(57)【要約】置換反応用の固体担体上の被覆された金属表面  固体担体上の被覆された金属表面であって、該被覆が、オリゴ（エチレングリコール）末端を有するアミド基を含むアルキルチオールの自己集合した、チオール末端を経由して金属表面に堅く付加している単分子層（ＳＡＭ）、およびアミド基を経由してＳＡＭ形成ＯＥＧ分子に結合した低分子量抗原からなり、アルキル部分は１〜２０個のメチレン基を有し、オリゴ（エチレングリコール）部分は１〜１５エチレンオキシ単位を有し、抗原、例えば爆薬および麻薬、は所望により抗原に対して特異的な抗体に可逆的に結合する、被覆された金属表面を開示する。固体担体上の被覆された金属表面は、被覆の抗原よりも抗体に対して高い親和力を有する水溶液中のアナライト抗原を、被覆からの抗体の置換を監視することにより検出するための分析装置、例えば圧電結晶微量天秤装置または表面プラズモン共鳴バイオセンサー、の一部としてアナライト抗原の検出方法に使用できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体担体上の被覆された金属表面であって、
前記被覆が、オリゴ（エチレングリコール）末端を有するアミド基を含むアルキルチオールの自己集合した、チオール末端を経由して金属表面に堅く付加している単分子層（ＳＡＭ）と、およびアミド基を経由して前記ＳＡＭ形成ＯＥＧ分子に結合した低分子量抗原とからなり、
前記アルキル部分が１〜２０個のメチレン基を有し、
前記オリゴ（エチレングリコール）部分が１〜１５エチレンオキシ単位を有し、
前記抗原が所望により前記抗原に対して特異的な抗体に可逆的に結合してなるものである、被覆された金属表面。
【請求項２】
前記金属が、金、銀、アルミニウム、チタンおよびクロムからなる群から選択される、請求項１に記載の固体担体上の被覆された金属表面。
【請求項３】
前記抗原が、同一であるかまたは異なるものであり、前記固体担体上の同じ単分子層にまたはパッチ状の異なった単分子層に結合してなり、所望により誘導体化された爆薬および麻薬からなる群から選択される、請求項１または２に記載の固体担体上の被覆された金属表面。
【請求項４】
前記爆薬が、トリニトロトルエン（ＴＮＴ）、ジニトロトルエン（ＤＮＴ）、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリニトロ−１，３，５−トリアジン（ＲＤＸ）、オクタヒドロ−１，３，５，７−テトラニトロ−１，３，５，７−テトラジン（ＨＭＸ）、ペンタエリトリトールテトラニトレート（ＰＥＴＮ）、およびニトログリセリン（ＮＧ）からなる群から選択される、請求項３に記載の固体担体上の被覆された金属表面。
【請求項５】
前記麻薬が、コカイン、ヘロイン、アンフェタミン、メタアンフェタミン、カンナビノール、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、およびメチレンジオキシ−Ｎ−メチルアンフェタミン（エクスタシー）からなる群から選択される、請求項３に記載の固体担体上の被覆された金属表面。
【請求項６】
前記固体担体が、圧電結晶電極またはガラス板またはプリズムである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の固体担体上の被覆された金属表面。
【請求項７】
前記オリゴ（エチレングリコール）が４〜６エチレンオキシ単位を有し、
前記アルキル基が１５メチレン単位を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の固体担体上の被覆された金属表面。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の固体担体上の被覆された金属表面の使用であって、
前記被覆から前記抗体が置換されるのを監視することにより、抗体に対する親和力が前記被覆の抗原より高いアナライト抗原を水溶液中で検出するための分析装置の一部としての使用。
【請求項９】
アナライト抗原を水溶液中で検出する方法であって、
必要であれば、抗体が結合していない請求項１〜７のいずれか一項に記載の固体担体上の被覆された金属表面を、抗原に特異的な抗体を前記被覆された金属表面と水溶液中で接触させることにより活性化することと、
前記抗体を前記被覆の前記抗原に結合させることと、
過剰の前記抗体を除去することと、
前記被覆に可逆的に結合した前記抗体の接触において、前記抗体に対する親和力が前記被覆の前記抗原より高い前記アナライト抗原を含む可能性がある前記水溶液を移動することと、
前記抗体を解離し、かつ、前記アナライト抗原と反応させることと、および
