(57)【要約】グラム陽性およびグラム陰性細菌を可視光線の作用に対して増感させる際の効率を著しく高め、先行技術で教示されているポルフィリンよりもはるかに低濃度かつはるかに短時間の光照射時間であっても、かかる細菌を死滅させる一群の新規な正荷電ポルフィリンが開示される。これらのポルフィリンは、周縁の置換基に４個までの正電荷と、該荷電部位のうちの１つ以上の部位から始まる、６〜２２個の炭素（６個及び２２個を含む）を備えた少なくとも１個の疎水性尾部とが存在することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
光力学的抗菌剤であって、該抗菌剤は、４個の第四級窒素を備えたポルフィリンを含み、該ポルフィリンはさらに、前記第四級窒素のうちの１個から始まる炭化水素尾部を含む抗菌剤。
【請求項２】
前記ポルフィリンは還元型ポルフィリンである請求項１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項３】
前記還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される請求項２に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項４】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項５】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである請求項４に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項６】
前記ポルフィリンは、金属キレート化ポルフィリンである請求項２に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項７】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである請求項６に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項８】
前記炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される請求項１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項９】
前記炭化水素尾部は６〜２２個の炭素原子を含有する請求項８に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１０】
前記炭化水素尾部は６〜１８個の炭素原子を含有する請求項９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１１】
前記炭化水素尾部はベンジル基を含む請求項１０に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１２】
前記炭化水素尾部は炭素原子６個の鎖を含む請求項１０に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１３】
前記炭化水素尾部は炭素原子１０個の鎖を含む請求項１０に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１４】
前記炭化水素尾部は炭素原子１４個の鎖を含む請求項１０に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１５】
前記炭化水素尾部は炭素原子１８個の鎖を含む請求項１０に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１６】
光力学的抗菌剤であって、該抗菌剤は、４個の第四級窒素を備えたメソ−テトラ−（Ｎ−メチル−ピリジル）ポルフィリンを含み、１個のＮ−メチル基は炭化水素尾部により置換されている抗菌剤。
【請求項１７】
前記炭化水素尾部は６〜２２個の炭素原子を含有する請求項１６に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１８】
前記炭化水素尾部は、６個よりも多く且つ１８個未満の炭素原子を含有する請求項１６に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１９】
前記ポルフィリンは還元型ポルフィリンである請求項１６に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２０】
前記還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される請求項１９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２１】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項１６に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２２】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属のキレートである請求項２１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２３】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項１９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２４】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである請求項２３に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２５】
前記炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される請求項１６に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２６】
前記炭化水素尾部はベンジル基を含む請求項２５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２７】
前記炭化水素尾部は炭素原子６個の鎖を含む請求項２５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２８】
前記炭化水素尾部は炭素原子１０個の鎖を含む請求項２５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２９】
前記炭化水素尾部は炭素原子１４個の鎖を含む請求項２５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項３０】
前記炭化水素尾部は炭素原子１８個の鎖を含む請求項２５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項３１】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する方法であって、
ポルフィリンの第１の窒素を化学量論量以下（substoichiometric quantity）の所望の疎水性炭化水素尾部のハロゲン化塩と反応させることによってその第１の窒素を四級化して、モノ第四級ポルフィリンを形成する工程と、
メチル化剤を用いて前記ポルフィリンの残存窒素を四級化して、４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性尾部とを有するポルフィリンを形成する工程と
を備える方法。
【請求項３２】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３１に記載の方法において、残存するポルフィリンまたはハロゲン化塩から前記モノ第四級ポルフィリンを分離する工程をさらに備える方法。
【請求項３３】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３２に記載の方法において、残存するポルフィリンまたはハロゲン化塩からモノ第四級ポルフィリンを分離する工程は、溶解性の相違を利用して行われる方法。
【請求項３４】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３２に記載の方法において、残存するポルフィリン、他の副産物、およびハロゲン化塩から、対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有する合成ポルフィリンを分離する工程をさらに備える方法。
【請求項３５】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３４に記載の方法において、残存するポルフィリン、他の副産物、およびハロゲン化塩から、対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有する合成ポルフィリンを分離する工程は、クロマトグラフィーを用いて行われる方法。
【請求項３６】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３４に記載の方法において、前記ハロゲン化塩は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル、分枝状アルケニル、芳香族、混合アルキル芳香族、および混合アルケニル芳香族のハロゲン化塩からなる群から選択される方法。
【請求項３７】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３４に記載の方法において、前記メチル化剤は、メチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化メチル、硫酸ジメチル、およびメチルフルオロスルホン酸塩からなる群から選択される方法。
【請求項３８】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３４に記載の方法において、前記ポルフィリンは還元型ポルフィリンである方法。
【請求項３９】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３８に記載の方法において、前記還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される方法。
【請求項４０】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３４に記載の方法において、前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである方法。
【請求項４１】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項４０に記載の方法において、前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである方法。
【請求項４２】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３８に記載の方法において、前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである方法。
【請求項４３】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項４２に記載の方法において、前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである方法。
【請求項４４】
グラム陽性またはグラム陰性細菌を死滅させる方法であって、
対称的に配置された４個の正電荷と１個の炭化水素尾部とを有するポルフィリンを含んだ光力学的抗菌剤にグラム陽性またはグラム陰性細菌を暴露する工程と、
前記細菌および抗菌剤を光照射する工程と
を備える方法。
【請求項４５】
