(57)【要約】  本発明は、関節リウマチに罹患している患者から自己抗体を検出する方法に関する。この目的を達成するために、本発明によれば、少なくとも２つのペプチド単位を用いるが、このうちの少なくとも１つのペプチド単位は、（プロ）フィラグリン、フィブリン、フィブリノーゲン、ビメンチン、サイトケラチン１およびサイトケラチン９に由来しない部分を含み、かつこのペプチド単位はモチーフＸＧを含み、そして１つのペプチド単位は、モチーフＸ非Ｇを含み、ここでＸはシトルリンまたはそのアナログであって、かつ非Ｇは、グリシン以外のアミノ酸である。
2005512092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチに罹患している患者から自己抗体を検出する方法であって、ここでシトルリン残基またはそのアナログを含む少なくとも１つの反応性ペプチドが、該少なくとも１つの反応性ペプチドと該自己抗体との間に複合体が形成されるのを可能にするのに十分に長い時間、該自己抗体と接触させられて、その後に該複合体が検出され、該方法は、該自己抗体がモチーフＸＧを含むペプチド単位、およびモチーフＸ非Ｇを含むペプチド単位と接触させられ、ここでＸが、シトルリン残基またはそのアナログであって、Ｇは、アミノ酸グリシンであり、かつ非Ｇはグリシン以外のアミノ酸であるという点で特徴付けられる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、非ＧがＨ、Ｉ、Ｗ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｃｉｔまたはそれらのアナログから選択されるアミノ酸であるという点で特徴付けられる方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記ペプチド単位の少なくとも１つが環状ペプチド単位であるという点で特徴付けられる方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法であって、ＸＧモチーフを有する前記ペプチド単位およびＸ非Ｇモチーフを有する前記ペプチドが、マルチペプチドの一部である方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法であって、前記Ｘ非Ｇペプチド単位が（プロ）フィラグリン、フィブリン、フィブリノーゲン、ビメンチン、サイトケラチン１およびサイトケラチン９に由来しないという点で特徴付けられる方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法であって、前記ＸＧペプチド単位Ｘ非Ｇペプチド単位が、以下：
0002-27  H Q K R G Cit G W S R A A
0002-29  H Q R R V Cit G W S R A A
0002-31  H Q R R T Cit G G S R A A
0002-32  H Q R K W Cit G A S R A A
0002-36  H Q F R F Cit G Cit S R A A
0002-37  H Q K W R Cit G R S Cit A A
0002-63  H Q F R F Cit G W S R A A
からなる群より選択され、
そして該Ｘ非Ｇペプチド単位は、以下：
0107-32  K P Y T V Cit K F M R R P
0107-35  A R F Q M Cit H Cit R L I R
0107-45  Y S F V W Cit S H A R P R
0113-30  A R F Q M R H Cit R L I R
0218-36  R N L R L Cit R E R N H A
からなる群より選択される、
という点で特徴付けられる方法。
【請求項７】
式（ＩＩ）：（Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５）−Cit−（Ａ６）−（Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１）
を有する配列を含むペプチドであって、
ここで、
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５は、以下：
-  RHGRQ
-  IRCitYK
-  HGRQCit
-  GRQCitCit
-  FQMCitH
-  CitWRGM
-  ARFQM
-  QCitYKW
-  KPYTV
-  RNLRL
-  RRRCitY
-  RFKSN
-  RGKSN
-  RWVSQ
-  MKPRY
-  KSFVW
-  YSFVW
-  FQMRH
-  RNMNR
-  RMGRP
およびそれらの相同配列、
から選択されるアミノ酸配列であり；
Ａ６は、グリシン以外のアミノ酸を示し；
Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１は、以下：
-  KYIIY
-  TNRKF
-  KWCitKI
-  CitRAVI
-  RCitGHS
-  CitGRSR
-  CitYIIY
-  CitRLIR
-  IERKR
-  FMRKP
-  FMRRP
-  ERNHA
-  AVITA
-  TPNRW
-  TYNRW
-  RTPTR
-  RIVVV
-  HARPR
-  RGMCitR
-  IRFPV
およびそれらの相同配列、
から選択されるアミノ酸配列を示す、
ペプチド；
ならびに、式（ＩＩ）を有する該ペプチドのアナログ。
【請求項８】
式（ＩＩＩ）：（Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６）−Cit−（Ｂ７）−（Ｂ８−Ｂ９−Ｂ１０−Ｂ１１）
を有する配列を含むペプチドであって、ここで
Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６は、以下：
-  INCitRAS
-  ICitKRLY
-  KCitCitYNI
-  RLYFICit
-  IRQGAR
-  CitERCitVQ
-  CitHQRIT
-  RICitRVCit
-  GRNQRY
-  RCitRQHP
-  CitCitRCitVA
-  RPKQHV
-  RKCitGCitR
-  RCitCitRNT
-  RCitQCitFT
-  QLVYLQ
-  QYNRFK
-  CitLRHIR
-  PRCitCitCitK
-  RCitQVRY
-  GRCitHAH
-  ARHVIR
-  RCitGHMF
-  GRNIRV
-  QIFYLCit
-  RQGPIA
-  GVYLVR
-  NCitCitRRV
-  KCitRLCitY
-  GRRCitCitL
-  RMPHCitH
およびそれらの相同配列、
から選択されるアミノ酸配列であり；
Ｂ７は、グリシン以外のアミノ酸を示し；
Ｂ８−Ｂ９−Ｂ１０−Ｂ１１は、以下：
-  CitHRR
-  CitIRR
-  FRRN
-  AQTT
-  GYPK
-  RPPQ
-  GCitRK
-  PIPR
-  YTIH
-  RIKA
-  CitRVR
-  TRRP
-  TIRP
-  IKCitR
-  RNVV
-  CitRRY
-  CitRPR
-  TRCitCit
-  CitCitGR
-  LCitRCit
-  RVRCit
-  VPRT
-  YCitFR
-  ARCitCit
-  RQCitR
-  HIRR
-  CitMMR
-  CitRICit
-  VRKS
-  PCitCitR
-  CitRRK
およびそれらの相同配列、
から選択されるアミノ酸配列を示す、
ペプチド；
ならびに、式（ＩＩＩ）を有する該ペプチドの機能的なアナログ。
【請求項９】
請求項７または８に記載のペプチドであって、Ａ６およびＢ７が互いに独立して、Ｃｉｔ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＰから選択されるという点で特徴付けられるペプチド。
【請求項１０】
請求項７ないし９のいずれか１項に記載のペプチドであって、該ペプチドが環状ペプチドであって、その環が少なくとも８、９、１０または１０より多いアミノ酸を含むという点で特徴付けられるペプチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のペプチドであって、該ペプチドが環状ペプチドであって、その環が少なくとも１１アミノ酸を含むという点で特徴付けられるペプチド。
【請求項１２】
請求項７ないし１１のいずれか１項に記載のペプチドであって、該ペプチドが以下：
R H G R Q Cit Cit K Y I I Y
I R Cit Y K Cit I T N R K F
R H G R Q Cit Cit Cit Y I I Y
A R F Q M Cit H Cit R L I R
Q Cit Y K W Cit K I E R K R
K P Y T V Cit K F M R K P
K P Y T V Cit K F M R R P
R N L R L Cit R E R N H A
R R R Cit Y Cit R A V I T A
R F K S N Cit R T P N R W
R G K S N Cit R T Y N R W
R F K S N Cit R T Y N R W
R G K S N Cit R T P N R W
R W V S Q Cit R R T P T R
M K P R Y Cit R R I V V V
K S F V W Cit S H A R P R
Y S F V W Cit S H A R P R
R N M N R Cit W R G M Cit Rおよび
R M G R P Cit W I R F P V
またはそれらのアナログ、
から選択されるペプチド配列を含むという点で特徴付けられる、ペプチド。
【請求項１３】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のペプチドであって、以下：
I N Cit R A S Cit K Cit H R R
I Cit K R L Y Cit M Cit I R R
K Cit Cit Y N I Cit Cit F R R N
R L Y F I Cit Cit R A Q T T
I R Q G A R Cit R G Y P K
Cit E R Cit V Q Cit R R P P Q
