(57)【要約】本発明は、生体サンプル中の標的核酸を少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させる工程を含み、前記試薬または一連の試薬により前記標的核酸内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別し、１つまたは複数の前記ＣｐＧの位置のメチル化状態から結腸細胞増殖障害の有無を結論付ける、１つまたは複数の遺伝子エストロゲン受容体、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、プロゲステロン受容体、ミオグロビン、ｐｃｎａ、ｃｄｃ２、ｃ−ｅｒＢ２、ｐ５３、およびＣＥＡ内のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を同定する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中の標的核酸を少なくとも１つの試薬または一連の試薬と接触させる工程を含み、前記試薬または一連の試薬により前記標的核酸内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを区別し、１つまたは複数の前記ＣｐＧの位置のメチル化状態から結腸細胞増殖障害の有無を結論付ける、１つまたは複数の遺伝子エストロゲン受容体、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、プロゲステロン受容体、ミオグロビン、ｐｃｎａ、ｃｄｃ２、ｃ−ｅｒbＢ２、ｐ５３、およびＣＥＡ内のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を同定する方法。
【請求項２】
ゲノムＤＮＡを含む生体サンプルを得る工程と、
前記ゲノムＤＮＡを抽出する工程と、
前記ゲノムＤＮＡサンプル中の５位でメチル化されていないシトシン塩基を処理することによってウラシルまたは塩基対合挙動に関してシトシンと異なる別の塩基に変換する工程と、
前処理した前記ゲノムＤＮＡのフラグメントを、配列番号７６〜配列番号９７に記載のプライマーオリゴヌクレオチド組およびポリメラーゼを使用して増幅する工程と、前記増幅物が検出可能な標識を有することと、
フラグメントを検出する工程と、
１つまたは複数のシトシンの位置のメチル化状態を同定する工程とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬が亜硫酸水素塩溶液、重亜硫酸塩溶液、または二亜硫酸塩溶液であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行うことを特徴とする、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１００〜２０００塩基対長の１０個を超える異なるフラグメントが増幅されることを特徴とする、請求項２〜４にいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
いくつかのＤＮＡセグメントの増幅を１つの反応容器で行うことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼが熱耐性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅物の標識が蛍光標識であることを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅物の標識が放射性核種であることを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記各増幅物を、オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーへのハイブリッド形成によって検出することを特徴とする、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーが配列番号９８〜５２３からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅物の標識が質量分析計で検出される典型的な質量を有する検出可能な分子フラグメントであることを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記増幅物または前記増幅物のフラグメントを、質量分析計で検出することを特徴とする、請求項２〜７または１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
産生された前記フラグメントは、質量分析計での検出能を高めるために正味の電荷が正または負のいずれかであることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して検出および視覚化することを特徴とする、請求項１２〜１４の１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記増幅工程により、バックグラウンドＤＮＡと対照的に、結腸組織の特異的ゲノムメチル化状態に基づいて、健常および／または罹患した結腸組織において特に目的とするＤＮＡが優先的に増幅されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）ゲノムＤＮＡを含む生体サンプルを得る工程と、
ｂ）前記ゲノムＤＮＡを抽出する工程と、
ｃ）前記標的核酸を１つまたは複数のメチル化感受性制限酵素で消化する工程と、
ｄ）前記ＤＮＡ消化物を増幅する工程と、
ｅ）前記増幅物を検出する工程とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的核酸が、配列番号１２〜配列番号３１またはこれらとハイブリッド形成する配列およびこれらのフラグメントからなる群より選択される１つまたは複数の配列を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用い行うことを特徴とする、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
いくつかのＤＮＡセグメントの増幅を１つの反応容器で行うことを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリメラーゼが熱耐性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号３２〜配列番号７５およびこれらに相補的な配列からなる群より選択される配列の１つである前処理ゲノムＤＮＡの単離核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の配列番号３２〜配列番号７５の１つである前処理ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するか同一である少なくとも１０個のヌクレオチドからなる少なくとも１つの塩基配列を含む、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマー。
【請求項２４】
前記塩基配列が少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載のオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマー。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが、前記オリゴマーの三等分したおよそ中央に存在することを特徴とする、請求項２３に記載のオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマー。
【請求項２６】
配列番号９８〜配列番号５２３からなる群より選択される配列の１つである、オリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
請求項２２〜２６のいずれかに記載の少なくとも２つのオリゴマーを含む、オリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーの組。
【請求項２８】
請求項２２に記載の配列番号３２〜７５に記載の配列およびこれらに相補的な配列の１つに全ＣｐＧジヌクレオチドの対応するゲノムメチル化状態を検出するためのオリゴマーを含む、請求項２７に記載のオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーの組。
【請求項２９】
配列番号３２〜７５に記載の配列および／またはこれらに相補的な配列およびこれらのセグメントの１つのＤＮＡ配列の増幅用のプライマーオリゴヌクレオチドとしての、請求項２３に記載の少なくとも２つのオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーの組。
【請求項３０】
少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固相に結合していることを特徴とする、請求項２２および請求項２３に記載のオリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーの組。
【請求項３１】
