(57)【要約】本発明は、新規化合物ならびにＩκＢのＩＫＫ−βリン酸化に対するアミノチオフェン阻害剤を用いる疾病の治療方法を提供する。それを実施する場合、これらのアミノチオフェン阻害剤は、ＮＦ−κＢの過剰活性化が関与している疾病において、転写因子ＮＦ−κＢの病理学的活性化をブロックする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式Ｉ：
【化１】
2005506334.tif 000006
［式中、
Ｒ１はＣＯＮＨ２、またはＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ２はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ３はＨ、またはハロゲンであり；
Ｒ４はアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ５はＨまたはアルキルであり；
ただし、Ｒ１がＣＯＮＨ２である場合には、Ｒ６はＨ、ＣＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮＨ−アリール、ＣＯＮＨ−ヘテロアリール、ＣＳＮＨ２、ＣＳＮＨ−アルキル、ＣＳＮＨ−アリール、ＣＳＮＨ−ヘテロアリール、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２ＮＨ−アリール、およびＳＯ２ＮＨ−ヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１がＳＯ２ＮＨ２である場合には、Ｒ６はＣＯＮＨ２であり；
Ｒ１がＣＯＮＨ２である場合には、Ｒ２はＮＨＣＯＮＨ２でない］で示される化合物およびその医薬上許容される塩、水和物および溶媒和物。
【請求項２】
３−アセチルアミノ−５−（４−クロロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミド；
３−アセチルアミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミド；
５−（４−フルオロ−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド；
５−（３−クロロ−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド；
５−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド；および
５−フェニル−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド
からなる群より選択される請求項１記載の化合物。
【請求項３】
病理学的なＮＦ−κＢの活性化により特徴付けられる疾病の治療方法であって、治療を要する患者に有効量の請求項１記載の化合物を投与することにより該病理学的な活性化を阻害することを特徴とする方法。
【請求項４】
疾病が炎症または組織修復障害である請求項３記載の方法。
【請求項５】
疾病が、炎症および組織修復障害；特に、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎；骨粗しょう症および線維症；乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線照射（ＵＶ）により誘発される皮膚ダメージを包含する皮膚病；全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎を包含する自己免疫疾患、組織および器官の拒絶反応、アルツハイマー病、卒中、アテローム性動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病を包含する癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を包含する感染およびある種のウイルス感染に関連する炎症、成人の呼吸困難症候群、毛細血管拡張性運動失調からなる群より選択されるものである請求項４記載の方法。
【請求項６】
疾病が皮膚病である請求項３記載の方法。
【請求項７】
疾病が乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線照射による皮膚ダメージからなる群より選択される請求項３記載の方法。
【請求項８】
疾病が自己免疫疾患、組織および器官の拒絶反応、アルツハイマー病、卒中、アテローム性動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、骨関節炎、骨粗しょう症ならびに毛細血管拡張性運動失調からなる群より選択されるものである請求項３記載の方法。
【請求項９】
疾病が自己免疫疾患である請求項３記載の方法。
【請求項１０】
自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎または強直性脊椎炎である請求項３記載の方法。
【請求項１１】
疾病が癌および／または悪液質である請求項３記載の方法。
【請求項１２】
癌がホジキン病である請求項３記載の方法。
【請求項１３】
疾病が後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を包含する感染およびある種のウイルス感染に関連した炎症である請求項３記載の方法。
【請求項１４】
疾病がＡＩＤＳである請求項３記載の方法。
【請求項１５】
疾病が成人の呼吸困難症候群である請求項３記載の方法。
【請求項１６】
ＮＦ−κＢおよびチェックポイントキナーゼの二重阻害が存在する請求項３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には、アミノチオフェン化合物を用いる転写因子ＮＦ−κＢ（核因子−κＢ）の病理学的活性化を阻害する方法に関する。かかる方法はＮＦ−κＢの活性化が関与する疾病の治療に特に有用である。より詳細には、これらの方法は、ＮＦ−κＢダイマーの分解および活性化を結果として引き起こすＩκＢ（阻害性蛋白κＢ）のＩＫＫ−β（ＩκＢキナーゼ−β）リン酸化を阻害するために用いることができる。かかる方法は、炎症および組織修復障害；特に、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎；骨粗しょう症および線維症；乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線照射（ＵＶ）により誘発される皮膚ダメージを包含する皮膚病；全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、を包含する自己免疫疾患、組織および器官の拒絶反応、アルツハイマー病、卒中、アテローム性動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病を包含する癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を包含する感染およびある種のウイルス感染に関連する炎症、成人の呼吸困難症候群、毛細血管拡張性運動失調を包含するＮＦ−κＢ活性化に関連した種々の疾病の治療において有用である。
【０００２】
発明の背景
急性および慢性炎症および癌に関与するメディエイタを理解する最近の科学の進歩は、有効な治療のサーチの新たな戦略を導いた。伝統的なアプローチは、特異的抗体、受容体アンタゴニスト、または酵素阻害剤の使用のごとき直接標的化法を包含する。種々のメディエイタの転写および翻訳に関与する調節機構の解明における最近のブレークスルーは、遺伝子転写レベルに向けられた治療アプローチに対する興味の増加を導いた。
【０００３】
核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）はポリペプチドのＲｅｌ／ＮＦ−κＢファミリーの種々の組み合わせから構成される、密接に関連したダイマー転写因子複合体のファミリーに属する。該ファミリーは哺乳動物における個々の遺伝子産物、ＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０／ｐ１０５）、ＮＦ−κＢ２（ｐ４９／ｐ１００）、ｃ−ＲｅｌおよびＲｅｌＢからなり、それらはすべてヘテロダイマーまたはホモダイマーを形成しうる。これらの蛋白は非常に相同的な３００個のアミノ酸「Ｒｅｌ相同ドメイン」を共有しており、該ドメインはＤＮＡ結合およびダイマー化ドメインを含んでいる。Ｒｅｌ相同ドメインの外部Ｃ−末端は、ＮＦ−κＢを細胞質から核へと輸送するのに重要な核トランスロケーション配列である。さらに、ｐ６５およびｃＲｅｌは、それらのＣ末端に強力なトランス活性化ドメインを有する。
【０００４】
