(57)【要約】ヒト脈管形成性始原細胞のインビトロでの同定、単離および培養のための簡略化された安価な方法が提供される。前記方法、および前記方法において提供される始原細胞は、インビトロでの血管工学、先天的および後天的な血管異常および血液学的異常を処置するために、また、脈管形成プロセスおよび血管形成プロセスに影響を及ぼす薬物を評価および開発するために、また、組織の分化および発達をさらに研究するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化ＥＳ細胞から脈管形成性の始原細胞を調製するための方法であって、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、（ｂ）脈管形成性の始原細胞である５０μｍより小さい前記細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ろ過が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項１記載の方法。
【請求項６】
未分化ＥＳ細胞から上皮始原細胞を調製するための方法であって、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、（ｂ）上皮始原細胞である５０μｍより大きい前記細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
を含む方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項６記載の方法。
【請求項８】
５０μｍより大きい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項６記載の方法。
【請求項９】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項６記載の方法。
【請求項１１】
体細胞を脈管形成性始原細胞の集団から調製する方法であって、
（ａ）脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、
（ｂ）体細胞の分化を誘導するために好適な少なくとも１つの増殖因子の存在下で脈管形成性始原細胞の集団を培養し、それにより、体細胞を調製すること、
を含む方法。
【請求項１２】
工程（ａ）が、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、（ｂ）脈管形成性の始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
によって行われる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記成長因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エフリン（Ｅｐｈ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、サイトカイン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
血管組織を調製する方法であって、
（ａ）脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、
（ｂ）血管組織の分化を誘導するために好適な条件のもと、少なくとも１つの脈管形成性増殖因子および／または血管形成性増殖因子の存在下で脈管形成性始原細胞の前記集団を培養すること、
を含む方法。
【請求項１９】
工程（ａ）が、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、（ｂ）脈管形成性の始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
によって行われる請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
脈管形成性始原細胞の前記集団が半固体の脈管化促進培地で培養される請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
脈管形成性始原細胞の前記集団が３次元の足場において培養される請求項１８記載の方法。
【請求項２６】
前記脈管形成性増殖因子および／または血管形成性増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エフリン（Ｅｐｈ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）からなる群から選択される請求項１８記載の方法。
【請求項２７】
血管の発達、成長および／または変化に対する因子の影響を明らかにする方法であって、
（ａ）脈管形成性始原細胞の集団を得ること、
（ｂ）脈管形成性始原細胞の前記集団を因子にさらすこと、および、
（ｃ）脈管形成性始原細胞の前記集団に対する因子の影響を明らかにし、それにより、血管の発達に対するその影響を明らかにすること、
を含む方法。
【請求項２８】
工程（ａ）が、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、（ｂ）脈管形成性の始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
によって行われる請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
因子が物質および／または環境因子である請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
因子が、血管形成および／または脈管形成の推定される下方調節因子（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であり、前記方法はさらに、工程（ｂ）の前に血管形成および／または脈管形成を促進するために好適な条件のもとで脈管形成性始原細胞の前記集団を培養することを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
因子が、血管形成および／または脈管形成の推定される上方調節因子（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であり、前記方法はさらに、工程（ｂ）の前に血管形成および／または脈管形成を制限する条件のもとで脈管形成性始原細胞の前記集団を培養することを含む請求項２７記載の方法。
【請求項３６】
脈管形成性始原細胞の集団を含む細胞培養物であって、脈管形成性始原細胞の集団は少なくとも１４日間にわたって増殖状態で維持することができ、かつ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エフリン（Ｅｐｈ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、サイトカイン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの増殖因子にさらされたとき、平滑筋細胞、内皮細胞および／または造血細胞への分化が可能である細胞培養物。
【請求項３７】
脈管形成性始原細胞の前記集団は少なくとも１つの外因性ポリペプチドを発現することができる請求項３６記載の細胞培養物。
【請求項３８】
前記外因性ポリペプチドは、細胞表面マーカー、細胞表面抗原、血管形成因子、脈管形成因子および造血因子からなる群から選択される請求項３７記載の細胞培養物。
【請求項３９】
前記外因性ポリペプチドが誘導可能な様式で発現する請求項３７記載の細胞培養物。
【請求項４０】
基質と、脈管形成性始原細胞の集団とを含む組成物であって、
前記の脈管形成性始原細胞は、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得る工程、および、
（ｂ）脈管形成性始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離する工程、
により行われる方法によって未分化ＥＳ細胞から調製される組成物。
【請求項４１】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項４２記載の組成物。
【請求項４４】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項４０記載の組成物。
【請求項４５】
前記基質は、マトリゲル、コラーゲンゲルおよびポリマー足場からなる群から選択される請求項４０記載の組成物。
【請求項４６】
前記脈管形成性始原細胞が、前記基質内における血管の発達を誘導するような様式で前記基質と接触させられる請求項４０記載の組成物。
【請求項４７】
哺乳動物対象における血管の疾患または状態を緩和または防止する方法であって、
（ａ）脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、
（ｂ）前記脈管形成性始原細胞が内皮細胞および平滑筋細胞に分化することを刺激するために好適な条件のもとで、前記脈管形成性始原細胞を対象に投与し、それにより前記血管の疾患または状態を緩和すること、
を含む方法。
【請求項４８】
脈管形成性始原細胞の前記集団を得ることが、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、
（ｂ）脈管形成性始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
によって行われる請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項４７記載の方法。
【請求項５３】
前記血管の疾患または状態は、先天性の血管障害、後天的な血管障害、および虚血／再灌流傷害からなる群から選択される請求項４７記載の方法。
【請求項５４】
哺乳動物組織を脈管化させる方法であって、
（ａ）脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、
（ｂ）前記脈管形成性始原細胞が内皮細胞および平滑筋細胞に分化することを刺激するために好適な条件のもとで、前記脈管形成性始原細胞を前記哺乳動物組織と接触させることによって行われ、それにより、組織の血管分布を高めること、
を含む方法。
【請求項５５】
脈管形成性始原細胞の前記集団を得ることが、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、
（ｂ）脈管形成性始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
によって行われる請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物組織が脈管化を必要とする操作された非血管組織である請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物組織が胚組織である請求項５４記載の方法。
【請求項６２】
工程（ｂ）がインビトロで行われる請求項５４記載の方法。
【請求項６３】
工程（ｂ）がインビボで行われる請求項５４記載の方法。
【請求項６４】
哺乳動物対象における血液学的な疾患または状態を緩和または防止する方法であって、
（ａ）脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、
（ｂ）前記脈管形成性始原細胞が内皮細胞および血液細胞に分化することを刺激するために好適な条件のもとで、前記脈管形成性始原細胞を対象に投与し、それにより前記血液学的な疾患または状態を緩和すること、
を含む方法。
【請求項６５】
工程（ａ）が、
（ａ）個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、（ｂ）脈管形成性の始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
によって行われる請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
工程（ａ）が、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記未分化ＥＳ細胞がヒトＥＳ細胞である請求項６４記載の方法。
【請求項７０】
前記血液学的な疾患または状態は、先天性の血液障害、後天的な血液障害、凝固障害および新生物疾患からなる群から選択される請求項６４記載の方法。
【請求項７１】
内皮細胞を血管組織から調製する方法であって、
（ａ）血管組織から細胞を解離するために設計された条件に血管組織を供し、それにより、解離された細胞の混合集団を得ること、および、
（ｂ）内皮細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
を含む方法。
【請求項７２】
５０μｍより小さい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記血管組織がヒト血管組織である請求項７１記載の方法。
【請求項７５】
上皮細胞を血管組織から調製する方法であって、
（ａ）血管組織から細胞を解離するために設計された条件に血管組織を供し、それにより、解離された細胞の混合集団を得て、それにより、個々の細胞の混合集団を得ること、および、
（ｂ）上皮細胞である５０μｍより大きい細胞を前記混合細胞集団から単離すること、
を含む方法。
【請求項７６】
５０μｍより大きい前記細胞が、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
ろ過による前記単離が５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記血管組織がヒト血管組織である請求項７５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞に由来する脈管形成性の始原細胞を単離および培養するための新規な方法に関する。より詳細には、本発明は、組織工学、研究および診断法において脈管形成性の始原細胞を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト胚幹細胞を培養で無限に増殖させることを可能にし、これにより、方向づけられた組織特異的な様式での分化の誘導を用いた実験を可能にする様々な技術が開発されている（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｊ他、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２０００、６：８８〜９５；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ他、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０００、１８：３９９〜４０４；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２０００、９７：１１３０７〜１２）。ヒト胚幹細胞の成長および発達は現在、注意深く研究されており、急速に蓄積しつつある知識が、インビトロ組織工学、移植医療、遺伝子組換え胚の作製、および変性疾患の処置を含む様々な革新的な治療的適用において用いられている。最も重要なことに、合衆国大統領は、医療および研究に対する胚幹細胞の計り知れない重要性を認めており、最近では、既存のヒト胚幹細胞株を使用するプロジェクトを是認している（ホワイトハウス概況報告書：胚幹細胞研究［２００１年８月９日］）。しかしながら、発達の複雑な段階のインビトロ操作は、実質的な量の所望される細胞系譜および特定の表現型を確実に得るためには、依然として極めて重要な目標である。
【０００３】
胚発達および成体における血管形成
胚発達の初期段階では、血管形成が、中胚葉に由来する内皮細胞始原体がデノボでの分化、拡大および合着を受けて、原始的な細管の網状組織を形成する、脈管形成と呼ばれるプロセスによって生じている（Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ＧＤ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０７：２４２）。これらの血管は、一般には、それぞれが異なる機能を果たす２つの細胞系譜から構成される：血液を伝えるための通路を形成し、しかし、単独では脈管形成を完了させることができない内側の内皮細胞、および、脆弱な通路を破裂から保護し、安定化させ、止血の制御を提供する内皮周囲の平滑筋細胞（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ、２０００、６：３８９）。第３の細胞系譜（造血細胞）は、血管細胞と共通する始原体を有し、血液細胞に分化する。脊椎動物の胚では、脈管形成は沿軸中胚葉および側板中胚葉において生じ、これらは、心臓原基、背側大動脈、ならびに、頭部、肺および胃腸系の大きい血管を生じさせる。血管形成は、大きい血管および小さい血管の複雑な網状組織への原始的な血管叢の成熟化および再構築を伴う。血管形成はまた、最初は無血管の器官（例えば、腎臓、脳および肢芽など）の脈管化をもたらす。
【０００４】
血管形成は、正常な組織成長のために出生後も要求され、成体の生涯にわたって続き、例えば、雌性動物の正常な発情期において子宮内膜の血管新生のときに、胎盤において妊娠時に、また、創傷治癒時に継続する（Ｒｉｓａｕ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７、３８６：６７１〜６７４）。
【０００５】
さらに、数多くの疾患および障害が、異常な内皮成長、すなわち、アテローム性動脈硬化における内皮の過剰増殖、腫瘍の成長および転移における血管新生、そして、慢性関節リウマチ、網膜症、血管腫および乾癬における脱調節された血管形成に関連している（Ｆｏｌｋｍａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、１９９５、１：２７〜３１；ＨａｎａｈａｎおよびＦｏｌｋｍａｎ、Ｃｅｌｌ、１９９６、８６：３５３〜６４）。
【０００６】
インビトロでの胚内皮細胞
胚内皮細胞（ＥＥＣ）の機能、起源および性質に対する研究では、ＥＥＣが肝臓の器官形成を促進し得ること（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｋ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、２９４：５５９）、膵臓の分化を誘導し得ること（Ｌａｍｍｅｒｔ  Ｅ他、２００１、２９４：５６４）、また、特定の条件のもとで心筋細胞にトランス分化し得ること（Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ  Ｇ他、２００１、９８：１０７３３）が解明されている。内皮前駆体の分化および発達の本質は未だ完全には理解されていないが、血管平滑筋細胞（ｃ−ＳＭＣ）の造血的発達および生成が血管の発達と強く関係づけられることが明らかになりつつある。
【０００７】
胚幹細胞は、培養で維持することが困難であり、自発的な分化を生じさせやすい。継続中の培養物の場合、胚盤胞の内部塊に由来する細胞が、典型的には、その未分化な表現型および増殖性を保持させるために、マウスの胚繊維芽細胞「フィーダー」細胞の層の表面で成長させられる（Ｋｅｌｌｅｒ，ＧＭ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９５、７：８６２〜６９）。マウスでは、胚的に異なる細胞タイプへの初期の分化を、間質細胞株との同時培養によって誘導することができ（Ｐａｌａｃｉｏｓ  Ｒ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９５、９２：７５３０〜３４）、または、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンなどの基質上での培養によって誘導することができ（Ｏｇａｗａ  Ｍ他、Ｂｌｏｏｄ、１９９９、９３：１１６８〜７７）、または、３つの胚葉への領域的な分化が明らかにされる、「胚葉体」（ＥＢ）への胚様体幹（ＥＳ）細胞のインビトロ凝集によって誘導することができる（Ｋｅｌｌｅｒ、ＧＭ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９５、７：８６２〜６９）。
【０００８】
ネズミ胚幹細胞
ネズミＥＳ細胞における脈管形成事象の研究は有益である。造血細胞および内皮細胞の両方が、マウスＥＳ細胞由来の胚様体から生じた芽細胞コロニーで観測されている（Ｃｈｏｉ  Ｋ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９８、１２５：７２５）。ネズミＥＳ細胞を用いた研究もまた行われており、Ｎｉｓｈｉｋａｗａおよび共同研究者らは、３Ｄ胚様体形成が側板中胚葉細胞の分化のためには要求されないことを明らかにしていた。培養された凝集しないマウス胚細胞がコラーゲン基質上で成長させられたとき、血管内皮カドヘリンを発現する細胞（ＶＥ−ｃａｄ＋）が造血細胞を生じさせることが見出された（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ＳＩ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９８、１２５：１７４７；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ＳＩ他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９８、８：７６１；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｔ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ、２００１、６：１１１３）。平滑筋細胞（ＳＭＣ）表現型マーカー（例えば、表面マーカーおよび形態学的マーカー）が観測されるとき、胚内皮管に関連する初期の内皮周囲ＳＭＣが内皮からトランス分化することを示すことができ（Ｇｉｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｄｅ−Ｇｒｏｏｔ，ＡＣ他、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ、１９９９、１９：１５８９）、また、内皮細胞および平滑筋細胞への胚の共通する脈管始原体（Ｆｌｋ１＋）の分化を観測することができる（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２）。しかしながら、マウスＥＣ系からヒトＥＣ系への直接的な外挿を行う試みは期待はずれの結果で終わっており、このことは、発達プロセスおよび要件の多くが種特異的であることを示している（例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ他、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ．、２０００、１８：３９９〜４０４を参照のこと）。具体的には、マウス胚幹（ｍＥＳ）細胞におけるその発現とは対照的に、血管特異的増殖因子受容体ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）が未分化のヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）では発現し（Ｋａｕｆｍａｎ，ＤＳ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００１、９８：１０７１６〜２１）、分化の最初の１週間は増大しない（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ，Ｓ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００２、９９：４３９１〜９６）。このことは、ＶＥＧＦＲ２発現の時期が脊椎動物の種間で異なり得ることを示している（これはまたＮｉｓｈｉｋａｗａによって総説される；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ＳＩ他、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２００１、１３：８６２〜６９）。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ他（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ、Ｓ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００２、９９：４３９１〜９６）はさらに、他の内皮マーカー、すなわち、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄ）および血小板−内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ１／ＣＤ３１）が、ｈＥＳ分化の最初の１週間の間に増大することを報告していた。明らかに、特異的な様々な内皮特異的因子の発現の協調が、適切な組合せで、ヒトの脈管形成には非常に重要である。
