5g）を、30ml塩化メチレン中の10mlピリジンの混合物中、クロロギ酸コレステロール（1.1g）で処理した。一晩攪拌した後、さらに600mgのクロロギ酸コレステロールを添加し、そして反応混合物をさらに4時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー分析によって、環外アミンおよび3'-O-ペンチルアミン側鎖での反応産物が示された。望ましい産物、3'-O-［ペンチルアミノ-カルボニル-オキシコレステリル］-シチジンを、より遅い移動産物として、収率43％で得た。
【０１９８】
600mgの3'-O-［ペンチルアミノ-カルボニル-オキシコレステリル］-シチジンをピリジン（2x10ml）と同時蒸発させ、そしてその後、10mlの無水ピリジンに溶解した。氷槽を用いて外部から冷却しながら、シリンジを用いて、5分間の期間に渡って、塩化トリメチルシリル（1ml）を添加して、そして溶液を30分間攪拌した。その後、ベンゾイルクロリド（1ml）を添加し、その後、10mlのピリジンを添加した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。外部から冷却しながら4mlの水を添加して、そして30分後、4mlの濃縮水酸化アンモニウム（30％）を添加した。攪拌をさらに1時間続けた。その後、反応混合物を蒸発させ、そして塩化メチレンおよび水の間で抽出した。塩化メチレン層を蒸発させて、1.2gの未精製N4-ベンゾイル-3-O-［ペンチルアミノカルボニル-オキシ-コレステリル］-シチジンを得て、これをその後、クロロホルム中の2.5％メタノールを用いて、シリカカラム中で精製した。13Cおよび1H NMRスペクトル研究によって、産物同一性および均一性を確認した。
【０１９９】
N4-ベンゾイル-3-O-［ペンチルアミノカルボニル-オキシ-コレステリル］-シチジン（450mg）を2gの調節孔ガラス（CPG、スクシニル化しそしてキャップ化したもの）に添加し、そしてこの混合物に200mgのジメチルアミノピリジン、1gのEDC［1-エチル-3-ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド、400μlのトリエチルアミンおよび10mlのピリジンを添加した。混合物を手首動作（wrist-action）震蘯装置中で一晩震蘯した。その後、CPGをろ過し、塩化メチレン、メタノール、塩化メチレン、そしてその後、エーテルで洗浄した。その後、1.5gのペントクロロフェノール、1gのEDC、1mlのトリエチルアミン、および10mlのピリジンをCPGに添加して、そして震蘯を16時間続けた。その後、3mlのピペリジンを添加し、そして震蘯を5分間続けた。CPGをろ過し、洗浄し、そして乾燥させた。9mgの誘導体化CPGを塩化メチレン中の2％ジクロロ酢酸25mlで処理し、そして装填は、比色アッセイを用いて、27.16μmol／gであると測定された。このCPGを用いて、ISIS13328（GATCC＊、C＊は、3'-O-アルキルアミノコレステロールシチジン残基を示す；NMR研究に用いる）、ISIS13329、ISIS13330、ISIS13331、およびISIS13332を合成した。本発明のオリゴヌクレオチドの他の3'-O-アルキルアミノコレステロール誘導体、および5'-フルオレセイン・イソチオシアネート（FITC）コンジュゲートを、WO 95／06659および上記プロトコルに開示する方法を用いて、同様の方式で調製する。
【０２００】
【表９−１】
2005518452.tif 000033
【０２０１】
【表９−２】
2005518452.tif 000034
【０２０２】
【表９−３】
2005518452.tif 000035
【０２０３】
【表９−４】
2005518452.tif 000036
【０２０４】
＊配列を5'から3'方向に、左から右に書く。すべてのオリゴヌクレオチドは、別に示さない限り、完全に置換されたホスホロチオエート主鎖を含有する。
＊＊ORF、オープンリーディングフレーム。
【０２０５】
B.オリゴヌクレオチドが仲介するMDR1 mRNAの阻害
ヒトMDR1遺伝子を含有するプラスミド（pSK1 MDR）でトランスフェクションしたNIH 3T3細胞が先に記載されている（Kaneら, Gene, 1989, 84, 439）。これらの細胞は、多剤耐性現象を研究するのに有用なモデルであることが立証されている。10％ウシ胎児血清（FBS）および60ng／mlコルヒチンを含有するDMEM培地中、95％空気、5％CO2の大気中で、細胞を増殖させた。
【０２０６】
大部分の場合、陽イオン性リポソーム（LipofectinR）との複合体として投与されるオリゴヌクレオチドに、多剤耐性3T3細胞を曝露した。しかし、コレステロール-コンジュゲート化（共有結合）オリゴヌクレオチドを用いるすべての研究は、陽イオン性リポソームの非存在下で行った。以下の方法にしたがって、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。162mmフラスコ中で細胞を増殖させた。95％集密に達したら、10mlの10％FBS／DMEM中、5x106／プレートで100mmプレートに細胞を植え付け、そして24時間インキュベーションした。この段階で、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄し、そしてその後、8mlの血清不含培地を添加した。ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドに関しては、20μg／ml LIPOFECTINR（GIBCO／BRL、メリーランド州ゲイザーズバーグ）および多様な量のオリゴヌクレオチドを混合し、室温で30分間プレインキュベーションし、そしてその後、多様な時間、CO2インキュベーター中、37℃で細胞とインキュベーションした。2'-O-メチルホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドにも、同様の方法を用いた。コレステロール-ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドで処理するため、抗生物質を含む血清不含培地（LIPOFECTINRの非存在下）中の細胞に、化合物を単に添加して、そして多様な時間、CO2インキュベーター中、37℃でインキュベーションした。生体色素アッセイを用いる予備実験において、オリゴヌクレオチド実験で用いる多様な処理の細胞傷害性を評価した。別に示さない限り、培地のみで維持した対照試料に対して、オリゴヌクレオチドで処理した試料では、通常、生存細胞数に10％未満しか相異がないように、条件を選択した。血清不含培地中で長期間インキュベーションすると、MDR-3T3細胞は高レベルの生存度を維持したが、細胞分裂は大部分抑制された。
【０２０７】
ノーザンブロッティングによって、MDR1 mRNA発現を測定するため、4Mグアニジニウム・イソチオシアネート溶解し、その後、塩化セシウム勾配によって、総細胞RNAを単離し、そして1.2％ホルムアルデヒドを含有する1.2％アガロースゲル上でRNAを分離して、そしてニトロセルロース膜にトランスファーした（Deanら, J. Biol. Chem., 1994, 269, 16416）。ブロットを、32P放射標識ヒトMDR1 cDNAプローブとハイブリダイズさせた。先に記載されるように（Alahariら, Nucl. Acids Res., 1993, 21, 4079）、pSK1 MDRプラスミド上で、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって、MDR1 cDNAプローブを単離した。PCRには、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた：
【０２０８】
【化２４】
2005518452.tif 000037
【０２０９】
生じた断片をアガロースゲル上で確認し、そして製造者の指示にしたがい、商業的に入手可能な無作為プライマー標識キット（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）を用いて、32P-dCTPで放射標識した。ハイブリダイゼーション緩衝液（25mM KPO4、pH7.4；5xSSC；5xデンハルト溶液、100μg／mlサケ精子DNAおよび50％ホルムアミド）中、フィルターを一晩ハイブリダイズさせた（Alahariら, Nucl. Acids Res., 1993, 21, 4079）。この後、1xSSC、0.1％SDSで2回洗浄し、そして0.25xSSC、0.1％SDSで2回洗浄した。X-OMAT ARフィルムに曝露することによって、ハイブリダイズしたバンドを視覚化し、そしてPhosphorImagerTM（Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニーベール）を用いて定量化した。RNAが同等の量で装填されていることを確認するため、ブロットを剥がして、そして32P標識ベータ-アクチンプローブ（Clontech、カリフォルニア州パロアルト）で再探査した（reprobed）。
【０２１０】
1. MDR1メッセージ発現を特異的に減少させるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの同定
