(57)【要約】本発明は、一般的に細胞（たとえば真核細胞）に巨大分子および化合物（たとえば核酸分子）を導入するために有用である、細胞培養培地（特に、無血清、非動物由来、および/または化学的に規定された培地）に向けられる。本発明に従って、このような導入が、前記培地の存在下において生じ得る。次いで、このように導入された物質を含む細胞を、培地において培養することができ、かつ導入された物質の細胞に対する効果を測定または決定することができる。特に、本発明は、細胞（特に真核細胞）への核酸分子（たとえばベクター）の導入、および細胞における核酸分子によってコードされるタンパク質の発現を可能にする。本発明は、細胞に異なる手順（たとえば、細胞を培養する段階対、細胞をトランスフェクションする段階）が行われるたびに、細胞培養培地を交換する必要を除去する。したがって、本発明は、トランスフェクションおよび発現研究の間に、細胞の多数の操作および移動の必要性が避けられる。また、本発明は、細胞を培養および形質転換/トランスフェクションするために有用な組成物ならびにキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養において少なくとも1つの真核細胞への1つまたは複数の巨大分子の導入を支持し、かつ導入に続く少なくとも1つの該細胞の培養を支持する細胞培養培地であって、
少なくとも1つの細胞の増殖を支持するために、少なくとも1つの細胞の存在から、導入の間に使用した培地を除去する必要がなく、かつ/または、
導入後に、導入を行った培地の体積の約10倍以下までの、ほぼ同体積である培地の体積での培養において、増殖が達成され得る培養培地。
【請求項２】
導入の前に少なくとも1つの細胞の培養を支持することができる、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項３】
導入の前に培養を支持することができ、かつ導入前の培養の間に除去される必要がない、請求項2記載の細胞培養培地。
【請求項４】
導入の後に、培地を新しい培地で補給、置換、または補足することが、補給、置換、または補足がされない培地における培養と比較して、培養を改善しない、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項５】
新しい培地で補給、置換、または補足することが、補給、置換、または補足がされない培地におけるタンパク質収量と比較して、少なくとも1つの細胞のタンパク質収量を改善しない、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項６】
培養が懸濁培養である、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項７】
1つまたは複数の巨大分子が、少なくとも1つの核酸分子を含む、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項８】
少なくとも1つの核酸が導入される、少なくとも1つの細胞における核酸の発現を支持する、請求項7記載の細胞培養培地。
【請求項９】
少なくとも1つの核酸分子がデオキシリボ核酸（DNA）である、請求項7記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
培養が少なくとも1つのタンパク質産物の産生を含む、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項１１】
少なくとも1つのタンパク質産物が、少なくとも1つのポリペプチドまたはタンパク質を含む、請求項10記載の細胞培養培地。
【請求項１２】
少なくとも1つのタンパク質産物が、少なくとも1つのタンパク質によって触媒される反応産物である少なくとも1つの分子を含む、請求項10記載の細胞培養培地。
【請求項１３】
無血清培地である、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項１４】
化学的に規定された培地である、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項１５】
低タンパク質または無タンパク質培地である、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項１６】
動物から得られる物質を実質的に欠くか、または含まない、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項１７】
動物由来物質を実質的に欠くか、または含まない、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項１８】
ポリオール、ヒドロキシピリジン誘導体、1,3,5-N,N',N'';-トリス(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)アミノメチルベンゼン、エチレンジ-アミン-N,N'-テトラメチレンホスホン酸、トリスクシン、酸性サッカライド（たとえばグルコン酸第一鉄）、グリコサミノグリカン、ジエチレントリアミン五酢酸、ニトリロ三酢酸モノ-、ビス-、またはトリス-置換2,2'-ビピリジン、ヒドロキサメート誘導体（たとえばアセトヒドロキサム酸）、アミノ酸、デフェロキサミン、フェリオキサミン、鉄塩基性ポルフィン、ポルフィリンおよびその誘導体、DOTA-リジン、テキサフィリン、サプフィリン、ポリアミノカルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸、ポリエチレンカルバメート、ピコリン酸、4-ピリドキシ酸、3-ヒドロキシ-2-ピリジンマルトール、エチルマルトール、黒穂菌属フェリクローム、ニコチン酸-N-オキシド、ならびにIRC011からなる群より選択される、少なくとも1つの化合物を含む、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項１９】
ヒドロキシピリジン誘導体を含む、請求項18記載の細胞培養培地。
【請求項２０】
ヒドロキシピリジン誘導体が、2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド、3-ヒドロキシ-4-ピロン、3-ヒドロキシピピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-ヒドロキシピリド-2-オン、1,2-ジメチル-3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-メチル-3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン、ニコチン酸-N-オキシド、および2-ヒドロキシ-ニコチン酸からなる群より選択される、請求項19記載の細胞培養培地。
【請求項２１】
ヒドロキシピリジン誘導体が2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドである、請求項20記載の細胞培養培地。
【請求項２２】
少なくとも1つのアミノ酸、少なくとも1つのビタミン、少なくとも1つの無機塩、少なくとも1つの有機塩、少なくとも1つの微量金属、少なくとも1つのヌクレオチド、少なくとも1つの緩衝塩、少なくとも1つの糖、少なくとも1つの脂質、および少なくとも1つのホルモンからなる群より選択される、1つまたは複数の成分を含む、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項２３】
アミノ酸、糖、脂肪酸、ビタミン、pH緩衝剤、界面活性剤、微量金属またはその塩もしくは水和物、アミン化合物、増殖因子、モル浸透圧濃度および/もしくはイオン強度を制御し、かつ/または膜ポテンシャルを維持する薬剤、フラビン、解糖系に関与するか、または解糖系の産物である化合物、アルコールアミン、環状アルコール、リン脂質またはその一部分、亜セレン酸の塩、二価または三価のカチオン、プテリジン誘導体、吉草酸、および/または補酵素からなる群より選択される、少なくとも1つの成分をさらに含む、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項２４】
少なくとも1つの細胞が、植物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項２５】
少なくとも1つの細胞が動物細胞である、請求項24記載の細胞培養培地。
【請求項２６】
動物細胞が、哺乳類細胞、魚細胞、昆虫細胞、両生類細胞、および鳥類細胞からなる群より選択される、請求項25記載の細胞培養培地。
【請求項２７】
動物細胞が哺乳類細胞である、請求項26記載の細胞培養培地。
【請求項２８】
少なくとも1つの細胞が上皮細胞である、請求項25記載の細胞培養培地。
【請求項２９】
哺乳類細胞が、293細胞、PER-C6細胞、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、HeLa細胞、およびSp2/0細胞からなる群より選択される、請求項26記載の細胞培養培地。
【請求項３０】
哺乳類細胞が293細胞である、請求項29記載の細胞培養培地。
【請求項３１】
少なくとも1つの細胞は懸濁培養されている、請求項24記載の細胞培養培地。
【請求項３２】
トランスフェリンを実質的に欠くか、または含まない、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項３３】
インスリンを実質的に欠くか、または含まない、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項３４】
いかなるポリアニオン化合物も実質的に欠くか、または含まない、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項３５】
培地が硫酸デキストランを実質的に欠くか、または含まない、請求項1記載の細胞培養培地。
【請求項３６】
導入のために、リポフェクトアミン2000が培地に混合される、請求項1記載の培地。
【請求項３７】
水と、アミノ酸、糖、脂肪酸、ビタミン、pH緩衝剤、界面活性剤、微量金属またはその塩もしくは水和物、アミン化合物、増殖因子、モル浸透圧濃度および/もしくはイオン強度を制御し、かつ/または膜ポテンシャルを維持する薬剤、フラビン、解糖系に関与するか、または解糖系の産物である化合物、アルコールアミン、環状アルコール、リン脂質またはその一部分、亜セレン酸の塩、二価または三価のカチオン、プテリジン誘導体、吉草酸、ならびに/または補酵素からなる群より選択される少なくとも1つの成分とを混合する段階を含む、培地を作製する方法であって、
ここで該培地は、培養物中の少なくとも1つの真核細胞への、1つまたは複数の巨大分子の導入を支持し、かつ導入に続く少なくとも1つの細胞の培養を支持し、
少なくとも1つの細胞の増殖を支持するために、少なくとも1つの細胞の存在から、導入の間に使用した培地を除去するが必要がなく、かつ/または、
導入後に、導入を行った培地の体積の約10倍以下までの、約同体積である培地の体積での培養において、増殖が達成される方法。
【請求項３８】
真核細胞を培養する方法であって：
（a）請求項1記載の細胞培養培地と細胞を接触させる段階；および
（b）培養において細胞の培養を支持するのに適した条件下で、細胞を維持する段階
を含む方法。
【請求項３９】
培養が懸濁培養である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
培地の存在下において、少なくとも1つの細胞に、少なくとも1つまたは複数の化合物、または巨大分子を導入する段階をさらに含む、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
1つまたは複数の化合物または巨大分子が、少なくとも1つの核酸分子を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも1つの核酸分子がデオキシリボ核酸（DNA）である、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
培地が無血清培地である、請求項38記載の方法。
【請求項４４】
培地が化学的に規定された培地である、請求項38記載の方法。
【請求項４５】
培地が、低タンパク質または無タンパク質培地である、請求項38記載の方法。
【請求項４６】
培地が動物から得られる物質を実質的に欠くか、もしくは含まない、または動物由来物質を実質的に欠くか、もしくは含まない、請求項38記載の方法。
【請求項４７】
培地が、ポリオール、ヒドロキシピリジン誘導体、1,3,5-N,N',N''-トリス(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)アミノメチルベンゼン、エチレンジ-アミン-N,N'-テトラメチレンホスホン酸、トリスクシン、酸性サッカライド（たとえばグルコン酸第一鉄）、グリコサミノグリカン、ジエチレントリアミン五酢酸、ニトリロ三酢酸モノ-、ビス-、またはトリス-置換2,2'-ビピリジン、ヒドロキサメート誘導体（たとえばアセトヒドロキサム酸）、アミノ酸、デフェロキサミン、フェリオキサミン、鉄塩基性ポルフィン、ポルフィリンおよびその誘導体、DOTA-リジン、テキサフィリン、サプフィリン、ポリアミノカルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸、ポリエチレンカルバメート、ピコリン酸、4-ピリドキシ酸、3-ヒドロキシ-2-ピリジンマルトール、エチルマルトール、黒穂菌属フェリクローム、ニコチン酸-N-オキシド、ならびにIRC011からなる群より選択される少なくとも1つの化合物を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４８】
培地がヒドロキシピリジン誘導体を含む、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
ヒドロキシピリジン誘導体が、2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド、3-ヒドロキシ-4-ピロン、3-ヒドロキシピピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-ヒドロキシピリド-2-オン、1,2-ジメチル-3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-メチル-3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン、ニコチン酸-N-オキシド、および2-ヒドロキシ-ニコチン酸からなる群より選択される、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
ヒドロキシピリジン誘導体が2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドである、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
培地が、アミノ酸、糖、脂肪酸、ビタミン、pH緩衝剤、界面活性剤、微量金属またはその塩もしくは水和物、アミン化合物、増殖因子、モル浸透圧濃度および/もしくはイオン強度を制御し、かつ/または膜ポテンシャルを維持する薬剤、フラビン、解糖系に関与するか、または解糖系の産物である化合物、アルコールアミン、環状アルコール、リン脂質またはその一部分、亜セレン酸の塩、二価または三価のカチオン、プテリジン誘導体、吉草酸、ならびに/または補酵素からなる群より選択される1つまたは複数の成分を含む、請求項38記載の方法。
【請求項５２】
真核細胞が、植物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項38記載の方法。
【請求項５３】
真核細胞が動物細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
動物細胞が、哺乳類細胞、魚細胞、昆虫細胞、両生類細胞、および鳥類細胞からなる群より選択される、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
動物細胞が上皮細胞である、請求項52記載の方法。
【請求項５６】
動物細胞が哺乳類細胞である、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
哺乳類細胞が293細胞、PER-C6細胞、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、HeLa細胞、およびSp2/0細胞からなる群より選択される、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
哺乳類細胞が293細胞である、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
培地がトランスフェリンを実質的に欠くか、または含まない、請求項38記載の方法。
【請求項６０】
培地がインスリンを実質的に欠くか、または含まない、請求項38記載の方法。
【請求項６１】
培地がいかなるポリアニオン化合物も実質的に欠くか、または含まない、請求項38記載の方法。
【請求項６２】
培地が硫酸デキストランを実質的に欠くか、または含まない、請求項38記載の方法。
【請求項６３】
導入のために、リポフェクトアミン2000が培地に混合される、請求項40記載の方法。
【請求項６４】
培養物中の少なくとも1つの真核細胞に、1つまたは複数の巨大分子を導入するための方法であって：
（a）培養において、請求項1記載の培地中で少なくとも1つの真核細胞を培養する段階；
（b）少なくとも1つの巨大分子の1つまたは複数を、少なくとも1つの細胞に導入させるのに十分な条件下で、培養物中に少なくとも1つの巨大分子を導入する段階；および
（c）産生が少なくとも1つの分子によって制御される産物を産生するために、培地中で少なくとも1つの細胞を培養する段階、
を含み、
ここで少なくとも1つの細胞の増殖は、新しい培地を含まない培地中において継続し、
少なくとも1つの細胞の増殖を支持するために、少なくとも1つの細胞の存在下から、導入の間に使用した培地を除去する必要がなく、および/または、
導入後に、導入を行った培地の体積の約10倍以下までの、ほぼ同体積である培地の体積での培養において、増殖が達成される方法。
【請求項６５】
導入の前に、培地が少なくとも1つの細胞の培養を支持する、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
導入の後に、培地を新しい培地で補給、置換、または補足することが、補給、置換、または補足がされない培地における培養と比較して、培養を改善しない、請求項64記載の方法。
【請求項６７】
培地を新しい培地で補給、置換、または補足することが、補給、置換、または補足がされない培地におけるタンパク質収量と比較して、少なくとも1つの細胞のタンパク質収量を改善しない、請求項64記載の方法。
【請求項６８】
培養が懸濁培養である、請求項64記載の方法。
【請求項６９】
導入後の少なくとも4時間の間、産生中に培地が補給、置換、または補足されない、請求項64記載の方法。
【請求項７０】
導入後の少なくとも12時間の間、産生中に培地が補給、置換、または補足されない、請求項64記載の方法。
【請求項７１】
導入後の少なくとも24時間の間、産生中に培地が補給、置換、または補足されない、請求項64記載の方法。
【請求項７２】
導入後の少なくとも36時間の間、産生中に培地が補給、置換、または補足されない、請求項64記載の方法。
【請求項７３】
導入後の少なくとも48時間の間、産生中に培地が補給、置換、または補足されない、請求項64記載の方法。
【請求項７４】
導入後の少なくとも60時間の間、産生中に培地が補給、置換、または補足されない、請求項64記載の方法。
【請求項７５】
導入後の少なくとも72時間の間、産生中に培地が補給、置換、または補足されない、請求項64記載の方法。
【請求項７６】
導入後の少なくとも90時間の間、産生中に培地が補給、置換、または補足されない、請求項64記載の方法。
【請求項７７】
培地が、少なくとも1つの細胞への1つまたは複数の巨大分子の導入を支持し、かつ導入に続く細胞の培養を支持する、請求項64記載の方法。
【請求項７８】
導入前に、培地が少なくとも1つの細胞の増殖を支持し、該培地は導入前ではない増殖を支持する、請求項64記載の方法。
【請求項７９】
少なくとも1つの細胞への少なくとも1つの巨大分子の導入が、巨大分子の導入後に細胞が培養される培地と同体積で達成される、請求項64記載の方法。
【請求項８０】
少なくとも1つの巨大分子が少なくとも1つの核酸分子を含む、請求項64記載の方法。
【請求項８１】
少なくとも1つの核酸分子がデオキシリボ核酸（DNA）である、請求項80記載の方法。
【請求項８２】
少なくとも1つの核酸分子がベクターを含む、請求項80記載の方法。
【請求項８３】
接触させる段階が、1つまたは複数のトランスフェクション薬剤の使用を含む、請求項64記載の方法。
【請求項８４】
培地が無血清培地である、請求項64記載の方法。
【請求項８５】
培地が化学的に規定された培地である、請求項64記載の方法。
【請求項８６】
培地が低タンパク質または無タンパク質培地である、請求項64記載の方法。
【請求項８７】
培地が動物由来物質を実質的に欠くか、または含まない、請求項64記載の方法。
【請求項８８】
培地が、ポリオール、ヒドロキシピリジン誘導体、1,3,5-N,N',N''-トリス(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)アミノメチルベンゼン、エチレンジ-アミン-N,N'テトラメチレンホスホン酸、トリスクシン、酸性サッカライド（たとえばグルコン酸第一鉄）、グリコサミノグリカン、ジエチレントリアミン五酢酸、ニトリロ三酢酸モノ-、ビス-、またはトリス-置換2,2'-ビピリジン、ヒドロキサメート誘導体（たとえばアセトヒドロキサム酸）、アミノ酸、デフェロキサミン、フェリオキサミン、鉄塩基性ポルフィン、ポルフィリンおよびその誘導体、DOTA-リジン、テキサフィリン、サプフィリン、ポリアミノカルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸、ポリエチレンカルバメート、ピコリン酸、4-ピリドキシ酸、3-ヒドロキシ-2-ピリジンマルトール、エチルマルトール、黒穂菌属フェリクローム、ニコチン酸-N-オキシド、ならびにIRC011からなる群より選択される、少なくとも1つの化合物を含む、請求項64記載の方法。
【請求項８９】
培地がヒドロキシピリジン誘導体を含む、請求項64記載の方法。
【請求項９０】
