(57)【要約】本発明は、エーテル類、アルコール類、アルデヒド類、及び蟻酸から選択される有機化合物の存在下での高エネルギー放射線の使用により特徴付けられる、グリコサミノグリカン類の脱重合のための物理的方法に関する。本発明はまた、Mwが1000乃至5500Daの範囲であること、400nmでの吸収が0.300未満であること、及びSO3-/COO-比が出発ヘパリン中における値以上であることによって特徴付けられる、中間体脱重合ヘパリンにも関する。中間体脱重合ヘパリンは、バッファ溶液に溶解させて、所望の分子量を得るためにゲル透過による分別することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エーテル類、アルコール類、アルデヒド類、アミド類、及び蟻酸からなる群より選択される有機化合物の存在下での、高エネルギー放射線の使用によって特徴付けられる、グルコサミノグリカン類の脱重合方法。
【請求項２】
前記グリコサミノグリカンが、ヘパリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高エネルギー放射線が、ガンマ線である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記有機化合物が、下式Ｉ、II、及びIII：
【化１】
2005520005.tif 000005
[上記式中、
各Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＣＨＯ、Ｃ1-Ｃ6アルキル及びアシル（任意に酸素原子によって置換されたもの）からなる群より個別に選択され；２つのＲ基が任意に互いと結合して環を形成する]
のいずれかに表される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のグルコサミノグリカンの脱重合方法。
【請求項５】
前記有機化合物が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブタノール、グリセリン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、ジオキソラン、ホルムアルデヒド、グリオキサール、アセトアルデヒド、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセタミド、N,N-ジエチルホルムアミド、N-メチルピロリドンからなる群より選択される、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記有機化合物の量が、0.1乃至5％の範囲である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
使用される放射線の量が、100kGyより多量であり、有機化合物の量が0.2乃至2％である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか一項の方法によって得られるグリコサミノグリカン類。
【請求項９】
Mwが1000乃至5500Daの範囲であること、400nmでの吸収が0.300未満、好ましくは0.200未満であること、及びSO3-/COO-比が出発ヘパリン中における値以上であることによって特徴付けられる、中間体脱重合ヘパリン。
【請求項１０】
Mwが3500Da以下であること、SO3-/COO-比が2.35以上であること、及びMw/Mnが1.2より大なる、請求項９に記載の中間体脱重合ヘパリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
グリコサミノグリカン類は、製薬品として多大な興味が寄せられる天然産物である。最も広く知られているものの中では、ヘパリン、デルマタン、ヘパランスルフェート、及びコンドロイチン類を挙げることができる。
【０００２】
天然産物の分子量は、かなり様々であり、通常は5乃至40kDaの範囲である。しかしながら、所定の応用については、分子量が低いほど高い製薬活性がもたらされることが既知である。これら化合物は高分子量であるため、しばしば経口投与が不可能である。さらにまた、グリコサミノグリカン類の特定の活性が、比較的に短い糖配列に関連していることは既知である。従って、分子中に存在する活性部位を切り離すことなく、グリコサミノグリカン類を脱重合させて分子量を低減させることは非常に有利であろう。グリコサミノグリカン類の化学的脱重合は当業界では周知であり、低めの分子量であるがＳ含量も低めであるグリコサミノグリカン類をもたらす。EP394971は、酵素的または化学的脱重合方法を開示している。得られたヘパリンオリゴマーは、９％未満の硫黄含量を有する。
【背景技術】
