(57)【要約】ＲＮＡ干渉によるイン・ビボにおけるターゲット遺伝子発現のダウンレギュレーションのための方法および組成物を提供する。これらの方法は、遺伝子に基づく薬剤開発におけるターゲットの発見および確認、およびヒト疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における予め選択した内在遺伝子をダウンレギュレーションする方法であって、上記哺乳類の組織に、二本鎖ＲＮＡ分子であって、前記内在遺伝子の発現を特異的に減少させまたは阻害する前記ＲＮＡ分子を含んでなる組成物を投与することを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡ分子が小さな干渉性ＲＮＡまたは長い二本鎖ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ分子が、長さが約２１−２３ｂｐの小さな干渉性ＲＮＡ分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ分子が、長さが約１００−８００ｂｐの長い二本鎖ＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物を前記哺乳類の組織に直接投与する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記投与が前記哺乳類の腫瘍中または前記哺乳類の関節中への注射による、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、前記哺乳類の前記組織への前記ＲＮＡ分子の送達を増すポリマー性キャリヤーをさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマー性キャリヤーが前記ＲＮＡ分子に結合するカチオン性ポリマーを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カチオン性ポリマーがアミノ酸コポリマーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーがヒスチジンおよびリシン残基を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーが分岐ポリマーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、前記哺乳類の前記組織への前記ＲＮＡ分子の送達を増す、ターゲット設定した合成ベクターを含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベクターがカチオン性ポリマー、親水性ポリマー、およびターゲッティングリガンドを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記カチオン性ポリマーがポリエチレンイミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記親水性ポリマーがポリエチレングリコールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ターゲッティングリガンドがＲＧＤ配列を含んでなるペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
パルス電場を、前記組成物と実質的に同時存在する前記組織に加える、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記内在遺伝子が突然変異内在遺伝子である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記突然変異遺伝子における少なくとも１つの突然変異が、前記遺伝子のコードまたは調節領域におけるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組織に第二の電気パルスを実質的に同時に加えることをさらに含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類の予め選択した内在遺伝子をダウンレギュレーションする方法であって、前記哺乳類の組織に、ベクター組成物を投与することを含んでなり、
ここで、前記ベクターが、ＲＮＡ転写体の転写を制御する調節配列に作動可能に連結した前記転写体をコードし、
前記転写体が、前記内在遺伝子の発現を特異的に減少させまたは阻害する二本鎖ＲＮＡ分子を、前記組織において形成することができる、方法。
【請求項２２】
前記ベクターがウイルスベクター、またはプラスミド、コスミドまたはバクテリオファージベクターである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記内在遺伝子が、発癌遺伝子、増殖因子遺伝子、脈管形成因子遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ遺伝子、タンパク質チロシンキナーゼ遺伝子、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ遺伝子、タンパク質チロシンホスファターゼ遺伝子、受容体遺伝子、マトリックスタンパク質遺伝子、サイトカイン遺伝子、増殖ホルモン遺伝子、および転写因子遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記調節配列がプロモーターを含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロモーターが組織選択的プロモーターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織選択的プロモーターが、皮膚選択的プロモーターまたは腫瘍選択的プロモーターである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭＰＳＶ  ＬＴＲ、ＳＶ４０、ＡＦＰ、ＡＬＡ、ＯＣおよびケラチン特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記電気パルスが、前記組織に約１０〜約２０分間加えられる少なくとも５０Ｖの矩形波パルスを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記電気パルスが単極性、二極性または多極性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記電気パルスが前記組織に約１０〜約２０分間加えられる、１２０Ｖの指数関数的に減衰するパルスを含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
前記電気パルスを、カリパス電極、メアンダー電極、針電極、ミクロ針アレイ電極、ミクロパッチ電極、リング電極、およびそれらの組合せからなる群から選択される電極を介して加える、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
