(57)【要約】本発明は、細胞における染色体異常の発生率が癌の発生率と相関し、染色体異常の程度が大きいほど癌が発生する確率が高く、癌の重症度が高いという発見に基づく。本発明は、組織試料における中心体異常を検出する方法を含む。本発明は、癌の予測および診断のための新たな方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における上皮内病変の進化を予測する方法であって、
（a）対象の上皮内病変由来の組織試料中の細胞の微小管形成中心を検査する段階、
（b）該細胞における中心体異常を検出する段階、および
（c）検出された任意の中心体異常の重大度を判定する段階
を含み、任意の中心体異常の重大度が、該上皮内病変が高悪性度浸潤癌へと進化する確率と相関する方法。
【請求項２】
試料とする組織が、前立腺、乳房、子宮頸部、肺、脳、結腸または上皮のものである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
（a）、（b）、および（c）のいずれかまたはすべてが自動化されている、請求項1記載の方法。
【請求項４】
対象における癌を予測する方法であって、
（a）対象由来の組織試料中の細胞の微小管形成中心を検査する段階、および
（b）該細胞における中心体異常を検出する段階
を含み、中心体異常の存在によって該患者が癌を発症する確率が高いことが示される方法。
【請求項５】
中心体異常が、中心体の直径が同じ組織試料中の正常上皮に存在する中心体の直径の2倍を上回ることである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
中心体異常が、中心体の最大径と最小径との比が約2を超えることである、請求項4記載の方法。
【請求項７】
中心体異常が形状異常である、請求項4記載の方法。
【請求項８】
中心体異常が、中心体の欠乏である、請求項4記載の方法。
【請求項９】
中心体異常が、多数の小さな点として形成された中心体である、請求項4記載の方法。
【請求項１０】
段階（a）および（b）を多数の細胞に対して繰り返し、検出される中心体異常が（1）微小管形成中心を検査した細胞の約5％超に2つより多くの中心体が存在すること、または（2）検査した細胞における中心体と核との比が約2.5を上回ることである、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
中心体異常がペリセントリンレベルの上昇である、請求項4記載の方法。
【請求項１２】
試料とする組織が子宮頸部、乳房、前立腺、結腸、脳、肺または上皮のものである、請求項4記載の方法。
【請求項１３】
患者における癌の侵襲性の度合いを予測する方法であって、
（a）患者の前癌病変由来の組織試料中の細胞の微小管形成中心を検査する段階、
（b）該細胞における中心体異常を検出する段階、および
（c）検出された任意の中心体異常の重大度を判定する段階
を含み、該中心体異常の重大度が、該患者が侵襲性癌を有するか発症する確率と直接相関する方法。
【請求項１４】
染色体異常の出現率が正常細胞と比較して約2倍〜約4倍高いことが癌の組織学的/細胞学的進行度と相関する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
試料とする組織が子宮頸部、乳房、前立腺、結腸、脳、肺または上皮のものである、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
対象における癌を予測する方法であって、
（a）対象からの組織試料中の細胞の紡錘体を検査する段階、および
（b）細胞における紡錘体異常を検出する段階
を含み、紡錘体異常が検出されることによって、該対象が癌を有するか発症する確率が高いことが示される方法。
【請求項１７】
試料とする組織が子宮頸部、乳房、前立腺、結腸、脳、肺または上皮のものである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
対象における癌を予測する方法であって、
（a）関心対象の細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンのレベルを測定する段階、
（b）（a）におけるペリセントリンのレベルを健常対照細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンの濃度と比較する段階、および
（c）関心対象の細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンのレベルが健常対照細胞培養物または組織試料におけるそれよりも高いならば癌を発症する確率が高いと予測する段階
を含む方法。
【請求項１９】
関心対象の細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンのレベルが、健常対照細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンのレベルの少なくとも約2倍である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
中心体異常を自動的に検出するためのシステムであって、
（a）検査する細胞培養物または組織試料、
（b）細胞培養物または組織試料を検査用に自動的に調製するための手段、
（c）高倍率顕微鏡、
（d）細胞培養物または組織試料を含むプレートを保持するために適合化されており、正しい調整のためにプレートを動かし細胞培養物または組織試料のアレイに焦点を合わせるための手段を有するXYステージ、
（e）デジタルカメラ、
（f）励起光を細胞培養物または組織試料のアレイに向けるための光学的手段および細胞から発せられた蛍光をデジタルカメラに向けるための手段を有する光源、
（g）デジタルカメラからのデジタルデータを受け取って処理するためのコンピュータ手段であって、カメラから画像を受け取るためのデジタル式フレームグラバー、ユーザ相互作用およびアッセイ結果の表示のためのディスプレイ、データの記憶および保管のためのデジタル記憶媒体、ならびに結果の制御、取得、処理および表示のための手段を含むコンピュータ手段、ならびに
（h）細胞培養物または組織試料における中心体異常を検出するためのコンピュータ手段
を含むシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は癌の予測および診断の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、健常な細胞が癌細胞化する関連疾患によって構成される1つのカテゴリーである。通常、細胞は、身体が必要とした場合にのみ、比較的秩序立った様式で成長して分裂し、より多くの細胞を生成する。しかし、癌の場合には、新たな細胞が必要でなくなっても細胞は分裂および増殖を続ける。これは増殖物または腫瘍といった組織の塊の形成を招くことがある。癌は全世界的に主要な死因の一つである。前立腺癌、乳癌および子宮頸癌は最も多い癌の形態であり、多くの死亡の原因となっている。
【０００３】
中心体は、ヒト細胞の遺伝的安定性に影響を及ぼすプロセスにおいて決定的な役割を果たしている。これは、染色体分離の忠実度を確保するために必須なプロセスである、紡錘体形成、細胞質分裂および細胞周期進行に関与する。中心体は動物細胞における主要な微小管形成中心であり、有糸分裂における微小管紡錘体の形成に寄与するとともに、細胞質分裂の進行およびS期への移行を制御する。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、一部には、細胞における染色体異常の発生率は将来の癌の発生率と相関するという発見に基づく。したがって、本発明は、癌の予測および診断を行うための、さらには所定の腫瘍の重症度に関する予後判定を行うための、新たな方法を提供する。
【０００５】
本発明は、患者の上皮内病変（in situ lesion）からの組織試料（例えば、前立腺、乳房、子宮頸部、脳、肺、結腸の組織、または癌が発生しうる他の任意の組織）中の細胞の微小管形成中心を検査すること、細胞における中心体異常を検出すること、および検出された中心体異常の重大度を判定することにより、患者における上皮内病変の進化（evolution）を予測する方法であって、任意の中心体異常の重大度が、その上皮内病変が高悪性度浸潤癌（high grade invasive cancer）に進化する確率と相関するような方法を特徴とする。これらの方法、および本発明の任意の他の方法は、完全または部分的に自動化することができる。
【０００６】
本発明はまた、患者からの組織試料（例えば、前立腺、乳房、子宮頸部、脳、肺、結腸の組織、または癌が発生しうる他の任意の組織）中の細胞の微小管形成中心を検査すること、および細胞における中心体異常（例えば、中心体の直径が同じ組織試料中の正常上皮に存在する中心体の直径の2倍を上回る、中心体の最大径と最小径との比が約2を上回る、形状異常、中心体が存在しない、または多数の小さな点として形成された中心体、ペリセントリン（pericentrin）レベルの上昇）を検出することにより、患者における癌を予測する方法であって、中心体異常の存在によってその患者が癌を発症する確率が高いことが示されるような方法も特徴とする。本方法は多数の細胞に対して繰り返し行うことができ、この場合には、検出される中心体異常は、微小管形成中心の検査を行った細胞の約5％超に2つを上回る中心体が存在すること、または中心体と核との比が約2.5を上回ることである。
【０００７】
もう1つの面において、本発明は、患者の前癌病変からの組織試料（子宮頸部、乳房、前立腺、または癌が発生しうる他の任意の組織）中の細胞の微小管形成中心を検査すること、細胞における中心体異常を検出すること、および検出された中心体異常の重大度を判定することにより、患者における癌の侵襲性の度合い（degree of aggressiveness）を予測する方法であって、任意の中心体異常の重大度が、その患者が侵襲性癌を有するかそれを発症する確率と相関する（例えば、染色体異常の出現率が正常細胞と比較して約2倍〜4倍高いことが、癌の組織学的/細胞学的な程度と相関する）ような方法を含む。
【０００８】
本発明はまた、患者からの組織試料（例えば、子宮頸部、乳房、前立腺、または癌が発生しうる任意の他の種類の組織）中の細胞の紡錘体を検査すること、および細胞における紡錘体異常を検出することにより、患者における癌を予測する方法であって、紡錘体異常が検出されることによってその患者が癌を有するか癌を発症する確率が高いことが示される方法も含む。
