(57)【要約】本発明は、島細胞新生に関連するタンパク質（ＩＮＧＡＰ）及びＩＮＧＡＰペプチドの投与計画及び製剤を含む。本明細書に開示されている製剤は、医薬組成物として許容できる安定性を有することが明らかにされている。更に、前記製剤は機能性島を再生することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然発生の哺乳類島新生関連タンパク質の少なくとも１５の連続するアミノ酸を有するポリペプチドを含む医薬組成物であって、該アミノ酸配列が配列識別番号：１、配列識別番号：２又は配列識別番号：３及びその断片に由来しており、ｐＨが約４〜約６である医薬組成物。
【請求項２】
前記組成物が凍結乾燥粉末又は溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物のｐＨが約４〜約５であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、製薬上許容できるエステル、塩、及びこれらの混合物から成る群から選択される形態であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
約０．１ｍｇ〜約３００ｍｇのポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
ヒト又はその他の哺乳類における糖尿病治療のための薬剤の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項７】
哺乳類におけるランゲルハンス島、膵β細胞の再生、又は正常な生理学的グルコース調節の確立のための薬剤の製造における、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項８】
投与が１日１回、１日２回、１日３回、１週間に１回、２週間に１回、月１回、連続注入及びこれらの組み合わせから成る群から選択される頻度である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項９】
ａ．請求項１の医薬組成物、及び
ｂ．用法指示書
を含む、請求項６〜８のいずれかに記載の使用のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
膵島細胞塊は、Ｉ型真性糖尿病で失われ、この疾病では進行性自己免疫反応がインスリン産生β細胞の選択的破壊を生じさせる。２型真性糖尿病は、いわゆる成人発症の疾病であるが若い肥満の人々にも増えている症状で、β細胞塊が正常の６０％も減少する場合がある。膵臓内で機能するβ細胞の数は、糖尿病の発生、経過及び結果にきわめて重要である。Ｉ型糖尿病では、正常の２％未満までのβ細胞塊の減少がある。ＩＩ型糖尿病で発生するような重度のインスリン抵抗性に直面しても、糖尿病が発生するのは、β細胞塊の不十分な代償性増加がある場合に限られる。従って、どちらの主形態の糖尿病の発生でも、適応β細胞成長がないこと及びその後のインスリン分泌の欠乏とみなすことができる。前駆体細胞からの島及びβ細胞の成長を刺激する能力は、島新生として知られ、糖尿病の回復への新規及び魅力的なアプローチである。
【０００２】
一連の実験を通じて、イロトロピン（ilotropin）と呼ばれる膵抽出物が調製され、膵管系に関連する先在する前駆細胞からのβ細胞新生を刺激することが実証された。島新生につながる膵管細胞の形質転換は内因成長因子、遺伝子及びタンパク質産生に依存するという仮説に基づいて、その後イロトロピン（ilotropin）中の活性成分を識別するための研究が行われた。この一連の研究は、新規遺伝子及びその関連タンパク質、島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）の発見につながった。
【０００３】
ＩＮＧＡＰペプチド（ＩＮＧＡＰ104〜118）は、１７５アミノ酸ＩＮＧＡＰ内に含有される１５アミノ酸配列で、ハムスターで管細胞増殖を刺激することが明らかになっている。ＩＮＧＡＰペプチドは、本願に引用され援用される米国特許第５，８３４，５９０号の配列識別番号：２のアミノ酸１０３〜１１７である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ＩＮＧＡＰペプチドの投与計画及び製剤を含む。本明細書に開示されている製剤は、製薬剤として許容できる安定性及びヒト臨床試験のための十分な安全性を有することが明らかにされている。このようにして調製されたＩＮＧＡＰペプチドは、更に、正常なフィードバック制御を維持する機能性島細胞を再生することが明らかにされている。
