(57)【要約】本発明は、適切な宿主細胞系で異種遺伝子産物を発現するために、および／または異種遺伝子産物を発現し、パッケージし、および／または提供するマイナス鎖をレスキューするために使用される、組換えウシパラインフルエンザウイルス（bPIV）cDNAまたはRNAに関する。特に異種遺伝子産物は、PIVの別の種または別のマイナス鎖RNAウイルス（特に限定されないが、インフルエンザウイルス、RSウイルス、ヒトメタニューモウイルス、および鳥類ニューモウイルスを含む）からの生成物を含む。キメラウイルスおよび発現産物は、広範囲の病原体および抗原に対するワクチンを含むワクチン製剤で使用することが有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタニューモウイルスポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むキメラウシパラインフルエンザウイルス３型。
【請求項２】
メタニューモウイルスポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むキメラヒトパラインフルエンザウイルス３型。
【請求項３】
メタニューモウイルスポリペプチドをコードする異種ヌクレオチド配列を含むキメラウシパラインフルエンザウイルス３型／ヒトパラインフルエンザウイルス３型。。
【請求項４】
該ウイルスは、メタニューモウイルスの同じ遺伝子から得られる異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項５】
該ウイルスは、メタニューモウイルスの少なくとも２つの異なる遺伝子から得られる異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項６】
ウイルスのゲノム中の１つ以上の読みとり枠は、(i) 鳥類ニューモウイルス（APV）Fタンパク質；(ii) APV Gタンパク質；(iii) APV SHタンパク質；(iv) APV Nタンパク質；(v) APV Pタンパク質；(vi) APV M2タンパク質；(vii) APV M2-1 タンパク質；(viii) APV M2-2タンパク質；または(ix) APV Lタンパク質の１つ以上をコードするORFにより置換されている、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項７】
ウイルスのゲノム中の１つ以上の読みとり枠は、(i) 哺乳動物ニューモウイルス（MPV）Fタンパク質；(ii) 哺乳動物MPV Gタンパク質；(iii) 哺乳動物MPV SHタンパク質；(iv) 哺乳動物MPV Nタンパク質；(v) 哺乳動物MPV Pタンパク質；(vi) 哺乳動物MPV M2タンパク質；(vii) 哺乳動物MPV M2-1 タンパク質；(viii) 哺乳動物MPV M2-2タンパク質；または(ix) 哺乳動物MPV Lタンパク質の１つ以上をコードするORFにより置換されている、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項８】
鳥類ニューモウイルスは、APV A型、APV B型、APV C型、またはAPV D型である、請求項６のウイルス。
【請求項９】
哺乳動物MPVは、変種A1、変種A2、変種B1、または変種B2である、請求項７のウイルス。
【請求項１０】
異種ヌクレオチド配列がウイルスの完全なゲノムに付加される、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列は、パラインフルエンザウイルスゲノムの104、1774、および3724のヌクレオチド位置で付加される、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項１２】
パラインフルエンザウイルスのヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列により置換されている、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項１３】
異種配列がパラインフルエンザウイルスのゲノム中に挿入され、ゲノムは１つ以上の遺伝子が欠失している、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項１４】
ウシパラインフルエンザウイルスはカンザス（Kansas）株ウシパラインフルエンザ３型である、請求項１のウイルス。
【請求項１５】
異種ヌクレオチド配列は、Fタンパク質、Gタンパク質、またはその断片をコードするヌクレオチド配列から得られる、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項１６】
Fタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質のエクトドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、およびパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の管腔ドメインを含む、請求項１５のウイルス。
【請求項１７】
ヌクレオチド配列は、配列番号１〜５、14、または15である、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項１８】
ヌクレオチド配列は、配列番号６〜13、16、または17である、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項１９】
ウイルスは、RSウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列またはRSウイルスの変異型をさらに含む、請求項１、２または３のウイルス。
【請求項２０】
RSウイルスは、RSウイルスA型、RSウイルスB型、ウシRSウイルス、またはヒツジRSウイルスである、請求項１９のウイルス。
【請求項２１】
配列は、該RSウイルスのFタンパク質、Gタンパク質、またはその断片をコードするヌクレオチド配列から得られる、請求項１９のウイルス。
【請求項２２】
ウイルスゲノムは、異種ヌクレオチド配列以外に、ワクチン製剤での使用により適した表現型（例えば、弱毒化表現型または抗原性が上昇した表現型）を有するキメラウイルスを与える変異または修飾を有する、請求項１、２または３のキメラパラインフルエンザウイルス。
【請求項２３】
異種ヌクレオチド配列の遺伝子間領域は改変されている、請求項１、２または３のキメラパラインフルエンザウイルス。
【請求項２４】
異種ヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５または６位よりなる群から選択されるパラインフルエンザウイルスゲノムの位置で付加され、該異種ヌクレオチド配列の遺伝子間領域は改変されている、請求項１、２または３のキメラパラインフルエンザウイルス。
【請求項２５】
請求項１、２または３のウイルスのゲノムをコードする組換えDNAまたはRNA分子。
【請求項２６】
請求項１８のウイルスのゲノムをコードする組換えDNAまたはRNA分子。
【請求項２７】
請求項１、２または３のキメラウイルスと薬剤学的に許容される賦形剤とを含むワクチン製剤。
【請求項２８】
請求項１８のキメラウイルスと薬剤学的に許容される賦形剤とを含むワクチン製剤。
【請求項２９】
キメラウイルスは、弱毒化表現型または抗原性が上昇した表現型を与えるゲノム修飾または変異を含む、請求項２７のワクチン製剤。
【請求項３０】
修飾または変異は天然に存在する変異体から得られる、請求項２９のワクチン製剤。
【請求項３１】
ワクチンは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、鳥類、またはげっ歯類の免疫応答をモジュレートするのに使用される、請求項２７のワクチン製剤。
【請求項３２】
ワクチンは、ヒト幼児または小児の免疫応答をモジュレートするのに使用される、請求項３０のワクチン製剤。
【請求項３３】
請求項１、２または３のキメラウイルスと薬剤学的に許容される賦形剤とを含む免疫原性製剤。
【請求項３４】
請求項１８のキメラウイルスと薬剤学的に許容される賦形剤とを含む免疫原性製剤。
【請求項３５】
キメラウイルスは、弱毒化表現型または抗原性が上昇した表現型を与えるゲノム修飾または変異を含む、請求項３３の免疫原性製剤。
【請求項３６】
修飾または変異は天然に存在する変異体から得られる、請求項３５の免疫原性製剤。
【請求項３７】
ワクチンは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、鳥類、またはげっ歯類の免疫応答をモジュレートするのに使用される、請求項３３のワクチン製剤。
【請求項３８】
ワクチンは、ヒト幼児または小児の免疫応答をモジュレートするのに使用される、請求項３６のワクチン製剤。
【請求項３９】
請求項２７のワクチンを投与することを含む、哺乳動物の呼吸器感染症を治療または予防する方法。
【請求項４０】
呼吸器感染症はMPV感染症である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
呼吸器感染症は、MPV、RSV、hPIV、またはこれらの組合せによる感染症である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
被験体はヒトである、請求項３９の方法。
【請求項４３】
ヒト被験体は５才未満である、請求項４２の方法。
【請求項４４】
ヒト被験体は２才未満である、請求項４２の方法。
【請求項４５】
ヒト被験体は、呼吸器感染症以外に疾患または症状に罹っている、請求項４２の方法。
【請求項４６】
疾患または症状は、嚢胞性繊維症、白血病、非ホジキンリンパ腫、喘息、および骨髄移植、および腎移植である、請求項４５の方法。
【請求項４７】
ヒト被験体は免疫無防備状態の個体である、請求項４２の方法。
【請求項４８】
ヒト被験体は老人である、請求項４２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第60/358,934号（2002年２月21日出願）（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
同時係属および本本出願人による米国特許出願第          号（本明細書と同じ日に出願された）（発明者としてRonaldus Fourchier、Bemadetta van den Hoogen、Albertus Osterhaus、Aurelia Haller、およびRoderick Tangが記載されている）、標題「メタニューモウイルス株およびワクチン製剤におけるかつ抗原配列の発現用のベクターとしてのその使用」は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
1. 緒言
本発明は、適切な宿主細胞系で異種遺伝子産物を発現するために、および／または異種遺伝子産物を発現し、パッケージし、および／または提供するマイナス鎖RNA組換えウイルス（negative strand RNA recombinant virus）をレスキューするために使用される、組換えパラインフルエンザウイルス（parainfluenza virus）（PIV）cDNAまたはRNAに関する。特に本発明は、異種遺伝子産物を発現するキメラPIVを含むワクチン調製物であって、異種遺伝子産物は好ましくは抗原性ペプチドまたはポリペプチドであるワクチン調製物を包含する。ある実施形態において本発明のPIVベクターは、同じかまたは異なるウイルスにコードされる１つ、２つ、または３つの異種遺伝子産物を発現する。好適な実施形態において異種配列は、PIVの別の種または別のマイナス鎖RNAウイルス（negative strand RNA virus）（特に限定されないが、インフルエンザウイルス、RSウイルス（RSV）、哺乳動物メタニューモウイルス（metapneumovirus）、および鳥類ニューモウイルスを含む）からの抗原性ポリペプチドである異種遺伝子産物をコードする。本発明のワクチン調製物は、２価または３価のワクチン調製物を含む多価ワクチンを包含する。本発明の多価ワクチンは、それぞれが異種抗原性配列を発現する１つのPIVベクター、またはそれぞれが異なる異種抗原性配列をコードする２つ以上のPIVベクターの形で投与される。本発明のワクチン調製物は、単独でまたは他のワクチン、予防薬、または治療薬とともに投与することができる。
【背景技術】
【０００４】
2. 発明の背景
パラインフルエンザウイルス感染は、幼児と小児で重症の呼吸器疾患を引き起こす（Taoら、1999, Vaccine 17:1100-08）。感染性パラインフルエンザウイルス感染症は、世界中で呼吸器感染症にかかった小児患者のすべての入院数の約20％を占める（同上）。PIV関連疾患を治療するための有効な抗ウイルス療法は無く、PIV感染を予防するためのワクチンはまだ認可されていない。
【０００５】
PIVは、パラミクソウイルス科（paramyxoviridae）のレスピロウイルス属 (respirovirus)（PIV1、PIV3）またはルブラウイルス属 (rubulavirus)（PIV2、PIV4）のメンバーである。PIVは２つの構造モジュール(module)から構成されている：(1) 内部リボ核タンパク質コア、またはヌクレオカプシド（ウイルスゲノムを含む）、(2) 外部のほぼ球形のリポタンパク質エンベロープ。そのゲノムは、マイナスセンスRNAの１本鎖からなり、これは、約15,456ヌクレオチドの長さであり、少なくとも８個のポリペプチドをコードする。これらのタンパク質には、ヌクレオカプシド構造タンパク質（属によりNP、NC、またはN）、ホスホタンパク質（P）、マトリックスタンパク質（M）、融合糖タンパク質（F）、血球凝集素−ノイラミニダーゼ糖タンパク質（HN）、大ポリメラーゼタンパク質（L）、および機能が未知のCタンパク質とDタンパク質がある（同上）。
【０００６】
パラインフルエンザヌクレオカプシドタンパク質（NP、NC、またはN）は、各タンパク質単位内に２つのドメインを含有する。これらのドメインには以下を含む：アミノ末端ドメイン（これは分子のほぼ２／３を含み、RNAと直接相互作用する）とカルボキシ末端ドメイン（これは、組み立てたヌクレオカプシドの表面上にある）。これらの２つのドメインの結合部にはヒンジが存在すると考えられ、このためこのタンパク質にある程度の可撓性を与えている（Fieldsら（編）、1991, Fundamental Virology、第２版、ラーベンプレス（Raven Press）、ニューヨークを参照、これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。マトリックスタンパク質（M）はウイルスの組み立てに関与すると考えられ、ウイルス膜とヌクレオカプシドタンパク質とに相互作用する。ホスホタンパク質（P）はリン酸化を受け、転写制御、メチル化、リン酸化およびポリアデニル化に関与すると考えられている。不活性前駆体として最初に産生される融合糖タンパク質（F）は翻訳時に切断されて、２つのジスルフィド結合したポリペプチドを産生する。活性Fタンパク質はウイルス膜と相互作用し、そこではウイルスエンベロープと宿主細胞原形質膜との融合を促進することにより、宿主細胞へのパラインフルエンザウイルス粒子の貫通を促進する（同上）。糖タンパク質である血球凝集素−ノイラミニダーゼ（HN）はエンベロープから突き出て、ウイルスに血球凝集素およびノイラミニダーゼ活性を付与する。HNは、HNタンパク質を脂質二重層に固定するのに機能する疎水性の強いアミノ末端を有する（同上）。最後に大ポリメラーゼタンパク質（L）は、転写と複製の両方で重要な役割を果たす（同上）。
【０００７】
パラインフルエンザウイルスは最初1959年に、輸送熱の兆候を示すコウシから単離された。以来これは、正常なウシ、堕胎された胎児、および呼吸系疾患の兆候を示すウシから単離されている（Breker-Klassenら、1996, Can. J. Vet. Res. 60:228-236。Shibuta, 1977, Micorobiol. Immunol. 23(7):617-628も参照されたい）。ヒトおよびウシPIV3は、中和エピトープを共有するが、異なる抗原性を示す。HNタンパク質ではヒトとウシのウイルス株には大きな差が存在する。実際、ウシ株はhPIV感染に対してある程度の中和抗体を誘導するが、ヒト株は、ヒトPIV3に対してより広いスペクトルの中和抗体を誘導するようである（Van Wyke Coelinghら、1990, J. Virol. 64:3833-3843）。
【０００８】
すべてのマイナス鎖RNAウイルス（PIVを含む）の複製は、RNAを複製するのに必要な細胞機構の欠如により複雑になる。さらにマイナス鎖ゲノムは、翻訳が起きる前にプラス鎖（mRNA）コピーに転写されなければならない。従ってゲノムRNA単独では、細胞への侵入に必要なRNA依存性RNAポリメラーゼを合成することができない。L、PおよびNタンパク質は、ゲノムRNAとともに宿主細胞に入らなければならない。
【０００９】
PIV mRNAを転写するほとんどまたはすべてのウイルスタンパク質はまたゲノムの複製を行うと仮定されている。タンパク質の同じ相補体の別の用途（すなわち、転写または複製）を制御する機構は明らかにされていないが、このプロセスは１つ以上のヌクレオカプシドタンパク質の多数の遊離型を含むようである。ウイルスの貫通直後に、鋳型としてヌクレオカプシド中のマイナスセンスRNA（negative-sense RNA）を使用してLタンパク質により転写が開始される。ウイルスRNA合成は、転写中にモノシストロン性mRNAを産生するように制御される。
【００１０】
転写後、ウイルスゲノム複製はマイナスセンスRNAウイルスによる感染における２番目の基本的な事象である。他のマイナス鎖RNAウイルスと同様に、PIV中のウイルスゲノム複製はウイルス特異的タンパク質により仲介される。複製性RNA合成の最初の生成物は、PIVゲノムRNAの相補的コピー（すなわち、プラス極性）（cRNA）である。これらのプラス鎖コピー（抗ゲノム）は、その末端の構造がプラス鎖mRNA転写体とは異なる。mRNA転写体とは異なり、抗ゲノムcRNAは5'末端でキャッピングもメチル化もされず、3'末端では末端切断もポリアデニル化も無い。cRNAはそのマイナス鎖鋳型と末端を共有し、相補型中にすべての遺伝子情報を含む。cRNAは、PIVマイナス鎖ウイルスゲノム（vRNA）の合成の鋳型として機能する。
【００１１】
bPIVマイナス鎖ゲノム（vRNA）と抗ゲノム（cRNA）はヌクレオカプシドタンパク質により包まれている；キャプシドに包まれていない唯一のRNA種はウイルスmRNAである。bPIV RNAの複製と転写は宿主細胞の細胞質で起きる。ウイルス成分の組み立ては、宿主細胞の原形質膜（ここでは成熟ウイルスが出芽により放出される）で起きるようである。
【００１２】
2.1. パラミクソウイルス
古典的には、破壊的な疾患媒体としてパラミクソウイルスは、毎年世界中の多数の動物やヒトの死亡の原因となっている。パラミクソウイルスは、モノネガウイルス目 (Mononegavirales)（マイナス−センス１本鎖RNAウイルス）内の科であり、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）とニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）からなる。後者の亜科は現在分類学的に、ニューモウイルス属（Pneumovirus）とメタニューモウイルス属（Metapneumovirus）とに分けられる（Pringle, 1999, Arch. Virol. 144/2,2065-2070）。ニューモウイルス属（Pneumovirus）の１つの種であるヒトRSウイルス（hRSV）は、世界中で幼児および小児の間の下気道感染症の単一の最も重要な原因である（Domachowske & Rosenberg, 1999, Clin. Microbio. Rev. 12(2):298-309）。ニューモウイルス属の他のメンバーには、ウシおよびヒツジのRSウイルスとマウスのニューモウイルス（PVM）がある。
【００１３】
過去数十年間に、哺乳動物の疾患、特にヒトの、特に呼吸器疾患（RTI）の数種類の原因物質が同定されている（Evans, Viral Infections of Humans, Epidemiology and Control. 第３版中（Evans, A.S.編）、22-28（プレヌム出版社（Plenum Publishing Corporation）、ニューヨーク、1989）。哺乳動物のRTIの古典的原因物質は、ヒト（hRSV）およびウシまたはヒツジ（bRSVおよび／またはoRSV）のような反芻動物中に存在するニューモウイルス属に属するRSウイルスである。ヒトRSVでは、逆交差中和アッセイ、免疫学的アッセイにおけるGタンパク質の反応性、およびG遺伝子のヌクレオチド配列の差が、２つのhRSV抗原性サブグループを定義するのに使用される。このサブグループ内では、アミノ酸配列は94％（サブグループA）または98％（サブグループB）の同一性を示し、サブグループ間ではわずかに53％のアミノ酸配列同一性しか存在しない。さらなる変化が、モノクローナル抗体、RT-PCR測定法、およびRNAse保護測定法に基づくサブグループ内で観察される。両方のサブグループからのウイルスは世界的に分布し、単一の季節に存在する。感染は、あらかじめ存在する免疫の存在下で起きることがあり、抗原性の変化は再感染には厳密に必須ではない。例えば、Sullender, 2000, Clinical Microbiology Reviews 13(1):1-15; Collinsら、Fields Virology, B.N. Knipe、Howley, P.M. 編、1996, フィラデルフィア：リッペンコット−ラーベン（Lippencott-Raven）, 1313-1351; Johnsonら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84(16):5625-9; Collins, The Paramyxoviruses中、D.W. Kingsbury編者、1991, プレヌム・プレス（Plenum Press）：ニューヨーク、p. 103-153。
【００１４】
別の古典的ニューモウイルスは、一般に実験室マウスに存在するマウスの肺炎ウイルス（PVM）である。しかし哺乳動物で観察される疾患の比率にまでは、公知の病原体には割り当てられていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
2.2. RSV感染症
RSウイルス（RSV）は、幼児と小児の重症の下気道呼吸器疾患の最も重要な原因である（Feigenら編、1987、Textbook of Pediatric Infectious Diseases中、ダブリュー・ビー・ソンダース（WB Saunders）、フィラデルフィア、1653-1675頁；New Vaccine Development, Establishing Priorities、第１巻、1985、ナショナルアカデミープレス（National Academy Press）、ワシントンDC、397-409頁；およびRuuskanenら、1993、Curr. Probl. Pediatr. 23:50-79）。RSV感染の毎年の流行は世界的に明らかであるが、ある特定の季節のRSV疾患の頻度と重症度は地域により変動する（Hall, 1993, Contemp. Pediatr. 10:92-110）。北半球の温帯地域では、これは通常晩秋に始まり、晩春に終わる。１次RSV感染はほとんど６週齢〜２才の小児で起き、まれに院内流行中に最初の４週齢に起きる（Hallら、1979, New Engl. J. Med. 300:393-396）。RSV感染のリスクの高い小児には、特に限定されないが早産児（Hallら、1979, New Engl. J. Med. 300:393-396）および気管支肺異形成の小児（Groothuisら、1998、Pediatrics 82:199-203）、先天性心疾患（MacDonaldら、New Engl. J. Med. 300:397-400）、先天性または後天性免疫不全症（Ograら、1988、Pediatr. Infect. Dis. J. 7:246-249；およびPohlら、1992, J. Infect. Dis. 165:166-169）、および嚢胞性繊維症（Abmanら、1988, J. Pediatr. 113:826-830）がある。RSV感染で入院した心疾患または肺疾患を有する幼児の死亡率は３％〜４％である（Navasら、1992, J. Pediatr. 121:348-354）。
【００１６】
RSVは幼児や小児と同様に成人にも感染する。健常成人ではRSVは主に上気道疾患を引き起こす。一部の成人（特に老人）は、従来報告されていたものより高率に症候性RSV感染症を有する（Evans, A.S.編、1989, Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control, 第３版、プレヌムメディカルブック（Plenum Medical Book）、ニューヨーク、525-544頁）。ナーシングホームの患者および施設の若者の間でもいくつかの流行が報告されている（Falsey, A.R., 1991, Infect. Control Hosp. Epidemiol. 12:602-608; およびGarvieら、1980, Br. Med. J. 281:1253-1254）。最後にRSVは、免疫抑制者、特に骨髄移植患者で重症の疾患を引き起こすことがある（Hertzら、1989, Medicine 68:269-281）。
【００１７】
確立したRSV疾患の治療オプションは限定されている。下気道の重症のRSV疾患はしばしば大きな支持療法（加湿酸素の投与と呼吸補助）を必要とする（Fieldsら編、1990, Fields Virology, 第２版、第１巻、ラーベンプレス（Raven Press）、ニューヨーク、1045-1072頁）。
【００１８】
ワクチンによりRSV感染および／またはRSV関連疾患を予防できることがあるが、まだこれを適応症として認可されたワクチンは無い。ワクチン開発に対する大きな障害は安全性である。ホルマリンで不活性化したワクチンは免疫原性であるが、これは予想外に免疫した幼児で、同様に調製した３価のパラインフルエンザワクチンで免疫した幼児より、RSVによるより高率かつ重症の下気道疾患を引き起こした（Kimら、1969, Am. J. Epidemiol. 89:422-434; およびKapikianら、1969, Am. J. Epidemiol. 89:405-421）。いくつかのRSVワクチン候補はあきらめられ、いくつかは開発中である（Murphyら、1994, Virus Res. 32:13-26）が、たとえ安全性の問題が解決しても、ワクチンの効力も改良しなければならない。解決すべき多くの問題がある。下気道疾患の頻度のピークは生後２〜５ヶ月であるため、生誕直後の新生児期免疫が必要である。新生児の免疫応答の未成熟さが母親から獲得したRSV抗体の高力価と組合わさって、新生児期のワクチン免疫原性を低下させると予測される（Murphyら、1988, J. Virol. 62:3907-3910; およびMurphyら、1991, Vaccine 9:185-189）。最後に１次RSV感染と疾患は、以後のRSV疾患に対して充分防御してくれない（Hendersonら、1979, New Engl. J. Med. 300:530-534）。
【００１９】
現在RSV疾患の予防のために認可されている唯一のアプローチは受動免疫である。IgGの防御性役割を示唆する最初の証拠は、フェレット（Prince, G.A., 博士論文、カリホルニア大学ロサンゼルス校、1975）とヒト（Lambrechtら、1976, J. Infect. Dis. 134:211-217；およびGlezenら、1981, J. Pediatr. 98:708-715）の母親の抗体が関与する観察結果から得られた。Hemmingら（Morellら編、1986、Clinical Use of Intravenous Immunoglobulins、アカデミックプレス（Academic Press）、ロンドン、285-294頁）は、新生児敗血症が疑われる新生児の静脈内免疫グロブリン（IVIG）の薬物動態が関与する試験中に、RSV感染の治療または予防においてRSV抗体が有用である可能性を認識した。この試験では、呼吸器分泌物がRSVを与えた一人の幼児が、IVIG注入後に急速に回復したことが観察された。IVIGロットの以後の解析により、異常に高力価のRSV中和抗体が明らかになった。この同じ研究者のグループは次に、RSV中和抗体が濃縮された高度免疫抗体または免疫グロブリンが、RSV感染に対してコトンラットおよび霊長類を防御する能力を調べた（Princeら、1985, Virus Res. 3:193-206; Princeら、1990, J. Virol. 64:3091-3092; Hemmingら、1985, J. Infect. Dis. 152:1083-1087; Princeら、1983, Infect. Immun. 42:81-87; およびPrinceら、1985, J. Virol. 55:517-520）。これらの試験の結果は、IVIGがRSV関連疾患を治療または予防する以外に、RSV感染を予防するのに使用されることを示す。
【００２０】
最近の臨床試験は、この受動的に投与されたRSV高度免疫グロブリン（RSV IVIG）が、リスクのある小児をRSVによる重症の下気道感染から防御する能力を証明した（Groothiusら、1993, New Engl. J. Med. 329:1524-1530；および The PREVENT Study Group, 1997, Pediatrics 99:93-99）。これは、RSV感染の予防に対して大きな進歩であるが、この治療法は広く使用されるにはいくつかの限界がある。第１にRSV IVIGは、その有効用量を達成するためには数時間にわたる静脈内注入をしなければならない。第２に高度免疫グロブリン中の活性物質の濃度は、リスクのある成人または心肺機能が低下したほとんどの小児を治療するのに不充分である。第３に静脈内注入では、RSVシーズンには毎月通院する必要がある。最後に、この製品に対する需要を満たすに、RSVに対する高度免疫グロブリンを産生するための充分な供与者を選択することが困難である。現在、高度免疫グロブリンの産生の資格のある充分なRSV中和抗体力価を持つのは、正常供与者の約８％のみである。
【００２１】
免疫グロブリンの比活性を改良するための１つの方法は、１つ以上の高力価のRSV中和モノクローナル抗体（MAb）を開発することであろう。好適な薬物動態を保持し、かつヒト抗マウス抗体応答の出現を避ける（RSVシーズンの間繰り返し投与が必要であろうから）ために、このようなMAbはヒトまたはヒト化されていなければなければならないであろう。RSV表面上の２つの糖タンパク質（FとG）は、中和抗体の標的であることが証明されている（Fieldsら、1990、前述；およびMurphyら、1994、前述）。
【００２２】
RSVのFタンパク質のA抗原性部位中のエピトープに対するヒト化抗体（SYNAGIS（登録商標））は、RSVシーズン（北半球では11月〜４月）中に、RSVにより引き起こされた重症の下気道疾患の予防のために、推奨された月毎の投与量の15mg/kg体重で小児患者に筋肉内投与することが、認可されている。SYNAGIS（登録商標）は、ヒト（95％）とマウス（５％）抗体配列の複合体である。Johnsonら、1997, J. Infect. Diseases 176:1215-1224およびUS Patent No. 5,824,307（その全内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。Cor（Pressら、1970、Biochem. J. 117:641-660）とCess（Takashiら、1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:194-198）のヒトIgG1の定常ドメインとVH遺伝子の可変フレームワーク領域からヒト重鎖配列が得られた。ヒト軽鎖配列は、Cの定常ドメインとJ-4を有するVL遺伝子K104の可変フレームワーク領域から得られた（Bentleyら、1980, Nature 288:5194-5198）。ヒト抗体フレームワークへの相補性決定領域の移植が関与するプロセスにおける、マウスモノクローナル抗体であるMab 1129から得られたマウス配列（Beelerら、1989, J. Virology 63:2941-2950）。
【００２３】
2.3. 鳥類ニューモウイルス
鳥類ニューモウイルス（APV）が引き起こす呼吸系疾患は、南アフリカで1970年代後半に最初に記載され（Buysら、1980, Turkey 28:36-46）、そこでは七面鳥産業にとって壊滅的な影響があった。七面鳥の疾患は副鼻腔炎と鼻炎を特徴とし、七面鳥鼻気管炎（TRT）と呼ばれた。APVのヨーロッパ分離株はまた、ニワトリの頬腫れ症候群（swollen head syndrome）の要因であることが強く示唆されている（O'Brien, 1985, Vet. Rec. 117:619-620）。元々この疾患は、ニューカッスル病ウイルス（NDV）に感染したブロイラーニワトリの群に出現し、ニューカッスル病（ND）に関連する二次的問題であると考えられた。ヨーロッパAPVに対する抗体が、SHSの発症後罹患したニワトリで検出され（Cookら、1998, Avian Pathol. 17:403-410）、APVが原因であることを示唆している。
【００２４】
七面鳥の上気道感染である鳥類鼻気管炎の原因物質である七面鳥鼻気管炎ウイルス（TRTV）として知られている鳥類ニューモウイルス（APV）（Giraudら、1986, Vet. Res. 119:606-607）は、最近指定されたメタニューモウイルス属の唯一のメンバーであり、感染症に関連せず、または哺乳動物の疾患には関連しないと最近まで言われていた。APVの血清学的サブグループは、G糖タンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、およびG糖タンパク質も認識するモノクローナル抗体を使用する中和検査に基づいて区別することができる。しかしヌクレオチド配列およびアミノ酸配列中の他の差を使用して、APVの血清学的サブグループを区別することができる。サブグループA、BおよびD内で、Gタンパク質はサブグループ内で98.5％〜99.7％の配列同一性、およびサブグループ間の31.2％〜38％のアミノ酸の同一性が観察される。例えばCollinsら、1993, Avian Pathology, 22: p. 469-479；Cookら、1993, Avian Pathology, 22:257-273；Bayon-Auboyerら、J Gen Virol, 81(Pt 11):2723-33；Seal, 1998, Virus Res, 58(1-2):45-52；Bayon-Auboyerら、1999, Arch Virol, 144(6):91-109；Juhaszら、1994, J Gen Virol, 75 (Pt 11):2873-80を参照されたい。
【００２５】
APVのさらなる血清型は、WO00/20600（参照することにより本明細書に組み込まれる）に提供され、これはAPVのコロラド分離株を記載し、これをin vitro血清中和検査を用いて既知のAPVまたはTRT株と比較した。まずコロラド分離株を、認識されているTRT分離株に対する単一特異的ポリクローナル抗血清に対して試験した。コロラド分離株は、TRT株のいずれに対する単一特異的抗血清によっても中和されなかった。しかしこれは、サブグループA株に対して作成した高度免疫抗血清により中和された。この抗血清は、相同的ウイルスを１：400の力価に、そしてコロラド分離株を１：80の力価に中和した。上記方法を使用して、コロラド分離株はTRTモノクローナル抗体に対して試験された。各ケースで、逆数中和力価は＜10であった。コロラド分離株に対して作成した単一特異的抗血清はまた、両方のサブグループのTRT株に対して試験された。試験したTRT株のいずれも、コロラド分離株に対する抗血清により中和されなかった。
【００２６】
APVのコロラド株は、TRTウイルスのサブグループAまたはサブグループB株による抗原刺激に対してSPFニワトリを防御しない。これらの結果は、コロラド分離株が鳥類ニューモウイルスのさらなる血清型の最初の例かも知れないことを示唆する（Bayon-Auboyerら、2000, J Gen Virol, 81:2723-33を参照）。
【００２７】
鳥類ニューモウイルスは、１本鎖の非セグメント化RNAウイルスであり、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）のニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）のメタニューモウイルス属（metapneumovirus）に属する（CavanaghとBarrett, 1988, Virus Res. 11:241-256; Lingら, 1992, J. Gen. Virol. 73:1709-1715; Yuら, 1992, J. Gen. Virol. 73:1355-1363）。パラミクソウイルス科は、２つの亜科に分けられる：パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）とニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）。パラミクソウイルス亜科は、特に限定されないがパラミクソウイルス属（Paramyxovirus）、ルブラウイルス属 (Rubulavirus)、およびモルビリウイルス属（Morbillivirus）を含む。最近ニューモウイルス亜科は、遺伝子の順序と配列相同性に基づき２つの属に分けられた：すなわち、ニューモウイルス（pneumovirus）とメタニューモウイルス（metapneumovirus）（Naylorら、1998, J. Gen. Virol., 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159）。ニューモウイルス属には、特に限定されないが、ヒトRSウイルス（hRSV）、ウシRSウイルス（bRSV）、ヒツジRSウイルス、およびマウスニューモウイルスがある。メタニューモウイルス属には、特に限定されないが、ヨーロッパ鳥類ニューモウイルス（サブグループAとB）があり、これはhRSV（ニューモウイルス属の標準種）から区別される（Naylorら、1998, J. Gen. Virol., 79:1393-1398; Pringle, 1998, Arch. Virol. 143:1449-1159）。APVのUS分離株は、ヨーロッパ分離株とは抗原的および遺伝子的に異なることがわかったため、メタニューモウイルス属内の第３の群（サブグループC）である（Seal, 1998, Virus Res. 58:45-52; Senneら、1998, Proc. 47th WPDC, カリホルニア、67-68頁）。
【００２８】
負に染色されたAPVの電子顕微鏡観察は、長さが1000〜2000nmの範囲の長い繊維を有する、多形性の、特に球形の直径が80〜200nmの範囲のウイルス粒子を明らかにする（CollinsとGough、J. Gen. Virol. 69:909-916）。このエンベロープは、長さが13〜15nmのとげが散在した膜からなる。ヌクレオカプシドはらせん形で、直径14mmでピッチが７mmである。ヌクレオカプシドの直径は、パラミクソウイルス（Paramyxovirus）属やモルビリウイルス（Morbillivirus ）属のもの（これらは通常約18nmの直径を有する）より小さい。
【００２９】
鳥類ニューモウイルス感染は、世界中に何年も存在しているにもかかわらずアメリカ合衆国では新たに起きている疾患である。1996年の５月にコロラドで、非常に感染性の強い七面鳥の疾患が出現し、後にアイオワ州Amesの国立家畜サービス研究所（National Veterinary Services Laboatory (NVSL)）で単離された（Senneら、1997, Proc. 134th Ann. Mtg., AVMA, pp.190）。この時期以前は、米国とカナダには鳥類ニューモウイルスはいないものだと考えられていた（Personら、1993, Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases: Applied Research and Practical Applications for Diagnosis and Control、78-83頁中；HeckerとMyers, 1993, Vet. Rec. 132:172）。1997年の初期に、ミネソタ州の七面鳥で血清学的にAPVの存在が検出された。最初に診断が確認されるまでに、すでにAPV感染症は多くの農場に広がっていた。この疾患は、上気道の臨床症状（泡沫状の目、鼻汁、および鼻腔の腫脹）を引き起こす。これは２次感染症により悪化する。感染した鳥の罹患率は100％にもなる。死亡率は１〜90％の範囲であり、６〜12週齢の家禽で最大になる。
【００３０】
鳥類ニューモウイルスは接触により伝搬する。鼻汁、感染した鳥の行動、汚染水、汚染された装置；汚染された飼料トラック、および荷下ろし活動などが、ウイルスの伝搬に寄与する。回収された七面鳥はキャリアーであると考えられる。ウイルスは卵を生む七面鳥の卵管上皮に感染することが証明されており、APVは若い家禽で検出されているため、卵伝搬は可能性が考えられる。
【００３１】
ヒトの呼吸系疾患の大部分は、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）とニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）のメンバーにより引き起こされ、呼吸器感染を引き起こす種々のウイルスに対して防御性を付与する有効なワクチンに対するニーズが存在する。
【００３２】
本明細書の文献の引用または考察は、決してこれらが本発明の先行技術であることを認めるものではない。
【発明を解決するための手段】
【００３３】
3. 発明の要約
本発明は、異種または固有ではない遺伝子産物を発現するように、特に抗原性ポリペプチドおよびペプチドを発現するように遺伝子操作された、組換えパラインフルエンザウイルスcDNAとRNAに関する。ある実施形態において本発明は、異種抗原または異種抗原の免疫原性および／または抗原性断片を発現するように遺伝子操作した、組換えウシまたはヒトパラインフルエンザウイルスに関する。本発明の別の実施形態において、組換えウシまたはヒトパラインフルエンザウイルスは、PIVゲノムに固有ではない配列（変異PIVヌクレオチド配列を含む）を発現するように遺伝子操作される。特に本発明は、組換えKansas株ウシパラインフルエンザ３型ウイルスならびにこれをコードするcDNAおよびRNA分子に関する。本発明はまた、ワクチン製剤での使用により適した表現型を有するキメラウイルスを与える修飾を有する組換えPIVに関する。
【００３４】
本発明は、種々のウイルス感染症、特に呼吸器感染症を引き起こすウイルスに対して防御性を付与することができるワクチンとして調製されるキメラPIVを、初めて提供する。具体的な実施形態において本発明は、パラインフルエンザ、インフルエンザ、またはRSウイルス感染に対して防御性を付与することができるワクチンを提供する。本発明は、哺乳動物宿主のメタニューモウイルス感染に対して防御性を付与することができるワクチンを、初めて提供する。
【００３５】
本発明において組換えウイルスは、内因性または固有のゲノム配列もしくは固有ではないゲノム配列にコードされる、ウシパラインフルエンザウイルスまたはヒトパラインフルエンザウイルスから得られるものである。本発明において、固有ではない配列とは、表現型の変化を引き起こすかまたは引き起こさない、特に限定されないが点突然変異、転位、挿入、欠失などを含む１つ以上の変異のために固有のまたは内因性ゲノム配列とは異なる配列である。
【００３６】
本発明において本発明のキメラウイルスは、１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明においてキメラウイルスは、ゲノムに異種ヌクレオチド配列が付加されているかまたはヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列で置換されているヌクレオチド配列にコードされる。
【００３７】
本発明はまた、特に限定されないが、異なる株のPIV、インフルエンザウイルス、RSウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルス）、鳥類ニューモウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、他のウイルス、病原体、細胞性遺伝子、腫瘍抗原、またはこれらの組合せからの遺伝子を含む、遺伝子産物をコードする異種配列の組合せをコードする、遺伝子操作された組換えパラインフルエンザウイルスおよびウイルスベクターに関する。さらに本発明は、RSウイルスから得られるヌクレオチド配列と組合せた、およびさらにおよびヒトパラインフルエンザウイルスから得られるヌクレオチド配列と組合せた、メタニューモウイルスから得られるヌクレオチド配列を含有する遺伝子操作された組換えパラインフルエンザウイルスに関する。本発明はまた、パラインフルエンザウイルスの異なる種および株からの遺伝子（ヒトPIV3のFおよびHN遺伝子を含む）をコードするように遺伝子操作された組換えパラインフルエンザベクターおよびウイルスを包含する。
【００３８】
ある実施形態において本発明のPIVベクターは、１つ以上の異種配列を発現するように遺伝子操作され、ここで異種配列は、好ましくは抗原性遺伝子産物である遺伝子産物をコードする。好適な実施形態において本発明のPIVベクターは、抗原性ポリペプチドおよびペプチドをコードする１つ、２つ、または３つの異種配列を発現する。ある実施形態において異種配列は、同じウイルスからまたは異なるウイルスから得られる。好適な実施形態において異種配列は、別の種のPIV（例えばヒトPIV）、PIVの変異株、または、特に限定されないがインフルエンザウイルス、RSウイルス（RSV）、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルス（hMPV））、および鳥類ニューモウイルスを含む別のマイナス鎖RNAウイルス、からの抗原性ポリペプチドである異種遺伝子産物をコードする。ある実施形態において異種配列は、異種遺伝子産物の免疫原性および／または抗原性断片をコードする。
【００３９】
好適な実施形態において、組換えPIVはウシPIV３型または弱毒化ヒトPIV３型である。ある実施形態においてPIVゲノムの融合(F)タンパク質、血球凝集素(HN)糖タンパク質、または他の必須ではない遺伝子をコードする配列は、欠失され、異種抗原性配列により置換される。さらに別の実施形態においてPIVゲノムは、異種ヌクレオチド配列以外に、ワクチン製剤での使用により適した表現型（例えば、弱毒化表現型または抗原性が上昇した表現型）を有するキメラウイルスを与える変異または修飾を有する。
【００４０】
具体的な実施形態においてPIVゲノム中に挿入される異種ヌクレオチド配列は、Fタンパク質、Gタンパク質またはHNタンパク質をコードするヌクレオチド配列から得られる。ある実施形態において挿入されるヌクレオチド配列は、キメラFタンパク質、キメラGタンパク質またはキメラHNタンパク質をコードする。具体的な実施形態においてFタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質のエクトドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、およびパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の管腔ドメインを含む。ある実施形態において挿入されるヌクレオチド配列はFタンパク質をコードし、ここで、可溶性Fタンパク質が発現されるように、Fタンパク質の膜貫通ドメインは欠失される。
【００４１】
別の具体的な実施形態において本発明は、メタニューモウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列を含むPIVゲノムを含むキメラウイルスを提供する。具体的な実施形態においてPIVウイルスは、Kansas株ウシパラインフルエンザ３型である。別の実施形態においてPIVウイルスは、弱毒化表現型を有するヒトパラインフルエンザウイルスである。さらに別の実施形態において本発明は、ウシパラインフルエンザ骨格中にヒトパラインフルエンザFおよびHN遺伝子を含有するように遺伝子操作された、キメラウシパラインフルエンザウイルス３型／ヒトパラインフルエンザウイルスを提供する。キメラウイルスはさらに、メタニューモウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列をさらに含み、および／またはRSウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列をさらに含んでよい。
【００４２】
ある実施形態において本発明のウイルスは、メタニューモウイルスの少なくとも２つの異なる遺伝子から得られる異種ヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態において、異種配列は、メタニューモウイルス、例えば鳥類ニューモウイルスおよびヒトメタニューモウイルスから得られる。さらに詳しくは異種配列は、鳥類ニューモウイルスA、B、CまたはD型を含む鳥類ニューモウイルス、好ましくはC型から得られる。
【００４３】
