(57)【要約】本発明は共役リノール酸（ＣＬＡ）を生産することのできる新規の菌主に関するものである。本発明の菌主にはビフィドバクテリウムブレベ（Bifidobacterium breve）ＣＢＧ-Ｃ２菌主、ビフィドバクテリウムシュドカルテヌラチューム（Bifidobacterium pseudocartenulatum）ＣＢＧ-Ｃ４菌主及びエンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）ＣＢＧ-Ｃ５菌主が含まれる。本発明の菌主はＣＬＡ生産能力が優れており、ＣＬＡを生成して培地に分泌する一方、菌体内に蓄積することができる。また、本発明の菌主は胃酸や胆汁等の酸と抗生物質に対して強い耐性を持つ。本発明の菌主を含む組成物は水溶性多糖類からなる被覆物質内に本発明の菌主とＣＬＡを含むカプセル剤形態で製造され、機能性食品及び医薬品として使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡ（Linoleic acid）をＣＬＡ（conjugated linoleic acid）に転換させることのできる新菌主。
【請求項２】
請求項１に記載の、ビフィドバクテリウムブレベ（Bifidobacterium breve）ＣＢＧ-Ｃ２菌主。
【請求項３】
請求項１に記載の、寄託番号KACC 91001で寄託された菌主。
【請求項４】
請求項２に記載の、寄託番号KCTC 10462BPで寄託された菌主。
【請求項５】
請求項１に記載の、ビフィドバクテリウムシュドカルテヌラチューム（Bifidobacterium pseudocartenulatum）ＣＢＧ-Ｃ４菌主。
【請求項６】
請求項５に記載の、寄託番号KACC 91003で寄託された菌主。
【請求項７】
請求項１に記載の、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）ＣＢＧ-Ｃ５菌主。
【請求項８】
請求項７に記載の、寄託番号KACC 91002で寄託された菌主。
【請求項９】
請求項７に記載の、寄託番号KCTC 10208BPで寄託された菌主。
【請求項１０】
請求項１乃至請求項９のうち何れか１つに記載の菌主の菌体を有効成分とするＣＬＡ生成用組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の、癌、動脈硬化、糖尿病及び肥満等、ＣＬＡにより抑制される疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至請求項９のうち何れか１つに記載の菌主の菌体とＣＬＡを核物質として含有し、水溶性多糖類を被覆物質として含有するカプセル剤。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項９のうち何れか１つに記載の菌主を利用してＬＡからＣＬＡを生成する方法。
【請求項１４】
請求項１乃至請求項９のうち何れか１つに記載の菌主の菌体を食品又は医薬品の有効成分として添加してＣＬＡを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
【０００２】
本発明は、共役リノール酸（conjugated linoleic acid、以下‘ＣＬＡ’という）を生産することができる新規の菌主に関するものである。
背景技術
【０００３】
ＣＬＡは必須脂肪酸であるリノール酸（linoleic acid、以下‘ＬＡ’という）の共役化異性体であって、反芻動物の乳や筋肉にから微量に発見される天然脂肪酸成分である。
ＣＬＡは鎖内部のシス（ｃｉｓ）−９及びトランス（ｔｒａｎｓ）−１１、又はトランス−１０及びシス−１２位置に鎖内部の及びトランス（ｔｒａｎｓ）配列に共役化二重結合を持つが、特にシス−９及びトランス−１１部位の共役化二重結合により人体に有用な生理活性が現れる。
ＣＬＡは動脈硬化症の発生低下（Artery.1977.22:266-277）、免疫機能向上（J.Nut.1999.129:32-38）、抗癌作用（Anticancer research.1997.17:969-973）、成長促進（J.Nut.2000.130:2981-2989）及び糖尿病等の疾患に対し優秀な治療効果を現し、体脂肪減少（Am.J.Physiol.1998.275:R667-R672）を通じて肥満を抑制するとも知られている。このような特性によりＣＬＡは機能性食品及び医薬品の有効成分として有用に利用することができる。
【０００４】
ＣＬＡは主に動物性食品に含有されており、特に反芻動物に多く存在するものとして知られている。牛肉のＣＬＡ含量は２．９〜４．３mgＣＬＡ／ｆａｔであり、子羊においては５．６mgＣＬＡ／ｆａｔで、海産物においては０．３〜０．６mgＣＬＡ／ｆａｔの少量が存在し、乳製品における含量は牛乳の場合５．５mgＣＬＡ／ｆａｔ、またチーズにおいては３〜７mgＣＬＡ／ｆａｔの量が確認される。人間の一日  ＣＬＡ摂取量は主に菜食である東洋人の場合には０．１ｇ／ｄａｙであり、肉食を多くする西洋人の場合は０．４ｇ／ｄａｙと予想されている。
