(57)【要約】  遺伝子変異体の同定、特に核酸分子の集団中に起こる配列変異体間の差の同定、特にポリＡ部位用法の同定または発見、あるいは核酸試料中のポリＡ部位用法の確定、ならびに代替的ポリＡ部位から生じる遺伝子変異体。
2005515790.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に存在するかまたは潜在的に存在する転写遺伝子の配列または転写遺伝子変異体の配列内のポリアデニル化部位または代替的ポリアデニル化部位の存在を確定するためのおよび／またはそれらを同定するための方法であって、以下の：
（ａ）試料中の転写遺伝子から生成される遺伝子断片の集団内の個々の遺伝子断片に関して得られる一組のシグナルを含むデータセットを生成するが、この場合、個々の遺伝子断片に関するシグナルは、長さおよび部分配列情報の組合せならびにその遺伝子断片に関する大きさ成分を含み、データセットは、集団中に存在しないと確定された長さおよび部分配列情報の組合せに関してゼロという大きさ成分、ならびに存在すると確定される長さおよび部分配列情報の組合せが、その組合せを有する遺伝子断片の集団中の存在を示すよう定性的であるか、あるいは集団中に存在する個々の遺伝子断片の量の指標を提供するよう定量的である遺伝子断片に関するシグナルの大きさ成分を含有し；そして
（ｂ）データセット内のシグナルをデータベースと比較することによりデータベース内の１つまたは複数の遺伝子候補を遺伝子断片に割り当てるが、この場合、データベースは既知のポリＡ部位および／または「仮想遺伝子」を有するｍＲＮＡを表すデータを含み、ここで、仮想遺伝子は各々、実際の遺伝子内の考え得るポリアデニル化部位を表すと定義され、
（ｃ）大きさゼロの少なくとも１つのシグナルに各々割り当てられる遺伝子候補を結果から除外し、
（ｄ）それにより、各々が既知のポリアデニル化部位および／またはデータセット内の非ゼロ大きさを有するシグナルに割り当てられる仮想遺伝子を有するｍＲＮＡである１つまたは複数の遺伝子または遺伝子変異体の一組を定義する結果を得て、この結果が前記試料中の１つまたは複数の遺伝子または遺伝子変異体の前記組の実際の存在の指標を提供する
ことを包含する前記方法。
【請求項２】
実際に起こる可能性に関して実際の遺伝子内の考え得るポリアデニル化部位を採点し、実際に起こる可能性の限定閾値を超える仮想遺伝子をデータベース中に含入することにより、データベース中の仮想遺伝子が提供される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記データベース中の仮想遺伝子が１つまたは複数の実際の遺伝子内の全ての考え得るポリアデニル化部位を集合的に表す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを切断し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む切断遺伝子断片を精製することにより遺伝子断片の集団が提供される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを制限酵素で消化し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む消化遺伝子断片を精製することにより遺伝子断片の集団が提供される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
以下の：
試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを一次制限酵素で消化し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む消化遺伝子断片を精製することにより遺伝子断片の一次集団を提供し；そして
試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを二次制限酵素で消化し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む消化遺伝子断片を精製することにより遺伝子断片の二次集団を提供し；そして場合により
試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを三次制限酵素またはさらなる制限酵素で消化し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む消化遺伝子断片を精製することにより遺伝子断片の三次集団またはさらなる集団を提供する
ことを包含する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
以下の：
データセット内の一次集団および二次集団、ならびに任意に三次集団またはさらなる集団の各々に関してシグナル内の非ゼロ大きさシグナルを有する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する１つまたは複数のｍＲＮＡの同一性を確定し、それにより一次および二次集団の両方または全ての集団に関するシグナル内の非ゼロ大きさシグナルを有する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡが試料中に存在する転写遺伝子または転写遺伝子変異体中のポリアデニル化部位に対応すると同定される
ことを包含する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
一次、二次および三次制限酵素が用いられて、遺伝子断片の一次、二次および三次集団を提供する、請求項６または請求項７記載の方法。
【請求項９】
遺伝子断片に関するシグナルが存在する遺伝子断片の量に関する定量的情報を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
以下の：
鋳型としてｍＲＮＡを用いて試料中の各ｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより一次ｃＤＮＡ鎖の集団を提供し；
ｍＲＮＡを除去し；
各一次鎖と相補的な二次ｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供し；
ＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素で二本鎖ｃＤＮＡ分子を消化して、消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供するが、各消化二本鎖ｃＤＮＡ分子は制限酵素消化により提供される付着末端を有し；
アダプターオリゴヌクレオチドの集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端にライゲートするが、アダプターオリゴヌクレオチドは各々、付着末端と相補的な末端配列およびプライマーアニーリング配列を含み、それにより各々が一次鎖および二次鎖を含む二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供するが、この場合、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖は各々３’末端アダプターオリゴヌクレオチドを含み、そして二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖は各々３’末端ポリＡ配列を含み；
前記二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製し；
一次プライマーの集団および二次プライマーの集団を用いてｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有する二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子に関してポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するが、この場合、一次プライマーは各々アダプターオリゴヌクレオチドのプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含み；そして
制限酵素がＩＩ型酵素である場合、一次プライマーは各々少なくとも１つの３’末端可変ヌクレオチドをそして任意に１つより多い３’末端可変ヌクレオチドを含むが、この場合、可変ヌクレオチド（あるいは可変ヌクレオチド内の対応する位置では各一次プライマー）は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択されるヌクレオチドであり（あるいはそれらを有し）、それにより一次プライマーの集団が一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内のプライマーアニーリング配列と隣接して、一次プライマーの集団内の一次プライマーの可変ヌクレオチド（単数または複数）と相補的なヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；あるいは
制限酵素がＩＩＳ型酵素である場合、一次プライマーは一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内にアダプターオリゴヌクレオチドの集団内のアダプターオリゴヌクレオチドの末端配列と相補的なヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
二次プライマーはオリゴＴ配列ならびに次式：（Ｇ／Ｃ／Ａ）（Ｘ）n（式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｎはゼロ、少なくとも１または１より大きい数である）に従う３’可変部を含み；それにより、二次プライマーの集団が二次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖内のポリＡと隣接して、二次プライマーの集団内の二次プライマーの可変と相補的なヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを含む鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
それによりポリメラーゼ連鎖反応増幅が二本鎖化産物ＤＮＡ分子（前記遺伝子断片）の集団を提供し、この各々は、一次鎖産物ＤＮＡ分子および二次鎖産物ＤＮＡ分子を含み；
長さに基づいて二本鎖化産物ＤＮＡ分子を分離し；そして
前記二本鎖化産物ＤＮＡ分子を検出し；
それにより各二本鎖化産物ＤＮＡ分子に関するシグナルが前記二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さと（ｉ）一次プライマー可変ヌクレオチド（単数または複数）（この場合、ＩＩ型制限酵素が用いられる）または（ｉｉ）アダプターオリゴヌクレオチド末端配列（この場合、ＩＩＳ型制限酵素が用いられる）の組合せにより提供され；
この場合、一次および二次の異なる制限酵素および任意に三次の異なる制限酵素またはさらに異なる制限酵素により得られる二本鎖化産物ＤＮＡ分子（前記遺伝子断片）の一次および二次集団、ならびに任意に三次集団またはさらなる集団に関するシグナルが提供される
ことを包含する、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記データセット中のシグナルが、以下の：
（ｉ）前記一次および二次ならびに任意に三次またはさらなる各集団中の遺伝子断片に対応し得るデータベース中の既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する全ｍＲＮＡを列挙して、各集団に関しておそらくは存在する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの一覧表を作成し、そして
（ｉｉ）遺伝子断片と明確に対応しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡを列挙して、各集団に関して明確に存在しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの一覧表を作成し、次に
（ｉｉｉ）明確に存在しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡを各集団に関しておそらくは存在する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの一覧表から除去し、そして
（ｉｖ）おそらくは存在する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡならびに明確に存在しないｍＲＮＡ分子の一覧表を、（ｉｉｉ）における各集団に関して作製された各一覧表を組合せることにより作成する；
ことにより、既知のポリＡ部位および／または前記仮想遺伝子を有するｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較され、
それにより既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する１つまたは複数のｍＲＮＡを試料中に実際に存在するｍＲＮＡに対応すると同定する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の：
