(57)【要約】本発明は、疾病または先天的欠陥の診断指標としての、ヒストンアミノ末端修飾に特異的な抗体の使用に関する。１つの実施態様において、ヌクレオソームが、ヒストン特異的抗体を用いて患者の血液または血清試料から単離され、そして付随するＤＮＡが、診断およびスクリーニング上の目的で、精製され、分析される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体中の活性な遺伝子配列を検出する方法であって、
該個体由来の体液試料を用意すること；
該試料を、活性な遺伝子配列と結合する修飾されたヒストンと結合する抗体と接触させること；
該抗体と結合したヌクレオソームを単離すること；
該ヌクレオソームと結合したＤＮＡを精製すること；および
該個体中の活性な遺伝子配列を検出するために、精製ＤＮＡによりコード化される遺伝子を同定すること、
の段階を含む、方法。
【請求項２】
抗体が、
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ（配列番号：１）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（配列番号：２）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：３）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：４）、および
Ｓｅｒ（Ｐ）  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：５）、
からなる群から選択されるペプチドと特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遺伝子を同定する段階が精製ＤＮＡをシークエンスすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
精製ＤＮＡが該シークエンス段階の前に増幅される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
遺伝子を同定する段階が、相補鎖のハイブリダイゼーションに適した条件下で、該精製ＤＮＡを既知の核酸配列と接触させることを含む（ここで、その相補体への精製ＤＮＡのハイブリダイゼーションが当該遺伝子を同定するものである）、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
精製ＤＮＡが、それを既知のＤＮＡ配列と接触させる前に標識される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
既知のＤＮＡ配列が固体表面に固定化される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
体液が、尿、血液、リンパ液、血漿、または血清からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
体液が血液、血漿、または血清である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
個体中の不活性な遺伝子配列を検出する方法であって、
該個体由来の体液試料を用意すること；
該試料を、不活性な遺伝子配列と結合する修飾されたヒストンと結合する抗体と接触させること；
該抗体と結合したヌクレオソームを単離すること；
該ヌクレオソームと結合したＤＮＡを精製すること；および
該個体中の不活性な遺伝子配列を検出するために、精製ＤＮＡによりコード化される遺伝子を同定すること、
の段階を含む、方法。
【請求項１１】
抗体が、
Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：６）、
Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号：８）、および
Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（配列番号：９）、
からなる群から選択されるペプチドと特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
遺伝子を同定する段階が、精製ＤＮＡをシークエンスすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
精製ＤＮＡが、該シークエンス段階の前に増幅される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子を同定する段階が、相補的配列のハイブリダイゼーションに適した条件下で、該精製ＤＮＡを既知の核酸と接触させることを含む（ここで、その相補体への精製ＤＮＡのハイブリダイゼーションが遺伝子を同定するものである）、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
精製ＤＮＡが、それを既知のＤＮＡ配列と接触させる前に標識される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
既知のＤＮＡ配列が固体表面に固定化される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
既知のＤＮＡ配列が固定化されたＤＮＡマイクロアレイを含み、該固定化ＤＮＡとその相補体との結合が検出可能なシグナルを発生させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
体液が血液または血清である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
個体のアポトーシス細胞から放出されるヌクレオソームを単離する方法であって、
血液または血清試料を用意すること；
該試料を、アミノ酸配列Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（Ｐ）  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ（配列番号：７）を含むペプチドと特異的に結合する抗体を含む組成物と接触させること；
アポトーシス細胞から放出されたヌクレオソームを回収するために、該抗体と結合したヌクレオソームを単離すること、
の段階を含む、方法。
【請求項２０】
疾病状態と関係する染色質の変化を検出する方法であって、
ヒストンタンパク質に特異的な抗体の使用により、健常個体および罹病個体から採取された試料から、ヌクレオソームの第１および第２のプールをそれぞれ作成するために、無細胞のヌクレオソームを単離すること；
精製ＤＮＡの第１および第２のプールを作成するために、該単離されたヌクレオソームの第１および第２のプールと結合したＤＮＡを精製すること；
相補配列間のハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、ＤＮＡの第１および第２のプールを同一セットのＤＮＡマイクロアレイと接触させること（ここで、精製されたプールのＤＮＡ中の配列と、マイクロアレイの核酸配列とのハイブリダイゼーションが、検出可能なシグナルを発生させるものである）；