ヒドロキシピリジン誘導体が、2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド、3-ヒドロキシ-4-ピロン、3-ヒドロキシピピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-ヒドロキシピリド-2-オン、1,2-ジメチル-3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-メチル-3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン、ニコチン酸-N-オキシド、および2-ヒドロキシ-ニコチン酸からなる群より選択される、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
ヒドロキシピリジン誘導体が2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドである、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
培地が、アミノ酸、糖、脂肪酸、ビタミン、pH緩衝剤、界面活性剤、微量金属またはその塩もしくは水和物、アミン化合物、増殖因子、モル浸透圧濃度および/もしくはイオン強度を制御し、かつ/または膜ポテンシャルを維持する薬剤、フラビン、解糖系に関与するか、または解糖系の産物である化合物、アルコールアミン、環状アルコール、リン脂質またはその一部分、亜セレン酸の塩、二価または三価のカチオン、プテリジン誘導体、吉草酸、ならびに/または補酵素からなる群より選択される、1つまたは複数の成分を含む、請求項64記載の方法。
【請求項９３】
少なくとも1つの細胞が、植物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項64記載の方法。
【請求項９４】
細胞が動物細胞である、請求項93記載の方法。
【請求項９５】
動物細胞が、哺乳類細胞、魚細胞、昆虫細胞、両生類細胞、および鳥類細胞からなる群より選択される、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
動物細胞が上皮細胞である、請求項94記載の方法。
【請求項９７】
動物細胞が哺乳類細胞である、請求項95記載の方法。
【請求項９８】
哺乳類細胞が、293細胞、PER-C6細胞、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、HeLa細胞、およびSp2/0細胞細胞からなる群より選択される、請求項97記載の方法。
【請求項９９】
哺乳類細胞が293細胞である、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
培地がトランスフェリンを実質的に欠くか、または含まない、請求項64記載の方法。
【請求項１０１】
培地がインスリンを実質的に欠くか、または含まない、請求項64記載の方法。
【請求項１０２】
培地がいかなるポリアニオン化合物も実質的に欠くか、または含まない、請求項64記載の方法。
【請求項１０３】
培地が硫酸デキストランを実質的に欠くか、または含まない、請求項64記載の方法。
【請求項１０４】
培地がブチレートを含む、請求項64記載の方法。
【請求項１０５】
1つまたは複数の巨大分子が、培養物中の少なくとも約20パーセントの細胞に導入される、請求項64記載の方法。
【請求項１０６】
1つまたは複数の巨大分子が、培養物中の約20パーセントから約100パーセントの細胞に導入される、請求項64記載の方法。
【請求項１０７】
導入後および培養前に、巨大分子を含む培地を培養物から除去することなく、少なくとも1つの巨大分子の導入後に、培地中で少なくとも1つの細胞を培養する段階をさらに含む、請求項64記載の方法。
【請求項１０８】
培養において、細胞に対する巨大分子の導入の効果を、決定する段階、定量する段階、または測定する段階をさらに含む、請求項64記載の方法。
【請求項１０９】
少なくとも1つの細胞への少なくとも1つの核酸分子の導入の効果を、決定する段階、定量する段階、または測定する段階をさらに含む、請求項64記載の方法。
【請求項１１０】
少なくとも1つの細胞における少なくとも1つの核酸分子によってコードされる、少なくとも1つのポリペプチドのレベル、または存在、または非存在が、測定され、定量され、または決定される、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
導入のために、リポフェクトアミン2000が培地に混合される、請求項64記載の方法。
【請求項１１２】
請求項1記載の細胞培養培地を含む、インビトロにおいて細胞を培養およびトランスフェクションするためのキット。
【請求項１１３】
少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの核酸分子を導入するための、1つまたは複数の薬剤をさらに含む、請求項112記載のキット。
【請求項１１４】
1つまたは複数の核酸分子をさらに含む、請求項112記載のキット。
【請求項１１５】
少なくとも1つの細胞をさらに含む、請求項114記載のキット。
【請求項１１６】
培養において、少なくとも1つの細胞を培養するための、および/または培養において、少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの核酸分子を導入するための説明書をさらに含む、請求項115記載のキット。
【請求項１１７】
培養が懸濁培養である、請求項116記載のキット。
【請求項１１８】
請求項1記載の細胞培養培地、ならびに少なくとも1つの真核細胞、少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの核酸分子を導入するための1つまたは複数の薬剤、および1つまたは複数の核酸分子からなる群より選択される、少なくとも1つの構成要素を含む組成物。
【請求項１１９】
少なくとも1つの核酸分子がデオキシリボ核酸（DNA）を含む、請求項118記載の組成物。
【請求項１２０】
少なくとも1つの核酸分子のそれぞれがベクターを含む、請求項118記載の組成物。
【請求項１２１】
培地が無血清培地である、請求項118記載の組成物。
【請求項１２２】
培地が化学的に規定された培地である、請求項118記載の組成物。
【請求項１２３】
培地が低タンパク質または無タンパク質培地である、請求項118記載の組成物。
【請求項１２４】
培地が、動物供与源由来の物質を実質的に欠くか、もしくは含まない、または動物由来物質を実質的に欠くか、もしくは含まない、請求項118記載の組成物。
【請求項１２５】
培地が、ポリオール、ヒドロキシピリジン誘導体、1,3,5-N,N',N''-トリス(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)アミノメチルベンゼン、エチレンジ-アミン-N,N'-テトラメチレンホスホン酸、トリスクシン、酸性サッカライド（たとえばグルコン酸第一鉄）、グリコサミノグリカン、ジエチレントリアミン五酢酸、ニトリロ三酢酸モノ-、ビス-、またはトリス-置換2,2'-ビピリジン、ヒドロキサメート誘導体（たとえばアセトヒドロキサム酸）、アミノ酸、デフェロキサミン、フェリオキサミン、鉄塩基性ポルフィン、ポルフィリンおよびその誘導体、DOTA-リジン、テキサフィリン、サプフィリン、ポリアミノカルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸、ポリエチレンカルバメート、ピコリン酸、4-ピリドキシ酸、3-ヒドロキシ-2-ピリジンマルトール、エチルマルトール、黒穂菌属フェリクローム、ニコチン酸-N-オキシド、ならびにIRC011からなる群より選択される、少なくとも1つの化合物を含む、請求項118記載の組成物。
【請求項１２６】
培地がヒドロキシピリジン誘導体を含む、請求項118記載の組成物。
【請求項１２７】
ヒドロキシピリジン誘導体が、2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド、3-ヒドロキシ-4-ピロン、3-ヒドロキシピピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-ヒドロキシピリド-2-オン、1,2-ジメチル-3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-メチル-3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン、ピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン、ニコチン酸-N-オキシド、および2-ヒドロキシ-ニコチン酸からなる群より選択される、請求項118記載の組成物。
【請求項１２８】
ヒドロキシピリジン誘導体が2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドである、請求項126記載の組成物。
【請求項１２９】
培地が、少なくとも1つのアミノ酸、少なくとも1つのビタミン、少なくとも1つの無機塩、少なくとも1つの有機塩、少なくとも1つの微量金属、少なくとも1つのヌクレオチド、少なくとも1つの緩衝塩、少なくとも1つの糖、少なくとも1つの脂質、および少なくとも1つのホルモンからなる成分の群より選択される、1つまたは複数の成分をさらに含む、請求項118記載の組成物。
【請求項１３０】
少なくとも1つの真核細胞が、植物細胞および動物細胞からなる群より選択される、請求項118記載の組成物。
【請求項１３１】
細胞が動物細胞である、請求項119記載の組成物。
【請求項１３２】
動物細胞が、哺乳類細胞、魚細胞、昆虫細胞、両生類細胞、および鳥類細胞からなる群より選択される、請求項131記載の組成物。
【請求項１３３】
動物細胞が上皮細胞である、請求項131記載の組成物。
【請求項１３４】
動物細胞が哺乳類細胞である、請求項132記載の組成物。
【請求項１３５】
哺乳類細胞が、293細胞、PER-C6細胞、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、HeLa細胞、およびSp2/0細胞からなる群より選択される、請求項134記載の組成物。
【請求項１３６】
哺乳類細胞が293細胞である、請求項135記載の組成物。
【請求項１３７】
培地がトランスフェリンを実質的に欠くか、または含まない、請求項118記載の組成物。
【請求項１３８】
培地がインスリンを実質的に欠くか、または含まない、請求項118記載の組成物。
【請求項１３９】
培地がいかなるポリアニオン化合物も実質的に欠くか、または含まない、請求項118記載の組成物。
【請求項１４０】
培地が硫酸デキストランを実質的に欠くか、または含まない、請求項118記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、細胞培養の分野に関する。特に、本発明は、細胞の培養およびトランスフェクションに適した培地を提供する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
細胞培養培地は、制御された、人工の、およびインビトロの環境において細胞を維持および増殖するために必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の特徴および製剤は、特定の細胞の要求によって変化する。重要なパラメーターは、モル浸透圧濃度、pH、および栄養素組成を含む。
【０００３】
細胞培養培地製剤は、文献においてよく立証されており、多数の培地が市販されている。初期の細胞培養研究では、培地製剤は、血液の化学組成および物理化学的性質（たとえば、モル浸透圧濃度、pH、その他）に基づいており、「生理的溶液」といわれていた（Ringer, S.、J. Physiol.. 3：380-393（1880）；Waymouth, C.、In：Cells and Tissues in Culture、第1巻、Academic Press、London、pp. 99-142（1965）；Waymouth, C.、In Vitro 6：109-127（1970））。しかし、哺乳類の体の異なる組織の細胞は、酸素/二酸化炭素分圧、ならびに栄養素、ビタミンおよび微量元素の濃度に関して異なる微小環境にさらされ；したがって、異なる細胞型のインビトロにおける培養（culture）の成功には、異なる培地製剤の使用が必要である。細胞培養培地の典型的な構成成分は、アミノ酸、有機および無機の塩、ビタミン、微量金属、糖、脂質、ならびに核酸を含み、その型および量は、所与の細胞または組織型の特定の要求に依存して変化し得る。
【０００４】
培地製剤は、動物、植物、および細菌細胞を含む多くの細胞型を培養（cultivate）するために使用されてきた。培養細胞（cultivated cell）は、生理的プロセスおよび有用な生物学的物質の産生の研究を含む多くの用途を有する。このような有用な産物の例は、モノクローナル抗体、ホルモン、増殖因子、酵素などを含む。このような産物は、多くの商業的および治療的な適用を有し、組換えDNA技術の出現により、細胞がこれらの産物を大量に産生するように設計することもできる。また、培養細胞（cultured cell）は、ベクターおよび/またはワクチンとして使用することができるウイルスの単離、同定、および増殖のために日常的に使用される。したがって、インビトロで細胞を培養できることは、細胞生理学の研究のために重要なだけでなく、別の費用対効果の高い手段によって得られない、有用な物質の産生のためにも必要である。
【０００５】
インビトロの細胞培養培地を使用して増殖する種々の細胞型のうちで、特に関心対象であるのは、上皮に由来する細胞である。上皮は、器官の内部および外部の表面、ならびに高等生物の腺を裏打ちする。上皮は、環境と生体との間の外部界面（たとえば、皮膚）、または器官と間隙との間の内部界面（たとえば、腸管の粘膜内張り）におけるこのような局在のために、恒常性の維持において主要な役割を有する。上皮は、たとえば栄養素および老廃物の輸送および透過性を調節することにより、この機能を実行する（Freshney, R.I.、in：Culture of Epithelial Cells、Freshney, R.I.編、New York：Wiley-Liss、pp.1-23（1992））。
【０００６】
上皮を形成する細胞は、一般的に上皮細胞と呼ばれる。これらの細胞は、皮膚におけるものは多層で、または肺胞におけるものは単層で存在し得る。予想されるように、上皮細胞の構造、機能、および生理学は、しばしば組織特異的である。たとえば、皮膚の表皮性上皮細胞は、重層扁平上皮として組織化され、主に生体の保護障壁の形成に関与するが、多くの腺の分泌上皮細胞は、立方細胞において単層でしばしば見出され、分泌タンパク質および糖タンパク質の産生において主要な役割を有する。これらの位置または機能に関わらず、上皮細胞は、通常再生性である。すなわち、正常な状態下で、または外傷もしくはその他の活性化刺激に応答して、上皮細胞は、分裂または増殖することができる。この再生能力により、様々な一次上皮細胞および細胞株がインビトロで首尾よく培養（cultivate）されるに至るまで、上皮細胞のインビトロにおける操作を容易にした（Freshney、同上）。
【０００７】
様々な上皮細胞および上皮細胞株の単離および使用が文献に報告されている一方で、上皮性の形態を示すヒト胚性腎臓細胞株293（「293細胞」）は、特に外因性リガンド受容体の発現、ウイルスの産生、ならびに同種および異種の組換えタンパク質の発現の研究に有用であることが判明した。たとえば、米国特許第5,166,066号は、精神活性薬の候補の同定、およびスクリーニングに有用なことが判明しているベンゾジアゼピン結合部位を含む、機能性GABA受容体を含む安定な293細胞株の構築を記載する。また、293細胞は、天然および組換えアデノウイルスなどのウイルスを産生するために使用され（Garnier, A.ら、Cytotechnol. 15：145-155（1994）；Bout, A.ら、Cancer Gene Therapy 3（6）：S24、要約 P-52（1996）；Wang, J.-W.ら、Cancer Gene Therapy 3（6）：S24、要約 P-53（1996））、これはワクチン産生、または組換えタンパク質発現のためのアデノウイルスベクターの構築に使用することができる。最後に、293細胞は、様々な組換えヒトタンパク質の大量産生において有用なことが判明している（Berg, D.T.ら、 BioTechniques 14（6）：972-978（1993）；Peshwa, M.V.ら、Biotechnol. Bioeng. 41：179-187（1993）；Garnier, A.ら、Cytotechnol. 15：145-155（1994））。
【０００８】
繊維芽細胞と漠然と呼ばれている細胞は、多くの異なる組織から単離されており、結合組織細胞であると理解される。胚および成体の組織に由来する、繊維芽性細胞と漠然と呼ばれる細胞株を培養（cultivate）することは、明らかに可能である。繊維芽細胞は、特徴として「紡錘状」の見かけを有する。繊維芽細胞様の細胞は、繊維芽細胞に典型的な形態学的特徴を有する。光学顕微鏡下において、これらが培養容器の表面に単層で増殖するときは、細胞は鋭く伸びた（「紡錘状形」）ように見える。コラーゲンI型などの適切なマーカーで確認後、細胞株を繊維芽細胞または繊維芽細胞様とみなすことができる（Freshney, R.I.、in：Culture of Epithelial Cells、Freshney, R.I.編、New York：Wiley Liss、pp.1-23（1987））。
【０００９】
CHO細胞は、チャイニーズハムスター卵巣に由来する上皮細胞および繊維芽細胞の両方に分類されている。チャイニーズハムスター卵巣（CHO-K1）から開始された細胞株（Kao, F.-T. およびPuck, T.T.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60：1275-1281（1968））は、長年培養されているが、その同一性はいまだ確かめられていない。
【００１０】
大部分の一次性の哺乳類上皮細胞、哺乳類繊維芽細胞、上皮細胞株、および繊維芽細胞株は、典型的には単層培養で増殖させられる。しかし、一部の適用については、このような細胞を懸濁培養として培養（cultivate）するほうが有利であると考えられる。たとえば、懸濁培養は、3次元空間において増殖する。しかし、同様の大きさの容器における単層培養では、容器表面上において二次元でしか増殖することができない。したがって、懸濁培養は、単層培養と比較して、より高い細胞収量をもたらすことができ、同様に、より高い収量の生物学的製剤（たとえば、ウイルス、組換えポリペプチドなど）をもたらすことができる。さらに、懸濁培養は、単層培養でしばしば必要とされるトリプシン処理および遠心よりも、培養容器に単に新しい培養培地を添加する（希釈継代培養する）ことにより、養分補給およびスケールアップが容易である。養分補給の容易さ、および懸濁培養が容易にスケールアップできることは、、同等の数の細胞を取り扱うための時間および労力を実質的に節約することを意味する。
【００１１】
しかし、一次上皮細胞、一次繊維芽細胞、上皮細胞株、および繊維芽細胞株などの多くの付着依存性細胞は、懸濁培養には容易に適合しない。これらは、典型的には最適な増殖のために基質への接着に依存するので、懸濁液におけるこれらの細胞の増殖には、ラテックスまたはコラーゲンビーズなどのマイクロキャリアにこれらが付着することを必要とし得る。したがって、この様式で増殖した細胞は、従来の単層培養よりも高密度の培養（culture）が可能だが、厳密にはなお表面に付着し、これらの細胞の継代培養には、単層培養を継代培養するために使用するものと同様の工程を必要とする。さらに、大きいバッチまたは発酵槽培養が確立される場合、大容量のマイクロキャリアは、しばしば培養容器の最下段に沈殿し、これにより、細胞にせん断損傷を生じさせることなくマイクロキャリア（したがって細胞）を懸濁させておくための、複雑な混合機構を必要とする（Peshwa, M.V.ら、Biotechnol. Bioeng. 41：179-187（1993））。
【００１２】
多くの形質転換細胞は、懸濁液中で増殖することができるが（Freshney, R.I.、Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique、New York：Alan R. Liss, Inc.、pp. 123-125（1983））、懸濁培養を成功させるには、比較的高タンパク質の培地か、または血清もしくは血清成分（接着因子フィブロネクチンおよび/またはビトロネクチンなど）を培地に補うこと、または精巧な灌流培養制御システム（Kyung, Y.-S.ら、Cytotechnol. 14：183-190（1994））を必要とし、これが不利になり得る。さらに、多くの上皮細胞は、懸濁液で増殖するときに凝集体または「凝集塊」を形成し、これが継代培養の成功を妨害し、増殖速度および培養物による生物学的製剤の産生を減少させる。凝集が発生すると、培地にさらされる全体的な細胞の表面積が減少し、細胞は栄養を奪われ、培地中に老廃物を効率的に交換することができない。その結果、増殖が遅くなり、かつ得られる細胞密度が減少し、タンパク質発現が損なわれる。
【００１３】
典型的には、細胞培養培地製剤は、ウシ胎児血清（FBS）（5％〜20％v/v）、または動物の胎児、器官、もしくは腺からの抽出物（0.5％〜10％v/v）などの不定構成成分を含む、各種添加物で補足される。FBSは、動物細胞培養培地において最も一般的に適用される補足物であるが、新生児仔ウシ、ウマ、およびヒトを含むその他の血清供与源も日常的に使用される。培養培地の補足のための抽出物を調製するために使用した器官または腺は、顎下腺（Cohen, S.、J. Biol. Chem. 237：1555-1565（1961））、下垂体（Peehl, D.M.およびHam, R.G.、In Vitro 16：516-525（1980）；米国特許第4,673,649号）、視床下部（Maciag, T.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76：5674-5678（1979）；Gilchrest, B.A.ら、J. Cell. Physiol. 120：377383（1984）、眼の網膜（Barretault, D.ら、Differentiation 18：29-42（1981））、および脳（Maciag, T.ら、Science 211：1452-1454（1981））を含む。これらの型の化学的に不定な補足物は、細胞培養培地においていくつかの有用な機能を果たす（Lambert, K.J.ら、In：Animal Cell Biotechnology、第1巻、Spier, R.E.ら編、Academic Press New York、pp. 85-122（1985））。たとえば、これらの補足物は、不安定または水不溶性の栄養素のための担体またはキレート剤を提供し；毒性部分に結合し、かつ中和し；ホルモンおよび増殖因子、プロテアーゼ阻害剤ならびに必須の、多くは未確認または不定の低分子量の栄養素を提供し；かつ物理的ストレスおよび損傷から細胞を保護する。したがって、血清または器官/腺の抽出物は、動物細胞の培養（cultivation）のための最適な培地を提供するために、比較的低コストの補足物として一般に使用される。
