(57)【要約】  インヒビターＬと複合体を形成した配列番号２のＰＶＥ２ＴＡＤ様ポリペプチドを含む結晶化させることができる組成物が開示される。本発明はまた、前記結晶化可能ＨＰＶＥ２ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＨＰＶＥ２ＴＡＤ−Ｌ）を製造する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：ａ）精製緩衝液に含まれる精製ＨＰＶＥ２ＴＡＤを可溶化インヒビターＬと混合し、前記ＨＰＶＥ２ＴＡＤ−Ｌ複合体を含む複合体溶液を作製し；さらに、ｂ）結晶化緩衝液中でａ）から前記複合体を結晶化させる。本発明はまた結晶化アポＨＰＶＥ２ＴＡＤを製造する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：ａ）精製緩衝液に含まれるアポＨＰＶＥ２ＴＡＤを結晶化緩衝液と混合する。インヒビター結合ポケットを明らかにするＨＰＶＥ２ＴＡＤ−Ｌ複合体のＸ線結晶構造座標もまた提供される。前記インヒビター結合ポケットは、前記ポケットと結合する有望な小分子インヒビターのスクリーニングに有用である。
2005512954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式のインヒビターＬと複合体を形成した配列番号２のＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ様ポリペプチドを含む結晶化可能組成物。
【化１】
2005512954.tif 000008
【請求項２】
前記ポリペプチドがＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤである請求項１に記載の結晶化可能組成物。
【請求項３】
前記ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤがＨＰＶ−11から得られる請求項２に記載の結晶化可能組成物。
【請求項４】
以下の工程を含む、請求項１に記載の結晶化ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）を製造する方法：
ａ）精製緩衝液に含まれたＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを可溶化インヒビターＬと混合して前記ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体を生成し；さらに
ｂ）前記複合体をａ）から結晶化緩衝液中で結晶化させる。
【請求項５】
前記ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤがＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）において、前記精製緩衝液がＴＣＥＰおよびＤＴＴから選択される還元剤を含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記還元剤が約１ｍＭから約10ｍＭの濃度のＴＣＥＰである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＣＥＰが５ｍＭの濃度である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）において、前記精製緩衝液がｐＨ７から９の間で用いられる請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記精製緩衝液がｐＨ８で用いられる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）において、前記精製緩衝液がさらにＮａＣｌ、ＮＨ4ＳＯ4またはＫＣｌから選択される塩を含む請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩が約200ｍＭから約800ｍＭの濃度のＮａＣｌである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記塩が500ｍＭの濃度のＮａＣｌである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）において、前記精製緩衝液がさらにトリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたはビス−トリスから選択される安定化緩衝液を含む請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記安定化緩衝液が約０ｍＭから約50ｍＭの濃度のトリス−ＨＣｌである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記安定化緩衝液が25ｍＭの濃度のトリス−ＨＣｌである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程ａ）において、前記精製緩衝液がさらに０ｍＭから１ｍＭの濃度のＥＤＴＡを含む請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＥＤＴＡが０ｍＭから0.5ｍＭの濃度である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＤＴＡが0.1ｍＭの濃度である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ）において、前記ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤが、前記精製緩衝液中で約５mg/mLから約15mg/mLの濃度で用いられる請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤが、前記精製緩衝液中で約10mg/mLの濃度で用いられる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｂ）において、前記結晶化緩衝液が、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムから成る群から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記結晶化緩衝液が約50ｍＭから約0.2Ｍの濃度のＭＥＳである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
結晶化緩衝液が0.1Ｍの濃度のＭＥＳである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程ｂ）において、前記結晶化緩衝液がさらに、ＭＰＤ、イソプロパノール、エタノールおよびtert−ブタノールから成る群から選択される沈澱剤を含む請求項４に記載の方法。
【請求項２６】
前記沈澱剤が30％から約40％の濃度のＭＰＤである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記沈澱剤が35％の濃度のＭＰＤである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程ｂ）において、前記結晶化緩衝液が4.5から6.5のｐＨで用いられる請求項４に記載の方法。
【請求項２９】
前記結晶化緩衝液が5.5のｐＨで用いられる請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｂ）において、前記結晶化が０℃から10℃で実施される請求項４に記載の方法。
【請求項３１】
前記結晶化が４℃で実施される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
以下の工程を含む結晶化アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを製造する方法：
ａ）請求項４にしたがって、精製緩衝液に含まれるアポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを結晶化緩衝液と混合する。
【請求項３３】
前記アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤがアポＳｅ−ＨＰＶ−11Ｅ２ ＴＡＤである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記結晶化緩衝液が、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムから成る群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記結晶化緩衝液が約50ｍＭから0.2Ｍの濃度のコハク酸ナトリウムである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記結晶化緩衝液が0.1Ｍの濃度のコハク酸ナトリウムである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記結晶化緩衝液がさらに、ＰＥＧ８Ｋ、ＰＥＧ４ＫまたはＰＥＧ５Ｋモノメチルエーテルを含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記結晶化緩衝液がさらに、約10％から約25％の濃度のＰＥＧ５Ｋモノメチルエーテルを含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記結晶化緩衝液がさらに、18％の濃度のＰＥＧ５Ｋモノメチルエーテルを含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記結晶化緩衝液が4.5から6.5のｐＨで用いられる請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記結晶化緩衝液が5.0のｐＨで用いられる請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記結晶化緩衝液がさらに約0.1Ｍから約0.4Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記硫酸アンモニウムが0.2Ｍの濃度である請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤタンパク質溶液が、前記精製緩衝液中で約１mg/mLから約15mg/mLの濃度で用いられる請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
前記アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤが、前記精製緩衝液中で約５mg/mLの濃度で用いられる請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記結晶化が０℃から10℃で実施される請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記結晶化が４℃で実施される請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
以下の工程を含む、結晶化ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）の製造方法：
ａ）請求項３２にしたがってインヒビターＬを結晶化緩衝液中に溶解し；さらに
ｂ）結晶化アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤをａ）に浸漬する。
【請求項４９】
以下の工程を含む、結晶化ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）の製造方法：
ａ）請求項３２にしたがって、結晶化ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを含む結晶化緩衝液にインヒビターＬを添加する。
【請求項５０】
請求項１に記載のＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）のＸ線結晶構造座標。
【請求項５１】
図９に示される請求項５０に記載のＸ線結晶構造座標。
【請求項５２】
ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤのインヒビター結合ポケットを示す請求項５１に記載のＸ線結晶構造座標。
【請求項５３】
