(57)【要約】ある種の組織に存在するプロテアーゼにのみ感受性であるプロテアーゼ切断部位を含む改変神経毒が開示されている。この毒素は、筋肉中のプロテアーゼによって選択的に活性化することができるか、または血液中のプロテアーゼによって選択的に不活性化することができる。
2005506036.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたボツリヌス毒素(ＢｏＴＯＸ)または破傷風毒素(ＴｅＴＯＸ)であって、該改変は、活性のために無傷のままでなければならない領域中にプロテアーゼ切断部位を含んでなり、該切断部位は、毒性が望ましくない組織においてのみ有効レベルで存在するプロテアーゼによる切断に対して特異的に感受性であり、該領域は、該部位の存在により毒性が破壊されない領域である改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸ。
【請求項２】
組織が血液である請求項１に記載の改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸ。
【請求項３】
プロテアーゼがトロンビンである請求項２に記載の改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸ。
【請求項４】
切断部位が、重鎖の受容体結合領域とトランスポート領域の間にある請求項１に記載の改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸ。
【請求項５】
請求項１に記載の改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項６】
発現させるための配列に機能的に結合させた請求項５に記載のヌクレオチド配列を含んでなる発現系。
【請求項７】
請求項６に記載の発現系を含有するように改変した組換え宿主細胞。
【請求項８】
プロテアーゼ切断部位を有し、該部位での切断が毒素を不活性化するものである改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸの製造方法であって、請求項７に記載の宿主細胞を、該ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸが産生される条件下で培養し、所望により該ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸを培養物から回収することを含んでなる方法。
【請求項９】
改変されたＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸであって、プロテアーゼ切断部位を介して結合した重鎖および軽鎖を含んでなり、該プロテアーゼ切断部位は、毒性が望ましい組織においてのみ有効レベルで存在するプロテアーゼによる切断に対して感受性である改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸ。
【請求項１０】
組織が筋肉である請求項９に記載の毒素。
【請求項１１】
請求項９に記載の改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子。
【請求項１２】
発現させるための配列に機能的に結合させた請求項１１に記載のヌクレオチド配列を含んでなる発現系。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現系を含有するように改変した組換え宿主細胞。
【請求項１４】
プロテアーゼ切断部位を有し、該部位での切断が毒素を活性化するものである改変ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸの製造方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を、該ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸが産生される条件下で培養し、所望により該ＢｏＴＯＸまたはＴｅＴＯＸを培養物から回収することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、毒活性が望ましくない組織において不活性化され、所望の標的において活性化される改変神経毒に関する。より具体的には、本発明は、非標的組織におけるプロテアーゼ活性に対して感受性である切断部位を毒素の非重要領域に挿入すること、ならびに、標的においてプロテアーゼにより活性化される一本鎖形態に関する。
