(57)【要約】  ヤマノイモ科、オオバコ科またはナス科の圧潰された植物原材料から水を用いた抽出によって得られ、分子量１２００〜４００００ｋＤならびにグルコース対ウロン酸重量比１：２〜４を持つ水溶性酸性ペプチドグリカンである、免疫刺激、抗ウィルスおよび／または抗菌活性を持つ物質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤマノイモ科、オオバコ科またはナス科の圧潰された植物原材料から水を用いた抽出によって得られ、分子量１２００〜４００００ｋＤならびにグルコース対ウロン酸重量比１：２〜４を持つ水溶性酸性ペプチドグリカンである、免疫刺激、抗ウィルスおよび／または抗菌活性を持つ物質。
【請求項２】
ペプチド部分が酸性ペプチドグリカンの総質量の１３±３％を構成する、請求項１に記載の物質。
【請求項３】
１０〜１５％のパルミチン酸およびステアリル酸を２．４：１の比で含有する、請求項１または請求項２に記載の物質。
【請求項４】
治療用途のための、先行請求項のいずれかに記載の物質。
【請求項５】
先行請求項のいずれかに記載の物質、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項６】
液体形である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
向上した抗体合成により改善可能な症状の治療に使用する医薬品の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の物質の使用。
【請求項８】
活性化マクロファージにより改善可能な症状の治療に使用する医薬品の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の物質の使用。
【請求項９】
活性化単球により改善可能な症状の治療に使用する医薬品の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の物質の使用。
【請求項１０】
活性化ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）により改善可能な症状の治療に使用する医薬品の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の物質の使用。
【請求項１１】
活性化顆粒球により改善可能な症状の治療に使用する医薬品の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の物質の使用。
【請求項１２】
活性化サイトカイン合成により改善可能な症状の治療に使用する医薬品の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の物質の使用。
【請求項１３】
活性化インターフェロン合成により改善可能な症状の治療に使用する医薬品の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は免疫刺激剤として活性である植物抽出物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
生物活性多糖類は、ジャガイモ球茎の芽の圧潰、沸騰水による抽出、１６〜１８時間の２０℃での維持、抽出物の分離、２０日以上の保存、分子量による分画、および１００００ダルトンを超える分子量を持つ物質の抽出、続く濃縮および乾燥によって生成されてきた（ロシア特許第２１０８８００Ｃ１号，Ａ６１Ｋ  ３５／７８，２０．０４．１９９８）。この方法で製造された物質は抗ウィルスおよび抗菌特性を所有する。
【０００３】
免疫刺激活性を所有する多糖類は、植物材料のホルムアルデヒド水溶液による処理、酸水溶液中での保存、ペクチン多糖類のシュウ酸アンモニウム水溶液による抽出、および凍結乾燥によって製造されてきた。例えばウキクサ類などの雑草の任意の種、およびより高等な植物、例えばＯｂｅｒｎａ  ｂｅｈｅｎ（Ｌ）の精細に切断された「水面上」部分などの、淡水花植物が原材料として使用される（ロシア特許第２１４９６４２Ｃ１号，Ａ６１  Ｋ３５／７８，２７．０５．２０００）。
【０００４】
Ｌ．Ａ．ＣｈｅｋａｎｏｖｓｋａｙａおよびＡ．Ｖ．Ｇｅｎｅｒａｌｏｖは、ジャガイモＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍの芽からの生物活性調製物「ガンマプラント」の抽出および特性を開示している。Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ  Ｊｏｕｒｎａｌ（２０００）３４（３）：５１−５６を参照。その製造は、原材料の圧潰、沸騰水による抽出、水性抽出物の遠心分離、濃縮およびアセトンによる沈殿、全生成物の精製および乾燥を含む。精製は通常であり、透析、ＡｃＡ４４でのゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、および最終段階におけるＨＰＬＣを含む。この方法を用いて製造した物質は、７０ｋＤの分子量を持ち、炭水化物９０%およびタンパク質１０％を含む、糖タンパク質である。ガンマプラントの炭水化物部分は、グルコース７０％、アラビノース３．７%、キシロース２．０８%、ガラクトース６．８４％、マンノース０．５８％、アミノ糖類１％、ウロン酸５．１％より成る。