【０００９】
さらに、本発明は、対象における癌を予測する方法であって、関心対象の細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンのレベルを測定すること、関心対象の細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンのレベルを健常対照細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンの濃度と比較すること、および関心対象の細胞培養物または組織試料におけるペリセントリンのレベルが健常対照細胞培養物または組織試料におけるそれよりも高い（例えば、少なくとも約2倍）ならば癌を発症する確率が高いと予測することを含む方法を含む。
【００１０】
また、本発明は、中心体異常を自動的に検出するためのシステムであって、検査しようとする細胞培養物または組織試料、細胞培養物または組織試料を検査用に自動的に調製するための手段（例えば、多数の試料に対する免疫組織化学法、免疫蛍光法、パラフィン包埋）、高倍率顕微鏡、細胞培養物または組織試料を含むプレートを保持するために適合化されており、正しい調整のためにプレートを動かすためおよび細胞培養物または組織試料のアレイに焦点を合わせるための手段を有するXYステージ、デジタルカメラ、励起光を細胞培養物または組織試料のアレイに導くための光学的手段および細胞から発せられた蛍光をデジタルカメラに導くための手段を有する光源、デジタルカメラからのデジタルデータを取り込んで処理するためのコンピュータ手段であって、カメラから画像を取り込むためのデジタル式フレームグラバー、ユーザとの対話およびアッセイ結果の表示のためのディスプレイ、データの保存およびアーカイブのためのデジタル記憶媒体、ならびに結果の制御、取得、処理および表示のための手段を含むコンピュータ手段、ならびに細胞培養物または組織試料における中心体異常を検出するためのコンピュータ手段、を含むシステムも特徴とする。
【００１１】
本明細書で用いる場合、細胞の「進化（evolution）」とは、増殖性が増大し、生存性（survivability）が増大し、化学療法に対する耐性が増大した細胞に対するダーウィン淘汰のことを指す。
【００１２】
本明細書で用いる場合、細胞または組織または腫瘍の「発生（development）」とは、正常な段階から前浸潤段階へ、さらに低悪性度、中悪性度および高悪性度（または侵襲性）の癌（例えば、グリーソン（Gleason）尺度、パパニコロー塗抹標本もしくは乳癌の徴候において細胞の侵襲性を記載するために用いられる変化、または任意の癌の重症度、進展もしくは進行を計測するために用いられる種々の尺度もしくは測定単位による評価で）の段階への進行のことを指す。
【００１３】
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。本発明の実施または検討のために本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に説明するものである。本明細書で言及するすべての刊行物は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。衝突が生じる場合には、定義を含め、本明細書が支配的であるものとする。さらに、材料、方法および実施例は例示のためのものであり、発明の範囲の制限を意図したものではない。
【００１４】
本発明は数多くの利益を提供する。これは組織試料からの癌の早期の予測および診断を可能にする。このことは、そうでない場合よりも癌に対する治療を早期に開始することを可能にすることにより、患者の生存率を高めうる。これは最も頻度の高い癌のうち3種：前立腺癌、乳癌および子宮頸癌について特に言える。本発明はまた、中心体異常に特有の診断的特徴も提供し、それにより、癌の予測および診断の効率および精度を高める。さらに、本発明は、特定の癌（例えば、前立腺癌）の重症度に関する予後の判定を可能にし、それにより、治療法の決定（例えば、予後が侵襲性癌に関するものであれば外科手術を選択するという決定）を、そうでない場合に可能になるよりも早期に下すことを可能にする。
【００１５】
本発明の態様の1つまたは複数に関する詳細は、添付の図面および以下の説明に示されている。本発明のその他の特徴、目的および利点は、その説明および図面、ならびに特許請求の範囲によって明らかになると考えられる。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、組織試料中の細胞の微小管形成中心を検査することにより、患者における上皮内病変の進化を予測するための方法を含む。本発明はまた、組織試料を中心体異常に関して検査することにより、患者における癌の発生を予測する方法も含む。さらに、本発明は、組織試料を中心体異常の重大度に関して検査することにより、癌の侵襲性の度合いを予測する方法も含む。これらの方法は、中心体を含む任意の組織における癌（例えば、前立腺、乳房または子宮頸部、上皮、肺、結腸、脳の癌および他のすべての癌）を予測するために用いることができる。本発明の特別な利点の一つは、その方法をヒトの検査によって行うこともでき、自動化することもできることである。組織の調製、中心体異常に関する検査、および分析の自動化により、結果として得られる癌に関する予測の速さ、効率および精度を高めることができる。
【００１７】
細胞の分析方法
細胞を中心体障害（centrosome defect）に関して分析するために用いうる方法は数多くある。これらの方法のいくつかの例を以下に提供する。
【００１８】
まず、標準的な生検採取法を用いて、患者から組織試料を採取する。ひとたび採取すれば、試料をさまざまな手法で調製することができる。例えば、それをホルマリン固定してパラフィン包埋することができる。中心体の描出は組織の染色によって強化しうる（例えば、ペリセントリン抗体による免疫染色）。組織試料における上皮内癌（carcinoma in situ）の存在を確認するために、新たに調製したヘマトキシリン・エオシン染色切片に対して標準的な組織病理学的基準を適用する（Rosai, J.,「Akerman's Surgical Pathology」（Mosby, New York）, 1996）。染色したところで、または別の手法によって検査用に調製したところで、顕微鏡（例えば、高分解能の光学顕微鏡または電子顕微鏡）、または細胞内構造を検出するためのその他の適切な装置を、中心体の検出および観察に用いる。
【００１９】
中心体異常の判定のために参照組織試料を用いることができる。例えば、正常中心体を含む、組織型または起源が同じである健常組織の試料を、染色体異常の存在に関してアッセイする任意の組織試料と比較することができる。
【００２０】
参照組織試料を入手する方法の一つは、アッセイしようとする組織試料、および同じ患者の同じ組織からの参照組織試料の両方を得ることを含む。例えば、一方の試料は健常なことが判明している位置から、他方の試料はアッセイしようとする位置からという複数の組織試料を1人の患者の同じ前立腺から採取することができる。
【００２１】
または、参照組織試料を、参照として将来用いるために先に（歯科記録と同じように）同じ患者から採取しておくこともできる。またはそれを組織が健常なことが判明している異なる患者から採取することもできる。代表的な健常組織試料を保存して、参照として用いることができる。健常なことが判明している参照組織を将来の比較のために保存しておくことも可能と考えられる。または、健常なことが判明している参照組織の外観を、アッセイしようとする組織との目視による、またはその他の（例えば、自動化された、またはコンピュータによる）比較のために、別の媒体（例えば、紙の上の画像、コンピュータ画像など）に記録することも可能と考えられる。多くの他の方法も可能である。
【００２２】
または、細胞系を用いることもできる。例えば、比較しようとする細胞系（例えば、健常細胞系およびアッセイしようとする細胞系）を、5％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むケラチノサイト-SFM規定培地中においてカバーガラス上で増殖させることができる。Pihan, G.A.ら（Cancer Res, 58: 3974-85, 1998）に記載された通りに、0.1％トリトン-Xを含む微小管安定化緩衝液中で細胞の透過化処理を行った後に、細胞100個を冷（-20℃）メタノール中で固定し、中心体の免疫染色を行った。免疫蛍光およびFISHを用いることもできる。
【００２３】
染色体異常のいくつかの例には以下のものが含まれる：
（1）直径が、組織型または起源が同じである健常試料に存在する中心体の直径の2倍を上回る中心体がある、
（2）中心体において、中心体の最大径と最小径との比が約1.5〜2を上回る、
（3）組織において、検査した細胞の約5％超に細胞1個当たり2つを上回る中心体がある、または中心体と核との比が約2.5を上回る、
（4）異常な形状をした中心体、
（5）中心体が存在しない、
（6）健常な中心体の構成と対比して多数の小さな点として形成された中心体、および
（7）細胞内ペリセントリンレベル（または濃度）の上昇。一般に、染色体異常には、組織型または起源が同じである健常組織の試料における中心体とのあらゆる違いが含まれうる。違いは、1回のサンプリング時期または多数のサンプリング時期のいずれかにおける、形状、サイズ、色調、配向、他の細胞構造または細胞内構造との接近度、出現時期、経時的な移動、または出現もしくは挙動に関する任意の他の様相でありうる。
【００２４】
異なる組織試料における染色体異常の頻度を比較することが可能である。例えば、健常参照試料における染色体異常の頻度を、アッセイしようとする組織における対応する頻度と比較することができる。癌を発症する確率の高さ、またはより侵襲性の高い癌を発症する確率の高さは、参照組織試料とアッセイ対象の組織試料との間の染色体異常の頻度の違いと相関する。
【００２５】
染色体異常の観察または検出のために用いたものと類似した方法を用いて紡錘体を検査することも可能である。例えば、ホルマリン固定してパラフィン包埋した保存組織における紡錘体の染色のためにg-チューブリンを用いうるが、これは、g-チューブリンは紡錘体極を修飾するが、チューブリンおよびbチューブリンのかなりの割合は細胞質性であり、紡錘体微小管シグナルが不明瞭となるためである。