前記インヒビター結合ポケットが、アミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94の側鎖によって境界が定められた深い空洞を含み、前記ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤのＹ19の側鎖がその天然の位置から移動して、小分子インヒビターの侵入を許容するような容積をもつ深い空洞を形成する請求項５２に記載のＸ線結晶構造座標。
【請求項５４】
前記深い空洞がその底部に並んだＨ29およびＴ97を有する請求項５３に記載のＸ線結晶構造座標。
【請求項５５】
前記ポケットがさらに、アミノ酸Ｌ15、Ｉ36、Ｅ39、Ｋ68、Ｎ71およびＡ72の１つまたは２つ以上によって境界が定められた浅い空洞を含む請求項５２に記載のＸ線結晶構造座標。
【請求項５６】
前記インヒビター結合ポケットが、配列番号９、配列番号10、配列番号11および配列番号18によって表されるアミノ酸クラスターに割り当てられた座標にしたがってその境界を定められる請求項５３に記載のＸ線結晶構造座標。
【請求項５７】
前記インヒビター結合ポケットの深い空洞が、図9に記載のＨ32、Ｗ33およびＬ94によって境界が定められる請求項５３に記載のＸ線結晶構造座標。
【請求項５８】
図９に示すＸ線結晶構造座標または前記構造座標の少なくとも一部に関してコード化されたデータ保存物質を含むコンピュータ読出し可能データ保存媒体。
【請求項５９】
以下を含むＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体の三次元映像を作製するコンピュータ：
ａ）図９に示す前記構造座標に関してコード化されたデータ保存物質を含むコンピュータ読出し可能データ保存媒体；
ｂ）前記データを加工するための指示の保存用メモリー；
ｃ）前記コンピュータ読出し可能データを前記三次元映像に加工するために、前記コンピュータ読出し可能データ保存媒体と結合させた中央演算ユニット；および
ｄ）前記三次元映像をディスプレーするために前記中央演算ユニットと結合させたディスプレーユニット。
【請求項６０】
以下の工程を含む、Ｅ２ ＴＡＤインヒビターの特定または性状決定に有用なＥ２タンパク質の製造方法：
ａ）請求項１にしたがって、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ結晶構造を用いて、ＨＰＶインヒビター結合ポケット残基を特定し；
ｂ）前記ＨＰＶインヒビター結合ポケット残基をワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）のタンパク質残基と比較し；
ｃ）前記ＣＲＰＶ残基を前記ＨＰＶ残基に変異させてハイブリッドを作製し；さらに
ｄ）前記ハイブリッドをインヒビターによる抑制についてテストする。
【請求項６１】
下記式Ｌのインヒビターと複合体を形成した配列番号２のＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ様ポリペプチドを含む結晶。
【化２】
2005512954.tif 000009
【請求項６２】
前記Ｅ２ ＴＡＤが、図９に記載のアミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94の座標によって形成された深い空洞を含むインヒビター結合ポケットを含む請求項６１に記載の結晶。
【請求項６３】
図９に記載のＨＰＶ11Ｅ２ ＴＡＤアミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94の構造座標によって境界が定められた深い空洞を含む分子もしくは複合体またはその三次元モデルと結合する化学物質の潜在的能力を評価する方法。
【請求項６４】
以下の工程を含むＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ様結合ポケットを含む分子の有望なインヒビターを特定する方法：
（ａ）Ｈ32、Ｗ33およびＬ94の原子座標を用いて、Ｅ２ ＴＡＤ様結合ポケットを含む分子の三次元構造を作製し；
（ｂ）前記３Ｄ構造を用いて、前記有望なインヒビターをデザインまたは選択し；
（ｃ）前記インヒビターを合成し；
（ｄ）前記インヒビターを前記分子と接触させて、前記有望なインヒビターが前記分子と相互作用する能力を判定する。
【請求項６５】
ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤの分子と結合する化合物をデザインする方法であって、前記方法が、前記化合物と前記分子の局所領域との間の立体化学的相補性を評価する工程を含み、前記分子が以下の特徴を有する前記化合物をデザインする方法：
（ｉ）図９に示される原子座標に実質的に位置するＥ２ ＴＡＤのアミノ酸１−201、その類似体または切端形；
（ii）図９に示される座標とその完全な翻訳および／または回転によって関連を示すアミノ酸の１つまたは２つ以上のサブセット；または
（iii）Ｅ２ ＴＡＤに属するもののアミノ酸配列に存在するアミノ酸であって、図９に示される原子座標に実質的に位置するインヒビター結合ポケットのアミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94によって境界が定められるＥ２ ＴＡＤの三次元構造と同等な構造を形成するアミノ酸。
【請求項６６】
ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤのＤＮＡ複製活性を抑制する薬剤の製造方法であって、前記方法が、アミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94の座標によってその境界が定められるＴＡＤ上のポケットに適合する薬剤を特定またはデザインし、それによって前記ＴＡＤと結合する薬剤を製造することを含む前記複製活性を抑制する薬剤の製造方法。
【請求項６７】
請求項１に記載のＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビターＬ複合体の結晶構造モデルが保存されているコンピュータ読出し可能媒体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、乳頭腫（パピローマ）ウイルスＥ２タンパク質、特にインヒビターと複合体を形成するヒトパピローマウイルス11（ＨＰＶ−11）Ｅ２タンパク質のトランスアクチベーションドメインの結晶構造に関する。本発明は特に、インヒビター結合ポケットの境界を定める結晶構造座標、および前記ポケットに適合する有望なインヒビターを特定することができる三次元構造モデルを提供する。さらにまた、パピローマウイルス（特にヒトパピローマウイルス）のＤＮＡ複製に必要なＥ２タンパク質活性のインヒビターをデザインおよび選別することを可能にする方法が開示される。
【０００２】
発明の背景
乳頭腫（パピローマ）ウイルス（ＰＶ）はエンベロープをもたないＤＮＡウイルスで、上皮の過剰増殖病巣を誘発する。パピローマウイルスは自然界に広く分布し、高等脊椎動物で認められる。とりわけ、ヒト、ウシ、ウサギ、ウマおよびイヌ由来のウイルスの性状が決定されている。最初のパピローマウイルスは、ワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）として1933年に報告された。そのときから、ワタオウサギパピローマウイルスは、ウシパピローマウイルス1型（ＢＰＶ−１）とともにパピローマウイルスに関する研究のための実験用標準ウイルスとして役立ってきた。ほとんどの動物のパピローマウイルスは純粋な上皮性増殖病巣に附随し、さらに動物のほとんどの病巣が皮膚に存在する。ヒトでは、これまでに同定された７５を越えるパピローマウイルス（ＨＰＶ）の型があり、それらは感染部位によって分類されてきた：皮膚上皮および粘膜上皮（口腔および生殖器粘膜）。前記皮膚関連疾患には扁平いぼ、足底いぼなどが含まれる。粘膜関連疾患には喉頭乳頭腫および肛門性器疾患（子宮頸癌を含む）が含まれる（Fields, 1996, Vurology, 3rd ed. Lippincott-Raven Pub., Philadelphia, N.Y.）。
肛門性器疾患と関係がある２５を越すＨＶＰの型が存在する。これらは“低リスク”型と“高リスク”型とに分けられる。低リスク型にはＨＶＰ６型と11型が含まれ、前記は、主に良性の病巣、例えば尖圭コンジローム（性器いぼ）および軽度の扁平上皮内病巣（ＳＩＬ）を誘発する。米国では、約５百万人が性器いぼを示し、そのうちの９０％はＨＰＶ−６およびＨＰＶ−11による。
【０００３】
高リスク型は重度ＳＩＬおよび子宮頚癌に関連し、きわめてしばしばＨＶＰ16、18、31、33、35、45および52型が含まれる。軽度ＳＩＬから重度ＳＩＬへの移行は、低リスクＨＶＰ型を含む病巣と較べて高リスクＨＶＰ−16および18を含む病巣ではるかに頻繁である。さらに４つのＨＶＰ型（16、18、31および45型）のみが子宮頚癌で頻繁に検出される。世界中で毎年、約50万の新規症例が子宮頸部の侵襲性癌と診断されている（Fields, 1996, 上掲書）。
性器いぼの治療には物理的除去、例えば凍結療法、ＣＯ2レーザー、電気外科手術、または外科的切除が含まれる。細胞毒製剤（例えばトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、ポドフィリンまたはポドフィロクス）もまた用いることができる。免疫調節剤（例えばインターフェロンおよびイミキノイド（アルダラ（Aldara（登録商標），3M Pharmaceuticals））もまた利用することができる。前記の治療は全てのウイルス粒子の除去に完全に有効であるというわけではなく、高い代償または前記に関連する不快な副作用が存在する。さらにまた再発性いぼは一般的である（Beutner & Ferenczy, 1997, Amer. J. Med., 102(5A):28-37）。
従来のＨＰＶ感染治療方法が有効ではないことで、前記の感染を制御または排除する新規な手段を特定することの必要性が示された。最近では、抗ウイルス化合物、特にウイルス複製を妨げることができる化合物の発見に向けて努力が重ねられている（Hughes & Romanos, 1993, Nucleic Acids Res. 21:5817-5823; Clark et al., Antiviral Res., 1998, 37(2):97-106; Hajduk et al., 1997, J. Med. Chem., 49(20):3144-3150; Cowsert et al., 1993, Antimicrob. Agents. Chemother., 37(2):171-177）。したがって最終的に、ＨＰＶ感染によって惹起されるいずれかの疾患を排除する可能性を有する、含有されるべき有望な化学療法標的薬剤を特定するためにＨＰＶの遺伝学の研究が重要になった。
【０００４】
ＰＶのライフサイクルは角化細胞の分化と密接に結びついている。感染は、基底上皮内の組織破壊部位で発生すると考えられている。正常細胞とは異なり、垂直分化中の細胞は分裂し続ける。感染細胞が前進分化にあるときは、細胞の複製機構は維持され、それによってウイルスＤＮＡの複製は増加し、最終的には後期遺伝子発現およびビリオンアッセンブリーが分化最終点の角化細胞で生じ、ウイルス粒子が放出される（Fields, 上掲書）。
パピローマウイルスゲノムの各々のコード鎖は、約１0個の明瞭な翻訳開放読み枠を含み、これらは初期ＯＲＦまたは後期ＯＲＦに分類されている。Ｅ１からＥ８遺伝子はウイルス複製サイクルの初期に発現される。２つの後期遺伝子（Ｌ１およびＬ２）は、それぞれメジャーおよびマイナーキャプシドタンパク質をコードする。前記Ｅ１およびＥ２遺伝子生成物は、ウイルスＤＮＡ複製で機能し、一方Ｅ５、Ｅ６およびＥ７はホスト細胞増殖を調節する。Ｅ３、Ｅ４およびＥ８遺伝子生成物の機能は現時点では明らかではない。
ＨＰＶの研究によって、Ｅ１およびＥ２タンパク質はウイルスＤＮＡ複製に必要な唯一のウイルスタンパク質である（Kuo et al., 1994, J. Biol. Chem. 30:24058-24065）。この要件はウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）のそれと同様である。実際のところ、全てのパピローマウイルス（ＰＶ）のＥ１およびＥ２タンパク質並びに複製起点配列間には、ウイルスの種および型に関係なく高度な類似性が存在する（Kuo et al., 1994, 上掲書）。
【０００５】