【発明の概要】
【０００５】
本発明により、免疫刺激、抗ウィルスおよび抗菌活性を持つ新規物質をヤマノイモ科、オオバコ科またはナス科の圧潰植物原材料から抽出することができる。特に、水性抽出物を遠心分離にかけ、次に濃縮して、そして塩化ナトリウムの存在下で９６％のエタノールによって沈殿させる。沈殿物を溶解させ、生理的食塩水または酸を用いて再沈殿させ、そのようにして得られた粗酸性ペプチドグリカンをアルカリまたはアルカリ金属塩の飽和溶液によって処理する。浄化した酸性ペプチドグリカンは、ゲルクロマトグラフィーを用いて精製し、次に乾燥させる。
【０００６】
そのような方法は、操作の特定の順序によって、強力な免疫刺激、抗ウィルスおよび抗菌活性を持ち、１２００〜４００００ｋＤの分子量、および１：２〜４のグルコース対ウロン酸重量比を持つ水溶性酸性ペプチドグリカンである、新たな物質を与える。薬学的組成物は、ペプチドグリカンとともに１種以上の薬学的に許容される充填剤および／または担体を含んでもよい。
【好ましい実施形態の説明】
【０００７】
所与の方法は、好ましくは、植物の葉、茎、根、球茎および／または芽を使用する。植物の別の部分は、その発生から成熟までのどの段階でも使用できる。
【０００８】
二次沈降の間、セタブロンまたは塩化カルシウムは好ましくは塩として使用される。有機または無機酸、あるいは酸性非有機塩は、酸性剤として使用できる。二次沈降は、粗酸性ペプチドグリカンが各種の付随する多糖類およびタンパク質から分離されるようにする。
【０００９】
酸性ペプチドグリカン生成物は、例えばゲルクロマトグラフィーを使用して精製できる。ＴＳＫ  ＨＷ−７５Ｆ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ２Ｂまたは４Ｂ  ＣＬが適切なクロマトグラフィー剤である。
【００１０】
新規物質のペプチド部分は、ペプチドグリカン分子全体の質量の１３±３％を構成する。ペプチドの量はウシ血清アルブミンを標準として用いたローリー法を使用して測定した（Ｌｏｗｒｙ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ（１９５１）１９３：２６５−２７５）。表１に示す分析が得られた（５種類の支配的なアミノ酸を示す）。
【００１１】
【表１】
2005515266.tif 000002
【００１２】
分子の多糖類部分は、以下より成ることが見いだされた。
ガラクトウロン酸  １８＋６％
グルコース  ９〜３％
ガラクトース  ５．５＋２％
マンノース  ０．７＋０．２５％
アラビノース  ３．８＋１．３％
ラムノース  １．９＋０．９％
【００１３】
酸性糖は、濃硫酸での３，５−ジメチルフェノールとの発色反応に基づいて決定した（Ｕｓｏｖｅｔ等，Ｂｏｔａｎｉｃａ  Ｍａｒｉｎａ（１９９５），３８：４３−５１）。３−メチルシリル誘導体の形のウロン酸のガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）を用いて、酸性ペプチドグリカン中のガラクトウロン酸の支配的存在が見出された（Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１１８：３−４０）。中性糖は、その酢酸ポリオール形でのＧＬＣ分析を用いて検出した（Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ，同上）。
【００１４】
以下に報告する結果から明らかとなるように、本発明の物質は、各種の有益な特性を持つ。抗体合成増強または活性化マクロファージ、単球、ＮＫ細胞、顆粒球またはサイトカインまたはインターフェロン合成のどれかによって改善できる、ヒトまたは他の哺乳類または動物における症状の治療（予防を含む）に使用することができる。そのような症状は当業者に既知である。
【００１５】
使用時に、物質は通常、許容される担体を含む薬学的組成物として調合されるであろう。適切な担体の例（液体でもよい）は、当業界で周知であり、所望の投与経路にしたがって選択されるであろう。経路およびまた投薬は、症状の重症度、患者の状態、他の治療などの通常の要因に応じて、当業者がただちに選択することができる。これらの要因に関する指針は、以下の実施例によって与えられる。
【００１６】
以下の実施例は本発明を説明するものである。
［実施例１］
【００１７】
ヤマノイモ科ヤマノイモ属（Ｄ．ｃｕａｃａｓｉａ  Ｌｉｐｓｋｙ）の根部分の植物細胞を培地で培養した。インキュベーション期間の終わりに、細胞塊を濾過によって分離し、上澄を濃縮し、蒸留水で透析して、凍結乾燥させた。
【００１８】
培養液から製造した乾燥混合物５ｇに蒸留水５００ｍｌを添加した。抽出は室温にて３時間実施した。不溶性沈降物は遠心分離を用いて廃棄した。上澄を体積２００ｍｌに濃縮した。その中に塩化ナトリウム２００ｍｇを溶解させ、次に９６％のエタノール６００ｍｌを添加した。沈降物を遠心分離により４０００ｒｐｍにて３０分間抽出した。次に沈降物を、９６％のエタノール５０ｍｌを用いて洗浄し、遠心分離にかけ、そして空気流の下で乾燥させた。
【００１９】
