(57)【要約】  本発明は、誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と少なくとも６５％一致する、少なくとも８個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含有するペプチドであって、ペプチドのアミノ酸配列が構成的Ｈｓｃ７０アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と少なくとも１つのアミノ酸で異なり、誘導性Ｈｓｐ７０を自然に産生する細胞を特異的に認識でき、Ｈｓｃ７０エピトープではなく変異型及び非変異型Ｈｓｐ７０エピトープの両方を認識できる細胞障害性Ｔリンパ球をインビトロまたはインビボで誘導できることを特徴とする、ペプチドに関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と少なくとも６５％一致する、少なくとも８個の連続したアミノ酸のアミノ酸配列を含有するペプチドであって、ペプチドのアミノ酸配列が、構成的Ｈｓｃ７０アミノ酸配列と同じ長さのアミノ酸配列と、少なくとも１つのアミノ酸で異なっており、誘導性Ｈｓｐ７０を自然に産生する細胞を特異的に認識でき、Ｈｓｃ７０エピトープではなく変異型および非変異型Ｈｓｐ７０エピトープの両方を認識できる細胞傷害性Ｔリンパ球をインビトロまたはインビボで誘導できることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列が、誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と少なくとも７５％一致する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列が、誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列内の同じ長さの部分に一致する、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列が、構成的Ｈｓｃ７０アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの３番目から最後のＣ末端アミノ酸までに配置されるアミノ酸の少なくとも１個で異なることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列が、構成的Ｈｓｃ７０アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの４番目から最後のＣ末端アミノ酸までに配置されるアミノ酸の少なくとも１個で異なることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列が、９個のアミノ酸を含有し、構成的Ｈｓｃ７０アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの４番目から９番目のアミノ酸までに配置されるアミノ酸の少なくとも１個で異なることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列が、１０個のアミノ酸を有し、構成的Ｈｓｃ７０アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの４番目から１０番目のアミノ酸までに配置されるアミノ酸の少なくとも１個で異なることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列が、誘導性Ｈｓｐ７０アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、ペプチドの１番目、２番目または最後のＣ末端アミノ酸に配置されるアミノ酸の少なくとも１個で異なることを特徴とする、請求項１、２または請求項４〜７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】
３番目のアミノ酸から最後のＣ末端アミノ酸の１つ前までのアミノ酸配列が、誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と一致することを特徴とする、請求項１、２または請求項４〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列が、誘導性Ｈｓｐ７０アミノ酸配列の同じ長さのアミノ酸配列と、少なくとも１個のアミノ酸で異なることを特徴とする、請求項１、２または請求項４〜９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１１】
【表１】
2005512517.tif 000019
からなるアミノ酸配列群のいずれかのメンバーと、少なくとも６５％の相同性を有するかもしくは同一であるアミノ酸配列を含有するかまたはこのアミノ酸配列からなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１２】
【表２】
2005512517.tif 000020
からなるアミノ酸配列群のいずれかのメンバーと、少なくとも６５％の相同性を有するかもしくは同一であるアミノ酸配列を含有するかまたはこのアミノ酸配列からなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１３】
【表３】
2005512517.tif 000021
からなるアミノ酸配列群のいずれかのメンバーと、少なくとも６５％の相同性を有するかまたは同一であるアミノ酸配列を有するか、またはこのアミノ酸からなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１４】
【表４】
2005512517.tif 000022
からなるアミノ酸配列群のいずれかのメンバーと少なくとも６５％の相同性を有するかまたは同一であるアミノ酸配列を含有するか、またはこのアミノ酸配列からなる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の第１のアミノ酸配列と、
該第一のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載され、該第１のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアミノ酸配列とは異なるエピトープアミノ酸配列
からなる群から選択した少なくとも１つの第２のアミノ酸配列とを含有するポリエピトープ。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＬＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬを含有するか、またはこのアミノ酸配列からなる、請求項１５に記載のポリエピトープ。
【請求項１７】
生物分解性微粒子である担体に連結していることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１５または１６に記載のポリエピトープ。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１５または１６に記載のポリエピトープをコードする核酸配列。
【請求項１９】
ベクターに連結していることを特徴とする、請求項１８に記載の核酸配列。
【請求項２０】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１５もしくは１６に記載のポリエピトープ、または請求項１７に記載のペプチドもしくはポリエピトープ、または請求項１８もしくは１９に記載の核酸を用いることにより、誘導性Ｈｓｐ７０を自然に発現する細胞を特異的に標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球反応をインビトロで誘導するための方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法によって取得し得る、細胞傷害性Ｔリンパ球。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、少なくとも１個のペプチドを表面上に提示する、抗原提示細胞。
【請求項２３】
製剤上許容可能な賦形剤と一緒に、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチド、請求項１５もしくは１６に記載のポリエピトープ、請求項１７に記載のペプチドもしくはポリエピトープ、請求項１８もしくは１９に記載の核酸、請求項２１に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球、または請求項２２に記載の抗原提示細胞を少なくとも含有する医薬組成物またはワクチン。
【請求項２４】
製剤上許容可能な賦形剤と一緒に、ＳＬＦＥＧＩＤＦＹ、ＳＬＦＥＧＩＤＦＹＴおよびＬＭＧＤＫＳＥＮＶからなる群から選択したアミノ酸配列を含有するかまたはこのアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも含有する、医薬組成物またはワクチン。
【請求項２５】
製剤上許容可能な賦形剤と一緒に、次の配列ＬＭＧＤＫＳＥＮＶと少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含有するか、またはこのアミノ酸配列からなるペプチドを少なくとも含有する、医薬組成物またはワクチン。
【請求項２６】
ガンもしくはウイルス性疾患の治療に有用な薬剤の調製のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のペプチド、請求項１５もしくは１６に記載のポリエピトープ、請求項１７に記載のペプチドもしくはポリエピトープ、請求項１８もしくは１９に記載の核酸、請求項２１に記載の細胞傷害性Ｔリンパ球、または請求項２２に記載の抗原提示細胞の使用。
【請求項２７】
ガンの治療に有用な薬剤の調製のための、ＳＬＦＥＧＩＤＦＹ、ＳＬＦＥＧＩＤＦＹＴ、ＬＭＧＤＫＳＥＮＶからなる群から選択したアミノ酸配列を含有するかまたはこのアミノ酸配列からなるペプチドの使用。
【請求項２８】