ウイルスＤＮＡの複製がin vitroで進行し、Ｅ１タンパク質が過剰に存在する場合は、複製はＥ２の非存在下で進行することが可能である。in vivoでは、大量の細胞性ＤＮＡが存在するとき、複製にはＥ１およびＥ２の両方の存在が要求される。in vivoでの複製開始機構は、Ｅ１およびＥ２の複製起点への協調的結合を必要とし、それによって三次元的タンパク質−ＤＮＡ複合体のアッセンブリーがもたらされると考えられている（Mohr et al., 1990, Science 250:1694-1699）。Ｅ２タンパク質は転写活性化因子であり、Ｅ１タンパク質と結合し、そうすることでＥ１のＢＰＶ複製起点への結合を高める（Seo et al., 1993b, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2865-2869）。したがって、Ｅ２は、Ｅ１を複製起点に誘導する特異的な因子として機能する（Sedman & Stenlud, 1995, Embo. J. 14:6218-6228）。ＨＰＶでは、Ｅ２はＥ１の複製起点への結合を安定化させると提唱されている（Lui et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(45):27283-27291; McBride et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:18411-18414）。これらのＤＮＡ−タンパク質およびタンパク質−タンパク質相互作用はＤＮＡ複製起点で生じる（Sverdrup & Myers, 上掲書）。
多数のヒトおよび動物の血清型の特徴を有する約45ｋＤのＥ２タンパク質は、２つのドメインを含む共通の構成を有する。そのＮ−末端のトランスアクチベーションドメイン（ＴＡＤ）は長さが約220アミノ酸であり、そのＣ−末端のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は100アミノ酸である。両ドメインは可撓性のリンカー領域によって結合している。
【０００６】
Ｅ２は、ウイルスのイニシエータータンパク質Ｅ１とともにＤＮＡ複製起点に協調的に結合し、最終的には機能的なＥ１六量体を生じることによってウイルスの複製を活性化させる。Ｅ２はまたウイルス転写の中心的な調節因子であり、基本的転写因子（ＴＡＴＡ結合タンパク質、ＴＦIIIＢおよびＴＡＦII70（近位プロモータ結合タンパク質、例えばＳｐ１）、および他の細胞性因子（例えばＡＭＦ−１、これはＥ２の転写活性化に正の影響を及ぼす）を含む）と相互作用を示す。
前記の多くの相互作用のいずれが転写活性化の達成に十分であるのかまたは必要であるのかはなおあいまいである。前記の細目は、エンハンサー結合タンパク質は以下のようにして転写活性化因子として機能するという考えに一致する：エンハンサー結合タンパク質は特異的なタンパク質−タンパク質の接触により、全般的転写機構の成分をプロモーターに結合させてＲＮＡポリメラーゼIIの補充という目的を達成する。Ｅ２の第三の機能は、ウイルスＤＮＡの正確な分離を促進することである。ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ゲノムおよびＥ２タンパク質は有糸分裂時にホスト細胞染色体で一緒に存在するが、前記は完全なＥ２ ＴＡＤの存在に依存する。
Ｅ２ＤＢＤは二量体化して、ＤＮＡ結合部位の大溝（major groove）内に位置する側面を接する認識らせんとともにβ−バレルを形成する。対照的に、Ｅ２ ＴＡＤの構造は、HarrisとBotchan（ 1999, Science, 284(5420):1673）がＸ線結晶学によってＨＰＶ−18のＥ２ ＴＡＤタンパク分解フラグメントの最初のモデルを提供するまでは不明であった。前記のモデルによって、５５Åｘ４０Åｘ３０Åのカシューナッツ形タンパク質が提唱された。前記タンパク質は、その一方の側面に凹形の割れ目を、反対の面に細長い隆起部を有する。前記著者らは、明瞭に他と区別可能な表面が既知のＥ２の活性に対応するか否かを調べ、特に、転写にとって重要な特有の表面の範囲を明らかにするＥ175、Ｌ178、Ｙ179およびＩ73を包含する主要なくぼみの内側端を構成する主要残基クラスターを特定した。
【０００７】
Antsonら（2000, Nature, 403:805-809）は、ＨＰＶ−16由来の完全なＥ２ ＴＡＤの結晶構造（７つの保存残基（Ｒ3７、Ａ69、Ｉ73、Ｅ76、Ｌ77、Ｔ81およびＱ80）のクラスターを含む、第二の新規に特定された仮定的Ｅ２−Ｅ２ ＴＡＤ接触面を含む）を開示した。前記著者らは、Ｑ12およびＥ39はＥ１との相互作用に必要であろうと提唱した。
Ｅ２タンパク質は抗ウイルス剤として有望な標的であると考えられる。しかしながら、Ｅ２を標的とする薬剤発見の試みは、インヒビターと複合体を形成するＥ２の構造に関する情報の欠如によって妨げられてきた。ハリス（Harris）のモデルもアントソン（Antson）のモデルも潜在的インヒビター結合ポケットの位置特定および／または性状決定に関して何らの情報も提供していない。アポ−Ｅ２ ＴＡＤの構造に関する情報は、前記アポ−タンパク質の表面に関してある貴重な情報を提供したが、前記はインヒビターとの結合時に誘発される構造変化に典型的ではないことことが今では明らかである。
固有のＥ２インヒビターの欠如（Ｅ２インヒビターはＥ２とインヒビターの共結晶に必要である）は、Ｅ２内のインヒビター結合ポケットの探索を妨げてきた。したがって、そのようなタンパク質−インヒビター複合体のＸ線結晶学的分析はこれまで可能ではなかった。
本発明は多数の文献を引用するが、それら文献は参照により本明細書に含まれる。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、ヒトパピローマウイルスＥ２タンパク質のトランスアクチベーションドメインとＥ２の小分子インヒビターとの複合体を含む新規な組成物、並びに前記組成物の製造方法を提供することによって、従来技術では未解決であった問題を解決した。有利なことには、本発明はさらに、結晶化およびＸ線回折が可能で、それによってＨＰＶＥ２タンパク質のトランスアクチベーションドメインのインヒビター結合ポケットに関する重要な情報を提供することができるＥ２−インヒビター複合体を提供する。前記インヒビターは、共結晶を精製する極めて貴重なツールを提供し、ＨＰＶの複製サイクル中にＥ１との相互反応に必要であろうと思われる、以前には不明であったインヒビター結合ポケットの性状決定を可能にする。
本発明はまた、ＨＰＶＥ２のインヒビター結合ポケットと少なくともいくつかの構造的に類似する特色を含む分子または分子複合体の三次元構造の少なくとも一部分を決定する方法を提供する。
本発明はまた、有望なインヒビターの結合を分析および予測し、前記特定されたポケットと結合するさらに別のインヒビターの探索を促進することができる３Ｄモデルを提供する。本発明で開示する前記ポケットの位置の特定および性状の決定によって、ＰＶ感染の治療において有望な新規治療目標が提供される。
本発明はまた、前記新規な目標を調節することができる薬剤を特定するためのスクリーニング方法、およびＰＶＤＮＡ複製を妨げることができる少なくとも１つの前記のような薬剤を選択するシステムを提供する。
本発明はまた、Ｅ１−Ｅ２相互作用を抑制する薬剤を製造する方法を提供する。前記方法は、本明細書に開示したポケットに適合する薬剤を特定するかまたはデザインすることを含む。
【０００９】
本発明の第一の特徴にしたがえば結晶化可能組成物が提供される。前記組成物は、下記式のインヒビターＬと複合体を形成した配列番号：２のＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ様ポリペプチドを含む。
【００１０】
【化１】
2005512954.tif 000003
【００１１】
本発明の第二の特徴にしたがえば、上記で定義した、前記インヒビターＬと複合体を形成した配列番号：２のＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ様ポリペプチドを含む結晶が提供される。
本発明の第三の特徴にしたがえば、上記で定義した結晶化ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体を製造する方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：
ａ）精製緩衝液に含まれる精製ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを可溶化インヒビターＬと混合し、前記ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体を含む複合体溶液を作製し；さらに、
ｂ）結晶化緩衝液中でａ）から前記複合体を結晶化させる。
本発明の第四の特徴にしたがえば、以下を含む、結晶化アポＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを製造する方法が提供される：
ａ）精製緩衝液に含まれるアポＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを結晶化緩衝液と混合する。
本発明の第五の特徴にしたがえば、上記で定義した結晶化ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体を製造する方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：
ａ）結晶化緩衝液にインヒビターＬを溶解し；さらに、
ｂ）上記で定義した結晶化アポＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを浸漬する。
本発明の第六の特徴にしたがえば、上記で定義したＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）のＸ線結晶構造座標が提供される。
本発明の第七の特徴にしたがえば、コンピュータ読出し可能データ保存媒体が提供される。前記媒体は、図９に示すＸ線結晶構造座標または前記構造座標の少なくとも一部分に関してコード化されたデータ保存物質を含む。
本発明の第八の特徴にしたがえば、本明細書に定義した前記ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体の三次元映像を作製するコンピュータが提供される。前記コンピュータは以下を含む：
ａ）図９に示す前記構造座標に関してコード化されたデータ保存物質を含むコンピュータ読出し可能データ保存媒体；
ｂ）前記コンピュータ読出し可能データを加工するための指示の保存用メモリー；
ｃ）前記コンピュータ読出し可能データを前記三次元映像に加工することを目的とする、前記コンピュータ読出し可能データ保存媒体と結合させた中央演算ユニット；および
ｄ）前記三次元映像をディスプレーするための、前記中央演算ユニットと結合させたディスプレーユニット。
本発明の第九の特徴にしたがえば、Ｅ２ ＴＡＤインヒビターの特定または性状決定に有用なＥ２タンパク質を製造する方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：
ａ）本明細書に定義したＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ結晶構造を用いてＨＰＶインヒビター結合ポケットの残基を特定し；
ｂ）前記ＨＰＶインヒビター結合ポケット残基を別のＰＶＥ２の類似残基と比較し；
ｃ）前記他のＰＶ残基を前記ＨＰＶ残基に変異させてハイブリッドを作製し、
ｄ）前記ハイブリッドをインヒビターによる抑制についてテストする。
【００１２】
定義
本明細書を通して以下の略語が用いられる。
“結合する”という用語は、化学物質または化合物、またはその一部分との間での近接した状態を指す。前記結合は非共有結合でもよく（この場合、水素結合、ファンデルワールス力または静電気的相互作用は並列している状態で極めて有利に働く）、または共有結合でもよい。
本明細書で用いられる“結合ポケット”は分子または分子複合体の一領域を指し、前記は、その形状の結果として別の分子、分子複合体、化学物質または化合物と優先的に結合する。本明細書で用いられるように、前記ポケットは少なくとも深い空洞を含み、場合によって浅い空洞も含む。
本明細書で用いられる“複合体”は、化学的物質と結合した分子またはタンパク質、その保存的類似体もしくは切端形の組合せを指す。
【００１３】
本出願で用いられるα−アミノ酸の略語は以下に示される：
2005512954.tif 000004
【００１４】