現在までＣＬＡの大量生産のために様々な方法が開発されてきた。既存の方法は尿素付加法、分子蒸留法、ＨＰＬＣ方法等、ＣＬＡをＬＡから化学的に合成する方法があり、ＬＡをＣＬＡに転換することのできる活性を持つ微生物が多数分離されたことがある。
しかし、化学的合成法は高価な装備を必要としたり、工程に非常に長い時間が所要される等の問題が多い。また、これらの方法は単一種類のＣＬＡだけでなく多様な種類の異性体を一緒に生成するので、既存の化学的方法で単一種類のＣＬＡ異性体のみを生産するということは非常に非効率的である。
従ってＣＬＡを最も効率的に生産できる方法はＣＬＡを生成できる微生物からＣＬＡを生産、分離することである。ＣＬＡを生産すると知られている代表的な微生物はラクトバチルス（Lactobacillus）、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、ブチリビブリオフィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）等の腸内微生物であり、多くの国家においてこれらは家畜に投与する生菌剤（probiotics）、飼料等の機能性食品や医薬品の有効成分として有用に使用されている。
しかしながら、国内においてはＣＬＡを食品や医薬品の有効成分として直接添加することが未だ許可されていない。従って、ＣＬＡを食品及び医薬品の有効成分として使用しようとすれば、微生物からＣＬＡを分離して添加する方法よりは、ＣＬＡを生成できる微生物の菌体自体を直接添加してＣＬＡを間接的に生成するようにする方法を使用せねばならない。
【０００５】
現在までに知られているところによれば、腸内微生物により合成されたＣＬＡは、シス−９、トランス−１１とシス−１２、トランス−１０の比率が約５０％ずつ生成される化学的な合成方法とは違い、シス−９とトランス−１１のみ特異的に生成される。反芻動物由来の肉類においては少量のシス−９とトランス−１１が確認されるが、脱脂乳を利用した発酵乳製品においては非常に低いシス−９とトランス−１１が検出されるだけで、特に各種乳酸菌を利用した発行キムチにおいてもシス−９とトランス−１１が存在しないものと知られている。従って、大韓民国特許出願番号２００１−００４７２９２ではラクトバチルス属微生物を利用して微生物によって合成された純粋なシス−９とトランス−１１型のＣＬＡを食品に添加する方法を開示したことがあるが、実際の食品においては極微量のＣＬＡ含量が確認されただけである。
また、ＣＬＡ生成微生物が食品又は医薬品の有効成分として使用され得るためには、製造された製品の流通期間の間中、微生物が製品製造時と同じように高い比率で残存せねばならず、人等、動物の体内へ摂取された後は腸内で高い生存率と活性を保たねばならない。またスーパーバクテリア（superbacteria）を始めとした腸内の有害な菌と競争して優位を占めるためには抗生物質に対して優秀な耐性を備えねばならない。
しかし、現在市販中の製品の有効成分として使用される微生物のうち多くの菌主は、貯蔵中の製品だけでなく摂取後に胃を通過する過程においてさえ存在することができず、抗生物質に対する耐性も微弱であることが分かった。
発明の開示
発明が解決しようとする課題
【０００６】
従って、優秀なＣＬＡ生産能力と共に、動物の体内において高い生存力と活性を現し、菌体自体を食品及び医薬品の有効成分として直接添加できる菌主に対する発明は依然として課題として残っている。
課題を解決するための手段
【０００７】
前記課題を達成するため、本発明では共役リノール酸を生産でき、酸と抗生物質に対して優れた耐性を持ち、菌体自体を食品及び医薬品に添加する時ＣＬＡを間接的に生成できる新規の菌主を提供する。
また、本発明では前記菌主とＣＬＡを含有するカプセル剤を提供することにより、機能性発酵食品、乳製品及び医薬品を製造することのできる方法を提供する。
【０００８】
本発明はＣＬＡを生産することのできる新規の菌主を提供する。
本発明の菌主は韓国人嬰児の糞便から分離された菌主であり、ＬＡをＣＬＡに変換できることを特徴とする。
本発明の菌主にはビフィドバクテリウムブレベ（Bifidobacterium breve）ＣＢＧ-Ｃ２菌主、ビフィドバクテリウムシュドカルテヌラチューム（Bifidobavterium pseudocartenulatum）ＣＢＧ-Ｃ４菌主及びエンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）ＣＢＧ-Ｃ５菌主が含まれる。
発明を実施するための最良の形態
【０００９】
本発明の菌主を分離する方法は次の通りである。
韓国人嬰児の糞便から菌主を分離し、３００個程度の菌落（colony）を任意に採取して基質であるＬＡが添加された培地で培養する。培養液をヘキサン（hexane）で抽出した後、吸光度を測定してＣＬＡ生成能力が優秀な菌主を選別する。
前記過程により選別された菌主に対し、各菌主が生成する脂肪酸をガスクロマトグラフィ（Gas Chromatograph；以下ＧＣという）法で分析し、ＬＡからＣＬＡを生成することができるかどうかを再度確認する。
