(57)【要約】【課題】ＧＨ放出の強力かつ選択性の刺激物質であり且つ酵素分解に対して高度に耐性である、式（１）のアミノ酸配列を持つ、新規ペプチド−成長ホルモン放出ホルモン類似体およびその薬学的に許容される塩を提供する。【解決手段】  新規ペプチドは、リジン、２，４−ジアミノ酪酸または２，３−ジアミノプロピオン酸の適切な誘導体をポリマー支持体に結合したペプチド鎖中の適切な位置に導入し、側鎖アミノ基を脱保護し、そして遊離アミノ基をグアジニン化剤と反応させ、残りすべてのｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を除去し、該支持体から該合成ペプチドを分離させ、そして場合により薬学的に許容される塩に該ペプチドを変換することによって、固相合成法を用いて製造される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｒ２０−Ｒ２１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｒ２９−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中：Ｒ１１は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ１２は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２０は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２１は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２９は、Ｄ−Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐである）
のアミノ酸配列を持つ、新規ペプチドである成長ホルモン放出ホルモン類似体およびその薬学的に許容し得る塩。
【請求項２】
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２；
（２）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｏｒｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−Ｏｒｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２；
（３）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｂ−ＮＨ２；
（４）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｂ−ＮＨ２；
（５）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｂ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２；
（６）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２；
（７）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｐ−ＮＨ２；および
（８）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−Ｇａｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｐ−ＮＨ２；
から成る群より選択される請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２である請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｏｒｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−Ｏｒｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２である請求項２記載のペプチド。
【請求項５】
式（Ｉ）：
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｒ２０−Ｒ２１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｒ２９−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中：
Ｒ１１は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ１２は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２０は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２１は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２９は、Ｄ−Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐである）
のアミノ酸配列を持つ、新規ペプチドである成長ホルモン放出ホルモン類似体およびその薬学的に許容し得る塩を製造する、固相合成法を用いる方法であって、リジン、２，４−ジアミノ酪酸または２，３−ジアミノプロピオン酸の適切な誘導体をポリマー支持体に結合したペプチド鎖中の適切な位置に導入し、側鎖アミノ基を脱保護し、そして遊離アミノ基をグアジニン化剤と反応させ、残りすべてのｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を除去し、そして該支持体から該合成ペプチドを分離させ、次いで精製し、そして場合により薬学的に許容し得る塩に該ペプチドを変換することを特徴とする方法。
【請求項６】
ポリマー支持体としてＭＢＨＡ樹脂が使用される請求項５記載の方法。
【請求項７】
４−（ジメチルアミノ）ピリジンの存在下でＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素がグアニジン化剤として使用される請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
合成ペプチドがフッ化水素を用いて支持体から分離される請求項５または６記載の方法。
【請求項９】
合成ペプチドが高性能液体クロマトグラフィーによって精製される請求項５記載の方法。
【請求項１０】
活性成分、１つ以上の担体および／または１つ以上の賦形剤からなり、該活性成分が式（Ｉ）：
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｒ２０−Ｒ２１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｒ２９−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中：