【００２６】
中心体の自動分析
本発明は、染色体異常の試料採取、検査または分析に関する以上の面のいずれかの自動化を含む。例えば、コンピュータを、健常中心体の画像（例えば、形状、色調、サイズ、数、配向、外観、挙動など）を患者の組織試料または細胞培養物からの中心体の画像と比較するためにプログラム化することができる。これらの画像は、細胞組織または細胞培養物を、顕微鏡、または中心体の特定の特徴を観察または検出するための他の装置によって観察しうるように、染色体の関心対象の1つまたは複数の様相を強調するためのさまざまな手法で調製することによって作成しうる。細胞組織または細胞培養物の調製は、二色免疫蛍光法、二色免疫組織化学法または両方を同時に用いる染色などの技法を含みうる。さらに、自動化により、行いうる分析の量を大きく増加させることが可能になる。例えば、パンチ包埋したパラフィンスライドを用いてスライド1枚当たり100個またはそれを上回る腫瘍を染色体異常に関して分析することが可能と考えられる。図8は、組織試料または細胞試料を染色体異常に関して検査および分析するために用いうる自動システムの一例を示している。
【００２７】
例えば、染色体異常に関して検査しようとする患者からの細胞を、標準的な細胞培養法を用いて培養する。続いて、これらの細胞を自動システムに投入する。システムは染色または描出を強化する他の何らかの手段によって細胞試料を自動的に調製する。続いて、システムが顕微鏡を用いて試料を検査する。顕微鏡は試料における目的の特徴を映像化した後に、そのような特徴に関する情報をコンピュータに送信する。続いてコンピュータは細胞における目的の特徴（例えば、中心体の形状、サイズ、色調または数）を、参照物の特徴（例えば、健常細胞または同じ患者から採取して以前に分析した試料のもの）と比較する。コンピュータは、癌に関する予測を可能にするため、そしてそれが可能であれば、具体的な予測を明確にするために、一方の試料における中心体が異なる試料におけるものと十分に類似しているか否か、または異なるか否かを判断するようにプログラムすることができる。
【００２８】
本発明は、高倍率で高解像度の三次元像取得顕微鏡の利用を含む。顕微鏡は、細胞の全平面にある中心体を映像化しうる一連のZ方向の写真を撮影しうる顕微鏡であってよい。光源は白色光、蛍光または多波長蛍光のいずれでもよい。
【００２９】
本発明は、免疫組織化学法または免疫蛍光法のための試料を調製するために従来の方法を用いる、従来の免疫組織化学法または免疫蛍光法を用いることができる。
【００３０】
実際的な一例として、ある患者が20歳の時点で組織試料を提供し、自動システムを用いてその検査および分析を行い、その結果得られた染色体情報を彼女の医療記録に保管することが可能と考えられる。続いて、この患者が25歳の時点（およびその後の一定間隔）で第2の組織試料を提供し、その検査および分析を再び行った上で、元の試料に関する結果と比較する。染色体の特徴の変化（例えば、後に採取した試料における中心体と核との比が、前に採取した試料組織と比較して統計学的に有意に大きい）があれば、この患者がその組織中で癌の初期発生を来しているという予測が得られる。続いて、この患者に対して、癌の症状が現れるまで待つ場合よりも早期に癌治療を開始することが可能と考えられる。これにより、彼女が生存する確率は高められると思われる。
【００３１】
本発明の方法を自動化しうる手法は数多くある。これらには、国際公開公報第00/26408号ならびに米国特許第6,553,135号、第6,418,236号、第6,372,183号、第6,330,349号、第6,328,567号、第6,317,617号、第6,215,892号、第6,200,781号、第6,190,170号、第6,127,133号、第6,088,473号、第6,048,314号、第6,011,862号、第5,984,870号、第5,812,419号、第5,790,690号、第5,717,602号、第5,656,499号、第5,650,122号、第5,631,165号、第5,620,898号、第5,526,258号および第5,509,042号に開示された方法の任意のものが含まれ、これらはすべてその全体が参照として本明細書に含まれる。組織試料または細胞試料における染色体異常の検査および分析を自動化するために用いうる市販のシステムの例には、Molecular Devices CorporationによるDiscovery-1（商標）またはDiscovery-TMA（商標）システムがある（ほかにはMetaMorph（登録商標）、MetaFluor（登録商標）またはMetaVue（商標）システムもある）。
【００３２】
中心体異常
染色体不安定性（CIN）は、有糸分裂時の連続的な染色体分離異常によって引き起こされると考えられており、これはヒトの癌における遺伝的不安定性の最も多い型である（Lengauer C.ら、Nature: 643-9, 1998）。染色体の構造変化とともに、CINは癌に特徴的なダーウィン的ゲノム進化を促進する上で重要であると考えられている（Cahill, D. P.ら、Trends Cell Biol, 9: M57-60, 1999）。CINならびに染色体の切断および誤修復の複合的な影響により、癌に特徴的な腫瘍抑制遺伝子の累進的な喪失および腫瘍促進遺伝子（癌遺伝子、細胞生存遺伝子）の過剰なコピーの蓄積を説明することが可能である。実際に、癌におけるヘテロ接合性の消失は主に染色体全体または大きな染色体ドメインに影響を及ぼし、このことはそれが正常染色体全体または構造的に異常な染色体の不分離に起因することを示唆している（Thiagalingam, S.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 98: 2698-702, 2001）。CINは、腫瘍細胞の増殖、播種転移および治療抵抗性を援助する細胞状態に向かっての癌の強固な進化を促すと考えられている（Lengauer C.ら、Nature, 396: 643-9, 1998；Cahill, D. P.ら、Trends Cell Biol, 9: M57-60, 1999；Lengauer, C.ら、Nature, 386:623-7, 1997；Pihan, G.A.ら、Cancer Res, 58: 3974-85, 1998；Pihan, G.A.ら、Semin Cancer Biol, 9: 289-302, 1999）。染色体分離における忠実度の消失に伴ってみられる一連の事象に共通する要素は、中心体の機能異常である（総説に関しては、Pihan, G A.ら、Semin Cancer Biol, 9: 289-302, 1999；Brinkley, B.R.、Trends Cell Biol, 11: 18-21, 2001；Doxsey, S.、Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 688-98, 2001；Lingle, W. L.ら、Curr Top Dev Biol, 49: 313-29, 2000；Marx, J., Science, 292: 426-9, 2001；Winey, M., Curr Biol: R449-52, 1999を参照のこと）。
【００３３】
中心体は動物細胞における主要な微小管形成中心であり、有糸分裂における微小管紡錘体の形成に寄与するとともに、細胞質分裂の進行およびS期への移行を制御する（Doxsey, S., Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 688-98, 2001；Hinchcliffe, E. H.ら、Genes Dev, 15: 1167-81, 2001；Khodjakov, A.ら、J Cell Biol, 153: 237-42, 2001；Piel, M.ら、Science, 291: 1550-3, 2001）。中心体障害はさまざまな起源の侵襲性癌で検出されている（Pihan, G. A.ら、Cancer Res, 58: 3974-85, 1998；Lingle, W. L.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 95: 2950-5, 1998）。本発明は、少なくとも一部には、組織における中心体障害はその組織が癌を発症するか否か、このような癌の進化、およびその癌の結果的な重症度と強く相関するという発見に基づく。
【００３４】
形成中の紡錘体における中心体に関して実証されている役割から、多数の中心体を有する腫瘍細胞は多極紡錘体を形成し、それが次に染色体の分離異常を生じさせ、遺伝的不安定性の一因になるというモデルが推測されている。この現象は、二倍体細胞で、または以前に細胞分裂に失敗し、過剰な中心体を有する多数体細胞となった細胞で起こりうる（Meraldi, P.ら、Embo J, 21: 483-92, 2002）。ヒトの癌における中心体障害の発生率、ならびに紡錘体の集合および染色体分離におけるそれらの重要な役割にもかかわらず、ヒトの腫瘍発生の最も早期における中心体の役割はこれまで他には実証されていない。本発明は、少なくとも一部には、中心体障害および遺伝的不安定性がいくつかの低悪性度前立腺腫瘍にみられ、それらが侵襲性腫瘍の発生前に存在するという発見に基づく。しかし、中心体障害は、それらが早期の本疾患に対して最も高い潜在能力を有すると考えられ、腫瘍発生に関する予後判定マーカーおよび治療のための治療標的として役立つ可能性がある、最も早期のヒト癌とはこれまで関連付けられていないように思われる。
【００３５】
上皮内癌として知られているヒトにおける前浸潤癌病変は、この問題を幾分詳細に直接検討するという、またとない機会を提供する。本発明は、少なくとも一部には、中心体障害が種々の組織に由来する上皮内癌で生じ、紡錘体異常、細胞学的変化および染色体不安定性といった、中心体機能異常と関連のある他の腫瘍様特徴と共分離されるという認識に基づく。
【００３６】
中心体障害および前癌病変