【００１４】
残念なことに、組織培養の適用における血清または器官/腺の抽出物の使用は、いくつかの欠点を有する（Lambert, K.J.ら、In：Animal Cell Biotechnology、第1巻、Spier, R.E.ら編、Academic Press New York、pp. 85-122（1985））。たとえば、これらの補足物および血清の化学組成は、単一のメーカからのものでさえロット間で変化する。また、補足物は、培養細胞の健康および最終産物の質を深刻に害し得る、感染因子（たとえば、マイコプラズマおよびウイルス）で汚染され得る。また、血清または動物抽出物などの不定構成成分の使用は、培養細胞の栄養およびホルモンの要求の真の定義および解明を妨げ、従って、制御された方法で、培養（culture）における細胞増殖および分化に対する、特定の増殖因子または栄養素の効果を研究する能力を排除する。さらに、不定な補足物は、異常増殖および分化、ならびに培養細胞における疾患に関連した変化を、研究者が研究することを妨げる。最後に、生物学的物質の工業生産において細胞培養培地を使用する人にとって最も重要なことに、培養培地の血清および器官/腺抽出物の補足は、血清または抽出物タンパク質の非特異的な同時精製のために、培養培地からの所望の物質の精製を複雑にし、費用を増加させ得る。
【００１５】
血清を補った培地中で増殖した細胞において見られる発現レベルに対して、無血清培地において増殖した細胞から得られる組換えタンパク質の発現レベルが改善する（Battista, P.J.ら、Am. Biotech. Lab. 12：64-68（1994））。しかし、無血清培地は、なおもアルブミン、フェチュイン、種々のホルモン、およびその他のタンパク質などの、1つまたは複数の様々な動物由来の構成成分を含み得る。タンパク質またはペプチドの存在は、組換えタンパク質の精製を困難にし、時間がかかり、かつ高価なものにする。
【００１６】
血清または器官/腺の抽出物の使用におけるこれらの欠点を克服するために、多くのいわゆる「規定された（defined）」培地が開発されている。これらの培地は、単一の細胞型の培養（culture）を支持するためにしばしば特異的に処方され、不定補足物を含まず、その代わりに、血清または抽出物によって通常提供される、規定された量の精製された増殖因子、タンパク質、リポタンパク質、およびその他の物質を組み入れる。このような培養培地の構成成分（および、その濃度）は正確に知られているので、これらの培地は一般に「規定された培養培地」と称される。時に、「規定された培養培地」とは、「無血清培地」または「SFM」という用語と交換可能に使用される。SFM製剤の多くは、市販されており、Invitrogen Corporation、Carlsbad、Californiaから入手可能な、血管内皮細胞、ケラチノサイト、単球/マクロファージ、リンパ球、造血幹細胞、繊維芽細胞、軟骨細胞、または肝細胞の培養（culture）を支持するために設計されたものなどである。しかし、SFMと規定培地との間の違いは、SFMは血清およびタンパク質画分（たとえば、血清アルブミン）を欠くが、器官/腺の抽出物などのその他の不定構成成分を欠く必要はない培地であるということである。実際に、報告されているか、または市販されているいくつかのSFMは、ケラチノサイトのインビトロにおける培養（culture）を支持するいくつかの製剤を含む、このような不定構成成分を含有する（Boyce, S.T.およびHam, R.G.、J. Invest. Dermatol. 81：33（1983）；Wille, J.J.ら、J. Cell. Physio. 121：31（1984）；Pittelkow, M.R.およびScott, R.E.、Mayo Clin. Proc. 61：771（1986）；Pirisi, L.ら、J. Virol. 61：1061（1987）；Shipley, G.D.、およびPittelkow, M.R.、Arch. Dermatol. 123：1541（1987）；Shipley, G.D.ら、J. Cell. Physiol. 138：511-518（1989）；Daley, J.P.ら、FOCUS（GlBCO/LTI）12：68（1990）；米国特許第4,673,649号および第4,940,666号）。したがって、SFMは、本用語の真の定義において規定培地であるとみなすことはできない。
【００１７】
規定培地は、一般にいくつかの明確な利点を使用者に提供する。たとえば、規定培地の使用により、血清または抽出物を含有する培地中で細胞を培養したときにはマスクされ得る、特定の増殖因子またはその他の培地成分の細胞生理に及ぼす効果の調査を容易する。さらに、規定培地は、典型的には血清または抽出物を含むものよりも非常に低い量のタンパク質を含み（実際に、規定培地は、しばしば「低タンパク質培地」と称される）、規定培地で培養した細胞によって産生される生物学的物質の精製を、はるかに簡単に、かつ低費用にする。
【００１８】
本質的にビタミン、アミノ酸、有機および無機の塩、ならびに緩衝液からなる、いくつかの極めて単純な規定培地が、細胞培養のために使用されている。しかし、このような培地（しばしば「基礎培地」と呼ばれる）は、通常、大部分の動物細胞に必要な栄養性内容物が、非常に欠乏している。従って、ほとんどの規定培地は、基礎培地にさらなる構成成分を組み入れて、培地をより栄養的に複雑にしているが、無血清および培地の低タンパク質含量を維持している。このような構成成分の例は、ウシ血清アルブミン（BSA）またはヒト血清アルブミン（HSA）；上皮細胞増殖因子（EGF）もしくは線維芽細胞増殖因子（FGF）などの天然（動物）または組換えの供与源に由来する一定の増殖因子；脂肪酸、ステロール、およびリン脂質などの脂質；ホスホエタノールアミン、エタノールアミン、およびリポタンパク質などの脂質誘導体および複合体；インスリン、ハイドロコーチゾン、およびプロゲステロンなどのタンパク質およびステロイドホルモン；ヌクレオチド前駆体；ならびに一定の微量元素を含む（Waymouth, C.、in：Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology、第1巻：Methods for Preparation of Media, Supplements,andSubstrata for Serum Free Animal Cell Culture、Barnes, D.W.ら編、New York：Alan R. Liss, Inc.、pp. 23-68（1984）、およびGospodarowicz, D.、同上、pp. 69-86（1984）により概説される）。
【００１９】
しかし、細胞培養培地における動物タンパク質補足物の使用は、一定の欠点を有する。たとえば、培地および/または培地から精製される産物は、特に、補足物が培養される細胞の供与源とは異なる動物に由来する場合、免疫原であり得るという危険性がある。治療として使用される生物学的物質がこのような培養培地から精製される場合、これらの免疫原タンパク質またはペプチドの一定量が同時精製され、このような治療を受ける動物において、アナフィラキシーに至る免疫反応およびアナフィラキシーを含む免疫反応を誘導し得る。
【００２０】
この潜在的問題を取り除くために、培養される細胞と同じ生物種に由来する補足物を使用することができる。たとえば、ヒト細胞の培養（culture）は、補足物としてHSAを使用して、促進することができるが、ウシ細胞の培養（culture）のための培地には、その代わりにBSAを使用すると考えられる。しかし、この手法は、培養培地中に汚染物および外因性の病原体（HSA調製物からのクロイツフェルトヤコブ病（CJD）、またはBSA調製物からのウシ海綿状脳症（「狂牛病」）プリオンなど）を導入する危険があり、このような培地を動物およびヒトの治療の調製物に使用することに、明らかに否定的な影響を与え得る。実際には、このような安全性の理由により、バイオテクノロジー業界および政府機関は、このような病原体を含み得る動物由来タンパク質を含む細胞培養培地の使用を、次第に規制し、阻止し、さらには禁止している。
【００２１】
SFMにおける動物タンパク質の使用の制限を解決するために、動物タンパク質を完全に含まない動物細胞培養培地を構築するために、いくつかの試みがなされている。たとえば、一部の培養培地では、窒素およびその他の必須栄養源を提供するために、基礎培地に酵母細胞の抽出物を組み入れている（たとえば英国特許出願第GB 901673号；Keay, L.、Biotechnol. Bioengin. 17：745-764（1975）を参照のこと）。もう1つの手法において、コムギグルテンの加水分解産物を、酵母抽出物の添加あり、または無しで使用して、動物細胞のインビトロにおける増殖を促進させた（日本特許出願第JP 2-49579号）。さらにその他の培地は、肉またはα-ラクトアルブミンもしくはカゼイン（たとえば、ペプトン）などのタンパク質の、酵素消化物によって血清を置換したものが開発され、これは細菌培養において伝統的に使用されてきた（Lasfargues, E.Y.ら、In Vitro 8（6）：494-500（1973）；Keay, L.、Biotechnol. Bioeng. 17：745-764（1975）；Keay, L.、Biotechnol. Bioeng. 19：399-411（1977）；Schlager, E.-J.、J. Immunol. Meth. 194：191-199（1996））。しかし、これらの手法はいずれも、様々な動物細胞の培養に最適な培地を提供しなかった。さらに、コムギ、オオムギ、ライ麦、およびオートムギを含む特定の植物からの抽出物は、動物細胞に由来する無細胞系においてタンパク質合成を阻害することが示され（Coleman, W.H.およびRoberts, W.K.、Biochim. Biophys. Acta 696：239-244（1982））、細胞培養培地におけるこれらの植物に由来するペプチドの使用は、インビトロでの動物細胞の増殖を、刺激するよりもむしろ、実際には阻害し得ることが示唆される。最近、イネペプチドを含む動物細胞培養SFM製剤が、様々な正常動物細胞および形質転換動物細胞の培養（cultivation）に有用であることが記載され、かつ示された（米国特許第6,103,529（参照として本明細書に組み入れられる）を参照されたい）。
【００２２】
動物由来の補足物を細胞培養培地に添加することによってもたらされる潜在的問題にもかかわらず、このような補足物は、日常的に使用される。規定培地に頻繁に添加されるこのような補足物の1つは、トランスフェリンである。トランスフェリンは、インビボにおいて細胞に鉄を送達する機能を果たす。哺乳類細胞による鉄取込みの機構は、概説されている（Qian, Z.M.およびTang, P.L.（1995）Biochim. Biophys. Acta 1269、205-214）。鉄は、エネルギー生産および酸化的呼吸を含む多数の代謝プロセスにおける補助因子として必要とされるので、インビトロおいて大部分の細胞の培養（cultivation）を成功させるために必要な鉄を送達するために、無血清の培地をトランスフェリンで補うことが多い。トランスフェリンの調製における種々の潜在的な外因性薬剤に対する懸念により、トランスフェリンの代用として使用できるその他の天然の鉄担体化合物の検索が促進された。天然の鉄担体はしばしば血清に由来し、したがって血清補足の上記した制限に供されるという事実により、この検索は複雑である。
【００２３】
天然に由来する金属担体を使用することの限界を克服するために、金属、特に亜鉛、鉄、マンガン、およびマグネシウムを培養細胞に供給するために使用する一定の金属結合化合物が探検されている。キレート剤（たとえば、EDTA）および一定の酸またはその塩（たとえば、クエン酸塩、ピコリン酸塩、および安息香酸またはヒドロキサム酸の誘導体）などの単純な担体は、一定の無血清の増殖培地に有用であることが示された（米国特許番号5,045,454および5,118,513；Testaら、Brit. J. Haematol. 60：491-502,（1985）；Ganeshaguruら、Biochem. Pharmacol. 29：1275-1279（1980）；Whiteら、Blood 48：923-929（1976）を参照されたい）。
【００２４】
これらの参照はいくつかの金属担体を開示しているが、いくつかの実験的因子がデータの解釈を複雑にする。データは、限られた数の細胞株から集められ、一継代の結果を示す。さらに、培地は血清で補われていた。血清は、内在的にトランスフェリンおよびその他の潜在的鉄担体を含む。血清を補った培地中で培養（culture）された細胞増殖に対しては、血清またはトランスフェリンの非存在下で1または2継代した後でさえ、「持ち越し効果」がある（たとえば、Keenan, J.およびClynes, M.（1996）In Vitro Cell Dev. Biol-Animal 32,451-453を参照されたい）。その他の既知の金属結合化合物は、体から鉄を除去するために医薬として使用されているが、送達のためではない。残念なことに、これらの単純な鉄キレート化合物の多くは、培養細胞に対する十分な鉄利用能、または培養細胞による十分な鉄取り込みを提供しない。
【００２５】
一旦特定の細胞型の増殖に適した培地製剤が決定されると、所望の生物学的物質の産生を最適化するために、問題の細胞を変更することが頻繁に必要である。生物学的物質の有効な産生および精製において重要な工程は、物質を産生する細胞への1つまたは複数の巨大分子（たとえば、ペプチド、タンパク質、核酸など）の導入である。これは、種々の方法によって達成され得る。細胞に巨大分子を導入するための1つの広く使われる方法は、トランスフェクションとして既知である。
【００２６】
典型的には、細胞の増殖のために最適化された細胞培養培地中で、標的細胞を所望の細胞密度に増殖させる。一旦所望の密度に達したら、培地をトランスフェクションプロセスのために最適化された培地に交換する。ほとんどの状況下では、トランスフェクションに使用される培地は、細胞の増殖を支持しないが、トランスフェクション培地は、単に細胞に核酸を導入するために使用される。その結果、本プロセスは、一般に、培養培地から通常は遠心によって細胞を回収し、微量の増殖培地を除去するために細胞を洗浄し、関心対象の巨大分子の存在下でトランスフェクション培地に細胞を懸濁し、巨大分子の取込みに充分な期間トランスフェクション培地中で細胞をインキュベートし、選択的に、トランスフェクション培地を除去して細胞由来のトランスフェクション培地の残存物を洗浄し、次いで増殖培地にトランスフェクションされた細胞を再懸濁する必要がある。増殖培地をトランスフェクション培地に交換する工程、細胞を洗浄する工程、トランスフェクション培地を増殖培地に戻して交換する工程は、細胞の直接の操作（hands-on manipulation）をかなり必要とし、したがって組換えDNA技術の時間および費用が実質的に増加する。
【００２７】
歴史的な例として、293細胞は、血清を補ったバージョンの複合培地（complex medium）（すなわち、DMEM）において単層培養で培養（cultivate）された。懸濁液中で増殖する場合、293細胞は大きな細胞の群集（cluster）に凝集する傾向を有する。これらの大きな細胞凝集塊の形成は、細胞の生存度を減少させる。凝集体の中央の細胞は、直接培地にさらされないので、これらの細胞は、培地中の栄養素への接触が制限され、培地中へと廃棄物を交換することが困難である。さらに、このような培地への接触の減少により、群集中の細胞は、培地中に導入した因子による遺伝的操作（すなわち核酸による形質転換）には適さなくなる。これらの問題の結果として、293細胞は、一般に生物学的物質の産生のための懸濁培養には使用されなかった。
【００２８】
したがって、懸濁液における真核細胞の増殖を可能にし、一方で少ない操作量で細胞のトランスフェクションを可能にする細胞培地に対する技術の必要性が、当技術分野においてなおも残っている。このような培地は、好ましくは、哺乳類細胞を高密度に増殖することを容易にし、かつ/または組換えタンパク質の発現レベルを増加し、細胞凝集を減少し、かつ血清、トランスフェリン、インスリンなどの動物タンパク質の補足を必要としない、無血清、かつ/または化学的に規定された（chemically defined）、かつ/または無タンパク質培地、および/または動物由来物質を欠く培地であるべきである。好ましくは、この型の培地は、293細胞およびCHO細胞などの、上皮細胞および繊維芽細胞を含む、通常は付着依存性である哺乳類細胞の懸濁液培養を可能にすると考えられる。このような培養培地は、細胞生理に対する増殖因子およびその他の刺激の効果の研究を容易にし、バイオテクノロジー産業において、培養哺乳類細胞によって産生される生物学的物質（たとえば、ウイルス、組換えタンパク質など）のより簡単かつより費用効果のある産生および精製を可能とし、哺乳類細胞の培養（cultivation）を利用する方法において、より一貫した結果を提供すると考えられる。これらの必要性およびその他は、本発明によって満たされる。
【発明の開示】
【００２９】
発明の概要
本発明は、培養における少なくとも1つの真核細胞への1つまたは複数の巨大分子の導入を支持し、かつ導入に続く少なくとも1つの細胞の培養（cultivation）を支持し、ここで、少なくとも1つの細胞の増殖は、新しい培地を含まない培地中において継続する、細胞培養培地を提供する。好ましい態様においては、少なくとも1つの細胞の増殖を支持するために、少なくとも1つの細胞の存在から、導入の間に使用した培地を除去する必要がない。もう1つの好ましい態様において、導入後に、導入を行った培地の体積の約10倍以下までの、ほぼ同体積である培地の体積での培養（cultivation）において、増殖が達成される。本発明の培地を使用すると、細胞に核酸を導入した後、および核酸が導入された細胞をさらに培養（culture）して核酸を発現させる前に、培地を補給、置換、または補足する必要が無い。
【００３０】
また、本発明は、水と、アミノ酸、糖、脂肪酸（リノール酸、リノレン酸、および特に12、14、16、18、19、20、または24炭素原子の脂肪酸（それぞれの炭素鎖は分岐しているか、または分岐していない）など）、アラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ポリエン酸（たとえば、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、および/またはリノレン酸）、ビタミン（ピリドキシン、ナイアシンアミド、チアミンなど）、pH緩衝剤、界面活性剤、微量金属またはその塩もしくは水和物、アミン化合物、増殖因子、モル浸透圧濃度および/またはイオン強度を制御し、かつ/または膜ポテンシャルを維持する薬剤、フラビン、解糖系に関与するかまたは解糖系の産物である化合物、アルコールアミン、環状アルコール、リン脂質またはその一部分（塩化コリンなど）、亜セレン酸の塩（例えば亜セレン酸ナトリウム）、二価または三価のカチオン（マンガン、カルシウム、亜鉛、マグネシウム、銅、または鉄など）、プテリジン誘導体（葉酸など）、吉草酸（リポ酸など）、ならびに/あるいは補酵素（リボフラビンなど）からなる群より選択される、少なくとも1つの成分とを混合することを含む培地の作製方法であって、ここで培地は、（a）培養における少なくとも1つの巨大分子の真核細胞への導入、（b）少なくとも1つの巨大分子が導入された細胞の培養（cultivation）、および選択的に（c）タンパク質産物を形成するための、巨大分子が導入された細胞における核酸の発現を支持し、ここで少なくとも1つの分子を含む培地は、細胞への少なくとも1つの分子の導入後、ならびに培養（cultivation）、および核酸の最適な発現の前に、培養物から除去され新しい培地で置換される必要がない方法を提供する。
【００３１】
また、本発明は、水と、アミノ酸、糖、脂肪酸（リノール酸、リノレン酸、および特に12、14、16、18、19、20、または24炭素原子の脂肪酸（それぞれの炭素鎖は分岐しているか、または分岐していない）など）、アラキドン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ポリエン酸（たとえば、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、および/またはリノレン酸）、ビタミン（ピリドキシン、ナイアシンアミド、チアミンなど）、pH緩衝剤、界面活性剤、微量金属またはその塩もしくは水和物、アミン化合物、増殖因子、モル浸透圧濃度および/またはイオン強度を制御し、かつ/または膜ポテンシャルを維持する薬剤、フラビン、解糖系に関与するかまたは解糖系の産物である化合物、アルコールアミン、環状アルコール、リン脂質またはその一部分（塩化コリンなど）、亜セレン酸の塩（亜セレン酸ナトリウムなど）、二価または三価のカチオン（マンガン、カルシウム、亜鉛、マグネシウム、銅、または鉄など）、プテリジン誘導体（葉酸など）、吉草酸（リポ酸など）、ならびに/あるいは補酵素（リボフラビンなど）からなる群より選択される、少なくとも1つの成分とを混合することによって得られる培地であって、ここで培地は、（a）培養における少なくとも1つの巨大分子の真核細胞への導入、（b）少なくとも1つの巨大分子が導入された細胞の培養（cultivation）、および（c）巨大分子が導入された細胞における核酸の発現を支持し、ここで少なくとも1つの分子を含む培地は、細胞への少なくとも1つの巨大分子の導入後、ならびに培養（cultivation）、および核酸の最適な発現の前に、培養物から除去され新しい培地で置換される必要がない培地を提供する。
【００３２】
また、本発明は、真核細胞を培養（cultivate）する方法であって：（a）細胞を本発明の細胞培養培地と接触させる段階；（b）培養（culture）における細胞の培養（cultivation）を支持するのに適した条件下で細胞を維持する段階；および（c）選択的に核酸を発現させてタンパク質産物を形成させる段階を含む方法を提供する。
【００３３】
また、本発明は、培養物において少なくとも1つの真核細胞に、1つまたは複数の巨大分子を導入するための方法であって：（a）培養において請求項1記載の培地中で少なくとも1つの真核細胞を培養（culturing）する段階；（b）少なくとも1つの巨大分子の1つまたは複数を、少なくとも1つの細胞に導入させるのに充分な条件下で、培養物中に少なくとも1つの巨大分子を導入する段階；（c）少なくとも1つの分子によって産生が制御される産物を産生するために、培地において少なくとも1つの細胞を培養（cultivate）する段階であって、ここで少なくとも1つの細胞の増殖は、新しい培地を含まない培地中において継続し、ここで少なくとも1つの細胞の増殖を支持するために、少なくとも1つの細胞の存在から、導入の間に使用した培地を除去する必要がなく、かつ/または、導入後に、導入を行った培地の体積の約10倍以下までの、ほぼ同体積である培地での培養（cultivation）において、増殖が達成される段階を含む方法を提供する。
【００３４】