Ｒ１１は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ１２は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２０は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２１は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２９は、Ｄ−Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐである）
のアミノ酸配列を持つ、少なくとも１つの成長ホルモン放出ホルモン類似体またはその薬学的に許容し得る塩であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
ヒト成長ホルモン欠損関連障害を治療する方法であって、治療を必要とする患者に、式（Ｉ）：
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｒ２０−Ｒ２１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｒ２９−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中：
Ｒ１１は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ１２は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２０は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２１は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２９は、Ｄ−Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐである）
のアミノ酸配列を持つ、ペプチド−ｈＧＨ−ＲＨ類似体またはその薬学的に許容し得る塩の治療有効量を投与することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規ペプチドであるヒト成長ホルモン放出ホルモンの類似体、該新規ペプチドの製造方法、およびこれらの治療上の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン（ＧＨ、ソマトトロピン）の放出および合成は、２つの相互拮抗性の視床下部ホルモン−成長ホルモン放出抑制ホルモン（ＧＩＨ、ソマトスタチン）および成長ホルモン放出ホルモンの定常性の制御下にある。ヒト成長ホルモン放出ホルモン（ｈＧＨ−ＲＨ）の投与に基づく治療は、ＧＨ不全の患者の大多数に対して実施できる。４４のアミノ酸残基を含む内在性ｈＧＨ−ＲＨの全生物活性をなお保持する最も短い断片が、そのN末端類似体ｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）−ＮＨ２であることが明らかにされている。ｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）−ＮＨ２ペプチドは合成によって製造することができる；セルモレリンアセテートという名前の合成ｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）−ＮＨ２は、小児の低身長症の治療での使用が承認されており、神経分泌障害の治療に関し、不妊女性におけるゴナドトロピン誘発排卵用のアジュバントとして、およびＡＩＤＳ関連の異化障害の治療に関しても、研究中である。
【０００３】
しかし、ｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）−ＮＨ２は、酵素分解に対して比較的非耐性である。観察される主要な代謝産物は、トリプシン様酵素によって引き起こされる、Ａｒｇ１１−Ｌｙｓ１２とＬｙｓ１２−Ｖａｌ１３との間の結合開裂を特徴とする［（非特許文献１）］。ｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）−ＮＨ２の類似体のトリプシンによる分解時に、Ｃ末端アミド結合を含むすべての塩基性アミノ酸残基のカルボキシル基部位にてペプチド結合の加水分解が発生し、これに対してＯｒｎ残基がＬｙｓの代わりに存在するという点が異なる類似体の場合は、Ａｒｇ残基に隣接する結合のみが加水分解されることが最近明らかにされた［（非特許文献２）］［（非特許文献３）］。この発見は、位置１２および２１にＯｒｎを含有する類似体の例外的に高いインビボ活性に引き続き一致している［（非特許文献４）］。
【非特許文献１】Ｌ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｔ．Ｒ．Ｄｏｗｎｓ，Ｅ．Ｐ．Ｈｅｉｍｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｉｘ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９，８３，１５３３−１５４０
【非特許文献２】E．Ｗｉｔｋｏｗａｓｋａ，Ａ．Ｏｒｌｏｗｓｋａ，Ｂ．Ｓａｇａｎ，Ｍ．Ｓｍｏｌｕｃｈ，Ｊ．Ｉｚｄｅｂｓｋｉ  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．２０００，６（Ｓｕｐｐｌ．），１８９
【非特許文献３】Ｅ．Ｗｉｔｋｏｗａｓｋａ，Ａ．Ｏｒｌｏｗｓｋａ，Ｂ．Ｓａｇａｎ，Ｍ．Ｓｍｏｌｕｃｈ，Ｊ．Ｉｚｄｅｂｓｋｉ  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．２００１，７，１６６−１７２
【非特許文献４】Ｊ．Ｉｚｄｅｂｓｋｉ，Ｊ．Ｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｅ．Ｈｏｒｗａｔｈ，Ｇ．Ｈａｌｍｏｓ，Ｋ．Ｇｒｏｏｔ，Ａ．Ｖ．Ｓｃｈａｌｌｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，４８７２−４８７６
【０００４】
ｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）−ＮＨ２の不安定性の問題を、特にアミノ酸配列中の位置２９のＡｒｇをＡｇｍ（４−グアニジルブチルアミン）で置換することによって［（非特許文献５）］、または位置１のＴｙｒをＤａｔ（デスアミノチロシン）で、および位置１２のＬｙｓをＤ−Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＯｒｎで置換することによって［（特許文献１）］および［（特許文献２）］克服する試みが行われてきた。
【非特許文献５】Ｂａｊｕｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９８２，Ｂｌａｈａ  ａｎｄ  Ｍｅｌｏｎ，編．；Ｗ．Ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，６４３−６４７頁