ＮＦ−κＢの活性は、それと蛋白の阻害剤ＩκＢファミリーのメンバーとの相互作用により調節される。この相互作用はＮＦ−κＢ蛋白上の核局在化配列を効果的にブロックし、かくして、ダイマーが核へ移動するのを防止する。広範な刺激が多数のシグナルトランスダクション経路によりＮＦ−κＢを活性化させる。細菌生成物（ＬＰＳ）、いくつかのウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−１）、炎症サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１）、環境性および酸化性ストレスならびにＤＮＡ損傷剤が包含される。しかしながら、すべてに共通した刺激はＩκＢのリン酸化およびその後の分解である。ＩκＢは、最近同定されたＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−β）により２つのＮ末端セリンにおいてリン酸化される。部位特異的突然変異の研究により、いったんリン酸化された蛋白はユビキチン−プロテアソーム経路を経る分解用にフラッグを付されるという点で、これらのリン酸化がその後のＮＦ−κＢの活性化に重要であることが示された。ＩκＢがないと、活性なＮＦ−κＢ複合体が核に転移して、そこでそれらが選択的な様式で好ましい遺伝子特異的エンハンサー配列に結合しうる。多くのサイトカインおよびケモカイン、細胞接着分子、急性フェーズ蛋白、免疫調節蛋白、エイコサノイド代謝酵素ならびに抗−アポトーシス遺伝子がＮＦ−κＢにより調節されている遺伝子に関連している。
【０００５】
ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８のごときサイトカイン、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭのごとき細胞接着分子、ならびに誘導可能亜硝酸酸化シンターゼ（ｉＮＯＳ）を包含する多数の前炎症メディエイタの調節発現においてＮＦ−κＢが重要な役割を果たしていることはよく知られている。かかるメディエイタは炎症部位における白血球の動員において役割を演じており、ｉＮＯＳの場合にはいくつかの炎症性および自己免疫疾患において器官破壊を導く。
【０００６】
炎症性疾患におけるＮＦ−κＢの重要性は、喘息を包含する気道炎症に関する研究においてさらに高められており、そこでＮＦ−κＢが活性化されていることが示されている。この活性化はこれらの疾患に特徴的なサイトカイン産生増加および白血球浸潤の基礎となっている。さらに、吸入されたステロイドは気道過敏性を低下させ、喘息性気道の炎症応答を抑制することが知られている。ＮＦ−κＢのグルココルチコイド阻害に関する最近の知見に鑑みると、これらの効果はＮＦ−κＢの阻害を介して媒介されると考えてよい。
【０００７】
炎症性疾患におけるＮＦ−κＢの役割に関するさらなる証拠はリューマチ性滑膜の研究から得られる。通常には、ＮＦ−κＢは不活性細胞質複合体として存在するが、最近の免疫組織化学的研究により、ＮＦ−κＢが核に存在し、それゆえリューマチ性滑膜を構成する細胞において活性があることが示されている。さらに、ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βでの刺激に応答してヒト滑膜細胞中で活性化されることが示されている。かかる分布は、この組織に特徴的なサイトカインおよびエイコサノイドの産生増加に関する機構を基礎としうる。Roshak, A. K., et al., J. Biol. Chem., 271,  31496-31501 (1996)参照。ＩＫＫ−βの発現はリューマチ性関節炎患者の滑膜細胞において示されており、遺伝子導入の研究により、これらの細胞中の刺激された炎症メディエイタ産生におけるＩＫＫ−βの中心的役割が示されている。Aupperele et al. J. Immunology 1999. 163:427-433 および Aupperle et al. J. Immunology 2001;166:2705-11参照。より最近になって、野生型ＩＫＫ−βアデノウイルス構築物の関節内投与は、ドミナント−ネガティブＩＫＫ−βにより阻害されたアジュバントにより誘導される関節炎のラットに投与している間に足の腫れを引き起こすことが示された。Tak et al. Arthritis and Rheumatism 2001; 44:1897-1907参照。
【０００８】
ＮＦ−κＢ／ＲｅｌおよびＩκＢ蛋白もまた新生物の形質転換および転移において役割を果たしている可能性がある。ファミリーのメンバーがインビトロおよびインビボにおいて過剰発現、遺伝子増幅、遺伝子転移または転座の結果としての細胞の形質転換に関連している。さらに、これらの蛋白をコードする遺伝子の転移および／または増幅はある種のヒトリンパ腫の２０〜２５％において見られる。さらに、ＮＦ−κＢはオンコジーンｒａｓにより活性化され、ＮＦ−κＢ活性化の遮断はｒａｓにより媒介される細胞の形質転換を抑制する。そのうえ、アポトーシスの調節におけるＮＦ−κＢの役割が報告されており、腫瘍細胞増殖の調節におけるこの転写因子の役割が強調されている。ＴＮＦ、イオン化照射およびＤＮＡ損傷剤はすべてＮＦ−κＢを活性化させ、その結果、数種の抗−アポトーシス蛋白のアップレギュレーションされた発現を導いた。逆に、ＮＦ−κＢの阻害は、数種の細胞タイプにおいてこれらの作用剤によるアポトーシス性細胞死滅を促進することが示された。このことは、化学療法に対する腫瘍細胞の主な耐性機構である可能性があるので、ＮＦ−κＢ活性化の阻害剤は、単一作用剤または混合治療剤として有用な化学療法作用剤でありうる。最近の報告は骨格筋細胞分化の阻害剤ならびにサイトカインにより誘導される筋肉疲労の調節剤としてのＮＦ−κＢに関連しており（Guttridge et al. Science; 2000; 289: 2363-2365）、新規癌治療剤としてのＮＦ−κＢ阻害剤の潜在能力をさらに支持するものである。
【０００９】
いくつかのＮＦ−κＢ阻害剤がC. Wahl, et al. J. Clin. Invest. 101(5), 1163-1174 (1998), R. W. Sullivan, et al. J. Med. Chem. 41, 413-419 (1998), J. W. Pierce, et al. J. Biol. Chem. 272, 21096-21103 (1997)に記載されている。
【００１０】
海洋天然産物であるヒメニアルジシン（hymenialdisine）はＮＦ−κＢを阻害することが知られている。Roshak, A., et al., JPET, 283,  955-961 (1997).  Breton, J. J and Chabot-Fletcher, M. C., JPET, 282,  459-466 (1997)。
【００１１】
さらに、ＩＫＫ複合体のインドールおよびベンズイミダゾール阻害剤に関する特許が出願されており（DE 19928424 および WO200130774参照）、天然産物であるスタウロスポリン（staurosporine）ケルセチン（quercetin）、Ｋ２５２ａおよびＫ２５２ｂはＩＫＫ−β阻害剤であることが示されている。Peet, G. W. and Li, J. J. Biol. Chem., 274, 32655-32661 (1999) および Wisniewski, D., et al., Analytical Biochem. 274, 220-228 (1999)参照。
【００１２】
米国特許第３９６３７５０号にはある種のアミノチオフェン類の製造が記載されている。
【００１３】
発明の概要
本発明は、新規化合物ならびに本発明の化合物を用いる転写因子ＮＦ−κＢの活性化抑制のための新規方法に関する。
本発明の１の目的は、転写因子ＮＦ−κＢの活性を変化させることにより治療的に改変されうる疾病の治療方法を提供することである。
したがって、第１の態様において、本発明は、式Ｉで示される化合物を含む医薬組成物を提供する。
もう１つの態様において、本発明は、ＩＫＫ−βによるＩκＢのリン酸化およびその後の分解を阻害することにより疾病の病理が治療的に改変されうるものである、疾病の治療方法を提供する。
さらにもう１つの態様において、本発明は、ＮＦ−κＢの病理学的活性化を阻害することにより疾病の病理が治療的に改変されうるものである、疾病の治療方法を提供する。
【００１４】
特別な態様において、本発明は、炎症性および組織修復障害、特にリューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎、骨粗しょう症および線維症的疾病、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線照射（ＵＶ）により誘発される皮膚ダメージを包含する皮膚病；全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎塩を包含する自己免疫疾疾患、組織および器官の拒絶反応、アルツハイマー病、卒中、アテローム製動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病を包含する癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（エイズ）を包含する感染およびある種のウイルス感染に関連した炎症、成人性呼吸困難症候群ならびに毛細血管拡張性運動失調を包含する、ＮＦ−κＢ活性化に関連した種々の疾病の治療方法を提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の化合物は下式Ｉ：