本発明はまた、１つ以上の異種抗原配列を発現するキメラPIVを含むワクチン調製物および免疫原性組成物を提供する。具体的な実施形態において本発明は、２価および３価ワクチンを含む多価ワクチンを提供する。本発明の多価ワクチンは、各異種抗原配列を発現する１つのPIVベクター、またはそれぞれが異なる異種抗原配列をコードする２つ以上のPIVベクターの形で投与される。ある実施形態において本発明のワクチン調製物は、１つ、２つ、または３つの異種ポリペプチドを発現するキメラPIVを含み、ここで異種ポリペプチドは、同じウイルスの１つの株、同じウイルスの異なる株、または異なるウイルスから得られる配列によりコードすることができる。好ましくは異種抗原配列は、特に限定されないがインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、RSウイルス（RSV）、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルス（hMPV））、および鳥類ニューモウイルス（APV）を含むマイナス鎖RNAウイルスから得られる。異種抗原配列には、特に限定されないが、ヒトパラインフルエンザウイルスFもしくはHNタンパク質、RSVのFタンパク質、インフルエンザウイルスA、BおよびC型のHAタンパク質、およびヒトMPVと鳥類ニューモウイルスのFタンパク質をコードする配列がある。さらに好ましくは本発明のワクチン調製物は、増殖力があり感染性である弱毒化キメラウイルスを含む。好適な実施形態において組換えPIVは、ウシPIV３型、またはヒトPIVの弱毒化株である。
【００４４】
ある実施形態においてワクチン調製物は、本発明のキメラウイルスを含み、ここでPIVゲノムのF、HNまたはいくつかの他の必須ではない遺伝子は置換または欠失されている。好適な実施形態において本発明のワクチン調製物は、PIVの株を目的の宿主中で弱毒化表現型を用いて遺伝子操作することにより調製される。好適な実施形態において本発明のワクチン調製物は、PIVの弱毒化株を遺伝子操作することにより調製される。
【００４５】
ある実施形態において異種ヌクレオチド配列は、完全なPIVゲノムに付加される。ある実施形態においてPIVゲノムは、異種配列がウイルスゲノムの１、２、３、４、５または６位で挿入され、その結果異種配列がウイルスゲノムの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ目の遺伝子として発現されるように、遺伝子操作される。具体的な実施形態において異種配列は、ウイルスゲノムの１、２、または３位で挿入される。ある実施形態において、挿入された異種遺伝子のコード配列の末端と、下流の遺伝子のコード配列の開始部分の間の遺伝子間領域は所望の長さに改変されて、異種配列の発現が上昇するかまたはキメラウイルスの増殖が上昇する。あるいは遺伝子間領域は、所望の長さに改変され、異種配列の発現または組換えもしくはキメラウイルス（例えば弱毒化表現型）の増殖を改変する可能性がある。ある実施形態において挿入位置と異種ヌクレオチド配列の横に位置する遺伝子間領域の長さは、異種配列の発現の所望のレベルと所望のウイルス増殖特性とを有する組換えもしくはキメラウイルスが選択されるように、遺伝子操作される。
【００４６】
ある実施形態において本発明は、本発明の組換えまたはキメラウイルスと、薬剤学的に許容される賦形剤とを含むワクチン製剤を提供する。具体的な実施形態において本発明のワクチン製剤は、例えばヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類のような被験体、または鳥類種の被験体の免疫応答をモジュレートするために使用される。さらに具体的な実施形態においてワクチンは、ヒトの幼児または小児の免疫応答をモジュレートするために使用される。ある実施形態において本発明は、獣医学的使用のためのワクチン製剤に関する。本発明のワクチン調製物は、単独で、または他のワクチンもしくは他の予防薬もしくは治療薬と一緒に投与することができる。
【００４７】
3.1. 慣用と略語
cDNA  相補的DNA
CPE  細胞変性作用
L大タンパク質
M  マトリックスタンパク質（エンベロープの内側の線）
F  融合糖タンパク質
HN  血球凝集素−ノイラミニダーゼ糖タンパク質
N、NPまたはNC  核蛋白質（RNAに関係しポリメラーゼ活性に必要）
P  ホスホタンパク質
MOI  感染多重度
NA  ノイラミニダーゼ（エンベロープ糖タンパク質）
PIV  パラインフルエンザウイルス
BPIV  ウシパラインフルエンザウイルス
bPIV3  ウシパラインフルエンザウイルス３型
hPIV  ヒトパラインフルエンザウイルス
hPIV3  ヒトパラインフルエンザウイルス３型
bPIV/hPIVまたはb/hPIV  hPIV配列を有する組換えbPIV
b/h PIV3またはbPIV3/hPIV3  hPIV３型配列を有する組換えbPIV３型
nt  ヌクレオチド
RNP  リボ核タンパク質
RRNP  組換えRNP
VRNA  ゲノムウイルスRNA
CRNA  抗ゲノムウイルスRNA
HMPV  ヒトメタニューモウイルス
APV  鳥類ニューモウイルス
位置  ウイルスの遺伝子操作に関して位置が使用される時、これは、転写されるウイルスゲノムの遺伝子の位置を示す。例えば１位に遺伝子が存在するなら、それは転写されるウイルスゲノムの最初の遺伝子である；もし遺伝子が２位に存在するなら、それは転写されるウイルスゲノムの第２の遺伝子である。
【００４８】
bPIV3、b/h PIV3およびこれらの誘導体の１位  ゲノムのヌクレオチド104位、または転写されるウイルスゲノムの最初の遺伝子の位置
bPIV3、b/h PIV3およびこれらの誘導体の２位  ゲノムのヌクレオチド1774位、または未変性のパラインフルエンザウイルスの第１と第２の読みとり枠の間の位置、または転写されるウイルスゲノムの第２の遺伝子の位置
bPIV3、b/h PIV3およびこれらの誘導体の３位  ゲノムのヌクレオチド3724位、または未変性のパラインフルエンザウイルスの第２と第３の読みとり枠の間の位置、または転写されるウイルスゲノムの第３の遺伝子の位置
bPIV3、b/h PIV3およびこれらの誘導体の４位  ゲノムのヌクレオチド5042位、または未変性のパラインフルエンザウイルスの第３と第４の読みとり枠の間の位置、または転写されるウイルスゲノムの第４の遺伝子の位置
bPIV3、b/h PIV3およびこれらの誘導体の５位  ゲノムのヌクレオチド6790位、または未変性のパラインフルエンザウイルスの第４と第５の読みとり枠の間の位置、または転写されるウイルスゲノムの第５の遺伝子の位置
bPIV3、b/h PIV3およびこれらの誘導体の６位  ゲノムのヌクレオチド8631位、または未変性のパラインフルエンザウイルスの第５と第６の読みとり枠の間の位置、または転写されるウイルスゲノムの第６の遺伝子の位置
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
4. 図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については後記する。
【００５０】
5. 発明の説明
本発明は、異種または固有ではない配列を発現するのに使用される、特に限定されないが、組換えウシおよびヒトPIV cDNAおよびRNA構築体を含む、組換えパラインフルエンザcDNAおよびRNA構築体に関する。
【００５１】
本発明において組換えウイルスは、内因性または固有のゲノム配列または固有ではないゲノム配列にコードされる、ウシパラインフルエンザウイルスまたはヒトパラインフルエンザウイルスから得られるものである。本発明において、固有ではない配列とは、表現型の変化を引き起こすかまたは引き起こさない、特に限定されないが点突然変異、転位、挿入、欠失などを含む１つ以上の変異のために、固有のまたは内因性ゲノム配列とは異なるものである。
【００５２】
本発明において本発明のキメラウイルスは、１つ以上の異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明においてキメラウイルスは、ゲノムに異種ヌクレオチド配列が付加されているかまたはヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列で置換されているヌクレオチド配列により、コードされる。これらの組換えおよびキメラウイルスおよび発現産物は、ヒトまたは動物への投与に適したワクチンとして使用される。例えば本発明のキメラウイルスは、ニューモウイルス、RSウイルス、パラインフルエンザウイルス、またはインフルエンザウイルス感染に対して防御性を付与するためのワクチン製剤で使用される。
【００５３】
ある実施形態において本発明は、ヒトまたはウシPIV変種から得られ、１つ、２つ、または３つの異種配列、好ましくは種々の病原体、細胞性遺伝子、腫瘍抗原およびウイルスからの外来抗原および他の生成物をコードする異種遺伝子を発現するように遺伝子操作されたPIV cDNAおよびRNA構築体に関する。特に異種配列は、麻疹ウイルス（morbillivirus）またはマイナス鎖RNAウイルス［特に限定されないが、インフルエンザウイルス、RSウイルス（RSV）、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルス変種A1、A2、B1およびB2）、および鳥類ニューモウイルスサブグループA、B、CおよびDを含む］から得られる。哺乳動物MPVは、変種A1、A2、B1またはB2の哺乳動物MPVでもよい。しかし本発明の哺乳動物MPVは、まだ同定されていないMPVの追加の変種も包含し、変種A1、A2、B1またはB2に限定されない。本発明の別の実施形態において異種配列は固有ではないPIV配列（変異PIV配列を含む）である。ある実施形態において、異種配列は同じかまたは異なるウイルスから得られる。
【００５４】
具体的な実施形態において本発明のウイルスは、ヒトメタニューモウイルスまたは鳥類ニューモウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列を含む組換えPIVである。PIVゲノム中に挿入される異種配列には、特に限定されないがヒトメタニューモウイルス変種A1、A2、B1またはB2のF、GおよびHN遺伝子をコードする配列、鳥類ニューモウイルスA、B、CまたはD型のF、GおよびHN遺伝子をコードする配列、およびこれらの免疫原性および／または抗原性断片がある。
【００５５】
ある実施形態において異種ヌクレオチド配列はウイルスゲノムに付加される。別の実施形態において異種ヌクレオチド配列は、内因性ヌクレオチド配列と交換される。異種ヌクレオチド配列は、PIVゲノムの種々の位置、例えば１、２、３、４、５または６位で、付加または挿入される。好適な実施形態において異種ヌクレオチド配列は、１位で、付加または挿入される。別の好適な実施形態において異種ヌクレオチド配列は、２位で、付加または挿入される。さらに別の好適な実施形態において異種ヌクレオチド配列は、３位で、付加または挿入される。異種ヌクレオチド配列をウイルスの小さい数の位置で挿入または付加すると、より大きい数の位置での挿入と比較して、異種ヌクレオチド配列がより強く発現される。これは、ウイルスのゲノムを通して起きる転写勾配のためである。しかしウイルスの複製効率も考慮しなければならない。例えば本発明のb/h PIV3キメラウイルスにおいて、１位での異種遺伝子の挿入はin vitroの複製速度を遅らせ、in vivoでも低下する（セクション８、実施例３および図５、ならびにセクション26、実施例21を参照）。従って、異種ヌクレオチド配列の強い発現が所望なら、小さい数の位置で異種ヌクレオチド配列を挿入することは本発明の好適な実施形態である。最も好ましくは、異種配列の強い発現が所望なら、異種配列は、b/h PIV3ゲノムの２位で挿入される（セクション5.1.2 後述、およびセクション８、実施例３を参照）。
【００５６】
ある他の実施形態において組換えまたはキメラPIVゲノムは、異種遺伝子のコード配列の末端と下流の遺伝子のコード配列の開始部分との遺伝子間領域が改変されるように、遺伝子操作される。さらに別の実施形態において本発明のウイルスは、異種ヌクレオチド配列が１、２、３、４、５または６位よりなる群から選択される位置で挿入されるように、かつ異種ヌクレオチド配列と次の下流の遺伝子との遺伝子間領域が改変されるように、遺伝子操作された組換えまたはキメラPIVゲノムを含む。適切なアッセイを使用して、適切なレベルの遺伝子発現とウイルス増殖特性を達成するための最適な挿入モード（すなわち、挿入する位置、遺伝子間領域の長さ）を決定する。詳細についてはセクション5.1.2.（後述）を参照されたい。
【００５７】
ある実施形態において本発明のキメラウイルスは、２つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有する。異種ヌクレオチド配列はPIVゲノムの種々の位置で挿入される。好適な実施形態において、ある異種ヌクレオチド配列が１位に挿入され、別の異種ヌクレオチド配列が２または３位に付加または挿入される。本発明の他の実施形態において、PIVゲノムの大きい数の位置に追加の異種ヌクレオチド配列が挿入される。本発明において異種配列の位置は、ウイルスゲノムから配列が転写される順序であり、例えば１位の異種配列はゲノムから転写される最初の遺伝子配列である。
【００５８】
本発明のある実施形態において、本発明のウイルスのゲノム中に挿入すべき異種ヌクレオチド配列は、マイナス鎖RNAウイルス（特に限定されないが、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、RSウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス、および鳥類ニューモウイルスを含む）から得られる。本発明の具体的な実施形態において異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスから得られる。別の具体的な実施形態において異種ヌクレオチド配列は、鳥類ニューモウイルスから得られる。さらに詳しくは本発明の異種ヌクレオチド配列は、ヒトまたは鳥類メタニューモウイルスのF、GもしくはSH遺伝子またはその一部をコードする。具体的な実施形態において異種ヌクレオチド配列は、配列番号１〜配列番号５、配列番号14および配列番号15の任意の１つでよい（表16参照）。ある具体的な実施形態においてヌクレオチド配列は、配列番号６〜配列番号13、配列番号16および配列番号17の任意の１つのタンパク質をコードする（表16参照）。ある具体的な実施形態においてヌクレオチド配列は、配列番号314〜389の任意の１つのタンパク質をコードする。
【００５９】
本発明の具体的な実施形態において本発明の異種ヌクレオチド配列は、A型鳥類ニューモウイルスから得られる。別の本発明の具体的な実施形態において本発明の異種ヌクレオチド配列は、B型鳥類ニューモウイルスから得られる。さらに別の本発明の具体的な実施形態において本発明の異種ヌクレオチド配列は、C型鳥類ニューモウイルスから得られる。系統発生的分析は、A型とB型は、C型に対するより互いにより密接に関連していることを示す（Seal, 2000, Animal Health Res. Rev. 1(1):67-72）。A型とB型はヨーロッパで見つかり、C型は米国で最初に単離された。
【００６０】
本発明の別の実施形態において異種ヌクレオチド配列はキメラポリペプチドをコードし、ここでエクトドメイン（ectodomain）は、ベクター骨格が得られるPIVの株以外のウイルスから得られ、膜貫通ドメインと管腔ドメインはPIV配列から得られる。得られるキメラウイルスは、選択されたマイナス鎖RNAウイルスの抗原性を付与し、弱毒化表現型を有するであろう。
【００６１】
本発明の具体的な実施形態において異種ヌクレオチド配列はキメラFタンパク質をコードする。特にキメラFタンパク質のエクトドメインはメタニューモウイルスのエクトドメインであり、その結果ヒトメタニューモウイルスまたは鳥類ニューモウイルスおよび膜貫通ドメインならびに管腔ドメインは、パラインフルエンザウイルス（例えば、ヒトまたはウシパラインフルエンザウイルス）の膜貫通ドメインと管腔ドメインである。特定の理論に拘束はされないが、キメラFタンパク質の挿入は目的の宿主中のウイルスをさらに弱毒化するかも知れないが、そのエクトドメインによるFタンパク質の抗原性を保持される。
【００６２】
本発明のキメラウイルスは、種々の感染症（特に限定されないが、ニューモウイルス感染、RSウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、インフルエンザウイルス感染、またはこれらの組合せを含む）に対する防御性を付与するワクチン製剤中で使用される。本発明は、２価および３価ワクチンを含む１つ以上の異種抗原配列を発現するキメラPIVを含むワクチン調製物を提供する。本発明の２価および３価ワクチンは、それぞれが異種抗原配列を発現する１つのPIVベクター、またはそれぞれが異なる異種抗原配列をコードする２つ以上のPIVベクターの形で投与される。好ましくは異種抗原配列は、マイナス鎖RNAウイルス（特に限定されないが、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、RSウイルス（RSV）、哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルス）および鳥類ニューモウイルスを含む）から得られる。すなわち本発明のキメラウイルス粒子は、例えば抗ヒトインフルエンザワクチン、抗ヒトパラインフルエンザワクチン、抗ヒトRSVワクチン、および抗ヒトメタニューモウイルスワクチンを作成するように遺伝子操作される。好ましくは本発明のワクチン調製物は、増殖力があり感染性がある弱毒化キメラウイルスを含む。本発明のワクチン調製物は、単独で、または他のワクチンもしくは他の予防薬もしくは治療薬と一緒に投与することができる。
【００６３】
本発明はまた、広範囲のウイルスおよび／または抗原（腫瘍抗原を含む）に対するワクチンを調製するための、ウイルスベクターおよびキメラウイルスの使用に関する。本発明のウイルスベクターとキメラウイルスは、体液性免疫応答、細胞性免疫応答を刺激することによりまたは抗原に対する耐性を刺激することにより、被験体の免疫系をモジュレートするのに使用される。本明細書において被験体とは、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類、および鳥類のメンバーを意味する。腫瘍抗原を送達する時本発明は、免疫応答介在拒絶を受けやすい疾患（例えば、非固形腫瘍またはサイズの小さい固形腫瘍）を有する被験体を治療するのに使用される。また、本明細書に記載のウイルスベクターやキメラウイルスによる腫瘍抗原の送達は、大きな固形腫瘍の切除後の治療に有用であろう。本発明はまた、癌を有することが疑われる被験体を治療するのに使用される。
【００６４】
本発明は、特に限定されないが記載の目的のために以下の段階に分けられる：(a) 組換えcDNAおよびRNA鋳型の構築；(b) 組換えcDNAおよびRNA鋳型を使用する異種遺伝子産物の発現；および(c) 組換えウイルス粒子中の異種遺伝子のレスキュー。
【００６５】
5.1. 組換えcDNAおよびRNAの構築
本発明は、パラインフルエンザウイルス（ウシパラインフルエンザウイルスと哺乳動物パラインフルエンザウイルスの両方と含む）のゲノムから得られるウイルスベクターにコードされる組換えまたはキメラウイルスを包含する。本発明において組換えウイルスは、内因性もしくは固有のゲノム配列または固有ではないゲノム配列にコードされるウシパラインフルエンザウイルスもしくは哺乳動物パラインフルエンザウイルスから得られるものである。本発明において固有ではない配列とは、表現型の変化を引き起こすかまたは引き起こさない、特に限定されないが点突然変異、転位、挿入、欠失などを含む１つ以上の変異のために、固有のまたは内因性ゲノム配列とは異なる、配列である。本発明の組換えウイルスは、パラインフルエンザウイルス（ウシパラインフルエンザウイルスと哺乳動物パラインフルエンザウイルスの両方と含む）のゲノムから得られるウイルスベクターにコードされるウイルスを包含し、ウイルスゲノムに固有ではない核酸を含有しても含有しなくてもよい。本発明においてパラインフルエンザウイルスのゲノムから得られるウイルスベクターは、パラインフルエンザウイルスの１つのORFの少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するものである。
【００６６】
本発明はまた、ワクチン製剤での使用により適した表現型（例えば弱毒化表現型または抗原性が増強された型）を有するウイルスを与えるウシおよび／または哺乳動物PIVゲノムから得られるウイルスベクターを含む組換えウイルスを包含する。変異と修飾は、ウイルスのコード領域、遺伝子間領域、およびリーダー配列とトレーラー配列中でもよい。
【００６７】
本発明において本発明のウイルスベクターは、哺乳動物パラインフルエンザウイルス、特にヒトパラインフルエンザウイルス（hPIV）のゲノムから得られる。特に本発明の実施形態においてウイルスベクターは、ヒトパラインフルエンザウイルス３型のゲノムから得られる。本発明においてこれらのウイルスベクターは、ウイルスゲノムに固有ではない核酸を含有してもしなくてもよい。
【００６８】
本発明において本発明のウイルスベクターは、ウシパラインフルエンザウイルス（bPIV）のゲノムから得られる。本発明の具体的な実施形態において、ウイルスベクターはウシパラインフルエンザウイルス３型のゲノムから得られる。本発明においてこれらのウイルスベクターは、ウイルスゲノムに固有ではない核酸を含有してもよい。
【００６９】
本発明においてキメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む組換えbPIVまたはhPIVである。本発明においてキメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列がゲノムに付加されているか、または内因性または固有のヌクレオチド配列が異種ヌクレオチド配列で置換されているヌクレオチド配列にコードされる。本発明においてキメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列をさらに含む本発明のウイルスベクターにコードされる。本発明においてキメラウイルスは、ウイルスゲノムに固有ではない核酸を含有してもしなくてもよいウイルスベクターにコードされる。本発明においてキメラウイルスは、異種ヌクレオチド配列が付加、挿入、または固有のもしくは固有ではない配列と置換されているウイルスベクターにコードされる。
【００７０】
キメラウイルスは、２つ以上のウイルスに対して防御する組換えワクチンの作成のために特に有用である（Taoら、J. Virol. 72::2955-2961；Durbinら、2000, J. Virol. 74:6821-6831；Skiadopoulusら、1998, J. Virol. 72:1762-1768 (1998)；Tengら、2000, J. Virol. 74:9317-9321）。例えば、別のマイナス鎖RNAウイルス（例えばMPV）の１つ以上のタンパク質を発現するhPIVまたはbPIVウイルスベクター、またはMPVの１つ以上のタンパク質を発現するRSVベクターは、そのようなベクターでワクチン接種された個体を、ウイルス感染に対して防御することが企図される。他のパラミクソウイルスについて同様のアプローチが企図される。弱毒化および複製欠損ウイルスは、他のウイルスについて示唆されているように、生きたワクチンによるワクチン接種目的に有用かも知れない（PCT WO02/057302、６頁と23頁を参照、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００７１】
本発明において本発明の組換えまたはキメラウイルスをコードするウイルスベクター中に取り込まれる異種配列には、メタニューモウイルスの異なる株、鳥類ニューモウイルスの株、および他のマイナス鎖RNAウイルス［特に限定されないが、RSV、PIV、インフルエンザウイルスおよび他のウイルス（麻疹ウイルスを含む）を含む］がある。
【００７２】
本発明のある実施形態において本発明のキメラまたは組換えウイルスは、１つ以上の配列、遺伝子間領域、末端配列、またはその一部、または全ORFが、異種もしくは固有ではない配列で置換されているウイルスゲノムから得られるウイルスベクターにコードされる。本発明のある実施形態において本発明のキメラウイルスは、１つ以上の異種配列がベクターに付加されているウイルスゲノムから得られるウイルスベクターにコードされる。
【００７３】
本発明の具体的な実施形態は、パラインフルエンザウイルスゲノムから得られるヌクレオチド配列にコードされる骨格を含むキメラウイルスである。好適な実施形態においてPIVゲノムは、ウシPIV（例えばbPIV3のKansas株）またはヒトPIVから得られる。好適な実施形態においてPIVゲノムは、ウシパラインフルエンザウイルスヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または完全なbPIVゲノムに異種配列が付加されている、bPIV3のKansas株から得られる。本発明のさらに具体的な実施形態は、ヒトパラインフルエンザウイルスヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または完全なhPIVゲノムに異種配列が付加されている、ヒトパラインフルエンザウイルス３型ゲノムから得られるヌクレオチド配列にコードされる骨格を含むキメラウイルスである。本発明のさらに具体的な実施形態は、(a) ウシパラインフルエンザウイルスF遺伝子とHN遺伝子がヒトパラインフルエンザウイルスのF遺伝子とHNゲノムで置換されている（bPIV/hPIV）、および(b) 異種配列が完全なbPIVゲノムに付加されている、ウシパラインフルエンザウイルスゲノム（例えばbPIV3のKansas株）から得られるヌクレオチド配列にコードされる骨格を含むキメラウイルスである。
【００７４】
本発明はまた、ワクチン製剤での使用により適した表現型（例えば弱毒化表現型または抗原性が増強された型）を有するキメラウイルスを与える、変異または修飾を含むbPIV、hPIV、またはbPIV/hPIVゲノムから得られるヌクレオチド配列にコードされる骨格を含むキメラウイルスを包含する。本発明のこの具体的な実施形態において、ウシPIV3骨格中の異種配列はbPIV3には異種である任意の配列である。
【００７５】
本発明の別の具体的な実施形態は、hPIVヌクレオチド配列が異種配列で置換されているか、または異種配列が完全なhPIVゲノムに付加されている、ヒトPIV 1、2、または3から得られるヌクレオチド配列にコードされる骨格を含むキメラウイルスであって、ただし生じるキメラウイルスは、血球凝集素−ノイラミニダーゼと融合糖タンパク質がhPIV1により置換されているキメラhPIV3ではない、キメラウイルスである。本発明はまた、hPIVゲノムから得られるヌクレオチド配列にコードされる骨格を含み、異種配列以外に、ワクチン製剤での使用により適した表現型（例えば弱毒化表現型または抗原性が増強された型）を有するキメラウイルスを与える変異または修飾を有する、キメラウイルスを包含する。
【００７６】
ウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーターの相補体、例えば本発明の3'-PIVウイルス末端の相補体、または3'-と5'-PIVウイルス末端の両方の相補体が横に位置する異種遺伝子コード配列は、当該分野で公知の方法を使用して構築される。生じるRNA鋳型は負の極性であり、ウイルスRNA-合成装置が鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含有することができる。あるいはウイルスRNA合成装置が鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列と含有する正の極性のRNA鋳型を使用してもよい。適切なウイルス配列を有しウイルスポリメラーゼ認識と活性を可能にする組換えRNA鋳型のin vitroまたはin vivo産生のために、これらのハイブリッド配列を含有する組換えDNA分子をクローン化し、DNA指令RNAポリメラーゼ、例えばバクテリオファージT7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、または真核生物ポリメラーゼ（例えばポリメラーゼI）などにより転写することができる。
【００７７】
ある実施形態において本発明のPIVベクターは、抗原性ポリペプチドおよびペプチドをコードする１つ、２つ、または３つの異種配列を発現する。ある実施形態において異種配列は、同じウイルスまたは異なるウイルスから得られる。ある実施形態において同じ異種ヌクレオチド配列の２つ以上のコピーが、ウシパラインフルエンザウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、またはbPIV/hPIVキメラベクターのゲノム中に挿入される。ある好適な実施形態において同じ異種ヌクレオチド配列の２つのコピーが本発明のウイルスのゲノムに挿入される。ある実施形態において異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルス、例えばヒトメタニューモウイルスまたは鳥類ニューモウイルスから得られる。具体的な実施形態においてメタニューモウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルスのF遺伝子である。別の具体的な実施形態においてメタニューモウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルスのG遺伝子である。ある別の実施形態において異種ヌクレオチド配列は、RSウイルスから得られる。具体的な実施形態においてRSウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列は、RSウイルスのF遺伝子である。他の具体的な実施形態においてRSウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列は、RSウイルスのG遺伝子である。１つ以上の異種ヌクレオチド配列が挿入される時、各挿入されるコピーの挿入位置と遺伝子間領域の長さは、操作することができ、セクション5.1.2.（後述）に従って異なる測定法により測定することができる。
【００７８】
ある実施形態においてキメラウイルスまたは発現産物のレスキューは、宿主細胞系中の逆遺伝学（reverse genetics）により行われ、ここでは宿主細胞はキメラcDNAまたはRNA構築体を用いてトランスフェクトされる。本発明のRNA鋳型は、適切なDNA配列をDNA指令RNAポリメラーゼで転写することにより調製される。本発明のRNA鋳型は、DNA指令RNAポリメラーゼ（例えばバクテリオファージT7ポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、または真核生物ポリメラーゼ（例えばポリメラーゼI））を使用して適切なDNA配列を転写することにより、in vitroまたはin vivoで調製される。ある実施形態において本発明のRNA鋳型は、Hoffmannら, 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113に記載のようなプラスミドベースの発現系、またはHoffmannとWebster, 2000, J. Gen. Virol. 81:2843-2847に記載のような単向性RNAポリメラーゼI-ポリメラーゼII転写系を使用して、適切なDNA配列を転写することにより、in vitroまたはin vivoで調製される。生じる負の極性のRNA鋳型は、ウイルスRNA合成装置が鋳型を認識することを可能にする適切な末端配列を含有するであろう。あるいは適切な末端配列と含有しウイルスRNA合成装置が鋳型を認識することを可能にする正の極性のRNA鋳型を使用してもよい。正の極性のRNA鋳型からの発現は、DNA依存性RNAポリメラーゼにより認識されるプロモーターを有するプラスミドの転写により行われる。例えばT7プロモーターの制御下で正のRNA鋳型をコードするプラスミドDNAを、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスT7系と一緒に使用することができる。
【００７９】
ウイルス配列の翻訳の内部開始を可能にし、正規の末端開始部位からの外来タンパク質コード配列の発現、またはその逆を可能にするために、２シストロン性mRNAを構築することができる。あるいは転写単位が開始部位とポリアデニル化部位を有する内部転写単位から、外来タンパク質を発現してもよい。別の実施形態において、生じる発現タンパク質が融合タンパク質であるように、外来遺伝子がPIV遺伝子中に挿入される。
【００８０】
ある実施形態において本発明は、本発明のウイルスを含む３価ワクチンに関する。具体的な実施形態において３価ワクチンのために使用されるウイルスは、メタニューモウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルスまたは鳥類ニューモウイルス）から得られる第１の異種ヌクレオチド配列と、RSウイルスから得られる第２の異種ヌクレオチド配列を含有する、キメラウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型ウイルスである。別の実施形態においてそのような３価ワクチンは、(a) ヒトパラインフルエンザウイルスのF遺伝子とHN遺伝子の遺伝子産物；(b) メタニューモウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質；および(c) RSウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列にコードされるタンパク質に特異的であろう。具体的な実施形態において第１の異種ヌクレオチド配列はRSウイルスのF遺伝子であり１位に挿入され、第２の異種ヌクレオチド配列はヒトメタニューモウイルスのF遺伝子であり３位に挿入される。さらに多くの組合せが本発明により包含され、一部を例として表１に示す。他の組合せのために、鳥類ニューモウイルスのFまたはG遺伝子を使用できる。さらにキメラFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を使用することができる（前述参照）。それほど好適ではない実施形態において異種ヌクレオチド配列は、ウイルスゲノムの大きい数の位置に挿入することができる。
【表１】
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【００８１】
別の実施形態において、異種配列と下流の遺伝子のコード配列の開始部位の間の遺伝子間領域を改変することができる。例えば表１に列挙された各遺伝子は、好ましい長さの遺伝子間領域を有する。ある実施形態において３価ワクチンは、１位に挿入されたRSウイルスのF遺伝子を有するb/h PIV3、177ヌクレオチドの改変された遺伝子間領域（元々下流のN遺伝子開始コドンAUGまで75ヌクレオチド）、およびその天然の遺伝子間領域を有するヒトメタニューモウイルスのF遺伝子とを含む。さらに多くの組合せが本発明により包含され、異種ヌクレオチド配列の各挿入は、セクション5.1.2.（後述）に従って操作される。
【００８２】
より広い実施形態において本発明の発現産物とキメラウイルス粒子を遺伝子操作して、より広範囲の病原体（ウイルス抗原、腫瘍抗原、および自己免疫疾患に関与する自己抗原を含む）に対するワクチンを作成してもよい。この目標を達成する１つの方法は、存在するPIV遺伝子を修飾して各外部ドメインに外来配列を含有させることを含む。異種配列がエピトープまたは病原体の抗原である場合、これらのキメラウイルスを使用して、これらの決定基が得られる疾患物質に対する防御性免疫応答を誘発してもよい。
【００８３】
これらのハイブリッド分子を構築する１つの方法は、異種ヌクレオチド配列をPIVゲノム（例えば、hPIV、bPIV、またはbPIV/hPIV）のDNA相補体に挿入して、異種配列の横に、ウイルスポリメラーゼ活性に必要なウイルス配列（すなわち、ウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーター（以後ウイルスポリメラーゼ結合部位と呼ぶ）およびポリアデニル化部位）が存在するようにすることである。好適な実施形態において異種コード配列の横に、5'末端と3'末端の複製プロモーター、遺伝子開始配列と遺伝子停止配列、および5'末端および／または3'末端に存在するパッケージングシグナルとを含むウイルス配列が存在する。別のアプローチではポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド（例えば、ウイルスゲノムセグメントの3'末端または両端の相補体）を異種コード配列に連結して、ハイブリッド分子を構築することができる。外来遺伝子または外来遺伝子のセグメントを標的配列内に置くことは、以前は標的配列内の適切な制限酵素の存在により指令された。しかし分子生物学の最近の進歩は、この問題を大幅に緩和した。部位特異的突然変異誘発を使用することにより、制限酵素は標的配列内の任意の位置に容易に置くことができる（例えば、Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488に記載の方法を参照）。後述の種々のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術ままた、配列の特異的挿入（すなわち、制限酵素部位）を可能にし、ハイブリッド分子の容易な構築を可能にする。あるいはPCR反応を使用して、クローニングの必要無く組換え鋳型を調製することができる。例えばPCR反応を使用して、DNA指令RNAポリメラーゼプロモーター（例えば、バクテリオファージT3、T7またはSP6）を含有する２本鎖DNA分子、および異種遺伝子とPIVポリメラーゼ結合部位を含有するハイブリッド配列を調製することができる。次にこの組換えDNAから直接RNA鋳型を転写することができる。さらに別の実施形態において、RNAリガーゼを使用して異種遺伝子の負の極性を特定するRNAとウイルスポリメラーゼ結合部位とを連結することにより、組換えRNA鋳型を調製してもよい。
【００８４】
さらに、ウイルスのレスキューの成功に重要な「６の規則（Rule of Six）」に従うために、１つ以上のヌクレオチドを非翻訳領域のHN遺伝子の3'末端で付加することができる。「６の規則（Rule of Six）」は多くのパラミクソウイルスに適用され、機能的であるためにはRNAゲノムのヌクレオチドの数が６の倍数であることを必要とする。ヌクレオチドの付加は、当該分野で公知の技術、例えばQuikChange突然変異誘発キット（ストラタジーン（Stratagene））のような市販の突然変異誘発キットを使用して行うことができる。適切な数のヌクレオチドの付加後、適切な制限酵素で消化しゲル精製して、正しいDNA断片（例えば、hPIV3 FおよびHN遺伝子のDNA断片）を単離することができる。ポリメラーゼ活性の配列用件と本発明で使用される構築体は以下のセクションに記載される。
【００８５】
理論に拘束はされないが、いくつかのパラメータが組換えウイルスの複製速度と異種配列の発現レベルに影響を与える。特にbPIV、hPIV、b/h PIV中の異種配列の位置、および異種配列の横に位置する遺伝子間領域の長さが、複製速度と異種配列の発現レベルを決定する。
【００８６】
ある実施形態においてウイルスのリーダー配列とトレーラー配列は、野生型ウイルスに対して修飾される。さらに具体的な実施形態においてリーダーおよび／またはトレーラーの長さは改変してもよい。別の実施形態においてリーダーおよび／またはトレーラーの配列は、野生型ウイルスに対して変異させられる。
【００８７】
本発明の組換えウイルスの産生は、マイナス−センスウイルスRNA（vRNA）ゲノムの部分的または完全長コピー、またはその相補的コピー（cRNA）の複製に依存する。vRNAまたはcRNAは、感染性ウイルスから単離され、in vitro転写により産生され、または核酸のトランスフェクションにより細胞で産生される。組換えマイナス鎖ウイルスの産生は機能性ポリメラーゼ複合体に依存する。典型的にはニューモウイルスのポリメラーゼ複合体は、N、P、LおよびおそらくM2タンパク質からなるが、これらに必ずしも限定されない。
【００８８】
ポリメラーゼ複合体またはその成分は、ウイルス粒子から単離でき、１つ以上の成分を発現する細胞から単離でき、または特異的発現ベクターのトランスフェクションにより産生される。
【００８９】
MPVの感染性コピーは、上記のvRNA、cRNA、またはこれらのRNAを発現するベクターが、上記ポリメラーゼ複合体16により複製される時に得られる（Schnellら、1994, EMBO J 13:4195-4203; Collinsら、1995, PNAS 92:11563-11567; Hoffmannら、2000, PNSA 97:6108-6113; Bridgenら、1996, PNAS 93:15400-15404; Paleseら、1996, PNAS 93:11354-11358；Peetersら、1999, J. Virol. 73:5001-5009；Durbinら、1997, Virology 235:323-332）。
【００９０】
本発明は、本発明の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。PIVのポリメラーゼ成分（おそらくN、P、LおよびM2だが、これらに必ずしも限定されない）を含有するプラスミドまたはウイルスベクターは、関連する種類の細胞（細菌、昆虫、真核細胞）での成分の発現のために原核細胞中で作成される。PIVゲノムの完全長または部分的コピーを含有するプラスミドまたはウイルスベクターは、in vitroおよびin vivoでのウイルス核酸の発現のために、原核細胞中で作成されるであろう。後者のベクターは、キメラウイルスまたはキメラウイルスタンパク質の作成のため他のウイルス配列を含有してもよく、複製欠損ウイルスの作成のためウイルスゲノムの一部を欠いてもよく、弱毒化ウイルスの作成のため変異、欠失または挿入を有してもよい。
【００９１】
PIV（野生型、弱毒化型、複製欠損型、またはキメラ）の感染性コピーは、上記の最新技術に従うポリメラーゼ成分の同時発現により産生することができる。
【００９２】
さらに、１つ以上の完全長または部分的PIVタンパク質を一過性または安定に発現する真核細胞を使用することができる。そのような細胞は、トランスフェクション（タンパク質または核酸ベクター）、感染（ウイルスベクター）または形質導入（ウイルスベクター）により作成することができ、上記の野生型、弱毒化型、複製欠損型またはキメラウイルスの補足に有用である。
【００９３】
挿入される異種遺伝子配列
本発明は、１つ以上の異種配列を発現するための組換えウシまたはヒトパラインフルエンザウイルスの遺伝子操作を包含し、ここで異種配列は、遺伝子産物または好ましくは抗原性および／または免疫原性である遺伝子産物の断片をコードする。本明細書において用語「抗原性」とは、分子が抗体またはMHC分子に結合する能力を意味する。用語「免疫原性」とは、分子が宿主で免疫応答を引き起こす能力を意味する。
【００９４】
好適な実施形態において挿入される異種ヌクレオチド配列は、マイナス鎖RNAウイルス（特に限定されないが、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、RSウイルス、哺乳動物メタニューモウイルス（例えばヒトメタニューモウイルス）、および鳥類ニューモウイルスを含む）から得られる。好適な実施形態において挿入される異種配列は、特に限定されないが、ヒトPIVのFもしくはHN遺伝子、RSVのF遺伝子、インフルエンザウイルスA、B、もしくはC型のHA遺伝子、ヒトMPVのF遺伝子、鳥類ニューモウイルスのF遺伝子、またはこれらの免疫原性および／または抗原性断片がある。
【００９５】
別の実施形態において挿入される異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスおよび／または鳥類ニューモウイルスから得られる。ある実施形態において挿入される異種ヌクレオチド配列は、(a) ヒトメタニューモウイルスとRSウイルス；および／または(b) 鳥類ニューモウイルスとRSウイルスから得られる。
【００９６】
本発明のある好適な実施形態において挿入される異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスおよび／または鳥類ニューモウイルスからのF遺伝子から得られる。ある実施形態においてF遺伝子は、(a) ヒトメタニューモウイルスおよびRSウイルス；および／または(b) 鳥類ニューモウイルスおよびRSウイルスから得られる。
【００９７】
本発明のある実施形態において挿入される異種ヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスおよび／または鳥類ニューモウイルスから得られるG遺伝子である。ある実施形態においてG遺伝子は、(a) ヒトメタニューモウイルスおよびRSウイルス；および／または(b) 鳥類ニューモウイルスおよびRSウイルスから得られる。
【００９８】
ある実施形態において、ヒトメタニューモウイルス、鳥類ニューモウイルス、およびRSウイルスから得られる異なるF遺伝子および／または異なるG遺伝子の任意の組合せを本発明のウイルス中に挿入できるが、ただしすべての実施形態において、本発明の組換えパラインフルエンザウイルス中に、ヒトメタニューモウイルスまたは鳥類ニューモウイルスから得られる少なくとも１つの異種配列が存在する。
【００９９】
ある実施形態において挿入されるヌクレオチド配列は、ヒトメタニューモウイルスから得られるFタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。他のある実施形態において挿入されるヌクレオチド配列は、鳥類ニューモウイルスから得られるGタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。さらに別の実施形態において挿入されるヌクレオチド配列は、鳥類ニューモウイルスから得られるFタンパク質をコードするヌクレオチド配列である。ただし、本発明のすべての実施形態において、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルスから得られ、挿入される異種ヌクレオチド配列はRSウイルスのFタンパク質またはGタンパク質をコードする。
【０１００】
ある実施形態において挿入されるヌクレオチド配列は、キメラFタンパク質またはキメラGタンパク質をコードする。キメラFタンパク質は、異なるウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルス、鳥類ニューモウイルスおよび／またはRSウイルス）からのFタンパク質の一部を含む。キメラGタンパク質は、異なるウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルス、鳥類ニューモウイルスおよび／またはRSウイルス）からのGタンパク質の一部を含む。具体的な実施形態においてFタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質のエクトドメイン、パラインフルエンザウイルスのFタンパク質の膜貫通ドメイン、およびパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の管腔ドメインを含む。ある実施形態において挿入される核酸は、可溶性Fタンパク質が発現されるように、Fタンパク質の膜貫通ドメイが欠失されたFタンパク質をコードする。
【０１０１】
ある実施形態において本発明の異種ヌクレオチド配列は、配列番号１〜配列番号５、配列番号14および配列番号15（表16を参照）のいずれかである。ある具体的な実施形態においてヌクレオチド配列は、配列番号６〜配列番号13、配列番号16、および配列番号17（表16を参照）のいずれかのタンパク質をコードする。ある具体的な実施形態においてヌクレオチド配列は、配列番号314〜389のいずれかのタンパク質をコードする。
【０１０２】
RSウイルスから得られる異種ヌクレオチド配列については、例えばPCT/US98/20230（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１０３】
好適な実施形態において本発明のキメラウイルス中に発現することができる異種遺伝子配列には、特に限定されないが、呼吸系疾患に至るウイルスの抗原性エピトープや糖タンパク質（例えば、インフルエンザ糖タンパク質、特に血球凝集素H5、H7、RSウイルスエピトープ、ニューカッスル病ウイルスエピトープ、センダイウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルス（ILV））をコードするものがある。最も好適な実施形態において異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルスおよび／または鳥類ニューモウイルス）から得られる。本発明のさらに別の実施形態において、本発明のキメラウイルス中に遺伝子操作できる異種遺伝子配列には、特に限定されないが、ウイルスエピトープやウイルスの糖タンパク質（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、Ａ型またはＣ型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタインバーウイルスの糖タンパク質、ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質、サルウイルス５または流行性耳下腺炎ウイルス、ウェストナイルウイルス、デングウイルス、ヘルペスウイルスの糖タンパク質、ポリオウイルスのVPI、およびヒト免疫不全症ウイルス（HIV）から得られる配列、好ましくは１型または２型）をコードするものがある。さらに別の実施形態において本発明のキメラウイルスに遺伝子操作できる異種遺伝子配列には、特に限定されないがマレック病ウイルス（MDV）エピトープ、感染性バーサル病（Bursal Disease）ウイルス（IBDV）、ニワトリ貧血ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス（ILV）、鳥類インフルエンザウイルス（AIV）、狂犬病、ネコ白血病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、および豚痘ウイルスのエピトープをコードするものがある（Fieldsら（編）、1991, Fundamental Virology、第２版、ラーベンプレス（Raven Press）、ニューヨークを参照（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【０１０４】