このようにして選別された本発明の菌主は３種類で、夫々ＣＢＧ−Ｃ２、ＣＢＧ−Ｃ４及びＣＧＢ−Ｃ５と命名され、２００２年４月３日農業生命工学研究院農用微生物保存センターに夫々寄託番号KACC 91001、KACC 91003及びKACC 91002として寄託された状態である。また、ＣＢＧ-Ｃ２（KCTC 10462BP）とＣＢＧ-Ｃ４（KCTC 10208BP）は生命工学研究院遺伝資源センター遺伝子銀行にも夫々２００２年３月２５日と２００３年４月１０日付で寄託された状態である。
【００１０】
上記のような方法で得られた本発明の菌主はＣＬＡ生産能力が優れており、胃酸や胆汁等の酸と抗生物質に対し強い耐性を持っている。
本発明の微生物から生産されるＣＬＡはシス−９とトランス−１１の立体構造のみを含むが、これらは既に公知である通り多様な生理活性を持つ異性体であるため、これら構造物を含む脂肪酸とアシルグリセロールは各種動物性由来の乳製品、植物由来の原料物質による乳製品、発酵食品及び健康性機能性食品と生菌剤（probiotics）等の開発のため広範囲に利用することができる。
従って、本発明の菌主は菌体固定化等の生物学的方法によりＣＬＡの異性体を大量に生合成するにおいて効率的に利用することができる。
本発明の菌主は生菌体だけでなく死菌体形態でも食医薬品添加が可能であるが、これは本発明の菌主がＣＬＡを培養液或いは反応液に分泌しながら、同時に相当量のＣＬＡを菌体内蓄積できる特性を有しているためである。
従って、本発明の菌主はＬＡ添加培地で培養した菌体自体を食品及び医薬品等多様な組成物の有効成分として添加してＣＬＡが間接的に生成されるようにすることができるので、ＣＬＡを食品及び医薬品に直接添加することのできなかった既存の問題を解決し、ＣＬＡを多量含有した機能性製品の開発を促進することができる。
本発明はまた、前記菌主を含有する食品及び薬剤学的組成物を提供する。本発明の組成物は本発明のビフィドバクテリウムブレベＣＢＧ-Ｃ２菌主、ビフィドバクテリウムシュドカルテヌラチュームＣＢＧ-Ｃ４菌主又はエンテロコッカスフェシウムＣＢＧ-Ｃ５菌主のうち、選択された一つ以上の菌体を有効成分として含有する。
本発明の組成物はＣＬＡ生成率を高め菌主の生育安定性を増大させるために有機酸等を追加の有効成分として含有することができる。本発明の組成物において有機酸は化学的に合成されたり、又は微生物から精製されて分離されたＣＬＡになることができる。
具体的に本発明の組成物は、本発明の菌主のうち選択された一つの菌体とＣＬＡを一緒に含むこととができる。
【００１１】
本発明の組成物は、前記有効成分以外にも必要に応じて多様な補助成分を追加で含むことができる。
本発明の食品組成物の場合、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸（folic acid）、ビタミンＣ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ等のビタミン類と、銅、カルシウム、鉄、マグネシウム、カリウム、亜鉛等のミネラル又は乳酸菌等を含有することができる。
また、本発明の食品組成物のうち、健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤又は天然炭水化物等を追加成分として含有することができる。香味剤としてはタウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスファルタムのような合成甘味剤等を挙げることができる。天然炭水化物としてはブドウ糖、果糖等の単糖類、マルトース、スクロース等の二糖類、デクストリン、サイクロデクストリン等の多糖類、キシリトール、ソルビトール、エリトリトール等の糖アルコール類が挙げられる。
本発明の薬剤学的組成物の投与量又は摂取量は６０〜１３０μＭ（Cancer Epidemiol.Biol.Prev.2000.9:689-696）、また、食品組成物の投与量又は摂取量は３．４〜６ｇ／日（J.Nutr.2000.130:2943-2948）であることが望ましいが、必要に応じて加減することができる。本発明の組成物は摂取量に関係なく体内に安全に吸収される。投与量又は摂取量は組成物に含有された有効成分及び別の成分の種類及び含量、剤形の種類及び患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、同時使用される薬物を始めとした多様な因子により調節することができる。
本発明の組成物は人体に投薬する場合、化学的に合成されたＣＬＡ含有食品及び医薬品に比べ副作用の憂慮がない。
【００１２】
本発明の組成物は前記有効成分以外にも薬剤学的又は食品において許容可能な担体を１種以上含んで製剤化することができる。