【背景技術】
【０００２】
構造および機能
神経毒、例えばボツリヌス菌(Clostridium botulinum)および破傷風菌(Clostridium tetani)から得られる神経毒は、神経細胞の極めて強力かつ特異的な毒である。単一の既知の破傷風毒素および複数の既知のボツリヌス毒素の両方は、それらの活性化された形態において、ジスルフィド結合を介して結合した２つのペプチド酸鎖、即ち約５０ＫＤａの軽鎖(ＬＣ)および約１００ＫＤａの重鎖(ＨＣ)を含んでなる。これら毒素はインビボにおいて一本鎖として合成されるが、これは毒性ではない。しかし、翻訳後修飾において一本鎖に切れ目(ニック)が入れられ、独立したＬＣおよびＨＣ(Ｓ-Ｓにより結合される)が生成すると、毒素が活性になる。
【０００３】
破傷風およびボツリヌス毒素は、ヒトにおいて０.１〜１ｎｇ／ｋｇ体重の致死量を有する。これらは、影響を受けたニューロンにおいて、神経伝達物質の放出を阻害することによって機能する。破傷風神経毒(ＴｅＮＴ)は、主に中枢神経系において作用し、一方、ボツリヌス神経毒(ＢｏＮＴ)は、末梢神経系の神経筋接合部および他のコリン作動性シナプスにおいて作用する。両タイプは、影響を受けたニューロンの軸索からシナプスへのアセチルコリン放出を阻害することによって作用し、麻痺を生じさせる。影響を受けたニューロンに対する中毒作用は、長く続き、最近まで不可逆的であると考えられていた。
【０００４】
破傷風神経毒の唯一の形態が既知であり、ボツリヌス神経毒の７つの異なる免疫学的に別個の形態(ＢｏＮＴ／Ａ〜ＢｏＮＴ／Ｇと称される)が既知である。これらタイプの全てがボツリヌス菌の単離体によって産生されるが、他の２つの種(C.baratiiおよびC.butyricum)も、それぞれ／Ｆおよび／Ｅに類似した毒素を産生する。
【０００５】
タイプとは無関係に、中毒の分子機序は同じように見える。最初に、重鎖(ＨＣ)と細胞表面受容体の間の特異的な相互作用によって、毒素が標的ニューロンのシナプス前膜に結合する(この受容体は、ボツリヌス毒素の各タイプに対して、およびＴｅＮＴに対して異なっているものと考えられる)。ＨＣのカルボキシル末端が、細胞表面への毒素の標的化に重要であると考えられる。
【０００６】
第２の工程において、毒素は、毒を与えられた細胞の原形質膜を横切り、受容体媒介のエンドサイトーシスにより細胞によって呑み込まれ、毒素を含有するエンドソームが形成される。次に、毒素は、エンドソームから細胞質中に入る。この工程は、エンドソーム内ｐＨを低下させるプロトンポンプによりもたらされるエンドソーム内の酸性環境によってもたらされるコンフォメーション変化によって媒介されると考えられる。約５.５またはそれ以下のｐＨにおいて、重鎖のアミノ末端の配列が、このコンフォメーション変化を誘発する。コンフォメーションのシフトは疎水性残基を露出させ、これが、エンドソーム膜中への毒素の埋込みを可能にし、次に、細胞質ゾルへの転位を可能にする。
【０００７】
細胞質ゾルにおいては、ＨＣとＬＣを結合するジスルフィド結合の還元が起こる。ボツリヌス毒素および破傷風毒素の全毒活性はＬＣ中に含まれている。これは、亜鉛(Ｚｎ++)エンドペプチダーゼであり、神経伝達物質を含有する小胞の認識および原形質膜の細胞質表面とのドッキング、ならびに、小胞と原形質膜との融合に必須である「ＳＮＡＲＥ」タンパク質を選択的に切断する。
【０００８】
「ＳＮＡＲＥ」タンパク質には、毒素の種々の形態に対して異なって反応するいくつかの形態が存在する。ＴｅＮＴ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｆ、およびＢｏＮＴ／Ｇは、シナプトソーム膜タンパク質であるシナプトブレビン[小胞関連膜タンパク質(ＶＡＭＰ)とも称される]の分解を引き起こす。シナプス小胞の表面から伸びるＶＡＭＰの細胞質ゾルドメインの大部分は、これらの切断現象のいずれかの結果として除去される。それぞれの毒素(ＴｅＮＴおよびＢｏＮＴ／Ｂを除く)は、異なる結合を特異的に切断する。
【０００９】
ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅは、原形質膜関連のタンパク質ＳＮＡＰ-２５(このタンパク質は、原形質膜の細胞質ゾル表面に多く結合し、存在する)を切断する。ＢｏＮＴ／Ｃは、シンタキシン(大部分が細胞質ゾルに露出した内在性タンパク質)を切断する。シンタキシンは、シナプス前末端活性ゾーンのカルシウムチャンネルと相互作用する。
