(57)【要約】本発明は、以下の構成成分：Ｉ）直接又は間接的、抗増殖的又は細胞傷害的に活性な一発現産物又は複数の上記発現産物をコードするヌクレオチド配列、ＩＩ）構成的に活性であるか、又は微生物中で活性化され得るか又は活性化配列の制御下で血漿タンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＩＩＩ）任意に、構成的に活性であるか、又は微生物中で活性化され得る活性化配列の制御下で細胞特異的リガンドをコードするヌクレオチド配列、ＩＶ）微生物の外表面で構成成分Ｉ）及びＩＩ）そして任意にＩＩＩ）の発現産物の発現を誘導するか、又は構成成分Ｉ）の発現産物の分泌並びに構成成分ＩＩ）及び任意にＩＩＩ）の発現を誘導し、そして好ましくは構成的に活性である輸送系に関するヌクレオチド配列、Ｖ）任意に、哺乳類細胞の細胞質ゾル中の微生物の溶解のために、並びに溶解微生物中に含有される少なくとも１つ又は複数の構成成分Ｉ）及びＶＩ）を有するプラスミドの細胞内放出のために用いられるタンパク質に関するヌクレオチド配列、そしてＶＩ）微生物中で活性化され得る及び／又は構成成分Ｉ）を発現するために組織細胞特異的、腫瘍細胞特異的、機能特異的又は非細胞特異的である活性化配列：が、そのゲノム中に挿入され、発現され得る被膜を有する微生物に関する。本発明の微生物は、上記構成成分Ｉ）〜ＶＩ）のいずれかが１回又は数回存在し、そして同一であるか又は異なり得ることをさらに特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構成成分：
Ｉ）直接又は間接的、抗増殖的又は細胞傷害的に活性な一発現産物又は複数の前記発現産物をコードするヌクレオチド配列、
ＩＩ）微生物中で活性化され得るか又は構成的に活性である活性化配列の制御下で血漿タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
ＩＩＩ）場合により、微生物中で活性化され得るか又は構成的に活性である活性化配列の制御下で細胞特異的リガンドをコードするヌクレオチド配列、
ＩＶ）微生物の外表面で構成成分Ｉ）及びＩＩ）そして任意にＩＩＩ）の発現産物の発現を誘導するか、又は構成成分Ｉ）の発現産物の分泌並びに構成成分ＩＩ）及び任意にＩＩＩ）の発現を誘導し、そして好ましくは構成的に活性である輸送系に関するヌクレオチド配列、
Ｖ）場合により、哺乳類細胞の細胞質ゾル中の微生物の溶解のために、並びに溶解微生物中に含有される少なくとも１つ又は複数の構成成分Ｉ）及びＶＩ）を有するプラスミドの細胞内放出のために用いられるタンパク質に関するヌクレオチド配列、そして
ＶＩ）微生物中で活性化され得る及び／又は構成成分Ｉ）を発現するために組織細胞特異的、腫瘍細胞特異的、機能特異的又は非細胞特異的である活性化配列
が、そのゲノム内に挿入され、発現され得る微生物であって、上記構成成分Ｉ）〜ＶＩ）のいずれかが１又は数個存在し、そして同一であるか又は異なる前記微生物。
【請求項２】
ウイルス、細菌又は単細胞寄生生物である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記微生物の毒力が低減される、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
グラム陽性又はグラム陰性細菌である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
大腸菌、コレラ菌、リステリア菌、及び赤痢菌から成る群から選ばれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項６】
細菌のエンベロープである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
インターフェロン；インターロイキン；前アポトーシスタンパク質；免疫細胞、腫瘍細胞に関して、あるいは腫瘍が生じる組織の細胞に関して抑制的に又は細胞傷害的に作用する抗体及び抗体断片；抗増殖的に活性なタンパク質；細胞傷害性タンパク質；炎症の誘導物質、特にインターロイキン、サイトカイン又はケモカイン；細胞分裂抑制物質の不活性前段階の細胞分裂抑制物質への活性化又は裂開のためのウイルス性、細菌性酵素、あるいは酵母、軟体動物、哺乳類又はヒトから生じる酵素；細胞特異的リガンド及び酵素からの融合産物；並びに新脈管形成の阻害剤から成る群から選ばれる少なくとも１つのタンパク質を前記構成成分Ｉ）がコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項８】
前記構成成分ＩＩ）が、アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビン、ヘモグロビン、α−１−リポタンパク質、α−２−リポタンパク質、β−１−リポタンパク質及びα−２−マクログロブリンから成る群から選ばれる少なくとも１つの血漿タンパク質をコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
前記構成成分ＩＩＩ）が腫瘍細胞、腫瘍内皮細胞、腫瘍を生じる組織細胞、活性化内皮細胞、マクロファージ、樹状細胞及びリンパ球から成る群から選ばれる標的生物体に特異的な少なくとも１つのリガンドをコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記構成成分ＩＩＩ）が、甲状腺、乳腺、唾液腺、リンパ腺、乳腺、胃粘膜、腎臓、卵巣、前立腺、子宮頸部、膀胱及び母斑から成る群から選ばれる組織の組織細胞型に特異的な少なくとも１つのリガンドをコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
前記構成成分ＩＶ）が、大腸菌のヘモリシン輸送シグナル、コーロバクター属のコーロバクタークレセンダス（Caulobacter crescendus）のＳ層（ＲｓａＡ）タンパク質及び／又は大腸菌のＴｏｌＣタンパク質をコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
前記構成成分ＩＶ）が、グラム陽性細菌の溶解タンパク質、リステリア属のリステリアモノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）の溶解タンパク質、リステリアモノサイトゲネスのＰＬＹ５５１及び／又はリステリアモノサイトゲネスのホリンをコードする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
長い血中停留時間を有する物質、特に、アルブミン、トランスフェリン、プレアルブミン、ヘモグロビン、ハプトグロビン、α−１−リポタンパク質、α−２−リポタンパク質、β−１−リポタンパク質、α−２−マクログロブリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、天然又は合成ポリマーとのＰＥＧ接合体、例えばポリエチレンイミン、デキストラン、ポリゲリン、ヒドロキシエチルデンプン及びこれらの物質の混合物から成る群から選ばれる少なくとも１つの物質が結合される請求項１〜１２のいずれか一項に記載の微生物であって、物質の結合が物理吸着、化学吸着により又は共有結合的に起こる前記微生物。
【請求項１４】
前記構成成分Ｉ）、ＩＩ）、ＩＶ）及びＶＩ）並びに任意に１つ又は複数の構成成分ＩＩＩ）及びＶ）を含むプラスミド又は発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載のプラスミドが産生され、微生物がこのプラスミドで形質転換される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物の生産方法。
【請求項１６】
医薬組成物の製造のための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微生物の使用。
【請求項１７】