薬剤学的又は食品において許容可能な担体は食塩水、滅菌水、リンガー液、デクストローズ溶液、マルトデクストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤等、別の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液等のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤として製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法により、又はRemington’s Pharmaceutical Science（最近版）、Mack Publishing Company, Easton PAに開示されている方法を利用して各疾患に応じて、又は成分に応じて望ましく製剤化することができる。
本発明の組成物の製剤形態は顆粒剤、散剤、顆粒剤、被覆錠、錠剤、カプセル剤、煎薬、エキス剤、座剤、シロップ、汁、懸濁剤、乳剤及び活性化学物の徐放型製剤等にすることができる。
本発明は前記組成物のカプセル剤を提供する。
本発明のカプセル剤は被覆物質（coating material）と、被覆される内部の核物質（core material）で成り立つ。
【００１３】
本発明のカプセル剤において核物質は本発明の菌主のうち選択された一つとＣＬＡを一緒に含むことが望ましい。
本発明のカプセル剤において核物質を囲む被覆物質は吸水性、分散性、粘着性が優れた水溶性多糖類を使用する。
本発明において使用可能な水溶性多糖類は澱粉、寒天、カラギナン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム（sodium alginate）、ポリメチルメタクリレート（polymetacrylate）、小麦蛋白、大豆蛋白を始めとし、メチルセルロース（methylcellulose）、ハイドロプロピルセルロース（hydroxylpropylcellulose）、ハイドロプロピルメチルセルロース（hydroxyl-propylmethylcellulose）等のセルロース誘導体、キサンタンガム（xanthan gum）、アラビアガム（arabic gum）、ローカストビーンガム（locust bean gum）、グアガム（guar gum）、タマリンドガム（tamarind gum）、タラガム（Tara gum）、カラヤガム（karaya gum）、トラガカンスガム（tragacanth gum）、ガティガム（ghatti gum）等のガム類、それからジェラン（gellan）、キサンタン（xanthan）、ペクチン（LA、HM type）、デクストラン（dextran）、グルカン（glucan）、グルコマンナン（glucomannan）、アラビノガラクタン（arabinogalactan）、ファセレラン（furcelleran）、プルラン（pullulan）、グルコサミン（glucosamine）、ゼラチン（gelatin）、カゼイン（casein）のうち、選択された一つ以上にすることができる。
本発明のカプセル剤製造時、コーティング物質の量は用途及び目的に応じてその量を適宜加減することができ、核を基準として一般的に使用される範囲である１〜８０重量％範囲の量で使用するのが良い。
本発明のカプセル剤は前記水溶性多糖類以外にも、放出制御効果を高めたり溶解度を高めるために一般的に使用されるコーティング物質を追加で含むことができる。
また、本発明のカプセル剤は必要に応じて乳化剤、保護剤及び可塑剤を追加で含むことができる。
【００１４】
本発明のカプセル剤の製造方法は、通常的に使用されるカプセル化方法のうち適切な方法を選んで使用することができる。例えば、本発明のカプセル剤を製造する方法は、乳化安定性を有する分散媒に本発明の菌主の培養菌体、有機酸及びカプセル被覆物質を分散させる乳化工程、乳化分散液を攪拌させてカプセル膜を製造するカプセル膜生成工程、それから硬化剤と反応剤を添加してカプセル膜を硬化させる硬化工程を含む一般的なカプセル化製造工程から成る。
発明の効果
【００１５】
このように製造された本発明のカプセル剤は、酸化防止を通じて外部環境から菌主を保護するので低温で長期間安定的に貯蔵が可能である。
ＣＬＡのような脂肪酸は本来、熱、酵素、酸、アルカリ、微生物などに対し不安定であるが、適切な被覆物質により微細カプセル化(microencapsulation)されると、貯蔵-安定性及び服用上の便宜性が増加する。
本発明のカプセル剤は、酸性条件である腸内においても一定の放出調節により一定水準の生菌数を維持することになる。
【００１６】
また、本発明のカプセル剤は、微細カプセル化により体内水溶系における比重及び分散性を増加させるので、生体利用率がさらに高まり貯蔵食品及び乳飲料及び乳製品に対する適応性を向上させることができる。
従って、本発明のカプセル剤は腸内において本発明の菌主が安定して生育できるようにする。腸内で増殖した本発明の菌主は持続的にＣＬＡを生産するので動脈硬化の発生低下、体脂肪減少、免疫機能向上、抗癌効果、成長促進効果等を得ることができる。また、本発明の菌主が腸内において優占種の位置を占めることにより、腸内で有害な微生物の成長を阻害する生菌剤（probiotics）として作用するようになるので、持続的に腸機能を活性化して改善することができる。