本発明の他の異種配列には、自己免疫疾患に特徴的な抗原をコードするものがある。これらの抗原は典型的には、哺乳動物の組織の細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどから得られ、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、悪性貧血、アジソン病、硬皮症、自己免疫萎縮性胃炎、若年性糖尿病、および円板状紅斑性狼瘡に特徴的な抗原がある。
【０１０５】
アレルゲンである抗原には一般に、タンパク質または糖タンパク質があり、花粉、ホコリ、カビ、胞子、ふけ、昆虫および食物から得られる抗原がある。さらに腫瘍抗原に特徴的な抗原は典型的には、腫瘍組織の細胞表面、細胞質、核、細胞内器官などから得られる。例としては、腫瘍タンパク質（変異癌遺伝子にコードされるタンパク質を含む）、腫瘍に関連するウイルスタンパク質、および糖タンパク質に特徴的な抗原を含む。腫瘍には、特に限定されないが、唇、鼻咽頭、咽頭と口腔、食道、胃、大腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、喉頭、肺と気管支、皮膚黒色腫、乳房、頸部、子宮、卵巣、膀胱、腎臓、子宮、脳、および神経系の他の部分、甲状腺、前立腺、睾丸、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および白血病の癌から得られるものがある。
【０１０６】
ある具体的な実施形態において異種配列は、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）、好ましくはヒト免疫不全症ウイルス-1またはヒト免疫不全症ウイルス-2のゲノムから得られる。本発明の別の実施形態において異種コード配列は、PIVウイルスタンパク質内に異種ペプチド配列を含有するキメラ遺伝子産物が発現されるように、PIV遺伝子コード配列内に挿入される。本発明のそのような実施形態において異種配列はまた、ヒト免疫不全症ウイルスのゲノム、好ましくはヒト免疫不全症ウイルス-1またはヒト免疫不全症ウイルス-2のゲノムから得られる。
【０１０７】
異種配列がHIVから得られる場合、そのような配列には、特に限定されないがenv遺伝子（すなわち、gp160、p120、および／またはgp41のすべてまたは一部をコードする配列）、pol遺伝子（すなわち、転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および／またはインテグラーゼのすべてまたは一部をコードする配列）、gag遺伝子（すなわち、p7、p6、p55、p17/18、p24/25のすべてまたは一部をコードする配列）、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、および／またはvpxがある。
【０１０８】
別の実施形態においてキメラウイルス中に遺伝子操作することができる異種遺伝子配列には、免疫増強活性を有するタンパク質をコードするものがある。免疫増強性タンパク質の例には、特に限定されないがサイトカイン、インターフェロンＩ型、ガンマインターフェロン、コロニー刺激因子、およびインターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12がある。
【０１０９】
さらに、キメラウイルス中に遺伝子操作することができる他の異種遺伝子配列には、細菌から得られる抗原（例えば細菌表面糖タンパク質）、真菌から得られる抗原、種々の他の病原体および寄生体から得られる抗原をコードするものがある。細菌病原体から得られる異種遺伝子配列の例には、特に限定されないが以下の属の種：サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、クラミジア（Chlamydia）、ヘリコバクター（Helicobacter）、エルシニア（Yersinia）、ボルデテラ（Bordetella）、シュードモナス（Pseudomonas）、ナイセリア（Neisseria）、ビブリオ（Vibrio）、ヘモフィルス（Haemophilus）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、ストレプトミセス（Streptomyces）、トレポネマ（Treponema）、コキシエラ（Coxiella）、エーリキア（Ehrlichia）、ブルセラ（Brucella）、ストレプトバシラス（Streptobacillus）、フソスピロヘータ（Fusospirocheta）、スピリルム（Spirillum）、ウレアプラズマ（Urelaplasma）、スピロヘータ（Spirochaeta）、マイコプラズマ（Mycoplasma）、アクチノミセーテス（Actinomycetes）、ボレリア（Borrelia）、バクテロイデス（Bacteroides）、トリコモラス（Trichomoras）、ブランハメラ（Branhamella）、パステレラ（Pasteurella）、クロストリジウム（Clostridium）、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、リステリア（Listeria）、バチルス（Bacillus）、エリシペロトリックス（Erysipelothrix）、ロードコッカス（Rhodococcus）、エシェリキア（Escherichia）、クレブシェラ（Klebsiella）、シュードモナス（Pseudomonas）、エンテロバクター（Enterobacter）、セラチア（Serratia）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス（Streptocossus）、レギオネラ（Legionella）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、プロテウス（Proteus）、キャンピロバクター（Campylobacter）、エンテロコッカス（Enterococcus）、アシネトバクター（Acinetobacter）、モルガネラ（Morganella）、モラキセラ（Moraxella）、シトロバクター（Citrobacter）、リケッチア（Rickettsia）、ロクリメイー（Rochlimeae）、ならびに細菌種：緑膿菌（P. aeruginosa）、大腸菌（E. coli）、ピー・セパシア（P. cepacia）、エス・エピデルミス（S. epidermis）、イー・フェカリス（E. faecalis）、エス・ニューモニアス（S. pneumonias）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、エヌ・メニンギチディス（N. meningitidis）、エス・ピオゲネス（S. pyogenes）、パストレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、およびピー・ミラビリス（P. mirabilis）から得られる抗原をコードするものがある。
【０１１０】
病原性真菌から得られる異種遺伝子配列の例には、特に限定されないが、真菌、例えばクリプトコッカス・ネオホルマンス（Cryptococcus neoformans）；ブラストミセス・デルマティディス（Blastomyces dermatitidis）；イエロミセス・デルマティディス（Aiellomyces dermatitidis）；ヒストプラズマ・カプスラツム（Histoplasma capsulatum）；コクシディオイデス・イミティス（Coccidioides imminis）；カンジダ（Candida）種（カンジダ・アルビカンス（C. albicans）、カンジダ・トロピカリス（C. tropicalis）、カンジダ・パラシロシス（C. parapsilosis)、カンジダ・グリエルモンディイ（C. guilliermondii）およびカンジダ・クルセイ（C. krusei）を含む）；アスペルギルス（Aspergillus）種、例えばアスペルギルス・フミガツス（A. fumigatus）、アスペルギルス・フラブス（A. flavus）およびアスペルギルス・ニガー（A. niger）；リゾプス（Rhizopus）種；リゾムコール（Rhizomucor）種；カンインガメラ（Cunninghammella）種；アポフィソミセス（Apophysomyces）種；例えばアポフィソミセス・サクセナエ（A. saksenaea）、アポフィソミセス・ムコール（A. mucor）およびアポフィソミセス・アブシディア（A. absidia)；スポロスリックス・シェンキイ（Sporothrix schenckii）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）；シューダレシェリア・ボイヂイ（Pseudallescheria boydii）、トルロプシス・グラブラタ（Torulopsis glabrata）；トリコフィトン（Trichophyton）種、ミクロスポルム（Microsporum）種およびデルマトフィレス（Dermatophyres）種、ならびに現在または後に病原性であることが明らかになる他の任意の酵母または真菌から得られる抗原をコードするものがある。
【０１１１】
最後に寄生体から得られる異種遺伝子配列の例には、特に限定されないがアピコンプレックス（Apicomplexa）門 のメンバー、例えばバベシア（Babesia）、トキソプラズマ（Toxoplasma）、プラスモジウム（Plasmodium）、エイメリア（Eimeria）、イソスポラ（Isospora）、アトキソプラズマ（Atoxoplasma）、シストイソスポラ（Cystoisospora）、ハンモンジア（Hammondia）、ベスニオチア（Besniotia）、サルコシスティス（Sarcocystis）、フレンケリア（Frenkelia）、ヘモプロテウス（Haemoproteus）、ロイコシトズーン（Leucocytozoon）、セイレリア（Theileria）、ペルキンスス（Perkinsus）およびグレガリナ（Gregarina）種；ニューミシスティス・カリニイ（Pneumocystis carinii）；ミクロスポラ（Microspora）門のメンバー、例えばノセマ（Nosema）、エンテロシトズーン（Enterocytozoon）、エンセファリトズーン（Encephalitozoon）、セプタータ（Septata）、ムラゼキア（Mrazekia）、アンブリオスポラ（Amblyospora）、アメソン（Ameson）、グルゲア（Glugea）、プレイストフォラ（Pleistphora）およびミクロスポリジウム（Microsporidium）種；およびアセトスポラ（Ascetospora）門のメンバー、例えばハプロスポリジウム（Haplosporidium）種、ならびに熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、プラスモジウム・ビバックス（P. vivax）、プラスモジウム・オバレ（P. ovale）、プラスモジウム・マラリア（P. malaria）；トコソプラズマ・ゴンディイ（Toxoplasma gondii）；レイシュマニア・メキシカーナ（Leishmania mexicana）、レイシュマニア・トロピカ（L. tropica）、レイシュマニア・マジョール（L. major）、レイシュマニア・エチオピカ（L. aethiopica）、レイシュマニア・ドノバニ（L. donovani）、トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）、トリパノソーマ・ブルセイ（T. brucei）、シストソーマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）；シストソーマ・ヘマトビウム（S. haematobium）、シストソーマ・ジャポニウム（S. japonium）；トリキネラ・スピラリス（Trichinella spiralis）；ウチェレリア・バンクロフティ（Wuchereria bancrofti）；ブルギア・マライリ（Brugia malayli）；エントアメーバ・ヒストリティカ（Entamoeba histolytica）；エンテロビウス・ベルミクロアルス（Enterobius vermiculoarus）；タエニア・ソリウム（Taenia solium）、タエニア・サギナータ（T. saginata）、トリコモナス・バギナティス（Trichomonas vaginatis）、トリコモナス・ホミニス（T. hominis）、トリコモナス・テナックス（T. tenax）；ギアルディア・ランブリア（Giardia lamblia）；クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）；ニューモシティス・カリニイ（Pneumocytis carinii）、バベシア・ボビス（Babesia bovis）、バベシア・ディバージェンス（B. divergens）、バベシア・ミクロティ（B. microti）、イソスポラ・ベリ（Isospora belli）、エル・ホミニス（L. hominis）；ジエントアメーバ：・フラギリス（Dientamoeba fragilis）；オンコセルカ・ボルブルス（Onchocerca volvulus）；アスカリス・ルミブリコイデス（Ascaris lumbricoides）；ネカトール・アメリカニス（Necator americanis）；アンシロストーマ・デュオデナーレ（Ancylostoma duodenale）；ストロンギロイデス・ステルコラリス（Strongyloides stercoralis）；カピラリア・フィリピネンシス（Capillaria philippinensis）；アンギオストロンギルス・カントネンシス（Angiostrongyhlus cantonensis）；ヒメノレピス・ナーナ（Hymenolepis nana）；ディフィロボスリウム・ラツム（Diphyllobothrium latum）；エキノコッカス・グラヌロスス（Echinococcus granulosus）、エキノコッカス・マルチロキュラリス（E. multilocularis）；パラゴニムス・ウェステルマニ（Paragonimus westermani）、パラゴニムス・カリエンシス（P. caliensis）；クロノルキス・シネンシス（Chlonorchis sinensis）；オピストルキス・フェリネアス（Opisthorchis felineas）、ジー・ビベリニ（G. Viverini）、ファスシオラ・ヘパティカ（Fasciola hepatica）、サルコプテス・スカビエイ（Sarcoptes scabiei）、ペディキュルス・フマヌス（Pediculus humanus）；フチルルス・プビス（Phthirlus pubis）；およびデルマトビア・ホミニス（Dermatobia hominis）、ならびに現在または後に病原性であることが明らかになる他の任意の寄生体から得られる抗原をコードするものがある。
【０１１２】
5.1.2. 挿入されるメタニューモウイルス配列
哺乳動物MPVのタンパク質。本発明はさらに、融合タンパク質をコードする核酸配列に関し、ここで融合タンパク質は哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片、および哺乳動物MPVからは得られない１つ以上のペプチドもしくはタンパク質を含有する。具体的な実施形態において本発明の融合タンパク質は、哺乳動物MPVまたはその断片、およびペプチドタグ、例えば特に限定されないが、ポリヒスチジンタグを含有する。本発明はさらに融合タンパク質に関し、ここで融合タンパク質は哺乳動物MPVのタンパク質またはその断片、および哺乳動物MPVからは得られない１つ以上のペプチドもしくはタンパク質を含有する。本発明はまた、哺乳動物MPVのタンパク質をコードする核酸の誘導体に関する。本発明はまた、哺乳動物MPVのタンパク質の誘導体に関する。誘導体は、特に限定されないがタンパク質の変異型であり、例えば特に限定されないが、付加、欠失、末端切断、置換および逆位がある。誘導体はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質のキメラ型でもよく、ここでタンパク質の少なくとも１つのドメインは異なるタンパク質から得られる。誘導体はまた、他の分子（例えば、薬剤）に共有結合または非共有結合で結合した哺乳動物MPVのタンパク質の型でもよい。
【０１１３】
NL/100（また00-1）と呼ぶウイルス分離株は、変種A1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列を配列番号95に示す。NL/17/00と呼ぶウイルス分離株は変種A2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列を配列番号96に示す。NL/1/99（また99-1）と呼ぶウイルス分離株は変種B1の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列を配列番号94に示す。NL/1/94と呼ぶウイルス分離株は変種B2の哺乳動物MPVであり、そのゲノム配列を配列番号97に示す。本出願に開示した配列のリストおよびその対応する配列番号を表16に示す。
【０１１４】
哺乳動物MPVのタンパク質は、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質またはM2-2タンパク質、またはこれらの断片でもよい。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、少なくとも25アミノ酸、少なくとも50アミノ酸、少なくとも75アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも125アミノ酸、少なくとも150アミノ酸、少なくとも175アミノ酸、少なくとも200アミノ酸、少なくとも225アミノ酸、少なくとも250アミノ酸、少なくとも275アミノ酸、少なくとも300アミノ酸、少なくとも325アミノ酸、少なくとも350アミノ酸、少なくとも375アミノ酸、少なくとも400アミノ酸、少なくとも425アミノ酸、少なくとも450アミノ酸、少なくとも475アミノ酸、少なくとも500アミノ酸、少なくとも750アミノ酸、少なくとも1000アミノ酸、少なくとも1250アミノ酸、少なくとも1500アミノ酸、少なくとも1750アミノ酸、少なくとも2000アミノ酸、少なくとも2250アミノ酸の長さでもよい。哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、多くても25アミノ酸、多くても50アミノ酸、多くても75アミノ酸、多くても100アミノ酸、多くても125アミノ酸、多くても150アミノ酸、多くても175アミノ酸、多くても200アミノ酸、多くても225アミノ酸、多くても250アミノ酸、多くても275アミノ酸、多くても300アミノ酸、多くても325アミノ酸、多くても350アミノ酸、多くても375アミノ酸、多くても400アミノ酸、多くても425アミノ酸、多くても450アミノ酸、多くても475アミノ酸、多くても500アミノ酸、多くても750アミノ酸、多くても1000アミノ酸、多くても1250アミノ酸、多くても1500アミノ酸、多くても1750アミノ酸、多くても2000アミノ酸、多くても2250アミノ酸の長さでもよい。
【０１１５】
本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はNタンパク質であり、ここでNタンパク質は系統発生的に、APV C型のNタンパク質より、哺乳動物MPVのNタンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（配列番号の説明については表16も参照されたい）のウイルスゲノムにコードされるNタンパク質）に、より密接に関連している。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はPタンパク質であり、ここでPタンパク質は系統発生的に、APV C型のNタンパク質より、哺乳動物MPVのPタンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムにコードされるタンパク質）に、より密接に関連している。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はMタンパク質であり、ここでMタンパク質は系統発生的に、APV C型のMタンパク質より、哺乳動物MPVのMタンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムにコードされるMタンパク質）に、より密接に関連している。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのFタンパク質はタンパク質であり、ここでFタンパク質は系統発生的に、APV C型のFタンパク質より、哺乳動物MPVのFタンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムにコードされるFタンパク質）に、より密接に関連している。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はM2-1タンパク質であり、ここでM2-1タンパク質は系統発生的に、APV C型のM2-1タンパク質より、哺乳動物MPVのM2-1タンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムにコードされるM2-1タンパク質）に、より密接に関連している。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はM2-2タンパク質であり、ここでM2-2タンパク質は系統発生的に、APV C型のM2-2タンパク質より、哺乳動物MPVのM2-2タンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムにコードされるM2-2タンパク質）に、より密接に関連している。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はGタンパク質であり、ここでGタンパク質は系統発生的に、APV C型の任意のタンパク質より、哺乳動物MPVのGタンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムにコードされるGタンパク質）に、より密接に関連している。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はSHタンパク質であり、ここでSHタンパク質は系統発生的に、APV C型の任意のタンパク質より、哺乳動物MPVのSHタンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムにコードされるSHタンパク質）に、より密接に関連している。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はLタンパク質であり、ここでLタンパク質は系統発生的に、APV C型の任意のタンパク質より、哺乳動物MPVのLタンパク質（例えば配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスゲノムにコードされるLタンパク質）に、より密接に関連している。
【０１１６】
本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はNタンパク質であり、ここでNタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各Nタンパク質のアミノ酸配列は配列番号366〜369に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるNタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はNタンパク質であり、ここでPタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各Pタンパク質のアミノ酸配列は配列番号78〜85に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるPタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はMタンパク質であり、ここでMタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各Mタンパク質のアミノ酸配列は配列番号358〜361に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるMタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はFタンパク質であり、ここでFタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各Fタンパク質のアミノ酸配列は配列番号18〜25に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるFタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はM2-1タンパク質であり、ここでM2-1タンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各M2-1タンパク質のアミノ酸配列は配列番号42〜49に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるM2-1タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はM2-2タンパク質であり、ここでM2-2タンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各M2-2タンパク質のアミノ酸配列は配列番号50〜57に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるM2-2タンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はGタンパク質であり、ここでGタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各Gタンパク質のアミノ酸配列は配列番号26〜33に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるGタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はSHタンパク質であり、ここでSHタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各SHタンパク質のアミノ酸配列は配列番号86〜93に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるSHタンパク質のアミノ酸配列と、少なくと
も60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明のある実施形態において哺乳動物MPVのタンパク質はLタンパク質であり、ここでLタンパク質は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各Lタンパク質のアミノ酸配列は配列番号34〜41に開示される；また表16も参照）のウイルスゲノムにコードされるLタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。
【０１１７】
哺乳動物MPVのタンパク質の断片は、断片に相補的なタンパク質の部分にわたって、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のウイルスにコードされる相同性タンパク質と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。具体的な実施形態において本発明は、Fタンパク質のエクトドメインおよびその同族体を含有する哺乳動物MPVのFタンパク質の断片を提供する。エクトドメインを含有するFタンパク質の断片の同族体は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97（各Fタンパク質のアミノ酸配列は配列番号18〜25に開示される；また表16も参照）のウイルスにコードされるFタンパク質のエクトドメインを含有する対応する断片と、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。
【０１１８】
ある実施形態において本発明は、サブグループAの哺乳動物MPVのタンパク質およびその断片を提供する。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、ここでNタンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるNタンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるNタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、ここでGタンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるGタンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるGタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、ここでPタンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるPタンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるPタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、ここでMタンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるMタンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるMタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのFタンパク質を提供し、ここでFタンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるFタンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるFタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのM2-1タンパク質を提供し、ここでM2-1タンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるM2-1タンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるM2-1タンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのM2-2タンパク質を提供し、ここでM2-2タンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるM2-2タンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるM2-2タンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、ここでSHタンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるSHタンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるSHタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、ここでLタンパク質は系統発生的に、配列番号94または配列番号97にコードされるウイルスにコードされるLタンパク質よりも、配列番号95または配列番号96のウイルスにコードされるLタンパク質に、より密接に関連している。
【０１１９】
他の実施形態において本発明は、サブグループBの哺乳動物MPVのタンパク質およびその断片を提供する。本発明はサブグループBの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、ここでNタンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるNタンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるNタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのGタンパク質を提供し、ここでGタンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるGタンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるGタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのPタンパク質を提供し、ここでPタンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるPタンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるPタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのMタンパク質を提供し、ここでMタンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるMタンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるMタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのNタンパク質を提供し、ここでFタンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるFタンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるFタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのM2-1タンパク質を提供し、ここでM2-1タンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるM2-1タンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるM2-1タンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのM2-2タンパク質を提供し、ここでM2-2タンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるM2-2タンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるM2-2タンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのSHタンパク質を提供し、ここでSHタンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるSHタンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるSHタンパク質に、より密接に関連している。本発明はサブグループAの哺乳動物MPVのLタンパク質を提供し、ここでLタンパク質は系統発生的に、配列番号95または配列番号96にコードされるウイルスにコードされるLタンパク質よりも、配列番号94または配列番号97のウイルスにコードされるLタンパク質に、より密接に関連している。
【０１２０】
本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のGタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のGタンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のGタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のGタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のGタンパク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のGタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のGタンパク質を提供し、ここでGタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のGタンパク質（配列番号28）と、少なくとも66％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。具体的な実施形態において、哺乳動物MPVのGタンパク質は配列番号119〜153のアミノ酸配列を有する。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のNタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のNタンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のNタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のNタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のNタンパク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のNタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のNタンパク質を提供し、ここでNタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のNタンパク質（配列番号72）と、少なくとも98.5％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のPタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のPタンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のPタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のPタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のPタンパク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のPタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺
乳動物MPVのB1変種のPタンパク質を提供し、ここでPタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のPタンパク質（配列番号80）と、少なくとも96％、少なくとも98％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のMタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のMタンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のMタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のMタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のMタンパク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のMタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のMタンパク質を提供し、ここでMタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のMタンパク質（配列番号64）と同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のFタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のFタンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のFタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のFタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のFタンパク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のFタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のFタンパク質を提供し、ここでFタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のFタンパク質（配列番号20）と少なくとも99％同一である。具体的な実施形態において哺乳動物MPVのFタンパク質は、配列番号248〜327のアミノ酸配列を有する。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のM2-1タンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のM2-1タンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のM2-1タンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のM2-1タンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のM2-1タンパク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のM2-1タンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のM2-1タンパク質を提供し、ここでM2-1タンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のM2-1タンパク質（配列番号44）と、少なくとも98％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のM2-2タンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のM2-2タンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のM2-2タンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のM2-2タンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のM2-2タンパク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のM2-2タンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のM2-2タンパク質を提供し、ここでM2-2タンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のM2-2タンパク質（配列番号52）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のSHタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のSHタンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のSHタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のSHタ��パク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のSHタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のSHタンパク質を提供し、ここでSHタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のSHタンパク質（配列番号88）と、少なくとも83％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のLタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB1変種のLタンパク質は系統発生的に、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のLタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のLタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のLタンパク質よりも、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のLタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB1変種のLタンパク質を提供し、ここでLタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/99で示される哺乳動物MPVのB1変種のLタンパク質（配列番号36）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。
【０１２１】
本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のGタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のGタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のGタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のGタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のGタンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のGタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のGタンパク質を提供し、ここでGタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のGタンパク質（配列番号26）と、少なくとも66％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のNタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のNタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のNタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のNタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のNタンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のNタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のNタンパク質を提供し、ここでNタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のNタンパク質（配列番号70）と、少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のPタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のPタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のPタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のPタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のPタンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のPタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のPタンパク質を提供し、ここでPタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のPタンパク質（配