また、本発明は、インビトロにおいて細胞を培養（cultivation）およびトランスフェクションするためのキットであって、本発明の細胞培養培地、および：細胞に少なくとも1つの核酸分子を導入するための1つまたは複数の薬剤、1つまたは複数の巨大分子、少なくとも1つの細胞、培養物中において少なくとも1つの細胞を培養（culture）するための、および/または培養（culture）において少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの核酸分子を導入するための説明書、のうちの１つまたは複数を選択的にさらに含むキットを提供する。
【００３５】
また、本発明は、本発明の細胞培養培地、ならびに少なくとも1つの真核細胞、少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの巨大分子を導入するための1つまたは複数の薬剤、および1つまたは複数の巨大分子からなる群より選択される、少なくとも1つの構成成分を含む組成物を提供する。
【００３６】
本発明のその他の態様は、以下の図面および本発明の記載、ならびに特許請求の範囲に照らして当業者には明らかであると考えられる。
【００３７】
発明の詳細な説明
本発明は、真核細胞および原核細胞の両者の増殖のための改良培地製剤を提供する。本発明の培地は、増殖、導入、および/または培養（cultivation）間で培地の補給、置換、補足、または変更を必要とせずに、細胞増殖、培養物中における細胞への巨大分子の導入、および細胞培養（cultivation）を支持する。本発明の培地は、任意の細胞の増殖および培養（cultivation）を支持または増強するために使用することができる。また、本発明は、1つまたは複数の望まれていない構成成分、たとえば動物由来成分の代用として、またはそれらを置換するために使用することができる化合物を提供する。置換化合物は、望まれていない構成成分の少なくとも1つの所望の機能を提供する。
【００３８】
定義
以下の記載において、細胞培養および組換えDNA技術において使用される多くの用語が広く利用される。このような用語が与えられる範囲を含む、明細書および請求の範囲の明瞭かつより一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００３９】
培養物への巨大分子または化合物の「導入」という用語は、培養培地への巨大分子または化合物の供給を指す。
【００４０】
少なくとも1つの細胞への巨大分子または化合物の「導入」という用語は、巨大分子または化合物が細胞内に内部移行されるように、細胞に巨大分子または化合物を供給することを指す。たとえば、巨大分子または化合物は、トランスフェクション、形質転換、注入、および/またはリポソーム導入を使用して細胞に導入することができ、また、当業者に既知のその他の方法を使用して細胞に導入されてもよい。好ましくは、巨大分子または化合物は、リポソーム導入によって細胞に導入される。巨大分子は、好ましくはタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、または核酸である。巨大分子は、タンパク質であってもよい。または、巨大分子は、ペプチドであってもよい。または、巨大分子は、ポリペプチドであってもよい。また、巨大分子は、核酸であってもよい。
【００４１】
本明細書において使用される「巨大分子」という用語は、生体分子を包含する。1つの態様において、巨大分子という用語は、核酸を指す。好ましい態様において、巨大分子という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）を指す。より好ましくは、巨大分子という用語は、DNAを指す。より好ましくは、巨大分子という用語は、相補的DNA（cDNA）を指す。巨大分子は、荷電しているか、または荷電していなくてもよい。DNA分子は、荷電した巨大分子の例である。
【００４２】
本明細書において使用される「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）およびリボ核酸（RNA）を含む任意の核酸を指す。好ましい態様において、「核酸」とは、ゲノムDNA、相補的DNA（cDNA）、およびオリゴDNAを含むオリゴヌクレオチドを含むDNAを指す。より好ましくは、「核酸」とは、ゲノムDNAおよび/またはcDNAを指す。
【００４３】
本明細書において使用される、「核酸の発現」という用語は、細胞における核酸の複製、DNAのメッセンジャーRNAへの転写、RNAのタンパク質への翻訳、タンパク質の翻訳後修飾、および/もしくは細胞におけるタンパク質の輸送、またはその変形もしくは組み合わせを指す。
【００４４】
「成分（ingredient）」という用語は、化学的または生物学的な起源に関わらず、細胞の増殖もしくは繁殖（proliferation）を維持または促進するために、細胞培養培地において使用することができるあらゆる化合物を指す。「構成成分」、「栄養素」、および「成分」という用語は、交換可能に使用することができ、全てがこのような化合物を指すことを意味する。細胞培養培地に使用される典型的な成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などを含む。エキソビボで細胞の培養（cultivation）を促進または維持するその他の成分は、特定の要求に従って、当業者によって選択され得る。本発明の培地は、ウシ血清アルブミン（BSA）またはヒト血清アルブミン（HSA）、上皮細胞増殖因子（EGF）もしくは線維芽細胞増殖因子（FGF）などの天然（動物）または組換え供与源に由来する、1つまたは複数の増殖因子、脂肪酸、ステロール、およびリン脂質などの1つまたは複数の脂質、ホスホエタノールアミン、エタノールアミン、およびリポタンパク質などの1つまたは複数の脂質誘導体および複合体、1つまたは複数のタンパク質、インスリン、ハイドロコーチゾン、およびプロゲステロンなどの1つまたは複数のステロイドホルモン、1つまたは複数のヌクレオチド前駆体；ならびに1つまたは複数の微量元素からなる群より選択される1つまたは複数の構成成分を含み得る。
【００４５】
本明細書において使用される、「細胞」という用語は、真核細胞および原核細胞の全ての型を含むことを指す。好ましい態様において、本用語は真核細胞、特に哺乳類細胞を指す。
【００４６】
「細胞培養(cell culture)」または「培養（culture）」とは、人工の、インビトロの環境における細胞の維持を意味する。
【００４７】
「培養（cultivation）」とは、増殖および/または分化および/または継続的な生存度を補助する条件下での、インビトロにおける細胞の維持を意味する。「培養（cultivation）」とは、「細胞培養」と交換可能に使用することができる。培養（cultivation）は、生細胞数/ml培養培地によって評価される。巨大分子の導入後の培養（cultivation）は、好ましくは産物、たとえばウイルスにおけるタンパク質産物の産生を含む。
【００４８】
本明細書において使用されるものとして、「培地を補給、置換、または補足すること」という用語は、ある体積の新しい細胞培養培地をすでに培養物において存在していた培地に添加すること、および/または培養物においてすでに存在していた培地を新しい培地と置換すること、および/またはすでに培養物に存在していた培地に新しい培地を補うことを指す。新しい培地は、少なくとも1つの細胞に導入するための1つもしくは複数の巨大分子または化合物を含まない培地であるか、または培養（cultivation）においてこれらの増殖を支持するために細胞と接触したことのない培地である。当業者は、細胞計測（手動または自動化されたもの）、トリパンブルー排除法、タンパク質またはその他の物質の産生、アラマーブルーアッセイ、1つもしくは複数の代謝産物の存在または濃度、細胞接着、形態学的外観、消費された培地の解析などの当業者に既知の技術によって、細胞増殖および/または生存度をモニターすることにより、培地を除去および/または補給、置換、もしくは補足することによる利点があるか、または必要があるかどうかを決定することができる。モニターする技術の1つまたは組み合わせは、培地が、増殖、少なくとも1つの巨大分子の導入、および/または少なくとも1つの巨大分子の導入後の培養（cultivation）を支持するために必要であるかどうかを決定するために使用することができる。
【００４９】
「組換えタンパク質」とは、宿主細胞に導入された核酸によってコードされるタンパク質を指す。宿主細胞は、核酸を発現する。「核酸の発現」という用語は、「核酸によってコードされるRNAのタンパク質の発現」と同義である。本明細書において使用される「タンパク質」とは、重合アミノ酸、たとえばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質などを広く指す。
【００５０】
「タンパク質収量」という用語は、培養された（cultured）細胞によって発現されるタンパク質の量を指し、たとえば産生されたタンパク質のグラム/ml培地に関して測定され得る。タンパク質が細胞によって分泌されない場合、タンパク質は当業者に既知の方法によって細胞の内部から単離することができる。タンパク質が細胞によって分泌される場合、タンパク質は、当業者に既知の方法によって培養培地から単離することができる。細胞によって発現されるタンパク質の量は、当業者によって容易に決定され得る。タンパク質は、組換えタンパク質であってもよい。
【００５１】
「タンパク質産物」とは、タンパク質による産生または作用に関連した産物である。タンパク質産物は、タンパク質であってもよい。また、タンパク質産物は、産物を産生する1つまたは複数のその他の物質による、タンパク質の作用から生じる産物であってもよい。このような作用の例は、タンパク質による酵素作用である。
【００５２】
「懸濁培養（suspension culture）」とは、培養容器における細胞の大多数または全てが懸濁液中に存在し、容器表面または容器内の別の表面に、培養容器の細胞の少数が接着するかまたは全く接着しない細胞培養を意味する。好ましくは、「懸濁培養」は、培養容器の細胞のうち、懸濁液中に存在し、培養容器上または培養容器内の表面に接着しない細胞を75％より多く有する。より好ましくは、「懸濁培養」は、培養容器の細胞のうち、懸濁液中に存在し、培養容器上または培養容器内の表面に接着しない細胞を85％より多く有する。培養容器の細胞の95％より多くが懸濁液で存在し、培養容器上または培養容器内の表面に接着しない「懸濁培養」がさらに好ましい。
【００５３】
本発明の培地、方法、キット、および組成物は、細胞の単層培養または懸濁培養のいずれか、トランスフェクション、および培養（cultivation）のため、ならびに単層培養または懸濁培養における細胞でのタンパク質の発現のために適している。好ましくは、本発明の培地、方法、キットおよび組成物は、細胞の懸濁培養、トランスフェクション、および培養（cultivation）のため、ならびに懸濁培養における細胞でのタンパク質産物の発現のためのものである。
【００５４】
「培養容器」とは、細胞を培養（culture）するための無菌環境を提供することができる、任意の容器、たとえば、ガラス、プラスチック、または金属容器を意味する。
【００５５】
「細胞培養培地（cell culture medium）」、「組織培養培地（tissue culture medium）」、「培養培地（culture medium）」（それぞれの場合において複数形は「培地（media）」）、および「培地製剤」という語句は、細胞または組織を培養する（cultivate）ための栄養溶液を指す。これらの語句を、交換可能に使用することができる。
【００５６】
「合わせる（combining）」という用語は、成分を混合すること（mixing）、または混ぜること（admixing）を指す。
【００５７】
分子の誘導体は、基礎環状または複素環式の分子を含むが、さらなる側鎖基または修飾された側鎖基を有するこれらの化合物を含む。好ましくは、「誘導体」とは、基礎分子と、ただ1つの反応物分子、しかしおそらく2、3、4、5、6つなどの反応物分子と反応させることによって形成される。誘導体を形成するために、単一工程の反応が好ましいが、複数工程、たとえば2つ、3つ、4つ、5つ、6つなどの反応が当業者に既知である。誘導体化合物を形成するために、置換、縮重、および加水分解反応が好ましく、かつこれらを組み合わせてもよい。または、誘導体化合物は、好ましくは1つ、しかしおそらくは2つ、3つ、4つ、5つ、6つなどの反応により、基礎環状もしくは複素環式の化合物、またはその置換産物もしくは縮合産物を形成し得る化合物であってもよい。
【００５８】
細胞培養培地は、多くの成分で構成され、これらの成分は、培地間で変更することもできる。細胞培養培地に使用されるそれぞれの成分は、独特の物理的および化学的特徴を有する。成分の適合性および安定度は、部分的には、成分の水溶液における「溶解性」によって決定される。「溶解性」および「可溶性」という用語は、成分がその他の成分と溶液を形成し、そのままである能力を指す。したがって、成分が、これらが測定可能または検出可能な沈降物を形成することなく溶液の状態を維持し得る場合は、適合する。
【００５９】
また、「適合性成分」とは、共に溶液の状態を維持し、「安定」な組み合わせを形成し得る培地成分を意味する。「適合性成分」を含む溶液は、細胞が利用できる1つまたは複数の培地由来成分の濃度が、もはや細胞の最適な増殖または所望の増殖を支持しなくなるレベルにまで減少するように、成分が実質的に沈殿、劣化（degrade）、または分解（decompose）しない場合に、「安定」であるといわれる。また、劣化を検出することができない場合、または1×細胞培養培地製剤における同じ成分の分解と比較したときに、分解がより遅い速度で生じるとき、成分は「安定」であるとみなされる。たとえば、1×培地製剤において、グルタミンは、ピロリドンカルボン酸およびアンモニアに分解することが知られている。グルタミンの分解は、ある期間にわたって、グルタミンおよび二価カチオンが存在する溶液または組み合わせ中において、ほとんど検出することができないか、もしくは全く検出することができないので、二価カチオンと組み合わせたグルタミンは、「適合性成分」であるとみなされる。米国特許第5,474,931号を参照されたい。したがって、本明細書において使用される「適合性成分」という用語は、濃縮した製剤または1×製剤として溶液に混合されたときに、「安定」かつ「可溶性」である特定の培養培地成分の組み合わせを指す。
【００６０】
「1×製剤」とは、細胞培養培地に作用濃度で見出される、一部または全ての成分を含む、任意の水溶液を指すことを意味する。「1×製剤」とは、たとえば、細胞培養培地またはその培地のための成分の任意のサブグループを指し得る。1×溶液の成分の濃度は、インビトロで細胞を維持または培養（cultivate）するために使用される、細胞培養製剤において見出される成分の濃度とほぼ同じである。細胞のインビトロにおける培養（cultivation）のために使用される細胞培養培地は、定義により1×製剤である。多くの成分が存在する場合、1×製剤のそれぞれの成分は、細胞培養の間、培地中のそれぞれの成分の濃度とほぼ等しい濃度を有する。たとえば、RPMI-1640培地は、その他の成分の中に、0.2g/L L-アルギニン、0.05g/L L型アスパラギン、および0.02g/L L-アスパラギン酸を含む。これらのアミノ酸の「1×製剤」は、溶液中にこれらの成分とほぼ同じ濃度を含む。したがって、「1×製剤」を指す場合、溶液中のそれぞれの成分が、記載されている細胞培養培地中に見出されるものと同じ濃度か、またはほぼ同じ濃度を有することが意図される。細胞培養培地の1×製剤における成分の濃度は、当業者に周知である。たとえば、Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture、Allen R. Liss、N.Y.（1984）、Handbook of Microbiological Media、第2版、Ronald M. Atlas、Lawrence C. Parks編（1997）CRC Press、Boca Raton、FL、ならびにPlant Culture Media 第1巻:Formulations and Uses、E.F. George、D.J.M. Puttock、およびH.J.George（1987）Exegetics Ltd. Edington、Westbury、Wilts、BA13 4QG Englandを参照されたい（各々は、全体として本明細書に参照として組み入れられる）。しかし、モル浸透圧濃度および/またはpHは、特により少数の成分が1×製剤に含まれる場合、培養培地と比較すると、1×製剤においては異なり得る。
【００６１】
「10×製剤」とは、その溶液中のそれぞれの成分の濃度が、細胞培養中の培地におけるそれぞれの成分の濃度よりも約10倍大きい溶液を指す。たとえば、RPMI-1640培養培地の10×製剤は、その他の成分の中に、2.0g/L L-アルギニン、0.5g/L L-アスパラギン、および0.2g/L L-アスパラギン酸（上記の1×製剤と比較）を含み得る。「10×製剤」とは、1×培養製剤において見出されるものの約10倍の濃度で、多くのさらなる成分を含む。容易にわかることだが、「25×製剤」、「50×製剤」、「100×製剤」、「500×製剤」、および「1000×製剤」とは、1×細胞培養製剤と比較して、それぞれ約25倍、50倍、100倍、500倍、または1000倍濃度で成分を含む溶液を示す。また、培地製剤および濃縮溶液のモル浸透圧濃度およびpHは、変動し得る。
【００６２】
「微量元素」または「微量元素成分（trace element moiety）」という用語は、培養培地中に存在するその他の成分もしくは構成成分の量または濃度と比較して、非常に低量または低濃度（すなわち、「微量」）でしか細胞培養培地に存在しない成分を指す。本発明において、これらの用語は、Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu1+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ge4+、Se4+、Br-、I-、Mn2+、F-、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+およびZr4+およびこれらの塩を包含する。たとえば、以下の塩は、本発明の培養培地における微量元素として使用することができる：AgN03、AlCl3・6H20、Ba(C2H302)2、CdSO4・8H2O、CoCl2・6H20、Cr2(SO4)3・1H2O、GeO2、Na2SeO3、H2SeO3、KBr、KI、MnCl2・4H20、NaF、Na2Si03・9H20、NaV03、(NH4)6Mo7O24・4H20、NiSO4・6H20、RbCl、SnCl2、およびZrOCl2・8H20。微量元素部分の適切な濃度は、日常的な実験法のみを使用して、当業者によって決定され得る。
【００６３】
「アミノ酸」という用語は、アミノ酸またはそれらの誘導体（たとえば、アミノ酸類似体）、ならびにそれらのD-およびL-体を指す。このようなアミノ酸の例は、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニン、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、N-アセチルシステインを含む。
【００６４】
「無血清培地」とは、血清（たとえば、ウシ胎児血清（FBS）、仔ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒト血清など）を含まない培地であり、一般にSFMという文字によって示される。
【００６５】
「無血清培養条件」および「無血清条件」という用語は、いかなる型の血清も排除した細胞培養条件を指す。これらの用語は、交換可能に使用することができる。
【００６６】
「化学的に規定された」培地は、細胞培養において使用する前に、それぞれの化学種およびそのそれぞれの量が既知であるものである。化学的に規定された培地は、化学種が既知でない、かつ/または定量されていない可溶化液または加水分解産物を用いずにに作製される。化学的に規定された培地は、本発明の培地の1つの好ましい態様である。
【００６７】
「無タンパク質」培養培地という用語は、タンパク質（たとえば血清アルブミンもしくは吸着因子などの血清タンパク質、増殖因子などの栄養タンパク質、またはトランスフェリン、セルロプラスミンなどの金属イオン担体タンパク質）を含まない培養培地を指す。好ましくは、ペプチドが存在する場合、ペプチドはより小さなペプチド、たとえばジペプチドまたはトリペプチドである。好ましくは、デカペプチド以上の長さのペプチドは、無タンパク質培地に存在するアミノ酸の約1％未満、より好ましくは約0.1％未満、さらにより好ましくは約0.01％未満である。
【００６８】
本明細書において使用される「低タンパク質」培養培地という用語は、タンパク質を低い量でしか含まない（典型的には、5％〜10％血清を補った標準基礎培地などの、標準的な量のタンパク質を含む培養培地において見出される総タンパク質の量または濃度の、約10％未満、約5％未満、約1％未満、約0.5％未満、または約0.1％未満）培地を指す。
【００６９】
本明細書において使用される、「動物由来」物質という用語は、全体的または部分的に動物供与源から由来する物質を指し、組換え動物DNAまたは組換え動物タンパク質DNAを含む。好ましい培地は、動物由来物質を含まない。
【００７０】
「遷移元素」または「遷移金属」（これらは、交換可能に使用することができる）は、外殻よりもむしろ内側の電子価殻が部分的にのみ満たされ、その結果、元素が所与の元素の系列において最も陽性の物質と最も陽性でない物質との間の遷移結合（transitional link）として作用する元素を意味する。遷移元素は、典型的には、高融点、高密度、高い双極性または磁気モーメント、多価、および安定な複合体イオンを形成する能力によって特徴づけられる。本発明において有用なこのような遷移元素の例は、スカンジウム（Sc）、チタン（Ti）、バナジウム（V）、クロム（Cr）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、コバルト（Co）、ニッケル（Ni）、銅（Cu）、亜鉛（Zn）、イットリウム（Y）、ジルコニウム（Zr）、ニオブ（Nb）、モリブデン（Mo）、テクネチウム（Tc）、ルビジウム（Ru）、ロジウム（Rh）、パラジウム（Pd）、銀（Ag）、カドミウム（Cd）、ランタン（La）、ハフニウム（Hf）、タンタル（Ta）、タングステン（W）、レニウム（Re）、オスミウム（Os）、イリジウム（Ir）、白金（Pt）、金（Au）、水銀（Hg）、およびアクチニウム（Ac）を含む。本発明のものを含む培養培地組成物に使用するための遷移元素として特に関心対象であるものは、鉄のイオン、キレート、塩、および複合体（Fe++またはFe+++）である。
【００７１】
