(57)【要約】【課題】過敏症疾患等の免疫系疾患の予防及び治療に有効な免疫寛容ペプチドを提供する。【解決手段】  促進処理することなく（すなわち、アピトープである）、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合でき、特にミエリン塩基性タンパク質ペプチド（１３１−１４８、１３５−１４９、１３６−１５０、１３７−１５１、１３８−１５２、１３９−１５３、１４０−１５４）から選ばれるアピトープを提供する。また、そのようなペプチドを疾患の治療及び／又は予防に利用する方法、並びに疾患の治療及び／又は予防を目的とした製薬構造体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
促進処理することなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合可能であり、かつミエリン塩基性タンパク質の残基１３１−１５８の一部を含むペプチド。
【請求項２】
最小エピトープ１４２−１５２及び／又は最小エピトープ１４０−１４８からなることを特徴とする請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ミエリン塩基性タンパク質ペプチドは、１３４−１４８，１３５−１４９，１３６−１５０，１３７−１５１、１３８−１５２、１３９−１５３，及び１４０−１５４から選択されることを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド。
【請求項４】
疾患の治療及び／又は予防に使用されることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
上記疾患には多発性硬化症が含まれることを特徴とする請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
少なくとも１又はそれ以上を用いて製薬構造体が構成されることを特徴とする請求項１乃至請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
上記請求項１乃至請求項５に記載のペプチドを被験体に投与するステップを含む疾患の治療及び／又は予防方法。
【請求項８】
上記請求項１乃至請求項５に記載のペプチドを疾患の治療及び／又は予防に使用する医薬製品に利用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミエリン塩基性タンパク質に由来するペプチドに関し、特に、ミエリン塩基性タンパク質の残基１３１−１５８を含むペプチド、及びこれらのペプチドを疾患の治療及び／又は予防に使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
適応免疫反応において、Ｔ型リンパ細胞は、タンパク質抗原の内部エピトープを認識できる。抗原細胞（以下、ＡＰＣという。）は、タンパク質抗原を抽出して（take up）、短いペプチドの断片に減成する。ペプチドは、細胞内の主要組織適合抗原複合体（以下、ＭＨＣという。）クラスＩ又はＩＩ分子に結合し、細胞表面に運ばれる。ＭＨＣ分子と合接する細胞表面が存在すると、ペプチドは、Ｔ細胞（Ｔ細胞受容体（以下、ＴＣＲという。）を介して）によって認識される。この場合、ペプチドがＴ細胞のエピトープである。
【０００３】
Ｔ細胞エピトープは、侵入した抗原に対してであろうと、体内の抗原に対してであろうと、あらゆる抗原に対する適合免疫反応において中心的な役割（central role）を果たす。過敏症（アレルギー、自己免疫性疾患、移植拒絶反応を含む）において、Ｔ細胞によってなされる中心的な役割が実験的モデルを使用することによって証明されつつある。（Ｔ細胞エピトープの構造に基づく）合成ペプチドをアジュバンド（免疫助成剤）と組み合わせて投与することで、炎症やアレルギー疾患を誘発することができる。
【０００４】
これとは対照に、可溶性のペプチドエピトープを投与することによって、特定のペプチドエピトープに対して免疫寛容性を誘発できることが証明されている。可溶性ペプチド抗原を投与することは、経験的な自己免疫疾患の脳脊髄炎（ＥＡＥ−多発性硬化症（ＭＳ）のモデル）（Metzler and Wraith （1993） Int. Immunol. 5: 1159-1165; Liu and Wraith （1995） Int. Immunol. 7: 1255-1263; Anderton and Wraith （1998） Eur. J. Immunol.28: 1251-1261）、経験的な関節炎、糖尿病、uveoretinitis（上記Anderton and Wraith （1998）に記載されている。）において疾患を抑制する効果的な手法として示されている。これはまた、進行性のＥＡＥ疾患に対する治療手法として示されている（上記Anderton and Wraith（1998））。
【０００５】
免疫寛容ペプチドを病気の予防や治療に使用することは、大いに注目すべき点である。その理由は、特定の免疫寛容エピトープが同一組織内の個々の抗原に対するＴ細胞の応答を抑制できることが示されたことである。この現象は、「バイスタンダ抑制（bystander suppression）」として知られている。このバイスタンダ抑制とは、特定の免疫寛容ペプチド（上記Anderton and Wraith（1998）に示される。）を用いることによって、与えられた抗原に対して少なくとも１つ以上のエピトープ（好ましくは全てのエピトープ）、及び与えられた疾患に対して少なくとも１つ以上の抗原に寛容を誘発することができることを意味している。これは、特定の疾患において全ての病原性抗原を識別する必要性を不要にするものである。