疾病状態と関係する染色質の変化を検出するために、精製ＤＮＡの第１のプールで得られるハイブリダイゼーションパターンを、精製ＤＮＡの第２のプールに対して比較すること；
の段階からなる、方法。
【請求項２１】
ヒストン特異的抗体が、
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ（配列番号：１）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（配列番号：２）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：３）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：４）、
Ｓｅｒ（Ｐ）  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：５）、
Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：６）、
Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号：８）、および
Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（配列番号：９）、
からなる群から選択されるペプチドと特異的に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
該精製ＤＮＡが、それをマイクロアレイと接触する段階の前に増幅される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
該精製ＤＮＡが、それをマイクロアレイと接触させる段階の前に標識される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
疾病状態を検出する方法であって、
修飾されたヒストンに特異的な抗体の使用により、個体から無細胞のヌクレオソームを単離すること；および
単離されたヌクレオソームと結合した核酸配列の同一性を決定すること（ここで、特定の核酸配列の同定が、疾病状態の診断的特徴となるものである）；
の段階を含む、方法。
【請求項２５】
抗体が、アミノ酸配列Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（Ｐ）  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ（配列番号：７）を含むペプチドと特異的に結合する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
該核酸配列が核酸をシークエンスすることにより同定される、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
米国政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＧＭ４０９２２およびＧＭ５３５１２の下、米国政府の援助で成された。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、２００２年２月２０日に出願された仮特許出願番号６０／３５８，３２５、および２００２年３月１９日に出願された仮特許出願番号６０／３６５，４５９（これらの記載は引用により全体として本明細書に取り込まれる）に基づき、米国特許法第１１９（ｅ）条の規定による優先権を主張する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、様々な疾病状態を診断するための組成物および方法に関する。より具体的には、該方法は、個体の血液、血漿、または血清から無細胞のヌクレオソームを単離するために、ヒストンタンパク質の翻訳後修飾により作り出される固有のヒストンエピトープに特異的な抗体を用いる。
【０００４】
発明の背景
真核生物において、ＤＮＡは、繰り返し染色質サブユニットであるヌクレオソームを形成するために、ヒストンタンパク質と複合体を形成する。ＤＮＡのこのパッケージングは、転写または複製の様なＤＮＡを鋳型とするプロセスのため、ＤＮＡへアクセスしようとしているタンパク質に対して厳しい制限を設けている。ヒストンアミノ末端の翻訳後修飾は、真核生物の細胞ゲノムの染色質構造の決定、ならびに細胞遺伝子の発現の制御において、重要な働きをすることが急速に明らかになりつつある。
【０００５】
ヒストンのアミノ末端「テール」ドメインで生じるアセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、およびＡＤＰリボシル化を含む、多くのヒストンの共有結合性修飾が報告された。該修飾型の多様性、および該修飾を受ける残基の顕著な特異性は、複雑な序列および組合せられた機能が不明確なままであることを示す。ヒストンアミノ末端で生じると知られている共有結合性修飾のうち、アセチル化がおそらく最も研究されており、かつ理解されている。最近の研究により、染色質中のプロモーターを標的とするための動員に応答して、ヒストンのリジン残基をそれぞれ特異的にアセチル化、または脱アセチル化する、既に特徴付けられた活性化補助因子および抑制補助因子が同定された（Berger (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 11,336-341参照）。該研究は、染色質リモデリングがヌクレオソームの鋳型からの転写の制御において基礎的な働きをするという、説得力のある証拠を提供する。
【０００６】
特異的な翻訳後修飾を生じるヒストンを特異的に認識する抗体の使用により、本発明者は「ヒストンコード」を解明しつつある。特に、ヒストンタンパク質、およびそれに関係する共有結合性修飾が、染色質構造を変えることができる機序（これにより、転写の「オン・オフ」状態における遺伝的相違、あるいは特定された高次構造を定義することにより、染色体の安定的な伝播を導く）に関与するという証拠が明らかになりつつある。従って、該特異的な修飾が、結合するＤＮＡの転写状態を示すマーカーとして働き得る。
【０００７】
ヌクレオソームは、健常個体（Stroun et al., Annals of the New York Academy of Sciences 906: 161-168 (2000)）、ならびに罹患個体の血清で検出され得ると最近報告された。さらに、血清ヌクレオソーム濃度は、良性および悪性疾病に罹患している患者で相当高いと報告された（Holdenrieder et al., Int J Cancer, 95 (2): 114-120 (Mar 20,2001)）。腫瘍発生患者でのヌクレオソームの高濃度は、増殖中の腫瘍で自然発生的に生じるアポトーシス由来であると推測される。従って、患者血中のヌクレオソームの上昇した濃度の存在が、増加した細胞死と関係する疾病の診断的特徴（disgnostic）となり得る（Holdenrieder et al., Anticancer Res, 19 (4A): 2721-2724 (1999)）。