前記電極が面積が１ｃｍ２のカリパス電極である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記カリパス電極を、厚みが約１ｍｍ〜約６ｍｍの皮膚の襞（skin fold）に加える、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
予め選択された内在遺伝子の望ましくない発現に関連した哺乳類の疾患の治療方法であって、核酸組成物を前記哺乳類の組織に適用し、かつ実質的に同時にパルス電場を前記組織に加えることを含んでなり、前記核酸組成物が前記組織における前記内在遺伝子の発現を減少させる、方法。
【請求項３５】
前記疾患が癌または前癌増殖である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組織が胸部組織、結腸組織、前立腺組織、肺組織または卵巣組織である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸組成物が、小さな干渉性ＲＮＡ、長い二本鎖ＲＮＡ、または実質的に二本鎖ＲＮＡ分子を形成することができるＲＮＡ転写体をコードするポリヌクレオチド分子を含んでなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡ分子が、長さが約２１〜２３ｂｐの小さな干渉性ＲＮＡ分子である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＮＡ分子が、長さが約１００〜８００ｂｐの長い二本鎖ＲＮＡである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＲＮＡの長さが約１００塩基対以下である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸組成物が、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉをコードすることができるベクターであり、該ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記ベクターはレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳類がヒトである、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記予め選択した内在遺伝子が、発癌遺伝子、増殖因子遺伝子、脈管形成因子遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ遺伝子、タンパク質チロシンキナーゼ遺伝子、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ遺伝子、タンパク質チロシンホスファターゼ遺伝子、受容体遺伝子、マトリックスタンパク質遺伝子、サイトカイン遺伝子、増殖ホルモン遺伝子、および転写因子遺伝子からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記遺伝子がＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本出願は、２００２年８月６日の米国仮出願番号第６０／４０１，０２９号に対する優先権を主張するものであり、上記出願明細書の内容は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、核酸のイン・ビボ伝達を通じたＲＮＡ干渉による、例えばｓｉＲＮＡデュープレックスを用いることによる、患者におけるターゲット遺伝子発現のダウンレギュレーションのための方法および組成物を提供する。この方法は、遺伝子に基づく薬剤開発のターゲット発見および確認に有用である。本発明はまた、患者における疾患の治療のための、例えば癌、感染性疾患および／または炎症性疾患を治療するためのｓｉＲＮＡ療法の臨床応用を目的とする方法および組成物を提供する。
【０００３】
背景技術
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡが配列特異的に遺伝子発現を阻害する転写後プロセスである。ＲＮＡｉプロセスは、少なくとも２工程からなり、第一工程中に、長めのｄｓＲＮＡは内在性リボヌクレアーゼによって開裂され、「小さな干渉性ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡと呼ばれる短めの２１−または２３−ヌクレオチドの長さのｄｓＲＮＡとなる。第二工程では、次に、この小さめのｓｉＲＮＡは、ターゲットｍＲＮＡ分子の分解を媒介する。このＲＮＡｉ効果は、長めの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または短めの小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞中のターゲットターゲット配列に導入することによって行うことができる。最近、ＲＮＡｉは、ターゲット遺伝子に相補的なｄｓＲＮＡを生成するプラスミドを導入することによっても行うことができることが明らかにされた。
【０００４】
ＲＮＡｉ法は、キイロショウジョウバエ（２０，２２，２３，２５）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（１４，１５，１６）、および  ミノカサゴ（２０）における遺伝子機能決定実験で良好に用いられてきた。これらのモデル生物では、化学的に合成した短めのｓｉＲＮＡまたはイン・ビトロにて転写した長めのｄｓＲＮＡがいずれもターゲット遺伝子発現を効果的に阻害することができることが報告されている。ヒト以外の哺乳類およびヒトの細胞培養物でＲＮＡｉ効果を良好に達成する方法が報告されている（３９−５６）。しかしながら、ＲＮＡｉ効果は、成長した動物モデルでは観察が困難であった（５７）。これは、少なくとも２つの理由によるものであり、第一に、長い二本鎖ＲＮＡを哺乳類細胞に導入することによってインターフェロン遺伝子発現のアップレギュレーションによる抗ウイルス応答が誘発されて細胞のアポトーシスおよび死を生じ、第二に、細胞へのｄｓＲＮＡの伝達効率が特に動物疾患モデルでは低すぎるからである。ＲＮＡｉは遺伝子ターゲッティング確認および核酸治療のいずれにおいても潜在的有用性があるが、この手法の進歩はＲＮＡｉ分子が動物疾患モデルに余り送達されないため妨げられてきた。従って、ＲＮＡｉ分子をイン・ビボにおいて送達する改良法が強く望まれているといえる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、したがって、哺乳類において１以上の特異的遺伝子の発現を阻害する方法を提供することである。
【０００６】
さらに、本発明の目的は、哺乳類において１以上の特異的遺伝子の発現を阻害することにより、哺乳類の疾患を治療する方法を提供することである。
【０００７】
これらの目的の達成において、哺乳類において予め選択した内在遺伝子をダウンレギュレーションする方法であって、二本鎖ＲＮＡ分子を含んでなり、このＲＮＡ分子が内在遺伝子の発現を特異的に減少させまたは阻害する組成物を、哺乳類の組織に投与することを特徴とする方法が提供された。この内在遺伝子のダウンレギュレーションは、遺伝子の発現によって引き起こされるまたは悪化する哺乳類の疾患の治療に用いることができる。この哺乳類はヒトであってもよい。
