(57)【要約】  本発明は、置換された単環式芳香族化合物を、対応するカルボン酸および関連する化合物に酸化する生体触媒法に関する。好ましい実施形態において、本発明は、ｐ−キシレンおよびｍ−キシレンからそれぞれ、４−ヒドロキシメチル安息香酸および３−ヒドロキシメチル安息香酸を生成する生体触媒法を記載する。４−ヒドロキシメチル安息香酸は、キシレンモノオキシゲナーゼ酵素を含有する単一の組換え微生物を用いたｐ−キシレンの酸化によって調製された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を式Ｉ
【化１】
2005512513.tif 000027
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は独立してＨまたはＣＨ３、またははＣ１からＣ２０の置換もしくは未置換アルキルまたは置換もしくは未置換アルケニルまたは置換もしくは未置換アルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも２つが存在し且つＨではない）
に従う置換された単環式芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）Ｒ１〜Ｒ６のいずれか１つまたは全てが酸化される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる置換された単環式芳香族基質の酸化方法。
【請求項２】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の酵素を式Ｉ
【化２】
2005512513.tif 000028
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は独立してＨまたはＣＨ３、またはＣ１からＣ２０の置換もしくは未置換アルキルまたは置換もしくは未置換アルケニルまたは置換もしくは未置換アルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも２つが存在し且つＨではなく、そしてＲ１〜Ｒ６のいずれか１つまたは全てが酸化される）
に従う芳香族基質にｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる
ことを含んでなる置換された単環式芳香族基質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酸化方法。
【請求項３】
芳香族基質がｐ−キシレン、４−メチルベンジルアルコール、ｐ−トルアルデヒド、ｐ−トルイル酸、ｍ−キシレン、３−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒド、およびｍ−トルイル酸よりなる群から選択される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｐ−キシレン、４−メチルベンジルアルコール、ｐ−トルアルデヒドおよびｐ−トルイル酸よりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）４−ヒドロキシメチル安息香酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる４−ヒドロキシメチル安息香酸の製造方法。
【請求項５】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｍ−キシレン、３−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒドおよびｍ−トルイル酸よりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）３−ヒドロキシメチル安息香酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる３−ヒドロキシメチル安息香酸の製造方法。
【請求項６】
組換え生物が細菌種、真菌種および酵母種よりなる群から選択される請求項１、４および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
組換え生物がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、サルモネラ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）属、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、パンドレア（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）属、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）属およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）属よりなる群から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉｉｉ）の培養を細菌細胞増殖用の培養培地および有機基質の受渡しのための有機溶媒を含んでなる培地中で行う請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組換え生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ｘｙｌＭサブユニットが、
（ｉ）配列番号：１０、配列番号：１６および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対して９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に完全に相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸によってコードされる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｘｙｌＡが、
（ｉ）配列番号：１２、配列番号：１８および配列番号：２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対して９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に完全に相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸によってコードされる請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
キシレンモノオキシゲナーゼ酵素がプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）属の一員から単離される請求項１、４および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
プロテオバクテリア属の一員がバークホルデリア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、ノボスフィンゴビウム属、スフィンゴモナス属、パンドレア属、デルフチア属およびコマモナス属よりなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｐ−キシレン、４−メチルベンジルアルコールおよびｐ−トルアルデヒドよりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）ｐ−トルイル酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなるｐ−トルイル酸の製造方法。
【請求項１５】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｐ−キシレンおよび４−メチルベンジルアルコールよりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）ｐ−トルアルデヒドが生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなるｐ−トルアルデヒドの製造方法。
【請求項１６】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物をｐ−キシレンと接触させ、
（ｉｉｉ）４−メチルベンジルアルコールが生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる４−メチルベンジルアルコールの製造方法。
【請求項１７】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｍ−キシレン、３−メチルベンジルアルコールおよびｍ−トルアルデヒドよりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）ｍ−トルイル酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなるｍ−トルイル酸の製造方法。
【請求項１８】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｍ−キシレンおよび３−メチルベンジルアルコールよりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）ｍ−トルアルデヒドが生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなるｍ−トルアルデヒドの製造方法。
【請求項１９】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物をｍ−キシレンと接触させ、
（ｉｉｉ）３−メチルベンジルアルコールが生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養する
ことを含んでなる３−メチルベンジルアルコールの製造方法。
【請求項２０】
組換え生物が細菌種、真菌種および酵母種よりなる群から選択される請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
組換え生物がアスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピヒア属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、サルモネラ属、バシラス属、アシネトバクター属、ロドコッカス属、ストレプトマイセス属、エシェリキア属、シュードモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、アナベナ属、チオバシラス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、バークホルデリア属、ノボスフィンゴビウム属、スフィンゴモナス属、パラコッカス属、パンドレア属、デルフチア属およびコマモナス属よりなる群から選択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組換え生物が大腸菌である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｘｙｌＭサブユニットが、
（ｉ）配列番号：１０、配列番号：１６および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対して９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に完全に相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸によってコードされる請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ｘｙｌＡが、
（ｉ）配列番号：１２、配列番号：１８および配列番号：２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対して９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に完全に相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸によってコードされる請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
キシレンモノオキシゲナーゼ酵素がプロテオバクテリア属の一員から単離される請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
プロテオバクテリア属の一員がバークホルデリア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、ノボスフィンゴビウム属、スフィンゴモナス属、パンドレア属、デルフチア属およびコマモナス属よりなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｏ−キシレン、２−メチルベンジルアルコール、ｏ−トルアルデヒド、ｏ−トルイル酸、５−スルホ−ｍ−キシレン、５−スルホ−３−メチルベンジルアルコール、５−スルホ−ｍ−トルアルデヒド、および５−スルホ−ｍ−トルイル酸よりなる群から選択される置換された単環式芳香族基質と接触させる
ことを含んでなり、該置換された単環式芳香族基質を対応する生成物に酸化する置換された単環式芳香族基質の酸化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年８月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／３１１、４９０号明細書の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、置換された単環式芳香族化合物の酸化のためのｘｙｌＡおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼの利用法に関する。キシレンモノオキシゲナーゼを含有する組換え微生物による４−ヒドロキシメチル安息香酸およびｐ−キシレンの他の酸化誘導体の生成が特に興味深い。
【背景技術】
【０００３】
単環式芳香族化合物の酸化には種々の化学的経路が知られている。例えば、テレフタル酸を調製する商業的方法には、ｐ−キシレンの液相酸化が含まれる（アモコ）（Ａｍｏｋｏ）。アモコ法は、重金属触媒と臭素化合物の存在下、低級脂肪族モノカルボン酸溶媒中、液相において、分子状酸素含有気体により、ｐ−キシレンを酸化し、直接テレフタル酸を形成することを含む（特許文献１）。より具体的には、前記反応は、９５％酢酸中、共触媒としてＮＨ４Ｂｒとテトラブロモエタンの混合物を用い、ＣｏとＭｎにより触媒される。前述の酸化は、高温（１０９〜２０５℃）および高圧（１５〜３０ｂａｒ）の苛酷な条件下で実施される。したがって、反応速度は高く、ｐ−キシレンに基いたテレフタル酸の収量は９５％またはそれ以上の高さである。しかしながら、反応装置は、主に臭素化合物およびモノカルボン酸溶媒の使用により、腐食が激しくなる。したがって、通常のステンレススチールは前記反応装置の構築に使用できず、また、ヘイステロイ（Ｈａｓｔｅｌｌｏｙ）（登録商標）またはチタンなどの高価な材料が必要である。さらに、酸性触媒が大量に用いられ、また酸化条件が厳しいため、溶媒自体の燃焼も避けられず、その損失を無視することはできない。また、アモコ法により、ｍ−キシレンがイソフタル酸へ酸化することが示されている。これらの方法により、キシレン類の酸化は可能であるが、それらは費用がかさみ、また環境汚染物質を含有する廃液を生じる。また、これらの方法では、ｐ−キシレンまたはｍ−キシレンの部分酸化された誘導体を生成することが困難である。
【０００４】
トルエンやキシレン異性体など、芳香環状のメチル基の生物学的酸化はよく知られている（非特許文献１）。例えば、Ｔｏｌ経路に関するｘｙｌ遺伝子を有する細菌は、トルエン上のメチル基を連続的に酸化して、ベンジルアルコール、ベンズアルデヒド、そして最後に安息香酸を生じさせる。十分に特性評価されたＴｏｌプラスミドｐＷＷＯ上に位置しているｘｙｌ遺伝子が配列決定されている（アシンダー（Ａｓｓｉｎｄｅｒ）ら、上記）；（非特許文献２）。ｘｙｌ遺伝子は２つのオペロンへと構築される。上方経路のオペロンは、トルエンを安息香酸へと酸化するために必要な酵素をコードする。下方経路のオペロンは、安息香酸をトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路の中間体へと変換する酵素をコードする。
【０００５】
