(57)【要約】１型インターフェロン誘導因子（例えば、二本鎖ＲＮＡ）を、抗原送達系および／または免疫刺激分子（例えば、免疫刺激核酸配列）と組み合わせて含む、同時投与された抗原の免疫応答を増大するためのアジュバント組成物が、記載される。本発明は、１以上の抗原送達系（例えば、サブミクロンの水中油型エマルジョン、カチオン性脂質、リポソーム、ＩＳＣＯＭ、微小粒子など）および／または免疫刺激分子（例えば、免疫刺激核酸配列（ＩＳＳ）（ＣｐＹ、ＣｐＲおよび非メチル化ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によって連結された、シトシン、続いてグアノシン）が挙げられる）との組み合わせた、１型インターフェロン誘導因子（例えば、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））の使用が、同時投与された抗原に対する、このような送達系を用いないで観察される抗体力価よりも有意に高い抗体力価を提供するとの驚くべき知見に部分的に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、該組成物は、以下：
（１）１型インターフェロン誘導因子；ならびに
（２）抗原送達系および／または免疫刺激分子、
を含み、
該組成物は、該抗原送達系および／または該免疫刺激分子なしの、該抗原および１型インターフェロン誘導因子のみの送達と比較して、同時投与された抗原に対する免疫応答を増大し得、該同時投与された抗原は、該組成物中に必要に応じて存在する、
組成物。
【請求項２】
前記組成物が、１型インターフェロン誘導因子、抗原送達系および免疫刺激分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、１型インターフェロン誘導因子および抗原送達系を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記１型インターフェロン誘導因子が、ｄｓＲＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ｄｓＲＮＡが、ウイルスｄｓＲＮＡまたは合成ｄｓＲＮＡである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｄｓＲＮＡが、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ポリ［ｒＩ−ｒＣ］）、ポリリボグアニル酸−ポリリボシチジル酸（ポリ［ｒＧ−ｒＣ］）、またはポリリボアデニル酸−ポリリボウリジル酸（ポリ［ｒＡ−ｒＵ］）である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｄｓＲＮＡが、ポリ［ｒＩ−ｒＣ］である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原送達系が、サブミクロンの水中油型エマルジョンおよび／または微小粒子を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗原および／または前記１型インターフェロン誘導因子が、前記微小粒子と会合している、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記微小粒子が、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酢酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステルおよびポリ無水物からなる群から選択されるポリマーを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記微小粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原および／または前記１型インターフェロン誘導因子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）を含む微小粒子に吸着されている、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物であって、前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、以下：
（１）代謝可能な油であって、全容量の０．５％〜２０％の量で存在する、油；および
（２）乳化剤であって、０．０１重量％（ｗ／ｖ）〜２．５重量％（ｗ／ｖ）である、乳化剤、
を含み、
該油および該乳化剤が、油滴を有する水中油型エマルジョンの形態で存在し、該油滴の実質的に全ての直径が、約１００ｎｍ〜１ミクロン未満である、組成物。
【請求項１４】
前記油が、全容量の１％〜１２％の量で存在し、そして前記乳化剤が、０．０１重量％（ｗ／ｖ）〜１重量％（ｗ／ｖ）の量で存在する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステル、および／またはソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステルもしくはソルビタントリエステルを含む、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステルもしくはポリオキシエチレントリエステル、および／またはソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステルもしくはソルビタントリエステルを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
１つ以上の前記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートおよびソルビタントリオレエートであり、存在する該ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートおよびソルビタントリオレエートの量が、１重量％（ｗ／ｖ）である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、４〜５％ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、および／または０．２５〜１．０％のソルビタントリオレエートを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、本質的に、５容量％のスクアレンを含み；そして１つ以上の前記乳化剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートおよびソルビタントリオレエートからなる群から選択され、存在する該乳化剤の総量が、１重量％（ｗ／ｖ）である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫刺激分子が、免疫刺激核酸配列（ＩＳＳ）である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＩＳＳが、ＣｐＧオリゴヌクレオチドである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の組成物であって、前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、配列５’−Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４を含み、ここで、Ｘ１およびＸ２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴおよびＴｐＧからなる群から選択される配列であり；そしてＸ３およびＸ４は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＧｐＴ、ＣｐＡおよびＴｐＧからなる群から選択され、ここで、ｐは、ホスフェート結合を表す、組成物。
【請求項２３】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、配列ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴまたはＧＴＣＧＣＴを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＣｐＧモチーフが、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号３）である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗原が、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ抗原または髄膜炎菌タンパク質である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗原が、ＨＣＶ抗原であり、該ＨＣＶ抗原が、Ｅ１Ｅ２ポリペプチドである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２ポリペプチドが、図１Ａ〜１Ｃの１９２〜８０９位に示されるアミノ酸の連続した配列に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２ポリペプチドが、図１Ａ〜１Ｃの１９２〜８０９位に示されるアミノ酸の配列を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗原が、ＨＩＶ抗原であり、該ＨＩＶ抗原が、ｇｐ１２０またはｐ５５ｇａｇである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗原が、髄膜炎菌抗原であり、該髄膜炎菌抗原が、ＯＲＦ２８７および／または９６１由来のＭｅｎＢタンパク質である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法における、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項３２】
１型インターフェロン誘導因子と抗原送達系および／または免疫刺激分子とを合わせる工程を包含する、組成物を作製する方法。
【請求項３３】
前記方法が、抗原と、前記１型インターフェロン誘導因子ならびに前記抗原送達系および／または前記免疫刺激分子とを合わせる工程をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、アジュバント組成物に関する。特に、本発明は、抗原送達系および／または免疫刺激分子（例えば、免疫刺激核酸配列）と組み合わせた１型インターフェロン誘導因子（例えば、２本鎖ＲＮＡ）を含むアジュバント組成物の使用であって、同時投与された抗原の免疫応答を増強するための使用に関する。このアジュバント組成物は、予防用組成物および治療組成物の両方において使用を見出す。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ワクチン組成物はしばしば、免疫応答を増強するための免疫学的アジュバントを含む。
例えば、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、実験ベースで多くの抗原について首尾良く用いられている、強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは、以下の３つの成分を含む：鉱油、乳化剤、および死滅マイコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。抗原水溶液は、これらの成分と混合されて、水中油型エマルジョンが作製される。アジュバントとして有効ではあるが、ＣＦＡは、マイコバクテリア成分の存在に主に起因して、疼痛、膿瘍形成および熱を含め、重篤な副作用を引き起こす。それゆえ、ＣＦＡは、ヒトおよび獣医学のワクチンにおいては用いられない。
【０００３】
ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、ＣＦＡについて観察されるアジュバント活性を生じるマイコバクテリア細胞壁複合体の最小単位である。例えば、Ｅｌｌｏｕｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７４）５９：１３１７を参照のこと。広範囲のアジュバント能力および副作用を示す、ＭＤＰのいくつかの合成アナログが作製されている。これらのアナログの概説について、Ｃｈｅｄｉｄら，Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ（１９７８）２５：６３を参照のこと。ＭＤＰの代表的アナログとしては、ＭＤＰのトレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９８７）５：２２３）、ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅｄｉｄら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：４１７）、およびムラミルトリペプチドの親油性誘導体（Ｇｉｓｌｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９８１）Ｙ．ＹａｍａｍｕｒａおよびＳ．Ｋｏｔａｎｉ編，Ｅｘｃｅｒｐｔａ  Ｍｅｄｉｃａ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１６７頁）が挙げられる。
【０００４】
ＭＤＰの１つの親油性誘導体は、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）である。このムラミルトリペプチドとしては、このムラミルペプチド部分が水性環境と会合しながら、分子の疎水性部分と脂質環境との会合を可能にするリン脂質テールが挙げられる。従って、ＭＴＰ−ＰＥ自体は、乳化剤として作用して、安定な水中油型エマルジョンを作製し得る。ＭＴＰ−ＰＥは、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（低オイル）と称される、０．００８％  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭを有する４％スクアレンのエマルジョンにおいて用いられて、有効な結果を伴って単純疱疹ウイルスｇＤ抗原を送達する（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：１７２０−１７２７）とはいえ、物理的安定性が乏しい。近年、ＭＦ５９が、ワクチン組成物における使用のために開発されている。ＭＦ５９は、安全な、高度に免疫原性の、サブミクロンの水中油型エマルジョンであり、ＭＦ５９は、４〜５％  ｗ／ｖ  スクアレン、０．５％  ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、０．５％  ＳＰＡＮ  ８５ＴＭ、および必要に応じて可変量のＭＴＰ−ＰＥを含む。例えば、Ｏｔｔら，「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，２７７〜２９６頁を参照のこと。
【０００５】
インターフェロンおよび他のサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−１）は、通常、低レベルで発現されるが、多数の刺激（例えば、ウイルス感染および細菌感染）によって高レベルの発現まで誘導される。ここで、サイトカイン産生を担うウイルス産物が２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であることが考えられる。例えば、Ｍａｊｄｅ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．（２０００）２０：２５９−２７２を参照のこと。実際、ウイルスのｄｓＲＮＡによって誘導される炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインは現在、細菌感染およびウイルス感染によって引き起こされるフルー様症状（例えば、発熱、疲労、嗜眠状態および筋肉痛）の主な原因であると考えられる。ｄｓＲＮＡの送達によって刺激されるＩＦＮ−１産生は、アジュバント活性を提示することが報告されている。例えば、Ｌｅ  Ｂｏｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１４：４６１−４７０を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アジュバントの存在にもかかわらず、従来のワクチンはしばしば、標的化された病原体に対する十分な保護を提供することができない。従って、安全かつ無毒性のアジュバントを含む有効なワクチン組成物についての必要性が、引き続いて存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、１以上の抗原送達系（例えば、サブミクロンの水中油型エマルジョン、カチオン性脂質、リポソーム、ＩＳＣＯＭ、微小粒子など）および／または免疫刺激分子（例えば、免疫刺激核酸配列（ＩＳＳ）（ＣｐＹ、ＣｐＲおよび非メチル化ＣｐＧモチーフ（リン酸結合によって連結された、シトシン、続いてグアノシン）が挙げられる）との組み合わせた、１型インターフェロン誘導因子（例えば、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））の使用が、同時投与された抗原に対する、このような送達系を用いないで観察される抗体力価よりも有意に高い抗体力価を提供するとの驚くべき知見に部分的に基づく。このような組み合わせの使用は、予防用組成物および治療用組成物の両方において使用するための種々のワクチン抗原の免疫原性を増強するための、安全かつ有効なアプローチを提供する。
【０００８】
従って、１つの実施形態では、本発明は、以下を含む組成物に関する：（１）１型インターフェロン誘導因子；ならびに（２）抗原送達系および／または免疫刺激分子、ここで、この組成物は、この抗原送達系および／または免疫刺激分子なしでの抗原および１型インターフェロン誘導因子のみでの送達と比較した場合、同時投与された抗原に対する免疫応答を増大し得る。この同時投与された抗原は、アジュバント組成物中に存在してもよく、あるいは、別個の組成物中で送達されてもよい。別個に送達された場合、この抗原は、同じかまたは異なる部位に送達され得、そしてこの組成物の前に、この組成物に続いて、またはこの組成物と同時に、送達され得る。これらの実施形態は、以下でより詳細に考察される。
【０００９】
なお別の実施形態では、本発明は、脊椎動物被験体において免疫応答を刺激する方法に関し、この方法は、治療有効量の選択された抗原、ならびに１型インターフェロン誘導因子および抗原送達系および／または免疫刺激分子を含むアジュバント組成物を被験体に対して投与する工程を包含し、ここで、このアジュバント組成物は、選択された抗原に対する免疫応答を増大させ得る。この抗原は、アジュバント組成物中に存在してもよく、または別個の組成物中で投与されてもよい。上記で説明するように、この抗原が別個で送達される場合、これは、同じ部位に送達されてもよく、異なる部位に送達されてもよく、そしてアジュバント組成物の前に、アジュバント組成物に続いて、またはアジュバント組成物と同時に、送達され得る。
【００１０】
なおさらなる実施形態では、本発明は、組成物を作製する方法に関し、この方法は、１型インターフェロン誘導因子と抗原送達系および／または免疫刺激分子を合わせる工程を包含する。特定の実施形態では、この方法は、選択された抗原と、１型インターフェロン誘導因子ならびに抗原送達系および／または免疫刺激分子とを合わせる工程をさらに包含する。特定の実施形態では、この１型インターフェロン誘導因子はｄｓＲＮＡであり、この抗原送達系は、サブミクロンの水中油型エマルジョンおよび／または微小粒子であり、この免疫刺激分子は、メチル化されていないＣｐＧモチーフ（例えば、ＣｐＧｌ（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号３））であり、そしてこの抗原は、ＨＣＶ抗原（例えば、ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２ポリペプチド）、ＨＩＶ抗原（例えば、ｇｐ１２０もしくはｐ５５ｇａｇ）または髄膜炎菌抗原（例えば、ＯＲＦ２８７および／またはＯＲＦ９６１由来のＭｅｎＢタンパク質）である。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、ＨＣＶ、ＨＩＶもしくは髄膜炎菌の抗原、ｄｓＲＮＡおよび抗原送達系ならびに／または免疫刺激分子を含む組成物に関する。特定の実施形態では、このＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２ポリペプチドであり、このＨＩＶ抗原は、ｇｐ１２０および／またはｐ５５ｇａｇであり、そしてこの髄膜炎菌抗原は、ＯＲＦ２８７および／またはＯＲＦ９６１由来のＭｅｎＢタンパク質である。特定の実施形態では、この抗原送達系は、サブミクロンの水中油型エマルジョンおよび／または微小粒子であり、そしてこの免疫刺激分子は、メチル化されていないＣｐＧモチーフである。
【００１２】
なお別の実施形態では、本発明は、脊椎動物被験体中の免疫応答を刺激する方法に関し、この方法は、治療有効量のＨＣＶ、ＨＩＶまたは髄膜炎菌抗原、ならびにｄｓＲＮＡおよびサブミクロンの水中油型エマルジョンを含むアジュバント組成物をこの被験体に投与する工程を包含する。この抗原は、アジュバント組成物中で投与されてもよく、あるいは、別個の組成物中で投与されてもよい。この抗原が別個に送達される場合、これは、同じかまたは異なる部位に送達され得、そしてこのアジュバント組成物の前に、このアジュバント組成物に続いて、またはこのアジュバント組成物と同時に、送達され得る。特定の実施形態では、このＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２ポリペプチドであり、このＨＩＶ抗原は、ｇｐ１２０またはｐ５５ｇａｇであり、そしてこの髄膜炎菌抗原はＯＲＦ２８７および／またはＯＲＦ９６１由来のＭｅｎＢタンパク質である。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、脊椎動物被験体における免疫応答を刺激する方法に関し、この方法は、治療有効量のＨＣＶ、ＨＩＶまたは髄膜炎菌の抗原、ならびにｄｓＲＮＡおよび微小粒子を含むアジュバント組成物を被験体に投与する工程を包含する。この抗原は、このアジュバント組成物中で投与されてもよく、あるいは、別個の組成物中で投与されてもよい。この抗原が別個に送達される場合、これは、同じ部位に送達されてもよく、異なる部位に送達されてもよく、そしてアジュバント組成物の前に、アジュバント組成物に続いて、またはアジュバント組成物と同時に、送達され得る。特定の実施形態では、このＨＣＶ抗原は、ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２ポリペプチドであり、このＨＩＶ抗原はｇｐ１２０またはｐ５５ｇａｇであり、そしてこの髄膜炎菌抗原は、ＯＲＦ２８７および／またはＯＲＦ９６１由来のＭｅｎＢタンパク質である。
【００１４】
上記で詳述した実施形態のうちの特定のものでは、このｄｓＲＮＡは、ウイルスｄｓＲＮＡまたは合成ｄｓＲＮＡ（例えば、ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ポリ［ｒＩ−ｒＣ］）、ポリリボグアニル酸−ポリリボシチジル酸（ポリ［ｒＧ−ｒＣ］）またはポリリボアデニル酸−ポリリボウリジル酸（ポリ［ｒＡ−ｒＵ］）であるがこれらに限定されない）である。
【００１５】
さらに、このサブミクロンの水中油型エマルジョンは、以下を含み得る：
（１）代謝可能な油であって、ここで、この油は、総容量の０．５％〜２０％の量で存在する、油、および
（２）乳化剤であって、ここで、この乳化剤は、０．０１重量（ｗ／ｖ）％〜２．５重量（ｗ／ｖ）％で存在し、そしてこの油およびこの乳化剤は、実質的に全ての直径が約１００ｎｍから１ミクロン未満である油小滴を有する、水中油型エマルジョンの形態で存在する、乳化剤。
【００１６】
他の実施形態では、このサブミクロンの水中油型エマルジョンは、上記の通りであり、そしてあらゆるポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーならびにあらゆるムラミルペプチドを欠く。
【００１７】
さらなる実施形態では、この乳化剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステル、またはポリオキシエチレンソルビタントリエステル、ならびに／またはソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステルもしくはソルビタントリエステルを含む。
【００１８】
特定の実施形態では、この油は、総容量の１％〜１２％（例えば、１％〜４％）の量で存在し、そしてこの乳化剤は、０．０１重量（ｗ／ｖ）％〜１重量（ｗ／ｖ）％（例えば、０．０１重量（ｗ／ｖ）％〜０．０５重量（ｗ／ｖ）％）である。
【００１９】
本明細書中に記載される他の実施形態では、このサブミクロンの水中油型エマルジョンは、４％  ｗ／ｖ〜５％  ｗ／ｖのスクアレン、０．２５％  ｗ／ｖ  〜１．０％  ｗ／ｖのＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）および／または０．２５％〜１．０％  ＳＰＡＮ  ８５ＴＭ（トリオレイン酸ソルビタン）、ならびに必要に応じてＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（ｌ’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む。
【００２０】
他の実施形態では、このサブミクロンの水中油型エマルジョンは、本質的に以下からなる：
（１）５容量％のスクアレン；および
（２）ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）およびＳＰＡＮ  ８５ＴＭ（トリオレイン酸ソルビタン）からなる群より選択される、１以上の乳化剤であって、ここで、乳化剤の総量は、１重量（ｗ／ｖ）％であり；ここで、このスクアレンおよびこの乳化剤は、実質的に全ての直径が約１００ｎｍから１ミクロン未満である油小滴を有する、水中油型エマルジョンの形態で存在し、そしてここで、この組成物は、あらゆるポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーを欠く。
【００２１】
他の実施形態では、この１以上の乳化剤は、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびトリオレイン酸ソルビタンであり、そして存在するモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンおよびトリオレイン酸ソルビタンの総量は、１重量（ｗ／ｖ）％である。
【００２２】
特定の実施形態では、この組成物は、ムラミルペプチドを欠く。
【００２３】
上記の本発明のなおさらなる実施形態では、この微小粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、およびポリ無水物）からなる群より選択されるポリマーを含む。
【００２４】
特定の実施形態では、この微小粒子は、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）からなる群より選択されるポリ（α−ヒドロキシ酸）を含む。
【００２５】
さらなる実施形態では、この１型インターフェロン誘導因子および／またはこの抗原は、微小粒子と会合する。特定の実施形態では、この１型インターフェロン誘導因子は、ＰＬＧ微小粒子に吸着され、ここで、この微小粒子の表面は、カチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）で処理されて、微小粒子に対して増強された吸着特性が付与される。他の実施形態では、この抗原は、微小粒子（例えば、ＰＬＧ微小粒子）に吸着され、ここで、この微小粒子の表面は、アニオン性界面活性剤（例えば、ＤＳＳ）で処理されて、この微小粒子に対して増強された吸着特性が付与される。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して明らかになる。さらに、特定の手順または組成物をより詳細に記載する種々の参考文献が本明細書中に示される。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術範囲内である、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，第Ｉ版および第ＩＩ版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，最新版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容がそうではないと明らかに示すのでない限り、複数形の参照を包含することに留意すべきである。従って、例えば、「抗原」に対する参照は、２以上の抗原の混合物などを包含する。
【００２９】
以下のアミノ酸略号は、本文全体にわたって用いられる：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）      アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）  アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）    グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）  グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）    イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）      リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）    フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）      セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
トレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）    トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）      バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００３０】
（Ｉ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が用いられ、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【００３１】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして最小の長さの産物に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、定義の中に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、定義によって包含される。この用語はまた、このポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を包含する。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、このタンパク質が所望の活性を保持する限り、ネイティブな配列に対して（一般に、本質的に保存的な）改変（例えば、欠失、付加および置換）を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発による場合のように意図的であってもよく、または例えば、タンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因する誤りによる場合のように偶発的であってもよい。
【００３２】
「抗原」とは、宿主の免疫系を刺激して、その抗原が提示された場合に細胞抗原特異的免疫応答または体液性抗体応答を行わせる１以上のエピトープ（以下に定義される）を含む分子を意味する。用語「抗原」とは、本明細書中で用いられる場合、サブユニット抗原（すなわち、抗原が天然で会合している生物全体とは分けられ、区別される、タンパク質）ならびに死滅、弱毒化または不活化された細菌、ウイルス、寄生生物または他の微生物の両方を示す。抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）またはそのフラグメント、および合成ペプチドミモトープは、抗原または抗原決定基を模倣し得、そしてまた、本明細書中で用いられるような抗原の定義の下で捕捉される。同様に、治療タンパク質もしくは免疫原性タンパク質または抗原決定基をインビボで（例えば、遺伝子治療および核酸免疫適用において）発現する、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもまた、本明細書中の抗原の定義に含まれる。さらに、本発明の目的のために、抗原は、いくつかの既知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌のうちのいずれか、ならびに種々の腫瘍抗原のうちのいずれかに由来し得る。
【００３３】
「ＨＣＶ抗原」は、ＨＣＶポリタンパク質に由来する、上記の通りの抗原である。このポリペプチドは、ＨＣＶに物理的に由来する必要はないが、合成または組換えによって産生され得る。さらに、このポリペプチドは、以下でさらに考察される種々のＨＣＶ株のうちのいずれかから誘導され得る。多数の保存された領域および可変領域が、これらの株の間で公知であり、そして一般に、これらの領域由来のエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列が整列される場合、高い程度の配列相同性（例えば、３０％より高い、好ましくは４０％より高い、アミノ酸配列相同性）を有する。これらの株の多くの完全な遺伝子型は公知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号、ならびにＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２３８８００およびＡＪ２３８７９９を参照のこと。
【００３４】
「Ｅ１ポリペプチド」とは、ＨＣＶ  Ｅ１領域由来の分子を意味する。ＨＣＶ−１領域の成熟Ｅ１領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号をつけられた、ポリタンパク質のアミノ酸およそ１９２から始まり、アミノ酸およそ３８３まで続く。（図１Ａ〜１Ｃを参照のこと。図１Ａ〜１Ｃのアミノ酸１９２〜３８３は、配列番号２のアミノ酸２０〜２１１の位置に対応する）。１７３付近からおよそ１９１までのアミノ酸（配列番号２のアミノ酸１〜１９）は、Ｅ１に対するシグナル配列として作用する。従って、「Ｅ１ポリペプチド」とは、シグナル配列を含む前駆体Ｅ１タンパク質か、またはこの配列を欠く成熟Ｅ１ポリペプチドか、また、さらには、異種シグナル配列を有するＥ１ポリペプチドのいずれかを意味する。Ｅ１ポリペプチドは、アミノ酸のおよそ３６０〜３８３位で生じるＣ末端膜アンカー配列を含む（１９９６年２月１５日公開の国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１を参照のこと）。本明細書に示されるように、Ｅ１ポリペプチドは、Ｃ末端アンカー配列またはその部分を含んでも含まなくてもよい。
【００３５】
「Ｅ２ポリペプチド」とは、ＨＣＶ  Ｅ２領域由来の分子を意味する。ＨＣＶ−１領域の成熟Ｅ２領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号をつけられた、アミノ酸およそ３８３〜３８５で始まる。（図１Ａ〜１Ｃを参照のこと。図１Ａ〜１Ｃのアミノ酸３８３〜３８５は、配列番号２のアミノ酸の２１１〜２１３位に対応する）。シグナルペプチドは、ポリタンパク質のアミノ酸およそ３６４で始まる。従って、「Ｅ２ポリペプチド」とは、シグナル配列を含む前駆体Ｅ２タンパク質か、またはこの配列を欠く成熟Ｅ２ポリペプチドか、また、さらには、異種シグナル配列を有するＥ２ポリペプチドのいずれかを意味する。Ｅ２ポリペプチドは、アミノ酸のおよそ７１５〜７３０位で生じるＣ末端膜アンカー配列を含み、アミノ酸残基およそ７４６まで延び得る（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：５０６３〜５０７３を参照のこと）。本明細書に示されるように、Ｅ２ポリペプチドは、Ｃ末端アンカー配列またはその部分を含んでも含まなくてもよい。さらに、Ｅ２ポリペプチドはまた、Ｅ２のＣ末端にまさに隣接して生じるｐ７領域の全部または一部を含み得る。図１Ａ〜１Ｃに示されるように、ｐ７領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた、７４７〜８０９の位置（配列番号２のアミノ酸５７５〜６３７位）で見出される。さらに、複数の種のＨＣＶ  Ｅ２が存在することが知られている（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９〜８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７〜５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５〜１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７〜４０２６）。従って、本発明の目的のために、用語「Ｅ２」は、Ｅ２のＮ末端からのアミノ酸の１〜２０個以上の欠失（例えば、１個、２個、３個、４個、５個〜１０個〜１５個、１６個、１７個、１８個、１９個などのアミノ酸の欠失）を有する種を含むが、これらに限定されないＥ２の任意のこれらの種を包含する。このようなＥ２種は、これらのアミノ酸３８７で始まる種、アミノ酸４０２で始まる種、アミノ酸４０３で始まる種などを含む。
【００３６】
ＨＣＶ−１由来の代表的なＥ１領域およびＥ２領域が、図１Ａ〜１Ｃおよび配列番号２に示される。本発明の目的のために、Ｅ１領域およびＥ２領域は、ＨＣＶ−１のゲノムによってコードされるポリタンパク質のアミノ酸番号に対して規定され、そして、開始因子メチオニンは１の位置に指定される。例えば、Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１〜２４５５を参照のこと。しかし、本明細書で使用される用語「Ｅ１ポリペプチド」または「Ｅ２ポリペプチド」は、ＨＣＶ−１配列に限定されないということに注意すべきである。この点に関して、他のＨＣＶ単離体における対応するＥ１領域またはＥ２領域は、配列を最大整列にする様式で、単離体由来の配列を整列させることによって容易に決定され得る。このことは、任意の多数のコンピューターソフトウェアパッケージ（例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｎｉａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙから入手可能なＡＬＩＧＮ１．０（Ａｔｔｎ：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ博士））により実施され得る。Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：２４４４〜２４４８を参照のこと。
【００３７】
さらに、本明細書で規定されるように、「Ｅ１ポリペプチド」または「Ｅ２ポリペプチド」は、図面に示される正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際に、ＨＣＶゲノムは、インビボで定常流動の状態にあり、そして、単離体間の比較的高い程度の変動性を示す幾つかの可変ドメインを含む。多数の保存領域および可変領域が、これらの株の間で公知であり、一般的に、２つの配列が整列される場合、これらの領域由来のエピトープのアミノ酸配列は、高い程度の配列相同性（例えば、３０％より高い、好ましくは４０％より高い、６０％より高い、そしてさらに８０〜９０％より高い相同性のアミノ酸配列相同性）を有する。これらの用語が、任意の種々のＨＣＶ株およびＨＣＶ単離体由来のＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドを包含し、これらの単離体は、Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１〜２３９９（例えば、株１、株２、株３、株４など）に記載されるＨＣＶの６個の遺伝子型のいずれか、ならびに新規に同定された遺伝子型、およびこれらの単離体のサブタイプ（例えば、ＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ１ｂなど）を有する単離体を包含することは、容易に理解される。
【００３８】
従って、例えば、用語「Ｅ１」または「Ｅ２」ポリペプチドは、任意の種々のＨＣＶ株由来のネイティブのＥ１配列またはＥ２配列、ならびに以下にさらに規定されるアナログ、ムテインおよび免疫原性フラグメントをいう。これらの株の多数の完全な遺伝子型が、公知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号ならびにＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２３８８００およびＡＪ２３８７９９を参照のこと。
【００３９】
さらに、用語「Ｅ１ポリペプチド」および「Ｅ２ポリペプチド」は、ネイティブ配列への改変（例えば、内部欠失、付加および置換（一般的には、本質的に保存的である））を含むタンパク質を包含する。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介するように、意図的であり得るか、または、天然に存在する突然変異事象を介するように、偶発的であり得る。全てのこれらの改変は、改変されたＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドが、それらの意図された目的について機能する限りにおいて、本発明に包含される。従って、例えば、Ｅ１ポリペプチドおよび／またはＥ２ポリペプチドが、ワクチン組成物において使用されるべき場合、改変は、免疫学的活性（すなわち、ポリペプチドに対する体液性免疫応答または細胞性免疫応答を惹起するための能力）を損なわないようにしなければならない。
【００４０】
「Ｅ１Ｅ２」複合体とは、上記のように、少なくとも１つのＥ１ポリペプチドおよび少なくとも１つのＥ２ポリペプチドを含むタンパク質を意味する。このような複合体はまた、Ｅ２のＣ末端にまさに隣接して生じるｐ７領域の全部または一部を含み得る。図１Ａ〜１Ｃに示されるように、ｐ７領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた、７４７〜８０９位（配列番号２のアミノ酸５７５〜６３７位）で見出される。ｐ７タンパク質を含む代表的なＥ１Ｅ２複合体は、本明細書では、「Ｅ１Ｅ２８０９」と呼ばれる。
【００４１】
Ｅ１Ｅ２複合体におけるＥ１およびＥ２の会合の様式は、重要ではない。Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドは、非共有結合的相互作用（例えば、静電力を介して）を介して会合され得るか、または共有結合によって会合され得る。例えば、本願のＥ１Ｅ２ポリペプチドは、上記で定義したように、免疫原性Ｅ１ポリペプチドおよび免疫原性Ｅ２ポリペプチドを含む融合タンパク質の形態であり得る。融合体は、Ｅ１Ｅ２キメラをコードするポリヌクレオチドから発現され得る。あるいは、Ｅ１Ｅ２複合体は、個々に産生されたＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を単に混合することによって、自発的に形成し得る。同様に、同時発現分泌された場合、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は、自発的に複合体を形成し得る。従って、この用語は、Ｅ１および／またはＥ２の精製の際に自発的に形成するＥ１Ｅ２複合体（凝集体とも呼ばれる）を包含する。このような凝集体は、１以上のＥ２単量体に会合した１以上のＥ１単量体を含み得る。少なくとも１つのＥ１単量体および少なくとも１つのＥ２単量体が存在する限り、存在するＥ１単量体およびＥ２単量体の数は、等しくある必要はない。Ｅ１Ｅ２複合体の存在の検出は、標準的なタンパク質検出技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および免疫学的技術（例えば、免疫沈降））をもちいて容易に決定される。
【００４２】
「ＨＩＶ抗原」は、上記で規定されるように、ＨＩＶポリタンパク質由来の抗原である。ポリペプチドは、物理的にＨＩＶ由来である必要はないが、合成的に、または組換えによって産生され得る。さらに、ポリペプチドは、任意の種々のＨＩＶ単離体由来であり得る。多数の保存領域および可変領域が、これらの鎖の間において既知であり、一般的に、２つの配列が整列される場合、これらの領域由来のエピトープのアミノ酸配列は、高い配列相同性（例えば、３０％より多い、好ましくは４０％より多いアミノ酸配列相同性）を有する。代表的なＨＩＶ単離体としては、ＳＦ１６２、ＳＦ２、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８、ＡＦ１１０９７５、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、または、１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡが挙げられる。ＨＩＶゲノムの種々の領域が、表２に示され、そして８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（図５Ａ〜５Ｄ；配列番号５）に対して番号付けされている。
【００４３】
「ｇｐ１２０抗原」は、上記で規定されるように、ＨＩＶのＥｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域由来の抗原を意味する。ｇｐ１２０の主要なアミノ酸配列は、およそ５１１個のアミノ酸であり、そして、約６０，０００ダルトンのポリペプチドコアを有する。ポリペプチドは、Ｎ連結グリコシル化によって広範囲に改変され、分子の見かけの分子量を１２０，０００ダルトンにまで増加させる。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、５つの超可変ドメインに散在する比較的保存された５つのドメインを含む。ＨＩＶ−１ＨＸＢ−２株のｇｐ１２０主要配列における１８システイン残基の位置、およびｇｐ１２０配列におけるおよそ２４個のＮ連結グリコシル化部位の１３の位置は、全てではないが、ｇｐ１２０配列とほぼ共通している。超可変ドメインは、広範なアミノ酸の置換、挿入および欠失を含む。このバリエーションにもかかわらず、全てではないにしても、ほとんどのｇｐ１２０配列は、ウイルスレセプターＣＤ４に結合するウイルスの能力を保存する。「ｇｐ１２０抗原」は、単一のサブユニットまたは多量体の両方を含む。さらに、この用語は、ヒトコドンをシミュレートし、毒性を低減させるための最適コドン使用のために改変されたｇｐ１２０配列を包含する。このような改変された配列は、当該分野で公知であり、同様のものを生成する配列および方法は、共有国際公開番号ＷＯ００／３９３０２において詳細に記載されている。
【００４４】
「ｐ５５ｇａｇ抗原」は、上記で規定されるように、およそ１４９４のヌクレオチドに広がる領域によってコードされるＨＩＶのＧＡＧ領域を示す抗原を意味する（表２を参照のこと）。この用語は、ヒトコドンをシミュレートし、毒性を低減させるための最適コドン使用のために改変された配列を包含する。このような改変された配列は、当該分野で公知であり、同様のものを生成する配列および方法は、共有国際公開番号ＷＯ００／３９３０２において詳細に記載されている。
【００４５】
用語「アナログ」および「ムテイン」は、所望の活性（例えば、本明細書に記載される免疫反応性）を保持する対象分子の生物学的に活性な誘導体、またはこのような誘導体のフラグメントをいう。一般的に、用語「アナログ」は、改変が免疫原性活性を損なわない限り、ネイティブのポリペプチド配列および、ネイティブの分子に対して１つ以上のアミノ酸の付加、置換（一般的に、本質的に保存的である）、および／または欠失をともなう構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」は、１以上のペプチド模擬体（「ペプトイド」）（例えば、国際公開番号ＷＯ９１／０４２８２に記載されるようなもの）を有するペプチドをいう。好ましくは、アナログまたはムテインは、そのネイティブ分子と少なくとも同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびポリペプチドムテインを作製する方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００４６】
特に好ましいアナログは、本質的に保存的である置換（すなわち、側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内において生じる置換）を含む。特に、一般的に、アミノ酸は、４つのファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性アミノ酸−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時には、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンとイソロイシンもしくはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、トレオニンとセリンの単離された置換、またはアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸の類似の保存的な置換は、生物学的活性において重要な効果を有さないということが、当然に予測可能である。例えば、分子の所望の機能が、インタクトなままである限り、目的のポリペプチドは、約５〜１０個までの保存的または非保存的なアミノ酸置換、あるいはさらに約１５〜２５個もしくは５０個までの保存的または非保存的なアミノ酸置換、あるいは５〜５０の間の任意の整数個の置換を含み得る。当業者は、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓプロットおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットに対する参照によって、変化を許容し得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００４７】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドを意図する。このフラグメントは、Ｃ末端欠失、Ｎ末端欠失、および／またはネイティブのポリペプチドの内部欠失を含み得る。一般的に、特定のタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、エピトープを規定する全長分子の少なくとも約５〜１０個の隣接アミノ酸残基、好ましくは、全長分子の少なくとも約１５〜２５個の隣接アミノ酸残基、および最も好ましくは、全長分子の少なくとも約２０〜５０個の隣接アミノ酸残基、または５個のアミノ酸残基と全長分子との間の任意の整数個の隣接アミノ酸残基を含む。ただし、本明細書で規定されるように、議論されているフラグメントは、免疫学的応答を引き出す能力を保持する。ＨＣＶポリペプチドの公知の免疫原性フラグメントの説明については、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１〜１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３〜３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；米国特許第６，１５０，０８７号および同第６，１２１，０２０号を参照のこと。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５個のアミノ酸、好ましくは、約５個〜１０個または１５個のアミノ酸、そして約５００個以下のアミノ酸（あるいは、それらの間の任意の整数個）の配列をいい、このエピトープは、それ自体によってか、または広範な配列の部分として、エピトープが投与される被験体における免疫学的応答を引き出す配列を規定する。しばしば、エピトープは、このような配列に応答して生成される抗体に結合する。このフラグメントの長さについては決定的な上限は存在せず、タンパク質配列のほぼ全長を含み得るか、または、目的の抗原由来の２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質でさえ含み得る。本発明において使用されるエピトープは、それが由来する親タンパク質の部分の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。例えば、ウイルスゲノムは、定常流動の状態にあり、そして、単離体間で比較的高い変動性を示す幾つかの可変ドメインを含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブの配列と同一な配列、ならびにネイティブの配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に、本質的に保存的である））を包含する。
【００４９】
エピトープを含む所定のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、固体支持体上で多数のペプチド（このペプチドはこのタンパク質分子の一部分に対応する）を同時に合成し、そしてこのペプチドを支持体上に結合させた状態で、このペプチドを抗体と反応させることによって、決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１７８〜１８２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５に記載されている。このような技術を用いて、ＨＣＶの多くのエピトープが同定されている。例えば、Ｃｈｉｅｎら，Ｖｉｒａｌ，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４），３２０〜３２４頁、およびさらに以下を参照のこと。同様に、コンフォメーションエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴法などによって、アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することにより容易に同定される。例えば、前出のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的抗原性プロットおよび疎水性親水性指標プロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを用いて算出されたプロットなど）を用いて同定され得る。このコンピュータープログラムは、抗原性プロフィールを決定するため、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４〜３８２８）を、そして疎水性親水性指標プロットについては、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５〜１３２）を、使用する。
【００５０】
選択された抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する分子に対する体液性および／または細胞性免疫応答の、被験体における発生である。本発明の目的のためには、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介される応答である。細胞性免疫応答の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と関連して提示され、そして細胞の表面に発現される、ペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊の誘導および促進、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、細胞の表面上でＭＨＣ分子に関連するペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能の刺激を補助し、そしてその活性に集中するのを補助するように働く。「細胞免疫応答」はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導されるものを含む、サイトカイン、ケモカインおよび活性化Ｔ細胞および／または他の白血球細胞により産生される他のこのような分子の産生をいう。細胞性免疫応答を引き起こす組成物またはワクチンは、細胞表面においてＭＨＣ分子と会合する抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するのに役立ち得る。細胞媒介性免疫応答は、その表面で抗原を提示する細胞に、またはその近くに指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が生成され、免疫された宿主の将来の防御を可能にし得る。特定の抗原が細胞媒介性免疫応答を刺激する能力は、多数のアッセイによって、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性アッセイによって、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球をアッセイすることによって、決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６を参照のこと。
【００５１】
従って、本明細書において用いる場合、免疫学的応答は、ＣＴＬの生成および／またはヘルパーＴ細胞の生成もしくは活性化を刺激する応答であり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答（例えば、結合中和（ＮＯＢ）抗体）を惹起し得る。ＮＯＢ抗体応答の存在は、例えば、Ｒｏｓａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１７５９に記載される技術によって容易に決定される。従って、免疫学的応答は、以下の効果の１つ以上を含み得る：Ｂ細胞による抗体の生成；ならびに／または目的の組成物もしくはワクチンに存在する抗原（単数または複数）に対して特異的に指向されるサプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／または抗体補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に防御を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００５２】
