(57)【要約】本発明は、緑内障を診断および／または予測するためのエクスビボ方法に関する。前記方法は、ヒト個体の組織および／または血液サンプルにおいて、少なくとも組織リモデリングに関連する遺伝子の群から選択される遺伝子の改変された遺伝子発現パターンを検出することを含んでなる。さらに、本発明は、指定された遺伝子群の遺伝子の核酸プローブを含んでなるＤＮＡマイクロアレイに関する。
2005518812.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑内障を診断および／または予測するためのエクスビボ方法であって、
ヒト個体の組織および／または血液サンプルにおいて、少なくとも組織リモデリングに関連する遺伝子の群から選択される遺伝子の改変された遺伝子発現パターンを検出すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記遺伝子発現パターンは、ＤＮＡ修復に関連する遺伝子および／または細胞付着に関連する遺伝子および／または虚血／再潅流障害に関連する遺伝子もしくは緑内障障害の影響を受けた遺伝子の群から選択される遺伝子をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子発現パターンは、少なくとも１つの遺伝子が４つの遺伝子群のそれぞれに由来する、合計で少なくとも４つの遺伝子、好ましくは合計で少なくとも８つの遺伝子を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記改変された遺伝子発現パターンは転写レベルで決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
組織リモデリングに関連する前記遺伝子の群は、以下の遺伝子：
メタロプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害因子およびプロテイナーゼ３、
を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ修復に関連する前記遺伝子の群は、以下の遺伝子：
ＸＰＧＣ、１４−３−３σ、ｐ５３、ＭＤＲ−Ｘ、サービビン、ＤＥＡＤボックスＸアイソフォームタンパク質（ＤＢＸ）、Ｘ連鎖網膜症タンパク質、ＳＴＭ２遺伝子家族性アルツハイマー病、ＭＲＣＫ（筋強直性ジストロフィーキナーゼ関連ｃｄｃ４２結合キナーゼ）、チオレドキシン、ＮＦκＢ、アポトーシスタンパク質１の阻害因子（ＨＩＡＰ１、ＡＰＩ１）、ＩＡＰ相同体Ｃ、ＴＮＦＲ２−ＴＲＡＦシグナリング複合体タンパク質、ＭＩＨＣ、サイクリンＡ１、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）βサブユニット１（ＧＮＢ１）、トランスデューシンβ−１サブユニット、
を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞付着に関連する前記遺伝子の群は、以下の遺伝子：
Ｅ−カドヘリン、チトクロムＰ４５０、シクロオキシゲナーゼ２、ｒｈｏＧＤＰ解離因子１、ｒｈｏＧＤＩα、ＡＲＨＧＤＩＡ、チモシンβ、ＶＥＧＥＦＲ１、チロシンタンパク質キナーゼ受容体ＳＦＬＴ、ホスホリパーゼＣγ１、１−ホスファチジル−イノシトール−４，５−ビスホスフェート−ホスホジエステラーゼγ１、ＰＬＣ−ＩＩ、ＰＬＣ−１４８、６８ｋＤａ  Ｉ型ホスファチジル−イノシトール−４−ホスフェート−５−キナーゼαキナーゼ、１−ホスファチジルイノシトール−４−ホスフェートキナーゼ、ジホスホ−イノシチドキナーゼ、Ｇタンパク質活性型内向き整流性カリウムチャンネル３、ＫＩＲ３．３、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）βサブユニット１、トランスデューシンβ−１サブユニット、Ｒａｃαセリン／スレオニンキナーゼ、タンパク質キナーゼＢ、ｃ−ａｋｔ、ａｋｔ１、
を含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
虚血／再潅流障害に関連するかもしくは緑内障障害の影響を受けた前記遺伝子の群は、以下の遺伝子：
２０Ｓプロテオソーム、ＮＴＰ、Ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫＫ）、ＪＮＫ活性化キナーゼ１（ＪＮＫＫ１）、ＭＡＰキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ＳＲｐ２０スプライシング因子、リンパ球ＩｇＥ受容体、トロンボキサンＡ２受容体、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＩＴＫ、アルカリホスファターゼ、
を含んでなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記改変された遺伝子発現は、白血球、好ましくは、末梢リンパ球、単球および幹細胞において決定される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
固相支持体に固定化された核酸プローブのアレイであって、ここで、前記アレイは、組織リモデリングに関連する前記遺伝子の群から選択される遺伝子の少なくとも核酸プローブを含んでなるアレイ。
【請求項１１】
前記アレイは、ＤＮＡ修復に関連する遺伝子および／または細胞付着に関連する遺伝子および／または虚血／再潅流障害に関連する遺伝子もしくは緑内障障害の影響を受けた遺伝子の前記群から選択される遺伝子の核酸プローブをさらに含んでなる、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１２】
前記核酸プローブは請求項５〜８のいずれか１項に記載の遺伝子から選択される、請求項９または１０に記載のアレイ。
【請求項１３】
前記アレイは上記に記載の４種の遺伝子群から選択される遺伝子の核酸プローブのみを含んでなる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のアレイ。
【請求項１４】
緑内障を診断および／または予測するためのエクスビボ方法における請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のアレイの使用。
【請求項１５】
緑内障を診断および／または予測するための前記エクスビボ方法は請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
緑内障の体細胞遺伝子療法のための請求項１〜１５のいずれか１項に記載の４種の遺伝子群から選択される遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑内障を診断および／または予測するための方法ならびに核酸プローブのアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は、アポトーシスプロセスによっていくつかの網膜神経節細胞（ＲＣＧ）が死滅する視神経障害である。
【０００３】
原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）は、緑内障の最も一般的な形態である。該疾患は、小柱網の改変を特徴とし、空所を閉止せずに眼球を放置するための水分の正常な能力が妨害される。本疾患のそのような妨害の特徴は眼内圧（ＩＯＰ）の上昇であり、適切かつ適時に処置されなければ進行性の視力の消失および失明を生じる。
【０００４】
