(57)【要約】本発明は、単離されたヒト免疫グロブリン可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）構築物の最適化方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるＶＨドメインを含む、単離されたポリペプチド。
（ｉ）ＶＨ１ａサブクラスに属するＶＨドメインであって、２９位のＦ及び／又は８９位のＬのアミノ酸残基を含む、上記ＶＨドメイン；
（ｉｉ）ＶＨ１ｂサブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位のＬのアミノ酸残基を含む、上記ＶＨドメイン；
（ｉｉｉ）ＶＨ２サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ＶＨドメイン；
（ｉｖ）ＶＨ４サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４７位のＡ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ＶＨドメイン；
（ｖ）ＶＨ５サブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位のＬ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ＶＨドメイン；並びに
（ｖｉ）ＶＨ６サブクラスに属するＶＨドメインであって、５位のＶ、１６位のＧ、５８位のＩ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ＶＨドメイン。
【請求項２】
ＶＨ１ａサブクラスに属するＶＨドメインであって、２９位のＦ及び／又は８９位のＬのアミノ酸残基を含むＶＨドメインを含む、請求項１記載の単離されたポリペプチド
【請求項３】
ＶＨ１ｂサブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位のＬのアミノ酸残基を含むＶＨドメインを含む、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
ＶＨ２サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含む、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
ＶＨ４サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４７位のＡ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含む、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
ＶＨ５サブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位のＬ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含む、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
ＶＨ６サブクラスに属するＶＨドメインであって、５位のＶ、１６位のＧ、５８位のＩ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含む、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
請求項１記載のＶＨドメインを含む抗体又はその機能的フラグメント。
【請求項９】
請求項８記載の抗体又はその機能的フラグメントを１以上含む、抗体又はその機能的フラグメントのライブラリー。
【請求項１０】
以下からなる群より選択されるポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
（ｉ）ＶＨ１ａサブクラスに属するＶＨドメインであって、２９位のＦ及び／又は８９位のＬのアミノ酸残基を含むＶＨドメインを含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＶＨ１ｂサブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位のＬのアミノ酸残基を含むＶＨドメインを含むポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＶＨ２サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含むポリペプチド；
（ｉｖ）ＶＨ４サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４７位のＡ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含むポリペプチド；
（ｖ）ＶＨ５サブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位のＬ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含むポリペプチド；並びに
（ｖｉ）ＶＨ６サブクラスに属するＶＨドメインであって、５位のＶ、１６位のＧ、５８位のＩ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含むポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸配列に対応する核酸配列を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載の核酸配列に対応する核酸配列を有する宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１０記載の単離された核酸配列を発現するステップを含む、ＶＨドメイン、又は抗体若しくはその機能的フラグメントの製造方法。
【請求項１４】
以下のステップを含む、単離された核酸配列の取得方法：
（ｉ）ＶＨ１ａサブクラスドメインをコードする核酸配列において、２９位のＦ及び８９位のＬからなる群より選択されるアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを置換するステップ；又は
（ｉｉ）ＶＨ１ｂサブクラスドメインをコードする核酸配列において、８９位のＬのアミノ酸残基をコードするコドンを置換するステップ；又は
（ｉｉｉ）ＶＨ２サブクラスドメインをコードする核酸配列において、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択されるアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを置換するステップであって、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ステップ；又は
（ｉｖ）ＶＨ２サブクラスドメインをコードする核酸配列において、９０位のＹのアミノ酸残基をコードするコドンを置換するステップ；又は
（ｖ）ＶＨ４サブクラスドメインをコードする核酸配列において、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択されるアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを置換するステップであって、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ステップ；又は
（ｖｉ）ＶＨ４サブクラスドメインをコードする核酸配列において、９０位のＹのアミノ酸残基をコードするコドンを置換するステップ；又は
（ｖｉｉ）ＶＨ５サブクラスドメインをコードする核酸配列において、７７位のＲ、８９位のＬ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択されるアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを置換するステップであって、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ステップ；又は
（ｖｉｉｉ）ＶＨ６サブクラスドメインをコードする核酸配列において、５位のＶ、１６位のＧ、４４位のＶ、５８位のＩ、７２位のＤ、７６位のＧ、７８位のＦ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択されるアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを置換するステップであって、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ステップ；又は
（ｉｘ）ＶＨ６サブクラスドメインにおいて、９０位のＹのアミノ酸残基をコードするコドンを置換するステップ。
【請求項１５】
前記核酸配列において２以上のコドンを置換する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
さらに以下のステップ：
（ｉ）前記ドメインについて、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ５、及びＶＨ６からなるＶＨコンセンサス配列群から選択される対応するアミノ酸コンセンサス配列を同定するステップ；
（ｉｉ）前記コンセンサス配列のアミノ酸残基に対応する１以上のコドンを、前記ドメインの核酸配列の対応する位置に置換するステップ、
を含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４記載の核酸配列を発現するステップを含む、ポリペプチドの取得方法。
【請求項１８】
抗体又はその機能的フラグメントのライブラリーの構築方法であって、以下のステップ：
（ｉ）請求項１４記載の少なくとも１つの核酸配列を得るステップ；及び
（ｉｉ）得られた核酸配列を多様に変化させ、多様化した核酸配列の集団を作製するステップ、
を含み、上記多様化した核酸配列は、多様化したＶＨドメインを含む抗体ライブラリーの作製及びスクリーニングのために発現させうる、上記方法。
【請求項１９】
以下からなる群より選択されるＶＬドメインを含む、単離されたポリペプチド。
（ｉ）ＶＬκ２サブクラスに属するＶＬドメインであって、１８位にアミノ酸残基Ｒを含み、１８位がＲである場合には９２位がＴである、上記ＶＬドメイン；及び
（ｉｉ）ＶＬλ１サブクラスに属するＶＬドメインであって、４７位にアミノ酸残基Ｋを含む、上記ＶＬドメイン。
【請求項２０】
ＶＬκ２サブクラスに属するＶＬドメインであって、１８位のＲのアミノ酸残基を含み、１８位がＲである場合には９２位がＴであるＶＬドメインを含む、請求項１９記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
ＶＬλ１サブクラスに属するＶＬドメインであって、４７位のＫのアミノ酸残基を含むＶＬドメインを含む、請求項１９記載の単離されたポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１９記載のＶＬドメインを含む、抗体又はその機能的フラグメント。
【請求項２３】
請求項２２記載の抗体又はその機能的フラグメントを１以上含む、抗体又はその機能的フラグメントのライブラリー。
【請求項２４】
以下からなる群より選択されるポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
（ｉ）ＶＬκ２サブクラスに属するＶＬドメインであって、１８位のＲのアミノ酸残基を含み、１８位がＲである場合には９２位がＴであるＶＬドメインを含むポリペプチド；及び
（ｉｉ）ＶＬλ１サブクラスに属するＶＬドメインであって、４７位のＫのアミノ酸残基を含むＶＬドメインを含むポリペプチド。
【請求項２５】
請求項２４記載の核酸配列に対応する核酸配列を含むベクター。
【請求項２６】
請求項２４記載の核酸配列に対応する核酸配列分子を有する宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２４記載の単離された核酸配列を発現するステップを含む、ＶＬドメイン、又は抗体若しくはその機能的フラグメントの製造方法。
【請求項２８】
以下のステップを含む、核酸配列を得る方法：
（ｉ）ＶＬκ２サブクラスドメインをコードする核酸配列において、１２位のＳ、４５位のＱ、及び１８位のＲからなる群より選択されるアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを置換するステップであって、１８位がＲである場合には９２位がＴである上記ステップ；又は
（ｉｉ）ＶＬλ１サブクラスドメインをコードする核酸配列において、４７位のＫのアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンを置換するステップ；又は
（ｉｉｉ）ＶＬλ１ドメインをコードする核酸配列において、７位のＳ、８位のＰ、及９位のＳのアミノ酸残基をそれぞれコードする少なくとも３つのコドンを置換するステップ；又は
（ｉｖ）ＶＬλ２ドメインをコードする核酸配列において、７位のＳ、８位のＰ、及９位のＳのアミノ酸残基をそれぞれコードする少なくとも３つのコドンを置換するステップ；又は
（ｖ）ＶＬλ３ドメインをコードする核酸配列において、７位のＳ、８位のＰ、及９位のＳのアミノ酸残基をそれぞれコードする少なくとも３つのコドンを置換するステップ。
【請求項２９】
前記核酸配列において２以上のコドンを置換する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
さらに以下のステップ：
（ｉ）前記ドメインについて、ＶＬκ２、ＶＬλ１、ＶＬλ２、及びＶＬλ３からなるＶＬコンセンサス配列群から選択される対応するアミノ酸コンセンサス配列を同定するステップ；
（ｉｉ）前記コンセンサス配列のアミノ酸残基に対応する１以上のコドンを、前記ドメインの核酸配列の対応する位置に置換するステップ、
を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
請求項２４記載の核酸配列を発現するステップを含む、ポリペプチドの取得方法。
【請求項３２】
抗体又はその機能的フラグメントのライブラリーの構築方法であって、以下のステップ：
（ｉ）請求項２４記載の少なくとも１つの核酸配列を得るステップ；及び
（ｉｉ）得られた核酸配列を多様に変化させ、多様化した核酸配列の集団を作製するステップ、
を含み、上記多様化した核酸配列は、多様化したＶＨドメインを含む抗体ライブラリーの作製及びスクリーニングのために発現させうる、上記方法。
【請求項３３】
請求項１記載のポリペプチド及び請求項１９記載のポリペプチドを含む、抗体又はその機能的フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００１年７月１９日に出願された欧州特許第０１ １１ ６７５６．６号に関する優先権を主張するものであり、該特許は、その全文を本明細書に参照として組み込むものとする。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、特異性が高く、標的範囲が広いことから、基礎研究、臨床及び工業的使用における様々な状況において多くの用途が認められている。かかる場合、抗体は、ほぼすべての種類の基質を選択的に認識する手段として役立つ。しかし、抗体の多能性にもかかわらず、いくつかの重要な用途で抗体分子を用いる場合には、抗体固有の制限が存在する。例えば、治療又はｉｎ ｖｉｖｏ診断用抗体フラグメントは、ヒト患者において所望の標的で蓄積するのに長い血清半減期を必要とし、そのため、抗体は、プロテアーゼによる沈降及び分解に耐性がなければならない（Willudaら、1999）。工業用途では、往々にして、有機溶剤、界面活性剤中で、又は高温で機能できる抗体が要求されるが、これらのすべてが、抗体分子の安定性に対し厳しい難題となる（Dooleyら、1998；Harrisら、1994）。また、特に臨床用途では、サイズについて考慮する必要がある。腫瘍透過を増強する場合には、小さい分子ほど有利であるため、大きなサイズの完全抗体の作製は、治療法によっては不利であると考えられる。さらに、抗体の用途に対する高い要求、並びに、そのような用途の種類の増加によって、これまでより効率的な高レベル生産のための方法が必要となる。
【０００３】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントは、これらの制限のいくつかを回避するために設計された１つの抗体形態である（Birdら、1988；Hustonら、1988）。これら分子のサイズを抗体が抗原結合部分まで小さくされており、これら部分は、可変リンカーを介して連結される重及び軽鎖の可変ドメインを含んでいる。ほとんどのｓｃＦｖフラグメントは、大腸菌における組換え発現から十分な量で容易に取得することができる（Glockshuberら、1992；Pluckthunら，1996）。これらのフラグメントの生産収率は、その安定性、並びに、可溶性及びフォールディング効率の影響を受けるため、発現挙動に影響を及ぼす重要なｓｃＦｖフラグメントでの位置を確認するのに多大な努力が為されてきた（Knappik及びPluckthun、1995；Forsbergら、1997；Kipriyanovら、1997；Niebaら、1997）。
【０００４】
抗体分子の安定性に影響を与える因子は、ほとんどｓｃＦｖフラグメントを用いて研究されてきた（Worn及びPluckthun、2001）。ｓｃＦｖフラグメントの全体的安定性は、ＶＬ及びＶＨの内因性構造安定性と、それらの相互作用がもたらす外因性安定化に左右される（Worn及びPluckthun、1999）。いくつかのｓｃＦｖについては、単離されたＶＨ及びＶＬドメイン、並びに、全ｓｃＦｖフラグメントの安定性は、近年測定及び比較されている（Jagerら、2001；Jager及びPluckthun、1999a；Worn及びPluckthun、1999）。ヒトＶＨ３コンセンサスフレームワークへのループ植継ぎにより作製された抗ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ ｈｕ４Ｄ５−８のＶＨドメイン（Caterら、1992；Rodriguesら、1992）は、変性の自由エネルギー１４．４ｋＪ／モル−１Ｍ−１を示す（Jagerら、2001）。この低い熱力学的安定性は一見すると意外であるが、ＨＥＲ２に対する親和性を高めるためのループ植継ぎの後、導入されたＶＨ３コンセンサス配列のフレームワーク残基には複数の差異がある（Carterら、1992）。触媒抗体のＶＨドメインＩｃａＨ−０１（Ohageら、1999）は、それをコンセンサス配列に変換することにより、安定性向上を目的として作製された（Steipeら、1994）。ＶＨ３ドメインの頻繁な使用により、このコンセンサス全体が、ＶＨ３コンセンサスに向けて大きく偏ってくる。７つの位置が確認され、個別に交換された（Wirtz及びSteipeら、1999）。
【０００５】
ｓｃＦｖフラグメント、並びに極めて多様な作製抗原に対する完全なヒト抗体は、現在、複数の抗体ライブラリーから取得することができる（Griffithsら、1994；Vaughanら、1996；Knappikら、2000）。これらのライブラリーは、所望の標的分子と結合する抗体フラグメントをパニングすることにより富化するが、選択手順は、発現挙動、発現させた抗体構築物の細菌宿主に対する毒性、プロテアーゼ感受性、フォールディング効率、及び安定性など、別の因子のために偏ってくる。安定フレームワークの多様なライブラリーを作製するのに、２つの解決法が考えられる。第１は、単一の安定フレームワークを用いることである（Holtら、2000；Piniら、1998；Soderlingら、2000）。これらのライブラリーは、ＶＨドメイン用のマスターフレームワークとして、生殖系列遺伝子ＤＰ４７を用いる（Tomlinsonら、1992）。というのは、この遺伝子は、細菌系で良好に発現し（Griffithsら、1994）、極めて頻繁に、ヒト個体においてｉｎ ｖｉｖｏで発現する（de Wildtら、1999）からである。Griffithsライブラリーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで作製されたＣＤＲ３およびＦＲ４配列を用いて、生殖系列ＶＨバンクから構築される（Griffithsら、1994）。ＣＤＲ（Holtら、2000；Piniら、1998）、又はｉｎ ｖｉｖｏプロセシングした遺伝子配列から取得したＣＤＲ（Soderlingら、2000）に様々な点突然変異を導入することにより、多様性が達成されている。
【０００６】
安定フレームワークの構造的に多様なライブラリーを達成する第２の方法は、ヒトコンセンサス抗体フレームワークをさらに最適化することである。フレームワーク１のコンホメーションについてコンホメーションの変化を有する様々なフレームワーク（Honegger及びPluckthun、2001a；Jungら、2001；Saul及びPoljak、1993）は、多様なＣＤＲ２コンホメーションに適用できるのに対し（Saul及びPoljak、1993）、様々なフレームワーク４の配列は、ＣＤＲ３コンホメーションに影響を与える。ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬ、Knappikら、2000）は、４９のマスター遺伝子を形成するリンカー領域を介して連結する７つのＶＨと７つのＶＬの合成コンセンサスフレームワークの組み合わせから構成される（Knappikら、2000）。
【０００７】
このライブラリーは、主要ＶＨ及びＶＬ−サブファミリー（ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、及びＶＨ６、Ｖκ１、Ｖκ２、Ｖκ３、Ｖκ４、Ｖλ１、Ｖλ２及びＶλ３）のフレームワーク領域のコンセンサス配列のセットを基礎としている。これらのサブファミリーは、ＶＨ１サブファミリーを含む既知生殖系列配列から同定され（ＶＢＡＳＥ、Cook及びTomlinson, 1995）、このＶＨ１サブファミリーは、ＣＤＲ−Ｈ２コンホメーションが異なるため、さらにＶＨ１ａ及びＶＨ１ｂに区分される。サブファミリーの各々について、該サブファミリーに属するあらゆる既知の再構成抗体配列のデータベースから、フレームワーク領域のコンセンサス配列を計算した。
【０００８】
これら１４のコンセンサス配列は、理想的には、ヒト可変ドメインフレームワークの構造レパートリーを提示する。