分析装置を使用して前記被覆された金属表面上の質量損失を検出することとを含んでなる、方法。
【請求項１０】
前記分析装置が、圧電結晶微量天秤装置および表面プラズモン共鳴バイオセンサーからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析装置が、請求項１〜７いずれか一項に記載の固体担体上の被覆された金属表面が中に配置されているフローセルを備えてなる、請求項９または１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可逆的に結合した、アナライト（analyte）に特異的な抗体を金属表面被覆から置換することにより、特に水溶液中のアナライトを検出するための、置換反応用の、固体担体上の被覆された金属表面に関する。水溶液中のアナライトの置換を、従って、その存在を検出することは、分析装置、例えば圧電結晶微量天秤(Piezoelectric Crystal Microbalance)（ＰＣＭ）装置または表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance)（ＳＰＲ）バイオセンサー、で行う。
【背景技術】
【０００２】
ＳＰＲバイオセンサーは、特定金属表面の近くにおける分子相互作用に関する情報を引き出すのに使用できる、敏感なリアル−タイム技術である。この技術により、濃度、会合および解離速度定数および親和力ならびにエピトープマッピングおよび相互作用特異性の測定が可能になる[B. Liedberg and K. Johansen, Affinity biosensing based on surface plasmon detection in 「Methods in Biotechnology, Vol. 7: Affinity Biosensors: Techniques and Protocols」, K.R. Rogers and A. Muchandani (Eds.), Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 31-53]。この研究された反応に関与する成分の一つは、ＳＰＲ実験の前または最中に金属表面上に固定される。固定された分子を連続流に露出し、その中に相互作用する化学種を注入することができる。この方法は、光学的検出に基づき、検知信号は、表面における誘電関数または屈折率の変化を反映する。これらの変化は、表面における分子の相互作用により引き起こされる。
【０００３】
ＰＣＭ技術は、微量天秤装置中の振動する圧電結晶に基づき、結晶は、例えば石英、窒化アルミニウム（ＡｌＮ）またはニオブ酸ナトリウムカリウム（ＮＫＮ）からなる。結晶が石英結晶である場合、その装置はＱＣＭ（石英結晶微量天秤）と呼ばれる。ＰＣＭおよびＱＣＭは、重量センサーであり、従って、質量変化に敏感である。ＱＣＭは、圧電石英結晶板を備えてなり、その上に金属電極が両側に堆積している。そのような結晶板上に印加された交流電位差がせん断波を誘導する。厚さが半波長の奇数整数になるような特定周波数で、結晶は共鳴する[M. Rodahl, F. Hoeoek, A. Krozer, P. Brzezinski and B. Kasemo, Quartz crystal microbalance setup for frequency and Q-factor measurements in gaseous and liquid environments, Review of Scientific Instruments 66 (1995) pp. 3924-3930]。エネルギー的に最も好ましい半波長の数は１である。共鳴周波数は、結晶の厚さによって異なるが、通常はＭＨｚ領域にある。板の表面上における質量変化により、共鳴周波数が変化する。０．０１Ｈｚの周波数変化を容易に測定できることから、ＱＣＭは、質量変動を測定するための敏感なセンサーになる。多くの特許および他の文献が、圧電石英結晶（ＱＣＭ）の、例えば様々な免疫測定技術、および細菌およびウイルスの検出における、親和力に基づく化学的センサー／検出器としての使用を記載している。これらの用途のほとんどで、ＱＣＭ計器を、相互作用対、例えば抗体と抗原、間の相互作用の後における結晶の重量増加を分析するのに使用している。
【０００４】