前記ポルフィリンは還元型ポルフィリンである請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属のキレートである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記炭化水素尾部は６〜２２個の炭素原子を含有する請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記炭化水素尾部は、６個より多く且つ１８個未満の炭素原子を含有する請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記炭化水素尾部はベンジル基を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記炭化水素尾部は炭素原子６個の鎖を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記炭化水素尾部は炭素原子１０個の鎖を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記炭化水素尾部は炭素原子１４個の鎖を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記炭化水素尾部は炭素原子１８個の鎖を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポルフィリンは、約１０μＭから約０．１μＭの濃度で存在する請求項４４に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポルフィリンは、約５μＭから約０．５μＭの濃度で存在する請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポルフィリンは１μＭの濃度で存在する請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗菌剤に関する。より詳しくは、本発明は、テトラピロール巨大環の周縁置換基に配置されている少なくとも２個から最高４個までの正電荷と、かかる荷電部位または隣接する２つの荷電部位のうちの１つから始まる少なくとも１個の疎水性尾部とを有し、グラム陽性およびグラム陰性の両細菌を死滅させる光力学的薬剤として活性である、一連の新規な正荷電ポルフィリンに関する。
【背景技術】
【０００２】
増え続ける微生物によって新たに生じている抗生物質耐性は、世界的な健康問題であると認識されている（非特許文献１及び２）。歴史上、新しい抗生物質の開発および発見は時間のかかる過程であり、それには不確実性、期待外れが伴い、かつその成功も相対的に稀でしかない。抗生物質が発見された後も、可能性のある薬剤候補については厳しい試験を行い、その安全性と効果を保証しなければならない。このため、頻繁に報告されている薬剤耐性微生物の出現によって、医療専門家や公衆の間で不安が引き起こされ、多くの人が、今後起こり得る問題を未然に防ぐのに十分な新規抗生物質を速やかに開発することができるかどうか懸念している。
【０００３】
これを受けて、従来的方法ではない、微生物を死滅させるための抗生物質手法の開発の可能性について研究者達は探求し始めた。かかる開発努力の目標には、抗生物質で処理不可能な感染をコントロールすることだけではなく、さらには、標的の遺伝物質に関与しない、あるいはその他の点でも変異原性でない殺菌機序を選択することにより抗生物質耐性微生物株のさらなる発生を抑制することが含まれる。この手法は、殺菌剤の作用に対して潜在的耐性を有する微生物株の淘汰及び発生を少なくともある程度は予防するように作用する。
【０００４】
評価されているかかる方法の１つには、光線力学療法（「ＰＤＴ」）による微生物感染治療がある。この治療は、たいていの抗生物質の一般的な機序とは異なる機序を利用しているらしく、細菌を根絶するための有効な代替方法であると思われる。一般に、ＰＤＴは、光によって活性化されると細菌、マイコプラズマおよび酵母をはじめとする種々の原核細胞および真核細胞に有害な活性酸素種（「ＲＯＳ」）を生成する光増感分子の使用に基づいている（非特許文献３及び４）。
【０００５】
この手法の重要な特徴の１つは、多くの光力学的薬剤の光増感活性が細菌の抗生物質耐性によって損なわれないことである。その代わりに、この手法は、光増感剤自体の化学構造に大きく左右される（非特許文献５）。様々なタイプの既知の中性および陰イオン性光増感剤は、例えば、グラム陽性細菌に対しては際立った光毒性活性を示すが、グラム陰性細菌に対しては、グラム陰性細菌の外膜の透過性がＥＤＴＡまたはポリカチオンによる処理によって改変されない限り、細胞毒性活性をあまり示さない（非特許文献６及び７）。いかなる理論にも拘泥するものではないが、現在の研究に照らせば、（グラム陽性細菌に比べて）グラム陰性細菌の細胞エンベロープは複雑で厚いことから、これらの光増感剤分子の効率的な結合が妨げられる可能性があると思われる。さらに、エンベロープは、致命的な損傷を受け得る前に、光増感剤分子によって生成された細胞毒性の活性酸素種を簡単に遮断し、非活性化し得る（非特許文献８及び９）。
【０００６】
一方、ポルフィリンやフタロシアニンをはじめとする正荷電光増感剤は、細胞エンベロープの天然構造を変更する必要なく、グラム陰性細菌の効率的な不活性化を促進する（非特許文献１０及び１１）。この場合も、いかなる理論にも拘泥するものではないが、正電荷は、一度感光によって損傷を受けると、細胞生存性を低下させる重要な細胞部位での光増感剤分子の結合を促進すると思われる（非特許文献１２）。
【０００７】
目下研究されている正荷電光増感剤のファミリーの１つは、ポルフィリン分子に基づくものである。ポルフィリンは、環状のテトラピロール核を有する巨大環状分子化合物である。そのため、ポルフィリンは、一般に、金属イオンに配位結合した２価陰イオンの形態で見出される。テトラピロール核の特有の特性により、ポルフィリンは、多くの生物系において、多数の生命過程で重大な役割を果たす中核をなしてきた。クロロフィルやヘムなどの本質的な生物学的過程において極めて重要であるいくつかの化合物は、金属イオンとポルフィリン核の配位結合に由来する（非特許文献１３）。
【０００８】
一般に、ポルフィリンは、１位および８位の１ヶ所または複数箇所、ならびにメソ−（ピロール結合）炭素原子の１個または複数個において、側鎖（例えばメチル、エチル、ビニル、プロピオン酸または芳香族基など）により水素が置換されることにより、親テトラピロールポルフィンから誘導される（非特許文献１３）。ポルフィリンは、含有する側鎖に基づいて分類されることが多い。１種または２種のピロール成分を水素化すると、対応するクロロフィル、および細菌性クロロフィル誘導体が得られる。
【０００９】
上で簡単に記載したように、ポルフィリンは、コバルト、銅、鉄、マグネシウム、ニッケル、銀および亜鉛をはじめとする種々の金属イオンを含む金属キレートを形成し得る（非特許文献１３の４１９ページ）。ヘムはポルフィリンの鉄キレート化合物であるが、クロロフィルおよび細菌性クロロフィルはマグネシウムキレート化合物である。こうしたポルフィリンは、一般に前駆体グリシンおよびスクシニルＣｏＡから合成される。非特許文献１４を参照されたい。
【００１０】
現在のポルフィリン、およびそれを用いる技術の場合、ポルフィリンが細菌感染症および他の微生物による感染症の治療において抗菌剤として作用し、さらには水の光殺菌法でも使用されるためには、ポルフィリンは少なくとも１０ミクロモルの濃度で用いられなければならない。そして、約３０分間光照射されなければならない。非特許文献１４を参照されたい。
【００１１】
グラム陽性細菌とグラム陰性細菌の両方を死滅させるのに有効である（大腸菌を有効に不活性化する能力を含む）ことが示されたポルフィリンベースのカチオン性光増感剤の１つは、カチオン性メソ−テトラ（Ｎ−メチル−４−ピリジル）ポルフィン、すなわち「Ｔ4ＭＰｙＰ」である。特許文献１５〜１８を参照されたい。いかなる理論にも拘泥するものではないが、このポルフィリンの光毒性活性は、外部膜および細胞膜両方の酵素機能および輸送機能の損障によって媒介されると考えられる。ＤＮＡは、Ｔ4ＭＰｙＰ感光性の第一の標的でないことが判明している。
【００１２】
さらに、光増感剤の親水性または親油性が、標的細胞への光増感剤の結合、ひいてはその細胞毒性活性に大きな影響を及ぼすことが証明されている（非特許文献１９）。
目下知られているポルフィリン光増感剤、目下のそれらの合成の方法、およびそれらを使用するための既知の技術は、目的とする多くの用途には不十分である。高濃度の薬剤が必要であること、および長時間の光照射が必要とされることから、これはある程度真実である。これらの要因により、これらの方法は煩わしく不便なものとなっている。さらに、かかる条件は、多くの医学上の用途および／または工業上の用途に適していない。
【非特許文献１】
タンガー（Tunger）ら、Int. J. Antimicrob. Agents、第１５巻：１３１〜１３５ページ、２０００年
【非特許文献２】
ジョルゲンセン（Jorgensen）およびフェラーロ（Ferraro）、Clin. Infect. Dis.、第３０巻：７９９〜８０８ページ、２０００年
【非特許文献３】
マリーク（Malik）ら、J. Photochem. Photobiol. B: Biol.、第５巻：２８１〜２９３ページ、１９９０年
【非特許文献４】
ベルトリーニ（Bertolini）ら、Microbios、第７１巻：３３〜４６ページ、１９９２年
【非特許文献５】
マリークら、J. Photochem. Photobiol. B:Biol.、第１４巻：２６２〜２６６ページ、１９９２年
【非特許文献６】
ベルトリーニら、FEMS Microbiol. Lett.、第７１巻：１４９〜１５６ページ、１９９０年
【非特許文献７】
ニッツァン（Nitzan）ら、Photochem. Photobiol.、第５５巻：８９〜９７ページ、１９９２年
【非特許文献８】
エーレンバーグ（Ehrenberg）ら、Photochem. Photobiol.、第４１巻：４２９〜４３５ページ、１９８５年
【非特許文献９】
ヴァルドュガ（Valduga）ら、Photochem. Photobiol. B: Biol.、第２１巻：８１〜８６ページ、１９９３年
【非特許文献１０】
マーチャット（Merchat）ら、J. Photochem. Photobiol. B: Biol.、第３２巻：１５８〜１６３ページ、１９９６年
【非特許文献１１】
ミノック（Minnock）ら、J. Photochem. Photobiol. B: Biol.、第３２巻：１５９〜１６４ページ、１９９６年
【非特許文献１２】
マーチャットら、J. Photochem. Photobiol. B: Biol.、第３５巻：１４９〜１５７ページ、１９９６年
【非特許文献１３】
エイチ・アール・マーラー（H. R. Mahler）およびイー・エイチ・コルデス（E. H. Cordes）、Biological Chemistry、第２版、４１８ページ、１９６６年
【非特許文献１４】
エル・ストライヤー（L. Stryer）、Biochemistry、第２版、５０４〜５０７ページ、１９８１年
【非特許文献１５】
マーチャットら、J. Photochem. & Photobiol. B: Biol.、第３２巻：１５３〜１５７ページ、１９９６年
【非特許文献１６】
マーチャットら、J. Photochem. & Photobiol. B: Biol.、第３５巻：１４９〜１５７ページ、１９９６年
【非特許文献１７】
オクノ（Okuno）、Synthesis、１９８０年７月、５３７ページ
【非特許文献１８】
ヴァルドュガら、Biochem. Biophys. Res. Comm.、第２５６巻：８４〜８８ページ、１９９９年
【非特許文献１９】
マーチャットら、J. Photochem. Photobiol. B: Biol.、第３５巻：１４９〜１５７ページ、１９９６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、医学用途または他の用途のための新規な感光性抗菌剤が求められていることは明らかである。当技術分野における１つの改善は、非変異原性である有機体を不活性化または死滅させる経路を利用する抗菌剤を提供することである。また、さらなる当技術分野における改善は、グラム陽性およびグラム陰性細菌双方並びに他の微生物に対する使用に好適な、今までのものに替わる疎水性カチオン性ポルフィリン光増感剤を提供することである。最後に、当技術分野におけるさらなる改善は、目下、当技術分野で知られ、かつ教示されているものよりも低濃度かつ短時間で有効に機能し得る光増感剤を提供することである。
【００１４】
本発明の主題の組成物、それらの合成方法、およびそれらの使用に関連した方法は、当該技術分野の現状に応じて開発されている。特に、本発明のこれらの態様は、目下利用可能な正荷電ポルフィリン、ポルフィリン合成方法、ならびにグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌をはじめとする微生物を死滅させるためのポルフィリンの使用方法によっては完全には解決されていない、当該技術分野における問題に応じて開発されたものである。したがって、本発明の全体的な目的は、正荷電光力学的ポルフィリンと、当技術分野におけるものよりも性能の良い光力学的抗菌剤としてのそれらの使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
先の目的を達成するために、本明細書の好ましい実施形態で実施され、そこに広く記載されている本発明によれば、一群の新規な正荷電ポルフィリンが提供される。これらの新規なポルフィリンの多くは、最高４個までの正電荷を有している。さらに、これらの新規なポルフィリンは、長さが６〜２２個の炭素（６個及び２２個を含む）の少なくとも１本の炭化水素鎖からなる少なくとも１個の疎水性尾部も含む。
【００１６】