キシレンモノオキシゲナーゼは、これら化合物の１つのメチル基の水酸化を触媒することによって、トルエンおよびキシレンの代謝を開始する（アシンダー（Ａｓｓｉｎｄｅｒ）ら、上記）；（非特許文献３）。キシレンモノオキシゲナーゼは、還元等価物をヒドロキシラーゼ構成要素（ＸｙｌＭ）へと伝達するＮＡＤＨ受容体構成要素（ＸｙｌＡ）を有している（非特許文献４）。この酵素は、プラスミドｐＷＷＯ上のｘｙｌＡおよびｘｙｌＭによってコードされる（アシンダーら、上記）。ｐＷＷＯキシレンモノオキシゲナーゼに関するクローン化遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。クローン化キシレンモノオキシゲナーゼは、種々の置換トルエン類を、相当する安息香酸誘導体へと酸化する。ｐ−キシレンおよびｍ−キシレンに対するクローン化キシレンモノオキシゲナーゼの効果は先行技術においては周知ではない。しかし、クローン化キシレンモノオキシゲナーゼは、プソイドクメン（１，２，４−トリメチルベンゼン）上の１つのメチル基の酸化を触媒する（ブーラーら、上記）。シュードモナス−プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）においてキシレンモノオキシゲナーゼは、Ｔｏｌ経路の最初のステップを生じさせ、２種の別個のデヒドロゲナーゼは次の２つの酸化ステップを生じさせる（ハラヤマら、上記）が、クローン化ｐＷＷＯキシレンモノオキシゲナーゼは、基質特異性が緩められており、ベンジルアルコールおよびベンズアルデヒドを酸化して安息香酸を形成する（ブーラーら、上記）。
【０００６】
一般に、化学物質の生成には、幾つかの理由から生物学的方法が望ましい。１つの利点は、生物学的反応を触媒する酵素は、基質特異性を有していることである。したがって、生物学的方法により、化合物の複合混合物を含有する開始材料を用いて、特定のキラル異性体または構造異性体を生成することが時に可能である。他の利点は、生物学的方法が、酵素制御下、段階的様式で進行することである。その結果、生物学的方法における中間体は、類似の化学的方法における中間体よりも、容易に単離できることが多い。３番目の利点は、生物学的方法が化学的製造法よりも、環境に対して害が少ないと一般に認められていることである。とりわけこれらの利点から、生物学的方法によってｐ−キシレンまたはｍ−キシレンを出発物質として用い、これらの化合物の部分的に酸化された誘導体を製造することが望ましい。
【０００７】
上述の方法は、単環式芳香族構造体の置換基酸化には有用であるが、１種以上の置換基酸化では多酵素的方法を伴う。組換え生物内ヘの多酵素的方法の技術は費用がかさみかつ時間がかかり、また必要な酵素全ての調節と発現が必要である。
【０００８】
【特許文献１】米国特許第２，８３３，８１６号明細書
【非特許文献１】ダグレイ（Ｄａｇｌｅｙ）ら、Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．６：１〜４６頁（１９７１）
【非特許文献２】バーレイジ（Ｂｕｒｌａｇｅ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.５５：１３２３〜１３２８頁（１９８９）
【非特許文献３】デイビー（Ｄａｖｅｙ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９：９２３〜９２９頁（１９７４）
【非特許文献４】スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：１６９０〜１６９５頁（１９９１）
【非特許文献５】ブーラー（Ｂｕｈｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１００８５〜１００９２頁（２０００）
【非特許文献６】ウッボルツ（Ｗｕｂｂｏｌｔｓ）ら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６０８〜１５（１９９４））
【非特許文献７】ハラヤマ（Ｈａｒａｙａｍａ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：４５５〜６１頁（１９８６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、解決すべき問題は、置換された単環式化合物を工業的に有用なカルボン酸および関連する化合物に酸化するための環境に安全で経済的な方法を提供することである。本出願人は、ｘｙｌＡおよびｘｙｌＭサブユニットを有するクローン化キシレンモノオキシゲナーゼ類が、その他のクローン化酵素中間体の補助なしに、単環式化合物の複数の置換基を十分に酸化するという発見によって上記の問題を解決した。特に、本出願者は、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）株ＡＳＵ１およびプラスミドｐＷＷＯからクローン化したｘｙｌＭおよびｘｙｌＡ遺伝子を含んでなる単一のキシレンモノオキシゲナーゼ種を用いて、適切な基質存在下、大腸菌内に別々に発現させることにより、Ｐ−キシレンおよびｍ−キシレン上の両方のメチル基を酸化して、それぞれ４−ヒドロキシメチル安息香酸および３−ヒドロキシメチル安息香酸を生成することが可能であることを証明した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、単環式カルボン酸および関連化合物生成のために、単環式芳香族化合物上のメチルおよび他の置換基の単一ステップの酸化方法を提供する。本法は、環状構造体上のメチル基および他の置換基の複数酸化のために、キシレンモノオキシゲナーゼの酵素活性を利用する。他のキシレンモノオキシゲナーゼ類が全て、環上のただ１つのアルキル部分酸化を行うことが示されていた従来の技術よりも、本法は進歩している。
【００１１】
本発明のキシレンモノオキシゲナーゼ類は、以下のスキームに従って、ｐ−キシレンから４−ヒドロキシメチル安息香酸への変換、すなわち、ｐ−キシレン→４−メチルベンジルアルコール→ｐ−トルアルデヒド→ｐ−トルイル酸→４−ヒドロキシメチル安息香酸を十分に媒介する（図１）。
【００１２】
同様に、本発明のキシレンモノオキシゲナーゼは、以下の同様の経路により、ｍ−キシレンから３−ヒドロキシメチル安息香酸への変換、すなわち、ｍ−キシレン→３−メチルベンジルアルコール→ｍ−トルアルデヒド→ｍ−トルイル酸→３−ヒドロキシメチル安息香酸を媒介する（図２）。
【００１３】
基質特異性の緩和が見られるため、当該キシレンモノオキシゲナーゼの基質として、その他の置換された単環式芳香族も予想される。これらには、ｏ−キシレンおよび５−スルホ−ｍ−キシレン、ならびにそれら各々の酸化中間体が含まれる。ｏ−キシレンから２−ヒドロキシメチル安息香酸への変換は、以下のように進行すると予想される：ｏ−キシレン→２−メチルベンジルアルコール→ｏ−トルアルデヒド→ｏ−トルイル酸→２−ヒドロキシメチル安息香酸。同様に、５−スルホ−ｍ−キシレンは、以下の経路に従うと予想される：５−スルホ−ｍ−キシレン→５−スルホ−３−メチルベンジルアルコール→５−スルホ−ｍ−トルアルデヒド→５−スルホ−ｍ−トルイル酸→５−スルホ−３−ヒドロキシメチル安息香酸。
【００１４】
本発明は：（ｉ）ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を式Ｉ
【００１５】
【化１】
2005512513.tif 000002
【００１６】
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は独立してＨまたはＣＨ３、またはＣ１からＣ２０の置換もしくは未置換アルキルまたは置換もしくは未置換アルケニルまたは置換もしくは未置換アルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも２つが存在し且つＨではない）
に従う置換された単環式芳香族基質と接触させ、
（ｉｉｉ）Ｒ１〜Ｒ６のいずれか１つまたは全てが酸化される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養することを含んでなる置換された単環式芳香族基質の酸化方法を提供する。
【００１７】
本法は、キシレンモノオキシゲナーゼを発現する組換え生物を用いてインビボで、または、精製酵素または部分的精製酵素を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施できる。
【００１８】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ｉ）キシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｐ−キシレン、４−メチルベンジルアルコール、ｐ−トルアルデヒドおよびｐ−トルイル酸よりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、（ｉｉｉ）４−ヒドロキシメチル安息香酸が産生される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養することを含んでなる単環式芳香族化合物上の両方の置換基を酸化して、４−ヒドロキシメチル安息香酸を生成する方法を提供する。好ましい４−ヒドロキシメチル安息香酸産生微生物は、キシレンモノオキシゲナーゼがプロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）から単離される細菌である。
【００１９】
本発明はさらに、（ｉ）キシレンモノオキシゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ断片を含んでなる組換え微生物を準備し、（ｉｉ）ステップ（ｉ）の組換え微生物を、ｍ−キシレン、３−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒドおよびｍ−トルイル酸よりなる群から選択される芳香族基質と接触させ、（ｉｉｉ）３−ヒドロキシメチル安息香酸が生成される条件下でステップ（ｉｉ）の微生物を培養することを含んでなる、３−ヒドロキシメチル安息香酸を生成する方法を提供する。好ましい３−ヒドロキシメチル安息香酸産生微生物は、キシレンモノオキシゲナーゼがプロテオバクテリアから単離される細菌である。
【００２０】
他の特定の実施形態において、本発明は、適切な置換された単環式基質を、所望の中間体形成のため、インビボまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｘｙｌＡサブユニットおよびｘｙｌＭサブユニットを含んでなるキシレンモノオキシゲナーゼ酵素と接触させることを含んでなる、ｐ−トルイル酸、ｐ−トルアルデヒド、４−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルイル酸、ｍ−トルアルデヒド、３−メチルベンジルアルコールなどの部分的に酸化された中間体を生成する方法を提供する。
【００２１】
最後に、本発明において見られる基質特異性の緩和を考えると、当業者は、その他のｏ−キシレン（１，２−ジメチルベンゼン）、２−メチルベンジルアルコール、ｏ−トルアルデヒド、ｏ−トルイル酸、５−スルホ−ｍ−キシレン、５−スルホ−３−メチルベンジルアルコール、５−スルホ−ｍ−トルアルデヒド、５−スルホ−ｍ−トルイル酸などの置換された単環式芳香族化合物が、本発明に有用な基質であることを予想するであろう。
【００２２】
本発明は、本出願の一部を成している以下の詳細な説明および添付の配列の説明から、より十分に理解することができる。
【００２３】
以下の配列の説明、および本明細書に添付された配列一覧は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５に提示された、特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示を管理している規則に従っている。配列の説明は、本明細書中に参照により組み込まれているＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３：３０２１〜３０３０頁（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（第２号）：３４５〜３７３頁（１９８４）に記載されているＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ基準に従って定義されたとおり、ヌクレオチド配列特性に対しては一文字コード、アミノ酸配列に対しては三文字コードを含む。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いられる記号と形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に提示された規則に従っている。
【００２４】
配列番号：１はプライマーｘｙｌＡＦ１である。
配列番号：２はプライマーｘｙｌＡＲ１である。
配列番号：３はプライマーＪＣＲ１４である。
配列番号：４はプライマーＪＣＲ１５である。
配列番号：５はスフィンゴモナス株ＡＳＵ１の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列である。
配列番号：６は長さ１２．５９１ｂｐのコンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）１２．５である。
配列番号：７はプライマーＡＳＵ１ＭＡＦ１である。
配列番号：８はプライマーＡＳＵ１ＭＡＲ１である。
配列番号：９はスフィンゴモナスＡＳＵ１ｘｙｌＭ遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号：１０はスフィンゴモナスＡＳＵ１ｘｙｌＭのアミノ酸配列である。
配列番号：１１はスフィンゴモナスＡＳＵ１ｘｙｌＡ遺伝子のヌクレオチド配列  である。
配列番号：１２はスフィンゴモナスＡＳＵ１ｘｙｌＡのアミノ酸配列である。
配列番号：１３はプライマーＷＷＯＦ１である。
配列番号：１４はプライマーＷＷＯＲ２である。
配列番号：１５はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｐＷＷＯｘｙｌＭ遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号：１６はシュードモナスｐＷＷＯｘｙｌＭのアミノ酸配列である。
配列番号：１７はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ｐＷＷＯｘｙｌＡ遺伝子のヌクレオチド配列である。
配列番号：１８はシュードモナスｐＷＷＯｘｙｌＡのアミノ酸配列である。
配列番号：１９はスフィンゴモナスｐＮＬ１ｘｙｌＭ遺伝子（ジーンバンク受入番号ＡＦ０７９３１７）のヌクレオチド配列である。
配列番号：２０はスフィンゴモナスｐＮＬ１ｘｙｌＭ（ジーンバンク受入番号ＡＦ０７９３１７）のアミノ酸配列である。
配列番号：２１はスフィンゴモナスｐＮＬ１ｘｙｌＡ遺伝子（ジーンバンクバンク受入番号ＡＦ０７９３１７）のヌクレオチド配列である。
配列番号：２２はスフィンゴモナスｐＮＬ１ｘｙｌＡ（ジーンバンク受入番号ＡＦ０７９３１７）のアミノ酸配列である。
【００２５】
発明の詳細な記述
本発明は、単環式芳香族上に複数の置換基を酸化する能力を有するキシレンモノオキシゲナーゼの使用に関する。２種のサブユニット（ｘｙｌＭおよびｘｙｌＡ）を有する本発明のキシレンモノオキシゲナーゼは、スフィンゴモナスＡＳＵ１およびプラスミドｐＷＷＯからクローン化し、大腸菌において発現させた。ある特定の実施形態において、本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼ酵素を含有した単一の組換え微生物を用いた、ｐ−キシレンから４−ヒドロキシメチル安息香酸への生体変換を伴う４−ヒドロキシメチル安息香酸の生成法を提供する。
【００２６】
本発明は、繊維、フィルム、塗料、接着剤および飲料容器に必要なポリエステルの生成において、モノマーとしての有用性を有する３−ヒドロキシメチル安息香酸、４−ヒドロキシメチル安息香酸、２−ヒドロキシメチル安息香酸、および５−スルホ−３−ヒドロキシメチル安息香酸全ての生物学的生成に有用である。生物学的方法は、よりコスト効果があり、環境に有害な廃棄物の生成が少ないため、本発明は３−ヒドロキシメチル安息香酸および４−ヒドロキシメチル安息香酸の合成技術を進歩させる。
【００２７】
本開示では、多くの用語や略語が用いられている。以下の定義が供される。
「安息香酸」はＢＡと略記される。
「ｐ−トルイル酸」はＰＴＡと略記される。
「ｐ−トルアルデヒド」はＰＴＬと略記される。
「エチレンジアミンテトラ酢酸」はＥＤＴＡと略記される。
「２，６−ジメチルナフタレン」は２，６−ＤＭＮと略記される。
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
【００２８】
本明細書中に用いられる「ＡＴＣＣ」とは、米国（２０１１０−２２０９）バージニア州マナサスのユニバーシティー通り１０８０１所在のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（アメリカンタイプ培養コレクション国際寄託）を言う。「ＡＴＣＣ  Ｎｏ．」とは、ＡＴＣＣに寄託された培養物への受入番号である。
【００２９】
用語の「４−ヒドロキシメチル安息香酸産生微生物」とは、ｐ−キシレンを４−ヒドロキシメチル安息香酸へ、またはｍ−キシレンを３−ヒドロキシメチル安息香酸へ変換させ、かつキシレンモノオキシゲナーゼ酵素を含んでなる任意の微生物を言う。
【００３０】
用語「生体転換」および「生体変換」は交換可能に用いられ、化合物を他の形態に、または他の化合物へ酵素的に変換する過程を言う。生体変換または生体転換過程は、典型的には生体触媒によって行われる。
【００３１】
本明細書中に用いられる用語「生体触媒」とは、特定の単数または複数の化合物の生体変換できる単数または複数の酵素を含有する微生物を言う。
【００３２】
用語「キシレンモノオキシゲナーゼ」とは、単環式構造上のメチル置換基および他のアルキル置換基を、対応するカルボン酸へと酸化する能力を有する酵素を言う。