列番号78）と、少なくとも96%、少なくとも98％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のMタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のMタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のMタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のMタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のMタンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のMタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のMタンパク質を提供し、ここでMタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のMタンパク質（配列番号62）と、少なくとも99％または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のFタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のFタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のFタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のFタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のFタンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のFタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のFタンパク質を提供し、ここでFタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のFタンパク質（配列番号18）と、少なくとも98％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のM2-1タンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のM2-1タンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のM2-1タンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のM2-1タンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のM2-1タンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のM2-1タンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のM2-1タンパク質を提供し、ここでM2-1タンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のM2-1タンパク質（配列番号42）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のM2-2タンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のM2-2タンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のM2-2タンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のM2-2タンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のM2-2タンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のM2-2タンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のM2-2タンパク質を提供し、ここでM2-2タンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のM2-2タンパク質（配列番号50）と、少なくとも96％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のSHタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のSHタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のSHタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のSHタンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のSHタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のSHタンパク質を提供し���ここでSHタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のSHタンパク質（配列番号86）と、少なくとも84％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のLタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA1変種のLタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のLタンパク質、A2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のLタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のLタンパク質よりも、A1変種のプロトタイプであるNL/1/00分離株のLタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA1変種のLタンパク質を提供し、ここでLタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/00で示される哺乳動物MPVのA1変種のLタンパク質（配列番号34）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。
【０１２２】
本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のGタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のGタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のGタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のGタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のGタンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のGタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のGタンパク質を提供し、ここでGタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のGタンパク質（配列番号27）と、少なくとも66％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のNタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のNタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のNタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のNタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のNタンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のNタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のNタンパク質を提供し、ここでNタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のNタンパク質（配列番号71）と、少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のPタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のLタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のPタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のPタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のPタンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のPタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のPタンパク質を提供し、ここでPタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のPタンパク
質（配列番号79）と、少なくとも96％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のMタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のMタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のMタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のMタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のMタンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のMタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のMタンパク質を提供し、ここでMタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のMタンパク質（配列番号63）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のFタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のFタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のFタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のFタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のFタンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のFタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のFタンパク質を提供し、ここでFタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のFタンパク質（配列番号19）と、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のM2-1タンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のM2-1タンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のM2-1タンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のM2-1タンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のM2-1タンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のM2-1タンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のM2-1タンパク質を提供し、ここでM2-1タンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のM2-1タンパク質（配列番号43）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のM2-2タンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のM2-2タンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のM2-2タンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のM2-2タンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のM2-2タンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のM2-2タンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のM2-2タンパク質を提供し、ここでM2-2タンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のM2-2タンパク質（配列番号51）と、少なくとも96％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のSHタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のSHタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のSHタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のSHタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のSHタンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のSHタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のSHタンパク��を提供し、ここでSHタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のSHタンパク質（配列番号87）と、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のLタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのA2変種のLタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のLタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のLタンパク質、またはB2のプロトタイプであるNL/1/94分離株のLタンパク質よりも、A2変種のプロトタイプであるNL/17/00分離株のLタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのA2変種のLタンパク質を提供し、ここでLタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/17/00で示される哺乳動物MPVのA2変種のLタンパク質（配列番号35）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。
【０１２３】
本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のGタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のGタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のGタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のGタンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のGタンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のGタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のGタンパク質を提供し、ここでGタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB2変種のGタンパク質（配列番号29）と、少なくとも66％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のNタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のNタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のNタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のNタンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のNタンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のNタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のNタンパク質を提供し、ここでNタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB2変種のNタンパク質（配列番号73）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のPタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のPタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のPタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のPタンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のPタンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のPタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のPタンパク質を提供し、ここでPタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB
2変種のPタンパク質（配列番号81）と、少なくとも96％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のMタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のMタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のMタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のMタンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のMタンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のMタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のMタンパク質を提供し、ここでMタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB2変種のMタンパク質（配列番号65）と同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のFタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のFタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のFタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のFタンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のFタンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のFタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のFタンパク質を提供し、ここでFタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB2変種のFタンパク質（配列番号21）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のM2-1タンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のM2-1タンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のM2-1タンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のM2-1タンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のM2-1タンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のM2-1タンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のM2-1タンパク質を提供し、ここでM2-1タンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB2変種のM2-1タンパク質（配列番号45）と、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のM2-2タンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のM2-2タンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のM2-2タンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のM2-2タンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のM2-2タンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のM2-2タンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のM2-2タンパク質を提供し、ここでM2-2タンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB2変種のM2-2タンパク質（配列番号53）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のSHタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のSHタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のSHタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のSHタンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のSHタンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のSHタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のSHタンパク質を提供し、ここでSHタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB2変種のSHタンパク質（配列番号89）と、少なくとも84％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のLタンパク質を提供し、ここで哺乳動物MPVのB2変種のLタンパク質は系統発生的に、B1変種のプロトタイプであるNL/1/99分離株のLタンパク質、A1のプロトタイプであるNL/1/00分離株のLタンパク質、またはA2のプロトタイプであるNL/17/00分離株のLタンパク質よりも、B2変種のプロトタイプであるNL/1/94分離株のLタンパク質に、より密接に関連している。本発明は、哺乳動物MPVのB2変種のLタンパク質を提供し、ここでLタンパク質のアミノ酸配列は、プロトタイプNL/1/94で示される哺乳動物MPVのB2変種のLタンパク質（配列番号37）と、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。
【０１２４】
ある実施形態において配列同一性のパーセントは、完全長タンパク質の整列に基づく。別の実施形態において配列同一性のパーセントは、タンパク質の連続的アミノ酸配列の整列に基づき、アミノ酸配列は、25アミノ酸、50アミノ酸、75アミノ酸、100アミノ酸、125アミノ酸、150アミノ酸、175アミノ酸、200アミノ酸、225アミノ酸、250アミノ酸、275アミノ酸、300アミノ酸、325アミノ酸、350アミノ酸、375アミノ酸、400アミノ酸、425アミノ酸、450アミノ酸、475アミノ酸、500アミノ酸、750アミノ酸、1000アミノ酸、1250アミノ酸、1500アミノ酸、1750アミノ酸、2000アミノ酸、または2250アミノ酸の長さでもよい。
【０１２５】
本発明はさらに、哺乳動物MPV由来の核酸配列を提供する。本発明はまた、哺乳動物MPVから得られる核酸配列の誘導体を提供する。ある具体的な実施形態において核酸は修飾される。
【０１２６】
ある実施形態において本発明の核酸は、上記で定義した哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態において本発明の核酸は、上記で定義した哺乳動物MPVのサブグループAのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。具体的な実施形態において哺乳動物MPVのG遺伝子は、配列番号98〜132のヌクレオチド配列を有する。具体的な実施形態において哺乳動物MPVのF遺伝子は、配列番号168〜247のヌクレオチド配列を有する。ある実施形態において本発明の核酸は、上記で定義した哺乳動物MPVのサブグループBのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態において本発明の核酸は、上記で定義した哺乳動物MPVのA1変種のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態において本発明の核酸は、上記で定義した哺乳動物MPVのA2変種のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態において本発明の核酸は、上記で定義した哺乳動物MPVのB1変種のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。ある実施形態において本発明の核酸は、上記で定義した哺乳動物MPVのB2変種のGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質をコードする。
【０１２７】
ある実施形態において本発明は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列と、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であるヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態において本発明の核酸配列は、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列の断片と、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一であり、ここで断片は、25ヌクレオチド、50ヌクレオチド、75ヌクレオチド、100ヌクレオチド、150ヌクレオチド、200ヌクレオチド、250ヌクレオチド、300ヌクレオチド、400ヌクレオチド、500ヌクレオチド、750ヌクレオチド、1,000ヌクレオチド、1,250ヌクレオチド、1,500ヌクレオチド、1,750ヌクレオチド、2,000ヌクレオチド、2,00ヌクレオチド、3,000ヌクレオチド、4,000ヌクレオチド、5,000ヌクレオチド、7,500ヌクレオチド、10,000ヌクレオチド、12,500ヌクレオチド、または15,000ヌクレオチドの長さである。具体的な実施形態において本発明の核酸配列は、配列番号98〜132；配列番号168〜247；配列番号22〜25；配列番号30〜33；配列番号38〜41；配列番号46〜49；配列番号54〜57；配列番号58〜61；配列番号66〜69；配列番号74〜77；配列番号82〜85；または配列番号90〜93のヌクレオチド配列の１つと、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％、または100％同一である。
【０１２８】
本発明の具体的な実施形態において本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97の核酸配列の１つとハイブリダイズすることができる。本発明の具体的な実施形態において本発明の核酸配列は、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、または高ストリンジェンシー条件下で、配列番号98〜132；配列番号168〜247；配列番号22〜25；配列番号30〜33；配列番号38〜41；配列番号46〜49；配列番号54〜57；配列番号58〜61；配列番号66〜69；配列番号74〜77；配列番号82〜85；または配列番号90〜93の核酸配列の１つとハイブリダイズすることができる。ある実施形態において核酸は、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも75ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、少なくとも500ヌクレオチド、少なくとも750ヌクレオチド、少なくとも1,000ヌクレオチド、少なくとも1,250ヌクレオチド、少なくとも1,500ヌクレオチド、少なくとも1,750ヌクレオチド、少なくとも2,000ヌクレオチド、少なくとも2,00ヌクレオチド、少なくとも3,000ヌクレオチド、少なくとも4,000ヌクレオチド、少なくとも5,000ヌクレオチド、少なくとも7,500ヌクレオチド、少なくとも10,000ヌクレオチド、少なくとも12,500ヌクレオチド、少なくともまたは少なくとも15,000ヌクレオチドの長さにわたって、配列番号94、配列番号95、配列番号96、または配列番号97のヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【０１２９】
本発明はさらに、哺乳動物MPVのタンパク質に特異的に結合する抗体と抗原結合断片を提供する。本発明の抗体は、哺乳動物MPVのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質に特異的に結合する。具体的な実施形態において抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態において本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループAのウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質に特異的に結合する。具体的な実施形態において抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態において本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループBのウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質に特異的に結合する。具体的な実施形態において抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態において本発明の抗体は、哺乳動物MPVのA1変種のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質に特異的に結合する。具体的な実施形態において抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態において本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループA2のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質に特異的に結合する。具体的な実施形態において抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態において本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB1のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質に特異的に結合する。具体的な実施形態において抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体である。ある実施形態において本発明の抗体は、哺乳動物MPVのサブグループB2のウイルスのGタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質、Mタンパク質、Fタンパク質、M2-1タンパク質、M2-2タンパク質、SHタンパク質、またはLタンパク質に特異的に結合する。
【０１３０】
5.1.3. 異種遺伝子配列の挿入
本発明のウイルスベクターへの外来遺伝子配列の挿入は、異種配列によるウイルスコード領域の完全な置換、またはその部分的な置換、またはウイルスゲノムに異種ヌクレオチド配列を付加することにより行われる。完全な置換はおそらく、PCR指令突然変異誘発を使用することが最適であろう。簡単に説明すると、PCRプライマーAは5'末端〜3'末端へ以下を含むであろう：ユニークな制限酵素部位、例えばIIS制限酵素部位（すなわち、「シフター」酵素、これは特異的配列を認識するが、その配列の上流または下流でDNAを切断する）；PIV遺伝子の領域に相補的なヌクレオチドのストレッチ；および異種配列のカルボキシ末端コーディング部分に相補的なヌクレオチドのストレッチ。PCRプライマーBは、5'末端〜3'末端へ以下を含む：ユニークな制限酵素部位；PIV遺伝子の領域に相補的なヌクレオチドのストレッチ；および外来遺伝子の5'コーディング部分に対応するヌクレオチドのストレッチ。これらのプライマーを使用して外来遺伝子のクローン化コピーを用いてPCR反応後、ユニークな制限部位を使用して生成物が切断されクローン化される。クラスIIS酵素を用いる消化と精製ファージポリメラーゼを用いる転写は、外来遺伝子挿入を有するPIV遺伝子の正確な非翻訳末端を含有するRNA分子を与えるであろう。別の実施形態においてPCRプライムした反応は、バクテリオファージプロモーター配列を含有する２本鎖DNAをハイブリッド遺伝子配列を調製するのに使用され、その結果RNA鋳型はクローニングすることなく直接転写することができる。
【０１３１】
異種ヌクレオチド配列は、本発明のウイルスの種々の位置に付加または挿入することができる。ある実施形態において異種ヌクレオチド配列は、１位に付加または挿入される。別の実施形態において異種ヌクレオチド配列は、２位に付加または挿入される。別の実施形態において異種ヌクレオチド配列は、３位に付加または挿入される。別の実施形態において異種ヌクレオチド配列は、４位に付加または挿入される。別の実施形態において異種ヌクレオチド配列は、５位に付加または挿入される。それらの別の実施形態において異種ヌクレオチド配列は、６位に付加または挿入される。本明細書において用語「位置」は、転写されるウイルスゲノム上の異種ヌクレオチド配列の位置を示し、例えば１位は、それが転写される最初の遺伝子であることを意味し、２位は、それが転写される２番目の遺伝子であることを示す。ウイルスの小さい数の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入すると一般に、ウイルスのゲノムにわたって起きる転写勾配のために、より大きい数の位置での挿入と比較して、異種ヌクレオチド配列のより強い発現が起きる。しかし転写勾配はまた、ウイルスmRNAの特異的な比率を与える。外来遺伝子の挿入はこれらの比を乱し、異なる量のウイルスタンパク質が合成され、これがウイルス複製に影響を与える。すなわち挿入部位を選択する時には、転写勾配と複製動態の両方を考慮しなければならない。例えば、b/h PIV3の２位に異種ヌクレオチド配列を挿入すると、異種遺伝子の複製速度と発現レベルが最適となる。異種ヌクレオチド配列の強い発現が所望の場合は、小さい数の位置に異種ヌクレオチド配列を挿入することが本発明の好適な実施形態である。好適な実施形態において異種配列は、１、２または３位に付加または挿入される。
【０１３２】
本発明のウイルスに異種ヌクレオチド配列を挿入する時は、異種遺伝子のコード配列の最後と下流遺伝子のコード配列の開始部位との間の遺伝子間領域を改変して所望の効果を得ることができる。本明細書において用語「遺伝子間領域」とは、ある遺伝子の停止シグナルと、次に下流の読みとり枠のコード配列の開始コドン（例えばAUG）との間のヌクレオチド配列を意味する。遺伝子間領域は、非コード領域すなわち遺伝子の転写開始部位とコード配列の開始部位（AUG）との間を含む。この非コード領域はPIV3 mRNAや他のウイルス遺伝子中に天然に存在し、これは表２の非限定例に例示される。
【表２】
2005518208.tif 000003
【０１３３】
種々の実施形態において異種ヌクレオチド配列と下流の遺伝子との遺伝子間領域は、互いに独立に遺伝子操作して、少なくとも10ntの長さ、少なくとも20ntの長さ、少なくとも30ntの長さ、少なくとも50ntの長さ、少なくとも75ntの長さ、少なくとも100ntの長さ、少なくとも125ntの長さ、少なくとも150ntの長さ、少なくとも175ntの長さ、または少なくとも200ntの長さにすることができる。ある実施形態において異種ヌクレオチド配列と下流の遺伝子との遺伝子間領域は、互いに独立に遺伝子操作して、多くても10ntの長さ、多くても20ntの長さ、多くても30ntの長さ、多くても50ntの長さ、多くても75ntの長さ、多くても100ntの長さ、多くても125ntの長さ、多くても150ntの長さ、多くても175ntの長さ、または多くても200ntの長さにすることができる。種々の実施形態において、ウイルスゲノム中の所望の遺伝子の非コード領域は、互いに独立に遺伝子操作して、少なくとも10ntの長さ、少なくとも20ntの長さ、少なくとも30ntの長さ、少なくとも50ntの長さ、少なくとも75ntの長さ、少なくとも100ntの長さ、少なくとも125ntの長さ、少なくとも150ntの長さ、少なくとも175ntの長さ、または少なくとも200ntの長さにすることができる。ある実施形態においてウイルスゲノム中の所望の遺伝子の非コード領域は、互いに独立に遺伝子操作して、多くても10ntの長さ、多くても20ntの長さ、多くても30ntの長さ、多くても50ntの長さ、多くても75ntの長さ、多くても100ntの長さ、多くても125ntの長さ、多くても150ntの長さ、多くても175ntの長さ、または多くても200ntの長さにすることができる。
【０１３４】
異種ヌクレオチド配列を挿入する時、所望の効果を達成するために位置効果と遺伝子間領域操作を組合せて使用することができる。例えば異種ヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５アニーリング６位よりなる群から選択される位置に付加または挿入することができ、異種ヌクレオチド配列と次の下流の遺伝子との間の遺伝子間領域は改変することができる（表３を参照）。ある実施形態においてhRSV F遺伝子はb/h PIV3ベクターの１位に挿入され、F遺伝子とN遺伝子（すなわち、Fの次の下流の遺伝子）の間の遺伝子間領域は、177ヌクレオチドになるように改変することができる。さらに多くの組合せが本発明に包含され、例としてその一部を表３に示す。
【表３】
2005518208.tif 000004
【０１３５】
挿入される異種ヌクレオチド配列の目的（例えば、強い免疫原性を得るため）に応じて、挿入される異種ヌクレオチド配列の挿入位置と遺伝子間領域の長さは、種々の指標、例えば特に限定されないが、以下の非限定例のアッセイにより測定される複製動態とタンパク質もしくはmRNA発現レベルにより、測定することができる：プラークアッセイ、蛍光焦点アッセイ、感染中心アッセイ、形質転換アッセイ、終点希釈アッセイ、プレーティング効率、電子顕微鏡、血球凝集、ウイルス酵素活性の測定、ウイルス中和、血球凝集阻害、補体結合、免疫染色、免疫沈降と免疫ブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ、核酸検出（例えば、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析、ウェスタンブロット解析）、増殖曲線、レポーター遺伝子の使用（例えば、目的の異種遺伝子のようにウイルスゲノムに組み込まれた、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）または増強緑色蛍光タンパク質（eGFP）のようなレポーター遺伝子を使用して、タンパク質発現を観察する）、またはこれらの組合せ。これらのアッセイを実施するための方法は当該分野で公知（例えば、Flintら、Principles of Virology, Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, 2000, エーエスエム・プレス（ASM Press）、25〜56頁（この本文全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる）であり、非限定例は後述の実施例セクションに示される。
【０１３６】
例えば、発現レベルは、本発明のウイルスで培養細胞を感染させ、次に例えば異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット解析またはELISAによりタンパク質発現レベルを測定するか、または異種配列に特異的なプローブを使用するノーザンブロット解析によりRNA発現レベルを測定することにより、定量することができる。同様に異種配列の発現レベルは、動物モデルを感染させ、動物モデル中の本発明の組換えウイルスの異種配列から発現されるタンパク質のレベルを測定することにより、定量することができる。タンパク質レベルは、感染した動物から組織サンプルを得て、次に組織サンプルを、異種配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット解析またはELISAに付すことにより測定することができる。さらにもし動物モデルを使用するなら、異種配列の遺伝子産物に対して動物により産生される抗体の力価を、当業者に公知の方法（特に限定されないがELISAを含む）により定量することができる。
【０１３７】
異種配列はウイルスのゲノム中のヌクレオチド配列に相同的でもよいため、プローブと抗体が異種配列またはその遺伝子産物に本当に特異的であるように注意しなければならない。
【０１３８】
ある具体的な実施形態において、キメラb/h PIV3 RSVまたはb/h PIV3 hMPVまたはb/h PIV3 RSV FおよびhMPV FからのRSVまたはhMPVのFタンパク質の発現レベルを、当業者に公知の方法により測定することができる。Fタンパク質の発現レベルは、本発明のキメラウイルスで培養細胞を感染させ、次に例えばhMPVのFタンパク質および／またはGタンパク質に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット解析またはELISAによりタンパク質発現レベルを測定するか、またはヒトメタニューモウイルスのFタンパク質および／またはGタンパク質に特異的なプローブを使用するノーザンブロット解析によりRNA発現レベルを測定することにより、定量することができる。同様に異種配列の発現レベルは、動物モデルを感染させ、動物モデル中のFタンパク質および／またはGタンパク質のレベルを測定することにより、定量することができる。タンパク質レベルは、感染した動物から組織サンプルを得て、次に組織サンプルを、異種配列のFタンパク質および／またはGタンパク質に特異的な抗体を使用するウェスタンブロット解析またはELISAに付すことにより測定することができる。さらにもし動物モデルを使用するなら、異種配列のFタンパク質および／またはGタンパク質に対して動物により産生される抗体の力価を、当業者に公知の方法（特に限定されないがELISAを含む）により定量することができる。
【０１３９】
本発明の組換えウイルスの複製速度は、当業者に公知の方法により測定することができる。
【０１４０】
ある実施形態において、ウイルスゲノム中の異種配列の最適位置と遺伝子間領域の最適長さの特定を促進するために、異種配列はレポーター遺伝子をコードする。最適パラメータがいったん決定されると、レポーター遺伝子は、目的の抗原をコードする異種ヌクレオチド配列により置換される。当業者に公知の任意のレポーター遺伝子を本発明の方法で使用することができる。詳細についてはセクション5.5を参照されたい。
【０１４１】
組換えウイルスの複製速度は、当業者に公知の標準的方法により測定することができる。複製速度は、ウイルスの増殖速度で示され、ウイルスの力価を感染後の時間に対してプロットすることにより決定することができる。ウイルス力価は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。ある実施形態においてウイルスを含有する懸濁液が、ウイルスによる感染に罹りやすい細胞とインキュベートされる。本発明の方法で使用できる細胞タイプには、特に限定されないが、Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF1043(HEL)細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞、ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）、またはtMK細胞がある。ウイルスと細胞をインキュベーション後、感染された細胞の数が測定される。ある具体的な実施形態においてウイルスはレポーター遺伝子を含む。すなわちレポーター遺伝子を発現する細胞の数は、感染された細胞の数を示す。具体的な実施形態においてウイルスは、eGFPをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、eGFPを発現する細胞の数（すなわち、ウイルスに感染した細胞の数）は、FACSを使用して決定される。
【０１４２】
ある実施形態において本発明の組換えウイルスの複製速度は、同じ条件下でそこから組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの複製速度の多くても20％である。同じ条件とは、ウイルスの同じ初期力価、同じ株の細胞、同じインキュベーション温度、増殖培地、細胞の数、および複製速度に影響を与える他の試験条件である。例えば１位にRSVのF遺伝子を有するb/h PIV3の複製速度は、bPIV3の複製速度の多くても20％である。
【０１４３】
ある実施形態において本発明の組換えウイルスの複製速度は、同じ条件下でそこから組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの複製速度の、多くても5％、多くても10％、多くても20％、多くても30％、多くても40％、多くても50％、多くても75％、多くても80％、多くても90％である。ある実施形態において本発明の組換えウイルスの複製速度は、同じ条件下でそこから組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの複製速度の、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％である。ある実施形態において本発明の組換えウイルスの複製速度は、同じ条件下でそこから組換えウイルスが得られる野生型ウイルスの複製速度の、5％〜20％、10％〜40％、25％〜50％、40％〜75％、50％〜80％、または75％〜90％である。
【０１４４】
ある実施形態において本発明の組換えウイルスの異種配列の発現レベルは、同じ条件下でそこから組換えウイルスが得られる野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルの多くても20％である。同じ条件とは、ウイルスの同じ初期力価、同じ株の細胞、同じインキュベーション温度、増殖培地、細胞の数、および複製速度に影響を与える他の試験条件である。例えばbPIV3の１位のMPVのFタンパク質の異種配列の発現レベルは、bPIV3のウシFタンパク質の発現レベルの多くても20％である。
【０１４５】