【０００９】
対応する生殖系列可変ドメインの生殖系列ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列と、同一のＣＤＲ３とを含むこれらのコンセンサス配列を用いて、発現研究が行なわれた（Knappikら、2000）。従って、個々のＶＨおよびＶＬドメインは、大腸菌において良好に発現され、しかも安定していることが証明されている。しかし、これらの研究、並びに、組換え体ライブラリーにおけるそれらの個別の性能に関する研究（Hanesら、2000）から、個々の可変ドメインを互いに比較すると、それらにやはり顕著な差異があることがわかった。
【００１０】
全体発現の増強と、抗体又はそのフラグメントの安定性は、抗体ライブラリーのほとんどの用途で非常に望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明の技術上の問題は、抗体又はそのフラグメントの相対的安定性、全体発現及び溶解度を向上させることである。前記の技術上の問題に対する解決法は、請求項に記載し、以下に開示する実施形態を提供することにより、達成される。
【００１２】
本発明の技術的手法、すなわち、特定のサブクラスのヒト可変重鎖又は軽鎖抗体ドメインにおける１以上のフレームワーク残基を、それぞれ別のサブクラスのＶＨ又はＶＬドメインに関して改変する方法は、従来の技術によって提供及び提案のいずれも為されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、本明細書に記載及び意図された方法を用いて、特に、改変されたフレームワーク領域を有する抗体を提供する。核酸配列を突然変異させる方法は、当業者にはよく知られており、限定するものではないが、カセット突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲによる突然変異誘発（例えば、Sambrookら、1989；Ausubelら、1999を参照のこと）などがある。
【００１４】
一態様では、本発明は、以下からなる群より選択されるＶＨドメインを含む、単離されたポリペプチド（及び該ポリペプチドをコードする単離された核酸配列）を提供する：
（ｉ）ＶＨ１ａサブクラスに属するＶＨドメインであって、２９位にＦ及び／又は８９位にＬのアミノ酸残基を含む、上記ＶＨドメイン；
（ｉｉ）ＶＨ１ｂサブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位にＬのアミノ酸残基を含む、上記ＶＨドメイン；
（ｉｉｉ）ＶＨ２サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ＶＨドメイン；
（ｉｖ）ＶＨ４サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４７位のＡ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ＶＨドメイン；
（ｖ）ＶＨ５サブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位のＬ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ＶＨドメイン；並びに
（ｖｉ）ＶＨ６サブクラスに属するＶＨドメインであって、５位のＶ、１６位のＧ、５８位のＩ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである、上記ＶＨドメイン。
【００１５】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるＶＬドメインを含む、単離されたポリペプチド（及び該ポリペプチドをコードする単離された核酸配列）を提供する：
（ｉ）ＶＬ１κ２サブクラスに属するＶＬドメインであって、１８位にＲのアミノ酸残基を含み、１８位がＲである場合には、９２位はＴである、上記ＶＬドメイン；
（ｉｉ）ＶＬλ１サブクラスに属するＶＬドメインであって、４７位にＫのアミノ酸残基を含む、上記ＶＬドメイン。
【００１６】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、例えば、抗体又はそのフラグメントのライブラリーを構築するのに用いることができる。抗体又はそのフラグメントのライブラリーについては様々な刊行物（例えば、Vaughanら、1996；Knappikら、2000；米国特許第６，３００，０６４号を参照：これらの文献は、参照としてその全文が本明細書に組み込まれる）に記載されており、当業者には周知である。
【００１７】
本発明に関して、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン分子の重鎖の可変部分を意味する。「ＶＨ・・・サブクラス」という用語は、前記のように作製されたＨｕＣＡＬ（ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、及びＶＨ６）（Knappikら、2000））から取得した、対応する「ＶＨ・・・」コンセンサス配列によって決定されるサブクラスを意味する。これに関し、「サブクラス」という用語は、ＶＨ−サブファミリーのコンセンサス配列により呈示される高度の同一性及び類似性を共有する可変ドメインのグループを意味し、ここで、用語「サブファミリー」とは「サブクラス」の類義語として用いられる。本発明では、「コンセンサス配列」という用語は、ＨｕＣＡＬコンセンサス遺伝子を意味する。所与のＶＨドメインが「ＶＨサブクラスに属する」か否かの決定は、該ＶＨドメインとすべての既知ヒトＶＨ生殖系列セグメントとのアラインメント（ＶＢＡＳＥ、Cook及びTomlinson、1995）、並びに、ＢＬＯＳＵＭ（Henikoff及びHenikoff、1992）のような相同性検索マトリックスを用いた最も高い相同性の決定により実施する。相同性の決定、並びに相同性に基づく配列の分類のための方法は、当業者にはよく知られている。サブクラスへの個々の生殖系列配列の分類は、Knappikら（2000）に従って実施する。
【００１８】
本発明において、「ＶＬドメイン」という用語は、免疫グロブリン分子の軽鎖の可変部分を意味する。用語「ＶＬ・・・サブクラス」は、前記のように作製されたＨｕＣＡＬ（Ｖκ１、Ｖκ２、Ｖκ３及びＶκ４、並びに、Ｖλ１、Ｖλ２及びＶλ３；Knappikら、2000）から取得した、対応するＶＬ・・・コンセンサス配列によって決定されるサブクラスを意味する。
【００１９】
このライブラリーにおいて、主要ＶＬサブファミリーの各々についてのコンセンサス配列は、既知抗体配列から作製した（ＶＢＡＳＥ、Cook及びTomlinson、1995）。本発明において、アミノ酸残基の番号付けは、Honegger及びPluckthun（2001b）の構造により調節される手法に従う。
【００２０】
本発明において、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」の類義語として用いる。本発明に係る抗体又はそのフラグメントには、Ｆｖ（Skerra及びPluckthun、1988）、ｓｃＦｖ（Birdら、1988；Hustonら、1988）、ジスルフィド結合Ｆｖ（Glockshuberら、1992；Brinkmannら、1993）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２フラグメント、単ＶＨドメイン、又は、当業者には公知のその他のフラグメントがあり、これらは、免疫グロブリン又は免疫グロブリンフラグメントの少なくとも１つの可変ドメインを含み、かつ、標的に結合する能力を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、新規の免疫グロブリン配列と、それを作製する方法を提供する。本発明者らは、驚くことに、基準点として別のサブクラス（すなわち、サブファミリー）の配列を用いて、任意の可変重鎖又は軽鎖サブクラスの免疫グロブリンの特定のフレームワーク領域を最適化するための手法をみいだした。本発明はまた、このように最適化されたヒト可変ドメインをさらに改変する方法であって、以下のステップを含む方法を提供する：
（ｉ）ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ５、及びＶＨ６からなるＶＨコンセンサス配列群より選択される対応アミノ酸コンセンサス配列を同定するステップ、
（ｉｉ）上記コンセンサス配列のアミノ酸残基に対応する１以上のコドンを、前記ドメインの核酸配列の対応する位置に置換するステップ。
【００２２】
以下に示す手順は、結合活性を維持しながら、所与のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの特性を改善するのに、一般に適用可能な方法を説明するものである。（この方法は、本明細書で示す指示に従い、容易に改変して、所与のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの特性を改善することができる。）第１の手順は、所与のドメインの各残基を免疫グロブリン配列の様々なサブセットと比較することである。結合活性を保持するのが好ましいため、ＣＤＲ１（２５−４０）、ＣＤＲ２（５７−７７）、ＣＤＲ３（１０９−１３７）及び外側ループ（８４−８７）は、一般に考慮しない（Honegger及びPluckthun（2001b）に従う番号付け）。フレームワーク１クラスの決定、サブタイプ決定（６、７、９、１０）及びサブタイプ対応（１９、７４、７８、９３）残基を、同じクラスに入る配列のコンセンサス部分と比較する（Honegger及びPluckthun、2001a）。次に、別の残基を、有利な特性を有するＶＨドメイン（ファミリー１、３及び５）のコンセンサス配列と比較する（実施例１、Knappikら、2000を参照）。それから、構造モデルを用いて、残基の差異を分析する（実施例２を参照）。可溶性タンパク質の発現率及び／又は熱力学的安定性を高める突然変異として、本発明の実験でわかるように、以下のものが挙げられる：
（ｉ）ループ内の非グリシン残基を、正のφ角を有するグリシンで置換する突然変異、
（ｉｉ）β鎖において低βシート傾向を有する残基から、高βシート傾向を有する残基への突然変異、
（ｉｉｉ）溶媒露出疎水性残基から、親水性残基への突然変異、並びに、
（ｉｖ）不満足な水素結合を有する残基の置換。
【００２３】
好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨ３ではないＶＨサブクラスに属する特定のヒトＶＨドメインの改変方法であって、以下のステップを含む方法に関する：
（ａ）ＨｕＣＡＬ ＶＨ３ドメインの対応アミノ酸残基と比較して、異なる上記ＶＨドメインの特定アミノ酸残基を同定するステップ、
（ｂ）上記異なるアミノ酸残基の少なくとも１つを、上記ＨｕＣＡＬ ＶＨ３ドメインの対応アミノ酸残基で置換するステップ（ただし、置換アミノ酸残基が、前記サブクラスのコンセンサスアミノ酸残基ではない場合に限る）。
【００２４】
この基本的方法は、原則として、ＶＬドメインにも適用可能である。例えば、Ｖκドメインは、Ｖκ３のコンセンサス配列と比較することができる。というのは、このドメインは、Ｖκドメインのうち最も高い熱力学的安定性及び発現率を呈示するからである。合理的設計Ｖλドメインの物理的原理は、前述したＶＨドメインと同じである。
【００２５】
好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨ１ａサブクラスに属するＶＨドメインであって、２９位にＦ及び８９位にＬのアミノ酸残基を含むＶＨドメインを含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、ＶＨ１ｂサブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位にＬのアミノ酸残基を含むＶＨドメインを含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００２７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨ２サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００２８】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨ４サブクラスに属するＶＨドメインであって、１６位のＧ、４７位のＡ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００２９】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨ５サブクラスに属するＶＨドメインであって、８９位のＬ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００３０】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＨ６サブクラスに属するＶＨドメインであって、５位のＶ、１６位のＧ、５８位のＩ、７８位のＦ、９０位のＹ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、９７位がＲである場合には９９位はＥであるＶＨドメインを含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００３１】
さらにまた別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のＶＨドメインを含む、抗体又はその機能的フラグメントに関する。さらには、本発明の１以上の抗体又はその機能的フラグメントを含む抗体又はその機能的フラグメントのライブラリーが好ましい。
【００３２】
本発明のライブラリーは、ＨｕＣＡＬライブラリー（Knappikら、2000）から出発し、本発明の教示に従って、１以上のＶＨ及び／又はＶＬコンセンサス配列を最適化し、例えば、Knappikら、2000に記載されているトリヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて合成したオリゴヌクレオチドカセットを使用することにより、上記最適化配列における少なくとも１つのＣＤＲ領域に多様性を導入することによって、作製することができる。
【００３３】
さらにまた別の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＬ１κ２サブクラスに属するＶＬドメインであって、１８位のＲのアミノ酸残基を含み、１８位がＲである場合には９２位はＴであるＶＬドメインを含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００３４】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ＶＬλ１サブクラスに属するＶＬドメインであって、４７位のＫのアミノ酸残基を含むＶＬドメインを含む、単離されたポリペプチドに関する。
【００３５】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のＶＬドメインを含む、抗体又はその機能的フラグメントに関する。
【００３６】
最も好ましい実施形態では、本発明は、本発明の１以上の抗体又はその機能的フラグメントを含む抗体又はその機能的フラグメントのライブラリーに関する。
【００３７】
さらに好ましい実施形態では、（ａ）２９位をＦと、（ｂ）８９位をＬと交換するリストから選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ１ａサブクラスに属するヒトＶＨドメインを改変する方法に関する。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、８９位をＬと交換する、アミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ１ｂサブクラスに属するヒトＶＨドメインを改変する方法を提供する。
【００３９】
さらに別の好ましい実施形態では、（ａ）１６位をＧと；（ｂ）４４位をＶと；（ｃ）４７位をＡと；（ｄ）７６位をＧと；（ｅ）７８位をＦと；（ｆ）９７位をＲと交換する（ただし、９９位のアミノ酸残基はＥであるか、若しくはＥと交換する）リストから選択される、少なくとも１つアミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ２サブクラスに属するヒトＶＨドメインを改変する方法に関する。さらに、９０位をＹと交換する、アミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ２サブクラスに属するＶＨドメインを改変する方法が好ましい。
【００４０】
さらに別の好ましい実施形態では、（ａ）１６位をＧと；（ｂ）４４位をＶと；（ｃ）４７位をＡと；（ｄ）７６位をＧと；（ｅ）７８位をＦと；（ｆ）９７位をＲと（ただし、９９位のアミノ酸残基はＥであるか、若しくはＥと交換する）；及び（ｇ）９９位をＥと交換するリストから選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ４サブクラスに属するヒトＶＨドメインを改変する方法に関する。さらに、９０位をＹと交換する、アミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ４サブクラスに属するヒトＶＨドメインを改変する方法が好ましい。
【００４１】
別の好ましい実施形態では、（ａ）７７位をＲと；（ｂ）８９位をＬと；（ｃ）９７位をＲと；（ただし、９９位のアミノ酸残基はＥであるか、若しくはＥと交換する）；及び（ｄ）９９位をＥと交換するリストから選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ５サブクラスに属するヒトＶＨドメインを改変する方法を提供する。
【００４２】
さらに別の好ましい実施形態では、（ａ）５位をＶと；（ｂ）１６位をＧと；（ｃ）４４位をＶと；（ｄ）５８位をＩと；（ｅ）７２位をＤと（ｆ）７６位をＧと；（ｇ）７８位をＦと；及び（ｈ）９７位をＲと交換する（ただし、９９位のアミノ酸残基はＥであるか、若しくはＥと交換する）リストから選択される、少なくとも１つのアミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ６サブクラスに属するヒトＶＨドメインを改変する方法に関する。さらに、９０位をＹに交換する、アミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインを作製することにより、ＶＨ６サブクラスに属するＶＨドメインを改変する方法が好ましい。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、２つ以上のアミノ酸残基が交換されている、ＶＨドメイン改変方法に関する。
【００４４】
さらに別の実施形態では、ＶＨドメインの改変方法であって、以下のステップを含む方法を提供する：
（ｉ）上記ＶＨドメインをコードする核酸分子を用意するステップ；
（ｉｉ）上記核酸分子を突然変異させることにより、前記改変ＶＨドメインをコードする、改変された核酸分子を取得するステップ。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ１ａサブクラスドメインにおいて、２９位のＦ及び８９位のＬからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップを含む方法に関する。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ１ｂサブクラスドメインにおいて、８９位のＬのアミノ酸残基を置換するステップを含む方法に関する。
【００４７】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ２サブクラスドメインにおいて、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップを含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである方法に関する。さらには、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ２サブクラスドメインにおいて、９０位のＹのアミノ酸残基を置換するステップを含む方法が好ましい。
【００４８】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ４サブクラスドメインにおいて、１６位のＧ、４４位のＶ、４７位のＡ、７６位のＧ、７８位のＦ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップを含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである方法に関する。さらには、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ４サブクラスドメインにおいて、９０位のＹのアミノ酸残基を置換するステップを含む方法が好ましい。
【００４９】
さらにまた別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ５サブクラスドメインにおいて、７７位のＲ、８９位のＬ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップを含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである方法に関する。
【００５０】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ６サブクラスドメインにおいて、５位のＶ、１６位のＧ、４４位のＶ、５８位のＩ、７２位のＤ、７６位のＧ、７８位のＦ、９７位のＲ、及び９９位のＥからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップを含み、９７位がＲである場合には９９位はＥである方法に関する。さらには、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＨ６サブクラスドメインにおいて、９０位でＹのアミノ酸残基を置換するステップを含む方法が好ましい。
【００５１】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、２以上のアミノ酸残基を置換する本発明のポリペプチドを取得する方法に関する。