本明細書で用いられる“類似体”という用語は、本発明では、アミノ酸配列であって本来の配列と実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的活性のいずれか）を保持するアミノ酸配列を指す。前記類似体は同じ種に由来するものでも異なる種に由来するものでもよく、さらに天然の類似体でも合成によって製造されてもよい。前記の類似体には、タンパク質の生物学的活性が保存されていることを条件として、１つまたは２つ以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列が含まれる。特に、“保存的類似体”という用語は、下記の表に定義されるように強い類似性または弱い類似性を有する別のアミノ酸によって置換されたアミノ酸を含む類似体を指す（例えば以下を参照されたい：M.O. Dayhoff, (1978), Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, sippl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.）。
【００１５】
アミノ酸の類似性に関する表
2005512954.tif 000005
【００１６】
アミノ酸またはアミノ酸残基に関して“側鎖”という用語は、α−アミノ酸のα−炭素原子と結合した基を意味する。例えば、グリシンのＲ−基側鎖は水素であり、アラニンのそれはメチル、バリンのそれはイソプロピルである。α−アミノ酸の固有のＲ−基または側鎖については以下の成書に記載されている：A.L. Lehninger's text on Biochemistry（４章を参照されたい）。
“切端”という用語は、Ｅ２ ＴＡＤアミノ酸配列の任意のセグメントおよび／または上記に記載された一切の類似体の任意のセグメントであって、図９の座標によって境界が定められたインヒビター結合ポケットと同じ空間的関係にある、本発明のインヒビター結合ポケットの深い空洞の範囲を決定するために十分なアミノ酸を含むセグメントを指す。
“根平均二乗偏差”または“ｒｍｓ偏差”または“ｒｍｓｄ”という用語は、平均から逸脱した値を二乗したものの算術的平均の平方根を指す。原子を対象とする場合は、数字はオングストローム（Å）で与えられる。前記は、傾向または対象からの逸脱または変動を表現する一方法である。本発明では、全てのｒｍｓｄの比較は、Ｈ32、Ｗ33およびＬ94のみの主鎖原子を用いて重ね合わせた構造を剛体移動のみにより最小のオーバーラップｒｍｓと比較することによって得られた。我々のアポ構造と本明細書に開示した複合体との間の前記操作に対する主鎖原子のｒｍｓｄは0.078Åである。
【００１７】
好ましい実施態様
１．組成物
第一の実施態様にしたがえば、下記式Ｌと複合体を形成した配列番号２のＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ様ポリペプチドを含む結晶化可能組成物が提供される：
【００１８】
【化２】
2005512954.tif 000006
【００１９】
好ましくは、前記組成物は、ＨＰＶＥ２タンパク質のアミノ酸１−220（配列番号１）（Swiss Protのナンバリングにしたがって以下のように定義される：遺伝子座ＶＥ２＿ＨＰＶ11アクセッションＰ04015；固有ＩＤ、g137671）、その保存的類似体または切端形を含む。より好ましくは、Ｅ２のトランスアクチベーションドメイン（ＴＡＤ）はアミノ酸１−218、好ましくは１−215、より好ましくは１−201を含む。さらに好ましくは、本発明に用いられるＥ２ ＴＡＤはアミノ酸２−201、特に２−196を含む。さらに好ましくは、本組成物はＥ２ ＴＡＤのアミノ酸15−104を含む。
第一の実施態様の別の特徴では、本発明で用いられるＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤはＨＰＶ−11から得られ、さらに小分子インヒビターＬと複合体を形成する。他のタイプのパピローマウイルス（ＰＶ）（ＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）またはＣＲＰＶ（ワタオウサギパピローマウイルス）を含む）もまた本発明に含まれる。
第二の実施態様にしたがえば、インヒビターＬと複合体を形成した配列番号２のＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ様ポリペプチドを含む結晶が提供される。
【００２０】
２．結晶化の方法
本発明の第三の実施態様にしたがえば、上記に定義した結晶化ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）の製造方法が提供される。前記方法は以下の工程を含む：
ａ）精製緩衝液に含まれる精製ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを可溶化インヒビターＬと混合して、前記ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体を含む複合体溶液を作製し；さらに
ｂ）前記複合体をａ）から結晶化緩衝液中で結晶化させる。
第三の実施態様の工程ａ）の好ましい特徴では、前記インヒビターＬは100％ＤＭＳＯ中で60ｍＭの濃度で可溶化される。
第三の実施態様の工程ａ）の好ましい特徴では、前記精製緩衝液は、ＴＣＥＰおよびＤＴＴから選択できる還元剤を含む。より好ましくは、前記緩衝剤はＴＣＥＰである。好ましくは、前記緩衝剤は、約１ｍＭから約10ｍＭの濃度のＴＣＰＥである。より好ましくは、前記緩衝剤は５ｍＭの濃度のＴＣＰＥである。
好ましくは、前記精製緩衝液はｐＨ７から９の間で用いられる。より好ましくは、前記精製緩衝液はｐＨ８で用いられる。
前記緩衝剤の他にさらに、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤの安定化を促進するために塩を添加することができる。好ましくは、前記塩はＮａＣｌ、ＮＨ4ＳＯ4またはＫＣｌから選択することができる。より好ましくは、前記塩は約200ｍＭから約800ｍＭの濃度のＮａＣｌである。より好ましくは、前記塩は500ｍＭの濃度のＮａＣｌである。
前記還元剤の他にさらに、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤの安定化をさらに促進するために緩衝液を添加することができる。好ましくは、前記緩衝液はトリス−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳまたはビス−トリスから選択することができる。より好ましくは、前記緩衝液は約０ｎＭから約50ｍＭの濃度のトリス−ＨＣｌである。さらに好ましくは、前記緩衝液は25ｎＭの濃度のトリス−ＨＣｌである。
前記還元剤の他にさらに、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤのプロテアーゼによる分解を減少させるためにキレート剤を添加することができる。好ましくは、前記キレート剤はＥＤＴＡまたはＥＧＴＡでもよい。より好ましくは前記キレート剤は０ｍＭから１ｍＭの濃度のＥＤＴＡである。さらに好ましくは、前記キレート剤は０ｍＭから0.5ｍＭの濃度のＥＤＴＡである。さらに好ましくは前記キレート剤は0.1ｍＭの濃度のＥＤＴＡである。
第三の実施態様の工程ａ）の好ましい特徴では、好ましくは、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤタンパク質溶液は、前記精製緩衝液中で約５mg/mLから約15mg/mLの濃度で用いられる。より好ましくは、前記ＰＶ Ｅ２ ＴＡＤは前記精製緩衝液中で約10mg/mLのＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ濃度で用いられる。
【００２１】
第三の実施態様の工程ｂ）の好ましい特徴では、好ましくは、前記結晶化緩衝液は、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムから選択することができる。より好ましくは、前記結晶化緩衝液は約50ｍＭから約0.2Ｍの濃度のＭＥＳである。さらに好ましくは、前記結晶化緩衝液は0.1Ｍの濃度のＭＥＳである。
好ましくは前記結晶化緩衝液は、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤの結晶化を促進する沈澱剤をさらに含む。好ましくは前記沈澱剤は、ＭＰＤ、イソプロパノール、エタノールまたは第三ブタノールから選択することができる。より好ましくは、前記沈澱剤は、30％から約40％の濃度のＭＰＤである。さらに好ましくは、前記沈澱剤は35％の濃度のＭＰＤである。
好ましくは、前記結晶化緩衝液は4.5から6.5のｐＨで用いられる。さらに好ましくは前記結晶化緩衝液は5.5のｐＨで用いられる。
第三の実施態様の工程ｂ）の好ましい特徴では、前記結晶化は０℃から10℃で実施される。より好ましくは前記結晶化は４℃で実施される。
第三の実施態様の好ましい特徴では、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体の結晶化は懸垂滴蒸気拡散技術（hanging drop vapor diffusion technique）を用いて実施した。
第三の実施態様の重要な特徴では、結晶化ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体の発明はＸ線結晶学の適用が容易である。Ｘ線結晶分析を用いて、生成ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体結晶は、単位胞寸法がａ＝ｂ＝60.7Åでｃ＝82.5Åである空間群Ｐ４（１）に属し、さらに不整単位につき１つの分子を含む。初期回折データは、Ｒ−軸IIイメージプレートエリア検出装置（Molecular Structure Corp. Texas）を搭載したホームソースＸ線発生装置（Rigaku, Japan）を用いて測定された。好ましくは、3.15Åの解像データを100Ｋに冷却した複合体の単一結晶について集めた。
【００２２】
本発明の第四の実施態様にしたがえば、アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを結晶化させる方法が提供される。前記方法は、ａ）精製緩衝液に含まれるアポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを結晶化緩衝液と混合することを含む。
第四の実施態様の好ましい特徴では、前記アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤはアポＨＰＶ−11Ｅ２ ＴＡＤである。より好ましくは、前記アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤはアポＳｅ−ＨＰＶ−11Ｅ２ ＴＡＤである。
第四の実施態様の好ましい特徴では、前記精製緩衝液は本明細書に記載したものを含む。好ましくは、前記アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤタンパク質溶液は、前記精製緩衝液中で約１mg/mLから約15mg/mLの濃度で用いられる。より好ましくは、前記アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤは前記精製緩衝液中で約１mg/mLから約10mg/mLのＥ２ ＴＡＤの濃度で用いられる。さらに好ましくは、前記アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤは前記精製緩衝液中で5mg/mLの濃度で用いられる。
第四の実施態様の好ましい特徴では、前記結晶化緩衝液は、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムから選択することができる。より好ましくは、前記結晶化緩衝液は約50ｍＭから0.2Ｍの濃度のコハク酸ナトリウムである。さらに好ましくは、前記結晶化緩衝液は0.1Ｍの濃度のコハク酸ナトリウムである。
好ましくは、前記結晶化緩衝液はさらに、ＰＥＧ８Ｋ、ＰＥＧ４ＫまたはＰＥＧ５Ｋモノメチルエーテルを含む。より好ましくは、前記結晶化緩衝液はさらに、約10％から約25％の濃度のＰＥＧ５Ｋモノメチルエーテルを含む。さらに好ましくは、前記結晶化緩衝液はさらに18％の濃度のＰＥＧ５Ｋモノメチルエーテルを含む。
好ましくは、前記結晶化緩衝液は4.5から6.5のｐＨで用いられる。さらに好ましくは、前記結晶化緩衝液は5.0のｐＨで用いられる。
好ましくは、前記結晶化緩衝液はさらに約0.1Ｍから約0.4Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む。さらに好ましくは、前記結晶化緩衝液はさらに0.2Ｍの濃度の硫酸アンモニウムを含む。
