(57)【要約】本発明は植物の少なくとも１個の花において少なくとも１個の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子に高レベルの発現を付与するために使用することができるＳ−リナルールシンターゼ遺伝子に由来する単離プロモーターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列を含むプロモーターをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
植物の少なくとも１個の花において転写を開始することが可能な配列を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記配列が配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される前記ポリヌクレオチド。
【請求項５】
ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
植物の花において転写を誘導することが可能な単離プロモーターであって、前記プロモーターは配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む前記プロモーター。
【請求項８】
ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項７に記載のプロモーター。
【請求項９】
ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項７に記載のプロモーター。
【請求項１０】
請求項７に記載のプロモーターと前記プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、前記プロモーターが前記発現カセットで形質転換された植物の花において前記ポリヌクレオチド配列の転写と発現を開始することが可能である前記発現カセット。
【請求項１１】
ポリヌクレオチド配列が発現カセットにセンス方向に挿入されている請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１２】
ポリヌクレオチド配列が発現カセットにアンチセンス方向に挿入されている請求項１０に記載の発現カセット。
【請求項１３】
請求項１０に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１０に記載の発現カセットで安定的に形質転換された植物又は植物部分。
【請求項１５】
植物部分が細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯から構成される群から選択される請求項１４に記載の植物部分。
【請求項１６】
植物が単子葉植物である請求項１４に記載の植物。
【請求項１７】
前記単子葉植物がヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ）、及びイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）から構成される群から選択される請求項１６に記載の植物。
【請求項１８】
植物が双子葉植物である請求項１４に記載の植物。
【請求項１９】
前記双子葉植物がキョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）、シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）、フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、サワギキョウ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）、ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）、サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、キンボウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）、及びスミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）から構成される群から選択される請求項１８に記載の植物。
【請求項２０】
そのゲノムに前記発現カセットを含む請求項１４に記載の植物の種子。
【請求項２１】
キメラプロモーターとポリヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列は前記キメラプロモーターに機能的に連結されており、更に、前記キメラプロモーターは（ａ）植物の花においてプロモーター優先活性をもち、配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつ第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）植物においてポリヌクレオチド配列の転写を開始することが可能な少なくとも第２のポリヌクレオチド配列を含む前記発現カセット。
【請求項２２】
キメラプロモーターが植物の花においてプロモーター優先活性をもつ少なくとも第２のポリヌクレオチド配列を含む請求項２１に記載の発現カセット。
【請求項２３】
キメラプロモーターが植物の花においてプロモーター優先活性をもつ第２のポリヌクレオチド配列を含む請求項２１に記載の発現カセット。
【請求項２４】
キメラプロモーターが（ａ）植物の花においてプロモーター優先活性をもち、配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつ第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）植物の花においてプロモーター優先活性をもち、配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつ第２のポリヌクレオチドを含む請求項２１に記載の発現カセット。
【請求項２５】
キメラプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列が発現カセットにセンス方向に挿入されている請求項２１に記載の発現カセット。
【請求項２６】
キメラプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列が発現カセットにアンチセンス方向に挿入されている請求項２１に記載の発現カセット。
【請求項２７】
請求項２１に記載の発現カセットを含む発現ベクター。
【請求項２８】
請求項２１に記載の発現カセットで安定的に形質転換された植物又は植物部分。
【請求項２９】
植物部分が細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯から構成される群から選択される請求項２８に記載の植物部分。
【請求項３０】
植物が単子葉植物である請求項２８に記載の植物。
【請求項３１】
前記単子葉植物がヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ）、及びイネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）から構成される群から選択される請求項３０に記載の植物。
【請求項３２】
植物が双子葉植物である請求項２８に記載の植物。
【請求項３３】
前記双子葉植物がキョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）、シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）、フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、サワギキョウ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）、ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）、サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、キンボウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）、及びスミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）から構成される群から選択される請求項３２に記載の植物。
【請求項３４】
そのゲノムに前記発現カセットを含む請求項２８に記載の植物の種子。
【請求項３５】
植物の花において転写を開始することが可能なプロモーターを含むＤＮＡ分子で安定的に形質転換されたトランスジェニック植物細胞であって、前記プロモーターが配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む前記トランスジェニック植物細胞。
【請求項３６】
ＤＮＡ分子が更にプロモーターに機能的に連結された選択コーディング領域を含む請求項３５に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３７】
選択コーディング領域がセンス方向である請求項３６に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３８】
選択コーディング領域がアンチセンス方向である請求項３６に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項３９】
ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項３５に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４０】
ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項３５に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４１】
前記選択コーディング領域が昆虫耐性蛋白質、細菌病耐性蛋白質、真菌病耐性蛋白質、ウイルス病耐性蛋白質、アントシアニン生合成酵素、カロテノイド生合成酵素、花の香り生合成蛋白質、スクリーニング可能なマーカー蛋白質又は花の寿命を促進する蛋白質をコードする請求項３６に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４２】
前記選択コーディング領域がβ−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン及びグリーン蛍光蛋白質から構成される群から選択されるスクリーニング可能なマーカー蛋白質をコードする請求項３６に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４３】
前記選択コーディング領域がペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、及びペツニジンの化合物を産生するアントシアニン生合成酵素をコードする請求項３６に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４４】
前記選択コーディング領域がフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン及びアスタキサンチンの化合物を産生するカロテノイド生合成酵素をコードする請求項３６に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項４５】
トランスジェニック植物の花において選択蛋白質を発現させる方法であって、
（ａ）植物の花において転写を開始することが可能であり、配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにそのフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含むプロモーターに機能的に連結された選択コーディング領域を含む発現ベクターを得る段階と；
（ｂ）レシピエント植物細胞を前記ベクターで形質転換する段階と；
（ｃ）前記選択蛋白質を発現するトランスジェニック植物を前記レシピエント植物細胞から再生させる段階を含む前記方法。
【請求項４６】
選択コーディング領域がセンス方向である請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
選択コーディング領域がアンチセンス方向である請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
ストリンジェント条件が低ストリンジェンシーである請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
ストリンジェント条件が高ストリンジェンシーである請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記形質転換段階が電子銃照射、ポリエチレングリコールによるプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション及びアグロバクテリウムによる形質転換から構成される群から選択される方法を含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記形質転換段階が電子銃照射を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記形質転換段階がポリエチレングリコールによるプロトプラストの形質転換を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記形質転換段階がエレクトロポレーションを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記形質転換段階がアグロバクテリウムによる形質転換を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記レシピエント植物細胞が単子葉植物に由来する請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
単子葉植物がヒガンバナ科Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ、イネ科Ｇｒａｍｉｎａｅ、及びＰｏａｃｅａｅから構成される群から選択される請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記レシピエント植物細胞が双子葉植物に由来する請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
双子葉植物がキョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）、シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）、フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）、サワギキョウ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）、ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）、サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、キンボウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）、クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）、及びスミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）から構成される群から選択される請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物遺伝子工学に関する。より詳細には、本発明は、植物の少なくとも１個の花において、少なくとも１個の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の高レベルの発現を誘導することが可能なＳ−リナルールシンターゼ遺伝子に由来する単離プロモーター、植物の少なくとも１個の花において優先的に発現されるトランスジーン、及び前記トランスジーンを含む形質転換植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物組織でトランスジーンが発現するためには、植物の内部で機能的なプロモーターが機能的に連結されていることが必要である。プロモーター配列の選択により、植物内の何処で何時トランスジーンが発現されるかが決まる。構成的、誘導的、及び組織特異的プロモーター等の多数の異なる型のプロモーターが当分野で公知である。構成的プロモーターは植物の細胞全体でトランスジーンの連続発現が所望される場合に使用される。当分野で公知の構成的プロモーターとしては限定されないが、コメアクチン１（Ｗａｎｇら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２（８）：３３９９−３４０６（１９９２），米国特許第Ｎｏ．５，６４１，８７６号）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ  ＲＮＡ（Ｏｄｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０−８１２（１９８５））、ＣａＭＶ  １９Ｓ  ＲＮＡ（Ｌａｗｔｏｎら．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４９：９５−１０６（１９８７））、ｎｏｓ（Ｅｂｅｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：５７４５−５７４９（１９８７））、Ａｄｈ１（Ｗａｌｋｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６６２４−６６２８（１９８７））等が挙げられる。誘導的プロモーターは刺激に応答する遺伝子発現が所望される場合に使用される。当分野で公知の誘導的プロモーターとしては限定されないが、アブシシン酸ＡＢＡ及び膨圧誘導プロモーター、オーキシン結合蛋白質遺伝子のプロモーター（Ｓｃｈｗｏｂら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，４（３）：４２３−４３２（１９９３））、ＵＤＰグルコースフラボノイドグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Ｒａｌｓｔｏｎら，Ｇｅｎｅｔ．，１１９（１）：１８５−１９７（１９８８））等が挙げられる。組織特異的プロモーターは特定組織又は臓器での発現が所望される場合に使用される。当分野で公知の組織特異的プロモーターの例としては限定されないが、レクチン（Ｖｏｄｋｉｎら，Ｃｅｌｌ，３４：１０２３（１９８３），Ｌｉｎｄｓｔｒｏｎら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：１６０（１９９０）），エンドウマメ小サブユニットＲｕＢＰカルボキシラーゼ（Ｐｏｕｌｓｅｎら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５（２）：１９３−２００（１９８６），Ｃａｓｈｍｏｒｅら，Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２９−３８（１９８３））、Ｔｉプラスミドマンノピンシンターゼ（Ｌａｎｇｒｉｄｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３２１９−３２２３（１９８９））、ペチュニアカルコンイソメラーゼ（Ｖａｎ  Ｔｕｎｅｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，７：１２５７（１９８８））等が挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