【０００５】
従って、本発明の目的は、ランゲルハンス島新生に関与する製薬上許容できる安定なＩＮＧＡＰペプチド組成物を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、哺乳類の糖尿病を治療する方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、哺乳類の異常な生理学的グルコース調節を治療する方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、哺乳類の膵β細胞又はランゲルハンス島の数を増加させる方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、島細胞移植を受けた哺乳類を治療する方法を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、膵前駆細胞の分化を誘発する方法を提供することである。
【０００６】
引用されるすべての文献は、その関連部分において本明細書に引用して援用される；いずれの文献の引用もそれが本発明に関連する先行技術であることの容認として解釈されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（用語の解説）
次のリストは本明細書において使用する用語の定義である。
【０００８】
「薬学上許容できる塩」とは、本発明の化合物上のいずれかの酸性（例えば、カルボキシル）基に形成された陽イオン性の塩、又はいずれかの塩基性（例えば、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、モルフィリノ（morphylino）など）基に形成された陰イオン性の塩である。ＩＮＧＡＰペプチドは双性イオン性であることから、いずれの塩も可能であり許容できる。このような塩の多くが、当該技術分野で既知である。好ましい陽イオン性の塩には、アルカリ金属塩（例えばナトリウム及びカリウム）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム及びカルシウム）、及び有機塩（例えばアンモニウム）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい陰イオン性の塩には、ハロゲン化物、スルホン酸塩、カルボン酸塩、リン酸塩などが挙げられる。このような塩には、かつては存在しなかった光学中心を提供し得る付加塩が明らかに企図される。例えば、本発明の化合物からキラル酒石酸塩を調製してもよく、この定義にはこのようなキラル塩が含まれる。意図される塩は、患者である動物、哺乳類、又はヒトに投与される量で毒性のないものである。適切な酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、蟻酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、アジピン酸塩、グルタル酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ドデシル硫酸塩、シクロヘキサンスルファミン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
「生加水分解性エステル」とは、本発明の化合物のエステル類であり、エステルが化合物の生物活性に本質的に干渉せず、好ましくは化合物の生物活性に干渉せず、又はエステルがホスト内で容易に変換されて活性化合物を生成するものである。このようなエステルの多くが、米国特許第４，７８３，４４３号（ジョンストン（Johnston）及びモバシェリー（Mobashery）、１９８８年１１月８日発行）に記載されているように、当該技術分野において既知である。このようなエステルには、低級アルキルエステル、低級アシルオキシ−アルキルエステル（アセトキシメチルエステル、アセトキシエチルエステル、アミノカルボニルオキシメチルエステル、ピバロイルオキシメチルエステル、及びピバロイルオキシエチルエステルなど）、ラクトニルエステル（フタリジルエステル及びチオフタリジルエステルなど）、低級アルコキシアシルオキシアルキルエステル（メトキシカルボニルオキシメチルエステル、エトキシカルボニルオキシエチルエステル、及びイソプロポキシカルボニルオキシエチルエステルなど）、アルコキシアルキルエステル、コリンエステル、及びアルキルアシルアミノアルキルエステル（アセトアミドメチルエステルなど）が挙げられる。