非制御化細胞分裂により引き起こされる疾患、特に腫瘍疾患、例えば前立腺癌、卵巣癌、乳癌、胃癌、腎臓腫瘍、甲状腺腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、唾液腺腫瘍及び／又はリンパ腺腫瘍、白血病、炎症、臓器拒絶及び／又は自己免疫疾患の予防及び／又は治療のための医薬組成物の製造のための微生物の使用。
【請求項１８】
腫瘍の、及び腫瘍を生じる健常組織の除去のための、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
経口、ＩＭ、ＩＶ又はＩＰ投与のために、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の被膜を有する微生物が１つ又は複数の生理学的耐性担体物質を用いて生理学的有効用量で製造される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（産業上の利用分野）
本発明は、それにより抗増殖的又は細胞傷害的に作用する発現産物が発現される外来ヌクレオチド配列を有する微生物に、並びに製剤組成物の製造のためのこのような微生物の使用に、このような微生物の産生のためのプラスミド及び方法に、そしてこのような微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
減毒化微生物、例えば遺伝子修飾ウイルス、あるいは弱毒化細菌は、遺伝子療法に用いられる外来核酸配列のキャリアーとしての重要性が次第に高まっている。
【０００３】
遺伝子療法のために、微生物が遺伝子フェリーとして外来核酸を所望の組織細胞中に輸送することを予期して、外来核酸がｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織細胞中に挿入され、これらの細胞が患者に投与されるか、又は微生物が患者に注入される。
【０００４】
微生物は粒子である。生物体中に注入後、これらの粒子は主にいわゆる細網内皮系により受容される。この排除メカニズムに対しては、それでもやはり、標的組織中の遺伝子フェリーとして用いられる微生物の濃化を達成するために、微生物が細胞特異的リガンドとともに提供される。今日まで、この提供にもかかわらず、細網内皮系による微生物の排除は、わずかに低減され得たに過ぎない。
【０００５】
遺伝子療法の不可欠な研究目的は、薬物療法の全ての成功にもかかわらず、その治療が依然として不十分である増殖性疾患−例えば腫瘍、白血病、慢性炎症、自己免疫疾患及び移植臓器の拒絶−の療法である。例えば腫瘍の治療のための外科手術、放射線療法、化学療法そしてさらに免疫療法の全ての成功にもかかわらず、頭部及び頚部、中枢神経系、乳腺、肺、消化管、肝臓、膵臓、腎臓、皮膚、卵巣及び前立腺の進行性腫瘍の治癒は、今日まで達成され得ていない。
【０００６】
腫瘍療法のこの十分には成功しなかった理由は多種多様であり、未だ包括的に分かっていない。しかしながら主な理由には、以下のものが含まれる：ｉ）化学療法薬の、放射線照射のｉｎ  ｖｉｖｏ達成可能濃度に対する、又は免疫療法薬に対する腫瘍細胞の今までに（主として）存在する耐性；ｉｉ）療法に応答して生成されたそれぞれの治療薬に対する耐性。これらの誘導されたいわゆる二次耐性は、腫瘍細胞の遺伝的変異性により引き起こされて、耐性メカニズムの発達により腫瘍治療薬の作用をそれらに回避させた；ｉｉｉ）今日までに利用可能な腫瘍治療薬の薬物動態的及び／又は薬力学的不十分性。このために、それぞれの腫瘍療法薬の濃度は、原発性腫瘍が存在するか、再発又は転移が存在するかに関係なく、腫瘍を排除するには絶対的に小さすぎる。腫瘍治療薬のこれらの不十分性には、以下のものが含まれる：ｉｖ）高すぎる分布容積；ｖ）腫瘍又は腫瘍細胞での不十分な濃化；ｖｉ）腫瘍細胞における不十分な浸透能力；及び／又はｖｉｉ）全体的生物体に及ぼす毒性効果、これは腫瘍での濃化増大のための用量の増大を限定する。
【０００７】
これまでは、腫瘍で腫瘍治療薬を濃化することを試みるための、異なる方法が用いられた。
【０００８】
細胞増殖抑制剤に、抗腫瘍的に作用するサイトカインに、細胞傷害性タンパク質に、又は同位元素に結合された腫瘍細胞特異的リガンド、例えば抗体又はその裂開産物は、正常組織と比較して、腫瘍での細胞傷害性活性物質の濃化をもたらしたが、しかしながらこの濃化は、明らかにほとんどの場合、腫瘍の治療のためには十分でなかった（検討：Sedlacek et al., Contributions to Oncology 43: 1-145, 1992; Carter, Nature Reviews Cancer 1: 118-129, 2001）。
【０００９】
結果として、増幅系が意図され、それにより腫瘍でのそれぞれの活性物質の濃度が増大され得た。
【００１０】
増幅配列は、腫瘍中にこのような酵素を導入するという目的を有したが、これは一般に利用可能でないか又は残りの身体中で異質であり、これは次に、腫瘍中で、非毒性前段階の細胞増殖抑制剤を細胞傷害的に活性な細胞増殖抑制剤に転化するか又は分割し得る。腫瘍中への酵素の導入は、これらの酵素に結合された腫瘍細胞特異的リガンド（例えば抗体由来酵素媒介性プロドラッグ療法；ＡＤＥＰＴの形態で）の投与により、あるいは腫瘍細胞特異的又は非特異的ベクターによるこれらの酵素に関する遺伝子の投与（遺伝子由来酵素媒介性プロドラッグ療法；ＧＤＥＰＴ）により、実施された（Sedlacek et al., Contributions to Oncology 43: 1-145, 1992; Sedlacek, Critical Reviews in Oncology/Hematology 37: 169-215, 2001; McCormick, Nature Reviews Cancer 1: 130-141, 2001; Carter, Nature Reviews Cancer 1: 118-129, 2001）。
【００１１】
ＡＤＥＰＴ又はＧＤＥＰＴを用いた従来の臨床的研究は、しかしながら、不十分な治療結果を提供した。本質的問題として、以下のことが確認され得た：ｉ）外来酵素の免疫原性；ｉｉ）抗体−酵素接合体の相対的に小さい腫瘍局在化率（ＡＤＥＰＴ）；ｉｉｉ）許容可能なコストで十分に大量にヒト化酵素を用いてヒト化抗体から融合タンパク質を産生することの技術的難しさ；ｉｖ）抗体−酵素接合体又は遺伝子ベクターの腫瘍浸透性の欠如；並びにｖ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの小さすぎる形質導入率、即ち酵素に関する遺伝子が発現され得る腫瘍節の腫瘍細胞の数は、腫瘍−治療的有効性のためには小さ過ぎた。
【００１２】
別の増幅系は、腫瘍細胞に対する免疫応答の誘導を基礎にしており、その経過中に、特異的抗体形成細胞及び細胞傷害性細胞が増殖する。免疫反応の誘導のために、腫瘍抗原が適切な調製物中に投与される。腫瘍に対する免疫寛容（この免疫寛容は明らかに腫瘍患者に存在する）を、及び／又は自身の免疫反応に対する腫瘍の耐性を壊すことが目的である。
【００１３】
ここ10年以内で、腫瘍ワクチンの多数の技術的変化が異なる腫瘍抗原とアジュバントの組合せにより臨床的に研究されたが、しかしながら、腫瘍療法における所望の発展は達成されなかった。新規のアプローチ、例えば免疫原性腫瘍特異的抗原とアジュバントの組合せ、あるいは腫瘍特異的抗原を負荷された樹状細胞の、あるいは腫瘍特異的抗原をコードするヌクレオチド配列の投与は、初めての有望な臨床結果を生じたが、しかしながら今日まで、腫瘍療法における飛躍的発展は、ここでも認められ得ない。
【００１４】