【０００６】
ペプチドはまた、比較的低コストである点、及びペプチド類似物から免疫学的属性を変更したものを生産することができる点で、治療の有用なオプションである。このようにペプチドは、相互作用を変化させるために、ＭＨＣ（major histocompatability complex：主要組織適合抗原複合体）とＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）のどちらが変更されてもよい。
【０００７】
この研究において考えられる問題点の１つは、全てのペプチドが寛容を誘発できるＴ細胞エピトープとして作用するわけではないことが説明されていることである。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）ペプチド８９−１０１は、免疫化の後の優性免疫抗原であって、またＴ細胞の反応性を発現及びＥＡＥの誘導に対して非常に効果的な免疫原である。ところが、このペプチドは、溶液にて投与した場合、寛容を誘導する効果がないことが証明されている（上記Anderton and Wraith（1998）に示されている）。
【０００８】
寛容を誘発するＴ細胞の機能に関して、観察されたヒエラルキーに基づく多くの説明がなされている（例えば、上記Anderton and Wraith（1998）に記載されている。）。特に、ＭＨＣに対するペプチドの類似性と免疫寛容（上記Liu and Wraith（1995）に記載されている。）との相関関係があることが説明されている。しかし、観察結果のなかには、一致しないものもある。例えば、ＭＢＰ［８９−１０１］は、免疫寛容ではないが、比較的高い親和性をもってＩ−Ａｓに結合する。このように、ペプチドが免疫寛容を誘発することは直感的に予想できない。
【０００９】
本発明の発明者らは、ペプチドエピトープが抗原処理していない未発達のＡＰＣによって提供される適切なサイズであるとき、このエピトープが免疫学的寛容を誘導し得るということを示してきた（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０１／０３７０２）。Ｔ細胞エピトープのなかには寛容なものもあり、寛容を誘導できないものもあるという知見は、いくつかのエピトープがＭＨＣ分子によって提供されるようになる前段階で促進処理が必要であるという事実によって説明できる。これら促進処理が必要なエピトープは、溶液状態で投与されたときには寛容を誘導しないが、免疫助成剤（アジュバンド）とともに投与されると疾患を誘導することができる。
【００１０】
促進処理を必要としないエピトープは寛容を誘導できる。このようなエピトープは、発明者らによって「アピトープ（抗原処理独立エピトープ：Antigen Processing Independent epiTOPES）」と表現されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の発明者らは、ＭＢＰの残基１３１−１５８を試験して、抗原提示細胞をＴ細胞に固定することによってもたらされる多くのペプチドを発見した。これらのペプチドは、促進処理することなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩに結合できるということから、アピトープとして定義される。
【００１２】
第１の見地として、本発明は、ミエリン塩基性タンパク質の残基１３１−１５８の一部を含むアピトープを備えている。
【００１３】
本発明の発明者らは、また、特定Ｔ細胞分枝系によって見分けることができる残基中の２つの最小エピトープを確認してきた。ペプチドは、これらＭＢＰ１４２−１５２及び１４０−１４８であるエピトープの一方又は両方からなっていてもよい。
【００１４】
本発明の実施例としては、ペプチドは、ミエリン塩基性タンパク質ペプチド：１３４−１４８、１３５−１４９、１３６−１５０、１３７−１５１、１３８−１５２、１３９−１５３、１４０−１５４から選択されることが好ましい。
【００１５】
第２の見地として、本発明は、発明の第１の見地に関連する少なくとも１又はそれ以上のペプチドからなる製薬構造体を提供する。
【００１６】
第３の見地として、本発明は、発明の第１の見地に関連するペプチドを被験体に投与するステップを含む疾患の治療及び／又は予防方法を提供する。
【００１７】
また本発明は、疾患の治療及び／又は予防に使用するための医薬製品に、発明の第１の見地に関するペプチドを利用するものである。特に、本発明に係るペプチドは、多発性硬化症の治療及び予防に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
第１の見地として、本発明はペプチドに関する。
【００１９】
ペプチド
「ペプチド」という語は、典型的なＬ−アミノ酸や、隣接するアミノ酸のカルボキシル基とα−アミノ酸との間のペプチド結合によって典型的に互いに結合した一連の残基を表す通常の意味で使用されている。また、この語は、変性ペプチド及び合成ペプチド類似物を含む。
【００２０】
本発明に係るペプチドは、促進処理することなくＭＨＣのクラスＩ又はＩＩに結合できれば、如何なる長さであってもよい。
【００２１】
