(57)【要約】【課題】ヒト骨組織工学において、完全に経済的にかつ効率的に、腫瘍、炎症もしくは外傷による骨組織への欠損の修復またヒト骨の整形外科手術に用いることのできる、有機溶媒とは無縁で、三次元構造及び外部解剖学的構造を有する足場を提供する。【解決手段】複合材料で作製された足場および生体医療工学の分野におけるそれらの使用が開示され、ここで、それらの複合材料はヒト骨組織を再生するように誘導することができる生理活性微粒子を含む。これらの足場はケイ素、カルシウム、およびリン微粒子の組合せを、ヒト骨芽細胞を増殖および分化するように活発に誘導し、新しい骨の形成および石灰化を促進することができる生理活性物質として用いる。さらに、これらの足場は有機ポリマーを担体として用い、三次元構造および外部解剖学的形状をとり、かつ骨の再生および血管の新生に適合する幾つかの特徴を示し、それにより骨組織の修復およびヒト骨の整形外科手術において安全に、経済的に、および効率的に用いることができる。本発明はこれらの足場の調製方法も開示する。【選択図】図３
2005506114.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理活性誘導物質としてのケイ素含有無機元素微粒子、および担体としての有機ポリマーを含み、かつ微細孔および連結チャンネルを含む三次元構造を有する、ヒト骨組織工学のための足場。
【請求項２】
無機元素微粒子が、さらにカルシウムまたはリンをケイ素の生物学的誘導効果を相乗的に増強する補助物質として含む、請求項１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項３】
無機元素ケイ素微粒子が主要生理活性誘導物質として足場に用いられ、無機元素カルシウムおよびリン微粒子がケイ素の生物学的誘導効果を相乗的に増強する補助物質として用いられ、並びにケイ素／カルシウム／リン微粒子の組合せが生理活性物質として骨再生を誘導するための足場において用いられる、請求項２のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項４】
微粒子がケイ素微粒子、カルシウム微粒子、およびリン微粒子の混合物であるか、またはケイ素、カルシウムおよびリン元素の混合物の微粒子である、請求項１ないし３のいずれか１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項５】
微粒子の直径が１０ミクロン以下である、請求項１−４のいずれか１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項６】
微粒子の直径が１０００ｎｍ未満である、請求項５のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項７】
微粒子の直径が１００ｎｍ未満である、請求項６のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項８】
微粒子の直径が５ないし８０ｎｍである、請求項７のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項９】
微粒子における無機元素の原子含有率が６０−１００％ケイ素、０−３０％カルシウム、および０−２０％リンである、請求項１−８のいずれか１項のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１０】
微粒子における無機元素の原子含有率が６０−９０％ケイ素、０−２５％カルシウム、および０−１５％リンである、請求項９のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１１】
微粒子における無機元素の原子含有率が６０−７０％ケイ素、２０−２５％カルシウム、および１０−１５％リンである、請求項９のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１２】
担体としての有機ポリマーがポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、またはＰＬＡおよびＰＧＡの複合体（ＰＬＧＡ）からなる群より選択される、請求項１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１３】
活性成分としての微粒子の担体としての有機ポリマーに対する容積比が８０％：２０％ないし２０％：８０％である、請求項１２のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１４】
活性成分としての微粒子の担体としての有機ポリマーに対する容積比が７０％：３０％ないし３０％：７０％である、請求項１３のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１５】
微粒子の直径が１００ないし３００ミクロンである、請求項１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１６】
微粒子の占有率が５０％ないし９０％である、請求項１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１７】
連結チャンネルの直径が３５０ないし５００ミクロンである、請求項１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１８】
連結チャンネルの間の間隔が３ないし６ｍｍである、請求項１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項１９】
連結チャンネルおよび同心性微細孔が組合せ構造単位を形成する、請求項１のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項２０】
足場の形状がプレハブ型または解剖学的形態に合致するテイラーメイド型である、請求項１−１９のいずれか１項のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項２１】
プレハブ足場が球状形状、柱状形状、および四辺形形状からなる群より選択される形状を有し、プレハブ足場の直径が５ｍｍ未満であるときには微細孔のみが存在して連結チャンネルはなく、かつ微細孔の直径は０．５ｍｍないし５ｍｍの範囲で変化し、それに対して５ｍｍを上回るサイズを有するプレハブ足場は微細孔および連結チャンネルの両者を含む組立単位の集合である、請求項２０のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項２２】
テイラーメイド足場がテンプレートとしてのヒト骨欠損の解剖学的形態に従って設計された形状を有し、かつ連結チャンネルおよび同心性微細孔の両者を含む組立構造単位が集合した大容積足場である、請求項２０のヒト骨組織工学のための足場。
【請求項２３】