上述のように得られた乾燥生成物１ｇを蒸留水２００ｍｌ中で室温にて１時間混合することによって希釈した。この溶液に１０％のトリクロロ酢酸溶液５ｍｌを添加した。生じた沈殿物、すなわち酸性粗ペプチドグリカンを遠心分離によって分離し、そして水で洗浄した。続いて蒸留水５０ｍｌを添加し、混合しながら、沈降物の完全な溶解が行われるまで２５%のアンモニア溶液を滴下して添加した。
【００２０】
生成した溶液をゲルクロマトグラフィーのためにＴＳＫ  ＨＷ−７５Ｆカラムに導入した。水を用いて画分をカラムから溶出させた。分子量１２００〜４００００ｋＤを持つ第一の高分子量ピークを収集した。画分を回転蒸発器で濃縮し、凍結乾燥させた。
【００２１】
酸性ペプチドグリカンの収量は３９ｍｇであった。グルコース対ウロン酸の比は１：３であった。ペプチド含有率は１１．２％であった。
［実施例２］
【００２２】
ヤマノイモ科ヤマノイモ属（Ｄ．ｃｕａｃａｓｉａ  Ｌｉｐｓｋｙ）の新鮮な茎１００ｇを圧潰した。蒸留水５００ｍｌを添加し、圧潰生成物を３０〜４０℃にて５時間抽出した。混合物は機械プレスを用いて搾り、水性抽出物を収集し、透析して、そして蒸発器を用いて体積１００ｍｌまで濃縮した。塩化ナトリウム１００ｍｇを濃縮物に添加し、その後、９６％のエタノール３００ｍｌを添加した。沈殿物を遠心分離により４０００ｒｐｍにて３０分間抽出した。次に沈降物は９６％のエタノール３０ｍｌを用いて洗浄し、遠心分離にかけ、そして空気流の下で乾燥させた。
【００２３】
上述のように得られた乾燥生成物１ｇを蒸留水２００ｍｌ中で室温にて１時間混合することによって希釈した。不溶部分を廃棄し、濃塩酸５ｍｌを上澄に添加した。生じた沈降物を遠心分離によって分離し、水中で洗浄した。続いて蒸留水５０ｍｌを添加し、混合しながら、沈降物の完全な溶解が行われるまで２５%のアンモニア溶液を滴下して添加した。
【００２４】
水を用いて画分をカラムから溶出させた。分子量１２００〜４００００ｋＤを持つ第一の高分子量ピークを収集した。画分を蒸発器で濃縮し、次に凍結乾燥させた。
【００２５】
酸性ペプチドグリカンの収量は１６ｍｇであった。グルコース対ウロン酸の重量比は１：２．２であった。ペプチド含有率は１４．７%であった。
［実施例３］
【００２６】
オオバコ科（Ｐ．ｍａｊｏｒ  Ｌ．）からの新たに収穫したオオバコ葉１００ｇを蒸留水５００ｍｌ中で圧潰し、３０〜４０℃で加熱しながら４時間抽出した。混合物は機械プレスを用いて搾り、水性抽出物を収集し、透析して、そして蒸発器を用いて体積１００ｍｌまで濃縮した。塩化ナトリウム１００ｍｇを濃縮物に添加し、その後、９６％のエタノール３００ｍｌを添加した。沈殿物を遠心分離により４０００ｒｐｍにて３０分間抽出した。次に沈降物は９６％のエタノール３０ｍｌを用いて洗浄し、遠心分離にかけ、そして空気流の下で乾燥させた。
【００２７】
乾燥生成物１ｇを蒸留水２００ｍｌ中で室温にて１時間混合することによって希釈した。不溶部分を廃棄し、濃塩酸５ｍｌを上澄に添加した。生じた沈降物を遠心分離によって分離し、水中で洗浄した。続いて蒸留水５０ｍｌを添加し、混合しながら、沈降物の完全な溶解が行われるまで２５%のアンモニア溶液を滴下して添加した。
【００２８】
生成した溶液をゲルクロマトグラフィーのためにＴＳＫ  ＨＷ−７５Ｆカラムに導入した。水を用いて画分をカラムから溶出させた。分子量１２００〜４００００ｋＤを持つ第一の高分子量ピークを収集した。画分を蒸発器で濃縮し、次に凍結乾燥させた。
【００２９】
酸性ペプチドグリカンの収量は１６ｍｇであった。グルコース対ウロン酸の重量比は１：２．７であった。ペプチド含有率は１３．８％であった。
［実施例４］
【００３０】
酸性ペプチドグリカンを抽出するために、濃塩酸５ｍｌを使用する代わりに、ＮＨ４ＮＯ３または（ＮＨ４）２ＳＯ４の濃縮溶液２００ｍｌを使用することを除いて、実施例３を繰り返した。
【００３１】
最終生成物の収量は１４ｍｇであった。グルコースとウロン酸との質量相関は１：２．４であった。ペプチド含有率は１５．８%であった。
［実施例５］
【００３２】
ナス科（Ｓ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）からのジャガイモ芽５ｋｇを水１０Lとともに圧潰し、拡販しながら室温にて２時間抽出した。混合物を機械プレスで搾った。水抽出物を透析し、１０ｋＤ中空繊維カートリッジを用いて限外濾過によって１リットルまで濃縮した。
【００３３】
塩化ナトリウム１ｇを濃縮物に添加し、その後、９６％のエタノール３００ｍｌを添加した。沈殿物を遠心分離により４０００ｒｐｍにて３０分間抽出した。次に沈降物は９６％のエタノール３０ｍｌを用いて洗浄し、遠心分離にかけ、そして空気流の下で乾燥させた。
【００３４】
乾燥生成物１０ｇを蒸留水１リットル中で室温にて１時間混合することによって希釈した。不溶部分を廃棄し、５％の塩化カルシウム１５０ｍｌを上澄に添加した。沈降物、すなわち酸性ペプチドグリカンを遠心分離によって分離した。次に塩化ナトリウムの飽和溶液中に５０℃にて攪拌しながら、ポリマーが完全に可溶化するまで溶解させた。
【００３５】
生成した溶液をゲルクロマトグラフィーのためにＴＳＫ  ＨＷ−７５Ｆカラムに導入した。水を用いて画分をカラムから溶出させた。分子量１２００〜４００００ｋＤを持つ第一の高分子量ピークを収集した。画分を蒸発器で濃縮し、次に凍結乾燥させた。