【００５２】
さらにまた別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＬκ２サブクラスドメインにおいて、１２位のＳ、４５位のＱ、及び１８位のＲからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップを含み、１８位がＲである場合には９２位はＴである方法に関する。
【００５３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＬλ１サブクラスドメインにおいて、４７位のＫからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップを含む方法に関する。
【００５４】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、ＶＬκ１、ＶＬκ２及びＶＬκ３ドメインにおいて、８位のＰのアミノ酸残基を置換するステップを含む方法に関する。さらには、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、８位がＰであり、７及び９位でＳの置換をさらに含む、上記方法が好ましい。
【００５５】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、２以上のアミノ酸残基を置換する本発明の方法に関する。
【００５６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドを取得する方法であって、改変された核酸分子を発現させるステップをさらに含む方法に関する。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書において開示若しくは意図したように、新規のＶＨドメイン、抗体又はその機能的フラグメントをコードする単離された核酸分子に関する。
【００５８】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書において開示若しくは意図したように、新規のＶＬドメイン、抗体又はその機能的フラグメントをコードする単離された核酸分子に関する。
【００５９】
さらにまた別の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書において開示若しくは意図したように、ＶＬドメイン、抗体又はその機能的フラグメントを生産する方法であって、本発明の単離された核酸分子を発現させるステップを含む方法に関する。
【００６０】
本発明はまた、本発明の分子の保存的アミノ酸変異体を提供する。コードされたタンパク質の分子構造全体を保存する本発明の変異体も作製することができる。開示されたタンパク質産物を含む個々のアミノ酸の特性を考慮すると、当業者はいくつかの合理的置換を理解しうる。アミノ酸置換、すなわち、「保存的置換」は、例えば、関連する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づいて、実施することができる。
【００６１】
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンを含み；（ｂ）極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含み；（ｃ）正の電荷をもつ（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン、及びヒスチジンを含み；並びに（ｄ）負の電荷をもつ（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。置換は、典型的には、（ａ）〜（ｄ）のグループ内で実施することができる。さらに、グリシンとプロリンは、αヘリックスを破壊する能力に基づいて、相互に置換することができる、同様に、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン及びリシンなどの特定のアミノ酸は、一般に、αヘリックスにおいて認められることが多いが、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン及びトレオニンは、β折りたたみシートにおいて認められることが多い。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、及びプロリンは、一般に、順番に存在する。好ましい置換は、以下のグループ：（ｉ）Ｓ及びＴ；（ｉｉ）Ｐ及びＧ；並びに（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌ及び１間で実施することができる。公知の遺伝暗号、組換え体及び合成ＤＮＡ技法を考慮すれば、当分野の科学者は、保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【００６２】
本明細書において、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」とは、配列間で同一のアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列類似性」とは、同一であるか、又は、保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸のパーセンテージを示す。
【００６３】
本発明はまた、高度にストリンジェントな条件下で、本発明のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、抗体又はその機能的フラグメントにハイブリダイズする核酸を提供する。本明細書で用いる、高度にストリンジェントな条件とは、約５〜２０％の配列多様性、好ましくは約５〜１０％まで許容する条件である。限定するものではないが、高度にストリンジェントな（ハイブリッドのＴｍ計算値より１０℃低い）条件の例では、ハイブリッドのＴｍ計算値より低い適当なＴｉで、０．１×ＳＳＣ（標準生理食塩水−クエン酸バッファー）及び０．５％ＳＤＳの洗浄溶液を用いる。上記条件の最終ストリンジェンシーは、特に、用いたハイブリダイゼーション条件が、安定ハイブリッドと一緒に、これより不安定なハイブリッドを形成させる条件である場合には、主として洗浄条件応じて決まる。従って、ストリンジェンシーが高い洗浄条件ほど不安定なハイブリッドが排除される。前述した高度から中程度にストリンジェントな洗浄条件で、用いることができる一般的ハイブリダイゼーション条件は、適当なインキュベーション温度Ｔｉでの、６×ＳＳＣ（又は６×ＳＳＰＥ）、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡの溶液におけるハイブリダイゼーションである。好適な高ストリンジェンシー条件の概要については、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Press（1989））を参照されたい。
【００６４】
ストリンジェンシー条件は、ハイブリダイゼーション実験及び洗浄で用いた温度、ハイブリダイゼーション溶液及び洗浄液中の一価陽イオンのモル濃度、並びに、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドのパーセンテージと相関する。一般に、プローブを用いたハイブリダイゼーションによる感度は、プローブの量及び特異的活性、標的核酸の量、標識の検出可能性、ハイブリダイゼーションの速度、並びにハイブリダイゼーションの持続時間に影響される。ハイブリダイゼーション速度は、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドについてはＴｍより２０〜２５℃低いＴｉ（インキュベーション温度）、また、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの場合は、Ｔｍより１０〜１５℃低いＴｉで、最大化される。また、この速度は、約１．５Ｍ Ｎａ＋のイオン強度によっても最大化される。ハイブリダイゼーション速度は、二本鎖の長さに直接比例し、ミスマッチ度に反比例する。
【００６５】
しかし、ハイブリダイゼーションの特異性は、所望するハイブリッドと「バックグラウンド」ハイブリッド同士の安定性の差異と相関する。ハイブリッド安定性は、二本鎖長さ、塩基組成、イオン強度、ミスマッチ、及び不安定剤（使用する場合）と相関する。
【００６６】
完全なハイブリッドのＴｍは、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの場合、以下のように、Meinkothら（1984）の式を用いて推定することができ：
Tm＝81.5℃＋16.6（log M）＋0.41（％GC）−0.61（％form）−500/L
ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについては、以下の式を用いる：
Tm＝79.8℃＋18.5（log M）＋0.58（％GC）−11.8（％GC）2−0.56（％form）−820/L
上記式中、Ｍは、一価陽イオンのモル濃度で、０．０１〜０．４Ｍ ＮａＣｌ、
％ＧＣは、ＤＮＡにおけるＧ及びＣヌクレオチドのパーセンテージで、３０〜７５％、
％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーションにおけるホルムアミドのパーセンテージ、並びに、
Ｌは、ハイブリッドの塩基対の長さである。
【００６７】
Ｔｍは、１％ミスマッチにつき、０．５〜１．５℃（それぞれの計算では、平均値の１℃を用いることができる）ずつ減少する。
【００６８】
Ｔｍはまた、実験により決定することもできる。前記式で、ハイブリッドの長さ（Ｌ）が増加すれば、Ｔｍも高くなり、安定性が高まるため、全長ラット遺伝子配列をプローブとして用いることができる。
【００６９】
濾紙ハイブリダイゼーションは、典型的に、６８℃及び高イオン強度（例えば、５〜６×ＳＳＣ）（ストリンジェントではない）で実施した後、ストリンジェンシーを増加する１回以上の洗浄を実施する。その際、最後の洗浄は、最終的に所望する高ストリンジェンシーである。Ｔｍの式を用いて、最終洗浄に適したＴｉを推定することができる。あるいは、完全な二本鎖のＴｍを実験により決定してから、それに応じてＴｉを調節してもよい。
【００７０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載若しくは意図したＶＨドメイン、抗体又はその機能的フラグメントを製造する方法であって、本発明の単離された核酸分子を発現させるステップを含む方法に関する。
【００７１】
特に、このような方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）ＶＨドメインをコードする核酸分子を用意するステップ；
（ｉｉ）上記核酸分子を突然変異させることにより、少なくとも１つのアミノ酸残基交換を含む改変ＶＨドメインをコードする、改変された核酸分子を取得するステップ。核酸配列を突然変異させる方法は、当業者には公知であり、限定するものではないが、カセット突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲによる突然変異誘発などが挙げられる（例えば、Sambrookら、1989；Ausubelら、1999）。
【００７２】
さらには、本発明の単離された核酸分子を含むベクターが好ましい。
【００７３】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の単離された核酸分子、又は本発明のベクターを有する宿主細胞に関する。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、本発明のＶＨドメインは、限定するものではないが、抗体ライブラリーの構築、作製、発現及びスクリーニングを含む、あらゆる抗体の用途に用いることができる。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、本発明のＶＬドメインは、限定するものではないが、抗体ライブラリーの構築、作製、発現及びスクリーニングを含む、あらゆる抗体の用途に用いることができる。
【００７６】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載したＶＨ及びＶＬドメインの任意の組み合わせを含む、抗体又はその機能的フラグメント（並びにその作製方法）に関する。例えば、抗体は、以下を含みうる：
（ｉ）ＶＨ１ａサブクラスに属するＶＨドメインであって、２９位にＦ及び／又は８９位にＬのアミノ酸残基を含むＶＨドメイン；並びに
（ｉｉ）ＶＬκ２サブクラスに属するＶＬドメインであって、１２位のＳ、４５位のＱ、又は１８位のＲのうち１以上の置換を含み、１８位がＲである場合には９２位はＴであるＶＬドメイン。
【００７７】
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明に従う１以上の抗体又はその機能的フラグメントを含む、抗体又はその機能的フラグメントのライブラリーに関する。
【００７８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗体又はその機能的フラグメントをコードする単離された核酸分子に関する。
【００７９】
図面の説明
図１：単離されたＶＨ及びＶＬドメインの見かけ分子量の決定。５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌにおいて、以下のゲル濾過実験を実施した：
（ａ）ＶＨ３（実線）、ＶＨ１ａ（点線）、並びに０．９ＭＧｄｎＨＣｌの存在下でのＶＨ１ａ（長い破線）を含む、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムでの、単離されたヒトコンセンサスＶＨドメイン（５μＭ）；
（ｂ）Ｖκ１（実線）、Ｖκ２（長い破線）、Ｖκ３（点線）、及びＶκ４（短い破線）を含む、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムでの、単離されたＶκドメイン（５０μＭ）；並びに、
（ｃ）Ｖλ１（実線）、Ｖλ２（長い破線）及びＶλ３（点線）を含むＴＳＫカラムでの、単離されたＶλドメイン（５μＭ）。矢印は、分子量標準の溶出量：炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）、及びシトクロムｃ（１２．４ｋＤａ）を示す；
（ｄ）２８０ｎｍの検出波長を用いた、１９，０００ｒｐｍでのＶκ３の平衡沈降。実線は、単一種に対するデータの当てはめ（fitting）から取得し、１３，６１６Ｄａの分子量を算出した。当てはめたものの残りはランダムに分散しており、これは、単量体状態の仮定が妥当であることを示している。
【００８０】
図２：以下に示すＶＨドメインのＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせ：
（ａ）ＶＨ１ａ（黒丸）、ＶＨ１ｂ（白四角）、ＶＨ３（黒四角）及びＶＨ５（白丸）；
（ｂ）ＶＨ２（黒丸）、ＶＨ４（白四角）及びＶＨ６（黒四角）。すべての変性変化（ａ及びｂ）は、２８０ｎｍの励起波長での変性剤の濃度の関数として発光最大値の変化を追跡することにより、測定した。
【００８１】
図３：以下に示すＶＬドメインのＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせ：
（ａ）Ｖκ１（黒丸）、Ｖκ２（黒四角）、Ｖκ３（白四角）及びＶκ４（白丸）を含むＶκドメイン；並びに、
（ｂ）Ｖλ１（黒四角）、Ｖλ２（黒丸）、Ｖλ３（白四角）を有するＶλドメイン。すべての変性変化（ａ及びｂ）は、２８０ｎｍの励起波長での変性剤の濃度の関数として蛍光強度の変化を追跡することにより、測定した。
【００８２】
図４：ヒトコンセンサスＶκ３（ＰＤＢ登録名：１ＤＨ５）及びＶＨ３ドメイン（ＰＤＢ登録名：１ＤＨＵ）からなるｓｃＦｖフラグメントのモデル構造：
（ａ）左側にＶκ３、右側にＶＨ３を有する二次構造
（ｂ）荷電残基にはマークを付けた（グレー：Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＨｉｓ；黒：Ａｓｐ及びＧｌｕ）。各ドメインの底部には、荷電残基の集積、すなわち、ＶＬ及びＶＨドメインの電荷クラスターがある
（ｃ）疎水性コア残基：保存されたＴｒｐ４３（薄いグレー）の上方は、上部コア（濃いグレー）で、下方は下部コア（黒）である。詳細については明細書を参照
（ｄ）フォールディング効率に影響を及ぼす可能性のある位置を薄いグレーで示す。詳細については明細書を参照。イメージはすべて、プログラムＭＯＬＭＯＬ（Koradiら、1996）を用いて作製した。
【００８３】
図５：水素結合を有するヒトコンセンサス（ａ）ＶＨ３および（ｂ）Ｖκ３ファミリーの電荷クラスターの詳細図。イメージは、プログラムＭＯＬＭＯＬ（Koradiら、1996）を用いて作製した。
【００８４】
図６：上部コア残基の詳細図。（ａ）ＶＨ４、（ｂ）ＶＨ１ａ及び（ｃ）ＶＨ５（各々薄いグレー）と黒のＶＨ３、並びに（ｄ）薄いグレーのＶλ１と黒のＶλ３の重ね合わせ。詳細については明細書を参照。保存されたＴｒｐ４３を示す。残基４、８０及び８２は、明細書で述べるパッキング差異に寄与しないため、示していない。イメージは、プログラムＭＯＬＭＯＬ（Koradiら、1996）を用いて作製した。
【００８５】
図７：フレームワーク１分類に対応する下部コア残基の詳細図。（Ａａ）ＶＨ１ａ（薄いグレー）とＶＨ３（黒）、（Ｂｂ）ＶＨ４（薄いグレー）とＶＨ３（黒）、並びに（ｃ）Ｖλ１（薄いグレー）とＶλ３（黒）の重なり合い。詳細については明細書を参照。保存されたＴｒｐ４３を示す。イメージは、プログラムＭＯＬＭＯＬ（Koradiら、1996）を用いて作製した。
【００８６】
図８：５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムでのｓｃＦｖフラグメント（５μＭ）の分析用ゲル濾過：
（ａ）Ｈ３κ３（実線）、Ｈ４κ３（長い破線）、Ｈ１ａκ３（短い破線）並びに、１Ｍ ＧｄｎＨＣｌの存在下でのＨ１ａκ３（短い破線）；
（ｂ）Ｈ３κ３（実線）、Ｈ３κ１（長い破線）、Ｈ３λ１（短い破線）、並びに１Ｍ ＧｄｎＨＣｌの存在下でのＨ３λ１（短い破線）。矢印は、分子量標準の溶出量：ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）、及びシトクロムｃ（１４ｋＤａ）を示す。
【００８７】
図９：境界面安定化の様々なケースを示すＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせ。各パネルで、ｓｃＦｖフラグメント（黒四角）と、付随する単離されたＶＨ（白四角）及びＶＬ（白丸）ドメインを示す。（ａ）Ｈ５κ３、（ｂ）Ｈ１ａκ３、（ｃ）Ｈ３κ１及び（ｄ）Ｈ３κ２を有する場合のすべての変性変化は、２８０ｎｍの励起波長での変性剤の濃度の関数として発光最大値（ｓｃＦｖフラグメント及びＶＨドメインの場合）または蛍光強度（ＶＬドメインの場合）の変化を追跡することにより、測定した。
【００８８】
図１０：Ｖλドメインでの境界面安定化における様々なＬ−ＣＤＲ３の役割を示すＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせ。λ様Ｌ−ＣＤＲ３を有するＨ３λ１を含む（ａ）及びκ様Ｌ−ＣＤＲ３を有するＨ３λ１を含む（ｂ）では、ｓｃＦｖフラグメント（黒四角）と、構成成分の単離されたＶＨ３（白四角）及びＶλ１（白丸）ドメインを示す。κ様ＣＤＲ３を有する単離されたＶλドメインは、非可逆的挙動を示すため、（ｂ）では、Ｖλ１の再生曲線も示す（黒丸）。すべての変性変化は、２８０nmの励起波長での変性剤の濃度の関数として発光最大値（ｓｃＦｖフラグメント及びＶＨドメインの場合）または蛍光強度（ＶＬドメインの場合）の変化を追跡することにより、測定した。
【００８９】
図１１：５μＭの濃度における、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムでの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌにおける２Ｃ２−ｗｔ、２Ｃ３−ａｌｌ、６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌの分析用ゲル濾過。６Ｂ３−ｗｔ（長い破線）と６Ｂ３−ａｌｌ（点線）は類似した溶出量を示す。矢印は、分子量標準の溶出量：ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）、及びシトクロムｃ（１２．４ｋＤａ）を示す。２Ｃ２−ａｌｌ及び６Ｂ３−ａｌｌが有する突然変異は、表７及び図１２に一覧を示す。
【００９０】
図１２：（ａ）２Ｃ２−ｗｔ、２Ｃ２−ａｌｌ、６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌ、（ｂ）単一突然変異（使用した略字：ａ＝Ｑ５Ｖ、ｂ＝Ｓ１６Ｇ、ｃ＝Ｔ５８Ｉ、ｄ＝Ｖ７２Ｄ、ｅ＝Ｓ７６Ｇ、ｆ＝Ｓ９０Ｙ及びａｌｌ＝ａｄｃｄｅｆ）、及び（ｃ）有利な特性を有するＶＨドメインのコンセンサスに対する多重突然変異、並びに（ｄ）ｓｃＦｖ２Ｃ２を用いて例示したフレームワーク１サブタイプＩＩＩに対する突然変異（使用した略字：ｇ＝Ｐ１０Ａ及びｇｈ＝Ｐ１０Ａ＋Ｖ７４Ｆ）のＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせ。（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）では、太い実線及び太い点線が、（ａ）の２Ｃ２−ｗｔ及び２Ｃ２−ａｌｌにそれぞれ示した実験データの当てはめ（Jagerら、2001）を示す。すべての変性変化は、２８０ｎｍの励起波長での変性剤の濃度の関数として発光最大値の変化を追跡することにより測定した。
【００９１】
図１３：アラインメントしたＨｕＣＡＬ ＶＨ配列。アミノ酸は、残基のタイプに応じて網がけした：芳香族残基（Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ）、疎水性残基（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）、非荷電親水性残基（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ）、酸性残基（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性残基（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ）。有利な特性のＶＨドメイン（ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３、ＶＨ５）及び不利な特性のＶＨドメイン（ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ６）のグループ間で相関した配列差異を示す残基は、四角で囲んだ。番号付けは、Kabatら（1991）、並びにHonegger及びPluckthun（2001b）に従う。