「１型インターフェロン誘導因子」は、基底レベルを超える１型インターフェロン（ＩＦＮ−１）産生を誘導する分子を意味する。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、１型インターフェロンの主要な種である。従って、ＩＦＮ−１レベルは、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを測定するアッセイを用いて評価され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。１つの代表的なアッセイは、単層培養における、Ｌ細胞に対する水疱性口内炎ウイルスの細胞病理効果を阻害するサンプルの能力を測定する。例えば、Ｌｅ  Ｂｏｎら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１４：４６１−４７０を参照のこと。別のアッセイは、試験ウイルスとして脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を用いた培養物における抗ウイルス活性を測定する。例えば、Ｔａｚｕｌａｋｈｏｖａら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．（２００１）２１：６５−７３を参照のこと。
【００５３】
用語「抗原送達系」は、天然で粒子状のアジュバント（例えば、カチオン性エマルジョン、マイクロ以下ｏ／ｗエマルジョン、微小粒子、ＩＳＣＯＭ、リポソームなど）を含む。このような送達系は、一般的に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に関連する抗原（例えば、捕捉されているか、吸着されているか、そうでなければ関連する）を標的化するよう機能する。このような抗原送達系は、以下に詳細に記載される。
【００５４】
用語「免疫刺激分子」は、病原に由来し、病原関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を示すアジュバント（例えば、ＬＰＳおよびＭＰＬ）を意図する。この用語はまた、以下に記載されるような、免疫刺激ヌクレオチド配列を含み、生来の免疫系の細胞を活性化する。一旦活性化されると、生体の免疫細胞は、獲得した免疫応答を駆動し、集中させる。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「免疫刺激ヌクレオチド配列」または「ＩＳＳ」は、少なくとも１つの免疫刺激オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ−ＯＤＮ）部分を含むポリヌクレオチドを意味する。このＩＳＳ部分は、改変されたオリゴヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチシドの配列を含み得る少なくとも６つのヌクレオチド塩基を有する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。このＩＳＳ部分は、ＣＧ含有ヌクレオチド配列またはｐ（ｌＣ）ヌクレオチド配列を含むかまたはそれに隣接し得、これらは回帰的である。システインは、メチル化され得るかまたは非メチル化であり得る。本発明において使用する特定のＩＳＳ分子の例としては、以下でさらに議論されるＣｐＧ分子、ならびにＣｐＹ分子およびＣｐＲ分子などが挙げられる。
【００５６】
「組換え」タンパク質は、本明細書中に記載のように、所望の活性を保持し、組換えＤＮＡ技術によって調製されたタンパク質をいう。一般に、目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで、以下にさらに記載されるように、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下でタンパク質を生成するように、外来タンパク質を発現する。
【００５７】
「単離された」とは、ポリペプチドをいう場合、その分子が天然に見出される生物全体から分離され、そして別々であるか、または同じ型の他の高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、天然においてそのポリヌクレオチドと通常関連する配列の全てまたは一部を欠いた核酸分子；または天然で存在するが、その配列に関連する異種配列を有する配列；または染色体から解離した分子である。
【００５８】
「等価な抗原決定基」とは、特定の病原体（例えば、ＨＣＶ）の異なる亜種または株（例えば、ＨＣＶの株１、２または３など）由来の抗原決定基を意味する。この抗原決定基は、配列改変に起因して、必ずしも同一でなくてもよいが、問題のゲノム配列における等価な位置に存在する。一般的に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列が整列された場合、高い程度の配列相同性（例えば、３０％の相同性より大きい、通常は４０％の相同性より大きい（例えば、６０％の相同性より大きい、および８０〜９０％の相同性よりさらに大きい）、アミノ酸配列相同性）を有する。
【００５９】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の類似性の割合をいう。２つのＤＮＡまたは２つのポリペプチド配列は、これらの配列が、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列類似性または同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同はまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００６０】
一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド−ヌクレオチドの対応またはアミノ酸−アミノ酸の対応をいう。同一性の割合は、それらの配列を整列させ、２つの整列された配列の間の一致の正確な数を数え、短い方の配列の長さで割り、そして結果に１００を掛けることによる、２つの分子間の配列情報の直接的な比較によって決定され得る。容易に入手可能なコンピュータプログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、補遺５、３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（これは、ペプチド分析のために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムを適合させる））は、分析を助けるために使用され得る。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラム（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらもまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する））は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において入手可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、そして上に参照されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメーターを用いて容易に使用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性の割合は、６つのヌクレオチド位置のデフォルトスコアリングテーブルおよびギャップペナルティーを用いてＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００６１】
本発明の状況において同一性の割合を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによる著作権があり、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配給されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一そろいのパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し得、ここで、デフォルトパラメーターは、スコアリングテーブルのために使用される（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）。生成されるデータから、「一致」値が「配列同一性」を反映する。配列間の同一性の割合または類似性の割合を計算するための他の適切なプログラムは、当該分野において一般的に公知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅ）＝縮重なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００６２】
あるいは、相同性は、相同な領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて、一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズの決定によって決定され得る。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について規定されるように、例えばストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記を参照のこと。
【００６３】
１型インターフェロン誘導因子（例えば、ｄｓＲＮＡ）および抗原送達システムおよび／または免疫刺激性分子もしくはＩＳＳを含むアジュバント組成物は、抗原送達システムおよび／または免疫刺激分子なしで１型インターフェロン誘導因子とともに送達される場合に、等量の抗原によって誘導される免疫応答より大きな、免疫応答を誘発する能力を有する場合に、免疫応答を「増強」または「増大」するか、あるいは選択された抗原に対する「増強された」または「増大した」免疫原性を示す。このような増強された免疫原性は、抗原およびアジュバント組成物、ならびに抗原コントロールを動物に投与し、当該分野で周知のラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡのような標準的アッセイを使用して、その２つに対して抗体力価を比較することによって決定され得る。
【００６４】
本明細書中に提供される場合、用語アジュバント組成物および抗原の「有効（な）量」または「薬学的（に）有効（な）量」とは、以下に記載されるように、非毒性であるが、所望の応答（例えば、免疫学的応答）および必要に応じて対応する治療的効果（すなわち、治療的タンパク質の送達の場合、被験体の処置をもたらすために十分な組成物量）を提供するために十分な量をいう。以下で指摘するように、必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢、および一般的状態、処置される状態の重篤度、ならびに目的の特定の高分子、投与様式などに依存して、被験体から被験体へと変化する。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、慣用的な技術を使用して、当業者により決定され得る。
【００６５】
「脊椎動物被験体」によって、心臓型（ｃｏｒｄａｔａ）亜門の任意のメンバーが意味され、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーならびに他の無尾猿（ａｐｅ）およびサル種のような非ヒト霊長類を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌおよびネコのような家畜；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ、および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウのような家禽、野生のトリおよび狩猟鳥を含むトリなど。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成体および新生仔の両方の個体を網羅するように意図される。本明細書中に記載される本発明は、上記の脊椎動物種のいずれかにおける使用のために意図される。なぜなら、これらの脊椎動物の全ての免疫系は、同様に作用するためである。
【００６６】
（ＩＩ．本発明を実施する形態）
本発明の詳細に記載する前に、処方またはプロセスのパラメータは当然のことながら変化し得るので、本発明は特定の処方またはプロセスのパラメータに限定されないことが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語法は、本発明の特定の実施形態のみを記載する目的であり、そして限定するように意図されないこともまた理解されるべきである。
【００６７】
本明細書中に記載されるものと類似または等価な多くの組成物および方法が本発明の実施において使用され得るが、好ましい材料および方法は本明細書中に記載される。
【００６８】
上記のように、１型インターフェロン誘導因子（例えば、ｄｓＲＮＡ）を含むアジュバント組成物および抗原送達システムおよび／または免疫刺激性分子と組み合わせて送達される抗原は、このようなアジュバントなしで認められる抗体力価より有意に高い抗体力価を誘発するという発見に基づく。本発明の他のさらなる理解のために、より詳細な議論が、本発明の方法および組成物における使用のための抗原、ならびに１型インターフェロン誘導因子を含むアジュバント組成物の生成に関して以下に提供される。
【００６９】
（抗原）
特に、本発明の組成物および方法は、増強された免疫応答（細胞媒介性免疫および／または体液性抗体応答を含む）を提供する。従って、本発明の組成物および方法は、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答が所望されるような、任意の抗原（抗体、T細胞ヘルパーエピトープおよびT細胞傷害性エピトープを誘導し得る、ウイルス病原体、細菌性病原体、真菌性病原体および寄生生物性病原体に由来する抗原を含む）を用いた用途を見出す。このような抗原としては、ヒトウイルスおよび動物ウイルスによってコードされる抗原が挙げられるがこれらに限定されず、かつ、構造タンパク質または非構造タンパク質のいずれかに対応し得る。
【００７０】
この技術は、細胞内ウイルスおよび腫瘍細胞抗原（これらは通常は乏しい免疫応答を誘起する）に対する免疫にとって特に有用である。さらに、本組成物および本方法は、免疫精製目的、診断目的、および他の目的のために、実験動物における抗体を産生するのに使用され得る。
【００７１】
例えば、本発明は、以下に対する免疫応答を刺激するための用途を見出す：ヘルペスウイルスファミリーに由来する広範な多様性のタンパク質（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の１型および２型に由来するタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の糖タンパク質である、ｇＢ，ｇＤおよびｇＨ））；水痘帯状疱疹ウイルス(ＶＺＶ）に由来する抗原、エプスタイン−バーウイルスウイルス(ＥＢＶ)に由来する抗原、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原（ＣＭＶのｇＢおよびｇＨ）；ならびに他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）に由来する抗原（例えば、サイトメガロウイルスをタンパク質コード内容物に関する概要については、Ｃｈｅｅら，Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ(Ｊ.Ｋ.ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９０)ｐｐ.１２５−１６９、様々なＨＳＶ−１コードタンパク質の議論については、ＭｃＧｅｏｃｈら，Ｊ.Ｇｅｎ.Ｖｉｒｏｌ.（１９８８)６９:１５３１−１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＢタンパク質およびｇＤタンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子の議論については、米国特許第５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定については、Ｂａｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ(１９８４)３１０:２０７−２１１;ならびにＶＺＶの概説については、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ，Ｊ.Ｇｅｎ.Ｖｉｒｏｌ.（１９８６)６７:１７５９〜１８１６を参照のこと）。
【００７２】
肝炎ウイルスのファミリー（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）に由来する抗原はまた、本明細書中に記載される技術において便利に使用され得る。例示によって、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、配列を得るための方法と同様に、公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、さらに以下に記載されるいくつかのウイルスタンパク質をコードする。これらのタンパク質、ならびにその抗原性フラグメントは、本発明の方法における使用が見いだされる。同様に、ＨＤＶに由来するδ抗原の配列が公知であり(例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと)、この配列はまた、本発明の方法において便利に使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原（ｓＡｇ）、ならびにプレ表面配列（ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前は、ｐｒｅ−Ｓといわれていた）））ならびに上記の組み合わせ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２、およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）は、本明細書中における使用が見いだされる。例えば、ＨＢＶ構造の議論については「ＨＢＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ」（Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ｐｐ．１５９−１７６）；および米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号；Ｂｅａｍｅｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８，Ｂｉｒｎｂａｕｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；およびＺｈｏｕら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００７３】
他のウイルス由来の抗原もまた、本願発明の方法における使用が見いだされ、例えば、制限なく、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、ポリオウイルスなど）；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科；Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、鏡検病ウイルスなど）；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ科；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科（例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスなど）；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科；Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ科；Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｄａｅ科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる））のメンバーに由来するタンパク質が挙げられる（特に、単離株ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶＬＡＶ、ＨｌＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ）；ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４；ＨＩＶ−２；シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来する抗原が挙げられるが、これらに限定されない）。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎ウイルスに由来し得る。例えば、これらおよび他のウイルスの記載については、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編，１９９１）を参照のこと。
【００７４】
より具体的には、上記のＨＩＶ単離株のいずれかに由来するｇｐ１２０エンベロープタンパク質（ＨＩＶの種々の遺伝的亜型のメンバーを含む）が公知であり、報告されており（例えば、種々のＨＩＶ単離株のエンベロープ遺伝子配列の比較については、Ｍｙｅｒｓら，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ，１９９０，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）、これらの単離株のいずれかに由来する配列は、本発明における使用が見いだされる。さらに、本発明は、種々のＨＩＶ単離株のいずれかに由来する他の免疫原性タンパク質（種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ならびにｐｏｌ領域由来のタンパク質のいずれかを含む）に等しく適用され得る。
【００７５】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生じさせるために特に興味深い。インフルエンザＡの種々のＨＡ亜型が同定されている（Ｋａｗａｏｋａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら，「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」ｐ．１２７−１６８  Ｉｎ：Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。従って、これらの単離株のいずれかに由来するタンパク質はまた、本明細書中に記載の発明において使用され得る。
【００７６】
本明細書中に記載の組成物および方法における使用のための抗原はまた、多くの細菌抗原（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎、および他の病理的状態を引き起こす生物（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ、ＢおよびＣ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ型（ＨＩＢ）、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉが挙げられるが、これらに限定されない）に由来する抗原）に由来し得る。寄生生物抗原の例としては、マラリアおよびライム病を引き起こす生物に由来する抗原が挙げられる。
【００７７】
さらに、本明細書中に記載の方法は、種々の悪性癌を処置するための手段を提供する。例えば、本発明のシステムは、問題の癌に特異的な特定のタンパク質（例えば、活性化癌遺伝子、胎児抗原、または活性化マーカー）に対する体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を上昇させるために使用され得る。このような腫瘍抗原としては、任意の種々のＭＡＧＥ（黒色腫関連抗原Ｅ）が挙げられ、とりわけ、ＭＡＧＥ１、２、３、４など（Ｂｏｏｎ，Ｔ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ（Ｍａｒｃｈ  １９９３）：８２−８９）；任意の種々のチロシナーゼ；ＭＡＲＴ  １（Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原）、変異ｒａｓ；変異ｐ５３；ｐ９７黒色腫抗原；ＣＥＡ（癌胎児抗原）が挙げられる。
【００７８】
本発明は、診断および免疫精製目的のための多数の抗原に対する抗体を惹起するため、ならびに広範な種々の疾患を予防または処置するために使用され得ることが、容易に明らかである。
【００７９】
上記のように、本発明の組成物および方法は、ＨＣＶ抗原を使用し得る。Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムは、代表的に、約９，６００ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含み、これは、ポリタンパク質へと転写される。ポリタンパク質の全長配列は、欧州公開番号３８８，２３２および米国特許第６，１５０，０８７号に開示される。表１に示されるように、ＨＣＶポリタンパク質は、切断すると、ＮＨ２−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順で、少なくとも１０個の別個の生成物を生じる。コアポリペプチドは、ＨＣＶ−１に対して番号付けして、位置１〜１９１に存在する（ＨＣＶ−１ゲノムについて、Ｃｈｏｏら、（１９９１）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：  ２４５１−２４５５を参照のこと）。このポリペプチドは、さらにプロセシングされて、アミノ酸約１〜１７３を有するＨＣＶポリペプチドを生じる。エンベロープポリペプチドであるＥ１およびＥ２は、それぞれ、ほぼ１９２〜３８３位および３８４〜７４６位に存在する。Ｐ７ドメインは、ほぼ７４７〜８０９位で見出される。ＮＳ２は、タンパク質溶解活性を有する内在性膜タンパク質であり、そしてポリタンパク質のほぼ８１０〜１０２６位に見出される。ＮＳ２は、単独でかまたはＮＳ３（ほぼ１０２７〜１６５７位にて見出される）と組み合わせてかのいずれかで、ＮＳ２−ＮＳ３シスル（ｓｉｓｓｌｅ）結合を切断し、これは次いで、ＮＳ３のＮ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を有する大きいポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼ（ほぼ１０２７〜１２０７位に見出される）は、残りのポリタンパク質をプロセシングするように働く。ヘリカーゼ活性は、ほぼ１１９３〜１６５７位にて見出される。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒される、ＮＳ３−ＮＳ４ａ連結部での自己触媒的切断によって開始される。引き続くＮＳ３媒介性のＨＣＶポリタンパク質の切断は、別のポリペプチドのＮＳ３分子による、ポリタンパク質切断結合部の認識を包含するようである。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（１６５８位〜１７１１位あたりに見いだされるＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（約１７１２位〜１９７２位に見いだされるＮＳ４ｂ、および約１９７３位〜２４２０位に見いだされるＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（約２４２１位〜３０１１位に見いだされるＮＳ５ｂ）を遊離する。
【００８０】
【表１】
2005504816.tif 000002
＊ＨＣＶ−１に対して番号付けした。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５を参照のこと。
【００８１】
上記のＨＣＶポリタンパク質産物およびこれに由来する免疫原性ポリペプチドの配列は、公知である（例えば、米国特許第５，３５０，６７１号を参照のこと）。例えば、ＨＣＶポリタンパク質に由来する、多くの一般的および特定の免疫原性ポリペプチドが記載される。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，欧州公開番号３１８，２１６および３８８，２３２；Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２−３６４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８；Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら，Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８を参照のこと。これらの刊行物は、一般に、ＨＣＶに対する広範な背景、ならびにＨＣＶポリペプチド免疫学的試薬の製造および使用に対する広範な背景を提供する。
【００８２】