【００３６】
酸性ペプチドグリカンの収量は１７０ｍｇであった。グルコース対ウロン酸の重量比は１：４であった。
［実施例６］
【００３７】
ジャガイモ塊茎を使用し、二次沈降で９％のセタブロン溶液を塩として用いたことを除いて、実施例４を繰り返した。酸性ペプチドグリカンのアウトプットは１１４ｍｇであった。グルコースおよびウロン酸の重量比は１：３．５であった。ペプチド含有率は１６％であった。
［実施例７］
【００３８】
実施例３で得た酸性ペプチドグリカン２１．４ｍｇにトリフルオロ酢酸０．１Ｍ中で１００℃にて２時間にわたって部分加水分解を受けさせた。加水分解中に形成された沈降物は、遠心分離によって得られ（１３０００ｒｐｍ、２分間）、トリフルオロ酢酸および水を用いて洗浄し、次に凍結乾燥させた。沈降物（記号化Ｌ−１）の収量は１．５ｍｇであった。沈降物除去後に残った溶解性物質は真空気化によって乾燥させ、次にエタノール中で可溶化させて、微量のトリフルオロ酢酸を除去するために乾燥させた。残りを水３ｍｌに溶解させ、不溶性物質を遠心分離によって沈殿させて、水で洗浄し、凍結乾燥させた。
【００３９】
沈降物（Ｌ−２）の収量は１．５ｍｇであった。沈降物Ｌ−１およびＬ−２の総収量は、酸性ペプチドグリカンの初期質量の約１４％であった。沈降物は脂質によって表されることが見出された。
【００４０】
沈降物の加メタノール分解は以下のように実施した。Ｌ−１  ０．８ｍｇおよびＬ−２  ０．９ｍｇのサンプルはそれぞれ無水メタノール１ｍｌと混合し、次に塩化アセチル０．１ｍｌを上の各反応混合物に添加した（冷）。反応混合物はソルダーガラスアンプル中で１００℃にて４時間加熱し、これは沈降物の完全な溶解につながった。反応混合物は真空気化によって乾燥させ、次にクロロホルム１ｍｌを添加し、ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）およびクロマト質量分析計を用いて溶液を検査した。
【００４１】
両方のサンプル（Ｌ−１およびＬ−２）のＧＬＣスペクトルは同一であった。各スペクトルは２個の信号を持っていた。ＧＬＣはＣａｒｌｏ  Ｆｒａｃｔｏｖａｐ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４２００で実施した（ガスキャリアＨｅ、インジェクタ温度２８０℃、カラム−Ｕｌｔｒａ−１（２５ｍ×０．２ｍｍ×０．３３ｐｍ））。
【００４２】
マススペクトルは、パルミチン酸およびステアリル酸のメチルエステルの存在を比２：１で示した。イオン捕捉ＩＴＤ−７００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ、電子衝突  ７０ＥＶ、質量範囲  ｍ／ｚ３９−４５０、走査速度  １走査／秒、保持累積２４０秒）質量分析計を使用した。
［実施例８］  抗体合成の活性化
【００４３】
本実施例は、異種抗原と同時の酸性ペプチドグリカン（ＡＰＧ）の注射が、注射された抗原に特性の抗体生成の実質的な増強につながることを示す。実験では、マウスＣＢＡ、Ｃ５７ＢＩ／６、（ＣＢＡｘＣ５７ＢＩ／６）Ｆ１およびＢＡＬＢ／ｃを使用した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵アルブミン（ＥＡ）またはヒツジ赤血球（ＳＥ）をマウス免疫付与のための抗原として使用した。
【００４４】
ヒツジ脱線維素血液の赤血球を体積５０倍のハンクス溶液中で遠心分離により３回洗浄し（１０００ｒｐｍ、１０分）、同じ溶液中で再懸濁させた。マウスは、腹腔内へのＳＥ  ２ｍｌ、ＢＳＡ  ２００μｇまたはＥＡ  ５０μｇによって免疫付与した。後者の２つの抗原は、２〜４週の免疫付与の間隔で２回注射した。
【００４５】
ＡＰＧの適量を、使用の２〜３時間前にハンクス溶液または生理的食塩水に溶解させた。ＡＰＧは１〜１０００μｇの用量でマウスに投与した。ＢＳＡ、ＥＡまたはＳＥによってマウスに免疫付与したときに、抗原と同時にＡＰＧを投与した。
【００４６】
ＳＥによって免疫付与されたマウスにおける免疫反応の強度は、ＪｅｒｎｅおよびＮｏｒｄｉｎ（１９６３）の方法を用いて、脾臓細胞懸濁液中で検出された抗体形成細胞（ＡＦＣ）の数によって決定した。ＡＦＣは免疫付与の４〜５日後に検出した。マウス血清におけるＥＡまたはＢＳＡに対して特異性である抗体の存在は、固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を用いて検出した。ＢＳＡに対して特異性である抗体のアイソタイプは、マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３に対して特異性であるウサギ二次抗体を用いてＥＩＡによって決定した。
【００４７】
ＢＳＡおよびＡＰＧによる免疫付与後のマウス血清におけるＢＳＡに対して特異性である抗体のレベル（ＥＩＡ力価）は１：２００００に達したが、これに対してＢＳＡ単独を用いた免疫付与に対する反応のレベルは、はるかに低く、ＥＩＡ力価１：５００に達したのみであった。ＢＳＡに対する二次免疫反応の寿命も、抗原がＡＰＧと併用された場合に増加した。この場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３アイソタイプの抗体が優勢であった。ＢＳＡに対して特異性であるＩｇＭおよびＩｇＧ２ｂの生成は、ＡＰＧの影響下でより少ない程度まで増加した。アジュバントの効果は、ＡＰＧの用量に大きく依存した。ＡＰＧ  １０μｇの用量は、ＳＥに対する一次免疫反応を向上させるために最適であったが、これに対してＡＰＧ  １μｇの用量は、ＢＳＡに対する二次免疫反応の刺激に最適であった。