多数の異なる型のプロモーターが当分野で公知であるが、トランスジェニック植物において外来遺伝子の高レベル発現を誘導する能力等の有益な発現特性をもつ新規プロモーターの発見が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１態様において、本発明はプロモーターをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。本発明のプロモーターは植物の少なくとも１個の花において少なくとも１個の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の転写を開始することができる。この単離ポリヌクレオチドは配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつ。本発明は上記配列のフラグメント及び変異体にも関する。配列が配列番号２とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で４２℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で６５℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
【０００５】
第２の態様では、本発明は植物の少なくとも１個の花において少なくとも１個の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の転写を開始するのに優先的に活性なプロモーターをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドに関する。この単離ポリヌクレオチドは配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつ。本発明は上記配列のフラグメント及び変異体にも関する。配列が配列番号２とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で４２℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で６５℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
【０００６】
更に別の態様では、本発明は上記単離プロモーターを含む発現カセットに関する。本発明の発現カセットはポリヌクレオチド配列に機能的に連結された上記プロモーターを含む。このプロモーターは発現カセットで形質転換された植物の少なくとも１個の花において前記ポリヌクレオチド配列の転写と発現を開始することができる。プロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチド配列は発現カセットにセンス又はアンチセンス方向に挿入されている。
【０００７】
更に別の態様では、本発明は上記発現カセットを含む発現ベクターに関する。
【０００８】
更に別の態様では、本発明は上記発現カセットで安定的に形質転換された植物又は植物部分に関する。形質転換可能な植物部分としては限定されないが、細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯が挙げられる。形質転換可能な植物は単子葉植物でも双子葉植物でもよい。単子葉植物の例としては限定されないが、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）（ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ））；イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ又はＰｏａｃｅａｅ）（カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ナガハグサ属（Ｐｏａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ））が挙げられる。双子葉植物の例としては限定されないが、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）（ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ））；キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ又はＣｏｍｐｏｓｉｔａｅ）（アスター属（Ａｓｔｅｒ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、エゾギク属（Ｃａｌｌｉｓｔｅｐｈｕｓ）、キクニガナ属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ハリシャギク属（Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ）、ダリア属（Ｄａｈｌｉａ）、キク属（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ）、クンショウギク属（Ｇａｚａｎｉａ）、ガーベラ属（Ｇｅｒｂｅｒａ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ムギラワギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、オオハンゴンソウ属（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ）、マンジュギク属（Ｔａｇｅｔｅｓ）、ヒャクニチソウ属（Ｚｉｎｎｉａ））；ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）（ツリフネソウ属（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ））；シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）（ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ））；ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）（ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ））；アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）（フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ））；ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）（スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ））；アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（イワナズナ属（Ａｌｙｓｓｕｍ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、エゾスズシロ属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ））；リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）（トルコギキョウ属（Ｅｕｓｔｏｍａ））；フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）（テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ））；トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）（ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ））；シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）（サルビア属（Ｓａｌｖｉａ））；マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、レンリンソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ））；ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）（ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ））；サワギキョウ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）（ミゾカクシ属（Ｌｏｂｅｌｉａ））；アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）（トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ゼニアオイ属（Ｍａｌｖａ））；イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）（リモニウム属（Ｌｉｍｏｎｉｕｍ））；ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）（フロックス属（Ｐｈｌｏｘ））；サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）（シクラメン属（Ｃｙｃｌａｍｅｎ））；キンボウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）（トリカブト属（Ａｃｏｎｉｔｕｍ）、イチリンソウ属（Ａｎｅｍｏｎｅ）、オダマキ属（Ａｑｕｉｌｅｇｉａ）、リュウキンカ属（Ｃａｌｔｈａ）、オオヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ））；バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）（バラ属（Ｒｏｓａ））；アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）（ペンタス属（Ｐｅｎｔａｓ））；ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）（アンゲロニア属（Ａｎｇｅｌｏｎｉａ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、トレニア属（Ｔｏｒｅｎｉａ））；ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ））；セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）（オランダミツバ属（Ａｐｉｕｍ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、パースニップ属（Ｐａｓｔｉｎａｃａ））；クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）（クマツヅラ属（Ｖｅｒｂｅｎａ）、ランタナ属（Ｌａｎｔａｎａ））；スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）（スミレ属（Ｖｉｏｌａ））が挙げられる。
【０００９】
更に別の態様では、本発明は上記発現カセットを含む上記植物により生産された種子に関する。
【００１０】
更に別の態様では、本発明はポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたキメラプロモーターを含む発現カセットに関する。この発現カセットにおいて使用されるキメラプロモーターは（ａ）植物の少なくとも１個の花において少なくとも１個の目的とする機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の転写を開始することが可能であり、配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列並びにこれらの配列のフラグメント及び変異体から構成される群から選択される配列をもつ第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）植物においてポリヌクレオチド配列又は選択遺伝子の転写を開始することが可能な少なくとも第２のポリヌクレオチド配列を含む。場合により、キメラプロモーターを構成する第２のポリヌクレオチド配列は配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつ。これらの配列のフラグメント及び変異体も本発明の範囲に含まれる。キメラプロモーターに機能的に連結されたポリヌクレオチドは発現カセットにセンス又はアンチセンス方向に挿入することができる。
【００１１】
更に別の態様では、本発明はキメラプロモーターを含む上記発現カセットを含む発現カセットを含む発現ベクターに関する。
【００１２】
更に別の態様では、本発明はキメラプロモーターを含む上記発現カセットで安定的に形質転換された植物又は植物部分に関する。形質転換可能な植物部分としては限定されないが、細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯が挙げられる。形質転換可能な植物は単子葉植物でも双子葉植物でもよい。単子葉植物の例としては限定されないが、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）（ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ））；イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ又はＰｏａｃｅａｅ）（カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ナガハグサ属（Ｐｏａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ））が挙げられる。双子葉植物の例としては限定されないが、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）（ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ））；キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ又はＣｏｍｐｏｓｉｔａｅ）（アスター属（Ａｓｔｅｒ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、エゾギク属（Ｃａｌｌｉｓｔｅｐｈｕｓ）、キクニガナ属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ハリシャギク属（Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ）、ダリア属（Ｄａｈｌｉａ）、キク属（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ）、クンショウギク属（Ｇａｚａｎｉａ）、ガーベラ属（Ｇｅｒｂｅｒａ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ムギラワギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、オオハンゴンソウ属（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ）、マンジュギク属（Ｔａｇｅｔｅｓ）、ヒャクニチソウ属（Ｚｉｎｎｉａ））；ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）（ツリフネソウ属（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ））；シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）（ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ））；ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）（ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ））；アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）（フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ））；ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）（スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ））；アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（イワナズナ属（Ａｌｙｓｓｕｍ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、エゾスズシロ属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ））；リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）（トルコギキョウ属（Ｅｕｓｔｏｍａ））；フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）（テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ））；トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）（ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ））；シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）（サルビア属（Ｓａｌｖｉａ））；マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、レンリンソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ））；ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）（ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ））；サワギキョウ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）（ミゾカクシ属（Ｌｏｂｅｌｉａ））；アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）（トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ゼニアオイ属（Ｍａｌｖａ））；イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）（リモニウム属（Ｌｉｍｏｎｉｕｍ））；ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）（フロックス属（Ｐｈｌｏｘ））；サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）（シクラメン属（Ｃｙｃｌａｍｅｎ））；キンボウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）（トリカブト属（Ａｃｏｎｉｔｕｍ）、イチリンソウ属（Ａｎｅｍｏｎｅ）、オダマキ属（Ａｑｕｉｌｅｇｉａ）、リュウキンカ属（Ｃａｌｔｈａ）、オオヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ））；バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）（バラ属（Ｒｏｓａ））；アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）（ペンタス属（Ｐｅｎｔａｓ））；ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）（アンゲロニア属（Ａｎｇｅｌｏｎｉａ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、トレニア属（Ｔｏｒｅｎｉａ））；ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ））；セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）（オランダミツバ属（Ａｐｉｕｍ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、パースニップ属（Ｐａｓｔｉｎａｃａ））；クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）（クマツヅラ属（Ｖｅｒｂｅｎａ）、ランタナ属（Ｌａｎｔａｎａ））；スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）（スミレ属（Ｖｉｏｌａ））が挙げられる。