（ｉ）一次および二次ならびに任意に三次またはさらなる各集団中の遺伝子断片に対応し得るデータベース中の既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する全ｍＲＮＡを列挙し、そして式Ｆｉ＝ｍ1＋ｍ2＋ｍ3（式中、Ｆｉは断片からのシグナルの強度であり、数字はデータベース中の既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの単位元である）という一組の方程式を作成し（この場合、遺伝子断片に対応し得る既知のポリＡ部位または仮想遺伝子を有する各ｍＲＮＡは右手側の項として現れる）；
（ｉｉ）各実験に関して、各集団中の遺伝子断片に明確に対応しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡを列挙し、そして各集団中の遺伝子断片に明確に対応しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する各ｍＲＮＡに関して式０＝ｍ4（式中、数字はデータベース中の既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの単位元である）の方程式を書き；
（ｉｉｉ）連立方程式のシステムを作成するために方程式組を併合するが、この場合、方程式の数値は試料中に存在するかまたは潜在的に存在する転写遺伝子または転写遺伝子変異体の数より大きく；
（ｉｖ）連立方程式のシステムを解答することにより、各転写遺伝子または転写遺伝子変異体の発現レベルの量を確定し；そして
（ｖ）各遺伝子断片に関して提供されるシグナル内に発現レベルの確定量を含入する
ことを包含する請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記アダプターオリゴヌクレオチドをライゲートする前に、３’末端ポリＡ配列を含む鎖を含む消化二本鎖ｃＤＮＡ分子を精製することを包含する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
以下の：
ｉ）前記一次ｃＤＮＡ鎖を合成する前に、各ｍＲＮＡ分子のポリＡ尾を支持体に結合されたポリＴオリゴヌクレオチドとアニーリングすることにより固体支持体上に試料中のｍＲＮＡ分子を固定し、それにより支持体に結合された二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供し；そして
ｉｉ）二本鎖ｃＤＮＡ分子を消化して支持体に結合された消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供後、アダプターオリゴヌクレオチドの前記集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端に結繋する前に、支持体に結合されていない物質を洗い落とすことにより支持体に結合された消化二本鎖ｃＤＮＡ分子を精製し；そして
ｉｉｉ）アダプターオリゴヌクレオチドの集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端に結繋して、前記二本鎖ｃＤＮＡ鋳型分子を提供後、二本鎖ｃＤＮＡ分子に関する前記ポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施する前に、支持体に結合されていない物質を洗い落とすことにより、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製する
ことを包含する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記制限酵素が1/256〜1/4096 bpの切断頻度で二本鎖ＤＮＡを切断する、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記切断頻度が1/512または1/1024 bpである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記制限酵素がＩＩ型制限酵素である、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記制限酵素が二本鎖ＤＮＡを消化して、2〜4個のヌクレオチドの付着末端を提供する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記制限酵素がＨａｅＩＩ、ＡｐｏＩ、ＸｈｏＩＩおよびＨｓｐ９２１からなる群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記一次プライマーが各々1個の可変ヌクレオチドを有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記一次プライマーが各々2個の可変ヌクレオチドを有し、その各々がＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり得る、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記一次プライマーが各々3個の可変ヌクレオチドを有し、その各々がＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり得る、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのいずれかが前記可変ヌクレオチドであるかまたは一次プライマーの可変ヌクレオチド内の前記の対応する位置に存在することを示すために各一次プライマーが標識で標識される、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記制限酵素がＩＩＳ型制限酵素である、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記制限酵素が二本鎖ＤＮＡを消化して、2〜4個のヌクレオチドの付着末端を提供する、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記制限酵素がＦｏｋＩ、ＢｂｖＩ、ＳｆａＮＩおよびＡｌｗ２６１からなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記アダプターオリゴヌクレオチドの集団中のアダプターオリゴヌクレオチドが異なる末端配列を有する異なるアダプターオリゴヌクレオチドからの別個の反応容器中の消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の付着末端にライゲートされる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
各反応容器が単一アダプターオリゴヌクレオチド末端配列を含入する、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
各反応容器が多数のアダプターオリゴヌクレオチド末端配列を含入し、反応容器中の各アダプターオリゴヌクレオチドが同一反応容器中に異なる末端配列ならびに末端配列からのプライマーアニーリング配列および他のアダプターオリゴヌクレオチド配列のプライマーアニーリング配列を含み、各反応容器中のポリメラーゼ連鎖反応増幅に用いられている多数の一次プライマーに対応する、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
ｎが0である、請求項５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ｎが1である、請求項５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
ｎが2である、請求項５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記一次プライマーが標識される、請求項５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記標識がシーケンシング機により読取り可能な蛍光染料である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
二本鎖ＤＮＡ分子がシーケンシングゲルまたはキャピラリー上での電気泳動により長さに基づいて分離され、遺伝子断片に関するシグナルが電気泳動図として生成される、請求項５〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子変異体の同定に関する。特に本発明は、核酸分子の集団中に起こる配列変異体間の差の同定に関する。特定の実施形態において、本発明は、ポリＡ部位用法の同定または発見、あるいは核酸試料中のポリＡ部位用法の確定、ならびに代替的ポリＡ部位から生じる遺伝子変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
2〜3年で、ヒトおよび齧歯類ゲノムの配列は完成されるであろう。さらに複雑な仕事は、ゲノムからメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として発現される遺伝子の完全組であるトランスクリプトームの同定および特性化であり、そして終局的にはタンパク質への翻訳により生物体中の細胞の発達および適正機能を制御することである。
【０００３】
細胞における遺伝子作用を理解するという重要な一態様は、遺伝子からのｍＲＮＡの転写の調節を理解することである。これは、ｍＲＮＡのタンパク質コード部分の上流および下流の非コード領域中に主に位置する調節ＤＮＡ配列に結合されるエンハンサーおよびサイレンサーの複合組により制御される。これらの調節配列の多くは精確に限定されず、これがそれらの検出を難しくする。
【０００４】
近年、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳も、ｍＲＮＡの５’および３’領域に結合する一組の調節タンパク質により調節される、ということが実現された（Macdonald et al. 2001により再検討された）。翻訳調節に関して重要であることを立証したｍＲＮＡのさらなる特徴は、ｍＲＮＡの３’末端を限定する場合の代替的ポリアデニル化部位（ｐＡ部位）の使用である（2〜3の例に関しては、Touriol et al., 1999; Goldmann et al., 1999参照）。22％ものネズミおよび44％ものヒト調査遺伝子が、2〜9つの代替的ｐＡ部位を示す（Pauws et al., 2001）。
【０００５】
ｐＡ部位の選択は、調節配列素子がｍＲＮＡの下流部分に含まれそしてｍＲＮＡの半減期にも影響を及ぼすことを確定する。ｐＡ部位用法に関する利用可能なデータは、一般的ｐＡ部位確定方法の制約のために不十分であり、それゆえこの翻訳調節に関する一般的結論を下すことは難しい。この理由のために、種々の細胞型および条件におけるトランスクリプトームのｐＡ部位のレパートリーを確定するためのより良好な方法を見出すことが望ましい。
【０００６】
これまで、ｍＲＮＡの３’末端を調べるために、以下の2つの方法が用いられてきた：
１．クローン化ｍＲＮＡの直接シーケンシング
細胞試料からのｍＲＮＡの３’末端を特定的にクローニングし、シーケンシングすることにより、ｐＡ部位についての知識が蓄積され得る。この方法の主要な制約は、それが労働集約的であるという点、そして人工産物が全く一般的であり、したがって本当であると思われるためには数回、同一３’末端が見つけ出されなければならない点である。さらにクローン化配列の間にそれ相当に稀に珍しいｐＡ部位が示されて、ただ2〜3個の選定遺伝子に関する結果を得るために巨大クローニングプロジェクトを生じる。
【０００７】
２．ｐＡ部位特異的配列に関するコンピューター配列検索
ゲノムまたはＥＳＴ配列中の見込みのあるｐＡ部位を自動的に見出すために、コンピューターアルゴリズムにおけるＥＳＴクラスタリングアルゴリズムを用いてまたは用いずに、ｐＡ部位コンセンサス配列の利用可能な知識を用いるために、いくつかの努力がなされてきた（Tabaska and Zhang, 1999; Kan et al., 2001）。残念ながら、ｐＡ部位を特定する配列は、特に代替的ｐＡ部位を有する遺伝子に関して驚くほど多様であり（Beaudoing et al., 2000）、そして実現可能なコンセンサス配列が限定されていない。したがって最新コンピューターアルゴリズムからの予測は決定的ではなく、ｍＲＮＡシーケンシングにより確証される必要があり、これもまた、全−トランスクリプトーム分析のために巨大シーケンシングプロジェクトを生じる。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、これらの欠点に取り組むために組合せ同定を用いる。一組の断片に関して得られる長さおよび／または部分配列情報（この場合、各遺伝子は1つより多い断片により表される）を用いて、観察された断片を生成した遺伝子（またはその他の配列）をデータベース中で同定する。組合せ同定のための手がかりは、各遺伝子が1回より多く観察されることである。これは、各断片に関する多数の候補遺伝子を見出し得る（ＳＡＧＥにおけると同様に）場合でも、特定の断片への各遺伝子の関与を非多義的に同定するための十分な情報が集合的に存在する、という帰結を有する。
【０００９】
組合せ同定の一例は、特許出願GB0018016.6およびPCT/IB01/01539に、そしてさらに本明細書中に記載されている。
【００１０】
一般に、本方法の実施形態の実施に際しては、二本鎖ｃＤＮＡは試料中のｍＲＮＡから生成される。この二本鎖ｃＤＮＡは制限酵素消化を施されて、各々が制限酵素消化により提供された付着末端を有する消化二本鎖ｃＤＮＡ分子を提供する。
【００１１】