ガンまたはウイルス性疾患の治療に有用な薬剤の調製のための、ＬＭＧＤＫＳＥＮＶのアミノ酸配列を含有するかまたはこのアミノ酸配列からなるペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導性Ｈｓｐ７０由来のポリペプチドとこのポリペプチドを含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
ガンの免疫治療は、ガン患者にとって効果があることがすでに実証されている方法である（１−４）。したがって、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される、複数の腫瘍抗原とその対応するエピトープとが最近同定され、それらの一部がガンの臨床試験において試験されている。しかし、既知の標的抗原候補の大部分は非常に制限された発現であり、多くの場合黒色腫に限定されている。今日まで、多様なパネルの腫瘍において発現する腫瘍抗原はほとんど発見されていない。
【０００３】
主要なストレス−誘導性熱ショックタンパクであるＨｓｐ７０は、抗原ペプチドの特異的担体としてよく知られるシャペロンタンパクである（５、６）。事実、数多くの研究で、抗原ペプチド／Ｈｓｐ複合体がペプチドに特異的なＣＤ８＋反応を誘導することが実証されている（７）。これらの研究の結果は、Ｈｓｐ７０そのものが、この系において抗原として作用するのではなく、抗原ペプチドのためのビヒクルとして作用することを示している。しかし、誘導性Ｈｓｐ７０が、肺、乳房、腎臓、卵巣の悪性腫瘍、骨肉腫および結腸直腸ガン内の、ヒトの腫瘍において豊富にしかも優先的に発現するということは興味に値する（８−１６）。低酸素症の結果として、Ｈｓｐ７０が腫瘍に過剰に発現することもある（２４）。Ｈｓｐ７０は、広範囲にわたるアポトーシス、ネクローシスおよび低酸素などの刺激から細胞を保護することができるので、Ｈｓｐ７０は、腫瘍細胞に延命効果を与えると考えられている（１７）。事実、最近のデータは、Ｈｓｐ７０の過剰発現が、大部分の腫瘍細胞が生存するための一般的でしかも必要な事象であることを示唆している（１８、１９）。様々な化学療法処置下で、Ｈｓｐ７０を多量発現した、腫瘍の特権的発症が報告されている（２２、２３）。このような耐性メカニズムを克服することに対し、かなり大きな関心が寄せられている。
【０００４】
最近、Ｔｒｉｅｂらは、Ｈｓｐ７０タンパクに反応して増殖した腫瘍浸潤リンパ球系を、骨肉腫患者から単離した（２０）。さらに、Ｇａｕｄｉｎらは、Ｈｓｐ７０の変異配列由来のエピトープに特異的なＣＴＬクローンを単離し、開示している（２１）。ただし、このクローンは、腫瘍細胞中の内因性非変異同系エピトープを認識しなかった。
【０００５】
本発明は、Ｈｓｐ７０を自然に産生する細胞、それも特に腫瘍細胞を特異的に認識する細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導できるペプチドを提供する。本発明に定義のペプチドは、多種多様なガンに効果がある。ウイルス感染した細胞の場合にも、Ｈｓｐ７０の発現が増加する。
【０００６】
本発明は、誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と少なくとも６５％同一である、少なくとも８個の連続したアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むペプチドであって、構成的Ｈｓｃ７０アミノ酸配列と同じ長さのアミノ酸配列と少なくとも１個のアミノ酸で異なっており、誘導性Ｈｓｐ７０を自然に産生する細胞を特異的に認識でき、Ｈｓｃ７０エピトープではなく、変異型Ｈｓｐ７０エピトープおよび非変異型Ｈｓｐ７０エピトープの両方を認識できる、細胞傷害性Ｔリンパ球をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で誘導できるペプチドに関する。
【０００７】
特定の実施態様では、本発明に定義のペプチドは、誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
逆免疫的（Reverse immunology）研究方法によって、必ずしも免疫学的に主要ではなく、したがってタンパクの全体において免疫原性ではないペプチドエピトープを同定および使用することができる。ただし、このような亜主要エピトープは、特異的リンパ球による腫瘍の認識を誘導するのに効率的で有用である。本発明に定義の８−ｍｅｒ〜１０−ｍｅｒのペプチドは、腫瘍抗原としてしか作用せず、例えば、そのペプチドの担体の能力やシャペロン機能、タンパクの他の機能的活性は保持していない。
【０００９】
広範囲に渡って効率性を有する最適なＨｓｐ７０ワクチン候補を追求する中で、本発明者らは、天然Ｈｓｐ７０がＣＴＬによって認識される腫瘍抗原であることを実証している。逆免疫的研究方法を用いることにより、本発明者らは、驚くべき潜在的免疫原性を備えた天然エピトープを同定した。これらのエピトープは、インビボで担体としてあるいはこれに連結して使用することが可能である。
【００１０】
「誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列」は、スイスプロットバンクデータベース内に受託番号Ｐ０８１０７の下に登録されている、Ｈｓｐ７０−１遺伝子またはＨｓｐ７０−２遺伝子によってコードされたＨｓｐ７０−１タンパクのアミノ酸配列を意味する。「構成的Ｈｓｃ７０のアミノ酸配列」は、スイスプロットバンクデータベースに受託番号Ｐ１１１４２の下に登録されているＨｓｃ７０タンパクのアミノ酸配列を意味する。該アミノ酸配列は、実施例１の図１に示されている。
【００１１】
「誘導性Ｈｓｐ−７０を自然に産生する細胞」は、インビボでＨｓｐ−７０を発現し、従ってある腫瘍細胞やウイルス感染細胞のように、いくらかのＨｓｐ７０エピトープを提示する細胞を意味する。この定義には、例えばＨｓｐ−７０をコードする遺伝物質によるトランスフェクションのような、Ｈｓｐ７０の発現を誘導することを目的として何らかの修飾を施した細胞、またはＨｓｐ７０のフラグメントに対応するペプチドを「パルス供与した」細胞は含まない。
【００１２】
誘導性Ｈｓｐ７０を自然に産生する細胞を特異的に認識できる細胞傷害性Ｔリンパ球は、当業者によって既知の各種方法によって特徴付けされている。これらの方法では、細胞傷害性Ｔリンパ球ＩＦＮ−γかＴＮＦ−α分泌、またはリンパ球が介在したペプチドパルス供与した放射性同位体標識細胞標的の特異的溶解を測定する。一例として、ＥＬＩＳＰＯＴ検定法を使用してもよい。
【００１３】
「Ｔリンパ球が、Ｈｓｃ７０エピトープではなく変異型Ｈｓｐ７０エピトープと非変異型Ｈｓｐ７０エピトープを認識する」とは、Ｔリンパ球がＨｓｃ７０からのエピトープだけを発現する細胞は認識しないが、Ｈｓｐ７０からのエピトープだけでなく他のエピトープも発現する細胞は認識することを示している。
【００１４】
ストレス−誘導性Ｈｓｐ７０は、きわめて保存性のよいＨｓｐ７０タンパク質ファミリーの一メンバーであるので、このファミリーの他のメンバー、構成的熱ショックタンパクＨｓｃ７０との間で配列において相同性はきわめて高い。
【００１５】
Ｈｓｐ７０と、Ｈｓｃ７０のような遍在的発現プロファイルを有する他のタンパクとの間で共有されるエピトープは、免疫学的な自己に属し、特異的ＣＤ８＋のレパートリーに対して寛容となっているはずである。したがって、このような寛容のリスクを最小にするために、高親和性配列の特異的選別を、Ｈｓｃ７０と共有されていない誘導性Ｈｓｐ７０ペプチドに限定する（実施例１）。
【００１６】
本発明の新規な免疫原性ペプチドは、ＨＬＡクラスＩ分子に対する安定性と高親和性に基づいて選択した（実施例２を参照）。親和性は、細胞の表面に基準量のＨＬＡクラスＩ分子を安定させるのに必要なペプチド用量として定義する。ペプチド／ＨＬＡ分子複合体間の安定性は、この複合体の半減期を決定することによって測定する。
【００１７】
もう１つの特定の実施態様では、本発明に従うペプチドは、誘導性Ｈｓｐ−７０のアミノ酸配列内の同じ長さの部分と同一のアミノ酸配列を含有している。
【００１８】
特定の実施態様では、本発明に従うペプチドは、構成的Ｈｓｃ７０のアミノ酸配列と同じ長さのいずれのアミノ酸配列と、ペプチドの３番目のアミノ酸から最後のＣ末端アミノ酸までの間に配置されている少なくとも１個のアミノ酸により異なっているアミノ酸配列を含む。もう１つの特定の実施態様では、本発明に従うペプチドは、構成的Ｈｓｃ７０のアミノ酸配列と同じ長さをもついずれかのアミノ酸配列と、ペプチドの４番目のアミノ酸から最後のＣ末端アミノ酸までの間に配置されている少なくとも１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
第１のアミノ酸の遊離アミノ官能基に対応する、ペプチドのＮ末端の先端から、最後のＣ末端アミノ酸の遊離酸官能基に対応する、ペプチドのＣ末端の先端まで、アミノ酸には便宜上番号が付されている。
【００２０】
さらにもう１つの特定の実施態様では、本発明に従うペプチドは、９個のアミノ酸を含むが、そのアミノ酸配列は、構成的Ｈｓｃ７０タンパク質のアミノ酸配列の同じ長さのいずれかのアミノ酸配列と、ペプチドの４番目の位置から８番目の位置までの間に配置されている少なくとも１個のアミノ酸により異なる。
【００２１】
さらにもう１つの特定の実施態様では、本発明に従うペプチドは、１０個のアミノ酸を含むが、そのアミノ酸配列は、構成的Ｈｓｃ７０タンパク質のアミノ酸配列の同じ長さのいずれのアミノ酸配列と、ペプチドの４番目の位置から９番目の位置までの間に配置されている少なくとも１個のアミノ酸により異なる。
【００２２】
特定の実施態様によれば、本発明に従うペプチドは、誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列の同じ長さのいずれかのアミノ酸配列と、ペプチドの１番目、２番目または最後のＣ末端に配置されている少なくとも１個のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を含む。
【００２３】
もう１つの特定の実施態様では、本発明に従うペプチドは、３番目のアミノ酸から最後のＣ末端アミノ酸の１つ前のアミノ酸までのそのアミノ酸配列が、誘導性Ｈｓｐ７０のアミノ酸配列内の同じ長さをもつ部分と同一であることを特徴とする。
【００２４】