本出願の発明の一実施形態においては、光力学的抗菌剤は、４個の第四級窒素を有するポルフィリンを含む。本発明のこの形態では、ポルフィリンはさらに、第四級窒素のうちの１個から始まる炭化水素尾部を含む。いくつかの場合には、ポルフィリンは光吸収性還元型ポルフィリンである。いくつかの場合には、還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される。別の場合には、ポルフィリンまたは還元型ポルフィリンは、金属キレート化ポルフィリンである。これらの場合において、ポルフィリンキレートが光力学的抗菌剤として有用である金属としては、Ｍｇ（マグネシウム）、Ｓｃ（スカンジウム）、Ｚｎ（亜鉛）、Ａｌ（アルミニウム）、Ｉｎ（インジウム）、Ｔｌ（タリウム）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｇｅ（ゲルマニウム）、Ｓｎ（スズ）、Ｐｄ（パラジウム）、およびＰｔ（プラチナ）が挙げられる。
【００１７】
本発明の他の実施形態においては、炭化水素尾部が、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される。これらのうちいくつかの実施形態では、炭化水素尾部は、６〜２２個の炭素（６個及び２２個を含む）を含有する。他の実施形態では、炭化水素尾部は、１０〜１８個の炭素（１０個及び１８個を含む）を含有する。いくつかの特定の実施形態においては、炭化水素尾部はベンジル基を含む。他の実施形態では、炭化水素尾部は炭素６個の鎖を含む。さらに別の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１０個の鎖を含む。他の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１４個の鎖を含む。さらに別の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１８個の鎖を含む。
【００１８】
他の実施形態においては、本出願の発明は、４個の第四級窒素を有するポルフィリンを含み、さらには、第四級窒素のうちの１個から始まる、６〜２２個の炭素（６個及び２２個を含む）から構成された炭化水素尾部を含む、光力学的抗菌剤である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、炭化水素尾部は６〜１８個の炭素を含有する。他の実施形態では、ポルフィリンは光吸収性還元型ポルフィリンである。これらの実施形態では、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から還元型ポルフィリンが選択されてもよい。上記のように、炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、ポルフィリンまたは還元型ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである。これらの場合において、ポルフィリンキレートが光力学的抗菌剤として有用である金属としては、Ｍｇ（マグネシウム）、Ｓｃ（スカンジウム）、Ｚｎ（亜鉛）、Ａｌ（アルミニウム）、Ｉｎ（インジウム）、Ｔｌ（タリウム）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｇｅ（ゲルマニウム）、Ｓｎ（スズ）、Ｐｄ（パラジウム）、およびＰｔ（プラチナ）が挙げられる。
【００１９】
本発明の光力学的抗菌剤の特定の変形例では、炭化水素尾部はベンジル基を含む。他の変形例では、炭化水素尾部は炭素６個の鎖を含む。さらに別の変形例では、炭化水素尾部は炭素１０個の鎖を含む。他の変形例では、炭化水素尾部は炭素１４個の鎖を含む。さらに別の変形例では、炭化水素尾部は炭素１８個の鎖を含む。
【００２０】
好ましい実施形態では、本発明は、４個の第四級窒素を有し、Ｃ１〜Ｃ２２の範囲の炭化水素尾部により１個のＮ−メチル基が置換されている、一連のメソ−テトラ−（Ｎ−メチル−ピリジル）ポルフィリン誘導体を含む。いくつかの実施形態では、炭化水素尾部は６〜２２個の炭素を含有する。他の実施形態では、炭化水素尾部は６〜１８個の炭素を含有する。
【００２１】
これらのメソ−テトラ−（Ｎ−メチル−ピリジル）ポルフィリン誘導体の実施形態のいくつかでは、ポルフィリンは光吸収性還元型ポルフィリンである。これらのうちのいくつかでは、還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される。他の実施形態では、ポルフィリンまたは還元型ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである。これらの場合において、ポルフィリンキレートが光力学的抗菌剤として有用である金属としては、Ｍｇ（マグネシウム）、Ｓｃ（スカンジウム）、Ｚｎ（亜鉛）、Ａｌ（アルミニウム）、Ｉｎ（インジウム）、Ｔｌ（タリウム）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｇｅ（ゲルマニウム）、Ｓｎ（スズ）、Ｐｄ（パラジウム）、およびＰｔ（プラチナ）が挙げられる。
【００２２】
さらに、これらのメソ−テトラ−（Ｎ−メチル−ピリジル）ポルフィリン誘導体の実施形態のうちのいくつかでは、炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族化合物、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される。これらのいくつかでは、炭化水素尾部はベンジル基を含む。他の実施形態では、炭化水素尾部は炭素６個の鎖を含む。他の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１０個の鎖を含む。さらに別の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１４個の鎖を含む。さらに別の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１８個の鎖を含む。
【００２３】
本発明の他の実施形態においては、本発明は、４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する方法を含む。本発明のこの方法のある実施形態は、ポルフィリンを提供する工程と、ポルフィリンの第１の窒素を化学量論量以下の所望の疎水性炭化水素尾部のハロゲン化塩と反応させることにより、ポルフィリンの第１の窒素を四級化する工程と、モノ第四級ポルフィリンを非モノ第四級ポルフィリンから分離する工程と、ポルフィリンの残存窒素をメチル化剤を用いて四級化する工程と、対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有する合成ポルフィリンを反応混合物から分離する工程とを備える。本発明のいくつかの実施形態においては、モノ第四級ポルフィリンを非モノ第四級ポルフィリンから分離する工程、及び対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性尾部とを有する合成ポルフィリンを分離する工程の一方または両方は、所与の用途に適切である場合、短縮、簡略化、あるいは省略される。
【００２４】
ハロゲン化塩は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル、分枝状アルケニル、芳香族、混合アルキル芳香族、および混合アルケニル芳香族のハロゲン化塩からなる群から選択されてもよい。さらに、メチル化剤は、メチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化メチル、硫酸ジメチル、メチルフルオロスルホン酸塩、および他の好適なメチル化剤から選択されてもよい。本発明の方法におけるモノ第四級ポルフィリンを非モノ第四級ポルフィリンから分離する工程は、溶解性の相違を利用して実施されてもよい。さらに、対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性尾部とを有する合成ポルフィリンを分離する工程は、クロマトグラフィーを用いて実施されてもよい。この工程は、十分に高純度であって医薬グレードの純度が必要とされない工業目的における本発明のポルフィリンの生成など、ポルフィリンの所期の用途が保証する場合には、簡略化または省略されてもよい。
【００２５】
本発明はさらに、光力学的ポルフィリン抗菌剤を利用してグラム陽性細菌および／またはグラム陰性細菌をはじめとする微生物を死滅させる方法を含む。本明細書で用いられる微生物という用語には、細菌、カビ、藻類およびウイルスなどの微生物が含まれる。抗菌剤は、かかる微生物を死滅させるか、あるいはそれらの増殖を抑制する化学薬品のファミリーである。本方法の一実施形態は、対称的に配置された４個の正電荷と疎水性尾部とを有するポルフィリン光力学的抗菌剤を提供する工程と、グラム陽性細菌および／またはグラム陰性細菌を前記光力学的抗菌剤に暴露する工程と、抗菌剤を一定時間光照射する工程とを含む。
【００２６】
本方法のいくつかの変形例では、用いられるポルフィリンは光吸収性還元型ポルフィリンである。これらの場合、還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンの群から選択されてもよい。他の変形例では、ポルフィリンまたは還元型ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである。これらの場合には、ポルフィリンキレートが光力学的抗菌剤として有用である金属としては、Ｍｇ（マグネシウム）、Ｓｃ（スカンジウム）、Ｚｎ（亜鉛）、Ａｌ（アルミニウム）、Ｉｎ（インジウム）、Ｔｌ（タリウム）、Ｓｉ（ケイ素）、Ｇｅ（ゲルマニウム）、Ｓｎ（スズ）、Ｐｄ（パラジウム）、およびＰｔ（プラチナ）が挙げられる。
【００２７】
さらに、本発明の諸実施形態においては、炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択されてもよい。これらのうちのいくつかでは、炭化水素尾部は６〜２２個（６個及び２２個を含む）の炭素を含有してもよい。他の実施形態では、炭化水素尾部は６〜１８個（６個及び１８個を含む）の炭素を含有してもよい。さらに他の実施形態においては、炭化水素尾部はベンジル基を含んでもよい。他の実施形態では、炭化水素尾部は炭素６個の鎖を含んでもよい。さらに別の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１０個の鎖を含んでもよい。他の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１４個の鎖を含んでもよい。他の実施形態では、炭化水素尾部は炭素１８個の鎖を含んでもよい。本発明の好ましい実施形態では、本方法の光照射工程において白色光が用いられる。
【００２８】
本方法のいくつかの形態においては、ポルフィリンは、約１０Ｍ〜約０．１Ｍの濃度で存在する。他の形態においては、ポルフィリンは、約５Ｍ〜約０．５Ｍの濃度で存在する。この実施形態のさらに別の形態では、ポルフィリンは、１Ｍの濃度で存在する。この実施形態のいくつかの形態では、光照射を行う時間は、約１分〜約１０分であってよい。本発明のいくつかの実施形態では、この時間は約５分である。必要とされる光照射時間は、死滅させる細菌の種類、細菌が抗菌剤を取り込む速度、用いられる特定の抗菌剤の特性および濃度、用いられる光の波長、ならびに用いられる光の強度に基づいて決定される。当業者は、これらの要素に基づいて、所与の微生物を死滅させるために、または不活性化するために必要とされる時間を決定することができる。
【００２９】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および利点は、以下の記載および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになり、あるいは、下記のように本発明を実施することによって理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の現在好ましい実施形態は、図面および以下の詳細な記載を参照することにより、よりよく理解されよう。また、本発明の化合物の成分は、一般に、本明細書の図に記載し記述されているように、種々の異なる形態に構成し、設計することができることが容易に理解されよう。さらに、本明細書で立証されているように、これらの化合物は種々の濃度で用いることができる。したがって、図１から図８に示すような、本発明の装置、系および方法の実施形態についての以下のより詳細な記載は、特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の現在の好ましい実施形態を代表するものにすぎない。
【００３１】
対称的に配置された４個の正電荷を含むポルフィリンは、荷電部位のうちの１つから始まる、６〜２２個の炭素（６個及び２２個を含む）を含んだ疎水性の「尾部」を備えることにより、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対する光力学的薬剤としての活性が高まる。
【００３２】
この光力学的活性は、「尾部」が６〜１８個の炭素（６個及び２２個を含む）を含有する場合に、最も顕著に高まる。当業者は、同等の疎水性直鎖状アルケニル、分枝状アルキルまたはアルケニル、および芳香族、または混合アルキル芳香族またはアルケニル芳香族尾部でも同様の結果を予想することができよう。
【００３３】
