(57)【要約】本明細書ではII型トランスメンブランセリンプロテアーゼ10(MTSP10)ポリペプチドが提供される。これらのポリペプチドのチモーゲンおよび活性化型ならびに一本鎖および二本鎖型のプロテアーゼドメインも提供される。MTSP10の活性を調節する化合物を同定するためにこれらポリペプチドを用いる方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
II型膜型セリンプロテアーゼ10(MTSP14)のプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分もしくはそのドメインを含む、実質的に精製された一本鎖または二本鎖ポリペプチド。
【請求項２】
活性化二本鎖ポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
配列番号6で示されるアミノ酸配列と少なくとも60%、70%、80%または90%のアミノ酸配列同一性を含む配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号23で示されるアミノ酸配列と少なくとも60%、70%、80%または90%のアミノ酸配列同一性を含む配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号6または配列番号23で示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号5または配列番号23で示されるヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下で全長の少なくとも70%にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号5または配列番号23で示される配列を含むヌクレオチド配列のスプライス変異体であるヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドのMTSP10部分が本質的にMTSP10のプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分からなる、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
MTSP10がヒトポリペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項６】
本質的にMTSP10のプロテアーゼドメインまたはMTSP10のプロテアーゼドメインの触媒活性部分からなる、請求項１〜５のいずれかに記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項７】
配列番号6で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと約60%、70%、80%または90%を超える配列同一性を有し、プロテアーゼである、請求項１〜６のいずれかに記載の実質的に精製されたポリペプチド。
【請求項８】
プロテアーゼドメイン部分が、配列番号5で示されるヌクレオチド配列または少なくとも1つのそのドメインもしくはそのドメインの触媒活性部分を含む核酸分子と高ストリンジェンシー条件下で全長の少なくとも70%にわたってハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
ドメインがプロテアーゼドメインである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号6の残基1〜230を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項１１】
約50%までのアミノ酸が別のアミノ酸で置換され、かつ、
その結果生じるポリペプチドが非変異ポリペプチドの少なくとも1%、5%または10%の触媒活性を有する一本鎖または二本鎖ポリペプチドである突然変異タンパク質である、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
約10%までのアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
その結果生じるポリペプチドが一本鎖または二本鎖ポリペプチドであり、非変異ポリペプチドの少なくとも50%の触媒活性を有する、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
プロテアーゼドメイン中のシステインが別のアミノ酸で置換され、かつ、このシステインは本質的にプロテアーゼドメインからなるポリペプチドにおいては対合しないものである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
置換アミノ酸がセリンである、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１７】
(a)配列番号5のヌクレオチド1〜690で示されるか、または配列番号23で示されるヌクレオチド配列、またはタンパク質分解活性ポリペプチドをコードするその一部；
(b)配列番号5のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でその全長にわたって、またはその全長の少なくとも約70%にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；
(e)プロテアーゼドメイン、または配列番号5で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むその触媒活性部分をコードするヌクレオチド配列；および
(f)(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の縮重コドンを含むヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１１に記載の突然変異タンパク質ポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２０】
発現ベクターである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
真核ベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
作動可能なように連結されたヌクレオチド配列によりコードされるいずれかのポリペプチドの分泌を命令するヌクレオチド配列を含む、請求項２０または２１に記載のベクター。
【請求項２３】
ピキアベクターまたは大腸菌ベクターである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれかに記載のベクターを含む細胞。
【請求項２５】
原核細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
真核細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２７】
細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞の中から選択される、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２８】
哺乳類細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２９】
請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする内在遺伝子がその動物またはその原種の相同組換えまたは挿入突然変異誘発によって欠失または不活性化されている、組換え非ヒト動物。
【請求項３０】
MTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインを含むポリペプチドを産生する方法であって、
請求項２４〜２８のいずれかに記載の細胞を、コードされているポリペプチドを細胞に発現させる条件下で培養し、さらに
発現したポリペプチドを回収する
ことを含む、方法。
【請求項３１】
上記ポリペプチドが培地中へ分泌される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞がピキア細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
上記ポリペプチドが宿主細胞の細胞質で発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10のプロテアーゼドメインをコードする連続するヌクレオチド配列に相補的な少なくとも14個の連続するヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含む；または
請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10のプロテアーゼドメインをコードする連続するヌクレオチド配列に相補的な少なくとも16個の連続するヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含む；または
請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10のプロテアーゼドメインをコードする連続するヌクレオチド配列に相補的な少なくとも30個の連続するヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含む
、アンチセンス核酸分子。
【請求項３５】
配列番号5または22のヌクレオチド配列の相補物である連続するヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載のアンチセンス分子。
【請求項３６】
請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10をコードするヌクレオチド配列に由来する少なくとも約21個の連続するヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含む、二本鎖RNA(dsRNA)分子。
【請求項３７】
請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドの一本鎖型および／または二本鎖型プロテアーゼドメインと特異的に結合する抗体、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントもしくは誘導体(なお、この抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である)。
【請求項３８】
上記ポリペプチドの酵素活性を阻害する、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチド、および
上記ポリペプチドと直接またはリンカーを介して結合されたターゲッティングエージェント
を含むコンジュゲート。
【請求項４０】
上記ターゲッティングエージェントが、
コンジュゲートのアフィニティー単離または精製；
コンジュゲートの表面への結合；
コンジュゲートの検出；または
選択された組織または細胞へのターゲッティング送達
を可能とする、請求項３９に記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドの触媒活性を阻害する薬剤または処理；および
抗腫瘍および抗血管形成処理および薬剤から選択される別の処理または薬剤
を含む組合せ。
【請求項４２】
上記阻害剤ならびに抗腫瘍および／または抗血管形成剤が単一の医薬組成物として調剤されているか、または各々個別の医薬組成物として調剤されている、請求項４１に記載の組合せ。
【請求項４３】
上記阻害剤が抗体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖RNA(dsRNA)から選択される、請求項４１に記載の組合せ。
【請求項４４】
直接またはリンカーを介して結合された請求項１〜１５のいずれかに記載の2以上のポリペプチドを含む固相支持体。
【請求項４５】
上記ポリペプチドがアレイからなる、請求項４４に記載の支持体。
【請求項４６】
上記ポリペプチドが複数の異なるプロテアーゼドメインを含む、請求項４４に記載の支持体。
【請求項４７】
直接またはリンカーを介して結合された請求項１６〜１８のいずれかに記載の2以上の核酸分子またはそのオリゴヌクレオチド部分を含み、そのオリゴヌクレオチドが少なくとも16個のヌクレオチドを含む、固相支持体。
【請求項４８】
上記核酸分子がアレイからなる、請求項４７に記載の支持体。
【請求項４９】
上記核酸分子が異なるプロテアーゼドメインをコードする複数の分子を含む、請求項４７または４８に記載の支持体。
【請求項５０】
ポリペプチドのプロテアーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドを、上記ポリペプチドによってタンパク質分解切断される基質と、試験化合物またはその複数を加えると同時、加える前、または加えた後に接触させ；
上記試験化合物の存在下で切断された基質の量を測定し、さらに
対照に比べて切断された基質の量に変化をもたらす化合物を選択し、それにより上記ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する
ことを含む、方法。
【請求項５１】
上記試験化合物が上記ポリペプチドの活性を調節する小分子、ペプチド、ペプチドミメティクス、天然産物、抗体またはそのフラグメントである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
上記ポリペプチドが
(a)配列番号5または配列番号22のヌクレオチド配列；
(b)配列番号5または配列番号22のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下で全長にわたってまたは全長の少なくとも約70%にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6または配列番号23のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；
(e)プロテアーゼドメイン、または配列番号5で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むその触媒活性部分をコードするヌクレオチド配列；および
(f)(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の縮重コドンを含むヌクレオチド配列；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドから本質的になる、請求項５０〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
上記ポリペプチドが
配列番号5のアミノ酸1〜230の、または配列番号23で示され、配列番号23のアミノ酸463〜692を含むヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号5の、または配列番号23で示されるヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
配列番号6で示されるアミノ酸を含むポリペプチド；
配列番号6のアミノ酸配列または配列番号23のアミノ酸配列と少なくとも約60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
配列番号23で示される配列のスプライス変異体であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチドから本質的になる、請求項５０〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
切断された基質量の変化が試験化合物の存在下で切断された基質の量と試験化合物の不在下で切断された基質の量を比較することで評価される、請求項５０〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
複数のポリペプチドが直接またはリンカーを介して固相支持体に連結されている、請求項５０〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
上記ポリペプチドがアレイからなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
MTSP10ポリペプチドの、一本鎖および／もしくは二本鎖プロテアーゼドメインと、かつ／または一本鎖もしくは二本鎖ポリペプチドと、かつ／またはその一本鎖もしくは二本鎖型のタンパク質分解活性部分と特異的に結合する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10ポリペプチドまたはそのタンパク質分解活性部分と試験化合物またはその複数を、その結合を助ける条件下で接触させ；
a)一本鎖および／もしくは二本鎖型の上記ポリペプチドと、またはその一本鎖型および／もしくは二本鎖型のタンパク質分解活性部分と特異的に結合する試験化合物を同定するか、あるいは
b)一本鎖および／もしくは二本鎖型の上記ポリペプチドと、またはその一本鎖および／もしくは二本鎖型のタンパク質分解活性部分と結合することが既知である化合物の結合を阻害する試験化合物を同定する(なおここで、上記既知化合物は試験化合物の前、同時または後に上記ポリペプチドと接触させる)か
のいずれかを行うことを含む、方法。
【請求項５９】
上記ポリペプチドが直接またはリンカーを介して間接的に固相支持体に連結されている、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
上記試験化合物が小分子、ペプチド、ペプチドミメティクス、天然産物、抗体またはそのフラグメントである、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
複数の試験物質が同時にスクリーニングされる、請求項５８〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
複数のポリペプチドが固相支持体に連結されている、請求項５８〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
上記ポリペプチドが
(a)配列番号5のヌクレオチド配列；
(b)配列番号5のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下で全長にわたって、または全長の少なくとも約70%にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6のポリペプチドまたは配列番号23のアミノ酸463〜692を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；
(e)プロテアーゼドメイン、または配列番号5で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むその触媒活性部分をコードするヌクレオチド配列；および
(f)(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の縮重コドンを含むヌクレオチド配列
によってコードされるポリペプチドから本質的になる、請求項５８〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
チモーゲン型のMTSP10のアクチベーターを同定する方法であって、
チモーゲン型の請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10ポリペプチドまたはそのタンパク質分解活性部分と活性化型のポリペプチドの基質を接触させ；
試験化合物を加え(なお、この試験化合物は基質添加の前、後またはそれと同時に加える)；さらに
上記基質の切断を検出し、それにより上記チモーゲンを活性化する化合物を同定する
ことを含む、方法。
【請求項６５】
上記基質が発色基質である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
上記基質がL-ピログルタミル-L-プロリル-L-アルギニン-p-ニトロアニリンヒドロクロリドである、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
上記試験化合物が小分子、核酸またはポリペプチドである、請求項６４〜６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
哺乳類において新生物形成疾患を処置または予防する方法であって、有効量の請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドの阻害剤を哺乳類に投与することを含む、方法。
【請求項６９】
上記阻害剤が上記ポリペプチドと特異的に結合する抗体、またはその結合ドメインを含む抗体のフラグメントもしくは誘導体である(なお、この抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である)、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
上記ポリペプチドが
(a)配列番号5のヌクレオチド配列；
(b)配列番号5のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下で全長にわたって、または全長の少なくとも約70%にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6のポリペプチドまたは配列番号23のアミノ酸463〜692を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；
(e)プロテアーゼドメイン、または配列番号5で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むその触媒活性部分をコードするヌクレオチド配列；および
(f)(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の縮重コドンを含むヌクレオチド配列
によってコードされるポリペプチドから本質的になる、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
上記ポリペプチドが
(a)配列番号5のヌクレオチド配列；
(b)配列番号5のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でその長さにわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6のポリペプチドまたは配列番号23のアミノ酸463〜692を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；および
(e)(a)、(b)、(c)または(d)の縮重コドン
によってコードされるポリペプチドから本質的になる、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７２】
腫瘍の発生、増殖もしくは進行を阻害する、または悪性もしくは前悪性症状を処置する方法であって、請求項１〜１５のいずれかに記載のチモーゲン型のMTSP10ポリペプチドもしくはそのタンパク質分解活性部分の活性化切断を阻害する、または活性化型のMTSP10もしくはそのタンパク質分解活性部分の活性を阻害する薬剤を投与することを含む、方法。
【請求項７３】
上記症状が乳房、子宮頚部、前立腺、肺、卵巣または大腸の症状である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
上記薬剤がアンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖RNA(dsRNA)または抗体である、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
抗腫瘍および抗血管形成処置または薬剤から選択される別の処置または薬剤を投与することをさらに含む、請求項７２〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
上記ポリペプチドが
(a)配列番号5のヌクレオチド配列；
(b)配列番号5のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下で全長にわたって、または全長の少なくとも約70%にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；
(e)プロテアーゼドメイン、または配列番号5で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むその触媒活性部分をコードするヌクレオチド配列；および
(f)(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の縮重コドンを含むヌクレオチド配列
によってコードされるポリペプチドから本質的になる、請求項７２〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
上記ポリペプチドが
(a)配列番号5のヌクレオチド配列；
(b)配列番号5のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下でその長さにわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6のポリペプチドまたは配列番号23のアミノ酸463〜692を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；および
(e)(a)、(b)、(c)または(d)の縮重コドン
によってコードされるポリペプチドを含む、請求項７２〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
請求項１〜１５のいずれかに記載の、一本鎖および／もしくは二本鎖型のMTSP10ポリペプチドと、かつ／または一本鎖および／もしくは二本鎖型のMTSP10ポリペプチドのタンパク質分解活性部分と結合する化合物を同定する方法であって、
試験化合物と両形態とを接触させ；
上記化合物がどの形態と結合するか判定し；さらに
それが一方の形態のポリペプチドと結合する場合、その化合物が以下の特性：
(i)一本鎖チモーゲン型のポリペプチドの活性切断を阻害する；
(ii)二本鎖または一本鎖型の活性を阻害する；および
(iii)上記ポリペプチドの二量体形成を阻害する
のうち少なくとも1つを有するかどうかをさらに判定する
ことを含む、方法。
【請求項７９】
上記生体サンプルが血液、尿、唾液、涙、滑液、汗、間質液、脳脊髄液、精液サンプル、腹水、腫瘍組織生検および循環腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
両形態がプロテアーゼドメインから本質的になる、請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
新生物形成疾患を検出する方法であって、生体サンプルにおいて請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドを含むポリペプチドを検出し、その検出された量、形態および／または活性が新生物形成疾患を持たない被験体から検出されたポリペプチドの量、形態および／または活性と異なる、方法。
【請求項８２】
上記生体サンプルが血液、尿、唾液、涙、滑液、汗、間質液、精液、脳脊髄液、腹水、腫瘍組織生検および循環腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
配列番号23のCys296からCys573まで(含む)を含む二本鎖型のMTSPである、請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項８４】
被験体において前悪性病巣、悪性症状、またはその他の病態の存在を診断する方法であって、
被験体から生体サンプルを得；さらに
それを二本鎖および／または一本鎖型のMTSP10ポリペプチドと結合する検出可能な薬剤に曝す
ことを含み、上記病態が二本鎖または一本鎖型の有無によって特徴付けられる、方法。
【請求項８５】
腫瘍の進行および／または処置の有効性をモニタリングする方法であって、身体組織または体液サンプルにおいてMTSP10ポリペプチドを検出し、かつ／またはそのレベル、形態および／または活性を定量することを含む、方法。
【請求項８６】
上記腫瘍が乳房、子宮頚部、前立腺、肺、卵巣または大腸の腫瘍である、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
上記体液が血液、尿、汗、唾液、脳脊髄液および滑液である、請求項８４〜８６のじうれかに記載の方法。
【請求項８８】
MTSP10のプロテアーゼドメインから本質的になる単離された実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項８９】
MTSP10ポリペプチドのプロテアーゼ活性を調節する化合物を同定する方法であって、
請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドまたはそのタンパク質分解活性部分と上記ポリペプチドによってタンパク質分解切断される基質とを、試験化合物またはその複数を添加すると同時に、またはその前もしくは後に接触させ；
上記試験化合物の存在下で切断された基質の量を測定し；さらに
対照と比較して切断された基質の量に変化をもたらす化合物を選択し、それにより上記ポリペプチドの活性を調節する化合物が同定される
ことを含む、方法。
【請求項９０】
上記ポリペプチドが
(a)配列番号5のヌクレオチド配列；
(b)配列番号5のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下で全長にわたって、または全長の少なくとも約70%にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6のポリペプチドまたは配列番号23のアミノ酸463〜692を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；
(e)配列番号5で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分をコードするヌクレオチド配列；および
(f)(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の縮重コドンを含むヌクレオチド配列
によってコードされるポリペプチドを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
上記ポリペプチドが
(a)配列番号5のヌクレオチド配列；
(b)配列番号5のヌクレオチド配列と高ストリンジェンシー条件下で全長にわたって、または全長の少なくとも約70%にわたってハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号6のポリペプチドまたは配列番号23のアミノ酸463〜692を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
(d)(a)、(b)または(c)のスプライス変異体であるヌクレオチド配列；
(e)配列番号5で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分をコードするヌクレオチド配列；および
(f)(a)、(b)、(c)、(d)または(e)の縮重コドンを含むヌクレオチド配列
によってコードされるポリペプチドから本質的になる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
プロテアーゼドメインが配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む、請求項８９〜９１のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９３】
請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチドをコードする異種核酸を含む、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項９４】
請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10のプロテアーゼドメインをコードする連続するヌクレオチド配列と同じ少なくとも14個の連続するヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含む；または
請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10のプロテアーゼドメインをコードする連続するヌクレオチド配列と同じ少なくとも16個の連続するヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含む；または
請求項１〜１５のいずれかに記載のMTSP10のプロテアーゼドメインをコードする連続するヌクレオチド配列と同じ少なくとも30個の連続するヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーであって、アンチセンス分子は配列番号18のヌクレオチド1162〜1262を含む、プローブまたはプライマー。
【請求項９５】
配列番号18の少なくともアミノ酸85〜87および／または160〜165を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９６】
配列番号23の残基104〜217、222〜335、340〜377、381〜412または415〜453を含む1または1以上のポリペプチドを含むアミノ酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
35 U.S.C. §119(e) の下、2001年5月14日出願の、Edwin L. Madison and Yeh, Jiunn-Chernhに対する「トランスメンブランセリンプロテアーゼ10をコードする核酸分子、コードされるタンパク質よびそれに基づく方法」と題された米国仮出願第60/291,001号に対して優先権の利益を主張する。この出願の主題は出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の分野
プロテアーゼおよびその一部、特にプロテアーゼドメインをコードする核酸分子が提供される。また、該プロテアーゼおよびそのドメイン、ならびにコード核酸分子を用いる予後、診断および処置方法も提供される。
【０００３】
発明の背景およびその目的
癌は米国における主たる死因であり、腫瘍塊を形成するまでに増殖する異常な新生細胞の数の増加、これらの新生腫瘍細胞による隣接組織の侵害、および血液またはリンパ系を介して局部リンパ節や離れた部位へ転移する悪性細胞の発生を特徴とする。癌の顕著な特徴として、腫瘍細胞およびそれらの環境間の連絡の破壊がある。正常細胞は刺激シグナルがなければ分裂せず、阻害シグナルが存在すると分裂を止める。組織内の細胞間では増殖刺激シグナルおよび増殖阻害シグナルが日常的に交換されている。癌化または新生物形成状態では、細胞はこれらのシグナルを「くつがえす」能力、そして正常細胞が増殖しない条件下で増殖する能力を獲得している。
【０００４】
腫瘍細胞は増殖のために遺伝的変異を反映するいくつかの明瞭な異常形質を獲得している。十分研究されているある種の腫瘍のゲノムは活性化された癌遺伝子および不活性化された腫瘍抑制遺伝子をはじめ、独立に変異したいくつかの異なる遺伝子を有する。これらの遺伝的変異の各々は集合体として完全な新生物表現型を呈するいくつかの形質を付与する一役を担っているようである。
【０００５】
種々の生化学因子が様々な転移相と関連づけられている。コラーゲン、ラミニンなどの糖タンパク質、およびプロテオグリカンの細胞表面レセプターは浸潤および転移における重要なステップである細胞の接着を助ける。この接着により、腫瘍細胞の組織バリアへの浸透を助ける分解酵素の放出が誘導される。ひと度腫瘍細胞が標的組織へ侵入すると、さらなる増殖には特殊な増殖因子が必要となる。腫瘍の浸潤および進行には、腫瘍細胞が一次腫瘍から離れ、それを取り巻く正常組織を破壊し、さらに血管またはリンパ管へと移動して離れた部位へ運ばれるという一連の複雑な事柄が含まれる。この正常組織のバリアの破壊は、組織の基底膜および間質成分を構成している細胞外マトリックスのタンパク質を分解する特殊な酵素の合成によってなされる。
【０００６】
ある種の細胞外マトリックス分解酵素が腫瘍浸潤と関連づけられている。これにはマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)がある。例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼストロメリジンの産生が転移能を有する悪性腫瘍と関連づけられている(例えば、McDonnell et al. (1990) Smnrs. in Cancer Biology 1:107-115; McDonnell et al. (1990) Cancer and Metastasis Reviews 9:309-319参照)。
【０００７】
癌細胞の転移および組織浸潤能は基底膜の分解によって助長される。MMPをはじめいくつかのプロテイナーゼ酵素は腫瘍細胞の浸潤プロセスを助長することが報告されている。MMPは基底膜の分解を促進し、それにより腫瘍細胞を組織浸潤させることが報告されている。例えば、分子量約70kDaと92kDaの2つの主要なメタロプロテイナーゼは腫瘍細胞の転移能を高めるものと思われる。
【０００８】
II型トランスメンブランセリンプロテアーゼ
MMPの他、セリンプロテアーゼは新生物形成疾患の進行に関連づけられている。分泌型の酵素であれ細胞質貯蔵オルガネラに隔離されるものであれ、ほとんどのセリンプロテアーゼは血液凝固、創傷治癒、消化、免疫応答ならびに腫瘍浸潤および転移に役割を有する。II型トランスメンブランセリンプロテアーゼと呼ばれる、付加的な細胞外ドメインを有する膜固定タンパク質である、ある種の細胞表面タンパク質が確認されている。それらは細胞表面タンパク質として細胞内シグナル伝達および細胞表面タンパク質分解に役割を果たすものと位置づけられている。
【０００９】
細胞表面タンパク質分解は多様な細胞機能を媒介する生物活性タンパク質を生成するためのメカニズムである。膜会合プロアーゼとしては、膜型メタロプロテイナーゼ(MT-MMP)、ADAM(ジスインテグリン様およびメタロプロテイナーゼドメインを含むプロテアーゼ)およびトランスメンブランセリンプロテアーゼが含まれる。哺乳類ではヒトにおける7つを含む、少なくとも17メンバーのトランスメンブランセリンプロテアーゼファミリーが知られている(Hooper et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:857-860参照)。これらにはコリン(受託番号AF133845およびAB013874;Yan et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:14926-14938; Tomia et al. (1998) J. Biochem. 124:784-789; Uan et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:8525-8529参照);エンテロペプチダーゼ(エンテロキナーゼとも呼ばれる;ヒトタンパク質としては受託番号U09860; Kitamoto et al. (1995) Biochem. 27: 4562-4568; Yahagi et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 219:806-812; Kitamoto et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:7588-7592; Matsushima et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:19976-19982参照);ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(HAT;受託番号AB002134; Yamaoka et al. J. Biol. Chem. 273:11894-11901参照); MTSP1およびマトリプターゼ(TADG-15とも呼ばれる;配列番号1および2参照;受託番号AF133086/AF118224, AF04280022; Takeuchi et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:11054-1161; Lin et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:18231-18236; Takeuchi et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:26333-26342;およびKim et al. (1999) Immunogenetics 49:420-429);ヘプシン(受託番号M18930, AF030065, X70900; Leytus et al. (1988) Biochem. 27: 11895-11901; Vu et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:31315-31320;およびFarley et al. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1173:350-352参照;および米国特許第5,972,616号参照); TMPR2(受託番号U75329およびAF113596; Paoloni-Giacobino et al. (1997) Genomics 44:309-320;およびJacquinet et al. (2000) FEBS Lett. 468: 93-100参照);およびTMPRSS4(受託番号NM 016425; Wallrapp et al. (2000) Cancer 60:2602-2606参照)が含まれる。
【００１０】
セリンプロテアーゼはトランスメンブランセリンプロテアーゼおよび分泌型プロテアーゼを含み、新生物の発生および進行に関与するプロセスに関連づけられている。これらのプロテアーゼが腫瘍の増殖および進行を促進する正確な詳細機構はまだ精査されていないが、セリンプロテアーゼおよびその阻害剤は腫瘍の進行に関わる癌細胞浸潤における分解作用、転移拡散、および腫瘍の血管新生をはじめとする多くの細胞内および細胞外生理学的プロセスの制御に関与している。プロテアーゼは細胞外マトリックス(ECM)の分解に関与し、組織の再構築に寄与し、癌浸潤および転移に不可欠であると考えられている。いくつかのプロテアーゼの活性および／または発現が腫瘍の進行および発達と相関していることが示されている。
【００１１】
例えば、上皮癌組織でも正常組織でも発現する(Takeucuhi et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11054-61)、膜型セリンプロテアーゼMTSP1(マトリプターゼとも呼ばれる;米国特許第5,972,616号配列番号1および2;およびGenBank受託番号AF118224; (1999) J. Biol. Chem. 274:18231-18236;米国特許第5,792,616号参照、またTakeuchi (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:11054-1161も参照)が同定されている。マトリプターゼは最初にヒト乳癌細胞で主要なゼラチナーゼとして同定され(米国特許第5,482,848号参照)、当初はマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の一種と考えられていた。これは乳癌の転移に役割を果たすことが示唆されている。マトリプターゼはまた、種々の上皮組織において高いレベルの活性で発現し、ヒト胃腸管および前立腺でも発現する。MTSP3、MTSP4、MTSP6と呼ばれるMTSPは国際PCT出願PCT/US01/03471に基づく公開国際PCT出願WO 01/57194に記載されている。
【００１２】
前立腺特異的抗原(PSA)であるカリクレイン様セリンプロテアーゼは細胞外マトリックス糖タンパク質フィブロネクチンおよびラミニンを分解し、前立腺癌細胞による浸潤を助長すると仮定されている(Webber et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1(10):1089-94)。PSAのタンパク質分解活性をPSA特異的モノクローナル抗体で遮断すると、in vitroにおける高レベルのPSAを分泌するLNCaPヒト前立腺癌細胞による再構成基底膜マトリゲル (Matrigel)の浸潤に用量依存的な低下が起こる。
【００１３】
肝癌細胞で確認されている細胞表面セリンプロテアーゼであるヘプシンは卵巣癌で過剰発現する(Tanimoto et al. (1997) Cancer Res., 57(14):2884-7)。このヘプシン転写物は癌腫組織に豊富に見られ、正常な卵巣をはじめ正常な成体組織ではほとんど発現しない。ヘプシンは卵巣腫瘍で過剰発現することが多いので卵巣腫瘍細胞の浸潤プロセスおよび増殖能における候補プロテアーゼとなり得ることが示唆されている。
【００１４】
正常上皮細胞特異的1(NES1)と呼ばれるセリンプロテアーゼ様遺伝子(Liu et al., Cancer Res., 56(14):3371-9 (1996))が確認されている。全ての正常および不死化非腫瘍性上皮細胞系統でNES1 mRNAの発現が見られるが、大部分のヒト乳癌細胞系統はその発現の著しい低下または完全な欠如を示す。NES1と、増殖因子活性を調節することが知られているポリペプチドとの構造類似性およびNES1発現と乳癌発生の負の相関は、腫瘍形成の抑制におけるこのプロテアーゼ様遺伝子産物の直接的または間接的役割を示唆するものである。
【００１５】
よって、トランスメンブランセリンプロテアーゼは腫瘍の病因および病原に関与するものと思われる。これらのプロセスにおけるそれらの役割をさらに解明し、さらなるトランスメンブランプロテアーゼを同定する必要がある。従って本明細書の目的は、トランスメンブランセリンプロテアーゼ(MTSP)タンパク質ならびに腫瘍形成および／または発癌の調節または関与に関わる、かかるMTSPプロテアーゼをコードする核酸を提供することにある。本明細書の目的はまた、かかるプロテアーゼおよびかかるプロテアーゼをコードする核酸を用いる予後、診断および処置的スクリーニングを提供することである。
【００１６】
概要
本明細書では、本明細書でMTSP10と呼ばれるタンパク質のプロテアーゼドメインが提供される。このプロテアーゼドメイン、ならびにチモーゲンおよび活性型をはじめとする全長タンパク質、およびそれらの使用も提供される。スプライス変異体によってコードされるタンパク質も提供される。よって、本明細書ではMTSP10と呼ばれるタンパク質ファミリー、ならびに1以上のトランスメンブラン(TM)ドメイン、2つのCUBドメイン、3つのLDLレセプター型ドメインおよびセリンプロテアーゼ触媒ドメイン、特にそのプロテアーゼ(または触媒)ドメインを含む機能的ドメインが提供される。また、その突然変異タンパク質およびその他の誘導体および類似体も提供される。また本明細書では、MTSP10をコードする核酸も提供される。
【００１７】
本明細書で提供されるプロテアーゼドメインとしては、限定されるものではないが、例えば腫瘍細胞において非腫瘍細胞でのその活性とは異なる機能的活性を示すヒトを含む哺乳類に由来する、C末端からチモーゲンの活性化のための切断部位にN末端を有する一本鎖領域、またはMTSP10のin vitroタンパク質分解アッセイで一本鎖ポリペプチドとしてタンパク質分解活性を示すそのC末端切断部分が挙げられる。
【００１８】
また、これらのタンパク質およびプロテアーゼドメインをコードする核酸分子も提供される。一本鎖プロテアーゼドメインまたはそのその触媒活性部分をコードする核酸分子およびまた全長MTSP10またはその一部をコードするものも提供される。ある実施形態では、MTSP10と呼ばれるMTSPをコードする核酸が提供される。この核酸分子は配列番号5または配列番号22で示されるヌクレオチド配列、またはその触媒活性ポリペプチドもしくはドメインをコードするその一部(実施例1も参照)を含む。
【００１９】
また、触媒活性部分ポリペプチドの全てまたは一部をコードする核酸分子、あるいはプロテアーゼドメイン、またはその全長ポリペプチドまでを含み得るものであり、かつ、このようなMTSP10コード核酸とそれらの全長にわたって、または全長の少なくとも約70%、80%または90%にわたってハイブリダイズし、プロテアーゼドメインもしくはその一部をコードするより大きなポリペプチドをコードする核酸分子も提供される。ハイブリダイゼーションは一般に少なくとも低ストリンジェンシー、一般に中ストリンジェンシーおよび多くの場合は高ストリンジェンシー条件下で行う。
【００２０】
単離された核酸断片とは、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNA、またはRNAであり、あるいはタンパク質核酸またはその他のヌクレオチド類似体などのその他の成分も含み得る。単離された核酸は異種または天然プロモーター、およびその他の転写および翻訳調節配列などの付加的な成分を含んでもよく、これらの遺伝子は、レポーター遺伝子その他の指標遺伝子、すなわち指標をコードする遺伝子など、その他の遺伝子と連結させてもよい。
【００２１】
また、MTSP10またはその一部をコードするヌクレオチド配列に相補的な分子の配列を含む単離された核酸分子も提供される。
【００２２】