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ９４／１１３９６
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ９４／１１３９７
【０００５】
しかしこれらの試みの結果は不満足であり、薬剤の用量減少および／またはより低頻度の投与を可能にする、成長ホルモンを放出するより高い能力と酵素分解に対するより高い耐性を併せ持つ類似体への需要はなお存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明者らにより今や、ヒト成長ホルモン放出ホルモン類似体への選択アミノ酸の導入は、より高い生物活性−より良好な成長ホルモン放出能力の類似体を生じるだけでなく、酵素へのペプチド活性に有益な影響も有することが見出されている。選択アミノ酸は、位置２９のＤ−Ａｒｇ、およびＬｙｓならびにＡｒｇにより天然ペプチド中で占有されている位置の、その側鎖内にグアニジン基を含有するアミノ酸を含む。
【０００７】
本発明による新規ペプチド−成長ホルモン放出ホルモン類似体は、式（Ｉ）：
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｒ２０−Ｒ２１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｒ２９−ＮＨ２
（Ｉ）
（式中：
Ｒ１１は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ１２は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２０は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２１は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２９は、Ｄ−Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐである。）
のアミノ酸配列を持つ。
【０００８】
新規ペプチドは強力かつ選択性の成長ホルモン放出刺激物質であり、それらは酵素作用に対する高い耐性を示す。
【０００９】
新規ペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、そのような患者にまたは医薬製剤の活性成分として投与できる。
【００１０】
それゆえ本発明は、式（Ｉ）：
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｒ２０−Ｒ２１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｒ２９−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中：
Ｒ１１は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ１２は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２０は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２１は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２９は、Ｄ−Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐである。）
のアミノ酸配列を持つ、成長ホルモン放出ホルモン類似体の少なくとも１つの新規ペプチドまたはその薬学的に許容される塩および少なくとも１つの担体および／または賦形剤を含む医薬組成物にも関する。
【００１１】
新規ペプチドは、ｈＧＨ−ＲＨ欠損に関連する障害の予防および治療に有用である。
【００１２】
本発明はさらに、治療が必要な患者に治療有効量のペプチド−式（Ｉ）（式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ２０、Ｒ２１およびＲ２９は、上で定義したとおりである）のｈＧＨ−ＲＨ類似体を投与することを含む、ヒト成長ホルモン欠損関連障害を治療する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
新規ペプチド−成長ホルモン放出ホルモン類似体は、式（Ｉ）：
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｒ１１−Ｒ１２−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｒ２０−Ｒ２１−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｒ２９−ＮＨ２  （Ｉ）
（式中：
Ｒ１１は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ１２は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２０は、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２１は、ｈＡｒｇ、Ｏｒｎ、ＧａｂまたはＧａｐであり；
Ｒ２９は、Ｄ−Ａｒｇ、ｈＡｒｇ、ＧａｂまたはＧａｐである。）
のアミノ酸配列を持つ。
【００１４】
本発明の好ましいペプチドは：
（１）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２；
【００１５】
（２）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｏｒｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−Ｏｒｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２；
【００１６】
（３）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｂ−ＮＨ２；
【００１７】
（４）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｂ−ＮＨ２；
【００１８】
（５）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｂ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２；
【００１９】
（６）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２；
【００２０】
（７）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｐ−ＮＨ２；または
【００２１】