緑内障のもう１つの形態は、統計的に正常な眼内圧（ＩＯＰ≦２１ｍｍＨｇ）を伴う進行性視神経障害および視野の消失を特徴とする。この形態の緑内障は正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）に分類される。
【０００５】
過去に、緑内障を診断するための異なるインビボおよびエクスビボ診断方法が記載されている。
【０００６】
国際公開第９８／４４１０８号パンフレットは、緑内障を診断するためのインビボおよびインビトロ方法を開示しており、ここで、前記方法は、小柱網誘導性グルココルチコイド応答タンパク質（ＴＩＧＲ）の発現の決定に基づく。
【０００７】
国際公開第９８／３６０９８号パンフレットは、遺伝子チトクロムＰ４５０Ｂ１の変異の検出に基づく緑内障を診断するためのインビトロ方法について記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記で同定された先行技術は緑内障の診断方法について記載しているが、緑内障発達または該疾患の進行のための素因を有する患者の正確な同定を可能にする利用可能な方法は現在のところない。
【０００９】
従って、緑内障を診断および／または予測するための信頼できる方法ならびに前記方法の使用に適切な手段が緊急に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明の一般的目的は、緑内障を診断および／または予測するためのエクスビボ方法を提供することである。前記方法は、ヒト個体の組織および／または血液サンプルにおいて、少なくとも組織リモデリングに関連する遺伝子の群から選択される遺伝子の改変された遺伝子発現パターンを検出することを含んでなる。
【００１１】
用語「改変された遺伝子発現」は、健常被験体において観察される平均的な遺伝子発現レベルと比較して目的の遺伝子の遺伝子発現の増加および遺伝子発現の減少を包含する。ヒトの健康状態の決定は、通常、患者の健康に関する自覚症状の説明、医師による問診および患者の身体的検査に基づく。
【００１２】
本明細書において使用される用語である緑内障は、臨床上観察される全ての形態の緑内障を含んでなる。
【００１３】
本方法の好適な実施態様では、前記遺伝子発現パターンは、以下の群：ＤＮＡ修復に関連する遺伝子、細胞付着に関連する遺伝子、虚血／再潅流障害に関連する遺伝子もしくは緑内障障害の影響を受けた遺伝子の群から選択される遺伝子から選択される遺伝子をさらに含んでなる。
【００１４】
本方法のさらに好適な実施態様では、前記遺伝子発現パターンは、少なくとも１つの遺伝子が前記４つの遺伝子群のそれぞれに由来する、合計で少なくとも４つの遺伝子を含んでなる。より好適な実施態様では、前記遺伝子発現パターンは、少なくとも２つの遺伝子が前記４つの遺伝子群のそれぞれに由来する、合計で少なくとも８つの遺伝子を含んでなる。
【００１５】
前記４つの遺伝子群の遺伝子の任意の組み合わせは、本発明の方法の使用に適切であると理解されなければならない。例えば、第１の群の２つの遺伝子、第２の群の１つの遺伝子、第３の群の４つの遺伝子および第４の群の３つの遺伝子を使用することが可能である。
【００１６】
本発明の遺伝子の前記改変された遺伝子発現は、転写レベルで好適に決定される。
【００１７】
組織リモデリングに関連する遺伝子群の好適な遺伝子は、以下の遺伝子：
メタロプロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼ阻害因子およびプロテイナーゼ３、
である。
【００１８】
ＤＮＡ修復に関連する遺伝子の群の好適な遺伝子は、以下の遺伝子：
ＸＰＧＣ、１４−３−３σ（ストラティフィン（ｓｔｒａｔｉｆｉｎ））、ｐ５３、ＭＤＲ−Ｘ（ＡＢＣ（ＡＴＰ−結合カセット）−輸送体、サービビン、ＤＥＡＤボックスＸアイソフォームタンパク質（ＤＢＸ）、Ｘ連鎖網膜症タンパク質、ＳＴＭ２遺伝子家族性アルツハイマー病、ＭＲＣＫ（筋強直性ジストロフィーキナーゼ関連ｃｄｃ４２結合キナーゼ）、チオレドキシン、ＮＦκＢ、アポトーシスタンパク質１の阻害因子（ＨＩＡＰ１、ＡＰＩ１）、ＩＡＰ相同体Ｃ、ＴＮＦＲ２−ＴＲＡＦシグナリング複合体タンパク質、ＭＩＨＣ、サイクリンＡ１、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）βサブユニット１（ＧＮＢ１）、トランスデューシンβ−１サブユニット、
である。
【００１９】
細胞付着に関連する遺伝子群の好適な遺伝子は、以下の遺伝子：
Ｅ−カドヘリン、チトクロムＰ４５０、シクロオキシゲナーゼ２、ｒｈｏＧＤＰ解離因子１、ｒｈｏＧＤＩα、ＡＲＨＧＤＩＡ、チモシンβ、ＶＥＧＥＦＲ１、チロシンタンパク質キナーゼ受容体ＳＦＬＴ、ホスホリパーゼＣγ１、１−ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート−ホスホジエステラーゼγ１、ＰＬＣ−ＩＩ、ＰＬＣ−１４８、６８ｋＤａ  Ｉ型ホスファチジル−イノシトール−４−ホスフェート−５−キナーゼαキナーゼ、１−ホスファチジルイノシトール−４−ホスフェートキナーゼ、ジホスホ−イノシチドキナーゼ、Ｇタンパク質活性型内向き整流性カリウムチャンネル３、ＫＩＲ３．３、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（Ｉ）／Ｇ（Ｓ）／Ｇ（Ｔ）βサブユニット１、トランスデューシンβ−１サブユニット、Ｒａｃαセリン／スレオニンキナーゼ、タンパク質キナーゼＢ、ｃ−ａｋｔ、ａｋｔ１、
である。
【００２０】
虚血／再潅流障害に関連するかもしくは緑内障障害の影響を受けた遺伝子の群の好適な遺伝子は、以下の遺伝子：
２０Ｓプロテオソーム、ＮＴＰ、Ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫＫ）、ＪＮＫ活性化キナーゼ１（ＪＮＫＫ１）、ＭＡＰキナーゼ４（ＭＫＫ４）、ＳＲｐ２０スプライシング因子、リンパ球ＩｇＥ受容体、トロンボキサンＡ２受容体、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、ＩＴＫ、アルカリホスファターゼ、
である。
【００２１】
本発明の特に好適な実施態様では、前記改変された発現は、白血球、好ましくは、末梢リンパ球、単球および幹細胞において決定される。
【００２２】
本発明のもう１つの目的は、固相支持体に固定化された核酸プローブのアレイであって、ここで、前記アレイは、組織リモデリングに関連する遺伝子の群から選択される遺伝子の核酸プローブを含んでなる。
【００２３】
本発明の前記アレイは、以下の遺伝子群：ＤＮＡ修復に関連する遺伝子、細胞付着に関連する遺伝子、虚血／再潅流障害に関連する遺伝子もしくは緑内障障害の影響を受けた遺伝子から選択される遺伝子の核酸プローブをさらに含んでなる。
【００２４】
好適な実施態様では、前記アレイは、上記で同定された４種の遺伝子群のそれぞれから選択される遺伝子の核酸プローブを含んでなる。
【００２５】
もう１つの好適な好適な実施態様は、上記で規定された４種の遺伝子群から選択される遺伝子の核酸プローブのみを含んでなるアレイに関する。
【００２６】
本発明のアレイは、緑内障を診断および／または予測するためのエクスビボ方法、好ましくは、本発明の緑内障を診断および／または予測するための方法において使用することができる。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、緑内障の体細胞遺伝子療法のための上記で規定された３種の遺伝子群の遺伝子の使用である。
【００２８】
