(57)【要約】本発明は、変異原性ヌクレオシド類似体を使用してウイルス疾患を治療する方法に関する。
2005505536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、ウイルスの突然変異率を増加させる方法：
化合物が、下記の構造
2005505536.tif 000011
（式中、
R1は、D-、L-、およびその組合せから選択される立体配置でありかつα-、β-、およびその組合せから選択されるアノマー型である、Hおよび糖残基から選択されるメンバーであり；
R2は、H、ハロゲン、NR21R22、または生物学的条件下で切断可能な基であり；
R3は、O、NR4、NOR4、およびNN(R5)C(O)R4から選択され、
R4、R5、R21、およびR22は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されたメンバーである）
を有し、化合物が、ポリメラーゼにより、ウイルスをコードするゲノム核酸に組み込まれ、これによりウイルスの突然変異が誘発される、化合物をウイルス感染細胞に投与する段階。
【請求項２】
糖残基が、置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースが、下記群より選択されるメンバーである、請求項2記載の方法：
2005505536.tif 000012
（式中、
R6およびR7は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、および生物学的な条件下で切断可能な基から選択され；
XおよびYは、独立して、H、ハロゲン、硫黄、窒素、および-OHから選択される）。
【請求項４】
化合物が、下記の構造
2005505536.tif 000013
を有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ハロゲンがフルオロである、請求項3記載の方法。
【請求項６】
ウイルスをコードするゲノム核酸において、化合物が、第一の相補的ヌクレオチドを有する第一の天然ヌクレオチドを置換し、該化合物が、第一のヌクレオチド以外である第二のヌクレオチドを補完し、これによりウイルスの突然変異が誘発される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ゲノム核酸が、ゲノム核酸のRNAコピーである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ゲノム核酸が、ゲノム核酸のDNAコピーである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ウイルスがレトロウイルスまたはフラビウイルスである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
ウイルスがペスチウイルスである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
細胞が細胞培養物内に存在する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
細胞が動物内に存在する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
細胞がヒト細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスの突然変異率の増加により、ウイルス生存度が漸進的に低下する、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
2つ以上の化合物をウイルス感染細胞に投与する段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスが、C型肝炎、コロナウイルス、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、BVDV、およびデング熱ウイルスからなる群より選択されたRNAウイルスである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスがDNAウイルスである、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
以下の段階を含む、ウイルスの突然変異率を増加させる方法：
化合物が、下記の構造
2005505536.tif 000014
（式中、
R1は、D-、L-、およびその組合せから選択される立体配置でありかつα-、β-、およびその組合せから選択されるアノマー型である、Hおよび糖残基から選択されるメンバーであり；
R2は、H、ハロゲン、NR21R22、または生物学的条件下で切断可能な基であり；
R8、R9、R21、およびR22は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されるメンバーである）
を有し、化合物が、ポリメラーゼにより、ウイルスをコードするゲノム核酸に組み込まれ、これによりウイルスの突然変異が誘発される、化合物をウイルス感染細胞に投与する段階。
【請求項１９】
糖残基が、置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースが、下記群より選択されるメンバーである、請求項19記載の方法：
2005505536.tif 000015
（式中、
R6およびR7は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、および生物学的条件下で切断可能な基から選択され；
XおよびYは、独立して、H、ハロゲン、硫黄、窒素、および-OHから選択される）。
【請求項２１】
ハロゲンがフルオロである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
ウイルスをコードするゲノム核酸において、化合物が、第一の相補的ヌクレオチドを有する第一の天然ヌクレオチドを置換し、該化合物が、第一のヌクレオチド以外である第二のヌクレオチドを補完し、これによりウイルスの突然変異が誘発される、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
ゲノム核酸が、ゲノム核酸のRNAコピーである、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
ゲノム核酸が、ゲノム核酸のDNAコピーである、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスがレトロウイルスまたはフラビウイルスである、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
ウイルスがペスチウイルスである、請求項18記載の方法。
【請求項２７】
細胞が細胞培養物内に存在する、請求項18記載の方法。
【請求項２８】
細胞が動物内に存在する、請求項18記載の方法。
【請求項２９】
細胞がヒト細胞である、請求項18記載の方法。
【請求項３０】
ウイルスの突然変異率の増加により、ウイルス生存度が漸進的に低下する、請求項18記載の方法。
【請求項３１】
2つ以上の化合物をウイルス感染細胞に投与する段階を含む、請求項18記載の方法。
【請求項３２】
ウイルスが、C型肝炎、コロナウイルス、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、BVDV、およびデング熱ウイルスからなる群より選択されたRNAウイルスである、請求項18記載の方法。
【請求項３３】
ウイルスがDNAウイルスである、請求項18記載の方法。
【請求項３４】
以下の段階を含む、ウイルスの突然変異率を増加させる方法：
化合物が、下記の構造
2005505536.tif 000016
（式中、
R1は、D-、L-、およびその組合せから選択される立体配置でありかつα-、β-、およびその組合せから選択されるアノマー型である、Hおよび糖残基から選択されるメンバーであり；
R2は、H、ハロゲン、NR21R22、または生物学的条件下で切断可能な基であり；
R10およびR11は、独立して、OおよびNR12から選択されたメンバーであり、ここで
R12、R21、およびR22は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されたメンバーである）
を有し、化合物が、ポリメラーゼにより、ウイルスをコードするゲノム核酸に組み込まれ、これによりウイルスの突然変異が誘発される、化合物をウイルス感染細胞に投与する段階。
【請求項３５】
糖残基が、置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースが、下記群より選択されるメンバーである、請求項35記載の方法：
2005505536.tif 000017
（式中、
R6およびR7は、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、および生物学的条件下で切断可能な基から選択され；
XおよびYは、独立して、H、ハロゲン、硫黄、窒素、および-OHから選択される）。
【請求項３７】
ハロゲンがフルオロである、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
ウイルスをコードするゲノム核酸において、化合物が、第一の相補的ヌクレオチドを有する第一の天然ヌクレオチドを置換し、該化合物が、第一のヌクレオチド以外である第二のヌクレオチドを補完し、これによりウイルスの突然変異が誘発される、請求項34記載の方法。
【請求項３９】
ゲノム核酸が、ゲノム核酸のRNAコピーである、請求項34記載の方法。
【請求項４０】
ゲノム核酸が、ゲノム核酸のDNAコピーである、請求項34記載の方法。
【請求項４１】
ウイルスがレトロウイルスまたはフラビウイルスである、請求項34記載の方法。
【請求項４２】
ウイルスがペスチウイルスである、請求項34記載の方法。
【請求項４３】
細胞が細胞培養物内に存在する、請求項34記載の方法。
【請求項４４】
細胞が動物内に存在する、請求項34記載の方法。
【請求項４５】
細胞がヒト細胞である、請求項34記載の方法。
【請求項４６】
ウイルスの突然変異率の増加により、ウイルス生存度が漸進的に低下する、請求項34記載の方法。
【請求項４７】
2つ以上の化合物をウイルス感染細胞に投与する段階を含む、請求項34記載の方法。
【請求項４８】
ウイルスが、C型肝炎、コロナウイルス、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、BVDV、およびデング熱ウイルスからなる群より選択されたRNAウイルスである、請求項34記載の方法。
【請求項４９】
ウイルスがDNAウイルスである、請求項34記載の方法。
【請求項５０】
以下の段階を含む、ウイルスの突然変異率を増加させる方法：
化合物が、下記の構造
2005505536.tif 000018
（式中、
R13、R14、およびR15は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されたメンバーであり；