任意の所望の抗原性ＨＣＶポリペプチドは、本発明とともに利用され得る（例えば、ＨＣＶのＥ１および／またはＥ２エンベロープ糖タンパク質、ならびに非共有結合または共有結合相互作用のいずれかを介して結合するＥ１Ｅ２複合体を含む）。このような複合体は、エピトープを含む、Ｅ１およびＥ２の免疫原性フラグメントから作成され得る。例えば、Ｅ１ポリペプチドのフラグメントは、Ｅ１ポリペプチドの約５〜ほぼ全長の分子（例えば、Ｅ１ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、１８５またはより多くのアミノ酸、または示された数の間の任意の整数のアミノ酸）を含み得る。同様に、Ｅ２ポリペプチドのフラグメントは、Ｅ２ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、または３５０、または示された数の間の任意の整数のアミノ酸を含み得る。Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドは、同じＨＣＶ株または異なるＨＣＶ株に由来し得る。例えば、例えば、Ｅ２の超可変領域（例えば、アミノ酸３８４〜４１０または３９０〜４１０にまたがる領域）に由来するエピトープは、Ｅ２ポリペプチドに含まれ得る。Ｅ２配列またはＥ１Ｅ２複合体に組み込むための特に有効なＥ２エピトープは、この領域に由来するコンセンサス配列（例えば、コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（配列番号４））を含むものであり、このコンセンサス配列は、ＨＣＶ１型ゲノムのアミノ酸３９０〜４１０のコンセンサス配列を示す。Ｅ１およびＥ２のさらなるエピトープは公知であり、例えば、Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ  ９３／００３６５に記載される。
【００８３】
さらに、Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドは、膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠き得る。膜アンカー配列は、このポリペプチドを小胞体に会合させるように機能する。通常、このようなポリペプチドは、このタンパク質を発現する生物が培養される増殖培地中に分泌され得る。しかし、国際公開番号ＷＯ９８／５０５５６に記載されるように、このようなポリペプチドはまた、細胞内で収集され得る。増殖培地中への分泌は、多数の検出技術（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などが挙げられる）および免疫学的技術（例えば、免疫沈降アッセイ（例えば、１９９６年２月１５日に公開された国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１に記載されるような））を使用して容易に決定される。Ｅ１を用いると、一般に、アミノ酸約７３１位以上（ＨＣＶ１  Ｅ１の番号付けに基づく）で終結するポリペプチドは、ＥＲによって維持され、従って、増殖培地中に分泌されない。Ｅ２を用いると、アミノ酸約３７１位以上（これもまた、ＨＣＶ１  Ｅ２の番号付けに基づく）で終結するポリペプチドは、ＥＲによって維持され、そして分泌されない（例えば、１９９６年２月１５日に公開された、国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１を参照のこと）。これらのアミノ酸位置は絶対的ではなく、そしていくらか変動し得ることが注目されるべきである。従って、本発明は、膜貫通結合ドメインを維持するＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドの使用を企図し、そして膜貫通結合ドメインのすべてまたは一部を欠くポリペプチド（アミノ酸約３６９以下で終結するＥ１ポリペプチドおよびアミノ酸約７３０以下で終結するＥ２ポリペプチドを含む）は、本発明によって獲得されることが意図される。さらに、Ｃ末端短縮は、膜貫通ドメインを越えてＮ末端のほうへと伸長し得る。従って、例えば３６０以下の位置で起こるＥ１短縮および例えば７１５以下の位置で起こるＥ２短縮はまた、本発明によって包含される。必要な全てのことは、短縮されたＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドが、それらの意図される目的のための機能を維持することである。しかし、特に好ましい短縮Ｅ１構築物は、アミノ酸約３００を超えて伸長しない構築物である。最も好ましいものは、３６０位で終結するものである。好ましい短縮Ｅ２構築物は、アミノ酸約７１５位を超えて伸長しない、Ｃ末端短縮を有する構築物である。特に好ましいＥ２短縮物は、アミノ酸７１５〜７３０のいずれか（例えば、７２５）の後で短縮された分子である。短縮された分子が使用される場合、両方が短縮されたＥ１分子およびＥ２分子を使用することが好ましい。
【００８４】
Ｅ２は、多数の種として存在し（Ｓｐａｅｔｅら，Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）、そして切断（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）およびタンパク質分解が、Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端において起こり得る。従って、本明細書中で使用するためのＥ２ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質の、少なくともアミノ酸４０５〜６６１（例えば、４００、４０１、４０２・・・〜６６１（例えば、３８４〜６６１、３８４〜７１５、３８４〜７４６、３８４〜７４９、３８４〜８０９、または３８４から、６６１〜８０９の間の任意のＣ末端））（全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされた）を含み得る。同様に、本明細書における使用のために好ましいＥ１ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３２６、１９２〜３３０、１９２〜３３３、１９２〜３６０、１９２〜３６３、１９２〜３８３、または１９２から、３２６〜３８３の間の任意のＣ末端を含み得る。
【００８５】
Ｅ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドならびにそれらの複合体はまた、アシアロ糖タンパク質として存在し得る。このようなアシアロ糖タンパク質は、当該分野において公知の方法によって（例えば、末端グリコシル化がブロックされた細胞を使用することによって）生成される。これらのタンパク質がこのような細胞において発現され、そしてＧＮＡレクチンアフィニティークロマトグラフィーによって単離される場合、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は、自発的に凝集する。これらのＥ１Ｅ２凝集体を生成するための詳細な方法は、例えば、米国特許第６，０７４，８５２号に記載されている。例えば、Ｅ１Ｅ２複合体は、融合タンパク質としてか、または例えば、宿主細胞を目的のＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドをコードする構築物で同時トランスフェクトすることによってかのいずれかで、組換え的に容易に生成される。同時トランスフェクションは、トランスまたはシスのいずれかで、すなわち、別個のベクターを使用することによってかまたはＥ１遺伝子とＥ２遺伝子との両方を保有する単一のベクターを使用することによって、達成され得る。単一のベクターを使用してなされる場合、両方の遺伝子は、制御エレメントの単一のセットに由来し得るか、あるいは、これらの遺伝子は、個々の制御エレメントによって駆動される個々の発現カセット中のベクターに存在し得る。発現後、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は、自発的に会合する。あるいは、この複合体は、別々に生成された個々のタンパク質を、精製された形態または半精製された形態のいずれかで一緒に混合すること、あるいはなお、これらのタンパク質が分泌される場合、これらのタンパク質を発現する宿主細胞が培養された培養培地を混合することによって、形成され得る。最後に、本発明のＥ１Ｅ２複合体は、融合タンパク質として発現され得、ここで、Ｅ１の所望の部分が、Ｅ２の所望の部分に融合する。
【００８６】
さらに、Ｅ１Ｅ１複合体は、上記のように、切断およびタンパク質分解切断に起因して、分子の不均一な混合物として存在し得る。従って、Ｅ１Ｅ２複合体を含む組成物は、複数の種のＥ１Ｅ２（例えば、アミノ酸７４６で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２７１６）、アミノ酸８０９で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２８０９）、または上記の任意の他の種々のＥ１分子およびＥ２分子（例えば、１〜２０アミノ酸のＮ末端短縮を有するＥ２分子（例えば、アミノ酸３８７、アミノ酸４０２、アミノ酸４０３などで開始するＥ２種）））を含有し得る。
【００８７】
Ｅ１Ｅ２複合体は、融合タンパク質としてか、または目的のＥ１ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドをコードする構築物で宿主細胞を同時トランスフェクトすることによってかのいずれかで、組換え的に容易に生成される。同時トランスフェクションは、トランスまたはシスのいずれかで、すなわち、別個のベクターを使用することによってかまたはＥ１遺伝子とＥ２遺伝子との両方を保有する単一のベクターを使用することによって、達成され得る。単一のベクターを使用してなされる場合、両方の遺伝子は、制御エレメントの単一のセットに由来し得るか、あるいは、これらの遺伝子は、個々の制御エレメントによって駆動される個々の発現カセット中のベクターに存在し得る。発現後、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質は、自発的に会合する。あるいは、この複合体は、別々に生成された個々のタンパク質を、精製された形態または半精製された形態のいずれかで一緒に混合すること、あるいはなお、これらのタンパク質が分泌される場合、これらのタンパク質を発現する宿主細胞が培養された培養培地を混合することによって、形成され得る。最後に、本発明のＥ１Ｅ２複合体は、融合タンパク質として発現され得、ここで、Ｅ１の所望の部分が、Ｅ２の所望の部分に融合する。
【００８８】
培地中に分泌される全長Ｅ１タンパク質および全長Ｅ２タンパク質、短縮Ｅ１タンパク質および短縮Ｅ２タンパク質、ならびに細胞内で産生された短縮タンパク質から、Ｅ１Ｅ２複合体を生成するための方法は、当該分野において公知である。例えば、このような複合体は、米国特許第６，１２１，０２０号；Ｒａｌｓｔｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６７５３−６７６１，Ｇｒａｋｏｕｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；およびＬａｎｆｏｒｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）１９７：２２５−２３５に記載されるように、組換え的に産生され得る。
【００８９】
他のＨＣＶポリペプチドもまた、本発明において使用され得る。例えば、コア領域由来のＨＣＶポリペプチド（例えば、アミノ酸１〜１９１；アミノ酸１０〜５３；アミノ酸１０〜４５；アミノ酸６７〜８８；アミノ酸８６〜１００；アミノ酸８１〜１３０；アミノ酸１２１〜１３５；アミノ酸１２０〜１３０；アミノ酸１２１〜１７０の間に見出される領域由来のポリペプチド；および例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；および米国特許第６，１５０，０８７号において同定される任意のコアエピトープ）は、本組成物および本方法と共に用途を見出す。
【００９０】
さらに、ウイルスの非構造領域由来のポリペプチドもまた、本明細書中において用途を見出す。ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域は、記載されており、そしてこのタンパク質のアミノ酸配列および全体の構造が、Ｙａｏら．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９９年１１月）７：１３５３−１３６３に開示されている。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号もまた参照のこと。上で説明されたように、ネイティブ配列または免疫原性アナログのいずれかが、本処方物において使用され得る。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら，米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇら，米国特許第５，９９０，２７６号の両方が、ＮＳ３／４ａのアナログおよびこれらを作製するための方法を記載する。
【００９１】
さらに、本組成物および本方法において使用するためのポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３領域に由来し得る。多数のこのようなポリペプチドが公知であり、これには、ｃ３３ｃ領域およびｃ１００領域由来のポリペプチド、ならびにＮＳ３エピトープを含む融合タンパク質（例えば、ｃ２５）が挙げられるが、これらに限定されない。これらおよび他のＮＳ３ポリペプチドが、本組成物において有用であり、そして当該分野において公知であり、そして例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら，国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；および米国特許第６，１５０，０８７号に記載されている。
【００９２】
さらに、国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９に記載されるような、複数のエピトープ融合抗原（「ＭＥＦＡ」と称される）が、本組成物において使用され得る。このようなＭＥＦＡは、２つ以上の種々のウイルス領域由来の複数のエピトープを含む。これらのエピトープは、好ましくは、１つより多いＨＣＶ株由来であり、従って、単一のワクチンにおける複数の株のＨＣＶに対して保護する能力を付加する。
【００９３】
好都合なために、種々のＨＣＶ領域は、一般に、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２４５１に記載されるように、ＨＣＶ−１ａのゲノムによってコードされるポリタンパク質に対するアミノ酸数に関して規定され、開始メチオニンが、１位に指定される。しかし、本発明と共に使用するためのポリペプチドは、ＨＣＶ−１ａ配列由来のものに限定されない。ＨＣＶの任意の株または単離体が、本発明と共に使用するための抗原性配列を提供するための基礎として働き得る。この点に関して、別のＨＣＶ単離体における対応する領域は、２つの単離体由来の配列を、配列を最大の整列にするような様式で整列させることによって、容易に決定され得る。
【００９４】
ＨＣＶの種々の株および単離体が、当該分野において公知であり、これらは、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の変化によって、互いに異なる。例えば、単離体ＨＣＶ  Ｊ１．１は、Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載されている。２つの独立した単離体（ＨＣＶ−ＪおよびＢＫ）の完全コード配列は、それぞれ、Ｋａｔｏら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３によって記載されている。ＨＣＶ−１単離体は、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１７１１−１７１５によって記載されている。ＨＣＶ単離体ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７に記載されている。ＨＣＶ単離体ＨＣＴ  １８〜、ＨＣＴ  ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ  ２７、ＥＣ１およびＥＣ１０は、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記載されている。ＨＣＶ単離体Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１およびＨＣＶ−Ｋ２は、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１−１０２５に記載されている。ＨＣＶ単離体Ａ、Ｃ、ＤおよびＥは、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ５：２４３−２５４に記載されている。本発明の組成物および方法において使用するためのＨＣＶポリペプチドは、上記の引用したＨＣＶの株のいずれかから、あるいは感染した患者の組織または流体から単離された新たに発見された単離体から得られ得る。
【００９５】
本組成物および本方法における使用のための、他の好ましい抗原は、ＨＩＶ由来のものである。ＨＩＶゲノムとしては、Ｇａｇ（ｐ５５ｇａｇ）、Ｐｏｌ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、Ｖｐｕ、Ｅｎｖおよび／またはＮｅｆとして公知の領域が挙げられる。これらの領域のいずれかに由来するＨＩＶ抗原、種々のサブタイプのいずれかに由来するＨＩＶ抗原（例えば、ＨＩＶサブタイプＢおよびＨＩＶサブタイプＣ）、ならびに種々の単離体のいずれか（ＳＦ１６２、ＳＦ２、ＡＦ１１０９６５、ＡＦ１１０９６７、ＡＦ１１０９６８、ＡＦ１１０９７５、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ、８＿２＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡまたは１２−５＿１＿ＴＶ２＿Ｃ．ＺＡなど）は、本方法と共に用途を見出す。ＨＩＶゲノムの種々の領域は、表２に示され、番号は、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡに関する（図５Ａ〜５Ｄ；配列番号５）。しかし、他のＨＩＶ株またはＨＩＶ改変体における対応する領域（例えば、単離体ＨＩＶＩＩＩｂ、ＨＩＶＳＦ２、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＳＦ１７０、ＨＩＶＬＡＶ、ＨＩＶＬＡＩ、ＨＩＶＭＮ、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、様々なサブタイプ（例えば、サブタイプＡ〜Ｇ、およびＯ）由来の他のＨＩＶ−１株、ＨＩＶ−２株および様々なサブタイプ（例えば、ＨＩＶ−２ＵＣ１およびＨＩＶ−２ＵＣ２）ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ））をどのように決定するかは、本開示の教示を考慮して、当業者に容易に明らかである。（これらおよび他の関連するウイルスの記載については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編．１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編．１９９１）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｆｉｅｌｄｓ，ＢＮ，ＤＭ  Ｋｎｉｐｅ，ＰＭ  Ｈｏｗｌｅｙ編，１９９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡを参照のこと）例えば、配列比較プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴおよび本明細書中に記載される他のもの）または構造フラグメントの同定および整列（例えば、種々の領域を同定し得る、本明細書中に記載される「ＡＬＢ」プログラムのようなプログラム）を使用する。
【００９６】
ＨＩＶのエンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄの糖タンパク質（ｇｐ１６０）である。宿主細胞のウイルス感染の間、ｇｐ１６０は、宿主細胞のプロテアーゼによって切断されて、ｇｐ１２０および内在性膜タンパク質ｇｐ４１を形成する。ｇｐ４１部分は、ビリオンの膜二重層に係留され、一方でｇｐ１２０セグメントは、周囲の環境に突出する。ｇｐ１２０およびｇｐ４１は、より強く共有結合し、そして遊離ｇｐ１２０は、ビリオンの表面および感染した細胞から放出され得る。ｇｐ１２０ポリペプチドは、宿主細胞への進入を媒介する際の手段である。最近の研究は、ＣＤ４のｇｐ１２０への結合が、Ｅｎｖのコンホメーション変化を誘導し、これが、コレセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（例えば、ケモカインレセプター）への結合、および引き続く、細胞内へのウイルスの侵入を可能にすることを示した（Ｗｙａｔｔ，Ｒ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：７０５−７１１；Ｋｗｏｎｇ，Ｐら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：６４８−６５９）。ＣＤ４は、ｇｐ１２０の外側ドメイン、内側ドメイン、および架橋シートの界面で形成される凹部に結合する。
【００９７】
【表２】
2005504816.tif 000003
2005504816.tif 000004
2005504816.tif 000005
当業者が、任意の配列を表２に示される配列と容易に整列させて、上記のように任意の特定のＨＩＶ遺伝子の相対位置を決定し得ることが、明らかである。例えば、本明細書中に記載される整列プログラムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して、他のＨＩＶゲノム配列が、８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（表２）と整列され得、そして遺伝子の位置が決定され得る。ポリペプチド配列は、同様に整列され得る。
【００９８】
所望の領域が一旦同定された、種々のＨＩＶ抗原を得るための組換え方法は、当該分野において周知であり、そして以下にさらに記載される。米国特許第５，６１４，６１２号もまた参照のこと。
【００９９】
さらに、これらのＨＩＶ領域のいずれかの改変された配列（例えば、改変されたｇｐ１２０およびｐ５５ｇａｇ）が、本方法において使用され得る。配列は、最適コドン利用について改変され、ヒトコドンをシミュレートし得、そして毒性を低下させ得る。このような改変された配列は、当該分野において公知であり、そしてこれらを産生するための配列および方法は、共有にかかる国際公開番号ＷＯ００／３９３０４およびＷＯ００／３９３０２、ならびに国際公開番号ＷＯ９８／３４６４０に詳細に記載されている。
【０１００】
本方法はまた、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の抗原（細菌性髄膜炎および敗血症の原因となる要因）のために特に有用である。髄膜炎菌は、莢膜抗原および細胞壁抗原の免疫学的特徴に基づいて、血清学的群に分割される。現在認識されている血清型としては、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５、Ｘ、Ｙ、Ｚおよび２９Ｅが挙げられる。本発明の目的で、髄膜炎菌抗原は、種々の公知の血清型のいずれかに由来し得る。血清型特異性の原因である多糖は、いくつかのこれらの群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５およびＹを含む）から精製された。有効な多糖に基づく莢膜ワクチンは、血清群Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ１３５によって引き起こされる髄膜炎菌疾患に対して開発され、そしてこれらのワクチン抗原のいずれかは、本組成物および本方法において用途を見出す。本明細書中で用途を見出す種々の髄膜炎菌タンパク質抗原の記載については、例えば、国際公開番号ＷＯ９６／２９４１２、ＷＯ９６／１４０８６、ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ００／２２４３０、ＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４、ならびにＴｅｔｔｅｌｉｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８０９−１８１５およびＰｉｚｚａら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８１６−１８２０を参照のこと。さらに、糖抗原（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃｃｉｎｅ  １０：６９１−６９８およびＣｏｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１２５１−１２６３に記載されるような、例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹ由来のもの）は、本明細書中において用途を見出す。他の有用なＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原としては、国際公開番号ＷＯ９９／５７２８０、ＷＯ９９／２４５７８およびＷＯ９９／３６５４４に記載される、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｒｅａ由来のものが挙げられる。
【０１０１】
例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ（本明細書中で「ＭｅｎＢ」と称される）は、米国および欧州に在住する乳児および小児における細菌性髄膜炎の大部分を占める。従って、ＭｅｎＢ由来の抗原は、本組成物および本方法（例えば、ＭｅｎＢゲノムの種々のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によって発現される抗原）において特に有用である。例えば、国際公開番号ＷＯ９９／５７２８０を参照のこと。このような抗原の例としては、ＭｅｎＢタンパク質９６１およびＭｅｎＢタンパク質２８７が挙げられる。本明細書における使用のための他の髄膜炎菌抗原としては、莢膜ＭｅｎＢ多糖の誘導体（本明細書中で「ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体」と称される）が挙げられる。ＭｅｎＢ  ＰＳは、Ｎ−アセチル（α２→８）ノイラミン酸のホモポリマーである。ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体の例としては、欧州特許第５０４，２０２Ｂに記載されるような、Ｃ３〜Ｃ８Ｎ−アシル置換ＭｅｎＢ  ＰＳ誘導体が挙げられる。同様に、米国特許第４，７２７，１３６号は、「ＮＰｒ−ＭｅｎＢ  ＰＳ」と称される、Ｎ−プロピオニル化ＭｅｎＢ  ＰＳ分子を記載する。米国特許第６，０３０，６１９号に記載されるようなＭｅｎＢ  ＰＳの独特のエピトープの分子模倣物もまた、有用である。さらに、ＭｅｎＢ由来の外側膜小胞調製物（例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０１／００１６６、Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ  ３３８：１０９３−１０９６，Ｆｕｋａｓａｗａら  （１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：２９５１−２９５８およびＲｏｓｅｎｑｕｉｓｔら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：３２３−３３３）に記載されるものなど。
【０１０２】
ＭｅｎＢ、株ＭＣ５８の完全なゲノム配列が記載されている。Ｔｅｔｔｅｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８０９。血清殺菌性抗体応答を引き起こすいくつかのタンパク質は、全ゲノム配列決定によって同定されている。これらのタンパク質の多くは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの間で高度に保存されている配列を有する。Ｐｉｚｚａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：１８１６。従って、このような抗原は、本明細書中で用途を見出す。
【０１０３】
上で説明されたように、選択された抗原は、その全体またはその免疫原性フラグメントにおいて使用され得、そして免疫原性改変体が使用され得る。従って、選択された抗原は、欠失、挿入、または保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換によって改変され得るが、但し、免疫原性は維持される。
【０１０４】
