(57)【要約】  ルシフェラーゼの酵素活性を測定する方法は、ルシフェラーゼ等の発光性タンパク質と、保護された発光団とを接触させて、組成物を生成し、該組成物の発生する光を検出する工程を含む。該保護された発光団は、対応する未変性のセレンテラジンに対して、高い安定性と、改善されたシグナル対バックグラウンド比を与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式(XII)で表される化合物：
【化１】
2005515977.tif 000023
該一般式において、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；
R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；かつ
R11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基であり；
但し、R11、R14およびR15全てがアセチル基ではないことを条件とする。
【請求項２】
R7が、-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり；R8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2；およびR9がフェニル、インドリル、-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H4F、または-C6H4OR15である、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
R11、R14およびR15がエステルである、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
R11がアセチル基であり、かつR14およびR15が夫々独立に、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項1記載の化合物。
【請求項５】
R11がブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基であり、かつR14およびR15が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項1記載の化合物。
【請求項６】
以下の式(XII)で表され：
【化２】
2005515977.tif 000024
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；
R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；かつ
R11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基であり；また
22℃における、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の該式(XII)で表される化合物の濃度が、45分後に50％未満だけ低下することを特徴とする、該化合物。
【請求項７】
R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、R8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2であり、およびR9がフェニル、インドリル、-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H4F、または-C6H4OR15である、請求項6記載の化合物。
【請求項８】
R11、R14およびR15がエステルである、請求項6記載の化合物。
【請求項９】
R11、R14およびR15が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項6記載の化合物。
【請求項１０】
以下の式(XII)で表され：
【化３】
2005515977.tif 000025
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；
R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；かつ
R11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基であり；また
少なくとも1つの該酵素-離脱性基の除去により、原化合物を与え、しかも
22℃における、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の該式(XII)で表される化合物の濃度を、50％だけ低下するのに要する時間が、22℃における、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の該原化合物の濃度を、50％だけ低下するのに要する時間よりも長いことを特徴とする、該化合物。
【請求項１１】
少なくとも2つの該酵素-離脱性基の除去が、該原化合物を与える、請求項10記載の化合物。
【請求項１２】
全ての該酵素-離脱性基の除去が、該原化合物を与える、請求項10記載の化合物。
【請求項１３】
R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、R8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2であり、およびR9がフェニル、インドリル、-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H4F、または-C6H4OR15である、請求項10記載の化合物。
【請求項１４】
R11、R14およびR15がエステルである、請求項10記載の化合物。
【請求項１５】
R11、R14およびR15が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項10記載の化合物。
【請求項１６】
以下の式(XIII)または(XIV)で表され：
【化４】
2005515977.tif 000026
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R12およびR13は夫々独立に-H、-OH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたは-OR16であり；
nは0、1または2であり、かつ
R11、R14およびR16は夫々独立に酵素-離脱性基であることを特徴とする、化合物。
【請求項１７】
R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、かつR8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2である、請求項16記載の化合物。
【請求項１８】
R11、R14およびR16がエステルである、請求項16記載の化合物。
【請求項１９】
R11、R14およびR16が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項16記載の化合物。
【請求項２０】
nが1である、請求項16記載の化合物。
【請求項２１】
請求項1記載の化合物を、溶液状態で含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２２】
該溶液が、水性溶液である、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
該溶液が、DMSOまたはアルコールを含む、請求項21記載の組成物。
【請求項２４】
請求項6記載の化合物を、溶液状態で含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２５】
該溶液が、水性溶液である、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
該溶液がDMSOまたはアルコールを含む、請求項24記載の組成物。
【請求項２７】
請求項10記載の化合物を、溶液状態で含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２８】
該溶液が、水性溶液である、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
該溶液がDMSOまたはアルコールを含む、請求項27記載の組成物。
【請求項３０】
請求項16記載の化合物を、溶液状態で含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３１】
該溶液が、水性溶液である、請求項30記載の組成物。
【請求項３２】
該溶液がDMSOまたはアルコールを含む、請求項30記載の組成物。
【請求項３３】
保護された発光団であって、変性されたセレンテラジンであり、
そのエノール基が酵素-離脱性基を含むエステルまたはエーテルに転化されており、該酵素-離脱性基の除去が、原セレンテラジンを与え、かつ
22℃における、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の該変性セレンテラジンの濃度を、50％だけ低下するのに要する時間が、22℃における、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の該原セレンテラジンの濃度を、50％だけ低下するのに要する時間よりも長いことを特徴とする、上記発光団。
【請求項３４】
保護された発光団および発光性タンパク質を含むことを特徴とするキット。
【請求項３５】
該発光団から離れた、脱保護用酵素をも含む、請求項34記載のキット。
【請求項３６】
該保護された発光団および該発光性タンパク質が、別々の容器内に収容されている、請求項34記載のキット。
【請求項３７】
該保護された発光団および該発光性タンパク質が、同一の容器内に収容されている、請求項34記載のキット。
【請求項３８】
保護された発光団および脱保護用酵素を含み、該発光団および該脱保護用酵素が、別々の容器内に収容されていることを特徴とするキット。
【請求項３９】
発光性タンパク質の酵素学的活性を測定する方法であって、発光性タンパク質、脱保護用酵素および保護された発光団を溶液内で接触させて、組成物を生成し、および該組成物の発生する光を検出する諸工程を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項４０】
該発光性タンパク質が、レニラルシフェラーゼである、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
該保護された発光団が、以下の式(XII)で表される化合物である、請求項39記載の方法：
【化５】
2005515977.tif 000027
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；
R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；および
R11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基を表す。
【請求項４２】
R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、R8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2であり、およびR9がフェニル、インドリル、-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H4F、または-C6H4OR15である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