【００１３】
更に別の態様では、本発明はキメラプロモーターを含む上記発現カセットを含む上記植物により生産された種子にも関する。
【００１４】
更に別の態様では、本発明は植物の少なくとも１個の花において転写を誘導することが可能なプロモーターを含むＤＮＡ分子で安定的に形質転換されたトランスジェニック植物細胞に関する。プロモーターは配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む。これらの配列のフラグメント及び変異体も本発明に含まれる。植物細胞を形質転換するために使用されるＤＮＡ分子は更にプロモーターに機能的に連結された選択コーディング領域を含む。この選択コーディング領域はセンス方向でもアンチセンス方向でもよい。更に、選択コーディング領域は昆虫耐性蛋白質、細菌病耐性蛋白質、真菌病耐性蛋白質、ウイルス病耐性蛋白質、アントシアニン生合成酵素、カロテノイド生合成酵素、花の香り生合成蛋白質、スクリーニング可能なマーカー蛋白質又は花の寿命を促進する蛋白質をコードすることができる。選択コーディング領域がスクリーニング可能なマーカーをコードする場合には、前記スクリーニング可能なマーカーはβ−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン及びグリーン蛍光蛋白質から構成される群から選択することができる。選択コーディング領域がアントシアニン生合成酵素をコードする場合には前記アントシアニン生合成酵素はペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、及びペツニジンの化合物を産生することができる。選択コーディング領域がカロテノイド生合成酵素をコードする場合には、前記カロテノイド生合成酵素はフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、アドニルビン及びアドニキサンチンの化合物を産生することができる。
【００１５】
配列が配列番号２とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で４２℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で６５℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
【００１６】
更に別の態様では、本発明はトランスジェニック植物の少なくとも１個の花において第１のポリヌクレオチド配列を選択的に発現させる方法に関する。本方法は発現カセットを含む発現ベクターで植物又は植物細胞を形質転換する段階を含み、前記発現カセットはプロモーターと前記プロモーターに機能的に連結された第１のポリヌクレオチド配列を含み、プロモーターは植物の少なくとも１個の花において前記第１のポリヌクレオチド配列の転写を開始し、発現を誘導することが可能であり、配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む。これらの配列のフラグメント及び変異体も本発明の範囲に含まれる。第１のポリヌクレオチドは発現カセットにセンス又はアンチセンス方向に挿入される。
【００１７】
配列が配列番号２とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で４２℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で６５℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
【００１８】
発現カセットに挿入された第１のポリヌクレオチド配列は昆虫耐性蛋白質、細菌病耐性蛋白質、真菌病耐性蛋白質、ウイルス病耐性蛋白質、アントシアニン生合成酵素、カロテノイド生合成酵素、花の香り生合成蛋白質、スクリーニング可能なマーカー蛋白質又は花の寿命を促進する蛋白質をコードすることができる。第１のポリヌクレオチド配列がスクリーニング可能なマーカーをコードする場合には、前記スクリーニング可能なマーカーはβ−グルクロニダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン及びグリーン蛍光蛋白質から構成される群から選択することができる。第１のポリヌクレオチド配列がアントシアニン生合成酵素をコードする場合には前記アントシアニン生合成酵素はペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、及びペツニジンの化合物を産生することができる。第１のポリヌクレオチド配列がカロテノイド生合成酵素をコードする場合には、前記カロテノイド生合成酵素はフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、アドニルビン及びアドニキサンチンの化合物を産生することができる。
【００１９】
形質転換される植物又は植物細胞は単子葉植物に由来するものとすることができ、限定されないが、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）（ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ））；イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ又はＰｏａｃｅａｅ）（カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ナガハグサ属（Ｐｏａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ））が挙げられる。あるいは、形質転換される植物又は植物細胞は双子葉植物に由来するものとすることができ、限定されないが、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）（ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ））；キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）又は（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）（アスター属（Ａｓｔｅｒ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、エゾギク属（Ｃａｌｌｉｓｔｅｐｈｕｓ）、キクニガナ属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ハリシャギク属（Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ）、ダリア属（Ｄａｈｌｉａ）、キク属（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ）、クンショウギク属（Ｇａｚａｎｉａ）、ガーベラ属（Ｇｅｒｂｅｒａ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ムギラワギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、オオハンゴンソウ属（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ）、マンジュギク属（Ｔａｇｅｔｅｓ）、ヒャクニチソウ属（Ｚｉｎｎｉａ））；ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）（ツリフネソウ属（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ））；シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）（ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ））；ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）（ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ））；アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）（フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ））；ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）（スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ））；アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（イワナズナ属（Ａｌｙｓｓｕｍ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、エゾスズシロ属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ））；リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）（トルコギキョウ属（Ｅｕｓｔｏｍａ））；フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）（テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ））；トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）（ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ））；シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）（サルビア属（Ｓａｌｖｉａ））；マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、レンリンソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ））；ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）（ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ））；サワギキョウ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）（ミゾカクシ属（Ｌｏｂｅｌｉａ））；アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）（トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ゼニアオイ属（Ｍａｌｖａ））；イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）（リモニウム属（Ｌｉｍｏｎｉｕｍ））；ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）（フロックス属（Ｐｈｌｏｘ））；サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）（シクラメン属（Ｃｙｃｌａｍｅｎ））；キンボウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）（トリカブト属（Ａｃｏｎｉｔｕｍ）、イチリンソウ属（Ａｎｅｍｏｎｅ）、オダマキ属（Ａｑｕｉｌｅｇｉａ）、リュウキンカ属（Ｃａｌｔｈａ）、オオヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ））；バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）（バラ属（Ｒｏｓａ））；アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）（ペンタス属（Ｐｅｎｔａｓ））；ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）（アンゲロニア属（Ａｎｇｅｌｏｎｉａ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、トレニア属（Ｔｏｒｅｎｉａ））；ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ））；セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）（オランダミツバ属（Ａｐｉｕｍ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、パースニップ属（Ｐａｓｔｉｎａｃａ））；クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）（クマツヅラ属（Ｖｅｒｂｅｎａ）、ランタナ属（Ｌａｎｔａｎａ））；スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）（スミレ属（Ｖｉｏｌａ））が挙げられる。
【００２０】
更に別の態様では、本発明はトランスジェニック植物の少なくとも１個の花において選択蛋白質を発現させる方法に関する。本方法の第１段階は植物の花において転写を開始することが可能なプロモーターに機能的に連結された選択コーディング領域を含む発現ベクターを得る。プロモーターは配列番号２及びストリンジェント条件下で配列番号２とハイブリダイズする配列から構成される群から選択される配列をもつポリヌクレオチドを含む。これらの配列のフラグメント及び変異体も本発明の範囲に含まれる。第２段階はのレシピエント植物細胞を前記ベクターで形質転換する。第３段階は前記選択蛋白質を発現するトランスジェニック植物を前記レシピエント植物細胞から再生させる。
【００２１】
発現カセットで使用される選択コーディング領域はセンス方向でもアンチセンス方向でもよい。配列が配列番号２とハイブリダイズすることができるストリンジェント条件は低ストリンジェンシー条件でも高ストリンジェンシー条件でもよい。低ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で４２℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。高ストリンジェンシー条件は２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液で６５℃にて３０分間洗浄した後に前記洗浄を繰返す。
【００２２】
