(57)【要約】新しい血管を増殖させて、身体の虚血組織および器官への血流を回復または改善するのに用いるための組成物および器具が開示されている。ＩＧＤペプチド、特にＧＧＩＧＤＧＧ、を含む組成物は、ヒト内皮細胞の遊走を誘導することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル分析系で血管形成を促進することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］の配列を有する単離ペプチド。
【請求項２】
ＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択される少なくとも１つのペプチド、ならびに前記少なくとも１つのペプチド以外の少なくとも１つの血管新生増殖因子を含む血管新生組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの血管新生増殖因子が、骨由来血管新生タンパク質（ＢＤＡＰｓ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンジオゲニン、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）より成る群から選択されることを特徴とする請求項２記載の血管新生組成物。
【請求項４】
ＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択される少なくとも１つの細胞遊走刺激ペプチドペプチド、ならびに少なくとも１つの組み換え血管新生増殖因子を含む血管新生組成物。
【請求項５】
細胞増殖促進条件下で細胞遊走および／または血管新生を促進する活性を有する組成物であって、ＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択される少なくとも１つのペプチド、ならびにマトリクス材料を含む組成物。
【請求項６】
医薬として受容可能な担体を含むことを特徴とする請求項５記載の組成物。
【請求項７】
滅菌されていることを特徴とする請求項６記載の組成物。
【請求項８】
治療を必要とする個体の心臓の虚血領域に、生理学的に受容可能な担体中のＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択される少なくとも１つのペプチドを含む組成物を、血管内皮細胞遊走および／または増殖を促進するのに有効な量で心筋内投与する工程を含む、心筋血管新生を促進する方法。
【請求項９】
前記組成物が：
ＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択される少なくとも１つのペプチド；
骨由来血管新生タンパク質（ＢＤＡＰ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンジオゲニン、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）より成る群から選択される少なくとも１つの増殖因子；ならびに
生理学的に受容可能な担体；を含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記生理学的に受容可能な担体が、ポリビニルピロリジノンを含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記投与工程が、前記組成物を虚血領域に皮下注射によって投与することを含む請求項８記載の方法。
【請求項１２】
治療を必要とする人の末梢血管によって維持される器官または組織の虚血領域に、生理学的に受容可能な担体中のＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択されるペプチドを、前記虚血領域において血管内皮細胞遊走および／または増殖を促進するのに有効な量で投与する工程を含む、末梢血管新生を促進する方法。
【請求項１３】
前記投与工程が、
ＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択される少なくとも１つのペプチド；
骨由来血管新生タンパク質（ＢＤＡＰｓ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンジオゲニン、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）より成る群から選択される少なくとも１つの増殖因子；ならびに
生理学的に受容可能な担体；を含む組成物を、前記虚血領域に送達することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記生理学的に受容可能な担体が、ポリビニルピロリジノンを含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記投与工程が、虚血領域に皮下注射によって前記組成物を投与することを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