これらの細菌の細胞膜上で細菌中に導入される核酸配列の発現産物を発現するための、あるいはこれらの細菌により分泌されるそれらを有するための技法が開発されてきた。この技法の基礎は、グラム陰性細菌のＩ型分泌系の原型を示す大腸菌ヘモリシン系ｈｌｙＡｓである。ｈｌｓＡｓにより、サルモネラエンテリカ、エルシニアエンテロコリチカ及びコレラ菌におけるタンパク質抗原の効率的放出を可能にする分泌ベクターが開発された。このような分泌ベクターは、ヘモリシン分泌装置のためのｈｌｙＡシグナルペプチドに関するヌクレオチド配列に結合された任意のタンパク質抗原のｃＤＮＡ、ｈｌｙＢ及びｈｌｙＤ並びにｈｌｙ特異的プロモーターを含有する。この分泌ベクターにより、タンパク質はこの細菌の表面に発現され得る。したがって遺伝子修飾細菌は、導入核酸により発現されたタンパク質が細胞内に残存する細菌よりもかなり高い免疫防御をワクチンとして誘導する（Donner et al., EP 1015023 A, Gentschev et al., Gene 179: 133-140, 1996; Vaccine 19: 2621-2618, 2001; Hess et al., PNAS 93: 1458-1463, 1996）。しかしながらこの方法の欠点は、ｈｌｙ特異的プロモーターを用いることにより、細菌の外表面に発現されるタンパク質の量が非常に小さいという点である。
【００１５】
キャリアー細菌、例えばサルモネラ及びリステリアモノサイトゲネスによる哺乳類細胞中へのプラスミドＤＮＡの導入のための技法が、開発されてきた。これらのプラスミド中で含有される遺伝子は、それらが真核生物プロモーターの制御下にあった場合でも、哺乳類細胞中で発現され得た。プラスミドはリステリアモノサイトゲネス胚中に導入され、上記プラスミドは、任意の真核生物プロモーターの制御下で任意の抗原に関するヌクレオチド配列を含有する。特定の溶解遺伝子に関するヌクレオチド配列の導入により、リステリアモノサイトゲネス胚が抗原提示細胞の細胞質ゾル中に溶解し、そしてそれらのプラスミドを放出し、これが次にプラスミドコード化タンパク質の発現、プロセシング及び提示をもたらし、そしてこれらのタンパク質の免疫原性を明白に増大する（Dietrich et al., Nat. Biotechnol. 16: 181-185, 1998; Vaccine 19: 2506-2512, 2001）。
【００１６】
細胞内に定住する細菌の弱毒化変異体が開発された。例えばリステリアモノサイトゲネス、ネズミチフス菌及びチフス菌並びにＢＣＧのこのような変異体は、チフス及び結核に対する十分に耐容された生ワクチンとしてすでに用いられた。それらの弱毒化突然変異体を含めたこれらの細菌は一般に、免疫刺激性であり、かなりの細胞免疫応答を誘発し得る。例えばリステリアモノサイトゲネスは、ＴＨ１細胞の活性化により特定程度まで、細胞傷害性リンパ球の増殖を刺激する。これらの細菌は、抗原提示細胞（ＡＰＣ；マクロファージ及び樹状細胞）の細胞質ゾル中に直接的に分泌抗原を供給し、これが次に同時刺激分子を発現し、Ｔ細胞の効率的刺激を誘発する。リステリアは一部は食作用区画中で分解され、したがってこれらのキャリアー細菌により産生される抗原は、一方では、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して提示され得るし、したがってＴヘルパー細胞の誘導を生じる。他方で、リステリアはＡＰＣの細胞質ゾル中で食細胞からの放出後に複製する。したがってこれらの最近により産生され、分泌される抗原は、好ましくはＭＨＣクラスＩ経路により提示され、それによりこれらの抗原に対するＣＴＬ応答が誘導される。さらにリステリアとマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）及び好中球性顆粒球との相互作用により、このようなサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２；Unanue, Curr. Opin. Immunol. 9: 35-43, 1997; Mata and Paterson, J. Immunol. 163: 1449-14456, 1999）の発現が誘導され、これに関する抗腫瘍有効性が検出される、ということが示され得た。例えば腫瘍抗原の発現のために形質導入されたリステリアモノサイトゲネスの投与により、実験的腫瘍の増殖が抗原特異的に抑制され得た（Pan et al., Nat. Med. 1: 471-477, 1995; Cancer Res. 59: 5264-5269, 1999; Voest et al., Natl. Cancer Inst. 87: 581-586, 1995; Beatty and Paterson, J. Immunol. 165: 5502-5508, 2000）。腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列が導入された弱毒化サルモネラエンテリカ株は、腫瘍抗原発現細菌キャリアーとして、経口投与後に、異なる実験的腫瘍に対する特異的防御を生じ得た（Medina et al., Eur. J. Immunol. 30: 768-777, 2000; Zoller and Christ, J. Immunol. 166: 3440-3450, 2001; Xiang et al., PNAS 97: 5492-5497, 2000）。組換えサルモネラ株は、ウイルス感染（ＨＰＶ）に対する予防的ワクチンとしても（Benyacoub et al., Infect. Immun. 67: 3674-3679, 1999）、そして腫瘍ウイルス（ＨＰＶ）により不死化されたマウス腫瘍の療法的処置のため（Revaz et al., Virology 279: 354-360, 2001）にも有効であった。全身性腫瘍治療のために、特定的に選択された腫瘍組織上に定住するサルモネラ菌株が選択された（Murray et al., J. Bacteriol. 183: 5554-5564, 2001）。これらのサルモネラ菌株中に、並びに大腸菌株中に、選定酵素をコードするヌクレオチド配列が導入され、そしてこれらの細菌キャリアーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ  ｖｉｖｏで実験的腫瘍系において、ＧＥＤＰＴのために首尾よく用いられた（Pawelek et al., Cancer Res. 57: 4537-4544, 1997）。
【００１７】
炎症組織、特に腫瘍組織は、ほとんどの場合、腫瘍中で無秩序に進行する新脈管形成増大により特性化される。これらの新規形成血管では、可溶性並びに粒状物質が濃化され得るが、但し、それらは低分布容積を有し、したがって相対的に長い血中半減期を有する。この濃化（受動的ターゲッティングとも呼ばれる）は、治療方法のために用いられ得る（Sedlacek, Critical Reviews in Oncology/Hematology 37: 169-215, 2001）。
【発明の開示】
【００１８】
本発明の目的
増殖性疾患の治療において、特に腫瘍療法において、有効性増大を示す製剤組成物を提供することが、本発明の目的である。
【００１９】
本発明の基本概念並びに本発明が基礎とする知見
上記の技術的目的を達成するために、本発明は、そのゲノム中に以下の：Ｉ）直接又は間接的、抗増殖的又は細胞傷害的に活性な一発現産物又は複数の上記発現産物をコードするヌクレオチド配列；ＩＩ）微生物中で活性化され得る活性化配列の制御下で血漿タンパク質をコードするか又は構成的に活性であるヌクレオチド配列；ＩＩＩ）任意に、微生物中で活性化され得る活性化配列の制御下で細胞特異的リガンドをコードするか又は構成的に活性であるヌクレオチド配列；ＩＶ）微生物の外表面で構成成分Ｉ）及びＩＩ）そして任意にＩＩＩ）の発現産物の発現を誘導するか、又は構成成分Ｉ）の発現産物の分泌並びに構成成分ＩＩ）及び任意にＩＩＩ）の発現を誘導し、そして好ましくは構成的に活性である輸送系に関するヌクレオチド配列；Ｖ）任意に、哺乳類細胞の細胞質ゾル中の微生物の溶解のために、並びに溶解微生物中に含有される少なくとも１つ又は複数の構成成分Ｉ）及びＶＩ）を有するプラスミドの細胞内放出のために用いられるタンパク質に関するヌクレオチド配列；そしてＶＩ）微生物中で活性化され得る及び／又は構成成分Ｉ）を発現するために組織細胞特異的、腫瘍細胞特異的、機能特異的又は非細胞特異的である活性化配列構成成分が挿入され、発現され得る被膜微生物であって、構成成分Ｉ）〜ＶＩ）のいずれかが１回又は数回存在し、そして同一であるか又は異なる微生物を教示する。
【００２０】
