(57)【要約】  レチノイドを用いた幹細胞の処理は、幹細胞の肝膵組織への分化を誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の少なくとも一部を肝膵組織に分化させるのに効果的な条件下において、単離した幹細胞をレチノイドで処理することを含む、幹細胞分化の誘導方法。
【請求項２】
前記幹細胞は、胎盤、骨髄、脂肪組織、神経組織、臍帯、胚盤胞内細胞塊、および生殖細胞からなる群から選択される幹細胞源から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞は哺乳動物胚幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記レチノイドはビタミンＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記レチノイドは、レチノール、レチナールおよびレチノイン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レチノイドはレチノイン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記肝膵組織は膵組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記肝膵組織は膵内分泌組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記肝膵組織はインスリン産生細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記インスリン産生細胞はグルコース反応性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記肝膵組織は肝組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記条件は、前記幹細胞の少なくとも約１％を肝膵組織に分化させるのに効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記条件は、前記幹細胞の少なくとも約５％を肝膵組織に分化させるのに効果的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離した幹細胞をモルフォゲンで処理することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記モルフォゲンは、グルカゴン様ペプチドファミリーの成員、ｃＡＭＰ増強剤、ニコチンアミド、転写因子、タンパク質成長因子、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記モルフォゲンは、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４、ＰＤＸ−１、Ｎｇｎ−３、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、肝細胞成長因子、ベータセルリン、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法により生産される前記肝膵組織を含む組成物。
【請求項１８】
前記肝膵組織はグルコース反応性インスリン産生細胞を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法により生産される前記肝膵組織の少なくとも約１％以上を含む、
請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の方法により生産される前記肝膵組織の少なくとも約１０％以上を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１７に記載の組成物を精製することにより作製される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
腸外胃腸障害を有する哺乳動物を特定すること、および治療的に効果のある量の請求項１７に記載の組成物を前記哺乳動物に投与することを含む治療方法。
【請求項２３】