【０００８】
本発明に先立ち、発明者は、検出されたヌクレオソームを含むヒストンの種類を特徴付けることなく、個体の血中に存在するヌクレオソームの総数を単純にモニターした。血中を循環しているヌクレオソームは、固有に修飾されたヒストン（ここで、固有のヒストンエピトープおよび／または結合するＤＮＡが、特定の疾病状態と相関し得る）を含有すると予測される。従って、本発明の１つの態様は、修飾されたヒストンタンパク質と特異的に結合する抗体の使用による無細胞のモノまたはオリゴヌクレオソームの同定に関する。該修飾されたヒストンの同定は、疾病および先天的欠陥の診断マーカーとなり得る。
【０００９】
発明の要約
本発明は、個体の体液中に存在するヌクレオソーム（ここで、ヌクレオソームは１以上の修飾されたヒストンを含む）を検出する、非侵襲的診断方法に関する。より具体的には、抗体がヒストンのアミノ末端の特異的翻訳後修飾に対して作成され、そして該抗体を用いて、事前に選択された修飾されたヒストンを含有する無細胞ヌクレオソームが検出される。異なる種類の修飾されたヒストンの総数および／または割合の変化が、診断目的上用いられ得る。さらに、特定の核酸配列と結合する種類の修飾されたヒストンが、疾病状態の診断に用いられ得る。
【００１０】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のアミノ末端で見出される翻訳後修飾を表す図である。
【００１１】
発明の詳細な説明
定義
本発明の明細書および請求項において、次の用語は、以下で説明する定義にのっとり用いられる。
本明細書で用いられる用語「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに１本鎖および２本鎖ＤＮＡおよびｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および同類の用語は、核酸類似体、すなわちリン酸ジエステルバックボーン以外を有する類似体も含む。例えば、当該技術分野で知られており、かつバックボーンにリン酸ジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」が本発明の範囲内であると意図されている。
【００１２】
本明細書で用いられる用語「相補的」または「相補性」は、塩基対規則により関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド配列）に関して用いられる。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に相補的である。
【００１３】
本明細書で用いられる用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸の対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーション、およびハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の結合の強さ）は、核酸間の相補性の程度、関与条件のストリンジェンシー、形成された結合の長さ、および核酸中のＧ：Ｃ比の様な因子により影響される。
【００１４】
用語「ペプチド」は、３個のアミノ酸（ここで、アミノ酸は、天然に存在するかまたは合成（非天然に存在する）アミノ酸である）配列を包含する。ペプチド模倣物は、次の修飾のうち１つ以上を有するペプチドを含む：
１．１個以上のペプチジル−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−結合（ボンド）が、−−ＣＨ２−カルバメート結合（−−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−−）、ホスホン酸塩結合、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−−）結合、尿素（−−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−−）結合、−−ＣＨ２−第２アミン結合の様な非ペプチジル結合により、またはアルキル化ペプチジル結合（−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−）（ここで、ＲはＣｌ−Ｃ４アルキルである）で置き換えられた、ペプチド；
２．Ｎ末端が、−−ＮＲＲ１基、−−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基、−−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基、−−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（ここで、ＲおよびＲ１は水素であるか、またはＣｌ−Ｃ４アルキルである（ただし、ＲおよびＲ１は共に水素ではない）に誘導体化されている、ペプチド；
３．Ｃ末端が、−−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（ここで、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ４アルコキシからなる群から選択される）、および−−ＮＲ３Ｒ４（ここで、Ｒ３およびＲ４は、水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択される）に誘導体化されている、ペプチド。
【００１５】
ペプチド中の天然に存在するアミノ酸残基は、次の通り、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法連合（Biochemical Nomenclature Commission）により推奨された方法で省略される：フェニルアラニンは、ＰｈｅまたはＦであり；ロイシンは、ＬｅｕまたはＬであり；イソロイシンは、ＩｌｅまたはＩであり；メチオニンは、ＭｅｔまたはＭであり；ノルロイシンは、Ｎｌｅであり；バリンは、ＶａｌまたはＶであり；セリンは、ＳｅｒまたはＳであり；プロリンは、ＰｒｏまたはＰであり；トレオニンは、ＴｈｒまたはＴであり；アラニンは、ＡｌａまたはＡであり；チロシンは、ＴｙｒまたはＹであり；ヒスチジンは、ＨｉｓまたはＨであり；グルタミンは、ＧｌｎまたはＱであり；アスパラギンは、ＡｓｎまたはＮであり；リシンは、ＬｙｓまたはＫであり；アスパラギン酸は、ＡｓｐまたはＤであり；グルタミン酸は、ＧｌｕまたはＥであり；システインは、ＣｙｓまたはＣであり；トリプトファンは、ＴｒｐまたはＷであり；アルギニンは、ＡｒｇまたはＲであり；グリシンは、ＧｌｙまたはＧであり、そしてＸは任意のアミノ酸である。他の天然に存在するアミノ酸は、例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン等を含む。