有機溶媒を用いない加熱型成型法である、請求項１−２２のいずれか１項のヒト骨組織工学のための足場の調製方法。
【請求項２４】
腫瘍、炎症または外傷によって生じた骨欠損の再生修復または整形外科手術への、請求項１−２２のいずれか１項のヒト骨組織工学のための足場の使用。
【請求項２５】
使用がヒト体内におけるイン・サイツ細胞移植またはイン・ビトロ増殖細胞の移植によって達成される、請求項２４の使用。
【請求項２６】
ヒト体内におけるイン・サイツ細胞移植が未分化間質細胞を含有する骨欠損の創傷領域への様々なサイズおよび形状を有するプレハブ足場の直接移植を含む、請求項２５の使用。
【請求項２７】
イン・ビトロ増殖細胞の移植が、該イン・ビトロ増殖自己骨芽細胞を大テイラーメイド足場に移植した後、該足場をヒト体内に移植することを含む、請求項２５の使用。
【請求項２８】
骨欠損の再生修復および整形外科手術において用いられるヒト骨組織工学のための足場の調製へのケイ素含有無機元素微粒子の使用。
【請求項２９】
無機元素微粒子がカルシウムおよび／またはリン微粒子をさらに含む、請求項２８の使用。
【請求項３０】
無機元素微粒子の直径が１０ミクロン以下である、請求項２８または２９の使用。
【請求項３１】
無機元素微粒子の直径が１０００ｎｍ未満である、請求項３０の使用。
【請求項３２】
無機元素微粒子の直径が１００ｎｍ未満である、請求項３１の使用。
【請求項３３】
無機元素微粒子の直径が５ないし８０ｎｍである、請求項３２の使用。
【請求項３４】
微粒子中の無機元素の原子含有率が６０−１００％ケイ素、０−３０％カルシウム、および０−２０％リンである、請求項２８−３３のいずれか１の使用。
【請求項３５】
微粒子中の無機元素の原子含有率が６０−９０％ケイ素、０−２５％カルシウム、および０−１５％リンである、請求項３４の使用。
【請求項３６】
微粒子中の無機元素の原子含有率が６０−７０％ケイ素、２０−２５％カルシウム、および１０−１５％リンである、請求項３５の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト骨組織工学のための複合材料製の足場、特には、ヒト骨組織の再生を誘導する能力を有する新規医用微粒子複合材料製の足場、その調製方法およびヒト骨組織工学へのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒト骨組織工学は、吸収性生物学的材料を自己骨組織の再生を誘導するための足場として用いるプロセスに関する。前記足場の生理化学的特性および三次元構造は骨組織の再生に直接影響を及ぼす鍵である。生物学的材料の分子適合性の基準に基づいて、ヒト身体用の移植装置または組織工学用の足場は安全でなければならず、細胞および分子レベルで関連ヒト組織の再生および関連生理学的機能の回復を誘導するための生理活性を有する（Chou, et al, J. Cell Sci., 1995, 108:1563-1573；Chou, et al, J. Biomed. Mater. Res., 1996, 31:209-217；Chou, et al, J. Biomed. Mater. Res., 1998, 33:437-445）。
【０００３】
従来技術においては、足場用の材料の組合せは、主として、天然コラーゲン、リン酸カルシウム、または有機ポリマーから選択される。天然コラーゲンは、よりコストが高く、より物理的特性に乏しく、疾患を伝播し易く、かつヒト身体において過敏性を誘導する潜在的な不都合を有する（Pachence and Kohn, Biodegradable polymers for tissue engineering in Principles in Tissue engineering, 1997, p273-293）。リン酸カルシウム（Kukubo, et al, J. Mater. Science, 1985, 20:2001-2004；Feinberg, et al, Shanghai Journal of Stomatology, 2000, 9:34-38 および 88-93）は伸縮性に劣る不都合を有し、かつヒト骨組織の再生を誘導する生理活性を示す（Chou, et al, Biomaterials, 1999, 20:977-985）。有機ポリマー、例えば、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（グリコール酸）（PGA）、またはPLAおよびPGAの複合体（PLGA）も幾つかの不都合を有する：前記ポリマーの分解から放出される酸性分解生成物はヒト身体内の組織において炎症反応および異質反応を誘導することがある。さらに、これらのポリマーは、ヒト骨組織の再生を誘導する生理活性を持たない（Hubel, Bio/Technology, 1995, 13(6):565-576；Thomson, et al, Polymer scaffolds processing in principles in Tissue Engineering, 1997, p273-293；Cao, et al, Plast Reconstr. Surg. 1997, 100:297-304；Minuth, et al, Cell Tissue Research, 1998, 291(1): 1-11；Wong Yulai, et al, Shanghai Journal of Stomatology, June 2000, 9(2):94-96）。従来技術においては、幾つかの生理活性タンパク質、例えば、細胞結合性タンパク質または骨誘導性タンパク質を非活性ポリマー足場上に移植する試みがなされている（Barrea, et al, Marcromolecules 1995, 28:425-432；Ugo and Reddi, Tissue engineering,
morphogenesis, and regeneration of the periodontal tissue by bone morphogenetic proteins,  1997）。しかしながら、これらの方法は、より高いコスト、移植タンパク質の不安定性および不均一性、並びに足場の滅菌の困難性のため、臨床的に実施することはほとんど不可能である。米国特許第５９７７２０４号は、有機ポリマーおよびバイオガラス（バイオセラミックス）を含む複合材料製の足場を開示する。前記バイオガラスは米国特許第４１０３００２号において最初に開示された。そこでは、前記材料とヒト骨組織との生体適合性を改善するのにケイ素、カルシウムおよびリンの組合せが用いられたが、骨組織の再生を誘導するためではなかった。実際、米国特許第５９７７２０４号および米国特許第４１０３００２号の両者は、骨組織の再生を誘導するケイ素の活性を明確に記述することもカルシウムおよびリンの相乗誘導効果に言及することもない。さらに、両特許に開示される材料はナトリウムを含む。しかしながら、ナトリウムには骨組織の再生に対する誘導活性はない。したがって、生体材料の分子適合性の原理によると、米国特許第５９７７２０４号において請求されるような足場には骨組織の再生を誘導する有意の生理活性はない。