小さな分子を従来の免疫センサーで分析することには、応答が遅い、すなわちセンサー結晶の重量変化が小さいために、明らかな難点がある。小さな分子の必要な検出を行うには、装置の感度を改良しなければならない。小さな分子の検出可能性を改良するには、小さな分子を大きな分子と、小さな分子と大きな分子との間の特異的な相互作用により反応させる必要がある。例えば、小さな抗原分子を抗体と反応させて抗体に特異的に結合させ、容易に検出できる抗原−抗体複合体を形成する。抗体に対する親和力がアナライト抗原より小さい抗原誘導体を表面に固定すると、これらの抗原に対して特異的な抗体を、固定された抗原に可逆的に結合することができる。次いで、溶液中にアナライト抗原が存在すると、固定された抗原から抗体が置換され、アナライト抗原との抗原−抗体複合体が形成される。抗体がマーカー、例えば蛍光標識、を有する場合、形成された複合体は、そのマーカーを利用して検出することができる。他方、固定された抗原が質量変化に敏感なバイオセンサーの表面に固定されると、その表面から抗体が置換されることにより、重量損失が起こる。そのような置換反応を本発明で使用する。
【０００５】
有機硫黄化合物、例えばアルキルチオール、は、十分に秩序付けられた、密に充填されたＳＡＭを金基材上に形成するのに使用できる。硫黄と金との間の強力な化学結合が分子を表面に結びつける。基材に固定された(pinned)後（これは数秒間で起こる）、分子は、アルキル鎖間のファンデルワールス力のために、密に充填された構造に組織化し始める。この後者の過程は、時間がかかり、十分に秩序付けられたＳＡＭが完成するまでに数時間ないし数日かかることもある。使用する分子の長さは、得られるＳＡＭの特性に強い影響力を有する。すべてトランスのＳＡＭは、完全に秩序付けられ、密に充填された単分子層であるのに対し、品質の悪いＳＡＭは、完全な、または末端のゴーシュ（多かれ少なかれスパゲッティ状）のような欠陥を有する。ＳＡＭ中の分子は、炭素鎖の固定(pinning)距離とファンデルワールス直径の大きさとの不適合のために、２５〜４０゜の鎖傾斜を示す[B. Liedberg and J.M. Cooper, Bioanalytical applications of self-assembled monolayers in "Immobilized Biomolecules in Analysis: A Practical Approach", T. Cass and F.S. Liegler (Eds.), Biosensors, Oxford university press, Oxford, pp. 55-78]。分子の遊離末端は、所望の基またはタンパク質にも結合することができる。このようにして、面白い、有用な特性を有する表面を設計することができる。異なったアルキルチオールを混合することにより、多様性がさらに増大する。しかし、装填溶液中のある種のチオール混合物は、同じ混合物のＳＡＭを必ずしも形成しないことに注意すべきである。反対に、自己集合(self-assembly)中に起こる複雑な熱力学的過程のために、形成される方が希である。我々が知る限り、抗原に対して特異的な抗体が、固定された抗原に可逆的に結合し、水溶液中で解離し、その抗体に対する親和力が固定された抗原よりも高いアナライト抗原と結合するような置換反応用には、低分子量抗原と結合したＳＡＭは開発されていない。
【発明の具体的な説明】
【０００６】
本発明は、被覆上の抗原に可逆的に結合した抗体が、解離およびアナライト抗原との反応により置換されるのを監視することにより、水溶液中でアナライト抗原を検出するための分析装置に有用な、固体担体上の被覆された金属表面を提供する。
【０００７】
本明細書および請求項では、抗体の用語は、抗体全体または抗体の、抗原と結合する部分または合成された抗原と結合する分子を含んでなる。
【０００８】
従って、本発明の一態様は、固体担体上の被覆された金属表面に関し、該被覆は、オリゴ（エチレングリコール）末端を有するアミド基を含むアルキル（ＯＥＧ）チオールの自己集合した単分子層（ＳＡＭ）からなる。ＯＥＧチオールは、金属表面に堅く付加したＳＨ基、およびアミド基を経由してＳＡＭ形成ＯＥＧチオール分子に導入された低分子量抗原を含み、アルキル部分は１〜２０個のメチレンを有し、ＯＥＧ部分は１〜１５エチレンオキシ単位を有し、抗原は所望により抗原に対して特異的な抗体に可逆的に結合する。
【０００９】
本発明の一実施態様では、オリゴ（エチレングリコール）は４〜６個のエチレンオキシ単位を有し、アルキル基は１５メチレン単位を有する。
【００１０】
低分子量抗原は、ＳＡＭ形成の前に、抗原上の官能基をＯＥＧチオールの末端官能基と反応させることにより、合成によりＯＥＧ分子に結合させる。これらの官能基は、カルボン酸、アミノおよび水酸基型でよい。抗原が反応のための官能基を持たない場合、反応の前に、低分子量抗原上に官能基を導入する必要があろう。