前記腸外胃腸障害は肝膵障害である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記肝膵障害は、糖尿病、膵炎、肝硬変、肝炎、癌および膵胆疾患からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記肝膵障害は糖尿病である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記肝膵組織はグルコース反応性インスリン産生細胞を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
糖尿病を有するヒトを特定すること、および治療的に効果のある量の請求項１８に記載の組成物を前記ヒトに投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[発明の背景]
[発明の分野]
本発明は、幹細胞分化の誘導方法に関し、特に、幹細胞をレチノイドで処理することにより肝膵組織を形成するよう幹細胞を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[関連技術の説明]
肝膵（hepaticopancreatic）障害および腸外（extraintestinal）胃腸障害は、世界中の何百万もの人々に影響を及ぼしている。このような障害の例には、糖尿病、膵炎、肝硬変、肝炎、癌および膵胆（pancreatico-biliary）疾患が含まれる。これらの障害の既存の治療は、部分的に満足のいくものでしかない。例えば、糖尿病は、発病の年齢および体が血中グルコースレベルを制御できなくなるメカニズムに応じて、２つの型に分けられる。Ｉ型糖尿病（若年性糖尿病）は、膵臓のランゲルハンス島に含まれるインスリン産生ベータ細胞の自己免疫破壊を特徴とし、通常、より若い患者に見られる。この型は、血中糖レベルの測定により示されるような指示された時間で精製インスリンの異所性注射によって処理されてきた。この治療は有効であるが、一過性の異常グルコースレベルの長期にわたる影響は、他の器官の緩やかな破壊を招き、腎不全、四肢の切断および視覚消失をもたらす。ＩＩ型糖尿病は一般に、より年齢の高い患者に発生し、インスリン産生に対する反応不能（インスリン非依存性）を特徴とし、この反応不能が最終的に糖尿病を招き、次いで、膵臓ベータ細胞を失わせる。
【０００３】
最近、膵島を含む単離したベータ細胞を移植する能力が、インスリン注射の必要性をなくす可能性を有し、また、正常な血中グルコース制御を取り戻させることが実証されてきている。しかし、この手法の技術的な困難性は、これらの構造の単離に適した器官がないこと、および、ドナーから一旦取り出された膵臓が本質的に不安定であることから発生する。それゆえ、移植の効力は、十分に多量の内分泌インスリン産生細胞（ＩＰＣ）が得られないことにより制限される。
【０００４】
N. Moriya等は、予定外胚葉組織をアクチビンおよびレチノイン酸で処理することによる、膵臓様構造の形成を報告している（「アクチビンおよびレチノイン酸で処理したゼノパス（Xenopus）外胚葉からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ膵臓形成（In Vitro Pancreas Formation
From Xenopus Ectoderm Treated witrh Activin and Retinotic Acid）」（Develop. Growth Differ., Vol. 42, pp. 593 - 602 (2000)）を参照）。D. StaffordおよびV. Princeは、ゼブラフィッシュの成長においてすべての膵細胞型の形成はレチノイドシグナル伝達に依存していることを最近報告している（「膵臓の発生、増殖および幹細胞（Pancreas
Development, Proliferation and Stem Cells）」（meeting abstract, Oct 18-19, 2001 Ntional Institute of Health）を参照）。R. McKay 等は、胚様体を無血清培地に蒔くことによる胚幹細胞のインスリン分泌構造への分化を報告している（「胚幹細胞の膵島様インスリン分泌構造への分化（Differentiation of Embryonic Stem Cells to Insulin-Secreting Structures Similar to Pancreatic Islets）」（Science, Vol. 292, pp 1389
- 1394 (2001)）を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[発明の概要]