【００１０】
ＴｅＮＴおよびＢｏＮＴの両方は、神経筋接合部において取込まれる。ＢｏＮＴは、末梢ニューロン内に残存し、これら細胞からの神経伝達物質アセチルコリンの放出をブロックする。ＴｅＮＴは小胞中に入り、これが軸索に沿って体細胞に逆行移動し、脊髄の阻害ニューロンと運動ニューロンの間のシナプス間スペースに放出される。ここで、ＴｅＮＴは、阻害ニューロンの受容体に結合し、再び内在化され、軽鎖が細胞質ゾル中に入って、これら細胞からの阻害性神経伝達物質４-アミノ酪酸(ＧＡＢＡ)およびグリシンの放出をブロックする。
【００１１】
薬学的応用
ＢｏＮＴの希釈調製物が、種々の痙攣症状[斜視(眼の誤整列)、ベフラロスパズム(bephlarospasm)(無意識の眼瞼閉鎖)および片顔面痙攣を含む]を有する患者の処置における治療剤として、１９８１年から使用されている。例えば、Borodicらの"Pharmacology and Histology of the Therapeutic Application of Botulinum Toxin in Therapy with Botulinum Toxin", 119-157 (Jankovic J.& Hallett編、1994)を参照(この記載は本明細書の一部を構成する)。この毒素調製物を、作用させるべきニューロンの部位に特異的かつ局所的に供給する。ＢｏＮＴ／Ａは最も強力なＢｏＮＴであり、最もよく特徴付けられている。また、ＢｏＮＴ／Ａの希釈調製物の筋肉内注射を用いて、脳損傷、脊髄損傷、発作、多発性硬化症および脳性麻痺による痙攣症状が有効に処置されている。麻痺の程度は、標的部位に供される用量および容量の両方に依存する。
【００１２】
明らかに、標的部位に投与される毒素の活性を制限するのが望ましい。多くの戦略が採用されている(これらには、直接注射の他に、カプセルポンプの移植または遅延放出ゲルの投与が含まれる)。しかし、このような試みの成功は、完璧とは言いがたい。投与部位からの毒素の拡散のために、全身性の問題(例えば、嚥下困難)が発生する。これらの望ましくない作用という現実は、投与可能な用量レベルを制限した。例えば、両腕または両足の処置を必要としている対象は、副作用のために、問題のある両方の四肢に毒素を投与することができないのが普通である。従って、本来的に標的部位において特異的に作用する毒素形態を提供するのが望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記のような改変された形態を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、特定の標的組織に対する毒性の特異性が付与されるように、非重要領域にプロテアーゼ標的部位を含むボツリヌス毒素および破傷風毒素(これらの変異体および誘導体を含む)を提供するものである。通常、これらの毒素は神経筋接合部において活性であり、従って筋肉組織において毒性であるべきである。また、これらは中枢神経系の部位において活性であってもよい。全身性の拡散は主に血流によって起こるので、どのような分子が血流に入っても直ちに、毒素を不活性化するのが望ましいであろう。それぞれ血液または筋肉プロテアーゼに感受性である切断部位を適切に選択することによって、毒素を、血液中で不活性化されるか、筋肉中で活性化されるか、またはその両方である形態で供することができる。切断部位は、その存在が毒素活性を破壊せず、また、その切断が場合に応じて活性化または不活性化の結果を与える、毒素の領域に供さなければならない。
【００１５】
即ち、１つの態様において、本発明は、改変されたボツリヌス毒素または破傷風毒素であって、該改変が、活性のために無傷のままでなければならないドメイン中に切断部位を含有させることを含んでなり、該切断部位が、毒活性が望ましくない組織においてのみ有効レベルで存在するプロテアーゼによる切断に対して感受性であり、切断部位それ自体が毒素を不活性化しないものである、改変ボツリヌス毒素または破傷風毒素に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、改変されたボツリヌス毒素または破傷風毒素であって、該改変が、不活性形態の毒素が活性化されるようなプロテアーゼのための標的切断部位を含んでなる、改変ボツリヌス毒素または破傷風毒素に関する。この場合には、切断部位に特異的なプロテアーゼは、毒性が望ましい組織においてのみ有効量で存在するであろう。
