(57)【要約】本発明は、ペプチド、組成物、及び患者における有害又は不要な細胞の除去又は破壊を必要とする状態、例えば良性及び悪性腫瘍を、タンパク質（及びそのようなタンパク質のアミノ酸配列から誘導されたペプチド）を用いて治療する方法に関し、該アミノ酸配列は、神経糸タンパク質及び他の関連分子から誘導された少なくとも一つのアミノ酸配列を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１０〜１２４からなる群の一つ以上から選ばれるペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の１個以上のペプチドとその担体とを含む組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドの相同体、誘導体、フラグメント又は変異体を含むタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドのアミノ酸配列を基にしてリバース−Ｄ順の配列になっているアミノ酸を含むタンパク質。
【請求項５】
ペプチドの３’又は５’末端のいずれかにフランキングしている１〜２５個の追加のアミノ酸で修飾された請求項１に記載のペプチドを含むタンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載の少なくとも２個のペプチドを含むタンパク質。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドの少なくとも２回の反復を含むタンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドのミメティック。
【請求項９】
抗体、抗体のフラグメント又は抗体様分子に融合した請求項１に記載のペプチドを含むタンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチド並びにその相同体、フラグメント及び変異体に対応するアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の１個以上の核酸とその製薬上許容しうる担体とを含む組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載のペプチドのアミノ酸配列の一部に対応する少なくとも一つのアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載の１個以上のペプチドとその担体とを含む組成物。
【請求項１４】
請求項１２に記載のペプチドの相同体、誘導体、フラグメント又は変異体を含むペプチド。
【請求項１５】
請求項１２に記載のペプチドのアミノ酸配列を基にしてリバース−Ｄ順の配列になっているアミノ酸を含むペプチド。
【請求項１６】
ペプチドの３’又は５’末端のいずれかにフランキングしている１〜２５個の追加のアミノ酸で修飾された請求項１２に記載のペプチドを含むペプチド。
【請求項１７】
請求項１２に記載の少なくとも２個のペプチドを含むペプチド。
【請求項１８】
請求項１２に記載のペプチドの少なくとも２回の反復を含むペプチド。
【請求項１９】
請求項１２に記載のペプチドのミメティック。
【請求項２０】
抗体、抗体のフラグメント又は抗体様分子に融合した請求項１２に記載のペプチドを含むペプチド。
【請求項２１】
請求項１２に記載のペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の１個以上の核酸とその製薬上許容しうる担体とを含む組成物。
【請求項２３】
細胞の除去又は破壊を必要とする患者における状態を治療する方法であって、その必要のある哺乳動物に、治療上有効量の請求項１〜２３のいずれか１項に記載のペプチド、ミメティック、核酸、又は組成物を投与することを含む方法。
【請求項２４】
投与が、経口、皮下、皮内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、くも膜下、鼻腔内、腫瘍内、局所、及び経皮からなる群から選ばれる方法が含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
治療が、外科的切除、臓器移植、組織移植、化学療法、免疫療法、ワクチン接種、熱又は電気的剥離、寒冷療法、レーザー療法、光線療法、遺伝子療法、及び放射線からなる群から選ばれる治療法で患者が治療される前、中、後に患者に投与される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳及びその外皮、脊髄及びその外皮、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、脳下垂体、生殖器官、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節、及びリンパ組織からなる群から選ばれる組織の良性又は悪性腫瘍である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳及びその外皮、脊髄及びその外皮、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、脳下垂体、生殖器官、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節、及びリンパ組織からなる群から選ばれる組織の過形成、肥大、又は過成長である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳及びその外皮、脊髄及びその外皮、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、脳下垂体、生殖器官、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節、及びリンパ組織からなる群から選ばれる組織のウィルス性、細菌性、又は寄生虫性変化である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記状態が、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、心臓、脾臓、唾液腺、血液、脳及びその外皮、脊髄及びその外皮、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、脳下垂体、生殖器官、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節、及びリンパ組織からなる群から選ばれる組織の奇形である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記組織がリンパ組織である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記状態が扁桃肥大である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記状態が前立腺肥大である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記状態が乾癬である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記状態が湿疹である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記状態が皮膚病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記状態が組織に対する美容修正である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記組織が、皮膚、眼、耳、鼻、咽頭、口、筋肉、結合組織、毛髪、及び乳房である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記状態が血管疾患である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記状態が痔である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記状態が静脈瘤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４１】
前記血管疾患がアテローム性動脈硬化又は動脈硬化である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記状態が、炎症性疾患、自己免疫疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患／遺伝病、外傷性疾患又は身体外傷、栄養欠乏症、感染症、アミロイド病、線維症、沈着症、先天性奇形、酵素欠乏症、中毒、酩酊、環境病、放射線疾患、内分泌性疾患、消耗性疾患及び機械的疾患からなる群から選ばれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記ペプチドが膵臓糸タンパク質のアミノ酸配列から誘導されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項４４】
前記ペプチドが、抗体、抗体フラグメント、及び抗体様結合分子からなる群から選ばれる分子と複合化、連結、又は結合しており、前記分子は他の細胞に結合するより腫瘍又は他の標的への結合の方に高い親和性を有している、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ペプチドが、該ペプチドと、抗体、抗体フラグメント、及び抗体様結合分子からなる群から選ばれる分子とからなる単一の新規クローン組換え分子の一部であり、前記分子は他の細胞に結合するより腫瘍又は他の標的への結合の方に高い親和性を有している、請求項２３に記載の方法。
【請求項４６】
ペプチドであって、
（i）配列番号１５：
【化１】
2005506061.tif 000042
で表されるアミノ酸配列を有するペプチド；又は
（ii）配列番号１８：
【化２】
2005506061.tif 000043
で表されるアミノ酸配列を有するペプチド；
から選ばれる少なくとも１個のペプチドを含むペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００１年７月１９日に出願された仮出願第６０／３０６，１６１号、発明の名称“細胞の除去又は破壊を必要とする腫瘍及び他の状態の治療に有効なタンパク質及びペプチド(Proteins and peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells)”、２００１年７月１９日に出願された仮特許出願第６０／３０６，１５０号、発明の名称“細胞の除去又は破壊を必要とする腫瘍及び他の状態の治療に有効なペプチド(Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells)”、及び２００１年１１月１６日に出願された仮特許出願第６０／３３１，４７７号、発明の名称“細胞の除去又は破壊を必要とする腫瘍及び他の状態の治療に有効なペプチド(Peptides effective in the treatment of tumors and other conditions requiring the removal or destruction of cells)”に基づく優先権を主張する。前記各出願の開示内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。
発明の分野
本発明は、細胞要素の除去又は破壊を必要とする、ヒトにおける良性又は悪性腫瘍のような状態を、神経糸タンパク質(neural thread protein)のアミノ酸配列の一部に対応する、類似する又は相同するアミノ酸配列を含有するタンパク質及びペプチドを用いて治療する方法に関する。本発明の方法は、化合物を単独で又は担体に結合させて筋肉内、経口、静脈内、くも膜下、腫瘍内、鼻腔内、局所、経皮投与することを含むが、これらに限定されない。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの医学的治療及び処置の本質は、有害又は不要な組織の除去又は破壊を伴う。そのような意義ある治療の例は、がん成長の外科的除去、転移性腫瘍の化学療法による破壊、及び腺（例えば前立腺）過形成の縮小などである。他の例は、不要な顔毛、いぼ、皮下組織、リンパ組織又は脂肪組織の除去などである。
【０００３】
有害又は不要な細胞及び組織を破壊しその除去を促進又はその更なる成長を阻害するが、作用は主に局所的で全身毒性は最小限もしくは皆無、というような有効な薬剤が求められている。神経糸タンパク質及びそれらの関連分子はそのような薬剤の一クラスであることが、係属中の米国特許出願第１０／０９２，９３４号、出願日２００２年３月８日、発明の名称：神経糸タンパク質を用いる腫瘍及び関連状態の治療法(Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins)に開示されている。前記出願の開示内容はその全体を引用によって本明細書に援用する。神経糸タンパク質ＡＤ７ｃ−ＮＴＰのアミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を含有するペプチドもそのような薬剤である。これらのペプチドは、係属中の米国特許出願第１０／１５３，３３４号、出願日２００２年５月２４日、発明の名称：細胞の除去又は破壊を必要とする腫瘍及び他の状態の治療に有効なペプチド(Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells)に開示されている。前記出願の開示内容はその全体を引用によって本明細書に援用する。
【０００４】
がんとは細胞の内部調節機構の異常によってもたらされる、細胞の制御されない成長及び複製である。正常細胞が組織を構成するが、これらの細胞が、特定化され、制御され、調和された単位としてふるまう能力を失うと（脱分化）、その欠陥によって細胞集団内の秩序が失われる。こうなったときに腫瘍が形成される。
【０００５】
組織の良性過成長は、生体からの細胞の除去が望ましい異常である。良性腫瘍は、体全体に転移はしないものの、病気の症状を引き起こす細胞増殖である。そのような腫瘍でも、脳のような器官の接近不能な領域にあると命取りになりかねない。良性腫瘍は、肺、脳、皮膚、脳下垂体、甲状腺、副腎皮質及び髄質、卵巣、子宮、精巣、結合組織、筋肉、腸、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、肝臓、胆嚢、膵臓、前立腺、心臓、及び他の器官などの器官に発生する。
【０００６】
がん治療の第一段階は手術であることが多い。手術の目的は様々である。手術を用いて目に見える腫瘍をなるべく多量に切除することもあれば、腫瘍の塊を少なくとも縮小することもある（腫瘍の主塊を取り除き、他の手段による治療を必要とする部分を小さくする）。がんの種類や部位によって、手術は患者の何らかの症状も緩和しうる。例えば、外科医が広がっている脳腫瘍の大部分を除去できれば、頭蓋内圧が低下し、患者の症状は改善される。
【０００７】
すべての腫瘍が手術に適しているわけではない。完全に除去することが不可能な体内の部分に位置していることもあり得る。こうした例は脳幹（脳の呼吸を司る部分）の腫瘍や大血管の中及び周囲に成長した腫瘍であろう。このような場合、手術の役割は腫瘍除去に高リスクが伴うため制約される。
【０００８】
場合によっては腫瘍の縮小に手術が必要ないため、手術が使われないこともある。一例はリンパ節のがんであるホジキンリンパ腫で、化学療法と放射線療法の併用に非常によく反応する。ホジキンリンパ腫では手術が治癒の達成に必要なことは滅多にないが、診断を確定するためにほとんどいつも使用されている。
【０００９】
化学療法は、体中の迅速に分裂する細胞（腫瘍に見られるような）を特異的に攻撃する薬物療法（通常経口又は注射による投与）を用いる広く知られたがん治療の形態である。このため、化学療法は、既に転移したがんや、血液及びリンパ系を通じて拡散する可能性が高いものの原発腫瘍以外は明らかでない腫瘍の治療に有用性が高い。化学療法は、局在化している腫瘍の、手術や放射線療法に対する反応を高めるために使用されることもある。これが当てはまるのは、例えば頭部及び頚部の一部のがんである。
【００１０】
残念なことに、正常でも迅速に分裂しているヒト体内の他の細胞（例えば胃の内膜及び毛髪）も化学療法の影響を受ける。このため、多くの化学療法薬は、吐き気、嘔吐、貧血、脱毛又は他の症状などの望ましくない副作用を引き起こす。これらの副作用は一過性なので、これらの副作用の多くの軽減に役立ちうる薬物療法がある。知識が蓄積するに従って、研究者らはがん細胞をよく殺すだけでなく患者に対する副作用も少ない新規の化学療法薬を考案してきた。
【００１１】
化学療法は様々な方法で患者に投与される。ある場合には丸薬であり、ある場合には静脈内又は他の注射による投与である。注射式化学療法の場合、患者は治療のために通院する。他の化学療法薬は１日２４時間血流中への連続注入を必要とする。このような種類の化学療法の場合、患者が装着する小ポンプを植え込むための小手術が行われることがある。その後該ポンプによって薬物が徐々に投与される。多くの場合、度重なる針刺しの必要性を排除するために患者の静脈に常設ポートが設置される。
【００１２】
放射線療法もがんとの闘いに汎用される別の武器である。放射線は、腫瘍細胞内のＤＮＡを損傷することによってがんを殺す。放射線は様々な方法で照射されるが、最も一般的な方法は、非常に精確な方式で患者に放射線のビームを向け、腫瘍に焦点を合わせる。これを行うには、患者が台上に横たわり、ビームが患者の周りを移動する。処置は数分間で終わるが、特定の全処方線量を達成するには（腫瘍の種類に応じて）数週間のあいだ毎日行われることになる。
【００１３】
密封小線源療法（近接照射療法、ブラキー療法）と呼ばれる別の放射線療法が使用されることもある。これは、放射性ペレット（シーズ）又はワイヤを利用し、それらを体内の腫瘍領域に埋め込むことを必要とする。移植は一時的でも永久的でもよい。永久的移植の場合、患者が放射能を浴びないようにシーズ中の放射線は数日間又は数週間かけて崩壊する。一時的移植の場合、全放射線量は通常数日間で照射されるので、患者はその間入院する必要がある。いずれのタイプのブラキー療法も、放射線は一般的にがんを局所的に制御するために非常に的を絞った領域に照射される（化学療法が全身を処置するのとは対照的）。
【００１４】
ごく一部の患者は骨髄移植に回されることもある。この方法は通常がんが特に攻撃的であるか、又は従来療法で治療した後がんが再発した患者を対象に実施される。骨髄移植は複雑な方法である。多くの種類があり、それによって副作用や治癒の可能性も変わる。ほとんどの移植は特別のセンターで実施され、多くの場合その使用は研究的とみなされる。
【００１５】
ほかにもいくつかの療法がある。ただし、ほとんどはまだ臨床試験で模索中で、まだ標準的治療になっていない。その例は、免疫療法、モノクロナール抗体、血管新生阻害因子、及び遺伝子療法の使用などである。
【００１６】
免疫療法：放射線や化学療法とは全く別に患者自身の免疫系ががんと闘うのを手助けするように設計された種々の技術がある。多くの場合、目標を達成するために研究者らは特別に誘導されたワクチンを患者に接種する。
【００１７】
モノクロナール抗体：これらは、がん細胞と非がん細胞の抗原性及び／又は他の特徴の違いを利用してがん細胞に結合するように設計された抗体である（正常細胞には結合しない）。該抗体は、患者に単独で、又は種々の細胞毒化合物と組み合わせて、又は放射性の形態で投与できる。その結果、がん細胞を優先的に標的にする該抗体によって毒物や放射能が所望の細胞に運搬される。
【００１８】
血管新生阻害因子：がん細胞は迅速に分裂し腫瘍が成長するので、じきにそれらへの血液供給が追いつかなくなりうる。これを補うために、一部の腫瘍はその近辺の血管成長を誘発するのに役立つと考えられている物質を分泌する。そうすることによって、がん細胞に血管由来の栄養素を供給する。実験的療法は、腫瘍に通じる血管の成長を阻止するように設計されている。
【００１９】
遺伝子療法：がんは、最終的にがん細胞の産生とその過剰増殖をもたらす一連の突然変異の産物である。がんは、がん細胞に、がんの増殖をチェック又は停止させるように作用する遺伝子、細胞のプログラムされた細胞破壊機構を作動させる遺伝子、細胞の免疫認識を増強させる遺伝子、又は腫瘍成長を阻害する毒性代謝産物又はサイトカインに転化するプロドラッグを発現する遺伝子を導入することによって治療できる。
【００２０】
良性腫瘍及び奇形も、手術、放射線療法、薬物療法、熱又は電気的剥離、寒冷療法、及びその他を含む各種方法によって治療できる。良性腫瘍は転移しないが、大きく成長したり再発することはある。良性腫瘍の外科的摘出と言えども一般に手術のあらゆる困難と副作用を伴い、一部の良性腫瘍、例えば下垂体腺腫、脳の髄膜腫、前立腺肥大、及びその他などは摘出手術を繰り返さなければならないことが多い。
【００２１】
不要な細胞要素が関与し選択的細胞除去が望ましい状態はまだほかにもある。例えば、心疾患及び脳卒中は一般的にアテローム性動脈硬化によって起こる。アテローム性動脈硬化は線維性脂肪の増殖性病変で、変性した平滑筋要素が血管壁を歪め、管腔を狭窄し、血流を圧迫し、局所的凝血の素因を作り、最終的には閉塞及び梗塞に至る。アテローム性動脈硬化に対する各種治療法は、バイパス移植；人工的移植；再疎通、掻爬、放射線、レーザー、又は他の除去を用いる血管形成術；脂質削減によりアテローム性動脈硬化を阻害する薬物療法；抗凝固療法；及び食事、運動、ライフスタイルの一般的対策などである。アテローム性動脈硬化病変を外科的処置によるリスク及び副作用なしに除去する方法が求められている。