本発明は、以下に記載の本発明の詳細な説明を考慮すれば、本発明がさらに理解され、上記以外の目的についても明らかとなるであろう。該説明は、添付の図面を参考にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明の方法によって特定の遺伝子の発現パターンを決定することにより、緑内障患者の正確な診断および慢性緑内障の発達または該疾患の進行の素因を伴う患者の正確な同定が可能である。本発明の方法は、多くの診断上の利点を提供する。例えば、前記方法は高感度であり、患者から小組織サンプルおよび／または少量の体液、特に血液を採取／回収することによって侵襲が最小限である。
【００３０】
当業者であれば、本発明の方法において用いることができる適切な遺伝子発現検出方法を知っている。前記方法は、例えば、ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイム定量ＰＣＲ、免疫組織化学法、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット分析を含んでなる。
【００３１】
好適な実施態様では、遺伝子発現レベルが転写レベルで決定され、即ち、ＲＮＡ転写物の量が決定される。患者の生物学的サンプル、例えば、組織サンプル、好ましくは、血液サンプルは、ｍＲＮＡ単離および精製のために確立された方法の１つを使用して処理され、ｍＲＮＡが単離される。好ましくは、ＲＮＡは末梢血白血球から単離される。次いで、単離されたＲＮＡは、逆転写酵素による反応でＤＮＡに転写される。次いで、得られるｃＤＮＡは、本発明の方法によって分析することができる。本発明における使用に特に適切な方法は、遺伝子の発現レベルの迅速な決定を可能にするＲＴ−ＰＣＲである。ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーは、遺伝子の非保存領域が増幅されるように好適に選択される。
【００３２】
前記ＲＮＡ転写物を検出するための好適な手段はＤＮＡマイクロアッセイである。ＤＮＡマイクロアッセイの構築およびそれらの使用は、当該分野において周知である。例えば、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｏｐｒｏａｃｈ、Ｍ．シェーナ（Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ）編、オックスフォード大学出版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、英国オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、１９９９；レミュックス（Ｌｅｍｉｅｕｘ）ら、Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  １９９８，４，ｐ．２７７−２８９；およびインターネットサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｃｈｉｐ．ｃｏｍならびに本明細書において引用した参考文献を参照のこと。
【００３３】
アレイは、固相支持体に固定化された核酸プローブを含んでなる。本明細書において使用される用語「核酸プローブ」は、例えば、オリゴヌクレオチド、部分的または完全なｃＤＮＡを対形成させることによって、相補配列の標的核酸に結合することが可能な一本鎖核酸を包含する。核酸プローブは、天然または修飾された塩基を含むことができる。核酸プローブは、１０〜５００、１０〜２５０、１０〜１５０、１０〜７５、１０〜５０および１０〜２５塩基長の間であり得る。使用されるプローブの特定の長さは特定の遺伝子に依存し、前記長さはそれぞれの遺伝子について当業者によって決定されなければならない。
【００３４】
好適な実施態様では、前記核酸プローブは、目的のタンパク質の非保存ドメイン、より好ましくは、目的のタンパク質の非保存Ｎ末端ドメインまたは非保存Ｃ末端ドメインに由来する。
【００３５】
ＤＮＡアレイを使用する本発明の方法の例示的実施態様は、以下の工程：核酸のサンプルの調製、核酸のサンプルのアレイへのハイブリダイゼーション、ハイブリダイズした核酸の検出およびハイブリダイゼーションパターンの分析を含んでなる。
【００３６】
核酸サンプルの調製は、典型的に、以下の工程：組織ならびに／あるいは体液サンプルからのｍＲＮＡの単離および精製、ｃＤＮＡへの逆転写および必要に応じて第２鎖の合成を含む。合成されたｃＤＮＡは、典型的に標識される。標識は、例えば、組み入れられるヌクレオチドの１つによって導入することができる。仕様に適切な検出可能な標識は、例えば、分光的、光化学的、生化学的または免疫化学的手段を含む。
【００３７】
１つの検出方法では、サンプルのｍＲＮＡから誘導される変性され標識された核酸は、アレイに適用される。前記核酸は、アレイに固定化された相補的プローブにハイブリダイズし、標識を検出することによってハイブリダイゼーションが同定される。標識の位置は、アレイにおけるそれぞれのプローブについて検出され、あれ以上のプローブに相補的であるそれぞれの配列の濃度は、例えば、読み取り器を使用して蛍光強度を測定することによって決定される。患者サンプルのハイブリダイゼーションパターンをコントロールサンプルと比較すると、どのプローブが２つのサンプル間での発現に差異が認められるｍＲＮＡから誘導される核酸鎖にハイブリダイズするかが示される。コントロールの発現パターンとは異なる患者サンプルの発現パターンは、緑内障または緑内障の素因を示す。
【００３８】
緑内障に関連する遺伝子またはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドの上記で規定された群の遺伝子は、緑内障の遺伝子治療に使用することができる。
【００３９】
遺伝子治療のために、上記で同定された群のタンパク質をコードする核酸は、適切なベクター、好ましくは、アデノウイルスベクターに導入され、対象となる標的細胞、好ましくは視神経の神経節細胞における前記タンパク質の発現を可能にする。遺伝子治療に適切であり、特定の遺伝子の発現を可能にする上記ベクターは、標的細胞特異的プロモーターの制御下でコードする核酸を含んでなる。遺伝子治療方法およびベクターシステムについては、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔ．ブランケンシュタイン（Ｔ．Ｂｌａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ）、１９９８およびＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ−ｆｒｏｍ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ、カムＭ．フイ（Ｋａｍ  Ｍ．Ｈｕｉ）編に記載されている。
【実施例】
【００４０】
実施例によって、本発明をさらに例示する。
【００４１】
目的
血管攣縮症候群の患者間の分子レベルに対する特異的差異について調べるために、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）患者および高眼圧緑内障（ＨＴＧ）患者を健常コントロールと比較した。
【００４２】
結果
１．コメットアッセイ