化学的に前処理した請求項２に記載のゲノムＤＮＡの分析による対応するゲノムＤＮＡのシトシンメチル化状態および／または一塩基多型（ＳＮＰ）を決定するためのプローブとしての、請求項２２〜２５のいずれかに記載のオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーの組の使用。
【請求項３２】
対応するゲノムＤＮＡのメチル化状態の決定および／または一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のための、請求項２２に記載の前処理ゲノムＤＮＡの使用。
【請求項３３】
配列番号３２〜配列番号７５およびこれらに相補的な配列の１つの中にＣｐＧジヌクレオチドの対応するゲノムメチル化状態に関連する疾患を分析するためであって、請求項２２〜２６のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴマーが固相に結合している、異なるオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーの整列物（アレイ）の製造方法。
【請求項３４】
請求項３３によって得ることができる、異なるオリゴマーまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーの整列物（アレイ）。
【請求項３５】
長方形の格子または六方格子の形態の平面固相に整列されていることを特徴とする、請求項３４に記載の異なるオリゴヌクレオチド−および／またはＰＮＡ−オリゴマー配列のアレイ。
【請求項３６】
先行する請求項の１項に記載の少なくとも１つの核酸を含む遺伝子のメチル化状態に関連する前立腺細胞増殖障害の分析のためのＤＮＡ／ＰＮＡアレイ。
【請求項３７】
前記固相の表面が、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、または金から構成されていることを特徴とする、請求項３４〜３６のいずれかに記載のアレイ。
【請求項３８】
結腸細胞増殖障害の特徴付け、分類、診断、および区別のための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法の使用。
【請求項３９】
亜硫酸水素塩（＝二亜硫酸塩、重亜硫酸塩）試薬ならびに請求項２２〜２９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーを含む、キット。
【請求項４０】
結腸細胞増殖障害の特徴付け、分類、診断、および区別のための、請求項２２に記載の前処理ゲノムＤＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分子生物学における近年の方法論の発展によって研究されている観察のレベルは、遺伝子自体、これらの遺伝子のＲＮＡへの翻訳、および得られたタンパク質である。遺伝子が個体の発生過程のある時点で切り替えられる問題ならびに特定の細胞および組織中の特定の遺伝子の活性化および阻害がどのようにして制御されるのかという問題は、遺伝子またはゲノムのメチル化の程度および特徴に相関し得る。これに関して、個々の遺伝子またはゲノムのメチル化パターンの変化自体が病態を引き起こし得る。
【０００２】
本発明は、特にこれらのシトシンメチル化状態を使用したゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメータの分析による結腸癌または結腸癌の素因の特徴付け、等級付け、進行期分類、処置、および／または診断のための核酸、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ−オリゴマー、および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
結腸癌は、米国で２番目の最も一般的な癌の死因である。これは、結腸の始まり（盲腸）から結腸の終わり（直腸）までの結腸（大腸）の任意の癌である。結腸癌は、大腸上皮の悪性腫瘍である。これは、変異した１つの細胞から始まり、視覚可能なポリープに成長する。ポリープが結腸中に残存する場合、ポリープは、他の器官に侵襲することができる癌性腫瘍に成長し得る。悪性疾患への進行の背景となる機構は完全には理解されていないが、ほとんどのポリープは３〜７年で癌性になる。結腸癌の予防は、癌性になる前のポリープの除去によるこの過程の停止を意味する。結腸癌は、結腸直腸上皮細胞のゲノムと宿主環境との間の相互作用を示す。両因子は、腫瘍発症に不可欠である。結腸癌を、４０歳以前ではほとんど発症しない非遺伝型および若年層でしばしば発症する遺伝型結腸癌に区別することができる。
【０００４】
ヒト結腸癌は、腺腫性ポリープから癌への多進行期発癌経路を経る。多数の遺伝的事象が特徴付けられており、「腫瘍抑制遺伝子」および細胞周期の進行およびプログラム細胞死を調節するタンパク質を正常にコードする感受性遺伝子の変化が含まれる（Ｋｉｎｚｌｅｒ  ＫＷ，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．、「癌領域の操作」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、５月１５日、２８０（５３６６）、１０３６〜７）。高齢者での結腸癌の罹患率の高さおよび進行した疾患における死亡率の高さを考慮すると、新規の予防ストラテジーが必要である。癌の診断後、治療計画を決定する前に癌の範囲または「進行期」を決定することが重要である。進行期分類は、患者の癌の進行を評価し、癌が体内の他の部分に拡大している範囲を定義する方法である。癌の範囲または進行期を分類するためのいくつかのシステムが存在する。２つの最も一般的なシステムのうちの１つは、癌の４つの進行期を定義する「第Ｉ期、第ＩＩ期、第ＩＩＩ期、第ＩＶ期」システムである。第Ｉ期は、腫瘍が小さくリンパ節に拡大していない初期癌を示す。第ＩＩ期および第ＩＩＩ期では、腫瘍が段階的により進行し、第ＩＶ期は、体内の他の領域に拡大した転移性疾患をいう。これらの進行期分類システムを理解するための１つの非常に重要な点は、疾患の進行期および生存の見込みを大まかにしか評価していないことである。数値は平均のみを示す。ある特定の患者の結果または予後についてはまったく言及していない。
【０００５】
結腸癌に関する遺伝子には、以下のものが含まれる。
ｐ１６（Ｄａｉ  ＣＹ．，Ｆｕｒｔｈ  ＥＥ．，Ｍｉｃｋ  Ｒ．，Ｋｏｈ  Ｊ．，Ｔａｋａｙａｍａ  Ｔ．，Ｎｉｉｔｓｕ  Ｙ．，Ｅｎｄｅｒｓ  ＧＨ．，、「ｐ１６（ＩＮＫ４ａ）発現はヒト結腸新形成の初期に始まり、細胞増殖マーカーと逆に相関する」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２０００年１０月、１１９（４）、９２９〜４２）。
ｐ２７（Ｌｉｕ  ＤＦ．，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｋ．，Ｃｏｏｐｅｒ  ＧＳ．，Ｇｒａｄｙ  ＷＭ．、Ｗｉｌｌｉｓ  Ｊ．、「ｐ２７細胞周期インヒビターは、右側結腸癌のリンパ節転移と逆に相関する」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．、１９９９、１３（６）、２９１〜５）。
ｐ５３（Ａｒａｎｇｏ  Ｄ．，Ｃｏｒｎｅｒ  ＧＡ．，Ｗａｄｌｅｒ  Ｓ．，Ｃａｔａｌａｎｏ  ＰＪ．，Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ  ＬＨ．、「ｃ−ｍｙｃ／ｐ５３相互作用によりインビトロおよびインビボで５−フルオロウラシルに対するヒト結腸癌細胞の感受性を決定する」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年６月１５日、６１（１２）、４９１０〜５）。
ｃｄｃ２（Ｍｏｒａｇｏｄａ  Ｌ．，Ｊａｓｚｅｗｓｋｉ  Ｒ．，Ｍａｊｕｍｄａｒ  ＡＰ．、「クルクミンにより胃癌および結腸癌細胞の細胞周期およびアポトーシスの調節が誘導された」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年３〜４月、２１（Ａ）、８７３〜８）。
ＰＣＮＡ（Ｚｈａｎｇ  Ｙ．，Ｉｗａｍａ  Ｔ．，Ｓｕｇｉｈａｒａ  Ｋ．、「遺伝性腸疾患におけるアポトーシスおよび細胞増殖の組織化学的研究」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｄｅｎｔ．Ｓｃｉ．、１９９８年６月、４５（２）、７７〜８４）。
ＣＥＡ（Ｖｏｇｅｌ  Ｉ．，Ｆｒａｎｃｋｓｅｎ  Ｈ．，Ｓｏｅｔｈ  Ｅ．，Ｈｅｎｎｅ−Ｂｒｕｎｓ  Ｄ．，Ｋｒｅｍｅｒ  Ｂ．，Ｊｕｈｌ  Ｈ．、「癌胎児抗原および免疫細胞学的に検出された腹腔内結腸直腸癌細胞に対する予後の影響」、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．、２００１年２月、１８１（２）、１８８〜９３）。
ｃ−ｅｒｂＢ２（Ｅｒｉｃ  Ｐ．，Ｓｏｖｏｖａ  Ｖ．，Ｓｌｏｎｃｏｖａ  Ｅ．，Ｌｏｊｄａ  Ｚ．，Ｊｉｒａｓｅｋ  Ａ．，Ｃｅｒｍａｋ  Ｊ．、「左結腸および右結腸の散発性癌中のいくつかの分子マーカーの発現の相違」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．、２０００年８月、９（４）、２６５〜８）。