【００１６】
本明細書で用いられる用語「保存的アミノ酸置換」は、次の５つの群のうち１つとの交換として、本明細書で定義される：
Ｉ．小さい、脂肪族、非極性、またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性、負に荷電した残基、およびそのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性、正に荷電した残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．大きい、脂肪族、非極性の残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；
Ｖ．大きい、芳香族性残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「精製された」および類似の用語は、天然環境中の分子または化合物と一般的に関係する他の要素が実質的にない（少なくとも６０％ない、好ましくは７５％ない、そして最も好ましくは９０％ない）形態の分子または化合物の単離に関する。
【００１８】
用語「疾病状態」は、先天的欠陥、癌の様な病的状態、および環境因子および病原菌（細菌、ウイルス等）に対する応答性を含む、生きている動物または植物の正常状態の障害と関係するいずれかの状態を包含することが意図されている。
【００１９】
「治療薬剤」、「医薬剤」、または「薬剤」は、患者の疾患、苦痛、疾病、または傷害の処置（予防、診断、緩和、または治癒を含む）において用いられる任意の治療、または予防薬剤を意味している。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「処置すること」は、特異的な疾患または状態と関係する症状を緩和すること、および／または該症状を予防または除去することを含む。例えば、癌を処置することは、癌細胞の成長および／または分裂を予防すること、または遅延させること、ならびに癌細胞を殺すことを含む。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「医薬的に許容される担体」は、リン酸緩衝食塩水溶液、および油／水または水／油乳濁液の様な水および乳濁液、および様々な種類の湿潤剤の様な、任意の標準的な医薬担体を包含する。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメントの様なその結合フラグメントを意味している。
本明細書で用いられる用語「非経腸」は、皮下、静脈内、または筋肉内投与を含む。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「修飾されたヒストン」は、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４からなる群から選択されるヒストンタンパク質（ここで、アミノ末端の少なくとも３０個以上のアミノ酸残基のうち１個以上が、アセチル化、メチル化、リン酸化、またはユビキチン化により翻訳後修飾されている）を意味している。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「修飾されたアミノ酸」は、アミノ酸と共有結合した１個以上の修飾基を含むアミノ酸残基を含む。例えば、それぞれの修飾されたリジン残基は、モノ−、ジ−、またはトリ−メチル化されるためのキャパシティーを有し、そして一般的にメチル化リジンについては、該可能性の３つ全てを包含することが意図されている。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「活性な遺伝子配列」は、転写活性に適任である遺伝子を意味している。
本明細書で用いられる用語「不活性な遺伝子配列」は、転写活性に適任でない遺伝子を意味している。
【００２６】
発明
ヌクレオソームが患者の血中で検出され得ること、および血液ヌクレオソーム濃度レベルの上昇が癌の診断的特徴となることが、最近報告された。しかしながら、この先行研究はヌクレオソーム集団の総数を単純にモニターし、ヒストンの中身に基づき、互いに異なるヌクレオソームの部分集団を説明していない。本発明者は、ヒストンの特定の翻訳後修飾が、染色質構造を変化させ得る機序に寄与することを発見した。そして、該染色質リモデリングは、ヌクレオソームの鋳型からの転写の制御において基礎的な働きをすると信じられている。さらに、本発明者は、ヌクレオソームがアポトーシスの過程を通じて、翻訳後修飾を維持することを最初に証明した。具体的には、実施例１に記載のアポトーシスを経験した乳腺癌細胞由来のヌクレオソームは、そのメチル化、リン酸化、またはアセチル化修飾を維持し、そして該修飾が、該修飾に対して生じた特異的抗体を用いて検出され得る。
【００２７】
本発明は改良された疾病の診断検査に関し、これは、無細胞の修飾されたヌクレオソーム集団の上昇、または変更された染色質構造の存在について、温血動物の血液をスクリーニングすることを含む。より具体的には、本発明は、ヒストンペプチドのアミノまたはカルボキシ末端の翻訳後修飾と特異的に結合する抗体の使用に関する。検出されたヌクレオソーム上の固有のヒストンの存在は、染色質構造、および修飾されたヒストンタンパク質と結合する核酸配列の転写活性に関する情報を提供する。
【００２８】
従って、本発明は、哺乳類、より好ましくはヒトの血液（および、他の体液）からヌクレオソームを単離するために、コアヒストンタンパク質のフレキシブルなＮ末端およびＣ末端テール上の翻訳後修飾により形成された固有のエピトープに対して特異的な抗体を用いる、改良された診断スクリーニングに関する。本発明で用いる固有のエピトープとして働くヒストンアミノ酸残基の適当な翻訳後修飾が、図１に記載されている。個体血中の特異的なヒストン修飾を１個以上検出することは、特定の疾病状態の診断的特徴となる。
【００２９】
本発明の１つの実施態様をに従って、活性な遺伝子配列（真性染色質）、または不活性な遺伝子配列（異質染色質）と結合する固有のヒストンマーカーに対する抗体を用いて、疾病状態を示す不適当な遺伝子発現を検出可能である。例えば、個体の血中または他の体液中に存在するヌクレオソーム集団のスクリーニングは、腫瘍抑制遺伝子の不活性化、あるいは癌遺伝子の活性化を明らかにする。
【００３０】
個体中の該活性化または不活性化遺伝子配列の検出方法は、個体から体液試料を得る段階、および修飾されたヒストンに特異的な抗体を用いて、該試料からヌクレオソームを単離する段階を含む。該ヌクレオソームは、尿、血液、リンパ液、血漿、または血清を含む１以上の患者体液から回収可能である。従って、疾病状態を診断するための最小限に侵襲性のスクリーニングを提供する。１つの実施態様において、該ヌクレオソームは、個体の血液、血漿、または血清から回収される。体液中に存在するヌクレオソームの安定性を増強するために、該試料は好ましくは１０ｍＭ  ＥＤＴＡで処理され、そして−２０℃で保存される。修飾されたヒストンを標的とする抗体との免疫沈降の前処理（precursor）として、血液、血漿、または血清中のヌクレオソームは、ポリ−リジンまたはストレプトアビジンでコートされた固体支持体への集積により、まず濃縮され得る。後者の方法は、ストレプトアビジンでの捕獲に先立ち、ヒストンを優先的にビオチン化するために、血中に存在するビオチン化トランスフェラーゼ活性を利用する（Hymes & Wolf, J. Nutr. 129, 485S-489S, 1999）。
