(57)【要約】本発明の実施態様は、一般には、新規な細菌抗原抽出およびその使用方法に関する。本発明のさらなる実施態様では、本発明の新規な細菌抗原が、血清または他の体液におけるバルトネラ抗体を検出するための診断キットにおいて使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素結合免疫吸着アッセイにおいて使用される新規なバルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）抗原の抽出であって、
（ａ）バルトネラ属細菌細胞を集める工程、
（ｂ）バルトネラ属細菌細胞を第１の分離物中に分離する工程、
（ｃ）第１の分離物を第１の懸濁物中に懸濁する工程、
（ｄ）第１の懸濁物を超音波処理する工程、および
（ｅ）抗原を可溶性画分中に抽出する工程
を含む前記抽出。
【請求項２】
超音波処理する前に、懸濁されたバルトネラ属細菌細胞を第２の分離物中に分離すること、および、第２の分離物を第２の懸濁物中に懸濁することをさらに含む、請求項１に記載の抽出。
【請求項３】
第１の懸濁物が界面活性剤緩衝液中にである、請求項１に記載の抽出。
【請求項４】
第２の懸濁が界面活性剤緩衝液中にである、請求項２に記載の抽出。
【請求項５】
バルトネラ属細菌細胞を成長させることをさらに含む、請求項１に記載の抽出。
【請求項６】
バルトネラ属細菌が、バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・キンタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、バルトネラ・クラリドゲイアエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｃｌａｒｉｄｇｅｉａｅ）およびバルトネラ・ビンソニイ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｖｉｎｓｏｎｉｉ）からなる群から選択される、請求項１に記載の抽出。
【請求項７】
バルトネラ属細菌細胞を分離する工程が遠心分離機において分離される、請求項１に記載の抽出。
【請求項８】
バルトネラ属細菌細胞を分離する工程がボルテックス処理をさらに含む、請求項１に記載の抽出。
【請求項９】
ペレットを溶液に懸濁する工程が緩衝化生理的食塩水溶液中にである、請求項１に記載の抽出。
【請求項１０】
界面活性剤溶液が非イオン性である、請求項３に記載の抽出。
【請求項１１】
抽出された上清を免疫アッセイにおいて溶解物として利用することをさらに含む、請求項１に記載の抽出。
【請求項１２】
免疫アッセイが酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項１１に記載の抽出。
【請求項１３】
溶解物が、バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・キンタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、バルトネラ・クラリドゲイアエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｃｌａｒｉｄｇｅｉａｅ）およびバルトネラ・ビンソニイ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｖｉｎｓｏｎｉｉ）からなる群から選択されるバルトネラ属細菌抗体の血清中の存在を検出するための診断キットの一部である、請求項１１に記載の抽出。
【請求項１４】
血清がネコから採取される、請求項１３に記載の抽出。
【請求項１５】
バルトネラ属細菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）に対する抗体の血清中の存在を検出するための診断キットであって、
バルトネラ属細菌の溶解物抗原で被覆されたプレート、および
バルトネラ属細菌溶解物に結合した抗体に結合する酵素標識されたコンジュゲート
を含む、前記診断キット。
【請求項１６】
バルトネラ属細菌の溶解物が請求項１から９のいずれか一項に従って調製される、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項１７】
コンジュゲートの可視化を可能にする基質をさらに含む、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項１８】
基質が酵素標識を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
基質が、比色測定シグナル、蛍光測定シグナルまたは化学発光シグナルを酵素標識の存在下でもたらすための組成物である、請求項１８に記載の診断キット。
【請求項２０】
陽性コントロールをさらに含む、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２１】
陰性コントロールをさらに含む、請求項１５に記載の診断キット。
【請求項２２】
読み取り装置をさらに含む、請求項１５に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物においてバルトネラ属細菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）を検出するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体および／または抗原を検出するための従来の免疫アッセイには、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）プロトコルなどの酵素免疫アッセイ、ＲＩＡ−免疫沈殿アッセイなどの放射免疫アッセイ、および免疫蛍光プロトコルが含まれる。典型的には、所定量の抗原（または抗体）が固相（タンパク質結合性の表面）に吸着させられる。抗体（抗原）について分析される試験サンプルが、その後、抗原（抗体）が結合している表面に接触させられ、試験サンプル中の抗体（抗原）が、固定化されている抗原（抗体）に結合する。放射活性な免疫グロブリンプローブまたは酵素標識されている免疫グロブリンプローブが、その後、その表面に接触させられ、固定化されている抗体（抗原）に結合する。固体担体に結合した標識されているプローブの量を定量することができ、その量により、試験サンプル中の抗体（抗原）濃度が示される。
【０００３】
放射免疫アッセイ手法を使用することの欠点には、多数の希釈工程、インキュベーション工程および洗浄工程を含む甚だしいサンプル操作が必要であることが含まれる。さらには、潜在的に有害な放射性同位体が用いられる。放射免疫アッセイプロトコルに従ってサンプルを処理することには、少なくとも数時間が費やされ、また、比較的複雑な実験設備および熟練した技術者が必要である。
【０００４】
他方で、免疫蛍光染色では、一般に、特異性が正確に示され、また、抗原−抗体反応の可視化が可能である。しかしながら、免疫蛍光方法論は、大規模で行うためには時間がかかり、大規模で行うことが困難である。さらに、免疫蛍光アッセイ結果の分析では、経験を積んだ技術者の分析的判断が要求される。さらに、感度およびイオンからの妨害が、免疫蛍光アッセイにおいて遭遇する問題点である。
【０００５】
別のタイプの免疫アッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。ＥＬＩＳＡプロトコルでは、典型的には、数段階の血清希釈物および１つの標的抗原（抗体）濃度を使用する多数の微量アッセイが伴う。マイクロタイタープレートが、典型的には、抗体（抗原）の存在を検出するために必要な多数の微量アッセイを行うために使用される。ＥＬＩＳＡマルチウエル技術は下記の手法上の類似点を有している：
１．ポリスチレン製マイクロタイタープレートのウエルが受動的吸着によって関連した抗原で感受性にされる。その後、プレートは洗浄される。
２．試験サンプルが、感受性にされたウエルにおいてインキュベーションされ、プレートが再び洗浄される。サンプルに存在する抗体がウエル表面上の固定化されている抗原に結合する。