【００１１】
本発明の固体担体上の被覆された金属表面は、通常、使用の前は抗原に特異的な抗体とは別に保存する。しかし、置換分析に使用する時、固体担体上の被覆された金属表面は、被覆の抗原に可逆的に結合した特異的な抗体を含んでなる。
【００１２】
本発明の固体担体上の被覆された金属表面の金属は、好ましくは金、銀、アルミニウム、クロムおよびチタンからなる群から選択される。現在好ましい金属は金である。
被覆の抗原は、ＳＡＭへの結合を通して固定されていることを除いて、アナライト抗原と同一であるか、またはその誘導体である。例えば、被覆の抗原は、結合された抗体の水溶液中での解離を最適化するために誘導体化することができる。
【００１３】
本発明の被覆のＳＡＭに結合される抗原は、同一であるか、または異なる、すなわち抗原は、同じ特異的抗体に結合してもよいし、または異なった特異的抗体に結合する２種類以上の結合した抗原の混合物があり、水溶液中で幾つかの異なったアナライト抗原の存在を検出することもできる。抗体が異なったマーカー、例えば蛍光マーカー、を有する場合、異なった抗体の置換を検出することができる。しかし、幾つかの異なった抗体の混合物は、通常、試料の、標的抗原のいずれかに対するスクリーニング、例えば試料の、麻薬または爆薬のいずれかに対するスクリーニング、が十分である場合に使用する。互いに異なった親和力を有する、異なった抗原および抗体間の干渉を避けるには、固体担体上に異なった抗原を有する被覆の個別パッチまたはスポットの微小列を導入する必要があろう。
本発明の好ましい実施態様では、被覆の抗原を、所望により誘導体化した爆薬および麻薬からなる群から選択する。選択された被覆の抗原と特異的な抗体との結合が強すぎて、水溶液中での抗体の解離が妨害される場合、例えば官能基、例えばエステルまたはアミノ基、の変性により（本来の基を除去するか、または置き換えることにより）、あるいは抗原分子の一部を排除するか、または新しい官能基もしくは側鎖を抗原分子に導入することにより、抗原分子を化学的に変性し、その抗体に対する親和力を下げることができる。
【００１４】
爆薬は、好ましくはトリニトロトルエン（ＴＮＴ）、ジニトロトルエン（ＤＮＴ）、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリニトロ−１，３，５−トリアジン（ＲＤＸ）、オクタヒドロ−１，３，５，７−テトラニトロ−１，３，５，７−テトラジン（ＨＭＸ）、ペンタエリトリトールテトラニトレート（ＰＥＴＮ）、およびニトログリセリン（ＮＧ）からなる群から選択され、麻薬は、好ましくはコカイン、ヘロイン、アンフェタミン、メタアンフェタミン、カンナビノール、テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、およびメチレンジオキシ−Ｎ−メチルアンフェタミン（エクスタシー）からなる群から選択される。
【００１５】
現在好ましい実施態様では、本発明の固体担体上の被覆された金属表面の固体担体は、圧電結晶電極またはガラス板またはプリズムであり、例えば圧電石英結晶電極上の被覆された金属表面はＰＣＭ装置で使用するのに好適であり、ガラス板またはプリズム上の被覆された金属表面はＳＰＲ装置で使用するのに好適である。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明の固体担体上の被覆された金属表面の、被覆から抗体が置換されるのを監視することにより、特異的抗体に対する親和力が被覆の抗原より高いアナライト抗原を水溶液中で検出するための分析装置の一部としての使用に関する。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、アナライト抗原を水溶液中で検出する方法であって、必要であれば、抗体が結合していない本発明の固体担体上の被覆された金属表面を、抗原に特異的な抗体を被覆された金属表面と水溶液中で接触させることにより、活性化すること、抗体を被覆の抗原に結合させること、過剰の抗体を除去すること、抗体に対する親和力が被覆の抗原より高いアナライト抗原を含む可能性がある水溶液を、被覆に可逆的に結合した抗体と接触させ、抗体を解離させ、アナライト抗原と反応させること、および分析装置を使用して被覆された金属表面上の質量損失を検出することを含んでなる方法に関する。
【００１８】
本発明の方法の一実施態様では、分析装置は、圧電結晶微量天秤装置および表面プラズモン共鳴バイオセンサーからなる群から選択される。
現在好ましい実施態様では、分析装置は、本発明の固体担体上の被覆された金属表面が中に配置されているフローセルを備えてなる。