R16は、D-、L-、およびその組合せから選択される立体配置でありかつα-、β-、およびその組合せから選択されるアノマー型である、Hおよび糖残基から選択されるメンバーであり；
AおよびBは、独立して、NおよびCR17から選択されたメンバーであり；
R17は、H、OH、CN、N3、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のアルケニル、置換型または非置換型のアルキニル、ハロゲン、NR18、およびSR19から選択されるメンバーであり、
R18およびR19は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されたメンバーである）
を有し、化合物が、ポリメラーゼにより、ウイルスをコードするゲノム核酸に組み込まれ、これによりウイルスの突然変異が誘発される、化合物をウイルス感染細胞に投与する段階。
【請求項５１】
糖残基が、置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースである、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
化合物が下記の構造
2005505536.tif 000019
を有する、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースが、下記群より選択されるメンバーである、請求項51記載の方法：
2005505536.tif 000020
（式中、
R6およびR7は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、および生物学的条件下で切断可能な基から選択され；
XおよびYは、独立して、H、ハロゲン、硫黄、窒素、および-OHから選択される）。
【請求項５４】
ハロゲンがフルオロである、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
ウイルスをコードするゲノム核酸において、化合物が、第一の相補的ヌクレオチドを有する第一の天然ヌクレオチドを置換し、該化合物が、第一のヌクレオチド以外である第二のヌクレオチドを補完し、これによりウイルスの突然変異が誘発される、請求項50記載の方法。
【請求項５６】
ゲノム核酸が、ゲノム核酸のRNAコピーである、請求項50記載の方法。
【請求項５７】
ゲノム核酸が、ゲノム核酸のDNAコピーである、請求項50記載の方法。
【請求項５８】
ウイルスがレトロウイルスまたはフラビウイルスである、請求項50記載の方法。
【請求項５９】
ウイルスがペスチウイルスである、請求項50記載の方法。
【請求項６０】
細胞が細胞培養物内に存在する、請求項50記載の方法。
【請求項６１】
細胞が動物内に存在する、請求項50記載の方法。
【請求項６２】
細胞がヒト細胞である、請求項50記載の方法。
【請求項６３】
ウイルスの突然変異率の増加により、ウイルス生存度が漸進的に低下する、請求項50記載の方法。
【請求項６４】
2つ以上の化合物をウイルス感染細胞に投与する段階を含む、請求項50記載の方法。
【請求項６５】
ウイルスが、C型肝炎、コロナウイルス、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、BVDV、およびデング熱ウイルスからなる群より選択されたRNAウイルスである、請求項50記載の方法。
【請求項６６】
ウイルスがDNAウイルスである、請求項50記載の方法。
【請求項６７】
下記の構造を有する化合物
2005505536.tif 000021
（式中、
R1は、D-、L-、およびその組合せから選択される立体配置でありかつα-、β-、およびその組合せから選択されるアノマー型である、Hおよび糖残基から選択されるメンバーであり；
R2は、H、ハロゲン、NR21R22、または生物学的条件下で切断可能な基であり；
R3は、O、NR4、NOR4、およびNN(R5)C(O)R4から選択され、
R4、R5、R21、およびR22は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されるメンバーである）。
【請求項６８】
糖残基が置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースである、請求項67記載の化合物。
【請求項６９】
下記の構造
2005505536.tif 000022
を有する、請求項67記載の化合物。
【請求項７０】
置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースが、下記群より選択されるメンバーである、請求項68記載の化合物：
2005505536.tif 000023
（式中、
R6およびR7は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、および生物学的条件下で切断可能な基から選択され；
XおよびYは、独立して、H、ハロゲン、硫黄、窒素、および-OHから選択される）。
【請求項７１】
ハロゲンがフルオロである、請求項70記載の化合物。
【請求項７２】
下記の構造を有する化合物
2005505536.tif 000024
（式中、
R1は、D-、L-、およびその組合せから選択される立体配置でありかつα-、β-、およびその組合せから選択されるアノマー型である、Hおよび糖残基から選択されるメンバーであり；
R2は、H、ハロゲン、NR21R22、または生物学的条件下で切断可能な基であり；
R8、R9、R21、およびR22は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されるメンバーである）。
【請求項７３】
糖残基が置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースである、請求項72記載の化合物。
【請求項７４】
置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースが、下記群より選択されるメンバーである、請求項72記載の化合物：
2005505536.tif 000025
（式中、
R6およびR7は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、および生物学的条件下で切断可能な基から選択され；
XおよびYは、独立して、H、ハロゲン、硫黄、窒素、および-OHから選択される）。
【請求項７５】
ハロゲンがフルオロである、請求項74記載の化合物。
【請求項７６】
下記の構造を有する化合物
2005505536.tif 000026
（式中、
R1は、D-、L-、およびその組合せから選択される立体配置でありかつα-、β-、およびその組合せから選択されるアノマー型である、Hおよび糖残基から選択されるメンバーであり；
R2は、H、ハロゲン、NR21R22、または生物学的条件下で切断可能な基であり；
R10およびR11は、独立して、OおよびNR12から選択されたメンバーであり、
R12、R21、およびR22は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されるメンバーである）。
【請求項７７】
糖残基が置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースである、請求項76記載の化合物。
【請求項７８】
置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースが、下記群より選択されるメンバーである、請求項77記載の化合物：
2005505536.tif 000027
（式中、
R6およびR7は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、および生物学的条件下で切断可能な基から選択され；
XおよびYは、独立して、H、ハロゲン、硫黄、窒素、および-OHから選択される）。
【請求項７９】
ハロゲンがフルオロである、請求項78記載の化合物。
【請求項８０】
下記の構造を有する化合物
2005505536.tif 000028
（式中、
R13、R14、およびR15は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されたメンバーであり；
R16は、D-、L-、およびその組合せから選択される立体配置でありかつα-、β-、およびその組合せから選択されるアノマー型である、Hおよび糖残基から選択されるメンバーであり；
AおよびBは、独立して、NおよびCR17から選択されたメンバーであり；
R17は、H、OH、CN、N3、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のアルケニル、置換型または非置換型のアルキニル、ハロゲン、NR18、およびSR19から選択されるメンバーであり、
R18およびR19は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、置換型または非置換型のアリール、および置換型または非置換型のヘテロアリールから選択されたメンバーである）。
【請求項８１】
糖残基が置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースである、請求項80記載の化合物。
【請求項８２】
下記の構造
2005505536.tif 000029
を有する、請求項80記載の化合物。
【請求項８３】
置換型または非置換型のリボースまたはデオキシリボースが、下記群より選択されるメンバーである、請求項81記載の化合物：
2005505536.tif 000030
（式中、
R6およびR7は、独立して、H、置換型または非置換型のアルキル、置換型または非置換型のヘテロアルキル、および生物学的条件下で切断可能な基から選択され；
XおよびYは、独立して、H、ハロゲン、硫黄、窒素、および-OHから選択される）。
【請求項８４】
ハロゲンがフルオロである、請求項83記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2001年8月24日に提出された米国特許出願第60/314,728号の優先権を主張し、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援する研究および開発の下でなされた発明者らの権利に関する声明
なし
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