【００１０】
用語「治療」は、本明細書では、少なくとも、本発明の化合物の投与が、被験体、好ましくは哺乳類被験体、より好ましくはヒトで、異常な生理学的グルコース調節に関連する疾病を軽減することを意味するために使用される。従って、「治療」という用語は、被験者の異常な生理学的グルコース調節に媒介される疾患の予防、特に被験者が該疾病にかかりやすいがまだ該疾病と診断されていないときの該疾患の予防；異常な生理学的グルコース調節を媒介とする疾患の抑制；及び／又は異常な生理学的グルコース調節を媒介とする疾患の緩和又は後退を含む。本発明の方法が異常な生理学的グルコース調節を媒介とする疾患の予防を指向する限り、用語「予防」は、疾病状態が完全に防止されることを必要としないことが理解される（ウェブスター（Webster）の大学生用辞典第９版）。むしろ、本明細書で使用するとき、予防という用語は、異常な生理学的グルコース調節を媒介とする疾患が現れる前に本発明の化合物を投与できるように、異常な生理学的グルコース調節を媒介とする疾患にかかりやすい集団を識別する、当業者の能力を指す。この用語は、疾病状態を完全に回避することを意味するものではない。異常な生理学的グルコース調節を媒介とする疾患（例えば、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病）の危険がある集団は、該疾病の家族歴によって示される、糖尿病にかかりやすい遺伝的体質を有する人である。その他のリスク要因には、肥満又は食事が挙げられる。
【００１１】
（製造及び安定性）
ＩＮＧＡＰペプチドは天然の１７５アミノ酸ＩＮＧＡＰ内に含有されるアミノ酸番号１０４〜１１８から成る１５アミノ酸配列である。ＩＮＧＡＰペプチドは、当該技術分野において既知の種々の手段のいずれでも合成できるが、好ましい合成手段は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相合成を通じる手段である。ＩＮＧＡＰペプチドの好ましい形態は、製薬上許容できる塩の形態、好ましくは酢酸塩のＩＮＧＡＰペプチドである。ペプチドの塩の生成は、当該技術分野において既知である。Ｆｍｏｃ合成は、米国特許第４，１０８，８４６号に記載されている。Ｆｍｏｃは、ピペリジンを使用して樹脂からメトキシカルボニル（ｍｏｃ）を分割し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してペプチドを分割する。この方法に従って製造されたＩＮＧＡＰは、分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって容易に精製できる。
【００１２】
ＩＮＧＡＰペプチドは、次のアミノ酸配列を有する：
ＮＨ２−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＣＯＯＨ（配列識別番号：３）
ＩＮＧＡＰペプチドは、化学式がＣ64Ｈ100Ｎ20Ｏ22であり、分子量が１５０１．６±１ダルトンであり、比旋光度が１％酢酸中で −１０３．２°である。
【００１３】
ＩＮＧＡＰペプチドの構造は、ＩＮＧＡＰペプチド分子をその構成要素のアミノ酸に加水分解するアミノ酸解析によって確認される。アミノ酸は分子構造に基づいて定量化され、正しいモル比で存在することが証明される。ペプチドの分子質量は、エレクトロスプレー質量分析を用いて測定でき、分子の計算された理論質量と一致すべきである（１５０１．６±１質量単位）。
【００１４】