エストロゲン受容体（Ｃａｍｐｂｅｌｌ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｍ．，Ｌｙｎｃｈ  ＩＪ．，Ｂｈａｒｄｗａｊ  Ｂ．、「結腸癌におけるエストロゲン受容体（ＥＲ）サブタイプおよびＥＲβイソ型の発現」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００１年１月１５日、６１（２）、６３２〜４０）。
プロゲステロン受容体（Ｒｅｉｃｈ  Ｏ．，Ｒｅｇａｕｅｒ  Ｓ．，Ｕｒｄｌ  Ｗ．，Ｌａｈｏｕｓｅｎ  Ｍ．，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｒ．、「低悪性度子宮内膜間質部肉腫におけるエストロゲンおよびプロゲステロン受容体の発現」、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２０００年３月、８２（５）、１０３０〜４）およびミオグロビン（Ｎａｋａｏ  Ａ．，Ｓａｋａｇａｍｉ  Ｋ．，Ｕｄａ  Ｍ．，Ｍｉｔｓｕｏｋａ  Ｓ．，Ｉｔｏ  Ｈ．、「結腸の癌肉腫：症例報告および文献の概説」、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１９９８年４月、３３（２）、２７６〜９）。
【０００６】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡにおいて最も頻繁な塩基の共有結合の改変物である。これは、例えば、転写の調節、遺伝的刷り込み、および腫瘍形成に関与する。したがって、遺伝情報の成分としての５−メチルシトシンの同定は非常に興味深い。しかし、５−メチルシトシンはシトシンと同一の塩基対合を行うので、配列決定によって５−メチルシトシンの位置を同定することができない。さらに、５−メチルシトシンによって保有される後成的情報は、ＰＣＲ増幅時に完全に失われる。
【０００７】
比較的新しく且つ現在最も頻繁に使用されている５−メチルシトシンのＤＮＡの分析法は、亜硫酸水素塩のシトシンとの特異的反応に基づき、その後のアルカリ加水分解の際に、その塩基対合挙動においてチミジンに対応するウラシルに変換される。しかし、５−メチルシトシンは、これらの条件下で改変されない。したがって、元のＤＮＡは、ハイブリッド形成挙動によって最初にシトシンと区別することができないメチルシトシンが「通常の」分子生物学的技術（例えば、増幅およびハイブリッド形成または配列決定）を使用して残存シトシンとしてのみ検出することができるような様式で変換される。これらの全ての技術は、現在完全に使用することができる塩基対合に基づく。感受性に関して、先行技術は、アガロースマトリクス中に分析すべきＤＮＡを封じ込め、これによりＤＮＡの拡散および復元を防止し（亜硫酸水素塩のみが一本鎖ＤＮＡと反応する）、全沈殿工程および精製工程を迅速な透析に置換する方法によって定義される（Ｏｌｅｋ  Ａ．，Ｏｓｗａｌｄ  Ｊ．，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ．、「改変および改良された亜硫酸水素塩ベースのシトシンメチル化分析法」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９６年１２月１５日、２４（２４）、５０６４〜６）。この方法を使用して、個々の細胞を分析して方法の能力を示すことが可能である。しかし、現在、約３０００塩基対までの長さの個々の領域のみが分析されており、数千の見込みのあるメチル化事象の全体的な分析は不可能である。しかし、この方法は、少量のサンプル由来の非常に小さなフラグメントを確実に分析することもできない。これらは、拡散保護にもかかわらずマトリクスを通過して失われる。
【０００８】
５−メチルシトシンのさらなる公知の検出方法の概説を、以下の総論から得ることができる。Ｒｅｉｎ，Ｔ．，ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９８、２６、２２５５。
【０００９】
現在まで、いくつかの例外（例えば、Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ  Ｍ．，Ｌｉｃｈ  Ｃ．，Ｂｕｉｔｉｎｇ  Ｋ．，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  Ｗ．，Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ  Ｂ．、「ＳＮＲＰＮ遺伝子座での対立遺伝子メチル化の相違に基づくアンゲルマンおよびプラーダー−ウィリ症候群の診断のための１チューブＰＣＲ試験」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９７年３月〜４月、５（２）、９４〜８）を除いて、研究で亜硫酸水素塩技術のみが使用されている。しかし、亜硫酸水素塩処理後には常に短くて特異的な既知の遺伝子のフラグメントが増幅されて完全に配列決定されるか（Ｏｌｅｋ  Ａ．，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ．、「Ｈ１９メチル化刷り込みの着床前個体発生」、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９７年１１月、１７（３）、２７５〜６）、または個々のシトシンの位置を、プライマー伸長反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ＭＬ．，Ｊｏｎｅｓ  ＰＡ．、「メチル化感受性１ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）を使用した特異的部位でのメチル化の相違の迅速な定量」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７年６月１５日、２５（１２）、２５２９〜３１、ＷＯ特許９５００６６９）または酵素消化（Ｘｉｏｎｇ  Ｚ．，Ｌａｉｒｄ  ＰＷ．、「ＣＯＢＲＡ：高感度且つ定量的なＤＮＡメチル化アッセイ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７年６月１５日、２５（１２）、２５３２〜４）によって検出する。さらに、ハイブリッド形成による検出もまた記載されている（Ｏｌｅｋら、ＷＯ９９２８４９８）。
【００１０】
個々の遺伝子のメチル化検出のための亜硫酸水素塩技術の使用をテーマにしたさらなる刊行物を以下に示す。Ｇｒｉｇｇ  Ｇ．，Ｃｌａｒｋ  Ｓ．、「ゲノムＤＮＡ中の５−メチルシトシン残基の配列決定」、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、１９９４年６月、１６（６）、４３１〜６、４３１、Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ  Ｍ．，Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｂ．，Ｄｉｔｔｒｉｃｈ  Ｂ．，Ｂｕｉｔｉｎｇ  Ｋ．，Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ  Ｂ．，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  Ｗ．、「ヒトゲノム中の刷り込みセグメント：ゲノム配列決定法によって決定したプラーダー−ウィリ／アンゲルマン症候群領域中の異なるＤＮＡメチル化パターン」、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９７年３月、６（３）、３８７〜９５、Ｆｅｉｌ  Ｒ．，Ｃｈａｒｌｔｏｎ  Ｊ．，Ｂｉｒｄ  ＡＰ．，Ｗａｌｔｅｒ  Ｊ．，Ｒｅｉｋ  Ｗ．、「個々の染色体のメチル化分析：亜硫酸水素塩ゲノム配列決定のための改良プロトコール」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９４年２月２５日、２２（４）、６９５〜６、Ｍａｒｔｉｎ  Ｖ．，Ｒｉｂｉｅｒａｓ  Ｓ．，Ｓｏｎｇ−Ｗａｎｇ  Ｘ．，Ｒｉｏ  ＭＣ．，Ｄａｎｔｅ  Ｒ．、「ゲノム配列決定はｐＳ２遺伝子の５’領域中のＤＮＡの低メチル化とヒト乳癌細胞株でのその発現との間の相関関係を示す」、Ｇｅｎｅ、１９９５年５月１９日、１５７（１−２）、２６１〜４、ＷＯ９７／４６７０５、ＷＯ９５／１５３７３、およびＷＯ９５／４５５６０。
【００１１】
オリゴマーアレイ製造における先行技術の概要を、１９９９年１月刊行のＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの特別版（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、第２１巻、１９９９年１月）およびその参考文献から得ることができる。
【００１２】
固定化ＤＮＡアレイの配列決定に蛍光標識プローブがしばしば使用される。特定のプローブの５’ＯＨへのＣｙ３およびＣｙ５色素の単純な結合は、蛍光標識に特に適切である。ハイブリッド形成したプローブの蛍光の検出を、例えば共焦点顕微鏡によって行うことができる。多数のその他の色素に加えて、Ｃｙ３およびＣｙ５は市販されている。