MDR 3T3細胞から単離したRNAを1.0kbのPCRに基づくMDR1プローブで探査した；これによって、4.4kbの転写物が明らかになった。最初の実験において、MDR 3T3細胞を、20μg／ml LIPOFECTINRの存在下、1.0μM濃度のいくつかの異なるアンチセンス・オリゴヌクレオチド、または対照オリゴヌクレオチドに24時間曝露した。AUGコドンと重複する領域をターゲティングする1つのオリゴヌクレオチド、ISIS5995は、MDR1メッセージレベルに約50％の減少を引き起こした（表10）。オリゴヌクレオチドISIS10221およびISIS10222は、ISIS5995と同じ塩基組成を有するが、「スクランブル化」配列であり、これを特異性対照として用いた。pSK1 MDRプラスミドでトランスフェクションしたNIH 3T3細胞を90％集密まで増殖させ、そして血清不含培地中、LipofectinRの存在下で24時間、オリゴヌクレオチド（1μM）で処理した。総RNAを単離し、そしてアガロース・ホルムアルデヒドゲル上で分画し、そしてニトロセルロース膜上にブロッティングした。これらの膜を32P放射標識1.0kb MDR1 cDNAで探査し、そしてその後、剥がして、そして32P放射標識ベータ-アクチンcDNAプローブで再探査して、RNAが同等の量で装填されていることを確認し、MDR1転写物のレベルをベータ-アクチンバンドに関して規準化するのを可能にした。PHOSPHORIMAGERTM（Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニーベール）を用いて転写物レベルを定量化した；恣意的な単位で値を表す（ベータ-アクチン転写物は、本質的に一定であった）。
【０２１１】
【表１０】
2005518452.tif 000038
【０２１２】
この実験を数回反復し、そして非飽和オートラジオグラム上のMDR1およびベータ-アクチンバンドをレーザー濃度測定によって比較した。ISIS5995およびISIS10221オリゴヌクレオチドのMDR1／ベータ-アクチン比は、それぞれ、0.49および1.01であり、ISIS5995によって、MDR1メッセージレベルが特異的に阻害されることが示された。
【０２１３】
2.オリゴヌクレオチドISIS5995によるMDR1メッセージレベル阻害の時間経過
ISIS5995が仲介するMDR1調節の時間経過を評価するため、トランスフェクション細胞を、24時間、48時間、および72時間、1μM ISIS5995、または1μM ISIS10221で処理した。MDR1およびベータ-アクチンRNAレベルを上述のように調べた。細胞をISIS5995で24時間処理した後、MDR1 mRNAの最大特異的減少が観察された；処理がより長くても、mRNAレベルはより低くならなかった。これらの非修飾オリゴヌクレオチドでは、MDR1 mRNAレベルの減少は、血清不含培地中でオリゴヌクレオチド処理を行い、そして陽イオン性リポソームを用いた場合にのみ、達成された。この結果は、細胞培養中のホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドのアンチセンス作用に関する、先の観察と一致する（Bennettら, Mol. Pharm., 1992, 41, 1023；Manoharanら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651）。ISIS5995オリゴヌクレオチドで多数回処理しても、単回処理よりも高い特異的なMDR1メッセージレベルの減少は引き起こされなかったが、より高い細胞傷害性が観察された。ISIS5995に24時間曝露した後、オリゴヌクレオチドを含まない培地に戻した細胞が、24時間以内に、正常レベルのMDR1 mRNAを示したため、MDR1 mRNA発現の減少は可逆的であった。
【０２１４】
3. MDR1メッセージ減少の濃度依存性
オリゴヌクレオチドISIS5995での多剤耐性3T3細胞の処理によって、MDR1メッセージの濃度依存性阻害が生じた（図1）。100nMと同程度に低い濃度で、メッセージレベルのある程度の減少が観察された。最大特異的効果は、およそ1.0μMで観察された；これは、MDR1メッセージのおよそ60％の減少を引き起こした。LipofectinRとともに、より高い濃度のオリゴヌクレオチド（5〜10μM）を用いると、より高い非特異的影響が生じ、すなわちベータ-アクチンメッセージレベルが減少し、そして細胞傷害性が増加したが、こうした影響はISIS5995およびISIS10221（スクランブル化対照）両方で観察された。
【０２１５】
C. オリゴヌクレオチドが仲介するP-糖タンパク質阻害
実施例（9）（B）に記載するように、トランスフェクションしたMDR NIH 3T3細胞を増殖させ、そしてオリゴヌクレオチドで処理した。ウェスタンブロッティングによって、P-糖タンパク質発現を測定するため、1.2x106／プレートで60mmプレートに細胞を植え付け、そして血清含有培地中で24時間インキュベーションした。上述のように、血清不含培地中で、多様な時間、細胞をオリゴマーで処理した。その後、溶解緩衝液（20mM Tris、pH7.5、2mM EDTA、500mM EGTA、2mM PMSF、1mM DTT、アプロトニン（10μg／ml）、0.5％Triton-X）中で細胞を抽出し、そして簡単に超音波処理した。微量遠心管中、溶解物を4℃で20分間回転させ、そしてタンパク質含量に関して、生じた上清を確認した。等量のタンパク質（通常20μg）をSDS試料緩衝液と混合し、そして煮沸した。8％ SDS PAGEによってタンパク質試料を分離し、そして分離したタンパク質を、ポリビニリデンフロリド膜（Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード）に電気泳動的にトランスファーした。膜をブロッキングし（PBS中の3％BSA、2％脱脂粉乳で）、そしてその後、2μg／ml C219抗P-糖タンパク質抗体（Signet、マサチューセッツ州デダム）で処理した。0.1％Tween-20で3回洗浄した後、ウサギ抗マウス抗体（Cappel、ノースカロライナ州ダラム）と膜をインキュベーションした。ECL（増進化学発光、Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）によって、または125I二次抗体を用いて、免疫反応性タンパク質を視覚化した。
【０２１６】
P-糖タンパク質の発現は、多剤耐性3T3細胞をISIS5995オリゴマーで処理すると減少し、これは、mRNAレベルのノーザンブロット解析と一致した。ウェスタンアッセイにおいて、P-糖タンパク質は、ISIS5995処理によって、少なくとも80％減少し、そしてISIS10440によって約50％減少した。対照的に、スクランブル化対照オリゴマーISIS10221は、P-糖タンパク質発現を減少させなかった。P-糖タンパク質発現の減少は、24時間後に最少であり、48時間までには容易に検出可能となり、そして曝露72時間後にようやく最大に達した。したがって、タンパク質レベルでの影響は、メッセージレベルで観察された減少より遅れていた。この観察は、P-糖タンパク質が非常に安定であり、そして通常、t1／2が48〜72時間であって、かなりゆっくり代謝回転するという事実（Richertら, Biochem., 1988, 28, 7607）と一致する。
【０２１７】
D. MDR1メッセージレベルおよびP-糖タンパク質発現に対する、オリゴヌクレオチド5995のコレステロール誘導体の影響
ISIS5995の5'-コレステロール誘導体（ISIS11073）とともに、スクランブル化対照オリゴヌクレオチドISIS10221の5'-コレステロール誘導体（ISIS12064）を合成し、そしてMDR1メッセージおよびP-糖タンパク質レベルに対するその影響を調べた。以下に説明するように、3'-コレステロール誘導体もまた調製し、そして試験した。
【０２１８】
トランスフェクションしたMDR NIH 3T3細胞を増殖させ、そして実施例（9）（B）に記載するように、オリゴヌクレオチドで処理した。実施例（9）（C）に記載するように、ノーザンブロッティングによって、MDR1 mRNA発現を測定した。フローサイトメトリーによって、細胞表面P-糖タンパク質レベルを測定するため、5ml培地中、1.2x106／プレートで60mmプレートに細胞を植え付け、10％FBS／DMEM中で1日増殖させ、そして血清不含培地中でオリゴマーに曝露した。オリゴヌクレオチド処理後、細胞をPBSで2回洗浄し、0.25mlのパンクレアチンを添加して、細胞をプレートから取りはずし、そして分散した細胞を10％FBS／DMEMに再懸濁し、そして37℃で2時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、そして50μlの20μg／ml MRK16抗P-糖タンパク質抗体（Kamiya、カリフォルニア州サウザンドオークス）を添加した（Ishidaら, Jpn. J. Cancer Res., 1989, 80, 1006）。この混合物を氷上で45分間インキュベーションし、そして10％FBS／PBSで3回洗浄した。その後、20μlの10倍希釈二次抗体、R-フィコエリトリン（R-PE）コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG（Sigma、ミズーリ州セントルイス）と、細胞を30分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を10％FBS／PBSで2回洗浄した。最後に、細胞を500μlのPBSに再懸濁した。Becton Dickinsonフローサイトメーター上でCiceroソフトウェアアプリケーション（Cytomation、コロラド州フォートコリンズ）を用いて、生存細胞中のR-PE蛍光レベル（光散乱によって測定）を定量化した。
【０２１９】
表11は、MDR1 mRNA発現に対するコレステロール-コンジュゲート化ホスホチオエート・オリゴヌクレオチドの影響を示す。血清不含培地中、多様な濃度のオリゴヌクレオチドISIS11073（5'-コレステロール5995）またはISIS12064（5'-コレステロール10221；スクランブル化対照）でMDR-3T3細胞を24時間処理した。総RNAを単離し、分画し、そしてMDR1 cDNA断片で探査した；同じブロットを剥がし、そしてベータ-アクチンプローブで再探査した。PHOSPHORIMAGERTMを用いて、結果を定量化した；ベータ-アクチンメッセージに対するMDR1の比を表に示す。表11に示すように、250nM〜2.5μM範囲の濃度のISIS11073（コレステロール5995）で処理すると、MDR1メッセージレベルの特異的減少が生じた。陽イオン性リポソームの使用なしに、ISIS11073で、MDR1 mRNA発現の少なくとも約60％の阻害が得られたことに注目するのが重要である。