【００２２】
不要な細胞要素が関与し選択的細胞除去が望ましい他の例は、いぼのようなウィルス誘発性成長などである。別の例は、炎症状態で見られる肥大性炎症性腫瘤、及び肥厚性瘢痕又はケロイドである。さらに別の例は美容関係の内容で、顔の毛のような不要毛の除去、又は美容を目的とした、顔の真皮や結合組織又は四肢の真皮や結合組織中の不要組織部分の縮小などである。
【００２３】
さらに別の例は当業者には明らかであろう。これらの例のすべて又はほとんどで、不要な細胞要素を従来療法のリスクや副作用なしに除去又は破壊できる療法、そしてより正確に不要細胞要素を除去するための療法が求められている。
【００２４】
神経糸タンパク質（neural thread protein, ＮＴＰ）は最近特徴が明らかになった脳タンパク質のファミリーである。このファミリーの一員であるＡＤ７ｃ−ＮＴＰは〜４１ｋＤの膜関連リンタンパク質で、神経突起発芽に関わる機能を有する（ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３０９３−３１０４（１９９７）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ａｌｚ．．Ｒｅｐ．，２：３２７−３３２（１９９９）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅ  ＳＭ及びＷａｎｄｓ  ＪＲ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３：３４５−３５３（２００１））。ＡＤ７ｃ−ＮＴＰをコードする遺伝子及びＡＤ７ｃ−ＮＴＰの予測タンパク質配列は同定され報告されている（ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３０９３−３１０４（１９９７））。〜４１ｋＤ種のほか、神経糸タンパク質の他の種（〜２６ｋＤ、〜２１ｋＤ、〜１７ｋＤ、及び〜１５ｋＤ）も同定され、神経外胚葉腫瘍、星状芽細胞腫、グリア芽細胞腫、及び低酸素、スキーマ（ｓｃｈｅｍａ）、又は脳梗塞による傷害に関連している（Ｘｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３８２３−３８２９（１９９３）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５（１０）：１０３８−５０（１９９６）、ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１３８（１−２）：２６−３５（１９９６）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１３５（２）：１１８−２５（１９９６）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３０９３−３１０４（１９９７）；及びｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ａｌｚ．．Ｒｅｐ．，２：３２７−３３２（１９９９））。
【００２５】
神経糸タンパク質の種は、米国特許第５，９４８，６３４号；５，９４８，８８８号；及び５，８３０，６７０号（いずれも“神経糸タンパク質の遺伝子発現とアルツハイマー病の検出(Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease)”）、及び米国特許第６，０７１，７０５号（“神経疾患又は神経障害の検出法(Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction)”に記載されクレームされている。これらの特許の開示内容は特にその全体を引用によって本明細書に援用する。それらに記載されているように、ＮＴＰは細胞死の間に応答増強（アップレギュレーション）され産生される。従って死滅した及び死にかけの神経細胞はＮＴＰを過剰産生すると記載されており、ゆえにその存在は神経細胞の死及びアルツハイマー病（ＡＤ）の発症を示す。
【００２６】
他の種の神経糸タンパク質は、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ遺伝子の他の産生物（例えば、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質データベース登録＃ＸＰ＿０３２３０７  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に記載の１１２アミノ酸タンパク質）又は神経糸タンパク質に類似している（例えば、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質データベース登録＃ＡＡＨ１４９５１  ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に記載の１０６アミノ酸タンパク質、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質データベース登録＃ＸＰ＿０３９１０２  ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９に記載の別の１０６アミノ酸タンパク質、及びＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質データベース登録＃ＡＡＨ０２５３４  ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１に記載の６１アミノ酸タンパク質）と確認されている。
【００２７】
神経糸タンパク質はＡＤに関連し、ＮＴＰはＡＤの細胞死に関連して応答増強される。ＡＤ７ｃ−ＮＴＰのｍＲＮＡは対照と比べてＡＤの脳で応答増強されている；脳及びＣＳＦにおけるＡＤ７ｃ−ＮＴＰタンパク質の濃度は対照よりＡＤで高い；そしてＡＤ７ｃ−ＮＴＰの免疫反応性は老人斑、神経原線維変化（ＮＦＴ）、ＡＤ及びダウン症の脳の変性ニューロン、ニユーロピル糸、及び異栄養性神経突起芽に見られる（Ｏｚｔｕｒｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４１９−４２３（１９８９）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８６（３）：１００４−１３（１９９０）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１１３（２）：１５２−１６４（１９９２）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３２（６）：７３３−４２（１９９２）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５（１０）：１０３８−５０（１９９６）、ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１３８（１−２）：２６−３５（１９９６）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１３５（２）：１１８−２５（１９９６）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３０９３−３１０４（１９９７）；及びｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ａｌｚ．．Ｒｅｐ．，２：３２７−３３２（１９９９））。ＮＴＰは、細胞内、ニューロピル内の微細突起内、又はＡＤ及びダウン症の脳の細胞外に局在している（ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，３２（６）：７３３−４２（１９９２））。
【００２８】
高められた濃度のＡＤ７ｃ−ＮＴＰタンパク質がＡＤ患者のＣＳＦ及び尿中に見出されている（ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅ及びＷａｎｄｓ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ７：９８９−９６（２００２）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅ及びＷａｎｄｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ３：３４５−３５３（２００１）；Ｍｕｎｚａｒら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４：６１−６５（２００１）；Ｋａｈｌｅら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５４：１４９８−１５０４（２０００）；Ｍｕｎｚａｒら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ３：１５５−１５９（２０００）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２：３２７−３３２（１９９９）；及びｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １００：３０９３−３１０４（１９９７））。
【００２９】
ＮＴＰの過剰発現はアルツハイマー病の細胞死のプロセスにも関連している（ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅ及びＷａｎｄｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６０：１９５−２０７（２００１）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅ及びＷａｎｄｓ、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５８：８４４−４９（２００１））。ＡＤ７ｃ−ＮＴＰはダウン症の脳組織中にも確認されている（Ｗｎａｄｓら、国際特許公開第ＷＯ９０／０６９９３号；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ  １３５：１１８−２５（１９９６）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ａｌｚ．．Ｒｅｐ．，２：３２７−３３２（１９９９））。ＮＴＰの過剰発現は正常眼圧緑内障にも関連しているようだという何らかの証拠がある（Ｇｏｌｕｂｎｉｔｓｃｈａｊａ−Ｌａｂｕｄｏｖａら、Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  ２１：８６７−７６（２０００））。
【００３０】
ＮＴＰは、インビトロでは神経膠腫及び神経芽細胞腫の細胞培養物で、またインビボでは正常齧歯類の筋組織、皮下結合組織、及び真皮、並びに各種の異なるヒト及び非ヒト起源腫瘍、例えば乳がん、皮膚がん及び乳頭腫、結腸がん、脳の神経膠腫、並びに齧歯類モデルのその他の両方で細胞死を起こす有効な薬剤であることが証明されている。係属中の米国特許出願第１０／０９２，９３４号、発明の名称：神経糸タンパク質を用いる腫瘍及び関連状態の治療法(Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins)、出願日２００２年３月８日、参照。
【００３１】
前述の関連技術の説明を含む本明細書の記述全体を通して、米国特許のいずれか及びすべてを含め本明細書中に記載の公的に入手可能ないずれか及びすべての文献は、引用によって特にその全体を本明細書に援用する。前述の関連技術の説明は決して、係属中の米国特許出願を含め本明細書中に記載のいずれかの文献が本発明の先行技術であることを承認することを意図しているのではない。
【００３２】
当該技術分野には不要な細胞要素を処置するための新規で低毒性の治療法に対する需要が依然としてある。本発明はこれらの需要に応えるものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
発明の要旨
本発明は、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰに含有されるペプチド配列は有害又は不要な細胞の破壊又は除去に有効な薬剤であり、それらの変異体及び相同体はヒト及び他の哺乳動物を含む他の生体の他のタンパク質にも見出されるという本発明者らによる発見に一部は伴うものである。ペプチド配列が発見されると、これらのタンパク質は、当業者であれば、広く利用可能な公的及び商業的タンパク質データベース、例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのタンパク質データベース、及びＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）のようなサーチプログラムを利用して見つけることができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、“ギャップありＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新生代のタンパク質データベースサーチプログラム”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２参照。
【００３４】
次に、当業者であれば、これらのタンパク質を本明細書中に記載のアッセイ法を用いてスクリーニングし、不要又は有害細胞の破壊又は除去用薬剤としての有効性を決定することができる。一つ以上のそのような有効薬剤を発見した当業者は、次にこれらの薬剤のどの部分が本明細書中に記載の、又は係属中の米国特許出願第１０／１５３，３３４号、発明の名称：細胞の除去又は破壊を必要とする腫瘍及び他の状態の治療に有効なペプチド(Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells)、出願日２００２年５月２４日、に記載のＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチド配列に相同又は類似の配列を含有しているかを決定し、それらの薬剤の該当部分を当業者に公知の方法を用いて合成し、そして合成した薬剤について不要又は有害細胞の破壊又は除去用薬剤としての有効性を試験することができる。さらに、当業者であれば、発見されたそのようないずれかのタンパク質のアミノ酸配列を用いて、他のペプチド配列が本明細書中に記載の、又は係属中の米国特許出願第１０／１５３，３３４号、発明の名称：細胞の除去又は破壊を必要とする腫瘍及び他の状態の治療に有効なペプチド(Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells)、出願日２００２年５月２４日、に記載のＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチド配列に類似又は相同でない、相同又は類似していると判定することもできよう。次にこれらの新規合成配列について、不要又は有害細胞の破壊又は除去用薬剤としての有効性を試験できるだろう。
【００３５】
本発明は、ペプチド、組成物、及び不要な細胞増殖、例えば良性及び悪性腫瘍、腺（例えば前立腺）過形成、不要な顔毛、いぼ、及び不要な脂肪組織の治療方法に関する。そのような方法は、その必要のある哺乳動物に、細胞死を起こす有効薬剤として知られている関連タンパク質、関連ペプチド、又はＮＴＰペプチドを治療上有効量投与することを含む。“関連タンパク質”、“関連ペプチド”及び“ＮＴＰペプチド”の用語は以下に定義する。
【００３６】
本発明のペプチドは、神経糸タンパク質の種のアミノ酸配列の一部に対応する少なくとも一つのアミノ酸配列を有する。本発明の組成物は、該ペプチド及び製薬上許容しうる担体を含む。本発明のペプチド又はタンパク質（“細胞死ペプチド”）は、単独で投与することも、又は担体もしくは抗体と複合化させて組成物に処方することもできる。細胞死ペプチドは、単独で又は担体と複合化させて、噴霧、注入、ボーラス注射、移植デバイス、徐放システムなどにより、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、腫瘍内、病巣内、皮内、くも膜下、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮投与できる。あるいは、細胞死ペプチドは、該ペプチドを発現する遺伝子を投与することにより、そのような産生を誘発するワクチンを投与することにより、又は該ペプチドをインビボで発現する細胞、細菌もしくはウィルスを導入することにより、遺伝子修飾などの結果、インビボで発現させることもできる。
【００３７】
さらに、細胞死ペプチドは、良性及び悪性腫瘍並びに他の不要又は有害な細胞成長を治療するための他の療法と組み合わせて使用することもできる。前述の一般的説明と以下の詳細な説明はいずれも例示及び説明的なものであり、クレームした本発明をさらに説明するために提供されるものである。他の目的、利点、及び新規特徴は以下の本発明の詳細な説明から当業者には容易に明らかであろう。
好適な態様の詳細な説明
本明細書中で使用している用語及びフレーズは別途記載のない限り以下の定義の通りである。
【００３８】
“ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ”という表現は、〜４１ｋＤのタンパク質並びにそれをコードする遺伝子及び核酸配列のことで、ｄｅ  ｌａ  ＭｏｎｔｅらによるＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  １００：３０９３−１０４（１９９７）、米国特許第５，９４８，６３４号、５，９４８，８８８号、及び５，８３０，６７０号の配列１２０及び１２１、並びにＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ０１０１４４に記載されている。その核酸及びアミノ酸配列を図１に示す。“ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ”という用語は、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰの生物学的に活性なフラグメント、変異体、誘導体、相同体及びミメティックも含む。
【００３９】
“ＮＴＰ”又は“神経糸タンパク質”という用語は、神経糸タンパク質及び関連分子（膵臓糸タンパク質を含む）並びにそれらのタンパク質をコードしている核酸配列のことで、以下のタンパク質及びこれらのタンパク質のアミノ酸配列をコードしている核酸配列を含む（これらに限定されない）：
（ａ）ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ；
（ｂ）神経糸タンパク質の〜４２、〜２６、〜２１、〜１７、〜１４、及び〜８ｋＤ種であって、米国特許第５，９４８，６３４号、５，９４８，８８８号、５，８３０，６７０号、及び６，０７１，７０５号、並びにｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５５（１０）：１０３８−５０（１９９６）、ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１３８（１−２）：２６−３５（１９９６）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．，１３５（２）：１１８−２５（１９９６）；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３０９３−３１０４（１９９７）；及びｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ａｌｚ．．Ｒｅｐ．，２：３２７−３３２（１９９９）に記載のタンパク質；
（ｃ）バージニア州マナッサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにアクセッション番号ＨＢ−１２５４６で寄託されているモノクロナール抗体＃２又はバージニア州マナッサスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにアクセッション番号ＨＢ−１２５４５で寄託されているモノクロナール抗体＃５によって特異的に認識されるタンパク質；
（ｄ）ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｅ）米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列４０に記載の、及びＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＥ２５４４７、ＰＩＤ  ｇ１００４８５４０に掲載の１２２アミノ酸神経糸タンパク質、これのアミノ酸配列を図２に示す（“ＮＴＰ−１２２”）；
（ｆ）ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＸＰ＿０３２３０７、ＰＩＤ  ｇ１４７２５１３２に掲載の１１２アミノ酸神経糸タンパク質、これのアミノ酸配列を図３に示す（“ＮＴＰ−１１２”）；