【００４８】
ＢａＢｂ／ｃマウスでのＥＡ特異性抗体の生成に対するＡＰＧの影響は、表２に示すデータによって明らかにされる。リポペプチドは、周知の免疫アジュバントである、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４であった。
【００４９】
【表２】
2005515266.tif 000003
［実施例９］  組織マクロファージの活性化
【００５０】
本実施例は、腹腔滲出液から採取したマウスの組織マクロファージがＡＰＧの存在下で、インビトロ培養によって強力に活性化されることを示す。活性化はその代謝および酵素活性においてと同様に、その形態（その大きさおよび形状が変化した細胞）において見られた。
【００５１】
（ＣＢＡｘＣ５７ＢＩ／６）Ｆ１マウスに、培地１９９  ３ｍｌを用いて腹腔内注射した。腹腔滲出液を注射５分以内に収集した。１０〜１５のマウスによる滲出液を同じシリコン処理遠心分離管に収集し、１０００ｒｐｍにて１０分間スピンダウンした。細胞ペレットを再懸濁させ、１ｍｌあたり腹腔滲出細胞２〜２．５ｍｌｎまで濃度を調節した。
「マクロファージによる酸化ラジカルの生成」
【００５２】
ＰＥＣの細胞懸濁液１ｍｌをケミルミノグラフ試験管に注入し、空気中に５％のＣＯ２の湿潤環境で３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーションの後、培地１９９を用いて非接着性細胞を洗い流した。１ｍｌあたり０〜５０μｇのＡＰＧを含有する完全培養液（ＲＰＭＩ−１６４０、ＦＣＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、およびゲンタマイシン１０μｇ／ｍｌ）１ｍｌを、各管内にその管に付着した接着性細胞の上に注入した。次に管を２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、培養液を、ハンクス溶液（フェノールレッドを除く）、グルコース５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ緩衝液１０ｍＭおよびルミノール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）０．６２ｍＭから調製した緩衝溶液（ｐＨ７．２）０．５ｍｌと交換した。
【００５３】
接着性マクロファージによる酸化ラジカルの生成は、自発的およびザイモザン誘発性化学発光のレベルとして評価した。３つの実験の合計の結果を、細胞１ｍｌｎ、１分間あたりの平均衝撃数で表す。２４時間にわたるＡＰＧの存在下での接着性マクロファージのインキュベーションは、その自発的化学発光のレベルに影響を与えなかったが、微生物細胞壁の成分であるザイモザンに反応して酸化代謝産物を生成する細胞の能力をかなり（５０％まで）向上させた。マクロファージの化学発光活性の上昇は、０．２μｇ／ｍｌ  ＡＰＧにてすでに開始し、５．５μｇ／ｍｌ  ＡＰＧにてその最大値に達する。この用量依存性は、ＡＰＧ濃度とよく相関し、その形態変化によって評価されるマクロファージの最大活性化につながる。
「マクロファージ膜上の５’−ヌクレオチダーゼ（５’−ＮＴＤａｓｅ）の活性」
【００５４】
５’−ＮＴＤａｓｅ酵素のレベルの検出は、マクロファージ活性化の評価の高度に有益な方法のひとつである。免疫調節剤の影響下でのこの酵素活性の低下が、その免疫向上および抗感染効力とよく関連していることが既知である。
【００５５】
腹腔マクロファージの５’−ＮＴＤａｓｅのレベルに対するＡＰＧの影響を判定するために、（ＣＢＡｘＣ５７ＢＩ／６）Ｆ１マウスに、生理的食塩水０．５ｍｌ中のＡＰＧ  ３０μｇを腹腔内注射した。対照マウスには、ＡＰＧなしの生理的食塩水０．５ｍｌを注射した。注射の２４時間後、各マウスの腹膜を培地１９９で洗浄することによって、腹腔滲出液の細胞を採取した。体積１０ｍｌのＰＥＣの懸濁液を１００ｍｍペトリ皿に入れ、次に３７℃および５％のＣＯ２にて２時間インキュベートした。非接着性細胞を除去し、これに対して接着性細胞はゴム製ポリスマンを使用して皿表面から採取し、次にＰＥＣ濃度を体積５０μｌ中２ｍｌｎに調整した。懸濁液のこの量を９６ウェルマイクロタイタープレートに入れ、次に５’−アデノシンモノホスフェートを５’−ＮＴＤａｓｅのサブストレートとして添加し、細胞を上述の条件下で６０分間インキュベートした。インキュベーション後にすべてのウェルに配置されたモリブデン試薬の発色強度にしたがって、光度測定（λ６２０ｎｍ）を用いて酵素活性を測定した。結果を１ｍｌｎ  ＰＥＣあたりの光学密度の単位として、および対照レベルのパーセントでの相対５’−ＮＴＤａｓｅ活性として示した。ＡＰＧ存在下での５’−ＮＴＤａｓｅの活性は、対照レベルの１６％であった。
［実施例１０］  ヒト免疫系の活性化
【００５６】