本発明の目的のために、好ましくは遺伝子情報のためのキャリアーとしての被膜微生物、並びに増殖性疾患の予防及び治療のための上記の被膜微生物の使用が記載される。本発明は、以下の経験及び技術的発展に基づいている。
【００２１】
したがって本発明の目的物は、好ましくは増殖性疾患の治療のためのヌクレオチド配列に関するキャリアーとしての被膜微生物であって、以下の構成成分が微生物中に挿入されていた：Ｉ）少なくとも１つの直接又は間接的、抗増殖的又は細胞傷害的に活性な発現産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列；ＩＩ）微生物中で活性化され得る少なくとも１つの活性化配列の制御下で少なくとも１つの血漿タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列；ＩＩＩ）任意に、微生物中で活性化され得る少なくとも１つの活性化配列の制御下で少なくとも１つの細胞特異的リガンドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列；ＩＶ）微生物の外表面で構成成分Ｉ）及びＩＩ）そしてＩＩＩ）の発現産物の発現を可能にするか、又は構成成分Ｉ）、ＩＩ）及びＩＩＩ）の分泌を可能にする少なくとも１つの輸送系に関する少なくとも１つのヌクレオチド配列；Ｖ）任意に、哺乳類細胞の細胞質ゾル中の微生物の溶解のために、並びに溶解微生物中に含有されるプラスミドの細胞内放出のために用いられる少なくとも１つのタンパク質に関する少なくとも１つのヌクレオチド配列；そしてＶＩ）微生物中で活性化され得る少なくとも１つの活性化配列及び／又は構成成分Ｉ）を発現するための少なくとも１つの組織細胞特異的、腫瘍細胞特異的又は非細胞特異的活性化配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の好ましい実施形態
構成成分Ｉ）
構成成分Ｉ）は、少なくとも１つの直接又は間接的、抗増殖的又は細胞傷害的に活性な発現産物をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列である。直接的、抗増殖的に活性な発現産物は、本発明の意味においては、例えばインターフェロン、例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−β、免疫細胞又は腫瘍細胞を抑制するインターロイキン、例えばＩＬ−１０、ＩＬ−１２、前アポトーシスペプチド又はタンパク質、例えばＴＮＦ−α、ｆａｓリガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、免疫細胞、腫瘍細胞又は腫瘍が生じる組織の細胞に抑制的に作用するか又はそれらに対して細胞傷害的に作用する抗体又は抗体の断片、例えばｉ）腫瘍関連又は腫瘍特異的抗原、ｉｉ）リンパ球に対する、例えばＴ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、Ｃ４０リガンド、Ｂ７．１又はＢ７．２に関する受容体、インターロイキン、例えばＩＬ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５又は−１６に関する受容体、インターフェロンに関する受容体あるいはケモカインに関する、例えばＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ−α、ＭＩＰ−β、ＩＬ−８、ＭＧＳＡ／Ｇｒｏ、ＮＰＡ−２又はＩＰ−１０に関する受容体に対する抗原、ｉｉｉ）組織特異的抗原、例えば、乳腺、腎臓、母斑、前立腺、甲状腺、胃粘膜、卵巣、子宮頸部、膀胱の細胞の組織特異的抗原、抗増殖的に活性なタンパク質、例えば網膜芽腫タンパク質（ｐＲｂ＝ｐ１１０）又は関連ｐ１０７及びｐ１３０タンパク質、あるいはこれらのタンパク質の抗増殖的に活性な突然変異体、ｐ５３タンパク質及び類似タンパク質又はこれらのタンパク質の増殖的に活性な突然変異体、ｐ２１（ＷＡＦ−１）タンパク質、ｐ２７タンパク質、ｐ１６タンパク質、ＧＡＡＤ４５タンパク質、Ｂｃ１２ファミリーの抗増殖的に活性なタンパク質、例えばｂａｄ又はｂａｋ、細胞傷害性タンパク質、例えばパーフォリン、グランザイム、オンコスタチン、細胞の成長又は増殖に関与する、例えば受容体をコードするｍＲＮＡに特異的な、シグナル伝達酵素に特異的な、細胞周期に関与するタンパク質に特異的な、転写因子に特異的な、又は輸送タンパク質に特異的なアンチセンスＲＮＡ又はｍＲＮＡに特異的なリボザイムに対する抗原に対して向けられる抗体である。間接的には、増殖的に活性なタンパク質は、例えば急性炎症及び免疫反応の誘導物質、例えばケモカイン、例えばＲＡＮＴＥＳ（ＭＣＰ−２）、単球走化性及び活性化因子（ＭＣＡＦ）、ＩＬ−８、マクロファージ炎症タンパク質−１（ＭＩＰ−１−α、−β）、好中球活性化タンパク質−２（ＮＡＰ−２）、インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、サイトカイン、例えばＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、細胞傷害性物質の不活性前段階の細胞傷害性物質への活性化又は裂開のための酵素（上記酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ又はリアーゼである）である。このような酵素の例は、β−グルクロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グ���コースオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン−アクチベーターカルボキシペプチダーゼ、シトシンデアミナーゼ、デオキシシチジンキナーゼ、チミジンキナーゼ、リパーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、キナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ラクテートオキシダーゼ、ペニシリンＶアミダーゼ、ペニシリンＧアミダーゼ、リソザイム、β−ラクタマーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ、Ｂ又はＧ２、ニトロレダクターゼ、シトクロムＰ４５０オキシダーゼである。本発明に従って、酵素は、ウイルス、細菌、酵母、軟体動物、昆虫又は哺乳類から生じ得る。好ましくはヒトから生じる酵素が用いられる。さらに、本発明の意味において、細胞特異的リガンドと酵素との融合産物を、及び／又は新脈管形成を抑制するタンパク質、例えばプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（ＰＡＩ−１）、ＰＡＩ−２又はＰＡＩ−３、アンギオスタチン又はエンドスタチン、インターフェロン−α、−β又は−γ、インターロイキン１２、血小板因子４、トロンボスポンジン−１又は−２、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、血管内皮細胞増殖阻害剤（ＶＥＧＩ）をコードする核酸構築物が好ましい。本発明の意味において、構成成分Ｉ）は、１つ又は複数の同一の又は異なる、直接的又は間接的に、増殖的又は細胞傷害的に活性なタンパク質をコードする１つ又は複数のヌクレオチド配列を示し得る。好ましいのは、付加的又は相乗的作用を有するタンパク質の組合せである。付加的又は相乗的作用は、例えば異なって活性なタンパク質の以下の組合せに関して予測され得る：細胞傷害性タンパク質及び前アポトーシスタンパク質、酵素及び細胞傷害性及び／又は前アポトーシスタンパク質、抗血管新生タンパク質及び細胞傷害性及び／又は前アポトーシスタンパク質、炎症の誘導物質及び酵素又は細胞傷害性、前アポトーシス性及び／又は抗血管新生タンパク質。
【００２３】
構成成分ＩＩ）