【００９２】
図１４：有利な特性を有するＶＨドメインのコンセンサスに対する単一突然変異の全体図。図の中央には、ＶＨ６（黒いリボン、ＰＤＢ登録名：１ＤＨＺ）とＶＬκ３ドメイン（グレーのリボン、ＰＤＢ登録名：１ＤＨ５）からなるモデルｓｃＦｖフラグメントが、矢印で指した単一突然変異と一緒に示されており、この矢印は、単一突然変異の拡大図を示している。すべてのイメージは、プログラムＭＯＬＭＯＬ（Koradiら、1996）を用いて作製した。番号付けは、Honegger及びPluckthun（2001b）に従う。
【００９３】
図１５：（ａ）野生型ＶＨ６ドメイン（ＰＤＢ登録名：１ＤＨＺ）及び（ｂ）改変Ｐ１０Ａ及びＶ７４Ｆを有する二重突然変異型のモデルにおいて、残基（６、７及び１０）及び相関残基（１９、７４、７８、９３）を決定するフレームワーク１サブタイプＩＩＩの全体図。（ｃ）リボンで表示するのは、黒いフレームのＶＨドメインであり、これは、（ａ）及び（ｂ）に描いた拡大領域を示している。すべてのイメージは、プログラムＭＯＬＭＯＬ（Koradiら、1996）を用いて作製した。番号付けは、Honegger及びPluckthun（2001b）に従う。
【００９４】
図１６：（ａ）２Ｃ２−ｗｔ及び２Ｃ２−ａｌｌ並びに（ｂ）６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌの結合活性の比較。抗原をコーティングしたチップに対する様々なｓｃＦｖ濃度の導入後、時間に対してプロットした共鳴単位と共に、ＢＩＡｃｏｒｅ実験を示す。実線は野生型ｓｃＦｖフラグメントを、また、点線は、有利なＶＨドメインのコンセンサスに向けた６種の突然変異すべてを有するｓｃＦｖフラグメントを示す。（ａ）では、１．２５、０．６３、０．３１及び０．１６μＭの濃度の２Ｃ２−ｗｔ及び２Ｃ２−ａｌｌが、（ｂ）では、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６及び０．０８μＭの濃度の６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌをプロットした。
【００９５】
図１７：６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌの競合ＢＩＡｃｏｒｅ分析。（ａ）６Ｂ３−ｗｔ（１６ｎＭ）及び（ｂ）６Ｂ３−ａｌｌ（１０ｎＭ）を、様々な濃度のミオグロビンと一緒に１時間インキュベートした後、ミオグロビンをコーティングしたセンサーチップに導入した。線形センサグラムから、対応する全可溶性抗原濃度に対し、傾き（共鳴単位対時間（秒））をプロットした。この傾きは、導入した溶液中の非複合体化ｓｃＦｖと相関する。Hanesら（1998）に従い、当てはめからＫｄを算出した。各点は、３つの独立した測定値の平均値である。実施例により、本発明を説明する。
【実施例】
【００９６】
以下に示す実施例では、分子生物学実験はすべて、標準プロトコル（Ausubelら、1999）に従い実施する。
【００９７】
実施例１
発現ベクターの構築
すべての発現ベクターについての出発点は、発現ベクターｐＢＳ１３（Knappikら、2000）におけるＶＨ−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４−ＶＬの配向のＨｕＣＡＬライブラリーのｓｃＦｖマスター遺伝子であり、これらはすべて、抗体ｈｕ４Ｄ５−８のＨ−ＣＤＲ３及びＬ−ＣＤＲ３を有していた（Carterら、1992）。７つの単離されたヒトコンセンサスＶＨドメインを、マスター遺伝子からＰＣＲ増幅した後、ＢｓｓＨＩＩとＳｔｙＩ制限部位との間のＣＤＲ３領域を、代謝選択により見いだされるＣＤＲ−Ｈ３をコードするYNHEADMLIRNWLYSDVに交換した（J. Burmesterら、未公表の結果）。最終発現プラスミドは、ベクターｐＡＫ４００（Krebberら、1997）の誘導体であり、そこには、７つの異なるＶＨドメインの発現カセットがＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位との間に導入され、また、ｓｋｐカセット（Bothmann及びPluckthun、1988）がＮｏｔＩ制限部位に導入されている。上記発現カセットは、ｐｈｏＡシグナル配列、短いＦＬＡＧタグ（DYKD）、７つのＶＨドメインの１つ、及びヘキサヒスチジンタグから構成される。
【００９８】
制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＥｃｏＲＩを用いて、マスター遺伝子から７つの単離されたヒトコンセンサスＶＬドメインを切り出した後、これをこれら制限部位を有するｐＡＫ４００誘導体に連結した。ＢｂｓＩとＭｓｃＩ制限部位との間のＶλドメインのＬ−ＣＤＲ３をQSYDSSLSGVV（１０７〜１３８）と交換した。このλ様Ｌ−ＣＤＲ３は、Ｖλドメインの場合には、Ｋａｂａｔデータベース（Kabatら、1991）に存在する配列からのコンセンサスＬ−ＣＤＲ３であり、１３６位に保存されたｃｉｓ−プロリンを有するｈｕ−４Ｄ５−８のκ様Ｌ−ＣＤＲ３とは対照的である。選択した長さのコンセンサスλ様Ｌ−ＣＤＲ３は、配列の２０％に認められ、これは、最も高いパーセンテージを示す。１０９位のトリプトファンは、５４％という最も頻度の高い残基であるが、これを、配列の２０％を占めるトリシンと交換することにより、保存された固有トリプトファンの天然（野生型）状態の蛍光シグナルを妨害しないようにする。最終発現カセットは、ｐｅｌＢシグナル配列、７つのＶＬドメインの１つ、及びヘキサヒスチジン−タグから構成される。
【００９９】
制限部位ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩを介して発現プラスミドｐＭＸ７中にｓｃＦｖフラグメントをクローニングした。前記のように、Ｖλドメインにおいてκ様Ｌ−ＣＤＲ３を交換した。最終発現カセットは、ｐｈｏＡシグナル配列、短いＦＬＡＧタグ（DYKD）、７つのＶＨドメインの１つ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー及び７つのＶＬドメインの１つ、長いＦＬＡＧタグ（DYKDDDD）並びにヘキサヒスチジン−タグから構成される。
【０１００】
可溶性ペリプラズム発現
ｄＹＴ培地（３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１．０％グルコースを含む３０ｍｌ）に単細菌コロニーを接種し、２５℃で一晩インキュベートした。１リットルのｄＹＴ培地（３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４）に前培養物を接種し、２５℃でインキュベートした（バッフル付き５Ｌフラスコ、１０５ｒｐｍ）。ＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭとなるまで添加することにより、ＯＤ５５０が１．０のときに発現を誘導した。インキュベーションを１８時間継続したところ、細胞密度は、ＯＤ５５０が８．０〜１１．０に達した。細胞を遠心分離（８，０００ｇ、４℃で１０分）により回収し、４０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐH７．５）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ中に懸濁させた後、フレンチプレス溶解により破砕した。粗抽出物を遠心分離（４８，０００ｇ、４℃で６０分）にかけ、上清を０．２μｍフィルターで濾過してから、ＩＭＡＣクロマトグラフィーに直接アプライした。
【０１０１】
分離用２カラム精製
２つのカラムを直列に連結した方法（Pluckthunら、1996）を用いてタンパク質を精製した。この手法では、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグを利用する固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムの溶出液をイオン交換カラムに直接導入した。イオン交換カラムからの溶出は、０〜８００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で行った。ＶＨ及びＶκドメインは、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）中のＨＳ陽イオン交換カラムで精製し、Ｖλドメイン及びｓｃＦｖフラグメントは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のＨＱ陰イオン交換カラムで精製した。プールした画分は、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。
【０１０２】
不溶性ペリプラズム発現
ＬＢ培地（３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１％グルコースを含む３０ｍｌ）に単一の細菌コロニーを接種し、３７℃で一晩インキュベートした。１リットルのＳＢ培地（１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、０．１％グルコース、０．４Ｍスクロース）に１０ｍｌの前培養物を接種し、２５℃でインキュベートした。ＩＰＴＧを最終濃度が０．０５ｍＭとなるまで添加することにより、ＯＤ５５０＝０．８で発現を誘導した。インキュベーションを２５℃で１５時間継続した。遠心分離の後、細胞を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２中に懸濁させた後、フレンチプレス溶解により破砕した。標準プロトコル（Buchner及びRudolph、1991）に従って、封入体を単離した。１Ｌの細菌培養物からの封入体ペレットを室温にて、１０ｍｌの可溶化バッファー（０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＤＴＴ）中で可溶化させた。得られた溶液を遠心分離にかけ、上清を、ＤＴＴを含まない可溶化バッファーに対して１０℃で透析した。このサンプルをニトリロトリ酢酸カラム（Qiagen）（Ｎｉ２＋で荷電されている）に導入し、変性条件下でＩＭＡＣを実施した。溶出液を再生バッファー（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、０．４Ｍアルギニン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセロール、０．５ｍＭε−アミノ−カプロン酸、０．５ｍＭベンズアミジニウム−ＨＣｌ）中で最終濃度が１μＭとなるよう１６℃で１０倍に希釈した。［ＧＳＨ］：［ＧＳＳＧ］のモル濃度比が０．２：１ｍＭ（酸化条件）又は５：１ｍＭ（還元条件）で、再生バッファーにおける還元又は酸化グルタチオンのいずれかの存在により、ジスフィルド結合の形成を触媒した。再生混合物を１６℃で２０時間インキュベートし、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。
【０１０３】
Ｎｉ−ＮＴＡバッチ精製
ｓｃＦｖフラグメントのフレンチプレス溶解で得た２０ｍＬの上清を２ｍＬの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリーと一緒に室温で３０分インキュベートした。懸濁液を直径１．５ｃｍの空のカラムに導入し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１Ｍ ＮａＣｌで十分に洗浄した。非特異的結合タンパク質を除去するため、カラムを３０ｍＭイミダゾールで洗浄した。２５０ｍＭイミダゾールを添加することにより、ｓｃＦｖフラグメントを溶出した。サンプルの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により確認した後、２８０ｎｍでの吸光度により濃度を決定した。対照として常にＨ３κ３と同時に、４つのｓｃＦｖフラグメントを精製した。Ｈ３κ３の収率、並びにＯＤ５５０が１０の１Ｌの発現培養物に対し収率を正規化した。
【０１０４】
不溶性タンパク質比の決定
１ＬのｓｃＦｖフラグメント発現実験から得たフレンチプレス溶解抽出物のアリコートを４℃で３０分かけて１６，０００ｇにて遠心分離した。上清（可溶性画分）及び沈降物（不溶性画分）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁させた）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した後、記載されている（Lindnerら、1997）ように、抗Ｈｉｓ抗体３Ｄ５を用いたウエスタンブロットを実施した。ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒＴＭ４４００（Alpha Innotech Corporation）を用いて化学発光を検出し、ソフトウエアＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒＴＭ５５００（Alpha Innotech Corporation）を用いてバンドの密度を測定した。この方法は多くのステップを含んでおり、誤差が高い可能性があるため、誤差が１０％と推定して、１０位までの端数を切り捨てて不溶性物質のパーセンテージとして数値を示す。
【０１０５】
ゲル濾過クロマトグラフィー
精製されたタンパク質のサンプルを５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＮａＣｌで平衡したゲル濾過カラムで分析した。ＳＭＡＲＴシステム（Pharmacia）を用いて、５０μＬの量及び６０μＬ／分の流速で、濃度が５μＭの単離されたＶＨドメイン及びｓｃＦｖフラグメントをＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラム（Pharmacia）に、また、濃度が５０μＭ及び５μＭの単離されたＶκドメインをＳｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラム（Pharmacia）に注入した。ＨＰＬＣシステム（ＨＰ）を用いて、シリカを基材とするＴＳＫ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（TosoH）に、５０μＬ量、濃度５μＭ、及び流速０．５ｍＬ／分で、Ｖλドメインを注入した。リゾチーム（１４ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）及びウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）を分子標準として用いた。溶出の後、ＳＭＡＲＴシステムの場合には２８０ｎｍで、また、ＨＰＬＣシステムの場合には２２０ｎｍでの吸光度を検出した。
【０１０６】
超遠心分離
ＸＬ−Ａ分析用超遠心分離装置（Beckmann）で、沈降平衡を決定した。サンプルを１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び１００ｍＭ ＮａＣｌに対して一晩透析し、サンプルＯＤ２８０が０．４で、標準６チャンネルの１２ｍｍ光路長（pathlength）セルに充填した。各セルセクターに過フッ化炭化水素ＦＣ４３を添加することにより、仮底をつくる。サンプルは、２０℃にて１９，０００ｒｐｍで２４時間にわたり遠心した。０．００１ｃｍの半径方向間隔、２８０ｎｍでデータを収集し、各サンプルについて、最少１０スキャンを平均した。以前に記載されている（Liuら、1998）ように、単一種又は単量体−二量体平衡のいずれかの存在を仮定したモデルを用いて、装置製造者により提供されたソフトウエアでデータを分析した。標準方法を用いて、溶媒密度及びサンプルの部分量を算出した。
【０１０７】
ＶＨドメインの発現及びタンパク質精製
主要フレームワークサブクラスを呈示する７つのＨｕＣＡＬコンセンサスＶＨドメインを同じＣＤＲ−Ｈ３で発現させることにより、それらの生物物理学的特性を比較することができる。まず、ＶＨドメインを抗体ｈｕ４Ｄ５−８からのＣＤＲ３（WGGDGFYAMDY）（Carterら、1992）を用いて調べたが、ＶＨドメインは、それ自体で発現した場合には不溶性であり、小さな封入体ペレットだけが得られた。これは驚くことではない。何故なら、ＶＨドメインは、露出した広い疎水性境界面（通常はＶＬで覆われている）を含むため、全部ではないにしろ多くが、ペリプラズム発現時にそれ自体では不溶性となるためである（Jagerら、2001；Jager及びPluckthun、1999b；Wirtz及びSteipe、1999）。しかし、近年、ＨｕＣＡＬからの３つの単離されたＶＨドメイン（フレームワーククラスＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ３を有するもの）が、代謝選択実験において選択された。これらは、大腸菌のペリプラズムで発現させ、細胞抽出物の可溶性画分から精製することができた。選択されたＶＨドメインの主な特徴は、ＣＤＲ３の長さである。というのは、３つの選択された可溶性ＶＨフラグメントはすべて、長いＣＤＲ３を含むからである。この長いＣＤＲ３は、ＶＨの疎水性境界面を覆い、これにより、凝集を阻止している可能性がある。選択されたＶＨ３ドメインの１つに由来するＣＤＲ３（YNHEADMLIRNWLYSDV）を導入することにより、大腸菌のペリプラズムにおいてＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ３を可溶性形態で発現させ、２ｍｇ／ｌの収率で細胞抽出物の可溶性画分から精製することができた。
【０１０８】
対照的に、ＶＨ２、ＶＨ４、ＶＨ５及びＶＨ６は、大腸菌ペリプラズムで依然として不溶性であった。これらのドメインは、変性条件下でＩＭＡＣを用いて不溶性画分から精製し、溶出した画分をｉｎ ｖｉｔｒｏ再生に供した。酸化グルタチオンのレドックスシャッフルを用いて、１Ｌの大腸菌培養物から、約１ｍｇの可溶性の再生したＶＨ５ドメインを得ることができた。ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６は、還元された過剰量のグルタチオンを含むレドックスシャッフルを用いてしか再生することができず、１ｌの大腸菌から約０．２ｍｇの可溶性の再生タンパク質を回収した。ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ５は、４℃で溶解したままであり、分解は観察されなかった。これとは対照的に、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６は、４℃になると、凝集する高い傾向を有する。従って、後の実験はすべて、新しく精製されたタンパク質を用いて実施した。
【０１０９】
分析用ゲル濾過
精製されたＶＨドメインのサンプルを、ＳＭＡＲＴシステム（Pharmacia）を用いて、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌで平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムで分析した。ＶＨドメインを２μＭの濃度で、５０μｌの量を注入したが、その際、流速は５０μｌ／分とした。リゾチーム（１４ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）及びウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）を分子標準として用いた。
【０１１０】
溶解した精製ドメインのオリゴマー状態を分析するために、分析用ゲル濾過実験を実施した。ＶＨ１ｂ、ＶＨ３、及びＶＨ５は、予想したサイズの単量体（図１ａでは、単量体ＶＨドメインの例として、ＶＨ３を示す）で溶出する。ＶＨ１ａは、天然条件下で、特定することができない３つのピークで溶出する。従って、本発明者らは、少量の変性剤が凝集体を分解できるかどうかを調べた。０．５Ｍ ＧｄｎＨＣｌを含む溶出バッファーを用いると、特定されないピークが減少し、上記サイズの単量体でピークが出現した。０．９Ｍ ＧｄｎＨＣｌでは、ＶＨ１ａは、単量体に相当する単一のピークで溶出する（図１ｂでは、０及び０．９Ｍ ＧｄｎＨＣｌでのＶＨ１ａの溶出プロフィールを示す）。ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６は、天然条件下では、カラムから溶出しなかった。溶出バッファーに１．７Ｍ ＧｄｎＨＣｌを添加しても、これらのドメインがカラムに付着するのを阻止できなかった。溶出は、１Ｍ ＮａＯＨでしか達成できなかった。
【０１１１】
ＶＨフラグメントの平衡変性実験
蛍光スペクトルをＰＴＩアルファスキャン分光蛍光計（Photon Technologies, Inc. オンタリオ、カナダ）を用いて２５℃で記録した。励起及び発光には、それぞれ、２ｎｍ及び５ｎｍのスリット幅を用いた。新しく精製したタンパク質及びＧｄｎＨＣｌ原液（５０ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中、７．２Ｍ）から、０．５μＭの最終タンパク質濃度と、０〜５Ｍの濃度範囲のＧｄｎＨＣｌの変性剤を含むタンパク質／ＧｄｎＨＣｌ混合物（２ｍｌ）を調製した。ＧｄｎＨＣｌの各最終濃度は、その屈折率から決定した。１０℃で一晩のインキュベーション後、２８０ｎｍの励起波長で、３２０から３７０ｎｍまでサンプルの蛍光発光スペクトルを記録した。変性濃度を上げていくと、記録した蛍光スペクトルの最大値は、約３４２から３４８ｎｍまでシフトした。蛍光スペクトルをガウス関数に当てはめる（単離されたＶＨドメイン及びｓｃＦｖフラグメント）ことにより、蛍光最大値を決定するか、あるいは、３４５ｎｍでの蛍光強度（単離されたＶＬドメイン）をＧｄｎＨＣｌ濃度に対してプロットした。記載されている（Jagerら、2001）ように、単離したヒトコンセンサスＶＨ及びＶＬドメインのタンパク質安定性を算出した。１プロットでのＶＨ、ＶＬ及びｓｃＦｖ変性曲線を比較するために、最高値を１に、最低値を０に設定することにより、相対蛍光最大値及び蛍光強度を概算した。