本発明のカプセル剤を含む組成物は、具体的に乳製品（牛乳、豆乳、加工乳）、発酵乳（液状ヨーグルト、糊状ヨーグルト）、発酵性食品（キムチ類、醤類）、家畜用飼料、健康補助食品等にすることができる。
本発明の菌主を有効成分として含有する食品組成物は家畜用飼料を始めとして各種キムチ類、醤類等の発酵食品及びヨーグルト、チーズ等の発酵乳製品で、抗癌、免疫増強、体脂肪減少等の効果を期待することができる。
本発明の菌主を有効成分として含有する薬剤学的組成物は、癌、動脈硬化、糖尿病及び肥満等、ＣＬＡにより抑制される疾患の予防又は治療に使用することができる。
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実施例
【００１７】
以下、本発明の菌主を下記実施例においてより詳細に説明するが、実施例により本発明が制限されるものではない。
【００１８】
実施例１
本発明の菌主分離、同定及び特性確認
1）本発明の菌主の分離及び同定
本発明の菌主を分離するため、嬰児の糞便を採取した。
ＣＬＡを生成する微生物を分離するため、母乳、混合、離乳栄養児の糞便１０種を採取し、滅菌流動パラフィンが重層されたＭＲＳ培地に接種した。滅菌生理食塩水（０．５％ｗ／ｖ）で３０〜１５０個程度の菌落（colony）が生じるように希釈し、L-cysteineが０．０５％添加されたＭＲＳ（Man Rogosa Sharpe）培地に塗抹した後、嫌気槽にガスパック（Gas Pack、MGC、mitsubishi）と一緒に入れ３７℃で７２時間培養した。この時、ＬＡを０．５％（ｗ／ｖ）ツイーン８０（tween 80）によく乳化させて綿濾過した後ＭＲＳ培地に添加し、菌培養時に嫌気条件を造成するため、滅菌された培養容器にＭＲＳ培地を隙間なくぎっしりと分株した。
培養された培地において３００個程度の菌落を任意選択し、各菌主をＭＲＳ培地に２回継代培養した後２０ｍｌ試験管に１％接種し４８時間培養した。培養液をヘキサン（hexane）で抽出した後、２３３ｎｍにおいて吸光度を測定してＣＬＡ生成量を得、これを菌体量、すなわち６００ｎｍにおける吸光度値に補正し相対的なＣＬＡ生成量を比較した。
生菌数測定はＭＲＳ寒天培地を利用して１０倍希釈法により平板培養し、これを嫌気槽（Difco、USA）に入れてガスパックと一緒に４８時間経過後、生成された菌落の数を数えて測定した。
このようにしてＣＬＡ生成能力が優秀な３菌主を選抜し、ＣＢＧ-Ｃ２、ＣＢＧ-Ｃ４及びＣＢＧ-Ｃ５と夫々命名した。本発明の菌主に対しｒＲＮＡの塩基序列を分析してその属と種を同定した。
その結果、ＣＢＧ-Ｃ２菌主はビフィドバクテリウムブレベ、ＣＢＧ-Ｃ４菌主はビフィドバクテリウムシュドカルテヌラチューム、ＣＢＧ-Ｃ５菌主はエンテロコッカスフェシウムに属するものと判明した。
各菌主は２００２年４月３日農業生命工学研究院農用微生物保存センターにＣＢＧ-Ｃ２（KACC 91001）、ＣＢＧ-Ｃ４（KACC 91003）、ＣＢＧ-Ｃ５菌主は寄託番号KACC 91002として寄託された。また、ＣＧＢ-Ｃ２（KCTC 10462BP）とＣＢＧ-Ｃ４（KCTC 10208BP）は生命工学研究院遺伝資源センター遺伝子銀行にも夫々２００３年３月２５日と２００３年４月１０日付で寄託された状態である。
【００１９】
２）本発明の菌主が生成する脂肪酸の組成確認
本発明の菌主が生成する脂肪酸の組成を確認し、本発明の菌主がＣＬＡを生成するかどうか再度確認するため、次のようにＧＣを行った。
菌体をＬＡ（５００μｇ／ｍｌ）が含まれた培地において48時間培養した後、遠心分離した。
培養液或いは蒸留水に懸濁した菌体に2倍の体積のイソプロピルアルコール（isopropyl alcohol）を添加して激しく混合した後、ここに1.5倍の体積のヘキサンを加えて3分間揺らしながら混合した。
前記混合液を常温で３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、２３３ｎｍにおいて上清液の吸光度を測定した。抽出した脂肪酸はAmerican Oil Chemists’s Society：Official Method and Recommended Practoces pf AOCS, 4th.ed(1989)方法によりメチルエステル（methly ester）化してＧＣ分析に必要な試料を準備した。
ＧＣ分析時の条件は次の通りである。この時、ＦＩＤが附着されたGC DS-6200（DONAM）を使用し、コラムはHP-FFAP capillary column（30m×0.25mm、厚さ0.25μm）を使用し、オーブン温度は２１０℃、インジェクター（injector）温度は２５０℃、デテクター（detector）温度は２７０℃であった。運搬気体はヘリウムを使用し１ｍｌ/分 流速で湧出させ、分解比（split ratio）は５０：１とした。各ピークの面積は機器に連結された積分計（model 3390A、Hewlett-packard、USA）を利用して求めた。ＣＬＡの同定は標準物質の停泊時間と比較して確認し、ＣＬＡの含量は標準物質の面積とＣＬＡの面積比により分析試料として使用し、その結果を図１に示した。