【００３１】
本発明で用いられる抗修飾ヒストン抗体は、ヒストンテールの翻訳後修飾により形成される既知のヒストンエピトープを標的とする抗体のいずれからも選択され得る。本発明で用いられる抗体のエピトープとして使用され得る、ヒストンテールのいくつかの翻訳後修飾のリストが、図１で提供される。該抗体をそれぞれ用いて、対応する修飾されたヒストンを含有する患者血中に存在するヌクレオソームを単離できる。血中の修飾されたヒストンの同定は、特定の疾病または疾患を示し得る。個体中の該抗体により検出された無細胞のヌクレオソーム数の有意な増加（野生型レベルと比べて）、および／または別のヒストン修飾と比べて、１以上の特定のヒストン修飾の割合の変化は、特定の疾病状態を示し得る。
【００３２】
１つの実施態様において、活性な遺伝子配列と結合すると知られている修飾されたヒストンと結合するか、あるいは不活性な遺伝子配列と結合する修飾されたヒストンと結合する抗体が、選択される。遺伝子活性化と関係するものとして同定されたヒストンエピトープは、次のものを含む：
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ（配列番号：１）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（配列番号：２）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：３）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：４）、および
Ｓｅｒ（Ｐ）  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：５）、
ここで、「Ｓｅｒ（Ｐ）」、「Ａｒｇ（Ｍ）」、および「Ｌｙｓ（Ａ）」は、それぞれ、修飾されたアミノ酸であるリン酸化セリン、メチル化アルギニン、およびアセチル化リジンを表す。１つの実施態様において、抗体は、配列番号：１を含むペプチド配列（ここで、リジン残基はジメチル化されている）に特異的である。遺伝子不活性化と関係するものとして同定されたヒストンエピトープは、次のものを含む：
Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：６）、
Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号：８）、
Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（配列番号：９）。
【００３３】
１つの実施態様において、抗体は、配列番号：８を含むペプチド配列（リジン残基がジメチル化されている）に特異的である。該抗体を用いて、疾病状態を示す如何なる異常遺伝子発現も検出できる。
【００３４】
または、ヌクレオソームと結合する核酸配列（ヒストン修飾の１つの特異的な抗体を用いた免疫沈降により、血液から単離される）は、疾病状態または疾病の可能性の診断を補助するための標準的な技術（すなわち、潜在ウイルスの同定、または他の遺伝子前提条件）を用いて分析され得る。
【００３５】
本発明の１つの実施態様に従って、個体の体液由来のヌクレオソームが、本発明の修飾されたヒストンに特異的な抗体のうち１以上を用いた免疫沈降により単離される。または、本発明の修飾されたヒストンに特異的な抗体は、試料から無細胞のヌクレオソームを単離する方法を提供するための不溶性支持体に結合され得る。該支持体は、粒子または固体形であり、プレート、試験管、ビーズ、球、フィルター、または膜を含み得るが、これらに限られない。不溶性支持体に抗体を固定する方法は、当該技術分野の技術者に既知である。１つの実施態様において、本発明の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーで用いるのに適当な不溶性支持体に固定される。標的とする抗原との抗体の特異的な結合を可能とするのに適した条件下で、試料が修飾されたヒストンに特異的な抗体と接触させられた後、修飾されたヒストンを含むヌクレオソームが、当該技術分野の技術者に知られた標準的技術を用いて単離され得る。
【００３６】
ヌクレオソームが試料から単離されると、ヌクレオソームと結合したＤＮＡが、ＰＣＲまたは他の増幅技術により、標準的な技術（回収されたＤＮＡを必要に応じて増幅することを含む）を用いて回収され得る。１つの実施態様に従って、免疫沈降されたヌクレオソームと結合したＤＮＡが精製され、そして該ＤＮＡによりコード化される遺伝子が同定される。体液試料からヌクレオソームをまず単離するために用いられた特異的な抗体に依存して、該方法は、個体中の活性または不活性な遺伝子のいずれかを同定することが可能となる。
【００３７】
単離されたヌクレオソームと結合したＤＮＡによりコード化される遺伝子を同定するために用いられる段階は、当該技術分野の技術者に既知の分析的方法のいずれかを含む。１つの実施態様に従って、該遺伝子配列は、精製されたＤＮＡを直接マイクロシークエンスすることにより同定される。または、１つの実施態様において、精製されたＤＮＡは、ＰＣＲ技術または他の増幅技術を用いてまず増幅され、その後配列分析の様なＤＮＡ分析がさらになされる。
【００３８】
１つの実施態様において、単離されたヌクレオソームと結合したＤＮＡによりコード化される遺伝子は、相補的配列のハイブリダイゼーションに適した条件下で、既知の核酸配列と精製されたＤＮＡを接触させることにより同定され得る（ここで、その相補鎖への精製ＤＮＡのハイブリダイゼーションが当該遺伝子を同定するものである）。例えば、既知のＤＮＡ配列または精製されたＤＮＡのいずれかが標識プローブとして働き、そして非標識配列が固体表面に固定される、サザンブロット分析が行われ得る。
【００３９】
核酸プローブは、当該技術分野で既知の標準的技術（本発明は、特定の検出システムまたは標識のいずれかに制限されることを意図していない）を用いて検出可能なマーカーで標識され得る。例えば、核酸プローブは、フルオロフォア、放射性同位元素、またはビオチンまたはジコキシゲニンの様な非同位体標識物質で標識され得る。
【００４０】
１つの実施態様に従って、重要な種々の遺伝子を表す既知の核酸配列が、固体表面に固定化される。好ましくは、該配列はマイクロアレイ（既知の配列それぞれが固体表面上の位置を決められている）の形で固定化される。該方法において、相補鎖と精製されたヌクレオソームＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションにより固体表面の特定の領域で形成されたシグナルによって、該配列によりコード化される遺伝子を同定する。１つの実施態様において、精製されたヌクレオソームＤＮＡが標識され（そして、１つの実施態様においては、ＤＮＡが増幅され、続いて標識される）、続いて、相補的配列とのハイブリダイゼーションに適した条件下で、既知の配列のマイクロアレイと接触させられる。事前に決めた時間をおいた後、未結合および非特異的結合物質が該マイクロアレイから洗い出され、そして該アレイが検出可能なシグナルについてスクリーニングされる。