R11、R14およびR15がエステルである、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
R11、R14およびR15が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項41記載の方法。
【請求項４５】
該保護された発光団が、以下の式(XIII)または(XIV)で表される化合物である請求項39記載の方法：
【化６】
2005515977.tif 000028
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R12およびR13は夫々独立に-H、-OH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたは-OR16であり；
nは0、1または2であり、かつ
R11、R14およびR16は夫々独立に酵素-離脱性基である。
【請求項４６】
R7が-CH2-C6H5、ナフチル、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、または-CH2-C6H4OR14であり、かつR8が-CH2C6H5、-CH2C6H11、-CH2C5H9、または-(CH2)3NHC(=NH)NH2である、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
R11、R14およびR16がエステルである、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
R11、R14およびR16が夫々独立に、アセチル、ブチリル、アセトキシメチル、プロパノイルオキシメチル、ブチリルオキシメチル、またはピバロイルオキシメチル基である、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
nが1である、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
該組成物が、細胞を含む、請求項39記載の方法。
【請求項５１】
該組成物が、上記脱保護酵素を含有する細胞を含む、請求項39記載の方法。
【請求項５２】
該組成物の発生する光の検出が、細胞中の該脱保護酵素の位置を示す、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
該組成物が、細胞溶解物を含む、請求項39記載の方法。
【請求項５４】
該脱保護酵素がエステラーゼである、請求項39記載の方法。
【請求項５５】
該溶液が水性溶液である、請求項39記載の方法。
【請求項５６】
該溶液がDMSOを含む、請求項39記載の方法。
【請求項５７】
該保護された発光団が、変性されたセレンテラジンであり、そのエノール基が酵素-離脱性の基を含むエステルまたはエーテルに転化されている、請求項39記載の方法。
【請求項５８】
ルシフェラーゼを含む生細胞内でルミネッセンスを発生させる方法であって、該方法が、溶液中で、該細胞と、保護された発光団とを接触させる工程を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項５９】
該保護された発光団が、変性されたセレンテラジンであり、該エノール基が、酵素-離脱性の基を含むエステルまたはエーテルに転化されている、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
該保護された発光団が、以下の式(XII)で表される化合物である、請求項58記載の方法：
【化７】
2005515977.tif 000029
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；
R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；かつ
R11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基を表す。
【請求項６１】
該保護された発光団が、以下の式(XIII)または(XIV)で表される化合物である請求項58記載の方法：
【化８】
2005515977.tif 000030
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R12およびR13は夫々独立に-H、-OH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたは-OR16であり；
nは0、1または2であり、かつ
R11、R14およびR16は夫々独立に酵素-離脱性基である。
【請求項６２】
非-発光性酵素の酵素活性を測定する方法であって、非-発光性酵素と、発光性タンパク質および保護された発光団を含む液状混合物とを接触させて、組成物を生成する工程と、該組成物の発生する光を検出する工程とを含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項６３】
該保護された発光団が、変性されたセレンテラジンであり、該エノール基が、該非-発光性酵素により離脱可能な基を含むエステルまたはエーテルに転化されている、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
該保護された発光団が、以下の式(XII)で表される化合物である、請求項62記載の方法：
【化９】
2005515977.tif 000031
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；
R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；かつ
R11、R14およびR15は夫々独立に該非-発光性酵素により脱離可能な、酵素-離脱性基を表す。
【請求項６５】
該保護された発光団が、以下の式(XIII)または(XIV)で表される化合物である請求項62記載の方法：
【化１０】
2005515977.tif 000032
ここで、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；
R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；
R12およびR13は夫々独立に-H、-OH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたは-OR16であり；
nは0、1または2であり、かつ
R11、R14およびR16は夫々独立に該非-発光性酵素により脱離可能な、酵素-離脱性基である。
【請求項６６】
更に、DMSOまたはアルコールもしくはこれらの混合物をも含む請求項34記載のキット。
【請求項６７】
該保護された発光団と同一の容器内に、更に、DMSOまたはアルコールもしくはこれらの混合物をも含む請求項38記載のキット。
【請求項６８】
R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項６９】
R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-15のアルキル基および炭素原子数1-15のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項1記載の化合物。
【請求項７０】
R11、R14およびR15が夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項1記載の化合物。
【請求項７１】
R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項10記載の化合物。
【請求項７２】
R11、R14およびR15が、夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項10記載の化合物。
【請求項７３】
R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項16記載の化合物。
【請求項７４】
R11、R14およびR15が、夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項16記載の化合物。
【請求項７５】
R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項41記載の方法。
【請求項７６】
R11、R14およびR15が夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項41記載の方法。
【請求項７７】
R11、R14およびR15が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項45記載の方法。
【請求項７８】
R11、R14およびR15が夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項45記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
リポータ分子は、生物学、生化学、免疫学、細胞生物学および分子生物学の分野において、分子的な事象を追跡するために、日常的に利用されている。例えば、リポータ分子は、該リポータ分子の濃度が、該分子に結合した特異的なプロモータからの転写によるものである、アッセイにおいて使用されている。リポータ分子アッセイは、遺伝子発現、レセプタ活性、転写因子、細胞内シグナル発生、mRNAプロセッシングおよびタンパク質の折畳みを含む、生物学的な過程を研究するのに利用できる。このようなアッセイにおいて典型的に用いられている、リポータ分子の分析は、放射性同位体、酵素活性、蛍光またはルミネッセンスの検出を含む。この技術は、Akhavan-Tafti等によって、”Bioluminescence and Chemi-luminescence. Fundamentals and Applied Aspects. Proceedings of the 8th International Symposium on Bioluminescence and Chemi-luminescence", Cambridge, Sept. 1994, Eds. Campbel, Kricka, Stanley, John Wiley and Sons, 1994において一般的に論じられている。
【０００２】
生物学的アッセイにおけるミネッセンスは、典型的に発光性タンパク質の活性に関連する。アッセイ系において有用な発光性タンパク質は、レニラルシフェラーゼ、オプロフォルス(Oplophorus)ルシフェラーゼ、バルグラ(シプリジナ) [Vargula (Cypridina)] ルシフェラーゼ、ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ、およびエクオリンを包含するが、これらに制限されない。発光反応において、発光性タンパク質と発光団と呼ばれる適当な分子との相互作用は、反応生成物の一つとして光を生成する。この反応において生成された光の量(即ち、フォトンの数)は、測定することができる。この測定は、ある物質が、あるサンプル中に存在するか、あるいは存在しないかを、定性的に決定するために利用できる。また、この測定を、該反応中の発光性タンパク質および/または発光団の濃度を算出する目的で、定量的に利用することもできる。