（ｇ）ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＨ１４９５１、ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１に掲載の１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質、これのアミノ酸配列を図４に示す（“ＮＴＰ−１０６Ａ”）；
（ｈ）ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＸＰ＿０３９１０２、ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９に掲載の１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質、これのアミノ酸配列を図５に示す（“ＮＴＰ−１０６Ｂ”）；
（ｉ）米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列３０に記載の、及びＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＥ２５４４５、ＰＩＤ  ｇ１００４８５３８に掲載の９８アミノ酸神経糸タンパク質、これのアミノ酸配列を図６に示す（“ＮＴＰ−９８”）；
（ｊ）米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列４８に記載の、及びＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＥ２５４４８、ＰＩＤ  ｇ１００４８５４１に掲載の７５アミノ酸神経糸タンパク質、これのアミノ酸配列を図７に示す（“ＮＴＰ−７５”）；
（ｋ）米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列３６に記載の、及びＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＥ２５４４６、ＰＩＤ  ｇ１００４８５３９に掲載の６８アミノ酸神経糸タンパク質、これのアミノ酸配列を図８に示す（“ＮＴＰ−６８”）；
（ｌ）ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＨ０２５３４、ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１に掲載の６１アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質、これのアミノ酸配列を図９に示す（“ＮＴＰ−６１”）；
（ｍ）膵臓糸タンパク質；
（ｎ）米国特許第６，０７１，７０５に記載の神経膵臓糸タンパク質（ｎＰＴＰ）；及び
（ｏ）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されているＨＢ９９３４、ＨＢ９９３５、及びＨＢ９９３６からなる群由来のハイブリドーマによって産生される抗体に特異的に認識されるタンパク質。
【００４０】
“ＮＴＰペプチド”という表現は、ＮＴＰのアミノ酸配列の少なくとも一部又はＮＴＰのフラグメントに対応するアミノ酸配列を含むペプチドのことで、別途記載のない限りそのようなペプチドの相同体、誘導体、変異体、融合タンパク質、及びペプチドミメティックを含む。“ＮＴＰペプチド”という表現は、米国特許出願第１０／０９２，９３４号及び１０／１５３３３４号に具体的に掲載されているペプチドも含む（これらに限定されない）。“ＮＴＰペプチド”という表現は、好ましくは以下のＮＴＰのアミノ酸配列：
【００４１】
【表１】
2005506061.tif 000002
【００４２】
及びこれらの具体的に掲載したＮＴＰペプチドの相同体、誘導体、変異体、フラグメント、融合タンパク質、及びペプチドミメティックも含む（これらに限定されない）。
“関連タンパク質”というフレーズは、一つ以上のＮＴＰペプチドと同一、極めて近似、又は相同である一つ以上のアミノ酸配列を含有するタンパク質のことである。
【００４３】
“関連ペプチド”という表現は、関連タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも一部に対応するアミノ酸配列からなるペプチドのことで、そのようなペプチドの相同体、変異体、融合タンパク質、リバースＤペプチド及びペプチドミメティックを含む。“関連ペプチド”という表現は、好ましくは以下の関連タンパク質のアミノ酸配列：
【００４４】
【表２】
2005506061.tif 000003
【００４５】
及びこれらの具体的に掲載した関連ペプチドの相同体、誘導体、変異体、融合タンパク質、及びペプチドミメティックも含む（これらに限定されない）。
“細胞死ペプチド”というフレーズは、細胞死を起こす有効な薬剤であることが証明されている関連タンパク質又は関連ペプチドのことである。
【００４６】
“フラグメント”という用語は、ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質又は関連ペプチドのアミノ酸配列の連続部分配列からなるタンパク質又はポリペプチドのことで、スプライス変異体のような天然のフラグメント及び天然のインビボにおけるプロテアーゼ活性の結果生じたフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、アミノ末端、カルボキシ末端で、及び／又は内部的に（例えば天然スプライシングによって）切断されててもよい。そのようなフラグメントは、アミノ末端のメチオニンを持つようにも持たないようにも製造してもよい。“フラグメント”という用語は、同じＮＴＰタンパク質もしくはＮＴＰペプチド、又は関連タンパク質もしくは関連ペプチド由来のフラグメント（同一でも異なっていても）を含み、共通又は共通でない連続アミノ酸配列が直接的に又はリンカーを介して結合している。
【００４７】
“変異体”という用語は、ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドのアミノ酸配列と比べた場合に、一つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入が存在するタンパク質又はポリペプチドのことで、ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質又は関連ペプチドの天然の対立遺伝子変異体又は選択的スプライス変異体を含む。“変異体”という用語は、ペプチド配列の中の１個以上のアミノ酸の、類似もしくは相同アミノ酸又は非類似アミノ酸（１個又は複数個）による置換を含む。アミノ酸が類似又は相同であるとランクづけできる尺度は数多くある（Ｇｕｎｎａｒ  ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における配列分析），ｐ．１２３−３９（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９８７））。好適な変異体は、１個以上のアミノ酸の位置でのアラニン置換を含む。他の好適な置換は、タンパク質の全体的な実効電荷、極性、又は疎水性にほとんどまたは全く影響を及ぼさない保存的置換を含む。保存的置換を以下の表２に示す。
【００４８】
【表３】
2005506061.tif 000004
【００４９】
表３にアミノ酸置換の別のスキームを示す。
【００５０】
【表４】
2005506061.tif 000005
【００５１】
他の変異体はあまり保存的でないアミノ酸置換からなりうる。例えば、（ａ）置換領域におけるポリペプチド骨格の、例えばシート又はへリックス構造としての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルク、の維持に及ぼす影響がより著しく異なる残基の選択などである。一般的に機能により顕著な影響を及ぼすと考えられる置換は、（ａ）グリシン及び／又はプロリンが別のアミノ酸で置換されている又は欠失又は挿入されている；（ｂ）親水性残基、例えばセリル又はトレオニルが疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、又はアラニルを置換している（又はその逆）；（ｃ）システイン残基が任意の他の置換基を置換している（又はその逆）；（ｄ）電気的に陽性の側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル、又はヒスチジルが電気的に陰性の残基、例えばグルタミル又はアスパルチルを置換している（又はその逆）；又は（ｅ）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンがそのような側鎖を持たない残基、例えばグリシンを置換している（又はその逆）、というような置換である。他の変異体は、新規のグリコシル化及び／又はリン酸化部位を生じるように設計された、又は既存のグリコシル化及び／又はリン酸化部位を削除するように設計されたものを含む。変異体は、グリコシル化部位、タンパク分解的切断部位及び／又はシステイン残基における少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。変異体は、追加のアミノ酸残基をリンカーペプチド上のＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質又は関連ペプチドのアミノ酸配列の前又は後に有するＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質及び関連ペプチドも含む。例えば、関連ペプチドのアミノ及びカルボキシ末端の両方にシステイン残基を加えれば、ジスルフィド結合の形成によって関連ペプチドを環化させることができる。“変異体”という用語には、関連タンパク質又は関連ペプチドの３’又は５’末端のいずれかにフランキングしている少なくとも１個及び２５個以上までの追加のアミノ酸を有する関連タンパク質又は関連ペプチドのアミノ酸配列を有するポリペプチドも包含される。
【００５２】
“誘導体”という用語は、プロセシング及び他の翻訳後修飾のような自然過程によってだけでなく、化学修飾技術によって、例えば１個以上のポリエチレングリコール分子、糖、ホスフェート、及び／又は他のそのような分子を、該分子（１個又は複数個）が野生型の関連タンパク質又は関連ペプチドに自然に結合しない場合、付加させることによって化学的に修飾されている化学修飾タンパク質又はポリペプチドのことを言う。誘導体には塩も含まれる。そのような化学修飾は、基本書及びさらに詳細な研究論文、並びに多数の研究文献によく記述されており、また当業者には周知である。同じ型の修飾が所定のタンパク質又はポリペプチドのいくつかの部位で同程度に又は異なる程度に存在しうることはわかるであろう。また、所定のタンパク質又はポリペプチドが多種の修飾を含有していてもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、及びアミノ又はカルボキシ末端を含め、タンパク質又はポリペプチドのどこでも起こりうる。修飾は、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化とＡＤＰ−リボシル化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡによるアミノ酸のタンパク質への付加、例えばアルギニル化、及びユビキチン化などである。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（タンパク質−−構造及び分子特性）、第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（１９９３）及びＷｏｌｄ，Ｆ．，“Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ（翻訳後タンパク質修飾：観点と展望”、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ    Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（タンパク質の翻訳後共有修飾）のｐ１−１２，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ニューヨーク（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）及びＲａｔｔａｎら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ（タンパク質合成：翻訳後修飾と老化）”，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）参照。“誘導体”という用語には、タンパク質又はポリペプチドが分枝化又は環化（分枝があってもなくても）する化学修飾も含まれる。環状、分枝、及び分枝環状タンパク質又はポリペプチドは、翻訳後の自���過程の結果でありうるが、完全合成法でも製造されうる。
【００５３】
“相同体”という用語は、２個のポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するのに一般的に使用される標準法による測定で、場合にもよるが、ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドとアミノ酸配列が少なくとも６０％同一であるタンパク質のことをいう。２個のタンパク質間の類似性又は同一性の程度は公知法で容易に算出できる。これには、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（数理分子生物学），Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（バイオコンピューティング：情報科学とゲノムプロジェクト），Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（配列データのコンピュータ分析、パートＩ），Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学における配列分析），ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列分析プライマー），Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ  Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性を測定する好適な方法は、調べられる配列間のマッチを最大限にするように設計されている。同一性及び類似性を測定する方法は公的に利用可能なコンピュータプログラムに体系化されている。
【００５４】
二つの配列間の同一性及び類似性を測定するのに有用な好適なコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，及びＦＡＳＴＡ，Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０）を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩ及び他の供給元から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  メリーランド州ベセスダ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））。例えば、ＧＡＰ（ウィスコンシン州マディソン、ウィスコンシン大学、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（遺伝子コンピュータグループ））のようなコンピュータアルゴリズムを用いる場合、パーセント配列同一性を測定する２個のタンパク質又はポリペプチドを、それぞれのアミノ酸の最適なマッチングが得られるように位置合わせ（アラインメント）する（アルゴリズムによる測定で“マッチしたスパン”）。
【００５５】
ギャップ開始ペナルティ（３×平均ダイアゴナルで計算される；“平均ダイアゴナル”は使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；“ダイアゴナル”は特定の比較マトリックスによって各完全アミノ酸に割り当てられたスコア又はナンバーである）及びギャップ伸張ペナルティ（通常ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスがアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（タンパク質配列及び構造のアトラス），ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３［１９７８］参照；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９［１９９２］参照）もアルゴリズムで使用できる。次にパーセント同一性をアルゴリズムで計算する。相同体は典型的には、比較ＮＴＰタンパク質、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質又は関連ペプチドと比べて、場合にもよるが、一つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有することになる。
【００５６】
“ペプチドミメティック”又は“ミメティック”という用語は、ペプチド又はタンパク質の生物活性を模擬するが化学的性質はもはやペプチド性でない、すなわちペプチド結合（すなわちアミノ酸間のアミド結合）をもはや全く含有しない生物活性化合物のことをいう。ここではペプチドミメティックという用語は広い意味で使用し、性質がもはや完全にペプチドでない、偽ペプチド、半ペプチド、及びペプトイドのような分子を含む。この広い意味でのペプチドミメティックの例（ペプチドの一部がペプチド結合を欠く構造によって置換されている場合）を以下に示す。本発明によるペプチドミメティックは、完全に又は部分的に非ペプチドであっても、該ペプチドミメティックが基づいているＮＴＰペプチド、関連タンパク質又は関連ペプチドの活性基の三次元配置と極めて類似した空間的配置を取る反応性化学部分を提供する。活性部位の幾何学がこのように類似している結果、ペプチドミメティックは、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドの生物活性に類似した影響を生物系に及ぼす。
【００５７】
本発明のペプチドミメティックは、好ましくは、三次元的形状と生物活性の両方が、本明細書中に記載のＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドと実質的に類似している。ペプチドミメティックを製造するための当該技術分野で公知のペプチド構造修飾法の例は、骨格のキラル中心の反転によるＤ−アミノ酸残基構造への変換などで、この構造により、特にＮ末端で、活性に悪影響を及ぼすことなくタンパク分解に対する安定性の増大がもたらされうる。一例が、論文“Ｔｒｉｔｉａｔｅｄ  Ｄ−ａｌａ1−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（トリチウム化Ｄ−ａｌａ1−ペプチドＴ結合）”，Ｓｍｉｔｈ  Ｃ．Ｓ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．３７１−３７９（１９８８）に示されている。第二の方法は、安定化のための環状構造の変更、例えばＮ−Ｃ鎖間イミド及びラクタムである（Ｅｄｅら、Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｖｉｅｒ（編）“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ペプチド：化学と生物学）”，Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ（１９９１），ｐｐ．２６８−２７０）。これの一例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｇ．らによる米国特許第４，４５７，４８９号（１９８５）に開示されているようなコンフォメーション的に制約されたチモペンチン様化合物に提供されている。前記特許の開示内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。第三の方法は、関連タンパク質又は関連ペプチドのペプチド結合を、耐タンパク分解性を付与する偽ペプチド結合で置換することである。
【００５８】