レチノイドの使用が、幹細胞を膵組織および肝組織等の肝膵組織系統へ分化させること
が現在発見されている。本明細書中に記載された方法を用いて、肝膵組織は研究室で形成が可能であり、さらに、肝膵障害や腸外胃腸障害に苦しむ人々または動物は、これらの肝膵組織の移植により治療可能である。
【発明の効果】
【０００６】
好ましい実施の形態では、幹細胞の少なくとも一部を肝膵組織に分化させるのに効果的な条件下において単離した幹細胞をレチノイドで処理することを含む幹細胞分化の誘導方法が提供される。好ましくは、レチノイドはレチノイン酸であり、肝膵組織は膵分泌組織である。
【０００７】
別の好ましい実施の形態では、肝膵組織を含む組成物であって、幹細胞の少なくとも一部を肝膵組織に分化させるのに効果的な条件下において単離した幹細胞をレチノイドで処理することを含む方法により生産される組成物が提供される。好ましくは、上記組成物は膵分泌組織を含む。
【０００８】
別の好ましい実施の形態では、腸外胃腸障害を有する哺乳動物を特定すること、上記哺乳動物に治療的に効果のある量の組成物を投与することとを含む治療方法であって、上記組成物は幹細胞の少なくとも一部を肝膵組織に分化させるのに効果的な条件下において単離した幹細胞をレチノイドで処理することを含む方法により生産される治療方法が提供される。好ましくは、上記腸外胃腸障害は肝膵障害であり、上記哺乳動物はヒトである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
[好適な実施の形態の詳細な説明]
好ましい実施の形態は、幹細胞をレチノイドで処理することにより細胞分化を誘導することを含む。「幹細胞」とは、体の多くの細胞型を生成し得る自己新生（self-renewing）細胞である。幹細胞は、当業者に既知の方法により種々の源から得られ得る。好ましい幹細胞は単離した幹細胞であり、好ましくは、胎盤、骨髄、血液、脂肪組織、神経組織、臍帯血液、胚盤胞内細胞塊、および生殖細胞からなる群から選択された幹細胞源から単離される。最も好ましくは、単離した幹細胞は、哺乳動物胚幹細胞である。「単離した」幹細胞は、それらが得られた源よりも高い重量の分画の幹細胞を含む。
【００１０】
本明細書に記載される幹細胞分化方法は、臨床的に有効量の分化幹細胞を生産するため、好ましくは比較的多数の幹細胞について行われる。このような多量の幹細胞の生産用の種々の方法が当該技術分野で既知である。例えば、幹細胞は成長および増殖を促進する種々の既知の技術により培養可能である（E. J. Robertson、「奇形癌および胚幹細胞：実際的なアプローチ（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach）」（IRL Press (1987)）を参照）。単離した幹細胞は、胚様体の形態、例えば、幹細胞の培養により生産されたものであってもよい。
【００１１】
幹細胞、好ましくは、単離した幹細胞は、好ましくは、その幹細胞の少なくとも一部が肝膵組織に分化するように、レチノイドで処理される。「レチノイド」は、頭−尾様式で結合した４つのイソプレノイド単位からなる化合物のクラスの成員である（G. P. Moss、「生化学命名法および関連文献（Biochemical Nomenclature and Related Documents）」（2nd Ed. Portland Press, pp. 247 - 251 (1992))を参照）。「ビタミンＡ」は、レチノールの生物活性を定性的に示すレチノイドの一般表記である。好ましいレチノイドは式（Ｉ）で表される分子であり、式中、二重結合はそれぞれ独立にシスまたはトランスが可能であり、ＲはＣＨ2ＯＨ、ＣＨＯ、ＣＯ2Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＣＯＣＨ3、ＣＨ2ＮＨ2、ＣＨ＝ＮＯＨ、ＣＨ＝Ｎ（ＣＨ2）4ＣＨＮＨ2ＣＯ2Ｈ、ＣＯ2Ｃ2Ｈ5、およびβＤ−グルコピラヌロン酸（beta-D-glucopyranuronic acid）からなる群から選択される。
【００１２】
【化１】
2005515753.tif 000002
【００１３】
他の好ましいレチノイドには、式（Ｉ）の環が開環して１つまたは複数の水素原子が各末端基に付加されて作製されるセコ（seco）レチノイド；ＣＨ3、ＣＨ2、ＣＨまたはＣ基がレチノイドから排除されたノル（nor）レチノイド；および共役ポリエン系が１位置ずれたレトロ（retro）レチノイドが含まれる。非常に好ましいレチノイドは、レチノイン酸（Ｒ＝ＣＯ2Ｈ）、レチノール（Ｒ＝ＣＨ2ＯＨ）およびレチナール（Ｒ＝ＣＨＯ）である。