初期ＤＮＡ損傷の評価。生細胞の解凍直後、健常コントロールの大部分（５５％）は、僅かな程度のＤＮＡ損傷を示した（クラス２）が、重度のＤＮＡ損傷を示したのはこのグループの僅か５％に過ぎない（クラス４）。２５％ではＤＮＡ損傷を観察することができなかった（クラス１）が、健常コントロールの１５％はクラス３に分類することができた。ＮＴＧ患者では、より高い程度のＤＮＡ損傷への移行を観察することができた。ＮＴＧ患者から誘導される細胞は、４１％の百分率でクラス３の状態（中等度のＤＮＡ損傷）で主に検出することができた。また、コントロールと比較すると、重度のＤＮＡ損傷の状態（クラス４）の細胞の百分率は、２６％にまで増加した。ＤＮＡ損傷を伴わない細胞の量はむしろ安定に保持された（２９）が、クラス２の状態の細胞の量は４％に減少した。ＨＴＧ患者の分布パターンは、ＮＴＧ患者のグループにむしろ類似した。細胞の大部分（４７％）は、中等度の状態（クラス３）のＤＮＡ損傷を示し、細胞の２１％はＤＮＡ損傷を示さず、１０％は軽度（クラス２）を示し、２２％は重度のＤＮＡ損傷（クラス４）を示した。図１に、ＮＴＧ患者および健常コントロールの分布パターンを示す。毛細血管拡張性運動失調の患者はＤＮＡ損傷に対する陽性コントロールとしての役割を果たした。
【００４３】
インビトロインキュベーション後のＤＮＡ損傷の評価。解凍後、細胞は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中、３７℃で、３時間の再生期間を経た。その後、ＤＮＡの状態を決定した。解凍直後の評価を比較すると、健常コントロールから誘導される細胞の大部分は、それぞれＤＮＡ損傷なし（３１％；クラス１）および、軽度（２６％；クラス２）に移行した。さらに、２７％の細胞は、中等度のＤＮＡ損傷（クラス３）を示し、１６％は重度のＤＮＡ損傷（クラス４）を示した。対照的に、ＮＴＧ患者のグループ内では、ＤＮＡが損傷を受けていない細胞の量の増加を観察することはできなかった。平均で、以下のような分布が認められた：ＤＮＡ損傷なし（クラス１）が１３％、軽度のＤＮＡ損傷（クラス２）が２９％、中等度のＤＮＡ損傷（クラス３）が３２％および重度のＤＮＡ損傷（クラス４）が２６％。ＨＴＧ患者のグループ内では、細胞の大部分は、５４％で中等度のＤＮＡ損傷（クラス３）および３６％で重度のＤＮＡ損傷（クラス４）を示すことができた。平均で、１０％の細胞をクラス１（ＤＮＡ損傷なし）および５％をクラス２（軽度のＤＮＡ損傷）に分類することができた。
【００４４】
２．サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションおよびドットブロット
サブトラクトされたｃＤＮＡは、全てのＮＴＧ患者について極めて類似のパターンを示した。サブトラクトされたｃＤＮＡをクローニングし、配列決定した。それらの配列をデータジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）と比較すると、表１および２に列挙される以下の公知のタンパク質をコードする遺伝子との相同性が示された。健常コントロールと比較したＮＴＧ患者の異なる発現パターンをより良好に可視化するために、６例のＮＴＧ患者および６例の健常コントロールによるドットブロットを実施した。結果を図２に示す：コントロールと比較して、ＮＴＧ患者は、ｍＲＮＡ発現のレベル上でｐ５３および２０Ｓ−プロテアソームサブユニットの若干の増加、ならびに神経糸タンパク質（ＮＴＰ）の発現のより強力な増加を示した。対照的に、ｍＲＮＡ発現は、ＸＰＧＣ（色素性乾皮症相補性群因子）、サービビンおよび新規に同定された遺伝子ＭＤＲ−Ｘについては減少した。
【００４５】
【表１】
2005518812.tif 000003
【００４６】
【表２】
2005518812.tif 000004
【００４７】
ＸＰＧＣ転写物の増幅。ドットブロット実験に加えて、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＸＰＧＣ遺伝子発現を評価した。図３に示される通り、すべてのＮＴＧ患者は、ＸＰＧＣ遺伝子発現の欠損を示した。対照的に、１例のボランティア（ｎｏ．５）を除く全ての健常コントロールにおいて、ＸＰＧＣが検出可能であった。ボランティアｎｏ．５の再調査では、視神経乳頭の緑内障性陥凹が認められたが、視野は正常であった。このことは、該個体はａ）緑内障障害を発達する危険性があり、ｂ）既に視野測定以前の緑内障（ｐｒｅｐｅｒｉｍｅｔｒｙ  ｇｌａｕｃｏｍａ）を患っていることを示す。
【００４８】
３．アトラス（Ａｔｌａｓ）ｃＤＮＡ発現アレイ
緑内障患者対健常コントロールのスクリーニングされた遺伝子のスペクトルを、イマジンシステム（Ｉｍａｇｉｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）と組み合わせたｃＤＮＡ発現アレイを使用することによって拡張した。結果は、コントロールと比較して、緑内障患者の９２遺伝子の改変された遺伝子発現を示した。遺伝子のうち３３遺伝子はダウンレギュレーションを示し、５９遺伝子はアップレギュレートされた。組織リモデリングに必須なタンパク質の一群であるメタロプロテイナーゼに注目すると、以下の遺伝子の発現パターンが、緑内障患者の白血球において改変されたことが見出された：マトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）および膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）のアップレギュレーション、ならびにメタロプロテイナーゼ阻害因子１前駆体１（ＴＩＭＰ−１）のレギュレーション不全。ＭＭＰ−９およびＭＴ１−ＭＭＰについての結果はサブトラクティブ・ハイブリダイゼーションによって確認することができ、リアルタイムＱＰＣＲ（定量ＰＣＲ）を確認することができた。上記のスクリーニングされた遺伝子のデータを表３に列挙する。
【００４９】
【表３】
2005518812.tif 000005
【００５０】
４．特異的ＲＴ−ＰＣＲを使用する標的遺伝子発現の確認
ＲＴ−ＰＣＲによってＭＭＰ−９およびＭＴ１−ＭＭＰのｃＤＮＡフラグメントを増幅して、健常コントロールとは対照的に緑内障患者の循環白血球におけるそれらのフラグメントの導入を確認した（図４Ｃ〜Ｆ）。ｃＤＮＡ合成の内部コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子βアクチンを増幅した（図４ＡおよびＢ）。
【００５１】
５．制限分析
標的ＰＣＲ産物の増幅を、制限分析によって確認した。３％「広範囲」アガロースゲルにおける標的ＲＴ−ＰＣＲ産物の制限分析。図５において、レーン１は、非消化増幅産物に属し；レーン２および３、ならびにさらに４および５は選択されたエンドヌクレアーゼによる消化によって得られた増幅産物に属する。ＡｌｕＩを使用して、制限分析を実施し、５８および１５１塩基対（（ｂｐ）；図５Ａ）のフラグメントを得、４５および１６４ｂｐのフラグメントについてはＡｖａＩ、フラグメント１５、４４および１５９ｂｐについてはＨａｅＩＩＩ、フラグメント７７および１３２ｂｐについてはＲｓａＩを使用し、全て２０９ｂｐのβアクチン増幅産物に由来した。２８９ｂｐのＭＭＰ−９増幅産物由来のフラグメントを得るために、ＡｌｕＩを使用して制限分析を実施し、４０、１２３および１２５ｂｐフラグメントのフラグメントを得、４６および２４３ｂｐのフラグメントを得るためにＨｐａＩＩ、１２３および１６６のフラグメントを得るためにＰｖｕＩＩ、ならびに１４２および１４７ｂｐのフラグメントを得るためにＲｓａＩを使用した（図５Ｂ）。２９５ｂｐのＭＴ１−ＭＭＰ増幅産物からフラグメントを得るために、６、５４、５８、６９および１０８ｂｐのフラグメントにはＨａｅＩＩＩ、ならびに１２５および１７０ｂｐのフラグメントにはＲｓａＩを使用して、制限分析を実施した（図５Ｃ）。３９３ｂｐのＴＩＭＰ−１増幅産物からフラグメントを得るために、２、３０、９６および２６５ｂｐのフラグメントにはＨａｅＩＩＩ、１５４および２３９ｂｐのフラグメントにはＨｉｎｄＩＩ、１５２および２４１ｂｐのフラグメントにはＨｐａＩＩならびに２８、２９および３３６のフラグメントにはＰｓｔＩを使用して、制限分析を実施した（図５Ｄ）。