RNAウイルス疾患は、エイズ、肝炎、気道のライノウイルス感染、インフルエンザ、麻疹、ポリオ、およびその他を含む、人間のウイルス疾患のウイルス罹患率および死亡率の大半に関与している。B型およびC型肝炎、ならびにT細胞ヒト白血病などの治療が困難であるRNA中間体を介して複製するRNAまたはDNAウイルスにより引き起こされる慢性の持続的な疾患がその他にも数多く存在する。多くの一般的なヒト疾患は、ウイルスにコードされるRNAレプリカーゼにより複製されるRNAウイルスにより引き起こされる。この群に含まれるのは、インフルエンザ（Zurcherら、J.Gen.Virol.77:1745(1996)）、デング熱（Becker、Virus-Genes 9:33(1994)）およびライノウイルス感染（Horsnellら、J.Gen.Virol.、76:2549(1995)）である。動物の重要なRNAウイルス疾患には、ネコ白血病および免疫不全、ヒツジのビスナ・マエディ、ウシのウイルス性下痢、ウシ粘膜疾患、ならびにウシ白血病が含まれる。DNAウイルスに関してはいくつかのワクチンが利用可能であるが、B型肝炎などの疾患は依然として蔓延している。B型肝炎は、RNA中間体を通して自己のゲノムを複製するDNAウイルスにより引き起こされる（SummersおよびMason、Cell 29:4003(1982)）。効果的なワクチンが予防薬として存在するが、持続的な慢性HBV感染の効果的な治療法は存在しない。
【０００４】
現在、多くのウイルス疾患に対する効果的な治療法は存在しない。インフルエンザに対するワクチン接種が効果的である場合もあるが、一方でウイルスゲノムの急速な進化の結果である、前年の循環株で固定された突然変異に応じて、新しいワクチンを毎年作製しなければならない。C型肝炎の現在の治療においてインターフェロンが使用されるが、疾患が治癒することは殆どない。
【０００５】
従って、RNAおよびDNAウイルスにより媒介される疾患を効果的に予防または寛解する必要がある。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点も同時に提供する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ウイルス複製を阻害する新しい戦略を提供する。本発明の方法では、特定のデオキシリボヌクレオシド類似体およびリボヌクレオシド類似体を使用して、ウイルスの突然変異率を劇的に増加させる。このウイルス突然変異率の増加により、ウイルスの子孫世代の生存度が低下し、これによりウイルス複製が阻害される。
【０００７】
従って、ある種の態様において、本発明は、DNAまたはRNAヌクレオシド類似体をウイルス感染細胞に投与することにより、ウイルスの突然変異率を増加させる方法を提供する。細胞は、培養物中に存在しても、ヒト患者などの動物内に存在してもよい。類似体は、RNAまたはDNAポリメラーゼにより、ウイルスをコードするゲノム核酸のRNAまたはDNAコピーに組み込まれ、これによりウイルスの突然変異が誘発される。
【０００８】
好ましい態様において、ヌクレオシド類似体は、1つまたはそれ以上の天然ヌクレオシドを置換できる。鋳型依存的ポリメラーゼは、鋳型中の相補的なまたは非相補的なヌクレオシドの反対側にヌクレオシドを組み込むと考えられる。組み込まれた類似体がその後コピーされると、ウイルスゲノム内に突然変異が生じる。これにより鋳型依存的な核酸のコピーにばらつきが生じる。時間が経過すると、誘導されたこれらの変化（すなわち突然変異）が蓄積され、子孫ウイルスの生存度の低下が引き起こされる。
【０００９】
動物におけるウイルス突然変異率を増加させる方法を提供する。本方法では、治療的有効量のヌクレオシド類似体を動物に投与する。例えば、動物は、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、デング熱ウイルスからなる群より選択されるウイルスに感染したヒト患者であってもよい。1つの態様において、ヌクレオシド類似体は、動物のウイルス感染細胞内に存在するポリメラーゼにより、天然の相補的核酸の効率範囲の少なくとも約0.1％の効率範囲で、ウイルスのゲノム核酸に組み込まれる。本方法は、とりわけ、エイズ、B型肝炎、C型肝炎、およびT細胞白血病の治療を提供する。ネコ白血病ウイルス感染、ネコ免疫不全ウイルス感染、BVDV感染、および水疱性口内炎ウイルス感染を含むがこれらに限定されない非ヒト感染の治療も提供する。
【００１０】
薬学的組成物が提供される。本組成物は、治療的有効量のヌクレオシド類似体および薬学的に許容される担体を有する。好ましいヌクレオシド類似体は、本明細書に特記されたものである。好ましい化合物は、経口または非経口投与に適している。
【００１１】
発明の詳細な説明
序論
本発明において、5-ホルミルウリジンおよびイソグアノシンが、僅か数継代の後に、麻疹ウイルスおよびBVDVなどのウイルスの複製をインビトロで停止させることが実証された。これらの類似体はどちらも、互変異性体を形成でき、これにより3つの水素結合の形成が可能になる。従って、5-ホルミルウラシルは、アデニンの代わりにグアニンと対を形成でき、イソグアニンはアデニンの代わりにチミンまたはウラシルと対を形成できる。5-ホルミルウリジンの場合、C-5のアルデヒド基の存在により、N-3からC-4の酸素ヘのプロトンの移動により形成される希な互変異性体の比率が増加する。これは同様に、他の結合型でも可能である。ウイルスゲノムにおいて突然変異を引き起こす基礎となる互変異性はこれまで、インビトロアッセイ法におけるデオキシ類似体について記載されてきただけであり、今までに完全なウイルス系では報告されていなかった。
【００１２】
それ故、本発明は、細胞培養物中においてだけでなく動物およびヒトに対する治療法においても有用である、5-ホルミルウリジン、イソグアノシン、ならびにその誘導体および変異体を使用した、ウイルス突然変異誘発を誘導する方法に関する。本方法は、DNAまたはRNAウイルス（すなわちDNAまたはRNAゲノムを有するウイルス）に対して有用である点において有利である。1つの態様において、本発明の方法は、RNAウイルス（RNAゲノムを有するウイルス）、およびさもなくばRNA中間体により複製されるレトロウイルスまたは他のウイルスを標的とするために使用する場合に有利である。別の態様において、本発明の方法は、B型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびパピローマウイルスなどのDNAウイルスを標的化するのに有益である。作用機構に縛られる訳ではないが、1つの態様において、本発明の方法は、ウイルスによりコードされるウイルスゲノム核酸、および細胞によりコードされるウイルスゲノム核酸の両方に組み込まれるミスコードヌクレオシドを利用し、これにより例えば互変異性によりゲノムウイルスの子孫コピーにミスコードを引き起こし、誤った塩基対形成を可能にする（例えば、Moriyamaら、Nucleic Acids Symposium 42:131-132(1999)；Robinsonら、Biochemistry 37:10897-10905(1998)；Anensenら、Mutation Res.476:99-107(2001)；Lutzら、Bioorganic & Medicinal Chem.Letts.8:499-504(1998)；およびKlunglandら、Toxicology Letts.119:71-78(2001)を参照されたい）。
【００１３】
ウイルスは、ウイルスゲノム核酸が細胞ゲノム中に組み込まれたものであり得る。その細胞ゲノムを組み込むウイルスの例にはレトロウイルスが含まれるが、これに限定されない。1つの特に好ましい態様において、ウイルスはHIVである。他の好ましいウイルスには、HIV-1、HIV-2、HTLV-1、HTLV-II、およびSIVが含まれる。別の態様において、ウイルスは、B型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス（例えばHSV、CMV、EBV）、またはパピローマウイルス（例えばHPV）などのDNAウイルスである。または、ウイルスゲノムはエピソーム性でもよい。これらには、多くのヒトおよび動物の病原体、例えばフラビウイルス（例えばデング熱および黄熱病）、ペスチウイルス（フラビウイルス科の一属）（例えばBVDV（ウシウイルス性下痢ウイルス））、C型肝炎ウイルス（同様にフラビウイルス科の一属）、フィロウイルス（例えばエボラウイルス）、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス（呼吸器合胞体ウイルスを含む）、麻疹、流行性耳下腺炎、ピコルナウイルス（エコーウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルスを含む）、トガウイルス（脳炎、コロナウイルス、風疹を含む）、ブンヤウイルス、レオウイルス（ロタウイルスを含む）、ラブドウイルス、アレナウイルス（例えばリンパ球性脈絡髄膜炎）ならびにヒトおよび動物のその他のRNAウイルスが含まれる。標的化されうるレトロウイルスには、ヒトT細胞白血病（HTLV）ウイルス、例えばHTLV-1およびHILV-2、成人T細胞白血病（ATL）、ヒト免疫不全ウイルス、例えばHIV-1およびHIV-2、ならびにサル免疫不全ウイルス（SIV）が含まれる。一部の態様において、ウイルスはA型肝炎またはB型肝炎である。例えば、Fields Virology（第3版、1996）を参照されたい。ウイルス疾患およびその複製に関するさらなる情報は、WhiteおよびFenner、Medical Virology、第4版、Academic Press（1994）およびPrinciples and Practice of Clinical Virology、Zuckerman、BanatvalaおよびPattison編、John Wiley and Sons(1994)に見出すことができる。
【００１４】
本発明の方法に使用するのに好ましい化合物には、5-ホルミルウリジン、イソグアノシン、ならびにその誘導体および変異体が含まれる。ヌクレオシド類似体の突然変異誘発能を検出するアッセイ法を提供する（例えば実施例1を参照されたい）。本アッセイ法において、ヌクレオシド類似体は、核酸鋳型の存在下でウイルス核酸に組み込まれ、核酸が細胞性またはウイルス性のポリメラーゼにより合成され、かつ組み込みにより子孫ウイルスに突然変異が引き起こされたかどうかが判定される。任意で、天然（すなわちG、A、U、および/またはC）ヌクレオチドも、核酸ポリマーに組み込まれる。本方法は任意で、アッセイにおけるヌクレオシド類似体および任意の天然のリボヌクレオシドの核酸ヘの組み込み率を比較する段階を含む。追加のアッセイ法の例については、例えば米国特許第6,132,776号、第6,130,036号、第6,063,628号、および第5,512,431号（その全体が参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【００１５】
定義
本明細書に示されたまたは当業者に既知であるアッセイを使用してウイルス突然変異率を増加させる化合物の量とは、化合物の「ウイルス突然変異誘発量」であり、それにより細胞または被験者においてウイルス突然変異が増加または誘発される。
【００１６】
被験者におけるウイルス感染を減少させる目的で、ウイルス突然変異に影響を及ぼす化合物に関するアッセイの文脈における「ウイルス突然変異率の増加」または「ウイルスの突然変異の誘発」という用語には、間接的または直接的にウイルス突然変異の測定値となる、任意のパラメータの決定が含まれる。これには、物理的、機能的、および化学的な効果、例えば核酸配列および組成物の変化、塩基対形成、ウイルス力価、細胞死、細胞変性作用、ウイルス消滅などが含まれる。