本発明においては、制限酵素消化部位のポリＡからの距離に、ならびに部分配列情報に基づいた遺伝子断片の長さに関して、情報が収集される。各遺伝子断片に関する長さおよび部分配列情報の組合せは、その遺伝子断片に関するシグナルを提供し、そして遺伝子断片の集団に関するシグナルのデータセットが生成され得る。上記のように、核酸分子の長さは、標準電気泳動技法を用いて確定され得る。部分配列情報は、制限酵素に関する認識部位の知識により、そしてまたその末端の単数または複数の塩基によって、制限酵素消化に起因する末端を有する遺伝子断片とアニーリングする異なるアダプターを用いた消化断片の示差的増幅により得られる。
【００１２】
したがって例えばアダプターオリゴヌクレオチドの集団（複数のアダプター）は、消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の消化末端に結繋され、それにより各々一次鎖および二次さを含む二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供するが、この場合、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖は各々３’末端アダプターオリゴヌクレオチドを含み、そして二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖は各々３’末端ポリＡ配列を含む。
【００１３】
これらの二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子は精製されて、ｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有するｃＤＮＡ断片の集団を提供する。
【００１４】
二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の精製は、熟練者に利用可能な任意の適切な手段により達成され得る。例えばｃＤＮＡ分子の一端のポリＡまたはポリＴ配列はビオチンでタギングされて、ストレプトアビジン被覆ビーズとの結合によりこれらの二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の精製を可能にする。あるいはこれらの二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の単離は、ＰＣＲ前に、オリゴＴおよび／またはオリゴＡプローブとの結合によって、ハイブリダイゼーション選択により達成され得る。
【００１５】
好ましくは、３’末端ポリＡ配列を有する鎖を含む消化二本鎖ｃＤＮＡ分子は、アダプターオリゴヌクレオチドを結繋する前に精製される。これは、アダプターの非特異的結繋を防止するという利点を有する。またこれは、熟練者に利用可能な方法のいずれか、例えば上記のようなビオチンタギングによる精製を用い得る。
【００１６】
好ましい実施形態では、ｃＤＮＡ配列の３’末端は、制限消化前に固定される。したがってｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡの一端は、５’末端のオリゴＴ（本来、ｍＲＮＡの３’末端のポリＡと相補的である）により、固体支持体（例えばビーズ、例えば磁気またはプラスチック製、あるいは例えば遠心分離または磁気作用、あるいは細分手法のための亜小室を有する微細加工反応小室（ここで化学物質は小室を通過して洗浄される）により、洗浄中に保持され得る任意のその他の固体支持体）に固定される。ｃＤＮＡ配列の他方端は制限酵素消化を施され、そしてアダプターは遊離（消化）端に結繋される。したがって上記の消化二本鎖ｃＤＮＡ分子または二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の精製は、固体支持体上に所望の分子を保持しながら、過剰物質を洗い落とすことにより達成され得る。
【００１７】
ＰＣＲは、ｃＤＮＡ両端（一方はｃＤＮＡの一方の鎖の３’末端でアダプターとアニーリングするよう意図され、他方は（ｍＲＮＡ中の元のポリＡに対応して）ｃＤＮＡの他方の鎖の３’末端でポリＡとアニーリングするようオリゴＴを含有する）でアニーリングするプライマーを用いて実施され得る。ＩＩ型酵素による使用に関しては、各プライマーは、相補的配列を有するｃＤＮＡのサブセットを増幅する可変ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列を含む（一方の鎖に関するアダプターに隣接するかまたは他方の鎖に関するポリＡに隣接する）。ＩＩＳ型酵素に関しては、酵素が二本鎖ＤＮＡを切断する場合に生成される異なる可能性がある付着末端と結繋するアダプターが用いられる。したがってアダプターの集団は、ＩＩＳ型酵素による切断／消化後に、ＤＮＡの集団内の考え得る全ての付着末端と相補的であるよう用いられ得る。アダプターとアニーリングするプライマーが、ＰＣＲに用いられる。
【００１８】
プライマーは標識され、そして標識は関連プライマー可変部における対応する位置の関連Ａ、Ｔ、ＣまたはＧヌクレオチドに対応し得る。これは、ＰＣＲで産生される二本鎖ＤＮＡが標識されるということを、そして標識と生成物ＤＮＡの長さの組合せが特徴的シグナルを提供するということを意味する。別の状況では、生成物の長さと（ｉ）ＩＩ型酵素消化に関して用いられるＰＣＲプライマーまたは（ｉｉ）ＩＩＳ型消化に関して用いられるアダプターの組合せが特徴的シグナルを提供する。
【００１９】
試料中の所定の遺伝子は、所定の制限酵素により切断され、そして本方法に従ってアニーリングするアダプターを用いて増幅される場合、長さおよび配列情報からなるシグナルを生じる断片を産生する。これは、多数の遺伝子が同一断片シグナルを生じることが起こり得るため、データベース中の単一遺伝子に対する簡単な検索により直接的に独特に特定可能であるというわけではない。しかしながら同一試料に関する断片の異なる集団を生成するための2つまたはそれ以上の異なる制限酵素の使用により、断片の唯一の同定を可能にする多数のシグナルが得られる。したがって異なる制限酵素で処理される同一試料に関しては、異なるパターンのシグナルが生成され、そしてこれは、組合せ同定アルゴリズムを用いて既知のｍＲＮＡに関するシグナルのデータベースとそのパターンを比較させる。
【００２０】
2つまたはそれ以上の異なる制限酵素を用いて一試料に関して生成されるシグナルのパターンは、「仮想遺伝子」として割り当てられる既知の配列のデータベースから生成されるパターンと比較され得るが、この場合、考え得るポリＡ部位が示される。仮想遺伝子は、実際の遺伝子内の停止コドンの下流の考え得るポリアデニル化部位を表すと定義され、データベース中の仮想遺伝子は１つまたは複数の実際の遺伝子内のいくつかのまたは全ての考え得るポリアデニル化部位を集合的に表し得るか、あるいは任意の適切な手段により、例えばコンピューター分析および／または実験法により確定される候補または潜在的ポリアデニル化部位を表し得る。
【００２１】
仮想遺伝子は、実験的に確定されたポリＡ部位周囲（例えばいくつかの実験的誤差を可能にするために）または予測ポリＡ部位周囲の2〜3の塩基内の部位に関して含まれ得る。仮想遺伝子は、コンピューター敵に確定された任意のもっともらしいポリＡシグナルの下流の任意の1つまたは複数の考え得る部位に関して含まれ得る。好ましい実施形態では、例えばコンピューター的確定ポリＡシグナルおよび／または実験的証拠に基づいて、利用可能な注釈の組合せが併合される。各注釈位置は得点を与えられ、得点は、注釈位置からの距離によって介入位置に対しても与えられる。閾値組の適用は、擬陽性および擬陰性のレベルの低減を可能にする。他の実施形態では、考え得る部位は全て、例えば酵母またはマウス遺伝子の分析のために用いられ得る。
【００２２】
仮想遺伝子は、性格であるポリＡ部位の見込みによって、例えば実験的に確定されるポリＡ部位に関しては5〜10個の塩基またはコンピューター予測ポリＡ部位に関しては10〜20個の塩基内の考え得るポリＡ部位に関して含まれ得る。好ましくは採点システムが用いられるが、この場合、実験的に確定されるポリＡ部位はコンピューターで予測されるものより高い得点を与えられ、そして確定または予測部位周囲の考え得る部位は下降得点を与えられ、その得点は実験的確定ポリＡ部位に関してはより急速に下降する。得点に関する閾値の使用は、データベースに用いられる仮想遺伝子の数を低減する。したがって例えば仮想遺伝子は、一実施形態では、実験的確定ポリＡ部位に関するデータベース中に含まれ得るが、この場合、実験的確定ポリＡ部位の５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチド内の仮想遺伝子は各部位に関して含まれる。仮想遺伝子は、一実施形態では、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のヌクレオチド内の予測ポリＡ部位の予測ポリＡ部位に関するデータベース中に含まれる。
【００２３】
したがって多数の消化反応の結果に出現する断片に対応する仮想遺伝子は、実在すると同定される。
【００２４】
本発明の実施形態に従って、以下のような技法が用いられ得る：
１．断片に対応するデータベース中の遺伝子全てが列挙される。これは各実験に関して考え得る発現遺伝子の一覧表を作成する。
２．次に、断片に明確に対応しない遺伝子が列挙される（即ち、実験で見出されなかった長さおよび／または部分配列を有する断片を示すであろうもの）。これは各実験に関する明確な非発現遺伝子の一覧表を作成する。
【００２５】
３．各実験における非発現遺伝子が次に、各々の他の実験においておそらくは発現される遺伝子の一覧表から除去される。
４．結果は、ほとんどの場合、各断片が単一候補遺伝子同定を保持する各実験に関する一覧表である。
【００２６】
これは、試料中に実際に存在する各々の実遺伝子が「ｋ」回（ここで、「ｋ」は実験数、即ち「ｋ」この断片を用いて実施された異なる制限消化の数である）観察されるに違いないため、「ｋ」個の断片で機能する。ｋ個未満の数の断片がデータベース中の仮想遺伝子に関して観察される場合には、その仮想遺伝子は試料中に実遺伝子として実際には存在しなかったが、但し、もちろん、遺伝子は実験に用いられた異なる制限酵素の全てにより切断され得る、即ち、遺伝子は適切な制限酵素認識部位を含む。この場合、ｋ個の異なる制限酵素について、遺伝子は多数の酵素「λ」により切断されず、その場合、遺伝子は「ｋ−λ」個の断片を生じるはずである。ｋ−λより少ない断片が観察される場合、遺伝子はさらに排除され得る。したがって例えば遺伝子が3回消化を施される（ｋ＝3）が、しかしそのうちの2回だけ切断され得る（λ＝1）場合には、仮想遺伝子候補は、予測値2の代わりに断片が1個だけ観察される場合、さらに排除され得る。
【００２７】
したがって、全ての仮定的に考え得るポリＡ部位を代表するデータベース中の仮想遺伝子と比較した場合、試料中に存在する、実際のポリＡ部位を用いて、実遺伝子から生成される断片に関して生じたシグナルに関する組合せ方程式を解くことは、試料中に実際に存在する遺伝子に用いられる実ポリＡ部位の同定を可能にする。
【００２８】
アバンダンス測定値が各断片に関して利用可能である場合（例えば電気泳動トレースにおけるピーク高）、分析は、例えばGB0018016.6およびPCT/IB01/01539に記載されたように、定量的に実施され得る：
【００２９】
１．各実験における断片に対応するデータベース中の遺伝子は全て列挙される（即ち、試料中の実遺伝子から生成される断片に関して生成される長さおよび／または配列情報に関するシグナルと釣り合う仮想遺伝子）。これは、各実験に関しておそらくは発現される遺伝子の一覧表を生成する（即ち、現実に存在し、試料中に実際に存在し得る仮想遺伝子）。各実験における各断片に関して、式Ｆｉ＝ｍ１＋ｍ２＋ｍ３（式中、１、２、３等は遺伝子のｉｄであり、Ｆｉは断片からのシグナルの強度である）の方程式が書き表される。電気泳動における断片ピークに対応し得る各仮想遺伝子は、右手側の一項として現れる。
【００３０】
２．例えば162 bpでのピークがデータベース中の仮想遺伝子２３４、６４７および７８に対応し、それが強度2546を有する場合には、対応する方程式は以下のように書き表される：
2546＝ｍ２３４＋ｍ６４７＋ｍ７８
【００３１】
３．次に各実験に関して、断片と明確に対応しない仮想遺伝子が列挙される（即ち、試料中に存在する場合、実験においては見出されない長さを有する断片を生じるもの）。これは、各実験に関する明確な非発現遺伝子の、即ち、試料中に明確に実際には存在しない仮想遺伝子の一覧表を生じる。その一覧表の各仮想遺伝子に関して、方程式は次式のように書き表される：
0＝ｍ６５７
（式中、上記と同様に６５７は仮想遺伝子ｉｄである）。
【００３２】
４．したがって連立方程式のシステムが、未知数ｍ（＝試料中の遺伝子数）および方程式ｎ＝ｋｍ（式中、ｋは実験数である）を用いて得られる。全ての遺伝子が全実験において一重項として作動する場合には、各遺伝子はそれ自体の方程式中にちょうど1回出現するため、ｎ＝ｋｍである。それらが二重項または多重項として作動するほど、ｎは小さくなる。しかしながらｎ＞ｍである限り、システムは過大確定され、したがって標準計算方法を用いて解答されて、最小二乗解法を見つけ出す。例えば標準計算分析パッケージＭＡＴＬＡＳ（The MathWorks, Inc.）におけるバックスラッシュ演算子が用いられ得る。
【００３３】
５．システムの最小二乗解法は、その発現レベルの最良近似値を各遺伝子に与える。実施される実験数が多いほど、近似値はより良好である。誤差は、余りをコンピューター処理することにより（即ち、方程式中に概算遺伝子活性を挿入して、算定ピーク強度を得て、それを測定強度と比較することにより）、概算され得る。模擬試験は、50 000の未知数での100 000の方程式のシステムは標準パソコンで16時間で解答され得る、ということを示す。