【０００９】
ヒト胚幹細胞
ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞株は１９９８年に最初に得られ（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ＪＡ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２：１１４５；米国特許第６２００８０６号（Ｔｈｏｍｓｏｎ他）；米国特許第６３３１４０６号（Ｇｅａｒｈａｒｔ  ＪＤおよびＳｈａｍｂｌｏｔｔ  ＭＪ））、近年では、細胞系譜特異的な様式でインビトロで分化させるために誘導されている（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  Ｍ他、ＰＮＡＳ、２０００、９７：１１３０７〜３１２；国際特許出願公開第ＷＯ０２１０３４７Ａ２号（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ、Ｎ））。ｈＥＳ細胞は、何百回の倍化時間を通して胚幹細胞表現型を維持し、また、すべての胚細胞系譜に分化するので、研究および臨床的適用のための潜在的に無限の細胞供給源を提供している。造血細胞分化および内皮細胞分化の両方がヒトＥＳ細胞で観測されている。今日まで、ｈＥＳ細胞の造血分化は、Ｓ１７（ネズミ骨髄）間質細胞株またはＣ１６６（卵黄嚢内皮）間質細胞株のいずれかと同時培養することが必要であり、これにより、細胞表面抗原ＣＤ３４および造血コロニー形成などの主要なヒト造血組織特徴の出現が誘導される（Ｋａｕｆｍａｎ、ＤＳ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００１、９８：１０７１６〜２１）。別の最近の研究では、内皮細胞が、内皮特異的マーカーのＰＥＣＡＭ−１に対して惹起されたモノクローナル抗体を使用してヒト胚様体（ＥＢ）からの細胞分取（ＦＡＣＳ）によって選択されていた（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ，Ｓ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００２、９９：４３９１〜９６）。ＰＥＣＡＭ−１＋の選択された胚様体由来（ＥＢＤ）細胞は、フォンビルブラント因子、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥ−ｃａｄ表面マーカーなどの内皮特異的な特徴を示し、また、軟基質（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）において培養されたとき、原始的な血管様索の形成を示した。ＰＥＣＡＭ−１＋のＥＢＤ細胞はさらに、生分解性ポリマーマトリックススポンジに接種し、ＳＣＩＤマウスに移植した後、血管構造をインビボで形成することが観測されていた。しかしながら、ヒトＥＳを分化させるための上記の方法はすべて、内皮表現型の出現の前に非ヒト細胞との同時培養または胚様体の形成のいずれかが必要であり、また、内皮細胞マーカーに従った選択のための免疫蛍光細胞分取が必要であり、これらは、上記の方法を、多くの臨床的適用のためには費用がかかり、かつ好適でない方法にしている。従って、胚様体内への凝集または免疫蛍光選択の制限を伴うことなく、ヒト胚幹細胞を培養し、選択し、また、その分化を導くための単純化された、あまり費用のかからない方法を提供することは好都合である。
【００１０】
先行技術では、胚幹細胞の調製および使用に関する数多くの技術および方法が分化のために開示されている。初期の技術では、胚盤胞期の胚に由来する内部細胞塊細胞（採取物または凍結保存物）が幹細胞の供給源として要求された（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１２９２０６Ａ１号（Ｃｉｂｅｌｌｉ他）；米国特許出願公開第２００２００４５２５９Ａ１号（Ｌｉｍ他）、同２００２０００４２４０Ａ１（Ｗａｎｇ）を参照のこと）。多くの他の技術は、分化を開始させるために、幹細胞の胚様体への凝集に依拠している（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００７００２１Ａ３号（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  ＪおよびＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  Ｎ）を参照のこと）。
【００１１】
培養状態の幹細胞を分化させるための様々な方法もまた開示されている。国際特許出願公開第ＷＯ０１３４７７６Ａ１号、米国特許出願公開第２００２００１５６９４Ａ１号および米国特許第６２８０７１８号（これはすべてＫａｕｆｍａｎ  Ｄ他による）には、哺乳動物の間質細胞と同時培養することによってヒト胚幹細胞を造血細胞に分化させる方法が開示される。米国特許出願公開２００２００２３２７７Ａ１（Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ，Ｈ他）には、マウスにおける脈管形成関連遺伝子Ｖｅｚｆｌの同定および単離、ならびに、Ｖｅｚｆｌ発現に基づいて内皮細胞および前駆体を選択するための方法が開示される。また、血管形成を調節するための方法、ならびに、対象における血管疾患および新生物を診断および処置するための方法も開示されており、この場合、これらの方法では、組織におけるＶｅｚｆｌのレベルを検出し、測定し、そして改変することが用いられる。しかしながら、記載された遺伝子組換えＥＳ細胞実験は、マウスの胚様体細胞のみに限定されており、ヒト胚細胞または他の霊長類胚細胞のいずれも使用されていなかった。さらに、選択は、その開示によれば、Ｖｅｚｆｌの発現に基づいており、従って、凝集および免疫蛍光分取の前記制限を克服することはできなかった。
【００１２】
米国特許出願公開２００２００３９７２４Ａ１（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ＭＫ）には、ヒト胚神経始原細胞の分化および選択のための方法、ならびに、その治療的使用、診断的使用および研究使用が開示される。開示されたヒト神経始原細胞は、例えば、神経変性疾患の再構成治療のためには、ヒト胚様体からもまた得られ、神経細胞特異的マーカーのＮＣＡＭおよびＡ２Ｂ５の発現および検出に従って選択および単離されている。同様に、国際特許出願公開第ＷＯ０１８１５４９Ａ３号（Ｒａｍｂｈａｔｌａ  ＬおよびＣａｒｐｅｎｔｅｒ  ＭＫ）には、造血系譜細胞への分化を誘導するために胚様体をｎ−ブチラートで処理するための方法が開示される。凝集しないｈＥＳ起源、または、いずれかの適用における始原体単離の簡略化された方法については何ら言及されていない。
【００１３】
最近、Ｂｅｎｅｖｅｎｉｓｔｙ（国際特許出願公開第ＷＯ０２１０３４７Ａ２号、Ｂｅｎｅｖｅｎｉｓｔｙ）は、凝集した胚様体由来細胞を外因性因子で処理し、培養物を特定の系譜細胞タイプについて濃縮することによってヒト胚幹細胞の「方向づけられた分化」を行うための方法を開示した。使用された因子は、分化の知られている作用因子であり、例えば、レチノイン酸、ニューロン増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子などであった。分化は、デノボでの遺伝子発現、および組織系譜特異的な細胞表面マーカーの出現によって決定された。
【００１４】
米国特許出願公開２００１００４１６６８Ａ１（Ｂａｒｏｎ、Ｍ他）には、造血、ならびに哺乳動物の成体由来幹細胞および胚中胚葉由来幹細胞からの血管成長を改変するための、胚外の形態形成遺伝子産物（例えば、ヘッジホッグ、ＴＮＦおよびＷＮＴなど）の使用が開示される。例えば、外部からの適用または遺伝子操作による、幹細胞環境におけるこれらの胚外遺伝子産物のレベルの調節が、血液の異常、過剰脈管形成、血管新生、および組織の再脈管化を伴う疾患の処置および診断のために幹細胞の造血能力および／または血管能力の強化または低下のいずれかを行うために開示されている。しかしながら、ヒト胚組織の処置は提案されているが、ヒトの成体細胞または胚細胞を使用する例は全く示されておらず、また、上記制限を克服するために設計された、凝集しない胚幹細胞の培養または選択のための方法は開示されていない。
【００１５】
従って、ヒト脈管形成性始原細胞のインビトロでの同定、単離および培養のための簡略化された安価な方法が求められている。そのような方法、およびそのような方法によって単離された始原細胞は、インビトロでの血管工学、先天的および後天的な血管異常および血液学的異常を処置するために、また、脈管形成プロセスおよび血管形成プロセスに影響を及ぼす薬物を評価および開発するために、また、組織の分化および発達をさらに研究するために使用することができる。
【発明の開示】
【００１６】
発明の要約
本発明の１つの局面によれば、未分化ＥＳ細胞から脈管形成性の始原細胞を調製するための方法が提供される。この場合、この方法は、個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、脈管形成性の始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離することによって行われる。
【００１７】
本発明の別の局面によれば、未分化ＥＳ細胞から上皮始原細胞を調製するための方法が提供される。この場合、この方法は、個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、上皮始原細胞である５０μｍより大きい細胞を前記混合細胞集団から単離することによって行われる。
【００１８】
本発明のさらに別の局面によれば、体細胞を脈管形成性始原細胞の集団から調製する方法が提供される。この場合、この方法は、脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、体細胞の分化を誘導するために好適な少なくとも１つの増殖因子の存在下で脈管形成性始原細胞の集団を培養することによって行われる。
【００１９】
本発明のなおさらに別の局面によれば、血管組織を調製する方法が提供される。この場合、この方法は、脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、血管組織の分化を誘導するために好適な条件のもと、少なくとも１つの脈管形成増殖因子および／または血管形成増殖因子の存在下で脈管形成性始原細胞の集団を培養することによって行われる。
【００２０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、脈管形成性始原細胞の集団は半固体の脈管化促進培地で培養される。
【００２１】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、脈管形成性始原細胞の集団は３次元の足場において培養される。
【００２２】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、脈管形成性増殖因子および／または血管形成性増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エフリン（Ｅｐｈ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）および胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）からなる群から選択される。
【００２３】
本発明のさらなる局面によれば、血管の発達、成長および／または変化に対する因子の影響を明らかにする方法が提供される。この場合、この方法は、脈管形成性始原細胞の集団を得ること、脈管形成性始原細胞の集団を因子にさらすこと、および、脈管形成性始原細胞の集団に対する因子の影響を明らかにし、それにより、血管の発達に対するその影響を明らかにすることによって行われる。
【００２４】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、因子は物質および／または環境因子である。
【００２５】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、因子は、血管形成および／または脈管形成の推定される下方調節因子（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であり、上記方法はさらに、血管形成および／または脈管形成を促進するために好適な条件のもとで脈管形成性始原細胞の集団を培養することを含む。
【００２６】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、因子は、血管形成および／または脈管形成の推定される上方調節因子（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であり、上記方法はさらに、血管形成および／または脈管形成を制限する条件のもとで脈管形成性始原細胞の集団を培養することを含む。
【００２７】
本発明のさらなる局面によれば、哺乳動物対象における血管の疾患または状態を緩和または防止する方法が提供される。この場合、この方法は、脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、脈管形成性始原細胞が内皮細胞および平滑筋細胞に分化することを刺激するために好適な条件のもとで、脈管形成性始原細胞を対象に投与することによって行われる。
【００２８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、血管の疾患または状態は、先天性の血管障害、後天的な血管障害、および虚血／再灌流傷害からなる群から選択される。
【００２９】
本発明のさらになる局面によれば、哺乳動物組織を脈管化させる方法が提供される。この場合、この方法は、脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、脈管形成性始原細胞が内皮細胞および平滑筋細胞に分化することを刺激するために好適な条件のもとで、脈管形成性始原細胞を哺乳動物組織と接触させることによって行われる。
【００３０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、哺乳動物組織は、脈管化を必要とする操作された非血管組織、および／または胚組織である。
【００３１】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、脈管形成性始原細胞を哺乳動物組織と接触させることはインビトロまたはインビボで行われる。
【００３２】
本発明のなおさらなる局面によれば、哺乳動物対象における血液学的な疾患または状態を緩和または防止する方法が提供される。この場合、この方法は、脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、脈管形成性始原細胞が内皮細胞および血液細胞に分化することを刺激するために好適な条件のもとで、脈管形成性始原細胞を対象に投与することによって行われる。
【００３３】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、血液学的な疾患または状態は、先天性の血液障害、後天的な血液障害、凝固障害および新生物疾患からなる群から選択される。
【００３４】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、脈管形成性始原細胞の集団を得ることは、個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離することによって行われる。
【００３５】
本発明のなおさらなる局面によれば、基質と、脈管形成性始原細胞の集団とを含む組成物が提供される。この場合、前記の脈管形成性始原細胞は、個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得る工程、および、脈管形成性始原細胞である５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離する工程により行われる方法によって未分化ＥＳ細胞から調製される。
【００３６】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、基質は、マトリゲル、コラーゲンゲルおよびポリマー足場からなる群から選択される。
【００３７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、脈管形成性始原細胞は、基質内における血管の発達を誘導するような様式で基質と接触させられる。
【００３８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、血液学的な疾患または状態は、先天性の血液障害、後天的な血液障害、凝固障害および新生物疾患からなる群から選択される。
【００３９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、個々の未分化ＥＳ細胞を培養することは、ＥＳ細胞の凝集を避けること、コラーゲン上での成長、２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の細胞接種濃度、および分化培地の存在からなる群から選択される少なくとも１つの条件に未分化ＥＳ細胞を供することによって行われる。
【００４０】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、未分化ＥＳ細胞はヒトＥＳ細胞である。
【００４１】
本発明のさらなる局面によれば、内皮細胞を血管組織から調製する方法が提供される。この場合、この方法は、血管組織から細胞を解離するために設計された条件に血管組織を供し、それにより、解離された細胞の混合集団を得ること、および、５０μｍより小さい細胞を前記混合細胞集団から単離することによって行われる。
【００４２】
本発明のさらなる局面によれば、上皮細胞を血管組織から調製する方法が提供される。この場合、この方法は、血管組織から細胞を解離するために設計された条件に血管組織を供し、それにより、解離された細胞の混合集団を得て、それにより、個々の細胞の混合集団を得ること、および、５０μｍより大きい細胞を前記混合細胞集団から単離することによって行われる。
【００４３】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、血管組織はヒト血管組織である。
【００４４】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、５０μｍより小さい細胞、または５０μｍより大きい細胞は、ろ過、形態計測および／またはデンシトメトリーによって単離される。
【００４５】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ろ過は、５０μｍより小さい細孔サイズを有するフィルターによって行われる。
【００４６】
本発明のさらにさらなる局面によれば、脈管形成性始原細胞の集団を含む細胞培養物が提供される。この場合、脈管形成性始原細胞の集団は少なくとも１４日間にわたって増殖状態で維持することができ、かつ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エフリン（Ｅｐｈ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、サイトカイン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）からなる群から選択される少なくとも１つの増殖因子にさらされたとき、平滑筋細胞、内皮細胞および／または造血細胞への分化が可能である。
【００４７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、脈管形成性始原細胞の集団は、細胞表面マーカー、細胞表面抗原、血管形成因子、脈管形成因子および造血因子からなる群から選択される少なくとも１つの外因性ポリペプチドを発現することができる。
【００４８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらにさらなる特徴によれば、外因性ポリペプチドは誘導可能な様式で発現する。
【００４９】
別途に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記に記載される。ここで言及される全ての公報、特許出願、特許および他の文献はその全体をここに参照して組入れられる。矛盾する場合には、本特許明細書（定義を含む）が優先する。さらに、材料、方法および例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
【００５０】
図面の簡単な記述
本発明を、本明細書中で、例示のみを目的として添付の図面を参照して記載する。ここでは詳細な図面を参照して、示した個々の事項は本発明の好ましい実施形態の例示および例示的考察のみを目的とし、最も有用と考えられるものを示すことおよび本発明の原理および概念的局面の説明が容易に理解されるために示すことを強調する。これに関して、本発明の基本的理解に必要とされる以上により詳細に本発明の構造細部を示すことを意図せず、図面と共に示した説明により、どのようにして本発明のいくつかの形態を実際に実施することができるのかが当業者に明らかとなる。