植物細胞の形質転換は当分野で公知の技術を使用して実施することができ、限定されないが、電子銃照射、ポリエチレングリコールによるプロトプラストの形質転換、エレクトロポレーション及びアグロバクテリウムによる形質転換が挙げられる。形質転換されるレシピエント植物細胞は単子葉植物に由来するものでも双子葉植物に由来するものでもよい。単子葉植物の例としては限定されないが、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）（ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ））；イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ又はＰｏａｃｅａｅ）（カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ナガハグサ属（Ｐｏａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ））が挙げられる。双子葉植物の例としては限定されないが、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）（ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ））；キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ又はＣｏｍｐｏｓｉｔａｅ）（アスター属（Ａｓｔｅｒ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、エゾギク属（Ｃａｌｌｉｓｔｅｐｈｕｓ）、キクニガナ属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ハリシャギク属（Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ）、ダリア属（Ｄａｈｌｉａ）、キク属（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ）、クンショウギク属（Ｇａｚａｎｉａ）、ガーベラ属（Ｇｅｒｂｅｒａ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ムギラワギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、オオハンゴンソウ属（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ）、マンジュギク属（Ｔａｇｅｔｅｓ）、ヒャクニチソウ属（Ｚｉｎｎｉａ））；ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）（ツリフネソウ属（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ））；シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）（ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ））；ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）（ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ））；アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）（フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ））；ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）（スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ））；アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（イワナズナ属（Ａｌｙｓｓｕｍ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、エゾスズシロ属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ））；リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）（トルコギキョウ属（Ｅｕｓｔｏｍａ））；フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）（テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ））；トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）（ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ））；シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）（サルビア属（Ｓａｌｖｉａ））；マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、レンリンソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ））；ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）（ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ））；サワギキョウ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）（ミゾカクシ属（Ｌｏｂｅｌｉａ））；アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）（トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ゼニアオイ属（Ｍａｌｖａ））；イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）（リモニウム属（Ｌｉｍｏｎｉｕｍ））；ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）（フロックス属（Ｐｈｌｏｘ））；サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）（シクラメン属（Ｃｙｃｌａｍｅｎ））；キンボウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）（トリカブト属（Ａｃｏｎｉｔｕｍ）、イチリンソウ属（Ａｎｅｍｏｎｅ）、オダマキ属（Ａｑｕｉｌｅｇｉａ）、リュウキンカ属（Ｃａｌｔｈａ）、オオヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ））；バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）（バラ属（Ｒｏｓａ））；アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）（ペンタス属（Ｐｅｎｔａｓ））；ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）（アンゲロニア属（Ａｎｇｅｌｏｎｉａ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、トレニア属（Ｔｏｒｅｎｉａ））；ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ））；セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）（オランダミツバ属（Ａｐｉｕｍ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、パースニップ属（Ｐａｓｔｉｎａｃａ））；クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）（クマツヅラ属（Ｖｅｒｂｅｎａ）、ランタナ属（Ｌａｎｔａｎａ））；スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）（スミレ属（Ｖｉｏｌａ））が挙げられる。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
緒言
本発明は植物の少なくとも１個の花等の特定組織で転写を開始するためのプロモーターとしてのＳ−リナルールシンターゼ遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列の使用に関する。本発明のポリヌクレオチド配列は植物の少なくとも１個の花において目的蛋白質を発現させるために使用することができる。
【００２４】
定義
本発明の種々の側面又は態様は本明細書に記載する見出しに限定されず、明細書全体を参照して理解することができる。従って、以下に定義する用語は明細書全体を参照して完全に定義される。
【００２５】
本明細書で使用する「外来コーディング領域」又は「選択コーディング領域」なる用語は生物に導入又は再導入されるポリヌクレオチド又は選択遺伝子のコーディング領域を意味する。例えば、カロテノイドルテインをコードするコーディング領域（ポリヌクレオチド又は選択遺伝子に由来する）は生物（例えばマリーゴールド等の植物）に導入又は再導入される場合に外来コーディング領域又は選択コーディング領域とみなされる。
【００２６】
本明細書で使用する「発現」なる用語は構造遺伝子又はポリヌクレオチド等のコーディングＤＮＡ分子の転写及び翻訳によりポリペプチドを産生するプロセスを含む細胞内プロセスの組合せを意味する。
【００２７】
本明細書で使用する「発現カセット」なる用語は遺伝子形質転換により宿主ゲノムに導入されるように設計されたキメラＤＮＡ分子を意味する。本発明の好ましい発現カセットは選択遺伝子又はポリヌクレオチド配列の発現を誘導するために必要な全遺伝子エレメントを含む。本発明の発現カセットはＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターを含む。
【００２８】
本明細書で使用する「発現ベクター」なる用語は少なくとも１個の発現カセットを含むＤＮＡベクターを意味する。
【００２９】
「遺伝子」なる用語は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくは（ペプチド、ポリペプチド、蛋白質をコードする）他のＤＮＡ、またはＲＮＡ分子、発現の調節に関与するコーディング配列のフランキング領域を意味する。
【００３０】
本明細書で使用する「宿主」なる用語は細菌、完全植物、小植物、又は植物部分（例えば植物細胞、プロトプラスト、カルス、根、塊茎、珠芽、種子、苗、花粉及び植物組織）を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する「単離」なる用語はポリヌクレオチドや蛋白質等の材料が（ａ）その天然環境に認められるような通常この材料に付随するか又はこれと反応する成分を実質的又は本質的に含まないか、あるいは（ｂ）この材料がその天然環境にある場合には、この材料が意図的な人的介入により組成を改変されているか及び／又はこの材料の本来の遺伝子座以外の細胞内の遺伝子座に配置されていることを意味する。
【００３２】
本明細書で使用する「マーカー遺伝子」なる用語はマーカー遺伝子を発現する細胞に別個の表現型を付与し、マーカー遺伝子をもたない細胞から形質転換細胞を区別させる遺伝子を意味する。このような遺伝子は観察又は試験により（即ちグリーン蛍光蛋白質等によるスクリーニングにより）識別できるスクリーニング可能なマーカーをコードすることができる。
【００３３】
本明細書で使用する「組織優先」なる用語は特定機能を実施する細胞の任意の群において最高レベルのポリヌクレオチド又は選択遺伝子発現を意味する。細胞の群で最高レベルのポリヌクレオチド又は遺伝子発現を測定する技術は当分野で公知であり、限定されないが、組織化学及び蛍光アッセイが挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用する「花優先」なる用語は植物の少なくとも１個の花において優先的な少なくとも１個のポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現を意味する。
【００３５】
本明細書で使用する「花弁優先」なる用語は花弁組織において最高レベルのポリヌクレオチド又は選択遺伝子発現を意味する。細胞の群で最高レベルのポリヌクレオチド又は遺伝子発現を測定する技術は当分野で公知であり、限定されないが、組織化学及び蛍光アッセイが挙げられる。
【００３６】
本明細書で使用する「植物部分」又は「植物の部分」なる用語は細胞、プロトプラスト、細胞組織培養物、カルス、細胞塊、胚、花粉、胚珠、花弁、花柱、雄蘂、葉、根、根端及び葯を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」なる用語は任意長のヌクレオチドのポリマー形を意味し、リボヌクレオチドでもデオキシリボヌクレオチドでもよい。この用語は２本鎖及び１本鎖ＤＮＡと２本鎖及び１本鎖ＲＮＡを含む。更にメチル化又はキャッピング等のポリヌクレオチドの修飾形態と非修飾形態む含む。
【００３８】
本明細書で使用する「プロモーター」なる用語はポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現制御エレメントを提供し、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合してこの遺伝子の転写（ＲＮＡ合成）を開始するＤＮＡ配列又はＤＮＡ配列群上の認識部位を意味する。プロモーターは一般に転写の開始、調節、及び効率に関与する数個の調節エレメントから構成され、このようなエレメントは転写開始部位に近接する数百あるいは数千ヌクレオチドであり得る。このような調節エレメントとしては限定されないが、ＴＡＴＡボックス、エンハンサー、上流活性化配列等が挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用する「選択遺伝子」なる用語はトランスジェニック植物、植物細胞又は植物部分で発現させる遺伝子を意味する。選択遺伝子は宿主ゲノムに内在するものでもよいし、外来でもよい。選択遺伝子が宿主ゲノムに存在する場合には、遺伝子の天然コピーとは異なる１個以上の調節又は機能エレメントを含む。
【００４０】
本明細書で使用する「形質転換細胞」なる用語はそのＤＮＡ相補鎖が外来ＤＮＡ分子（即ち外来コーディング領域）を細胞に導入することにより改変されている細胞を意味する。「外来ＤＮＡ分子」は（１）細胞に本来存在しない配列と、（２）形質転換される細胞に内在しており、前記細胞に再導入される配列を含む。
【００４１】
本明細書で使用する「トランスジーン」なる用語は宿主ゲノムに組込まれているか又は宿主細胞で自律複製することができ、１個以上の細胞産物を発現させることが可能なＤＮＡセグメントを意味する。
【００４２】
本明細書で使用する「トランスジェニック植物」なる用語は植物又はその任意後続世代の植物の子孫であって、植物又はその子孫のＤＮＡが同一株の非トランスジェニック植物に本来存在しない外来ＤＮＡ分子を導入されているものを意味する。トランスジェニック植物は形質転換される植物に内在する配列も含むことができるが、「外来」遺伝子は遺伝子の発現レベル又はパターンを変化させるように改変されている。
【００４３】
本明細書で使用する「トランジットペプチド」なる用語は特定オルガネラ又は細胞内の他の位置にポリペプチドを誘導することが可能なポリペプチド配列を意味する。
【００４４】
本明細書で使用する「ベクター」なる用語は宿主細胞で複製可能であるか、及び／又は別のＤＮＡセグメントを機能的に連結して付加セグメントの複製を生じることができるＤＮＡ分子を意味する。ベクターの１例はプラスミドである。
【００４５】
配列表
本願は５種のポリヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列も含む。これらのポリヌクレオチド配列では、塩基対は以下の塩基コードにより記載される。
記号    意味
Ａ      アデニン
Ｃ      シトシン
Ｇ      グアニン
Ｔ      チミン
Ｕ      ウラシル
Ｍ      Ａ又はＣ
Ｒ      Ａ又はＧ
Ｗ      Ａ又はＴ／Ｕ
Ｓ      Ｃ又はＧ
記号    意味
Ｙ      Ｃ又はＴ／Ｕ
Ｋ      Ｇ又はＴ／Ｕ
Ｖ      Ａ又はＣ又はＧ；Ｔ／Ｕ以外
Ｈ      Ａ又はＣ又はＴ／Ｕ；Ｇ以外
Ｄ      Ａ又はＧ又はＴ／Ｕ；Ｃ以外
Ｂ      Ｃ又はＧ又はＴ／Ｕ；Ａ以外
Ｎ      （Ａ又はＣ又はＧ又はＴ／Ｕ）。
【００４６】
本願に示すアミノ酸はＬ形であり、以下のアミノ酸３文字略語により記載される。
略語    アミノ酸名
Ａｌａ  Ｌ−アラニン
Ａｒｇ  Ｌ−アルギニン
Ａｓｎ  Ｌ−アスパラギン
Ａｓｐ  Ｌ−アスパラギン酸
Ａｓｘ  Ｌ−アスパラギン酸又はアスパラギン
Ｃｙｓ  Ｌ−システイン
Ｇｌｕ  Ｌ−グルタミン酸
Ｇｌｎ  Ｌ−グルタミン
Ｇｌｘ  Ｌ−グルタミン又はグルタミン酸
Ｇｌｙ  Ｌ−グリシン
Ｈｉｓ  Ｌ−ヒスチジン
Ｉｌｅ  Ｌ−イソロイシン
Ｌｅｕ  Ｌ−ロイシン
Ｌｙｓ  Ｌ−リジン
Ｍｅｔ  Ｌ−メチオニン
Ｐｈｅ  Ｌ−フェニルアラニン
Ｐｒｏ  Ｌ−プロリン
Ｓｅｒ  Ｌ−セリン
Ｔｈｒ  Ｌ−スレオニン
Ｔｒｐ  Ｌ−トリプトファン
Ｔｙｒ  Ｌ−チロシン
Ｖａｌ  Ｌ−バリン
Ｘａａ  Ｌ−不明又はその他。
【００４７】
好適態様の説明
１態様では、本発明はプロモーターをコードするＳ−リナルールシンターゼ（ＬＩＳ）遺伝子に由来する単離ポリヌクレオチド配列の使用に関する。本明細書に記載するポリヌクレオチド配列は植物の少なくとも１個の花において目的とする任意の機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現を誘導することができる。このような発現は花優先のみならず、より詳細には花弁優先であることが判明した。
【００４８】
本発明のプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号２と図１のヌクレオチド７−１０３３に示される（以下、「ＬＩＳ１プロモーター」と言う）。このポリヌクレオチド配列はＣｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉｉに由来するＳ−リナルールシンターゼ遺伝子（配列番号１）から誘導した。Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉｉに由来するＳ−リナルールシンターゼ遺伝子の完全ポリヌクレオチド及びアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＡＦ０６７６０１（配列番号１）とＣｓｅｋｅ，Ｌ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．，１５：１４９１−１４９８（１９９８）に記載されている。Ｓ−リナルールシンターゼ遺伝子は揮発性モノテルペノイドであるＳ−リナルールの産生を触媒する花の香りの生合成酵素であるＳ−リナルールシンターゼをコードする（Ｄｕｄａｒｅｖａら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，８：１１３７−１１４８（１９９６））。
【００４９】
別の花化合物である安息香酸カルボキシルメチルトランスフェラーゼは安息香酸メチルの生合成における最終酵素であり、キンギョソウの花に最も豊富に存在する芳香化合物として知られている。キンギョソウでは、ＢＡＭＴ遺伝子活性の大部分が花冠の上下葉で検出された（Ｄｕｄａｒｅｖａら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１２：９４９−９６１（２０００））。１実施例によると、ＢＡＭＴ遺伝子に由来するプロモーターはトランスジェニックペチュニア花弁組織で外来遺伝子発現を誘導しないことが分かった。従って、このプロモーターは他の種で花弁優先プロモーターであると予想することができない。
【００５０】
本発明のプロモーターは本発明のプロモーターの配列との配列相同に基づいて当分野で公知の慣用技術を使用して他の生物から他のプロモーターを単離するために使用することができる。これらの技術では、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド長、最も好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長のユニークな他の配列と選択的にハイブリダイズするプローブとして本発明のプロモーターの全部又は一部を使用する。これらのプローブはポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）を使用して選択した生物から対応するプロモーターを増幅するために使用することができる。この技術は所望生物から付加プロモーターを単離するため又は生物におけるプロモーターの存在を調べるための診断アッセイとして使用することができる。例えば、プレーティングしたＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングが挙げられる（プラーク又はコロニー；例えばＩｎｎｉｓら，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）参照）。