【００３４】
本発明は、ポリアデニル化部位を見つけるための新規のアプローチである。延長により、それは、制限酵素切断後に核酸断片の長さに差を生じる任意の機能部位をマッピングするためにも適用され得る。このような部位としては、制限酵素部位それ自体、ＲＮＡの代替的スプライシングおよび５’キャッピング部位が挙げられる。必要とされるものは全て、理論的可能性を表す、例えば特定の酵素に関して考え得る制限部位および考え得るポリＡ部位の組合せを表す付加的仮想遺伝子を生成するためである。したがってそれは、全体的規模での機能的遺伝子特徴の系統的発見のための新規の一般的方法である。
【００３５】
要するに本発明の方法は、試料中の核酸から得られる多数の断片に関する長さおよび部分配列情報を含有するデータセットを生成し、次に、組合せ同定アルゴリズムを用いてデータベース中の遺伝子配列を代替的ポリアデニル化が確定されうるような方法で断片に割り当てることを包含し得る。
【００３６】
データセットは冗長であり、即ち分析される各遺伝子は、データセット中に多数回表示される。このようなデータセットの例としては、GB0018016.6およびPCT/IB01/01539のプロファイリング法に従って、そして本明細書中に開示されているように生成されるものが挙げられるが、この場合、ｍＲＮＡ試料はｃＤＮＡに変換されて、酵素で、好ましくはＩＩＳ型酵素で制限を施され、その後、多数の副反応でアダプター結繋（例えば256の場合、用いられる制限酵素は4塩基オーバーハング、例えばＦｏｋＩを切断する）およびＰＣＲ増幅に付される。このようなプロフィールは各々、各断片に関する配列の多数の塩基対の長さ（例えば9塩基対）についての情報を保有する。データセットが多数のこのようなプロフィールを含み、異なる控訴を用いて生成されるその数が2またはそれ以上、あるいは3またはそれ以上、例えば2または3または4、好ましくは3である場合には、試料中の各遺伝子は、異なる断片によりその同数回表示される。必要とされる組成物のデータセットを仮定すると、その場合、配列データベースからの候補遺伝子を割り当てるために組合せ同定アルゴリズムを用い得る。
【００３７】
試料中でのポリアデニル化部位の発見またはポリＡ部位用法の確定のために、各々の考え得るポリアデニル化部位が独立した候補遺伝子（「仮想遺伝子」）と考えられる割り当て判定基準が用いられる。情報の十分な冗長性を含有する制限消化物から生成されるデータセットを用いて、こともあろうに仮想遺伝子を含めた考え得る候補が試料中に実際に存在したことが多義的に確定され得る。これは、全ての確証された仮想遺伝子に関する代替的ポリアデニル化部位の存在に関する直接的実験的証拠を同時に提供する。
【００３８】
図１は、ポリアデニル化部位の発見を包含する本発明の一実施形態を例示する。2つの候補ポリ（Ａ）部位を有する遺伝子を仮定し、そして3つの異なる酵素による制限酵素切断によりこの場合生成される3つの遺伝子プロフィールを仮定すると、候補ポリ（Ａ）部位に対応するピークの出現は、それらの存在に関する直接実験証拠を提供する。ポリ（Ａ）部位の位置の変化が、3つのプロフィール全てにおけるその部位に由来する断片に影響を及ぼす、ということに留意されたい。暗示により、各遺伝子についてより多くの情報が得られるほど（即ちより独立したプロフィールが生成されるほど）、各ポリ（Ａ）部位について発見されるものはより確信のあるものである、ということが明らかである。逆に、各遺伝子について得られる情報が多いほど、より多くのポリ（Ａ）部位が導入され、解明され得る。
【００３９】
本発明は、発現遺伝子の試料中の代替的ポリアデニル化部位を発見するために、あるいは代替的ポリアデニル化部位が存在することを確定するために用いられ得る。代替的ポリアデニル化はしばしば進化中に選択されて、ｍＲＮＡ代謝回転の組織特異的調節を付与するため、本発明の実施態様のような直接的な且つ大規模でのそれらの発見および同定は、当該技術分野への重要な寄与である。
【００４０】
本発明の一態様に従って、試料中に存在するかまたは潜在的に存在する転写遺伝子の配列または転写遺伝子変異体の配列内のポリアデニル化部位または代替的ポリアデニル化部位の存在を確定するためのおよび／またはそれらを同定するための方法であって、以下の：
（ａ）試料中の転写遺伝子から生成される遺伝子断片の集団内の個々の遺伝子断片に関して得られる一組のシグナルを含むデータセットを生成するが、この場合、個々の遺伝子断片に関するシグナルは、長さおよび部分配列情報の組合せならびにその遺伝子断片に関する大きさ成分を含み、データセットは、集団中に存在しないと確定された長さおよび部分配列情報の組合せに関してゼロという大きさ成分、ならびに存在すると確定される長さおよび部分配列情報の組合せが、その組合せを有する遺伝子断片の集団中の存在を示すよう定性的であるか、あるいは集団中に存在する個々の遺伝子断片の量の指標を提供するよう定量的である遺伝子断片に関するシグナルの大きさ成分を含有し；そして
【００４１】
（ｂ）データセット内のシグナルをデータベースと比較することによりデータベース内の１つまたは複数の遺伝子候補を遺伝子断片に割り当てるが、この場合、データベースは既知のポリＡ部位および／または「仮想遺伝子」を有するｍＲＮＡを表すデータを含み、ここで、仮想遺伝子は各々、実際の遺伝子内の考え得るポリアデニル化部位を表すと定義され、
【００４２】
（ｃ）大きさゼロの少なくとも１つのシグナルに各々割り当てられる遺伝子候補を結果から除外し、
（ｄ）それにより、各々が既知のポリアデニル化部位および／またはデータセット内の非ゼロ大きさを有するシグナルに割り当てられる仮想遺伝子を有するｍＲＮＡである１つまたは複数の遺伝子または遺伝子変異体の一組を定義する結果を得て、この結果が前記試料中の１つまたは複数の遺伝子または遺伝子変異体の前記組の実際の存在の指標を提供する
ことを包含する方法が提供される。
【００４３】
データベース中の仮想遺伝子は、実際に起こる可能性に関して実際の遺伝子内の考え得るポリアデニル化部位を採点し、実際に起こる可能性の限定閾値を超える仮想遺伝子をデータベース中に含入することにより、提供され得る。
【００４４】
データベース中の仮想遺伝子は、１つまたは複数の実際の遺伝子内の全ての考え得るポリアデニル化部位を集合的に表し得る。
【００４５】
遺伝子断片の集団は、試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを切断し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む切断遺伝子断片を精製することにより提供され得る。
【００４６】
遺伝子断片の集団は、試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを制限酵素で消化し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む消化遺伝子断片を精製することにより提供され得る。
【００４７】
本方法の一実施形態は、以下の：
試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを一次制限酵素で消化し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む消化遺伝子断片を精製することにより遺伝子断片の一次集団を提供し；そして
試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを二次制限酵素で消化し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む消化遺伝子断片を精製することにより遺伝子断片の二次集団を提供し；そして任意に
試料中のｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーを三次制限酵素またはさらなる制限酵素で消化し、そして各々が末端ポリＡ配列を含む消化遺伝子断片を精製することにより遺伝子断片の三次集団またはさらなる集団を提供する
ことを包含する。
【００４８】
一次および二次集団、ならびに任意に三次集団またはさらなる集団が提供される本発明の方法は、以下の：
データセット内の一次集団および二次集団、ならびに任意に三次集団またはさらなる集団の各々に関してシグナル内の非ゼロ大きさシグナルを有する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する１つまたは複数のｍＲＮＡの同一性を確定し、それにより一次および二次集団の両方または全ての集団に関するシグナル内の非ゼロ大きさシグナルを有する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡが試料中に存在する転写遺伝子または転写遺伝子変異体中のポリアデニル化部位に対応すると同定される
ことを包含し得る。
【００４９】
好ましい実施形態では、3つの異なる制限酵素が用いられて、遺伝子断片の3つの集団を提供する。
【００５０】
集団中の遺伝子断片に関して生成されるシグナルは、限定長および配列情報の遺伝子断片の量のシグナル定量的確定の条項に含入することにより、試料中のｍＲＮＡの量に定量的に関連し得る。遺伝子断片の量は一般に増幅後に測定されるが、しかし試料中の対応するｍＲＮＡの量（言い換えれば発現レベル）に再び関連づけられ得る。
【００５１】
好ましい実施形態に用いられる制限酵素は、1/256〜1/4096 bp、好ましくは1/512または1/1024 bpの切断頻度で、二本鎖ＤＮＡを切断し得る。
【００５２】
制限酵素がＩＩ型制限酵素である場合、ＨａｅＩＩ、ＡｐｏＩ、ＸｈｏＩＩまたはＨｓｐ９２１を用いるのが好ましい。制限酵素がＩＩＳ型制限酵素である場合、ＦｏｋＩ、ＢｂｖＩまたはＡｌｗ２６１を用いるのが好ましい。その他の適切な酵素は、ＲＥＢＡＳＥにより同定される（rebase.neb.comあるいは任意のウエブブラウザーを用いてＲＥＢＡＳＥを見つける）。
【００５３】
好ましくは制限酵素は、二本鎖ＤＮＡを消化して2〜4個のヌクレオチドの付着末端を提供する。ＩＩＳ型酵素に関しては、4ヌクレオチドの付着末端が好ましい。
【００５４】
上記のように、二次、または二次および三次の、あるいはさらにそれ以上の異なるＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素（単数または複数）を用いて、試料から得られる遺伝子断片に関する2つまたはそれ以上のパターンのシグナルを生成することにより、情報が得られる。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、3つの異なる制限酵素が用いられる。
【００５５】
遺伝子断片に関するシグナルは、存在する遺伝子断片の量に関する定量的情報を含み得る。
【００５６】
本発明の実施態様に従った方法は、以下の：
鋳型としてｍＲＮＡを用いて試料中の各ｍＲＮＡと相補的なｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより一次ｃＤＮＡ鎖の集団を提供し；
ｍＲＮＡを除去し；
各一次鎖と相補的な二次ｃＤＮＡ鎖を合成し、それにより二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供し；
ＩＩ型またはＩＩＳ型制限酵素で二本鎖ｃＤＮＡ分子を消化して、消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の集団を提供するが、各消化二本鎖ｃＤＮＡ分子は制限酵素消化により提供される付着末端を有し；
アダプターオリゴヌクレオチドの集団を消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の各々の付着末端に結繋するが、アダプターオリゴヌクレオチドは各々、付着末端と相補的な末端配列およびプライマーアニーリング配列を含み、それにより各々が一次鎖および二次鎖を含む二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を提供するが、この場合、二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖は各々３’末端アダプターオリゴヌクレオチドを含み、そして二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖は各々３’末端ポリＡ配列を含み；
上記の二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子を精製し；
一次プライマーの集団および二次プライマーの集団を用いてｍＲＮＡの３’末端と相補的な配列を有する二本鎖鋳型ｃＤＮＡ分子に関してポリメラーゼ連鎖反応増幅を実施するが、
この場合、一次プライマーは各々アダプターオリゴヌクレオチドのプライマーアニーリング配列とアニーリングする配列を含み；そして
【００５７】
制限酵素がＩＩ型酵素である場合、一次プライマーは各々少なくとも１つの３’末端可変ヌクレオチドをそして任意に１つより多い３’末端可変ヌクレオチドを含むが、この場合、可変ヌクレオチド（あるいは可変ヌクレオチド内の対応する位置では各一次プライマー）は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択されるヌクレオチドであり（あるいはそれらを有し）、それにより一次プライマーの集団が一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内のプライマーアニーリング配列と隣接して、一次プライマーの集団内の一次プライマーの可変ヌクレオチド（単数または複数）と相補的なヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；あるいは