本発明の化合物の実施形態における光物理学的効果および光増感性効果を評価した。これらの試験においては、カチオン性ポルフィリンが有効な抗菌活性を持つ光増感剤のクラスに相当することが確認される。具体的には、閃光光分解データによると、徐々に長くなる炭化水素鎖でＴ4ＭＰｙＰ（既知の光力学的増感剤）中の１個のＮ−メチル基を置換しても、最低三重項状態の量子収率および寿命はわずかな影響しか受けないことが明らかである。さらに、これは、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド（「ＮＡＴＡ」）などの生物学的モデル基質の光増感酸化反応の効率性がわずかにしか影響されないことを示すものである（疎水性の実施例１１、表４を参照）。
【００３４】
いかなる理論にも拘泥するものではないが、中性で均質な水性媒体中の高疎水性ポルフィリンは、その寿命が短いことから、通常の時間分解分光技術によって検出不可能な大型オリゴマーを生成すると思われる。
【００３５】
一方、二量体種がポルフィリン分子全体の最高で３０％まで存在しても、Ｔ4ＭＰｙＰを用いた蛍光崩壊試験によって示唆されているように（疎水性の実施例９、表２）、三重項状態生成およびＮＡＴＡ光酸化の効率に対してあまり影響がないと思われる。
【００３６】
また、単量体性のＣ１０、Ｃ１４およびＣ１８誘導体と比較した場合、１μＭのＣ２２の存在下における光照射によって生じる、大腸菌増殖の抑制が小さくなることによって示されるように、塊状成分の存在により、ポルフィリンの抗菌光毒性作用の効率を制御することができる。しかし、この場合の主な役目は、細菌細胞に対する種々のポルフィリンの親和性によって果たされる。したがって、黄色ブドウ球菌（S. aureus）および大腸菌（E. coli）の両細胞に対して比較的低い結合性を示す（図６および図７を参照）Ｔ4ＭＰｙＰとそのＣ６類似体は、１０μＭの高濃度でしか両細胞株に対して有意な静菌作用および殺菌作用を光誘起しないが、Ｃ１０、Ｃ１４およびＣ１８類似体は、１０分の１の濃度で同様の効果をもたらす。これらの結果は、光増感剤分子の疎水性が僅かに高まっても、細菌細胞に対するその親和性が高まり、それによってより効率的な光不活性化が促進されることを示唆する。
【００３７】
本発明では、長さが調節された飽和アルキル鎖を導入することによって疎水性の程度を調節した。いかなる理論にも拘泥するものではないが、鎖長の長いポルフィリン誘導体が示す暗所毒性によって示されるように、恐らく、かかる鎖は、鎖の存在が細菌細胞の正常な機能および／または形態を妨害する可能性を含めて、追加の作用を引き起こすものと思われる。さらに、最近の知見により、ポリリシン鎖が光増感剤分子に共有結合すると、種々の微生物株に対するその活性が強められることが明らかになっている。ハンブリン（Hamblin）は、ポリリシン誘導体化クロリンｅ６を用いて同様の結果を報告している。
【００３８】
本発明では、脂溶性置換基の存在により、膜性細胞ドメインにおけるポルフィリン光増感剤の局在化が促進されるはずである。その結果、光プロセスにおいて遺伝物質に関与する可能性は低くなり、したがって、変異原性作用の開始を促進する可能性も低くなる。同時に、ほとんどの場合、この現象が特定の膜タンパク質の発現と関係があるので、膜内のポルフィリン濃度が高いと、抗生物質耐性細菌に対する光不活性化活性が最適化されるはずである。耐メチシリン性黄色ブドウ球菌株がＣ１０〜Ｃ１４誘導体の存在下での照射に対して示す高い感光性は、この仮説を十分裏付けている。
【００３９】
本発明のポルフィリンは、マーチャット（Merchat）が用いた濃度の５〜２０分の１の低いポルフィリン増感剤濃度で、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に対して光力学的効果を示した。ベンジル尾部を含むポルフィリンは、同一条件下において、ベースのポルフィリンの約２倍の有効性があった。いかなる理論にも拘泥するものではないが、炭化水素成分は、細菌細胞の細胞膜に対するポルフィリンの親和性を高め、それにより、より大きな集積とより強固な結合を起こし得ると思われる。これに加えて、炭化水素成分は、細胞膜の本来の構造の限られてはいるが重要な崩壊をもたらし、それによって、細胞の感光性を高め得る。
【００４０】
したがって、本発明の一実施形態は、対称的に配置された４個の正電荷（第四級窒素）と、第四級窒素のうちの１個から始まり、６〜２２個の炭素（総数）を含有する少なくとも１個の疎水性炭化水素尾部とを備えた、ポルフィリンまたは光吸収性還元型ポルフィリン（クロリンまたはバクテリオクロリンなど）およびその光力学的に活性な金属キレートを含む。かかるポルフィリンのいくつかの例としては、５−（４−Ｎ−デシルピリジル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジル）ポルフィンテトラクロリド塩、または他の好適な陰イオン、および二塩酸などの塩形態；あるいはそれらの５，１０，１５，２０テトラ（３−ピリジル）ポルフィン類似体、ならびに５−（４−Ｎ−テトラデシルジメチルアミノフェニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−トリメチルアミノフェニル）ポルフィンテトラクロリド塩、または他の好適な陰イオン、および二塩酸などの塩形態がある。
【００４１】
１．一般的合成手順
本発明の光力学的抗菌性ポルフィリンは、以下の一般的な合成法に従って調製される。特定の合成例をこの一般的な説明の後に記載するが、これは、本発明の広範な一般的方法の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。本出願で説明するポルフィリンは、ポルフィリン核の周囲に対称的に配置された基に結合している４個の窒素を含有する既知のポルフィリンから調製される。これらの窒素は、正電荷を有する第四級アンモニウム塩に転換することができる。
【００４２】
本発明の第１の工程では、ポルフィリンを適当な溶媒中の化学量論量以下のアルキル、アルケニルまたはベンジルハロゲン化物と反応させることにより、これらの窒素のうちの１個を第四級の形態に変化させる。次いで、溶解性の相違を用いて、得られたモノ第四級ポルフィリンを出発ポルフィリンから分離させる。生成物のポルフィリンの所期の用途が保証する場合、この工程は、簡略化、短縮、あるいは省略してもよい。
【００４３】
次いで、このモノ第四級ポルフィリンを、メチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩、硫酸ジメチル、メチルフルオロスルホン酸塩、ヨウ化メチル、または他の通常用いられる好適なメチル化剤などのメチル化剤を用いることにより、残りの窒素位置で完全に四級化させる。
【００４４】
最終生成物は、クロマトグラフィーなどの分離技術を用いて、反応混合物から最終生成物を抽出することによって精製される。対イオン（陰イオン）は、イオン交換媒体を用いて変えることができる。製品ポルフィリンが所期の用途を十分に保証する場合、この最終分離工程は、簡略化、短縮、あるいは省略してもよい。
【００４５】
２．合成実施例
【実施例１】
【００４６】
５−（４−Ｎ−デシルピリジル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンテトラクロリドジヒドロクロリド塩の調製：
１グラム（１．６１ミリモル）の５，１０，１５，２０テトラ（４−ピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンと２８５ｍｇ（１．２９ミリモル）の１−ブロモデカンを氷酢酸２０ｍｌ中で２２時間還流させた。Ｃ−１８シリカ逆相プレート薄層クロマトグラフィーを９０／１０メタノール／６Ｎ  ＨＣｌ  Ｖ／Ｖで溶出すると、やや多目の出発ポルフィリンと痕跡量のジ−Ｎ−デシル誘導体とともに約３５〜４０％のモノ−Ｎ−デシル誘導体が現れた（置換の増加につれてＲｆは減少）。この混合物をメタノール２００ｍｌに注ぎ入れ、冷蔵庫内で数時間冷却し、次いで冷凍庫内に数時間置き、出発ポルフィリンを沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって回収し、生成物を含有しているデカントした溶媒を回転式真空器で乾燥させた。得られた固形物を４時間、メタノール１５０ｍｌ中で還流し、冷蔵庫内で一晩冷却し、得られる固形物を遠心分離によって除去した。デカントしたその溶液を薄層クロマトグラフィー（上述と同じ系）にかけ、わずかな２置換ポルフィリンと痕跡量の出発ポルフィリンとともに、主として１置換生成物が得られた。溶媒を回転式エバポレーションにより除去し、次いで、それ以上の精製を行わずに次の工程に用いた。
【００４７】
固形物を１グラムのメチル−ｐ−トルエンスルホン酸を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍｌ中に溶解し、２時間還流した。回転式エバポレーションにより溶媒を除去し、固形物を脱イオン水５０ｍｌに溶解させ、濾過して不溶物を除去した。この溶液を、４０ミクロンのブチル（Ｃ−４）逆相パッキング（J. T. Baker）を充填した８ｃｍ×２ｃｍのクロマトグラフィー・カラムにかけた。３ＮのＨＣｌでカラムを簡単に洗浄し、次いで、５０％メタノール、５０％１Ｎ  ＨＣｌで溶出した。主たるバンドを回収し、回転式エバポレーションにより乾燥させ、光沢のあるダークグリーン色の粉末４００ｍｇを得た。これは、ＷｈａｔｍａｎＫＣ２シリカ逆相プレート薄層クロマトグラフィーの５０％メタノール、５０％１Ｎ  ＨＣｌ  Ｖ／Ｖ  Ｒｆ  ０．２による溶出によって、９５％より高いと推定された。
【実施例２】
【００４８】
５−（４−Ｎ−テトラデシルピリジル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンテトラクロリドジヒドロクロリド塩の調製：
無水の酢酸ナトリウム５００ｍｇに加えた、１グラム（１．６１ミリモル）の５，１０，１５，２０テトラ（４−ピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンと３５７ｍｇ（１．２９ミリモル）の１−ブロモテトラデカンを氷酢酸２０ｍｌ中で１６時間還流させた。シリカ・プレートの薄層クロマトグラフィーをイソプロパノール／水／アセトン／酢酸／濃縮水酸化アンモニウム（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）で溶出すると、痕跡量の２置換ポルフィリンと残存している出発ポルフィリンとともに、約３０％の１置換ポルフィリンが現れた。回転式エバポレーションにより溶媒を除去し、メタノール２００ｍｌで４時間還流することにより、固形物を抽出した。温めながら固形物を濾過して大部分の出発ポルフィリンを除去し、次いで、数時間冷蔵庫内で冷却した後、再度残存する大部分の出発ポルフィリンを除去した。ロータリー・エバポレータでこの溶液の体積を約２０ｍｌまで減少させ、次いで、数時間冷蔵庫内で冷却した。上記の薄層クロマトグラフィー系によって確認したところ、小型ブッフナー漏斗で濾過した固形物は、少量の出発ポルフィリンを含むが、大部分が１置換ポルフィリンであった。
【００４９】
固形物を０．５グラムのメチル−ｐ−トルエンスルホン酸を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｍｌ中で２時間還流した。回転式エバポレーションにより溶媒を除去し、固形物を脱イオン水５０ｍｌに溶解させ、濾過して不溶物を除去した。この溶液を、４０ミクロンのブチル（Ｃ−４）逆相パッキング（J. T. Baker）を充填した８ｃｍ×２ｃｍのクロマトグラフィー・カラムにかけた。３ＮのＨＣｌでカラムを短時間洗浄し、次いで、５０％メタノール、５０％１Ｎ  ＨＣｌで溶出した。中心の主たるバンドを回収し、回転式エバポレーションにより乾燥させ、光沢のあるダークグリーン色の粉末１１０ｍｇを得た。これは、ＷｈａｔｍａｎＫＣ２シリカ逆相プレート薄層クロマトグラフィーの７０％メタノール、３０％１Ｎ  ＨＣｌ  Ｖ／Ｖ  Ｒｆ  ０．２２による溶出によって、９５％以上であると推定された。さらに、約９０％の純度を持つ生成物８０ｍｇを溶出剤の他の画分から回収した。
【実施例３】
【００５０】
５−（４−Ｎ−ヘキシルピリジル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンテトラクロリドジヒドロクロリド塩の調製：
１グラム（１．６１ミリモル）の５，１０，１５，２０テトラ（４−ピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン、１−ヨードヘキサン２７３ｍｇ（１．２９ミリモル）、および無水酢酸ナトリウム５００ｍｇを氷酢酸２０ｍｌ中、１８時間還流させた。シリカ・プレートの薄層クロマトグラフィーをイソプロパノール／水／アセトン／酢酸／濃縮水酸化アンモニウム（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）で溶出すると、わずかに１５〜２０％の１置換生成物が現れた。さらに１４４ｍｇの１−ヨードヘキサンをこの混合物に添加し、還流をさらに１０．５時間継続した。上記の系の薄層クロマトグラフィーにより、２０〜２５％の１置換生成物が現れた。この混合物に１−ヨードヘキサンをさらに１４４ｍｇ添加し、さらに１２時間還流を継続したところ、上述の薄層クロマトグラフィー系により推定３０％の１置換生成物が得られた。回転式エバポレーションにより溶媒を除去し、固形物を還流用メタノール１００ｍｌで２時間抽出した。２４時間冷蔵庫内でこの混合物を冷却し、次いで、濾過して大部分の出発ポルフィリンを除去した。ロータリー・エバポレータでこの溶液の体積を約３０ｍｌまで減少させ、次いで、冷蔵庫内で一晩冷却した。濾過を行い、上述の薄層系によって推定された、約８５〜９０％の１置換ポルフィリンを含有した固形物約１００ｍｇが得られた。