Cit H Q R I T Cit V G Cit R K
R I Cit R V Cit Cit T P I P R
G R N Q R Y Cit L Y T I H
R Cit R Q H P Cit H R I K A
Cit Cit R Cit V A Cit F Cit R V R
R P K Q H V Cit H T R R P
R K Cit G Cit R Cit Cit T I R P
R Cit Cit R N T Cit H I K Cit R
R Cit Q Cit F T Cit Cit R N V V
Q L V Y L Q Cit Cit Cit R R Y
Q Y N R F K Cit Cit Cit R P R
Cit L R H I R Cit Q T R Cit Cit
P R Cit Cit Cit K Cit R Cit Cit G R
R Cit Q V R Y Cit Cit L Cit R Cit
G R Cit H A H Cit P R V R Cit
A R H V I R Cit Cit V P R T
R Cit G H M F Cit V Y Cit F R
G R N I R V Cit Cit A R Cit Cit
Q I F Y L Cit Cit H R Q Cit R
R Q G P I A Cit L H I R R
G V Y L V R Cit L Cit M M R
N Cit Cit R R V Cit M Cit R I Cit
K Cit R L Cit Y Cit P V R K S
G R R Cit Cit L Cit R P Cit Cit R
R M P H Cit H Cit S Cit R R K
またはそれらのアナログ、
から選択されるペプチド配列を含むという点で特徴付けられる、ペプチド。
【請求項１４】
式（ＩＶ）：（Ｃ１−Ｃ２）−（Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５）−Ｘ−Ｇ−Ｃ６−（Ｃ７−Ｃ８−Ｃ９−Ｃ１０）
を有する配列を含むペプチドであって、
ここでＣ１−Ｃ２は、ＨＱ、ＧＦ、ＥＧまたはＧＶであり；
Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５は、３つのアミノ酸を示し、その少なくとも１つ、および好ましくは２つは各々独立して、塩基性アミノ酸、芳香族アミノ酸またはＶであり；
Ｃ６は、塩基性アミノ酸もしくは芳香族アミノ酸に等しいか、またはＡ、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｖ、ＳもしくはＣｉｔまたはそれらのアナログに等しく；そして
Ｃ７−Ｃ８−Ｃ９−Ｃ１０は、ＳＲＡＡ、ＳＣｉｔＡＡ、ＲＰＬＤ、ＲＶＶＥまたはＰＧＬＤである、
ペプチド；ならびに式（ＩＶ）を有する該ペプチドのアナログ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のペプチドであって、該ペプチドが環状ペプチドであって、その環は少なくとも８、９、１０または１０より多いアミノ酸を含むという点で特徴付けられる、ペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のペプチドであって、該ペプチドが環状ペプチドであって、その環は少なくとも１１アミノ酸を含むという点で特徴付けられる、ペプチド。
【請求項１７】
請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載のペプチドであって、該ペプチドが以下：
H Q R K W Cit G A S R A A
H Q H W R Cit G A S R A A
H Q F R F Cit G Cit S R A A
H Q E R R Cit G E S R A A
H Q K W R Cit G F S R A A
H Q R W K Cit G G S R A A
H Q R R T Cit G G S R A A
H Q R R G Cit G G S R A A
H Q Cit F R Cit G H S R A A
G F F S A Cit G H R P L D
H Q E R G Cit G K S R A A
H Q E K R Cit G K S R A A
H Q R W L Cit G K S R A A
H Q K R N Cit G K S R A A
E G G G V Cit G P R V V E
H Q W R H Cit G R S Cit A A
H Q K W N Cit G R S R A A
H Q K F W Cit G R S R A A
H Q K Cit K Cit G R S R A A
H Q K W R Cit G R S Cit A A
H Q A W R Cit G R S Cit A A
H Q N Q W Cit G R S R A A
H Q N S K Cit G R S R A A
H Q K R R Cit G R S R A A
H Q K R F Cit G R S R A A
H Q K R Y Cit G R S R A A
H Q K R H Cit G R S R A A
H Q E R A Cit G S S R A A
H Q E K M Cit G V S R A A
H Q K R G Cit G W S R A A
H Q R R V Cit G W S R A A
H Q W N R Cit G W S R A A
H Q Q R M Cit G W S R A A
H Q S H R Cit G W S R A A
H Q F R F Cit G W S R A A
H Q K R R Cit G W S R A A
G V K G H Cit G Y P G L D
または、それらのアナログから選択される配列を含むという点で特徴付けられるペプチド。
【請求項１８】
マルチペプチドであって、該マルチペプチドは、直鎖または分枝鎖のマルチペプチドであって、以下：
式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を有するペプチド単位ならびにそれらのアナログから選択されるペプチド単位；
式（ＩＶ）を有するペプチド単位およびそれらのアナログ；
から、互いに独立して選択される少なくとも２つの直鎖または環状ペプチド配列を含むという点で特徴付けられるマルチペプチド。
【請求項１９】
関節リウマチに対する自己抗体の存在を決定するための診断用試験キットであって、請求項７ないし１７のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１８に記載のマルチペプチド、またはそれらの混合物を、少なくとも１つのさらなる試薬とともに含むという点で特徴付けられる診断用試験キット。
【請求項２０】
ＲＡの診断に適切なペプチドの選択のための方法であって、ここでペプチドライブラリーが、ＲＡ患者から得られた抗体でスクリーニングされ、ここで該ペプチドライブラリーが、以下：
Ｌｉｂ（１）：Ｈ  Ｑ  Ｅ  Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ  Ｓ  Ｒ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システインおよびトリプトファン以外の任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（２）：Ｈ  Ｑ  Ｘ Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｇ  Ｘ  Ｓ  Ｒ／Ｃｉｔ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンを含む、任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（３）：Ｈ  Ｑ  Ｅ  Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ  Ｓ  Ｒ／Ｃｉｔ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンを含む、任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（４）：Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンまたはその等価物を含む任意のアミノ酸である、ライブラリー、
からなる群より選択される方法。
【請求項２１】
診断アッセイにおいて使用される請求項２０に記載の方法の補助によって得ることができるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトルリン残基またはそのアナログを含むペプチドを用いて、関節リウマチに罹患している患者から自己抗体を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
このような方法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ９７／００６２４から公知である。この刊行物には、フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）由来のペプチドの使用が記載されており、これには、関節リウマチに罹患している患者から自己抗体の検出のためにシトルリン（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎ）またはそのアナログが含まれる。従って、用いられるペプチドは、診断への応用に適切であり、そしてそれまでと比べて、さらに確実な検出を可能にする。さらに詳細には、これによって、疑陽性の減少、すなわちより高い特異性がもたらされる。さらに、その検出感度は比較的高い。ｃｆｃ１と示される１つのペプチドは、関節リウマチに罹患している患者由来の血清の３６％までに認められた。このペプチドの環状改変体が、さらに多く認められることが明らかになっている（６３％）。
【０００３】
上記の方法はまた、国際特許出願ＰＣＴ／ＦＲ００／０１８５７からも公知である。この刊行物には、フィブリンまたはフィブリノーゲン由来のペプチドの使用が記載されており、これには、関節リウマチに罹患している患者からの自己抗体の検出のための、シトルリンまたはそのアナログが含まれている。
【０００４】