３．酵素標識された抗Ｉｇ（すなわち、サンプルに対応する動物種に対する抗免疫グロブリン抗体）コンジュゲートがウエルにおいてインキュベーションされる。コンジュゲートは酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼなど）を含有する。コンジュゲートは任意の「捕捉」されている抗体または結合している抗体と反応する。過剰な試薬は洗い流される。
４．酵素の基質が加えられ、プレートがインキュベーションされる。分解速度が、工程２での試験サンプルにおける抗体濃度に比例する色の変化によって示される。
５．反応が停止させられるか、または阻止することができ、色の変化が、可視的に、または分光光度計でアッセイされる。
【０００６】
そのようなＥＬＩＳＡ手法は有用であり、しかし、一般には、他の免疫アッセイ技術のように、必ずしも特異的ではない。特に、バルトネラを検出するためのＥＬＩＳＡ  ＯＭＰプロセスは、低レベルで特異的でない傾向がある。
【０００７】
バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）はヒトのネコひっかき病（ＣＳＤ）の病原体であり、細菌性血管腫症、細菌性紫斑病、再発性菌血症および心内膜炎に関連している。（ロシャリメア属（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）によるネコひっかき病、細菌性血管腫症および他の感染症、Ｎ．他、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９４、３３０：１５０９頁〜１５１５頁）。ネコは、バルトネラ・ヘンセラエをヒトに移す媒介体として作用することが証拠から示されているが、ネコは自然感染に対して無症候性であるようである（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  Ｒ．菌血症および３つのネコ集団、Ｋｏｒｄｉｃｋ他、抗菌剤および化学療法に関する第３４回学際会議のアブストラクト、アメリカ微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、１９９４年）。しかしながら、いくつかの最近の研究では、実験的に感染させたネコが、発熱、食欲不振、嗜眠および末梢リンパ節障害などの臨床的徴候を発症し得ることが示されている（家ネコにおけるバルトネラ・ヘンセラエによる実験的感染および自然感染、他、Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎ  Ｆａｃｔ．Ｄｉｓ．、１９９７、２０：４１頁〜５１頁）。これらの臨床的徴候は短時間で消失し、ネコの飼い主によって気づかれないことさえあり得る。しかしながら、何回かの感染が再発する傾向がある。
【０００８】
文献では、バルトネラ・ヘンセラエによる感染に対する強い免疫応答が存在することが広く報告されている（ネコの液性免疫系によって認識されるバルトネラ特異的な免疫優勢抗原の同定、Ｆｒｅｅｌａｎｄ他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９９年７月、５５８頁〜５６６頁）。しかしながら、ネコにおけるバルトネラ・ヘンセラエの病理発生は明瞭には理解されてない。バルトネラ・ヘンセラエの検出における複雑化要因の１つが、バルトネラ・ヘンセラエが自然感染したネコは、一般に、臨床的疾患をそのような期間中に引き起こすことなく数ヶ月から数年に続くことがある菌血症の再発期間を有するということである（バルトネラ・ヘンセラエの病原性菌株が接種された子ネコにおける臨床的疾患、Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ他、ＡＪＶＲ、第６１巻、第４号、２０００年４月、３７５頁）。
【０００９】
実験的に感染させたネコの臨床的徴候に関して矛盾する報告が存在する（家ネコにおけるバルトネラ・ヘンセラエによる自然感染の実験、Ａｂｂｏｔｔ他、Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１９９７、２０：４１頁〜５１頁）。様々な研究では、実験的に感染させたネコには臨床的徴候がないことが報告されており、一方で、他の研究では、軽い発熱を含む軽度の臨床的徴候、ならびに、感染後８週間までにおける一部のネコでの組織病理学的病変が報告されている（バルトネラ・ヘンセラエ感染ネコの血液伝播の後での菌血症の再発、Ｋｏｒｄｉｃｋ他、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７、５８：４９２頁〜４９７頁）。バルトネラ・ヘンセラエを実験的に感染させた子ネコにおける他の臨床的徴候には、嗜眠および食欲不振が含まれている（バルトネラ・ヘンセラエの病原性菌株が接種された子ネコにおける臨床的疾患、Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ他、ＡＪＶＲ、第６１巻、第４号、２０００年４月、３７８頁）。別の興味深い観測結果は、バルトネラ・ヘンセラエ感染の子ネコは、臨床的徴候を１回だけ経験したバルトネラ・ヘンセラエ感染の成体ネコとは対照的に、臨床的徴候の２回の症状発現を経験したということである（同上）。
【００１０】
ペットのネコは、通常、バルトネラ感染について、または、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅに対する抗体についてスクリーニングされていない。しかしながら、血清学的スクリーニングは、感染している可能性のあるネコを選ぶことを防ぐことによって、免疫低下している飼い主にとって、または、小さい子供を有する飼い主にとって有益であり得る。これは、ネコひっかき病が、ヒトでは、特に、小さい子供および免疫低下者では、重篤になり得る疾患を生じさせ得るからである。従って、ネコをバルトネラ感染についてスクリーニングすることは望ましい。
【００１１】
上記で議論された市販の診断ツールのうち、最も一般的なものが免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）である（疑われるネコひっかき病における「ロシャリメア・ヘンセラエ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）」抗原に対する応答、Ｒｅｇｎｅｒｙ他、Ｌａｎｃｅｔ、１９９２、３３９：１４４３頁〜１４４５頁）。ＩＦＡには多くの制限がある。このアッセイは、非常に多数のサンプルを用いて行うことが困難であり、時間および費用がかかり、また、蛍光光源を備えた顕微鏡を必要とする。それ以外の一般的に使用されている免疫アッセイであるＥＬＩＳＡは、迅速で、無害で、かつ高感度である傾向を有する。従って、技術分野は、操作が比較的容易であり、また、簡便かつ無害である、バルトネラに対する抗体を検出するための方法および／または診断キットを求めることにおいてである。本発明は、１つの実施態様において、そのような方法および診断キットを提供する。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の様々な実施態様により、生物におけるバルトネラ感染に対する抗体応答を正確かつ迅速に高感度でアッセイするための方法および診断キットが提供される。
【００１３】
本発明の様々な他の実施態様により、現場にとどまりながら使用され得るバルトネラ感染用のＥＬＩＳＡ診断キットが提供される。本発明のＥＬＩＳＡ診断キットの新規性および独創性は、少なくとも部分的には、使用される抗原の新規な調製方法と、関連するキットの新規な方法との特定の組合せにある。
【００１４】
一般に、本発明の実施態様では、細菌抗原抽出の可溶性画分が素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の固相における被覆抗原として利用されるが、これに対して、先行技術の抗原は、一般には、不溶性画分またはペレット化画分、すなわち、外膜タンパク質（以降、「ＯＭＰ」と呼ばれる）に由来する。本発明の実施態様では、先行技術の免疫診断技術と比較して、高まった感度、および種特異性がより大きい反応が明らかにされる。