【化１】
2005506334.tif 000002
［式中、
Ｒ１はＣＯＮＨ２、またはＳＯ２ＮＨ２であり；
Ｒ２はＮＲ５Ｒ６であり；
Ｒ３はＨ、またはハロゲンであり；
Ｒ４はアリールまたはヘテロアリールであり；
Ｒ５はＨまたはアルキルであり；
ただし、Ｒ１がＣＯＮＨ２である場合には、Ｒ６はＨ、ＣＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨ−アルキル、ＣＯＮＨ−アリール、ＣＯＮＨ−ヘテロアリール、ＣＳＮＨ２、ＣＳＮＨ−アルキル、ＣＳＮＨ−アリール、ＣＳＮＨ−ヘテロアリール、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２ＮＨ−アリール、およびＳＯ２ＮＨ−ヘテロアリールからなる群より選択され；
Ｒ１がＳＯ２ＮＨ２である場合には、Ｒ６はＣＯＮＨ２であり；
Ｒ１がＣＯＮＨ２である場合には、Ｒ２はＮＨＣＯＮＨ２でない］で示される化合物およびその医薬上許容される塩、水和物および溶媒和物から選択される。
【００１６】
本発明において有用な好ましい化合物は
３−アセチルアミノ−５−（４−クロロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミド；
３−アセチルアミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミド；
５−（４−フルオロ−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド；
５−（３−クロロ−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド；
５−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド；および
５−フェニル−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド
を包含する。
【００１７】
本発明は、炎症性および組織修復障害、特にリューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎、骨粗しょう症および線維症的疾病、乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線照射（ＵＶ）により誘発される皮膚ダメージを包含する皮膚病；全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎塩を包含する自己免疫疾疾患、組織および器官の拒絶反応、アルツハイマー病、卒中、アテローム製動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病を包含する癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（エイズ）を包含する感染およびある種のウイルス感染に関連した炎症、成人性呼吸困難症候群ならびに毛細血管拡張性運動失調を包含する、ＮＦ−κＢ活性化に関連した種々の疾病の治療方法を提供する。
【００１８】
定義
本発明は、本発明の化合物のすべての水和物、溶媒和物、複合体およびプロドラッグを包含する。プロドラッグは共有結合した化合物であり、インビボにおいて式ＩおよびＩＩで示される活性のある親薬剤を放出するものである。キラル中心または別形態の異性中心が本発明の化合物中に存在する場合、エナンチオマーおよびジアステレオマーを包含するすべての形態のかかる異性体（複数も可）は本発明に包含される。キラル中心を含む本発明の化合物をラセミ混合物、エナンチオマー的に豊富化された化合物として使用してもよく、あるいはよく知られた方法を用いてラセミ混合物を分離し、個々のエナンチオマーを単独で用いてもよい。化合物が不飽和炭素−炭素二重結合を有する場合、シス（Ｚ）およびトランス（Ｅ）の両方の異性体が本発明の範囲内である。化合物がケト−エノール互変異性体のごとき互変異性体として存在する場合、各互変異性体は、平衡状態であってもあるいは１の形態が優勢であっても本発明の範囲内である。
【００１９】
式Ｉまたはその下位の式中に含まれる置換基の意味は、特記しないかぎり、いずれの場合にもその意味から独立したものであり、あるいはまた他のいずれの場合にも他の置換基の意味とは独立したものである。
【００２０】
本明細書の用語「アルキル」は、一重の炭素−炭素結合により結合された、１〜６個の炭素原子を有する、置換されていてもよい炭化水素基をいう。アルキル炭化水素基は直鎖状、分枝状または環状であってよく、飽和または不飽和であってよい。置換アルキル上に存在してもよい置換基は、アリール、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＣＯ、ハロゲン、ＣＦ３、およびＯＣＦ３からなる群より選択される。
【００２１】
本明細書の用語「アリール」は、共役パイ電子系を有する少なくとも１個の環を有する置換されていてもよい芳香族基をいい、２個までの共役または縮合した環システムを含むものである。アリールは炭素環式アリールおよびバイアリール基を包含し、それらはいずれも置換されていてもよい置換基はハロゲン、Ｃ１−４アルキル、ＮＨ２、ＯＣＦ３、ＣＦ３、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＣＮ、ＣＨＯ、ＳＯ２−アルキルおよびＮＯ２からなる群より選択される。
【００２２】
本明細書の用語「ヘテロアリール」は、共役パイ電子系を有する少なくとも１個の環を有する置換されていてもよい芳香族基をいい、２個までの共役または縮合した環システムおよびＯ、ＳおよびＮから選択される１〜３個の異種原子を含むものである。ヘテロアリールは炭素環式ヘテロアリールアリール、アリール−ヘテロアリールおよびバイヘテロアリール基を包含し、それらはいずれも置換されていてもよい。好ましい置換基は、ハロゲン、Ｃ１−４アルキル、ＮＨ２、ＯＣＦ３、ＣＦ３、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＣＮ、ＣＨＯ、ＳＯ２−アルキルおよびＮＯ２からなる群より選択される。ヘテロアリール環の例はピロール、フラン、チオフェン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ピリジン、キノリン、イソキノリン、キノリジン、ピラゾール、イミダゾール、イソオキサゾール、オキサゾール、イソチアゾール、チアゾール、ピリダジン、ピリミジンおよびピラジンを包含する。
【００２３】
本明細書の用語「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩを包含する。
【００２４】
製造方法
アミノチオフェンカルボン酸アミドアナログの一般的製造をスキームＩおよびＩＩに示す。市販アミノチオフェンカルボン酸エステル１から合成を開始した。ジ炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル［（Ｂｏｃ）２Ｏ］を用いるアミノ基の保護およびエステルの加水分解により酸３を得た。得られた酸を１，１−カルボニルジイミダゾールを用いて活性化させ、次いで、水酸化アンモニウムと反応させ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理し、次いで、アミノチオフェンカルボン酸アミド５を得た。化合物５は容易にアセトアミド６、アウルホニルアミド７ａおよびメチルウレア７ｂに変化させられた。
【化２】
2005506334.tif 000003
【化３】
2005506334.tif 000004
【００２５】
ウレイドチオフェンスルホンアミドの一般的製造をスキームＩＩＩにて説明する。ｔｅｒｔ−ブチルスルホンアミド８から合成を開始した。ｎ−ＢｕＬｉを用いる脱保護、次いで、アジ化４−メチル−ベンゼンスルホニルおよび水素化ホウ素ナトリウムとの反応を行ってアミノ−チオフェン９を得た。ＨＣｌでの処理および４−フルオロフェニルボロニックアシッドとのスズキカップリングによりアミノ−チオフェンスルホンアミド１１を得た。次いで、第１級アミンをウレア１２に変換した。
【化４】
2005506334.tif 000005
【００２６】
下記実施例は本発明の説明を意図するものであり、何ら限定的なものではない。
【００２７】