ＰＣＴ／ＥＰ９８／０７７１４には、関節リウマチの診断のための（プロ）フィラグリン由来の合成ペプチドの使用が開示されている。この出願にはまた、ヒトのビメンチン、サイトケラチン１、サイトケラチン９および他の中間フィラメントタンパク質由来の合成ペプチドが記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、上記の方法では依然として、関節リウマチに罹患しているすべての患者のうちの限られた数しか検出できない。従って、実質的に等しいか、さらに改善された特異性を維持したまま検出感度の増大を達成できる方法が強く必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的を達成するために、本発明は、序文に述べた方法を提供する。この方法は、この自己抗体が、モチーフＸＧを含むペプチド単位、およびモチーフＸ非Ｇを含むペプチド単位と接触させられるという点で特徴的であり、ここでＸは、シトルリン残基またはそのアナログであり、Ｇはアミノ酸グリシンであり、そして非Ｇは、グリシン以外のアミノ酸である。
【０００７】
以下に記載される実験は、関節リウマチに罹患している患者から得られた血清が、抗体の２つの異なる集団を含むことを示している。この１つの集団は、上記の以前に公表された文献に記載されているようなＸＧペプチド単位と反応性である。この集団は、一部が、以前に公表されたＸＧペプチド単位を用いて検出可能であり、そしてさらに大きい部分については、本発明のペプチド単位を用いて検出可能である。抗体の他の集団は、Ｘ非Ｇペプチド単位と反応する。これまでに、この抗体の集団は、以前に公表された文献中のようには観察されていない。以下により詳細に記載されるように、関節リウマチに罹患している患者由来の血清の大部分が、抗体の両方の集団を含む。結果として、これらの血清は、ＸＧまたはＸ非Ｇペプチド単位を含む診断試験の方法によって検出することができる。しかし、関節リウマチに罹患している患者由来の血清の大部分が、２つの集団のうちの１つしか含まないようである。従って、Ｘ非Ｇペプチド単位のみに対する抗体を含む血清は、上記の公表された文献に記載されている診断試験では検出されないか、またはごくわずかな部分のみが検出される。これらの血清の大部分は、この診断試験がＸ非Ｇペプチド単位を含む場合、ここで検出することができる。従って、本発明の改良された診断方法は、少なくとも１つのＸＧおよび１つのＸ非Ｇペプチドを含む。従って、本発明の診断試験は、公開された文献による試験よりもさらに２０％高感度であり得る。
【０００８】
Ｘ非Ｇモチーフを有するペプチド単位が、ヒトの（プロ）フィラグリン、フィブリンまたはフィブリノーゲンのような天然のタンパク質、ならびに関連のタンパク質であるビメンチン、およびサイトケラチン１およびサイトケラチン９、または他の関連の中間フィラメントタンパク質に由来しない部分を含む場合、特に良好な結果が得られた。
【０００９】
驚くべきことに、天然のタンパク質に由来しないこのようなＸ非Ｇペプチドと本発明のＸＧペプチドとを組み合わせた場合、さらに改良された診断方法が得られることが示された。より詳細には、本発明の方法によるこのような組み合わせのペプチド単位の使用によって、極めて高い検出感度でありながら優れた特異性を維持している診断方法が得られる。これは、ますます驚くべきことである。なぜなら、上記の公表文献は、ＲＡ患者由来の自己抗体が、（プロ）フィラグリン、フィブリン、フィブリノーゲン、ビメンチン、サイトケラチン１またはサイトケラチン９のような天然に存在するタンパク質由来のペプチドと特に良好に反応するという概念に依然として基づいているからである。例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９８／０７７１４には、フィラグリン由来Ｘ非Ｇペプチド（ＩＰＧ１２４９）が記載されている。これは、ＳＬＥ患者由来の血清のうち３．３％と交差反応性であり、そしてフィラゲリンと８２％の相同性を有する。
【００１０】
Ｘ非Ｇモチーフを有するペプチド単位がトリペプチドを含む場合、良好な結果が得られるが、ここでは、中心のアミノ酸は、シトルリンまたはそのアナログであり、そして好ましくは、ＸＸＫ、ＸＸＹ、ＫＸＩ、ＭＸＲ、ＲＸＹ、ＷＸＫ、ＭＸＨ、ＶＸＫ、ＮＸＲ、ＷＸＳ、ＲＸＷ、ＹＸＭ、ＩＸＸ、ＸＸＦ、ＲＸＨ、ＴＸＶ、ＰＸＨ、ＡＸＦ、ＦＸＲ、ＹＸＦ、ＬＸＭ、ＬＸＹ、ＹＸＰ、ＨＸＳおよびＰＸＷから選択される。
【００１１】
好ましくは、非Ｇは、Ｈ、Ｉ、Ｗ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｃｉｔまたはそれらのアナログから選択されるアミノ酸である。以下の実験に示されるように、このようなＸ非Ｇペプチド単位は、極めて有効である。
【００１２】
ＸＧモチーフを含むペプチド単位は、（プロ）フィラグリン、フィブリン、フィブリノーゲン、ビメンチン、サイトケラチン１またはサイトケラチン９由来のものであるか、またはそうでない場合もあり、そして事実上ＰＣＴ／ＮＬ９７／００６２４から公知のｃｆｃ１が有効である。
【００１３】
この文脈では、アミノ酸という用語には、天然のアミノ酸および非天然のアミノ酸の両方、ならびにＤ型立体配置またはＬ型立体配置を有するアミノ酸が含まれる。
本出願においては、非天然のアミノ酸は、レトロインバーソ（ｒｅｔｔｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド、レトロペプチド、側鎖がペプチド骨格のアミド窒素原子上に位置するペプチド、およびペプチド骨格のＣＯが２、３または好ましくは単一の−ＣＨ２−基（シュードペプチド）（ｐｓｅｕｄｏ−ｐｅｐｔｉｄｅ）で置換されているペプチドとして存在する種類のアミノ酸であると理解される。
【００１４】
アミノ酸はまた修飾されてもよい。例えば、カルボン酸基は、エステル化されてもよく、アミドに転化されてもよく、そしてアミノ基はアルキル化、例えばメチル化されてもよい。あるいは、ペプチド上の官能基は、保護基または標識（例えば、蛍光基または放射性標識）を伴っていてもよい。ペプチド中のアミノ基およびカルボン酸基は、酸または塩基を用いることによって形成された塩の形態で存在してもよい。合成ペプチドが用いられる場合は、用いることが可能な本発明の範囲内におさまる全ての種類の改変体を作製することは極めて簡単である。例えば、フェニルアラニンおよびチロシンに由来するような芳香族側鎖基は、１つ以上のハロゲン原子を用いてハロゲン化されてもよい。ペプチド模倣の実施形態および有機物模倣の実施形態もまた、本発明の範囲および本発明の方法におけるそれらの適用の内におさまる。Ｃｉｔ残基の代わりに、図１ａおよび図１ｂに提示されるような、Ｃｉｔ残基のアナログをアミノ酸の形態で用いることも可能である。このようなアナログおよびそれらの調製は、当業者に公知である。例えば、Ｓｏｎｋｅら、Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ（２０００），２３〜５８頁、およびＧｒｅｅｎｅ：Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９）。好ましい実施形態によれば、シトルリンアナログの側鎖は、式（Ｉ）：
【化Ｉ】
2005512092.tif 000003
【００１５】
を有し、
ここでＱ＝ＮＨ２、ＣＨ３、ＮＨＣＨ３、またはＮ（ＣＨ３）２；
Ｙ＝Ｏ、ＮＨ、またはＮＣＨ３；
Ｚ＝Ｏ、ＮＨ、またはＣＨ２；そして
ｎ＝２、３、または４、であり；
ただし、Ｑ＝ＮＨ２、かつＺ＝ＮＨであり、ＹはＮＨでない条件である。
【００１６】
この状況では、ペプチド単位は、少なくとも７アミノ酸長であるペプチドであると理解される。ペプチド単位は１つ以上の側鎖を有してもよい。また、ペプチド単位またはこのペプチド単位の末端は互いに独立して、アセチル化、グリコシル化、アルキル化、またはリン酸化されてもよい。
【００１７】
この状況におけるペプチド単位は、これらのタンパク質に対する相同性（アミノ酸配列の類似性）が、８０％未満、より好ましくは７５％未満、例えば７０％または６５％未満、そして最も好ましくは６０％未満、例えば５５％または５０％未満である場合に、（プロ）フィラグリン、フィブリン、フィブリノーゲン、ビメンチン、サイトケラチン１またはサイトケラチン９および他の中間フィラメントタンパク質由来でないと示される。（プロ）フィラグリン、フィブリン、フィブリノーゲン、ビメンチン、サイトケラチン１およびサイトケラチン９に由来しない、表５に示されるペプチド単位は、１５〜４５％の相同性を有する。相同性の検査において、アルギニン、シトルリンおよびシトルリンのアナログは、等価（同一）であると考えられる。
【００１８】
ＸＧおよびＸ非Ｇを含むペプチド単位は、同じ分子の一部であってもそうでなくてもよい。これは、後に理解される。検出アッセイを実行するために、ペプチド単位は、キャリアに結合させられてもよく、必要に応じて標識を伴って提供されてもよい。この複合体は、当業者に周知の任意の方式で検出することができる。この複合体は、例えば、複合体自体が標識されない競合アッセイの場合には、間接的に検出されてもよい。２つのペプチド単位との反応は、同時に起きても、連続して起きても、そして同じ容器（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）中で起きても、異なる容器中で起きてもよい。
【００１９】
本出願は、当業者となる方法についての教育的な刊行物とは意図されない。従って、当業者が本発明を理解し、それを実行し、保護の範囲を理解するために十分な情報を提供することに限られる。
【００２０】
好ましくは、このペプチド単位は、診断されたＲＡ患者由来の１００の無作為な血清のうち少なくとも２つによって認識される。かなり高い割合、好ましくは少なくとも３０％により認識されるペプチド単位を使用することが明らかに好ましい。本発明の方法におけるペプチド単位の数は、好ましくは２または２より多い。
【００２１】
好ましくは、本発明は、上記の方法に関する。ここでは、ＸＧモチーフを有するペプチド単位およびＸ非Ｇモチーフを有するペプチド単位は、患者由来の一連の血清の少なくとも１０％によって両方が認識される。当然ながら、より高い検出感度を生じるペプチド単位の組み合わせが好ましい。本明細書に記載されるようなペプチド単位のいくつかの組み合わせを用いれば、４０％、６０％、７０％、８０％またはさらには８５％、そして９０％より大きい検出感度で診断試験を実行することができる。
【００２２】