様々な技術および試薬が、標的細胞に巨大分子を導入するために利用可能である。通常使用される試薬は、たとえばリン酸カルシウム、DEAE-デキストラン、および脂質を含む。これらの型の試薬を使用するための詳細なプロトコルの例については、多数の参照テキスト、たとえばCurrent Protocols in Molecular Biology、第9章、Ausubelら編、John Wiley and Sons、1998、が利用できる。
【００７２】
リポソームなどの脂質凝集体は、細胞に巨大分子を送達するための薬剤として有用であることが見出されている。特に、1つまたは複数のカチオン性脂質を含む脂質凝集体は、細胞内へのアニオン性巨大分子（たとえば核酸）の送達において極めて効率がよいことが示されている。1つの通常使用されるカチオン性脂質は、N-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）である。DOTMAを単独で含むか、またはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）との1：1の混合液で含むリポソームは、細胞に核酸を導入するために使用されている。DOTMA：DOPEの1：1の混合液は、リポフェクチン（LIPOFECTIN、登録商標）の商品名の下でInvitrogen Corporation、Carlsbad、CAから市販されている。細胞に核酸を導入するために使用されるもう1つのカチオン性脂質は、1,2-ビス(オレオイル-オキシ)-3-3-(トリメチルアンモニア)プロパン（DOTAP）である。DOTAPにおいてはオレオイル部分がエーテル結合を介してプロピルアミンバックボーンに結合されるが、DOTMAにおいてはエステル結合を介して結合されるという点で、DOTAPはDOTMAと異なる。DOTAPは、標的細胞によってより容易に分解されると考えられる。トリメチルアンモニウム部分のメチル基のうちの1つがヒドロキシエチル基で置換された、構造的に関連した化合物群は、ホスホリパーゼAのローゼンタールインヒビター（RI）に構造の点で類似する（Rosenthalら（1960）J.Biol.Chem 233： 2202-2206を参照されたい）。RIは、プロピルアミン核に結合したステアロイルエステルを有する。RIのジオレオイル類似体は、通常は、プロピルアミン核に対する脂質部分の結合によって、DORI-エーテルおよびDORI-エステルと略記される。ヒドロキシエチル部分のヒドロキシル基は、たとえばカルボキシスペルミンへのエステル化により、さらに誘導体化され得る。
【００７３】
細胞に巨大分子を導入するために使用されてきた化合物のもう1つの分類（class）は、脂質に結合されたカルボキシスペルミン部分を含む（Behrら（1989）Proceedings of the National Academy of Scineces、USA86：6982-6986および欧州特許第0 394 111号を参照されたい）。この型の化合物の例は、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン 5-カルボキシスペルミルアミド（DPPES）および5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（DOGS）を含む。DOGSは、トランスフェクタム（TRANSFECTAM、商標）の商品名の下でPromega、Madison、WIから市販されている。
【００７４】
コレステロールのカチオン誘導体（3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)]コレステロール、DC-Chol）は、合成され、DOPEと共にリポソームに製剤化されており（Gaoら（1991）BBRC 179（1）：280-285を参照されたい）、細胞にDNAを導入するために使用されている。このように、製剤化されたリポソームは、低レベルの細胞毒性で効率的に細胞にDNAを導入することが報告された。DOPEにポリリジンを結合させることによって形成されるリポポリリジン（Zhouら（1991）BBA 1065：8-14を参照されたい）は、血清の存在下で細胞に核酸を導入するために有効であることが報告されている。
【００７５】
細胞に核酸を導入するために使用されるその他の型のカチオン性脂質は、米国特許第5,674,908号および第5,834,439号、ならびに国際公開公報第00/27795号として刊行された国際出願第PCT/US99/26825号に記載されたものなどの、高度に充填されたポリカチオン性アンモニウム、スルホニウム、およびホスホニウム脂質を含む。巨大分子の送達のための1つの好ましい薬剤は、Invitrogenから入手可能であるリポフェクトアミン2000（LIPOFECTAMINE2000、商標）である。国際公開公報00/27795として刊行された米国国際出願第PCT/US99/26825号を参照されたい。
【００７６】
細胞に「巨大分子を導入するための試薬」は、細胞への巨大分子の移行を容易にする、当業者に既知の任意の物質である。たとえば、米国特許第5,279,833号を参照されたい。いくつかの態様において、試薬は、「トランスフェクション試薬」であってもよく、1つまたは複数の標的細胞への1つまたは複数の核酸の取込みを増大させる、任意の化合物および/または組成物であってよい。様々なトランスフェクション試薬が、当業者に既知である。適切なトランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミン（PEI）などのカチオン性ポリマー、ポリリジンおよびポリアルギニンなどの正に荷電したアミノ酸のポリマー、正に荷電したデンドリマーおよび破砕（fractured）デンドリマー、カチオン性β-シクロデキストリン含有ポリマー（CD-ポリマー）、DEAE-デキストランなどを含む、1つまたは複数の化合物および/または組成物を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、細胞に巨大分子を導入するための試薬は、カチオン性脂質および/または中性脂質であり得る1つまたは複数の脂質を含むこともできる。好ましい脂質は、N-[1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド（DOTMA）、ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPE）、1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(4'-トリメチルアンモニオ)プロパン（DOTAP）、1,2-ジオレオイル-3-(4'-トリメチルアンモニオ)ブタノイル-sn-グリセロール（DOTB）、1,2-ジオレオイル-3-サクシニル-sn-グリセロールコリンエステル（DOSC）、コレステリル(4'-トリメチルアンモニオ)ブタノエート（ChoTB）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB）、1,2-ジオレオイル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORI）、1,2-ジオレイルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DORIE）、1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（DMRIE）、O,O'-ジドデシル-N-[p(2-トリメチルアンモニオエチルオキシ)ベンゾイル]-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、1つまたは複数の脂質に抱合されたスペルミン（たとえば、5-カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（DOGS）、N,NI,NII,NIII-テトラメチル-N,NI,NII,NIII-テトラパルミチルスペルミン（TM-TPS）、およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン5-カルボキシスペルミルアミド（DPPES））、リポポリリジン（DOPEに抱合されたポリリジン）、トリリジル-アラニル-TRIS モノ-、ジ-、およびトリ-パルミチン酸などの、脂肪酸（TFA）および/またはペプチドに抱合されたTRIS（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン,トロメタミン）、3β-[N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル]コレステロール（DC-Chol）、N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタミン酸クロリド（TMAG）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、2,3-ジオレイルオキシ-N-[2(スペルミン-カルボキシアミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）ならびにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００７７】
当業者であれば、上述した脂質のある一定の組み合わせ、たとえば商品名リポフェクトアミン（LIPOFECTAMINE、商標）の下でInvitrogen Corporation、Carlsbad、CAから入手可能である、DOSPAおよびDOPEの3：1（w/w）の組み合わせ、商品名リポフェクチン（LIPOFECTIN、登録商標）の下でInvitrogen Corporation、Carlsbad、CAから入手可能である、DOTMAおよびDOPEの1：1（w/w）の組み合わせ、商品名DMRIE-C試薬の下で、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CAから入手可能である、DMRIEおよびコレステロールの1：1（M/M）の組み合わせ、商品名セルフェクチン（CellFECTIN、登録商標）の下でInvitrogen、Corporation、Carlsbad、CAから入手可能である、TM-TPSおよびDOPEの1：1.5（M/M）の組み合わせ、商品名リプフェクトエース（LipfectACE、登録商標）の下でInvitrogen Corporation、Carlsbad、CAから入手可能である、DDABおよびDOPEの1：2.5（w/w）の組み合わせなどが、細胞に核酸を導入するために特に適していることが示されたことを認識すると考えられる：。上述した脂質の組み合わせに加えて、その他の化合物と混合された脂質を含むその他の製剤、特に核局在化配列を含むペプチドおよびタンパク質と混合された脂質を含む製剤が、当業者に既知である。たとえば、国際公開公報第00/27795号として刊行された国際出願第PCT/US99/26825号を参照されたい。
【００７８】
本発明は、（a）培養（culture）における真核細胞への少なくとも1つの巨大分子の導入、（b）少なくとも1つの巨大分子が導入された細胞の培養（cultivation）、および選択的に（c）少なくとも1つの巨大分子が導入された細胞における、タンパク質産物の産生または核酸の発現、を支持する培地であって、巨大分子を含む培地は、細胞に少なくとも1つの巨大分子の導入後、ならびに培養（cultivation）およびタンパク質産物の産生または核酸の発現前に、培養物から除去され、かつ新しい培地と置換されることを必要としない培養培地に向けられる。本発明の培地を使用すると、少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの巨大分子を導入した後、および少なくとも1つの巨大分子が導入された細胞をさらに培養してタンパク質産物を産生させるか、または核酸を発現させる前に、培地を補給、置換、または補足する必要がない。本発明の培地、方法、キット、および組成物において、培地は、無血清培地、および/または化学的に規定された培地、および/または無タンパク質もしくは低タンパク質の培地、および/または動物由来成分を含まない培地、またはこれらの特徴の組み合わせを有する培地である。
【００７９】
CD CHO培地（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）は、懸濁培養においてCHO細胞をトランスフェクションするために使用することができる。しかし、CD CHO培地におけるCHO細胞のトランスフェクションは、トランスフェクション後にトランスフェクションした細胞が培養（culture）される培地よりも、相対的に少ない体積のCD CHO培地において、核酸で細胞をトランスフェクションする場合にのみ機能する。したがって、核酸をトランスフェクションした後にCD CHO培地で培養（culture）される細胞については、細胞を相対的に少ない体積でトランスフェクションさせ、次いで、次の培養のために相対的に多い体積のCD CHO培地でトランスフェクション細胞を希釈する必要がある。
【００８０】
好ましい態様において、培養における細胞への化合物または巨大分子（たとえば、核酸）の導入に関して、本発明の培養培地は、CD CHO培地で行うよりも高い細胞形質転換効率を容易にし、および/またはトランスフェクション後に細胞が培養される体積よりも少ない体積でトランスフェクションする必要がなく、かつ/またはCD CHO培地で行うよりも高い細胞生存度を容易にし、かつ/またはCD CHO培地で行うよりも高い細胞密度（すなわち、培養培地の細胞/ml）を容易にし、かつ/または培養における細胞において、CD CHO培地で行うよりも高いレベルでの組換えタンパク質の発現を容易にする。好ましくは、少なくとも1つの巨大分子の導入またはトランスフェクションのため、およびその後の培養のために、同じ体積の培地が使用される。または、細胞は分割されるか、または、培地体積は、約2倍、約5倍、約8倍、もしくは約10倍未満に増加される。好ましい態様において、本発明の培養培地は、CD CHO培地ではない。
【００８１】
本発明の培地、方法、キットおよび組成物は、任意の体積の培養培地において、少なくとも1つの巨大分子を導入するため、またはトランスフェクションするため、および培養（culture）するために使用することが意図される。このような導入は、好ましくは、トランスフェクションされた細胞を培養するために使用される量の0.1倍〜10倍の培地において達成される。好ましくは、細胞培養体積は、約1ミリリットルよりも多い。より好ましくは、細胞培養体積は、約1ミリリットル〜250リットルである。より好ましくは、細胞培養体積は、約30ml〜約50リットルである。より好ましくは、細胞培養体積は、約100ml〜約50リットルである。より好ましくは、細胞培養体積は、約500ml〜約50リットルである。より好ましくは、細胞培養体積は、約500ml〜約25リットルである。より好ましくは、細胞培養体積は、約500ml〜約10リットルである。より好ましくは、細胞培養体積は、約500ml〜約5リットルである。より好ましくは、細胞培養体積は、約500ml〜約1リットルである。
【００８２】
本発明の培地、方法、キット、および組成物において、培地は、好ましくは巨大分子の導入またはトランスフェクションを阻害し得る化合物、たとえば、ポリスルホン化化合物および/またはポリ硫酸化化合物などのポリアニオン化合物を含まない。好ましくは、培地は硫酸デキストランを含まない。
【００８３】
本発明の培地、方法、キット、および組成物は、培地を交換する必要なく、培養細胞に化合物または巨大分子（特に巨大分子、たとえば核酸、タンパク質、およびペプチド）を導入することを可能にする（たとえばトランスフェクションによって）。1つの好ましい態様において、本発明は、真核細胞の培養（cultivation）およびトランスフェクションのための培地を提供する。
【００８４】
本発明の培地、方法、キット、および組成物を使用して、当業者は、培養において細胞に巨大分子または化合物（たとえば、核酸）を導入することができる。好ましくは、巨大分子または化合物（たとえば、核酸）は、細胞の少なくとも約20パーセントに導入される。より好ましくは、巨大分子または化合物（たとえば、核酸）は、細胞の約20パーセント〜約100パーセントに導入される。より好ましくは、巨大分子または化合物（たとえば、核酸）は、細胞の約30パーセント〜約100パーセントに導入される。より好ましくは、巨大分子または化合物（たとえば、核酸）は、細胞の約50パーセント〜約100パーセントに導入される。実際には、巨大分子または化合物は、細胞の約20％から約90％、細胞の約20％から約80％、細胞の約30％から約60％、70％、80％、もしくは90％、細胞の約20％、30％、40％、または50％から約70％、75％、80％、85％、90％、95％、もしくは98％などで導入され得る。細胞の約60％、70％、75％、もしくは80％から約90％、または約100％近くまでもが、導入された分子または化合物を含み得る。
【００８５】
本発明の培地、方法、キット、および組成物の好ましい態様において、1つまたは複数の望ましくない構成成分（すなわち、1つまたは複数の血清成分、1つまたは複数の不定成分、1つまたは複数のタンパク質成分、および/または1つまたは複数の動物由来成分）は、1つまたは複数の置換化合物によって1つまたは複数の機能が置換されるか、または置き換えられている。本発明の置換化合物は、金属結合化合物および/または1つまたは複数の遷移元素複合体であってよく、複合体は、1つまたは複数の金属結合化合物と複合体を形成した、1つまたは複数の遷移元素またはその塩もしくはイオンであってよい。好ましくは、培地は、トランスフェリンなどの1つまたは複数の天然由来金属担体、またはその他の動物由来のタンパク質もしくは抽出物の非存在下において、インビトロでの細胞の培養（cultivation）を支持することができる。金属結合化合物は、培地に金属結合化合物を添加する前に、遷移金属と複合体を形成していてもよい。その他の態様において、金属結合化合物は、培地に金属結合化合物を添加する前に遷移金属と複合体を形成していない。好ましくは、本発明の培地は、トランスフェリンを含まず、かつ/またはインスリンを含まない。
【００８６】
また、本発明は、1つまたは複数の置換化合物と培地の組み合わせによって得られる細胞培養培地に関する。好ましくは、培地は、無血清培地、および/または化学的に規定された培地、および/または無タンパク質もしくは低タンパク質の培地であってもよく、かつ/または動物由来成分を欠く培地であってよい。培地は、好ましくはトランスフェリンを含まず、かつ/またはインスリンを含まない。いくつかの好ましい態様において、培地は、インビトロにおける細胞の培養（cultivation）を支持することができ、かつ/または細胞への巨大分子の導入を可能にし得る。いくつかの態様において、1つまたは複数の置換化合物は、金属結合化合物であってもよく、かつ/または遷移元素複合体であってもよく、複合体は、少なくとも1つの金属結合化合物に複合体を形成した、少なくとも1つの遷移元素またはその塩もしくはイオンを含む。本発明のこの局面において使用するための好ましい遷移元素、金属結合化合物、および遷移元素複合体は、本明細書において詳細に記載されたものを含む。
【００８７】
本発明の置換化合物は、インビトロにおいて培養（culture）した細胞への遷移金属の送達を容易にし得る。好ましい態様において、置換化合物は、鉄を送達してトランスフェリンを置換し得る。好ましい置換化合物は、ヒドロキシピリジン誘導体である。好ましくは、ヒドロキシピリジン誘導体は、2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド、3-ヒドロキシ-4-ピロン、3-ヒドロキシピピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-ヒドロキシピリド-2-オン、1,2-ジメチル-3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-メチル-3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン、およびピリドキサールイソニコチニルヒドラゾン、ニコチン酸-N-オキシド、2-ヒドロキシ-ニコチン酸からなる群より選択される。最も好ましくは、ヒドロキシピリジン誘導体は、2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドである。
【００８８】
本発明の置換化合物は、真核および/または原核細胞、組織、器官などを培養（cultivate）または増殖させるための培地を含む、任意の培地と共に使用することができる。このような培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、最小必須培地（MEM）、基礎培地イーグル（BME）、RPMI-1640、Ham's F-10、Ham's F-12、α最小必須培地（αMEM）、グラスゴー最小必須培地（G-MEM）、およびイスコフ（Iscove's）改変ダルベッコ培地（IMDM）を含むが、これらに限定されない。市販されているか（たとえば、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CAから）、または本発明に従って同等に使用することができる、当業者に既知のその他の培地は、293 SFM、CD-CHO培地、VP SFM、BGJb培地、ブリンスター（Brinster's）BMOC-3培地、細胞培養凍結培地、CMRL培地、EHAA培地、eRDF培地、フィッシャー培地、ガンボーグ（Gamborg's）B-5培地、GLUTAMAX（商標）補足培地（supplemented media）、グレース昆虫細胞培地、HEPES緩衝培地、リヒター（Richter's）改変MEM、IPL-41昆虫細胞培地、リーボビッツ（Leibovitz's）L-15培地、マッコイ（McCoy's）5A培地、MCDB131培地、メディア199、改変イーグル培地（MEM）、培地NCTC-109、シュナイダーショウジョウバエ（Drosophila）培地、TC-100昆虫培地、ウェイマウス（Waymouth's）MB752/1培地、ウィリアム培地E、無タンパク質ハイブリドーマ培地II（PFHM II）、AIM V培地、ケラチノサイトSFM、規定ケラチノサイトSFM、STEMPRO（登録商標）SFM、STEMPRO（登録商標）登録商標完全メチルセルロース培地、HepatoZYME-SFM、ニューロベイサル（Neurobasal、商標）培地、ニューロベイサル（Neurobasal）-A培地、ハイバネート（Hibernate、商標）A培地、ハイバネート（Hibernate）E培地、内皮SFM、ヒト内皮SFM、ハイブリドーマSFM、PFHMII、Sf900培地、Sf900 II SFM、EXPRESS FIVE（登録商標）培地、CHO-S-SFM、AMINOMAX-II完全培地、AMINOMAX-C100完全培地、AMINOMAX-C100基礎培地、PB-MAX（商標）核型分析培地、KARYOMAX骨髄核型分析培地、KNOCKOUT D-MEMおよびCO2非依存性培地を含むが、これらに限定されない。上記の培地は、JRH、Sigma、HyClone、およびBioWhittakerなどの当業者に既知の製造者から得られる。本発明の実施に適した培地のさらなる例は、米国特許第5,135,866号および第5,232,848号、ならびに国際公開公報第88/02774号、国際公開公報第98/15614号、国際公開公報第98/08934号、および欧州特許第0 282 942において見出すことができ、その全体は、参照として明確に本明細書に組み入れられる。