一般的にペプチド構造と生物活性に影響を及ぼさないいくつかの偽ペプチド結合が報告されている。このアプローチの一例はレトロ−インバーソ(retro-inverso)偽ペプチド結合を代用することである（“チモペンチンの生物学的に活性なレトロインバーソ類似体(Biologically active retroinverso analogues of thymopentin)”，Ｓｉｓｔｏ  Ａ．ら、Ｒｉｖｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．及びＭａｒｓｈａｌｌ，Ｇ．Ｒ．（編）“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ペプチド、化学、構造及び生物学）”，Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ（１９９０），ｐｐ．７２２−７７３）及びＤａｌｐｏｚｚｏら、（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４１：５６１−５６６、引用によって本明細書に援用する）。この修飾によれば、ペプチドのアミノ酸配列は、前述のＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドの配列と、１個以上のペプチド結合がレトロ−インバーソ偽ペプチド結合で置換された以外は同一であり得る。最もＮ末端のペプチド結合が置換されるのが好ましい。なぜならば、そのような置換は、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク分解に対して耐性を付与するからである。アミノ酸の化学基を類似構造の他の化学基で置換することによってさらに修飾することもできる。生物活性をほとんどないし全く喪失せずに酵素切断に対する安定性を増大させることが知られている別の適切な偽ペプチド結合は、還元型等電子偽ペプチド結合である（Ｃｏｕｄｅｒら（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４１：１８１−１８４、引用によってその全体を本明細書に援用する）。
【００５９】
従って、これらのペプチドのアミノ酸配列は、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドの配列と、１個以上のペプチド結合が等電子偽ペプチド結合で置換された以外は同一であり得る。“アミノ酸配列”という表現は、本明細書では好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸、好ましくは少なくとも４個、更に好ましくは少なくとも５個の配列を示すために使用される。最もＮ末端のペプチド結合が置換されるのが好ましい。なぜならば、そのような置換は、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク分解に対して耐性を付与するからである。１個以上の還元型等電子偽ペプチド結合を有するペプチドの合成は当該技術分野で公知である（Ｃｏｕｄｅｒら（１９９３）、上記）。他の例は、ケトメチレン又はメチルスルフィド結合の導入によるペプチド結合の置換などである。
【００６０】
ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、及び関連ペプチドのペプトイド誘導体も別のクラスのペプチドミメティックで、生物活性に必要な重要な構造決定基は保持しながらもペプチド結合が除去されているため、耐タンパク分解性を有する（Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９３６７−９３７１、引用によってその全体を本明細書に援用する）。ペプトイドはＮ−置換グリシンのオリゴマーである。いくつかのＮ−アルキル基が報告されており、それぞれ天然アミノ酸の側鎖に対応する（Ｓｉｍｏｎら（１９９２）、上記）。ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドの一部又はすべてのアミノ酸が、置換されるアミノ酸に対応するＮ−置換グリシンで置換されてよい。
【００６１】
“ペプチドミメティック”又は“ミメティック”という用語は、以下に定義のリバース−Ｄペプチド及び鏡像異性体も含む。
“リバース−Ｄペプチド”という用語は、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドのＬ−アミノ酸配列と比べて、逆の順に配列されたＤ−アミノ酸からなる生物学的に活性なタンパク質又はペプチドのことをいう。従って、Ｌ−アミノ酸のＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドのカルボキシ末端残基が、Ｄ−アミノ酸ペプチドのアミノ末端になり、以下同様である。例えば、ＮＴＰペプチド、ＳＳＷＤＹは、ＹdＤdＷdＳdＳdになる。Ｄd、Ｓd、Ｗd、及びＹdは、それぞれＬ−アミノ酸のＤ、Ｓ、Ｗ、及びＹに対応するＤ−アミノ酸である。
【００６２】
“鏡像異性体”という用語は、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドのアミノ酸配列中の１個以上のＬ−アミノ酸残基が、対応するＤ−アミノ酸残基で置換されている生物学的に活性なタンパク質又はペプチドのことをいう。
【００６３】
本明細書中に記載のアミノ酸及びアミノ酸残基は、以下の表に示す承認された１文字又は３文字記号に従って表示されうる。
【００６４】
【表５】
2005506061.tif 000006
【００６５】
本発明は、本発明において上で定義したような細胞死ペプチドを含む組成物に関する。好適な細胞死ペプチドは、ＮＴＰペプチドに対して類似又は相同である。しかしながら、関連タンパク質の部分又はフラグメントに基づく他の細胞死ペプチドの使用も本発明に含まれる。例えば、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチド配列及び類似の変異体及び相同体も、様々なヒト及び非ヒトタンパク質（“関連タンパク質”）に見出される。特に、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ遺伝子は、ヒト及び他の霊長類のゲノムの他の遺伝子にも見出されるのと極めて類似したＡｌｕ−型配列を含有する。
【００６６】
従って、すべてとは言わないまでも一部の関連タンパク質も、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰペプチドと相同又は極めて類似したペプチド配列（“関連ペプチド”）を含有するので、細胞死を起こす有効な薬剤であると証明されるだろうと予想するのは理にかなっている。同様に、当業者であれば、細胞死を起こす有効な薬剤であることがわかった任意の関連タンパク質のアミノ酸配列に基づいて特定の関連ペプチドを合成し、細胞死を起こす薬剤としての有効性について、それらを試験することができるだろう。
【００６７】
細胞死を起こす有効な薬剤であることがわかった関連タンパク質から誘導された他のペプチド配列も、細胞死を起こす有効な薬剤であり得る。当業者であれば、過度の実験をせずとも、有効な関連タンパク質の、該タンパク質の全アミノ酸配列にわたるフラグメントを、他の有効なペプチド配列を同定する目的で合成することができる。
【００６８】
一部の関連タンパク質は、ＮＴＰペプチド配列と同一、極めて類似、又は相同のアミノ酸を含有することが知られている以下のタンパク質を含む。
【００６９】
【表６−１】
2005506061.tif 000007
【００７０】
【表６−２】
2005506061.tif 000008
【００７１】
【表６−３】
2005506061.tif 000009
【００７２】
【表６−４】
2005506061.tif 000010
【００７３】
【表６−５】
2005506061.tif 000011
【００７４】
【表６−６】
2005506061.tif 000012
【００７５】
【表６−７】
2005506061.tif 000013
【００７６】
【表６−８】
2005506061.tif 000014
【００７７】
【表６−９】
2005506061.tif 000015
【００７８】
【表６−１０】
2005506061.tif 000016
【００７９】
【表６−１１】
2005506061.tif 000017
【００８０】
【表６−１２】
2005506061.tif 000018
【００８１】
【表６−１３】
2005506061.tif 000019
【００８２】
【表６−１４】
2005506061.tif 000020
【００８３】
【表６−１５】
2005506061.tif 000021
【００８４】
【表６−１６】
2005506061.tif 000022
【００８５】
【表６−１７】
2005506061.tif 000023
【００８６】
【表６−１８】
2005506061.tif 000024
【００８７】
【表６−１９】
2005506061.tif 000025
【００８８】
【表６−２０】
2005506061.tif 000026
【００８９】
【表６−２１】
2005506061.tif 000027
【００９０】
【表６−２２】
2005506061.tif 000028
【００９１】
【表６−２３】
2005506061.tif 000029
【００９２】
【表６−２４】
2005506061.tif 000030
【００９３】
【表６−２５】
2005506061.tif 000031
【００９４】
【表６−２６】
2005506061.tif 000032
【００９５】
【表６−２７】
2005506061.tif 000033
【００９６】
【表６−２８】
2005506061.tif 000034
【００９７】
【表６−２９】
2005506061.tif 000035
【００９８】
【表６−３０】
2005506061.tif 000036
【００９９】
【表６−３１】
2005506061.tif 000037
【０１００】
【表６−３２】
2005506061.tif 000038
【０１０１】
【表６−３３】
2005506061.tif 000039
【０１０２】
【表６−３４】
2005506061.tif 000040
【０１０３】
【表６−３５】
2005506061.tif 000041
【０１０４】
本発明に包含されるＮＴＰペプチド、関連タンパク質、関連ペプチド、及びそれらのフラグメント、変異体、誘導体、相同体及びミメティックは、当業者に公知の方法を用いて製造できる。例えば、組換えＤＮＡ技術、タンパク質合成、そして天然のＮＴＰペプチド、関連タンパク質、関連ペプチド、ならびにそれらのフラグメント、変異体、誘導体、及び相同体の単離などの方法である。
【０１０５】
ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドは、周知の組換えＤＮＡ技術による方法を用いて製造できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，コールドスプリングハーバー、ニューヨーク［１９８９］）及び／又はＡｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学におけるカレントプロトコル），Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク［１９９４］に記載されているような方法である。
【０１０６】
ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドをコードする遺伝子又はｃＤＮＡは、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、又はＰＣＲ増幅によって得ることができる。ライブラリーのスクリーニングに有用なプローブ又はプライマーは、例えば他の関連タンパク質に見出される保存モチーフのような、同じ又は関連ファミリーの遺伝子由来の他の公知遺伝子又は遺伝子フラグメントに関する配列情報に基づいて作ることができる。また、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドをコードしている遺伝子が一つの種から確認されている場合、その遺伝子の全部又は一部をプローブとして使用して他の種由来の相同遺伝子を確認することができる。該プローブ又はプライマーは、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドの遺伝子を発現すると考えられる様々な組織源由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いてもよい。典型的には高度にストリンジェントな条件をスクリーニングに適用し、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小限にする。
【０１０７】
ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドをコードする遺伝子を調製する別の手段は、専門家に周知の、例えばＥｎｇｅｌｓらが報告しているような方法（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７３４［１９８９］）を用いる化学合成法の使用である。これらの方法に含まれるのは、とりわけ、核酸合成のためのホスホトリエステル法、ホスホロアミダイト法、及びＨ−ホスホネート法である。そのような化学合成に好適な方法は、標準的ホスホロアミダイト化学を用い、ポリマーを支持体とする合成法である。典型的には、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドをコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチドの長さになるであろう。約１００ヌクレオチドを超える核酸はこれらの方法を用いるといくつかのフラグメントとして合成できる。次に該フラグメントを一緒に繋げば、全長のＮＴＰペプチド、関連タンパク質、又は関連ペプチドが作製できる。通常、タンパク質のアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントはメチオニン残基をコードするＡＴＧを持つ。このメチオニンは、宿主細胞で産生されるタンパク質が該細胞から分泌されるように設計されているかどうかによって、成熟形の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドに存在してもしなくてもよい。
【０１０８】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードする遺伝子、ｃＤＮＡ、又はそのフラグメントは、標準の連結技術を用いて適当な発現又は増幅ベクターに挿入することができる。ベクターは典型的には用いられる特定の宿主細胞で機能を発揮するように選ばれる（すなわち、ベクターは宿主細胞の機構に適合し、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現を起こすことができる）。関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードする遺伝子、ｃＤＮＡ、又はそのフラグメントは、原核宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞（バキュロウィルス系）及び／又は真核宿主細胞で増幅／発現されうる。宿主細胞の選択は、一部は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドがグリコシル化及び／又はリン酸化されるかどうかによって決まるであろう。その場合、酵母、昆虫、又は哺乳動物の宿主細胞が好ましい。
【０１０９】
典型的には、いずれかの宿主細胞で使用されるベクターは、５’フランキング配列（プロモーターとも言われる）と他の調節エレメントを含有する。例えば、エンハンサー、複製起点エレメント、転写終結エレメント、供与及び受容スプライス部位を含有する完全イントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位エレメント、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択マーカーエレメントなどである。これらの各エレメントは以下で説明する。場合により、ベクターはタグ配列、すなわち、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードする配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有することもある。該オリゴヌクレオチド分子は、ポリＨｉｓ（例えばヘキサＨｉｓ）、又はＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウィルス）もしくはｍｙｃ（これらに対する抗体は市販されている）のような他のタグをコードする。このタグは、通常、ポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの宿主細胞からのアフィニティー精製の手段としての役割を果たすことができる。アフィニティー精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして用いるカラムクロマトグラフィーによって達成できる。場合により、タグはその後、精製された関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドから、ある種のペプチダーゼを用いるような様々な手段によって除去することができる。
【０１１０】
ヒト免疫グロブリンのヒンジ部とＦｃ領域は、当業者であれば、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに融合させることができる。その結果のＦｃ−融合タンパク質は、プロテインＡのアフィニティーカラムを用いて精製できる。Ｆｃはインビボでの薬物動態的半減期が長いことが知られているので、Ｆｃに融合したタンパク質は、融合していないものよりインビボでの半減期が実質的に長くなることがわかっている。また、Ｆｃ領域への融合は、一部の分子の生物活性にとって有用となりうる分子の二量体化／多量体化を可能にする。
【０１１１】
５’フランキング配列は、同種（すなわち宿主細胞と同じ種／株由来）、異種（すなわち宿主細胞の種又は株以外の種由来）、ハイブリッド（１より多い供給源由来の５’フランキング配列の組合せ）、合成であっても、又は天然の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチド遺伝子の５’フランキング配列であってもよい。従って、５’フランキング配列の供給源は、５’フランキング配列が宿主細胞の機構の中で機能的であり、該機構によって活性化されうるならば、いずれの単細胞原核又は真核生物、いずれの脊椎又は無脊椎動物、あるいはいずれの植物であってもよい。
【０１１２】
本発明のベクターに有用な５’フランキング配列は、当該技術分野で周知のいくつかの方法のいずれかから得てもよい。典型的には、本発明で有用な、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチド遺伝子のフランキング配列以外の５’フランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって予め確認されているだろうから、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織源から単離することができる。場合によっては、５’フランキング配列の全ヌクレオチド配列がわかっていることもある。ここでは、５’フランキング配列は、核酸合成又はクローニングで前述した方法を用いて合成されうる。
【０１１３】
５’フランキング配列のすべて又は一部のみがわかっている場合、５’フランキング配列は、ＰＣＲを用いて及び／又は適切なオリゴヌクレオチド及び／又は同種又は別種由来の５’フランキング配列のフラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。
【０１１４】
５’フランキング配列が不明の場合、５’フランキング配列を含有するＤＮＡのフラグメントを、例えばコード配列又は別の遺伝子もしくは複数の遺伝子までも含有していてもよい大きなＤＮＡ断片から単離すればよい。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを単離するために注意深く選んだ一つ以上の酵素を用いて、制限エンドヌクレアーゼ消化によって達成できる。消化後、所望のフラグメントは、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラム又は当業者に公知の他の方法によって単離できる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は当業者には容易にわかるであろう。
【０１１５】
複製起点エレメントは、典型的には市販されている原核発現ベクターの一部であり、宿主細胞におけるベクターの増幅に役割を果たす。ベクターをあるコピー数に増幅することは、場合によっては関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの最適発現のために重要であり得る。選択したベクターが複製起点部位を含有していなければ、公知配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに連結すればよい。転写終結エレメントは、典型的には関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードする配列の３’末端に位置し、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの転写を終結させる役割を果たしている。通常、原核細胞中の転写終結エレメントは、ポリＴ配列がその後に続くＧ−Ｃに富むフラグメントである。エレメントは、ライブラリーからクローン化しても、ベクターの一部として市販品を購入してもよいが、前述のような核酸合成法を用いて容易に合成することもできる。