【０００８】
予め選択した内在遺伝子の望ましくない発現に関連した哺乳類における疾患の治療方法であって、核酸組成物を哺乳類の組織へ適用し、かつ実質的に同時にパルス電場をこの組織に加え、核酸組成物が組織の内在遺伝子の発現を減少させることができるようにすることを含んでなる方法もまた提供されている。疾患は、癌または前癌増殖であってもよく、組織は、例えば胸部組織、結腸組織、前立腺組織、肺組織または卵巣組織であることができる。
【０００９】
ＲＮＡ分子は、小さな干渉性ＲＮＡまたは長い二本鎖ＲＮＡであることがある。小さな干渉性ＲＮＡ分子は、長さが約２１−２３ｂｐであってよい。長い二本鎖ＲＮＡの長さは、約１００−８００ｂｐであってよい。ＲＮＡの長さは、約１００塩基対以下であってよい。
【００１０】
組成物は、哺乳類の組織に直接、例えば哺乳類の腫瘍または関節に注射によって投与することができる。
【００１１】
組成物は、哺乳類の組織へのＲＮＡ分子の送達を高めるポリマー性キャリヤーをさらに含んでなることができる。ポリマー性キャリヤーは、ＲＮＡ分子に結合するカチオン性ポリマーを含んでなることができる。カチオン性ポリマーは、例えばヒスチジンおよびリシン残基を含むアミノ酸コポリマーであることができる。このポリマーは分岐ポリマーであってよい。
【００１２】
組成物は、哺乳類の組織へのＲＮＡ分子の送達を高めるターゲット設定した合成ベクターを含むことができる。合成ベクターは、カチオン性ポリマー、親水性ポリマー、およびターゲッティングリガンドを含んでなることができる。ポリマーは、ポリエチレンイミンであってよく、親水性ポリマーはポリエチレングリコールであってよく、および／またはターゲッティングリガンドはＲＧＤ配列を含んでなるペプチドであってよい。
【００１３】
これらの方法のいずれかにおいて、パルス電場は組成物と実質的に同時に組織に加えることができる。第二の電気パルスを実質的に同時に組織に加えて、送達を高めることができる。
【００１４】
内在遺伝子は突然変異内在遺伝子であってよく、突然変異遺伝子における少なくとも１個の突然変異は遺伝子のコードまたは調節領域におけるものであることができる。
【００１５】
上記組成物は、ベクター組成物であって、ここで、ベクターが転写体の転写を制御する調節配列に作動可能に連結したＲＮＡ転写体をコードし、転写体が内在遺伝子の発現を特異的に減少させまたは阻害する二本鎖ＲＮＡ分子を組織において形成することができる、組成物であることができる。ベクターは、ウイルスベクター、またはプラスミド、コスミドまたはバクテリオファージベクターであることができる。調節配列は、プロモーター皮膚選択的プロモーターまたは腫瘍選択的プロモーターのような組織選択的プロモーターを含んでなることができる。プロモーターは、ＣＭＶ、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭＰＳＶ  ＬＴＲ、ＳＶ４  ＡＦＰ、ＡＬＡ、ＯＣおよびケラチン特異的プロモーターからなる群から選択することができる。
【００１６】
これらの方法のいずれかにおいて、内在遺伝子は、発癌遺伝子、増殖因子遺伝子、脈管形成因子遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ遺伝子、タンパク質チロシンキナーゼ遺伝子、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ遺伝子、タンパク質チロシンホスファターゼ遺伝子、受容体遺伝子、マトリックスタンパク質遺伝子、サイトカイン遺伝子、増殖ホルモン遺伝子、および転写因子遺伝子からなる群から選択することができる。遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、およびＶＥＧＦ２０６からなる群から選択することができる。
【００１７】
電気パルスの適用を含む方法において、パルスは、組織に約１０〜約２０分間加えることができる少なくとも５０Ｖの矩形波を含んでなることができる。パルスは、単極性、二極性または多極性であることができる。パルスは、組織に約１０〜約２０分間加えることができる１２０Ｖの指数関数的に減衰するパルスを含んでなることができる。これらの方法のそれぞれにおいて、電気パルスは、カリパス電極、メアンダー電極、針電極、ミクロ針アレイ電極、ミクロパッチ電極、リング電極、およびそれらの組合せからなる群から選択される電極を介して加えることができる。カリパス電極は、面積が約１ｃｍ２であることができる。カリパス電極は、厚みが約１ｍｍ〜約６ｍｍの皮膚の襞に加えることができる。
【００１８】
本発明の他の目的、特徴および利点は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示しているが、本発明の精神および範囲内での様々な変更や修飾はこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、単なる例示として示すものであることを理解すべきである。
【発明の具体的説明】
【００１９】
イン・ビボにおける効率的なＲＮＡｉ送達の方法を提供する。一つの態様によれば、ＲＮＡｉを、患者、例えばヒトまたは他の動物にパルス電場（電気穿孔）の使用によって局所的および全身的に送達する。この方法は、（１）総ての形態のＲＮＡｉ、例えばｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡデュープレックス、（２）総ての形態のＲＮＡｉペイロード、例えば合成、イン・ビトロで転写したおよびベクター発現したＲＮＡｉ、および（３）電気穿孔に利用できる総ての種類の組織および臓器と共に用いることができる。他の方法としては、ＲＮＡｉをポリマーキャリヤーを用いておよび静脈内（ＩＶ）送達によって送達する。
【００２０】
本発明はまた、ＲＮＡｉの送達に用いる媒質、効果的送達に選択された経路、およびイン・ビボでの電気穿孔に用いるのに適したパラメーターを提供する。本発明による方法を用いて、その相当するＲＮＡｉと同時送達されるレポーター遺伝子のダウンレギュレーションを行った。また、これらの方法を良好に用い、相当するＲＮＡｉの異なるペイロード（payload）形態の送達後に、例えばＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ２などの脈管形成因子の発現のダウンレギュレーションによって抗腫瘍効力を示した。
【００２１】
本発明者らは、動物疾患モデルにおける様々な形態のＲＮＡｉ、例えば小さな干渉性ＲＮＡ（２１−２３ｎｔ）および二本鎖ＲＮＡ（約７００ｂｐ）のある種の特性を同定した。本発明は、イン・ビボにおけるＲＮＡｉ効果を達成し、機能的ゲノム研究および核酸治療における様々な応用への極めて大きな可能性を保持する強力な手段を提供する。