本明細書中での使用のための抗原は、分子生物学の標準的な技術を使用して産生され得る。例えば、上記分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して（例えば、この遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、あるいはこれらを含むことが既知であるベクターから遺伝子を誘導することによって）得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、ウイルス核酸分子から、当該分野において記載される技術を使用して、直接単離され得る。ＨＣＶについては、このような技術は、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，米国特許第５，３５０，６７１号に記載されている。目的の遺伝子はまた、クローニングよりむしろ、合成的に産生され得る。分子は、特定の配列について適切なコドンを用いて設計され得る。次いで、標準的な技術によって調製された重複オリゴヌクレオチドから、完全配列が構築され、そして完全なコード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【０１０５】
従って、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を保有するベクターから得られ得るか、または当該分野で公知の様々なオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、適切な場合、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）を使用して、完全にもしくは部分的に合成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、（前出）を参照のこと。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機で生成される重複合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングし、続いて適切なＤＮＡリガーゼで連結し、そしてＰＣＲによりこの連結したヌクレオチド配列を増幅することによるものである。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８４〜４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド指向型合成（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４：７５〜８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指向型変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７、およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６）、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用するギャップオリゴヌクレオチド（ｇａｐｐｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の酵素充填（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３）を使用して、改変されたかもしくは増大された抗原結合能力、および免疫原性を有する分子を提供し得る。
【０１０６】
一旦、コード配列が調製または単離されると、このような配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、そして適切なクローニングベクターの選択が可能である。適切なベクターとしては、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体または適切な制御エレメントと会合した場合に複製し得るウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
次いで、コード配列は、発現のために使用される系に依存して、適切な制御エレメントの制御下に置かれる。従って、このコード配列は、プロモータ、リボソーム結合部位（細菌での発現のため）、および必要に応じて、オペレーターの制御下に置かれ得、その結果、目的のＤＮＡ配列は、適切な形質転換体によってＲＮＡに転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列（これは後に、翻訳後プロセシングにおいて、宿主によって除去され得る）を含んでも含まなくても良い。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照のこと。
【０１０８】
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関して配列の発現の調節を可能にする調節配列を付加することが所望であり得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、調節化合物の存在を含む、化学的刺激または物理的刺激に対してオンまたはオフにされる遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。他の型の調節エレメントもまた、ベクター中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを増加するために本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７）およびヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８号））が挙げられる。発現カセットはさらに、適切な宿主細胞において自律的に複製するための複製起点、１つ以上の選択マーカー、１つ以上の制限部位、高いコピー数についての可能性および強力なプロモーターを含み得る。
【０１０９】
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列と共にベクター中に位置するように構築され、制御配列に対するコード配列の位置および配向は、コード配列が制御配列の「制御」下で転写されるように存在する（すなわち、制御配列にてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写する）。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成するために所望であり得る。例えば、いくつかの場合において、適切な配向で配列が制御配列に結合され得るように（すなわち、リーディングフレームを維持するように）配列を改変することが必要であり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、制御配列および適切な制限部位をすでに含む発現ベクターに直接クローニングされ得る。
【０１１０】
上に説明されるように、目的のポリペプチドの変異体またはアナログを生成することが所望であり得る。目的の組成物における使用のためのこの抗原の変異体またはアナログは、目的のポリペプチドをコードする配列の一部を欠失することによって、配列の挿入によって、そして／または配列内での１つ以上のヌクレオチドの置換によって調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための技術（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：６４０９を参照のこと。
【０１１１】
分子は、昆虫発現系、哺乳動物発現系、細菌発現系、ウイルス発現系および酵母発現系を含む広範な種々の系において発現され得、これらは全て当該分野で周知である。
【０１１２】
例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）において記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から市販されている。同様に、細菌発現系および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、において記載されている。酵母発現系もまた、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎにおいて記載されている。
【０１１３】
上の系を用いる使用のための多数の適切な宿主細胞がまた公知である。例えば、哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そして例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎（「ＭＤＢＫ」）細胞、およびその他を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含む。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．のような細菌宿主において、本発明の構築物を用いる用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターを用いる使用のための昆虫細胞としては特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【０１１４】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該分野で周知の種々の遺伝子送達技術を使用して、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または適切な宿主細胞中の安定なエピソームエレメント上に維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【０１１５】
選択される発現系および宿主に依存して、これらの分子は、タンパク質が発現される条件下で、上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖させることによって生成される。次いで、発現されたタンパク質は、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系が、タンパク質を増殖培地中に分泌する場合、生成物は、培地から直接精製され得る。生成物が分泌されない場合、生成物は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当業者の範囲内である。
【０１１６】
（１型インターフェロンアジュバント組成物）
１つ以上の抗原（上記のように作製された）は、１型インターフェロン誘導因子、抗原送達システムおよび／または免疫刺激分子を含むアジュバント組成物とともに投与される。抗原は、アジュバント組成物の送達の前、同時または後のいずれかで投与され得る。別々に投与される場合、抗原は、さらに以下に記載されるような組成物中に提供される。あるいは、抗原は、アジュバント組成物で提供され得る。
【０１１７】
１型インターフェロン誘導因子は、基底レベルより上の１型インターフェロン（ＩＦＮ−１）の産生を誘発する。ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、１型インターフェロンの主要な種である。従って、ＩＦＮ−１レベルは、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βを測定するアッセイを使用して評価され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。１つの代表的なアッセイは、単層培養物中のＬ細胞に対する水疱性口内炎ウイルスの細胞病理学的影響を阻害するサンプルの能力を測定する。例えば、Ｌｅ  Ｂｏｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１４：４６１〜４７０を参照のこと。別のアッセイは、試験ウイルスとして脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）を使用して培養物中の抗ウイルス活性を測定する。例えば、Ｔａｚｕｌａｋｈｏｖａら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．（２００１）２１：６５〜７３を参照のこと。
【０１１８】
１型インターフェロン誘導因子としては、Ｍｅｇａｓｉｎ、Ｋａｇｏｃｅｌ  （「ＮＩＡＲｎｅｄｉｃｐｌｕｓ」，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、Ｓａｖｒａｔｓ、Ｒａｇｏｓｉｎ（Ｎ．Ｆ．Ｇａｍａｌｅｙａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）およびＧｏｓａｌｉｄｏｎを含むゴシポールの誘導体である芳香族炭化水素（これに限定されない）のような天然起源の低分子量フェノールのような天然化合物；二本鎖ＲＮＡを含むポリマー（さらに以下を参照のこと）；Ａｍｉｘｉｎ（ＯＯＯ「Ｌａｎｃｅｐｈａｒｍ」、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）のようなフルオレノン（これに限定されない）のような合成化合物、およびアクリダノンＮｅｏｖｉｒおよびＣｙｃｌｏｆｅｒｏｎ（ＮＴＦＦ「Ｐｏｌｙｓａｎ」、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、Ｒｕｓｓｉａ）のような硝酸塩基；およびＡｍｐｌｉｇｅｎ（ポリ［Ｉ−Ｃ１２Ｕ］、Ｐｏｌｕｄａｎおよびポリグアシルのようなポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１１９】
本発明の組成物および方法とともに使用するための１つの特定の好ましい１型インターフェロン誘導因子は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。アジュバント組成物における使用のための二本鎖ＲＮＡは、種々の供給源由来であり得る。多くの生物（酵母およびウイルスを含む）が、天然にｄｓＲＮＡを産生する。このような供給源由来のｄｓＲＮＡは、間欠的なリボグアニル酸−リボシチジル酸（［ｒＧ−ｒＣ］）塩基対およびリボアデニル酸−ポリリボウリジル酸（［ｒＡ−ｒＵ））塩基対から構成される。一本鎖ＤＮＡウイルスを除いて全てのウイルスが、ｄｓＲＮＡを産生するようである。ウイルスｄｓＲＮＡは、相補鎖の二重鎖の形態で、または一本鎖ＲＮＡ内の分子内二次構造の形態のいずれかで存在する。ｄｓＲＮＡウイルス（ゲノム）、ｓｓＲＮＡウイルス（転写中間体）、ｄｓＤＮＡウイルス（対称転写、続く、ＲＮＡ−ＲＮＡアニーリング）、およびレトロウイルス（ウイルスｍＲＮＡ内の二次構造）についてのｄｓＲＮＡのウイルス供給源は、公知であり、例えば、Ｍａｊｄｅ，Ｊ．Ａ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．（２０００）２０：２５９−２７２およびＪａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｌａｎｄ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）２１９：３３９−３４９に記載される。
【０１２０】
ウイルスｄｓＲＮＡの特定の供給源としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｍｅｎｇｏウイルス感染細胞由来のｄｓＲＮＡ（Ｆａｌｃｏｆｆら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９７３）３：５９０−５９８）；レオウイルスおよび真菌ウイルス由来のｄｓＲＮＡ（Ｆｉｅｌｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６７）５８：１００４−１０１０、Ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉら，Ｊ．Ｖｉｔｏｌ．（１９８５）５４：４０８−４１３）；レトロウイルスｄｓＲＮＡ（Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｌａｎｄ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）２１９：３３９−３４９）、例えば、ＨＩＶ−１由来（Ｍａｉｔｒａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２０４：８２３−８２７）；ピコルナウイルス感染細胞から抽出されたｄｓＲＮＡ（Ｆａｌｃｏｆｆら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９７３）３：５９０−５９８）；インフルエンザ感染肺からのｄｓＲＮＡ（Ｍａｊｄｅら，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ．（１９９１）１０：１０５−ｌ１５）；感染植物細胞からのｄｓＲＮＡ（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８５）１４２：２９１−２９８）；トガウイルスからのｄｓＲＮＡ（Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７５）３：４５−６９）；ルベラウイルス感染細胞からのｄｓＲＮＡ（Ｌｅｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２００：３０７−３１２）；Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔウイルス感染細胞からのｄｓＲＮＡ（Ｌｅｅ  ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２００：３０７−３１２）；デング熱ウイルス感染細胞からのｄｓＲＮＡ（ＭａｃＫｅｎｚｉｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９６）２２０：２３２−２４０）；Ｌａｒｉｆａｎ（Ｒｉｇａ、Ｌａｔｖｉａ）およびＲｉｄｏｓｔｉｎ（「Ｄｉａｐｈａｒａｍ」ＮＯＰ「ＶＥＣＴＯＲ」、Ｂｅｒｄｓｋ、Ｒｕｓｓｉａ）として公知のｄｓＲＮＡ。これらの種々のｄｓＲＮＡのいずれか、および他の供給源由来のｄｓＲＮＡは、本発明の組成物および方法との用途を見出す。
【０１２１】
感染細胞からのｄｓＲＮＡは、核酸抽出の標準的な方法（例えば、フェノール抽出技術）を使用して容易に得られ、これらは、上記の刊行物のいくつかに記載される。例えば、Ｆａｌｃｏｆｆら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９７３）３：５９０−５９８；Ｆａｙｅｔら，Ｐｒｏｇ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．（１９７２）５：２６７−２７３；Ｍａｊｄｅら，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇｅｎ．（１９９１）１０：ｌ０５−１１５）を参照のこと。
【０１２２】
多くの合成ｄｓＲＮＡもまた公知であり、本明細書中で用途を見出され、そして当該分野で周知であり記載される技術を使用して合成される。このような合成ｄｓＲＮＡとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ポリ［ｒＩ−ｒＣ］）およびポリリボグアニル酸−ポリリボシチジル酸（ポリ［ｒＧ−ｒＣ］）（例えば、Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎら，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９６７）６：８３−１４１を参照のこと）；ポリリボアデニル酸−ポリリボウリジル酸（ポリ［ｒＡ−ｒＵ］）；混合塩基組成の低分子量ｄｓＲＮＡ（例えば、限定しないが、３０９ｂｐを有する合成ｄｓＲＮＡ）（Ｈａｉｎｅｓら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２６７：１８３ｌ５−１８３１９）ならびに、例えば、米国特許第５，９０６，９８０号および同第５，２５８，３６９号に記載される合成ミスマッチｄｓＲＮＡ。さらに、改変骨格を有するｄｓＲＮＡは、当該分野で周知の技術を使用して作製され得る。合成ｄｓＲＮＡは、種々の長さを有し得、そして一般的に、５０〜２５０ｂｐの長さ、例えば、７５〜１５０、８５〜１００または５０〜２５０ｂｐの長さの間の任意の整数の範囲である。リボイノシン酸の９０マー鎖およびそれにアニールされるリボシチジル酸の９０マー鎖を含む代表的な合成９０マーｄｓＲＮＡは、以下に実施例において記載される。
【０１２３】
上に説明されるように、１型インターフェロン誘導因子とともに抗原送達システム（すなわち、特定の送達システム）を使用することは、１型インターフェロン誘導因子単独の使用と比較して、有意に増強した免疫応答を提供する。従って、本発明に従って、１型インターフェロン誘導因子は、抗原送達システムと組み合わされ、そして／または送達の前に免疫刺激分子と組み合わされる。本明細書中での使用のための特定の抗原送達システムとしては、サブミクロンのｏ／ｗエマルジョン、カチオン性エマルジョン、微小粒子、ＩＳＣＯＭ、リポソームなどが挙げられる。
【０１２４】
特に、本明細書中での使用のためのサブミクロンのｏ／ｗエマルジョンは、非毒性の代謝可能な油および市販の乳化剤を含む。非毒性の代謝可能な油の例としては、植物油、魚油、動物油または合成調製油が挙げられるが、これらに限定されない。魚油（例えば、タラ肝油、鮫肝油および鯨油）が好ましく、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン（鮫肝油において見出される）が特に好ましい。油成分は、約０．５容量％〜約２０容量％、好ましくは、約１５容量％までの量、より好ましくは、約１容量％〜約１２容量％、最も好ましくは、１容量％〜約４容量％の油で存在する。
【０１２５】
アジュバントの水性部分は、緩衝化生理食塩水または純水であり得る。この組成物が非経口投与を意図するので、組成物と生理学的流体との間の異なるイオン濃度に起因する組成物の投与後膨潤または迅速な吸収を妨げるために、張性（すなわち、重量オスモル濃度）が、正常な生理学的流体と本質的に同じであるように、最終溶液を構成することが好ましい。水ではなく生理食塩水が使用される場合、正常な生理学的状態と適合性のｐＨを維持するために生理食塩水を緩衝化することが好ましい。また、特定の例において、特定の組成物の成分の安定性を確実にするために、特定のレベルでｐＨを維持することが必要であり得る。従って、組成物のｐＨは、一般的にｐＨ６〜８であり、ｐＨは、任意の生理学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ｔｒｉｓ、重炭酸緩衝液または炭酸緩衝液など）を使用して維持され得る。存在する水性剤の量は、一般的に、組成物を所望の最終容量にするのに必要な量である。
【０１２６】
ｏ／ｗ処方物中での使用のために適切な乳化剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、ソルビタントリエステル、例えば、ＳＰＡＮＴＭまたはＡＲＬＡＣＥＬＴＭの名称で、市販されるもの（例えば、ＳＰＡＮＴＭ８５（ソルビタントリオレート）））；ポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステル、ポリオキシエチレンソルビタントリエステル（例えば、ＴＷＥＥＮ８０ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）のような名称ＴＷＥＥＮＴＭによって市販されることが公知）；名称ＭＹＲＪＴＭの下で入手可能なポリオキシエチレン脂肪酸エーテル；ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪酸（例えば、ＢＲＩＪＴＭの名称によって公知なもの）。これらの物質は、多くの業者（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、およびＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥを含む）から容易に入周可能である。これらの乳化剤は、単独でまたは組み合わせで使用され得る。乳化剤は、通常、０．０２重量％〜約２．５重量％（ｗ／ｖ）、好ましくは、０．０５重量％〜約１重量％、そして最も好ましくは、０．０１重量％〜約０．５重量％の量で存在する。存在量は、一般的に、使用されるオイルの約２０〜３０重量％である。
【０１２７】
エマルジョンはまた、他の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド）を含み得、これには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタム（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニンー２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられ得るが、これらに限定されない。免疫刺激細菌細胞壁成分（例えば、モノホスホリピド  Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）もまた、存在し得る。あるいは、エマルジョンは、これらの薬剤を含まなくてもよい。しかし、本発明のサブミクロンｏ／ｗエマルジョンは、任意のポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン（ＰＯＰ−ＰＯＥ）ブロックコポリマーを欠き得る。本発明との使用のための種々の適切なサブミクロンｏ／ｗエマルジョン処方物、ならびに免疫刺激剤の説明については、例えば、国際公開番号ＷＯ  ９０／１４８３７；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５；Ｖａｎ  Ｎｅｓｔら，「Ａｄｖａｎｃｅｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９２，Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｎｅｗ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら，編）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．５７−６２（１９９２）；Ｏｔｔら，「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５）ｐｐ．２７７−２９６；および米国特許第６，２９９，８８４号を参照のこと。サブミクロン粒子（すなわち、１ミクロン未満の直径の粒子およびナノメーターサイズの範囲の粒子）を作製するために、多くの技術が使用され得る。例えば、高圧力下において、流体を小さな開口部を通すことによって発生する高剪断力の原理によって作動する市販の乳化機が、使用され得る。市販の乳化機の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ），Ｇａｕｌｉｎ  Ｍｏｄｅｌ  ３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ）、およびＲａｉｎｎｉｅ  Ｍｉｎｉｌａｂ  Ｔｙｐｅ  ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ  Ａｔｏｍｉｚｅｒ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ）。個々の乳化機とともに使用するための適切な圧力は、当業者によって容易に決定される。例え��、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザーが使用される場合、５０００〜３０，０００ｐｓｉでの操作は、約１００〜７５０ｎｍの直径を有する油滴を生成する。
【０１２８】
油滴のサイズは、油に対する界面活性剤の比率（比率が増加すると、液滴サイズが減少する）、作動圧力（作動圧力が増加すると、液滴サイズが減少する）、温度（温度が上昇すると、液滴サイズが減少する）を変化させること、および両親媒性免疫刺激剤を添加すること（このような薬剤の添加は、液滴サイズを減少させる）によって変更され得る。実際の液滴サイズは、特定の界面活性剤、オイルおよび免疫刺激剤（存在する場合）、ならびに選択された特定の作動条件とともに変化する。液滴サイズは、サイジング機器（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造される市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  Ｎ４ＭＤ）の使用によって変更され得、パラメーターは、実質的に全ての液滴が１ミクロン未満の直径、好ましくは、約０．８ミクロン未満の直径、そして最も好ましくは、約０．５ミクロン未満の直径であるまで、上記ガイドラインを使用して変更され得る。実質的に全てによって、少なくとも８０％（数による）、好ましくは、少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％、および最も好ましくは、少なくとも約９８％を意味する。粒子サイズ分布は、代表的に、ガウス分布であり、その結果、平均直径は、示された限界よりも小さい。
【０１２９】