【００３３】
用語「ｘｙｌＭ」とは、キシレンモノオキシゲナーゼの鉄含有ヒドロキシラーゼサブユニットをコードするＤＮＡ分子を言う。
【００３４】
用語「ｘｙｌＡ」とは、キシレンモノオキシゲナーゼのＮＡＤＨ結合電子伝達サブユニットをコードするＤＮＡ分子を言う。
【００３５】
用語「置換された単環式芳香族基質」とは、一般式
【００３６】
【化２】
2005512513.tif 000003
【００３７】
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は独立してＨまたはＣＨ３、またはＣ１からＣ２０の置換もしくは未置換アルキルまたは置換もしくは未置換アルケニルまたは置換もしくは未置換アルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも２つが存在し且つＨではない）を有する化合物を言う。
【００３８】
用語「アルキル」とは、任意の炭素原子からの水素原子によるアルカン由来の一価の基、すなわちＣｎＨ２ｎ＋１−を意味する。非分枝状アルカンの末端炭素からの水素原子除去に由来した基は、通常のアルキル（ｎ−アルキル）基の下位区分、すなわちＨ[ＣＨ２]ｎ−を形成する。ＲＣＨ２−、Ｒ２ＣＨ−（ＲはＨではない）およびＲ３Ｃ−（ＲはＨではない）基は、それぞれ、第一級アルキル基、第二級アルキル基、第三級アルキル基である。
【００３９】
用語「アルケニル」とは、炭素−炭素二重結合を有し、かつ一般式ＣｎＨ２ｎの非環式分枝状または非分枝状炭化水素を意味する。一つ以上の二重結合を有する非環式分枝状または非分枝状炭化水素は、アルカジエン、アルカトリエンなどである。
【００４０】
用語「アルキリデン」は、同一の炭素原子から２個の水素原子の除去によりアルカンから形成された二価の基で、その自由電子価は二重結合の部分である（例えば、（ＣＨ３）２Ｃ＝プロパン−２−イリデン）。
【００４１】
用語「単離された核酸断片」または「単離された核酸分子」とは、合成、非天然または変更ヌクレオチドを、場合によっては含有する一本鎖またはニ本鎖のＲＮＡポリマー、またはＤＮＡポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態にある単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、遺伝子ＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントからなる。
【００４２】
核酸分子の一本鎖形態が、温度と溶液イオン強度の適切な条件下、他の核酸分子にアニールできる場合、核酸分子はｃＤＮＡ、遺伝子ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの、他の核酸分子と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションの条件と洗浄条件は周知であり、ジェイ・サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、イー・エフ・フリッシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．）およびティー・マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー（１９８９）、特にその中の１１章と表１１．１（参照により全体を本明細書中に組み込んである）に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「緊縮性」を決定する。緊縮条件は、関連性の遠い生物の相同配列などのいくらか類似した断片の選別、密接に関連した生物の機能的酵素を複製する遺伝子などの高度に類似した断片の選別のために調整できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、緊縮条件を決定する。好ましい条件の１つでは、以下の一連の洗浄を用いる：室温で１５分間、６ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで開始、その後４５℃で３０分間、２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを反復し、次いで５０℃で３０分間、０．２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回反復。より好ましい緊縮条件では、より高い温度を用いるが、０．２ＸＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの最後の３０分間の洗浄温度を６０℃に上げること以外、洗浄は上記の条件と同じである。他の好ましい高緊縮条件では、６５℃、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを最後の２回の洗浄に用いる。ハイブリダイゼーションには、２種の核酸が相補的配列を含有することが必要であるが、ハイブリダイゼーションの緊縮性に依って、塩基間の誤対合が起こる可能性がある。核酸のハイブリッド形成のための適切な緊縮性は、核酸の長さ、および相補正の程度に依存し、変数は当業界に周知である。２種のヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高くなるにつれて、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに関するＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍ値に対応）は、以下の順序で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００個のヌクレオチド以上のハイブリッドに関しては、Ｔｍを算出する等式が誘導されている（サンブルックら、上記９．５０〜９．５１を参照）。それより短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチド類を用いるハイブリダイゼーションでは、誤対合の位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サンブルックら、上記１１．７〜１１．８を参照）。一実施形態では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０個のヌクレオチドである。ハイブリッド形成可能な核酸の最短の長さは、少なくとも約１５個のヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは、少なくとも約２０個のヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも約３０個のヌクレオチドの長さである。さらに、温度および洗浄溶液の塩濃度は、プローブの長さなどの要因に依って、適宜調整できることは、当業技術者に認識されるであろう。
【００４３】
用語「相補的」は、互いにハイブリッドを形成できるヌクレオチド塩基間の関係を述べるために用いられる。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンは、チミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。したがって、本発明はまた、添付する配列リストに報告された完全配列ならびに実質的に類似の核酸配列に相補的な単離された核酸断片を含む。
【００４４】
「コドン縮退」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変化を許容する遺伝子コードにおける相違を言う。したがって、本発明は、配列番号：１０、１６、２０、および配列番号：１２、１８、２２および配列番号：１２で示されたキシレンモノオキシダーゼ酵素をコードする全ての、または実質的部分をコードする任意の核酸断片に関する。当業技術者は、所与のアミノ酸を明示するために、ヌクレオチドコドンの利用において特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」についてよく認識している。したがって、宿主細胞において発現改善のための遺伝子を合成する場合、そのコドン利用頻度が宿主細胞の好ましいコドン利用頻度に近づくように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００４５】
「合成遺伝子」は、当業者に周知の方法を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチドのビルディングブロックから組み立てることができる。これらのビルディングブロックを結合し、遺伝子セグメントを形成するようにアニールし、次いで酵素的に組み立てて遺伝子全体を構築する。ＤＮＡ配列に関連する場合、「化学的に合成された」とは、ヌクレオチド成分がｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられることを意味する。ＤＮＡの手動による化学的合成が、十分に確立された方法を用いて達成でき、または自動化化学合成が、多くの商品入手できる機械装置の１つを用いて実施できる。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映させるヌクレオチド配列の最適化に基いた最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドンの使用が宿主により好まれるこれらコドンに対してバイアスされている場合、当業技術者は、遺伝子発現が好結果となる可能性を認識する。配列情報が入手できる宿主細胞由来の遺伝子調査に基いて好ましいコドンが決定できる。
【００４６】
「遺伝子」とは、特定の蛋白質を発現する核酸断片を言い、コード配列を先導する（５’非コード配列）およびコード配列に従う（３’非コード配列）調節配列を含む。「天然の遺伝子」とは、天然にそれ自体の調節配列と共に見出される遺伝子を言う。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見出されない調節配列とコード配列を含んでなる天然遺伝子ではない任意の遺伝子を言う。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源由来の調節配列とコード配列、または同一の起源由来ではあるが、天然に見出される様式とは異なる様式で配置される調節配列とコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」とは、生物のゲノム内に本来の位置にある天然遺伝子を言う。「外来」遺伝子とは、通常、宿主生物に見出されないが、遺伝子転移により宿主生物に導入される遺伝子を言う。外来遺伝子は、非天然生物またはキメラ遺伝子に挿入された天然遺伝子を含んでなることができる。「トランス遺伝子」は、形質変換法によりゲノムに導入された遺伝子である。
【００４７】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を言う。「好適な調節配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を言い、関連したコード配列の転写、RNAプロセシングまたはＲＮＡ安定性、または翻訳に影響を与える。調節配列としてはプロモータ類、翻訳リーダー配列、イントロン類、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができる。
【００４８】
「プロモータ」とは、機能的ＲＮＡのコード配列の発現を制御できるＤＮＡ配列を言う。一般に、コード配列は、プロモータ配列の３’に位置する。プロモータ類は、その全体が天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される種々のプロモータ類に由来する種々の要素からなるか、または合成ＤＮＡセグメントを含んでなることができる。種々のプロモータ類は、種々の組織または細胞種、または種々の発達段階、または種々の環境条件に応じて遺伝子発現を指令できることが当業者によって理解されている。多くの場合、大抵の細胞種において遺伝子を発現させるプロモータ類は、通常、「構成的プロモータ類」と呼ばれる。多くの場合、調節配列の正確な境界は、完全には定められていないことから、種々の長さのＤＮＡ断片類が、同一のプロモータ活性を有し得る。
【００４９】
「ＲＮＡ転写体」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から生じる生成物を言う。ＲＮＡ転写体がＤＮＡ配列の完全な相補的な複製物である場合、これは転写一次生成物と呼ばれ、またはＲＮＡ転写体が、転写一次生成物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列である場合もあり、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロン類がなく、また、細胞により蛋白質へと翻訳され得るＲＮＡを言う。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、ｍＲＮＡ由来の二重鎖ＤＮＡを言う。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、したがってＲＮＡ転写体を言い、細胞により蛋白質に翻訳できる。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的転写一次生成物、またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的で、標的遺伝子の発現を妨害するＲＮＡ転写体を言う（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写体のいずれかの部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列のいずれかであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、未だ翻訳されていないが、細胞過程に影響を及ぼすアンチセンスＲＮＡ、リゾチームＲＮＡ、または他のＲＮＡを言う。
【００５０】
用語「操作可能に結合した」とは、ある機能が他の機能によって影響を受けるような、１つの核酸断片上の核酸配列の対合を言う。例えば、あるプロモータが、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、このプロモータは操作可能に結合している（すなわち、コード配列は、そのプロモータの転写制御下にある）。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で調節配列と操作可能に結合できる。
【００５１】
本明細書で用いられる用語「発現」とは、本発明の核酸断片に由来するセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と着実な蓄積を言う。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を言う場合もある。
【００５２】
「形質変換」とは、ある核酸断片が宿主生物のゲノム中に移入することを言い、遺伝的に安定な遺伝形質を生じる。形質変換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物を言う。
【００５３】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」とは、細胞の中心的な部分ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常、環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある染色体外因子を言う。これらの因子は、任意の起源由来の自律複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであって、その中では、多くのヌクレオチド配列が独特の構造へと結合または組替えられて、適切な３’未翻訳配列と共に、選択された遺伝子生成物のためのプロモータ断片やＤＮＡ配列を細胞内へ導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含有し、かつ外来遺伝子の他に、ある特定の宿主細胞の形質転換を促進させる因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含有し、かつ外来遺伝子の他に、異種の宿主においてその遺伝子発現を高めることのできる因子を有する特定のベクターを指す。
【００５４】