合成分子が生物活性であることを確認するため、バイオアッセイを使用して活性を確認してもよい。ＡＴＣＣ（米国バージニア州マナッサス）から入手できるラット膵管細胞系のＡＲＩＰ細胞が該アッセイに使用される。細胞を９６穴培養プレートに１０，０００個／穴で播き、１０％のウシ胎児血清を含有するダルベッコ（Dulbecco）の最少必須培地（ＤＭＥＭ）中で２４時間培養する。２４時間後、血清を含有しないＤＭＥＭで培地を置き換える。一対の穴を種々の用量（０、１０-3及び１０-5ｇ／ｍｌ）のＩＮＧＡＰペプチドで処理する。２１時間後、培地にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals））からのＢｒｄＵ標識溶液を追加し、更に３時間培養する。２４時間後、細胞を６０℃で６０分間乾燥し、固定及び変性する。これらを、すべてキットの指示に従ってＢｒｄＵ抗体に９０分間暴露し、１５分間成長させる。ＢｒｄＵ標識を、ワラック・ビクトール（Wallac Victor）１４２０マルチラベルカウンタ（Multilabel Counter）で定量する。結果を、１穴当たり１００〜２０，０００細胞の密度で播種され同じ培養プレートで成長した細胞の標準曲線と比較する。図１に示すように、このアッセイを使用したとき、０．１μｇ／ｍｌのＩＮＧＡＰペプチドで処理した培養の対照と比べて細胞数が約１．６倍増加する。
【００１５】
（バルクＩＮＧＡＰペプチドの安定性）
安定性は、試料の純度、不純物の全パーセンテージ、（ＨＰＬＣ又はその他の好適な定量法によって測定された）個々の不純物のパーセンテージ、外観、及び水分含有量が挙げられるがこれらに限定されない種々のパラメータを比較することによって決定される。ＨＰＬＣ法は、ＩＮＧＡＰペプチドのレベルと比較した分解生成物のレベルの増加を決定するのに使用できる。ＩＮＧＡＰペプチド試料（溶液及び凍結乾燥粉末のいずれも）は、種々の温度で、湿気の存在又は非存在下で、及び明色又は暗色バイアル瓶で保管される。異なる保管条件での分解は、不純物の増加及びＩＮＧＡＰペプチド含有量の減少につながる。試料調製は、８０％を超える純度、好ましくは９０％を超える純度、より好ましくは９５％を超える純度、及び最も好ましくは９７％を超える純度であることが望ましい。
【００１６】
凍結乾燥粉末としてのＩＮＧＡＰペプチドは、種々の保管条件下で安定である。ＩＮＧＡＰペプチドの純度は、これらの条件下で維持され、分解生成物は許容できるレベルよりも低い。最大６ヵ月までの更なる保管は、ＩＮＧＡＰペプチドのいかなる目立つ分解も引き起こさない。
【００１７】
（組成物）
本発明の別の態様は、（ａ）安全且つ有効な量の本発明のペプチドと（ｂ）製薬上許容できる担体とを含む組成物である。レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（マック出版社（Mack Publishing Company）（ペンシルバニア州イーストン））最新版に開示されているものなどの、標準的な医薬品製剤技術が使用される。
【００１８】
「安全且つ有効な量」とは、それを必要とする動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト被験者で、治療される症状において良い方向への変化を有意に誘発するのに十分であるが、重大な副作用（毒性、炎症、アレルギー反応など）を回避する程十分に低く、本発明の方法で使用されたときに妥当な利益対危険性比に相応の本発明のペプチドの量を意味する。具体的な「安全且つ有効な量」は、明らかに、治療される特定の症状、被験者の身体的条件、治療持続期間、併用療法の性質（もしあれば）、使用される固有の剤形、用いられる担体、その中におけるペプチドの溶解度、及び組成物に望まれる投与計画のような要因によって変化する。当業者は本発明による「安全且つ有効な量」の決定に、次の教示を使用してもよい。スピルカー（Spilker）Ｂ．著、臨床研究及びプロトコル作成の手引（Guide to Clinical Studies and Developing Protocols）、レーブン・プレス・ブックス社（Raven Press Books,Ltd．）、ニューヨーク、１９８４年、７〜１３頁、５４〜６０頁；スピルカー（Spilker）Ｂ．著、臨床試験の手引（Guide to Clinical Trial）、レーブン・プレス社（Raven Press,Ltd.）、ニューヨーク、１９９１年、９３〜１０１頁；クレイグ（Craig）Ｃ．、及びＲ．スティツェル（Stitzel）編、現代薬理学（Modern Pharmacology）、第２版、リトルブラウン社（Little,Brown and Co.）、ボストン、１９８６年、１２７〜３３頁；Ｔ．スピート（Speight）編、エイブリーの薬物治療：臨床薬理学及び治療の原理と実践（Avery's Drug Treatment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics）、第３版、ウィリアムス・アンド・ウイルキンス（Williams and Wilkins）、ボルチモア、１９８７年、５０〜５６頁；Ｒ．タラリダ（Tallarida）、Ｒ．ラファ（Raffa）及びＰ．マクゴニグル（McGonigle）著、一般薬理学の原理（Principles in General Pharmacology）、スプリンガー・フェアラーク（Springer-Verlag）、ニューヨーク、１９８８年、１８〜２０頁。