図１はヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する（図１Ａ〜図１Ｈ）。図１Ａは分化−選択手法の概略を例示する。図１Ｂは、コラーゲン上で６日間の培養を行った後の細胞の通常とは異なる形態学を示す一連の顕微鏡写真である：大型の平坦な繊維を有する細胞（矢印）、および、それよりも小さい、大きな核を有する平坦化した細胞（矢頭）に留意すること。図１Ｃは、ろ過され、単離された脈管形成性始原細胞における内皮細胞表面マーカーのＦＡＣＳ分析を示す一連の図である。ろ過された細胞は、ＶＥ−カドヘリンに対する一次抗体（ＶＥ−ｃａｄ）、ＶＥＧＦＲ２に対する一次抗体（ＶＥＧＦＲ２）、および蛍光標識された抗ＩｇＧにさらされたか、または二次抗体単独（ＩｇＧ−ＦＩＴＣ）だけにさらされた。ＶＥ−ｃａｄを発現する細胞の割合が大きいこと（７８％）に留意すること。図１Ｄ〜図１Ｅは、ろ過され、単離された脈管形成性始原細胞におけるＶＥ−ｃａｄ発現の間接的な免疫形態学的分析を示す写真である。ろ過された細胞の固定および設置された１２時間培養物の免疫蛍光染色は、より高倍率（図１Ｅ）では見ることができるが、ＶＥ−ｃａｄの強い局在化を細胞−細胞の隣接接合部において示している。図１Ｆは、単離された脈形成性始原細胞における内皮マーカーおよび造血マーカーの発現を示すＥｔＢｒ染色ゲルの写真である。ＣＤ３１およびＴｉｅ２の内皮マーカーの発現、ならびに、Ｔａｌ１、ＧＡＴＡ２およびＡＣ１３３の初期脈前駆体マーカーの発現が、より小さい平坦なろ過された細胞（ろ過物）、および未分化ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞から得られた総ＲＮＡにおいてＲＴ−ＰＣＲによって比較された。ハウスキーピングマーカーのＧＡＰＤＨが増幅の内部標準として使用される。ＣＤ３１、Ｔｉｅ２、Ｔａｌ１およびＧＡＴＡ２の各マーカーの、内皮、平滑筋および造血（ＥＳＨ）に特異的な発現が顕著であることに留意すること。図１Ｇは、ろ過によって保持されたより大型の平坦な細胞の蛍光顕微鏡写真であり、これらは、小さなヒト脈管形成性始原細胞では検出されない上皮様表現型平滑筋細胞マーカー（α−ｓｍａ）の出現を示している。図１Ｈは、単離されたより大型の保持された細胞における上皮様マーカーの発現を示すＥｔＢｒ染色ゲルの写真である。カルポニン、カルデスモン、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）およびＳＭ−ＭＨＣの各マーカーの発現が、より大きい平坦な保持された細胞（保持物）、および、より小さいヒト脈管形成性始原体（ろ過）細胞から得られた総ＲＮＡにおいてＲＴ−ＰＣＲによって比較された。ハウスキーピングマーカーのＧＡＰＤＨが増幅の内部標準として使用される。平滑筋細胞マーカーのすべての発現がヒト脈管形成性始原細胞では存在しないこと、そして、保持された細胞におけるそれらの発現が顕著であることに留意すること。図１Ｉは、より小さいろ過された細胞（左パネル）およびより大きい保持された細胞（右パネル）の両方におけるＢｒｄＵ取り込みの顕微鏡写真であり、これらは、より小さいヒト脈管形成性始原細胞の活発な増殖を明らかにしている。より大きい非増殖性の保持された細胞（矢印）における最小限の���り込みとは対照的に、より小さい黒くなった細胞核におけるＢｒｄＵの活発な取り込みに留意すること。スケールバーは１００μｍである。
図２は培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている（図２Ａ〜図２Ｍ）。図２Ａは、１０ｎｇ／ｍｌのｈＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）とともに１０日間〜１２日間、２．５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２でＩＶ型コラーゲン上で再培養された共通するヒト脈管形成性始原細胞における平滑筋細胞マーカーの発現を示すＥｔＢｒ染色ゲルの写真である。平滑筋細胞マーカーのカルデスモン、平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、カルポニン、ＳＭ２２αおよびＳＭ−ＭＨＣの各マーカーの発現が、増殖因子で処理された細胞（ｖ−ＳＭＣ）、および非処理のヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ始原体）細胞から得られた総ＲＮＡにおいてＲＴ−ＰＣＲによって比較された。ハウスキーピングマーカーのＧＡＰＤＨが増幅の内部標準として使用される。平滑筋細胞マーカーのすべての発現がＥＳＨ細胞には存在しないこと、および、ｈＰＤＧＦ−ＢＢで処理された細胞におけるそれらの発現が顕著であることに留意すること。図２Ｂ〜図２Ｅは、ヒト血小板由来増殖因子（ｈＰＤＧＦ）−ＢＢで処理されたヒト脈管形成性始原細胞において発現した平滑筋細胞マーカーの免疫蛍光検出の顕微鏡写真である。処理された細胞の固定された調製物が、αＳＭＣに対する一次抗体（図２Ｂ）、スムーセリンに対する一次抗体（図２Ｃ）、ＳＭ−ＭＨＣに対する一次抗体（図２Ｄ）、およびカルポニンに対する一次抗体（図２Ｅ）で染色され、蛍光性の二次抗体で免疫検出され、蛍光顕微鏡観察によって可視化された。上皮様細胞および紡錘体形状細胞の両方のタイプが、増殖因子で処理された培養物において染色されていることに留意すること。図２Ｆ〜図２Ｈは、５０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１６５（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）とともに１０日間〜１２日間にわたって２．５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２でＩＶ型コラーゲン上で再培養されたヒト脈管形成性始原細胞において発現した内皮細胞マーカーの検出を示す顕微鏡写真である。増殖因子で処理された細胞は固定され、抗ＶＥｃａｄ抗体（図２Ｆ）または抗フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）抗体（図２Ｇ）に関して本明細書中上記に記載されるように免疫検出された。抗ｖＷＦの染色がヴァイベル−パラーデ体に局在化することに留意すること（図２Ｇ）。Ｄｉｌｌ標識されたａｃ−ＬＤＬの取り込み（１０μｇ／ｍｌ、４時間、３７℃）（図２ｈ）もまた検出された（図２Ｈ）。図２Ｉおよび図２Ｊは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）で処理されたヒト脈管形成性始原細胞（図２Ｊ）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）で処理されたヒト脈管形成性始原細胞（図２Ｉ）の両方におけるＢｒｄＵ取り込みの顕微鏡写真であり、これらは内皮型細胞の活発な増殖（染色）を明らかにしている。ストレスファイバーの出現（図２Ｉ、矢印）、および、より大型のｈＰＤＧＦ処理細胞の低下した取り込み（図２Ｊ）とは対照的に、ＶＥＧＦ処理細胞の黒くなった細胞核におけるＢｒｄＵの活発な取り込み（図２Ｉ）に留意すること。図２Ｋ〜図２Ｍは、ヒト脈管形成性始原細胞から形成された造血系コロニーの顕微鏡写真である。ＥＳＨ細胞が選択され、造血分化を促進させるためにサイトカインが補充された半固体培地で培養された。１２日間のインキュベーションの後で検出された造血系コロニー（ＣＦＵ）の特徴的な出現に留意すること。
図３は増殖因子で処理されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞における血管構造の形成を示す顕微鏡写真（図３Ａ〜図３Ｄ）および電子顕微鏡写真（図３Ｅ〜図３Ｇ）である。Ｉ型コラーゲン上（図３Ａ）またはマトリゲル内（図３Ｂ）に接種された、凝集した（５０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１６５および１０ｎｇ／ｍｌのｈＰＤＧＦ−ＢＢが補充された分化培地で２４時間の）ＥＳＨ細胞は血管形成を７日間の成長の後に示した（両方の組織学切片における出芽および管状構造に留意すること）。同じ調製物のトルイジンブルー染色切片では、マトリゲルにおける内皮細胞の浸透および血管網状構造の形成が明らかにされ（図３Ｃ）、そして、より高倍率では、脈管内で形成された白血球が明らかにされた（矢印、図３Ｄ）。スケールバーは１００μｍ（図３Ａ〜図３Ｃ）または２００μｍ（図３Ｄ）である。図３Ｅ〜図３Ｇは、Ｍａｔｒｉｇｅｌにおける血管形成の電子顕微鏡写真であり、これらは、内皮細胞に典型的な十分に形成されたヴァイベル−パラーデ体を示している（図３Ｅ、６０００倍の倍率；挿入図、１２０００倍）。図３Ｆは、マトリゲル（Ｍ）内の伸張した内皮細胞（ＥＣ）によって形成された脈管の中心に、（ヘモグロビンのために）暗く染色されている血液細胞（ＢＣ）が存在することを明瞭に示している（５０００倍の倍率）。図３Ｇは、明瞭に識別することができる内腔（Ｌｕ）、特徴的なリポタンパク質カプセル（Ｌｉ）、ヴァイベル−パラーデ体（ＷＰ）およびグリコーゲン（Ｇ）を含有するマトリゲル（Ｍ）内の内皮細胞（Ｎ核）の典型的な配置を示している（図３Ｇ、５０００倍の倍率）。
図４はヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞による３Ｄアルギン酸塩足場のインビトロでの脈管化を示す組織学切片の顕微鏡写真である（図４Ａ〜図４Ｂ）。ＥＳＨ凝集物が、５０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１６５および１０ｎｇ／ｍｌのｈＰＤＧＦ−ＢＢが補充された分化培地においてｌｆｌ２０  ５０μｌのアルギン酸塩足場にインビトロで接種され、１４日間インキュベーションされた。図４Ａは、２つの代表的な足場細孔の周りにおける脈管の形成を示す。より高倍率（図４Ｂ）では、平滑筋細胞の隣接層を伴う伸張した平坦な内皮細胞の典型的な血管壁構造が明らかにされる。スケールバーは１００μｍである。
図５は血管形成の阻害剤に対するＥＳＨ由来組織の感受性を明らかにする２組の顕微鏡写真である（図５Ａ〜図５Ｂ）。ＥＳＨ凝集物がマトリゲルに接種され、５０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１６５および１０ｎｇ／ｍｌのｈＰＤＧＦ−ＢＢが単独で補充された分化培地（図５Ａ）、または、５０μｇ／ｍｌの血管形成阻害性の抗ＶＥ−ｃａｄモノクローナル抗体（クローンＢＶ６、ＣＨＥＭＩＣＯＮ  ＩＮＴＮＬ，Ｉｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）の添加を伴う補充された分化培地（図５Ｂ）において７日間インキュベーションされた。抗ＶＥ−ｃａｄで処理された培養物では、細胞突出がなく、また、管構造および網状組織構造がないことに留意すること（図５Ｂ）。スケールバー−１００μｍ。
図６はｈＥＳ細胞に由来する脈管始原細胞の、培養に基づく濃縮を例示する（図６Ａ〜図６Ｆ）。図６Ａは濃縮手順の概略を示す。図６Ｂは、ＩＶ型コラーゲン上で培養された６日目のｈＥＳ細胞凝集物の倒立型光学顕微鏡観察像である。この画像には、未分化ｈＥＳ細胞（矢印）および種々のタイプの分化した細胞が示される。図６Ｃは、６日目の単一細胞懸濁培養物の倒立型光学顕微鏡観察像であり、２つの細胞タイプ（繊維配置を有する大きな平坦な細胞（矢印）、および、大きい核を伴うより小さい平坦な細胞）が例示される。図６Ｄは、ＶＥ−ｃａｄ、ＣＤ３１およびＶＥＧＦＲ２に対する、ろ過された細胞のＦＡＣＳ分析である。図６Ｅは間接的な免疫蛍光分析であり、ｉ）斑点状の表面ＣＤ３１（ヒトｖ−ＳＭＣ始原体について以前に報告された通りである）、（ｉｉ）核Ｇａｔａ２、および（ｉｉｉ）Ｔａｌ１の発現が示される。図６Ｆは、より小さい始原体およびより大きい始原体の細胞増殖を、（ｉおよびｉｉ）ＢｒｄＵ取り込み（より小さい始原細胞に存在し、より大きい細胞には存在しない）（矢印）、および（ｉｉｉ）ろ過された細胞の６６±２％に存在する核Ｋｉ６７発現によって明らかにする。核はＤａｐｉ（１：１０００）で染色された。スケールバー−１００μｍ。
図７は始原細胞における系譜分化を例示する（図７Ａ〜図７Ｄ）。図７Ａ−５０ｎｇ／ｍｌのｈＶＥＧＦ１６５とともに１０日間〜１２日間にわたって再培養されたろ過細胞が、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの取り込みについて調べられた（左側は明るい光での細胞、および右側は蛍光照射での細胞）。図７Ｂ−個々の分離された細胞が、（ｉ）Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ代謝、（ｉｉ）核周囲のｖＷＦ、（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方について調べられた。図７Ｃ−１０ｎｇ／ｍｌのｈＰＤＧＦ−ＢＢとともに１０日間〜１２日間にわたって再培養されたろ過細胞は、紡錘体様形状の細胞におけるＳＭＡ発現の上方調節を示した。図７Ｄ−ＲＴ−ＰＣＲ分析はさらなるｖ−ＳＭＣマーカーの上方調節を明らかにした。核はＤａｐｉ（１：１０００）で染色された。スケールバー−１００μｍ。
図８はＶＥ−ｃａｄ＋細胞のクローン分析を例示する（図８Ａｉ〜図８Ｂｉｉｉ）。図８Ａ（ｉ）は、単一のＶＥ−ｃａｄ＋細胞から形成された典型的な８日目のコロニーを例示する。２つの明確な細胞形状が観測された：内皮細胞様形態学［図８Ａ（ｉｉ）］、およびｖ−ＳＭＣに類似する紡錘体様形態学（矢印）［図８Ａ（ｉｉｉ）］。紡錘体形状の細胞はＳＭＡ［図８Ｂ（ｉ）］およびカルポニン［図８Ｂ（ｉｉ）］を発現した。図８Ｂ（ｉｉｉ）は、ＶＥＧＦが補充されたコロニーにおけるＡｃ−ＬＤＬ代謝を例示する。核はＤａｐｉで染色された。スケールバー−１００μｍ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
好適な実施形態の説明
本発明は、脈管形成性始原細胞の簡便かつ安価な調製のために使用され得る新規な方法、ならびに、例えば、ヒト幹細胞から調製される細胞培養物およびその組成物に関する。詳細には、本発明は、脈管形成性の始原細胞を幹細胞から単離するために使用することができ、また、例えば、組織工学、血管形成研究、治療的適用および診断的適用において使用される単離された脈管形成性の始原細胞をインビトロで成長および分化させるために使用することができる。
【００５２】
本発明の原理および操作は、図面および添付の説明を参照してより深く理解することができる。本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は以下の説明に記載されるか図面で例示される詳細にその適用が制限されないと理解すべきである。本発明は、他の実施形態が可能であるか、種々の方法で実施または実行することができる。また、本明細書中で使用した用語および専門用語は説明を目的とし、制限と見なすべきではないと理解すべきである。
【００５３】
最近の調査研究では、胚細胞が多能性細胞のための供給源として潜在的に役立ち得ることが例示されている。そのような細胞は、多数の細胞タイプに分化する能力を有しているので、ヒトの治療において有用である（Ｒ．Ａ．Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｓｃｉ．Ａｍ．、１９９９、２８０：６８）。胚幹細胞に関する初期の研究は、モデルとして同系交配マウス系統を使用して行われていた。マウスＥＳ細胞と比較した場合、サルおよびヒトの多能性細胞は、はるかにより脆弱であることが判明しており、また、同じ培養条件および操作に対して応答しない。
【００５４】
近年、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳ）および生殖細胞系（ｈＥＣ）細胞が単離され、培養で維持されている。ヒト胚ｈＥＳ細胞およびヒトｈＥＣ細胞はともに、ヒト多能性幹細胞の長く探し求められていた特徴を有しており、分化することなくインビトロで増殖し続けることができ、正常な核型を保持し、また、すべての成体細胞タイプを生じさせるために分化する能力を保持している。しかしながら、培養におけるｈＥＳ細胞およびｈＥＣ細胞の自発的な体細胞分化が、構造的組織化の一定したパターンを何ら伴うことなく進行し、これにより、多様な異なる細胞系譜を表す様々な表現型の非常に不均一な混合物を伴う様々な細胞集団の多細胞凝集物が生じている（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ、ＢＥ他、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２００１、１９：１１３４）。
【００５５】
先行技術の研究では、特定の細胞タイプ系譜の始原細胞をＥＳ細胞から単離するために好適な様々な方法が記載されている。しかしながら、そのような方法は、典型的には、極めて複雑であり、また、費用がかかる。最初、ヒト胚幹細胞は哺乳動物の間質細胞層の表面で成長させられる（例えば、米国特許第６２８０７１８号（Ｋａｕｆｍａｎ，ＤＳおよびＴｈｏｍｓｏｎ，ＪＡ）を参照のこと）か、または、テラトーマのような生きた宿主内で成長させられる（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ＪＡ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２：１１４５〜４７）か、または、胚様体（ＥＢ）として知られている多細胞構造体に懸濁状態で凝集させられる（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ００７００２１Ａ３号（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｓ−Ｅｌｄｏｒ  ＪおよびＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  Ｎ）および国際特許出願公開第ＷＯ０２１０３４７Ａ２号（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  Ｎ）を参照のこと）かのいずれかであり、また、分化因子にさらされ、これにより、典型的には、様々な細胞タイプおよび系譜の混合集団が得られている。その後、特定の系譜の始原細胞の単離が、系譜特異的なマーカーの免疫検出、および、蛍光分取または磁石分取による細胞系譜の分離に基づいて達成される（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０１８１５４９Ａ３号（Ｒａｍｂｈａｔｌａ  ＬおよびＣａｒｐｅｎｔｅｒ  ＭＫ）；米国特許第６２８０７１８号（Ｋａｕｆｍａｎ，ＤＳおよびＴｈｏｍｓｏｎ，ＪＡ）；国際特許出願公開第ＷＯ０１２９２０６Ａ１号（Ｃｉｂｅｌｌｉ，Ｊ）；国際特許出願公開第ＷＯ０１６８８１５Ａ１号（Ｐｅｒａ，ＭＦおよびＢｅｎ−Ｈｕｒ  Ｔ）を参照のこと）。上記の方法はすべて、類似する欠点に悩まされている。すなわち、始原細胞への初期のＥＳ分化は、多くの複雑な操作、および、間質細胞層、生きた宿主組織または他のＥＢ細胞との複雑な相互作用を伴う。さらに、細胞表面マーカーの発現または呈示による選択は効率的ではなく、このことは、さらにより集約的な操作を必要とし、また、試薬および検出装置に対する大きな費用を生じさせ、また、始原細胞の成長力および生殖不能性を脅かしている。
【００５６】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、脈管形成性の始原細胞が、凝集を防止し、特異的な内皮分化因子とともにＩＶ型コラーゲン上で培養し、そして簡便かつ効率的なサイズ選択方法を用いることによって胚幹細胞から簡便かつ安価に調製され得ることを発見している。本発明によって調製される脈管形成性始原細胞は、培養でさらに拡大培養することができ、また、内皮組織、壁組織および造血組織にインビトロで分化させるために、すなわち、適切な基質に接種されたとき、小さい脈管構造および大きい脈管構造の両方を形成させるために誘導することができ、そして、組織工学、診断目的および研究目的のために遺伝子操作することができ、また、組織工学、診断目的および研究目的のために好適であるという点で好都合である。
【００５７】
従って、本発明の１つの局面によれば、脈管形成性の始原細胞をヒトＥＳ細胞などの未分化ＥＳ細胞から調製する方法が提供される。この方法は、本発明のこの局面によれば、個々の未分化ＥＳ細胞を、未分化ＥＳ細胞が脈管形成性の始原細胞に分化することを誘導するために好適な様式で培養し、それにより、混合細胞集団を得ること、および、５０μｍより小さい細胞を混合細胞集団から単離することによって行われる。この様式で単離された細胞は、本明細書中下記の実施例の節において明瞭に例示されるように、脈管形成性の始原細胞である。
【００５８】
本明細書中で使用される表現「脈管形成性（の）始原細胞」は、内皮もしくは平滑筋の始原体（例えば、血管芽細胞など）、または成熟した内皮細胞もしくは平滑筋細胞、あるいは造血前駆体（例えば、赤芽球コロニー形成ユニットおよび巨核球など）または成熟した血液細胞（例えば、赤血球および白血球など）である後代を生じさせることができる細胞の集団を示す。典型的には、脈管形成性の始原細胞は、内皮系譜、平滑筋系譜および造血系譜に特徴的である表現型マーカーのいくつかを発現する。典型的には、脈管形成性の始原細胞は、脱分化または再プログラム化されない限り、インビトロで単独で培養されたとき、他の胚性胚葉の後代を生じさせない。多能的な脈管形成性始原細胞である個々の細胞が存在する場合があるが、集団内の細胞のそれぞれが、２つ以上のタイプの後代を形成する能力を有することを意味しないことが理解される。
【００５９】
本明細書中で使用される用語「全能性（の）」、用語「多能性（の）」および用語「多能的（な）」は、発達上の柔軟性の程度が低下しつつある細胞を示す。全能性の細胞はすべての細胞タイプまたは完全な生物に発達することができる（例えば、割球）。多能性の細胞はすべての細胞タイプに発達することができる（例えば、ＥＳ細胞）。多能的な細胞は特定の系譜の細胞にだけ分化することができる（例えば、脈管形成性始原細胞）。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「内皮始原細胞」または用語「内皮前駆細胞」は、成熟した内皮細胞を生じさせることができる細胞を示す。これらの細胞は、造血細胞または平滑筋細胞を生じさせる能力を有してもよく、またはそのような能力を有しなくてもよい。
【００６１】
本明細書中で使用される用語「上皮始原細胞」または用語「上皮前駆細胞」は、成熟した平滑筋細胞を生じさせることができる細胞を示す。
【００６２】
本明細書中で使用される用語「造血始原細胞」または用語「造血前駆細胞」は、成熟した血液細胞を生じさせることができる細胞を示す。
【００６３】