ペプチド単位のうち少なくとも１つが環状ペプチド単位である場合に、検出の感度がさらに増大され得ることが示されている。
ＸＧモチーフを有するペプチド単位およびＸ非Ｇモチーフを有するペプチド単位は好ましくは、マルチペプチドの一部である。本発明の状況において、マルチペプチドは、少なくとも２つの抗原性ペプチド単位からなる分子であり、すなわちペプチド単位の組み合わせであって、これは共有結合によって結合されている場合もあり、そうでない場合もある。このようなマルチペプチドは、直線のペプチド単位、分枝したペプチド単位、環状のペプチド単位、またはそれらの組み合わせから構成されてもよい。マルチペプチドは、同じアミノ酸配列を有するペプチド単位と異なるアミノ酸配列を有するペプチド単位の両方から構成され得る。本発明によるマルチペプチドは、少なくとも７個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸を含み、すなわちこのペプチド単位は重複している場合がある。ＸＧおよびＸ非Ｇモチーフが決して重複しないことは言うまでもない。
【００２３】
本発明はまた、本発明の方法に極めて有用である、Ｘ非Ｇペプチド単位に関し、このペプチド単位は以下を含む：
式（ＩＩ）：
（Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５）−Cit−（Ａ６）−（Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１）
を有する配列であって、
ここで、
Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５は、以下：
-  RHGRQ
-  IRCitYK
-  HGRQCit
-  GRQCitCit
-  FQMCitH
-  CitWRGM
-  ARFQM
-  QCitYKW
-  KPYTV
-  RNLRL
-  RRRCitY
-  RFKSN
-  RGKSN
-  RWVSQ
-  MKPRY
-  KSFVW
-  YSFVW
-  FQMRH
-  RNMNR
-  RMGRP
およびそれらの相同配列である、
から選択されるアミノ酸配列であり；
Ａ７は、グリシン以外のアミノ酸を示し；
Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１は、以下：
-  KYIIY
-  TNRKF
-  KWCitKI
-  CitRAVI
-  RCitGHS
-  CitGRSR
-  CitYIIY
-  CitRLIR
-  IERKR
-  FMRKP
-  FMRRP
-  ERNHA
-  AVITA
-  TPNRW
-  TYNRW
-  RTPTR
-  RIVVV
-  HARPR
-  RGMCitR
-  IRFPV
およびそれらの相同配列である、
から選択されるアミノ酸配列である、
配列；
ならびに、式（ＩＩ）を有するペプチドの機能的なアナログ。
【００２４】
本発明はまた、本発明の方法に極めて有用な、Ｘ非Ｇペプチド単位に関し、このペプチドは以下を含む：
式（ＩＩＩ）：（Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６）−Cit−（Ｂ７）−（Ｂ８−Ｂ９−Ｂ１０−Ｂ１１）
を有する配列であって、
ここで
Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６は、以下：
-  INCitRAS
-  ICitKRLY
-  KCitCitYNI
-  RLYFICit
-  IRQGAR
-  CitERCitVQ
-  CitHQRIT
-  RICitRVCit
-  GRNQRY
-  RCitRQHP
-  CitCitRCitVA
-  RPKQHV
-  RKCitGCitR
-  RCitCitRNT
-  RCitQCitFT
-  QLVYLQ
-  QYNRFK
-  CitLRHIR
-  PRCitCitCitK
-  RCitQVRY
-  GRCitHAH
-  ARHVIR
-  RCitGHMF
-  GRNIRV
-  QIFYLCit
-  RQGPIA
-  GVYLVR
-  NCitCitRRV
-  KCitRLCitY
-  GRRCitCitL
-  RMPHCitH
およびそれらの相同配列である、
から選択されるアミノ酸配列であり；
Ｂ７は、グリシン以外のアミノ酸を示し；
Ｂ８−Ｂ９−Ｂ１０−Ｂ１１は、以下：
-  CitHRR
-  CitIRR
-  FRRN
-  AQTT
-  GYPK
-  RPPQ
-  GCitRK
-  PIPR
-  YTIH
-  RIKA
-  CitRVR
-  TRRP
-  TIRP
-  IKCitR
-  RNVV
-  CitRRY
-  CitRPR
-  TRCitCit
-  CitCitGR
-  LCitRCit
-  RVRCit
-  VPRT
-  YCitFR
-  ARCitCit
-  RQCitR
-  HIRR
-  CitMMR
-  CitRICit
-  VRKS
-  PCitCitR
-  CitRRK
およびそれらの相同配列である、
から選択されるアミノ酸配列である、
配列；
ならびに、式（ＩＩＩ）を有するペプチドの機能的なアナログ。
【００２５】
「相同配列」という用語は、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５、Ａ７−Ａ８−Ａ９−Ａ１０−Ａ１１、Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｂ４−Ｂ５−Ｂ６、およびＢ８−Ｂ９−Ｂ１０−Ｂ−１１と組み合わせて用いる場合、各々のアミノ酸配列の多くとも２つのアミノ酸が他の多くのアミノ酸（シトルリンおよび／またはそのアナログを含む）として置換されてもよく、多くとも２つのアミノ酸（またはそのアナログを含む）が導入されていてもよく、多くとも２つのアミノ酸が存在しなくてもよいことを意味する。
【００２６】
「アナログ」という用語は、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のペプチドと組み合わせて用いられる場合、場合に応じて以下を意味する：
−１つ以上のアミノ酸がＤ型立体配置を有してもよいこと、
−１つ以上の側鎖（シトルリンまたはそのアナログの側鎖以外）またはこのペプチドの末端が互いに独立して、アセチル化、グリコシル化、アルキル化、またはリン酸化されてもよいこと、そして
−１つ以上のアミノ酸が、天然でないアミノ酸によって置換されてもよいこと。
【００２７】
Ａ６およびＢ７は（互いに独立して）、好ましくは、Ｃｉｔ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、ＶおよびＰから選択される。
本発明の方法に用いられる特定の好ましいペプチドは、それらが以下：
R H G R Q Cit Cit K Y I I Y
I R Cit Y K Cit I T N R K F
R H G R Q Cit Cit Cit Y I I Y
A R F Q M Cit H Cit R L I R
Q Cit Y K W Cit K I E R K R
K P Y T V Cit K F M R K P
K P Y T V Cit K F M R R P
R N L R L Cit R E R N H A
R R R Cit Y Cit R A V I T A
R F K S N Cit R T P N R W
R G K S N Cit R T Y N R W
R F K S N Cit R T Y N R W
R G K S N Cit R T P N R W
R W V S Q Cit R R T P T R
M K P R Y Cit R R I V V V
K S F V W Cit S H A R P R
Y S F V W Cit S H A R P R
R N M N R Cit W R G M Cit Rおよび
R M G R P Cit W I R F P V
、ならびに
I N Cit R A S Cit K Cit H R R
I Cit K R L Y Cit M Cit I R R
K Cit Cit Y N I Cit Cit F R R N
R L Y F I Cit Cit R A Q T T
I R Q G A R Cit R G Y P K
Cit E R Cit V Q Cit R R P P Q
Cit H Q R I T Cit V G Cit R K
R I Cit R V Cit Cit T P I P R
G R N Q R Y Cit L Y T I H
R Cit R Q H P Cit H R I K A
Cit Cit R Cit V A Cit F Cit R V R
R P K Q H V Cit H T R R P
R K Cit G Cit R Cit Cit T I R P
R Cit Cit R N T Cit H I K Cit R
R Cit Q Cit F T Cit Cit R N V V
Q L V Y L Q Cit Cit Cit R R Y
Q Y N R F K Cit Cit Cit R P R
Cit L R H I R Cit Q T R Cit Cit
P R Cit Cit Cit K Cit R Cit Cit G R
R Cit Q V R Y Cit Cit L Cit R Cit
G R Cit H A H Cit P R V R Cit
A R H V I R Cit Cit V P R T
R Cit G H M F Cit V Y Cit F R
G R N I R V Cit Cit A R Cit Cit
Q I F Y L Cit Cit H R Q Cit R
R Q G P I A Cit L H I R R
G V Y L V R Cit L Cit M M R
N Cit Cit R R V Cit M Cit R I Cit
K Cit R L Cit Y Cit P V R K S
G R R Cit Cit L Cit R P Cit Cit R
R M P H Cit H Cit S Cit R R K
またはそれらのアナログ、
から選択される少なくとも１つのペプチド配列を含むという点で特徴付けられる。
【００２８】
本発明の方法に用いられる適切なＸＧペプチドは好ましくは、以下：式（ＩＶ）：（Ｃ１−Ｃ２）−（Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５）−Ｘ−Ｇ−Ｃ６−（Ｃ７−Ｃ８−Ｃ９−Ｃ１０）