【００１３】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子の分析のために非常に有効に開発されている（Ｋａｒａｓ  Ｍ．，Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ  Ｆ．、「１０，０００ダルトンを超える分子量のタンパク質のレーザー脱離イオン化」、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８年１０月１５日、６０（２０）、２２９９〜３０１）。分析物を光を吸収するマトリックスに埋め込む。マトリックスを、短期間のレーザーパルスによって蒸発させて、非断片化様式で分析物分子を気相に変換する。分析物を、マトリックス分子での衝突によってイオン化する。電圧の印加により、イオンを無電界飛行チューブに加速する。その異なる分子量により、イオンが異なる速度で加速される。イオンが小さいほどより大きなイオンよりも迅速に検出器に到達する。
【００１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析は、ペプチドおよびタンパク質の分析に非常に適している。核酸分析は、いくらかより困難である（Ｇｕｔ  ＩＧ．，Ｂｅｃｋ  Ｓ．，、「ＤＮＡおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ．、１９９５、１、１４７〜５７）。核酸に対する感度はペプチドの約１／１００であり、フラグメントのサイズの増加につれて不均衡に減少する。
【００１５】
負の電荷を帯びた骨格の多い核酸では、マトリックスを介したイオン化プロセスはあまり有効ではない。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析では、マトリックスの選択が非常に重要な役割を果たす。ペプチド脱離のために、非常に細かく結晶化するいくつかの非常に有効なマトリックスが見出されている。現在、いくつかのＤＮＡについての反応性マトリックスが存在するが、感度の相違は減少しなかった。感度の相違を、ペプチドにより類似の様式でのＤＮＡの化学修飾によって減少させることができる。骨格の通常のリン酸塩がチオリン酸塩に置換されたホスホロチオエート型核酸を、簡単なアルキル化化学を使用して中性の電荷のＤＮＡに変換することができる（Ｇｕｔ  ＩＧ．，Ｂｅｃｋ  Ｓ．、「選択的ＤＮＡアルキル化手順および質量分析による検出」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９５年４月２５日、２３（８）、１３６７〜７３）。この改変ＤＮＡへの電荷タグの結合のより、ペプチドと同一レベルに感度が増加する。電荷タグ化のさらなる利点は、非改変基質の検出を非常に困難にする夾雑物に対する分析の安定性の増大である。
【００１６】
ゲノムＤＮＡを、標準的な方法を使用して、細胞、組織、または他の試験サンプルのＤＮＡから得る。この標準的な方法論は、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ編、「分子クローニング：実験マニュアル」、１９８９などの参考文献で見出される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、遺伝子エストロゲン受容体、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、プロゲステロン受容体、ミオグロビン、ｐｃｎａ、ｃｄｃ２、ｃ−ｅｒｂＢ２、ｐ５３、およびＣＥＡ中の異常なメチル化を、結腸発癌と正に相関させることができることを開示する。これにより、制限酵素分析または核酸ベースの方法を使用した遺伝子のメチル化を検出するアッセイによって結腸癌または結腸癌の素因を検出可能である。
【００１８】
開示した本発明は、結腸癌分析のための方法および核酸を提供する。本発明は、健常な結腸組織と癌性結腸組織とを区別する手段を開示する。本発明は、組織学的分析などの比較的主観的な性質の現在使用されている方法と対照的な分子レベルでの結腸癌の改良された診断、予後、進行期分類、および等級付け手段を提供する。さらに、開示された本発明は、現在の組織学的分析方法および細胞学的分析方法では生検が十分な量の組織を含む必要があるという点で最先端の方法よりも改良されている。本発明の方法を、微量サンプルの分類に使用することができる。
【００１９】
本発明は、エストロゲン受容体、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、プロゲステロン受容体、ミオグロビン、ｐｃｎａ、ｃｄｃ２、ｃ−ｅｒｂＢ２、ｐ５３、およびＣＥＡからなる群より選択される１つまたは複数の遺伝子の標的核酸を標的配列内のメチル化および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別することができる試薬または一連の試薬に接触させることを特徴とする、結腸細胞増殖障害の検出方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメータの確認方法を提供する。本方法は、結腸癌の等級付け、進行期分類、処置、および／または診断で使用される。本方法は、シトシンメチル化および一塩基多型を分析することができる。
【００２１】
本発明の１つの実施形態では、ゲノムＤＮＡサンプルを、最初に組織または細胞供給源から単離する。このような供給源には、細胞株、組織学的スライド、体液、またはパラフィン包埋組織を含み得る。抽出は当業者に標準的な任意の手段であってよく、これらには、界面活性剤溶解物、超音波処理、およびガラスビーズでのボルテックスの使用が含まれる。一旦核酸が抽出されると、二本鎖ゲノムＤＮＡを、分析で使用する。
【００２２】
好ましい実施形態では、化学処理の前にＤＮＡを切断することができ、これは特に制限エンドヌクレアーゼを使用する当業者に標準的な任意の手段であり得る。
【００２３】
本方法の第３の工程では、ゲノムＤＮＡサンプルを、５’位でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル、チミン、またはハイブリッド形成挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換する様式で処理する。これを、以後「前処理」と理解する。
【００２４】
上記のゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩（二亜硫酸塩、亜硫酸塩）を使用して処理し、その後にアルカリ加水分解によって非メチル化シトシン核酸塩基をウラシルまたは塩基対合挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換することが好ましい。
【００２５】
本方法の第４の工程では、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを、当該分野で公知のいくつかの方法（すなわち、実時間ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｌｉｇｈｔアッセイ）、オリゴヌクレオチドのブロッキング、メチル化特異的一塩基多型伸長（以後、ＭｓＳＮｕＰＥと呼ぶ）、メチル化特異的ＰＣＲ（以後、ＭＳＰと呼ぶ）、および核酸配列決定）の１つまたは組み合わせを使用して分析する。
【００２６】
蛍光ベースの実時間定量ＰＣＲ（Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、６、９８６〜９９４、１９９６）は、ポリメラーゼ連鎖反応を継続的にモニターしながらオリゴヌクレオチドプライマーと同時にハイブリッド形成される二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを使用したＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ）を使用する。ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ反応は、正方向増幅プライマーと逆方向増幅プライマーの間に存在するＧｐＣが豊富な配列とハイブリッド形成するようにデザインされたＴａｑＭａｎ（商標）プローブと呼ばれる非伸長性インテロゲイティングオリゴヌクレオチドを使用する。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合したリンカー部分（例えば、ホスホラミダイト）に共有結合した蛍光「レポーター部分」および「消光部分」をさらに含む。亜硫酸水素塩処理後の核酸内のメチル化分析のために、Ｍｅｔｈｙｌ  Ｌｉｇｈｔアッセイとしても公知の米国特許第６，３３１，３９３号に記載のメチル化特異性プローブが必要である。本発明に記載の使用にも適切なＴａｑＭａｎ（商標）検出法の変形形態には、二重プローブテクノロジー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標））または蛍光増幅プライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）テクノロジー）の使用が含まれる。これらの両技術を、亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの使用およびさらにＣｐＧジヌクレオチド内のメチル化分析に適切な様式で適用することができる。
【００２７】