構成成分ＩＩ）は、微生物中で活性化され得る活性化配列の制御下で少なくとも１つの血漿タンパク質をコードする一ヌクレオチド配列である。好ましいのは、ヒト血漿タンパク質、即ち24時間より長い血中での平均停留時間を有するものである。これらの例としては特に、例えばアルブミン（ヌクレオチド１〜２２５８；Hinchliffe et al., EP 0248637-A, 9/12/1987）、トランスフェリン（ヌクレオチド１〜２３４６；Uzan et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 119: 273-281, 1984; Yang et al., PNAS-USA 81: 2752-2756, 1984）、セルロプラスミン（Baranov et al., Chromosoma 96: 60-66, 1987）、ハプトグロビン（ヌクレオチド１〜１４１２；Raugei et al., Nucleic Acids Res.11: 5811-5819, 1983; Yang et al.,PNAS-USA 80: 5875-5879, 1983; Brune et al., Nucleic Acids Res. 12: 4531-4538, 1984）、ヘモグロビンα（ヌクレオチド１〜５７６；Marotta et al., PNAS-USA 71: 2300-2304, 1974; Chang et al., PNAS-USA 74: 5145-5149, 1977）、ヘモグロビンβ（ヌクレオチド１〜６２６；Marotta et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 19: 165-175, 1976; Marotta et al., J. Biol. Chem. 252: 5019-5031, 1977）、α−２−マクログロブリン（ヌクレオチド１〜４５９９；WO 9103557 A, 21/3/1991）が挙げられる。しかしながら他の血漿タンパク質、例えばα−１−リポタンパク質、α−２−リポタンパク質、β−１−リポタンパク質も含まれる。本発明に従った微生物による少なくとも１つのこれらの血漿タンパク質の発現は、結果として、全身投与後、特に血液循環系への注入後に、食作用中の細胞により低度に微生物が受容されるということを有し、したがって血中により長く留まり得るし、そして腫瘍血管系中に又は慢性炎症の血管中に濃化され得る。
【００２４】
構成成分ＩＩＩ）
構成成分ＩＩＩ）は、微生物中で活性化され得る活性化配列の制御下で細胞特異的リガンドをコードするヌクレオチド配列である。このリガンドの特異性は、そのために微生物が用いられる増殖性疾患の種類に、そして治療的有効性を達成するために微生物中で構成成分Ｉ）が接触されるようになる細胞又は組織によっている。例えば腫瘍疾患において、腫瘍細胞に対する、即ち腫瘍関連又は腫瘍特異的抗原又は腫瘍内皮細胞に対する、あるいはそれぞれの腫瘍が生じる組織細胞に対する、例えば甲状腺、前立腺、卵巣、乳腺、腎臓、胃粘膜、母斑、子宮頸部、膀胱の細胞に対する；慢性炎症、細胞性自己免疫疾患及び移殖臓器の拒絶に対する特異性を有するリガンド、マクロファージ、樹状細胞、Ｔリンパ球に対する、又は活性化内皮細胞に対する特異性を有するリガンドが用いられる。このようなリガンドは、例えば腫瘍細胞に、白血病細胞に、腫瘍内皮細胞に、組織細胞に、マクロファージ、樹状細胞、Ｔリンパ球に、あるいは活性化内皮細胞に選択的に結合する特異的抗体又はこれらの抗体の抗原結合断片、増殖因子、インターロイキン、サイトカイン又は細胞接着分子である。
【００２５】
構成成分ＩＶ）
構成成分ＩＶ）は、微生物の外表面で構成成分Ｉ）、ＩＩ）及び／又はＩＩＩ）の発現産物の発現を可能にする輸送系をコードするヌクレオチド配列である。それぞれの構成成分は、選択肢として、微生物の膜上に分泌されるか又は発現され、即ち膜結合され得る。構成成分ＩＩ）及びＩＩＩ）は、好ましくは発現、膜結合される。このような輸送系は、例えば大腸菌のヘモリシン輸送シグナルである（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でｈｌｙＡ、ｈｌｙＢ及びｈｌｙＤを含有するヌクレオチド配列、Gentschev et al., Gene 179: 133-140, 1996）。以下の輸送シグナルが用いられ得る：分泌のためには、ｈｌｙＢ及びｈｌｙＤタンパク質の存在下でのＣ末端ｈｌｙＡ輸送シグナル；膜結合、発現のための、ｈｌｙＢタンパク質存在下でのＣ末端ｈｌｙＡ輸送シグナル；大腸菌のヘモリシン輸送シグナル（ｈｌｙ特異的細菌プロモーターの制御下でのｈｌｙＡ、ｈｌｙＢ及びｈｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）；コーロバクタークレセンダスのＳ層タンパク質（ＲｓａＡ）；分泌のための並びに膜結合発現のための、Ｃ末端ＲｓａＡ輸送シグナル（Umelo-Njaka et al., Vaccine 19: 1406-1415, 2001）；大腸菌E. coliのＴｏｌＣタンパク質に関する輸送シグナル（ＴｏｌＣタンパク質はKoronakis et al., Nature 405: 914-919, 2000により、並びにGentschev et al., Trends in Microbiology 10: 39-45, 2002により記載された）；膜結合発現のための、Ｎ末端輸送シグナル。
【００２６】
構成成分Ｖ）
構成成分Ｖ）は、哺乳類細胞の細胞質ゾル中で発現され、並びに宿主細胞の細胞質ゾル中のプラスミドの細胞内放出のために微生物を溶解するタンパク質に関する少なくとも１つの溶解物質をコードするヌクレオチド配列である。このような溶解タンパク質（エンドリシン）は、例えばリステリア特異的溶解タンパク質、例えばＰＬＹ５５１（Loessner et al., Mol. Microbiol. 16: 1231-41, 1995）、リステリアプロモーターの制御下でのリステリア特異的ホリンである。本発明の好ましい実施形態は、異なる構成成分Ｖ）の組合せ、例えば溶解タンパク質とホリンとの組合せである。
【００２７】
構成成分ＶＩ）
構成成分ＶＩ）は、構成成分Ｉ）の発現を制御する任意のアクチベーター配列を表す。微生物の外表面での構成成分Ｉ）の発現のために、構成成分ＶＩ）は、細菌中で活性化され、当業者に既知である活性化配列の１つである。このような活性化配列は、例えば構成的活性プロモーター領域、例えば大腸菌のβ−ラクタマーゼ遺伝子の、又はｔｅｔＡ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を有するプロモーター領域（Busby and Ebright, Cell 79: 743-746, 1994）、誘導され得るプロモーター、好ましくは細胞中での受容後に活性になるプロモーターである。後者に属するのは、S. monocytogenesのａｃｔＡプロモーター（Dietrich et al., Nat. Biotechnol. 16: 181-185, 1998）又はL. monocytogenesのｐａｇＣプロモーター（Bumann, Infect. Immun. 69: 7493-7500, 2001）が挙げられる。好ましいのは、標的細胞の細胞質ゾル中の細菌キャリアーのプラスミドの放出後に、この細胞中で活性化されるアクチベーター配列である。例えばＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター又は当業者に既知の任意のその他のプロモーター又はエンハンサー配列が用いられ得る。好ましいのはさらに、細胞特異的又は機能特異的アクチベーター配列である。細胞特異的又は機能特異的アクチベーター配列の選択は細胞又は組織によっているが、この場合、細菌キャリアー又は細菌キャリアーから放出されるプラスミドは、構成成分Ｉ）を発現するものである。