【０１１６】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択的培地で成長した宿主細胞の生存及び成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に抗生物質又は他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、又はカナマイシンに対する耐性を付与する、（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏を補完する、又は（ｃ）複合培地からは得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好適な選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。
【０１１７】
一般的にシャイン・ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）と呼ばれているリボソーム結合エレメントは、通常ｍＲＮＡの翻訳開始に必要である。該エレメントは典型的には、プロモーターの３’側、及び合成される関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドのコード配列の５’側に位置する。シャイン・ダルガーノ配列は多様であるが、典型的にはポリプリン（すなわちＡ−Ｇの含有量が高い）である。多くのシャイン・ダルガーノ配列は同定されており、それぞれは当業者によって本明細書中に記載の方法を用いて容易に合成でき、原核ベクターに使用できる。
【０１１８】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドが宿主細胞から分泌されるのが望ましい場合、シグナル配列を用いて、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを、それが合成される宿主細胞の外に出るように誘導することができる。そして、タンパク質のカルボキシ末端部分を削除し、膜に係留されないようにすればよい。典型的には、シグナル配列は、関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子又はｃＤＮＡのコード領域に、又は関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子のコード領域の５’末端に直接位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択した宿主細胞で機能的なシグナル配列はいずれも、関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子又はｃＤＮＡと共に使用できる。従って、シグナル配列は関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子又はｃＤＮＡに対して同種又は異種であってよく、関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子又はｃＤＮＡに対して同種又は異種であってよい。さらに、シグナル配列は前述の方法を用いて化学合成することもできる。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在を介しての宿主細胞からのポリペプチドの分泌は、該ポリペプチドからアミノ末端のメチオニンを除去する結果になるだろう。
【０１１９】
多くの場合、関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子又はｃＤＮＡの転写は、ベクターに１個以上のイントロンが存在することによって増大しうる。このことは、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドが真核宿主細胞、特に哺乳動物の宿主細胞で産生される場合、特にそうである。使用されるイントロンは、関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子内に天然に存在しうる。特に、使用される遺伝子が全長ゲノム配列又はそのフラグメントの場合はそうである。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない場合（ほとんどのｃＤＮＡの場合）、イントロンは別の供給源から得ることができる。フランキング配列及び関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子に対するイントロンの位置は、イントロンが有効であるように転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、発現ベクターに挿入された関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドの遺伝子がｃＤＮＡ分子の場合、イントロンの好適な位置は、転写開始部位の３’側、及びポリＡ転写終結配列の５’側である。好ましくは、関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドのｃＤＮＡの場合、イントロン（１個又は複数個）は、ｃＤＮＡの一方の側又は他方の側（すなわち５’又は３’）に位置しているのでこのコード配列を妨害しない。いかなるウィルス、原核及び真核生物（植物又は動物）を含む、いかなる供給源のいかなるイントロンも、それが挿入される宿主細胞と適合する限り、本発明の実施に使用できる。また合成イントロンも本発明に包含される。場合により、１より多くのイントロンがベクターに使用されうる。
【０１２０】
使用されるベクターに前述のエレメントの一つ以上がまだ存在していない場合、それらを個々に得てベクターに連結することができる。各エレメントを得るのに使用される方法は当業者に周知であり、そして前述の方法とほぼ同等である（すなわち、ＤＮＡの合成、ライブラリースクリーニングなど）。
【０１２１】
本発明の実施に使用される最終ベクターは、典型的には、市販のベクターのような出発ベクターから構築される。そのようなベクターは、完成したベクターに包含されるべきエレメントの一部を含んでいてもいなくてもよい。出発ベクターに所望のエレメントが全く存在しない場合、各エレメントを個々にベクターに連結すればよい。その方法は、ベクターを適当な制限エンドヌクレアーゼで切断し、連結されるエレメントの末端とベクターの末端とが連結に適合するようにする。場合によっては、十分な連結を得るために、一緒に連結される末端を平滑化するのが必要なこともある。平滑化は、クレノウＤＮＡポリメラーゼ又はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用い、全４種類のヌクレオチドの存在下で、“付着末端”をまず補充することによって達成される。この方法は当該技術分野では周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載されている。あるいは、ベクターに挿入される二つ以上のエレメントを最初に一緒に連結し（互いに隣接して配置されることになる場合）、それからベクターに連結することもできる。
【０１２２】
ベクターを構築する別の方法は、各種エレメントのすべての連結を一つの反応混合物中で同時に実施することである。この場合、エレメントの不適切な連結や挿入のために、無意味な又は機能しない多くのベクターが生じることになろう。しかしながら、機能するベクターは、制限エンドヌクレアーゼ消化によって同定及び選択することができる。
【０１２３】
本発明の実施に好適なベクターは、細菌、昆虫、及び哺乳動物の宿主細胞と適合性のあるものである。そのようなベクターは、とりわけ、ｐＣＲII、ｐＣＲ３、及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、カリフォルニア州サンジエゴ）、ｐＢＳ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）、ＰＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃII；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）などである。
【０１２４】
ベクターが構築され、全長の又は切断された関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードする核酸分子がベクターの適正な部位に挿入されたら、完成したベクターを増幅及び／又はポリペプチド発現のために適切な宿主細胞に挿入できる。宿主細胞は、原核宿主細胞（例えば大腸菌E. coli）又は真核宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、又は脊椎動物細胞）であってよい。宿主細胞は適当な条件下で培養されると、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを合成できるので、次にそれを培地から採集するか（宿主細胞がそれを培地に分泌する場合）、又はそれを産生している宿主細胞から直接採集すればよい（分泌されない場合）。
【０１２５】
採集後、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの方法を用いて精製できる。関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの産生にふさわしい宿主細胞の選択は、一部は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドがグリコシル化されるのか又はリン酸化されるのか（この場合は真核宿主細胞が好ましい）ということと、生物活性を有する関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドによって生物学的に活性なタンパク質が製造されるように、宿主細胞がタンパク質をその天然の三次構造（例えばジスルフィド結合の正しい配向など）に折りたたむことができるやり方によるであろう。関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、合成後、以下に記載するような適当な化学条件を用いて折りたたむことができる。本発明に有用な適切な細胞又は細胞系は、哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎性腎（ＨＥＫ）２９３もしくは２９３Ｔ細胞、又は３Ｔ３細胞、を含む。適切な哺乳動物宿主細胞の選択及び形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物産生、並びに精製の各方法は、当業者であれば本明細書中に提供したガイドラインを用いて達成できる。他の適切な哺乳動物細胞系は、サルＣＯＳ−１及びＣＯＳ−７細胞系、並びにＣＶ−１細胞系を含む。哺乳動物宿主細胞の更なる例は、霊長類細胞系及び齧歯類細胞系で形質転換細胞系も含む。正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養物由来の細胞株、並びに一次外植片も適切である。候補の細胞は、選択遺伝子に遺伝子型的欠陥があっても、又は優性に作用する選択遺伝子を含有していてもよい。他の適切な哺乳動物細胞系は、マウス神経芽細胞種Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウス由来の３Ｔ３系、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞系を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
本発明に適切な宿主細胞として同様に有用なのは細菌細胞である。例えば、大腸菌の様々な株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５．α．、ＤＨ１０、及びＭＣ１０６１）は、宿主細胞としてバイオテクノロジーの分野でよく知られている。様々な系統の枯草菌(B.subtilis)、シュードモナス属(Pseudomonas spp.)、他のバシラス属(Bacillus spp.)、ストレプトミセス属(Streptomyces spp.)なども本方法に使用してもよい。当業者に公知の多くの系統の酵母細胞も、本発明のポリペプチドの発現用宿主細胞として利用できる。
【０１２７】
さらに、所望であれば、昆虫細胞系も本発明の方法に利用してもよい。そのような系は、例えばＫｉｔｔｓら、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−８１７［１９９３］）、Ｌｕｃｋｌｏｗ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−５７２［１９９３］）及びＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９［１９９３］）に記載されている。好適な昆虫細胞はＳｆ−９及びＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）である。
【０１２８】
ベクターの選択された宿主細胞への挿入（形質転換又はトランスフェクションとも言われる）は、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、又はＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を用いて達成できる。選択される方法は、一部は使用される宿主細胞の種類によって決まることになろう。これらの方法及び他の適切な方法は当業者に周知であり、例えば上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる文献に記載されている。
【０１２９】
ベクターを含有する（すなわち形質転換又はトランスフェクトされた）宿主細胞は、当業者に周知の標準培地を用いて培養してもよい。培地は通常、細胞の成長と生存に必要なすべての栄養素を含有している。大腸菌の培養に適切な培地は、例えばルリアブロス（Luria Broth, ＬＢ）及び／又はテリフィックブロス（Terrific Broth, ＴＢ）である。真核細胞の培養に適切な培地は、ＲＰＭＩ  １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭで、いずれも培養されている特定の細胞系の必要に応じて血清及び／又は成長因子を補充してもよい。昆虫培養に適切な培地は、必要に応じてイーストレート（yeastolate）、ラクトアルブミン加水分解物(lactalbumin hydrolysate)、及び／又はウシ胎仔血清を補充したグレースの(Grace's)培地である。典型的には、形質転換細胞のみの選択的成長に有用な抗生物質又は他の化合物をサプリメントとして培地に加える。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換を受けたプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントによって決定されることになろう。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性の場合、培地に添加される化合物はカナマイシンになる。
【０１３０】
宿主細胞で産生される関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの量は、当該技術分野で公知の標準法を用いて評価できる。そのような方法は、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、質量分析、免疫沈降法、及び／又はＤＮＡ結合ゲルシフト法のような活性アッセイを含むが、これらに限定されない。
【０１３１】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計されている場合、大部分の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは細胞培養の培地に見出すことができる。このようにして製造されたタンパク質は通常アミノ末端のメチオニンを持たない。細胞から分泌されるときに除去されるからである。しかしながら、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、細胞質及び／又は細胞核内（真核宿主細胞の場合）、又はサイトゾル内（グラム陰性菌の宿主細胞の場合）に存在することになり、アミノ末端のメチオニンを有しうる。
【０１３２】
宿主細胞の細胞質及び／又は細胞核内にある関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドについては、典型的には、まず宿主細胞を機械的に又は洗剤で破壊し細胞内の内容物を緩衝溶液中に放出させる。その後、この溶液から関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを単離することができる。
【０１３３】
溶液からの関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの精製は各種の技術を用いて達成できる。タンパク質が、ヘキサヒスチジン（例えばＮＴＰペプチド／ヘキサＨｉｓ）又はＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｔｃｈ、セントルイス、ＭＩ）もしくはカルモジュリン結合ペプチド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）のような他の小ペプチドのようなタグをカルボキシル又はアミノ末端のいずれかに含有するように合成されている場合、溶液をアフィニティーカラムに通すことによりワンステッププロセスで本質的に精製できる。アフィニティーカラムは、カラムマトリックスがタグに対して又は直接タンパク質に対して（すなわち関連タンパク質又は関連ペプチドを特異的に認識するモノクロナール抗体）高親和性を有しているカラムである。例えば、ポリヒスチジンは、ニッケル、亜鉛及びコバルトに非常に親和的かつ特異的に結合する。従って、ニッケルベースのアフィニティー樹脂（ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＸｐｒｅｓｓ  Ｓｙｓｔｅｍに使用されている）又はコバルトベースのアフィニティー樹脂（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ−ＣＬＯＮＴＥＣＨのＴａｌｏｎ  ｓｙｓｔｅｍに使用されている）を採用している固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーを使用すれば、関連タンパク質／ポリＨｉｓの精製ができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １０．１１．８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク［１９９３］参照）。
【０１３４】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドがタグを結合せずに製造され、利用できる抗体もない場合、他の周知の精製法が使用できる。そのような方法は、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ゲル溶離と組み合わせた非変性ゲル電気泳動、及び分取用等電点電気泳動（Ｉｓｏｐｒｉｍｅ  ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むが、これらに限定されない。場合により、これらの二つ以上の技術を組み合わせることで純度向上を達成できることもある。
【０１３５】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドが主として細胞内に見出されると考えられる場合、細胞内物質（グラム陰性菌の場合の封入体も含む）は、当業者に公知の任意の標準技術を用いて宿主細胞から抽出できる。例えば、宿主細胞を、フレンチプレス、ホモジナイズ、及び／又は超音波処理とその後の遠心分離によって溶解し、ペリプラズム／細胞質の内容物を放出させればよい。関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドがサイトゾル内で封入体を形成している場合、該封入体は内側及び／又は外側の細胞膜に結合できることが多いので、主として遠心分離後のペレット物質中に見出されるであろう。次に、該ペレット物質を、両極端のｐＨで、又はアルカリ性ｐＨのジチオトレイトールもしくは酸性ｐＨのトリスカルボキシエチルホスフィンのような還元剤の存在下、洗剤、グアニジン、グアニジン誘導体類、尿素、又は尿素誘導体類のようなカオトロピック剤で処理すると、封入体を放出、分断、及び可溶化することができる。次に、可溶性の形態になった関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降法などを用いて分析できる。関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの単離が所望であれば、単離は、以下及びＭａｒｓｔｏｎら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５［１９９０］）に記載のような標準法を用いて達成できる。
【０１３６】