ここで本発明を幾つかの図面および実験の説明により例示するが、本発明は、具体的に説明する細部に限定されるものではない。
【００１９】
実験の説明
２種類の分子（第一はタンパク質をはじき、第二はＴＮＴ類似体である）を含み、それによって、低レベルの非特異的結合を示す様々な量の類似体を含むＳＡＭを得ることができる混合単分子層を製造した。
【００２０】
最初の工程は、オリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）末端を有するアミド基を含むアルキルチオールから構築されたＳＡＭの耐タンパク質特性を評価することであった。この目的に選択した２種類の分子は、ＥＧ４およびＥＧ６である（図４）。以前の報告は、これらの分子のはじく特性を示している[P. Harder, M. Grunze, R. Dahint, G.M. Whitesides and P.E. Laibinis, Molecular conformation in oligo(ethylene glycol)-terminated self-assembled monolayers on gold and silver surfaces determines their abilitiy to resist protein adsorption, Journal of Physical Chemistry B, 102 (1998) pp. 426-436]。それぞれ純粋なＥＧ４およびＥＧ６、ならびにこれら２種類の異なった組成のＳＡＭを、幾つかの技術、すなわちヌルエリプソメトリー、接触角度ゴニオメトリーおよび赤外線反射吸収分光法（ＩＲＡＳ）の使用により試験した。
【００２１】
さらに、すべて２，４−ジニトロベンゼン末端基を含む３種類のＴＮＴ類似体分子（ＡＮＡ１、ＡＮＡ２およびＡＮＡ３）（図５）を個別に、および上記のＯＥＧ組成物の中の好適な候補との様々な混合で試験した。次いで、これらの混合ＳＡＭを、純粋なＯＥＧＳＡＭに使用したのと同じ技術により試験した。さらに、１００％類似体（１、２および３個別に）から製造されたＳＡＭをＸ線光電子顕微鏡（ＸＰＳ）で試験した。
【００２２】
ヌルエリプソメトリーおよびＩＲＡＳを使用し、ＡＢＴＮＴを結合する容量も、すべてのＴＮＴ類似体に対して様々な混合比で測定した。その上、ＴＮＴへの露出に応答するＡＢＴＮＴの置換強度を、ＳＰＲおよびＱＣＭにより試験した。
【００２３】
化合物
ＥＧ４およびＥＧ６分子は、the division of Applied Physics and Chemistry, Department of Physics and Measurement Technology, Linkoeping University、ウエーデン、から入手し、ＡＮＡ１、ＡＮＡ２およびＡＮＡ３は、the division of Chemistry, Department of Physics and Measurement Technology, Linkoeping University、ウエーデン、で合成した。ＡＢＴＮＴおよびＴＮＴは、Biosensor Application Aweden ABから入手した。
【００２４】
試料の調製
シリコンウェハーをＴＬ２（MilliQ水：２５％過酸化水素：３７％塩化水素６：１：１、８５℃で１０分間）中で洗浄し、MilliQ水中で十分にすすぎ、窒素ガス中で乾燥させてから、電子線蒸発により、５Åチタンおよび２０００Å金の被覆を施した。使用した装置は、Balzers UMS 500 Pシステムである。蒸発速度は、チタンおよび金に対してそれぞれ１Å／ｓおよび１０Å／ｓであった。少なくとも１０−９の基本圧力を維持し、蒸発中、圧力は常に低い１０−７のスケールにあった。この種の表面を、ＳＰＲおよびＱＣＭ測定以外のすべての実験に使用した。ＳＰＲ表面（通常の金）は、Biacore AB, Uppsala, スエーデン、から、金被覆したＱＣＭ結晶はBiosensor Applications Swedenから入手した。ＳＰＲ実験に使用した表面は、その他の実験に使用した表面と同等の表面粗さを有していたのに対し、ＱＣＭ結晶の表面被覆は、はるかに粗いものであった。
【００２５】