を有する配列であって、
ここでＣ１−Ｃ２は、ＨＱ、ＧＦ、ＥＧまたはＧＶであり；
Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５は、３つのアミノ酸を示し、その少なくとも１つ、および好ましくは２つは、各々独立して、塩基性アミノ酸、芳香族アミノ酸またはＶであり；
Ｃ６は、塩基性アミノ酸もしくは芳香族アミノ酸に等しいか、またはＡ、Ｇ、Ｅ、Ｐ、Ｖ、ＳもしくはＣｉｔまたはそれらのアナログに等しく；そして
Ｃ７−Ｃ８−Ｃ９−Ｃ１０は、ＳＲＡＡ、ＳＣｉｔＡＡ、ＲＰＬＤ、ＲＶＶＥまたはＰＧＬＤである、配列；
ならびに式（ＩＶ）を有するこのペプチドのアナログ、
を含む。
「アナログ」という用語は、式（ＩＶ）のペプチドと組み合わせて用いられる場合、場合に応じて以下を意味する：
−１つ以上のアミノ酸がＤ型立体配置を有してもよいこと、
−１つ以上の側鎖（シトルリンまたはそのアナログの側鎖以外）またはこのペプチドの末端が互いに独立して、アセチル化、グリコシル化、アルキル化、またはリン酸化されてもよいこと、そして
−１つ以上のアミノ酸が、天然でないアミノ酸によって置換されてもよいこと。
【００２９】
本発明の方法に用いられることに適したＸＧペプチドの特定の例は、以下から選択される配列を含む：
H Q R K W Cit G A S R A A
H Q H W R Cit G A S R A A
H Q F R F Cit G Cit S R A A
H Q E R R Cit G E S R A A
H Q K W R Cit G F S R A A
H Q R W K Cit G G S R A A
H Q R R T Cit G G S R A A
H Q R R G Cit G G S R A A
H Q Cit F R Cit G H S R A A
G F F S A Cit G H R P L D
H Q E R G Cit G K S R A A
H Q E K R Cit G K S R A A
H Q R W L Cit G K S R A A
H Q K R N Cit G K S R A A
E G G G V Cit G P R V V E
H Q W R H Cit G R S Cit A A
H Q K W N Cit G R S R A A
H Q K F W Cit G R S R A A
H Q K Cit K Cit G R S R A A
H Q K W R Cit G R S Cit A A
H Q A W R Cit G R S Cit A A
H Q N Q W Cit G R S R A A
H Q N S K Cit G R S R A A
H Q K R R Cit G R S R A A
H Q K R F Cit G R S R A A
H Q K R Y Cit G R S R A A
H Q K R H Cit G R S R A A
H Q E R A Cit G S S R A A
H Q E K M Cit G V S R A A
H Q K R G Cit G W S R A A
H Q R R V Cit G W S R A A
H Q W N R Cit G W S R A A
H Q Q R M Cit G W S R A A
H Q S H R Cit G W S R A A
H Q F R F Cit G W S R A A
H Q K R R Cit G W S R A A
G V K G H Cit G Y P G L D
または、それらのアナログ。
【００３０】
本発明のペプチドは好ましくは、環状ペプチドであって、その環は少なくとも１０アミノ酸、およびより好ましくは少なくとも１１アミノ酸を含む。当業者は、環状ペプチドの調製に関する種々の方法に精通しており、さらなる説明は不要である。
【００３１】
本発明の最も好ましい方法によれば、ＸＧペプチドは、少なくとも１つのＸ非Ｇペプチドと組み合わせて用いられ、ここではＸＧペプチドは以下：
0002-27  H Q K R G Cit G W S R A A
0002-29  H Q R R V Cit G W S R A A
0002-31  H Q R R T Cit G G S R A A
0002-32  H Q R K W Cit G A S R A A
0002-36  H Q F R F Cit G Cit S R A A
0002-37  H Q K W R Cit G R S Cit A A
0002-63  H Q F R F Cit G W S R A A
からなる群より選択され、
そして該Ｘ非Ｇペプチド単位は、以下：
0107-32  K P Y T V Cit K F M R R P
0107-35  A R F Q M Cit H Cit R L I R
0107-45  Y S F V W Cit S H A R P R
0113-30  A R F Q M R H Cit R L I R
0218-36  R N L R L Cit R E R N H A
からなる群より選択される。
【００３２】
診断試験の所望の特異性および検出感度、ならびに検査下の関節リウマチ血清の各々の集団に依存して、好ましいＸＧおよびＸ非Ｇペプチド単位の組み合わせは、以下：
０００２−２７および０１０７−３２；０００２−２７および０１０７−３５；０００２−２７および０１０７−４５；０００２−２７および０１１３−３０；０００２−２７および０２１８−３６；０００２−２９および０１０７−３２；０００２−２９および０１０７−３５；０００２−２９および０１０７−４５；０００２−２９および０１１３−３０；０００２−２９および０２１８−３６；０００２−３１および０１０７−３２；０００２−３１および０１０７−３５；０００２−３１および０１０７−４５；０００２−３１および０１１３−３０；０００２−３１および０２１８−３６；０００２−３２および０１０７−３２；０００２−３２および０１０７−３５；０００２−３２および０１０７−４５；０００２−３２および０１１３−３０；０００２−３２および０２１８−３６；０００２−３６および０１０７−３２；０００２−３６および０１０７−３５；０００２−３６および０１０７−４５；０００２−３６および０１１３−３０；０００２−３６および０２１８−３６；０００２−３７および０１０７−３２；０００２−３７および０１０７−３５；０００２−３７および０１０７−４５；０００２−３７および０１１３−３０；０００２−３７および０２１８−３６；０００２−６３および０１０７−３２；０００２−６３および０１０７−３５；０００２−６３および０１０７−４５；０００２−６３および０１１３−３０；０００２−６３および０２１８−３６、
からなる群より選択される。
【００３３】
上記の組み合わせから、平均で６％の検出感度の増大が得られることが示されており、これにより、ＸＧおよびＸ非Ｇペプチドのこのような組み合わせ試験の合計の検出感度は７５〜７８％となる。
【００３４】
以下の実施例に記載される結果によって、種々のペプチド単位がまた血清の異なるコホートを検出することがさらに示された。第三のペプチド単位またはさらに第四以上のペプチド単位を追加することによって、検出感度をさらに増大させることができた。上記の群から選択されるペプチド単位の組み合わせに依存して、本発明の診断試験によって、８８〜９２％の検出感度が達成できた。
【００３５】
本発明はまた、マルチペプチドであって、直鎖状または分枝したマルチペプチドであり、以下：
−式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）を有するペプチド単位ならびにそれらのアナログから選択されるペプチド単位；
−式（ＩＶ）を有するペプチド単位およびそれらのアナログ、
から互いに独立して選択される少なくとも２つの直鎖状または環状のペプチド配列を含むという点で特徴付けられるマルチペプチドに関する。
【００３６】
このようなマルチペプチドは、本発明の方法における使用に極めて適切である。これによって、この方法をより簡易にかつより確実に実行することが可能になる。なぜなら、ペプチドは同じ公知の率で用いられ、そしてアッセイの間または準備作業の間の余計な操作（例えば、マルチペプチドでのマイクロプレートのコーティング）が回避されるからである。
【００３７】
本発明はさらに、関節リウマチに罹患している患者から自己抗体の存在を検出するための診断キットに関する。ここで、この診断キットには、請求項５ないし１３のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項１４に記載のマルチペプチド、またはそれらの混合物が、少なくとも１つのさらなる試薬とともに含まれる。
【００３８】
本発明はまた、薬学的組成物としての使用のための、上記のような免疫毒素分子のペプチドもしくは抗体、またはそれらの組み合わせに関する。
本発明はさらに、関節リウマチのための薬学的組成物または診断薬を調製するための、上記のような免疫毒度分子のペプチドもしくは抗体、またはその組成物に関する。
【００３９】
本発明はまた、抗原免疫複合体のサイズを増大させることにより自己免疫疾患の処置のための薬学的組成物を調製するための、上記のペプチドまたはその組成物の適用に関し、それにより、形成された免疫複合体の清澄性を高める。
【００４０】
従って、本発明はまた、本発明の少なくとも１つのペプチドをそのような処置が必要である患者の体内に導入することによる、関節リウマチの処置のための方法に関する。
本発明はさらに、ＲＡの診断に適切なペプチドの選択の方法に関する。ここでは、ＲＡ患者から得られた抗体でペプチドライブラリーがスクリーニングされ、そしてこのペプチドライブラリーは、以下：
Ｌｉｂ（１）：Ｈ  Ｑ  Ｅ  Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ  Ｓ  Ｒ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システインおよびトリプトファン以外の任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（２）：Ｈ  Ｑ  Ｘ Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｇ  Ｘ  Ｓ  Ｒ／Ｃｉｔ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンを含む、任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（３）：Ｈ  Ｑ  Ｅ  Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ  Ｓ  Ｒ／Ｃｉｔ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンを含む、任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（４）：Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンを含む、任意のアミノ酸である、