用語の「配列分析ソフトウェア」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の分析に有用な何らかのコンピュータ演算法またはソフトウェアプログラムを言う。配列分析ソフトウェアは、商品として入手できるか、または独立して開発できる。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、限定はしないが、ＧＣＧプログラム一式（ウィスコンシン州マジソンのウィスコンシン・パッケージ・バージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）９．０、ジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））ＢＬＡＳＰ、ＢＬＡＳＴＡＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルトシュル（Ａｌｔｓｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（米国５３７１５ウィスコンシン州マジソン、パーク通り１２２８Ｓのディー・エヌ・エー・スター社（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．））、およびスミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）演算を組み込んだＦＡＳＴＡプログラム（ダブリュー・アール・ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、[Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．]（１９９４）、１９９２年開催、１１１〜２０頁。編集者：スハイ（Ｓｕｈａｉ）、サンダー（Ｓａｎｄｏｒ）。出版元：ニューヨーク州ニューヨークのプレナム（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））が挙げられる。本出願の明細書内では、配列分析ソフトウェアが分析に用いられる場合、分析結果は、他に特記しない限り、参照プログラムの「デフォルト値」に基くことが理解されよう。本明細書中に用いられる「デフォルト値」とは、最初の初期化時に、ソフトウェアに当初ロードされていた何らかの数値またはパラメータのセットを意味する。
【００５５】
本明細書中に用いられる標準的な組替えＤＮＡ法および分子クローニング法は、当業界に周知であり、ジェイ・サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、イー・エフ・フリッシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびティー・マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、（１９８９）（以後「マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；ティ・ジェイ・シルハーヴィ（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、エム・エル・ベナン（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）およびエル・ダブリュー・エンキスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのコールドスプリングハーバー・ラボラトリイ・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、（１９８４）；エフ・エム・オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．）ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、グリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ワイリイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）により出版（１９８７））によって記載されている。
【００５６】
本発明は、キシレンモノオキシゲナーゼにより置換された単環式芳香族の酸化法を記載している。好ましい方法では、キシレンモノオキシゲナーゼ酵素を含有する単一の組換え微生物を用いたｐ−キシレンの４−ヒドロキシメチル安息香酸への生体変換を含む４−ヒドロキシメチル安息香酸の生成を記載している。本発明の他の好ましい実施形態では、キシレンモノオキシゲナーゼ酵素を含有する単一の組換え微生物を用いた、ｍ−キシレンが酵素的に３−ヒドロキシメチル安息香酸へと変換される。本発明の他の実施形態は、キシレンモノオキシゲナーゼ酵素を含有する単一の組換え微生物を用いた、ｏ−キシレンから２−ヒドロキシメチル安息香酸への酵素的変換を含む。本発明のさらに他の実施形態は、キシレンモノオキシゲナーゼ酵素を含有する単一の組換え微生物を用いた、５−スルホ−ｍ−キシレンから５−スルホ−３−ヒドロキシメチル安息香酸変換への酵素的変換を含む。
【００５７】
本発明において好適なキシレンモノオキシゲナーゼの２つの例が単離され、証明された。キシレンモノオキシゲナーゼの１つは、活性スラッジから単離された細菌で、１６ＳｒＲＮＡ配列によりスピンゴモナス種に分類されたものから得られた。スピンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼＸｙｌＭサブユニットは、配列番号：１０で示され、配列番号：９で示される核酸分子によってコードされる。スピンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼＸｙｌＡサブユニットは、配列番号：１２で示され、配列番号：１１で示される核酸分子によってコードされる。
【００５８】
本発明の他のキシレンモノオキシゲナーゼは、シュードモナス‐プディータ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｄｉｔａ）株ＡＴＣＣ３３０１５細菌に含有されるプラスミドｐＷＷＯから単離される。シュードモナスキシレンモノオキシゲナーゼＸｙｌＭサブユニットは、配列番号：１６で示され、配列番号：１５で示される核酸分子によってコードされる。シュードモナスキシレンモノオキシゲナーゼＸｙｌＡサブユニットは、配列番号：１８で示され、配列番号：１７で示される核酸分子によってコードされる（上記、アシンダーら）。
【００５９】
上記のように、スピンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼとシュードモナスキシレンモノオキシゲナーゼの双方とも、２種の酵素サブユニットからなる。１種のサブユニットは、ｘｙｌＡオープンリーディングフレームによってコードされ、ＮＡＤＨ結合電子伝達サブユニットをコードする。もう一種のサブユニットは、ｘｙｌＭオープンリーディングフレームによってコードされ、鉄含有ヒドロキシラーゼをコードする。スピンゴモナスＸｙｌＭ蛋白質の配列を、標準的演算法を用いて公共のデータベースと比較し、他の知られた一遺伝子とアミノ酸レベルで９８％の同一性を有することを見出した。
【００６０】
キシレンモノオキシゲナーゼ活性を有する微生物の単離
本発明のキシレンモノオキシゲナーゼは、種々の供給源から単離できる。好適な供給源としては、工業廃液、汚染工業現場および廃液処理施設からの土壌が挙げられる。本発明のキシレンモノオキシゲナーゼの１つは、廃水処理施設の活性スラッジから単離された。
【００６１】
キシレンモノオキシゲナーゼを含有していると思われるサンプルは、少なくとも１種の芳香族有機基質と組合わせた好適な増殖培地における温置によりエンリッチできる。好適な基質としては、４−ヒドロキシメチル安息香酸生合成経路の酵素によって生態転換される中間体が挙げられる。本発明に使用される好適な芳香族有機基質としては、限定はしないが、ｐ−キシレン、４−メチルベンジルアルコール、ｐ−トルアルデヒド、ｐ−トルイル酸、ｍ−キシレン、３−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒド、ｍ−トルイル酸、ｏ−キシレン、５−スルホ‐ｍ−キシレン、５−スルホ−３−メチルベンジルアルコール、５−スルホ−ｍ−トルアルデヒド、５−スルホ−ｍ−トルイル酸が挙げられ、そのうち、ｐ−キシレンとｍ−キシレンが好ましい。組換え微生物は、唯一の炭素源として、種々の幾つかの芳香族基質を利用できることが好ましい。したがって、例えば、好ましい微生物は、ｐ−キシレンおよび他の中間体で増殖できる。本発明における他の好ましい中間体は、ｐ−トルイル酸である。
【００６２】
微生物のエンリッチメントとスクリーニングに必要な増殖培地と方法は、当業界によく知られており、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（フィリップ・ガーハート（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、アール・ジー・イー・ミューレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ・エヌ・コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン・ダブリュー・ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス・エイ・ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびジー・ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編集）、アメリカ微生物学会、ワシントン、ＤＣ．（１９９４）；またはトーマス・ディー・ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９）、マサチューセッツ州サンダーランドのシナウアー・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．）、に例が見られる。
【００６３】
キシレンモノオキシゲナーゼ含有微生物の特性評価
キシレンモノオキシゲナーゼ含有微生物（ＡＳＵ１株）の一例は、前記微生物の１６ｓＲＮＡ遺伝子配列の分析により、スフィンゴモナス種として同定された。標準プロトコル（上記、マニアチス）に従って１６ｓＲＮＡを増幅し、ＡＳＵ１株からクローン化し、公共のデータベースにおける配列と比較した。この比較により、ＡＳＵ１の１６ＳｒＲＮＡは、スフィンゴモナスの幾つかの株に対して、著しく高い相同性を有していることが判明した。
【００６４】
スフィンゴモナスは、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、パンドレア（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）が例として挙げられる。プロテオバクテリアは生理学的に微生物の多様な群を形成し、５つの亜門（α、β、γ、ε、δ）を示す（マディガン（Ｍａｄｉｇａｎ）ら、「Ｂｒｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、第８版、ニュージャージー州アッパーサドルリバーのプレンティス・ホール（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ）（１９９７））。プロテオバクテリアの５つの亜門全てが、炭素とエネルギーの供給源として有機化合物を利用する微生物を含有している。単離された特定の微生物は、スフィンゴモナス属であるが、上記の方法によって単離された他のプロテオバクテリアの一員、例えば、シュードモナス（γ亜門）は好適であると考えられる。なぜならば、芳香族化合物の代謝に関する遺伝子は、プラスミド上に局在化していることが多いが、プラスミドは、プロテオバクテリアのメンバー間でしばしば転移できるからである（上記アシンダーおよびウィリアムス）；スプリンゲル（Ｓｐｒｉｎｇａｅｌ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４２：３２８３〜３２９３頁（１９９６））。
【００６５】
したがって、限定はしないが、バークホルデリア、アルカリゲネス、シュードモナス、スフィンゴモナス、ノボスフィンゴビウム、およびコマモナスなどの細菌群から単離されたキシレンモノオキシゲナーゼはいずれも本発明に好適であると考えられる。
【００６６】
キシレンモノオキシゲナーゼ相同体の同定
本発明は、ｐ−キシレンから４−ヒドロキシメチル安息香酸へ、またｍ−キシレンから３−ヒドロキシメチル安息香酸へと生体変換する能力を有するキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子および遺伝子生成物の例を提供する。限定はしないが、これらの中には、スピンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼ（配列番号：１０〜１２により同定）、シュードモナスキシレンモノオキシゲナーゼ（ＡＴＣＣ株３３０１５、上記アシンダーら）、配列番号：１５〜１８により同定）およびスフィンゴモナスプラスミドＰＮＬ１（ジーンバンク受入番号、ＡＦ０７９３１７）キシレンモノオキシゲナーゼ（配列番号：１９〜２２により同定）が含まれる。同様の基質特異性を有する他のキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子が、配列依存プロトコルに基いて、同定、単離できることは認識されるであろう。
【００６７】
配列依存プロトコルを用いた相同体の分離は当業界でよく知られている。配列依存プロトコルの例としては、限定はしないが、核酸ハイブリダイゼーション法、および核酸増幅法の種々の利用法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、「ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）」、エス・テイバー（Ｔａｂｏｒ，Ｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、１０７４頁（１９８５））または鎖置換増幅（ＳＤＡ、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、３９２頁（１９９２））に例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法が挙げられる。
【００６８】
例えば、本発明のキシレンモノオキシゲナーゼと類似した蛋白質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られた方法論を用い、配列番号：９、１１、１５、１７、１９、２１に示された核酸断片の全部または一部を利用して直接、またはＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして用いて単離し、所望の細菌ライブラリをスクリーンすることができると考えられる。当該核酸配列に基く特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当業界によく知られた方法（マニアチス）によってデザインし合成できる。さらに、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳さらに、末端標識法、または入手できるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システムを用いるＲＮＡプローブなど、当業技術者に知られた方法により、配列の全体をＤＮＡプローブ類を合成するために直接利用できる。さらに、特定のプライマー類をデザインし、本配列の一部または完全長を増幅させるために使用できる。得られた増幅生成物を、増幅反応中に直接標識または増幅反応後に標識でき、適切な緊縮条件下で完全長のＤＮＡ断片単離するためのプローブとして用いることができる。
【００６９】
典型的には、ＰＣＲタイプのプライマー指令型増幅法において前記プライマー類は、種々の配列を有し、互いに相補的ではない。所望の試験条件に依って、前記プライマー類の配列は、標的核酸の効率的で忠実な複製に供するようにデザインされる必要がある。ＰＣＲプライマーデザイン法は、当業界に一般的でよく知られている（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ケイ・イー・デイビス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編集、（１９８６）３３〜５０頁、バージニア州ヘルンドンのＩＲＳプレス（Ｐｒｅｓｓ））；ダブリュー・リチリク（Ｒｙｃｈｌｉｋ、Ｗ．）、ビー・エイ・ホワイト（Ｗｈｉｔｅ、Ｂ．Ａ．）（編集）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９９３）、１５巻、３１〜３９頁、「ＰＣＲプロトコル：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ニュージャージー州トトワヒュ‐マニア・プレス（Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ））。
【００７０】