【００５８】
制限酵素がＩＩＳ型酵素である場合、一次プライマーは一次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖内にアダプターオリゴヌクレオチドの集団内のアダプターオリゴヌクレオチドの末端配列と相補的なヌクレオチドの配列を含む鋳型ｃＤＮＡ分子の一次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
【００５９】
二次プライマーはオリゴＴ配列ならびに次式：（Ｇ／Ｃ／Ａ）（Ｘ）n（式中、Ｘは任意のヌクレオチドであり、ｎはゼロ、少なくとも１または１より大きい数（例えば2）である）に従う３’可変部を含み；それにより、二次プライマーの集団が二次鎖産物ＤＮＡ分子（その各々は鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖内のポリＡと隣接して、二次プライマーの集団内の二次プライマーの可変と相補的なヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを含む鋳型ｃＤＮＡ分子の二次鎖と相補的である）のポリメラーゼ連鎖反応における合成をプライムし；
【００６０】
それによりポリメラーゼ連鎖反応増幅が二本鎖化産物ＤＮＡ分子（上記の遺伝子断片）の集団を提供し、この各々は、一次鎖産物ＤＮＡ分子および二次鎖産物ＤＮＡ分子を含み；
長さに基づいて二本鎖化産物ＤＮＡ分子を分離し；そして
上記の二本鎖化産物ＤＮＡ分子を検出し；
【００６１】
それにより各二本鎖化産物ＤＮＡ分子に関するシグナルが上記の二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さと（ｉ）一次プライマー可変ヌクレオチド（単数または複数）（この場合、ＩＩ型制限酵素が用いられる）または（ｉｉ）アダプターオリゴヌクレオチド末端配列（この場合、ＩＩＳ型制限酵素が用いられる）の組合せにより提供され；
【００６２】
この場合、一次および二次の異なる制限酵素および任意に三次の異なる制限酵素またはさらなる異なる制限酵素により得られる二本鎖化産物ＤＮＡ分子（上記の遺伝子断片）の一次および二次集団、ならびに任意に三次集団またはさらなる集団に関するシグナルが提供される
ことを包含し得る。
【００６３】
一次鎖からのｍＲＮＡの除去は、当該技術分野で利用可能な任意のアプローチによりなされ得る。これは、例えばＲＮアーゼによる消化を包含し、部分消化および／または二次ｃＤＮＡ鎖を合成するＤＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡの置換であり得る（例えばClontechTMＳＭＡＲＴTM系におけると同様）。
【００６４】
本発明の実施態様では、データセット中のシグナルは、以下の：
（ｉ）上記の一次および二次ならびに任意に三次またはさらなる各集団中の遺伝子断片に対応し得るデータベース中の既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する全ｍＲＮＡを列挙して、各集団に関しておそらくは存在する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの一覧表を作成し、そして
【００６５】
（ｉｉ）遺伝子断片と明確に対応しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡを列挙して、各集団に関して明確に存在しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの一覧表を作成し、次に
【００６６】
（ｉｉｉ）明確に存在しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡを各集団に関しておそらくは存在する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの一覧表から除去し、そして
【００６７】
（ｉｖ）おそらくは存在する既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡならびに明確に存在しないｍＲＮＡ分子の一覧表を、（ｉｉｉ）における各集団に関して作製された各一覧表を組合せることにより作成する；
ことにより、既知のポリＡ部位および／または上記の仮想遺伝子を有するｍＲＮＡに関して確定されるかまたは予測されるシグナルのデータベースと比較され、
それにより既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する１つまたは複数のｍＲＮＡを試料中に実際に存在するｍＲＮＡに対応すると同定する。
【００６８】
これは、以下の：
（ｉ）一次および二次ならびに任意に三次またはさらなる各集団中の遺伝子断片に対応し得るデータベース中の既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する全ｍＲＮＡを列挙し、そして式Ｆｉ＝ｍ1＋ｍ2＋ｍ3（式中、Ｆｉは断片からのシグナルの強度であり、数字はデータベース中の既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの単位元である）という一組の方程式を作成し（この場合、遺伝子断片に対応し得る既知のポリＡ部位または仮想遺伝子を有する各ｍＲＮＡは右手側の項として現れる）；
【００６９】
（ｉｉ）各実験に関して、各集団中の遺伝子断片に明確に対応しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡを列挙し、そして各集団中の遺伝子断片に明確に対応しない既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有する各ｍＲＮＡに関して式０＝ｍ4（式中、数字はデータベース中の既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡの単位元である）の方程式を書き；
【００７０】
（ｉｉｉ）連立方程式のシステムを作成するために方程式組を併合するが、この場合、方程式の数値は試料中に存在するかまたは潜在的に存在する転写遺伝子または転写遺伝子変異体の数より大きく；
（ｉｖ）連立方程式のシステムを解答することにより、各転写遺伝子または転写遺伝子変異体の発現レベルの量を確定し；そして
（ｖ）各遺伝子断片に関して提供されるシグナル内に発現レベルの確定量を含入する
ことを包含し得る。
【００７１】
本発明の実施形態に用いられる一次プライマーは各々、1つの可変ヌクレオチドを有し得る。他の実施形態では、それらは各々、2つの可変ヌクレオチドを有し、その各々はＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり得る。他の実施形態では、それらは各々、3つの可変ヌクレオチドを有し、その各々はＡ、Ｔ、ＣまたはＧであり得る。
【００７２】
各一次プライマーは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのいずれかが上記の可変ヌクレオチドであるか、あるいは一次プライマーの可変ヌクレオチド内の上記の対応する位置に存在することを示すために標識で標識され得る。
【００７３】
アダプターオリゴヌクレオチドの集団中のアダプターオリゴヌクレオチドは、異なる末端配列を有する異なるアダプターオリゴヌクレオチドからの別個の反応容器中の消化二本鎖ｃＤＮＡ分子の付着末端に結繋され得る。
【００７４】
本発明の方法の実施形態では、各反応容器は、単一アダプターオリゴヌクレオチド末端配列を含入し得る。他の実施形態では、各反応容器は多数のアダプターオリゴヌクレオチド末端配列を含入し、同一容器中に異なる末端配列ならびに末端配列からのプライマーアニーリング配列および他のアダプターオリゴヌクレオチド配列のプライマーアニーリング配列を含む反応容器中の各アダプターオリゴヌクレオチドは、各反応容器中のポリメラーゼ連鎖反応増幅に用いられている多数の一次プライマーに対応する。
【００７５】
ＩＩ型酵素による消化後のＰＣＲのために用いられる各一次プライマー中には、単一可変ヌクレオチド、あるいは1つより多い、例えば2または3個のヌクレオチドを有する可変ヌクレオチド配列が存在し得る。可変配列中の各位置では、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの各々が集団中に示されるよう、一次プライマーが提供され得る。
【００７６】
各二次プライマー（オリゴｄＴを含む）では、ｎは0、1または2であり得る。
アダプター配列の変異性は付着末端により提供されるため、ＩＩＳ型制限酵素が用いられるＰＣＲのために用いられるプライマーには可変性ヌクレオチドは必要でない。一般に、ＩＩＳ型制限酵素が用いられる場合、制限酵素に関して考え得る付着末端は全て集団中で表示され、そして各アダプターが別個の反応容器中の試料の分画に結繋され得るよう、アダプターの集団が提供される。その場合、各反応容器中に用いられるアダプターは既知であり、この情報と二本鎖化産物ＤＮＡ分子の長さとの組合せは所望の特徴的パターンを提供する。
【００７７】
好ましい実施形態では、アダプターを結繋する場合、アダプターは、例えば化学的に、一方の鎖上で遮断され得る。これは、遮断基、例えば３’デオキシオリゴヌクレオチドまたは５’オリゴヌクレオチドを用いて達成され得るが、この場合、リン酸基は窒素、ヒドロキシルまたは別の遮断部分により置き換えられている。これは、他方の非遮断鎖での結繋を可能にし、そして特異性を改良するために用いられ得る。250:1より大きい特異性が得られる。ＰＣＲは、単一結繋鎖から進行し得る。さらに、材料および方法に記載されているように、結繋特異性および／または効率を改良する結繋条件が確認されている。これらの条件は4つまでの可変塩基対とアダプターの結繋において特異性を達成するのに有益である、ということが判明した。
【００７８】
便宜のために、多数のアダプターが単一反応容器中に併合されるが、この場合、所定の容器中の各々の異なるアダプター（ＩＩＳ型制限酵素消化により提供される潜在的付着末端の集団内の一付着末端と相補的な異なる末端配列を有する）は、異なるプライマーアニーリング配列を含む。例えば3つの異なるアダプターが1反応容器中に併合され得る。対応する一次プライマーが次に用いられ、そしてこれらは、それぞれの異なるアダプターオリゴヌクレオチドから生じる生成物間を区別するために標識され得る。
【００７９】
ＩＩ型酵素が用いられる場合、一次プライマーが標識され得るが、しかし個々のポリメラーゼ連鎖反応増幅が別個の反応容器中で実施される場合、一次プライマーが用いられることは既知である。そうでなければ、標識化は、一次プライマー配列がどちらの二本鎖ＤＮＡ産物分子を提供しているかに関する便利な情報を提供する。
【００８０】
3つの異なる一次プライマーＰＣＲ増幅が各反応容器中で実施され、各一次プライマーが適切に標識される（任意に標識化サイズマーカーを用いて）、というのが便利である。
分離は、キャピラリーまたはゲル電気泳動を用い得る。反応当たり1標識が用いられ、キャピラリーまたはレーン当たり4つの染料を用い、そのうちの1つはサイズマーカーを保有し得る。
【００８１】
標識は、蛍光染料であるのが便利であり、標準シーケンシング機を用いて読取られるそれらの長さに基づいて、関連シグナル（例えばゲル上）が電気泳動後に二本鎖化産物ＤＮＡ分子を分離させる。
【００８２】
データベースとの比較のためにデータセットのシグナルを提供するために生成される遺伝子断片の集団が固体支持体上に調製され得るが、この場合、試料中の各転写遺伝子または転写遺伝子変異体は独特の遺伝子断片により示される。集団は、蛍光プライマーを用いたＰＣＲ増幅後に、キャピラリー電気泳動機で表示され得る。各電気泳動図中の帯域の数を低減するために、例えば以下の2つの方法（α）および（β）のうちの一方を用いて、初期ライブラリーが細分され得る。
【００８３】
（α）通常ＩＩ型酵素を用いて生成されるライブラリーに関しては、アダプターは各断片の付着末端に結繋される。アダプターは、制限酵素により生成される付着末端と相補的な部分およびプライマーがアニーリングする部分を含む。一プライマーアニーリング配列、あるいは最小量の交差ハイブリダイゼーションを示す小数の、例えば2または3の異なる配列を用いて、その少数の個々の反応を単一反応容器中で進行させ得る。次にライブラリーは多数の異なる反応容器中に分割され、各容器中の断片のサブセットは、未知の配列中に突出する2〜3の余分の塩基を保有する３’（オリゴＴ）および５’（ユニバーサルアダプター）末端と適合性であるプライマーを用いてＰＣＲ増幅される。したがって各反応において、突出塩基の異なる組合せは、断片のサブセットの選択的増幅を引き起こす。
【００８４】
（β）ＩＩＳ型酵素により生成されるライブラリー（それらの認識配列の外側を切断して、遺伝子特異的付着末端を提供する）に関しては、ライブラリーは多数の異なる反応容器に分割される。全ての考え得る付着末端がその組中に示されるよう、ユニバーサル不変部分および可変付着末端を含有する一組のアダプターが意図される。各反応容器中で、単一のこのようなアダプターが結繋される。アダプターを保有する各容器中の断片のサブセットは次に、ユニバーサル高緊縮プライマーを用いて増幅される。
【００８５】
両方法において、その結果生じる反応物は、断片長および存在度を定量するキャピラリー電気泳動機上で別個に走行され得るが、これは、原試料中の対応するｍＲＮＡの相対的存在度を示す。
【００８６】
各遺伝子断片に関しては、以下のものが既知であり、特徴的シグナルを提供するために用いられる：
−  遺伝子断片（例えば4〜8塩基）を生成するために用いられる制限酵素部位；