（８）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−Ｇａｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｐ−ＮＨ２；
を含む。
【００２２】
生物活性および消化酵素作用に対する耐性に関して特に好ましいペプチドは：
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２、および
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｏｒｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−Ｏｒｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２
である。
【００２３】
新規ペプチドは、ヒト成長ホルモン放出ホルモンの作用に関連する障害の予防および治療に有用であり、したがってそれらは小児低身長症、高齢関連障害の治療に、除脂肪体重ならびに骨塩含有量の増加に、創傷治癒に、皮膚火傷および骨折の治療に、慢性疾患関連脱力感における非ステロイド性タンパク同化剤として、そして診断にも使用できる。
【００２４】
本発明の方法により、ヒト成長ホルモン放出ホルモンの作用に関連する障害の治療において、式（Ｉ）のアミノ酸配列を持つｈＧＨ−ＲＨのペプチド−類似体の治療有効量が、そのような治療を必要とする患者に投与される。
【００２５】
投薬レベルおよび投与計画は、特定の疾患、患者の年齢、体重および症状によって変わり、ヒト成長ホルモン放出ホルモン欠損の治療のための既知の治療的および予防的方法に基づいて、専門家が決定できる。この種の疾患の治療において、ｈＧＨ−ＲＨ類似体の適切な投薬単位は通例、投薬１回につき体重１キログラムあたり０．０１〜２μｇである。適切な一日用量は、デポー形またはインプラントなどの制御放出形態を除いて、１日につき１または２、３の投与単位で患者に投与できる。制御放出形態は、１５日または３０日おきに１回、あるいは３ヶ月おきに１回投与される。
【００２６】
本発明の新規ペプチドは通常、患者に適切な医薬製剤にて、静脈内、皮下、筋肉内、経口、経鼻または肺吸入などの許容される経路によって投与される。
【００２７】
新規ペプチドは、単独でまたは、場合により、相互の作用が悪い方向に阻害されないという条件で、ヒト成長ホルモン放出ホルモン欠損に関連する障害の治療に使用される他の治療剤と併用して投与することができる。そのような化合物は、同時に単一の製剤または別個の製剤として、または連続的に、専門家が決定した順序および間隔で投与できる。医療専門家には、選択すべき薬剤および組合せがわかるであろう。
【００２８】
本発明の医薬製剤は、式Ｉのアミノ酸配列を持つペプチド−ｈＧＨ−ＲＨ類似体である、少なくとも１つの活性物質またはその薬学的に許容される塩、および少なくとも１つの担体および／または賦形剤を含む。
【００２９】
本発明の医薬製剤は、たとえば［（非特許文献６）］からなどの、当業者に周知の各種の医薬形態で調製できる。
【非特許文献６】Ｒｅｍｍｉｎｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０
【００３０】
注射および輸液に適切な医薬製剤は、滅菌水性、水性−有機および非水性の溶液、懸濁液、溶液調製用の乾燥物質および錠剤、およびインプラントを含む。担体は、液相中での活性成分を均等に分布させるために懸濁液の調製に使用され、それらはポリソルベート、レシチン、ＰＥＧ−ポリプロピレングリコールコポリマー、ホスホラン、ポリホスホランおよびカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゴムまたはゼラチンなどの水溶性ポリマーのクエン酸塩などの、ペプチド化剤を含む。注射用製剤は、ｐＨ調節剤、緩衝液、トニックおよび保存料などの、薬学的に許容される担体または賦形剤を含有してもよい。乾燥物質は、適切な溶媒を用いた希釈による、溶液または即席懸濁液の製剤に使用される。
【００３１】
患者の便宜上、および物質放出の適切な特性を達成するために、ペプチド誘導体は、活性物質を含む、結晶性ポリマーマイクロカプセルなどの、制御放出長期活性注射用製剤として好都合に投与される。時間放出製剤の別の例は、液体組成物を形成するための、水混和性溶媒への生分解性ポリマーおよび本発明のペプチドの溶解により、調合されたポリマーベースのインプラントである。注射するときに、ポリマーはデポーを形成し、それから活性物質がゆっくりと放出される。
【００３２】
経口経路による投与に適した医薬製剤は、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、水和ケイ酸マグネシウム、ステアリル酸、ステアリル酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはゴムなどの薬学的に許容される固体担体を含有する、錠剤、丸薬、粉末、顆粒、ペレットまたはカプセルを含む。錠剤または顆粒は、好ましい時間放出を行う投薬単位を実現するために、コーティングまたは別の処理をしてもよい。そのような保護層またはコーティングの形成のために、ポリマー酸およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールまたは酢酸セルロースなどの他の物質との混合物を含む、多数の各種物質が使用できる。
【００３３】
ペプチドを活性成分として含む医薬製剤は、吸入用のエアゾールまたは粉末としての投与に適した形でも存在する。通例のエアゾール製剤は、活性成分の水溶液に加えて、緩衝液、等張性物質、保存料、および場合により、投与用噴霧器または滴下器を利用して活性成分の投与を可能にする他の賦形剤を含有することができる。
【００３４】
本発明の新規ペプチドは、古典的な溶液合成または固相合成などの、既知の化学合成方法の１つによって製造できる。
【００３５】
溶液合成方法において、保護された側鎖（反応性側鎖が存在する場合）またはペプチド断片を備えたアミノ酸の適切に保護される末端Nα−アミノ誘導体は、アミノ酸またはペプチド断片の適切に保護されたカルボキシル誘導体によって縮合される。α−アミノ官能基は一般に、酸不安定性ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ、ＣＢｚ）または置換類似体などのウレタン形で、または塩基性条件下で安定である、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基の形で保護される。カルボキシル官能基はたとえば、求核塩基の存在下で不安定であるメチルエステル、酸性条件下で不安定であるｔｅｒｔ−ブチルエステルまたは水素分解条件下で不安定であるベンジルエステルとして保護することができる。保護構造におけるカルボキシル基は、アジド法、混合無水物法、活性化エステル法、ホスホニウムまたはウロニウム塩法によって、またはカルボジイミド法によって、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールまたは３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジンなどの、ラセミ化を引き起こさずに反応を触媒する化合物を用いて、活性化される。縮合の方法、およびペプチド化学作用で一般に使用される保護基は、［（非特許文献７）］および［（非特許文献８）］で概説されている。