胚幹細胞は、集団内の幹細胞およびその派生体の実質的な部分が未分化細胞の形態学的特徴を示しており、これにより、それらが胚起源または成体起源の分化した細胞から明瞭に区別されるとき、「未分化」として記載される。未分化ＥＳ細胞は当業者によって容易に認識されており、典型的には、大きな核／細胞質比および顕著な核仁を有する細胞として光学顕微鏡像では見える。同様に、未分化細胞は、系譜特異的なマーカー、例えば、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄ）または血小板−内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）などが存在しないことによって分化細胞から区別することができる。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「分化（した）細胞」は、発達経路の下流側に下っている細胞を示す。従って、多能性の胚幹細胞は、系譜限定された前駆細胞に分化することができ、例えば、神経細胞、肝細胞および血液細胞タイプに対してそれぞれ多能性である神経始原体、肝細胞始原体または造血細胞、ならびに、上記で示された内皮細胞タイプ、平滑筋細胞タイプおよび血液細胞タイプなどに分化することができる。これらは、その経路のさらに下流側の他のタイプの前駆体にさらに分化することができ、または、特定の組織タイプに特徴的である最終段階の分化細胞に分化することができ、また、さらに増殖する能力を保持する場合があるか、またはそのような能力を保持しない場合がある。血管内皮、壁平滑筋および赤血球は最終分化細胞の例である。
【００６５】
本明細書中上記で述べられたように、個々の未分化ＥＳ細胞は、脈管形成性始原細胞への分化を誘導するために好適な様式で培養される。本発明の方法によって利用される未分化ＥＳ細胞は、採取もしくは凍結保存された胚細胞集塊から得られる哺乳動物胚幹細胞、インビトロ受精の胚細胞集塊に由来する細胞、および／または培養されたＥＳ細胞株であり得る。ＥＳ細胞はヒト起源または非ヒト起源であり得る。
【００６６】
本明細書中下記の実施例の節において明瞭に明らかにされるように、本発明の方法および組成物は、ヒト胚幹細胞との使用のために好適である。ヒト胚幹細胞分化を操作および制御するための方法を確立することが、現在の医学的取り組みおよび科学的取り組みの主要な目標であるので、本発明の好ましい実施形態において、未分化ＥＳ細胞はヒトＥＳ細胞である。好ましくは、ＥＳ細胞は、本明細書中下記の実施例の節において詳しく記載されるように、非凝集細胞である。
【００６７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、個々の未分化ＥＳ細胞の分化は、ＥＳ細胞の凝集を防止するために、ＩＶ型コラーゲン、ラミニンまたはゼラチンなどの接着性基質が被覆されたプレートでそのような細胞を培養すること、細胞を２Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２の濃度で接種すること、および分化培地を提供することによって行われる。最も好ましい実施形態において、個々の未分化ＥＳ細胞は、ＩＶ型コラーゲンが被覆されたプレート（これは、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｗａｒｅ、ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から入手可能である）において成長させられる。ＥＳ細胞を分化させるための条件のさらなる記載については実施例の節を参照のこと。
【００６８】
本発明の方法論の重要な特徴の１つは、細胞接種工程である。本発明を実施に移しているとき、３次元の胚様体構造が、以前には主張されていたが、ヒト胚幹細胞の中胚葉分化のために要求されないことが観測された。そのフィーダー層から除かれ、分化培地とともにＩＶ型コラーゲン上に単一細胞として置床された未分化ＥＳ細胞は、内皮分化の指標の発現を示した（図１Ａ〜図１Ｇ）。細胞接種濃度は、本発明の方法論の効率に対して劇的な影響を及ぼしていた。例えば、マウスＥＳを用いた先行技術の研究（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２）に従って接種された細胞は生存可能ではなく、そのような高濃度（１．０〜１．５Ｘ１０５細胞／ｃｍ２）のｈＥＳ細胞は不均一な集団をもたらした。それよりも低い細胞接種濃度（５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２）は、小さい平坦な内皮様細胞の大部分と、より少数の大きい平滑筋様細胞とを含む明確な細胞集団をもたらした（図１Ｂ）。
【００６９】
下記の実施例の節では、「個々の未分化ＥＳ細胞」を非凝集条件のもとで培養する方法のさらなる記載が提供される。
【００７０】
本明細書中で使用される用語「分化培地」は、ＥＳ細胞の成長および分化を支援することができる好適な培地を示す。本発明とともに使用され得る好適な分化培地の例には、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、米国）および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）が補充されたαＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）またはダルベッコ最少必須培地（ＤＭＥＭ）を基礎として調製される様々な増殖培地が含まれる。
【００７１】
本明細書中上記で述べられたように、本明細書中上記で詳しく記載されたように未分化ＥＳ細胞を培養することにより、小さい平坦な内皮様細胞の大部分と、より少数の大きい平滑筋様細胞とを含む明確な細胞集団が生じる（図１Ｂ）。
【００７２】
特定の系譜始原体を選択するための以前の技術は、分化および特定の細胞系譜の指標を免疫検出すること、そして、蛍光または磁石によって細胞を分取すること（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ０２１０３４７Ａ２号（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ）、米国特許第６２８０７１８号（Ｋａｕｆｍａｎ，ＤＳおよびＴｈｏｍｓｏｎ，ＪＡ）、国際特許出願公開第ＷＯ０１２９２０６Ａ１号（Ｃｉｂｅｌｌｉ，Ｊ他）を参照のこと）に依存しているが、これらの方法は面倒であり、かつ費用がかかる。本発明の教示に従って得られる混合細胞集団の観測された形態学的特徴は、混合細胞集団からの脈管形成性始原細胞の簡便かつ迅速な単離を可能にした。下記の実施例の節において例示されるように、５０μｍ未満の小さい細胞の選択は、混合細胞集団からの脈管形成性始原細胞の迅速かつ効率的な単離を可能にしている（図１Ｃ〜図１Ｆ）。
【００７３】
従って、本発明の方法論では、分化後のサイズ／形態学により選択する工程が用いられる。サイズ／形態学によるそのような選択は、下記でさらに記載されるように、様々なろ過法、形態測定法および／またはデンシトメトリー法を使用して行うことができる。
【００７４】
様々なろ過方法がこの分野では広く知られており、例えば、網目物、ふるい、フィルターなどに通すことなどがある。フィルターは、繊維状マトリックスまたは多孔性材料から構成され得る。そのようなフィルターは、いくつかの市販されているフィルターのいずれかであり得るが、これらには、限定されないが、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｎｎ−Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、米国）またはＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）から得られる細胞培養フィルターが含まれる。好ましいフィルターは、細孔サイズが４０μｍであるナイロン網目フィルター（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｗａｒｅ、ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、米国）であり、これは、より小さい内皮様細胞を通過させることができ、より大きい平滑筋様細胞を除外することができる。
【００７５】
「形態測定」は、外形形態の測定を示し、２Ｄ画像分析および３Ｄ画像分析（これらに限定されない）を含む方法を用いることができる。５０μｍより小さい細胞を同定および単離するために好適な最新式の画像化分析ソフトウエアを、当業者は市販品から入手することができ［例えば、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｄｏｗｎｉｎｇ、ＰＡ、米国）、Ｉｍａｇｉｃ−５（Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｒｌｉｎ，ドイツ）、およびＳｔｅｒｅｏｌｏｇｅｒ（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｌａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｉｎｃ．、Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、ＶＡ、米国）を参照のこと］、また、所望する外形特徴（例えば、サイズ）を有する対象物を選択するために、広く知られている光学顕微鏡観察技術およびフロー分取技術と組み合わせることができる（好適な装置については、例えば、米国特許第６２４９３４１号（Ｂａｓｉｊｉ他）を参照のこと）。
【００７６】
「デンシトメトリー」は対象物の光学的または物理的な密度の測定を示す。より小さい内皮様細胞は細胞成分の特有かつ特徴的な分布を有するので、デンシトメトリー測定を、細胞を特徴づけ、その分離および単離のための基準を提供するために使用することができる。内皮様細胞のデンシトメトリー単離のために好適な装置は、例えば、ＭＥＣＯＳ−Ｃ１血液細胞デンシトメトリー分析計（ＭＥＣＯＳ  Ｃｏ．、Ｍｏｓｃｏｗ、ロシア）である。細胞はまた、ＦＩＣＯＬＬＴＭまたはＰＥＲＣＯＬＬＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）などの調製用密度勾配による沈降によって分離することができる（デンシトメトリー分画技術の網羅的な総説については、Ｐｅｒｔｏｆｔ，Ｈ、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０００、４４：１〜３０を参照のこと）。従って、本発明は、始原細胞を作製および単離するための容易かつ迅速な方法を提供する。そのような始原細胞を単離する以前の方法は、望ましい増殖能を有しない始原体集団をもたらしており、このため、その実用的な適用が制限されていた（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ、ＢＥ他、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０００、１８：３９９〜４０４；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ、Ｍ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２０００、９７：１１３０７〜３１２）。本発明の方法によって単離された脈管形成性始原細胞は、非常に数多くの回数の細胞倍化による増殖によって非常に多数の同一の細胞を生じさせることができる。
【００７７】
本発明の教示に従って単離された脈管形成性始原細胞の集団は、内皮始原体マーカーのＶＥ−カドヘリンを発現する細胞（図１Ｃ〜図１Ｅ）および内皮マーカーを発現する細胞（図１Ｆ）の量が多いことによって、また、核内への（ＢｒｄＵ）の取り込み（図１Ｉ）によって示されるように、活発に増殖することによって特徴づけられる。さらに分化させるためのさらなる刺激がない場合、これらの細胞は、非常に多数の多能的な脈管形成性始原細胞を生じさせることができる。さらに、脈管形成性始原細胞は、この分野で典型的に用いられているコンディションイング、貯蔵および解凍のための方法のいずれかに従った凍結保存によって非常に長い期間にわたって生存可能な状態で維持することができる（例えば、米国特許第６１４０１２３号（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ他）を参照のこと）。
【００７８】
分化した細胞は様々な治療法において重要であるために、胚性前駆細胞の方向づけられた分化は、幹細胞を培養することの技術分野における重要な目標を提供している。培養で維持された胚幹細胞は、多くの場合、自発的な分化（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２：１１４５〜４７）を受けるが、胚様体に由来する細胞の方向づけられた分化（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ＭＪ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００１、９８：１１３〜１８）、および、ＭＥＦ細胞と同時培養されたヒトＥＳ細胞の方向づけられた分化（Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００１、９８：１０７１６〜７２１）が、環境因子の操作によって明らかにされている。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ他は、マウス骨髄間質細胞との培養によってヒトＥＳ細胞における造血分化を誘導した（Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００１、９８：１０７１６〜７２１；米国特許第６２８０７１８号（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｄ他）；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ（米国特許出願公開２００２００３９７２４Ａ１）は、ｃＡＭＰ活性化因子および／または神経栄養増殖因子にさらすことによって神経始原細胞におけるニューロン細胞およびグリア細胞の発達を誘導した。Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙは、ヒト胚様体細胞を様々な増殖因子にさらすことによって、拍動する心筋細胞およびニューロン様細胞を作製した（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｊ他、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２０００、６：８８〜９５；Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，Ｍ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２０００、９７：１１３０７〜３１２；国際特許出願公開第ＷＯ０２１０３４７Ａ２号（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ  Ｎ））。しかしながら、上記の方法はすべて、同時培養、胚様体形成、または細胞表面マーカーの免疫検出による始原体選択のいずれかを用いている。
【００７９】
本発明の脈管形成性始原細胞の方向づけられた分化は、特異的な血管増殖因子、平滑筋増殖因子または造血増殖因子にさらすことによって行うことができる。
【００８０】
下記の実施例の節において例示されるように、低濃度で接種された脈管形成性始原細胞を増殖因子にさらすことにより、特定の成熟した細胞表現型への分化が誘導される。増殖因子ｈＶＥＧＦに対する暴露は、内皮細胞表現型の形態学的指標および機能的指標の両方の出現を誘導し（図１Ｃ〜図１Ｆおよび図２Ｆ〜図２Ｈ）、その一方で、平滑筋増殖因子ｈＰＤＧＦ−ＢＢに対する暴露は平滑筋細胞マーカーを上方調節した（図２Ａ〜図２Ｅ）。同様に、サイトカインに対する暴露は脈管形成性始原細胞の造血分化を刺激した（図２Ｋ〜図２Ｍ）。
【００８１】
従って、本発明の別の局面によれば、体細胞を本発明の脈管形成性始原細胞の集団から調製する方法が提供され、この場合、この方法は、本明細書中上記で記載されたように脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、脈管形成性始原細胞の集団を、体細胞の分化を誘導するために好適な少なくとも１つの増殖因子の存在下で培養することによって行われる。
【００８２】
本明細書中で使用される用語「体細胞」は、形態学的基準、免疫学的基準、生化学的基準および／または機能的基準によって特定の細胞表現型に属するとして同定可能な、明確な系譜の細胞を示す。体細胞は、定義により、始原細胞および幹細胞よりもさらに分化しているが、始原細胞および幹細胞よりも多能的ではない。体細胞の例は、本発明の関連では、内皮細胞、平滑筋細胞および血液細胞である。
【００８３】
非常に多数の増殖因子が、脈管形成、血管形成および造血分化の複雑なプロセスに関係している（総説については、Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ、２０００、６：３８９〜９５；Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０７：２４２〜４８を参照のこと）。一部の増殖因子（すなわち、ＶＥＧＦ、ＡｎｇおよびＰＤＧＦ）は、それらの影響が、他の増殖因子よりも優勢であるが、始原細胞の体細胞への効果的な分化は、典型的には、多数の因子の組み合わさった、そして時間的に協調した作用の結果である。
【００８４】
従って、本発明のこの局面の実施形態の１つによれば、方向づけられた分化は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エフリン（Ｅｐｈ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）、サイトカイン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＳＣＦ）（これらに限定されない）を含む１つ以上の増殖因子を使用することによって行われる。そのような因子は、細胞培養において使用される好適な調製物で、当業者には市販品から入手することができる。
【００８５】
さらに、上記の増殖因子は、互いに異なる種々の役割を発達プロセスにおいて有する関連した分子を含む因子ファミリーを含み得ることが理解される。従って、ＶＥＧＦファミリーのメンバー（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、・・・、ＶＥＧＦ−Ｄ）、ＧＭ−ＣＳＦおよびｂＦＧＦに対する暴露は内皮分化を刺激することができ、その一方で、ＰＤＧＦファミリーおよびＡｎｇファミリーは平滑筋発達および内腔形成においてそれぞれ重要である。
【００８６】
本発明を実施に移しているとき、分化培地に最初にさらし、そして、ろ過によるサイズ選択を行った後、本発明の平滑筋始原体でなく、本発明の脈管形成性始原細胞は、細胞増殖を示す、ＢｒｄＵの核での活発な取り込みを示すことが明らかにされた。
【００８７】
従って、本発明の別の局面によれば、脈管形成性始原細胞の集団を含む細胞培養物が提供される。この場合、脈管形成性始原細胞の集団は、本明細書中上記で詳しく記載されたように、増殖可能な未分化状態を１４日以上もの長期にわたって持続することができ、また、少なくとも１つの血管形成増殖因子、脈管形成増殖因子または造血増殖因子にさらされたとき、平滑筋細胞、内皮細胞および／または造血細胞に分化することができる。従って、本発明の細胞培養物は、比較的分化していない状態で拡大培養および維持することができる。
【００８８】
胚幹細胞および成体幹細胞の多能性および増殖性は、当然のことではあるが、インビトロでの組織調製および組織工学のためにこれまで利用されている。組織工学では、組織の始原体または前駆体が、個々の細胞のレベルでの分化だけでなく、組織／臓器移植片のための供給源として、または人工臓器支持体のための供給源として、または器官バイオリアクターとして使用され得る認識可能かつ機能的な組織構造および器官構造への形態学的、生化学的および解剖学的な組織化をも達成するために、適切な分化因子とともにインビトロで培養される。インビトロで操作されている組織の例には、軟骨（Ｋｏｃｈ  ＲＪおよびＧｏｒｔｉ  ＧＫ、Ｆａｃｉａｌ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ、２００２、１８：５９〜６８）、皮膚（Ｌｅｅ  ＫＨ、Ｙｏｎｓｅｉ  Ｍｅｄ  Ｊ、２０００、４１：７７４〜７９）、尿生殖器組織（Ａｔａｌａ  Ａ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｕｒｏｌ、１９９９、９：５１７〜２６）、および膵臓小島（Ｍａｒｉａ−Ｅｎｇｌｅｒ  ＳＳ他、Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ、２００１、３４：６９１〜７）がある。しかしながら、これらの組織は、幹細胞からではなく、分化した組織成分から操作されている。胚幹細胞が、機能的な膵臓小島様構造体（Ｌｅｍｅｌｓｋｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１、２９２：１３８９〜９４）および血液組織（Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００１、９８：１０７１６〜２１）をインビトロで生じさせるために使用されている。
【００８９】
血管様構造もまたインビトロで形成されている。Ｋａｕｓｈａｌ他（Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２００１、７：１０３５〜４０）は、末梢の内皮始原体が、脱区画化された（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）ブタ血管上に機能的な新血管を形成することを報告していた。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ他（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、２００２、９９：４３９１〜９６）は、ヒト胚様体に由来する内皮細胞を用いて研究したとき、マトリゲルにおける管様構造の形成を明らかにし、また、移植されたとき、微小血管を明らかにした。しかしながら、これらの血管様構造体は、典型的には、正常な血管に特徴的である正常な複雑な脈管／壁組織化を有していない。
【００９０】
本発明を実施に移しているとき、驚くべきことに、本発明の脈管形成性始原細胞は、適切な増殖因子とともにマトリゲルにおいて成長させたとき、小さい毛細管様脈管を形成し（図３Ａ〜図３Ｇ）、また、より大きな脈管構造をアルギン酸塩足場で形成する（図４Ａおよび図４Ｂ）ことが発見された。両方の場合において、脈管構造体内における血液細胞の形成と同様に、正常な内皮組織化および壁組織化が観測された（図３Ｅ〜図３Ｇおよび図４Ａ〜図４Ｂ）。
【００９１】
従って、本発明の別の局面によれば、血管組織を調製するための方法が提供される。この方法は、本発明の脈管形成性始原細胞の集団を、少なくとも１つの脈管形成増殖因子および／または血管形成増殖因子の存在下、血管組織の分化を誘導するための好適な条件のもとで培養することによって行われる。