図１に示された通り、全ての菌主においてＬＡピークとＣＬＡピークが同時に観察された。
従って、本発明の菌主はＬＡを基質としてＣＬＡを生成できることがわかる。
【００２０】
3）本発明の菌主において、ＣＬＡ生成の最適条件確認
本発明の菌主において、ＣＬＡ生成の最適条件を確認するため、基質であるＬＡが培地に存在する場合と存在しない場合の2条件において、各菌主の生育特性を観察した。
まず、前培養して活性化された菌主をＬＡ（５００μｇ／ｍｌ）が含まれたＭＲＳ培地２ｌに１％になるように接種した後、時間別で培養液を回収して菌体濃度、ＣＬＡ生成量及び培養液のｐＨを測定してその結果を図２に示した。
図２に示された通り、各菌主は対数期（log phase）にさしかかるに従ってＣＬＡ生成量も増加し、停止期（stationary phase）に到達する直前にＣＬＡを最大に生成した。培養液の最初ｐＨは６．５程度であったが、培養時間が経つ程に下がって約５０時間発酵後にはｐＨ４．２程度を示した。
一方、前培養した菌主をＬＡが含まれていないＭＲＳ培地に１％になるように接種した後、２０ｍｌ試験管に分株して培養し生長曲線を測定し、１８時間培養後から６〜１２時間毎に培養液のｐＨを測定した。菌体を回収して菌体量の１０倍の体積のトリス（Tris）緩衝液に懸濁させた後、酵素反応を行い生長曲線の変化によるＣＬＡイソメラーゼ（isomerase）の力価変化を観察した。この時、酵素反応に添加したＬＡの濃度は１００μｇ／ｍｌであり、その結果を図３に示した。
図３に示された通り、ＬＡを添加せずに培養した場合はＬＡを添加して培養した場合よりも停止期に至る時間がより長かった。培養液の最終ｐＨは４．２程度であった。
従って、本発明の菌主は対数期から停止期に移る直前に最大にＣＬＡを生成することが分かる。
また、前記結果のうち、ＬＡが存在する時に得た実験結果は基質存在下に菌を発酵反応させて製品を開発する時、またＬＡが存在しない時に得た実験結果は菌自体を製品の有効成分として添加してＣＬＡを間接的に生成しようとする場合に、単位菌体当たり最大力価を示す菌体の成長時期を把握するにおいて有用に使用することができる。
【００２１】
４）本発明の菌主培養時、培養液と菌体に夫々分布するＣＬＡの量確認
本発明の菌主培養時、培養液と菌体に夫々分布するＣＬＡの量を確認するため、次の通り実験を行った。
まず、ＬＡが含まれた培養液に各菌主を接種した後、１８、２４、３６、４８時間毎に菌体濃度及びＣＬＡ生成程度を測定し、その結果を図４に示した。
図４に示された通り、菌体と培養液に夫々存在するＣＬＡの比率は初期、即ち１８時間後にはＣＢＧ−Ｃ２の場合１：１．８５、ＣＢＧ−Ｃ４の場合１：２．１、ＣＢＧ−Ｃ５の場合１：１．５４であった。次第に生育時間が経つ程に培地内のＣＬＡ量が増加し、４８時間後には下記表１に示した通り、ＣＢＧ−Ｃ２の場合１：３．５、ＣＢＧ−Ｃ４の場合１：２．９、ＣＢＧ−Ｃ５の場合１：２の比率を示した。
【００２２】
表１
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一方、ＬＡを添加していない培養液に各菌主を接種した後、１８、２４、３６、４８時間培養した菌体を回収してＬＡが含有された緩衝液と混合した後、１時間反応させた後、生成されたＣＬＡの分布を測定してその結果を図５に示した。
図５に示された通り、生育時間が次第に経つ程に培地内にＣＬＡ量が増加した。培養３６時間後には表２に示された通り、菌体により１時間生成されたＣＬＡの分布は菌体と培地の比がＣＢＧ−Ｃ２、ＣＢＧ−Ｃ４、ＣＢＧ−Ｃ５が夫々１．３：１、１．６：１、０．６：１であった。
【００２３】
表２
2005522216.tif 000006
従って、本発明の菌主はＣＬＡを生成して培地へ分泌する一方、菌体内にも蓄積することができる。
本発明の菌主のこのような特性は、菌体自体を食品及び医薬品の有効成分として添加してＣＬＡが生成されるようにするにおいて使用することができる。
【００２４】
５）本発明の菌主において、炭素元の種類による菌の成長及びＣＬＡ生成量の変化確認
本発明の菌主において、糖元の種類による生長及びＣＬＡ生成量の変化を確認するため、ブドウ糖（glucose）、果糖（fructose）、乳糖（lactose）及び砂糖（sucrose）等、多様な炭素元が添加された培地において菌主を培養して生長程度とＣＬＡ生成量を測定し、その結果を図６に示した。
各菌主の成長に最も適した炭素元は図６ａに示された通り、培地にＬＡが存在する場合ＣＢＧ-Ｃ２はブドウ糖、ＣＢＧ-Ｃ４は乳糖と砂糖、ＣＢＧ-Ｃ５は乳糖であり、培地にＬＡが存在しない場合ＣＢＧ-Ｃ２は乳糖、ＣＢＧ-Ｃ４は乳糖と砂糖であった。
一方、ＬＡ添加培地において４８時間培養した後のＣＬＡ生成量は図６ｂに示された通り、ＣＢＧ−Ｃ２とＣＢＧ−Ｃ４はブドウ糖を炭素元として使用した時に最大値を示した反面、ＣＢＧ−Ｃ５は炭素元によって殆ど影響を受けなかった。