亜硫酸水素塩処理核酸の分析によるメチル化評価のためのさらに適切な方法は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用である。このようなオリゴヌクレオチドの使用は、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２３（４）、１９９７、７１４〜７２０、Ｄ．Ｙｕ，Ｍ．Ｍｕｋａｉ，Ｑ．Ｌｉｕ，Ｃ．Ｓｔｅｉｎｍａｎに記載されている。ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲプライマーと同時に亜硫酸水素塩処理核酸とハイブリッド形成させる。核酸のＰＣＲ増幅を、ブロッキングプローブの５’位で終了させ、それによりブロッキングプローブの相補配列が存在する核酸の増幅が抑制される。プローブを、メチル化状態特異的様式で亜硫酸水素塩処理核酸とハイブリッド形成するようにデザインすることができる。例えば、非メチル化核酸集団内のメチル化核酸の検出のために、問題の位置でメチル化されない核酸の増幅を、「ＣＡ」と対照的に、問題の位置に「ＣＧ」を含むブロッキングプローブの使用により抑制する。
【００２８】
本方法のさらに好ましい実施形態では、Ｇｏｎｚａｌｇｏ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５、２５２９〜２５３１）に記載のＭＳ  ＳＮｕＰＥなどのテンプレート指向性オリゴヌクレオチド伸長を使用して分析する。
【００２９】
本方法の別の実施形態では、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の評価を、メチル化特異的ＰＣＲを使用した処理核酸のＰＣＲ分析によって行うことができる。メチル化特異的プライマー（ＭＳＰ）は、例えば、Ｈｅｒｍａｎらに付与された米国特許第６，２６５，１７１号に記載されている。ＭＳＰプライマーは、少なくとも１つの亜硫酸水素塩処理ＣｐＧジヌクレオチドを含むヌクレオチド配列へのアニーリングに特異的なオリゴヌクレオチドからなる。したがって、前記プライマーの配列は、少なくとも１つのＣＧ、ＴＧ、またはＣＡジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧ中のＣ位置の３’位に「Ｔ」を含む。シトシンが亜硫酸水素塩反応によって変換されているので、ＭＳＰプライマーは一般に比較的少数しかシトシンを含まない。しかし、プライマーがメチル化シトシンジヌクレオチドに特異的である場合、前記シトシンの位置は、プライマーオリゴヌクレオチド内に変換される。
【００３０】
プライマーをポリメラーゼを使用して伸長し、得られた二本鎖核酸を、熱処理によって変性させることが好ましい。プライマーのアニーリング、伸長、および変性の連続サイクルを、Ｍｕｌｌｉｓに付与された米国特許第４，５８２，７８８号に記載のポリメラーゼ連鎖反応によって行う。
【００３１】
本方法のさらなる実施形態では、本方法の第３の工程で産生された増幅物の配列決定およびその後の配列分析によって分析することができる（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ．ら、１９７７、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７４：５４６３〜５４６７）。
【００３２】
特に好ましい実施形態では、本方法は以下の工程を含む。
【００３３】
本方法の第１の工程では、ゲノムＤＮＡサンプルを、組織または細胞供給源から単離しなければならない。このような供給源には、細胞株、組織学的スライド、体液、またはパラフィン包埋組織を含み得る。抽出は当業者に標準的な任意の手段であり、これらには、界面活性剤溶解物、超音波処理、およびガラスビーズでのボルテックスの使用が含まれる。一旦核酸が抽出されると、二本鎖ゲノムＤＮＡを、分析で使用する。
【００３４】
好ましい実施形態では、化学処理の前にＤＮＡを切断することができ、これは特に制限エンドヌクレアーゼを使用する当業者に標準的な任意の手段であり得る。
【００３５】
本方法の第２の工程では、ゲノムＤＮＡサンプルを、５’位でメチル化されていないシトシン塩基をウラシル、チミン、またはハイブリッド形成挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換する様式で処理する。これを、以後「前処理」と理解する。
【００３６】
上記のゲノムＤＮＡを、亜硫酸水素塩（二亜硫酸塩、亜硫酸塩）を使用して処理し、その後にアルカリ加水分解によって非メチル化シトシン核酸塩基をウラシルまたは塩基対合挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換することが好ましい。
【００３７】
第３の工程では、前処理したＤＮＡのフラグメントを、配列番号７６〜９７に記載のプライマーオリゴヌクレオチド組および好ましくは熱安定性ポリメラーゼを使用して増幅する。統計的および実用的な検討のために、１００〜２０００塩基対長の１０個を超える異なるフラグメントを増幅することが好ましい。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅を、まったく同一の反応容器で同時に行うことができる。通常、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅を行う。
【００３８】
当業者に自明のデザインの別のプライマーを使用して、本方法を行うこともできる。これらは、その配列が添付書類で特定されている塩基配列（配列番号３２〜配列番号７５）の少なくとも１８塩基対長のセグメントとそれぞれ逆に相補的であるか同一である少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むべきである。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、いかなるＣｐＧジヌクレオチドも含まないことを特徴とすることが好ましい。本方法の特に好ましい実施形態では、前記プライマーオリゴヌクレオチドの配列を、目的の結腸組織特異的ＤＮＡのみに選択的にアニーリングおよび増幅してバックグラウンドまたは無関係のＤＮＡの増幅を最小にするようにデザインする。本発明の文脈では、バックグラウンドＤＮＡは、健常および罹患している関連組織特異的メチル化パターン（この場合、関連組織は結腸組織である）を含まないゲノムＤＮＡを意味する。
【００３９】
本発明によれば、増殖時に少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドが固相に結合することが好ましい。異なるオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー配列を、長方形の格子または六方格子の形態の平面固相に整列することができ、固相表面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、または金から構成されることが好ましく、ニトロセルロースまたはプラスチックなどの他の材料を同様に使用することが可能である。
【００４０】
増幅を使用して得られたフラグメントは、直接または間接的に検出可能な標識を保有し得る。質量分析計で検出することができる典型的な質量を有する蛍光標識、放射性核種、または検出可能な分子のフラグメントの形態の標識が好ましく、産生されたフラグメントが質量分析計での検出能を高めるために正味の電荷が正また負のいずれかであることが好ましい。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して検出および視覚化することができる。
【００４１】
本方法の第３の工程で得られた増幅物を、その後にオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡプローブのアレイまたは組にハイブリッド形成させる。この文脈では、以下に記載の様式でハイブリッド形成が起こる。ハイブリッド形成時に使用されるプローブ組は、少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーから構成されることが好ましい。このプロセスでは、増幅には、予め固相に結合させたオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプローブとして使用する。特に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドを、配列番号９８〜５２３からなる群から選択する。その後非ハイブリッド形成フラグメントを除去する。前記オリゴヌクレオチドは、添付書類で特定されている塩基配列のセグメントと逆に相補的であるか同一である１０ヌクレオチド長の少なくとも１つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは、１０量体の５’末端から５番目〜９番目のヌクレオチドである。各ＣｐＧジヌクレオチドについて１つのオリゴヌクレオチドが存在する。
【００４２】
本方法の次の工程では、非ハイブリッド形成増幅物を除去する。
【００４３】
本方法の最終工程では、ハイブリッド形成した増幅物を検出する。この文脈では、増幅物に結合した標識が、オリゴヌクレオチド配列が存在する固相の各位置で検出可能であることが好ましい。
【００４４】
本発明によれば、増幅物の標識は、質量分析計で検出することができる典型的な質量を有する蛍光標識、放射性核種、または検出可能な分子のフラグメントであることが好ましい。増幅物、増幅物のフラグメント、または増幅に相補的なプローブの検出に質量検出計が好ましく、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用して検出および視覚化することができる。産生されたフラグメントは、質量分析計での検出能を高めるために正味の電荷が正また負のいずれかであり得る。