ある実施形態において本発明の組換えウイルスの異種配列の発現レベルは、同じ条件下でそこから組換えウイルスが得られる野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルの、多くても5％、多くても10％、多くても20％、多くても30％、多くても40％、多くても50％、多くても75％、多くても80％、多くても90％である。ある実施形態において本発明の組換えウイルスの異種配列の発現レベルは、同じ条件下でそこから組換えウイルスが得られる野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルの、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％である。ある実施形態において本発明の組換えウイルスの異種配列の発現レベルは、同じ条件下でそこから組換えウイルスが得られる野生型ウイルスのFタンパク質の発現レベルの、5％〜20％、10％〜40％、25％〜50％、40％〜75％、50％〜80％、または75％〜90％である。
【０１４６】
5.1.4. HN遺伝子への異種遺伝子配列の挿入
PIVの血球凝集素およびノイラミニダーゼ活性に関与するタンパク質は、単一の遺伝子であるHNによりコードされる。HNタンパク質は、ウイルスの主要な表面糖タンパク質である。種々のウイルス（例えば、パラインフルエンザ）について、血球凝集素およびノイラミニダーゼタンパク質は、多くの抗原性部位を含有することが証明されている。従ってHNの抗原性部位を外来タンパク質の一部で置換すると、この外来タンパク質に対して激しい体液性応答が起きる。もしHN分子中に配列が挿入され、それがHNの外表面で発現されると免疫原性となる。例えばHIVのgp160から得られるペプチドは、HNタンパク質の抗原性部位を置換し、gp160とHNタンパク質の両方に対して体液性免疫応答を引き起こす。別のアプローチでは外来ペプチド配列は、ウイルス配列を欠失させることなく抗原性部位内に挿入される。そのような構築体の発現産物は、外来抗原に対するワクチンにおいて有用であり、前記問題（ワクチン接種した宿主中の組換えウイルスの増殖）を避けることができる。抗原性部位にのみ置換を有する完全なHN分子は、HN機能を可能にし、増殖力のあるウイルスの構築を可能にする。従ってこのウイルスは、さらなるヘルパー機能の必要なく増殖することができる。ウイルスはまた別の方法で弱めて、偶然エスケープするという危険を避けることができる。
【０１４７】
細胞表面でタンパク質を発現するために、またはこれらが細胞から放出されることを可能にするために、他のハイブリッド構築を行ってもよい。表面糖タンパク質としてHNは、細胞表面への輸送に必要なアミノ末端切断可能シグナル配列と、膜固定に必要なカルボキシ末端配列を有する。細胞表面上に外来タンパク質を発現させるために、HNシグナルを使用してハイブリッドタンパク質を作成することが必要かも知れない。この場合融合タンパク質は、追加の内部プロモーターから別の融合タンパク質として発現される。あるいは、輸送シグナルのみが存在して膜固定ドメインが存在しないなら、タンパク質は細胞の外に分泌される。
【０１４８】
5.1.5. ２シストロン性RNAの構築
ウイルス配列の翻訳の内部開始を可能にし、正規の末端開始部位から外来タンパク質コード配列の発現を可能にするために、２シストロン性mRNAを構築することができる。あるいは、ウイルス配列が正規の末端読みとり枠から翻訳され、外来配列が内部部位から開始される、２シストロン性mRNAを構築してもよい。いくつかの内部リボゾーム侵入部位（IRES）配列が使用できる。選択されるIRES配列は、パラインフルエンザパッケージング制限への妨害を避けるために、充分短くなければならない。すなわち、そのような２シストロン性アプローチのために選択されるIRESは長さが500ヌクレオチド以下で、理想的長さは250ヌクレオチド未満である。具体的な実施形態においてIRESは、ピコルナウイルス（picornavirus）から得られ、追加のピコルナウイルス配列を含まない。好適なIRES要素には、特に限定されないが哺乳動物BiP IRESおよびＣ型肝炎ウイルスIRESがある。
【０１４９】
あるいは、転写単位が開始部位とポリアデニル化部位とを有する新しい内部転写単位から、外来タンパク質を発現してもよい。別の実施形態において外来遺伝子は、生じる発現タンパク質が融合タンパク質であるように、PIV遺伝子中に挿入される。
【０１５０】
5.2. 組換えcDNAとRNA鋳型を使用する異種遺伝子産物の発現。
【０１５１】
上記のように調製される組換え鋳型は、適切な宿主細胞中で異種遺伝子産物を発現するための、または異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスを作成するための種々の方法で使用することができる。ある実施形態において組換えcDNAを使用して適切な宿主細胞をトランスフェクトすることができ、生じるRNAは異種遺伝子産物の高レベルの発現を指令してもよい。高レベルの発現を提供する宿主細胞系には、PIVで重複感染した細胞株、PIV機能を補足するように遺伝子操作された細胞株などのウイルス機能を提供する連続的細胞株がある。
【０１５２】
本発明の別の実施形態において、異種遺伝子産物の発現を達成するために、組換え鋳型を使用してウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞株をトランスフェクトしてもよい。このために、ポリメラーゼタンパク質（例えばLタンパク質）を発現する形質転換細胞株が、適切な宿主細胞として使用される。宿主細胞は同様に遺伝子操作されて、他のウイルス機能または追加の機能（例えば、HN、NPまたはN）を提供してもよい。
【０１５３】
別の実施形態において、異種遺伝子産物の発現を達成するために、ヘルパーウイルスが、細胞に使用されるRNAポリメラーゼタンパク質を提供してもよい。さらに別の実施形態において細胞は、ウイルスタンパク質（例えば、NまたはNP、P、M2-1およびLタンパク質）をコードするベクターでトランスフェクトされる。
【０１５４】
異なる方法を使用して、異種遺伝子産物の発現を検出してもよい（例えば、Flintら、Principles of Virology, Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, 2000, エーエスエム・プレス（ASM Press）、25〜56頁（この本文全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる）参照）。測定例として、ウイルスで感染された細胞はメタノールまたはアセトンで透過性にされ、異種遺伝子産物に対して作成した抗体とインキュベートされる。次に１次抗体を認識する２次抗体が加えられる。この２次抗体は通常、異種遺伝子産物の発現が視覚化または検出できるように、通常標識物に結合される。
【０１５５】
5.3. 組換えウイルス粒子のレスキュー
キメラウイルスを調製するために、プラスまたはマイナスセンス中のPIVゲノムおよび／または外来タンパク質をコードする修飾cDNA、ウイルスRNA、またはRNAを使用して、複製とレスキューに必要なウイルスタンパク質と機能を提供する細胞をトランスフェクトしてもよい。あるいは、PIVゲノムおよび／または外来タンパク質をコードするDNAまたはRNAによるトランスフェクションの前、最中、または後に、細胞をヘルパーウイルスでトランスフェクトしてもよい。例えば、US Patent No. 5,166,057（1992年11月24日）；US Patent No. 5,854,037（1998年12月29日発行）；ヨーロッパ特許広報EP0702085A1（1996年２月20日公開）；米国特許出願No. 09/152,845；国際特許公報PCTWO97/12032（1997年４月３日）；WO96/34625（1996年11月７日公開）；ヨーロッパ特許広報EP-A780475；WO99/02657（1999年１月21日公開）；WO98/53078（1998年11月26日公開）；WO98/02530（1998年１月22日公開；WO99/15672（1999年４月１日公開）；WO98/13501（1998年４月２日公開）；WO97/06270（1997年２月20日公開）；およびEPO78047SA1（1997年６月25日公開）（これらはそれぞれ参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、当該分野で公知の方法をいくつでも使用して、合成組換えプラスミドPIV DNAおよびRNAを複製し、感染性ウイルス粒子中にレスキューすることができる。
【０１５６】
本発明のある実施形態において、ウイルスポリメラーゼによる認識のために、および成熟ウイルス粒子を作成するのに必要なパッケージングシグナルのために、必須のマイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域を含有する合成組換えウイルスRNAが調製される。マイナス鎖RNAウイルスをレスキューするための逆遺伝学アプローチを適用するのに、多くの異なるアプローチが使用される。まず、組換えDNA鋳型から組換えRNAが合成され、精製したウイルスポリメラーゼ複合体とin vitroで再構成して、組換えリボ核タンパク質（RNP）を作成し、これを使用して細胞をトランスフェクトする。別のアプローチでは、in vitroまたはin vivoで合成RNAの転写中にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在するなら、より効率的なトランスフェクションが行われる。このアプローチでは、cDNAプラスミドから合成RNAが転写され、これはポリメラーゼタンパク質をコードするcDNAプラスミドとともにin vitroで同時転写されるか、または、ポリメラーゼタンパク質の存在下でin vivoで、すなわちポリメラーゼタンパク質を一過性にもしくは構成性に発現する細胞中で転写される。
【０１５７】
本明細書に記載のさらなるアプローチにおいて感染性キメラウイルスの産生は、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系（例えば、ウイルス／宿主細胞発現系；ポリメラーゼタンパク質を発現するように遺伝子操作された形質転換細胞株など）中で複製され、その結果感染性キメラウイルスがレスキューされる。この例では、ヘルパーウイルスの機能は発現されるウイルスポリメラーゼタンパク質により提供されるため、ヘルパーウイルスは使用する必要がない。
【０１５８】
本発明において、組換えおよびキメラウイルスの複製とレスキューを行うのに、当業者に公知の任意の方法が使用される。１つのアプローチは、宿主細胞をトランスフェクトする前にin vitroでの複製に必要なウイルスタンパク質と機能を供給する。そのような実施形態において、ウイルスタンパク質は、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、精製ウイルスタンパク質、または組換え発現ウイルスタンパク質の形で供給される。ウイルスタンパク質は、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写前、最中または後に供給される。全混合物を使用して宿主細胞をトランスフェクトしてもよい。別のアプローチでは、複製に必要なウイルスタンパク質と機能が、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの転写前、またはその最中に供給される。そのような実施形態において複製に必要なウイルスタンパク質と機能は、野生型ウイルス、ヘルパーウイルス、ウイルス抽出物、ウイルスタンパク質を発現する合成cDNAもしくはRNAの形で供給され、感染またはトランスフェクションにより宿主細胞中に導入される。感染／トランスフェクションは、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAの導入の前または同時に起きる。
【０１５９】
特に好適なアプローチでは、本発明の組換えまたはキメラウイルスのすべてのウイルス遺伝子を発現するように遺伝子操作された細胞は、所望の遺伝子型を含有する感染性キメラウイルスを産生し、こうして選択系の必要性を排除する。理論的にはPIVの構造タンパク質をコードする６つの遺伝子の任意の１つまたは６つの遺伝子の任意の１つの一部を、外来配列で置換することができる。しかしこの場合に必要な部分は、欠陥ウイルス（正常なウイルス遺伝子産物が欠失または改変されているため欠陥性である）を増殖する能力である。この問題を避けるために多くの可能なアプローチがある。あるアプローチでは変異体タンパク質を有するウイルスを、同じタンパク質の野生型を構成的に発現するように構築された細胞株中で増殖させることができる。こうして細胞株は、ウイルス中の変異を補足する。同様の方法を使用して、任意のPIV遺伝子を構成的に発現する形質転換細胞株を構築してもよい。ウイルスタンパク質を発現するように作成されたこれらの細胞株を使用して、組換えウイルス中の欠陥を補足し、こうしてこれを増殖させることができる。あるいは、組換えウイルスを増殖させるのに、いくつかの天然の宿主範囲系が利用できる。
【０１６０】
さらに別の実施形態において、複製に必要なウイルスタンパク質や機能は、合成cDNAまたはRNAの形の遺伝物質として供給され、その結果これらは、キメラウイルスをコードする合成cDNAまたはRNAと同時にトランスフェクトされる。特に好適なアプローチでは、キメラウイルスおよびウイルスポリメラーゼおよび／または他のウイルス機能を発現するプラスミドが、宿主細胞中に同時トランスフェクトされる。例えばゲノムまたは抗ゲノムPIV RNAをコードするプラスミド（野生型または修飾型）は、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質NPまたはN、P、M2-1、またはLをコードするプラスミドとともに宿主細胞中に同時トランスフェクトされる。あるいはキメラb/h PIV3ウイルスのレスキューは、T7 RNAポリメラーゼをコードする修飾ワクシニアウイルスアンカラ（Modified Vaccinia Virus Ankara）（MVA）、またはMVAとポリメラーゼタンパク質（N、PおよびL）をコードするプラスミドとの組合せを使用することにより行われる。例えばMVA-T7または鷄痘-T7を、Vero細胞、LLC-MK-2細胞、Hep-2細胞、LF1043(HEL)細胞、tMK細胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL-2（アカゲザル）、FCL-1（ミドリサル）、WI-38（ヒト）、MRC-5（ヒト）細胞、293T細胞、QT6細胞、QT35細胞、およびCEF細胞中に感染させることができる。MVA-T7または鷄痘-T7で感染後、完全長抗ゲノムb/h PIV3 cDNAを、発現プラスミドをコードするNP、P、M2-1およびLとともにHeLaまたはVero細胞中にトランスフェクトすることができる。あるいはプラスミドトランスフェクションによりポリメラーゼを提供してもよい。次に細胞および細胞上清を採取し、単回凍結／融解サイクルにかけることができる。次に、得られる細胞溶解物を使用して、1-ベータ-D-アラビノフラノシルシトシン（araC）（ワクシニアウイルス複製のインヒビター）の存在下で、新鮮なHeLaまたはVero細胞単層を感染させて、ウイルスストックを作成することができる。これらのプレートからの上清と細胞を採取し、一回凍結／融解し、bPIV3ウイルス粒子の存在を、PIV3特異的抗血清を使用してウイルスプラークの免疫
染色により検出する。
【０１６１】
組換えウイルスを増殖させる別のアプローチは、野生型ウイルスとの同時培養である。これは、組換えウイルスを取り、これと他の野生型ウイルス（好ましくはワクチン株）とを同時感染することにより行われる。野生型ウイルスは欠陥ウイルス遺伝子産物を補足し、野生型と組換えウイルスの両方の増殖を可能にする。あるいはヘルパーウイルスを使用して、組換えウイルスの増殖を指示してもよい。
【０１６２】
別のアプローチでは、PIVウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する組換えウイルスとともに同時感染された細胞中で、合成鋳型が複製される。実際この方法は、本発明の組換え感染性ウイルスをレスキューするのに使用される。このために、PIVポリメラーゼタンパク質を、特に限定されないがウイルス発現ベクター（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、バキュロウイルスなど）またはポリメラーゼタンパク質を発現する細胞株（例えば、Krystalら、1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2709-2713）を含む任意の発現ベクター／宿主細胞系で発現してもよい。さらに６つのPIVタンパク質を発現する宿主細胞の感染により、感染性キメラウイルス粒子が産生される。ウイルスの増殖力を改変することなく組換えウイルスを構築することは可能であることに注目されたい。次にこれらの改変ウイルスは増殖コンピタントとなり、複製するためにヘルパー機能を必要としないであろう。
【０１６３】
5.4. 組換えウイルスの弱毒化
本発明の組換えウイルスはさらに遺伝子操作して、弱毒化表現型を示すようにすることができる。特に本発明の組換えウイルスは、ウイルスをワクチンとして投与した被験体で弱毒化表現型を示す。弱毒化は、当業者に公知の任意の方法により行われる。理論に拘束はされないが、例えば目的の宿主中で天然には充分複製しないウイルスを使用して（例えば、ヒトでウシPIV3ベクターを使用して）、ウイルスゲノムの複製の低下により、ウイルスが宿主細胞を感染する能力の低下により、またはウイルスタンパク質が集合して野生型ウイルスと比較して感染性ウイルス粒子になる能力の低下により、組換えウイルスの弱毒化表現型が引き起こされる。ウイルスのいくつかの配列（リーダー配列およびトレーラー配列）の増殖力は、ミニゲノムアッセイを使用して試験することができる（セクション5.5.1を参照）。
【０１６４】
本発明の組換えウイルスの弱毒化表現型は、当業者に公知の任意の方法により試験することができる（例えば、セクション5.5を参照）。ウイルス候補は例えば、細胞培養系で宿主を感染する能力についてまたは複製速度について試験することができる。ある実施形態において、改変された遺伝子がN、P、L、M2またはこれらの組合せである時、弱毒化ウイルスを試験するために、ミニゲノム系が使用される。ある実施形態において、異なる温度の増殖曲線を使用して、ウイルスの弱毒化表現型が試験される。例えば弱毒化ウイルスは、35℃で増殖できるが、39℃や40℃では増殖できない。ある実施形態において異なる細胞株を使用して、ウイルスの弱毒化表現型を評価することができる。例えば弱毒化ウイルスは、サル細胞株でのみ増殖することができ、ヒト細胞株では増殖せず、または異なる細胞株で達成されるウイルス力価は、弱毒化ウイルスにより異なる。ある実施形態において、小さい動物モデル（特に限定されないが、ハムスター、コトンラット、マウスおよびモルモットを含む）の呼吸器官でのウイルス複製を使用して、ウイルスの弱毒化表現型が評価される。他の実施形態において、ウイルスにより誘導される免疫応答（特に限定されないが、抗体力価（例えば、プラーク低下中和アッセイまたはELISAにより測定される）を含む）を使用して、ウイルスの弱毒化表現型が評価される。具体的な実施形態においてプラーク低下中和アッセイまたはELISAが、低用量で行われる。ある実施形態において、組換えウイルスが動物モデルで病状を誘発する能力を試験することができる。組換えウイルスが動物モデルで病状を誘発する能力の低下は、その弱毒化表現型を示す。具体的な実施形態において候補ウイルスは、粘液産生により示される鼻感染のサルモデルで試験される。
【０１６５】
本発明のウイルスを弱毒化して、ウイルスの１つ以上の機能特性障害することができる。ある実施形態において弱毒化は、そこから弱毒化ウイルスが得られる野生型のウイルスと比較して測定される。他の実施形態において弱毒化は、異なる宿主系で弱毒化ウイルスの増殖を比較することにより測定される。すなわち非限定例について、ヒト宿主でのウシPIV3の増殖が、ウシ宿主でのウシPIV3の増殖と比較して低下しているなら、ウシPIV3はヒト宿主で増殖させると弱毒化されると言われる。
【０１６６】
ある実施形態において本発明の弱毒化ウイルスは、宿主を感染することができ、感染性ウイルス粒子が産生されるように宿主中で複製することができる。しかし野生型株と比較して、弱毒化株は増殖しても低力価であり、増殖が遅い。当業者に公知の任意の方法を使用して、弱毒化ウイルスの増殖曲線を測定し、これを野生型ウイルスの増殖曲線を比較することができる。方法の例については実施例セクション（後述）を参照されたい。具体的な実施形態において弱毒化ウイルスは、記載の条件下でVero細胞中で、105 pfu/ml未満、104 pfu/ml未満、103 pfu/ml以下未満、または102 pfu/ml未満までしか増殖しない。
【０１６７】
ある実施形態において本発明の弱毒化ウイルス（例えばキメラPIV3）は、野生型ウイルス（例えば野生型PIV3）が複製するようには、ヒト細胞中で複製できない。しかし弱毒化ウイルスは、インターフェロン機能が欠如した細胞株（例えばVero細胞）中で複製することができる。
【０１６８】
他の実施形態において本発明の弱毒化ウイルスは、宿主を感染することができ、宿主中で複製することができ、そして本発明のウイルスのタンパク質が細胞質膜中に挿入されることを可能にするが、弱毒化ウイルスは、宿主に新しい感染性ウイルス粒子を産生させない。ある実施形態において弱毒化ウイルスは、宿主に感染し、宿主中で複製し、ウイルスタンパク質が、宿主の細胞質膜中に野生型哺乳動物ウイルスと同じ効率で挿入されるようにする。他の実施形態において、弱毒化ウイルスが、ウイルスタンパク質を宿主細胞の細胞質膜中に挿入されるようにする能力が、野生型ウイルスと比較して低下する。ある実施形態において弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主中で複製する能力は、野生型ウイルスと比較して低下する。当業者に公知の任意の方法を使用して、哺乳動物細胞を感染することができ、宿主内で複製することができ、宿主の細胞質膜にウイルスタンパク質を挿入することができる。方法の例についてはセクション5.5を参照されたい。
【０１６９】
ある実施形態において本発明の弱毒化ウイルスは宿主を感染することができる。しかし野生型PIVと比較して、弱毒化PIVは宿主中で複製されない。具体的な実施形態において弱毒化ウイルスは宿主に感染することができ、宿主がウイルスタンパク質を細胞質膜に挿入することを可能にするが、弱毒化ウイルスは宿主中で複製されない。当業者に公知の任意の方法を使用して、弱毒化ウイルスが宿主に感染したかどうか、および宿主がウイルスタンパク質を細胞質膜中に挿入するようにしたかどうかを試験することができる。
【０１７０】
ある実施形態において、弱毒化哺乳動物ウイルスが宿主に感染する能力は、同じ宿主に野生型ウイルスが感染する能力と比較して低下している。当業者に公知の任意の方法を使用して、ウイルスが宿主に感染できるかどうかを測定することができる。方法の例についてはセクション5.5を参照されたい。
【０１７１】
ある実施形態において、弱毒化表現型を有するウイルスを生成するために、ウイルスのゲノムに変異（例えばミスセンス変異）が導入される。変異（例えばミスセンス変異）は、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子に導入することができる。変異は、付加、置換、欠失、またはこれらの組合せでもよい。具体的な実施形態において、N、P、LまたはM2タンパク質に単一のアミノ酸欠失変異が導入され、これはミニゲノムアッセイで機能についてスクリーニングすることができ、ウイルス中の予測される機能について評価することができる。さらに具体的な実施形態においてミスセンス変異は低温感受性変異である。他の実施形態においてミスセンス変異は熱感受性変異である。ある実施形態においてウイルスのPタンパク質の主要なリン酸化部位が除去される。別の実施形態において、温度感受性株を生成するためにウイルスのL遺伝子中に変異が導入される。さらに別の実施形態において、切断が起きないかまたは非常にゆっくり起きるように、F遺伝子の切断部位が変異される。
【０１７２】
別の実施形態において、組換えウイルスのゲノム中に欠失が導入される。さらに具体的な実施形態において欠失は、組換えウイルスのN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、G遺伝子、またはL遺伝子に導入することができる。具体的な実施形態において欠失は、本発明の組換えウイルスのM2遺伝子中にある。他の具体的な実施形態において欠失は、本発明の組換えウイルスのSH遺伝子中にある。さらに別の実施形態において、M2遺伝子とSH遺伝子の両方が欠失されている。
【０１７３】
ある実施形態において、組換えウイルスの遺伝子間領域が改変される。ある実施形態において、遺伝子間領域の長さが改変される。例についてはセクション5.1.2.を参照されたい。別の実施形態において遺伝子間領域は、ウイルスゲノムの5'末端から3'末端にシャフルされる。
【０１７４】
別の実施形態において、組換えウイルスの遺伝子のゲノム位置が変化させられる。ある実施形態において、F遺伝子またはG遺伝子がゲノムの3'末端に移動される。別の実施形態において、N遺伝子はゲノムの5'末端に移動される。
【０１７５】
ある実施形態においてウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスの遺伝子を異なる種のウイルスの遺伝子で置換することにより行われる。例については、bPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子が、それぞれhPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子で置換される。別の実施形態において、hPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子が、それぞれbPIV3のN遺伝子、P遺伝子、F遺伝子、M2遺伝子、M2-1遺伝子、M2-2遺伝子、SH遺伝子、HN遺伝子、またはL遺伝子で置換される。好適な実施形態においてウイルスの弱毒化は、１つ以上のポリメラーゼ関連遺伝子（例えば、N、P、LまたはM2）を異なる種のウイルスの遺伝子で置換することにより行われる。
【０１７６】
ある実施形態においてウイルスの弱毒化は、野生型ウイルスのタンパク質の１つ以上の特定のドメインを、異なる種のウイルスの対応するタンパク質由来のドメインで置換するか、または欠失させることにより行われる。ある実施形態では、bPIV3のFタンパク質のエクトドメインが、メタニューモウイルスのFタンパク質のエクトドメインで置換される。好適な実施形態においてL、NまたはPタンパク質の１つ以上の特定のドメインが、異なる種のウイルスの対応するタンパク質由来のドメインで置換される。別の実施形態において、可溶性Fタンパク質が発現されるように、Fタンパク質の膜貫通ドメインが欠失される。
【０１７７】
本発明のある実施形態において、弱毒化表現型を達成するために、本発明の組換えウイルスのリーダー配列および／またはトレーラー配列を修飾することができる。より具体的な実施形態においてリーダー配列および／またはトレーラー配列は、野生型ウイルスと比較して、少なくとも１ヌクレオチド、少なくとも２ヌクレオチド、少なくとも３ヌクレオチド、少なくとも４ヌクレオチド、少なくとも５ヌクレオチド、または少なくとも６ヌクレオチドだけ、長さが短縮される。他のより具体的な実施形態において、組換えウイルスのリーダー配列および／またはトレーラー配列が変異される。具体的な実施形態においてリーダー配列およびトレーラー配列は、互いに100％相補的である。別の実施形態において、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、または10ヌクレオチドが互いに相補的ではなく、リーダー配列およびトレーラー配列の残りのヌクレオチドは互いに相補的である。ある実施形態において非相補的ヌクレオチドは互いに異なる。別の実施形態において、もしトレーラー中の非相補的ヌクレオチドがプリンなら、リーダー配列中の対応するヌクレオチドもプリンである。別の実施形態において、もしトレーラー中の非相補的ヌクレオチドがピリミジンなら、リーダー配列中の対応するヌクレオチドもプリンである。
【０１７８】
生きた弱毒化ワクチンが使用される時、その安全性も考慮しなければならない。ワクチンは疾患を引き起こしてはならない。本発明において、ワクチンを安全にすることができる当該分野で公知の任意の方法が使用される。弱毒化法以外に、他の方法を使用してもよい。１つの非限定例は、ウイルス粒子膜中に取り込まれない可溶性異種遺伝子を使用することである。例えば可溶性RSV F遺伝子の単一のコピー（膜貫通ドメインおよびサイトゾルドメインが欠如したRSV遺伝子）を使用することができる。これはウイルス粒子膜中に取り込まれないため、ウイルスの親和力が変化しないと予測される。
【０１７９】
ワクチンの安全性を試験するために種々のアッセイを使用することができる。セクション5.5.（後述）を参照されたい。特にショ糖勾配と中和アッセイを使用することができる。ショ糖勾配アッセイは、異種タンパク質がウイルス粒子中に挿入されているかどうかを調べるために使用することができる。異種タンパク質がウイルス粒子中に挿入されるなら、たとえ親株が症状を引き起こなくても、ウイルス粒子が症状を引き起こす能力について試験しなければならない。理論に拘束はされないが、もし異種タンパク質がウイルス粒子中に取り込まれるなら、ウイルスは新しい、おそらく病理的性質を獲得している可能性がある。
【０１８０】
5.5. キメラウイルスのウイルス力価、抗原性配列の発現、免疫原性および他の特性の測定
すべての細胞培養系、動物モデル系、または被験体で、キメラウイルスまたは組換えウイルスの増殖速度を測定するために、本発明では多くのアッセイが使用される。本発明においてはまた、ウイルス粒子の感染、複製、およびパッケージングを達成するためのキメラウイルスおよび組換えウイルスの必要条件を測定するために、多くのアッセイが使用される。
【０１８１】
ウイルス力価を経時的に測定してウイルスの増殖特性を調べるために、本明細書に記載のアッセイが使用される。具体的な実施形態においてウイルス力価は、感染細胞または感染被験体からサンプルを得て、サンプルの連続希釈物を調製して、単一プラークの出現を可能にするウイルスの希釈率で、感染に感受性の細胞の単層をウイルスで感染させることにより測定される。次にプラークが計測され、ウイルス力価は１mlのサンプルあたりのプラーク形成単位として表される。本発明の具体的な実施形態において、被験体中の本発明のウイルスの増殖速度は、被験体中のウイルスに対する抗体の力価により推定される。理論に拘束はされないが、被験体中の抗体力価は、被験体中のウイルス力価のみでなく抗原性も反映している。ウイルスの抗原性が一定なら、被験体中の抗体力価の増加を、被験体中のウイルスの増殖曲線を測定するために使用することができる。好適な実施形態において、動物またはヒトでのウイルスの増殖速度は、感染後の複数の時点で宿主の体液をサンプリングし、ウイルス力価を測定することにより試験される。
【０１８２】
細胞培養系または被験体中の異種遺伝子配列の発現は、当業者に公知の任意の方法により測定される。ある実施形態において異種遺伝子の発現は、転写体のレベルを定量することにより測定される。転写体のレベルは、それぞれ転写体に特異的なプローブまたはプライマーを使用してノーザンブロット解析またはRT-PCRにより測定することができる。ウイルスはアンチセンス配向であるが転写体はセンス配向であるため、転写体はウイルスのゲノムから区別される。ある実施形態において異種遺伝子の発現は、異種遺伝子のタンパク質産物のレベルを定量することにより測定される。タンパク質のレベルは、タンパク質に特異的な抗体を使用してウェスタンブロット解析により測定することができる。
【０１８３】
具体的な実施形態において、異種遺伝子はペプチドタグで標識される。ペプチドタグは、ペプチドタグに対する抗体を使用して検出することができる。検出されるペプチドタグのレベルは、異種遺伝子から発現されるタンパク質のレベルを示す。あるいはペプチドタグを使用して、異種遺伝子から発現されるタンパク質を単離することができる。精製タンパク質の量は、異種遺伝子の発現レベルの相関する。そのようなペプチドタグおよびそのようなペプチドタグに融合したタンパク質の単離のための方法は、当該分野で公知である。当該分野で公知の種々のペプチドタグを異種遺伝子の修飾に使用することができ、例えば特に限定されないが、免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジン配列（Petty, 1996, 金属−キレート親和性クロマトグラフィー、分子生物学の現代のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）、１〜３巻（1994〜1998）、Ausubel, F.M., Brent, R., Kunston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A.およびStruhl, K.編、ジョンワイリーアンドサンズインク（John Wiley and Sons Inc.）発行、アメリカ合衆国、Greene publish. Assoc. & Wiley Interscinece）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST；Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229）、大腸菌（E. coli）マルトース結合タンパク質（Guanら、1987, Gene 67:21-30）、種々のセルロース結合ドメイン（US Patent No. 5,496,934；5,202,247；5,137,819；Tommeら、1994, Protein Eng. 7:117-123）、およびFLAGエピトープ（Short Protocols in Molecular Biology, 1999, Ausubelら編、ジョンワイリーアンドサンズインク（John Wiley and Sons Inc.）、ユニット10.11）などがある。他のペプチドタグは特異的結合パートナーにより認識され、こうして結合パートナーへの親和性結合による単離を促進し、これは好ましくは固定化されるかおよび／または固体支持体上に固定化される。当業者に公知のように多くの方法（特に限定されないが、DNAクローニング、DNA増幅、および合成法）を使用して、上記ペプチドタグのコード領域を得ることができる。ペプチドタグの一部およびその検出と単離のための試薬は、市販されている。
【０１８４】
被験体からのサンプルは、当業者に公知の任意の方法により得られる。ある実施形態においてサンプルは、鼻吸引液、のどスワブ、喀痰、または気管支肺胞洗浄液からなる。
【０１８５】
5.5.1. ミニゲノム構築体
アンチセンスレポーター遺伝子を含有するために、ミニレプリコン構築体を作成することができる。本発明において当業者に公知の任意のレポーター遺伝子を使用することができる。具体的な実施形態において、レポーター遺伝子はCATである。ある実施形態においてレポーター遺伝子は、デルタ肝炎リボザイム（Hep-d Ribo）およびT7ポリメラーゼ末端（T-T7）シグナルに連結されたマイナス−センスbPIVもしくはhPIVリーダー、およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターが先行するbPIVもしくはhPIVトレーラー配列が横に存在してもよい。
【０１８６】
ある実施形態においてミニレプリコンをコードするプラスミドは、宿主細胞中にトランスフェクトされる。宿主細胞は、T7 RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、およびM2.1遺伝子を発現する。ある実施形態において宿主細胞は、T7 RNAポリメラーゼ、N遺伝子、P遺伝子、L遺伝子、およびM2.1遺伝子をコードするプラスミドによりトランスフェクトされる。別の実施形態においてミニレプリコンをコードするプラスミドは宿主細胞中にトランスフェクトされ、宿主細胞はヘルパーウイルスにより感染される。
【０１８７】
レポーター遺伝子の発現レベルおよび／またはその活性は、当業者に公知の任意の方法、例えば特に限定されないが、セクション5.5.6.に記載の方法により測定することができる。
【０１８８】
ある、さらに具体的な実施形態においてミニレプリコンは以下の成分を記載の順序で含む：T7 RNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼI、リーダー配列、遺伝子開始点、GFP、トレーラー配列、デルタ肝炎リボザイム配列、またはRNAポリメラーゼI停止配列。T7がRNAポリメラーゼとして使用されるなら、デルタ肝炎リボザイム配列を停止配列として使用すべきである。もしRNAポリメラーゼIが使用されるなら、RNAポリメラーゼI停止配列を停止シグナルとして使用すべきである。レスキューシステムに依存して、ミニレプリコンの配列はセンスまたはアンチセンス配向でもよい。ある実施形態においてリーダー配列は、本発明のウイルスの野生型リーダー配列に対して修飾してもよい。リーダー配列は、ACにより随時先行されてもよい。T7プロモーター配列はG-ダブレットまたはトリプレットがあってもなくてもよく、ここでG-ダブレットまたはトリプレットは転写増強を与える。
【０１８９】
具体的な実施形態において、細胞はT0で本発明のウイルスで感染される。24時間後T24で、細胞はミニレプリコン構築体でトランスフェクトされる。T0から48時間後とT0から72時間後、細胞はレポーター遺伝子の発現について試験される。蛍光性レポーター遺伝子産物が使用されるなら（例えば、GFP）、レポーター遺伝子の発現はFACSを使用して試験することができる。
【０１９０】
ある実施形態において細胞はT=0時間に６つのプラスミドでトランスフェクトされる。t=40時間とT=60時間に細胞が採取され、CATまたはGFP発現について分析される。
【０１９１】
別の具体的な実施形態において細胞はT0でMVA-T7で感染される。１時間後T1で、細胞はミニレプリコン構築体でトランスフェクトされる。T0から24時間後、細胞は本発明のウイルスで感染される。T0から72時間後、細胞はレポーター遺伝子の発現について試験される。蛍光性レポーター遺伝子産物が使用されるなら（例えば、GFP）、レポーター遺伝子の発現はFACSを使用して試験することができる。
【０１９２】
5.5.2. 感染の頻度の測定
感染の頻度は、例えば特に限定されないが、感染の存在について臨床サンプル（例えば、鼻スワブ）の試験を含む当該分野で公知の任意の方法により測定することができ、例えばhMPV、RSV、hPIV、bPIV/hPIV成分は、免疫蛍光アッセイ（IFA）により、それぞれ抗hMPV抗原抗体、抗RSV抗原抗体、抗hPIV抗原抗体、および／または異種ヌクレオチド配列の遺伝子産物に特異的な抗体を使用して検出することができる。
【０１９３】
ある実施形態において完全な細胞を含有するサンプルは直接処理することができ、ここで完全な細胞の無い分離株は、まず許容細胞株（例えばHEp-2細胞）で培養すべきである。ある実施形態において、培養細胞懸濁液は、例えば300×ｇで５分間室温で遠心分離し、次にPBS、pH7.4（Ca++とMg++を含まない）で同じ条件下で洗浄することにより清澄化される。細胞ペレットは分析のために少量のPBSに再懸濁される。完全な細胞を含有する初代臨床分離株はPBSと混合され、300×ｇで５分間室温で遠心分離される。無菌ピペットチップを使用して界面から粘液を除去し、細胞ペレットをPBSで同じ条件下で再洗浄する。次にペレットを分析のために少量のPBSに再懸濁する。各細胞懸濁液の５〜10μlを、アセトン洗浄した12ウェルHTCスーパーキュアドガラススライド上の５mmのウェルにスポットし、風乾させる。スライドを冷（−20℃）アセトンで10分間固定する。PBS−１％BSAを各ウェルに加え次に室温で10分間インキュベートして、反応を阻止する。スライドをPBS−0.1％ツイーン-20で３回洗浄し、風乾する。各１次抗体試薬の10μlをブロッキングバッファーで250ng/mlに希釈し、ウェルにスポットし、反応物を加湿37℃環境で30分間インキュベートする。次にスライドを、PBS−0.1％ツイーン20を３回交換して充分洗浄し、風乾する。ブロッキングバッファーで250ng/mlに希釈した適切な２次結合抗体試薬の10μlを各ウェルにスポットし、反応物を加湿37℃環境でさらに30分間インキュベートする。次にスライドを、PBS−0.1％ツイーン20を３回交換して洗浄する。５μlのPBS−50％グリセロール−10mMトリスpH8.0−１mM EDTAを各反応ウェルにスポットし、スライドにカバーガラスをのせる。次に各反応ウェルを蛍光顕微鏡で200×でB-2Aフィルター（EX450−490nm）を使用して分析する。陽性反応物を、非染色細胞または２次試薬のみで染色した細胞から得られた自己蛍光バックグランドに対してスコアをつける。RSV陽性反応物を、感染細胞の細胞質中に小さな封入体がある明るい蛍光により解析する。
【０１９４】
5.5.3. 血清力価の測定
抗体血清力価は、当該分野で公知の任意の方法により測定され、例えば特に限定されないが、血清サンプル中の抗体または抗体断片の量は、サンドイッチELISAにより定量される。簡単に説明するとELISAは、マイクロタイタープレートを４℃で、血清中の抗体または抗体断片を認識する抗体で同時トランスフェクションする。次にプレートをPBS−ツイーン−0.5％ BSAで室温で約30分間ブロックする。PBS-BSA-BSAで希釈した精製抗体または抗体断片を使用して標準曲線を作成し、サンプルをPBS-BSAで希釈する。サンプルと標準物質をアッセイプレートの二重のウェルに加え、室温で約１時間インキュベートする。次に非結合抗体をPBS-ツイーンで洗い流し、結合抗体と標識２次抗体（例えば、ヤギ抗ヒトIgGに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼ）で室温で約１時間処理する。標識抗体の結合は、標識物に特異的な発色基質を加え、基質のターンオーバー速度を例えば分光光度計で測定することにより検出される。血清中の抗体または抗体断片濃度レベルは、サンプルの基質ターンオーバーの速度を標準曲線の基質ターンオーバーの速度と比較することにより決定される。
【０１９５】
5.5.4. 抗原刺激試験
このアッセイは、本発明の組換えウイルスと本発明のワクチンが、動物モデル系（特に限定されないが、コトンラット、シリアンゴールデンハムスター、およびBalb/cマウスを含む）で下気道ウイルス感染を予防する能力を測定するために使用される。組換えウイルスおよび／またはワクチンは、静脈内（IV）経路、筋肉内（IM）経路、または鼻内経路（IN）により投与することができる。組換えウイルスおよび／またはワクチンは、当業者に公知の任意の方法により投与することができる。このアッセイはまた、抗体の血清濃度を、抗体が結合するウイルスの肺力価の低下と相関させるために使用される。
【０１９６】
０日に、特に限定されないが、コトンラット（Sigmodon hispidis、平均体重100ｇ）とハムスター（例えば、シリアンゴールデンハムスター）を含む動物群に、目的の組換えウイルスもしくはワクチンまたはBSAを、筋肉内注射、静脈内注射、または鼻内経路により接種する。本発明の組換えウイルスまたはワクチンの投与の前、最中、または後に、動物に野生型ウイルスを感染させ、ここで野生型ウイルスは、これに対してワクチンを作成したウイルスである。ある実施形態において動物は本発明の組換えウイルスおよび／またはワクチンの投与後、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間、野生型ウイルスで感染される。好適な実施形態において動物は、本発明の組換えウイルスおよび／またはワクチンの投与後、21日間野生型ウイルスで感染される。別の好適な実施形態において動物は、本発明の組換えウイルスおよび／またはワクチンの投与後、28日間野生型ウイルスで感染される。
【０１９７】
感染後、動物を屠殺し、その鼻甲介組織および／または肺組織を採取し、適切なアッセイ（例えば、プラークアッセイおよびTCID50アッセイ）によりウイルス力価を測定する。ウシ血清アルブミン（BSA）10mg/kgを陰性対照として使用する。抗原刺激時の血清中の抗体濃度は、サンドイッチELISAを使用して測定することができる。
【０１９８】
5.5.5. 臨床治験
本発明のワクチンまたはその断片はin vitroアッセイで試験されており、動物モデルはさらに、安全性、耐性、免疫原性、感染性、および正常な健常ヒト志願者の群（すべての年齢群）での薬物動態について評価される。好適な実施形態において健常人志願者は、約６週齢またはそれ以上の幼児、小児および成人である。志願者には、本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンを鼻内、筋肉内、静脈内または肺送達系で単回投与した。６〜60週齢の血清陰性の小児には、本発明のウイルスおよび／またはワクチンの多回投与が必要かも知れない。生後６ヶ月までもまた、局所性および全身性の免疫を刺激し母親からの抗体による中和を克服するために、本発明のウイルスおよび／またはワクチンの多回投与が必要である。好適な実施形態において２、４および６ヶ月齢での初期投与処方と生後２年目の最初に追加投与が使用される。本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンは、単独でまたは対応する年齢で推奨される小児ワクチンと同時に投与することができる。
【０１９９】
好適な実施形態において、２重盲検プラセボ比較臨床治験が使用される。具体的な実施形態において、コンピューター作成ランダム化スケジュールが使用される。例えば試験の各被験者は、１つの単位として登録され、１つの症例番号が割り当てられる。１つの家族内の複数の被験者は、登録のために個人として処理される。試験の期間、親／保護者、被験者、および研究者は、被験者が割り当てられた治療群については、知らされないままである。血清とウイルスの試験は、治療群の割り当てについて知らされていない研究者により行われる。しかしワクチン接種後に得られる鼻洗浄液からのワクチンウイルスの単離により、実験室の職員にはワクチンがわかる可能性がある。血清の職員とウイルスの職員は別で、血清グループは培養結果の情報を得られないようにされる。
【０２００】
各志願者は好ましくは、本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンを投与される少なくとも12時間前はモニターされ、各志願者は臨床施設で投与された後少なくとも15分間はモニターされる。次に志願者は、投与後に通院して１〜14日、21日、28日、35日、42日、49日および56日にモニターされる。好適な実施形態において志願者は、各ワクチン接種後に最初の１ヶ月は通院してモニターされる。すべてのワクチン関連の重症の有害事象は、治験の全期間を通して報告される。重症の有害事象とは以下のように定義される：1) 死亡を引き起こす、2) 即時的に生命にかかわる、3) 永久的または重い不具を引き起こす、4) 入院が必要になるかまたは現在の入院を長引かせる、5) 先天性異常を引き起こす、6) 癌である、または7) 試験ワクチンの過剰投与の結果である。ワクチンに関連しない重症の有害事象は、最初のワクチン接種の日に始まり最後のワクチン接種後30日まで続いて報告される。ワクチンに関連しない重症の有害事象は、最後のワクチン接種後の30日の報告期間後の５〜８ヶ月は報告されない。前回の投与後に小児がワクチン関連の重症の有害事象を有するなら、ワクチン／プラセボの投与は行われない。ワクチンに無関係と考えられるが重要な有害事象は、次の投与の決定を行う前に、臨床試験追跡者と医学追跡者により検討される。
【０２０１】
血液サンプルは、留置カテーテルまたは直接の静脈穿刺（例えば、10mlの赤いフタのバキュテイナー試験管を使用して）により、以下の間隔で採取される：(1) 本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与前；(2) 本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与中；(3) 本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与後、５分、10分、15分、20分、30分、１時間、２時間、４時間、８時間、12時間、24時間、および48時間；および(4) 本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与後、３日、７日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、および56日。具体的な実施形態において、全部で５回の採血（それぞれ３〜５ml）が行われ、ワクチンまたはプラセボの投与のそれぞれ１回目、３回目および追加免疫の前と、３回目の投与と追加免疫の約１ヶ月後。サンプルは室温で凝固させ、遠心分離して血清を集める。
【０２０２】
本発明のウイルスに対する株特異的血清血球凝集阻害（HAI）抗体のレベルについて血清を試験する。免疫原性の他の指標（例えば、IgG、IgA、または中和抗体）も試験する。同時に投与された１つ以上の他のワクチンに対する血清応答を測定してもよい。患者サンプル中の本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンに対して作成された抗体の量は、ELISAにより定量することができる。
【０２０３】
志願者の血清中の抗体濃度レベルは、本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与後の各採血間隔の血清レベルから、投与前血清レベル（バックグランドレベル）を引いて補正する。各志願者について薬物動態パラメータは、モデルに依存しないアプローチ（Gibaldiら編、1982, Pharmacokinetics, 第２版、マーセルデッカー（Marcel Dekker）、ニューヨーク）に従って、補正した血清抗体または抗体断片濃度から計算する。
【０２０４】
ワクチン／プラセボの各投与後の約２、３、４、５、６、７または８日目に得られた鼻洗浄液は、本発明のワクチンウイルスの放出を検出するために培養される。好適な実施形態において、ワクチン／プラセボの各投与後の７日目に得られた鼻洗浄液が培養される。鼻咽頭スワブ、咽頭スワブ、または鼻洗浄液はまた、試験の任意の時期に、熱性病（直腸温度が102°Fより高いかまたは同等）、および／またはクループ、細気管支炎または肺炎のある志願者中の他のウイルスの存在を調べるために使用される。サンプルはドライアイスで、試験に指定された場所に輸送する。本発明のワクチンウイルスの単離と定量のためのアッセイ、およびMAbを使用して本発明のワクチンウイルスを同定するための免疫染色アッセイが使用される（そのようなアッセイの例は、後述の実施例セクションに記載されている）。鼻洗浄試料は、他のウイルスとIgG、IGAおよび中和抗体を含む免疫応答について試験される。