通常には、Bruker AC 400スペクトル計を用いて４００ＭＨｚで核磁気共鳴スペクトルを記録した。ＣＤＣｌ３はジューテリオクロロホルム、ＤＭＳＯ−ｄ６はヘキサジューテリオジメチルスルホキシドであり、ＣＤ３ＯＤはテトラジューテリオメタノールである。内部標準テトラメチルシランから低磁場側へ１００万あたりの部数で化学シフトを表す。ＮＭＲデータの略号は以下のごとし：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｍ＝マルチプレット、ｄｄ＝ダブレットのダブレット、ｄｔ＝トリプレットのダブレット、ａｐｐ＝見かけ、ｂｒ＝広い。Ｊはヘルツ単位で測定されたＮＭＲ結合定数を示す。エレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化法を用いるＭＤＳ ＳＣＩＥＸ）ＬＣ−ＭＳ）装置で質量スペクトルを取った。すべての温度はセ氏である。薄層クロマトグラフィーにはAnaltech Silica Gel GF および E. Merck Silica Gel 60 F-254 薄層プレートを用いた。E. Merck Kieselgel 60 (230-400 メッシュ) シリカゲルにてフラッシュクロマトグラフィーを行った。
【００２８】
実施例１
３−アセチルアミノ−５−（４−クロロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミドの調製
１ａ）３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５−（４−クロロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸メチルエステル
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の３−アミノ−５−（４−クロロフェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチル（１ｇ，３．７３ｍｍｏｌ）の溶液に４−（ジメチルアミノ）ピリジン（４５ｍｇ，０．３７３ｍｍｏｌ）およびジ炭酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（１．２２ｇ，５．６ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間撹拌後、溶液をブライン溶液（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１００ｍＬ，３ｘ）で抽出した。一緒にした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル，４：１）を行なった後、標記化合物１ａを白色固体として得た。
【００２９】
１ｂ）3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-5-(4-クロロ-フェニル)-チオフェン-2-カルボン酸
エタノール（２０ｍＬ）中の１ａ（１．３７ｇ，３．７３ｍｍｏｌ）の溶液を水（２０ｍＬ）中のＫＯＨ（６２７ｍｇ、１１．２ｍｍｏｌ）と混合した。得られた混合物を６０℃で１時間加熱し、ＨＣｌ（５０ｍＬ，１２Ｎ）で希釈し、酢酸エチル（６０ｍＬ，３ｘ）で抽出した。一緒にした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して化合物１ｂを黄色固体として得た。
【００３０】
１ｃ）［２−カルバモイル−５−（４−クロロ−フェニル）−チオフェン−３−イル］−カルバミン酸ｔｅｒｔブチルエステル
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の１ｂ（１．３ｇ，３．７ｍｍｏｌ）の溶液に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．２ｇ，７．４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を１時間撹拌し、水酸化アンモニウム（３７％，５ｍＬ）と混合した。混合物をブライン溶液（１０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。一緒にした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル，４：１）を行なった後、化合物１ｃを黄色固体として得た。
【００３１】
１ｄ）３−アミノ−５−（４−クロロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミド
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の１ｃ（２５０ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）の溶液にＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。得られた溶液を１時間撹拌し、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（６０ｍＬ）と混合し、次いで、酢酸エチル（５０ｍＬ，３ｘ）で抽出した。一緒にした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル，１：１）を行なった後、化合物１ｄを黄色固体として得た。ＭＳ（ＥＳ）２５３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【００３２】
１ｅ）３−アセチルアミノ−５−（４−クロロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミド
ＴＨＦ（１０ｍＬ）中の１ｄの固体（２０ｍｇ，０．０７９ｍｍｏｌ）を塩化アセチル（１１．２μＬ，０．１５８ｍｍｏｌ）で１時間処理した。得られた溶液を水（０．１ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２ｍＬ）で希釈した。混合物を濃縮した。逆相ＨＰＬＣにより分離した後、標記化合物を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳ）２９５（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＳＯＣＤ３）δ１１．０８（ｓ，１Ｈ），８．２７（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｗｓ，２Ｈ），７．６８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），２．１４（ｓ，３Ｈ）。
【００３３】
実施例２
３−アセチルアミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミドの調製
２ａ）３−アミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミド
実施例１ａ〜１ｄの手順に従って、３−アミノ−５−（４−フルオロフェニル）チオフェン−２−カルボン酸メチルから化合物を得た。化合物は黄色固体である：ＭＳ（ＥＳ）２３７（Ｍ＋Ｈ）＋
【００３４】
２ｂ）３−アセチルアミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−２−カルボン酸アミド
実施例１ｅの手順に従って、２ａから標記化合物を得た。化合物は白色固体である：ＭＳ（ＥＳ）２７９（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＳＯＣＤ３）δ１１．０９（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｓ１，Ｈ），７．７２−７．６９（ｍ，４Ｈ），７．３５−７．３０（ｍ，２Ｈ），２．１４（ｓ，３Ｈ）
【００３５】
実施例３
５−（４−フルオロ−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミドの調製
３ａ）３−アミノ−５−クロロ−チオフェン−２−スルホン酸ｔｅｒｔ−ブチルアミド
−７８℃においてＴＨＦ（１０ｍＬ）中の５−クロロ−チオフェン−２−スルホン酸ｔｅｒｔ−ブチルアミド（３１０ｍｇ，１．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、ｎ−ブチルリチウム（ヘキサン中１．６Ｍ，１．７ｍＬ，２．７ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた溶液を−３０℃まで温め、−２０℃ないし−３０℃に１０分間維持した。それをＴＨＦ（２ｍＬ）中のアジ化４−メチルベンゼンスルホニル（３６１ｍｇ，１．８３ｍｍｏｌ）の溶液と混合した。混合物を周囲温度で１時間撹拌し、次いで、ブライン溶液（３０ｍＬ）で希釈し、ＮａＢＨ４（５００ｍｇ，１３．２ｍｍｏｌ）およびＨ２Ｏ（５ｍＬ）と混合した。混合物を室温で２時間撹拌し、次いで、ブライン溶液（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（５０ｍＬ，３ｘ）で希釈した。一緒にした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル，４：１）を行なった後、３ａ（２５０ｍｇ）を黄色油状物質として得た。
【００３６】
３ｂ）３−アミノ−５−クロロ−チオフェン−２−スルホン酸アミド
濃塩酸溶液（１０ｍＬ）中の３ａ（２５０ｍｇ，０．９３ｍｍｏｌ）の溶液を５５℃で２時間加熱した。すべての溶媒を除去した後、３ｂ（１９８ｍｇ）を黄色固体として得た。