【０２２０】
【表１１】
2005518452.tif 000039
【０２２１】
レーン1、未処理細胞；レーン2、2.5μM 5'ISIS12064で処理した細胞；レーン3〜6、それぞれ、250nM、500nM、1.0μMおよび2.5μMの濃度のISIS11073で処理した細胞。
細胞表面のP-糖タンパク質の発現に対する5'-コレステロール5995（ISIS11073）オリゴヌクレオチドの影響を観察するため、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーを利用した。多剤耐性3T3細胞を、0.5〜2.5μMの範囲に渡って増加する濃度のISIS11073で処理すると、P-糖タンパク質表面発現が対照レベルの約40％まで漸進的に減少した。スクランブル化対照オリゴマー（5'-コレステロール10221、ISIS12064）で、P-糖タンパク質発現のある程度の非特異的減少もまた観察されたが、アンチセンス化合物の影響は、試験したすべての濃度で高かった。平行実験において、P-糖タンパク質表面発現に対する、LIPOFECTINRとともに投与した1μMのISIS5995またはISIS10221の影響を調べた。LIPOFECTINRとともに投与した、アンチセンス（ISIS5995）またはスクランブル化5'-コレステロール（ISIS10221）ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの試験濃度は、同等の濃度のコレステロール-コンジュゲート化類似体よりもより有効でなかった。したがって、単独で投与したコレステロール・ホスホロチオエート・アンチセンス化合物は、少なくとも、陽イオン性リポソームとともに投与したホスホロチオエート・アンチセンス化合物と同程度に有効である。さらに、コレステロール・オリゴヌクレオチドは、陽イオン性脂質とともに投与した際、標準的ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドが示すよりも、実験間変動が少なかった。
【０２２２】
細胞表面のP-糖タンパク質の発現に対する3'-コレステロール5995オリゴヌクレオチド（ISIS13329）の影響を観察するため、上述のように、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーを利用した。0.5〜2.5μMの範囲に渡って増加する濃度のISIS13329で、多剤耐性3T3細胞を処理すると、P-糖タンパク質表面発現が対照レベルの約50％まで漸進的に減少した。平行実験において、P-糖タンパク質表面発現に対する、LIPOFECTINRとともに投与した1μMのISIS5995またはISIS13332の影響を調べた。LIPOFECTINRとともに投与した、アンチセンス（ISIS5995）またはスクランブル化3'-コレステロール（ISIS13332）ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの試験濃度は、同等の濃度のコレステロール-コンジュゲート化類似体よりもより有効でなかった。したがって、単独で投与したコレステロール・ホスホロチオエート・アンチセンス化合物は、少なくとも、陽イオン性リポソームとともに投与したホスホロチオエート・アンチセンス化合物と同程度に有効である。しかし、コレステロール・オリゴヌクレオチドは、陽イオン性脂質とともに投与した際、標準的ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドが示すよりも、実験間変動が少なく、そしてしたがって好ましい。3'-コレステロール・オリゴヌクレオチドのさらなる利点は、3'-エキソヌクレアーゼに対する安定性である。
【０２２３】
E. Rh123蓄積に対するオリゴヌクレオチドの影響
ローダミン123は、P-糖タンパク質の基質である蛍光色素であり、そして多剤耐性細胞から外に迅速に輸送される。したがって、Rh123取り込みは、多剤耐性表現型に対する多様な処理の影響を評価する、単純でそして便利な方法として使用可能である。フローサイトメトリーによって、ローダミン123取り込みを測定するため、重要でない点を変化させて、Twentymanら（Eur. J. Cancer, 1994, 30, 1360）に記載される方法にしたがった。簡潔には、7.5x105細胞を6ウェルプレートに植え付け、1日間インキュベーションし、そして上述のようにオリゴマーで処理した。パンクレアチンで細胞を取りはずし、そして10％FBS／DMEMに再懸濁した。ローダミン123（Sigma、ミズーリ州セントルイス）を水に溶解し、1.0μg／mlの最終濃度で添加した；いくつかの時点で、500μlの試料を採取し、培地で1回洗浄し、そして500μlの培地に再懸濁した。Ciceroソフトウェアを用いて、Becton Dickinsonフローサイトメーター上、ローダミン123の蓄積に関して、生存細胞を解析した。
【０２２４】
増加する濃度のISIS11073（コレステロール-コンジュゲート化ISIS5995）で多剤耐性3T3細胞を処理すると、P-糖タンパク質発現が漸進的に減少し（図2）、これはRh123蓄積増加と平行していた（図3）。P-糖タンパク質発現の場合におけるように、スクランブル化対照オリゴマー（ISIS12064；コレステロール-コンジュゲート化ISIS10221）でもまた、ある程度の非特異的影響が観察された；が、アンチセンス化合物の影響は、有意に大きかった。
【０２２５】
実施例10：コレステロール-コンジュゲート化オリゴヌクレオチドの取り込みおよび細胞内分布
実施例9が示すように、実験によって、ISIS5995の3'-コレステロール誘導体（ISIS13329）が、P-糖タンパク質発現に対して、5'-コレステロール5995（ISIS11073）と同等の影響を有することが示された。MDR1アンチセンス・オリゴヌクレオチドの細胞取り込み速度および細胞内分布を決定するため、5'-FITC、3'-コレステロール・オリゴヌクレオチドを用いて、以下の実験を行った。
【０２２６】
フローサイトメトリーによって、FITC標識オリゴヌクレオチドの細胞蓄積を定量化した。共焦点顕微鏡系を用いたことを除いて、本質的に先に記載されるように（Shojiら, Nucl. Acids Res., 1991, 19, 5543）、デジタル化蛍光顕微鏡を用いて、細胞ごとに基づき、細胞取り込みおよび細胞内分布を視覚化した。細胞体を貫く視覚的切片を取ることによって、細胞内蛍光を視覚化した；各場合で、細胞の最上部の表面およびカバーガラスの表面の間のおよそ中間部分の切片を調べた。同じ細胞の位相差画像もまた得た。Comosソフトウェアが制御するBiorad MRC600スキャナ／レーザーとともに、Nikon Fluor 40／1.3 Oil Ph4DL対物レンズを用いた。デジタル化画像において、未結合FITC5995オリゴマーで処理した細胞に対して、シグナル獲得レベルおよび黒色レベル（gain and black level）設定を最適にし、そしてその後は変化させなかった。
【０２２７】
フローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡実験のインキュベーション条件は以下のとおりであった。MDR 3T3細胞を、LIPOFECTINRを伴い、または伴わず、1μM ISIS13331（5'-FITC、3'-コレステロール5995）、または1μM ISIS13434（5'-FITC5995）で、血清不含培地中、37℃で2時間（図4）、または18時間（図5）処理した。細胞を採取し、そしてフローサイトメーターを用いて、蛍光プロフィールを決定した；非生存細胞を排除するように、光散乱パラメーターを設定した。LIPOFECTINRでの18時間の処理の場合、蛍光が非常に高レベル（約104単位）の細胞があり；これらを1つのチャネルに集積して、そしてプロットの右側の端に垂直な線として示す（図5）。カバーガラス上に蒔いた細胞を、上述のように18時間処理し、そしてその後、上述のように、共焦点顕微鏡によって調べた。
【０２２８】
図4に見られるように、2時間のインキュベーション期間中、コレステロール・コンジュゲート化オリゴヌクレオチド（ISIS13331）は、細胞に迅速に蓄積し、一方、未結合ISIS13434、およびLIPOFECTINRと複合体を形成したISIS13434は、はるかにより低い度合いに蓄積した。3'-コレステロール・コンジュゲート化5995（ISIS13331）の細胞蓄積は、2時間で、ISIS13434よりおよそ40倍高かった。一晩インキュベーションした後（図5）、未結合ISIS13434は、なお、ISIS13331より有意に低い細胞蓄積を示した。LIPOFECTINRと複合体を形成したISIS13434は、一晩インキュベーション後、実質的な、しかし非常に不均質な細胞取り込みを示した。ホスホロチオエートの安定性に関する先の実験（Akhtarら, Trends in Cell Biology, 1992, 2, 139）に基づいて、蓄積した大部分の蛍光は、未結合FITCよりむしろ、FITCコンジュゲート化オリゴヌクレオチドに相当すると考えられる。
【０２２９】
共焦点顕微鏡画像は、フローサイトメトリーの観察を本質的に確認し、そして拡大した。ISIS13434では、細胞内蓄積はほとんど見られなかった。LipofectinRと複合体を形成したISIS13434で処理した細胞は、広範囲に及ぶが非常に不均質な細胞取り込みを示し、非常に染色された細胞があり、そして他のものは本質的に染色されなかった；また、LIPOFECTINR粒子のバックグラウンドに加えて、カバーガラスに結合した会合オリゴヌクレオチドがあった。LipofectinRで処理した細胞のあるものは、蛍光の核蓄積を示した。ISIS13331（5'-FITC、3'-コレステロール）オリゴヌクレオチドで処理した細胞は、均一に、細胞質および核両方で、広範囲の染色を示した。これらの観察によって、コレステロール・コンジュゲート化が、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みの迅速性、量、および均一性を増進し、そして実質的な細胞質蓄積および核蓄積を導くことが立証される。