【００５２】
５．リアルタイムＰＣＲを使用する遺伝子発現の定量分析
目的の遺伝子およびハウスキーピング遺伝子βアクチンの個々のＣt値に基づいて、相対的遺伝子発現を算出した。健常ボランティアとは対照的に、全ての緑内障患者の白血球はＭＭＰ−９の発現を示したが、転写レベルでは両極端の症例間で５倍までの差異を示した。また、ＴＩＭＰ−１の転写レベルはこれらの患者では極めて異質であり、サンプルによって２５×までの差異が認められる。さらに、ＭＭＰ−９、およびＭＩＭＰ−１間の転写の増加には相関関係が存在しない。ＭＴ１−ＭＭＰは５例の緑内障患者では高度に発現され、１例の患者では弱く発現される。
【００５３】
結論
１．フラグメント化されたＤＮＡの程度に依存して、正常眼圧緑内障（ＮＴＧ）患者は、正常と比較して、それほど十分なＤＮＡ修復能力を示さない。
【００５４】
２．また、これらの患者は、様々な遺伝子の発現パターンが正常とは異なる。遺伝子は、ａ）組織リモデリング、ｂ）ＤＮＡ修復、ｃ）虚血−再潅流およびｄ）付着に関与する遺伝子ファミリーに属する。
【００５５】
材料および方法
１．血液サンプル
ＮＴＧおよびＨＴＧ患者ならびに健常コントロールから血液サンプルを回収した。全ての緑内障患者は、両側の典型的緑内障性視神経乳頭陥凹および視野欠損を有した。ＮＴＧ患者では、眼内圧（ＩＯＰ）は決して２１ｍｍ  Ｈｇを超えなかったが、指の局所冷却後、これらの全てのＮＴＧ患者は２０秒間を超える血流の停止を示し、これは、爪縁部の毛細管顕微鏡によって検出した（血管攣縮を示す）。対照的に、ＨＴＧ患者は、２１ｍｍ  Ｈｇを超えるＩＯＰを示したが、血管攣縮性応答は示さなかった。健常コントロールの眼科学的検査では、目立った結果は得られず、また攣縮性応答も得られなかった。採血の少なくとも４週間前に全身的または局所的な眼の治療を受けた患者はいなかった。
【００５６】
２．白血球の単離
先に記載（カルマー（Ｋａｌｍａｒ）ら、１９８８）のように、密度勾配遠心によって、ヘパリン化血液から白血球を単離した。単離後、ＰＢＳ洗浄した白血球を乾燥ペレットとして−７０℃で保存するかまたは生細胞としてＤＭＳＯ含有培養培地中で凍結した。
【００５７】
３．コメットアッセイ
サンプルの調製。フラグメント化ＤＮＡを含有する細胞の割合は、コメットアッセイを使用することによって評価した。コメットアッセイ（トレビゲン社（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  ＩＮＣ．）、米国（ＵＳＡ））または単一細胞電気泳動の原理は、電場の影響下で変性、切断したＤＮＡフラグメントが細胞外（ｏｕｒ  ｏｆ）へ泳動する能力に基づく。損傷を受けていないＤＮＡは、電流が適用される場合、ゆっくりと泳動し、核の範囲内に留まる。ＤＮＡ「コメット」テイル形状および泳動パターンを評価することによって、ＤＮＡ損傷を評価することが可能である（図１）。詳細については、方法がオストリング（Ｏｓｔｌｉｎｇ）およびジョンソン（Ｊｏｈａｎｓｏｎ）（１９８４）によって説明された。簡単に説明すると、サンプルあたり２００〜３００細胞の密度で単離された白血球を、低融点アガロースのベット中に固定化した。細胞溶解後、サンプルをアルカリで処置し、ＤＮＡを巻き戻して変性させ、損傷部位を加水分解した。電気泳動後、サンプルを、ＳＹＢＲグリーン（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ）、蛍光ＤＮＡ挿入染料で染色した。
【００５８】
サンプルの分析。コメットは、倍率２００×で蛍光顕微鏡（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））下で可視化した。５１５〜５６０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍに対するバリアフィルターを使用した。少なくとも１００コメットを各データポイントについて分析した。ＤＮＡ損傷の定量では、コメットの全長（ヘッドおよびテイル）を測定し、マケルビー−マーチンら（１９９３）の基準に従って、損傷の程度を算出した。ＤＮＡの泳動の程度を考慮し、コメットの視覚的局面に基づいて、損傷の程度を４つのクラス（１〜４）に割り当てた（ビスバーディス（Ｖｉｓｖａｒｄｉｓ）ら、１９９７）。図１に示される通り、鮮明なヘッドを有し、テイルを有さないコメットをクラス１（無傷な（ｉｎｔａｃｔ）ＤＮＡ）に分類し、小さなヘッドおよび長い散乱したテイルを有するコメットをクラス４（重度のＤＮＡ損傷）に分類した。中間的な特徴はクラス２および３に割り当てた。次いで、健常ドナーについて算出された平均よりも大きな細胞消失はクラス５に分類した。初期のＤＮＡ損傷（ＤＤ）およびＢＰＳ中、３７℃で３時間のインキュベーション後のＤＮＡ損傷（ＤＤ３）は、ジャロスジンスキー（Ｊａｌｏｓｚｙｎｓｋｉ）ら（１９９７）が記載し、変更を加えた以下の式（１）を使用して、定量的に評価した：
ＤＤ＝（ｎ2＋２ｎ3＋３ｎ4＋４ｎ5）／（Ｓ／１００）
式中、ＤＤ：ＤＮＡ損傷、ｎ2〜ｎ4：それぞれクラス２、３および４において算出されたコメットの量；Ｓ：クラス１を含むスコア化したコメットの総数。
【００５９】
統計解析。初期のＤＮＡ損傷および３時間のインキュベーション後の修復能を、ノンパラメトリックな二元ＡＮＯＶＡ分析によって３つのグループ間で比較した。全ての統計解析は、グラフパッド・プリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（バージョン２．０１）を使用して行った。統計的有意差は、両側、対応のないスチューデントｔ検定によって算出した。
【００６０】
４．サブトラクティブ・ハイブリダイゼーションによる「遺伝子ハンティング」
ｍＲＮＡの単離。ｍＲＮＡの単離は、製造者のプロトコルに従って、クイック・プレップ・マイクロｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ウプサラ、スウェーデン（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））を使用して、実施した。品質チェックは、［α−32Ｐ］ｄＡＴＰ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、英国バッキンガムシャー（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ））の組み入れ、続く１％アガロースゲル上での電気泳動、その後のオートラジオグラフィー（サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｃｋ）ら、１９８１）を使用して、ファーストストランド（Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成キット（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ウプサラ、スウェーデン（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））によって実施した。反射フィルム（ＮＥＮライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を２時間、室温でゲルに暴露した。
【００６１】