【００３７】
３ｃ）３−アミノ−５−（４−フルオロ−フェニル）−チオフェン−２−スルホン酸アミド
１，４−ジオキサン／水（４０ｍＬ，３：１）中の３ｂ（１０４ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）の溶液に、４−フルオロフェニルボロニックアシッド（１４０ｍｇ，１ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３（２１２ｍｇ，２ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（９％ Ｐｄ，５９ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を１１０℃で３時間加熱し、ブライン溶液（５０ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（５０ｍＬ，３ｘ）で抽出した。一緒にした有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル，１：１）を行なった後、３ｃ（４５ｍｇ，３３％）を黄色固体として得た：ＭＳ（ＥＳ）２７３（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）８７．５２（ｍ，２Ｈ），７．０４（ｍ，２Ｈ），６．７２（ｓ，１Ｈ）
【００３８】
３ｄ）５−（４−フルオロ−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の３ｃ（３０ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）の混合物に、イソシアン酸クロロスルホニル（１４μＬ，０．１６５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、水（０．５ｍＬ）と混合した。逆相ＨＰＬＣを用いる分離により３ｄ（２０ｍｇ，５８％）を白色固体として得た。ＭＳ（ＥＳ）３１６（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．０２（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｍ，２Ｈ），７．２０（ｍ，２Ｈ）
【００３９】
実施例４
５−（３−クロロ−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミドの調製
４ａ）３−アミノ−５−（３−クロロ−フェニル）−チオフェン−２−スルホン酸アミド
実施例３ｃの手順に従って、３−クロロベンゼンボロニックアシッドおよび３ｂから標記化合物を得た。この化合物は白色固体である：ＭＳ（ＥＳ）２８９（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．６２（ｓ１Ｈ），７．５３（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），６．９２（ｓ，１Ｈ）
【００４０】
４ｂ）５−（３−クロロ−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド
実施例３ｄの手順に従って、４ａから標記化合物を得た。この化合物は白色固体である：ＭＳ（ＥＳ）３３２（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＳＯＣＤ３）δ８．２８（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｓ，２Ｈ），７．６９（ｓ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．４９（ｍ，２Ｈ），６．７２（ｓ，２Ｈ）
【００４１】
実施例５
５−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミドの調製
５ａ）３−アミノ−５−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−チオフェン−２−スルホン酸アミド
実施例３ｃの手順に従って、４−トリフルオロメチルベンゼンボロニックアシッドおよび３ｂから標記化合物を得た。この化合物は白色固体である：ＭＳ（ＥＳ）３２３（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．０２（ｓ，１Ｈ）
【００４２】
５ｂ）５−（４−トリフオロメチル−フェニル）−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド
実施例３ｄの手順に従って、標記化合物を得た。この化合物は白色固体である：ＭＳ（ＥＳ）３６６（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ８．２０（ｓ，１Ｈ），７．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）
【００４３】
実施例６
５−フェニル−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミドの調製
６ａ）３−アミノ−５−フェニル−チオフェン−２−スルホン酸アミド
実施例３ｃの手順に従って、フェニルボロニックアシッドおよび３ｂから標記化合物を得た。この化合物は白色固体である：ＭＳ（ＥＳ）２５５（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ７．６１（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３７（ｍ，３Ｈ），６．８９（ｓ，１Ｈ）
【００４４】
６ｂ）５−フェニル−３−ウレイド−チオフェン−２−スルホン酸アミド
実施例３ｄの手順に従って、６ａから標記化合物を得た。この化合物は白色固体である：ＭＳ（ＥＳ）２９８（Ｍ＋Ｈ）＋；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＳＯＣＤ３）δ８．３０（ｓ，１Ｈ），８．１０（ｓ，１Ｈ），７．６８−７．３９（ｍ，８Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ）
【００４５】
本発明は、式Ｉの化合物および医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。したがって、式Ｉの化合物を医薬の製造に用いてもよい。後で説明するように製造される式Ｉの化合物の医薬組成物を、非経口投与用の溶液または凍結乾燥粉末として処方してもよい。使用前に適切な希釈剤または他の医薬上許容される担体を添加することにより粉末を復元してもよい。液体処方は緩衝化された等張水溶液であってもよい。適切な希釈剤の例は通常の等張セイライン溶液、標準水中５％デキストロースまたは緩衝化酢酸ナトリウムもしくは酢酸アンモニウム溶液である。かかる処方は非経口投与に特に適するが、経口投与に用いてもよく、あるいは一定量の吸入器もしくは吸入用ネブライザーに入れてもよい。ポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、マンニトール、塩化ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムのごとき賦形剤を添加することが望ましい。
【００４６】
別法として、これらの化合物をカプセル封入、錠剤化あるいは経口投与用のエマルジョンまたはシロップとして調合してもよい。医薬上許容される固体または液体担体を添加して組成物の安定化を促進してもよく、あるいは組成物の調合を容易ならしめてもよい。固体担体はデンプン、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白陶土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アラビアゴム、寒天またはゼラチンを包含する。液体担体は糖蜜、ピーナッツ油、オリーブ油、セイラインおよび水を包含する。担体はモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独またはロウとの混合物のごとき除放性材料を含有してもよい。固体担体の量は様々であるが、好ましくは、１回分につき約２０ｍｇないし約１ｇであろう。錠剤形態が必要ならば粉砕、混合、顆粒化、および圧縮；あるいは硬ゼラチンカプセル形態が必要な場合には粉砕、混合および充填を包含する慣用的な製薬方法に従って医薬組成物を製造する。液体担体を用いる場合、調合物はシロップ、エリキシル、エマルジョンまたは水性もしくは非水製懸濁液の形態であろう。かかる液体処方を直接経口投与してもよく、あるいは軟ゼラチンカプセルに充填してもよい。
【００４７】
直腸投与には、本発明の化合物をカカオ脂、グリセリン、ゼラチンまたはポリエチレングリコールのごとき賦形剤と混合し、座薬に成型してもよい。
【００４８】