本実施例は、ヒト末梢血中を循環する免疫系細胞に対するＡＰＧのインビトロ影響を示す。
「ヒトＮＫ細胞の活性化」
【００５７】
ヒトＮＫ細胞に対するＡＰＧ影響の結果としての活性化マーカーの出現は、三色レーザ血球計算を用いて見出された。ヘパリン処置血は、「Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ」システム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いて健常ドナーの静脈穿刺によって採取した。ＡＰＧ調製物は溶媒ＲＰＭＩ−１６４０中で１ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、０．２２ｍｃｍフィルタによる濾過によって滅菌した。ＡＰＧ０．０１６〜１００μｇ／ｍｌの２倍の連続濃度を溶媒ＲＰＭＩ−１６４０で調製し、４８ウェルＮｕｎｃ培養プレートのウェルに０．２ｍｌの量として入れた。負の対照として、ＡＰＧなしのＲＰＭＩ−１６４０  ０．２ｍｌを使用した。各ウェルにヘパリン処置血０．２ｍｌを添加した。サンプルは３７℃および５％のＣＯ２にて３〜４８時間インキュベートした。インキュベーション後、血液サンプル０．０５ｍｌを１．２ｍｌプラスチック管に入れた。以下の抗体５μｌを挿入した。抗ＣＤ１６−ＦＩＴＣ（Ｓｏｒｂｅｎｔ）、抗ＣＤ６９−フィコエリトリン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、抗ＣＤ３−ＰｅｒＣＲ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。管を５秒間振り、次に室温にて暗所で２０分間にわたってインキュベーションした。溶解固定溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１ｍｌを各試験管に添加し、次に室温にて１５分間維持した。試験管を３００ｇにて１０分間遠心分離にかけ、上澄液を除去し、細胞ペレットを等張溶液０．５ｍｌ中で再懸濁させた。
【００５８】
レーザ作動式蛍光サイトフルオロメータ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）の使用、およびＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェアの使用は、ＮＫ細胞のわずか７％が、ＡＰＧ不在下で活性化マーカーであるＣＤ６９を発現するが、細胞培養物中に１０μｇ／ｍｌ  ＡＰＧが存在すれば、実際にはすべて（９６％）のＮＫ細胞が活性化され、そしてＣＤ６９を発現することを示した。
「ＡＰＧの影響下でのＮＫ細胞の細胞溶解活性の上昇」
【００５９】
単核画分は、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配遠心分離（３０分、室温にて３０分間、３００ｇ）を使用して、ヘパリン処置血から得た。細胞を培地１９９で洗浄し、１０％ウシ胎仔血清、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）および１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加した、ＲＰＭＩ−１６４０を含む完全培地（ＣＭ）中に２ｍｌｎ／ｍｌで懸濁させた。細胞懸濁液１ｍｌを１２ウェルＮｕｎｃ培養プレートの各ウェルに入れ、次にＣＭ（対照）１ｍｌ、２０μｇ／ｍｌでＡＰＧ溶液１ｍｌまたはインターロイキン−２（ＩＬ−２、２０ＭＥ／ｍｌ、標準ＮＫ細胞活性化物質）１ｍｌを細胞培養物に添加した。培養物を５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃にて３時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を遠心分離管に収集し、遠心分離（１０分間、３００ｇ）によって沈降させ、そしてＣＭ  １ｍｌあたり５ｍｌｎ細胞の濃度で再懸濁させた。回収した細胞は細胞溶解エフェクタとして作用した。ＣＭ中のエフェクタ細胞の連続２倍希釈物３組を、９６ウェル丸底培養プレートに導入した（体積０．１ｍｌ）。Ｋ５６２細胞系源の３H−ウリジン標識標的細胞１０，０００個を各培養ウェルに添加した。エフェクタおよび標的細胞の混合物を５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃にて４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞はＴｉｔｅｒｔｅｋ  Ｃｅｌｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ  ５５０を用いて紙フィルタ上に移動し、次にＷａｌｌａｃ  １４０９メータを用いて放射能レベルをカウントした。
【００６０】
ＡＰＧ存在下でのエフェクタ細胞の３時間のインキュベーションの後、２９％のＮＫ細胞はＣＤ６９を発現し、それは細胞が活性化されたことを意味した。Ｋ５６２腫瘍標的細胞の対するそのようなＡＰＧ活性化エフェクタ細胞の細胞溶解活性の試験は、ＡＰＧの影響下で、ＮＫ細胞が標的細胞を殺す能力の上昇を示した。これは低いエフェクタ対標的比において、特に、ＮＫ細胞の細胞溶解能力がＡＰＧの影響下で３倍上昇した、比６．２５および１２．５において、さらに明らかであった。ＡＰＧは、ＣＤ６９の発現またはＫ−５６２腫瘍細胞に対する死滅活性のどちらによって評価されたかにかかわらず、ＮＫ細胞の活性化においてＩＬ−２よりも有効であった。