【００４５】
上記の方法を、ゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメータの確認に使用することが好ましい。
【００４６】
本方法を可能にするために、本発明は、さらに、遺伝子エストロゲン受容体、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、プロゲステロン受容体、ミオグロビン、ｐｃｎａ、ｃｄｃ２、ｃ−ｅｒbＢ２、ｐ５３、およびＣＥＡの化学修飾ＤＮＡならびにシトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーを提供する。本発明は、遺伝的および後成的パラメータ（特に、ゲノムＤＮＡのシトシンメチル化パターン）が結腸癌の特徴付け、等級付け、進行期分類、および／または診断に特に適切であるという発見に基づく。
【００４７】
配列番号１２〜配列番号５２３の本発明による核酸を、ゲノムＤＮＡの遺伝的および／または後成的パラメータの特徴付け、等級付け、進行期分類、および／または診断に使用することができる。
【００４８】
配列番号３２〜配列番号７５およびこれらに相補的な配列である１つの化学的に前処理したゲノムＤＮＡの少なくとも１８塩基長の配列を含む核酸を使用した本発明にしたがってこの目的を行う。
【００４９】
これまで、化学修飾した核酸を、疾患に関連する遺伝的および後成的パラメータの確認と関連付けることができなかった。
【００５０】
前処理ＤＮＡの分析（ゲノムシトシンメチル化状態の検出）のためにオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーによって本発明の目的をさらに行い、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号３２〜配列番号７５に記載の前処理ゲノムＤＮＡとハイブリッド形成する少なくとも１０ヌクレオチド長の少なくとも１つの塩基配列を含む。本発明に記載のオリゴマープローブは、初めて結腸癌の特異的な遺伝的および後成的パラメータ（特に、結腸癌の特徴付け、等級付け、進行期分類、および／または診断での使用）を確認することが可能となる重要且つ有効なツールを構成する。オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含むことが好ましい。プローブはまた、特に好ましい対合性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在し得る。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが１３量体の５’末端から５番目〜９番目のヌクレオチドである本発明に記載のオリゴヌクレオチドが特に好ましく、ＰＮＡ−オリゴマーの場合、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが９量体の５’末端から４番目〜６番目のヌクレオチドであることが好ましい。
【００５１】
本発明に記載のオリゴマーを、通常、配列番号３２〜配列番号７５の配列の各ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つのオリゴマーを含むいわゆる「組」で使用される。配列番号３２〜配列番号７５の一つから各ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つのオリゴマーを含む組が好ましい。
【００５２】
本発明に記載のオリゴヌクレオチド組の場合、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが固相に結合していることが好ましい。１組の全オリゴヌクレオチドが固相に結合していることがさらに好ましい。
【００５３】
本発明は、さらに、化学的に前処理したゲノムＤＮＡ（配列番号３２〜配列番号７５の配列およびこれらに相補的な配列）中のシトシンメチル化状態の検出で使用される少なくとも１０ｎ（オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー）の組に関する。これらのプローブは、結腸癌の遺伝的および後成的パラメータの特徴付け、等級付け、進行期分類、および／または診断を行うことができる。さらに、プローブは、結腸癌の素因の診断を行うことができる。オリゴマー組を、配列番号３２〜配列番号７５の１つに記載の前処理ゲノムＤＮＡ中の一塩基多型（ＳＮＰ）の検出にも使用することができる。
【００５４】
本発明によれば、本発明によって利用される異なるオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーの整列物（いわゆる「アレイ」）は、同様に固相に結合する様式で存在することが好ましい。異なるオリゴヌクレオチド−および／またはＰＮＡ−オリゴマー配列のこのアレイを、長方形の格子または六方格子の形態の固相上に整列させるという点で特徴付けることができる。固相表面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、または金から構成されることが好ましい。しかし、ペレットまたは樹脂マトリックスの形態で存在することができるニトロセルロースおよびナイロンなどのプラスチックを同様に利用可能である。
【００５５】
したがって、本発明のさらなる主題は、結腸癌の等級付け、進行期分類、および／または診断のためのキャリア材料に固定したアレイの製造方法であり、この方法では、本発明に記載の少なくとも１つのオリゴマーを固相に結合させる。このようなアレイの製造方法は、例えば、固相化学および光不安定性保護基を使用した米国特許第５，７４４，３０５号から公知である。
【００５６】
本発明のさらなる主題は、結腸癌の特徴付け、等級付け、進行期分類、および／または診断のためのＤＮＡチップに関する。さらに、ＤＮＡチップは、結腸癌の素因を診断することができる。ＤＮＡチップは、少なくとも１つの本発明に記載の核酸を含む。ＤＮＡチップは、例えば、米国特許第５，８３７，８３２号で公知である。
【００５７】
さらに、本発明の主題は、例えば、亜硫酸水素塩含有試薬、その配列が添付書類で特定されている塩基配列（配列番号３２〜配列番号７５）の１８塩基長のセグメントに対応するか相補的な少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチド組、オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー、ならびに記載の方法を実施および評価するための説明書から構成され得るキットである。しかし、本発明のラインに沿ったキットはまた、上記の成分の一部のみを含むことができる。
【００５８】
本発明に記載のオリゴマーまたはそのアレイならびに本発明に記載のキットは、結腸癌の特徴付け、等級付け、進行期分類、および／または診断または結腸癌の素因の診断に使用することを意図する。本発明によれば、本方法を、ゲノムＤＮＡ内の重要な遺伝的および／後成的パラメータの分析（特に、結腸癌および結腸癌の素因の特徴付け、等級付け、進行期分類、および／または診断用）に使用することが好ましい。
【００５９】
本発明に記載の方法を、例えば、結腸癌の特徴付け、等級付け、進行期分類、および／または診断に使用する。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態は、化学的前処理の必要のないゲノムＤＮＡのメチル化状態の分析方法である。本方法の第１の工程では、ゲノムＤＮＡサンプルを、組織または細胞供給源から単離しなければならない。このような供給源には、細胞株、組織学的スライド、体液、またはパラフィン包埋組織（例えば、脳、中枢神経系、またはリンパ組織）を含み得る。抽出は当業者に標準的な任意の手段であり、これらには、界面活性剤溶解物、超音波処理、およびガラスビーズでのボルテックスの使用が含まれる。一旦核酸が抽出されると、二本鎖ゲノムＤＮＡを、分析で使用する。
【００６１】
好ましい実施形態では、化学処理の前にＤＮＡを切断することができ、これは特に制限エンドヌクレアーゼを使用する当業者に標準的な任意の手段であり得る。本方法の第２の工程では、次いで、ＤＮＡを、メチル化感受性制限酵素で消化する。制限部位でのＤＮＡの加水分解が特定のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態に有益なように消化を行う。
【００６２】
第３の工程では、制限フラグメントを増幅する。好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してこれを行う。
【００６３】
最後の工程では、増幅物を検出する。検出は、当該分野で標準的な任意の手段であってよく、例えば、ゲル電気泳動分析、ハイブリッド形成分析、ＰＣＲ産物への検出可能なタグの組み込み、ＤＮＡアレイ分析、ＭＡＬＤＩ、またはＥＳＩ分析が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明は、さらに、本発明を使用して得たゲノムＤＮＡ内の重要な遺伝的および／または後成的パラメータを別の遺伝的および／または後成的パラメータ組と比較することができ、この相違を患者または個体の不利益または関連する事象の診断および／予後の基礎として使用する、患者または個体に不利益または関連する事象の診断および／または予後に関する。