本発明の方法は、式Ｉの化合物の局所吸入および結腸内投与を包含する。局所投与は非全身投与を意味し、本発明の化合物の外部からの皮膚、頬腔への投与、かかる化合物の耳、目および鼻への滴下を包含し、化合物は有意には血流に入らない。全身投与は蛍光、静脈、腹腔内および筋肉内投与を包含する。局所投与による治療的または予防的効果に必要な本発明の化合物（以下、有効成分という）の量は、もちろん、選択した化合物、処置すべき症状の性質および重篤度ならびに治療される動物により変更されようが、最終的には医師の裁量による。
【００４９】
有効成分をそのまま単独で投与することも可能であるが、それを医薬処方として提供することが好ましい。有効成分は、局所投与には、処方の０．０１ないし５．０重量％を占めてもよい。
【００５０】
獣医用ならびにヒトの医療用の本発明の局所処方は、１種またはそれ以上の許容される担体および所望により他の治療成分と一緒になった有効成分を含む。担体は、処方の他の成分と適合するものであり、その受容者に有害でないという意味で「許容される」ものでなくてはならない。
【００５１】
局所投与に適した処方は、治療が必要な部位へ皮膚を通して浸透するのに適した液体または半液体調合物を包含し、例えば、リニメント、ローション、クリーム、軟膏またはパスタ、ならびに目、耳または鼻への投与に適した滴剤である。
【００５２】
本発明の滴剤は滅菌水性または油性溶液または懸濁液を含んでいてもよく、殺細菌剤および／または殺真菌剤および／または他の適当な保存料の適当な水溶液、好ましくは界面活性剤を含む水溶液中に有効成分を溶解することにより調合してもよい。次いで、得られた溶液を濾過により清澄化させ、適当な容器中に移し、その後密封し、オートクレーブまたは９０〜１００℃に半時間維持することにより滅菌することができる。別法として、濾過により溶液を滅菌し、無菌的方法により容器に移してもよい。滴剤に含有させるに適した殺細菌剤および殺真菌剤の例は、フェニルマーキュリックニトラートまたはアセタート（０．００２％）、ベンザルコニウムクロリド（０．０１％）およびクロロヘキシジンアセタート（０．０１％）である。油性溶液の調製に適した溶媒はグリセロール、希アルコールおよびプロピレングリコールを包含する。
【００５３】
本発明のローションは、皮膚または目への適用に適したものを包含する。アイローションは殺細菌剤を含んでいてもよい滅菌水溶液を含んでいてもよく、滴剤の調合と同様の方法により調合してもよい。皮膚に適用するローションまたはリニメントは、アルコールまたはアセトンのごとき乾燥を促進し皮膚を冷却する薬剤、および／またはグリセロールのごとき湿潤剤またはヒマシ油もしくは落花生油のごとき油脂を含んでいてもよい。
【００５４】
本発明のクリーム、軟膏またはパスタは外用される有効成分の半固体処方である。それらは、細かくふるい分けされた、あるいは粉末形態の有効成分をそれのみ、あるいは水性もしくは非水製液体中の溶液もしくは懸濁液として、適当な機器の助けを借りてグリース状または非グリース状基材と混合することにより製造されうる。基材は硬、軟または流動パラフィンのごとき炭化水素、グリセロール、蜜ロウ、金属セッケン、粘滑剤、アーモンド油、トウモロコシ油、落花生油、ヒマシ油またはオリーブ油のごとき天然起源の油脂またはその誘導体、プロピレングリコールまたはマクロゴールのごときアルコールと一緒になったステアリン酸またはオレイン酸を含んでいてもよい。処方はソルビタンエステルまたはポリオキシエチレン誘導体のごときアニオン性、カチオン性または非イオン性界面活性剤のような適当な界面活性剤を含んでいてもよい。天然ガム類、セルロース材料またはケイ酸塩含有シリカのごとき無機材料のような懸濁剤、ならびにラノリンのごとき他の成分が含まれていてもよい。
【００５５】
本発明の有用性
式Ｉの化合物はＩκＢのＩＫＫ−ベータキナーゼリン酸化の阻害剤として有用であり、そのようなものとしてＮＦ−κＢ活性化の阻害剤である。本発明の方法は、該化合物の医薬組成物および処方を包含する該化合物の組成物および処方を用いるものである。
【００５６】
特に、本発明は、不適切なＮＦ−κＢ活性化に関連する疾病の治療方法を提供し、該方法は、治療を要する動物、特に哺乳動物、最も特別にはヒトに１種またはそれ以上の式Ｉの化合物を投与することを含む。本発明は、特に、炎症および組織修復障害；特に、リューマチ性関節炎、炎症性腸疾患、喘息およびＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）、骨関節炎；骨粗しょう症および線維症；乾癬、アトピー性皮膚炎および紫外線照射（ＵＶ）により誘発される皮膚ダメージを包含する皮膚病；全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎を包含する自己免疫疾患、組織および器官の拒絶反応、アルツハイマー病、卒中、アテローム性動脈硬化、再狭窄、糖尿病、糸球体腎炎、ホジキン病を包含する癌、悪液質、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を包含する感染およびある種のウイルス感染に関連する炎症、成人の呼吸困難症候群、毛細血管拡張性運動失調の治療方法を提供する。
【００５７】
急性の治療には、１種またはそれ以上の式Ｉの化合物の非経口投与が有用である。水または通常のセイライン中５％デキストロース中の化合物の静脈輸液、あるいは適切な賦形剤を伴う類似の処方が最も有効であるが、筋肉内ボーラス注射も有用である。典型的には、非経口用量は、ＩＫＫ−ベータを阻害し、それゆえＮＦ−κＢの活性化を阻害するに有効な血漿中濃度を維持させるように、約０．０１ないし約５０ｍｇ／ｋｇ；好ましくは０．１ないし２０ｍｇ／ｋｇである。１日の合計用量が約０．４ないし約８０ｍｇ／ｋｇ／日となるようなレベルで１日に１ないし４回化合物を投与する。本発明の方法に使用される化合物の正確な治療上有効な量、ならびにかかる化合物が最もうまく投与される経路は、治療効果を示すに必要な濃度と薬剤の血中レベルを比較することにより当業者により容易に決定される。
【００５８】
薬剤濃度がＩＫＫ−ベータを阻害し、それゆえＮＦ−κＢを活性化させるに十分であるように、あるいは本明細書に開示した他の治療的指標を得るに十分であるように、式Ｉの化合物を患者に経口投与してもよい。典型的には、化合物を含有する医薬組成物を、患者の症状に適合するように、約０．１ないし約５０ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与する。好ましくは、経口用量は約０．５ないし約２０ｍｇ／ｋｇであろう。
【００５９】
薬剤濃度がＩＫＫ−ベータを阻害し、それゆえＮＦ−κＢの活性化を阻害し、あるいは本明細書に開示した他の治療的指標が得られるように、式Ｉの化合物を患者に局所投与してもよい。典型的には、約０．０１重量％ないし約５重量％の局所処方として化合物を含有する医薬組成物を投与する。
【００６０】
本発明の化合物を本発明に従って投与する場合には、許容されない毒物学的効果は考えられない。
【００６１】
本明細書に記載の、ＮＦ−κＢの活性化を阻害する化合物の能力は、ＩＫＫ−βによるＩκＢ−αのＮ−末端フラグメントのリン酸化を阻害する能力において明確に証明される（例えば、表Ｉ参照）。また、これらの化合物は、前炎症性刺激（例えば、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ等）で細胞が活性化された場合にヒト単球および他の哺乳動物細胞におけるＩκＢ−αの分解およびＮＦ−κＢの核トランスロケーションをブロックする。さらに、これらの化合物は、ＬＰＳにより刺激されたヒト単球および刺激されたヒト一次滑膜線維芽細胞からの前炎症メディエイタの産生を阻害する。本発明のＮＦ−κＢ阻害剤の疾病の治療における有用性は、種々の疾病におけるＮＦ−κＢ活性化の重要性を前提としている。
【００６２】
ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８のごときサイトカイン（Mukaida et al., 1990; Liberman and Baltimore, 1990; Matsusaka et al., 1993）を包含する多数の前炎症メディエイタ、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭのごとき接着分子（Marui et al., 1993; Kawai et al., 1995; Ledebur and Parks, 1995）、ならびに誘導可能な亜硝酸オキシドシンターゼ（ｉＮＯＳ）（Xie et al., 1994; Adcock et al., 1994）の調節された発現において重要な役割を果たしている（全引用文献はこのセクションの末尾にある）。かかるメディエイタは白血球の炎症部位における動員において役割を果たすことが知られており、ｉＮＯＳの場合には、いくつかの炎症疾患および自己免疫疾患において器官破壊を導きうる（McCartney-Francis et al., 1993; Kleemann et al., 1993）。
【００６３】