サブトラクティブ・ライブラリーの構築。原則として、サブトラクティブ・ライブラリーの構築は、活性化／抑制されて、病理学的条件下でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるそれらの遺伝子の転写物（ｃＤＮＡの形態）のクローニングに基づく。これらの遺伝子を同定するために、転写物の２つのプール：患者由来のｍＲＮＡの完全なプールおよび健常コントロール由来のｍＲＮＡの完全なプールを使用する。両プールの転写物は誘導性および非誘導性プールのｍＲＮＡと呼ばれ、分子生物学的比較を経て、その後、２つのプール間の差異のサブトラクションが行われ、疾患によって活性化または抑制される転写物が示される。サブトラクティブ・ライブラリーの構築は、次のようにして行われる：白血球サンプルおよびコントロール由来のｍＲＮＡを、サブトラクター・キット（Ｓｕｂｔｒａｃｔｏｒ  Ｋｉｔ）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、リーク、オランダ（Ｌｅｅｋ，ＮＬ））の取扱説明書に従って、ＵＶ照射によってビオチン化した。擬陽性の結果を回避するために、非誘導性プールのｍＲＮＡを過剰に添加した。等量の各ｍＲＮＡプールを逆転写に供し、続いて、ｍＲＮＡ−テンプレートを変性した。それぞれ新たに合成したｃＤＮＡプール（誘導性プール）を、６８℃で４８時間、対応する非誘導性ビオチン化ｍＲＮＡ−プールにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション混合物をストレプトアビジンと共にインキュベートし、従って、全てのビオチン化分子（非誘導性ならびにＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド）をストレプトアビジンと複合させた。ストレプトアビジン核酸複合体を、フェノール−クロロホルム抽出によって取り出し、サブトラクトしたｃＤＮＡをエタノールによって沈殿させた（シブ（Ｓｉｖｅ）およびジョン（Ｊｏｈｎ）、１９８８）。ＮＴＧ患者／コントロールのそれぞれの対について、両プール：誘導性「ＮＴＧ遺伝子」および誘導性「正常遺伝子」をサブトラクトした。第２の鎖のｃＤＮＡ合成を、ｃＤＮＡ合成キット（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ連邦共和国（ＦＲＧ））により実施した。構築されたライブラリーの目的は、個々に、およびＮＴＧ患者のグループと健常コントロールとで遺伝子発現を比較することである。個々の対および対応するグループの両方からサブトラクトされているそれらの遺伝子のみが、関連性があるとみなされている。
【００６２】
サブトラクトされたｃＤＮＡのクローニング。サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）によって記載されたクローニング方法に従って、ｐＳＰＯＲＴ１クローニングベクター（ギブコ・ライフ・テクノロジーズ（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、エーゲンシュタイン、ドイツ連邦共和国（Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ，ＦＲＧ））を使用して、サブトラクトされたｃＤＮＡをクローニングした。サブトラクトされたｃＤＮＡの可視化を可能にするために、ｐＳＰＯＲＴ１ベクターの複数のクローニング部位を制限するユニバーサルプライマーＩ−５' ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３'（配列番号１）およびＩＩ−５'ＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ３'（配列番号２）を使用して、クローニングしたｃＤＮＡを増幅した。増幅物を１％アガロースゲル中で分析した。対応するｃＤＮＡを、ＤＮＡクリーンキット（ＡＧＳ、ハイデルベルク、ドイツ連邦共和国（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＲＧ））で浄化したゲルから切り出し、ｐＵＣ１８ベクターのＳｍａＩ部位に再クローニングした。組換え分子を、ＩＮＶａＦ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ）細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）、リーク、オランダ（Ｌｅｅｋ，ＮＬ））での形質転換に使用した。制限分析を使用して、挿入されたフラグメントの長さについて、組換えプラスミドＤＮＡを分析した。キアフィルター・プラスミド・ミディ・システム（ＱｉａＦｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｓｙｓｔｅｍ）（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ヒルデン、ドイツ連邦共和国（Ｈｉｌｄｅｎ，ＦＲＧ））を使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。ＭＷＧ−バイオテック（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）（エベルスベルク、ドイツ連邦共和国（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，ＦＲＧ））により、プラスミドＤＮＡを配列決定した。
【００６３】
遺伝子の同定。データとＤＮＡおよびタンパク質遺伝子バンク（ＥＭＢＬアンドＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（ＥＭＢＬ  ａｎｄ  ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）、ハイデルベルク、ドイツ連邦共和国（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＦＧＲ））とのコンピュータ支援による比較によって、相同性を決定した。ＭＷＧ−バイオテック（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）（エベルスベルク、ドイツ連邦共和国（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，ＦＲＧ））製「ＤＮＡＳＩＳ」プログラムを使用して、アラインメントを調製した。
【００６４】
ドットブロット分析。特定の転写物を定量するために、個々のクローニングおよび配列決定されたｃＤＮＡを、ドットプッロトハイブリダイゼーションのための特定の標識されたプローブとして使用した。クローニングおよび精製後、標識の前に９５℃で５分間それぞれのプローブを変性し、続いて、ルネサンス・ランダム・プライマー・フルオレセイン−１２−ＵＴＰラベリング・キット（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−１２−ＵＴＰ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）（ＮＥＮ・ライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を使用して、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰで標識した。ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）およびバンクロフト（Ｂａｎｃｒｏｆｔ）のプロトコル（１９８２）に従って、ドットブロット技術を使用し、単離したｍＲＮＡ−プールのアリコートを特異的プローブとのハイブリダイゼーションに適用した。