身体の虚血組織への血流を高める方法であって、生理学的に受容可能な担体中のＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択される少なくとも１つのペプチドを、虚血組織への血流を回復または増加させるのに十分血管内皮細胞遊走および／または増殖を促進するのに有効な量で、前記虚血組織の特定領域に投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記投与工程が、アテローム硬化性疾患が原因で狭窄した天然の血管に隣接する部位に前記組成物を送達することを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記投与工程が、バイパス移植片に隣接する部位に前記組成物を送達することを含む請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記投与工程が、
ＩＧＤ［配列番号１］、ＩＧＤＳ［配列番号２］、ＩＧＤＱ［配列番号３］およびＧＧＩＧＤＧＧ［配列番号４］より成る群から選択される少なくとも１つのペプチド；
骨由来血管新生タンパク質（ＢＤＡＰｓ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンジオゲニン、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）より成る群から選択される少なくとも１つの増殖因子；ならびに
生理学的に受容可能な担体；を含む血管新生組成物を、アテローム硬化性疾患が原因で狭窄した天然の血管に隣接する部位に送達することを含む請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、側副血管の増殖を促進して標的器官および組織への血流を増加させることによる、人体の主要器官の虚血症状の治療に関する。より詳細には、本発明は、天然の血管の狭窄またはバイパス移植片の閉塞に起因する血流減少に伴う心血管疾患を治療するための、ペプチドを主成分とする血管新生組成物、方法および器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国では、潜在的な冠状動脈性心臓病が原因の心不全は現在、主な死因の１つである。現在、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術および経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）は重度心疾患を治療するために最も広く用いられる介入である。ＣＡＢＧでは、冠動脈閉鎖または閉塞の部分をバイパスするために、および血流を回復するために、自家血管が用いられる。ＰＴＣＡでは、詰まった血管の詰まりを取り除いて心臓への適当な血流を回復するためにカテーテル器具が用いられ、血管開存を維持するために金属製ステントが通常埋め込まれる。これらの手順の両方が高度に侵襲的と考えられており、またある程度の発生率の再狭窄を伴い、また、特に患者が高齢であるかまたは以前にＣＡＢＧまたはＰＴＣＡの処置を受けている場合は、冠動脈閉塞からの救済が必要なすべての患者に適切ではない可能性がある。さらに、末梢血管疾患では、脚、腸、および身体の他の部分へ血液を供給する血管にアテローム硬化性狭窄が生じている場合は、閉塞した末梢血管のサイズが小さいために、どちらの処置も選択肢とならない可能性がある。
【０００３】
一部の人では、ある期間にわたって新しい側副血管が形成され、閉塞した血管の周囲に天然のバイパスを与える、血管新生すなわち新しい血管の増殖の自然発生的な過程によって、血管閉塞は部分的に補償されている。血管新生の過程は一般的に、さらに成熟血管へ発達する毛細血管を形成する、基底膜の分解と内皮細胞の移動および増殖を含む。リンパ球または内皮細胞から放出される、天然に存在する細胞分裂促進因子は、血管新生を誘導し、および損傷組織または血液不足の組織の新血管形成を促進することができる。新たに形成された血管は、損傷した血管の機能をしばしば補足または完全に置換することができ、それによって、閉塞した血管が供給していた不足組織の血流を回復する。
【０００４】
一部の人は、虚血組織への減少した血流を適当に補償する十分な側副血管を生じることができない。したがって、まだ開発中である別の治療方法は、閉塞部分の周囲での新しい血管の増殖を誘導または促進し、心臓または他の血液不足の組織への適当な血流を回復することを試みる。誘導または促進された血管新生は、冠状動脈性心臓病を治療するための最も侵襲性の低い方法を提供し、患者人口の大きな割合における使用に適当であり（特にＣＡＢＧまたはＰＴＣＡのどちらについても候補にならない一部の患者を含む）、また心筋組織および末梢組織の両方の心血管形成に適用可能であると、多くの研究者に信じられている。
【０００５】