【００５１】
本発明は本発明のプロモーターに対応し、本発明のプロモーターとハイブリダイズし、開示配列と少なくとも５０％相同、７０％相同、８５％相同、９０％相同、９５％相同、更には９９％相同の配列にも関する。即ち、プローブとターゲットの配列類似度は少なくとも約５０％、約７０％、約８５％、約９０％、約９５％、更には約９５％の範囲とすることができる。
【００５２】
比較のための配列の整列方法は当分野で周知である。遺伝子比較はデフォルトパラメーターを使用してＢＬＡＳＴ“ＧＥＮＥＭＢＬ”データベースに含まれる配列との一致をＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９３）；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴも参照）により検索することにより決定することができる。デフォルトパラメーターを使用してＢＬＡＳＴＮアルゴリズムによりＧＥＮＥＭＢＬデータベースに含まれる全公共入手可能なＤＮＡ配列との一致について配列を分析することができる。本発明の配列との一致は完全プロモーターに対して少なくとも５０％の配列一致度、より好ましくは少なくとも７０％の配列一致度、より好ましくは少なくとも７５％の配列一致度、より好ましくは少なくとも８０％の一致度、より好ましくは少なくとも８５％の配列一致度、より好ましくは少なくとも９０％の配列一致度、より好ましくは少なくとも９５％の配列一致度、最も好ましくは少なくとも９９％の配列一致度をもつポリヌクレオチド配列を意味する。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチド配列（配列番号２）にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列の同定はストリンジェント条件の使用等の当分野の慣用技術を使用して実施することができる。本明細書で使用する「ストリンジェント条件」又は「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」なる用語はプローブが他の配列よりも検出可能に高度な程度（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）までそのターゲット配列とハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェント条件はターゲット配列に依存し、ポリヌクレオチドの構造により異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに１００％相補的なターゲット配列を同定することができる（このようなプロービングは「ホモプロービング」として知られる）。あるいは、より低い類似度を検出するように配列をある程度ミスマッチさせるようにストリンジェンシー条件を調節することができる（このようなプロービングは「ヘテロプロービング」として知られる）。一般に、この種のプローブは約１００ヌクレオチド長〜約２５０ヌクレオチド長である。
【００５４】
核酸のハイブリダイゼーションに関する詳細な手引きはＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）に記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））も参照。
【００５５】
特異性は一般にハイブリダイゼーション後の洗浄に依存し、必須因子は最終洗浄溶液のイオン強度と温度である。一般に、ストリンジェント洗浄温度条件は規定イオン強度及びｐＨで特定配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃〜約２℃低くなるように選択される。ＤＮＡの融点又は変性は狭い温度範囲で生じ、二重螺旋からその相補的１本鎖への分解に相当する。プロセスは遷移中間点の温度Ｔｍ（融点とも言う）により表される。融点を決定するための式は当分野で公知である。
【００５６】
本発明のプロモーターに好適なハイブリダイゼーション条件としては４２℃で５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、６ｘ標準クエン酸食塩水（“ＳＳＣ”）、０．５％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（“ＳＤＳ”）、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡの溶液中のハイブリダイゼーションが挙げられる。低ストリンジェンシー洗浄条件の例としては４２℃で３０分間２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液中のハイブリダイゼーションとその反復が挙げられる。中ストリンジェンシー洗浄条件の例としては５０℃で３０分間２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液中のハイブリダイゼーションとその反復が挙げられる。高ストリンジェンシー洗浄条件の例としては６５℃で３０分間２ＸＳＳＣ，０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの溶液中のハイブリダイゼーションとその反復が挙げられる。本発明のプロモーターに対応する配列は全上記条件を使用して得られる。
【００５７】
本発明は本発明のプロモーター（即ち配列番号２）から誘導されるフラグメント及び変異体にも関する。本明細書で使用する「フラグメント」とはポリヌクレオチド配列の一部を意味する。本発明のフラグメントは配列番号２の一部を含む。これらのフラグメントは生物活性を維持することができるので、植物の少なくとも１個の花において機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の発現を誘導することが可能なフラグメントを含む。本発明のプロモーターのポリヌクレオチドフラグメントは少なくとも２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０１０ヌクレオチドを含むか又は本明細書に開示する全長ＬＩＳ１プロモーターに存在するヌクレオチド数まで含む。ポリヌクレオチドフラグメントは通常は特定プロモーター配列のＴＡＴＡ認識配列（ＴＡＴＡボックスとしても知られる）を含む。このようなフラグメントは制限酵素を使用して本明細書に開示するプロモーターのポリヌクレオチド配列を切断するか、天然プロモーターＤＮＡ配列からポリヌクレオチド配列を合成するか、又はＰＣＲ技術を使用することにより得られる。特にＭｕｌｌｉｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｎｉｏｌ．１５５：３３５−３５０（１９８７），及びＥｒｌｉｃｈら，（１９８９）ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））参照。
【００５８】
上記に要約したように、本発明は本発明のプロモーター（配列番号２）の変異体にも関する。本明細書で使用する「変異体」なる用語は実質的に類似する配列を意味する。天然変異体はポリメラーゼ連鎖反応等の当分野で公知の慣用技術を使用して同定することができる。変異体ポリヌクレオチドは更に以下に詳述する部位特異的突然変異誘発により生産されたもの等の合成により誘導されたポリヌクレオチド配列も含む。生体活性変異体も本発明の範囲に含まれる。
【００５９】
本発明のプロモーターの変異体は当分野で公知の慣用技術を使用して配列番号２を挿入、欠失又は突然変異させることにより生産することができる。例えば、上記に要約したように、このような変異体は配列番号２の部位特異的突然変異誘発により得られる配列を含む。部位特異的突然変異誘発を実施するための技術はＭｉｋａｅｌｉａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：３７６（１９９２），Ｚｈｏｕら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：６０５２（１９９１）に記載されている。更に、本発明はＺｈｕら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１６８１−８９（１９９５）により記載されているように、プロモーター活性を損わずに欠失させることができる転写開始部位の近傍のＴＡＴＡボックスまでのプロモーターの５’部分の変異体にも関する。このような変異体は植物の少なくとも１個の花において発現を誘導する能力を維持すべきである。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチド配列は植物の少なくとも１個の花において特定蛋白質又はポリペプチド産物又はＲＮＡ分子をコードする機能的に連結されたポリヌクレオチド及び／又は選択遺伝子から選択コーディング領域の発現を誘導するのに使用することができる。レシピエント植物細胞の形質転換にＬＩＳ１プロモーターと併用する特定選択コーディング領域の選択は形質転換の目的によって異なる。植物の形質転換の主目的の１つは商業的に望ましいか、農学又は園芸学的に重要な形質を植物に付加することである。このような形質としては限定されないが、昆虫抵抗性ないし耐性、疾病抵抗性ないし耐性（ウイルス、細菌、真菌）、色（例えば（１）アントシアニン（限定されないが、例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、ペツニジン等のアントシアニン化合物を産生するアントシアニン生合成酵素の産生又は発現増加による（上記化合物を産生するアントシアニン生合成酵素をコードするポリヌクレオチド及び遺伝子配列は当分野で公知であり、Ｈｏｌｔｏｎら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７：１０７１−１０８３（１９９５）に記載されている）及び／又は（２）カロテノイド（限定されないが、例えばフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン等の化合物を産生するカロテノイド生合成酵素の産生又は発現増加による（上記カロテノイド化合物を産生するカロテノイド生合成酵素をコードするポリヌクレオチド及び遺伝子配列は当分野で公知であり、ＷＯ００／３２７８８と米国特許第５，６８４，２３８号、５，５３０，１８８号、５，４２９，９３９号及び５，６１８，９８８号、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｇａｎｔｔ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ｅｄ．Ａ．Ｖａｉｎｓｔｅｉｎ（Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（２００２）），Ｃｈａｍｏｖｉｔｚら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２９６（３）：３０５−３１０（１９９２），Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｊ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４６：５２１−５４７（１９９５），Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３２８（１−２）：１３０−１３８（１９９３），Ｈｕｇｕｅｎｅｙ，ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０９（１）：３９９−４０７（１９９２），Ｈｕｎｄｌｅら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１５（３）：３２９−３３４（１９９３），Ｋａｊｉｗａｒａら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９（２）：３４３−３５２（１９９５），Ｋｕｎｔｚら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２（１）：２５−３４（１９９２），Ｌｉｎｄｅｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４（２）：３６９−７９（１９９４），Ｌｏｔａｎら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３６４（２）：１２５−１２８（１９９５），Ｍａｔｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９（１５）：６７６１−６７６４（１９９２），Ｍｉｓａｗａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２（１２）：６７０４−６７１２（１９９０），Ｍｉｓａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），１１６（５）：９８０−９８５（１９９４），Ｓａｎｄｍａｎｎ，Ｇ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６９（３）：２５３−２５７（１９９２），Ｓａｎｄｍａｎｎら，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，５９（１−２）：７７−８２（１９９０）及びＫａｊｉｗａｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２４：４２１−４２６（１９９７）に記載されている））、花の香り、花の寿命等が挙げられる。選択コーディング領域はセンス又はアンチセンス方向で本発明のプロモーターと併用することができる。
【００６１】
更に別の態様では、本発明は植物の少なくとも１個の花において特定蛋白質又はポリペプチド産物又はＲＮＡ分子をコードする機能的に連結されたポリヌクレオチド及び／又は選択遺伝子から選択コーディング領域の発現を誘導するために使用することができるキメラプロモーターに関する。より詳細には、本発明のポリヌクレオチド又はそのフラグメントもしくは変異体はキメラプロモーター（以下、「ＬＩＳ１キメラプロモーター」と言う）を形成するために当分野で公知の慣用技術を使用して別のプロモーターと機能的に連結することができる。例えば、本発明のプロモーターは植物の少なくとも１個の花において前記キメラプロモーターに機能的に連結された少なくとも１個のポリヌクレオチド又は選択遺伝子の高レベル発現を誘導するためにＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの特定領域と機能的に連結することができる。本発明のＬＩＳ１プロモーターと共にＬＩＳ１キメラプロモーターを作製するために使用されるプロモーターは単に植物の花においてポリヌクレオチド配列又は選択遺伝子の発現を誘導するのでなくてもよい。実際に、このプロモーターは単に組織特異的プロモーターでなくてもよい。場合により、前記プロモーターは構成的プロモーターでも誘導的プロモーターでもよく、いずれも当分野で周知である。
【００６２】
形質転換にＬＩＳ１プロモーターと併用する特定選択コーディング領域の選択は形質転換の目的によって異なる。植物の形質転換の主目的の１つは商業的に望ましいか、農学又は園芸学的に重要な形質を植物に付加することである。このような形質としては限定されないが、昆虫抵抗性ないし耐性、疾病抵抗性ないし耐性（ウイルス、細菌、真菌）、色（例えば（１）アントシアニン（限定されないが、例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、ペツニジン等のアントシアニン化合物を産生するアントシアニン生合成酵素の産生又は発現増加による）及び／又は（２）カロテノイド（限定されないが、例えばフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、アドニルビン、アドニキサンチン等のカロテノイド化合物を産生するカロテノイド生合成酵素の産生又は発現増加による）、花の香り、花の寿命等が挙げられる。特定選択コーディング領域はセンス又はアンチセンス方向でＬＩＳ１キメラプロモーターと併用することができる。
【００６３】
別の態様では、本発明は２種以上の形質転換構築物によるレシピエント細胞の形質転換に関する。別個の選択蛋白質をコードするベクターを使用するか又は２種以上のポリヌクレオチドもしくは選択遺伝子配列を組込んだ単一ベクターを使用して単一形質転換イベントで２種以上のトランスジーンを作製することができる。例えば、昆虫又は疾病（ウイルス、細菌、真菌）抵抗性、色もしくは花の香りの改変（増減）又は花の寿命を付与するトランスジーン等の任意種類の２種以上のトランスジーンを所望に応じて使用することができる。
【００６４】
更に別の態様では、本発明は植物又は植物細胞と２種以上のベクターの同時形質転換に関する。同時形質転換はマーカーと１種以上の目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子を含むベクターを使用して実施することができる。あるいは、ベクター（限定されないが、例えばプラスミド）毎に異なる目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子を含むこともでき、プラスミドをレシピエント宿主細胞に同時に送達することができる。この方法によると、マーカーを導入した細胞の所定百分率は他の目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子も受け取っていると予想される。その場合、マーカーにより選択される全細胞が細胞に同時に提示された他の目的蛋白質を発現する訳ではない。
【００６５】
植物形質転換に適した任意ベクターを本発明で使用できる。このようなベクターとしては限定されないが、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（「ＹＡＣ」）、細菌人工染色体（「ＢＡＣ」）又は他の任意の適切なクローニングシステムが挙げられる。挿入容量の大きいクローニングシステムを使用すると、２個以上の選択遺伝子を含む大きいＤＮＡ配列を導入できると予想される。このような配列の導入はＢＡＣ、ＹＡＣ、又は植物人工染色体の使用により助長することができる。
【００６６】
従来記載されているベクターから単離された発現カセットを形質転換で使用することができる。植物細胞を形質転換するために使用されるＤＮＡ分子は一般にレシピエント宿主細胞に導入されて発現されるｃＤＮＡ即ち１個以上の選択遺伝子又はポリヌクレオチドを含む。ＤＮＡ分子はＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーター以外に更にエンハンサー、ポリリンカー、イントロン、ターミネーター又は他の調節因子もしくは遺伝子発現を変化させる遺伝子等の構造を含むことができる。植物細胞を形質転換するために使用されるＤＮＡ分子は発現カセットにセンス又はアンチセンス方向に挿入することができ、多くの場合には得られる組換え細胞で発現される蛋白質をコードし、その結果、スクリーニング可能又は選択可能な形質を付与するか及び／又は得られるトランスジェニック植物に改善された表現型を付与する。しかし、必ずしもそうでない場合もあり、本発明は発現されないトランスジーン又は非コーディングＲＮＡ（例えばアンチセンスＲＮＡ分子、リボザイムをコードするポリヌクレオチド又はＲＮａｓｅ  Ｐ−によりターゲットＲＮＡ分子の切断を促進することが可能なポリヌクレオチド）を組込んだトランスジェニック植物及び植物部分にも関する。