チオール装填溶液に露出する前に、試料表面をＴＬ１（MilliQ水：２５％過酸化水素：３０％アンモニア５：１：１、８５℃で１０分間）中で洗浄し、MilliQ水中で十分にすすいだ。９９．５％エタノールを基剤とする装填溶液中のチオールの濃度は、純粋なチオール溶液ならびに混合チオール溶液に対して２０μＭであった。表面の温置は、室温条件で約４０時間行った。試料を９９．５％エタノール中で２回すすぎ、次いで３分間超音波処理（ＱＣＭ結晶上の金被覆はこの工程に耐えられないので、この処理は省略した）し、９９．５％エタノール中でさらに２回すすいだ。他に指示がない限り、これらの表面は、純粋な９９．５％エタノール中で最高８時間保存してから、窒素ガス中で乾燥させ、分析した。ＩＲＡＳおよびヌルエリプソメトリーで検査した多くの試料も、室内条件で３０分間、ＡＢＴＮＴ濃度０．０２ｇ／Ｌで温置し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で調製し、再度検査した。試料は常に、ＴＬ１洗浄したピンセットで取り扱った。
【００２６】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
ＳＰＲ実験には、Biacore ABから入手した、温度制御フローセルを備えた２種類の異なった計器を使用した。一連の実験を、２フローチャネルを備えたBiacoreX装置で行った。これらの実験に対して、流量は１０μＬ／分に設定し、試料表面に、ＡＢＴＮＴ（０．０２ｇ／Ｌ）７０μＬ注入により装填した。続いて濃度１００ｐｇ／μＬおよび１０ｎｇ／／μＬのＴＮＴ溶液を別のフローチャネル中に注入して置換を引き起こし、ＡＢＴＮＴを表面から解離させた。
【００２７】
使用した第二の計器は、４フローチャネルを備えたBiacore2000であった。流量は５０μＬ／分であり、注入量はすべて１００μＬであった。４フローチャネルは、常に連続的に流した。前と同様に、注入したＡＢＴＮＴは、濃度が０．０２ｇ／Ｌである。ＴＮＴ注入濃度は１、１０および１００ｐｇ／μＬであった。
【００２８】
すべての場合で、流した緩衝液はＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり、ＡＢＴＮＴおよびＴＮＴ溶液はどちらも同じ媒体中で調製した。ＳＰＲ実験に使用した試料表面は、約４００Åの金で被覆したガラス板であり、フローセル温度は２５℃に維持した。
【００２９】
石英結晶微量天秤（ＱＣＭ）
ＱＣＭ測定は、Biosensor Applications Sweden ABから入手した、僅かに変形したフローセルシステムＶ２Ｂで室内条件で行った。使用したAT-cutＱＣＭ結晶は、共鳴周波数１０ＭＨｚの厚させん断モード型であった。堆積させたチタンおよび金層の厚さは、それぞれ２５０〜３００Åおよび４００〜４５０Åであった。パラメータはすべて、Biacore2000による実験と同様に、すなわち流量５０μＬ／分、注入量１００μＬ、ＡＢＴＮＴ濃度０．０２ｇ／Ｌ、ＴＮＴ濃度１、１０および１００ｐｇ／μＬ、および流した緩衝液ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に設定した。ここで注意すべきは、ＴＮＴ注入は、同じフローチャネルで順次行った、つまり事実上、ＴＮＴに露出していない表面には１ｐｇ／μＬＴＮＴ注入だけを行った。
結果
【００３０】
ＯＥＧ分子
ＯＥＧ分子ＥＧ４およびＥＧ６を使用して金上にＳＡＭを製造した。純粋なＥＧ４およびＥＧ６ＳＡＭに加えて、両方の分子を含む２種類の混合ＳＡＭを調製し、試験した。後者は、７５％および５０％のＥＧ４を含み、残りがＥＧ６である。混合単分子層は、ＥＧ４：ＥＧ６３：１およびＥＧ４：ＥＧ６１：１で表した。ヌルエリプソメトリーおよび接触角度ゴニオメトリーにより測定したＥＧ４およびＥＧ６の様々な組成物のＳＡＭ特性を表１に示す。自己集合製法は、良好な反復性を示し、最近の知見[R. Valiokas, M. Oestblom S. Svedhem, S.C.T. Svensson, and B. Liedberg; Temperature-driven phase transitions in oligo(ethylene glycol)-terminated self-assembled monolayers, The Journal of Physical Chemistry B, 104(32)(2000)pp.7565-7569, REF.]と一致する結果を得た。接触角度ゴニオメトリー測定で得た小さな角度は、これらのＳＡＭの疎水性が低いことを示しており、これは、はじく特性の多くの前提条件の一つである。ＥＧ６の比率が増加するにつれて、厚さの僅かな増加が認められる。一般的に、疎水性表面は、タンパク質および細胞を引き付ける。さらに、低いヒステリシスの値は、非常に均質な表面を示唆している。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
ＴＮＴ類似体