【０００３】
発光反応は、極めて少量の、特定の被検体を検出するのに利用でき、該物質は、分析中に同定され、かつ測定される。例えば、発光反応は、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、パーオキシダーゼ、グリコシダーゼ、様々な代謝産物、例えばATPまたはNADHおよびリポータ分子を検出し、かつ定量するのに利用できる。発光反応は、また結合相互作用、例えば抗体およびヌクレオチドプローブにより媒介される相互作用を介して、被検体を検出し、かつ定量するのに利用できる。発光反応のもう一つの応用は、2つの分子が相互に結合できるか否か、または同一細胞内で局在化できるか否かを決定することができる、バイオルミネッセンス共鳴エネルギー伝達(bioluminescence resonance energy transfer; BRET)である(Angers等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(7): 3684-9)。典型的には、発光反応は、約1×10-16M未満、しばしば1×10-19M未満にてサンプル中に存在する被検体を検出するのに利用できる。
【０００４】
ある被検体を測定するのにルミネッセンスを利用する場合、該被検体の存在に依存しない反応によっては、殆どまたは全く光が生成されないことが好ましい。例えば、レニラルシフェラーゼに対して典型的に使用されるアッセイ条件下で、発光性タンパク質が存在しない場合でさえ、一般的に光を検出することができる。発光性タンパク質の触媒活性に依存しないルミネッセンスは、自己ルミネッセンス(auto-luminescence)と呼ばれる。この自己ルミネッセンスは、「バックグラウンド」であると考えられる。というのは、該系に関する有意な情報を与えないが、全体としての発光出力に寄与している。自己ルミネッセンスは、該被検体の活性由来の光(即ち、「シグナル」)の量を正確に測定する能力を減じるために、その分析アッセイの有用性が限定される恐れがある。このことは、ノイズの強度が、実際のシグナルの強度に対して大きい場合に、特に問題となる可能性がある。この測定の不確かさは、該シグナルの強度(S)と、該バックグラウンドの強度(B)との比、即ちシグナル対バックグラウンド比(S/B)によって定量化することができる。
【０００５】
自己ルミネッセンスは、例えば該発光団の自然酸化によって起り得る。また、該アッセイ系への、様々な成分、例えば脂質(特に、臨海ミセル濃度、即ちCMC以上の濃度の)、疎水性タンパク質(特に、規定された三次元構造を持つもの)、および細胞または疎水性の微小な環境を含む他の生物学的な物質の添加は、自己ルミネッセンスを大幅に高める可能性がある。
【０００６】
自己ルミネッセンス性を呈する可能性のある、一群の発光団は、上記セレンテラジン類である。セレンテラジン類は、様々な海洋性のルシフェラーゼと相互作用して、該セレンテラジンを対応するセレンテラミドへ酸化することによって、光を発生する。この酸化が、発光性タンパク質によって容易になった場合には、該フォトンは、該基質と該タンパク質との相互作用に対応し、結果としてシグナルを生成する。セレンテラジンも、発光性タンパク質が全く存在しない場合においてさえ、溶液内に存在する場合に、自発的な発光酸化のために、該バックグラウンドに寄与する。バックグラウンドの生成に加えて、この不安定性も、該発光シグナルの寿命を短くする恐れがある。このため、短期間の間に、多数のサンプルに関するルミネッセンスを測定する必要が生じ、この分析全体に、更なる不確実性をもたらす可能性がある。
【０００７】
セレンテラジンの修飾または変性が、その発光応答を改良する試みにおいて、検討されてきた。影響を受けるセレンテラジンの特性は、カルシウムイオン(Ca2+)に対する感受性(Shimomura等, Biochem. J., 1993, 296: 549-551; Shimomura等, Biochem. J., 1989, 261: 913-920)；スーパーオキシドアニオン(O2-)に対する感受性(Teranishi等, Anal. Biochem., 1997, 249: 37-43)；個々の発光性タンパク質に対する特異性(Inouye等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1997, 233: 349-53)；および細胞膜浸透性(Shimomura, Biochem. J., 1997, 326: 297-298)を含む。典型的には、これら誘導体は、核としてのイミダゾピラジン構造に結合した置換基の同等性により、天然のセレンテラジンとは異なっている。幾つかのアッセイ環境におけるその改良にも拘らず、これらの変性されたセレンテラジンが、自己ルミネッセンスの問題を回避することについては報告されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、直接的または間接的に発光団として機能することができ、かつ正常な使用条件化で、低い自己ルミネッセンスをもたらす組成物を提供することが望ましい。これら組成物は、更に従来の発光団に比して高い安定性を示すこともできる。発光性タンパク質以外の物質に対して感受性の高い組成物を提供することも望ましい。このような組成物とこれら物質との相互作用は、該組成物を発光団(発光性化合物)に転化することを可能とした。かくして、このような多機能性組成物は、非-発光性物質または過程を、発光法により分析する方法を提供できた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一局面においては、以下の式(XII)で表される化合物を提供する：
【００１０】
【化１】
2005515977.tif 000002
【００１１】
この化合物において、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；かつR11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基であり；但し、R11、R14およびR15全てがアセチル基ではないことを条件とする。
本発明のもう一つの局面においては、上記式(XII)において、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；かつR11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基である化合物を提供する。22℃における、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の該式(XII)で表される化合物の濃度は、45分後に50％未満だけ低下する。
【００１２】
本発明の更に別の局面においては、上記式(XII)において、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；R9はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-C6H4OR15であり；R10は-H、-CH3または-CH(CH3)2であり；かつR11、R14およびR15は夫々独立に酵素-離脱性基である化合物を提供する。少なくとも1つの該酵素-離脱性基の除去は原化合物を与え、しかも22℃において、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の該化合物の濃度を、50％だけ低下するのに要する時間は、22℃において、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の該原化合物の濃度を、50％だけ低下するのに要する時間よりも長い。
更に別の本発明の局面においては、以下の式(XIII)または(XIV)で表される化合物を提供する：
【００１３】
【化２】
2005515977.tif 000003
【００１４】
この化合物において、R7はH、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、または-CH2-C6H4OR14であり；R8はH、アルキル、ヘテロアルキル、またはアリール基であり；R12およびR13は夫々独立に-H、-OH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたは-OR16であり；nは0、1または2であり、かつR11、R14およびR16は夫々独立に酵素-離脱性基である。
本発明の更に別の局面においては、上記化合物の一つを、溶液状態で含む組成物を提供する。
更に別の本発明の局面においては、保護された発光団を提供し、これは変性されたセレンテラジンであり、そのエノール基は酵素-離脱性基を含むエステルまたはエーテルに転化されており、該酵素-離脱性基の除去は、原セレンテラジンを与える。22℃において、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の、該変性セレンテラジンの濃度を50％だけ低下するのに要する時間は、22℃において、F12媒体および10％牛胎児血清を含む混合物中の、該原セレンテラジンの濃度を50％だけ低下するのに要する時間よりも長い。
【００１５】
本発明の更に別の局面では、保護された発光団および発光性タンパク質を含むキットを提供する。
更に別の本発明の局面では、保護された発光団および脱保護酵素を含むキットを提供する。該発光団および該脱保護酵素は、別々の容器内に収容されている。
本発明の更に別の局面では、発光性タンパク質の酵素活性を測定する方法を提供し、この方法は、溶液中で発光性タンパク質、脱保護酵素、および保護された発光団を接触させて、組成物を生成する工程と、この組成物の発生する光を検出する工程とを含む。
更に別の本発明の局面では、ルシフェラーゼを含有する生細胞内で、ルミネッセンスを発生させる方法を提供し、この方法は、溶液内で該細胞と保護された発光団とを接触させる工程を含む。
本発明の更に別の局面では、非-発光性酵素の酵素活性を測定する方法を提供し、該方法は、非-発光性酵素と、発光性タンパク質および保護された発光団を含む液状混合物とを接触させて、組成物を生成する工程と、この組成物の発生する光を検出する工程とを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、発光団を化学的に変性して、未変性の基質よりも高い安定性を持つ、保護された発光団を生成する方法を提供する。本発明は、また発光性タンパク質に対して、保護された発光団として機能し得る、種々の組成物をも提供する。この保護された発光団を、少なくとも部分的に該発光団に転化することができ、結果として、生成する基質と、発光性タンパク質との相互作用を可能とする。該保護された発光団は、例えば培地内での、自己ルミネッセンスを低下させるが、該細胞内での該発光性タンパク質-依存性ルミネッセンスの同様な低下を示すことはない。この作用は、シグナル対バックグラウンド比を高めることにより、アッセイ感度の改善に役立つ。
【００１７】
本発明の組成物は、様々な分析用途において有用である。培養細胞を用いたその場での応用に対して、該組成物は、発光団および発光性タンパク質を、同時に局在化することを可能とする。この組成物は、基質またはタンパク質何れであっても良い、発光性被検体を検出し、かつ定量するのに利用できる。この組成物は、更に保護された発光団を発光団に転化する酵素を検出し、かつ定量するのに利用できる。現場での測定は、また遺伝的リポータ、例えば少なくとも1種のリポータが発光団を利用する多重リポータの分析を包含する。