【００４１】
本発明は、アポトーシスを介した細胞死の増加により特徴付けられる疾病状態（例えば、癌）を診断するためのアポトーシスマーカーを利用する方法も包含する。個体中の新生物細胞の存在は、該新生物細胞のアポトーシスの結果として血中のヌクレオソームレベルを上昇させることが示された。従って、本発明者は、ヌクレオソームの分析をアポトーシス細胞から放出されたものに限ることにより、診断スクリーニングの感度を上昇させることを意図している。ひとつのヒストンエピトープが、アポトーシスマーカーとして働くことが同定された（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／２４４０５を参照。この記載は本明細書に取り込まれる）。該エピトープに対する抗体が、様々な人工的な刺激で刺激されて、アポトーシス細胞死経路に入った細胞を同定する。該抗体は、ヒストンＨ２Ｂのアミノ末端ペプチドＳｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（Ｐ）  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ（配列番号：７）（ここで、「Ｓｅｒ（Ｐ）」はリン酸化セリンを表す）に対するものである。該抗体を用いて、アポトーシス細胞から放出されたヌクレオソームを選択的に単離できる。
【００４２】
従って、本発明の１つの態様において、該「アポトーシス抗体」を用いて、アポトーシス／増幅された細胞死と関係する疾病の診断指標として、患者の体液中に存在するヌクレオソームを検出できる。Ｈ２Ｂのアミノ末端から１４番目の位置にあるセリンアミノ酸（Ｓｅｒ１４）は、アポトーシス過程をこれから経験するかまたは既に始まった細胞において、生体内で選択的にリン酸化されるので、該抗体は、疾病を有するかまたは生じるリスクのある個体のアポトーシス細胞から放出された、血中に存在するヌクレオソームを検出するために高感度となる。それゆえ、該抗体は、個体の疾病状態を検出するための特に有効な診断的特徴となる。該診断方法は、血液、血漿、または血清試料を得る段階、該試料を、ペプチドＳｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ（Ｐ）  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ（配列番号：７）の様なＳｅｒ１４の位置でリン酸化されるヒストンＨ２Ｂアミノ末端ペプチドに特異的な抗体を含む組成物と接触させる段階、およびアポトーシス細胞から放出されたヌクレオソームを回収するために該抗体と結合したヌクレオソームを免疫沈降する段階を含む。アポトーシスマーカーの抗体で免疫沈降されたヌクレオソームの閾値が、アポトーシス／増幅された細胞死と関係する疾病状態を予測する。
【００４３】
１つの実施態様に従って、患者から単離された無細胞のヌクレオソームと結合したＤＮＡを分析することにより、患者の腫瘍関連遺伝子を検出する方法が提供される。該実施態様に従って、無細胞のヌクレオソームが、ヒストンタンパク質と特異的に結合する１以上の抗体を用いて、体液から単離される。該ヌクレオソームは免疫沈降され、結合ＤＮＡが精製され、精製されたＤＮＡ配列によりコード化される遺伝子を同定するための分子分析技術の対象とされる。１つの実施態様において、免疫沈降されたヌクレオソームから回収されたＤＮＡは、ＰＣＲを介して必要に応じて増幅され、続いて該ＤＮＡが、相補的な核酸配列のハイブリダイゼーション（ここで、核酸２本鎖の形成により検出可能なシグナルが生じる）に適した条件下で、核酸マイクロアレイと接触させられる。該方法において、無細胞のヌクレオソームと結合したＤＮＡによりコード化される遺伝子が、同定され得る。無細胞のヌクレオソームと結合したＤＮＡによりコード化される特定の遺伝子を同定することは、処置に起因する好ましい効果ならびに副作用についてモニターすることを含む、治療上の処置をモニターするのに特に有用である。さらに、ヒストンのアミノおよびカルボキシテールの翻訳後修飾により作成される、ある種のヒストンエピトープを標的とする抗体を選択することにより、無細胞のヌクレオソームのある種のサブセットが免疫沈降され、そして結合ＤＮＡが分析される。
【００４４】
１つの実施態様に従って、腫瘍関連遺伝子を検出すること、または成人女性中の胎児ＤＮＡを同定する方法が提供される。該方法は、対象の胎児または腫瘍遺伝子と結合した固有に修飾されたヒストンタンパク質を利用して、胎児のＤＮＡか、または原発腫瘍のＤＮＡを単離する段階を含む。例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／２６２８３で既に記載された抗体は、リジン９でアセチル化されたヒストンと結合するＤＮＡを特異的に沈殿させる。母親のＤＮＡと比べて、胎児中の対象の遺伝子と結合したヒストンの異なるアセチル化が、胎児ＤＮＡの単離および同定を可能とする。具体的には、ヌクレオソームを生じる胎児ＤＮＡが選択的に沈殿され、そして該ＤＮＡがＰＣＲまたは別の増幅技術により回収される。免疫沈降されたヌクレオソームから回収されたＤＮＡのシークエンスは、胎児遺伝子、または腫瘍細胞と関係する核酸配列中の変異の存在または不存在の同定を可能とする。従って、該技術は、胎児の遺伝子欠陥のスクリーニング、ならびに早期癌のスクリーニングのための重要な非侵襲的技術となり得る。
【００４５】
本発明の１つの重要な態様において、該方法を用いて、胎児が特定の遺伝子欠陥のヘテロ接合体、あるいはホモ接合体であるかを決定できる。それゆえ、１つの態様において、本発明は、母親がその病気のキャリアーであるときでさえ適切であるという利点を有する、遺伝子疾病および形質の非侵襲的出生前診断を可能とする。さらに、該出生前診断は、家族調査を必要とせずに行われ得る。
【００４６】
１つの実施態様において、本発明の抗体が標識される。本発明が特定の検出システムまたは標識に限られることは意図されていない。抗体は、フルオロフォア、放射性同位元素、またはビオチンまたはジコキシゲニンの様な非放射性標識試薬で標識される；ビオチンを含有する抗体は、蛍光色素の様な任意の検出可能な標識と結合した「検出試薬」（例えば、アビジン）を用いて検出される。１つの実施態様において、本発明のヒストン特異的抗体は、２次抗体（ここで、２次抗体は標識され、かつ１次（ヒストン特異的）抗体に特異的である）の使用により検出される。または、該ヒストン特異的抗体は、放射性同位元素、またはＦＩＴＣまたはローダミンの様なフルオロフォアで直接標識され；かかる場合、２次検出試薬は、標識プローブの検出に必要とされない。続いて、血中の修飾されたヒストンの存在が、関連標識抗体の使用により検出され得る。