【０２３０】
実施例11：P-糖タンパク質発現に対する、3'-コレステロール、2'-メトキシエトキシギャップマーの影響
A. P-糖タンパク質発現に対する、2'-メトキシエトキシオリゴヌクレオチドの影響
ISIS5995（ISIS13758、MDR1の開始コドン領域をターゲティングする）、ISIS5998（ISIS13755、MDR1の停止コドン領域をターゲティングする）、およびISIS10221（ISIS13753、ISIS5995のスクランブル化対照）の2'-メトキシエトキシ誘導体を調製し、そしてP-糖タンパク質発現を調節する能力に関して調べた。活性をアッセイするため、本質的に図2に記載するように（実施例9）、実験を行った。これらのオリゴヌクレオチドは、5つの5'ヌクレオチドおよび5つの3'ヌクレオチドに対して2'-メトキシエトキシ修飾を有する「キメラ」化合物または「ギャップ化」化合物であり、ここで各メトキシエトキシシトシンは5-メチルシトシンであり、そして分子の中央の10ヌクレオチドはホスホロチオエートデオキシヌクレオチドである。この配置によって、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに耐性の「ウィング」を持ちながら、RNアーゼHの作用を支持する中央部分を保持することが可能になる。
【０２３１】
図6に示すように、ISIS5995の2'-メトキシエトキシ誘導体（ISIS13758）は、P-糖タンパク質発現を阻害する、増進した能力を示した（図2と比較されたい）。さらに、親化合物が、MDR1 mRNA発現に対して有望でない効果しか持たなかったにもかかわらず、ISIS5998の2'-メトキシエトキシ誘導体、ISIS13755は、これらのアッセイにおいて、有意な活性を示した（実施例9（B））。これらの結果は、オリゴヌクレオチドにメトキシエトキシ修飾を取り込むことによって達成可能な、オリゴヌクレオチド活性の有効性増進の例である。いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、これらの結果は、メトキシエトキシ修飾が、多くのヌクレアーゼに対する耐性をオリゴヌクレオチドに与える能力とともに、オリゴヌクレオチドがターゲティングする核酸（すなわちRNAまたはDNA）分子に対するハイブリダイゼーション親和性を増加させる能力から生じる活性増進を立証すると考えられる。
【０２３２】
B. コレステロール-コンジュゲート化2'-メトキシエトキシオリゴヌクレオチド
上述のように、3'-O-［ペンチルアミノ-カルボニル-オキシ-コレステリル］-シチジンCPGを用いて、コレステロールをISIS13758（翻訳開始コドン領域をターゲティングする2'-メトキシエトキシ）、ISIS13753（ISIS13758の2'-メトキシエトキシ・スクランブル化対照）、ISIS13755（翻訳終結コドン領域をターゲティングする2'-メトキシエトキシ）およびISIS14429（ISIS13755の2'-メトキシエトキシ・スクランブル化対照）にコンジュゲート化する。実施例9に記載するように、生物学的アッセイを行う。これらのホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは、3'-コレステロール（細胞取り込みおよびヌクレアーゼ耐性のため）、隣接部の2'-メトキシエトキシ修飾（ターゲット核酸へのより優れた結合およびヌクレアーゼ耐性のため）、および中央の10ヌクレオチド領域の2'-デオキシヌクレオチド（「ギャップ」）を有するキメラ化合物である。この配置によって、キメラオリゴヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性、高親和性「ウィング」を有しながら、オリゴヌクレオチドがターゲットRNA分子に結合した際、RNアーゼHの作用を支持する未修飾の中央「ギャップ」を保持することが可能になる。3'オリゴヌクレオチドの3'末端にコレステロール部分を配置すると、3'エキソヌクレアーゼに対する耐性が確実になり、細胞取り込みが増進し、そして5'末端は、さらなる官能基のコンジュゲート化のために利用可能なままとなる。
【０２３３】
実施例12：マウスにおける活性オリゴヌクレオチドの血漿取り込みおよび組織分布
実施例7（C）由来のオリゴヌクレオチド、オリゴマー71（配列番号20）を第一の試験オリゴヌクレオチドとして用いた。図において、このオリゴヌクレオチドをISIS8005と特定する。さらに、同じ配列のオリゴヌクレオチドを同じ方式で調製した。これらのさらなるオリゴヌクレオチドには、ISIS3082と図中に特定されるホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド、およびISIS9047と図中に特定される、5'アミノ基を介してヌクレオチドの5'位に連結されるC18アルキル基を取り込んだオリゴヌクレオチド（実施例7（C）の方法と同じ方式で、実施例8（G）の化合物を利用して調製する）が含まれる。このオリゴヌクレオチドを、Grahamら（Nuc. Acids Res., 1993, 16, 3737-3743）の方法と同様にトリチウム化した。
【０２３４】
A.動物および実験法
研究する各オリゴヌクレオチドに関して、体重約25グラムのオスBalb／cマウス（Charles River Laboratories, Inc.、マサチューセッツ州ウィルミントン）20匹を、4つの処置群の1つに無作為に割り当てた。1週間の順化後、マウスに、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.0中で、3H放射標識オリゴヌクレオチド（およそ750nmol／kg；124〜170μCi／kgの範囲）を尾静脈に単回注射した。投与溶液中のオリゴヌクレオチドの濃度は、およそ60μMであった。1回の後眼窩出血（投与0.25時間後、0.5時間後、2時間後、または4時間後のいずれか）および最終出血（投与1時間後、3時間後、8時間後または24時間後いずれか）を各群から収集した。ケタミン／キシラジン麻酔後、心臓穿刺によって最終出血を収集した。放射能測定用に各血液試料のアリコットを取っておき、そして残った血液をEDTAコーティング収集試験管に移し、そして遠心分離して血漿を得た。24時間で終了する群からは、間隔を置いて（0〜4時間、4〜8時間および8〜24時間）尿および糞便を収集した。
【０２３５】
終了時、肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、脳、骨格筋試料、小腸の一部、皮膚試料、膵臓、骨（骨髄を含有する両大腿骨）および2つのリンパ節を各マウスから収集し、そしてその重量を測定した。糞便の重量を測定し、そしてその後、Brinkmann Polytronホモジナイザー（ニューヨーク州ウェストベリー）を用いて、蒸留水と1：1でホモジナイズした。血漿、組織、尿および糞便ホモジネートを、燃焼による放射能解析用および損なわれていない（intact）オリゴヌクレオチド含量の測定用に分割した。収集後、すべての試料をドライアイス上で直ちに凍結し、そして解析まで-80℃で保管した。
【０２３６】
B.血漿、組織、および排泄物における放射能の解析
血漿および尿試料を、直接シンチレーションバイアルに測り入れ、そして15mlのBetaBlend（ICN Biomedicals、カリフォルニア州コスタメサ）の添加後、液体シンチレーション計測によって、直接解析した。すべての他の試料（組織、血液およびホモジナイズした糞便）を燃焼ボートに測り入れ、そして生物材料酸化装置（モデルOX-100；R. J. Harvey Instrument Corp.、ニュージャージー州ヒルズデール）中で酸化した。15mlのBetaBlendおよび5mlのHarveyトリチウムカクテル（R. J. Harvey Instrument Corp.、ニュージャージー州ヒルズデール）で構成される、20mlのカクテル中に、3H2Oを収集した。3H-マンニトールの溶液をスパイクした試料の燃焼によって、燃焼効率を毎日測定し、そして範囲は73.9〜88.3％であった。Beckman LS9800またはLS6500液体シンチレーション系（Beckman Instruments、カリフォルニア州フラートン）を用いて、液体シンチレーション計測を行った。自動化消光補正を伴って、試料を10分間測定した。分あたりの崩壊値を燃焼過程の効率に関して補正した。
【０２３７】
C.解析データ
試料中の放射能は、試料1グラムあたり1分あたりの崩壊として表した。これらの値を放射標識の比活性で割って、試料1グラムあたりの総オリゴヌクレオチドのナノモル等量のデータを表し、その後、臓器または組織あたりの投与した用量のパーセントに変換した。組織密度が1グラム／mlと仮定して、nmol／グラムのデータを総μM濃度に変換した。各時点での血漿、肝臓または腎臓中の損なわれていないオリゴヌクレオチドの濃度を計算するため、平均総μM濃度を投与溶液中の損なわれていないオリゴヌクレオチドのパーセント（82〜97％）で割り、その後、CGEまたはHPLCによって測定されるように、各時点での損なわれていないオリゴヌクレオチドの平均パーセントを乗じた。その後、直線回帰による組織半減期の計算にこれらのデータを用い、そして異なる修飾オリゴヌクレオチドの血漿薬物動態学を比較した。PCNONLIN4.0（Statistical Consultants, Inc.、ノースカロライナ州アペックス）を用いて薬物動態学パラメーターを決定した。データを調べた後、一区画多量（bolus）投入、一次排出モデル（ライブラリーモデル1）を使用のために選択した。
【０２３８】
D.血漿取り込みおよび生体分布の結果