これらの差異は、該アミノ酸配列内の連続した位置または分離した位置に配置することができる。
【００２５】
ペプチド配列は、その免疫原性を人工的に増大させるため修飾してもよい。ペプチド内のアミノ酸置換は、ＨＬＡクラスＩ分子に対するそれらの親和性を高め、各個々のペプチドの正確な処理を促進するために実施する。例えば、各ペプチドの親和性は、好ましくないアミノ酸を同定し、より効能の優れたエピトープが得られることが示されているアラニンとこれらを置き換えることによって、増大させる。該突然変異体は、そのエピトープの特異性に影響を与えずに、ペプチドの免疫原性を高めることを意図している：該突然変異体は、エピトープペプチドと一部のＨＬＡ分子との間の親和性を高めることができるように設計されるが、細胞傷害性リンパ球によるエピトープの認識を大幅に修正するわけではない。
【００２６】
特に、ＨＬＡ分子／Ｔ細胞レセプタと主に相互作用するエピトープペプチドの領域はペプチドのアミノ酸配列の３番目からＣ末端アミノ酸迄に配置されているので、ペプチドの１番目、２番目および／またはＣ末端の位置にのみ配置されるが、３番目のアミノ酸から最後のＣ末端アミノ酸の１つ前までの同一アミノ酸配列を保存する突然変異体は、細胞傷害性Ｔリンパ球によるペプチドの認識能力を維持しながらペプチドの免疫原性を高めることを意図される。
【００２７】
さらに、特にペプチドのＮ末端位置における配列の付加は、プロテアソームによるそれらの自然分解やＴＡＰ分子による小胞体への輸送を増大する。
【００２８】
本発明のもう１つの特定の実施態様では、上に定義のペプチドは、
【００２９】
【表５】
2005512517.tif 000002
：からなるアミノ酸配列群のいずれかのメンバーと少なくとも６５％相同であるかまたは同一であるいずれかのアミノ酸配列を含むか、または、このアミノ酸配列からなる。
【００３０】
本発明の別の特定の実施態様では、上に定義のペプチドは、
【表６】
2005512517.tif 000003
【００３１】
：からなるアミノ酸配列群のいずれかのメンバーと少なくとも６５％相同であるかまたは同一であるいずれかのアミノ酸配列を含むか、または、このアミノ酸配列からなる。
【００３２】
本発明の別の特定の実施態様では、上に定義のペプチドは、
【００３３】
【表７】
2005512517.tif 000004
：からなるアミノ酸配列群のいずれかのメンバーと少なくとも６５％相同であるかまたは同一であるいずれかのアミノ酸配列を含むか、または、このアミノ酸配列からなる。
【００３４】
本発明の別の特定の実施態様では、上に定義のペプチドは、
【００３５】
【表８】
2005512517.tif 000005
：からなるアミノ酸配列群のいずれかのメンバーと少なくとも６５％相同であるかまたは同一であるいずれかのアミノ酸配列を含むか、または、このアミノ酸配列からなる。
【００３６】
上に定義のようなＨｓｐ７０由来のペプチド中のすべてが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１またはＨＬＡ−Ａ＊０７０１分子に結合するのに必要な、一次アンカーモチーフを有している。白人集団内では、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１およびＨＬＡ−Ａ＊０７０２がほとんど、代表的なＨＬＡ分子と定義される。このようなモチーフの存在は、ペプチドの免疫原性特性と相関関係を有する、このようなＨＬＡ分子に対する高親和性を付与するのに必要である。
【００３７】
次のアミノ酸配列：ＹＬＧＹＰＶＴＮＡＶ（ＨＳＰ１３４）、ＬＭＧＤＫＳＥＮＶ（ＨＳＰ３８０）、ＬＬＬＬＤＶＡＰＬ（ＨＳＰ３９１）およびＬＬＤＶＡＰＬＳＬ（ＨＳＰ３９３）を有するペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックネズミ実験モデル（ＨＨＤマウス）で特異的細胞傷害性Ｔ細胞免疫反応を生じさせることができる。
【００３８】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１によって制限されるペプチドＨＳＰ１３４、ＨＳＰ３８０、ＨＳＰ３９１およびＨＳＰ３９３は、Ｈｓｐ７０を過剰発現している様々な起源のヒト腫瘍細胞の表面に存在し、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックＨＨＤマウス内で誘導された特異的ＣＴＬによって認識される。これらは、Ｈｓｐ７０を過剰発現している腫瘍を認識する特異的ヒトＣＴＬを刺激できることも実証されている。
【００３９】
ＨＬＡ−Ａ＊０３０１やＨＬＡ−Ｂ＊０７０２のような他のＨＬＡ分子に対して高親和性のＨｓｐ７０特異的エピトープも同定されている。
【００４０】
できれば、本発明に従うペプチドは、アミノ酸配列ＹＬＧＹＰＶＴＮＡＶ、ＬＬＬＬＤＶＡＰＬおよびＬＬＤＶＡＰＬＳＬのいずれか１つを含むか、または、このアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００４１】
本発明は、前に定義の配列群から選択した第１のアミノ酸配列と、
・該第１のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、
・前に引用した配列群から選択され、該第１のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列、
・前に引用した配列群から選択されたいずれのアミノ酸配列と異なるエピトープアミノ酸配列
である少なくとも第２のアミノ酸配列を含むポリエピトープにも関する。
【００４２】
ポリエピトープは、ＨＬＡ分子と結合して細胞表面に提示され、リンパ球によって認識される、細胞による抗原処理から派生するアミノ酸配列である複数のエピトープを含むか、または、これらのエピトープからなるポリペプチドとして定義される。ポリエピトープには、同じエピトープ、または同じタンパク質の複数の異なるエピトープ、または異なる抗原のエピトープの１つ以上のコピーを含んでいてもよい。これらのエピトープは、重複しているか、連続しているか、またはリンカーによって結合していてもよい。
【００４３】
上記のようなペプチドとして本発明に従うポリエピトープは、その免疫原性を人工的に高めるために修飾してもよい。このような修飾は、例えば、特にＮ末端上におけるアミノ酸置換や配列の付加であってもよい。
【００４４】
本発明の特定の実施態様では、ポリエピトープは、アミノ酸配列ＬＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬを有するか、またはこのアミノ酸配列を含む。
【００４５】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する高親和性のために選択した、上記ポリペプチドエピトープのうちの３個（ＨＳＰ３８０、ＨＳＰ３９１およびＨＳＰ３９３）は一体となって、アミノ酸配列ＬＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬを有する連続２２−ｍｅｒポリエピトープを形成する。これらのポリペプチドとポリエピロープは、実施例３に図解されているように、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックネズミ実験モデルで特異的細胞傷害性Ｔ細胞免疫反応を生じさせることができる。
【００４６】
２２アミノ酸の天然ポリエピトープは、ＨＨＤネズミモデル内ではインビボで、およびヒトＰＢＭＣからはインビトロで、３個のＨＳＰ３８０、ＨＳＰ３９１およびＨＳＰ３９３エピトープに対する３つの個別の免疫反応を生じることができるという特徴を有する（実施例を参照）。
【００４７】
本発明の別の実施態様では、上に定義のようなペプチドまたはポリエピトープは、担体に連結される。該担体は、使用のために、ペプチドまたはポリエピトープに結合した化合物であってもよい。例えば、担体は、ペプチドまたはポリエピトープの免疫原性特性を上げたり、食細胞によるエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でのその摂取を促進することを意図してもよい。一例として、この担体は、天然または合成の生物分解性微粒子であってもよい。本発明に従うペプチドまたはポリエピトープは、恐らく微粒子の表面に結合（conjugate）されるであろう。
【００４８】
本発明は、上に定義のようなペプチドまたはポリエピトープをコードする核酸配列にも関する。
【００４９】
本発明の特定の実施態様では、この核酸配列は、ベクターに連結される。このベクターは、例えば、特定の宿主に適合させた発現ベクターまたは細胞、それも特に抗原提示細胞による該核酸の摂取を促進するよう設計されたベクターであってもよい。該ベクターは、プラスミド、アデノウイルスまたはレトロウイルスのベクターであってもよい。
【００５０】
本発明は、誘導性Ｈｓｐ７０を自然に発現する細胞を特異的に標的とする細胞傷害性Ｔリンパ球反応をインビトロで誘導する方法にも関する。該方法は、上に定義のようなペプチドまたは上に定義のポリエピトープを使用し、細胞傷害性Ｔリンパ球をインビトロで誘導することを意図とした、当業者によってよく知られているいずれの方法であってもよい。
【００５１】
本発明の特定の実施例では、細胞傷害性Ｔリンパ球反応をインビトロで誘導するためのこの方法では、上に定義のようなペプチドもしくは上に定義のようなポリエピトープをコードする核酸を使用する。
【００５２】
本発明は、この方法によって取得した細胞傷害性Ｔリンパ球にも関する。本発明に従う細胞傷害性Ｔリンパ球は、ヒトの腫瘍膜に存在する特異的ペプチドを介してヒトの腫瘍を認識できる（実施例４）。
【００５３】
本発明は、上に定義のような、少なくとも１つのペプチドを表面で提示する抗原提示細胞にも関する。また、上記のようなペプチドまたはポリエピトープとの接触に置かれた抗原提示細胞にも関する。
【００５４】
ペプチドもしくはポリエピトープを、エキソビボでヒト抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に負荷すると、負荷された樹状細胞によって提示されるペプチドを認識する特異的Ｔリンパ球が効果的に活性化できる（実施例５）。このような負荷されたＡＰＣは、特にインビトロでは特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、インビボでは誘導性Ｈｓｐ７０を過剰発現している腫瘍に対する免疫イフェクター細胞によって媒介される、効能の高い抗腫瘍反応を誘導するのに特に効果的である。一例として、ＡＰＣは樹状細胞であってもよい。