【００１７】
「ヌクレオシド」は、リボースまたはデオキシリボースに接続されたヘテロ環式窒素含有塩基であるアデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）、またはウラシル（U）のいずれかを含み；リン酸基の付加時に、前記化合物はヌクレオチドとなる。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルである。重合ヌクレオチドであるデオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）は、細胞または生物と環境との相互作用を究極的に制御する遺伝子情報を保存している。本発明のヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体（交換可能に使用される）は天然または合成である。
【００１８】
RNAおよびDNAにおける4つの「天然ヌクレオチド」は、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、またはシトシンを含む。互いに相補的なヌクレオチドとは、互いの間に相補的水素結合を形成する傾向を有するものであり、具体的には、Aに対する天然相補体はUまたはTであり、Uに対する天然相補体はAであり、Tに対する天然相補体はAであり、Cに対する天然相補体はGであり、Gに対する天然相補体はCである。
【００１９】
「核酸」とは、一本鎖型または二本鎖型いずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーであり、特に制限しない限り、天然ヌクレオチドの類似体を包含する。
【００２０】
本明細書において使用される「ヌクレオシド類似体」が、以下でより詳細に定義されるが、これにはリボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの類似体ならびにそれらの三リン酸が含まれる。前記したように、これらは天然でも非天然でもよく、天然供給源に由来しても合成されてもよい。これらのモノマー単位は、ヌクレオシド類似体（またはリン酸化に関与するモノマーが考えられる場合には「ヌクレオチド」類似体）である。例えば、構造基は、オリゴヌクレオチドへの組み込みのために、ヌクレオシドの糖または塩基に任意で付加され、例えば糖の2'-O位におけるメチル基またはアリル基、または2'-O基を置換するフルオロ基、またはヌクレオシド塩基上のブロモ基などがある。ホスホジエステル結合、すなわちオリゴヌクレオチド類似体の「糖-リン酸骨格」は、例えば、メチルホスホネートまたはO-メチルホスフェートで置換または修飾される。
【００２１】
「ゲノム核酸」とは、ウイルス粒子によりパッケージングされた天然核酸ポリマー（RNAまたはDNA）をコードする核酸に相同的である核酸ポリマーである。典型的には、パッケージングされた核酸は、ウイルス複製に必要ないくつかまたは全ての成分をコードしている。ゲノム核酸は任意でヌクレオチド類似体を含む。共通の配列（「先祖」核酸）を有する核酸から先祖核酸の天然修飾または人工修飾によって得られた場合に、核酸は相同的である。レトロウイルスゲノム核酸は任意で、レトロウイルス粒子によってパッケージングされる能力を有するRNAをコードする。このような核酸は、パッケージング部位と、選択した核酸とを組換え結合することにより構築され得る。
【００２２】
「ウイルス感染細胞」とは、ウイルス核酸が形質導入された細胞である。核酸は任意で、細胞ゲノムに組み込まれるか、または任意でエピソーム性である。
【００２３】
ウイルスまたは核酸の「突然変異率」は、例えばポリメラーゼにより、核酸がコピーされた時に生じる変化の数を意味する。典型的には、これは経時的に測定される、すなわち、ウイルスの複数回のコピー中および複数世代中に生じる変化の数である。
【００２４】
「ポリメラーゼ」とは、既存の鋳型ポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）に相補的なポリヌクレオチド配列を産生する酵素（DNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼ）を意味する。例えば、RNAポリメラーゼとは、RNAウイルスポリメラーゼもしくはレプリカーゼまたはRNA細胞性ポリメラーゼである。「細胞性ポリメラーゼ」とは、細胞に由来するポリメラーゼである。細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。細胞性RNAポリメラーゼは、典型的には、PolIIまたはPolIIIなどのRNAポリメラーゼである。PolII酵素が最も好ましい。「哺乳動物RNAポリメラーゼII」とは、哺乳動物に由来するRNAポリメラーゼIIである。「ヒトRNAポリメラーゼII」とは、ヒトに由来するRNAポリメラーゼIIである。「ネズミRNAポリメラーゼII」とは、マウスに由来するRNAポリメラーゼIIである。ポリメラーゼは任意で、天然であるか、または人工的に（例えば組換え的に）作製される。
【００２５】
「細胞培養物」とは、動物の体外に存在する細胞群である。これらの細胞は、任意で、細胞バンク、動物、もしくは血液バンクから単離された一次細胞、またはこれらの供給源の1つから培養された二次細胞、または、広く入手可能である人工的に維持された長期生存（long-lived）インビトロ培養物である。
【００２６】
「生存度の漸進的な低下」とは、経時的な、ウイルス群の複製能または感染能の測定可能な低下を意味する。
【００２７】
「ウイルス粒子」とは、RNAウイルスまたはRNA中間体を有するウイルス、例えばBVDV、HCV、またはHIVにより実質的にコードされるウイルス粒子である。粒子中の非ウイルス成分または細胞成分の存在は、細胞膜からの出芽を典型的に含む、ウイルス複製プロセスの共通の結果である。
【００２８】
「HIV粒子」とは、HIVにより実質的にコードされるレトロウイルス粒子である。粒子中の非HIVウイルス成分または細胞成分の存在は、細胞膜からの出芽を典型的に含む、HIV複製プロセスの共通の結果である。一部の用途において、レトロウイルス粒子は、2つ以上のウイルス（しばしばHIVおよびVSV）由来のウイルスタンパク質の同時発現により作為的に「シュードタイプ化（pseudotyped）」され、得られるレトロウイルス粒子の宿主範囲は拡大する。HIV粒子中の非HIV成分の有無は粒子の本質的な性質を変化させない、すなわち粒子は依然として、HIV複製の一次産物として産生される。
【００２９】
「フラビウイルス」は、フラビウイルス科を意味するために使用され、この科の3つの属である、フラビウイルス、ペスチウイルス（例えばBVDV）、およびC型肝炎ウイルス（例えばHCV）が含まれる。
【００３０】
以下で考察した方法においては配列整列化（alignment）が必要であるが、比較のためのこのような配列整列化法は当技術分野において公知である。比較のための最適な配列整列化は、SmithおよびWaterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482の局所相同性アルゴリズムにより；NeedlemanおよびWunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性整列化アルゴリズムにより；PearsonおよびLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性探索法により；これらのアルゴリズムのコンピューター実行（Intelligenetics、カリフォルニア州マウンテンビューによるPC/GeneプログラムのCLUSTAL、ウィスコンシンGenetics Software Package、Genetics Computer Group(GCG)、575Science Dr.Madison、米国ウィスコンシンのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTAを含むがこれに限定されない）により実行されうる。CLUSTALプログラムは、HigginsおよびSharp(1988)Gene、73:237-244およびHigginsおよびSharp(1989)CABIOS 5:151-153；Corpetら（1988）Nucleic Acids Research 16、10881-90；Huangら（1992）Computer Applications in the Biosciences 8、155-65、およびPearsonら（1994）Methods in Molecular Biology 24、307-31により十分に記載されている。一般的には、アラインメントを視覚的に検査し、コンピューターを利用して調整した後に、手動で精緻化する。
【００３１】
配列同一率（％）および配列類似率（％）を決定するのに適した好ましいアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムであり、これはAltschulら、Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)およびAltschulら、J.Mol.Biol.215:403-410(1990)にそれぞれ記載されている。BLASTおよびBLAST2.0を、本明細書に記載のデフォルトパラメータと共に使用して、本発明の核酸およびタンパク質についての配列同一率（％）を決定する。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により公共的に入手可能である。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（W）11、期待値（E）10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、ワード長3、期待値（E）10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff&Henikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)を参照されたい）、アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。
【００３２】
「アルキル」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特記しない限り、直鎖または分岐鎖または環式の炭化水素基、あるいはそれらの組合せを意味し、これは完全に飽和しているか、モノ不飽和またはポリ不飽和であってよく、かつ指定した炭素原子数を有する二価または多価の基を含むことができる（すなわちC1-C10は1個から10個の炭素を意味する）。飽和炭化水素基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えばn-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルなどの相同体および異性体などの基が含まれるがこれらに限定されない。不飽和アルキル基は、1つまたは複数の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例には、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、およびより高級な相同体および異性体が含まれるが、これらに限定されない。「アルキル」という用語は、特記しない限り、以下により詳細に定義したアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」を含むことを意味する。炭化水素基に限定されるアルキル基は、「ホモアルキル」と称される。