また、少なくとも低ストリンジェンシー、一般に中ストリンジェンシー、より典型的には高ストリンジェンシー条件下で配列番号5もしくは配列番号22で示されるヌクレオチド配列またはその縮重物とハイブリダイズする核酸分子も提供される。ある実施形態では、この単離された核酸断片は配列番号5または配列番号22で示されるヌクレオチド配列(またはその縮重物)を含む核酸分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。ある実施形態では、それは配列番号5で示されるヌクレオチドを含む。全長MTSP10ポリペプチドは配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列を含み、配列番号5もしくは配列番号22で示されるヌクレオチド配列またはその縮重物によってコードされる。また、全長分子およびスプライス変異体、ならびにウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、チンパンジーおよびゴリラをはじめとする霊長類、齧歯類、イヌ、ネコなどの種、およびペット、農場動物および動物園動物など対象となるその他の種に由来するMTSP10をコードする核酸分子をはじめ、その他のMTSPをコードする核酸を単離する方法も提供される。配列番号5および23で示されるものをはじめ、本明細書で提供される核酸分子は、これら核酸分子またはそれを基にして選択されたプライマーもしくはプローブを用いて適当なライブラリーをスクリーニングすることなどにより、ヒト起源また他の種由来の全長MTSP10ポリペプチドをコードする核酸分子を得るために用いることができる。
【００２３】
またプローブまたはプライマーとして使用でき、配列番号5もしくは配列番号22で示される少なくとも約10、14、16のヌクレオチド、一般には1000未満、もしくは100以下のヌクレオチド(またはその相補物)を含むか、あるいは少なくとも約30のヌクレオチド(またはその相補物)を含むか、あるいはこのようないずれかの断片またはオリゴヌクレオチドとそれらの全長(または少なくともその約70、80または90%)にわたってハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、その断片またはオリゴヌクレオチドも提供する。これらの断片の長さはそれらを用いる目的および／または目的のゲノムの複雑性の関数である。一般にプローブまたはプライマーは約30、50、150または500のヌクレオチド未満を含む。
【００２４】
また、本明細書で提供される核酸分子のいずれかを含むプラスミドも提供される。これらのプラスミドを含む細胞も提供される。このような細胞としては、限定されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。
【００２５】
これらの細胞は細胞表面でMTSP10を発現する細胞であることから、これらの細胞を用いて、コードされるMTSP10ポリペプチドおよびその一部を発現させる方法も提供される。このような細胞は候補となる処置化合物を同定する方法において用いられる。
【００２６】
MTSP10、特にそのプロテアーゼドメインは、MTSP10が細胞によって発現される条件下で上記細胞を増殖させ、さらに発現したMTSP10ポリペプチドを回収することにより生産することができる。
【００２７】
また、MTSP10ポリペプチドがそれら細胞の表面で発現する細胞、一般には哺乳類細胞および酵母細胞などの真核細胞も提供される。このような細胞はMTSP10ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するための薬剤スクリーニングアッセイに用いられる。in vitro結合アッセイをはじめとするこれらのアッセイ、およびシグナル伝達がMTSP10によって直接、またはプロ増殖因子の活性化を介するなど間接的に媒介される転写に基づくアッセイが評価される。
【００２８】
また、このような核酸分子によってコードされるペプチドも提供される。このようなポリペプチドとしては、MTSP10プロテアーゼドメイン、またはその特異性および／またはプロテアーゼ活性が実質的に変化しないようなアミノ酸変化を伴うポリペプチドが含まれる。特に、セリンプロテアーゼ触媒ドメインを含み、さらにその他のドメインも含み得る実質的に精製された哺乳類MTSP10ポリペプチドが提供される。MTSP10はホモ二量体を形成することもできるし、膜結合タンパク質などの他の数種のタンパク質とヘテロ二量体を形成することもできる。また、MTSP10と少なくとも60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質も提供され、ここでこの同一性%は同一性%を最大にする標準的なアルゴリズムおよびギャップペナルティーを用いて求められる。ヒトMTSP10ポリペプチドが例示されているが、他の哺乳類のMTSP10ポリペプチドも意図される。本明細書ではMTSP10のスプライス変異体、特にタンパク質分解活性プロテアーゼドメインを有するものが意図される。
【００２９】
他の実施形態では、MTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分を含む実質的に精製されたポリペプチドが提供される。これらのものとして配列番号6または配列番号23と少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは触媒活性ポリペプチドまたはCUBドメインまたはLDLレセプタードメインを含むその一部がある。
【００３０】
また、MTSP10の一本鎖プロテアーゼドメインの突然変異タンパク質、特にフリーの(すなわちプロテアーゼドメインの他のいずれのCys残基ともジスルフィド結合を形成しない)プロテアーゼドメインのCys残基が別のアミノ酸への置換、必ずしも必要ではないが典型的には保存的アミノ酸置換、または活性をなくさない置換で置換されている突然変異タンパク質、グリコシル化部位がなくされている突然変異タンパク質も提供される。
【００３１】
よって、1以上のCys残基、特に活性化された2つの形態では対合するが、単独のプロテアーゼドメインでは対合しない残基(すなわち、プロテアーゼドメインの26番残基のCys(配列番号5および6参照)がいずれかのアミノ酸、必ずしも必要ではないが典型的には、Serなどの保存的アミノ酸残基で置換されている突然変異タンパク質が意図される。MTSP10の突然変異タンパク質、特に一本鎖プロテアーゼドメインにおいて対合していないCysなどのCys残基が活性をなくさない別のアミノ酸で置換されているものが提供される。触媒活性が保持されるその他の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する突然変異タンパク質も意図される(例えばアミノ酸置換例としては表1を参照)。
【００３２】
本明細書では、限定されるものではないが、そのスプライス変異体、およびMTSPをコードする核酸、ならびにそのドメイン、誘導体および類似体をはじめとするMTSP10ポリペプチドが提供される。また、チモーゲン型のMTSP10の活性化により生じるものと機能的に同等なN末端を有する一本鎖プロテアーゼドメインも提供される。MTSP10のプロテアーゼドメインの切断部位はアミノ酸Rとアミノ酸Iの間(R↓IIGGT)である(配列番号6の残基1〜5；配列番号23の残基462〜467参照)。配列番号23のN67, N272; N336; N383, N409およびN418に可能性のあるグリコシル化部位がある。MTSP10の触媒トリアッドはH503、D551およびS647である。
【００３３】
以下のような可能性のあるジスルフィド結合が存在する：C488-C504、C587-C653、C619-C632、C643-C673(配列番号22および23参照)(42〜58番、136〜201番、168〜182番および191〜220番のキモトリプシン)。Cys残基C573-C296の間でジスルフィド結合が生じてこのプロテアーゼドメインを別のドメインと連結し、その結果、活性化切断(配列番号23の残基R462とI463の間)の際に生じるポリペプチドは二本鎖分子となる。C573(配列番号23)は一本鎖型のプロテアーゼドメインではフリーのCysである。断っておくが、このプロテアーゼはまた二本鎖分子として提供することもできる。一本鎖型および二本鎖型はタンパク質分解活性がある。配列番号23で示される二本鎖型のポリペプチドが提供され、また、より小さな触媒活性のある二本鎖型も提供される。二本鎖型は典型的にはC573と、Cys296などのプロテアーゼドメインの外側のCysとの間で結合させることにより作出される。活性化切断されてもこの結合はなお二本鎖ポリペプチドを生じる。「A」鎖の大きさはR46とI463の間の活性切断前の最初のポリペプチド長の関数である。本明細書ではプロテアーゼドメイン(配列番号23の残基463〜692)またはその触媒活性断片を含むいずれの長さのポリペプチドも意図される。二本鎖型としては少なくともC296からC573まで(含む)のポリペプチドのプロテアーゼドメインを含む。
【００３４】
MTSPは肺、前立腺、大腸および乳房などの特定の腫瘍または癌細胞、その他の腫瘍では卵巣、膵臓、肺で発現または活性化される。MTSP10は腫瘍細胞で発現または活性化されることから着目される。特に本明細書ではMTSP10は例えば食道腫瘍組織、肺癌、前立腺癌、膵臓癌および乳癌および細胞株、ならびに特定の正常細胞および組織でも発現することが示される(例えば、組織特異的発現プロフールに関しては実施例を参照)。活性化されたMTSP10のレベルは前立腺癌、子宮癌、肺癌、食道癌、または大腸癌または白血病あるいはその他の癌の診断因子となり得る。被験体の細胞上もしくは細胞の近傍または体液中のMTSP10の発現および／または活性化は乳癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌およびその他の癌のマーカーとなり得る。
【００３５】
よって、本明細書で提供されるMTSPは特定の腫瘍の診断マーカーとして役立ち得る。特定の実施形態では、MTSP10ポリペプチドは腫瘍を持たない被験体の体液におけるそのレベルとは異なるレベルで体液中に検出できる。他の実施形態では、このポリペプチドは腫瘍に存在し、このポリペプチドの基質または補因子は同じ種類の組織の非腫瘍細胞におけるその発現レベルとは異なるレベルで発現する。また他の実施形態では、腫瘍細胞におけるMTSP10ポリペプチドの発現および／または活性のレベルは非腫瘍細胞でのその発現および／または活性化のレベルとは異なる。その他の実施形態では、MTSP10は腫瘍に存在し、MTSP10の基質または補因子は同じ種類の組織の非腫瘍細胞におけるその発現レベルとは異なるレベルで発現する。
【００３６】
本明細書ではまた、MTSP10の活性化、発現または活性を調節する小分子をはじめとする化合物などのエフェクター、およびpH、温度およびイオン強度などの条件を確認するアッセイも提供される。アッセイ例としては、MTSP10のプロテアーゼドメインの、既知の基質、典型的には蛍光標識、発色標識またはその他の検出可能な標識を施した基質をタンパク質分解切断する能力に対する試験化合物の効果を評価する。プロテアーゼドメインの活性を調節する作用因子、一般には化合物、特に小分子はMTSP10の活性を調節する候補化合物である。これらのプロテアーゼドメインはまたプロテアーゼ特異的抗体を作製するために用いることもできる。
【００３７】
MTSP10活性を調節する化合物のスクリーニング方法も提供される。これらの化合物はそれらをMTSP10またはそのプロテアーゼドメインおよびMTSP10の基質と接触させることにより同定される。それら化合物の不在下に比べて化合物の存在下で切断された基質の量に変化があれば、その化合物がMTSP10活性を調節することを示す。このような化合物をさらなる分析のため、または組成物またはアゴニストなど、MTSP10の活性の調節を目的とした使用のために選択する。また、これらの化合物は、これらの基質とMTSP10またはその細胞外ドメインもしくは触媒活性部分を発現する細胞を接触させることによって同定することもできる。
【００３８】
本明細書ではまた、MTSP10活性を調節する方法、およびMTSP10活性の阻害、拮抗、促進あるいはまた変更をはじめとする調節を行う化合物をスクリーニングする方法が提供される。タンパク質のタンパク質分解(触媒)部分を含むMTSP10の細胞外ドメインが特に注目される。
【００３９】
本発明ではさらに、一本鎖および二本鎖型のMTSP10と特異的に結合する抗体、これらの抗体を含有する細胞、組合せ、キットおよび製品が提供される。MTSP10、特に一本鎖プロテアーゼドメイン、二本鎖型のプロテアーゼドメイン、チモーゲンおよび活性型のMTSP10およびその断片と特異的に結合する抗体。生体活性、特にプロテアーゼ活性を阻害する中和抗体も提供される。
【００４０】
本明細書ではさらに、MTSP10およびMTSP10をコードする核酸を用いる予後、診断、処置的スクリーニング法が提供される。特にこれらの予後、診断および処置的スクリーニング法は肺癌、大腸腺癌および卵巣癌などの腫瘍または癌の予防または処置、あるいは予防または処置に有用な薬剤の発見に用いられる。
【００４１】
本明細書ではまた、MTSP10活性のモジュレーター、特に本明細書で提供されるスクリーニング方法に従って得られるモジュレーターも提供される。このようなモジュレーターは癌状態を処置する上で用途を持ち得る。
【００４２】
被験体において異常なMTSP10レベルを検出することを特徴とする疾病または疾患の診断方法も提供される。この方法はMTSP10のDNA、RNA、タンパク質または機能的活性のレベルを測定することによって行うことができる。疾病または疾患のない類似のサンプル(またはその他の適当な対照)で見られるDNA、RNA、タンパク質または機能的活性のレベルに対してMTSPのDNA、RNA、タンパク質または機能的活性のレベルが上昇または低下していれば、被験体またはその他関連のいずれか適当な対照に疾病または疾患が存在することを示す。
【００４３】
また、一本鎖および／または二本鎖型のMTSP10と結合する化合物を同定する方法であって、試験化合物と両形態とを接触させ；上記化合物がどの形態と結合するか判定し；さらにそれが一方の形態のMTSP10と結合する場合、その化合物が以下の特性：
(i)一本鎖チモーゲン型のMTSP10の活性を阻害する；
(ii)二本鎖または一本鎖型の活性を阻害する；および
(iii)上記タンパク質の二量体形成を阻害する
のうち少なくとも1つを有するかどうかをさらに判定する
ことによる方法も提供される。これらの形態は全長であっても末端切断型であってもよく、限定されるものではないが、活性化切断部位(配列番号23のアミノ酸R462とI463の間)での切断、またはプロテアーゼドメインもしくはその触媒活性部分の発現から生じたプロテアーゼドメインが含まれる。
【００４４】
本明細書では、医薬上許容される担体または賦形剤中にMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインおよび／または全長もしくはその他のドメインを含有する医薬組成物が提供される。
【００４５】
本明細書ではまた、MTSP10ポリペプチドおよびMTSP10のプロテアーゼドメインを一本鎖型または活性化型で含む製品も提供される。これらの製品はa)パッケージング材料、b)ポリペプチド(またはコード核酸)、特にその一本鎖プロテアーゼドメイン、およびc)その製品がMTSP10ポリペプチド活性のモジュレーターを同定するアッセイに用いるためのものであることを示すラベルを含み、本明細書ではこのような製品も提供される。
【００４６】
本明細書では、a)一本鎖または二本鎖型のMTSP10ポリペプチドまたはプロテアーゼドメイン、およびb)MTSPに直接、またはリンカーを介して連結されたターゲッティングエージェント(なお、このエージェントはi)コンジュゲートのアフィニティー単離または精製、ii)コンジュゲートの表面への結合、iii)コンジュゲートの検出、またはiv)選択された組織または細胞へのターゲッティング送達を助けるものである)を含有するコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートはさらに複数のエージェントを連結して含むこともできる。コンジュゲートは化学的コンジュゲートであってもよいし、融合タンパク質であってもよい。このターゲッティングエージェントはタンパク質またはペプチド断片であり得る。このタンパク質またはペプチド断片はタンパク質結合配列、核酸結合配列、脂質結合配列、多糖結合配列、または金属結合配列を含み得る。
【００４７】
本明細書ではMTSP10ポリペプチド、そのドメインまたはコード核酸を含有する組合せ、キットおよび製品も提供される。例えば本明細書では組合せが提供される。この組合せはa)MTSP10活性の阻害剤と、b)抗癌処置または抗癌剤を含み得る。MTSP阻害剤および抗癌剤は単一の医薬組成物として調剤してもよいし、あるいは各々個別の医薬組成物として調剤してもよい。MTSP10阻害剤としては、プロテアーゼドメインと特異的に結合する抗体など、MTSP10に対して作製された抗体またはそのフラグメントもしくは結合部分、MTSP10産生阻害剤、またはMTSP10膜局在化阻害剤またはMTSP10活性化阻害剤であり得る。その他のMTSP10阻害剤としては、限定されるものではないが、アンチセンス核酸またはRNAiなど、MTSP10、特にプロテアーゼドメインの部分をコードする二本鎖RNA(dsRNA)、異種配列がMTSP10またはそれをコードする遺伝子の生物活性を不活性化するように挿入された異種ヌクレオチド配列とともにMTSP10をコードする遺伝子の少なくとも一部をコードする核酸が挙げられる。例えばMTSP10をコードする遺伝子部分は異種配列にフランキングしていて、MTSP10をコードするゲノム遺伝子との相同組換えを促進するものであってもよい。
【００４８】
また、有効量のMTSP10阻害剤を哺乳類に投与し、それにより腫瘍または癌が処置または予防される、哺乳類の腫瘍または癌の処置または予防方法も提供される。処置または予防に用いるMTSP10阻害剤を医薬上許容される担体または賦形剤とともに投与する。処置する哺乳類はヒトであってもよい。この処置または予防方法はMTSP10阻害剤の投与と同時、投与後または投与前に抗癌処置または薬剤の投与をさらに含み得る。
【００４９】
また、MTSPをコードする遺伝子が不活性化されたものを有し、かつ非天然プロモーター制御下にMTSP10をコードする遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物も提供される。このような動物は腫瘍の発生、増殖および／または進行の動物モデルにおいて有用である。本明細書ではさらに、天然、非天然プロモーター制御下、またはプラスミドもしくは人工染色体などの外因性エレメント上にある異種核酸MTSP10を含むトランスジェニック非ヒト動物も提供される。本明細書では特に、MTSP10の遺伝子がその遺伝子の天然プロモーターではないか、あるいはその非ヒト動物における遺伝子の天然プロモーターではないプロモーターの制御下にある場合、あるいはMTSP10をコードする核酸が非ヒト動物に対して異種であり、かつ、そのプロモーターが天然または非天然プロモーターであるか、またはMTSP10がプラスミドもしくは人工染色体などの染色体外エレメント上にある場合の組換え非ヒト動物が提供される。組換えおよびトランスジェニック動物は相同組換え法および非相同組換え法によって作出することができる。
【００５０】
遺伝子療法も提供される。このような方法は不活性型のMTSP10をin vivoまたはex vivo投与することにより、あるいはMTSPをコードする核酸分子を投与することにより達成することができる。
【００５１】
また、腫瘍細胞で発現する、または活性となるMTSP10、特に腫瘍細胞におけるその機能的活性が非腫瘍細胞におけるよりも高いMTSP10によって活性化されるプロドラッグを投与することによる腫瘍を処置する方法も提供される。このプロドラッグを投与するのであるが、投与すると細胞で発現した活性のあるMTSP10がプロドラッグを切断し、腫瘍細胞の近傍で有効剤が放出される。この有効な抗癌薬は腫瘍近傍に集積する。これはMTSP10が他の細胞に比べて腫瘍細胞で多量に、あるいは高いレベルで、あるいは優先的に発現する、または活性となる場合に特に有用である。
【００５２】
また、被験者において前悪性病巣、悪性症状またはその他の病態の存在を診断する方法であって、被験体から生体サンプルを得；さらにそれを二本鎖および／または一本鎖型のMTSP10と結合する検出可能な薬剤に曝すことにより、上記病態が二本鎖および／または一本鎖型の有無によって特徴付けられる方法も提供される。
【００５３】
チモーゲン型のMTSP10の活性化または活性型の活性を阻害する薬剤を投与することによる、腫瘍の浸潤もしくは転移を阻害する、または悪性もしくは前悪性症状を処置する方法も提供される。これらの症状としては、限定されるものではないが、乳房、子宮頚部、前立腺、肺、卵巣または大腸の腫瘍などの症状が挙げられる。
【００５４】
詳細な説明
A.定義
特に断りのない限り、本明細書で用いる全ての技術および科学用語は本発明が属する分野の業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書の開示中に挙げられている全ての特許、特許出願、公開出願および公報、Genbank配列、ウェブサイトおよびその他の資料は特に断りのない限り、出典明示によりその全内容を組み入れる。本明細書の用語に複数の定義がある場合には、本節を重視する。URLまたはその他この種の識別名もしくはアドレスが参照されている場合、この種の識別名は変更可能であり、インターネット上の特定の情報は変更があってもよいが、インターネットを検索することで同等の情報が見つけられると解釈する。これらに対する参照はそのような情報の有効性および一般流布を明示するものである。
【００５５】
本明細書において保護基、アミノ酸およびその他の化合物のいずれの略号も特に断りのない限り、それらの一般的な用法、認識されている略号、またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature((1972) Biochem. 11:942-944参照)に従うものである。
【００５６】
本明細書においてセリンプロテアーゼとは、タンパク質またはペプチドの加水分解にセリン残基が関与する多様なプロテアーゼファミリーをさす。このセリン残基はその触媒作用にセリン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸を含む触媒トリアッド機構の一部、またその触媒作用にセリンおよびリジンを含むヒドロキシル/ε-アミンまたはヒドロキシル/α-アミン触媒ダイアッド機構の一部であり得る。ヒトを含む哺乳類起源のSPが特に注目される。当業者ならば一般にポリペプチドの非必須領域の単一アミノ酸置換では実質的に生物活性は変化しないことが分かるであろう(例えば、Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224参照)。
【００５７】
本明細書において「トランスメンブランセリンプロテアーゼ(MTSP)」とは、本明細書に記載されるような共通の構造的特徴を有しているトランスメンブランセリンプロテアーゼファミリーをさす(Hooper et al. (2001) J. Biol. Chem.276:857-860も参照)。従って、例えば「MTSP」であれば、限定されるものではないが、MTSP3、MTSP4、MTSP6、MTSP7、または他のいずれかの供給源から得られる、あるいは合成によって作製された、あるいは同じ活性を示す同等の分子をはじめとする、MTSP遺伝子ファミリーによってコードされるあらゆるタンパク質が含まれる。その他のMTSPとしては、限定されるものではないが、コリン、エンテロペプチダーゼ、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(HAT)、MTSP1、TMPRSS2、およびTMPRSS4が挙げられる。例としてのMTSPおよび／またはそのドメインのコード核酸分子の配列およびコードされるアミノ酸配列は例えば米国出願第09/776,191号(その中の配列番号1〜12、49、50および61〜72、国際PCT出願WO 01/57194として公開)に示されている。この用語はまた各メンバーの活性を実質的に変化させないアミノ酸置換を有するMTSPを包含し、また、そのスプライス変異体も包含する。必須ではないが保存的アミノ酸置換をはじめとする好適な置換は当業者に公知であり、結果として生じる分子の触媒活性などの生物活性をなくすことなく行うことができる。
【００５８】
本明細書においてMTSP10とは本明細書でいう場合には常に、
配列番号5または配列番号22で示されるヌクレオチド配列によって、あるいは配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸セットの配列をコードするヌクレオチドを含むヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
配列番号5または配列番号22で示されるヌクレオチド配列と低、中または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列またはその触媒活性部分を含むポリペプチド；
配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列と少なくとも約60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／または
配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列を含むMTSP10のスプライス変異体によってコードされるポリペプチド
の少なくとも1つ、または全て、またはそのいずれかの組合せを含む。
【００５９】
特に、配列番号5および6で示されるようなプロテアーゼドメインを有するMTSP10ポリペプチドが提供される。このポリペプチドは一本鎖または二本鎖ポリペプチドである。プロテアーゼ活性を保持するそのより短い部分も提供される。MTSP由来のプロテアーゼドメインは表面ループにおける挿入および欠失をはじめ、大きさおよび構成が異なっている。それらは、活性部位トリアッド、主要特異性ポケット、オキシアニオンホールおよび／またはプロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインのその他の特徴の少なくとも1つを含む保存構造を保持する。よって、本明細書の目的のためには、このプロテアーゼドメインは本明細書で定義されたMTSPの一部であり、これまでに確認されているコリン、エンテロペプチダーゼ、ヒト気道トリプシン様プロテアーゼ(HAT)、MTSP1、TMPRSS2およびTMPRSS4などの他のMTSPのドメインと相同なものであるが、in vitroアッセイにおいては単離された一本鎖型のプロテアーゼドメインがタンパク質分解的に機能し得るとは認識されていなかった。折りたたまれたキモトリプシン(S1)の酵素のより大きなクラスのように(例えば、インターネットでアクセスできるMEROPSデータベース参照)、MTSPプロテアーゼドメインは高度のアミノ酸配列同一性を有している。活性に必要なHis、AspおよびSer残基は保存されたモチーフに存在する。二本鎖型の第2鎖のN末端が生じる活性化部位はこの保存されたモチーフに位置し、容易に同定することができる。例示されているMTSP10では、それは配列番号23のR462とI463の間である。
【００６０】
MTSP10は動物、特に哺乳類由来のものであってよく、限定されるものではないが、ヒトをはじめとする霊長類、齧歯類、鳥類、反芻動物およびその他の動物が挙げられる。その全長チモーゲンまたは二本鎖活性型、あるいは二本鎖活性型または一本鎖型であり得る、プロテアーゼドメインをはじめとするそのいずれかのドメインも考えられる。
【００６１】
本明細書において「MTSPのプロテアーゼドメイン」とは、タンパク質分解活性を示し、かつ、キモトリプシン/トリプシンファミリープロテアーゼドメインと相同性および構造的特徴を共有するMTSPの細胞外プロテアーゼドメインをさす。従ってそれは少なくとも標準的なin vitroアッセイによって評価されるタンパク質分解活性を示すドメインの最小部分である。本明細書ではこのようなプロテアーゼドメインおよびその触媒活性部分も意図される。また、一本鎖型として触媒的に作用するその最小断片を含む末端切断型のプロテアーゼドメインも提供される。
【００６２】
MTSP10のプロテアーゼドメインとは本明細書でいう場合には常に、
a)配列番号6で示されるアミノ酸、特にその1〜230番のアミノ酸の配列を含むポリペプチド；
b)配列番号23で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
c)配列番号5または配列番号22で示されるヌクレオチド配列と低、中または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
d)配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列またはその触媒活性部分を含むポリペプチド；
e)配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列と少なくとも約60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／または
f)a)〜e)のいずれかのMTSP10をコードするヌクレオチド配列のスプライス変異体によってコードされるポリペプチドのプロテアーゼドメイン
の少なくとも1つ、または全て、またはそのいずれかの組合せ、あるいはその触媒活性部分を含む。
【００６３】
MTSP由来のプロテアーゼドメインは表面ループにおける挿入および欠失をはじめ、大きさおよび構成が異なっている。それらは、活性部位トリアッド、主要特異性ポケット、オキシアニオンホールおよび／またはプロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインのその他の特徴の少なくとも1つを含む保存構造を保持する。よって、本明細書の目的のためには、このプロテアーゼドメインは本明細書で定義されたMTSPの一部であり、他のMTSPのドメインと相同なものである。折りたたまれたキモトリプシン(S1)の酵素のより大きなクラスのように(例えば、インターネットでアクセスできるMEROPSデータベース参照)、MTSPプロテアーゼドメインは高度のアミノ酸配列同一性を有している。活性に必要なHis、AspおよびSer残基は保存されたモチーフに存在する。その切断が二本鎖型におけるプロテアーゼドメインのN末端を生じさせる活性化部位は保存されたモチーフに位置し、容易に同定することができる。
【００６４】
活性型とはin vivoおよび／またはin vitroで活性のある形態を意味する。本明細書においてプロテアーゼドメインはまた二本鎖型としても存在し得る。本明細書では、少なくともin vitroで一本鎖型のSPおよびその触媒ドメインまたはタンパク質分解活性部分(典型的にはC末端切断型)がプロテアーゼ活性を示すことが示される。よって本発明では、単離された一本鎖型のSPプロテアーゼドメインおよびその活性を調節する薬剤の同定のためのin vitro薬剤スクリーニングアッセイにおけるそれらの使用が提供される。
【００６５】
本明細書においてMTSPの触媒活性ドメインとは、そのプロテアーゼドメインをさす。MTSPのプロテアーゼドメインという場合には通常、このタンパク質の一本鎖型に対する言及も含む。二本鎖型または両形態を意図する場合には、その旨明示する。チモーゲン型の各タンパク質は一本鎖であり、これは活性化切断によって活性のある二本鎖型へと変換される。
【００６６】
本明細書において活性化切断とは、そのプロテアーゼドメインのN末端でのプロテアーゼの切断をさす(通常は、配列番号6のアミノ酸残基1、配列番号23の残基463〜492を含む全長タンパク質のRとIの間)。プロテアーゼドメインの外側のCysとプロテアーゼドメイン内のCys(この場合配列番号23のCys573)の間のCys-Cys対合により、切断時に生じるポリペプチドは二本鎖を有する(「A」鎖とプロテアーゼドメインである「B」鎖)。切断は別のプロテアーゼまたは自己触媒によって達成することもできる。
【００６７】
本明細書において二本鎖型のプロテアーゼドメインとは、この場合プロテアーゼドメインと残りのポリペプチド、すなわち「A」鎖を連結するプロテアーゼドメインの外側のCysとCys573(配列番号23)の間でCys対合している二本鎖型のプロテアーゼからなる二本鎖型をさす。二本鎖プロテアーゼドメイン型とは、「残りのポリペプチド」、すなわち「A」鎖が短縮され、かつ、プロテアーゼドメインの外側のCysからを含むいずれの形態のものもさす。例えば二本鎖型のMTSP10は配列番号23のCys296からCys573(含む)までを含み、ここでA鎖はCys296からR462までを含み、B鎖はI463から少なくともCys573までを含む。
【００６８】
目的のMTSPとしては、腫瘍細胞において非腫瘍細胞とは異なって、典型的にはより高く活性化および／または発現されるもの、および腫瘍細胞と非腫瘍細胞では基質が異なる、あるいは基質、補因子またはレセプターに関して異なる、あるいはまたMTSPの活性または特異性が変化している細胞に由来するものが挙げられる。
【００６９】
本明細書においてヒトタンパク質とは、それらが他の哺乳類で見られる変異体ではない限り、対立遺伝子変異体および保存変異体をはじめとする、ヒトゲノムに存在するDNAなどの核酸によってコードされるものである。
【００７０】
本明細書において「SPのプロテアーゼドメインまたは触媒活性部分をコードする核酸」とは、挙げられた一本鎖プロテアーゼドメインまたはその活性部分のみをコードし、他のSPの連続部分を連続配列としてコードしない核酸をさすものと解釈すべきである。
【００７１】
本明細書において触媒活性とは、セリンプロテアーゼとしてのSPの活性をさす。SPの機能とは腫瘍の発生、増殖または進行の促進またはそれらへの関与をはじめとする腫瘍生物学におけるその機能、およびシグナル伝達における役割もさす。触媒活性とは選択された基質のタンパク質分解作用を検出するin vitroタンパク質分解アッセイで評価されるような、プロテアーゼとしてのSPの活性をさす。
【００７２】
本明細書においてCUBドメインとは、相補的成分C1r/C1sにおいてタンパク質-タンパク質相互作用を媒介するモチーフであり、また、発達過程に関与する種々のタンパク質において確認されている。
【００７３】
本明細書において「LDLR」とは、LDLレセプターとの結合を媒介する低密度リポタンパク質レセプタードメインをさす。
【００７４】
本明細書においてチモーゲンとは、タンパク質分解酵素の不活性な前駆体である。このような前駆体は活性型よりも必ずしも大きくはないが、一般に大きい。セリンプロテアーゼに関して、チモーゲンは触媒および自己触媒切断、または活性酵素を生じる活性化補因子の結合をはじめ、特異的な切断によって活性のある酵素に変換される。従ってチモーゲンはアクチベーターの作用によってタンパク質分解酵素へと変換される酵素的に不活性なタンパク質である。
【００７５】
本明細書において「疾病または疾患」とは、例えば感染または遺伝子欠陥によって起こり、同定可能な症状を特徴とする生物の病態をさす。
【００７６】
本明細書において新生物(新生物形成)とは、異常な新生増殖をさし、従って良性であれ悪性であれ、腫瘍と同じものを意味する。過形成とは異なり、新生物増殖は最初の刺激がなくなっても持続する。
【００７７】
本明細書において新生物形成疾患とは、腫瘍の発達、増殖、転移および進行を含む癌に関するいずれかの疾患をさす。
【００７８】
本明細書において癌とは、いずれかの種の悪性腫瘍によって引き起こされる疾病の一般用語をさす。
【００７９】
本明細書において腫瘍に対して用いる悪性とは、増殖制御および位置制御の欠如を伴う転移能を有する一次腫瘍をさす。
【００８０】
本明細書において抗癌剤(「抗腫瘍または抗新生物剤」と互換的に用いられる)とは、抗癌処置で用いるいずれかの薬剤をさす。これらには単独で用いる、または他の化合物と併用する、新生物形成疾患、腫瘍および癌に関連する臨床徴候または診断マーカーを緩和、軽減、改善、予防または緩解状態にする、もしくは緩解状態で維持し得るいずれの薬剤も含み、本明細書で提供される方法、組合せおよび組成物で用いることができる。限定されるものではないが、抗新生物剤の例としては抗血管形成剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、ある種の天然産物、白金配位錯体、アントラセンジオン類、代替尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ある種のホルモン、アンタゴニストおよび抗癌性多糖類が挙げられる。
【００８１】
本明細書においてスプライス変異体とは、1を超える種のmRNAが生じるDNAなどのゲノム核酸の一次転写物の異なるプロセシングによって作り出された変異体をさす。本明細書ではSPのスプライス変異体が提供される。
【００８２】
本明細書において血管形成とは、限定されるものではないが、腫瘍に伴う血管新生をはじめ、新しい血管の確立および維持(血管新生)に直接または間接的に関与するプロセス全体を広く含むものとする。
【００８３】
本明細書において抗血管形成処置または抗血管形成剤とは、単独で用いる、または他の処置もしくは化合物と併用する、望ましくない、かつ／または制御できない血管形成に関連する臨床徴候または診断マーカーを緩和、軽減、改善、予防または緩解状態にする、もしくは緩解状態で維持し得るいずれの処置法および化合物もさす。よって、本明細書の目的では、抗血管形成剤は血管の確立または維持を阻害する薬剤をさす。 このような薬剤としては、限定されるものではないが、抗腫瘍剤、および糖尿病性網膜症、再狭窄、過増殖性疾患その他のような望ましくない血管形成を伴う他の疾患を処置するための薬剤が挙げられる。
【００８４】
本明細書において非抗血管原性抗腫瘍剤とは、主として血管形成を阻害することによって働くのではない抗腫瘍剤をさす。
【００８５】
本明細書においてプロ血管形成剤とはプロ血管原性剤とは、血管の確立または維持を促進する薬剤である。このような薬剤としては、心臓発作および卒中をはじめとする心血管疾患を処置するための薬剤が挙げられる。
【００８６】
本明細書において望ましくない、かつ／または制御できない血管形成とは、血管形成刺激剤の影響が血管形成阻害剤の影響より大きい病的血管形成をさす。本明細書において不全型血管形成とは、正常な血管形成に欠陥があって異常な血管形成を生じたり、血管形成がなされなかったり、血管形成が実質的に低下したりするような疾患に関連した病的血管形成をさす。
【００８７】
本明細書においてSPタンパク質のプロテアーゼドメインとは、タンパク質分解活性を示すSPのプロテアーゼドメインをさす。よって、それは標準的なin vitroアッセイによって評価した場合にタンパク質分解活性を示すタンパク質の少なくとも最小部分である。本明細書ではそれは一本鎖型および二本鎖活性型もさす(二本鎖型を意図する場合はその旨記載するものとする)。プロテアーゼドメインの例としては配列番号6で示されるアミノ酸配列(配列番号5のヌクレオチドによってコードされるアミノ酸1〜230)の、プロテアーゼ活性を示すに少なくとも十分な部分が挙げられる。
【００８８】
また、in vitroタンパク質分解アッセイにおいてタンパク質分解活性を有し、かつ、MTSP10ポリペプチドの全長またはプロテアーゼドメインあるいはその他のドメインと少なくとも60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするか、または特に中、通常は高ストリンジェンシー条件下で、プロテアーゼドメインまたはその他のドメインをコードする核酸とその全長にわたって、またはその全長の少なくとも約70%、80%または90%にわたってハイブリダイズする核酸分子も考えられる。
【００８９】
これらのプロテアーゼドメインに関しては、N末端残基が活性にとって重要であり得る。本明細書ではMTSP10プロテアーゼの一本鎖型プロテアーゼドメインは触媒活性があることが示される。このプロテアーゼドメインは一般に活性のためにそのN末端アミノ酸を必要とするので、C末端は切断することができる。除去可能な量はそのポリペプチドを、触媒的切断を評価するin vitroアッセイでプロテアーゼ活性に関して調べることで実験的に判定することができる。
【００９０】
よって、プロテアーゼ活性を保持するそのプロテアーゼドメイン、特に一本鎖ドメインのさらに短い部分も考えられる。このようなより短い形態は一般にこのプロテアーゼドメインのC末端切断型である。このようなドメインは活性部位トリアッド、主要特異性ポケット、オキシアニオンホールおよび／またはプロテアーゼのセリンプロテアーゼドメインのその他の特徴など、少なくとも1つの構造的特徴を含む保存構造を示す。このように本明細書の目的では、このプロテアーゼドメインは本明細書に定義されたようにMTSP10の一本鎖部分であるが、キモトリプシンまたはトリプシンのプロテアーゼドメインと類似または相同な構造的特徴および配列の保持という点で相同である。このポリペプチドは一本鎖としてタンパク質分解活性を示す。
【００９１】
本明細書において相同とは、約25%より大きい、例えば25%、40%、60%、70%、80%、90%または95%などの核酸配列同一性を意味する。必要に応じて相同性%を明示する。「相同性」および「同一性」は互換的に用いられる場合が多い。一般に配列は最大の一致が得られるようにアライニングする(例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I,  Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照)。配列同一性により、標準的なアライメントアルゴリズムプログラムで保存されているアミノ酸の数を求め、各提供者が確立したデフォルトギャップペナルティーとともに用いる。実質的に相同な核酸分子は典型的には中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーにて核酸の全長にわたって、あるいは着目する全長核酸分子の少なくとも約70%、80%または90%にわたってハイブリダイズする。また、ハイブリダイズする核酸分子のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も考えられる。
【００９２】
任意の2つの核酸分子が少なくとも例えば80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%「同一」であるヌクレオチド配列を有するかどうかは、例えばPearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444におけるようなデフォルトパラメーターを用いる「FAST A」プログラムなどの公知のコンピューターアルゴリズムを用いて判定することができる(他のプログラムとしてはGCGプログラムパッケージ(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073が挙げられる)。例えば、同一性の判定にはNational Center for Biotechnology Information databaseのBLAST関数が使用できる。その他商業的または公的に利用できるプログラムとしては、DNAStar "MegAlign"プログラム(Madison, WI)およびthe University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap"プログラム(Madison WI))がある。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性%は例えばGAPコンピュータープログラム(例えば、Smith and Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482)によって改訂されたNeedleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443)を用いて配列情報を比較することで求めることができる。要するにこのGAPプログラムでは、類似性をアライニングされた記号(すなわちヌクレオチドまたは核酸)の同じものの数を2配列の短い方の記号の総数で割ったものと定義する。GAPプログラムのデフォルトパラメーターとしては、(1)単項比較マトリックス(同一である場合には1、同一でない場合には0の値を含む)およびSchwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)に記載のGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745のウエイト比較マトリックス、(2)各ギャップに対しペナルティー3.0、各ギャップにおける各記号にさらにペナルティー0.10、および(3)末端ギャップにはペナルティーなしの条件を含み得る。よって本明細書において「同一性」とは、試験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの間の比較を表す。
【００９３】
本明細書において少なくとも「90%同一」とは、参照ポリペプチドに対して90〜99.99までの同一性%をさす。90%を超えるレベルの同一性とは、例にとれば100アミノ酸長の試験および参照ポリヌクレオチドが比較されるということを示しており、試験ポリペプチド中のせいぜい10%(すなわち100のうち10)のアミノ酸が参照ポリペプチドとは異なる。類似性の比較は試験および参照ポリヌクレオチドの間で行うこともできる。このような違いはアミノ酸配列の全長にわたってランダムに分布した点突然変異として現れる場合もあるし、最大許容値、例えば10/100アミノ酸の差(約90%の同一性)までの様々な長さの1を超える位置にクラスターをなしている場合もある。このような違いは核酸またはアミノ酸置換または欠失として定義される。約85〜90%を超える相同性または同一性レベルでは、結果はプログラムおよびギャップパラメーターセットには依存しないものとなるはずであり、このような高いレベルの同一性は多くの場合ソフトウエアにたよるまでもなく容易に評価することができる。
【００９４】
本明細書においてプライマーとは、プライマー伸張産物の合成が開始され得る、2以上、典型的には3を超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをさす。合成を行い得る実験条件としては、ヌクレオシド三リン酸、ならびにDNAポリメラーゼなどの重合および伸張のための作用因子、好適なバッファー、温度およびpHの存在が挙げられる。
【００９５】
本明細書において動物とは、限定されるものではないが、ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジ、齧歯類、ブタおよびヒトなどのいずれかの動物である。非ヒト動物とは意図する動物としてヒトを除くものである。本明細書で提供されるSPは動物、植物、原核生物および真菌類などいずれの起源をとするものであってもよい。ほとんどのMTSP10は哺乳類起源など動物起源のものである。
【００９６】
本明細書において遺伝子療法とはこのような処置を求める疾患または症状を有する哺乳類、特にヒトの特定の細胞、すなわち標的細胞に異種核酸(DNAなど)を導入することを含む。DNAなどの核酸は、異種核酸(DNAなど)が発現し、それによってコードされている処置産物が産生されるように、選択された標的細胞へ導入する。あるいはまた、この異種核酸(DNAなど)は何らかの方法で、処置産物をコードするDNAの発現を媒介することができ、あるいはこれは何らかの方法で処置産物の発現を直接または間接的に媒介するペプチドまたはRNAなどの産物をコードすることもできる。遺伝子療法はまた、欠陥遺伝子を代替するまたはそれが導入されている哺乳類または細胞によって産生される遺伝子産物を補足する遺伝子産物をコードする核酸を送達するために使用することもできる。導入された核酸は、哺乳類宿主では本来産生されない、あるいは処置上有効な量または処置上有用な時点で産生されないその増殖因子阻害剤などの処置化合物、またはそのレセプターなどのその腫瘍壊死因子もしくは阻害剤をコードすることができる。処置産物をコードする異種核酸（DNAなど）は、その産生またはその発現を増強する、あるいはまた変化させるために罹患宿主の細胞へ導入する前に改変することができる。遺伝子療法はまた、遺伝子発現の阻害剤またはレプレッサーまたはその他のモジュレーター送達も含み得る。
【００９７】
本明細書において異種核酸とは、in vivoではそれが発現される細胞によっては本来産生されない、あるいは転写、翻訳またはその他の調節可能な生化学的プロセスを変化させることにより内在性核酸(DNAなど)の発現を変化させるメディエーターを媒介またはコードする核酸(DNAがRNAをコードする場合)およびタンパク質である。異種核酸(DNAなど)はまた、外来核酸(DNAなど)と呼ぶこともできる。当業者ならば核酸が発現する細胞に対して異種または外来と認識する、またはみなすであろうDNAなどの核酸はいずれも本明細書においては異種核酸に含まれ、異種核酸には外から加えたものであるが、内生的にも発現する核酸も含まれる。異種核酸の例としては、限定されるものではないが、薬剤耐性を付与するタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸、抗癌剤、酵素およびホルモンなど処置上有効な物質をコードする核酸、および抗体などその他のタイプのタンパク質をコードするDNAなどの核酸が挙げられる。異種核酸によってコードされる抗体はその異種核酸が導入された細胞の表面に分泌または発現させることができる。異種核酸は一般にそれが導入された細胞にとっては内在的なものではなく、別の細胞から得られたものであるか、合成によって作製されたものである。必ずしもそうではないが一般に、このような核酸はそれがこの場合には発現するが、その細胞によっては本来産生されないRNAおよびタンパク質をコードする。
【００９８】
核酸を宿主に導入した際に遺伝性または後天性疾患の徴候、発現を緩和または排除する、あるいはその疾患を治癒する産物が。また、RNAiおよびアンチセンスなどの生物学的に活性な核酸分子も含まれる。
【００９９】
本明細書においてポリペプチドが本質的にプロテアーゼドメインからなると言う場合、ポリペプチドのSP部分だけがプロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分であることを意味する。このペプチドは所望により、また通常は付加的な非SP由来アミノ酸配列を含む。
【０１００】
本明細書において癌または腫瘍処置または薬剤とは、単独で用いる、または他の処置もしくは化合物と併用する場合に、不全型血管形成に関連する臨床徴候または診断マーカーを緩和、軽減、改善、予防または緩解状態にする、もしくは緩解状態で維持し得るいずれの処置法および／または化合物もさす。
【０１０１】
本明細書においてドメインとは、その分子の他の部分とは構造上および／または機能上異なる分子部分、例えばタンパク質またはコード核酸をさす。