【００１７】
他の態様において、本発明は、両タイプの切断部位を含むように改変された毒素に関する。即ち、このような毒素は、筋肉中で特異的に活性化されるが、それが血流中に輸送されたときには不活性化されるであろう。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、改変された毒素をコードする組換え物質およびその製造方法に関する。また、本発明は、神経毒活性によって利益を受ける症状を処置するための方法であって、本発明の神経毒を投与するか、またはその局所産生のための発現系を投与することを含んでなる方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明に関連する所望の性質を得るために改変されるボツリヌス毒素および破傷風毒素には、天然の形態に加えて、その変異体および誘導体が含まれる。このような変異体には、例えば、ＢｏＮＴ／Ａの重鎖または軽鎖の一部が、ＢｏＮＴ／ＥまたはＢｏＮＴ／Ｇまたは破傷風毒素の対応する領域によって置換されたキメラ形態の毒素が含まれる。種々の組合せを想定することができる。この毒素は、ある天然毒素からの重鎖を、別の軽鎖と組合せて有することができる。さらに、変異体は、活性に無関係な領域において、１〜５個の置換(好ましくは、性質が類似したアミノ酸による置換、即ち、保存性のアミノ酸置換)を含むことができる。また、変異体は、活性が実質的に影響されない領域において、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸の欠失を含むことができる。上記毒素の誘導体には、脂質化、ＰＥＧ化、ホスホリル化、またはそれ以外に追加の共有結合した基により誘導体化された形態、例えばＮ-末端アシル化およびＣ-末端アミド化された形態が含まれる。このように、本発明に従って改変される毒素は、天然毒素の広範囲な変異体および誘導体を包含することができる。本明細書において使用され、規定される「ボツリヌス毒素」および「破傷風毒素」なる用語は、天然毒素だけでなく、上記のような変異体および誘導体をも意味する。
【００２０】
本発明は、プロテアーゼ切断部位を含む、改変された形態のボツリヌス毒素または破傷風毒素(上記のような変異体および誘導体を含む)に関する。切断部位が毒素の不活性化を与える態様においては、該部位は、切断部位それ自体の存在が毒活性を破壊しない領域中に存在しなければならない。「毒活性を破壊しない」とは、改変された形態の毒活性が、未改変形態の少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは５０％、さらに好ましくは７５％、最も好ましくは少なくとも９０％であることを意味する。また、毒活性が毒素それ自体の活性に等しいか、またはそれを越える形態も含まれる。このような非重要領域は、通常の毒性アッセイ、例えば、Zhou,L.ら[Biochemistry (1995) 34: 15175-15181](組換え産生させたＳＮＡＰ-２５を切断する軽鎖の能力に関するインビトロアッセイを記載する)が記載しているアッセイを用いて、改変毒素の得られる毒性を評価することにより、実験的に決定することができる。通常行われている他の適当なアッセイには、単純にマウスに注射して致死性を評価することが含まれる。このようなアッセイは、例えば、Maisey,E.A.ら[Eur J.Biochem.(1988) 177: 683-691]により記載されている。
【００２１】
しかし、このような部位の位置に関する合理的な決定は、毒素の既知のコンホメーションに基づくことができる。ボツリヌス毒素Ａ型の結晶構造が、例えば、Lacy,D.B.ら[Nature Structural Biology (1998) 5: 898-902]により記載されている。この結晶構造ならびにボツリヌス毒素Ａ型に関して得られた他のデータに基づいて、以下に記載するように、ある種の特徴が明らかである。全てのボツリヌス毒素および破傷風毒素の類似性のゆえに、Ａ型に関して以下に詳細に記載する記述は、残りの毒素型および破傷風毒素に同様に当てはめることができる。一次アミノ酸配列は、全ての場合に類似しており、機能および作用機序も同様に類似している。簡単に言うと、軽鎖は球状であり、多数の露出したループの最小二次構造を含んでおり、重鎖は、２つの球状領域および対の二重らせんを含んでなるようである。「ベルト」を構成する軽鎖の延長は、複合体の部分を区切る。プロテアーゼ標的部位(その切断が不活性化を与える)を配置するための適当な領域は、重鎖の結合ドメインとトランスポートドメインの間に、重鎖の結合ドメインの２つの球体の間に、軽鎖の非触媒領域において、ならびに、ベルト領域において見い出されるであろう。