第四の実施態様の工程の好ましい特徴では、前記結晶化は０℃から10℃で実施される。より好ましくは前記結晶化は４℃で実施される。
前記アポＨＰＶ−11Ｅ２ ＴＡＤ結晶は、単位胞寸法がａ＝54.9Å、ｂ＝169.9Åおよびｃ＝46.1Åである空間群Ｃ222に属し、さらに不整単位につき１つの分子を含む。回折データは、ビームラインＸ４ａ（NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York）により採集した。４つのデータセットを、セレニウム吸収端近くの４つの異なるｘ線波長（0.9790Å、0.9794Å、0.9743Å、および0.9879Å）で100Ｋに冷却した単一結晶から集めた。画像はＡＤＳＣＱ４ＣＣＤにより採集した。好ましくは、最大解像は2.4Åであった。
本発明の第五の実施態様にしたがえば、以下の工程を含む、結晶化ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）の製造方法が提供される：
ａ）インヒビターＬを結晶化緩衝液に溶解し；さらに
ｂ）結晶化アポＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤをａ）に浸漬する。
本発明の第五の実施態様のまた別の特徴では、以下の工程を含む、上記に定義した結晶化ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）の製造方法が提供される：
ａ）結晶化ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤを含む結晶化緩衝液にインヒビターＬを添加する。
【００２３】
３．Ｘ線座標
第六の実施態様にしたがえば、上記に定義したＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体（ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ）のＸ線結晶構造座標が提供される。より好ましくは、前記座標はインヒビター結合ポケットの座標である。さらに好ましくは、前記ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体の座標一式は図９のとおりである。
好ましくは、インヒビター結合ポケットは、アミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94の側鎖によって境界が定められる深い空洞を含み、前記ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤのＹ19の側鎖はその天然の位置から移動して、小分子インヒビターの侵入を許容するような容積をもつ深い空洞を形成する。より好ましくは、前記深い空洞はその底部に並んだＨ29およびＴ97を有する。さらに好ましくは、前記ポケットはさらに、アミノ酸Ｌ15、Ｉ36、Ｅ39、Ｋ68、Ｎ71およびＡ72の１つまたは２つ以上によって境界が定められる浅い空洞を含む。
好ましくは前記インヒビター結合ポケットは、以下のアミノ酸クラスターに割り当てられた座標にしたがってその境界が明示される：
【００２４】
15    21......28........ 39.....68  72........90            104
LLELYEE...... KHIMHWKCIRLE..... KGHNA........ EPWTLQDTSYEMWLT
(配列番号９)    (配列番号10)     (配列番号11)  (配列番号18)
【００２５】
より好ましくは、前記インヒビター結合ポケットおよび特にその深い空洞は、図9のようにＨ32、Ｗ33およびＬ94の座標によって定められる。より好ましくは、前記は、Ｈ32、Ｗ33およびＬ94の側鎖の座標によって定められる。
また別には、タンパク質構築物のＹ19の側鎖を変更してもよい。前記はＹ19の側鎖に妨害されることなく類似の深い空洞を再現するであろう。
さらに好ましくは、前記深いポケットの底部はアミノ酸Ｈ29およびＴ97の座標によってその境界が定められる。さらに好ましくは、前記インヒビター結合ポケットの浅い空洞は、アミノ酸Ｌ15、Ｉ36、Ｅ39、Ｋ68、Ｎ71およびＡ72の１つまたは２つ以上の座標によって境界が定められる。
【００２６】
本発明のＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体の三次元構造は、図9に示す一組の構造座標によって定められる。“構造座標”という用語は、結晶形態にあるＥ２−Ｌ複合体の原子（散乱中心）によってＸ線の単色ビームの回折を基にして得られたパターンに関する、数学的操作で得られるデカルト座標を指す。この回折データを用いて、結晶の繰返し単位の電子密度マップを計算する。続いて前記電子密度マップを用いて、Ｅ２ ＴＡＤインヒビターポケットの個々の原子の位置を確定する。
タンパク質またはタンパク質−インヒビター複合体またはその部分に対する一組の構造座標は、三次元における形状を定める相対的位置を示す一組の点であることは当業者には理解されよう。したがって、完全に異なる一組の座標が類似または同一の形状を示すことがあるということは可能なことである。
座標における変動は、構造座標の数学的操作によって生じるであろう。例えば、図９に示す構造座標は、構造座標の結晶学的並べ換え、構造座標セットの細分化もしくはマトリックス操作、または上記の任意の組合せによって操作することができる。
分子または分子複合体またはその部分が同じものと考えることができるほどＨＰＶＥ２タンパク質またはＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤの全てもしくはその部分と十分に類似しているか否かを決定するためには、種々の計算による分析が必要である。そのような分析は、従来のソフトアプリケーション、例えばＱＵＡＮＴＡのモリキュラーシミラリティーアプリケーション（Molecular Simulations Inc., San Diego, CA）バージョン4.1で実施できる。
前記モリキュラーシミラリティーアプリケーションは、異なる構造、同じ構造の異なる配置、および同じ構造の異なる部分間での比較を可能にする。構造を比較するためにモリキュラーシミラリティーで用いられる方法は４つの工程に分割される：１）比較されるべき構造のローディング；２）これら構造中の同価原子の決定；３）フィッティング（重ね合わせ）操作の実施；および４）結果の分析。
各構造は名称によって特定される。続いて1つの構造を標的（すなわち固定構造）として特定し、残りの全ては作業構造（すなわち移動構造）である。ＱＵＡＮＴＡ内の原子同価性はユーザーの入力によって決定されるので、本発明の目的のためにはｒｍｓｄ値は、比較される２つの構造間のアミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94のための主鎖原子を用いて決定された。
剛体フィッティング法（rigid fitting method）を用いたときは、標的構造との最適な重ね合わせを得るために前記作業構造を転換および回転させる。前記のフィッティング操作は、同価原子の固有対に対する前記重ね合わせの根平均二乗差が絶対最小であるように、移動構造に適用するべき最適な転換および回転を計算するアルゴリズムを用いる。２つの構造を重ね合わせた後、ｒｍｓｄ値は、同価原子の固有セットについて計算することができる。
【００２７】
４．機械読出し可能媒体に保存された座標
第七の実施態様では、図９に示す構造座標または前記構造座標の少なくとも一部に関してコード化されたデータ保存物質を含むコンピュータ読出し可能データ保存媒体が提供される。そのようなコンピュータ読出し可能データ保存媒体の例は当業者には周知であり、例えばＣＤ−ＲＯＭおよびディスク（“フレキシブルディスク”）が含まれる。
したがって本発明にしたがえば、ＨＰＶＥ２−インヒビター複合体（および特にＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体）およびその部分の構造座標を機械読出し可能保存媒体に保存することができる。前記のデータを種々の目的、例えば薬剤の発見およびタンパク質結晶のＸ線結晶解析に用いることができる。
したがって第八の実施態様では、以下を含むＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体の三次元映像を作製するコンピュータが提供される：
ａ）図９に示す前記構造座標に関してコード化されたデータ保存物質を含むコンピュータ読出し可能データ保存媒体；
ｂ）前記コンピュータ読出し可能データを加工するための指示を保存するメモリー；
ｃ）前記コンピュータ読出し可能データを前記三次元映像に加工するために、前記コンピュータ読出し可能データ保存媒体と結合させた中央演算ユニット；および
ｄ）前記三次元映像をディスプレーするために前記中央演算ユニットと結合させたディスプレーユニット。
【００２８】
５．ポケットの三次元構造
本発明はまた、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤインヒビター結合ポケットと構造的に類似する特色を含む分子複合体の少なくとも一部分の三次元構造が提供される。
本発明にしたがえば、前記インヒビター結合ポケットの形状は、深いポケットおよび場合によって浅いポケットを含むとみなすことができる（図７参照）。前記深い空洞の形状は、アミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94の側鎖の相対的な位置によって定められ、図９に示すそれらの絶対座標によって決められない。類似の座標または三次元モデルは異なる技術から得ることができ、本発明の範囲内に含まれる。
したがって本発明はまた、ＨＰＶＥ２−インヒビター複合体、特にＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体の三次元構造を提供する。重要なことには、前記によって、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤインヒビター結合ポケットの形状および構造に関する情報が初めて提供された。
【００２９】
６．スクリーンニングのために三次元モデルを使用する
第九の実施態様では、アミノ酸Ｈ32、Ｗ33およびＬ94を含むＨＰＶ−11Ｅ２タンパク質トランスアクチベーションドメインの構造座標またはその三次元モデルによって定められる結合ポケットを含むパピローマウイルスＥ２トランスアクチベーションドメインと結合する化学物質の潜在的能力を評価する方法が提供される。
場合によって、本発明はさらに、前記結合ポケットが、前記深いポケットの底部の境界を定めるＨ29およびＴ97の一方または両方の構造座標をさらに含む、前記化学物質の潜在的能力の評価方法を提供する。
場合によって、本発明はさらに、前記結合ポケットが、Ｌ15、Ｉ36、Ｅ39、Ｋ68、Ｎ71およびＡ72から成る群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の構造座標をさらに含む、前記化学物質の潜在的能力の評価方法を提供する。
本発明は、ＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤインヒビター結合ポケットまたはその任意の部分に適合および／または結合することができる抑制性化合物を含む化学物質を考案、選別および合成するために、構造を基準にしてまたは論理的に薬剤をデザインする技術を使用することを初めて可能にした。
本発明によって可能になった特に有用な薬剤デザイン技術の１つは反復薬剤デザインである。反復薬剤デザインは、連続的なタンパク質／化合物セットの三次元構造を判定および評価することによってタンパク質と化合物の結合を最適化する方法である。
【００３０】
天然のリガンドまたは基質とそれらの対応するレセプターまたは酵素の結合ポケットとの結合は、多くの生物学的作用メカニズムの基礎であることは、当業者には理解されるところであろう。同様に、多くの薬剤が、レセプターおよび酵素の結合腔との結合を介してそれらの生物学的作用を発揮する。そのような結合は結合ポケットの全体または任意の部分で発生するであろう。そのような結合を理解することによって、その標的レセプターまたは酵素とより有利に結合し、したがって生物学的作用が改善された薬剤のデザインが促進されるであろう。したがって、このような情報はレセプターまたは酵素の有望なリガンドまたはインヒビター、例えばＨＰＶＥ２様ポリペプチド、より重要なことにはＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤのインヒビターの考案に重要である。