内皮細胞の増殖の直接的な誘引および／または誘導、または次に血管新生因子を産生する他の細胞型（たとえば、肥満細胞またはマクロファージ）を刺激することによる間接的作用のいずれかを通じて血管新生を促進する、いくつかの血管新生物質が近年同定されている。これらの物質の例は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、オステオネクチンまたはＳＰＡＲＣ、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンジオゲニン、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）を含む。これらの血管新生物質または因子のそれぞれは、合成であるか、つまり非生物起源から化学的に製造されるか、または組み換え製造方法によって製造される（非特許文献１）。
【０００６】
同時譲渡された特許文献１（ベネディクトら／ズルツァー・バイオロジー社（Ｂｅｎｅｄｉｃｔ ｅｔ ａｌ.／Ｓｕｌｚｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ, Ｉｎｃ.））に開示された別の血管新生物質は、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦのような単独因子の多くよりも頑健な血管新生反応を与える、骨由来血管新生タンパク質（ＢＤＡＰ）混合物である。
【０００７】
局在的な血管新生および／または創傷治癒を促進するための多くの手法は、目的部位で支持体または足場の役割を果たすことができ、標的細胞が通常は特異的細胞表面受容体を介してそれと相互作用して細胞増殖を促進することができる、細胞外マトリクス様の材料の導入を含む。細胞外マトリクス（「ＥＣＭ」）は、結合組織の細胞を取り囲む上皮の下の構造的に安定な物質であり、一種の天然の足場材料を構成する。ＥＣＭはまた、結合組織の巨大分子成分と定義することができ、一般的にプロテオグリカン、多糖およびタンパク質から成り、細胞形態、細胞遊走および分化、および細胞増殖の調節に主要な役割を果たす。タンパク質のＥＣＭファミリーの部分集合の１つが接着タンパク質である。２つの主要な接着タンパク質であるフィブロネクチンとラミニンは、組織修復、胚発生、血液凝固、および細胞遊走／接着を含む多数の細胞過程に関与する。したがって、細胞増殖を促進するために有利な細胞環境を提供することに向けられたさまざまな研究には、フィブロネクチンまたは特定のフィブロネクチンペプチドが関与する。これらの研究の多くは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＡｓｐすなわちＲＧＤ配列を利用し、これはフィブロネクチンの細胞結合領域の一部である（たとえば、特許文献２（ディッカーソンら（Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ.）およびショーら（非特許文献２）を参照。）
近年、１型フィブロネクチンモジュールの成分であるイソロイシン−グリシン−アスパラギン酸（Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＡｓｐすなわちＩＧＤ）トリペプチド配列が、皮膚繊維芽細胞の細胞遊走を誘導できることが報告されている（ショーら（非特許文献３）。以前は、生物活性はフィブロネクチン中の保存されたＩＧＤ配列だとされてはいなかったが、以前の研究は、細胞外フィブロネクチンマトリクスの集合体中の９番目の１型反復が、ＩＧＤＳ配列を含むことを示唆していた（非特許文献４）。特許文献３（ショーら／ダンディー大学（Ｓｃｈｏｒ ｅｔ ａｌ.／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｕｎｄｅｅ））では、ＩＧＤを含むある種のペプチドが記載され、そのＩＧＤＳペプチドは、ラット創傷治癒モデルにおいてある条件下で繊維芽細胞遊走および血管数を増加させることが示された。
【０００８】
細胞遊走および血管新生のさまざまな調節因子の同定および理解が顕著に進歩している一方、アテローム硬化性疾患に冒された血液不足の器官および組織への循環を回復するため、心臓および末梢血管系によって維持される組織のような体内の虚血部位での血管新生を促進するための効果的な方法が差し迫って必要とされるままである。
【特許文献１】米国特許第６,２１１,１５７号明細書
【特許文献２】米国特許第５,６７７,２７６号明細書
【特許文献３】国際公開第９９／０２６７４号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第１０／０２７,６６９号明細書
【非特許文献１】フリードマン, Ｓ.Ｂ., アイスナー, Ｊ.Ｍ., 虚血性心臓血管疾患のための治療的血管新生（Ｆｒｅｅｄｍａｎ, Ｓ.Ｂ., ａｎｄ Ｉｓｎｅｒ, Ｊ.Ｍ., Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ, Ｊ. Ｍｏｌ. Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ. ５３（３）: ３７９−３９３ （２００１））