【００６７】
上述のように、ＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターを含む形質転換構築物にエンハンサー配列を加え、目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子のコーディング領域に機能的に連結することができる。エンハンサー配列は真核細胞で機能するプロモーターの転写開始部位の５’側に配置することができる。場合により、これらのエンハンサー配列はイントロンの内部に存在する。エンハンサー配列は目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子のコーディング配列の５’又は３’側に順又は逆方向に挿入することができる。本発明により使用可能なエンハンサーの例としてはＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター及びオクトピンシンターゼ遺伝子に由来するエンハンサー配列が挙げられる（Ｅｌｌｉｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ，６（１１）：３２０３−３２０８（１９８７））。
【００６８】
選択蛋白質を発現させるためにＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターとエンハンサーを併用する場合には、エンハンサーはプロモーターと目的とする機能的に連結されたポリヌクレオチド又は遺伝子のコーディング領域の開始コドンの上流に配置することが好ましい。しかし、エンハンサーにより付与される有益な特性が得られるように、目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子の他のコーディング領域に対してエンハンサーを別の配置で使用することもできる。例えば、エンハンサーはプロモーターの５’側、プロモーターの内部、目的ポリヌクレオチドもしくは選択遺伝子のコーディング領域の内部（他のイントロン配列が存在する場合にはその任意イントロン配列の内部を含む）、又はコーディング領域の３’側に配置することができる。
【００６９】
エンハンサー配列に加え、ＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターを含む形質転換構築物で非翻訳リーダー配列も使用できる。このような構築物で使用することができる好ましいリーダー配列としては、目的とする機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子の付加コーディング領域の最適発現を誘導することが可能な配列をもつものが挙げられる（即ちｍＲＮＡ安定性を増加もしくは維持、翻訳の誤った開始を防止、又はより効率的な翻訳開始を促進することが可能な好適コンセンサスリーダー配列の付加）。形質転換構築物で使用することができる非翻訳リーダー配列は当業者が容易に決定することができる。
【００７０】
本発明により作製される形質転換構築物は更に３’末端プロセシングのシグナルとして機能する３’末端ＤＮＡ配列を含むことができ、ＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターに機能的に連結された配列をコードすることにより産生されるｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にする。ＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターと併用することができるポリアデニル化領域としては限定されないが、リボース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ−オキシゲナーゼ（ｒｂｃＳ）の小サブユニット、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ遺伝子に由来するターミネーター（ｎｏｓ  ３’末端）（Ｂｅｖａｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１（２）：３６９−３８５（１９８３））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのオクトピンシンターゼ遺伝子に由来するＴ７転写産物のターミネーター、及びジャガイモ又はトマトに由来するプロテアーゼインヒビターＩ又はＩＩ遺伝子の３’末端をコードする遺伝子に由来するものが挙げられる。
【００７１】
本発明の形質転換構築物は更にトランジットペプチドとシグナル配列を使用することができる。発現させようとするポリヌクレオチド又は選択遺伝子のコーディング配列に結合されており、翻訳後に初期翻訳産物から除去することができ、細胞内又は細胞外膜内又は膜を通して蛋白質の輸送を助長する配列をトランジットペプチド（これらのペプチドは液胞、小胞、プラスチド及び他の細胞内オルガネラ内への蛋白質輸送を助長する）及びシグナル配列（これらのペプチドは小胞体、ゴルジ装置及び細胞膜の外側への輸送を助長する）と言う（米国特許第５，７２８，９２５号は葉緑体トランジットペプチドを記載しており、米国特許第５，５１０，４７１号は最適化トランジットペプチドを記載している。）。細胞内外の区画への蛋白質の輸送を助長することにより、これらの配列は蛋白分解から保護することにより遺伝子産物の蓄積を増加することができる。これらの配列は更に高度に発現される遺伝子からの付加ｍＲＮＡ配列を遺伝子のコーディング配列に付加することができる。リボソームにより翻訳されるｍＲＮＡは翻訳できないｍＲＮＡよりも安定であるので、ポリヌクレオチド又は遺伝子の前に翻訳可能なｍＲＮＡが存在すると、遺伝子からのｍＲＮＡ転写産物の総安定性を増し、従ってポリヌクレオチド又は遺伝子産物の合成を増すことができる。トランジット及びシグナル配列は翻訳後に初期翻訳産物から除去されるので、これらの配列を使用すると、最終ポリペプチドに出現しない付加翻訳配列を加えることができる。更に、蛋白質の安定性を高めるためには所定蛋白質のターゲティングが望ましいと予想される（米国特許第５，５４５，８１８号参照）。
【００７２】
本発明のＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターは機能的に連結されたスクリーニング可能なマーカー遺伝子の発現を誘導するために使用することもできる。本発明で使用することができるスクリーニング可能なマーカー遺伝子からのコーディング領域の例としては限定されないが、下表１に示すものが挙げられる。
【００７３】
【表１】
2005518805.tif 000002
【００７４】
別の態様では、本発明は選択蛋白質を植物において効率的に発現させるための方法と組成物に関する。本発明のＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターは選択蛋白質を単子葉植物又は双子葉植物等の任意型の植物及び植物部分で発現させるために使用することができる。ＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターを使用することができる単子葉植物の例としては限定されないが、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）（ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ））；イネ科（Ｇｒａｍｉｎａｅ又はＰｏａｃｅａｅ）（カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ナガハグサ属（Ｐｏａ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、トウモロコシ属（Ｚｅａ））が挙げられる。ＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターを使用することができる双子葉植物の例としては限定されないが、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）（ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ））；キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ又はＣｏｍｐｏｓｉｔａｅ）（アスター属（Ａｓｔｅｒ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、エゾギク属（Ｃａｌｌｉｓｔｅｐｈｕｓ）、キクニガナ属（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）、ハリシャギク属（Ｃｏｒｅｏｐｓｉｓ）、ダリア属（Ｄａｈｌｉａ）、キク属（Ｄｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ）、クンショウギク属（Ｇａｚａｎｉａ）、ガーベラ属（Ｇｅｒｂｅｒａ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ムギラワギク属（Ｈｅｌｉｃｈｒｙｓｕｍ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、オオハンゴンソウ属（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ）、マンジュギク属（Ｔａｇｅｔｅｓ）、ヒャクニチソウ属（Ｚｉｎｎｉａ））；ツリフネソウ科（Ｂａｌｓａｍｉｎａｃｅａｅ）（ツリフネソウ属（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ））；シュウカイドウ科（Ｂｅｇｏｎｉａｃｅａｅ）（ベゴニア属（Ｂｅｇｏｎｉａ））；ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）（ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ））；アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）（フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ））；ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）（スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ））；アブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）（イワナズナ属（Ａｌｙｓｓｕｍ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、エゾスズシロ属（Ｅｒｙｓｉｍｕｍ）、アラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）、ダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ））；リンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）（トルコギキョウ属（Ｅｕｓｔｏｍａ））；フウロソウ科（Ｇｅｒａｎｉａｃｅａｅ）（テンジクアオイ属（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ））；トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）（ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ））；シソ科（Ｌａｂｉａｔａｅ）（サルビア属（Ｓａｌｖｉａ））；マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）（ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、レンリンソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、エンドウ属（Ｐｉｓｕｍ））；ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）（ユリ属（Ｌｉｌｉｕｍ））；サワギキョウ科（Ｌｏｂｅｌｉａｃｅａｅ）（ミゾカクシ属（Ｌｏｂｅｌｉａ））；アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）（トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ゼニアオイ属（Ｍａｌｖａ））；イソマツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）（リモニウム属（Ｌｉｍｏｎｉｕｍ））；ハナシノブ科（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｃｅａｅ）（フロックス属（Ｐｈｌｏｘ））；サクラソウ科（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）（シクラメン属（Ｃｙｃｌａｍｅｎ））；キンボウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）（トリカブト属（Ａｃｏｎｉｔｕｍ）、イチリンソウ属（Ａｎｅｍｏｎｅ）、オダマキ属（Ａｑｕｉｌｅｇｉａ）、リュウキンカ属（Ｃａｌｔｈａ）、オオヒエンソウ属（Ｄｅｌｐｈｉｎｉｕｍ）、キンポウゲ属（Ｒａｎｕｎｃｕｌｕｓ））；バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）（バラ属（Ｒｏｓａ））；アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）（ペンタス属（Ｐｅｎｔａｓ））；ゴマノハグサ科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）（アンゲロニア属（Ａｎｇｅｌｏｎｉａ）、キンギョソウ属（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）、トレニア属（Ｔｏｒｅｎｉａ））；ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ））；セリ科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）（オランダミツバ属（Ａｐｉｕｍ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、パースニップ属（Ｐａｓｔｉｎａｃａ））；クマツヅラ科（Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ）（クマツヅラ属（Ｖｅｒｂｅｎａ）、ランタナ属（Ｌａｎｔａｎａ））；スミレ科（Ｖｉｏｌａｃｅａｅ）（スミレ属（Ｖｉｏｌａ））が挙げられる。
【００７５】
上記に要約したように、本発明は選択蛋白質を植物及び植物部分で発現させるためのＬＩＳ１プロモーター及びＬＩＳ１キメラプロモーターを提供する。本発明により植物宿主細胞において発現させる選択蛋白質の選択は形質転換の目的によって異なる。作物の形質転換の主目的の１つは商業的に望ましいか、農学又は園芸学的に重要な形質を植物に付加することである。このような形質としては限定されないが、昆虫抵抗性ないし耐性、疾病抵抗性ないし耐性（ウイルス、細菌、真菌）、色（アントシアニン（限定されないが、例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、マルビジン、ペツニジン等）及び／又はカロテノイド（限定されないが、例えばフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン等））、花の香り、花の寿命等が挙げられる。
【００７６】
本発明の別の態様では、２種以上の目的ポリヌクレオチド及び／又は選択遺伝子を使用してレシピエント植物細胞の形質転換を実施することができる。更に、別個のトランスジーンをコードするベクターを使用するか又は２種以上のコーディング配列を組込んだ単一ベクターを使用して単一形質転換イベントで目的とする２種以上のポリヌクレオチド又は選択遺伝子に由来する２種以上の外来コーディング領域を提供することもできる。例えば、収束、発散又は共直線方向にｂａｒ及びａｒｏＡ発現ユニットをもつプラスミドが特に有用であるとみなされる。昆虫、疾病（ウイルス、細菌、真菌）又は色（アントシアニン（限定されないが、例えばペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、ペツニジン等）及び／又はカロテノイド（限定されないが、例えばフィトエン、フィトフルエン、ζ−カロテン、ニューロスポレン、リコペン、γ−カロテン、β−カロテン、α−クリプトキサンチン、β−クリプトキサンチン、カンタキサンチン、カプサンチン、カプソルビン、ゼアキサンチン、ビオラキサンチン、ネオキサンチン、アンテラキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン等））、花の香り又は花の寿命を付与するトランスジーン等の任意種類の２種以上のトランスジーンを所望に応じて使用することができる。
【００７７】
別の態様では、本発明のＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターは植物表現型を変化させるが、蛋白質に翻訳されないＲＮＡ分子（転写産物）を発現させる目的で機能的に連結されたポリヌクレオチド又は選択遺伝子を植物に導入するために使用することができる。このような目的はアンチセンスＲＮＡ、リボザイムと呼ばれるＲＮＡ酵素を使用するか又はＲＮａｓｅ  ＰによるターゲットｍＲＮＡ分子の分解を促進することが可能なＲＮＡ転写産物の使用により実施することができる。アンチセンスＲＮＡ、リボザイム又はＲＮａｓｅ  ＰによるターゲットｍＲＮＡの分解は形質転換植物における天然又は導入された植物遺伝子の発現を低減又は除去するために使用することができる。
【００７８】
当分野で公知の慣用技術によりターゲット分子の発現を抑制するために少なくとも１個のアンチセンスＲＮＡ分子の発現を使用することができる。より詳細には、本発明は相補的ポリヌクレオチド単位（例えばアンチセンスＲＮＡ分子）をコードするポリヌクレオチド配列に本発明のプロモーターを機能的に連結することができる発現カセットの構築に関する。この相補的ポリヌクレオチド単位とターゲット分子の結合は阻害的とすることができる。例えば、ターゲット分子がｍＲＮＡ分子である場合には、相補的ポリヌクレオチド単位であるＲＮＡが結合する結果としてハイブリダイゼーションが生じ、ターゲット蛋白質の翻訳が阻止される。
【００７９】
あるいは、本発明のプロモーターはリボザイムをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結することができる。より詳細には、本発明はリボザイムをコードするポリヌクレオチド配列に本発明のプロモーターを機能的に連結された発現ベクターの構築に関する。ｍＲＮＡ分子で所定ターゲット配列に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を発現するようにリボザイムを設計できることは当分野で公知である。例えば、タバコプロトプラストでリボザイムによりネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子発現の１００％までの阻害が達成された（Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅら，ＥＭＢＯ  Ｊ，１１：１５２５（１９９２）参照）。本発明では、リボザイムに適したターゲットＲＮＡ分子の例としては植物生化学経路に存在する生合成酵素をコードするｍＲＮＡが挙げられる。