【００２２】
また、このタンパク質の他の特徴も既知である。ＢｏＮＴ／Ａ軽鎖の最近の研究は、標的基質ＳＮＡＰ-２５に対する毒素の特異性および活性のために重要なある種の特徴を明らかにした。即ち、Zhouら[Biochemistry 34: 15175-15181 (1995)]の研究は、軽鎖アミノ酸残基Ｈｉｓ227をチロシンにより置換すると、得られたポリペプチドはＳＮＡＰ-２５を切断することができないことを示した。Kurazonoら[J.Biol.Chem. 14721-14729 (1992)]は、組換えＢｏＮＴ／Ａ軽鎖を用いて、アプリシア・カリフォルニカ(Aplysia californica)の頬神経節のシナプス前コリン作動性ニューロンにおいて研究を行い、８個のＮ-末端残基または３２個のＣ-末端残基の除去は、毒性を停止させないが、１０個のＮ-末端残基または５７個のＣ-末端残基の除去は、この系において毒性を停止させることを示した。最も最近になって、全ＢｏＮＴ／Ａホロ毒素の結晶構造が解明され、その活性部位は、Ｈｉｓ222、Ｇｌｕ223、Ｈｉｓ226、Ｇｌｕ261およびＴｙｒ365の関与を含むことが示された[Lacyら(上記)；これらの残基は、Kurazonoら(上記)のＢｏＮＴ／Ａ軽鎖のＨｉｓ223、Ｇｌｕ224、Ｈｉｓ227、Ｇｌｕ262およびＴｙｒ366に対応する]。重要なことは、ＢｏＮＴ／Ａ〜ＥおよびＴｅＮＴの軽鎖を整列させたときに、これら鎖の全てが、ＢｏＮＴ／Ａに類似した位置に上記の残基を例外なく有していることである[Kurazonoら(上記)]。
【００２３】
ＢｏＮＴ／Ａの触媒ドメインは、ＳＮＡＰ-２５のＣ-末端に極めて特異的であり、切断が起こるために最少１７個のＳＮＡＰ-２５アミノ酸を必要とするようである。触媒部位はポケットに似ており、Ｃｙｓ429とＣｙｓ453の間のジスルフィド結合によって、軽鎖が重鎖に結合したときに、重鎖の転位ドメインが、触媒ポケットへの接近をブロックするようである(軽鎖が細胞質ゾルに入るまで)。次いでジスルフィド結合が還元されたときに、触媒ポケットが「開き」、軽鎖が完全に活性になる。上記したように、ＶＡＭＰおよびシンタキシンは、ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＴｅＮＴ、およびＢｏＮＴ／Ｃ1によってそれぞれ切断され、一方、ＳＮＡＰ-２５はＢｏＮＴ／ＡおよびＥによって切断される。
【００２４】
切断部位それ自体の存在は、毒活性を保持させるものでなければならないが、該部位における実際の切断は、不活性化を与えなければならない。ここで不活性化とは、毒素が、未切断形態の毒性の５０％、好ましくは２５％、より好ましくは１０％、さらに好ましくは１％を保持することを意味する。即ち、部位の位置は、部位それ自体に関して非重要領域中にあるべきであるが、該部位における切断は、大きな効果を有していなければならない。
【００２５】
血液により不活性化しうるボツリヌス毒素を設計するためには、血流中に比較的特異的に見い出されるプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ部位が望ましい。これらのプロテアーゼには、以下の表１に示すプロテアーゼが含まれる(この表に、その認識部位をも示す)。
【表１】
2005506036.tif 000003
【００２６】
明らかに、凝固因子ＸＩａ、ＸＩＩａ、ＩＸａおよびＶＩＩａならびにカリクレイン、プロテインＣ、ＭＢＰ関連のセリンプロテアーゼ、オキシトシナーゼおよびリシンカルボキシペプチダーゼは、比較的非特異的な標的部位を有するが、凝固因子Ｘａおよびトロンビンは、より高い特異性の機会を与える。
【００２７】
ボツリヌス毒素中にトロンビンまたは凝固因子Ｘａ部位を設計する際に、挿入部位の位置は、上記のように、該部位の存在は毒素活性に干渉しないが、該部位での切断が毒素活性を破壊するかまたは大きく阻害するような位置である。一般に、重鎖中の受容体結合領域または内在化領域中ではあるが、これら領域中の機能ドメインから離れて部位を配置することによって、作用の初期工程を標的化することができる。重鎖の受容体結合ドメイン中の挿入部位は、受容体結合溝から離れているべきであり、全ての場合において、部位は、それに血液プロテアーゼが自由に接近することができるように、タンパク質の表面にあるように選択すべきである。