簡単に説明すると、ｍＲＮＡ−プールのサンプルを、正に帯電させたナイロンメンブラン上に配置した。固定化後、ナイロンメンブランを、ブロック試薬（ＮＥＮ・ライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））を含有するプレハイブリダイゼーション溶液中、３時間、６５℃、ハイブリダイゼーションオーブン中でインキュベートした。メンブランを、各標識されたプローブで、段階的に、１晩、６５℃でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、プレハイブリダイゼーション緩衝液で２回メンブランを洗浄することによって、非特異的結合材料を除去した。次いで、メンブランをブロッキング試薬でブロックし、抗フルオレセインＨＲＰ抗体（１：１０００；ＮＥＮ・ライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））と共に１時間、３７℃でインキュベートした。洗浄後、メンブランを、核酸化学ルミネセンス試薬（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＮＥＮ・ライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））中で１時間インキュベートし、その後、オートラジオグラフィー反射フィルム（ＮＥＮ・ライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））室温で、１時間暴露した。同じ様式で、それぞれのハイブリダイゼーションを実施した。製造者のプロトコルに従い、個々のハイブリダイゼーションの間で、メンブランをはがした。デンシトメーター（ｄｅｎｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して、フィルムのデンシトメトリー（ｄｅｎｓｉｏｍｅｔｒｙ）およびＭＷＧ−バイオテック（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）（ドイツ連邦共和国（ＦＲＧ））製定量ソフトウェアプログラムを実施した。
【００６５】
統計解析。以後のクルスカル−ウォリスの検定によるＡＮＶＡおよびスチューデントのｔ検定を適用し、回帰直線分析を実施した。有意性のレベルはｐ＜０．０５においてであった。
【００６６】
５．ｃＤＮＡプローブの発現アレイへのハイブリダイゼーションによる「遺伝子ハンティング」
異なる分子発現パターンの評価のために設計されたアトラス（Ａｔｌａｓ）TMヒト１．２アレイ（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、米国（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＵＳＡ））を使用した。アトラス（Ａｔｌａｓ）TMヒト１．２アレイは、全てナイロンメンブラン上に固定化された１１７６ヒトｃＤＮＡ、９ハウスキーピングコントロールｃＤＮＡ、およびネガティブコントロールを含む。ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ウプサラ、スウェーデン（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓ））製ファーストストランド（Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成キットを使用して、緑内障患者および健常コントロールから誘導される単離されたｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を実施した。合成およびフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰによる標識後（上記を参照のこと）、アトラス（Ａｔｌａｓ）TMヒト１．２アレイを、それぞれ個々の標識されたｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、いくらかの洗浄工程により非特異的結合材料を除去し、次いで、ブロッキング試薬によって、メンブランをブロックした。その後、メンブランを、抗フルオレセインＨＲＰ抗体（ＮＥＮ・ライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））と共に１時間、３７℃でインキュベートし、続いて、洗浄手順および化学ルミネセンス試薬（ＮＥＮ・ライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））と共にインキュベートを行った。次いで、メンブランをオートラジオグラフィー反射フィルム（ＮＥＮ・ライフ・サイエンス・プロダクツ（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））室温で、１時間暴露した。アトラス（Ａｔｌａｓ）ｃＤＮＡ発現アッセイの分析のために特別に開発されたアトラス・イメージ（Ａｔｌａｓ  Ｉｍａｇｅ）２．０ソフトウェア（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト、米国（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＵＳＡ））を使用して、評価を実施した。
【００６７】
６．ポリメラーゼ連鎖反応
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）。標的遺伝子の発現を定量的に検出し、リアルタイム定量ＰＣＲ（以下を参照のこと）の個々の反応条件を最適化するために、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＴＩＭＰ１遺伝子のために設計された特異的プライマーで、ＲＴ−ＰＣＲを実施した。ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ウプサラ、スウェーデン（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓ））製ファーストストランド（Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成キットを使用して、緑内障患者および健常コントロールから誘導される単離されたｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を実施した。ホットスタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）Ｔａｑポリメラーゼ（アベジーン（Ａｂｇｅｎｅ）、ハンブルグ、ドイツ連邦共和国（Ｈａｍｂｕｒｇ，ＦＲＧ））を使用してＰＣＲを実施し、３５サイクル稼動させた。ＤＮＡを伴わないＰＣＲはネガティブコントロールとしての役割を果たし、配列テンプレートを伴うＰＣＲはポジティブコントロールとしての役割を果たした。分析のために、アガロースゲルで分別された臭化エチジウム染色されたＰＣＲ産物を、ＵＶ証明下で可視化した。