【０１１２】
ＧｄｎＨＣｌ平衡変性実験により、７つのヒトコンセンサスＶＨドメインの熱力学的安定性を試験した。変性剤濃度に応じた蛍光最大値のシフトにより、ＶＨドメインの変性（unfolding）をモニタリングした。図２ａは、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ５の平衡変性曲線の重ね合わせを示す。図２ｂでは、重ね合わせを正規化することにより、変性（折りたたまれていない）タンパク質の画分を示す。これらドメインの平衡変性は、協同的かつ可逆的であり、これは、二状態挙動を示す。ＶＨ１ａドメインは、０．９Ｍ ＧｄｎＨＣｌで変性し始めるが、この時点で、ゲル濾過分析により示されるように、ＶＨ１ａは溶解状態の単量体である。従って、この変化は、単量体ＶＨ１ａドメインの安定性だけの影響を受けるのであって、多量体化平衡には影響されない。変性の自由エネルギーを決定するために、ＶＨ１ａの変化前の領域（その実際の傾きは、解離によって起こるスペクトル変化の影響を受ける）が、ＶＨ１ｂドメインと同じ傾き及び切片を有すると仮定した。ＶＨ３は、自由エネルギーの最高変化を変性（ΔＧＮ−Ｕ）時に５２．７ｋＪモル−１及び変性協同性（ｍＵ）時に１７．６ｋＪモル−１Ｍ−１呈示する。ＶＨ１ｂは、ΔＧＮ−Ｕが２６．０ｋＪモル−１及びｍＵが１２．７ｋＪモル−１Ｍ−１で、中間の安定性である。ＶＨ１ａ及びＶＨ５は、上記より安定性が低く、それぞれ、ΔＧＮ−Ｕ値が１３．７及び１９．９ｋＪモル−１と、ｍＵ値が１０．１及び８．６ｋＪモル−１Ｍ−１である（表１）。ｍＵ値の範囲は、このサイズ（１４〜１５ｋＤａ）のタンパク質の予想値と比較可能であり、これは、少なくともＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ３が、二状態変化に予想される協同性を有することを示している（Myersら、1995）。図２ｃにおけるＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６の変化曲線が呈示する協同性は乏しく、これは、ＧｄｎＨＣｌ平衡変性中に二状態挙動が起こらないことを示している。これらＶＨドメインの単量体状態は確認することができなかったが、この複雑化した変化の一部は多量体の解離に関与すると考えられる。１．６及び１．８Ｍ ＧｄｎＨＣｌをそれぞれ中間点として、１．０〜２．５Ｍ ＧｄｎＨＣｌの間でＶＨ２及びＶＨ４の広範な変化が起こった。ＶＨ６は、中間点を０．８Ｍとして、０．５〜１．４Ｍ ＧｄｎＨＣｌの間で変化を示す。これは、試験したドメインの中で最も低い中間点であり、これは、ＶＨ６が最も安定性の低いヒトＶＨドメインであることを意味している。
【０１１３】
ＶＬフラグメントの発現及びタンパク質精製
抗体ｈｕ４Ｄ５−８（配列：HYTTP（Carterら、1992））からのκ様Ｌ−ＣＤＲ３を保有する４つのヒトコンセンサスＶκドメイン（Ｖκ１、Ｖκ２、Ｖκ３及びＶκ４）を大腸菌のペリプラズムにおいて可溶形態で発現させた。ＩＭＡＣ、続いて陽イオン交換カラムによる精製後、Ｖκドメインを多量に取得することができ、その量は、ＯＤ５５０＝１０に正規化した細菌培養物１Ｌ当たり、Ｖκ３の１７．１ｍｇから、Ｖκ１の４．５ｍｇまでの範囲であった（表１）。κ様Ｌ−ＣＤＲ３は、１３６位に保存されたｃｉｓ−プロリンを有する（可変ドメイン残基の番号付け手法は、Honegger及びPluckthun、2001に従う）。Ｖλドメインのアミノ酸配列は、この位置にプロリンを示すことは決してない。従って、本発明者らは、これらのドメインに、ヒトコンセンサスλ様ＣＤＲ３（配列：YDSSLSGV）を用いた。３つのヒトコンセンサスＶλドメイン（Ｖλ１、Ｖλ２及びＶλ３）も、大腸菌のペリプラズムにおいて可溶形態で発現させたが、ＩＭＡＣ及び陰イオン交換カラムによる精製後の収率は、Ｖλドメインの方がはるかに低く、ＯＤ５５０＝１０に正規化した細菌培養物１Ｌ当たり、Ｖλ２の１．９ｍｇから、Ｖλ１の０．３ｍｇまでの範囲であった（表１）。
【０１１４】
ＶＬフラグメントの分析用ゲル濾過
単量体ＶＨフラグメントが、１３ｋＤａ前後の予想分子量で溶出する（図１ａ）のに対し、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ中のＶＬドメインは、様々なカラム材料と相互作用する。Ｖκドメインの場合には、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ−１２カラムで最良の結果を取得することができた（図１ｂ）。５０μＭのタンパク質濃度では、Ｖκ３及びＶκ２は、２ｋＤａの分子量で、κ４は１２ｋＤａで溶出し、また、Ｖκ１は、カラム全量でも、広範なピークで溶出する。Ｖκ４の濃度を５０〜５μＭに変えると、ピークは２ｋＤａの分子量にシフトするが、これは、２ｋＤａで溶出するＶκドメインは単量体、また１２ｋＤａで溶出するＶκドメインは二量体であるという仮定のもとに、濃度依存的二量体−単量体平衡を示している（以下参照）。１Ｍ ＧｄｎＨＣｌの添加、又はＮａＣｌ濃度を２Ｍにするという示唆では、溶出プロフィールは変化しなかった。５μＭの濃度でのＶλドメインは、シリカを基材とするＴＳＫカラムとの非特異的相互作用を示し（図１ｃ）、Ｖλ１及びＶλ２は７ｋＤａの分子量で、またＶλ３は、１２ｋＤａの見かけ分子量で溶出する。
【０１１５】
分析用ゲル濾過からのこれらの結果を解釈するために、サンプルを平衡超遠心分離により分析した。この方法を用いて、ＶＬドメインについて様々なカラムの溶出値を較正した。Ｖκ３及びＶλ２からは、単量体と一致する結果が得られたが、λ３は二量体（１例として、Ｖκ３に関する図１ｄに示す）を呈示する。従って、６ｋＤ及び２ｋＤの見かけ分子量でそれぞれ溶出するＶＬドメイン：Ｖκ２、Ｖκ３並びにＶλ１及びＶλ２は、実際に単量体であり、１２ｋＤａで溶出するＶＬドメイン：Ｖκ４及びＶλ３は二量体である。カラムの全量でも溶出する（カラム材料との強力な相互作用を意味する）Ｖκ１は、超遠心分離では単量体として挙動する（表１）。
【０１１６】
ＶＬフラグメントの平衡変化実験
ほとんどのＶＬドメインは、ただ一つのトリプトファン（高度に保存されたＴｒｐ４３）を有し、これは、天然状態ではコア内に位置している。天然条件下でのＧｄｎＨＣｌ変性では、蛍光がジスフィルド結合Ｃｙｓ２３−Ｃｙｓ１０６により完全に消光することから、発光最大値を決定することはできなかった。変性の間にトリプトファンは溶媒に暴露され、蛍光強度の急速な上昇をもたらす。従って、ＧｄｎＨＣｌ濃度対蛍光強度のプロットに関して６−パラメーターフィット（Pace及びScholtz、1997）を用いて、熱力学的パラメーターを計算することにより、二状態挙動と一致する曲線が得られた。ＶＬドメインはすべて、可逆的変性挙動を示す（データは示していない）。図３（ａ）及び３（ｂ）は、Ｖκ及びＶλドメインのＧｄｎＨＣｌ濃度に対する相対蛍光強度のプロットを示す。Ｖκ３は、ΔＧＮ−Ｕが３４．５ｋＪモル−1の最も安定したＶＬドメインであり、次に、２９．０ｋＪモル−1のＶκ１、さらに、それぞれ２４．８及び２３．７ｋＪモル−1のＶκ２及びＶλ１が続く（表１）。最も安定性の低いＶＬドメインは、１６．０及び１５．１ｋＪモル−1のＶλ２及びＶλ３である。ＶＬドメインはすべて、１１．１〜１６．２ｋＪモル−1Ｍ−１のｍ値を示すが、これは、これらドメインが二状態変化に予想される協同性を有することを意味する（Myersら、1995）。ヒトコンセンサスＶκ４は、保存されたＴｒｐ４３以外に、５８位に露出したトリプトファンを有し、これは天然状態では消光しない。変性曲線は完全に可逆性であるが、前変化の急勾配の後に、非協同的変化を示す。この不確実性のために、Ｖκ４のΔＧＮ−Ｕ値はなく、変化の中間点だけが報告され、これは１．５Ｍ ＧｄｎＨＣｌの地点である。Ｖκ４ドメインＬｅｎについては、３２ｋＪ／モルの安定性が報告されている（Raffenら、1999）。
【０１１７】
一次配列及びモデル構造の分析
単離されたＶＨフラグメントのグループでは、大きな差異がみられる。ＶＨ３は可溶性タンパク質の最高収率と最高熱力学的安定性を示し、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ５は、中間の収率と中間又は低い安定性を示すのに対し、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６は、変性剤誘導の変性の間により凝集しやすい挙動と低い協同性を示す。Ｖκ及びＶλドメインの特性はこれより均質である。熱力学的安定性は、ＶκのグループとＶλドメインのグループでは、約１０ｋＪ／モルしか違わない。一般に、安定性と可溶性収率は、Ｖλドメインより単離されたＶκドメインの方が高い。可変抗体ドメインのこのような挙動の違いを説明しうる構造的理由を分析するために、一次配列と、７つのヒトコンセンサスＶＨ及びＶＬドメインのモデル化構造を分析した。モデルについては、以前公表されている（Knappikら、2000）（ＰＤＢ登録名：１ＤＨＡ（Ｈ１ａ）、１ＤＨＯ（Ｈ１ｂ）、１ＤＨＱ（Ｈ２）、１ＤＨＵ（Ｈ３）、１ＤＨＶ（Ｈ４）、１ＤＨＷ（Ｈ５）、及び１ＤＨＺ（Ｈ６））並びにＶＬドメイン（ＰＤＢ登録名：１ＤＧＸ（κ１）、１ＤＨ４（κ２）、１ＤＨ５（κ３）、１ＤＨ６（κ４）、１ＤＨ７（λ１）、１ＤＨ８（λ２）、１ＤＨ９（λ３））。モデルの品質は、各ドメインによって変動する。タンパク質データバンク（Protein Data Bank）における多数の抗体構造は、例えば、ＶＨ３フレームワークを使用し、モデルを構築するのに選択される鋳型構造は、ＣＤＲ３領域（ＰＢＭ登録名：１ＩＧＭ）を除いて８６％の配列同一性を有し、鋳型間の構造的差異を追跡することにより、配列差異を識別することができた。ＶＨ６の場合には、ＰＤＢでＶＨ６生殖系列ファミリーのメンバーの結晶構造を入手できないため、最も類似した鋳型がヒトＶＨ４及びマウスＶＨ８ドメインであった。両方の生殖系列ファミリーは、ＶＨ６（ＩＩＩ）とは異なるフレームワーク１構造サブタイプ（Ｉ）をコードする（Honegger及びPluckthun、2001）。ＶＨ６について選択した鋳型（ＰＤＢ登録名：７ＦＡＢ）は、ＣＤＲ３領域を除いて、６２％配列同一性を有し、ヒトＶＨ４に属する。単離した状態のドメインに関して３つの疑問が生じてくる。すなわち、ＶＨ３は例外的に安定しているのかどうか、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６は、発現及び凝集に関して比較的挙動が劣っているのかどうか、Ｖκドメインは、Ｖλドメインより、高い収率をもたらし、安定性が高いのかどうか。
【０１１８】
塩橋
正の電荷をもつアミノ酸と負の電荷をもつアミノ酸との間の塩橋、並びに、同じ電荷をもつアミノ酸間の反発作用は、タンパク質安定性に重要な役割を果たす（Nakamura、1996）。図４ａは、それぞれ特徴的な二次構造を有するＶＬκ３及びＶＨ３ドメインからなるｓｃＦｖフラグメントの概略図を示す。図４ｂには、ｐＨ７．０において正の電荷をもつ残基をグレーで、負の電荷をもつ残基を黒でそれぞれ示す。ドメインの底部（base）には荷電残基が集積している。ＶＨドメインには、保存された残基Ａｒｇ４５、Ｇｌｕ５３、Ａｒｇ７７及びＡｓｐ１００が、Ａｒｇ４５−Ｇｌｕ５３、Ａｒｇ４５−Ａｓｐ１００、及びＡｒｇ７７−Ａｓｐ１００を連結する内部の保存された塩橋を形成している（図５ａ）。７７位において、ＶＨ５の共通残基（consensus）は、他のサブファミリーの共通残基のＡｒｇではなく、Ｇｌｎである（表２）。この変化により、Ａｒｇ７７とＡｓｐ１００を連結する保存されている塩橋が消失する。さらに、９７位及び９９位の荷電残基は、電荷クラスターの一部となる可能性がある。ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ６のみが９９位にＧｌｕを有する。これらのドメインは、ＰＤＢ登録名が１ＩＧＭの構造に認められるようにＧｌｕ９９−Ａｒｇ４５間に別の塩橋を、又はＰＤＢ登録名が１ＢＪ１、１ＩＮＥ、２ＦＢ４及び１ＶＧＥの構造に認められるようにＧｌｕ９９−Ａｒｇ７７間に別の塩橋を形成しうる。
【０１１９】
ＶＬドメイン（図５（ｂ））においては、４５位のアミノ酸は非荷電であり、５３位及び９７位のアミノ酸は、ＶＨドメインにおけるこれらの位置のアミノ酸と比較して保存されているか、又は非荷電である。従って、電荷クラスターは、ただ１つの保存された塩橋（Ａｒｇ７７とＡｓｐ１００を連結する）と、１つの主鎖−側鎖水素結合（Ｇｌｕ９７とＡｒｇ７７を連結する）を含む（図５（ｂ））。最も安定性が低いＶκドメインＶκ２は、４５位にＬｅｕを有し、これはＴｙｒ１０４との側鎖−側鎖水素結合を形成することができない。この結合は、他のＶＬドメイン、またＶＨドメインでも保存されている（図５（ａ）及び（ｂ））。
【０１２０】
疎水性コアパッキング
別の重要な安定化因子は、疎水性コアパッキングである（Pace、1990）。すべてのモデル構造をキャビティーについて検査した。キャビティーは、不適正なパッキングを意味し、これによって、ファンデルワールス相互作用が減少し、熱力学的安定性が低下する。ファンデルワールス接触表面は、プログラムＭｏｌｍｏｌ（Koradiら、1996）を用いて、１．４Åの水半径（water radius）で作成した。キャビティーをみつけたら、その周辺の残基が該キャビティーに対する疎水性表面積に寄与することがないかどうかを調べた。疎水性残基で覆われたキャビティーは、このような位置では水分子がエネルギー的に不利になるため、さらに不都合である。これらのキャビティー、並びに様々な可変ドメインフレームワーク間の配列比較に基づいて、疎水性コア内の位置を確認することができ、これによって、準最適パッキングが達成されると考えられる。図４Ｃに、分析したコア残基の全体図を示す。コア残基を２つの領域、すなわち図４ａに示す配向に従い上部及び下部コアの２つの領域に区分した。上部コアは、Ｔｒｐ４３より上方の内部残基、Ｃｙｓ２３とＣｙｓ１０６間の保存されたジスルフィド結合、並びにＣＤＲに向いたＧｌｎ／Ｇｌｕ６から構成される。ＣＤＲ残基の一部は、上部コアに含まれ、その結果、様々なＣＤＲが上部コア（及び全体の安定性に対するその寄与）に強力な影響を及ぼし、その逆に、上部コアの残基もＣＤＲのコンホメーション（及び抗原結合のアフィニティー又は特異性）に影響を及ぼす（Eigenbrotら、1993）。下部コアは、Ｔｒｐ４３より下方にあり、そのコンホメーションは、６位、７位、１０位及び７８位のアミノ酸の種類に関連する（Saul及びPoljak、1993）。
【０１２１】
上部コア
残基２、４、２５、２９、３１、４１、８０、８２、８９及び１０８は、上部コアを形成する。表２に示した配列アラインメントでは、これらの残基を可変ドメインについて比較している。ＶＨドメインでは、２つの配列モチーフを識別することができる。すなわち２９位及び３１位に２つの大きな芳香族残基を含むＶＨ３様モチーフ（ＶＨ１ｂ、ＶＨ３、ＶＨ５）、２５位及び２９位の芳香族残基の代替位置（ＶＨ２）、並びに４１位にＴｒｐ、及び２５位に大きな脂肪族残基を含むＶＨ４／ＶＨ６モチーフ。図６（ａ）は、ＶＨ３上へのＶＨ４の重ね合わせを示し、前記モチーフ間の差異を強調している。ＶＨ３様モチーフでは、Ｐｈｅ２９及びＰｈｅ３１が、隣接する残基２、２５、３１及び１０８間の空隙を充填している。ＶＨ４／ＶＨ６モチーフでは、前記２つの残基が、より小さな残基に変化している。ここで、Ｔｒｐ４１及びＶａｌ２５のメチル基が空隙を充填している。ＶＨ１ａは、ＶＨ３様モチーフに属するが、２９位にはＰｈｅではなく、Ｇｌｙを有する。この空隙を埋める残基は他にはなく、その結果、疎水性キャビティーが生じる（図６（ｂ））。ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ５は、８９位にＬｅｕ（ＶＨ３）ではなく、Ａｌａを有する。このイソプロピル基の喪失に対する明確な埋め合わせはない。加えて、Ａｌａ２５（ＶＨ３）をＶＨ５のＧｌｙに置換する（表２）のはメチル基の喪失と同等であり、ＶＨ５の上部コアのパッキングをさらに弱化させる（図６（ｃ））。
【０１２２】
図６（ｄ）は、Ｖκ及びＶλドメインの代表例としてのＶκ３及びＶλ１ドメインの上部コアの重ね合わせを示す。ＶＨドメインと比較して、Ｖκドメインのパッキング密度は小さいが、これは、ＶＨドメインが少なくとも２つの芳香族残基を有するのに対し、Ｖκドメインの上部コアには８９位にただ１つの大きな芳香族アミノ酸しかないためである（表２）。Ｖλドメインではパッキング密度はさらに低下する。というのは、２５位及び８９位に、Ｖκドメインがそれぞれ有するＡｌａ／Ｓｅｒ及びＰｈｅではなく、これより小さいＧｌｙ及びＡｌａがあるためであり、これは、Ｖλドメインの熱力学的安定性が低いことと一致する。
【０１２３】
下部コア
ＶＨドメインでは、安定性と、Honegger及びPluckthun（Honegger及びPluckthun、2001）に従うフレームワーク１分類の間に興味深い相関が見られる。これは、下部コアの疎水性コアパッキングに影響を与え（Saul及びPoljak、1993）、６位、７位及び１０位のアミノ酸の種類によって決定される（表３）。最も安定したＶＨ３ドメインは、サブグループＩＩに入るが、中間の特性を有するＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ５は、サブグループＩＩＩに入る（表３）。高い封入体傾向を示し、かつ協同的変性を呈示しないＶＨドメインであるＶＨ２及びＶＨ４は、サブグループＩに入る。ＶＨ６は、６位にＧｌｎを含み、７位にＰｒｏが存在しないことから、サブグループＩＩＩのメンバーである。しかし、以前の実験（Jungら、2001）から、１０位のＰｒｏはこのドメインを不安定化することがわかっている。
【０１２４】
残基１９、７４、７８、９３及び１０４（表２）は下部コアの一部であり、これらは、残基１３、１９、２１、４５、５５、７４、７７、７８、９１、９３、９６、１００、１０２、１０４及び１４５から構成されている。最も安定したフレームワークであるＶＨ３だけが７８位に大きな芳香族アミノ酸残基（Ｐｈｅ）を有する。しかし、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ５は、７４位にＰｈｅを有するため、７４位と７８位の残基を単に入れ替えるだけで、恐らく、同様の相互作用が起こるであろう（図７（ａ））。ＶＨ５は、９３位での別の交換（ＭｅｔからＴｒｐに）を有する。ＶＨ５におけるこの別の芳香族残基が、Ｐｈｅ７８の喪失と、電荷クラスターでの不十分な相互作用とを埋め合わせるのを助けうる（前記参照）。Ｔｙｒ１０４以外に、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６の下部コアを安定化する別の芳香族残基はない（図７（ｂ））。
【０１２５】
ＶＬドメインでは、ただ１つのフレームワーク１サブタイプしかなく（Honegger及びPluckthun、2001）、その結果、Ｖκ及びＶλドメインの下部コア残基はほとんど同じであり、類似した配向を有する（表２及び図７）。
【０１２６】
溶解度及びフォールディング効率に影響を与えうる残基
不十分な発現挙動、並びに熱力学的理由よりも速度論のために凝集する傾向の高さ（Fink、1988）と相関する可能性がある残基をさらに調べた。この分析は、優れた生物物理学的特性のＶＨ（ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ５）により分類したヒトコンセンサスＶＨドメインと、より凝集しやすいＶＨドメイン（ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６）との配列アラインメントから開始した（表３）。
【０１２７】
露出した疎水性残基の突然変異は、天然ｓｃＦｖフラグメントの溶解度（塩析により測定）は変えないが、ｉｎ ｖｉｖｏフォールディング率には多大な影響を及ぼすことがすでに明らかにされている（Niebaら、1997）。５位が溶媒に露出されると、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６の親水性残基Ｇｌｎ又はＬｙｓは、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ５の疎水性Ｖａｌとは対照的に、凝集傾向を低下すると考えられる。しかし、安定性に有利な選択実験（Jungら、1999）では、ｓｃＦｖ ４Ｄ５ＦｌｕのＶａｌ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ及びＧｌｕからＶａｌが選択され、これは恐らく局部的二次構造性質の重要性を示すと思われる。
【０１２８】
ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６は、１６位に保存された正のφ角をもつ非グリシン残基を有し（図４（ｄ））、これは、好ましくない局部的コンホメーションの原因となる。１６位に非Ｇｌｙ残基を有すると決定された構造（例えば、ＰＤＢ登録名：１Ｃ０８、１ＤＱＪ、１Ｆ５８）から、正のφ角が局部的に維持され、明らかに周囲（surroundings）によって強化されていることが確かにわかる。対照的に、奇数番号のＶＨはすべて、この位置にＧｌｙを有する。
【０１２９】
抗体ＭｃＰＣ６０３については、Knappik及びPluckthun、1995により、４８位にある別のＰｒｏに隣接するＰｒｏ４７をＡｌａと交換しても、熱力学的安定性は向上しないが、フォールディング効率が増強することが明らかにされている。ＶＨ２及びＶＨ４はまた、４７位にＰｒｏを有する。ＶＨ６では、５８位で、高度に保存された疎水性コア残基ＩｌｅをＴｈｒと交換するが、これには、不満足な水素結合供与体が内部に含まれている。
【０１３０】
Ｈ１０位でのプロリン残基は、ＦＲ１コンホメーションに強力な影響を及ぼす。ＶＨ構造は、Ｈ６位、Ｈ７位及びＨ１０位に存在するアミノ酸の種類に応じて、それぞれ異なるＦＲ１コンホメーションと、下部コアのパッキングでの相関する差異を有する４つのサブタイプに分類することができる（Honegger及びPluckthun、2001a）。これらの残基が確かにコンホメーションの相違を引き起こすことを証明するために、Jungら（2001）は、同じＶＨドメインに様々なＨ６／Ｈ７／Ｈ１０残基の組み合わせを導入し、Ｘ線結晶学によって構造に対する影響を測定した。それらの系では、１０位にＰｒｏを含むすべての組み合わせは、同じ位置にＧｌｙ、Ａｌａ又はＳｅｒを含む分子と比較して不安定であった。これらの構築物は、この位置に通常異なるアミノ酸を含むＶＨドメインと「不自然な」組み合わせでＰｒｏを含んでいたため、不安定化作用は局部配列と全体配列との間のミスマッチに起因するとも考えられ、挙動が不十分なＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６はすべてＰｒｏ１０を含むのに対し、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３及びＶＨ５は、この位置にＧｌｙ又はＡｌａを有する。