【００８９】
また、本発明は、本発明の培地において細胞を培養（culture）する段階、および1つまたは複数の細胞による巨大分子の取り込みを引き起こす条件下で、培地中の細胞を1つまたは複数の巨大分子と接触させる段階を含む、細胞に巨大分子を導入するための方法を提供する。好ましくは、培地は、無血清培地、および/または化学的に規定された培地、および/または無タンパク質もしくは低タンパク質培地であり、かつ/または動物由来の構成成分を欠く培地であってよい。好ましい細胞は、真核細胞を含む。より好ましくは、細胞は、哺乳類細胞である。培地は、1つまたは複数の置換化合物を含むこともでき、好ましくはトランスフェリンを含まず、かつ/またはインスリンを含まない。いくつかの好ましい態様において、培地は、同じ培地における細胞の増殖およびトランスフェクションを可能にする。いくつかの態様において、巨大分子は、1つまたは複数の核酸を含んでよく、細胞による核酸分子の取り込みを引き起こす条件は、1つまたは複数の細胞へ核酸を導入させる試薬と核酸を接触させることを含む。
【００９０】
また、本発明は、本発明の培地を含む組成物および細胞を提供する。好ましくは、培地は、無血清培地、および/または化学的に規定された培地、および/または無タンパク質もしくは低タンパク質の培地、および/または動物由来の成分を欠く培地である。好ましい細胞は、真核細胞を含む。より好ましくは、細胞は、哺乳類細胞である。培地は、1つまたは複数の置換化合物を含んでよく、好ましくはトランスフェリンを含まず、かつ/またはインスリンを含まない。好ましくは、培地は、同じ培地における細胞の増殖およびトランスフェクションを支持する。
【００９１】
また、本発明は、本発明の培地、および1つまたは複数の細胞に巨大分子を導入するための、1つまたは複数の試薬を含む組成物を提供する。好ましくは、培地は、無血清培地、および/または化学的に規定された培地、および/または無タンパク質もしくは低タンパク質の培地、および/または動物由来の構成成分を欠く培地である。培地は、1つまたは複数の置換化合物を含んでよく、好ましくはトランスフェリンを含まず、かつ/またはインスリンを含まない。好ましくは、培地は、トランスフェクション試薬を含み、かつ巨大分子は核酸である。巨大分子は、また、タンパク質および/またはペプチドであってもよい。いくつかの態様において、試薬は、1つまたは複数のカチオン性脂質であり得る、1つまたは複数の脂質を含む。より好ましくは、試薬は中性およびカチオン性脂質の混合物を含む。いくつかの態様において、試薬は、単独、または1つもしくは複数の脂質との混合物で提供され得る、1つまたは複数のペプチドおよび/またはタンパク質を含む。
【００９２】
また、本発明は、本発明の培地、および細胞に導入される1つまたは複数の巨大分子を含む組成物を提供する。好ましくは、培地は、無血清培地、および/または化学的に規定された培地、および/または無タンパク質もしくは低タンパク質の培地、および/または動物由来の構成成分を欠く培地である。培地は、1つまたは複数の置換化合物を含んでよく、好ましくはトランスフェリンを含まず、かつ/またはインスリンを含まない。巨大分子は、たとえば核酸および/またはタンパク質および/またはペプチドであってもよく、かつ複合体を形成していないか、または細胞へ巨大分子を導入するための1つまたは複数の試薬と複合体を形成していてもよい。好ましくは、巨大分子は核酸であり、1つまたは複数のトランスフェクション試薬と複合体を形成していてもよい。
【００９３】
また、本発明は、本発明の培地、少なくとも1つの細胞、少なくとも1つの巨大分子、少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの巨大分子を導入するための、少なくとも1つの試薬からなる群より選択される少なくとも1つの構成成分（または、その組み合わせ）を含む組成物を提供する。好ましくは、細胞は、真核細胞である。より好ましくは、細胞は、哺乳類細胞である。好ましくは、培地は、無血清培地、および/または化学的に規定された培地、および/または無タンパク質もしくは低タンパク質の培地、および/または動物由来の構成成分を欠く培地である。培地は、1つまたは複数の置換化合物を含んでよく、好ましくはトランスフェリンを含まず、かつ/またはインスリンを含まない。いくつかの好ましい態様において、試薬は、トランスフェクション試薬であり、かつ巨大分子は核酸（たとえばRNAおよび/またはDNA）である。または、巨大分子はタンパク質および/またはペプチドである。
【００９４】
いくつかの態様において、試薬は、1つまたは複数がカチオン性脂質であり得る1つまたは複数の脂質を含む。より好ましくは、試薬は、中性およびカチオン性の脂質の混合物を含む。いくつかの態様において、試薬は、単独または1つもしくは複数の脂質との混合物で提供され得る、1つまたは複数のペプチドおよび/またはタンパク質を含む。好ましい態様において、試薬は、細胞に巨大分子を導入するために、巨大分子と複合体を形成する。
【００９５】
また、本発明は、細胞の培養（culture）およびトランスフェクションのための培地を含む少なくとも1つの容器を含む、細胞の培養（culture）およびトランスフェクションのためのキットを提供する。また、このようなキットは、本発明の培地、少なくとも1つの細胞、少なくとも1つの巨大分子、少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの巨大分子を導入するための、少なくとも1つの試薬、少なくとも1つの緩衝液または緩衝化塩、および少なくとも1つの細胞に少なくとも1つの巨大分子を導入するためのキットを使用するための説明書からなる群より選択される、少なくとも1つの構成成分（または、その組み合わせ）を含んでよい。好ましくは、培地は、無血清培地、および/または化学的に規定された培地、および/または無タンパク質もしくは低タンパク質の培地、および/または動物由来の構成成分を欠く培地である。培地は、1つまたは複数の置換化合物を含んでよく、好ましくはトランスフェリンを含まず、かつ/またはインスリンを含まず、かつ/または動物増殖因子を含まない。培地は、金属結合化合物であり得る、1つまたは複数の置換化合物を含んでよく、かつ/または1つまたは複数の置換化合物を含む、1つまたは複数の複合体を含んでよい。いくつかの態様において、培地は、金属結合化合物であり得る1つまたは複数の置換化合物と複合体を形成した、1つもしくは複数の遷移元素またはそのイオンもしくは塩を含む、1つまたは複数の複合体を含んでよい。いくつかの態様において、培地は、インビトロにおける細胞の培養（cultivation）を支持することができ、その中で培養される細胞のトランスフェクションを可能にする。いくつかの態様において、本発明のキットは、細胞をトランスフェクションするための脂質を含む、少なくとも1つの容器をさらに含むこともできる。いくつかの態様において、本発明のキットは、核酸を含む少なくとも1つの容器を含んでよい。
【００９６】
本発明の1つの局面によれば、遷移元素は、好ましくはスカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルビジウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ランタン、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、水銀、およびアクチニウム、またはその塩もしくはイオンからなる群より選択され、好ましくは、鉄の塩である。適切な鉄の塩は、FeCl3、Fe(N03)3、もしくはFeSO4、またはFe+++もしくはFe++イオンを含有するその他の化合物を含むが、これらに限定されない。
【００９７】
好ましい置換化合物は、金属結合化合物を含むが、これらに限定されない。たとえば、国際特許出願第PCT/US00/23580号、国際公開公報01/16294号を参照されたい。
【００９８】
本発明の金属結合化合物は、遷移元素と相互作用または結合し、かつ細胞によるこれらの取込みを容易にすることができる、任意の巨大分子を含む。このような相互作用/結合は、共有結合性または非共有結合性であり得る。本発明の本局面において使用される金属結合化合物は、好ましくはポリオール、ヒドロキシピリジン誘導体、1,3,5-N,N',N''-トリス(2,3-ジヒドロキシベンゾイル)アミノ-メチルベンゼン、エチレンジアミン-N,N'-テトラメチレンホスホン酸、トリスクシン、酸性サッカライド（たとえば、グルコン酸第一鉄）、グリコサミノグリカン、ジエチレントリアミン五酢酸、ニコチン酸-N-オキシド、2-ヒドロキシニコチン酸、モノ-、ビス-、またはトリス-置換2,2'-ビピリジン、ヒドロキサメート誘導体（たとえばアセトヒドロキサム酸）、アミノ酸誘導体、デフェロキサミン、フェリオキサミン、鉄塩基性ポルフィンおよびその誘導体、DOTA-リジン、テキサフィリン、サプフィリン、ポリアミノカルボン酸、α-ヒドロキシカルボン酸、ポリエチレンカルバメート、エチルマルトール、3-ヒドロキシ-2-ピリジン、ならびにIRC011からなる群より選択される。1つの好ましい態様において、金属結合化合物は、ソルビトールまたはデキストランなどのポリオールであり、特にソルビトールである。関連した態様において、金属結合化合物は、2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド、3-ヒドロキシ-4-ピロン、3-ヒドロキシピピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-ヒドロキシピリド-2-オン、1,2-ジメチル-3-ヒドロキシピリド-4-オン、1-メチル-3-ヒドロキシピリド-2-オン、3-ヒドロキシ-2(1H)-ピリジノン、エチルマルトールまたはピリドキサールイソニコチニルヒドラゾンなどのヒドロキシピリジン誘導体であり、好ましくは2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドである。本発明の本局面に従う特に好ましい態様において、遷移金属複合体は、ソルビトール-鉄複合体または2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド-鉄複合体であり得る。また、本発明の金属結合化合物は、Ca++およびMg++などの二価のカチオンと結合することもできる。
【００９９】
本発明は、金属結合化合物であり得る1つまたは複数の置換化合物を含み、少なくとも1つのアミノ酸（L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、またはL-バリン、N-アセチル-システインなど）、少なくとも1つのビタミン（ビオチン、塩化コリン、D-Ca++パントテン酸、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、またはビタミンB12など）、少なくとも1つの無機塩（カルシウム塩、CuSO4、FeSO4、Fe(NO3)3、FeCl3、KCl、マグネシウム塩、マンガン塩、酢酸ナトリウム、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Na2SO4、セレニウム塩、シリコン塩、モリブデン塩、バナジウム塩、ニッケル塩、スズ塩、ZnCl2、ZnSO4またはその他の亜鉛塩など）、アデニン、エタノールアミン、D-グルコース、1つまたは複数のサイトカイン、ヘパリン、ハイドロコーチゾン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレッシン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードサイロニン、PLURONIC F68およびチミジンからなる成分の群より選択される1つまたは複数の成分をさらに含む細胞培養培地に関する。
【０１００】
本発明の培養培地は、選択的に1つまたは複数の緩衝化剤を含んでよい。適切な緩衝化剤は、N-[2-ヒドロキシエチル]-ピペラジン-N'-[2-エタンスルホン酸]（HEPES）、MOPS、MES、リン酸塩、重炭酸塩、および細胞培養適用における使用に適したその他の緩衝化剤を含むが、これらに限定されない。適切な緩衝化剤は、培養（culture）される細胞に対して実質的な細胞毒性なしに、緩衝化能力を提供するものである。適切な緩衝化剤の選択は、細胞培養分野における通常の技術の範囲内である。
【０１０１】
本発明に従って、本発明の細胞培養培地の形成において使用するために適した培地は、1つまたは複数の成分を含んでよく、たとえばアデニン、エタノールアミン、D-グルコース、ヘパリン、緩衝化剤、ハイドロコーチゾン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレッシン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードサイロニン、チミジン、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、N-アセチル-システイン、ビオチン、塩化コリン、D-Ca++パントテン酸、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンB12、Pluronic F68、組換えインスリン、カルシウム塩、CuSO4、FeSO4、FeCl3、Fe(N03)3、KCl、マグネシウム塩、マンガン塩、酢酸ナトリウム、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Na2SO4、セレニウム塩、シリコン塩、モリブデン塩、バナジウム塩、ニッケル塩、スズ塩、ZnCl2、ZnSO4またはその他の亜鉛塩からなる群より選択される、1つまたは複数の成分を合わせることによって得ることができ、それぞれの成分は、インビトロにおける細胞の培養（cultivation）を支持する量で添加される。
【０１０２】
また、本発明は、エタノールアミン、D-グルコース、HEPES、インスリン、リノール酸、リポ酸、フェノールレッド、PLURONIC F68、プトレッシン、ピルビン酸ナトリウム、トランスフェリン、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリン、ビオチン、塩化コリン、D-Ca++-パントテン酸、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンB12、1つまたは複数のカルシウム塩、Fe(N03)3、KCl、1つまたは複数のマグネシウム塩、1つまたは複数のマンガン塩、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、1つまたは複数のセレニウム塩、1つまたは複数のバナジウム塩、および1つまたは複数の亜鉛塩から選択される成分を含む細胞培養培地に向けられ、それぞれの成分は、インビトロにおける哺乳類上皮細胞の懸濁培養を支持する量で存在する。また、本発明は、選択的に、たとえば1つまたは複数のサイトカイン、ヘパリン、1つもしくは複数の動物ペプチド、1つまたは複数の酵母ペプチド、および1つまたは複数の植物ペプチド（もっとも好ましくは1つまたは複数のイネ、アロエ（aloevera）、大豆、トウモロコシ、コムギ、エンドウ、カボチャ、ホウレンソウ、ニンジン、ジャガイモ、サツマイモ、タピオカ、アボカド、オオムギ、ココナツ、および/またはインゲン、および/または1つもしくは複数のその他の植物）からなる群より選択される、1つまたは複数の補足物をさらに含み得るこのような培地に向けられ、たとえば、国際公開公報第98/15614号として刊行された国際出願番号PCT/US97/18255を参照されたい。
【０１０３】
以下の表1〜3に一覧を示す上記の成分は、溶液中に一緒に混合された場合に、本発明の完全な培養培地を形成する。これらの完全な培地は、本明細書においてより詳細に説明されるとおり、様々な哺乳類細胞の培養（culture）における使用に適している。表1〜3において得られる情報および当業者が備えている知識に基づいて、当業者は、過度の実験なしに有効な培地製剤を得ることができる。
【０１０４】
（表１）成分の好ましい範囲
2005506048.tif 000002
***モル浸透圧濃度を調整するために添加した。量は、製剤間でいくぶん変化すると考えられる。NaCLは、約160mOsmoから、275+/-5mOsmoの範囲内の値へ浸透圧を調整するために添加される。
【０１０５】
（表２）例示的培地
2005506048.tif 000003
***モル浸透圧濃度を調整するために添加した。量は、製剤間でいくぶん変化すると考えられる。NaCLは、約160mOsmoから、275+/-5mOsmoの範囲内の値へ浸透圧を調整するために添加される。
【０１０６】
（表３）よく規定された培地
2005506048.tif 000004
***モル浸透圧濃度を調整するために添加した。量は、製剤間でいくぶん変化すると考えられる。NaCLは、約160mOsmoから、275+/-5mOsmoの範囲内の値へ浸透圧を調整するために添加される。
【０１０７】
本発明によって提供される培地は、無タンパク質でもよく、かつ1×製剤であるか、または、たとえば10×、20×、25×、50×、100×、500×、もしくは1000×培地製剤として濃縮され得る。
【０１０８】
また、本発明の培地は、乾燥粉末培地（「DPM」）、顆粒化調製物（これは、水の添加を必要とするが、pH調整などのその他の処理は必要としない）、液体培地、または培地濃縮物などの種々の形態で調製され得る。
【０１０９】
維持のためだけでなく、増殖または産物の産生にも有用な培地である基礎培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機の塩、糖、ならびにその他の構成成分を含む多くの成分を含んでよく、それぞれの成分は、インビトロにおいて哺乳類上皮細胞の培養（cultivation）を支持する量で存在する。
【０１１０】
本発明の培地、方法、キット、および組成物において、培地は、様々な細胞を培養（culture）するために使用され得る。好ましくは、培地は、真核細胞を培養するために使用される。より好ましくは、培地は、植物および/または動物細胞を培養（culture）するために使用される。より好ましくは、培地は、哺乳類細胞、魚細胞、昆虫細胞、両生類細胞、または鳥細胞を培養（culture）するために使用される。より好ましくは、培地は、哺乳類細胞を培養するために使用される。より好ましくは、培地は、一次上皮細胞（たとえば、ケラチノサイト，頚部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、および網膜上皮細胞）、ならびに確立された細胞株およびこれらの系統（たとえば、293胚性腎臓細胞、BHK細胞、HeLa頸部上皮細胞、およびPER-C6網膜細胞、MDBK（NBL-1）細胞、911細胞、CRFK細胞、MDCK細胞、CHO細胞、BeWo細胞、チャン（Chang）細胞、デトロイト562細胞、HeLa229細胞、HeLa S3細胞、Hep-2細胞、KB細胞、LS 180細胞、LS 174T細胞、NCI-H-548細胞、RPMI2650細胞、SW-13細胞、T24細胞、WI-28 VA13,2RA細胞、WISH細胞、BSC-1細胞、LLC-MK2細胞、クローン（Clone）M-3細胞、I-10細胞、RAG細胞、TCMK-1細胞、Y-1細胞、LLC-PK1細胞、PK(15)細胞、GH1細胞、GH3細胞、L2細胞、LLC-RC256細胞、MHlC1細胞、XC細胞、MDOK細胞、VSW細胞、ならびにTH-I、Bl細胞、またはその派生物）、任意の組織または器官の線維芽細胞（心臓、肝臓、腎臓、大腸、小腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細管）、リンパ系組織（リンパ腺、アデノイド、扁桃、骨髄および血液）、脾臓、ならびに繊維芽細胞および繊維芽細胞様細胞株（たとえば、CHO細胞、TRG-2細胞、IMR-33細胞、Don細胞、GHK-21細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー（Dempsey）細胞、デトロイト551細胞、デトロイト510細胞、デトロイト525細胞、デトロイト529細胞、デトロイト532細胞、デトロイト539細胞、デトロイト548細胞、デトロイト573細胞、HEL 299細胞、IMR-90細胞、MRC-5細胞、WI-38細胞、WI-26細胞、MiC1細胞、CHO細胞、CV-1細胞、COS-1細胞、COS-3細胞、COS-7細胞、Vero細胞、DBS-FrhL-2細胞、BALB/3T3細胞、F9細胞、SV-T2細胞、M-MSV-BALB/3T3細胞、K-BALB細胞、BLO-11細胞、NOR-10細胞、C3H/IOTI/2細胞、HSDM1C3細胞、KLN205細胞、マッコイ細胞、マウスL細胞、系統2071（マウスL）細胞、L-M系統（マウスL）細胞、L-MTK-（マウスL）細胞、NCTCクローン2472および2555、SCC-PSA1細胞、Swiss/3T3細胞、インドムンチャク細胞、SIRC細胞、CII細胞、およびイェンゼン細胞、またはこれらの派生物を含むが、それらに限定されない）を含む哺乳類細胞を培養（culture）するために使用される。より好ましくは、培地は、293細胞、PER-C6細胞、CHO細胞、COS細胞、およびSp2/0細胞からなる群より選択される、培養哺乳類細胞を培養（culture）するために使用される。より好ましくは、培地は、培養293細胞を培養（culture）するために使用される。好ましくは、培地は懸濁液中において細胞を培養（culture）するために使用される。
【０１１１】
本発明の培地によって支持される細胞は、任意の動物、好ましくは哺乳類、および最も好ましくはマウスまたはヒトに由来し得る。本培地で培養（cultivate）される細胞は、正常細胞または異常細胞（すなわち、形質転換細胞、確立された細胞、または患部組織試料に由来する細胞）であり得る。
【０１１２】
また、本発明は、本明細書に開示した培養培地製剤を使用する、哺乳類上皮細胞または繊維芽細胞を培養する方法であって、（a）本発明の細胞培養培地と細胞を接触させる段階；および（b）細胞の培養を支持するのに適切な条件下で細胞を培養する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様において、本発明の方法は、選択的に1つまたは複数の細胞に1つまたは複数への巨大分子の導入を引き起こす条件下で、1つまたは複数の巨大分子を含む（好ましくは、1つまたは複数の核酸を含む）溶液と培養細胞を接触させる段階を含み得る。好ましくは、これらの方法に従って培養（cultivate）される細胞（上記した細胞のいずれをも含み得る）は、懸濁液中で培養（cultivate）される。