【００５５】
樹状細胞は、熟練した技術者によって何らかの方法でヒトもしくは動物の組織から採取された、精製されたか部分的に濃縮されたＣＤ１４＋単球またはＰＢＭＣ画分のような、単核球を分化させて調製してもよい。その後、臨床で使用するためには、細胞の採取は、サイトアファレーシス（cytapheresis）法または濃縮白血球アフェレーシスの密度勾配遠心分離法によって実施する。細胞は、臨床での使用に適した標準の装置、フラスコおよび培養器により培養する。
【００５６】
特定の実施態様では、樹状細胞は末梢血単球の培養によって取得し、ＷＯ  ９７／４４４４１、Boyerら（２８）もしくはBocaccioら（２９）に従って洗い分けてもよい。簡単には、樹状細胞は、５００U/ml  ＧＭ−ＣＳＦ（Leucomax、Novartis Pharma）および５０ng/ml  ＩＬ−１３（Sanofi Synthelabo）を補充したＡＩＭＶ培地で分化させ、７日間の培養後に洗い分ける。次に、取得した未熟な樹状細胞をＩＦＮγ、ポリＩ：Ｃ、ＣＤ４０のリガンド、抗ＣＤ４０抗体、リポ多糖類、ＴＮＦαまたはＦＬＡＴ３リガンドを含む作動性（agonistic）サイトカインのような、当業者によってよく知られた成熟化因子やサイトカインを使用することによって「成熟」させてもよい。未熟な樹状細胞は、ＷＯ  ０２／５６６７５に記載の方法を用いて、恐らくはＩＦＮ−γと一緒にして、バクテリア膜抽出物および／またはリボソーム抽出物を使用することにより成熟化を促してもよい。
【００５７】
特定の実施態様では、未熟な樹状細胞をRibomunyl（１ug/ml）およびＩＦＮγ（５００U/ml）の存在下で、６時間、完全ＡＩＭＶ培地（Life Technologies、Paisley PA49RF、GB）内で培養する。凍結乾燥RibomunylR（Inava Laboratory、Pierre Fabre、Paris、France）の各試薬瓶には、K.pneumoniae、S.pneumoniae、S.pyogenesおよびH.influenzaeからの０，０１０mgのリボソーム画分、およびK.pneumoniaeからの０，０１５mgの膜画分が含まれている。ＩＦＮγ（Imukin）は、Boehringer Ingelheim Franceから取得した。細胞を、６時間洗浄した後に、完全ＡＩＭＶ培地（成熟化因子の非存在下で）で４０時間の時点までさらに培養した。別の実施態様では、未熟な樹状細胞を抗ＣＤ４０抗体（２μg/ml）およびポリＩ：Ｃ（１００μg/ml）の存在下で、６時間、完全ＡＩＭＶ培地内で培養し、その後で洗浄してからさらに３４時間培養した。
【００５８】
樹状細胞は、単核球の分化のためのＩＦＮ−αを用いて取得してもよい。次に、全ＰＢＭＣ、部分的濃縮したもしくは高度に精製した単球を、Ｉ型ＩＦＮの存在下で、直接培養する。単球は、抗ＣＤ１４ミクロビーズ（MACS Cell Isolation Kits、Miltenyi Biotec、Germany）による正の免疫淘汰を用いて、混在したリンパ系細胞を激減させることによって、精製できる。あるいは、ハプテン結合ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ５６抗体（MACS Cell Isolation Kits、Miltenyi Biotec、Germany）のカクテルに向けられた抗ハプテンモノクローナル抗体と結合しているミクロビーズを、製造元の推奨通りに使用してもよい。
【００５９】
特に専用の手順では、細胞をＶａｃｃｅｌｌ（登録商標）プロセッサー（Immuno-Designed Molecules、Paris、France）のような「閉鎖プロセッサー」内で処理および培養するが、これには、１，０００ＩU/mlのＩ型ＩＦＮおよび５００U/mlのＧＭ−ＣＳＦの存在下で、培地および自己血清を伴なう、ガス透過疎水性の袋内の５％のＣＯ2湿潤空気中における、３７℃での細胞培養が含まれる。便宜上、無血清培地、ヒトＡＢもしくは自己血清を使用してもよい。別の種類の標準の培地（例えばRPMI-1630、MEM、Iscoveの修飾Dulbecco培地、Dulbeccoの修飾Eagle培地）はＤＣの以後の使用に従って使用するが、Ｘ−ＶＩＶＯ２０やＡＩＭ−Ｖのようなヒトの患者の治療に適した培地を、臨床プロトコールに用いられるＤＣの培養のために使用することが好ましい。
【００６０】
いずれのＩ型ＩＦＮ調製でも、ＩＦＮ−ＤＣの精製に使用できる：すなわち、組み換えＩＦＮα：ＩＦＮα２ｂ、ＩＦＮα２ａ、健全な対象者からの刺激を与えた白血球からの天然ＩＦＮα（ＩＦＮαｎ）、コンセンサスＩＦＮα（ＣＩＦＮ）および組み換えＩＦＮβである。適切な濃度は、たとえ５００−２，０００ＩU/ml、５００−１，０００ＩU/mlの範囲および特に１，０００ＩU/mlの濃度が最も好ましい場合であっても、１００ＩU/mlより高くなければならない。共刺激（Costimulatory）分子の上向調節に関しては、ＩＦＮの投与量が５００〜１，０００ＩU/mlの範囲内で最適な増強効果が観察されたが、１００ＩU/mlのＩＦＮ投与では、有意な効果は認められなかった。ＤＣ表現型における比肩しうる増強効果は、３日間の培養期間中に、血液由来単球にＧＭ−ＣＳＦとともに添加した天然のＩＦＮ−α、ＩＦＮα２ｂ、ＣＩＦＮおよびＩＦＮβのようなＩ型ＩＦＮの各種製剤を用いて得られる。
【００６１】
最終的濃度が上に示した範囲内であることを前提として、培地にＩＦＮを添加する代わりに、培地内でＩ型ＩＦＮを誘導できるいずれかの物質で処理してもよい。この処理の期間は通常３日以内であり、その終わりには、未付着のＤＣおよび緩やかに付着しているＤＣを採取する。２日目と３日目との間に回収された細胞を直接使用するか、または向流型遠心分離で洗い分けるか、または系特異的抗体と結合したビーズを用いた負の免疫磁性淘汰のいずれかによって精製することが好ましい。あるいは、連続的に使用するためには、便宜上、ＤＣを低温保存してもよい。
【００６２】
方法には、単核球もしくは単球からＤＣを派生させた後、上記のような既知の成熟化剤の中から選択して使用する成熟化剤、ＤＣのさらなる成熟化工程も含んでもよい。
【００６３】
樹状細胞は、Keoghらによって記述されるような、当業者によってよく知られた方法を用いて、他の樹状細胞前駆体から取得してもよい（３０）。
【００６４】
抗原提示細胞は、当業者によってよく知られたいずれの方法で抗原を負荷してもよい。特定の実施態様では、樹状細胞には、３７℃で２時間、本発明に従うペプチド（１０μg/ml）でパルス供与してもよい。細胞は、成熟時間が終わる前に、ペプチドでパルス供与してもよい。
【００６５】
上に定義のようなペプチドまたはポリエピトープは、注入後に抗原提示細胞がさらに好ましく提示および処理できるように修飾してもよい。例えば、ペプチドまたはポリエピトープは、特定のベクターに結合するか、またはＮ端末端もしくはそれらのＣ端末端に荷電アミノ酸で付加してもよい。
【００６６】
前に定義の核酸は、ＡＰＣに適正に負荷されるように、特定のベクターに連結してもよい。
【００６７】
特に誘導性Ｈｓｐ７０を過剰発現し、特に膜上にペプチドが十分に発現することを示されている、各種ヒトの腫瘍細胞系を用いることにより、ヒトの腫瘍を、本発明のポリペクチドを用いた免疫療法により標的とすることが可能であるという事実が実証された。
【００６８】
このように、同定されたＨｓｐ７０エピトープは、恐らくは、外科手術、放射線療法、化学療法薬、または抗血管形成化合物のような、ガンの確立した治療法や発達中の療法と一緒に、広範囲のガンの免疫療法に利用すると、都合がよい。
【００６９】
本発明は、製剤上許容可能な賦形剤と一緒に、少なくとも、上に定義のペプチドまたはポリエピトープを作用物質として含む薬剤組成物もしくはワクチンにも関する。該ペプチドまたはポリエピトープは、恐らくは上に述べたベクターと連結する。
【００７０】
特定の実施例では、本発明に従う薬剤組成物もしくはワクチンは、少なくとも、製剤上許容可能な賦形剤と関連して、ＳＬＦＥＧＩＤＦＹ、ＳＬＦＥＧＩＤＦＹＴ、ＬＭＧＤＫＳＥＮＶからなる群から選択したいずれかのアミノ酸配列を含むか、または、このアミノ酸配列からなるペプチドを含む。
【００７１】
さらに詳細には、本発明は、少なくとも、製剤上許容可能な賦形剤と一緒に、アミノ酸配列ＬＭＧＤＫＳＥＮＶを含むかまたは、このアミノ酸配列からなるペプチドを含む、本発明に従う薬剤組成物またはワクチンに関する。
【００７２】
薬剤組成物もしくはワクチンの各投与量には、上に定義のようなペプチドまたはポリペプチドを含んでいてもよく、恐らくは当業者によってよく知られたいずれかの抗原に由来するいくらかの他のペプチドまたはポリエピトープを含んでいてもよい。一例として、本発明に従う薬剤組成物には、上に定義のような有効投与量のペプチドまたはポリエピトープと、いくつかの腫瘍細胞に特異的に発現している抗原から派生する有効投与量のペプチドエピトープを含有していてもよい。有効投与量のペプチドまたはポリエピトープは、１００μg〜１０mgのペプチドまたはポリエピトープを含む。
【００７３】
本発明の別の実施態様では、薬剤組成物またはワクチンは、恐らくはベクターに連結する該ペプチドまたはポリエピトープをコードする核酸を含有する。
【００７４】
各投与量の薬剤組成物またはワクチンには、１００μg〜１０mgの核酸を含有していてもよい。該薬剤組成物またはワクチンは、上に定義の有効投与量の核酸と、当業者によってよく知られたいずれかの抗原をコードする有効投与量の核酸とを含有してもよい。
【００７５】
本発明の別の実施態様では、薬剤組成物またはワクチンは、前に述べた方法によって取得したような細胞傷害性Ｔリンパ球を含有する。
【００７６】
本発明の別の実施態様では、薬剤組成物またはワクチンは、上に定義の、少なくとも１つのペプチドをその表面に提示する抗原提示細胞を含有する。
【００７７】
薬剤組成物またはワクチンは、皮内、皮下、静脈内、リンパ管内、結節内、粘膜内または筋肉内投与のような、各種生薬形態で患者に投与してもよい。
【００７８】