−  その長さ（制限酵素切断部位とポリＡ部位との間の距離を代表する）；
−  副反応（細分法により示されるが、しかし一般に付加的4〜6塩基に対応する）。
【００８７】
データベースからの既知の配列を用いて各断片を同定するために十分な情報が生成される。これは、断片長分布（酵素により示される）および細分（突出塩基によりおよび／または付着末端により（ＩＩＳ型）示される）の組合せを選択することにより実施され得る。2塩基（16の副反応）という少ない、あるいは8という多い（65536副反応）数の塩基が用いられ得る；小トランスクリプトームが分析されている場合、少数の副反応で十分であり得る；高処理量分析法が利用可能である場合、多数の副反応が非常に多数の遺伝子または遺伝子変異体の分離を可能にする。実際、4〜6塩基が通常は用いられる。
【実施例】
【００８８】
実験的例証
サブセット（フレーム）を生成するためのＩＩＳ酵素により生成される付着末端への多数のアダプターの結繋と、その後のユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ。組合せ同定による代替的ポリアデニル化部位の発見。
【００８９】
以下のようにマウスｍＲＮＡに関して実験を実施した。材料および方法のさらなる詳細を以下に挙げる。
【００９０】
固体支持体上で、ｃＤＮＡを合成した。ビオチニル化オリゴｄＴでプライムされたｍＲＮＡからの逆転写酵素（ＲＴ）により、一次鎖を合成した。ｍＲＮＡを切断するＲＮアーゼ、ならびにＲＮアーゼにより取り残される小ＲＮＡ断片をプライムオフし、それが続くと、他のＲＮＡ断片を置換するＤＮＡポリメラーゼにより二次鎖を生成した。二本鎖ｃＤＮＡをストレプトアビジン被覆ダイナビーズ（Dynal, Norway）に結合させた。
【００９１】
次に、5ヌクレオチドの認識配列を有するクラスＩＩＳエンドヌクレアーゼを用いて、ｃＤＮＡを切断した。クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼは、それらの認識配列から精確な距離で二本鎖ＤＮＡを切断する（クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの例では、認識配列から9および13ヌクレオチド）。クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼのその他の例としては、ＢｂｖＩ、ＳｆａＮＩおよびＡｌｗ２６Ｉ、ならびにSzybalski et al. (1991) Gene, 100, 13-26に記載されたその他のものが挙げられる。固体支持体に結合されたｃＤＮＡの３’部分を次に、固体支持体を用いて精製した。ｃＤＮＡを次に256の分画に分け、そして異なるアダプターを各分画中の断片に結繋した。
【００９２】
用いられる一酵素は、ＦｏｋＩであった。ＦｏｋＩ切断は、4つのヌクレオチド５’オーバーハングをもたらし、各オーバーハングは遺伝子特異的であるがしかし任意の塩基の組合せからなる。これら4つの位置における単一の考え得るヌクレオチド組合せを保有する一アダプターを各分画中に、即ち総計256のアダプターおよび分画を用いた。アダプターを一鎖上で遮断し、他方の鎖上でのみ結繋を起こさせることにより、特異性を改善した。再び固体支持体により、次にｃＤＮＡを精製して、余分な非結繋アダプターを除去した。アダプター配列の定常部分と相補的な一ユニバーサルプライマーおよびポリＡ尾と相補的なものを用いて、256分画に関してＰＣＲを実施した。
【００９３】
３’プライマーはオリゴｄＴであり、したがって元のｍＲＮＡのポリアデニル化配列と相補的であった。各プライマーを未知の配列に延びる塩基、グアニン、アデノシンまたはシトシンを用いて設計した（二次またはさらなる塩基が含まれ、グアニン、アデノシン、チミンまたはシトシンのいずれかである）。各ウエルに、3つの考え得る３’プライマーの混合物を投入した。これは、３’プライマーが常にポリメラーゼをポリＡ尾の最初に向けて、限定されたそして再現可能な断片長を生じる、ということを保証した。
【００９４】
その結果生じたＰＣＲ産物を精製し、ＡＢＩプリズムキャピラリーシーケンサーに入れた。したがってキャピラリー電気泳動設備とともに提供される検出器およびソフトウェアを用いて定量した各断片のサイズおよび蛍光により、発現遺伝子を表すＰＣＲ断片を分離した。
【００９５】
同一試料に関して3つの独立したプロフィールが得られるよう、この手法を、異なるＩＩＳ型制限酵素（ＦｏｋＩ、ＢｂｖＩおよびＢｓｍＡＩ）を用いて3回実施した。この分析における各断片に独特の情報、即ち9つのヌクレオチド（例えばＦｏｋＩ認識配列および切断部位）ならびにキャピラリーシーケンサーから得られたＦｏｋＩ制限部位に対するポリアデニル化からのサイズを組合せて、各ｍＲＮＡの単位元（ＥＳＴ、遺伝子またはｍＲＮＡ単位元）は、本明細書中で立案されたような組合せアルゴリズムを用いて確立され得る（GB0018016.6およびPCT/IB01/01539も参照）。
【００９６】
マウスゲノムからの5247遺伝子の発現に対応する擬似データセットを構築した。3094の既知のポリアデニル化部位を用いて、そして11057のポリアデニル化部位を無作為に限定したが、しかし遺伝子データベースにおいて、既知のポリアデニル化部位の10ヌクレオチド近辺では、あるいは推定および既知のポリアデニル化シグナルに対して10〜30ヌクレオチドの領域では、利用可能にされなかった。
【００９７】
11057の限定付加的ポリアデニル化部位に関する情報を含有しないオリジナルマウス遺伝子データセットを用いて、本明細書中で立案したようなアルゴリズムを用いて擬似データセットを分析した場合、それは発現を5226の発現遺伝子に、そして既知の活性ポリアデニル化部位3094のうちの3004に正しく割り当てた。
【００９８】
もっとも重要なのは、それが非登録（実験では「未知の」）ポリアデニル化部位11057のうちの10438を突き止めて、代替的ポリアデニル化部位を検出するための本発明の有用性を提供したことである。
【００９９】
試料中の転写ｍＲＮＡに対応する遺伝子断片に関するシグナルを生成するためのサブセット（フレーム）を生成するための未知の配列中に突出する１つまたは複数の塩基を有するＰＣＲプライマーの使用
標準技法に従って、試料からＲＮＡを精製した。ＲＮＡを65℃で10分間変性させて、オリゴテックスOligotexビーズ（Qiagen）に付加し、ビーズと共有結合したオリゴｄＴ鋳型とアニーリングさせた。鋳型としてオリゴテックスビーズに結合されたｍＲＮＡを用いて、一次ｃＤＮＡ合成を実施した。したがってこの一次鎖ｃＤＮＡは、オリゴテックスビーズと共有結合するようになる（Hara et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 7097）。上記のHara et alに記載されたように、二次鎖合成を実施した。要するに、オリゴｄＴによりプライムされたｍＲＮＡから逆転写酵素（ＲＴ）により一次鎖を合成した。ｍＲＮＡを切断するＲＮアーゼ、ならびにＲＮアーゼにより残された小ＲＮＡ断片をプライムオフし、それが進行すると他のＲＮＡ断片を置換するＤＮＡポリメラーゼにより二次鎖を生成した。オリゴテックスビーズに結合された二本鎖ｃＤＮＡを精製し、ＨａｅＩＩで制限消化した。ＨａｅＩＩを用いた。代替的酵素としては、ＡｐｏＩ、ＸｊｏＩＩおよびＨｓｐ９２１（ＩＩ型）、ならびにＦｏｋＩ、ＢｂｖＩおよびＡｌｗ２６１（ＩＩＳ型）が挙げられる。ｃＤＮＡを再び精製して、オリゴテックスに結合されたｃＤＮＡの分画を保持した。
【０１００】
アダプターをｃＤＮＡのＨａｅＩＩ部位に結繋した。アダプターは、ＨａｅＩＩ部位と相補的な配列および余分なヌクレオチドを含有して、全てのｃＤＮＡのＰＣＲのためのユニバーサル鋳型を提供した。次にｃＤＮＡを再び精製して、塩、タンパク質および非結繋アダプターを除去した。
【０１０１】
ｃＤＮＡを、96ウエル皿中の96等プールに分けた。各ウエル中の精製断片の一サブセットのみをＰＣＲ増幅するために、多重ＰＣＲを以下のように設計した。
【０１０２】
５’プライマーはユニバーサル鋳型と相補的であるが、しかし2つの塩基を未知の配列に延長した。これらの塩基のうちの第一のものは、チミンまたはシトシンで、ＨａｅＩＩ部位の揺らぎ塩基に対応したが、一方、第二のものはグアニン、シトシン、チミンまたはアデノシンのうちのいずれかであった。各５’プライマーを、炭素スペーサーにより、ＡＢＩプリズムキャピラリーシーケンサーにより検出可能な蛍光色素に蛍光的に結合させた。蛍光色素は、二次塩と調和した。各ウエルに、4つ全ての蛍光色素（それゆえ4つの二次塩基全て）を有する4つのプライマーを投入した。半数のウエルには、チミジン一次塩基を有するプライマーを、そして半数にはシトシン一次塩基を有するものを投入した。
【０１０３】
３’プライマーはオリゴｄＴであり、したがって元のｍＲＮＡのポリアデニル化配列と相補的であった。未知の配列に延びる3つの塩基を用いて各プライマーを設計し、その第一のものはグアニン、アデノシンまたはシトシンであり、一方他の2つは4つの塩基のいずれかであった。各ウエルに単一３’プライマーを投入した。したがってＰＣＲ反応は384の副反応に多重化した：各々において4つの蛍光色素チャンネルを有する96ウエル。
【０１０４】
標準ＰＣＲ反応ミックス、例えば緩衝剤、ヌクレオチド、ポリメラーゼを付加した。ペルティエサーマルサイクラー（ＰＴＣ−200）で、ＰＣＲを実行した。この実験に用いた各プライマー対は、そのプライマー対の独特の4つのヌクレオチド組合せを含有する遺伝子のみを認識し、増幅する。これらの遺伝子の各々のＰＣＲ断片のサイズは、ポリアデニル化およびもっとも近いＨａｅＩＩ部位間の長さに対応する。
【０１０５】
その結果生じたＰＣＲ産物をイソプロパノール沈降させて、ＡＢＩプリズムキャピラリーシーケンサーに投入した。したがってＡＢＩプリズムとともに供給された検出器およびソフトウェアを用いて定量された各断片のサイズおよび蛍光により、発現遺伝子を示すＰＣＲ断片を分離した。
【０１０６】
用いたプライマーの組合せは、各蛍光チャンネルおよび試料中の〜70ＰＣＲ産物という理論的平均をもたらす（所定の試料中で発現される20％の遺伝子および合計140,000個の遺伝子を基礎にして）。ＨａｅＩＩ制限消化後に既知の遺伝子から生成されるポリアデニル化を含めた３’断片の統計学的サイズ分布の分析は、概算で80％が断片単独のフレームおよび長さに基づいて独自に同定され得る、ということを示した。ＡＢＩプリズムは、1〜2,000ヌクレオチド間に0.5％の分解能を有する。この不確実性を考慮して、〜60％の発現遺伝子が独自に同定され得る。同一プロトコールを用いるが、しかしＨａｅＩＩ酵素を別の5塩基切断制限酵素に置き換えた付加的平行実験を用いると、理論的限界がゲノム中の全転写体の〜96％に、そして実際限界（ＡＢＩプリズムの分解能を考えると）が〜85％に増大される。
【０１０７】
試料中の各ｍＲＮＡのレベルは、ＡＢＩプリズムにおけるシグナル強度に対応する。この分析における各断片に独特の情報、即ち8.5ヌクレオチド（例えばＨａｅＩＩ認識配列）およびポリアデニル化からＨａｅＩＩ制限部位までのサイズを併合すると、各ｍＲＮＡの単位元はそれゆえ、１つまたは複数のｍＲＮＡにおける停止コドンの下流の全ての理論的に考え得るポリＡ部位を表す既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するｍＲＮＡを含有するデータベースとの比較により確立され得る。
【０１０８】
全ての既知の遺伝子およびユニジーンunigeneＥＳＴクラスターに関する検索可能データベースを、以下のように構築した。
【０１０９】
部分的相同断片のクラスターを含有する公的データベースであるユニジーンをダウンロードした（しかし本発明は、単一またはクラスターか断片の任意の組とともに用いられる）。各クラスターに関しては、ポリＡシグナルおよびポリＡ配列を含有する断片を全て、上流ＨａｅＩＩ部位に関して走査した。ＨａｅＩＩ部位が見出されない場合には、ＨａｅＩＩ部位が見出されるまで、同一クラスターからの配列を用いて、５’に向けて断片を延長した。次に、ＨａｅＩＩおよびポリＡ配列に隣接する塩基対からフレームを確定し、ＨａｅＩＩ消化物の長さを算定した。フレームおよび長さを、迅速読出しのためのデータベースにおける索引として用いた。
【０１１０】
ＡＢＩプリズムからの出力をデータベースに対して実行し、したがってこの試験の試料中に含入されるＲＮＡ中で実際に発現される任意の１つまたは複数の既知の遺伝子およびＥＳＴ発現レベルの同定を可能にした。
【０１１１】
サブセット（フレーム）を生成するためのＩＩＳ型酵素により生成される付着末端との多数アダプターの結繋とその後のユニバーサルプライマーによるＰＣＲ
別の組の実験では、方法を簡素化し、分解能増大を達成した。前節に記載したように固体支持体上でｃＤＮＡを合成したが、今回は磁気ダイナビーズDynaBead（材料および方法に記載されている）を用いる。次にｃＤＮＡを、4または5ヌクレオチドの認識配列を有するクラスＩＩＳエンドヌクレアーゼで切断した。
【０１１２】
クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼは、それらの認識配列から精確な距離で二本鎖ＤＮＡを切断する（クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの例では、認識配列から9および13ヌクレオチド）。クラスＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼのその他の例としては、ＢｂｖＩ、ＳｆａＮＩおよびＡｌｗ２６Ｉ、ならびにSzybalski et al. (1991) Gene, 100, 13-26に記載されたその他のものが挙げられる。上記のように固体支持体を用いて、ｃＤＮＡの３’部分を次に精製した。ｃＤＮＡを次に256の分画に分け、そして異なるアダプターを各分画中の断片に結繋した。