【００４７】
１つの実施態様に従って、疾病状態と関連する染色質変化を検出する方法が提供される。該方法は、ヌクレオソームの第１および第２のプールをそれぞれ作り出すために、健常個体および罹病個体から採取された生物学的試料から、無細胞のヌクレオソームを単離する段階を含む。典型的には、該生物学的試料は、血液試料またはその派生物（例えば、血清または血漿）を含むが、リンパ液、尿、唾液の様な、細胞外ＤＮＡを含有する他の体液も用いられ得る。１つの好ましい実施態様において、ヌクレオソームは、１以上のヒストン特異的抗体の使用により、生物学的試料から回収される。１つの実施態様において、ヒストン特異的抗体は、図１で示されるヒストンのアミノおよびカルボキシテールの翻訳後修飾の１つにより、作られるエピトープと結合する抗体である。１つの実施態様において、ヒストン特異的抗体は、
Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ（配列番号：１）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（配列番号：２）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：３）、
Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：４）、
Ｓｅｒ（Ｐ）  Ｇｌｙ  Ａｒｇ（Ｍ）  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ（Ａ）（配列番号：５）、
Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ（配列番号：６）、
Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号：８）、および
Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ（配列番号：９）、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドと結合する抗体である。
【００４８】
１つの実施態様において、該ヒストン特異的抗体は、ペプチドＡｌａ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｇｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ（配列番号：１）、またはＧｌｎ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ（Ｍ）  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ（配列番号：８）と結合する抗体である。
【００４９】
生物学的試料からヌクレオソームを単離後、該単離されたヌクレオソームと結合したＤＮＡが、精製されたＤＮＡの第１および第２のプール（健常個体から回収されたＤＮＡのセット、および特定の疾病状態に罹患している個体から回収されたＤＮＡのセット）を作成するために、ヌクレオソームの第１および第２のプールから精製される。続いて、該精製されたＤＮＡが、ＤＮＡシークエンス、核酸ハイブリダイゼーション分析（サザンブロット分析を含む）、ＰＣＲ増幅、または別のスクリーニング法の様な標準的分子技術を用いて分析され、精製されたＤＮＡ配列の２つのプール間の違いが同定される。核酸配列の２つのプールのうち１つにだけ存在する核酸配列が、疾病状態と関係する可能性のある発現／抑制遺伝子（ヌクレオソームを単離するために用いられた抗体に依存する）を表す。
【００５０】
１つの実施態様に従って、健常および非健常個体の無細胞ヌクレオソームから回収されたＤＮＡの２つのプールは、相補的配列間のハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、同一セットのＤＮＡマイクロアレイとそれぞれ別々に接触させられる。該マイクロアレイは、特定の疾病と関係するＤＮＡのサブセットを含有するか、あるいは１以上の特定の細胞種類および発生ステージで発現する配列の全セットを含有する。該既知配列は、固体表面、またはマイクロアレイを形成するための「チップ」上に固定化され得る。該マイクロアレイは、当該技術分野の技術者に知られた技術を用いて用意され得る。該マイクロアレイは、精製されたＤＮＡのプール由来のヌクレオソーム中の配列とマイクロアレイの核酸配列とのハイブリダイゼーションが、検出可能なシグナルを発生するように設計される。
【００５１】
１つの実施態様において、精製されたヌクレオソームＤＮＡの２つのプール（すなわち、健常および非健常供給源由来）が標識され、マイクロアレイと接触させられる。そして１つの実施態様においては、該ＤＮＡ配列がＰＣＲにより増幅され、標識され、そして該配列がマイクロアレイと接触させられる。続いて、未結合および非特異的結合物質を除去するための該アレイの洗浄により、マイクロアレイ上に存在する既知の配列と特異的に結合する標識配列の検出が可能となり、従って、標識配列の同一性（identity）が明らかとなる。さらに、精製ＤＮＡの第２のプールと、精製ＤＮＡの第１のプールで得られたハイブリダイゼーションパターンの比較により、疾病状態と潜在的に関係する染色質変化が明らかとなる。
【００５２】
ある種の遺伝子が特定の疾病状態と関係するとして同定されると、続いて該遺伝子配列が本方法論を用いる診断検査のための基礎を形成し得る。１つの実施態様に従い、病変をスクリーニング／検出する方法は、修飾されたヒストンに特異的な抗体の使用により、個体から無細胞のヌクレオソームを単離する段階、および単離されたヌクレオソームと結合した核酸配列の同一性を決定する段階を含む。該配列の同一性は、配列分析によるか、または既知の配列とのハイブリダイゼーションにより決定され得る。事前に選択された特定の核酸配列の同定が、疾病状態の診断的特徴となる。例えば、癌と関係すると既に明らかな癌遺伝子または遺伝子変異の存在は、事前に選択される特定の配列を決定する。
【００５３】
染色質免疫沈降ＤＮＡを現在のゲノムマイクロアレイ技術と組み合わせることにより（チップ上）、「ヒストンコード」と関連する配列と結合する固有の修飾されたヒストンと関連するヒト（または他の）ゲノムの任意の位置を調べることが可能である。例えば、メチル（Ｋ４）Ｈ３抗体（配列番号：１の配列に特異的）を用いて免疫沈降されたＤＮＡが、固体表面または「チップ」上に固定化され、従って、転写に適する与えられた細胞の全核酸配列を表す。同様に、メチル（Ｋ９）Ｈ３抗体（配列番号：６の配列に特異的）を用いて免疫沈降されたＤＮＡが、固体表面または「チップ」に固定化され、従って、転写に適さない与えられた細胞の全核酸配列を表す。個体の血液からヌクレオソームを収集すること、結合したＤＮＡを回収すること、該ＤＮＡを標識すること、続いて標識されたＤＮＡを、固定化されたＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせることで、遺伝子の異常発現を明らかにする。相違は、定性的ならびに定量的に測定され得る。該情報を知ることは、様々なヒト癌において、鍵となる腫瘍抑制遺伝子または癌遺伝子のタンパク質のオン／オフ状態を決定する際に非常に有益である。