【００８０】
更に別の態様では、本発明のプロモーターはＲＮａｓｅ  ＰによるターゲットｍＲＮＡ分子の分解を促進することが可能なＲＮＡ分子（転写産物）の産生を誘導するために使用することができる。より詳細には、本発明は更に本発明のプロモーターがＲＮａｓｅ  ＰによるターゲットｍＲＮＡ分子の分解を促進することが可能なＲＮＡ転写産物の産生を誘導する発現ベクターの構築に関する。このアプローチによると、外来リボザイム、ＲＮａｓｅ  Ｐを特定ｍＲＮＡ種に誘導した後に細胞リボザイムにより切断するための外部案内配列を構築することができる（米国特許第５，１６８，０５３号；Ｙｕａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：１２６９（１９９４）参照）。
【００８１】
本発明は更に同時抑制メカニズムにより天然遺伝子産物の発現が低下したトランスジェニック植物を生産するように少なくとも１個のポリヌクレオチド又は選択遺伝子を導入するためにＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターを使用できると想定する。タバコ、トマト及びペチュニアで示されたように（Ｇｏｒｉｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１７７０−１７７４（１９９１），Ｓｍｉｔｈら，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２４：４４７−４８１（１９９０），Ｎａｐｏｌｉら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：２７９−２８９（１９９０），ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：２９１−２９９（１９９０））、アンチセンス遺伝子で観察されると同様に天然遺伝子のセンス転写産物の発現を低下させるか又は天然遺伝子を発現させなくなることができる。導入される遺伝子は標的天然蛋白質の全部又は一部をコードすることができるが、天然蛋白質のレベルを低下させるためにその翻訳は必要ないと思われる。
【００８２】
本発明は更にトランスジーン発現効率を確認又は決定するための当分野で公知の２種以上のアッセイの使用に関する。例えば、種々の異なるエンハンサー配列、ターミネーター又は地の調節因子と併用する場合に植物の少なくとも１個の花において蛋白質発現を誘導するＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターの効率を測定するためにアッセイを使用することができる。また、蛋白質発現を誘導するＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターの種々の欠失突然変異体の効率を測定するためにアッセイを使用することもできる。
【００８３】
アッセイする生物サンプルは当分野で公知の分子生物学技術を使用して任意植物材料から単離されたポリヌクレオチドとすることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡ又は断片又は全細胞ＲＮＡとすることができる。ＲＮＡを使用する場合には、適宜ＤＮＡに変換することができる。
【００８４】
本発明で使用することができる種々のアッセイの例としては蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（「ＦＩＳＨ」）、直接ＤＮＡシーケンシング、パルスフィールドゲル電気泳動（「ＰＦＧＥ」）解析、ＲＮＡ又はＤＮＡゲルブロット解析、１本鎖コンホメーション解析（「ＳＳＣＡ」）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（「ＡＳＯ」）、ドットブロット解析、変性グラジエントゲル電気泳動及び制限酵素断片長多形（「ＲＦＬＰ」）が挙げられる。
【００８５】
特定トランスジーンが発現される効率を測定するためには、トランスジーンにより発現されるポリペプチドを精製し、定量する。蛋白質の精製技術は当分野で公知である。これらの技術としては限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、高速蛋白質液体クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーが挙げられる。更に、免疫法も蛋白質検出に使用することができる。方法としては限定されないが、酵素免疫測定法（「ＥＬＩＳＡ」）、ウェスタンブロット及びラジオイムノアッセイ（「ＲＩＡ」）が挙げられる。
【００８６】
本発明の関連で使用するのに適した植物形質転換法としてはＤＮＡを宿主細胞に導入できる任意方法が挙げられ、限定されないが、下表２に記載する方法が挙げられる。
【００８７】
【表２】
2005518805.tif 000003
【００８８】
上記形質転換技術の任意のものにより形質転換された植物細胞を培養し、形質転換遺伝子型をもつ完全植物を再生することができる。このような再生技術は組織培養増殖培地で所定植物ホルモンを操作することにより行われ、一般にはＬＩＳ１プロモーター又はＬＩＳ１キメラプロモーターと目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子に由来するコーディング領域と共に導入したマーカー因子を利用する。培養プロトプラストからの植物再生はＥｖａｎｓら，Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．１２４−１７６，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３；及びＢｉｎｄｉｎｇ；Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｐｐ．２１−７３，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９８５に記載されている。再生は植物カルス、外植体、器官、又はその部分からも得られる。このような再生技術はＫｌｅｅら，Ａｎｎ．Ｒｅｆ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．３８：４６７−４８６（１９８７）に概説されている。
【００８９】
本発明の方法は天然には存在しない方法及び状況で種々の目的ポリヌクレオチド又は選択遺伝子を形質転換植物組込むために特に有用である。特に、種々のポリヌクレオチド又は選択遺伝子を天然植物の特徴ではない時点又は量で発現させることができる。
【００９０】
当業者に自明の通り、形質転換構築物がトランスジェニック植物に安定的に組込まれ、機能可能であることが確認された後に、雌雄交配により他の植物体に導入することができる。交配する種に応じて多数の標準育種技術の任意のものを使用することができる。
【００９１】
以下、本発明の実施例を記載するが、以下の実施例により本発明を制限するものではない。
【実施例１】
【００９２】
ｐＢＨＸプラスミド
ｐＢＨＸ１０９
ＧＦＰ遺伝子（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨに所在のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なプラスミドｐＣＤ３−３２７に含まれるｓｍ−ＲＳＧＦＰバージョン）に融合したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＵＢＱβポリユビキチン遺伝子（１．３ｋｂ）のプロモーター含有領域とｎｏｓ  ｐｏｌｙＡシグナル含有領域から構成される２．４Ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離した。次に、このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで予め消化しておいたＴ−ＤＮＡバイナリーベクターにライゲーションし、ｐＢＨＸ１０９を作製した。
【００９３】
ｐＢＨＸ１１３
ＧＦＰ遺伝子（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨに所在のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手可能なプラスミドｐＣＤ３−３２７に含まれるｓｍ−ＲＳＧＦＰバージョン）に融合したＣｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉｉ  ＬＩＳ１遺伝子のプロモーター含有領域（ｐＢＨＸ１０３と同一領域）とｎｏｓ  ｐｏｌｙＡシグナル含有領域から構成されるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離した。次に、このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで予め消化しておいたＴ−ＤＮＡバイナリーベクターにライゲーションし、ｐＢＨＸ１１３を作製した。
【００９４】
ｐＢＨＸ９４
Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉｉ  ＬＩＳ１遺伝子の５’フランキング領域を含むプラスミドをミシガン大学から入手した。プライマーとしてＢＨＸ３０：ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＡＡＴＣ（配列番号３）とＢＨＸ３１：ＧＧＣＣＡＴＧＧＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＴＧＧ（配列番号５）を使用してＬＩＳ１  ５’フランキング領域を含む〜１ｋｂフラグメントをＰＣＲにより合成した。これらのプライマーは一方の末端が５’フランキング領域とアニールし、３’末端が５’未翻訳リーダー領域内にアニールするように設計した。フラグメントの５’及び３’末端を夫々切断する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩでＰＣＲ産物を消化した。ＮｃｏＩ部位はＬＩＳ１蛋白質コーディング領域の開始コドンにオーバーラップする。消化したフラグメントをゲル精製した後、プロモーターなしにプラスミドに導入したｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジーン（予めＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏＩで消化）とインフレーム融合し、ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジーン（ｐＢＨＸ９４と命名）を作製した。
【００９５】
ｐＢＨＸ９９
プラスミドｐＢＨＸ９４をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジーンを含むフラグメントを遊離させた。次に、このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで予め消化しておいたＴ−ＤＮＡバイナリーベクターにライゲーションし、ｐＢＨＸ９９を作製した。
【００９６】
ｐＢＨＸ１０３
Ｃｌａｒｋｉａ  ｂｒｅｗｅｒｉｉ  ＬＩＳ１遺伝子の５’フランキング領域を含むプラスミドをミシガン大学から入手した。プライマーとしてＢＨＸ３０：ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＴＡＡＴＡＡＴＧＴＡＴＣＡＡＡＡＴＣ（配列番号３）とＢＨＸ３６：ＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＧＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＴＡＡＧＧＴＧＧ（配列番号４）を使用してＬＩＳ１  ５’フランキング領域を含む〜１ｋｂフラグメントをＰＣＲにより合成した。これらのプライマーは一方の末端が５’フランキング領域とアニールし、３’末端が５’未翻訳リーダー領域内にアニールするように設計した。フラグメントの５’及び３’末端を夫々切断する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｍａＩでＰＣＲ産物を消化した。消化したフラグメントをゲル精製した後、多重クローニング部位領域（ＭＣＳ）とそれに続いてｎｏｓ  ｐｏｌｙＡシグナル含有領域を含み、ＨｉｎｄＩＩＩとＳｍａＩで消化しておいたプラスミドに挿入し、ＬＩＳ１：：ＭＣＳ：：ｎｏｓトランスジーン（ｐＢＨＸ１０３と命名）を作製した。
【００９７】
ｐＢＨＸ１０７
（ｒｂｓＳトランジットペプチドをｃｒｔＢ蛋白質コーディング領域のＮ末端に融合したｃｒｔＢ遺伝子を含む）プラスミドｐＡＴＣ９２１に由来する１．５ｋｂ  ＨｉｎｃＩＩフラグメントをプラスミドｐＢＨＸ１０３のＬＩＳ１プロモーターとｎｏｓフラグメントの間に位置するＳｍａＩ部位にセンス方向に挿入し、プラスミドｐＢＨＸ１０７を作製した。
【００９８】
ｐＢＨＸ１１２
プラスミドｐＢＨＸ１０７をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化し、ＬＩＳ１：：ｃｒｔＢ：：ｎｏｓトランスジーンを含むフラグメントを遊離させた。次に、このフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで予め消化しておいたＴ−ＤＮＡバイナリーベクターにライゲーションし、ｐＢＨＸ１１２を作製した。
【実施例２】
【００９９】
ＬＩＳ１プロモーター又は構成的ＵＢＱ３プロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株における遺伝子発現の評価
ＬＩＳ１プロモーターによる花組織における遺伝子発現を評価するために、’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’品種ペチュニアをＬＩＳ１：：ＧＦＰ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ１１３）又はＵＢＱ３：：ＧＦＰ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ１０９）構築物で形質転換した。ＵＢＱ３は当分野で周知の構成的プロモーターである。ペチュニア形質転換体を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、蛍光顕微鏡から発生される青色光を使用して各植物体からのサンプル花のＧＦＰ発現を評価した。明白な発現のない０から最高発現に相当する４までの主観的採点システムを使用した。
【０１００】
結果を下表３に示す。ＬＩＳ１により誘導されるＧＦＰ発現は花弁及び花喉の花組織で最も明白であった。試験したＬＩＳ１及びＵＢＱ３トランスジェニック植物体のうちで雌蘂組織にＧＦＰ発現が認められたのはＬＩＳ１プロモーター含有植物体２株のみであった。構成型プロモーターで予想される通り、ＵＢＱ３により誘導されるＧＦＰ発現のほうが花組織全体でより均一であった。この結果、花弁組織におけるＬＩＳ１プロモーターとＵＢＱ３構成的プロモーターによるＧＦＰ発現は同等であることが分かった。
【０１０１】
【表３】
2005518805.tif 000004
【実施例３】
【０１０２】
ＬＩＳ１プロモーター又はＣａＭＶ由来３５Ｓプロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株における遺伝子発現の評価
プラスミドＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ９９）を含む１１個のトランスジェニック’Ｄｒｅａｍｓ  Ｗｈｉｔｅ’品種ペチュニア株（’Ｄｒｅａｍｓ  Ｗｈｉｔｅ’はＰａｎＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，６２２  Ｔｏｗｎ  Ｒｏａｄ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬの市販品）と３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ構築物（ｐＢＩ１２１）を含む３個のトランスジェニック株を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、各植物体からのサンプル花及び若葉を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸シクロヘキシルアンモニウム塩溶液（Ｘ−ｇｌｕｃ）で組織化学的に染色し、各種組織におけるＧＵＳ発現を評価した（下表４参照）。明白な発現のない０から最高発現に相当する３までの主観的採点システムを使用した。
【０１０３】
下表４に示すように、数個の株は花優先発現を示す。これに対して全３個の３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＩ１２１）株は試験した全組織で中度から高度のＧＵＳ発現を示した（下表４参照）。この結果、ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ９９）トランスジェニック株のうちには葉組織でＧＵＳ発現を示すものがあり、ＬＩＳ１プロモーターはペチュニアゲノムの特定領域に組込み後に不適切に発現される可能性があることが分かった（所謂「位置効果」）。他方、同定された（６個の）ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ９９）株の殆どは花弁及び他の花組織で中から高度の発現を示し、葉に明白なＧＵＳ発現はなかった。図２に示す写真から明らかなように、ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ又は３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＩ１２１）構築物を含むトランスジェニックペチュニア株間にはＧＵＳ発現の差がある。
【０１０４】
【表４】
2005518805.tif 000005
【０１０５】
３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＩ１２１）形質転換株と比較してＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ９９）で形質転換した植物体におけるＧＵＳ活性の定量的測定値を得るために、メチルウンベリフェリル−Ｂ−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）を基質として各種植物組織からの無細胞粗抽出物を利用してＧＵＳ発現の蛍光検出を実施した。二重分析を実施し、結果を下表５に示す。
【０１０６】
全ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ形質転換植物体は花弁におけるＧＵＳ発現が対照よりも多く、１株（１７００−１−６）以外は３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ形質転換植物体の花弁よりも多かった。更に、全ＬＩＳ１：：ｇｕｓＳ：：ｎｏｓ形質転換植物体で花弁のＧＵＳ発現のほうがは葉及び萼組織よりも有意に多かった。ペチュニア株１７００−１−１４Ａは花弁組織で最高発現を示し、２１６０．４±６２６．３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ［ｆｗ］のレベルであった。このＧＵＳ活性レベルは双子葉植物において非常に活性であるとして知られているプロモーターであるＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターの２８倍である。従って、ＬＩＳ１プロモーターはペチュニア花弁で高レベルの発現を誘導すると結論することができる。
【０１０７】
【表５】
2005518805.tif 000006
【０１０８】
ＬＩＳ１プロモーターが他のペチュニア変異株で花優先遺伝子発現を生じることを例証するために、’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’品種ペチュニアの形質転換体でＧＵＳ活性を測定した。二重分析を実施し、結果を下表６に示す。総ＧＵＳ発現はトランスジェニック’Ｄｒｅａｍｓ  Ｗｈｉｔｅ’の花弁に比較してＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’ペチュニアの花弁のほうが少ないが、傾向は同じである。３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ株の花弁は６３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ［ｆｗ］のレベルであるのに対してＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジェニック’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’ペチュニアの花弁におけるＧＵＳ発現レベルは６１〜４１９ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ［ｆｗ］であり、ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジェニック’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’ペチュニアの花弁における遺伝子発現レベルは３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ株と同等以上であることが判明した（９９Ａ−２７００−１−５株で６倍まで）。他方、ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジェニック株の葉及び萼組織におけるＧＵＳ発現レベルは夫々０．７〜７．３及び１．９〜２０．５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ［ｆｗ］であった。３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジェニック株のＧＵＳ発現は葉組織で１０４ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ［ｆｗ］、萼組織で９３．９ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ［ｆｗ］に達した。３５Ｓは公知構成的プロモーターであるので、３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジェニック株の各種組織におけるＧＵＳ発現の均質性は予想通りである。’Ｄｒｅａｍｓ  Ｗｈｉｔｅ’及び’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’両品種のペチュニアのＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓトランスジェニック株で得られた対照的な結果はＬＩＳ１プロモーターによる花優先発現を明白に示している。
【０１０９】
このように、ＧＵＳ活性の組織化学アッセイと蛍光アッセイの結果は一致し、ＬＩＳ１プロモーターがペチュニアの花組織で高レベルのトランスジーン発現を誘導できることが実証された。
【０１１０】
【表６】
2005518805.tif 000007
【実施例４】
【０１１１】
ＬＩＳ１プロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニアの花部分と生育中の花弁における遺伝子発現の評価
プラスミドＬＩＳ１：：ｇｕｓＨ：：ｎｏｓを含むトランスジェニック’Ｄｒｅａｍｓ  Ｗｈｉｔｅ’品種ペチュニア株１７００−１−１４Ａは花弁組織で最高のＧＵＳ発現株として同定された（上記表５参照）。この株を使用して更に試験し、ＧＵＳ発現に及ぼす花齢の効果を芽又は花長により調べ、成熟花の特定花部分におけるＧＵＳ発現を測定した。
【０１１２】
萼から花弁端までの長さが２〜５ｃｍの花を１７００−１−１４Ａ株から選択して花弁におけるＧＵＳ活性を測定した。芽が閉じた段階が一般に２ｃｍであり、完全に開花すると５ｃｍになる。結果を下表７に示すように、芽から成熟花までにＧＵＳ発現は１７４倍に増加し、花の成熟につれてＧＵＳ発現が増すことが分かった。
【０１１３】
【表７】
2005518805.tif 000008
【０１１４】
１７００−１−１４Ａの完全に開いた花において花部分におけるＧＵＳ活性を測定した。試験した花部分は花弁先端部（遠位）、花弁基部、葯／花粉、及び雌蘂とした。二重分析を実施し、結果を下表８に示す。全花組織でＧＵＳ発現が観察され、最高のＧＵＳ発現は雌蘂であった。雌蘂ＧＵＳ発現は遠位花弁組織の１４倍であった。従って、ＬＩＳ１プロモーターはペチュニア花組織全体にわたって高レベルの発現を誘導すると結論することができる。
【０１１５】
【表８】
2005518805.tif 000009
【実施例５】
【０１１６】
ＬＩＳ１プロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックマリーゴールド株における遺伝子発現の評価
ＬＩＳ１プロモーターが第２の異種植物種で高レベルのＧＵＳ発現を誘導できるか否かを調べるために、マリーゴールド（Ｔａｇｅｔｅｓ  ｅｒｅｃｔａ）植物体ＰａｎＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｅｅｄ権利保護育種株１３８１９をＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ９９）構築物で形質転換し、形質転換株１株９９Ａ−３３００−１−１０を回収した。ＧＵＳ発現を検出するための蛍光アッセイをこの株の各種植物組織で実施した。ＬＩＳ１：：ｇｕｓＡを発現するペチュニアの場合と同様に、ＧＵＳ発現（ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ［ｆｗ］）は花組織で高かったが、萼と葉では高くなかった。これらの結果はＬＩＳ１プロモーターがマリーゴールドで花優先遺伝子発現を誘導したことを示す。
【０１１７】
ＧＵＳ活性を検出するための蛍光アッセイを使用してＬＩＳ１：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＳ９９）で形質転換したＰＡＳ育種株１３８１９の他のトランスジェニック植物体も評価した。上記９９Ａ−３３００−１−１０株を対照雄親ＰａｎＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｅｅｄ権利保護育種株１３８１９と交配した子孫も評価した。二重分析を実施し、結果を下表９に示す。雌蘂、花弁及び発生中の種子を含むマリーゴールド花組織でＬＩＳ１による比較的高レベルのＧＵＳ発現が観察された。雌蘂では３５１ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ［ｆｗ］までのＧＵＳ発現が観察された。このレベルは’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’品種ペチュニアの花弁組織で観察されたＬＩＳ１によるＧＵＳ発現と同等である。葉組織の発現は著しく低いか、又は全く観察されなかった。試験した６個の花托のうちの２個で高レベル発現が観察された。
【０１１８】
トランスジェニック９９Ａ−３３００−１−１０を使用して交配した子孫９９Ａ−１０−２、９９Ａ−１０−３、９９Ａ−１０−１７及び９９Ａ−１０−１８を分析した処、トランスジーンは雌雄交配遺伝性であることが分かった。更に、２種の子孫（９９Ａ−１０−１７と９９Ａ−１０−１８）では最高の花弁発現レベルが観察された。
【０１１９】
花組織でＬＩＳ１により誘導されるＧＵＳ発現のレベルは対照植物体の花において観察されるよりも高く、試験したうちの３株を除き、花組織でＬＩＳ１により誘導されるＧＵＳ発現は３５Ｓ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ形質転換植物体よりも高い。従って、ＬＩＳ１プロモーターはマリーゴールドで遺伝性であり、マリーゴールドとペチュニアの花組織で高レベルのトランスジーン発現を誘導すると結論することができる。
【０１２０】
【表９】
2005518805.tif 000010
【実施例６】
【０１２１】
ＬＩＳ１プロモーターとｃｒｔＢを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株の評価
ＬＩＳ１：：ｃｒｔＢ：：ｎｏｓを含むｐＢＨＸ１１２で形質転換した２個の’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’品種ペチュニア植物体からの花を分析し、遺伝子発現が特定花領域に局在しているか否かを調べた。ｃｒｔＢ遺伝子はカロテノイド生合成経路の初期に存在する無色カロテノイド中間体であるフィトエンを産生する酵素である酵素フィトエンシンターゼをコードする。植物体を１１２−３２００−１−４５と１１２−３２００−１−５９と命名し、花を花弁、上部花喉及び下部花喉の３部分に分割した。各部分から全ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡゲルブロット分析を実施した。図３に示す結果から明らかなように、ｃｒｔＢｍＲＮＡは花弁及び上部花喉組織の両者に中レベルで存在し、下部花喉組織は程度が低く、遺伝子発現を転写産物レベルで検出できることが確認された。
【０１２２】
花弁組織における遺伝子活性を更に実証するために、ＬＩＳ１：：ｃｒｔＢ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ１１２）構築物を使用して形質転換した’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’品種ペチュニア株を使用してＨＰＬＣ分析を実施した。ＨＰＬＣ分析では、花弁組織抽出手順は乾燥植物材料におけるカロテンとキサントフィルの公式抽出法に従った（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ａｎａｌｙｓｉｓ（１９８０）１３ｔｈ  Ｅｄ．，ＡＯＡＣ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＶＡ，ｓｅｃ．４３．０１８−４３．０２３参照）。抽出中に組織を鹸化しなかった。
【０１２３】
ＨＰＬＣ装置はＡｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０に冷蔵オートサンプラー、カラムヒーター及びＷａｔｅｒｓ  Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  ９９６検出器（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を取付けた。３μｍ，２．０ｘ１５０ｍｍのＹＭＣ  Ｃ３０カラムで分離し、同一材料のガードカラムを使用した。標準はＩＣＣ  Ｉｎｄｏｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎｅｗ  ＪｅｒｓｅｙとＤＨＩ−Ｗａｔｅｒ  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｈｏｒｓｈｏｌｍ，デンマークから入手した。乾燥サンプルをメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルとメタノールに総容量２００μｌまで再懸濁し、濾過した。勾配法を使用してカロテノイドを分離した。初期勾配条件は９０％メタノール：５％水：５％メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを流速０．４ｍｌ／分で流した。０分から１５分までは移動相を初期条件から８０メタノール：５水：１５メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルまで変化させ、１５分から６０分までは２０メタノール：５水：７５メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルまで変化させた。次の１０分間で移動相を初期条件に戻し、カラムを更に１５分間平衡化させた。カラム温度は２７℃に維持した。注入量は１０μＬとした。下表１０に示すカロテノイドの値は４５０ｎｍの総面積の百分率としてのピーク面積を使用して表す。フィトエンはスペクトルシグネーチャーに基づいて同定し、フィトエン面積は最大プロットから決定した。データは標準化ピーク面積として表し、括弧内の数値は総カロテノイドピーク面積に対する各カロテノイドの百分率を示す。
【０１２４】
対照に比較して１０倍以上のβ−カロテンレベルが観察されることから花弁組織におけるＬＩＳ１プロモーター活性は明白である。トランスジェニックには対照花弁組織で検出されなかったフィトエンの存在も観察された。ゼアキサンチンとルテインの含量は対照と有意差がない。
【０１２５】
【表１０】
2005518805.tif 000011
【０１２６】
ＬＩＳ１：：ｃｒｔＢ：：ｎｏｓ（ｐＢＨＸ１１２）構築物が雌雄交配遺伝性であるか否かを調べるために、上記１１２Ａ−３２００−１−５３及び１１２Ａ−３２００−１−４５株を親雌として’Ｃａｒｐｅｔ  Ｂｕｔｔｅｒ  Ｃｒｅａｍ’品種ペチュニア，（ＰａｎＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｅｅｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，６２２  Ｔｏｗｎ  Ｒｏａｄ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬの市販品）又はＰａｎＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｅｅｄ権利保護育種株６９２３−１と交配した。２種の子孫７６８５及び７６８８からの花弁及び葉組織のカロテノイド含量を上記ＨＰＬＣ手順に従って分析した。対照は同一交配からの非トランスジェニック植物体とした。この分析では、抽出中に葉組織を鹸化して葉緑素を除去した。下表１１に示すカロテノイドの値は４５０ｎｍの総面積の百分率としてのピーク面積を使用して表す。フィトエンはスペクトルシグネーチャーに基づいて同定し、フィトエン面積は最大プロットから決定した。データは標準化ピーク面積として表す。
【０１２７】
対照に比較して１７倍の花弁組織β−カロテンレベルが観察されることから花弁組織におけるＬＩＳ１プロモーター活性の遺伝性は明白である。上述のように、トランスジェニック花弁組織にはフィトエンが観察されたが、対照花弁組織には検出されなかった。葉組織カロテノイド含量は対照組織と実質的に差がなかった。ゼアキサンチンとルテインの含量は対照と有意差がない。ＬＩＳ１プロモーターはマリーゴールドとペチュニアの両者で遺伝性であり、両種の花において高レベルのトランスジーン発現を誘導すると結論することができる。
【０１２８】
【表１１】
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【実施例７】
【０１２９】
ＢＡＭＴプロモーターとｇｕｓＡを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株におけるＧＵＳ発現の評価
ＢＡＭＴプロモーターを使用して花組織における遺伝子発現を評価するために、’Ｍｉｔｃｈｅｌｌ’品種ペチュニアをＢＡＭＴ：：ｇｕｓＡ：：ｎｏｓ構築物で形質転換した。ＢＡＭＴ（安息香酸カルボキシメチルトランスフェラーゼ）はキンギョソウの花に最も豊富に存在する芳香化合物として知られている揮発性エステルである安息香酸メチルの生合成における最終酵素である。ペチュニア形質転換体を作製した。温室で顕花植物体が樹立されたら、１７個の個体植物体からのサンプル花及び若葉をＸ−ｇｌｕｃ溶液で染色し、ＧＵＳ活性を検出した。明白な発現のない０から最高発現に相当する４までの主観的採点システムを使用した。
【０１３０】
下表１２に示すように、ペチュニア形質転換体の花弁組織にＧＵＳ発現をは検出されなかった。キンギョソウでは、ＢＡＭＴ遺伝子活性の大部分は花冠の上下葉で検出された（Ｄｕｄａｒｅｖａら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１２：９４９−９６１（２０００））。従って、外来遺伝子の花弁発現を誘導するために花弁組織で発現された遺伝子に由来するプロモーターを使用できるとは予想できない。
【０１３１】
【表１２】
2005518805.tif 000013
【０１３２】
本明細書に引用する全文献及び特許は参考資料として組込む。
【０１３３】
以上の説明及び実施例により本発明を例証した。以上の説明に鑑みて多数の変形が当業者に自明であるので、以上の説明は非限定的な例証である。請求の範囲の適用範囲と精神に含まれるこのような全変形も本発明に含むものとする。
【０１３４】
本発明の概念と範囲から逸脱せずに本明細書に記載する本発明の方法の組成、操作及び構成を変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１Ａはオリゴヌクレオチドプライマー（ＢＨＸ３０及びＢＨＸ３６）を含むＬＩＳ１プロモーターのポリヌクレオチド配列を示す。図１Ａに示すポリヌクレオチド配列は１０４８塩基対長であり、ヌクレオチド３−８にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含み、ヌクレオチド１０４０−１０４５にＳｍａＩ部位を含む。  図１ＢはオリゴヌクレオチドプライマーＢＨＸ３０のヌクレオチド配列を示す。このプライマーは図１Ａに示すポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１−２９を構成する。  図１ＣはオリゴヌクレオチドプライマーＢＨＸ３６のヌクレオチド配列を示す。このプライマーは図１Ａに示すポリヌクレオチド配列のヌクレオチド１０１８−１０４８の逆相補配列である。
【図２】ＬＩＳ１プロモーターを含むプラスミドと３５Ｓ  ＲＮＡ構成的プロモーターを含むプラスミドで形質転換したトランスジェニックペチュニア株間のＧＵＳ発現差の写真を示す。
【図３】ＬＩＳ１：：ｃｒｔＢ：：ｎｏｓを含むｐＢＨＸ１１２で形質転換した植物体に由来するペチュニア花セクションのＲＮＡゲルブロット分析を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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