【００１５】
本発明の様々な実施態様のさらなる局面では、サンプル中の抗体を測定するために、遠心分離機、超音波処理器および／または吸光度読み取り装置が含まれる。
【００１６】
本明細書中で使用される用語「集める」およびその任意の活用変化形は、回収することおよび回収を意味し、回収することおよび回収を示す。本明細書中で使用される用語「被覆するために十分な体積で」は、少なくとも実質的にすべての結合した抗原（または場合により抗体）と反応するための十分な結合性成分を提供するために十分な体積を意味し、そのような体積を示す。
【００１７】
本発明の実施態様により、バルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）の細菌細胞から得られたバルトネラ抗原の新規な溶解物が提供される。さらなる実施態様では、本発明の溶解物をバルトネラ属細菌から抽出するための新規な方法が提供される。他の実施態様では、本発明の新規な溶解物が、サンプル（例えば、血清サンプルまたは他の体液など）におけるバルトネラ属細菌に対する抗体を検出するための診断キットおよび／または免疫アッセイにおいて利用される。
【００１８】
本発明の実施態様は、バルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バルトネラ・キンタナ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｑｕｉｎｔａｎａ）、バルトネラ・バチリホルミス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、バルトネラ・ビンソニイ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｖｉｎｓｏｎｉｉ）、バルトネラ・クラリドゲイアエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｃｌａｒｉｄｇｅｉａｅ）およびその他（これらに限定されない）を含むすべてのタイプのバルトネラについて溶解物を調製するために使用することができる。
【００１９】
溶解物を調製するための本発明の実施態様は一般には、下記の工程を含む、バルトネラ抗原を抽出するための新規な方法を構成する：
（ａ）バルトネラ属細菌細胞を集める工程、
（ｂ）バルトネラ属細菌細胞を分離する工程、
（ｃ）懸濁されたバルトネラ細菌細胞を超音波処理する工程、および
（ｄ）可溶性画分を抽出する工程。
本発明の抽出された可溶性画分、溶解物または上清の様々な実施態様が、様々な免疫アッセイにおいて、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの酵素結合免疫アッセイにおいて利用され得る。
【００２０】
細菌を集めること：
細菌を数多くの供給源から得ることができる。様々な実施態様において、細菌抗原が、細菌細胞などの細胞から抽出される。細胞から抗原を単離または抽出するために知られている方法は極めて多様である。異なる様々な細菌種の成分はかなり異なっているので、広範囲に適用される方法はほとんどない。細菌抗原は、１）細胞外タンパク質、鞭毛および菌体外多糖などの細胞外成分、２）細胞壁の一部、３）細胞膜の一部、および／または、４）細胞内成分であり得る。しかしながら、精製された抗原の懸濁物から得ることができる抗原は、混入する宿主物質をほとんど含んでいない。このことは、他の抗原および大きく妨害する妨害物を含まない抗原をもたらすと考えられる。
【００２１】
１つの実施態様において、バルトネラ属細菌は血液寒天フラスコで成長させられる。１つの実施態様において、バルトネラ属細菌は人口的な環境で成長させられる。人工的な環境は、バルトネラ属細菌の周りの雰囲気の構成要素の一部またはすべての濃度を変化させることによって、例えば、温度および／またはその他を変化させることによって得ることができる。
【００２２】
成長させられたバルトネラ属細菌は、この分野で一般的な任意の方法によって、例えば、スパチュラを用いてかき取ることなどによって集めることができる。別の実施態様において、細胞はガラスビーズとともに集められる。
【００２３】
細菌を集めた後、細菌抗原が抽出される。
【００２４】
抗原の抽出：
バルトネラ属細菌からの抗原の本発明の抽出では、抗原が可溶性画分（すなわち、上清）に保持される。１つの実施態様において、抽出は、バルトネラ細胞の第１の分離、生理的食塩水溶液における細胞の第１の懸濁、懸濁物を超音波処理すること、超音波処理された懸濁物を分離すること、および可溶性画分を抽出することによって行われる。これらの工程は、この分野で一般的な様式によって行うことができる。さらに、本発明の様々な実施態様において、バルトネラ細胞の第２の分離を行う工程および／または界面活性剤溶液におけるバルトネラ細胞の第２の懸濁を行う工程が含まれることがある。他の実施態様では、上記で示された工程のすべてが、抗原を抽出する際に行われないことがある。そのような示された工程は例であり、また、例示のためだけであって、必須ではない。
【００２５】
１つの実施態様において、バルトネラ細胞が遠心分離によって第１の分離物中に分離される。そのような実施態様において、細胞は、ペレットを形成させるために十分な時間にわたって遠心分離され得る。ペレットを形成させることにより、サンプルが沈降特性に基づいて分離されることが意味される。分離物のペレットは、典型的には、より大きい密度を有する部分である。ペレット部分は固体部分により定義される場合があり、かつ／または、分離物の一部分として定義される場合がある。ペレットは、このプロセスのこの段階では、細胞の抗原の一部を少なくとも含有し得る。しかしながら、他の実施態様において、ペレットは、このプロセスのこの段階では、細胞の抗原を全く含有しない。他の実施態様では、分離方法は重要でないので、他の分離方法を利用することができ、例えば、ホモジネーション、圧搾、窒素キャビテーション、浸透圧分離、低張圧分離、超音波処理、凍結−解凍、界面活性剤分離、カオトロピック剤および／または酵素処理などを利用することができる。
【００２６】
バルトネラが第１の分離物中に分離された後、分離物は第１の懸濁物中に懸濁される。１つの実施態様において、分離された細胞の第１の懸濁は生理的食塩水溶液においてであり、例えば、ｐＨ９．０でのホウ酸塩生理的食塩水溶液などにおいてである。しかしながら、他の生理的食塩水溶液を使用することができ、例えば、例として、また、限定としてではなく、リン酸塩緩衝化生理的食塩水、ｔｒｉｓ衝化生理的食塩水などを使用することができる。同様に、生理的食塩水溶液のｐＨは変化し得るが、最良の結果を得るためには、より塩基性の溶液を使用することが望ましい。第１の懸濁の後、第１の懸濁物はボルテックス処理または渦流処理され得る。溶液をボルテックス処理することにより、細菌細胞集塊物の均一な分散が助けられる。
【００２７】
懸濁された溶液は、上記のような遠心分離などによって、もう一度、第２の分離物中に分離される。上清が取り出され、廃棄され、ペレットおよび／またはペレット部分が第２の懸濁における懸濁のために保持される。好ましい実施態様において、第２の懸濁は非イオン性界面活性剤溶液においてである。界面活性剤溶液により、抗原の少なくとも一部がペレットから上清に抽出される。
【００２８】
特定の実施態様において、第２の懸濁物は、その後、凝集している細胞をさらに分離するために破壊される。好ましい実施態様において、破壊処理は、Ｂｒａｎｓｏｎモデル４５０Ｓｏｎｉｆｉｅｒなどの超音波処理器を用いて行われる。好ましい実施態様において、懸濁は、溶液の過度な加熱を防止するために、超音波処理の間、氷浴で冷却される。水冷カップホーンのようなデバイスを、場合により、懸濁物を冷却するために使用することができる。破壊処理された溶液は、その後、上記のような遠心分離などによって第３の分離物中に分離され得る。しかしながら、この分離の上清が保持され、これに対して、ペレットは廃棄される。
【００２９】