加えて、前記特許において開示されるようなプロセスは前記複合材料足場の調製において有機溶媒を用い、これはヒト身体に対する潜在的な細胞毒性を生じる可能性がある。米国特許第６０５１２４７号は、米国特許第４１０３００２号のバイオガラスおよび骨の欠陥の修復において有用な多糖（例えば、デキストラン）を含む複合材料を開示する。しかしながら、前記複合材料は単にペーストまたはパテを形成するのに用いられ、組織工学のための微細三次元構造および特定の圧力耐性を有する足場の調製には不適切である。さらに、前記複合材料のバイオガラスの組合せは骨組織の再生の誘導に対して不活性である。米国特許第５９７７２０４号、第４１０３００２号および第６０５１２４７号において用いられるバイオガラスは７０ミクロンを上回る平均粒子径（直径）を有する。複合材料の物理的特性はそのような大粒子によって明らかに冒され、そのような無機元素が足場の複合材料の分解間に均一に放出されることはあり得ない。米国特許第４１９２０２１号および第５０１７６２７号は有機ポリマーおよびリン酸カルシウムを含む複合材料を開示し、これは骨の欠陥を修復するための足場の調製に用いることができる。しかしながら、この複合材料は骨組織の再生の誘導に対しては不活性であり、前記足場について設計された微小空隙率および細孔径は移植および骨細胞の再生には適切ではない。米国特許第５５５２４５４号は、有機ポリマー粒子の表面上にリン酸カルシウムがコートされている複合材料を開示する。この設計には骨組織の再生に対する誘導効果がなく、組織工学用の足場の微細三次元構造を達成するのに用いることもできない。
【０００４】
ヒト骨組織工学用の足場の三次元構造は新しい骨における骨組織および血管の両者の再生に重要である。従来技術において、米国特許第５９７７２０４号、第４１９２０２１号、第５０１７６２７号および第５５５２４５４号は全て足場を均一な多孔性もしくは非多孔性形態として設計し、多孔性足場における細孔形状、細孔径および細孔分布は一様である。しかしながら、そのような類似の均一に分布した細孔を有する足場は骨組織再生には適切ではない。従来技術において開示されるそのような足場の使用の例において、足場の細孔の直径は１５０ないし４００ミクロンの範囲をとる。これは、ヒト細胞が足場の中心部分に侵入することを保証するのに十分な大きさではない。したがって、骨組織の再生は、単に、それらの足場を取り巻く２ないし３ｍｍで生じる。他の側面において、比較的大きな細孔径（４００ミクロン超）は骨組織の再生に適切ではない（Cartner and Mhiatt, Textbook of Histology, 1997；Tsuruga et al, J. Biochem., 1997, 121:317-324；Gauthier et al, J Biomed. Mat. Res., 1998, 40:48-56）。生体適合材料の分子適合性によると、足場の中心部分における血管の再生がそれらの足場における新しい骨の成長の鍵であり、血管は、一般に、４００ミクロンを上回る直径を有するチャンネルにおいてのみ形成される。したがって、従来技術における均一な細孔を有する足場が骨再生および血管再生の異なる要求を同時に満たすことはあり得ず、それ故、そのような足場の骨組織工学への実際の適用は限定される。
【０００５】
したがって、ヒト骨芽細胞の増殖および分化の誘導、新しい骨の形成および石灰化の促進、並びに細胞および分子レベルでの関連生理学的機能の回復に対して生理活性を有する、ヒト組織工学において有用な足場に対する多大な要求が従来技術において存在する。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５９７７２０４
【特許文献２】
米国特許第４１０３００２
【特許文献３】
米国特許第６０５１２４７
【特許文献４】
米国特許第４１９２０２１
【特許文献５】
米国特許第５０１７６２７
【特許文献６】
米国特許第５５５２４５４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の目的
本発明の目的は、有機溶媒とは無縁であり、かつ三次元構造および外部解剖学的構造を有する足場であって、生体適合材料の分子適合性における原理に基づいて有機溶媒を用いることなく加熱型成型法によって調製され、ケイ素、カルシウム、およびリンの微粒子の組合せで作製される複合粒子状材料を、ヒト骨芽細胞の増殖及び分化を活発に誘導し、かつ新しい骨の形成および石灰化を促進し得る足場の生理活性物質として、担体としての特定の割合の有機ポリマーと組み合わせて用い、前記複合材料が骨組織の再生の誘導に対する生理活性および所望の物理的特性を有する足場を提供することである。得られる足場は、ヒト骨組織工学において、安全に、経済的に、かつ効率的に、腫瘍、炎症もしくは外傷によって生じる骨組織の欠損の修復またはヒト骨の整形外科手術に用いることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
上記目的を達成するため、本発明の一側面は、微細孔および連結チャンネルの両者を備える三次元構造を有し、骨組織の再生の主要誘導性物質としての無機ケイ素微粒子、相乗誘導性物質としてのカルシウムおよび／またはリン微粒子、並びに担体のとしての有機ポリマーを含む、ヒト骨組織工学のための複合足場を提供することである。本発明の別の側面は、ヒト骨組織工学のための複合材料足場を調製するための方法であって、有機溶媒を用いることのない加熱型成型法を含む方法を提供することである。本発明のさらなる側面は、腫瘍、炎症もしくは外傷によって生じる骨組織の欠損の回復並びにヒト骨の整形外科手術における、細胞のインサイツ移植またはヒト身体においてイン・ビトロで予め増殖させた骨芽細胞の移植による、ヒト骨組織工学のための複合材料足場の使用を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト骨組織工学用の足場を調製するための化学的成分として有用な微粒子状要素を求める本発明者の長期的かつ熱心な研究に基づき、前記微粒子状要素はヒト骨組織の再生の誘導に対して生理活性を有し、自己分解性であり、かつイン・ビボで足場周囲の酸性またはアルカリ性物質を中和することが可能である。本発明者らは、ケイ素微粒子がヒト骨芽細胞の増殖および分化、骨の形成および石灰化を誘導する主要活性成分として用いられ；カルシウム微粒子が骨芽細胞の増殖および分化を相乗的に誘導する活性成分として用いられ；並びにカルシウムおよびリン微粒子が再生した骨の石灰化を相乗的に誘導する活性成分として用いられる、ヒト骨組織工学用の足場を自発的に開発した。これらの元素の組合せは生体毒性がなく、骨組織の再生の誘導に対して活性であり、かつイン・ビボで分解して新しい骨と置き換わることができる。したがって、組織工学におけるタンパク質製品の使用が回避され、生成コストが低下し、臨床実務における足場の安全性および有効性が増大する。