【０２０５】
5.5.6. レポーター遺伝子
ある実施形態において本発明の方法を用いて、組織培養物または動物モデル中のレポーター遺伝子発現の測定のためのアッセイを使用することができる。レポーター遺伝子のヌクレオチド配列は、bPIV、hPIV、またはb/h PIV3のようなウイルス中にクローン化され、ここで(i) レポーター遺伝子の位置は変化し、(i) レポーター遺伝子の横に位置する遺伝子間領域の長さは変化する。レポーター遺伝子発現の最適速度およびレポーター遺伝子を含むウイルスの最適複製速度を調べるために、異なる組合せが試験される。
【０２０６】
ある実施形態においてレポーター遺伝子を含めるためにミニゲノム構築体が作成される。ミニゲノム構築体の構築についてはセクション5.5.1.を参照されたい。
【０２０７】
レポーター遺伝子産物が豊富にあることは、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。そのような方法には、特に限定されないが、それぞれレポーター遺伝子に特異的なプローブまたは抗体を使用するノーザンブロット解析またはウェスタンブロット解析がある。
【０２０８】
ある実施形態においてレポーター遺伝子は、FACSで検出できる蛍光シグナルを発する。FACSは、レポーター遺伝子が発現される細胞を検出するのに使用することができる。
【０２０９】
本発明の具体的な実施形態を実施するための方法は、特に明記しない場合は、分子生物学、微生物学、および組換えDNA操作と産生を利用し、これらは当業者によりルーチンに行われている。例えばSambrook、1989, モレキュラークローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）、第２版；DNAクローニング、第１巻と２巻（Glocer編、1985）；および転写と翻訳（Transcription and Translation）（Hames & Higgins編、1984）を参照されたい。
【０２１０】
レポーター遺伝子産物の生化学的活性は、レポーター遺伝子の発現レベルを示す。レポーター遺伝子活性の総レベルはまた、本発明の組換えウイルスの複製速度に依存する。すなわち組換えウイルスからのレポーター遺伝子の真の発現レベルを調べるために、総発現レベルを、細胞培養物または動物モデル中の組換えウイルスの力価で割らなければならない。
【０２１１】
本発明の方法で使用できるレポーター遺伝子には、特に限定されないが、以下の表４に示す遺伝子がある。
【表４】
2005518208.tif 000005
【０２１２】
レポーター遺伝子の量は、特にウェスタンブロット解析またはノーザンブロット解析、またはヌクレオチド配列の転写、タンパク質中のmRNAの量の定量に使用される任意の他の方法により測定することができる（Short Protocols in Molecular Biology, Ausubelら（編）、ジョンワイリーアンドサンズインク（John Wiley and Sons Inc.）、第４版、1999を参照）。ある実施形態において、レポーター遺伝子産物の活性は、組換えウイルスからのレポーター遺伝子発現の読み出し情報として測定される。レポーター遺伝子産物の活性の定量のために、レポーター遺伝子産物の生化学的特性を調べることができる（表１）。レポーター遺伝子産物の生化学的活性の測定法は、当業者に公知である。本発明の方法で使用可能なレポーター遺伝子の例のより詳細な説明を以下に示す。
【０２１３】
ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼは、酸素と基質（ルシフェリン）の存在下で発光し、細胞培養物、個々の細胞、全生物体、およびトランスジェニック生物における遺伝子発現のリアルタイムの低光イメージングに使用されている酵素である（Greer & Szalay, 2002, Luminescence 17(1):43-74の総説がある）。
【０２１４】
本明細書において、本発明に関して使用される用語「ルシフェラーゼ」は、すべてのルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼ活性を有するルシフェラーゼから得られる組換え酵素を包含する。ホタルのルシフェラーゼ遺伝子は、例えばフォティヌス（Photinus）とゲンジボタル（Luciola）種から充分性状解析されている（例えば、北アメリカ産ホタル（Photinus pyralis）についての国際特許公報WO95/25798、ゲンジボタル（Luciola cruciata）とヘイケボタル（Luciola lateralis）についてのヨーロッパ特許出願EP0524448、およびルシオラ・ミングレリカ（Luciola mingrelica）についてのDevineら、1993, Biochim. Biophys. Acta 1173(2):121-132を参照されたい。他の真核生物ルシフェラーゼ遺伝子には、特に限定されないがウミシイタケ（sea panzy）（ウミシイタケ（Renilla reniformis）、Lorenzら、1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(10):4438-4442を参照）、およびツチボタル（glow worm）（ツチボタル（Lampyris noctiluca）、例えばSula-Newbyら、1996, Biochem J. 313:761-767を参照）。細菌のルシフェリン−ルシフェラーゼ系には、特に限定されないが陸生のフォトルハブヅス・ルミネセンス（Photorhabdus luminescens）（例えば、Manukhovら、2000, Genetika 36(3):322-30）と海洋細菌ビブリオ・フィッシェリ（Vibrio fischeri）とビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）（例えば、それぞれMiyamotoら、1998, J. Biol. Chem. 263(26):13393-9、およびCohnら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1):120-3を参照）がある。本発明に包含されるルシフェラーゼはまた、SquirrellらのUS Patent No. 6,265,177（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の変異体ルシフェラーゼを含む。
【０２１５】
緑色蛍光タンパク質
緑色蛍光タンパク質（「GFP」）は、238アミノ酸のタンパク質であり、アミノ酸65〜67は、蛍光を発するのに追加の基質や補助因子を必要としない発色団の形成に関与する（例えば、Prasherら、1992, Gene 111:229-233；Yangら、1996, Nature Biotechnol. 14:1252-1256；およびCodyら、1993, Biochemistry 32:1212-1218を参照）。
【０２１６】
本明細書において、本発明に関して使用される用語「緑色蛍光タンパク質」または「GFP」は、すべてのGFP（緑以外の色を発する種々の型のGFPを含む）、またはGFP活性を有するGFP由来の組換え酵素を包含する。GFPの未変性の遺伝子は、生物発光性クラゲのオワンクラゲ（Aequorea victoria）からクローン化された（例えばMorinら、1972, J. Cell Physiol. 77:313-318）。野生型GFPは395nmに大きな励起ピークと470nmに小さな励起ピークを有する。470nmの吸収ピークは、標準物質フルオレセインイソチオシアネート（FITC）フィルターセットを使用してGFPレベルを追跡することを可能にする。GFP遺伝子の変異体は、発現を増強し励起と蛍光を修飾するのに有用であることがわかっている。例えば65位のセリンがアラニン、グリシン、イソロイシン、またはスレオニンで置換された変異体GFPは、488nmで励起された時、野生型タンパク質より励起極大がシフトし大きな蛍光を有する（例えば、Heimら、1995, Nature 373:663-664を参照）；US Patent No. 5,625,048；Delagraveら、1995, Biotechnology 13:151-154；Cormackら、1996, Gene 173:33-38；およびCramerら、1996, Nature Biotechnol. 14:315-319）。488nmでGFPを励起する能力は、標準的蛍光活性化細胞ソーター解析（「FACS」）装置でGFPを使用することを可能にする。別の実施形態においてGFPは、特に限定されないがウミシイタケ（Renilla reniformis）のようなクラゲ以外の生物から単離される。
【０２１７】
EGFPは、哺乳動物細胞中で明るい蛍光と強い発現について最適化されている野生型GFP(3-5)の赤にシフトした変種である。（励起極大＝488nm；発光極大＝507nm）。EGFPはGFPmut1変種をコードし、これは、Phe-64からLeuとSer-65からThrへの２重アミノ酸置換を有する。EGFP遺伝子のコード配列は、ヒトコドン使用への選択性に対応する190を越えるサイレント塩基変化を有する。
【０２１８】
ベータガラクトシダーゼ
ベータガラクトシダーゼ（「β-gal」）は、β−ガラクトシド（乳糖を含む）とガラクトシド類似体o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシドピラノシド（「ONPG」）とクロロフェノールレッド-b-D-ガラクトピラノシド（「CPRG」）の加水分解を触媒する酵素である（Nielsenら、1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(17):5198-5202；Eusticeら、1991, Biotechniques 11:739-742；およびHendersonら、1986, Clin. Chem. 32:1637-1641を参照）。β-gal遺伝子は、そのタンパク質生成物が極めて安定であり、細胞溶解物中でタンパク質分解に対して耐性であり、かつ容易に測定できるため、レポーター遺伝子として充分機能する。ONPGが基質として使用される時、β-gal活性は、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを使用して定量することができる。
【０２１９】
本明細書において、本発明に関連して使用される用語「ベータガラクトシダーゼ」は、すべてのβ-gal（lacZ遺伝子産物を含む）またはβ-gal活性を有するβ-gal由来の組換え酵素を包含する。β-gal遺伝子は、そのタンパク質生成物が極めて安定であり、細胞溶解物中でタンパク質分解に対して耐性であり、かつ容易に測定できるため、レポーター遺伝子として充分機能する。ONPGが基質である実施形態において、β-gal活性は、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを使用して420nmで変換されるONPGの量を測定することにより定量することができる。CPRGが基質である実施形態において、β-gal活性は、分光光度計またはマイクロプレートリーダーを使用して570〜595nmで変換されるCPRGの量を測定することにより定量することができる。
【０２２０】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
哺乳動物細胞は検出できるレベルのCAT活性を有さないため、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「CAT」）は、哺乳動物細胞系で通常レポーター遺伝子として使用される。CATの測定は、細胞抽出物を放射能標識クロラムフェニコールおよび適切な補助因子とインキュベートして、例えば薄層クロマトグラフィー（「TLC」）により生成物から出発物質を分離し、次にシンチレーション計測により行われる（例えば、US Patent No. 5,726,041、これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２２１】
本明細書において本発明に関連して使用される用語「クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ」または「CAT」は、すべてのCAT、またはCAT活性を有するCAT由来の組換え酵素を包含する。高処理スクリーニングには、細胞処理、ラジオアイソトープ、およびクロマトグラフィー分離を必要としないレポーター系がより適しているが、レポーター遺伝子としてのCATは、レポーター遺伝子の安定性が重要な場合に好適である。例えばCATレポータータンパク質はin vivoの半減期が約50時間であり、これは、蓄積対動的変化型の結果を所望の場合に有利である。
【０２２２】
分泌型アルカリホスファターゼ
分泌型アルカリホスファターゼ（「SEAP」）酵素は、アルカリホスファターゼの末端切断型であり、タンパク質の膜貫通ドメインの切断が、これを細胞から周りの媒体への分泌されることを可能にする。
【０２２３】
本明細書において本発明に関連して使用される用語「分泌型アルカリホスファターゼ」または「SEAP」は、すべてのSEAPまたはアルカリホスファターゼ活性を有するSEAP由来の組換え酵素を包含する。SEAP活性は、特に限定されないが、蛍光基質の触媒の測定、免疫沈降、HPLC、およびラヂオメトリック検出を含む種々の方法により検出することができる。比色検出法に対して感度が高い点から、発光法が好ましい。SEAPを使用する利点は、SEAPタンパク質は細胞から外に分泌され、これがサンプリングとアッセイ操作の自動化を促進するため、細胞溶解工程が必要無いことである。Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼのインヒビターの細胞ベースの評価で使用されるSEAPを使用する細胞ベースのアッセイは、PottsらのUS Patent No. 6,280,940に記載されている（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２２４】
5.5.7. 細胞培養系、発育鶏卵、および動物モデル
本発明のウイルスを増殖させるかまたはその活性を試験するのに、当該分野で公知の細胞培養系を使用することができる（例えば、Flintら、Principles of Virology, Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, 2000, エーエスエム・プレス（ASM Press）、25〜29頁（この本文全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる）参照）。そのような細胞培養系の例には、特に限定されないが、動物組織から調製される初代細胞培養物（例えば、サル腎臓、ヒト胚羊膜、腎臓、および包皮、およびニワトリまたはマウスの胚）；単一の型の均一集団からなり、死滅するまでに100回まで分裂できる二倍体細胞株（例えば、ヒト胚由来の細胞培養物、例えばヒト胚性肺由来のWI-38）；および培養で無期限に増殖できる単一の型の細胞からなる連続的細胞株（例えば、HEp-2細胞、Hela細胞、Vero細胞、Lおよび3T3細胞、およびBHK-21細胞）がある。
【０２２５】
本発明のウイルスはまた、発育鶏卵で増殖することもできる。受精後５〜14日に、殻にドリルで穴をあけ、その複製に適した部位にウイルスを注入する。
【０２２６】
本発明のウイルスの有効性や安全性を調べるような種々の目的を達成するのに、本発明では当該分野で公知の任意の動物モデルを使用することができる。そのような動物モデルの例には、特に限定されないがコトンラット（Sigmodon hispidis）、ハムスター、マウス、サル、およびチンパンジーがある、好適な実施形態において、シリアンゴールデンハムスターが使用される。
【０２２７】
5.5.8. 中和アッセイ
異種表面糖タンパク質はウイルス粒子中に取り込まれてウイルスの向性表現型を改変させるかどうかという重要な安全性の問題に取り組むために、中和アッセイを行うことができる。本明細書において用語「向性（tropism）」は、特定の型の細胞に対するウイルスの親和性を示す。向性は通常、ウイルスが入ることができてかつその細胞だけである特定の細胞上の細胞受容体の存在により決定される。中和アッセイは、異種表面糖タンパク質（非限定例はマイナス鎖RNAウイルスのFタンパク質である）のMAb、または異種表面糖タンパク質に対する抗体を含むポリクローナル抗血清を使用して行われる。異なる希釈の抗体を試験して、本発明のキメラウイルスを中和できるかどうか調べられる。異種表面糖タンパク質はウイルス粒子表面上に、抗体結合と中和を引き起こすのに充分な量で存在してはならない。
【０２２８】
5.5.9. ショ糖勾配アッセイ
異種タンパク質がウイルス粒子中に取り込まれるかどうかの問題は、生化学的アッセイを使用してさらに調べられる。感染した細胞溶解物を20〜60％ショ糖勾配で分画し、種々の画分を集め、異種タンパク質とベクタータンパク質の存在と分布をウェスタンブロットにより分析する。画分とウイルスタンパク質はまた、プラークアッセイによりピークウイルス力価について測定することができる。ショ糖勾配の例は、セクション23（後述）に記載される。異種タンパク質がウイルス粒子に結合している時、これらはウイルス粒子と同時移動する。
【０２２９】
5.6. キメラウイルスを使用するワクチン製剤
本発明は、本発明の遺伝子操作したマイナス鎖RNAウイルスを含むワクチン製剤を包含する。本発明の組換えPIVウイルスは、種々の病原体に対する防御的応答を誘導する外来エピトープを発現するためのビヒクルとして使用してもよい。具体的な実施形態において本発明は、hPIV感染に対する防御性を与えるようにワクチン製剤中で修飾されている組換えbPIVウイルスまたは弱毒化hPIVの使用を包含する。
【０２３０】
本発明のワクチン調製物は、２価および３価ワクチン調製物を含む多価ワクチンを包含する。本発明の２価および３価ワクチンは、それぞれが異種抗原性配列を発現する１つのPIVベクター、またはそれぞれが異なる異種抗原性配列をコードする２つ以上のPIVベクターの形で投与される。例えば、１つ以上の異種抗原配列を発現する第１のキメラPIVは、１つ以上の異種抗原配列を発現する第２のキメラPIVとともに投与することができ、ここで第２のキメラPIV中の異種抗原配列は、第１のキメラPIV中の異種抗原配列とは異なる。第１および第２のキメラPIV中の異種抗原配列は、同じウイルスから得ることができるが、異なるタンパク質をコードするかまたは異なるウイルスから得られる。好適な実施形態において第１のキメラPIV中の異種抗原配列はRSウイルスから得られ、第２のキメラPIV中の異種抗原配列はヒトメタニューモウイルスから得られる。別の好適な実施形態において第１のキメラPIV中の異種抗原配列はRSウイルスから得られ、第２のキメラPIV中の異種抗原配列は鳥類ニューモウイルスから得られる。
【０２３１】
ある好適な実施形態において本発明のワクチン製剤は、マイナス鎖RNAウイルス（特に限定されないが、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、RSウイルス、および哺乳動物メタニューモウイルス（例えば、ヒトメタニューモウイルス））により引き起こされる感染に対して防御するために使用される。さらに詳しくは本発明のワクチン製剤は、ヒトメタニューモウイルスおよび／または鳥類ニューモウイルスによる感染に対して防御するために使用される。ある実施形態において本発明のワクチン製剤は、(a) ヒトメタニューモウイルスおよびRSウイルス；および／または(b) 鳥類ニューモウイルスおよびRSウイルスによる感染に対して防御するために使用される。
【０２３２】
好適な実施形態において本発明は、本発明の核酸によりコードされるタンパク質性分子、またはメタニューモウイルス特異的ウイルスタンパク質、またはこれらの機能性断片を提供する。有用なタンパク質性分子は、例えば本発明のウイルスから得られる任意の遺伝子または遺伝子断片から得られる。特に有用なのは、F、SHおよび／またはGタンパク質、または抗原もしくはサブユニット免疫原として含めるためのその抗原性断片であるが、不活性化した全ウイルスを使用することもできる。特に有用なのは、系統発生分析について同定される組換え核酸断片によりコードされるタンパク質性物質であり、好適なのは、in vivo（例えば、診断抗体を与えるための防御目的の）またはin vitro（例えば、ファージ表示（phage display）技術または合成抗体を作成するのに有用な別の方法）であっても、MPV特異的抗体もしくはT細胞応答を誘発するための、系統発生分析に有用なORFの範囲内にあるものである。
【０２３３】
本発明のウイルス、核酸、タンパク質性分子またはこれらの断片、抗原および／または抗体を含む医薬組成物は、例えばMPV感染および／または呼吸系疾患の治療または予防法で使用され、この方法は個体に本発明の医薬組成物を提供することを含む。幼児や小児は本明細書に記載のヒトMPVにより最も感染を受けやすいため、これは該個体がヒトである時、特に該ヒトが５才未満である時特に有用である。一般に急性期には患者は、上気道症状に罹りやすく、これは他の呼吸系疾患および他の疾患に罹りやすくする。下気道症状が起きることもあり、これはより重症の他の症状に罹りやすくする。本発明の組成物は、癌患者、移植受容者、および老人を含む免疫無防備状態者の治療に使用することができる。
【０２３４】
本発明はまた、本発明のウイルスを含む細胞培養物または実験動物を樹立し、該培養物または動物を抗ウイルス剤候補で処理し、該ウイルスに対するまたは該培養物もしくは動物の感染に対する該物質の効果を測定することを含む、呼吸器疾患の治療に有用な抗ウイルス剤を得る方法を提供する。本発明はまた、医薬組成物の調製のための、特にMPV感染または関連疾患により引き起こされる時の、特に呼吸器疾患の治療用の医薬組成物の調製のための、本発明の抗ウイルス剤の使用を提供し、MPV感染または呼吸系疾患の治療または予防法で有用な、本発明の抗ウイルス剤を含む医薬組成物を提供し、該方法は、そのような医薬組成物を個体に提供することを含む。
【０２３５】
本発明のある実施形態において、本発明のワクチンは哺乳動物メタニューモウイルスを含む。より具体的な実施形態において、哺乳動物メタニューモウイルスはヒトメタニューモウイルスである。好適な実施形態において、ワクチン製剤で使用される哺乳動物メタニューモウイルスは弱毒化表現型を有する。弱毒化表現型を達成するための方法についてはセクション5.4.を参照されたい。
【０２３６】
本発明はまた、PIV、RSV、APV、および／またはhMPVによる感染の予防と治療のためのワクチン製剤を提供する。ある実施形態において本発明のワクチンは、本発明の組換えおよびキメラウイルスを含む。ある実施形態においてウイルスは弱毒化されている。
【０２３７】
具体的な実施形態においてワクチンはAPVを含み、ワクチンはヒトにおけるhMPV感染の予防と治療に使用される。理論に拘束はされないが、APVのFタンパク質とhMPVのFタンパク質との相同性が高いために、APVによる感染は、hMPVと交差反応しhMPVによる感染や関連疾患から宿主を防御する抗体を、宿主中で産生させる。
【０２３８】
別の具体的な実施形態においてワクチンはhMPVを含み、ワクチンは、鳥（特に限定されないが七面鳥）におけるAPV感染の予防と治療に使用される。理論に拘束はされないが、APVのFタンパク質とhMPVのFタンパク質との相同性が高いために、hAPVによる感染は、APVと交差反応しAPVによる感染や関連疾患から宿主を防御する抗体を、宿主中で産生させる。
【０２３９】
ある実施形態において本発明のワクチン製剤は、(a) ヒトメタニューモウイルスとヒトパラインフルエンザウイルス；および／または(b) 鳥類ニューモウイルスとヒトパラインフルエンザウイルスおよび関連疾患、による感染に対して防御するために使用される。
【０２４０】
ある実施形態において本発明のワクチン製剤は、(a) ヒトメタニューモウイルス、RSウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルス；および／または(b) 鳥類ニューモウイルス、RSウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルスおよび関連疾患、による感染に対して防御するために使用される。
【０２４１】
ある実施形態において本発明のワクチン製剤は、ヒトメタニューモウイルス、RSウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルスによる感染に対して防御するために使用される。ある実施形態において本発明のワクチン製剤は、鳥類ニューモウイルス、RSウイルス、およびヒトパラインフルエンザウイルス、および関連疾患に対して防御するために使用される。
【０２４２】
異なるウイルス種の間のFタンパク質の相同性が高いために（アミノ酸配列の比較については図１を参照）、本発明のワクチン製剤は、そこからFタンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列が得られたウイルスとは異なるウイルスから防御するために使用することができる。具体的な実施形態においてワクチン製剤は、ワクチン製剤は、鳥類ニューモウイルスA型から得られる異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含有し、ワクチン製剤は、鳥類ニューモウイルスA型と鳥類ニューモウイルスB型による感染から防御するために使用される。ある具体的な実施形態においてワクチン製剤は、鳥類ニューモウイルスサブグループCから得られる異種ヌクレオチド配列を含むウイルスを含有し、ワクチン製剤は、鳥類ニューモウイルスサブグループAと鳥類ニューモウイルスサブグループDによる感染から防御するために使用される。
【０２４３】
本発明は、PIV、hMPV、APV（APV CとAPV Dを含む）、インフルエンザ、RSV、センダイウイルス、おたふくかぜウイルス、喉頭気管炎ウイルス、シミアンウイルス5、ヒトパピローマウイルス、ならびに他のウイルス、病原体および関連疾患に対して防御するのに有用な、ヒトと動物に投与されるワクチン製剤を包含する。本発明はさらに、ヒトメタニューモウイルス感染症、鳥類ニューモウイルス感染症、および関連疾患に対して防御するのに有用な、ヒトおよび動物に投与されるワクチン製剤を包含する。
【０２４４】
ある実施形態において本発明は、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス（FLV）およびイヌジステンパーウイルスを含む家畜動物疾患に対して有用なワクチン製剤を包含する。さらに別の実施形態において本発明は、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウイルスに対して家畜を防御するのに、およびさらに狂犬病ウイルスに対して野生動物を防御するのに、有用なワクチン製剤を包含する。
【０２４５】
逆遺伝学法により作成される弱毒化ウイルスは、本明細書に記載のワクチンと医薬製剤に使用することができる。逆遺伝学法はまた、ウイルス産生に重要な他のウイルス遺伝子に、追加の変異を遺伝子操作するのに使用することができる。例えば5'非コード領域の変異はmRNA翻訳に影響を与え、キャプシドタンパク質中の変異はウイルスの組み立てに影響を与えると考えられ、温度感受性および低温適合性変異体はしばしば親ウイルスより病原体が小さい（例えば、Flintら、Principles of Virology, Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, 2000, エーエスエム・プレス（ASM Press）、670-683頁（この本文全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる）参照）。有用なワクチン株変種のエピトープを遺伝子操作して、弱毒化ウイルスとすることができる。あるいは他のウイルスまたは非ウイルス病原体から得られる抗原を含む完全に外来のエピトープを遺伝子操作して、弱毒化株とすることができる。例えば、HIVのような関連の無いウイルスの抗原（gp160、gp120）、寄生体抗原（例えばマラリア）、細菌もしくは真菌抗原、または腫瘍抗原を遺伝子操作して、弱毒化株とすることができる。あるいはin vivoでウイルスの向性を改変するエピトープを遺伝子操作して、本発明のキメラ弱毒化ウイルスとすることができる。
【０２４６】
実質的に任意の異種遺伝子配列を、ワクチンで使用するための本発明のキメラウイルスに構築することができる。好ましくは生物学的応答調節物質（biologicall response modifiers）として作用する残基やペプチドを、ワクチンで使用するための本発明のキメラウイルスに構築することができる。好ましくは種々の病原体のいずれかに防御性免疫応答を誘導するエピトープ、または中和抗体に結合する抗原は、キメラウイルスによりまたはその一部として発現される。例えば本発明のキメラウイルスに構築することができる異種遺伝子配列には、特に限定されないが、インフルエンザおよびパラインフルエンザ血球凝集素−ノイラミニダーゼ、および融合糖タンパク質（例えばヒトPIV3のHNとF遺伝子）がある。さらに別の実施形態においてキメラウイルスに構築することができる異種遺伝子配列には、免疫調節活性を有するタンパク質をコードするものがある。免疫調節活性を有するタンパク質の例には、特に限定されないが、サイトカイン、インターフェロンＩ型、ガンマインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン-1、-2、-4、-5、-6、-12およびこれらの物質のアンタゴニストがある。
【０２４７】
さらに、ワクチンで使用するための本発明のキメラウイルスに構築できる異種遺伝子配列には、特に限定されないが、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）、好ましくは１型もしくは２型から得られる配列がある。好適な実施形態において、抗原の供給源でもよい免疫原性HIV由来ペプチドは、脊椎動物で免疫応答を誘発するのに使用されるキメラPIVに構築される。そのようなHIV由来ペプチドには、特に限定されないが、env遺伝子から得られる配列（すなわち、gp160、gp120、および／またはgp41のすべてまたは一部をコードする配列）、pol遺伝子（すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および／またはインテグラーゼのすべてまたは一部をコードする配列）、gag遺伝子（すなわちp7、p6、p55、p17/18、p24/25のすべてまたは一部をコードする配列）、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、および／またはvpxから得られる配列がある。
【０２４８】
他の異種配列は、すこし列記すると、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAG）；Ａ型もしくはＣ型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタインバーウイルスの糖タンパク質；ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質；RSV、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５またはおたふくかぜウイルスの糖タンパク質；インフルエンザウイルスの糖タンパク質；ヘルペスウイルスの糖タンパク質；ポリオウイルスのVP1；非ウイルス病原体（例えば、細菌や寄生体）の抗原決定基、から得られる。別の実施形態において免疫グロブリン遺伝子のすべてまたは一部を発現してもよい。例えば、そのようなエピトープを模倣する抗イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域を、本発明のキメラウイルスに構築してもよい。
【０２４９】
他の異種配列は腫瘍抗原から得られ、生じるキメラウイルスを使用して、腫瘍細胞に対する免疫応答を生成してin vivoで腫瘍退縮を引き起こすことができる。これらのワクチンは、他の治療法（特に限定されないが、化学療法、放射線療法、手術、骨髄移植などを含む）と一緒に使用してもよい。本発明において組換えウイルスを遺伝子操作して、腫瘍関連抗原（TAA）、特に限定されないが、Ｔ細胞に認識されるヒト腫瘍抗原（RobbinsとKawakami, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:628-636、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、メラノサイト系統タンパク質（gp100、MART-1/MelanA、TRP-1（gp75）、チロシナーゼを含む）；腫瘍特異的な広く共有されている抗原、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-V、p15；腫瘍特異的変異抗原、β-カテプシン、MUM-1、CDK4；乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、および膵臓癌の非黒色腫抗原、HER-2/neu、ヒトパピローマウイルス-E6、-E7、MUC-1、を発現させてもよい。
【０２５０】
さらに別の実施形態において異種ヌクレオチド配列は、メタニューモウイルス、例えばヒトメタニューモウイルスおよび／または鳥類ニューモウイルスから得られる。さらに別の実施形態において本発明のウイルスは、１つはメタニューモウイルス（例えばヒトメタニューモウイルスおよび／または鳥類ニューモウイルス）から得られ、他の１つはRSウイルスから得られる、２つの異なる異種ヌクレオチド配列を含有する。この異種ヌクレオチド配列は、各ウイルスのFタンパク質またはGタンパク質をコードする。具体的な実施形態において異種ヌクレオチド配列はキメラFタンパク質をコードし、ここでキメラFタンパク質は、メタニューモウイルスのFタンパク質のエクトドメインと膜貫通ドメイン、ならびにパラインフルエンザウイルスのFタンパク質の管腔ドメインを含有する。
【０２５１】
生きた組換えウイルスワクチンまたは不活性化組換えウイルスワクチンを調製することができる。宿主中での増殖により、自然の感染で起きている増殖への同様の種類と程度の刺激が延長され、従って大きな長期持続性の免疫が付与されるため、生きたワクチンが好ましい。そのような生きた組換えウイルスワクチン製剤の産生は、細胞培養物またはニワトリ胚の尿嚢での増殖と次の精製を含む従来法を使用して行われる。
【０２５２】
この点で、ウイルス目的の遺伝子操作されたPIV（ベクター）は、これらの株中の弱毒化特性の存在が好ましい。トランスフェクションで使用される鋳型への適切な変異（例えば、欠失）の導入は、新規ウイルスに弱毒化特性を提供することができる。例えば、温度感受性または低温適応に関連する特異的ミスセンス変異を欠失変異にすることができる。これらの変異は、低温または温度感受性変異体に関連する点突然変異より安定なはずであり、復帰変異頻度は極めて低いはずである。
【０２５３】
あるいは、「自殺」特性を有するキメラウイルスを構築してもよい。そのようなウイルスは、宿主内でほんの数回の複製を経験するのみであろう。ワクチンとして使用されると、組換えウイルスは複製サイクルが限定され、充分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主中ではそれ以上進まず、疾患を引き起こさないであろう。１つ以上のPIV遺伝子が欠如しているかまたは変異PIV遺伝子を有する組換えウイルスは、連続的に複製することができないであろう。細胞株中で欠陥ウイルスを産生することができ、これはそのような遺伝子を永久に発現するであろう。基本的な遺伝子が欠如したウイルスはこれらの細胞株中で複製されるが、ヒト宿主に投与すると、複製ラウンドを完了することができないであろう。そのような調製物は、この不全サイクルで免疫応答を誘導するのに充分な数の遺伝子を転写および翻訳するであろう。あるいは多量の株が投与され、その結果これらの調製物は不活性化（死滅）ウイルスワクチンとして機能する。不活性化ワクチンについては、異種遺伝子産物がウイルス成分として発現され、その結果遺伝子産物がウイルス粒子に関連していることが好ましい。そのような調製物の利点は、これらが未変性のタンパク質を含有し、ホルマリンまたは死滅ウイルスワクチンの製造に使用される他の物質による処理により不活性化されないことである。あるいは、cDNAから作成された変異PIVは強く弱毒化され、その結果数回しか複製しない。
【０２５４】
ある実施形態において本発明のワクチンは弱毒化ウイルスを含む。理論に拘束はされないが、たとえ弱毒化ウイルスが細胞に新しい感染性ウイルス粒子を作成させることができなくても、ウイルスタンパク質が宿主の細胞質膜に挿入され、こうして免疫応答を刺激するため、弱毒化ウイルスはワクチンとして有効である。
【０２５５】
本発明のこの態様の別の実施形態において、キメラウイルスを「死滅させる」従来法を使用して不活性化ワクチン製剤が調製される。不活性化ワクチンは、その感染性が破壊されているという意味で「死滅」している。その免疫原性に影響を与えるすることなく、ウイルスの感染性が破壊されることが理想的である。不活性化ワクチンを調製するために、キメラウイルスを細胞培養物またはニワトリ胚の尿嚢で増殖させて、ゾーン超遠心分離により精製し、ホルムアルデヒドまたはβ-プロピオラクトンにより不活性化し、プールする。生じるワクチンは通常筋肉内に接種される。
【０２５６】
免疫応答を増強するために、不活性化ワクチンを適当なアジュバントを用いて調製してもよい。そのようなアジュバントには、特に限定されないがミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム；表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン；ペプチド；油状エマルジョン；および有用な可能性のあるヒトアジュバント、例えばBCG、コリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）、ISCOMS、およびヴィロソームがある。
【０２５７】
上記ワクチン製剤を導入するために多くの方法が使用され、特に限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、皮内、および鼻内や吸入経路がある。ワクチンが設計される病原体の自然の感染経路により、キメラウイルスワクチン製剤を導入することが好ましい。
【０２５８】
ある実施形態におい本発明は免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物はキメラPIVを含む。ある実施形態において免疫原性組成物は弱毒化キメラPIVを含む。ある実施形態において免疫原性組成物は、薬剤学的に許容される担体をさらに含む。
【０２５９】
本発明のワクチンの有効性と安全性を評価するために、種々の方法が使用される。有効なワクチンは、副作用が最小で、正しい本来の細胞性かつ体液性応答を誘発することにより、病原体による疾患からワクチン接種した個体を防御するワクチンである。ワクチンは疾患を引き起こしてはならない。ワクチンは、ウイルスの複製とワクチン接種した被験体の免疫応答を測定することができる任意の方法を使用して評価される。非限定例が後述の実施例の欄に記載される。
【０２６０】
5.6.1. 本発明のワクチンまたは免疫原性調製物の投与処方と投与
本発明は、１つ以上の異種または固有ではない抗原性配列を発現するキメラPIVを含むワクチンと免疫原性調製物を提供する。本発明のワクチンまたは免疫原性調製物は、単一のまたは多価ワクチン（２価および３価ワクチンを含む）を包含する。本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、種々のウイルス感染症に対する防御性を提供するのに有用である。特に本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、宿主の呼吸器感染症に対する防御性を提供する。
【０２６１】
本発明の組換えウイルスおよび／またはワクチンまたは免疫原性製剤は、単独でまたは他のワクチンと一緒に投与することができる。好ましくは本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、呼吸器疾患に対する防御性を提供する他のワクチンまたは免疫原性製剤（特に限定されないが、RSウイルスワクチン、インフルエンザワクチン、麻疹ワクチン、おたふくかぜワクチン、風疹ワクチン、肺炎球菌ワクチン、リケッチアワクチン、ブドウ球菌ワクチン、百日咳ワクチン、または呼吸器癌に対するワクチンを含む）と一緒に投与される。好適な実施形態において本発明のウイルスおよび／またはワクチンは、対応する年齢で推奨される小児ワクチンと同時に投与される。例えば、２ヶ月齢、４〜６ヶ月齢では、本発明のウイルスおよび／またはワクチンは、DtaP(IM)、Hib(IM)、ポリオ（IPVまたはOPV）およびＢ型肝炎（IM）と同時に投与することができる。12ヶ月齢または15ヶ月齢では、本発明のウイルスおよび／またはワクチンは、Hib(IM)、ポリオ（IPVまたはOPV）、NMRII（登録商標）(SubQ)；Varivax（登録商標）(SubQ)、およびＢ型肝炎（IM）と同時に投与することができる。本発明の方法で使用できるワクチンは、種々の刊行物、例えば、ヨルダン報告2000（The Jordan Report 2000）、微生物と感染症部門（Division of Microbiology and Infectious Diseases）、アレルギーと感染症の国立研究所（National Institutes of Allergy and Infetious Diseases）、国立衛生研究所（National Institutes of Health）（この内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に総説がある。
【０２６２】
本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、被験体にそのまま、または医薬組成物もしくは治療組成物の形で投与される。本発明のアジュバントと免疫原性抗原（例えば、ウイルス、キメラウイルス、変異ウイルス）を含む医薬組成物は、従来法の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、湿式粉砕、乳化、封入、捕捉、または凍結乾燥法により製造される。医薬組成物は、従来法で１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または、薬剤学的に使用可能な本発明の免疫原性抗原の処理を促進する補助剤を使用して調製される。適切な製剤は、特に、選択される投与経路に依存する。
【０２６３】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物が、アジュバントを含むかまたは１つ以上のアジュバントとともに投与される時、使用されるアジュバントには、特に限定されないが、ミネラル塩アジュバントまたはミネラル塩ゲルアジュバント、顆粒アジュバント、微粒子アジュバント、粘性アジュバント、および免疫刺激アジュバントがある。アジュバントの例には、特に限定されないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、フロインド完全アジュバント、フロインド不完全アジュバント、スクアレンもしくはスクアレン水中油アジュバント製剤、生分解性および生体適合性ポリエステル、重合リポソーム、トリテルペノイドグリコシドまたはサポニン（例えば、QuilAおよびQS-21、商品名STIMULON、ISCOPREPでも販売されている）、N-アセチルムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（スレオニル-MDP、商品名TERMURTIDEでも販売されている）、LPS、モノホスホリル脂質Ａ（3D-MLA、商品名MPLでも販売されている）。
【０２６４】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物が投与される被験体は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトであるが、非ヒト動物、例えば特に限定されないが、霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ、七面鳥）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびげっ歯類でもよい。
【０２６５】
本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を導入するのに多くの方法が使用され、例えば特に限定されないが、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、皮内、および鼻内や吸入経路、および乱刺法（皮膚の最上層を、例えば二又針を使用して引っ掻く）がある。
【０２６６】
局所投与には、本発明のワクチンまたは免疫原性調製物は、当該分野で公知のように液剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤などとして調製される。
【０２６７】
鼻内または吸入による投与には、本発明の調製物は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適当な気体）を使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアゾル噴霧型で投与することが便利である。加圧エアゾル剤の場合、投与単位は計量を供給する弁を提供することにより決定される。例えば化合物と適切な粉末ベース（例えば乳糖またはデンプン）との粉末混合物を含有する、吸入器または注入器で使用するゼラチンのカプセルやカートリッジが調製される。
【０２６８】
注射には、本発明のワクチンまたは免疫原性調製物は、水性液剤、好ましくは生理学的適合性のバッファー（例えば、ハンクス塩、リンゲル液、またはリン酸緩衝化生理食塩水）で調製される。液剤は、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような調製剤を含有してもよい。あるいはタンパク質は、使用前に適当なビヒクル（例えば、無菌の発熱性物質を含まない水）で復元するための粉末型でもよい。
【０２６９】
投与のためのワクチンまたは免疫原性製剤の有効量の決定は、特に本明細書に記載の詳細な説明を考慮すれば、当業者の技術の範囲内である。
【０２７０】
有効量は、まずin vitroアッセイにより推定される。例えば当該分野で公知の技術を使用して、動物モデルで免疫応答を誘導するように用量が調製される。当業者は、本明細書に記載の結果に基づき、すべての動物種への投与を容易に最適化できるであろう。例えば免疫原性組成物として使用される時、適当な用量は、上記のように投与される時抗体応答を誘発できる組成物の量である。ワクチンとして使用される時本発明のワクチンまたは免疫原性製剤は、１〜36週間、約１〜３回投与される。好ましくは約２週間〜約４週間の間隔で１または２回投与され、以後定期的に追加免疫的ワクチン接種が行われる。個々の動物については別のプロトコールが適切なことがある。適当な用量は、上記のように投与された時、少なくとも４〜12ヶ月感染から動物を防御するのに充分な免疫応答を、免疫動物で誘導できる量のワクチン製剤である。一般にある用量中に存在する抗原の量は、宿主１kgあたり約１pg〜約100mg、典型的には約10pg〜約１mg、および好ましくは約100pg〜約１μgである。適当な用量範囲は、注入経路と患者の大きさにより変動するが、典型的には約0.1mL〜約５mLである。
【０２７１】
具体的な実施形態において本発明のウイルスおよび／またはワクチンは、開始時の単回投与量が少なくとも103 TCID50、少なくとも104 TCID50、少なくとも105 TCID50、少なくとも106 TCID50で投与される。別の具体的な実施形態において本発明のウイルスおよび／またはワクチンは多回投与される。好適な実施形態において２、４および６ヶ月齢の初期投与処方と生後２年目のはじめの追加免疫量が使用される。さらに好ましくは、少なくとも105 TCID50または少なくとも106 TCID50の各用量が、多回投与処方で投与される。ウイルスの複製速度は、臨床治験でのワクチンの用量を調整するための指標として使用することができる。例えばウイルスの複製速度を試験するためのアッセイ（例えば、増殖曲線、利用できるアッセイについてはセクション5.5.を参照）を使用して、本発明のウイルスおよび／またはワクチンの複製速度をbPIV3の複製速度と比較することができ、これは以前の研究で証明された（Clementsら、J. Clin. Microbiol. 29:1175-82(1991)；Karronら、J. Infect. Dis. 171:1107-14 (1995)；Karronら、Ped. Inf. Dis. J. 5:650-654 (1996)を参照。これらの試験は、ウシPIV3ワクチンが一般に安全であり、ヒト志願者（成人、６〜60週齢の小児、および２〜６ヶ月齢の幼児）により許容されることを示した。これらの試験で被験体は、少なくとも103 TCID50〜106 TCID50の単回投与のbPIV3を受けた。12人の小児が、１回ではなく２回の105 TCID50ワクチンを受け、好ましくない作用は無かった。bPIV3について匹敵する複製速度は、臨床治験で匹敵する用量が使用できることを示唆する。bPIV3と比較してより遅い複製速度は、より多量を使用できることを示唆する。
【０２７２】
5.6.1.1. 抗原刺激試験
このアッセイは、本発明の組換えウイルスと本発明のワクチンが動物モデル系（例えば特に限定されないがコトンラットまたはハムスター）で下気道ウイルス感染を予防する能力を、測定するのに使用される。組換えウイルスおよび／またはワクチンは、静脈内（IV）経路、筋肉内（IM）経路、または鼻内経路（IN）により投与することができる。組換えウイルスおよび／またはワクチンは、当業者に公知の任意の方法により投与することができる。このアッセイはまた、抗体の血清濃度を、抗体が結合するウイルスの肺力価の低下と相関つけるのに使用される。