ＴＮＴ類似体をＥＧ４と混合する前に、それらの類似体を、純粋なＡＮＡ１、２および３をそれぞれ含む装填溶液から集合させたＳＡＭで個別に試験した。エリプソメトリーおよび接触角度測定の結果を表２に示す。予想したように、類似体の厚さはＯＥＧ分子の厚さを超えている。３種類の類似体間の小さな差は、分子の長さの違いを反映しているが、図５に示すそれらの化学的構造を思い起こさせる。ここで認められた接触角度は、ＯＥＧ分子に関して見られた角度より一般的に大きい。また、前進および後退角度間のヒステリシスも大きく、より粗い表面を表している。製造されるＳＡＭに欠陥を導入する可能性がある比較的かさばったジニトロベンゼン末端基が表面から離れる方を向いていることを考えて、これは予想できる。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
ＡＢＴＮＴの固定
ＡＢＴＮＴを結合する能力を、様々なＴＮＴ類似体に対してそれらの異なった混合比で評価した。幾つかの技術を使用したが、それらはよく一致していた。
【００３５】
図６に示す２つのグラフは、ＩＲＡＳおよびエリプソメトリー測定に基づいており、様々な類似体およびそれらのＥＧ４との混合比に対して固定されたＡＢＴＮＴの量を示す。ＩＲＡＳデータに関して、アミドＩバンドの一部を、結合されたＡＢＴＮＴの尺度として使用し、１７１０〜１６６５ｃｍ−１の間で積分する。エリプソメトリーデータは、ＡＢＴＮＴ中で温置した後の被膜厚さの増加を示す。ここで、ＥＧ４はそのタンパク質をはじく特性を示す。固定されたＡＢＴＮＴの量は、事実上ゼロである。さらに、抗体の結合は大量の類似体を含む３種類のＳＡＭに対して極めて類似している。１％類似体溶液から集合させたＳＡＭは、一般的に低い固定度を示す。
【００３６】
官能性試験
３種類のＴＮＴ類似体の、それらの異なった混合比における官能性を考えられる２つの態様で評価した。第一は、それらのＡＢＴＮＴ結合容量であり、第二は、ＴＮＴ露出に応答するＡＢＴＮＴの解離である。両方の場合に、２種類のリアル−タイム技術、すなわちＳＰＲおよびＱＣＭを使用した。ＳＰＲ測定では、応答単位（ＲＵ）の増加は、表面に結合したＡＢＴＮＴ量の増加に対応するのに対し、ＱＣＭ実験では、周波数低下がそれに等しい。３種類の類似体はすべて高い可能性を有するが、ＡＮＡ１が他よりも僅かに高い性能を示したので、ＡＮＡ１に焦点を合わせた。この項におけるすべての実験に対して、流れる緩衝液ＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり、ＡＢＴＮＴおよびＴＮＴ溶液の両方を同じ媒体中で調製した。ＡＢＴＮＴ濃度は常に０．０２ｇ／Ｌであった。
ＡＢＴＮＴ結合容量
【００３７】
ＳＰＲ実験には２種類の計器、すなわちBiacore ABから入手したBiacore2000およびBiacoreX装置を使用した。Biacore2000装置で行った測定では、流量は５０μＬ／分に設定し、試料表面にＡＢＴＮＴ１００μＬを注入して装填した。図７に、ＥＧ４およびＡＮＡ１、およびそれらの混合物のＡＢＴＮＴ結合容量を示す。純粋なＥＧ４のＳＡＭでは非常に低い吸着が見られ、そのタンパク質をはじく特性をさらに支持している。異なった混合比間で同じ相互関係が、１０μＬ／分およびＡＢＴＮＴ注入量７０μＬで行ったBiacoreX計器における実験でも見られた（データは示していない）。
【００３８】
ＱＣＭ測定は、Biosensor Applications Sweden ABにより開発された、僅かに変形したフローセルシステムＶ２Ｂで室内条件で行った。すべてのパラメータは、Biacore2000による実験と同様に、すなわち流量５０μＬ／分およびＡＢＴＮＴ注入量１００μＬに設定した。ＥＧ４およびＡＮＡ１およびそれらの混合物のＡＢＴＮＴ結合容量を示す曲線を図８に示す。やはり、ＥＧ４の低いＡＢＴＮＴ結合容量が明らかに立証されている。
【００３９】
ＡＢＴＮＴの、様々なＳＡＭへの結合は、ＳＰＲおよびＱＣＭ実験で同様である。ＴＮＴ類似体を最も多く含む３種類の表面は、すべてＡＢＴＮＴを表面に非常に良く結合し、抗体の解離は非常に遅い。新しい緩衝液に一定して露出されるので、ある程度のＡＢＴＮＴの解離が予想される、すなわち真の平衡には決して到達し得ない。
ＡＢＴＮＴ置換
【００４０】
ＥＧ４とＡＮＡ１の様々な混合比に対する、ＴＮＴ注入１、１０および１００ｐｇ／μＬに応答するＡＢＴＮＴ脱着を示すＳＰＲ曲線（Biacore2000、流量５０μＬ／分）を図９に示す。これらの表面は、ＡＢＴＮＴ１００μＬの注入により予め装填した。
【００４１】