【００２２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用は、細胞培養物、およびキイロショウジョウバエ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびミノカサゴ（zebrafish）のようなモデル生物において速やかに発展してきた。ＲＮＡｉの研究によって、長いｄｓＲＮＡが細胞性リボヌクレアーゼIIIであるＤｉｃｅｒによって加工され、短い干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれ、配列特異的ｍＲＮＡ分解を媒介する３’−オーバーハングを有する約２１ｎｔのデュープレックスを生成することを見出した（５）。ＲＮＡｉの機構に関する理解およびその急速に拡大する用途は、生物医学における過去１０年間の主要な飛躍的進歩を示している。特異的遺伝子の発現を干渉するためのｓｉＲＮＡデュープレックスの使用には、ターゲット入手可能性の知識、ｓｉＲＮＡのターゲット細胞への効果的送達、および幾つかの生物学的応用にあっては細胞におけるｓｉＲＮＡの長期活性を必要とする。
【００２３】
機能的ゲノム手段としてのｓｉＲＮＡに関する文献が急速に増えるのと共に、新規療法としてｓｉＲＮＡ分子を使用することに関心がもたれてきている。良好な治療用途は、最適化した局所的および全身的送達方法の良好な開発によって変化する。ｓｉＲＮＡの治療薬としての使用の利点は、その特異性（３，４）、安定性（１８）および作用機序（５，６）による。
【００２４】
癌において、腫瘍形成過程は、腫瘍遺伝子、脈管形成因子、増殖因子、および突然変異体腫瘍抑制因子の異常な過剰発現の結果であると考えられるが、他のタンパク質の従位発現（under-expression）も重要な役割を果たしている。増大する証拠によって、ｓｉＲＮＡデュープレックスがイン・ビトロおよびイン・ビボのいずれにおいても腫瘍形成遺伝子を「ノックダウン」することができ、重要な抗腫瘍効果を生じるという概念は支持されている（６）。本発明者らは、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞および１４８３細胞で誘発された異種移植腫瘍モデルにおけるヒトＶＥＧＦの実質的ノックダウンにより４０−８０％の腫瘍増殖阻害が達成されることを明らかにした。ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡによって誘発される抗脈管形成効果は腫瘍の微小脈管構造を変更し、腫瘍細胞アポトーシスを活性化し、他方において細胞傷害性化学療法薬の効力も高めることが予想される。しかしながら、抗脈管形成薬および化学療法薬の顕著に向上した抗腫瘍効力を達成するには、極めて効果的な送達方法により高濃度の薬剤が局所腫瘍組織に蓄積するようにすることが必要である。
【００２５】
本発明者らは、以前に、腫瘍疾患を制御するターゲットを決定し従って抗腫瘍薬発見を正当化する、薬剤ターゲットの確認方法を開示している（ＰＣＴ／ＵＳ０２／３１５５４参照）。この方法は、動物腫瘍モデルにおけるトランスジーン過剰発現により直接ターゲットを確認し、疾患制御を欠くターゲットを除去する。この方法では、タンパク質生成、抗体、および／またはトランスジェニック動物の必要性が減少し、ターゲットが実際に疾患を制御する明瞭かつ明確な証拠が提供される。さらに、この方法は、細胞培養のみに依存しかつ疾患病理を生じる複数の種類の細胞の複雑な相互作用を外す方法では失われることがある重要な情報を提供する。
【００２６】
本発明者らはまた、動物腫瘍モデルへの高処理量送達に適する遺伝子送達技術を報告した。ＷＯ０１／４７４９６号明細書を参照されたい。また、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。これらの方法により、プラスミドを腫瘍へ直接投与し、「金標準」ヌクレオチド送達試薬と比較して効率を有意に増加（例えば、７倍）させることができる。従って、これらの方法は、強力な腫瘍発現および腫瘍における候補ターゲットタンパク質の活性を提供する。
【００２７】
このプラットフォームは、腫瘍組織において従位発現した遺伝子を確認するための強力な手段である。しかしながら、腫瘍組織で過剰発現する遺伝子を確認するため、遺伝子サイレンシングを達成する方法が極めて望まれる。最近、二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象によって遺伝子特異的サイレンシングを誘発することが示された。ＲＮＡｉの機構は完全には解明されていないが、初期の結果はこのＲＮＡｉ効果が哺乳類細胞を含む様々な種類の細胞においてイン・ビトロにて達成されされることを示唆した。
【００２８】
ターゲットｍＲＮＡに対してターゲット設定した二本鎖ＲＮＡが、そのターゲットを分解し、これによって相当する遺伝子のサイレンシングを引き起こす。大きな二本鎖ＲＮＡは、酵素Ｄｉｃｅｒを伴うＲＮアーゼIII様活性によって長さが２１−２３ヌクレオチドの小さめの断片に開裂される。ｓｉＲＮＡ（小さな干渉性ＲＮＡ）として知られるこれらの短めの断片は、ｍＲＮＡの開裂を媒介すると考えられる。ＲＮＡｉ機構による遺伝子ダウンレギュレーションは近年Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓや他の下等生物で研究されてきたが、培養されている哺乳類細胞でのその有効性がつい最近示されたばかりである。ＲＮＡｉ効果は、最近ホタルルシフェラーゼ遺伝子レポーター系を用いてマウスで示された（５７）。
【００２９】
イン・ビボにおける遺伝子機能確認のため、およびヒト疾患治療のための核酸治療の潜在的臨床応用のためのＲＮＡｉプラットフォームを開発するため、本発明者らは、腫瘍担持マウスモデルにて幾つかのイン・ビボ研究を行った。これらの実験において、腫瘍関連リガンド（ヒトＶＥＧＦ）または受容体（マウスＶＥＧＦＲ２）をターゲッティングするｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを、異種移植したヒトＭＣＦ−７由来の腫瘍またはヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を担持するヌードマウスに腫瘍内送達した。本発明者らは、ＲＮＡｉがイン・ビボにおける腫瘍細胞において、ターゲット遺伝子を効果的にサイレンシングすることができ、その結果、腫瘍増殖が阻害されることを初めて示すことができた。
【００３０】
このように一般的に記載された本発明は、下記の例を参照することによって一層容易に理解されるが、これらの例は例示のために提供したものであり、本発明を制限しようとするものではない。
【００３１】
例１ 同時トランスフェクションしたｄｓＲＮＡによって媒介された異種色腫瘍におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子サイレンシング