動物血漿取り込みおよび組織分布試験の結果を図7〜図10にグラフで示す。図7に見られるように、各試験オリゴヌクレオチドの血漿濃度は、24時間の試験期間に渡って、最初の注入レベルからより低いレベルに減少する。本発明のコンジュゲート基を所持する2つのオリゴヌクレオチドの血漿濃度は、コンジュゲート非所持ホスホロチオエートのものよりも、より長い期間、より高いレベルで維持された。試験化合物はすべて、図8、図9、および図10に示すように、血漿から組織に取り込まれた。本発明の2つの化合物は、多様な組織間で異なる分布を有した。図8は、非コンジュゲート化ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド、ISIS3082の組織分布を示す。図9は、オリゴヌクレオチドISIS9047（ISIS3082と同一であるが、5'末端残基にコンジュゲート化されたC18アミン部分を有する）の組織分布を示し、一方、図10は、オリゴヌクレオチドISIS8005（やはりISIS3082由来であり、そして5'末端残基にコンジュゲート化されたコレステリル部分を有する）の組織分布を示す。5'-C18アミン・アンチセンス・オリゴヌクレオチド（ISIS9047）の分布は、肝臓への分布が増加し、そして血漿で幾分長く保持されることを除いて、親化合物ISIS3082と同様であった。これらの特性のどちらも、5'-コレステリルアンチセンス・オリゴヌクレオチドの場合、さらに増進し、肝臓シグナルの量は、投与後、少なくとも24時間、増加しつづけた。
【０２３９】
E. 5'-コレステロール-コンジュゲート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる、哺乳動物肝臓におけるICAM-1発現の調節
動物血漿取り込みおよび組織分布研究の結果によって、ネズミICAM-1をターゲティングする、5'-コレステロール-コンジュゲート化アンチセンス・オリゴヌクレオチド、ISIS8005は、i.v.投与後、ネズミ肝臓に優先的に蓄積することが示される。この優先的な蓄積の結果、哺乳動物肝臓において、ICAM-1の調節が増進するかどうかを決定するため、以下の実験を行った。
【０２４０】
マウスを以下のようにオリゴヌクレオチドで処理し、そして調べた。まず、10〜30mg／kgのオリゴヌクレオチド（または対照溶液）を、LPS処理の24時間前および2時間前に、各マウスに投与した（i.v.）（図11は30mg／kg用量での結果を示す）。その後、ICAM-1発現を誘導するため、細菌リポ多糖（LPS）をマウスに注射した。2時間後、マウスを屠殺し、そしてさらに研究するため、特定の臓器、またはその特定の部分を取り除いた。単離し、ホモジナイズした組織から、Chirgwinら（Biochemistry, 979, 18, 5294）のグアニジニウム／CsCl精製法に本質的にしたがって、RNAを調製して、電気泳動し、そして当該技術分野に周知の方法にしたがって、ハイブリダイゼーション研究（ノーザン解析）を行うため、ナイロン膜にトランスファーした。マウスICAM-1 mRNAを検出するため、テンプレートとしてマウスICAM-1クローンを用いて、無作為オリゴヌクレオチドプライミング合成によって、放射標識プローブを調製した。RNAが同等の量で装填されていることを確認し、そしてICAM-1転写物レベルをG3PDHシグナルに関して規準化するのを可能にするため、ブロットを剥がし、そして32P標識グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）プローブ（Clontech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パロアルト）で再探査した。X-OMAT ARフィルムに曝露することによって、ハイブリダイズバンドを視覚化し、そして製造者の指示（Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニーベール）に本質的にしたがって、PHOSPHORIMAGERTMを用いて定量化した。
【０２４１】
図11に示すように、LPSは、i.v.投与（「LPS-IV」）したか、またはi.p.投与（「LPS-IP」）したか、いずれであっても、未処置動物（「BASAL」）に比較して、少なくとも一桁、ネズミ肝臓中のICAM-1 mRNAレベルを誘導した。既定の投薬量で、取り込み促進剤の非存在下、ISIS3082（「3082-30」、ISIS3082の30mg／kgを示す）は、肝臓中のICAM-1 mRNAのLPSが仲介する誘導を逆転させることが不能であった。対照的に、これらの条件下で、ISIS3082の5'-コンジュゲート化コレステロール誘導体、ISIS8005（「8005-30」）は、LPSを投与したがオリゴヌクレオチドを投与していない動物の肝臓に存在する量に比較して、肝臓ICAM-1 mRNA量を約50％減少させた。対照である5'-コレステロール・コンジュゲート化スクランブル化オリゴヌクレオチド、ISIS13293は、誘導されるICAM-1レベルに明らかな影響は示さなかった。
【０２４２】
同様の実験において、5'-コレステロール・アンチセンス・オリゴヌクレオチドISIS8005の配列（遺伝子ターゲット）特異性を調べた。ICAM-1をターゲティングするISIS8005は、発癌遺伝子c-raf由来のmRNA、またはICAM-1に関連するが異なる細胞接着分子PECAM-1をコードするmRNAのレベルに、影響を及ぼさなかった。図12に示すように、5'-コレステロール3082類似体は、c-rafまたはPECAM-1 mRNAレベルに、認識可能な影響を及ぼさなかった。
【０２４３】
哺乳動物肝臓におけるICAM-1 mRNAのアンチセンスが仲介する阻害が、臓器特異的であるのかどうかを決定するため、上述の実験に用いた屠殺動物由来の肺試料におけるICAM-1 mRNAのレベルを、ノーザンアッセイによって調べた。図13に示すように、LPSの投与は、肝臓試料で見られるより少ない度合いであるが、肺において、ICAM-1 mRNAレベルを誘導した。いかなる場合も、ISIS3082も、またその5'-コレステロール・コンジュゲート、ISIS8005も、これらの条件下で、いかなる大きな度合いにも、ICAM-1のLPSが仲介する誘導を逆転させることは不能であった。
【０２４４】
単離肝臓試料の免疫組織学的切片を調製し、そしてICAM-1に特異的な一次抗体および西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（HRP）にコンジュゲート化した二次抗体を用いて染色した。図14に示すように、未処置肝臓（「Basal」）由来の横断切片は、ICAM-1の誘導剤であるLPS、およびICAM-1をターゲティングする5'-コレステロール・コンジュゲート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドISIS8005で処置した肝臓と、実質的に区別不能である（左の2つのパネル）。対照的に、LPSで誘導され、そしてISIS8005の5'-コレステロール・コンジュゲート化スクランブル化対照（5'-GCG-TTG-CTC-TTC-TTC-TTG-CG、配列番号64）ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドであるISIS13293で処置した肝臓は、ICAM-1に結合（一連の抗体を介する）したHRPから生じるシグナルのため、非常に暗く見える（右の2つのパネル）。これらの結果によって、哺乳動物肝臓中のICAM-1タンパク質レベルが、肝臓中のICAM-1 mRNAレベル同様、配列特異的方式で、コレステロール-コンジュゲート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドによって調節可能であることが示される。さらに、LPSおよびISIS8005で処置した肝臓に未処置（「basal」）肝臓の全体の細胞構造を比較すると、ICAM-1誘導を、アンチセンスが仲介して逆転させても、全体の細胞欠損が生じないことが明らかである。
【０２４５】
比較のため、ISIS3082の3'-コレステロール-コンジュゲート化誘導体であるISIS9388（配列番号20）もまた調製した。具体的には、ISIS9388は、実施例4（B）由来のホスホロアミダイトおよび本明細書に開示する他の方法を用いた合成中に、オリゴヌクレオチドに導入される、3'末端3'-O-ヘキシルアミノコレステリル部分を含有する。前述の方法にしたがって、ネズミ肝臓において、ICAM-1 mRNAレベルを調節する能力に関して、ISIS9388、およびいくつかの関連する対照化合物を試験した。図15に示す結果によって、5'-コレステロール・コンジュゲート（ISIS8005）同様、3'-コレステロール・コンジュゲート（ISIS9388）は、これらの条件下（すなわちオリゴヌクレオチド10mg／kgの投薬量）で、ICAM-1 mRNAレベルを約50％減少させうることが立証される。
【０２４６】
この実施例の結果によって、コレステロール-コンジュゲート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、in vitroで培養哺乳動物細胞に優先的に取り込まれ、そしてin vivoで哺乳動物肝臓をターゲティングすることが立証される。さらに、in vivoで肝臓をターゲティングするオリゴヌクレオチドは、コレステリル部分の付着点と関係なく、in vivoで、肝臓において、そのターゲット遺伝子の配列特異的アンチセンス調節を達成する。総合すると、これらの知見は、コレステリル部分にオリゴヌクレオチドをコンジュゲート化し、そして哺乳動物にコレステロール-オリゴヌクレオチド・コンジュゲートを投与することによって、哺乳動物において、生物学的活性アンチセンス・オリゴヌクレオチドを肝臓組織に優先的にターゲティングし、そしてそれによって、哺乳動物肝臓において、遺伝子発現を調節する方法の基礎を提供する。
【０２４７】
実施例13：ビス-コレステリル-コンジュゲート化ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの取り込み
A. ISIS-9389の合成