場合によって、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドが単離時に生物学的に活性でないことがありうる。ポリペプチドをその三次構造にリフォールディング又は変換し、そしてジスルフィド結合を生じさせる、種々の方法を使用すれば、生物活性を回復させることができる。そのような方法は、可溶化ポリペプチドを、特定濃度のカオトロープの存在下、通常７を超えるｐＨに暴露することを含む。カオトロープの選択は、封入体の可溶化に使用した選択とほとんど同じであるが、通常はそれより低い濃度で、また必ずしも可溶化に使用したのと同じカオトロープでなくてもよい。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液も、還元剤又は還元剤とある特定比のその酸化形を含有することで、ある特別の酸化還元（レドックス）電位を生じ、タンパク質のシステインブリッジ形成時にジスルフィドのシャッフリングが起こることが可能になるであろう。よく使用されるレドックスカップルをいくつか挙げると、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が含まれる。多くの場合、リフォールディングの効率を上げるために共溶媒が必要であり、この目的のためによく使用される試薬は、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、及びアルギニンを含む。
【０１３７】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの封入体が宿主細胞にほとんど形成されていない場合、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、主として細胞ホモジネートの遠心後の上清中に見出されうる。該関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、上清から以下に記載のような方法を用いて単離できる。
【０１３８】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの部分又は完全単離が好ましい状況においては、精製は当業者に周知の標準法を用いて達成できる。そのような方法は、電気泳動による分離とその後のエレクトロエルーション、各種クロマトグラフィー（免疫アフィニティー、分子ふるい、及び／又はイオン交換）、及び／又は高速液体クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない。場合により、完全な精製のためにこれらの方法を二つ以上使用するのが好ましいこともある。
【０１３９】
組換えＤＮＡ技術を用いる関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの調製及び精製法のほか、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチド、ならびにそれらのフラグメント、変異体、相同体及び誘導体は、当該技術分野で公知の技術を用いる化学合成法（例えば固相ペプチド合成）によって製造することもできる。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９［１９６３］）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２［１９８５］）、及びＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（固相ペプチド合成），Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，イリノイ州ロックフォード［１９８４］）に記載のような技術である。そのようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを持つようにも持たないようにも合成してもよい。化学合成された関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、これらの文献に記載の方法を用いて酸化され、ジスルフィド結合を形成することができる。該関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、組換え製造された又は天然源から精製された関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドに匹敵する生物活性を有すると考えられるので、組換え又は天然関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドと互換的に使用できる。
【０１４０】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドがポリマーに連結されている化学修飾された関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチド組成物も、本発明の範囲に包含される。選択されるポリマーは、ポリマーが結合しているタンパク質が生理的環境のような水性環境中で沈殿しないように、典型的には水溶性である。選択されるポリマーは、通常１個の反応基、例えばアシル化のための活性エステル又はアルキル化のためのアルデヒドを有するように修飾されているため、本方法で提供されているように重合度が制御できる。ポリマーはいかなる分子量のものであってもよく、また枝分かれしていてもいなくてもよい。関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドポリマーの範囲にはポリマーの混合物を含む。
【０１４１】
場合によっては、天然の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの核酸及び／又はアミノ酸変異体を調製するのが望ましいこともある。核酸変異体は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ増幅、又は他の適切な方法を用いて製造できる。その場合、プライマーは所望の点変異を有する（突然変異誘発技術の解説については上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、及び上記Ａｕｓｕｂｅｌら参照）。Ｅｎｇｅｌｓら（上記）による方法を用いる化学合成を利用してもそのような変異体が製造できる。当業者に公知の他の方法も同様に使用できる。
【０１４２】
好適な核酸変異体は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの産生に使用される宿主細胞においてコドン選択（codon preference）に関わるヌクレオチド置換を含有するものである。そのようなコドンの最適化は、ウィスコンシン州マディソン、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０によって提供されているような、高度に発現された細菌遺伝子のコドン選択についてのＥｃｏｈｉｇｈ．Ｃｏｄのようなコドン頻度表を組み込んだコンピュータアルゴリズムによって決定できる。他の有用なコドン頻度表は、Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ、Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ、Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ、Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ、及びＹｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄを含む。他の好適な変異体は、野生型と比較して前述のように保存的アミノ酸変化（例えば、天然アミノ酸側鎖の電荷又は極性が、異なるアミノ酸の置換によって実質的に変化しない）をコードするもの、及び／又は新規のグリコシル化及び／又はリン酸化部位を生じるように設計されたもの、又は既存のグリコシル化及び／又はリン酸化部位を削除するように設計されたものである。
【０１４３】
関連タンパク質、関連ペプチド、ＮＴＰペプチド、そのフラグメント、相同体、変異体、誘導体及び塩は、当業者に公知の従来のペプチド合成技術を用いて製造することもできる。これらの技術は、化学カップリング法（Ｗｕｎｓｃｈ，Ｅ：“Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ（有機化学の方法）”，Ｖｏｌｕｍｅ  １５，Ｂａｎｄ  １＋２，Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｖｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｎ，ｔｈｉｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，シュトゥットガルト（１９７４）、及びＢａｒｒａｎｙ，Ｇ．；Ｍａｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．：“Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ペプチド）”、編者Ｅ．Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｐｐ．１−２８４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８０）参照）、酵素カップリング法（Ｗｉｄｍｅｒ，Ｆ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．，Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．４４，ｐｐ．３７−４６（１９７９）、及びＫｕｌｌｍａｎｎ，Ｗ．：“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（酵素的ペプチド合成）”，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．フロリダ州ボーカラトーン（１９８７）、及びＷｉｄｍｅｒ，Ｆ．，Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｊ．Ｔ．“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ（生物学及び医学における合成ペプチド）”、編者Ａｌｉｔａｌｏ，Ｋ．，Ｐａｒｔａｎｅｎ，Ｐ．，Ｖａｔｉｅｒｉ，Ａ．，ｐｐ７９−８６，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，アムステルダム（１９８５）参照）、又は化学及び酵素法の組合せ（これがプロセス設計及び経済にとって好都合な場合）などである。本明細書中に提供したガイドラインを用いて、当業者は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドのペプチド配列を変えて、もとの又は天然の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドと同じ又は類似の生物活性を有する相同体を製造することができる。
【０１４４】
所定の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドのタンパク質自体よりミメティックを使用する方が好都合であり得る。一般に、ペプチドミメティックの方が生体内利用性が高く、作用期間が長く、そしてタンパク質やペプチドよりも安価に製造できる。
【０１４５】
従って、前述の関連タンパク質、関連ペプチド及びＮＴＰペプチドは、類似の生物活性を有する、ひいては類似の治療的有用性を有するそのような小化合物の開発に有用性がある。関連タンパク質、関連ペプチド及びＮＴＰペプチドのペプチドミメティックスは、コンビナトリアルケミストリー技術及び当該技術分野で公知の他の技術を用いて開発できる（例えば、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０ｔｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（第２０回欧州ペプチドシンポジウム会報）、編者Ｇ．Ｊｕｎｇ，Ｅ．Ｂａｙｅｒ，ｐｐ２８９−３３６及びそれに収載されている参考文献参照）。
【０１４６】
ペプチドミメティックを製造するための当該技術分野で知られているペプチドの構造修飾法の例は、骨格のキラル中心の反転によるＤ−アミノ酸残基構造への変換などである。この構造は、活性に悪影響を及ぼすことなく特にＮ末端でのタンパク質分解に対する安定性を増大させうる。一例が、論文“Ｔｒｉｔｉａｔｅｄ  Ｄ−ａｌａ1−Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔ  Ｂｉｎｄｉｎｇ（トリチウム化Ｄ−ａｌａ1−ペプチドＴ結合）”，Ｓｍｉｔｈ  Ｃ．Ｓ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓ．，１５，ｐｐ．３７１−３７９（１９８８）に記載されている。
【０１４７】
第二の方法は、安定化のための環状構造の変更、例えばＮ−Ｃ鎖間イミド及びラクタムである（Ｅｄｅら、Ｓｍｉｔｈ及びＲｉｖｉｅｒ（編）“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ペプチド：化学と生物学）”，Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ（１９９１），ｐｐ．２６８−２７０）。これの一例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，Ｇ．らによる米国特許第４，４５７，４８９号（１９８５）に開示されているようなコンフォメーション的に制約されたチモペンチン様化合物に提供されている。前記特許の開示内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。
【０１４８】
第三の方法は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドのペプチド結合を、耐タンパク分解性を付与する偽ペプチド結合で置換することである。一般的にペプチド構造と生物活性に影響を及ぼさないいくつかの偽ペプチド結合が報告されている。このアプローチの一例はレトロ−インバーソ(retro-inverso)偽ペプチド結合を代用することである（“チモペンチンの生物学的に活性なレトロインバーソ類似体(Biologically active retroinverso analogues of thymopentin)”，Ｓｉｓｔｏ  Ａ．ら、Ｒｉｖｉｅｒ，Ｊ．Ｅ．及びＭａｒｓｈａｌｌ，Ｇ．Ｒ．（編）“Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ペプチド、化学、構造及び生物学）”，Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ（１９９０），ｐｐ．７２２−７７３）及びＤａｌｐｏｚｚｏら、（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４１：５６１−５６６、引用によって本明細書に援用する）。この修飾によれば、ペプチドのアミノ酸配列は、前述の関連タンパク質、関連ペプチド及びＮＴＰペプチドの配列と、１個以上のペプチド結合がレトロ−インバーソ偽ペプチド結合で置換された以外は同一であり得る。最もＮ末端のペプチド結合が置換されるのが好ましい。なぜならば、そのような置換は、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク分解に対して耐性を付与するからである。
【０１４９】
１個以上の還元型レトロ−インバーソ偽ペプチド結合を有するペプチドの合成は当該技術分野で知られている（Ｓｉｓｔｏ（１９９０）及びＤａｌｐｏｚｚｏら（１９９３）、上記）。このように、ペプチド結合は非ペプチド結合で置き換えることができ、それによってペプチドミメティックが元のペプチドと類似の構造、従って生物活性を取ることが可能になる。アミノ酸の化学基を類似構造の他の化学基で置換することによってさらに修飾することもできる。生物活性をほとんどないし全く喪失せずに酵素切断に対する安定性を増大させることが知られている別の適切な偽ペプチド結合は、還元型等電子偽ペプチド結合である（Ｃｏｕｄｅｒら（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，４１：１８１−１８４、引用によってその全体を本明細書に援用する）。従って、これらのペプチドのアミノ酸配列は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの配列と、１個以上のペプチド結合が等電子偽ペプチド結合で置換された以外は同一であり得る。最もＮ末端のペプチド結合が置換されるのが好ましい。なぜならば、そのような置換は、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク分解に対して耐性を付与するからである。１個以上の還元型等電子偽ペプチド結合を有するペプチドの合成は当該技術分野で公知である（Ｃｏｕｄｅｒら（１９９３）、上記）。他の例は、ケトメチレン又はメチルスルフィド結合の導入によるペプチド結合の置換を含む。
【０１５０】
関連タンパク質、関連ペプチド及びＮＴＰペプチドのペプトイド誘導体も別のクラスのペプチドミメティックで、生物活性に必要な重要な構造決定基は保持しながらもペプチド結合が除去されているため、耐タンパク分解性を有する（Ｓｉｍｏｎら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：９３６７−９３７１、引用によってその全体を本明細書に援用する）。ペプトイドはＮ−置換グリシンのオリゴマーである。いくつかのＮ−アルキル基が報告されており、それぞれ天然アミノ酸の側鎖に対応する（Ｓｉｍｏｎら（１９９２）、上記、引用によってその全体を本明細書に援用する）。関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの一部又はすべてのアミノ酸が、置換されるアミノ酸に対応するＮ−置換グリシンで置換されている。
【０１５１】
ペプチドミメティックの開発は、元の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの三次構造を、ＮＭＲ分光法、結晶学及び／又はコンピュータ支援分子モデリングによって決定することによって支援することができる。これらの技術は、元のペプチドより高い効力及び／又は高い生体内利用性及び／又は高い安定性を有する新規組成物の開発に役立つ（Ｄｅａｎ（１９９４）、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１６：６８３−６８７；Ｃｏｈｅｎ及びＳｈａｔｚｍｉｌｌｅｒ（１９９３），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．，１１：１６６−１７３；Ｗｉｌｅｙ及びＲｉｃｈ（１９９３），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，１３：３２７−３８４；Ｍｏｏｒｅ（１９９４），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，１５：１２４−１２９；Ｈｒｕｂｙ（１９９３），Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，３３：１０７３−１０８２；Ｂｕｇｇら（１９９３），Ｓｃｉ．Ａｍ．，２６９：９２−９８、いずれも引用によってその全体を本明細書に援用する）。
【０１５２】
可能性あるペプチドミメティックが同定されたら、合成し、以下の実施例に概要を記載した方法を用いて検定してその活性を評価することができる。上記方法によって得られ、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの生物活性と類似の三次元構造を有するペプチドミメティック化合物は本発明に包含される。当業者であれば、ペプチドミメティックは、前述の一つ以上の修飾を有する任意の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドから作製できることは容易に理解されよう。また、本発明のペプチドミメティックスは、治療用化合物としての用途のほかに、さらに強力な非ペプチド化合物の開発にも利用できることは理解されよう。
【０１５３】
本明細書中に記載の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを合成できる機関が今日いくつかある。例えば、ＮＴＰペプチドの配列が与えられると、そのような機関で該ペプチドを合成し、合成したペプチドを文書とペプチドの同定証明書を添付して発送してくれる。
【０１５４】
本発明は、関連タンパク質、関連ペプチド及びＮＴＰペプチド、並びにそれらの対応核酸分子を、関連タンパク質、関連ペプチド、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドのＤＮＡ又は対応するＲＮＡが哺乳動物の組織又は体液試料中に存在するかどうかを定性的に又は定量的に試験するアッセイに使用することも包含する。関連タンパク質、関連ペプチド、ＮＴＰペプチド、及びそれらの対応核酸分子は、そのようなアッセイで、関連タンパク質、関連ペプチドもしくはＮＴＰペプチド又はコードされた関連タンパク質、関連ペプチドもしくはＮＴＰペプチドが生物活性を示すかどうかの標品に利用できる。関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの核酸配列は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドのＤＮＡ又は対応するＲＮＡが哺乳動物の組織又は体液試料中に存在するかどうかを定性的に又は定量的に試験する有用なハイブリダイゼーション用プローブの供給源となり得る。