【００２５】
６）本発明の菌主のｐＨ、胆汁及び抗生物質に対する耐性確認
本発明の菌主のｐＨ耐性、胆汁耐性及び抗生物質耐性等の特性を次の通り確認した。
分離、同定された新菌主を利用してＣＬＡ生産乳酸菌を接種して発酵させた製品や或いは菌体内に含有されているＣＬＡを利用した添加剤としての用途のため各菌主の生育特性を比較した。
【００２６】
1）ｐＨ耐性
本発明の菌主のｐＨ耐性を確認するため、培地にＬＡが含まれている場合と含まれない場合の２条件下において菌を培養しながら培養液のｐＨ変化を観察し、その結果を図２と図３に示した。
図２と図３に示された通り、培地にＬＡが含まれているかどうかに関係なく、菌生育が停止期にさしかかりながら培養液のｐＨが急激に減少した。最終ｐＨが４．２程度まで下がることから見て、典型的な乳酸菌の発酵の様相を備えている。
前記結果を元に、培養液のｐＨ変化による菌の生育の如何を確認するため、塩酸を使用してＭＲＳ培地をｐＨ２〜６まで多様に準備した。各培地に各菌主を接種し３７℃で４８時間培養しながら菌の生育の如何を観察し、その結果を表３に示した。
【００２７】
表３
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（−：全く増殖しない、＋：若干増殖、＋＋：非常に増殖）
表３によれば、本発明の菌主はｐＨ３．０〜６．０の範囲において全て生育が可能であり、特にＣＢＧ−Ｃ４菌主が最も優れたｐＨ耐性を示した。
従って、本発明の菌主は弱アルカリと弱酸性に渡る広い範囲において全て生育が可能であり、特に胃酸が分泌されて酸性環境が造成される胃において充分に生存できることがわかる。
【００２８】
２）胆汁耐性
本発明の菌主の胆汁耐性を確認するため、胆汁の成分であるソジュームデオキシコレート（sodium deoxycolate）が０、１００、３００、５００、８００及び１０００μｇ／ｍｌと多様に添加されたＭＲＳ培地を準備した。各培地に菌主を接種して３７℃で４８時間培養しながら生育の如何を検討し、この時、対照菌主としては胆汁耐性を全く持たないバチラスサブチリス（Bacillus subtiliｓ）を使用し、その結果を表４に示した。
【００２９】
表４
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表４に示された通り、本発明の菌主は全て胆汁濃度１０００μｇ／ｍｌまでも良好に生育した反面、対照菌主であるバチラスサブチリスの場合は１００μｇ／ｍｌにおいても生育が不可能であった。
従って、本発明の菌主は胆汁が分泌される胃腸管において安定的に生育できることが分かる。
【００３０】
３）抗生物質耐性
本発明の菌主の抗生物質耐性を確認するため、２０ｍｌ試験管に夜通し培養した菌主をＭＲＳ培地に希釈して固体培地を製造した。対照菌主としてはラクトバチラスローテリ（Lactobacillus reuteri）を使用した。
抗生物質として本実験に使用した抗生剤はアンピシリン（ampicillin）、テトラサイクリン（tetracycline）、ストレプトマイシン（streptomycin）、リファマイシンｓｖ（rifamycin sv）及びカナマイシン（kanamycin）であり、夫々５０μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ及び１００００μｇ／ｍｌの３濃度を準備した。
前記の通り準備された抗生物質を夫々紙ディスク（paper disc）に４０μｌずつ落とした後、ディスクを乾燥させた。ディスクを菌が混合された培地上に載せ、３７℃で４８時間培養しながら生育の如何を観察してその結果を表５に示した。
【００３１】
表５
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表５に示された通り、本発明の菌主は全て2〜3個の抗生物質に対して耐性を示した。特にＣＢＧ-Ｃ５菌主は１０００μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１００００μｇ／ｍｌのテトラサイクリン等、高い濃度で処理された抗生物質に対しても耐性を示し、抗生物質に対する耐性が最も良好であった。
従って、本発明の菌主は広範囲な種類と濃度範囲の抗生物質に対し耐性を持っていることが分かる。
【００３２】
実施例２
発明の菌主及びＣＬＡを含有するカプセル剤及び乳製品の製造
本発明の菌主及びＣＬＡを含有するカプセル剤及び乳製品を次の通り製造した。
共役リノール酸の微細カプセル化のためのコーティング物質を製造するため、植物性多糖類であるジェラン、キサンタン、澱粉、寒天が１〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で含まれた混合物を準備した。前記混合物に乳化剤としてＨＬＢ（hydrophilic lipophilic balance）の数値が４．７であるソルビタンモノスティアレートを添加した後、６０℃で加熱して完全に溶解した後、加熱殺菌して４０℃に冷却して混合水溶液を製造した。この時、ソルビタンモノスティアレートの濃度は０．０１−１％（ｗ／ｖ）になるように処理し、コーティング剤と菌体の混合比率は7：3（w/w）にして均質化した。