一般に、ＰＣＲプライマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の相同遺伝子をコードする、より長い核酸断片を増幅するために用いることができる。しかし、前記ポリメラーゼ連鎖反応はまた、あるプライマーの配列が前記核酸断片から導入される、クローン化核酸断片類のライブラリ上で実施できる。あるいは、第２のプライマー配列は、クローン化ベクター由来の配列に基くことができる。例えば、当業技術者は、ＰＣＲを用いて転写体の一点と３’末端または５’末端との間の領域の複製を増幅し、ｃＤＮＡを生成させるＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：８９９８（１９８８））を利用できる。本配列から、３’および５’方向に方向付けられたプライマー類をデザインできる。商品として入手できる３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ−メリーランド州ロックビレのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いて、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片類を単離できる（オーハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８６：５６７３頁（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２１７頁（１９８９））。
【００７１】
あるいは、本配列は、同族体同定のためのハイブリダイゼーション試剤として使用できる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素としては、プローブ、関心対象の遺伝子または遺伝子断片を含有すると考えられるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が挙げられる。本発明のプローブは、典型的には、検出すべき核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出すべき核酸配列と「ハイブリッド形成可能」である。プローブ長は５塩基から数万塩基にわったて変えることができ、実施される特定の試験に依存する。典型的には、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が好適である。検出すべき核酸配列に相補的であることが必要なのはプローブ分子の一部だけである。また、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、不完全な相補的分子間でも生じ、その結果、ハイブリッド形成された領域における塩基のある一定の部分は、本来の相補的塩基と対合していない。
【００７２】
ハイブリダイゼーション法は、十分に規定されている。典型的には、プローブとサンプルを、核酸のハイブリダイゼーションを可能とする条件下で混合しなければならない。このことは、プローブとサンプルを無機塩または有機塩の存在のもとで、適切な濃度と温度条件下で接触させることを含む。プローブと核酸サンプルとの間に全ての可能なハイブリダイゼーションが生じ得るように、プローブと核酸サンプルを十分長時間接触させなければならない。混合物中のプローブ、または標的物の濃度により、ハイブリダイゼーションが生じるために必要な時間が決定される。プローブまたは標的物濃度が高いほど、必要とされるハイブリダイゼーション温置時間は短くなる。場合によっては、カオトロピック試剤を加えてもよい。カオトロピック試剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化させる。さらに、カオトロピック試剤は、短いオリゴヌクレオチドプローブの鋭敏な緊縮ハイブリダイゼーションを室温で可能にする（ヴァンネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３〜５１５１頁（１９９１））。その中の好適なカオトロピック試剤としては、特に塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的には、カオトロピック試剤は３Ｍの最終濃度で存在する。必要に応じて、典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドをハイブリダイゼーション混合物に添加することができる。
【００７３】
典型的には、これらは、約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶媒を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液には、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５Ｍ〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５Ｍ〜０．１Ｍのクエン酸ナトリム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの緩衝剤、約０．０５％〜０．２％のドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤、または０．５ｍＭ〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（ウィスコンシン州ミルウォキー、ファーマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ））（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）および血清アルブミンが用いられる。典型的なハイブリダイゼーション溶液にはまた、例えば子牛胸腺ＤＮＡまたはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡなどの約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの核断片ＤＮＡ由来の未標識担体核酸、および場合によっては、約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌグリシンが含まれる。ポリエチレングリコール、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオン性ポリマー類、および硫酸デキストランなどのアニオン性サッカライドのポリマー類などの種々の極性水溶性試剤または膨潤性試剤を含む体積排除試剤などの他の添加物もまた含み得る。
【００７４】
組換え体の発現
当該キシレンオキシゲナーゼ配列の遺伝子および遺伝子生成物は、微生物宿主細胞内へ導入できる。当該遺伝子および核酸分子を発現する好ましい宿主細胞は、真菌群または細菌群の中に広く見出すことができ、温度、ｐＨ値および溶媒耐容性の広範囲にわたって増殖する微生物宿主である。転写、翻訳および蛋白質生合成装置は、細胞の供給源に係りなく同一であるため、機能的遺伝子は、細胞バイオマスを生成するために用いられる炭素供給源に係りなく発現する。光合成宿主または化学的独立栄養宿主の場合、大規模な微生物増殖および機能的遺伝子発現では、広範囲の単純、または複雑な炭水化物、有機酸やアルコール、メタン、二酸化炭素などの飽和炭水化物を利用できる。しかし、機能的遺伝子は、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または少量の無機イオン類などの微量栄養物の形態と量を含む特定の増殖条件によって調節、抑制または低下させることができる。さらに、培養液に添加され、典型的には栄養源またはエネルギー源としては考えられていない特定の調節分子の存在または非存在下で機能的遺伝子の調節が達成できる。遺伝子発現においては増殖率もまた重要な調節因子となり得る。好適な宿主株の例としては、限定はしないが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの真菌または酵母種、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、パンドレア（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）などの細菌種が挙げられる。
【００７５】
微生物発現システムおよび外来蛋白質の高濃度発現を指令する調節配列を含む発現ベクターは当業者によく知られている。これらのうちのいずれかが、当該配列のいずれかの遺伝子生成物生成のためのキメラ遺伝子を構築するために用いることができると考えられる。次にこれらのキメラ遺伝子を形質変換により適切な微生物内へ導入され、高濃度の酵素発現を準備することができると考えられる。
【００７６】
好適な宿主細胞の形質転換に有用なベクター類、またはカセット類は当業界によく知られている。典型的にはベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択性マーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。好適なベクター類は、転写開始を制御する遺伝子の５’領域および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞に相同の遺伝子から誘導される場合が最も好ましいいが、このような制御領域は、産生宿主として選択された特定種に固有の遺伝子から誘導される必要はないことは理解すべきである。
【００７７】
所望の宿主細胞内に当該ＯＲＦ類の発現を推進するために有用な開始制御領域、すなわちプロモーター類は数多く存在し、当業者に周知である。事実上、これらの遺伝子を働かせることのできるいずれのプロモーターも本発明に好適であり、限定はしないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０，ＡＤＨ１，ＰＧＫ、ＰＨＯ５，ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１，ＴＲＰ１，ＵＲＡ３，ＬＥＵ２，ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセスにおける発現に有用）；ＡＯＸ１（ピヒアにおける発現に有用）；およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ＩＰＬ、ＩＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌における発現に有用）、ならびにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーター類およびバシラス属における発現に有用である種々のファージプロモーター類が挙げられる。
【００７８】
終結制御領域もまた、好ましい宿主に固有の種々の遺伝子から誘導できる。場合によっては、終結部位は必要ないが、含まれていれば最も好ましい。
【００７９】
キシレンモノオキシゲナーゼを含んでなる好適な発現カセットが構築されると、それを本発明の方法における使用に好適な宿主を形質転換するために利用できる。本発明において好ましいカセット類は、キシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＭサブユニットとｘｙｌＡサブユニットの双方を含有するカセット類であり、ここで、
ｘｙｌＭサブユニットは、
（ｉ）配列番号：１０、配列番号：１６および配列番号：２０よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対して９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に完全に相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子によってコードされ、
また、ｘｙｌＡサブユニットは、
（ｉ）配列番号：１２、配列番号：１８および配列番号：２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｉｉ）（ｉ）に対して９５％同一性を有する単離された核酸分子、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）に完全に相補的な単離された核酸分子
よりなる群から選択される単離された核酸分子によってコードされる。
【００８０】
４−ヒドロキシメチル安息香酸および中間体の製造方法
種々の置換された単環式芳香族化合物を対応するカルボン酸と関連化合物に酸化するために、本発明のキシレンモノオキシダーゼを使用してもよい。具体的に本発明の方法は、４−ヒドロキシメチル安息香酸に対して用いることができる。
【００８１】
当該反応に対する好適な基質は、式
【００８２】
【化３】
2005512513.tif 000004
【００８３】
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は独立してＨまたはＣＨ３、またははＣ１からＣ２０の置換もしくは未置換アルキルまたは置換もしくは未置換アルケニルまたは置換もしくは未置換アルキリデンであり、Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも２つが存在し且つＨではない）によって定められる。
【００８４】
単環式芳香族化合物の生成が望まれる場合の基質としては、限定はしないが、ｐ−キシレン、４−メチルベンジルアルコール、ｐ−トルアルデヒド、ｐ−トルイル酸、ｍ−キシレン、３−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒド、ｍ−トルイル酸、ｏ−キシレン、２−メチルベンジルアルコール、ｏ−トルアルデヒド、ｏ−トルイル酸、５−スルホ−ｍ−キシレン、５−スルホ−３−メチルベンジルアルコール、５−スルホ−ｍ−トルアルデヒド、および５−スルホ−ｍ−トルイル酸が挙げられる。
【００８５】
４−ヒドロキシメチル安息香酸または３−ヒドロキシメチル安息香酸の生成が望まれる場合、キシレンモノオキシダーゼを含有する組換え微生物を好適な増殖培地中、置換された単環式芳香族基質と接触させ、４−ヒドロキシメチル安息香酸または３−ヒドロキシメチル安息香酸の生成に関して、反応培地をモニタする。
【００８６】
４−ヒドロキシメチル安息香酸または３−ヒドロキシメチル安息香酸および他の生成物の商業的生成が望まれる場合、種々の培養方法論が適用できる。例えば、組換え微生物宿主からの大規模生成は、バッチ方法論または連続培養方法論の双方により生成できる。
【００８７】
古典的なバッチ培養法は、培養液の組成が培養開始時に設定され、培養過程の間、人工的変更に受けない閉鎖システムである。したがって、培養過程の開始時に、所望の単一または複数の生物が接種され、このシステムに何も添加せずに、増殖活性または代謝活性を生じさせる。しかし、典型的には「バッチ」培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨや酸素濃度などの因子を制御して試みられる。バッチシステムにおいて、代謝物およびシステムのバイオマス組成は、培養終了時まで、一定して変化する。バッチ培養中の細胞は、静的な誘導期から高増殖対数期まで、そして最終的には増殖が減少、または停止する定常期へと緩やかに進む。処理されなければ、定常期の細胞は結局死滅する。対数期の細胞は、最終生成物またはあるシステムでは、中間体の生成バルクを生じさせることが多い。定常期の生成または対数期後の生成は他のシステムにおいて得ることができる。
【００８８】
標準的バッチシステムの変法に供給バッチシステムがある。供給バッチ培養法もまた、本発明において好適であり、培養の進行に応じて基質を徐々に増量し、添加していくこと以外は典型的なバッチシステムを含んでなる。カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があり、培養液中の基質量を制限したい場合に、供給バッチシステムは有用である。供給バッチシステムにおける実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶解酸素、および二酸化炭素などの廃ガス分圧などの測定可能な因子の変化に基いて予測される。バッチ培養法と供給バッチ培養法は当業界において一般的に周知であり、それらの例は、参照により本明細書中に組み込まれている、トーマス・ディー・ブロック（Ｔｈｏｍａｓ、Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版（１９８９）、マサチューセッツ州サンダーランドのシナウアー・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．）、またはムクンド・ヴィー・デシュパンデ（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６、２２７頁（１９９２））に見ることができる。
【００８９】
４−ヒドロキシメチル安息香酸または３−ヒドロキシメチル安息香酸の商業的生成はまた、連続培養によって達成できる。連続培養は、規定の培養培地がバイオ反応器に連続的に添加され、同時に、順化培地のある等しい量を同時に除去されて処理する開放システムである。連続培養は一般に、一定の高い液相密度で細胞を維持し、細胞は主として対数増殖期にある。あるいは、連続培養は固定化細胞により実施でき、そこで炭素および栄養物を連続的に添加して、価値のある生成物、副生成物、または廃棄物を、細胞マスから連続的に除去する。細胞の固定化は、天然および／または合成材料からなる広範囲の固体支持体を用いて行うことができる。
【００９０】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終生成物濃度に影響を与える１つの因子または幾つかの数の因子のモジュレーションができる。例えば、一方法では、炭素源または窒素濃度などの栄養物を一定の割合に制限することが維持され、他の全てのパラメータは適度にされる。他のシステムでは、増殖に影響を与える多数の因子を連続的に変化させる一方で、培地濁度を測定して細胞濃度を一定に保持する。連続システムは定常状態の増殖条件を維持するために努めるもので、培地除去による細胞損失と培養中の細胞増殖率との均衡を保持しなければならない。連続培養処理のために栄養物および増殖因子をモジュレートする方法、ならびに生成物の形成率を最大化する技術は、工業的微生物学分野でよく知られており、種々の方法が上記ブロックにより詳述されている。