【００１８】
生物内でのインビボ用途については、上記の同時局在化は、細胞発生の研究を可能とする。非-発光性酵素に対する保護された発光団の特異性を利用して、特定の器官、組織または細胞型における発光性被検体を測定し、あるいは同様な対象内における非-発光性酵素を測定するために利用できる。インビトロ用途に関連して、経時的に、多数の物質および過程を測定することが可能である。これら分析は、例えば該発光性タンパク質の発現、被検体の濃度、および該保護された発光団を発光団に転化する、非-発光性酵素の発現を包含する。
【００１９】
基質
本発明にとって有用な上記発光団は、セレンテラジン類と呼ばれる一群の化合物を含む。セレンテラジンなる用語は、イミダゾピラジン構造を持つ分子として定義され、溶液中で所定の発光性タンパク質と接触した際に、ルミネッセンスを生じる能力を持つことによって特徴付けられる。セレンテラジン類は、広範囲に渡る発光性タンパク質、具体的には海洋性ルシフェラーゼに作用した際にルミネッセンスを生じることが知られている。海洋性ルシフェラーゼの例は、レニラルシフェラーゼ、エクオリン、ガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ、オプロフォルス(Oplophorus)ルシフェラーゼ、およびシプリジナ(Cypridina)ルシフェラーゼを包含する。
セレンテラジンの例は、以下の構造式I-IIIによって与えられる：
【００２０】
【化３】
2005515977.tif 000004
【００２１】
ここでR1、R2、R3およびR4は夫々独立にH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたはこれらの組み合わせであり得、R5およびR6は夫々独立にH、OH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたはこれらの組み合わせであり得る。構造IIについては、ｎは0、1または2、好ましくは1であり得る。
好ましくは、R1は-CH2-C6H5、-CH2-C6H4OH、-CH2-C6H4F、-CH(CH3)CH2CH3、またはナフチル基(以下の構造IV-A)である。
好ましくは、R2は-CH2C6H5、-(CH2)3NHC(=N)NH2、-CH2C6H11(以下の構造IV-B)；または-CH2C5H9(以下の構造IV-C)である。
【００２２】
【化４】
2005515977.tif 000005
【００２３】
好ましくは、R3は-C6H4OH、-C6H4NH2、-C6H5、-C6H4F、またはインドリル(以下の構造V)である：
【００２４】
【化５】
2005515977.tif 000006
【００２５】
好ましくは、R4は-H、-CH3、または-CH(CH3)2である。
好ましくは、R5およびR6は夫々独立にHまたはOHを表す。
ここで使用する用語「アルキル」とは、1〜20個の炭素原子、好ましくは1〜15個の炭素原子を含み、直鎖、分岐、または環式であり得る炭化水素鎖であり、例えば-CH3、-CH2(CH2)nCH3、-(CH2)nCH(CH3)2、-(CH2)nC(CH3)3(ここでｎは整数である)、アダマンチル、および上記構造IV-BおよびIV-Cである。
「ヘテロアルキル」なる用語は、1またはそれ以上のヘテロ原子、例えばO、N、Sおよびハロゲンをも含むアルキル基であり、例えば-(CH2)n-O-(CH2)mCH3、-(CH2)n-C(=O)-N(CH3)2、-(CH2)3NHC(=N)NH2、および-(CH2)nC(=O)OH(ここでｎおよびｍは整数である)を意味する。
【００２６】
「ヘテロ環式」なる用語は、2〜30個の炭素原子および少なくとも一つのヘテロ原子(O、NまたはS)を、該ヘテロ原子を含むリングを形成するように含む、炭化水素鎖である。このリングは、飽和の、部分的に飽和の、または芳香族リングであり得る。このリングは、また単環式、二環式または多環式のリングであり得る。その例は、アクリジン、ベンゾチアゾリン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンゾチアゾール、ベンゾチオフェニル、カルバゾール、シンノリン、フラン、イミダゾール、1H-インダゾール、インドール、イソインドール、イソキノリン、イソチアゾール、モルホリン、オキサゾール(即ち1,2,3-オキサジアゾール)、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタラジン、ピペラジン、プテリジン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、キナゾリン、キノリン、キニキサリン、チアゾール、1,3,4-チアジアゾール、チオフェン、1,3,5-トリアジン、トリアゾール(即ち、1,2,3-トリアゾール)等を包含する。
【００２７】
「アリール」なる用語は、6〜30個の炭素原子と、少なくとも一つの芳香族炭素環式基を含み、場合によりO、N、Sおよびハロゲン等のヘテロ原子を含む置換基をも含む炭化水素鎖を意味し、例えば-C6H5(フェニル基)、-C6H4OH、-C6H4-C6H5、-C9H7、-C6H4OCH3、-C6H4NH2、-C6H4SH、-CH2-C6H5、およびナフチル基である。
天然のセレンテラジンおよび変性セレンテラジンを含む、セレンテラジン類は、WI、マディソンのプロメガ社(PROMEGA CORPORATION)およびOR、ウジェーヌのモレキュラープローブズ社(MOLECULAR PROBES INC.)から入手できる。セレンテラジン類は、また例えばShimomura等, Biochem. J., 1989, 261: 913-20; Inouye等, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1997, 233: 349-53;およびTeranishi等, Anal. Biochem., 1997, 249: 37-43に記載されているようにして、合成することも可能である。
【００２８】
天然のセレンテラジン並びに変性セレンテラジン両者を、ここでは広義に「セレンテラジン類」と呼び、発光性タンパク質と共に発光団として機能する。これら発光団（発光性物質、化合物）の特定の例は、以下の表Aに略述するような構造Iを基本とするもの、並びに以下の表Bにおいて略述するような構造IIおよびIIIを基本とするものを包含する。通常「セレンテラジン」と呼ばれる、構造VIを持つセレンテラジン類、通常「セレンテラジン-h」と呼ばれる、構造VIIを持つセレンテラジン類、および通常「ジデオキシセレンテラジン」と呼ばれる、構造VIIIを持つセレンテラジン類は、以下の表Aにおける夫々第一、第二および第三記載項目に相当する。
【００２９】
【表１】
2005515977.tif 000007
【００３０】
【表２】
2005515977.tif 000008
【００３１】
【表３】
2005515977.tif 000009
【００３２】
【表４】
2005515977.tif 000010
【００３３】
【表５】
2005515977.tif 000011
【００３４】
【化６】
2005515977.tif 000012
【００３５】
セレンテラジン類は、様々な発光性タンパク質に対する発光団として機能できる。この相互作用に影響を与える因子は、該発光性タンパク質の同等性および周囲環境の特性を含む。例えば、レニラまたはオプロフォルスルシフェラーゼまたはエクオリン等の発光性タンパク質と、セレンテラジンとの、O2および痕跡量の補因子Ca2+の存在下における相互作用は、ルミネッセンスを引起すであろう。このセレンテラジンは、以下に示すように、この過程において、酸化されて対応するセレンテラミドとなる：
【００３６】
【化７】
2005515977.tif 000013
【００３７】
これらの相互作用によってもたらされるルミネッセンスは、測定することができ、また幾つかの系においては、タンパク、セレンテラジン、および/または関連する補因子と関連付けることが可能である。ルミネッセンスの測定は、典型的には所定の表面積を持つサンプルから放出される光の強度を積分することによって行われる。ルミネッセンスの測定のために有用な装置は、ルミノメータ、チャージカップルドデバイス(CCD)、および光電子増倍管を含む。
【００３８】
保護された発光団
保護された発光団は、ルミネッセンスアッセイの有用性を高める可能性がある。「保護された発光団」とは、最早、発光性タンパクと相互作用して、ルミネッセンスを引起すことのないように、変性(修飾)されているセレンテラジンとして定義される。この変性が、該セレンテラジンに対する酵素-離脱性基の付加である場合、該保護された発光団と適当な酵素との相互作用は、ルミネッセンスを生じ得る、活性なセレンテラジンを生成する。該保護された発光団を発光団に転化する該酵素は、好ましくは非-発光性の酵素である。上記セレンテラジンの全てが、保護された発光団に転化できる。用語「基」とは、化学的な化合物の任意の部分を意味する。
【００３９】
一般に、この誘導体化は、フェノール(-C6H4-OH)、カルボニル(>C=O)およびアニリン(-C6H4-NH2)等の官能基を、その周辺に対する反応性がより低い基に転化することを含む。これら官能基の正常な反応性は、該酵素-離脱性基の存在により阻害されるので、該酵素-離脱性基は、保護基と呼ぶことができる。可能な保護基は、エステラーゼとの相互作用によって除去できる、エステルを含む。可能な保護基は、またホスホジエステラーゼおよびアルカリンホスファターゼを含む、ホスファターゼとの相互作用によって除去できる、ホスホリルを包含する。可能な保護基は、更にグリコシダーゼ、α-D-ガラクトシド、β-D-ガラクトシド、α-D-グルコシド、β-D-グルコシド、α-D-マンノシド、β-D-マンノシド、β-D-フルクトフラノシド、およびβ-D-グルコシドウロネートとの相互作用により除去できる、グルコシルをも含む。当業者は、本発明において使用可能な他の酵素-離脱性保護基を認識しているはずである。酵素と酵素-離脱性基との相互作用の例は、米国特許第5,831,102号並びにTsien, R.Y., Nature, 1981, 290: 527-28; Redden, P.R.等, Int. J. Pharm., 1999, 180: 151-60;およびAnnaert, P.等,Pharmaceut. Res., 1997, 14: 492-96に記載されている。
【００４０】
酵素-離脱性基は、特定の酵素の作用によってのみ除去できるように設計することができる。例えば、幾つかの脂肪酸を酵素-離脱性基として使用でき、また特定のエステラーゼのみが、これら保護された発光団を発光団に転化するであろう。高い立体障碍を持つ保護基、例えばt-ブチル基を使用することができる。このような保護基は、嵩高い、立体障碍を持つエステルに作用できる、新規なエステラーゼをスクリーニングする上で有用であり得る。アミノ酸を保護基として使用することも可能である。該保護された発光団は、更にそのエノール酸素原子を、保護基と接続する窒素原子で置換することによって、変性することもできる。この種の保護基は、引続きプロテアーゼにより除去することができ、またこの保護された発光団のその後の加水分解による、エノール/カルボニルへの転化は、ある発光団を与えるであろう。
【００４１】