本発明は、ガンやウイルス性疾患の治療に有用な薬剤の調製での、本発明に従う薬剤組成物もしくはワクチンの使用にも関する。
【００７９】
本発明に従う薬剤組成物またはワクチンは、化学療法（例えば、シスプラチンや５フルオロウラシルでの治療による）、または抗血管形成治療と併用してもよい。
【００８０】
本発明は、ガンやウイルス性疾患の治療に有用な薬剤の調製での、上に記載のようなペプチド、ポリエピトープ、核酸、細胞傷害性Ｔリンパ球または抗原提示細胞のいずれかの使用に関する。
【００８１】
特定の実施態様では、本発明は、ガンやウイルス性疾患の治療に有用な薬剤の調製での、ＳＬＦＥＧＩＤＦＹ、ＳＬＦＥＧＩＤＦＹＴ、ＬＭＧＤＫＳＥＮＶからなる群から選択したいずれかのアミノ酸配列を含有するか、または、このアミノ酸配列からなるペプチドの使用に関する。
【実施例】
【００８２】
〔材料と方法〕
ＨＬＡクラスＩに対するペプチドの相対的親和性の測定。研究対象のＨＬＡクラスＩ分子（３ｘ１０5細胞／mL）を発現するＴａｐ−／−細胞を、１６時間、３７℃で１００ng/mlのヒトβ−２ｍを補給した無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中で１００μM〜０．１μMの範囲の各種ペプチド濃度を用いて培養した。次に、細胞を２回洗浄し、まず特異的抗クラスＩｍＡｂで、続いてＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ  ｍＡｂで染色して、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の発現を定量化した。各種ペプチド濃度ごとに、ＨＬＡ特異的染色率を、１００μMの基準ペプチドで得た染色の％として計算した。相対的親和性（ＲＡ）は、ＲＡ＝（２０％のＨＬＡ発現を誘導する各ペプチドの濃度／２０％のＨＬＡ発現を誘導する基準ペプチドの濃度）：として決定した。ＲＡ値が低くなるほど、ＨＬＡに対するペプチド結合が増強していく。各ペプチドの平均ＲＡ値は、少なくとも３回の独立した実験から決定した。
【００８３】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する相対的親和性の研究のためには、Ｔａｐ−／−ＨＬＡ−Ａ＊０２０１  Ｔ２細胞、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ｍＡｂ  ＢＢ７．２および基準のＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合ペプチドＨＩＶｐｏｌ５８９（ＩＶＧＡＥＴＦＹＶ）を使用した。ＨＬＡ−Ａ＊０３０１に対する相対的親和性の研究のためには、Ｔａｐ−／−ＨＬＡ−Ａ＊０３０１Ｔ２−Ａ３細胞を用いる。ＨＬＡ−Ｂ＊０７０１に対する相対的親和性の研究のためには、Ｔａｐ−／−ＨＬＡ−Ｂ＊０７０１  Ｔ２−Ｂ７細胞を用いる。
【００８４】
ペプチド／ＨＬＡクラスＩ複合体の安定性に関する評価。Ｔａｐ−／−細胞（１０6／mL）を、１００ng/mLのβ−２ｍを補給した無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃で１００μMの各ペプチドと供に一晩培養した。次に、細胞を４回洗浄して、遊離ペプチドを除去し、１時間、ブレフェルジン（Brefeldin）Ａ（１０μg/mL）で培養して、新たに合成されるＨＬＡ分子の細胞表面の発現を遮断し、洗浄して０時間、２時間、４時間または６時間、３７℃で培養した。その後で、まず細胞をＨＬＡ特異的ｍＡｂ、続いてＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ  ｍＡｂで染色した。各時点で、ペプチドにより誘導されたＨＬＡの発現を、ペプチド培養前細胞の平均蛍光度−ペプチドの非存在下で同様の条件の下に処理した細胞の平均蛍光度：として計算した。ＤＣ５０（溶解複合体；ＤＣ）を、ｔ＝０での安定したＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ペプチド複合体の５０％の損失に必要な時間として定義した。
【００８５】
ＨＬＡトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬの生成。１４０μgのＩ−Ａb制限ＨＢＶコア由来Ｔヘルパーエピトープ（１２８−１４０；配列ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ）の存在下で、ＨＬＡトランスジェニックマウスの尻尾の根元に不完全フロイドアジュバント（ＩＦＡ）で乳化した１００μgのペプチドを皮下注射した。１１日後に、脾臓細胞（１０mL中５ｘ１０7細胞）をペプチド（１０μM）によりインビトロで刺激した。培養６日目に、大半の応答集団を特異的細胞傷害性について試験した。反応時には、さらに、１〜０．１μMのペプチドと５０U/mL  ＩＬ−２（Proleukin、Chiron Corp.）の存在下で、２０ｘ１０6の３５Ｇｙを照射した脾臓細胞により、インビトロでＣＴＬ株を週１回再刺激した。最後に刺激してから６日後に細胞傷害性を検査し、７日目に５０U/mL  ＩＬ−２を追加して１１〜１３日後に、ＴＮＦ−α分泌を検査した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックＨＨＤマウスを用いた。Ｂ７Ｂ７ＫdマウスおよびＨＬＡ−Ａ＊０３０１トランスジェニックマウスを、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０１およびＨＬＡ−Ａ＊０３０１制限ペプチドをそれぞれ研究するために用いた。
【００８６】
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からのＣＴＬの生成。インフォームドコンセントを取得した健全なドナーから採取した新鮮なＰＢＭＣを、研究対象のＨＬＡクラスＩ分子に対して血清学的に類別し、標準のフィコール−パック（Amersham Pharmacia Biotech AB）を用いて精製した。樹状細胞（ＤＣ）を、５００U/mLのＧＭ−ＣＳＦ（R&D Systems Inc. MN）および５００U/mLのＩＬ−４（R&D Systems Inc. MN）の存在下で、Keoghら（３０）によって記述されているように７日間プラスチック付着性ＰＢＭＣを培養することによって調製した。
【００８７】
次に、ＤＣを２μg/mLの抗ＣＤ４０抗体および１００ng/mLのポリＩ：Ｃ（Sigma-Aldrich）を用いて２日間成熟化させた。このＤＣ増強集団の免疫蛍光染色は、＞９０％がＣＤ８６／Ｂ７−２＋およびＨＬＡ−ＤＲ＋細胞であることを示した。自己ＣＤ８＋精製Ｔ細胞（CD8 MicroBeads、Miltneyi Biotec Inc. CA）に、培地（ＣＭ；１０％のヒトＡＢ血清、１０nMのＬグルタミンおよびゲンタイマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０）中に１０：１のＴ：ＤＣ比で、週１回、ペプチド（１０μM）を２時間に渡ってパルス付与したＤＣを用いて刺激を与え、そして３５Ｇｙを照射した。１ｘ１０3U/mLのＩＬ−６および５U/mLのＩＬ−１２（R&D Systems Inc. MN）を、培養の最初の１週間の間添加した。２０U/mL臨床等級のＩＬ−２（Proleukin、Chiron Corp.）および１０ng/mLのＩＬ−７（R&D Systems Inc. MN）を、培養の次の２週間の間に添加した。最後にＤＣで刺激してから７日後に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｂ−ＥＢＶ細胞（IFN-γ Secretion Assay、Miltenyi Biotec Inc. CA）によって提示されたペプチドの接触後、ペプチド特異的ＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気により選別した。ペプチド特異的Ｔ細胞の特徴付けについては、精製工程後７日に試験した。
【００８８】
ガン患者から採取したＨｓｐ７０特異的ＴＩＬの同定。インフォームドコンセントを取得したガン患者から採取した新鮮なＰＢＭＣを、研究対象のＨＬＡクラスＩ分子に対して血清学的に類別し、標準のフィコール−パック（Amersham Pharmacia Biotech AB）を用いて精製した。
コラゲナーゼ溶液で固形腫瘍を粉砕した小片を溶解することによって、腫瘍浸潤リンパ球と腫瘍細胞株を調製した。大半の腫瘍株は１０％ＦＣＳのＤＭＥＭ培地中で培養し、最後にクローン化した。さらに、切除した新鮮な腫瘍浸潤リンパ節から、押しつぶして細胞を培地中に放出させてＴリンパ球を取得した。
【００８９】
はじめに、ＨＬＡクラスＩ分子とＨｓｐ７０の発現プラスミドの両方でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞とＨｓｐ７０ペプチドテトラマー陽性ＣＤ８＋細胞の接触したときのＴＮＦ−α分泌の検出を通じて、Ｈｓｐ７０特異的ＴＩＬの検出に取り組んだ。
【００９０】
既知のＨｓｐ７０ペプチドに特異的なＴＩＬの同定には、エリスポット検査で取り組んだ。この検査の感度を高めるために、分析前にインビトロで１回リンパ球を刺激した（２２）。０日目に、ＰＢＬまたは押しつぶしたリンパ節を解凍し、１０mMのペプチドの存在下で、１０％のヒトＡＢ血清培地中に２ｘ１０6細胞の濃度で２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に２mL／ウェルで分注した。各実験には、ペプチドが分注されていないウェルも含む。２日後に、３００ＩU/mL臨床等級のインターロイキン２（Proleukin、Chiron Corp.）を培地に添加した。１２日目に、エリスポットで培養細胞の反応度を試験した。
【００９１】