ＭＨＣのクラスＩ又はＩＩ分子の分子長は、典型的には、７〜１３のアミノ酸からなり、より一般的なものは８〜１０のアミノ酸からなる。ペプチド結合は、全ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝において、ペプチド主鎖の原子と不変部位との間の接触によって両端にて安定化されている。ペプチドのカルボキシ末端とアミノ末端との結合溝の両端には不変部位がある。ペプチド長の変動は、ペプチド骨格において起こる縺れ、またしばしば柔軟性をもったプロリン又はグリシン残基にて起こる縺れによって決まる。
【００２２】
ＭＨＣのクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、典型的には８〜２０個のアミノ酸長であり、より一般的なのは１０及び１７個のアミノ酸長であるが、これより長くもなり得る。これらのペプチドは、両端がオープンになったＭＨＣＩＩペプチド結合溝にそって伸張された構造になっている（ＭＨＣクラスＩペプチド結合溝とは異なる。）ペプチドは、主に、ペプチド結合溝に沿った保護残基に接した主鎖原子によって規制されている。
【００２３】
本発明に係るペプチドは、化学的方法を用いて生成されてもよい（Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky , Springer-Verlag, Berlin.）。例えば、ペプチドは、固相法によって合成することができ（Roberge JY et al （1995) Science 269: 202-204）、樹脂から割削され、高性能液体クロマトグラフィによって精製できる（e. g., Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。例えば、ＡＢＩ  ４３  １  Ａペプチド合成装置（Perkin Elmer）を用いて製造業者から提供された指示にしたがって自動的に合成してもよい。
【００２４】
またペプチドは、組み換えによって、或いは長鎖のポリペプチドから分割生成されてもよい。例えば、ペプチドは、ミエリン塩基性タンパク質から分割生成される。ペプチドの合成は、アミノ酸解析又は配列決定法（例えば、エドマン分解法：Edman degradation procedure）により確立されている。
【００２５】
本発明に係るペプチドは、ＭＢＰの残基１３１−１５８誘導される。好ましくは、本発明に係るペプチドは、ＡＰＣによる抗原の天然処理によって帰因する抗原断片から誘導される。
【００２６】
ペプチドは、このほかにも実践的な目的に使用される様々な特性がある。例えば、ペプチドは、生体における許容濃度で可溶でなくてはならない。好ましくは、ペプチドは、最高でも０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶でなくてはならない。より好ましくは、ペプチドは、最高でも１ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶でなくてはならない。最も好ましくは、ペプチドは、最高でも５ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶でなくてはならない。
【００２７】
鼻腔投与における服用量の最大値は、最新の方法では、鼻腔あたり約２００ｐｌである。仮にペプチドが１ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶であれば、各鼻腔に２服することで８００μｇが患者に投与される。一回の服用が５ｍｇを超えることは、例外的である。
【００２８】
また、ペプチドが治療に有効であるためには、体内で十分に安定していることも重要である。発明者らは、体内で投与後３０分経過して、試験ペプチドの全量が５０％に低下し、投与後４時間経過して、ペプチド量が約３０％に低下することがわかった。しかし、５日経過後にも依然として検出可能な程度含まれる（約５％）ことがわかった。体内におけるペプチドの半減期は、少なくとも１０分程度は必要であり、好ましくは３０分、より好ましくは４時間、更に好ましくは２４時間である。
【００２９】
本発明の発明者らは、ペプチドを鼻腔内へ投与すると流出するリンパ節が投与後約４時間経過後に最大値となるが、５日経過後もペプチドが依然として検出される（最大約５％程度のレベルで）ことを見出した。ペプチドは、流出するリンパ節に長期間に亘って治療効果を発揮できる治療活性濃度で十分に安定していることが好ましい。
【００３０】
ペプチドはまた、体内で良好な生物学的利用能を示さなくてはならない。ペプチドは、体内で、障害なく細胞表面にてＭＨＣ分子に結合できる構造を保持しなくてはならない。
【００３１】
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）
ＭＢＰは、すでに特徴付けがされ配列されたミエリン（Rothら（1987）J. Neurosci. Res. 17（4）321-328 ; Accession number M30516）に由来する抗原である。
【００３２】
本発明に係るペプチドは、ＭＢＰ残基１３１−１５８から誘導される。
【００３３】
本発明に係るペプチドは、好ましくは残基中における１又は複数の最小Ｔ細胞エピトープである。またはこれら最小Ｔ細胞エピトープからなる。例えば、最小エピトープとしてはＭＢＰ１４２−１５２又は１４０−１４８である。
【００３４】
また、好ましくは、このペプチドは、以下に示すミエリン塩基性タンパク質ペプチド群から選択される。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