【０１１３】
本発明は、選択的に、1つまたは複数の哺乳類上皮細胞または線維芽細胞、例えば上記した細胞、特に1つまたは複数の293胚性腎臓細胞、PER-C6網膜細胞、およびCHO細胞などをさらに含み得る、本発明の培養液を含む組成物をさらに提供する。
【０１１４】
本発明は、さらに、（a）懸濁液において培養（cultivate）する哺乳類細胞を得る段階；および（b）懸濁液における細胞の培養を支持するのに充分な条件下で、本発明の培養培地と細胞を接触させる段階を含む、懸濁液において哺乳類細胞（特に、上記したもの、特に293胚性腎臓上皮細胞、PER-C6、およびCHO細胞）を培養する方法に関する。
【０１１５】
本発明はさらに、ウイルスを産生する方法、およびこれらの方法によって産生されるウイルスに関し、本方法は、（a）ウイルスを感染させるための、哺乳類細胞、好ましくは上記の哺乳類細胞、たとえば霊長類、特にサルおよびヒト、最も好ましくは293性胚腎臓上皮細胞、PER-C6細胞、911細胞、またはCHO細胞を得る段階；（b）ウイルスによる細胞の感染を促進するのに適した条件下で、ウイルスと細胞を接触させる段階；ならびに（c）細胞によるウイルスの産生を促進するのに適した条件下において、本発明の培養培地中で細胞を培養（cultivate）する段階を含む。これらの方法によって産生され得るウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスを含む。
【０１１６】
本発明はさらに、ポリペプチドを産生する方法、およびこれらの方法によって産生されるポリペプチドに関し、本方法は、（a）細胞、好ましくは上記した哺乳類細胞、最も好ましくは293胚性腎臓上皮細胞、PER-C6、またはCHO細胞を得る段階；（b）細胞への核酸の導入を引き起こす条件下で、ポリペプチドをコードする核酸を含む溶液と細胞を接触させる段階；および（c）細胞による所望のポリペプチドの発現に有利な条件下で、本発明の培地中で細胞を培養（cultivate）する段階を含む。
【０１１７】
また、本発明は、1つまたは複数の置換化合物を含む組成物、特に細胞培養培地に向けられる。いくつかの態様において、置換化合物は、金属結合化合物、および/または1つまたは複数の金属結合化合物と複合体を形成した、1つもしくは複数の遷移元素であり得る。本発明のこのような細胞培養培地は、植物細胞、動物細胞（特にヒト細胞）、昆虫細胞、細菌細胞、酵母細胞、およびより一般的に、任意の型の真核細胞または原核細胞を、増殖させるか、または培養するために使用され得る。したがって、本発明の置換化合物は、任意の型または種類の培養培地に添加されてよく、好ましくは、このような培地中の天然に由来する金属担体（たとえば、トランスフェリンなどの動物由来タンパク質または抽出物）を置換するために使用される。また、本発明は、たとえばインビトロにおける真核細胞、特に動物細胞の培養（cultivation）のための方法を含む、このような組成物の使用方法に向けられる。また、本発明は、このような培養培地、および1つまたは複数の細胞、特に本明細書において具体的に参照した細胞を含む組成物、ならびに上記の組成物の1つまたは複数を含むキットに関する。
【０１１８】
もう1つの局面において、本発明は、インビトロにおける細胞の培養（cultivation）のためのキットに関する。本キットは、1つまたは複数の容器を含み、第一の容器は、本発明の培地を含む。キットは、1つまたは複数の追加の容器をさらに含んでよく、それぞれの容器は、1つまたは複数のサイトカイン、ヘパリン、1つまたは複数の動物ペプチドもしくは動物由来ペプチド、1つまたは複数の酵母ペプチド、ならびに1つまたは複数の植物ペプチド（これは、好ましくはイネ、アロエ、大豆、トウモロコシ、コムギ、エンドウ、カボチャ、ホウレンソウ、ニンジン、ジャガイモ、サツマイモ、タピオカ、アボカド、オオムギ、ココナツおよび/またはインゲン、および/または1つまたは複数のその他の植物に由来する、1つまたは複数のペプチドである）からなる群より選択される1つまたは複数の補足物を含む。
【０１１９】
本発明のキットは、核酸、および/または本発明の培地中で培養（culture）される細胞への少なくとも1つの巨大分子、たとえば核酸の導入を容易にする試薬、すなわちトランスフェクション試薬とを含む、1つまたは複数の容器をさらに含むことができる。好ましいトランスフェクション試薬は、カチオン性脂質などを含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
本発明の1つの局面に従うキットは、1つまたは複数の本発明の培養培地、1つまたは複数の金属結合化合物であり得る1つまたは複数の置換化合物、および/または1つもしくは複数の遷移元素複合体を含んでよく、選択的に、1つまたは複数の核酸およびトランスフェクション試薬を含んでよい。本発明のもう1つの側面に従うキットは、1つまたは複数の細胞培養培地（その1つは、基礎培地であってよい）および1つまたは複数の置換化合物を含むことができる。好ましい置換化合物は、金属結合化合物および/または遷移元素複合体を含むが、これらに限定されず、前記複合体は、少なくとも1つの金属結合化合物と複合体を形成した、少なくとも1つの遷移元素またはその塩もしくはイオンを含む。本発明のこの局面に従うキットに使用される好ましい遷移元素、金属結合化合物、および遷移元素複合体は、本明細書において詳細に記載されるものを含む。
【０１２１】
また、本発明のキットは、細胞を培養するため、および/または細胞に巨大分子または化合物（たとえば、DNAなどの核酸）を導入するために、キットを使用するための説明書を含んでよい。
【０１２２】
本明細書に記載した方法および適用に対する、その他の適切な改変および適応が明らかであり、かつ本発明またはその任意の態様の範囲から逸脱せずに作成され得ることは、当業者であれば容易に理解すると考えられる。ここで詳細に本発明を記載したが、例示の目的のためのみに本明細書に含まれ、かつ本発明を限定することは意図されない以下の実施例への参照により、本発明は明確に理解されると考えられる。
【０１２３】
実施例1
293細胞（ATCC、CRL 1573）のセミコンフルエントな接着培養は、容易に懸濁培養に順応する。まず、細胞をトリプシン-EDTA（0.05％のトリプシン、0.53mMのNa4EDTA）溶液で剥離させ、次いでトリプシンを阻害するために、10％のFBSを補った通常の培地に再懸濁する。再懸濁した細胞を5分間200×gで遠心分離する。細胞ペレットを293 SFM（Invitrogen、Corporation、Carlsbad、CAから入手可能）に再懸濁する（この製剤は、国際公開公報第98/08934号に記載されており、特に参照により本明細書に組み入れられる）。または、細胞はVERSENE（Na4EDTA、0.53mM）で剥離させて、293 SFMに再懸濁することができる。
【０１２４】
懸濁培養に変換した後の293細胞の初期の接種密度は、1×106細胞/mLである。細胞は、8％CO2-92％の空気で平衡化した37℃のインキュベータにおいて、回転振盪機上で150rpmで振盪する。細胞が1.5×106細胞/mLの密度に達したときに、これらを293 SFMで3.0×105細胞/mLの密度に希釈する。293細胞は凝集する傾向を有するので、継代および計数時に、細胞を約45秒間激しくボルテックスにかけて大部分が単一細胞の懸濁液を得ることもできる。懸濁培養で数回継代した後、達成できる最大の密度を決定することができる。ここで記載した293細胞は、懸濁培養において約3〜4×106細胞/mLまで増殖した。
【０１２５】
細胞増殖を支持するための種々の置換化合物の能力は、トランスフェリンまたは置換化合物を含まない293 SFM（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）において維持した293細胞を使用して評価した。5μg/mLのヒト全トランスフェリン（holo-transferrin）を含む保存培養物を293 SFM中に調製した。置換化合物の評価のために、293細胞を、20mlの最終体積中2×105細胞/mlの生存可能な初期接種密度で、125mLの振盪フラスコにおいて確立した。全ての培養物は、8％のCO2を含む加湿した空気中において37℃で維持した。トランスフェリンの持ち越し効果を除去するために、細胞を合計3継代の間、4日間隔で継代培養した。それぞれの継代培養では、細胞を2×105細胞/mLの密度で接種した。陰性対照培養物は、トランスフェリンまたは置換化合物のいずれも非存在下で確立した一方で、陽性対照培養物は、5μg/mLのヒト全トランスフェリンを含んだ。置換化合物のストックは、0.1M〜0.2MのddH2O溶液に調製し、必要に応じて5N NaOHまたはHClを使用して可溶化した。鉄複合体は、1：1（v/v）で混合し、22℃で5分〜10分間インキュベートした0.2Mの置換化合物および鉄ストックを用いて確立した。置換化合物を含む全ての溶液は、トランスフェリンおよび無血清培地に添加する前に、0.22μmのMillex-GVフィルタを使用して濾過滅菌した。
【０１２６】
特記した場合を除き、置換化合物は、単独で、または塩化第二鉄もしくは硫酸第一鉄と組み合わせて、25μM、50μM、および100μMで評価した。組み合わせて使用する場合は、置換化合物を鉄イオンと等モル濃度で使用した。表4の値は、3回目の継代において決定した、2つ組の培養物に対する対照増殖（control growth）の割合の平均を表す。補われていない、すなわち、トランスフェリンまたは置換化合物のいずれも含まない培地は、3継代以上、細胞の増殖を支持することができなかった。
【０１２７】
種々の置換化合物の存在下において増殖した293細胞の結果を、表4に示す。複合体を形成していない培地製剤に添加した場合は、置換化合物を単独で記載し、遷移金属との複合体として添加した場合は、遷移金属の供与源を置換化合物とともに記載する。
【０１２８】
本実施例およびその他の実施例においては、293 SFM培地を使用した。293 SFM培地は、もはやInvitrogen（Carlsbad、CA）から入手することはできないが、293 SFMII培地（Invitrogen、Carlsbad、CA）を使用して同様の結果が予想される。
【０１２９】
（表４）293細胞の増殖に対する置換化合物の効果
2005506048.tif 000005
2005506048.tif 000006
【０１３０】
実施例2
トランスフェリンの非存在下において細胞の増殖を支持するための置換化合物の能力は、CD CHO培地（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA、この製剤は国際公開公報第98/08934号に記載されている）で維持したCHO細胞を使用して評価した。5μg/mLのヒト全トランスフェリンを含む保存培養物を、CD CHO培地中に調製した。置換化合物の評価のために、CHO細胞を、20mLの最終体積中1×105細胞/mLの生存可能な初期接種密度で、125mLの振盪フラスコにおいて確立した。全ての培養物は、8％のCO2を含む加湿した空気中において、37℃で維持した。トランスフェリンの持ち越し効果を除去するために、細胞を合計3継代の間、4日間隔で継代培養した。陰性対照培養物は、トランスフェリンまたは置換化合物のいずれも非存在下で確立した一方で、陽性対照培養物は、5μg/mLのヒト全トランスフェリンを含んだ。置換化合物のストックは、0.1M〜0.2MのddH2O溶液に調製し、必要に応じて5N NaOHまたはHClを使用して可溶化した。鉄複合体は、1：1（v/v）で混合し、22℃で5分〜10分間インキュベートした0.2Mの置換化合物および鉄ストックを用いて確立した。置換化合物を含む全ての溶液は、トランスフェリンおよび無血清培地に添加する前に、0.22μmのMillex-GVフィルタを使用して濾過滅菌した。
【０１３１】
特記した場合を除き、置換化合物は、単独で、または塩化第二鉄もしくは硫酸第一鉄と組み合わせて、25μM、50μM、および100μMで評価した。表の値は、3回目の継代において決定した、2つ組の培養物に対する対照増殖の割合の平均を表す。補われていない、すなわち、トランスフェリンまたは置換化合物のいずれも含まない培地は、3継代以上、細胞の増殖を支持することができなかった。
【０１３２】
CHO細胞の培養においてトランスフェリンを置換するための、種々の置換化合物の能力を決定した。結果を表5に示す。複合体が形成されていない培地製剤に添加した場合は、置換化合物を単独で記載し、遷移金属との複合体として添加した場合は、遷移金属の供与源を置換化合物とともに記載する。
【０１３３】
（表５）CHO細胞の増殖に対する置換化合物の効果
2005506048.tif 000007
【０１３４】
実施例3
トランスフェリンの非存在下において細胞の増殖を支持する置換化合物の能力は、CD ハイブリドーマ（Hybridoma）培地（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）で維持したSp2/0細胞を使用して評価した。
【０１３５】
5μg/mLのヒト全トランスフェリンを含む保存培養物をCD ハイブリドーマ培地中に調製した。置換化合物の評価のために、Sp2/0細胞を、20mlの最終体積において、0.5×105細胞/mLの生存可能な初期接種密度で、75cm2の組織培養フラスコを使用する静置培養で確立した。全ての培養物を、8％のCO2を含む加湿した空気中において37℃で維持した。トランスフェリンの持ち越し効果を除去するために、細胞を合計3継代の間、4日間隔で継代培養した。陰性対照培養物は、トランスフェリンまたは置換化合物のいずれも非存在下で確立した一方、陽性対照培養物は、5μg/mLのヒト全トランスフェリンを含んだ。置換化合物のストックは、0.1M〜0.2MのddH2O溶液に調製し、必要に応じて5N NaOHまたはHClを使用して可溶化した。鉄複合体は、1：1（v/v）混合し、22℃で5分〜10分間インキュベートした0.2Mの置換化合物および鉄ストックを用いて確立した。置換化合物を含む全ての溶液は、トランスフェリンおよび無血清培地に添加する前に、0.22μmのMillex-GVフィルタを使用して濾過滅菌した。
【０１３６】
特記した場合を除き、置換化合物は、単独で、または塩化第二鉄もしくは硫酸第一鉄と組み合わせて、25μM、50μM、および100μMで評価した。表の値は、3回目の継代において決定した、2つ組の培養に対する対照増殖の割合の平均を表す。補われていない、すなわち、トランスフェリンまたは置換化合物のいずれも含まない培地は、3継代以上細胞の増殖を支持することができなかった。
【０１３７】
Sp2/0細胞の培養において、トランスフェリンを置換するための種々の置換化合物の能力を決定し、結果を表6に示す。複合体が形成されていない培地製剤に添加した場合は、置換化合物を単独で記載し、遷移金属との複合体として添加した場合は、遷移金属の供与源を置換化合物とともに記載する。
【０１３８】
（表６）Sp2/0細胞の増殖に対する置換化合物の効果
2005506048.tif 000008
【０１３９】
実施例4
トランスフェクションに使用したプロトコル
使用した細胞は、懸濁または接着のいずれかで培養した293-F細胞である。293-F細胞は、Pharmacopeia、Princeton、NJのRobert Horlickから得られる293細胞のクローンである。トランスフェクション実験前の数回の継代（＞4）の間に、細胞を被験培地に順応させた。懸濁液において培養する場合、各継代において細胞を1mlにつき3×105生細胞で分割した。トランスフェクションの週には、1mlにつき3x105生細胞で細胞を接種した。約48時間の培養（2日）後、細胞を30秒間ボルテックスにかけ、計数し、以下の手順に記載するように、適切な体積をトランスフェクションのために使用した。
【０１４０】
トランスフェクション実験のために使用した基礎培地の組成を、表7に示す。
【０１４１】
（表７）
2005506048.tif 000009
2005506048.tif 000010
【０１４２】
さらに、基礎培地は、2.4g/LのNaHC03、2.98g/LのHepes、4mMのL-グルタミン、および3ml/LのPLURONIC F-68（Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA）を含む。
【０１４３】
モル浸透圧濃度は、約275mOsm〜310mOsm、好ましくは約280mOsmに調整し、かつpHは、約7.0から約7.45、好ましくは7.4にそれぞれ調整する。上記培地は、インスリン、トランスフェリン、クエン酸塩キレート、硫酸デキストランを含まず、L-グルタミンおよびPLURONIC F-68を含む293 SFMと称される。この培地に対して、1つまたは複数の本発明の置換化合物および1つまたは複数の金属を添加することもでき、たとえば25μMの2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド、および0.375mg/LのZnSO4・7H20をトランスフェクション培地に添加することもできる。
【０１４４】
15mlの振盪フラスコにおけるトランスフェクション実験のため、1.5×107生細胞に対応する体積の細胞を遠心分離し、上澄みを除去した。ペレットを14.5mlの新しい被験培地に懸濁した。それぞれの培地では、2つ組で試験した。
【０１４５】
700μlの被験培地+60μlのDNA（DNAは、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA、カタログ番号10586-014から入手可能な、プラスミドpCMV-SPORT-β-galを使用した）+240μlのリポフェクトアミン2000（LIPOFECTAMINE2000）（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA、カタログ番号11668-019から入手可能）を微量遠心チューブ中で合わせ、核酸とトランスフェクション試薬の複合体を形成させるために、室温で30分間混合液をインキュベートすることにより、トランスフェクションのための核酸を調製した。本実験および後に続く全ての実験では、トランスフェクションのためにDNAと脂質の複合体を形成する際に、添加は常に、まず被験培地にDNAを添加して、次いでDNA-被験培地の混合物にリポフェクトアミン2000を添加することにより行った。複合体の形成後、500μlの複合体を、それぞれの2つ組の振盪フラスコに添加した。最終細胞濃度は、1×106生細胞/mlであり、最終DNA濃度は、1μg/1×106生細胞であり、かつ最終リポフェクトアミン2000濃度は8μl/1×106生細胞であった。
【０１４６】
10mlの振盪フラスコを使用した場合、1.0x107生細胞に対応する体積の細胞を遠心分離し、上澄みを除去した。ペレットを、9.5mlの新しい被験培地に再懸濁した。微量遠心チューブにおいて、800μlの被験培地+40μlのDNA+160μlのリポフェクトアミン2000を合わせ、30分間インキュベートして複合体を形成させ、500μlの複合体をそれぞれの振盪フラスコに添加した。振盪フラスコ内の懸濁液の最終細胞濃度は、1×106生細胞/mlであり、最終DNA濃度は、1μg/1×106生細胞であり、最終リポフェクトアミン2000濃度は、8μl/1×106生細胞であった。
【０１４７】
24時間後、2mlの試料を除去して、β-ガラクトシダーゼ活性を決定した。それぞれ2mlの試料を遠心分離して、上澄みを除去し、細胞ペレットを1mlのダルベッコ-PBS（D-PBS、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）中で再懸濁した。次いで、細胞を遠心分離し、1mlのD-PBS中で二回目の再懸濁をした。試料を-70℃に保存した。β-ガラクトシダーゼに関するアッセイ法の前に、試料を合計5回の凍結-融解サイクルに供した。β-ガラクトシダーゼ活性の量が高いため、10μlおよび20μlの試料を、0ng〜700ngのβ-ガラクトシダーゼの範囲の標準曲線に対して走らせた。
【０１４８】
インサイチューにおける染色によってβ-ガラクトシダーゼ活性を測定するために、1mlの試料（すなわち、約1×106細胞）を使用した。
【０１４９】
24ウェルプレートにおいて293-F細胞をトランスフェクションするために使用したプロトコル：
それぞれの処理のために3つのウェルを設定した。3×106生細胞に対応する体積の培地を遠心分離した。上澄みを除去し、600μlの被験培地に細胞を再懸濁した。24ウェルプレートのそれぞれのウェルには、200μlの再懸濁した細胞を入れた。
【０１５０】
トランスフェクション実験のための核酸を調製するために、93μlの被験培地+3μlのDNA+24μlのリポフェクトアミン2000を、微量遠心チューブ中で合わせ、30分間複合体を形成させた。40μlの複合体のアリコートを、それぞれのウェルに添加した。複合体の添加の5時間後、250μlの被験培地をそれぞれのウェルに添加した。最終細胞濃度は、ウェルあたり1×106生細胞であり；最終DNA濃度は、1×106生細胞あたり1μgであり、および最終リポフェクトアミン濃度2000は、1×106生細胞あたり8μlであった。
【０１５１】
トランスフェクションの24時間後、β-ガラクトシダーゼの定量のために試料を回収した。それぞれの試料について、2つ組のウェルの内容物をプール（pool）し（すなわち、アッセイ法につき約2×106細胞）、微量遠心チューブへ移した。細胞を遠心分離し、上澄みを除去し、1mlのD-PBSに細胞を再懸濁した。細胞を二度目のペレットにして1mlのD-PBSに再懸濁した。試料を-70℃に保存した。β-ガラクトシダーゼについてのアッセイ法を行う前に、試料を合計5回凍結-融解した。それぞれの試料のアリコート（15μlおよび25μl）をアッセイして、β-ガラクトシダーゼ0ng〜70ngの範囲の標準曲線と比較することによって活性を決定した。
【０１５２】
それぞれの処理の第三のウェルは、β-ガラクトシダーゼ活性（すなわち、約1×106細胞）に対するインサイチュー染色のために使用した。
【０１５３】
実施例5
種々の置換化合物の存在下において培養した細胞のトランスフェクション効率の比較
293細胞を、示された種々の置換化合物の存在下において単層培養で増殖させ、上記の通りにトランスフェクション実験を行った。結果を表8に示し、値は、2×106細胞あたりのβ-ガラクトシダーゼのナノグラムとして表した、β-ガラクトシダーゼ活性である。比較は、D-MEM培地において形成されたDNA複合体、および被験培地において形成されたDNA複合体のトランスフェクション効率間で行った。置換化合物は、25μMの濃度で存在した。
【０１５４】
（表８）
2005506048.tif 000011
【０１５５】