本発明の足場の生理活性性組合せは米国特許第５９７７２０４号に開示される足場のバイオガラスとは異なり、本発明の生理活性性組合せはケイ素のみ、または主要成分としてのケイ素および特定の割合のカルシウムおよび／またはリンを含むが、ナトリウムとは無縁である。加えて、本発明におけるこれらの元素の粒子直径は従来技術のものとは異なる。したがって、本発明は、骨組織の再生のための新規化学物質およびそれらの組合せの割合の選択に関する。本発明は有機ポリマー、例えば、ＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡを前記ケイ素、カルシウム、リン微粒子の担体として用い、これは成形のために前記ケイ素、カルシウムおよびリン微粒子を連結させ、前記足場に圧力耐性を付与する。複合材料中のケイ素、カルシウム、およびリン微粒子は前記足場の生理活性成分として用いられ、したがって、前記足場は前記生理活性成分の貯蔵所として機能する。前記生理活性成分は、前記有機ポリマーがイン・ビボで分解するときに徐々に、連続的に、かつ均一に足場から放出されて骨の形成を誘導し、かつ前記有機ポリマーの酸性分解生成物を中和し、骨組織の再生に適する環境を提供する。したがって、本発明は、骨組織工学用の足場が生物学的誘導を欠き、かつ骨の大容積欠損の修復に用いることができないという、従来技術に横たわる問題に取り組む。
【００１０】
本発明においては、全ての無機元素は微粒子であり、これらは５０ミクロンを上回る直径を有する粒子の形態にある元素に関連する米国特許第５９７７７０４号とは異なる。他に述べられない限り、本発明の「微粒子」は１０ミクロン以下の直径を有する粒子、好ましくは１０００ｎｍ未満、より好ましくは１００ｎｍ未満、最も好ましくは５ないし８０ｎｍの直径を有するナノ粒子と定義される。本発明の範囲においては、１００ｎｍ超または１０ミクロン未満の直径を有するケイ素、カルシウムおよびリン微粒子も、それらも生物学的誘導効果を有するため、本発明の目的の達成に用いることができる。そのような粒子に存在する唯一の相違は、それが有する誘導効果はより弱いことであり、これはそれらがよりゆっくりと分解および拡散するためである。本発明において用いられる微粒子の直径は従来技術における骨組織工学用の足場の材料に用いられるものよりも明らかに小さい。さらに、本発明において用いられる微粒子の直径は、足場中の化学元素の均一な分布、それらの化学元素の足場からの均一な放出を助成し、足場の圧力耐性を改善することができる。
【００１１】
本発明においては、他に述べられない限り、「生理活性誘導性物質」は、特定の生理学的機能が達成されるように正常細胞を活発に刺激して特異的に増殖および分化させることができる物質と定義される。本発明のケイ素、カルシウムおよびリン元素は、正常ヒト骨芽細胞を活発に誘導して増殖させ、かつ骨芽細胞の一連の特定の生理学的機能（例えば、アルカリホスファターゼの生理活性、オステオカルシンの合成および分泌、並びに骨の石灰化）を刺激することができる生理活性誘導性物質である。従来技術における足場中の全ての無機元素の組合せには、本発明の組合せが有するものと同様の生物学的誘導活性はない。
【００１２】
本発明においては、他に述べられない限り、「ヒト組織工学のための足場」は、安全かつ生理活性であり、特定の期間内にイン・ビボで吸収され得る生体材料で作製されている、特定の三次元構造およびヒト骨における欠損領域の解剖学的形態と一致する形状を有する足場と定義される。そのような足場がイン・ビボで移植されるとき、それらは増殖および分化するのに好ましい環境条件を骨芽細胞に提供し、並びに足場における新しい骨の漸進的形成を促進し、一方で前記足場の枠材料はイン・ビボで徐々に吸収されて最終的に消失し、かつ前記足場の位置が新しい骨で置き換えられる。従来技術における全ての足場は本発明の足場のものに類似する特定の三次元構造を欠く。
【００１３】
本発明者らは、無機元素「ケイ素」を、ヒト骨組織工学において生理活性誘導効果を有する足場における主要活性成分として最初に立証し、かつ用いる。図１に示される正常ヒト骨芽細胞の実験データ（下記参照）は、細胞培養培地に添加されたケイ素イオンが新しい骨の形成における鍵生物学的指数、例えば、骨芽細胞の増殖、アルカリホスファターゼの生理活性、オステオカルシンの合成および分泌、並びに骨の石灰化等に対する有意の誘導および促進効果（２−４倍）を有することを立証する。図３に示される動物モデルに対するデータ（下記参照）は、さらに、無機元素ケイ素粒子がイン・ビボで移植された後に、無機ケイ素粒子が周囲の軟組織に拡散し、新しい骨の形成の早期段階（２週間）を特徴付けるイオウイオン濃度を高め、並びに成熟かつ緻密な骨の形成の後期段階（８週間）を特徴付けるカルシウムおよびリンイオン濃度の増加も誘導することを立証する。これらの証拠に基づき、本発明は最初に現状打破を達成し、すなわち、無機元素ケイ素の特定の生物学的誘導効果が確認され、元素ケイ素を骨組織工学のための足場において用いることができる。加えて、図１のデータは、ケイ素の濃度がそれらの生物学的誘導効果に直接比例し、かつケイ素の最大誘導効果がケイ素の飽和濃度（１００ｐｐｍ）で出現することを示す。
加えて、図１に示される実験のデータは、無機元素ケイ素および無機元素カルシウムおよびリンの組合せが、明らかに、正常ヒト骨芽細胞の増殖、オステオカルシンの合成および分泌、並びに骨の石灰化を促進する相乗効果を有することを立証する。したがって、本発明は無機元素カルシウムおよびリンを相乗性物質として用いてケイ素イオンの生理活性を補助する。
【００１４】
本発明においては、他に述べられない限り、全ての元素の組合せは、新しい骨組織の形成が積極かつ効率的に誘導されるように、ケイ素イオンを唯一の、または主要な生物学的誘導物質として用い、かつカルシウムおよび／またはリンを相乗的に活性の物質として用いる。好ましくは、「生物学的誘導物質として用いられる元素の組合せ」における原子含有物のパーセンテージは６０−１００％ケイ素、０−３０％カルシウム、および０−２０％リンであり；より好ましくは、６０−９０％ケイ素、０−に５％カルシウム、および０−１５％リンであり；並びに、最も好ましくは、６０−７０％ケイ素、２０−２５％カルシウム、および１０−１５％リンである。
【００１５】
前記生理活性複合材料におけるケイ素／カルシウム／リン微粒子は単一元素微粒子の全種類の混合物の形態にあるか、または全ての種類の元素を混合し、通常の物理的もしくは化学的方法によって乾燥粉砕することにより得られる。図１によると、微粒子混合物中または複合元素の微粒子中の原子の相対量は本発明の目的を達成するのに重要な要素ではなく、これは、異なる原子または重量比が単に異なるレベルの誘導活性を生じるためである。したがって、ケイ素が主要生理活性誘導物質として用いられ、かつカルシウムおよびリンが相乗的生理活性誘導物質として用いられる、これら３種類の元素の任意の原子または重量比を有する全ての組合せを本発明の足場のための生理活性物質として用いることができる。
【００１６】