【０２７３】
０日目に、動物群（例えば特に限定されないが、コトンラット（Sigmodon hispidis、平均体重100ｇ）、カニクイザル（cynomolgous macacques）（平均体重2.0kg））に、目的の組換えウイルスまたはキメラウイルスもしくはBSAを筋肉内注射、静脈内注射、もしくは鼻内経路により投与する。本発明の組換えウイルスまたはワクチンの投与の前、同時、または後に、動物を野生型ウイルスに感染させる（ここで野生型ウイルスはそれに対してワクチンが作成されるウイルスである）。ある実施形態において動物は野生型ウイルスで、本発明の組換えウイルスおよび／またはワクチンの投与の少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、１週間または１ヶ月以上、感染される。
【０２７４】
感染後コトンラットを屠殺し、肺組織を取り、肺ウイルス力価をプラーク力価測定により測定する。ウシ血清アルブミン（BSA）10mg/kgを陰性対照として使用する。抗原刺激時の血清中の抗体濃度を、サンドイッチELISAにより測定する。同様にカニクイザル（macacques）で、鼻と肺洗浄液中のウイルス力価を測定することができる。
【０２７５】
5.6.1.2. 標的集団
本発明のある実施形態において本発明の治療法および診断法は、年齢により規定される。ある実施形態において本発明の治療法および／または診断法の標的集団は、呼吸器感染症以外に疾患または障害があることが特徴である。
【０２７６】
具体的な実施形態において標的集団は、２才未満の小児を包含する。さらに具体的な実施形態において２才未満の小児は、呼吸器感染症以外の疾患を持たない。
【０２７７】
別の実施形態において標的集団は、５才を超える患者を包含する。さらに具体的な実施形態において５才を超える上記患者は、追加の疾患または障害（嚢胞性繊維症。白血病、および非ホジキンリンパ腫、または最近受けた骨髄移植もしくは腎移植を含む）に罹っている。
【０２７８】
本発明の具体的な実施形態において標的集団は、hMPV感染が宿主の免疫抑制に関連する被験体を包含する。具体的な実施形態において被験体は免疫無防備状態の個体である。
【０２７９】
ある実施形態において本発明の方法の標的集団は老人を包含する。
【０２８０】
具体的な実施形態において本発明の方法により処理される被験体は、冬にhMPVで感染させた。
【０２８１】
5.6.1.3. 臨床治験
in vitroアッセイで試験した本発明のワクチンまたはその断片および動物モデルは、正常健常成人志願者の群で、その安全性、耐性および薬物動態についてさらに評価される。志願者に、筋肉内、静脈内または肺送達系で、本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンを単回投与する。臨床施設で本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの単回投与の前少なくとも24時間、各志願者を追跡し、投与後少なくとも48時間各志願者は追跡されるであろう。次に、志願者を通院させて、投与後３、７、14、21、28、35、42、49、および56日目に追跡する。
【０２８２】
血液サンプルを、留置カテーテルまたは10mlの赤いフタのバキュテイナー試験管を使用して直接静脈穿刺により以下の間隔で採取する：(1) 本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与前；(2) 本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与中；(3) 本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与後、５分、10分、15分、20分、30分、１時間、２時間、４時間、８時間、12時間、24時間、および48時間目；および(4) 本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与後、３日、７日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、および56日目。サンプルは室温で凝固させ、遠心分離して血清を集める。
【０２８３】
患者のサンプル中の本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンに対して作成された抗体の量は、ELISAにより定量することができる。PBMCおよび肺および鼻洗浄液中のＴ細胞免疫（細胞障害性およびヘルパー応答）も追跡することができる。
【０２８４】
志願者の血清中の抗体濃度レベルは、本発明の組換えウイルスおよび／または本発明のワクチンの投与後の各採血間隔での血清レベルから、投与前血清レベル（バックグランドレベル）を引いて補正する。各志願者について薬物動態パラメータは、モデルに依存しないアプローチ（Gibaldiら編、1982, Pharmacokinetics, 第２版、マーセルデッカー（Marcel Dekker）、ニューヨーク）に従って、補正した血清抗体または抗体断片濃度から計算する。
【０２８５】
以下の例は、本発明の例示であり、決して本発明を限定するものではない。実施例で使用した細胞とウイルスは以下のように維持される：RSV A2株とウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型をベクターとしたRSVウイルス（bPIV3/hPIV3/RSV ウイルス）は、Opti-MEM（ギブコビ／アールエル（Gibco/BRL））中のVero細胞中でゲンタマイシンの存在下で増殖させた。修飾ワクシニアウイルスAnkara（MVA-T7）またはファージT7 RNAポリメラーゼを発現した鶏痘ウイルスT7（FP-T7）は、ニワトリ胚腎細胞（CPAFAS）中で増殖させた。Vero細胞、HeLa細胞およびHep-2細胞は、10％胎児牛血清（FBS）、２mM L-グルタミン、非必須アミノ酸、および抗生物質を補足したMEM（JRHバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences））中で維持した。
【実施例】
【０２８６】
6. 実施例１：キメラウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３ cDNAの構築とクローニング
bPIV3のF遺伝子とHN遺伝子をhPIV3のもので置換するために、追加の制限酵素部位を感染性bPIV3 cDNAに導入した。部位特異的突然変異誘発を使用して、5041位にユニークなNheI部位を導入し、bPIV3 cDNAのnt8529でSalI部位を導入した。修飾完全長bPIV3 cDNAをNheIとSalI制限酵素で処理し、F遺伝子とHN遺伝子を除くウイルスbPIV3配列のすべてを発現する〜14kbのDNA断片を、ゲル精製して単離した。
【０２８７】
hPIV3 F遺伝子とHN遺伝子配列を得るために、10cmのプレートのコンフルエントなVero細胞にhPIV3の株（hPIV3/Tex/12084/1983）を感染させた。37℃で３日間インキュベーション後、細胞を採取し、RNA STAT-LS50（テルテストインク（Tel-Test Inc.））を使用して総RNAを単離した。hPIV3特異的オリゴを使用して逆転写によりhPIV3ゲノムの4828位でアニーリングして、ウイルスcDNAを作成した。hPIV3 F遺伝子とHN遺伝子をTaqポリメラーゼを使用してPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅した。PCR産物をpT/A TOPOクローニングベクター（インビトロゲン（Invitrogen））にクローン化し、２つのクローン（#11と#14）からhPIV3 F遺伝子とHN遺伝子を配列決定した。配列分析は、クローン#11についてF遺伝子は正しいがHN遺伝子は異常配列を含有する；クローン#14についてHN遺伝子は正しいが、F遺伝子は異常停止コドンを含有する、ことを明らかにした。すなわち機能性hPIV3 F遺伝子とHN遺伝子を含有するプラスミドが、#11の正しいF遺伝子を#14の正しいHN遺伝子と、以下の方法で組合せることにより構築された。hPIV3プラスミド（#11と#14）をNheIとEcoRIで消化した。正しいF遺伝子を有する1.6kb断片をクローン#11から単離し、正しいHN遺伝子とプラスミド配列を含有する8.5kb断片をクローン#14から単離した。２つの断片を連結して、完全なhPIV3 F遺伝子とHN遺伝子含有プラスミドを産生した。正しい配列をDNA配列分析により確認した。最後に、非翻訳領域のHN遺伝子の3'末端に単一のヌクレオチドを付加して、「６の規則（Rule of Six）」を満足させた。単一のヌクレオチドの付加は、QuickChange突然変異誘発キット（ストラタジーン（Stratagene））を使用して行い、DNA配列決定により確認した。次に正しいhPIV3 F遺伝子とHN遺伝子DNA断片を、NheIとSalIで消化して単離し、3.5kb DNA断片をゲル精製した。
【０２８８】
上記のbPIV3配列を有する14.5kbのDNA断片と、hPIV3 F遺伝子とHN遺伝子を含有する3.5kbのDNA断片とを連結して、完全長b/h PIV3キメラcDNAを構築した（図３を参照）。広範な制限酵素マッピングにより、完全長キメラプラスミドDNAを確認した。さらにキメラ構築体のM/FとHN/L遺伝子結合部をDNA配列決定して、それぞれbPIV3とhPIV3配列ならびにNheIとSalI制限酵素部位を含有することが確認された。
【０２８９】
7. 実施例２：キメラウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたRSウイルスFまたはG cDNAの構築とクローニング
ウイルス複製に対するb/h PIV3ゲノムの１位または２位へのRSV抗原挿入の効果を調べるために、RSウイルス（RSV）F遺伝子とG遺伝子をキメラウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３ベクター（b/h PIV3ベクター）の異なる位置にクローン化した。図４を参照。
【０２９０】
ウシ／ヒト（b/h）PIV3 cDNAに外来遺伝子を導入するために、部位特異的突然変異誘発によりQuickChangeキット（ストラタジーン（Stratagene））を使用して、AvrII制限酵素部位をb/h PIV3 cDNAプラスミドに導入した（Hallerら、2000；2001、これは実施例６と同じ内容である）。以下のオリゴ 5'GAA ATC CTA AGA CCC TAG GCA TGT TGA GTC3' とその相補体を使用して、１つのAvrII部位をb/h PIV3ゲノムのヌクレオチド（nt）104に導入して４つのヌクレオチドを改変させた。この制限酵素部位を使用して、ウイルスゲノムの最初（最も3'）の位置にRSV遺伝子を挿入した。以下のオリゴ 5'CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCATGGAAGACAATG3' とその相補体を使用して、別のAvrII部位をN-P遺伝子間領域にnt 1774で導入して２つのヌクレオチドを改変させた。この制限部位を使用して、b/h PIV3のN遺伝子とP遺伝子の間の第２の位置でRSV遺伝子を挿入した（図４）。nt 104と1774にAvrII部位を有する完全長b/h PIV3 cDNAを、逆遺伝学によりウイルスを回収してその機能について試験した。
【０２９１】
RSV Gカセットの構築（N-P遺伝子停止／開始）：b/h PIV3 cDNAをPCR鋳型として使用して、bPIV3 N-P遺伝子間領域ならびにRSV G遺伝子の3'末端配列を含有するDNA断片を作成した。この断片は以下のオリゴを使用してPCRにより作成した：5'CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACAAAGAGATGACCACTATCAC3'と5'CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGTTGTGG3'。次にこの断片を使用して重複PCRを行い、bPIV3 N-P遺伝子間領域をRSV G遺伝子に付加した。第２のPCR反応で、RSV G遺伝子とF遺伝子を含有するプラスミドをDNA鋳型として使用し、オリゴ5'CAGCGGATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3'と上記の短いPCR断片から作成したオリゴをプライマーとして使用した。bPIV3 N-P遺伝子間領域に連結したRSV G遺伝子と、隣接するAvrII制限酵素部位とを含有する生じるPCR断片を、pGEM3中にクローン化した。RSV G遺伝子を配列決定して、完全な読みとり枠と予測されたアミノ酸配列の存在を確認した。RSV G遺伝子を有するDNA断片を、AvrII制限酵素部位を使用して第１のまたは第２の位置に、AvrIIで線状化したbPIV3（1-5 bPIV3）ゲノムの最初の5200ヌクレオチドのみを有するサブクローン中に挿入した。本例と他の例において1-5 bPIV3は、ウシPIV3ゲノムのヌクレオチド１〜5196（または5200）を意味する。この位置にBstB1部位がある。
【０２９２】
RSV Fカセットの構築（N-P遺伝子開始／停止）：RSV F遺伝子の5'末端と3'末端にAvrII部位を付加したオリゴを使用して、完全長bPIV3/RSV F+G cDNAプラスミドからPCRによりRSV F遺伝子断片を単離し、nt 1774にAvrII部位を有する1-5 bPIV3プラスミド中に導入し、これをAvrIIで線状化した。1-5 bPIV3/RSV G2を鋳型として使用してPCRにより、bPIV3 N-P遺伝子間領域を単離した。オリゴ5'GACGCGTCGACCACAAAGAGATGACCACTATCACC3'とbPIV3 F遺伝子でアニーリングするオリゴを使用して、bPIV3 N-P遺伝子間領域、AvrII部位、およびnt 5200までのbPIV3配列を含有するPCR断片を作成した。PCR断片をSalIとNheIで消化し、RSV F遺伝子を有する1-5 bPIV3プラスミドに２位で付加し、これをSalIとNheIで処理した。N-P遺伝子間領域を含有するRSV F遺伝子を１位に導入するために、1.8kbのRSV FカセットをAvrIIを使用して切り出し、nt 104にAvrII部位を含有する1-5 bPIV3中に連結し、これをAvrIIで線状化した。
【０２９３】
短い遺伝子間領域を有するRSV Fカセットの構築（N停止/N開始）：鋳型として1-5 bPIV3/RSV F2、オリゴ5'GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAACCCTAGGACTGTA3'、およびAvrII制限酵素部位を含むRSV F遺伝子の5'末端の上流でアニーリングするオリゴを使用してPCR反応により、短いN-N遺伝子間領域を有するRSV F遺伝子を作成した。RSV F遺伝子と短いN-N遺伝子間領域を含有するPCR産物をAvrIIで消化し、1-5 bPIV3 nt 104に導入し、これをAvrIIで線状化した。
【０２９４】
制限酵素マッピングにより正しい配向を確認後、最初の位置にRSV遺伝子を有するプラスミドをSphIとBssHIIで消化し、4kbの（1-5 bPIV3/RSV G1）または4.8kbの（1-5 bPIV3/RSV F1）DNA断片を単離した。第２のクローニング工程で、b/h PIV3ゲノムの残りをSphI-BssHII 15.1kbのDNA断片として付加して、完全長cDNAを得た。第２の位置にRSV遺伝子を有するbPIV3サブクローンをSphIとヒトのNheIで切断し、5.8kbの（bPIV3/RSV G2）と6.5kbの（bPIV3/RSV F2）DNA断片を単離した。第２のクローニング工程で、b/h PIV3ゲノムの残りを14kbの大きさのNheI-SphI DNA断片として付加した。完全長b/h PIV3/RSVプラスミドをSTBL-2細胞（ギブコビーアールエル（Gibco/BRL））で増殖させ、これは高収率の完全長ウイルスcDNAプラスミドを与えた。
【０２９５】
8. 実施例３：ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたRSウイルスFまたはGは、mRNA産生とタンパク質発現ならびにin vitroでのウイルス複製について位置効果を示した
実施例２の構築体中のRSV F遺伝子またはG遺伝子の有効な発現を確認するために、およびPIV3ゲノム中の遺伝子挿入の位置効果を調べるために、３つの実験を行った。
【０２９６】
まず、キメラウイルスによるRSVタンパク質発現を証明するために、キメラウイルス感染細胞溶解物のウェスタンブロットを行い、RSV特異的抗血清とプローブ結合させた。図5Aを参照されたい。ウェスタンブロットは以下のように行った：キメラウイルスを使用して、（70〜80％）サブコンフルエントなVero細胞をMOI 0.1または1.0で感染させた。感染の48時間後、培地上層を除去し、感染した単層を１mlのPBSで洗浄した。次に細胞を、0.05％ b−メルカプトエタノール（シグマ（Sigma））を含有する400mlのリームリ（Laemmli）バッファー（バイオラッド（Bio-Rad））で溶解した。15mlの各サンプルを12％トリス塩酸Ready Gel（バイオラッド（Bio-Rad））で分離し、セミドライトランスファーセル（バイオラッド（Bio-Rad））を使用してナイロン膜に移した。ナイロン膜を、0.5％(v/v)ツイーン20（シグマ（Sigma））を含有するPBS［pH7.6］（PBST）で洗浄し、５％(w/v)ドライミルクを含有するPBST（PGST-M）で室温で20〜30分ブロッキングした。膜を、PBST-M中の1:1000希釈のRSV Fモノクローナル抗体（WHO 1269、1200、1153、1112、1243、1107）の混合物、またはPBST-M中の1:2000希釈のRSV G 10181ポリクローナル抗体（オルビゲン（Orbigen））と、室温で１時間インキュベートした。PBSTで４回洗浄後、膜をPBST-M中の1:2000希釈の２次西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（ダコ（Dako））と室温で１時間インキュベートした。膜をPBSTで４回洗浄し、化学発光基質（アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia））を使用して発色させ、Biomax Light Film（コダック（Kodak））に露光してタンパク質バンドを視覚化した。
【０２９７】
Vero細胞中のb/h RSV F1* N-Nの複製効率の低下（図5C、下記参照）に一致して、感染後48時間に検出されたRSV F1 の量は、b/h PIV3/RSV F2または野生型RSV A2感染細胞中に存在するものより約10倍少なかった（レーン２、３および４を比較、図5A）。F1 断片を示す50kDaバンドが、キメラウイルスならびに野生型RSVで感染した細胞で検出された。しかし野生型RSVと比較して、キメラウイルスの感染細胞溶解物中では20kDaのF断片のより多くの蓄積があった。より大きなMOI 1.0でのb/h PIV3/RSV F1* N-N感染を繰り返すと（図5A、レーン１）、b/h RSV F1感染した細胞中のF1 断片は、感染48時間後に野生型RSVレベルまで蓄積した。b/h PIV3/RSV F1またはb/h PIV3/RSV F2感染細胞中の50kDaと20kDaのF1 断片の相対量は、約１：５であった。キメラウイルスで感染した細胞ではF0 は検出されず、野生型RSV感染でも観察されたようにb/h PIV3/RSV F1およびb/h PIV3/RSV F2感染中に、F0 前駆体が効率的に処理されたことを示した。
【０２９８】
b/h PIV3/RSV G1、b/h PIV3/RSV G2および野生型RSVで感染した細胞中のRSV Gの相対発現を図5Aに示す。それぞれ約50kDaと90kDaで泳動した未成熟型とグリコシル化型のRSV Gが検出された。b/h PIV3/RSV G1で感染した細胞は、野生型RSVで感染した細胞で見られるものと同様のRSV G発現レベルを示した（レーン１と３、図5A）。しかしb/h PIV3/RSV G2で感染した細胞では、RSV Gの蓄積は野生型RSVで感染した細胞中に存在するものより約２〜３倍多かった（レーン２と３、図5A）。まとめるとこれらのデータは、キメラb/h PIV3/RSVが１または２位でRSVタンパク質を効率的に発現することを示した。しかし２位にRSV遺伝子を有するウイルスはより高レベルのRSVタンパク質を発現した。
【０２９９】
次にノーザンブロット解析は、mRNA転写がウェスタンブロットにより示されたタンパク質発現の結果と相関することを示した（図5Bを参照）。ノーザンブロットは以下のように行った：ウイルス感染細胞からTrizol LS（ライフテクノロジーズ（Life Technologies））を使用して総細胞RNAを調製した。１回のフェニル−クロロホルム抽出とエタノールによる沈殿により、RNAをさらに精製した。RNAペレットをジエチルピロカーボネート処理した水に再懸濁し、−80℃に保存した。等量の総RNAを、１％ホルムアルデヒド含有１％アガロースゲルで分離し、Turboblotter装置（シュレイチャー・アンド・シュエル（Schleicher & Schuell））を使用してナイロン膜（アマシャム・ファルマシア・バイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））に移した。ブロットを、DIG RNA標識キット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals））を使用してin vitro転写により合成したジゴキシゲニン（DIG）-UTP-標識リボプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションはExpress hyb溶液（クロンテク（Clontech））中で68℃で12時間行った。ブロットを２×SSC（１×SSCは0.015Ｍ NaClと0.015Ｍクエン酸ナトリウムを含有した）−0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で68℃で２回洗浄し、次に0.5×SSC−0.1％SDSで１回洗浄し、最後に0.1×SSC−0.1％SDSで洗浄した。ハイブリダイズしたプローブからのシグナルをDIG-発光検出キット（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals））を使用して検出し、Biomax Light Film（コダック（Kodak））に露光して視覚化した。
【０３００】
b/h PIV3/RSV F1* N-N、b/h PIV3/RSV F2、b/h PIV3/RSV G1およびb/h PIV3/RSV G2のノーザン解析は、RSV FまたはRSV GのウイルスmRNAレベルが、観察されたRSVタンパク質レベルとよく相関することを示した（図5B）。RSV F mRNAの最も低いレベルは、b/h PIV3/RSV F1* N-Nについて観察され、これはまた、産生されるRSV Fタンパク質が最も少なかった。b/h PIV3/RSV G1はより少ないRSV G mRNAを産生し、b/h PIV3/RSV G2で観察するものより低いRSV Gタンパク質レベルを与えた。
【０３０１】
最後に異なるウイルス（１位または２位にRSV FまたはRSV G遺伝子を有する）の増殖は、タンパク質発現とRNA転写の結果と相関する。図5Cに示す増殖曲線は以下のように得られた：Vero細胞を90％コンフルエンスになるまで増殖させ、MOI 0.01または0.1でb/h PIV3、b/h PIV3/RSV F1、b/h PIV3/RSV G1、b/h PIV3/RSV F2、およびb/h PIV3/RSV G2で感染させた。感染した単層を37℃でインキュベートした。感染の0、24、48、72、96および120時間後、細胞と培地を一緒に採取し、−70℃で保存した。各時点の採取物のウイルス力価を、TCID50またはVero細胞中のプラークアッセイにより測定した。TCID50アッセイは、37℃で６日間インキュベーション後のCPEについて視覚的に調べ、プラークアッセイは、５日間のインキュベーション後RSVポリクローナル抗血清で免疫染色して定量した。
【０３０２】
Vero細胞中MOI 0.01で、第１位のRSV GまたはRSV F遺伝子を有するキメラウイルス（b/h PIV3/RSV G1とb/h PIV3/RSV F1* N-N）は、より低速で複製し、第２位にRSV遺伝子を含有するウイルスより長い誘導期を示した。感染後96時間のb/h PIV3/RSV F1* N-Nとb/h PIV3/RSV G1のピーク力価は、それぞれ106.7と105.5 TCID50/mlであった（図5C）。これに対してb/h PIV3/RSV F2とb/h PIV3/RSV G2のピーク力価は、感染96時間後にそれぞれ108.0と107.4であった（図5C）。b/h PIV3対照ウイルスは108.0 TCID50/mlのピーク力価を示した（図5C）。b/h PIV3/RSV F2は、b/h PIV3/RSV F1* N-Nより1.3 log10高い力価を与えた。b/h PIV3/RSV G2は、b/h PIV3/RSV G1より1.9 log10高い力価を与えた。結果は、１位にRSV遺伝子を有するキメラウイルスが２位にRSV遺伝子を含有するキメラウイルスと比較して、in vitroでの複製の開始が遅れることを示した。
【０３０３】
高力価のb/h PIV3/RSV F1* N-Nとb/h PIV3/RSV G1が達成されるかどうかを調べるために、増殖曲線をより高いMOI 0.1で繰り返した。MOI 0.1では、b/h PIV3/RSV F1* N-Nとb/h PIV3/RSV G1のピーク力価は0.5〜1.3 log10上昇した（データは示していない）。これらのウイルスの誘導期は短縮し、増殖サイクル中に早くピーク力価が達成された。
【０３０４】
9. 実施例４：ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３ゲノムへのeGFP挿入のウイルス複製への位置効果
ウシ／ヒトPIV3ベクター骨格への遺伝子挿入の効果を、PIV3のすべての遺伝子の間に連続的にeGFP遺伝子を導入し、ウイルス複製とeGFP発現への作用を観察することにより調べた（図６）。この種のアッセイは、特異的比率のウイルスmRNAを与えるパラミクソウイルスについて観察された転写勾配の重要性を調べる。外来遺伝子の挿入はこれらの比率を撹乱し、ウイルス複製に影響を与える異なる量のウイルスタンパク質が合成される。eGFP遺伝子は、ウイルス粒子膜中に取り込まれず、従ってウイルスプロセス（例えば、パッケージング、発芽、侵入など）を妨害しないため、このアッセイにeGFPが選択された。eGFPをb/h PIV3ゲノムの４つの位置に挿入し、そのうちの３つをeGFP発現とウイルス複製について性状解析した。eGFP遺伝子カセットをbPIV3 N-P遺伝子間領域に連結した。b/h GFP1はb/h PIV3ゲノムの3'に最も近い位置にeGFP遺伝子カセットを有した。b/h PIV3/GFP2は、b/h PIV3ゲノムのN遺伝子とP遺伝子の間にeGFP遺伝子カセットを含有した。b/h PIV3/GFP3はPとMの間に位置し、b/h PIV3/GFP4は、b/h PIV3のMとFの間にeGFP遺伝子を有した（図６）。
【０３０５】
eGFP遺伝子カセットの構築：eGFP遺伝子の鋳型は市販されており、例えばこれは、BDバイサイエンシーズ（BD Biosciences）（pIRES2-EGFP）またはクロンテク（Clontech）（pEGFP-N1）から購入できる。Hoffmannら、Virology 267:310-317 (2000)を参照されたい。eGFP遺伝子はPCRにより単離され、重複PCR法を使用して以下のオリゴを使用してbPIV3 N-P遺伝子間領域を付加した：5'ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3'、5'GGACGAGCTGTACAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCATG3'、および5'CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3'。eGFPカセットをpCR2.1中に挿入し、配列決定し、６の規則（Rule of Six）への固執を確認した。eGFPカセットをAvrIIで消化し、ゲル精製し、後述するようにb/h PIV3の１、２、３および４位に挿入した。
【０３０６】
１位と２位にeGFP遺伝子を有する完全長cDNAの作成：nt １〜5200にbPIV3配列を含有しnt 104（１位）またはnt 1774（２位）にAvrII制限酵素部位を含有する1-5 bPIV3プラスミド中へ、eGFP遺伝子カセットを挿入した。制限酵素マッピングにより正しい配向を確認後、１位にeGFP遺伝子を有するプラスミドをSphIとBssHIIで消化し、4kb（1-5 eGFP1）DNA断片を単離した。次にb/h PIV3ゲノムの残りをSphI-BssHII 15.1kb DNA断片として付加し、完全長cDNAを得た。２位にeGFPを含む完全長cDNAの作成のために、２位にeGFP遺伝子を有するbPIV3サブクローンをSphIとNheIで切断し、5.8kb （1-5 eGFP2）DNA断片を単離した。次にb/h PIV3ゲノムの残りを14kbの大きさのNheI-SphI DNA断片として付加した。完全長キメラb/h PIV3/eGFPプラスミドをSTBL-2細胞（ギブコビーアールエル（Gibco/BRL））で増殖させると、これは高収率の完全長ウイルスcDNAプラスミドを与えた。
【０３０７】
３位と４位にeGFP遺伝子を有する完全長cDNAの作成：b/h PIV3ゲノムの３位へeGFPカセットを挿入するために、bPIV3のnt 1-5200を含有するサブクローンのP-M遺伝子間領域中のnt 3730にAvrII制限酵素部位を導入し、２つのヌクレオチドを改変した。QuickChange PCR反応で以下のオリゴとその相補体を使用してAvrII部位を導入した：5'GGACTAATCAATCCTAGGAAACAATGAGCATCACC3'。eGFPカセットをAvrIIで消化し、nt 3730にAvrII部位を有する、AvrIIで線状化した1-5 bPIV3サブクローン中に連結した。SphI〜NheIの5.5kbのDNA断片を、GFP含有サブクローンから単離し、SphIとNheIで消化したb/h PIV3 cDNA中に導入して完全長プラスミドを得た。b/h PIV3ゲノムの４位にeGFP遺伝子カセットを付加するために、nt 1-8500からb/h PIV3配列を含有するサブクローンを作成した。このサブクローンをNheI（nt 5042）で線状化し、適合性のあるAvrII末端を含有するeGFPカセットを挿入した。次にeGFPカセットを有するサブクローンをSphIとXhoIで消化し、7.1kbのDNA断片を単離した。b/h PIV3プラスミドをSphIとXhoIで処理し、11kb 断片を得た。これらの２つのDNA断片を連結してb/h PIV3/GFP4を作成した。
【０３０８】
b/h PIV3/GFP1、2、および3により産生されたeGFPの量を２つの方法で評価した。第１に、Vero細胞をb/h PIV3 GFP1、2、および3でMOI 0.1と0.01で20時間感染させて産生した緑の細胞の量を、蛍光顕微鏡を使用して測定した（図7A）。b/h PIV3/GFP3は、b/h PIV3/GFP1や2よりも顕著に少ない緑の細胞を産生した。
【０３０９】
第２に、感染細胞についてウェスタン解析を行い、ブロットをGFP MAbならびにPIV3 PAbとプローブ結合させた。b/h PIV3/GFP2が劇的に少ないeGFPタンパク質を産生するという最初の観察結果が確認された（図7B）。b/h PIV3 GFP1とGFP2は、同じような量のeGFPタンパク質を産生した。ウェスタンブロット法は、PIV3抗体とプローブ結合することにより、同じ用量をのせることを制御した（図7B）。興味深いことにすべての３つのウイルスは同様の量のPIV3タンパク質を産生した（HNタンパク質が最も顕著なバンドであった）。これらの結果は、b/h PIV3/GFP3は、１位と２位に比較して３位でより少ないGFP mRNAを転写することを示唆した。このデータは、パラミクソウイルス中のウイルスmRNAの転写勾配の存在を示した。PIV3 HNタンパク質の産生レベルは、eGFP遺伝子挿入により影響を受けなかった（図7B）。
【０３１０】
GFP遺伝子挿入が、b/h PIV3/GFP1、2、および3のウイルス複製の動態に影響を与えるかどうかを調べるために、Vero細胞中の多サイクル増殖曲線を作成した（図7C）。増殖曲線は、b/h PIV3/GFP1が、b/h PIV3/GFP2またはGFP3より、感染後24時間および48時間のウイルス複製の開始が遅れることを示した。しかし、得られた最後のピーク力価はすべての３つのウイルスで同様であった。b/h PIV3/GFP2とGFP3の複製の動態はほとんど同一であった（図7C）。興味深いことに、ウイルスmRNAの改変比は、ウイルス複製に大きな影響を与えないようであった。
【０３１１】
10. 実施例５：異なる遺伝子間領域を有するキメラウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたRSウイルスの構築とクローニング
３つの異なる構築体を使用して、タンパク質発現とウイルス複製に対する遺伝子間領域（各mRNAの間のヌクレオチド、例えばF遺伝子とN遺伝子の間のヌクレオチド）の作用を調べた。図８を参照されたい。第１の構築体は１位のb/h PIV3をベクターとしたRSV F1* N-Nで、これはより短いbPIV N遺伝子停止／N遺伝子開始配列を有した（図４のRSV F1* N-N）；第２の構築体は１位のb/h PIV3をベクターとしたRSV Fであった（図４のRSV F2）；そして最後の１つは１位のb/h PIV3をベクターとしたRSVであった（図４のRSV F1）。すべての３つの構築体は、セクション７の実施例２に記載のクローニング方策に従って作成した。
【０３１２】
２つのカセットの間の最も顕著な差は、b/h PIV3/RSV F1* N-N中のN遺伝子開始配列とN翻訳開始コドンの間の距離であり、これはわずかに10ntの長さである。これに対して、b/h PIV3/RSV F2ではこの距離は86ntである。他の差は、b/h PIV3/RSV F2ではP遺伝子開始配列が使用されるが、b/h PIV3/RSV F1* N-NではN遺伝子開始配列が使用されることである。ウイルス転写単位の転写遺伝子開始と翻訳開始の距離がウイルス複製に影響を与えるかどうかを調べるために、b/h PIV3/RSV F2で使用されたものと同じRSV F遺伝子カセットを含有するb/h PIV3/RSV F1構築体を作成した。
【０３１３】
11. 実施例６：RSウイルス遺伝子の下流の遺伝子間領域の長さおよび／または性質はウイルス複製に影響を与える
実施例５の３つの構築体を以下の実験で使用して、タンパク質発現とウイルス複製に対する遺伝子間領域の作用を調べた。図９を参照されたい。
【０３１４】
まず、b/h PIV3/RSV F1、b/h PIV3/RSV F1* N-N、およびb/h PIV3/RSV F2のRSV Fタンパク質発現を、Vero細胞でMOI 0.1で感染後の24時間と48時間にウェスタンブロットにより比較した。ウェスタンブロットは以下のように行った：キメラウイルスを使用して、（70〜80％）サブコンフルエントなVero細胞をMOI 0.1で感染させた。感染の24時間後と48時間後に培地上層を除去し、感染した単層を１mlのPBSで１回洗浄した。次に細胞を、0.05％ b-メルカプトエタノール（シグマ（Sigma））を含有する400mlのリームリ（Laemmli）バッファー（バイオラッド（Bio-Rad））で溶解した。15mlの各サンプルを12％トリス塩酸Ready Gel（バイオラッド（Bio-Rad））で分離し、セミドライトランスファーセル（バイオラッド（Bio-Rad））を使用してナイロン膜に移した。ナイロン膜を、0.5％(v/v)ツイーン20（シグマ（Sigma））を含有するPBS（pH7.6）（PBST）で洗浄し、５％(w/w)ドライミルクを含有するPBST（PGST-M）で室温で20〜30分ブロッキングした。膜を、PBST-M中の1:1000希釈のRSV Fモノクローナル抗体（WHO 1269、1200、1153、1112、1243、1107）の混合物と、室温で１時間インキュベートした。PBSTで４回洗浄後、膜をPBST-M中の1:2000希釈の２次西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（ダコ（Dako））と室温で１時間インキュベートした。膜をPBSTで４回洗浄し、化学発光基質（アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia））を使用して発色させ、Biomax Light Film（コダック（Kodak））に露光してタンパク質バンドを視覚化した。
【０３１５】
b/h PIV3/RSV F1は、感染後24時間および48時間にb/h PIV3/RSV F2のレベルに近いRSV F1タンパク質レベルを発現したが、b/h PIV3/RSV F1* N-Nよりははるかに高かった。従って、ゲノム開始成分と翻訳開始コドンの間の間隔は、ウイルス複製にとって決定的に重要かも知れない。N遺伝子開始配列をP遺伝子開始配列に変化させたが、この変化は、単一のヌクレオチドの変化を引き起こしたのみであった。これらの因子のいずれかが、RSV Fタンパク質発現表現型をレスキューすることに関与しているかも知れない。
【０３１６】
次に、Vero細胞中でMOI 0.1でb/h PIV3/RSV F1、b/h PIV3/RSV F1* N-N、およびb/h PIV3/RSV F2のウイルス複製の動態を比較するために多サイクル増殖曲線を作成したが、これは以下のように行った：Vero細胞を90％コンフルエンスまで増殖させ、MOI 0.1でb/h PIV3、b/h PIV3/RSV F1* N-N、b/h PIV3/RSV F1、およびb/h PIV3/RSV F2で感染させた。感染した単層を37℃でインキュベートした。感染後０、24、48、72、および96時間に、細胞と培地を一緒に採取し、−70℃で保存した。各時点の採取物のウイルス力価を、Vero細胞中のプラークアッセイにより測定した。プラークアッセイは、５日間のインキュベーション後RSVポリクローナル抗血清で免疫染色して定量した。
【０３１７】
図9Bに示したように、b/h PIV3/RSV F1* N-Nの複製の開始は遅れ、ピーク力価はb/h PIV3/RSV F2のものより低かった。これに対してb/h PIV3/RSV F1は、b/h PIV3/GFP2で観察されたものととほとんど同一の増殖曲線を示した。
【０３１８】
12. 実施例７：３価ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとした構築体のクローニング
以下の例は、単回の生きた弱毒化ウイルスを使用して、RSV、hMPVおよびhPIV3が引き起こす疾患から小児を防御するための、hPIV3、RSV F、およびhMPV Fの表面糖タンパク質（FとHN）を有する３価ワクチンの作成に関する。これらの３価ウイルスは逆遺伝学により回収された。
【０３１９】
２つのウイルスゲノムの構築（それぞれが２つの追加の異種配列挿入を有するキメラb/h PIV3骨格を有し、１つの異種ヌクレオチド配列はメタニューモウイルスF遺伝子から得られ、他の異種ヌクレオチド配列はRSウイルスF遺伝子から得られる）を以下のように行った（図10参照）：プラスミドb/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/hMPV F2をSphIとNheIで消化し、6.5kbの断片を単離した。b/h PIV3/RSV F1またはb/h PIV3/hMPV F1の完全長cDNAをSphIとNheIで消化し、14.8kbのDNA断片を単離し、b/h PIV3/RSV F2またはb/h PIV3/hMPV F2から得られる6.5kbのDNA断片に連結して、完全長ウイルスcDNAを作成した。
【０３２０】
上記構築体を有するウイルスをVero細胞中で増幅した。本明細書に記載のように遺伝子操作したウイルスは、パラインフルエンザウイルス感染、メタニューモウイルス感染、およびRSウイルス感染に対する３価ワクチンとして使用することができる。
【０３２１】
13. 実施例８：２つのRSウイルスのウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３ベクターへのクローニング
キメラウイルスにより多くのRSVタンパク質が産生されると、免疫原性が改善されるかどうかを調べるために、RSV F遺伝子の２つのコピーを有するキメラウイルスを設計した。このウイルスは逆遺伝学によりレスキューされ、生物学的にクローン化され、Vero細胞で増幅されて、１×106 pfu/mlの力価を有するウイルスストックを与えた。このウイルスb/h PIV3/RSV F1F2を使用して、ハムスターでのウイルス増殖動態、RSV Fタンパク質産生、および複製と免疫原性について評価することができる。
【０３２２】
構築体を以下のように作成した（図11を参照）：1-5 RSV F2プラスミドをSphIとNheIで消化し、6,5kbの断片を単離した。b/h PIV3/RSV F1の完全長cDNAをSphIとNheIで消化し、14.8kbのDNA断片を単離し、1-5 b/h PIV3/RSV F2から得られた6.5kbのDNA断片に連結して、完全長ウイルスcDNAを作成した。
【０３２３】
14. 実施例９：ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたヒトメタニューモウイルスF cDNAの構築とクローニング
ヒトメタニューモウイルス（hMPV）のF遺伝子を、b/h PIV3ゲノムの１位と２位に挿入した（図２）。hMPV F遺伝子カセットは、bPIV3 N-P遺伝子間領域を有した。hMPV F遺伝子プラスミド（pRF515）を使用し、hMPV F遺伝子中の単一のヌクレオチド変異を修正して（すなわち、ヌクレオチド3352をCからT（野生型）に修正した）、pRF515-M4を作成した。重複PCRを使用して、bPIV N-P遺伝子間領域をhMPV F遺伝子の3'末端に付加した。hMPV Fについて重複PCRオリゴは、5'GGCTTCATACCACATAATTAGAAAAATAGCA CCTAATCATGTTCTTACAATGGTCGACC3'あった。このクローニング工程の間、オリゴは、AvrII制限酵素部位を含有したPCR反応中のhMPV F遺伝子の5'末端（5'GCAGCCTAGGCCGCAATAACAATGTCTTGGAAAGTGGTGATC3'）と3'末端（5'CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3'）で使用した。QuickChange突然変異誘発キットと以下のオリゴ（5'CCTAGGCCGCAATAGACAATGTCTTGG3'、5'CCAAGACATTGTCTATTGCGGCCTAGG3'）を使用して、hMPV F遺伝子カセットを６の規則に一致するようにした。b/h PIV3/eGFP1とeGFP2について、セクション９、実施例４（前述）に記載したものと同じように完全長b/h PIV3/hMPV F1（１位）とF2（２位）cDNAプラスミドを作成した。
【０３２４】
15. 実施例10：ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたヒトメタニューモウイルスFの免疫沈降と複製アッセイ
b/h PIV3をベクターとしたヒトメタニューモウイルスFで２位（hMPV F2）でFタンパク質が発現されたことを確認するために、モルモットまたはヒト抗血清を使用してhMPV Fタンパク質を免疫沈降させた（図13Aを参照）。b/h PIV3により発現されたhMPV Fタンパク質の免疫沈降のために、Vero細胞をb/h PIV3またはb/h PIV3/hMPV F2でMOI 0.1または0.05で感染させた。感染の24時間後、細胞をシステインとメチオニンの無いDME（ICN）で１回洗浄し、同じ培地で30分インキュベートした。培地を除去し、システインとメチオニンを含まない100μCiの[35S]-Pro-Mix（アマシャム（Amersham））を含有する0.5mlのDMEを細胞に加えた。感染した細胞を35S-アイソトープの存在下37℃で５時間インキュベートした。培地を除去し、感染した細胞をプロテアーゼインヒビターを含有する0.3M RIPAバッファーで溶解させた。細胞溶解物をhMPV モルモットまたはヒトポリクローナル抗血清でインキュベートし、IgG-アガロース（シグマ（Sigma））に結合させた。0.5M RIPAバッファーで３回洗浄後、サンプルを10％タンパク質ゲルで分画した。ゲルを乾燥させ、Ｘ線フィルムに暴露させた。
【０３２５】
b/h PIV3/hMPV F2によるhMPV Fタンパク質の発現を、gpとヒト抗hMPV抗血清を使用して免疫沈降により証明した（図13A）。興味深いことにb/h PIV3/hMPV F2の溶解物中に、約80kDaで泳動する特異的バンドが観察された。このサイズはF前駆体タンパク質F0に対応した。b/h PIV3とモック対照レーンには、異なるサイズの非特異的バンドも観察された（図13）。このデータは、b/h PIV3/hMPV F2がhMPV Fタンパク質を発現することを示唆した。しかし、利用できるhMPV抗体試薬は限定されており、これらの抗血清はhMPV Fタンパク質の前駆体とのみ相互作用する。切断されたF1が不安定であり、従ってこの方法を使用しては容易に視覚化できないのかも知れない。
【０３２６】
b/h PIV3/hMPV F2のウイルス複製の動態を測定し、MOI 0.1のVero細胞中のb/h PIV3とb/h PIV3/RSV F2について観察されたものと比較するために、増殖曲線を作成した（図13B）。データは、b/h PIV3/hMPV F2がb/h PIV3/RSV F2と比較して、感染24時間後の複製開始の遅延を示すことを証明した。しかし感染の48時間後およびそれ以降は、複製の差は観察されなかった。
【０３２７】
また、b/h PIV3/hMPV F1のウイルス複製の動態を測定し、MOI 0.1のVero細胞中のb/h PIV3/RSV F2とb/h PIV3について観察されたものと比較するために、増殖曲線を作成した（図13C）。データは、b/h PIV/hMPV F1がb/h PIV3/hMPV F2またはb/h PIV3と比較して、複製開始の遅延と低いピーク力価を示すことを証明した。b/h hMPV F1のプラークサイズもまた、b/h hMPV F2と比較して小さかった。
【０３２８】
キメラウイルスb/h PIV3/hMPV F1とF2もまた、シリアンゴールデンハムスター中で感染し複製する能力が評価された（表５）。結果は、ハムスターの鼻甲介と肺中でb/h PIV3/hMPV F1とF2が、b/h PIV3について観察されたレベルまで複製することを示した。各hMPVは、ハムスターの上気道および下気道中で5.3および3.6 log10 TCID50/g 組織の力価まで複製した。これらのデータは、b/h PIV3/hMPV F1とF2が、ハムスターの気道中で効率的に感染かつ複製することを示しており、こうしてハムスターはhMPVの免疫原性を測定するための適当な小動物モデルであり、この動物モデルを使用してhMPVワクチン候補を評価することができることを示した。
【表５】
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【０３２９】
16. 実施例11：可溶性RSウイルスF遺伝子構築体のクローニング
可溶性RSV F遺伝子（膜貫通ドメインとサイトゾルドメインが欠如したRSV F遺伝子）の単一のコピーを含有する構築体も作成した（図14）。この構築体を使用して免疫原性について試験することができる。この利点は、可溶性RSV Fがウイルス粒子膜中に取り込まれないことであろう。従ってこのウイルスは、ウイルス向性が変化しないと予測されるため、より安全なキメラウイルスと見なされる。b/h PIV3/sol RSV FのcDNAプラスミドは逆遺伝学によりレスキューすることができる。
【０３３０】
プラスミド1-5/RSV F2（前記）をPCRのDNA鋳型として使用した。オリゴRSV f.2（5'GCTGTAACAGAATTGCAGTTGC3'）（これは、RSVのnt 5946でアニーリングする）とオリゴ5'CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATTAGGTGCTATTTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3'を使用して、RSV Fの膜貫通ドメインと細胞質ドメインを除去し、150ヌクレオチドを欠失させた。得られたPCR断片をHpaIとSalIで消化し、HpaIとSalIで処理した1-5 RSV F2中に導入して1-5 bPIV3/sol RSV Fを得た。このプラスミドをSphIとNheIで消化し、得られた断片を、SphIとNheIで消化したb/h PIV3 cDNAに導入して完全長cDNAを作成した。
【０３３１】
17. 実施例12：ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたヒトメタニューモウイルスFで感染した細胞中のヒトメタニューモウイルスFの発現
b/h 104 hMPV Fウイルスストックを連続10倍希釈し、これを使用してサブコンフルエントなVero細胞を感染させた。感染細胞にゲンタマイシン含有optiMEM培地を重層し、35℃で５日間インキュベートした。細胞を100％メタノールで固定し、1:1000希釈の抗hMPV001モルモット血清、次に1:1000希釈の抗モルモットHRP結合抗体で免疫染色した。hMPV Fの発現を、AEC基質システム（ダコ社（DAKO corporation））の存在下で特異的発色により視覚化した。図15Aを参照されたい。