このようなアクチベーター配列は、例えば腫瘍細胞関連アクチベーター配列（例えばミッドカイン、ＧＲＰ、ＴＣＦ−４、ＭＵＣ−１、ＴＥＲＴ、ＭＹＣ−ＭＡＸ、界面活性剤タンパク質、α−胎児タンパク質、ＣＥＡ、チロシナーゼ、繊維性酸性タンパク質、ＥＧＲ−１、ＧＦＡＰ、Ｅ２Ｆ１、塩基性ミエリン、α−ラクトアルブミン、オステオカルシン、サイログロブリン及びＰＳＡに関する遺伝子のアクチベーター配列）（McCormick, Nature Reviews Cancer 1: 130-141, 2001）、ＶＥＧＦ、フォン・ウィルブランド因子、脳特異的内皮グルコース−１輸送体、エンドグリン、ＶＥＧＦ受容体、特にＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２及びＶＥＧＦ−Ｒ３、ＴＩＥ−２、ＰＤＥＣＧＦ受容体、Ｂ６１、エンドセリン−１、エンドセリン−Ｂ、マンノース６−リン酸塩受容体、ＶＣＡＭ−１及びＰＥＣＡＭ−１のような好ましくは内皮細胞により発現されるタンパク質に関する遺伝子の内皮細胞特異的アクチベーター配列（Sedlacek, Critical Reviews in Oncology/ Hematology 37: 169-215, 2001）、好ましくは患者の腫瘍細胞が生じる組織細胞中で発現されるタンパク質、例えば乳房組織（例えばＭＵＣ−１、α−ラクトアルブミン）、甲状腺（例えばサイログロブリン）、前立腺（例えばカリクレイン−１、アンドロゲン受容体、ＰＳＡ）、卵巣、母斑（例えばチロシナーゼ）及び腎臓の細胞中で発現されるタンパク質に関する遺伝子のアクチベーター配列、マクロファージ，樹状細胞又はリンパ球中で発現されるタンパク質、例えばインターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、接着分子、インターフェロン、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン又はインターフェロンに対する受容体に関する遺伝子のアクチベーター配列、低酸素により活性化されるアクチベーター配列、例えばＶＥＧＦ又はエリスロポエチンに関するアクチベーター配列である。
【００２８】
微生物中への構成成分Ｉ）〜ＶＩ）の挿入は、当業者に既知の分子生物学的方法によりなされる。例えばキャリアーとして細菌を用いるために、適切なプラスミド中に構成成分が挿入される方法、並びにこれらのプラスミドが細菌中に導入される方法を、当業者は熟知している。
【００２９】
本発明に従って、これらの微生物は、増殖性疾患、例えば腫瘍、白血病、慢性炎症、自己免疫疾患又は臓器移植片の拒絶の予防又は治療のために患者に投与される。このような疾患を治療するために、本発明による微生物が、局所的に又は全身的に、例えば血液循環中に、体腔中に、器官中に、関節中に又は結合組織中に、適切な調製物中で投与される。全身性投与、特に血液循環中への投与を用いて、構成成分ＩＩ）の作用を超えたいわゆる細網内皮系による微生物の望ましくない受容を低減し、そして微生物の血中停留時間を延長するために、微生物は、長い血中停留時間を有する物質の溶液中に懸濁され得る。懸濁後、インキュベーションを行なう。微生物の懸濁及びインキュベーションは、例えば血漿又は血清中で行なわれる。しかしながら懸濁及びインキュベーションは好ましくは、長い血中停留時間を有する物質の溶液又は物質の混合物の溶液中で実施される。これらの物質の例としては、例えばアルブミン、トランスフェリン、プレアルブミン、ヘモグロビン、ハプトグロビン、α−１−リポタンパク質、α−２−リポタンパク質、β−１−リポタンパク質、α−２−マクログロビン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、天然又は合成ポリマー、例えばポリエチレンイミン、デキストラン、ポリゲリン、ヒドロキシエチルデンプンとのＰＥＧ接合体が挙げられる。
【００３０】
このような溶液中での懸濁及びインキュベーションにより、本発明の微生物の表面への当該物質の吸着が起こる。しかしながらこれらの物質による微生物のコーティングは、接合によっても達成され得る。接合の方法は、Sedlacek et al., Contributions to Oncology 32: 1-132, 1988に要約されている。
【００３１】
吸着によるコーティングは、例えば好ましくは10分〜24時間の時間に亘って、好ましくは4℃の温度で、好ましくは0.1〜50％のコーティング物質を含有する溶液中での微生物の懸濁により行なわれる。
【００３２】
本発明に従って、微生物としては好ましくは、その毒力が低減された細菌が用いられる。さらに好ましいのは、大腸菌、サルモネラエンテリカ、エルシニアエンテロコリチカ、コレラ菌、リステリアモノサイトゲネス、赤痢菌から成る群から選択される細菌である。
本発明と関連した微生物はさらに、生又は生存する微生物の膜エンベロープ、いわゆるゴーストである。このような膜エンベロープは、例えばEPA 0540525に従って産生される。
【００３３】
本発明の目的物は、本発明の微生物を含有する医薬製剤、並びに増殖性疾患の予防及び／又は治療のためのこの薬剤の使用である。本発明の意味における増殖性疾患は、拡大性又は非制御性細胞増殖を伴う疾患、例えば腫瘍疾患、例えば癌腫又は肉腫、白血病、慢性炎症、自己免疫疾患又は臓器移植片の拒絶である。疾患の予防又は治療のために、本発明の微生物は、好ましくは100個〜100万個の用量で医薬製剤中で、患者に局所的に又は全身的に投与される。
【００３４】
被覆されたという用語は、微生物の膜の外側に、上記のような多数の同一の又は異なる分子（特徴Ｉ）〜ＩＩＩ）のうちの１つ又は複数に従って発現されるか及び／又は選択される）が提供されることを意味し、幾何学的被覆面積率は0.001〜1、特に0.01〜1、例えば0.1〜1である。幾何学的被覆面積率は、微生物の表面への半径方向（微生物の中心に関して）投影図中の全分子の総面積を、微生物の表面積で割った比率から算定され得る。通常は簡素化として、微生物の球表面を仮定し、算定は微生物の体積を基礎とする。「被覆化」という特徴は、適用可能な場合には、任意条件的である。
【実施例】
【００３５】
実施例
実施例１：ヒトアルブミン及びβ−グルクロニダーゼの膜結合発現のための細菌株の構築
本実施例では、最菌株Ｓｔ２１−ｂｇｌｕの生成方法を記載する。この弱毒化チフス菌Ｔｙ２１ａ株（ヒトへの使用を認可されたキャリアー）は、ヒトβ−グルクロニダーゼとｈｌｙＡ並びにヒトアルブミンとｈｌｙＡの大腸菌膜結合融合タンパク質のｈｌｙ分泌機構により発現する。構築は、公表済みのプラスミドｐＭＯｈｌｙ１（Gentschev et al., Behring Inst. Mitt. 57-66, 1994）及びｐＧＰ７０４（Miller and Mekalanos, J. Bacteriol. 170: 2575-2583, 1988）を基礎にする。菌株は、受動的ターゲッティング（Bermudes et al., Adv. Exp. Med. Biol. 465: 57-63, 2000）により、腫瘍でのβ−グルクロニダーゼの濃化を可能にし、したがってβ−グルクロニダーゼにより活性化されるプロドラッグの腫瘍組織に制限された裂開を可能にする。
【００３６】
膜結合発現は、ｈｌｙＢタンパク質の存在下での、しかしながら完全機能性ｈｌｙＤタンパク質の不存在下で、ｈｌｙＡ分泌タンパク質のＣ末端とのタンパク質の融合により、サルモネラ中で起こり得る。しかしながらｈｌｙＤは、そうでない場合、分泌機構と外膜のＴｏｌＣタンパク質との間の結びつきが生じないというわけではないため、完全にかけているわけではないはずである（Spreng et al., Mol. Microbiol. 31: 1596-1598, 1999）。これらの例では、膜結合発現のためのｈｌｙＤタンパク質の考え得る修飾のうちの１つが示される。先ず、ベクターｐＭＯｈｌｙＤＤが構築されるが、この場合、機能性ｈｌｙＤタンパク質は産生されない。この目的のために、エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩ及びＡｐａＩにより、ｈｌｙＤ遺伝子の一部がベクターｐＭＯｈｌｙ１から除去される。制限消化後、３’−５’エキソヌクレアーゼにより末端が消化され、10,923 bp断片が再結繋される。その後、β−グルクロニダーゼ遺伝子がこのベクター中にインフレームでｈｌｙＡ遺伝子にクローン化される。この目的のために、ｃＤＮＡバンクからのｂｇｌｕのｃＤＮＡ（GenBank寄託番号（Ｇｂ）：M15182）を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、以下のプライマーを用いて増幅した：