【非特許文献２】Ｓ.Ｌ. Ｓｃｈｏｒ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １０９:２５８１−２５９０ （１９９６）
【非特許文献３】Ｓ.Ｌ. Ｓｃｈｏｒ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１２:３８７９−３８８８ （１９９９）
【非特許文献４】チェルヌーソフらＭＡ Ｃｈｅｒｎｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ., Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃhｅｍ ２６６:１０８５１−１０８５８ （１９９１）
【非特許文献５】Ｐａｒｓｏｎｓ−Ｗｉｎｇｅｒｃｅｒ ｅｔ ａｌ., Ｍｉｃｒｏ−ｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５:２０１−２１４ （１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、身体の虚血組織への血流を回復または改善するための新しい血管を増殖させることでの使用のための、特に心臓および末梢血管疾患の治療のための組成物、器具および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態では、血管新生が必要な部分（たとえば、虚血領域）のような、血管新生が求められる身体の領域に血管新生を促進するための組成物が与えられる。ある特定の実施形態では、血管新生活性を有しアミノ酸配列イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸（標準アミノ酸一文字表記で「ＩＧＤ」）を有する領域を含むタンパク質を含む組成物が与えられる。好ましい実施形態では、当該タンパク質の完全アミノ酸配列は５０個以下のアミノ酸残基を含み、より好ましくは２５個以下、さらにより好ましくは１０個以下を含む。
【００１１】
別の一実施形態では、血管新生活性およびアミノ酸配列イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸［配列番号１］を有するタンパク質を含む組成物が提供される。さらに別の一実施形態では、血管新生活性およびアミノ酸配列グリシン−グリシン−イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸−グリシン−グリシン［配列番号２］（「ＧＧＩＧＤＧＧ」）を有するタンパク質を含む組成物が提供される。さらなる一実施形態では、血管新生活性およびアミノ酸配列イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸−イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸［配列番号３］（「ＩＧＤＩＧＤ」）を有するタンパク質を含む組成物が提供される。さらに別の一実施形態では、血管新生活性およびアミノ酸配列イイソロイシン−グリシン−アスパラギン酸−イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸［配列番号４］（「環状ＩＧＤＩＧＤ」）を有する環状タンパク質を含む組成物が提供される。さらに別の一実施形態では、血管新生活性および次式で表されるアミノ酸配列含む組成物が提供される:
ＺＺＩＧＤＺＺ          （式１）
式中、Ｉはイソロイシンを表し、Ｇはグリシンを表し、Ｄはアスパラギン酸を表し、Ｚは２０種の生物学的アミノ酸のうち任意のものを表す。配列番号１〜４のペプチド、およびその他の代表的なＩＧＤペプチドは、ヒト上皮細胞、ヒト繊維芽細胞およびヒツジ核細胞（ｎｕｃｌｅｕｓ ｃｅｌｌｓ）を含むさまざまな細胞型において遊走を誘導する能力による評価では、驚くほど優れた生物活性を示すことが見出されている。
【００１２】
別の一実施形態では、血管新生活性およびアミノ酸配列イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸−セリン［配列番号５］（「ＩＧＤＳ」）を有するタンパク質を含む組成物が提供される。別の一実施形態では、血管新生活性およびアミノ酸配列イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸−グルタミン［配列番号６］（「ＩＧＤＱ」）を有するタンパク質を含む組成物が提供される。
【００１３】
本発明の別の一実施形態では、配列番号１〜６および式１のペプチドのうち少なくとも１つ、および上記のペプチド以外の少なくとも１つの血管新生増殖因子を含む血管新生組成物（すなわち、血管新生活性を示す組成物）が提供される。一部の実施形態ではその別の血管新生増殖因子は骨由来血管新生タンパク質混合物（ＢＤＡＰ）、１種類以上の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンジオゲニン、内皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）である。