【０３３２】
b/h NP-O hMPV Fウイルスストックを連続10倍希釈し、これを使用してサブコンフルエントなVero細胞を感染させた。感染細胞にペニシリン／ストレプトマイシン、L-グルタミンおよび胎児牛血清を含有する１×L15/MEM培地を補足したEMEM/L-15培地（JRHバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）；レネクサ（Lenexa）、カンザス州）中の１％メチルセルロースを重層し、35℃で５日間インキュベートし、100％メタノールで固定し、1:1000希釈の抗hMPV001モルモット血清、次に1:1000希釈の抗モルモットHRP結合抗体で免疫染色した（図15Bを参照）。hMPV001モルモット血清はhMPV001タンパク質に特異的であり、b/h PIV3タンパク質には結合しない。
【０３３３】
18. 実施例13：Hela細胞とVero細胞中のキメラウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型ウイルスのレスキュー
bPIV3レスキューと同様の方法を使用して、キメラb/h PIV3ウイルスのレスキューを行った。逆遺伝学によるb/h PIV3キメラウイルスのレスキューを、LipofecTACE（ギブコビーアールエル（Gibco/BRL））を使用してHeLa細胞で行った。80％コンフルエントなHeLa細胞、Hep-2細胞、またはVero細胞を、MVAでMOI ４で感染させた。感染の１時間後完全長抗ゲノムb/h PIV3 cDNA（４μg）をNP（0.4μg）、P（0.4μg）およびL/pCITE（0.2μg）発現プラスミドとともに、HeLa細胞またはVero細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、細胞と細胞上清を採取（P0）し、１回の凍結−融解サイクルを行った。次に得られた細胞溶解物を使用して、1-ベータ-D-アラビノフラノシルシトシン（araC）（ワクシニアウイルス複製のインヒビター）の存在下で、新鮮なVero細胞単層を感染させてP1ウイルスストックを作成した。これらのプレートから上清と細胞を採取し、１回凍結−融解し、bPIV3ウイルス粒子の存在を、PIV3特異的抗血清を使用するウイルスプラークの免疫染色により測定した。P1採取物の細胞溶解物によりVero細胞単層の完全なCPEが得られ、免疫染色は広範なウイルス感染の存在を示した。
【０３３４】
19. 実施例14：ウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型をベクターとしたヒトメタニューモウイルスFウイルスのレスキュー
１位（b/h 104 hMPV F）または２位（b/h NP-P hMPV F）でhMPV Fを発現するb/h PIV3ウイルスを以下のように得た。６ウェルプレート中の80〜90％コンフルエントなHep-2細胞またはVero細胞を、鶏痘ウイルス-T7で感染多重度（m.o.i）0.1〜0.3で感染させた。鶏痘ウイルス-T7で感染後、細胞をPBSで１回洗浄し、以下の量のプラスミドDNAでトランスフェクトした：完全長b/h 104 hMPV Fまたはb/h NP-P hMPV F cDNA  2.0μg、pCiteN  0.4μg、pCiteP  0.4μg、pCiteL  0.2μg。（pCiteプラスミドは、T7プロモーターとその後に脳心筋炎ウイルス（EMCV）由来のIRES成分を有する）。トランスフェクションは、製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン2000（インビトロゲン（InVitrogen））の存在下で行った。トランスフェクション反応物を33℃で５〜12時間インキュベートし、次にリポフェクタミン2000を含有する培地を、ゲンタマイシンを含有する２mlの新鮮なoptiMEMで置換した。トランスフェクトした細胞をさらに33℃で２日間インキュベートした。細胞をSPGで安定化させ、−80℃で１回の凍結−融解サイクルで溶解した。レスキューしたウイルスを増幅するために、粗細胞溶解物を使用して新しいVero単層を感染させた。
【０３３５】
20. 実施例15：ウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型をベクターとしたRSウイルス遺伝子の逆遺伝学によるレスキュー
前記したトランスフェクション法（実施例13を参照）を使用して、HeLa細胞またはHep-2細胞中で逆遺伝学により感染性ウイルスを回収した。簡単に説明すると、６ウェル組織培養プレート中の80〜90％コンフルエントなHep-2細胞またはVero細胞を、鶏痘ウイルス-T7またはMVA-T7で、それぞれ感染多重度（m.o.i）0.1〜0.3または１〜５で感染させた。FP-T7またはMVA-T7で感染後、細胞をPBSで１回洗浄し、以下の量のプラスミドDNAでトランスフェクトした（2.0μgの完全長b/h PIV3 RSV FまたはG cDNA、0.4μgのpCITE/N、0.4μgのpCITE/P、0.2μgのpCITE/L）。トランスフェクションは、製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン2000（インビトロゲン（InVitrogen））の存在下で行った。トランスフェクション反応物を33℃で５〜12時間インキュベートし、次にリポフェクタミン2000を含有する培地を、ゲンタマイシンを含有する２mlの新鮮なoptiMEMで置換した。トランスフェクトした細胞をさらに33℃で２日間インキュベートした。細胞をSPGで安定化させ、−80℃で１回の凍結−融解サイクルで溶解した。レスキューしたウイルスを増幅するために、粗細胞溶解物を使用して新しいVero単層を感染させた。Vero細胞中で限界希釈によりキメラウイルスを精製し、106〜108 pfu/mlの高力価のウイルスストックを作成した。キメラウイルスのRSV遺伝子をRT-PCRにより単離し、配列を確認した。RSVタンパク質の発現は、感染したVero細胞単層をRSVヤギポリクローナル抗血清（バイオジェネシス（Biogenesis））で免疫染色して確認した。
【０３３６】
21. 実施例16：RT-PCRによるキメラウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型ウイルスレスキューの確認
レスキューしたウイルスがキメラ性であること、すなわちウイルスがbPIV3骨格中にhPIV3 FとHN遺伝子配列を含有することを確認するために、ウイルスRNAゲノムをさらにRT-PCRにより分析した。３つの独立に得られたb/h PIV3の分離株のP1ウイルスストックを感染させたVero細胞を採取し、総RNAを単離した。bPIV3の4757位でアニーリングするオリゴを使用して、ウイルスRNAを増幅した。nt 5255〜6255からのウイルス領域をPCRにより増幅した。得られた1kbのPCR断片はhPIV3配列を含有するはずである。これを、hPIV3に特異的でありbPIV3の相補的領域を切断しない酵素（Sac1とBglII）で消化して確認した（図２を参照）。予測されるように、Sac1とBglIIはPCR断片を小さい断片に切断し、単離された配列がhPIV3由来であることを確認している（レーン３、５、７を参照）。さらにnt 9075〜10469からのポリメラーゼL遺伝子中の領域をPCRにより増幅した。この領域はbPIV3配列を含有するはずである。再度1.4kbのPCR断片を、bPIV3に特異的でありhPIV3の同等の領域を切断しない酵素（PvuIIとBamHI）で消化して確認した（図３）。1.4kb断片はPvuIIとBamHIの両方で切断され、ポリメラーゼ遺伝子が元々bPIV3であることを確認している（図３のレーン３、４、６、７、９および10を参照）。要約すると、RT-PCR分析は、レスキューされたb/h PIV3がキメラ性を有することを示す。これは、bPIV3遺伝骨格中にhPIV3 FとHN遺伝子を含有する。
【０３３７】
22. 実施例17：ウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型をベクターとしたRSウイルス遺伝子の遺伝的安定性
b/h PIV3/RSVキメラウイルスが遺伝的に安定であり、導入されたRSV遺伝子カセットを保持することを証明するために、感染された細胞溶解物をVero細胞中で連続的にブラインドで継代した。T25フラスコ中のサブコンフルエントなVero細胞をb/h PIV3/RSVでMOI 0.1で感染させ、35℃で４日間またはCPEが見えるまでインキュベートした。インキュベーション期間の最後に、感染細胞と培地を採取し、凍結と融解を２回行い、得られた細胞溶解物を使用して新しいT25フラスコのVero細胞を感染させた。このサイクルを10回繰り返した。P1〜P10のすべての細胞溶解物をプラークアッセイで分析し、RSVタンパク質の発現とウイルス力価測定のためにRSVポリクローナル抗血清で免疫染色した。継代10で、RSV遺伝子カセットをRT-PCRにより単離し、RSV遺伝子配列をDNA配列分析（可能なヌクレオチド変化を同定するため）により証明した。分析した10継代について、すべての分離株はRSV遺伝子カセットとRSVタンパク質発現を保持した（データは示していない）。
【０３３８】
23. 実施例18：ショ糖勾配上のウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型をベクターとしたRSウイルス遺伝子のウイルス粒子分画
RSVタンパク質がb/h PIV3ウイルス粒子中に取り込まれたどうかを、生化学的アッセイを使用してさらに調べた。Vero細胞にキメラb/h PIV3/RSVウイルスのそれぞれをMOI 0.1で接種した。最大のCPEが見えた時、感染した単層を凍結させ、融解し、2000rpmで10分遠心分離した。上清を20％ショ糖クッションで100,000×ｇで90分遠心分離した。次にペレットをPBSに再懸濁し、20〜66％ショ糖勾配上に静かに重層した。勾配を100,000×ｇで20分遠心分離して平衡化した。勾配の上から初めて、18個の２mlの画分を採取した。各画分の0.4mlをウイルス力価測定のために取った。各画分を２倍量の20％ PBSに再懸濁し、100,000×ｇで１時間遠心分離して濃縮した。次にペレットをリームリ（Laemmli）バッファー（バイオラッド（Bio-Rad））に再懸濁し、ウェスタンブロットにより、RSV F MAb（NucMzx L1FR-S28R）、RSV（バイオジェネシス（BIogenesis））およびbPIV3（VMRD）ポリクローナル抗血清を使用して、RSVとPIV3タンパク質について分析した。バキュロウイルス中で発現され均一になるまで精製したＣ末端を切断したRSV Fタンパク質をまた、ショ糖勾配で分析した。
【０３３９】
画分をまた、プラークアッセイによりピークウイルス力価について分析した。遊離のRSV F（バキュロウイルス中で作成しＣ末端切断した）、RSV A2、およびb/h PIV3の対照勾配を最初に行った。勾配の上の部分の画分３、４、５および６に遊離のRSV Fの大部分が存在した（図16A）。RSVウイルス粒子の最大濃度は、画分10、11および12に観察された（図16B）。RSV画分をRSVポリクローナル抗血清ならびにRSV F MAbとプローブ結合させた。最大量のRSVウイルス粒子を含有した画分はまたRSV Fの最も強いシグナルを示し、これはRSV Fタンパク質がRSVウイルス粒子と同時泳動し結合していることを示唆する（図16B）。これらの画分はまた、最も高いウイルス力価を示した（図16B）。b/h PIV3ウイルス粒子はより多型性であり、従ってb/h PIV3ウイルス粒子を含有するピーク画分の拡散はより広範囲であった。b/h PIV3ウイルス粒子は画分９、10、11、12、および13中に存在した（図16C）。再度最も多量のウイルス粒子を有する画分はまた、プラークアッセイにより最も高いウイルス力価を示した（図16C）。b/h PIV3/RSV F2のショ糖勾配画分を、PIV3ポリクローナル抗血清とRSV F MAbを用いて分析した（図16D）。最も多くのウイルス粒子を有する画分は、PIV3抗血清を使用してウェスタンにより証明されたように、画分11、12、13および14であった。同様に、これらはまた最も多量のRSV Fタンパク質を示した画分であった。しかし画分５と６には一部の遊離のRSV Fもまた存在した。画分11、12、13および14はピークウイルス力価を示した（図16D）。同様にb/h PIV3/RSV G2の最も多くのウイルス粒子を含有する画分（画分９、10、11、および12）はまた、RSV Gタンパク質の最も強いシグナルを示した（図16E）。再度これらは最も高いウイルス力価を有する画分であった（画分16E）。これらのデータはまとめると、大部分のRSV FおよびGタンパク質がb/h PIV3ウイルス粒子と同時泳動するか結合していることを示唆した。しかし、勾配の上の画分には一部の遊離のRSV Fもまた存在した。
【０３４０】
24. 実施例19：キメラウシパラインフルエンザ３型／ヒトパラインフルエンザ３型をベクターとしたRSウイルス（RSV）はRSV抗血清により中和できなかった
b/h PIV3ウイルス粒子中に取り込まれたRSV表面糖タンパク質がウイルス粒子の向性表現型を変化させるかどうかの重要な安全性問題を調べるために、中和アッセイを行った（表６と７）。RSV F MAb（WHO 1200 MAb）は1:2000希釈で野生型RSV A2の50％を中和した（表６）。これに対して1:25の希釈でもキメラb/h PIV3/RSVのいずれも中和しなかった。同様に1:400希釈のRSV抗血清（バイオジェネシス（Biogenesis））はRSV A2の50％を中和したが、1:15.6の希釈でもb/h PIV3 RSVを中和しなかった（表６）。
【表６】
2005518208.tif 000007
【０３４１】
hPIV3 MAb C191/9は1:500希釈でb/h PIV3/RSVと同様にb/h PIV3の50％を中和した（表７）。hPIV3 HN MAb 68/2は1:16,000希釈でb/h PIV3を中和し、1:32,000希釈でb/h PIV3/RSVを中和した（表７）。
【表７】
2005518208.tif 000008
【０３４２】
25. 実施例20：キメラウシPIVは弱毒化表現型を示し、in vivoで投与されると強い防御性応答を誘発する
５週齢のシリアンゴールデンハムスターを、５×105 pfuの野生型bPIV3、組換えbPIV3、hPIV3、ヒト/ウシPIV3、およびプラセボで感染させた。５つの異なる動物群をマイクロアイソレーターケージ中で別々に飼育した。感染の４日後、動物を屠殺した。動物の鼻甲介と肺をホモジナイズし、−80℃で保存した。組織中に存在するウイルスをMDBK細胞中のTCID50アッセイにより37℃で測定した。ウイルス感染をモルモット赤血球を用いる血球吸着により確認した。表８は、ハムスターの肺と鼻甲介中の異なるPIV3の複製力価を示す。組換えbPIV3とb/h PIV3キメラウイルスはハムスターの肺中で弱毒化されていることに注意されたい。
【表８】
2005518208.tif 000009
【０３４３】
さらに、感染前と感染後21日目にハムスターから採取した血清サンプルを、血球凝集阻害アッセイで分析した。血清サンプルを受容体破壊酵素（RDE、デンカ生研（Denka Seiken Co.））で処理し、モルモット赤血球と氷上で１時間インキュベートして非特異的凝集素を除去した。連続２倍希釈したハムスター血清サンプルに野生型bPIV3とhPIV3を加えた。最後にモルモット赤血球（0.5％）を加え、室温で血球凝集を起こさせた。表９は、異なるPIV3株で感染した時のハムスターで生成した抗体応答を示す。b/h PIV3キメラウイルスが、野生型hPIV3と同様に、hPIV3に対して組換えまたは野生型bPIV3が生成する応答を遙かに超える、強い抗体応答を生成することに注意されたい。
【表９】
2005518208.tif 000010
【０３４４】
これらの結果は、これらの組み換え体をワクチン製剤での使用に適したものにする本発明のb/h PIV3キメラウイルスの性質を証明する。b/h PIV3キメラウイルスはin vivoで投与した時弱毒化表現型を示すのみでなく、野生型hPIV3と同様に強い抗体応答を生成する。すなわち本発明のキメラウイルスは、弱毒化表現型を有することと野生型hPIVのように強い免疫応答を誘発することのユニークな組合せを有するため、これらのキメラウイルスは、PIVによる感染を阻止および／または防御するためにヒトでの使用の成功に必要な特徴を有する。
【０３４５】
26. 実施例21：ハムスターの上気道および下気道中のウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたRSウイルスGまたはFタンパク質の複製
５週齢のシリアンゴールデンハムスター（１群６匹）を、１×106 pfuまたは１×104 pfuのb/h PIV3、b/h PIV3/RSV、RSV A2またはプラセボ培地で100ml容量で鼻内感染させた。異なる動物群をマイクロアイソレーターケージ中で別々に飼育した。感染の４日後、動物の鼻甲介と肺を採取し、ホモジナイズし、−70℃で保存した。組織中に存在するウイルスをVero細胞中のTCID50アッセイにより測定した。抗原刺激アッセイのために、28日目に動物の鼻内に、１×106 pfu/mlのhPIV3またはRSV A2を接種した。抗原刺激の４日後、動物の鼻甲介と肺を単離し、定量のために免疫染色したVero細胞上のプラークアッセイにより抗原刺激ウイルス複製について測定した。表10は、ハムスターの肺と鼻甲介中の異なる株の複製力価を示す。
【表１０】
2005518208.tif 000011
【０３４６】
シリアンゴールデンハムスターは、組換えbPIV3とhPIV3の遺伝子操作ウイルスの複製と免疫原性を評価するのに適した小動物モデルである。RSV抗原の導入はキメラb/h PIV3がハムスター中で複製する能力を変化させないだろうと予測した。結果は、すべてのキメラウイルスが、ハムスターの鼻甲介中でb/h PIV3のレベルと同様のレベルまで複製した（表10）。これに対して１位にRSV遺伝子を有するキメラウイルスは、b/h PIV3と比較してハムスターの肺中で１〜1.5 log10低い力価を示した（表10）。２位にRSV遺伝子を含有するキメラウイルスは、ハムスターの下気道中でb/h PIV3について観察されたものと同様の力価まで複製した（表10）。
【０３４７】
27. 実施例22：ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたRSウイルスで免疫したハムスターはヒトパラインフルエンザ3とRSウイルスA2による抗原刺激に対して防御された
免疫の28日後に、ハムスターに１×106 pfuのRSV A2またはhPIV3を抗原刺激して、b/h PIV3/RSVに誘導される免疫原性を評価した。b/h PIV3/RSVを投与した動物は、RSVならびにhPIV3から完全に防御された（表11）。プラセボ培地を投与された動物のみが、上気道と上気道に高力価の抗原刺激ウイルスを示した。このアッセイはまた、RSVで免疫した動物はhPIV3による抗原刺激から防御されなかったことを示した。同様にhPIV3でワクチン接種された動物は、高力価のRSV抗原刺激ウイルスを示した（表11）。
【表１１】
2005518208.tif 000012
【０３４８】
28. 実施例23：ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたRSウイルスによるハムスターのワクチン接種は血清HAIと中和抗体を誘導する
抗原刺激の前に、免疫した動物から28日目に血清サンプルを得た。ハムスターの血清を、50％プラーク低下アッセイを使用してRSV中和抗体の存在について、および血球凝集阻害（HAI）アッセイを使用してPIV3 HAI血清抗体について分析した（表８）。50％プラーク低下アッセイ（中和アッセイ）は以下のように行った：ハムスター血清を連続２倍希釈し、100pfuのRSV A2と１時間インキュベートした。次にウイルス−血清混合物をVero細胞単層に移し、メチルセルロースを重層した。35℃で５日間インキュベーション後、定量のためにRSVポリクローナル抗血清を使用して単層を免疫染色した。Ｖ底96ウェルプレート中で28日目のハムスターの血清の連続２倍希釈物をhPIV3と25℃で30分インキュベートして、血球凝集阻害（HAI）アッセイを行った。次に各ウェルにモルモット赤血球を加え、さらに90分インキュベーションを続け、各ウェル中の血球凝集の有無を記録した。
【０３４９】
結果は、RSV Fタンパク質を発現するウイルスは、野生型RSVでワクチン接種した動物から得られる血清で観察されるものとほぼ同じ中和抗体力価を示すことを示した（表12）。これに対してRSV Gタンパク質を発現するウイルスは、はるかに低いレベルのRSV中和抗体を示した（表12）。すべてのキメラb/h PIV3/RSVハムスター血清は、b/h PIV3で観察されたレベルに近いHAI血清抗体レベルを示した（表12）。結果は、キメラb/h PIV3がハムスター中で効率的に感染し複製すること、および防御性免疫応答を誘発することを示した。
【表１２】
2005518208.tif 000013
【０３５０】
29. 実施例24：低用量のウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたRSウイルスによるハムスターのワクチン接種はRSウイルスA2による抗原刺激からハムスターを防御し、HAIと中和抗体を誘導する
ワクチン候補を同定するために、異なる構築体（実施例２を参照）を有する低用量のウイルスを使用してハムスターを免疫した。抗原刺激実験の結果を表13に要約する。
【表１３】
2005518208.tif 000014
【０３５１】
次に、50％プラーク低下アッセイ（中和アッセイ）により中和抗体力価を測定した。中和アッセイは、Vero細胞を使用してb/h PIV3、b/h PIV3/RSVキメラウイルス、またはRSウイルスについて行った。RSウイルスポリクローナル抗血清（バイオジェネシス（Biogenesis）；プール（Poole）、イングランド）、MedImmuneから得られたRSV F MAb（WHO 1200 MAb）、またはhPIV3 F（C19/9）とHN（68/2）MAbの連続２倍希釈物を、0.5mlのoptiMEM中の約100pfuのb/h PIV3、b/h PIV3/RSVキメラウイルスまたはRSVと室温で60分インキュベートした。インキュベーション後、ウイルス−血清混合物をVero細胞単層に移し、35℃で１時間インキュベートし、EMEM/L-15培地（JRHバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）；レネクサ（Lenexa）、カンザス州）中の１％メチルセルロースを重層し、35℃でインキュベートした。接種の６日後、感染細胞単層を免疫染色した。中和力価は50％のウイルスプラークを示した最も高い血清希釈率の逆数として表した。中和アッセイは、b/h PIV3、b/h PIV3/RSVキメラウイルス、またはRSV A2で免疫したハムスターから感染の28日後に得た血清について行った。ハムスターの血清を連続２倍希釈し、100pfuのRSV A2と１時間インキュベートした。ウイルス−血清混合物をVero細胞単層に移し、メチルセルロースを重層した。35℃で５日間インキュベーション後、定量のためにRSVポリクローナル抗血清を使用して単層を免疫染色した。ハムスターのプレ血清の中和抗体力価は＜1.0であり、HAI抗体力価は＜4.0であった。血球凝集阻害（HAI）アッセイは、28日目のハムスター血清の連続２倍希釈物をＶ底96ウェルプレート中でhPIV3と25℃で30分インキュベートして行った。次に各ウェルにモルモット赤血球を加え、さらに90分インキュベーションを続け、各ウェル中の血球凝集の有無を記録した。表14は結果を要約する：
【表１４】
2005518208.tif 000015
【０３５２】
接種用量を動物１匹あたり１×104 pfuに減少させると、１位にRSV遺伝子を有するキメラウイルスの制限複製表現型が悪化した。b/h PIV3/RSV F１とG1は、b/h PIV3のそれと比較すると1.0〜2.0 log10だけ低下した力価まで、ハムスターの上気道で複製した（表13）。これに対して２位にRSV遺伝子を有するb/h PIV3/RSVは上気道で、b/h PIV3について観察されるレベルまで複製した。ハムスターの肺中の複製もまた、１位にRSV遺伝子を有するb/h PIV3/RSVについてさらに限定された（表13）。これに対して、b/h PIV3/RSV F2は、鼻甲介と肺中でそれぞれ105.2と103.9の高い力価まで複製した（表13）。ワクチン接種したハムスターを28日目に１×106 pfuのRSV A2で抗原刺激した（表13）。ハムスターの気道中で観察された低レベルの複製にもかかわらず、RSVによる抗原刺激から動物は下気道と上気道の両方で防御された（表13）。防御の程度は、wtRSVでワクチン接種した動物で観察されるものと同様であった。プラセボ培地を投与された動物のみが、鼻甲介と肺で高ウイルス力価を示した（表13）。28日目に免疫したハムスターから血清を採取し、RSV中和抗体とPIV3 HAI血清抗体の存在について分析した（表14）。wtRSV血清について観察された力価と比較して、b/h PIV3/RSVで免疫したハムスターから得られた血清では、RSV中和抗体の約50％の低下が観察された（表14）。しかし２位にRSV遺伝子を有するb/h PIV3を投与されていた動物から得られた血清は、１位にRSV遺伝子を有するb/h PIV3/RSVからの血清について観察されたものより高いRSV中和抗体力価を示した。PIV3 HAI血清抗体力価はまた、b/h PIV3血清と比較してわずかに低下した（表14）。
【０３５３】
30. 実施例25：ウシパラインフルエンザ３／ヒトパラインフルエンザ３をベクターとしたヒトメタニューモウイルスFで免疫したハムスターは、ヒトパラインフルエンザウイルス3またはヒトメタニューモウイルスNL/001による抗原刺激に対して防御された
５群のシリアンゴールデンハムスター（各群は６匹のハムスターを有した）を、それぞれb/h PIV3、b/h hMPV F1、b/h hMPV F2、hMPVまたはプラセボで免疫した。５つの異なる群をマイクロアイソレーターケージ中で別々に飼育した。免疫の28日後、ハムスターを１×106 pfuのhPIV3またはhMPV（NL/001株）で抗原刺激して、b/h PIV3/hMPV Fで誘導される免疫原性を評価した。抗原刺激の５日後、動物を屠殺した。動物の鼻甲介と肺をホモジナイズし、−80℃で保存した。組織中に存在するウイルスを、MDBK細胞中で37℃でTCID50アッセイにより測定した。ウイルス感染を、モルモット赤血球による血球吸着により確認した。表15は、ハムスターの肺と鼻甲介中のPIV3株とMPV株の複製力価を示す。
【表１５】
2005518208.tif 000016
【０３５４】
結果は、b/h PIV3/hMPV F2（２位のF）を投与された動物が、hMPVならびにhPIVから完全に防御されることを示した（表15）。しかしb/h PIV3/hMPV F1（１位のF）は上気道（例えば、鼻甲介）の感染hMPVの力価を2.5 log低下させるのみであったが、これはhMPVとhPIV感染からの下気道（例えば肺）で完全な防御を提供した（表15）。プラセボ培地を投与された動物は、または下気道と上気道で高力価の抗原刺激ウイルスを示した（表15）。
【０３５５】
本発明は、具体的に記載した実施形態によってその範囲を限定されるものではなく、これらは本発明の個々の態様を例示するのみであり、機能的に同等の任意の構築体、ウイルスもしくは酵素は本発明の範囲内である。実際本明細書に記載のもの以外に本発明の種々の変更態様が、上記説明と添付の図面から当業者には明らかであろう。そのような変更態様は、添付の特許請求の範囲内にあると考えられる。
【０３５６】
種々の刊行物が本明細書で引用されているが、これらの開示内容は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３５７】
配列リストの凡例
配列番号1  ヒトメタニューモウイルス分離株00-1マトリックスタンパク質（M）と融合タンパク質（F）遺伝子
配列番号2  鳥類ニューモウイルス融合タンパク質遺伝子、部分cds
配列番号3  鳥類ニューモウイルス分離株1b融合タンパク質mRNA、完全cds
配列番号4  融合タンパク質（F1とF2サブユニット）の七面鳥鼻気管炎ウイルス遺伝子、完全cds
配列番号5  鳥類ニューモウイルスマトリックスタンパク質（M）遺伝子、部分cdsと鳥類ニューモウイルス融合糖タンパク質（F）遺伝子、完全cds
配列番号6  パラミクソウイルスFタンパク質hRSV B
配列番号7  パラミクソウイルスFタンパク質hRSV A2
配列番号8  ヒトメタニューモウイルス01-71（部分配列）
配列番号9  ヒトメタニューモウイルス分離株00-1マトリックスタンパク質（M）と融合タンパク質（F）遺伝子
配列番号10  鳥類ニューモウイルス融合タンパク質遺伝子、部分cds
配列番号11  鳥類ニューモウイルス分離株1b融合タンパク質mRNA、完全cds
配列番号12  融合タンパク質（F1とF2サブユニット）の七面鳥鼻気管炎ウイルス遺伝子、完全cds
配列番号13  鳥類ニューモウイルス融合糖タンパク質（F）遺伝子、完全cds
配列番号14  七面鳥鼻気管炎ウイルス（CVL14/1株）結合タンパク質（G）mRNA、完全cds
配列番号15  七面鳥鼻気管炎ウイルス（6574株）結合タンパク質（G）、完全cds
配列番号16  七面鳥鼻気管炎ウイルス（CVL14/1株）結合タンパク質（G）mRNA、完全cds
配列番号17  七面鳥鼻気管炎ウイルス（6574株）結合タンパク質（G）、完全cds
配列番号18  HMPV分離株NL/1/00のFタンパク質配列
配列番号19  HMPV分離株NL/17/00のFタンパク質配列
配列番号20  HMPV分離株NL/1/99のFタンパク質配列
配列番号21  HMPV分離株NL/1/94のFタンパク質配列
配列番号22  HMPV分離株NL/1/00のF遺伝子配列
配列番号23  HMPV分離株NL/17/00のF遺伝子配列
配列番号24  HMPV分離株NL/1/99のF遺伝子配列
配列番号25  HMPV分離株NL/1/94のF遺伝子配列
配列番号26  HMPV分離株NL/1/00のGタンパク質配列
配列番号27  HMPV分離株NL/17/00のGタンパク質配列
配列番号28  HMPV分離株NL/1/99のGタンパク質配列
配列番号29  HMPV分離株NL/1/94のGタンパク質配列
配列番号30  HMPV分離株NL/1/00のG遺伝子配列
配列番号31  HMPV分離株NL/17/00のG遺伝子配列
配列番号32  HMPV分離株NL/1/99のG遺伝子配列
配列番号33  HMPV分離株NL/1/94のG遺伝子配列
配列番号34  HMPV分離株NL/1/00のLタンパク質配列
配列番号35  HMPV分離株NL/17/00のLタンパク質配列
配列番号36  HMPV分離株NL/1/99のLタンパク質配列
配列番号37  HMPV分離株NL/1/94のLタンパク質配列
配列番号38  HMPV分離株NL/1/00のL遺伝子配列
配列番号39  HMPV分離株NL/17/00のL遺伝子配列
配列番号40  HMPV分離株NL/1/99のL遺伝子配列
配列番号41  HMPV分離株NL/1/94のL遺伝子配列
配列番号42  HMPV分離株NL/1/00のM2-1タンパク質配列
配列番号43  HMPV分離株NL/17/00のM2-1タンパク質配列
配列番号44  HMPV分離株NL/1/99のM2-1タンパク質配列
配列番号45  HMPV分離株NL/1/94のM2-1タンパク質配列
配列番号46  HMPV分離株NL/1/00のM2-1遺伝子配列
配列番号47  HMPV分離株NL/17/00のM2-1遺伝子配列
配列番号48  HMPV分離株NL/1/99のM2-1遺伝子配列
配列番号49  HMPV分離株NL/1/94のM2-1遺伝子配列
配列番号50  HMPV分離株NL/1/00のM2-2タンパク質配列
配列番号51  HMPV分離株NL/17/00のM2-2タンパク質配列
配列番号52  HMPV分離株NL/1/99のM2-2タンパク質配列
配列番号53  HMPV分離株NL/1/94のM2-2タンパク質配列
配列番号54  HMPV分離株NL/1/00のM2-2遺伝子配列
配列番号55  HMPV分離株NL/17/00のM2-2遺伝子配列
配列番号56  HMPV分離株NL/1/99のM2-2遺伝子配列
配列番号57  HMPV分離株NL/1/94のM2-2遺伝子配列
配列番号58  HMPV分離株NL/1/00のM2遺伝子配列
配列番号59  HMPV分離株NL/17/00のM2遺伝子配列
配列番号60  HMPV分離株NL/1/99のM2遺伝子配列
配列番号61  HMPV分離株NL/1/94のM2遺伝子配列
配列番号62  HMPV分離株NL/1/00のMタンパク質配列
配列番号63  HMPV分離株NL/17/00のMタンパク質配列
配列番号64  HMPV分離株NL/1/99のMタンパク質配列
配列番号65  HMPV分離株NL/1/94のMタンパク質配列
配列番号66  HMPV分離株NL/1/00のM遺伝子配列
配列番号67  HMPV分離株NL/17/00のM遺伝子配列
配列番号68  HMPV分離株NL/1/99のM遺伝子配列
配列番号69  HMPV分離株NL/1/94のM遺伝子配列
配列番号70  HMPV分離株NL/1/00のNタンパク質配列
配列番号71  HMPV分離株NL/17/00のNタンパク質配列
配列番号72  HMPV分離株NL/1/99のNタンパク質配列
配列番号73  HMPV分離株NL/1/94のNタンパク質配列
配列番号74  HMPV分離株NL/1/00のN遺伝子配列
配列番号75  HMPV分離株NL/17/00のN遺伝子配列
配列番号76  HMPV分離株NL/1/99のN遺伝子配列
配列番号77  HMPV分離株NL/1/94のN遺伝子配列
配列番号78  HMPV分離株NL/1/00のPタンパク質配列
配列番号79  HMPV分離株NL/17/00のPタンパク質配列
配列番号80  HMPV分離株NL/1/99のPタンパク質配列
配列番号81  HMPV分離株NL/1/94のPタンパク質配列
配列番号82  HMPV分離株NL/1/00のP遺伝子配列
配列番号83  HMPV分離株NL/17/00のP遺伝子配列
配列番号84  HMPV分離株NL/1/99のP遺伝子配列
配列番号85  HMPV分離株NL/1/94のP遺伝子配列
配列番号86  HMPV分離株NL/1/00のSHタンパク質配列
配列番号87  HMPV分離株NL/17/00のSHタンパク質配列
配列番号88  HMPV分離株NL/1/99のSHタンパク質配列
配列番号89  HMPV分離株NL/1/94のSHタンパク質配列
配列番号90  HMPV分離株NL/1/00のSH遺伝子配列
配列番号91  HMPV分離株NL/17/00のSH遺伝子配列
配列番号92  HMPV分離株NL/1/99のSH遺伝子配列
配列番号93  HMPV分離株NL/1/94のSH遺伝子配列
配列番号94  分離株NL/1/99(99-1)HMPV（ヒトメタニューモウイルス）cDNA配列
配列番号95  分離株NL/1/00(00-1)HMPV cDNA配列
配列番号96  分離株NL/17/00 HMPV cDNA配列
配列番号97  分離株NL/1/94 HMPV cDNA配列
配列番号98  分離株NL/1/00のG遺伝子コード配列（A1）
配列番号99  分離株BR/2/01のG遺伝子コード配列（A1）
配列番号100  分離株FL/4/01のG遺伝子コード配列（A1）
配列番号101  分離株FL/3/01のG遺伝子コード配列（A1）
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配列番号327  分離株HK/1/02のFタンパク質配列
【図面の簡単な説明】
【０３５８】
【図１Ａ】ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、異なる鳥類ニューモウイルスからの異なるFタンパク質とのアミノ酸配列の対になった整列。２つの配列の間の同一のアミノ酸を、アミノ酸の一文字記号により示す。２つのアミノ酸配列の間の保存されたアミノ酸交換は「＋」記号で示し、スペースは非保存アミノ酸交換を示す。A) ヒトメタニューモウイルスFタンパク質と、マガモ（Mallard Duck）から単離された鳥類ニューモウイルスのFタンパク質との整列（エクトドメインが85.6％同一）。
【図１Ｂ】ヒトメタニューモウイルスのFタンパク質と、異なる鳥類ニューモウイルスからの異なるFタンパク質とのアミノ酸配列の対になった整列。２つの配列の間の同一のアミノ酸を、アミノ酸の一文字記号により示す。２つのアミノ酸配列の間の保存されたアミノ酸交換は「＋」記号で示し、スペースは非保存アミノ酸交換を示す。B) ヒトメタニューモウイルスFタンパク質と、七面鳥から単離された鳥類ニューモウイルスのFタンパク質との整列（サブグループB：エクトドメインが75％同一）。
【図２】b/h PIV3キメラウイルスの３つの異なる分離株から得られたnt5255〜nt6255のPCR断片を増幅した。得られた１kbのDNA断片を、ヒトPIV3のF遺伝子に特異的な酵素で消化した。これらの酵素は、ウシPIV3の対応する断片は切断しない。１％アガロースゲルは、未消化断片（レーン２、５および６）とSacIまたはBgIII消化断片（それぞれレーン４、６およびレーン９、10、および11）を示す。レーン10中のサンプルは未消化であるが、BgIIIによる消化を繰り返すと、このサンプルは切断された（データは示していない）。レーン１と８はDNAサイズマーカーを示す。
【図３】b/h PIV3キメラウイルスの３つの異なる分離株から得られたnt9075〜nt10469のPCR断片を増幅した。得られた1.4kbのDNA断片を、ウシPIV3のL遺伝子に特異的な酵素で消化した。これらの酵素は、ヒトPIV3の対応する断片は切断しない。１％アガロースゲルは、未消化1.4kb断片（レーン２、５および８）を示す。BamHIとPvuIIを用いる消化により産生された小さいDNA断片を、レーン３、４、６、７、９および10に示す。レーン１はDNAサイズマーカーを示す。
【図４】bPIV3/hPIV3ベクター、およびb/h PIV3をベクターとしたRSV FまたはG cDNAを含む６つの構築体を示す。ウシPIV3 F遺伝子とHN遺伝子は欠失され、それぞれヒトPIV3 FHN遺伝子で置換される。RSV FまたはG遺伝子は、１位または２位にクローン化される。すべてのRSV遺伝子は、RSV F1*+(N-H)（これは、短いbPIV3 N遺伝子と停止/N遺伝子開始配列が後に続く）を除いて、bPIV3 N-P遺伝子間領域に連結される。
【図５Ａ】b/h PIV3をベクターとしたRSV F遺伝子またはG遺伝子は陽性の作用を示した。(A)は、キメラウイルス感染した細胞溶解物のウェスタンブロット解析である。RSV Fタンパク質に対するモノクローナル抗体（MAb）を使用してFタンパク質を検出し、RSV Gタンパク質に対するポリクローナル抗体（PAb）を使用してGタンパク質を検出した。すべてのキメラウイルスならびに野生型RSVで感染した細胞中に、F1断片を示す50kDaバンドを検出した。野生型RSVと比較して、キメラウイルスの感染した細胞溶解物中に、20kDaのF断片が多く蓄積した。実験はMOI 0.1で行ったが、レーン１ではb/h PIV3をベクターとしたRSV F1* N-N感染を、より高いMOIの1.0で繰り返した。約50kDaと90kDaで泳動した未成熟型とグリコシル化型のRSV Gタンパク質が検出された。
【図５Ｂ】b/h PIV3をベクターとしたRSV F遺伝子またはG遺伝子は陽性の作用を示した。(B)はノーザンブロット解析であり、これは、mRNA転写が図5Aで証明したタンパク質発現の結果と相関することを示した。等量の総RNAを、１％ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に移した。DIG RNA標識キットを使用してin vitro転写により合成したジゴキシゲニン（DIG）-UTP-標識リボプローブに、ブロットをハイブリダイズさせた。
【図５Ｃ】b/h PIV3をベクターとしたRSV F遺伝子またはG遺伝子は陽性の作用を示した。(C)は、Vero細胞中のb/h PIV3をベクターとしたRSV Fタンパク質またはGタンパク質を含むキメラウイルスの増殖曲線である。Vero細胞は90％コンフルエンスまで増殖させ、MOI 0.1で感染させた。感染した単層を37℃でインキュベートした。各時点のウイルス力価はTCID50により測定し、これは、37℃で６日間インキュベーション後にCPEを視覚的に検査して行った。
【図６】b/h PIV3をベクターとした増強された緑色蛍光タンパク質（eGFP）構築体。eGFP遺伝子をb/h PIV3ベクター中にすべてのPIV3遺伝子の間に連続して導入した（ここでは１、２、３および４位のみを示す）。eGFP遺伝子をbPIV3 N-P遺伝子間領域に連結した。b/h GFP1構築体は、b/h PIV3ゲノムの最も3'近位にeGFP遺伝子カセットを有する。b/h GFP2構築体は、N遺伝子とP遺伝子の間にeGFP遺伝子カセットを含有する。b/h GFP3構築体は、P遺伝子とM遺伝子の間にeGFP遺伝子カセットを含有し、b/h GFP4構築体は、b/h PIV3のMとFの間にeGFP遺伝子カセットを含有する。
【図７Ａ】b/h PIV3ゲノム中の増強された緑色蛍光タンパク質（eGFP）挿入の位置効果。(A)は、b/h PIV3をベクターとしたeGFP 1、2、および3を用いて、MOI 0.1とMOI 0.01でVero細胞を20時間感染させて産生された緑細胞の量を示す。
【図７Ｂ】b/h PIV3ゲノム中の増強された緑色蛍光タンパク質（eGFP）挿入の位置効果。(B)は、感染された細胞溶解物のウェスタンブロット解析である。ブロットはGFP MAbならびにPIV3 PAbとプローブ結合した。PIV3抗体はまた、ブロットが同じ充填量を有することを示すために使用した。
【図７Ｃ】b/h PIV3ゲノム中の増強された緑色蛍光タンパク質（eGFP）挿入の位置効果。(C)は、Vero細胞中のb/h PIV3をベクターとしたGFP構築体（１、２および３位）の増殖曲線である。
【図８】異なる遺伝子間領域を有するb/h PIV3をベクターとしたRSV F遺伝子の構築体。３つの構築体、RSV F1* N-N、RSV F2 N-P、およびRSV F1 N-Pは、それぞれ図４中のRSV F* (N-N)、RSV F2、およびRSV F1と同じである。RSV F1* N-N中のN遺伝子開始配列とN遺伝子翻訳開始コドンの間の距離は、わずかに10ヌクレオチド（nt）の長さである。これに対して、この距離はRSV F2構築体中では86ntの長さである。RSV F1* N-Nはまた、RSV F2構築体で行われるようにP遺伝子開始配列よりN遺伝子開始配列を使用する。
【図９Ａ】挿入されたRSV遺伝子の下流の遺伝子間領域の長さおよび／または性質は、ウイルス複製に影響を与える。(A) キメラウイルス中のRSV Fタンパク質発現のウェスタンブロット解析。ブロットはRSV Fタンパク質に対するモノクローナル抗体とプローブ結合させた。RSV F1構築体により発現され、感染後24時間と48時間に測定したF1タンパク質レベルは、RSV F2構築体で観察されたレベルに近かったが、RSV F1* N-N構築体よりははるかに高かった。
【図９Ｂ】挿入されたRSV遺伝子の下流の遺伝子間領域の長さおよび／または性質は、ウイルス複製に影響を与える。(B)は、MOI 0.1でのVero細胞中のRSV F1、RSV F1* N-NおよびRSV F2構築体のウイルス複製の動態を比較する多サイクル増殖曲線である。各時点の採取物のウイルス力価はプラーク測定法で測定し、これは５日間インキュベーション後の定量のためのRSVポリクローナル抗血清を用いて免疫染色して行った。
【図１０】３価のb/h PIV3をベクターとしたRSV FとhMPV Fの構築体。それぞれキメラb/h PIV3ベクター、メタニューモウイルスF遺伝子から得られた第１の異種配列、およびRSウイルスF遺伝子から得られた第２の異種配列を含む２つのウイルスゲノムを示す。いずれかの構築体を有するウイルスをVero細胞中で増幅した。記載のように遺伝子操作したウイルスは、パラインフルエンザウイルス感染、メタニューモウイルス感染、およびRSウイルス感染に対して、３価ワクチンとして使用することができる。
【図１１】２つのRSV F遺伝子を有する構築体。この構築体は、RSV Fタンパク質産生、ハムスター中の複製と免疫原性についての増殖動態を決定するのに使用することができる。
【図１２】キメラb/h PIV3をベクターとしたhMPV F構築体。ヒトメタニューモウイルス（hMPV）のF遺伝子をb/h PIV3ゲノムの１位と２位に挿入した。hMPV F遺伝子カセットは、bPIV3 N-P遺伝子間領域を有した。
【図１３Ａ】b/h PIV3をベクターとしたhMPV F遺伝子の免疫沈降と複製測定法（２位で）。(A)は、モルモットまたはヒト抗hMPV抗血清を使用したhMPV Fタンパク質の免疫沈降を示す。約80kDaで泳動する特異的バンドが、b/h PIV3をベクターとしたhMPV F2の溶解物中で観察された。このサイズは、F前駆体タンパク質F0に対応する。異なるサイズの非特異的バンドはまた、b/h PIV3とモック対照レーン中に観察された。
【図１３Ｂ】b/h PIV3をベクターとしたhMPV F遺伝子の免疫沈降と複製測定法（２位で）。(B)は、b/h PIV3/hMPV F2のウイルス複製の動態を測定し、これをMOI 0.1でVero細胞中のb/h PIV3およびb/h PIV3/RSV F2について得られたものと比較するために行われたものと比較する。
【図１３Ｃ】b/h PIV3をベクターとしたhMPV F遺伝子の免疫沈降と複製測定法（２位で）。(C)は、b/h PIV3/hMPV F1のウイルス複製の動態を測定し、これをMOI 0.01でVero細胞中のb/h PIV3/hMPV F2およびb/h PIV3について得られたものと比較するために行われたものと比較する。
【図１４】キメラb/h PIV3をベクターとした可溶性RSV F遺伝子構築体。この構築体は、可溶性RSV F遺伝子（膜貫通ドメインとサイトゾルドメインが欠如したRSV F遺伝子のバージョン）の単一のコピーを含む。この構築体の利点は、可溶性RSV Fがウイルス粒子ゲノム中に取り込まれないことであろう。
【図１５Ａ】免疫染色したb/h PIV3/hMPV F1とb/h PIV3/hMPV F2。(A) b/h PIV3/hMPV F1ウイルスを希釈し、サブコンフルエントなVero細胞を感染させるのに使用した。感染細胞に、ゲンタマイシンを含有するoptiMEM培地を重層し、35℃で５日間インキュベートした。細胞を固定し、モルモット抗hMPV血清で免疫染色した。hMPV Fの発現を、AEC基質系の存在下で特異的発色により視覚化した。
【図１５Ｂ】免疫染色したb/h PIV3/hMPV F1とb/h PIV3/hMPV F2。(B) b/h PIV3/hMPV F2ウイルスを希釈し、Vero細胞を感染させるのに使用した。感染された細胞に、EMEM/L-15培地（JRHバイオサイエンシーズ（JRH Biosciences）；Lenexa、KS）中の１％メチルセルロースを重層した。細胞をインキュベートし、固定し、次に抗hMPVモルモット血清で免疫染色した。抗hMPVモルモット血清はhMPV001タンパク質に特異的である。
【図１６Ａ】ショ糖勾配上のb/h PIV3をベクターとしたRSV遺伝子のウイルス粒子分画。これらのシリーズの実験は、RSVタンパク質がb/h PIV3ウイルス粒子中に取り込まれるかどうかを調べる。(A)は、遊離のRSV F（バキュロウイルス中で作成され、Ｃ末端が切断されている）の対照勾配を示す。遊離のRSV Fの大部分は、画分３，４、５、および６中に存在した。
【図１６Ｂ】ショ糖勾配上のb/h PIV3をベクターとしたRSV遺伝子のウイルス粒子分画。これらのシリーズの実験は、RSVタンパク質がb/h PIV3ウイルス粒子中に取り込まれるかどうかを調べる。(B)は、画分10、11および12で最も高濃度のRSVウイルス粒子が観察されたことを示す。RSV画分をRSVポリクローナル抗血清ならびにRSV F MAbとプローブ結合させた。最大量のRSVウイルス粒子を含有する画分はまた、RSV Fの最も強いシグナルを示し、RSV Fタンパク質はRSVウイルス粒子と同時移動し関連した。(B)の最後の数字は、画分10、11および12がプラーク測定法により最も高いウイルス力価を示したことを証明する。
【図１６Ｃ】ショ糖勾配上のb/h PIV3をベクターとしたRSV遺伝子のウイルス粒子分画。これらのシリーズの実験は、RSVタンパク質がb/h PIV3ウイルス粒子中に取り込まれるかどうかを調べる。(C) b/h PIV3ウイルス粒子はより多型であり、b/h PIV3ウイルス粒子を含有するピーク画分の広がりはより広かった。
【図１６Ｄ】ショ糖勾配上のb/h PIV3をベクターとしたRSV遺伝子のウイルス粒子分画。これらのシリーズの実験は、RSVタンパク質がb/h PIV3ウイルス粒子中に取り込まれるかどうかを調べる。(D) b/h PIV3/RSV F2のショ糖勾配画分を、PIVポリクローナル抗血清とRSV F MAbで分析した。多量のウイルス粒子を含有する画分は、PIV3抗血清を使用するウェスタンにより示されるように、画分11、12、13および14であった。対応してこれらは、最多量のRSV Fタンパク質を示す画分でもあった。一部の遊離のRSV Fはまた画分５と６に存在した。画分11、12、13および14はピークウイルス力価を示した。
【図１６Ｅ】ショ糖勾配上のb/h PIV3をベクターとしたRSV遺伝子のウイルス粒子分画。これらのシリーズの実験は、RSVタンパク質がb/h PIV3ウイルス粒子中に取り込まれるかどうかを調べる。(E) 多量のb/h PIV3/RSV G2のウイルス粒子を含有する画分（９、10、11および12）はまた、RSV Gタンパク質の最も強いシグナルを示した。再度これらは、最も高いウイルス力価を有する画分であった。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【国際調査報告】
2005518208.tif 000225
2005518208.tif 000226