【０１１３】
例えばＦｏｋＩ切断は、4つのヌクレオチド５’オーバーハングをもたらし、各オーバーハングは遺伝子特異的であるがしかし任意の塩基の組合せからなる。これら4つの位置における単一の考え得るヌクレオチド組合せを保有する一アダプターを各分画中に、即ち総計256のアダプターおよび分画を用いた。
【０１１４】
デオキシオリゴヌクレオチドの使用による一鎖上でのアダプターの化学的遮断により、所定のヌクレオチド組合せを保有するアダプターの、断片集団中の相補的ヌクレオチド配列との高特異的結繋を達成した。その結果、一方の鎖に関してのみ結繋を起こさせた。
【０１１５】
4つの塩基対オーバーハングを保有する単一鋳型を用いて、結繋の特異性を試験した。このオーバーハングと正確に相補てきであるか、あるいは1、2または3つの不適正を有するアダプターを設計した。アダプターを鋳型に結繋し、ＰＣＲを実施して、アダプター配列の各々から得られた生成物の相対量を査定した。
【０１１６】
上方の鎖の３’末端（ならびにＰＣＲ過程での干渉を防止するために下方鎖の３’末端でも）にデオキシヌクレオチドを含むことにより遮断されたアダプターに関して高特異性が達成される、ということが判明した。結果を図４に示す。配列ＧＣＣＧは、鋳型オリゴヌクレオチドの配列と正確に相補的である。この配列を保有する生成物の量は、１つまたは複数の不適正を有する配列を保有する生成物の量の約250倍である、ということが分かる。それゆえ結繋反応は高特異性を伴って進行する、ということが分かる。
【０１１７】
リン酸基が窒素基により置き換えられるオリゴヌクレオチドを下方鎖の５’末端に導入することにより化学的に遮断されたアダプターも結繋特異性を改善することが判明したが、しかし改善の程度は上記のアダプターの場合より低いことが判明した。
【０１１８】
さらに、高反応効率を付与する結繋条件を用いた（材料および方法に記載されているような）。
【０１１９】
再び固体支持体を利用して、次にｃＤＮＡを精製して、余分な非結繋アダプターを除去した。アダプター配列の定常部分と相補的な一ユニバーサルプライマーおよびポリＡ尾と相補的なものを用いて、256分画に関してＰＣＲを実施した。
【０１２０】
３’プライマーはオリゴｄＴであり、したがって元のｍＲＮＡのポリアデニル化配列と相補的であった。各プライマーを未知の配列に延びる塩基、グアニン、アデノシンまたはシトシンを用いて設計した（二次またはさらなる塩基が含まれ、グアニン、アデノシン、チミンまたはシトシンのいずれかである）。各ウエルに、3つの考え得る３’プライマーの混合物を投入した。これは、３’プライマーが常にポリメラーゼをポリＡ尾の最初に向けて、限定されたそして再現可能な断片長を生じる、ということを保証した。
【０１２１】
この第二のプロトコールの利点は、多数のフレーム中へのスリッティングが、ＰＣＲでなく結繋過程で起こり、ＰＣＲにおける高緊縮性不変的プライマーの使用を可能にする、という点である。これは、特異性および再現可能性の改善をもたらす。別の利点は、任意の4−塩基オーバーハングと適合性の256のアダプターの一組が、異なる配列を認識するがしかし依然として4塩基オーバーハングを生じるＩＩＳ型酵素を用いた多数の実験において再使用され得る、という点である。
【０１２２】
その結果生じたＰＣＲ産物を精製し、ＡＢＩプリズムキャピラリーシーケンサーに入れた。したがってＡＢＩプリズムとともに提供される検出器およびソフトウェアを用いて定量した各断片のサイズおよび蛍光により、発現遺伝子を表すＰＣＲ断片を分離した。
【０１２３】
ＡＢＩプリズムは4つの検出チャンネルを有するため、異なる蛍光を用いて、4つの別個のフレームを各反応容器中で適用し得る。4つの異なるユニバーサルフォーワードプライマー（５’末端）は、それらの間の非交差ハイブリダイゼーションを用いて設計されていた。これらのプライマーの使用は、256の反応を64に低減させた。代替的実施形態では、3つのプライマーおよび3つのアダプターを用いて、ＡＢＩプリズム中の1つのチャンネルがサイズ参照のために用いることを可能にする。反応の総数はその場合86である。
【０１２４】
オリゴｄＴプライマーのアニーリング温度を増大することも望ましい。これは、任意の配列を有する尾部を付加し（フォーワードプライマーのいずれかと交差ハイブリダイズしない）、オリゴｄＴを含有する長いプライマーを、任意配列と同一の、高融点を有する短いプライマーと混合することにより可能になった。次に低温で最初の数回のサイクルを実施し、この時点ではオリゴｄＴプライマーのみがアニーリングし、その後、全ての断片が付加された尾部を有した。これは次に、長い尾部が存在することによって、その後のサイクルを高温で実施させた（この時点では短いプライマーのみがアニーリングする）。このアプローチはＰＣＲの特異性を増大し、バックグラウンドを低減する。
【０１２５】
用いたプライマーの組合せは、各蛍光チャンネルおよび試料中の〜80ＰＣＲ産物という理論的平均をもたらす（所定の試料中で発現される20％の遺伝子および合計100,000個の転写体を基礎にして）。ＦｏｋＩ制限消化後に既知の遺伝子から生成されるポリアデニル化を含めた３’断片の統計学的サイズ分布の分析は、概算で67％が断片単独のフレームおよび長さに基づいて独自に同定され得る、ということを示した。同一プロトコールを用いるが、しかしＦｏｋＩ酵素を別の5塩基切断クラスＩＩＳ制限酵素に置き換えた付加的平行実験を用いると、理論的限界がゲノム中の全転写体の〜89％に、そして三次実験収率が〜99％に増大される。
【０１２６】
これらの数値は、実際には2つの実験において二重項として作動する遺伝子が、本発明に従って組合せアルゴリズムを用いてその二重項相手の少なくとも1つが発現されない（機会は96％）場合、依然として独特であると同定され得るため、概算値以下である。このそして同様の作用は、上記の計算では無視された。
【０１２７】
この分析における各断片に独特の情報、即ち9ヌクレオチド（例えばＦｏｋＩ認識配列および切断部位）およびキャピラリー配列から得られるポリアデニル化からＦｏｋＩ制限部位までのサイズを併合すると、各遺伝子断片（各々同一試料中のｍＲＮＡに独自に対応する）の同一性はそれゆえ、上記のような既知のポリＡ部位および／または仮想遺伝子を有するＲＮＡのデータベースとの比較により確立し得る。
【０１２８】
断片同定
試料に関する多数の独立したパターンに基づいた本発明の組合せアルゴリズムは、遺伝子同定に関する多数の利点を提供する。
【０１２９】
最初に、実施される実験数が多いほど、所定の遺伝子がそれらのうちの少なくとも1つにおいて一重項断片として作動し、したがって非多義的に同定され得る見込みが高い。所定の遺伝子が全ての実験において二重項として作動する場合でも、実験のうちの1つにおけるその二重項相手のうちの1つが別の実験において一重項として作動すべきであり、そこに存在しない場合には、それは依然として同定され得る。
【０１３０】
例えば遺伝子ＡおよびＢに対応する162 bpで実験Ｉにおける断片が存在し、ＡおよびＣに対応する36 bpに実験ＩＩにおける断片が存在する場合には、実験ＩにおいてはＣを調べ（それがそこで一重項として作動する必要がある場合、214 bpでと表示し、そしてそれが存在しない場合、即ち214 bpでピークでない場合には、Ｉにおいては162 bpでのピークがＡとして同定され得る）、そして実験ＩＩにおいてはＢを調べ得る。この簡単な手法は、2つの実験だけが実施された場合でも、非多義的に同定され得る遺伝子の数を大いに増大する。
【０１３１】
ＡＢＩプリズムキャピラリー電気泳動機からの概算誤差率を用いたコンピューターシミュレーションは、全遺伝子の85〜99％が、正常断片長誤差の存在下でも正しく同定され得る、ということを示す。
【０１３２】
第二に、これらの組合せアルゴリズムはともに、断片サイズまたは遺伝子３’末端長についての不確実性を克服するために用いられ得る。これは、試料から得られる断片ピーク数＋明らかに発現されないとして排除され得る遺伝子の数が候補遺伝子の総数（即ち生物体中の遺伝子数）より大きい限り、アルゴリズムは各断片に遺伝子を割り当てるのに成功する。数学形態のアルゴリズムに関しては、方程式の数が候補遺伝子のすうより大きい場合に、システムは解答され得る。
【０１３３】
したがって候補遺伝子数は、各断片に関する正しい候補を首尾よく選択する能力を失うことなく、ある点まで増大され得る。断片の長さが未知である場合、考え得る断片長の各々を有する断片との適正は、存在し得る遺伝子の一覧表に加えられ得る。同様に、データベース中の３’末端の位置が未知である場合には、断片により示される位置に３’末端を有する全ての遺伝子が、存在し得る遺伝子の一覧表に付加され得る。擬陽性は、上記の条件を満たすならば、アルゴリズムにより自動的にその後排除される。
【０１３４】
擬陽性を排除するシステムの力は、断片の数ならびに明確に存在しないとして排除され得る遺伝子の数の両方を増大するので、より多数の独立したプロフィールを実施することにより増大され得る。
【０１３５】
細分の最適数が確定され得る
反応を細分する目的は、多遺伝子に対応する断片ピークの数を提言するためである。
2つの因子：副反応の数および断片のサイズ分布：が二重項の数を確定する。
【０１３６】
最適サイズ分布は、検出方法によっている。キャピラリー電気泳動は、約500 bpまでの単一塩基対分解能を、その後は約0.15％分解能を有する。したがって広がりすぎる分布は有用でない。しかし狭い分布は、その場合、遺伝子が何がなんでも分解能を解明し得ない真の二重項（正確に同じ長さを有する）として作動し始めるため、同様に困難を示し得る。
【０１３７】
確率1/512で切断する酵素を用いて切断する場合に、長さｎの断片を見出す確率は、以下のように示される：
Ｐ1（ｎ）＝（511/512）n（1/512）
【０１３８】
反応が192の副反応に分けられる場合、所定の副反応において長さｎの断片を見つけ出す確率は、以下のように示される：
Ｐ2（ｎ）＝（511/512）n（1/512）（1/192）
【０１３９】
Ｍ個の考え得る遺伝子からの単一遺伝子に対応するこの断片の確率は、以下のように示される：
Ｐ独自（ｎ）＝Ｐ2（ｎ）（１−Ｐ2（ｎ））(M-1)
【０１４０】
言い換えれば、これは、一遺伝子がその長さの一断片を提供し、他の全てが提供しない確率である。
【０１４１】
単一実験において独自に同定され得る遺伝子の総数は、全検出可能長全体を合計することにより得られる。
【０１４２】
計器の不正確さを考慮に入れると、Ｐ独自は、以下のようになる：
Ｐ独自（ｎ）＝Ｐ2（ｎ）（（１−Ｐ2（ｎ））(M-1)）(1+2En)
（式中、Ｅは不正確さの大きさである）。これは、他の遺伝子が同一長＋／−因子Ｂを有さない場合、独自の遺伝子が同定され得る、ということを符号で表している。
【０１４３】
例えばヒトにおいて50 000個の遺伝子が存在する場合、われわれの計器は0.2％の誤差を有し、1000 bpまでの断片を検出し得るし、全ての配列の1/512を切断する酵素を用いてわれわれは切断して、192の副反応に細分し、次に、単一実験では独自に全遺伝子の56％を、2つの実験では80％、そして3つの実験では96％を同定し得る。
【０１４４】
Mathematicaにおいて、独自に同定可能な遺伝子の数は以下のように算定し得る：
Prob[n_]:=（511/512）^ｎ*1/512*1/192
Sum[50000* Prob[n]((1- Prob[n]) ^50000) ^1 + 0.002n,{n,1,1000}]*192
パラメーターを変えることにより、同定確率に及ぼす作用を迅速に観察し得る。
【０１４５】
上記のように、より多くの実験を実施する場合、より強力な組合せ同定法が用いられ得るが、しかしそれらは全て、増大数の単集合遺伝子から利益を得る。
【０１４６】
材料および方法
セクション１  −  ＩＩ型制限酵素を使用
総ＲＮＡからのｍＲＮＡの単離
純ｍＲＮＡがビーズに結合されるまで、オリゴテックスOligotexプロトコールに従って総ＲＮＡ20 μgからｍＲＮＡを単離し、洗浄して、清浄にする。回転沈降させて、20 μlの蒸留水中に再懸濁する。懸濁液は、0.5 mgのオリゴテックスを含有するはずである。反応物を2 x 10 μl中で細長断片化する。70℃で10分間加熱変性して、次に氷上で急冷する。以下のプロトコールの各々を用いて、一次鎖ｃＤＮＡを合成する：
【０１４７】
ＡＭＶを用いた一次鎖ｃＤＮＡ合成
一次鎖緩衝液を付加する：5 μlの5x ＡＭＶ緩衝液、2.5 μlの10 mMｄＮＴＰ、2.5 μlの40mMピロリン酸ナトリウム、0.5 μlのＲＮアーゼ阻害剤、2 μlのＡＭＶ  ＲＴ、2.5 μlの5 mg/mlＢＳＡ。
【０１４８】
42℃で60分間インキュベートする。総容積：25 μl（注：より多くの希釈オリゴテックス懸濁液を得るためには、100 μl中で実行するのがより良好であり得る）。
【０１４９】
ＡＭＶを用いた二次鎖ｃＤＮＡ合成
12.5 μlの10x ＡＭＶ二次鎖緩衝液（500 mMのトリス、ｐＨ7.2、900 mMのＫＣｌ、30 mMのＭｇＣｌ2、30 mMのＤＴＴ、5 mg/mlのＢＳＡ）、29 Uの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、1 UのＲＮアーゼＨを付加して、ｄＨ2Ｏで最終容積を125 μlとする。
14℃で2時間インキュベートする。
【０１５０】
制限酵素切断および脱リン酸化
オリゴテックス／ｃＤＮＡ複合体を回転沈降させて、1.8 μlの10x ＦｏｋＩ緩衝液、16.2 μlのＨ2Ｏ、2 μlのＦｏｋＩ、1 μの仔ウシ腸ホスファターゼ（次の過程における自己結繋を防止するために付着末端を脱リン酸化するために含まれる）中に再懸濁する。