【００９２】
本発明のこの局面の実施形態の１つによれば、血管組織が、脈管形成性の始原細胞を半固体の脈管化促進培地で培養することによって調製される。そのような培地は、典型的には、増殖因子で処理された分化途中の脈管形成性細胞が凝集後に混合される細胞外マトリックス成分（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）またはコラーゲン（例えば、ラット尾コラーゲンＩ）を含む。増殖因子は、脈管形成性および／または血管形成性の成長または発達を誘導することが知られている上記の脈管形成因子および／または血管形成因子のいずれか、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン（Ａｎｇ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エフリン（Ｅｐｈ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）および胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）などであり得る。好ましい実施形態において、増殖因子は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５および１０ｎｇ／ｍｌのｈＰＤＧＦ−ＢＢである。脈管構造体の成長は、典型的には、７日間〜１５日間のインキュベーションの後で明らかになる。特徴的な内皮細胞成分、例えば、ヴァイベル−パラーデ体およびリポタンパク質カプセルなど；脈管内腔、ならびに、血液細胞が、下記の実施例の節において詳しく記載されるように、組織学および電子顕微鏡観察によって検出される。
【００９３】
複雑で、巨視的な組織構造もまた、本発明の始原体を、多孔性の支持体、または足場に接種することによってインビトロで模倣することができる。そのような支持体は、この分野では広く知られており（米国特許第５７５９８３０号および同第５７７０４１７号（Ｖａｃａｎｔｉ他）、ならびに同第６３７９９６２号（Ｈｏｌｙ他））を参照のこと）、近年には、例えば、宿主細胞による脈管化および上皮化のための管状の血管補綴具として、血管再生（米国特許出願公開２００２００１９６６３Ａ１（Ｔｅｒｍｉｎ，ＰＬ他））のために、繊維芽細胞による創傷修復（米国特許出願公開２００２００７６８１６（Ｄａｉ，Ｊ他））のために、また、インビトロでの骨工学（米国特許出願公開２００２００２８５１１（ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｉｎ，ＪＤ他））のために提案されている。本発明の実施形態の１つにおいて、毛細管サイズよりも大きい血管組織が、脈管形成性始原細胞を３次元の足場で培養することによって調製される。好ましい実施形態において、足場は、多孔性かつ生分解性のスポンジ様物質であり、例えば、ポリＬ−乳酸、ポリ乳酸−グリコール酸またはアルギン酸塩などであり、また、分化培地はＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍｌ）およびｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）の増殖因子を含有する。そのようなアルギン酸塩足場で成長させられた本発明の血管組織は、典型的には、培養における１４日目に、内腔、内皮細胞および平滑筋細胞、細胞封入およびフォンビルブラント因子などの血管の特徴を示している（図４Ａ〜図４Ｂ）。
【００９４】
本発明の方法によって調製された生きている血管組織は、再生治療のために、また、非血管組織の血管新生のために使用することができる。血管組織は、糖尿病の微小血管障害の場合のように、不十分な脈管化または誤った脈管化を受けている胚の器官、成長中の器官または成体の器官に移植することができ、あるいは、虚血性の心臓疾患および脳血管疾患の場合のように、虚血損傷を受けている組織、またはその危険性のある組織に移植することができる。同様に、本発明の血管組織は、外科的バイパス、血管変性（アテローム性動脈硬化など）および自己免疫疾患の場合における組織置換療法のために大きい直径の血管を提供することができる。
【００９５】
本発明の脈管形成性始原細胞から調製された培養物または血管組織を分化させることはまた、血管の発達および機能をもたらすプロセスを調べるために好適なモデルを提供することが理解される。例えば、本発明の細胞および組織は、毒性が疑われる物質、抗体、催奇物質、薬物およびその他の存在下で培養することができ、または、非標準的な環境因子、例えば、温度、気体分圧およびｐＨなどにさらすことができ、または、他の組織もしくは他の生物に由来する細胞の存在下で同時培養することができる。成長および発達のパラメーターの変化、例えば、内皮マーカー発現の欠如もしくは遅れ、増殖能の喪失、またはインビトロ脈管化の崩壊などが、様々な因子の影響を明らかにするために評価され得る。
【００９６】
従って、本発明の別の局面によれば、血管の発達、成長および／または変化に対する因子の影響を明らかにする方法が提供される。この方法は、本発明の脈管形成性始原細胞の集団を因子にさらし、細胞に対する因子の影響を明らかにすることによって行われる。
【００９７】
脈管形成性始原細胞は、血管の発達、成長または変化を阻害または下方調節することが疑われる因子にさらすことができる。そのようなアッセイは、薬物の開発および研究では広く知られており、他の非血管プロセスの処置のために意図された物質の望ましくない副作用を試験するために用いることができ、あるいは、脈管形成の新規な阻害剤を発見するために使用することができる。血管の発達および成長を阻害する作用の評価を可能にするために、脈管形成性始原細胞を培養する条件は、脈管形成および血管形成のために有利にしなければならず、あるいは、より好ましくは、脈管形成および血管形成のために最適にしなければならない。これには、調べられている血管発達の特定の段階のための、培地成分（例えば、増殖因子または分化因子など）、温度、基質組成、気体分圧などの他の最適化が含まれる。
【００９８】
実際、本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、血管形成を阻害する抗ＶＥ−ｃａｄ  ｍＡｂとの本発明の脈管形成性始原細胞のインキュベーションはｈＶＥＧＦによる分化を妨げたことを発見した（図５Ａ〜図５Ｂ）。同様に、妊娠の初期合併症を処置するために意図された薬物を、脈管形成性始原細胞をさらし、薬物を除き、細胞の成長または発達の変化を、この分野で一般的に使用されている方法によってモニターすることによって、胚の血管発達に対する潜在的な有害作用についてスクリーニングすることができる。同様に、脈管形成性始原細胞における血管形成および／または脈管形成を刺激または上方調節する因子を、最適ではない培養条件のもとで最も良く評価することができる。脈管形成および／または血管形成に影響を及ぼす物質には、ペプチド、ペプチドミメティクス、ポリペプチド、抗体、化学的化合物および生物学的媒介因子が含まれる。
【００９９】
始原細胞集団は、組織工学、移植および再生治療が非常に容易であるので、そのような細胞の遺伝子操作は、以前には得ることができなかった特有の特徴を有する細胞集団を発達させる供給源を提供し得る。
【０１００】
本明細書中下記の実施例の節の実施例１において明瞭に例示されるように、本発明の脈管形成性始原細胞は活発な増殖を示しており、従って、そのような活発な増殖は、そのような細胞を遺伝子操作しやくし、それにより、そのような細胞は、例えば、少なくとも１つの外因性ポリペプチドを発現することができようにされる。そのような細胞培養物において発現させられる外因性ポリペプチドは、細胞表面マーカー、細胞表面抗原、血管形成因子、脈管形成因子および造血因子であり得る。発現させることができるさらなるポリペプチドは、例えば、様々な受容体、リガンド、細胞接着分子、酵素、ペプチドホルモン、および免疫系のタンパク質である。
【０１０１】
本発明の脈管形成性始原細胞は、外因性ポリペプチドまたは外因性ポリペプチドの前駆体形態をコードするヌクレオチド配列を導入することによって、外因性ポリペプチドを発現させるために操作することができる。外因性の外来核酸配列は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、顕微注入、リポフェクション、レトロウイルスベクターまたは他のウイルスベクターまたは細菌ベクター、あるいは、当業者に広く知られている他の手段によって、培養物の脈管形成性始原細胞に移すことができる。好ましくは、外因性配列の発現は誘導可能である。外因性ポリペプチドを発現する細胞は、この分野で広く知られている様々な技術によってスクリーニングおよび単離することができ、これらには、免疫ブロッティング、免疫蛍光、ＥＬＩＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲが含まれるが、これらに限定されない。外因性ポリペプチドを発現する細胞は、例えば、欠陥部を修復するか、または欠陥部を増大させるために、集め、拡大培養し、分化させ、使用することができる。このようにして、細胞、組織または器官を、宿主生物による移植物の拒絶を低下させる外因性の主要組織適合性抗原を伴って調製することができる。さらに、脈管形成増殖因子を発現および分泌する細胞、または増殖因子受容体を過剰発現する細胞を選択および培養することができ、これにより、分化因子に対する変化した時間的な動力学および／または感受性を有する脈管形成性始原細胞の培養物が得られる。
【０１０２】
本発明の方法によって単離された脈管形成性始原細胞は、血管疾患および血管関連疾患の処置において治療的に使用することができる。潜在的な適用には、損傷組織および虚血組織を修復するための細胞移植、再生中の組織の脈管化、ならびに胚の再生医療が含まれる。幹細胞および始原細胞のそのような治療的適用の例には、成体の内皮始原体を移植した後の虚血組織の領域で観測される血管成長の増強（Ｋａｗａｍｏｔｏ  Ａ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１、１０３：６３４〜３７）、および、マウスにおける誘導された発作での脳虚血の後での成体内皮始原体による血管新生（Ｚｈａｎｇ  ＺＧ他、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、２００２、９０：２８４〜８８）がある。
【０１０３】
従って、本発明のさらに別の局面によれば、哺乳動物対象における血管の疾患または状態を緩和または防止する方法が提供される。この方法は、本発明の脈管形成性始原細胞を対象に投与することによって行われる。
【０１０４】
本発明の始原細胞を対象（特に、ヒト対象）に投与する方法には、対象における標的部位内への細胞の注入または移植が含まれ、本発明の細胞は、対象内への細胞の、注入または移植による導入を容易にする送達ビヒクルに入れることができる。そのような送達ビヒクルには、細胞および流体を受容対象の体内に注入するためのチューブ（例えば、カテーテル）が含まれる。好ましい実施形態において、チューブは、本発明の細胞が、所望される位置において対象に、それを介して導入され得るニードルをさらに有する（例えば、シリンジ）。本発明の始原細胞は種々の形態でそのような送達ビヒクル（例えば、シリンジ）に入れることができる。例えば、細胞が、そのような送達ビヒクルに含有されたとき、溶液中に懸濁することができ、または担体マトリックスに埋め込むことができる。本明細書中で使用される用語「溶液」は、本発明の細胞が生存可能な状態を保ち続けるキャリアまたは希釈剤を含む。本発明のこの局面とともに使用され得るキャリアおよび希釈剤には、生理的食塩水、水性緩衝剤溶液、溶媒および／または分散媒体が含まれる。そのようなキャリアおよび希釈剤の使用はこの分野では広く知られている。溶液は、好ましくは、無菌であり、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動性である。好ましくは、溶液は、製造および貯蔵の条件のもとで安定であり、また、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用により、細菌および真菌などの微生物の汚染作用を受けないように保存される。本発明の溶液は、本明細書中に記載されるような始原細胞を、キャリアまたは希釈剤、および、要求される場合、上記で列挙された他の成分に配合し、その後、ろ過滅菌することによって調製することができる。
【０１０５】
脈管形成性始原細胞が配合され得るか、または埋め込まれ得る担体マトリックスには、受容者に対する適合性を有するマトリックスで、受容者に対して有害でない生成物に分解するそのようなマトリックスが含まれる。天然および／または合成の生分解性マトリックスがそのようなマトリックスの例である。天然の生分解性マトリックスには、血漿凝固物（例えば、哺乳動物に由来するもの）、ポリマー足場、マトリゲルおよびコラーゲンマトリックスが含まれる。合成の生分解性マトリックス（足場）には、合成ポリマー、例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などが含まれる。合成ポリマーの他の例、および、細胞をこれらのマトリックスに配合するか、または埋め込む様々な方法がこの分野では知られている。例えば、米国特許第４２９８００２号および米国特許第５３０８７０１号を参照のこと。これらのマトリックスは、脆弱な始原細胞に対する担体および保護をインビボで提供し、従って、脈管形成性始原細胞が受容対象に導入される好ましい形態である。
【０１０６】
本発明の移植された脈管形成性始原細胞の分化は、周囲の組織に由来する因子によって導かれ得るか、または、系譜特異的な増殖因子との移植前のインキュベーションによって開始され得る。従って、例えば、平滑筋の再生を必要とする欠陥を、平滑筋前駆体が濃縮された集団を達成するためにＰＤＧＦ−ＢＢにさらされた細胞を用いて処置することができる。
【０１０７】
本発明の方法により処置され得る血管の疾患および状態には、先天的な血管障害、後天的な血管障害、および虚血／再灌流傷害が含まれる。本明細書中で使用される用語「先天的な血管障害」は、生まれたときから存在する血管障害を示し、これには、遺伝性の障害および発達上の障害の両方が含まれる。「後天的な血管障害」は、出生後に生じる血管障害を示し、これには、全身的疾患または他の疾患の二次的な血管徴候、例えば、糖尿病の微小血管障害などが含まれる。「虚血／再灌流傷害」は、中断または低下した血液供給、および、虚血組織において循環を再確立することに関連する組織損傷（特に、炎症応答）から生じる細胞傷害または組織傷害を示す。
【０１０８】
そのような処置から利益を受け得る状態には、虚血状態（例えば、心筋、脳または末梢血管の虚血に関連する虚血状態）、創傷治癒、組織の移植（移植片を含む）、および、内皮細胞の成長および増殖を伴う状態（例えば、冠状動脈血管形成術、ステント設置または関連する手法の後）、動脈移植片の再内皮化、ならびに、Ａ−Ｖシャントにおける内皮再生（例えば、腎臓透析患者において）が含まれる。霊長類においてブタ始原体の異種移植片を使用したときに遭遇する合併症（Ｂｕｈｌｅｒ  Ｌ他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０００、７０：１２３２〜３１）を考慮して、本発明の方法は、ヒト幹細胞に対して適用することができ、そのような血管状態を処置するために特に適する。
【０１０９】
本発明の脈管形成性始原細胞は、造血増殖因子およびサイトカインにさらされたとき、血液細胞始原体および成熟した血液細胞に分化することを誘導し得ること（それぞれ、図２Ｋ〜図２Ｍおよび図３Ｄ〜図３Ｆ）が本発明では認められたので、本発明の脈管形成性始原細胞はまた、哺乳動物対象における血液学的な疾患または状態を処置または防止するために使用することができる。
【０１１０】
そのような処置は、細胞を、内皮細胞および血液細胞の両方への分化を刺激するために好適な条件のもとで対象に投与することによって行われる。このような様式で処置または防止され得る血液学的な疾患または状態には、先天的な血液障害、後天的な血液障害、凝固障害、および新生物疾患が含まれる。
【０１１１】
本発明の方法による処置のために好適な凝固障害の一例が、フォンビルブラント病、すなわち、内皮フォンビルブラント凝固因子の欠乏によって引き起こされる血友病の１つのタイプである。本発明を実施に移しているとき、本発明の方法によって調製される分化した内皮細胞がフォンビルブラント因子を含有することが発見された（図３Ａ〜図３Ｇおよび図４Ａ〜図４Ｂ）。従って、本発明の内皮細胞または内皮始原細胞、あるいはその組成物を投与することができ、これにより、凝固因子が産生され、凝固不全が軽減される。
【０１１２】
上記の治療的適用に加えて、本発明の方法によって単離および調製された脈管形成性始原細胞は、非血管組織または生来的に脈管化が不良な組織の脈管化をもたらすために使用することができる。組織工学の分野で直面する非常に重要な課題の１つが、移植のためにインビトロで調製された組織および器官の十分な灌流であることが認められる。今日まで、組織工学のほとんどの方法は、永続的な生着と、酸素および栄養分の移動とを提供するために、微細孔担体と、宿主からの脈管化とに頼っているが、厚い複雑な組織（例えば、肝臓）が関係する場合には特に、様々な、そして多くの場合には予測できない結果が伴っている。１つの代替法が、混合された肝細胞および内皮細胞によるインビトロでの定着のために、「血管」通路を微細加工によってシリコンで作製することである（Ｋａｉｈａｒａ  Ｓ他、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ、２０００、６：１０５〜０７）。正常な発達をより厳密に模倣する別の方法では、内皮細胞が、血管網状組織を成長中の組織に提供するために、皮膚細胞（Ｂｌａｃｋ  ＡＦ他、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ、１９９９、１５：８１〜９０）または脂肪細胞（Ｆｒｅｒｉｃｈ  Ｂ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ、２００１、３０：４１４〜２０）と同時培養されている。しかしながら、これらはいずれも、生存可能かつ移植可能な脈管化した組織を操作することには成功していない。
【０１１３】
従って、本発明のさらなる局面によれば、哺乳動物組織を脈管化させる方法が提供される。この方法は、脈管形成性始原細胞の集団を得ること、および、細胞を、脈管形成性始原細胞が内皮細胞および平滑筋細胞に分化するために好適な条件のもとで哺乳動物組織と接触させることによって行われる。１つの好ましい実施形態において、哺乳動物組織は、操作された非血管組織である。
【０１１４】
そのような操作された組織の例には、移植のための、インビトロで調製された肝細胞、上皮細胞および皮膚細胞、膵臓細胞および骨細胞の集塊がある。組織を分化途中の脈管形成性始原細胞と接触させることは、本明細書中上記で詳しく記載されたように、操作された組織構造において一般に使用されているような半固体マトリックスにおける同時培養または多孔性足場での同時培養によって行うことができる。哺乳動物組織を接触させることは、宿主生物への移植の前にインビトロで、あるいは、以前に移植された組織または存在する組織に対してインビボで行うことができる。別の好ましい実施形態において、哺乳動物組織は、成体宿主生物への移植のために、または、胚としての移植および成長のために調製された胚組織である。
【０１１５】
本発明を実施に移しているとき、本発明の方法論のサイズ選択工程によって保持された５０μｍより大きい細胞は、特徴的な内皮細胞マーカーおよび形態学（それぞれ、図１Ｈおよび図１Ｇ）を発現する平滑筋細胞前駆体が濃縮された集団を含むこともまた認められた。
【０１１６】
従って、本発明はまた、内皮始原細胞を未分化ＥＳ細胞から調製する方法を提供する。この方法は、未分化ＥＳ細胞を、脈管形成性始原細胞への分化に好適な様式で培養すること、および、５０μｍより大きい細胞を単離することによって行われる。内皮前駆体の培養、および平滑筋細胞へのそれらの分化に関する条件は、脈管形成性始原細胞について本明細書中に詳しく記載されている条件と実質的に類似しているが、内皮増殖因子または脈管形成増殖因子に代えて、平滑筋増殖因子または上皮増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢなど）が代わりに使用された。しかしながら、上皮細胞および平滑筋細胞は、より小さい脈管形成性始原細胞の増殖能を有しないことが認められた。
【０１１７】
成体の血管組織は、存在位置および機能だけでなく、サイズ、形態学および細胞マーカーによって区別可能な内皮細胞および上皮細胞から構成される。血管細胞タイプを単離するための現在の方法は、細胞表面マーカーの検出、免疫蛍光およびフローサイトメトリーに頼っており（例えば、Ｋｅｖｉｌ  ＥＧおよびＢｕｌｌａｒｄ  ＤＣ、Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃａｎｄ、２００１、１７３：１５１〜５７を参照のこと）、このことは、実験および初代培養のための血管細胞の調製を面倒で、高価かつ不十分にしている。従って、本発明の方法は、未分化幹細胞からだけでなく、血管組織から細胞を単離および調製するために用いることができる。好ましい実施形態において、血管組織の細胞は、解離させられた細胞と、脈管形成性始原細胞について本明細書中で詳しく記載されるようにサイズ選択により単離されたより小さい（５０μｍより小さい）内皮細胞との混合集団を得るために、機械的手段または酵素的手段（例えば、トリプシン消化またはコラゲナーゼ消化など）によって解離させられる。同様に、成体の内皮細胞を、類似する方法によって血管組織から単離することができ、この場合、上皮細胞が濃縮されている（５０μｍより大きい）保持された細胞集団が集められる。
【０１１８】
実施例
ここでは、上記説明と共に以下の実施例を参照して、非限定的様式で本発明を例示する。
【０１１９】