【００１９】
本発明のペプチドは、製薬上許容できる緩衝液に溶解又は懸濁される。ペプチドが溶解される緩衝液は、ペプチドのｐＨ、溶解度及び従って生物学的利用能に影響しうる。緩衝液の選択はペプチド組成物、投与経路、並びに望ましいペプチドの溶解性、生理学的環境でのペプチドの半減期、及び生理学流体のｐＨ及び緩衝能の程度によって異なる。好ましい緩衝液のｐＨは、ペプチドのｐＫa値に近くてもよく、又はペプチドが送達される生理学的環境に依存してもよい。好適な緩衝液には、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、グリシン、クエン酸塩、イミダゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい緩衝液は、酢酸塩緩衝液である。
【００２０】
対象となるペプチドに加えて、対象の発明の組成物は、製薬上許容できる担体を含有する。本明細書中で使用するとき、「製薬上許容できる担体」という用語は、動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトへの投与に好適な、１つ以上の適合性のある固体又は液体充填剤希釈溶液又はカプセル化物質を意味する。本明細書で使用するとき、「適合性のある」という用語は、この組成物の構成成分が、通常の使用状況下で、組成物の薬学的有効性を実質的に減少させる相互作用がないような方式で、対象のペプチドと互いに混ざり合うことができることを意味する。当然、製薬上許容できる担体は治療される動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトへの投与に好適であるように、十分に純度が高く、且つ十分に毒性が低くなければならない。対象の化合物と併せて使用すべき製薬上許容できる担体の選択は、ペプチドの投与手段によって基本的に決定される。対象のペプチドが注入される場合、製薬上許容できる好ましい担体は、血液適合性のあるコロイド状懸濁剤を用いて無菌に調製される。
【００２１】
特に、全身投与のための製薬上許容できる担体には、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸塩緩衝液、乳化剤、等張生理食塩水、及び発熱物質を含まない水が挙げられる。非経口投与のために好ましい担体には、プロピレングリコール、エチルオレエート、ピロリドン、エタノール、及びゴマ油が挙げられる。好ましくは、製薬上許容できる担体は、非経口投与のための組成物では全組成物の少なくとも約９０重量％含まれる。
【００２２】
本発明の組成物は、好ましくは単位剤形で提供される。本明細書で使用するとき、「単位剤形」とは、優良医療基準に準じ、１回の投薬において動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト被験体への投与に好適な量のＩＮＧＡＰペプチドを含有する本発明の組成物である。これらの組成物は好ましくは約０．１ｍｇ（ミリグラム）〜約３００ｍｇ、より好ましくは約５ｍｇ〜約１５０ｍｇのＩＮＧＡＰペプチドを含有する。本発明の組成物を用いた治療の頻度は、所望の大粒丸薬（ボーラス：bolus）を達成するために、並びに副作用を回避するために変更されてもよい。従って、治療スケジュールの非限定例には、１日１回、１日２回、１日３回、１週間に１回、２週間に１回、月１回、及びこれらの組み合わせが挙げられる。あるいは、本発明の組成物は、連続注入で投与されてもよい。
【００２３】