【０１３１】
４４位に、奇数番号のＶＨドメインのＶａｌとは対照的に、偶数番号のＶＨドメインはＩｌｅを有する。この位置は、ＶＬとの境界面に位置し、単離されたドメインに一切影響を与えることはないが、ＶＬとの複合体の場合には、影響を及ぼすに相違ない。偶数番号のＶＨドメインの露出したＣＤＲ２残基６０は、大きな芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ及びＴｙｒ）であり、フォールディング効率を低下させる可能性がある。この残基は、抗原結合に関与する可能性があるために、交換することはできない。
【０１３２】
抗体ＭｃＰＣ６０３において溶媒露出残基７２を疎水性残基ＡｌａからＡｓｐに換えると、可溶性／不溶性比を２０倍高めるが、熱力学的安定性は変わらない（Knappikら、1995）。ＶＨ６は、この位置に疎水性Ｖａｌを有する。
【０１３３】
奇数番号のＶＨドメインは、偶数番号のＶＨドメインが７６位にＴｈｒ又はＳｅｒを有するのとは対照的に、同位置にＧｌｙを有する。ＰＤＢに見出されると判定された抗体構造の半分で、この位置の残基は正のφ角を有するが、これは、この位置でグリシンの方がよいことを示している。
【０１３４】
ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ５の半分内側に存在する（semi-buried）９０位にはＴｙｒが位置するのに対し、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６はＶａｌ又はＳｅｒを有する。偶数番号のドメインの不十分な挙動に対するこの置換の影響は実験でしか試験することができない。
【０１３５】
ＶＬドメインは、主としてκ及びλドメインに分類することができるため、分析は、これら２つのグループの比較に基づいて行なった。１４６位、１４８位及び１４９位での溶媒露出Ｃ末端で、Ｖκドメインは、Ｖλドメインがこれらの位置にＴｈｒ、Ｌｅｕ及びＧｌｙをそれぞれ有するのと対照的に、荷電アミノ酸を有する（表４、図４（ｄ））。さらに、κドメインの１３８位の親水性Ｔｈｒをλドメインの疎水性Ｖａｌと交換する（表４、図４（ｄ））。Ｖλドメインにおける非親水性残基のこのような交換により、これらドメインのフォールディング効率が低下し、Ｖκドメインと比較して低い可溶性収率に寄与する要因となりうる。
【０１３６】
プロリンは、αヘリックス及びβ鎖切断因子（breaker）であるため、それらの二次構造を不安定化する。ＶＬドメインの１２位及び１８位は、両者ともβシート構造の一部である。Ｖκ２だけが両位置にＰｒｏを有し、他のＶＬドメインではそれぞれＳｅｒ及びＡｒｇがこれらの位置で優勢な残基である（表４、図４（ｄ））。
【０１３７】
ｓｃＦｖフラグメントの発現及びタンパク質精製
単離されたヒトコンセンサスＶＨ及びＶＬドメインの生物物理学的特性決定の後、ＶＨ及びＶＬの体系的組み合わせも試験することにより、生物物理学的特性に対するそれらの相互の影響を理解し、可変ペプチドリンカーを介してＶＨドメインがＶＬドメインに結合されているｓｃＦｖを選択した。４９の可能なＶＨ−ＶＬ組み合わせの数を制限するために、最も安定なＶＨドメインＶＨ３を有するｓｃＦｖフラグメントを７つのヒトコンセンサスＶＬドメインの各々と組み合わせて試験し、逆に、最も安定なＶＬドメインＶκ３を７つのヒトコンセンサスＶＨドメインの各々と組み合わせた。ｓｃＦｖフラグメントにおける単離された可変ドメインの個々の生物物理学的特性の相互補償又は付加があるか否か、あるいは、相乗効果が起こりうるか否かを試験しなければならない。
【０１３８】
ｓｃＦｖフラグメントにおけるＶＨドメインはすべて同じＨ−ＣＤＲ３を有し、これは、良好に発現する抗体４Ｄ５のＶＨドメインから誘導される（Knappikら、2000；Carterら、1992）。ｓｃＦｖフラグメントにおけるＶκ及びＶλドメインは、それぞれκ様及びλ様Ｌ−ＣＤＲ３を有する。すべてのｓｃＦｖフラグメントをペリプラズムにおいて可溶形態で発現させ、ＩＭＡＣで精製した後、陰イオン交換カラムに付すことができた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、フラグメントの純度は９８％を超えることが確認され（データは示していない）、後の測定はすべて、新しく精製したタンパク質を用いて実施した。様々なＶＨ又はＶＬドメインを有するｓｃＦｖフラグメントの発現率を比較するために、本発明者らは、さらにバッチ方法でこれらｓｃＦｖを単離した。収率測定に固有の誤差を試験するために、ｓｃＦｖ Ｈ３κ３を４回独立に精製した。ＯＤ５５０＝１０（上記条件下で振盪フラスコ内の最終細胞密度の近似値である）に正規化した１Ｌ細菌培養物から精製したＨ３κ３の収率は、６．５±０．２ｍｇであった。試験した全ｓｃＦｖフラグメントの収率をＨ３κ３の収率に正規化すると、２．６〜１２．４ｍｇ／Ｌの範囲となった（表５）。Ｈ１ａκ３及びＨ１ｂκ３は、それぞれ１１．１ｍｇ／Ｌ及び１２．４ｍｇ／Ｌ（Ｈ３κ３の量の１．７倍及び１．９倍）と、最高収率を示すのに対し、Ｈ２κ３、Ｈ４κ３及びＨ６κ３は、Ｈ３κ３の０．６倍、０．４倍及び０．６倍であり、Ｖκ３ドメインを含むｓｃＦｖフラグメントの最低収率を示す。ＶＨ３を含むが、ＶＬドメインが異なるｓｃＦｖフラグメントはすべて、Ｈ３κ３より低い収率しか示さない。不溶性タンパク質率は、Ｈ３κ３について４つの独立した測定で（３０±１０）％と決定した。試験したその他のｓｃＦｖフラグメントは、５０％〜１０％の不溶性タンパク質率を示すが、Ｈ２κ３、Ｈ４κ３及びＨ６κ３は例外で、これらは８０％〜９０％の不溶性タンパク質率を示す（表５）。
【０１３９】
ｓｃＦｖフラグメントの分析用ゲル濾過
Ｈ３κ３は、２９ｋＤａの見かけ分子量で、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ中５μＭのタンパク質濃度で、分析用ゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５から溶出するが、これは、Ｈ３κ３が溶解状態では単量体であることを示している。ＶＬドメインとしてＶＬκ３を含む他のｓｃＦｖフラグメントも上記条件下で単量体であるが、Ｈ１ａκ３は例外で、これは、単量体ピーク以外に、これより小さい二量体及び多量体ピークも示す。Ｈ４κ３は、これに加えて、１０％未満の少量の二量体を示す。図８（ａ）は、Ｈ１ａκ３及びＨ４κ３と一緒に、単量体ｓｃＦｖフラグメントの一例としてＨ３κ３のクロマトグラムを示す。ＶＨ３及びＶκドメインを含むｓｃＦｖフラグメントはすべて単量体であるが、Ｈ３κ１は、加えて小さな二量体ピークを示す（図８（ｂ）は、単量体ｓｃＦｖフラグメントの一例としてのＨ３κ３、並びにＨ３κ１を示す）。対照として、Ｖλドメインを含むｓｃＦｖフラグメントはすべて、単量体−二量体平衡を示し、二量体の含量は、Ｈ３λ１の場合の２０％から、Ｈ３λ２の場合の７０％までである（図８（ｂ）は、Ｖλドメインを含むｓｃＦｖフラグメントの一例としてＨ３κ１を示す）。溶出バッファー中１Ｍ ＧｄｎＨＣｌを用いて、天然条件下で二量体画分を含んだすべてのｓｃＦｖフラグメントは、２９ｋＤａの見かけ質量での単一ピークで溶出し、これは、これらフラグメントがその時点で完全に単量体であることを示している。１Ｍ ＧｄｎＨＣｌにおけるクロマトグラムを、Ｖλドメインを含むｓｃＦｖフラグメントの一例としてＨ１ａκ３については図８（ａ）に、Ｈ３λ１については図８（ｂ）にそれぞれ示す。この濃度は、すべてのｓｃＦｖフラグメントの主要変化より低いことに留意すべできである。唯一の例外はＨ３λ２であり、これは１m ＧｄｎＨＣｌ中に２０％の含量の二量体をまだ含んでいる。２Ｍ ＧｄｎＨＣｌでは、Ｈ３λ２もただ一つの単量体ピークしか示さない（データは示していない）。
【０１４０】
ｓｃＦｖフラグメントの平衡変性（脱折りたたみ）実験
変性剤の濃度の関数としてｓｃＦｖフラグメントの変性（脱折りたたみ）及び再生（再折りたたみ）を、２８０nmでの励起後の蛍光発光の最大値のシフトにより、モニターした。各ｓｃＦｖフラグメントは、可逆的変性挙動を示す（データは示していない）。ｓｃＦｖフラグメントは、２つのドメインから構成されており、これらのドメインは異なる固有の安定性を有し、境界面領域にわたって相互作用し、潜在的に互いを安定化させることができるため、ｓｃＦｖの変性は通常二状態過程ではない（Worn及びPluckthun、2001）。従って、ΔＧＮ−Ｕ値はまったく報告されないが、変性の変化の中間点が与えられる。これは、ｓｃＦｖフラグメントの安定性の半定量的測定値である。ＶＨ又はＶＬドメインへの変化の指定（assignment）は、単一ドメインの変化の決定により行なわれる（表１）。表５では、ｓｃＦｖフラグメントにおけるＶＨ及びＶＬドメインについて中間点の一覧を示す。１つの変化だけが見える場合には、中間点をＶＨ及びＶＬドメインの両方に指定する。
【０１４１】
単離されたＶＨ及びＶＬドメインの変性特性、並びにｓｃｆｖフラグメントにおけるこれらドメインの組み合わせがわかれば、ｓｃＦｖフラグメントの安定性に対し境界面相互作用が及ぼす影響を体系的に研究することが可能になる。様々なケースを区別することができる（Worn及びPluckthun、1999）。すなわち、単離されたＶＨ及びＶＬドメインの安定性が非常に類似していれば、得られるｓｃＦｖも同じ安定性を有する（例としてＨ５κ３を示す図９（ａ）を参照）。一方のドメインが他方より有意に安定している場合には、安定性の低い方を他方のドメインとの境界面相互作用により安定化させることができる（ＶＨ１ａを安定化する、安定性が高い方のＶκ３を有するＨ１ａκ３を示す図９（ｂ）、並びに、Ｖκ１を安定化する、安定性が高い方のＶＨ３を有するＨ３κ１を示す図９（ｃ）を参照）。しかし、ドメインの安定性が異なっていても、安定性が低い方のドメインの安定化が起こらないこともありうる（例としてＨ３κ２を示す図９（ｄ）を参照）。
【０１４２】
Ｖλドメインを含むｓｃＦｖフラグメントは、単離された単一ドメインのいずれよりも安定していることから、興味深い挙動を示す（例としてＨ３λ１を示す図１０（ａ）を参照）。明らかに、ＶＨとＶＬドメインの間の境界面相互作用が非常に強いため、単離されたドメインの固有の安定性以上に、ドメインが安定化されている。境界面が最終的に崩壊すると、ｓｃＦｖ内の単離されたドメインは直接変性するが、これは、急速な変化を説明している。この驚くべき挙動は、Ｌ−ＣＤＲ３の配列に強く依存している。
【０１４３】
Ｖλドメインもクローニングし、κ様Ｌ−ＣＤＲ３で精製した。κ様Ｌ−ＣＤＲ３を含む単離されたＶλドメインは極めて収率が低かった。これらは、変性剤誘導平衡変性において可逆的挙動を呈示せず、λ様Ｌ−ＣＤＲ３を含む対応するＶλドメインより低い変性中間点を有する。ＶＨ３と、κ様ＣＤＲ３を有するＶλドメインとの組み合わせは、分析用ゲル濾過において、λ様ＣＤＲ３を有するものと同様の収率及び二量体／単量体比を示すが、ＧｄｎＨＣｌ変性における挙動は異なっている。例として、図１０（ｂ）は、κ様Ｌ−ＣＤＲ３を有するＨ３λ１を示すが、その際、単離されたＶλ１の再生曲線と比較して、Ｖλ１ドメインはわずかにしか安定しておらず、これは、この場合、境界面安定化がそれほど強くないことを示している。図１０（ａ）及び（ｂ）に示す２つのｓｃＦｖフラグメントの相違は、Ｌ−ＣＤＲ３が異なることだけであり、これが、明らかにこのような劇的な安定化の違いの原因であることに留意すべきである。１３６位にプロリンを含むκ様ＣＤＲ３は、剛性のΩループを形成し、これが恐らくＶＨとＶＬの間の完全な配向を妨害していると考えられる。
【０１４４】
要約すると、変性が２Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ以上でしか開始しないことが明らかになった最も安定なｓｃＦｖフラグメントは、Ｈ３κ３、Ｈ１ｂκ３、Ｈ５κ３及びＨ３κ１である。単離されたＶλドメインはそれ自体ではむしろ不安定であり、ＶＨ３と組み合わせて、非常に安定なｓｃＦｖフラグメントを構成することができるが、この効果はＬ−ＣＤＲ３に依存する。このＣＤＲが、ＶＬからＶＨへの有利な配向を生み出し、従って、境界面を介したより緊密な相互作用を可能にすると考えられる。１Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ以上で変性を開始し、安定性が中間のｓｃＦｖフラグメントは、Ｈ１ａκ３、Ｈ２κ３、Ｈ３κ２及びＨ３κ４であり、また、Ｈ４κ３及びＨ６κ３は、安定性があまり高くなく、１Ｍ ＧｄｎＨＣｌ以下で変性を開始するｓｃＦｖフラグメントである。
【０１４５】
実施例２：一般化手法による免疫グロブリンＶＨドメインの生物物理学的特性の構造に基づく改善
略語
ＣＤＲは、相補的決定領域；ＧｄｎＨＣｌは、塩酸グアニン；ＨｕＣＡＬは、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー；ＩＭＡＣは、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；ＩＰＴＧは、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド；ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーによって連結された重鎖及び軽鎖の可変ドメインからなる一本鎖抗体フラグメント；ＶＨは、抗体の重鎖の可変ドメイン；ＶＬは、抗体の軽鎖の可変ドメインをそれぞれ示す。
【０１４６】
ｓｃＦｖフラグメントにおいてコンセンサスＶＨ及びＶＬドメインを単独で用いて、並びに、組み合わせて実施したＶ遺伝子ファミリーの体系的実験から、本発明者らは、ヒト生殖系列ファミリー２、４及び６のＶＨドメインを含む抗体フラグメントでは、発現収率が比較的低く、平衡変性の協同性はさらに低いことがわかった。疎水性コアのパッキング、電荷クラスターの完全性、不満足な水素結合の発生、並びに、低βシート傾向、正のφ角及び露出した疎水性側鎖を有する残基の分析から、本発明者らは、これらの生殖系列コード配列の不十分な特性の原因と考えられる残基を正確に指摘した。これらのいくつかは、偶数番号サブグループのドメイン間で共通であるが、奇数番号のドメインには存在しない。この実験で、本発明者らは、ＶＨ６フレームワークを用いて、２つの異なるｓｃＦｖフラグメントにおいて上記残基を単独で、並びに組み合わせて体系的に交換し、それらの平衡安定性及びフォールディング率への影響を説明する。本発明者らは、安定性を２０．９ｋＪ／モル、発現率を４倍向上させた。そして現在、これらのデータを用いて、さらに優れた生物物理学的特性を有する上記及び類似生殖系列ファミリーに由来する抗体を合理的に作製することができる。さらには、本発明者らは、上記フレームワークにより提供される有意な追加多様性を活用するライブラリーのために改善された設計を提供する。実験した両抗体はともに、完全にその結合アフィニティーを保持しており、これは、ＣＤＲのコンホメーションが影響を受けなかったことを示している。
【０１４７】
組換え抗体は、生物学的研究から治療まで、増え続けている用途に用いられる。高い抗原特異性及びアフィニティーを呈示する以外に、このような組換え抗体は、要求される用途に応じて、高収率で取得できること、凝集傾向が低いこと、並びに、高い変性剤濃度、高温及びプロテアーゼに対して安定していることが求められる。これらの用途の多くに対して人気の高い形態は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントであり、その際、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）は、可変リンカーを介して、軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）と連結するか、あるいは、その逆も成立する（１〜３）。この形態は、完全な抗原結合部位を含み、細菌（４）及び酵母（５）を含む非常に多種の宿主に発現させることができる。本発明者らは、ｓｃＦｖフラグメントの単純な構造がドメイン相互作用の解決をはるかに容易にすると考え、ｓｃＦｖフラグメントに関する前述の疑問について研究することを決めたが、同じドメインを含むＦａｂフラグメント及び抗体全体における物理的特性の違いも明らかになった。
【０１４８】
生物物理学的挙動に重要な突然変異は、平衡熱力学的安定性若しくはフォールディング中の凝集傾向のいずれか、又はその両方に影響を与えうる。これらの特性は識別可能であり、これら特性の１つだけに影響を与える突然変異は知られており（以下を参照）、往々にしてそれらは関連し、アミノ酸交換は両方に作用を及ぼしうる。熱力学的安定性に影響を与える突然変異は、以下のような多様なタイプの相互作用に寄与する可能性がある：疎水性コアのパッキング、二次構造性質、電荷相互作用、水素結合、変性時の不溶化、強化した局部構造との適合性、並びにその他多数（６、７）。フォールディング効率に影響を与える突然変異も、中間体の安定性が重要な要素であるため、上記リストに含まれる。さらにここで、天然タンパク質は、「負の設計（negative design）」（８）を用いて、凝集を防止する。これにより、その最も単純な形態で、表面上の疎水性パッチが阻止される。抗体の場合には、このような疎水性パッチは、天然タンパク質の溶解度（正しくは、可溶性天然タンパク質の最大濃度として定義される）にほとんど影響を及ぼさないことがわかっている（９）。疎水性パッチは、フォールディング収率、従って、大腸菌における機能的タンパク質の収率には極めて劇的な影響を及ぼしうる。この収率は口語で「溶解度」と呼ばれることが多いが、これは誤りである。というのは、上記収率は可溶性タンパク質を生産する過程全体を表わすのであって、その溶解度ではないからである。
【０１４９】
ｓｃＦｖフラグメントの場合には、その２ドメイン性質のためにさらに複雑さが増している。２つのドメインは、互いを安定化し、ドメインの相対固有安定性及びそれらの境界面に応じて、協同的に又は平衡中間物と一緒に、のいずれかで、変性することができる（１０）。しかし、ドメイン相互作用に関する研究、並びに、単離されたドメイン及びそれらの相互作用の体系的研究（実施例１と、１１を参照）から、本発明者らは現在この系を解明することができる。本発明者らは、問題箇所を正確に突きとめ、本明細書の実験で、これらの小さな欠点を修正することにより、実際に表現型の顕著な改善が達成されることを証明したいと思う。
【０１５０】
従って、熱力学的安定性から発現収率を区別することが重要である。抗体のペリプラズム発現では、機能的タンパク質の観察された発現レベルを制限する最も重要なものはペリプラズムフォールディング収率である（４）。機能的タンパク質の収率が低い抗体は、ペリプラズム凝集体を発生する。可溶性タンパク質の発現収率の増加をもたらす三つの主要機構があり、それらは、全発現レベルの増加（ただし、フォールディング収率は一定とする）、大腸菌におけるフォールディング収率の増加、又は大腸菌プロテアーゼによる分解の減少である。三つの機構はすべて、菌株、発現ベクター、培地組成、及び発現温度（参照（４）にまとめる）の選択、並びにペリプラズマシャペロンの共発現（１２、１３）を含む外因性因子の影響を幾分受ける。しかし、折りたたまれたタンパク質の発現収率の変化に対する主な寄与は、タンパク質配列自体の変化によるものである。同じベクターに位置する分泌タンパク質の場合には、翻訳開始領域と、タンパク質配列（シグナル配列）の開始は、様々な変異体で同じである。従って、配列変化がそれ自体で翻訳に影響を与えるとはほとんど考えられない。熱力学的安定性をさらに高める突然変異もタンパク質のプロテアーゼ消化を低下させることが多い。というのは、大腸菌プロテアーゼは、通常、基質として変性タンパク質を選択するからである。しかし、大腸菌プロテアーゼの潜在的切断部位を除去する突然変異も分解を阻止する可能性がある。
【０１５１】
従って、突然変異は、タンパク質の平衡熱力学的安定性に影響するのとは独立に、フォールディングの効率にも影響を与えると考えられる。フォールディング過程の副反応は、往々にして、凝集したタンパク質を生成させ、これは封入体を豊富に含む。多いフォールディング及び凝集への速度論的分配には、中間物の熱力学的安定性を高める、又は溶媒暴露疎水性残基を除去する、あるいは、表面を凝集体の成長に不適にする（「負の設計」（８））いずれかの突然変異によって、影響を与えることができる。さらに、フォールディング効率を高める突然変異も、外側膜の漏出を招き、その結果、大腸菌の生存能を減弱させる有毒な副産物（多くの場合、可溶性凝集体）の形成を阻止することにより、間接的に、高い全発現レベルをもたらすことができる。
【０１５２】
ｓｃＦｖフラグメントの可溶性タンパク質の熱力学的安定性及び収率を向上させる残基を見いだす様々な手法がある（Worn及びPluckthunにより概説（７））。以前は、ほとんどの作業が、個々の抗体の最適化に集中していた。改善しようとする抗体の三次元（３Ｄ）構造がわかれば、詳細な分析によって、問題を起こす残基を同定し、これらを部位特異的突然変異誘発によって交換することができる（１４〜１６）。第２の手法では、ランダム突然変異誘発の後、所望する特性の改善に向かう偏り（bias）を含む選択を実施する（１７〜１９）。第３の手法としてのコンセンサス手法（２０）は、免疫系によって自然にコードされた抗体からの配列情報を用いる。すべての遺伝子ファミリーについて想定されているように、免疫グロブリン可変ドメインの遺伝子は、同義遺伝子重複及び突然変異により分岐している。選択された遺伝子はさらに、抗体が高いアフィニティーで抗原構造と結合する能力を最適化する体細胞突然変異により、加速した「局部」進化を行うが、これらの突然変異は生殖系列では伝搬されない。対照的に、現在のＩｇ遺伝子座をつくるために原始Ｖ遺伝子の重複の間に取得された突然変異は、生殖系列ファミリーに特異的な差異として明らかである。本発明の実験で、本発明者らは、生殖系列コード化ＶＨ、Ｖκ及びＶλファミリーの生物物理学的特性についての本発明者の知識と、前記の知識とを統合して、抗体の生物物理学的特性を改善する遺伝的手法を探究しようとした（実施例１、１１参照）。本発明者らは、初めに生殖系列コード化配列を有する遺伝子に的を絞ったため、本発明者らの手法は個々の分子の改善、従って、体細胞突然変異により導入された改変の除去に限定されないが、特に、様々な生殖系列遺伝子によりコード化された問題残基に関する。
【０１５３】