一般に、本明細書中で使用した用語および本発明で使用した実験手順には、分子、生化学、微生物学、および組換えＤＮＡの技術が含まれる。このような技術は、文献で完全に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４；Ａｕｓｕｂｅｌら、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９８９；Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｗａｔｓｏｎら、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら編、“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”、第１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９８；米国特許第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１２９６５９号、および同第５２７２０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編、１９９４；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編、１９９４；Ｓｔｉｔｅｓら編、“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ、１９９４；Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ編、“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８０を参照のこと；利用可能な免疫アッセイは、特許および化学論文に広く記載されており、例えば、米国特許第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号、および同第５２８１５２１号；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、１９８４；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編、１９８５；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編、１９８４；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編、１９８６；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍ���ｓ”、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、１９８４および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、第１〜１３７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ、１９９０；Ｍａｒｓｈａｋら、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ”、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６（その全てが本明細書中に完全に記載されているかのように参照として援用される）を参照のこと。他の一般的引例を、本明細書中に記載する。引例中の手順は当該分野で周知であると考えられ、読者の都合のために記載する。引例中に含まれる全ての情報は、本明細書中で参考として援用される。
【０１２０】
別途に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等な方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記に記載される。
【０１２１】
材料および方法
細胞培養
未分化のままであるヒト幹（ｈＥＳ）細胞（Ｈ９．２、Ｈ１３）が、２０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ、米国）、または血清代替物およびｂＦＧＦ、１ｍＭのＬ−グルタミン、０．１ｍＭのメルカプトエタノールおよび１％の非必須アミノ酸ストック（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）が補充された８０％ノックアウトＤＭＥＭ培地（ピルビン酸非添加、高グルコース配合；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）において、以前の記載（Ａｍｉｔ  Ｍ他、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２０００、２２７：２７１〜７８）のように不活化マウス胚フィーダー層（ＭＥＦ）上で成長させられた。ｈＥＳ細胞は、１％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ、米国）が補充されたＥＤＴＡ（５ｍＭ）を使用してフィーダー層から除かれ、４０μｍの網目のろ過器（Ｂｅｎｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）を使用して単一細胞に分散された。
【０１２２】
分化の場合、未分化ｈＥＳの単一細胞を、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、米国）および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）が補充されたαＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）からなる分化培地において、５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２の濃度でＩＶ型コラーゲン被覆６ウエルディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）または０．１％ゼラチン被覆６ウエルディッシ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）に置床した。培養の６日目に、細胞を４０μｍの網目のろ過器（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）でろ過して、分析し、または、さらなる分化のために再培養した。再培養の場合、ろ過された細胞を、ｈＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍｌ）またはｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）（ともにＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）から得られる）を含む分化培地（上記参照）において、ＩＶ型コラーゲン被覆ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）に２．５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２で、さらに１０日間〜１２日間にわたって接種した。
【０１２３】
コラーゲンゲルおよびＭａｔｒｉｇｅｌでの３Ｄ脈管化アッセイ
３次元培養の前に、分化培地で６日間培養されたろ過細胞を、ＥＤＴＡ（５ｍＭ）を用いて集め、０．３〜０．５Ｘ１０６個／ｍｌの細胞を、凝集を誘導するために最大で２４時間、非被覆ペトリディッシュ（Ｅｉｎ−Ｓｈｅｍｅｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）で、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５およびｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する分化培地においてインキュベーションした。コラーゲンゲルアッセイの場合、凝集物を２Ｘ分化培地に再懸濁して、等容量のラット尾コラーゲンＩ（３ｍｇ／ｍｌ）（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、スイス）と混合した。最初、この混合物の２５０μｌを２４ウエルディッシュに入れ、３７℃で１５分間重合させ、その後、同じ増殖因子が補充された分化培地の５００μｌを加えた。Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイの場合、２４ウエルディッシュを３８０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）で被覆し、３７℃で３０分間インキュベーションして、凝集物を、ｈＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する分化培地においてマトリゲルに接種した。いくつかのアッセイでは、凝集物はＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）の内部に再懸濁され、３７℃で３０分間インキュベーションされ、その後、ｈＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する分化培地とともにウエルに加えられた。すべてのアッセイについて、細胞は７日間〜１２日間にわたってインキュベーションされ、位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ  Ｌｔｄ、Ｈａｍｂｕｒｇ  ＧｍｂＨ）を使用して分析された。
【０１２４】
足場の脈管化
ＬＦ１２０  ５０μｌのアルギン酸塩足場（Ｓｈａｐｉｒｏ  ＬおよびＣｏｈｅｎ  Ｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９７、１８：５８３）をＳｍａｄａｒ  Ｃｏｈｅｎ教授（ベングリオン大学、Ｂｅｅｒ  Ｓｈｅｂａ、イスラエル）から譲り受けた。上記で記載されたように、この足場には、本明細書中上記で記載されたように調製された、２４時間経ったＥＳＨ細胞凝集物が接種された。およそ０．５〜１．０Ｘ１０６個の細胞が足場あたり接種された。その後、細胞を含有する足場は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５および１０ｎｇ／ｍｌのｈＰＤＧＦ−ＢＢが補充された分化培地において培養された。
【０１２５】
造血コロニーアッセイ
造血始原体の能力が、ろ過されたＶＥＧＦ処理のＶＥ−ｃａｄ＋  ＥＳＨ細胞を、単一細胞として、プレートあたり１〜２Ｘ１０５個の細胞で、サイトカイン補充の半固体培地（Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  ＧＦ＋培地；ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）に接種することによって明らかにされた（アッセイの詳細については、Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ他、ＰＮＡＳ、２００１、９８：１０７１６〜２１を参照のこと）。１４日間のインキュベーションの後、プレートを、標準的な基準［Ｅａｖｅｓ  ＣおよびＬａｍｂｉｅ  Ｋ、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｏｌｏｎｉｅｓ（１９９５）；ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ］に従ってコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）数についてスコア化した。
【０１２６】
免疫染色、Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬおよびＢｒｄＵの取り込み
培養された細胞を、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を含むリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）と室温で３０分間インキュベーションすることによってその場に固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、供給者の説明書に従って、関連の一次抗体で染色した：ヤギ抗ヒトＫＤＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）、マウス抗ｈＣＤ３１、マウス抗ｈＳＭＡ、マウス抗ｈカルポニン、マウス抗ｈ平滑筋ミオシン重鎖（これらはすべて、ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、米国）から得られる）、ヤギ抗ヒトＶＥ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、米国）（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、米国）、マウス抗スムーセリン（ＣＨＥＭＩＣＯＮ，Ｉｎｔｎ’ｌ，Ｉｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）。コントロールは、二次抗体単独でインキュベーションされた細胞からなった。免疫染色された培養物は、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｌｔｄ．、Ｈａｍｂｕｒｇ  ＧｍｂＨ）を使用して検査および写真撮影された。
【０１２７】
Ｄｉｌｌ標識ａｃ−ＬＤＬの取り込みの場合、培養されたＥＳＨ細胞が１０μｇ／ｍｌのＤｉｌｌ標識ａｃ−ＬＤＬ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、ＭＡ、米国）と３７℃で４時間インキュベーションされた。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ  Ｌｔｄ．、Ｈａｍｂｕｒｇ  ＧｍｂＨ）を使用して検査および写真撮影した。
【０１２８】
ＥＳＨ培養物および分化途中の細胞におけるＢｒｄＵの取り込みを、製造者の説明書に従って、ＢｒｄＵ染色キット（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、米国）を使用してその位置で調べた。簡単に記載すると、ＢｒｄＵ溶液を培養培地で１：１００に希釈して、細胞に一晩加え、その後、ＰＢＳで２回洗浄し、７５％エタノールで固定して、特異的なＢｒｄＵ免疫染色を行った。
【０１２９】
免疫表現型
細胞は、以前の記載（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＥ他、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２００１、１９：１１３４）のように免疫蛍光染色を使用して特徴づけが行われた。簡単に記載すると、フィルター分離されたＥＳＨ細胞を、上記で記載されたように、分化培地（αＭＥＭ、１０％ＦＢＳおよび０．１β−メルカプトエタノール）において、ＩＶ型コラーゲンプレートで１２時間〜２０時間にわたって再培養し、固定して、特異的な細胞タイプマーカーの発現について、抗ヒトＶＥ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、米国）および抗ヒトＫＤＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）を用いてアッセイした。少なくとも１５０個の細胞がこれらのマーカーのそれぞれの発現について無作為の視野内でスコア化された（１００倍）。実験は少なくとも３回繰り返された。
【０１３０】
組織形態学および免疫組織化学分析
細胞を含有するＭａｔｒｉｇｅｌまたはコラーゲンゲル（これらは、本明細書中上記のコラーゲンゲルおよびＭａｔｒｉｇｅｌの３Ｄ脈管化アッセイについて記載された通りである）を、上記で記載されたように、２４ウエルディッシュにおいて、ガラス製カバーガラスに載せた。処理が完了したとき、カバーガラス上の細胞含有ゲルブロックを１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、段階濃度のアルコール浴（７０％〜１００％）で脱水し、パラフィンに包埋した。使用された場合、アルギン酸塩足場は直接、段階濃度のアルコールで脱水された。一般的な組織形態学の場合、１μｍ〜８μｍの切片がヘマトキシリン／エオシンまたはトルイジンブルーで染色された。脱パラフィン化切片が、製造者の説明書に従って、ＬＳＡＢ＋染色キット（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、米国）またはＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ染色キット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）を使用して、関連の一次抗体で免疫染色された。染色された切片を、１００倍〜４００倍の倍率で顕微鏡を使用して、観察し、写真撮影した。
【０１３１】
ＦＡＣＳ分析
内皮始原体マーカーのＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）およびＶＥ−ｃａｄを発現する細胞が、上記で記載されたように、ろ過、およびＩＶ型コラーゲンでの別個の再培養の後、２つのサイズ分離されたヒトＥＳ細胞集団から検出され、定量された。ＦＡＣＳ分析の場合、ＥＳＨろ過細胞を、５％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄し、ヒトＶＥ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、米国）またはヒトＫＤＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）とインキュベーションして、洗浄し、そして好適な二次抗体と３０分間インキュベーションした。細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）をＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウエアとともに使用して分析した。両方のアッセイにおいて、二次抗体のみと反応した細胞がコントロールとして使用された。
【０１３２】
電子顕微鏡観察
Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはコラーゲンゲルに接種された細胞を、３％グルタルアルデヒドを含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウムで１時間固定し、次いで、１％ＯｓＯ４を含むベロナール−酢酸緩衝液で１時間、後固定した。電子顕微鏡観察分析のための調製は、Ｒａｍｂａｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの病理学部門（Ｈａｉｆａ、イスラエル）での標準的な手順に従って行われた。簡単に記載すると、細胞をクエン酸鉛で染色し、脱水し、Ｅｐｏｎ樹脂に包埋した。切片を、ダイアモンドナイフを使用して６００Åの厚さで切断し、ＪＥＭ−１００ＳＸ電子顕微鏡を使用して検査し、写真撮影した。
【０１３３】
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ分析
総ＲＮＡを、製造者の説明書に従って、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を使用して始原体および種々の系譜細胞から抽出した。総ＲＮＡをＵＶ分光光度法によって定量し、１μｇを各ＲＴサンプルのために使用した。ＲＮＡを、製造者の説明書に従って、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を用いて逆転写した。選択された転写物のＰＣＲ分析を、反応あたり１μｇのＲＴ産物を使用して、ＢＩＯＴＡＱＴＭＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯＬＩＮＥ，Ｌｔｄ  ＧｍｂＨ、Ｌｕｃｋｅｎｗａｌｄｅ、ドイツ）を用いて行った。場合により、ＭｇＣｌ２濃度（通常、１．５ｍＭ）を較正した（これは下記に示される）。ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける半定量的な結果を確保するために、各プライマーセットに対するＰＣＲサイクルの数は、増幅の直線範囲内にあることが確認された。さらに、すべてのＲＮＡサンプルは、内部標準としてのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの等しい増幅を生じさせるために調節された。ＰＣＲ条件およびプロトコルは下記からなった：９４℃で５分（ホットスタート）；その後、（ａ）９４℃で３０秒間、（ｂ）アニーリング温度（Ｔａ、これは下記に示される）で３０秒間、および（ｃ）７２℃で３０秒間の３０サイクル〜４０サイクル（実際の回数は下記に示される）、最後に７２℃で７分間の最後の伸張で終了する。オリゴヌクレオチド特異的な条件は下記の通りであった：α−ｓｍａ、３２サイクル、Ｔａ：６０℃（Ｙａｍａｍｕｒａ、Ｈ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｒｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．）、１９９８、７９：２４５）；カルポニン、３５サイクル、Ｔａ：６０℃（Ｙａｍａｍｕｒａ、Ｈ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｒｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．）、１９９８、７９：２４５）；ＳＭ−ＭＨＣ、３５サイクル、Ｔａ：６２℃、１ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｏｒｅｈａｍ他、Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｅｔｅｔ  Ｇｙｎｙｃｏｌ、２００１、１８５：９４４〜５２）；ＳＭ２２α、３５サイクル、Ｔａ：６０℃（Ｙａｍａｍｕｒａ、Ｈ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｒｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．）、１９９８、７９：２４５）；カルデスモン、３５サイクル、Ｔａ：６０℃（Ｄｕｐｌａａ、Ｃ．他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、１９９７、８０：１５９）；ＧＡＴＡ２、３５サイクル、Ｔａ：５５℃（Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ他、ＰＮＡＳ、２００１、９８：１０７１６）；ＡＣ１３３、３２サイクル、Ｔａ：６０℃（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ  ＭＪ他、ＰＮＡＳ、２００１、９８：１１３）；Ｔｉｅ２、３５サイクル、Ｔａ：６０℃（Ａｈｍａｄ，Ｓ他、Ｃａｎｃｅｒ、２００１、９２：１１３８）；ＣＤ３１、３２サイクル、Ｔａ：６０℃（Ｑｕａｒｍｂｙ，Ｓ他、Ａｒｔｅｒｉｏ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓ  Ｂｉｏｌ、１９９９、１９：５８８〜９７）；Ｔａｌ１、４０サイクル、Ｔａ：５３℃（Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ他、ＰＮＡＳ、２００１、９８：１０７１６）；ＧＡＰＤＨ、３２サイクル、Ｔａ：６０℃（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ  Ｊ他、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ、２０００、６：８８）。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドプライマー：
ＰＣＲ反応のために、下記の特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが使用された：