【００３３】
「アルキレン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、-CH2CH2CH2CH2-により例示されるがこれに限定されない、アルカンに由来する二価基を意味し、かつ「ヘテロアルキレン」として後述する基がさらに含まれる。一般的には、アルキル（またはアルキレン）基は、1個から24個の炭素原子を有し、10個またはそれ未満の炭素原子を有するような基が本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般的に8個またはそれ未満の炭素原子を有するより短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
【００３４】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）なる語は、その慣用的な意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を介して分子の残りに付着されるアルキル基を意味する。
【００３５】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体または別の語と組合わせて、特記しない限り、記載の炭素原子数およびO、N、Si、およびSからなる群より選択される少なくとも1つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分岐鎖または環式の炭化水素基、あるいはそれらの組合せを意味し、ここで窒素原子および硫黄原子は選択的に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は選択的に4級化されてもよい。ヘテロ原子（群）O、N、およびSおよびSiは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置に、またはアルキル基が分子の残りに付着される位置に配置され得る。例には、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、および-CH=CH-N(CH3)-CH3が含まれるがこれらに限定されない。2つまでのヘテロ原子が連続してもよく、例えば、-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3が挙げられる。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、-CH2-CH2-S-CH2CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-により例示されるがこれらに限定されない、ヘテロアルキルに由来する二価の基を意味する。ヘテロアルキレン基に関して、ヘテロ原子は、鎖末端の一方または両方を占有することもできる（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。またさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基に関して、連結基の式が記載されている方向は、連結基の配向を暗示するわけではない。例えば、式-C(O)2R'-は、-C(O)2R'-および-R'C(O)2R-の両方を示す。
【００３６】
「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体または他の語との組合せで、特記しない限り、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環式形を示す。さらに、ヘテロシクロアルキルに関して、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りに付着される位置を占有できる。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれるがこれらに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例には、1-(1,2,5,6-テトラヒドロピリジル)、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニルなどが含まれるがこれらに限定されない。
【００３７】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（C1-C4）アルキル」という用語は、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどが含まれるがこれらに限定されないことを意味する。
【００３８】
「アリール」という用語は、特記しない限り、単環または一緒に縮合されているかもしくは共有結合的に連結した多環（三環まで）であり得る、多不飽和で芳香族の炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、N、O、およびSから選択された0個から4個のヘテロ原子を含むアリール基（または環）を意味し、窒素原子および硫黄原子は選択的に酸化されており、かつ窒素原子は選択的に4級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を通して残りの分子に付着されうる。アリール基およびヘテロアリール基の非制限的な例には、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソキサゾリル、4-イソキサゾリル、5-イソキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル、および6-キノリルが含まれる。前記したアリールおよびヘテロアリール環系の各々の置換基は、下記の許容可能な置換基の群より選択される。
【００３９】
簡潔にするために、「アリール」という用語は他の用語と組合わせて使用した場合（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、前記に定義したようなアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。従って、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子により置換されているアルキル基（例えばフェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど）を含む、アルキル基にアリール基が付着している基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）を含むことを意味する。
【００４０】
前記の各用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、示した基の置換形および非置換形の両方を含むことを意味する。各々のタイプの基に好ましい置換基は、以下に提供する。
【００４１】
アルキルおよびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとしばしば称される基を含む）の置換基は、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'-、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CN、および-NO2から選択されるがこれらに限定されない0から（2m'＋1）の範囲の数の多様な1つまたは複数の基であり得、ここでm'はこのような基における炭素原子の総数である。R'、R''、R'''、およびR''''は、各々好ましくは独立して、水素、およびヘテロアルキル、非置換アリール、1個から3個のハロゲンで置換されたアリール、非置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリール-(C1-C4)アルキル基を意味する。本発明の化合物が例えば2つ以上のR基を含む場合、R'基、R''基、R'''基、およびR''''基が2つ以上存在する場合の各々と同様に、各R基は独立して選択される。R'およびR''が同じ窒素原子に付着している場合、それらは窒素原子と合わせて、5、6、または7員環を形成することができる。例えば、-NR'R''は、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルを含むがこれらに限定されないことを意味する。置換基に関する前記の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば-CF3および-CH2CF3）およびアシル（例えば-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3など）を含むことを意味すると理解するであろう。
【００４２】
アルキル基について記載した置換基と同様に、アリール基およびヘテロアリール基の置換基は種々であり、0から芳香族環系上の開いた原子価の総数までの数の、例えば、ハロゲン、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R''R''')=NR''''、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CN、および-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、フルオロ(C1-C4)アルコキシ、およびフルオロ(C1-C4)アルキルから選択され；ここでR'、R''、R'''、およびR''''は、好ましくは独立して、水素、(C1-C8)アルキルおよびヘテロアルキル、非置換アリールおよびヘテロアリール、(非置換アリール)-(C1-C4)アルキル、および(非置換アリール)オキシ-(C1-C4)アルキルから選択される。本発明の化合物が例えば複数のR基を含む場合、R'基、R''基、R'''基、およびR''''基が複数存在する場合の各々と同様に、R基はそれぞれ独立して選択される。
【００４３】
アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の2つの置換基は選択的に、式-T-C(O)-(CRR'2)q-U-の置換基で置換され得；ここでTおよびUは、独立して、-NR-、-O-、-CRR'-、または単結合であり、qは0から3の整数である。または、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の2つの置換基は、選択的に、式-A-(CH2)r-B-の置換基で置換され得、ここでAおよびBは、独立して、-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-、または単結合であり、rは1から4の整数である。このように形成された新しい環の単結合の1つは、選択的に、二重結合で置換されてもよい。または、アリール環またはヘテロアリール環の隣接する原子上の2つの置換基は選択的に式-(CRR')s-X-(CR''R''')t-の置換基で置換され得、ここでsおよびtは、独立して、0から3の整数であり、Xは、-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、または-S(O)2NR'-である。置換基R、R'、R''、およびR'''は、好ましくは独立して、、水素または置換もしくは非置換(C1-C6)アルキルから選択される。
【００４４】
本明細書で使用される「ヘテロ原子」という用語は、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）、およびケイ素（Si）を含むことを意味する。
【００４５】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載した化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的無毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能性を含む場合、中性型のこのような化合物を、十分量の所望の塩基と、ニートでまたは適切な不活性溶媒中で接触させることにより塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウムの塩、または類似の塩が含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能性を含む場合、中性型のこのような化合物を、十分量の所望の酸と、ニートでまたは適切な不活性溶媒中で接触させることにより酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸などのような無機酸由来の塩、ならびに、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、乳酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒性の有機酸由来の塩が含まれる。また、アルギネートなどのようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えばBergeら、「薬学的塩（Pharmaceutical Salts）」、Journal of Pharmaceutical Science、1977、66、1-19を参照されたい）。本発明の一部の特定の化合物は、化合物を塩基付加塩または酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする、塩基性官能性および酸性官能性の両方を含む。
【００４６】
中性型の化合物は、好ましくは、塩を塩基または酸と接触させて、慣用的な方法で親化合物を単離することにより再生される。親型の化合物は、極性溶媒中での溶解度などの一部の物理的特性において種々の塩型とは異なるが、その他の点では、本発明の目的に関して塩は親型の化合物と等価である。
【００４７】
塩型の他に、本発明は、プロドラッグ型の化合物を提供する。本明細書に記載した化合物のプロドラッグは、生理的条件下で化学的変化を容易に受けて本発明の化合物を与える化合物である。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境における化学的または生化学的な方法により、本発明の化合物に変換されうる。例えば、プロドラッグは、経皮パッチレザバー中に適切な酵素または化学的試薬と共に配置された場合に、本発明の化合物ヘとゆっくりと変換されることができる。
【００４８】
本発明の化合物の一部は、非溶媒和型ならびに溶媒和型（水和型を含む）として存在できる。一般に、溶媒和型は非溶媒和型と等価であり、かつ本発明の範囲内に包含される。本発明の化合物の一部は、複数の結晶型または無定型で存在し得る。一般に、全ての物理的形状は、本発明により考えられる用途において同等であり、本発明の範囲内であることが意図される。
【００４９】
本発明の化合物の一部は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有し；ラセミ体、ジアステレオ異性体、幾何学的異性体、および個々の異性体は、本発明の範囲内に包含される。
【００５０】
本発明の化合物はまた、このような化合物を構成する1つまたは複数の原子において、非天然的な割合の原子同位体を含み得る。例えば、本化合物は、放射性同位体、例えばトリチウム（3H）、ヨウ素-125(125I)、または炭素-14（14C）で放射標識され得る。本発明の化合物の同位体変種の全ては、放射性であってもなくても、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【００５１】
突然変異誘発ヌクレオシドについてのアッセイ法
1つの態様において、本発明の好ましいヌクレオシド類似体、例えば5-ホルミルウリジンおよびイソグアノシンならびにその誘導体および変種は、ポリメラーゼにより組み込まれて伸長されることができる。一般に、このような類似体は、RNAまたはDNAヘと組み込まれた後のポリメラーゼ分子によるそれらの伸長を可能にするホスホジエステル結合を有する。従って、鎖終結を引き起こす一部のウイルス阻害剤（例えば3'-ヒドロキシル基を欠失した類似体）とは異なり、本発明の好ましい類似体とは、一般的に、その組み込み時にRNAまたはDNAの合成を終結させない非鎖終結（non-chain-terminating）類似体である。その代わり、それらは好ましくは誤差誘発類似体であり、DNAまたはRNAの産物に組み込まれることができるが、その組み込み位置において塩基対形成特性を効果的に変化させ、これにより組み込み部位においてRNA配列またはDNA配列無いに誤差を導入する。
【００５２】
ヒトRNAポリメラーゼIIおよびウイルスポリメラーゼ／レプリカーゼなどのポリメラーゼによる改変ヌクレオチドの組み込み、または細胞キナーゼによるヌクレオシド類似体のリン酸化に関するパラメータの決定は、DNAポリメラーゼによるデオキシヌクレオシド三リン酸の組み込みに使用されるのと類似した方法により行なわれる（Boosalisら、J.Biol.Chem.262:14689-14698(1987)）。選択された状況において、ウイルスゲノムに導入される突然変異の頻度を直接決定（JiおよびLoeb、Virol.、199:323-330(1994)）できる。
【００５３】
ヌクレオシド類似体は、細胞性ポリメラーゼまたはウイルスポリメラーゼにより、インビトロアッセイ法において等量で比較した場合、天然の相補的核酸の効率の少なくとも約0.1％、好ましくは少なくとも約5％、最も好ましくは同等の効率で、ゲノム核酸のDNAコピーまたはRNAコピーに組み込まれる。従って、1000塩基以上において誤差率約1は、ウイルスの変異誘発を増大させるのに十分である。ヌクレオシド類似体が不正確な塩基対形成を引き起こす能力は、DNAまたはRNAヘの類似体の組み込みにより生じる突然変異の頻度および性質の試験および調査により決定され得る。例えば、溶菌（lytic）RNAウイルス（例えばインフルエンザA）における突然変異率は、DNAウイルスにおいてよりも約300倍高いことが報告されている（Drake、PNAS、USA 90:4171-4175(1993)）。しかし、レトロウイルスは通常、溶解RNAウイルスよりも約1桁低い平均的割合で突然変異すると考えられている。
【００５４】
例えば、HIVの場合、ウイルスRNAまたは組み込まれたHIVのDNAは、相補的プライマーおよび4つ全てのデオキシヌクレオシド三リン酸を用いたPCR反応を使用して、逆転写酵素により、およびその後DNAポリメラーゼによりコピーされる。コピーされたゲノム領域は、逆転写酵素遺伝子における600ヌクレオチドセグメントに対応する。70ラウンドのPCR後にコピーされたDNAまたはRNAを、プライマー配列を切断する制限酵素で処理し、プラスミドに連結する。大腸菌のトランスフェクション後に個々のクローンを得、プラスミド内の増幅セグメントをシークエンシングする。この領域内の突然変異は、コンピュータを利用した解析により、個々の配列を、RNA類似体の非存在下で同じウイルスを平行培養することにより得られた対照ウイルス配列と比較して決定される。10回の連続的なウイルス継代後、またはウイルス検出の消失時点で、各ヌクレオチドについて決定を行なう。類似した手順は、他の関心対象のウイルスにも効果的であり、当業者には容易に理解されよう。
【００５５】
細胞性もしくはウイルス性のRNAポリメラーゼによる、逆転写酵素（または他のウイルス酵素）による、またはDNAポリメラーゼによる類似体の組み込みを、直接または別々に比較することができ、別々の試験結果はその後に比較される。関心対象のポリメラーゼないで類似体の組み込みの比較は、ヌクレオチド組み込みに関して「マイナス」シークエンシングゲルアッセイ法の変法を使用して実施できる。4つのヌクレオシド三リン酸のうち3つおよび1つの三リン酸型類似体を含む反応液中で、5'-32P標識プライマーを伸長させる。鋳型は、適宜、RNAまたはDNAのいずれかであり得る。反応から排除されるヌクレオチドに相補的な鋳型ヌクレオチドを超えるプライマーの伸長は、類似体の組み込みに依存しかつ比例すると考えられる。類似体の組み込み量は、ある位置から次の位置ヘとシークエンシングゲル上で伸長されるオリゴヌクレオチドの割合の関数として計算される。組み込みはオートラジオグラフィーにより判定し、次いで、デンシトメトリーを行うか、または、各バンドを切り出して液体シンチレーション分光法により放射能を計測する。
【００５６】
本発明のヌクレオシド類似体をウイルス感染細胞にインビトロまたはインビボのいずれかで投与する場合、相同的な複製ウイルス核酸の高度可変（highly variable）群を含む、細胞群が産生される。高度可変細胞群は、変異原性ヌクレオシド類似体のウイルス感染細胞への投与、およびウイルス群の突然変異率の増加に起因する。従って、高度可変ウイルス群は、ウイルスの突然変異率が、ヌクレオシド類似体の投与により増加したという指標となる。群の可変性を測定することにより、ウイルス群の生存度の評価が得られる。言い換えると、ウイルス群の生存度は、細胞群の健康についての予診的指標となる。例えば、ヒト患者におけるHIV群の生存度の低さは、患者の予後の改善に対応する。
【００５７】
好ましくは、選択した変異原性ヌクレオシド類似体は水溶性であり、かつ標的細胞内に急速に進入する能力を有すると考えられる。一般的にはあまり望ましくないが、脂質可溶性類似体もまた、特に血液-脳関門を通過する必要がある場合には有用であると考えられる。ヌクレオシド類似体は、必要であれば、細胞キナーゼによりリン酸化され、RNAまたはDNAに組み込まれる。