【００２８】
以下の表２は、図１に示したボツリヌス毒素Ａのアミノ酸配列中の、トロンビンによる切断のための部位改変のいくつかの例を示すものである。この表において、下線はトロンビン認識部位を示し、太字の残基は追加のアミノ酸である。また、天然配列中には存在していたが、部位の挿入時に削除された残基をカッコ内に示す。アステリスク(*)は、トロンビンが切断するであろうペプチド結合を示す。
【表２】
2005506036.tif 000004
提案した部位の位置をも図１に示す。
【００２９】
このように、不活性化切断のためには、プロテアーゼは、血液中に高レベルで存在しているものであるべきである。この点で適するプロテアーゼはトロンビンであり、これは、以下に示すように、本発明の改変形態の毒素を不活性化するに十分なレベルで血液中に存在する。プロテアーゼの「有効」レベルとは、臨床的に適するレベルの用量で血流中に入った毒素の少なくとも５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％またはそれ以上を不活性化することができる濃度を意味する。
【００３０】
一般に、ボツリヌス毒素の投与レベルは、ナノグラムレベル濃度のオーダーにあるので、比較的高い濃度のプロテアーゼを必要とすることは期待されない。
【００３１】
筋肉によって選択的に活性化される毒素の形態に関しては、これら形態は、一本鎖形態の毒素前駆体を含んでなるのが好ましい。このような形態[クロストリジウム(Clostridium)それ自体によるタンパク質分解活性に対して耐性である]を、大腸菌などの他の生物における組換え産生のために設計した。事実として、ある種の場合には、クロストリジウムは、ほとんど未切断の一本鎖形態を産生する。
【００３２】
インビトロで適用された酵素による切断のために鎖間ループ領域にタンパク質分解部位を有する一本鎖形態が、１９９９年１０月２５日出願の米国特許出願Ｎo.６０/１５０,７１０に記載されている(この記載は本明細書の一部を構成する)。この出願に記載されているように、破傷風毒素またはボツリヌス毒素の一本鎖形態は、軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列を、例えば図１の残基４３７〜４４８に対応するリンカー領域を介して連結することによって構築される。本発明の場合、このリンカー領域に、筋肉において十分な濃度で特異的に存在するプロテアーゼのための標的部位(この部位において切断がなされる)を供する。
【００３３】
一本鎖形態の製造には遺伝子操作が含まれるので、(血液中での不活性化に供される形態の構築と同様)、７種類のボツリヌス毒素および破傷風毒素の種々の領域の混合および釣合せが、当業者の技術範囲内である。即ち、ボツリヌスＡ軽鎖を、ボツリヌス毒素Ｂの重鎖と、または破傷風重鎖トランスメンブラン領域およびボツリヌスＧ受容体認識領域と組合せて使用することもできる。上記の米国仮出願において一本鎖産物として例示されている特定の毒素は、一本鎖の破傷風毒素であるが、適当なプロテアーゼ部位を有する他の一本鎖毒素を容易に加工しうることが明らかである。即ち、本発明において、プロテアーゼ切断部位の性質は、筋肉プロテアーゼに感受性であるように改変されるであろう。
【００３４】
本発明の方法に従って改変しうる基質である神経毒は、上記の背景セクションに記載したような天然神経毒であるか、あるいは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９５/３２７３８、ＷＯ９６/３３２７３、ＷＯ９８/０７８６４およびＷＯ９９/１７８０６に記載された改変神経毒であってよい(これら文献の記載は本明細書の一部を構成する)。上記のように、本発明の選択的に活性化および不活性化される毒素は、神経毒の重鎖および軽鎖成分を、容易に混合および釣合せることができ、キメラとして製造することができるというさらなる利点を有する。
【実施例】
【００３５】
以下に挙げる実施例は、説明を意図するものであり、本発明を限定するものではない。
実施例１：血液中のトロンビン活性