無機元素ケイ素、カルシウムおよびリンはヒト骨組織の増殖、骨芽細胞の分化、並びに骨の石灰化を誘導し得る生理活性元素として定義される。これも生体材料分野における躍進である。従来技術においては、合成または抽出された外来性オステオゲニン、オーキシンまたはコネキシン等を生物学的誘導効果を有するものと考えているが、これらの生物学的生成物は安全性に乏しく、生理活性の安定性に劣り、かつコストが高く、したがって、生体工学において用いることはほとんど不可能である。上記に加えて、本発明の無機元素の組合せの誘導活性は、図３の動物モデルにおいて示されるような移植された材料と組織との界面での骨再生と放出されたケイ素イオンの分布との密接な関係、図２において示されるようなヒト正常骨芽細胞のモデルに対するものに加えて図７において示されるような動物モデルに対するケイ素／カルシウム／リン微粒子およびＰＬＧＡを含む複合材料の骨再生誘導効果によってさらに立証される。上述の理由で、無機元素ケイ素、カルシウムおよびリンを生理活性タンパク質の置換、および有意の生物学的誘導効果の達成に用いることができることが初めに立証される。さらに、これらの無機元素は、より低いコスト並びにより高い安全性および安定性で容易に調製することができる安全かつ安定な足場を得、並びにそれらの足場の実務的適用可能性が高まるように、ヒト骨組織工学のための足場において生体活性材料として用いることができる。
【００１７】
従来技術においては、有機ポリマー（ＰＬＡ、ＰＧＡおよびＰＬＧＡ）が一般に単一の足場材料として用いられる。ここでもまたこれらの有機ポリマーには生物学的誘導活性がなく、ヒト体内のそれらの酸性分解生成物がイン・ビボでの骨組織の再生を妨害する。本発明においては、有機ポリマーは、単に、ケイ素、カルシウムおよびリン微粒子の特定の組合せの担体として用いられる。異なる割合の担体を有する足場での試験結果によると、無機元素の組合せの含有率が８０％を上回る場合にはそれらの足場の圧力耐性は比較的弱くなり、したがって、動物体内において特定の立体構造を維持することができず、無機元素の組合せの含有率が２０％未満である場合には生物学的誘導活性が８週間以内での新しい骨の完全な形成を促進するには不十分となる。足場の圧力耐性と生体活性との妥協点を得るため、本発明は、図２、図４および図６に関連する例の生物学的試験に従い、ケイ素／カルシウム／リンの組合せの有機ポリマーに対する容積比を８０：２０ないし２０：８０、好ましくは７０：３０ないし３０：７０の範囲内に定義する。この範囲内で、足場複合体の溶解度を調整することができる。ケイ素／カルシウム／リンの組合せの含有率が増加するに従い、骨組織再生の誘導に対する生理活性が増加する。これら２種類の材料の量は、ヒト骨組織の修復に関する異なる要求が満たされるように、この範囲内で調整することができる。本発明は、生理活性物質の組合せおよび有機ポリマーを用い、そのような生理活性物質の貯蔵所として機能し得る足場を形成する。イン・ビボでの有機ポリマー（ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ）の溶解（１ないし８週間）に伴い、ケイ素／カルシウム／リン微粒子が連続的かつ安定に放出されて骨芽細胞の増殖および分化並びに骨再生の全プロセスの間の骨の形成および石灰化を誘導する。加えて、放出されたケイ素／カルシウム／リンナノ粒子は有機ポリマーの酸性分解生成物を中和することができ、それが足場を取り巻く、骨組織の再生に有利な局所環境を生じる。
【００１８】
従来技術においては、骨の欠損を修復するための全てのリン酸カルシウムまたはバイオガラスは５０ミクロンを上回る直径を有する大粒子である。そのような大粒子を複合材料において用いると、その複合材料の物理的特性が冒される。さらに、足場の有機ポリマーに埋め込まれた大粒子の放出は均一ではない。したがって、本発明は、１０ミクロン以下、好ましくは１０００ｎｍ未満、より好ましくは１００ｎｍ未満、最も好ましくは５−８０ｎｍの範囲の直径を有するケイ素／カルシウム  リン微粒子を用い、それによりそれらの微粒子は有機ポリマー中に均一に埋め込まれ、その有機ポリマーが分解する間に徐々に、かつ均一に放出される。これらの微粒子は、３種類の元素の各々の微粒子を本発明において定義される原子含有率に従って混合することによって調製される。
【００１９】
従来技術においては、様々な足場の三次元構造は均一な細孔径および均一な分布を有する微細孔性である。これらの足場の不都合は、比較的小さい（３００ミクロン未満の直径を有する）微細孔が骨芽細胞および血管の侵入に不利であり、比較的大きい（４００ミクロンを上回る直径を有する）微細孔が骨組織の再生に不利であるという点にある。そのため、骨生体工学におけるこれらの足場の実際の適用は明らかに制限される。本発明は、図６に示される微細孔および連結チャンネルの両者を含む三次元構造を有する足場を用いる（下記参照）。他の直径についての試験結果によると、１００ミクロン未満の直径を有する細孔は細胞の侵入に適さず、３００ミクロンを上回る直径を有する細孔は新しい骨の形成に適さない。そのため、図４ないし図７に示される調製および生物学的試験の実施例において用いられる全ての足場（下記参照）は１００ないし３００ミクロンの範囲の直径を伴う微細孔を有する。本発明において定義される直径を有する微細孔は骨芽細胞の増殖および新しい骨の再生に適する。本発明の微細孔の占有率は５０％ないし９０％である。例えば、図４、図６および図７に示される実施例において用いられる足場の微細孔の占有率は、それぞれ、８０％、５０％および５０％である。微細孔の他の占有率についての試験結果によると、９０％を上回る微細孔占有率を有する足場の物理的圧力耐性は明らかに弱く、かつ周囲の組織からの圧力に抗するには不十分であり、それに対して、微細孔の占有率が５０％未満である場合には骨芽細胞が足場に侵入して新しい骨を形成することはほとんど不可能である。連結チャンネルの異なる直径に関する試験結果によると、直径が５００ミクロンを上回る場合、足場の圧力耐性は明らかに弱く、かつ大容積骨組織の新生が妨害され、それに対して、直径が３５０ミクロン未満であるときには細胞の侵入および骨組織の形成が妨害される。したがって、本発明の連結チャンネルの直径は、足場の深部領域への細胞の侵入を保証し、かつそれらの連結チャンネルに沿って足場内部に成長する血管を介して新しい骨に栄養分および酸素が供給されるように、３５０ないし５００ミクロンの範囲にある。連結チャンネルの間隔に関する試験結果によると、足場の圧力耐性は間隔が３ｍｍ未満であるときにより弱く、それに対して新しい骨を形成するための足場の全ての微細孔への細胞の侵入は間隔が６ｍｍを上回るときに妨害され、したがって、新しい骨の形成には不適切である。したがって、本発明の連結チャンネルの間隔は、好ましくは、全ての微細孔への連結チャンネルを介する細胞の侵入が保証されるように、３ないし６ｍｍの範囲にある。本発明は連結チャンネルおよび同心的に配置された微細孔の両者を含む三次元構造を備えた組合せ単位を用い、これは（建築ブロックのように）反復集合して大きな骨の欠損を修復するためのより大容積の様々な足場を形成することができる。この新規三次元構造は骨の再生に有益である微細孔並びに細胞の均一な分布、ヒト組織への栄養分の輸送、および新しい骨における血管の再生に有益である連結チャンネルを含み、したがって、従来技術においては修復することができなかった大容積の骨の欠損の修復に用いることができる。５ｍｍ未満のサイズを有する小サイズの足場または患者の硬化性残滓を有する様々な骨の欠陥については、微細孔のみを有し、かつ様々な形状、例えば、図４および図６に示されるような球状形状、柱状形状または四辺形形状を有する足場を本発明に従って用いることができる。