【００１４】
「肝膵組織」との用語は、肝組織または膵組織を意味し、膵内分泌組織、膵外分泌組織、およびインスリン産生細胞が含まれる。幹細胞は、好ましくは、幹細胞の少なくとも一部を肝膵組織に分化させるのに効果的な条件下においてレチノイドで処理される。好ましい条件には、単離した幹細胞をレチノイドと、約０℃〜約４５℃の範囲、好ましくは約３７℃の温度で接触させること、および、時間／レチノイド濃度条件を分化に好ましいように変えることが含まれる。レチノイドは、レチノイド濃度が正確に制御可能であるよう、好ましくは水溶液の形態で用意される。
【００１５】
レチノイド濃度が好ましくは比較的高い、例えば、約１モル（１Ｍ）以下である場合には、細胞とレチノイドの接触は短時間、例えば、数秒であってもよく、または、レチノイド濃度が好ましくは比較的低い、例えば、約１マイクロモル（１μＭ）以上である場合には、レチノイドとの接触はより長く、例えば、数週間であってもよい。したがって、接触中のレチノイド濃度は、広い範囲、好ましくは約１μＭ以上、より好ましくは約１００μＭ以上、好ましくは約１Ｍ以下、より好ましくは約０．０１Ｍ以下で可変である。同様に、接触時間は広い範囲、好ましくは約１０秒以上、より好ましくは約１時間以上、好ましくは約２週間以下、より好ましくは約４日以下で可変である。「接触」とは、能動的に攪拌するか否かにかかわらず、幹細胞とレチノイドとを接触させる種々の方法のすべての様式を含む広い意味で用いられる。したがって、接触には、幹細胞をレチノイド溶液中で洗うこと、幹細胞をレチノイド溶液中に懸濁させること、幹細胞をレチノイド溶液中で緩やかに攪拌すること、レチノイド溶液を基体上の肝細胞の単層に添加すること等が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、幹細胞は、最初の短期間緩やかに攪拌した後、比較的静かな期間をおくことにより、レチノイドと接触される。別の送達の実施の形態では、レチノイド分子を他の固体／ペプチド／タンパク質または小分子支持構造（例えば、マトリクス分子、他の薬剤／ペプチド、あるいは培養皿、ビーズ、または基体取付要素などの固体表面）に結合させることも可能である。
【００１６】
好ましい方法では、幹細胞は、幹細胞の少なくとも一部を膵組織に分化させるのに効果的な条件下でレチノイドで処理される。好ましくは、膵組織は、膵内分泌組織、より好ましくはインスリン産生細胞を含む。最も好ましくは、インスリン産生細胞はグルコース反応性である。「グルコース反応性」とは、細胞のインスリン産生量がグルコースレベルに反応して変化することを意味する。別の好ましい実施の形態では、肝膵組織は、肝組織を含む。
【００１７】
好ましい実施の形態では、幹細胞は、レチノイドおよびモルフォゲンと接触される。この状況では、「モルフォゲン」は、細胞の分化を誘導する合成または天然化合物またはタンパク質因子である。好ましいモルフォゲンの例には、グルカゴン様ペプチドファミリーの成員（例えば、ＧＬＰ−１、エキセンディン−４（exendin-4）等（T. J. Kieffer and
J. F. Habener、「グルカゴン様ペプチド（The Glucagon-like Peptides）」（Endocrinology Reviews Dec 1999, Vol 20, no. 6 pp 876 - 913）を参照））、ｃＡＭＰ増強剤（例えば、フォルスコリン、ＩＢＭＸ、テフィリン（thephyline）等）、ニコチンアミド、アセチルコリンおよび関連分子、転写因子（例えば、ＰＤＸ−１、Ｎｇｎ−３等（M. Sander and M. S. German「ベータセル転写因子および膵臓の発生（The beta cell transcription factors and development of the pancreas）」（Journal of Molecular Medicine
May 1997, Vol 75, no. 5, pp 327-40）を参照））、タンパク質成長因子（例えば、ガストリン、ガストリン放出ペプチド、肝細胞成長因子、ベータセルリン等（H. Edlund、「膵細胞の分化および機能の制御因（Factors controlling pancreatic cell differentiation and function）」（Diabetologia Sept 2001, Vol 44, no. 9, pp 1071 - 9）を参照））、ならびにこれらの混合物が含まれる。より好ましくは、モルフォゲンは、エキセンディン−４、ガストリン、および／またはガストリン放出ペプチドおよびこれらの混合物である。