干渉性ＲＮＡがマウス腫瘍モデルにおける遺伝子発現を阻害するかどうかを検討するため、直接腫瘍内注射に続いて電気穿孔を用い、ヌードマウスに異種移植したヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍に、裸にしたｄｓＲＮＡおよびルシフェラーゼ発現プラスミドＤＮＡを同時送達した。簡単に説明すれば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子由来の７００ｂｐ  ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、Ｔ７プロモーター配列をＰＣＲ反応中にＤＮＡ断片の両端に加えた。次に、このＤＮＡ断片を、イン・ビトロにおける転写のＤＮＡ鋳型として用いた。イン・ビトロ転写は、New England BioLab製のｄｓＲＮＡ生成キットを用いて製造業者の指示書に従って行った。ルシフェラーゼ発現プラスミドｐＣＩＬｕｃ  ２μｇと、ルシフェラーゼ遺伝子またはＬａｃＺ遺伝子由来のｄｓＲＮＡ  ０．５、２および５μｇとを、３０μｌの生理食塩水の最終容積中に混合した。食塩水溶液中のＤＮＡ／ｄｓＲＮＡ混合物を、Ｎｃｒ  Ｎｕ／Ｎｕマウスに異種移植したヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍に精密注射器(Stepper,Tridake)で直接投与した。
【００３２】
投与直後に、パルス電場の手法を用いた（図１）。伝導性ゲルの薄層(KY Jelly)を腫瘍表面に加え、プレート電極および腫瘍を良好に接触させ、電気穿孔装置(BTX ECM830, San Diego)を用いて腫瘍のそれぞれの側に置いた２枚の外部プレート電極を介して電気パルスを送った。電気穿孔のパラメーターは、下記の通りであった。電圧対電極距離比（電場強度）は２００−Ｖ／ｃｍであり、それぞれのパルスの時間は２０ｍｓであり、２つのパルスの時間間隔は１秒（１Ｈｚ）であった。パルスの数は６であった。ＤＮＡを投与して２４時間後に、動物を屠殺した後に腫瘍を摘出した。それぞれの腫瘍を、 Fastprep (Q-BIOgene)を速度４で用い、ホモジナイジング管(Lysing Matrix D, Q-BIOgene)中にて、１ｘリーシス緩衝液(Promega)８００μｌ中で４℃で４０秒間ホモジナイズした。ホモジェネートを、氷上にて３０分間インキュベーションした後、１４，０００ｒｐｍにて２分間遠心分離した。上清を新しい試験管に移し、１０μｌをルシフェラーゼアッセイキット(Promega)およびルミノメーター(Monolight 2010, Analytic Luminescence Lab.)を用いるルシフェラーゼ活性分析に用いた。
【００３３】
図２に示されるように、同時送達したルシフェラーゼ遺伝子由来のｄｓＲＮＡは、異種移植した腫瘍におけるルシフェラーゼ発現をサイレンシングすることができた。同時送達したｐＣＩＬｕｃプラスミドＤＮＡ  ２μｇに対して有意な遺伝子サイレンシングを行うには０．５μｇ程度のｄｓＲＮＡで十分であった。非特異的ｄｓＲＮＡ干渉効果は、ＬａｃＺ遺伝子由来のｄｓＲＮＡ  ５μｇをｐＣＩＬｕｃプラスミドＤＮＡ  ２μｇと共に同時送達したときに見られた。非特異的効果は、これより低用量のｄｓＲＮＡ（０．５μｇおよび２μｇ）では見られなかった。これは、成熟マウス異種移植腫瘍における、ｄｓＲＮＡ依存性の特異的遺伝子サイレンシングの最初の観察である。
【００３４】
例２ ＲＮＡｉ介在性のヒトＶＥＧＦ遺伝子サイレンシングは、マウスにおけるヒトＭＣＦ−７由来の腫瘍増殖を阻害する
イン・ビボ研究を行うことにより、導入されたｓｉＲＮＡが同時送達したレポーター遺伝子をサイレンシングするだけでなく、内在遺伝子、例えばＶＥＧＦの発現のダウンレギュレーションすることもできることを明らかにした。ターゲット遺伝子が腫瘍制御遺伝子であるときには、遺伝子のダウンレギュレーションによって治療効力、すなわち腫瘍増殖の阻害が引き起こされる。ヒトＶＥＧＦは脈管形成および内皮細胞増殖を誘導し、脈管形成の調節に重要な役割を演じている。ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６などのヒトＶＥＧＦの数種類のスプライス変異体があり、それぞれは特異的エキソン付加物を含んでなる。ＶＥＧＦ１６５が最も有力なタンパク質であるが、ＶＥＧＦ１２１の転写体がさらに多量に存在することがある。ＶＥＧＦ１６５は、４５ｋＤａのホモ二量体として分泌されるヘパリン結合糖タンパク質である。通常は内皮細胞自身を除くほとんどの種類の細胞が、ＶＥＧＦを分泌する。最初に発見されたＶＥＧＦであるＶＥＧＦ１６５は脈管透過性を増加するので、これは脈管透過性因子としても知られている。さらに、ＶＥＧＦは、部分的には内皮細胞における酸化窒素シンターゼの刺激によって血管拡張を引き起こす。ＶＥＧＦは細胞移動を刺激し、アポトーシスを阻害することもできる。
【００３５】
２種類の動物モデルを用いて比較研究を行った。第一の腫瘍モデルはＭＣＦ−７胸部腫瘍系を用いて確立し、第二の腫瘍モデルはＭＣＦ−７由来の腫瘍細胞系であるＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５を用いて確立した。任意の種類のＲＮＡｉを投与する前に、ＭＣＦ−７自身によって誘導されたものよりもＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５によって誘導された腫瘍について、より侵略的腫瘍増殖を観察した。この挙動は既に報告されており、脈管形成促進活性による腫瘍増殖エンハンサーとしてのＶＥＧＦ１６５の役割を表している。ＶＥＧＦ特異的ダウンレギュレーションを行うために、１０μｇのｈＶＥＧＦ遺伝子由来のｓｉＲＮＡ（２１ｎｔ）またはＬａｃＺ遺伝子由来のｓｉＲＮＡを、ヌードマウスにおいてヒトＶＥＧＦ１６５を過剰発現する異種移植ＭＣＦ−７ＮＥＧＦ１６５腫瘍に直接投与した。２種類のｓｉＲＮＡ（２１ｎｔ）配列は、ヒトＶＥＧＦ１６５遺伝子をターゲットするようにデザインした。ＶＥＧＦＲＮＡｉＡ配は5'-ucgagacccugguggacauuu-3'であり、ＶＥＧＦＲＮＡｉＢ配列は5'-ggccagcacauaggagagauu-3'である。いずれのｓｉＲＮＡも、両端に２個のＵＵオーバーハングを有する二本鎖であった。腫瘍内投与のため、２種類のｓｉＲＮＡのそれぞれ５μｇにより、ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ  １０μｇを作製した。さらに、同量のｄｓＲＮＡ（１０μｇ）ターゲッティングＶＥＧＦ１６５遺伝子も、同じ送達方法によって導入した。上記のようにｓｉＲＮＡを投与した直後、電気パルスを腫瘍に直接加えた。第二のｓｉＲＮＡ処理は、最初の投与の７日後に行った。腫瘍容積を、ｈＶＥＧＦ遺伝子サイレンシングの指標として測定した。
【００３６】
図３に示されるように、非特異的ＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡを投与したＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５によって誘導される腫瘍は、ＭＣＦ−７によって誘導される腫瘍より一層速やかに増殖した。ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡおよびｄｓＲＮＡの投与は、明らかに腫瘍増殖阻害効果を示した。９日目および１６日目の２回のＲＮＡｉの投与により、腫瘍増殖がイン・ビボにて阻害された。興味深いことには、ＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡおよびｄｓＲＮＡを投与することによって、異なる阻害パターンが得られた。ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡを投与したところ、遅延効果が示され、これは２３日後に一層強い阻害を示した。一方、ＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡの投与により、最初の処理の後であっても一層早期の阻害が示された（図４）。これは、ｈＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡｓおよびｈＶＥＧＦ  ｄｓＲＮＡが治療した腫瘍におけるｈＶＥＧＦ遺伝子を特異的にサイレンシングし、従って、抗脈管形成機構により腫瘍増殖を遅らせることを示した。