【００２０】
ヒト骨組織工学のための本発明の足場の解剖学的形状は、骨の欠損の位置およびサイズに応じて、２つのグループ、すなわち、プレハブ型およびテーラーメイド型に分けることができる。プレハブ足場は様々な形状、例えば、球形形状、柱状形状、または四辺形形状等であり得る。プレハブ足場の直径が５ｍｍ未満である場合、足場中には微細孔のみが存在し、連結チャンネルは存在しない。これらの小サイズの足場は０．５ｍｍないし５ｍｍの範囲の様々な直径のものであり得る。５ｍｍを上回るサイズを有するプレハブ足場は、骨の欠損の空間が最大程度まで充填されるように、異なるサイズおよび形状を有する微細孔および連結チャンネルの両者を含む組合せ単位の集合体として設計される。これらのプレハブ足場は、異なるサイズおよび形状を有し、かつヒト体内の異なる位置の骨の欠損領域を骨組織の再生のために充填するのに用いられる。テーラーメイド足場は、ヒト骨の解剖学的形態に合致する足場の形状を設計するのにヒト骨の走査画像をテンプレートとして用い、それらの足場は微細孔および連結チャンネルの両者を含む組合せ構造を有し、これらは大きな骨の欠損の修復、ヒト骨の整形外科手術、およびその形状を維持する残留骨壁がない場合の治療に用いることができる。
【００２１】
加えて、従来技術においては生体工学用の有機ポリマー足場を調製するのに有機溶媒が通常用いられる。有機溶媒を足場から完全に除去することはほとんど不可能であるため、これはヒト骨組織の再生に有害である。従来技術に公知のヒト骨組織工学用の足場の調製方法とは異なり、本発明の方法は生体工学用のプレハブまたはテーラーメイド足場の調製に通常の加熱型成型法を用い、有機溶媒の使用が回避される。本発明の方法は、従来技術における足場中の残留有機溶媒によって生じる細胞毒性を回避することができ、かつ足場のバッチ生産のコストを低下させることができる。
【００２２】
ヒト骨組織工学用の本発明の足場の臨床使用には、イン・ビボでの細胞のイン・サイツ移植またはイン・ビトロ増殖細胞の移植が含まれる。イン・ビボでの細胞のイン・サイツ移植は、手術の間のヒト骨欠損の空洞への小サイズプレハブ足場の直接移植、手術の間に骨欠損の空洞に捕捉された血液および組織浸出液中に豊富な未分化間質細胞の足場の細孔間の空間へ浸透するための直接使用、並びに足場の材料による骨の再生の誘導を含む。したがって、そのような方法は、応力がかからない位置での骨の残留外壁を伴う骨の欠損の修復に用いることができる。移植されたプレハブ足場は、０．５ｍｍを上回るサイズを有する足場の組合せである。例えば、図４および図６に示される球形および柱状足場を上記方法において用いることができる。イン・ビトロ増殖細胞の移植は、応力のかかる位置または骨の残留外壁を伴わない位置での骨の欠損の修復に用いられる。正常ヒト自己骨芽細胞（これは、それを足場に移植することによって大容積骨欠損を修復するのに大量に必要である）の源は医療分野において常に深刻な問題である。本発明において用いられる正常ヒト由来のイン・ビトロ増殖自己骨芽細胞はこの問題を解決することができる。本発明は、患者から誘導される自己表層骨格断片を骨芽細胞の源として用いる。図７に示されるように、０．２ｃｍ３の表層骨格断片をイン・ビトロで増殖させ、６００−１０００万個の正常骨形成活性を有する自己骨芽細胞を産生させることができる。さらに、これは傷跡を残さず、最終部位に対する機能的影響も身体的影響もない。２ｃｍ３正常自己骨を再生するための足場を供給するには５５００万個の増殖骨芽細胞で十分である。臨床実務においては、テーラーメイド足場を、その足場に増殖骨芽細胞をイン・ビトロで移植した後に骨欠損領域に埋め込み、その骨を通常の骨手術によって合金支持副木で固定する。足場中での新しい骨の再生に伴い、これらの副木の支持力が徐々に低下し、新しい骨の負荷が徐々に増加し、かつ最終的には、再生した骨の生理学的機能が回復する（下記「組織工学によるヒト側頭下顎関節の関節突起再建の動物モデル」を参照）。
【００２３】
従来技術と比較すると、本発明の利点は：ヒト骨再生に関する誘導活性を有するケイ素／カルシウム／リン微粒子の生理活性材料としての使用が本発明の足場の生物学的有効性を生物学的誘導活性のない従来技術に公知の足場より優れたものとし；微細孔および連結チャンネルの両者を含む組合せ単位の足場における使用がそれらの足場におけるヒト細胞の均一な分布および血管の再生を促進し、従来技術において再生された骨が足場を取り巻く局所領域のみに限定されるという問題を解決することにある。さらに、三次元的に合致する構造を有する足場の組合せ単位を反復して集合させて十分な容積を形成することにより、従来技術においては達成することができなかった大きなヒト骨欠損の修復および再生を本発明においては達成することができる。
以下の非限定的な実施例を図面と組み合わせて用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００２４】
実施例１．ケイ素、カルシウム、リン微粒子は正常ヒト体内で骨芽細胞の増殖、アルカリホスファターゼの生理活性、オステオカルシンの合成および分泌、並びに骨石灰化を有意に生物学的に誘導する
【００２５】
この試験において用いられるヒト骨芽細胞は年齢２０ないし２５歳の健常ドナーから得る。各々の細胞群は１人のドナーの0.2cm3表層骨格断片から得る。この試験において用いられる細胞には合計で5群が存在する。5群の試験データの平均値および標準偏差を図１に示す。実権室内でドナーの０．２ｃｍ３表層骨格断片を増殖させて６００−１０００万個の骨形成活性を有する自己骨芽細胞を産生できることがわかる。この試験において用いられる細胞培養培地には１０ミクロン未満の直径を有するケイ素、カルシウム、リン粒子が図１の表の下に示される特定の濃度または割合で予め添加されており、ケイ素の飽和濃度は１００ｐｐｍである。培養の間、特定の濃度の粒子を含有する培養培地を同じ濃度の粒子を含有する新鮮な培地と３日毎に置き換える。第１２日および第２０日に、以下の試験を実施する：１）骨芽細胞の増殖試験：異なる濃度または割合の化学添加物を含有する培養培地中で成長する細胞の総数を通常の細胞フローカウンティング装置によってカウントし、図１に示される骨芽細胞の増殖倍数を最初の２４時間に培養皿上に付着した細胞の数を基準にして算出して、無機元素ケイ素が骨該細胞の増殖に対する明白な誘導効果を有し、かつその誘導効果がケイ素の濃度に直接比例することを示す。