「顆粒球の活性化」
【００６１】
各種の細胞に対する活性化マーカーの発現の試験は、ＡＰＧが顆粒球上でＣＤ６９発現を誘発することを示した。顆粒球の活性化は、ＡＰＧの存在下でのインビトロインキュベーションの２４時間後に明らかであった。このとき、顆粒球の６０％がＣＤ６９を発現していた。
［実施例１１］  サイトカインの合成および分泌の活性化
【００６２】
本実施例は、ＡＰＧがヒト血液細胞におけるサイトカイン生成を活性化することを示す。例えばＡＰＧは、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−８（ＩＬ−８）の生成を開始する。
【００６３】
ヘパリン処置血は、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）を用いて健常ドナーの静脈穿刺によって採取した。ＡＰＧ調製物は溶媒ＲＰＭＩ−１６４０中で１ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、０．２２ｍｃｍフィルタによる濾過によって滅菌した。０．０１６〜１００μｇ／ｍｌ  ＡＰＧの２倍連続濃度を溶媒ＲＰＭＩ−１６４０で調製し、４８ウェルＮｕｎｃ培養プレートのウェルに０．２ｍｌの量として入れた。負の対照として、ＡＰＧなしのＲＰＭＩ−１６４０  ０．２ｍｌを使用した。各ウェルにヘパリン処置血２ｍｌを添加した。
【００６４】
サンプルは３７℃および５％のＣＯ２で３〜４８時間インキュベートした。インキュベーション後、培地０．２ｍｌを０．５ｍｌ遠心分離試験管に収集し、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離にかけた。上澄を−７０℃で凍結させ、分泌サイトカインを決定するのに使用した。培養ウェルに残った細胞をピペットで静かに吸い上げ、１．２ｍｌプラスチック製試験管に移して、フローサイトメトリーを使用して細胞活性化マーカーを決定した。培養上澄中のＩＬ−１β濃度は、ＥＩＡを用いて決定した。Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（フランス）が製造したＩＬ−１βキットを、製造者の指示にしたがって使用した。ＴＮＦ−αおよびＩＬ−８は、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ベルギー）による各ＥＩＡキットを用いて測定した。発色強度は、Ｄｙｎａｔｅｃｈ（スイス）が製造した自動光度計（４５０ｎｍ）リーダーを使用して測定した。
【００６５】
細胞内サイトカインは、三色レーザ活性化フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国）を使用してヒト血液単球内で検出した。ヘパリン処置血は、各種濃度のＡＰＧおよび真核細胞中のタンパク質分泌の阻害剤である、１０μｇ／ｍｌブレフェルジンを含有するＲＰＭＩ−１６４０によって１：１で希釈した。サンプルは３７℃および５％のＣＯ２（Ｓｉｇｍａ，米国）で５時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液０．１ｍｌを取り、溶解固定溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を添加した。混合物を室温に１５分間維持した。試験管を遠心分離にかけ（３００ｇ、１０分間）、上澄を廃棄し、細胞ペレットを細胞透過カクテル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）０．５ｍｌ中で懸濁させた。懸濁液を室温に１０分間維持した。この生成物は細胞内部の着色を可能にする。ウシ血清０．５％およびアジ化ナトリウム０．１％を含有する等張液５ｍｌを添加した後、細胞を遠心分離（３００ｇ、１０分間）によって沈降させ、上澄を廃棄し、抗体５μｌを細胞ペレットに添加した。単球内のＩＬ−１βを測定するために、抗体の以下の混合物を使用した。抗ｌＬ−１ｓｓ−ＦＩＴＣ（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂ．）、抗ＣＤ１４−ＰＥ（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂ．）、および抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。細胞内測定は同様であったが、標識抗体の各混合物中でＦＩＴＣ標識抗ＴＮＦ−αを使用した。
【００６６】