抗原処理独立エピトープ（アピトープ）
本発明に係るペプチドは、促進処理することなくＭＨＣクラスＩ又はＩＩ分子に結合できる（ペプチド結合溝において）。このようなペプチドは、本報では、塔Aピトープ煤i抗原処理独立エピトープ：Antigen Processing Independent epiTOPES）として知られている。
【００３７】
与えられた抗原から誘導されたペプチドの細胞表面提示は、不規則ではなく、頻繁に生じる少量のエピトープによって支配されている傾向がある。特異なペプチドの優性は、多くの因子、例えば、ＭＨＣ分子を結合するための相対親和度、ＡＰＣ内におけるジェネレーションの空間的時間的位置、及び分解耐性に依存する。抗原のためのエピトープヒエラルキ−は、免疫反応の進行とともに変化し得る。そして、このエピトープヒエラルキ−の変化は、自己寛容性及び自己免疫性に対して重要な影響を及ぼす。免疫優性決定残基は、良好な免疫寛容原であると思料される。本具体例において、本発明に係るアピトープは、優性エピトープに基づいている。
【００３８】
しかし、免疫優性ペプチドに対する初期免疫反応の後、エピトープの「拡散」が亜優性決定基を生じる（Lehmannらによって示されている。（（1992) Nature 358: 155-157））。亜優性エピトープの提示は、自己免疫性のトリガとして重要である。本発明に係るアピトープは、副優性エピトープに基づいてもよい。
【００３９】
与えられる如何なる抗原に対して、陰性アピトープが存在していてもよい。陰性エピトープは、全ての抗原として投与されたときには、Ｔ細胞反応を生成することができないが、ペプチドとして投与されたときには、Ｔ細胞反応を刺激することができる。ＡＰＣ内のペプチド中の抗原の処理中に、陰性エピトープが分解される。
【００４０】
陰性エピトープは、生体外にてエピトープとして働き、促進処理することなくＭＨＣ分子に結合でき、更に陰性エピトープを認識するＴ細胞にアネルギーを誘発する。しかし、このようなアピトープは、天然で処理された抗原のエピトープを認識し免疫寛容性がないＴ細胞でなくてはならないため、治療には使用できない。
【００４１】
抗原に対するエピトープは、ＡＰＣによって提示されるとき、全抗原（下記参照。）に亘って重複するペプチドに対するＴ細胞反応を測定することによって同定することができる。この研究により、ペプチドの「入れ子型対（nested sets）」が明らかになる。また、特定のＴ細胞系及びＴ細胞分枝系（Ｔ細胞クローン）に対する最小エピトープは、切断されたペプチド（truncated peptides）の反応を測定することによって評価できる。
【００４２】
抗原における最小エピトープがアピトープのように作用するとは仮定できない。最小エピトープのアミノ酸側面がＭＨＣへの最適な結合のためには必要であると思われる。アピトープは、異なるＴ細胞クローンの最小エピトープ間に微妙な相違があってもよいように設計されている必要がある。
【００４３】
全てのエピトープに対応するアピトープを同定できない点は、強調すべきである。エピトープのなかには、エンドゾームに付加したＭＨＣに付随する方法でＭＨＣに結合するものもあるという明確な証拠がある。したがって、Ｖｉｎｅｒらによって示されたプロセスを必要とする（（1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 2214-2218)）。これが、最小エピトープの個々が必ずアピトープのように作用すると仮定できないもう１つの理由である。
【００４４】
Ｔ細胞エピトープを含むペプチドの同定
与えられた抗原に含まれるＴ細胞エピトープを同定する技術には、多くの方法が知られている
天然処理されたエピトープは、抗原含有ＡＰＣから溶離されたペプチドの重量分光光度分析によって同定される。ＡＰＣは、特定遺伝子を転換することによって抗原を取り上げる（take up）ことを促進させるか、又は細胞内タンパク質を生成させる。典型的なＡＰＣは、溶液中又はＡＰＣ細胞表面に対して十分にターゲットされたタンパク質とともに培養される（温置される）。３７℃での温置の後、細胞を洗浄し、クラスＩＩタンパク質は、例えば、親和クロマトグラフィにより精製される。最適な化学的培地（例えば、酸性雰囲気下）を用いてＭＨＣを精製操作すると、ＭＨＣからペプチドが溶出する。このペプチド給源を分離し、同様に処理されたコントロールＡＰＣ由来のペプチドと性質を比較する。タンパク質を表す又はタンパク質から与えられる細胞の特徴ピークを（例えば、重量分光測定により）解析し、ペプチド断片を同定する。この手法により、通常、抗原処理によって特定の抗原から得られるペプチドの部位（通常、「入れ子型対（nested sets）」として確認される）についての情報が得られる。
【００４５】
エピトープのほかの同定方法には、試験管試験（生体外試験）にて、ペプチドの抗原鎖との重複と分布の分類を合成し測定する方法がある。例えば、ペプチド鎖内には１５のアミノ酸があり、５又は１０のアミノ酸が重複して使用されている。ペプチドは、抗原提示細胞及びＴ細胞を含む抗原提示系でテストされる。例えば、抗原提示系は、ラットの脾細胞（murine splenocyte）から用意し、ヒト細胞はＰＢＭＣ又は扁桃腺から用意する。若しくは、抗原提示系は、特定のＴ細胞系又はＴ細胞分枝系、及び／又は特定の抗原提示細胞タイプを含む。
【００４６】