【００５４】
１つの実施態様において、染色質の免疫沈降を用いて、マイクロアレイの使用により、広範囲のゲノムでの活性な遺伝子の位置を決定する。例えば、１つの好ましい実施態様において、免疫沈降された染色質の２つのプール（すなわち、疾病および健常組織由来の免疫沈降された染色質）を含む方法は、当該技術分野の技術者に知られた標準的技術を用いる遺伝子チップ、ＤＮＡマイクロアレイ、またはプロテオミクスチップの使用を含む。例えば、ＷＯ０１／１６８６０、ＷＯ０１／１６８６０、ＷＯ０１／０５９３５、ＷＯ００／７９３２６、ＷＯ００／７３５０４、ＷＯ００／７１７４６、およびＷＯ００／５３８１１（これらの記載は、本明細書に特に取り込まれる）で記載されるシステムのいずれかが、本発明での使用に適している。好ましくは、チップの特定の位置での免疫沈降された染色質の相互作用が明らかとなり、該チップは、免疫沈降された染色質と結合したＤＮＡ配列の単離が可能となるように、既知のＤＮＡ配列の様な既知化合物の所定アレイを含有する。
【００５５】
様々な修飾がヒストンコードと関連するので、該技術の鍵は、それらに特異的な抗体を使用することである。ヒトおよび他のゲノムに対してのこの適用は、エピゲノムの基礎となる。本発明は、それぞれのオン／オフ抗体として、Ｌｙｓ４／Ｌｙｓ９メチルＨ３抗体の使用を詳述したが、この概念は、「ヒストンコード」に対して形成される抗体の全てに対してより一般的に適用される。例えば、Ｌｙｓ９メチル対Ｓｅｒ１０ホスホＨ３抗体は、分化対増殖を制御する「メチル／ホスホ」スイッチもある。本発明は、Ｈ３リジン２７および３６、およびＨ４リジン２０を含むＨ３およびＨ４ヒストンのアミノ末端の別のメチル化領域に対する抗体も包含する。該抗体を生成するために用いられるペプチドは、次に挙げられる：
Ｈ３リジン２７：ＡＡＲＫ（Ｍ）ＳＡＰＶＣＧ（配列番号：１０）
Ｈ３リジン３６：ＳＧＧＶＫ（Ｍ）ＫＰＨＫＣＧ（配列番号：１１）
Ｈ４リジン２０：ＲＨＲＫ（Ｍ）ＩＬＲＤＣＧ（配列番号：１２）
（ここで、Ｋ（Ｍ）はメチル化されたリジン残基を表し、下線を引いたＧＣは、該抗体の生成のため、Ｈ３配列に加えられたアミノ酸を意味している）。
【００５６】
実施例１
アポトーシス細胞由来のオリゴヌクレオソームの検出
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したLeibovitz培地中に１．７５×１０６細胞／２５ｃｍ２で播種した。対数増殖中である４８時間後に、３つのフラスコの細胞を、０．１〜０．３Ｍ  タキソールまたはＤＭＳＯ（ビークル、最終濃度０．００２％）で、３７℃にて８または１８時間刺激した。
【００５７】
続いて細胞を、ダルベッコリン酸緩衝食塩水２×１０ｍｌでそっと洗浄し、続いて最小容量（２００Ｌ／２５ｃｍ２）の可溶化バッファー：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、
１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、
１％  トリトン−Ｘ１００、
２．５ｍＭ  ピロリン酸ナトリウム、
１０ｍＭ  グリセロリン酸塩、
中で、室温にて３０分間可溶化した。
【００５８】
これに、最終濃度：
１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、
２００ｎｇ／ｍｌ  トリコスタチンＡ、
２Ｍ  スタウロスポリン、
１Ｍ  オカダ酸、
０．５Ｍ  シベルメトリン、
５００Ｍ  ＡＥＢＳＦ（ＰＭＳＦに代わる安定なもの）、
１ｇ／ｍｌ  アプロチニン、
１Ｍ  Ｅ−６４、
１Ｍ  ロイペプチン、
となる様に設計された阻害剤カクテルを添加して、直ちに使用した。
【００５９】
続いて、洗剤に不溶性（非分画）の染色質、未変性の核および細胞をペレットとするために、細胞溶解物を４℃にて３２５ｇで１０分間遠心した。必要に応じて生成されたモノおよびオリゴヌクレオソームの濃縮物を含有する上清を回収し、等分して−８０℃で保存した。続いて、試料を、ＥＬＩＳＡ（Roche diagnosticのキット：カタログ番号１７７４４２５）でヌクレオソームの中身について、およびリン酸化、アセチル化、またはメチル化ヒストンに特異的な抗体シリーズを用いるウエスタンブロット（Upstate）により、タンパク質レベルでの「マークした」ヌクレオソームの存在について分析した。
【００６０】
ＥＬＩＳＡは、ビークルと比べて、８時間タキソールで処理した細胞上清中で約４０〜４５倍濃縮したヌクレオソームを示す。最大添加量（１６Ｌ／ウェル）の細胞溶解物含有ヌクレオソームを、ＭＥＳバッファーシステム（Novex）を用いたＮｕＰＡＧＥ１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（還元）での電気泳動により、分離した。ニトロセルロース膜に移した後、４℃で一晩、メチル化ヒストンＨ３（ｌｙｓ−４）、リン酸化ヒストンＨ３（ｓｅｒ−１０）、およびアセチル化ヒストンＨ３（ｌｙｓ−１４）に特異的なポリクローナルウサギ抗体で、ブロットにプローブ結合させた。続いて、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−１−リン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム色素生産性基質（Invitrogen）と結合した、アルカリホスファターゼ結合抗ウサギヤギ抗体を用いて、タンパク質を目に見えるようにした。ヌクレオソームがアポトーシス過程を通じて、リン酸化、アセチル化、およびメチル化ヒストン成分を維持していることを示す陽性結果を、「マークしたヒストン特異的」抗体の両方で得た。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、ヒトヒストンタンパク質Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４のアミノ末端で見出される翻訳後修飾を表す図である。
【配列表】
2005517431.tif 000002
2005517431.tif 000003
2005517431.tif 000004
2005517431.tif 000005
2005517431.tif 000006
2005517431.tif 000007
2005517431.tif 000008
【図１】
2005517431.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成16年10月5日(2004.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2005517431000001.app
【国際調査報告】
2005517431.tif 000010