【０１０２】
本明細書においてプロテアーゼとは、タンパク質またはペプチドの加水分解を触媒する酵素をさす。これにはそのチモーゲン型および活性型も含まれる。明瞭にするため、プロテアーゼという場合には全ての形態をさし、特定の形態の場合は明示する。本明細書の目的では、このプロテアーゼドメインはSPタンパク質の一本鎖および二本鎖型のプロテアーゼドメインを含む。MTSP10についても、プロテアーゼドメインは一本鎖および二本鎖型のプロテアーゼドメインを含む。
【０１０３】
本明細書において核酸とは、DNA、RNA、ならびにタンパク質核酸(PNA)およびその混合物をはじめとするその類似体を含む。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。プローブまたはプライマーについては所望により蛍光または放射性標識などの検出可能標識で標識した一本鎖分子が考えられる。このような分子はライブラリーのプロービングまたはプライミングのためには、典型的にはそれらの標的が統計学的に独特なものであるか、または低コピー数(典型的には5未満、一般には3未満)となるような長さのものである。一般にプローブまたはプライマーは着目する遺伝子と相補的または同一の少なくとも14、16または30個の連続する配列を含む。プローブおよびプライマーは10、20、30、50、100またはそれ以上の核酸長であってもよい。
【０１０４】
本明細書においてSPの断片または一部をコードする核酸とは、示されたSPの断片または一部だけをコードし、SPの他の連続する部分はコードしない核酸をさす。
【０１０５】
本明細書において、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位ならびにその他のシグナル配列などの調節およびエフェクターヌクレオチド配列に対する異種核酸の作動可能な連結とは、DNAなどかかる核酸とかかるヌクレオチド配列の間の関係をさす。従って作動可能な連結または作動的結合とは、DNAなどの核酸と、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位ならびにその他のシグナル配列などの調節およびエフェクターヌクレオチド配列との機能的関係をさす。例えばプロモーターに対するDNAの作動可能な連結とは、そのDNAとそのプロモーターとの間の、かかるDNAの転写がそのDNAを特異的に認識し、結合して転写するRNAポリメラーゼによってそのプロモーターから開始されるような物理的および機能的関係をさす。発現および／またはin vitro転写を最適化するには、クローンの5'非翻訳部分を除去、付加または変化させて、不適切となり得る余分な択一的翻訳開始コドン、または転写もしくは翻訳いずれかのレベルで発現を妨害し得るまたは低下させ得るその他の配列を除去する必要があり得る。あるいは、共通リボソーム結合部位(例えば、Kozak J. Biol. Chem. 266:19867-19870 (1991)参照)を開始コドンのすぐ5'側に挿入し、発現を増強することができる。このような改変の妥当性は(または必要性)は経験的決定することができる。
【０１０６】
本明細書においてアンチセンスオリゴヌクレオチドに関して少なくともRNAの一部に相補的な配列とは、そのRNAは一般には中または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズして安定な二重らせんを形成し得るに十分な相補性を有する配列を意味し、従って、二本鎖SPアンチセンス核酸の場合には二重らせんDNA(またはdsRNA)の片方の鎖を試験するか、あるいは三重らせんの形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズ能はアンチセンス核酸の相補性の程度および長さによって異なる。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほどそれが含み得るSPコードRNAとミスマッチする塩基が多くなるが、なお、安定した二重らせん(または場合によっては三重らせん)を形成する。当業者ならばミスマッチの許容度をハイブリダイズした複合体の融点を求める標準的な手法を用いることで確認することができる。
【０１０７】
本明細書の目的では、生じるタンパク質がプロテアーゼ活性を示す限り、SPおよびそのプロテアーゼドメインのいずれでアミノ酸置換を行ってもよい。考えられるアミノ酸置換としては、表１に示されるものなどの保存的置換が挙げられ、これらはタンパク質分解活性をなくさない。本明細書に記載されるように、切断部位およびその他のこの種の部位の除去など、タンパク質の特性を変化させる置換も考えられるが、このような置換は一般に非保存的であり、当業者ならば容易に行うことができる。
【０１０８】
アミノ酸の好適な保存的置換は当業者に公知であり、一般に生じる分子の生物活性、例えば酵素活性を変化させずに行うことができる。当業者ならば、一般にポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させないことを認識している(例えば、Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224参照)。また、SP、特に一本鎖プロテアーゼ部分の触媒活性断片も本定義内に含まれる。保存的アミノ酸置換は例えば下記表１で示されるものに従って行う。
【表１】
2005506832.tif 000002
他の置換も可能であり、経験的に、あるいは既知の保存的置換に従って判断することができる。
【０１０９】
本明細書において、Abuは2-アミノ酪酸であり、Ornはオルニチンである。
【０１１０】
本明細書においてアミノ酸は、本明細書で見られる種々のアミノ酸配列で存在するが、周知の三文字または一文字略号に従って識別される。ヌクレオチドは種々のDNA断片で存在するが、当技術分野で通常用いられている標準的な一文字表記で表される。
【０１１１】
本明細書において、本明細書で開示されるヌクレオチド配列に基づくプローブまたはプライマーは配列番号5または配列番号22の少なくとも10、14、典型的には16個の連続するヌクレオチド配列を含み、プローブは配列番号5または配列番号22の少なくとも30、50または100個の連続するヌクレオチド配列を含む。特異的ハイブリダイゼーション用のプローブまたはプライマーの長さは着目するゲノムの複雑性の関数となる。
【０１１２】
本明細書において特定の医薬組成物の投与による特定の疾患の徴候の改善とは、恒久的なものであれ一時的なものであれ、持続的なものであれ一過性のものであれ、組成物の投与に帰すことができる、または組成物の投与に関連する何らかの軽減をさす。
【０１１３】
本明細書においてアンチセンスポリヌクレオチドとは、mRNAまたは二本鎖DNAのセンス鎖に相補的な合成ヌクレオチド塩基配列をさす。適当な条件下でセンスおよびアンチセンスポリヌクレオチドを混合すると、その2分子は結合またはハイブリダイズする。これらのポリヌクレオチドがmRNAと結合(ハイブリダイズ)すると、タンパク質合成(翻訳)の阻害が起こる。これらのポリヌクレオチドが二本鎖DNAと結合すると、RNA合成(転写)の阻害が起こる。このようにして起こる翻訳および／または転写の阻害はセンス鎖によってコードされるタンパク質の合成の阻害をもたらす。アンチセンス核酸分子は典型的には標的核酸と特異的に結合するに十分な数のヌクレオチド、一般に少なくとも5個の連続するヌクレオチド、多くの場合では少なくとも14または16または30個の連続するヌクレオチドまたは着目する遺伝子をコードする核酸分子のコード部分、例えばSPの一本鎖プロテアーゼドメインをコードする核酸に相補的な改変ヌクレオチドを含む。
【０１１４】
本明細書においてアレイとは、3以上のメンバーを含む抗体などのエレメントの集合体である。アドレサブルアレイとは、アレイのメンバーが典型的には固相支持体上の位置によって識別できるものである。よって、一般にアレイのメンバーは固相表面の個別に識別できる位置に固定される。
【０１１５】
本明細書において抗体とは、天然のものであれ、部分的もしくは完全に合成により製造されたものであれ、免疫グロブリンをさし、その抗体の特異的結合能を保持するその誘導体も含む。よって、抗体には免疫グロブリン結合ドメインに相同または実質的に相同な結合ドメインを有するいずれのタンパク質もが含まれる。抗体にはIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEをはじめとするクレームの免疫グロブリンのメンバーが含まれる。
【０１１６】
本明細書において抗体フラグメントとは、全長抗体の特異的結合能の少なくとも一部を保持する全長に満たない抗体のいずれかの誘導体をさす。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Fab、Fab'、F(ab)2、一本鎖Fvs (scFV)、FV、dsFVジアボディーおよびFdフラグメントが挙げられる。フラグメントはジスルフィド結合によるなどして連結された複数の鎖を含む得る。抗体フラグメントは一般に少なくとも約50のアミノ酸、典型的には少なくとも200のアミノ酸を含む。
【０１１７】
本明細書においてFv抗体フラグメントは非共有結合的相互作用によって連結された1つの可変重鎖ドメイン(VH)と1つの可変軽鎖ドメインからなる。
【０１１８】
本明細書においてdsFVとは、VH-VL対を安定化させる操作された分子内ジスルフィド結合を有するFvをさす。
【０１１９】
本明細書においてF(ab)2フラグメントは、免疫グロブリンをペプシンでpH4.0〜4.5にて消化することで得られる抗体フラグメントであり、組換え発現により同等のフラグメントを得ることができる。
【０１２０】
本明細書においてFabフラグメントは、免疫グロブリンをパパインで消化することで得られる抗体フラグメントであり、組換え発現により同等のフラグメントを得ることができる。
【０１２１】
本明細書においてscFVsとはいずれの順序であってもよいがポリペプチドリンカーによって共有結合された可変軽鎖(VL)と可変重鎖(VH)を含む抗体フラグメントをさす。このリンカーは2つの可変ドメインが実質的に干渉することなく架橋されるような長さのものである。含まれるリンカーとしては溶解度を高めるためにいくつかのGluまたはLys残基が全体に分散した(Gly-Ser)n基がある。
【０１２２】
本明細書においてヒト化抗体とは、ヒトへの投与が免疫応答を引き起こさないようにヒトアミノ酸配列を含むように改変された抗体をさす。このような抗体の作製方法は公知である。例えば、このような抗体を生産するためには、モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ、または大腸菌もしくはCHO細胞などのその他の原核もしくは真核細胞においてコード核酸は、不変領域のアミノ酸組成がヒト抗体に基づく抗体を発現するよう、組換え核酸技術によって改変される。このような不変領域を同定するためのコンピュータープログラムが設計されている。
【０１２３】
本明細書において二重特異性抗体(diabody)は二量体scFVであり、二重特異性抗体は典型的にはscFvsよりも短いペプチドリンカーを有し、通常二量体を形成する。
【０１２４】
本明細書において、組換えDNA法を用いることによる組換え手段による産生とは、クローニングされたDNAによってコードされるタンパク質を発現させるための分子生物学の周知の方法の使用を意味する。
【０１２５】
本明細書において評価とは、サンプル中に存在するSPまたはそのドメインの活性の絶対値を得る、また、その活性のレベルの指数、比率、パーセンテージ、視覚その他指標となる値を得るという意味において定量および定性的判定を含むものとする。評価は直接的なものでも間接的なものであってもよく、実際に検出される化学種は、もちろん、それ自体タンパク質分解産物である必要はなく、例えばその誘導体または何らかのさらなる物質であってもよい。
【０１２６】
本明細書において生物活性とは、化合物のin vivo活性、または化合物、組成物またはその他の混合物のin vivo投与時に生じる生理学的応答をさす。よって、生物活性にはこのような化合物、組成物および混合物の処置作用および医薬活性が含まれる。生物活性はこのような活性の試験または使用のために設計されたin vitro系でも観測できる。よって、本明細書の目的では、ルシフェラーゼの生物活性は基質の酸化時に蛍光が生じるそのオキシゲナーゼ活性である。
【０１２７】
本明細書において機能的活性とは、全長タンパク質に伴う1以上の活性を示すポリペプチドまたはその一部をさす。機能的活性とは、限定されるものではないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性(ポリペプチドと結合する、または抗ポリペプチド抗体との結合に関してポリペプチドと競合する能力)、免疫原性、多量体形成能、ポリペプチドのレセプターまたはリガンドと特異的に結合する能力が挙げられる。
【０１２８】
本明細書においてコンジュゲートとは、MTSP10、特にその一本鎖プロテアーゼドメインおよび1以上のターゲッティングエージェントをはじめ、1以上のSPを含む本明細書で提供される化合物をさす。これらのコンジュゲートとしては、組換え手段により融合タンパク質として産生されるもの、例えばメルカプト基とのカップリングのような化学カップリングによるなど、化学的手段によって産生されるもの、および少なくとも1つのSPまたはそのドメインが直接またはリンカーを介して間接的にターゲッティングエージェントに連結されるその他のいずれかの方法によって産生されるものが挙げられる。
【０１２９】
本明細書においてターゲッティングエージェントとは、そのコンジュゲートと、コンジュゲートまたはそのSP部分をインターナライズし得る細胞表面レセプターとの特異的結合を提供するタンパク質またはその有効部分のような任意の一部分である。ターゲッティングエージェントはまた、例えばコンジュゲートのアフィニティー単離または精製、コンジュゲートの表面への結合、あるいはコンジュゲートまたはコンジュゲートを含有する複合体の検出を促進または助長するものであってもよい。
【０１３０】
本明細書において抗体コンジュゲートとは、ターゲッティングエージェントが抗体であるコンジュゲートをさす。
【０１３１】
本明細書において、ある分子の誘導体または類似体とは、その分子に由来する部分またはその分子の改変型をさす。
【０１３２】
本明細書において特定の疾病を処置する化合物の有効量とは、その疾病に伴う症状を改善する、または何らかの方法で軽減するのに十分な量である。このような量は単位投与量として投与してもよいし、それが効果的なものとなる投与計画に従って投与してもよい。この量は疾病を治癒し得るものであるが、疾病の症状を改善するために投与するのが典型である。望ましい症状の改善を達するためには反復投与が必要な場合もある。
【０１３３】
本明細書において2つの核酸配列についていう場合の同等とは、着目するその2つの配列が同じアミノ酸配列または同等のタンパク質をコードすることを意味する。2つのタンパク質またはペプチドに関して同等という場合には、その2つのタンパク質またはペプチドが、そのタンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させないアミノ酸置換(限定されるものではないが、上記表１に示されるもののような保存的変異など)のみを有する実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。同等が特性をさす場合、この特性は同じ程度で存在する必要はない(例えば、2つのペプチドは同種の酵素活性を異なる割合で示してもよい)が、これらの活性は実質的に同じであるのが通常である。2つのヌクレオチド配列に関していう相補的とは、その2つのヌクレオチド配列が対応するヌクレオチド間で典型的には25%未満、15%、5%または0%のミスマッチだけでハイブリダイズし得ることを意味する。必要に応じ相補性のパーセンテージは明示する。この2つの分子は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするように選択するのが典型的である。
【０１３４】
本明細書において、タンパク質の活性または遺伝子もしくは核酸の発現を調節する薬剤はタンパク質の活性を低下または上昇あるいはまた変化させるか、何らかの方法で細胞内での核酸の発現をアップレギュレーションするか、ダウンレギュレーションするか、あるいはまた変化させる。
【０１３５】
本明細書においてSPの活性阻害剤には、in vitroスクリーニングアッセイにおいて、SPの生産、翻訳後修飾、成熟または膜局在化を妨げるまたは低下させるいずれかの物質、あるいはその特に一本鎖型のタンパク質分解能を妨げるまたは低下させるいずれかの物質が含まれる。
【０１３６】
本明細書において新生物形成疾患を処置または予防する方法とは、腫瘍、その転移、腫瘍の血管形成またはその疾病を特徴付けるその他のパラメーターなどの症状のいずれかが軽減される、改善される、予防される、緩解状態とされるまたは緩解状態に維持されることを意味する。それはまた新生物形成疾患および転移の特徴が処置によって排除、軽減または予防されることも意味する。限定されるものではないが、この特徴の例としては制御できない基底膜および近傍の細胞外マトリックスの崩壊、内皮細胞の移動、分裂および新しい機能性毛細管への組織化、およびこのような機能性毛細管の持続が挙げられる。
【０１３７】
本明細書においてこれらコンジュゲートの医薬上許容される塩、エステルまたはその他の誘導体としては、このような誘導体化のための公知の方法を用いて当業者が容易に製造することができ、かつ、実質的な毒性作用なく動物またはヒトに投与できる化合物を形成するいずれかの塩、エステル、または誘導体を含み、これらは医薬上有効であってもプロドラッグであってもよい。
【０１３８】
本明細書においてプロドラッグとは、in vivo投与した際に生物学上、医薬上または処置上有効な形態の化合物へと代謝あるいは変換される化合物である。プロドラッグを製造するには、医薬上有効な化合物を、その有効化合物が代謝プロセスによって再生されるように改変する。このプロドラッグは代謝安定性または薬物の輸送の特徴を変化させるよう、副作用または毒性をマスキングするよう、薬物の香味を改良するよう、あるいは薬物のその他の特徴または特性を変化させるよう設計することができる。in vivoにおける薬物動態プロセスおよび薬物代謝に関する知見によって、当業者ならば医薬上有効な化合物が分かれば、その化合物のプロドラッグを設計することができる(例えば、Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392参照)。
【０１３９】
本明細書において、本明細書で提供されるスクリーニング方法によって同定される薬物とは、処置薬として、または処置薬の設計のためのリード化合物として用いる候補となるいずれかの化合物をさす。このような化合物は有機小分子、ペプチド、ペプチドミメティクス、アンチセンス分子またはRNAiなどのdsRNA、抗体、抗体フラグメント、組換え抗体およびその他薬物候補またはリード化合物として役立ち得る化合物をはじめとする小分子であり得る。
【０１４０】
本明細書においてペプチドミメティックとは、生物活性型の特定のポリペプチドのコンホメーションおよび特定の立体化学的特徴を模倣する化合物である。一般にペプチドミメティクスは化合物のある望ましい特性を模すが、生物活性のあるコンホメーションの欠如や結合の崩壊を招くフレキシビリティーなどの望ましくない特性は模さないように設計する。ペプチドミメティクスは生物活性化合物から、望ましくない特性に寄与する特定の基または結合を生物学的等価体に置き換えることにより作製することができる。生物学的等価体は当業者に公知のものである。例えばエンケフェリン類似体ではメチレンバイオアイソスターCH2Sがアミド置換体として用いられている(例えば、Spatola (1983) pp. 267-357 in Chemistry and BIochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, Weistein, Ed. volume 7, Marcel Dekker, New York参照)。経口投与可能なモルヒネはエンドルフィンペプチドのペプチドミメティックである化合物である。本明細書の目的では、環状ペプチドもペプチドミメティクスに含まれる。
【０１４１】
本明細書においてプロモーター領域またはプロモーターエレメントとは、それが作動可能なように連結されているDNAまたはRNAの転写を制御するDNAまたはRNAセグメントをさす。プロモーター領域はRNAポリメラーゼの認識、結合および転写開始に十分な特定の配列を含む。このプロモーター領域の部分はプロモーターと呼ばれる。また、プロモーター領域はこのRNAポリメラーゼの認識、結合および転写開始活性を調節する配列を含む。これらの配列はシス作用するものであってもよいし、トランス作用因子に応答するものであってもよい。プロモーターはその調節の性質に応じて構成型のものでも調節型のものでもよい。原核生物で用いるのに考えられるプロモーターの例としてはバクテリオファージT7およびT3プロモーターが挙げられる。
【０１４２】
本明細書においてレセプターとは、所定のリガンドに親和性を有する分子をさす。レセプターはレセプターは天然に存在する分子であっても合成分子であってもよい。レセプターはまた当技術分野では抗リガンドとも呼ばれる。本明細書においてレセプターおよび抗リガンドは互換的である。レセプターはそのままの状態で用いてもよいし、他種との集合体として用いてもよい。レセプターは結合メンバーと直接または特定の結合物質もしくはリンカーを介して間接的に共有結合または非共有結合または物理的接触によって結合し得る。レセプターの例としては、限定されるものではないが、抗体、細胞膜レセプター、表面レセプターおよびインターナライジングレセプター、特定の抗原決定基(ウイルス、細胞またはその他の物質上にあるものなど)、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜およびオルガネラと反応性のあるモノクローナル抗体および抗血清が挙げられる。
【０１４３】
レセプターおよびこのようなレセプターを用いる適用の例としては、限定されるものではないが以下のものが挙げられる。
a) 酵素： 抗生物質[リガンド]選択の標的として役立つ、微生物の生存に必須の特定の輸送タンパク質または酵素;
b) 抗体: 着目する抗原のエピトープと結びつく抗体分子上のリガンド結合部位の同定が検討でき、抗原エピトープを模倣する配列の決定が、その免疫原がこのような配列の1以上に基づくワクチンの開発、あるいは自己免疫疾患などに対する処置処置に有用な関連の診断剤または化合物の開発につながり得る;
c) 核酸: タンパク質またはRNAなどのリガンド結合部位の同定;
d) 触媒ポリペプチド: 1以上の反応体の1以上の生成物への変換を含む化学反応を促進し得る、ポリペプチドを含む高分子；このようなポリペプチドは一般に少なくとも1つの反応体または反応中間体に特異的な結合部位およびその結合部位に近接した活性官能基を含み、なおこの官能基は結合した反応体を化学的に修飾し得る(例えば、米国特許第5,215,899号参照);
e) ホルモンレセプター: レセプターと高い親和性で結合するリガンドの同定はホルモン置換療法の開発に有用である。例えば、このようなレセプターと結合するリガンドの同定は血圧を制御する薬物の開発につながり得る;
f) 脳のオピエートレセプターと結合するリガンドの同定はモルヒネおよび関連薬物の常用癖の低い代替物の開発に有用である。
【０１４４】
本明細書においてサンプルとは、アナライトアッセイが望まれるアナライトを含有するいずれのものもさす。サンプルは体液または生体組織などの生体サンプルでありうる。体液の例としては尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、精子、羊水などが挙げられる。生体組織とは、結合組織、上皮組織、筋肉組織および神経組織をはじめとする、細胞の、通常はヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルス構造の構造素材の1つをなすそれらの細胞内物質を伴う特定種の集合体である。生体組織の例としてはまた、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞も挙げられる。
【０１４５】
本明細書においてミスマッチのパーセンテージを判定する際のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは以下の通りである。
1) 高ストリンジェンシー: 0.1×SSPE、0.1% SDS、65℃
2) 中ストリンジェンシー: 0.2×SSPE、0.1% SDS、50℃
3) 低ストリンジェンシー: 1.0×SSPE、0.1% SDS、50℃
【０１４６】
当業者ならば安定なハイブリッドのために洗浄工程を選択することは周知であり、SSPEの成分も分かっている(例えば、Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, in: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), vol. 3, p. B.13、また汎用される実験溶液を記載している多くのカタログも参照)。SSPEはpH7.4リン酸緩衝0.18NaClである。さらに当業者ならばハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度と温度の関数であるTｍ(Tｍ=81.5℃-16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-600/l)によって判定され、従ってハイブリッドの安定性に重要な洗浄工程における唯一のパラメーターがSSPE(またはSSC)のナトリウムイオン濃度と温度であることが分かっている。
【０１４７】
同等のストリンジェンシーは別のバッファー、塩および温度を用いて達成できるものと理解される。限定されるものではないが例として、低ストリンジェンシー条件を用いる方法としては以下の通りである：(また、Shilo and Weinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792 (1981)も参照): DNAを含むフィルターを40℃で6時間、35%ホルムアミド、5X SSC、50mMトリス-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1% PVP、0.1% Ficoll、1% BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNA(10X SSCは1.5M塩化ナトリウム、および0.15Mクエン酸ナトリウム、pH7に調整したものである)を含有する溶液で前処理する。
【０１４８】
ハイブリダイゼーションは以下の改変を伴う同溶液で行う： 0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100μg/mlサケ精子DNA、10%(wt/vol)硫酸デキストラン、および5〜20X 106cpm 32P標識プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で40℃にて18〜20時間インキュベートした後、2X SSC、25mMトリス-HCl(pH7.4)、5mM EDTA、および0.1% SDSを含有する溶液中で55℃にて1.5時間洗浄する。この洗浄溶液を新鮮な溶液に置き換え、60℃にてさらに1.5時間インキュベートする。フィルターをブロットドライし、オートラジオグラフィーに露光する。必要であれば65〜68℃でフィルターの3回目の洗浄を行い、フィルムに再び露光する。使用できるその他の低ストリンジェンシー条件は当業者に公知である(例えば、種間ハイブリダイゼーションに用いられるものなど)。
【０１４９】
限定されるものではないが例として中ストリンジェンシーの条件を用いる方法としては以下の通りである: DNAを含むフィルターを55℃で6時間、6X SSC、5Xデンハート溶液、0.5% SDSおよび100μg/ml変性サケ精子DNAを含有する溶液中で前処理する。同溶液でハイブリダイゼーションを行い、5〜20×106cpm 32P標識プローブを用いる。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中で55℃にて18〜20時間インキュベートした後、1X SSCおよび0.1% SDSを含有する溶液中で60℃にて30分間2回洗浄する。フィルターをブロットドライし、オートラジオグラフィーに露光する。使用できるその他の中ストリンジェンシー条件は当業者に公知である。フィルターの洗浄は2X SSC、0.1% SDSを含有する溶液中で37℃にて1時間行う。
【０１５０】
限定されるものではないが例として高ストリンジェンシー条件を用いる方法は以下の通りである: DNAを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを65℃にて8時間〜一晩、6X SSC、50mMトリス-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA、および500μg/ml変性サケ精子DNAかならるバッファー中で行う。フィルターを、100μg/ml変性サケ精子DNAおよび5〜20×106cpmの32P標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中で65℃にて48時間ハイブリダイズさせる。フィルターの洗浄は2X SSC、0.01% PVP、0.01% Ficoll、および0.01% BSAを含有する溶液中で37℃にて1時間行う。その後、オートラジオググラフィー前に0.1X SSC中で50℃にて45分間の洗浄を行う。使用できるその他の高ストリンジェンシー条件も当業者に公知である。
【０１５１】
実質的に同一または実質的に相同または類似とは関連の技術分野の業者が理解しているように文脈によって異なり、通常には少なくとも60%または70%同じであることを意味し、好ましくは少なくとも80%、85%より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも5%同じであることを意味する。
【０１５２】
本明細書において産物に対して実質的に同一とは、着目する特性がその産物の代わりに実質的に同一の産物を使用できるに十分違いがないというような十分な類似性を意味する。
【０１５３】
本明細書において実質的に純粋とは、 このような純度を評価するために当業者が用いる薄層クロマトグラフィー(TLC)、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などの標準的な分析方法によって判定されるような容易に検出できる不純物を含まないと考えられるに十分均一であること、またはさらなる精製がその物質の酵素および生物活性などの物理・化学的特性を検出できる範囲では変化させないといったように十分純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するための化合物の精製方法は当業者に公知である。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は立体異性体または異性体の混合物であってもよい。このような場合、さらなる精製により化合物の特異的活性が増強され得る。
【０１５４】
本明細書において標的細胞とは、in vivoでSPを発現する細胞をさす。
【０１５５】
本明細書において試験物質(または試験化合物)とは、その作用が本明細書で提供されるアッセイなどのin vitro法によって判定されるような、SP、特にプロテアーゼドメインまたは活性に関して十分なその一部を含む一本鎖型に対するものである化学的に定義された化合物(例えば、有機分子、無機分子、有機/無機分子、タンパク質、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、脂質、多糖類、糖類、または糖タンパク質などのようなこれらの分子のハイブリッド)または化合物の混合物(例えば、試験化合物ライブラリー、天然抽出物または培養上清など)をさす。
【０１５６】
本明細書において処置薬、処置計画、放射線保護剤または化学処置薬とは、ワクチンをはじめ当業者に公知の従来の薬物および薬物療法を意味する。放射線処置薬は当技術分野で周知のものである。
【０１５７】
本明細書において処置とは、症状、疾患または疾病の徴候を改善するあるいは有益な方向に変えるいずれかの方法を意味する。本明細書の組成物の医薬的使用も処置に含まれる。
【０１５８】
本明細書においてベクター(またはプラスミド)とは、発現またはその複製のいずれかの目的で異種核酸を細胞へ導入するために用いる個々のエレメントをさす。これらのベクターは典型的にはエピソームに留まるが、遺伝子またはその一部のゲノム染色体への組み込みを達成するよう設計することもできる。また、酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考えられる。このようなビヒクルの選択または使用は当業者に周知のものである。発現ベクターとしてはプロモーター領域などこのようなDNA断片の発現を達成し得る調節配列と作動可能なように連結されたDNAを発現させ得るベクターが挙げられる。よって発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたはその他のベクターなど、適当な宿主細胞へ導入された際にクローニングされたDNAの発現をもたらす組換えDNAまたはRNA構築物をさす。適当な発現ベクターは当業者に周知であり、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能であるもの、およびエピソームに留まるもの、または宿主細胞ゲノムへ組み込まれるものが含まれる。
【０１５９】
本明細書においてタンパク質結合配列とは、タンパク質またはペプチド配列と、一般には一連のタンパク質またはペプチド配列と、あるいは特定のタンパク質またはペプチド配列と特異的に結合し得るタンパク質もしくはペプチド配列または他の高分子の一部をさす。
【０１６０】
本明細書においてエピトープタグとは、エピトープタグで標識されたタンパク質またはペプチドのその後の生化学的および免疫学的分析を助けるエピトープに相当するアミノ酸残基の短いストレッチをさす。エピトープタグ標識はエピトープタグの配列を適当な発現ベクターのタンパク質コード配列に含めることによって達成される。エピトープタグタンパク質はそれらのタグに対して作製された特異性の高い抗体を用いてアフィニティー精製することができる。
【０１６１】
本明細書において金属結合配列とは、金属イオン、一般には一連の金属イオンまたは特定の金属イオンと特異的に結合し得るタンパク質またはペプチド配列をさす。
【０１６２】
本明細書において組合せとは、2種以上のもののいずれかの会合を意味する。
【０１６３】
本明細書において組成物とは、いずれかの混合物をさす。それは溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはそのいずれの組合せであってもよい。
【０１６４】
本明細書において流体とは、流動可能ないずれかの組成物をさす。よって流体には、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、およびその他この種の組成物の形態にある組成物が含まれる。
【０１６５】
本明細書において細胞抽出液とは、溶解または破砕した細胞からなる調製物または画分をさす。
【０１６６】
本明細書において薬剤は、タンパク質単独で会合しているか、あるいはその会合基質、結合相手などを伴って会合しているかに関連する特定の配列を考えずに無作為にその薬剤を選択する場合には、無作為に選択されるという。無作為に選択される薬剤の例としては、化学ライブラリーまたはペプチドコンビナトリアルライブラリー、あるいは生物の増殖液またはコンディショニング培地の使用がある。
【０１６７】
本明細書において薬剤は、標的部位の配列および／または薬剤の作用と関連したそのコンホメーションを考慮に入れた非無作為性に基づいてその薬剤を選択する場合には、合理的に選択または設計される、という。実施例で記載するように、配列番号3または配列番号4を有するタンパク質においてはセリンプロテアーゼ結合部位および(触媒)部位が提示されている。薬剤はこれらの部位を構成するペプチド配列を用いて合理的に選択または合理的に設計することができる。例えば、合理的に選択されるペプチド剤としては、そのアミノ酸配列がATPまたはカルモジュリン結合部位もしくはドメインと同一であるペプチドが挙げられる。
【０１６８】
限定するものではなく開示を明解にするため、詳細な説明を以下のサブセクションに分ける。
【０１６９】
B. MTSP10ポリペプチド、その突然変異タンパク質、誘導体および類似体
MTSP
MTSPは哺乳類またその他の種で見られるトランスメンブランセリンプロテアーゼファミリーである。MTSPは腫瘍細胞では正常細胞とは異なるレベルで発現かつ／または活性化される、あるいは腫瘍細胞ではその基質または補因子またはレセプターにおける変化などにより正常細胞とは異なる機能的活性を有すると考えられることから着目される。
【０１７０】
MTSPはタンパク質分解細胞外C末端ドメイン；N末端付近に疎水性ドメインを有するトランスメンブランドメイン；短い細胞質ドメイン；およびさらなる調節ドメインを含み得る可変長ステム領域をはじめとするいくつかの共通の構造的特徴を有する。これらのタンパク質分解ドメインは保存されたモチーフに存在する触媒活性に必要な保存されたHis、AspおよびSer残基を含む配列相同性を共有する。これらのMTSPは通常はチモーゲンとして合成され、切断により二本鎖型へと活性化され得る。本明細書では一本鎖タンパク質分解ドメインがin vitroで機能可能であり、従ってこのファミリーメンバーの活性を調節する薬剤を同定するためのin vitroアッセイにおいて有用であることを示す。
【０１７１】
本明細書の目的では、MTSPのプロテアーゼドメインは活性化切断から生じなくともよく、二本鎖活性化産物を商事、むしろN末端がコンセンサス配列↓VVGG、↓IVGG、↓VGLL、↓ILGG、↓IVQG、または↓IVNG  ↓IASGあるいはその他のかかるモチーフを含む一本鎖ポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは活性化切断の結果でもないし二本鎖型でもないが、タンパク質分解(触媒)活性を示す。これらのプロテアーゼドメインポリペプチドはMTSP10の活性を調節する薬剤をスクリーニングするアッセイで用いられる。
【０１７２】
MTSPファミリーは処置的介入の標的であり、腫瘍発達、増殖および／または進行の診断マーカーとしても役立ち得る。上述したように、このファミリーのメンバーは腫瘍発達、増殖および／または進行に関連づけられているタンパク質分解プロセスに関与する。このような関係はECM分解および／またはプロ増殖因子、プロホルモンまたはプロ血管形成化合物の再構築および活性化に関連するプロセスにおけるタンパク質分解酵素としてのそれらの機能に基づいている。さらに、同じ組織の腫瘍細胞と非腫瘍細胞では、それらの発現レベルまたは活性化、もしくは基質レベルまたは基質の変更およびそのレベルに起因するそれらの見掛けの活性のレベルが異なる。同様に腫瘍細胞と非腫瘍細胞の間ではこれらのプロテアーゼ補因子またはレセプターのレベルも異なり得る。従って、それらの活性および／または発現を調節する化合物とそれらを接触させることなどによる、タンパク質分解活性などのそれらの活性およびシグナル伝達および／またはそれらの発現における役割を変化させるプロトコールおよび処理は腫瘍発達、増殖および／または進行に影響を与え得る。また、いくつかの例では、活性化および／または発現のレベルは肺癌、大腸腺癌、および卵巣癌などの腫瘍において変化をもたらし得る。
【０１７３】
MTSP10
MTSP10は腫瘍細胞で発現する、または活性があることから着目される。本明細書で提供されるMTSP10は新生物形成疾患を持たない被験体に比べて新生物形成疾患を有する被験体(すなわち、哺乳類、特にヒト)における活性化および／または発現もしくは機能のレベルにより、特定の腫瘍の診断マーカーとして役立ち得る。さらに、特定の組織において活性(および／または発現)が検出されれば新生物形成疾患の指標とすることができる。本明細書では、本明細書で提供されるMTSP10が特定の腫瘍で発現および／または活性化されることから、それらの活性化または発現が腫瘍の発達、増殖および／または進行の診断マーカーとして役立ち得ることを示す。その他の例では、このMTSPポリペプチドは補因子、基質またはレセプターの活性または発現における変化により活性の変化を示し得る。さらにいくつかの例では、これらのMTSP10および／またはその変異体は細胞表面から放出させる(shed)ことができる。血清、血液、唾液、脳脊髄液、滑液および間質液、尿、汗およびその他このような液体および分泌物などの体液において、放出されたMTSP、特にその細胞外プロテアーゼドメインが検出されれば腫瘍診断マーカーとして役立ち得る。特にこのような放出されたポリペプチドが新生物形成疾患を持たないことが分かっている被験体と比べて、または同じ被験体からの以前のサンプルと比べて被験体でより高いレベルで検出されればその被験体における新生物形成疾患の指標とすることができる。
【０１７４】
ポリペプチドおよび突然変異タンパク質
本明細書ではMTSP10のプロテアーゼドメインを含む単離された実質的に純粋な一本鎖および二本鎖ポリペプチドが提供される。これらのポリペプチドは他の非MTSP配列のアミノ酸も含み得るが、プロテアーゼドメイン、または本明細書で提供されているいずれかのものなど、このようなプロテアーゼ活性を評価するいずれかのin vitroアッセイにおいて触媒活性を示すに十分なその一部を含む。
【０１７５】
本明細書で提供されるMTSP10ポリペプチドは腫瘍細胞により、または腫瘍細胞において、典型的には同じ種類の非腫瘍細胞により発現されたまたは活性化されたレベルとは異なるレベルで発現または活性化される。よって、例えば、MTSPが子宮頚腫瘍細胞で発現するとすれば、非腫瘍性子宮頸細胞でのレベルとは異なるレベルで発現または活性化される。MTSP10の発現または活性化は子宮頚癌、肺癌、食道癌、大腸癌、前立腺癌、子宮癌、膵臓癌、乳癌およびその他の腫瘍の指標とすることができる。
【０１７６】
プロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分を含む単離された実質的に純粋なプロテアーゼが提供される。一本鎖型および二本鎖型のMTSP10が提供される。これらのプロテアーゼドメインはより大きなタンパク質に含まれてもよく、このようなより大きなタンパク質は所望によりMTSP10チモーゲンであってよい。MTSP10をコードする核酸およびプロテアーゼドメインのタンパク質配列の例は配列番号5および6で示されている。本明細書ではまた、配列番号5または配列番号22で示される配列を含む全長MTSP10をコードする核酸分子および配列番号6または配列番号23の残基1〜230で示されているアミノ酸配列またはその触媒活性部分を含むポリペプチドも提供される。このようにMTSP10ポリペプチドは配列番号6の残基1〜230または配列番号23の残基463〜492で示されるアミノ酸配列を含む。プロテアーゼ活性を保持するそのより小さな部分も考えられる。
【０１７７】
実質的に精製されたMTSP10プロテアーゼは、少なくとも中、通常は高ストリンジェンシーの、そのプロテアーゼドメインコード核酸がその全長にわたって、あるいは全長の少なくとも約70%、80%または90%にわたってハイブリダイズするような条件下で、配列番号6で示される残基1〜230をコードするヌクレオチド配列によってコードされるプロテアーゼドメインを含む核酸分子とハイブリダイズする核酸によってコードされている。ある実施形態では、実質的に精製されたMTSPプロテアーゼは配列番号6の残基1〜230で示されるアミノ酸配列またはその触媒活性部分を実質的に含む一本鎖ポリペプチドである。
【０１７８】
また、実質的に精製されたMTSP10チモーゲン、活性化二本鎖型、一本鎖プロテアーゼドメインおよび二本鎖プロテアーゼドメインも含まれる。これらのポリペプチドは触媒活性を示し、かつ、配列番号5または配列番号22で示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と、典型的には中、通常は高ストリンジェンシー条件下で、通常はそのプロテアーゼドメインの全長にわたって、または全長の少なくとも約70%、80%または90%(または実質する的に全長)にわたってハイブリダイズするプロテアーゼドメインをコードする配列を含む核酸によってコードされる。本明細書ではまたスプライス変異体も意図される。
【０１７９】
構造的特徴
配列番号23のMTSP10の触媒トリアッドはH503、D551およびS647である。MTSP10のジスルフィド結合対は以下の通りである：C488-C504、C587-C653；C619-C632；C643-C673。プロテアーゼドメイン内にあるCys573はそのドメインの外側のCys596と結合し、一本鎖型のプロテアーゼドメインにおいては対合していない。
【０１８０】
MTSP10は残基463〜692(配列番号23；配列番号6の残基1〜230に相当)の触媒ドメインおよびトランスメンブランドメインの他にいくつかのドメインを含む。これらはそれぞれaa104-217およびaa222-335の2つのCUBドメイン；それぞれaa340-377、aa381-412およびaa415-453の3つのLDLaドメインを含む。
【０１８１】
プロテアーゼドメイン
MTSPプロテアーゼドメインはMTSP10の一本鎖プロテアーゼドメインを含む。いずれかのMTSP、特にMTSP10のプロテアーゼドメインであるMTSPの部分を含むプロテアーゼドメインまたはタンパク質が提供される。このタンパク質はアミノ酸のその他の非MTSP配列も含んでもよいが、本明細書で提供されるものなど、プロテアーゼドメインまたはこのようなプロテアーゼ活性を評価するいずれかのin vitroアッセイで触媒活性を示すに十分なその一部を含む。また、二本鎖活性型の全長プロテアーゼ、および二本鎖型のプロテアーゼドメインも提供される。このように、プロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分を一本鎖型のSPとして含む単離された実質的に純粋なプロテアーゼが提供される。これらのプロテアーゼドメインはより長いタンパク質に含まれていてもよく、このような長いタンパク質は所望により全長を含み全長までの活性化MTSP10タンパク質、またはMTSP10チモーゲンであってもよい。
【０１８２】
特に例としてのプロテアーゼドメインは、配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列(配列番号5または配列番号22のヌクレオチドによってコードされている)の、in vitroにおいて触媒活性を保持するのに少なくとも十分な部分を含む。
【０１８３】
断っておくが、MTSPのプロテアーゼドメインはチモーゲンが活性化された際に切断部位(一般にコンセンサス配列R↓VVGG、R↓IVGG、R↓IVQ、R↓IVNG、R↓ILGG、R↓VGLL、R↓ILGGまたはその変異体；N末端R↓VまたはR↓I、なお矢印は切断部位を表す)でN末端(IV、VV、ILおよびIIなど)を生じる一本鎖ポリペプチドまたは二本鎖ポリペプチドである。産生される例としてのMTSP10のプロテアーゼドメインは配列番号23のR462と残基463のIの間での活性化切断(R↓I)によって生じ、配列番号23で示されるような配列R↓IIGGTを含む。一本鎖型は配列番号6の残基1〜230またはその触媒活性部分を含む。よって本明細書では、プロテアーゼドメイン(配列番号23の残基463〜692)またはその触媒活性断片を含むいずれの長さのポリペプチドも意図される。また二本鎖型も提供され、配列番号23の少なくともC296からC537(含む)までのポリペプチド、またはそれと少なくとも60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するMTSP10の対応する残基、および／または
a)配列番号6で示されるアミノ酸、特にアミノ酸１〜230の配列を含むポリペプチド；
b)配列番号23で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
c)配列番号5または配列番号22で示されるヌクレオチド配列と低、中または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、あるいはその全長の少なくとも70%、80%、90%または95%にそってハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
d)配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列またはその触媒活性ドメインを含むポリペプチド
e)配列番号6または配列番号23で示されるアミノ酸配列と少なくとも約60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド；および／または
f)a)〜e)のいずれかのMTSP10をコードするヌクレオチド配列のスプライス変異体によってコードされるポリペプチドのプロテアーゼドメインを含む。
【０１８４】
また、(a)〜(e)として以下に明示される基準を満たす核酸分子によってコードされるポリペプチドも提供される。
【０１８５】
突然変異タンパク質および誘導体
全長MTSP10、チモーゲンおよびその活性型、ならびにMTSP10プロテアーゼドメイン、その一部、ならびにこのようなポリペプチドの突然変異タンパク質および誘導体が提供される。機能的に活性なMTSP10のドメイン、断片、誘導体または類似体は、セリンプロテアーゼ活性、免疫原性および抗原性など、MTSP10ポリペプチドに関連する1以上の機能的活性を示し得る。
【０１８６】