【００５８】
ヌクレオシドの調製
本発明の化合物は、容易に入手可能な出発材料または既知の中間体を使用して調製されうる。本発明の方法に使用するために、ヌクレオシド誘導体は好ましくはその一リン酸、二リン酸、または三リン酸として調製される。ヌクレオシド類似体のリン酸化は、一般的には、酵素的方法、化学的方法、または酵素的方法と化学的方法との併用により行なわれる。ホスホトランスフェラーゼ活性の供給源として小麦シュート抽出物の粗供給源を使用して、酵素的リン酸化を実施できる（Giziewiczら、Acta.Biocim.Pol.22:87-98(1975)；およびSugar、IN MOLECULAR ASPECTS OF CHEMOTHERAPY、Springer-Verlag、1991、p.240-270を参照されたい）。リン酸化はまた、Blackら、Biochemistry 32:11618-11626(1993)に記載のようにヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたはその突然変異体を使用して実施されうる。ヘルペスチミジンキナーゼは広範な基質特異性を有し、多種多様なヌクレオシド類似体をリン酸化する。得られる一リン酸の精製は、HPLCを使用して達成できる。
【００５９】
一リン酸誘導体を三リン酸ヘさらに変換するためには、典型的には、Hoardら、J.Am.Chem.Soc.87:1785-1788(1965)(これは参照として本明細書に組み入れられる)に提供された方法などの化学的方法を使用する。
【００６０】
当技術分野において既知であるように、ヌクレオシド、ヌクレオシドおよびその類似体は、ラセミ混合物として、または、いずれかのエナンチオ種が普及している（典型的には約70％を超える普及率、より好ましくは約90％を超える普及率、さらにより好ましくは約98％を超える普及率）エナンチオ特異的組成物として調製できる。例えば、非天然立体配置またはL-エナンチオマー立体配置において優性であるエナンチオ特異的ヌクレオシド類似体を（例えばD-リボースの代わりにL-リボースを組み込むことにより）入手または合成できる。エナンチオ特異的ヌクレオシド組成物は、活性をさらに最適化し毒性を最小限にするための本発明の文脈において使用可能である。説明として、本発明の文脈において活性を示すラセミ混合物について、そのエナンチオ特異的組成物の1つは、典型的には、他方よりも高い活性および／または高い特異性（および従って、任意の特定の濃度における副作用の可能性がより低い）を示しうる。それ故、このような類似体のエナンチオ特異的組成物を使用して、効力および／または特異性を最適化できる。
【００６１】
エナンチオ特異的類似体（および／または他の構造変種）を使用して、本発明の文脈において使用されるべき類似体の細胞内局在化に影響を及ぼすこともできる。特に、エナンチオ特異的または他の変種類似体は、このような類似体の取り込みまたは細胞内局在化に関与する細胞機構により、より効率的に処理され得る。例えば、標的とする哺乳動物細胞により優先的に取り込まれる（および／または標的とする哺乳動物細胞のサイトゾルに局在する）類似体を使用できる。ここでも、説明のために、本発明の文脈において活性を示すラセミ混合物について、そのエナンチオ特異的組成物の1つは、一般的には他方よりも大きな細胞取り込み（および／またはサイトゾルヘのより多い分配）を示す。このような構造的多様性はまた、類似体が酵素（例えば、組み込み前にヌクレオシドをヌクレオシドリン酸に変換できる細胞キナーゼ、またはホスファターゼなどの細胞性分解酵素）により処理される効率に影響を及ぼすと考えられ、これにより、より高い活性および／または安定性を示す組成物を単離できる。
【００６２】
前記のヌクレオシド類似体およびヌクレオシド類似体三リン酸の他に、本発明は、コンビナトリアル合成法を使用して調製される一部の誘導体を利用する。例えば、前記したモノマーの混合物を、標準的な合成法を使用して保護し、その後、脱水、光誘導性の結合切断または異性化、酸化、還元、アルキル化、アシル化などの1つまたは複数の化学的形質転換に供することができる。
【００６３】
イソグアノシンおよびその類似体の調製
イソグアノシンは、天然供給源から単離できる（例えば、Kimら、Arch.Pharm.Res.17:115-118(1994)を参照されたい）。イソグアノシンおよび類似体の合成も当業者には既知である。例えばCottamら、Nuc.Acids Res.11:871-882(1983)；Yamazakiら、Nuc.Acids Res.3.251-259(1976)；およびMarumotoら、Nuc.Acids Res.18:37-40(1987)を参照されたい。
【００６４】
5-ホルミルウリジンおよびその類似体の調製
DNAにおけるチミングリコールから5-ヒドロキシメチルウラシルヘの酸化は、酸化またはγ線照射により引き起こされる天然過程である（R.Teouleら、Radiat.Res.57、46(1974)）。同じ過程が、チミンおよび多くのチミン誘導体のペルオキソ二硫酸イオンを用いた、70℃における処理により、インビトロにおいて観察されている（T.Itaharaら、Bull.Chem.Soc.Jpn.67、2257-2264(1994)）。研究者らは、他の主要な生成物である5-ホルミルウラシルが、これらの反応において5-ヒドロキシメチルウラシルと共に形成されることを見出した。本発明者らは、5-ホルミルウラシルヌクレオシドおよびその類似体の一般的な合成法として、このチミンヌクレオシドおよび類似体の既知の酸化を選択した。
2005505536.tif 000003
【００６５】
対応するグリコシル化チミン誘導体は、市販されているか、または、既知の文献手順により合成されうる。チミジン（β-D-糖型、X=H、Y=H）、α-チミジン（α-D-糖型、X=H、Y=H）、1-β-D-アラビノフラノシルチミン（β-D-糖型、X=H、Y=OH）、および5-メチルウリジン（β-D-糖型、X=OH、Y=H）はSigmaから入手できる。
【００６６】
L-チミジン（β-L-糖型、X=H、Y=H）は、既知の方法（E.Moyroundら、Nucleosides Nucleotides 18、4-5、1999、693-696）により合成できる。5-メチル-L-ウリジン（β-L-糖型、X=OH、Y=H）も既知である（E.Moyroundら、Tetrahedron、56(11)、2000、1475-1484）。そのα型（α-L-糖型、X=OH、Y=H）はTougard、Acta Crystallogr.Sect.B.、29、1973、2227に報告されている。同じ論文により、1-β-L-アラビノフラノシルチミン（β-L-糖型、X=H、Y=OH）が報告された。1-α-D-アラビノフラノシルチミン（α-D-糖型、X=H、Y=OH）は、方法（Roberts、Visser J.Am.Chem.Soc.、74、1952、668）により合成されうり、そのL異性体の1-α-L-アラビノフラノシルチミン（α-L-糖型、X=H、Y=OH）は（S.Czerneckiら、Synthesis 9、1991、683-686）により合成されうる。
【００６７】
蛍光修飾された糖を有する化合物は文献において知られている。1-(2'-デオキシ-2'-フルオロ-β-D-アラビノフラノシル)チミン（FMAU）（β-D-糖型、X=H、Y=F）および1-(2'-デオキシ-2'-フルオロ-α-D-アラビノフラノシル)チミン（α-D-糖型、X=H、Y=F）の両方が知られている（Tann,C.H.ら、J.Org.Chem.、50(19)、1985、3644-3647）。FMAUはまた、K.A.Watanabeら、J.Med.Chem.、26(2)、1983、152-156により合成でき、そのL異性体（L-FMAU）2'-デオキシ-2'-フルオロ-5-メチル-β-L-アラビノフラノシルウラシル（β-L-糖型、X=H、Y=F）の実際的な合成も公表されている（J.Du.ら、Nucleosides Nucleotides 18、2、1999、187-195）。2'-フルオロ-5-メチル-2'-デオキシウリジン（β-D-糖型、X=F、Y=H）は、Codingtonら、J.Org.Chem.29、1964、558-563により合成できる。2'-デオキシ-2',2'-ジフルオロ-5-メチル-ウリジン（β-D-糖型、X=F、Y=F）およびそのL-異性体の2'-デオキシ-2',2'-ジフルオロ-5-メチル-L-ウリジン（β-L-糖型、X=F、Y=F）は、本発明者らの知る限りでは知られていないが、既知の2'-デオキシ-2',2'-ジフルオロウリジンと同じように合成できる（L.W.Hertelら、J.Org.Chem.、53(11)、1988、2406-2409）。
【００６８】
未知のL-ヌクレオシド類似体のほとんどは、既知のD-ヌクレオシドに関する以下の確立された手順により合成可能である。なぜなら、L-ヌクレオシドに関して、対応する出発材料のほとんどは市販されているからである。
【００６９】
または、5-ホルミルウラシルヌクレオシドおよび類似体は、5-ホルミルウラシルを対応するハロ糖でグリコシル化することにより合成されうる。α-アノマー型およびβ-アノマー型のヌクレオシド類似体の分離可能な混合物は、標準的に単離される。このアプローチは、2-デオキシ-3,5-ジ-O-p-トルオイル-D-リボフラノシルクロライドを用いた、既知の5-ホルミルウラシルのグリコシル化の例により実証されうる（M.P.Mertes、J.Heterocycl.Chem.、7、1970、751）。
2005505536.tif 000004
【００７０】
5-ホルミルウラシルのα-アノマー型のヌクレオシド類似体のいくつかは、入手し易いβ-アノマーの既知の塩基触媒性アノマー化により得られうる（V.W.Armstrongら、Nucl.Acids Res.3(7)1976、p.1791-1810）。
2005505536.tif 000005
【００７１】
5-ホルミルウラシルヌクレオシドおよび類似体を、多くの既知の方法により保護できる。血流中において反応性5-ホルミルウラシルが、対応するカルボン酸ヘと酸化されることまたはタンパク質とのそれらが反応することを防ぐために、アルデヒド基の保護が必要となる可能性がある。生物学的利用能も薬物分子の疎水性により影響を受ける可能性があるが、これは、アルデヒドの適切な誘導体化／保護により調整可能である。活性アルデヒドの放出は、細胞内のpH変化および／または酵素作用により補助され得る。アルデヒドの最も一般的な酸不安定性保護とは、アセタール形成である。アセタールの最適安定性は、アルデヒド基の保護について適切なアルコールを選択することにより達成できる。一般的には、環式アセタールは、加水分解条件に対してより安定である。
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【００７２】
アルデヒドの、別の一般的な誘導体化は、ヒドラジドの形成である。
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【００７３】