【０１５５】
それ自体生物学的に活性でない関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを認識及び／又は結合する抗体の製造に有用であり得る。そのような抗体は標準法を用いて製造できる。従って、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドと反応する抗体、並びに短鎖の抗体フラグメント及びそのような抗体の他の反応性フラグメントも本発明の範囲内に含まれると考える。抗体は、ポリクロナール、モノクロナール、組換え、キメラ、一本鎖及び／又は二重特異性抗体でありうる。典型的には、該抗体又はそのフラグメントは、ヒト由来であるか又はヒト化されることになろう。すなわち、患者に投与した場合に該抗体に対する免疫反応を防止又は最小限にするように調製される。好適な抗体は、ポリクロナール又はモノクロナールのヒト抗体である。抗体フラグメントは、本発明の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドと反応する任意のフラグメント、例えばＦab、Ｆab'、などである。また、本発明は、いずれかの関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを選択された哺乳動物に対して抗原として提示し、次いで公知技術によって哺乳動物の細胞（例えば脾臓細胞）をある種のがん細胞と融合して不死化細胞系を製造することによって作製したハイブリドーマも提供する。そのような細胞系及びすべて又は一部の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドに対する抗体の作製に使用する方法も本発明に包含される。
【０１５６】
該抗体はさらに、インビボ及びインビトロにおける診断又は研究目的で使用することもできる。例えば、標識した形態を用いて体液又は細胞試料中の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの存在を検出する。
【０１５７】
本発明はまた、１個以上の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを、関連タンパク質、関連ペプチド、ＮＴＰペプチド、関連タンパク質／関連ペプチド／ＮＴＰペプチドのＤＮＡ又は対応するＲＮＡが哺乳動物の組織又は体液試料中に存在するかどうかを定性的に又は定量的に試験するアッセイの較正標準として使用することも包含する。
【０１５８】
本発明は、細胞の除去を必要とする状態、例えば良性及び悪性腫瘍、腺（例えば前立腺）過形成、不要な顔毛、いぼ、及び不要な脂肪組織の新規治療法に関する。そのような方法は、その必要のある哺乳動物に、治療上有効量の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを投与することを含む。
【０１５９】
該状態は、例えば、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳及びその外皮、脊髄及びその外皮、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、脳下垂体、生殖器官、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、リンパ節及びリンパ系、並びに他の器官の腫瘍であり得る。
【０１６０】
本明細書中で使用している“悪性腫瘍”という用語は、分化不良の、中等度に分化した、及びよく分化した形態で発生するすべての形態のヒトのがん、肉腫及び黒色腫を包含するものとする。
【０１６１】
本発明は、良性腫瘍を手術のリスクと望まざる副作用を減らして除去できる治療法を求める当該技術分野の需要に応える。手術が危険な体内の深奥に位置するような領域（例えば、脳、心臓、肺、及びその他）における良性腫瘍の除去法は特に求められている。
【０１６２】
細胞を除去しなければならない状態の治療法は、そのような状態の従来の治療法、例えば、外科的切除、化学療法、及び放射線と組み合わせて使用できる。関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、そのような従来式治療法の前、中、又は後に投与できる。
【０１６３】
治療される状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳及びその外皮、脊髄及びその外皮、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、脳下垂体、生殖器官、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、並びにリンパ節及びリンパ系からなる群から選ばれる組織の過形成、肥大、又は過成長であり得る。
【０１６４】
本発明の方法を用いて治療できる他の状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳及びその外皮、脊髄及びその外皮、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、脳下垂体、生殖器官、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、並びにリンパ節及びリンパ系からなる群から選ばれる組織のウィルス性、細菌性、又は寄生虫性変化であり得る。
【０１６５】
治療される状態は、肺、乳房、胃、膵臓、前立腺、膀胱、骨、卵巣、皮膚、腎臓、洞、結腸、腸、胃、直腸、食道、血液、脳及びその外皮、脊髄及びその外皮、筋肉、結合組織、副腎、副甲状腺、甲状腺、子宮、精巣、脳下垂体、生殖器官、肝臓、胆嚢、眼、耳、鼻、咽頭、扁桃、口、並びにリンパ節及びリンパ系、からなる群から選ばれる組織の奇形又は障害であり得る。
【０１６６】
特に、治療される状態は、扁桃肥大、前立腺肥大、乾癬、湿疹、皮膚病又は痔であり得る。治療される状態は、アテローム性動脈硬化又は動脈硬化のような血管疾患、又は静脈瘤のような血管疾患であり得る。また治療される状態は、皮膚、眼、耳、鼻、咽頭、口、筋肉、結合組織、毛髪、又は乳房組織のような組織に対する美容修正であってもよい。
【０１６７】
関連タンパク質、関連ペプチド及び／又はＮＴＰペプチドの治療用組成物も本発明の範囲に含まれる。そのような組成物は、治療上有効量の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを製薬学的に許容しうる担体と混合して含む。担体材料は、注射用の水、好ましくは哺乳動物への投与用溶液に共通の他の材料が補充されている水であり得る。典型的には、治療用に使用する関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、精製された関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを一つ以上の生理学的に許容しうる担体、賦形剤又は希釈剤と共に含む組成物の形態で投与されることになろう。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンを混合した生理食塩水は適当な担体の例である。好ましくは、製品は適当な賦形剤（例えばショ糖）を用いて凍結乾燥物として処方される。他の標準的担体、希釈剤、及び賦形剤が所望により含まれてもよい。組成物は、当業者に公知の適当な範囲のｐＨ値を有する緩衝液、例えばｐＨ約７．０〜８．５のトリス緩衝液、又はｐＨ約４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含む。さらにソルビトール又はその適切な代替物を含んでいてもよい。
【０１６８】
不要な細胞要素をターゲティングするために、抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、又は特異的腫瘍マーカー、例えば細胞受容体、シグナルペプチドもしくは過剰発現酵素、に対して高親和性を有する分子と複合化又は連結又は結合させた関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを使用することも本発明の範囲に包含される。抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、又は特異的腫瘍マーカーに対して高親和性を有する分子は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチド複合体を、特定の細胞又は組織標的をターゲティングするために使用される。例えば、独特の表面抗原又は発現抗原を有する腫瘍は、抗体、抗体フラグメント、又は抗体様結合分子の標的となり得るので、腫瘍細胞を関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドで殺すことができる。抗体ターゲッティングを用いるこのような手法は、用量の低減、標的細胞への結合と取込みの可能性の増大、並びに転移腫瘍及び顕微鏡サイズの微小腫瘍を標的及び治療することに対する有用性の増大、といった利点が期待される。
【０１６９】
本発明は、タンパク質又は他の分子と複合化又は連結又は結合させて組成物にした関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの使用も包含する。すなわち、該組成物は、腫瘍又は他の不要細胞の部位もしくはその近辺で、腫瘍特異的又は部位特異的酵素もしくはプロテアーゼによって、又は腫瘍もしくは他の不要細胞を標的とする抗体複合体によって分解されると、該腫瘍又は他の不要細胞の部位もしくはその近辺で関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを放出する。
【０１７０】
本発明はまた、タンパク質又は他の分子と複合又は連結又は結合させて組成物にした関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの使用も包含する。すなわち、該組成物は、治療される組織を光（レーザー療法又は他の光力学もしくは光活性化療法におけるような）、他の形態の電磁放射、例えば赤外線放射、紫外線放射、Ｘ線又はγ線放射、局在熱、α又はβ線放射、超音波照射、又は他の局在エネルギー源に暴露すると、関連タンパク質、関連ペプチドもしくはＮＴＰペプチドまたは関連タンパク質、関連ペプチドもしくはＮＴＰペプチドの何らかの生物活性フラグメントを放出する。
【０１７１】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、単独でも、一緒でも、又は治療される適応症の必要に応じて、他の医薬組成物、例えばサイトカイン、成長因子、抗生物質、アポトーシス誘発薬、抗炎症薬、及び／又は化学療法薬と組み合わせて使用することもできる。
【０１７２】
本発明は、デンドリマー、フラーレン、並びに他の合成分子、ポリマー及び巨大分子を用いる関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの治療用組成物も包含する。すなわち、関連タンパク質、関連ペプチドもしくはＮＴＰペプチド及び／又はその対応するＤＮＡ分子が、それ自体で又は腫瘍特異的マーカーのような他の分子種と共に、該分子、ポリマー又は巨大分子に複合、結合又は封入されている組成物である。例えば、米国特許第５，７１４，１６６号“生物活性及び／又は標的指向デンドリマー複合体(Bioactive and/or Targeted Dendrimer Conjugates)”は、とりわけ、標的誘導物を有する少なくとも一つのデンドリマーとそれに結合した少なくとも一つの生物活性薬で構成される樹状ポリマー複合体の製造法及び使用法を提供している。
【０１７３】
本発明はまた、関連タンパク質、関連ペプチドもしくはＮＴＰペプチド及び／又は遺伝子と、脂質エマルジョン、ミセルポリマー、ポリマーミクロスフェア、電気活性ポリマー、ヒドロゲル及びリポソームのような薬物送達ビヒクルとの治療用組成物も包含する。
【０１７４】
不要細胞に伝達される関連タンパク質、関連ペプチドもしくはＮＴＰペプチド又は関連遺伝子もしくは遺伝子等価物の使用も本発明に包含される。腫瘍内での関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの過剰発現は、腫瘍内の細胞の死を誘発し、ひいては腫瘍細胞数を削減するのに使用できる。不要細胞要素を治療するための関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの遺伝子又は遺伝子等価物の伝達は、低用量でよい、標的細胞要素の細胞子孫に継代される、従って治療頻度が少なくて済む、及び総体的治療の低減といった利点があると期待される。本発明はまた、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを含有する融合タンパク質をコードする遺伝子の、不要細胞又は隣接細胞への伝達も包含する。この場合、遺伝子の発現と融合タンパク質の産生及び／又は分泌の後、該融合タンパク質が天然酵素もしくはプロテアーゼによって又はプロドラッグによって分解され、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを不要細胞の中、その部位又はその近辺に放出する。
【０１７５】
クローン組換え関連タンパク質−、関連ペプチド−又はＮＴＰペプチド−抗体複合体；クローン組換え関連タンパク質−、関連ペプチド−又はＮＴＰペプチド−抗体フラグメント複合体；及びクローン組換え関連タンパク質−、関連ペプチド−又はＮＴＰペプチド−抗体様タンパク質複合体の使用も本発明に包含される。標的指向複合体（例えば抗体、抗体フラグメント、抗体様分子、又はがん特異的受容体もしくは他の腫瘍マーカーに対する親和性の高い分子）と結合させたクローン関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの利点は、そのような分子が、前述の標的を指向するという利点とクローン複合体分子の製造及び標準化産生の利点を合わせ持っているということである。
【０１７６】
経口投与用の固体剤形は、カプセル、錠剤、ピル、散剤及び顆粒剤を含むが、これらに限定されない。そのような固体剤形の場合、活性化合物は好ましくは以下の少なくとも一つ、すなわち、（ａ）クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムのような一つ以上の不活性賦形剤（又は担体）；（ｂ）デンプン、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、及びケイ酸のような充填剤又は増量剤；（ｃ）カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖及びアカシアのような結合剤；（ｄ）グリセロールのような保湿剤；（ｅ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種の複合シリケート、及び炭酸ナトリウムのような崩壊剤；（ｆ）パラフィンのような溶液凝固遅延剤；（ｇ）第四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；（ｈ）アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤；（ｉ）カオリン及びベントナイトのような吸着剤；及び（ｊ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール類、ラウリル硫酸ナトリウム、又はそれらの混合物のような滑沢剤；と混合される。カプセル、錠剤、及びピルの場合、剤形は緩衝剤も含みうる。
【０１７７】
経口投与用の液体剤形は、製薬学的に許容しうるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシルを含む。液体剤形は、活性化合物のほかに、当該技術分野で通常使用されている不活性希釈剤、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤を含んでもよい。乳化剤の例は、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類、例えば綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール類、ソルビタンの脂肪酸エステル類、又はこれらの物質の混合物などである。
【０１７８】
そのような不活性希釈剤のほかに、該組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、風味料及び着香料などの補助剤を含むこともできる。
本発明の組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の組成物及び投与法にとって所望の治療的応答を得るのに有効な関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの量を得る必要があるため、変動しうる。従って、選択される用量レベルは、所望の治療効果、投与経路、所望の治療期間、及び他の要因によって決まる。
【０１７９】
ヒトを含む哺乳動物の場合、体表面積を基に有効量を投与することができる。様々な大きさ、種の動物、及びヒトに関する用量の相互関係（ｍｇ／Ｍ2体表面積に基づく）は、Ｅ．Ｊ．Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈらによって、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．，５０（４）：２１９（１９６６）に報告されている。体表面積は、個体の身長及び体重からおよそ決定できる（例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ニューヨーク州アーズリー、ｐｐ５３７−５３８（１９７０）参照）。
【０１８０】
宿主に投与される関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの総日用量は、１回で投与しても分割して投与してもよい。用量単位組成物は、日用量を構成するのに使用される量の約数に相当する量を含有しうる。しかしながら、特定の患者に対する特定の用量レベルは、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間及び経路、投与薬物の効力、吸収及び排出速度、他の薬物との組合せ、及び治療される特定の疾患の重症度などの様々な要因によって異なるであろうことは理解されよう。
【０１８１】
本発明による関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチド組成物の投与法は、該化合物を、噴霧、注入、ボーラス注射、移植デバイス、徐放システムなどにより、筋肉内、経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、腫瘍内、病巣内、皮内、くも膜下、鼻腔内、眼内、動脈内、局所、経皮投与することを含むが、これらに限定されない。
【０１８２】
本発明の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの別の投与法は、経皮（transdermal）又は経皮（transcutaneous）経路による方法である。そのような態様の一例はパッチの使用である。特に、パッチは、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はＤＭＳＯと綿実油の混合物中での関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの微細懸濁液を用いて調製でき、腫瘍を持つ哺乳動物の皮膚と、腫瘍部位から離れた皮膚ポーチ（skin pouch）内で接触させる。他の溶媒及び固体支持体を用いた他の媒体又はその混合物も同等に機能するであろう。該パッチは、溶液又は懸濁液の形態の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチド化合物を含有できる。次にパッチを患者の皮膚に適用するが、その手段は、例えば患者の皮膚を折りたたみ、縫合糸、クリップ又は他の保持装置で皮膚を保持することによって形成した皮膚ポーチ内に該パッチを挿入する方法を取ることができる。このパウチは、哺乳動物に妨害されずに皮膚との連続接触を確保するような様式で使用されるべきである。皮膚ポーチの使用以外にも、皮膚と接触しているパッチを確実に固定する任意のデバイスが使用できる。例えば絆創膏を用いてパッチを皮膚の適所に保持するなどである。