不安定化突然変異は、起こる確率が非常に高いが、ドメイン安定性全体が特定の閾値を下回らない限り、選択において中立である（２０）。反対に、熱力学的安定性の向上をもたらすランダム突然変異は、正の選択が存在しないと、起こる確率は極めて低い。その結果、相同免疫グロブリン可変ドメインのアラインメントにおけるあらゆる位置で最も頻度の高いアミノ酸が、該タンパク質ドメインの安定性に最も有利であるはずである。この方法をＶκドメインについて試験したところ、提案した１０種の突然変異のうち、６つが安定性を高めた。しかし、この手法に特有の単純化は、すべてのフレームワークを単一の「理想的」配列に平均化することである。様々な生殖系列遺伝子又はフレームワークは、抗体多様性に関して重要な機能を有する。第１に、外側ループ内のフレームワーク残基、及び二回軸に近いフレームワーク残基は、それぞれタンパク質−及びハプテン−抗原に対する重要な相互作用に寄与することができる。第２に、いくつかのフレームワーク領域は、ＣＤＲのコンホメーションに影響を与え、これによって、抗原結合を間接的にモジュレートすることができる。第３に、様々なフレームワークは相互に不適合な残基を有するが、これらを単純に他のフレームワークの残基と交換することはできない。その結果、優れた特性を有する多種多様なフレームワークを作出するには、ファミリー特異的な解決法が必要になる。本明細書で、本発明者らはこの手法の基本を提供する。
【０１５４】
近年、本発明者らは、ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー（ＨｕＣＡＬＴＭ）（２１）からのヒト生殖系列ファミリー特異的コンセンサスドメインの生物物理学的特性を分析した（実施例１と、１１を参照）。ＶＨドメインの場合には、本発明者らは、ＶＨ３生殖系列ファミリー特異的コンセンサスドメインが最も安定したＶＨドメインであり、次に、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ５コンセンサスドメインが中間の安定性で、凝集しやすい挙動はほんのわずかかまったくないことを見いだした。これに対し、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６ドメインは、変性剤誘導変性中の協同性が低く、また、収率は低く、凝集傾向が高いことがわかった。疎水性コアパッキング及び塩橋形成についての詳細な分析から、ＶＨ３ドメインは常に最適溶液であるのに対し、その他のＶＨドメインはすべて何らかの欠点があることが明らかになり、ＶＨ３の高い熱力学的安定性を説明している。さらに、有利な特性（ファミリー１、３及び５）及び不利な特性（ファミリー２、４及び６）を有するＶＨドメイン別に分類した配列アラインメントを用いて、フォールディング効率を潜在的に低下させる（不利な特性の理由となる）偶数番号のＶＨドメインの残基を同定し、構造的に分析した。
【０１５５】
この研究では、本発明者らは、ヒト生殖系列ファミリー特異的コンセンサスＶＨドメインの生物物理学的特性の知識を利用した構造に基づく手法を用い（実施例１と、１１を参照）、加えて、モデルとしてＶＨ６フレームワークを改善するための公表されている所内選択実験（A. Honeggerら、未公表）の表を参照した。本発明者らは、ＶＨ６フレームワークを選択した。何故なら、このフレームワークは、他のヒトＶＨドメインと比較して、ある程度凝集しやすい挙動を呈示し、変性の中間点が最も低く、このことは、ＶＨ６が最も低い熱力学的安定性を有するＶＨドメインであることを示しているからである。これらの特性は、単離されたドメイン、並びにＶκ３を含むｓｃＦｖ形態でも観察されている（実施例１と、１１参照）。本発明者らは、ＨｕＣＡＬ（２１）から選択されたＶＨ６フレームワークを含む次の２つのｓｃＦｖフラグメントを用いた：トランスフェリンに連結したペプチドＭ１８と結合する２Ｃ２、及びミオグロビンと結合する６Ｂ３（詳細については、「材料及び方法」を参照）。部位特異的突然変異誘発を用い、かつ本発明者の構造分析に基づいて、６つの突然変異（Ｑ５Ｖ、Ｓ１６Ｇ、Ｔ５８Ｉ、Ｖ７２Ｄ、Ｓ７６Ｇ及びＳ９０Ｙ）を単独で、及び数種の組み合わせで導入した。上記突然変異は、独立に作用し、個別に交換可能であると仮定され、また、不利な特性のファミリーから、有利な特性のＶＨファミリーのグループを識別する特徴でもあった。本発明者らは、これらの突然変異体と野生型ｓｃＦｖフラグメントの比較を、フォールディング収率への影響、並びに、独立に、熱力学的安定性の測度である変性の自由エネルギーについて実施し、これら突然変異の付加度を決定した。
【０１５６】
発現ベクターの構築
ヒトコンセンサスドメインＶＨ６及びＶＬκ３（Ｈ−ＣＤＲ３：QRGHYGKGYKGFNSGFFDF及びＬ−ＣＤＲ３：QYYNIPT）を含むｓｃＦｖフラグメント２Ｃ２（A. Hahnら、MorphoSys AG、未公表の結果）は、トランスフェリンに連結した配列：CDAFRSEKSRQELNTIASKPPRDHVFのペプチドＭ１８（Jerini GmbH、ベルリン）に対するパニングにより取得したのに対し、ＶＨ６及びＶＬλ３（Ｈ−ＣＤＲ３：SYFISFFSFDY及びＬ−ＣＤＲ３：SYDSGFSTV）を含むｓｃＦｖフラグメント６Ｂ３（S. Mullerら、MorphoSys AG、未公表の結果）は、ウマ骨格筋由来のミオグロビン（Sigma）に対するパニングにより取得した。両方のｓｃＦｖフラグメントを制限部位ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩを介して発現プラスミドｐＭＸ７にサブクローニングした（２１）。Stratagene製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的突然変異誘発キットを用いて、製造者の指示に従い、様々な突然変異を導入した。抗体における固有のＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓａＢＩ及びＥｃｏＲＩ部位を用いて、制限フラグメントを交換することにより、多重突然変異を構築した。最終発現カセットは、ｐｈｏＡシグナル配列、短いＦＬＡＧタグ（DYKD）、配向：ＶＨ６ドメイン−（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカー−ＶＬドメインのｓｃＦｖフラグメント、続いて、長いＦＬＡＧタグ（DYKDDDD）及びヘキサヒスチジン−タグから構成される。
【０１５７】
発現及び精製
３０ｍＬのｄＹＴ培地（３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１．０％グルコースを含む）に単細菌コロニーを接種し、２５℃で一晩振盪させた。１リットルのｄＹＴ培地（３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、５０ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４を含む）にこの前培養物を接種してから、２５℃でインキュベートした（バッフル付き５Ｌフラスコ、１０５ｒｐｍ）。ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭまで添加することにより、ＯＤ５５０＝１．０で発現を誘導した。インキュベーションを１８時間継続すると、細胞密度は、ＯＤ５５０＝８．０〜１１．０に達した。細胞を遠心分離（８，０００ｇ、４℃で１０分）により回収し、４０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５００ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁させた後、フレンチプレス溶解により破砕した。粗抽出物を遠心分離（４８，０００ｇ、４℃で６０分）にかけ、上清を０．２μｍフィルターに通過させた。直列連結式２カラム法（４）を用いて、タンパク質を精製した。この手法では、Ｃ末端Ｈｉｓタグを用いた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムの溶出液をイオン交換カラムに直接載せた。イオン交換カラムからの溶出は、０〜８００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で達成した。ｓｃＦｖ ２Ｃ２由来の構築物を１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）中のＨＳ陽イオン交換カラムで精製し、６Ｂ３由来の構築物は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のＨＱ陰イオン交換カラムで精製した。プールした画分を５０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析した。タンパク質濃度をＯＤ２８０により決定した。可溶性収率を、ＯＤ５５０が１０の１リットル細菌培養物に正規化した。
【０１５８】
ゲル濾過クロマトグラフィー
精製したｓｃＦｖフラグメントのサンプルを、ＳＭＡＲＴシステム（Pharmacia）を用いて、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＮａＣｌで平衡したＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムにより分析した。サンプルは、５０μｌ量中５μＭの濃度で注入し、流速は６０μｌ／分であった。リゾチーム（１４ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）及びウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）を分子量標準として用いた。
【０１５９】
平衡変性実験
ＰＴＩアルファスキャン分光蛍光計（Photon Technologies, Inc.、オンタリオ、カナダ）で、蛍光スペクトルを２５℃で記録した。励起及び発光の両方に２ｎｍのスリット幅を用いた。新しく精製したタンパク質及びＧｄｎＨＣｌ原液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ中８Ｍ）から、０．５μＭの最終タンパク質濃度と、０〜５Ｍ ＧｄｎＨＣｌの変性剤濃度を含むタンパク質／ＧｄｎＨＣｌ混合物（１．６ｍｌ）を調製した。ＧｄｎＨＣｌの各最終濃度は、屈折率を測定することにより決定した。１０℃で一晩インキュベーションした後、サンプルの蛍光発光スペクトルを、２８０ｎｍの励起波長で、３２０ｎｍから３７０ｎｍまで記録した。変性剤濃度を高くすると、記録された発光スペクトルの最大値が約３４０ｎｍから３５０nｎｍに推移した。蛍光発光最大値は、蛍光発光スペクトルをガウス関数に当てはめることにより決定し、ＧｄｎＨＣｌ濃度に対してプロットした。タンパク質安定性を記載のように計算した（２２、２３）。１プロットでのｓｃＦｖ変性曲線を比較するために、最高値を１に、最低値を０に設定して、発光最大値を概算することにより、正規化放射最大値を得た。
【０１６０】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０中５μｇ／ｍｌの濃度で、ウマ骨格筋由来のミオグロビン（Sigma）及びトランスフェリンに連結したペプチドＭ１８（Jerini GmbH、ベルリン）をＭａｘｉｓｏｒｂ９６ウェルプレート（Nunc）に４℃で一晩かけてコーティングした。プレートを室温で２．０％スクロース、０．１％ウシ血清アルブミン（Sigma）、０．９％ＮａＣｌ中で２時間かけてブロッキングした。２μＭ〜０．１２５μＭの濃度でサンプルをインキュベートした後、α−テトラ−ｈｉｓ抗体（Qiagen）、次に、アルカリ性ホスファターゼとコンジュゲートした抗マウス抗体を用いて、結合したｓｃＦｖフラグメントを検出した。
【０１６１】
ＢＩＡｃｏｒｅ測定
２，７００共鳴単位（ＲＵ）のウマ骨格筋由来のミオグロビン（Sigma）でコーティングした１レーンと、２，５００ＲＵのトランスフェリンに連結したペプチドＭ１８（Jerini GmbH、ベルリン）でコーティングした１レーンと、対照面として１ブランクレーンを有するＣＭ５−チップ（Amercham Pharmacia）を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を実施した。再生のために、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０及び２Ｍ ＮａＳＣＮ中５μＭ〜０．０８μＭの範囲にある様々な抗体濃度を用いて、２５μＬ／分の一定流速で、各結合−再生サイクルを２５℃で実施した。同じチップ、バッファー及び再生条件での競合ＢＩＡｃｏｒｅ（２４、２５）を用いて、溶解状態での抗体解離定数の決定を実施した。一定濃度のｓｃＦｖフラグメントと、可変量の抗体を少なくとも１時間１０℃で前インキュベートした後、１００μＬの量のサンプルに導入した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア（Pharmacia）及びＳｉｇｍａＰｌｏｔ（SPSS Inc.）を用いることにより、データを評価した。線形センサグラムの解離期の傾きを全抗原濃度に対してプロットし、以前記載されている（２６）ように解離定数を計算した。
【０１６２】
野生型ｓｃＦｖフラグメントの特性
構造に基づく設計により生物物理学的特性を改善するための本発明者らの手法を試験するためのモデル系としてＶＨ６フレームワークを選択し、モデル系としてＨｕＣＡＬから選択される以下の２つのｓｃＦｖフラグメントを用いた：トランスフェリンと連結したペプチドＭ１８に結合し、Ｖκ３と対合するＶＨ６からなる２Ｃ２と、ミオグロビンに結合し、Ｖλ３と対合するＶＨ６からなる６Ｂ３。上記２つの抗体は、ＣＤＲ３が異なる（「材料及び方法」を参照）が、それ以外ではＶＨ６配列は同じである。野生型（ｗｔ）ｓｃＦｖフラグメント２Ｃ２及び６Ｂ３を大腸菌のペリプラズムに発現させた。ｓｃＦｖフラグメントは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてイオン交換カラムにより細胞抽出物の可溶性画分から精製した。ｓｃＦｖフラグメントの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定したところ、９８％を超えた（データは示していない）。ＯＤ５５０＝１０に正規化した１リットル細菌培養物の精製後の２Ｃ２−ｗｔ及び６Ｂ３−ｗｔの可溶性収率は、それぞれ１．２±０．１ｍｇ及び０．４±０．１ｍｇであった。ウエスタンブロットで決定したところ、発現させたタンパク質全量のそれぞれ約１０％及び２５％が不溶性の状態で認められた。オリゴマー状態を分析用ゲル濾過により決定した。両タンパク質ともに、２９ｋＤａの見かけ分子量で溶出するが、これは、両者が単量体であることを示している（図１１）。各タンパク質の熱力学的安定性を平衡ＧｄｎＨＣｌ変性により測定した。ｓｃＦｖフラグメントの変性を、変性剤濃度の関数として蛍光発光最大値の推移によりモニターした。図１２（ａ）は、２Ｃ２−ｗｔ及び６Ｂ３−ｗｔの変性曲線を示す。両方の曲線とも、ただ１つの変化しか示さないが、これは、ｓｃＦｖフラグメント内のＶＨ及びＶＬが同時に変性することを示している（１０）。折りたたまれた（folded）及び変性した（unfolded）状態の蛍光強度は類似しており、最大値は１７ｎｍしか変わらないため、最大値の推移を用いて、変性した分子の集団を決定することができる（２７）。ｓｃＦｖフラグメントの変性は二状態過程であると仮定して、変性ΔＧＮ−Ｕの自由エネルギーを決定することができる（２８、２９）。２Ｃ２−ｗｔはΔＧＮ−Ｕ５１．３ｋＪ／モルを、６Ｂ３−ｗｔはΔＧＮ−Ｕ５１．３ｋＪ／モルをそれぞれ示し、ｍ値はそれぞれ２５．２ｋＪモル−１Ｍ−１及び２７．４ｋＪモル−１Ｍ−１であった。これらのｍ値は、このサイズのタンパク質に予想された範囲内にあり、これは、両ｓｃＦｖフラグメントが二状態過程に予想される協同性を有することを示している（３０）。
【０１６３】
突然変異を選択する上での構造的根拠
ヒトＶＨ６フレームワークを含むｓｃＦｖフラグメント２Ｃ２及び６Ｂ３の特性を改善するための突然変異体の第１セットを構造モデルの分析から選択した。尚、この分析は、有利な生物物理学的特性を有するＶＨドメイン（ファミリー１、３及び５）と、不利な特性を有するＶＨドメイン（ファミリー２、４及び６）別に分類したヒトコンセンサスＶＨドメインの配列アラインメントに基づいて行なった。（図１３）。本発明者らの目的は、抗原結合に影響しそうにない、一般的に適用可能な突然変異を識別することであったため、フレームワークの残基に的を絞り、ＣＤＲ領域は排除した。２Ｃ２及び６Ｂ３において本発明者らが研究した残基を、特定の変化についての推論とともに以下に示す：
Ｑ５Ｖ：安定性に有利なｓｃＦｖ ４Ｄ５Ｆｌｕの選択実験で、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ及びＧｌｕの中から、この位置にＶａｌを選択した（１８）。５位は第１β鎖の一部であり、ＶａｌはＧｌｎと同様に高いβシート傾向を有する（３１）。しかし、露出した疎水性残基の突然変異は、ｉｎ ｖｉｖｏフォールディング収率に多大な影響を及ぼすことが既に示されている（９）。図１４は、ＶＨ６−ＶＬκ３ｓｃＦｖフラグメントのモデル（２１）（ＰＤＢ登録名：１ＤＨＺ（ＶＨ６）及び１ＤＨ５（ＶＬκ３））の５位のＧｌｎが溶媒に暴露されていることを示している。従って、ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ５の疎水性Ｖａｌとは対照的に、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６の親水性残基Ｇｌｎ又はＬｙｓがフォールディング効率を増強するのではないかと考えられる。要約すると、この突然変異は、βシート傾向を高める代償として、露出した疎水性残基を生成する。
【０１６４】
Ｓ１６Ｇ：ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６は非グリシン残基を有するが、それでも、フレームワーク１のループ内の１６位に保存された正のφ角を有し（図１４）、恐らくこれが不利な局部コンホメーションを引き起こすと考えられる。１６位に非グリシン残基を有すると認められた構造（例えば、ＰＤＢ登録名：１Ｃ０８、１ＤＱＪ、１Ｆ５８）から、確かに、正のφ角が局部的に維持され、明らかに周囲によって強化されていることがわかる。対照的に、奇数番号のＶＨはすべてこの位置にＧｌｙを有する。
【０１６５】
Ｔ５８Ｉ：５８位の残基は、高度に保存されたＩｌｅであり、これは疎水性コア内部に向いている（図１４）。ＶＨ６だけがこの位置にＴｈｒを有し、この位置には内部に不満足な水素結合供与体が含まれている。従って、この残基をＩｌｅに換えた。
【０１６６】
Ｖ７２Ｄ：溶媒暴露残基７２（図１４）を、抗体ＭｃＰＣ６０３において、ＡｌａからＡｓｐに換えたところ、不溶性ペリプラズム画分と比較して、可溶性ペリプラズム画分に存在するタンパク質の比率が２０倍増加したが、熱力学的安定性を測定可能な程度に改変することはなかった（１５）。これは、この残基がフォールディング効率に影響を及ぼしうることを示している。最も安定なＶＨファミリーＶＨ３のコンセンサス配列だけがこの位置にＡｓｐを有する。
【０１６７】
Ｓ７６Ｇ：奇数番号のＶＨドメインは、フレームワーク２の７６位にＧｌｙを有する（図１４）が、これとは対照的に、偶数番号のＶＨドメインはＴｈｒ又はＳｅｒを有する。ＰＤＢに存在する既知の抗体構造の半分で、この位置の残基は正のΦ角を有することから、この位置でのグリシンの選択は好適であるといえるだろう。
【０１６８】
Ｓ９０Ｙ：ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ、ＶＨ３及びＶＨ５の半分内側に存在する９０位（図１４）にはＴｙｒが位置するのに対し、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６はＶａｌ又はＳｅｒを有する。この残基は、フォールディングした免疫グロブリンのβシートの一部であり、ＶＨ６ではＳｅｒと交換するが、ＴｙｒはＳｅｒよりも高いβシート傾向を有する（３１）。
【０１６９】
２０位及び８８位では、官能基特異的差異もみられる（１３）。両位置での残基は溶媒に露出しており、βシートに参加する。２０位では、奇数番号のＶＨドメインは、Ｌｙｓ及びＡｒｇの塩基性残基を有するのに対し、偶数番号のドメインは、Ｔｈｒ又はＳｅｒを示す。８８位では、有利な特性を有するドメインはすべてＴｈｒを含み、不利な特性のドメインはＧｌｎを含む。しかし、これらの残基はすべて疎水性であり、同様のβシート傾向を有するため、フォールディング効率の差異は小さいと予想される。従って、これら残基は交換しなかった。
【０１７０】
単一突然変異
前述した６種の突然変異（Ｑ６Ｖ、Ｓ１６Ｇ、Ｔ５８Ｉ、Ｖ７２Ｄ、Ｓ７６Ｇ及びＳ９０Ｙ）を部位特異的突然変異誘発により２Ｃ２−ｗｔ及び６Ｂ３−ｗｔに導入した。１種の突然変異を有するｓｃＦｖフラグメントすべてを、野生型ｓｃＦｖフラグメントと同じ方法で発現させ、精製したところ、溶解状態で単量体であった（データは示していない）。単一突然変異体、及び後に構築した多重突然変異体のすべてにおいて、ペリプラズムにおける不溶性タンパク質に対する可溶性タンパク質の比率は一定であり、全発現レベルが増加した場合でもそうであった。生物物理学的データを表７にまとめる。２Ｃ２及び６Ｂ３において突然変異により生じた改善を比較するために、可溶性タンパク質の発現収率を、対応する野生型ｓｃＦｖフラグメントの収率に対して正規化した後、変性の自由エネルギー（ΔＧＮ−Ｕ）を、対応するｓｃＦｖ−ｗｔに対する差異（ΔΔＧＮ−Ｕ）として示す。変性剤誘導変性曲線を図１２（ｂ）に示す。
【０１７１】
非グリシン残基を正のΦ角と交換する単一突然変異（Ｓ１６Ｇ及びＳ７６Ｇ）の両方が、可溶性タンパク質の収率を約２倍高めた。熱力学的安定性も、野生型ｓｃＦｖフラグメントと比較して、２Ｃ２−Ｓ１６Ｇ及び６Ｂ３−Ｓ１６Ｇの場合にはΔΔＧＮ−Ｕがそれぞれ６．２及び７．３ｋＪ／モル、２Ｃ２−Ｓ７６Ｇ及び６Ｂ３−Ｓ７６ＧではΔΔＧＮ−Ｕがそれぞれ３．７及び３．５ｋＪ／モルと、両方の単一突然変異で増加した。ループ領域におけるＧｌｙへの突然変異は、さらに高い可変性をもたらし、これによって、ドメイン全体を安定化する逆平行βシートの最適配向が可能になる。これら突然変異体の収率が高いのは、恐らく、タンパク質の安定化したフォールディング状態によって起こるプロテアーゼ耐性及びフォールディング効率の増大によるものであろう。
【０１７２】