固体支持体5'-O-（ジメトキシトリチル）-3'-O-［ヘキシル-N-（3-オキシカルボニル-コレステリル）アミノ］ウリジン-2'-O-スクシニルアミノプロピル）-調節孔ガラス（実施例4を参照されたい）から出発して、上述の実施例4にしたがい、標準的デオキシヌクレオチドホスホロアミダイトを用いて、ISIS-3082およびISIS-9388と同じ配列を有する3'，5'-ビス-コレステリル-コンジュゲート化PS-ODNであるISIS-9389を合成した。酸化工程中、Beaucage試薬を用いて、ホスホロチオエート連結を導入した。5％〜95％CH3CNの勾配を用いて、精製を行った。HPLC、CGEおよび質量分析解析によって、最終産物を性質決定した。
【０２４８】
B. ［3H］ISIS-9389の調製
生物学的運命の監視を可能にするため、Grahamら（Nucl. Acids Res. 21：3737-3743, 1993）に記載されるように、プリンヌクレオチドのC8位で、熱触媒交換によって、ISIS-9389を3Hで放射標識した。以下の可動相を用いて、1ml／分の流速で、Waters C4カラム（5μM、300オングストローム、300x3.9mm）を用いた逆相HPLCによって、［3H］ISIS-9389を精製した：A、50mMトリエチルアンモニウムアセテート（pH7.0）；B、アセトニトリル。試料（0.5ml）を注入した後、10％Bで5分間、その後、10〜90％B（25分間）の勾配で、カラムから溶出させた。続いて、90％Bで10分間、カラムから溶出させた。これらの条件下で、ISIS-9389の保持時間は、およそ28分（ISIS-3082およびISIS-9388：それぞれ13分および25分）であった。Rumpら（Bioconj. Chem. 9341-349, 1998）に記載されるように、アセトン中の3％（w／v）NaClO4を10体積添加することによって、放射標識オリゴヌクレオチドは、Na塩として沈殿した。［3H］ISIS-9389の比放射能は、およそ50x106dpm／mgであり、そして放射化学純度は＞98％であった。
【０２４９】
C.ラット血清および血漿における、ISIS-9389安定性の測定
ラット血清またはEDTA-血漿（4mM EDTA）と［3H］ISIS-9389を、20μg／mlの濃度で、37℃でインキュベーションした。90分後、インキュベーション混合物200μlのアリコットを等体積の抽出緩衝液（25mM EDTA、100mM NaCl、0.5％Nonidet P-40および1mg／mlプロテイナーゼKを含有する25mM Tris-HCl緩衝液、pH8.0）と混合し、そして56℃でさらに2時間インキュベーションした。続いて、試料を400μlのフェノール／イソアミルアルコール／クロロホルム（25：1：24；体積）と混合した。10分間震蘯した後、遠心分離によって相分離した。400μlの水で有機相を4回洗浄した。水性相を合わせ（総抽出効率およそ40％）、そしてspeed-vac濃縮装置中で乾燥させた。残渣を水に溶解し、そして30μgの未標識ISIS-9389をマーカーとして添加した（最終体積600μl）。500μlのアリコットを上述のように逆相HPLCに供した。1mlの分画を収集し、そして放射能に関してアッセイした。ラット血清または血漿と［3H］ISIS-9389を90分間インキュベーションした後、未標識ISIS-9389マーカーの位置で、95％の放射能が溶出することが見出された。ISIS-9389の保持は、コレステロールの存在に依存するため、これによって、放射標識オリゴヌクレオチドがなお両方のコレステロール部分を含有することが示され、該オリゴヌクレオチドが損なわれていなかったことが示される。
【０２５０】
D.血漿クリアランスおよび組織分布の測定
ペントバルビタールナトリウム（60mg／kg）を腹腔内注射することによって、体重200〜350グラムの間のオス・ウィスターラットを麻酔し、そして腹腔を開けた。ペニス静脈を通じて、PBS、pH7.4に溶解した放射標識オリゴヌクレオチドを注入した（2ml／kg体重）。示した時点で、0.2〜0.3mlの血液試料を下大静脈から採取し、そしてヘパリン処理試験管に収集した。試料を16，000xgで2分間遠心分離し、そして放射能に関して血漿をアッセイした。さらなるプロセシングなしに、Emulsifer SafeTMまたはHionic FluorTMシンチレーションカクテル（Packard、イリノイ州ダウナーズグローブ）を用い、液体シンチレーション分光法によって、Packard Tri-Carb 1500液体シンチレーションカウンター中、3Hを含有する試料を計測した。式：血漿体積（ml）＝［0.0219x体重（g）］＋2.66を用いて、血漿中の放射能総量を計算した。
【０２５１】
示した時点で、肝小葉を結紮し、そして切除し、そして実験終了時に肝臓の残りを取り除いた。結紮に成功した肝臓組織の量は、総肝臓量の15％を超えなかった。各時点での肝臓中の放射能量を、肝臓試料の放射能および重量から計算した。実験終了時に肝臓外組織を取り除き、そして放射能を計測することによって、その組織による取り込みを測定した。Packard 306試料酸化装置を用いて、組織試料をプロセシングした。いくつかの組織（例えば骨）を、計測する前に、95℃で10M NaOHに溶解した。組織中の放射能を、試料採集時に組織に存在する血漿の放射能に対して補正した。
【０２５２】
非線形回帰プログラム（GraphPad、ISIソフトウェア、カリフォルニア州サンディエゴ）によって、静脈内注射した放射標識オリゴヌクレオチドの血漿クリアランスを解析した。2区画モデルによって、データを最適に適合させた。排除曲線の0時間への外挿によって、分布体積（Vdis）を計算した。式：T1／2＝0.693／keを用いて、排除速度定数（ke）から、排除の半減期を計算した。式：CL＝Vdisxkeを用いて、総体クリアランス（CL）を計算した。
【０２５３】
ラットに放射標識オリゴヌクレオチドを多量注射した後、ISIS-9389の廃棄を研究した。この際の用量、1mg／kg体重は、前臨床モデルにおいて、そして患者において、有効であると見出された、ICAM-1に向けられたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの用量範囲内であった。血漿からの放射能のクリアランスを90〜180分間追跡した。図16は、［3H］ISIS-9389注射後の放射能の血漿クリアランスを示す。迅速に分布する最初の段階の後、放射能は、23.6±0.3分の半減期で、循環から一掃された。ISIS-9389の血漿クリアランスを90分間追跡した。表12において、ISIS-9389の薬物動態パラメーターをISIS-9388およびISIS-3082のパラメーターと比較する。3つのオリゴヌクレオチドの分布体積は、有意には異ならなかった。ISIS-9389は、親化合物ISIS-3082とほぼ同じ速度で循環から一掃されたが、ISIS-9388より迅速に一掃された。
【０２５４】
【表１２】
2005518452.tif 000040
【０２５５】
注射90分後、［3H］ISIS-9389のおよそ95％の注射用量が循環から一掃されたとき、体全体の放射能分布を測定した。結果を表13に示す。最も際立った発見は、肝臓における多量の放射能である：用量の83.0±0.8％であり、これは一掃された量の87.8±0.8％に相当する。有意な量の放射能を含有する他の組織は、脾臓および骨（骨髄）のみであった。肝臓、脾臓および骨（骨髄）を合わせると、ISIS-9388のクリアランスの＞95％を占めた。皮膚や筋肉のような大きい組織さえ、用量の＜1％しか含有しなかった。未コンジュゲート化PS-ODNの廃棄に重要な役割を果たす腎臓には、少量のISIS-9388（用量の＜0.5％）しか蓄積しなかった。ISIS-9389の腎臓取り込みは、ISIS-3082の取り込みより、およそ50倍低かった。肝臓、脾臓および骨髄の特異的取り込み（回収重量％で回収放射能％を割った、相対比放射能として表す）は、他の組織いずれのものより、少なくとも1桁高い。図17は、ISIS-9389の組織分布と、ISIS-3082およびISIS-9388の組織分布を比較する。肝臓は、3つのオリゴヌクレオチドすべての取り込みにおいて、最も重要な組織であるが、コレステロールとのコンジュゲート化は、肝臓取り込みを有意に増進した。ISIS-3082の約40％が肝臓に取り込まれ、一方、3'-コレステロール修飾誘導体ISIS-9388の肝臓取り込みは約70％であった。第二のコレステロールのコンジュゲート化によってISIS-9389を得て、このオリゴヌクレオチドは、驚くべきことに、ほぼ独占的に肝臓に取り込まれた。
【０２５６】
【表１３】
2005518452.tif 000041
【０２５７】
E.肝細胞種に渡るISIS-9389の測定
肝臓は、実質細胞、内皮細胞およびクッパー細胞を含む、いくつかの能動的エンドサイトーシス細胞種を含有する。ISIS-9389の肝臓取り込みに関与する細胞種（類）を同定するため、上述のようにラットを麻酔し、そして放射標識オリゴヌクレオチドを注射した。注射60分後、肝臓を灌流し、そしてNagelkerkerkeら（J. Biol. Chem. 263：12221-12227, 1983）に記載されるように、実質細胞、クッパー細胞および内皮細胞を単離した。低温（8℃）で細胞単離法を実行して、内部に取り込まれたオリゴヌクレオチドのプロセシングを妨げた。放射能およびタンパク質に関して細胞分画をアッセイした。細胞を分離する少し前に、肝小葉を結紮し、そして切除して、総肝臓取り込みを決定した。細胞タンパク質mgあたりの取り込みおよび総肝臓タンパク質への各細胞種の寄与から、総肝臓取り込みに対する多様な細胞種の寄与を計算した。他のリガンドで見られるように、単離法の間、有意な量の放射能が細胞から失われることはなかった。計算される肝臓取り込み（すなわち多様な細胞種の寄与の総和）と実際に肝小葉で測定された値を比較することによって、各実験において、これを確認した。総肝臓取り込みへの細胞の寄与およびISIS-9389のクリアランスへの肝臓の寄与から、各細胞種に取り込まれる投与用量の割合を計算した。オリゴヌクレオチドの分子量、肝臓重量（体重の4.3±0.1％、10の測定の平均±S.E.M.）、肝臓密度（1.07mg／ml）および肝臓における異なる細胞区画の体積から、細胞内濃度を計算した。細胞体積の75％は水からなると仮定した。