【００３７】
ｂｇｌｕ５’：ATGCATTGCAGGGCGGGATGCTGTACC
ｂｇｌｕ３’：ATGCATAAGTAAACGGGCTGTTTTCCAAAC
【００３８】
βグルクロニダーゼのｃＤＮＡと相補的である領域に下線を付し、生成ＮｓｉＩ位置に関する情報はイタリック体で示す（以下においてもこの種の表示を用いる；オリゴヌクレオチド配列は、ここでも、そして以下でも同様に、５’−３’として示す）。プライマーは、シグナル配列を伴わずに遺伝子が増幅されるよう、選択される。生成物（1,899 bp）を適切なＰＣＲクローニングキットを用いてサブクローニングし、次に≒1,890 bp断片をＮｓｉ消化により抽出する。その後、ＮｓｉＩ断片をＮｓｉＩ切断ベクターｐＭＯｈｌｙＤＤ中にクローン化する。これは、ベクターｐＭＯ  ＤＤｂｇｌｕを生じる（図１）（ＮｓｉＩ断片がＮｓｉＩ切断ベクターｐＭＯｈｌｙ中にクローン化されると、プラスミドｐＭＯｂｇｌｕが得られて、融合タンパク質の分泌を可能にする）。第二部では、アルブミンｈｌｙＡ融合の染色体組込みのための組込みベクターが産生される。ｐＭＯｈｌｙを基礎にしているこのベクターは、アルブミンｃＤＮＡとｈｌｙＡ遺伝子との融合物を保有する。クローニングのために、市販ｃＤＮＡバンクからのアルブミン遺伝子のｃＤＮＡ（Ｇｂ：A06977）が、ＰＣＲにより増幅され、以下のプライマーがＮｓｉＩを生成する：
【００３９】
５’：ATGCATGGGTAACCTTTATTTCCCTTC
３’：ATGCATAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-
【００４０】
1,830 bp断片はサブクローニングされ、次にＮｓｉＩで切断される。1,824 bp断片はここで、ＮｓｉＩ消化ｐＭＯｈｌｙ１中に結繋される。したがって完成プラスミドｐＭＯｈｌｙ  ａｌｂはｈｌｙＢ、ｈｌｙＤ、並びにアルブミン及びｈｌｙＡからの融合タンパク質を発現する。停留時間に関する実験のために、ＮｓｉＩ断片は代替的にベクターｐＭＯ  ＤＤ中にも挿入され、このベクターは、ｐＭＯ  ＤＤａｌｂという名称を有する。さらなる経過中、すでに記載したクローニング戦略の修飾を、サルモネラ染色体中の組込みのために用いる（Miller et Mekalanos, J. Babteriol. 170: 2575-2583, 1988）。この目的のために、先ずサルモネラのａｒｏＡ遺伝子をベクターｐＵＣ１８中にクローン化した（以下のプライマー：
【００４１】
プライマー５’：ATGGAATCCCTGACGTTACAACCC
プライマー３’：GGCAGGCGTACTCATTCGCGC
【００４２】
を用いたＰＣＲ。ｐＵＣ１８のＨｉｎｃＩＩ界面への1,281 bp断片のブラントクローニング）。その後、ａｒｏＡ中に位置する341 bp断片を、ＨｉｎｃＩＩ消化とその後の再結繋により除去した。このベクターをｐＵＣ１８  ａｒｏＡ’と呼んだ。次にａｌｂ−ｈｌｙＡ融合遺伝子を、ｐＭＯｈｌｙ上に位置するプロモーター配列と一緒にベクターｐＵＣ１８ａｒｏＡ’中にクローン化した。この目的のために、ベクターｐＭＯｈｌｙ  ａｌｂをＡａｃＩＩ及びＳｗａＩで消化し、次に３’−５’エキソヌクレアーゼで処理する。3,506 bpブラント断片を抽出し、ＨｉｎｃＩＩＩ消化ｐＵＣ１８ａｒｏＡで結繋する。これは、ベクターｐＵＣａｒｏ−ａｌｂを生じる。ここで、ａｒｏＡが側面に位置するａｌｂ−ｈｌｙＡ断片をベクターｐＵＣａｒｏ−ａｌｂからの全てのアクチベーター配列を用いてベクターｐＧＰ７０４中にクローン化する。この目的のために、ｐＵＣａｒｏ−ａｌｂをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次に５’−３’エキソヌクレアーゼで処理する（ブラント）。その後、ＥｃｏＲＩ消化を実施し、4,497断片をＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ（ブラント）消化ベクターｐＧＰ７０４（ＥｃｏＲＩ／ＲＶ断片：6,387 bp）中に結繋する。組込みベクターコピーＧＰａｒｏ−ａｌｂ（図２）を得る。ベクターを大腸菌ＳＭ１０１ｐｉｒ株中で形質転換する。この菌株は、複製に必要なＰタンパク質を生成するため、ベクターを複製させる。ベクターはここで接合により、ベクターの複製を可能にしない受容体株チフス菌Ｔｙ２１ａ中にトランスフェクトされる。したがってテトラサイクリン選択により、ベクターを染色体的に組み込んだ細菌のみが選択される。細胞質アルブミン産生の立証は、細菌溶離物のウエスタンブロット分析により行なわれる。この菌株Ｓｔ２１−ａｌｂはａｌｂ−ｈｌｙＡ融合体を発現するが、しかし、それをこの形態で膜上に分泌も発現もし得ない。この目的のために、膜結合発現に関しては、さらに、機能性ｈｌｙＢ（ｐＭＯ  ＤＤｇｌｕとして）又は機能性ｈｌｙＢ及びｈｌｙＤ（ｐＭＯ  ｂｇｌｕとして）を有するプラスミドが存在する必要がある。
【００４３】
本実施例では、プラスミドｐＭＯ  ＤＤｇｌｕを菌株Ｓｔ２１−ａｌｂとともに用いる。これは、菌株Ｓｔ２１−ａｌｂ  ｐＭＯ  ＤＤｂｇｌｕを生じて、ｈｌｙ分泌系ヒトアルブミン並びにヒトβ−グルクロニダーゼにより膜上に発現する。この菌株を次に、本特許の意味におけるプロドラッグ転換のために用い得る。
【００４４】
実施例２：ヒトβ−グルクロニダーゼの遺伝子情報を供給するためのアルブミン−ｈｌｙＡ融合体で被覆された細菌株の構築
本実施例に記載する細菌株は、腫瘍細胞に関するヒトβ−グルクロニダーゼをコードするＤＮＡを受動的ターゲッティングし、これを次に腫瘍細胞中で発現することにより供給するよう意図される。取り扱いが特に容易である菌株を生成するために、本実施例では、実施例１の場合と同様にわずかに修飾された菌株を、アルブミンの膜発現のために用いる。アルブミン−ｈｌｙＡ並びにｈｌｙＢに関する情報をコードする遺伝子は、染色体に組み込まれるべきものである。それにより、この菌株は構成的膜結合アルブミンを発現する。
【００４５】
この目的のために、上記のベクターｐＭＯｈｌｙ  ａｌｂをＢｓｒＢＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、次に５’−３’エキソヌクレアーゼで処理する。この消化は、完全原核生物活性化配列並びに遺伝子ｈｌｙＣ、ａｌｂ−ｈｌｙＡ及びｈｌｙＢを含有するが、しかしながらｈｌｙＤを含有しない付着末端を有する5,815 bp断片を生じる。この断片をここで、上記のベクターｐＵＣ１８ａｒｏＡ’のＨｉｎｃＩＩ界面に平滑末端的に（bluntly）挿入し得る。それにより、ベクターｐＵＣａｒｏ−ａｌｂ−Ｂを得る。ＥｃｏＲＩ−ＮｒｕＩ消化により、6,548 bp断片を再びＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ消化ベクターｐＧＰ７０４中に挿入し得る（図３）。さらなる手法（チフス菌Ｔｙ２１ａ中の複製及び組込み）は、上記の戦略に対応する。その結果生じる菌株Ｓｔ２１−ａｌｂ−Ｂは、構成的膜結合アルブミンｈｌｙＡ融合タンパク質を発現する。ｈｌｙＤをコードするベクターをトランスフェクトする場合、アルブミン−ｈｌｙＡ融合タンパク質が分泌される。βグルクロニダーゼをコードするＤＮＡを供給するためのプラスミドは、市販ベクターｐＣＭＶβ（Clontech）を基礎にする。構築のために、先ず、ｂｇｌｕ遺伝子と分泌シグナルの融合物を用いる必要がある。本実施例では、ｔＰＡ前駆体分子のシグナルペプチドが用いられるべきものである。このシグナルペプチドは、融合タンパク質の特に効率的な産生及び分泌を可能にする。融合物をクローニングするために、第一段階では、ＰＣＲにより、以下のプライマーを用いてシグナルペプチドをコードする領域の末端まで、ｔＰＡ  ｃＤＮＡ（Ｇｂ  E02027）の５’ＵＴＲを増幅する（ブラント生成ポリメラーゼによる増幅）：
【００４６】
５’：GCGGCCGCAGGGAAGGAGCAAGCCGTGAATTT
３’：AGCTTAGATCTGGCTCCTCTTCTGAATC
【００４７】