均質化された菌体懸濁液を10℃の冷却水に噴霧器で噴霧し微細カプセルの懸濁菌体液を製造した。
製造された微細カプセルは低温発酵製品であるキムチ製造時1％（w/v）を加えた。製品別カプセル添加量は、牛乳、豆乳、液状ヨーグルトの場合4.2％(w/v)を添加し、糊状ヨーグルトと豆乳発酵乳には7.3％(w/v)を添加して各乳製品を製造した。乳製品は4℃又は10℃で低温状態が維持される冷蔵庫で保管された。
前記の通り製造された乳製品に対して微細カプセルの保存性を実験した結果、4℃及び10℃の冷蔵温度で7〜14日間保管された場合、101~2 個/ｍｌ程度の生菌数が減少する傾向を示した。この程度の減少率は通常的な基準で見る時、非常に微弱な数値である。
従って、本発明のカプセル剤は長期間経過しても生菌数が安定的に維持され、貯蔵安定性が優れていることがわかる。
産業上の利用可能性
【００３３】
本発明の菌主はＬＡからＣＬＡを優れた効率で生成できるだけでなく、胃酸と胆汁酸、それから抗生物質に対して優秀な耐性を持つ。
本発明の菌主はＣＬＡを生産した後、菌体内に蓄積できるため、ＣＬＡが間接的に生成されるようにする効果がある。
従って、本発明の菌主を含む組成物は、水溶性多糖類からなる被覆物質内に本発明の菌主とＣＬＡを含むカプセル剤形態等で製造され、機能性食品及び医薬品として有用に使用することができる。
また、本発明の菌主は菌体固定化等の生物学的方法によりＣＬＡ以外にもＣＬＡの異性体を多量に生合成するにおいて効率的に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の菌主が生成する脂肪酸の組成物を確認するためのＨＰＬＣ分析結果を示した図である。
【図２】リノール酸（ＬＡ）が添加された培地において本発明の菌主の成長状態、ＣＬＡ生成及び培養液のｐＨ変化を示した図である。
【図３】リノール酸（ＬＡ）が添加されていない培地において本発明の菌主の生長状態及びＣＬＡ生成を示した図である。
【図４】リノール酸（ＬＡ）が添加された培地において本発明の菌主を培養した時、培養液と菌体に夫々分布するＣＬＡの量を比較して示した図である。
【図５】リノール酸（ＬＡ）が添加されていない培地において本発明の菌主を培養した時、培養液と菌体に夫々分布するＣＬＡの量を比較して示した図である。
【図６】本発明の菌主をブドウ糖、果糖、乳糖及び砂糖が夫々炭素元として添加された培地において培養し、生長程度（a）とＣＬＡ生成量（b）を測定した結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月8日(2004.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡ（Linoleic acid）をＣＬＡ（conjugated linoleic acid）に変換することのできるビフィドバクテリウムブレベ（Bifidobacterium breve）ＣＢＧ-Ｃ２菌主。
【請求項２】
請求項１に記載の、寄託番号KACC 91001で寄託された菌主。
【請求項３】
請求項１に記載の、寄託番号KCTC 10462BPで寄託された菌主。
【請求項４】
ＬＡをＣＬＡに変換することのできるビフィドバクテリウムシュドカルテヌラチューム（Bifidobacterium pseudocartenulatum）ＣＢＧ-Ｃ４菌主。
【請求項５】
請求項４に記載の、寄託番号KACC 91003で寄託された菌主。
【請求項６】
請求項４に記載の、寄託番号KCTC 10208BPで寄託された菌主。
【請求項７】
ＬＡをＣＬＡに変換することのできるエンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）ＣＢＧ-Ｃ５菌主。
【請求項８】
請求項７に記載の、寄託番号KACC 91002で寄託された菌主。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のうち何れか１つに記載の有効成分としてＣＬＡを生成する組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の、癌、動脈硬化、糖尿病及び肥満等、ＣＬＡにより抑制される疾患の予防又は治療用組成物。
【請求項１１】
請求項１乃至請求項８のうち何れか１つに記載の菌主の菌体とＣＬＡを核物質として含有し、水溶性多糖類を被覆物質として含有するカプセル剤。
【請求項１２】
請求項１乃至請求項８のうち何れか１つに記載の菌主を利用してＬＡからＣＬＡを生成する方法。
【請求項１３】
請求項１乃至請求項８のうち何れか１つに記載の菌主の菌体を食品又は医薬品の有効成分として添加してＣＬＡを生成する方法。
【国際調査報告】
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