【００１４】
本発明のさらに別の一実施形態に記載の、配列番号１〜６および式１のペプチドのうち少なくとも１つ、および少なくとも１つの組み換え血管新生増殖因子を含む血管新生組成物が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる一実施形態では、細胞増殖促進条件下で細胞遊走および／または血管新生を促進する活性を有する組成物が提供される。その組成物は配列番号１〜６および式１のペプチドのうち少なくとも１つ、およびマトリクス材料を含む。一部の実施形態では、その組成物はまた医薬として受容可能な担体を含み、その組成物は身体での使用のために滅菌することができる。
【００１６】
本発明のある別の実施形態では、心筋血管新生を促進する方法が提供される。本方法は、そのような治療を必要とする人の心臓の虚血領域に、生理学的に受容可能な担体中の、配列番号１〜６および式１のペプチドのうち少なくとも１つを含む組成物を、虚血領域において血管内皮細胞遊走および／または増殖を促進するのに有効な量で心筋内投与することを含む。
【００１７】
本方法の別の一実施形態では、患者に投与される組成物は、配列番号１〜６および式１の上記で特定されたペプチドのうち少なくとも１つに加えて、生理学的に受容可能な担体、および下記の増殖因子のうち少なくとも１つを含む:ＢＤＡＰ、１種類以上のＢＭＰ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アンジオゲニン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、およびＴＮＦ−α。一部の実施形態では担体はポリビニルピロリドンを含む。好ましい一実施形態では、本方法は組成物を虚血領域に注射によって送達することを含む。
【００１８】
本方法の別の一実施形態では、治療を必要とする人の末梢血管によって維持される器官または組織の虚血領域に、生理学的に受容可能な担体中の、配列番号１〜６および式１のペプチドのうち少なくとも１つを含む組成物を、虚血領域において血管内皮細胞遊走および／または増殖を促進するのに有効な量で投与することを含む、末梢血管新生を促進する方法が提供される。その組成物はまた、下記の増殖因子の１つ以上を含みうる:ＢＤＡＰ、１種類以上のＢＭＰ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アンジオゲニン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、およびＴＮＦ−α。生理学的に受容可能な担体はポリビニルピロリドンを含むことができ、方法は組成物を虚血領域に皮下注射によって投与することを含みうる。
【００１９】
本発明のさらに別の一実施形態では、治療を必要とする人の身体の虚血組織への血流を促進する方法が提供される。本方法は、生理学的に受容可能な担体中の、配列番号１〜６および式１のペプチドのうち少なくとも１つを含む血管新生組成物を、虚血組織への血流を回復または増加させるのに十分な程度血管内皮細胞遊走および／または増殖を促進するのに有効な量で、虚血組織の一定範囲に投与することを含む。一部の実施形態では、本方法は組成物をアテローム硬化性疾患が原因で狭窄した天然の血管に隣接する部位に送達することを含む。本方法は組成物をバイパス移植片に隣接する部位へ投与することを含みうる。本方法の一部の実施形態は、配列番号１〜６および式１のペプチドのうち少なくとも１つおよび担体に加えて、上記で特定した増殖因子のうち少なくとも１つを含む血管新生組成物を投与することを含む。本発明のこれらおよび他の実施形態、特性および利点は下記の説明および図面を参照して明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本開示では、「イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド」、「Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド」、および「ＩＧＤ含有ペプチド」の語はすべて、少なくとも１つのイソロイシン−グリシン−アスパラギン酸配列を有し、また細胞接着促進活性を有するペプチドをいう。「ＩＧＤ」はその配列の標準的なアミノ酸記号表記である。非常に広い意味で、ＩＧＤモチーフペプチドへの言及はまた、イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸ペプチドを含むかまたは、イソロイシン−グリシン−アスパラギン酸配列のものと類似の細胞接着促進の性質を示すペプチドも含む。