誘導体としては、限定されるものではないが、マウスおよびラットなどの齧歯類；ニワトリなどの鳥類;ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物;ブタなどのヒツジ(ovine such as pigs);およびヒトをはじめとする動物のMTSP10に基づくものがある。例えばMTSP10誘導体は置換、付加または欠失によってそれらの配列を変更することで作出することができる。MTSP10誘導体としては、限定されるものではないが、配列内の残基が機能的に同等なアミノ酸残基で置換されてサイレント変異となっている変異配列を含むMTSP10の全アミノ酸配列または部分アミノ酸配列を主要なアミノ酸配列として含むものが挙げられる。例えば、配列内の1以上のアミノ酸残基が、機能的同等物として働く類似極性の別のアミノ酸で置換してサイレント変異を生じさせることができる。配列内の1つのアミノ酸の置換はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば非極性（疎水性）アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる(例えば、表１参照)。そのアミノ酸の約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%または95%までが別のアミノ酸で置換されているMTSP10、またはプロテアーゼドメインなどのそのドメインの突然変異タンパク質も提供される。一般にこのような突然変異タンパク質は非変異型タンパク質のプロテアーゼ活性の少なくとも約1%、2%、3%、5%、7%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%を保持する。当業者ならば野生型プロテアーゼの活性の少なくとも1%を保持するポリペプチドがスクリーニングアッセイまたはその他の適用に用いるために十分な活性があることが分かる。
【０１８７】
そのアミノ酸の約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%までが別のアミノ酸で置換されているのMTSP10、またはプロテアーゼドメインなどのそのドメインの突然変異タンパク質も提供される。一般にこのような突然変異タンパク質は非変異型タンパク質のプロテアーゼ活性の少なくとも約1%、2%、3%、5%、7%、8%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%または90%(活性の増強としてはすなわち101、102、103、104、105、110%またはそれ以上)を保持する。
【０１８８】
本明細書で提供されるポリペプチドとしては、MTSP10プロテアーゼドメイン、またはその特異性およびプロテアーゼ活性が実質的変化しない、あるいは約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%など明示されたパーセンテージだけ変化する(上昇または低下する)ようなアミノ酸変化を有するポリペプチドが含まれる。特にトランスメンブラン(TM)ドメインを有する実質的に精製された哺乳類MTSPポリペプチドが提供され、これはさらに2つのCUBドメイン、3つのLDLレセプター型ドメインおよびセリンプロテアーゼ触媒ドメインを含む。
【０１８９】
また、MTSP10と少なくとも60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質も提供され、ここでこの同一性%は同一性%を最大にする標準的なアルゴリズムおよびギャップペナルティーを用いて求められる。ヒトMTSP10ポリペプチドが含まれるが、他の哺乳類のMTSP10ポリペプチドも意図される。必要であれば厳密な同一性%も明示することができる。
【０１９０】
1以上のCys残基、特に活性化二鎖型では対合しているが、プロテアーゼドメイン単独では対合していない残基がいずれかのアミノ酸、必ずしも必要ではないが典型的にはSerなどの保存的アミノ酸残基で置換されている突然変異タンパク質が意図される。MTSP10の突然変異タンパク質、特に一本鎖プロテアーゼドメインのCys573などのCys残基がSer、GlyまたはAlaなどの別のアミノ酸で置換され、活性をなくしていないものが提供される。また、配列番号6で示されるアミノ酸、特に1〜230のアミノ酸の配列を含むプロテアーゼドメインまたはその触媒活性断片と少なくとも約60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する、実質的に精製されたMTSP10ポリペプチドおよびその機能的ドメイン(触媒活性ドメインおよび一部を含む)も提供される。
【０１９１】
アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているこのタンパク質の突然変異タンパク質も提供される。突然変異タンパク質としてはCys残基が、典型的にはセリンなどの保存的アミノ酸残基で置換されているものが挙げられる。本明細書ではこのような突然変異タンパク質も提供される。アミノ酸配列の10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%またはそれ以上が置換されているが、生じるポリペプチドが同じ基質に対する非改変型としての触媒活性の少なくとも約1%、2%、3%、5%、7%、8%、10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%または95%を保持する突然変異タンパク質が提供される。
【０１９２】
突然変異タンパク質は保存的アミノ酸置換およびまた非保存的アミノ酸置換を作出することによって作製できる。例えばタンパク質の特性を望ましく変化させるアミノ酸置換を作出することができる。ある実施形態では、ポリペプチドの分解を防ぐ突然変異は作出することができる。多くのプロテアーゼはRおよびKなどの塩基性残基の後で切断するが、このような切断をなくすには、この塩基性残基を非塩基性残で置換する。また、プロテアーゼドメインの外側のアミノ酸における非保存的変化はプロテアーゼ活性を変化させずに行うことができる。プロテアーゼ活性以外の活性を担うアミノ酸における非保存的変化が望ましい場合がある。例えばプロテアーゼと阻害剤との相互作用は阻害剤とプロテアーゼの相互作用部位において非保存的変化を果たすことで、触媒活性を保持したまま遮断することができる。同様に、レセプター結合も、レセプターとプロテアーゼの相互作用部位において非保存的または保存的変化を果たすことで、触媒活性を変化させずに変化させることができる。
【０１９３】
MTSP10の少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、典型的には10〜15のアミノ酸を含む抗原エピトープが提供される。これらの抗原エピトープは例えば抗体を作製するために使用される。各エピトープまたはそれらの組合せ、および一本鎖および二本鎖型に特異的な抗体も提供される。
【０１９４】
核酸分子、ベクターおよびプラスミド、細胞およびMTSP10ポリペプチドの発現
核酸分子
ヌクレオチドコード配列の縮重により、MTSPと実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の核酸配列も考えられる。これらには限定されるものではないが、その配列内にそのアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって改変され、従ってサイレント変異を生じるMTSP10コード遺伝子の全てまたは一部を含む核酸分子が含まれる。
【０１９５】
核酸
本明細書ではまた、MTSP10をコードする核酸分子およびコードされるタンパク質も提供される。特にそのスプライス変異体をはじめ、動物由来のMTSP10をコードする核酸分子が提供される。コードされるタンパク質もまた提供される。また、その機能的ドメインも提供される。提供される核酸分子の各々について核酸はDNAでもRNAでもPNAでもその他の核酸類似体であってもよく、あるいは非天然ヌクレオチド塩基を含んでもよい。また、MTSPをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子も提供される。
【０１９６】
また、in vitroタンパク質分解アッセイにおいてタンパク質分解活性を有する一本鎖または二本鎖MTSPプロテアーゼをコードするか、MTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインの全長と少なくとも60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有するか、あるいはプロテアーゼドメインをコードする核酸と特に中、通常は高ストリンジェンシー条件下で、それらの全長にわたって、または全長核酸の少なくとも約70%、80%または90%にわたってハイブリダイズする核酸も提供される。上記のように、コードされるポリペプチドは一本鎖としてのプロテアーゼを含み、その活性型も作出でき、提供される。
【０１９７】
ある実施形態では、MTSP10と呼ばれるMTSPをコードする核酸分子が提供される。この核酸分子は配列番号5または配列番号22で示されるヌクレオチド配列においてオープンリーディングフレームを含む。また、以下の核酸配列(配列番号5)、特にその単一のプロテアーゼドメインまたはMTSP10のいずれかのドメインをコードするヌクレオチドにより包含されるオープンリーディングフレームと少なくとも低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、通常は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸分子も提供される。
【０１９８】
特定の実施形態では、この単離された核酸断片は配列番号5で示されるヌクレオチド配列を有する核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、通常は配列番号5のヌクレオチド1〜690で示されるヌクレオチド配列を含む。このタンパク質はトランスメンブランドメイン(TM)およびセリンプロテアーゼドメインを含み、CUBドメインおよびLDLRドメインをはじめとする付加的なドメインを含み得る。
【０１９９】
また、アミノ酸が他のアミノ酸で置換されているポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異タンパク質も提供される。突然変異タンパク質としては、Cys残基をコードするコドンがセリンをコードするコドンなどの他のアミノ酸残基で置換されているものがある。本明細書ではこのような突然変異タンパク質も提供される。このような各ドメインはこのようなドメインをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であるので本明細書で提供される。いくつかのMTSPではLDLRドメイン、スカベンジャー-レセプターシステイン豊富(SRCR)ドメインおよびその他のドメインをさらに含むことができる。
【０２００】
単離された核酸断片はゲノムDNAまたはcDNAをはじめとするDNAであるか、RNAであるか、あるいはペプチド核酸(PNA)およびその他のヌクレオチド類似体のようなその他の成分を含み得る。単離された核酸分子は異種または天然プロモーター、およびその他の転写および翻訳調節配列などの付加的な成分を含むことができ、これらの遺伝子はレポーター遺伝子またはその他の指標遺伝子すなわち指標をコードする遺伝子などその他の遺伝子と連結させることができる。
【０２０１】
また、MTSP10をコードする上記ヌクレオチド配列と少なくとも低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、典型的には高ストリンジェンシーでハイブリダイズし、かつ、プロテアーゼドメインおよび／またはMTSP10の全長タンパク質もしくは全長プロテアーゼドメインもしくはその他のドメインの少なくとも60%、70%、80%もしくは90%、あるいはそのスプライス変異体または対立遺伝子変異体をコードする核酸分子も提供される。通常、これらの分子はこのような条件下で少なくとも1つのドメインに関してそれらの全長にわたって、または全長の少なくとも70%、80%もしくは90%にわたってハイブリダイズし、プロテアーゼまたは細胞外ドメインなど、そのポリペプチドの少なくとも1つのドメインをコードする。特にこのような核酸分子としては、少なくとも1つの膜セリンプロテアーゼドメインをコードし、(1)プロテアーゼまたはそのドメインをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ、(2)以下：
(a)配列番号5、特にヌクレオチド1〜690、または配列番号22で示されるヌクレオチド配列を含むプロテアーゼまたはそのドメインをコードするヌクレオチド配列；
(b)このような部分または全長プロテアーゼをコードし、かつ、通常、このようなタンパク質またはその断片をコードする哺乳類細胞に存在するmRNA転写物に相補的な核酸と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
(c)配列番号5、特にヌクレオチド1〜690、または配列番号22で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチドセットの配列を含むプロテアーゼまたはそのドメインをコードするヌクレオチド配列；
(d)このような部分もしくは全長オープンリーディングフレームによってコードされるアミノ酸配列を含むトランスメンブランプロテアーゼまたはそのドメインをコードするヌクレオチド配列；
(e)配列番号5または配列番号22で示される配列と少なくとも約60%、70%、80%、90%または95%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプロテアーゼまたはそのドメインをコードするヌクレオチド配列；
(f)このようなサブユニットをコードし、かつ、mRNA転写物に相補的なDNAと低、中または高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むトランスメンブランプロテアーゼをコードするヌクレオチド配列；
の中から選択される、いずれかの単離された核酸断片を含む。
【０２０２】
単離された核酸断片とは、MTSPコード配列の少なくとも10ヌクレオチド、25ヌクレオチド、50ヌクレオチド、100ヌクレオチド、150ヌクレオチドまたは200ヌクレオチド以上の連続するヌクレオチド、あるいは全長SPコード配列を含み得る。もう1つの実施形態では、これらの核酸は35、200または500ヌクレオチド長よりも短い。MTSP10コード核酸とハイブリダイズする、またはMTSP10コード核酸と相補的な核酸は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。例えばMTSP10コード核酸の少なくとも10、25、50、100もしくは200ヌクレオチド、または全コード領域、特にそのプロテアーゼドメインと相補的な配列(特にその逆相補物である)を含む核酸が提供される。MTSP10についてはその全長タンパク質またはドメインまたは活性断片も提供される。
【０２０３】
プローブ、プライマー、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびdsRNA
また、プローブまたはプライマーとして使用でき、少なくとも約10ヌクレオチド、14ヌクレオチド、通常は少なくとも約16ヌクレオチド、多くの場合では約30ヌクレオチドを含むその断片も提供される。このプローブまたはプライマーの長さはプロービングするゲノムの大きさの関数であり、ゲノムが大きいほど単一部位に対する特異的ハイブリダイゼーションに必要とされるプローブまたはプライマーが大きい。当業者ならば適当な大きさのプローブおよびプライマーを選択することができる。記載されるように一般に一本鎖である。使用時に変性させれば二本鎖プローブおよびプライマーも使用できる。
【０２０４】
これら核酸分子に由来するプローブおよびプライマーも提供される。このようなプローブおよびプライマーはMTSP10の連続するヌクレオチドと同一な少なくとも8、14、16、30、100以上の連続するヌクレオチドを含み、配列番号5または配列番号22の少なくとも14、16、30、50または100の連続するヌクレオチド配列のプローブがある。これらのプローブおよびプライマーは所望により放射性標識または蛍光タグなどの検出可能な標識で標識してもよく、あるいは質量分析またはその他の手段で検出できるだけの異なる質量を有していればよい。
【０２０５】
また、MTSP10をコードするヌクレオチド配列またはその一部に相補的な分子の配列を含む単離された核酸分子も提供される。RNAiなどの二本鎖RNA(dsRNA)も提供される。
【０２０６】
プラスミド、ベクターおよび細胞
これらの核酸分子を含むプラスミドおよびベクターも提供される。コードされたタンパク質を発現する細胞をはじめ、これらのベクターを含む細胞も提供される。細胞は細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞または動物細胞であってもよい。本明細書では、MTSPまたはその一本鎖型のプロテアーゼドメインを、例えばコードされるMTSPが細胞によって発現されるような条件下で細胞を増殖させ、発現したタンパク質を回収することによって産生させる方法も提供される。なお、MTSP10に関しては全長チモーゲンおよび活性化タンパク質および活性化(二本鎖)プロテアーゼおよび一本鎖プロテアーゼドメインが提供される。本明細書に記載されるように、これらの細胞は細胞質において分泌または発現可能なタンパク質の発現に用いられる。
【０２０７】
以下に述べるように、MTSP10ポリペプチドおよびその触媒活性部分は細胞表面で発現させることができる。さらにその全てまたは一部を天然シグナル配列または異種シグナルを用いて分泌タンパク質として発現させることもできる。あるいはそのポリペプチドの全てまたは一部を封入体として細胞質中で発現させ、それから単離することもできる。必要であれば得られたタンパク質は再折りたたみすべく処理することができる
【０２０８】
上記の考察は例示されるMTSP10の概要といくつかの詳細を示すものである。
【０２０９】
C. 腫瘍特異性および組織発現プロフィール
MTSPは腫瘍細胞では正常細胞とは異なるレベルで発現および／または活性化される、あるいはMTSPに対する基質またはMTSPの補因子もしくはレセプターにおける変更によるなど腫瘍細胞では正常細胞とは異なる機能的活性を有すると考えられることから着目される。MTSP10は腫瘍細胞で発現または活性化されることから着目される。よって本明細書で提供されるMTSPは特定の腫瘍に対する診断マーカーとして役立ち得る。
【０２１０】
MTSPは各々特徴的な組織発現プロフィールを有し、特にMTSPはもっぱら腫瘍で発現または活性化されるというわけではないが、特徴的な腫瘍組織発現または活性化プロフィールを示す。MTSPはその基質または補因子またはレセプターもしくはMTSPの機能的活性を変化させるその他の因子に違いがあるために腫瘍細胞では非腫瘍細胞とは異なる活性を有する場合がある。従って、新生物形成疾患を持たない被験体に比較した新生物形成疾患を有する被験体(すなわち哺乳類、特にヒト)における活性および／または発現のレベル、あるいは機能によって、各々特定の腫瘍の診断マーカーとして役立ち得る。さらに、特定の組織での活性(および／または発現)の検出は新生物形成疾患の指標となり得る。体液中に放出された(shed)MTSPは新生物形成疾患は指標となり得る。また、各々の活性および／または発現プロフィールにより、それらはその活性のモジュレーターの投与またはMTSPの1つによって特異的に活性化されるプロドラッグの投与によるなど、処置標的としても役立ち得る。
【０２１１】
組織発現プロフィール
MTSP10
MTSP10転写物は膵臓、肺および腎臓で検出された。MTSP10転写物はまた小腸Marathon-Ready cDNA (Clontech)でも検出されている。MTSP10転写物は乳癌(GI-101)、肺癌(LX-1およびGI-117)、卵巣癌(GI-102)、および膵臓腺癌(GI-103)でも検出されている。MTSP10転写物は前立腺腺癌(PC3)でも検出されている。MTSP10転写物はまたヌードマウスで増殖したCWR22R前立腺腫瘍でも検出されている。2つの形態の大腸腺癌(GI-112およびCX-1)では明確なシグナルは検出されていない。
【０２１２】
D.  MTSPポリペプチド遺伝子の同定および単離
MTSP10ポリペプチドおよび／またはそのドメインはタンパク質精製および組換えタンパク質発現に関する当技術分野で周知の方法によって得ることができる。目的の遺伝子をコードする核酸の同定には当業者に公知のいずれの方法を用いてもよい。MTSPポリペプチドをコードする全長(すなわち全コード領域を包含する)cDNAまたはゲノムDNAクローンを得るには当技術分野で利用できるいずれの方法を用いてもよい。例えば、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーにおいて、正常および腫瘍細胞または組織で発現される配列、例えばMTSP10ポリペプチド(配列番号5および17)をコードする核酸を増幅するにはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることができる。適当な起源(例えば腫瘍または癌組織)に由来する核酸サンプル(RNAまたはDNA)、通常はcDNAライブラリーから配列をPCR増幅するためのプライマーとして、同定された配列の3'および5'末端の配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。
【０２１３】
PCRは例えばPerkin-Elmer CetusサーマルサイクラーとTaqポリメラーゼ(Gene Amp(商標))を用いて行うことができる。増幅されるDNAとしては、真核生物由来のmRNAまたはcDNAまたはゲノムDNAのいずれもが含まれる。PCR反応に用いる場合、いくつかの異なる縮重プライマーを合成することも選択できる。既知のヌクレオチド配列と単離される核酸ホモログとの間のより高い、またはより低い程度のヌクレオチド配列類似性を考慮することで核酸ホモログを増幅するため(例えば、ヒト以外の種に由来するMTSPポリペプチド配列を得るため、またはMTSP10ポリペプチドとの相同性を有するヒト配列を得るため)にはPCR反応の誘導に用いるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることもできる。種間ハイブリダイゼーションでは、低〜中ストリンジェンシー条件を用いる。同種ハイブリダイゼーションでは、中〜高ストリンジェンシー条件を用いる。これらの条件は経験的に決定することができる。
【０２１４】
同定されたMTSPポリペプチド配列の全てまたは一部を含む核酸、またはMTSPポリペプチドホモログの全てまたは一部をコードする核酸が首尾よく増幅されれば、そのセグメントを分子クローニングして配列決定し、それをプローブとして用いて完全なcDNAまたはゲノムクローンを単離することができる。次には、この遺伝子の完全ヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および機能分析のためのそのタンパク質産物の生産が可能となる。ヌクレオチド配列が決定されれば、オープンリーディングフレームの決定のための当技術分野で周知のいずれかの方法、例えばヌクレオチド配列解析のための公開コンピュータープログラムを用いてMTSPポリペプチド遺伝子のタンパク質産物をコードするオープンリーディングフレームを決定することができる。オープンリーディングフレームが定義されれば、そのオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定するのが通例である。このようにして完全なMTSPポリペプチド遺伝子のヌクレオチド配列ならびにMTSPポリペプチドタンパク質および類似体のアミノ酸配列を同定することができる。
【０２１５】
いずれの真核細胞であってもMTSPポリペプチド遺伝子の分子クローニングの核酸ソースとして利用できる可能性がある。これらの核酸は脊椎動物、哺乳類、ヒト、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、ウマ、イヌ、ならびにその他の霊長類ソース、昆虫、植物およびその他の生物から単離できる。DNAはクローニングされたDNA(例えばDNA「ライブラリー」)から当技術分野で公知の標準的な方法により、化学合成により、cDNAクローニングにより、または所望の細胞から精製したゲノムDNAもしくはその断片のクローニングにより得ることができる(例えば、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover, D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, II参照)。ゲノムDNAに由来するクローンはコード領域の他、調節DNA領域およびイントロンDNA領域を含み得るが、cDNA由来のクローンはエキソン配列しか含まない。遺伝子はそのソースに関わらずその複製に好適なベクター中へ分子クローニングしなければならない。
【０２１６】
ゲノムDNA由来の遺伝子の分子クローニングでは、そのある部分が目的の遺伝子をコードするDNA断片を作製する。このDNAは種々の制限酵素を用いて特定の部分で切断することができる。あるいは、マンガンの存在下でDNAアーゼを用いてDNAを断片化してもよいし、例えば音波処理によりDNAを物理的に剪断してもよい。この線状DNA断片は次に、限定されるものではないが、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーをはじめとする標準的な技術によって大きさに従って分離することができる。
【０２１７】
DNA断片が作製できれば、いくつかの方法で目的遺伝子を含む特定のDNA断片の同定を行うことができる。例えばMTSPポリペプチド(いずれの種のものであってもよい)遺伝子(例えば上記のようにして得られたPCR増幅産物または既知のヌクレオチド配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチド)またはその特定のRNAの一部、またはその断片を精製および標識し、作製したDNA断片を、標識プローブとの核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることができる(Benton and Davis, Science 196:180 (1977); Grunstein and Hogness, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961 (1975))。プローブと実質的相同性を有するDNA断片がハイブリダイズする。また、制限酵素消化して、利用できるならば既知の制限地図に従って予測されたものと断片サイズを比較することにより、あるいはDNA配列解析を行い、既知のMTSPポリペプチドのヌクレオチド配列と比較することにより適当な断片を同定することもできる。遺伝子の特性をもとにさらなる選択を行うこともできる。あるいは、その発現産物の物理的、化学的または免疫学的特性に基づくアッセイにより、その遺伝子の存在を検出することもできる。例えばcDNAクローンまたは適切なmRNAをハイブリッド選択するDNAクローンとしては、例えば類似または同じ電気泳動での移動、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図、抗原特性、セリンプロテアーゼ活性を有するタンパク質を生じるものを選択することができる。抗MTSPポリペプチド抗体が利用できる場合にはELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)型の手法において標識した抗体とMTSPポリペプチドを合成すると推定されるクローンを結合させることによりタンパク質を同定することができる。
【０２１８】
MTSP10ポリペプチドゲノムDNAを単離する別法としては、限定されるものではないが、既知の配列から遺伝子配列を化学合成すること、またはcDNAからMTSPタポリペプチドをコードするmRNAを作製することが挙げられる。例えば、MTSPポリペプチド遺伝子のcDNAクローニングのためのRNAをそのタンパク質を発現する細胞から単離することができる。次に、同定および単離された核酸を適当なクローニングベクターへ挿入することができる。当技術分野で公知の多数のベクター-宿主系を使用できる。可能性のあるベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミドまたは改変ウイルスがあるが、このベクター系は用いる宿主細胞に適合するものでなければならない。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、λ誘導体などのバクテリオファージ、またはpBR322もしくはpUCプラスミド誘導体などのプラスミドまたはBluescriptベクター(Stratagene, La Jolla, CA)が挙げられる。クローニングベクターへの挿入は例えばそのDNA断片を相補的付着端を有するクローニングベクターへ連結することで達成することができる。断片に対して相補的な制限部位を用いれば、そのDNAはクローニングベクターには存在せず、DNA分子の末端は酵素的に修飾することができる。あるいは、そのDNA末端にヌクレオチド配列(リンカー)を連結することで所望のいずれの部位も作製できるが、これらの連結リンカーは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする化学合成された特異的オリゴヌクレオチドを含むことができる。別法としては、切断したベクターおよびMTSPポリペプチド遺伝子をホモポリマーテーリングにより改変することもできる。組換え分子は形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、カルシウム沈殿およびその他の方法によって宿主細胞に導入することができ、これにより多数の遺伝子配列コピーが作出される。
【０２１９】
特定の実施形態では、単離されたMTSPポリペプチド遺伝子、cDNAまたは合成DNA配列を組み込んだ組換えDNA分子で宿主細胞を形質転換することにより複数の遺伝子コピーを作出することができる。従って、形質転換体を増殖させ、その形質転換体から組換えDNA分子を単離し、必要であれば単離した組換えDNAから挿入遺伝子を回収することにより多量の遺伝子を得ることができる。
【０２２０】
E. MTSPポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインをコードする核酸を含むベクター、プラスミドおよび細胞、ならびにMTSPタンパク質の発現
ベクターおよび細胞
1以上のMTSPポリペプチドを組換え発現させるには、MTSPポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む核酸を適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。また、必要な転写および翻訳シグナルもMTSP遺伝子の天然プロモーターおよび／またはそれらのフランキング領域によって提供することができる。
【０２２１】
また、MTSPをコードする核酸を含むベクターも提供される。それらのベクターを含む細胞も提供される。細胞としては真核および原核細胞が含まれ、ベクターは使用に好適ないずれのものであってもよい。
【０２２２】
ベクターを含む、内皮細胞をはじめとする原核および真核細胞が提供される。このような細胞としては細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が挙げられる。これらの細胞は、(a)コードされるMTSPポリペプチドまたはMTSPポリペプチドのプロテアーゼドメインが細胞によって発現されるような条件下で上記細胞を増殖させ、次に(b)発現したプロテアーゼドメインタンパク質を回収することにより、MTSPポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインを生産するのに用いられる。例示的な実施形態では、このプロテアーゼドメインは培地中に分泌される。
【０２２３】
ある実施形態では、プロテアーゼ活性を有し、SPタンパク質のプロテアーゼドメインのみの全てまたは一部、またはその複数コピーを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターが提供される。また、そのプロテアーゼドメインおよび全長SPタンパク質まで(全長を含む)のさらなるSPタンパク質の部分、ならびにその複数コピーをコードするヌクレオチド配列を含むベクターも提供される。これらのベクターは細胞中でのSPタンパク質またはそのプロテアーゼドメインの発現に関して、あるいはSPタンパク質が分泌タンパク質として発現するように選択することができる。あるいは、これらのベクターはコードされたタンパク質の分泌に必要なシグナルを含むこともできる。プロテアーゼドメインが発現すると、核酸はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α接合因子シグナル配列もしくはその一部などの分泌シグナルまたは天然シグナル配列をコードする核酸と結びつく。
【０２２４】
タンパク質コード配列を発現させるには多様な宿主-ベクター系を用いることができる。このようなものとして、限定されるものではないが、ウイルス(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)感染哺乳類細胞系、ウイルス(例えばバキュロウイルス)感染昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母などの微生物、またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNAで形質転換した細菌が挙げられる。ベクターの発現エレメントはその強度および特性において様々である。用いる宿主-ベクター系に応じて多数の好適な転写および翻訳エレメントのいずれか1つを用いることができる。
【０２２５】
適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するには、核酸断片をベクター中へ挿入することを目的とした当業者に公知のいずれの方法を用いてもよい。これらの方法としてin vitro組換えDNAおよび合成技術ならびにin vivo組換え(遺伝子組換え)が挙げられる。MTSPポリペプチド、またはそのドメイン、誘導体、断片もしくはホモログをコードする核酸配列の発現は第二の核酸配列によって調節することができ、これによりこれらの遺伝子またはその断片はその組換えDNA分子で形質転換された宿主で発現する。例えばこれらタンパク質の発現は当技術分野で公知のいずれかのプロモーター／エンハンサーによって制御することができる。特定の実施形態では、このプロモーターはMTSPポリペプチドの遺伝子にとって本来のものではない。使用できるプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981))、ラウス肉腫ウイルスの長い3’末端反復に含まれるプロモーター(Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981))、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982))、β-ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731 1978))またはtacプロモーター(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983))などの原核生物発現ベクター(また、“Scientific American 242:79-94 (1980)のUseful Priteins from Recombinant Bacteria”も参照)；ノパリン合成酵素プロモーター(Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984))またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981))および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼ(Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984))のプロモーターを含む植物発現ベクター;Gal4プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーターなどの酵母およびその他の真菌類に由来するプロモーターエレメント；および組織特異性を示し、トランスジェニック動物において用いられている以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞で活性なエステラーゼI遺伝子制御領域(Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987))、膵β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985))、リンパ細胞で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987))、精巣、乳房、リンパ細胞および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域(Leder et al. Cell 45:485-495 (1986))、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987))、肝臓で活性なα-フェトタンパク質遺伝子制御領域(Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987))、肝臓で活性なα-1アンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987))、骨髄細胞で活性なβグロビン遺伝子制御領域(Mogram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986))、脳の乏突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987))、骨格筋で活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, Nature 314:283-286 (1985))、および視床下部の性腺刺激細胞で活性な性腺刺激ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))が挙げられる。
【０２２６】
特定の実施形態では、MTSPポリペプチド、またはそのドメイン、断片、誘導体もしくはホモログをコードする核酸と作動可能なように連結されたプロモーター、1以上の複製起点、および所望により1以上の選択マーカー(例えば抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターが用いられる。MTSPポリペプチドのコード配列またはその一部を含む発現ベクターは例えばこれらのコード部分を3つのpGEXベクター(グルタチオンSトランスフェラーゼ発現ベクター(Smith and Johnson, Gene 7:31-40 (1988))の各々のEcoRI制限部位へサブクローニングすることにより作出される。これは適切なリーディングフレームにおける産物の発現を意図したものである。MTSPポリペプチドのプロテアーゼドメインの発現のための例示的ベクターおよび系としては周知のピキアベクター(例えば、Invitrogen, San Diego, CAから入手可能)、特にコードされているタンパク質が分泌するように設計されたものが挙げられる。このタンパク質はまた、封入体などにおいて細胞質にて発現させることもできる。ベクターの一例が実施例に記載されている。
【０２２７】
大腸菌(E. coli)細胞の形質転換のためのプラスミドとしては例えばpET発現ベクター(米国特許第4,952,496合参照、NOVAGEN, Madison, WIから入手可能;また、この系について記載したNovagenが公開している文献も参照)がある。このようなプラスミドとしてはT7lacプロモーター、T7ターミネーター、誘導性大腸菌lacオペレーターおよびlacレプレッサー遺伝子を含むpET 11a；T7プロモーター、T7ターミネーターおよび大腸菌ompT分泌シグナルを含むpET 12a-c；ならびにHisカラムによる精製で用いるHis-タグ(商標)リーダー配列およびカラム精製後に切断を可能とするトロンビン切断部位、T7-lacプロモーター領域およびT7ターミネーターを含むpET 15bおよびpET19b(NOVAGEN, Madison, WI)が挙げられる。
【０２２８】
これらベクターをピキア細胞および、大腸菌などの細菌細胞のような宿主細胞に導入し、そこでタンパク質が発現される。ピキア株の例としては例えばGS115がある。細菌宿主の例としてはlacUVプロモーター(米国特許第4,952,496号参照)などの誘導プロモーターに作動可能なように連結されたT7 RNAポリメラーゼをコードするDNAの染色体コピーを含み得る。このような宿主としては限定されるものではないが、溶原性大腸菌株BL21(DE3)が挙げられる。
【０２２９】
発現およびタンパク質産生
MTSPドメイン、誘導体および類似体は当技術分野で公知の種々の方法によって産生させることができる。例えばMTSPポリペプチド、あるいはそのドメイン、断片または誘導体を発現する組換え細胞が同定されれば、個々の遺伝子産物を単離、分析することができる。これは限定されるものではないが産物を放射性標識した後にゲル電気泳動、免疫アッセイ、マーカー標識産物との架橋、およびタンパク質分解活性のアッセイにより分析するなど、タンパク質の物理的および／または機能的特性に基づいたアッセイによって行う。
【０２３０】
MTSP10ポリペプチドは限定されるものではないがカラムクロマトグラフィー(例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、逆相高速クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど)、示差遠心分離、示差溶解度またはタンパク質精製に用いる他のいずれかの標準的な技術をはじめとする当技術分野で公知の標準的な方法によって(複合体もしくはタンパク質を発現する天然源または組換え宿主細胞のいずれかから)単離、精製することができる。機能的特性は当技術分野で公知のいずれかの好適なアッセイを用いて評価することができる。
【０２３１】
あるいは、MTSPポリペプチドまたはそのドメインもしくは誘導体が同定されれば、それをコードする遺伝子のヌクレオチド配列からタンパク質のアミノ酸配列を推定することができる。結果としてタンパク質またはそのドメインもしくは誘導体は当技術分野で公知の標準的な化学法によって合成することができる(例えば、Hunkapiller et al, Nature 310:105-111 (1984)参照)。
【０２３２】
MTSPポリペプチド配列の操作はタンパク質レベルで行うことができる。本明細書ではまた、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子またはその他の細胞リガンドとの連結による翻訳中または翻訳後に異なる修飾を受けるMTSPポリペプチドタンパク質、そのドメイン、誘導体または類似体もしくはその断片も意図する。多数の化学修飾はいずれも、限定されるものではないが臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンおよびその他のこのような薬剤の存在下での代謝合成による特異的化学切断をはじめとする公知の技術によって行うことができる。
【０２３３】
さらに、MTSPポリペプチドのドメイン、類似体および誘導体も化学合成することができる。例えば所望のドメインを含むか、または所望のin vitro活性を媒介するMTSPポリペプチドの一部に相当するペプチドはペプチド合成装置を用いて合成することができる。さらに所望により、非従来型アミノ酸または化学的アミノ酸類似体をMTSPポリペプチド配列へ置換または付加として導入することもできる。非従来型アミノ酸としては、限定されるものではないが、通常アミノ酸のD異性体、a-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、ε-Abu、e-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、またβ-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、および一般にはアミノ酸類似体が挙げられる。また、アミノ酸はD型(右旋型)またはL型(左旋型)であってもよい。
【０２３４】
天然産物が突然変異体であると推定されるか、または新しい種から単離される場合、その天然源、ならびにin vitroで発現したもの、またはin vivoもしくはin vitroで合成された発現ベクターから単離されたMTSPポリペプチドのアミノ酸配列はDNA配列の解析から、あるいはまた単離されたタンパク質の直接配列決定によって決定することができる。このような解析はマニュアルシーケンシングにより、または自動アミノ酸シーケネーターの使用によって行うことができる。
【０２３５】
修飾
本明細書ではMTSPポリペプチドおよびドメインの種々の修飾を意図する。MTSPをコードする核酸分子は当技術分野で公知の多くの方法のいずれかによって修飾することができる(Sambrook et al. (1990) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)。これらの配列を適当な部位で制限酵素にて切断した後、所望によりさらに酵素修飾し、単離してin vitroで連結することができる。MTSPのドメイン、誘導体または類似体をコードする遺伝子の産生においては修飾した遺伝子が、所望の活性がコードされている遺伝子領域に翻訳停止シグナルによって妨げられない元の翻訳リーディングフレームを確実に保持するよう留意しなければならない。
【０２３６】
さらにMTSPをコードする核酸分子は翻訳、開始および／または終結配列を作出および／または破壊するよう、あるいはコード領域にバリエーションを作り出し、かつ／または新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成または既存のものを破壊してさらなるin vitro修飾を助長するよう、in vitroまたはin vivoで変異させることができる。また、本明細書で記載されるように、Cys残基の置換およびグリコシル化部位の除去または付加など、一次配列の変更を伴う突然変異タンパク質も考えられ、配列番号6で示されるアミノ酸配列を含むMTSP10はN67、N336、N383、N409およびN418(配列番号23)に可能性のあるグリコシル化部位を有する。突然変異は、限定されるものではないが、化学的突然変異誘発およびin vitro部位指定突然変異誘発(Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253:6551-6558 (1978))、TAB(登録商標)リンカー(Pharmacia)の使用をはじめとする当技術分野で公知の突然変異誘発技術のいずれかによって達成することができる。ある実施形態では、例えば、MTSPポリペプチドまたはそのドメインを蛍光標識を含むように修飾する。他の特定の実施形態では、MTSPポリペプチドを異種二機能性を用いて複合体のメンバーに連結することができるように改変する。
【０２３７】
さらに、MTSPのドメイン、類似体および誘導体も化学合成することができる。例えば所望のドメインを含むか、または所望のin vitro活性を媒介するMTSPの一部に相当するペプチドはペプチド合成装置を用いて合成することができる。さらに所望により、非従来型アミノ酸または化学的アミノ酸類似体をMTSP配列へ置換または付加として導入することもできる。非従来型アミノ酸としては、限定されるものではないが、通常アミノ酸のD異性体、a-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、ε-Abu、e-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、またβ-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、および一般にはアミノ酸類似体が挙げられる。また、アミノ酸はD型(右旋型)またはL型(左旋型)であってもよい。
【０２３８】
F. スクリーニング方法
本明細書で示されるように、一本鎖プロテアーゼドメインはその活性を調節する化合物を同定する種々の方法で使用することができる。腫瘍細胞でより高い活性または発現を示すSPについては、タンパク質分解活性を阻害する化合物が特に注目される。腫瘍細胞でより低いレベルで活性を示すSPについては、活性を増強する化合物または薬剤が注目されることであろう。いずれの場合にも同定される化合物としては候補癌処置薬となる薬剤を含む。
【０２３９】
数種のアッセイが本明細書に例示、記載されている。このプロテアーゼドメイン部分は他のアッセイでも使用できると考えられる。しかしここでは、一本鎖プロテアーゼドメインが触媒活性を示すことを示す。それ自体in vitroスクリーニングアッセイに理想的なものである。それらは結合アッセイにも使用できる。
【０２４０】
MTSP10全長チモーゲン、活性化酵素、一本鎖および二本鎖プロテアーゼドメインは本明細書で提供されるものをはじめ当業者に公知のいずれのスクリーニングアッセイでの使用も考えられる。よって以下の記載がタンパク質分解アッセイに向けられたものであれば、MTSP10をはじめいずれのSPの一本鎖プロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分の使用にも当てはまるものとする。本明細書では結合アッセイなどの他のアッセイ、特にそのスプライス変異体などのいずれかの変異体を含むMTSP10とともに用いるものが提供される。
【０２４１】
1. SPタンパク質のプロテアーゼ活性を調節する薬剤を同定する触媒アッセイ
本明細書ではSP、特に一本鎖プロテアーゼドメインまたはその触媒活性部分の触媒活性のモジュレーターを同定する方法が提供される。これらの方法は、MTSP10、全長チモーゲンまたは活性型、特にその一本鎖ドメインを試験物質の存在下でMTSP10の基質と接触させ、その基質のタンパク質分解作用を検出し、それによりMTSP10の活性を評価し、その活性を対照と比較することによって実施できる。例えば対照は全長チモーゲンまたは活性型、特にその一本鎖ドメインをはじめとするMTSP10をMTSP10の基質と接触させ、その基質のタンパク質分解作用を検出し、それによりMTSP10の活性を評価することによって評価されるMTSP10の活性であってもよい。試験化合物の存在下と不在下での結果を比較する。活性の違いがその試験化合物がMTSP10の活性を調節することを示す。MTSP10活性化切断のアクチベーターも考えられ、このようなアッセイを以下に述べる。
【０２４２】