【０００３】
WO90/04607には、H2O2及びCu2+の使用によるヘパリン及びデルマタンスルフェートのの脱重合を開示している。SO3-/COO-比は、出発ヘパリン中での方が僅かに低い。US4987222は、ガンマ線の使用によるヘパリンの脱重合方法を開示している。実施例は、Mwがおよそ5000Daであり高S含量を有するヘパリンの調製を開示している。しかしながら、この方法で製造されたヘパリンは、無制御の副反応の結果としてかなりの量の分解生成物を生じる。該特許は、放射線量とMwの減少との間の直接的関係を示す。しかしながら、US4987222による放射線の使用では、ヘパリンのMwに限られた減少が可能になるのみである。照射がいったん所定の値を越えると、色が暗くなる。
【特許文献１】EP394971
【特許文献２】WO90/04607
【特許文献３】US4987222
【非特許文献１】European Pharmacopoeia 4th ed.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、グルコサミノグリカン類の化学構造を実質的に変化させることなく、その分子量を低減させることが望ましい。
【０００５】
本発明は、エーテル類、アルコール類、アルデヒド類、アミド類、及び蟻酸から選択される有機化合物の存在下でのグリコサミノグリカン類の脱重合のための物理的方法に関する。これはまた、この方法により得られるグリコサミノグリカン類に関する。
【０００６】
本発明は、グルコサミノグリカン類の化学構造を実質的に変化させることなく、その分子量を低減させる、物理的脱重合方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的は、有機化合物の存在下での高エネルギー放射線の使用により達成される。出発物質としてヘパリンを使用する場合には、この方法は、400nmにおける低い吸収及び高いS含量によって特徴付けられる超低分子量から低分子量のヘパリンを生じる。
【０００８】
とりわけ、本発明による脱重合グリコサミノグリカン類のSO3-/COO-比は、出発グリコサミノグリカン類の比よりも高く；ヘパリンの場合には、好ましくは2.3よりも高く、更に好ましくは2.35よりも高い。本発明による方法において使用される出発物質は、天然グリコサミノグリカン類、例えばヘパリン、ヘパランスルフェート、デルマタン、及びコンドロイチンである。別の好適な出発物質は、既知の方法によって得られるグリコサミノグリカン類の誘導体である。したがって、例えば、ヘキソサミンの残基のN-アセチルまたはN-スルフェート基は、N-脱硫酸化またはN-脱アセチル化反応を経てアミノ基中で変換可能であり、ウロン酸のスルフェート基は、脱硫酸化反応を経てエポキシ基を生成させることができる。
【０００９】
別の実施態様においては、本発明の方法のための出発物質として、化学的または酵素的な、または高エネルギー放射線による、脱重合方法を既に経た、グリコサミノグリカンを使用することができる。部分的に脱重合したグリコサミノグリカン類の使用は、例えば、副作用として部分的脱重合を有する酸予備処理を経たヘパリンの場合、または官能化グリコサミノグリカン類を脱重合する場合に関連する。官能基の導入に使用される条件は、時に多糖類の分子量の低下を引き起こしている。
【００１０】
出発物質としての低分子量ヘパリンの使用の別の実施例は、ミクロヘパリン（Mwがおよそ1200-1600Da）の製造におけるものである。この場合には、脱重合を二工程で行うことが好ましいであろう。こうした方法は、少なくとも１つの工程が本発明によって実行されることを条件として、本発明の範疇に入る。
【００１１】
従って、両方の工程を高エネルギー放射線の使用によって行うことが可能であるのみならず、高エネルギー放射線を使用することによる第１の脱重合に次いで、化学的−酵素的脱重合を使用する第二工程を行うこと、または化学的−酵素的脱重合の第一工程に次いで、高エネルギー放射線によって行うことも可能である。
【００１２】
本発明の方法は、多糖類の化学構造の著しい変更を行うことなく、グリコサミノグリカンの分子量を減少させる。とりわけ、本発明の方法は、超低分子量グリコサミノグリカンの、元々のグリコサミノグリカン以上のS含量と共に、400nmでの、好ましくは0.300未満、最も好ましくは0.200未満の吸収によって特徴付けられる。
【００１３】
グリコサミノグリカンを脱重合するために使用される高エネルギー放射線には、グリコサミノグリカン上でラジカルを発生させるあらゆる放射線が可能であり、好ましい放射線はガンマ線、好ましくは以下の放射線源：60Co、241Am、137Cs、及び226Raから得られるものであり、最も好ましいガンマ線は、放射線源として60Coから得られるものである。60Coは、5.3年の半減期を有し、1.17及び1.33MeVのエネルギーで２つの光子を放出する。