これら酵素-離脱性基は、好ましくはアルコール官能性基の誘導体である。セレンテラジン類におけるカルボニル官能基の場合、誘導体化は、該カルボニルのエノール基(-C=C-OH)への転化を含む。該セレンテラジンのカルボニルおよびエノール型は、溶液中で、エノール型の基質の割合が、常に一定となるような、動的な平衡状態にある可能性がある。該エノール基のヒドロキシル(-OH)部分を、誘導体化することができる。アシル化剤を使用した、エステル形成を介する誘導体化を、以下に模式的に示す。構造VIを有するセレンテラジンは、2つのフェノール基と一つのカルボニル基とを含み、これら基の任意の組み合わせを保護することができる。
【００４２】
【化８】
2005515977.tif 000014
【００４３】
エーテル保護基を用いた誘導体化は、例えば該セレンテラジンを、アセトキシメチルブロミド等のアルキル化剤で処理することにより行うことができる。エステル保護基を用いた誘導体化は、例えば該セレンテラジンを、酢酸無水物またはアセチルクロリド等のアシル化剤で処理することによって行うことができる。これら誘導体化は、塩基性条件下、即ち7〜14なる範囲内のpHにて行われる。これら条件下で、フェノール系ヒドロキシルおよびイミダゾロン酸素両者が反応して、該対応するエステルまたはエーテルを生成し得る。該イミダゾロン酸素は、該エノール型である場合に、反応するものと考えられる。この保護/脱保護法並びに様々な保護基の例は、「有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」, Greene, Wuts編, John Wiley & Sons, NY, 1991に記載されている。
この誘導体化方法の一例は、セレンテラジンVIからの保護された発光団IXの合成である。保護された発光団IXは、3個のアセチル保護基が存在することから、トリアセチル-セレンテラジンとしても知られている。
【００４４】
【化９】
2005515977.tif 000015
【００４５】
化合物IXの構造を持つ化合物は、報告されているところによれば、天然のセレンテラジンVIの構造を確立する研究における、中間体として使用されている(Inoue等, Tetrahedron Letters, 1977, 31: 2685-2688)。保護された発光団IXは、他の保護された発光団と比較して、かなり低い安定性を示し、該アセチル誘導体化エノール基の不安定性(lability)をもたらす。
【００４６】
与えられた保護基に対して、誘導されたエノールは、同様に誘導されたフェノールよりも一層不安定である。このエノール誘導体の高い反応性は、該エノール誘導体を選択的に加水分解して、再度該イミダゾロンカルボニルを得ることを可能とする。この型の化合物は、部分的に保護された種と呼ばれる。というのは、その官能基の幾つかが保護され、その他が保護されていないからである。これらの部分的に保護された種は、生物学的アッセイにおいて利用でき、あるいはこれらを更に別のアシル化剤またはアルキル化剤と反応させて、非対称の化合物を製造でき、この化合物は一種以上の型の保護基を含むものである。適当な保護基の選択は、考察中の細胞の型および望ましい加水分解速度に依存する可能性がある。この選択的な加水分解は、例えばInoue等, Tetrahedron Letters, 1977, 31: 2685-88に記載されているように行うことができる。これを、トリアセチル-セレンテラジン(IX)の、ジアセチル-セレンテラジン(X)への加水分解およびその後の非対称性保護発光団(XI)の生成に関連して、以下の反応式に示す：
【００４７】
【化１０】
2005515977.tif 000016
【００４８】
以下に示す構造XII〜XIVは、カルボニル基上に保護基を持つ、保護された発光団を示すものである：
【００４９】
【化１１】
2005515977.tif 000017
【００５０】
R7、R8、R9およびR10は夫々独立にH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたはこれらの組み合わせであり得る。R12およびR13は夫々独立に-OR16、H、OH、アルキル、ヘテロアルキル、アリールまたはこれらの組み合わせであり得る。構造XIIIに対して、nは0、1または2、好ましくは1であり得る。
好ましくは、R7はR1について記載したものと同一であり、あるいは-CH2-C6H4OR14である。
好ましくは、R8はR2について記載したものと同一であり、またR10はR4について記載したものと同一である。
好ましくは、R9はR3について記載したものと同一または-C6H4OR15である。
【００５１】
一緒にRPで表される、R11、R14、R15およびR16は保護基であり、また夫々独立に様々な保護基の何れかを表すことができる。好ましくは、これらの種は、対応するO原子と共に、エーテル、エステルまたはその組み合わせである。例えば、この保護基はアセチル(RP=-C(=O)-CH3)、ブチリル(RP=-C(=O)-C3H7)、アセトキシメチル(RP=-CH2-O-C(=O)-CH3)、プロパノイルオキシメチル(RP=-CH2-O-C(=O)-C2H5)、ブチリルオキシメチル(RP=-CH2-O-C(=O)-C3H7)、ピバロイルオキシメチル(RP=-CH2-O-C(=O)-C(CH3)3)、またはt-ブチリル(RP=-C(=O)-C(CH3)3)であり得る。
保護された発光団の具体的な例は、トリアセチル-セレンテラジン(IX)、トリブチリル-セレンテラジン(XV)、ジアセチルセレンテラジン-h(XVI)、アセトキシメチルジアセチル-セレンテラジン(XVII)、アセトキシメチルアセチルセレンテラジン-h(XVIII)、ピバロイルオキシメチルセレンテラジン-h(XIX)、およびアセトキシメチルジデオキシセレンテラジン(XX)を含む。
【００５２】
【化１２】
2005515977.tif 000018
【００５３】
上記保護基は、取外すことができ、また該保護された発光団が適当な脱保護酵素と相互作用した場合に、その元の官能基を復元する。エステルおよびエーテル保護基に関連して、該脱保護酵素は、例えばエステラーゼを含む任意のヒドロラーゼであり得る。脱保護された状態においてカルボニル官能基(即ち、カルボニル)を持つセレンテラジン類は、レニラルシフェラーゼ、オプロフォルスルシフェラーゼ、シプリジナルシフェラーゼ、およびエクオリンを包含する発光性タンパク質との、発光性の相互作用を可能とする。該保護された発光団は、そのカルボニルサイトにおいてのみ脱保護されて、発光団に転化できる。しかし、そのフェノール性ヒドロキシル基における保護基の存在は、依然として障碍となり、あるいは発光性の相互作用を妨害する可能性がある。
【００５４】
保護された発光団の特性
該保護された発光団は、その対応する発光団と比較して、正常な使用条件下で高い安定性を示す。セレンテラジン類は、典型的に溶媒和された際に、特に中性pH以上にて水性溶液中で(例えば、細胞培養倍地中で)溶媒和された場合に、不安定となり、またこの不安定性が、自己ルミネッセンスに導く可能性がある。自己ルミネッセンスは、この系について測定されるバックグラウンドに寄与し、この測定の感度を低下する。また、この不安定性は、このシグナルの持続時間を比較的短いものとする可能性がある。この期間は、該シグナルの半減期として定量化でき、これは該シグナルが、その元の強度の半分に減衰されるのに要する時間として、定義される。
【００５５】
保護された発光団および発光団両者に関する「安定性」とは、特定の環境における、特定の化合物の半減期として定義される。この半減期は、該化合物の濃度を、その初期値の半分に減じるのに要する時間である。特定の化合物の存在および/または濃度は、当業者には公知の様々な技術によって測定することができる。これら技術は、例えば核磁気共鳴（NMR)および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を含む。好ましくは、安定性は、まず発光団または保護された発光団と、水性混合物とを混和して、初期濃度の溶液を得る。この水性混合物は、好ましくは温度22℃において10％の牛胎児血清を含むF12媒体である。次いで、少量のアリコートを、適当な時間間隔で、この混合物から取り出して、該化合物の濃度をHPLCで測定する。この測定される濃度が、該初期濃度の50％まで減衰するのに要する時間が、半減期である。より長い半減期が、より安定な化合物に対応する。
【００５６】
本発明の保護された発光団は、その対応する発光団よりも安定である。安定性の比較において、該発光団は、該保護された発光団の「原化合物(parent compound)」と呼ばれる。というのは、全ての酵素-離脱性基が除去されているからである。該保護された発光団に対する他の原化合物は、その部分的に脱保護されている誘導体である。即ち、原化合物は、少なくとも一つの酵素-離脱性基が除去されている、保護された発光団を含む。例えば、化合物VIおよびX両者は、化合物IXに対する原化合物である。
【００５７】
該保護された発光団の顕著な安定性は、発光アッセイの様々な強化をもたらす。例えば、該保護された発光団は、発光性タンパク質と接触した際に、ルミネッセンスを生じないが、まず適当な脱保護酵素と相互作用させる必要がある。かくして、該保護された発光団は、該発光性タンパク質との極近傍において、発光団に転化され得る。該保護された発光団よりも安定性の劣る該発光団は、不安定化（即ち、自己ルミネッセンス）から保護されなければならない。というのは、該保護された発光団は、該脱保護酵素と相互作用した後に初めて、その活性化状態となるからである。該脱保護酵素細胞または生物の特定の領域に制限されている場合に、その領域においてのみルミネッセンスを検出することができる。
発光アッセイにおける保護された発光団の使用は、このアッセイのシグナル/バックグラウンド比の増大および該ルミネッセンスシグナルの安定性改善を含む、多くの他の利点をもたらす可能性がある。
【００５８】
アッセイ：インビトロ
本発明の幾つかの態様において、該保護された発光団は、アッセイ用の試薬として使用できる。ルシフェラーゼを用いたアッセイは、当分野において周知である。このようなアッセイは、遺伝子発現および調節等の生物学的なメカニズムを分析するのに、特に有用である。典型的には、細胞を、ルシフェラーゼをコードする核酸でトランスフェクションし、次いでタンパク抽出物を生成するために溶解する。このタンパク抽出物におけるルシフェラーゼの存在は、基質を含む試薬の添加によって測定される。
好ましい態様では、保護された発光団は、レニラルシフェラーゼを含むアッセイで使用する。レニラルシフェラーゼは、このアッセイにおける唯一の光発生タンパク質であり得(Srikantha等, J. Bacteriol., 1996, 178(1): 121-9; Liu & Escher, Gene, 1999, 237(1): 153-9)、1種またはそれ以上の光発生タンパク質と共に存在でき(Skarpidi等, Blood, 2000, 96(1): 321-6; Parsons等, Anal. Biochem., 2000, 281(2): 187-92; Stables等, J. Recept. Signal Transduct. Res., 1999, 19(1-4): 395-410; Grentzmann等, RNA, 1998, 4(4): 479-86)、または他の光発生タンパク質を含む融合タンパクの一部であり得る(Liu等, Luminescence, 2000, 15(1): 45-9)。
【００５９】
幾つかの態様においては、保護された発光団をアッセイで使用するが、このアッセイでは、脱保護酵素が、該アッセイ試薬を添加する前に、サンプル中に存在する。このようなアッセイは、サンプル中の脱保護酵素の存在を決定する方法において有用であり得る。例えば、レニラルシフェラーゼおよび保護された発光団をサンプルに添加できる。脱保護酵素がサンプル中に存在する場合には、該保護された発光団は活性化され、光を発生するためにルシフェラーゼにより利用されるであろう。脱保護酵素が存在しない場合には、該保護された発光団はルシフェラーゼに利用されないままであり、光は発生しない。このようなアッセイは、またサンプル中の該脱保護酵素の相対的な濃度を測定する上で有用である。