ある実施形態では、上記スクリーニング法で複数の試験化合物が同時にスクリーニングされる。別の実施形態では、次に標的細胞に特異的である可能性のある薬剤を同定する手段として標的細胞からMTSP10を単離する。
【０２４３】
もう1つの実施形態では、試験化合物は処置化合物であり、これにより試験化合物の存在下および不在下で測定されたMTSP10活性の違いが標的細胞がその処置化合物に応答することを示す。
【０２４４】
ある方法は、(a)MTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインを1または複数の試験化合物と、そのリガンドと化合物との間の相互作用を助ける条件下で接触させ、さらに(b)その複数のものの中でそのリガンドと特異的に結合する1以上の化合物を同定するステップを含む。
【０２４５】
本明細書で提供されるもう1つの方法は、a)MTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインをMTSP10ポリペプチドの基質と接触させ、その基質のタンパク質分解作用を検出し、それによりMTSP10ポリペプチドの活性を評価し、b)MTSP10ポリペプチドを試験化合物の存在下でMTSP10ポリペプチドの基質と接触させ、その基質のタンパク質分解作用を検出し、それによりMTSP10ポリペプチドの活性を評価し、さらにc)ステップa)およびb)で評価したMTSP10ポリペプチドの活性を比較し、それによりステップa)で測定された活性とステップb)で測定された活性が異なっていれば、その試験物質がMTSP10ポリペプチドの活性を調節することを示す、というステップを含む。
【０２４６】
もう1つの実施形態では、複数の試験物質が同時にスクリーニングされる。試験物質の存在下と不在下でのMTSP10ポリペプチドの活性を比較してその試験物質がMTSP10ポリペプチドのモジュレーターであるかどうかを評価する際にはその活性を並行してアッセイする必要は必ずしもないが、このような並行測定が典型的である。ある時点でのMTSP10ポリペプチドの活性を測定し、その測定活性をMTSP10ポリペプチド活性の履歴値と比較することができる。
【０２４７】
例えば試験物質の存在下でのMTSP10ポリペプチド活性を測定し、試験物質の不在下で予め測定したMTSP10ポリペプチド活性の履歴値と比較することができ、逆も可能である。これは例えばアッセイを行うためのキットとともに提供されている添付書類またはパンフレットにMTSP10ポリペプチドの活性を示すことでなし得る。
【０２４８】
特定のSPの基質を選択する方法は実施例に記載されており、特定のタンパク質分解アッセイが例示されている。
【０２４９】
組合せおよびその組合せを含むキットが所望によりアッセイの実施の説明書を添付して提供される。これらの組合せとしてはMTSP10ポリペプチドおよびアッセイするMTSP10ポリペプチドの基質、ならびに所望により基質のタンパク質分解作用を検出する試薬を含む。基質は特定のMTSP10ポリペプチドによってタンパク質分解作用を受けるタンパク質をはじめ、発色または蛍光分子であるこれらの基質は、MTSP10ポリペプチドの試験基質切断能を調べることで実験的に同定することができる。最も効果的に(すなわち、最低濃度、および／または最高速度、または所望の条件下で)切断される基質が同定される。
【０２５０】
さらに本明細書では上記の組合せを含むキットが提供される。このキットは所望によりMTSP10ポリペプチド活性のモジュレーターを同定するための説明書を含んでもよい。いずれのMTSP10ポリペプチドもその活性のモジュレーターを同定する標的と考えられる。
【０２５１】
2. 結合アッセイ
本明細書ではまた、MTSP10と結合する薬剤、特に化合物を同定および単離する方法が提供される。これらのアッセイはチモーゲン型、単離された一本鎖プロテアーゼドメイン(またはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインを含むMTSP10ポリペプチド以外のタンパク質)、および全長チモーゲンまたは延長されたプロテアーゼドメインに由来する活性型をはじめとするその活性型と結合する薬剤を同定すべく設計されている。同定された化合物は腫瘍またはその他異常な血管形成を伴う疾患および疾病の処置用の化合物を同定するための候補またはリード化合物となる。本方法で用いるMTSP10ポリペプチドとしては、MTSP10一本鎖プロテアーゼドメインまたはそのタンパク質分解活性部分をはじめ、本明細書で定義されたいずれのMTSP10ポリペプチドも含む。
【０２５２】
本明細書では種々の方法が提供される。これらの方法は液相またはMTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインが直接またはリンカーを介して間接的に固相支持体に結合されている固相反応で行うことができる。スクリーニングアッセイは実施例に記載され、これらのアッセイを用いて候補化合物が同定されている。本明細書の目的では、上記の結合アッセイは全てMTSP10のために提供されている。
【０２５３】
本明細書ではMTSP10一本鎖および／または二本鎖プロテアーゼドメイン、チモーゲンまたは全長活性化MTSP10もしくはその二本鎖プロテアーゼドメインと特異的に結合する化合物などの薬剤を同定する方法が提供される。この方法は、(a)MTSP10を1または複数の試験薬剤と、MTSP10と薬剤の間の結合を助ける条件下で接触させ、さらに(b)その複数のものの中でMTSP10と特異的に結合する1以上の薬剤を同定することにより行うことができる。
【０２５４】
例えば、このような方法の実施においては、MTSP10ポリペプチドを可能性のある結合相手または細胞の抽出液もしくは画分と、可能性のある結合相手とポリペプチドの会合が可能な条件下で混合する。混合した後、MTSP10と会合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその他の分子を混合物から分離する。次に、MTSP10と結合した結合相手を取り出し、さらに分析することができる。結合相手を同定および単離するには例えば配列番号6の完全ポリペプチドなどの完全タンパク質を使用できる。あるいはそのタンパク質の断片を用いてもよい。
【０２５５】
細胞抽出液、または血液、血漿、尿、汗、滑液、CSFその他のこの種の体液などの体液を得るには種々の方法が使用できる。例えば物理的または化学的破砕法で細胞を破砕してもよい。物理的破砕法の例としては、限定されるものではないが、音波処理および機械剪断が挙げられる。化学溶解法の例としては、限定されるものではないが、界面活性剤溶解および酵素溶解が挙げられる。当業者ならば本方法で用いる抽出液を得るための細胞抽出液調製方法を容易に選定することができる。
【０２５６】
細胞抽出液が調製されれば、この抽出液とMTSP10を、このタンパク質と結合相手の会合が起こり得る条件下で混合する。ヒト細胞の細胞質または血液などの体液中に見られるものに類似する条件をはじめ、種々の条件が使用できる。浸透圧、pH、温度および用いる細胞抽出液の濃度などの特徴はタンパク質と結合相手の会合を至適化すべく変更することができる。同様に体液から目的分子を単離する方法も公知である。
【０２５７】
適当な条件下で混合した後、結合した複合体を混合物から分離する。混合物を分離するには種々の技術が使用できる。例えばMTSP10に特異的な抗体を用いて結合相手複合体を免疫沈降させることができる。あるいはクロマトグラフィーおよび密度／沈降遠心分離などの標準的な化学的分離技術が使用できる。
【０２５８】
抽出液中の非会合細胞成分を除去した後、常法を用いて複合体から結合相手を解離させることができる。例えば解離は塩濃度または混合物のpHを変化させることで達成することができる。
【０２５９】
混合抽出液からの会合した結合相手ペアの分離を助けるため、MTSP10を固相支持体に固定化してもよい。例えばこのタンパク質はニトロセルロースマトリックスまたはアクリルビーズに結合させることができる。タンパク質またはその断片を固相支持体へ結合させれば、その抽出液に見られる他の成分からペプチド／結合相手ペアを分離する際の助けとなる。同定された結合相手は単一のタンパク質か2以上のタンパク質からなる複合体のいずれかであり得る。
【０２６０】
あるいは一本鎖プロテアーゼをコードする核酸分子は酵母ツーハイブリッド系で使用できる。この酵母ツーハイブリッド系は他のタンパク質の相手のペアを同定するために用いられているが、本明細書に記載の核酸分子を用いるために容易に採用することができる。
【０２６１】
特にMTSP10に関する別のin vitro結合アッセイでは少なくともこれらのタンパク質の1つの触媒ドメインおよび1以上の候補結合標的または基質を含むポリペプチド混合物を用いる。この混合物を適当な条件下でインキュベートした後、MTSP10または触媒ドメインを含むそのポリペプチド断片が候補基質と結合または相互作用する能力を評価する。細胞フリー結合アッセイでは、化合物のうち1つが検出可能な標識を含むか、または検出可能な標識と結合されている。この標識は放射性、発光、光学密度または電子密度などの直接検出用に提供することもできるし、あるいはエピトープタグ、酵素などの間接的検出用に提供することもできる。標識および他のアッセイ成分の性質に応じ、標識を検出するには種々の方法が使用できる。例えば標識は固相支持体に結合したものを検出することもできるし、あるいは標識を含む結合複合体部分を固相支持体から分離して、その後標識を検出することもできる。
【０２６２】
3. シグナル伝達の検出
トランスメンブランタンパク質であるMTSP10は細胞表面レセプターとして直接、またはシグナル伝達を誘導し得る増殖因子前駆対などのタンパク質を活性化させることにより間接的にシグナル伝達に関与し得る。
【０２６３】
さらにMTSP10の細胞外ドメインなどのMTSP10の分泌は、細胞表面レセプターと結合または相互作用することで直接、あるいはシグナル伝達を開始させ得るプロ増殖因子などのタンパク質を活性化することで間接的にシグナル伝達に関与し得る。シグナル伝達を評価するアッセイは当業者に周知のものであり、MTSP10ポリペプチドとともに用いるためにも採用することができる。
【０２６４】
MTSP10、特に全長または細胞表面にMTSP10の細胞外ドメインまたはその機能的部分を固定させるに十分な部分により直接、またはプロ増殖因子の活性化を介して間接的に媒介されるシグナル伝達に影響を及ぼす、または変化をもたらす薬剤を同定するアッセイが提供される。このようなアッセイには例えば、リポーター遺伝子からの発現に対する作用を検出することにより伝達されたシグナルの調節作用を評価する転写に基づくアッセイが挙げられる(例えば米国特許第5,436,128号参照)。
【０２６５】
4. MTSP10をコードする核酸の発現を調節する薬剤を同定する方法
もう1つの実施形態ではMTSP10をコードする核酸の発現を調節する薬剤を同定する方法を提供する。このようなアッセイではMTSP10をコードする核酸の発現レベルの変化をモニタリングするいずれかの利用可能な手段を用いる。
【０２６６】
あるアッセイ形式では、MTSP10またはそのドメイン、特にプロテアーゼドメインのオープンリーディングフレームとアッセイ可能ないずれかの融合相手との間のリポーター遺伝子融合物を含む細胞株を調製することができる。ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をはじめ多くのアッセイ可能な融合相手が公知であり、容易に利用できる(Alam et al., Anal. Biochem. 188: 245-54 (1990))。次にこのリポーター遺伝子融合物を含む細胞株を適当な条件および時間で試験薬剤に曝す。薬剤に曝したサンプルと対照サンプル間のリポーター遺伝子の発現の違いにより、MTSP10をコードする核酸の発現を調節する薬剤が同定される。
【０２６７】
さらなるアッセイ形式を用い、薬剤がMTSP10をコードする核酸の発現を調節する能力をモニタリングすることもできる。例えば核酸とのハイブリダイゼーションによりmRNAの発現を直接モニタリングすることができる。細胞株を適当な条件および時間で試験薬剤に曝し、標準的な手法により全RNAまたはmRNAを単離する(例えば、Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press参照)。これらの核酸から、薬剤に曝した細胞と対照細胞の間のRNA発現レベルにおける差を検出するためのプローブを調製することができる。必ずしも必要ではないが、高ストリンジェンシー条件下で標的核酸とだけハイブリダイズするプローブを設計するのが典型的である。高ストリンジェンシー条件下では相補性の高い核酸ハイブリッドだけが生じる。従って、アッセイ条件のストリンジェンシーはハイブリッドを形成するために2つの核酸鎖の間に存在しなければならない相補性の程度を決定する。ストリンジェンシーはプローブ:標的ハイブリッドと存在し得るプローブ:非標的ハイブリッド間の安定性の差が最大となるように選択しなければならない。
【０２６８】
プローブは当技術分野で公知の方法により核酸から設計することができる。例えば、プローブのG+C含量およびプローブ長はプローブの標的配列との結合に影響を与える。プローブの特異性を至適化する方法もよく用いられる(例えば、Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press;およびAusubel et al. (1995) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Co., NY参照)。
【０２６９】
ハイブリダイゼーション条件は各プローブの必要に応じて公知の方法を用いて改変する(例えば、Sambrook et al. (1989) MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press);およびAusubel et al. (1995) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Co., NY参照)。全細胞RNAまたはポリA RNA富化RNAのハイブリダイゼーションは利用可能ないずれの形式によっても達成することができる。例えば全細胞RNAまたはポリA RNA富化RNAは固相支持体に固定することができ、この固相支持体を少なくとも1種の核酸分子、または1種の核酸分子の一部を含む少なくとも1種のプローブに、そのプローブが特異的にハイブリダイズする条件下で曝す。あるいは少なくとも1種の配列、または1種の配列の一部を含む核酸断片を多孔質ガラスウエハーなどの固相支持体に固定化してもよい。次にこのガラスウエハーをサンプル由来の全細胞RNAまたはポリA RNAに、固定化した配列が特異的にハイブリダイズする条件下で曝すことができる。このようなガラスウエハーおよびハイブリダイゼーション法は広く利用でき、例えばBeattie (WO 95/11755)が開示したものがある。あるプローブが非処理細胞集団および薬剤に曝した細胞集団からのRNAサンプルと特異的にハイブリダイズする能力を調べることにより、MTSP10ポリペプチドをコードする核酸の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする薬剤が同定される。
【０２７０】
ある形式では、非曝露対照細胞集団に対する、試験薬剤に曝した細胞集団の相対的タンパク質量をアッセイすることができる(例えば、前立腺癌細胞株、肺癌細胞株、大腸癌細胞株、または乳癌細胞株)。この形式では、特異的抗体などのプローブを用いて種々の細胞集団または体液中のタンパク質の発現または活性レベルの違いをモニタリングする。細胞株または集団または体液は適当な条件および時間で試験薬剤に曝す。細胞溶解液または体液は曝露した細胞株または集団と対照となる非曝露細胞株または集団または非曝露体液から調製することができる。これらの細胞溶解液または体液を次にプローブを用いて分析する。
【０２７１】
例えば、MTSP10のNおよびC末端断片を細菌内で発現させ、これを用いてこれらの断片と結合するタンパク質を探すことができる。MTSP10のNまたはC末端領域に対するHis-タグまたはGSTの融合など、基質として用いる融合タンパク質を調製することができる。これらの融合タンパク質は例えばグルタチオン-セファロースビーズに結合させた後、細胞溶解液または体液でプロービングすることができる。溶解前に細胞または体液はMTSP10またはそのドメインと相互作用するタンパク質を調節し得る候補薬剤で処理することができる。融合タンパク質と結合する溶解タンパク質は当技術分野で公知のように、SDS-PAGEにより分離し、単離し、タンパク質配列決定または質量分析によって同定することができる。
【０２７２】
抗体プローブはそれらが十分な長さであれば(例えば、MTSP10ポリペプチドの4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40またはそれ以上の連続するアミノ酸)ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を用いて、あるいは免疫原性を増強する必要があれば好適な担体と結合させて、適当な免疫化プロトコールで好適な哺乳類宿主を免疫化することで作製される。ウシ血清アルブミン(BSA)、キーホールリンペット・ヘモシアニン(KLH)またはその他の担体タンパク質などの担体による免疫コンジュゲートの調製方法は当技術分野で周知のものである。例えばカルボジイミド試薬を用いた直接コンジュゲーションが有効な場合もあるし、Pierce Chemical Co., Rockford, ILが供給しているものなどの架橋試薬がハプテンに接近性を与える上で望ましい場合もある。ハプテンペプチドは例えば担体との結合を促進すべく、Cys残基を有する、またはシステイン残基が散在したアミノまたはカルボキシ末端のいずれかで延長し得る。免疫原の投与は当技術分野で一般に理解されているように適切な期間、適切なアジュバントを用いて通常注射により行う。免疫化過程中は抗体の力価を求め、抗体形成の妥当性を調べる。
【０２７３】
抗ペプチド抗体は例えばMTSP10のカルボキシ末端アミノ酸に相当する合成ペプチドを用いて作製することができる。合成ペプチドは1〜3アミノ酸長、通常は少なくとも4以上のアミノ酸残基長といった短いものであってよい。これらのペプチドは標準的な方法を用いてKLHに結合させることができ、ウサギまたは有蹄類などの動物へ感作させることができる。次に例えば共有結合ペプチドを含むActigelビーズを用いてポリクローナル抗体を精製することができる。
【０２７４】
このようにして作製されたポリクローナル抗血清はいくつかの適用には満足のいくものであるが、医薬組成物としてはモノクローナル製剤が一般に用いられる。目的のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株はKohler et al., (Nature 256: 495-7 (1975))の標準的な方法、または一般に知られているようにリンパ球または脾臓細胞の不死化を行う改変法を用いて作製することができる。目的抗体を分泌する不死化細胞株は、抗体がペプチドハプテン、ポリペプチドまたはタンパク質である免疫アッセイによってスクリーニングされる。目的抗体を分泌する適当な不死化細胞培養物が確認されれば、これらの細胞をin vitroまたは腹水によりin vivo産生させることで培養することができる。MTSP10の触媒ドメインまたは活性化切断部位(領域)を認識するモノクローナル抗体が特に注目される。
【０２７５】
さらにチモーゲンまたは二本鎖型のMTSP10を用いてコンホメーションエピトープを認識するモノクローナル抗体を作製することもできる。次に培養上清または腹水上清から目的のモノクローナル抗体を回収する。完全な抗体と同様に免疫学的に有意な部分を含むモノクローナルまたはポリクローナル抗血清のフラグメントもアンタゴニストとして使用できる。Fab、Fab'、F(ab')2フラグメントなどの免疫反応性フラグメントは、これらフラグメントが通常完全な免疫グロブリンよりも免疫原性が低いことから特に処置に関して用いられる場合が多い。
【０２７６】
これらの抗体またはフラグメントも製造可能である。また、複数種の起源を持つキメラに関してはレセプターの目的領域に特異的に結合する領域を作製することもできる。
【０２７７】
上記方法でアッセイされる薬剤は無作為に選択することもできるし、あるいは合理的に選択または設計することもできる。
【０２７８】
薬剤は例えばペプチド、小分子および炭水化物であってもよい。当業者ならば薬剤の構造特性については制限がないことが容易に分かるであろう。
【０２７９】
ペプチド薬剤は当技術分野で公知のように標準的な固相(または液相)ペプチド合成法を用いて調製することができる。さらにこれらのペプチドをコードするDNAも市販のオリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成し、標準的な組換え生産系を用いて組換え生産することができる。遺伝子にコードされないアミノ酸が含まれる場合には固相ペプチド合成を用いた生産が必要となる。
【０２８０】
G. MTSP10ポリペプチドの少なくとも1つの活性を調節する試験物質のアッセイ形式および選択
MTSP10の少なくとも1つの活性を調節する薬剤の同定方法を提供する。これらの方法にはファージディスプレーおよびその他MTSP10の活性における変化を評価する方法が含まれる。このような方法またはアッセイでは目的の活性をモニタリングまたは検出するいずれの手段を用いてもよい。スクリーニングアッセイを行うには種々の形式および検出プロトコールが知られている。このような形式およびプロトコールのいずれかをMTSP10ポリペプチド活性のモジュレーターの同定に採用することができる。以下、プロトコール例について述べる。
【０２８１】
1. ハイスループットスクリーニングアッセイ
上記のアッセイは単一のMTSP10ポリペプチドをスクリーニングする、かつ／または1回のアッセイで単一の試験物質をスクリーニングする場合に実施することもできるが、このアッセイは典型的にはハイスループットスクリーニング方式、すなわち複数のSPタンパク質が、かつ／または複数の試験物質に対して同時にスクリーニングされる方式で実施される(一般には、High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances (Devlin, Ed.) Marcel Dekker, 1997; Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91 (1997);およびSilverman et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:397-403 (1998)参照)。例えば、このアッセイはマルチウェル(例えば、24、48、96、384、1536ウェル、またはそれ以上の密度)、チップまたはアレイ形式で行うことができる。
【０２８２】
ハイスループットスクリーニング(HTS)は疾病標的に対して多数の多様な化学構造を調べて「ヒット」を確認する方法である(Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91 (1997))。HTS法の分野の現在の水準はサンプル調製、アッセイ手順およびその後の膨大なデータの処理を取り扱うべく高度に自動化およびコンピューター化されている。
【０２８３】
ハイスループットスクリーニングで用いられる検出技術は検討する生化学経路の種類によって異なる(Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91 (1997))。これらの方法としては、種々の酵素アッセイに採用できるシンチレーションプロキシミティーアッセイ(SPA) などの放射性化学法(Lerner et al., J. Biomol. Screening, 1:135-143 (1996); Baker et al., Anal. Biochem., 239:20-24 (1996); Baum et al., Anal. Biochem., 237:129-134 (1996);およびSullivan et al., J. Biomol. Screning 2:19-23 (1997))およびタンパク質-タンパク質相互作用アッセイ(Braunwalder et al., J. Biomol. Screening 1:23-26 (1996); Sonatore et al., Anal. Biochem. 240:289-297 (1996);およびChen et al., J. Biol. Chem. 271:25308-25315 (1996))、ならびに限定されるものではないが比色および発光検出法、共鳴エネルギー転移(RET)法、時間分解蛍光(HTRF)法、細胞蛍光アッセイ、例えば蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)法(例えば、Gonzalez et al., Biophys. J., 69:1272-1280 (1995)参照)、蛍光偏光または異方性法(例えば、Jameson et al., Methods Enzymol. 246:283-300 (1995); Jolley, J. Biomol. Screening 1:33-38 (1996); Lynch et al., Anal. Biochem. 247:77-82 (1997))、蛍光補正分光光度法、その他この種の方法をはじめとする非同位元素的検出法が挙げられる。
【０２８４】
2. 試験物質
小分子、抗体、タンパク質、核酸、ペプチド、天然産物、天然産物を含有する抽出物ならびにそれらのライブラリーおよびコレクションを含む試験化合物は上記アッセイおよび以下に記載するMTSP10ポリペプチド活性を調節する化合物を同定するためのアッセイでスクリーニングすることができる。候補化合物をスクリーニングおよび同定するにはコンピューター化学を利用した合理的創薬の方法論を用いることができる。
【０２８５】
これらのスクリーニング法によって同定される化合物としてはアンタゴニストをはじめとする阻害剤が挙げられ、またアゴニストであってもよい。スクリーニングのための化合物としては、利用できる、既知の、または作製可能ないずれの化合物および化合物コレクションも含む。
【０２８６】
a. 化合物の選択
化合物はそれらのセリンプロテアーゼ、特にMTSP10ポリペプチドの阻害の効力および選択性に関して選択できる。本明細書に記載するように、また、周知のように、標的セリンプロテアーゼおよびその基質はプロテアーゼとその基質の反応を可能とするアッセイ条件下で合わせる。アッセイは試験化合物の不在下と増加濃度の試験化合物の存在下で行う。セリンプロテアーゼ活性の50%が試験化合物によって阻害される試験化合物濃度が、その化合物のIC50値(阻害剤濃度)またはEC50値(有効濃度)である。一連の、または一群の試験化合物の中でIC50またはEC50値が高い化合物よりもIC50またはEC50値が低いものほど、より強力なセリンプロテアーゼ阻害剤であると考えられる。このIC50測定は比較的単純なアッセイに用いられ、EC50は細胞を用いるものなどより複雑なアッセイ用いられる場合が多い。
【０２８７】
候補化合物は、MTSP10ポリペプチド活性の阻害に関してin vitroアッセイで測定した場合、100nM以下のIC50値を持つのが典型である。これらの試験化合物はまたセリンプロテアーゼに対する選択性でも評価する。本明細書に記載するように、また周知のように、試験化合物はセリンプロテアーゼおよびその他の酵素のパネルに対してその効力をアッセイし、それぞれのアッセイ系で各試験化合物のIC50値またはEC50値を求める。標的酵素、例えばMTSP10ポリペプチドに対して低いIC50値またはEC50値を示し、かつ、試験パネル内の他の酵素(例えば、ウロキナーゼ組織プラスミノーゲンアクチベーター、トロンビン、Xa因子)に対して高いIC50値またはEC50値を示す化合物がその標的酵素に対して選択性があると考えられる。一般に標的酵素アッセイにおけるIC50値またはEC50値が選択性酵素パネルにおいて測定された、その次に小さいIC50値またはEC50値よりも少なくとも1オーダー小さければその化合物は選択性があるとみなす。
【０２８８】
化合物はまたそれらのin vivo活性についても評価する。試験化合物の評価のために選択されるアッセイの種類はその化合物によって処置または予防しようとする病態、ならびに試験化合物について評価しようとする投与経路によって異なる。
【０２８９】
例えばMTSP10ポリペプチドの阻害によって腫瘍増殖を減退させる化合物の活性を評価するにはJankun et al., Canc. Res. 57:559-563 (1997)が記載したPAI-1評価のための方法が使用できる。要するに、ATCC細胞株DU145およびLnCaPをSCIDマウスに注射する。腫瘍が確立した後、その化合物のin vitro特性から決定した投与計画に従ってマウスに試験化合物を与える。Jankun et al.は化合物を水で投与した。約5週間の間、週に2回腫瘍の体積を測定した。化合物を投与した動物が適当な対照化合物を投与した動物に比べて腫瘍体積の低下を示せば、その化合物は活性があるとみなす。
【０２９０】
腫瘍体積の減少に対するブタプロテアーゼ阻害剤p-アミノベンズアミジンの作用を評価すべく設計した別のin vivo試験モデルがBillstrom et al., Int. J. Cancer 61:542-547 (1995)により記載されている。
【０２９１】
化合物が転移の発生を軽減する、または転移を抑制する能力を評価するには、Kobayashi et al. Int. J. Canc. 57:727-733d (1994)が記載している手法を使用することができる。要するに、肺定着能（potential in）の高いものとして選択したネズミ異種移植片をC57B1/6マウスへ静脈注射(実験的転移)または腹壁へ皮下注射(自発的転移)する。試験する種々の濃度の化合物は注射前にマトリゲル中の腫瘍細胞に混合させればよい。腫瘍接種後1〜6日目かまたは7〜13日目かのどちらかに試験化合物の腹腔内注射を毎日行った。この動物を腫瘍接種後約3〜4週間で犠牲にし、肺の腫瘍コロニーを計数する。得られたデータの評価から試験化合物、最適用量および投与経路の効果に関する判断が可能となる。
【０２９２】
腫瘍体積および転移の減少に対する試験化合物の活性は、それらの阻害剤を評価するためのRabbani et al., Int. J. Cancer 63:840-845 (1995)に記載のモデルで評価できる。そこへ、Mat LyLu腫瘍細胞をコペンハーゲンラットの脇腹に注射した。継続して種々の用量の試験化合物を最高3週間投与するため、この動物に浸透圧小型ポンプを埋め込んだ。試験中、転移が増大するにつれ、実験動物および対照動物の腫瘍重および腫瘍体積を評価した。得られたデータの評価から試験化合物、最適用量および投与経路の効果に関する判断が可能となる。これらの著者のうち何人かがXing et al., Canc. Res. 57:3585-3593 (1997)に関連プロトコールを記載している。
【０２９３】
化合物の抗血管形成活性を評価するには、ウサギ角膜の血管新生モデルを使用することができる(例えば、 Avery et al. (1990) Arch. Ophthalmol., 108:1474-147参照)。Avery et al.はニュージーランド白ウサギを麻酔した後、角膜中央の切開を行い、放射状の角膜ポケットを形成することを記載している。徐放性のプロスタグランジンペレットをこのポケット内に置き、血管新生を誘発した。試験化合物を5日間腹腔内投与し、その時点で動物を犠牲にした。試験化合物の作用は、血管新生応答およびそれによる角膜縁の血管新生の面積を算出するのに使用できる角膜輪部を撮影した断続写真を観察して評価する。適当な対照と比較して血管新生の領域が小さくなればその試験化合物が血管新生の減少または阻害に有効であることを示す。
【０２９４】
血管形成の抑制における試験化合物の効果を評価するのに用いる血管形成モデルはMin et al., Canc. Res. 56:2428-2433 (1996)に記載されている。C57BL6マウスに、血管形成誘発剤としてbFGFを含むマトリゲル混合物を試験化合物とともに、また化合物を伴わずに皮下注射した。5日後、この動物を犠牲にし、血管新生を可視化できるマトリゲルプラグを撮影する。マトリゲルおよび有効量の試験化合物を投与した実験動物は、対照動物もしくは有効量未満の、または有効量を含まない化合物を投与した実験動物よりも低い血管新生を示した。
【０２９５】
一次腫瘍の拡散を制限する能力について化合物を試験すべくデザインされたin vivo系が、Crowley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5021-5025 (1993)に記載されている。ヌードマウスに、CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)を発現するよう操作した腫瘍細胞(PC3)を注射する。腫瘍サイズおよび／または転移を減少させるそれらの能力について試験する化合物を動物に投与した後、腫瘍サイズおよび／または転移増殖の測定を行う。さらにまた、種々の臓器で検出されたCATレベルは試験化合物の転移阻害能の指標となり、対照動物に対して処理動物の組織でCATの検出が少なければその組織に移動したCAT発現細胞が少ないことを示す。
【０２９６】
侵襲性が高いことが知られている腫瘍細胞系F3IIを用い(例えば、Alonso et al. (1996) Breast Canc. Res. Treat. 40:209-223参照)、試験セリンプロテアーゼ阻害剤の抑制能を評価するように計画したIn vivo実験モデルが提供される。Alonsoは毒性測定、腫瘍増殖、侵襲性、自発的転移、実験的肺転移、および血管形成アッセイに関するin vivo研究を記載している。
【０２９７】
CAMモデル(ニワトリ胚絨毛尿膜モデル; Ossowski(988) J. Cell Biol. 107:2437-2445)は試験化合物の阻害活性を評価するもう一つの方法を提供する。CAMモデルでは、腫瘍細胞はCAMを含む絨毛尿膜を通じて浸潤する(なお、いくつかのセリンプロテアーゼ阻害剤の存在下では膜を経た腫瘍細胞の浸潤は低下するか、全くなくなる)。従って、CAMアッセイは種々の濃度の試験化合物の存在下および不在下でCAMおよび腫瘍細胞を用いて実施する。腫瘍細胞の侵襲性は化合物の阻害活性の指標となるような条件下で測定する。阻害活性を有する化合物は腫瘍浸潤が低いことと関係する。
【０２９８】
CAMモデルは標準の血管形成アッセイにも用いられる(すなわち、新しい血管の形成に作用する)(Brooks et al. Methods in Molecular Biology 129:257-269 (1999)))。このモデルによれば、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)などの血管形成インデューサーを含むフィルターディスクをCAM上に置く。サイトカインのCAM中への拡散が局部的な血管形成を誘発し、これはフィルターディスクのすぐ下のCAM内の血管分岐点の数を計数するなどいくつかの方法で測定できる。同定された化合物のサイトカイン誘発性血管形成阻害能はこのモデルを用いて試験することができる。試験化合物は血管形成インデューサーを含むフィルターディスクに加えてもよいし、膜に直接置いてもよいし、全身投与してもよい。試験化合物の存在下および／または不在下での新規の血管形成の程度はこのモデルを用いて比較することができる。試験化合物の存在下で新しい血管の形成が少ないことが、抗血管形成活性の指標となる。MTSP10ポリペプチドの阻害剤に対する抗血管形成活性を証明することは、そのSPタンパク質の血管形成における役割を示すものである。
【０２９９】
b. 既知のセリンプロテアーゼ阻害剤
スクリーニングのための化合物は、そのMTSP10活性阻害能を試験し得るセリンプロテアーゼ阻害剤であり得る。例えばスクリーニングアッセイで用いるセリンプロテアーゼ阻害剤としては、限定されるものではないが、セリンプロテアーゼ阻害剤3(SPI-3)(Chen, et al., Citokine, 11:856-862 (1999));アプロチニン(Iijima, R., et al., J. Biochem. (Tokyo) 126:912-916 (1999));Kazal型セリンプロテアーゼ阻害剤様タンパク質(Niimi, et al. Eur. J. Biochem., 266:282-292 (1999));Kunitz型セリンプロテアーゼ阻害剤(Ravichandran, S., et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 55:1814-1821 (1999));組織因子経路阻害剤-2/マトリックス関連セリンプロテアーゼ阻害剤(TFPI-2/MSPI)、(Liu, Y. et al. Arch. Biochem. Biophys. 370:112-8 (1999));Bukunin(Cui, C.Y. et al. J. Invest. Dermatol. 113:182-8 (1999));メシル酸ナファモスタット(Ryo, R. et al.  Vox Sang. 76:241-6 (1999));TPCK(Huang et al. Oncogene 18:3431-3439 (1999));合成綿結合セリンプロテアーゼ阻害剤(Edwards et al. (1999) Wound Repair Regen. 7:106-18); FUT-175 (Sawada et al. (1999) Stroke 30:644-50;セリンプロテアーゼ阻害剤FUT-0175およびトロンボキサン合成酵素阻害剤OKY-046の組合せ(Kaminogo et al. (1998) Neurol. Med. Chir. (Tokyo) 38:704-8; discussion 708-9);ラットセリンプロテアーゼ阻害因子2.1遺伝子(LeCam, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 253:311-4 (1998));グランザイムBを有するラット下垂体複合体で発現する新規の細胞内セリンプロテアーゼ阻害剤(Hill et al. FEBS Lett. 440:361-4 (1998));3,4-ジクロロイソクマリン(Hammed et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 219:132-7 (1998));LEX032(Bains et al. Eur. J. Pharmacol. 356:67-72 (1998));N-トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトン(Dryjanski et al. Biochemistry 37:14151-6 (1998));セリンプロテアーゼ阻害剤ニューロセルピンのマウス遺伝子(P112)(Berger et al. Gene, 214:25-33 (1998));ラットセリンプロテアーゼ阻害剤2.3遺伝子(Paul et al. Eur. J. Biochem.  254:538-46 (1998));Ecotin(Yang et al. J. Mol. Biol. 279:945-57 (1998));14kDaの植物関連セリンプロテアーゼ阻害剤(Roch et al. Dev. Comp. Immunol. 22(1):1-12 (1998));マトリックス関連セリンプロテアーゼ阻害剤TFPI-2/33kDa MSPI(Rao et al. Int. J. Cancer 76:749-56 (1998));ONO-3403(Hiwasa et al., Cancer Lett. 126:221-5 (1998));ブデラスタシン(Bdellastasin)(Moser et al. Eur. J. Biochem. 253:212-20 (1998));ビクニン(Xu et al. J. Mol. Biol. 276:955-66 (1998));メシル酸ナファモスタット(Mellgren et al. Thromb. Haemost. 79:342-7 (1998));増殖ホルモン依存性セリンプロテアーゼ阻害剤Spi 2.1(Maake et al. 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【０３００】
c. コンビナトリアルライブラリーおよびその他のライブラリー
スクリーニングアッセイのための化合物源は、限定されるものではないが、コンビナトリアルライブラリーをはじめとするライブラリーであってよい。コンビナトリアルライブラリーの合成法およびかかるコンビナトリアルライブラリーの特徴は当技術分野において公知である(一般的に、Combinatorial Libraries: Synthesis, Screening and Application Potential (Cortese Ed.) Walter de Gruyter, Inc., 1995; Tietze and Lieb, Curr. Opin. Chem. Biol., 2(3):363-71 (1998); Lam, Anticancer Drug Des., 12(3):145-67 (1997); Blaney and Martin, Curr. Opin. Chem. Biol., 1(1):54-9 (1997); および Schultz and Schultz, Biotechnol. Prog., 12(6):729-43 (1996)参照)。
【０３０１】
様々なライブラリー、主にペプチドおよびヌクレオチドに基づくオリゴマーライブラリーを生成する方法および戦略は、分子生物学的方法および／または同時化学合成方法論を用いて開発されてきた(例えば、Dower et al., Annu. Rep. Med. Chem., 26:271-280 (1991); Fodor et al., Science, 251:767-773 (1991); Jung et al., Angew. Chem. Ind. Ed. Engl., 31:367-383 (1992); Zuckerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4505-4509 (1992); Scott et al., Science, 249:386-390 (1990); Devlin et al., Science, 249:404-406 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990);およびGallop et al., J. Medicinal Chemistry, 37:1233-1251 (1994)参照)。得られるコンビナトリアルライブラリーは何百万もの化合物を含む可能性があり、これをスクリーニングして選択した活性を示す化合物を同定することができる。
【０３０２】
このライブラリーは大きく3つのカテゴリー:ランダムペプチドまたはタンパク質が、プラスミドから発現したファージ粒子またはタンパク質の表面に提示される融合タンパク質ディスプレーペプチドライブラリー;個々の化合物または化合物の混合物が、樹脂ビーズ(例えば、Lam et al., Nature, 354:82-84 (1991)参照)および綿支持体(例えば、Eichler et al., Biochemistry 32:11035-11041 (1993)参照)などの不溶性マトリックス上に提示される支持体結合合成化学ライブラリー;および、これらの化合物を液相で用いる方法(例えば、Houghten et al., Nature, 354:84-86 (1991); Houghten et al., BioTechniques, 313:412-421 (1992);およびScott et al., Curr. Opin. Biotechnol., 5:40-48 (1994)参照)に分類される。合成ペプチドおよびオリゴヌクレオチドコンビナトリアルライブラリーには多数の例があり、非ペプチド系有機小分子を含むライブラリーの作製には多くの方法がある。このようなライブラリーは、合して多様な有機分子の混合物を形成する、または合して選択されたファーマコフォア(薬理的作用団)モノマーに基づくライブラリーを形成し得るモノマーの基本セットに基づくものであり得る。
【０３０３】
ランダムコンビナトリアルライブラリーまたは決定論的コンビナトリアルライブラリーのいずれもがここで開示および／または請求されるスクリーニング方法によってスクリーニング可能である。これら2つのライブラリーでは、このライブラリーの各ユニットが固相支持体上で単離および／または固定化できる。決定論的ライブラリーでは、先験的に各固相支持体上の特定のユニットの位置が分かっている。ランダムライブラリーでは、特定のユニットの位置は先験的には分からないが、各部位はなお単一の独特のユニットを含む。ライブラリーを作成する多くの方法が当業者に公知である(例えば、Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1984), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5131-5135 (1985)参照)。当業者に公知のいずれの技術によって作成されるコンビナトリアルライブラリーも意図される(例えば、スクリーニングに関してはSchultz and Schultz, Biotechnol. Prog., 12(6):729-43 (1996)の表1; Bartel et al., Science, 261:1411-1418 (1993); Baumbach et al. BioPharm, (Can):24-35 (1992); Bock et al.  Nature, 355:564-566 (1992); Borman, S., Combinatorial chemists focus on samll molecules molecular recognition, and automation, Chem. Eng. 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【０３０４】
例えば、MTSP10ポリペプチドまたはSPタンパク質のプロテアーゼドメインと結合するペプチドはファージディスプレーライブラリーを用いて同定できる。例としての実施形態では、この方法には、a)ファージライブラリーのファージをMTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインに接触させ;(b)そのタンパク質と結合するファージを単離し;さらに(c)単離したファージにコードされる少なくとも1つのペプチドを同定し、MTSP10ポリペプチドと結合するペプチドを同定することを含み得る。
【０３０５】
H. MTSP10ポリペプチド活性のモジュレーター
本明細書では、スクリーニングにより同定された、あるいはその他のスクリーニング方法でMTSP10ポリペプチドまたはプロテアーゼドメインを用いて生成された、MTSP10活性を調節する化合物を提供する。これら化合物は直接MTSP10ポリペプチドと相互作用することによって作用するか、またはその転写または翻訳を変化させることによって作用する。このような分子としては、限定されるものではないが、MTSP10ポリペプチド、特にそのプロテアーゼドメインと特異的に反応する抗体、MTSP10ポリペプチド、抗体、ペプチドミメティクスおよびその他このような化合物の発現を変化させるアンチセンス核酸またはRNAiなどの二本鎖RNA(dsRNA)が挙げられる。
【０３０６】
1. 抗体
本明細書で提供されるMTSP10ポリペプチド、特にその一本鎖プロテアーゼドメインあるいは全長またはプロテアーゼドメインの活性型またはチモーゲン型と特異的に結合するポリクローナルおよびモノクローナル抗体をはじめとする抗体が提供される。
【０３０７】
一般に、この抗体はモノクローナル抗体であり、典型的にはこの抗体はMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインと特異的に結合する。特定の実施形態では、MTSP10の各々の一本鎖および／または二本鎖型プロテアーゼドメインに対する抗体が提供される。また、MTSP10のいずれかのドメインおよびその二本鎖と特異的に結合する抗体も提供される。
【０３０８】
MTSP10ポリペプチドおよびそのドメイン、断片、ホモログおよび誘導体を免疫原として用いて、そのような免疫源と特異的に結合する抗体の作製することができる。このような抗体としては、限定されるものではないが ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Fabフラグメント、およびFab発現ライブラリーなどが挙げられる。特定の実施形態では、ヒトMTSP10ポリペプチドに対する抗体が生産される。もう1つの実施形態では、セリンプロテアーゼドメインを含むMTSP10ポリペプチド断片からなる複合体を抗体作製の免疫原として用いる。
【０３０９】
当技術分野で公知の種々の手法は、MTSP10ポリペプチド、そのドメイン、誘導体、断片または類似体に対するポリクローナル抗体の作製に用いることができる。抗体の作製のためには、天然MTSP10ポリペプチドまたは合成形態、あるいは架橋MTSP10ポリペプチドなど上記の誘導体を注射して種々の宿主動物を免疫化することができる。このような宿主動物としては、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられる。種々のアジュバントを用いて宿主の種に応じた免疫応答を増強することができ、限定されるものではないが、フロイントのアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルション、ジニトロフェノールなどの界面活性物質、ならびに弱毒ウシ結核菌(bacille Calmette-Guerin(BCG))およびコリネバクテリウム・パルブム(corynebacterium parvum)など有用であり得るヒトアジュバントが挙げられる。
【０３１０】