本明細書中で使用するための特に好ましいサブミクロンの水中油エマルジョンは、必要に応じて変動量のＭＴＰ−ＰＥを含むスクアレン／水エマルジョン（例えば、４〜５％  ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜１．０％  ｗ／ｖのＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ（ポリオキシエチレンソルビタン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｌｔｈｙｌｅｎｅｓｏｒｂｉｔａｎ）モノオレエート）および／または０．２５〜１．０％のＳＰＡＮ  ８５ＴＭ（ソルビタントリオレエート）、ならびに必要に応じてＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含むサブミクロンの水中油エマルジョン（例えば、「ＭＦ５９」として公知のサブミクロンの水中油エマルジョン（国際公開番号ＷＯ  ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号；およびＯｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９５、２７７−２９６頁）））である。ＭＦ５９は、４〜５％  ｗ／ｖスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％  ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、および０．５％  ｗ／ｖ  ＳＰＡＮ  ８５ＴＭを含み、そして必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含み、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方される。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、より好ましくは約０〜２５０μｇ／用量、そして最も好ましくは０〜１００μｇ／用量の量で、存在し得る。本明細書中で使用する場合、用語「ＭＦ５９−０」は、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記のサブミクロンの水中油エマルジョンをいい、一方で「ＭＦ５９−１００」は、１用量当たり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む、など。本明細書中での使用のための別のサブミクロンの水中油エマルジョンであるＭＦ６９は、４．３％  ｗ／ｖ  スクアレン、０．２５％  ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、および０．７５％  ｗ／ｖ  ＳＰＡＮ  ８５ＴＭおよび必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含む。なお別のサブミクロンの水中油エマルジョンは、１０％スクアレン、０．４％  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、５％  プルロニックブロックされたポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンのエマルジョンに微小流体化された、ＭＦ７５（ＳＡＦとしても公知）である。ＭＦ７５−１００は、１用量当たり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む。
【０１３０】
サブミクロンの水中油エマルジョン、このエマルジョンを作製する方法、および組成物中で使用するための免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド）は、国際公開番号ＷＯ  ９０／１４８３７および米国特許第６，２９９，８８４号において詳細に記載されている。
【０１３１】
一般に、本発明の目的のために、約１０μｇ〜１０ｍｇのｄｓＲＮＡ、より好ましくは５００μｇ〜５ｍｇ、なおより好ましくは１００μｇ〜１ｍｇ（例えば、５０．．．４０．．．３０．．．２０．．．１０μｇなど〜０．５ｍｇのｄｓＲＮＡ）、およびこれらの範囲内の任意の整数が、本明細書中に記載されるサブミクロンの水中油エマルジョン中に存在する。
【０１３２】
微小粒子もまた、抗原送達システムとしての用途を見出す。用語「微小粒子」は、本明細書中で使用する場合、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜３０μｍ、そして最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子をいう。好ましくは、この微小粒子は、針およびキャピラリーを閉塞せずに非経口投与を可能にする直径の粒子である。微小粒子のサイズは、当該分野で周知の技術（例えば、光子補正分光法、レーザー回折および／または走査型電子顕微鏡）によって容易に決定される。
【０１３３】
本明細書での使用のための微小粒子は、滅菌可能で非毒性でありかつ生体分解性の物質から形成される。このような物質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリビニルアルコールおよび酢酸エチレンビニル。好ましくは、本発明での使用のための微小粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）に由来し、そして特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号を参照のこと）またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドもしくはグリコール酸とのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」））（例えば、米国特許第４，７６７，６２８号を参照のこと））またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーに由来する。この微小粒子は、種々の分子量を有し、そしてコポリマー（例えば、ＰＬＧ）の場合には種々のラクチド：グリコリド比を有する種々のポリマー性出発物質のいずれかに由来し得、その選択は、ほぼ、ポリペプチドの所望の用量および処置される疾患に一部依存する、選択事項である。これらのパラメータは、以下により詳細に議論する。本発明において有用な微小粒子を製造するための生体分解性ポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬから市販され、容易に入手可能である。
【０１３４】
本明細書中での使用のために特に好ましいポリマーは、ＰＬＡポリマーおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして問題のポリペプチドについての所望の放出速度を提供するのに適切な分子量は、当業者によって容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００〜約２５０，０００の範囲である。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般に、約１０，０００〜約２００，０００の範囲、好ましくは約１５，０００〜約１５０，０００の範囲、そして最も好ましくは約５０，０００〜約１００，０００の範囲である。
【０１３５】
ＰＬＧのようなポリマーが微小粒子の形態で使用される場合、種々のラクチド：グリコリド比が、本明細書中にて用途を見出し、そしてこの比は、ほぼ、所望の分解速度に一部依存する、選択事項である。例えば、５０：５０のＰＬＧポリマー（５０％のＤ，Ｌ−ラクチドおよび５０％のグリコリドを含む）は、速吸収性コポリマーを提供するが、一方、ラクチド成分の増加に起因して、７５：２５のＰＬＧは、よりゆっくりと分解し、そして８５：１５および９０：１０は、さらによりゆっくりと分解する。ラクチド：グリコリドの適切な比は、処置される障害の性質に基づいて、当業者によって容易に決定されることが、容易に明らかである。さらに、種々のラクチド：グリコリド比を有する微小粒子の混合物は、所望の放出反応速度論を達成するために、処方物中での用途を見出す。種々のラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬを含む多数の供給源から市販され、容易に入手可能である。これらのポリマーはまた、例えば、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ（１９８８）２２：８３７−８５８に記載されるような、当該分野で周知の技術を使用して、乳酸成分の単純な重縮合によって、合成され得る。
【０１３６】
所望の分子（例えば、ｄｓＲＮＡおよび／または抗原）を含む微小粒子、またはその表面に吸着された分子を有する微小粒子のいずれかが、調製される。このような微小粒子を調製するためのいくつかの技術が、当該分野で公知である。例えば、二重エマルジョン／溶媒エバポレーション技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３に記載される）は、これらの微小粒子を作製するために、本明細書中で使用される。これらの技術は、ポリマー溶液の液滴からなる一次エマルジョンの形成を含み、これは、引き続いて、粒子安定剤／界面活性剤を含む連続水相と混合される。
【０１３７】
より具体的には、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２によって記載されるような、水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒エバポレーションシステムは、これらの微小粒子を形成するために使用され得る。この技術において、粒子状ポリマーは、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ジメチルクロライド（塩化メチレンおよびジクロロメタンとも称される）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と合わせられる。このポリマーは、有機溶媒中の、約２〜１５％、より好ましくは約４〜１０％、そして最も好ましくは６％の溶液で提供される。このポリマー溶液は、例えば、ホモジナイザーを使用して、乳化される。次いで、このエマルジョンは、多量のエマルジョン安定剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドン）水溶液と合わせられる。このエマルジョン安定剤は、代表的には約２〜１５％溶液で、より好ましくは約４〜１０％溶液で、提供される。次いで、この混合物は、ホモジェナイズされて、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンを生成する。次いで、有機溶媒がエバポレートされる。
【０１３８】
処方物パラメータは、小さい（＜５μｍ）微小粒子および大きい（＞３０μｍ）微小粒子の調製を可能にするように、操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、攪拌を減少させることによって、大きい微小粒子が生じ、内相容量を増加させても、大きい微小粒子が生じる。小さい粒子は、高濃度のＰＶＡを用いて低水相容量によって提供される。
【０１３９】
微小粒子はまた、例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  第二版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されるような、噴霧乾燥およびコアセルベーション；Ｈａｌｌら、（１９８０）Ｔｈｅ  ”Ｗｕｒｓｔｅｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓ”、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、Ｖｏｌ．２、１３３−１５４頁  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦｌｏｒｉｄａおよびＤｅａｓｙ，Ｐ．Ｂ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９に記載されるようなエアサスペンジョンコーティング技術（例えば、パンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング）；ならびにＬｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８−９１０に記載されるようなイオン性ゲル化を使用して形成され得る。
【０１４０】
粒子サイズは、例えば、レーザー光散乱によって、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを組み込む分光光度計を使用して、決定され得る。一般に、粒子サイズは、室温で決定され、そして粒子の直径についての平均値を得るために、問題のサンプルの複数回（例えば、５〜１０回）の分析を含む。粒子サイズはまた、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して容易に決定され得る。
【０１４１】
微小粒子を使用する前に、タンパク質含量（例えば、微小粒子が、この微小粒子に吸着した目的の抗原を含むかまたは有する場合）が決定され得、その結果、適切な免疫応答を誘発するために適切な量の微小粒子が、この被験体に送達され得る。微小粒子のタンパク質含量は、当該分野で公知の方法に従って、例えば、微小粒子を破壊し、そして捕捉されたポリペプチドを抽出することによって、決定され得る。例えば、微小粒子は、例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９１）８：７１３；Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）５９：２９７８；およびＥｌｄｒｉｄｇｅら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９０）１１：２０５に記載されるように、ジメチルクロライドおよび蒸留水中に抽出されたタンパク質中に、溶解され得る。あるいは、微小粒子は、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む０．１Ｍ  ＮａＯＨ中に分散され得る。このサンプルは、攪拌され、遠心分離され、そしてその上清が、適切なアッセイを使用して特定のポリペプチドについてアッセイされる。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９４）１０３：３７−４５を参照のこと。
【０１４２】
抗原が微小粒子に会合している場合、これらの粒子は、好ましくは、約０．１％〜約４０％（ｗ／ｗ）のポリペプチド、より好ましくは約２％〜約２５％（ｗ／ｗ）のポリペプチド、そしてなおより好ましくは約３％〜４％から約１８％〜２０％（ｗ／ｗ）のポリペプチドまでを含み得る。微小粒子におけるポリペプチドのロードは、以下により詳細に議論されるように、所望の用量および処置される状態に依存する。
【０１４３】
調製後、微小粒子は、さらなる使用のために、そのまま保存され得るか、または凍結乾燥され得る。この微小粒子にｄｓＲＮＡおよび／または抗原を吸着するために、この微小粒子調製物は、目的のｄｓＲＮＡおよび／または抗原と単に混合され、そして得られた処方物は、使用前に、再び凍結乾燥され得る。一般に、本発明の目的のために、約１０μｇ〜約１０ｍｇのｄｓＲＮＡ、より好ましくは５００μｇ〜５ｍｇ、なおより好ましくは１００μｇ〜１ｍｇ（例えば、５０．．．４０．．．３０．．．２０．．．１０μｇなど〜０．５ｍｇのｄｓＲＮＡ）、およびこれらの範囲内の任意の整数が、本明細書中に記載される微小粒子に吸着または捕捉される。
【０１４４】
調製された微小粒子上に高分子を吸着するための１つの好ましい方法は、国際公開番号ＷＯ  ００／０５０００６に記載される。簡潔には、微小粒子は、再水和され、そして透析可能なアニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤を使用して、微小粒子の実質的にモノマーの懸濁物へと分散される。有用な界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：種々のＮ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡとして公知）（例えば、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−７として公知）、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、およびデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−１０））；コール酸；コール酸ナトリウム；デオキシコール酸；デオキシコール酸ナトリウム；タウロコール酸；タウロコール酸ナトリウム；タウロデオキシコール酸；タウロデオキシコール酸ナトリウム；３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳ）；３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）；−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン−スルホネート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ  ３−１２）；Ｎ，Ｎ−ビス−（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−デオキシコールアミド（ＤＥＯＸＹ−ＢＩＧＣＨＡＰ）；−オクチルグルコシド；スクロースモノラウレート；グリココール酸／グリココール酸ナトリウム；ラウロサルコシン（ナトリウム塩）；グリコデオキシコール酸／グリコデオキシコール酸ナトリウム；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；３−（トリメチルシリル）−１−プロパンスルホン酸（ＤＳＳ）；セトリミド（ＣＴＡＢ、その主成分は、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイドである）；ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド；ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド；ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロマイド；テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド；ベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロマイド；ベンジルジメチル−ヘキサデシルアンモニウムクロライドおよびベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムブロマイド。上記の界面活性剤は、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販される。当該分野で公知の種々のカチオン性脂質もまた、界面活性剤として使用され得る。Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、１９９６、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１６３−７２ならびにＧａｏ，Ｘ．およびＬ．Ｈｕａｎｇ．１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２：７１１０−７２２を参照のこと。
【０１４５】
次いで、この微小粒子／界面活性剤混合物は、例えば、セラミックモータおよび乳鉢を使用して、滑らかなスラリーが形成されるまで、物理的に粉末化される。次いで、適切な水性緩衝液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）またはＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水）が添加され、そして得られた混合物を、微小粒子が完全に懸濁されるまで、超音波処理またはホモジナイズする。次いで、目的の高分子（例えば、ｄｓＲＮＡまたは抗原）がこの微小粒子懸濁物に添加され、そしてこのシステムを透析して界面活性剤を除去する。ポリマー微小粒子および界面活性剤システムは、好ましくは、目的の高分子が、その高分子の活性を維持したままで、微小粒子表面に吸着されるように、選択される。表面吸着した高分子を含む、得られた微小粒子は、未結合の高分子を含まないように洗浄され得、そして以下にさらに記載されるように、適切な緩衝液処方物中の懸濁物として保存されるか、または適切な賦形剤と共に凍結乾燥され得る
具体的には、荷電した界面活性剤（例えば、アニオン性界面活性剤またはカチオン性界面活性剤）の存在下で作製される微小粒子は、正味の負の電荷または正味の正の電荷を有する荷電表面を有する微小粒子を生じる。これらの微小粒子は、より多様な分子を吸着し得る。例えば、アニオン性界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）または３−（トリメチルシリル）−１−プロパンスルホン酸（ＤＳＳ））を用いて作製される微小粒子（すなわち、ＰＬＧ／ＳＤＳ微小粒子またはＰＬＧ／ＤＳＳ微小粒子）は、正に荷電した抗原（例えば、タンパク質）を吸着する。同様に、カチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）用いて作製される微小粒子（すなわち、ＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子）は、負に荷電した高分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）を吸着する。
【０１４６】
微小粒子およびサブミクロンの水中油エマルジョンが一緒に使用される場合、これら２つは、当該分野で周知の技術を使用して合わせられる。例えば、米国特許第６，０８６，９０１号を参照のこと。一般に、これらの微小粒子およびサブミクロンの水中油エマルジョンは、単に混合すること、攪拌すること、または振とうすることによって、合わせられ得る。他の技術（例えば、２つの成分の混合物を、小さい開口部（例えば、皮下針）を迅速に通過させること）もまた、アジュバント成分を提供するために使用され得る。合わされる場合、組成物の種々の成分は、広範な比率で存在し得る。例えば、微小粒子およびエマルジョン成分は、代表的に、１：５０〜５０：１の容量比、好ましくは１：１０〜１０：１の容量比、より好ましくは約１：３〜３：１の容量比、そして最も好ましくは約１：１の容量比で使用される、しかし、他の比率が、特定の目的のためにはより適切であり得る。
【０１４７】
本発明の方法および組成物と共に使用するための他の特定の抗原送達システムとしては、カチオン性脂質およびリポソームが挙げられる。種々のカチオン性脂質が当該分野で公知であり、そして本明細書中にて用途を見出す。Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１６３−１７２ならびにＧａｏおよびＨｕａｎｇ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２：７１１０−７１２２を参照のこと。
【０１４８】
リポソームによる脂質カプセル化は、一般に、目的の核酸（ｄｓＲＮＡの場合）および／または抗原を安定に結合または捕捉および保持することができるリポソームを使用して、達成される。濃縮ｄｓＲＮＡ：脂質調製物の比は、変動し得るが、一般に、約１：１０〜１：０．２５（例えば、１：５または１：１）またはこれらの範囲内の任意の整数である（ｄｓＲＮＡ  ｍｇ：脂質  μモル）。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の概説について、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７を参照のこと。
【０１４９】
本発明における使用のためのリポソーム調製物は、一般に、カチオン性の（正に荷電した）調製物である。カチオン性リポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１）；および精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２）の、機能的な形態での細胞内送達を媒介することが示されている。
【０１５０】
カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ−［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの商標の下で入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６もまた参照のこと）。他の市販の脂質としては、ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野で周知の技術を使用して、容易に入手可能な物質から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載については、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／１１０９２を参照のこと。
【０１５１】
リポソームは、多層ビヒクル（ＭＬＶ）、小さい単層ビヒクル（ＳＵＶ）または大きい単層ビヒクル（ＬＵＶ）を含み得る。種々のリポソーム−核酸複合体は、当該分野で公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  （１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【０１５２】
さらに、他の特定のシステムおよびポリマーが、抗原送達システムとして使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、ならびにこれらの分子の結合体）は、目的のｄｓＲＮＡおよび抗原を送達するために有用である。例えば、遺伝子移入に有用な送達系の概説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。
【０１５３】
上記のように、ＩＳＣＯＭは、本発明の方法および組成物において有用な別の抗原送達系である。本発明での使用のためのＩＳＣＯＭは、当該分野で周知の標準的な技術を使用して生成され、そして例えば、米国特許第４，９８１，６８４号、同第５，１７８，８６０号、同第５，６７９，３５４号および同第６，０２７，７３２号；欧州公開番号ＥＰＡ  １０９，９４２；同１８０，５６４および同２３１，０３９号；Ｃｏｕｌｔｅｒら、（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１２４３に記載される。代表的には、用語「ＩＳＣＯＭ」は、グリコシド（例えば、トリテルペノイドサポニン（特にＱｕｉｌ  Ａ）と疎水性領域を含む抗原との間で形成される免疫原性複合体をいう。例えば、欧州公開番号ＥＰＡ  １０９，９４２および同１８０，５６４を参照のこと。この実施形態において、抗原（通常は疎水性領域を有する）または１型インターフェロン誘導因子は、界面活性剤中で可溶化され、そしてこの反応混合物に添加され、それによって、ＩＳＣＯＭは、その中に分子を取り込んで形成される。しかし、所望の疎水性特性を欠く分子は、疎水性アミノ酸、脂肪酸ラジカル、アルキルラジカルなどを有するペプチドとの結合後に、免疫原性複合体中に取り込まれ得る。
【０１５４】
欧州公開番号ＥＰＡ  ２３１，０３９中で説明されるように、所望の分子の存在は、基本的なＩＳＣＯＭ構造（マトリックスまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸという）を形成するために必須ではない。この構造は、ステロール（例えば、コレステロール）、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）およびグリコシド（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）から形成され得る。従って、目的の分子は、マトリックス中に取り込まれるのではなく、マトリックスの外側に存在し、例えば、静電相互作用によって、マトリックスに吸着される。例えば、高い正の電荷を有するタンパク質は、疎水性力を介してではなく、ＩＳＣＯＭ粒子に静電的に結合され得る。サポニンおよびＩＳＣＯＭのより詳細な一般議論、ならびにＩＳＣＯＭを処方する方法について、Ｂａｒｒら、（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２：２４７−２７１（１９９８）を参照のこと。同じ概念が、所望の場合にＩＳＣＯＭを使用してｄｓＲＮＡを送達するために適用される。
【０１５５】
より詳細には、古典的ＩＳＣＯＭは、コレステロール、サポニン、リン脂質、および免疫源の組み合わせにより形成される。古典的ＩＳＣＯＭ処方物は、代表的に、直径約４０ｎｍの粒子であり、所望の分子が、サポニン、コレステロールおよびリン脂質から構成される負に荷電したケージ様の五角形１２面体（ｄｏｃｄｅｃａｈｅｄｒａｌ）構造内に包含されている粒子である（Ｍｏｒｅｉｎら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０８：４５７）。ＩＳＣＯＭマトリクス組成物は、同様であるが、所望の分子を含まずに形成される。高い正電荷を有する分子は、水素結合ではなく、静電的にＩＳＣＯＭ粒子に結合し得る。サポニンおよびＩＳＣＯＭのより詳細な一般的議論、およびＩＳＣＯＭを処方する方法については、Ｂａｒｒら（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２：２４７〜２７１（１９９８）を参照のこと。
【０１５６】