エリスポット（ELISPOT）検査。エリスポット検査を用いて、ペプチドエピトープ特異的ＩＦＮ−γ放出エフェクター細胞を定量化した。混合セルロースエステル膜９６ウェルプレート（MultiScreen MAHA S4510;Millipore）に一晩、抗ＩＦＮ−γ抗体（ＭＡＢ２８５）を塗布しておいた。これらのウェルを洗浄し、１０％のヒトＡＢ血清培地でふさぎ、各種濃度の細胞を４重でウェルに添加した。次に、ペプチドを各ウェルに添加し、プレートを一晩培養した。翌日、培地を廃棄し、ビオチン化抗体（BAF285-Biotin）を添加する前に洗浄した。プレートを２時間インキュベーションしてから洗浄し、ストレプトアビジン−酵素結合体（Streptavidin-AP;Boehringer Mannheim GmbH）を各ウェルに添加した。室温で１時間プレートをインキュベーションし、ｐＨ９．５のホスファターゼアルカリ緩衝液（１００mM  ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１００mM  ＮａＣｌ、５mM  ＭｇＣｌ2）中の酵素基質ＢＣＩＰ−ＮＢＴ（S3771;Promega、France）を各ウェルに添加し、１０〜２０分間室温でインキュベーションした。暗紫色のスポットが出現した時点で水道水で洗浄することによって、反応を終結させた。スポットを自動画像分析システムＥＬＩＳＰＯＴ  Ｒｅａｄｅｒ（AID Strassberg、Germany）を用いてカウントした。ペプチド特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度は、スポット形成細胞の数と抗ＣＤ８  ｍＡｂ（clone 3B5;Caltag Laboratories、CA）で免疫染色処理によりあたった研究対象のリンパ球集団におけるＣＤ８＋の頻度から計算することができた。
【００９２】
これらの検査はすべて、各種ペプチド抗原ごとに、４重で実施した。
【００９３】
細胞傷害性検査。標的を、９０分間、１００μＣｉの51Ｃｒで標識し、３回洗浄した後に、９６ウェルのＶ底プレート（１００μLのＲＰＭＩ１６４０＋５％ＦＣＳ中、２．５ｘ１０3細胞／ウェル）内に分注した。これらを、６０分間、３７℃でペプチドをパルス供与した。次に、様々な数の１００μLのエフェクターをウェルに添加し、４時間、３７℃で培養した。培養後に、１００μLの上澄を採取し、γカウンターで放射活性を測定した。特異的溶解率を溶解率＝（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）ｘ１００：として決定した。自然放出は、常に３ＮのＨＣｌによって誘導された最大放出の＜２０％であった。
【００９４】
ＴＡＰ欠損ネズミＲＭＡＳ−ＨＨＤおよびヒトＴ２細胞を、細胞傷害性のためのＨＬＡ−Ａ＊０２０１の標的として使用した。また、ネズミＰ８１５−Ｂ７およびヒトＴ２−Ｂ７細胞を、細胞傷害性のためのＨＬＡ−Ｂ＊０７０１の標的として使用した。
【００９５】
ＣＯＳトランスフェクト細胞におけるペプチド処理検査。各種条件に対して４重で、平底の９６ウェルプレート内の１０％ＦＣＳのＤＭＥＭに２．２ｘ１０4サルＣＯＳ細胞を分注した。１８時間後に、培地を廃棄し、Ｈｓｐ７０とＨＬＡクラスＩ分子をコードする各ＤＮＡプラスミド１００ngを、１０％のNuserum  １０mMのクロロキン  １０mg/mLのDEAE デキストランのＤＭＥＭ内でＣＯＳ細胞と接触させて置いた。３７℃で４時間培養した後、トランスフェクション培地を廃棄し、プラスミドを取り込むために、５０μLの１０％ＤＭＳＯのＰＢＳを２分間添加した。次に、これを廃棄し、トランスフェクトＣＯＳ細胞を４０時間１０％ＦＣＳのＤＭＥＭ内に置いた。その後で、ＴＮＦ−α分泌検査で、トランスフェクトＣＯＳ細胞を５ｘ１０4のネズミＣＴＬとともに用いた。
【００９６】
ＴＮＦ−α分泌検査。４日目にトランスフェクトＣＯＳ細胞または１０5標的腫瘍細胞を５０μLの１０％ＦＣＳのＲＰＭＩに分注し、必要に応じて、１時間、１０μMのペプチドを用いて培養した。遮断実験では、１時間３０分、抗ＨＬＡクラスＩ抗体ｗ６／３２または無関係の抗体を標的細胞とともに培養した。次に、５ｘ１０4のＴ細胞を５０μLの１０％ＦＣＳのＲＰＭＩに添加し、６時間培養した。各条件を４重で試験した。５０μLの上澄を採取した。１０4〜０．０８pg/mLの範囲のＴＮＦ−α（I. Apfler、Bender Wien、Austriaにより提供）の最終量で５０μLの標準の希釈液を調製した。上澄と標準の希釈液の両方に、５０μLの３ｘ１０4のＴＮＦ−α感受性ＷＥＨＩ−１６４ｃ１３細胞を添加した。これらを、３７℃で１６時間培養した（２３）。細胞増殖の阻害度をＭＴＴ比色分析法によって評価した。簡単には、５０μLの２．５mg/mLのＭＴＴ（Sigma-Aldrich）を添加し、３７℃で４時間培養した。次に、細胞を１００μLのｐＨ４．７の３３％Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（Sigma-Aldrich）２０％ＳＤＳ水溶液を用いて溶解させた。細胞溶解の２時間後、ＯＤをDynatechのＭＲ５０００分光光度計を用いて、５５０nmで測定した。標準の希釈液を線形補間することによってＴＮＦ−αの定量を計算した。
【００９７】
腫瘍細胞によるＨｓｐ７０発現に関するウエスタンブロット分析。細胞標本をＰＢＳですすいだ後、３mMのＥＤＴＡ、１０mMのＮａＦおよび０．１％のスルホベタイン１４を含有するｐＨ６．８の１２５mMのＴｒｉｓ／ＨＣｌ中で、４℃で３０分間溶解させた。遠心分離処理後（１３０００rpm、１０分、４℃）、ＢＣＡ検査（Pierce）を用いて上澄中のタンパク質含有量を定量化した。３０μgのタンパク質を変性条件下で、５−１５％勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥに充填し、ニトロセルロース膜に転移させた。３７℃で、適量の抗体（抗ＨＳＰ７０、Stressgen、希釈１：１０００、抗アクチン、Chemicon、希釈１：２０００）を用いて１時間膜をインキュベーションすることによって、ＨＳＰ７０およびアクチンを検出した。一次抗体の固定を、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ（Sigma）およびＥＣＬキット（Amersham Pharmacia）を用いて検出した。
【００９８】
細胞内ＩＦＮ−ｇ染色。５ｘ１０4のＴ細胞を１０5の刺激ペプチド負荷ＥＢＶ−Ｂ細胞もしくは１０5の腫瘍細胞と供に、２０μg/mlブレフェルジンＡ（Sigma、Oakville、Canada）の存在下で培養した。６時間後に、これらを洗浄し、ＰＢＳ中のｒ−フィコエリトリン結合抗ＣＤ８抗体（Caltag Laboratories、Burlingame、CA）を用いて、４℃の温度条件下で、２５分間染色し、洗浄し、４％のＰＦＡで固定した。次に、細胞を０．５％のＢＳＡ  ０．２％のサポニン（Sigma、Oakville、Canada）のＰＢＳで浸透化させ、４℃で２５分間アロフィコシアニン結合抗ＩＦＮｇ  ｍＡｂ（PharMingen、Mississauga、Canada）で染色した。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）（Becton Dickinson、Mountain View、CA）で分析した。
【００９９】
結果
実施例１：特異的Ｈｓｐ７０領域の選択。ヒト誘導性Ｈｓｐ７０と構成的Ｈｓｃ７０のアミノ酸配列を整列し、不一致を目立たせた（図１）。少なくとも１つの不一致を含む、９−ｍｅｒペプチドまたは１０−ｍｅｒペプチドは、この後研究が集中し選択した領域を形成していた。
【０１００】
アミノ酸１−７、５２−６４、６８−８１、８５−１１９、１２８−１４４、１５４−１６３、１７７−１９１、２０４−２２１、２２８−２４３、２４６−２４０、２４６−２５５、２７３−２８８、２９７−３１５、３２０−３３４、３３７−３４６、３４８−３５８、３７２−３８１、３８８−４２７、４４９−４６２、４８０−４９８、５０５−５１４、５２２−６３２を含有する領域が、このようなペプチドすべての１番目のアミノ酸を決める。
【０１０１】
これらのＨｓｐ７０特異的領域に属するペプチドの中から、我々は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（位置２におけるＬ、Ｍ、ＶまたはＩおよびＣ末端位置におけるＬ、Ｖ、ＭまたはＩ）、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１（位置２におけるＬ、ＶまたはＭおよびＣ末端位置におけるＫ、ＹまたはＦ）およびＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（位置２におけるＰ）と結合するのに必要なアンカーモチーフを有しているペプチドを選択した。
【０１０２】
ａ）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１アンカーモチーフを有するペプチド：４２個のペプチド
【０１０３】
【表９】
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【０１０４】
ｂ）ＨＬＡ−Ａ＊０３０１アンカーモチーフを有するペプチド：１７個のペプチド
【０１０５】
【表１０】
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【０１０６】
ｃ）ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２アンカーモチーフを有するペプチド：２８個のペプチド
【０１０７】
【表１１】
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【０１０８】
ただし、表示「位置番号」は、対応するポリペプチド（ＨｓｐまたはＨｓｃ）におけるペプチドの１番目のアミノ酸の位置の番号に対応しているということに注意されたい。
【０１０９】
前方とＣ末端位置との間に少なくとも１つの不一致部を含む、９−ｍｅｒペプチドまたは１０−ｍｅｒペプチドは、この後で研究が集中した領域を形成していた。
【０１１０】
ｄ）ＨＬＡ−Ａ＊０２０１アンカーモチーフ及び、前方とＣ末端位置間に不一致部のＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０を有するペプチド：３２個のペプチド
【０１１１】
【表１２】
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【０１１２】
ｅ）ＨＬＡ−Ａ＊０３０１アンカーモチーフ及び、前方とＣ末端位置間に不一致部のＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０を有するペプチド：１０個のペプチド