本発明の基となった実験結果は、少なくとも一部には、中心体障害が発癌において決定的な役割を果たすことを示している。中心体障害は最も多いヒト癌のいくつかの進行型において高頻度に生じており、有糸分裂時の染色体分離の忠実度を損なわせることによって遺伝的不安定性の一因となる（Lengauer C.ら、Nature, 396: 643-9, 1998；Cahill, D. P.ら、Trends Cell Biol, 9: M57-60, 1999；Brinkley, B. R.、Trends Cell Biol, 11: 18-21, 2001；Doxsey, S.、Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 688-98, 2001；Marx, J., Science, 292: 426-9, 2001；Lingle, W. L.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 95: 2950-5, 1998）。上皮内癌は浸潤性上皮癌の直前の前駆病変であり、これは浸潤癌の遺伝子型および表現型の特徴のすべてではないもののいくつかを備えている（Bostwik, D. G, Semin Urol Oncol, 17: 187-98, 1999；Shultz, L. B.ら、Curr Opin Oncol, 11: 429-34, 1999；Wolf, J. K.ら、Cancer Invest, 19: 621-9, 2001）。本明細書に開示した実験結果は、中心体障害が、最も多いヒト癌のいくつかにおいて、腫瘍発生の形態学的に認知しうる最も早期に存在することを示している。それらは、発癌およびヒト上皮内癌の実験モデルに認められる大部分の病変においてCINおよび異数性が高頻度に観察されることの機構上の説明を与える（Bulten, J.ら、Am J Pathol, 152: 495-503, 1998；Levine, D. S.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 88: 6427-31, 1991；Li, R.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 94: 14506-11, 1997；Wang, X. W.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 96: 3706-11, 1999；Weinberg, D. S.ら、Arch Pathol Lab Med, 117: 1132-7, 1993）。これらのデータは、腫瘍発生過程の早期での遺伝的不安定性の発生における中心体障害の存在を示している。
【００３７】
さらに、中心体障害は上皮内病変の組織学的/細胞学的進行度（grade）と相関し、中心体は上皮内癌に特徴的な形態学的表現型の誘導にも役割を果たしている。中心体は細胞の極性、形状および運動性に役割を果たすことが示されており、上皮内癌ではこれらのすべてに混乱が生じている。さらに、子宮頸部の上皮内癌（CICまたは頸部上皮内癌）および女性乳房の上皮内癌（DCISまたは非浸潤性乳管癌）の病変の多くに紡錘体障害が存在すること、ならびにこれらの病変では中心体障害がCINと共分離されることは、中心体障害が上皮内癌において重要な機能的影響力を有することを示している。
【００３８】
本明細書に記載した実験結果は、中心体障害が、侵襲性腫瘍（良性のまま留まるものではなく）の発生に役割を果たすことを示している。例えば、高悪性度癌（DCIS（非浸潤性乳管癌）およびCIC（子宮頸部上皮内癌））への進行速度が大きい病変では中心体異常の頻度が高く、前立腺上皮内腫瘍（PIN）などの低悪性度浸潤癌に進行する病変では中心体障害の頻度が低い。乳房および子宮頸部の大部分の浸潤癌は侵襲性高悪性度癌であることが示されている。DCISおよびCICは通常、細胞学的には侵襲性癌と識別不能であるため、それらがこれらの侵襲性癌の元になると考えられている。これに対して、前立腺の癌は通常は低悪性度癌であり、これは大部分のPIN病変が低悪性度の外観を呈することに合致する。これらの結果は、中心体障害が染色体数の顕著かつ持続的な変化を誘導し、それによってゲノムのシャッフリングが起こるともに、浸潤癌にみられるような最も侵襲性の高い表現型の選択が可能になるという、腫瘍発生の中心体媒介モデルを裏づける。
【００３９】
本発明は、少なくとも一部には、疾患の最も早期にある細胞に中心体異常が存在することにより、上皮内病変の高悪性度浸潤癌への進化の予測が可能になるという発見に基づく。この発見は前立腺癌の管理の点から特に興味深く、これはこれらの腫瘍の大半が生物学的に低悪性度であるためである。現在、これらの癌は多くの場合、前立腺切除術によって治療されるが、これは侵襲性疾患に関する有効な予後判定指標がないためである。中心体異常によって高悪性度癌の発生が予測されるため、このような予測は、高悪性度癌に関して切実に必要とされている代用マーカーを与えることができる。中心体障害は侵襲性疾患と相関し、このことは後に浸潤癌へと進行した患者からのPIN病変を検査することによって示しうる。早期（前癌）病変における中心体障害は、後により悪性の、またはより侵襲性の高い腫瘍へと進行した病変ほど不良である。
【００４０】
1つの興味深い観察所見は、CIC病変の近傍の形態学的に正常な上皮において、低レベルではあるが測定可能なレベルの中心体障害が存在したことである（図2A）。これはヒトパピローマウイルス感染の存在のためである可能性がある。パピローマウイルスがほぼすべての子宮頸癌の原因であり、すべての前駆病変に存在することは十分に実証されている（Munger, K., Front Biosci, 7: d641-9, 2002）。さらに、パピローマウイルスは扁平上皮細胞における中心体異常を迅速に誘導しうることが最近示されている（Duensing, S.ら、Biochim Biophys Acta, 2: M81-8, 2001）。
【００４１】
もう1つの重要な発見は、上皮内癌における異常中心体の機能的な影響である。実験系および細胞系において（Brinkley, B. R., Trends Cell Biol, 11: 18-21, 2001；Ring, D.ら、J Cell Biol, 94: 549-56, 1982）、過剰中心体によって形成された多極紡錘体は融合して双極紡錘体を形成し、中心体障害が染色体分離に及ぼす機能上の結果を緩和することが示されている。融合が上皮内癌で起こるか否かはわかっていない。しかし、仮にそれが起こるとしても、それだけでは紡錘体多極性に対する過剰中心体の影響を完全に抑制するには不十分である。
【００４２】
中心体障害が上皮内癌の表現型の原因であるか結果であるかに関係なく、染色体異常によって癌の発生を予測することができる。したがって、染色体異常の同定は、予測用検査および癌特異的な有効な治療的介入のために重要である可能性がある。中心体障害が生じうる様式は数多くある。これらには、細胞周期の制御に関与するタンパク質の変化、中心体の構造または機能の変化、およびDNA修復の変化が含まれる。例えば、p53（Fukasawa, K.ら、Science, 271: 1744-7, 1996；Tarapore, P.ら、Oncogene, 20: 3173-84, 2001；Wang, X. J.ら、Oncogene, 17: 35-45, 1998）またはp53の下流のエフェクターもしくは調節因子、例えばMdm2（Carroll, P. E.ら、Oncogene, 18: 1935-44, 1999）、p21Waf/Cip1（Fukasawa, K.ら、Science, 271: 1744-7, 1996；Carroll, P. E.ら、Oncogene, 18: 1935-44, 1999；Mantel, C.ら、Blood, 93: 1390-8, 1999）もしくはGADD45（Wang, X. W.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 96: 3706-11, 1999；Hollander, M. C.ら、Nat Genet, 23: 176-84, 1999）の変異または消失は中心体異常を誘導する。過剰中心体を有する四倍体細胞に細胞周期を継続させるには、分裂期後p53依存性チェックポイントの阻害が決定的に重要と思われる（Andreassen, P. R.ら、Mol Biol Cell, 12: 1315-28, 2001；Khan, S. H.ら、Cancer Res, 58: 396-401, 1998；Lanni, J. S.ら、Mol Cell Biol, 18: 1055-64, 1998）。同様に、ペリセントリン（Pihanら、Cancer Res, 1: 2212-9, 2001；Purohit, A.ら、J Cell Biol, 147: 481-92, 1999）、g-チューブリン（Shu, H. B.ら、J Cell Biol, 130: 1137-47, 1995）、オーロラ（aurora）（Meraldi, P.ら、Embo J, 21: 483-92, 2002；Bischoff, J. R.ら、Embo J, 17：3052-65, 1998；Zhou, H.ら、Nat Genet, 20: 189-93, 1998）、ポロ（polo）（Connら、Cancer Res., 60: 6826-31）、TACC（Raff, J. W.ら、Cell, 57: 611-9, 1989）およびRanBP（Wiese, C.ら、Science, 291: 653-6, 2001）などの中心体関連タンパク質のレベルの変化は異常中心体をもたらす。さらに、Xrcc3（Griffin, C. S.ら、Nat Cell Biol, 2: 757-61, 2000）、Xrcc2（Griffin, C. S.ら、Nat Cell Biol, 2: 757-61, 2000）、BRCA1（Bertwistle, D.ら、Breast Cancer Res, 1: 41-7, 1999；Xu, X.ら、Mol Cell, 3: 389-95, 1999）、BRCA2（Kraakman-van der Zwet, M.ら、Mol Cell Biol, 22: 669-79, 2002；Tutt, A.ら、Curr Biol, 9: 1107-10, 1999）、Mre11（Yamaguchi-Iwai, Y.ら、Embo J, 18: 6619-29, 1999）もしくはDNAポリメラーゼβ（Bergoglio, V.ら、Cancer Res, 62: 3511-4, 2002）といったDNA修復に関与するタンパク質、またはATR（Smith, L.ら、Nat Genet, 19: 39-46, 1998）などのゲノム損傷シグナル伝達タンパク質の変異または機能的阻害も中心体異常をもたらしうる。また、中心体異常は、大腸腺腫性ポリポーシス遺伝子（APC）（その産物が微小管と相互作用する）の変異（Foddle, R.ら、Nat Cell Biol, 3: 433-8, 2001）、細胞質分裂障害（Doxsey, S., Nat Genet, 20: 104-6, 1998）および中心体成分の無動原体微小管形成中心（acentriolar microtubule organizing center）としての異所性集合（Doxsey, S., Nat Rev Mol Cell Biol, 2: 688-98, 2001；Pihan, G. A.ら、Cancer Res, 61: 2212-9, 2001；Purohit, A.ら、J Ce11 Biol, 147: 481-92, 1999）によっても生じうる。