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞培養（例えば、３Ｈ−チミジン取込）又はサイトカイン（cytokine）産生を媒介として測定される。ＴＨ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ試験のような一般的な手法によって検出されるＩＦＮγ産生を介して測定される。
【００４７】
重複するペプチドを調べると、通常、エピトープが検出された抗原部位がわかる。特定のＴ細胞に対する最小エピトープは、切断されたペプチド（truncated peptides）への反応を測定することによって評価できる。例えば、重複集合において残基１−１５を含むペプチドが含まれる反応が得られれば、両端が切断されたペプチドが含まれ（例えば、１−１４、１−１３、１−１２、２−１５、３−１５、４−１５等）、これは最小エピトープの同定に用いることができる。
【００４８】
抗原処理独立提示系（Antigen Processing Independent Presentation Systems：ＡＰＩＰＳ）
エピトープが同定できれば、次の段階は、このエピトープがアピトープとして機能するか否かを調べることである。
【００４９】
アピトープは、抗原処理に対する必要性に関係なくＴ細胞に提示されなくてはならない。アピトープは、Ｔ細胞エピトープを含む同定されたペプチドをもち、自由系処理を用いて同定することができる。切断されたペプチド及びペプチド類似体は、抗原処理独立提示系（Antigen Processing Independent Presentation Systems：ＡＰＩＰＳ）を使用して活性をテストすることができる。
【００５０】
ＡＰＩＰＳの例としては、以下が含まれる。
ａ）固定ＡＰＣ（ＣＤ２８に対する抗体をもつもの又はもたないもの）。
ｂ）ＭＨＣ分子クラスＩ又はＩＩを含む脂質膜（ＣＤ２８に対する抗体をもつもの又はもたないもの）。
ｃ）平面結合構造にある精製された天然又は組換型のＭＨＣ（ＣＤ２８に対する抗体をもつもの又はもたないもの）。
【００５１】
例えば、切断されたペプチドに対する応答を測定することによってポリペプチド内の最小エピトープを調査する研究では、Ｔ細胞の応答を調べるために固定ＡＰＣを使用することが知られている（Fairchild et al （1996) Int. Immunol. 8: 1035-1043）。ＡＰＣは、例えば、ホルムアルデヒド（通常パラホルムアルデヒド）又はグルタルアルデヒドを用いて固定できる。
【００５２】
脂質膜（平面膜又はリポソーム）としては人工脂質を用いるか、又はＡＰＣ由来の形質膜／ミクロソーム断片を用いる。
【００５３】
使用に際してＡＰＩＰＳは、組織培養プレートの培養床に適用されてもよい。ペプチド抗原が付加されると、ペプチド抗原は、選択されたＴ細胞系又はＴ細胞クローンの付加によって検出されたＡＰＩＰＳのＭＨＣ部分にペプチドを結合する。Ｔ細胞系又はＴ細胞クローンの活性化は、例えば、３Ｈ−チミジン取込又はサイトカイン分泌を介するような、既知の如何なる方法によって測定されてもよい。
【００５４】
免疫寛容（Tolerance）
本発明に係るペプチドは、抗原であるＭＢＰにとってのアピトープであるとき、ＭＢＰへの免疫寛容を誘発することができる。
【００５５】
本報では、「寛容原性の（tolerogenic）」という語を免疫寛容を誘発することができる、との意味として用いる。
【００５６】
免疫寛容とは、抗原への応答に失敗することである。自己抗原への免疫寛容は、免疫系の特徴としては不可欠であって、この自己抗原が失われると自己免疫疾患が起こる。適応免疫系は、自身の組織内に含まれる自己抗原の自己免疫攻撃を避ける一方で、膨大な種類の伝染病媒介物に対する適応性を維持しなければならない。これは、胸腺（免疫寛容の中核（Central tolerance））でのプログラム細胞死（apoptotic cell death）への早熟なＴ細胞の感応性によってほとんど制御されている。ところが、全ての自己抗原が胸腺にて検出されるわけではないため、自己反応胸腺細胞の細胞死は、不完全のままである。そのため、末梢組織（末梢免疫寛容）において、成熟した自己反応Ｔ細胞によって獲得された免疫寛容のメカニズムがある。中核及び末梢の免疫寛容のメカニズムに関する報告がアンダーソン等により与えられている（Immunological Reviews 169:123-137）。
【００５７】
免疫寛容は、少なくともＣＤ４＋Ｔ細胞の一部でのアネルギー誘発によって特徴付けられ、またそれによって生じるものである。Ｔ細胞を活性化するためには、ペプチドは、Ｔ細胞に対して２つの信号を送達できる「プロフェッショナル」ＡＰＣと結合されなければならない。第１の信号（シグナル１）は、ＡＰＣ表面のＭＨＣペプチド複合体によって送達される。第２の信号（シグナル２）は、ＡＰＣ表面のＣＤ８０、ＣＤ８６のような共刺激分子（costimulatory molecules）によって送達され、Ｔ細胞表面のＣＤ２８によって受け取られる。Ｔ細胞がシグナル２を受けることなくシグナル１を受け取ったときＴ細胞は活性化されず、アネルギーな状態になる。アネルギーなＴ細胞は、連続的な抗原投与（antigenic challenge）に対して免疫性があり、他の免疫反応を抑制できる可能性がある。アネルギーなＴ細胞は、Ｔ細胞の免疫寛容の介在に関与していると考えられる。
【００５８】
ペプチドは、成熟した抗原提示細胞によって操られるべきものであるから、ペプチドがＭＨＣ分子に結合された状態になる前に要求する処理は、免疫寛容を誘発しないと、本願発明の発明者らは予測している。成熟した抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞）は、抗原処理できるが、シグナル１及びシグナル２がＴ細胞に送達してＴ細胞を活性化することはできない。一方、エピトープは、未熟なＡＰＣ表面にあるクラスＩＩのＭＨＣに結合することができる。このように、エピトープは、共刺激分子なしでＴ細胞に与えられ、アネルギーなＴ細胞及び免疫寛容を誘発する。