【０１１３】
【表１３】
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【０１１４】
ｆ）ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２アンカーモチーフ及び、前方とＣ末端位置間に不一致部のＨｓｐ７０／Ｈｓｃ７０を有するペプチド：２２個のペプチド
【０１１５】
【表１４】
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【０１１６】
実施例２：高親和性を備えた特異的ＨＳＰ配列の選択
正常な細胞における基本の発現プロファイルにもかかわらず、Ｈｓｐ７０は免疫学的な自己に属し、胸腺または末梢で提示されるＨｓｐ７０エピトープが、特異的ＣＤ８＋レパートリーに寛容を有することを除外できない。ペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックＨＨＤマウスの免疫学的な自己にも属する場合には、このようなモデルで、エキソビボにおける寛容現象を研究できる。したがって、Ｈｓｐの免疫原性配列を同定するためのアプローチは、ネズミＨｓｐ７０配列と共有するＨｓｐ７０ペプチドの研究に限定した。
【０１１７】
コンピュータ化したアルゴリズムによって、ヒト誘導性Ｈｓｐ７０タンパク質の配列をＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合ペプチドに対して選別した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対する親和性および安定性を実験的に研究するため、強力なＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合体として予想されるが、Ｈｓｃ７０には存在せず、ネズミＨｓｐ７０に存在する４個の９または１０−ｍｅｒペプチドを選択した。ヒトＨｓｐ７０タンパク質および配列におけるそれらの位置を、以下の表１に要約する。実験の相対的親和性は、同じ量の基準ペプチドＨＩＶ  Ｐｏｌに相対して、基準数のＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ペプチド複合体を取得するのに必要なペプチド投与量を表している。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ペプチド複合体の安定性は、外因性のペプチド源を除去した時点における複合体の半減期として決定した。
【０１１８】
【表１５】
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【０１１９】
相対的親和性の決定によって、各ペプチドの親和性を実験的に検査した：Ｔ２細胞の表面に基準量のＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子を安定させるのに必要なペプチド投与量：および各ペプチドの安定性を、ペプチド／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子複合体の半減期（ＤＣ５０：解離複合体５０）を決定することによって検査した。
【０１２０】
４つの候補すべてが、相対的親和性＜５の所望のプロファイルを示し、それらの免疫原性を確保するのに十分高い親和性を備えていた。相対的親和性が５未満のペプチドの９８％より多くが、免疫原性であることがすでに実証されている（２７）。
【０１２１】
この後者のプロファイルを示す３つの候補は、３つすべて２２のアミノ酸内に位置する。これらは、天然の２２−ｍｅｒポリエピトープ：ＨＳＰ３８０、ＨＳＰ３９１およびＨＳＰ３９３を形成している。
【０１２２】
ペプチドに関する研究は、ネズミＨＳＰ７０の配列に存在していないペプチドにまで拡大している。このようなペプチドに関する相対的親和性の決定から、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に対して強力な親和性をもつペプチドＨＳＰ１３４（１０）を同定するに至った（表１）。ヒトの場合においても同様に、このペプチドは対象である。
【０１２３】
高親和性ペプチドの発見から、ＭＨＣ分子ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２に対しても導かれた。ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２の一次アンカーモチーフを提示するかもしくはコンピュータ化プログラムＢＩＭＡＳによって高い親和性を示すことが示される１１個のペプチドについて、それらの相対的親和性を試験した。１つのペプチドＨＳＰ１３７は、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２に対して高度な親和性を示した。以下の表２には、ネズミのＨｓｐ７０と共有されているＨｓｐ７０ペプチドの配列と、それらの同系Ｈｓｃ７０ペプチドおよびＨＬＡ−Ｂ＊０７０２分子に対する相対的親和性が示されている。
【０１２４】
【表１６】
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【０１２５】
実施例３：ＨＨＤマウスにおける誘導性ＨＳＰ７０ポリペプチドの免疫原性
我々は、ＨＨＤマウスで、選択した４つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１制限Ｈｓｐ７０ペプチドの免疫原性を研究した。インビボで４つのペプチドすべてに対してＣＴＬを誘導し、高活性ＣＴＬ株をインビトロで再刺激した後に得た。実際に、各ＣＴＬ株は、ＨＳＰ３８０に対しては約１０nMの活性（最大溶解度の５０％）で、ＨＳＰ１３４、ＨＳＰ３９１およびＨＳＰ３９３に対しては１０nM未満の活性でそれぞれのＨｓｐ７０ペプチドを認識している。ただし、これらの後者ペプチドに対する活性が常にＨｓｐ７０同系ペプチドに対してより約３ログ（log）分高いので、これらは、Ｈｓｃ７０同系ペプチドをかすかに認識するに過ぎなかった（図２）。これらのＣＴＬ株はそれぞれ、ｍＣＴＬ１３４、ｍＣＴＬ３８０、ｍＣＴＬ３９１およびｍＣＴＬ３９３として表されている。
【０１２６】
選択した４種類のペプチドを適正に処理し、実際にエピトープであることを示した。Ｈｓｐ７０とＨＨＤの両タンパク質の高度な発現を可能にするＣＯＳモデルにおいて、４つの細胞株ｍＣＴＬ１３４、ｍＣＴＬ３８０、ｍＣＴＬ３９１およびｍＣＴＬ３９３がＨｓｐ７０およびＨＨＤの両発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞を、はっきりと特異的に認識した（図３）。したがって、我々は、４種類のペプチドＨＳＰ１３４、ＨＳＰ３８０、ＨＳＰ３９１およびＨＳＰ３９３のすべてがエピトープであるということを、明確に実証した。
【０１２７】
実施例４：誘導性Ｈｓｐ７０過剰発現腫瘍は、特異的ポリペプチドに対し生成された細胞傷害性リンパ球によって認識される。
【０１２８】
我々は、特定の腫瘍細胞株に記述されるＨｓｐ７０の過剰発現が、腫瘍細胞の表面にこれらのエピトープを提示させるのに十分高いかどうかを研究した。我々は、このような高いＣＴＬ結合活性によって、最も多いＨｓｐ７０を発現するヒト腫瘍細胞を認識できるという仮説を立てて、この課題を取り組むために、入手してあった高活性をもつネズミＣＴＬを使用した。我々は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨｓｐ７０発現に対してヒト腫瘍細胞を選別し、４つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｈｓｐ７０＋各種の腫瘍：
乳ガン（ＭＣＦ−７）、肉腫（ＳＡＯＳ）、結腸ガン（Ｃａｃｏ−２）および膀胱ガン（ＳＥＧ）のプールを同定した（図４）。
【０１２９】
我々は、コントロールの腫瘍細胞株ＨＬＡ−Ａ０２０１＋Ｈｓｐ７０−（黒色腫Ｍ１１３およびＭ４４）も同定した。
【０１３０】
乳ガン由来腫瘍細胞株ＭＣＦ−７および肉腫由来腫瘍細胞株ＳＡＯＳは、最も高い構成的Ｈｓｐ７０レベルを示したので、認識検査に用いた。実際に、ｍＣＴＬ３９３は、ＴＮＦ−α分泌検査によって実証されたようにクラスＩ特異的様式で、両ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｈｓｐ７０＋腫瘍細胞株を特異的に認識した。これにより、特に、ＨＳＰ３９３がＨｓｐ７０過剰発現腫瘍の表面に適正に提示されるエピトープであり、したがってＨｓｐ７０由来ペプチドがガンの免疫治療におけるＣＴＬの良い標的を表わしていることを実証している。
【０１３１】
腫瘍細胞の表面におけるＨＳＰ３８０とＨＳＰ３９１の両エピトープの認識も実証されている。
【０１３２】
実施例５：ペプチド負荷ヒト樹状細胞によるＨＳＰペプチド特異的ＣＴＬの活性化
前に選択した３つのＨＳＰエピトープに対してヒトＣＴＬを誘導可能であるかどうかを調査するため、我々は、ペプチド負荷樹状細胞でＣＤ８＋細胞を刺激した。我々はペプチド特異的ＣＴＬを誘導した（ｈＣＴＬ３８０、ｈＣＴＬ３９１およびｈＣＴＬ３９３に関しては図７Ａと図７Ｂのデータを参照）。これらのヒトＣＴＬは、図３に記載されているＨｓｐ７０を過剰発現する各種組織学的型の数多くのパネルの腫瘍細胞の表面における特異的エピトープを認識できる。
【０１３３】
これらの高親和性ＨＳＰ７０ポリペプチドエピトープはさらに、ネズミＨｓｐ７０発現ＥＬ−４／ＨＨＤ腫瘍での攻撃からＨＨＤマウスを保護する能力により特徴づけられる。
【０１３４】
実施例６：３種類のＨｓｐ７０エピトープに対する多特異的免疫反応を生じる、２２−ｍｅｒのｐ３８０ポリエピトープの潜在能力
２２  ａ．ａ．天然ポリエピトープは、ＨＨＤネズミモデルにおけるインビボでの３種類のＨＳＰ３８０、ＨＳＰ３９１およびＨＳＰ３９３エピトープに対する３種類の異なる免疫反応を生じることができるという特徴をもつ。ＨＨＤマウスにワクチンを接種し、各エピトープに対するそれらの免疫反応をエキソビボでＩＦＮ−γエリスポット検査によって評価した。２２−ｍｅｒポリエピトープでのワクチン接種によって、ほとんどのマウスで免疫反応が誘導された（図８Ａの左のパネルと図８Ｂ）。面白いことに、２２−ｍｅｒポリエピトープでのワクチン接種は、３つのＨｓｐ７０エピトープすべてに対する免疫反応を誘導したが、３種類の混合物でワクチン接種したときには、ＨＳＰ３９１だけに対する偏った反応が生じた（図８Ａの右のパネル）。このことは、２２−ｍｅｒポリエピトープが、ＨＨＤマウスでは、複数のＨｓｐ７０エピトープに対してインビボで多特異的免疫反応を生じるという利点のあることを実証している。