【００４３】
実施例
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。一般的な実験手順についてまず説明する。
【００４４】
実験手順
免疫組織化学染色および分析
子宮頸部、女性の乳房および男性の前立腺の上皮内癌からのホルマリン固定パラフィン包埋組織を、UMass Memorial Health Careの病理部（Pathology Department）のファイルから選別した。試料を記載された通りにペリセントリン抗体によって免疫染色した（Pihan, G. A.ら、Cancer Res, 58: 3974-85, 1998；Pihanら、Cancer Res, 61: 2212-9, 2001；Purohit, A., J Cell Biol, 147: 481-92, 1999）。標本中の上皮内癌の存在を確認するために、新たに調製したヘマトキシリン・エオシン染色切片に対して標準的な組織病理学的基準を適用した（Rosai, J.,「Akerman's Surgical Pathology」（Mosby, New York）, 1996）。中心体の直径が同じ切片中の正常上皮に存在する中心体の直径の2倍を上回る場合、中心体の最大径と最小径との比が約2を上回る場合、または検査した細胞の約5％超に2つを上回る中心体が存在した場合には、中心体を異常とみなした（Pihanら、Cancer Res., 61: 2212-2219, 2001）。ホルマリン固定してパラフィン包埋した保存組織中の紡錘体を染色するためにはg-チューブリンを選択したが、これはそれは紡錘体極を修飾するが、チューブリンおよびbチューブリンのかなりの割合は細胞質性であり、紡錘体微小管シグナルが不明瞭となるためである。本発明者らおよび別の者が以前に示したように、異常な中心体を有する癌細胞株では、過剰中心体がもたらす明らかな結果である多極有糸分裂の頻度が高い（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998；Satoら、Clin. Cancer Res., 5: 963-70, 1999；Lingelら、Am. J. Pathol, 155: 1941-51, 1999；Saundersら、PNAS, 97: 303-8, 2000）。
【００４５】
染色体不安定性の分析
ペリセントリン免疫組織化学法のために用いたものと同時並行的な組織切片を、第1染色体および第8染色体の動原体を染色するために用いた（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998）。簡潔に述べると、脱パラフィン処理の後に、第1染色体および第8染色体に対して特異的なビオチン化動原体プローブとともに切片を変性させ、Hybriteオーブン（Vysis, Chicago, IL）内で、プローブの製造元により推奨されているハイブリダイゼーションバッファー中にて37℃で一晩ハイブリダイズさせた。適切なストリンジェンシーの洗浄後に切片を自動免疫染色装置の上に載せ、ハイブリダイズしたプローブを示すために、上記の免疫組織化学法に用いたものと同様のABC/DABプロトコールを用いた。核をヘマトキシリンによって薄く対比染色した。定量分析のためには、上皮内癌および形態学的に正常な近傍の上皮からの100〜200個の核におけるハイブリダイゼーションシグナルの数を記録した（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998）。これらのプローブを用いたところ、正常な二倍体組織は、核1つ当たりのシグナル数が3つを上回った細胞が10〜15％を占めることが示された（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998；Bultenら、Am. J. Pathol., 152: 495-503, 1998）。組織切片中のいくつかの核は切断され、核1つ当たりの見かけのシグナル数が2つ未満である二倍体細胞の数が人為的に増えていた。この理由から、見かけ上の損失ではなく、コンピュータで算出した信号利得（2つを上回る）を比較した。この制限のために、細胞系に対して行えるような、切片における染色体不安定性の絶対的な指標を得るための試みは行わなかった（Lengauerら、Nature, 386: 623-7, 1997；Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998）。その代わりに、異数性/CINの可能性が高い腫瘍を、シグナル数が2つを上回る核の割合が20％を上回るものと定義し（Bultenら、Am. J. Pathol., 152: 495-503, 1998）、この測定値を染色体不安定性/異数性の指標として用いた。
【００４６】
PINまたは正常前立腺上皮に由来する細胞系の分析
NCIの前立腺癌患者から腫瘍性および正常な上皮細胞系の同系ペアを樹立する試みにおいて、正常細胞系および高悪性度PIN細胞系の一対が同じ患者から導き出された（Brightら、Cancer Res., 57: 995-1002, 1997）。ドナー前立腺の病理検査により、正常な腺および広範な高悪性度PINのみが示され、浸潤癌は認められなかった。中心体の検討のために、細胞系を5％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むケラチノサイト-SFM規定培地中においてカバーガラス上で増殖させた。以前の記載の通りに（Pihanら、Cancer Res., 58:3974-85, 1998）、0.1％トリトン-Xを含む微小管安定化緩衝液中で細胞の透過化処理を行った後に、細胞100個を冷（-20℃）メタノール中で固定し、中心体の免疫染色を行った。第1染色体および第8染色体に対するプローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーションを以前の記載の通りに行った（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998）。免疫蛍光およびFISHを4回の別々の実験で行い、その結果を平均した。
【００４７】
実施例1．前浸潤癌病変には中心体障害がかなりの数存在する
子宮頸部の上皮内癌（CIC）、女性乳房の上皮内癌（DCIS）および男性前立腺の上皮内癌（PIN）について検討した。これらの病変は最も多いヒト癌の前駆病変である。さらに、乳癌および前立腺癌はそれぞれ女性および男性において2番目に多い死因である。
【００４８】
中心体タンパク質であるペリセントリンに対する抗体を用いて（Doxseyら、Cell, 76: 639-50, 1994）、本発明者らは腫瘍組織および非腫瘍組織の切片における微小管形成中心を記載の通りに検査した（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998；Pihanら、Cancer Res., 61: 2212-2219, 2001）。これらの病変において、過剰中心体（図1Bの矢印）、伸長性またはコルク抜き状などの異常な形状の中心体（図1Dおよび1F）、および同じ組織切片中の正常上皮におけるものよりも直径の大きい中心体（図1Bおよび1D）を含む、いくつかの種類の中心体異常が検出された。また、中心体が外見上認められない細胞または中心体が多数の小さな点として形成された細胞も観察された。この表現型は一部には組織切片の作製時の細胞切断の結果である可能性があるため、腫瘍細胞系で同様の表現型が観察された場合であっても、これらは障害としては評価しなかった。すべての前癌病変における中心体障害の定量化により、36〜72％は異常な中心体を有することが示されたが（図2A〜C）、非腫瘍性細胞における障害は検出不能であるか低レベルであった（図2A〜C）。中心体障害の頻度はDCIS病変およびCIC病変の方がPIN病変よりも高かった。DCISおよびCICとPINとの間の中心体異常の違いは、これらの病変の組織学的、細胞学的および遺伝学的な特徴の違いと一致する。DCISおよびCICは高度の核異型、細胞学的な秩序の乱れ、細胞極性の消失および遺伝的不安定性を示す。実際に、それらはしばしば細胞学的な特徴のみによって浸潤性乳癌および子宮頸癌と識別しうる（Crumら、J. Cell. Biochem. Suppl., 23: 71-9, 1995；O'Connellら、Breast Cancer Res. Treat., 32: 512, 1994）。これは、細胞極性および腺構造の保存が認められ、核および核小体の特徴のかなり微妙な違いによってのみ正常な腺と識別可能であるPIN病変とは対照的である。
【００４９】
以上をまとめると、中心体異常が前浸潤性病変に存在すること、およびそれらの頻度はCICおよびDCIS病変の方がPIN病変よりも高いことが示された。同様の結果が、間期細胞においてg-チューブリン抗体を用いても得られたが、観察された障害はペリセントリン抗体を用いた場合よりも少なかった。
【００５０】
実施例2．中心体障害の出現率は上皮内癌の組織学的進行度が高いほど増加する
組織学的/細胞学的進行度が異なる上皮内癌は、浸潤癌に進行するリスクの点で違いがある。3種類の前癌病変のすべてにおいて、組織学的/細胞学的進行度が高いと中心体障害の出現率は2〜4倍高いことが観察された（図3）。大部分のDCIS病変は中心体障害を示したが（図3E）、高悪性度PIN病変でこの表現型を有したのは36％に過ぎなかった（図3I）。DCISにおける中心体障害の驚くほど高い出現率は、DCISと浸潤性乳癌との間に細胞学的類似性があることに合致する（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998）。組織学的進行度2および3のCIC病変（「高悪性度」病変と総称される）は中心体障害の出現率が高く、DCIS病変で認められる率に近かった（図3A）。3種類の病変のすべてにおいて、中心体異常の程度は、浸潤癌に進化する性向の強い病変ほど大きかった。この傾向は、腫瘍の進行過程で起こる細胞学的および遺伝学的な変化の発生における中心体の重要な役割を示している。