【００３７】
例３：ＲＮＡｉ介在性マウスＶＥＧＦＲ２遺伝子サイレンシングによりマウスにおけるヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍増殖が阻害される
内在性腫瘍制御遺伝子をターゲッティングすることによる、腫瘍増殖に及ぼすＲＮＡｉ介在性遺伝子サイレンシングの効力を例示するため、イン・ビボ研究を行い、ＭＣＦ−７誘導体腫瘍担持ヌードマウスにおけるマウスＶＥＧＦＲ２遺伝子をサイレンシングした。２種類のｓｉＲＮＡｉは、マウスＶＥＧＦＲ２遺伝子をターゲッティングするようにデザインした。ＶＥＧＦＲ２ＲＮＡｉＡ配列は5'-gcucagcacacagaaagacuu-3'であり、ＶＧＦＲ２ＲＮＡｉＢ配列は5'-ugcggcgguggugacaguauu-3'である。いずれのｓｉＲＮＡも、両端に２個のＵＵオーバーハングを有する二本鎖であった。それぞれのｓｉＲＮＡ  ５μｇから、それぞれの送達について１０μｇを作製した。ｍＶＥＧＦＲ２もしくはＬａｃＺ遺伝子由来のｓｉＲＮＡｉ  １０μｇまたはｐＣＩＬｕｃプラスミドＤＮＡ  １０μｇを、ヌードマウスにおける異種移植したヒトＭＣＦ−７由来の腫瘍に直接投与した。上記のようにｓｉＲＮＡ／ＤＮＡを投与した直後に、電気パルスを腫瘍に直接加えた。第二のｓｉＲＮＡ／ＤＮＡの処理は、最初の投与の７日後に行った。腫瘍容積を、ｍＶＥＧＦＲ２遺伝子サイレンシングの指標として測定した。図５に示されるように、ｍＶＥＧＦＲ２遺伝子由来のｓｉＲＮＡを投与した腫瘍は、ｐＣＩＬｕｃプラスミドＤＮＡまたはＬａｃＺ遺伝子由来のｓｉＲＮＡを投与した腫瘍と比較して有意に遅く増殖した。ＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡ投与は腫瘍増殖を阻害せず、従って、ｍＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡが治療した腫瘍におけるｍＶＥＧＦＲ２遺伝子を特異的にサイレンシングし、これにより腫瘍増殖速度を遅らせることを示した。
【００３８】
ターゲッティング腫瘍制御遺伝子による腫瘍増殖に影響を与える、ＲＮＡｉ介在性の遺伝子サイレンシングの効力を更に例示するため、イン・ビボ研究をさらに行い、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍担持ヌードマウスにおけるマウスＶＥＧＦＲ２遺伝子をサイレンシングした。上記のｍＶＥＧＦＲ２由来のｓｉＲＮＡに加えて、マウスＶＥＧＦＲ２遺伝子由来のｄｓＲＮＡ（長さが７００ｎｔ）またはＬａｃＺ遺伝子由来のｓｉＲＮＡ  １０μｇを、ヌードマウスにおけるヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５を異種移植した腫瘍に直接投与した。上記のようにｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡを投与した直後に、電気パルスを腫瘍に加えた。第二のｄｓＲＮＡ／ｓｉＲＮＡｉ投与は、第一の投与の３日後に行った。マウスＶＥＧＦＲ２を特異的にターゲッティングするＤＮＡザイム(DNAzyme)１０μｇを、ｍＶＥＧＦＲ２遺伝子のダウンレギュレーションの正のコントロールとして用いた。腫瘍容積を、ｍＶＥＧＦＲ２遺伝子サイレンシングの指標として測定した。
【００３９】
図６に示されるように、ｍＶＥＧＦＲ２遺伝子由来のｄｓＲＮＡを投与した腫瘍は、ＬａｃＺ遺伝子由来のｓｉＲＮＡを投与した腫瘍と比較して有意に遅く増殖した。さらにまた、ｍＶＥＧＦＲ２遺伝子由来のｄｓＲＮＡを投与した腫瘍はｍＶＥＧＦＲ２  ＤＮＡザイムを投与した腫瘍と比較して有意に遅く増殖した。一方、ｍＶＥＧＦＲ２由来のｓｉＲＮＡを投与した腫瘍はｍＶＥＧＦＲ２  ＤＮＡザイムを投与した腫瘍と比較できる速度で増殖したが、それでもＬａｃＺ遺伝子由来のｓｉＲＮＡを投与した腫瘍より有意に遅かった（図６）。ＬａｃＺ  ｓｉＲＮＡ投与は腫瘍増殖を阻害しないので、ｍＶＥＧＦＲ２  ｄｓＲＮＡおよびｍＶＥＧＦＲ２  ｓｉＲＮＡが、治療を行ったＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍におけるｍＶＥＧＦＲ２遺伝子を特異的にサイレンシングし、従って腫瘍増殖速度を低下させるというのが本発明者らの結論である。腫瘍組織におけるｍＶＥＧＦＲ２遺伝子がｍＶＥＧＦＲ２遺伝子由来のｄｓＲＮＡによって実際に特異的にサイレンシングすることを明らかにするため、さらに生化学アッセイが行われている。
【００４０】
例４：ＰｏｌｙＴｒａｎ介在性ＲＮＡｉ送達により、マウスにおけるヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍増殖が阻害される
ターゲットに対するＲＮＡｉは、図１６の結果によって示されるようにポリマー介在性送達を用いて良好に送達することができる。ターゲットＩＣＴ１００３に対して指定されたＲＮＡｉを、ＰｏｌｙＴｒａｎ試薬（ヒスチジン−リシンコポリマー）を用いて腫瘍細胞に送達した。簡単に説明すれば、ＷＯ０１／４７４９６号明細書（この文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）に記載の方法および試薬を用いて、ＲＮＡｉを上記腫瘍モデルに送達した。ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡをコントロールとして用いた。図１６に示されるように、ＩＣＴ１００３に対して指定されたＲＮＡｉは、コントロールと比較して腫瘍増殖を阻害した。図１６に示される結果は、構造［（ＨＫ）４ＫＧＫ（ＨＫ）４］４Ｋ３を有する分岐試薬ＨＫ４ｂ（ＷＯ０１／４７４９６号明細書に記載）を用いて得た。当業者であれば、他のＨＫコポリマーを用いることができ、当該技術分野で知られている他のカチオン性ポリマーを用いることもできることを理解するであろう。
【００４１】
例５：ターゲット設定した合成ベクターを用いるＲＮＡｉの全身送達