トランスフェクション効率は、D-MEMよりむしろ被験培地を、DNAおよび脂質の複合体を形成するために使用したときの方が、一般に良好であった。トランスフェリン対照（ID番号；A）が最も機能し、トランスフェリンがトランスフェクションを容易にすることを示した。また、上記被験培地における細胞増殖が、トランスフェリンを含む培地における増殖および293 SFM-IIにおける増殖に匹敵したことは注目すべきである。
【０１５６】
被験培地のための基礎培地は、293-II+インスリン+L-グルタミン+PLURONIC F-68（-）硫酸デキストラン（-）トランスフェリン（+）置換化合物であった（被験培地のA〜M、表を参照されたい）。
【０１５７】
実施例6
置換化合物の濃度を変化させることの効果、および核酸複合体を形成するために使用される培地の効果
293細胞は、表9において特定した濃度で示された置換化合物を補った基礎培地において、単層培養で増殖させた。濃度欄の上部の数字は、第一の補足物の濃度であり、濃度欄の第二の数字は、第二の補足物の濃度である。DNA複合体を形成させるために使用した培地の効果を試験した。結果は、2×106細胞あたりのβ-ガラクトシダーゼのナノグラムとして示す。
【０１５８】
（表９）
2005506048.tif 000012
2005506048.tif 000013
2005506048.tif 000014
*注：他の全ての試料については、2×106生細胞/2-ウェルであったのに対し、D-MEM+10％ FBSにおける細胞増殖については、約1×106生細胞/2-ウェルしか存在しなかった。
【０１５９】
エチルマルトールは、100μMでは増殖を支持しなかった。50μMにおける増殖は、25μMよりわずかに良好だが、インスリン存在下におけるトランスフェクションはより良好であり（ID番号；B、C、H、P、およびQ）、ZnSO4の存在下とほぼ同じであった。
【０１６０】
2-ヒドロキシピリジンは、50μMで増殖を支持しなかった。このキレートがインスリンの代わりにZnSO4と組み合わせて存在したときに、トランスフェクションが良好だった（ID番号D、E、およびJを参照されたい）。
【０１６１】
DPTA・FeSO4は、ZnSO4の存在下よりも、インスリンの存在下でよく増殖を支持したが、ZnSO4の存在下においては、増殖は許容された。トランスフェクションの結果は、キレートがインスリンの代わりにZnSO4と組み合わせて存在したときに、非常に良好だった（ID番号FおよびLを参照されたい）。
【０１６２】
実施例7
接着細胞のトランスフェクション効率に対する硫酸亜鉛濃度の効果
インスリンの代わりとして、ZnSO4+キレート剤の存在下において増殖させた細胞のトランスフェクション効率を、種々の濃度のキレート剤およびZnSO4で試験し、結果を表10に示す。細胞は、示された補足物を含む基礎培地における単層培養で調製し、上記の通りにトランスフェクションしてアッセイした。
【０１６３】
（表１０）
2005506048.tif 000015
2005506048.tif 000016
【０１６４】
エチルマルトール（試料B〜E）は、試験した全てのZnSO4濃度で増殖を支持した（1×=0.188μg/ml、2×=0.375μg/ml、および5×=1.875μg/ml）；しかし発現は、ZnSO4濃度の増加に伴って減少し、1×ZnSO4が最高であった（C、D、およびEを参照されたい）。X-gal染色では、1×ZnSO4を含む培地で約40％、およびインスリンを含む培地で約50〜60％のトランスフェクション効率を示した。
【０１６５】
25μMの濃度の2-ヒドロキシピリジンは、1×、2×、および5×ZnSO4の濃度で、増殖を支持した（試料F〜J）が、0.5×では支持しなかった。発現は、1×、2×、および5×ZnSO4でほぼ同じであった（H、I、およびJを参照されたい）。X-gal染色は、試料H（1×ZnSO4）のみで行い、85％〜95％のトランスフェクション効率を示した。
【０１６６】
10μMの濃度の2-ヒドロキシピリジン（試料K）は、1×ZnSO4との組み合わせで増殖を支持した。発現は、2-ヒドロキシピリジンが25μMの場合よりもわずかに低かった（HをKと比較）。
【０１６７】
DPTA・FeS04では、1×、2×、および5×ZnSO4の濃度において増殖を支持したが、0.5×では支持しなかった。発現は、ZnSO4の濃度の増大に伴って減少し、1×が最高であった。X-gal染色は、トランスフェクション効率約50％（ID番号N）を示した。
【０１６８】
D-MEM+10％FBS+0.1mM NEAAにおける細胞は、非常に高発現であって、標準曲線の領域外であり、＞5000ng/約2×106細胞と見積もられた。X-gal染色は、約85％〜95％のトランスフェクション効率を示した。
【０１６９】
全ての被験培地中の細胞は、トランスフェクションの5時間（栄養補給の直前）および24時間（回収前）後の双方で非常に凝集した。カタログ対照における細胞は、凝集せずに、一様にウェルの底を覆った。また、細胞の量は、ウェルに対して非常に多かったと思われ、いくつかの層の互いの上に細胞がある結果となった。
【０１７０】
実施例8
2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドの存在下における、硫酸亜鉛濃度を変化させることの効果
293細胞を、示された補足物の存在下において基礎培地中で単層培養で増殖させた。細胞を上記のようにトランスフェクションし、アッセイした。結果は、表11に示す。
【０１７１】
（表１１）
2005506048.tif 000017
*値は、2つのウェルによって産生されるβ-ガラクトシダーゼの総ナノグラムであり、各ウェルは、示された細胞濃度に設定した。たとえば、8E5については、数値は、8×105細胞/ウェルの2つのウェルによって産生されるβ-ガラクトシダーゼのナノグラム、すなわち、1607ng/約1.6×106細胞である。
【０１７２】
トランスフェクション中に細胞を連続して回転しても、トランスフェクション結果は改善されなかった。
【０１７３】
ZnSO4の濃度増大により、発現は増加するようであった。これは、さらなるZnSO4が発現レベルに影響しないようであった、前記の実施例の結果とは対照的である。
【０１７４】
低濃度の2-ヒドロキシピリジン（10μM）は、発現を増大する（HをKと比較する）。また、これは、Kが実際にHよりもわずかに低かった最近の実験では見られなかった。
【０１７５】
実施例9
D-PBSおよび本発明の培地において複合体形成された核酸に対するトランスフェクション効率の比較
293細胞を、示したキレート剤および金属塩を示した濃度で補った基礎培地において、単層培養で増殖させた。キレート剤の濃度は、μモル/lで示し、金属塩の濃度は、μグラム/mlで示す。比較のために、25μMの+2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドおよび0.375μg/mlのZnSO4を補った被験培地において、懸濁培養した10mlフラスコの293細胞をトランスフェクションした。培地中の細胞濃度は、1×106細胞/mlであり、使用したDNAの濃度は、1μgDNA/106細胞であり、使用したリポフェクトアミン2000の濃度は8μl/106細胞であった。結果を表12に示す。
【０１７６】
（表１２）
2005506048.tif 000018
【０１７７】
β-ガラクトシダーゼのインサイチュー染色を行い、効率が20％以下だったことから、D-PBSを複合体形成のために使用するべきではないことが示された。被験培地において複合体を形成させたDNAをトランスフェクションした試料の形質転換効率は、トランスフェクションしたもののうち50％〜85％の範囲であった。これまでに見られた最高効率は、振盪フラスコからの細胞における98％〜100％のトランスフェクション効率であった。
【０１７８】
β-ガラクトシダーゼ発現は、全体的に以前の実験よりも低かったが、傾向は同様のようであった。また、データは、これらの実験において複合体を形成するために、D-PBSを使用するべきでないことを示す。振盪フラスコにおいて懸濁培養した細胞におけるβ-ガラクトシダーゼ発現は、単層培養において見られるものよりも実質的に高かった。トランスフェクション時から24時間後の回収時までフラスコが振盪機のプラットホーム（125rpm）に置かれていたことは強調されるべきである。改善したトランスフェクションおよび結果として生じる発現は、インキュベーション期間にわたって、24ウェルプレートよりも振盪フラスコにおいて細胞がより良い形状であったためである可能性がある。
【０１７９】
実施例10
懸濁液における細胞のトランスフェクション効率に対する硫酸亜鉛および2-ヒドロキシピリジン-N-オキシド濃度を変化させることの効果
単層培養に対して懸濁培養の293細胞で得られた、トランスフェクション結果の比較を行った。被験培地Aの細胞は、15mlの体積でトランスフェクションし、被験培地B〜Fの細胞は、10mlの体積でトランスフェクションした。全ての細胞密度は、トランスフェクション準備時に1×106生細胞/mlであった。使用したDNAおよび脂質濃度は、1×106生細胞あたり1μgDNAおよび8μlリポフェクトアミン2000であった。被験培地Aの細胞の2つ組の試料をトランスフェクションし、両複製からの結果を表13に示す。
【０１８０】
（表１３）
2005506048.tif 000019
【０１８１】
24ウェルプレートにおいてトランスフェクションした細胞については、使用した細胞密度は、ウェルあたり1×106生細胞であった。使用したDNAおよび脂質濃度は、1×106生細胞あたり1μgDNAおよび8μlリポフェクトアミン2000であり、結果を表14に示す。
【０１８２】
（表１４）
2005506048.tif 000020
【０１８３】
トランスフェクション効率およびβ-ガラクトシダーゼ発現量は、静置プレートよりもむしろ振盪フラスコにおいて、125rpmでトランスフェクションを行ったときが、はるかに良好だった。
【０１８４】
培地Aにおける発現は、発現が29118ng/約2×106細胞であった前述の実験よりも低かった。この実験で使用した体積は、125mlの振盪フラスコに10mlであった。被験培地への細胞の順応に関する増殖データは、全ての培地A〜Fについて細胞密度が同様であることを示す。細胞のX-gal染色では、ほぼ同じトランスフェクション効率を示す。
【０１８５】
実施例11
トランスフェクション培地における細胞増殖の比較
293-F細胞および293-Hの細胞の凍結したアリコートを融解し、計数する前に1継代の間、293 SFMII（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）に懸濁し、被験培地に濃度3×105生細胞/mlで懸濁した。
【０１８６】
細胞を125mlの振盪フラスコ中で15mlの被験培地に懸濁した。細胞を8％C02/92％空気の雰囲気において回転振盪機で125rpmで振盪した。培地A、B、およびCの組成は、表14に示したとおりであった；カタログ培地は、293 SFMII（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）であった。細胞は、4日ごとに計数し、その時に3×105生細胞/mlに分割した。図1Aおよび図1Bは、それぞれ被験培地における最初の3継代のそれぞれの細胞密度を示す。図1Aは、293-F細胞の細胞密度を示すが、図1Bは、293-H細胞の密度を示す。
【０１８７】
293-F細胞は、被験培地によく順応した。一部凝集があったが、単個細胞懸濁液を得るためには、ボルテックスにかけるだけで十分であった。
【０１８８】
293-H細胞は、被験培地において、293 SFMIIと同様の密度に増殖した。しかし、ボルテックスにかけることでは分離することができない多くの凝集があった。
【０１８９】
図2Aおよび図2Bでは、単一の継代における293-FおよびH細胞の増殖を比較する増殖曲線を示す。125mlのフラスコにおいて、25mlの培養培地に3×105生細胞/mlを3つ組で接種し、1mlの一定分量を毎日取り、生細胞を計数した。カタログ培地は、4mMのグルタミンを補った293 SFMIIであり、被験培地A、B、およびCは、表14のとおりである。図2Aは、293-F細胞で得られた結果を示し、図2Bは、293-H細胞で得られた結果を示す。全ての場合において、被験培地は、カタログ培地より効果的に細胞増殖を支持した。
【０１９０】
実施例12
細胞増殖に対する硫酸イオンおよび亜鉛イオンの効果
硫酸亜鉛中のイオンZn2+またはSO42+のどちらが細胞増殖を促進するかを決定するために、細胞を3×105細胞/mlの密度で接種し、種々の量のZnSO4、ZnCl2、またはNa2SO4を含む培地中で4日間増殖した後に計数した。25μMの2-ヒドロキシピリジン-N-オキシドおよび示された塩を補った被験培地を使用して、懸濁培養における亜鉛イオンおよび硫酸イオンの効果を評価した。図3に示すように、Na2SO4は、より少ない細胞増殖の結果となったのに対して、ZnCl2は、効果的に硫酸亜鉛を代用することができた。
【０１９１】
実施例13
トランスフェクション効率におけるフラスコ体積および条件培地（conditioned media）の評価
293細胞の懸濁液を、125mlの振とうフラスコにおいて、示された量の培地で増殖させた。下の結果は、2つ組のフラスコ（A-25mlは、単一フラスコだけである）の平均である。全ての場合における（準備の時点での）細胞密度は、1×106生細胞/mlであった。使用したDNAおよび脂質濃度は、1×106生細胞につきそれぞれ1μgおよび8μlであった。
【０１９２】
さらに、形質転換に対する条件培地の効果を評価した。結果を表15に示す。
【０１９３】
（表１５）
2005506048.tif 000021
注：本実験におけるβ-ガラクトシダーゼ産生は、前述の実験におけるng/約2×106の細胞の代わりに、ng/約1×106細胞として表した。
【０１９４】
培地Aにおいて準備したフラスコは、フラスコ内の細胞懸濁液の体積の効果、およびそのトランスフェクションに対する効果を試験するためのものである。10mlと15ml体積との間では、有意差がないようである。しかし、20mlのとき、次いで25mlに増加したときの減少は説明できない。また、25mlは、2つ組で準備していない点に注意されたい。
【０１９５】
BおよびCで準備した試料については、新しい培地におけるトランスフェクション能に対し、条件培地におけるトランスフェクション能を比較することが目的であった。条件培地は、培養物がトランスフェクション準備の日まで増殖していた培地からなる。これは、培養培地を交換することなく（すなわち、細胞を遠心沈殿して、再懸濁すること、その他）トランスフェクションを行うことができるかどうかを評価するために行われた。結果は、Bの条件培地における場合により多く産生されたβ-ガラクトシダーゼ、および培地Cにおける同程度の結果を示し、したがって、ある細胞密度に達した場合に、培養物にただ脂質-DNA複合体を添加することのみの可能性を支持する。
【０１９６】
A、B、およびCについての15mlの試料の比較では、β-gal定量に関していえば、AとBの間に有意差は示されず、Cについてはいくぶん低い結果であり、x-gal染色についても、同様の結果である。
【０１９７】
実施例14
トランスフェクション効率に対する培養体積の効果
培養培地の体積が、所与の数の細胞に対するトランスフェクション効率に影響を及ぼすかどうかを決定するために、2つのプロトコルを試験した。第一のプロトコルは、減少させた体積の培地に細胞を懸濁させ、核酸およびトランスフェクション試薬と接触させることを必要とした。インキュベーション期間の後、核酸を取り込ませるために、さらなる培地を添加して培養体積を最終体積にした。
【０１９８】
第二のプロトコルは、最終体積で培養物に核酸およびトランスフェクション試薬を導入することを必要とした。第二のプロトコルは、必要とする培地添加工程が1つ少ないので、これにより、必要とする細胞操作、および作業時間（hands-on time）がより少ない。
【０１９９】
両方のプロトコルについて、30mlの最終体積の培地において3×107細胞を使用した。核酸：トランスフェクション試薬の複合体は、次のように調製した：30μgのDNAを1mlの最小培地（OPTIMEM、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）に添加し、200μlのトランスフェクション試薬（リポフェクトアミン2000、Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）を1mlの最小培地に添加した。希釈したDNAおよびトランスフェクション試薬を合わせ、穏やかに混合して20分間室温でインキュベートした。複合体を細胞に添加して混合した。細胞は、合計48時間、8％CO2/92％空気中において振盪プラットホーム（125rpm）上で37℃でインキュベートした。24時間および48時間においてアリコートを取り、β-ガラクトシダーゼ活性、細胞濃度、細胞生存度、およびタンパク質含有量についてアッセイした。プロトコル1については、まず細胞を10mlの培地に懸濁し、DNA複合体を添加した。細胞を4時間インキュベートし、次いでさらに18mlの培地を添加した。プロトコル2については、細胞を28mlの培地に懸濁し、DNA複合体を添加した。結果を表16に示す。
【０２００】
（表１６）
2005506048.tif 000022
【０２０１】
表16に示すように、細胞による核酸の取込みを容易にするために、最初に減少させた体積で細胞を培養しても、β-ガラクトシダーゼの全収率は増加しなかった。
【０２０２】
実施例15
トランスフェクション効率に対するトランスフェクション試薬濃度の効果
減少させた体積で細胞と核酸複合体をインキュベートすることに利点が見られなかったので、プロトコル2を以下の実験において使用した。トランスフェクション試薬の量を変化させることの効果を評価するために、100μl、150μl、および200μlのリポフェクトアミン2000を使用して形質転換を行った。示した量のトランスフェクション試薬を1mlの最少培地に希釈し、30μgDNAを上記の1mlの培地に希釈した。希釈液を合わせて穏やかに混合して、室温で20分間インキュベートした。核酸複合体を28mlの培地中の3×107細胞に添加した。25時間および49時間においてアリコートを取り、上記アッセイをした。結果を表17に示す。
【０２０３】
（表１７）
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【０２０４】
トランスフェクション試薬の量は、β-ガラクトシダーゼの発現量に劇的な影響をおよぼさないようであった（100μlトランスフェクション試薬における1.2mg/30ml培養物を、200μlトランスフェクション試薬における1.3mg/30m1の培養物と比較）。対照的に、培地中のブチレートの存在は、1.3mg/30m1の培養物から2.7mg/30m1の培養物にβ-ガラクトシダーゼの産生を二倍以上にした。
【０２０５】
実施例16
293細胞について、PL-1、PL-2、およびPL000458培地の細胞増殖および生存度に対する効果を決定した。293-F細胞を振盪フラスコ（8％CO2、37℃、125rpm）に初期密度3×105細胞/ml（30ml培養で）で接種した。生存度および細胞密度を約24時間毎に測定した。結果を図4A〜Dに示す。
【０２０６】
ここで、理解を明確にする目的で、実例および実施例により本発明の一部の詳細を完全に記載したが、当業者であれば、本発明の範囲またはその任意の特定の態様に影響を与えることなく、条件、製剤、およびその他のパラメーターの幅および範囲内で、本発明を改変または変更することによって同じことを行うことができ、このような改変または変更は、添付の請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されることは明らかであると考えられる。
【０２０７】
本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、本発明が属する当業者の技術水準を表し、あたかもそれぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が、具体的にかつ独立に参照として組み入れられることが示されたのと同程度に、参照として本明細書に組み入れられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】図1Aは、本発明の培地における継代数の関数として、293-F細胞数/mlのプロットを示す棒グラフである。図1Bは、本発明の培地における継代数の関数として、293-H細胞数/mlのプロットを示す棒グラフである。293 SFMII培地（Invitrogen Corporation、Carlsbad、CA）対、基本型培地A、B、およびCにおいて培養した293-Fおよび293-H細胞の増殖。15mlの培養物を、凍結保存から回復させて一回継代した後、125mlの振盪フラスコにおいて、培地中3×105生細胞/mlでまいた。細胞を4日毎に計数して3×105生細胞/mlに分割した。3継代目で、細胞を増殖曲線のための培養物を接種するために使用した。図1Aでは、それぞれの継代数において、それぞれの棒は、左から右に、293 SFMII培地、培地A、培地B、および培地Cに対応する。図1Bでは、それぞれの継代数において、それぞれの棒は、左から右に293 SFMII培地、および培地Aに対応する。
【図２】図2Aは、本発明の培地において培養した日数の関数として、293-F生細胞数/mlを示すグラフである。図2Bは、本発明の培地において培養した日数の関数として、293-H生細胞数/mlを示すグラフである。293 SFMII培地（Invitrogen Corp.、Carlsbad、CA）対、基本型培地A、B、およびCにおいて培養した293-Fおよび293-H細胞の増殖。15mlの培養物を、3つ組の125ml振盪フラスコに3×105生細胞/mlで接種し、生存度および計数のために一日ごとに1mlの試料を採取した。細胞は、4mM L-グルタミンを補った293 SFMII培地において、または被験培地A、B、またはCのうちの1つにおいて培養した。
【図３】種々の塩を補った本発明の培地において、3回の各経代後の、293-F細胞数/mlのプロットを示す棒グラフである。それぞれの培地について、3つの棒は、左から右に継代1（pl）、継代2（p2）、および継代3（p3）に対応する。
【図４】図4Aは、パイロットロット1（PL1）、パイロットロット2（PL2）、およびパイロットロット（PL）000458培地における293-F細胞密度（細胞/ml）のプロットを示す棒グラフである。図4Bは、PL1、PL-2、およびPL000458培地における％293-F生細胞のプロットを示す棒グラフである。図4Cは、PL-2およびPL-2A（+インスリン）培地における293-F細胞の密度（細胞/ml）のプロットを示す棒グラフである。図4Dは、PL-2およびPL-2A（+インスリン）培地における％293-F生細胞のプロットを示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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