さらに、無機元素カルシウムおよびリンはシリコンの生物学的誘導効果を相乗的に増強する；２）アルカリホスファターゼの生理活性の決定。正常骨芽細胞の重要な特徴は正常機能を有するアルカリホスファターゼの分泌である。図１の表の下に示される条件下で１２日ないし２０日培養された細胞を試験する；これらの細胞をプラスマーゼによって脱着させ、通常の超音波発生器で破壊し、得られる細胞スラリーを通常のクロマトグラフィーで解析する；次に、時間あたり１０００万個の細胞によって産生されるアルカリホスファターゼによって分解される基質のミクロ当量数を算出する。これらの結果は、無機元素ケイ素がアルカリホスファターゼの生理活性および誘導効果をケイ素の濃度に比例して増強し得ることを立証した；３）オステオカルシンの合成および分泌の決定。オステオカルシンの合成および分泌は正常ヒト骨芽細胞の活性の特異的かつ重要な指数である。培養培地に分泌されたオステオカルシンの含有率を、ヒトオステオカルシンに対するモノクローナル抗体を用いる通常の免疫組織化学的方法によって決定する。結果は第１２日および第２０日に１０００万個の細胞によって分泌されるオステオカルシンのフェムトグラム値として表す。これらの結果は、無機元素ケイ素が正常ヒト骨芽細胞によるオステオカルシンの分泌の増加を特異的に誘導し得たことを示した。そのような誘導効果はケイ素の濃度に直接比例する。さらに、無機元素カルシウムおよびリンは相乗的に機能してケイ素の生物学的誘導効果を補助する。並びに４）骨石灰化の試験。骨芽細胞の隙間におけるカルシウムの沈着は新しい骨の形成の最終段階の間の重要な指数の１つである。各々の群の細胞を第１２日および第２０日に通常の方法によってカルシウム染色し、染色密度を通常のクロマトグラフィー機器によって決定した。これらの結果は、高濃度のケイ素、カルシウムおよびリンが有意かつ相乗的に機能し、正常ヒ���骨芽細胞の石灰化を誘導および増加させたことを立証した。
【実施例２】
【００２６】
実施例２．ケイ素、カルシウム、リン微粒子および有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料は正常ヒト骨芽細胞の増殖およびアルカリホスファターゼの生理活性の誘導において単一ＰＬＧＡ材料よりも有利である
【００２７】
この生物学的アッセイは、細胞培養物中でのイン・ビトロでの本発明のナノメートル複合材料の１群の誘導効果を説明し、単一有機ポリマーＰＬＧＡおよび通常のポリスチレン細胞培養皿に対して比較する。複合材料の元素組合せにおける無機元素の原子含有率は６７％ケイ素、２２％カルシウム、および１１％リンであり、無機元素の組合せのＰＬＧＡに対する容積比は５０：５０である。この複合材料および単一有機ポリマーＰＬＧＡを別々に処理し、直径２ｃｍおよび厚み１．５ｍｍを有するディスクを、型を用いる２００℃で８時間の加熱型成型法によって形成する（詳細な工程については実施例４も参照）。得られたディスクを直径２ｃｍの通常のポリスチレン細胞培養皿に別々に置き、細胞を異なる成形ディスク上に、または成形ディスクのない通常のポリスチレン細胞培養皿上に直接接種した後、培養細胞に対する異なる材料の効果を決定する。３群の試験細胞を３人の健常ドナーから得る。これらの細部を７日間培養した後、図１に述べられる方法によって細胞の増殖およびアルカリホスファターゼの生理活性を決定する。図２に示されるデータは３群の細胞の平均値および平均偏差である。これらの結果は、本発明の複合材料で作製されたディスクが単一ＰＬＧＡディスクおよび通常のポリスチレン細胞培養皿より優れた生物学的誘導効果を有することを立証する。
【実施例３】
【００２８】
実施例３．ケイ素ナノメートル材料を動物モデルに移植した後のケイ素イオンの拡散および分布、並びに新しい骨組織の再生を誘導するためのイオン分布
【００２９】
成体白ウサギをこの生物学的試験における動物モデルとして用いる。小錐により直径０．５ｃｍの骨空洞を動物モデルの腓骨に作製した後、５０−８０ｎｍの直径を有するケイ素／カルシウム／リン複合材料粒子（Ｓｉ：ＣＡ：Ｐ＝６７：２２：１１の原子比）をその空洞に充填し、最後に創傷領域を縫合する。試験動物に２または８週間給餌した後、複合材料で充填した部分および周囲組織を第２手術によって取り出し、それを１０％ホルムアルデヒドで固定し、樹脂で埋め込み、長軸方向断面に沿って１ｍｍスライスとして切片化して、最後に複合材料で充填した領域と周囲動物組織との界面の２つの側でのイオン濃度分布を放射イオンアナライザによって決定する。表１に示されるデータは５群の動物の原子パーセンテージでの平均値である。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
これらの結果は、複合材料を動物体内に２週間移植した後にケイ素イオンがケイ素ナノ粒子から放出され、かつ動物体内に拡散し、ケイ素イオン濃度の有意の局所的増加に加えて早期段階での新しい骨の活発な再生を示すイオウイオン濃度の増加を生じることを示す。８週間後、ケイ素イオンは動物体内において消失し、成熟した骨の形成を示すカルシウムおよびリン濃度は有意に増加する。この生物学的試験モデルは組織学的にも試験され、それらの結果は、界面の２つの側の組織画像が前述のイオン分布の変化によって特徴付けられる新しい骨の形成のダイナミックな変化に適合することを立証する。この生物学的試験の結果は、ケイ素イオンが新しい骨の形成の誘導に対する主要生理活性効果を有することを立証する。
【実施例４】
【００３２】
実施例４．ケイ素、カルシウム、リンナノ粒子および有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料で加熱型成型法によって作製された球形足場
【００３３】
これは複合材料で作製された球形足場の調製例である。出発物質はシリカ（ＳｉＯ２）、カルシア（ＣａＯ）、および三リン酸カルシウム（Ｃａ５ＨＯ１３Ｐ３）であって原子含有率はそれぞれ６７％ケイ素、２２％カルシウム、および１１％リンであり、出発物質の重量割合はそれに対応して４０％シリカ、６％カルシア、および５４％三リン酸カルシウムである。この調製法は、前記ケイ素−、カルシウム−およびリン−含有無機出発物質を前記重量割合に従って混合し、微粒子の直径が５ないし８０ｎｍの範囲に到達するまでＲｅｔｓｃｈトラック・オート・ローリング・ミラーによって３日間粉砕することを含む。微粒子の直径は電子走査顕微鏡によって確認する。有機ポリマーＰＬＧＡをステンレス電気粉砕ミラーによって粉砕し、細かいふるいでふるい掛けして２５ないし５０ミクロンの範囲の直径を有するＰＬＧＡ微粒子を得る。図３に示される球形足場を７０：３０の比の無機元素の組合せおよびＰＬＧＡで調製する。型をポリテトラフルオロエチレンから作製した後、ケイ素−、カルシウム−、リン−含有無機出発物質微粒子および有機ポリマー微粒子を前述の比で型に充填する。充填後、型をセラミック釜において２００℃で８時間焼成して徐々に冷却し（毎分１０℃）、最後に型からはずして図３に示される球形足場を得る（微細孔の占有率は８０％；および微細孔の直径は１００ないし３００ミクロン）。