MTSP10ポリペプチドまたはそのドメイン、誘導体、断片または類似体に対するモノクローナル抗体の作製のためには、連続した培養細胞系による抗体分子の産生を提供するものであればどんな技術を用いてもよい。このような技術として、限定されるものではないが、KohlerおよびMilstein(Nature 256:495-497 (1975))によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983))、およびヒトモノクローナル抗体を産生するEBVハイブリドーマ技術(Cole et al., in Monoclonal Antibody and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))が挙げられる。さらなる実施形態では、最近の技術を利用して無菌動物でモノクローナル抗体を産生させることができる(PCT/US90/02545)。ヒト抗体も使用でき、これはヒトハイブリドーマを用いることによって(Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 (1983))、またはin vitroでヒトB細胞をEBVウイルスで形質転換することによって(Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))得られる。MTSP10ポリペプチドに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を、適当な生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによる「キメラ抗体」の作製を目的に開発された技術(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))を用いてもよい。
【０３１１】
MTSP10をコードする核酸分子またはその一部はMTSP10と結合する抗体を作製するためにDNA免疫プロトコールで用いることができる(例えば、米国特許第5,795,872号、同第5,643,578号および同第6,337,072号参照)。
【０３１２】
一本鎖抗体の作製に関して記載された技術(米国特許第4,946,778号)を採用してMTSP10ポリペプチド特異的一本鎖抗体を作製することができる。さらなる実施形態では、Fab発現ライブラリーの構築に関して記載された技術(Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989))を用いてMTSP10ポリペプチドまたはそのドメイン、誘導体、または類似体に対して所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ容易な同定が可能となる。非ヒト抗体は公知の方法によって「ヒト化」することができる(例えば、米国特許第5,225,539号参照)。
【０３１３】
MTSP10 ポリペプチドまたはそのエピトープと特異的に結合する抗体フラグメントは、当技術分野で公知の技術によって作製することができる。例えば、このような断片としては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作出可能なF(ab’)2断片、F(ab’)2断片のジスルフィド橋の還元によって作製できるFab’ 断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製できるFab 断片、およびFv断片が挙げられる。
【０３１４】
抗体の作製において、所望の抗体のスクリーニングは当技術分野で公知の技術、例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)によってなし得る。MTSP10ポリペプチドの特定のドメインに特異的な抗体を選択するには、このようなドメインを含むMTSP10ポリペプチドの断片と結合する産物に対し作製したハイブリドーマをアッセイしてよい。
【０３１５】
上記の抗体は、例えば診断法における、例えばこれらのタンパク質のイメージング、適当な生理学的サンプル中でのそのレベル測定のための、MTSP10ポリペプチドタンパク質の限局化および／または定量化に関する当技術分野で公知の方法で用いることができる。もう1つの実施形態では、抗MTSP10ポリペプチド抗体またはその結合ドメインを含む断片を処置薬として用いる。
【０３１６】
2. ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクス
本明細書ではSPタンパク質と結合してその活性を調節する分子を同定するための方法を提供する。SP、特に一本鎖プロテアーゼドメインまたはその触媒活性断片と結合する分子の中にはペプチド、ポリペプチドおよび環状ペプチドを含むペプチドミメティクスが含まれる。ペプチドミメティクスとはMTSP10ポリペプチドなどの標的分子との特異的結合に必要なリガンドまたはポリペプチドの分子コンホメーションを模倣する分子または化合物である。例としての実施形態では、このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインと結合する。このようなペプチドおよびペプチドミメティクスとしては、MTSP10ポリペプチドと特異的に結合する、典型的にはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインと結合する抗体が挙げられる。本明細書の方法によって同定されるこのペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスはMTSP10ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【０３１７】
このようなペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスは哺乳類のMTSP10ポリペプチド活性に関連する疾病または疾患の診断、処置、予防およびスクリーニングに有用である。さらに、このペプチドおよびペプチドミメティクスはMTSP10ポリペプチドの活性を調節する、またはMTSP10ポリペプチドの活性を調節する、あるいはMTSP10ポリペプチド、一般的にはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインと特異的に結合する分子または化合物の同定、単離および精製に有用である。分子量の低いペプチドおよびペプチドミメティクスは標的分子、例えばMTSP10ポリペプチドまたはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインに対し強力な結合特性を有し得る。
【０３１８】
本明細書に記載のMTSP10ポリペプチドと結合するペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスはヒトをはじめとする哺乳類に投与してMTSP10ポリペプチド活性を調節することができる。従って、このような活性を調節するに十分な量のペプチド、ポリペプチドまたはペプチドミメティクス化合物を投与することを含む新生物形成疾患の処置法および予防法が提供される。従って、ペプチド、ポリペプチドまたはペプチドミメティクス化合物を処置上有効な量で被験体に投与する、このような疾病または疾患を有する被験体の処置法もまた本明細書で提供される。
【０３１９】
ペプチド、ポリペプチドまたはペプチドミメティクスを含む組成物は予防および／または処置を目的に投与することができる。処置用途では、上記のようにすでに疾病に罹患している患者に対し、病状および合併症を治癒させる、または少なくとも部分的にくい止めるのに十分な量の組成物を投与することができる。この使用に有効な量は疾病の重篤度ならびに患者の体重および全身状態によって異なり、経験によって決定することができる。
【０３２０】
予防用途では、ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスを含む組成を、特定の疾病に罹患しやすい、あるいはまた特定の疾患のリスクがある患者に投与する。このような量は「予防上有効な量」と定義される。この用法で、正確な量はこの場合もやはり患者の健康状態および体重によって異なる。従って、MTSP10ポリペプチドと結合するこのペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスを用いて有効成分として少なくとも1つのペプチド、ポリペプチドまたはペプチドミメティクスを医薬担体または希釈剤と会合させて含む医薬組成物を調製することができる。この化合物は、例えば、経口、肺内、非経口(筋肉内、腹腔内、静脈内(IV)または皮下注射)、吸入(微粉末製剤による)、経皮、鼻内、膣、直腸、または舌下の投与経路により投与でき、また、各投与経路に適した投与形に製剤することができる(例えば、PCT国際出願WO 93/25221およびWO 94/17784;ならびに欧州特許出願第613,683号参照)。
【０３２１】
MTSP10ポリペプチドと結合するペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスは、in vitroでMTSP10ポリペプチドの産生に影響を与えると思われる、およびMTSP10ポリペプチドの産生によって影響を受けると思われる多くの因子の評価をはじめ、MTSP10ポリペプチドの生物学的な役割を理解する独特のツールとして有用である。このようなペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスはまたMTSP10ポリペプチドと結合してその活性を調節するその他の化合物の開発においても、このような化合物はこのような開発を促進すべき構造と活性との間の関係に関する重要な情報をもたらすことから、有用である。
【０３２２】
このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスはまた、新規なMTSP10ポリペプチドまたはMTSP10ポリペプチドアゴニストのスクリーニングのためのアッセイにおいて競合結合剤としても有用である。このようなアッセイの実施形態では、この化合物は修飾せずに用いることもできるし、あるいは多様な方法、例えば、直接または間接的に検出可能なシグナルを与える部分の共有結合または非共有結合などの標識により修飾することもできる。これらいずれのアッセイにおいても、材料は直接または間接的に標識することができる。直接標識が可能なものとしては、ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼなどの125I 酵素(米国特許第3,645,090号)のような放射性標識、および蛍光強度、波長シフトまたは蛍光偏光における変化をモニタリングできる蛍光標識(米国特許第3,940,475号)といった標識群が挙げられる。間接標識が可能なものとしては、１つの構成要素をビオチン化した後、上記標識群の1つと共役させたアビジンと結合させるものが挙げられる。これらの化合物が固相支持体と結合している場合には、それらの化合物はスペーサーまたはリンカーを含んでもよい。
【０３２３】
さらに、MTSP10ポリペプチドとの結合能を基に、このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスを、生細胞、固定化細胞、体液、組織ホモジネート、および精製した天然生体材料でMTSP10ポリペプチドを検出する試薬として使用することができる。例えば、このようなペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスを標識することにより、MTSP10ポリペプチドを有する細胞を同定することができる。さらに、MTSP10ポリペプチドとの結合能を基に、このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスをin situ染色、FACS(蛍光活性セルソート)、ウエスタンブロット法、ELISAおよびその他の分析プロトコールに使用できる。MTSP10ポリペプチドとの結合能を基に、このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスをMTSP10ポリペプチドの精製、またはMTSP10ポリペプチド、例えば、MTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインをコードするポリペプチドを発現する細胞の精製に使用することができる。
【０３２４】
このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスはまた種々の医学研究および診断用の商業用試薬としても使用することができる。このペプチドおよびペプチドミメティクスの活性はin vitroまたはin vivoのいずれかでMcDonald (1992) Am. J. of Pediatric Hematology/Oncology, 14:8-21に記載の多数のモデルのうちの1つで評価することができる。
【０３２５】
3. ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクス療法
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドのものと特性が類似した非ペプチド薬剤として製薬産業で広く用いられている。この種の非ペプチド系化合物は「ペプチドミメティクス」と呼ばれている(Luthman et al., A Textbook of Drug Design and Development, 14:386-406, 2nd Ed., Harwood Academic Publishers (1996); Joachim Grante (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33:1699-1720; Fauchere (1986) J. Adv. Drug Res., 15:29; Veber and Freidinger (1985) TINS, p. 392;およびEvans et al. (1987) J. Med. Chem. 30:1229)。処置上有用なペプチドと構造的に類似したペプチドミメティクスを使用して同等または機能の向上した処置または予防効果を生むことができる。ペプチドミメティクスの製法およびその構造は当業者に公知である。
【０３２６】
コンセンサス配列の1以上のアミノ酸の、同型のD-アミノ酸での系統的置換(例えば、L-リジンの代わりにD-リジン)を用いて、より安定なペプチドを作製することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変異体を含む拘束ペプチドは当技術分野で公知の方法(出典明示により本明細書の一部とするRizo et al. (1992) An. Rev. Biochem., 61:387)、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド橋を形成し得る内部システイン残基を付加することで作製することができる。
【０３２７】
当業者ならば、このペプチドの生物学的または機能的活性に悪影響を与えることなくペプチドおよびミメティクスに修飾を行うことができるのが分かるであろう。さらに、当業者ならば、標的分子、例えばMTSP10ポリペプチドまたは一般的にMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインと結合するペプチドを模倣する三次元非ペプチド構造をどのようにデザインすればよいかが分かるであろう(例えば、Eck and Sprang (1989) J. Biol. Chem., 26: 17605-18795参照)。
【０３２８】
診断目的で使用する場合、このペプチドおよびペプチドミメティクスは検出可能な標識で標識することができ、従ってこのような標識のないペプチドおよびペプチドミメティクスは標識したペプチドおよびペプチドミメティクスの作製の中間体として役立ち得る。検出可能な標識は、このペプチドおよびペプチドミメティクスと共有結合している場合、in vivoで、例えばこのペプチドおよびペプチドミメティクスを投与した患者で、またはin vitroで、例えばサンプルまたは細胞で、このペプチドおよびペプチドミメティクスの検出を可能にする分子または化合物であり得る。好適な検出可能な標識は当技術分野で周知であり、例として放射性同位元素、蛍光標識(例えば、フルオレセイン)などが挙げられる。用いられる特定の検出可能な標識は決定的なものはなく、毒性のないレベルで検出可能なように選択される。このような標識の選択は十分当技術分野の範囲内にある。
【０３２９】
検出可能な標識とこのペプチドおよびペプチドミメティクスとの共有結合は当技術分野で周知の従来の方法によって達成される。例えば、125I放射性同位元素を検出可能な標識として用いた場合、125Iのペプチドまたはペプチドミメティクスとの共有結合は、アミノ酸チロシンをペプチドまたはペプチドミメティクスに組み込んだ後、ペプチドをヨウ素処理することにより達成することができる(例えば、Weaner et al. (1994) Synthesis and Applications of Isotopically-labelled Compounds, pp. 137-140参照)。チロシンがペプチドまたはペプチドミメティクスに存在しない場合、ペプチドまたはペプチドミメティクスのNまたはC末端へのチロシンの組み込みは周知の化学によって達成できる。同様に、32Pも従来の化学を用い、例えば水酸基を介してリン酸部分としてペプチドまたはペプチドミメティクスへ組み込むことができる。
【０３３０】
ペプチドミメティクスの標識は通常、直接またはスペーサー(例えば、アミド基)を介して1以上の標識を、定量的構造-活性データおよび／または分子モデリングから予測されるペプチドミメティクス上の非干渉位置と共有結合させることを含む。一般にこのような非干渉位置とは、ペプチドミメティクスがそれと結合して処置作用をもたらす高分子と直接接触しないような位置のことである。ペプチドミメティクスの誘導体化(例えば、標識)は、ペプチドミメティクスの所望の生物活性または薬理活性を実質的に妨害してはならない。
【０３３１】
MTSP10ポリペプチドまたはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインと結合し、かつ／またはその活性を調節する、またはMTSP10ポリペプチド活性を示すペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスは、新生物形成疾患の処置に使用できる。このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスは、in vivoまたはex vivoで処置の必要な被験体の細胞へ送達することができる。さらに、MTSP10ポリペプチド活性を有するペプチドもin vivoまたはex vivoで突然変異またはMTSP10ポリペプチド遺伝子をコードする対立遺伝子の欠失を有する細胞へ送達することができる。本明細書に記載のまたは当業者に公知の技術のいずれかを、実質的にその他のヒトタンパク質を含まないこのようなペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスの作製およびin vivoまたはex vivoでの送達に使用できる。例えば、このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスは微生物での発現またはin vitro合成により容易に作製できる。
【０３３２】
このペプチドまたはペプチドミメティクスはin vivoまたはex vivoで例えばマイクロインジェクションにより、またはリポソームの使用により細胞へ導入することができる。あるいは、このペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスは能動的にまたは拡散によってin vivoまたはex vivoで細胞に取り込ませることができる。さらに、このペプチド、ポリペプチドまたはペプチドミメティクスの細胞外の用途も新生物形成疾患の処置に十分な効果を与え得る。1)MTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインと結合する;または2)MTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインと類似した機能または活性を有するような薬剤または有機化合物などその他の分子を処置法に用いることができる。
【０３３３】
4. 合理的創薬
合理的創薬の目的は、例えばそのより活性なまたはより安定な形態、または例えばin vivoでポリペプチド(例えば、MTSP10ポリペプチド)の機能を増強するまたは妨害する薬剤を創り出すために相互作用する(例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト)、目的の生物活性ポリペプチドまたはペプチド、あるいは小分子またはペプチドミメティクスの構造類似体を作製することである。あるアプローチでは、まず、目的タンパク質(例えば、MTSP10ポリペプチドまたはプロテアーゼドメインを有するポリペプチド)の、または例えばMTSP10ポリペプチド-リガンド複合体の三次元構造をＸ線結晶学によって、コンピューターモデリングによって、または最も典型的にはコンビネーションアプローチ(例えば、Erickson et al. 1990参照)によって決定する。また、ポリペプチドの構造に関する有用な情報を相同タンパク質の構造に基づくモデリングによって得ることができる。さらに、アラニンスキャンによってペプチドを解析することもできる。この技術では、アミノ酸残基をAlaで置換し、ペプチド活性に対する効果を測定する。このペプチドの各々のアミノ酸残基をこの方法で解析してこのペプチドの重要な領域を決定する。
【０３３４】
また、MTSP10ポリペプチド、または一般的にMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインと結合するポリペプチドまたはペプチドを機能アッセイによって選択した後、このポリペプチドまたはペプチドの結晶構造を決定することができる。このポリペプチドは、例えば、MTSP10ポリペプチドまたはMTSP10ポリペプチドのタンパク質ドメインに特異的な抗体であり得る。このアプローチから、その後の創薬の基礎となり得るファーマコフォア(薬理的作用団)が得られる。さらに、MTSP10ポリペプチドまたはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインと結合する機能的、薬理活性ポリペプチドまたはペプチドに対し、抗イディオタイプポリペプチドまたはペプチド(抗id)を作製することによって結晶学を迂回することも可能である。鏡像の鏡像として、抗idの結合部位は、本来の標的分子、例えば、MTSP10ポリペプチドまたはMTSP10ポリペプチドを有するポリペプチドの類似体であると予想される。次にこの抗idを用いて化学的または生物学的に作製したペプチドバンクのバンクからペプチドを同定および単離することができる。選択されたペプチドは次にファーマコフォアとして役立つ。
【０３３５】
従って、例えば、改善された活性または安定性を有する、またはMTSP10ポリペプチド活性のモジュレーター(例えば、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)として働き、かつ、これらの方法、特に新生物形成疾患の診断、処置、予防およびスクリーニング法に有用である薬剤をデザインすることができる。MTSP10ポリペプチドをコードする核酸が利用できることで、十分量のMTSP10ポリペプチドをＸ線結晶学のような分析的研究を行うのに利用することができる。さらに、MTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインのアミノ酸配列の知識、例えば、配列番号23および6のアミノ酸配列にコードされるプロテアーゼドメインから、Ｘ線結晶学の代わりに、またそれに加えてコンピューターモデリング技術に関する指針を得ることができる。
【０３３６】
MTSP10ポリペプチドと結合するペプチドおよびペプチドミメティクスの同定方法
本明細書で提供されるMTSP10ポリペプチド(例えば、MTSP10ポリペプチドまたはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインを有するポリペプチド)に対して結合親和性を有するペプチドは、例えば、親和性増強プロセスと組み合わせたランダムペプチド多様性生成系により容易に同定することができる。具体的には、ランダムペプチド多様性生成系としては、「プラスミド上ペプチド」系(例えば、米国特許第5,270,170号および同第5,338,665号参照);「ファージ上ペプチド」系(例えば、米国特許第6,121,238号およびCwirla,et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6378-6382参照);「ポリソーム系」;「コードされた合成ライブラリー(ESL)」系;および「超大スケール固定化高分子合成」系(例えば、米国特許第6,121,238号;およびDower et al. (1991) An. Rep. Med. Chem. 26:271-280参照)が挙げられる。
【０３３７】
例えば、上記の手法を用いて、一般に所定数のアミノ酸残基長(例えば、12)を有するようランダムペプチドをデザインすることができる。ランダムペプチドをコードするオリゴヌクレオチドのコレクションを作製するため、コドンモチーフ(NNK)x(ここで、NはヌクレオチドA、C、GまたはT(等モル;用いる方法論によって、その他のヌクレオチドを用いてもよい)であり、KはGまたはT(等モル)であり、かつ、xはペプチド中のアミノ酸の数(例えば、12)に相当する整数である)を用いてNNKモチーフから得られる32の可能性のあるコドン(12のアミノ酸各々に対して1、5のアミノ酸各々に対して2、3のアミノ酸各々に対して3、および3つの停止コドンのうち1つだけ)のうちのどれか1つを具体化することができる。従って、NNKモチーフは全てのアミノ酸をコードし、停止コドンを1つだけコードして、コドンの偏りを少なくする。
【０３３８】
このランダムペプチドは、例えば、ファージ粒子の表面にファージfd誘導体のpIIIまたはpVIIIのいずれかのコートタンパク質を含む融合タンパク質の一部としてか(ファージ上のペプチド)、またはプラスミドと結合したLacIペプチド融合タンパク質との融合タンパク質として(プラスミド上のペプチド)提供し得る。このペプチドをコードするDNAをはじめとするファージまたはプラスミドは、プロテアーゼドメインを有する固定化MTSP10ポリペプチドを用いて親和性増強プロセスによって同定および単離することができる。親和性増強プロセスは「パンニング」とも呼ばれ、典型的には固定化MTSP10ポリペプチドを有するファージ、プラスミド、またはポリソームを複数回インキュベートし、MTSP10ポリペプチドと結合するファージ、プラスミド、またはポリソームを回収し(付随するDNAまたはmRNAとともに)、さらに回収したファージまたはプラスミドを量産する(付随するLacI-ペプチド融合タンパク質とともに)ことを含む。
【０３３９】
ペプチドおよびペプチドミメティクスの特徴
処置用ペプチド、ポリペプチドおよびペプチドミメティクスの中には約250〜約8,000ダルトンの分子量を有するものがある。このようなペプチドを親水性高分子でオリゴマー化、二量体化および／または誘導体化させれば(例えば、化合物の親和性および／または活性を向上させるため)、このようなペプチドの分子量は実質的に増え、約500〜約120,000ダルトン、一般には約8,000〜約80,000ダルトンの間の範囲であり得る。このようなペプチドには天然アミノ酸または合成(非天然)アミノ酸を9以上含み得る。当業者ならば、処置目的および／または診断目的に適したペプチドおよびペプチドミメティクスの親和性および分子量を決定することができる(例えば、Dower et al.,米国特許第6,121,238号参照)。
【０３４０】
これらのペプチドは1以上の種々の親水性高分子と共有結合させることができる。好適な親水性高分子としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを例とするポリアルキルエーテル類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体が挙げられる。これらのペプチド化合物をこのような高分子で誘導体化する場合、それらの結合活性においてあるとしてもわずかな低下を伴うだけでそれらの溶解度および循環半減期が増加し得る。これらのペプチド化合物は二量体化が可能で、各二量体サブユニットは親水性高分子と共有結合させることができる。これらのペプチド化合物はPEG化、すなわち、ポリエチレングリコール(PEG)と共有結合可能である。
【０３４１】
5. ペプチドおよびペプチドミメティクスの作製方法
MTSP10ポリペプチドと結合するペプチドは当技術分野で公知の従来技術、例えば、標準的な固相技術を用いて作製することができる。これら標準的方法には全面的固相合成、部分的固相合成法、断片縮合、従来の液相合成、および組換えDNA技術によるものも含まれる(例えば、出典明示により本明細書の一部とするMerrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149参照)。
【０３４２】
「コードされた合成ライブラリー」または「超大スケール固定化高分子合成」系(例えば、米国特許第5,925,525号および同第5,902,723号参照)を用いて、目的の活性を有する最小サイズのペプチドを割り出すことができる。さらに所望のモチーフ(または最小サイズのそのモチーフ)と1、2またはそれ以上の残基で異なるペプチド群を形成する全てのペプチドを作製することもできる。次にこのペプチドコレクションを、標的分子、例えばMTSP10ポリペプチド、または一般的にはMTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインとの結合能に関してスクリーニングすることができる。この固定化高分子合成系またはその他のペプチド合成法はまた末端切断類似体および欠失類似体ならびにこれらのペプチド化合物の末端切断および欠失類似体の組合せを合成するためにも使用できる。
【０３４３】
またこれらの手順を用いて20の天然に存在する、遺伝子コードされたもの以外のアミノ酸がペプチドの1、2またはそれ以上の位置で置換されているペプチドを合成することもできる。例えば、ナフチルアラニンはトリプトファンと置換して合成を促進させることができる。これらのペプチドと置換できるその他の合成アミノ酸としては、L-ヒドロキシプロピル、L-3,4-ジヒドロキシ-フェニルアラニル;L-d-ヒドロキシリシルおよびD-d-メチルアラニルなどのdアミノ酸；L-α-メチルアラニル、βアミノ酸およびイソキノリルが挙げられる。Dアミノ酸および非天然合成アミノ酸もこれらのペプチドに組み込むことができる(例えば、Roberts et al. (1983) Unusual Amino/Acids in Peptide Synthesis, 5(6):341-449参照)。
【０３４４】
これらのペプチドはまたリン酸化(例えば、W. Bannwarth et al. (1996) Biorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6(17):2141-2146参照)、およびその他のペプチド誘導体作製法(例えば、Hruby et al. (1990) Biochem. J., 268(2):249-262参照)によっても修飾することができる。従って、ペプチド化合物もまた同等または向上した生物活性を有するペプチドミメティクスの作製の基礎として役立つ。
【０３４５】
当業者ならば対応するペプチド化合物として同一または同等の目的生物活性を有するが、溶解度、安定性ならびに加水分解およびタンパク質分解感受性に関してそのペプチドよりも一層好ましい活性を有するペプチドミメティクスを構築するために種々の技術が利用できることが分かるであろう(例えば、Morgan et al. (1989) An. Rep. Med. Chem., 24:243-252参照)。N末端アミノ基、C末端カルボキシル基で修飾されたペプチドミメティクスを作製し、かつ／またはそのペプチドにおける1以上のアミド結合を非アミド結合に変える方法は当業者に公知である。
【０３４６】
アミノ末端修飾としては、限定されるものではないが、アルキル化、アセチル化およびスクシンイミド基を形成するカルボベンゾイル基の付加(例えば、Murray et al. (1995) Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 5th ed., Vol. 1, Manfred E. Wolf, ed., John Wiley and Sons, Inc.参照)が挙げられる。C末端修飾としては、C末端カルボキシル基がエステル、アミドで置換されているか、または環状ペプチドを形成するよう修飾されているミメティクスが含まれる。
【０３４７】
N末端およびC末端修飾に加え、ペプチドミメティクスをはじめとするペプチド化合物は、1以上の種々の親水性高分子で有利に修飾または共有結合させることができる。ペプチド化合物を親水性高分子で誘導体化すると、それらの結合活性においてあるとしてもわずかな低下を伴うだけで、それらの溶解度および循環半減期を増加させ、かつ、それらの免疫原性がマスキングできることが分かっている。好適な非タンパク質性高分子としては、限定されるものではないが、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを例とするポリアルキルエーテル類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオキシアルケン類、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、セルロースおよびセルロース誘導体、デキストランおよびデキストラン誘導体が挙げられる。一般的に、このような親水性高分子の平均分子量は約2,000〜約40,000ダルトン、および約5,000〜約20,000ダルトンなど、約500〜約100,000ダルトンの範囲にある。この親水性高分子の平均分子量は約5,000ダルトン、10,000ダルトンおよび20,000ダルトンであってもよい。
【０３４８】
ペプチド化合物を誘導体化する、またはペプチドとこのような高分子とを結合させる方法が記載されている(例えば、Zallipsky (1995) Bioconjugate Chem., 6:150-165; Monfardini et al. (1995) Bioconjugate Chem., 6:62-69;米国特許第4,640,835号;同第4,496,689号;同第4,301,144号;同第4,670,417号;同第4,791,192号;同第4,179,337号およびWO 95/34326参照、なおこれらは全て出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする)。
【０３４９】
その他のペプチド誘導体の作製方法は、例えば出典明示により本明細書の一部とするHruby et al. (1990), Biochem J., 268(2):249-262に記載されている。従って、これらのペプチド化合物はまた同等の生物活性を有する非ペプチド化合物の構造モデルとしても役立つ。当業者ならば、特定のペプチド化合物として同一または同等の目的生物活性を有するが、溶解度、安定性、ならびに加水分解およびタンパク質分解感受性に関して一層好ましい活性を有する化合物の構築に種々の技術が利用できることが分かるであろう(例えば、出典明示により本明細書の一部とするMorgan et al. (1989) An. Rep. Med. Chem., 24:243-252参照)。これらの技術には、ペプチド主鎖の、ホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミド、第二級アミン、およびN-メチルアミノ酸からなる主鎖での置換が挙げられる。
【０３５０】
ペプチド化合物は、システインのチオール基間に分子内ジスルフィド結合を有する環化形態で存在し得る。あるいは、二量(またはより高次のオリゴマー)化合物を得るためにシステインのチオール基間の分子内ジスルフィド結合を形成することができる。また、1以上のシステイン残基をホモシステインで置換することもできる。
【０３５１】
I. コンジュゲート
本明細書では、a)MTSP10ポリペプチドの一本鎖プロテアーゼドメイン(またはそのタンパク質分解活性部分)または全長チモーゲン、その活性型、あるいはその二本鎖または一本鎖プロテアーゼドメイン、およびb)MTSP10ポリペプチドと直接またはリンカーを介して結合しているターゲッティングエージェント(ここで、このエージェントはi)コンジュゲートのアフィニティー単離または精製、ii)コンジュゲートの表面への結合、iii)コンジュゲートの検出、またはiv)選択された組織または細胞へのターゲッティング送達を容易にする)を含むコンジュゲートが提供される。このコンジュゲートは化学コンジュゲートまたはその融合タンパク質混合物であり得る。
【０３５２】
ターゲッティングエージェントは、MTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインと直接またはリンカーを介して結合している組織特異的または腫瘍特異的モノクローナル抗体、あるいは増殖因子またはその断片などのタンパク質またはペプチド断片であり得る。ターゲッティングエージェントはまた、タンパク質結合配列、核酸結合配列、脂質結合配列、多糖結合配列、または金属結合配列、あるいは固相支持体と結合するためのリンカーを含むタンパク質またはペプチド断片であり得る。特定の実施形態では、このコンジュゲートはa)本明細書に記載されるようなMTSP10またはその一部、およびb)MTSP10ポリペプチドと直接またはリンカーを介して結合しているターゲッティングエージェントを含む。
【０３５３】
例えば、MTSP10ポリペプチドドメインのアフィニティー単離または精製、MTSP10ポリペプチドドメインの表面への結合、またはMTSP10ポリペプチドドメインの検出を容易にする働きをするタンパク質またはペプチド断片(またはその複数)を有するMTSP10ポリペプチドの、融合タンパク質および化学コンジュゲートなどのコンジュゲートが提供される。これらのコンジュゲートはチオール結合を介するものなどの化学コンジュゲーションにより作製することができ、また組換え手段によって融合タンパク質として作製することもできる。融合タンパク質においては、このペプチドまたはその断片はMTSP10ポリペプチドドメインのN末端またはC末端のいずれかと結合している。化学コンジュゲートではペプチドまたはその断片はコンジュゲーションがなされる限りいずれの部位にでも結合可能で、単一のMTSP10ポリペプチドドメインまたはその複数と結合されるこのようなペプチドまたは断片は複数であってもよい。
【０３５４】
ターゲッティングエージェントは細胞または組織へのin vitroまたはin vivo送達を目的としたものであり、細胞または組織特異的抗体、増殖因子および特定の細胞で発現する部分と結合するその他の因子(化合物を含む)などのエージェント、ならびに結合したタンパク質の方向付けられた送達を促進するその他の細胞または組織特異的エージェントが挙げられる。ターゲッティングエージェントとは細胞表面タンパク質との相互作用およびコンジュゲートまたはそのMTSP10ポリペプチド部分のインターナリゼーションによってMTSP10ポリペプチドを選択された細胞へ特異的に送達するものであり得る。
【０３５５】
これらのコンジュゲートは種々の方法で用いられ、標的細胞または組織に、またはその近傍に局在している特定のMTSP10による切断に対して細胞傷害性であるプロドラッグなどのプロドラッグの活性化法での使用に特に適している。プロドラッグはコンジュゲートの前、または同時に、あるいはコンジュゲートの後で投与される。標的細胞への送達の際、プロテアーゼはプロドラッグを活性化させ、その後プロドラッグは細胞傷害作用などの処置効果を示す。
【０３５６】
1. コンジュゲーション
MTSP10ポリペプチドドメインと結合したコンジュゲートは化学コンジュゲーション、組み換えDNA技術、または組み換え発現および化学コンジュゲーションの組み合わせのいずれの方法でも作製できる。MTSP10ポリペプチドドメインおよびターゲッティングエージェントはどの方向へも結合でき、1以上のターゲッティングエージェントおよび／またはMTSP10ポリペプチドドメインがコンジュゲートに存在可能である。
【０３５７】
a. 融合タンパク質
本明細書では融合タンパク質が提供される。融合タンパク質には、a)1または複数のMTSP10ポリペプチドドメイン、およびb)ターゲッティングエージェントが含まれる。融合タンパク質は一般に融合タンパク質をコードする核酸の組み換え発現により作出される。
【０３５８】
b. 化学コンジュゲーション
本明細書の化学コンジュゲーションを達成するには、MTSP10ポリペプチドドメインは1以上の選択されたリンカーを介してまたは直接ターゲッティングエージェントと連結させる。標的薬剤が核酸または非ペプチド薬剤などのペプチドまたはタンパク質以外のものである場合には化学コンジュゲーションを用いる必要がある。選択した部分の化学コンジュゲーションのためには当業者に公知のいずれの方法を用いてもよい。
【０３５９】
2. リンカー
本明細書では2つの目的のためのリンカーが意図される。コンジュゲートにはMTSP10ポリペプチド部分とターゲッティングエージェントとの間に1以上のリンカーを含めることができる。さらに、リンカーはMTSP10ポリペプチドまたはその一部を、ハイスループット固相スクリーニングプロトコールを目的としたものなどマイクロタイタープレート、シリコンもしくはシリコンコートチップ、ガラスまたはプラスチック支持体などの固相支持体に固定化するのを促進または向上させるために用いられる。
【０３６０】
本明細書ではコンジュゲートの作製のための当業者に公知のいずれのリンカーでも使用できる。これらのリンカーは典型的には化学コンジュゲートの作製に用いられ、ペプチドリンカーは融合タンパク質に組み込まれ得る。
【０３６１】
リンカーはMTSP10ポリペプチドのドメインおよびターゲッティングエージェントとの会合に適したいずれの部分であってもよい。このようなリンカーおよび結合には、限定されるものではないが、ペプチド結合、アミノ酸およびペプチド結合(典型的には1〜約60の間のアミノ酸、より一般的には約10〜30の間のアミノ酸を含む)、限定されるものではないが、N-スクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、スルホスクシンイミジル(4-ヨードアセチル)-アミノベンゾエート、4-スクシンイミジル-オキシカルボニル-a-(2-ピリジルジチオ)トルエン、スルホスクシンイミジル-6-[a-メチル-a-(ピリジルジチオール)-トルアミド]ヘキサノエート、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオネート、スクシンイミジル6[3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド)ヘキサノエート、スルホスクシンイミジル6[3(-(-2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド)ヘキサノエート、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、およびS-(2-チオピリジル)-L-システインをはじめとする、ヘテロ二官能性切断架橋リンカーなどの化学リンカーが挙げられる。その他のリンカーとしては、限定されるものではないが、MTSP10ポリペプチドのドメインとターゲッティングエージェントとの間の立体障害を減らすペプチドおよびその他の部分、細胞内酵素基質、コンジュゲートの柔軟性を高めるリンカー、コンジュゲートの溶解度を高めるリンカー、コンジュゲートの血清安定性を高めるリンカー、光切断性リンカーおよび酸切断性リンカーが挙げられる。
【０３６２】
その他化学結合コンジュゲートに適したリンカーおよび結合の例としては、限定されるものではないが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、障害ジスルフィド結合、およびアミンおよびチオール基など遊離反応基間の共有結合が挙げられる。これらの結合は、ポリペプチドの一方または双方に反応性チオール基を生じるヘテロ二官能性試薬を用いて、反応性マレイミド基またはチオール基が他方に結合可能な反応性チオール基またはアミン基を有するポリペプチド上でチオール基を反応させることによって作出される。その他のリンカーには、ビスマレイミドオトキシプロパン、酸不安性トランスフェリンコンジュゲートおよびアジピン酸ジヒドラジドなど、より酸度の高い細胞内コンパートメントで切断される酸切断性リンカー;紫外光または可視光に露光した際に切断される架橋リンカーおよびCH1、CH2、およびCH3などヒトIgG1の不変領域に由来する種々のドメインなどのリンカーが挙げられる(Batra et al. Molecular Immunol., 30:379-386 (1993)参照)。いくつかの実施形態では、各リンカーの所望の特性を利用するために数種のリンカーを含めることができる。
【０３６３】
化学リンカーおよびペプチドリンカーはリンカーとMTSP10ポリペプチドのドメインおよびターゲッティングエージェントとを共有結合させることによって挿入することができる。以下に記載のヘテロ二官能性試薬を用いてこのような共有結合を達成することができる。またペプチドリンカーをリンカーおよび処置薬(TA)、リンカーおよび標的エージェント、またはリンカー、標的エージェントおよび処置薬(TA)を融合タンパク質としてコードするDNAを発現させることで連結させることもできる。本明細書ではフレキシブルリンカーおよびコンジュゲートの溶解度を高めるリンカーの使用も意図され、単独でまたは他のリンカーとの併用も考えられる。
【０３６４】
a) 酸切断性、光切断性および熱感受性リンカー
酸切断性リンカー、光切断性リンカーおよび熱感受性リンカーも、特にMTSP10ポリペプチドのドメインの切断がより容易に反応しやすくするため必要である場合に使用できる。酸切断性リンカーとしては、限定されるものではないが、ビスマレイミドオトキシプロパン;およびアジピン酸ジヒドラジドリンカー(例えば、Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589参照)および細胞内トランスフェリン循環経路への進入に十分なトランスフェリンの部分を含む酸不安定性トランスフェリンコンジュゲート(例えば、Welh ner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4309-4314参照)が挙げられる。
【０３６５】
光切断性リンカーは露光した際に切断されるリンカーであり(例えば、Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107参照、なおこのリンカーは出典明示により本明細書の一部とする)、その結果、露光時に標的エージェントを放出する。露光時に切断される光切断性リンカーは公知であり(例えば、システインに対する光切断性保護基としてのニトロベンジル基の使用を記載したHazum et al. (1981) in Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 16th,  Brunfeldt, K (Ed), pp. 105-110;ヒドロキシプロピルメタクリルアミド共重合体、グリシン共重合体、フルオレセイン共重合体およびメチルローダミン共重合体をはじめとする水溶性光切断性共重合体を記載したYen et al. (1989) Makromol. Chem 190:69-82;近紫外光(350nm)露光時に光分解を受ける架橋リンカーおよび試薬を記載したGold macher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104-107;および光切断性結合を生じる塩化ニトロベンジルオキシカルボニル架橋試薬を記載したSenter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42:231-237参照)、その結果、露光時に標的エージェントを放出する。このようなリンカーは、光ファイバーを用いて露光できる皮膚科または眼科的条件での処置に特に用途を持つ。コンジュゲートを投与した後に眼または皮膚またはその他の身体部分を露光すればよく、結果としてコンジュゲートから標的部分が放出される。このような光切断性リンカーは、動物の体内から迅速なクリアランスを可能にするべくターゲッティングエージェントを除去することが望ましい診断プロトコールに関して有用である。
【０３６６】
b) 化学コンジュゲーションのためのその他のリンカー
種々の酸度またはアルカリ度の処置薬の放出のために提供するコンジュゲート種を作製するその他のリンカーとしては、トリチルリンカー、特に誘導体化トリチル基が挙げられる。このようにして処置薬が放出されるpH範囲を予め選択できることによってもたらされる柔軟性は、処置薬の送達を必要とする組織間の既知の生理的差異に基づくリンカーの選択を可能にする(例えば、米国特許第5,612,474号参照)。例えば、腫瘍組織の酸度は正常組織のものよりも低いと思われる。
【０３６７】
c) ペプチドリンカー
リンカー部分はペプチドであってもよい。ペプチドリンカーは融合タンパク質および化学結合コンジュゲートに用いることができる。 このペプチドは典型的には約2〜約60のアミノ酸残基、例えば約5〜約40、または約10〜約30のアミノ酸残基を有する。選択される長さは、リンカーが含められる用途などの要因によって異なる。
【０３６８】
ペプチドリンカーは、ターゲッティングエージェントがタンパク質性のものである場合に有利である。例えば、リンカー部分は一本鎖抗体研究で知られているものなど、柔軟なスペーサーアミノ酸配列であってよい。このような既知のリンカー部分の例としては、限定されるものではないが、 (GlymSer)nおよび(SermGly)n(nは1〜6であって、1〜4および2〜4などであり、mは1〜6であって1〜4および2〜4などである)などのペプチド、酵素切断性リンカーおよびその他のものが挙げられる。
【０３６９】
さらなる架橋部分は例えば、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883, 1988; Whitlow, M., et al., Protein Engineering 6:989-995, 1993; Newton et al., Biochemistry 35:545-553, 1996; A. J. Cumber et al., Bioconj. Chem. 3:397-401, 1992; Ladurner et al., J. Mol. Biol. 273:330-337, 1997;および米国特許第4,894,443号に記載されている。ある実施形態では、各リンカーの所望の特性を利用するため、数種のリンカーを含めることができる。
【０３７０】
3. ターゲッティングエージェント