【００６５】
本発明の文脈では、用語「ハイブリッド形成」は、サンプルＤＮＡにおけるワトソン−クリック型塩基対にしたがった二本鎖構造を形成する完全な相補配列へのオリゴヌクレオチドの結合と理解すべきである。
【００６６】
用語「機能的変異体」は、ＤＮＡ配列に相補的でストリンジェントな条件下で基準配列とハイブリッド形成する全ＤＮＡ配列を意味する。
【００６７】
本発明の文脈では、「遺伝的パラメータ」は、ゲノムＤＮＡおよびその調節にさらに必要な配列の変異および多型である。変異と指定されるのは、特に、挿入、欠失、点変異、逆位、および多型であり、ＳＮＰ（一塩基多型）が特に好ましい。
【００６８】
本発明の文脈では、「後成的パラメータ」は、特に、シトシンメチル化およびさらにその調節にさらに必要とされるゲノムＤＮＡおよび配列のＤＮＡ塩基のさらなる化学修飾である。さらなる後成的パラメータには、例えば、記載の方法を使用して直接分析できないが、同様にＤＮＡメチル化と相関するヒストンのアセチル化が含まれる。
【００６９】
以下では、本発明を、配列および実施例に基づいてより詳細に説明しているが、これに制限されない。
【００７０】
配列番号１〜１１は、遺伝子エストロゲン受容体、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、プロゲステロン受容体、ミオグロビン、ｐｃｎａ、ｃｄｃ２、ｃ−ｅｒbＢ２、ｐ５３、およびＣＥＡのゲノムＤＮＡを示す。これらの配列はＧｅｎｂａｎｋに由来し、現在予測されていない配列材料の全ての小さな変形形態（例えば、小さな欠失およびＳＮＰが含まれるが、これらに限定されない）を含むように選択する。
【００７１】
配列番号１２〜３１は、結腸細胞増殖障害の決定に特に有用なゲノムＤＮＡのセグメントを示す。
【００７２】
配列番号３２〜７５は、遺伝子エストロゲン受容体、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１６、プロゲステロン受容体、ミオグロビン、ｐｃｎａ、ｃｄｃ２、ｃ−ｅｒbＢ２、ｐ５３、およびＣＥＡの化学的に前処理した配列を示す。これらの配列を、現在予測されていない配列材料の全ての小さな変形形態（例えば、小さな欠失およびＳＮＰが含まれるが、これらに限定されない）を含むように選択する。
【００７３】
偶数の配列番号（例えば、配列番号３２、３４、３６、・・・）を有する配列は、それぞれ化学的に前処理されたゲノムＤＮＡ配列を示す。
【００７４】
奇数の配列番号（例えば、配列番号３３、３５、３７、・・・）を有する配列は、それぞれ化学的前処理したゲノムＤＮＡの配列を示す。前記ゲノムＤＮＡは、前の配列に由来するゲノムＤＮＡに相補的である（例えば、配列番号３２由来のゲノムＤＮＡの相補配列は配列番号３３に由来するゲノム配列に由来し、配列番号３３由来のゲノムＤＮＡの相補配列は配列番号３４由来の配列であるなど）。
【００７５】
配列番号７６〜９７は、配列番号３２〜７５に記載の化学的に前処理したＤＮＡの増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチド配列を示す。
【００７６】
配列番号９８〜５２３は、配列番号３２〜７５に記載の化学的に前処理したＤＮＡ内のＣｐＧの位置の分析に特に有用なオリゴマー配列を示す。
【００７７】
以下の実施例は、本発明の範囲を制限することなく本発明を詳細に説明する。
【実施例１】
【００７８】
ＰＣＲの説明
１０ｎｇの亜硫酸水素塩処理ＤＮＡ、６ｐｍｏｌの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、および１単位のＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ（Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ）を使用し、サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｒｄｏｒｆ  ＧｍｂＨ）を使用して１遺伝子ＰＣＲ反応を行った。Ｔａｑポリメラーゼの製造者は他の条件も推奨していた。１つの遺伝子を、９６℃で１４分の最初の変性、その後の３９サイクル（９６℃で６０秒、５５℃で４５秒、７２℃で７５秒）、および７２℃で１０分間の最後の伸長を行うＰＣＲによって増幅した。亜硫酸水素塩ＤＮＡを、結腸腺癌および健常な結腸組織の１２の適合サンプルから個別に単離されたゲノムＤＮＡから公開された手順にしたがって調製した。ゲノムＤＮＡを、ｗｉｚｚａｒｄＤＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して単離した。
【実施例２】
【００７９】
遺伝子ｐ１６のメチル化分析
以下の実施例は、特定のＣＧジヌクレオチドがメチル化について分析される遺伝子ｐ１６のフラグメントに関する。
【００８０】
第１の工程では、異なる塩基が塩基対合挙動に関して置換される一方で塩基の５位でシトシンメチル化が変化しないままである様式で塩基の５位でメチル化されない全シトシンを改変する様式で亜硫酸水素塩（亜硫酸水素、二亜硫酸塩）を使用してゲノム配列を処理する。
【００８１】
亜硫酸水素塩溶液を反応に使用する場合、非メチル化シトシン塩基を添加する。さらに、変性試薬または溶媒ならびにラジカル阻害剤も存在すべきである。その後のアルカリ加水分解により、非メチル化シトシン核酸塩基がウラシルに変換される。次いで、化学的に変換されたＤＮＡを、メチル化シトシンの検出に使用する。本方法の第２の工程では、処理したＤＮＡサンプルを、水または水溶液で希釈する。好ましくは、ＤＮＡをその後変性させる。本方法の第３の工程では、ＤＮＡサンプルを、好ましくは熱耐性ＤＮＡポリメラーゼを使用したポリメラーゼ連鎖反応で増幅する。この場合では、遺伝子ｐ１６のシトシンを分析する。この目的のために、５９８ｂｐ長の定義したフラグメントを、特定のプライマーオリゴヌクレオチドＴＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＧＧＴＴＧＡＧＧ（配列番号８２）およびＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＴＡＡＣＣＡＡＣＣＡ（配列番号８３）を使用して増幅する。
【００８２】
予め固相に結合させたオリゴヌクレオチド（例えば、ＴＡＡＧＴＧＴＴＣＧＧＡＧＴＴＡＡＴ（配列番号２３８））とハイブリッド形成して二本鎖構造を形成するサンプルとして増幅物を使用し、検出すべきシトシンが増幅物の４３９位に存在する。ハイブリッド形成産物の検出は、増幅に使用したＣｙ３およびＣｙ５蛍光標識プライマーオリゴヌクレオチドに基づく。増幅ＤＮＡのオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成反応は、図１Ａの健常な組織で示される亜硫酸水素塩処理ＤＮＡ中のこの位置にメチル化シトシンが存在する場合に限って起こる。したがって、ハイブリッド形成産物から分析すべき特定のシトシンのメチル化状態が推測される。
【００８３】
位置のメチル化状態を評価するために、増幅物のサンプルを、固相に予め結合させた別のオリゴヌクレオチドとさらにハイブリッド形成させる。前記オリゴヌクレオチドは、問題の位置以外はサンプルのメチル化状態を分析するために前に使用したオリゴヌクレオチドと同一である。分析すべき位置で、前記オリゴヌクレオチドはシトシン塩基と対照的にチミジン塩基を含む（すなわち、ＴＡＡＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴＡＡＴ（配列番号２３９））。したがって、ハイブリッド形成反応は、図１Ｂの腫瘍組織で示される分析すべき位置で非メチル化シトシンが存在する場合に限って起こる。
【実施例３】
【００８４】
結腸腫瘍と健常な結腸組織との区別
健常なサンプルと腺癌腫瘍との区別。健常な組織と腫瘍組織との間の腫瘍クラスの予想のために、選択したＣｐＧ部位の組に対してＳｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＳＶＭ）を使用した（Ｆ．Ｍｏｄｅｌ，Ｐ．Ａｄｏｒｊａｎ，Ａ．Ｏｌｅｋ，Ｃ．Ｐｉｅｐｅｎｂｒｏｃｋ、「ＤＮＡメチル化ベースの癌分類のための特徴の選択」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００１年６月、１７日増補版１、Ｓ１５７〜６４）。最初に、２クラスの手段の相違の有意性によって所与の作業のためにＣｐＧ部位をランク付けした。各ＣｐＧの有意性を、２サンプルのｔ検定によって評価した（Ｗ．Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ，Ｔ．Ｓｉｎｃｉｃｈ、「工学的および科学的統計」（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９５））。
【００８５】
メチル化パターンの腺癌腫瘍との関連について、最初に健常な組織および腺癌腫瘍組織のＤＮＡメチル化パターンの比較分析が必要である（図２ＡおよびＢ）。実施例１と同様にこれらの分析を行った。この様式で得られた結果をデータベースに保存し、２群間でメチル化が異なるＣｐＧジヌクレオチドを同定する。例えば、特定のＣｐＧでのメチル化の比較的不正確な定量方法である配列決定またはメチル化高感度「プライマー伸長反応」による非常に正確な様式によって行うことができる個々のＣｐＧメチル化率の決定によってこれを行うことができる。特に好ましい変異体では、前の実施例に示すように、何百何千というＣｐＧのメチル化状態を、オリゴマーアレイに対して分析することができる。例えば、コンピュータによって実行可能な分析物のクラスタ化によって、例えば、パターンを比較することも可能である。