本発明の範囲には、バルトネラ属細菌の抗原を可溶性画分（すなわち、上清）に分離するために、より少ない工程および／またはより多い工程の両方を含むプロセスが含まれる。例えば、多段階の分離および／または多段階の懸濁の両方を含むプロセスを使用することができる。
【００３０】
様々な実施態様において、上清は個々のサンプルに小分けされる。これらの個々のサンプルは、必要とされるまで、凍結および／または他の場合には保存され得る。サンプルの凍結および／または保存は、本発明の溶解物に悪影響を及ぼすことが示されていない。本発明の溶解物は、サンプルの分解を経ることなく、並はずれて安定であることが見出されており、特定の実施態様では、少なくとも４年の期間にわたって持続し得る。
【００３１】
抽出された抗原は、その後、免疫アッセイにおいて直ちに使用されるか、または、そうでない場合には所望されるようにされる。
【００３２】
免疫アッセイにおける溶解物の使用：
様々な免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫アッセイ、免疫蛍光アッセイおよび放射免疫アッセイなどを、本発明の溶解物とともに使用することができる。好ましい実施態様において、免疫アッセイは、バルトネラ属細菌抽出物に対する液性免疫（抗体）応答を測定するための酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）アッセイである。
【００３３】
ＥＬＩＳＡでは、一般に、基本的な装置が要求されるだけである。典型的に、しかし、限定としてではなく、ＥＬＩＳＡでは、抗原（または抗体）を結合させるためのプレート、試薬、サンプル（例えば、血清サンプルなど）、酵素標識に連結されており、かつ、上記工程において結合抗体に結合することができる二次抗体、酵素基質、および分光光度測定読み取り装置が要求される。しかしながら、ＥＬＩＳＡ法は多様であること、および、より多くの装置またはより少ない装置を利用する様々なＥＬＩＳＡ法が本発明の実施態様とともに使用され得ることが理解される。
【００３４】
本発明の免疫アッセイを行う際に使用され得る好適なプレートおよび／またはトレーが図１に例示される。この例示的な区切られたプレート１（この実施態様では１２の区域を有するプレート）は、１２の区域を有するプレートから商業的に得ることができる。区域は一般にはウエル２と呼ばれる。望ましくは、プレートは複数の識別可能なウエルに分けられる。例えば、トレーは、区域（この場合には９６区域）を示すために底面に印を付けることができる。これは、プレート１において、１２個のセルを、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」などとして印を付け、垂直にほぼ等間隔で、数字（「１」、「２」、「３」、「４」など）を付けることによって行うことができる。従って、この実施態様の９６個の区域は、Ａ−１セル、Ａ−２セルなどとして示される。ウエル２は、この分野では一般的であるように清浄化され得る。あるいは、ペトリ皿およびマルチウエル微量滴定プレートなどを使用することができる。
【００３５】
バルトネラ抗原については、バルトネラ抗原の供給源（例えば、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ抗原など）が、１ミリリットルあたり約０．５μｇから１０μｇのタンパク質またはリポ多糖の濃度の希釈溶液でプレートの各ウエルに加えられ、抗原をトレー表面に結合させるために十分な時間インキュベーションされる。しかしながら、他の実施態様では、抗原溶液が希釈されない場合がある。
【００３６】
図１を参照すると、結合した抗原３を有するトレート１のウエル２が例示される。使用され得る他の結合溶液には、バルトネラおよび緩衝液（例えば、生理的食塩水溶液など）が、分析におけるバックグラウンド結合および偽陽性を減少させるために最適な濃度の抗原を結合させるために含まれる。多くの抗原は、結合を行わせるために室温で約２時間から４時間インキュベーションされ得る。他の抗原は、異なる条件で、例えば、３７℃で３時間、その後、４℃で一晩で、あるいは、温度および／または時間の他の組合せで優先的に結合する。
【００３７】
好ましい実施態様において、プレート１は、緩衝液溶液で、例えば、界面活性剤（例えば、ツイーン−２０など）および保存剤（例えば、チメロサールなど）を伴うＰＢＳなどで洗浄される。しかしながら、他の実施態様では、プレート１は、被覆の前に、緩衝液で洗浄されないことがある。ＥＬＩＳＡ希釈液（ツイーン−２０および５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂スキムミルクを含む）を、被覆するために十分な体積で、ＥＬＩＳＡ希釈液として使用することができる。抗原を結合させた後、過剰な溶液は廃棄される。トレーの各区画は、このときには結合した抗原を有しており、抗原とのインキュベーションの後で露出したままにされていたプラスチックの結合部位に不活性な物質を結合させる目的で、ブロッキング剤（例えば、アルブミン、脱脂乳、オバルブミン、ゼラチン、血清など）の溶液で再び満たされる。この工程は、特定の抗原に向けられていない抗体分子の非特異的な吸着を減少させ、また、比色測定工程において重要であるコンジュゲートの非特異的な吸着を減少させる。溶液は室温でさらに４５分間インキュベーションされ、廃棄される。
【００３８】
その後、血清サンプルが、所定の濃度で、少なくとも１つのウエルに、被覆するために十分な体積で加えられる。１つの実施態様において、濃度は既知である。好ましい実施態様において、多数の濃度が、例えば、ＥＬＩＳＡプレート１における血清サンプルを連続希釈することなどによって使用される。１つの実施態様では、プレート１において、１２個のサンプル（Ａ〜Ｌ）を処理することができる。それぞれのサンプルが、例えば、１：１Ｋの希釈〜１：１２８Ｋの希釈（すなわち、１、２、４、８、１６、３２、６４、１２８）まで連続希釈され得る。プレート１は、結合している抗原３に対する血清サンプル中の抗体４の少なくともある程度の結合を行わせるために十分な時間インキュベーションされ得る（図２を参照のこと）。好ましい実施態様において、血清が、約３７℃で約１時間、ウエル２でインキュベーションされた。
【００３９】
インキュベーション後、血清および希釈液が捨てられ、ウエルが、ウエル２のいずれかに残留している血清を除くために十分に洗浄される。好ましい実施態様において、プレート１は、少なくとも４回、緩衝剤溶液（例えば、ＰＢＳなど）で洗浄される。
【００４０】
次に、種特異的な酵素結合の抗免疫グロブリンの形態でのコンジュゲートが試験プレートに加えられる。様々なコンジュゲートが市販されている。ほとんどがヤギまたはウサギで作製されている。しかしながら、この分野で一般的な他のコンジュゲートを使用することができる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲート化されたヤギ抗ネコ免疫グロブリンを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏ．またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙなどから得ることができる。バルトネラ属細菌を診断する場合、コンジュゲートは、いくつかの実施態様では、酵素が化学的に結合している（コンジュゲート化されている）抗ネコ免疫グロブリンである。好ましい実施態様において、西洋ワサビペルオキシダーゼが、抗原３に対する抗体４の存在または非存在を確認するために、抗ネコのＩｇＧ画分にカップリングさせられる。一般に、特定の希釈度（例えば、１：２Ｋなど）でのコンジュゲートが各ウエルに加えられ、（抗体４が存在する場合には）コンジュゲート５の少なくとも一部が抗体４に結合することを可能するために所定の時間および特定の条件のもとでインキュベーションされる。
【００４１】
インキュベーション後、血清および希釈液が捨てられ、ウエルが、ウエル２のいずれかに残留している血清を除くために十分に洗浄される。好ましい実施態様において、プレート１は、少なくとも４回、緩衝剤溶液（例えば、ツイーン−２０を伴うＰＢＳなど）で洗浄される。