本発明の組成物は、例えば経口投与、局所投与、鼻腔又は非経口投与に適した、さまざまな形態のいずれにすることもできる。所望する特定の投与経路によって、当該技術分野において周知の製薬上許容できるさまざまな担体を使用してもよい。これらには、固体又は液体の充填剤、希釈剤、ヒドロトロープ、界面活性剤、及びカプセル化物質が挙げられる。ＩＮＧＡＰペプチドの活性に実質的に干渉しない、任意の医薬品活性物質を含んでもよい。ＩＮＧＡＰペプチドと共に用いる担体の量は、ＩＮＧＡＰペプチドの１回用量につき実用的な投与物質量を与えるのに十分な量である。本発明の方法において有用な剤形を作るための技術と組成物は、以下の参考文献に記載されている：現代薬剤学（Modern Pharmaceutics）、９章及び１０章、バンカー＆ロードス（Banker & Rhodes）編（１９７９年）；リーバーマン（Lieberman）ら、製薬剤形：錠剤（Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets）（１９８１年）；及びアンセル（Ansel）、製薬剤形入門（Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms）、第２版（１９７６年）。
【００２４】
（ＩＮＧＡＰペプチド製剤）
好ましいＩＮＧＡＰペプチド製剤は、無菌水及び張度の調節のため必要に応じて塩化ナトリウムを用いた注入溶液であり、０、７．５、３０、及び１２０ｍｇ／０．５ｍｌ／バイアルの４種類の濃度で調製される。ｐＨを好ましいレベルに調節するため、必要に応じて塩酸及び水酸化ナトリウムを使用してもよい。更なる濃度を、高濃度原料液を等張生理食塩水を用いて希釈することによって調製してもよい。希釈はＩＮＧＡＰペプチドの生物学的効力に影響しない。
【００２５】
こうして調製されたＩＮＧＡＰペプチド製剤は、５℃で保管され、暗色又は明色の容器に入れられたとき、ｐＨ４〜６の範囲内で安定である。ただし、組成物が２５℃で保管された場合には多少の分解が観察される。分解は、ｐＨ４．５の組成物よりもｐＨ６の組成物の方で、より明白である。ＩＮＧＡＰペプチドは、８℃未満及びｐＨ６未満で保管したときに、より安定であるように見える。
【実施例】
【００２６】
（実施例１）  注入用ＩＮＧＡＰペプチド溶液
ＩＮＧＡＰペプチドの溶液１２０ｍｇを以下の規格に従って調製する。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
（実施例２）  正常なハムスターへのＩＮＧＡＰペプチド投与
ＩＮＧＡＰペプチドを、正常なハムスターにおける島形成に対する影響について調査した。ＩＮＧＡＰペプチド５ｍｇ／ｋｇ（２５ｍｇ／ｍ2）を１日１回４週間腹腔内投与し、１０日目及び３０日目にβ細胞塊を評価した。ＩＮＧＡＰペプチド処置によって、プラセボ処置動物と比較して島の数の有意な増加が生じた（図２）。島新生効果は、より多くのインスリンの産生及び膵臓内の島の数の増加によって明らかであった。新たに形成されたβ細胞は、膵管の壁に現れ、膵管から発達していた。これらのインスリン陽性細胞は、管の上皮細胞の分化及び島細胞の成長の結果生じ、その出現はＩＮＧＡＰペプチド処置の用量及び持続時間に比例した。より長期間の処置の間に、これらの細胞は管から離れて膵臓の実質組織で島を形成した。ＩＮＧＡＰペプチドの１０日間連続投与の後、島の数は３０％増加し、３０日までに組織内の島の数は２倍になり、動物モデルでイロトロピン（ilotropin）、ｒＩＮＧＡＰ及びセロハンラッピングを用いた過去の観察と一致した。
【００２９】
（実施例３）  インビボ有効性試験
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＳＴＺ（３５ｍｇ／ｋｇ／日×５日）で糖尿病にし、ＩＮＧＡＰペプチド処置（２５０μｇを１日２回）群及び生理食塩水対照群に各４匹ずつ分けた。ＩＮＧＡＰペプチド処置動物は４匹すべてで血糖濃度が正常値に回復したのに対し、生理食塩水処置マウスはすべて高血糖のままであった（図３）。３９日後に投与を停止し、更なる観察により、試験を終了した４８日後までの効果の持続性が明らかになった。ＩＮＧＡＰペプチド処置動物の組織病理学的評価の結果、正常に出現している島の存在と新たな島の形成領域の両方が、インスリン及びグルカゴン分泌細胞の正常な補体及び分布を含めて明らかになった（図４及び６）。グルカゴンは低血糖症に対する防御において主要な役割を果たすことから、グルカゴン産生細胞の出現は注目に値する。ＩＮＧＡＰペプチドが誘発する島新生のこの特徴は、過剰な糖尿病治療に付随して起こる低血糖症の対応調整管理障害の逆転に役立つ可能性がある。低血糖症は、ＩＮＧＡＰペプチド処置動物のいずれにも観察されなかった。生理食塩水処置した対照動物では、新しい島の形成は観察されなかった。ＩＮＧＡＰペプチド投与は、転写因子ＰＤＸ−１を発現する細胞によって証明されるように、管細胞の分化転換を誘発した（図５）。生理食塩水処置したＳＴＺ−糖尿病動物の島は、重度の炎症細胞浸潤を示し、壊死していた。ＩＮＧＡＰペプチド処置動物では、炎症は著しく減少し、島は健康に見えた（図６）。