あるいは、その等価物
からなる群より選択される。
【００４１】
結局、本発明は、診断アッセイに用いるための、上記の方法の補助を用いて得ることができるペプチドに関する。
「処置のための薬学的組成物」または「処置薬」または「処置薬の調製のためのタンパク質の使用」という用語は、上記の疾患の処置のための、上記のペプチド、またはこのペプチドに特異的に結合する抗体、および薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤（この２つの用語は交換可能である）を含む組成物に関連する。適切なキャリアまたは賦形剤であって、当業者が精通しているものは、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース液、ハンクス液、オイル、オレイン酸エチル、５％デキストロース含有生理食塩水、等張性および化学的安定性を改善する物質、緩衝液および防腐剤である。他の適切なキャリアとしては、組成物を受容する個体に対して有害な抗体の産生をそれ自体が誘導しない任意のキャリア、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグルコール酸、ポリマー性アミノ酸、およびアミノ酸ポリマーが挙げられる。「薬剤」は、当業者に公知の任意の方式で投与され得る。
【００４２】
本発明のペプチドは、標識されてもよいし（当該分野で周知のとおり、放射性、蛍光、その他）、またはキャリアとともに提供されてもよい。この形態でもまた、このようなペプチドは本発明の範囲内におさまる。例えば、ペプチドはキーホールリンペットヘモシアニンまたはウシ血清アルブミンのようなキャリアタンパク質に結合されてもよい。また、本発明のペプチドは、マイクロスフェア（金、ポリスチレンなど）、スライド、チップ、または反応容器の壁もしくはマイクロタイタープレートのウェルのような固体キャリアに非共有的に結合されてもよく、共有結合されてもよい。このペプチドは、直接または間接的な標識で標識されてもよい。例としては、ビオチン、フルオレセインおよび酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。この全てが一般に、当業者に公知であり、そしてさらなる説明は不要である。
【実施例１】
【００４３】
（ペプチド合成）
Ｄｅ  Ｋｏｓｔｅｒ  Ｈ．Ｓ．ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８７、ｐｐ．１７７〜１８８、（１９９５））によって記載されたようにシトルリン化された（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ）ペプチドを合成した。ビーズを用いて、このビーズにアミド結合によってペプチド分子を結合させ、これによって保護基の除去後も、ペプチド分子が依然としてこのビーズに結合しているようにさせた。ペプチドの合成のために、自動化マルチプルペプチドシンセサイザー（Ａｂｉｍｅｄ  ＡＭＳ４２２、Ａｂｉｍｅｄ、Ｌａｎｇｅｎ−ｆｅｌｄ、  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。組み込まれたアミノ酸およびペプチドリンカー６−アミノヘキサン酸をＦｍｏｃ基によって保護し、そしてカップリングを促進し、保護されたアミノ酸をＰｙＢＯＰおよびＮ−メチルモルホリンで活性化した。必要に応じて、その側鎖を、酸感受性側鎖を保護する基で保護した。用いたビーズは、およそ１００μｍの直径を有し、各々がおよそ１００ｐｍｏｌのペプチドを含んだ。この量のおよそ０．５％が外側に結合し、そして原則的に抗体に接近可能であると予想した。
【００４４】
より大量の合成のために、酸感受性リンカーを設けられたビーズを用いた。ペプチド合成の化学反応は、既に上記されたものにほぼ匹敵する。ペプチドを、トリフルオロ酢酸を用いて分割し、エーテル沈殿の方法によって単離したが、これらは全て当該分野で周知の方法によるものであり、これについてのさらなる説明は当業者には不要である。所望の配列を有するペプチドを商業的に入手することも当然ながら可能である。個々のペプチドの純度および同一性を、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよび飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）の方法によってチエックした。
【００４５】
上記の方法の補助によって、各々が多数の（８×１０６）シトルリン化ペプチドを含む、４つのペプチドライブラリーを作製した。以下の式は、各々のライブラリー中のペプチドのアミノ酸配列を示す：
Ｌｉｂ（１）：Ｈ  Ｑ  Ｅ  Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ  Ｓ  Ｒ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システインおよびトリプトファン以外の任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（２）：Ｈ  Ｑ  Ｘ Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｇ  Ｘ  Ｓ  Ｒ／Ｃｉｔ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンを含む、任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（３）：Ｈ  Ｑ  Ｅ  Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ  Ｓ  Ｒ／Ｃｉｔ  Ａ  Ａ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンを含む、任意のアミノ酸である
Ｌｉｂ（４）：Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ  Ｃｉｔ  Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ Ｘ
ここで、Ｘは、システイン以外であるがシトルリンを含む任意のアミノ酸である。
【００４６】
これらのライブラリーを関節リウマチに罹患している患者由来の血清を用いて以下に記載する方法に従ってスクリーニングした。
【実施例２】
【００４７】
（ビーズに結合させたペプチドと関節リウマチ（ＲＡ）に罹患している患者由来の血清との反応）
プロテインＡセファロースの補助によって、ＲＡに罹患していると臨床上診断された患者由来の血清からＩｇＧを単離した。このビーズを以下を含む溶液とともにインキュベートした：ｉ）患者由来の総血清、またはｉｉ）レポーター酵素に結合させた患者由来のＩｇＧ（アルカリホスファターゼ標識キット；Ｒｏｃｈｅ／Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。血清（ｉ）については、アルカリホスファターゼに結合させた抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ  Ｄ０３３６；Ｄａｋｏ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ、  Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、  Ｄｅｎｍａｒｋ）とともに第二のインキュベーションを実行した、各々のインキュベーション後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ  ８．９（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．９、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）でビーズを徹底的に洗浄した。
【００４８】
ほとんどのヒトＩｇＧに結合したペプチドを有するビーズ（アルカリホスファターゼの基質での染色後、これは不溶性の着色した生成物へと変換され、これらは最も強く着色したビーズとなる）を、顕微鏡の補助によって選択した。
【実施例３】
【００４９】
（ＥＬＩＳＡ）
ほとんどの目的のペプチドは、わずかに多い量で合成されて、直鎖状および環状の改変体、そしてほとんどの場合、シトルリンおよびアルギニン（＝コントロール）改変体を形成した。これらのペプチドをＲＡ患者由来の一連の血清との反応性について試験した。このペプチドをＥＬＩＳＡプレートにコーティングして、ＲＡ患者由来の血清とともにインキュベートした。各々の血清を二連で試験した。健常な人由来の血清を陰性コントロールとして用いた。
【実施例４】
【００５０】
（ＸＧペプチドのファミリー）
ｃｆｃ１と陽性の反応を示す血清を用いることによって（参考として本明細書に含まれる、ＰＣＴ／ＮＬ９７／００６２４を参照のこと）、グリシンを有するペプチドを、シトルリン残基に対して位置＋１（すなわち、Ｃ末端）に見出した。例えばＡ（アラニン）で＋１のＧを置き換えることによって、反応性は６５％低下する。特定のペプチドでは、位置−３上のＥ（グルタミン酸）は、Ａで置換されていないことが好ましい（活性の４７％の損失）。同様に、−４のＱ（グルタミン）、−５のＨ（ヒスチジン）および＋３のＳ（セリン）が、多くの場合に有利であることが明らかである。
【００５１】
従って、−ＸＧ−の組み合わせを有する多数のペプチド配列を選択したが、その全てがＲＡ血清と反応した。このＸＧファミリーの好ましいメンバーの特定の例は以下である。
表１：ＸＧペプチドのファミリー：
H Q R K W Cit G A S R A A     (0002-32)