（ａ）α−ｓｍａ：５’ＣＣＡＧＣＴＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧ３’（配列番号１）（センス）および５’ＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＡＴＴＣＧＧＴ３’（配列番号２）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは９６５塩基対である；
（ｂ）カルポニン：５’ＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧＡＣＧＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣ３’（配列番号３）（センス）および５’ＧＴＣＴＧＴＧＣＣＣＡＡＣＴＴＧＧＧＧＴＣ３’（配列番号４）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは６７１塩基対である；
（ｃ）ＳＭ−ＭＨＣ：５’ＣＴＡＣＡＧＧＡＧＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＧ３’（配列番号５）および５’ＧＣＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣ３’（配列番号６）、これらはヌクレオチド５７９（センス）およびヌクレオチド７５８（アンチセンス）にそれぞれ対応する。予測されるバンドサイズは１７９塩基対である；
（ｄ）ＳＭ２２α：５’ＣＧＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＴＣＣＡＡＡＡＴＣＧ３’（配列番号７）（センス）および５’ＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＧ３’（配列番号８）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは９２８塩基対である；
（ｅ）カルデスモン：５’ＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＡＧＧ３’（配列番号９）および５’ＧＣＴＧＣＴＴＧＴＴＡＣＧＴＴＴＣＴＧＣ３’（配列番号１０）、これらはヌクレオチド２４４（センス）およびヌクレオチド７９２（アンチセンス）にそれぞれ対応する。予測されるバンドサイズは５３０塩基対である；
（ｆ）ＧＡＴＡ２：５’ＡＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡ３’（配列番号１１）（センス）および５’ＴＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＣＴ３’（配列番号１２）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは２４２塩基対である；
（ｇ）ＡＣ１３３：５’ＣＡＧＴＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＡＡＡ３’（配列番号１３）（センス）および５’ＧＧＣＣＡＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧＴＣＣＴＡ３’（配列番号１４）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは２００塩基対である；
（ｈ）Ｔｉｅ２：５’ＡＴＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＧＣ３’（配列番号１５）（センス）および５’ＴＧＴＧＡＡＧＣＧＴＣＴＣＡＣＡＧＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧ３’（配列番号１６）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは５１２塩基対である；
（ｉ）ＣＤ３１：５’ＣＡＡＣＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＣＡＧＡ３’（配列番号１７）（センス）および５’ＧＧＡＧＣＣＴＴＣＣＧＴＴＣＴＡＧＡＧＴ３’（配列番号１８）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは２６０塩基対である；
（ｊ）Ｔａｌ１：５’ＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＴＣＣＴＣＣ３’（配列番号１９）（センス）および５’ＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＧＣＴＴＣ３’（配列番号２０）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは３３１塩基対である；
（ｋ）ＧＡＰＤＨ：５’ＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣ３’（配列番号２１）（センス）および５’ＧＴＡＣＴＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＣＡＴＣＧ３’（配列番号２２）（アンチセンス）。予測されるバンドサイズは３０２塩基対である。
【実施例１】
【０１３５】
ヒト幹細胞からのヒト脈管形成性始原細胞の単離および濃縮
研究および医療に対するヒト幹細胞技術の非常に大きな重要性にもかかわらず、非ヒト種を用いた研究でなされた発見をヒト幹細胞に適用することは、忍耐を要するほど困難であり、そのため、大きな工夫および多大な努力が要求される。例えば、ネズミの胚幹細胞（ｍＥＳ）株はその多能性を培養状態で保持しており、また、中胚葉系譜、内胚葉系譜および外胚葉系譜の細胞にインビトロで分化させるために予測可能に操作することができるが、ヒトおよび他の霊長類のＥＳ細胞株におけるインビトロ分化は、不一致、解体、および同期性の喪失によって特徴づけられており、これらは、インビトロでの組織の成功した組織化を妨げている（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、１９９８、３８：１３３〜１６５を参照のこと）。ヒト胚幹細胞からの脈管形成性始原細胞の単離を行う際、最初のヒトＥＳ中胚葉分化が、３Ｄ胚様体構造がマウス幹細胞中胚葉分化には要求されないという観測結果（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ−Ｉ．他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９８、１２５：１７４７）に基づいて、この分野で一般に使用されている３次元（３Ｄ）モデルではなく、新規な２次元（２Ｄ）モデルで試みられた。
【０１３６】
未分化ヒト胚幹細胞株のＨ９．２細胞およびＨ１３細胞が、以前の記載（Ａｍｉｔ  Ｍ他、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２０００、２２７：２７１〜７８）のように成長させられ、フィーダー層から除かれ、マウスＣＣＥ−ＥＳ細胞（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２）について記載されていたように、分化培地とともにＩＶ型コラーゲン被覆ディッシュに単一細胞として置かれた。マウス幹細胞を用いた以前の経験は、特定の細胞接種濃度が内皮分化の誘導のために極めて重要であることを示していた。しかしながら、推奨された細胞濃度（１Ｘ１０４細胞／ｃｍ２）でヒトＥＳ細胞を接種することは、細胞の死をもたらした。従って、いくつかの細胞接種濃度が調べられた。様々な結合基質に細胞をより大きい濃度（１．０〜１．５Ｘ１０５細胞／ｃｍ２）で接種することは、未分化細胞および分化途中の細胞の調和のない混合集団をもたらした（データは示されず）。驚くべきことに、細胞を低い濃度（５〜１０Ｘ１０４細胞／ｃｍ２）でＩＶ型コラーゲン基質に接種することにより、２つの異なる集団の細胞タイプを生じさせる分化が促進された（図１Ｂ）。細胞集団の著しい割合が、ネズミ細胞において以前に認められた内皮始原体の形態学（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ．他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２）に類似する大きな核を伴う、より小さい平坦な細胞（図１Ｂ、矢印）から構成され、一方で、残りは、明らかな繊維状構造を有する大きい平坦な細胞であった（図１Ｂ、矢頭）。
【０１３７】
これらの２つの細胞集団を分離し、より小さいヒト脈管形成細胞始原体を単離するために、細胞を４０μｍのろ過器でろ過し、内皮様細胞を大きな平坦な細胞から分離した。培養物における内皮始原体の割合を評価するために、ろ過された細胞集団を、ｈＥＳ細胞に由来するニューロン始原体の分化をモニターすることに関する以前の記載（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ＢＢ他、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２００１、１９：１１３４）のように、特異的な細胞タイプマーカーの検出によって特徴づけた。ろ過された細胞を置き、固定して、ヒト血管内皮の内皮受容体２（ＶＥＧＦＲ２、ＫＤＲ）および血管内皮カドヘリンＶＥ−ｃａｄの発現について免疫学的に分析した（これらはともに、マウス内皮始原体の発達において重要な役割を果たしていることが知られている；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｓ−Ｉ．他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９８、１２５：１７４７）。
【０１３８】
予想外であったが、２つの集団におけるこれらのマーカーの発現が免疫検出およびＦＡＣＳ分析によって定量されたとき（図１Ｃ〜図１Ｅ）、著しい割合のより小さい内皮様細胞がＶＥ−ｃａｄを発現することが見出され（７８％、図１Ｃ）、より小さい割合がＶＥＧＦＲ２を発現していた（２８％、図１Ｃ）。より小さいろ過された細胞が１２時間置かれ、固定され、蛍光性の抗ＶＥ−ｃａｄ抗体を用いて免疫形態学について分析されたとき（図１Ｄ〜図１Ｅ）、ＶＥ−ｃａｄが細胞−細胞の接合部で発現するときに観測された蛍光強度が低いこと（図１Ｅ）による可能性が最も高いが、ＶＥ−ｃａｄの著しくより大きい発現が検出された（９０．５５±５．２０％）。様々な細胞接種密度の試験により、最適なＶＥ−ｃａｄ発現が５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２においてであることが示された。
【０１３９】
ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅によってさらに特徴づけられたとき、内皮様細胞は、内皮マーカーのＣＤ３１およびＴｉｅ２；ＡＣ１３３／ＣＤ１３３、ＧＡＴＡ２およびＴａｌ１、初期の内皮／造血始原細胞マーカーを活発に発現していることが見出された（Ｐｅｉｃｈｅｖ，Ｍ他、Ｂｌｏｏｄ、２０００、９５：９５２；Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ他、ＰＮＡＳ、２００１、９８：１０７１６）（図１Ｆ、ろ過物）。未分化ヒト幹細胞から得られたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ（図１Ｆ、ｈＥＳ）では、ＣＤ３１、Ｔｉｅ２、Ｔａｌ１またはＧＡＴＡ２はいずれも発現していないこと、そして、ＡＣ１３３の発現がほんのわずかであることが明らかにされた。ＧＡＰＤＨバンドの強度が未分化細胞集団および分化細胞集団の両方について同一であることに留意すること（図１Ｆ）。このことは、分化に伴う細胞表現型の変化が特異的であることを示している。
【０１４０】
より大きい除外された細胞の免疫蛍光染色（図１Ｇ）では、上皮様表現型平滑筋細胞の特徴の存在（これは、Ｇｉｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒ−ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  Ａ．Ｃ．他、ＰＮＡＳ、２０００、９７：１１３０７によって総説される）、および、より小さいろ過された細胞では検出されないマーカー（αＳＭＡ）の存在が明らかにされた。ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅によってさらに特徴づけられたとき、より大きい除外された細胞は、上皮様マーカーのカルポニンおよびカルデスモン；平滑筋アクチン（ＳＭＡ）、およびＳＭ−ＭＨＣを活発に発現していることが見出された（図１Ｈ、保持物）。より小さいろ過された内皮様細胞から得られたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲでは、これらの上皮様細胞マーカーはいずれも発現していないことが明らかにされた（図１Ｈ、ろ過物）。ＧＡＰＤＨバンドの強度が両方の細胞集団について同一であることに留意すること（図１Ｈ）。このことは、分化に伴う細胞表現型の変化が特異的であることを示している。
【０１４１】
低密度の接種およびヒト幹細胞（ｈＥＳ）の培養から生じている２つの細胞集団が細胞増殖能について評価されたとき、ＢｒｄＵ取り込みアッセイは、上皮様の除外された大きい平滑筋様細胞は増殖することができず（図１Ｉ、矢印）、その一方で、より小さい内皮様始原細胞は、増殖能の保持を示す染色剤の明瞭な取り込みを有すること（図１Ｉ）を明らかにした。まとめると、これらの結果は、ヒト幹細胞は、胚様体としてではなく単一細胞として接種され、そして、細胞を含まない２次元マトリックスにおいてインビトロで培養されたとき、平滑筋様前駆体からろ過によって分離され得る増殖性の内皮様始原細胞を生じさせることができることを示している。
【実施例２】
【０１４２】
ヒト脈管形成性始原細胞の内皮細胞分化、平滑筋細胞分化および造血細胞分化のインビトロでの誘導
脈管形成性始原細胞の分化能を研究するために、細胞を、より低い細胞接種濃度（２．５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２）でＩＶ型コラーゲン被覆ディッシュにおいて再培養した。平滑筋細胞分化が、血小板由来増殖因子ＢＢ（ｈＰＤＧＦ−ＢＢ）を添加することによって誘導された。血小板由来増殖因子ＢＢは、ヒト幹細胞ではなく、ネズミ幹細胞（ｍＥＳ）においてＳＭＣ分化を誘導することが見出されている（Ｇｉｔｔｅｎｂｅｒｇｅｒ−ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  Ａ．Ｃ．他、ＰＮＡＳ、２０００、９７：１１３０７）。１０日間〜１２日間の培養の後、紡錘体様形状の細胞および上皮様表現型の細胞の両方が、平滑筋マーカーの発現の同時誘導と一緒に、培養物において検出された。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、平滑筋α−アクチン（ＳＭＡ）、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ−ＭＨＣ）、カルポニン、ＳＭ２２およびカルデスモンなどの特異的な平滑筋マーカーの上方調節が検出された（図２Ａ、ｖ−ＳＭＣ）が、これらは、ｈＰＤＧＦ−ＢＢ非処理の細胞から得られたＲＮＡでは顕著に検出することができなかった（図２Ａ、ＥＳＨ始原細胞）。ヒト平滑筋細胞マーカータンパク質の免疫蛍光検出（αＳＭＡ、図２Ｂ；スムーセリン、初期の平滑筋発達のマーカー、図２Ｃ；ＳＭ−ＭＨＣ、図２Ｄ；カルポニン、図２Ｅ）により、ｈＰＤＧＦ−ＢＢにさらすことによって、ヒト脈管形成性始原細胞のさらなるインビトロ分化に対する能力が確認される。
【０１４３】
内皮細胞に分化する能力を調べるために、ヒト脈管形成性始原細胞をｈＶＥＧＦ１６５にさらした。ｈＶＥＧＦ１６５は、ヒトの内皮細胞誘導ではなく、ネズミの内皮細胞誘導において効率的であることが見出されている（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２）。この操作は下記の内皮細胞特異的なマーカーの誘導をもたらした：免疫蛍光によって検出されるようなＶＥ−ｃａｄの同時発現、および、ヴァイベル−パラーデ体に貯蔵されるフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の出現（それぞれ図２Ｆおよび図２Ｇ）、より成熟した細胞におけるＤｉｌｌ−Ａｃ−ＬＤＬ取り込み（図２Ｈ）、そしてさらには、一部の成熟細胞におけるストレスファイバーの配置（図２Ｉ）。最も著しいことには、増殖因子により誘導される分化は、ｈＰＤＧＦ−ＢＢまたはｈＶＥＧＦ１６５のいずれかを用いた場合、系譜特異的な拘束を誘導しなかった。すなわち、内皮細胞タイプおよび平滑筋細胞タイプの両方が、これらの増殖因子のいずれかを投与することにより認められた。さらに、分化した細胞へのＢｒｄＵの取り込みは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）で処理された細胞（図２Ｉ）、および、特に、より小さい形態学を有するそのような細胞では、増殖能が維持されていることを示したが、一方、ｈＰＤＧＦ−ＢＢで処理された細胞は、低下した増殖能を示した（図２Ｊ）。単離された始原細胞の造血能もまた明らかにされた。ろ過された脈管形成性始原細胞のＶＥ−ｃａｄ発現集団がサイトカインとともに半固体培地において培養されたとき、造血性コロニーを示すＣＦＵ（図２Ｋ〜図２Ｍ）が認められた。従って、単離されたヒト脈管形成性始原細胞の分化が、系譜特異的な拘束または増殖能の喪失を伴うことなく、特異的な増殖因子によって、インビトロで、無細胞培地において、さらに誘導され、かつ制御され得る。
【実施例３】
【０１４４】
ＥＳＨ細胞によるインビトロでの脈管形成および血液細胞形成
脈管形成に特徴的な極めて重要な事象が、ネズミ胚幹細胞由来の胚様体を使用してインビトロで誘導される（例えば、Ｆｅｒａｕｄ  Ｏ他、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ、２００１、８１：１６６１〜８９）。しかしながら、ヒト多能性幹細胞を使用して、脈管形成プロセスをインビトロで模倣する努力は一般には成功していない。ヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞のインビトロでの脈管化能を調べるために、本発明者らは、２つの異なる３次元モデル（Ｉ型コラーゲンゲルおよびＭａｔｒｉｇｅｌ）を使用した。これらは、内皮細胞からの３Ｄ血管様形成を促進させるために使用されている（Ｍａｒｄｉ  ＪＡおよびＰｒａｔｔ  ＢＭ，Ｂ．Ｍ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９８８、１０６：１３７５；Ｋｕｂｏｔａ  Ｙ他、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９８８、１０７：１５８９）。
【０１４５】
ＥＳＨ細胞の凝集は、ｈＶＥＧＦおよびｈＰＤＧＦ−ＢＢが補充された分化培地の存在下では、Ｉ型コラーゲン（図３Ａ）またはＭａｔｒｉｇｅｌ（図３Ｂ）への接種の前において、コラーゲン基質およびＭａｔｒｉｇｅｌ基質の両方の初期の脈管形成および脈管化に関連する出芽および管様構造体を明らかに誘導している。組織学的切片は、内皮細胞がＭａｔｒｉｇｅｌ内に入り込み、血管形成に特徴的な管様の網状構造を形成していることを明らかにしている（図３Ｃ）。驚くべきことに、そして非常に重要なことに、より高倍率での観測により、これらのインビトロ培養された脈管の内部において血液細胞が明らかにされる（図３Ｄ、矢印）。電子顕微鏡観察により、細胞の細胞質における十分に形成された内皮特異的なヴァイベル−パラーデ体（ＷＰ）、リポタンパク質カプセル（Ｌｉ）、索において内腔（Ｌｕ）を形成する内皮細胞、および、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍ）内において内皮細胞（ＥＣ）により形成された脈管の内部における造血（ＢＣ）発達がさらに明らかにされる（図３Ｅ〜図３Ｇ）。これらの結果は、単離されたヒト脈管形成性始原細胞が、規定された条件のもとで、リポタンパク質代謝、ＶＩＩＩ（ｖＷＦ）因子の産生、血液細胞、およびインビトロでの血管構造の全成分を伴う機能的な内皮細胞に分化する能力を有することを初めて明らかにしている。
【実施例４】
【０１４６】
３次元足場の脈管化
操作された組織のインビトロでの脈管化は、再生医療の非常に重要な局面であり、培養された組織の生存性を移植の前後で維持するために非常に重要である。移植のために好適である大きな直径の血管構造体は、効率的な発達および成長のために支持用の骨組（例えば、足場）を要求する。従って、ヒト脈管形成性（ＥＳＨ）始原細胞の治療的可能性を、インビトロ組織工学モデル（３次元のアルギン酸塩足場）を使用して調べた。このモデルは、ヒト脈管形成性始原体ではなく、繊維芽細胞および肝細胞からのインビトロでの組織形成を支援することが示されている（Ｓｈａｐｉｒｏ  ＬおよびＣｏｈｅｎ  Ｓ、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９９７、１８：５８３；Ｇｌｉｃｋｌｉｓ  Ｒ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０００、６７：３４４）。
【０１４７】
ヒト脈管形成性始原細胞を、記載されたように凝集させ、多孔性のアルギン酸塩足場の内部に接種したとき、足場の細孔の周りにおける明確な脈管の形成が、ｈＶＥＧＦおよびｈＰＤＧＦ−ＢＢの両方が補充された分化培地での１４日間のインキュベーションの後で観測された（図４Ａ、赤く染色されている構造体）。脈管壁構造をより高倍率で調べることにより、脈管の形態学に特徴的な、平滑筋細胞によって取り囲まれた平坦な伸びた内皮細胞が明らかにされる（図４Ｂ）。従って、ヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞を３Ｄ足場で培養することにより、正常な血管形成に忠実な、分化したヒト幹細胞を伴う方向づけられたインビトロ脈管形成に対する能力が初めて明らかにされた。
【実施例５】
【０１４８】
血管形成に対するモデルとしてのヒト脈管形成性始原細胞の分化
最近の研究では、いくつかのネズミ胚幹細胞（ｍＥＳ）システムは、血管形成プロセスの重要な事象および時系列を再現できることが明らかにされている（Ｆｅｒａｕｄ，Ｏ他、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００１、８１：１６６９）。ＶＥ−ｃａｄ欠損系統のマウス（ＶＥ−ｃａｄ−／−）から得られたｍＥＳ細胞は内皮芽を発達させることができないという観測結果はさらに重要なことであった。しかしながら、単一細胞ではなく、胚様体（ｍＥＢ）のみが、脈管形成事象をインビトロで開始させることができた。
【０１４９】