【００５１】
固形物を４００ｍｇのメチル−ｐ−トルエンスルホン酸を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２０ｍｌ中で２時間還流し、次いで、回転式エバポレーションによって溶媒を除去した。この固形物を３０ｍｌの温水に溶解させ、濾過し、４０ミクロンのブチル（Ｃ−４）逆相パッキング（J. T. Baker）を充填した８ｃｍ×２ｃｍのクロマトグラフィー・カラムにかけた。３ＮのＨＣｌでカラムを短時間洗浄し、次いで、７０％１Ｎ  ＨＣｌ、３０％メタノール、Ｖ／Ｖで溶出した。３つの画分を回収し、ＷｈａｔｍａｎＫＣ２シリカ逆相プレート薄層クロマトグラフィーの５０％メタノール、５０％１Ｎ  ＨＣｌ、Ｖ／Ｖによる溶出によって推定した。第１の画分は、約２０％のテトラ−Ｎ−メチル化出発ポルフィリンが混入している所望の生成物を含有していた。第２の画分は、純度が９５％以上と推定される所望の生成物を含有しており、第３の画分は主としてジ−Ｎ−ヘキシル、ジ−Ｎ−メチル置換ポルフィリンであった。ロータリー・エバポレータで第２の画分から溶媒を除去し、固形物を数ｍｌの水中に溶解し、その溶液がダークグリーン色になるまで数滴の３Ｎ  ＨＣｌを徐々に増量し、次いで、その溶液を凍結乾燥装置により凍結乾燥した。光沢のあるダークグリーン色の粉末が得られ、その収率は４５ｍｇであった。上述の逆相薄層系におけるＲｆは０．３６であった。
【実施例４】
【００５２】
５−（４−Ｎ−オクタデシルピリジル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンテトラクロリドジヒドロクロリド塩の調製：
１グラム（１．６１ミリモル）の５，１０，１５，２０テトラ（４−ピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンと４９０ｍｇ（１．２９ミリモル）の１−ヨードオクタデカンを氷酢酸２０ｍｌ中、１６時間還流させた。９０／１０のメタノール／６Ｎ  ＨＣｌ  Ｖ／Ｖで溶出するＣ−１８シリカ逆相プレートの薄層クロマトグラフィーにより、痕跡量のジ−Ｎ−オクタデシル誘導体を含む、ほぼ等量のモノ−Ｎ−オクタデシル誘導体と出発材料が現れた（置換が増えるにつれてＲｆは低下）。回転式エバポレーションにより溶媒を除去し、氷酢酸１ｍｌとメタノール２００ｍｌを添加し、その溶液を６時間還流した後、室温で一晩放置した。その溶液を濾過し、濾液（少量の２置換ポルフィリンおよび出発ポルフィリンとともに、主として１置換ポルフィリンを含有している）をロータリー・エバポレータで蒸発乾固させた。メタノール１００ｍｌで３時間この固形物を還流し、室温で一晩放置し、次いで、冷凍庫に短時間置き、濾過し、この濾液を前の濾液に添加し、前述のように蒸発乾固させた。
【００５３】
乾燥濾液を合わせて１．５グラムのメチル−ｐ−トルエンスルホン酸を含有するＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド７５ｍｌ中に溶解させ、２時間還流した。ロータリー・エバポレータで溶媒を除去し、固形物を加温した脱イオン水７５ｍｌに溶解させ、濾過して不溶物を除去した。この溶液を４０ミクロンのブチル（Ｃ−４）逆相パッキング（J. T. Baker）を充填した２ｃｍ×１０ｃｍのクロマトグラフィー・カラムにかけた。最初に３ＮのＨＣｌで、次いで５０／５０  Ｖ／Ｖのメタノール／１Ｎ  ＨＣｌでカラムを溶出し、若干の不純物を除去した。生成物（ＷｈａｔｍａｎＫＣ２シリカ逆相プレート薄層クロマトグラフィーの７０／３０メタノール／３Ｎ  ＨＣｌ、Ｖ／Ｖ、Ｒｆ＝０．２５による溶出によって９５％以上であると推定された）を７０％メタノール、３０％３Ｎ  ＨＣｌ、Ｖ／Ｖによりカラムから溶出させ、ロータリー・エバポレータで乾燥させ、光沢のあるダークグリーン色の粉末４００ｍｇを得た。
【実施例５】
【００５４】
５−（４−Ｎ−ドコサニル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンテトラクロリドジヒドロクロリド塩の調製：
１グラム（１．６１ミリモル）の５，１０，１５，２０テトラ（４−ピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンと１−ブロモドコサン５０２ｍｇ（１．２９ミリモル）を無水酢酸ナトリウム５００ｍｇとともに氷酢酸２０ｍｌ中で１６時間還流させた。次いで、さらに２００ｍｇの１−ブロモドコサンを添加し、その溶液をさらに８時間還流させた。次いで、ロータリー・エバポレータでその溶液を蒸発乾固させた。１置換誘導体は、分別晶出によって、またはシリカ・カラムクロマトグラフイーによって、出発ポルフィリンから分離することは不可能であった。したがって、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド５０ｍｌに溶解した１グラムのメチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩でその粗製反応混合物を還流し、四級化工程を完了させた。この溶液を激しく撹拌している水１２５ｍｌにゆっくりと注ぎいれ、濾過し、４０ミクロンのブチル（Ｃ−４）逆相パッキング（J. T. Baker）を充填した８ｃｍ×２ｃｍのクロマトグラフィー・カラムにかけた。１ＮのＨＣｌでこのカラムを短時間に洗浄し、次いで、４０％メタノール、６０％１Ｎ  ＨＣｌ（Ｖ／Ｖ）、次いで、６０％メタノール、４０％１Ｎ  ＨＣｌ（Ｖ／Ｖ）で溶出し、テトラＮ−メチル化ポルフィリンを除去した。８０％メタノール、２０％１Ｎ  ＨＣｌ（Ｖ／Ｖ）によりカラムから生成物を溶出し、溶媒を回転式エバポレーションによって除去した。少量の水に生成物を溶解し、ダークグリーン色になるまで１ＮのＨＣｌを数滴添加し、次いで、凍結乾燥装置で凍結乾燥させ、光沢のあるダークグリーン色の粉末を１８０ｍｇ得た。ＷｈａｔｍａｎＫＣ２シリカ逆相プレート薄層クロマトグラフィーの７０％メタノール、３０％３Ｎ  ＨＣｌ（Ｖ／Ｖ）により、Ｒｆ＝０．１８で約９５％の純度であることが示された。
【実施例６】
【００５５】
５−（４−Ｎ−ベンジルピリジル）−１０，１５，２０−トリス（４−Ｎ−メチルピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンテトラクロリドジヒドロクロリド塩の調製：
無水酢酸ナトリウム５００ｍｇとともに、１グラム（１．６１ミリモル）の５，１０，１５，２０テトラ（４−ピリジル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィンと臭化ベンジル１９３ｍｇ（１．１３ミリモル）を２時間、氷酢酸２０ｍｌ中で還流させた。シリカ・プレートの薄層クロマトグラフィーをイソプロパノール／水／アセトン／酢酸／濃縮水酸化アンモニウム（Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ／Ｖ）で溶出すると、かなりな量の出発ポルフィリンとジ−Ｎ−ベンジル誘導体とともに、約５０％のモノ−Ｎ−ベンジル誘導体が現われた。この溶液をさらに加温しながらメタノール１５０ｍｌへ注ぎいれ、冷蔵庫内で一晩冷却した。この溶液を濾過し、大部分の出発ポルフィリンを除去し、次いで、ロータリー・エバポレータで蒸発乾固した。
【００５６】
モノ−Ｎ−ベンジルポルフィリン誘導体を含有するこの固形物を２時間、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｍｌ中のメチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩５００ｍｇで還流し、次いで、回転式エバポレーションによって溶媒を除去した。固形物を温水５０ｍｌに溶解し、濾過した後、４０ミクロンのブチル（Ｃ−４）逆相パッキング（J. T. Baker）を充填した８ｃｍ×２ｃｍのクロマトグラフィー・カラムにかけた。３ＮのＨＣｌでカラムを簡単に洗浄し、次いで、１ＮのＨＣｌ中の２０〜５０％メタノール（Ｖ／Ｖ）で溶出した。溶出された主なバンドは所望の生成物を含有しており、回転式エバポレーションによって溶媒を除去して光沢のあるダークグリーン色の粉末２５５ｍｇを得た。ＷｈａｔｍａｎＫＣ２シリカ逆相プレート薄層クロマトグラフィーの７０％メタノール、３０％１Ｎ  ＨＣｌ（Ｖ／Ｖ）による指定純度は、Ｒｆ＝０．３３で９５％より高かった。
【実施例７】
【００５７】
一連の新規な正荷電ポルフィリンを調製し、大腸菌（グラム陰性細菌）および抗生物質耐性のある黄色ブドウ球菌（グラム陽性細菌）について試験した。対称的に配置されている４個の正電荷を含むポルフィリンは、荷電部位の１個の部位で始まる、６〜２２個の炭素（６個及び２２個を含む）を含有する疎水性「尾部」を含むことによって、これらの細菌に対して光力学的薬剤としての効力が高くなることが確認された。さらに、「尾部」が６個より多く１８個未満の炭素を含有していた場合、この光力学的活性の上昇が最も顕著であった。直鎖状アルキル尾部およびベンジル尾部のみを調製し、試験したが、当業者は、同等の疎水性直鎖状アルケニル、分枝状アルキルまたはアルケニルおよび芳香族または混合アルキル芳香族またはアルケニル芳香族尾部も同様の効果を有すると予想するであろう。上記ポルフィリンは、これらの細菌に対して、ポルフィリン増感剤が５〜２０分の１の低い濃度で、上で引用したマーチャットの文献で用いられているベースのポルフィリン（Ｔ4ＭＰｙＰ）に匹敵する光力学的効果を示した。ベンジル尾部を有するポルフィリンは、同一条件下でベースのポルフィリンの約２倍の効果があった。表１を参照されたい。
【００５８】
細菌は、１．５％のＮａＣｌを補充した脳・心臓滲出物ブロス（ディフコ（Difco）社）中で２０℃にて好気的に増殖させた。大腸菌細胞は、脳・心臓滲出物ブロス中、３７℃にて好気的に増殖させた。対数増殖期にある細胞を遠心分離によって収集し、ｐＨ７．４で、２．７ｍＭのＫＣｌと０．１４ＭのＮａＣｌをさらに含む１０ｍＭリン酸緩衝食塩水を用いて３回洗浄した。約１０７個／ｍｌの最終濃度になるまでこの緩衝液で細胞を希釈した。
【実施例８】
【００５９】
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌を死滅させる本発明の各種ポルフィリンの能力をＴ4ＭＰｙＰの能力に対して試験した。表７を参照されたい。大腸菌と黄色ブドウ球菌の細胞を各化合物とともに５分間インキュベートし、次いで、白色光を時間を変えてそのサンプルに照射した。
【００６０】
【表１】
2005505574.tif 000002
まず、Ｔ4ＭＰｙＰを大腸菌と黄色ブドウ球菌に５分間、１０μＭの濃度で暴露した。第１のサンプルには５分間光照射した。その結果、大腸菌では２８．７％、黄色ブドウ球菌では９６．４％の増殖阻害があった。第２のサンプルには１５分間光照射した。その結果、大腸菌では８２．８％、黄色ブドウ球菌では１００％の増殖阻害があった。
【００６１】
次に、モノ置換ポルフィリンを大腸菌と黄色ブドウ球菌に暴露した。このポルフィリンはヘキサンの尾部で置換されていた。第１のサンプルを０．５μＭの濃度で５分間細菌に暴露した。５分間では大腸菌は４．８％しか阻害されなかった。３０分間では大腸菌は１５．５％阻害された。第２のサンプルを１０μＭのモノ置換ポルフィリンに暴露したところ、５分間では大腸菌は９８．７％阻害された。１０分間では大腸菌は１００％阻害された。
【００６２】
次に、１０個の炭素尾部を有する第２のモノ置換ポルフィリンで大腸菌と黄色ブドウ球菌を再度５分間処理した。０．５μＭのポルフィリンで第１のサンプルを処理し、５分間光照射した。５分間では、大腸菌は４６．３％まで増殖が阻害され、黄色ブドウ球菌は７３．９％まで阻害された。１０分間では、大腸菌は９２％阻害され、黄色ブドウ球菌は８７．９％まで阻害された。
【００６３】
第２のサンプルを１０個の炭素で置換したポルフィリンで１μＭの濃度にて処理した。白色光を５分間照射した後、大腸菌は９６．１％まで阻害され、１０分間では、大腸菌は１００％阻害された。本発明のポルフィリンの光物理学的特性と光生物学的特性を組み合わせたこの実験によって、これらのカチオン性ポルフィリンが抗菌活性を誘導する機序を解明するのに有用であることが判明した。いかなる理論にも拘泥するものではないが、光物理学的データは、緩衝水中、発光性非活性化が適度の機能を果たしていることを示していると思われる。しかし、鎖長の長い鎖式化合物Ｃ２２は例外として、三重項多様体への項間交差が、これらポルフィリンのＳ１状態の最も重要な緩和経路であると思われる。本質的に水中ではそれが凝集しているために、緩和は主に基底状態への内部変換によって生じる。