【０１３５】
次に我々は、２２−ｍｅｒポリエピトープをパルス供与したヒト樹状細胞が、ヒトＰＢＭＣから多特異的ＣＴＬ反応を生じることができるか否かについて調査した。ＣＤ８＋細胞をポリエピトープパルス供与樹状細胞で複数回再刺激したときに、３つのＨｓｐ７０エピトープすべてに対する特異性を示すＣＴＬ株を取得することができた（図９）。このことは、ポリエピトープが、２２−ｍｅｒ形態からその３つの構成エピトープに適正に処理され、このエピトープをパルス供与したヒト樹状細胞が３つのエピトープすべてに対する多特異的免疫反応の潜在的誘導因子となることを示している。
【０１３６】
これらの結果はすべて、２２−ｍｅｒポリエピトープが、インビトロおよびインビボの両方で、３つのＨｓｐ７０エピトープに対する多特異的免疫反応を誘導できることを実証している。
【０１３７】
【表１７】
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【図面の簡単な説明】
【０１３８】
図と表の説明
【図１】Ｈｓｐ７０に特異的に存在しＨｓｃ７０には存在していない９−ｍｅｒペプチドおよび１０−ｍｅｒペプチドの第１のアミノ酸（□四角で囲ったアミノ酸）を含有する領域の同定。
【図２】特異的Ｈｓｐ７０ペプチドに対するネズミのＣＴＬ活性と、それらのＨｓｃ７０同系ペプチドの認識。４つのグラフは、それぞれＨＳＰ１３４（ｍＣＴＬ１３４株）、ＨＳＰ３８０（ｍＣＴＬ３８０株）、ＨＳＰ３９１（ｍＣＴＬ３９１株）およびＨＳＰ３９３（ｍＣＴＬ３９３株）のペプチドで刺激した後に取得したＣＴＬ株による細胞溶解を示す。これら細胞標的に対するＣＴＬの活性は、４０：１のエフェクター：標的比を用いた51Ｃｒ放出検査によって決定する。標的細胞の溶解率は、Ｘ軸に表される培地におけるペプチド濃度の関数として、Ｙ軸に表される。各グラフでは、ダイヤモンド形の点のある黒い曲線が、ＨＳＰペプチド存在下における細胞溶解を表し、一方、四角い点のある灰色の曲線が、同系のＨＳＣペプチド存在下における細胞溶解を表す。ＨＳＰ１３４を提示する細胞に関するｍＣＴＬ１３４の活性を測定するためのペプチド濃度は、０、０１〜１mMの範囲である。ｍＣＴＬ３８０、ｍＣＴＬ３９１およびｍＣＴＬ３９３に対して、それぞれのペプチド濃度は、１ｐＭ〜１μMの範囲である。各曲線上の個々の点は、左から右へ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１nM、１０nM、１００nMおよび１μMのペプチド濃度に対応する。
【図３】エピトープＨＳＰ３８０、ＨＳＰ３９１、ＨＳＰ３９３およびＨＳＰ１３４の処理。トランスフェクトしたＣＯＳ細胞とネズミのＣＴＬ株を接触させた後のＣＯＳ細胞のＣＴＬ認識が、上澄（Ｘ軸、ＴＮＦ−αは、０〜５００pg/mlの範囲である）中のＣＴＬ分泌のＴＮＦ−α量として表される。これらのグラフは、ＣＯＳ細胞に接触した後に、それぞれｍＣＴＬ３８０、ｍＣＴＬ３９１、ｍＣＴＬ３９３およびｍＣＴＬ１３４の細胞傷害性細胞株別の、ＴＮＦ−α量を表す。各グラフでは、上下方向にある棒線が、ＣＴＬと接触している各種細胞、それぞれ、陰性のコントロール（ＣＯＳ細胞なし）、ＣＯＳ細胞、Ｈｓｐ７０発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞、ＨＨＤ発現プラスミドをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞、陽性のコントロール（ＨＨＤをトランスフェクトし、各ペプチドでパルス化されたＣＯＳ細胞）、ＨＨＤおよびＨｓｐ７０発現プラスミドでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞を表わす。
【図４】Ｈｓｐ７０発現のための様々な起源の腫瘍細胞株の選択。細胞内における誘導性Ｈｓｐ７０の発現に関しては、相対的定量化コントロールとしてアクチン発現を用いて、ウエスタンブロット法により検査を行った。誘導性Ｈｓｐ７０の発現は、試験の上側で検出され、コントロールのアクチンの発現は、試験の下側で検出された。左から右に配置された腫瘍細胞株抽出物は次の、Ｍ４４、Ｍ１１３、ＳＥＧ、Ｃａｃｏ−２、ＳＡＯＳ、ＭＣＦ−７である。
【図５】Ｈｓｐ７０を過剰発現しているヒト腫瘍細胞の表面における、エピトープのネズミのＣＴＬによる認識。腫瘍細胞のＣＴＬによる認識は、細胞と接触した後の上澄（Ｘ軸、ＴＮＦ−αは０〜１０００pg/mlの範囲である）中のＣＴＬ分泌のＴＮＦ−α量として表される。上下方向の棒線は、ＣＴＬと接触している各種細胞および試薬、それぞれ、２つの陰性のコントロール（Ｍ１１３、Ｍ４４）、ＳＡＯＳ、ＭＣＦ−７、混合培養前の抗クラスＩ（ｗ６／３２）抗体で遮断したＭＣＦ−７、および混合培養前に無関係な抗体で遮断したＭＣＦ−７を表わす。
【図６】エピトープＨＳＰ３９１およびＨＳＰ３９３による特異的ヒトＣＴＬの誘導。  特異性は、１０μMのペプチドをパルス供与した標的細胞で、51Ｃｒ放出検査を用いて検証した。Ｘ軸は、ＣＴＬ／標的細胞比、すなわち２０／１と１０／１を表す。Ｙ軸は、標的細胞溶解率を表す。上下のグラフは、ヒトＣＴＬ  ｈＣＴＬ３９１およびｈＣＴＬ３９３でそれぞれ取得した結果を表す。ダイヤモンド形の点のある黒い曲線は、関連するペプチド、すなわちＨＳＰ３９１またはＨＳＰ３９３の存在下における細胞溶解に対応する。四角い点のある灰色の曲線は、無関係のペプチド（ＨＩＶ  Ｐｏｌペプチド）の存在下における細胞溶解に対応する。
【図７Ａ】対応するペプチドに特異的なヒトＣＴＬによる、Ｈｓｐ７０ペプチドを負荷した細胞の認識能力。  ｈＣＴＬ３８０、ｈＣＴＬ３９１およびｈＣＴＬ３９３と題する３つのグラフは、それぞれ、ｐ３８０、ｐ３９１およびｐ３９３の特異的ヒトＣＴＬの試験を表す。ｐ３９１およびｐ３９３の特異的ＣＴＬについては、ＥＢＶ−Ｂ細胞で試験し、ｐ３８０特異的ＣＴＬについては、Ｔ２細胞で試験した。Ｘ軸に示される、活性化時の１０5のＣＤ８＋細胞に対するＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋細胞の数を、ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γの細胞を染色することによる評価として、測定した。ｐ３８０、ｐ３９１、ｐ３９３のいずれかをＥＢＶ−ＢまたはＴ２細胞に負荷した。無関係のＨＩＶｐｏｌ589ペプチドを負荷したＥＢＶ−ＢまたはＴ２細胞を陰性のコントロールとして用いた。
【図７Ｂ】特異的ヒトＣＴＬによる、Ｈｓｐ７０を発現するヒト腫瘍細胞の認識。  ｈＣＴＬ３９１およびｈＣＴＬ３９３と題する２つのグラフは、それぞれ、ｐ３９１およびｐ３９３特異的ヒトＣＴＬの試験を表す。ｐ３９１およびｐ３９３特異的ＣＴＬは、ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γの細胞を染色することによる評価として、活性化時にＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋細胞を測定することによってＨｓｐ７０を発現するヒト腫瘍細胞ＭＣＦ−７およびＳＡＯＳの認識に対して試験した。活性化時の１０5のＣＤ８＋細胞に対するＩＦＮ−γを産生するＣＤ８＋細胞の数は、Ｘ軸上に示される。ｐ３８０、ｐ３９１、ｐ３９３のいずれかをＥＢＶ−ＢまたはＴ２細胞に負荷した。Ｈｓｐ７０陰性Ｍ４４およびＭ１１３腫瘍細胞を陰性のコントロールとして用いた。
【図８Ａ】ポリエピトープの免疫原性：ＨＨＤマウスにワクチン接種したときの、エピトープｐ３８０、ｐ３９１およびｐ３９３に対する複数の免疫反応の誘導。左のグラフは、ポリエピトープでＨＨＤマウスが免疫を獲得した後に得られた結果を表し、右のグラフは、ペプチドｐ３８０、ｐ３９１およびｐ３９３の混合ペプチドでＨＨＤマウスを次の免疫した後に得られた結果を表している。ＩＦＮ−γエリスポット（Elispot）検査で、免疫反応をエキソビボでモニターした。Ｘ軸は、各種エピトープに反応した、免疫を獲得したマウスの割合を表している。Ｙ軸上の上下方向の棒線は、エピトープに対して免疫反応を示したマウスの全比率と、それぞれｐ３８０、ｐ３９１およびｐ３９３ペプチドに対して反応したマウスの比率を表す。
【図８Ｂ】免疫反応を示したマウスにおける特異的ＩＦＮ−γ分泌細胞の頻度。８つのグラフには、２２−ｍｅｒエピトープで免疫を獲得したマウスのそれぞれに関して取得した免疫反応を表す。Ｘ軸は、活性化時に、１０5エキソビボＣＤ８＋細胞に対するＩＦＮ−γを産生するＣＴＬの数を表す。Ｙ軸上の棒線は、ｐ３９１かｐ３９３ペプチドまたは無関係のＨＩＶ  ｐｏｌ５８９ペプチドに対するＩＦＮ−γを産生するＣＴＬのそれぞれのレベルを表す。
【図９】ｐ３８０、ｐ３９１またはｐ３９３に対するインビトロでの免疫反応を誘導を通じた、ヒト設定におけるポリエピトープの免疫原性。ポリエピトープ誘導のヒトＣＴＬに関して、細胞内のＩＦＮ−γ染色でｐ３８０、ｐ３９１もしくはｐ３９３または無関係のＨＩＶｐｏｌ589ペプチドを負荷したＴ２細胞に対する反応能力を試験した。Ｘ軸は、ＩＦＮ−γを産生するＣＴＬ／１０5のＣＤ８＋細胞の数を表している。Ｙ軸上の上下方向の棒線は、無関係のＨＩＶ  ｐｏｌ５８９ペプチド又は、ｐ３８０、ｐ３９１もしくはｐ３９３ペプチドを細胞にそれぞれ負荷したときに得られた結果を表す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｉ】
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【図７Ａ−ＩＩ】
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【図７Ａ−ＩＩＩ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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