【非特許文献７】Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）
【非特許文献８】Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）
【００３６】
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ［（非特許文献９）］固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法において、第一のアミノ酸が結合する官能基を含有する、反応溶媒ポリマー支持体中の不溶物が使用される。ポリマーマトリクスは、恒久性のＣ末端保護基として作用する。合成は、第一のＮα−保護アミノ酸のリンカー官能基への結合で開始する。アミノ官能基の脱保護の後、別の活性化保護アミノ酸が付加される。鎖伸長は、連続脱保護およびカップリングステップによって実施される。最後にＮ末端遊離ペプチドは、付随する側鎖官能基の脱保護とともに、樹脂から分離する。不溶性支持体はペプチド溶液から容易に濾過される。支持体相として適したポリマーは、たとえばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメタクリレート、クロロメチル化ジビニルベンゼン−ポリスチレンコポリマー、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）、ベンズヒドリルアミン樹脂（ＢＨＡ）などである。ポリマー支持体上でのペプチドの合成は、使用されるアミノ酸誘導体を溶解し、反応条件下で中性である溶媒中で実施される。好ましいのは、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、およびその混合物などの、さらに良好な膨潤特性を持つ溶媒である。アミノ酸がポリマー支持体から分離した後、たとえば高性能液体クロマトグラフィーを用いて精製される。
【非特許文献９】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１９６３），２１４９）
【００３７】
アミノ酸側鎖中にグアニジン基を含む、本発明の新規ペプチド−ＧＨ−ＲＨ類似体は好ましくは、リジン、２，４−ジアミノ酪酸または２，３−ジアミノプロピオン酸の適切な誘導体をポリマー支持体に結合したペプチド鎖中の適切な位置に導入し、側鎖アミノ基を脱保護し、そして遊離アミノ基をグアジニン化剤と反応させ、残りすべてのｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を除去し、支持体から合成ペプチドを分離させ、次いで精製し、場合により薬学的に許容される塩に該ペプチドを変換することによって、固相合成法を用いて製造される。
【００３８】
グアニジン化反応は、４−（ジメチルアミノ）ピリジンなどの反応プロモータの存在下で、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素などの過剰量のグアジニル化剤を使用して実施される。
【００３９】
合成ペプチドは、医薬用途に適した高度の純度を達成するために、好ましくは高性能液体クロマトグラフィー法によって精製される。
【００４０】
新規ペプチドは、各種の無機および有機酸および塩基の薬学的に許容される塩の形で、反応混合物から分離される。新規ペプチドは、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸とともに、または酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、マロン酸、スクシン酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、シュウ酸、桂皮酸、マンデル酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、および他の酸などの有機酸とともに、薬学的に許容される塩を形成する。
【００４１】
塩は、ペプチドのカルボキシルグルーピングを、トリメチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、コリンなどの有機塩基と同様に、アルカリ金属、アルカリ金属の水酸化物およびアルカノアートと反応させることによっても製造できる。
【００４２】
塩は、塩が不溶である溶媒中または媒体中で、遊離塩基または酸の形の物質を１当量以上の適切な塩基または酸それぞれに反応させることにより、既知の方法によって製造できる。
【００４３】
ｈＧＨ−ＲＨの新規ペプチド−類似体の酢酸塩は、本発明の好ましい実施形態である。
【００４４】
生物活性の決定
本発明の新規ペプチドの生物活性を試験するために、ラットにおける成長ホルモンおよび他の下垂体ホルモンの血漿レベルに対するそれらの影響を調査し、対照物質としてのｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）ＮＨ２の影響と比較した。
【００４５】
調査した物質は：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．より購入したｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）ＮＨ２および本発明のプロセスにより合成したｈＧＨ−ＲＨのペプチド−類似体であった。
【００４６】
オスのウィスターラット（２４０〜２６０ｇ）を明期１４時間、暗期１０時間の制御光スケジュールで収容し、ラットペレットおよび水を無制限に与えた。動物を無作為に実験グループに割り当て、生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ；０．３ｍｌ）、体重１ｋｇあたり５０または１５０μｇの用量のｈＧＨ−ＲＨ（１−２９）ＮＨ２、および体重１ｋｇあたり１または３μｇの用量の本発明のペプチドを与えた。ラットには、生理的食塩水０．３ｍｌに溶解させた対照ペプチドまたは試験を行った各新規類似体の皮下（ｓｃ．）注射を１回行った。
【００４７】
実験日にラットは、ケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔をかけ、血液採取のために頸静脈に慢性的にカニューレ挿入した。３０分後、試験物質をｓｃ．注射した。ラットの対照グループには、生理的食塩水のみを注射した。血液（約０．６ｍｌ）を頸静脈から、試験物質のｓｃ．投与の１分（サンプル「０」）前、１５および３０分後に採取した。各サンプル除去時に、同量のヘパリン処理生理的食塩水（１０ＵＩ／ｍｌ）で置換した。実験の終了時に、ケタミンの麻酔過剰量によって動物を殺処分した。血液サンプルを遠心分離にかけ、血漿サンプル（約０．３ｍｌ）を分離し、ＲＩＡ法によってアッセイするまで−２０℃にて保管した。