【００６４】
したがって、いかなる理論にも拘泥するものではないが、主として三重項状態がポルフィリンの増感特性を担っていることは明らかである。Ｔ１特性、特にＴ１の寿命は、塊状種の形成に大きく影響される。したがって、これは光活性の低下と関係がある。
【００６５】
したがって、設計された周縁の置換基を注意深く結合させることにより、テトラピロール巨大環が水溶性媒体中で凝集する傾向を相殺させることが重要と思われる。出願人が行った研究で得られたデータから、この目的が、適当な大きさ（Ｃ１０〜Ｃ１４）の１個の炭化水素鎖をポルフィリンに添加することにより、本発明の好ましい実施形態において達成され得ることが明らかである。さらに、この添加により、細菌細胞に対するポルフィリンの親和性が高まるという利点を得られる。
【００６６】
増感作用の効率を高める構造要素を導入する必要性は、グラム陰性細菌の場合に特に重要である。グラム陰性細菌は、グラム陽性細菌よりも明らかに光増感不活性化を受けにくいことは繰り返し報告されてきている（非特許文献３）。さらに、本出願に含まれている知見はこの結論を支持する。疎水性の実施例１３、表５を参照されたい。
【００６７】
協奏的暗所毒性および光毒性をもたらす光増感剤分子の技術は、現在の方法、特にｉｎ  ｖｉｖｏにおける光線療法の用途に好ましいと考えられる。これらの現在の方法の多くは、２組の化学薬品の並行導入に基づいている。化学薬品の第１組のメンバーは、細菌壁の浸透性を高めるように作用する。かかる化学薬品にはしばしば、ポリミキシンノナペプチドまたはＥＤＴＡが含まれる（非特許文献５及び６）。第２組の化学薬品には光増感剤が含まれ、それは、細菌を浸透性がより高めた後でよりよく機能することができる。
【００６８】
３．細菌への親和性に対する疎水性増大の効果を評価するための材料および方法、ならびに光物理学的特性を測定するための材料および方法
ポルフィリンおよび他の化学薬品：
メソ−テトラ（Ｎ−メチル−４−ピリジル）ポルフィンテトラトシレート（Ｔ4ＭＰｙＰ）は、フロンティア・サイエンティフィック（Frontier Scientific）（米国ユタ州ローガン（Ｌｏｇａｎ））から購入し、それ以上精製を行うことなく用いた。Ｔ4ＭＰｙＰの１個のＮ−メチル基が次第に増加する炭素原子を有するアルキル鎖で置換された種々のメソ−置換ポルフィンは、フロンティア・サイエンティフィック（米国ユタ州ローガン）研究所で合成された。種々のポルフィリン誘導体の化学構造を図１に示す。他のすべての化学薬品は分析級試薬で、それ以上の精製を行うことなく用いた。
【００６９】
分光学的および光物理学的試験：
リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．４）中のポルフィリン（約５μＭ）の基底状態吸収スペクトルを、ラムダ５Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ分光測光器で記録した。（計器械応答に対して補正した）蛍光スペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（ＬＳモデル）またはＳｐｅｘ（Fluorolog F112）分光蛍光計で記録した。ＰＢＳ中、および２％ドデシル硫酸ナトリウム（界面活性剤、以下「ＳＤＳ」と記す）を含有する水溶液中のポルフィリン誘導体の蛍光量子収率（ΦF）は、発光スペクトル（範囲：６００〜８００ｎｍ、５６０ｎｍで励起）の領域を測定することにより決定した。参照としてトルエンに溶解したテトラ−ｎ−プロピルポルフィセン（ΦF＝０．３８）を用いた（ブラスラベツキー（Braslavsky）ら、J. Photochem．Photobiol. B: Biol.、第４０巻：１９１〜１９８ページ、１９９７年）。すべての場合に、サンプルと対照溶液の吸光度は、内部のフィルター効果を最小限に抑えるために、励起波長０．１未満に保った。
【００７０】
ポルフィリン・サンプルの蛍光減衰時間は、位相シフト方法に基づいたSpex Fluorolog-τ2分光蛍光計によって測定した。周波数特性曲線（位相シフトおよび復調比対周波数）は全体的に分析した。
【００７１】
レーザー閃光光分解実験は、先に記載したゴーナー（Gorner）らの装置を用いて、３５５ｎｍおよび４２０ｎｍの励起波長により実施した（ゴーナーら、Photoinduced electron transfer between styrylanthracenes and electron donors and acceptors in acetonitrile、J. Chem. Noc. Faraday Erans．、第８８巻、２９〜３４ページ、１９９２年。）
光安定性試験：
ポルフィリンの光安定性は、ＰＢＳ中、ＵＶおよび熱線フィルターを備えたクオーツハロゲンランプの発光から分離された白色光（４００〜８００ｎｍ）を用いて、１μＭ溶液の照明について測定した（テクラス（Teclas）社、スイス国ルガーノ（Ｌｕｇａｎｏ））。ランプは、１５０ｍＷ／ｃｍ2のフルエンス率で動作させた。光照射中、溶液を磁気的に撹拌し、３７℃に維持した。ポルフィリン・サンプルの濃度は種々の光照射時間にて分光測光法によりモニターし、光安定性は、光照射前に測定した吸光度に対する残存吸光度％として表した。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける光酸化試験：
様々なポルフィリンの感光活性は、生物学的基質としてのＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド（ＮＡＴＡ、アルドリッチケミカル（Aldrich Chem. Co.）社）の光酸化の促進におけるそれらの効果を測定することにより試験した。この目的のため、ＰＢＳ中、または２％ＳＤＳを含有する水中の１０μＭ  ＮＡＴＡに、５μＭポルフィリンの存在下で光照射した。光照射は、干渉フィルター（バルザース（Balzers）社、リヒテンシュタイン）によって単離した、５１５±１０ｎｍの光で行い、溶液（２ｍｌ）は、１ｃｍの光学距離のクオーツキュベット中で磁気的に撹拌し、２５℃に維持した。ＮＡＴＡの光増感変化は、様々な光照射時間において２９０ｎｍ光による励起時の蛍光発光スペクトル（３００〜４５０ｎｍ）の強度の低下を測定することによって追跡した。１ｎＦ°／Ｆを光照射時間（ここで、Ｆ°およびＦは、それぞれ０時間およびｔ時間における蛍光強度を表す）に対してプロットして、光過程の一次反応速度定数を導出することができた。
【００７３】
入射光の強度は、アクチノメーターとしてトルエン中でＡｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ９９９Ｐを用いることにより測定した（ヘラー（Heller）、EPA Newslett.、第２９巻：４９〜６０ページ、１９８７年）。このパラメーターを用いて、種々のポルフィリンによって増感させたＮＡＴＡ光酸化の量子収率を計算した。
【００７４】
細菌細胞へのポルフィリンの結合：
大腸菌Ｏ４株（野生型）と、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ１１０株を脳・心臓滲出物ブロス（ＢＨＩ、ディフコ社、ミシガン州デトロイト）中で３７℃にて好気的に増殖させた。定常増殖期のこれらの細胞をブロス培養物の遠心分離（１５分間、２，０００ｇ）によって回収し、２．７ｍＭのＫＣｌおよび０．１４ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ＝７．４の１０ｍＭ  ＰＢＳを用いて２回洗浄し、１０８〜１０９個／ｍｌの密度（６５０ｎｍのいて約０．７の吸光度）でＰＢＳ中に懸濁した。この細胞懸濁液の５ｍｌアリコートを室温にて暗所で５分間、１μＭポルフィリンとともにインキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを直ちに回収するか、あるいは再度１回〜３回、ＰＢＳで洗浄し、その後遠心分離した。
【００７５】
細胞に結合したポルフィリンの量は、２％ＳＤＳ水溶液中に再懸濁し、一晩インキュベーションした後のペレットで測定した。細胞溶解物中のポルフィリン濃度は、４２０ｎｍにおける励起後に放射された、赤色蛍光（６００〜７５０ｎｍ）の強度を測定し、既知のポルフィリン濃度で得たキャリブレーションプロットでデータを補間することにより決定した。細胞サンプルのタンパク質含有量は、ローリー法（ローリー（Lowry）ら、J. Biol. Chem.、第１９３巻：２６５〜２７５ページ、１９５１年）によって決定し、それを用いて、細胞に結合したポルフィリンの量をタンパク質１ｍｇ当たりのポルフィリンのナノモルとして表した。
【００７６】
細菌細胞におけるポルフィリンの暗色毒性および光毒性：
大腸菌と黄色ブドウ球菌の両細胞におけるＴ4ＭＰｙＰおよびその類似体の毒性については、暗所における、または光線への暴露時のポルフィリンによる処理後の、増殖阻害の程度（静菌作用）と生存率の低下（細胞致死性／殺菌作用）を測定することにより評価した。
【００７７】
すべての場合に、細胞懸濁液（１０８〜１０９個／ｍｌ）５ｍｌを室温で暗所にて、０．５〜１０μＭの範囲の濃度の選択した光増感剤とともに５分間インキュベートした。暗所におけるインキュベーション後、細胞サンプルの一部を白色光（１５０ｍＷ／ｃｍ2）で照射した。光照射中、（最高３０分まで）細胞を３７℃に維持し、磁気的撹拌を行った。処理細胞と未処理のコントロール細胞とをＢＨＩで希釈して３７℃維持し、その間に、増殖曲線を決定するために、６５０ｎｍにおける懸濁液の吸光度を所定時間にモニターした。処理細胞の増殖阻害のパーセントは、以下の式：［１−（Ａx−Ａ0）／（Ａc−Ａ0）］×１００によって計算した。式中、ＡxおよびＡcは、それぞれ、処理細胞懸濁液およびコントロール細胞懸濁液について、３時間のインキュベーション後に測定された吸光度であり、一方、Ａ0は最初の吸光度を表し、Ａcは５時間インキュベーションした後のコントロール細胞懸濁液の吸光度である。細胞生存率については、脳・心臓寒天上に、処理細胞および未処理細胞の連続希釈アリコートをプレーティングし、３７℃で１８〜２４時間インキュベーションした後、コロニー数を数えることによって決定した。
【００７８】
４．疎水性の実施例
【実施例９】
【００７９】
吸収および放射特性
Ｔ4ＭＰｙＰの基底状態吸収スペクトル（図２を参照）は、１９４，０００Ｍ-1ｃｍ-1の分子吸光係数で４２２ｎｍにおいて強いソーレーバンド（Soret band）（メソ置換遊離塩基ポルフィリンに典型的である）を示し、かつ、５２０、５５２、５８５および６４０ｎｍにおいてＱバンドを示した。一般に、１個のピロール窒素のアルキル尾部の大きさが大きくなっても、ポルフィリンの基底状態スペクトルには影響しなかった。著しい変化は、Ｃ２２誘導体の場合にのみ確認された（図２を参照）。特に、約４４００ｃｍ-1の拡大がソーレーバンドの領域で検出されたが、これは、このポルフィリン・サンプルが広く凝集していることを示している。
【００８０】
緩衝液（ｐＨ＝７．４）中のＴ4ＭＰｙＰの蛍光スペクトルは、７１５ｎｍで最大を示し、６７５ｎｍでショルダーを示した（図３を参照）。一般に、青色ショルダーは、アルキル尾部の大きさが大きくなると大きくなることが確認された。Ｃ１８およびＣ２２誘導体では、蛍光スペクトルは２つの最大値（６６０および７２０ｎｍにおける）を示した。種々のポルフィリン誘導体に対する励起スペクトルを何種類かの放射波長で記録したが、対応する吸収スペクトルにいつもオーバーラップしていた。Ｃ１８およびＣ２２誘導体の場合にのみ、励起スペクトル中、ソーレーバンドが著しく狭くなることが確認されたが、これは、蛍光放射がモノマー成分によることを主に示唆するものである。これは文献データと一致する。表１に、ＰＢＳおよび２％ＳＤＳ水溶液媒体中の様々なポルフィリンについて得られた蛍光量子収率を示す。かかる収率はほとんど０．０３未満である。これは、第１の励起した一重項状態からの発光性崩壊が競合的緩和過程のうちであまり重要でないことを明らかに示している。ほとんどのポルフィリンでは、その量子収率はミセルの水溶液においてわずかに高いことがわかった。
【００８１】
【表２】
2005505574.tif 000003
特に、ＰＢＳ中のＣ２２誘導体についてのφF値が、同一媒体中の他のポルフィリンについて記録された値よりもはるかに小さかったが、一方、ＳＤＳでは他のφF値と同等であったことを確認することができる。この反応は、中性水溶液に低可溶性であるＣ２２誘導体が凝集塊を形成し、次いで、ＳＤＳ界面活性剤を添加することによって凝集が崩壊することを示す可能性が高い。
【００８２】
蛍光減衰時間は、位相シフト方法によって測定し、全放射光を記録した。周波数応答曲線の全体的な分析結果を表２にまとめた。
【００８３】
【表３】
2005505574.tif 000004