トロンビンタンパク質分解活性のアッセイのための基質は、ＧＳＴ-ＳＮＡＰ-２５(アミノ酸１２８〜１９７)融合タンパク質である(２つのタンパク質の間にトロンビン切断部位が挿入されている)。この基質を、１０μｇ／１.５５μｌ〜８.４５μｌのＰＢＳまたは血液調製物を含有する溶液に加えて、１０μｌの最終容量にした。この混合物を３７℃でインキュベートした。各処理に使用した１μｌ(１μｇの基質を含有する)を、ＤＴＴを含む１μｌの２ｘ試料緩衝液と混合し、５分間煮沸し、次いで１８％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに付した。次いで、このゲルをブロット処理し、Ａｂ１９７(これは、切断または未切断ＳＮＡＰ-２５128-197のＣ-末端を認識する)でプローブした。
【００３６】
結果は、この基質が血清によって切断され、相当に低いレベルで全血によって切断されることを示した。血漿と共にインキュベートすることによっては、切断生成物が検出されなかった。血漿中のトロンビン活性の欠如は、大部分の酵素が、恐らくはなおそのプロ酵素形態(プロトロンビン)にあることを示唆する。プロトロンビンは、血液凝固を開始させるタンパク質分解酵素のカスケードの結果としてトロンビンに活性化される。従って、トロンビンは、血清中においては凝固が誘発されているので存在するが、クエン酸塩の添加によって凝固が禁止されている血漿中には存在しない。クエン酸塩処理した全血と共にインキュベートした試料中に観察される痕跡量のトロンビン切断生成物は、低レベルの凝固経路活性化が起こっていることを示すものである。
【００３７】
通常、これら毒素は極めて低い(ナノグラム)レベルで注射されるので、示された低レベルの活性化のときであっても血液中のトロンビンレベルは、少なくとも十分な切断を行って毒素を実質的に不活性化するのに十分であることができる。さらに、毒素の注射によって引き起こされる外傷が、プロトロンビンの活性化を誘発して、トロンビンレベルを高めることができる。
【００３８】
実施例２：プロテアーゼに対する天然ＢｏＮＴ／Ａの安定性
ヒト血清中の未改変ＢｏＮＴ／Ａの安定性を試験するために、ＢｏＮＴ／Ａを１０μｇ／ｍｌヒト血清で加え、規定した時間にわたりインキュベートした。毒素の活性を、２０００年８月２５日出願の同時継続米国出願Ｎo.０９/１６４,６９２(１９９９年８月２５日出願の米国仮出願Ｎo.６０/１５０,７１０に対して優先権主張；これらの記載は本明細書の一部を構成する)に記載されているＳＮＡＰ-２５アッセイにおいて、４５０ｎｍでの吸光度により測定した。吸光度の値を、１０００ｐｇ毒素／ｍｌの希釈度において比較した。図２に示すように、ＢｏＮＴ／Ａは、ヒト血清において４日までほぼ安定であり、血清中で５日後に５０％の活性をなお保持していた。同様の結果が、純粋なＢｏＮＴ／Ａまたは複合体を全血または血漿と共にインキュベートしたときに見い出され、毒素は、試験した４８時間まで安定であった。これらの結果は、ＢｏＮＴ／Ａが血漿プロテアーゼによって直ちに分解されることなく血液中で安定であり、従って、本発明の方法によって不活性化されなければ、他の筋肉および器官に循環する可能性が高く、全身性の作用を引き起こす可能性が高いことを示唆するものである。
【００３９】
種々のプロテアーゼに対するＢｏＮＴ／Ａの耐性
ＢｏＮＴ／Ａを、過剰の精製した制限したプロテアーゼと共に、室温で一晩インキュベートし、次いで、上記したようなＳＮＡＰ-２５アッセイによって活性を分析した。因子Ｘａおよびトロンビンは血漿プロテアーゼであり、エンテロキナーゼは胃腸管への十二指腸分泌物中に存在する。活性を、１００ｐｇ／ｍｌ希釈の各毒素反応において比較した。これらの結果を図３に示す。この毒素はこれらのプロテアーゼに対して耐性である。トロンビンと共にインキュベートした毒素はその活性の１／３を失ったが、過剰の酵素を長時間にわたって使用しているので、これはトロンビン分解に対して極めて感受性が高いとは言えない。これらの処理した毒素のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル分析は、切断を示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ボツリヌス菌株Ｈall Ａから精製したボツリヌスＡ毒素のアミノ酸配列を示す配列図である。ここで、翻訳後修飾中に切断される残基４３７-４３８は、菌株ＮＣＴＣ２９１６および６２ＡのＤＮＡ配列によって得られる保存配列から選ばれる。
【図２】ヒト血清中のボツリヌス毒素Ａの安定性を示すグラフである。
【図３】種々のプロテアーゼに対するボツリヌス毒素Ａの耐性を示すグラフである。
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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