例は、Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＩＧＤ）［配列番号１］;Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＧＧＩＧＤＧＧ）［配列番号２］:Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＩｌｅＧｌｙ−Ａｓｐ（ＩＧＤＩＧＤ）［配列番号３］;環状Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（環状ＩＧＤＩＧＤ）［配列番号４］;Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＩＧＤＳ）［配列番号５］;およびＩｌｅ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ（ＩＧＤＱ）［配列番号６］である。これらのペプチドの構造は付属の配列リストに示す。別の例は、式１で特徴づけられるアミノ酸配列を有するペプチド、または５０個以下のアミノ酸残基のペプチドでＩＧＤ配列を含む領域を有するペプチドを含む。
【実施例】
【００２１】
配列番号１〜６のペプチドは、ペプチド合成装置を用いて合成によって作製した。ポリビニルピロリジノン（ポビドン）はＩＩＳＰケミカルズ（ＩＩＳＰ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ニュージャージー州ウェイン）から入手した。ヒト内皮細胞およびヒト繊維芽細胞はクローンティックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）（メリーランド州ウォーカーズビル）から入手した。
【００２２】
滅菌製剤の調製
配列番号１〜６に特定されたＩＧＤペプチドの滅菌製剤は、ペプチドをペプチド合成装置で合成し、結果として得られる溶液を０.２２ミクロンフィルターを用いて濾過滅菌して調製することができる。ペプチドは濾過滅菌後に凍結乾燥することができ、これと共に同時に出願された、全体が参照によって開示に含まれる「ポリペプチド増殖因子のためのポビドン含有担体」（ＰＯＶＩＤＯＮＥ−ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ ＣＡＲＲＩＥＲＳ ＦＯＲ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ ＧＲＯＷＴＨ ＦＡＣＴＯＲＳ）と題する同時係属の特許文献４に記載の通り、１%ポリビニルピロリジノン水溶液または他のポビドン化合物中で再構成することができる。あるいは、希ＨＣｌ（１０ｍｍｏｌ）といった別の既知の担体を使用することができる。ポビドンは細胞毒性がないため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 分析を実施する際の担体として好ましい。
【００２３】
実施例１−Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞遊走分析
本発明に記載のＩＧＤモチーフペプチドがヒト内皮細胞および平滑筋細胞の細胞遊走を促進する能力を、その遊走は血管新生に特徴的な過程であるが、配列番号１および２のペプチド、およびＤＩＧ配列で特徴づけられるＩＧＤペプチドのスクランブルについて細胞遊走分析を実施することによって評価した。ＧＧＤＩＧＧＧ配列によって特徴づけられる、そのスクランブルの末端に結合させたものもまた試験した。
【００２４】
ペプチドの細胞遊走を評価するための走化性試験トレイ（Ｃｈｅｍｏ Ｔｘ（商標）ディスポーザブル遊走チャンバー、直径６ｍｍ、３００ Ｉ／ウェル、８μｍフィルターメンブレン付き９６ウェル、ニューロプローブ社（Ｎｅｕｒｏ Ｐｒｏｂｅ, Ｉｎｃ.）、メリーランド州ゲイサーズビル）は、ＵＶ灯の下にトレイを一夜置くことによって滅菌した。膜を用いたその後の処理は無菌条件下で実施した。フィルターメンブレンにゼラチンを乗せ、３%酢酸に一夜浸し、次いで０.１ｍｇ／ｍＬセラチンに２時間浸して、試験する細胞に適した環境を与えた。それらは次いで滅菌水で洗浄し、風乾した。そのような膜は室温にて最大１ヶ月まで保存しうる。
【００２５】
分析に使用する細胞（上皮細胞または平滑筋細胞）は、慣習的な１０% ＦＢＳ血清の代わりに０.１%ウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）、および１Ｘペニシリン−ストレプトマイシン抗生物質を含む適当な培地中で、２４時間飢餓状態とした。走化性ユニットの９６ウェルチャンバーのウェルは０.１%血清のみかまたは０.１%血清と被験物質（それぞれ対照または化学誘引物質）を含む培地で満たした。フィルターメンブレンはプレート上に置き、フレームの角の穴をマイクロプレートの４本のピンと合わせ、膜を定位置に留めてウェル中の培地が膜に完全に接したことを確実にした。飢餓培地中の細胞懸濁液の５０μＬを、負荷毎の生菌数４×１０４個の濃度で、（各ウェル上の）各部位に播種した。プレートは３７℃にて５% ＣＯ２の雰囲気内で４時間培養した。
【００２６】