すべてのポルフィリン誘導体において、周波数応答トレースは、両指数関数によって十分にフィットした。Ｔ4ＭＰｙＰ曲線の分析により、高速成分については１．０ｎｓの減衰時間（τ１）と２９％の相対的重量が得られ、一方、低速成分については４．７ｎｓの減衰時間（τ２）が得られた。文献データとこの結果を比較すると、長い寿命の種と短い寿命の種は、それぞれポルフィリン誘導体の単量体および二量体に相当することがわかる。Ｃ６−、Ｃ１０−、Ｃ１４−およびＣ１８−誘導体について得られたトレースの分析結果により、Ｔ4ＭＰｙＰで得られた分析結果に（実験誤差内で）類似した減衰時間が得られた。しかし、アルキル誘導体の高速成分の相対的寄与率は、モデル化合物について得られたものよりも一桁低い率（２〜６％）であった。Ｃ２２誘導体では、高速成分は、０．５ｎｓの減衰時間と約３０％の相対的重量を示した。このパラメーターの適合における相違は、Ｃ２２の吸収および発光スペクトルで確認された変化とともに、新しい非活性化経路または相互作用過程の存在を示唆している可能性がある。
【実施例１０】
【００８４】
三重項状態特性
緩衝液中のポルフィリンの過渡スペクトルは、３５５および４２０ｎｍにおいてレーザー閃光光分解励起により記録した。Ｔ4ＭＰｙＰの時間変化スペクトル（図４ａを参照）は、三重項−三重項吸収により、４８０ｎｍにおいて最大を、４２５ｎｍにおいて最小（基底状態吸収に対応）を示した。シグナル（退色）の崩壊（成長）が第１次動力学によって生じ、その結果、９１μｓの寿命を有する基底状態が完全に回復された。４２５ｎｍの基底状態の既知の吸収係数を考慮し、完全減耗（depletion）方法を用いて、９２０ｎｍ（εT）でのポルフィリンの三重項−三重項吸収係数を得た。この場合、基底状態は吸収にほとんど影響を及ぼさない。また、これにより、アセトニトリルに溶解したベンゾフェノンの光学的にマッチした溶液を使用した実験装置による測定後に、三重項量子収率（φT）を決定することができた（表３を参照）。
【００８５】
【表４】
2005505574.tif 000005
Ｔ4ＭＰｙＰについては、文献値よりわずかに低い、φＴ値０．７３を得た。蛍光崩壊データによって示唆されるように、この不一致は、恐らく部分的に凝集したポルフィリン種の存在によるものである（表２を参照）。Ｃ６からＣ１８のポルフィリン誘導体を用いたレーザー閃光光分解実験では、そのスペクトル特性および崩壊特性がＴ4ＭＰｙＰについて記録されたものと類似していることから最低の三重項状態に同定された、短期の種が示された。これについて、図４ｂにＣ１８誘導体の結果を示す。一方、Ｃ２２誘導体の場合には過渡スペクトルは、３４０ｎｍと５１０ｎｍで異なる最大吸収と（図４ｃ）、０．１μｓの短い減衰時間を示した（表３を参照）。表から明らかなように、三重項量子収率はＮ−アルキル鎖の鎖長による影響を受け、Ｃ１８では有意な低下が示され、Ｃ２２ではさらに大きな低下が示された。
【００８６】
Ｃ２２の場合、青色波長領域の吸収スペクトルの拡大と、このポルフィリン・サンプルの全体の蛍光放射に対する低速崩壊成分および高速崩壊成分の明らかに低い寄与とによって示唆されるように、三重項寿命の短縮がＣ２２種の広範な凝集の形成を反映している可能性がある。三重項寿命に対してＮ−置換基の及ぼす影響ははるかに小さい（表３を参照）が、光力学的光増感剤でよく見られるように、酸素が存在するとかかる寿命は消滅した。凝集がＣ２２の光物理学的特性の低下の主たる原因であるという仮説は、リン酸塩緩衝水溶液では無視できるＮＡＴＡに対するその増感活性が、ＳＤＳミセルの存在下の他のポルフィリンで通常見られるものと非常に類似したものになるという知見によってさらに支持される（疎水性の実施例３、表４を参照）。この界面活性剤は、凝集したポルフィリン種の単量体化を引き起こすことが知られている。
【実施例１１】
【００８７】
Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミドおよびポルフィリン光退色に関する増感試験
様々なポルフィリンの内因性増感効率をモデル基質としてのＮＡＴＡに対して試験した。トリプトファンは、Ｉ型（ラジカル含有）およびＩＩ型（1Ｏ2含有）の両経路によってそのインドール成分の光増感変化が起こることが知られており（フート（Foote）、Oxygen and Oxy-Radicals in Chemistry and Biology、４２５〜４４０ページ、１９８１年）、したがって、実際の反応機構とは関係なく、光増感剤の活性を試験するためにそれを用いることができる。
【００８８】
表４から明らかなように、長いアルキル鎖を有するＴ4ＭＰｙＰとその類似体はともに、これまで他の光増感剤について確認されてきたように、１０-3範囲の量子収率で、ＮＡＴＡの容易に検出できる光酸化的分解を引き起こした（フート、Oxygen and Oxy-Radicals in Chemistry and Biology、４２５〜４４０ページ、１９８１年）。
【００８９】
【表５】
2005505574.tif 000006
２％ＳＤＳ水溶液中の様々なポルフィリン誘導体については、量子収率のわずかな変化しか測定されなかった。この場合、サンプルはすべて純粋なモノマーの形態であった。ＰＢＳ中でのＮＡＴＡ光酸化の量子収率値によって明らかなように、凝集塊の形成は、ポルフィリンの増感作用に著しい影響を与えることが明確に示されている（表４を参照）。かかる値は、２％ＳＤＳ中でＴ4ＭＰｙＰとＣ１４誘導体（両媒体中で主にモノマーの状態で存在する）について確認された値と非常に近く、一方、中性の均質水溶液中で多量に凝集するＣ２２では検出限界以下に減少することが観察された。
【００９０】
図５から明らかなように、ＰＢＳ中の１μＭ溶液に白色光を照射した場合、ポルフィリンはすべて次第に光退色していった。すべての場合に、ポルフィリン濃度の光誘導による低下は、双指数関数プロットによってフィットした。最初の高速崩壊相は、ほとんどの場合、１〜３分のｔ1/2によって特徴づけられるが、Ｃ２２誘導体サンプルは光安定性が著しく高いように見えた（ｔ1/2＝６．５分）。
【実施例１２】
【００９１】
細菌細胞へのポルフィリンの結合
黄色ブドウ球菌および大腸菌の各細胞へのＴ4ＭＰｙＰおよびその類似体の結合を図６および図７にそれぞれ示す。Ｎ−アルキル置換基の長さが炭素原子１個から１０個に長くなると、グラム陽性およびグラム陰性の両細菌によるポルフィリン集積の能力が高まることが明らかであった。アルキル鎖がＣ１４およびＣ２２へとさらに長くなっても、細胞結合ポルフィリンの量に対してあまり大きな影響はなかった。特に、未洗浄細菌細胞に結合したＣ１０〜Ｃ２２ポルフィリンの量は、Ｔ4ＭＰｙＰの約１０倍であった。すべての場合に、ポルフィリン結合は黄色ブドウ球菌細胞の場合の方が高かった。大腸菌細胞に対するポルフィリンの低親和性は、Ｃ６およびＣ１０誘導体において特に明白であり、黄色ブドウ球菌との結合は、グラム陰性細菌の場合に確認されたよりもおよそ２倍高かった。
【００９２】
細胞に結合しているポルフィリンの一部は洗浄を繰り返すことによって徐々に除去される可能性があり、このことは、ポルフィリン分子に細胞結合性の弱いものがあることを示唆している。しかし、光増感剤の疎水性が増大するにつれ、１回または３回洗浄した後の細胞になお結合しているアリコートは増加した。したがって、Ｔ4ＭＰｙＰで５分間インキュベーションした後、洗浄を３回行った大腸菌と黄色ブドウ球菌の各細胞は、それぞれ、最初の結合ポルフィリンのわずか１１％と１６％しか保持していなかった。これに対し、１０〜２２個の炭素原子を含む置換基を有するポルフィリン誘導体で細菌細胞をインキュベートした場合、これらの割合は、大腸菌では約６０％、黄色ブドウ球菌では７７％まで高まった。このことは、細菌にしっかりと結合されたポルフィリンの量がＴ4ＭＰｙＰの場合に確認されるよりも５０〜６０倍多いことを意味している。
【実施例１３】
【００９３】
細菌細胞におけるポルフィリンの暗色毒性および光毒性
細菌細胞における様々なポルフィリン誘導体の細胞毒性作用について、暗所で５分間インキュベーションした後、評価した。黄色ブドウ球菌について図８ａに、大腸菌について図８ｂに示したデータによれば、両細菌株に対する暗所細胞毒性の程度は光増感剤の化学構造に大きく左右されることがわかった。したがって、１０μＭ濃度のＴ4ＭＰｙＰまたはＣ６誘導体はかろうじて検出可能な程度に細菌細胞の増殖を阻害したが、１０μＭのＣ１４またはＣ１８誘導体でインキュベーションを行うと増殖は完全に阻害された。１０μＭのＣ１４またはＣ１８で細胞のインキュベーションを行った後、わずかに細胞生存率の緩やかな（２ｌｏｇｓ未満）低下がみられたことから、観察された効果は、（少なくとも大腸菌に対しては）殺菌性というよりむしろ主として静菌性であるように思われた。すべての場合にて、「暗所」細胞毒性は、大腸菌に比べて黄色ブドウ球菌の方が明らかに顕著であった（図８を参照）。
【００９４】
また、試験されたポルフィリンはすべて、暗所では実質的に効果を持たない濃度で黄色ブドウ球菌および大腸菌の細胞を損傷させる効率のよい光増感剤であった。表５から明らかなように、細胞増殖がかなり阻害されることが、１０μＭのＴ4ＭＰｙＰおよびＣ６の存在下で光照射した場合に、黄色ブドウ球菌と大腸菌の両方で確認された。
【００９５】
【表６】
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ポルフィリンの抗菌感光性は、Ｎ−アルキル鎖の鎖長をＣ１０およびＣ１４に長くすることによって高まり、１μＭの低用量で大腸菌の増殖を完全に阻害した。置換基の大きさをＣ１８およびＣ２２にさらに高めると、増感効率の低下を伴い、それは大腸菌の場合に特に明白であった。また、黄色ブドウ球菌よりも一般に耐感光性であるように思われるこの細菌株について、ポルフィリン光増感の結果としての生存率が下がるかどうか検査した。表６から明らかなように、生存率データは増殖阻害データと非常に類似していた。
【００９６】
【表７】
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最大の光効率は実際にＣ１０誘導体とＣ１４誘導体で確認され、１μＭポルフィリンの存在下で１５分間光照射した場合、大腸菌細胞の生存率は４ｌｏｇ低下した。１０μＭ濃度ではＣ６でのみ同様の結果が得られ、Ｔ4ＭＰｙＰおよびＣ２２誘導体ではその効率が下がることが示された。
【００９７】
このように、本発明は、疎水性の炭化水素鎖を含有する４個までの正電荷を備えた一群の新規な正荷電ポルフィリンを含む。炭化水素尾部は、炭素数が６〜２２個の少なくとも１個の炭化水素鎖を含んでもよい。その尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】既知の光力学的抗菌剤Ｔ４ＭＰｙＰの化学構造と、炭素原子数が次第に増加するＮ−アルキル置換基を有する本発明の新規なＴ４ＭＰｙＰ誘導体を示す図。
【図２】ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液中のＴ４ＭＰｙＰ（１）、Ｃ１８誘導体（２）およびＣ２２誘導体（３）の正規化吸収スペクトルを示すグラフ。
【図３】ｐＨ７．４の約５μＭリン酸塩緩衝液（「ＰＢＳ」）中のＴ４ＭＰｙＰ（実線）、Ｃ１８誘導体（点線）およびＣ２２誘導体（破線）の正規化蛍光放射（６００ｎｍ以上）および励起（６００ｎｍ未満）スペクトルを示すグラフ。
【図４】ｐＨ７．４の空気平衡化リン酸緩衝液中のポルフィリン誘導体の過渡吸収スペクトル（λｅｘｃ＝４２０ｎｍ）を示すグラフ。（ａ）遅延時間が１．０（○）、８．０（△）および８０（◇）μｓのＴ４ＭＰｙＰ。（ｂ）遅延時間が０．２（○）、２．０（△）および６．０（◇）μｓのＣ１８誘導体。（ｃ）遅延時間が０．０５（○）、０．１２（△）、０．２４（◇）および１．６（▽）μｓのＣ２２誘導体。
【図５】種々の時間で白色光を照射した後のポルフィリン誘導体の光退色を示すグラフ。ポルフィリン退色は、ソーレーバンドの最大値における吸光度の減少を測定することによりモニターした。４２２ｎｍ、Ｔ4ＭＰｙＰ（黒四角）；４２３ｎｍ、Ｃ１０（●）；４２４ｎｍ、Ｃ１４（  ）；および４３２ｎｍ、Ｃ２２（  ）。
【図６】黄色ブドウ球菌細胞に対するＴ４ＭＰｙＰとその類似体の結合を示すグラフ。細胞結合ポルフィリンの量は、細胞を洗浄せずに、室温にて１μＭポルフィリンで５分間のインキュベーションの後、及びＰＢＳによる１回および３回の洗浄の後、測定した。
【図７】大腸菌細胞に対するＴ4ＭＰｙＰおよびその類似体の結合を示すグラフ。実験条件は図６の条件と同じである。
【図８】暗所にて１μＭ（白色コラム）または１０μＭ（灰色コラム）のポルフィリンに５分間暴露させた黄色ブドウ球菌（ａ）および大腸菌細胞（ｂ）の増殖阻害を示すグラフ。
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年11月12日(2003.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光力学的抗菌剤であって、該抗菌剤は、４個の第四級窒素を備えたポルフィリンを含み、該ポルフィリンはさらに、前記第四級窒素のうちの１個から始まり６〜２２個の炭素原子を含有する炭化水素尾部を含む抗菌剤。
【請求項２】
前記ポルフィリンは還元型ポルフィリンである請求項１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項３】