【００６０】
他の態様では、該脱保護酵素は、アッセイ試薬中に含まれている。例えば、カブト虫およびレニラルシフェラーゼを含む二重ルシフェラーゼアッセイにおいては、ATP、ルシフェリン、および保護された発光団を、まずサンプルに添加することができる。該カブト虫ルシフェラーゼは、該ATPおよびルシフェリンを利用するので、発生する光を測定する。脱保護酵素は、その後添加される。該脱保護酵素は、該エノール/カルボニル基から、少なくとも該保護基を除去することによって、セレンテラジンを活性化する。したがって、基質はカルボニル基を持ち、この基はセレンテラジン-レニラルシフェラーゼ相互作用に関与できるので、発生する光を検出する。
【００６１】
カブト虫およびレニラルシフェラーゼを使用する別の態様では、該アッセイは、サンプル中の細胞を検出し、もしくは定量するために使用される。カブト虫ルシフェラーゼは、その活性においてATP依存性であるので、これを、サンプル中のATPを検出するのに利用する。この依存性は、カブト虫ルシフェラーゼを用いて、ATPアッセイ、細胞検出アッセイ、および細胞の生存性決定アッセイを行うのに有利であった。保護された発光団を用いた、一回の二重-ルシフェラーゼアッセイを利用して、サンプル中のATPおよび該脱保護酵素の存在を検出できる。
【００６２】
アッセイ：その場でのアッセイ
本発明の化合物は、細胞を分析するための、その場で行われる方法において、特に有用である。ルシフェラーゼを用いて、その場で細胞を分析する方法は、当分野において公知である(米国特許第5,998,204号参照)。本発明の保護された発光団は、その保護基を除去して、該ルシフェラーゼの基質とする必要がある。しかし、一旦保護基を除去すると、ルシフェラーゼは、該化合物を基質として直ぐに利用することができる。従って、その場でのイメージングにより、該脱保護酵素が細胞中に存在する位置を決定することができる。これは、ルシフェラーゼ、例えばレニラルシフェラーゼを発現する細胞と、保護された発光団とを接触させることによって、行うことができる。該保護された発光団を脱保護できる酵素が、該細胞内に存在する場合には常に、成長があるであろう。この成長は、イメージングシステムによって検出できる。保護された発光団は、またリポータ遺伝子発現の分析においても有用である。該保護された発光団を発光団に転化するのに必要な、該脱保護酵素の製造は、様々な因子によって影響される可能性がある。該脱保護酵素の存在およびその量は、該保護された発光団の利用によって決定できるので、該酵素の発現を検討することができる。
【００６３】
生物発光共鳴エネルギートランスファー(bioluminescence resonance energy transfer; BRET)を利用して、2種の分子が相互に結合できるか、あるいは細胞内に同時に局在できるかを決定することができる(Angers等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(7): 3684-9)。BRETは2種の生物発光性分子の使用、または1種の生物発光性分子および1種の蛍光性分子の使用を含む。これら分子は、該ドナーの発する光の波長が、該アクセプタの励起スペクトル範囲に入るように選択される。更にこれら分子の励起並びに発光スペクトルは、重なるとしても最小限度であるべきである。これらの分子が、相互に極めて近接した状態にある場合、該ドナーの励起は、光の放出ではなく、寧ろ該アクセプタへのエネルギーの伝達に導く。次いで、該アクセプタが、該伝達されたエネルギーを光として放出する。このように、これら分子が相互に近接した状態にある場合には、該ドナーから検出される光は少量であり、一方該アクセプタからは、多量の光が検出される。該分子が相互に近接した状態にない場合には、該ドナーから多量の光が検出され、一方該アクセプタから検出される光は少量である(PCT公開WO99/66324)。
【００６４】
該ドナーを第一のタンパク質と結合し、かつ該アクセプタを第二のタンパク質と結合することにより、これら2種のタンパク質の相互作用を、BRETの検出により測定することができる(Angers等, 2000)。好ましい態様において、該ドナーはレニラルシフェラーゼであり、また該アクセプタは緑色の蛍光発光性タンパク質である。このようなアッセイにおいて、保護された発光団を使用した場合、該アッセイの精度は、発光団の不安定化により発生する光が減少するために、大幅に増大する。
生化学的な過程のこの分析は、インビトロまたはその場の環境に制限されず、インビボでの研究に拡張することが可能である。該保護された発光団のインビボ発光分析への応用は、当業者には容易に明らかになるであろう。
【００６５】
キット
本発明の重要な局面の一つは、本発明による該保護された発光団を含むキットを包含する。ここにおいて詳細に記載する好ましい方法を包含する、発光団を利用する本質的に任意のアッセイにおいて、このキットを使用できる。好ましい態様において、特定のアッセイ用の必須の試薬が、このキットにより与えられる。このような試薬は、チオウレアまたはチオウレア誘導体、1種またはそれ以上の水性バッファーおよび酵素を含むことができる。試薬は、また該保護された発光団の溶解を助けるための、DMSOおよび/またはアルコールをも含むことができる。各試薬は、夫々独自の容器を持つか、あるいは幾つかの試薬を予め混合し、一つの容器に一緒に収容することができる。幾つかの態様において、該キットは、ルシフェラーゼをコードする遺伝子を含む。他の態様においては、該ルシフェラーゼタンパク自体が与えられる。
【００６６】
化合物
本発明は、また式XII、XIIIおよびXIVで示される、新規な化合物をも提供する。化合物XIIに関して、R7は-CH2-C6H4OC(=O)CH3であり、R9は-C6H4OC(=O)CH3であり、R10はHであり、およびR8は-CH2-C6H5であり、この場合R11は-C(=O)CH3ではない。好ましくは、本発明は、式XII、XIIIおよびXIVで示される、新規な化合物を提供し、ここで該化合物は、更に22℃における、F12媒体(培地)および10％牛胎児血清を含む混合物中で、少なくとも45分なる半減期を持つ。好ましくは、保護された式XII、XIIIおよびXIVで示される発光団は、水性環境内での、該化合物の半減期により測定した場合に、その原化合物よりも高い安定性を示す。具体的に、本発明は、式XV、XVI、XVII、XVIII、XIXおよびXXで示される新規化合物を提供する。
【実施例】
【００６７】
全ての溶媒および試薬は、以下のものを除いて、FISHER SCIENTIFICから入手した。マシューバッファー(Mathew's Buffer)は、SIGMA CHEMICALSから入手した以下のものから調製した：100mMの燐酸カリウムバッファー(pH7.4)、500mMの塩化ナトリウム、1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および0.1％(w/v)のタイプAゼラチン(75〜100ブルーム(Bloom))。ハム(Ham's) F12培地および牛胎児血清は、LIFE TECHNOLOGIESから入手し、ウサギエステラーゼは、SIGMA CHEMICALSから入手し、またレニラルシフェラーゼは、CHEMICON CORPから入手した。
【００６８】
実施例1
本例においては、3個のアセチル保護基を持つ、保護された発光団を、上記構造VIを持つセレンテラジンから合成した。無水ピリジン(20ml)に分散させたこの化合物VI(ストップ＆グロ(STOP AND GLOTM)基質、PROMEGA社製)(500mg；1.2mM)に、無水酢酸(1.1ml；12mM)を添加し、この反応系を室温にて、不活性雰囲気下に維持した。1時間後に、30mlの塩化メチレンをこの反応系に添加し、次いで80mlの水を添加した。この混合物を5分間撹拌し、次いで相を分離した。得られた有機相を、蒸発乾固させ、次いで以下のようにして、カラムクロマトグラフィーにより精製した。順相シリカ(20g)を、塩化メチレン中で溶媒和させ、適当なサイズのガラスカラムに収容した。抽出した反応混合物を、最少量の塩化メチレンにとり、このカラムの上部に適用した。段階的な勾配を利用した。即ち、酢酸エチル(EtOAc)の1％塩化メチレン溶液から出発して、極性を所定の化合物が溶出されるまで増大(EtOAcの10％CH2Cl2溶液)させた。HPLC(>95%)によって純粋であると考えられる画分をプールし、蒸発乾固して、410mgの純粋な化合物IXを得た。
【００６９】
実施例2
本例においては、3個のブチリル保護基を持つ、保護された発光団を、上記構造VIを持つセレンテラジンから合成した。無水ピリジン(30ml)に分散させたこの化合物VI(300mg；0.7mM)に、無水酪酸(1.12ml；7mM)を添加し、この反応系を室温にて、不活性雰囲気下に維持した。1時間後に、この反応混合物を、真空下において、シロップが生成するまで該溶媒を除去した。このシロップに30mlの塩化メチレンを、次いで80mlの水を添加した。この混合物を5分間撹拌し、次いで相を分離した。次に、得られた有機相を蒸発乾固し、更に以下のようにしてカラムクロマトグラフィーにより精製した。順相シリカ(20g)を、EtOAcの2％塩化メチレン溶液中で溶媒和させ、適当なサイズのガラスカラムに収容した。抽出した反応混合物を、最少量の塩化メチレンにとり、このカラムの上部に適用した。その移動相はアイソクラチックであり、所定の化合物全ては、酢酸エチルの2％塩化メチレン溶液で溶出させた。HPLC(>95%)によって純粋であると考えられる画分をプールし、蒸発乾固して、225mgの純粋な化合物XVを得た。
【００７０】
実施例3
本例においては、構造VIIを持つセレンテラジンを合成した。その合成手順は、Inoue等によって報告されている手順(Inoue & Kakoi, Heterocycles, 1998, 48(8): 1669)を改良したものであった。2-アミノ-3-ベンジル-5-(4-ヒドロキシフェニル)ピラジン(2g；7.2mM)をキシレン(80ml)に溶解した溶液に、一度に、フェニルピルビンサン(8.3g；50.5mM)を添加し、この反応混合物を1時間還流加熱し、次いで室温まで冷却させた。この混合物を、減圧下で、暗色の固体状の泡状物となるまで蒸発させた。この泡状物を、N.P.シリカ300g上での、塩化メチレン中のメタノールの段階的勾配を用いたクロマトグラフィーによって分離した。所定の生成物は、メタノールの5％塩化メチレン溶液で溶出され、2gの化合物VIIを与え、これはHPLCにより純度80％であることが確認された。このクロマトグラフィーを繰り返して、900mgの化合物VII(「セレンテラジン-h」；HPLCによれば純度>95％)を、褐色固体として得た。
【００７１】
実施例4
本例においては、構造VIIを持つセレンテラジンから、2つのアセチル保護基を有する、保護された発光団を合成した。無水ピリジン(15ml)に分散させたこの化合物VII(300mg；0.74mM)に、無水酢酸(1ml；11mM)を添加し、この反応系を室温にて、不活性雰囲気下に維持した。1時間後に、この反応混合物を、粘稠なシロップとなるまで蒸発させ、このシロップを以下のようにして、カラムクロマトグラフィーにより精製した。順相シリカ(40g)を、EtOAcとヘプタンとの1：3混合物で溶媒和させ、適当なサイズのカラムに投入した。該シロップを、最少量の塩化メチレンにとり、該カラムの上部に適用した。その移動相は、アイソクラチックであり、所定の化合物全ては、1：3EtOAc/ヘプタンで溶出した。HPLCにより純粋であると考えられる(>95％)全ての画分をプールし、蒸発乾固して、170mgの純粋な化合物XVIを得た。