【０１８３】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、徐放性製剤の形態で投与してもよい。適切な徐放性製剤の例は、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスなどである。徐放性マトリックスは、ポリエステル類、ヒドロゲル類、ポリラクチド類（Ｕ．Ｓ．３，７７３，９１９、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−Ｌ−グルタミン酸エチルのコポリマー類（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６［１９８３］）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７［１９８１］及びＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５［１９８２］）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、上記）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）などである。徐放性組成物はリポソームも含みうる。リポソームは当該技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって製造できる（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２［１９８５］；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；及びＥＰ１４３，９４９）。
【０１８４】
本発明の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの別の投与法は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを治療すべき腫瘍又は他の組織に直接又は間接的に注入することによる。そのような態様の一例は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを治療すべき腫瘍又は他の組織に直接注射することである。該治療法は、単回注射、一時に複数回注射、又は数時間、数日もしくは数ヶ月にわたる一連の注射からなるが、治療される腫瘍又は他の組織の退縮又は破壊は、生検、画像化又は他の組織成長モニター法によってモニターされる。治療される腫瘍又は他の組織への注射は、鼻、口、耳、膣、直腸又は尿道のような開口部に挿入したデバイスによるか、又はインビボで腫瘍又は組織に到達するために切開を通じてなされるが、適当な注射部位を確認するために超音波又は光ファイバースコープのような画像化又は光学システムと組み合わせて実施されうる。そのような態様の別の例は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを組織に時間をかけて一定注入できるデバイスの使用である。
【０１８５】
本発明の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの別の投与法は、除去又は破壊が必要とされる又は求められる腫瘍又は他の組織又は細胞要素を物理的に切除、剥離、又はそうでなければ殺滅もしくは破壊するために用いられる外科的又は同様の処置との組合せである。その場合、本発明の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドは、腫瘍又は他の組織が除去された領域を取り囲む隣接した領域に投与され、処置によって除去又は破壊されなかった腫瘍細胞又は他の細胞要素があればその成長を破壊又は妨害する。
【０１８６】
本発明の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの別の投与法は、治療される腫瘍又は他の組織内へのデバイスの移植による。そのような態様の一例は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを含有するウェハを治療される腫瘍又は他の組織に移植することである。該ウェハは、組織に治療量の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを時間をかけて放出する。あるいは又はさらに、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドを吸収させた膜、スポンジ、又は他の適切な材料を患部に移植することによって組成物を局所投与することもできる。移植デバイスが使用される場合、該デバイスは任意の適切な組織又は器官に移植してもよく、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの送達は、ボーラスにより、又は連続投与により、又は連続注入を用いるカテーテルにより、デバイスを通じて直接的になされうる。
【０１８７】
代替の投与法は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードする遺伝子の一つ以上のコピーを標的とされる細胞に導入し、必要であれば、該遺伝子のコピーに、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドの細胞内での産生開始を誘発する。遺伝子療法が適用できる一つの方法は、関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードする遺伝子（関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又は合成ＤＮＡ、又はそれらのフラグメント、変異体、相同体もしくは誘導体）の使用で、これを構成又は誘発プロモーターに機能可能に連結し、遺伝子療法のＤＮＡ構成体を形成させればよい。プロモーターは、該構成体が挿入される細胞又は組織型で活性であれば、内因性の関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドコード遺伝子と同種でも異種でもよい。遺伝子治療のＤＮＡ構成体の他の成分は、場合により、必要に応じて、部位特異的組込み用に設計されたＤＮＡ分子（例えば相同的組換えに有用な内因性フランキング配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサー、又はサイレンサー、親細胞に優る選択的利点を提供できるＤＮＡ分子、形質転換細胞を確認する標識として有用なＤＮＡ分子、負の選択システム、細胞特異的結合剤（例えば細胞標的用）、細胞特異的インターナリゼーション（細胞内取込み）因子、及びベクターによる発現を増強する転写因子並びにベクターの製造を可能にする因子を含みうる。
【０１８８】
インビボ又はエクスビボで細胞又は組織に遺伝子を送達する手段は、裸のＤＮＡの直接注入、弾道的な方法(ballistic methods)、リポソーム介在型伝達、受容体介在型伝達（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、及びリン酸カルシウム沈殿など、例えば米国特許第４，９７０，１５４号、ＷＯ９６／４０９５８、米国特許第５，６７９，５５９号、米国特許第５，６７６，９５４号、及び米国特許第５，５９３，８７５号に開示されている方法などである（これらに限定されない）。前記特許の開示内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。また、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、ポックスウィルス、レンチウィルス、パピローマウィルス又は単純ヘルペスウィルスのようなウィルスベクターの使用、ＤＮＡ−タンパク質複合体の使用、及びリポソームの使用も含まれる。遺伝子療法のベクターの使用については、例えば米国特許第５，６７２，３４４号、米国特許第５，３９９，３４６号、米国特許第５，６３１，２３６号、及び米国特許第５，６３５，３９９号に記載されている。前記特許の開示内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。
【０１８９】
関連タンパク質、関連ペプチド又はＮＴＰペプチドをコードする遺伝子は、本明細書中に記載のような方法を用いて、関連タンパク質、関連ペプチドもしくはＮＴＰペプチド、又はそのフラグメント、変異体、相同体、もしくは誘導体を発現及び分泌するようにエクスビボで遺伝子工学的に操作されたある種の細胞を患者に移植することによって送達することもできる。そのような細胞は、動物又はヒトの細胞で、患者自身の組織由来かヒト又はヒト以外の別の供給源由来でありうる。場合により、該細胞は不死化されうるか幹細胞であり得る。しかしながら、免疫反応の機会を減らすために、該細胞を被包して周囲組織の浸潤を回避するのが好適である。被包材料は、典型的には、タンパク質生成物は放出させるが、患者の免疫系又は周囲組織の他の有害因子による細胞の破壊は防止する生体適合性、半透性のポリマー性エンクロージャー又は膜である。膜による細胞の被包化に使用される方法は当業者には周知であり、被包化細胞の調製と患者へのその移植は、過度の実験をせずとも達成できる。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号；５，０１１，４７２号；及び５，１０６，６２７号参照。前記特許の開示内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。生細胞の被包化システムは、ＰＣＴ  ＷＯ９１／１０４２５に記載されている。前記特許の開示内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。他の各種の持続又は制御送達手段、例えばリポソーム担体、生腐食性粒子又はビーズの処方技術も当業者には公知であり、例えば、米国特許第５，６５３，９７５号に記載されている。前記特許の開示内容は引用によってその全体を本明細書に援用する。被包の有無にかかわらず、細胞は患者の適切な体組織又は器官に移植されうる。
【０１９０】
以下の実施例は本発明を説明するために提供する。しかしながら、本発明はこれらの実施例中に記載されている特定の条件又は詳細に制限されないことは理解されるべきである。本明細書全体を通じて、米国特許を含む公的に入手可能な文献へのいずれか又はすべての参照は、引用によって本明細書に具体的に援用されている。
【０１９１】
特に、本発明は、係属中の米国特許出願第１０／０９２，９３４号、神経糸タンパク質を用いる腫瘍及び関連状態の治療法(Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins)に記載の実施例を、引用によって明示的に援用している。前記出願特許は、完全なＡＤ７ｃ−ＮＴＰタンパク質が、インビトロでは神経膠腫及び神経芽細胞腫の細胞培養物で、インビボでは正常齧歯類の筋肉組織、皮下結合組織、及び真皮、並びに各種の異なるヒト及び非ヒト起源腫瘍、例えば乳がん、皮膚がん及び乳頭腫、結腸がん、脳の神経膠腫及び齧歯類モデルにおけるその他、の両方で細胞死を起こす有効な薬剤であることを示している。本発明はまた、米国特許出願第１０／１５３３３４号に記載の実施例を、引用によって明示的に援用している。前記出願特許は、ＮＴＰペプチドが、インビボで正常齧歯類の筋肉組織、皮下結合組織、真皮及び他の組織で細胞死を起こす有効な薬剤であることを示している。
【実施例】
【０１９２】
実施例１
本実施例の目的は、注射部位の組織に及ぼすＮＴＰペプチド＃６の影響を測定することであった。
【０１９３】
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００ｇの体重範囲）をエーテルで麻酔し、前立腺を外科的に切開して視覚化した後、ＮＴＰペプチド＃６を前立腺内注入によって投与した。注射は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬのＮＴＰペプチド＃６を３００μｌ（１．０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）、ＰＢＳのみの対照注射（ｎ＝６）、及び注射なしの対照（ｎ＝２）であった。ラットは７２時間後に安楽死させた。前立腺を解剖し、１０％の緩衝ホルマリンに２４時間固定し、パラフィン包埋し、切片に分け、Ｈ＆Ｅで染色した。各動物について前立腺全体を包埋し切片に分割した。すべての染色切片を組織学的に検査し測定した。各前立腺について、少なくとも４枚の組織切片を検査し、各組織切片について、互いに９０°を成す二つの断面直径（Ｄ）を測定した（１個の前立腺につき全部で≧８個の測定）。各前立腺のこれらの測定による平均直径を用い、Ｖ＝４／３（Ｄ／２）3に従って体積を推定した。
【０１９４】
結果：ＮＴＰペプチド＃６注射ラットの前立腺の体積の減少は、対照（ＰＢＳ注射のみの対照と注射なしの対照との間に識別可能な違いはなかった）と比較して平均４５％と推定された。処置ラットの前立腺は、腺上皮の広範な喪失、平坦化、及び萎縮を示していた。ｐＨ７．４のＰＢＳ中ＮＴＰペプチド＃６のラット前立腺への１．０ｍｇ／ｋｇの開放注入は、７２時間の時点で、未処置又はＰＢＳ処置対照と比べて＞４０％の推定前立腺体積減を生じた。
実施例２
本実施例の目的は、注射部位の組織に及ぼすＮＴＰペプチド＃７の影響を測定することであった。
【０１９５】
４匹の正常ラットに、皮膚及び皮下のそれぞれ異なる４つの箇所に、そして四肢骨格筋のそれぞれ異なる２つの箇所に、１００〜４００ｍＬの量の生理食塩水中のＮＴＰペプチド＃７（濃度０．１〜１ｍｇ／ｍＬ）を、ステンレススチールの２６ゲージ針を通してプラスチック注射器から注射した。
【０１９６】
動物を２４時間観察し、２４時間時に安楽死させた。個々の浸潤巣を切除し、１０％のホルマリンに固定し、パラフィン包埋し、染色して標準の組織病理学的方法で検査した。
対照は生理食塩水だけを投与された。
【０１９７】
結果：ＮＴＰペプチド＃７の注射により、注射部位に急性の組織壊死を起こした。壊死は、ＮＴＰペプチド＃７が注射された部位の筋肉組織、皮下結合組織、及び真皮に明白であった。壊死は注射面積に相関し、注射部位のはるか先まで拡散しているようには見えなかった。
【０１９８】
対照は、軽度の炎症領域があった以外、壊死又は細胞喪失の証拠は示さなかった。対照の筋肉の変化は最小限又は皆無であった。対照注射によって注射部位に軽度〜最小の急性炎症と、針による局所的な微小出血が見られた。
実施例３
本実施例の目的は、注射部位の組織に及ぼす関連ペプチド＃１の影響を測定することであった。
【０１９９】
上記実施例２のようにラットの皮膚及び皮下に関連ペプチド＃１を注射した。
動物を２４時間観察し、２４時間時に安楽死させた。組織を切除し、１０％のホルマリンに固定し、パラフィン包埋し、染色して標準の組織病理学的方法で検査した。
【０２００】
対照は実施例２と同じであった。
結果：関連ペプチド＃１の注射により、注射部位に細胞死と壊死を起こした。上記実施例２と同様、細胞死は、関連ペプチド＃１が注射された部位の筋肉組織、皮下結合組織、及び真皮に見られた。
【０２０１】
対照は、軽度の炎症領域があった以外、壊死又は細胞喪失の証拠はほとんど示さなかった。対照注射によって注射部位に軽度〜最小の急性炎症と、時に針による局所的な微小出血が見られた。
実施例４
本実施例の目的は、注射部位の組織に及ぼす関連ペプチド＃２の影響を測定することであった。
【０２０２】
雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００ｇの体重範囲）をエーテルで麻酔し、前立腺を外科的に切開して視覚化した後、関連ペプチド＃２を前立腺内注入によって投与した。注射は、ｐＨ７．４のＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬの関連ペプチド＃２を３００μｌ（１．０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝８）、ＰＢＳのみの対照注射（ｎ＝６）、及び注射なしの対照（ｎ＝２）であった。ラットは７２時間後に安楽死させた。前立腺を解剖し、１０％の緩衝ホルマリンに２４時間固定し、パラフィン包埋し、切片に分け、Ｈ＆Ｅで染色した。各動物について前立腺全体を包埋し切片に分割した。すべての染色切片を組織学的に検査し測定した。各前立腺について、少なくとも４枚の組織切片を検査し、各組織切片について、互いに９０°を成す二つの断面直径（Ｄ）を測定した（１個の前立腺につき全部で≧８個の測定）。各前立腺のこれらの測定による平均直径を用い、Ｖ＝４／３（Ｄ／２）3に従って体積を推定した。
【０２０３】
対照は実施例１と同一であった。
結果：上記実施例１と同様、関連タンパク質＃２の注射により、７２時間の時点で前立腺に著しい細胞喪失と萎縮が生じた。対照は最小の変化を示すか無変化で、針による軽度の局所的炎症であった。
実施例５
本実施例の目的は、注射部位の組織に及ぼす関連ペプチド＃３の影響を測定することであった。
【０２０４】
正常ラットの前立腺に、上記実施例１及び４のように関連ペプチド＃３を注射した。ラットは７２時間後に安楽死させ、その前立腺を上記実施例１及び４のように検査した。
結果：７２時間の時点で、最小の変化しかなかった対照と比べ、前立腺の顕著な細胞喪失と萎縮が見られた。
【０２０５】
本発明を特に好適な態様と実施例を引用しながら説明してきた。しかしながら、当業者であれば、本発明の精神及び範囲からそれることなく本発明に対して多様な変形がなされ得ることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ遺伝子と該遺伝子のＡＤ７ｃ−ＮＴＰタンパク質産物の完全なアミノ酸配列と核酸配列を示す図である（米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列１２０及び１２１；ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：３０９３−３１０４（１９９７）；ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＣ０８７３７；ＰＩＤ  ｇ３００２５２７）［配列番号１］。
【図２】図２は、１２２アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す図である（米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列４０；ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＥ２５４４７、ＰＩＤ  ｇ１００４８５４０）［配列番号２］（“ＮＴＰ−１２２”）。
【図３】図３は、１１２アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す図である（ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＸＰ ０３２３０７、ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１）［配列番号３］（“ＮＴＰ−１１２”）。
【図４】図４は、１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質の完全アミノ酸配列を示す図である（ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＨ１４９５１、ＰＩＤ  ｇ１５９２８９７１）［配列番号４］（“ＮＴＰ−１０６Ａ”）。
【図５】図５は、１０６アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質の完全アミノ酸配列を示す図である（ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＸＰ ０３９１０２、ＰＩＤ  ｇ１８５９９３３９）［配列番号５］（“ＮＴＰ−１０６Ｂ”）。
【図６】図６は、９８アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す図である（米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列３０；ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＥ２５４４５、ＰＩＤ  ｇ１００４８５３８）［配列番号６］（“ＮＴＰ−９８”）。
【図７】図７は、７５アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す図である（米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列４８；ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＥ２５４４８、ＰＩＤ  ｇ１００４８５４１）［配列番号７］（“ＮＴＰ−７５”）。
【図８】図８は、６８アミノ酸神経糸タンパク質の完全アミノ酸配列を示す図である（米国特許第５，８３０，６７０号、５，９４８，６３４号、及び５，９４８，８８８号の配列３６；ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＥ２５４４６、ＰＩＤ  ｇ１００４８５３９）［配列番号８］（“ＮＴＰ−６６”）。
【図９】図９は、６１アミノ酸神経糸タンパク質様タンパク質の完全アミノ酸配列を示す図である（ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ−タンパク質アクセッション＃ＡＡＨ０２５３４、ＰＩＤ  ｇ１２８０３４２１）［配列番号９］（“ＮＴＰ−６１”）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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