ＩＳＣＯＭマトリクスは、例えば、可溶化ステロール、グリコシドおよび（必要に応じて）リン脂質を一緒に混合することにより調製され得る。リン脂質が、用いられない場合、二次元構造が形成される。例えば、欧州公報番号ＥＰＡ２３１，０３９を参照のこと。用語「ＩＳＣＯＭマトリクス」とは、三次元構造および二次元構造の両方を言及するために用いられる。用いられるグリコシドは、一般的に、両親媒性特性を示し、かつ分子中に疎水性領域および親水性領域を含むグリコシドである。好ましくは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ  ａｎｄ  Ｑｕｉｌ  Ａ製のサポニン抽出物）が用いられる。他の好ましいサポニンは、Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ由来のエーシン（ａｅｓｃｉｎｅ）（Ｐａｔｔら（１９６０）Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  １０：２７３〜２７５）およびＧｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｓｔｒｕｔｈｉｕｍ由来のサポアルビン（ｓａｐｏａｌｂｉｎ）（Ｖｏｃｈｔｅｎら（１９６８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４２：２１３〜２２６）である。
【０１５７】
ＩＳＣＯＭを調製するために、グリコシドが、少なくとも必須のミセル形成濃度で用いられる。Ｑｕｉｌ  Ａの場合、この濃度は、約０．０３重量％である。ＩＳＣＯＭを生成するために用いられるステロールは、動物起源または植物起源のステロール（例えば、コレステロール、ラノステロール、ルミステロール、スティグマステロールおよびシトステロール）として公知であり得る。適切なリン脂質としては、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。一般的に、グリコシド（特に、それが、Ｑｕｉｌ  Ａである場合）：ステロール（特に、それが、コレステロールである場合）：リン脂質のモル分率は、１：１：０〜１（それぞれの数字について±２０％（好ましくは±１０％を超えない））である。これは、Ｑｕｉｌ  Ａ：コレステロールについて約５：１の重量比と等価である。
【０１５８】
溶解剤がまた、存在し得、そしてそれは、例えば、界面活性剤、尿素、またはグアニジンであり得る。一般的に、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤もしくは両性イオン性界面活性剤またはコール酸ベースの界面活性剤（例えば、デソキシコール酸ナトリウム、コレート、およびＣＴＡＢ）がこの目的のために用いられ得る。適切な界面活性剤の例としては、オクチルグルコシド、ノニルＮ−メチルグルカミドまたはデカノイルＮ−メチルグルカミド、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（例えば、９〜１０個のオキシエチレン基を有するポリエチレングリコールｐ−イソオクチル−フェニルエーテル（商品名ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００ＲＴＭで市販されている）、アシルポリオキシエチレンエステル（例えば、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステル（商品名ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ、ＴＷＥＥＮ８０ＴＭなどで市販されている））が挙げられるが、これらに限定されない。溶解剤は、一般的に、限外ろ過、透析、超遠心またはクロマトグラフィーなどによって、ＩＳＣＯＭの形成のために除去されるが、しかし、特定の方法において、この工程は必要ではない（例えば、米国特許第４，９８１，６８４号を参照のこと）。
【０１５９】
一般的に、グリコシド（例えば、ＱｕｉｌＡ）：抗原の重量比は、５：１〜０．５：１の範囲内である。好ましくは、この重量比は、約３：１〜１：１であり、より好ましくは、この比率は、２：１である。
【０１６０】
上で説明されるように、アジュバント組成物はまた、抗原送達系に加えて、または抗原送達系の替わりのいずれかで免疫刺激分子を含み得る。本発明における使用のための免疫刺激因子は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モノリン脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））。ＭＰＬは、乳濁液に処方されて、その免疫刺激の影響を増強させ得る。例えば、Ｕｌｒｉｃｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓにおける「ＭＰＬｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔ：ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｏ’Ｈａｇａｎ  ＤＴ編）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、ＮＪ（２０００）ｐｐ．２７３〜２８２を参照のこと。ＭＰＬは、サイトカイン（特に、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）の合成および放出を誘導することが示されている。他の有用な免疫刺激分子としては、ＬＰＳおよび免疫刺激核酸配列（ＩＳＳ）（非メチル化ＣｐＧモチーフ（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。
【０１６１】
非メチル化ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）（単球およびマクロファージ）の活性化を誘導することが示されている。例えば、米国特許第６，２０７，６４６号を参照のこと。従って、ＣｐＧファミリーの分子由来のアジュバント、ＣｐＧジヌクレオチドおよびＣｐＧモチーフを含む合成オリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７４：５４６およびＤａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：８７０〜８７６を参照のこと）（例えば、米国特許第６，２０７，６４６号に開示される種々の免疫刺激ＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれか）は、目的の方法および組成物において用いられ得る。そのようなＣｐＧオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも８〜約１００までの塩基対、好ましくは８〜４０塩基対、より好ましくは、１５〜３５塩基対、好ましくは１５〜２５塩基対、そしてこれらの値の間の任意の数の塩基対を含む。例えば、例えば、式５’−Ｘ１ＣＧＸ２−３’（ここでＸ１およびＸ２は、ヌクレオチドであり、そしてＣは、メチル化されていない）により示されるコンセンサスＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、免疫刺激ＣｐＧ分子としての使用が見出される。一般的に、Ｘ１は、Ａ、ＧまたはＴであり、そしてＸ２は、ＣまたはＴである。他の有用なＣｐＧ分子としては、式５’−Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４（ここで、Ｘ１およよびＸ２は、ＧｐＴ、ＧｐＧ、ＧｐＡ、ＡｐＡ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＴ、ＣｐＡ、ＣｐＧ、ＴｐＡ、ＴｐＴまたはＴｐＧのような配列であり、Ｘ３およびＸ４は、ＴｐＴ、ＣｐＴ、ＡｐＴ、ＡｐＧ、ＣｐＧ、ＴｐＣ、ＡｐＣ、ＣｐＣ、ＴｐＡ、ＡｐＡ、ＧｐＴ、ＣｐＡ、またはＴｐＧであり、ここで「ｐ」は、リン酸結合を示す）により表現される分子が挙げられる。好ましくは、これらのオリゴヌクレオチドは、５’末端および／または３’末端にかまたはそれらの近傍にＧＣＧ配列を含まない。さらに、ＣｐＧは、好ましくは、その５’末端で２つのプリン（好ましくは、ＧｐＡジヌクレオチド）と、または１つのプリンおよび１つのピリミジン（好ましくはＧｐＴ）と隣接し、そしてその３’末端で、２つのピリミジン（好ましくはＴｐＴまたはＴｐＣジヌクレオチド）と隣接する。従って、好ましい分子は、配列ＧＡＣＧＴＴ、ＧＡＣＧＴＣ、ＧＴＣＧＴＴまたはＧＴＣＧＣＴを含み、そしてこれらの配列は、複数の追加のヌクレオチドに隣接する。この中央の核領域の外側のヌクレオチドは、非常に修正され易く、変化するように見える。
【０１６２】
さらに、本明細書中で使用するためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、二本鎖でも一本鎖でもよい。二本鎖分子は、インビボで、より安定であり、一方で、一本鎖分子は、増強された免疫活性を示す。さらに、ホスフェート骨格が、改変（例えば、ホスホロジチオエート改変）されて、ＣｐＧ分子の免疫刺激活性を増強し得る。米国特許第６，２０７，６４６号に記載されるように、ホスホロチオエート骨格を有するＣｐＧ分子は、Ｂ細胞を優先的に活性化し、一方で、ホスホジエステル骨格を有するＣｐＧ分子は、単球類（マクロファージ、樹状細胞および単球）およびＮＫ細胞を優先的に活性化する。
【０１６３】
本発明の組成物において使用するための１つの例示的なＣｐＧオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号３）を有する。
【０１６４】
ＣｐＧ分子は、当該分野において周知の標準的な技術を用いて、それらが免疫応答を刺激する能力について容易に試験され得る。例えば、この分子が、体液性免疫応答および／細胞性免疫応答を刺激する能力は、上記のイムノアッセイを用いて容易に決定される。さらに、抗原およびアジュバントの組成物は、ＣｐＧ分子を伴い、そしてＣｐＧを伴わずに投与されて、免疫応答が増強されたか否かを決定し得る。
【０１６５】
使用される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、抗原および／またはアジュバントの組成物の送達の前にか、同時にか、またはその後のいずれかに投与され得る。抗原および／またはアジュバントの組成物での免疫の前に投与される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、免疫の５〜１０日程度前、好ましくは、免疫の３〜５日前、最も好ましくは、免疫の１〜３または２日前に投与され得る。別個に投与される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、抗原およびアジュバントの組成物と同じ送達部位または異なる送達部位のいずれかに送達され得る。刺激送達が所望される場合、ＣｐＧオリゴヌクレオチドが、抗原および／またはアジュバントの組成物に含まれ得る。一般的に、１用量あたり、約０．５μｇ〜１０００μｇのＣｐＧアジュバント組成物が用いられ、より一般的には、０．５μｇから約５００μｇ、好ましくは、１〜約１００μｇ、好ましくは、約５〜約５０μｇ、好ましくは、約５〜約３０μｇ、またはこれらの範囲内の任意の量のＣｐＧオリゴヌクレオチドが、本発明の方法において使用されることが見出される。
【０１６６】
上で説明されるように、一旦、アジュバント組成物が処方されると、それは、抗原の送達の前にか、同時にか、またはその後のいずれかに、脊椎動物被験体に投与され得る。抗原での免疫の前に投与される場合、アジュバント組成物は、免疫の５〜１０日程度前、好ましくは、免疫の３〜５日前、最も好ましくは、免疫の１〜３または２日前に目的の抗原とともに投与され得る。別個に投与される場合、アジュバント処方物は、抗原組成物と同じ送達部位または異なる送達部位のいずれかに送達され得る。さらに、抗原が、別個に投与される場合、それは、一般的に、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含むワクチン組成物中で投与される。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）がそのようなビヒクル内に存在し得る。さらに、このワクチン組成物は、下記のような、キャリア、追加のアジュバント、追加の免疫刺激因子などを含み得る。送達はまた、下記の通りである。
【０１６７】
同時送達が、所望される場合、抗原が、アジュバント組成物とともに含まれ得る。一般的に、これらの抗原およびアジュバントは、単純な混合、撹拌、または振盪によって混合され得る。他の技術（例えば、２つの成分の混合物を小さな開口部を通過させること（例えば、皮下注射針））もまた、ワクチン組成物を提供するために用いられ得る。
【０１６８】
混合される場合、この組成物の種々の成分が、広範な範囲の比率で存在し得る。例えば、抗原および乳濁液の組成物は、代表的に、１：５０〜５０：１、好ましくは、１：１０〜１０：１、より好ましくは、約１：３〜３：１、最も好ましくは約１：１の容量比で用いられる。しかし、他の比率が、特定の目的（例えば、特定の抗原が低い免疫原性を有する場合であり、この場合、より高い相対的量の抗原成分が必要とされる）のためにより適切であり得る。
【０１６９】
さらに、これらの組成物は、１つ以上の抗原（例えば、１より多いウイルス単離物由来の抗原、および追加のウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生生物抗原など）の混合物を含み得る。これらの組成物はまた、他の抗原および免疫調節因子（例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン）と共に投与され得、その免疫調節因子としては、ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５→ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１β、リバビリン、およびＲＡＮＴＥＳのようなサイトカインが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７０】
これらの組成物は、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールなど）を含み得る。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が、そのようなビヒクル中に存在し得る。
【０１７１】
キャリアが、必要に応じて存在し、このキャリアは、それ自体、その組成物を受容した個体に有害な抗体の産生を誘導しない分子である。適切なキャリアは、代表的には、大きく、徐々に代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集物（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、この抗原は、細菌毒素（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラなどに由来する毒素）に結合体化され得る。
【０１７２】
さらなるアジュバントがまた存在し得る（例えば、以下であるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油乳濁液処方物（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激因子を有するかまたは有さない）（例えば、（ａ）マイクロフルイダイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ））を用いてサブミクロン粒子へと処方される５％のＳｑｕａｌｅｎｅ、０．５％ＴＷＥＥＮ８０ＴＭ、および０．５％ＳＰＡＮ８５ＴＭを含む（必須ではないが、必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと）を含む）、ＭＦ５９（国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ（ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）の第１０章、（ｂ）１０％Ｓｑｕａｌａｎｅ、０．４％ＴＷＥＥＮ８０ＴＭ、５％プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックポリマーＬ１２１、およびサブミクロン乳濁液にマイクロフルイダイズされるかまたはより大きな粒子サイズの乳濁液を作製するようにボルテックスされたかのいずれかのｔｈｒ−ＭＤＰを含む、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％ＴＷＥＥＮ８０ＴＭ、および以下：モノリン脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸＴＭ））からなる群、からの細菌細胞壁成分の１つ以上を含む、ＲＩＢＩＴＭアジュバント系（ＲＡＳ））（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）；（３）ＱＳ２１またはＳＴＩＭＵＬＯＮＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のようなサポニンアジュバント、あるいはこれらから生成された粒子（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体））がまた用いられ得、このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠き得る（例えば、国際公開番号ＷＯ  ００／０７６２１を参照のこと）；（４）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（国際公開番号ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、などのようなサイトカイン；（６）コレラトキシン（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性トキシン（ＬＴ）のような細菌ＡＤＰリボシル化トキシンの弱毒化変異体、特に、ＬＴ−Ｋ６３（ここで、リジンが、６３位で、野生型アミノ酸と置換されている）、ＬＴ−Ｒ７２（ここで、アルギニンが、７２位で、野生型アミノ酸と置換されている）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここで、セリンが、１０９位で、野生型アミノ酸と置換されている）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここで、リジンが、９位で、野生型アミノ酸と置換され、グリシンが、１２９位で野生型アミノ酸と置換されている）（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１３２０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと）；（７）肺炎球菌糖と共に用いる場合、必要に応じて実質的にミョウバンの非存在下での（例えば、国際公開番号ＷＯ００／５６３５８を参照のこと）、ＭＰＬまたは３−Ｏ−デアシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、英国特許第２２２０２２１号を参照のこと）、欧州特許出願番号０６８９４５４；（８）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油乳濁液との組み合わせ（例えば、欧州特許出願番号０８３５３１８、欧州特許出願番号０７３５８９８、欧州特許出願番号０７６１２３１を参照のこと）；（９）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（例えば、Ｒｏｍａｎら、（１９９７）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：８７０〜８７６；Ｃｈｕら、（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、（１９８８）Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１２１６〜１２２４；Ｋｒｉｅｇら、（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、（１９９６）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、（１９８８）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７９：８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１７５９〜１７６４；Ｙｉら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４９１８〜４９２５；Ｙｉら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５３９４〜５４０２；Ｙｉら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：４７５５〜４７６１；Ｙｉら、（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５８９８〜５９０６；国際公開番号ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１を参照のこと）（例えば、少なくともＣＧジヌクレオチド上で、シトシンが、必要に応じて５−メチルシトシンと置換されている、オリゴヌクレオチド）；（１０）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、国際公開番号ＷＯ９９／５２５４９を参照のこと）；（１１）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、国際公開番号ＷＯ０１／２１２０７を参照のこと）または少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキエチレンアルキルエステル界面活性剤（例えば、国際公開番号ＷＯ０１／２１１５２）；（１２）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（例えば、国際公開番号ＷＯ００／６２８００を参照のこと）；（１３）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、国際公開番号ＷＯ００／２３１０５を参照のこと）；ならびに（１４）組成物の効果を増強するような免疫刺激因子として作用する他の物質）。
【０１７３】
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７４】
代表的には、これらの組成物は、注射可能物質として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され；注射前に液体ビヒクル中に溶解、または懸濁するのに適する固体形態もまた、調製され得る。
【０１７５】
これらの組成物は、治療有効量の抗原、および必要とされる場合、上記の任意の他の成分を含む。「治療有効量」により、免疫学的応答を誘導する抗原の量が意味される。予防が所望される場合、好ましくは、それが投与される個体における保護免疫応答が誘発される。そのような応答は、一般的に、被験体における、ワクチンに対する分泌性免疫応答、細胞性免疫応答および／または抗体媒介免疫応答の発生を生じる。通常、そのような応答はとしては、以下の効果のうち１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない；任意の免疫学的クラス由来の抗体（例えば、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤ、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、または免疫グロブリンＭ）の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫学的細胞に対する活性化シグナル、増殖シグナル、および分化シグナルの供給；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはγδＴ細胞の集団の拡張。
【０１７６】
一旦、処方されると、これらの組成物は、慣用的に、非経口的に（例えば、静脈内、皮下または筋内のいずれかの注射により）投与される。他の投与様式に適するさらなる処方物としては、経口処方物および肺処方物、坐剤、および経皮適用が挙げられる。投薬処置は、単回用量スケジュールでも複数回用量スケジュールでもよい。好ましくは、有効量は、疾患の症状の処置または予防を生じるのに十分である。正確な必要量は、数ある要素の中でも、処置される被験体；処置される個体の年齢および一般的な条件；個体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される保護の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定の抗原およびその投与様式に依存して変化する。適切な有効量は、当業者により容易に決定され得る。「治療有効量」は、当該分野において公知のインビトロおよびインビボでのモデルを用いる通常の試験を介して決定され得る相対的に広い範囲となる。以下の実施例において用いられるＨＣＶ抗原およびＨＩＶ抗原の量は、特定の抗原に対して指向される抗体の誘発を最適化するために用いられ得る一般的な指針を提供する。
【０１７７】
例えば、好ましくは、抗原は、霊長類（例えば、ヒヒ、チンパンジーまたはヒト）のような大型哺乳動物に対して、単回用量あたり約０．１μｇ〜約５．０ｍｇの用量でか、または示された範囲内の任意の量（例えば、単回用量あたり、０．５μｇ〜約１．０ｍｇ、１μｇ〜約５００μｇ、２．５μｇ〜約２５０μｇ、４μｇ〜約２００μｇ（例えば、２、４、５、６、７、８、１０．．．２０．．．３０．．．４０．．．５０．．．６０．．．７０．．．８０．．．９０．．．１００μｇなど））で筋内に注射される。
【０１７８】
抗原の投与は、哺乳動物において抗体力価を誘発し得、この抗体力価は、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年間、またはそれより長くにわたり残る。必要に応じて、抗体力価は、最初の注射の、２週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月後、１年後、またはそれより後に、１回以上の抗原のブースター注射を提供することにより、哺乳動物において維持され得る。
【０１７９】
好ましくは、抗原は、標準的なイムノアッセイ（例えば、以下の実施例において記載されるイムノアッセイ）を用いて決定される際の、少なくとも１００、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００（ゲノム平均力価）もしくはそれより高いか、または示した力価の間の任意の数の抗体力価を誘発する。
【０１８０】
（発明の実施に有用な株の寄託）
以下の株の生物学的純粋な培養物の寄託を、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に行った。示される登録番号が、好首尾な生存力試験の後、割り当てられ、そして必須の料金が支払われ、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約（ブタペスト条約）の規定の下でなされた。これは、寄託の日から３０年間の期間にわたる、生存可能な培養物の保持を保障する。これらの生物は、Ｂｕｔａｐｅｓｔ条約の合意の下で、ＡＴＣＣにより利用可能になり、このことは、米国特許庁長官により、米国特許法１２２条およびそれに準ずる長官規則（８８６ＯＧ６３８を特に援用する３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１２を含む）に従い権利を与えられたと決定されたものに対する子孫の恒久的かつ無制限の利用可能性を保障する。特許化の際、寄託された培養物の公共に対する入手可能性の全ての制限が撤回不能に取り除かれる。
【０１８１】
これらの寄託物は、単に当業者の簡便のために提供され、寄託が米国特許法１２２条の下で必要とされている認可ではない。これらの遺伝子の核酸配列、およびそれによりコードされる分子のアミノ酸配列は、本明細書中の記載と矛盾する場合、これを支配する。寄託された物質を作製、使用または譲渡するために、ライセンスが必要とされ得、そのようなライセンスは、ここでは、許可されない。
プラスミド          寄託の日                ＡＴＣＣ番号
Ｅ１Ｅ２−８０９    ２００１年８月１６日    ＰＴＡ−３６４３
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。本実施例は、例示目的のみのために提供され、そして本発明の範囲をいずれにも限定することは意図されない。
【０１８２】
使用した数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするための努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【実施例】
【０１８３】
（実施例１）
（ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２の産生）
本発明のワクチン組成物における使用のためのＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２複合体を、以下のように融合タンパク質として調製した。特に、哺乳動物発現プラスミドｐＭＨ−Ｅ１Ｅ２−８０９（図２、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６４３）は、ＨＣＶ１ａのアミノ酸１９２〜８０９を含むＥ１Ｅ２融合タンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。