本明細書における使用ではコンジュゲートの検出、固定化または精製を容易にするいずれのエージェントも意図される。化学コンジュゲートについてはこのような特性を持ついずれの部分も意図され、融合タンパク質については、ターゲッティングエージェントは標的とする活性に作用するのに十分なタンパク質、ペプチドまたはその断片である。意図されるターゲッティングエージェントとしてはMTSP10ポリペプチドまたはその部分を選択細胞または組織へ送達するものが挙げられる。このような佐用因子としては、腫瘍特異的モノクローナル抗体およびその部分、FGF、EGF、PDGF、VEGFなどの増殖因子、ケモカインをはじめとするサイトカインおよびその他の作用因子が挙げられる。
【０３７１】
4. 核酸、プラスミドおよび細胞
融合タンパク質をコードする単離核酸断片が提供される。この融合タンパク質をコードする核酸断片としては、a)MTSP10ポリペプチドのプロテアーゼドメインをコードする核酸; およびb) i)融合タンパク質のアフィニティー単離または精製;ii)融合タンパク質の表面への結合;またはiii)融合タンパク質の検出を容易にするタンパク質、ペプチドまたはその有効な断片をコードする核酸が挙げられる。一般的に、この核酸はDNAである。
【０３７２】
上記の核酸断片を含む複製用プラスミドおよび発現用ベクターも提供される。これらのプラスミドおよびベクターを含む細胞も提供される。この細胞は、限定されるものではないが、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞をはじめとする、好適な宿主であり得る。この核酸、プラスミド、およびこれらのプラスミドを含む細胞は、本明細書に記載のものをはじめ当技術分野で公知の方法に従って作製できる。
【０３７３】
上記融合タンパク質を作製する方法も提供される。方法の例としては、増殖、例えば融合タンパク質が細胞で発現するような条件下で融合タンパク質をコードするプラスミドを含む細胞を増やすべく細胞を培養し、発現した融合タンパク質を回収するステップを含む。組換えタンパク質の発現および回収方法は当技術分野で周知であり(一般的に、Current Protocols in Molecular Biology (1998) § 16, John Wiley & Sons, Inc.参照)、このような方法を融合タンパク質の発現および回収に用いることができる。
【０３７４】
回収した融合タンパク質は当技術分野で公知の方法、例えば遠心分離、濾過、クロマトグラフ、電気泳動、免疫沈降およびその他のかかる方法など、またはその組合せによって単離または精製することができる(一般に、Current Protocols in Molecular Biology  (1998) § 10, John Wiley & Sons, Inc.参照)。一般に、回収した融合タンパク質は、タンパク質または融合タンパク質のペプチド断片とアフィニティー結合部分との間のアフィニティー結合によって単離または精製される。上節で融合タンパク質の構築に関して述べたように、いずれのアフィニティー結合対も構築でき、融合タンパク質の単離または精製に使用できる。例えば、アフィニティー結合対はタンパク質結合配列/タンパク質、DNA結合配列/DNA配列、RNA結合配列/RNA配列、脂質結合配列/脂質、多糖結合配列/多糖、または金属結合配列/金属であり得る。
【０３７５】
5. 固定化およびその支持体
ターゲッティングエージェントが表面との結合を目的にデザインされている特定の実施形態では、MTSP10ポリペプチドはイオン結合または共有結合、非共有結合などの結合によって、あるいはその他の化学的相互作用によって支持体またはマトリックス材料の表面に結合させることができる。固定化は直接またはリンカーを介して行うことができる。MTSP10ポリペプチドは、限定されるものではないが、シリコンチップ、および本明細書に記載され、また当業者に公知であるその他の支持体をはじめとするいずれの好適な支持体にも固定化できる。複数のMTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインは、ハイスループットプロトコールおよび形式で用いるシリコンチップまたはその他のチップの表面上のコンジュゲートのアレイ(すなわち、2以上のパターンのもの)などの支持体と結合させることができる。
【０３７６】
また、MTSP10ポリペプチドのドメインは、ターゲッティングエージェントがそれに連結していなくても直接またはリンカーを介して表面と結合させることができることも注目される。よって、MTSP10ポリペプチドのドメインのアレイを含むチップも提供される。
【０３７７】
本明細書で意図されるマトリックス材料または固相支持体は一般に、リガンドおよびその他の分子を固定化するための当業者に公知のいずれの不溶性材料であってもよく、多くの化学合成および分離で用いられているものである。このような支持体は例えば、アフィニティークロマトグラフィー、生物活性物質の固定化、およびタンパク質、アミノ酸ならびにその他の有機分子および高分子をはじめとする生体分子の化学合成の際に用いられる。支持体の作製および使用は当業者に周知であり、多くのこのような物質およびその作製が知られている。例えば、アガロースおよびセルロースなどの天然支持体材料はそのそれぞれのソースから単離し、既知のプロトコールに従って加工することができるし、合成物質も既知のプロトコールに従って作製することができる。
【０３７８】
これらの支持体は典型的には固体、多孔質、変形性または硬質の不溶性材料であり、限定されるものではないが、ビーズ、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空糸、ニードル、中実ファイバー、ランダム図形、薄膜およびメンブランをはじめとする所望のいずれの構造および幾何学を有するものでもよい。従って、この製品としては、表面の全てまたは一部のコーティングあるいは粒子の含浸によるなど、マトリックス材料から、あるいはそれと合したものから製造できる。
【０３７９】
典型的に、マトリックスが粒状である場合、粒子は少なくとも約10〜2000μmであるが、選択された用途に応じてそれより小さくても大きくてもよい。マトリックスの選択は、少なくとも1つには、溶解度、官能基、機械的安定性、表面積膨潤性、疎水性または親水性の特性および意図する使用などそれらの物理化学的特性によって決定される。
【０３８０】
必要であれば、この支持体マトリックス材料は適当な反応性部分を含むよう処理することができる。予め反応性部分を含む支持体マトリックス材料が商業的に入手できる場合もある。これにより、反応性部分を含む支持体マトリックス材料は、分子が結合しているマトリックス支持体として役立ち得る。アミノシラン結合、ヒドロキシル結合またはカルボキシシラン結合などの反応性表面部分を含む材料は、シラン化反応などを含む十分確立された表面化学技術によって製造することができる。これらの材料の例は、γ-アミノプロピルシランと共有結合した表面酸化珪素部分、およびその他の有機部分、N-[3-(トリエチオキシ(ethyoxy)シリル)プロピル]フタラミン酸およびビス-(2-ヒドロキシエチル)アミノプロピルトリエトキシシランを有するものなどである。アミノ基反応性官能基を含む容易に入手できる材料の例としては、限定されるものではないが、パラ-アミノフェニルトリエトキシシランがある。また、誘導体化ポリスチレンおよびその他のこのような高分子は周知であり、当業者であれば容易に入手できる(例えば、多価官能基を有するTentagel(登録商標)樹脂が利用でき、これはRapp Polymere, Tubingen, Germanyから販売されている;米国特許第4,908,405号および同第5,292,814号参照;およびまたButz  et al., ペプチド Res., 7:20-23 (1994);およびKleine et al., Immunobiol., 190:53-66 (1994)参照)。
【０３８１】
これらのマトリックス材料としては、目的分子が結合する支持体マトリックスとして働き得るいずれの材料も含む。このような材料は当業者に公知であり、支持体マトリックスとして用いられるものを含む。このような材料としては、限定されるものではないが、無機物、天然高分子、および、限定されるものではないが、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドの共重合体、ジビニルベンゼン架橋ポリスチレンおよびその他(Merrifield, Biochemistry, 3:1385-1390 (1964)参照)、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、ポリスチレン、デキストラン、ポリアクリルアミド、ゴム、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、セルロース、海綿をはじめとする合成高分子が挙げられる。本明細書で特に注目されるものは、多孔質ガラス(例えば、米国特許第4,244,721号参照)およびホウケイ酸塩、アルコールおよび水を混合して製造されるその他のものである。
【０３８２】
合成支持体としては、限定されるものではないが、アクリルアミド、デキストラン誘導体およびデキストラン共重合体、アガロースポリアクリルアミド混合物、その他の高分子および種々の官能基との共重合体、メタクリル酸誘導体および共重合体、ポリスチレンおよびポリスチレン共重合体が挙げられる(例えば、Merrifield, Biochemistry, 3:1385-1390 (1964); Berg et al., in Innovation Perspect. Solid Phase Synth. Collect. Pap., Int. Symp., 1st, Epton, Roger (Ed), pp. 453-459 (1990); Berg et al., Pept., Proc. Eur. Pept. Symp., 20th, Jung, G. et al. (Eds), pp. 196-198 (1989); Berg et al., J. Am. Chem. Soc., 111:8024-8026 (1989); Kent et al., Isr. J. Chem., 17:243-247 (1979); Kent et al., J. Org. Chem., 43:2845-2852 (1978); Mitchell et al., Tetrahedron Lett., 42:3795-3798 (1976);米国特許第4,507,230号;同第4,006,117号;および同第5,389,449号参照)。このような材料としては、ポリビニルアルコール、ポリエチレン-アクリル酸共重合体などのアクリレートおよびアクリル酸、ポリエチレン-メタクリル酸共重合体、ポリエチレン-アクリル酸エチル共重合体、ポリエチレン-アクリル酸メチル共重合体、ポリプロピレン-アクリル酸共重合体、ポリプロピレン-メチル-アクリル酸共重合体、ポリプロピレン-アクリル酸エチル共重合体、ポリプロピレン-アクリル酸メチル共重合体、ポリエチレン-酢酸ビニル共重合体、ポリプロピレン-酢酸ビニル共重合体などの高分子および共重合体、ポリエチレン-無水マレイン酸およびポリプロピレン-無水マレイン酸などの酸無水物基を含むものからなるものが挙げられる。またリポソームも固相支持体としてアフィニティー精製に用いられている(Powell et al. Biotechnol. Bioeng., 33:173 (1989))。
【０３８３】
タンパク質およびその他の生体分子の固相または液相支持体への固定化に関して多数の方法が開発されている(例えば、Mosbach, Methods in Enzymology, 44 (1976); Weetall, Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides, (1975); Kennedy et al., Solid Phase Biochemistry, Analytical and Synthetic Aspects, Scouten, ed., pp. 253-391 (1983)参照;概要としては、Affinity Techniques. Enzyme Purification: Part B. Methods in Enzymology, Vol. 34, ed. W. B. Jakoby, M. Wilchek, Acad. Press, N.Y. (1974);およびImmobilized Biochemicals and Affinity Chromatography, Advances in Experimental Medicine and Biology, vol. 42, ed. R. Dunlap, Plenum Press, N.Y. (1974)参照)。
【０３８４】
最も一般に用いられる方法としては多数のジスルフィド結合、チオエーテル結合、障害ジスルフィド結合、および当業者に公知のアミンおよびチオール基などの遊離反応性基間の共有結合といった、直接もしくはリンカーを介しての支持体への吸収および吸着または共有結合がある(例えば、このような試薬の作製および使用を記載し、このような試薬の商業ソースを示しているthe PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Hand book, 1992-1993; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press (1993)参照;またDeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6909 (1993); Zuckermann et al., J. Am. Chem. Soc., 114:10646 (1992); Kurth et al., J. Am. Chem. Soc., 116:2661 (1994); Ellman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:4708 (1994); Sucholeiki, Tetrahedron Lttrs., 35:7307 (1994); Su-Sun Wang, J. Org. Chem., 41:3258 (1976); Padwa et al., J. Org. Chem., 41:3550 (1971);および光感受性リンカーを記載しているVedejs et al., J. Org. Chem., 49:575 (1984)参照)。
【０３８５】
固定化を達成するには、タンパク質またはその他の生体分子を含む組成物をアルミナ、カーボン、イオン交換樹脂、セルロース、ガラスまたはセラミックなどの支持体材料と接触させる。フルオロカーボン高分子が、生体分子が吸着によって結合されている支持体として用いられている(米国特許第3,843,443号;PCT公開国際出願WO/86 03840参照)。
【０３８６】
J. 予後および診断
MTSP10ポリペプチドタンパク質、そのドメイン、類似体、および誘導体、ならびにコード核酸(およびその相補的な配列)、および抗MTSP10ポリペプチド抗体は診断、特に肺癌、食道癌などの頭頸部癌、前立腺癌、大腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌および膵臓癌の診断に用いることができる。このような分子は免疫アッセイなどのアッセイで、MTSP10ポリペプチド発現に影響する種々の症状、疾病および疾患の検出、予後、診断またはモニタリング、あるいはその処置のモニタリングに用いることができる。本明細書の目的では体液または腫瘍組織中のMTSP10の存在が特に注目される。
【０３８７】
特に、このような免疫アッセイは、特異的結合が起こりうる条件下で、患者に由来するサンプルに抗MTSP10ポリペプチド抗体を接触させ、抗体による特異的結合の量を検出または測定することを含む方法によって行われる。組織切片におけるこのような抗体の結合を用いて、異常なMTSP10ポリペプチドの局在または異常なレベルのMTSP10ポリペプチド(例えば、上昇、低下または欠失)を検出することができる。特定の実施形態では、MTSP10ポリペプチドに対する抗体を用いて異常なレベルのMTSP10ポリペプチドが病態の指標となる、MTSP10ポリペプチドの存在に関する患者の組織または血清などの体液サンプルにおいてアッセイすることができる。
【０３８８】
使用できる免疫アッセイとしては、限定されるものではないが、ウエスタンブロット、放射性免疫測定法、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫アッセイおよびAタンパク質免疫アッセイなどの技術を用いる競合および非競合アッセイ系が挙げられる。
【０３８９】
MTSP10ポリペプチド遺伝子および関連する核酸配列ならびに相補配列をはじめとする部分配列もハイブリダイゼーションアッセイに使用できる。MTSP10ポリペプチド核酸配列、または少なくとも約8ヌクレオチド、一般的には14または16または30以上、一般的には1000未満または100までの連続するヌクレオチドを含むその部分配列はハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイは本明細書に記載のMTSP10ポリペプチド発現および／または活性の異常な変化に関連する症状、疾病または疾患の検出、予後、診断またはモニタリングに用いることができる。特に、このようなハイブリダイゼーションアッセイは、ハイブリダイゼーションが起こり得るような条件下で、核酸を含有するサンプルと、MTSP10ポリペプチドをコードするDNAまたはRNAとハイブリダイズ可能な核酸プローブとを接触させ、生じたハイブリダイゼーションを検出または測定するる方法によって行う。
【０３９０】
特定の実施形態では、被験体において異常なレベルのMTSP10ポリペプチドが検出されることを特徴とする疾病または疾患の診断方法が、被験体に由来するサンプル中のMTSP10ポリペプチドのDNA、RNA、タンパク質または機能的活性のレベルを測定することにより本明細書で提供される。この場合、疾病または疾患を持たない類似のサンプルで見られるMTSP10ポリペプチドのDNA、RNA、タンパク質または機能的活性のレベルに対して、MTSP10ポリペプチドのDNA、RNA、タンパク質または機能的活性のレベルにおける上昇または低下はその被験体に疾病または疾患が存在することを示す。
【０３９１】
1以上の容器に抗MTSP10ポリペプチド抗体、および所望により標識した抗体の結合相手を含む診断用のキットも提供される。あるいは、抗MTSP10ポリペプチド抗体を(検出マーカー、例えば、化学発光部分、酵素部分、蛍光部分または放射性部分で)標識することができる。1以上の容器にMTSP10ポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズ可能な核酸プローブを含むキットも提供される。特定の実施形態では、キットは1以上の容器にMTSP10ポリペプチドをコードする核酸の少なくとも一部の適当な反応条件下で[例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(例えば、Innis et al., 1990, PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA参照)、Qβレプリカーゼを利用するリガーゼ連鎖反応(欧州特許EP320,308参照)、環状プローブ反応、または当技術分野で公知のその他の方法によって]増幅誘導可能なプライマー対(例えば、各々6〜30ヌクレオチドの範囲の大きさ)を含み得る。キットは所望によりさらに容器内に所定量の精製MTSP10ポリペプチドまたは核酸、例えば標準または対照として用いるものを含むことができる。
【０３９２】
K. 医薬組成物および投与様式
1. 組成物の成分
本明細書では、MTSP10ポリペプチドの活性を調節すると同定された化合物を含む医薬組成物が提供される。また、MTSP10ポリペプチドの活性を調節する化合物と別の処置または化学療法用化合物などの新生物形成疾患の処置のための化合物との組合せも提供される。
【０３９３】
MTSP10ポリペプチドモジュレーターおよび抗腫瘍剤は、ともにまたは逐次または断続的投与のための個別の組成物としてパッケージングすることができる。あるいは、これらは単一の投与組成物または単一の組成物としての2つの投与組成物として提供することもできる。組合せもキットとしてパッケージングすることができる。
【０３９４】
a. MTSP10ポリペプチド阻害剤
単独または他の化合物と併用した場合に、望ましくない、かつ／または制御できない血管形成を含む新生物形成疾患に関連する臨床徴候または診断マーカーを緩和、軽減、改善、予防または緩解状態にする、もしくは緩解状態で維持し得る、本明細書に記載のものをはじめとするいずれのMTSP10ポリペプチド阻害剤も本組合せで使用できる。
【０３９５】
ある実施形態では、MTSP10ポリペプチド阻害剤は、MTSP10ポリペプチドまたはそのプロテアーゼドメインと特異的に反応する抗体またはそのフラグメント、MTSP10ポリペプチド産生の阻害剤、MTSP10ポリペプチドの膜局在阻害剤、またはMTSP10ポリペプチドの発現または特にその活性のいずれかの阻害剤である。
【０３９６】
b. 抗血管形成剤および抗腫瘍剤
単独または他の化合物と併用した場合に、望ましくない、かつ／または制御できない血管形成および／または腫瘍増殖ならびに転移、特に固形新生物、先天性血管異常および心血管疾患、慢性炎症性疾患および創傷修復異常、循環器疾患、クレスト症候群、皮膚疾患、または眼疾患に関連する臨床徴候または診断マーカーを緩和、軽減、改善、予防または緩解状態にする、もしくは緩解状態で維持し得る本明細書に記載のものをはじめとするいずれの抗血管形成剤および抗腫瘍剤も本組合せで使用できる。MTSP10ポリペプチドの阻害剤を併用する抗腫瘍剤も意図される。
【０３９７】
c. 抗腫瘍剤および抗血管形成剤
本明細書で提供される方法によって同定される、または本明細書で提供される化合物は抗腫瘍剤および／または抗血管形成剤と組み合わせて用いることができる。
【０３９８】
2. 製剤および投与経路
本発明の化合物および薬剤は典型的には単位量投与用に医薬組成物として調剤することができる。これら製剤中の化合物の濃度は投与時に意図する処置に有効な量の送達に有効なものである。典型的にはこれらの組成物は単位量投与向けに調剤する。組成物を調剤するには、その重量分の化合物またはその混合物を選択したビヒクルに、処置する症状が軽減または緩和されるような有効濃度で溶解、懸濁、分散させる、あるいはまた混合する。本明細書で提供される化合物の投与に好適な医薬担体またはビヒクルとしては、当業者が特定の投与様式に好適であると承知しているいずれの担体も含む。
【０３９９】
さらに、これらの化合物は組成物中に単独の医薬有効成分として調剤してもよいし、あるいは他の有効成分と組み合わせてもよい。組織ターゲッティングリポソームを含むリポソーム懸濁液も医薬上許容される担体として好適なものであり得る。これらは当業者に公知の方法に従って製造することができる。例えばリポソーム製剤は米国特許第4,522,811号に記載のようにして製造することができる。
【０４００】
有効化合物は処置する患者において望ましくない副作用なく処置上有用な作用を発揮するに十分な量で医薬上許容される担体に含める。処置上有効な濃度は本明細書に提供されるアッセイなど、公知のin vitroおよびin vivo系で化合物を試験することにより実験的に決定することができる。
【０４０１】
薬物組成物中の有効化合物の濃度はその有効化合物の吸収率、不活性化率および排出率、化合物の物理化学的特性、投与計画および投与量、ならびに当業者に公知のその他の要因によって異なる。
【０４０２】
典型的には処置上有効な投与形を考える。投与量は0.001〜1mg/ml血液量のオーダーであってよく、例えば約0.005〜0.05mg/mlおよび約0.01mg/mlなどである。医薬単位投与形は単位投与形当たり約1mg〜約1000mg、例えば約10〜500mg、約25〜75mgの必須有効成分または必須成分の組合せとなるように製造する。正確な用量は実験的に決定することができる。
【０４０３】
有効成分は一度に投与してもよいし、あるいはいくつかの少用量に分けて時間をおいて投与してもよい。正確な用量および処置期間は処置する疾病によって異なり、公知の試験プロトコールを用いて実験的に決定することもできるし、あるいはin vivoまたはin vitro試験データから推定することもできると考えられる。濃度または用量の値はまた緩和しようとする症状の重篤度によっても異なり得ることに注意を要する。さらにまた、特定の被験体の特定の投与計画は個々の必要性およびその組成物の投与者または投与管理者の専門的判断に従って経時的に調節すべきであり、また、本明細書で示される濃度範囲は単に例であって、請求される組成物またはそれらを含む組合せの範囲または使用を限定するものではない。
【０４０４】
医薬上許容される誘導体としては酸、塩、エステル、水和物、溶媒和物およびプロドラッグの形態が挙げられる。誘導体は典型的にはその薬物動態特性がそれと対応する中性化合物よりも優れたものとなるように選択する。
【０４０５】
このように有効濃度または有効量の、本明細書で提供される1以上の化合物またはその医薬上許容される誘導体を全身投与、局所投与または局部投与に好適な医薬担体またはビヒクルと混合して医薬組成物とする。化合物は処置を意図する疾患を緩和または処置するのに有効な量で含む。組成物中の有効化合物の濃度は有効化合物の吸収率、不活性化率、排出率、投与計画、投与量、特定の剤形、ならびに当業者に公知のその他の要因によって異なる。
【０４０６】
非経口、皮内、皮下、または局所適用に用いる溶液または懸濁液としては以下の成分：注射水、生理食塩水、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールおよびメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸および重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などのキレート剤;酢酸、クエン酸およびリン酸などのバッファー；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張力調整剤のいずれかを含んでよい。非経口製剤はガラス製、プラスチック製またはその他好適な材質のアンプル、使い捨てシリンジ、または一回量または複数量バイアルに封入することができる。
【０４０７】
化合物が十分な溶解度を示さない場合は化合物を可溶化する方法を使用することができる。このような方法は当業者に公知であり、限定されるものではないが、ジメチルスルホキシド(DMSO)などの補助溶媒の使用、Tween(登録商標)などの界面活性剤の使用、または重炭酸ナトリウム水溶液への溶解などが挙げられる。有効な医薬組成物の調剤にはまた、化合物のプロドラッグなど化合物の誘導体を使用することもできる。眼科適用としては、眼科上許容される担体中に組成物を調剤する。本明細書での眼用としては、局所投与または注射いずれかによる局所投与が考えられる。徐放性製剤も望ましい。典型的にはこれらの組成物は一回量で有効量を投与するような単位量投与用に調剤する。
【０４０８】
化合物にビヒクルを混合または添加した際、得られる混合物は溶液、懸濁液、エマルションまたはその他の組成物となり得る。得られる混合物の形態は意図する投与様式、選択した担体またはビヒクルでの化合物の溶解度をはじめ、いくつかの要因によって異なる。必要であればこれら化合物の医薬上許容される塩またはその他の誘導体を製造する。
【０４０９】
これら化合物は医薬上許容される担体中に、処置する患者に望ましくない副作用なく処置上有用な作用を発揮するに十分な量で含める。副作用の数および程度は化合物を投与する症状によって異なると考えられる。例えば、ある特定の毒性作用および望ましくない副作用は、命に関わる疾病を処置する場合には許容されるが、そうでもない疾患を処置する場合には許容されないことがある。
【０４１０】
またこれらの化合物は、所望の作用を損なうことのない他の有効物質と混合することもできるし、あるいは当業者に公知の所望の作用を補う物質と混合することもできる。本明細書で用いられるこれらの化合物および薬剤の製剤としては、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入、口内(例えば舌下)投与、非経口投与(例えば皮下、筋肉内、皮内または静脈投与)、経皮投与またはいずれかの経路に好適なものが挙げられる。あるケースでの最も好適な経路は処置する症状の性質および重篤度、ならびに用いる特定の有効化合物の性質によって異なる。これらの製剤は、好適量の化合物またはその医薬上許容される誘導体を含有する錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液または懸濁液、および経口溶液または懸濁液、ならびに水中油エマルションなどの単位投与形でヒトおよび動物への投与向けに提供される。医薬上処置上有効な化合物およびその誘導体は典型的には単位投与形または複数投与形で調剤し、投与する。本明細書において単位投与形とは、ヒトおよび動物被験体に適した物理的に別個の単位をさし、当技術分野で公知のように個別包装されている。各単位量は所望の処置作用をもたらすに十分な所定量の処置上有効な化合物を必要とされる医薬担体、ビヒクルまたは希釈剤と組み合わせて含有する。単位投与形の例としてはアンプルおよびシリンジならびに個別包装された錠剤またはカプセル剤が挙げられる。単位投与形はその一部、または複数を投与することができる。複数投与形は分離された単位投与形で投与されるように単一の容器に包装された複数の同一単位投与形である。複数投与形の例としてはバイアル、錠剤もしくはカプセル剤瓶、またはパイントもしくはガロン瓶が挙げられる。この場合、複数投与形は包装上分離できない複数の単位投与形である。
【０４１１】
この組成物は有効成分とともに、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムまたはカルボキシメチルセルロースなどの希釈剤;ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルクなどの滑沢剤;およびデンプン、アカシアゼラチンガムなどの天然ガム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよびその他当技術分野で公知のこの種の結合剤などの結合剤を含み得る。医薬上許容される投与可能な液体組成物は例えば、上記で定義したような有効化合物と所望の医薬アジュバントを、例えば水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、グリコール、エタノールなどの担体中に溶解、分散させる、あるいは担体中で混合することで溶液または懸濁液を形成させることにより作製できる。所望により投与する医薬組成物は湿潤剤、乳化剤または可溶化剤、pH調整剤などの微量の無毒の補助物質、例えば酢酸、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンおよびその他のこの種の薬剤を含んでもよい。このような投与形を製造する方法は当業者には公知のものであるか、明らかである(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15th Edition, 1975参照)。投与する組成物または製剤は処置する被験体の症状の緩和に十分な量の有効化合物を含む。
【０４１２】
0.005%〜100%の範囲の有効成分を含有し、残部は無毒な担体からなる投与形または組成物を製造することができる。経口投与には、これらの医薬組成物は、結合剤(例えば、アルファー化コーンスターチ、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース);増量剤(例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム);滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ);崩壊剤(例えば、ポテトスターチ、またはグリコール酸ナトリウムデンプン);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの医薬上許容される賦形剤を用いて常法により製造される例えば錠剤またはカプセル剤の形態をとってもよい。錠剤は当技術分野で周知の方法によりコーティングしてもよい。
【０４１３】
医薬製剤はまた例えば溶液、シロップ、または懸濁液などの液体であってもよく、あるいは水またはその他好適なビヒクルで使用前に再構成する薬物製品として提供することもできる。このような液体製剤は、沈殿防止剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油脂);乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビアガム);非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、または精留植物油);および保存剤(例えば、メチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸)などの医薬上許容される添加剤を用い、常法により製造することができる。
【０４１４】
直腸投与に好適な製剤は単位投与坐剤として提供することができる。これらは有効化合物を1以上の通常の固形担体、例えばカカオ脂と混合した後、得られた混合物を成形することにより製造することができる。
【０４１５】
皮膚または眼への局所適用に好適な製剤としては一般に軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアーゾル、およびオイルとして調剤する。使用可能な担体としてはワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびそれらの2以上の組合せが挙げられる。さらに局所製剤はヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ/ヒドロキシアルキル、メタクリーレトまたはポリメタクリルアミドから選択される増粘剤を0.05〜15重量%含むことが有利であり得る。局所製剤は多くの場合滴下により、あるいは結膜嚢への軟膏として適用する。またこれは眼、顔面の凹部および外耳道の洗浄または潤滑のためにも使用できる。また、前眼房その他の場所に注入することもできる。液体状の局所製剤は有効成分が放出するストリップ、コンタクトレンズなどの形態の親水性三次元高分子マトリックスとして提供することもできる。
【０４１６】
吸入による投与としては、本明細書で用いる化合物は、好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の好適なガスを用いて加圧パックまたはネブライザーから提供されるエアーゾルスプレーの形態で送達することができる。加圧エアーゾルの場合、投与単位は計量された量を送達するバルブを設けることで定量することができる。吸入または通気で用いるための例えばゼラチンのカプセルまたはカートリッジは化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含むよう配合することができる。
【０４１７】
口内(舌下)投与に好適な製剤としては例えば香味基剤、通常はスクロースおよびアラビアガムまたはトラガカントガム中に有効化合物を含むトローチ剤、およびゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアガムなどの不活性基剤中に化合物を含む香錠が挙げられる。
【０４１８】
これらの化合物は注射、例えばボーラス注射または点滴による非経口投与用に調剤することができる。注射用製剤は単位投与形、例えばアンプル、または保存剤を添加して複数用量容器で提供することができる。これらの組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションであってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤などの配合剤を含んでもよい。あるいは有効成分は使用前に好適なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水またはその他の溶媒で再構成する粉末状としてもよい。
【０４１９】
経皮投与に好適な製剤は長時間レシピエントの表皮との緊密な接触を保つようにした個別パッチとして提供することができる。このようなパッチは有効化合物を、例えば有効化合物に対して0.1〜0.2M濃度の、所望により緩衝させた水溶液として適宜含む。経皮投与に好適な製剤はまたイオン導入法によって送達することもでき(例えば、Pharmaceutical Research 3 (6), 318 (1986)参照)、典型的には所望により緩衝させた有効化合物の水溶液の形態をとる。
【０４２０】
これらの医薬組成物はまた徐放性手段および／または徐放性送達ディバイスによって投与することもできる(例えば、米国特許第3,536,809号;第3,598,123号;第3,630,200号;第3,845,770号;第3,847,770号;第3,916,899号;第4,008,719号;第4,687,610号;第4,769,027号;第5,059,595号;第5,073,543号;第5,120,548号;第5,354,566号;第5,591,767号;第5,639,476号;第5,674,533号および第5,733,566号参照)。
【０４２１】
望ましい血液レベルは血漿レベルにより確認されるので有効剤の点滴により維持することができる。主治医ならばいつどのように処置を終了、中断すればよいか、あるいは毒性、または骨髄不全、肝不全もしくは腎不全により低用量に処置を調節すればよいかが分かることを注記しておく。逆に主治医ならば臨床応答が十分でない(有害な副作用を除く)場合に、いつどのように処置を高用量に調節すればよいかも分かるであろう。
【０４２２】
また、MTSP10ポリペプチド阻害剤単独または他の薬剤との併用における効力および／または毒性も当技術分野で公知の方法によって評価することができる(一般に、O'Reilly, Investigational New Drugs, 15:5-13 (1997)参照)。
【０４２３】
有効化合物または医薬上許容される誘導体は徐放性製剤またはコーティングなど、化合物がその本体から急速に放出されるのを防ぐ担体を用いて製造することができる。
【０４２４】
これらの組成物および／または組合せをその投与に関する説明書とともに含むキットも提供される。このキットはさらに、典型的には無菌形態で包装された、複合体を注射するための針またはシリンジおよび／または包装されたアルコールパッドを含んでもよい。説明書は所望により医師または患者による有効剤の投与のために含める。
【０４２５】
最後にこれらの化合物またはMTSP10ポリペプチドもしくはそのプロテアーゼドメイン、または上記薬剤のいずれかを含有する組成物は包装材料、その包装材料の中に本明細書で意図される疾病または疾患の処置に有効な本明細書で提供される化合物またはその好適な誘導体、および化合物またはその好適な誘導体が本明細書で意図される疾病または疾患の処置用のものであることを示すラベルを含む製品としてパッケージングすることができる。ラベルには本処置が保証される疾患を記載することができる。
【０４２６】
L. 処置方法
本明細書の方法によって同定される化合物は動物、特にヒトをはじめとする哺乳類における新生物形成疾患を処置または予防するために用いられ、本明細書で提供される。ある実施形態では、本方法は有効量のMTSP10ポリペプチド阻害剤を哺乳類に投与し、それにより疾病または疾患を処置または予防することを含む。
【０４２７】
ある実施形態では、処置または予防に用いられるMTSP10ポリペプチド阻害剤は医薬上許容される担体または賦形剤とともに投与する。処置する哺乳類はヒトであり得る。本明細書で提供される阻害剤はスクリーニングアッセイによって同定されるものである。さらにまた、抗体およびアンチセンス核酸またはRNAiなどの二本鎖RNA(dsRNA)も意図される。
【０４２８】
この処置または予防方法はさらに、MTSP10ポリペプチド阻害剤(これはMTSP10ポリペプチドの活性を阻害することが確認されているいずれの化合物であってもよい)と同時、またはその前、またはその後に抗血管形成処置もしくは抗血管形成剤または抗腫瘍剤を投与することを含み得る。このような化合物としては小分子モジュレーター、MTSP10ポリペプチドに対する抗体またはその結合領域を含むそのフラグメントもしくは誘導体、アンチセンス核酸、またはMTSP10ポリペプチドの一部をコードする、もしくはそれに相補的なRNAiなどの二本鎖RNA(dsRNA)、ならびに異種ヌクレオチド配列が、その異種配列がMTSP10ポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部の生物活性を不活性化するように挿入されているMTSP10ポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも一部を含む核酸(ここで、このMTSP10ポリペプチドをコードする遺伝子の一部は、MTSP10ポリペプチドをコードするゲノム遺伝子との相同組換えを促進するように異種配列をフランキングしている)が挙げられる。また、このような分子は一般に約1000nt未満の長さである。
【０４２９】
1. アンチセンス処置
ある特定の実施形態では、以上に示したように、新生物形成疾患を処置または予防するためにMTSP10ポリペプチドアンチセンス核酸によってMTSP10ポリペプチド機能を低下させる、または阻害する。MTSP10ポリペプチドまたはその一部をコードする遺伝子またはcDNAに対してアンチセンスである少なくとも6ヌクレオチド、通常は約150までのヌクレオチドの核酸の処置的または予防的使用も提供される。本明細書においてMTSP10ポリペプチド「アンチセンス」核酸とは、いくらかの配列相同性のためにMTSP10ポリペプチドRNA(一般にmRNA)の一部と、一般に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得る核酸をさす。このアンチセンス核酸はMTSP10ポリペプチドmRNAのコードおよび／または非コード領域に相補的なものであり得る。このようなアンチセンス核酸はMTSP10ポリペプチド機能を低下または阻害する処置薬としての用途を有し、上記のような疾患の処置または予防に使用できる。
【０４３０】
MTSP10ポリペプチドアンチセンス核酸は少なくとも6ヌクレオチドのものであり、一般にオリゴヌクレオチド(6〜50ヌクレオチドなど、6〜約150ヌクレオチドの範囲)である。このアンチセンス分子はプロテアーゼドメインの全部または一部に相補的なものであり得る。例えばこのオリゴヌクレオチドは少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、または少なくとも125ヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドはDNAまたはRNAまたはキメラ混合物またはその誘導体もしくは改変体、一本鎖または二本鎖であり得る。このオリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で改変することができる。このオリゴヌクレオチドはペプチドまたは細胞膜(例えば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652 (1987);1988年12月15日公開のPCT公報WO 88/09810参照)または血液脳関門(例えば、1988年4月25日公開のPCT公報WO 89/10134参照)をわたる輸送を促進する薬剤、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤(例えば、Krol et al., BioTechniques 6:958-976 (1988)参照)またはインターカレーション剤(例えば、Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988)参照)などの他の補助基を含んでもよい。
【０４３１】
MTSP10ポリペプチドアンチセンス核酸は一般にオリゴヌクレオチド、典型的には一本鎖DNAもしくはRNAまたはその類似体もしくはその混合物である。例えばオリゴヌクレオチドとしてはヒトMTSP10ポリペプチドをコードする核酸の一部に対してアンチセンスである配列が挙げられる。このオリゴヌクレオチドは当技術分野で一般に知られている置換基でその構造上のいずれかの部分で改変することができる。
【０４３２】
MTSP10ポリペプチドアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキューオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w、および2,6-ジアミノプリンからなる群から選択される少なくとも1つの改変塩基部分を含み得る。
【０４３３】
もう1つの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースからなる群から選択される少なくとも1つの改変糖部分を含む。このオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート、ホスオロジチオエート、ホスホルミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはその類似体から選択される少なくとも1つの改変リン酸骨格を含み得る。
【０４３４】
このオリゴヌクレオチドはα-アノマー型オリゴヌクレオチドであってもよい。α-アノマー型オリゴヌクレオチドは相補的RNAと、両鎖が互いに平行に走る特異的二本鎖ハイブリッドを形成する(Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15:6625-6641 (1987))。
【０４３５】
このオリゴヌクレオチドは限定されるものではないがペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送剤またはハイブリダイゼーション誘発型切断剤などの他の分子とコンジュゲートさせることができる。これらのオリゴヌクレオチドは当技術分野で公知の標準的な方法により、例えば自動DNAシンセサイザー(Biosearch, Applied Biosystemsから市販されているものなど)を用いることで合成することができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはStein et al. (Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988))の方法により合成することができ、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは細孔性ガラス(controlled pore glass)支持体などを用いて作製することができる(Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988))。
【０４３６】
ある特定の実施形態では、MTSP10ポリペプチドアンチセンスオリゴヌクレオチドは触媒RNAまたはリボザイムを含む(例えば、1990年10月4日公開のPCT国際公報WO 90/11364; Sarver et al., Science 247:1222-1225 (1990)参照)。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは2'-0-メチルリボヌクレオチド(Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15:6131-6148 (1987))、またはキメラRNA-DNA類似体(Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330 (1987))である。あるいはこのオリゴヌクレオチドはRNAiなどの二本鎖RNA(dsRNA)であってもよい。
【０４３７】
もう1つの実施形態では、MTSP10ポリペプチドアンチセンス核酸は外来配列からの転写により細胞内で産生させる。例えば、ベクターを、細胞に取り込まれ、その細胞内でベクターまたはその一部が転写され、アンチセンス核酸(RNA)を産生するようにin vivoに導入することができる。このようなベクターはMTSP10ポリペプチドアンチセンス核酸をコードする配列を含む。このようなベクターはそれが転写されて目的のアンチセンスRNAを産生する限り、エピソームに留まっても染色体に組み込まれてもよい。このようなベクターは当技術分野で標準的な組換えDNA技術によって構築することができる。ベクターはプラスミド、ウイルス、または哺乳類細胞での複製および発現に用いられる当技術分野で公知のその他のものであってもよい。MTSP10ポリペプチドアンチセンスRNAをコードする配列の発現はヒトをはじめとする哺乳類細胞で作用することが当技術分野で知られているいずれのプロモーターによるものであってもよい。このようなプロモーターは誘導型のものであっても構成型のものであってもよい。このようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、SV40初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)、ラウス肉腫ウイルスの3'長い末端反復に含まれるプロモーター(Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)などが挙げられる。
【０４３８】
これらのアンチセンス核酸はヒトMTSP10ポリペプチド遺伝子をはじめとする、MTSP10ポリペプチド遺伝子のRNA転写物の少なくとも一部と相補的な配列を含む。絶対的な相補性の必要はない。
【０４３９】
新生物形成疾患の処置または予防に効果的なMTSP10ポリペプチドアンチセンス核酸の量は疾病の性質によって異なり、標準的な臨床技術によって実験的に決定することができる。可能であれば、アンチセンス細胞傷害性はin vitroで調べた後、ヒトでの試験および使用に先立ち有用な動物モデル系で調べるのことが望ましい。
【０４４０】
2. RNA干渉