【００９１】
４−ヒドロキシメチル安息香酸、３−ヒドロキシメチル安息香酸、２−ヒドロキシメチル安息香酸、５−スルホ−３−ヒドロキシメチル安息香酸および関連中間体の生成法
４−ヒドロキシメチル安息香酸、３−ヒドロキシメチル安息香酸、２−ヒドロキシメチル安息香酸または５−スルホ−３−ヒドロキシメチル安息香酸を生成するために、本発明のキシレンモノオキシゲナーゼが使用することができる。４−ヒドロキシメチル安息香酸の生成が望まれる場合、キシレンモノオキシゲナーゼを含有する組換え微生物を、好適な増殖培地中、ｐ−キシレンと接触させ、４−ヒドロキシメチル安息香酸の生成に関して反応培地をモニタする。本法はまた、それぞれのキシレン基質（４−ヒドロキシメチル安息香酸に対してはｐ−キシレン、３−ヒドロキシメチル安息香酸に対してはｍ−キシレン、２−ヒドロキシメチル安息香酸に対してはｏ−キシレン、５−スルホ−３−ヒドロキシメチル安息香酸に対しては５−スルホ−ｍ−キシレン）の生体変換において生じ得る４−ヒドロキシメチル安息香酸、３−ヒドロキシメチル安息香酸、２−ヒドロキシメチル安息香酸または５−スルホ−３−ヒドロキシメチル安息香酸生合成経路の何らかの中間体の生成にも有用である。したがって、例えば、４−メチルベンジルアルコール、ｐ−トルアルデヒド、ｐ−トルイル酸など、４−ヒドロキシメチル安息香酸生成に関連した中間体および３−メチルベンジルアルコール、ｍ−トルアルデヒドおよびｍ−トルイル酸など、３−ヒドロキシメチル安息香酸生成に関連した中間体のいずれもが、当該４−ヒドロキシメチル安息香酸微生物によって生成できると考えられる。さらに、２−メチルベンジルアルコール、ｏ−トルアルデヒド、ｏ−トルイル酸など、２−ヒドロキシメチル安息香酸生成に関連した中間体、および５−スルホ−３−メチルベンジルアルコール、５−スルホ−ｍ−トルアルデヒドおよび５−スルホ−ｍ−トルイル酸など、５−スルホ−ｍ−ヒドロキシメチル安息香酸生成に関連した中間体が、当該４−ヒドロキシメチル安息香酸微生物によって生成できると考えられる。
【実施例】
【００９２】
本発明は、以下の実施例においてさらに明らかにされる。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、例証のためにのみ供されることを理解する必要がある。上記考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認でき、その精神および範囲を逸脱することなく、種々の使用法および条件に適合させるために本発明の種々の変更と修飾を行うことができる。
【００９３】
一般法
以下の実施例に用いられる好適な方法は、ジェイ・サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．）、イー・エフ・フリッシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．）およびティー・マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、コールドスプリングハーバー・ラボラトリ・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）（１９８９）（以後マニアチス）に見ることができる。
【００９４】
細菌培養の維持と増殖に好適な材料と方法は、当業界に周知である。以下の実施例に使用するために好適な方法は、一般細菌学の方法のマニュアル（フィリップ・ガーハート（Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、アール・ジー・ムレイ（Ｒ．Ｇ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ・エヌ・コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーン・ダブリュー・ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリアム・エイ・ウッド（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル・アール・クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびジー・ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、アメリカ微生物学会、ワシントンＤＣ（１９９４））において、またはトーマス・ディー・ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、マサチューセッツ州サンダーランドのシナウアー・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）（１９８９）により提示されているものを見ることができる。細菌細胞の増殖と維持のために用いられる全試薬および材料は、他に指定しない限り、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー）、ＤＩＦＣＯラボラトリース（ミシガン州デトロイト）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ）、またはシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス）から入手した。
【００９５】
略語の意味は以下のとおりである：「ｈ」は、時間を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｓｅｃ」は、秒を意味し、「ｄ」は、日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分、すなわち、１リットル当りのミリグラム数を意味する。
【００９６】
培地：
エンリッチメント培養を設定するために、合成Ｓ１２培地を用いた。Ｓ１２培地は、以下のものを含有する：１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３，１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、および０．０００１％ＦｅＳＯ４および２μｍ塩酸チアミン。
【００９７】
Ｓ１２寒天を用いて、２，６−ジメチルナフタレン（２，６−ＤＭＮ）上で増殖する細菌をエンリッチメント培養液から単離し、炭素源とエネルギー源での増殖に関して、単離体を試験した。Ｓ１２寒天は、Ｓ１２培地に１．５％ノーブル（Ｎｏｂｌｅ）寒天を添加することにより調製した。
【００９８】
標準Ｍ９最少培地を用いて、クローン化キシレンモノオキシゲナーゼによる大腸菌のｐ−キシレン酸化をアッセイした。Ｍ９培地は、４２．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２２．１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．６ｍＭ  ＮａＣｌ、１８．７ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４および０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２からなった。０．４％のグリセロールを炭素／エネルギー源として用いた。
【００９９】
細菌株およびプラスミド類：
細菌スフィンゴモナス株ＡＳＵ１は、工業廃液処理施設から入手した活性スラッジから単離した。シュードモナス‐プディタ株ＡＴＣＣ３３０１５は、アメリカンタイプ培養コレクション（バージニア州マナサス）から入手した。大腸菌ＸＬ１−ブルーＭＲおよびスーパー・コス１・コスミドベクターは、スーパー・コス１・コスミド・ベクター・キット（ＳｕｐｅｒＣｏｓ１Ｃｏｓｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ）（カリフォｒニア州ラジョラのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））の一部として購入した。大腸菌ＤＨ５αのマックスエフィシェンシー（ＭａｘＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）（登録商標）のコンピテント細胞は、ギブコ（Ｇｉｃｃｏ）ＢＲＬ・ライフ・テクノロジーズ（メリーランド州ロックビル）から購入した。ＰＣＲ生成物のクローニングに用いる大腸菌株ＴＯＰ１０およびプラスミドベクターｐＣＲコンピテント細胞２．１−ＴＯＰＯ（商標）は、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カリフォルニア州カールスバッド）からキットとして購入した。
【０１００】
スフィンゴモナス株ＡＳＵ１コスミドライブラリの構築
スフィンゴモナス株ＡＳＵ１を、２５ｍＬのＬＢ培地において、３０℃で１６時間、振とうさせながら増殖させた。細菌細胞を、４℃でＳＳ３４ロータを用いて、ソルヴォール（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＲＣ５Ｃ遠心分離機（コネチカット州ニュータウンのケンドロー・ラブ・プロダクツ（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））にて、１０．０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄液をデカントし、細胞ペレットを２ｍＬのＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に静かに再懸濁させた。リゾチームを最終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌまで加えた。この懸濁液を３７℃で１５分間温置した。次にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度０．５％まで加え、プロテイナーゼＫを最終濃度、５０μｇ／ｍＬまで加えた。この懸濁液を５５℃で２時間温置した。懸濁液が透明になったら、この透明なライゼートを等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、水相を慎重に取り出し、新しい試験管に移した、水相を等容量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、水相を慎重に取り出し、新しい試験管に移した。０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量の無水エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを封孔ガラスパスツールピペットに静かに巻きつかせた。このＤＮＡを７０％エタノールで静かに洗浄し、風乾した。このＤＮＡを１ｍＬのＴＥに再懸濁させた。ＤＮＡを３７℃で３０分間ＲナーゼＡ（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）で処理した。次にＤＮＡをフェノール／クロロホルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、上記のとおり沈殿させた。このＤＮＡを１ｍＬのＴＥに再懸濁し、４℃で保存した。ＤＮＡの濃度と純度は、分光光度分析で、２６０ｎｍでの吸収対２８０ｎｍでの吸収比を測定することにより決定した。
【０１０１】
染色体ＤＮＡは、スーパー・コス１・コスミド・ベクター・キットの取扱い説明書に概略されているように、Ｓａｕ３Ａ（ウィスコンシン州マジソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））により部分消化させた。ＤＮＡ（３０μｇ）は、２５℃で５０μＬ反応容量において、Ｓａｕ３Ａの０．８単位によって消化させた。５μＬのアリコートを５分おきに反応管から、反応混合物が空になるまで取り出した。各アリコートを、１μＬのゲル付加緩衝液および１μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡと共に管に入れ、全てのアリコートを採取し得るまで氷上で保存した。アリコートを７５℃に加熱し、０．３％寒天ゲル上で分析し、消化速度を測定した。染色体ＤＮＡのサイズの減少は、反応時間の長さの増加に対応していた。３０μｇのＤＮＡを５０μＬ反応容量において、２５℃で３０分間、０．８単位のＳａｕ３Ａによって消化させる調製反応を行った。１０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加および反応液を７５℃に１０分間加熱することにより、消化を停止させた。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの等量で１回、クロロホルム：イソアミルアルコールの等量で１回抽出した。０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量の無水エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを５０μＬの水に再懸濁させた。部分消化されたＤＮＡを子牛腸アルカリホルファターゼ（ＣＩＡＰ）（ギブコＢＲＬ・ライフ・テクノロジーズ）によって、製造元により供給された１００μＬ反応緩衝液中、脱リン酸した。反応液を３７℃で３０分間温置した。さらに１μＬのＣＩＡＰを加え、反応液をさらに３０分間温置した。６００μＬの停止緩衝液（１００μＬ  １ＭトリスｐＨ７．５、２０μＬ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ，２ｍＬ  １Ｍ  ＮａＣｌ、２５０μＬ  ２０％ＳＤＳ、６００μＫ水）を加えて、反応を停止させ、この反応液を７０℃で１０分間温置した。反応液を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの等量で１回、クロロホルム：イソアミルアルコールの等量で１回抽出した。０．５容量の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容量の無水エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを２０μＬのＴＥに再懸濁させた。
【０１０２】
スーパー・コス１・コスミド・ベクター・キットの取扱い説明書に従って、調製したスーパーコス１ベクターＤＮＡに、脱リン酸ＡＳＵ１ＤＮＡを結合させた。ストラタジーンにより推奨されたギガパック（Ｇｉｇａｐａｃｋ）（登録商標）ＩＩＩＸＬパッケージング抽出物を用い、製造元の取扱い説明書に従って、結合ＤＮＡをラムダファージ層の中へパッケージされた。大腸菌ＸＬ１−ブルーＭＲによって感染させ、感染細胞をアンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）と共にＬＢ寒天上に乗せて測定すると、パッケージされたＡＳＵ１遺伝子ＤＮＡライブラリは、ＤＮＡ１μｇにつき、１．２×１０３コロニー形成単位の力価を含有した。任意に選択された６種の大腸菌形質転換体からコスミドＤＮＡが単離され、ＤＮＡの大型挿入体（２５〜４０ｋｂ）を含有していることが判明した。
【０１０３】
キシレンモノオキシゲナーゼに関するＡＳＵ１株コスミドライブラリのスクリーンイング
アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍＬ）含有のＬＢブイヨンを微量滴定用プレートのウェル（マサチューセッツ州アクトンのコーニング・ライフ・サイエンス、低蒸発皿付きコースター（Ｃｏａｓｔａｒ）（登録商標）＃３５９５を用い、２００μＬ／ウェル）に分配した。各ウェルに１種の組換え大腸菌コロニーを接種した。各プレートをエア‐ポア（Ａｉｒ−Ｐｏｒｅ）フィルム（カリフォルニア州ヴァレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））で覆い、プレートを３７℃で１６時間、振とう台の上で温置した。これらの微量滴定用プレートは、「カルチャー・セット＃１」と称された。
【０１０４】
微量滴定用プレート上の各々特定の位置に対応するウェル全てからの１０μＬアリコートを混合することにより、カルチャー・セット＃１の全ての培養液を９６個のプールへと合わせた（すなわち、Ａ１の位置にある全てのウェルを合わせ、Ａ２の位置にある全てのウェルを合わせ、というように）。プールを新たな９６ウェル微量滴定用プレートの中に入れた。
【０１０５】