反復薬剤デザインでは、一連のタンパク質／化合物複合体の結晶が得られ、続いて各複合体の三次元構造が解明される。そのようなアプローチによって各複合体のタンパク質と化合物間の結合を看破することができる。これは、抑制活性をもつ化合物の選別、前記新規なタンパク質／化合物複合体の入手、前記複合体の三次元構造の解明、および前記新規なタンパク質／化合物複合体と以前に解明されたタンパク質／化合物複合体との間の結合の比較によって達成される。化合物の変化がタンパク質／化合物結合にどのような影響を与えたかを調べることによって、これらの結合を最適化させることができる。
いくつかの事例では、反復薬剤デザインは、連続的なタンパク質−化合物複合体を形成し、続いて新規な各複合体を結晶化させることによって実施される。また別には、予め形成させたタンパク質結晶を上記で述べたようにインヒビターの存在下で浸漬し、それによってタンパク質／化合物複合体を形成し、さらに個々のタンパク質／化合物複合体の結晶化の要件を調べる。有利なことには、本発明で提供されるＨＰＶＥ２タンパク質結晶、特にＥ２ ＴＡＤ結晶は、上記で述べたようにインヒビターまたは特にＥ２インヒビター（例えば化合物Ｌ）の存在下で浸漬して、Ｅ２−インヒビター結晶複合体を提供することができる。
７．スクリーニングのためにポケットを使用する
ある事例では、Ｙ19の側鎖を欠くＥ２ ＴＡＤを創出し、本明細書に示したインヒビター結合ポケットを再現することができる。一次配列を前記のように改変して類似の結合ポケットを得ることは本発明の範囲内に包含される。さらにまたスクリーンニングの目的でそのような改変Ｅ２ ＴＡＤを使用し、新規に特定したポケットの有望なインヒビターをスクリーニングすることもまた本発明に包含される。
【００３１】
８．インヒビターの効率的結合のためにワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）を改変する
十番目の特徴では、以下の工程を含む、Ｅ２ ＴＡＤインヒビターの特定または性状決定に有用なＥ２タンパク質の製造方法が提供される：
ａ）上記に示したＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌ結晶構造を用いて、ＨＰＶインヒビター結合ポケット残基を特定し；
ｂ）前記ＨＰＶインヒビター結合ポケット残基をワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）のタンパク質残基と比較し；
ｃ）前記ＣＲＰＶ残基を前記ＨＰＶ残基に変異させてハイブリッドを作製し；さらに
ｄ）前記ハイブリッドをインヒビターによる抑制についてテストする。
実験用ウサギのワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）による感染またはＣＲＰＶゲノムのこれらウサギの皮膚への導入によって大きないぼの増殖がもたらされる。ＣＲＰＶモデル系は有望な抗ＨＰＶ治療の評価に用いられてきた（J.W. Kreider et al. (1992) “Preclinical system for evaluating topical podofilox treatment of papillomas: dose response and duration of growth prior to treatment “, J. Invest. Dermatol. 99:813-818）。前記は、Ｅ２結合−ＨＰＶＤＮＡ複製インヒビターのin vivo有効性の検査のために便利なシステムであると考えられよう。しかしながら、ＣＲＰＶおよびＨＰＶＥ２タンパク質はわずかに３９％の配列同一性を共有するだけであり、ＨＰＶタンパク質に結合するインヒビターはＣＲＰＶＥ２に結合しないかもしれない。
本明細書に述べたＨＰＶ Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビターの結晶構造を用いて、ＨＰＶインヒビター結合ポケットのメンバーであり、ＣＲＰＶタンパク質では相違する残基を特定することができる。続いて対応するＣＲＰＶ残基をＨＰＶの対応する残基に変異させることができる。Ｅ２タンパク質を生成させるために、得られたハイブリッドをハイブリッド遺伝子のin vitro翻訳によってテストし、前記Ｅ２タンパク質をin vitroアッセイ（例えばＥ２依存Ｅ１−ＤＮＡ結合アッセイ）で調べることができる（実施例６参照）。ハイブリッドタンパク質が前記アッセイで機能を示し、ＨＰＶインヒビターに感受性を示すことが証明された場合は、前記対応する遺伝子を用いてウサギでのいぼの増殖を誘発することができる。前記の方法により生じたいぼは、初めにＨＰＶＥ２を標的としていたインヒビターによって治療可能であるはずである。したがって、ＨＰＶＴＡＤインヒビター複合体の分析によって生じた前記ハイブリッドモデルは、動物モデルでＨＰＶ化合物複合体に用いることができる。この技術はまた他のパピローマウイルス、例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）（ただしこれに限定されない）にも応用できる。
本発明のさらに完全な理解のために以下の実施例で説明する。これらの実施例は説明を目的としており、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００３２】
実施例
実施例１：ＨＰＶ−11Ｅ２ ＴＡＤの発現と精製
Ｈｉｓタグ付加ＨＰＶ−11Ｅ２トランスアクチベーションドメインの発現：ＨＰＶ−11Ｅ２（配列番号２）のアミノ酸２−201をプラスミドpCR3-E2（Titolo, 1999）から以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させた：５’−CAA GAC GTG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAA GCA ATA GCC AAG −３’（センス）（配列番号３）および５’−CAC CAA GTG GAT CCG CTA GCT TAG CTA GAT ACA GAT GCA GGA−３’（アンチセンス）（配列番号４）。前記ＰＣＲ生成物をNcoIおよびBamHIを用いて消化し、さらに同じように消化したプラスミドpET-28bに連結した。前記連結生成物でマックスエフィシェンシー（MAX Efficiency（登録商標））コンピテントＤＨ５α大腸菌（LifeTechnologies）を形質転換させた。Ｈｉｓタグ付加ＨＰＶ11Ｅ２ ＴＡＤ（His−TAD）をコードするリコンビナントプラスミドを形質転換ＤＨ５αの培養から単離し、Ｅ２ ＴＡＤのＤＮＡ配列は正確であることを立証した。続いて前記単離プラスミドで大腸菌株BL21(DE3)pLysS（Novagen）を形質転換させた。
Ｅ２トランスアクチベーションドメインのＣ−末端に配置されるさらに４つのリジンをコードする第二の構築物（Ｌｙｓテール付加ＴＡＤ）を以下のプライマーを用いてＰＣＲによって作製した：５’−GGG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAA GCA ATA GCC AAG CGT TTA G−３’（センスプライマー）（配列番号５）および５’−CCC CGG ATC CTC ATT ACT TTT TCT TTT TGC TAG ATA CAG ATG CAG GAG AAC−３’（アンチセンスプライマー）（配列番号６）。このＰＣＲ生成物を上記のように消化し、プラスミドpET15bに連結した。ＨＰＶ11Ｅ２のアミノ酸２−201をコードするＤＮＡ配列が正確であることを立証し、このプラスミドで上記のように大腸菌株BL21(DE3)pLysSを形質転換した。
タンパク質の発現については、サークルグロー（CircleGrow）培養液（Bio101）（34μg/ｍLのクロラムフェニコールおよび50μg/ｍLのカナマイシン（His-TAD）または100μg/ｍLのアンピシリン（Lysテール付加TAD）を含む）に新鮮な一晩培養を１／２５容積で接種し、O.D.（600ｎｍ）が約1.0に達するまで細胞を37℃で増殖させた。続いて前記培養を22℃に移し、タンパク質の発現を0.5ｍMのＩＰＧＴを用いてO.D.（600nm）で誘発した。６時間後に細胞を遠心によって採集し、ドライアイス上で凍結させ−80℃で保存した。
【００３３】
Ｈｉｓタグ付加ＨＰＶ11ＴＡＤタンパク質の精製：精製方法は、Ｈｉｓタグ付加ＴＡＤおよびＬｙｓテール付加ＴＡＤタンパク質と同一であった。全工程は４℃で実施した。細胞を以下のプロテアーゼインヒビターを含む精製緩衝液（25mMトリス−HCl（pH8.0）、500mMのNaCl、５mMのTCEP）に５mL/gで再懸濁させた：ペプスタチン、ロイペプチンおよびアンチペイン（各５μg/ｍL）、フェニルメチルスルホニルフルオリド（１mM）およびペファブロック（Pefabloc（登録商標）；Roche、0.4ｍM）。前記懸濁物を超音波処理し、粗溶解物を26,000ｇで30分遠心した。上清を硫酸ニッケルで平衡化させた5ｍLのハイトラップキレートカラム（Hi-Trap, APB）に注入した。精製緩衝液＋０mMおよび25ｍMのイミダゾールで洗浄した後、ＴＡＤを100ｍＭのイミダゾールを含む精製緩衝液で溶出させた。ＴＡＤ含有分画をプールして５ｍＬ未満に濃縮し、続いて精製緩衝液＋0.1ｍＭのＥＤＴＡで平衡化させたスーパーデックス−75ゲルろ過カラム（APB）にロードした。純粋なＴＡＤを含有する分画をプールし、約５mg/mLに濃縮するか（Hisタグ付加TAD）または12mg/mLに濃縮した（Lysテール付加TAD）。濃縮タンパク質を分注し、ドライアイス上で凍結して−80℃で保存した。
【００３４】
セレノメチオニンを含むＨｉｓ−ＴＡＤの発現と精製：Ｈｉｓ−ＴＡＤをコードするプラスミドで大腸菌株Ｂ834（メチオニン栄養要求株）を形質転換した。単一細菌コロニーを、34μg/ｍLのクロラムフェニコールおよび50μg/mLのカナマイシンを含むＬＢ培養液中の一晩培養の接種に用いた。前記培養の一部分を、メチオニンを欠くＤＬ30培養液（D.M. LeMaster & R.M. Richards, Biochemistry (1985) 24:7263-68）で4000倍に希釈した。前記培養液には２μg/ｍLのビオチンおよびチアミン、並びに５０μg/mLのＤ，Ｌ−セレノメチオニン並びに同じ抗生物質が補充された。3７℃で26時間後に培養は0.8の密度（O.D. 600ｎm）に達し、発現は0.5ｍMのＩＰＴＧで23℃で誘発した。約７時間後に細胞を採集し上記に述べたように保存した。精製はＨｉｓ−ＴＡＤについて上記に述べたように実施したが、ただし精製緩衝液は使用前にヘリウムでパージし、Ｈｉｓ−ＴＡＤは、50および100mMのイミダゾールで洗浄後、200ｍMのイミダゾールで溶出させた。
【００３５】
実施例２：化合物Ｌの合成および精製
【００３６】
【化３】
2005512954.tif 000007
【００３７】
５−メチル１，３−インダンジオン（Ａ）
メタノール（79ｍL）中の４−メチルフタル酸無水物（25.65g，158.2mmol）の懸濁物に室温でナトリウムメトキシド（69ｍLの25重量％溶液、316mmol）を添加した。30分後に反応混合物を水で希釈し、水層をＥｔ2Ｏで洗浄した。水層をＨＣｌ（4Ｎ）で酸性化し、Ｅｔ2Ｏで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、ろ過して減圧下で濃縮した。
粗残留物をアセトニトリル（79mL）に溶解して０℃に冷却した。得られた溶液にＤＢＵ（31.3ｇ，206mmol）およびヨードメタン（33.7g，237.3mmol）を連続して添加した。０℃で1時間後に、ヨードメタン（33.7g，237.3mmol）を添加し、反応物を室温に加温し、さらに1時間攪拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し，残留物をＥｔ2O（300mL）で希釈した。前記エーテル溶液を塩酸（４Ｎ，100mL）、ＮａＯＨ（10％）およびブラインで連続して洗浄し、乾燥させて（ＭｇＳＯ4）ろ過し、さらに濃縮乾燥させた。得られた残留物をジアゾメタンのエーテル溶液で処理してエステル化を完了させ、その後乾燥させて４−メチルジメチルフタレート（22.2g，収量67％）を青黄色の油として得た。