【００４２】
工程ｂ）の溶液の安定化が、酵素標識された抗体を安定かつ実質的に純粋に保つＨＲＰコンジュゲート安定化溶液において溶液を４℃で保存することによって達成され得る。特定の実施態様において、ＨＲＰコンジュゲート安定化溶液は５０％（体積／体積）の蒸留水およびグリセロールを含有する。
【００４３】
特定の実施態様において、基質は、コンジュゲートを抗体に結合させる前では、コンジュゲートとの反応に供されていない。そのような場合、ＴＭＢ基質（これは、Ｋｉｒｋｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている）などの基質を、被覆するために十分な体積で、ウエル２に加えることができる。基質は、結合した抗体４の可視化を可能にするために、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどのクロモゲン、例えば、ＴＭＢ（これはＫｉｒｋｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙによって販売されている）（米国特許第５，０１３，６４６号を参照のこと；これは参照して本明細書により組み込まれる）などであり得る。
【００４４】
様々な実施態様において、基質６は、コンジュゲート５と反応する種類のいずれかの基質であり得る。特定の実施態様において、基質６は有色化合物をもたらす。例えば、ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビから得られるペルオキシダーゼなど）は、アミノサリチル酸および過酸化水素と反応したとき、またはｐ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素と反応したとき、またはテトラメチルベンジジンおよび過酸化水素と反応したとき、青色をもたらす。ウリックオキシドのような他の物質を、アクセプターとして、過酸化水素の代わりに使用することができる。アルカリホスファターゼは、ジニトロフェニルホスファートと反応したとき、黄色をもたらす。β−ガラクトシダーゼはｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドと反応して、紫色を与える。
【００４５】
本発明の方法を行う際に有用な酵素標識を有するいくつかの一般的なコンジュゲートには、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼがある。他の酵素、例えば、米国特許第４，２７５，１４９号に見出される列挙された酵素なども許容され得る。
【００４６】
様々な基質および発色団を、これらの酵素との使用のために利用することができる。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼでは、有色生成物を生じさせるために、Ｈ２Ｏ２、および下記の例示的なクロモゲンの１つまたは複数が用いられる：５−アミノサリチル酸、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルファミン酸）、ｏ−ジアニシジン、ｏ−フェニレンジアミンおよび３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなど。この酵素および他の酵素に対する他の例が米国特許第４，２９９，９１６号（これは参照して本明細書により組み込まれる）に示されている。好適な発色団のさらなる例には、ペルオキシダーゼ（これは、発色性基質およびアクセプター（例えば、過酸化水素またはウリックオキシドなど）を要求する）およびヒドロラーゼ（これは発色性基質のみを要求する）がある。
【００４７】
本発明の方法ではさらに、サンプル中の抗体を測定するためのコンピューター化された読み取りプロトコルが含まれ得る。許容され得る読み取り装置の一例が、Ｔｒｏｔｔｉｅｒ、Ｙ．Ｌ．他（１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０：４６〜５３）によって記載されるタイプに類似するものである。他の実施態様では、Ｅｌｘ８０８ＢｉｏＴｅｋなどの二波長読み取り装置が使用される。しかしながら、読み取り装置はこの分野では広く知られており、任意の好適な読み取り装置で十分である。
【００４８】
様々な実施態様において、本発明の読み取り装置は携帯型の読み取り装置である。携帯型の読み取り装置により、本発明の様々な実施態様が操作時に現場に持ち出されることが可能になる。他の実施態様では、この分野では一般的であるように、視覚的に読み取ることができるカラーチャートが利用される。
【００４９】
本発明の別の実施態様によれば、ネコなどの生物の血清においてバルトネラ抗体をアッセイするためのＥＬＩＳＡ診断キットが提供される。本発明のＥＬＩＳＡ診断キットは、別個のパッケージにおいて、下記の少なくとも１つを含む：
ａ）ネコの血清に存在する抗バルトネラ抗体に対して特異的な結合を生じさせるための精製されたバルトネラ抗原が結合しているプレートまたは固体担体；
ｂ）陽性コントロールとして使用される、バルトネラ属の種、亜種および／または菌株が実験的に接種されたネコから得られた血清；
ｃ）陰性コントロールとして使用される、特定の病原体を含まない集団から得られたネコ血清；および
ｄ）プレートまたは他の固相に結合しているネコ抗体に結合する酵素標識されたコンジュゲート。
【００５０】
工程ａ）の抗原は、固体担体に結合したとき、被覆緩衝液中において４℃で保存することによって安定化され得る。しかしながら、他の安定化法を利用することができる。
【００５１】
本発明のＥＬＩＳＡ診断キットはさらに、
ｅ）検出可能に標識されたコンジュゲートの可視化を可能にする基質
を含むことができる。
【００５２】
本発明の別の実施態様によれば、下記の工程を含む、本発明のキットを調製するための方法が提供される：
ａ）前記抗原細菌粗抽出物の遠心分離によってバルトネラ抗原を精製する工程；ｂ）工程ａ）の抗原を固体担体に固定し、前記固定された抗原を安定化させる工程；ｃ）バルトネラ属細菌の菌株で哺乳動物を免疫化し、陽性コントロール血清として使用するための血清を回収する工程；およびｄ）陰性コントロール血清として使用するためのバルトネラ非含有集団由来の血清を回収する工程。
【００５３】
本発明の診断キットのさらなる実施態様は、事前にパッケージされた陽性血清（現在、これは市販されていない）および／または陰性血清を含む。
【００５４】
本発明のキットは、新規な溶解物が利用され、また、動物病院または研究室などの現場での簡便かつ迅速な試験が可能であるという点で新規である。本発明のキットは、約３ヶ月の貯蔵安定性を有するという点で十分に安定である。改善された感度および貯蔵安定性は本発明の新規な溶解物調製の産物である。
【００５５】
本発明のキットは容易に使用され、迅速な結果をもたらす。単純な工程のみを行うことが必要とされるだけであるので、本発明のキットは、経験が非常に少ない獣医師によって使用することができ、また、動物が飼育されている現場で使用することができ、実験上の技術を必要としない。さらに、本発明のキットは、非常に信頼でき、かつ再現性のある結果をもたらすことが明らかにされた。
【００５６】
本発明のキットとともに含まれ得る他の付属物には、スパチュラ、バイアル、脱イオン水、事前に混合された緩衝液、および／またはブロッキング剤などが含まれる。しかしながら、他の試験キット設計が当業者には明らかであり得る。そのようなキットのすべてが本発明によって包含されることが意図される。
【００５７】
本発明は下記の実施例によってさらに例示される。
【００５８】
（実施例）