【００３０】
図４は、ストレプトゾトシン処置し、更にＩＮＧＡＰペプチド処置したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの膵臓の免疫細胞化学的特徴を示す。左上のパネルは、抗インスリン抗体で染色した管上皮のセグメントになお結合している島で、インスリンタンパク質の正常な存在及び分布を示している。左下のパネルは、抗グルカゴン抗体と抗ソマトスタチン抗体との混合物で染色した同じ島を示し、これも島外套領域におけるこれらの島細胞タンパク質の正常な分布を示している。右上のパネルは、Ｈ＆Ｅ染色で染色した管から発達した、新たに形成された島を示す。右下のパネルは、管の壁の中のインスリン陽性細胞を示す。
【００３１】
（実施例４）  ３１日間マウス試験（反復投与）
マウスにＩＮＧＡＰペプチドを０、２、２０、及び１００ｍｇ／ｋｇ／日で１日１回３１日間注入して、反復投与毒性試験を実施した。この試験では、オス１０匹及びメス１０匹ずつを４つの処置群に割り当て、及び回復動物（オス５匹及びメス５匹）の２つの処置群を割り当てた。終了時に血液を採取し、肉眼及び顕微鏡観察のために剖検を実施した。各群の動物の約半分で、臨床病理学及び血清レベルを評価した。選択された器官（脳、副腎、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、及び脾臓）の重量を測定し、相対的な器官重量を計算した。膵臓の切片を除去し、インスリン含有量評価のために液体窒素中で凍結した。膵臓組織の切片を独立顕微鏡検査に提出した。回復動物は、投与停止から２８日後に屠殺した。更なる調査のための種々のパラメータ並びに潜在的に薬剤に関連する異常知見を評価し、再現性及び潜在的臨床有意性を決定した。
【００３２】
筋肉内注射による３１日間連続ＩＮＧＡＰペプチド投与は、投与停止時及び処置後２８日間の評価で、用量関連の悪影響が生じなかった。注入部位の炎症が、最高用量のとき大きい頻度でオス及びメスに観察されたが、同じ用量で回復動物にはもはや観察されず、炎症の可逆性を示した。この３１日試験で、高用量のオスの動物１匹に、脾臓での髄外造血が認められた。炎症細胞浸潤、浮腫、壊死又は萎縮の顕微鏡的証拠は観察されなかった。顕著な所見は、小さな島の数が、管関連及び腺房組織中の両方で増加したことであった。３１日連続投与２時間後のＩＮＧＡＰペプチドの血清レベルは、定量限界以下であった。インスリン陽性組織面積の増大によって測定される製薬活性が、これらの動物で観察された（図７）。この結果は、無有害性影響量（ＮＯＡＥＬ）が３１日投与したＣＤ−１マウスで１００ｍｇ／ｋｇより大きいことを示唆する。
【００３３】
（実施例５）  ３４日間イヌ試験（反復投与）
ビーグル犬にＩＮＧＡＰペプチドを０、０．５、１．５、及び１０ｍｇ／ｋｇ／日で１日１回３４日間筋肉内注射して、反復投与毒性試験を実施した。３４日目の処置終了時に屠殺した動物から、及び処置終了から２５日後に屠殺した回復動物から、膵臓組織をβ細胞塊の定量化のために免疫組織化学によって得た。膵臓β細胞塊は、ＩＮＧＡＰペプチド投与後に増加した（図８参照）。これらの結果は、試験した用量範囲でのＩＮＧＡＰペプチドの筋肉内注射が、正常なビーグル犬で生物学的に重要な反応を生じさせることを示す。更に、膵臓組織切片の詳細な評価で、浮腫、炎症細胞浸潤、壊死又は萎縮のような変化は認められなかった。
【００３４】
（実施例６）  ヒト臨床試験
用量は、多くの場合、動物での有効性及び安全性試験の結果に基づく。Ｉ型又はＩＩ型真性糖尿病の治療で、７．５ｍｇ（６０ｋｇの患者の場合、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、又は４．６２５ｍｇ／ｍ2）及び１２０ｍｇ（６０ｋｇの患者の場合、１．６ｍｇ／ｋｇ、又は７４ｍｇ／ｍ2）の２つの用量のＩＮＧＡＰペプチドを例証する。ＩＮＧＡＰペプチド処置の有効性を決定するため、以下のパラメータを評価する。
【００３５】