【００１８】
モルフォゲンは、幹細胞をレチノイドと接触させるための本明細書中に記載された一般的な様式で、幹細胞と接触させてもよい。幹細胞はレチノイドおよびモルフォゲンといかなる順序で接触させてもよく、あるいは、同時に接触させてもよい。好ましくは、幹細胞は、初期段階ではレチノイドと、次いでその後の段階ではモルフォゲンまたはモルフォゲンとレチノイドとの組み合わせと接触されて、さらに幹細胞を分化させる。好ましい実施の形態では、レチノイドとモルフォゲンとの組み合わせは、一方の作用物質を単独で用いた場合よりもより多量の分化肝膵組織を生産する。
【００１９】
好ましい実施の形態では、本明細書中に記載された任意の方法により生産される分化した幹細胞または肝膵組織を含む組成物が提供される。生産の際、かかる組成物は、組成物全体の重量に対して、好ましくは約１重量％以上、より好ましくは約１０重量％以上、最も好ましくは約５０重量％以上の肝膵組織を含む。好ましい実施の形態では、かかる組成物は、幹細胞全体の重量に対して、少なくとも約１重量％、より好ましくは約５重量％以上、最も好ましくは約２５％以上の幹細胞を肝膵組織に分化させるのに効果的な条件から得られる。分化した幹細胞または肝膵組織の量は、種々の方法、好ましくは、遺伝子発現分析（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）、タンパク質発現（例えば、ウエスタンブロット法または免疫的アッセイ法）、インスリン放射免疫またはＥＬＩＳＡアッセイ、ならびに／あるいは組織／細胞特異的マーカを用いた蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により、決定可能である。遺伝子発現分析、タンパク質発現およびＦＡＣＳの組み合わせは、島／ベータ細胞の量の決定に好ましく用いられる。
【００２０】
本明細書中に記載されているような分化した幹細胞または肝膵組織を含む組成物は、水、安定剤、塩、透明なトレース用物質、ヘパリン、タンパク質、ポリペプチド等のような他の構成成分を含んでもよい。
【００２１】
好ましい組成物は、肝膵組織を含む組成物を精製して、それに含まれる肝膵組織のレベルを増大させ、かつ／または、同様に生産され得る他の組織のレベルを低減させることによっても生産可能である。種々の方法が、肝膵組織を含む組成物の精製に使用可能である。好ましい方法には、遺伝子導入法および物理的方法が含まれる。種々の遺伝子導入法は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第６，０１５，６７１号を参照）。遺伝子導入法は、一般に、特定の条件に対する脆弱性を増大または低減させるための、肝膵組織または他の組織のいずれかの遺伝子修飾を含む。例えば、幹細胞の遺伝子導入操作によ
り、肝膵組織に所定の薬剤処理に対する特別な耐性を付与することができ、この場合、他の組織は好ましくは同一の処理に対して感受性となる。肝膵組織は、好ましくは、薬剤処理後に生存している組織を集めることにより、精製された形態で回収される。さらに、染色やソーティング等の既知の技術を含む物理的精製方法、および、ＦＡＣＳ蛍光活性化セルソーティングまたはアフィニティ精製、例えば、アフィニティクロマトグラフィ、磁気ビーズ精製、免疫沈降等の自動化された方法を行ってもよい。
【００２２】
より多量の肝膵組織は、条件的に不死の肝膵組織の細胞系を遺伝子的に操作して、研究室の条件、例えば、３０℃で無限に成長させるが、その後３７℃の体内に移植した際には通常通りに成長させることにより、生産可能である。このような不死の細胞系の作製方法は既知である（M. J. O'Hare等、「単離されたばかりのヒト乳腺繊維芽細胞および内皮細胞の条件的不死化（Conditional Immortalization of Freshly Isolated Human Mammary Fibroblast ands Endothelial Cells）」（Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 98, pp. 646 -
651 (2001)）を参照）。
【００２３】