ＷＯ０１／４９３２４号明細書（この明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）に記載のタイプである、ターゲット設定した合成ベクターを用いて、ＲＮＡｉの全身送達を行うことができる。簡単に説明すれば、ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ（ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）合成ベクターを、例えばＷＯ０１／４９３２４号明細書の例５３および５６に記載されている通りに調製した。このベクターを用いて、ＲＮＡｉを静脈内注射によって全身に送達した。結果は図２０〜２２に示されており、これらの図はこのターゲット設定した合成ベクター法を用いて、抗−ＶＥＧＦ  ＲＮＡｉ分子を良好に送達することができることを示している。当業者であれば、当該技術分野で知られている他のターゲット設定した合成ベクター分子を用いることができることを理解されるであろう。例えば、ベクターは、ＲＮＡｉと少なくとも１つの複合体形成試薬とを含んでなるコア複合体からなる内殻を有することができる。ベクターはまた、フソゲニック（fusogenic）残基を含むことができ、これはコア複合体に固定されている殻を含んでなることができ、またはコア複合体へ直接組込むこともできる。ベクターは、ベクターを安定化しかつタンパク質および細胞への非特異的結合を減少させる外殻残基をさらに有することができる。外殻残基は親水性ポリマーを含んでなることができ、および／またはフソゲニック残基に固定することもできる。外殻残基を、コア複合体に固定することができる。ベクターは、ターゲット組織および細胞個体群へのベクターの結合を高めるターゲッティング残基を含むことができる。適当なターゲッティング残基は当該技術分野で知られており、ＷＯ０１／４９３２４号明細書に詳細に記載されている。
【００４２】
他のＲＮＡｉ送達の方法
ある種の応用によれば、ＲＮＡｉを、電気穿孔を行いまたは行わず、「裸の」試薬として直接投与することができる。これを用いて、例えば腫瘍組織への直接投与または関節への直接投与によりＲＮＡｉ分子およびＲＮＡｉ分子をコードするベクターを送達することができる。ＲＮＡｉは、例えば食塩溶液または緩衝食塩溶液のような適当なキャリヤーに含まれていてもよい。
【００４３】
ターゲット確認
薬剤ターゲット確認の究極目標は、候補のターゲットが実際に疾患を制御することを明らかにすることである。疾患制御ターゲットは、薬剤発見を正当化する高い価値のあるターゲットである。薬剤開発の目標は、疾患を効果的に治療制御するための重要な経路、およびその経路のキーとなる制御要素を選択的にターゲット設定する物質である。このような重要な経路および要素を確認するには、個々の候補ターゲットを加えまたは引くことによって疾患を制御すること、すなわち病理の明らかな増加または減少を生じることを明らかにする必要がある。イン・ビトロにおける細胞に基づく方法では、可能性のあるターゲットの同定および選択を促進するのに有用な情報が提供されている。しかしながら、疾患に関連したイン・ビトロの細胞モデルを制御するターゲットの能力は、ターゲットが実際に疾患過程、すなわち疾患の病理を生じる複数の種類の細胞の複雑な相互作用を制御することを証明にするには十分でないことが多い。ターゲットによる疾患制御の明確な実証は、真の疾患モデルにおけるターゲットの研究によってのみ得ることができる。
【００４４】
ターゲット発見の過程はゲノム法によって大幅に加速されたが、確認は隘路に入ったままである。第一世代のゲノム法は、確認工程で積み上げられた候補ターゲットの大きなプールを生成した。多くの方法が現在用いられて、これらの遺伝子ターゲットの機能が研究され、疾患過程におけるそれらの役割が確認されている。これらの方法の多くは効率的かつ高処理量であるという利点を有するが、制御の役割を決定するよりも疾患過程との相間または関連性の確率においてのみ成功することが多い。さらに新しい遺伝子ノックダウンおよび前進または逆ゲノム法が有用であることは明らかになったが、これらはその阻害または突然変異体が疾患の役割を有する遺伝子を同定したが、遺伝子の過剰発現から潜在的な重要な情報を逃している。さらに、それらは主としてイン・ビトロで細胞に基づく表現型を用いており、腫瘍脈管形成のようなほとんどの疾患の複雑な多細胞機構を反映せず、従って隣接細胞経路において重要なターゲットを見落とす危険を冒し、または完全な生物学的文脈なしでは不完全な疾患の関連性を提供する。
【００４５】
明確なターゲットの迅速確認
本発明による方法を用いて、癌関連薬剤ターゲットを確認することができる。この方法は、腫瘍組織における（複数の）内在遺伝子のサイレンシングによって動物腫瘍モデルにおいて直接ターゲットを確認し、遺伝子過剰発現を伴う方法と連繋して用いることができる。ＰＣＴ／ＵＳ０２／３１５５４号明細書を参照されたい。これらの方法により、遺伝子クローニングおよびシークエンシング、タンパク質および抗体またはトランスジェニック動物の生成のような、費用がかかりかつ遅い明確な確認工程の必要性が減少する。これらの２つの方法を組み合わせることによって、その過程が極めて促進され、極めて重要なことには弱いターゲットが速やかに除去される。さらに、この方法によって得られる結果により、ターゲットが実際に疾患を制御していることの明らかかつ明確な証拠が提供され、この重要な確認は薬剤発見の費用のかかる工程でも行う必要があったのである。この方法を用いて、細胞培養、モデル生物、トランスジェニック動物などから生成したような任意の候補ターゲットを確認することができる。
【００４６】
ターゲット発見：予備確認で見落としたターゲットの捕捉
イン・ビトロまたは疾患関連法がターゲット発見および確認における第一の「フィルター」として用いられるときに、不運にも、多くの重要な疾患制御ターゲットが失われることがあることも考えられる。多くの疾患制御ターゲットは、完全な疾患モデルを有する情況でのみ見出すことができる。例えば、腫瘍の脈管形成を制御するターゲットは、腫瘍と血管との結合においてのみ見出される。腫瘍の場合には、ある種の重要なターゲットは、腫瘍と周囲の組織との集合体を含むイン・ビボにおける生物学的系を検討することによってのみ見出すことができる。
【００４７】
高処理量ターゲット発見法
本発明者らはまた、疾患制御ターゲットを見出すという課題に対する解決法を提案した。この解決法とは、より高処理量の操作において、より大きな遺伝子ターゲットセットをスクリーニングすることに基本的方法を適用することによって、基本的方法をスケールアップすることである。この方法を動物腫瘍モデルにおける複数の候補遺伝子の処理にあわせて調整することにより、この方法は多くの場合において予備的機能確認法を省く機会を提供しうる。
【００４８】
腫瘍ターゲット除去
本発明による方法によれば、単独でまたはＰＣＴ／ＵＳ０２／３１５５４号明細書に記載の方法と組み合わせ、腫瘍増殖の制御能について候補ターゲットを速やかに試験することができる。腫瘍増殖の制御がごく弱いかまたは無視し得るほどである候補は、腫瘍増殖について強い効果を有するものの方を選択して、考察から除外することができる。これらの腫瘍ターゲット識別法により、ターゲットは、腫瘍増殖を高めるもの、腫瘍増殖にほとんど効果がないもの、および腫瘍増殖を阻害するものの３種類に速やかに区別される。
【００４９】
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【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】動物疾患モデルにおける電気穿孔法を介したＲＮＡｉ送達を示す。工程Ｉ：食塩水溶液を用いた宿主組織における二本鎖ＲＮＡを発現する裸のプラスミドＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（大きな断片−７００ｂｐ、または２１−２３ｎｔオリゴ）、および両者の、食塩水溶液を用いた宿主組織における局部送達；工程II：適当な装置およびプローブによるパルス電場処理；工程III：ターゲット設定したタンパク質のＲＮＡｉ阻害の効率、および治療効果を検出するための生物学的読出し。