【０２５８】
結果を表14に示す。内皮細胞は、肝臓において、取り込みの主要部位であり（肝臓取り込みの51.9％±6.4％）、一方、実質細胞およびクッパー細胞は、各々、肝臓取り込みの約25％を占めた。注射されたオリゴヌクレオチドがすべて循環から一掃されたとき、注射用量の87.7±0.8％が肝臓に取り込まれた。したがって、実質細胞、クッパー細胞および内皮細胞には、それぞれ、注射したオリゴヌクレオチド量の21.8±6.7％、20.4±2.2％および45.5±5.6％が蓄積した。実質細胞、クッパー細胞および内皮細胞におけるISIS-9388の細胞内濃度は、これらのデータから、そして3つの異なる細胞区画のサイズから、計算可能である。実質細胞およびクッパー細胞は、ほぼ等量のISIS-9389を含有する；が、実質細胞は細胞塊の＞90％を構成し、そしてクッパー細胞はわずか2.5％である。クッパー細胞におけるISIS-9389濃度は、したがって、実質細胞におけるよりはるかに高い（51.5±5.5μM対1.5±0.5μM）。しかし、内皮細胞が、最高濃度のISIS-9389を含有した（86.1±10.6μM）。
【０２５９】
【表１４】
2005518452.tif 000042
【０２６０】
図18は、異なる肝細胞種におけるISIS-9389の蓄積を、ISIS-3082およびISIS-9388の蓄積と比較する。コレステロールとコンジュゲート化すると、3つの肝細胞種すべてによる取り込みが高くなったが、非実質細胞、特にクッパー細胞による取り込みは、実質細胞の取り込みより大きい。
【０２６１】
オリゴヌクレオチドのビス-コレステロール・コンジュゲート化は、新たな療法実体（entity）に相当する。これらのコンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、ほぼ独占的に肝臓に取り込まれる。最高濃度は内皮細胞で見られた。肝臓内皮細胞におけるビス-コレステリル-コンジュゲート化オリゴヌクレオチドの選択的蓄積は、これらの細胞で発現される遺伝子をターゲティングするのに有益である。例えば、ICAM-1は、肝臓への好中球の有害な浸潤を生じる炎症条件下で、肝臓内皮細胞において上方制御されている。全身投与した、ICAM-1に特異的な非コンジュゲート化PS-ODNは、肝臓の内皮裏打ち細胞への好中球の接着を減少させ、そしてその結果、療法効果を発揮する（Wong, Hepatology 26：165A, 1997）。コレステロール・コンジュゲート化によって、これらのオリゴヌクレオチドの細胞蓄積は、より高くなり、この結果、療法効果が改善されるであろう。さらに、2つのコレステロール部分をコンジュゲート化すると、腎臓におけるオリゴヌクレオチド蓄積が約50倍減少するため、ターゲットではない組織、特に腎臓による取り込みが減少して、副作用が最小限になるであろう。
【０２６２】
肝臓、および肝臓の内皮細胞をターゲティングするため、オリゴヌクレオチドに2より多いコレステロール部分をコンジュゲート化することもまた、本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチドへのさらなるコレステロール部分のコンジュゲート化は、本明細書記載の方法および当該技術分野に周知の他の方法を用いて実行可能である。さらに、本発明の別の態様において、肝臓を優先的にターゲティングするため、本明細書に開示する親油性部分いずれかの、同一部分または異なる部分いずれか、2以上をコンジュゲート化する。
【０２６３】
F. ISIS-9388の肝臓取り込みにおけるスカベンジャー受容体の関連
ISIS-3082およびISIS-9388の肝臓取り込みにおけるスカベンジャー受容体の役割が先に立証されている（Bijsterboschら, Nucl. Acids. Res. 28：2717-2725, 2000；Bijsterboschら, Nucl. Acids Res. i 25：3290-3296, 1997）。内皮肝細胞、そしてより低い度合いでクッパー細胞は、非常に多様なポリアニオン性リガンドに結合してそして内部に取り込む、AI／II型スカベンジャー受容体（SR-AI／AII）を発現する。リガンドとSR-AI／AIIの相互作用は、ポリイノシン酸（ポリ-I）によって有効に阻害可能である。異なる三元構造を有するポリアデニル酸（ポリ-A）は阻害性でない。ISIS-9389の肝臓取り込みにおけるSR-AI／IIのありうる役割を研究するため、［3H］ISIS-9389を注射する少し前に、ラットにポリ-Iまたはポリ-A（Sigma、ミズーリ州セントルイス）をあらかじめ注射した。肝臓によるISIS-9389の取り込みは、ポリ-Iによって実質的に阻害された（図19）。ポリ-Aもまた、ISIS-9388の肝臓取り込みを阻害したが、ポリ-Iより有効でなかった。これらの知見によって、スカベンジャー受容体がISIS-9388の肝臓取り込みに主要な役割を果たすことが示唆される。
【０２６４】
G.血漿タンパク質とISIS-9388およびISIS-3082の会合
PS-ODNは、血漿タンパク質に結合し、その廃棄に影響を及ぼすようである（Cossumら, J. Pharmacol. Exp. Ther. 267：1181-1190, 1993）。ISIS-9389と血漿タンパク質の相互作用を調べるため、［3H］ISIS-9389とラット血漿をインキュベーションした（20μg／ml；静脈内注射直後の血漿濃度）。30分後、50μl試料ループ（Pharmacia、スウェーデン・ウプサラ）を備えたSuperose 6 Precisionカラム（3.2x300mm）上のサイズ排除クロマトグラフィーに、インキュベーション混合物を供した。流速50μl／分でカラムをPBSで溶出させた。100μlの分画を収集し、そして放射能に関してアッセイした。
【０２６５】
結果を図20に示す。［3H］ISIS-9389のクロマトグラフィープロフィールは、［3H］ISIS-9388および［3H］ISIS-3082のものと明らかに異なった。高分子量血漿タンパク質を含有する、0.90〜1.50mlで溶出する分画には、放射能はまったく回収されなかったため、3つのオリゴヌクレオチドはすべて、タンパク質結合していることが見出された。血漿タンパク質の大部分を含有する、1.50〜1.90mlで溶出する分画に、わずかな割合（15〜20％）のみが回収された。
【０２６６】
ISIS-9389は、2つのコレステロール残基を所持し、これは、ISIS-9389が血漿に存在する場合、リポタンパク質粒子の架橋を導く可能性がある。低密度リポタンパク質（LDL）および高密度リポタンパク質（HDL）とISIS-9389の相互作用を評価するため、［3H］ISIS-9389を放射性ヨウ素化ラットLDLおよびHDL（それぞれ0.2mg／mlおよび1.0mg／ml；ラット血漿中の濃度）とインキュベーションし、そしてサイズ排除クロマトグラフィーによって、インキュベーション混合物を解析した。図21は、ISIS-9389が容易にそして定量的にLDLおよびHDLと会合することを示す。ISIS-9389および両リポタンパク質の複合体は、天然LDLおよびHDLと同じ位置で溶出し、このことから、ISIS-9389がリポタンパク質粒子の架橋および凝集を誘導しないことが示される。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】図1は、トランスフェクションされた3T3細胞における、MDR1メッセージのオリゴヌクレオチド阻害に関する用量反応を示す。MDR-3T3細胞を、LIPOFECTINRの存在下、50nM、100nM、250nM、500nMまたは1000nMの濃度のISIS5995オリゴマー、あるいは1000nMのISIS10221スクランブル化対照オリゴマーで、24時間処理した。RNAを単離し、分離し、そして1.0kB MDR1 cDNA断片で探査した。同じブロットを剥がし、そしてベータ-アクチンプローブで探査して、装填が均一であることを確実にした。PHOSPHORIMAGERTM（Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニーベール）を用いて、ブロット由来のMDR1 mRNAレベルを定量化し、そして対照のパーセントとして値を表す。結果は、5つの独立した実験の平均値および平均の標準誤差に相当する。黒塗りの（filled）ひし形、ISIS5995；黒塗りの（closed）ひし形、ISIS10221。
【図２】図2は、P-糖タンパク質表面発現に対するコレステロール-コンジュゲート化ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドの影響を示す。血清不含培地中、MDR3T3細胞を多様な濃度のオリゴヌクレオチドISIS11073（5'-コレステロール5995）またはISIS12064（5'-コレステロール10221；スクランブル化対照）で48時間処理した。細胞を回収し、そして表面エピトープに対して向けられる抗P-糖タンパク質モノクローナル抗体で染色し、その後、フィコエリトリン-コンジュゲート化二次抗体で染色した。フローサイトメーターを用いて、生存細胞における細胞表面蛍光レベルを定量化し；非生存細胞を排除するように、光散乱パラメーターを設定した。LIPOFECTINRの存在下、1μMのオリゴヌクレオチドISIS5995およびISIS10221で処理した細胞を用いて、平行実験を行った。未処理MDR 3T3細胞のものを100％レベルとして、P-糖タンパク質発現の阻害パーセントとしてデータを示す。結果は、6回の測定の平均および標準誤差に相当する。黒塗りのひし形、ISIS11073（コレステロール-コンジュゲート化ISIS5995）；黒塗りの円、ISIS12064（コレステロール-コンジュゲート化ISIS10221；スクランブル化対照）；白抜きのひし形、ISIS5995；白抜きの三角形、ISIS10221。