好ましい実施の形態では、腸外胃腸障害を有する哺乳動物を特定すること、および本明細書中に記載されたような肝膵組織を含む組成物の治療的効果量を当該哺乳動物に投与することを含む治療方法が提供される。「腸外胃腸」障害とは、腸の内側以外の領域に基本的に位置する胃腸管の障害である。腸外胃腸障害の非限定の例としては、肝膵障害、十二指腸障害、胆管障害、垂障害、脾臓障害、および胃障害が挙げられる。「肝膵」障害は、膵臓と肝臓の障害である。肝膵障害の非限定の例としては、糖尿病、膵炎、肝硬変、肝炎、癌、および膵胆疾患が挙げられる。ヒトが、治療目的として好ましい哺乳動物である。特定器官または構造の「障害」には、その器官または構造が全く無い状況が含まれる。例えば、本発明の目的に関し、膵臓を有しない人は膵臓障害を有する。
【００２４】
肝膵組織を含む組成物は、様々な方法で被験体に投与され得る。好ましくは、組成物は標的器官に直接注射される。例えば、膵内分泌組織を含む組成物は膵臓に注射可能であり、肝組織を含む組成物は肝臓に注射可能である、等である。ある種の組織を含む組成物は、異なった種類の組織を含む器官に注射され得る。例えば、膵組織は肝臓に注射され得る。外因性組織の移植方法は既知である（J. Shapiro等、「グルココルチコイド不使用免疫抑制レジメンを用いたI型真性糖尿病を持つ7人の患者への島移植（Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using Glucocorticoid-free Immuno suppuressive Regimen）」（New Eng. Jour. Med. Vol. 343, pp 230-238）を参照）。
【００２５】
本発明の別の実施の形態では、分化幹細胞から形成された肝膵細胞または組織は、例えば、装置またはマイクロカプセルに封入され得る。一実施例では、分化過程から得られる膵または肝細胞は、体外装置として体の外側に生存可能に保持された装置内に収容され得る。好ましくは、この装置は血液循環系に接続され、これにより、分化細胞は体の外側に機能的に保持され、肝または膵不全状態を補助するよう役立つことができる。第二の実施例では、封入された細胞は特定の体内分画部分（body compartment）内に配置されていてもよく、これにより、これらの細胞は、免疫抑制または免疫調整薬剤の有無にかかわらず、延長された期間機能的であり続ける。
【００２６】
肝膵組織を含む組成物は、好ましくは治療的効果量で被験体に投与される。ヒトについては、かかる量は、十分に確立されたプロトコルに従って行われる臨床試験の結果から一般に決定される。動物については、日常的実験が、特定の障害および特定の組成物に関する治療的効果量の確立に用いられ得る。
【００２７】
種々の省略、付加および修正は本発明の範囲から逸脱しない限り、本明細書中に記載さ
れた方法および組成物に対してなされてもよく、かかる修正および変更はすべて、添付の特許請求の範囲に規定されるような本発明の範囲内にあるよう意図されることは、当業者には理解されるであろう。
【００２８】
[実施例１〜１０]
胚幹細胞系を培養し、マウス胚繊維芽細胞（Mouse Embryonic Fibroblast：ＭＥＦ）を用いず（１５００ユニット／ｍｌの培地中のリンパ球阻害因子（Lymphocyte Inhibitory Factor：ＬＩＦ）を用いて）、ゼラチンを塗布した組織培養（Tissue Culture：ＴＣ）皿上で、３日ごと１：８に分けて４回継代し、培養物からＭＥＦを除いた。得られた幹細胞はその後以下のように分化した：
【００２９】
１日目に、幹細胞をトリプシンで処理していくつかの凝集を壊し、次いで、１％ウシ胎児血清（Fetal Calf Serum：ＦＣＳ）培地（ＬＩＦ含まず）中に懸濁させた。その後、幹細胞を細菌用ペトリ皿の懸濁培養液中の胚様体へと自己凝集させた。３日目に、細胞に、新鮮な交換培地を施し、次いで、２つの細菌用ペトリ皿に分けた（サンプルおよび対照）。１μＭのレチノイン酸を含む溶液をサンプルと混合し、対照（レチノイン酸含まず）およびサンプルの両方を３７℃で放置した。新鮮な培地を（処理サンプルについては新鮮な１μＭのレチノイン酸とともに）５日目に与えた。７日目に、新鮮な培地を両方に与えたが、レチノイン酸は与えなかった（レチノイン酸は３日目から７日目までのみ存在）。
【００３０】