培養後、蓋を取り除き、フィルターは定位置のままで、膜の上表面上の細胞を静かに拭き取り、フィルター付きのプレートを容器上で４５°の角度に保持して、フィルターの上面を培地で注意深く洗浄した。膜の下面上の細胞を次いでメタノールで固定し、ディフクイック（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ）（商標）染色セットで染色した。膜はその後乾燥させ、光学顕微鏡下で視野内を計数することによって、フィルターの孔を通って移動した細胞の数を測定した。
【００２７】
結果は、ヒト大動脈内皮細胞とヒト平滑筋細胞の両方について、配列番号１と配列番号２のペプチドの両方が細胞遊走を促進したことを示す。ＤＩＧスクランブルとキャップ付き(capped)ＧＧＤＩＧＧＧスクランブルのどちらも、対照より有意に大きい細胞遊走は示さなかった。図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃを参照。
【００２８】
実施例２−Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ細胞増殖分析
本発明に記載のＩＧＤモチーフペプチドの、ヒト大動脈上皮細胞の細胞遊走を促進する能力を、配列番号１および２のペプチド、ＤＩＧスクランブルペプチド、およびスクランブルの末端結合付きであるＧＧＤＩＧＧＧについてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖分析を実施することによって評価した。〜９５％密集状態まで増殖したヒト大動脈上皮細胞を増殖培地に播種し（５０００細胞／ウェル）、４時間で細胞を接着させた。細胞をその後、実施例１で記載した飢餓培地に移し、約１８時間飢餓状態にした。細胞を次いで被験ペプチドを含む飢餓培地に移し、細胞をさらに４８時間増殖させた。培地をその後除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。細胞を次いで１回の凍結乾燥サイクルに供した。サイクォント（ＣｙＱｕａｎｔ）（商標）試薬（モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ユージーン）をその後細胞に取扱説明書に従って加え、細胞を暗所で５分間インキュベートした。色の強度−細胞の数と直接比例する−を励起波長４８５ｎｍ、検出波長を５３５ｎｍに合わせて測定する。
【００２９】
結果は、配列番号１と配列番号２のペプチドの両方がヒト大動脈内皮細胞の細胞増殖を促進したことを示す。ＤＩＧスクランブルとキャップ付きＧＧＤＩＧＧＧスクランブルのどちらも、対照的に、対照より有意に大きい細胞遊走は示さなかった。図２を参照。
【００３０】
実施例３−ウズラ漿尿膜（ＣＡＭ）血管新生分析
ＩＧＤモチーフペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏウズラ漿尿膜（ＣＡＭ）モデル中の内皮細胞および平滑筋細胞の細胞遊走および増殖を誘導するする活性を、その開示が引用によって援用される、パーソンズ−ウィンガーサーら（非特許文献５）によって記載されたのと同様の方法で分析した。要約すると、ニホンウズラの受精卵（ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｃｏｔｕｒｎｉｘ ｊａｐｏｎｉｃａ）を培養３日後にシャーレに開けた。培養７日後、それぞれ３７℃に予温した１％ポリビニルピロリジンに溶解した、実施例１および２で試験した４種類のＩＧＤモチーフペプチド（ＩＧＤ、ＧＧＩＧＤ、ＤＩＧ、ＧＧＤＩＧＧＧ）を、別々のシャーレ内のＣＡＭの表面上に均一に撒いた。培養２４時間後、ＣＡＭを固定し、切開して、終末期血管を含む樹状の動脈が見えるように倍率１０倍で撮影した。３連のＣＡＭ標本のデジタル像を倍率１０倍でグレースケール、白黒に二値化、およびスケルトン化して得た。血管分岐パターンを、フラクタル次元によって分析し定量した。
【００３１】
結果は、ＩＧＤとＧＧＩＧＤＧＧペプチドの両方がＣＡＭモデルで血管新生を促進した一方、ＤＩＧスクランブルとキャップ付きＧＧＤＩＧＧＧスクランブルのどちらも、対照より有意に良く血管新生を促進はしなかった。図３Ａおよび３Ｂを参照。
【００３２】
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏデータは、ＩＧＤモチーフペプチドがたとえば、イヌまたはウサギを含む既知の動物モデル、および同様の人の臨床状況で血管新生性であることを強く示唆する。血管密度、血管の大きさおよび成熟度の増加は、動物モデルにおける研究の結果として予測することができる。スクランブルしたペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で同様の陽性反応を引き起こすことができないことを考慮すると、ＩＧＤモチーフペプチドに対する特異性は明らかである。
【００３３】