【００１４】
脱重合方法において使用される放射線量は、幾つかの要因：グリコサミノグリカン類の種類、所望の最終Mw、使用される有機化合物の量及び種類、に依存する。一般的に、放射線の量は、50-300kGy、好ましくは100-250kGy、更に好ましくは120-200kGyの範囲をとるであろう。
【００１５】
実際、グリコサミノグリカンの構造は、脱重合方法の有効性に影響する。一般的に、硫黄含量が高いほど、同等の分子量の低減に要する放射線の量は多量になる。また、有機化合物の量の増加すると、同等のMwの低減を得るために要する放射線の量が増大する。
【００１６】
本発明による有機化合物は、アルコール類、エーテル類、アルデヒド類、アミド類、及び蟻酸からなる群より選択される。好ましくは、前記有機化合物は、下式Ｉ、II、及びIIIの化合物から選択される。
【００１７】
【化１】
2005520005.tif 000002
【００１８】
上記式中、  各Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＣＨＯ、Ｃ1-Ｃ6アルキル及びアシル（任意に酸素原子によって置換されたもの）からなる群より個別に選択され；２つのＲ基が任意に互いと結合して環を形成する。
【００１９】
アルコール類の好ましい例は、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、イソブタノール、グリセリンである。
エーテル類の好ましい例は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル、tert-ブチルメチルエーテル、ジオキソランである。
アルデヒド類の例は、ホルムアルデヒド、グリオキサール、アセトアルデヒド、またはこれらの安定化形態（トリオキサン、グリオキサールトリメリックジヒドレート）である。
アミド類の好ましい例は、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセタミド、N,N-ジエチルホルムアミド、N-メチルピロリドンである。
【００２０】
放射線に曝そうとする溶液中のグリコサミノグリカンの濃度は、大幅に変化可能である。好ましくは、これは2乃至25%m/v、更に好ましくは5乃至15%である。
【００２１】
本発明による有機化合物の量は、幾つかのパラメータに依存するが、一般的には0.1乃至5%の範囲に入る。100kGyまでの放射線量を使用する場合には、有機化合物の好ましい量は、0.1乃至1%の範囲に入り、一方で100kGyより多量の放射線量の場合には、有機化合物の好ましい量は、0.2乃至2%の範囲である。
【００２２】
照射の後、前記溶液は、酸化処理を用いることによって、またはこれを適当な樹脂上に流すことによって、任意に脱色される。その後、該溶液は、一般的に親水性溶媒中での沈殿により精製される。得られたペーストは、水中に再溶解させて、真空蒸留により凍結乾燥させることができる。
【００２３】
また、ゲル浸透クロマトグラフィーによって、中間体脱重合化グリコサミノグリカンを分別することも可能である。所望の分子量を含むフラクションは、回収され、限外濾過により濃縮され、凍結乾燥される。
【００２４】
（実験部分）
ガンマ線照射
放射線源周囲に生成物を運搬するシステムは、「マルチパス」タイプであり、前記生成物が曝されようとする放射線量に正比例した回数分、容器が回転する。各パスの間に、該生成物は約25kGyの放射線量を受容する。該過程を完了するためにかかる時間は、一度は放射線源のパワー（または活性）に依存するが、前記放射線源の自然な崩壊に従って、または放射性同位体の添加を考慮して、周期的に調整される。
【００２５】
（生成物特徴付け）
分子量（Mw及びMn）を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定した（クロマトグラフィー技術については、European Pharmacopoeia 4th ed.: 2.2.30及び2.2.46を、方法については、01/2002:0828 p.1297参照）。
260及び400nmでの吸収を、European Pharmacopoeia 4th ed. 01/2002:0828 p.1297に従って測定した。
Anti-Xa活性を、European Pharmacopoeia 4th ed.に記載の方法に従って測定した（クロマトグラフィー技術については、2.2.30及び2.2.46を、方法については、01/2002:0828 p.1297参照）。