【００７２】
実施例5
本例では、実施例4で合成した、保護された発光団(XVI)から、1個のアセチル保護基を(フェノール基上に)持つ保護された発光団を合成した。化合物XVIを、ピリジンと塩化メチレンとの1：1混合物に溶解した1％溶液を、0℃に冷却した。この溶液に、予備冷却した、1％のメタノール性アンモニア溶液を滴下した。このアンモニア溶液の体積は、化合物XVIを溶解するのに使用したピリジン/塩化メチレン1：1混合物の体積と等しいものであった。数分間反応させた後、アリコートをHPLCで検査して、脱保護の完了の程度を決定した。HPLCにより、該出発物質よりも高い極性をもつが、化合物VIよりも親油性の高い、新たなピークが生成(即ち、C18シリカ上でより早期に溶出される、溶出液)した。HPLCによって、これ以上の化合物XVIが検出されなくなったら、この反応混合物を、蒸発乾固し、次いで以下のようにして、カラムクロマトグラフィーにより精製した。シリカ対化合物の比75：1にて、順相シリカを、EtOAcとヘプタンとの1：2混合物で溶媒和させた。その移動相は、段階的勾配相であり、この溶媒系の極性を、完全に所定の生成物が溶出されるまで、該EtOAc濃度を高めることにより増大させた。HPLCにより純粋であると考えられる(>95％)全ての画分をプールし、濃縮して、純粋な化合物XXIを得た。化合物XXIは、構造Iを有しており、そこでR1は-CH2-C6H5であり、R2は-CH2C6H5であり、R3は-C6H4-O-C(=O)-CH3であり、R4はHである。
従って、化合物XXIは脱保護されたエノール/カルボニルであり、このものを保護することにより、非対称の保護された発光団を得ることができる。例えば、ブロモメチル酢酸との反応は、保護された発光団XVIIIを生成するであろう。
【００７３】
実施例6
本例では、(フェノール基上に)2個のアセチル保護基を持ち、かつ1個のアセトキシメチル保護基を持つ、保護された発光団を、実施例1で合成した、保護発光団(IX)から合成した。化合物IXの1％無水ピリジン溶液に、NaH(5.0当量)を添加し、この溶液を室温にて不活性雰囲気内で撹拌した。10分後に、ブロモメチル酢酸(5.0eq.)を、この混合物に滴添し、この反応混合物を、室温にて更に30分間撹拌した。この反応系に、該ピリジン体積の2倍に相当する量の塩化メチレンを添加し、次いで該ピリジン体積に等しい量の水を添加した。この混合物を5分間混合し、次いで得られた相を分離し、そのうちの有機相を蒸発乾固させた。得られた物質を、移動相としてEtOAc/ヘプタンを用い、順相シリカを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物XVIIを得ることができる。
【００７４】
実施例7
本例では、構造XIXを持つ保護発光団を、Aungst等(Pharmaceutical Research, 1995, 12(5): 763)による手順の改良を利用して、構造VIIを持つセレンテラジンから合成した。KI(0.122g; 0.74mM)、K2CO3(0.031g; 0.44mM)およびクロロメチルピバレート(1.1g; 7.3mM)を、無水DMF(3ml)に分散させた混合物に、化合物VII(0.3g; 0.73mM)を添加し、この反応系を室温にて不活性雰囲気下で、一夜撹拌した。HPLCによる分析は、化合物VIIの完全な消費および化合物XIXに関連する極性の低いピークの出現を示した。該DMFを減圧下で蒸発させた。得られた固体を塩化メチレンに溶解し、50gのN.P.シリカ上でのクロマトグラフィーにより精製して、255mgの化合物XIX(HPLCによる純度98％)を得た。
【００７５】
実施例8
本例では、構造VIIIを持つセレンテラジン(ジデオキシセレンテラジン)を、2-アミノ-3-ベンジル-5-フェニルピラジンおよび2-アセトキシ-3-フェニルプロペナールから合成した。該化合物2-アミノ-3-ベンジル-5-フェニルピラジンは、以前に記載された方法に従って調製した(Kishi, Y.等, Tet. Lett., 1972, 2747; Cormier, M.等, Biochemistry, 1979, 18(11): 2204; Hirano, T.等, Tetrahedron, 1997, 53(38): 12903-12916)。該化合物2-アセトキシ-3-フェニルプロペナールは、以下のようにして合成した。無水ピリジン(250ml)に溶解した、フェニルピルビンサン(25g; 152mM)の溶液に、無水酢酸(170ml)を添加した。この溶液を、不活性雰囲気下で、一夜撹拌し、メタノールの10％塩化メチレン溶液を用いた、薄層クロマトグラフィー(TLC)によって追跡した。該ピリジンを、減圧下で蒸発させ、得られたシロップを塩化メチレン(700ml)にとり、各200mlの0.1N水性HCl溶液で3回洗浄した。得られた有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、得られた濾液を、粘稠な琥珀色のシロップとなるまで濃縮した。このシロップを、塩化メチレンを用いた、N.P.シリカ上でのクロマトグラフィーにより精製し、24gの2-アセトキシ-3-フェニルプロペン酸を得た。このエノールアセテート中間体を、150mlのTHFに溶解し、0℃に冷却した。
【００７６】
次いで、塩化オキサリル(51ml; 580mM)を、撹拌しつつ滴下し、得られる溶液を0℃にて更に20分間撹拌した。ジメチルホルムアミド(DMF; 7.5ml)を滴下し、次いでこの溶液を、0℃にて4時間撹拌し、減圧下で濃縮し、トルエンと共に2回同時蒸発させ、酸塩化物を製造した。この酸塩化物中間体(14.5g; 87mM)を、200mlの1：1塩化メチレン/THF混合物に溶解した。この溶液を-70℃に冷却し、LiAl(OtBu)3H(152ml; 152mM)を滴下し、一方でこの反応系の温度を-70℃以下に維持した。LiAl(OtBu)3Hの添加が完了した後、撹拌を、-70℃にて2時間続けた。冷却浴を取外し、水性HCl(2N、100ml)を添加し、この反応系を室温まで昇温させた。この混合物を500mlのエーテルで抽出し、併合した有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過した。得られた濾液を、減圧下で濃縮して、粘稠な油状物を得、これを、N.P.シリカ(250g)およびヘキサン中の酢酸エチルの段階的な勾配を利用した、カラムクロマトグラフィーにより精製した。所定の化合物を酢酸エチルの10％ヘキサン溶液中に溶出して、琥珀色の油状物として、13.5gの2-アセトキシ-3-フェニルプロペナールを得た(収率80％、1H NMRにおいて、9ppmにアルデヒドのシングレット、ms=189)。
【００７７】
ジデオキシセレンテラジンを、以下のような改良を施した、Kishi等の以前に記載された方法(Tet. Lett., 1972)に従って、2-アミノ-3-ベンジル-5-フェニルピラジンおよび2-アセトキシ-3-フェニルプロペナールから調製した。2-アミノ-3-ベンジル-5-フェニルピラジン(2g; 8.1mM)のエタノール(125ml)溶液に、2-アセトキシ-3-フェニルプロペナール(3g; 16.2mM)を、一度に添加した。この溶液に、アルゴンガスを30分間に渡り通じることにより、酸素を除去した。濃厚な水性HCl(4ml)を添加し、この反応系を18時間に渡り加熱還流した。室温まで冷却した後、灰色がかった沈殿を濾過により集め、40mlのエタノールで洗浄し、真空下で乾燥して、1.28gの化合物VIII、即ちジデオキシセレンテラジン(収率80％)を得た。
このように、化合物VIIIは、脱保護されたエノール/カルボニルを有し、これは保護して、保護発光団を与えることができる。例えば、ブロモメチルアセテートとの反応は、保護発光団XXを生成するであろう。
【００７８】
インビトロ分析
実施例9：様々な保護発光団の安定性
セレンテラジンまたは保護発光団のサンプルを、約3mMなる濃度にて、メタノールに溶解した。これらの原液を、F12培地；F12培地+10％牛胎児血清；またはF12培地+0.01％ツイーン(Tween)20中に、1μMまで希釈した。サンプルを様々な時点において採取し、サンプル中に残留する化合物(セレンテラジンまたは保護発光団)の量を、HPLCを利用して測定した。各溶液における該化合物の半減期は、吸光度対時間の対数プロットにより得られる線形関数の、回帰分析を行うことによって決定した。次に、この化合物の濃度を、初期濃度の50％まで低下するのに要する時間を算出した。
【００７９】
【表６】
2005515977.tif 000019
【００８０】
その場での分析
これら実施例においては、発光団および保護発光団の挙動を、様々な培養細胞において、その場で検討した。細胞を、レニラルシフェラーゼをコードするプラスミドによって、一時的にまたは安定的にトランスフェクションした。ルミネッセンスを、セレンテラジン(VIまたはVII)または保護発光団(IX、XV、またはXVI)と接触させた細胞同士で比較した。経時のルミネッセンスを測定し、かつこのルミネッセンスを細胞が存在しない場合のものと比較することによって、該細胞と保護発光団との接触が、長い半減期で、一般にルミネッセンスを低下し、かつ未変性のセレンテラジンと接触させた細胞よりも、高いシグナル対バックグラウンド比に導くことを立証する。
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を、10％の牛胎児血清(FBS)を補充した、ハムF-12培地内に維持した。HeLaおよび293細胞を、10％の子牛血清(FCS)を補充したDMEM培地に維持した。全細胞系を、5％CO2の存在下で、37℃にて成長させた。細胞を、Tfx-20(PROMEGA社、E2391)またはトランスファースト(TransFastTM)トランスフェクション試薬(Transfection Reagent (PROMEGA社、E2431))を使用して、10cmのプレート当り、7.5×105細胞なる濃度にて、15μgのpUC19またはpRL-Controlプラスミド(PROMEGA社、E6271)によって、一時的にトランスフェクションした。翌日、トランスフェクション体をプールし、白色のDYNEX96-ウエルルミノメータプレートの48ウエルに分割した。
【００８１】
CHO細胞も、トランスファースト試薬を用いて、pHRL-ControlおよびpPGKNeo(クローン選択用の、ネオマイシン遺伝子を発現するプラスミド)で、独立に安定的にトランスフェクションした。500μg/mlのネオマイシン(PROMEGA社)におけるクローン選択に続き、安定なクローンを、完全F12培地内で、セレンテラジンを用いて、レニラルシフェラーゼ活性について選別した。
次に、このようにして調製した細胞を、様々なアッセイにかけた。これらアッセイ用の反応バッファーを、DMEMまたはF12培地を、FBSまたはFCS(10容量％)と共に使用して調製した。セレンテラジンVI、セレンテラジンVIIまたは保護発光団IX、XV、またはXVIの一つを、次に添加して、60μM濃度とした。次いで、これらバッファーを、以下のアッセイにおけるルミネッセンスの測定のために使用した。ルミネッセンスは、ORIONルミノメータを使用して測定した。
【００８２】
実施例10：シグナル対バックグラウンド比の増大を伴う、生細胞アッセイ