実施例では、当業者に知られていると見なされる多数の微生物学的技術および免疫学的技術が含まれることに留意しなければならない。そのような技術の開示が、例えば、Ｐｒｅｓｃｏｔｔ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（第３版、Ｗｍ．Ｃ．Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、およびＨａｒｌｏｗ他、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ；これは参照して本明細書により組み込まれる）に見出され得る。同様に、本明細書中に記載されている検出方法および類似する間接的な免疫細胞化学的方法において使用される具体的な試薬およびプロトコルは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８；その本文は参照して本明細書により組み込まれる）に見出される基準などの確立された基準に基づいて、この分野で利用できる試薬およびプロトコルから選択することができる。これらの実施例は単なる例示にすぎず、他の手順が使用され得ることもまた、当業者によって理解される。本特許の範囲を理解するために、実施例に続く請求項に留意しなければならない。
【実施例１】
【００５９】
サンプルの定義
本発明の新規な溶解物アッセイを比較するために、２９個のサンプルが本発明の新規な溶解物調製に従って処理され、２９個のサンプルが先行技術の外膜タンパク質（ＯＭＰ）調製に従って処理された。これらのサンプルは下記のように定義される：
【００６０】
【表１】
2005530998.tif 000002
【実施例２】
【００６１】
バルトネラ属細菌を成長させること
ａ．トリトン溶解物の場合
本実施例では、本発明の実施態様において使用されるバルトネラ・ヘンセラエ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ  ｈｅｎｓｅｌａｅ）抗原（Ａｇ）の調製および配合が記載される。
【００６２】
実験において、Ｃｏｌｕｍｂｉａ血液寒天の１０個の１５０ｃｍ３フラスコに、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅの１：６希釈物の１．５ｍｌが接種された。だが、他のバルトネラ種を使用することができる。接種されたフラスコは、１０％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で、Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の水冷ジャケット付インキュベーターでインキュベーションされた。培養物を７２時間成長させた。培養物を、直径が２ｍｍの滅菌ガラスビーズおよび約３ｍｌ／フラスコの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ）とともに集めた。取り除かれた細菌はピペットによってフラスコから回収された。ガラスビーズを１０ｍｌ／フラスコのＨＥＰＥＳで洗浄して、残留している取り除かれた細菌を回収した。
【００６３】
回収された細菌を、その後、Ｏａｋｒｉｄｇｅチューブにまとめ、４℃の環境で３，０００ＲＰＭにおいて１０分間、Ｍｉｓｔｒａｌ３０００ｉ遠心分離機で遠心分離した。その後、遠心分離から得られたペレットを２５ｍｌのホウ酸塩生理的食塩水溶液（ｐＨ９）に再懸濁した。ホウ酸塩生理的食塩水溶液は、８０ｍｌの１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍｌの０．５Ｍ  Ｈ３ＢＯ３、２４ｍｌの１．０Ｎ  ＮａＯＨ、および７９６ｍｌの蒸留Ｈ２Ｏからなる組成を有した。その後、ホウ酸塩生理的食塩水溶液に再懸濁されたペレットをボルテックス処理して、上記のように遠心分離した。
【００６４】
得られたペレットを除くすべての物質が廃棄された。その後、ペレットを、１％のトリトンＸ−１００（これはＴｒｉｔｏｎによって販売されている）を含む６ｍｌのホウ酸塩生理的食塩水溶液（ｐＨ９）に再懸濁した。その後、ペレットを、液体部分の中に挿入された超音波処理器のプローブにより、５０％の負荷サイクル、最大出力レベルで５分間、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒモデル４５０で超音波処理した。超音波処理は温度抑制のために氷上で行われた。その後、超音波処理された部分を上記のように遠心分離した。その後、得られた上清を１ｍｌのサンプルに小分けし、使用まで−２０℃で凍結した。
【００６５】
ｂ．ＯＭＰの場合
本実施例のこの部分では、本発明の実施態様において使用されるバルトネラ・ヘンセラエの外膜タンパク質の調製および配合が記載される：
１）Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅをＣｏｌｕｍｂｉａ血液寒天において成長させた（５個の１７５ｃｍ２フラスコ）。
２）Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅを、滅菌ガラスビーズ、１０ｍｌ／フラスコの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳとともに集めた。
３）細胞を、２０℃で２０分間、遠心分離機（Ｍｉｓｔｒａｌ３０００ｉ）において３０００ＲＰＭでペレット化した。上清を捨て、４℃で一晩保存する。
４）ペレットを１０ｍｌの１０ｍｍ  ＨＥＰＥＳに再懸濁した。再懸濁物を、２０℃で１０分間、遠心分離機（Ｍｉｓｔｒａｌ３０００ｉ）において３０００ＲＰＭでペレット化する。上清を捨て、ペレットを１０ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳに再懸濁する。その後、懸濁されたペレットを氷上に置いた。
５）その後、懸濁されたペレットを、４５秒の休止間隔を伴って１５秒間隔で１５分間、７０％の負荷サイクル、出力＝６（６／１０）で、沈められたマイクロチップを使用してＢｒａｎｓｏｎ４５０Ｓｏｎｉｆｉｅｒで超音波処理した。
６）その後、超音波処理されたペレットを１ｍｌの小分け物に分けて、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５４０２で２分間、４℃において１３，０００ＲＰＭで遠心分離した。その後、上清を清浄なチューブに移し、３０分間、上記のように遠心分離した。
７）その後、それぞれのペレットを、２％のサルコシルを含む２００ｕｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳに再懸濁した。その後、それぞれの再懸濁されたペレットを、ときどき混合しながら１時間、氷上に置いた。
８）その後、再懸濁されたペレットを、３０分間、上記のように遠心分離した。その後、上清を取り出した。
９）ペレットを２００ｕｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳに再懸濁し、−２０℃で凍結した。
【００６６】
Ｃ．抗血清の調製−陽性コントロール
好適な陽性の抗血清コントロールを、この分野では一般的であるように、供給者から購入することができる。
【００６７】
Ｄ．抗血清の調製−陰性コントロール
好適な陰性の抗血清コントロールを、この分野では一般的であるように、供給者から購入することができる。
【実施例３】
【００６８】
プレートの被覆
Ａ．バルトネラ・ヘンセラエに関するトリトン溶解物
１．適切な希釈度の決定
表１には、Ｇｒｅｉｎｅｒプレートが、実施例２に従って調製されたＢ．ｈｅｎｓｅｌａｅのトリトン溶解物を用いて４℃で一晩被覆された実験から得られた吸光度値が例示される。既知の陽性（コントロール）血清が、新規なトリトン溶解物の適正な被覆希釈度を決定するために、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅのトリトン溶解物に対して交差力価測定された。表２には、４℃で一晩被覆されたＧｒｅｉｎｅｒプレートを使用して、実施例１に従って調製されるように被覆された別のプレートにおける抗原に対して交差力価測定された既知の陰性（コントロール）血清についての吸光度値が例示される。プレートを被覆するために、抗原（Ａｇ）を、１〜６の縦列で、プレート全体で１：５００から始まって２倍づつ連続希釈した。７〜１２の縦列はＰＢＳのみを含有した。
【００６９】