【００４８】
成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、および甲状腺刺激ホルモン（ＧＨ、ＰＲＬ、ＬＨ、ＦＳＨおよびＴＳＨ）の血漿濃度は、Ｂｉｏｔｒａｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、英国）を用いて、血漿サンプルの０．０５ｍｌ分割量で決定した。ラットＧＨ、ＰＲＬ、ＬＨ、ＦＳＨおよびＴＳＨの感度はそれぞれ０．１６、０．０８、０．０８、０．０９および０．０５ｎｇ／管であった。
【００４９】
結果の統計分析は、Ｓｔａｔｓｏｆｔ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ  ＰＬ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓを用いて実施した。最初にデータの全グループを、コルモゴロフ−スミルノフ検定およびシャピロ−ウィルク検定により、正規性について試験した。グループ間の統計差は、一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した。ダンカンの多重範囲検定を用いて、事後比較を行った。しかし分散が著しく不均一であることが見出された場合、グループ間の比較は、順位変動のノンパラメトリック性クラスカル−ワリス解析によって実施した。
【００５０】
ホルモンレベルにおける個体差は、ホルモンレベルの補正によって除去し、各ラットについてホルモンの純濃度を計算した。各ホルモンのこの純濃度は、化合物注射１５分後の濃度と化合物注射前のホルモンの濃度差（Δ１５−０）、および化合物注射後１５分ならびに３０分のホルモンの濃度差（Δ１５−３０）として計算した。
【００５１】
ＧＨ放出に対する化合物の影響は、体重１ｋｇあたり５０．０μｇおよび１５０．０μｇのｈＧＨ−ＲＨ−（１−２９）ＮＨ２の、類似体については体重１ｋｇあたり１．０μｇおよび３．０μｇの注射後に、ＧＨの平均純濃度（Δ１５−０）の比較によって決定した。選択化合物（１）の結果を表１および２に示す。処置グループ間の有意差は、クラスカル−ワリス検定のＬｉｌｌｉｅｔｏｒの修正によって決定した。
【００５２】
【表１】
2005517633.tif 000002
【００５３】
結果は、平均±標準誤差として表す
＊ｐ＜０．０１対生理的食塩水対照
＊＊ｐ＜０．００１対生理的食塩水対照
【００５４】
【表２】
2005517633.tif 000003
【００５５】
結果は、平均ＤＧＨ［ｎｇ／ｍｌ］として表す。
血漿ＧＨの変化（ΔＧＨ）は、ＧＨ純濃度として表し、各ラットについて計算した。
＃Δ（１５−０）は、試験化合物の投与１５分後のＧＨ濃度と、化合物注射前（「０分」）のＧＨ濃度との差として計算した。Δ（１５−３０）は、試験化合物の投与後１５分のＧＨ濃度と化合物注射３０分後のＧＨ濃度との差として計算した。
＊＊ｐ＜０．００１対生理的食塩水対照
【００５６】
得られた結果は、試験ｈＧＨ−ＲＨ類似体が生理的食塩水対照と比較して、ラットにおけるＧＨ放出に刺激効果を見せることを示している。最強の刺激効果は、（１）と呼ばれる化合物によって示された。最大刺激効果は、その投与の瞬間から１５分後に見られた。この効果は投与後３０分間も見られた。ＧＨ純濃度に対する化合物１の影響は、５０倍の用量のｈＧＨ−ＲＨ−（１−２９）ＮＨ２の注射１５分後におけるこのホルモンの純濃度に匹敵した。化合物１の相対有効性は、１．０ならびに３．０μｇの用量、および体重１キログラム当たりｈＧＨ−ＲＨ−（１−２９）ＮＨ２の５０μｇならびに１５０μｇの用量に基づいていた。この新規類似体の相対有効性は、注射１５分後のｈＧＨ−ＲＨ−（１−２９）ＮＨ２と比較して、それぞれ７０および３８倍高かった。
【００５７】
本研究の間に、本発明の新規化合物が選択的に作用し、それらがラットの末梢血中で他の下垂体ホルモン−黄体刺激ホルモン、ルトロピン、フォリトロピンおよび甲状腺刺激ホルモンの血中濃度レベルに影響を及ぼさないことも判断された。
【００５８】
調製した化合物も、トリプシン消化試験において酵素耐性について試験した。
【００５９】
ペプチドサンプル（１．２ｍｇ）をｐＨ８．５の緩衝液（２．９ｍｌ；０．０５Ｍ酢酸アンモニウム溶液）中に溶解させ、３７℃で２０分間インキュベートした。次にトリプシン溶液を添加した（１００μｌ；０．０２ｍｇ／ｍｌ；Ｓｅｒｖａ，３６Ｕ／ｍｇ）。生じた溶液を３７℃にて６０分間インキュベートした。分割量（５００μｌ）を取出し、０．５Ｍ酢酸（１ｍｌ）で希釈し、次に凍結乾燥させた。Ｅｕｒｏｓｐｈｅｒ  １００  Ｃ１８（４．６×２５０ｍｍ、５ミクロン）を用いて、得られた物質をＨＰＬＣによって分析した。以下の溶媒系を使用した。Ａ，０．１％ＴＦＡ水溶液；Ｂ，アセトニトリルのＡによる８０％溶液；２５〜７５％Ｂの線形勾配による；流量１ｍｌ／分；検出は２２０ナノメートルで実施した。ペプチド消化の結果を表３にまとめる。
【００６０】
【表３】
2005517633.tif 000004
【００６１】
＊  Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ２（ｈＧＨ−ＲＨ−（１−２９）ＮＨ２）
【００６２】
表３に示す結果は、試験したｈＧＨ−ＲＨの新規類似体すべてが、対照標準、ｈＧＨ−ＲＨ−（１−２９）ＮＨ２よりもトリプシン消化に対してはるかに高い耐性を持つことを示している。それゆえ３０分後、対照ペプチドの完全な消化を引き起こす条件下で、他のペプチドは不変のままであるか［ペプチド（１）、（２）および（８）］、あるいは限定された加水分解のみを受ける。
【００６３】
本発明の新規ペプチドは、高い成長ホルモン放出活性を特徴とし、それらは選択的に作用して、他の下垂体ホルモン−黄体刺激ホルモン、ルトロピン、フォリトロピンおよび甲状腺刺激ホルモンのレベルに影響を及ぼさない。特に好ましいペプチドは、アミノ酸配列Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ−ＮＨ２を持ち、成長ホルモン放出に対して対照ペプチドｈＧＨ−ＲＨ−（１−２９）ＮＨ２よりも何倍もの強い効果を示し、それゆえ１５分後に最大刺激効果を可能にする。同時に、本発明の新規化合物は、消化酵素作用に対してｈＧＨ−ＲＨの既知の合成類似体よりもはるかに高い耐性を示し、そのことは新規化合物を、成長ホルモン不全関連障害の治療および予防に使用される薬学的薬剤の調製における利用で特に有用にする。
【００６４】
定義および表記
以下の定義および表記は、明細書および請求項の両方を含め本文書を通じて使用される用語のためのものである。
【００６５】
定義
アミノ酸の命名法および省略形は、一般に受入れられているＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ規則、たとえば［（非特許文献１０）］および［（非特許文献１１）］にしたがう。本明細書で使用される３文字の省略形は、以下の意味を持つ：
Ａｌａ＝アラニン
Ａｒｇ＝アルギニン