37℃で1時間インキュベートする。
回転沈降させて、品質管理のために上清を除去する。
【０１５１】
ホスファターゼ不活性化
70 μlのＴＥを付加する。70℃に10分間加熱する。室温に冷却して、10分間放置する。
【０１５２】
結繋（ライゲーション）
2 μlの10x結繋緩衝液、100xアダプター、2 μlのリカーゼ中に再懸濁し、Ｈ2Ｏで20 μlとする。
室温で2時間インキュベートする。
回転沈降させて、10 mMトリス（ｐＨ7.6）で洗浄する。
【０１５３】
プライマーおよびアダプター設計
アダプターを以下に示す（５’−３’）。それは相補的である長い鎖と短い鎖からなる。長い鎖は、ＨａｅＩＩ酵素切断により生成されるＧＣＧＣ付着末端と相補的な4つの余分な塩基を有する。
5’-GTCCTCGATGTGCGC-3’（配列番号１）
5’-ACATCGAGGAC-3’（配列番号２）
５’プライマーは5’-GTCCTCGATGTGCGCWN-3’（配列番号３）（式中、ＷはＡまたはＴであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）である。最後の塩基に対応する蛍光色素で標識された8つの異なる５’プライマーが存在する。
【０１５４】
３’プライマーはＴ20ＶＮＮ（ここで、ＶはＡ、ＧまたはＣであり、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである）である。即ち、25のチミンとその後の3つの塩基が示される。48の異なる３’プライマーが存在する。
３’および５’プライマーの全ての組合せ、あるいは合計で384の組合せを用いる。５’プライマーを最後の塩基に関してプールし（即ち、4つの蛍光色素を同一反応で実行する）、合計96の反応を生じた。
プライマーの組合せを、96ウエルＰＣＲプレート中に予備分配する。
【０１５５】
ＰＣＲ増幅
768 μlのＰＣＲ緩衝液（緩衝剤、酵素、ｄＮＴＰ）中に再懸濁して、8 μlを、2 μlのプライマーミックス（4つの５’プライマーおよび1つの３’プライマー）／ウエルを含有する予備作製プライマー−プレートの各ウエルに付加する。
【０１５６】
ホットスタートタッチダウンＰＣＲを用いて、以下のように各分画を増幅する：
ホットスタート
70℃に加熱する
Ｔａｑポリメラーゼを付加する
10サイクル
94℃で30秒
60℃で30秒、各サイクルを0.5℃だけ下げる
72℃で1分
25サイクル
94℃で30秒
55℃で30秒
72℃で1分
最後に
72℃で5分
4℃に冷却
【０１５７】
タッチダウンランプアニーリング温度は、高くまたは低く調整される必要がある。反応は、プラトー期に達するまで進行するだけのはずである。25サイクルは調整される必要がある。
【０１５８】
キャピラリー電気泳動による定量
長いキャピラリーおよび長い試験時間を用いて、断片分析に関して設定されたＡＢＩプリズム3700に96ウエルプレートを載せる。出力は、検出された各ピークに関する断片長（塩基対）およびピーク高／面積の表である。
例えば、データベースを参照しながら上記と同様に、同定に向けて進行する。
セクション２  −  ＩＩＳ型制限酵素を使用
【０１５９】
ストレプトアビジンダイナビーズの調製（ビーズにオリゴ体を結合する）
200 μlのＢ＆Ｗ緩衝液（Dynabeads）中で200 μlのダイナビーズを洗浄し、次に400 μlのＢ＆Ｗ緩衝液中にビーズを再懸濁する。
400 μlのＨ2Ｏ中に1250 ｐｍｏｌのビオチンＴ２５プライマーを懸濁し、ビーズと混合する。室温で15分間インキュベートする。手短に回転し、次に600 μlの上清を除去する。ビーズを計量分配し、少なくとも30秒間、磁気上に置く。
ビーズを200 μlのＢ＆Ｗ緩衝液で2回洗浄し、次に200 μlのＢ＆Ｗ緩衝液中に再懸濁する。
【０１６０】
総ＲＮＡからのｍＲＮＡのビーズとの結合
200 μlの再懸濁ビーズを1.5 mlのエッペンドルフ管中に移す。少なくとも30秒間、磁気上に置く。上清を除去し、100 μlの結合緩衝液（20 mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ7.5；1.0 MのＬｉＣＬ；2 mMのＥＤＴＡ）中に再懸濁する。洗浄を反復し、100 μlの結合緩衝液中にビーズを再懸濁する。
〜75 μgの総ＲＮＡまたは2.5 μgのｍＲＮＡをＲＮアーゼ無含有水または10 mMトリス−ＨＣｌで100 μlに調整する。
ビーズを予熱ＲＮＡ溶液と十分に混合する。室温（ｒｔ）で3〜5分間回転するかまたはそうでなければ混合することにより、アニーリングする。少なくとも30秒間、磁気上に置く。200 μlの洗浄緩衝液Ｂ（10 mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ7.5；0.15 MのＬｉＣＬ；1 mMのＥＤＴＡ）で2回洗浄する。
【０１６１】
一次鎖合成
上記のように磁気を用いて、200 μlの1x ＡＭＶ緩衝液（Promega）で少なくとも2回ビーズを洗浄する。5 μlの5xＡＭＶ緩衝液；2.5 μｌの10 mMｄＮＴＰ；2.5 μｌの40 mMピロリン酸ナトリウム、0.5 μlのＲＮアーゼ阻害剤、2 μlのＡＭＶ  ＲＴ（Promega）、1.25 μlの10 mg/mlＢＳＡ；11.25 μlのＨ2Ｏ（ＲＮアーゼ無含有）（総容積25 μl）と一緒に混合する。
42℃で1時間インキュベートする。
【０１６２】
二次鎖合成
100 μlの二次鎖混合物（6.25 μlのトリス、ｐＨ7.5；11.25 μlの1 MＫＣｌ；15 μlのＭｇＣｌ2；3.75 μlのＤＴＴ；6.25 μlのＢＳＡ；1 μｌのＲＮアーゼＨ、3 μｌのＤＮＡｐｏｌＩ；53.5 μlのＨ2Ｏ）（総容積100 μl）を直接一次鎖反応物に付加する。
14℃で2時間、混合しながらインキュベートする。
【０１６３】
切断
ＴＥ（10 mMのトリス、1 mMのＥＤＴＡ、ｐＨ7.5）で2回、100〜200 μlのＮＥＢ緩衝液で2回、磁気上でビーズを洗浄する。30 μlのＮＥＢ緩衝液中に再懸濁する。
1 μlの適切なＩＩＳ型酵素を付加し、混合する。
37℃で1〜2時間インキュベートし、しばしば混合する。上記のように磁気を用いて1350 μl中でＴＥで3回、次に1350 μlの結繋緩衝液で2回洗浄する。
リガーゼ酵素を含有する1606 μlの2xリガーゼ緩衝液中に再懸濁する。
【０１６４】
アダプター・ライゲーション（256の異なる容器中）
総容積10 μlに対して4 μl  中に30 pmolのアダプターを含有する256のウエル中に6 μl切断鋳型／ウエルを分取する。混合しながら37℃で1時間インキュベートする。ＴＥ80 μl中で2回洗浄し、20 μｌのＨ2Ｏ中に希釈する。
アダプターおよびプライマー設計
これらの実施態様におけるアダプターを以下に示す（５’−３’）。各対は相補的である短い鎖と長い鎖からなる。長い鎖は、ＦｏｋＩ切断により生成される付着末端と相補的な4つのヌクレオチドを有する（4x4x4x4の合計＝256の考え得るアダプター）。
【０１６５】
上方の短いほうの鎖の標識化バージョンも、フォワードＰＣＲプライマーとして役立つ。
【０１６６】
5’-CCAAACCCGCTTATTCTCCGCAGTA-3’（配列番号４）
5’-NNNNTACTGCGGAGAATAAGCGGGTTTGG-3’（配列番号５）
【０１６７】
5’-GTGCTCTGGTGCTACGCATTTACCG-3’（配列番号６）
5’-NNNNCGGTAAATGCGTAGCACCAGAGCAC-3’（配列番号７）
【０１６８】
5’-CCGTGGCAATTAGTCGTCTAACGCT-3’（配列番号８）
5’-NNNNAGCGTTAGACGACTAATTGCCACGG-3’（配列番号９）
【０１６９】
アダプターの各々を一方の鎖上で遮断する。これは、以下に示すように、デオキシ（ｄｄ）オリゴヌクレオチドを用いて、３’末端で上方鎖を遮断することにより達成され得る。
【０１７０】
5’(OH)-CCAAACCCGCTTATTCTCCGCAGTddA-3’（配列番号４）
5’(P)-NNNNTACTGCGGAGAATAAGCGGGTTTGG-(OH)3’（配列番号５）
【０１７１】
5’(OH)-GTGCTCTGGTGCTACGCATTTACCddG-3’（配列番号６）
5’(P)-NNNNCGGTAAATGCGTAGCACCAGAGCAC-(OH)3’（配列番号７）
【０１７２】
5’(OH)-CCGTGGCAATTAGTCGTCTAACGCddT-3’（配列番号８）
5’(P)-NNNNAGCGTTAGACGACTAATTGCCACGG-(OH)3’（配列番号９）
【０１７３】
あるいは遮断は、下方鎖の５’末端のリン酸基を窒素、ヒドロキシルまたはその他の遮断部分で置き換えることにより達成され得る。
【０１７４】
リバースプライマーを以下に示す：
5’-CTGGGTAGGTCCGATTTAGGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’（配列番号１０）
5’-CTGGGTAGGTCCGATTTAGGC-3’（配列番号１１）
ここで、3つの長いリバースプライマーの全体に関して、Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧである。
【０１７５】
ユニバーサルＰＣＲ
18 μlのＰＣＲ緩衝液（緩衝剤、酵素、ｄＮＴＰ、3つのユニバーサルアダプタープライマー、アンカー化オリゴ−Ｔプライマー）を付加する。
【０１７６】
各分画を以下のように増幅する：
ホットスタート
加熱する
Ｔａｑを70℃で付加する（または熱活性化Ｔａｑを用いる）
2サイクル
94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で1分
25サイクル
94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で1分
最後に
72℃で5分、4℃に冷却
【０１７７】
キャピラリー電気泳動による定量
長いキャピラリーおよび長い試験時間を用いて、断片分析に関して設定されたＡＢＩプリズム3700に96ウエルプレートを載せる。出力は、検出された各ピークに関する断片長（塩基対）およびピーク高／面積の表である。
【０１７８】
【化１】
2005515790.tif 000003
【０１７９】
【化２】
2005515790.tif 000004
【０１８０】
【化３】
2005515790.tif 000005
【０１８１】
【化４】
2005515790.tif 000006
【０１８２】
【化５】
2005515790.tif 000007
【０１８３】
【化６】
2005515790.tif 000008
【０１８４】
【化７】
2005515790.tif 000009
【０１８５】
【化８】
2005515790.tif 000010
【０１８６】
【化９】
2005515790.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は、ポリアデニル化部位の発見を包含する本発明の一実施形態を例示する。2つの候補ポリ（Ａ）部位を有する遺伝子を仮定し、そして3つの異なる酵素による制限酵素切断によりこの場合生成される3つの遺伝子プロフィールを仮定すると、候補ポリ（Ａ）部位に対応するピークの出現は、それらの存在に関する直接実験証拠を提供する。
【図２】図２は、ＩＩ型制限酵素（ＨａｅＩＩ）を用いた、試料中の転写ｍＲＮＡに関するシグナルの生成へのアプローチを略記する。
【図３】図３は、ＩＩＳ型制限酵素（ＦｏｋＩ）を用いた、試料中の転写ｍＲＮＡに関するシグナルの生成へのアプローチを略記する。
【図４】図４は、一鎖上で遮断されたアダプターに関する結繋の特異性を査定する実験の結果を示す。4つの塩基対一本鎖オーバーハングを有する単一鋳型オリゴヌクレオチドを用い、これと精確に相補的な、あるいは1、2または3つの不適正を伴う一本鎖化領域を有するアダプターを設計した。アダプターを鋳型オリゴヌクレオチドに結繋し、生成物をＰＣＲを用いて増幅した。
【図５】図５は、試料中に存在する転写ｍＲＮＡ分子に対応する遺伝子断片に関するシグナルの生成を略記する。過程Ｉ〜ＶＩＩを以下に示す：  過程Ｉでは、ｍＲＮＡが、オリゴ−ｄＴ尾を保有する磁気ビーズ上に捕捉される。  過程ＩＩでは、相補的ＤＮＡ鎖が合成され、依然としてビーズに結合される。  過程ＩＩＩでは、ｍＲＮＡが取り出され、二次ｃＤＮＡ鎖が合成される。二本鎖ｃＤＮＡは、ビーズに共有結合されたままである。  過程ＩＶでは、二本鎖ｃＤＮＡが2つの別個のプールに分割される。各プールは、異なる制限酵素で消化される。ｍＲＮＡの３’末端に対応するｃＤＮＡの配列は、ビーズに結合されたままである。  過程Ｖでは、アダプターがｃＤＮＡの消化末端に結繋される。本発明のこの実施形態では、256個の異なるアダプターが256の別個の反応において結繋される。さらにまた本発明のこの実施形態では、他方の鎖からのみＰＣＲが進行するよう、アダプターが一方の鎖上で遮断される。  過程ＶＩでは、分画の各々が単一ＰＣＲプライマー対を用いて増幅される。  過程ＶＩＩでは、ＰＣＲ産物がキャピラリー電気泳動に付される。これは、プールの各々に関するシグナルの個別パターンまたは組を、即ち、一次および二次の異なる制限酵素の各々によるｃＤＮＡの消化により提供される遺伝子断片の一次および二次集団を生じる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005515790.tif 000018
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