【００５１】
実施例3．上皮内癌では紡錘体異常の頻度が高い
有糸分裂細胞で過剰中心体によってもたらされると予想される結果の1つは、多極紡錘体の発生である（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998；Purohitら、J. Cell. Biol., 147: 481-92, 1999）。異常な紡錘体を同定するために、この免疫組織化学的手順において紡錘体極に対する最良のマーカーであるg-チューブリンを用いて切片を染色した（実験手順の項を参照されたい）。有糸分裂像の総数は一般に少なかったが、紡錘体はCIC病変の74％（29/39）、DCIS病変の35％（12/34）に認められ、PIN病変（0/42）および非腫瘍性細胞では認められなかった。PIN病変における紡錘体の出現率の低さは、固定の遅れ、および、他の上皮内病変（DCIS、CIC）と比較して前立腺腫瘍細胞の増殖が比較的遅いことの結果である可能性が高い。紡錘体を有する腫瘍のうち、DCISの75％（9/12）およびCICの34％（10/29）は異常な紡錘体を少なくとも1つ有していた（図4Hおよび4G）。障害のある紡錘体には、多極紡錘体（3つまたはそれを上回る極、図4B、DおよびF）、単一の細胞における多数の双極紡錘体（図4E）ならびに非対称性の双極紡錘体および多極紡錘体（図4DおよびF）が含まれた。
【００５２】
上皮内病変におけるこの表現型の程度の指標を得るため、および紡錘体数の少なさによってデータに導入される内在的なバイアスを避けるために、紡錘体数が10個またはそれを上回る細胞において異常紡錘体を算定した。そのようにして選択した場合における多極紡錘体の平均数はそれぞれ10.1+/-7.8および16.6+/-4.1であった（図4I）。単極紡錘体も検出されたが、組織切片の作製によって誘発された切断性アーチファクトの複合的な影響のため、それらの正当性を確認することはできなかった。病変の近傍にある正常上皮では有糸分裂像は稀にしか観察されなかった。これは、これらの組織では有糸分裂速度が低いためである可能性が最も高いが、すべての場合にこれらの外観は構造的に正常であった（対称性、双極、n＝4）。非腫瘍性組織における紡錘体の出現率が低いこと、および免疫組織化学的手順が有糸分裂細胞に及ぼす非特異的な影響の対照とすることを理由として、上皮内癌による結果を増殖性の高い上皮のものと比較した。吸収不全の一型であるセリアックスプルーの患者の生検標本において、小腸上皮は粘膜再生速度が高いために有糸分裂活性が高い。これらの生検標本において異常な有糸分裂は全く検出されず（n＝45）、このことから上皮内癌における観察所見が保存されていた組織生検試料の染色によるアーチファクトではないことが示された。
【００５３】
実施例4．中心体障害は前癌病変においてCINと相関する
染色体不安定性（Lengauer C.ら、Nature, 396: 643-9, 1998；Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998；Lingleら、PNAS, 95: 2950-5, 1998）および中心体障害はいずれも上皮癌に共通する特徴である（Marx, Science, 292: 426-9,2001；Lingleら、PNAS, 95: 2950-5, 1998；Pihanら、Cancer Res., 61: 2212-9,2001；Lingleら、Am. J. Pathol., 155: 1941-51, 1999）。上皮内癌において中心体障害とCINとの間に相関が存在するか否かを明らかにするために、これらの異常について連続組織切片の検査を行った（方法に関しては、Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998；Ghadamiら、Genes Chromosomes Cancer, 27: 183-90, 2000；Pihanら、Cancer Res., 61: 2212-9, 2001；Brightら、Cancer Res., 57: 995-1002, 1997を参照のこと）。
【００５４】
CINは多くの上皮内病変で観察されたが、同じ組織切片中の正常上皮には全く認められなかった（図5A、CおよびF）。さらに、3種類の上皮内癌のすべてにおいて、中心体障害とCINとの間には統計学的に有意であってランダムではない関連性（Fisherの直接法でp＜0.005）がみられた（図5G〜I）。実際に、中心体障害を伴う大部分の病変はCINを示した（63〜71％、図5）。その反対に、中心体障害がない場合にはCINはみられなかった（81〜95％、図5）。DCIS、CICおよびPINの間で中心体障害の程度は大きく異なるものの、中心体障害とCINとの間のこの相関は有意であった（図2）。興味深いことに、中心体障害はあるがCINはない病変（約30％）の方が、CINはあるが中心体障害はない病変（約10〜20％）よりも頻度が高く、このことから、前癌病変における腫瘍様表現型の進行においては中心体障害がCINよりも先行することが示された（Pihanら、Cancer Res., 58: 3974-85, 1998；Doxsey, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 2: 688-98）。
【００５５】
以上より、中心体障害を、CINならびに癌の発生および進行を予測するために利用することが可能である。
【００５６】
実施例5．PINおよび正常組織に由来する細胞系における中心体障害およびCIN
入手可能な既知の上皮内癌細胞系の1つ（Brightら、Cancer Res., 57: 995-1002, 1997）を中心体障害およびCINに関して調べた。細胞系は、これらの特徴に関してより優れた定量的指標を与えるとともに、最終的には中心体障害の原因となる分子的機序を検討するために用いることができる。高悪性度PIN病変由来の細胞系（1560PINTX）および正常前立腺上皮由来の対照細胞系（1560NPTX）、これらはいずれも外科的に摘出された同じ前立腺から生じている（Brightら、Cancer Res., 57: 995-1002, 1997）。中心体障害を検出するためにペリセントリン抗体を用いた免疫蛍光分析により、PIN細胞における中心体障害の出現率は正常細胞よりも有意に高いことが判明した（約4倍の高さ、図6H）。腫瘍の場合と同じく、多極紡錘体の出現率は中心体障害の出現率と並行し、PIN細胞の方が正常細胞よりも高い（図6I）。CINレベルもPIN由来の細胞の方が対照に比して一貫して高かった（図6J）。
【００５７】
以上より、中心体障害を、CINならびに癌（例えば、PIN細胞）の発生および進行の予測のために利用することができる。
【００５８】
実施例6．前立腺癌の診断
前立腺癌の原因は不明である。疾患の発生および進行に関与する基礎的な細胞機序の解明は、この主要な型のヒト癌の検出および治療のための方法を計画するために必須である。本発明は、侵襲性疾患に対する早期かつ有効な予後判定法の開発、および前立腺癌に対する新たな標的の同定に基づく新たな治療法の作成を可能にする。
【００５９】
前立腺腫瘍の病原性は細胞構築異常（グリーソン分類4、5）と相関し、高悪性度腫瘍は遺伝的不安定性を示す。しかし、これらの異常な細胞上の特徴の分子的および生物学的な基盤はほとんどわかっていない。中心体およびそれに付随した微小管は、紡錘体構築および細胞質分裂を染色体分離と協調させることにより有糸分裂において、ならびに細胞の極性および形状を調節することによって間期において決定的な役割を果たす。前立腺癌ではこれらのプロセスがすべて障害されている。いくつかの重要な観察所見により、中心体が前立腺癌におけるすべての既知の細胞性および遺伝的な変化に寄与することが示されている。中心体障害は前浸潤病変に存在し、腫瘍の進行に伴って重大度を増すが、これはグリーソン分類および遺伝的不安定性の変化と並行する。中心体タンパク質であるペリセントリンの過剰発現は前立腺腫瘍細胞と識別不能な特徴を生じさせ、インビトロでの前立腺細胞の悪性転換を誘導または悪化させる。前立腺癌および前浸潤病変における中心体障害およびペリセントリンレベルの上昇という新たな発見は、前立腺癌の進行過程で起こる細胞性および遺伝学的な変化の発生に関してこれまで解明されていなかった機序を示すものである。ペリセントリンが、癌と関連付けられているいくつかのキナーゼ（PKA、PKCおよびその他）と相互作用するという観察所見は、ペリセントリンの発癌性がペリセントリンとこれらのキナーゼとの相互作用の消失に起因するという発見につながる。
【００６０】
前立腺癌と診断された患者の大半は臨床的には活動性の低い腫瘍を有し、侵襲性が高くしばしば致死的である癌を発症するのは少数である。有効な予後判定検査があれば、活動性の低い疾患の患者に対する不要な治療をなくすこと、早期に介入して生存期間を延長させうる侵襲性疾患を有する患者を対象とすること、ならびに治療法のより優れたターゲティングおよび精緻化が可能になると考えられる。加齢と関連のあるこの癌のリスクを有する集団が劇的に増加していること（ベビーブーム世代の加齢）、および前立腺特異抗原（PSA）というより感度の高い指標によって前立腺癌と診断される個体の数が増加していることが理由で、このような検査の開発ははるかに重要性を増している。本発明者らは、ほぼすべての侵襲性腫瘍で中心体が異常であるが、前癌（PIN）病変ではそれはわずかな割合に過ぎないことを明らかにした。PIN病変における中心体障害の存在により、前立腺切除術または死亡の後に検査で示される臨床的に侵襲性のある腫瘍への進行を予測しうる。このアプローチを利用して、針生検標本における障害に関して、ならびに患者血清中の中心体の分子的要素の変化に関して検査を行うための臨床的アッセイを開発することが可能である。
【００６１】