プレートを、５％のＣａｒｎａｔｉｏｎ乾燥脱脂乳、０．１％のツイーン−２０および０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳからなる血清希釈液を用いて、ウエルあたり２００μｌで、３７℃で１時間ブロッキング処理した。その後、プレートを、０．１％のツイーン−２０および０．０１％のチメロサールを含むＰＢＳからなる洗浄緩衝液で１回洗浄した。表１に記載されるプレートについては、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅに対する陽性の血清が、１：１Ｋから始まってプレートの下に向かって２倍づつ血清希釈液で連続希釈された。表２に記載されるプレートについては、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅに対する陰性の血清が、１：１Ｋから始まってプレートの下に向かって２倍づつ血清希釈液で連続希釈された。プレートを、その後、３７℃で６０分間インキュベーションして、洗浄緩衝液で４回洗浄した。その後、血清希釈液において１：２Ｋで希釈されたヤギ抗ネコＩｇＧの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識された二次抗体を加え、プレートを３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、プレートを４回洗浄して、２成分ＴＭＢ基質を加えた。その後、プレートを暗所において室温で１０分間インキュベーションし、発色を１００μｌ／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度を二波長においてマイクロタイタープレート読み取り装置（ＩＣＮ  Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ｂｉｃｈｒｏｍａｔｉｃ）で読み取った。参照波長（５４０ｎｍ）での吸光度が、それぞれのウエルについて、主波長（４５０ｎｍ）での吸光度から引かれた。
【００７０】
表１
１から６までの数字が付けられた縦列には、溶解物被覆抗原の連続希釈物の吸光度値が例示される。７〜１２の縦列には、ベースラインを明らかにするための緩衝液だけの被覆抗原コントロールの吸光度値が例示される。横列の値は、陽性血清の連続希釈物の吸光度値に対する連続希釈度である。
【００７１】
【表２】
2005530998.tif 000003
【００７２】
表２
１から６までの数字が付けられた縦列には、溶解物被覆抗原の連続希釈物の吸光度値が例示される。７〜１２の縦列には、ベースラインを明らかにするための緩衝液だけの被覆抗原コントロールの吸光度値が例示される。横列の値は、陰性血清の連続希釈物の吸光度値に対する連続希釈度である。
【００７３】
【表３】
2005530998.tif 000004
【００７４】
これらの結果から、本発明の溶解物調製物は、ゼロに近いバックグラウンドを有する非常に明快なアッセイをもたらしていることが例示される。被覆のための最適な濃度は１Ｋから２Ｋの間であるようである。
【００７５】
２．Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅまたはクラミジアのいずれかが感染したネコからのスクリーニング
６枚のＧｒｅｉｎｅｒ  Ｍｉｃｒｏｌｏｎプレートを、１：２Ｋの濃度で、実施例１に従って調製されたＢ．ｈｅｎｓｅｌａｅのトリトン溶解物で被覆し、プレートの左側においてＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて４℃（以前のプレートから決定された値）で一晩インキュベーションした（＋）。プレートの右側はＰＢＳのみで被覆された（−）。プレートを１回洗浄し、０．１％ツイーン−２０、０．０１％のチメロサールおよび５％のＣａｒｎａｔｉｏｎ乾燥脱脂乳を伴うＰＢＳを含む２００μｌ／ウエルの血清希釈液を用いて３７℃で４５分間ブロッキング処理した。その後、プレートを１回洗浄し、その後、１：１Ｋから始まり、プレートの下に向かって２倍ずつ下げて、プレートの＋側および−側の両方で連続希釈した。その後、プレートを３７℃で１時間インキュベーションして、４回洗浄した。その後、１００μｌ／ウエルのヤギ抗ネコＩｇＧ−ＨＲＰを、（上記で規定されたように）血清希釈液での１：２Ｋの希釈度で、プレートにおいて３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、プレートを４回洗浄して、１００μｌのＫ＋Ｐ  ＴＭＢ基質をウエルあたり加えた。プレートを、上記のように、室温で１０分間、暗所に放置し、その後、１００μｌの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、直ちに４５０ｎｍから５４０ｎｍで読み取った。
【００７６】
表１
溶解物調製サンプルの調整前の吸光度値が、最初の採血の前にＢ．ｈｅｎｓｅｌａｅ生菌で抗原投与された６匹のネコ（１〜６）について下記に示される。縦列の見出し部は下記のような血清定義である：サンプル１〜６は、抗原投与されたネコ１〜６に由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル１ａ〜６ａは、ベースラインを明らかにするためのコントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００７７】
【表４】
2005530998.tif 000005
【００７８】
表２
溶解物調製物の調整前の吸光度値が、抗原投与後の４週間での上記の６匹のネコについて下記に示される。縦列の見出し部は下記のような血清定義である：サンプル７〜１２は、抗原投与後４週間目の抗原投与されたネコ１〜６に由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル７ａ〜１２ａは、ベースラインを明らかにするためのコントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は血清希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００７９】
【表５】
2005530998.tif 000006
【００８０】
表３
溶解物調製物の調整前の吸光度値が、抗原投与後の１２週間での上記の６匹のネコについて下記に示される。縦列の見出し部は下記のような血清定義である：サンプル１３〜１８は、抗原投与後１２週間目の抗原投与されたネコ１〜６に由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル１３ａ〜１８ａは、ベースラインを明らかにするためのコントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００８１】
【表６】
2005530998.tif 000007
【００８２】
表４
溶解物調製物の調整前の吸光度値が、クラミジアで抗原投与された６匹のネコについて下記に示される。縦列の見出し部は下記のような血清定義である：サンプル１９〜２４は、抗原投与されたネコに由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル１９ａ〜２４ａは、ベースラインを明らかにするためのコントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００８３】
【表７】
2005530998.tif 000008
【００８４】
表５
溶解物調製物の調整前の吸光度値が、クラミジアで抗原投与された３匹のネコ（１３〜１５）について下記に示される。さらに、陽性の血清サンプルおよび陰性の血清サンプルが処理された。縦列の見出し部は下記のような血清定義である：サンプル２５〜２７は、抗原投与されたネコ１３〜１５に由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル２８は陰性の血清コントロールである。サンプル２９は陰性の血清コントロールである。サンプル３０〜３４は、ベースラインを明らかにするためのコントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００８５】