前記還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される請求項２に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項４】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項５】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである請求項４に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項６】
前記ポルフィリンは、金属キレート化ポルフィリンである請求項２に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項７】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである請求項６に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項８】
前記炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される請求項１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項９】
前記炭化水素尾部は６〜１８個の炭素原子を含有する請求項１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１０】
前記炭化水素尾部はベンジル基を含む請求項９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１１】
前記炭化水素尾部は炭素原子６個の鎖を含む請求項９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１２】
前記炭化水素尾部は炭素原子１０個の鎖を含む請求項９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１３】
前記炭化水素尾部は炭素原子１４個の鎖を含む請求項９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１４】
前記炭化水素尾部は炭素原子１８個の鎖を含む請求項９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１５】
光力学的抗菌剤であって、該抗菌剤は、４個の第四級窒素を備えたメソ−テトラ−（Ｎ−メチル−ピリジル）ポルフィリンを含み、１個のＮ−メチル基は、６〜２２個の炭素原子を含有する炭化水素尾部により置換されている抗菌剤。
【請求項１６】
前記炭化水素尾部は、６個よりも多く且つ１８個未満の炭素原子を含有する請求項１５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１７】
前記ポルフィリンは還元型ポルフィリンである請求項１５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１８】
前記還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される請求項１７に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項１９】
前記ポルフィリンは、金属キレート化ポルフィリンである請求項１５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２０】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属のキレートである請求項１９に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２１】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項１７に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２２】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである請求項２１に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２３】
前記炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される請求項１５に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２４】
前記炭化水素尾部はベンジル基を含む請求項２３に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２５】
前記炭化水素尾部は炭素原子６個の鎖を含む請求項２３に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２６】
前記炭化水素尾部は炭素原子１０個の鎖を含む請求項２３に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２７】
前記炭化水素尾部は炭素原子１４個の鎖を含む請求項２３に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２８】
前記炭化水素尾部は炭素原子１８個の鎖を含む請求項２３に記載の光力学的抗菌剤。
【請求項２９】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する方法であって、
ポルフィリンの第１の窒素を化学量論量以下（substoichiometric quantity）の所望の疎水性炭化水素尾部のハロゲン化塩と反応させることによってその第１の窒素を四級化して、モノ第四級ポルフィリンを形成する工程と、
メチル化剤を用いて前記ポルフィリンの残存窒素を四級化して、４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性尾部とを有するポルフィリンを形成する工程と
を備える方法。
【請求項３０】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項２９に記載の方法において、残存するポルフィリンまたはハロゲン化塩から前記モノ第四級ポルフィリンを分離する工程をさらに備える方法。
【請求項３１】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３０に記載の方法において、残存するポルフィリンまたはハロゲン化塩からモノ第四級ポルフィリンを分離する工程は、溶解性の相違を利用して行われる方法。
【請求項３２】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３０に記載の方法において、残存するポルフィリン、他の副産物、およびハロゲン化塩から、対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有する合成ポルフィリンを分離する工程をさらに備える方法。
【請求項３３】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３２に記載の方法において、残存するポルフィリン、他の副産物、およびハロゲン化塩から、対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有する合成ポルフィリンを分離する工程は、クロマトグラフィーを用いて行われる方法。
【請求項３４】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３２に記載の方法において、前記ハロゲン化塩は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル、分枝状アルケニル、芳香族、混合アルキル芳香族、および混合アルケニル芳香族のハロゲン化塩からなる群から選択される方法。
【請求項３５】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３２に記載の方法において、前記メチル化剤は、メチル−ｐ−トルエンスルホン酸塩、ヨウ化メチル、硫酸ジメチル、およびメチルフルオロスルホン酸塩からなる群から選択される方法。
【請求項３６】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３２に記載の方法において、前記ポルフィリンは還元型ポルフィリンである方法。
【請求項３７】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３６に記載の方法において、前記還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される方法。
【請求項３８】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３２に記載の方法において、前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである方法。
【請求項３９】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３８に記載の方法において、前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである方法。
【請求項４０】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項３６に記載の方法において、前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである方法。
【請求項４１】
４個の第四級窒素上に対称的に配置された４個の正電荷と１個の疎水性炭化水素尾部とを有するポルフィリンを合成する請求項４０に記載の方法において、前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである方法。
【請求項４２】
グラム陽性またはグラム陰性細菌を死滅させる方法であって、
対称的に配置された４個の正電荷と６〜２２個の炭素原子を含有する１個の炭化水素尾部とを有するポルフィリンを含んだ光力学的抗菌剤にグラム陽性またはグラム陰性細菌を暴露する工程と、
前記細菌および抗菌剤を光照射する工程と
を備える方法。
【請求項４３】
前記ポルフィリンは還元型ポルフィリンである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記還元型ポルフィリンは、クロリンおよびバクテリオクロリンからなる群から選択される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属のキレートである請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポルフィリンは金属キレート化ポルフィリンである請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記金属キレート化ポルフィリンは、Ｍｇ、Ｓｃ、Ｚｎ、Ａｌ、Ｉｎ、Ｔｌ、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｓｎ、Ｐｄ、およびＰｔからなる群から選択される金属の金属キレートである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記炭化水素尾部は、直鎖状アルキル、直鎖状アルケン、分枝状アルキル鎖、分枝状アルケニル鎖、芳香族、混合アルキル芳香族種、および混合アルケニル芳香族種からなる群から選択される請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記炭化水素尾部は、６個より多く且つ１８個未満の炭素原子を含有する請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記炭化水素尾部はベンジル基を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記炭化水素尾部は炭素原子６個の鎖を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記炭化水素尾部は炭素原子１０個の鎖を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記炭化水素尾部は炭素原子１４個の鎖を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記炭化水素尾部は炭素原子１８個の鎖を含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記ポルフィリンは、約１０μＭから約０．１μＭの濃度で存在する請求項４２に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポルフィリンは、約５μＭから約０．５μＭの濃度で存在する請求項４２に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポルフィリンは１μＭの濃度で存在する請求項４２に記載の方法。
【国際調査報告】
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