新鮮な培地を９日目に再び与えた。１１日目に細胞を再びトリプシン処理し、次いで、１０％ＦＣＳ培地（ＬＩＦ含まず）が入ったＴＣ皿中に置いた。少量のアリコートを培養液から種々の時間（１４日目、１７日目、１９日目、２２日目、および２５日目）に採取し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による後の分析のために保存した。
【００３１】
１４日目に、各集団の２つの細胞（１０％ＦＣＳ）の群（サンプルおよび対照）について培地を変えた。１７日目に、培地を再び変えた。
【００３２】
１９日目に、付着細胞をピペット操作により穏やかに吹き剥がし、次いで、トリプシン処理をし、細菌用ペトリ皿の懸濁培養液中の１０％ＦＣＳ中に懸濁させた。２２日目および２５日目に、残っている細胞を集め、一部をＲＴ−ＰＣＲ分析用に残した。
【００３３】
１日目以降の培養は、全て２５ミリモル（ｍＭ）のグルコース（高グルコース）中で行い、１９日目以降は５．５ミリモルのグルコース（低グルコース）に変えた。グルコース濃度は、上限は３０ｍＭ〜１０ｍＭ、下限は０．５ｍＭ〜５ｍＭの範囲であった。
【００３４】
上記で集めたアリコートからの全てのＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．から購入）を用いて指示されているように精製した。特定のＲＮＡ転写物は（すなわち、インスリン）の存在は、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＱｉａｇｅｎ（登録商標）  ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen.Incから購入）で指示されているようにＲＴ−ＰＣＲにより決定した。全てのＲＮＡは分化しているＥＳ細胞の培養物から調製した。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、適当なオリゴヌクレオチドプライマー（ＩＮＳ−インスリン）または膵臓の特異的産物であるアミラーゼ（ＡＭＬ）を用いて行った。
【００３５】
表１にまとめたＲＴ−ＰＣＲ結果は、インスリンが対照サンプルのいずれにおいても生産されなかったことを示し、これは、インスリンまたはアミラーゼ産生細胞が存在しないことを示す。これと比べ、１４日目、１７日目、１９日目および２２日目に得られたアリコートから精製されたＲＮＡの、インスリン特異的ＲＴ−ＰＣＲの生成産物のゲル電気泳
動における正しいサイズのバンドの存在により示されるように（図１参照）、幹細胞をレチノイン酸で処理した場合にはインスリン産生細胞が得られた。図１のレーン１〜５および６〜１０は、レチノイン酸処理を伴うかまたは伴わない過程で取られた時点にそれぞれ対応する。バンドの強度はＲＴ−ＰＣＲ産物の存在量に対応する。
【００３６】
【表１】
2005515753.tif 000003
【００３７】
[実施例１１〜１２]
実施例１〜１０の上述した分化ＥＳ細胞を、さらに７日間、３２日目まで培養した。この時点で、分化細胞クラスターを生体染料であるジチゾン（ＤＴＺ）を用いて染色した。ＤＴＺは、分化したベータ細胞中に特に多量に存在し、かつ、インスリン含有保存構造に典型的な亜鉛含有顆粒のための特別な染料である（Z. A. Latif, J. Noel, and R. Alejandro、「新鮮な培養島の簡便な染色方法（A simple method of staining fresh and cultured islets）」（Transplantation, 1988. Vol. 45, no. 4: pp 827 - 30）を参照）。約２００〜３００のＤＴＺで陽性に染色された細胞クラスターを、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の腎臓カプセルが誘発した糖尿病重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスについて移植し、この動物の糖尿病状態を覆す能力を評価した（Wilson, G. L. and E. H. Leiter、「ストレプトゾトシンと膵臓ベータ細胞との相互作用およびインスリン依存糖尿病の誘発(Streprozotocin interactions with pancreatic beta cells and the induction of insulin-development diabetes)」（Current Topics Microbiol. Immunol. 1990, Vol. 156 pp 27 - 54）を参照）。
【００３８】