【００５９】
当然のことながら、エピトープはまた、成熟したＡＰＣの細胞表面のＭＨＣ分子に結合できるが、免疫系は、成熟したＡＰＣ以上に大量の未熟なＡＰＣを含んでいる（樹状細胞の１０％以下が活性化されている点がＳｕｍｍｅｒｓらにより示唆されている（（2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295）。）。したがって、エピトープの初期状態（default position）は、活性化というよりはアネルギー又は寛容である。
【００６０】
免疫寛容がペプチドの吸引によって誘発されるとき、特定ＣＤ４＋抗原の増殖が減少される。また、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γの生成及びこれら細胞によるＩＬ−４の生成は抑制されるが、ＩＬ−１０の生成は増加する。ペプチド移入されて寛容状態にあるハツカネズミにおけるＩＬ−１０の中立作用（neutralisation）によって、病気に対する感受性が完全に回復されることを示している。調節細胞の個数は、ＩＬ−１０及び中間免疫制御を生じる寛容状態によることが示されている（Burkhartらによる。（（1999) Int. Immunol. 11: 1625-1634））。
【００６１】
寛容性の誘発は、以下の操作を含む種々の手法によって観察することができる。
（ａ）生体内でペプチドがターゲットエピトープとなっている疾患を生じさせるために感受性を低下させる
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアネルギーの誘発（体外にて抗原を連続投与することによって検出される。）
（ｃ）以下、ｉ，ｉｉ，ｉｉｉによってＣＤ４＋Ｔ細胞の個数を変化させる。
（ｉ）培養における減数
（ｉｉ）ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の生成におけるダウンレギュレーション
（ｉｉｉ）ＩＬ−１０産生の増加
【００６２】
標的疾患
本発明に係るペプチドは、疾患の治療及び／又は予防に利用することができる。
【００６３】
本発明に係るペプチドは、特に、多発性硬化症（ＭＳ）の治療及び／又は予防に有効である。多発性硬化症（ＭＳ）は、ＣＮＳ白質に散在的に播種された多発性脱髄性障害によって特徴付けされる慢性の炎症性疾患であって、あらゆる部位及び時点にて発症する（McFarlin and McFarland, 1982 New England J. Medicine 307: 1183-1188 and 1246-1251）。ＭＳは、自己反応性Ｔ細胞によって引き起こされると考えられる。
【００６４】
動物では、ＭＢＰは免疫原性であり、ＭＢＰ特性Ｔリンパ球は、脳炎誘発性活性をもっている（Segalら 1994 J. Neuroimmunol. 51: 7-19、Voskuhlら 1993 J. Neuroimmunol 42: 187-192、また、Zamvilら 1985 Nature 317: 355-8）。
【００６５】
製薬構造体
第２の知見として、本発明は、発明の第１の知見として述べたペプチドの１又は複数を用いてなる製薬構造体に関する。この製薬構造体は、またＭＢＰ又は異なる抗原のほかの残基に由来する１又は複数のアピトープからなる。
【００６６】
本発明の発明者らは、寛容を効果的に誘導するために、「バイスタンダ抑制（bystander suppression）」によらず、多くの異なるＴ細胞クローンを標的にすることが必要であると予測した。それゆえ、治療又は予防のために複数のペプチドを個体に投与した。
【００６７】
製薬構造体は、例えば、１〜５０のアピトープからなることが好ましい。より好ましくは、１〜１５のアピトープからなる。１以上のアピトープからなるとき、これらのアピトープは、促進処理することなく全てがＭＨＣクラスＩに結合できること、又は全てがＭＨＣクラスＩＩに結合できることが好ましい。
【００６８】
また、２以上のアピトープからなるとき、製薬構造体は、キット形式とし、個々のアピトープ又はアピトープの幾つかを同時に独立して投与するか、分割投与又は連続投与する。
【００６９】
更に、製薬構造体（又はそのあらゆる部位）は、多回服用にて投与されるべきものであるが、各服用分に別々にパックされていてもよい。
【００７０】
製薬構造体は、１又は複数のアピトープ各々が治療上又は予防上効果的な量で構成され、場合に応じて、希釈液又は賦形剤等の製薬上許容できる担体からなる。
【００７１】
また、本発明に係る製薬組成において、１又は複数のアピトープの各々は、最適な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、又は可溶化剤と混合されてもよい。
【００７２】
投与
ペプチドは、補助剤がない場合には、可溶状態で投与されなくてはならない。
【００７３】
また、ペプチドは、粘膜経由で投与されることが好ましい。
【００７４】
実験は、ペプチドが可溶状態で腹膜内（i.p.）、静脈内（i.v.）、鼻腔内（i.n.）、又は経口に与えられれば、Ｔ細胞寛容を誘導できることを示している（Anderton and Wraith （1998) as above; Liu and Wraith （1995) as above; Metzler and Wraith （1999) Immunology 97: 257-263）。