各プールを１：１０に希釈し、プライマーｘｙｌＡＦ１（ＣＣＧＣＡＣＧＡＴＴＧＣＡＡＧＧＴ；配列番号：１）およびプライマーｘｙｌＡＲ１（ＧＧＴＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＴＡ；配列番号：２）と共に、商品キットを用い、製造元の取扱い説明書（コネチカット州ノルウォークのパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））に従って、ＰＣＲにより（５０μＬの反応液につき２μＬのプール培養液）スクリーニングした。シュードモナスプラスミドｐＷＷＯ（ジーンバンク（登録商標）受入番号Ｐ２１３９４）によりコードされたＸｙｌＡ配列をスフィンゴモナスプラスミドＰＮＬ１（ジーンバンク（登録商標）受入番号ＡＦ０７９３１７）によりコードされたＸｙｌＡ配列と整列させ、２つのアミノ酸配列が保存されている領域を同定することにより、これらのプライマーをデザインした。次に保存されたアミノ酸配列に対応するｐＮＬ１ヌクレオチド配列を、プライマーのデザインに用いた。パーキン・エルマー・ジーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ）（登録商標）９６００において、ＰＣＲを実施した。サンプルは９４℃で１分間温置し、次に９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを４０回行った。サンライズ９６ホライゾンタル（Ｓｕｎｒｉｓｅ９６  Ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ）・ゲル電気泳動装置（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズのカタログ番号１１０６８−１１１）を用い、ＴＥＡ緩衝液中、０．８％寒天ゲル上で、各反応液からの５μＬサンプルを分析した。このゲルは、９５ボルトで１時間作動させ、ＴＥＡ中、臭化エチジウム（最終濃度８μｇ／ｍＬ）で染色した。
【０１０６】
陽性プールを作製するために使用したカルチャー・セット＃１の各々の培養液を試験して、長さ約９００塩基対のＰＣＲ生成物を作製したプールの巻きを解いた。アンピシリン（最終濃度５０μ／ｍＬ）を含有するＬＢブイヨンをマイクロリットルプレートのウェル（２００μＬ／ウェル）に分配した。各ウェルに、カルチャー・セット＃１の培養液１０μＬを接種した。微量滴定用プレートをエア‐ポアフィルムで覆い、プレートを３７℃で１６時間、振とう台の上で温置した。各培養液を１：１０に希釈した。希釈した培養液を、プライマーｘｙｌＡＦ１（配列番号：１）およびプライマーｘｙｌＡＲ１（配列番号：２）と共にＰＣＲによりスクリーニングし、ＰＣＲ生成物を上記の寒天ゲル電気泳動によって分析した。
【０１０７】
コスミド挿入体の配列決定
コスミドＤＮＡを以下のとおり、配列決定用にサブクローニングした。数種のミニライゼートからコスミドＤＮＡを調製するために、スーパー・コス１・コスミド・ベクター・キットの製造元の取扱い説明書に従って、クローンＥ２／６を使用した。サブクローン化コスミドＤＮＡのライブラリの１つは、ＨａｅＩＩＩ（ウィスコンシン州マジソンのプロメガ）による部分消化によって断片化したＤＮＡを用いて構築した。サブクローン化コスミドＤＮＡの第２のライブラリは、噴霧化によって断片化したＤＮＡを用いて構築した。
【０１０８】
コスミドＤＮＡ（３０μＬ）を５０μＬ反応容量中、２５℃でＨａｅＩＩＩの１単位によって部分消化した。５μＬのアリコートを５分おきに反応管から、反応混合物が空になるまで取り出した。各アリコートを、１μＬのゲル付加緩衝液および１μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡと共に管に入れ、全てのアリコートを採取し得るまで氷上で保存した。アリコートを７５℃に加熱し、０．８％寒天ゲル上で分析し、消化速度を測定した。コスミドＤＮＡのサイズの減少は、反応時間の長さの増加に対応していた。予備反応は同様に２５分間行われた。１０μＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡの添加および反応液を７５℃に１０分間温置することにより、反応を停止させた。部分消化されたＤＮＡの断片ＴＥＡ緩衝液中、０．８％低溶融寒天ゲルにおいて、サイズによって分離した。２ｋｂ〜４ｋｂのサイズ範囲にあるＤＮＡ制限断片をゲルから切り取り、ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キットを用い、製造元の取扱い説明書（カリフォルニア州カールシバッドのＱバイオジーン社（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ））に従って精製した。
【０１０９】
噴霧化に用いるコスミドＤＮＡ（４５μＬ）は、ＲＮＡｓｅＡ（最終濃度２０μｇ／ｍＬ、シグマ・ケミカル社）により、３７℃で３０分間処理した。このＤＮＡは、フェノール／クロロホルムによる抽出、およびエタノールによる沈殿によって精製した。このＤＮＡを５０μＬのＴＥ緩衝液に再懸濁させた。このＤＮＡ（５０μＬ）を１ｍＬの水で希釈し、この溶液をろ過空気（２２ｐｓｉ、３０秒）によってネビュライザ（イリノイ州シカゴのＩＰＩメディカル・プロダクツ（ＩＰＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、カタログ番号４２０７）を通すことにより、断片化した。ＤＮＡ断片は、エタノール沈殿によって濃縮し、ＴＥＡ緩衝液中、０．８％低溶融寒天ゲルにおいて、サイズによって分離した。２ｋｂ〜４ｋｂのサイズ範囲にあるＤＮＡ断片をゲルから切り取り、ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キットを用い、４０μＬの水に再懸濁した。ＤＮＡ断片の両端を４０μＬの仕上げ反応液（４μＬ１０×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（プロメガ）、１μＬ１０ｍＭ  ＡＴＰ、１μＬＴ４ポリメラーゼ（６単位／μＬ：プロメガ）、１μＬポリヌクレオチドキナーゼ（６単位／μＬ：プロメガ）、３０μＬ噴霧化ＤＮＡ、１．６μＬ  ｄＮＴＰｓ（各ｄＮＴＰの２．５ｎＭを含有するストック溶液）、１．４μＬ水）で修復し、３７℃で１時間温置した。７５℃で１５分のろ過により反応を停止させた。仕上げたＤＮＡは、ジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キットを用いて精製し、２０μＬの水に再懸濁させた。
【０１１０】
ＨａｅＩＩＩによる消化、または噴霧化により生成したコスミドＤＮＡの断片を「レディー・ツウ・ゴー（Ｒｅａｄｙ  ｔｏ  Ｇｏ）」キット（ニュージャージー州ピスケータのアメリカン・バイオサイエンスイズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に含まれているＳｍａｌカットプラスミドｐＵＣ１８に結合した。結合したＤＮＡをジーンクリーン（ＧｅｎｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キットにより、製造元のプロトコルに従って処理し、次にエレクトロマックス（ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ）（登録商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）大腸菌細胞（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ）内へ、エレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションは、バイオラッド・ジーン・パルサー（Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）（カリフォルニア州ハーキュリース、バイオラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ‐ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））により、２．５ｋＶ、２５μＦ、２００ｚの設定を用いて実施した。エレクトロポレーションキュベットの内容物を１．５ｍＬミクロ遠心分離機に移し、３７℃で１時間温置した。培養サンプルをアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）とＸ−ｇａｌ（４μｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド；シグマ・ケミカル社）を有するＬＢ寒天上に塗り、３７℃で１６時間温置した。１ｍＬの増殖培地（５０μｇ／ｍＬアンピシリン、０．２％グルコースおよび２０ｍＭトリスＨＣｌ含有ＬＢ、ｐＨ７．５）を含有する９６四角形‐ウェルプレート（カリフォルニア州フラートンのベックマン・クールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））の各ウェル内に１つの白色コロニーを接種した。プレートを３７℃で１６時間、振とう台上に温置した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡプレップ９６ターボ・ミニプレップ・キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（カリフォルニア州ヴァレンシア、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて、各培養液から調製した。
【０１１１】
プラスミドは、自動ＡＢＩシーケンサ（カリフォルニア州フォスターシティーのアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））上で配列決定した。配列決定反応は、ｐＵＣ１８の一般的逆プライマーによって、開始させた。生じる配列は、シーケンサ３．０（ミシガン州アンアーバー、ジーン・コーズ・コープ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．））を用いて組み立てた。
【０１１２】
ｐ−キシレン代謝物のＨＰＬＣおよび同定
背景対照として２３０ｎｍ（第１波長）、２５４ｎｍ（第２波長）および４５０ｎｍに設定したフォトダイオードＵＶ可視検出器およびＬＣ／ＭＳＤ−ＥＳＩ院イオン分光光度計付属ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）１１００シリーズ上で分析を実施した。カラムは、アジリエント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｉｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カリフォルニア州パロアルト）から購入したヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）＃８８０９６７．９０１ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）（登録商標）ＳＢ−Ｃ８（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）であった。カラム温度は５０℃に制御した。移動相は０．０２ｍＭ酢酸アンモニウム（１８００ｍＬ水中、２０ｍＬ  １Ｍ酢酸アンモニウム（溶媒−２＝Ｓ−２））とアセトニトリル（溶媒−１＝Ｓ−１）であった。使用した勾配は、０分〜２５分はは１０％Ｓ−１と９０％Ｓ−２、２５分目に勾配を３０％Ｓ−１と７０％Ｓ−２に上げ、２５分〜３４分（９分）は勾配を９５％Ｓ−１と５％Ｓ−２に上げ、次の４分間はこのレベルに保った（すなわち、３８分まで。次の４分間で１０％Ｓ−１と９０％Ｓ−２に下げた）。移動相に用いた流速は、１．０ｍＬ／分であった。
【０１１３】
ｐ−キシレンから４−ヒドロキシメチル安息香酸への変換は、逆相ＨＰＬＣによってモニタした。培養上澄液は、分析前に０．２μｍフィルタ（ゲルマン・アクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）（登録商標）ＣＲＰＦＴＥ、ミシガン州アンアーバーのゲルマン／ポール・ライフ・サイエンスイズ（Ｇｅｌｌｍａｎ／Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；またはミリポア・ミレックス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｅｘ）（登録商標）−ＧＳ、マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア・コープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．））に通した。サンプル（１００μＬ）をゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）Ｃ８カラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）に注入した。補正とデータ解析は、全てヒューレット・パッカードのケムステーション・ソフトウェアを用いて行った。ｐ−キシレンの中間体を商品入手した商品と比較した。
【０１１４】
実施例１
工業廃液からのスフィンゴモナス種の単離
この実施例では、唯一の炭素とエネルギーの供給源として、２，６−ジメチルナフタレン（２，６−ＤＭＮ）で増殖できることを基にしたＡＳＵ１株の単離を説明する。種々の基質で増殖できるＡＳＵ１株の能力は、ＡＳＵ１株が２，６−ＤＭＮを分解するために、ＴＯＬ経路または類似の経路を利用することを示していた。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の分析によると、ＡＳＵ１株はスフィンゴモナス属に帰属するαープロテオバクテリアの一員に関連していることが示された。
【０１１５】
２，６−ＤＭＮで増殖する細菌をエンリッチメント培養液から単離した。エンリッチメント培養液は、１２５ｍＬのスクリューキャップ付きエーレンマイヤーフラスコ中、１０ｍＬのＳ１２培地に０．１ｍＬの活性スラッジを接種することにより設定した。活性スラッジは、ポンコ市（Ｐｏｎｃｏ  Ｃｉｔｙ）の廃水処理施設から入手した。エンリッチメント培養液は、２〜３片の２，６−ＤＭＮを直接培養培地へ添加し、酵母抽出液（最終濃度０．００１％）を加えることで補足した。エンリッチメント培養液は、交互振とうしながら２８℃で温置した。４日〜７日ごとに、９ｍＬの培養液を、０．００１％酵母抽出物および２〜３片の２，６−ＤＭＮを追加した同量のＳ１２培地と入れ替えることにより、培養液を希釈した。エンリッチメント培養液のサンプルをＳ１２寒天上に塗ることにより、２，６−ＤＭＮを炭素とエネルギーの唯一の供給源として利用する細菌を単離した。２，６−ＤＭＮをペトリ皿の蓋の内側に乗せた。ペトリ皿をパラフィンで密封し、逆さにして２８℃で温置した。次に２，６−ＤＭＮを炭素とエネルギーの唯一の供給源として利用する能力に関して、代表的な細菌コロニーを試験した。コロニーをＳ１２寒天プレートからＳ１２寒天プレートへ移し、各ペトリ皿の蓋の内側に２，６−ＤＭＮを供した。ペトリ皿をパラフィンで密封し、逆さにして２８℃で温置した。次に２，６−ＤＭＮを増殖に利用する単離体を、他の芳香族化合物を含有するＳ１２寒天プレート上での増殖に関して試験した。
【０１１６】
ＡＳＵ１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅し、以下のとおり分析した。ＡＳＵ１はＬＢ寒天（ミズーリ州セントルイス、シグマ・ケミカル社）上で増殖させた。０．２２μフィルタを通した１００ｍＬの水に、数個のコロニーを懸濁させた。細胞懸濁液を−２０℃で３０分間凍結させ、室温で溶かしてから９０℃に１０分間加熱した。ソルヴォール（Ｓｏｒｖａｌｌ）（登録商標）ＭＣ１２Ｖマイクロヒュージにおける１４，０００ＲＰＭで１分間の遠心分離によりデブリを除去した。上澄液中の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列は、プライマーＪＣＲ１４（ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ；配列番号：３）およびプライマーＪＣＲ１５（ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ；配列番号：４）と共に商品キットを用い、製造元の取扱い説明書（コネチカット州ノルウォークのパーキン・エルマー）に従って、ＰＣＲによって増幅した。パーキン・エルマー・ジーンアンプ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標））９６００において、ＰＣＲを実施した。サンプルは９４℃で５分間温置し、次に９４℃で３０秒、５５℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを３５回行った。増幅した１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、商品キットを用い、製造元の取扱い説明書（ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット、キアゲン）に従って精製し、自動ＡＢＩシーケンサ（カリフォルニア州フォスター市のアプライド・バイオシステムス）で配列決定した。配列決定反応は、プライマーＪＣＲ１４（配列番号：３）およびプライマーＪＣＲ１５（配列番号：４）によって開始させた。類似配列に関するジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））のＢＬＡＳＴ探索（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｓａ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７））に対し各単離体の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を疑問配列として用いた。