冠動脈血管新生または末梢血管新生のどちらかが望まれる一部の場合では、細胞遊走または動員および増殖をさらに促進するため、ペプチド注射組成物に細胞増殖促進マトリクス材料も含めることが好ましい可能性がある。適当なマトリクス材料は、ポリビニルピロリジノンおよびたとえば１０ｍｍｏｌ ＨＣｌといった希酸溶液を含む。ＩＧＤペプチド−マトリクス混合物は、好ましくは血管新生が望まれる虚血部位に導入される。
【００３４】
もう１つの別の血管新生促進組成物は、配列番号１〜６または式１のペプチドのうち任意のもののようなＩＧＤモチーフペプチドを、ＢＤＡＰ、１種類以上のＢＭＰ、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アンジオゲニン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、およびＴＮＦ−αといった既知の血管新生物質と組み合わせて含みうる。好ましい血管新生組成物は、ＧＧＩＧＤＧＧのようなＩＧＤモチーフペプチドおよび、同時譲渡された特許文献１に記載の骨由来血管新生タンパク質混合物（ＢＤＡＰ）を含む。別の好ましい実施形態では、組成物は配列番号１〜６および式１のＩＧＤモチーフペプチドのうち少なくとも１つ、およびＶＥＧＦの混合物を含む。組み合わせの、結果として生じる血管内皮細胞遊走刺激効果および／または細胞増殖効果は、ＩＧＤペプチドまたは他方の増殖因子単独のどちらかの効果と比較して、相加的かまたは相乗的でさえあると予測される。胚発生中または非胚組織でのｉｎ ｖｉｖｏの組織再生中のどちらかで、いくつかの増殖因子があるものは同時に、別のものは順にアップレギュレートされ、その過程の完了に１種類以上の因子が関与することを示す。単独の増殖因子が血管新生を誘導する能力を扱う、以前の研究の一部は、完全には成功しておらず、さらに１つ以上の因子またはシグナル伝達経路の必要性を強調している。
【００３５】
上記の例で考察した代表的なＩＧＤモチーフペプチドに加えて、適当な状況下で、ここに記載の治療方法において別の細胞遊走刺激ＩＧＤモチーフペプチドも、あるいは代わりに、使用することができる。そのようなＩＧＤペプチドが、参照により開示に含まれる特許文献３に記載されている。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態を示し説明した一方、当該分野の熟練者は本発明の精神および教示を離れることなくその改変を行うことができる。ここに記載の実施形態は単に例示的であり、制限することを意図しない。ここに開示した発明の多数の変形および改変が可能であり本発明の範囲内にある。したがって、保護の範囲は上記に示した説明または実施例によって制限されず、下記の請求項によってのみ制限され、その範囲は請求項の主題のすべての同等物を含む。請求項それぞれのすべては本発明の実施形態として明細書に組み込まれている。したがって、請求項は本発明のさらなる説明であり、好ましい実施形態への付加である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１の手順に従い実施した、選択したＩＧＤモチーフトリペプチドについての細胞遊走分析の結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１の手順に従い実施した、選択したＩＧＤモチーフトリペプチドについての細胞遊走分析の結果を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実施例１で試験したＩＧＤモチーフトリペプチドについての細胞遊走分析の結果を示す写真を示す。
【図２】図２は、実施例２の手順に従い実施した、４種類のＩＧＤモチーフトリペプチドについての細胞増殖分析の結果を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例３に従い実施した、４種類のＩＧＤモチーフトリペプチドについてのウズラＣＡＭ分析の結果を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例３で試験した、選択したＩＧＤモチーフトリペプチドについてのウズラＣＡＭ分析の結果の写真を示す。
【配列表】
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2005518409.tif 000003
【図１Ａ】
2005518409.tif 000004
【図１Ｂ】
2005518409.tif 000005
【図１Ｃ】
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【図２】
2005518409.tif 000007
【図３Ａ】
2005518409.tif 000008
【図３Ｂ】
2005518409.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月25日(2004.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005518409000001.app
【国際調査報告】
2005518409.tif 000010
2005518409.tif 000011