【００７５】
特に、ペプチドは、鼻腔内投与されることが好ましい。
【００７６】
ハツカネズミによる研究では、寛容を誘導するために必要なペプチドの継続投与が、受容体中のＴ細胞の前駆体頻度に依存することが示されている（Burkhart et al （1999) as above）。また、多くの研究で、ペプチドの反復投与が寛容を誘導することが証明されてきている（Burkhart et al （1999) as above）。ペプチドの服用回数と適切な服用とは、個体個体に依存するものであるが、好ましい具体例では、多回服用にて投与されている。
【００７７】
複数のペプチドが同時に投与されるとき、ペプチドは、単一又は多回服用にて投与するために適切な「混合薬」の形態でなくてはならない。また、ペプチドは、多回服用にて与えられることが好ましいが、各服用間の相対的なペプチド濃度を変更することができる。
【００７８】
好ましい実施例として、濃度を段階的に上昇させて患者に多回服用させる「服用量の段階的増加（dose escalation）」の観察結果が挙げられる。この用例としては、例えば、蜂毒針アレルギーに対する免疫療法用途としてホスホリパーゼＡ２ペプチドが使用される（Muller et al （1998) J. Allergy Clin Immunol. 101: 747-754 and Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102: 98-106）。
【実施例】
【００７９】
以下の例は、本発明の具体例を説明するのに好適なものであるが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。本発明は、特にこれらの例を用いて説明される詳細な実施例に関連付けられる。
【００８０】
例１  ＭＢＰ残基１３４−１５４内のＴ細胞アピトープの同定
物質及び方法
抗原
ヒトＭＢＰは、Ｄｅｉｂｌｅｒらによって示された方法によって脳白質から抽出し（Deibler et al., 1972 Preparative Biochemistry 2: 139）し、この純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価する。ＭＢＰ及びヒト型結核菌精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）（UK Central Veterinary Laboratory, Surrey）は、予め決定された最適濃度での増殖定量法に使用される。すなわち、各抗原に対する最適濃度は２０μｇ／ｍｌである。ＭＢＰ残基１４１−１５８に拡がる１５ｍｅｒの重複したペプチドは、Ａｂｉｍｅｄ  ＡＭＳ４２２多重ペプチド合成装置（Abimed, Langenfeld, Germany）で標準的なＦｍｏｃ化学合成によって合成される。各ペプチドは、１ａａ及び重複する１４ａａによって置換される。
【００８１】
組織培養基
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Sigma社製、Poole、UK）を含むＲＰＭＩ−１６４０基、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン硫酸エステル（１００ｍｇ／ｍｌ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（以上は全てLife Technologies社製, Paisley, Scotland）を組織培養基として用いる。漿液を除いた培養基は、リンパ系細胞及びＴＣＬを洗浄するために使用する。培養組織の調節及び評価分析のために、培養基は、１０％を熱不活性化された自己由来の血漿にて補う。
【００８２】
Ｔ細胞クローンの生成
ＭＢＰ特異性Ｔ細胞系（ＴＣＬ）は、８人のＭＳ患者及び２人の健康な被験者から生成する。各被験者からのＰＢＭＣを上述のように分離し、ＭＢＰ（５０μｇ／ｍｌ）を用意した６つの培養床に１×１０６ｃｅｌｌ／ｍｌを塗布する。各被験者からのＰＢＭＣの一部は、完全に凍結され引き続き行われる再刺激（restimulation）のために保管される。７日後、細胞を２％のＩＬ−２（Lymphocult-HT ; Biotest LTD.社製、Birmingham、UK）の新鮮な培地に移し、このときに全培養組織のうち１２個を、抗原と、ＩＬ−２と、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源として放射線処理（２５００Ｒａｄ）された自己由来のＰＭＢＣとを、Ｔ細胞：ＡＰＣ＝１：５の割合にて再刺激（restimulate）する。最初の再刺激（restimulation）のときに、ＭＢＰに対する細胞の特異的な増殖を調べる。すなわち、このＭＢＰにおいて、２×１０４個のＴ細胞及び１×１０５個の放射線処理された自己由来のＰＢＭＣは９６培養床の底部にて約３倍に培養される。細胞は２日間培養され、培養の最後の１８時間をかけて、３Ｈ−チミジン（Amersham International 社製、Amersham、UK）を０．４μＣｉにて律動的に送り込む。この後、細胞は、上述したように回収される。ＴＣＬは、δｃｐｍ＞１０００、及びＳＩ＞３でＭＢＰ特異性に対して陽性とされる。
【００８３】