トランスフェクションに続く24または48時間後に、該細胞から、該培地を吸引除去した。これら細胞を、ウエル当り100μlの1×の燐酸緩衝塩水で洗浄した。VIまたはIXを含有する反応バッファーを、ハーフログ(half-logs)によって、完全培地に滴下し(titrated)、これら溶液を空のウエルおよびトランスフェクションされた細胞を含むウエルに添加した。ルミネッセンスを、培地交換後5分の時点で測定した。最初の測定の直後に、タージトール(TERGITOL) NP-9 (SIGMA CHEMICALS)を、最終濃度1％まで添加した。サンプルを約15秒間混合し、ルミネッセンスを、ウエル当り1秒間に渡り積分した。細胞サンプルから測定したルミネッセンスは、タージトールNP-9を、セレンテラジンVIまたはVIIを含有するサンプルに添加した後に、増大した。細胞サンプルから測定したルミネッセンスは、タージトールNP-9を、セレンテラジンIX、XVまたはXVIもしくはXIXを含有するサンプルに添加した後に、殆ど自己ルミネッセンスのレベルまで低下した。
自己ルミネッセンスは、培地と血清のみを含むサンプルについて測定したルミネッセンスとして定義した。この自己ルミネッセンスで割った該ルミネッセンスを、シグナル対バックグラウンド比(S/B)とした。pHRL CMV, E6271でトランスフェクション下CHO細胞に関する結果を、以下の表Dに与える。
【００８３】
【表７】
2005515977.tif 000020
【００８４】
実施例11：自己ルミネッセンスの比較
該CMVプロモータ(PROMEGA、商品リスト)の制御の下で、合成レニラルシフェラーゼ遺伝子により安定的にトランスフェクションされた、CHO細胞を、10％FBSを含むF12培地内で、37℃にて、５％CO2の存在下で成長させた。細胞を96-ウエルプレートの3列(列A-C)に接種し、一夜生育させた。セレンテラジンVIまたはアセトキシメチルジアセチルセレンテラジンXVIIを、F12+10％FBSに60μMとなるように希釈した。セレンテラジンXVIIを含有する該F12を使用して、列Aの培地を交換し、(自己ルミネッセンスの測定を可能とするために)列Eにおける空のウエルにも添加した。該セレンテラジン含有F12を使用して、列Cの培地を交換し、また列Gにおける空のウエルにも添加した。列Bを利用して、セレンテラジンまたはアセトキシメチルジアセチルセレンテラジンが存在しない状態では、ルミネッセンスが全く発生しないことを確認した。このプレート上のウエル由来のルミネッセンスを、３時間に渡り、10分毎に測定し、経時の各化合物に関する、ルミネッセンス(発光性タンパク質-依存性ルミネッセンス)および自己ルミネッセンス(細胞を含まないウエルについて測定した、発光性タンパク質-独立性ルミネッセンス)としてグラフ化した。時間の関数として測定したルミネッセンスを、図１のグラフに示す。シグナル対バックグラウンド比を、図２のグラフに示す。
【００８５】
実施例12：半減期の短い遺伝的リポータ
本例は、タンパク質合成経路の２つの部分を遮断する効果を示す。プロマイシンおよびシクロヘキシミド両者は、タンパク質合成を阻害するが、これらは該合成経路の異なる点において、異なった仕方で阻害する。インビトロでは、該酵素は、強度において100倍以上も低下し、また22℃において3-5分なる半減期を持つであろう。
CHO細胞を、該CMVプロモータ(PROMEGA、商品リスト)の制御の下で、合成ヒト化レニラルシフェラーゼ遺伝子により安定的にトランスフェクションし、96-ウエルプレートにて、10％牛胎児血清を含むF12培地内で、37℃にて、5％CO2の存在下で成長させた。一連の12-16プレートの列Aのみに接種し、一夜生育させた。該培地を除去し、600μMのPOMセレンテラジン-h(XIX)を含有する、F12培地+10％FBSで置換した。1プレート上の細胞由来のルミネッセンスを測定し、全てのプレートをインキュベータに戻した。1プレート上の細胞由来のルミネッセンスを、培地置換後の各時間に、即ち1、2および3時間後に測定した。
【００８６】
また、ルミネッセンスは、培地置換の約3.5時間後にも測定した。プロマイシンまたはシクロヘキシミドは、各プレート上のウエルの半分に添加し、これらプレートをインキュベータに戻した。これを時間ゼロとした。時間ゼロにおいて、1プレート上の細胞由来のルミネッセンスを測定した。5分間隔で、該プレートを該インキュベータに戻し、新たなプレートを取出し、そのルミネッセンスを測定した。このサイクルを、変化率が低下するまで、5分毎に繰り返した。この時点で単一のプレートを取出し、そのルミネッセンスを測定した。次いで、このプレートを、手早くインキュベータに戻した。このサイクルをほぼ15分間隔で繰り返した。これらプレート全てにおいて測定されたルミネッセンスを、「未処理細胞」（タンパク質阻害剤に暴露されていないもの）および「処理細胞」(シクロヘキシミドまたはプロマイシンに暴露されたもの) として平均した。データを、該未処理サンプルについて同一の時点において測定された平均のルミネッセンスに対して規格化された、各時点のルミネッセンスとして、図３にグラフで示す。該未処理サンプルに関する絶対ルミネッセンスは、この分析の終了時点まで、時間ゼロにおける値と一致していた。
【００８７】
実施例13：セレンテラジン誘導体対セレンテラジン原化合物由来のルミネッセンスの局在化に関するアッセイ
A. POM-h (XIX)対セレンテラジン-h (VII)
CHO hRL25細胞(ルシフェラーゼを発現する) (4.5mlの(7.5x105細胞)/(プレート/5x109細胞/ml))を、5.5mlの培地に再懸濁し、96-ウエルプレートに入れた。翌日、細胞を吸引し、100μlのPBSで洗浄し、次いで再度吸引した。次に、基質を含まない(バックグラウンド)100μlの培地(F12)を、細胞を含まないウエルに添加した。次いで、これらウエルを、オリオン(ORION)ルミノメータ(BERTHHOLD)を用いて、1秒/ウエルについて読み取った(表E、B kg)。
同様に、100μMのPOM-hまたはセレンテラジン-h何れかを含む培地100μlづつを、細胞を含むウエルまたはウエルのみに入れた。次いで、オリオンルミノメータ(BERTHHOLD)を用いて、直後に(セレンテラジン)および添加後10分の時点(POM-h)にて、1秒/ウエルについて読み取った(表E、Subs)。
その後、0.5μlの精製レニラルシフェラーゼ(3.96x10-5M/反応(ケミコン(Chemicon))を、各ウエルに添加した。次いで、全てのウエルを、1秒/ウエルについて読み取った(表E、RL)。
【００８８】
【表８】
2005515977.tif 000021
【００８９】
ルシフェラーゼを発現するCHO hRL25細胞を利用した上記データは、POM-hが、該培地にルシフェラーゼを外性添加した前後両者において、発光団に転化されることを明らかにしており(19584 v. 35349)、このことは、この基質が細胞内で速やかに局在化されることを示唆している。対照的に、同様な条件下で、セレンテラジン-hは、ルシフェラーゼの予備的な外因性添加前には、その添加後に比較して低いルミネッセンスを有し(39342 v. 331381)、このことは、この基質が、エステラーゼを含む複合体を必要とすることなしに、該細胞の内側並びに外側で利用されていることを示唆している。
これらデータは、更に(殆どエステラーゼを含まない)培地のみにおいて、POM-hが、hRL25細胞-含有培地と比較して、低いルミネッセンスを持つことを明らかにし(3641 v. 35349)、このことは、このセレンテラジン誘導体が、ルシフェラーゼによって発光団に転化される前に、まずエステラーゼによって転化される必要があることを示す。これとは対照的に、セレンテラジン-hは培地のみおよびhRL25細胞-含有培地両者について、匹敵するルミネッセンスを示し(278467 v. 331381)、このことは、外因性のルシフェラーゼと反応できる前には、細胞媒介転化が全く不要であることを示唆している。
【００９０】
B. トリアセチルセレンテラジン(IX)対セレンテラジン(VI)
トランスフェクションされていないCHO細胞(自然にルシフェラーゼを生産することはない)および(ルシフェラーゼを発現する)CHO hRL25細胞(4.5mlの(7.5x105細胞)/(プレート/5x109細胞/ml))を、5.5mlの培地に再懸濁し、96-ウエルプレートに入れた。翌日、細胞を吸引し、100μlのPBSで洗浄し、次いで再度吸引した。次に、基質を含まない(バックグラウンド)100μlの培地(F12)を、細胞を含まないウエルに添加した。次いで、これらウエルを、オリオン(ORION)ルミノメータ(BERTHHOLD)を用いて、1秒/ウエルについて読み取った(表F、B kg)。
同様に、100μMのセレンテラジンまたはトリアセチルセレンテラジン何れかを含む培地100μlづつを、細胞を含むウエルまたはウエルのみに入れた。次いで、オリオンルミノメータ(BERTHHOLD)を用いて、直後に(セレンテラジン)および添加後４分の時点(トリアセチルセレンテラジン)にて、1秒/ウエルについて読み取った(表F、Subs)。
その後、0.5μlの精製レニラルシフェラーゼ(3.96x10-5M/反応(ケミコン(Chemicon))を、各ウエルに添加した。次いで、全てのウエルを、1秒/ウエルについて読み取った(表F、RL)。
【００９１】
【表９】
2005515977.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】実施例１１で測定したルミネッセンス及び自己ルミネッセンスを、時間の関数として表したグラフである。
【図２】実施例１１におけるシグナル対バックグラウンド比を表したグラフである。
【図３】実施例１２で測定したルミネッセンスデータを、未処理サンプルについて同一の時点において測定された平均のルミネッセンスに対して規格化した、各時点のルミネッセンスを表すグラフである。
【図１】
2005515977.tif 000033
【図２】
2005515977.tif 000034
【図３】
2005515977.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月4日(2004.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７３】
R11、R14およびR16が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項16記載の化合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７４】
R11、R14およびR16が、夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項16記載の化合物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７７】
R11、R14およびR16が夫々独立に、炭素原子数1-20のアルキル基および炭素原子数1-20のヘテロアルキル基からなる群から選択される、請求項45記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７８】
R11、R14およびR16が夫々独立に、1-20個の炭素原子を含み、かつエステル基およびエーテル基の少なくとも一方を含むヘテロアルキル基を表す、請求項45記載の方法。
【国際調査報告】
2005515977.tif 000036
2005515977.tif 000037
2005515977.tif 000038