【０１１７】
ＡＳＵ１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））配列データベースにおける他の１６ＳｒＲＮＡ配列と比較した。ＡＳＵ１株の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号：５）は、スフィンゴモナス属に帰属するα−プロテオバクテリアの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列のいくつかと有意に高い相同性を有していた。ＡＳＵ１の配列は、スフィンゴモナス株ＭＢＩＣ３０２０から単離された１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））受入番号ＡＢＯ２５２７９．１）に対し最も高い相同性（９９．６％同一性）を有していた。
【０１１８】
表１のデータは、ＡＳＵ１株が２，６−ＤＭＮおよび他のいくつかのメチル化芳香属化合物で増殖できることを示していた。しかし、ＡＳＵ１株はベンゼンを利用することはできなかった。
【０１１９】
【表１】
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【０１２０】
実施例２
スフィンゴモナス株ＡＳＵ１のキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
本実施例では、スフィンゴモナス株ＡＳＵ１のキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子（ｘｙｌＭおよびｘｙｌＡ）のクローニングを説明する。ＡＳＵ１株のｘｙｌＭ遺伝子およびｘｙｌＡ遺伝子は、プラスミドＰＮＬ１（ロミン（Ｒｏｍｉｎｅ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８１：１５８５〜６０２頁（１９９９））で見られるキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子と相同である。ＡＳＵ１株のｘｙｌＭ遺伝子およびｘｙｌＡ遺伝子を大腸菌において発現させた。
【０１２１】
ＡＳＵ１ＤＮＡを含有する約７００種のコスミドクローンの中から２種の陽性クローン（Ｅ２／６およびＧ９／６）を同定し、プライマーｘｙｌＡＦ１（配列番号：１）およびプライマーｘｙｌＡＲ１（配列番号：２）を用いてＰＣＲによってスクリーニングした。双方のクローンとも、３５〜４０ｋｂの挿入体を含有していた。サブクローンのライブラリを、ｐＵＣ１８を用い、コスミドＥ２／６から構築した。ｐＵＣ１８サブクローンは、ｐＵＣ１８の一般的逆プライマーによって配列決定した。配列は、シーケンサ３．０を用いて組み立てた。コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）の１つは、長さ１２，５９１ｂｐであった。ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））データベースの含まれている配列への類似性に関して、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｃｈ  Ｔｏｏｌ；アルトシュルら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９３））；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴも参照）探索を行って、この配列（コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）１２．５；配列番号：６）を分析した。国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｋｕｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されたＢＬＡＳＴＮ演算法を用いて（コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）１２．５；配列番号：６）をジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））ヌクレオチドデータベースに含まれた公的に入手できる全てのＤＮＡ配列を比較した。コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）（１２．５；配列番号：６）の広い部分が、プラスミドＰＮＬ１（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））受入番号ＡＦ０７９３１７：表２）と相同性を有していることが判明した。コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）（１２．５；配列番号：６）を６つのリーディングフレーム全てにおいて翻訳し、その翻訳生成物を、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））「ｎｒ」データベースに含まれる全て公的に入手できる蛋白質配列と比較することにより、コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）（１２．５；配列番号：６）におけるＯＲＦの検出に利用されるＮＣＢＩ提供のＢＬＡＳＴＸ演算法（ダブリュー・ギッシュ（Ｇｉｓｈ、Ｗ．）およびディー・ジェイ・ステーツ（Ｓｔａｔｅｓ、Ｄ．Ｊ．）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２頁（１９９３））を用いてコンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）（１２．５；配列番号：６）を複数ＯＲＦに関して分析した。コンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）（１２．５；配列番号：６）の領域２は、プラスミドＰＮＬ１上のｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＭ遺伝子に相同である２つのＯＲＦを含んでいた。蛋白質データベースに対するＢＬＡＳＴＸ解析に基いた配列の比較は、表３に示してある。スピンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＭサブユニットは、配列番号：１０で示され、配列番号：９で示される核酸分子によりコードされる。スピンゴモナスＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼのｘｙｌＡサブユニットは、配列番号：１２で示され、配列番号：１１で示される核酸分子によりコードされる。
【０１２２】
ｘｙｌＭおよびｘｙｌＡを含むＡＳＵ１ＤＮＡの一断片を、小型の多重複製プラスミド内へクローン化した。商品キットを用い、製造元の取扱い説明書（コネチカット州ノルウォークのパーキン・エルマー）に従って、ＰＣＲにより２．３ｋｂ断片を増幅させるために、プライマーＡＳＵ１ＭＡＦ１（ＴＡＡＣＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＣＧＧＡＣＴＧＣＧ；配列番号：７）とプライマーＡＳＵ１ＭＡＲ１（ＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＧＴＧＣＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧ；配列番号：８）を使用した。ＰＣＲは、スフィンゴモナス株ＡＳＵ１のＤＮＡを用い、パーキン・エルマー・ジーン・アンプ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ（登録商標））９６００において実施した。サンプルは９４℃で１分間温置し、次に９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを４０回行った。最終サイクル後、サンプルをさらに１０分間、７２℃で温置した。増幅したＤＮＡを、商品キットを用いて製造元の取扱い説明書（ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット、キアゲン社）に従って精製した。精製ＤＮＡをｐＣＲ（登録商標））２．１−ＴＯＰＯ（商標）に結合し、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡＣｌｏｎｉｎｇ（登録商標））キットを用い製造元の取扱い説明書（インビトロゲン・コープ）に従って大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。形質転換細胞を３７℃で２４時間、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン含有ＬＢ寒天上に塗っておいた。次に、いくつかのコロニーが青色になるまで、プレートをさらに１日〜２日、室温（約２５℃）で温置した。
【０１２３】
青色コロニーの形成は、モノオキシゲナーゼが媒介したインドールからインジゴへの変換によるものであった（ケイト（Ｋｅｉｔ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７６４＝７７０頁（１９８７）；オコーナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４２８７〜４２９１（１９９７））。インジゴ形成は、クローンがＡＳＵ１のｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子とを含有していること、そして、クローン化遺伝子から、機能的なキシレンモノオキシゲナーゼが発現していることを示した。
【０１２４】
【表２】
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【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
実施例３
シュードモナス−プチダのキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
本実施例では、シュードモナス−プチダのキシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子のクローニングを説明する。
【０１２７】
ｘｙｌＭおよびｘｙｌＡを含むｐＷＷＯＤＮＡの一断片を、小型の多重複製プラスミド内へクローン化した。商品キットを用い、製造元の取扱い説明書（パーキン・エルマー）に従って、ＰＣＲにより２．４ｋｂ断片を増幅させるために、プライマーＷＷＯＦ１（ＴＡＡＧＴＡＧＧＴＧＧＡＴＡＴＡＴＧＧＡＣＡＣ；配列番号：１３）とプライマーＷＷＯＲ２（ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＧＡＣＴＡＴＧＣＡＴＣＧＡＡＣＣＡＣ；配列番号：１４）を使用した。ＰＣＲは、シュードモナス株ＡＴＣＣ３３０１５を用い、パーキン・エルマー・ジーン・アンプ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ（登録商標））９６００において実施した。サンプルは９４℃で１分間温置し、次に９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間のサイクルを４０回行った。最終サイクル後、サンプルをさらに１０分間、７２℃で温置した。増幅したＤＮＡを、商品キットを用いて製造元の取扱い説明書（ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット、キアゲン社）に従って精製した。精製ＤＮＡをｐＣＲ（登録商標））２．１−ＴＯＰＯ（商標）に結合し、ＴＯＰＯ（商標）ＴＡＣｌｏｎｉｎｇ（登録商標））キットを用い製造元の取扱い説明書（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ）に従って大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。形質転換細胞を３７℃で２４時間、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン含有ＬＢ寒天上に塗っておいた。次に、いくつかのコロニーが青色になるまで、プレートをさらに１日〜２日、室温（約２５℃）で温置した。
【０１２８】
青色コロニーの形成は、モノオキシゲナーゼが媒介したインドールからインジゴへの変換によるものであった（ケイト（Ｋｅｉｔ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７６４−７７０頁（１９８７）；オコーナー（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４２８７〜４２９１（１９９７））。インジゴ形成は、クローンがｐＷＷＯのｘｙｌＭ遺伝子とｘｙｌＡ遺伝子とを含有していること、そして、クローン化遺伝子から、機能的なキシレンモノオキシゲナーゼが発現していることを示した。
【０１２９】
実施例４
クローン化ＡＳＵ１キシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子またはｐＷＷＯキシレンモノオキシゲナーゼを有する大腸菌組替え体によるｐ−キシレンの酸化遺伝子
実施例４では、スフィンゴモナス株ＡＳＵ１からクローン化された（クローン４ａ）またはプラスミドｐＷＷＯからクローン化された（クローン６ｆ）キシレンモノオキシゲナーゼ遺伝子を有する大腸菌組換え体が、ｐ−キシレンを酸化して４−ヒドロキシメチル安息香酸を形成できることを証明する。これらの結果は、これらのモノオキシゲナーゼがｐ−キシレンのメチル基を両方とも酸化できることを示している。
【０１３０】
大腸菌株ＴＯＰ１０ｐＣＲ（登録商標））２．１−ＴＯＰＯ（商標）およびキシレンモノオキシゲナーゼ（クローン４ａおよびクローン６ｆ）を発現する大腸菌クローンを、トリプトファン（１００μｇ／ｍＬ）、グリセロール（０．４％）、カサミノ酸（０．４％）および５０μｇ／ｍＬアンピシリンで補足されたＭ−９  ５０ｍＬを含有する５００ｍＬエーレンマイヤーフラスコへ接種した。培養液を３７℃で約２４時間、交互振とうしながら温置した。各培養液から遠心分離によって細胞を採取し、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、０．４％グリセロール、０．４％カサミノ酸（ジフコ（Ｄｉｆｃｏ））および１００μｇ／ｍＬトリプトファンで補足したＭ９培地に、６００ｎｍ（ＯＤ６００）における最終至適密度０．２から０．４まで再懸濁した。テフロン（Ｔｅｆｒｏｎ（登録商標））で内側を覆ったスクリューキャップ付きの５００ｍＬガラス製エーレンマイヤ−フラスコ各々に、再懸濁細胞の５０ｍＬアリコートを分配することにより、各株に関し対等の培養液の対を設定した。各対の第１の培養液は、１５×１５０ｍｍ試験管中、５００μＬのｐ−キシレンを補足した。各対の第２の培養液は、ｐ−キシレンを補足せず、対照として用いた。培養液は全て、３７℃で交互に振とうしながら温置した。２４時間の温置後、各培養液に１ｍＬの２０％グリセロールを加えた。サンプル（１．０ｍＬ）を定期的に培養液から取り出した。サンプルを遠心分離して細菌を取り出した。０．２２μｍアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標））ＣＲ  ＰＦＴＥフィルタに、サンプルの上澄液を通し、ＨＰＬＣによりｐ−キシレンの代謝物について分析した。
【０１３１】
ｐ−キシレンが培養液中に存在する場合は、２４時間温置後クローン４ａおよびクローン６ｆの培養液内に、３種のｐ−キシレン代謝物がＨＰＬＣよって検出された。前記代謝物は初めに、代謝物の保持時間（ＲＴ）を、基準試料の４−メチルベンジルアルコール（ＲＴ＝２１．９分）、ｐ−トルイル酸（ＲＴ＝２６．７分）および４−ヒドロキシメチル安息香酸（ＲＴ＝９．５分）と比較することにより同定した。４−ヒドロキシメチル安息香酸の同一性を、ＬＣ／ＭＳにより確認した。クローン４ａおよびクローン６ｆにより産生された４−ヒドロキシメチル安息香酸のマススペクトルは、標品として用いた基準試料である４−ヒドロキシメチル安息香酸のマススペクトル同一であった。ｐ−キシレンを含有したＴＯＰ１０ｐＣＲ（登録商標））２．１−ＴＯＰＯ（商標）の培養液には、ｐ−キシレン代謝物は何も検出されなかった（データは示さず）。また、ｐ−キシレンのないＴＯＰ１０ｐＣＲ（登録商標））２．１−ＴＯＰＯ（商標）、クローン４ａおよびクローン６ｆには、ｐ−キシレン代謝物が何も検出されなかった（データは示さず）。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】ｐ−キシレンからの４−ヒドロキシメチル安息香酸の生成を示す図である。
【図２】ｍ−キシレンからの３−ヒドロキシメチル安息香酸の生成を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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