炎症性疾患におけるＮＦ−κＢの重要な役割に関する証拠が喘息患者の研究において得られている。中程度のアトピー性喘息患者からの気管支生検は、正常非アトピー性対照からの生検と比較すると、粘膜下染色において活性化されたＮＦ−κＢ、全ＮＦ−κＢ、ならびにＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦαのごときＮＦ−κＢにより調節されるサイトカインに関する多くの細胞の有意な増加を示す（Wilson et al., 1998）。さらにそのうえ、ＮＦ−κＢ免疫反応性を示す血管のパーセンテージは、生検標本の上皮におけるＩＬ−８免疫反応性の増加と同様に増加する（Wilson et al., 1998）。そのようなものとして、これらの化合物により示されたＮＦ−κＢの阻害によるＩＬ−８産生の阻害は気道炎症において有益であると予測されるであろう。
【００６４】
最近の研究は、ＮＦ−κＢが炎症性腸疾患（ＩＢＤ）においても重要な役割を果たしている可能性を示唆している。活性化されたＮＦ−κＢは、クローン病患者および潰瘍性大腸炎患者の大腸生検標本において見られる（Ardite et al., 1998; Rogler et al., 1998; Schreiber et al., 1998）。活性化は、炎症を起こしている粘膜において明らかであるが、炎症を起こしていない粘膜においては明らかでなく（Ardite et al., 1998; Rogler et al., 1998）、同じ部位における増加したＩＬ−８ ｍＲＮＡ発現に関連している（Ardite et al., 1998）。さらに、コルチコステロイド処理は、腸のＮＦ−κＢ活性化を強く阻害し、大腸の炎症を抑制する（Ardite et al., 1998; Schreiber et al., 1998）。さらに、これらの化合物により示されるようなＮＦ−κＢの阻害によるＩＬ−８産生阻害は、炎症性腸疾患において有益であると予測されるであろう。
【００６５】
胃腸炎症の動物モデルは、大腸炎の重要な調節因子としてのＮＦ−κＢに関するさらなる支持を提供する。活性化複合体の主要成分であるｐ６５を有するマウスの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）により誘導された大腸の固有層マクロファージにおいて増加したＮＦ−κＢが観察されている（Neurath et al., 1996; Neurath and Pettersson, 1997）。ｐ６５アンチセンスの局所投与は、処置動物において確立された大腸炎の徴候をなくし、毒性の兆候も見られない（Neurath et al., 1996; Neurath and Pettersson, 1997）。そのようなものとして、ＮＦ−κＢの小型分子阻害剤はＩＢＤの治療に有用であろう。
【００６６】
炎症性疾患におけるＮＦ−κＢの役割に関するさらなる証拠はリューマチ性滑膜の研究から得られる。通常には、ＮＦ−κＢは不活性細胞質複合体として存在するが、最近の免疫組織学的研究は、ＮＦ−κＢが核に存在し、それゆえヒトリューマチ性滑液を含む細胞（Handel et al., 1995; Marok et al., 1996; Sioud et al., 1998）および疾病の動物モデル（Tsao et al., 1997）において活性を有することを示している。染色はＡ型滑膜細胞および血管内皮に関連したものである（Marok et al., 1996）。さらに、ＮＦ−κＢの構成的活性化が培養滑膜細胞（Roshak et al., 1996; Miyazawa et al., 1998）ならびにＩＬ−１βまたはＴＮＦαで刺激された滑膜細胞培養物（Roshak et al., 1996; Fujisawa et al., 1996; Roshak et al., 1997）において見られる。よって、ＮＦ−κＢの活性化は、炎症滑膜に特徴的なサイトカイン産生増加および白血球浸潤の原因となりうる。ＮＦ−κＢを阻害し、それによりこれらの細胞による前炎症メディエイタ（例えば、サイトカインおよびプロスタノイド）の産生を阻害するこれらの化合物の能力は、リューマチ性関節炎において利益をもたらすと予測されよう。
【００６７】
生物学的アッセイ：
薬理学的効果を生じさせるに必要な化合物の濃度を決定するための数種の生物学的アッセイの１つにおいて本発明の化合物を試験することができる。
【００６８】
核中のＮＦ−κＢ蛋白の存在を評価するための電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）においてＮＦ−κＢ活性を測定してもよい。目的細胞を培養して１ｘ１０６個／ｍＬの密度とする。遠心分離により細胞を集め、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋不含のＰＢＳで洗浄し、次いで、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋含有ＰＢＳに再懸濁して１ｘ１０７個／ｍＬとする。ＮＦ−κＢの活性化に対する化合物の影響を調べるために、細胞懸濁液を種々の濃度の薬剤または担体（ＤＭＳＯ ０．１％）で３７℃において３０分処理してから、ＴＮＦ−α（５．０ｎｇ／ｍＬ）でさらに１５分処理する。細胞および核抽出物を以下のようにして調製する。簡単に説明すると、インキュベーション期間の終わりに細胞（１ｘ１０７個）をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含のＰＢＳで２回洗浄する。得られた細胞ペレットを２０μＬのバッファーＡ（10mM Hepes (pH 7.9), 10mM KC1, 1.5mM MgCl2, 0.5mM ジチオスレイトール(DTT) および 0. 1% NP-40）に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベーションする。４℃で３５００ｒｐｍ、１０分間マイクロ遠心分離することにより核を集める。生じた上清を細胞抽出物として集め、核ペレットを１５μＬのバッファーＣ（20mM Hepes (pH 7.9), 0.42M NaCl, 1. 5mM MgCl2, 25% グリセロール, 0.2mM EDTA, 0.5mM DTT, および 0.5mM フッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)）に再懸濁する。懸濁物を４℃で２０分間おだやかに混合し、次いで、４℃で１４０００ｒｐｍ、１０分間マイクロ遠心分離する。上清を集め、６０μＬのバッファーＤ（20mM Hepes (pH 7.9), 50mM KC1, 20% グリセロール, 0.2mM EDTA, 0.5mM DTT, および 0.5 mM PMSF）で希釈する。すべての試料を分析するまで−８０℃で保存する。BioRad試薬を用いてBradford（Bradford, 1976）の方法に従って抽出物の蛋白濃度を決定する。
【００６９】
転写因子活性化に対する化合物の影響を、上記のごとく処理した細胞からの核抽出物を用いる電気泳動移動℃シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）においいて評価する。２本鎖ＮＦ−κＢコンセンサスオリゴヌクレオチド（5'AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'）をＴ４ポリヌクレオチドキナ−ゼおよび［ｇ−３２ＡＴＰ］で標識する。結合混合物（２５μＬ）は10mM Hepes-NaOH (pH 7.9), 4mM Tris-HCl (pH 7.9), 60mM KC1, 1mM EDTA, 1mM ジチオスレイトール, 10% グリセロール, 0.3 mg/mL ウシ血清アルブミン, および 1ug ポリ(dI-dC)・ポリ(dI-dC)を含有する。未標識競争物質の存在下または不存在下で、結合混合物（１０μｇの核抽出蛋白）を０．５ｎｇの３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチド（５００００〜１０００００ｃｐｍ）とともに室温で２０分インキュベーションし、その後、１Ｘ Ｔｒｉｓボラート／ＥＤＴＡ中で調製した４％ポリアクリルアミドゲルに混合物を乗せ、２００Ｖで２時間電気泳動する。電気泳動後、ゲルを乾燥させ、結合反応の検出のためにフィルムに曝露する。
【００７０】
ＩκＢのリン酸化に対する化合物の影響を、ウェスタンブロットにおいてモニターしてもよい。細胞抽出物を１０％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（BioRad, Hercules, CA）にかけ、次いで、蛋白をニトロセルロースシート（Hybondtm-ECL, Amersham Corp., Arlington Heights,IL）に移行させる。ＩκＢαまたはＩκＢβに対するポリクローナルウサギ抗体、ついで、ペルオキシダーゼ抱合ロバ抗−ウサギ二次抗体（Amersham Corp., Arlington Heights, IL）を用いてイムノブロットアッセイを行なう。エンハンストケミルミネッセンス（ＥＣＬ）アッセイ系（Amersham Corp., Arlington Heights, IL）を用いて免疫反応性バンドを検出する。