単離されたヒト脈管形成性始原細胞からの方向づけられたインビトロ血管発達が血管形成および脈管形成の生理学的プロセスを正確に反映しているかどうかを調べるために、阻害抗体の影響を、ＢＶ６（ヒト内皮細胞のインビトロでの管形成を阻害することが見出されている、ｈＶＥ−ｃａｄの特異的モノクローナル抗体）（Ｃｏｒａｄａ  Ｍ他、Ｂｌｏｏｄ、２００１、９７：１６７９）を使用して評価した。
【０１５０】
驚くべきことに、この抗ＶＥ−ｃａｄモノクローナル抗体は、ＥＳＨ細胞によるインビトロでの脈管化に対する強い阻害作用を示した。増殖因子が補充された分化培地における、Ｍａｔｒｉｇｅｌに接種されたＥＳＨ細胞のインキュベーション後７日目に、初期の脈管形成に典型的な脈管および網状構造をゲル中に明瞭に識別することができる（図５Ａ）。５０μｇ／ｍｌの抗ＶＥ−ｃａｄ抗体ＢＶ６を培地に添加することにより、脈管形成が明らかに妨げられ、不可欠な細胞出芽、ならびに管構造および網状構造の形成が阻害された（図５Ｂ）。従って、単離されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞のインビトロの方向づけられた分化は、ヒト血管形成−脈管形成の知られている阻害剤に対する感受性を示しており、そのため、血管に関連したエフェクタ−および治療を研究および評価するためのモデルを提供する。
【実施例６】
【０１５１】
脈管形成性始原体の濃縮
Ｙａｍａｓｈｉｔａ他（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２頁〜９６頁）によって教示される細胞濃度で接種されたｈＥＳ細胞を用いて行われた実験は細胞の死をもたらした（データは示されず）。そのため、ゼラチン、ラミニンまたはＩＶ型コラーゲンで被覆されたディッシュでの種々の細胞接種濃度を用いたいくつかの２Ｄ分化実験が考案され、行われた。
【０１５２】
材料および方法
非分化のままであるｈＥＳ細胞（Ｈ９．２、継代数：２９＋３６〜２９＋６０；Ｈ１３、継代数：３１〜５７；Ｉ６、継代数：３５〜５０）を不活化マウス胚フィーダー層（ＭＥＦ）上で成長させた。すべての実験が、Ｈ９．２系統およびＨ１３系統を使用して行われ、その一方で、始原体の濃縮実験および特徴づけ実験はまた、Ｉ６系統を使用して行われた。ｈＥＳ細胞を、ＩＶ型コラーゲナーゼを使用して分割し、小さい凝集体を得た。細胞を、１％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ）が補充された、５ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで処理し、その後、分化研究およびＦＡＣＳ分析を容易にするために４０μｍの網目のろ過器（Ｆａｌｃｏｎ）を使用して個々の細胞の懸濁物に分離した。未分化ｈＥＳ細胞の懸濁物を、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）が補充されたαＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）から構成される分化培地において、５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度でＩＶ型コラーゲン被覆ディッシュ（６ウエル、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）または０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）被覆ディッシュに置床した。６日間の培養の後、分化した細胞を４０μｍの網目のろ過器（Ｆａｌｃｏｎ）でろ過して、分析するか、または、ｈＶＥＧＦ１６５（５０ｎｇ／ｍｌ）またはｈＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍｌ）（ともにＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃから得られる）を含有する分化培地においてさらに１０日間〜１２日間、ＩＶ型コラーゲン被覆ディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での分化のために再培養した。
【０１５３】
クローン分析
濃縮された内皮細胞集団は、抗ＶＥ−カドヘリン−ＦＩＴＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でＦＡＣＳ分析のために免疫標識され、単一細胞が、ＩＶＦマイクロピペット（Ｃｏｏｋ）を使用して単離された。各細胞を適切な分化培地において９６ウエルプレート（ＩＶ型コラーゲン）のウエルに入れた。１時間の培養を行った後、各ウエルを、置かれた細胞数を確認するために（光学顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察の両方で）目視検査した。ＦＡＣＳではなく、機械的な単一細胞分離を使用した。なぜなら、単一のｈＥＳ細胞は、典型的には、ＦＡＣＳ分取手順の後、生存していないからである（データは示されず）。生き残った単一細胞の培養を１週間行った後に、単一細胞コロニーを認めることができた。培養後１ヶ月目に、各コロニーをＩＶ型コラゲナーゼで消化して、２４ウエルプレート（ＩＶ型コラーゲン）のウエルに移した。コンフルエントな培養物を消化して、連続培養または免疫表現型分析のいずれかのために使用した。
【０１５４】
結果
内皮始原体およびＳＭＣ始原体の単離および特徴づけ
本研究法（図１Ａ）は、３Ｄ胚様体構造が側板中胚葉細胞の分化のためには要求されないという知見に依拠した（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２〜９６）。
【０１５５】
しかしながら、Ｙａｍａｓｈｉｔａ他によって示唆された細胞濃度（１Ｘ１０５細胞／ｃｍ２〜１．５Ｘ１０５細胞／ｃｍ２）を使用する試みは、未分化コロニーと、未分化コロニーから分化した多数の細胞タイプとの両方を含む混合集団をもたらした（図６Ｂ）。
【０１５６】
ＩＶ型コラーゲン被覆ディッシュ、および、より低い細胞接種濃度（５Ｘ１０４個／ｃｍ２〜７Ｘ１０４個／ｃｍ２のｈＥＳ細胞）を使用することにより、本発明者らは、様々な特定の始原体集団に対する供給源としてより良好に役立ち得る、より均一な集団を得ることができた。この集団には、内皮始原体に類似する大きい核を伴うより小さい平坦な細胞（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２〜９６）と、線維状配置を伴う大きい平坦な細胞（図６Ｃ）との、２つのタイプの細胞が含まれた。
【０１５７】
従って、第２の接種実験（すなわち、ＩＶ型コラーゲン被覆ディッシュに接種された５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２〜７Ｘ１０４細胞／ｃｍ２）から得られる細胞集団が、特定の始原体集団を回収することを試みるさらなる実験において使用された。
【０１５８】
２つの優勢な部分集団はサイズにおいて実質的な違いを示したので、本発明の教示に従って得られた集団が４０μｍのフィルターでろ過され、従って、これにより、内皮様細胞が大きい平坦な細胞から分離された。内皮様細胞画分の分析により、ＶＥ−ｃａｄ濃縮集団（約３５％）の優先的な生存が明らかにされ、この集団は、繰り返されたろ過によってさらに濃縮された（約７５％）。内皮様細胞画分には、ＣＤ３１を発現する細胞（細胞の約６０％）、および、Ｆｌｋ−１を発現する細胞（細胞の約３０％）が含まれた（図６Ｄ）。両方の細胞画分について行われたＲＴ−ＰＣＲ分析は、内皮様細胞画分はｖ−ＳＭＣのマーカーを何ら発現していないことを示した。内皮様細胞画分の免疫表現型分析では、ＣＤ３４タンパク質の上方調節（１７±３％；ｎ＝３）、Ｔａｌ１タンパク質の上方調節（７５±８％；ｎ＝３）、およびＧａｔａ２タンパク質の上方調節（４２±１０％；ｎ＝３）が示された（図６Ｅ）。これらは、内皮／造血始原細胞の初期マーカーとして以前には示されていた（Ｋａｕｆｍａｎ  ＤＳ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２００１、９８：１０７１６〜１０７２１；Ｐｅｉｃｈｅｖ  Ｍ他、Ｂｌｏｏｄ、２０００、９５：９５２〜９５８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＳＭ他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、１２７：２４４７〜２４５９）。
【０１５９】
増殖能を評価するために、上記に記載された細胞画分をＢｒｄＵ取り込みおよびＫｉ−６７発現について分析した。ＢｒｄＵによる１２時間のパルス標識により、一部の内皮始原細胞がＢｒｄＵを取り込み、一方で、ＳＭＣ様細胞には、この能力を示すものはなかったことが明らかにされた（図６Ｆｉ〜ｉｉ）。両方の単離された画分はまた、Ｋｉ−６７（分裂中の細胞において見出される典型的な抗原）の発現について調べられた。この実験は、再培養された内皮様細胞の６６±２％（ｎ＝３）がＫｉ６７を発現し（図６Ｆｉｉｉ）、その一方で、不活化されたマウス胚繊維芽細胞（これはコントロールとして使用された）はＫｉ−６７について染色されなかった（データは示されず）。
【０１６０】
系譜分化
濃縮された始原体画分の分化能の研究では、より低い細胞接種濃度（２．５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２）でＩＶ型コラーゲン被覆ディッシュにおいて再培養することが要求された。そのような細胞が内皮細胞に連続して分化する可能性が、ｈＶＥＧＦ１６５（内皮細胞のよく知られている分裂促進因子）の存在下で調べられた。この分裂促進因子の存在は、Ｄｉｌ−アセチル化低密度リポタンパク質（Ａｃ−ＬＤＬ）の取り込み（図７Ａ）、および、ヴァイベル−パラーデ体に貯蔵されるフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の産生（図７Ｂ）を誘導した。ｖ−ＳＭＣ分化を誘導させるために、周皮細胞に対する知られている「呼び寄せ因子」、すなわち、血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）が使用された。この因子は、マウスＥＳ細胞をＳＭＣ系譜に分化させる際に効果的であることが証明されていた（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２〜９６）。ＰＤＧＦ−ＢＢにおける１０日間〜１２日間の培養を行った後、紡錘体様細胞が培養物に現れた。これらの細胞は平滑筋αアクチン（ＳＭＡ）を発現した（図７Ｃ）。他の特異的なｖ−ＳＭＣマーカー（例えば、平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ−ＭＨＣ）、ＳＭ２２およびカルデスモンなど）もまた、ＲＴ−ＰＣＲ分析（図７Ｄ）によって明らかにされるように、これらの細胞によって発現された。これらの結果は、本発明で単離された細胞がＳＭＣ表現型に分化することができることを示している。
【０１６１】
クローン分析
ｈＥＳ細胞から得られた様々な単一のＶＥ−ｃａｄ＋細胞が、これらの細胞が内皮細胞および壁細胞のための共通する始原体を含有するかどうかを明らかにするために調べられた。濃縮された脈管形成性集団から単離された様々な単一のＥ−ｃａｄ＋細胞がＩＶ型コラーゲン被覆９６ウエルプレートで再培養された。置床後１時間目に、各ウエルを、置かれた細胞数を確認するために（光学および蛍光の両方で）目視検査した。それらの分化能を調べるために、単一細胞を、ｈＶＥＧＦまたはｈＰＤＧＦ−ＢＢが補充された分化培地で培養した。単一細胞コロニーを、いずれかの条件のもとでの８日間の培養の後に観測することができた（図８Ａｉ）。置床効率は８％であったが、これは、ｍＥＳシステムについて報告されていた効率よりも低かった（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｊ他、Ｎａｔｕｒｅ、２０００、４０８：９２〜９６）。このことは、単一のｈＥＳ細胞を培養することは困難であることを示している（Ａｍｉｔ他、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ、２０００、２２７：２７１〜２７８）。
【０１６２】
ＶＥＧＦが補充された細胞培養物には、内皮細胞の形態学を有する細胞が優勢に含まれ（図８Ａｉｉ）、その一方で、ＰＤＧＦ−ＢＢが補充された培養物には、ｖ−ＳＭＣに類似する紡錘体様細胞が優勢に含まれた（図８Ａｉｉｉ）。これらの紡錘体様細胞はＳＭＡおよびカルポニンを発現した（図８Ｂｉ〜ｉｉ）。ＶＥＧＦ補充培養物では、ほとんどの細胞が、ｖＷＦの産生およびＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬの代謝によって特徴づけられ（図８Ｃｉｉｉ）、従って、内皮細胞表現型を示した。ＶＥ−ｃａｄ＋細胞を特異的な増殖因子にさらしたとき、１つの系譜への全細胞の拘束は生じなかった。ＰＤＧＦ−ＢＢ補充培養物には、ｖ−ＳＭＣマーカーを発現する細胞と、ＶＥ−ｃａｄ＋細胞として分類される細胞とが含まれた。
【０１６３】
本発明のいくつかの特徴は、明確化のために、別個の実施形態に関連して記載されているが、これらはまた、１つの実施形態において組合せで提供されている場合があることが理解される。逆に、本発明の様々な特徴が、簡潔化のために、１つの実施形態に関連して記載されているが、これらはまた、別個に、または任意の好適な部分的組合せで提供されている場合がある。
【０１６４】
本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、特許、および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１ａ】ヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する。
【図１ｂ】ヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する。
【図１ｃ】ヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する。
【図１ｄ】ヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する。
【図１ｅ】ヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する。
【図１ｆ】ヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する。
【図１ｇ】ヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する。
【図１ｈ】ヒトＥＳ細胞由来の脈管形成性始原細胞について、培養に基づいて選択するための概略、およびそのような選択を示す顕微鏡写真を提供する。
【図１ｉ】より小さいろ過された細胞（左パネル）およびより大きい保持された細胞（右パネル）の両方におけるＢｒｄＵ取り込みの顕微鏡写真であり、これらは、より小さいヒト脈管形成性始原細胞の活発な増殖を明らかにしている。
【図２ａ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｂ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｃ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｄ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｅ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｆ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｇ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｈ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｉ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｊ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｋ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｌ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図２ｍ】培養された共通する脈管形成性始原細胞の顕微鏡下での免疫蛍光研究およびＲＴ−ＰＣＲ研究であり、これらは、内皮細胞または平滑筋細胞の特徴が、特異的な増殖因子により媒介されて誘導されることを明らかにしている。
【図３ａ】増殖因子で処理されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞における血管構造の形成を示す顕微鏡写真である。
【図３ｂ】増殖因子で処理されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞における血管構造の形成を示す顕微鏡写真である。
【図３ｃ】増殖因子で処理されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞における血管構造の形成を示す顕微鏡写真である。
【図３ｄ】増殖因子で処理されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞における血管構造の形成を示す顕微鏡写真である。
【図３ｅ】増殖因子で処理されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞における血管構造の形成を示す電子顕微鏡写真である。
【図３ｆ】増殖因子で処理されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞における血管構造の形成を示す電子顕微鏡写真である。
【図３ｇ】増殖因子で処理されたヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞における血管構造の形成を示す電子顕微鏡写真である。
【図４ａ】ヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞による３Ｄアルギン酸塩足場のインビトロでの脈管化を示す組織学切片の顕微鏡写真である。
【図４ｂ】ヒト脈管形成性始原体（ＥＳＨ）細胞による３Ｄアルギン酸塩足場のインビトロでの脈管化を示す組織学切片の顕微鏡写真である。
【図５ａ】血管形成の阻害剤に対するＥＳＨ由来組織の感受性を明らかにする顕微鏡写真である。
【図５ｂ】血管形成の阻害剤に対するＥＳＨ由来組織の感受性を明らかにする顕微鏡写真である。
【図６ａ】ｈＥＳ細胞に由来する脈管始原細胞の、培養に基づく濃縮を例示する。
【図６ｂ】ｈＥＳ細胞に由来する脈管始原細胞の、培養に基づく濃縮を例示する。
【図６ｃ】ｈＥＳ細胞に由来する脈管始原細胞の、培養に基づく濃縮を例示する。
【図６ｄ】ｈＥＳ細胞に由来する脈管始原細胞の、培養に基づく濃縮を例示する。
【図６ｅ】ｈＥＳ細胞に由来する脈管始原細胞の、培養に基づく濃縮を例示する。
【図６ｆ】ｈＥＳ細胞に由来する脈管始原細胞の、培養に基づく濃縮を例示する。
【図７ａ】始原細胞における系譜分化を例示する。
【図７ｂ】始原細胞における系譜分化を例示する。
【図７ｃ】始原細胞における系譜分化を例示する。
【図７ｄ】始原細胞における系譜分化を例示する。
【図８ａ】ＶＥ−ｃａｄ＋細胞のクローン分析を例示する。
【図８ｂ】ＶＥ−ｃａｄ＋細胞のクローン分析を例示する。
【配列表フリーテキスト】
【０１６６】
配列番号１〜２２は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【配列表】
2005522213.tif 000002
2005522213.tif 000003
2005522213.tif 000004
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
2005522213.tif 000010
【図１ｃ】
2005522213.tif 000011
【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図１ｈ】
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【図１ｉ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図２ｇ】
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【図２ｈ】
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【図２ｉ】
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【図２ｊ】
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【図２ｋ】
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【図２ｌ】
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【図２ｍ】
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【図３ａ】
2005522213.tif 000031
【図３ｂ】
2005522213.tif 000032
【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図３ｆ】
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【図３ｇ】
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【図４ａ】
2005522213.tif 000038
【図４ｂ】
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【図５ａ】
2005522213.tif 000040
【図５ｂ】
2005522213.tif 000041
【図６ａ】
2005522213.tif 000042
【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
2005522213.tif 000045
【図６ｅ】
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【図６ｆ】
2005522213.tif 000047
【図７ａ】
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【図７ｂ】
2005522213.tif 000049
【図７ｃ】
2005522213.tif 000050
【図７ｄ】
2005522213.tif 000051
【図８ａ】
2005522213.tif 000052
【図８ｂ】
2005522213.tif 000053
【国際調査報告】
2005522213.tif 000054
2005522213.tif 000055