MTSP10をコードする遺伝子の発現を阻害するため、RNA干渉(RNAi)(例えば、Chuang et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:4985参照)を用いることができる。干渉RNA(RNAi)断片、特に二本鎖(ds)RNAiは、MTSP10機能の欠損を作り出すために使用できる。哺乳類、C.エレガンス、ショウジョウバエ(Drosophila)および植物ならびにヒトをはじめとする生物において遺伝子をサイレンシングするためのRNAiの使用に関する方法が知られている(例えば、 Fire et al. (1998) Nature 391:806-811 Fire (1999) Trends Genet. 15:358-363; Sharp (2001) Genes Dev. 15:485-490; Hammond, et al. (2001) Nature Rev. Genet. 2:110-1119; Tuschl (2001) Chem. Biochem. 2:239-245; Hamilton et al. (1999) Science 286:950-952; Hammond et al. (2000) Nature 404:293-296; Zamore et al. (2000) Cell 101:25-33; Bernstein et al. (2001) Nature 409: 363-366; Elbashir et al. (2001) Genes Dev. 15:188-200; Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498;国際PCT出願WO 01/29058;国際PCT出願WO 99/32619参照)。
【０４４１】
二本鎖RNA(dsRNA)を発現する構築物はエピソームに留まる、またはゲノムに組み込まれる複製ベクターを用いて動物または植物などの宿主へ導入する。適当な配列を選択することで、dsRNAの発現はMTSP10をコードする内在mRNAの蓄積により干渉され得る。RNAiはまたin vitroで発現を阻害するために使用することもできる。領域はMTSP10に対して選択性のある(すなわち、特有の)少なくとも約21(または21)のヌクレオチドを含み、これをRNAiの作製に用いる。約21ヌクレオチドのより短い断片は直接細胞へ形質転換でき(すなわち、in vitroまたはin vivo)、より大きなRNAi dsRNA分子は一般にそれらをコードするベクターを用いて導入する。dsRNA分子は少なくとも約21bp以上の長さ、例えば50、100、150、200およびそれ以上である。In vitroおよびin vivoで核酸分子を細胞へ導入する方法、試薬およびプロトコールは当業者に公知である。
【０４４２】
3. 遺伝子療法
ある例としての実施形態では、遺伝子療法によってMTSP10ポリペプチドの機能を増強するため、MTSP10ポリペプチドまたはその機能的ドメインもしくは誘導体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を投与する。遺伝子療法とは被験体に核酸を投与することによって行う処置をさす。この実施形態では核酸はそこにコードされている、MTSP10ポリペプチドの機能を増強することにより処置作用を媒介するタンパク質を産生する。当技術分野で利用できる遺伝子療法の方法はいずれでも使用できる(Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, An. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993);およびMorgan and Anderson, An. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIBTECH 11(5):155-215 (1993)参照)。
【０４４３】
例えば、遺伝子療法用の処置組成物としては、好適な宿主内でMTSP10ポリペプチドまたはそのドメイン、断片もしくはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの一部としてのMTSP10ポリペプチドをコードする核酸を含む。特にこのような核酸は作動可能なようにMTSP10ポリペプチドコード領域に連結されたプロモーターを有し、このプロモーターは誘導型のものでも構成型のものでも、所望により組織特異的なものであってもよい。もう1つの特定の実施形態では、MTSP10ポリペプチドコード配列および他のいずれかの所望の配列がゲノム中の望ましい部位で相同組換えを促進する領域でフランキングされている核酸分子を用いることで、SPタンパク質核酸の染色体内発現をもたらす(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989))。
【０４４４】
患者への核酸送達は、患者がその核酸または核酸保持ベクターに直接曝される直接的なものであっても、あるいはまずin vitroで細胞をその核酸で形質転換した後、患者に移植する間接的なものであってもよい。これらの2つのアプローチはそれぞれin vivoまたはex vivo遺伝子療法として知られている。
【０４４５】
ある特定の実施形態では、核酸を直接in vivo投与し、そこで発現させてコードされている産物を産生させる。これは例えばそれを適当な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば欠陥または弱毒レトロウイルスまたはその他のウイルスベクターを用いて感染させることにより(米国特許第4,980,286号参照)、あるいは裸のDNAの直接注入により、あるいは微粒子衝撃(例えば、遺伝子ガン; Biolistic, Dupont)、または脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクション剤でのコーティング、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセル封入の使用により、あるいは核に入ることが知られているペプチドと結合させて投与することにより、あるいはレセプターを媒介とするエンドサイトーシスを受けるリガンドと結合させて投与することによるなど(例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)参照)(これはそのレセプターを特異的に発現する細胞種をターゲッティングするために使用できる)、それが細胞内に存在するように投与することによる、当技術分野で知られている多くの方法のいずれかにより達成することができる。もう1つの実施形態では、リガンドがエンドソームを破壊して核酸にリソソーム分解を避けさせるための融合誘導性ウイルスペプチドである場合の核酸-リガンド複合体を形成させることができる。なおもう1つの実施形態では、特異的レセプターをターゲッティングすることで、核酸をin vivoにおいて細胞特異的取り込みおよび発現にターゲッティングすることができる(例えば、1992年4月16日付けのPCT公報WO 92/06180(Wu et al.); 1992年12月23日付けのWO 92/22635(Wilson et al.); 1992年11月26日付けのWO92/20316(Findeis et al.); 1993年7月22日付けのWO93/14188(Clarke et al.); 1993年10月14日付けのWO 93/20221(Young)参照)。あるいは、核酸は細胞内に導入し、相同組換えにより発現のため宿主細胞のDNAに組み込むこともできる(Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989))。
【０４４６】
ある特定の実施形態では、MTSP10ポリペプチド核酸を含むウイルスベクターを用いる。例えばレトロウイルスベクターが使用できる(Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993))。これらのレトロウイルスベクターはウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組み込みに必要でないレトロウイルス配列を欠くよう改変したものである。遺伝子療法に用いるMTSP10ポリペプチド核酸は患者への遺伝子送達を助けるベクターへクローニングする。レトロウイルスベクターに関してさらに詳しいことは、幹細胞の放射線療法耐性を高めるために造血幹細胞へmdr1遺伝子を送達することを目的としたレトロウイルスベクターの使用について記載したBoesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)に見出せる。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を示したその他の参照文献としては、Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993);およびGrossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)がある。
【０４４７】
アデノウイルスは遺伝子療法に使用できるもう1つのウイルスベクターである。アデノウイルスは呼吸器上皮に遺伝子を送達するのに特に魅力的な伝達体である。アデノウイルスは呼吸器上皮に自然感染し、そこで軽い疾病を引き起こす。アデノウイルス送達系の他の標的としては肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉がある。アデノウイルスは非分裂細胞に感染し得るという利点を持つ。Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)はアデノウイルスに基づく遺伝子療法の総説を記している。Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)では、アカゲザルの呼吸器上皮へ遺伝子を送達することを目的としたアデノウイルスベクターの使用を示している。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の事例はRosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et ak., Cell 68:143-155 (1992);およびMastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)で見出せる。
【０４４８】
アデノ随伴ウイルス(AAV)も遺伝子療法での使用のために提案されている(Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)。
【０４４９】
遺伝子療法のもう1つのアプローチとしては、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを媒介とするトランスフェクション、またはウイルス感染などの方法により遺伝子組織培養細胞へ導入することを含む。通常、導入方法は細胞に選択マーカーを導入することを含む。次にこれらの細胞を、導入された遺伝子を取り込んで発現する細胞を単離するための選択下に置く。このような細胞を次に患者へ送達する。
【０４５０】
この実施形態では、核酸は予め細胞へ導入し、結果として生じた組換え細胞をin vivo投与する。このような導入は、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、その核酸配列を含むウイルスまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などをはじめ、当技術分野で公知のいずれかの方法によって行うことができる。当技術分野では外来遺伝子を細胞へ導入するための多くの技術が知られており(例えば、Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985)参照)、レシピエント細胞の必要な発達機能および生理機能が壊れない限り使用することができる。これらの技術は細胞へ核酸を、その核酸が細胞により発現され、かつ、一般には遺伝してその細胞の後代によっても発現可能なように安定して導入されるようなものでなければならない。
【０４５１】
得られた組換え細胞は当業者で公知の種々の方法によって患者へ送達することができる。ある実施形態では、上皮細胞が例えば皮下注射される。別の実施形態では、組換え皮膚細胞を患者への皮膚移植片とすることができる。組換え血液細胞(例えば造血幹細胞または始原細胞)は静脈投与することができる。想定される細胞の使用量は望む作用、患者の状態などによって異なり、当業者ならば決定することができる。
【０４５２】
遺伝子療法の目的で核酸を導入し得る細胞としては、所望の利用可能ないずれの細胞種も含み、限定されるものではないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；種々の幹細胞または始原細胞、特に造血幹細胞または始原細胞、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓およびその他その供給源から得た幹細胞が挙げられる。
【０４５３】
例えば遺伝子療法に用いる細胞は患者自己のものである。遺伝子療法において組換え細胞を用いるある実施形態では、MTSP10ポリペプチド核酸を、それが細胞またはそれらの後代により発現され得るように細胞へ導入した後、これらの組換え細胞を処置効果を求めてin vivo投与する。特定の実施形態では幹細胞または始原細胞を用いる。単離してin vitroで維持可能ないずれの幹細胞および／または始原細胞でも本実施形態に従って使用できる可能性がある。このような幹細胞としては、限定されるものではないが、造血幹細胞(HSC)、皮膚および消化管の内層などの上皮組織の幹細胞、胎児心筋細胞、肝臓幹細胞(1994年4月28日付けのPCT公報WO 94/08598)、および神経幹細胞(Stemple and Anderson, Cell 71:973-985 (1992))が挙げられる。
【０４５４】
上皮幹細胞(ESC)またはケラチノサイトは公知の方法により皮膚および消化管の内層などの組織から得ることができる(Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980))。皮膚などの層状上皮組織では、基底板に最も近い層である胚層内の細胞の有糸分裂により再生が起こっている。消化管内層内の幹細胞はこの組織の急速な再生速度をもたらす。患者またはドナーの皮膚または消化管の内層から得たESCまたはケラチノサイトは組織培養で増殖させることができる(Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980); Pittelkow and Scott, Cano Clinic Proc. 61:771 (1986))。ドナーからESCが提供されれば、宿主対移植片反応性の抑制方法(例えば、適度な免疫抑制を促進するための照射、薬物または抗体投与)も使用できる。
【０４５５】
この実施形態では、造血幹細胞(HSC)に関してはHSCの単離、増殖およびin vitro維持を可能とする技術が使用できる。これを達成し得る技術には、(a)将来の宿主またはドナーから単離した骨髄細胞からのHSCの単離およびその培養系の確立、または(b)同種のものでも異種のものであってもよいが、予め確立されたHSCの長期培養系の使用が含まれる。一般に将来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法では非自己HSCが用いられる。特定の実施形態では、ヒト骨髄細胞は後腸骨稜から穿刺吸引によって得ることができる(例えば、Kodo et al., J. Clin. Invest. 73:1377-1384 (1984)参照)。例えば、HSCは高濃縮物または実質的に純粋な形態で作製することができる。この濃縮は長期培養前、培養中、または培養後に行うことができ、当技術分野で公知のいずれの技術によって行ってもよい。骨髄細胞の長期培養系は例えば改変Dexter細胞培養法(Dexter et al., J. Cell Physiol. 91:335 (1977)またはWitlock-Witte培養法(Witlock and Witte, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612 (1982))を用いて確立および維持することができる。
【０４５６】
ある特定の実施形態では、遺伝子療法の目的で導入する核酸は作動可能なようにコード領域に連結された誘導プロモーターを含み、これにより、適当な転写インデューサーの存在・不在を制御することで核酸の発現を制御できる。
【０４５７】
3. プロドラッグ
腫瘍を処置する方法も提供される。本方法はMTSP10により特定の部位で切断されて有効薬を放出するプロドラッグ、またはin vivoで有効薬に変換し得る前駆体を投与することにより実施される。MTSP10活性を発現する細胞と接触した際、プロドラッグは有効薬へと変換される。このプロドラッグは薬物または薬剤がコンジュゲートとしては不活性である、または細胞に入ることができないが、切断された際に活性化されるように標的MTSP10の基質と結合された細胞傷害剤などの抗腫瘍薬またはその他の処置薬(TA)などの有効薬を含むコンジュゲートであってよい。例えばこのプロドラッグはオリゴペプチド、典型的には比較的短い約10未満のアミノ酸のペプチドを含むものであってよく、すなわち標的MTSP10によってタンパク質分解切断される。細胞傷害剤としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、抗増殖剤およびチューブリン結合剤が挙げられる。その他、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシンおよびタキサンがある。
【０４５８】
M. 動物モデル
本明細書ではマウスおよびラットをはじめとする齧歯類、ウシ、ニワトリ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ゴリラをはじめとするサルおよびその他の霊長類などのトランスジェニック動物モデルおよび動物が提供される。特にMTSP10ポリペプチドをコードする異種核酸を含むトランスジェニック非ヒト動物または内在遺伝子のプロモーター領域およびその他の調節領域を置換または改変することによるなどしてポリペプチドの発現が変化させてあるトランスジェニック動物が提供される。このような動物は内在核酸と、強力なプロモーターの下、同種または相同組換えまたはその他の組換えによって発現させることによるなどして過剰発現または異常発現させることができる外的MTSP10遺伝子の間の組換えを促進することにより作出することができる。
【０４５９】
トランスジェニック動物は限定されるものではないがマイクロインジェクション、リポフェクション、およびその他の様式の遺伝子送達を用いて核酸を生殖細胞または胚幹細胞などの体細胞へ導入することによって作出できる。典型的には核酸を胚幹(ES)細胞などの細胞へ導入し、次にこのES細胞を胚盤胞へ注入し、その胚盤胞を代理母に移植し、その後トランスジェニック動物を誕生させる。一般に動物の染色体への異種核酸分子の導入は異種MTSP10をコードする核酸と内在する核酸の間の組換えによって起こる。この異種核酸は特定の染色体へターゲッティングすることができる。
【０４６０】
場合によってはノックアウト動物を作出することもできる。このような動物はまず、その染色体中のMTSP10ポリペプチド遺伝子と生物学的に不活性とされている外的MTSP10ポリペプチド遺伝子の間の相同組換えを促進することにより(典型的には異種配列、例えば、抗生物質耐性遺伝子の挿入による)作出することができる。ある実施形態では、この相同組換えは胚由来幹(ES)細胞を挿入により不活性化されたMTSP10ポリペプチド遺伝子を含むベクターで、相同組換えが起こるように形質転換した後、そのES細胞を胚盤胞へ注入し、その胚盤胞を代理母に移植し、その後にMTSP10ポリペプチド遺伝子が不活性化されたキメラ動物(「ノックアウト動物」)を誕生させることにより行う(Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)参照)。このキメラ動物は同系接合性ノックアウト動物を作出するために同系交配させることができ、次にこれを用いてさらなるノックアウト動物を作出することができる。ノックアウト動物としては、限定されるものではないが、マウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシおよびその他の非ヒト動物が挙げられる。例えばノックアウトマウスが作出される。得られた動物はMTSP10ポリペプチドの低発現を示す癌などの特定の疾病もモデルとして役立ち得る。このようなノックアウト動物は、例えばこのような疾病または疾患を処置または予防する能力を、あるいはその能力に関して試験化合物をスクリーニングすべく、このような疾患の動物モデルとして使用することができる。
【０４６１】
MTSP10ポリペプチドを過剰発現するものをはじめ、その他のタイプのトランスジェニック動物も作出できる。このような動物としては、正常な遺伝子が突然変異体、過剰発現型またはその他の形態などの変異体で置換された動物である「ノックイン」動物が含まれる。例えば齧歯類などのある種の内在遺伝子をヒト由来のものなど、別の種由来の遺伝子で置き換えることができる。複数の組み込みを受けた動物をはじめ、染色体の他の部位への非相同組換えにより動物を作出することもできる。
【０４６２】
第一世代のトランスジェニック動物を作出した後、キメラ動物を出生させてMTSP10ポリペプチドを過剰発現または異常発現するさらなる動物を作出することができる。このような動物としては限定されるものではないが、マウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシおよびその他の非ヒト哺乳類が挙げられる。得られた動物はMTSP10ポリペプチドの過剰発現または異常発現を示す癌などの特定の疾病のモデルとして役立ち得る。このような動物は例えばこのような疾病または疾患を処置または予防する能力を、あるいはその能力に関して試験分子をスクリーニングすべく、このような疾患の動物モデルとして使用することができる。ある特定の実施形態では、MTSP10を過剰発現または異常発現するマウスが作出される。
【０４６３】
以下の実施例は単に例を示すためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０４６４】
MTSP10の同定
マトリプターゼのプロテアーゼドメインのタンパク質配列(MTSP1;受託番号AF118224)を用い、tblastn検索および6つ全てのリーディングフレーム(両鎖)において動的に翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対してタンパク質クエリー配列を比較するアライメントアルゴリズムを用いるヒトHTGS (High Throughput Genomic Sequence)データベースを検索した。本明細書でMTSP10と呼ばれるものを含むいくつかの可能性のあるセリンプロテアーゼが同定された。
【０４６５】
不完全で順序づけられていないヒトゲノム配列に基づけば、第3染色体(AC024887およびAC073522クローン)または第8染色体(AC024964クローン)のいずれかに位置しているものと考えられる。GenBankおよびヒトESTデータベースに寄託された配列を検索したところ、同じ配列は寄託されていないことが示された。
【０４６６】
MTSP10のプロテアーゼドメインをコードするcDNAのクローニング
ゲノム配列に由来するMTSP10のヌクレオチド配列を用い、2つの遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。5'末端プライマー(C8-N1A-1)の配列は5'-CGCATCATCGGAGGCACAGACACCCT-3' (配列番号7)であり、3'末端プライマー(C8-NSP1-3AS)の配列は5'-CCAGGGAACAAAGTTTGACACCCTTGTG -3' (配列番号8)であった。
【０４６７】
ヒト膵臓マラソンcDNA(Clontech)から690bpのバンドが増幅された。次に配列解析を行ったところ、このDNA断片のヌクレオチド配列がゲノムMTSP10エキソン配列のそれと一致しており、MTSP10プロテアーゼドメインのほとんどを含むことが示された。このcDNA配列には停止コドンは見られなかった。
【０４６８】
MTSP10プロテアーゼドメインのコードDNAの3'末端を得るため、ヒト膵臓由来Marathon-Ready cDNAライブラリー(Clontech)で3'-RACE(cDNA末端の迅速増幅)反応を行った。
【０４６９】
最初のRACE反応は、遺伝子特異的プライマーC8-N1A-1、5'- CGCATCATCGGAGGCACAGACACCCT-3' (配列番号9)とともにマラソンcDNAアダプタープライマー1(AP1)を用いてPCRにより行った。アガロースゲルからPCR産物を精製した。
【０４７０】
次に、遺伝子特異的プライマー(Ch8-NSP1-4) 5'-CTCCCACTGGTCAGAGAGTTCGCAGTG-3' (配列番号10、最初の3'-RACE産物を鋳型として使用)とともにマラソンcDNAアダプタープライマー2(AP2)を用いて2回目のnested PCRを行った。RACE反応からの300bpより大きかったPCR産物をアガロースゲルから切り出して精製し、pCR2.1-TOPOクローニングベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)にサブクローニングした。次にコロニーハイブリダイゼーションを行い、MTSP10配列を含有する陽性コロニーを同定した。陽性コロニーはMTSP10プロテアーゼドメイン配列を含有する690bpのDNA断片(プライマーC8-N1A-1およびC8-NSP1-3ASを用いたPCR反応から得られたもの)を用いたコロニーハイブリダイゼーションおよびDNAシーケンシングによって同定した。3'-RACE産物の配列解析を行ったところ、推定される停止コドンを含む36bpのさらなる配列が得られた。
【０４７１】
正常および腫瘍組織におけるMTSP10の遺伝子発現プロフィール
MTSP10転写物の遺伝子発現プロフィールに関する情報を得るため、MTSP10特異的プライマーC8-N1A-1 (5'- CGCATCATCGGAGGCACAGACACCCT-3';配列番号11)およびC8-N1A-2AS (5'- CTCCCCACTGCGAACTCTCTGACCAGTG-3';配列番号12)を用い、いくつかの成人組織(Clontechカタログ番号K1420-1)cDNAパネルから作製したcDNA パネルについてPCR解析を行った。MTSP10転写物は膵臓、肺および腎臓で検出された。MTSP10はまた小腸Marathon-Ready cDNA (Clontech)でも検出された。また、ヌードマウスに異種移植した数種のヒト原発腫瘍から作製されたcDNAライブラリー(ヒト腫瘍マルチプルティッシュcDNAパネル、カタログ番号K1522-1, CLONTECH)からのMTSP10転写物のPCRも行った。MTSP10転写物は乳癌(GI-101)、肺癌(LX-1およびGI-117)、卵巣癌(GI-102)および膵臓腺癌(GI-103)で検出された。MTSP10転写物は前立腺腺癌(PC3)では弱く検出できたにすぎなかった。2形態の大腸腺癌(GI-112およびCX-1)では明確なシグナルは検出されなかった。また、MTSP10転写物はヌードマウスで増殖させたCWR22R前立腺腫瘍でも検出された。
【０４７２】
MTSP10の全長プロテアーゼドメインをコードするcDNAのPCR増幅
MTSP10のプロテアーゼドメインをコードするcDNA断片を得るため、遺伝子特異的プライマーとヒト膵臓由来cDNAライブラリーを用いたend-to-end PCR増幅を用いた。用いた2つのプライマーは、5'末端に対しては5'-CGCATCATCGGAGGCACAGACACCCT-3'(配列番号11)と3'末端に対しては5'-TTACAAAAGAGAAGGGACATATTTATGAATC-3' (配列番号21)であった、この両プライマーの配列はMTSP10のcDNA配列から導いたものであった。この5'プライマーはMTSP10プロテアーゼドメインの開始部のすぐ上流の領域をコードする配列(RIIGGTDTL)を含む。3'プライマーは推定停止コドンのすぐ後の配列に相当する。ヒト膵臓cDNAライブラリーから720bpの断片が増幅された。このPCR産物をQIAquickゲル抽出キット(Qiagen, Valencia, CA;カタログ番号28704)を用いて単離および精製し、DNAシーケンシング解析により確認した。
【０４７３】
MTSP10のセリンプロテアーゼドメインおよび他のプロテアーゼとのホモロジー
翻訳されたMTSP10プロテアーゼドメイン配列の配列解析を行ったところ、MTSP10がドメインの最初にプロテアーゼ活性化切断部位が存在することと高度に保存された3つの領域に触媒三残基(ヒスチジン、アスパラギン酸およびセリン)が存在することを特徴とするトリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含むことが示された。マトリプターゼ(受託番号AF118224;配列番号1および3)との他配列のアライメントによれば、このプロテアーゼドメインにおける47%の同一性が示される。
【０４７４】
配列解析
MTSP10核酸およびタンパク質配列はDNA Strider(バージョン1.2)を用いて解析した。MTSP10のプロテアーゼドメインをコードするcDNAは714bpの長さであり、238アミノ酸のタンパク質へと翻訳される。このプロテアーゼドメインのcDNA配列およびMTSP10の翻訳タンパク質配列は以下の通りである(また、配列番号5と22、および6と23も参照)。
【０４７５】
ヒトNTSP10プロテアーゼドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにドメインの構成
cDNA／タンパク質配列
配列範囲: 1〜2130
【表２】
2005506832.tif 000003
【表３】
2005506832.tif 000004
【表４】
2005506832.tif 000005
【表５】
2005506832.tif 000006
タンパク質配列
配列範囲: 1〜701
【表６】
2005506832.tif 000007
ドメインの構成
CUBドメイン        aa104〜217
CUBドメイン        aa222〜335
LDLaドメイン       aa340〜377
LDLaドメイン       aa381〜412
LDLaドメイン       aa415〜453
Ser protドメイン   aa462〜692
【実施例２】
【０４７６】
プロテアーゼMTSPドメインの発現
MTSP10およびそのプロテアーゼドメインをコードする核酸はピキア・パストリス(Pichia pastoris)ベクターpPIC9K(Invitrogenから入手可能;配列番号13参照)の誘導体へクローニングすることができる。プラスミドpPIC9kの特徴としては1〜948に5'AOX1プロモーター断片；855〜875に5'AOX1プライマー部位;949〜1218にα因子分泌シグナル;1152〜1172にα因子プライマー部位;1192〜1241に多重クローニング部位;1327〜1347に3'AOX1プライマー部位;1253〜1586に3'AOX1転写終結領域;4514〜1980にHIS4 ORF;5743〜4928にカナマイシン耐性遺伝子;6122〜6879に3'AOX1断片;7961〜7288にColE1オリジン;および8966〜8106にアンピシリン耐性遺伝子を含む。本明細書で用いるこのプラスミドはカナマイシン耐性遺伝子のXhoI部位を除去することによってpPIC9Kから得られたものであり、得られたベクターは本明細書ではpPIC9KXと呼ぶ。ピキアでの発現は公知の方法を用いて行うことができる(例えば、Zhang et al. (2000) Biotechnology and Bioengineering 70:No 1 October 5, 2000参照)。
【０４７７】
ピキアにおける発現のためのMTSP10のプロテアーゼドメインの突然変異誘発
MTSP10のプロテアーゼドメインをコードする遺伝子(配列番号23の残基462〜692)をPCR SOE(PCRを基にした、重複伸張によるスプライシング)により変異誘発して122番の不対システイン(キモトリプシンナンバリング系;配列番号23の残基573のCys)をセリンで置換した。各々122番のセリンのAGCコドンを含む2つの重複する遺伝子断片を以下のプライマー：5’遺伝子断片としてAGTTAACTCGAGAAAAGATCATCGGAGGCACAGACACCCTG 配列番号15およびACCAGTGGGAGGAATGCTTATTGGCTGAATGAG 配列番号16；3’遺伝子断片としてAGTTAAGAATTCCAAAAGAGAAGGGACATATTTATG 配列番号17およびCTCATTCAGCCAATAAGCATTCCTCCCACTGGT 配列番号18を用いてPCR増幅した。増幅した遺伝子断片を1%アガロースゲルで精製して混合し、再びPCR増幅してMTSP10 C122Sの全長コード配列を作製した。次にこの配列を制限酵素EcoIおよびXhoIで切断し、ベクターp9KXST2に連結した。ベクターp9KXST2は、塩基1228〜1233(CCTAGG)を、1つのグリシンリンカーと停止コドン(GGWSHPQFEK-停止;配列番号20)を有するC末端streptagII配列をコードする配列GGAGGTTGGTCTCATCCACAATTTGAAAAGTAA 配列番号19で置換してpPic9KXから得られたものである。
【０４７８】
MTSP10-ST2 C122Sの発現
C122S(キモトリプシン(chymtrypsin)ナンバリング;配列番号23のCys573)突然変異体およびC末端Strep-tag IIタグ付け形態のMTSP10Pを発現するP. pastorisクローンGS115/pPIC9KXST2:MTSP10-ST2 C122S Sac MC5を5リットル規模で発酵させた。200mlの一晩培養物(約24時間でOD600)を用い、6つの各Bioflo容器(New Brunswick Scientific, Edison, NJ)に3.2リットルの発酵培地を接種した。バッチ相複合培地としては10g/l酵母抽出物、20g/lペプトン、40g/lグリセロール、5g/l硫酸アンモニウム、0.2g/l硫酸カルシウム(二水和物)、2g/l硫酸マグネシウム(七水和物)、2g/l硫酸カリウム、25g/lヘキサメタリン酸ナトリウムおよび4.35ml/l PTM1を含んだ。この培養物をバッチ相にてpH 5.8、温度28℃で増殖させた。濃水酸化アンモニウムを用いて培養物のpHを維持した。必要に応じてKFO 880(KABO Chemicals, Cheyenne,WY)を発砲の制御に用いた。
【０４７９】
バッチ相の発酵は、培養物が培地中のグリセロールを全て消費する約23〜28時間続けた。この時点で50%(w/v)グリセロールの基質制限を設けたバッチは18ml/l*hrで始めた。1時間グリセロール供給バッチでは、培養物のpHは濃水酸化アンモニウムを添加することで2時間で5.8から7.0まで直線的に上昇させた。グリセロール供給バッチは3〜4時間とした。。この時点までに培養物は204〜234g/l細胞湿重の密度に達した。
【０４８０】
グリセロール供給バッチ相の終了後、メタノール誘導を開始した。培養物はZhang et al.の方法により、培養物1リットル当たり1.5mlのメタノールを加え、グリセロール供給速度を3時間で18ml/l*hrから0ml/l*hrまで直線的に低下させることによりメタノール利用へと遷移した。このメタノール添加は発酵槽全体の誘導を制御するために用いるMeOHセンサー(Raven Biotech, Vancouver, BC, Canada)のオンライン較正として役立った。MeOHセンサーにより示されるように最初のメタノール量が消費された後、さらに1.5ml/lを培養物に加え、MeOHセンサーを用いて誘導相を通じてそのレベルで発酵槽のメタノール濃度を制御した。発酵槽に供給したメタノールには2ml/lのPTM4溶液を添加した。誘導相は40〜44時間続けた。
【０４８１】
MTSP-10の回収および精製
各発酵物から細胞を遠心分離により除いた後、上清を回収した。上清をプールし、SRT5限外濾過システム(North Carolina SRT, Cary, NC)にて10kDa限外濾過カートリッジ(A/G Technologies Corp., Needham, MA)を用いて約1リットルまで濃縮した。この濃縮物を3容量のバッファーAでダイアフィルトレーションした。濃縮物をシステムから排出した後、濃縮材料と同量のバッファーAでシステムを洗浄した。濃縮物および洗浄材料を合わせると、約1リットルの最終限外濾過産物が得られた。 SartoBran 300 0.45 + 0.2 μmカプセルフィルター(Sartorius Separations Div., Edgewood, NJ)で最終的な上清の明澄化を行った。
【０４８２】
ジアフィルトレーションしたMTSP10-ST2をバッファーAで平衡化した90mlのベンズアミジンセファロース(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)上に一晩かけてゆっくりロードした。次にこのカラムを8カラム容量のバッファーBで洗浄して混入物を除去した。 MTSP10-ST2の溶出はバッファーCを用いて行った。45ml画分を回収し、活性およびSDS-PAGEにより分析した後、さらに精製すべき目的の材料をプールした。
【０４８３】
MTSP10のベンズアミジン後のサンプル(通常、2〜5mg mtsp10および100mMのベンズアミジンを含有する約150ml)を100mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA、0.001%tween80 pH8.0の結合バッファー中で透析した。Strep-Tactin Macroprep resin(カタログ番号2-1505-010;  IBA GmbH, Rudolf-Wissell-Str. 28, D-37079 Gottingen, Germany)を用いてmtsp10活性を保持させた。この樹脂懸濁物を低温室で浸透しながら1時間インキュベートした。mtsp10が樹脂と完全に結合したかどうかは、上清中のmtsp10活性をモニタリングすることにより調べた。通常、mtsp10活性の50〜70%が樹脂に保持可能である。次にこの樹脂をカラムに詰め、5カラム容量の結合バッファーで洗浄した。Mtsp10活性は2.5mM D-デスチオビオチン(Sigma製品)を含む結合バッファーを用いて溶出させた。活性画分は基質Spec-tPA(Chromogenics)を用いた活性アッセイによって確認し、プールして透析し、D-デスチオビオチンを除去した。
【表７】
2005506832.tif 000008
【実施例３】
【０４８４】
MTSP の活性を調節する候補化合物の同定のためのアッセイ
MTSP10阻害剤スクリーニングのためのアッセイ
ピキア・パストリスで発現したMTSP10のプロテアーゼドメインを、以下に示すようにCostar96ウェル組織培養プレート(Corning NY)で種々の化合物による阻害に関してアッセイした。約1〜10nMのMTSP10を阻害剤を伴わずに、または100000nMの阻害剤および7 1:6希釈からそのまま1Xのバッファー(29.2mM Tris, pH 8.4、29.2mMイミダゾール、217mM NaCl(最終量100μL))とともに加え、室温で30分間インキュベートする。400μMの基質Spectrozyme t-PA (American Diagnostica,, Greenwich, CT)を加え、37℃にて20分間、SpectraMAX Plusマイクロプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale CA)にて405nmでの吸光度の変化を追跡することにより反応をモニタリングする。またこのアッセイでSpectrozyme UKを基質として用いることもできる。
【０４８５】
基質の同定
アッセイで用いるその他の基質は基質試験により実験的に同定することができる。以下の基質リストは試験可能なものの例である。
【表８】
2005506832.tif 000009
pNA=パラニトラニリド(発色性)
AMC=アミノメチルクマリン(蛍光性)
【０４８６】
上記の基質が切断されなければ、対応するアッセイが使用できる。要するにプロテアーゼがプラスミノーゲンおよびトリプシノーゲンなどの酵素を活性化する能力を試験する。これらのアッセイを行うには、一本鎖プロテアーゼを、プラスミノーゲンおよびトリプシノーゲンなどのチモーゲンとともに、このチモーゲンに対してはlys-プラスミノーゲンといった既知の基質の存在下でインキュベートする。その一本鎖がチモーゲンを活性化すれば、プラスミンおよびトリプシンなどの活性化酵素はその基質を分解する。
【実施例４】
【０４８７】
その他のアッセイ
これらのアッセイはMTSP1に関して記載するが、このようなアッセイはMTSP10を伴った使用用に容易に適合させることができる。
【０４８８】
マトリプターゼまたはMTSP1のセリンプロテアーゼ活性の阻害を測定するアミド分解アッセイ
試験化合物がrMAP触媒活性の阻害剤として作用する能力をIC50値によって測定される、MAPによるアミド分解活性の、阻害剤によって誘導される阻害を調べることによって評価した。アッセイバッファーはHBSA(10mM Hepes、150mM塩化ナトリウム、pH 7.4、0.1%ウシ血清アルブミン)とした。特に断りのない限り、試薬は全てSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から入手した。
【０４８９】
2つのIC50アッセイ、すなわち(a)30分または60分(試験化合物および酵素の30分または60分のプレインキュベーション)のものと(b)0分(試験化合物および酵素のプレインキュベーションなし)のものを行った。30分または60分のIC50アッセイではCorningマイクロタイタープレートの適当なウェル中で以下の試薬を混合した：HBSA 50μl、HBSAに希釈(広い濃度領域にわたる)した試験化合物(または非阻害速度の測定に対してはHBSA単独)50μl、およびバッファーに希釈したrMAP(Corvas International)50μlで、活性部位の濾過によって測定すると最終酵素濃度は250pMとなった。周囲温度で30分または60分インキュベートした後、各ウェルに50μlの基質S-2765(N-α-ベンジルオキシカルボニル-D-アルギニル-L-グリシル-L-アルギニン-p-ニトロアニリンジヒドロクロリド; DiaPharma Group, Inc.; Franklin, OH)を加えて最終アッセイ量200μl、最終基質濃度100μM(約4倍のKm)とすることでアッセイを開始した。S-2765はアッセイ混合物に加える前に脱イオン水で再構成し、HBSAで希釈した。0分のIC50アッセイでも同様の試薬：HBSA 50μl、HBSAで希釈(同じ濃度領域にわたる)した試験化合物(または非阻害速度の測定に対してはHBSA単独)50μl、および基質S-2765 50μlを混合した。50μlのrMAPを加えることでアッセイを開始した。全ての化合物の最終濃度は両IC50アッセイ(30分または60分、および0分)で同じであった。
【０４９０】
発色基質の加水分解の初速度は、両アッセイで添加基質量の5%未満を用い、Thermo Max(登録商標)カイネティックマイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して、5分間にわたる405nmでの吸光度の変化により測定した。加水分解の初速度を50%低下させる阻害剤の添加濃度を2つのアッセイ(30分または60分、および0分)のそれぞれにおいて個々のIC50値として定義した。
【０４９１】
特異性の判定のためのin vitro酵素アッセイ
化合物がマトリプターゼ活性の選択的阻害剤として働く能力は、マトリプターゼ活性を50%阻害する試験化合物の濃度(IC50)を上記実施例のように測定し、マトリプターゼのIC50値と以下のセリンプロテアーゼ:トロンビン、組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター(rt-PA)、プラスミン、活性化Cタンパク質、キモトリプシン、Xa因子およびトリプシンの全てまたはいくつかに関して測定したものと比較することにより評価した。
【０４９２】
全てのアッセイで用いたバッファーはHBSA(10mM HEPES, pH7.5、150mM塩化ナトリウム、0.1%ウシ血清アルブミン)であった。
【０４９３】
IC50測定のためのアッセイはCorningマイクロタイタープレートの適当なウェル中でHBSA 50μl、HBSAで希釈した特定の濃度(広い濃度領域にわたる)の試験化合物(またはV0(非阻害速度)の測定に対してはHBSA単独)50μl、およびHBSAに希釈した酵素50μlを混合することで行った。周囲温度で30分間インキュベートした後、下記に示された濃度の基質50μlをウェルに加え、最終総量200μlとした。発色基質の加水分解の初速度は、添加基質5%未満を用い、Thermo Max(登録商標)カイネティックマイクロプレートリーダーを使用して、5分間にわたる405nmでの吸光度の変化により測定した。加水分解の初速度を50%低下させる阻害剤の添加濃度をIC50値として定義した。
【０４９４】
トロンビン(fIIa)アッセイ
発色基質ペファクロム(Pefachrome)t-PA(Pentapharm Ltd.から入手したCH3SO2-D-ヘキサヒドロチロシン-グリシル-L-アルギニン-p-ニトロアニリンを用いて酵素活性を測定した。基質は使用前に脱イオン水で再構成した。精製ヒトα-トロンビンはEnzyme Research Laboratories, Inc.から入手した。全てのアッセイで用いたバッファーはHBSA(10mM HEPES, pH7.5、150mM塩化ナトリウム、0.1%ウシ血清アルブミン)であった。
【０４９５】
IC50の測定は適当なウェル中でHBSA(50μL)、α-トロンビン(50μl)(最終酵素濃度は0.5nM)および阻害剤(50μl)(広い濃度領域にわたる)を混合し、基質ペファクロム-t-PA(50μl)(最終基質濃度は250μM、約5倍Km)の添加前に室温で30分間インキュベートすることで行った。ペファクロム-t-PAの加水分解の初速度は、添加基質5%未満を用い、Thermo Max(登録商標)カイネティックマイクロプレートリーダーを使用して、5分間にわたる405nmでの吸光度の変化により測定した。加水分解の初速度を50%低下させる阻害剤の添加濃度をIC50値として定義した。
【０４９６】
Xa因子
Xa因子の触媒活性はDiaPharma Group(Franklin, OH)から入手した発色基質S-2765(N-ベンジルオキシカルボニル-D-アルギニン-L-グリシン-L-アルギニン-p-ニトロアニリン)を用いて測定した。基質は全て使用前に脱イオン水で再構成した。S-2765の最終濃度は250μM(約5倍Km)とした。Enzyme Research Laboratories, Inc. (South Bend, IN)から入手した精製ヒトX因子およびXa因子(FXa)を活性化し、記載のようにしてそれから調製した[Bock, P.E., Craig, P.A., Olson, S.T., and Singh, P. Arch. Biochem. Biophys. 273:375-388 (1989)]。アッセイ前に酵素をHBSAで希釈し、最終濃度0.25nMとした。
【０４９７】
組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター(rt-PA)アッセイ
rt-PAの触媒活性は基質ペファクロムt-PA(Pentapharm Ltd.から入手したCH3SO2-D-ヘキサヒドロチロシン-グリシル-L-アルギニン-p-ニトロアニリン)を用いて測定した。基質はアッセイ前に脱イオン水で構成した後、HBSAで希釈し、最終濃度500μM(約3倍Km)とした。ヒトrt-PA(Activase(登録商標)はGenentech Inc.から入手した。この酵素はアッセイ前に脱イオン水で再構成し、HBSAに希釈し、最終濃度1.0nMとした。
【０４９８】
プラスミンアッセイ
プラスミンの触媒活性はDiaPharmaグループから入手した発色基質S-2366(L-ピログルタミル-L-プロリル-L-アルギニン-p-ニトロアニリンヒドロクロリド)を用いて測定した。基質はアッセイ前に脱イオン水で構成し、HBSAで希釈し、最終濃度300μM(約2.5倍Km)とした。精製ヒトプラスミンはEnzyme Research Laboratories, Inc.から入手した。この酵素はアッセイ前にHBSAで希釈し、最終濃度1.0nMとした。
【０４９９】
活性化タンパク質C(aPC)アッセイ
aPCの触媒活性は発色基質ペファクロムPC(Pentapharm Ltd.から入手したδ-カルボベンジルオキシ(carbobenzloxy)-D-リジン-L-プロリル-L-アルギニン-p-ニトロアニリンジヒドロクロリド)を用いて測定した。基質はアッセイ前に脱イオン水で構成し、HBSAで希釈し、最終濃度400μM(約3倍Km)とした。精製ヒトaPCはHematologic Technologies, Inc.から入手した。この酵素はアッセイ前にHBSAで希釈し、最終濃度1.0nMとした。
【０５００】
キモトリプシンアッセイ
キモトリプシンの触媒活性はDiaPharmaグループから入手した発色基質S-2586(メトキシ-スクシニル-L-アルギニン-L-プロリル-L-チロシル-p-ニトロアニリド)を用いて測定した。基質はアッセイ前に脱イオン水で構成した後にHBSAで希釈し、最終濃度100μM(約9倍Km)とした。精製(3X-結晶化; CDI)ウシ膵臓α-キモトリプシンはWorthington Biochemical Corpから入手した。この酵素はアッセイ前に脱イオン水で再構成し、HBSAで希釈し、最終濃度0.5nMとした。
【０５０１】
トリプシンアッセイ
トリプシンの触媒活性はDiaPharmaグループから入手した発色基質S-2222(ベンゾイル-L-イソロイシン-L-グルタミン酸-[γ-メチルエステル]-L-アルギニン-p-ニトロアニリド)を用いて測定した。基質はアッセイ前に脱イオン水で構成した後、HBSAで希釈し、最終濃度250μM(約4倍Km)とした。精製(3X-結晶化; TRL3)ウシ膵臓トリプシンはWorthington Biochemical Corpから入手した。この酵素はアッセイ前に脱イオン水で再構成し、HBSAで希釈し、最終濃度0.5nMとした。
【０５０２】
当業者には種々の改変が明らかであり、本発明は付属の特許請求の範囲によってのみ制限されるものとする。
【国際公開パンフレット】
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