【図２】異種移植腫瘍モデルにおけるルシフェラーゼ発現のＲＮＡｉ依存性抑制を示す。ルシフェラーゼ発現ベクター(pCI-Luc)は、直接３種類の濃度の特異的ｄｓＲＮＡ(Luc-dsRNA)および非特異的ｄｓＲＮＡ(LacZ-dsRNA)とともに、腫瘍内へ同時送達した。０．５μｇにおいて、ルシフェラーゼ発現は、特異的ｄｓＲＮＡを発現するベクターによって有意に阻害されたが、ＬａｃＺ−ｄｓＲＮＡでは阻害されなかった。特異的および非特異的ｄｓＲＮＡの濃度が５μｇの用量に達すると、阻害は非特異的になる。
【図３】電気穿孔法を介したＶＥＧＦに特異的なＲＮＡｉ送達による、脈管形成因子ＶＥＧＦのダウンレギュレーションによる腫瘍増殖の阻害を示す。ＭＣＦ７をＶＥＧＦ１６５とともに恒久的に形質導入すると、極めて侵略的な腫瘍系になる。１０μｇＲＮＡｉ分子を用いて２回電気穿孔を行ったところ、それぞれ腫瘍増殖を遅らせた。
【図４】ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡを用いた、異なる阻害動態を示す。同じパラメーターの電気穿孔、同じ送達経路、および同量の各形態のＲＮＡｉを用いたが、腫瘍増殖の阻害は異なっていた。ｄｓＲＮＡは初期の強い効果を示したが、ｓｉＲＮＡは遅延効果を示した。ＬａｃＺＲＮＡｉと比較して、ＶＥＧＦに特異的なｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡはいずれも配列特異的阻害を明らかに示した。
【図５】腫瘍増殖におけるＶＥＧＦＲ２特異的阻害を示す。マウスＶＥＧＦＲ２遺伝子は、腫瘍脈管形成および腫瘍細胞とのストロマクロストーキング（stromal Cross-talking）に枢要な役割を演じていると考えられている。ｍＶＥＧＦＲ２特異的ＲＮＡｉを腫瘍内へ２回送達した後に電気穿孔を行ったところ、腫瘍増殖はＬｕｃ発現プラスミドおよび非特異的ＲＮＡｉの送達と比較して明らかに遅延した。
【図６】ｓｉＲＮＡデュープレックス（傾向標識）を電気穿孔増進により腫瘍内に送達すると、腫瘍中に均一に分布した。この結果は、ｓｉＲＮＡ送達が通常は腫瘍中の小さな部分のみに局在しているプラスミドとは異なることを示していた。
【図７】ＬａｃＺを内在発現するように遺伝子工学処理を行ったＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５細胞によって形成された腫瘍中への、ＬａｃＺ特異的ｓｉＲＮＡ送達を示す。結果は、ｓｉＲＮＡ２０μｇによってＬａｃＺ−ｓｉＲＮＡの送達後２４時間にβ−Ｇａｌ発現が＞７０％減少したことを示している。
【図８】ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡおよびＬａｃＺ−ｓｉＲＮＡを用いて処理した主要組織の免疫組織学的染色を示す。Ｈ＆Ｅ染色は、ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡを投与した腫瘍の画像がＬａｃＺ−ｓｉＲＮＡを投与した腫瘍と有意に異なることを示した（Ａ−Ｂ）。腫瘍にＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡを投与したときには、ＶＥＧＦ染色（Ｃ）は喪失した。アポトーシス活性は、ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡを投与した腫瘍において有意にアップレギュレーションした。
【図９】イン・ビトロにおいて、ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡがｍＲＮＡレベルでＶＥＧＦ発現をノックダウンすること（左パネル）により、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌増殖が阻害された。
【図１０】ルシフェラーゼ発現プラスミドおよびＬｕｃ−ｓｉＲＮＡのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍への同時送達によって、ルシフェラーゼ発現の有意なノックダウンが起こることが示された。
【図１１】ＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡを腫瘍モデルに送達したところ、腫瘍組織におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルがダウンレギュレーションした。
【図１２】ＩＣＴ１０３１またはＡｐｒｉｌ遺伝子発現においてＲＮＡｉノックダウンを行ったところ、腫瘍増殖は阻害された。細胞に基づくアッセイでは、アポトーシス活性の有意な変化を示さなかった。
【図１３】ＩＣＴ１０２７またはＧＲＢ２遺伝子発現においてＲＮＡｉノックダウンを行ったところ、腫瘍増殖は阻害され、細胞アポトーシス活性は有意に増加した。
【図１４】ＩＣＴ１０２４またはＥＧＦ−ＡＰ遺伝子発現においてＲＮＡｉノックダウンを行ったところ、腫瘍増殖は阻害され、細胞アポトーシス活性有意に増加した。
【図１５】ＩＣＴ１０３０遺伝子発現においてＲＮＡｉノックダウンを行ったところ、腫瘍増殖が促進された。
【図１６】ＰｏｌｙＴｒａｎ（ＨＫポリマー）キャリヤーを介したＩＣＴ１００３−ｓｉＲＮＡ送達の結果、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡにて処理した腫瘍と比較して、腫瘍が阻害された。
【図１７】経口気管送達と呼ばれる方法によりマウス気管へルシフェラーゼ発現プラスミドおよびｌｕｃ−ｓｉＲＮＡを同時送達した結果、マウス肺においてｓｉＲＮＡを介したルシフェラーゼ阻害を生じた。様々な試料のルシフェラーゼ活性は、最初に肺を摘出した後、ルミノメーターで試験することによって測定した。
【図１８】電気穿孔によりマウス筋肉中へルシフェラーゼ発現プラスミドおよびｌｕｃ−ｓｉＲＮＡを同時送達した結果、マウス脚筋肉におけるｓｉＲＮＡを介したルシフェラーゼ阻害を生じた。
【図１９】電気穿孔によってマウス関節中へルシフェラーゼ発現プラスミドおよびｌｕｃ−ｓｉＲＮＡを同時送達した結果、マウス脚関節においてｓｉＲＮＡを介したルシフェラーゼ阻害を生じた。
【図２０】ＩＶ注射によるｓｉＲＮＡ送達の全身的方法では、腫瘍ターゲッティング効果を示した。腫瘍組織には、二重円による印を付けてある。
【図２１】マウスＶＥＧＦａの使用を示す。ＩＶ全身送達によるｍＶＥＧＦＲ１およびｍＶＥＧＦＲ２特異的ｓｉＲＮＡデュープレックスは、目の前の新脈管構造部分を有意に減少させた。
【図２２】図２１と同じ方法を用いた場合、ＲＮＡｉ投与群における赤色新脈管構造の減少はコントロール群におけるより明らかに大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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