【００７１】
下記のようにしてＩκＢキナーゼに関するアッセイを行なった：ＩＫＫ−αをヘキサ−ヒスチジンタグを付した蛋白としてバキュロウイルス感染昆虫細胞中で発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティーカラムで精製した。種々の濃度の化合物またはＤＭＳＯ担体および示された濃度のＡＴＰ（Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ）を含有するアッセイバッファー（20mM Hepes, pH 7.7, 2mM MgC12, 1mM MnC12, 10mM ss-グリセロリン酸, 10mM NaF, 10mM PNPP, 0.3mM Na3VO4, 1mM ベンズアミジン, 2μM PMSF, 10μg/ml アプロチニン, 1μg/mL ロイペプチン, 1μg/mL ペプスタチン, 1mM DTT）中で、５０ｎｇの精製蛋白を用いてキナーゼ活性をアッセイした。２００ｎｇのＩκＢ−ＧＳＴ（Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA）を添加して全体積５０μＬとすることにより反応を開始させた。３０℃で１時間反応させ、そしてＥＤＴＡを添加して最終濃度２０ｍＭとすることにより反応を終結させた。ホスホ−ＩκＢ−α（Ｓｅｒ３２）抗体(New England Biolabs, Inc., Beverly, MA)およびＥｕ３＋−標識抗−ウサギＩｇＧ(Wallac Oy, Turku, Finland)を用い、解離により促進されるランタノイド蛍光イムノアッセイ（Wallac Oy, Turku, Finland）によりキナーゼ活性を決定した。標準的なユーロピウムプロトコル（励起３４０ｎｍ、エミッション６１５ｎｍ；４００μｓ遅延後４００μｓ蛍光測定）を用い、VICTOR 1420 Multilabel Counter (Wallac)にてプレートを読んだ。データを蛍光（ｃｐｓ）単位として表す。
【００７２】
ＩＫＫ−βをＧＳＴ−タグ付き蛋白として発現させ、その活性を９６ウェルシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）にてアッセイした。簡単に説明すると、上記のごとくＩＫＫ−βをアッセイバッファーで希釈し（最終２０ｎＭ）、種々の濃度の化合物またはＤＭＳＯ担体、２４０ｎＭ ＡＴＰおよび２００ｎＣｉ［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰ（10mCi/mL, 2000Ci/mmol; NEN Life Science Products, Boston, MA）とした。ＩκＢ−αのアミノ酸１５〜４６を含むビオチン化ペプチド（American Peptide）を添加して最終体積５０μＬ中最終濃度２．４μＭとすることにより反応を開始させた。試料を３０℃で１時間インキュベーションし、次いで、０．２ｍｇのストレプトアビジン−被覆ＳＰＡ ＰＶＴビーズ（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を含む１５０μＬの停止バッファー（PBS w/o Ca2+, Mg2+, 0.1% Triton X-100(v/v), 10mM EDTA）を添加した。試料を混合し、室温で１０分間インキュベーションし、遠心分離（１０００ｘｇ，２分間）し、次いで、Hewlett-Packard TopCountで測定した。
【００７３】
一次滑膜線維芽細胞メディエイタ産生に対するＩＫＫ−β阻害剤の効果を下記のごとく評価した：すでに記載されているようにして（Roshak et al., 1996b）リューマチ性関節炎の成人患者から得た滑膜を酵素消化することによりヒトＲＳＦの一次培養物を得た。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（GIBCO, Grand Island, NY）を含むEarlの最少必須培地（ＥＭＥＭ）中で、３７℃、５％ ＣＯ２で細胞を培養した。いくつかの研究には、線維芽細胞を１６ｍｍ（直径）の２４ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA）に５ｘ１０４個／ｍＬの密度で撒いた。細胞（７０〜８０％集密）を一定時間ＩＬ−１β（１ｎｇ／ｍＬ）（Genzyme, Cambridge, MA）に曝露した。ＩＬ−１添加１５分前にＤＭＳＯ担体中の薬剤（１％）を細胞培養物に添加した。異なるドナーからの滑膜細胞を用いて実験を３〜４回行った。上記のごとく処理した細胞からＲＳＦ細胞抽出物を得た。簡単に説明すると、ヒトＲＳＦをトリプシン／ＥＤＴＡにより取り、洗浄し、次いで、遠心分離により集めた。すでに記載されているようにして（Dignamet al., 1983;Osborn, et al., 1989）細胞抽出物を調製した。簡単に説明すると、インキュベーション期間の終わりに細胞（１ｘ１０７個）をＣａ２＋およびＭｇ２＋不含ＰＢＳ中で２回洗浄した。得られた細胞ペレットを２０μＬのバッファーＡ（10mM Hepes (pH 7.9), 10mM KC1, 1.5mM MgCl2, 0.5mM）に再懸濁した。
【００７４】
ヒト単球により刺激されたエイコサノイドおよびサイトカイン産生に対するＩＫＫ−β阻害の効果を下記のごとく評価した：すでに説明されている二重勾配遠心分離によりヘパリン処理全血から単球を単離した。次いで、ＰＢＭＣｓが豊富化された単離された単球をＲＰＭＩ １６４０ １０％ ＦＢＳ（Hyclone, Logan, Utah）中２ｘ１０６個／ｍＬとして２４ウェルプレートに２時間付着させてさらに単球集団を豊富化させた。次いで、培地を除去し、細胞をＲＰＭＩ １６４０で１回洗浄し、１ｍＬのＲＰＭＩ １６４０ １０％ ＦＢＳをウェルに添加した。試験化合物をウェルに添加し、最終担体濃度を０．０５％ ＤＭＳＯとした。２００ｎｇ／ｍＬのエンドトキシン（LPS; E. coli serotype 026: B6) (Sigma, St. Louis, MO.）を添加することにより単球を活性化させ、２４時間インキュベーションした。ＴＮＦ−α（EIA developed at SB）、ＰＧＥ２（Cayman Chemical, Ann Arbor, MI）、およびＩＬ−８およびＩＬ−６（Biosource International, Camarillo, CA）に関して無細胞上清をＥＬＩＳＡにより分析した。トリパンブルー排除法により細胞の生存率を決定した。
【００７５】
ホルボールエステルにより誘導される炎症に対するＩＫＫ−β阻害剤の影響を下記のように評価した：ホルボールエステル（ＰＭＡ）をＢａｌｂ／ｃマウスの耳介外側の皮膚に適用することにより誘発された炎症応答は、多因子炎症細胞浸潤および炎症による皮膚の変化を試験するための有用なモデルであることが証明されている。強い炎症性傷害は好中球浸潤が支配的であり、それは、好中球に存在するアズール親和性顆粒酵素であるミエロペルオキシダーゼの組織濃度を測定することにより容易に測定することができる。さらに、耳の厚みを測定することにより炎症応答の正味の強さを測定することができる。Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝６／群）に薬剤または担体を投与し、次いで、ＰＭＡ（４μｇ／耳）を投与した。４時間後にマウスを殺し、耳の厚みを決定し、ＩκＢαウエスタンまたはＥＭＳＡ分析によりＮＦ−κＢ活性化をモニターした。
【００７６】
ラットのカラギーナンにより誘発される足の浮腫に対するＩＫＫ−βの影響を下記のように評価した：オスのLewisラット（Charles River-Raleigh, NC）を飼育し、エサと水を自由に取らせ、各実験用に体重２００〜２７５ｇとした。カラギーナン注射の３０分ないし１時間前に化合物または担体（０．５％トラガカント）（p.o.）または１０％ ＤＭＳＯ、５％ ＤＭＡ、３０％クレモフォア（Cremophor）（i.p.）を投与した。滅菌蒸留水中１％カラギーナンを右の後ろ足の足底表面に注射（０．０５ｍｌ／足）することにより浮腫を誘発した。化合物または担体の投与前、ならびに３時間後に足の厚みを測定して足の体積の変化を決定した。ＣＯ２吸入によりラットを安楽死させ、右の後ろ足を取り、即剤に液体窒素中で凍結し、分析まで−８０℃で保存した。
【００７７】
本明細書に引用された特許および特許出願（これらに限らない）を包含するすべての刊行物を、参照により本明細書に記載されているものとする。
上の説明は、いかにして本発明を実施するのかを十分に開示するものである。しかしながら、本発明は、本明細書に記載された特定の具体例に限定されるのではなく、そのすべての改変は特許請求の範囲およびそれらの均等の範囲内である。当業者は、通常の実験により、本発明の範囲を逸脱せずに種々の変更および修飾が可能であることを認識するであろう。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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