酢酸エチル（107mL）中の粗４−メチルジメチルフタレート（22.20g，106.6mmol）の溶液に水素化ナトリウム（97％，3.84g，160mmol）を添加した。得られた懸濁物を加熱して4.5時間還流させ、続いて室温に冷却し、Ｅｔ2Ｏ（100mL）を添加して黄色の沈殿物を得た。前記黄色の固体をろ過し、エチルアルコール／ジエチルエーテル（1/1）の混合物で２回洗浄した。
この黄色固体を続いてＨＣｌ（４Ｎ，100mL）に溶解し、過熱して３０分還流した。冷却後ＥｔＯＡｃを添加し、有機層を分離しブラインで洗浄し、乾燥させて（ＭｇＳＯ4）ろ過し、濃縮して５-メチル１，３−インダンジオンを黄色の固体（3.7g，収量22％）として得た。
【００３８】
工程ａ：
エタノール（13ｍL）中の５−メチルインダン−１，３−ジオン（Ａ）（410mg，2.6mmol）の溶液に３，４−ジクロロベンゾアルデヒド（Ｂ）（493mg，2.8mmol）を加え、続いてピペリジン（１滴）を添加した。反応混合物を加熱して30分還流した。冷却後、前記反応混合物に過酸化水素水（30％，0.87mL，7.7mmol）およびＤＢＵ（97mg，0.6mmol）を添加した。30分攪拌を継続し、続いてヘキサン（５mL）を添加し、沈殿物をろ過した。得られた固体をプロパノール／ヘキサン（1/1）の混合物で２回粉末化し、強真空下で乾燥させて３−（３，４−ジクロロフェニル）−スピロ（オキシラン−２，２’−［５−メチル−インダン］）−１’，３’−ジオン（D）（701mg，収量82％）を得た。
工程ｃ：
３−（３，４−ジクロロフェニル）−スピロ（オキシラン−２，２’−［５−メチル−インダン］）−１’，３’−ジオン（D）（200mg，0.8mmol）および１−（４−［１，２，３］−チアゾール−４イル−フェニル）−ピロール−２，５−ジオン（ｅ）（155mg，0.6mmol）のトルエン（4.6ｍL）中の混合物を加熱して１６時間還流した。冷却および濃縮後、残留物をＥｔＯＡｃで粉末化して２つの化合物Ｆ／Ｇの混合物（cis／cis異性ラセミ体、228mg，収量60％）を得た。
工程ｄ：
ＣＨ3ＣＮ（36mL）中の化合物Ｆ／Ｇの溶液に、ＮａＯＨ（0.02Ｎ，17.8mL，0.36mmol）を、注射筒ポンプを用いて１時間かけて添加した。添加が完了した後、反応混合物をさらに１時間攪拌した。続いて、前記溶液を凍結乾燥させてラセミ化合物Ｊ／Ｋ（227mg，定量的収量）を得た。キラルカラム（キラセルOD，イソクラテイック溶離液は0.06％のＴＦＡを含む65％ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ；205nmのＵＶランプ：流速７mL/分）を用いて、純粋な鏡像体Ｌを調製用ＨＰＬＣによる分割で得た。所望の分画を一まとめにし，凍結乾燥させた。対応するナトリウム塩は、アセトニトリル中でＮａＯＨ（0.02Ｎ，１当量）で処理し、続いて凍結乾燥して白色の固体としてナトリウム塩（15mg）を得ることによって製造した。
Ｌ：1Ｈ−ＮＭＲ（400ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6）δ10.35（ｓ，１Ｈ），8.40（ｄ，Ｊ＝8.6Ｈｚ，２Ｈ），7.89−7.80（ｍ，３Ｈ），7.64（ｍ，３Ｈ），7.52（ｄ，Ｊ＝8.3Ｈｚ，１Ｈ），7.51−7.34（ｍ，１Ｈ），5.75（ｓ，１Ｈ），4.19（ｍ，１Ｈ），3.78（ｍ，１Ｈ），2.57（ｓ，３Ｈ）；ＥＳＭＳｍ／ｚ606（ＭＨ＋）．
前記化合物の抑制活性は実施例6に記載した酵素アッセイにしたがって判定し、180nM
のＩＣ50を有すると決定された。インヒビターの選択性は、実施例７に記載したＳＶ４０の大型Ｔ抗原アッセイでは活性を欠くことによって実証された。
【００３９】
実施例３：Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体の形成
インヒビターＬの粉末を100％ＤＭＳＯ中で60mMの濃度で溶解させた。前記タンパク質溶液は精製緩衝液中の10mg/mLのＥ２ ＴＡＤから成っていた（精製緩衝液：25mMトリス−HCｌ（pH8.0），500ｍMのＮａＣｌ，５mMのＴＣＥＰ，0.1ｍMのＥＤＴＡ）。Ｅ２ ＴＡＤ−Ｌの複合体は、74μLのタンパク質溶液中に１μLのインヒビターＬを混合して作製した。結晶化実験を実施する前に前記溶液を４℃で２−３時間維持した。
実施例４：結晶化およびデータの収集
アポＥ２ ＴＡＤおよびＥ２ ＴＡＤ−Ｌ複合体の結晶化は、懸垂滴蒸気拡散技術（A. McPherson, Preparation and Analysis of Protein Crystals, Krieger Pub. 1989）を用いてＶＤＸ結晶化プレート（Hamton Research, Laguna Niguel, California）で実施した。
特にアポＨＰＶ−11Ｅ２ ＴＡＤの場合：Ｓｅ−Ｅ２ ＴＡＤ溶液１μL（精製緩衝液中に５mg/mL）を以下を含む溶液１μLと混合した：0.1Ｍのコハク酸ナトリウム（pH5.0）、18％のＰＥＧ5000mmeおよび0.2Ｍの硫酸アンモニウム。得られた２μLの液滴を、以下を含む１mLのレザバー溶液上に懸垂した：0.1Ｍのコハク酸ナトリウム（pH5.0）、18％のＰＥＧ5000mmeおよび0.2Ｍの硫酸アンモニウム。４℃で得られた結晶は、空間群C222に属し、単位胞寸法がａ＝54.9Å、ｂ＝169.9Åおよびｃ＝46.1Åであり、不整単位につき１つの分子を含んでいた。
回折データは、ビームラインＸ４ａ（NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York）により採集した。４つのデータセットを、セレニウム吸収端近くの４つの異なるｘ線波長（0.9790Å、0.9794Å、0.9743Å、および0.9879Å）で100Ｋに冷却した単一結晶から集めた。画像はＡＤＳＣＱ４ＣＣＤにより採集し、最大解像は2.4Åであった。
複合体の結晶化の場合：実施例３で述べた複合体溶液１μLを、以下を含む溶液１μLと混合した：0.1MのＭＥＳ（pH5.5）および35％ＭＰＤ（メチルペンタンジオール）。得られた液滴を、以下を含む１mLのレザバー溶液上に懸垂した：0.1MのＭＥＳ（pH5.5）、35％ＭＰＤ。続いてプレートを４℃に保存した。得られた結晶は、ａ＝ｂ＝60.7Åでｃ＝82.5Åの単位胞寸法をもつ空間群Ｐ４（１）に属し、さらに不整単位につき１つの分子を含んでいた。
初期回折データは、Ｒ−軸IIイメージプレートエリア検出装置（Molecular Structure Corp. Texas）を搭載したホームソースＸ線発生装置（Rigaku, Japan）を用いて測定された。3.15Åの解像データを100Ｋに冷却した複合体の単一結晶から集めた。
続いて、高解像回折データをビームラインＸ25（NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York）により採集した。回折画像は、カッパ軸ゴニオメーター（Enraf-Nonius, The Netherlands）搭載ブランデイス（Brandeis）Ｂ４検出装置（Brandeis University）により収集した。2.4Åの解像度の完全なデータセットが100Ｋに冷却した複合体の単一結晶から収集された（図９に提示）。
【００４０】
実施例５：フェージング、モデル構築および改良
アポ結晶データのフェージングは、プログラムＭＬＰＨＡＲＥ（Collaborative Computational Project, #4, 1994, The CCP4 suite: programs for Protein Crystallography, Acta Cryst. D50, 760-763）を用いて、ＭＡＤ（マルチ波長異常分散）によって実施した。
複合体結晶の場合、分子置換（ＭＲ）法を回折データフェーズの初期概算に用いた。Ｓｅ−Ｅ２ ＴＡＤのアポ構造をモデルとして用いた。回転および転換検索をプログラムＡＭＯＲＥ（Collaborative Computational Project, #4, 1994, The CCP4 suite: programs for Protein Crystallography, Acta Cryst. D50, 760-763）を用いて実施した。
電子密度マップへのモデルの構築はソフトＯ（Alwyn Jones, Upsala University, Sweden）を用いて実施し、モデルの改良はソフトＣＮＸ（Molecular Simulation Inc., San Diego, California）を用いて実施した。続いてこの新しいモデルを、電子密度マップ計算、モデル再構築およびモデル改良工程を含むサイクリング法によって改良した。最終的モデルはＥ２ ＴＡＤの残基２から196および２つのインヒビターＬ分子を含む。もっとも新しい結晶学Ｒ因子は24.6％であり、Ｒfree因子は29.3％である。
【００４１】
実施例６：Ｅ２依存Ｅ１複製起点結合アッセイ
本アッセイは、文献（McKay, 1981, J. Mol. Biol. 145:471）に記載されたＳＶ40Ｔ抗原のための類似のアッセイをモデルにして作製した。400ｂｐの放射能標識ＤＮＡプローブ（ＨＰＶ−11の複製起点を含む（Chiang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5799））を、鋳型として複製起点（固有BAMH1部位内のHPV-11ゲノムのヌクレオチド7886−61）をコードするプラスミドpBluescript（登録商標）ＳＫおよび前記複製起点に側面を接するプライマーを用いてＰＣＲによって作製した。放射能標識は［33Ｐ］ｄＣＴＰとして取り込ませた。結合アッセイ緩衝液は以下から成る：20mMのトリス（pH7.6）、100ｍMのＮａＣｌ、１mMのＤＴＴ、１mMのＥＤＴＡ。
用いた他の試薬は、プロテインＡ−ＳＰＡビーズ（タイプII、Amersham）およびＫ72ウサギポリクローナル抗血清（ＨＰＶ−11Ｅ１のＣ−末端14アミノ酸に対応するペプチドに対して作製）である。アマーシャム（Amersham）のプロトコルにしたがって、一ビンのビーズを25mLの結合アッセイ緩衝液と混合した。アッセイでは、飽和量のＫ72抗血清をビーズに添加し、前記混合物を1時間インキュベートし、１容の結合アッセイ緩衝液で洗浄し、続いて同じ容積の新しい結合緩衝液に再懸濁した。結合反応物には、８ngのＥ２、バキュロウイルス感染細胞から発現されたＥ１含有核抽出物の約100−200ng（WO99/57283で報告）、および0.4ngの放射能標識プローブが総容積80μLの結合アッセイ緩衝液に含まれていた。室温で１時間後に、25μLのＫ72抗体−ＳＰＡビーズ懸濁物を前記結合反応物に添加し混合した。さらに室温で１時間インキュベートした後、反応物を簡単に遠心してビーズを沈澱させ、複合体生成の程度をパッカードトップカウント（Packard TopCount（登録商標））によりシンチレーション計測で決定した。典型的には、Ｅ１およびＥ２を含む反応物のシグナルは、Ｅ１、Ｅ２またはその両者が除かれた場合に観察されるバックグラウンドより20−30倍高かった。
【００４２】
実施例７：ＳＶ40Ｔ抗原−ＤＮＡ結合アッセイ
本アッセイはＳＶ40Ｔ抗原（ＴＡｇ）−複製起点複合体の形成を測定する。前記アッセイはR.D.G. McKay（J. Mol. Biol. (1981), 145:471-488）によって確立された。基本的には、前記はＥ２依存Ｅ１−ＤＮＡ結合アッセイ（実施例６）に非常に類似し、ＴＡｇがＥ１およびＥ２に置き換えられ、放射能標識ＳＶ40複製起点プローブがＨＰＶ複製起点プローブに置き換えられている。ＴＡｇはＥ１およびＥ２と機能的相同性を共有するが配列類似性はきわめて低いので、本アッセイは実施例6のアッセイの副スクリーニングとして用いられる。
放射能標識した複製起点含有ＤＮＡプローブを、鋳型としてpCH110プラスミド（Pharmacia）を用いてＰＣＲで作製した。前記鋳型はＳＶ40の最小複製起点（ヌクレオチド7089−7023）をコードする。プライマーは以下のとおりである：“sv40-6958センス”＝５’−GCC CCT AAC TCC GCC CAT CCC GC（配列番号７）、および“sv40-206アンチ”＝５’−ACC AGA CCG CCA CGG CTT ACG GC（配列番号８）。ＰＣＲ生成物は長さが約370塩基対で、100μLのＰＣＲ反応物につき50μCiのｄＣＴＰ（α−33Ｐ）を用いて標識した。ＰＣＲ反応に続いて、キアゲン（Qiagen（登録商標））ＰＣＲ精製キットまたはフェノール抽出／エタノール沈澱法のいずれかを用いて生成物を精製した。前記精製した生成物をＴＥで1.5ng/μL（ゲル電気泳動で概算）に希釈した。新鮮な調製物は約150,000cpm/μLを示した。