再刺激（restimulation）と展開とを３サイクル行うことで、ＴＣＬは、ＡＰＣとして自己由来の放射線照射処理されたＰＢＭＣに対してＰＨＡ（Sigma社製, Poole, Dorset, UK）を作用させてクローン化される。Ｔ細胞は、０．１（細胞／床）（ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）、０．３ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ、及び１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌにて希釈条件を制限され、１×１０４の放射線処理されたＰＢＭＣ、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ、及び２％のＩＬ−２とともに寺崎プレート（Nunc International, Costar）を用いて培養される。１０〜１２日後、成熟陽性の床は、１×１０５放射線照射処理ＰＭＢＣ、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ、ＩＬ−２を用いて９６培養床のプレート底部周辺に塗布される。３日経過した培養床は、ＩＬ−２を含む新鮮な培地に移され、このとき、７つの分枝系は、５×１０５放射線照射処理ＰＭＢＣ、ＰＨＡ及びＩＬ−２を用いて４８培養床プレートに塗布される。ここで、分枝系は、ＭＢＰに対する特異的な応答のための増殖試験が行われる。ＭＢＰ特異性分枝系は、１週間後、ＰＨＡ又はダイナベッヅ（Dynabeads）（Dynal社製、ＵＫ）と、ＩＬ−２とともに１×１０６放射線照射処理ＰＭＢＣを用いて２４培養床プレートに塗布される。２４培養床プレート内において、上述した７〜１０日間の再刺激／展開サイクルを行ってクローン化が行われる。
【００８４】
増殖反応測定法
活性化された又はｐ−ホルムアルデヒドで固定されたＭｇａｒ（ＨＬＡ−ＤＲ２＋ｖｅ）細胞は、ペプチドを含む漿液又は漿液単独中でＴ細胞とともに培養される。Ｔ細胞増殖応答は、３Ｈ−チミジンを加えて測定する。各培養組織から１００μｌ採った３つの部分標本を、９６培養床あるマイクロタイタープレートの底部で４８時間培養し、その後、０．４μＣｉ［３Ｈ］−チミジン（Amersham International社製、Amersham、ＵＫ）を律動的に送り込む。２０時間経過後、細胞は、Mach 111 harvester 96 （Tomtec社製, Orange, New Jersey, USA）を用いたガラス繊維マット（LKB-Wallac社製、Turku、Finland）から回収される。３Ｈ−チミジンの取込は、マクロベータ液体シンチレーションカウンタ（LKB-Wallac）を用いて検出される。抗原を含む試験床は、δｃｐｍ＞１０００、刺激指数（ＳＩ）＞３、であれば陽性とされる。ここで、ＳＩは、（培養組織に含まれるＣＰＭ抗原）／（抗原を除く培養組織ＣＰＭ）である。
【００８５】
結果
残基１３１−１５８における入れ子型ＭＢＰペプチドの提示に対するＴ細胞クローンＭＳ６０：Ｄ２の応答を図１に示す。ペプチド１３４−１４８、１３５−１４９、１３６−１５０、１３７−１５１、１３８−１５２、１３９−１５３及び１４０−１５４は、促進処理しないＴ細胞に対して固定されたＡＰＣによって提示されるのであれば、アピトープとして決定される。
【００８６】
ペプチド１４０−１５４の提示に対するＴ細胞クローンＮ５の応答を図２に示す。これは、ペプチド１４０−１５４が促進処理しない固定されたＡＰＣによって提示されることを確証している。
【００８７】
例２  Ｔ細胞クローンＮ５及びＭＳ６０：Ｄ２によって認識された最小エピトープの同定
活性化されたＭｇａｒ細胞は、ＭＢＰ残基１３６−１５７由来の重複ペプチドを含む漿液又は漿液単独中で、Ｔ細胞Ｎ５とともに培養される。Ｔ細胞増殖は、３Ｈ−チミジンを添加して測定する。
【００８８】
この結果を図３に示す。Ｔ細胞クローンＮ５によって認識された最小エピトープは、ＭＢＰ１４２−１５２である。
【００８９】
Ｔ細胞クローンＭＳ６０：Ｄ２に対して同様の実験を行った（図１に示す固定されていないＭｇａｒ）ところ、Ｔ細胞クローンによって認識された最小エピトープは、ＭＢＰ１４０−１４８であった。
【００９０】
発明のシステム及び方法には、種々の変形例があって、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。
【００９１】
また、特に好ましい実施例に関して説明されているが、請求された発明はこの特定の実施例に過度に制限されない。発明を実現するために記述された様々な変形例は、化学、生物学、又は本発明が含まれる関連分野では熟練されたものであることは明白である。上記詳細な説明にて言及した全ての刊行物は、ここでは参考として全て含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】図１は、ＡＰＣによる入れ子型ＭＢＰペプチドにおける残基１３１−１５８に対するＴ細胞クローンＭＳ６０：Ｄ２の応答性を示す図である。
【図２】図２は、ＡＰＣによる入れ子型ＭＢＰペプチドにおける残基１４０−１５４に対するＴ細胞クローンＮ５の応答性を示す図である。
【図３】図３は、ＡＰＣによる入れ子型ＭＢＰペプチドにおける残基１３６−１５７に対するＴ細胞クローンＮ５の応答性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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