生成された166 bp断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化５’−３’エキソヌクレアーゼ処理市販ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）に結繋する。結繋は前進配向で行なう。それにより、ｔＰＡシグナル配列をコードする領域は、ＮｏｔＩ消化により生成プラスミドｐＣＤＮＡｔｐから完全に削除される。この237 bp断片をここで、ＮｏｔＩ消化後のベクターｐＣＭＶβの3,760 bpと結繋する（ベクター主鎖を含有する）。生成プラスミドｐＣＭＶｔｐ（3,972 bp）をここで、異種融合タンパク質の発現のために用い得る。プラスミドｐＣＭＶ  ｂｇｌｕの生成のために、適切なｃＤＮＡバンクからのｂｇｌｕ（Ｇｂ  M15182）遺伝子（シグナルペプチドに関する配列を伴わない）のｂｐｓ断片を、以下のプライマーを用いて精製して、ＳｐｅＩを生成する：
【００４８】
５’：ACTAGTCAGGGCGGGATGCTGTACCCCCAG
３’：ACTAGTCTTGCTCAAGTAAACGGGCTGTTTTC
【００４９】
ＳｐｅＩ消化後、1,899 bp断片をＳｐｅＩ消化ベクターｐＣＭＶｔｐに結繋する。生成プラスミドｐＣＭＶｔｐ  ｂｇｌｕは、β−グルクロニダーゼの成熟タンパク質の領域とのｔＰＡシグナルペプチドのＮ末端融合物をここでコードする。正確な位置の確定後、プラスミドｐＣＭＶｔｐ  ｂｇｌｕ（図４）を菌株Ｓｔ２１−ａｌｂ−Ｂ中で形質転換する。この菌株はここで、受動ターゲッティングにより腫瘍組織へのＤＮＡの供給を可能にし、そして次にトランスフェクト化腫瘍細胞によるＤＮＡの発現は、適切なプロドラッグの転換を可能にする。
【００５０】
実施例３：ｆａｓの細胞外ドメインの膜結合発現を用いたアルブミン−ＴｏｌＣ融合体で被覆された菌株の構築並びにプロドラッグを転換する酵素の供給
本実施例で示される菌株は、実施例２に示した特徴を、ｆａｓリガンド（ｆａｓＬ）を発現する（腫瘍）細胞での特異的ターゲッティングと結びつける。この菌株を用いて、ある種の乳癌におけるようなｆａｓＬ発現腫瘍細胞を特異的に攻撃することが可能である（Herrnring et al., Histochem. Cell. Biol. 113: 189-194, 2000）。腫瘍細胞によるｆａｓＬ発現は、これらの細胞が、攻撃中のｆａｓ発現リンパ球を積極的に排除し得るため、免疫回避に関して考え得るメカニズムと仮定した（Muschen et al., J. Mol. Med. 78: 312-325, 2000）。ここに示した菌株を用いて、療法に関して非常に問題があるこれらの腫瘍細胞を特定的に攻撃し、次にアポトーシス非依存性メカニズムにより排除し得る。キャリアー株は、本実施例においては、アルブミンと大腸菌のＴｏｌＣタンパク質との融合物を基礎にする。それにより、アルブミンの膜結合発現が達成される。ｆａｓの細胞外ドメインの膜結合発現は、プラスミドｐＭＯｈｌｙＤＤにより起こり、そして供給のためには、上記のプラスミドｐＣＭＶ−ｂｇｌｕを用いる。第一段階は、ＴｏｌＣアルブミンを発現するキャリアー株の生成を包含する。先ず、融合タンパク質に関する遺伝子が生成され、次に、ｐＵＣａｒｏＡ’及びｐＧＰ７０４中での連続クローニングにより、上記の実施例に従ってこの遺伝子がサルモネラゲノム中に組み込まれる。天然プロモーターを含めた大腸菌E. coliに関するＴｏｌＣ遺伝子は、プラスミドｐＢＲｔｏｌＣ中に存在する。これを、以下のプライマーにより増幅して、ベクターｐＡＸ６２９（ｔｏｌＣ遺伝子を含有する。ベクター中の領域は、Ｇｂ  X54049位置18〜1914に対応する）からＳａｌＩを生成する：
【００５１】
５’ｔｏｌ：TAACGCCCTATGTCGACTAACGCCAACCTT
３’ｔｏｌ：AGAGGATGTCGACTCGAAATTGAAGCGAGA
【００５２】
ＳａｌＩによる裂開後、1,701 bp断片をベクターｐＢＲ３２２（Ｇｂ  J01749）のＳａｌＩ界面に逆に結繋し、このようにしてｔｅｔ遺伝子を分断した。ＴｏｌＣの既知の結晶構造のために（Koronakis et al., Nature 405: 914-919, 2000）、ｔｏｌＣ遺伝子の特異なＫｐｎＩ界面への異種ＤＮＡの挿入は、外膜上の細胞外ループ中のコード化異種融合タンパク質の発現を可能にする。アルブミンの発現のために、以下のプライマーにより、ｃＤＮＡ（Ｇｂ  A06977）からアルブミン遺伝子を増幅して、ＫｐｎＩを生成する：
【００５３】
５’：GGTACCCGAGATGCACACAAGAGTGAGG
３’：GGTACCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC
【００５４】
1,770 bp断片のＫｐｎＩ消化後、ＤＮＡをＫｐｎＩ切断ベクターｐＢＲｔｏｌＣ中に挿入し得る。逆配向（ｔｏｌＣに対してインフレーム）は次に、ベクターｐＢＲｔｏｌＣ−ａｌｂを生じる。ｔｏｌＣ−アルブミン融合体に関する遺伝子をここで、ＥｃｏＲＶ及びＰｓｈＡＩ（断片3,970 bp）により逆配向にベクターｐＵＣａｒｏＡ’のＨｉｎｃＩＩ界面に結繋する。生成したベクターｐＵＣａｒｏ−ａｌｂ−ｔｏｌ（7,596 bp）をここで、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて線状化し、５’−３’エキソヌクレアーゼで処理し、次にＥｃｏＲＩで消化する。次に4,961 bp断片を、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ消化ベクターｐＧＰ７４０（図５）中に挿入する。接合（実施例１に従って）後、菌株Ｓｔ２１−ｔｏｌ−ａｌｂを得る。ここで、大腸菌Ｉ型分泌機構のｈｌｙＢ構成成分により、プラスミドを、ｆａｓ（ＣＤ９５）−ｈｌｙＡ融合タンパク質の膜結合発現のために用いる。この目的のために、先ず、以下のプライマーを用いて、ｆａｓ遺伝子（Ｇｂ：M67454）の細胞外領域をコードする区分を増幅して、ＮｓｉＩを生成する：
【００５５】
５’：ATGCATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGC
３’：ATGCATAGATCTGGATCCTTCCTCTTTGC
【００５６】
447 bp断片をＮｓｉＩで消化し、ｈｌｙＡ遺伝子に対してインフレームでＮｓｉＩ消化ベクターｐＭＯｈｌｙ  ＤＤ中に挿入する。このようにして得たベクターｐＭＯ  ＤＤ−ｆａｓ（図６）は、サルモネラ菌株中での形質転換後に、膜結合ｆａｓ断片を生じ、これは、適切なフォールディングにより、ｆａｓＬ発現細胞と結合し得る。したがってこれらのサルモネラは、ｆａｓＬ発現細胞、例えば腫瘍細胞で濃化され得る。
【００５７】
ｆａｓＬ腫瘍細胞を殺害するために、ここで、プラスミドｐＣＭＶ  ｂｇｌｕ（実施例２）をさらにまたサルモネラ中にトランスフェクトする。それにより、上記実施例の場合と同様に、腫瘍細胞によるβ−グルクロニダーゼの発現後、プロドラッグ−薬剤媒介性腫瘍療法が可能である。前の実施例と比較して、本実施例のより良好な有効性は、明確に、ｆａｓの細胞外ドメインの的確なフォールディングによっている。ｆａｓの代わりに、モノクローナル抗体のｆａｓＬ特異的ｆａｂ断片（細菌中で的確にフォールディングされ得る）を、本明細書に記載したのと同一のアプローチで用い得る。本実施例は、この技法により、ほとんどあらゆる細胞特異性を有する菌株の構築が適切な特異的ｆａｂ断片の使用により可能である、ということを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ベクター  ｐＭＯ  Ｄｂｇｌｕ
【図２】ベクター  ｐＧＰａｒｏａｌｂ
【図３】ｐＧＰａｒｏ−ａｌｂ−Ｂ
【図４】ｐＣＭＶｔｐ  ｂｇｌｕ
【図５】ｐＧＰａｒｏ−ａｌｂ−ｔｏｌ
【図６】ｐＭＯ  ＤＤ−ｆａｓ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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