H Q H W R Cit G A S R A A     (0002-42)
H Q F R F Cit G Cit S R A A   (0002-36)
H Q E R R Cit G E S R A A     (020699-2)
H Q K W R Cit G F S R A A     (0102-74)
H Q R W K Cit G G S R A A     (0002-28)
H Q R R T Cit G G S R A A     (0002-31)
H Q R R G Cit G G S R A A     (0002-33)
H Q Cit F R Cit G H S R A A   (0002-43)
G F F S A Cit G H R P L D     (0101-7)
H Q E R G Cit G K S R A A     (020699-1)
H Q E K R Cit G K S R A A     (020699-4)
H Q R W L Cit G K S R A A     (0002-30)
H Q K R N Cit G K S R A A     (0002-38)
E G G G V Cit G P R V V E     (0101-5)
H Q W R H Cit G R S Cit A A   (0002-34)
H Q K W N Cit G R S R A A     (0002-24)
H Q K F W Cit G R S R A A     (0002-25)
H Q K Cit K Cit G R S R A A   (0002-26)
H Q K W R Cit G R S Cit A A   (0002-37)
H Q A W R Cit G R S Cit A A   (0002-40)
H Q N Q W Cit G R S R A A     (0002-44)
H Q N S K Cit G R S R A A     (0002-45)
H Q K R R Cit G R S R A A     (0102-76)
H Q K R F Cit G R S R A A     (0102-77)
H Q K R Y Cit G R S R A A     (0102-78)
H Q K R H Cit G R S R A A     (0102-79)
H Q E R A Cit G S S R A A     (020699-3)
H Q E K M Cit G V S R A A     (020699-5)
H Q K R G Cit G W S R A A     (0002-27)
H Q R R V Cit G W S R A A     (002-29)
H Q W N R Cit G W S R A A     (0002-35)
H Q Q R M Cit G W S R A A     (0002-41)
H Q S H R Cit G W S R A A     (0002-39)
H Q F R F Cit G W S R A A     (0002-63)
H Q K R R Cit G W S R A A     (0102-75)
G V K G H Cit G Y P G L D     (0101-3)
上記のデータから、コンセンサス配列は、特別の位置を優先するように思われるアミノ酸に由来する。従って、好ましくはＲＡ血清によって認識されるＸＧペプチド単位は以下で表すことができる：
−３  −２  −１    ０  ＋１  ＋２
Ｋ    Ｒ    Ｒ    Ｘ    Ｇ    Ｒ
Ｒ    Ｗ                      Ｗ
Ｅ                            Ｋ
これらのペプチドの全てによって、良好〜優れた結果が示された。特にペプチド０００２−３５、０００２−３６および０００２−６３については、極めて満足であった。ほとんどの場合において、このようなペプチドの環状改変体は、さらに良好に反応した（後を参照のこと）。ちなみに、これは必ずしもそうであるとは限らない。例えば、直鎖状ペプチド０１０１−７は、血清の５５％と反応した。このペプチドの環状改変体は、１８６ＲＡ−血清の「わずか」４５％しか反応しなかった。予想通り、これらのペプチドのアルギニン改変体（ここでシトルリン（単数または複数）が、アルギニン（単数または複数）で置換されている）は、ＲＡ血清と反応しなかった。
【実施例５】
【００５２】
（ＸＧペプチドの環状改変体）
以下に記載するペプチドを、システインブロモ酢酸法によって環状化させた。いくつかの環状改変体を試験し、詳細には、ペプチド０００２−２７、０００２−２９、０００２−３１、０００２−３６、および０００２−６３の環状改変体が目的のものであることが判明した。
【００５３】
環の大きさ：多数の十分に反応するペプチドを用いて、各々が異なる環の大きさを有するさらなる環状ペプチドを合成した。これらのうち８、９、１０、１１および１２マーを最終的に試験した。これらのペプチドの全てを、それぞれ４８個のＲＡ血清および８個の正常血清を用いてＥＬＩＳＡで試験した。８マーおよび９マーは、それぞれ、血清のうちのいくつかと反応した（２２％（力価０．４７）および２８％（力価０．５））が、この力価（検出されたＯＤ値）は、より大きい環を用いた場合よりもかなり低かった（１０マーでは３３％で力価０．６０；１１マーおよび１２マーでは５０％で平均力価０．７４）。
【００５４】
【表２】
2005512092.tif 000004
上記の表は、ＲＡに罹患している患者から得た血清、および種々の他の自己免疫疾患に罹患している患者から得た血清を用いたＥＬＩＳＡを示す。これは、０００２−３６のようなペプチドに対するＲＡ血清の高い特異性を示す。事実上、いずれの例も、他の自己免疫疾患から得られた血清および正常な健常人由来の材料が陽性であることを示さなかった。ペプチド０００２−３６のアルギニン改変体（位置０および＋２のＲ、すなわち、この式ではＣｉｔの代わり）を試験した場合も、全ての試験したＲＡおよび正常血清で陰性であることが示された。
【００５５】
【表３】
2005512092.tif 000005
環状ｃｆｃ１および環状０００２−３６を用いることによって、さらに検出感度を２％増大させることができた（合計で７３％、表４を参照のこと）が、これについては、特異性の低下を伴わない限り、このタイプの適用は歓迎される改善である。後者は、そのような場合であるとは考えられない。従ってペプチドのＸＧ基内において、ＲＡ抗体と反応するそれらの能力に関しては多様性が存在する。
【００５６】
【表４】
2005512092.tif 000006
ＲＡ血清（全部で３１８個の血清）の２つのコホートにおける０００２−３６の直鎖状改変体および環状改変体を比較したところ、環状改変体は、直鎖状改変体よりも頻繁に（そしてさらに良好に）反応することが示された。さらに良好である理由は、環状改変体を用いて見出されたＯＤ値はまた、直鎖状組成物を用いたＯＤ値よりもかなり高かったからである。環状改変体が２つのシステインの間のＳ−Ｓ結合によって作製されているか、または、例えば、システイン基およびブロモアセチル基を反応することによって（システインの側鎖中のチオールとＮ末端ブロモアセチル基とを反応させることによって形成され、これによってチオエーテルを形成する）形成されたチオエーテルによって作製されているかは、重要ではない。ビーズに結合させたペプチド（ペプチジル樹脂）を同じペプチド中でブロモ酢酸のＮヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させことによって、ペプチドの合成後、このＮ末端ブロモアセチル基が形成される。閉環は、リン酸緩衝化アセトニトリル水溶液中（ｐＨ＝８）で生じる。
【実施例６】
【００５７】
（Ｘ非Ｇペプチドのファミリー）
驚くべきことに、（プロ）フィラグリン、フィブリン、フィブリノーゲン、ビメンチン、サイトケラチン１およびサイトケラチン９に由来しないペプチドもまた存在すること、そして上記のＸＧファミリーのペプチドと反応しないかまたはわずかに反応するＲＡ血清によって認識されたことを見出した。これらのペプチドの特徴は、Ｃｉｔのアミノ酸およびＣ末端側が塩基性（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族（Ｗ、Ｙ、Ｆ）脂肪族（Ｍ、Ｉ、Ｖ）またはＣｉｔ、ＳもしくはＰ（表５を参照）であるがＧではないことである。このため、Ｘ非Ｇファミリーという名前である。顕著なことに、Ｘ非Ｇペプチドは、−２、−１、＋１および＋２位置に、比較的多くの正に荷電したアミノ酸を含む。従って、これらのＲＡ血清中の抗体は、異なるペプチドの状況ではシトルリンと反応する。
【００５８】
記載したＸ非Ｇペプチドは全て、１つ以上のＸＧ陰性血清と反応した。例えば、ペプチド０１０７−３２、０１０７−３５、および０１０７−４５は、ＸＧ陰性血清のおよそ１５〜１８％と反応する。これらのペプチドの１つ以上に基づくＥＬＩＳＡ試験では、環状ｃｆｃ１および環状０００２−３６の組み合わせと比べて、少なくとも５％（７３％〜７８％）の感受性増大がもたらされる。極めて重要なことに、記載したＸ非Ｇペプチドでコントロール血清と反応するものはなかった。
表５：Ｘ非Ｇファミリーのペプチド
R H G R Q Cit Cit K Y I I Y         (0107-33)
R H G R Q Cit Cit Cit Y I I Y       (0107-34)
I R Cit Y K Cit I T N R K F         (0107-37)
A R F Q M Cit H Cit R L I R         (0107-35)
Q Cit Y K W Cit K I E R K R         (0107-43)
K P Y T V Cit K F M R K P           (0107-31)
K P Y T V Cit K F M R R P           (0107-32)
R N L R L Cit R E R N H A           (0107-36)
R R R Cit Y Cit R A V I T A         (0107-38)
R F K S N Cit R T P N R W           (0107-42)
R G K S N Cit R T Y N R W           (0107-39)
R F K S N Cit R T Y N R W           (0107-40)
R G K S N Cit R T P N R W           (0107-41)