結合反応は、30μLのＴＡｇ溶液（100ng/ウェル）、200ngの33Ｐ放射能標識ＤＮＡプローブおよび7.5μＬの10ｘＤＮＡ結合緩衝液（200mMのトリス−HCｌ（pH7.6）、100mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、10mMのＤＴＴ）を75μLの最終容積中で混合して実施した。結合反応は室温で60分間進行させた。大型Ｔ抗原：2.0mg/mL（Chimerxから購入）。
タンパク質−ＤＮＡ複合体は、プロテインＡ−ＳＰＡビーズに結合させたα−ＴＡｇモノクローナル抗体（PAb 101、サブタイプIgG2a、ハイブリドーマはATCCから入手、抗体は当施設内で精製）を用いて免疫学的に捕捉した。
タンパク質−ＤＮＡ複合体の免疫沈澱は室温で1時間実施した。プレートを簡単に遠心し、沈澱した放射能標識ＤＮＡフラグメントをトップカウント（TopCount（登録商標））計測装置で計測した。
【００４３】
考察
図２はＨＰＶ−16のＥ２ ＴＡＤの結晶構造モデルを示している（Antson et al., 2000, Nature, 403:805-809）。図５に示すように、このモデルの結合ポケット領域の拡大図は、アミノ酸Ｙ32、Ｗ33およびＬ94は、適切なポケットを形成するには小さいが、小分子インヒビターを収容するために前記アミノ酸の側鎖を相当に調節することなく小分子インヒビターがその内部と結合することが可能な空洞を形成することを示している。
対応するＨＰＶ−11Ｅ２ ＴＡＤドメインを結晶化してモデルを作製したときでも、前記対応するアミノ酸は再び、どのようなポケットも形成するには小さすぎるが、インヒビター結合に適した標的とみなすことができる空洞を形成することを示した（図６Ａ）。図６Ｂに示したように、本発明は初めて、新しいＥ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体の結晶構造が、ＨＰＶＤＮＡ複製過程の有望なインヒビターを特定する唯一のツールを構成する新規で予期せぬインヒビター結合ポケットを提供することを示した。
驚くべきことに、Ｅ２ ＴＡＤ−インヒビター複合体の構造は、インヒビターＬの結合が19位のチロシンの側鎖の移動を誘発することを示した（図７）。この位置で、前記芳香環は、アポ構造で認められる小さな空洞から顕著な態様で回転し、深い空洞を形成する。チロシン19の側鎖の移動によって、全ての原子について1.959Åのｒｍｓ偏差が生じる。この偏差が巨大な移動を構成することは当業者には理解されよう。そのような移動がそれ自身でも、または小分子インヒビターの存在下でも発生することは予測できなかったであろう。
さらにまた、ヒスチジン32のイミダゾール環は90度回転してインヒビターを収容するが、なお深い空洞の一部分であり続ける。ヒスチジン32の主鎖の移動は全ての原子について0.704Åのｒｍｓ偏差を与える。これら２つの回転移動はいずれも発生することが予測されず、結合ポケット内にこの深い空洞の形成をもたらすことは予期されなかった。
図６Ａに示したように、前記深い空洞はヒスチジン32、トリプトファン33およびロイシン94によってその境界が定められる。これら３つのアミノ酸残基の“全ての原子”のｒｍｓｄの置き換えは0.515Åである。前記のｒｍｓは、結合ポケットの場合にこれら残基の天然の可撓性によっては説明できない。実際、1.0Åのｒｍｓ偏差が200アミノ酸を含む完全なタンパク質の場合の正常範囲内と考えられる。この場合は、Antson（前掲書）のＨＰＶ−16アポＥ２ ＴＡＤと本出願人のＨＰＶ−11アポＥ２ ＴＡＤとの間のＨ32、Ｗ33およびＬ94の全ての原子についてのｒｍｓ偏差は0.212Åである。これは、前記3つの残基が協調して移動することができる予想可能な（上）限界を示している。本発明は、これら３つの残基の予測可能な移動の範囲を越えている。
セリン98は、Ｈ32、Ｗ33およびＬ94と同じ平面上に存在せず、前記は、Ｈ32、Ｗ33およびＬ94によって形成される深い空洞、並びにＬ15、Ｉ36、Ｅ39、Ｋ68、Ｎ71、Ａ72、Ｓ98およびＹ99から選択される１つまたは２つ以上のアミノ酸によって決定される浅い空洞を含むより大きなポケットのモデルを作製するためにまた用いることができるより浅い方の部分の一部分を形成する（図８参照）。
図９は、モデル作製のために用いることができるタンパク質−インヒビター複合体のＸ線座標リストである。これらの座標から明らかなことは、本出願人によって得られた複合体は２つのインヒビター分子を含むが、前記モデルは第二のインヒビターは深い空洞の外側に存在し、タンパク質とは顕著な態様では相互作用しないことを示しているということである。さらにまた、以下のアミノ酸は、ｘ−線からそれらを見えなくする高い可撓性のためにアラニンとしてモデルが作製されている：Ｅ２、Ｋ107、Ｋ173、Ｓ180、Ｍ182、Ｈ183およびＰ196。
Harris & Botchan（Science (1999), 284(5420):1673）によれば、種々のＥ２タンパク質は平均してわずかに30％のアミノ酸配列同一性を有するだけである。しかしながら、突然変異による分析で、種々のＥ２ ＴＡＤが共通の折り畳みおよび作用メカニズムを共有することが示唆された。この最後の記述に合致して、本出願人が明らかにしたインヒビター結合ポケットの範囲を定める前記アミノ酸クラスターは、低リスクと高リスクＨＰＶの間でさえも驚くべき高さの同一性／類似性を共有する（図10）。明らかにされた最初のクラスターは、ポケット領域から移動し、それによって深い空洞を開放するアミノ酸Ｙ19の側鎖を含む。このアミノ酸は種々のＨＰＶ型の間で高度に保存され、ＨＰＶ−６、11、16および18では100％の同一性を有する。第二のクラスターは、ポケットの深い空洞を形成するヒスチジン32およびトリプトファン33を含む。ヒスチジン32はＨＰＶ−16と11間で同一であり、低リスクおよび高リスクＨＰＶ間で強い類似性を有する。一方、トリプトファン33は４つの型間で100％同一である。最後に、四番目のクラスターは、またポケットの深い空洞を形成するロイシン94を含み、前記は４つのＨＰＶ型で１００％保存されている。
深いポケットの底部を形成するとき、Ｈ29はＨＰＶ−６、11および16で同一であり、ＨＰＶ−18で類似している。同様に、Ｔ97はＨＰＶ−６、11および18で同一であり、ＨＰＶ−16で類似している。
ポケットの浅い空洞を形成するとき、アミノ酸Ｌ15は明らかにされた最初のクラスターの一部分であり、低リスクおよび高リスクＨＰＶ間で高度に類似している。第二のクラスター内では、Ｉ36もまた高度に類似し、一方、Ｅ39は４つの型の全てで高度に保存されている。第三のクラスターは、結合ポケットの浅い空洞に並んでいることが示され、そこではＫ68およびＮ72は両方とも全型を通して高度に保存されている。最後にＮ71はＨＰＶ−６および11の間で同一であり、高リスク型では類似している。前記浅いポケットはさらに第四のクラスターのアミノ酸、例えばＳ98およびＹ99を含み、これらもまた種々の型のＨＰＶ間で高度に類似している。
前記高度な同一性／類似性は、本発明のＨＰＶ−11Ｅ２ ＴＡＤで示したように前記ポケットはまた他の型のＨＰＶ（低リスクであれ高リスクであれ）でも見出されるであろうということを強く示している。図９のデータを用いてモデルを作製したように、おそらくこのポケット、特にこの深い空洞に結合するインヒビターは、広範囲のパピローマウイルスに由来するＥ２タンパク質と結合／抑制する高い確率を有するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１−Ａ】図１Ａは、Sakaiら（J. Virol. (1996) 70:1602-11）によって得られたＨＰＶ−11のＥ２トランスアクチベーションドメイン（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。
【図１−Ｂ】図1Ｂは、実施例１の方法にしたがって得られたＨＰＶ−11のＥ２トランスアクチベーションドメイン（配列番号２）のアミノ酸配列を示す。
【図１】図２は、Antsonら（上掲書）が記載したＨＰＶ−16アポ−Ｅ２の立体リボンの模式図を示す。
【図３】図３は、本出願人が作製したＨＰＶ−11のアポ−Ｅ2の立体リボンの模式図を示す。
【図４】図４は、本明細書に記載した化合物Ｌと複合体を形成したＨＰＶ−11Ｅ２の立体リボンの模式図を示す。
【図５】図５は、ＨＰＶ−16アポ−Ｅ２ ＴＡＤ（Antson et al., 上掲書）のインヒビター結合ポケットの溶媒がアクセスできる表面を示す。
【図６−Ａ】図６Ａは、本出願人が作製したＨＰＶ−11アポ−Ｅ２のインヒビター結合ポケットの溶媒がアクセスできる表面を示す。
【図６−Ｂ】図６Ｂは、共結晶のインヒビター結合ポケットの溶媒がアクセスできる表面を示す。
【図７】図７は、インヒビターの結合に際して生じるＹ19およびＨ32の移動の模式図を示す。
【図８】図８は、特に深い空洞と浅い空洞を示すポケットの溶媒がアクセスできる上面図を示す。
【図９】図９は、化合物ＬとのＥ２ ＴＡＤ複合体（以下ではＨＰＶ ＴＡＤ Ｅ２−Ｌと称する）の共結晶からＸ線回折によって得られた、前記複合体の原子構造座標のリストである。前記複合体の調製は実施例３に記載されている。以下の用語は以下の意味を有する：ＡＡという用語はアミノ酸を指し、前記はこの欄内の各座標によって特定される；“ＣＰＲ”という用語はcis−プロリンを指す；ＢＬＨＡ＝インヒビターＬの第一の分子；ＢＬＨＢ＝インヒビターＬの第二の分子。鎖Ａのアミノ酸197から201に関する情報は、それらをｘ−線から見えなくさせているこれら残基の高い可撓性のために欠けている。同じ理由から、以下のアミノ酸はアラニンとして作製されている：Ｅ２、Ｋ107、Ｋ173、Ｓ180、Ｍ182、Ｈ183およびＰ196．“Ｘ、Ｙ、Ｚ”は、結晶学的にデカルト座標空間内で各原子について決定される原子の位置を示す。“Ｏｃｃ”は、各原子が座標によって特定される位置を占有する分子の割合を示す占有係数である。値“１”は、各原子が結晶の全ての分子において同じ構成（例えば同じ位置）を有することを示す。“Ｂ”は、その原子中心の周囲の原子の移動を測定する熱係数である。深い空洞を形成する残基の座標は太字で示されている。
【図１０】図１０は、ＨＰＶ−６Ａ、ＨＰＶ−11、ＨＰＶ−16およびＨＰＶ−18のＥ２トランスアクチベーションドメインのインヒビター結合ポケット領域を一般的に決定するアミノ酸配列クラスターのアラインメントを示す。太字の残基は、それらがインヒビター結合ポケットの深い空洞の境界を定めることを示している。一重下線は前記深い空洞の底部の残基を示し、二重下線は浅いポケットの残基を示している。Ｙ19はイタリック体で示されている。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図９−１４】
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【図９−１５】
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【図９−１６】
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【図９−１７】
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【図９−１８】
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【図９−１９】
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【図９−２０】
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【図９−２１】
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【図９−２２】
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【図９−２３】
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【図９−２４】
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【図９−２５】
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【図９−２６】
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【図９−２７】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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