【００６８】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＱＰＣＲ）。目的の遺伝子の発現の変化について記述するために、挿入染料および蛍光レポーター分子としてＳＹＢＥＲグリーン（ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ）Ｉを使用してＲＴ−ＱＰＣＲを実施し、ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱTM検出システム（バイオラッド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＬＡｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国（ＵＳＡ））において増幅された二本鎖産物の蓄積を検出した。ＲＴ−ＰＣＲは、上記の通りに実施したが、ただ唯一の例外は：ホットレッドＴａｑポリメラーゼ（アベジーン（Ａｂｇｅｎｅ）、ハンブルグ、ドイツ連邦共和国（Ｈａｍｂｕｒｇ，ＦＲＧ））をＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、スイス（ＣＨ））に置き換えて、発色シグナルの撹乱を回避したことであった。ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱTM検出システムのアルゴリズムは、内部リファレンス（ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）に対してレポーターシグナル（非挿入ＳＹＢＥＲグリーン（ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ））を標準化し、１０の脱落因数（ｄｅｆａｕｌｔｅｒ）により最初の数サイクルにおけるバックグランドシグナルのＳＤを増加して、閾値を決定する。ベースラインレベルを超えるサイクルは閾値サイクル（ＣT）として規定される。Ｃtは初期のテンプレートコピー数に依存し、核酸の開始量に比例する（ヘイド（Ｈｅｉｄ）ら）。目的の遺伝子とハウスキーピング遺伝子（βアクチン）との間のＣT値の差異をサブトラクトすることによって、データが標準化される。ＣT値の差異に基づき、ＮＴＧサンプルからコントロールサンプルにおける遺伝子発現について、相対レベルを算出した（ヘイド（Ｈｅｉｄ）ら、１９９６）。
【００６９】
統計解析。全ての値を平均値±ＳＥＭで表す。パラメティックデータについて、スチューデントのｔ検定を使用して、値を比較した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【００７０】
制限分析。標的ＰＣＲ産物を、特異的制限分析を使用して同定した。標的増幅産物は、消化の前に、ＤＮＡ単離キット（ＤＮＡ−クリーン（Ｃｌｅａｎ）TM、ハイバイド−ＡＧＳ（Ｈｙｂａｉｄ−ＡＧＳ）、ドイツ連邦共和国（ＦＲＧ））を使用するアガロースゲルからの抽出を経た。それらは、製造者（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）、スイス（ＣＨ））のプロトコルに従って、２０単位の各制限エンドヌクレアーゼを有する５０μｌの最終容積中で、４時間、消化した。消化しＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル中で分別し、臭化エチジウムによる染色後、ＵＶ光によって可視化した（図５）。
【００７１】
ここまで、本発明の好適な実施態様を示し、説明してきたが、本発明がそれらに制限されることはなく、添付の特許請求の範囲内で多様に具体化し、実施することできることはいうまでもない。
【００７２】
参考文献
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ホワイトＢＡ（Ｗｈｉｔｅ  ＢＡ）およびバンクロフトＦＣ（Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ＦＣ）、Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｓｉｍｐｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｍＲＮＡ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８２年  ８月  １０；２５７（１５）：８５６９頁−７２頁
ビスバルディスＥＥ（Ｖｉｓｖａｒｄｉｓ  ＥＥ）、タッシオウＡＭ（Ｔａｓｓｉｏｕ  ＡＭ）、ピペライスＳＭ（Ｐｉｐｅｒａｋｉｓ  ＳＭ）．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｆｒｅｓｈ  ａｎｄ  ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  Ｈ2０2  ａｎｄ  ｇａｍｍａ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｃｏｍｅｔ  ａｓｓａｙ．  Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  １９９７年  １月  ３１；３８３（１）：７１頁−８０頁
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】コメットアッセイの結果を示す。
【図２】ドットブロットアッセイの結果を示す（１：緑内障患者、２：健常コントロール）。
【図３】ＸＰＧＣ転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図４ａ】コントロール個体におけるβアクチン転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図４ｂ】緑内障患者におけるβアクチン転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図４ｃ】コントロール個体におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図４ｄ】緑内障患者におけるマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図４ｅ】コントロール個体における膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図４ｆ】は緑内障患者における膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＴ１−ＭＭＰ）転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図４ｇ】コントロール個体におけるメタロプロテイナーゼ阻害因子１前駆体１（ＴＩＭＰ−１）転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図４ｈ】緑内障患者におけるメタロプロテイナーゼ阻害因子１前駆体１（ＴＩＭＰ−１）転写物のＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を示す。
【図５ａ】βアクチンの２０９ｂｐ  ＰＣＲフラグメントの制限分析を示す。
【図５ｂ】２８９ｂｐ  ＭＭＰ−９  ＰＣＲフラグメントの制限分析を示す。
【図５ｃ】２９５ｂｐ  ＭＴ１−ＭＭＰ  ＰＣＲフラグメントの制限分析を示す。
【図５ｄ】３９３ｂｐ  ＴＩＭＰ−１  ＰＣＲフラグメントの制限分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図４ｇ】
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【図４ｈ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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