前立腺癌は米国で最も多い性別特異的癌であり、米国人の男性が罹患する癌全体のうち3分の1近くを占める。米国における浸潤性前立腺癌の生涯リスクは約20％に達し（37-40）、80歳代の人におけるそれは、剖検時の前立腺の組織病理学的検査によれば80％に近い。このように驚くほど高い出現率にもかかわらず、前立腺癌によって死亡する生涯リスクははるかに低く、現時点では3.6％前後と推定されている（1/28、NCIの疫学サーベイランスおよび最終結果のウェブサイト（Surveillance Epidemiology & End Results Website）、2,001）。出現率高くおよび死亡率が低いという傾向は、今後数十年、以下の2つの要因が相まってさらに強くなると考えられる：1）ベビーブーム世代の加齢、これはこの年齢依存的癌のリスクを有する集団の増加をもたらすと考えられる、および2）前立腺特異抗原（PSA）に対するさらに感度の高いアッセイの臨床的実施、これによって臨床症状の発生よりもはるかに前にますます小さな癌病変を検出することが可能になる。しかし、腫瘍の挙動を非侵襲的な手段によって予測することは現時点では不可能であり、疾患を有する本質的にすべての患者に対して根治的治療が勧められているため、臨床的な活動性の低い（低悪性度）癌を致死的な可能性のある疾患（高悪性度）と識別するための非侵襲性検査を開発することが不可欠なことが強く示される。このような検査があれば、活動性の低い前立腺癌を有する患者の大半は不要な前立腺切除術を受けずに済み、それによって医療費が大きく削減されるとともに、治療に伴う障害の多くが避けられると考えられる。また、この検査により、医療従事者が侵襲性疾患を有する患者という比較的均一な群に治療を集約させることが可能になり、そうなれば新たな治療法の有効性をより迅速に評価することができると考えられる。
【００６２】
現在、前立腺癌の進行に関する最良の予測指標はグリーソンスコアである。グリーソンスコアは当業者に周知であるため、その詳細をここに示すことはしない。このスコアは、進行性に異常化する細胞構築上の特徴（細胞学的過形成）および腺脱分化の指標であり、グリーソン分類として記録される。最近の研究により、グリーソン分類が最も高度（4、5）である腫瘍の比率の方が、グリーソンスコア自体よりも予測能力が高いと思われることが示されている。グリーソン分類が高度であるという特徴（腺の進行性脱分化、細胞学的過形成）および遺伝的不安定性（異数性）との間に密接な関係があることは、腫瘍に関連したこれらの特徴が機構上結びついているという可能性を示唆する。すなわち、細胞および組織の構築および遺伝的忠実度を制御する分子的要素および細胞内構造における障害は、腫瘍の進行の一因になるとともに腫瘍の臨床的挙動を示す可能性が高く、このため侵襲性癌を予測しうる可能性が高い。本発明者らは、グリーソン分類が高度な前立腺癌に認められる一連の特徴に寄与する生物因子を、これらの未解明の因子を疾患の診断および治療法に利用するために探索した。
【００６３】
高悪性度前立腺癌のすべての特徴は、これまで見逃されてきた現象、すなわち中心体の構造および機能の障害に起因する。腺分化、細胞の形状および極性の消失、ならびに遺伝的不安定性の発生はいずれも中心体機能異常によって引き起こされると考えられる。中心体は微小な細胞オルガネラであり、間期および有糸分裂において微小管成長の核となり、紡錘体を形成して娘細胞への染色体分離を媒介する。中心体は微小管形成体として、上皮腺の形成に不可欠な過程である細胞形状および細胞極性の確立といった、微小管を介した多くのプロセスにも重要な役割を果たしている。中心体はさまざまな細胞内活性の協調も担っており、これは一部には、細胞周期の進行、中心体および紡錘体の機能ならびに細胞周期チェックポイントを制御しているものといった調節性分子に対するドッキング部位を提供することによる。本発明は、少なくとも一部には、前立腺腫瘍の進行に関する中心体媒介モデルの解明に基づく（図7）。
【００６４】
侵襲性前立腺癌の大半で中心体には障害があり、中心体障害はグリーソン分類が高度になるほど増大する。前立腺腫瘍における中心体障害は、遺伝的不安定性、正常な細胞構造の消失および腺脱分化と相関し、このことは障害のある中心体とこれらの腫瘍に付随する特徴との間に厳密な関係があることを示している。本発明者らは、前立腺癌の前駆病変（前立腺上皮内腫瘍、PIN）のある割合（約20％）に異常中心体があることを見いだした。この興味深い観察所見は前立腺癌の病因および予後にとって重要な意味がある。腫瘍発生プロセスの早期に中心体の機能異常が存在することにより、それが疾患のより後期に起こる遺伝的不安定性および細胞学的過形成の一因となること、ならびにそれによって高悪性度癌の発生が予測されうることが示された。このデータは、PIN病変の同程度の割合も侵襲性疾患の指標である異数性を呈したことを示している。
【００６５】
前立腺癌の進行に関する本発明者らの中心体に基づくモデルに関して、最も説得力のある実験的根拠は、遺伝的不安定性およびグリーソン分類の進行期に特徴的な細胞性変化を、中心体タンパク質であるペリセントリンを過剰発現させることにより、正常細胞で誘導すること、および腫瘍細胞で悪化させることが可能であるという注目すべき観察所見である。ペリセントリンは中心体および紡錘体の形成および機能に必須である。ヒト細胞、マウス細胞およびサル細胞ならびに正常前立腺細胞におけるペリセントリンレベルを人為的に高めることにより、遺伝的不安定性、細胞学的過形成、中心体障害、微小管構造崩壊および紡錘体機能異常が誘導され、前立腺腫瘍細胞ではこれらの特徴が悪化する。これらの細胞はインビトロ増殖速度の上昇および有糸分裂チェックポイントの制御の異常といった他の腫瘍性特徴も示す。さらに、ペリセントリンレベルは腫瘍および中心体障害を有するPIN病変でも上昇している。以上からみて、ペリセントリンは腫瘍の進行に強く関与している。
【００６６】
ペリセントリンはPKA、PKCおよびその他のものとも相互作用する。腫瘍に関連した機能におけるペリセントリンの中心的な役割は、いくつかの必須の細胞成分との相互作用によって媒介される。これらの中には、染色体微小管の核形成に関与するタンパク質（例えば、gチューブリン）、およびペリセントリンの中心体上での構築に関与するタンパク質である細胞質性ダイネインがある。ペリセントリンは、それ自体が癌に関与しているプロテインキナーゼ、すなわちPKA、PKCなどとも相互作用する。ペリセントリンの腫瘍性特徴は、PKA、PKCおよびその他のものと結合するドメインにある。3種類のキナーゼはすべてペリセントリンと結合する（PKA、PKCおよびその他のもの）。ペリセントリンのPKC結合ドメインを発現させると、細胞におけるペリセントリン-PKC相互作用が解除され、細胞質分裂障害によって異数性（二核細胞）が誘導される。その反対の実験で、PKCのペリセントリン結合ドメインを発現させると、細胞質分裂障害および異数体細胞が誘導される。この表現型はPKC b11に対して特異的であり、他の7種のアイソフォームは異数性にほどんど影響を及ぼさなかった。同様の方法によってペリセントリン-PKA相互作用を妨げると紡錘体障害および二核細胞が生じた。重要なこととして、PKA結合ドメインを欠くペリセントリン変異体を発現させると、完全長タンパク質の場合よりも重大度の低い表現型が生じ、このことからペリセントリンにより誘導される異数性はPKAのペリセントリンとの結合が一因となることが示された。ペリセントリンと結合した状態の3種類のキナーゼはすべて、遺伝的忠実度の制御に関して独立的または協調的に作用し、これらの相互作用のいずれを妨げても（例えば、ペリセントリンの過剰発現による）異数性が誘導された。
【００６７】
紡錘体機能、細胞質分裂および染色体分離に対して個別に必須である分子と相互作用することから、ペリセントリンを、遺伝的安定性の維持にかかわる活性の中心拠点（hub）とみなすことができる。ペリセントリンレベルの上昇により、これらの活性がいかにして損なわれ、侵襲性前立腺癌の特徴が誘導されたかを想像することは容易である。例えば、紡錘体障害または細胞質分裂障害は遺伝的不安定性を招き、一方、微小管アレイの分解は細胞極性および形状の変化を引き起こし、それが腺の無秩序化を招くと考えられる。本発明者らの前立腺腫瘍の進行に関するペリセントリンおよび中心体を介したモデルは、インビボおよびインビトロの両方で、染色体不安定性、複数のDNA含有量を有する種族系統、二倍体に近い癌、さらには低四倍体および高四倍体腫瘍を含む、遺伝的不安定性のすべての形態を説明する。
【００６８】
セントリオリン（centriolin）と呼ばれる新規中心体タンパク質は2種類の癌遺伝子と相同である。アミノ末端領域にあるドメインは腫瘍性タンパク質18またはスタスミン（stathmin）と相同であり、一方、中央領域およびC末端にあるドメインはトランスフォーミング酸性コイルドコイルタンパク質またはTACCタンパク質と相同である。セントリオリンの機能を解明するために計画した研究で、本発明者らは、タンパク質レベルの変化が細胞を細胞周期から逸脱させるのに十分であることを見いだした。これは、短鎖干渉性RNA（siRNA/RNAi）を用いてセントリオリンの細胞レベルを低下させることにより、またはこのタンパク質のN末端にあるドメインの過剰発現によって行った。細胞を細胞周期から逸脱させる能力は、細胞を周期内で停止させるよりも、細胞増殖を阻止するには強力な方法である。さらに、細胞を細胞周期から逸脱させることは、それらが最終的には分化誘導につながる可能性のある特有の老化状態に移行する可能性を示唆する。セントリオリンのアミノ末端ドメインの発現は、細胞周期から強制的に逸脱させ、分化を誘導し、細胞に正常な機能を取り戻させることにより、前立腺癌（後期癌を含む）を有する男性における前立腺腫瘍細胞を消失させることができる。治療は、前立腺腫瘍細胞または任意の他の腫瘍細胞にG0様状態を課すことに基づきうる。
【００６９】