【００８６】
１１個の異なる遺伝子のゲノムフラグメントのパネル（表１に列挙）を、実施例１にしたがって亜硫酸水素塩処理し、一重ＰＣＲによって増幅した。しかし、当業者に自明のように、適切な様式で亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡを増幅する他のプライマーを使用すること、および／または多重形式でＰＣＲを行うことも可能である。しかし、表１に列挙したプライマーオリゴヌクレオチド対が特に好ましい。腺癌腫瘍サンプルと健常なコントロールサンプルとを区別するために、少なくとも６つのＣｐＧジヌクレオチドを含めることによって最適な結果が得られ、この識別に最も有益なＣｐＧの位置は、ｐ１６、ｐ５３、ＣＥＡ、ｃ−ｅｒｂＢ２、およびエストロゲン受容体遺伝子内に存在する（図２および表１を参照のこと）。さらに、パネルの分析した大部分のＣｐＧジヌクレオチドは、２つの表現型の間で異なるメチル化パターンを示した。結果は、メチル化フィンガープリントにより腺癌腫瘍を区別する診断を得ることができ、それにより多数の臨床局面で提供することができることを証明する。
【００８７】
クラスの推測のために、最も有意なＣｐＧの位置に対して最適な数のＣｐＧ部位が分離作業の複雑さに依存するＳＶＭを使用した。ＳＶＭの実施には、１ノルムソフトマージン分離超平面を見出すためのＳｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎアルゴリズムを使用した（Ｎ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ，Ｊ．Ｓｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ、「Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅの導入」、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、２０００）。ボックス制限を、Ｃ＝１０に設定した。８つのグループに分けた無作為に変異したサンプルに対する平均５０回を超える相互検証によって一般化のパフォーマンスを評価した。
【実施例４】
【００８８】
遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ２、ｐ５３、ＣＥＡ、ｐ１６、およびＥＲ１の最も有益なＣｐＧの位置のメチル化状態の分析
遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ２、ｐ５３、ＣＥＡ、ｐ１６、およびＥＲ１の遺伝子フラグメントの最も有益なＣｐＧの位置のメチル化状態を、本実施例に示す。メチル化状態を点で示す実施例２に対応して、表２は、より詳細な方法での結腸腫瘍組織および健常な結腸組織のメチル化状態の計算による種々の患者の異なる遺伝子フラグメントのメチル化状態を記載する。第１の列は特定の遺伝子フラグメントを示し、第２の列は調査したＣｐＧオリゴヌクレオチドを示し、第３の列は調査した組織（Ｔ＝腫瘍、Ｈ＝健常）の診断を示し、第４〜１７の列は１４人の異なる患者の結腸腫瘍組織および健常な結腸組織のＴＧオリゴヌクレオチドに対するＣＧオリゴヌクレオチドの蛍光シグナルの比の対数を示す。例えば、遺伝子ｐ１６（患者１１）のメチル化状態の比較は、このサンプルにおいて健常な組織は腫瘍組織と比較してメチル化が低いことを示す。例えば、患者１１の遺伝子ｃ−ｅｒｂＢ２について逆の比が認められる。この場合、腫瘍サンプルは、健常なサンプルよりもメチル化が高い。ＣｐＧの位置の分析では、健常なコントロールと比較してほとんどの腫瘍サンプルにおいて遺伝子ｐ５３、ＣＥＡ、ｐ１６、およびＥＲ１はメチル化が高く、ｃ−ｅｒｂＢ２のメチル化は低いことを示す。
【実施例５】
【００８９】
メチル化感受性制限酵素消化による遺伝子ＣＥＡおよびｐ１６のＣｐＧ部位のメチル化状態の同定
ＣＥＡ遺伝子では、７つのＣｐＧ部位を含む３５１ｂｐ長の定義したフラグメントを、特定のプライマーオリゴヌクレオチドＴＧＧＴＴＡＡＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＴ（配列番号５２４）およびＴＣＣＴＧＡＧＴＧＡＴＧＴＣＴＧＴＧＴＧ（配列番号５２５）を使用して増幅し、ｐ１６遺伝子では、２６個のＣｐＧ部位を含む３９１ｂｐ長の定義したフラグメントを、特定のプライマーオリゴヌクレオチドＡＴＧＡＣＡＣＣＡＡＡＣＡＣＣＣＣＧＡＴ（配列番号５２６）およびＣＴＧＴＣＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＧ（配列番号５２７）を使用して増幅する。増幅物の１２７位および１２９位にシトシンを含む遺伝子ＣＥＡのＣＧＣＧおよび増幅物の３６２位および３６４位にシトシンを含む遺伝子ｐ１６のＣＧＣＧは、ＳａｃＩＩ制限酵素認識配列ＣＣＧＣＧＧ中に存在する。２つのＣｐＧジヌクレオチドのうちの少なくとも１つのメチル化によってＳａｃＩＩの切断をブロックする。
【００９０】
結腸組織の腺癌および健常な結腸組織から単離したゲノムＤＮＡを、製造者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ＧｍｂＨ）が推奨するＳａｃＩＩで加水分解した。
【００９１】
１０ｎｇのＳａｃＩＩ制限ＤＮＡを、上記のＣＥＡおよびｐ１６遺伝子フラグメントの増幅用のテンプレートとして使用した。１０ｎｇのＤＮＡ、６ｐｍｏｌの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、および１単位のＨｏｔｓｔａｒｔＴａｑ（Ｑｉａｇｅｎ  ＡＧ）を使用し、サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＧｍｂＨ）を使用してＰＣＲ反応を行った。Ｔａｑポリメラーゼの製造者は他の条件も推奨していた。上記のプライマーを使用して、９６℃で１４分の最初の変性ステップ、その後の３０〜４５サイクル（ステップ２：９６℃で６０秒、ステップ３：５５℃で４５秒、ステップ４：７２℃で７５秒）、および７２℃で１０分間の最後の伸長を行うＰＣＲによって遺伝子フラグメントを増幅した。ＰＣＲ産物の存在を、アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００９２】
サイクルプログラムのステップ２〜ステップ４を３４、３７、３９、４２、および４５倍繰り返した場合の結腸癌組織から単離したＳａｃＩＩ加水分解ＤＮＡを使用して、ＰＣＲ産物を検出することができる。対照的に、サイクルプログラムのステップ２〜ステップ４を４２および４５倍繰り返した場合の健常な結腸組織から単離したＳａｃＩＩ加水分解ＤＮＡを使用しても、ＰＣＲ産物はわずかしか検出されない。これらの結果は、分析したＣＥＡおよびｐ１６遺伝子フラグメントのＳａｃＩＩ認識配列内に存在する少なくとも１つのＣｐＧの位置が健常なコントロールと比較して癌サンプルでより高いメチル化状態を示したことを示す。
【００９３】
【表１】
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【００９４】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】表面結合オリゴヌクレオチドへの蛍光標識増幅物のハイブリッド形成を示す図である。サンプルＡは健常な組織に由来し、サンプルＢは結腸腺癌組織に由来する。矢印で示した点での蛍光は、オリゴヌクレオチドに対する増幅物のハイブリッド形成を示す。配列ＴＡＡＧＴＧＴＴＣＧＧＡＧＴＴＡＡＴ（配列番号２３８）を含むオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成は、分析されるシトシンの位置でのメチル化を示し、ＴＡＡＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴＡＡＴ（配列番号２３９）を含むＴＧオリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成は分析されるシトシンの位置でのメチル化が起こらないことを示す。サンプルＡでは遺伝子ｐ１６の増幅物のＣＧの位置についてメチル化されず、相対的にサンプルＢでは同一の位置でのメチル化度はより高いことが認められる。
【図２】結腸腫瘍（Ａ）と健常な組織（Ｂ）との区別。メチル化の確率の高い部分は赤に対応し、不確実な部分は黒に対応し、確率の低い部分は緑に対応する。プロットの左側の標識は遺伝子（例えば、最高：２０６４）およびＣｐＧ（最高：１４８５Ａ）識別子である。表１に示すようなプライマーオリゴヌクレオチドを使用した一重ＰＣＲ反応によって作製したＣｙ５標識増幅物を使用してハイブリッド形成を行った。右側の標識は、２つの群の手段の相違の有意性（ｐ値、ｔ検定）を示す。各行は１つのＣｐＧに対応し、各列は１つのサンプルのメチル化レベルに対応する。２つの病変の差異診断の特徴への寄与にしたがってＣｐＧを配列し、上から下にかけて寄与が増大する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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