【実施例５】
【００３４】
実施例５．電子走査顕微鏡の画像は、ケイ素、カルシウム、リンナノ粒子および有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料で作製された足場中に微細孔を示す
【００３５】
得られた、ケイ素、カルシウム、リンナノ粒子および有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料で作製された足場をその長軸方向断面に沿って切断し、その内部微細孔を通常の電子走査顕微鏡によって検査する。図４に示されるその結果は、加熱型成型法によって調製された足場が連続する微細孔を備える構造を有することを立証する（それらの微細孔の直径は１００ないし３００ミクロンの範囲をとる）。
【実施例６】
【００３６】
実施例６．ケイ素、カルシウム、リンナノ粒子および有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料で加熱型成型法によって作製された柱状足場は微細孔およびそれらの微細孔を連結する連結チャンネルを含む三次元構造を有する
これは複合材料で作製された柱状足場の調製の例である。出発物質はシリカ（ＳｉＯ２）、カルシア（ＣａＯ）、および三リン酸カルシウム（Ｃａ５ＨＯ１３Ｐ３）であって原子含有率はそれぞれ６７％ケイ素、２２％カルシウム、および１１％リンであり、出発物質の重量割合はそれに対応して４０％シリカ、６％カルシア、および５４％三リン酸カルシウムである。この調製法は、前記重量割合の前記ケイ素−、カルシウム−およびリン−含有無機出発物質を混合し、微粒子の直径が５ないし８０ｎｍに到達するまでＲｅｔｓｃｈトラック・オート・ローリング・ミラーによって３日間粉砕することを含む。微粒子の直径は電子走査顕微鏡によって確認する。有機ポリマーＰＬＧＡをステンレス電気粉砕ミラーによって粉砕し、細かいふるいでふるい掛けして２５ないし５０ミクロンの範囲の直径を有するＰＬＧＡ微粒子を得る。図６に示されるプレハブ柱状足場を５０：５０の比の無機元素の組合せおよびＰＬＧＡから以下のように調製する。型をポリテトラフルオロエチレンから作製した後、３５０ないし５００ミクロンの直径を有する数本のステンレス鋼ワイヤを４ｍｍの間隔でその型内に指定された方向に設置する。前記出発物質を型に充填し、セラミック釜において２００℃で８時間焼成し、徐々に冷却（毎分１０℃）した後、型からはずす。柱状足場を取り出した後、ステンレス鋼ワイヤを引き抜くことで図５に示される柱状足場が生じる（微細孔の占有率は５０％；微細孔の直径は１００ないし３００ミクロン；および連結チャンネルの直径は５００ミクロン）。
【実施例７】
【００３７】
実施例７．組織工学による側頭下顎関節の関節突起再建のための動物モデル
【００３８】
図６に示されるように、ヒト側頭下顎関節の関節突起の解剖学的形状に従ってポリテトラフルオロエチレン型を調製し、図５に示される足場の調製方法に従ってテイラーメイド足場を調製する。図６ｂに示されるように、表層骨格断片を以下の工程によって患者の表層部分から収集する：局所麻酔下で体表面の隠された位置で軟組織を切開し、約０．２ｃｍ３の表層骨格断片を掻き落とし、細胞培養培地中で培養する。切開は縫合する。それは３ないし５日後に治癒し、患者の機能または形状に対する影響はない。得られた骨格断片を細胞培養チャンバー内の通常のポリスチレン培養皿に置き、３７℃で培養する。２週間後、図６ｂに示される正常骨形成活性を有する６００ないし１０００万個の自己骨芽細胞が０．２ｃｍ３の表層骨格断片から増殖する。図６ｂは通常の「Ｖａｎｃｕｓａ」法によるカルシウム沈着試験の陽性の結果を示し、ここで、ピンクに染色された骨細胞の堆積領域における褐色粒子が骨石灰化の証拠である。上記の理由で、これらの増殖細胞を医療実務のための足場において用いることができる。医療実務によると、２ｃｍ３の正常自己骨を再生および形成する足場には５００万個の細胞で十分である。関連工程はプラスマーゼによる培養皿からの増殖細胞の脱着、細胞溶液への足場の浸漬を含み、それにより足場の連結チャンネルおよび連結した微細孔を介して細胞が足場の部分に侵入する。内部に細胞を有する足場を、試験（図６ｃ参照）のため、通常の手術によって動物モデルの胎内に移植する。臨床実務においては、体内に移植された足場を通常の骨手術によって合金副木で固定する。足場における新しい骨の再生に伴い、固定副木の支持力が徐々に低下し、新しい骨の負荷が徐々に増加し、最後に再生した骨の生理学的機能が回復する。図６ｄに示されるように、新しい骨組織は細胞および足場を体内に６週間移植した後に形成される。例えば、この動物モデルの新しい骨を、移植した足場を手術によって取り出し、１０％ホルムアルデヒド溶液で２４時間固定し、パラフィンワックスに埋め込み、かつその組織を通常の方法によって切片化および染色することによって試験する。新たに形成された正常ヒト骨は普通の光学顕微鏡の下で観察することができ、Ｈａｒｖａｒｄ細管の出現が高密度骨の形成を立証する。話は変わって、新たに再生された血管が足場中の元の連結チャンネルの位置で見出される。これらの組織学的証拠は、正常骨組織の新生が満足のいくものであることを立証する。
【００３９】
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【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】骨芽細胞の増殖、アルカリホスファターゼの生理活性、オステオカルシンの合成および分泌、並びに正常なヒト身体における骨石灰化に対するケイ素、カルシウム、およびリンの効果。
【図２】ケイ素、カルシウム、およびリン微粒子並びに有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料で作製された足場と単一のＰＬＧＡで作製された足場の、正常なヒト身体における骨芽細胞の増殖およびアルカリホスファターゼの生理活性の誘導における性能の比較。
【図３】ケイ素、カルシウム、リンのナノ微粒子および有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料で作製された球形足場。
【図４】ケイ素、カルシウム、リンのナノ微粒子および有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料で作製された足場の微細孔のＳＥＭ写真。
【図５】加熱型成型法によりケイ素、カルシウム、リンのナノ微粒子および有機ポリマー（ＰＬＧＡ）を含む複合材料で作製された、微細孔および連結チャンネルからなる三次元構造を有する柱状足場の写真。
【図６】組織工学によるヒト顎関節の関節突起再建の動物モデル。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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