R W V S Q Cit R R T P T R           (0102-71)
M K P R Y Cit R R I V V V           (0102-73)
K S F V W Cit S H A R P R           (0107-44)
Y S F V W Cit S H A R P R           (0107-45)
R N M N R Cit W R G M Cit R         (0107-30)
R M G R P Cit W I R F P V           (0102-72)
および
I N Cit R A S Cit K Cit H R R       0215-46
I Cit K R L Y Cit M Cit I R R       0219-44
K Cit Cit Y N I Cit Cit F R R N     0222-56
R L Y F I Cit Cit R A Q T T         0222-57
I R Q G A R Cit R G Y P K           0223-12
Cit E R Cit V Q Cit R R P P Q       150202RA02
Cit H Q R I T Cit V G Cit R K       150202RA03
R I Cit R V Cit Cit T P I P R       061102RA01
G R N Q R Y Cit L Y T I H           061102RA02
R Cit R Q H P Cit H R I K A         061102RA03
Cit Cit R Cit V A Cit F Cit R V R   061102RA05
R P K Q H V Cit H T R R P           061102RA06
R K Cit G Cit R Cit Cit T I R P     061102RA07
R Cit Cit R N T Cit H I K Cit R     061102RA08
R Cit Q Cit F T Cit Cit R N V V     061102RA09
Q L V Y L Q Cit Cit Cit R R Y       061102RA11
Q Y N R F K Cit Cit Cit R P R       061102RA12
Cit L R H I R Cit Q T R Cit Cit     061102RA14
P R Cit Cit Cit K Cit R Cit Cit G R 061102RA15
R Cit Q V R Y Cit Cit L Cit R Cit   061102RA16
G R Cit H A H Cit P R V R Cit       061102RA17
A R H V I R Cit Cit V P R T         181102RA01
R Cit G H M F Cit V Y Cit F R       181102RA02
G R N I R V Cit Cit A R Cit Cit     181102RA04
Q I F Y L Cit Cit H R Q Cit R       221102RA01
R Q G P I A Cit L H I R R           221102RA02
G V Y L V R Cit L Cit M M R         0218-36
N Cit Cit R R V Cit M Cit R I Cit   271102RA01
K Cit R L Cit Y Cit P V R K S       271102RA02
G R R Cit Cit L Cit R P Cit Cit R   271102RA03
R M P H Cit H Cit S Cit R R K       271102RA04
上記のデータから、特定の位置が優先されると思われるアミノ酸のコンセンサス配列を導くことが可能である。従って、ＲＡ血清によって好ましく認識されるＸ非Ｇペプチド単位は、以下によって表すことができる：
-5  -4   3  -2  -1   0  +1  +2  +3  +4  +5
R   R   R   R   R   X   R   R   R   R   R
N   Y   V   Q       H   T   I   I   K
F   I   Y               Y   P   P
H   S   V                   H
G
実験によって、例えば、環形のペプチド０１０７−３５は、環状の０００２−３６とは反応しない血清のうちの１８％と反応することが示された。この検出感度は、他のペプチドによってさらに増大され得る。例えば、環状ペプチド０１０７−３２によってさらに８％増大させることができる。これによって検出感度は８０％まで増大させられる。同様の値をペプチド０１０７−４５について見出した。５２のうち全部で１７（３２％）において、ＸＧ陰性血清は、１つ以上のＸ非Ｇペプチドと反応することが示された。このことは、２つ以上のＸＧおよびＸ非Ｇペプチドの組み合わせを用いれば、本発明の好ましい実施形態は、８０％を上回る検出感度を達成することができることを意味する。従って、これは、式ＩＶを有するペプチドの組み合わせによって達成できる検出感度、およびＰＣＴ／ＮＬ９７／００６２４から公知である検出感度よりも優れている。
【００５９】
この検出感度は、さらに多くのペプチドを用いることによって、なおさらに増大させることができる。環状ＸＧペプチド（例えば、０００２−６３または０００２−３６）を直鎖状または環状のＸ非Ｇペプチド（例えば、０１０７−３５）と共に用いてＲＡ血清を試験すると、３１８個のＲＡ血清について７８％の検出感度が得られた。３番目、４番目および可能性としては５番目のペプチドを追加することによって、検出感度は８５％に増大した（それぞれペプチド０１０７−３２、０１０７−４２、０１０７−３４）。３１８個のＲＡ血清のうち４８個のみが記載したペプチドのうちの１つとは反応しなかった。
【実施例７】
【００６０】
（ＸＧおよびＸ非Ｇペプチド単位を含む診断試験の検出感度および特異性）
上記の方法を用いて、７個のＸＧペプチド単位を、関節リウマチに罹患している患者由来の表２に示した３１８個の血清との反応性について試験した。コントロール患者および正常ドナー由来の表２に示した血清の補助によって、特異性を決定した。表６は個々のペプチド単位の特異性および検出感度を示す。
【００６１】
【表６】
2005512092.tif 000007
本明細書に記載した方法によって、５つのＸ非Ｇペプチド単位を、関節リウマチに罹患している患者由来の表２に示した同じ３１８個の血清との反応性について試験した。特異性を、コントロールの患者および正常なドナー由来の表２に示した血清の補助を用いて再度決定した。表７は、個々のペプチド単位の特異性および検出感度を示す。
【００６２】
【表７】
2005512092.tif 000008
表７に示したＸ非Ｇペプチド単位の反応性を、表６のＸＧペプチドのいずれとも反応しない上記の３１８個の血清のパネル由来の８０個の血清を用いて試験した。従って、表８に示した割合は、Ｘ非Ｇペプチド単位に対する抗体を含むが、ＸＧ反応性抗体を含まない血清の割合を示す。
【００６３】
【表８】
2005512092.tif 000009
上記の結果は、表６のＸＧペプチド単位の各々が表７のペプチド単位の各々と組み合わせられた場合に、検出感度の増大が期待され得ることを示す。関節リウマチに罹患している患者由来の３１８個の血清の上記のパネルの代表的な部分を用いて、以下に示されるペプチド単位の全ての組み合わせを試験した。この実験によって、平均で６％の検出感度の増大が得られ、これによって、このような組み合わせの試験の合計の検出感度は７５％〜７８％になることを実際に示す。
【００６４】
試験したペプチド単位の組み合わせは以下である：
０００２−２７と０１０７−３２；０００２−２７と０１０７−３５；０００２−２７と０１０７−４５；０００２−２７と０１１３−３０；０００２−２７と０２１８−３６；０００２−２９と０１０７−３２；０００２−２９と０１０７−３５；０００２−２９と０１０７−４５；０００２−２９と０１１３−３０；０００２−２９と０２１８−３６；０００２−３１と０１０７−３２；０００２−３１と０１０７−３５；０００２−３１と０１０７−４５；０００２−３１と０１１３−３０；０００２−３１と０２１８−３６；０００２−３２と０１０７−３２；０００２−３２と０１０７−３５；０００２−３２と０１０７−４５；０００２−３２と０１１３−３０；０００２−３２と０２１８−３６；０００２−３６と０１０７−３２；０００２−３６と０１０７−３５；０００２−３６と０１０７−４５；０００２−３６と０１１３−３０；０００２−３６と０２１８−３６；０００２−３７と０１０７−３２；０００２−３７と０１０７−３５；０００２−３７と０１０７−４５；０００２−３７と０１１３−３０；０００２−３７と０２１８−３６；０００２−６３と０１０７−３２；０００２−６３と０１０７−３５；０００２−６３と０１０７−４５；０００２−６３と０１１３−３０；そして最後に０００２−６３と０２１８−３６。
【００６５】
表６および表８の結果に関して、種々のペプチド単位が、血清の異なるコホートをもまた検出したことがやはり注目されるべきである。このことから、３番目のペプチド単位またはさらに４番目またはさらなるペプチド単位が追加されると、ＸＧおよびＸ非Ｇペプチド単位の上記の組み合わせにより検出感度をさらに増大させることができると予想できる。このペプチド単位の選択された組み合わせに依存して、本発明の診断試験によって、８８〜９２％の検出感度を達成することが実際に可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１ａ】アミノ酸の形態で用いられるＣｉｔ残基のアナログ
【図１ｂ】アミノ酸の形態で用いられるＣｉｔ残基のアナログ
【図１ａ】
2005512092.tif 000010
【図１ｂ】
2005512092.tif 000011
【配列表】
2005512092000001.app
【国際調査報告】
2005512092.tif 000012
2005512092.tif 000013
2005512092.tif 000014
2005512092.tif 000015
2005512092.tif 000016
2005512092.tif 000017