ＯＨ含有Ｔｈｒ５８のＩｌｅへの突然変異（疎水性コア内部に向かう）は、可溶性タンパク質の収率を変えることはなかったが、２Ｃ２−Ｔ５８Ｉ及び６Ｂ３−Ｔ５８ＩでΔΔＧＮ−Ｕがそれぞれ７．９及び６．８ｋＪ／モルと、熱力学的安定性の顕著な増加を引き起こした。この安定性の著しい向上は、疎水性コア内の疎水性Ｉｌｅの更なるファンデルワールス相互作用、並びに、Ｔｈｒを内含する際必要な不溶化がないことによるものである。興味深いことに、この突然変異は、可溶性タンパク質の収率に影響を及ぼさず、これは、フォールディング効率が増加していないことを意味する。
【０１７３】
βシート状の残基をより高いβシート傾向の残基と交換する突然変異（Ｑ５Ｖ及びＳ９０Ｙ）は両方とも、可溶性タンパク質の収率の約１．８倍の増加をもたらした。さらに、熱力学的安定性は、やや増加したが、２Ｃ２−Ｓ９０Ｙだけは例外で、野生型ｓｃＦｖフラグメントと比較してわずかに減少しているほどであった。これら構築物の分析から、βシートに参加する残基をより高いβシート構成傾向の残基と交換する突然変異は、より高いフォールディング効率のために、可溶性タンパク質の収率を増大可能であることがわかる。ｓｃＦｖフラグメントによっては、恐らく、突然変異した残基の配向が改善され、βシートにおける水素結合を安定化する配向を促進するために、熱力学的安定も高くなる。
【０１７４】
最後の単一突然変異は、溶媒露出疎水性残基を親水性残基と交換するものである（Ｖ７２Ｄ）。２Ｃ２−Ｖ７２Ｄ及び６Ｂ３−Ｖ７２Ｄにおける可溶性タンパク質の収率は、それぞれ３．２倍及び１．８倍増加する。２Ｃ２−Ｖ７２Ｄにおける熱力学的安定性は変わらないが、６Ｂ３−Ｖ７２Ｄでは、ΔΔＧＮ−Ｕが２．２ｋＪ／モルと、わずかに増加する。
【０１７５】
多重突然変異
改善が付加的であるかどうかを決定するために、本発明者らは、単一突然変異の組み合わせをクローニングした。多重突然変異を含むｓｃＦｖフラグメントを前記のように発現及び精製した後、分析用ゲル濾過にかけたところ、これらも溶解状態で単量体であることが証明された（図１１では例として２Ｃ２−及び６Ｂ３−ａｌｌを示す）。試験した２Ｃ２の全多重突然変異体の変性曲線は、１つの急速な協同的変化を示す（図１２（ｄ））ことから、ＶＨ６での６種の突然変異により、Ｖκ３ドメインが安定化されることがわかるが、これは恐らく、突然変異したＶＨ６ドメインが、疎水性ＶＨ−ＶＬ境界面相互作用を介してＶκ３を安定化するためと考えられる。対照的に、二重突然変異体６Ｂ３−Ｑ５Ｖ＋Ｓ１６Ｇ及び６Ｂ３−Ｔ５８Ｉ＋Ｓ７６Ｇの平衡変性の変化からは、６Ｂ３−ｗｔと比較して、協同性が低いことが明らかになり、ｍ値はそれぞれ１８．９及び１９．３ｋＪモル−１Ｍ−１であった。これは、変性がもはや二状態過程ではないことを示している。有利な特性を有するＶＨドメインのグループと比較して、上記配列に由来する６種の突然変異すべてを有するｓｃＦｖフラグメント６Ｂ３（６Ｂ３−ａｌｌ）はむしろ低い協同性を示し、ｍ値は１４．３ｋＪモル−１Ｍ−１であった（図１２（ａ））。Ｖλ３ドメインは、単離されたＶＬドメインのうち最も低い熱安定性を有し（実施例１と、１１参照）、恐らく、多重突然変異を有するｓｃＦｖ ６Ｂ３で最初に変性を開始するのに対し、突然変異し、安定化したＶＨ６ドメインは、依然として折りたたまれた状態で、さらに高い変性剤濃度でしか変性しない。このように二状態挙動が欠如しているために、６Ｂ３の多重突然変異体についてはΔＧＮ−Ｕ値を計算することができなかった。
【０１７６】
可溶性タンパク質の収率及び熱安定性測定の詳細を表７に記載する。要約すると、単一突然変異の収率及び安定性に対する作用はほぼ完全に付加的である。６種の突然変異すべてを有するｓｃＦｖフラグメント（２Ｃ２−ａｌｌ及び６Ｂ３−ａｌｌ）は、野生型ｓｃＦｖフラグメントと比較して、それぞれ４．３倍〜４．２倍の収率増加を示す。２Ｃ２−ａｌｌの絶対値は、収率が５．１ｍｇ／Ｌ（２Ｃ２−ｗｔより３．９ｍｇ／Ｌ高い）、熱力学的安定性が７２．３ｋＪ／モルである。６Ｂ３−ａｌｌの場合、１．７ｍｇ／Ｌの収率が得られ、これは、６Ｂ３−ｗｔより１．３ｍｇ／Ｌ高い。
【０１７７】
フレームワーク１サブタイプの分析
ＶＨ構造は、６位、７位及び１０位のアミノ酸の種類に応じて４つの異なるフレームワーク１コンホメーションに区分することができる（３２）（番号付けは、Honegger及びPluckthunに従う（３３））。１９、７４、７８及び９３位の残基は、上記ドメインの下部の疎水性コアの一部であるため、熱力学的安定性及びフォールディング効率に影響を与えるが、これらの残基は、この構造的サブタイプと相関する（３２）。最も有利な特性を有するＶＨドメインは、サブタイプＩＩ（ＶＨ３）及びサブタイプＩＩＩ（ＶＨ１ａ、ＶＨ１ｂ及びＶＨ５）に入るのに対し、不利な特性のＶＨドメインであるＶＨ２及びＶＨ４は、サブグループＩに入る。改善しようとするＶＨ６は、サブタイプＩＩＩに割り当てることができる。サブタイプＩＩＩは、６位のＧｌｎの存在と、７位のＰｒｏの非存在を特徴とする（３２）。ヒトＶＨドメインのサブタイプＩＩＩ決定及び相関残基の分析（３２）から、ＶＨ６フラグメントは、１０、７４及び７８位に、稀にしか用いられない残基を有することがわかる（表８）。１０位のＰｒｏは、配列の８％で用いられるのに対し、Ａｌａは、配列の７６％で用いられる。Ｐｒｏは、Ａｌａより限定された数のコンホメーションしか許容しない。突然変異誘発実験（３４）では、１０位のＰｒｏは、サブタイプＩＶのＶＨドメインを不安定化することがわかった（マウスだけに起こり、ヒト配列では起こらない）。７４位のＶａｌ及び７８位のＩｌｅは、ＶＨサブタイプＩＩＩ配列と比較して、それぞれ１％及び８％の頻度を有する。２Ｃ２及び６Ｂ２においてＶａｌ７４を最も頻度の高いＰｈｅと交換した。何故なら、大きな芳香族アミノ酸は、恐らく疎水性コアのパッキング密度を高めるからである。Ｉｌｅ７８は、サブタイプＩＩＩコンセンサス残基Ａｌａ又はＶａｌ（Ｉｌｅと同様に非芳香族脂肪族残基である）と交換しなかった。というのは、パッキング密度への影響が恐らく小さいと思われるからである。図１５（ａ）では、フレームワーク１サブタイプ決定及び相関残基をＶＨ６のモデル（２１）（ＰＤＢ登録名：１ＤＨＺ）に示し、図１５（ｂ）では、Ｐ１０Ａ（１０位のＰｒｏをＡｌａへ変異）及びＶ７４Ｆを含む二重突然変異のモデルを示す。
【０１７８】
フレームワーク１サブタイプＩＩＩコンセンサスに対するＰ１０Ａ単独の、並びにＶ７４Ｆと組み合わせた突然変異を部位特異的突然変異誘発により野生型ｓｃＦｖフラグメントに導入した。２Ｃ２−Ｐ１０Ａ及び６Ｂ３−Ｐ１０Ａは、野生型ｓｃＦｖフラグメントと比較して、それぞれ２．９倍及び４．２倍の可溶性タンパク質収率増加を示したのに対し、Ｐ１０Ａ及びＶ７４Ｆを含む二重突然変異は、上記より低く、それぞれ１．９倍及び１．７倍の増加を示した。全生物物理学的データを表７にまとめる。単一及び二重突然変異体の大腸菌におけるペリプラズム発現の可溶性及び不溶性画分の分析から、全発現レベルと、突然変異により増加した可溶性タンパク質のレベルの両方、従って、可溶性対不溶性ｓｃＦｖフラグメント間の比が一定に維持されることがわかった（データは示していない）。ｓｃＦｖフラグメント２Ｃ２及び６Ｂ３の熱力学的安定性は、突然変異Ｐ１０Ａによって向上せず、二重突然変異Ｐ１０Ａ及びＶ７４Ｆでわずかに向上したにすぎない（それぞれ、ΔΔＧＮ−Ｕが０．５ｋＪ／モル及び０．４ｋＪ／モル）（表７、図１２（ｄ））。従って、生物物理学的分析から、ペリプラズムタンパク質の収率の増加によって証明されるように、突然変異Ｐ１０Ａはフォールディング効率を確かに高めるが、野生型ｓｃＦｖフラグメントと比較して安定性は変化しないことが明らかになった。対照的に、突然変異Ｖ７４は、二重突然変異体での収率に対するＰ１０Ａの正の作用が低下することから、恐らくフォールディング効率を犠牲にして、疎水性コアにおける安定化相互作用を増強するために、安定性をわずかに高めると考えられる。熱力学的安定性にわずかな上昇しか示さなかった二重突然変異体Ｐ１０Ａ＋Ｖ７４Ｆと比較して、単一突然変異体Ｐ１０Ａの収率が高いことから、本発明者らは、突然変異Ｐ１０Ａだけを２Ｃ２−ａｌｌ及び６Ｂ３−ａｌｌにクローニングし、構築物ｓｃＦｖ−ａｌｌ＋Ｐ１０Ａを得た。２Ｃ２−ａｌｌ及び６Ｂ３−ａｌｌと比較して、収率はそれぞれ０．８及び２．１の倍率で低下した。２Ｃ２−ａｌｌ＋ Ｐ１０Ａの場合には、熱力学的安定性は、ΔＧＮ−Ｕが６８．１ｋＪ／モルであり、２Ｃ２−ａｌｌよりも４．１ｋＪ／モル低かった。６Ｂ３−ａｌｌ＋Ｐ１０Ａにおいて、熱力学的安定性の半定量的測度である変性の中間点も、６Ｂ３−ａｌｌの中間点より低いＧｄｎＨＣｌ濃度であった。
【０１７９】
結合活性の決定
この研究の目標は、結合活性は保持しながら、ファミリー特異的分析に従う構造に基づく手法によって、ＶＨ６を含むｓｃＦｖフラグメントの収率及び安定性を改善できることを証明することであった。本発明者らは、２つの独立した方法（ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡｃｏｒｅ）により、結合活性を分析した。ＥＬＩＳＡについては、本発明者らは、対応する抗原をコーティングし、様々な濃度のｓｃＦｖフラグメントを使用した。本発明者らは、ｓｃＦｖ−Ｐ１０Ａを含むすべての単一突然変異、並びにｓｃＦｖ−ａｌｌ及びｓｃＦｖ−ａｌｌ＋Ｐ１０Ａの多重突然変異を試験した。すべての突然変異体が、類似した濃度依存性を示し、これらが、同じ結合親和力を有することを示している（データは示していない）。
【０１８０】
抗原をコーティングしたチップ上を流れる様々な濃度のｓｃＦｖフラグメントを用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ実験を実施した。図１６ａ及び１６ｂは、それぞれ２Ｃ２−ｗｔ及び−ａｌｌ並びに６ｂ３−ｗｔ及び−ａｌｌの重ね合わせを示し、共鳴単位（ＲＵ）対時間としてプロットした。いずれの場合にも、抗原コーティングチップに対するｓｃＦｖ−ｗｔ及び−ａｌｌの会合曲線及び解離曲線が重なり合っており、これは、結合が完全に保持されていることを示している。しかし、解離期は、ｓｃＦｖフラグメントの導入前のバックグラウンドレベルに到達しなかったため、抗原解離定数（Ｋｄ）の明確な決定ができなかった。この非特異的結合は、様々な抗原コーティング密度で観察された（２，７００ＲＵ及び３７０ＲＵ、データは示していない）。これは、この挙動がチップとの再結合によるものではなく、部分的に変性したｓｃＦｖフラグメントの小さな部分が、抗原コーティングチップに非特異的に付着するためと考えられる。従って、競合ＢＩＡｃｏｒｅ実験（２４、２５）を実施して、溶解状態でＫｄを決定した。この実験では、ｓｃＦｖタンパク質を可溶性抗原と一緒にインキュベートし、固定化抗原を含むＢＩＡｃｏｒｅチップに混合物を導入した。抗原結合ｓｃＦｖではなく、遊離ｓｃＦｖだけが、表面上の抗原と結合することができた。これにより、溶解状態での解離定数を、どんな非特異的結合現象からも独立に決定することができる。以前の実験から、Ｋｄは、１０−７Ｍ前後であると推定されている。従って、５０ｎＭ〜３０μＭの様々な濃度のミオグロビンの存在下で、それぞれ１６ｎＭ及び１０ｎＭの６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌを用いて、競合ＢＩＡｃｏｒｅ実験を実施した。溶解状態の対応する全抗原濃度に対する会合期の傾きのプロットから、以前記載されている（２６）（図１７）ように、６Ｂ３−ｗｔのＫｄは（１．９±０．５）・１０−７Ｍ、また、６Ｂ３−ａｌｌのそれは（１．５±０．４）・１０−７Ｍと計算された。両方のＫｄ値とも、実験誤差範囲内にあり、これは、結合が完全に保持されていることを示している。
【０１８１】
この実験の目的は、構造に基づく、ファミリー−コンセンサスによる推定の妥当性を証明することである。本発明者らは、可溶性タンパク質の発現収率及び熱力学的安定性を向上するためのモデル系としてヒト生殖系列ファミリーＶＨ６コンセンサスドメインを含むｓｃＦｖフラグメントを選択した。これら生物物理学的特性を改善する潜在的突然変異を、フレームワーク１サブタイプに規定される残基及び他の相互作用残基と、同じサブタイプ内に存在するコンセンサス配列との比較により同定した。次の潜在的突然変異のセットは、潜在的不完全に関する構造の分析によりみいだした。尚、この分析は、既知の有利な生物物理学的特性を有するＶＨドメイン（ファミリー１、３及び５）のコンセンサス配列との比較によって実施した。本発明者らは、この分析からＣＤＲ残基を排除した。本発明者らは、ヒト可変ドメインサブグループのコンセンサス配列の生物物理学的特性を予め体系的に決定していたため、このような残基の位置を正確にみいだすことができた（実施例１と、１１）。この実験から、提案された７種すべての単一突然変異が３つのカテゴリーに入ることがわかる。すなわち、これらの突然変異は、可溶性タンパク質の発現収率増加又は熱力学的安定性向上のいずれか、あるいは両方をもたらす。この区分は、該タンパク質の生物物理学的特性を決定する上でのこれら残基の役割を理解するのに役立つ。上記７種の突然変異のうち、ｓｃＦｖ ２Ｃ２の場合には３つ、またｓｃＦｖ ６Ｂ３の場合には５つもが、両方の生物物理学的特性の改善をもたらす。これらの結果から、ファミリーアラインメントに従う、構造に基づく分析の組み合わせは、免疫グロブリン可変ドメインの特性を改善する有力な方法であることがわかる。本発明者らの分析（実施例１と、１１）は、あらゆるヒトファミリーを対象とするため、この用途のための一般的手法となる。
【０１８２】
有利な特性を有するＶＨドメインのコンセンサスに対する単一突然変異の様々な組み合わせの分析から、自由エネルギーの改善はほぼ完全に付加的であることがわかり、これは、突然変異が独立に作用することを示している。野生型ｓｃＦｖフラグメントと比較して、最も高い収率及び熱力学的安定性を有する突然変異体は確かに、６種の突然変異を含む突然変異体である。ｓｃＦｖ ２Ｃ２の場合には、最良の突然変異体の特性は、最も安定なＶＨドメインであるＶＨ３、並びに異なるＣＤＲ３を有する同じＶＬドメインのＶκ３からなるモデルｓｃＦｖフラグメントの特性と同等であり（ヒト可変抗体ドメインの体系的生物物理学的特性決定の一部であった）（実施例１と、１１参照）、これは、少数の残基を交換するだけで、不利な特性の抗体を非常に有利な特性の抗体に改変することが確かに可能であることを示している。最も重要なことは、結合に重要なＣＤＲ及びそれらのフレームワーク残基の両方が維持されることである。６種の突然変異を有するｓｃＦｖフラグメントに対する突然変異Ｐ１０Ａの付加により、発現収率及び熱力学的安定性の両方が低下するが、野生型ｓｃＦｖフラグメントでは、この突然変異によって、２Ｃ２−Ｐ１０Ａの場合には２．９倍、また、６Ｂ３−Ｐ１０Ａの場合には４．２倍可溶性収率が高くなり、熱力学的安定性は不変のままであった。１０位に近い突然変異Ｑ５Ｖ及びＳ１６Ｇは、１０位でのアミノ酸の種類とは無関係であるため、依然としてＶＨ６フレームワークに有利であるに違いない。改善されたフレームワークにおいてこの突然変異の生物物理学的特性が低下した理由は、実験により決定された３Ｄ構造を用いてしか説明することができないであろう。Ｖκ３を含む２Ｃ２、並びにＶλ３及び様々なＨ−ＣＤＲ３ループを含む６Ｂ３では、類似した結果が得られたことから、前記の改善はＶＬドメイン、並びにＣＤＲ３の配列及び長さとは独立であるようだ。６Ｂ３突然変異体Ｖ７２Ｄ及びＳ９０Ｙの熱力学的安定性はわずかに向上したが、２Ｃ２では、安定性の向上をまったく観察することができなかったため、例外はわずかなものが２つだけであった。すでに、Ｖκドメインとは対照的に、ｓｃＦｖフラグメントＶλドメインは、非常に安定なＶＨ−ＶＬ境界面を形成することができ、単離されたドメインの固有の安定性以上にｓｃＦｖフラグメント全体の安定性を高めることがわかっていた（実施例１と、１１参照）。７２位の残基は、境界面相互作用に関与しないが、それに極めて近接している（図１４）。従って、突然変異Ｖ７２Ｄによって、境界面の配向に小さな変化が起こる可能性があり、これは、２Ｃ２のＶκ３ドメインには影響しないが、６Ｂ３のＶλ３ドメインとの境界面相互作用を介して、小さな安定化効果をもたらす。９０位の残基は、ＶＬに対し境界面と反対側にあり、かつ、ＣＤＲ３から２９残基離れている。このことから、６Ｂ３の安定性がやや向上したのは、おそらく２Ｃ２とは異なるＶＬドメイン及びＣＤＲ３配列のためではないことがわかる。
【０１８３】
本発明者らは、抗原に直接接触する可能性があるＣＤＲの残基を交換しなかったが、フレームワーク内の改変がＣＤＲの配向、従って、抗原結合に影響を与えうることは先験的に排除できない。従って、本発明者らは実験により結合特性を決定した。しかし、試験した突然変異の場合には、抗原結合は完全に保持されることが、３つの独立した方法により証明された。
【０１８４】
この実験では、本発明者らは、不利な特性の抗体フレームワークを、そのフレームワークの結合活性及び結合特性を保持しながら、非常に有利な抗体フレームワークに合理的に変換可能であることを証明する。さらに容易な手法は、好適なＶＬドメインを含む非常に安定なＶＨ３フレームワークを直接用いるものであることも証明することができた。しかし、フレームワーク残基は、ＣＤＲの配向に影響を与え、ＶＨ−ＶＬ境界面に位置するハプテン結合キャビティーの一部である可能性があり、「外側ループ」を構成することができる。このループは、場合によっては抗原結合に関与することが認められた。従って、これらの「フレームワーク」残基は、親和性及び多様性に大きく寄与することができ、単一フレームワークがあらゆる場合に理想的な解決をもたらすわけではないようだ。従って、本発明者らは、安定なフレームワークの構造的に多様なライブラリーを達成する好ましい手法は、本明細書に提示したヒトコンセンサス抗体フレームワークを最適化することであると考える。何故なら、この手法は、すべての天然ファミリーを対象とする全範囲の安定骨格に適用できるからである。
【０１８５】
この実験では、本発明者らは、ＶＨ６フレームワークの改善に的を絞った。しかし、配列類似性のために、試験した突然変異のうち５つ（Ｑ５Ｖ、Ｓ１６Ｇ、Ｖ７２Ｄ、Ｓ７６Ｇ及びＳ９０Ｙ）は、ファミリーＶＨ２及びＶＨ４に属するＶＨドメインについて同様の結果をもたらすに違いない。この手法は、抗体ライブラリーの設計に有用であるが、多くの場合、例えば、トランスジェニックマウス（３５、３６）に由来する、ヒト化（３７）により、又は天然配列のライブラリーからのファージ展示（３８〜４０）により得られた、所与のヒト抗体もまた改善によって利益を得るであろう。
【０１８６】
また、これらの結果から、いくつかのヒト生殖系列遺伝子は、その生物物理学的特性に関して、タンパク質の最適な形態をコードしないことがわかる。天然ドメインの生物物理学的特性は広範囲に及ぶため、限定された安定性が免疫系にとって望ましい特性であると断定することはできない。むしろ、ＶＨ２、ＶＨ４及びＶＨ６の安定性は、十分良好であるため、免疫系により許容されると考えられる。しかし、安定性が十分良好ではない生物医学的又は生物工学的用途についても、本発明者らはこれらの特性を改善する道筋を提供したといえるだろう。
【０１８７】
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【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】単離されたＶＨ及びＶＬドメインの見かけ分子量の決定を示す図である。
【図２】ＶＨドメインのＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせを示す図である。
【図３】ＶＬドメインのＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせを示す図である。
【図４】ヒトコンセンサスＶκ３（ＰＤＢ登録名：１ＤＨ５）及びＶＨ３ドメイン（ＰＤＢ登録名：１ＤＨＵ）からなるｓｃＦｖフラグメントのモデル構造を示す図である。
【図５】水素結合を有するヒトコンセンサス（ａ）ＶＨ３および（ｂ）Ｖκ３ファミリーの電荷クラスターの詳細図である。
【図６】上部コア残基の詳細図である。
【図７】フレームワーク１分類に対応する下部コア残基の詳細図である。
【図８】５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌにおけるＳｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムでのｓｃＦｖフラグメント（５μＭ）の分析用ゲル濾過を示す図である。
【図９】境界面安定化の様々なケースを示すＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせを示す図である。
【図１０】Ｖλドメインでの境界面安定化における様々なＬ−ＣＤＲ３の役割を示すＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせを示す図である。
【図１１】５μＭの濃度における、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５カラムでの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）及び５００ｍＭ ＮａＣｌにおける２Ｃ２−ｗｔ、２Ｃ３−ａｌｌ、６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌの分析用ゲル濾過を示す図である。
【図１２】（ａ）２Ｃ２−ｗｔ、２Ｃ２−ａｌｌ、６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌ、（ｂ）単一突然変異、及び（ｃ）有利な特性を有するＶＨドメインのコンセンサスに対する多重突然変異、並びに（ｄ）ｓｃＦｖ２Ｃ２を用いて例示したフレームワーク１サブタイプＩＩＩに対する突然変異のＧｄｎＨＣｌ変性曲線の重ね合わせを示す図である。
【図１３】アラインメントしたＨｕＣＡＬ ＶＨ配列を示す図である。
【図１４】有利な特性を有するＶＨドメインのコンセンサスに対する単一突然変異の全体図である。
【図１５】（ａ）野生型ＶＨ６ドメイン及び（ｂ）改変Ｐ１０Ａ及びＶ７４Ｆを有する二重突然変異型のモデルにおいて、残基（６、７及び１０）及び相関残基（１９、７４、７８、９３）を決定するフレームワーク１サブタイプＩＩＩの全体図である。
【図１６】（ａ）２Ｃ２−ｗｔ及び２Ｃ２−ａｌｌ並びに（ｂ）６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌの結合活性の比較を示す図である。
【図１７】６Ｂ３−ｗｔ及び６Ｂ３−ａｌｌの競合ＢＩＡｃｏｒｅ分析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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