pH、およびR基の種類に応じた安定性によって、ヒドラジドは変化する。適切な誘導体化により、酸性pHのリソソームの下または還元環境の下において細胞内で活性アルデヒドを放出する化合物が得られうる。
【００７４】
異なる糖を有する多くの5-ホルミルウラシルを合成できる。化合物1-β-D-アラビノフラノシル-5-ホルミルウリジン（β-D-糖型、X=H、Y=OH）はすでに、市販の1-β-D-アラビノフラノシルチミン（β-D-糖型、X=H、Y=OH）から合成されており、現在試験中である。D型およびL型の両方のフルオロ修飾糖でグリコシル化された5-ホルミルウリジンも合成できる。これらは新規化合物であり、いくつかの珍しい特性が生じることが期待され得る。プロドラッグ型には、アセタールおよびヒドラジドのようなアルデヒドが含まれる。
【００７５】
投与および薬学的組成物
薬学的に許容される担体は、一部には、投与する特定の組成物、および組成物の投与に使用する特定の方法により決定される。従って、本発明の薬学的組成物の適切な製剤は広範に存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第17版、1989）。
【００７６】
経口投与に適した製剤は、（a）液体溶液、例えば、水、生理食塩水、またはPEG400などの希釈液中に懸濁された、有効量のパッケージングされた核酸；（b）各々、液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして所定の量の活性成分を含む、カプセル剤、カシェ剤、または錠剤；（c)適切な液体中の懸濁液；および（d）適切なエマルジョンからなり得る。錠剤形は、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤化剤、保存剤、香味剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合性の担体の1つまたは複数を含むことができる。ロゼンジ形は、例えばショ糖などの香味中に活性成分を含むことができ、トローチは、ゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖などの不活性基剤中に活性成分を含み、かつ、アラビアゴムエマルジョン、ゲルなどは活性成分の他に当技術分野において既知の担体を含むことができる。
【００７７】
選択した化合物を単独でまたは他の適切な成分と組合わせて、吸入により投与されるエアゾール製剤にすることができる（すなわちこれらは「噴霧」されうる）。ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴射剤中に、エアゾール製剤を入れることができる。
【００７８】
直腸投与に適した製剤には、坐剤基剤と共にパッケージングされた核酸からなる、例えば坐剤が含まれる。適切な坐剤基剤には、天然もしくは合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が含まれる。さらに、選択した化合物と基剤（例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素を含む）との組合せからなるゼラチン直腸カプセルを使用することもできる。
【００７９】
例えば、動脈内（関節内）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下経路などによるの非経口投与に適した製剤には、水性および非水性の等張無菌注射溶液（これは抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および、対照レシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含むことができる）、ならびに、水性および非水性の無菌懸濁液（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含むことができる）が含まれる。本発明の実践において、組成物は、例えば、静脈内注入により、経口で、局所的に、腹腔内で、膀胱内で、または髄腔内で投与されうる。非経口投与、経口投与、および静脈内投与が、好ましい投与法である。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどの、単回用量または複数回用量の密封容器で提供されうる。
【００８０】
注射溶液および懸濁液は、前記した種類の無菌粉末、顆粒、および錠剤から調製されうる。エクスビボ治療用の核酸が形質導入された細胞もまた、前記したように静脈内にまたは非経口的に投与されうる。
【００８１】
薬学的調製物は、好ましくは単位剤形である。このような形において、調製物は、適切な量の活性成分を含む単位用量へとさらに分割される。単位剤形はパッケージング調製物であり得、パッケージは、バイアルもしくはアンプル中に小分けされた錠剤、カプセル剤、および散剤などの、別個の量の調製物を含む。また、単位剤形とは、カプセル剤、錠剤、カシェ剤、またはロゼンジ自体であってもよく、または、適切な数の、パッケージングされた形状のこれら任意のものであり得る。本組成物は、望ましいならば、他の適合性の治療剤を含むことができる。
【００８２】
治療的有効量の化合物とは、感染またはウイルス力価を測定可能に減少させる化合物、またはさもなくば、ウイルス症状の主観的な寛解をもたらす、もしくは、臨床医または他の有資格観察者に認められるような同定可能な客観的改善をもたらす化合物である。
【００８３】
ウイルス感染の治療のための治療的用途において、本発明の薬学的方法で利用される化合物は、初回投与量1日あたり約0.001mg/kgから約1000mg/kgで投与される。約0.01mg/kgから約500mg/kg、または約0.1mg/kgから約200mg/kg、または約1mg/kgから約100mg/kg、または約10mg/kgから約50mg/kgの1日量範囲を使用できる。しかし、投与量は、患者の必要量、治療される状態の重篤度、および使用する化合物に応じて変化し得る。本発明の文脈において患者に投与される用量は、患者において経時的に有益な治療応答をもたらすのに十分でなければならない。用量のサイズもまた、特定の化合物の投与に伴う任意の副作用の存在、性質、および程度により決定される。特定の状況における適切な用量の決定は、医師の技術内である。一般に、治療は、その化合物の最適用量よりも少ない量で開始される。その後、環境下で最適な効果が達成されるまで少しずつ用量を増加する。望ましいならば、簡便のために、全1日量を分割して、1日の間に少しずつ投与してもよい。
【００８４】
本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願は、各々の刊行物または特許出願が個々にかつ具体的に参照として組み入れられることが示されるのと同様に、参照として本明細書に組み入れられる。
【００８５】
前記の本発明は、理解を明確にするのを目的として、説明および例証のために幾分詳細に記載されたが、本発明の開示に照らせば、当業者には、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変化および改変を行ない得ることが容易に理解されると考えられる。
【００８６】
実施例
以下の実施例は制限のためではなく、説明のために提供されるものである。当業者は、変化または改変されても本質的に同様の結果をもたらしうる、多くの重要でないパラメータを容易に認識すると考えられる。
【００８７】
実施例1：MVまたはBVDVに感染した細胞培養物における5-ホルミルウリジンおよびイソグアノシンの活性
細胞毒性を、CV-1細胞またはBT細胞において段階的な量のヌクレオシド類似体を使用してアッセイした。100pfuのウイルスを、105個のCV-1細胞（MV）またはBT細胞（BVDV）に接種した。MVまたはBVDV（HCVの代用）に対する抗ウイルス活性を、類似体の存在下または非存在下でウイルスを継代することにより試験した。
【００８８】
スクリーニング実験において、薬物の存在下または非存在下で3日間から4日間、細胞中で増殖させた後、細胞変性効果（CPE）およびウイルス力価により、MVまたはBVDVの複製を評価した。ウイルスを、処置群が消滅するまで連続的に継代した。実験は三つ組みで実施した（図12および図4を参照されたい）。
【００８９】
5-ホルミルウリジンについて、シークエンシングを実施し、ウイルス消滅が、ヌクレオシドによるウイルス突然変異誘発に起因することを確認した。MVクローンを、4継代目の処置ウイルスおよび対照ウイルスから選択し、1kb断片のマトリックスおよび1.7kb断片のポリメラーゼをシークエンシングした。図3に示したように、0.15mMの5-ホルミルウリジンの存在下での突然変異率は、MVの自発的突然変異率の1.6倍である。BVDV糖タンパク質の断片も同様にシークエンシングしたが、ここで、BVDVウイルスは2mMの5-ホルミルウリジンで処理された。1継代目では、処置ウイルスは、ヌクレオシド存在下において3.75倍の突然変異増加を示した（図5を参照されたい）。
【００９０】
5-ホルミルウリジンのIC50は、1mMを上回った。濃度0.5mMで、5-ホルミルウリジンは、1継代中のMVおよびBVDV複製を完全に阻害した。EC50は、両方のウイルスについて0.15mMであり、EC90はMVでは0.3mMであり、BVDVでは0.4mMであった。
【００９１】
イソグアノシンおよび2,6ジアミノプリンリボシドも同様に、BVDVに対する抗ウイルス活性について試験した。ウイルス複製は、1回の継代の後に阻害された（図6を参照されたい）。EC50は、2,6ジアミノプリンリボシドでは70μMであり、イソグアノシンでは80μMである。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明のいくつかの化合物を示す。
【図２】DMSO対照と比較した、麻疹ウイルス（MV）に対する5-ホルミルウリジンおよび5-ヒドロキシウリジンの活性を示す。％CPEは、ウイルスにより誘導された細胞変性効果を示す組織培養細胞の割合（％）を意味する。
【図３】MVを5-ホルミルウリジンで処理することにより誘導された突然変異を示す。マトリックス遺伝子1kb断片および4継代のMVクローンのポリメラーゼ1.7kb断片、MVは0.15mMの5-ホルミルウリジン対DMSO対照で処理。
【図４】DMSO対照と比較した、BVDVに対する5-ホルミルウリジンおよび5-ヒドロキシウリジンの活性を示す。％CPEは、ウイルスにより誘導された細胞変性効果を示す組織培養細胞の割合（％）を意味する。
【図５】BVDVを5-ホルミルウリジンで処理することにより誘導された突然変異を示す。1継代のBVDVクローンの糖タンパク質遺伝子1kb断片、BVDVは2mMの5-ホルミルウリジン対DMSO対照で処理。
【図６】リバビリンと比較した、BVDVに対する5-ホルミルウリジン、2,6-ジアミノプリンリボシド、及びイソグアノシンの抗ウイルス活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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