スルフェート及びカルボキシレートイオンは、European Pharmacopoeia 4th ed.による電気伝導技術によって測定した（方法については、2.2.38及び01/2002:0828 p.1297参照）。
【実施例】
【００２６】
（実施例１）
ヘパリンナトリウム（100g、Mw 14800Da）を、5mlのイソプロピルアルコールを含む複蒸留（bi-distilled）水中に溶解させた。該溶液を体積（1l）にし、1.5lのパイレックス（登録商標）ガラス容器に注入し、アルゴンでパージして密閉した。前記容器を60Co源を使用し、150kGyの総量を照射した。照射した溶液は、4.8乃至5.5のpH及び暗黄色を呈した。Duoliteタイプの軽くアミノ化したフェノール樹脂により脱色し、アセトン中で沈殿させた。得られたペーストは水中に溶解させ、真空下で蒸留してスプレー乾燥させた。中間体脱重合ヘパリンは、下記の特徴を有していた。
Mw：4980Da
有機スルフェート：12.20%
ウロン基：28.2%
SO3-/COO-＝2.40
Mw/Mn=1.4
Anti Xa：109U/mg
中間体脱重合ヘパリンを、バッファ溶液中に溶解し、所望の分子量を得るためにゲル浸透によって分別した。
【００２７】
（実施例２）
ヘパリンナトリウム（100g、Mw 13500Da）を、4mlのイソプロピルアルコールを含む複蒸留水中に溶解させた。該溶液を1.5lのパイレックス（登録商標）ガラス容器に注入し、アルゴンでパージして密閉した。前記容器を60Co源を使用し、180kGyの総量を照射した。照射した溶液は暗黄色を呈した。これを過酸化水素などの酸化性物質を加えることによって脱色した。該溶液は、32%のNaOHの添加及び7時間に亘り激しい撹拌下におくことにより、pH8-8.5に維持した。
その後溶液のpHは、10%のHClを使用して6.5に調整し、その後酸化物質の反応が観察されなくなるまでNaHSO3で処理し、アセトンの添加によって沈殿させる。得られた固体を、水に溶解させ、軽量フラクションを留去し、ヘパリン溶液をスプレー乾燥させたところ、得られた軽粉末は、下記の特徴を有していた。
Mw：4300Da
有機スルフェート：11.41%
ウロン基：27.79%
SO3-/COO-＝2.48
Mw/Mn=1.7
Anti Xa：92U/mg
中間体脱重合ヘパリンを、バッファ溶液中に溶解し、所望の分子量を得るためにゲル浸透によって分別した。
【００２８】
（実施例３）
1.8kgのヘパリンを水中に溶解させ、該溶液を体積18lとした。その後これを、それぞれ2l入りのボトル9つに分配した。各操作において使用した有機化合物の種類及び量を、表１に示す。各場合において、濃度は0.1Mであった。出発ヘパリンはMw=13500Daを有していた。照射量は180kGyであった。表１のデータは、本発明による化合物の存在が、400nmでの値に示されるような色の急激な減退及び、更に260nmでの吸収の減少をもたらし、一方で有機化合物無しの試料についてはMwが実質的に変化なく維持されることを示す。
比較例７及び８は、本発明において定義されるもの以外の、様々な化合物の分類に属する有機化合物（エステル類及び酸類）の使用では、400nm及び260nmでの吸収は減少しないことを示す。
【００２９】
【表１】
2005520005.tif 000003
【００３０】
（実施例４：有機化合物の量の影響）
様々な量のイソプロパノールを使用して一連の操作を行った。500mlの10%w/vヘパリン（Mw=14300）水溶液を調製し、5つのボトルに分配した。
各ボトルに、表2に示した量のイソプロパノールを加えた。
該溶液を、総量で120kGyの放射線で照射した。
表２のデータは、イソプロパノールの増大により260nmでの吸収の減少及びMWの増大を生じることを明らかに示す。260nmでの吸収の値は、紫外領域であるにもかかわらず、試料の視覚的外観と矛盾のないものである。
【００３１】
【表２】
2005520005.tif 000004
【００３２】
（実施例５：デルマタンスルフェートの脱重合化）
100gのデルマタンスルフェート（Mw＝28000）及び4mlのイソプロパノールを含む、11gの水溶液を調製した。該溶液を、窒素を用いて排出し、60Coガンマ線180kGyで照射した。
透明な溶液を中和し、アセトンで直接沈殿させた。軽質ペーストを水に溶解させ、真空下で留去してスプレー乾燥させた。中間体脱重合デルマタンスルフェートは、下記の特徴を有していた。
Mw：3900Da
有機スルフェート：6.39%
ウロン酸：26.78%
SO3-/COO-＝1.44
Mw/Mn=1.6
CoIIa＝27U/mg
Anti Xa：なし
【国際調査報告】
2005520005.tif 000006
2005520005.tif 000007
2005520005.tif 000008