【図３】図3は、図2に記載するように処理した細胞をローダミン123取り込みに関して解析した実験の結果を示す。オリゴヌクレオチド処理に続いて、細胞を洗浄し、そしてその後、血清不含培地中1μg／mlのRh123に37℃で曝露した。1時間後、細胞を洗浄し、そしてフローサイトメーターを用いて、生存細胞に蓄積したRh123の量を定量化した。結果は、3回の測定の平均および標準誤差に相当する。記号は図2と同様である。
【図４】図4は、コレステロール-コンジュゲート化ホスホチオエートMDR1オリゴヌクレオチドの取り込みおよびその影響の細胞内分布を示す。血清不含培地中、MDR-3T3細胞を1μM ISIS13331（5'-FITC、3'-コレステロール5995）、または1μM ISIS13434（5'-FITC5995）で、37℃で2時間処理した。細胞を採取し、そしてフローサイトメーターを用いて、蛍光プロフィールを決定した；非生存細胞を排除するように、光散乱パラメーターを設定した。実線、未結合ISIS13434（5'-FITC5995）；破線、LipofectinRを伴うISIS13434；点線、ISIS13331（5'-FITC、3'-コレステロール5995）。
【図５】図5は、2時間でなく、18時間処理したことを除いて、図4と同様に処理した細胞の、コレステロール-コンジュゲート化ホスホロチオエートMDR1オリゴヌクレオチドの取り込みおよびその影響の細胞内分布を示す。LIPOFECTINRで18時間処理すると、いくつかの細胞は非常に高レベル（104単位より多い）の蛍光を生じ；これらを1つのチャネルに集積させ、そしてプロットの右側の垂直な線として示す。
【図６】図6は、図2に本質的に記載されるフローサイトメトリーによって決定されるような、2'-メトキシエトキシオリゴヌクレオチドによるP-糖タンパク質（PGP）発現の調節を示す。白抜きの四角形、ISIS13753（ISIS10221の2'-メトキシエトキシ誘導体）；黒塗りの円、ISIS13755（ISIS5998の2'-メトキシエトキシ誘導体）；黒塗りの四角形、ISIS13758（ISIS5995の2'-メトキシエトキシ誘導体）。
【図７】図7は、対照化合物および本発明の2つの化合物のマウス血漿濃度を示すグラフである。血漿濃度を時間に対してプロットする。
【図８】図8は、マウスの中の多様な組織での対照化合物ISIS3082の分布を示す三次元グラフである。1つの軸上に特定の組織を示し、第二の軸上に時間を示し、そして第三の軸上に用量パーセントを示す。静脈内注射によって化合物を搬送した。
【図９】図9は、マウス中の多様な組織での本発明の化合物ISIS9047の分布を示す三次元グラフである。1つの軸上に特定の組織を示し、第二の軸上に時間を示し、そして第三の軸上に用量パーセントを示す。静脈内注射によって化合物を搬送した。
【図１０】図10は、マウス中の多様な組織での本発明のさらなる化合物ISIS8005の分布を示す三次元グラフである。1つの軸上に特定の組織を示し、第二の軸上に時間を示し、そして第三の軸上に用量パーセントを示す。静脈内注射によって化合物を搬送した。
【図１１】図11は、コレステロール-コンジュゲート化オリゴヌクレオチドによる、Balb／cマウスの肝臓におけるICAM-1 mRNAレベルの調節を示すデータを示す。用語：BASAL、未処理細胞；LPS、リポ多糖（ICAM-1誘導剤）；ISIS3082、マウスICAM1配列に対してターゲティングされたアンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド；ISIS8005、ISIS3082の5'-コレステロール・コンジュゲート；ISIS13293、ISIS8005の5'-コレステロール-コンジュゲート化スクランブル化対照オリゴヌクレオチド；添字、「-30」は、オリゴヌクレオチドの用量（30mg／kg）を示す。
【図１２】図12は、5'-コレステロールISIS3082類似体（ISIS8005）が、ネズミ肝臓において、c-rafおよびPECAM-1 mRNAレベルにまったく影響を与えないことを示す。用語：BASAL、未処理細胞；LPS、リポ多糖（ICAM-1誘導剤）；ISIS8005、マウスICAM-1に対してターゲティングされた5'-コレステロール・コンジュゲート化ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴヌクレオチド；ISIS13293、ISIS8005の5'-コレステロール-コンジュゲート化スクランブル化対照オリゴヌクレオチド；添字、「-10」は、オリゴヌクレオチドの用量（10mg／kg）を示す。
【図１３】図13は、ネズミ肺において、5'-コレステロールISIS3082類似体（ISIS8005）が、ICAM-1レベルに対してほとんど影響を及ぼさないことを示す。用語：BASAL、未処理細胞；LPS、リポ多糖（ICAM-1誘導剤）；ISIS3082、マウスICAM1配列に対してターゲティングされたアンチセンス・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド；ISIS8005、ISIS3082の5'-コレステロール・コンジュゲート；ISIS13293、ISIS8005の5'-コレステロール-コンジュゲート化スクランブル化対照オリゴヌクレオチド；添字、「-30」は、オリゴヌクレオチドの用量（30mg／kg）を示す。
【図１４】図14は、コレステロール-コンジュゲート化アンチセンス・ヌクレオチドによる、LPSが仲介するICAM-1誘導の逆転の組織像を示す。
【図１５】図15は、Balb／cマウス肝臓ICAM-1 mRNAレベルが3'-コレステロール-コンジュゲート化アンチセンス・オリゴヌクレオチドによって調節可能であることを示す。用語：basal、未処理細胞；lps、リポ多糖（ICAM-1誘導剤）；ISIS9388、マウスICAM-1に対してターゲティングされた3'-コレステロール・コンジュゲート化ホスホロチオエート・アンチセンス・オリゴヌクレオチド；ISIS13293、ISIS8005の5'-コレステロール-コンジュゲート化スクランブル化対照オリゴヌクレオチド；ISIS6777、VCAM-1に対してターゲティングされた対照オリゴヌクレオチド；添字、「-1」、「-10」および「-20」は、オリゴヌクレオチドの用量（それぞれ、1、10または10mg／kg）を示す。
【図１６】図16は、静脈内注射した［3H］ISIS-9389の血漿クリアランスを示すグラフである。ラットに、1mg／kg体重の用量で［3H］ISIS-9389を静脈内注射した。示した時間で、血液試料を採取し、そして血漿中の放射能を測定した。値は、3匹のラットの平均±S.E.M.である。
【図１７】図17は、静脈内注射した［3H］ISIS-3082、［3H］ISIS-9388および［3H］ISIS-9389（すべて1mg／kg体重）の組織取り込みの比較を示すグラフである。注射90分後（ISIS-9389およびISIS-3082）または180分後（ISIS-9388）、すべての組織に渡る放射能分布を測定した。組織中の放射能を試料採取時の循環から一掃された放射能の％として表し、そして組織中の放射能は、各組織のクリアランスへの寄与を構成する。試料採取時、ISIS-3082、ISIS-9388およびISIS-9389の注射用量の97.9±0.3％、88.9±2.3％および94.4±0.6％がそれぞれ一掃されていた。値は、3匹のラットの平均±S.E.M.である。
【図１８】図18は、すべて1mg／kg体重の用量の、静脈内注射した［3H］ISIS-3082、［3H］ISIS-9388および［3H］ISIS-9389の肝細胞種による取り込みを示すグラフである。注射1時間後、実質細胞、内皮細胞およびクッパー細胞を単離し、そして各細胞種に関連する放射能量を測定した。総肝臓取り込みへの各細胞種の寄与を、細胞タンパク質mgあたりの取り込みおよび総肝臓タンパク質に対する各細胞種の寄与から計算した。各細胞種に取り込まれる、投与した用量の割合（すべてのオリゴヌクレオチドが一掃された際）を、総肝臓取り込みに対する各細胞種の寄与およびクリアランスに対する肝臓の寄与から計算した（ISIS-3082、ISIS-9388およびISIS-9389の用量の、それぞれ41.4±1.4％、71.7±3.7％および87.7±0.8％）。値は、3〜4匹のラットの平均±S.E.M.である。
【図１９】図19は、［3H］ISIS-9389の肝臓取り込みに対するポリアニオンの影響を示すグラフである。ラットに、1mg／kg体重の用量で［3H］ISIS-9389を静脈内注射した。標識リガンド注射の1分前、動物に10mg／kgポリイノシン酸（ポリ-I）、10mg／kgポリアデニル酸（ポリ-A）、または等体積の生理食塩水溶媒（2ml／kg）を投与した。示した時間に、肝臓中の放射能量を測定した。値は、3〜4匹のラットの平均±S.E.M.である。
【図２０】図20は、血漿構成要素とISIS-9389、ISIS-9388およびISIS-3082の会合を示すグラフである。［3H］-標識オリゴヌクレオチドを、20μg／mlの濃度で、ラット血漿と37℃でインキュベーションした。30分後、インキュベーション混合物のアリコットをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。分画を収集し、そして放射能に関してアッセイした。結果を回収量（回収＞95％）の割合として表す。LDL、HDL、血清アルブミンおよび未結合オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）の溶出体積を矢印で示す。
【図２１】図21A〜図21Bは、LDLおよびHDLとISIS-9389の会合を示すグラフである。［3H］ISIS-9389（20μg／ml）を0.2mg／mlのラット125I-HDLと37℃でインキュベーションした（図21B）。30分後、インキュベーション混合物のアリコットをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。分画を3H（●）および125I（○）に関してアッセイした。結果を回収放射能（回収＞80％）の割合として表す。LDL、HDL、および未結合ODNの溶出体積を矢印で示す。
【国際調査報告】
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