ｈＡｒｇ＝ホモアルギニン（６−グアニジン−２−カプロン酸）
Ａｓｎ＝アスパラギン
Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｄａｔ＝デスアミノチロシン、３−（４’−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸
Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｇａｂ＝４−グアニジン−２−アミノ酪酸
Ｇａｐ＝３−グアニジン−２−アミノプロピオン酸
Ｉｌｅ＝イソロイシン
Ｌｅｕ＝ロイシン
Ｌｙｓ＝リジン
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｐｈｅ＝フェニルアラニン
Ｓｅｒ＝セリン
Ｔｈｒ＝トレオニン
Ｔｙｒ＝チロシン
Ｖａｌ＝バリン
【００６６】
上の説明で引用したすべてのペプチド配列は、実施例および添付請求項において、Ｎ末端アミノ基が開始し、Ｃ末端アミノ基が終了する標準表記で記載されている。アミノ酸は別途明示しない限り、Ｌ型配置である。
【非特許文献１０】Ｒ．Ｍ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｍ．Ｎ．Ｌｉｅｂｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，ｉｎ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔ．Ｍ．Ｄｅｖｌｉｎ，Ｅｄ．；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２
【非特許文献１１】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８（１９８４），９−３７
【００６７】
ここで本発明を、以下の詳細な、制限しない実施例を参照して説明する。
実施例
【００６８】
ペプチド合成の一般的方法
Ａ．ペプチド鎖形成
α−アミノ官能基を保護するために、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基を使用した；側鎖は以下の基によって保護された：Ａｓｐ−シクロヘキシルにより；Ｏｒｎ−ベンジルオキシカルボニル；ＳｅｒおよびＴｈｒ−ベンジル；Ｔｙｒ−２−ブロモベンジルオキシカルボニル基。
【００６９】
ｈＡｒｇ残基を含有する類似体を調製するために、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）誘導体の形のリジン残基をペプチド鎖の適切な位置に導入した。
Ｇａｂおよび／またはＧａｐ残基を含有する類似体を調製するために、それぞれＢｏｃ−Ｄａｂ（Ｆｍｏｃ）およびＢｏｃ−Ｄａｐ（Ｆｍｏｃ）誘導体の形の、２，４−ジアミノ酪酸残基および２，３−ジアミノプロピオン酸残基を適切な位置に挿入した。
【００７０】
Ｏｒｎ残基を含有する類似体を調製するために、Ｂｏｃ−Ｏｒｎ（Ｚ）誘導体を合成中にペプチド鎖の適切な位置に導入した。
【００７１】
ＭＢＨＡ樹脂（４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、Ｂａｃｈｅｍ  ＣａｌｉｆｏｒｎｉａまたはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、約０．５ｍｅｑ．／ｇ）を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で３０分間膨潤させた後、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の５％ＤＣＭ溶液で処理し（１×１分、１×２０分）、ＤＣＭで洗浄した（６×１分）。
【００７２】
保護ペプチド樹脂は、以下のプロトコルにしたがって、各合成ステップの標準手順を用いて合成した：
（ａ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の５５％ＤＣＭ溶液による、Ｂｏｃ基の除去（１×１分、１×２０分）；
（ｂ）ＤＣＭ洗浄（３×１分）；
（ｃ）３０％１，４−ジオキサン／ＤＣＭ溶液による洗浄（２×１分）；
（ｄ）ＤＣＭ洗浄（３×１分）；
（ｅ）５％ＤＩＥＡ／ＤＣＭによる中和（１×１分、１×５分）；
（ｆ）ＤＣＭ洗浄（６×１分）；
（ｇ）ＤＣＭ中１．２モルのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、保持時間：２時間を用いた、カルボジイミド法によるＢｏｃ−アミノ酸（１．２モル）のカップリング。Ｂｏｃ−ＧｌｎおよびＢｏｃ−Ａｓｎの場合、１．２モルのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を反応混合物に添加した；
（ｈ）ＤＣＭ洗浄（６×１分）。
【００７３】
Ｂ．グアニジン基の導入
Ｌｙｓ残基からＦｍｏｃ基を除去するために、保護ぺプチジル樹脂を５０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液に暴露し（１×１０分、１×２時間）、次に樹脂をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３×１分）、５０％ＤＭＦ／ＤＣＭ溶液（３×２分）、５０％メタノール／ＤＣＭ溶液、およびＤＣＭ（３×２分）で洗浄した。次にペプチジル樹脂をＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素（５倍モル過剰）と、ＤＭＦ中の４−（ジメチルアミノ）ピリジン（７０ｍｇ）の存在下で４時間反応させた。得られたペプチジル樹脂をＤＭＦ（３×１分）、およびＤＣＭ（３×１分）で洗浄し、Ｂｏｃ基を５５％ＴＦＡ／ＤＣＭ溶液（１×１分、１×２０分、１×４０分）によって除去し、ＤＭＣ洗浄（３×１分）、５０％ＤＭＦ／ＤＣＭ洗浄（２×１分）およびＤＣＭ洗浄（２×１分）を続けた。
【００７４】
Ｃ．樹脂からのペプチドの分離
ペプチジル樹脂をアニソールの存在下で、液体フッ化水素（ＨＦ）に暴露した。反応は０℃にて１時間実施した。その後、ＨＦを減圧下で除去し、残留物を冷ジエチルエーテルで洗浄し、５０％酢酸溶液で抽出して、その後、凍結乾燥させた。
【００７５】
ペプチドの精製
粗ペプチドは、Ｖｅｒｔｅｘカラム、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ−３００  Ｃ１８（８×２００ｍｍ、５ミクロン）を備えたＫｎａｕｅｒシステムを使用して、高性能液体クロマトグラフィー法によって精製した。以下の溶媒系を使用した：Ａ，ＴＦＡ０．１％水溶液；Ｂ，ＭｅＣＮのＡによる８０％溶液。溶出は勾配モード２０〜５５％で３０分間、次に定組成５５％Ｂで３０分間、流速２ｍｌ／分で実施した。画分はＶｅｒｔｅｘカラム、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００  Ｃ１８（４×２５０ｍｍ、５ミクロン）、勾配モード２５〜７０％で３０分間；流速：１ｍｌ／分での溶出を用いて分析した。検出は２２０ｎｍで実施した。均質画分（クロマトグラムで単一ピーク）をプールし、水で希釈して、凍結乾燥させ、クロマトグラフィー的に均質な生成物を得た。ペプチドの構造を決定した。ペプチドの構造は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ９５Ｓ（ブレーメン、ドイツ）分光計でのＥＳＩ−ＭＳマススペクトル測定によって決定した。