図９における曲線の外観は、ＡＮＡ１含有量の低いＳＡＭにはＡＢＴＮＴ結合が弱く、そのために置換反応が起こり易くなることを示している。これは、抗体の原子価が２であること、およびそれらの、表面との相互作用の結果であろう。ＡＮＡ１の含有量が高い程、ＡＢＴＮＴが、２個（各エピトープに１個ずつ）のＴＮＴ類似体を見つけ出して結合する機会が多くなる。ＥＧ４：ＡＮＡ１が９９：１である場合、単純にＡＮＡ１が少ないために、これはあまり起きないであろう。抗体の結合強度は、そのエピトープの一方だけが、または両方が抗原に結合しているかによって大きく異なるので、この特徴は相関性が高い。
【００４２】
図１０および１１には、ＱＣＭ測定（流量５０μＬ／分、注入量１００μＬ）から得た対応する結果を示す。ＴＮＴ注入により引き起こされる質量損失は、共鳴周波数の増加として観察される。濃度に比例する周波数の微分ｄｆ／ｄｔも含まれており、通常、より鮮明な検出信号を与える。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１は、幾つかの麻薬、すなわちコカイン、ヘロイン、アンフェタミン、エクスタシー、メタアンフェタミン、カンナビノールおよびテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）の化学式を示す。
【図２】図２は、トリニトロトルエン（ＴＮＴ）および２，４−ジニトロトルエン（２，４−ＤＮＴ）の化学式を示す。
【図３】図３は、固体担体の金属表面、例えばＱＣＭ電極、上で起こる置換機構を図式的に示す。この図は原寸大ではない。実際には、抗体はＴＮＴ分子よりはるかに大きい。図に示すセンサー表面は、自己集合（ＳＡＭ）技術により形成されている。誘導体化されたＴＮＴ分子、ＴＮＴ類似体はＳＡＭを経由して金属表面に共有結合され、ＴＮＴおよびＴＮＴ類似体に対して特異的なＡＢＴＮＴ抗体は、最初は可逆的に、ゆるく、ＴＮＴ類似体に結合し、溶液中のＴＮＴに露出されると、ＡＢＴＮＴは解離し、ＴＮＴと複合体を形成する。
【図４】図４は、ＥＧ４およびＥＧ６の化学構造を示す。
【図５】図５は、ＡＮＡ１、ＡＮＡ２およびＡＮＡ３の化学構造を示す。
【図６】図６は、ＡＢＴＮＴ（０．０２ｇ／Ｌ）中で３０分間温置した後の、ＥＧ４との様々な混合比における、様々なＴＮＴ類似体への抗体の吸着を示す。２種類の技術、すなわちＩＲＡＳおよびヌルエリプソメトリー、の間で優れた一致が観察される。
【図７】図７は、リアル−タイム技術ＳＰＲ(Biacore2000)により、ＥＧ４およびＡＮＡ１、およびそれらの混合物に対して観察されるＡＢＴＮＴ結合容量を示す。流量は５０μＬ／分に設定し、１００μＬ量のＡＢＴＮＴ（０．０２ｇ／Ｌ）を注入した。ＳＡＭ上へのＥＧ４の吸着が低いことに注意する。
【図８】図８は、リアル−タイム技術ＱＣＭ（Ｖ２Ｂ）により、ＥＧ４およびＡＮＡ１、およびそれらの混合物に対して観察されるＡＢＴＮＴ結合容量を示す。流量は５０μＬ／分に設定し、１００μＬ量のＡＢＴＮＴ（０．０２ｇ／Ｌ）を注入した。ＳＡＭ上へのＥＧ４の吸着が低いことに注意する。
【図９】図９は、ＥＧ４およびＡＮＡ１、およびそれらの混合物のＳＡＭに対してＴＮＴ注入１、１０および１００ｐｇ／μＬに対するＳＰＲ応答を示すBiacore2000計器による実験を示す。表面は、１００μＬのＡＢＴＮＴを注入することにより、予め装填した。流量は５０μＬ／分に設定した。
【図１０】図１０は、変形Ｖ２Ｂフローセル機構に対して行ったＱＣＭ測定を示す。流量は５０μＬ／分に設定し、ＴＮＴ注入量はすべて１００μＬであった。表面は、１００μＬを注入することにより、ＡＢＴＮＴ（０．０２ｇ／Ｌ）で予め装填した。ＳＡＭは、１００％および５０％ＡＮＡ１を含む装填溶液から集合させた。注入におけるＴＮＴ濃度は１、１０および１００ｐｇ／μＬであり、これらは連続的に行い、ＴＮＴに予め露出した表面に対して第二および第三のＴＮＴ注入を行った。矢印は注入を示す。
【図１１】図１１は、変形Ｖ２Ｂフローセル機構に対して行ったＱＣＭ測定を示す。流量は５０μＬ／分に設定し、ＴＮＴ注入量はすべて１００μＬであった。表面は、１００μＬを注入することにより、ＡＢＴＮＴ（０．０２ｇ／Ｌ）で予め装填した。ＳＡＭは、１０％および１％ＡＮＡ１を含む装填溶液から集合させた。注入におけるＴＮＴ濃度は１、１０および１００ｐｇ／μＬであり、これらは連続的に行い、ＴＮＴに予め露出した表面に対して第二および第三のＴＮＴ注入を行った。矢印は注入を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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