図２のグラフは、レチノイン酸で処理した分化胚幹細胞が、移植後のＳＴＺ−ＳＣＩＤマウスの血中グルコースレベルを正すことが可能であることを示す。図２はまた、偽処理対照マウス（処置されたが、レチノイン酸処理分化胚幹細胞は移植されなかった）の血中グルコースレベルが正されなかったことを示す。
【００３９】
移植組織を取り出し、ホルマリンで固定し、パラフィンブロックに包埋し、次いで、蛍光（ローダミン）またはペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）免疫組織化学分析用にセクションにした。図３に示す顕微鏡写真は、特定の抗体染色により決定された場合の移植されたレチノイン酸処理分化組織中のインスリンタンパク質の存在を示す。
【００４０】
[実施例１３〜１４]
胚幹細胞系を、実施例１〜１０について上述したように、マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を用いずに（１５００ユニット／ｍｌの培地中のリンパ球阻害因子（ＬＩＦ）を用いて）、ゼラチンを塗布した組織培養（ＴＣ）皿上で培養した。その後、形成された胚様体を、分離され、ＴＣ皿に付着されたものとは対照的に、実験の間懸濁状態で保持した以外は、上述したように（３日目から７日目の間のレチノイン酸間処理により）得られた幹細胞を分化させた。１日目以降の培養は全て、２５ミリモル（ｍＭ）のグルコース(高グルコース）で行い、１９日目以降は５．５ミリモル（生理学的グルコース）のグルコースに変えた。
【００４１】
３２日目に、懸濁された胚様体を集め、ホルマリンで固定し、パラフィンブロックに包埋し、次いで、免疫組織化学分析用にセクションにした。免疫ペルオキシダーゼ細胞化学を用いて、インスリンをレチノイン酸で処理した分化細胞凝集体中に局所化させた。図４に再製した顕微鏡写真は、一次抗体を有しない対照サンプル（図４Ａ）と比較して、特定の抗体染色（図４Ｂ）により決定されたような複数のレチノイン酸処理胚様体中におけるインスリンタンパク質の存在を示す。これらの結果は、レチノイン酸で処理された胚様体がインスリンを産生することを示す。
【００４２】
［実施例１５〜２１］
種々のモルフォゲン（ガストリン、ガストリン放出ペプチドおよびエキセンディン−４）を１９日後に添加した以外は、実施例１〜１０で上述したように（レチノイン酸処理を伴ってかまたは伴わずに）一連の胚様体を調製した。得られた胚様体を３２日目に集め、インスリン特異的放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）によりインスリン含有量についてアッセイした。全インスリン含有量の測定のため、各分化条件当り１００ＥＢに対応する細胞ペレットをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１ｍｌのナノ純度の水に再懸濁させ、超音波処理した。インスリンレベルは、感受性ラットインスリンＲＩＡキット（感度０．０２ｎｇ／ｍｌ、Linco Research, Inc.）を用いて、既知の較正標準で製造者の指示に従って測定した。図５に描いた結果は、レチノイン酸およびモルフォゲンで処理した胚様体は、モルフォゲン単独で処理した胚様体のインスリンのよりはるかに高いレベルのインスリンを産生したことを示す。これらの結果は、レチノイド処理が他の膵モルフォゲンの分化効果を増強させるのに使用可能であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】レチノイン酸非存在下で分化した胚幹細胞と比較した、レチノイン酸存在下で分化した胚幹細胞についてのＲＴ−ＰＣＲ分析の結果として得た、ゲル電気泳動結果の写真を示す。
【図２】時間の関数として、分化ＥＳ細胞で偽処理または処理したマウスの血中グルコースレベルを示すプロットである。
【図３】抗インスリン抗体で染色した移植組織切片の顕微鏡写真を示す。
【図４】レチノイン酸存在下で分化した胚幹細胞の顕微鏡写真を示す。パネルは、一次抗体を有しない陰性対照(図４Ａ）または一次抗体の添加後のインスリン特異的染色(図４Ｂ）を示す。
【図５】結果的に分化した幹細胞のインスリン含有量の測定により決定された、種々のモルフォゲン／レチノイン酸の組み合わせの存在下における分化幹細胞の効果を示すプロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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