【実施例１】
【００７６】
Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ−ＮＨ２［化合物（１）］の製造
【００７７】
ＭＢＨＡ樹脂（４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．４９ｍｅｇ．／ｇ）３．１ｇは、ペプチド合成の上述の一般的方法（Ａ節）による適切な保護アミノ酸誘導体の結合の後、十分に保護されたペプチジル樹脂を与えた：  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）−Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−樹脂。
【００７８】
ペプチド合成の上述の一般的方法（Ｂ節）による続いての手順は、すべての保護基の除去および完全なグアニジン化の後、すべてのＢｏｃ基の脱保護が続き、ペプチジル樹脂Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ−ＮＨ２−樹脂９．５３ｇを与えた。
【００７９】
ペプチド合成の上述の一般的方法（Ｃ節）にしたがって、本樹脂をアニソール（１５ｍｌ）の存在下で液体フッ化水素（２００ｍｌ  ＨＦ）の作用に暴露させ、これによりＨＰＬＣ決定に基づき、純度５０％の粗ペプチド４．５が与えられた。
ペプチド合成の上述の一般的方法（上のＤ節）にしたがって、粗ペプチド（２０ｍｇサンプル）を高性能液体クロマトグラフィー法によって精製した。これは純度９２．３％（ＨＰＬＣに基づく）の表題ペプチド４．３ｍｇを与えた；マススペクトル：Ｃ１５７Ｈ２５８Ｎ４７Ｏ４３の場合、Ｍ＝３４９２．０；
登録されたｍ／ｚ：
［Ｍ＋２Ｈ］２＋：理論値  １７４７．０、測定値  １７４７．６；
［Ｍ＋３Ｈ］３＋：理論値  １１６５．０、測定値  １１６５．４；
［Ｍ＋４Ｈ］４＋：理論値  ８７４．０、測定値  ８７４．０；
［Ｍ＋５Ｈ］５＋：理論値  ６９９．４、測定値  ６９９．４。
【実施例２】
【００８０】
化合物（２）−（８）の製造
上述の詳細な説明に十分に類似した手順において適切に保護されたアミノ酸を用いて、以下のペプチドを合成した：
【００８１】
（２）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｏｒｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ２０−Ｏｒｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−ｈＡｒｇ２９−ＮＨ２；ＭＳ：Ｃ１５３Ｈ２５１Ｎ４３Ｏ４３の場合、Ｍ＝３３８０．９；登録されたｍ／ｚ：
［Ｍ＋３Ｈ］３＋：理論値  １１２８．０、測定値  １１２７．９；
［Ｍ＋４Ｈ］４＋：理論値  ８４６．２、測定値  ８４６．２；
［Ｍ＋５Ｈ］５＋：理論値  ６７７．２、測定値  ６７６．９。
【００８２】
（３）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｂ−ＮＨ２；ＭＳ：Ｃ１４７Ｈ２３８Ｎ４７Ｏ４３の場合、Ｍ＝３３５１．８；登録されたｍ／ｚ：
［Ｍ＋３Ｈ］３＋：理論値  １１１８．３、測定値  １１１８．６；
［Ｍ＋４Ｈ］４＋：理論値  ８３９．０、測定値  ８３９．２；
［Ｍ＋５Ｈ］５＋：理論値  ６７１．４、測定値  ６７１．６。
【００８３】
（４）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｂ−Ｇａｂ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｂ−ＮＨ２；ＭＳ：Ｃ１４９Ｈ２４２Ｎ４７Ｏ４３の場合、Ｍ＝３３７９．８；登録されたｍ／ｚ：
［Ｍ＋４Ｈ］４＋：理論値  ８４６．０、測定値  ８４６．３；
［Ｍ＋５Ｈ］５＋：理論値  ６７７．０、測定値  ６７７．２。
【００８４】
（５）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｂ−ｈＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２；ＭＳ：Ｃ１５４Ｈ２５３Ｎ４７Ｏ４３の場合、Ｍ＝３４５１．０；登録されたｍ／ｚ：
［Ｍ＋３Ｈ］３＋：理論値  １１５１．３、測定値  １１５２．０；
［Ｍ＋４Ｈ］４＋：理論値  ８６３．８、測定値  ８６３．８；
［Ｍ＋５Ｈ］５＋：理論値  ６９１．２、測定値  ６９１．６。
【００８５】
（６）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−ｈＡｒｇ−Ｇａｂ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−ｈＡｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｄ−Ａｒｇ−ＮＨ２；ＭＳ：Ｃ１５４Ｈ２５３Ｎ４７Ｏ４３の場合、Ｍ＝３４５１．０；登録されたｍ／ｚ：
［Ｍ＋３Ｈ］３＋：理論値  １１５１．３、測定値  １１５１．４；
［Ｍ＋４Ｈ］４＋：理論値  ８６３．８、測定値  ８６３．６；
［Ｍ＋５Ｈ］５＋：理論値  ６９１．２、測定値  ６９１．３。
【００８６】
（７）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｐ−ＮＨ２；ＭＳ：Ｃ１４２Ｈ２２９Ｎ４７Ｏ４３の場合、Ｍ＝３２８２．７；登録されたｍ／ｚ：
［Ｍ＋３Ｈ］３＋：理論値  １０９５．２、測定値  １０９５．３；
［Ｍ＋４Ｈ］４＋：理論値  ８２１．７、測定値  ８２１．７；
［Ｍ＋５Ｈ］５＋：理論値  ６５７．５、測定値  ６５７．８。
【００８７】
（８）  Ｄａｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ１０−Ｇａｐ−Ｇａｐ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ｈＡｒｇ−Ｇａｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｎｌｅ−Ａｓｐ−Ｇａｐ−ＮＨ２；ＭＳ：Ｃ１４５Ｈ２３５Ｎ４７Ｏ４３の場合、Ｍ＝３３２４．８；登録されたｍ／ｚ：
［Ｍ＋３Ｈ］３＋：理論値  １１０９．３、測定値  １１０９．６；
［Ｍ＋４Ｈ］４＋：理論値  ８３２．２、測定値  ８３２．２；
［Ｍ＋５Ｈ］５＋：理論値  ６６６．０、測定値  ６６６．０。
【国際調査報告】
2005517633.tif 000005
2005517633.tif 000006
2005517633.tif 000007