１．全インスリン用量が維持された状態で、空腹時グルコースレベルが３５ｍｇ／ｄｌより大きく減少。
２．空腹時グルコースレベルが米国糖尿病学会（ＡＤＡ）基準により決められた正常範囲に維持された状態で、インスリン用量の減少が２５％。
３．空腹時Ｃ−ペプチドの１ｎｇ／ｍｌを超える増加が得られる。サスタカル（Sustacal）（登録商標）（ブースト（Boost）（登録商標））に反応してＣ−ペプチドの２ｎｇ／ｍｌを超える増加が得られる。
【００３６】
各患者は無作為にＩＮＧＡＰペプチドの１回の単回筋肉内注射を受ける。有効性及び安全性データの評価後、患者は、医師が適切と考えた場合に更にＩＮＧＡＰペプチド注入を受けてもよい。
【００３７】
以下の表に、ＩＮＧＡＰペプチド処理又はプラセボ処置を受けた患者に実施された評価の部分的一覧を要約する。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
（刺激Ｃ−ペプチド）
刺激Ｃ−ペプチド試験は、少なくとも１０時間の一晩絶食期間の後の朝に実施される。試験は、空腹時グルコースが８０〜２５０ｍｇ／ｄｌである場合に限り実施される。患者は、前日の夜に自分の糖尿病薬を飲むことができるが、試験の朝は試験が終了するまで該薬を服用すべきではない。ブースト（Boost）（登録商標）摂取の直前、及び摂取の０．５、２、及び４時間後にＣ−ペプチド測定用の血液試料を採取する。ブースト（Boost）（登録商標）は経口摂取で投与される。患者は、その空腹時Ｃ−ペプチドが１．０ｎｇ／ｍｌ未満であり、その最大刺激Ｃ−ペプチド値が２．０ｎｇ／ｍｌ未満である場合、インスリン欠乏とみなされる。
【００４０】
処置の結果、ＩＮＧＡＰペプチドを受けた患者は糖負荷の改善、空腹時グルコースレベルの低下、必要なインスリン用量の低下、空腹時Ｃ−ペプチドレベルの増大、及びブースト（Boost）（登録商標）に反応したＣ−ペプチドレベルの増大を示した。プラセボ処置を受けた患者はこのような改善を示さない。
【００４１】
特に指定された場合を除き、数量、パーセンテージ、部分、及び割合を含むすべての量は、「約」という語で修飾されると理解され、量は有効数字を表すことを意図しない。
特に指定された場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は「１又はそれ以上」を意味する。
【００４２】
本発明の特定の実施形態について説明し記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な他の変更及び修正が可能であることは、当業者に明らかである。従って、添付の特許請求の範囲に、本発明の範囲内にあるすべてのこうした変更及び修正を包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】細胞数の用量依存性増加を示すＩＮＧＡＰペプチド処置したＡＲＩＰ細胞（ラット膵管細胞系）を示す。
【図２】正常なシリアンハムスターへのＩＮＧＡＰ投与後の島細胞塊の増加を示す。
【図３】ストレプトゾトシン誘発糖尿病のＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスでのＩＮＧＡＰペプチド又は生理食塩水投与後の血糖の時間的経過を示す。
【図４】ＩＮＧＡＰペプチド処置したストレプトゾトシン誘発糖尿病のＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスから得た膵臓のインスリン及びグルカゴンの正常な分布を示す。
【図５】ＩＮＧＡＰペプチドがＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスの膵管壁細胞内でＰＤＸ−１発現を刺激することを示す。
【図６】ストレプトゾトシン処置した、及びストレプトゾトシン後にＩＮＧＡＰ処置したＣ５７ＢＬ／Ｊ６マウスから採取した膵臓の組織学的比較を示す。
【図７】ＩＮＧＡＰペプチドで３１日間処置した正常なマウスでのインスリン免疫反応性組織面積の増加を％で示す。
【図８】ＩＮＧＡＰペプチドで３４日間処置した正常な犬でのインスリン免疫反応性組織面積の増加を％で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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