前立腺癌は、活動性の低い低悪性度の癌における比較的正常なものから高悪性度で生物学的に侵襲性のある癌における高度な異常までの範囲にわたる、比較的広いスペクトルの細胞学的、生物学的および遺伝的な特徴を有するという点で、乳癌、肺癌および結腸癌を含む固形腫瘍の中で独特である。中心体機能異常は、低悪性度腫瘍から、癌の播種転移および死亡を伴う高悪性度の形態への転換をもたらす。要約して述べると、中心体障害はPIN病変および低悪性度腫瘍のある割合に認められ、腫瘍の進行に伴って増大して悪性前立腺癌では偏在性となる。中心体障害を伴う腫瘍ではペリセントリンレベルが上昇しており、培養細胞においてペリセントリンのレベルを人為的に高めると、前立腺腫瘍性の特徴が誘導されるか悪化する。ペリセントリンの発癌特性は、それ自体が腫瘍発生と関連付けられているキナーゼ（PKA、PKCおよびその他）と相互作用するドメインに存在する。本発明者らは最近、機能的に抑制した場合に細胞周期からの逸脱を誘導する新規中心体遺伝子を見いだし、このことから腫瘍細胞の増殖を阻止するための新たなアプローチが推定された。この方法は、前立腺腫瘍の増殖に対して細胞周期からの逸脱を誘導するために用いることができる。前立腺特異的ターゲティング、および細胞周期からの逸脱を引き起こすセントリオリン構築物を含むレトロウイルスの発現による、前立腺腫瘍細胞の増殖の阻害。例えば、PSMAの受容体を含み、前立腺特異的プロバシンプロモーターの転写制御下でドミナントネガティブGo誘導性セントリオリン構築物を発現する「二重ターゲティング性」自己活性化複製能欠損レトロウイルスベクターを構築することができる。前立腺癌細胞系に対するG0ウイルスの発現により、このG0ウイルスを特異的にターゲティングさせることができる。このG0誘導性レトロウイルスは異種移植片およびTRAMP前立腺癌マウスモデルにおいて前立腺腫瘍細胞に対して特異的にターゲティングさせ、それを停止させることが可能である。前立腺特異的ターゲティングおよび細胞周期からの逸脱を引き起こすセントリオリン構築物を含むレトロウイルスの発現により、前立腺腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。これを行うためには、PSMAの受容体を含み、前立腺特異的プロバシンプロモーターの転写制御下でドミナントネガティブGo誘導性セントリオリン構築物を発現する「二重ターゲティング性」自己活性化複製能欠損レトロウイルスベクターを構築するとよい。次に、前立腺癌細胞系に対するG0ウイルスの特異的ターゲティングおよび発現に関して試験を行う。このG0誘導性レトロウイルスは異種移植片およびTRAMP前立腺癌マウスモデルにおいて前立腺腫瘍細胞に対して特異的にターゲティングさせ、それを停止させることが可能である。
【００７０】
本発明者らは、前立腺切除術後に侵襲性癌を有することが証明された患者からの一組のPIN生検標本において中心体障害を観察した。前浸潤性病変における中心体障害の存在、ならびにペリセントリンを過剰発現させることによって前立腺細胞における中心体障害および腫瘍性特徴を誘導することが可能であることから、中心体障害が前立腺腫瘍の発生を引き起こし、腫瘍の進行速度を高めることが示された。PIN生検標本および前立腺切除術組織の検討により、PIN病変における障害のある中心体の存在とその後の侵襲性癌の発生との間の相関が判明した。
【００７１】
本発明者らは、ヴォルター・リード・メディカルホスピタル（Walter-Reed Medical Hospital）を含むいくつかの施設の協力を得て、PIN病変（針生検で検出）から浸潤癌（前立腺切除術後に検出）に進行した症例200例を入手した。前立腺切除術で活動性の低い疾患しか認められなかったPIN病変を有する生検標本が提供された（n＝57）。PIN病変および侵襲性腫瘍における中心体障害の同定には免疫組織化学法および免疫蛍光法を用いうる；本発明者らは、予測的な価値に関して分析しうる中心体の特徴を同定した（上記を参照）。さらに、ペリセントリンレベルがすべての腫瘍で上昇しており、低悪性度から高悪性度になるにつれてそれが上昇することを本発明者らが示したように、PIN病変におけるペリセントリンレベルには予測能力がある。中心体障害は、後に高悪性度腫瘍を発症した患者からのすべてのPIN病変で認められた。中心体は高悪性度腫瘍に付随する変化に寄与する。この観察所見には予後判定の面で重要な価値がある。6箇所生検で「PINのみ」であった患者に対する現在の臨床的管理については、この段階からの腫瘍の進行は他の研究者によって確認されていないため、議論がある。PINにおける中心体障害は、高悪性度前立腺癌を発症するリスクの高い患者を明確にするとともに、臨床医が治療上の決断を下す一助となりうる。中心体の以上の特徴およびペリセントリンレベルの検査により、わずかな変化でも同定することが可能になる。
【００７２】
ヒト材料の組織病理、DNA含有量および分子組成に関する検討により、浸潤癌の近傍にあるPIN病変は構造的および遺伝的に癌と関連があることが示されており、このことは浸潤性要素が近傍のPIN病変から生じていることを示す。中心体障害は腫瘍の進行の一因となり、この種の障害は浸潤癌の近傍にあるPIN病変に存在する（またはより重大である）が、腫瘍から離れた場所にあるPIN病変または低悪性度腫瘍の近傍にあるPIN病変には中心体障害がないことがある。中心体障害が浸潤癌の近傍にあるPIN病変に限定的であるか否か（またはより重大であるか否か）を明らかにするために、免疫ペルオキシダーゼ標識により、根治的前立腺切除術によって得られた組織を、腫瘍組織からより隔たったものと比較することが可能である。
【００７３】
その他の態様
本発明のさまざまな態様について説明した。しかし、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を行いうることは理解されるであろう。したがって、その他の態様は上記の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図1A〜図1Fは、上皮内癌における中心体障害を示した一連の顕微鏡写真である。中心体を描出するためにペリセントリンに対する抗体で免疫染色した正常上皮（1A、1Cおよび1E）および上皮内癌（1B、1Dおよび1F）の顕微鏡写真（1000倍）。正常上皮では中心体は丸く、サイズが均一であるが（矢印、1A、1Cおよび1E）、上皮内癌ではそれらはより大きいか（1B、1D、1F中の矢印）、多様か（1B）、または構造的に異常（1Dおよび1F中の矢印）である。核はヘマトキシリンによって淡青色に染色されている。1D中の挿入図は、伸長した中心体をさらに高倍率で示している。
【図２】図2A〜図2Cは、中心体障害が上皮内癌で高頻度であることを示した一連のグラフである。中心体障害はCIC病変（2A）、DCIS病変（2B）およびPIN病変（2C）のそれぞれ62％、75％および28％に存在する（N、正常上皮）。第1のカラム（2A〜C）、累積した障害；第2のカラム（A'-C'）、カテゴリー別にみた中心体の分類（#は数、Szはサイズ、Shは形状）。
【図３】図3A〜図3Lは、組織学的進行度が高いほど中心体障害の出現率が高くなることを示した一連のグラフである。それぞれの前浸潤病変における中心体障害の累積出現率（左のカラム）は、CICに関する進行度1〜3（3A、1-3）ならびにDCIS（3E）およびPIN（3I）に関する低悪性度（3L）および高悪性度（3H）を含む。Nは正常上皮を特定している。中心体障害のそれぞれの下位カテゴリーは、中心体数（3B、3F、3J）、形状異常（3C、3G；3K）およびサイズ（3D、3H、3L）の増加を含め、進行度が高くなると増加する。
【図４】図4A〜図4Iは、紡錘体障害がCICおよびDCISで多くみられることを示した一連の顕微鏡写真（左）およびグラフ（右）である。CICおよびDCIS（それぞれ4Aおよび4C）におけるg-チューブリンで免疫染色された双極紡錘体の例。多極紡錘体（4B、CIC；4D、4F、DCIS）および多数の紡錘体（4E、DCIS）の例。それぞれのCIC病変（4G）およびDCIS病変（4H）における双極紡錘体（x軸）および多極紡錘体（y軸）の数に関する定量分析。それぞれの円は個々の病変を表す。塗りつぶした円は10個またはそれを上回る有糸分裂を伴う病変を表し、これらはCICおよびDCISにおける紡錘体障害の程度の評価に含めた。免疫染色された紡錘体が10個を上回るCIC病変およびDCIS病変（4Gおよび4H中の赤色の円）において、紡錘体の平均10％および17％は異常である。
【図５】図５A〜図5Iは、中心体異常が上皮内癌における染色体不安定性と相関することを示した、一連の顕微鏡写真（左）およびグラフ（右）である。CIC（5B）、DCIS（5D）およびPIN（5F）の試料におけるインサイチューハイブリダイゼーション反応の例。多くの細胞が第8染色体に関して2つを上回るシグナルを有し（5B、5D、5F中の矢印）、すなわち染色体不安定性（CIN+）を呈している。近傍の正常上皮における細胞（5A、5C、5E）では2つを上回るシグナルを有するものは稀である。正常な中心体（5N）または異常な中心体（5A）を伴うCIC（5G）、DCIS（5H）およびPIN（5I）病変における染色体不安定性（CIN+）に関する定量分析。CINは、異常な中心体を伴う大部分の病変、および中心体異常を伴わない病変のごく一部に存在する。
【図６】図6A〜図6Jは、上皮内病変由来の細胞系における中心体障害および紡錘体障害ならびに染色体不安定性を示した、一連の顕微鏡写真（上）およびグラフ（下）である。正常上皮（1560NPTX、6A、6B、有糸分裂、6E、間期）および同じ前立腺からの高悪性度PIN病変（1560PINTX、6C、6D、有糸分裂、6F、6G、間期）に由来する細胞系における中心体および紡錘体を示した免疫蛍光像。このデータの定量により、1560PINTXの方が1560NPTXよりも、中心体障害（6H）、紡錘体障害（61）および染色体不安定性（6J）の出現率が2〜4倍高いことが示されている。
【図７】腫瘍の進行に関する中心体媒介モデルを示した概略図である。
【図８】細胞を用いる走査システムの構成要素の略図である。倒立蛍光顕微鏡1が用いられ、これは例えば、カメラに対して倍率1〜100倍の標準的な対物レンズ、および電源装置2を備えた白色光源（例えば、100W水銀灯または75Wキセノン灯）を用いるツァイス・アキソバート（Zeiss Axiovert）倒立蛍光顕微鏡などである。顕微鏡の対物レンズの上方でプレート4をXY方向に動かすためのXYステージ3がある。Z軸焦点駆動装置5は焦点を合わせるために対物レンズをZ方向に動かす。ジョイスティック6は、ステージのXYZ方向への手動的移動（必要な場合）をもたらす。高解像度デジタルカメラ7は、プレート上の各ウェルまたは位置から画像を取得する。カメラ用電源装置8、自動制御装置9および中央演算処理装置10がある。PC 11はディスプレイ12を提供し、付随するソフトウェアを備えている。プリンタ13はハードコピー記録の印刷を提供する。  種々の図面における同様の参照記号は同様の要素を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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