結果は、ＡＰＧが単球によるＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−８の生成を刺激することと、単球が細胞内培地ではこれらのサイトカイン源であることを示した。確かにブレフェルジンＡをインキュベーション培地に添加し、それゆえタンパク質の分泌が遮断され、そして単球内のこれらのサイトカインの蓄積がフローサイトメトリーを用いて記録された場合、培地内のその濃度はバックグラウンドレベルであった。ブレフェルジンＡなしでは、サイトカインが絶えず細胞外に輸送され、それゆえＡＰＧの濃度に依存して、培地中のサイトカイン濃度が劇的に上昇したため、単球中のサイトカインの蓄積は明らかではなかった。用量依存性曲線は、４０ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍｌへのインビトロでのＡＰＧ濃度の上昇とともに、単球によるＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−８の生成の指数的増加を示した。
［実施例１２］  インターフェロン合成の誘発
【００６７】
ＡＰＧのインターフェロン誘発活性の試験は、ヒト細胞系、すなわちＬ−４１、線維芽球様細胞、およびＪ−９６、単球様細胞系を用いてインビトロで実施した。インターフェロン誘発の強度は、脳心筋炎ウィルス（ＥＭＶ）に感染したヒト細胞系に対するＡＰＧの抗ウィルス活性によって評価した。体積１００μｌあたり細胞２０，０００個を９６ウェル平底培養プレートの各ウェルに入れた。Ｊ−９６細胞の培養には培地１９９を使用したのに対して、Ｌ−４１はイーグルの最小必須培地を使用して培養した。どちらの培地にも、１０％ウシ胎仔血清、３００μｌ／ｍＬ  Ｌ−グルタミンおよび１００単位／ｍｌペニシリンを添加した。
【００６８】
二重鎖微生物ＤＮＡ調製物である、Ｒｉｄｏｓｔｉｎ（Ｖｅｃｔｏｒ、ロシア）を参照インターフェロン誘発物質として使用した。ＡＰＧおよびＲｉｄｏｓｔｉｎのインターフェロン誘発有効性は、L−４１およびJ−９６細胞をＥＭＶの細胞病原性の影響からインビトロで保護するそれらの能力にしたがって評価した。インターフェロン誘発能力は、細胞の５０％をウィルスによって引き起こされる細胞死から保護する、化合物の最小有効濃度（ＣＰＤ５０）として表した。
【００６９】
試験を行った調製物の２倍連続希釈物を細胞培養物で調製し、ＡＰＧまたはＲｉｄｏｓｔｉｎの最終濃度を０〜１００μｇ／ｍｌとした。感染細胞の生存度およびウィルスの細胞病原性効果は、感染の２４時間後に光学顕微鏡（Ｌｅｉｔｚ、倍率２００ｘ）を用いてカウントした。各ケースで３回の実験について、結果を表３および４に示す。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
【表４】
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［実施例１３］  抗菌防御力の活性化
【００７２】
ＡＰＧは、マウスのネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）実験感染を用いて、抗菌防御力のエンハンサとして試験を行った。実験は両方の性の体重１２〜１４ｇのマウスに対して実施した。感染の２４時間前に、ＡＰＧの異なる用量（３．３μｇ、１０μｇまたは３０μｇ）を皮下注射した。マウスには、１０２、１０３、１０４または１０５微生物細胞（マウスあたり）によって腹腔内に抗原投与した。死亡率は２０日間にわたって記録した。調製物の保護有効性は、動物の生存率（％）、５０％の死を引き起こす感染用量（ＩＤ５０）、および抗原投与後の寿命の延長にしたがって評価した。結果を表５に示す。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
ＡＰＧがニワトリのブドウ球菌に対する抗感染防御力をうまく上昇させることも見出されている。さらにＡＰＧを用いた免疫調節は、抗菌化学療法の有効性を向上させることができる。抗菌調製物のｎｉｆｕｌｉｎを、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）１．５×１０９個による抗原投与の２０分後に、用量１０ｍｇ／ｋｇを経口でニワトリに導入した。ｎｉｆｕｌｉｎを用いた療法は、抗原投与対照グループの４０％に対して、ニワトリの生存率を７０％まで上昇させた。ＡＰＧおよびｎｉｆｕｌｉｎの併用は、感染ニワトリを１００％防御した。
［実施例１４］  抗ウィルス防御力の活性化
【００７５】
ＡＰＧの抗ウィルス効果は、単純ヘルペスウィルスI型（ＨＳＶ−１）感染の実験モデルを使用して、白色非近交系マウスで試験した。結果はＡＰＧの予防および治療効果を示した。抗原投与４８時間前のマウスあたりＡＰＧ３μｇの注射１回、または抗原投与４８および２４時間前のマウスあたりＡＰＧ３〜３０μｇの注射２回は、４０〜６０％の動物を感染による死から保護した。
【００７６】
ＡＰＧがウイルス感染に対するヒト細胞の耐性を向上させる能力は、ＶＥＲＯ細胞培養物におけるＨＳＶ−１感染を使用して試験した。ＨＳＶ−１によって引き起こされる細胞死からＶＥＲＯ細胞に保護されているＡＰＧが示された。
【００７７】
ウィルス複製は未処置のＶＥＲＯ細胞と比較して、ＡＰＧを用いて処置したＶＥＲＯ細胞内で劇的に抑制された。それゆえ抗原投与の２４時間前にＶＥＲＯ細胞がＡＰＧを用いて予備処理されている場合、ＨＳＶ−１力価は１００〜１０００倍低下した。ＶＥＲＯ細胞のＨＳＶ−１による抗原投与後に調製物を投与すると、ウィルスの力価は、７０−１００倍低下した。
【国際調査報告】
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