【０１８４】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ｐＭＨ−Ｅ１Ｅ２−８０９由来のＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２配列の発現のために使用した。特に、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、使用した。Ｕｒａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７：４２１６−４２２０によって記載されるこれらの細胞は、ＣＨＯ  Ｋ−１由来であり、そしてジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子における二重欠失によってｄｈｆｒ欠損にされた。
【０１８５】
ＤＧ４４細胞を、ｐＭＨ−Ｅ１Ｅ２−８０９でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、ｄｈｆｒ遺伝子を発現する細胞のみが増殖し得るように選択培地中で増殖した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述）。単離されたＣＨＯコロニーを、９６ウェルプレートの各ウェルに拾って（約８００コロニー）入れた。元々の９６ウェルプレートから、複製を発現実験を実施するために作製した。複製プレートを、細胞がコンフルエントな１つの層を作るまで増殖させた。細胞を、プレートのウェルに固定し、冷メタノールを使用して透過性にした。抗Ｅ１抗体および抗Ｅ２抗体（それぞれ、３Ｄ５Ｃ３および３Ｅ５−１）を、固定された細胞をプローブするために使用した。抗マウスＨＲＰ結合体、続く基質の添加後、最大の発現を有する細胞株を、決定した。次いで、最大に発現する細胞株を、２４ウェルクラスタープレートへと増殖した。発現についてのアッセイを、繰り返し、再び、最大発現の細胞株を、より大きな容量のウェルに増殖した。これを、最大発現の細胞株が、６ウェルプレートから組織培養フラスコで増殖されるまで繰り返した。この時点で、細胞の正確な計数および回収を可能にするのに十分な細胞の量が存在し、そして定量的発現アッセイを実施した。ＥＬＩＳＡを、細胞抽出物に対して実施し、高い発現体を決定した。
【０１８６】
（実施例２）
（ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２の精製）
発現の後、ＣＨＯ細胞を溶解し、細胞内で産生されたＥ１Ｅ２８０９を、ＧＮＡレクチンアフィニティークロマトグラフィー（ＧＮＡ工程）、その後の、ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）カラムクロマトグラフィー（ＨＡＰ工程）、ＤＶ５０膜濾過（ＤＶ５０工程）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムクロマトグラフィー（ＳＰ工程）、Ｑ膜濾過（Ｑ工程）およびＧ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィー（Ｇ２５工程）によって精製した。処理工程の各終了時に、生成物プールを、０．２μｍで濾過し、２〜８℃で保存するかまたは次の精製工程によって即座に処理するかのいずれかであった。精製処理の完了時に、抗原を、０．２μｍ濾過し、処方物に対して濾過するまで−６０℃以下で凍結して維持した。
【０１８７】
具体的には、細胞を溶解するために、２容量の冷蔵溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中の１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を２〜８℃で、ＣＨＯ細胞に添加した。混合物を、２〜８℃、５０００ｒｐｍで４５分間遠心分離し、破片を除去した。上清を回収し、Ｓａｒｔｏｒｉａｓ  ０．６５μｍ  Ｓｅｒｔｏｐｕｒｅプレフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、次いで、Ｓａｒｔｏｒｉａの０．６５μｍ  Ｓｅｒｔｏｆｉｎｅプレフィルター、続いて、Ｓｅｒｔｏｒｉｏｕｓ  ０．４５μｍ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルター、０．２μｍ  Ｓａｒｔｏｂｒａｎフィルターを通して濾過した。濾過された溶解物を、ＧＮＡカラムにロードする前に氷上に維持した。
【０１８８】
ＧＮＡアガロースカラム（１８８５ｍｌ、２００×６００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を、ロードの前に８カラム容量の平衡化緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＰＯ４、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ６．８）で前平衡化した。溶解物を、３１．４ｍｌ／分（６ｃｍ／時間）で一晩、カラムにアプライした。カラムを、４ベッド容量の平衡化緩衝液で洗浄し、次いで、５ベッド容量の１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ６．８で再度洗浄した。生成物を、１Ｍ  メチルα−Ｄ−マンノシルピラノシド（ＭＭＰ）、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ６．８で溶出した。約１カラム容量の溶出ピークを回収し、０．２μｍのフィルターで濾過し、そしてＨＡＰクロマトグラフィーのために−６０℃以下で保存した。
【０１８９】
ＨＡＰクロマトグラフィーを室温で実施した。１２００ｍｌ（１００×１５０ｍｍ）のＩ型セラミックヒドロキシアパタイトカラムを、１カラム容量の０．４Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ６．８でコンディショニングし、次いで、１０カラム容積以下の１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ６．８で平衡化した。４つのロットのＧＮＡ溶出プールを、３０℃未満の循環水浴で解凍し、０．２μｍ濾過し、そして平衡化されたカラム上に１３１ｍｌ／分（１００ｃｍ／時間）でロードした。ＨＡＰ平衡化緩衝液を、ロード後の追跡緩衝液としてアプライした。フロースルーは、ＵＶがこれらのベースラインを上昇する場合、収集された。生成物回収を、生成物プール体積がロード体積およびカラム容量の７５％の体積に到達した場合、停止した。ＨＡＰフロースループールを、さらにＤＶ５０ウイルス減少濾過によってさらに処理した。
【０１９０】
ＤＶ５０濾過を、室温で実施した。ＤＶ５０ロードを、ＨＡＰプールを２倍に希釈し、そして０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ５．３に調節することによって調製した。希釈および調節を、希釈緩衝液−１（３ｍＭクエン酸、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加し、生成物プールのｐＨを５．３に調節し、続いて、希釈緩衝液−２（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ５．３）の添加によって、最終体積を元のＨＡＰプール容量の２倍にした。
【０１９１】
希釈かつ調節されたＨＡＰプール（ＤＶ５０ロード）を、１０インチのＰａｌｌ  Ｕｌｔｉｐｏｒ  ＶＦ  ＤＶ５０膜カートリッジ（Ｐａｌｌ）を通して濾過した。フィルターハウジングを、フィルターカートリッジを用いて組み立て、水で予備湿潤化し、そして使用前に１２３℃で６０分間オートクレーブすることによって滅菌し、ゆっくりと排気した。次いで、フィルターを、ＳＰ平衡化緩衝液（１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ５．３）で予備湿潤化し、排水し、その後、４５ｐｓｉ以下の圧力でＤＶ５０ロードを適用した。ＤＶ５０ロードを、約８００ｍｌ／分の流速で、約３０ｐｓｉの膜内外圧で適用した。濾液を回収し、２〜８℃で一晩保存し、そしてＳＰ工程で使用した。
【０１９２】
ＳＰクロマトグラフィーを、室内で室温で実施した。８８ｍｌ（５０×４５ｍｍ）のＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）を、１５カラム容量の平衡化緩衝液（１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ５．３）で平衡化した。ＤＶ５０濾液を、カラムにアプライした。カラムを、まず、５カラム容量の平衡化緩衝液、続いて２０カラム容量の洗浄緩衝液（１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、ｐＨ６．０を含む）で洗浄した。生成物を、１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、ｐＨ６．０を用いてカラムから溶出した。全２８０ｎｍ吸収ピークを、生成物ピークとして回収した。生成物プールを、２〜８℃で一晩保存し、Ｑ膜濾過工程において使用した。
【０１９３】
Ｑ膜濾過工程を、室温で実施した。２つの滅菌Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ  Ｑ１００Ｘ円板膜を、直列に連結した。膜を、３００ｍｌ以上のＱ平衡化緩衝液（１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、ｐＨ６．０）で平衡化した。全ＳＰ溶出プールを、３０〜１００ｍｌ／分の流速で平衡化Ｑ膜を通して濾過し、その後、４０ｍｌのＱ平衡化緩衝液でフラッシュした。濾液およびフラッシュ液を、回収し、そして生成物プールとしてあわせ、そしてＧ２５工程において使用した。
【０１９４】
Ｇ２５工程を、室温で実施した。１１１５−ｍｌ（１００×１４２ｍｍ）Ｐａｒｍａｃｉａ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｅａｐａｃｋ，ＮＪ）を５カラム容量以上の処方緩衝液（１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、２７０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、ｐＨ６．０）で平衡化した。Ｑ濾液プールを、カラムにアプライし、カラムフロースルーを回収し、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過し、使用まで−６０℃以下で凍結保存した。
【０１９５】
（実施例３）
（ｄｓＲＮＡアジュバント組成物およびＨＣＶ抗原の使用）
上記のように産生かつ精製されたＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２８０９の免疫原性を、代表的な送達系と組み合わせてｄｓＲＮＡが増強する能力を、以下のように決定した。
【０１９６】
本研究において使用される処方物を、表３に要約する。ＭＦ５９（４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖ  ＴＷＥＥＮ  ８０ＴＭ、０．５％  ＳＰＡＮ８５ＴＭを含む、代表的なサブミクロン水中油エマルジョン）を以前に記載されるように生成した。国際公開番号ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号；およびＶａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５，２７７頁−２９６頁のＯｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」を参照のこと。
【０１９７】
これらの研究において使用されるｄｓＲＮＡは、ポリ［ｒＩ−ｒＣ］であり、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。ｄｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅを含まない蒸留水中で再構成され、室温で上記成分に添加される。
【０１９８】
使用されるＣｐＧ分子は、５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３’（配列番号３）であった。
【０１９９】
全ての群において使用される処方物は、上記されるように産生される、１用量当たり２．０μｇのＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２８０９抗原を含んだ。
【０２００】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、５つの群（１群当たり１０匹のマウス）に分割し、表３に特定される成分を含むワクチン組成物を筋内的に投与される。動物を、最初の注射の３０日後および９０日後にブーストした。血清を、最後の注射の１４日後に回収し、抗Ｅ１Ｅ２抗体力価および抗Ｅ２抗体力価を、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１に記載されるように酵素免疫アッセイによって決定した。
【０２０１】
結果を、表３および図３に示す。理解され得るように、アジュバントとしてのＭＦ５９と合わせたｄｓＲＮＡを使用して、ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２で免疫されたマウスは、ｄｓＲＮＡのみ、ＣｐＧ１のみ、またはＭＦ５９のみをアジュバントとして使用してＥ１Ｅ２で免疫したマウスよりも有意により高い（Ｐ＜０．０５）レベルのＥ１Ｅ２抗体を産生した。さらに、抗体力価は、ｄｓＲＮＡ＋ＭＦ５９群において、ｄｓＲＮＡを含まないＣｐＧ＋ＭＦ５９を投与された動物の群においてより高かった。
【０２０２】
（表３．アジュバントとしてｄｓＲＮＡおよびＭＦ５９を使用するＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２８０９の免疫原性）
【０２０３】
【表３】
2005504816.tif 000006
（実施例４）
（ｄｓＲＮＡアジュバント組成物およびＨＩＶ抗原の使用）
ＨＩＶ抗原の免疫原性を、代表的な送達系と組み合わせてｄｓＲＮＡが増強する能力を、以下のように決定した。
【０２０４】
４Ａ．ＨＩＶｇｐ１２０の免疫原性を、種々の送達系と組み合わせてｄｓＲＮＡが増強する能力を試験するために、以下の実験を実施した。
【０２０５】
本研究において使用される処方物を、表４に要約する。ＭＦ５９、ＣｐＧ１およびｄｓＲＮＡは、上記される通りである。
【０２０６】
ＨＩＶｇｐ１２０を、以前に記載される技術を使用して産生した。例えば、改変されたｇｐ１２０配列を産生するための方法を記載する、国際公開番号ＷＯ００／３９３０２を参照のこと。
【０２０７】
ＰＬＧ／ＣＴＡＢ（別の代表的な送達系）は、セトリミド（ｃｅｔｒｉｍｉｄｅ）（ＣＴＡＢ）で処理され、ｄｓＲＮＡの吸収を増大されたポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微小粒子である。ＰＬＧポリマーは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから得られた。使用されるＰＬＧポリマーは、ＲＧ５０５であり、これは、５０／５０のコポリマー比および６５ｋＤａの分子量を有する。ＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子を、Ｓｉｎｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：８１１−８１６に記載されるように生成した。簡潔には、カチオン性微小粒子を、改変された溶媒蒸発処理を使用して生成した。１０ｍｌの５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のポリマー溶液を、Ｉｋａホモジナイザー（Ｉｋａ−Ｗｅｒｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を使用して高速で１ｍｌ  ＰＢＳを含む塩化メチレン中で乳化した。次いで、一次エマルジョンを、ＣＴＡＢを含む５０ｍｌの蒸留水（０．５％ｗｔ／ｖｏｌ）に添加した。これは、室温で６０００ｒｐｍで１２時間攪拌された水／油／水エマルジョンを形成し、塩化メチレンが蒸発することを可能にする。得られた微小粒子を、１０，０００ｇで遠心分離することによって、蒸留水で２回洗浄しそして凍結乾燥した。使用の前に、４℃で６時間、ｄｓＲＮＡの０．２ｍｇ／ｍｌ溶液（５ｍｌ）中で１００ｍｇの微小粒子をインキュベートすることによって、ｄｓＲＮＡを、微小粒子に吸着させた。
【０２０８】
ＰＬＧ／ＤＳＳは、抗原の吸着を増強するために３−（トリメチルシリル）−１−プロパンスルホン酸（ＤＳＳ）で処理されたＰＬＧ微小粒子である。吸着されたｇｐ１２０抗原を有するＰＬＧ／ＤＳＳ微小粒子を、ＣＴＡＢの代わりにＤＳＳを用いて上記のように生成した。ＤＳＳは、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている。
【０２０９】
全ての群について使用される処方物は、１回用量当たり１０μｇのＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原を含んだ。ＰＬＧ／ＤＳＳ／ｇｐ１２０微小粒子を、示されたアジュバントを含むかまたは含まないｄｓＲＮＳ／ＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子と混合し、そして免疫の前にボルテックスした。
【０２１０】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、６つの群（１群当たり１０匹のマウス）に分割し、これらのマウスに、表４に特定される成分を含むワクチン組成物を筋内的に投与した。動物を、最初の注射の３０日後および９０日後にブーストした。血清を、最後の投与の１４日後に回収し、抗ｇｐ１２０抗体の力価を、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５：９０３７−９０４３に記載される酵素免疫アッセイによって決定した。
【０２１１】
結果を、表４に示す。理解され得るように、アジュバントとしてのＭＦ５９と合わせたｄｓＲＮＡを使用して、ＨＩＶ  ｇｐ１２０で免疫したマウスは、ｄｓＲＮＡのみ、ＣｐＧ１のみ、またはＭＦ５９のみをアジュバントとして使用してｇｐ１２０で免疫したマウスよりも有意により高い（Ｐ＜０．０５）レベルのｇｐ１２０抗体を産生した。さらに、抗体力価は、ＰＬＧ／ＣＴＡＢ微小粒子に吸着されたｄｓＲＮＡを投与されたマウスの群において、ｄｓＲＮＡのみを投与された動物の群においてより高かった。
【０２１２】
（表４．アジュバントとしてｄｓＲＮＡおよびＭＦ５９またはＰＬＧ／ＣＴＡＢを使用するＨＩＶ  ｇｐ１２０の免疫原性）
【０２１３】
【表４】
2005504816.tif 000007
４Ｂ．ＨＩＶｐ５５ｇａｇの免疫原性を、種々の送達系と組み合わせてｄｓＲＮＡが増強する能力を試験するために、以下の実験を実施した。
【０２１４】
本研究において使用される処方物を、表５に要約する。ＭＦ５９、ＣｐＧ１、ＰＬＧ／ＤＳＳおよびｄｓＲＮＡは、上記される通りである。
【０２１５】
ＨＩＶｐ５５ｇａｇを、以前に記載されるように産生した。例えば、改変されたｐ５５ｇａｇ配列を産生するための方法を記載する、国際公開番号ＷＯ００／３９３０２を参照のこと。ＰＬＧ／ＤＳＳ／ｐ５５ｇａｇ微小粒子を、ｇｐ２０の代わりにｐ５５ｇａｇを用いて上記されるように生成した。
【０２１６】
全ての群について使用される処方物は、１回用量当たり１０μｇのＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇ抗原を含んだ。
【０２１７】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、５つの群（１群当たり１０匹のマウス）に分割し、これらのマウスに、表５に特定される成分を含むワクチン組成物を筋内的に投与した。動物を、最初の注射の３０日後および９０日後にブーストした。血清を、最後の投与の１４日後に回収し、抗ｐ５５ｇａｇ抗体の力価を、Ｋａｚｚａｚら、Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｄｅｌ．（２０００）６７：３４７−３５６に記載される酵素免疫アッセイによって決定した。
【０２１８】
結果を、表５および図４に示す。理解され得るように、ＭＦ５９を含むかまたは含まないＣｐＧ１と合わせたｄｓＲＮＡを使用して、ＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇで免疫したマウスおよびＭＦ５９と合わせたｄｓＲＮＡで免疫したマウスは、ｄｓＲＮＡのみを使用してｐ５５ｇａｇで免疫したマウスよりも有意により高い（Ｐ＜０．０５）レベルのＰ５５ｇａｇ抗体を産生した。
【０２１９】
（表５．アジュバントとしてｄｓＲＮＡおよびＭＦ５９を使用するＨＩＶ  ｐ５５ｇａｇの免疫原性）
【０２２０】
【表５】
2005504816.tif 000008
（実施例５）
（ｄｓＲＮＡアジュバント組成物およびＭｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ抗原の使用）
Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ抗原の免疫原性を、代表的な送達系と組み合わせてｄｓＲＮＡが増強する能力を、以下のように決定した。
【０２２１】
５Ａ．本研究において使用される処方物を、表６および７に要約する。ＰＬＧ／ＣＴＡＢ、ＰＬＧ／ＤＳＳ、ＣｐＧ１、ＭＦ５９、およびｄｓＲＮＡは、上記される通りである。さらに、いくつかの群（表に示されるように）について、ＣｐＧ１を、微小粒子に吸着した。
【０２２２】
使用されるＭｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ抗原は、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ  Ｂ（Ｍｅｎ  Ｂ）タンパク質２８７および９６１であった。これらのタンパク質は、国際公開番号ＷＯ９９／５７２８０に記載される。所定の各抗原の用量は、１免疫当たり２０μｇであった。これらの抗原はまた、上記のプロトコルを使用して、ＰＬＧ／ＤＳＳ微小粒子に吸着された。
【０２２３】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、１０個の群（１群当たり１０匹のマウス）に分割し、これらのマウスに、表６および７に特定される成分を含むワクチン組成物を筋内的に投与した。動物を、最初の注射の２１日後および３５日後にブーストした。血清を、第２の投与の１４日後（第２のブーストと同時に）、および最後のブーストの１４日後に回収し、抗２８７抗体および抗９６１抗体の力価を、酵素免疫アッセイによって決定した。明記された力価は、所定の逆数血清希釈および４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．０．５を示す。
【０２２４】
結果を、表６および７に示す。理解され得るように、ＰＬＧ／ｄｓＲＮＡを使用してＰＬＧ／ＭｅｎＢ９６１で免疫したマウスは、ＰＬＧ／ＭｅｎＢ９６１のみで免疫したマウスよりも有意により高いレベルの抗９６１抗体を産生した。さらに、抗９６１抗体力価は、ＰＬＧ／ｄｓＲＮＡおよびＰＬＧ／２８７およびＰＬＧ／９６１を投与されたマウスの群において、ｄｓＲＮＡを含まないＰＬＧ／２８７およびＰＬＧ／９６１のみを投与された動物の群においてより有意に高かった。
【０２２５】
（表６．種々のアジュバントを使用するＭｅｎＢ９６１の免疫原性）
【０２２６】
【表６】
2005504816.tif 000009
（表７．種々のアジュバントを使用するＭｅｎＢ９６１＋ＭｅｎＢ２８７の免疫原性）
【０２２７】
【表７】
2005504816.tif 000010
５Ｂ。この研究で使用する処方物を、表８にまとめる。ＭｅｎＢ  ９６１および２８７タンパク質、ＭＦ５９およびｄｓＲＮＡは、上記の通りである。さらに、この群のいくつか（表に示されるような）について、ミョウバンおよび完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を、この処方物に使用した。これらの処方物のいずれも、ＰＬＧを含まなかった。
【０２２８】
Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、５つの群に分け、そして上記のように、表８に記載される成分を含むワクチン組成物を投与しそしてブーストした。血清を収集し、そして上記のようにして、抗９６１抗体を使用してアッセイした。
【０２２９】
結果を、表８に示す。理解できるように、ミョウバンおよびｄｓＲＮＡと組み合わせたＭｅｎＢ  ９６１＋２８７で免疫したマウスは、ｄｓＲＮＡなしで、ミョウバンおよびＭｅｎＢ  ９６１＋２８７で免疫したマウスよりも有意に高いレベルの抗９６１抗体を産生した。ＭＦ５９およびｄｓＲＮＡと組み合わせたＭｅｎＢ  ９６１＋２８７で免疫したマウスにおける抗体力価は、同様に、ｄｓＲＮＡの非存在下で、ＭＦ５９と共にＭｅｎＢ  ９６１＋２８７で免疫したマウスより高い力価を示した。
【０２３０】
表８．種々のアジュバントを使用するＭｅｎＢ  ９６１の免疫原性
【０２３１】
【表８】
2005504816.tif 000011
（実施例６）
（ポリ［ｒＩ−ｒＣ］の活性）
合成ポリリボイノシン酸−ポリリボシチジル酸（ポリ［ｒＩ−ｒＣ］）ｄｓＲＮＡの９０マーを、合成した。このｄｓＲＮＡは、リボイノシン酸の９０マー鎖およびこれにアニーリングされたリボシチジル酸の９０マー鎖を含んだ。この合成ｄｓＲＮＡを、ヒト末梢血単核細胞によるインビトロでＴＮＦおよびＩＬ−１２  ｐ４０の産生を刺激する能力について試験した。示された結果は、４つのドナーからのものであり、そして化合物を、１００μｇ／ｍｌの最終濃度で試験した。活性は、異種ポリ［ｒＩ−ｒＣ］サンプルの２０％と７０％との間であった。従って、この合成ｄｓＲＮＡ誘導体は、インビトロで活性を示した。
【０２３２】
【表９】
2005504816.tif 000012
従って、新規のアジュバント組成物およびこれを使用する方法が開示される。上記から、本発明の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書中に記載されてきたが、添付の特許請求の範囲により規定されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｃ（配列番号１および２）は、ＨＣＶ−１  Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域についてのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。この図に示す番号は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質と比較したものである。Ｅ１領域、Ｅ２領域およびｐ７領域を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃ（配列番号１および２）は、ＨＣＶ−１  Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域についてのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。この図に示す番号は、全長ＨＣＶ−１ポリペプチドと比較してである。Ｅ１領域、Ｅ２領域およびｐ７領域を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃ（配列番号１および２）は、ＨＣＶ−１  Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域についてのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を示す。この図に示す番号は、全長ＨＣＶ−１ポリペプチドと比較してである。Ｅ１領域、Ｅ２領域およびｐ７領域を示す。
【図２】図２は、本発明について用いられる代表的Ｅ１Ｅ２タンパク質であるＥ１Ｅ２８０９をコードするプラスミドｐＭＨＥｌＥ２−８０９の図である。
【図３】図３は、実施例に記載のように、Ｅ１Ｅ２８０９＋ｄｓＲＮＡ；Ｅ１Ｅ２８０９＋ＣｐＧ１；Ｅ１Ｅ２８０９＋ＭＦ５９；Ｅ１Ｅ２８０９＋ＭＦ５９およびＣｐＧ１；ならびにＥ１Ｅ２８０９＋ｄｓＲＮＡおよびＭＦ５９で免疫したマウス由来のＥ１Ｅ２８０９抗Ｅ２  ＩｇＧ抗体力価を示す。バーは、１０匹のマウスの群の相乗平均抗体力価（ＧＭＴ）を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図４】図４は、実施例に記載されるように、ｐ５５ｇａｇ＋ＭＦ５９およびＣｐＧ１（１０μｇ）；ｐ５５ｇａｇ＋ＭＦ５９およびｄｓＲＮＡ（１０μｇ）；ｐ５５＋ＣｐＧ１（１０μｇ）；ならびにｄｓＲＮＡ（１０μｇ）（単独）で免疫したマウス由来の抗ｐ５５ｇａｇ  ＩｇＧ抗体力価を示す。バーは、１０匹のマウスの群の相乗平均抗体力価（ＧＭＴ）を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄ（配列番号５）は、ＨＩＶ  Ｃ  ８＿５＿ＴＶ１＿Ｃ．ＺＡ（ＴＶ１とも呼ばれる）型のヌクレオチド配列を示す。種々の領域を表２に示す。
【図１Ａ】
2005504816.tif 000013
【図２】
2005504816.tif 000014
【図３】
2005504816.tif 000015
【図４】
2005504816.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2005504816.tif 000017
2005504816.tif 000018
2005504816.tif 000019
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005504816.tif 000126
2005504816.tif 000127