【表８】
2005530998.tif 000009
【００８６】
Ｂ．ＯＭＰ
比較のために、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅの外膜タンパク質（ＯＭＰ）抗原（Ａｇ）調製物を被覆抗原として用いるアッセイが、上記の新規な溶解物に対する手順に従って行われた。
【００８７】
６枚のＧｒｅｉｎｅｒ  Ｍｉｃｒｏｌｏｎプレートを、プレートの左側において、０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）における１８７ｍｇ／ｍｌの濃度で、実施例２に従って調製されたＢ．ｈｅｎｓｅｌａｅのＯＭＰを用いて４℃で一晩被覆した。プレートの右側は０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液のみで被覆された。プレートを１回洗浄して、２００μｌ／ウエルの血清希釈液でブロッキング処理し、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、プレートを１回洗浄し、その後、血清を、１：１Ｋから始まり、プレートの下に向かって２倍ずつ下げて、プレートの＋側および−側の両方で連続希釈した。その後、プレートを３７℃で１時間インキュベーションして、４回洗浄した。次いで、１００μｌ／ウエルのヤギ抗ネコＩｇＧ−ＨＲＰを、（上記で規定されたように）血清希釈液での１：２Ｋの希釈度で、プレートにおいて３７℃で４５分間インキュベーションした。その後、プレートを４回洗浄して、１００μｌのＫ＋Ｐ  ＴＭＢ基質を各ウエルに加えた。プレートを、上記のように、１０分間、室温で暗所においてインキュベーションし、その後、１００μｌ／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、直ちに４５０ｎｍ−５４０ｎｍで読み取った。
【００８８】
表１
ＯＭＰ調製物の調整前の吸光度値が、最初の採血の前に上記の抗原投与されたネコについて下記に示され、これらは、最初の採血の前に得られた溶解物調製物に対する血清に対応する。縦列の見出し部は下記のようなサンプルである：サンプル１〜６は、抗原投与されたネコ１〜６に由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル１ｂ〜６ｂは、コントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００８９】
【表９】
2005530998.tif 000010
【００９０】
表２
ＯＭＰ調製物の調整前の吸光度値が、抗原投与後の４週間での上記の６匹のネコについて下記に示され、これらは、抗原投与後の４週間目に得られた溶解物調製物に対する血清に対応する。縦列の見出し部は下記のようなサンプルである：サンプル７〜１２は、抗原投与後４週間目の抗原投与されたネコに由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル７ｂ〜１２ｂは、コントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００９１】
【表１０】
2005530998.tif 000011
【００９２】
表３
ＯＭＰ調製物の調整前の吸光度値が、抗原投与後の１２週間での上記の６匹のネコ（１〜６）について下記に示され、これらは、抗原投与後の１２週間目に得られた溶解物調製物に対する血清に対応する。縦列の見出し部は下記のようなサンプルである：サンプル１３〜１８は、抗原投与後１２週間目の抗原投与されたネコに由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル１３ｂ〜１８ｂは、ベースラインを明らかにするためのコントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００９３】
【表１１】
2005530998.tif 000012
【００９４】
表４
ＯＭＰ調製物の調整前の吸光度値が、クラミジアで抗原投与された６匹のネコ（７〜１２）について下記に示され、これらは、ネコ７〜１２について上記で得られた溶解物調製物に対する血清に対応する。縦列の見出し部は下記のようなサンプルである：サンプル１９〜２４は、抗原投与されたネコ７〜１２に由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル１９ｂ〜２４ｂは、ベースラインを明らかにするためのコントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示されるサンプル定義を参照する。
【００９５】
【表１２】
2005530998.tif 000013
【００９６】
表５
ＯＭＰ調製物の調整前の吸光度値が、クラミジアで抗原投与された３匹のネコ（１３〜１５）について下記に示され、これらは、ネコ１３〜１５について上記で得られた溶解物調製物に対する血清に対応する。さらに、対応する陽性の血清サンプルおよび陰性の血清サンプルが処理された。縦列の見出し部は下記のようなサンプルである：サンプル２５〜２７は、抗原投与されたネコ１３〜１５に由来する血清から得られた吸光度値である。サンプル２８は陰性の血清コントロールである。サンプル２９は陰性の血清コントロールである。サンプル２５ｂ〜２９ｂは、ベースラインを明らかにするためのコントロールとして使用された緩衝液のみの縦列から得られた吸光度値である。横列の見出し部は希釈度である。これらの定義は、実施例１に示される定義である。
【００９７】
【表１３】
2005530998.tif 000014
【実施例４】
【００９８】
調整された生データ値
Ａ．溶解物調製物の調整後の値
下記の表における値は、本発明の新規な溶解物調製物に対する調整された光学濃度値である。調整された値は、プレートの緩衝液のみ（右）側の調整前のＯＤ値をプレートのＡｇ被覆（左）側における対応するウエルから引くことによってコンピューター処理された。
【００９９】
カットオフ光学濃度値が、プレートの緩衝液のみ（右）側の平均値＋プレートの緩衝液のみ（右）側の３標準偏差を採用することによって計算された。サンプル１〜６に対するカットオフ値は０．０５８であった。サンプル７〜１２に対するカットオフ値は０．０３２であった。サンプル１３〜１８に対するカットオフ値は０．０４０であった。サンプル１９〜２４に対するカットオフ値は０．０７４であった。サンプル２５〜２９に対するカットオフ値は０．０３７であった。
【０１００】
【表１４】
2005530998.tif 000015
【０１０１】
アッセイは非常に明快であった。プレートの右側におけるバックグラウンドＯＤシグナルは、存在する場合でも、ほとんどない程度であった。
【０１０２】
Ｂ．ＯＭＰ調製物の調整後の値
下記の表における値は、本発明の先行技術のＯＭＰ調製物に対する調整された光学濃度値である。調整された値は、プレートの緩衝液のみ（右）側の調整前のＯＤ値をプレートのＡｇ被覆（左）側における対応するウエルから引くことによってコンピューター処理された。
【０１０３】
カットオフ光学濃度値が、プレートの緩衝液のみ（右）側の平均値＋プレートの緩衝液のみ（右）側の３標準偏差を採用することによって計算された。サンプル１〜６に対するカットオフ値は０．０８８であった。サンプル７〜１２に対するカットオフ値は０．０９２であった。サンプル１３〜１８に対するカットオフ値は０．０４９であった。サンプル１９〜２４に対するカットオフ値は０．０３０であった。サンプル２５〜２９に対するカットオフ値は０．０２９であった。
【０１０４】
【表１５】
2005530998.tif 000016
【０１０５】
ＯＭＰ調製物では、血清濃度がより大きい場合、バックグラウンドノイズが増大していることが明らかにされる。
【実施例５】
【０１０６】
終点の比較
２９個のサンプルの比較により、本発明の新規な溶解物調製物は、血清濃度がより高い場合でもバックグランドノイズがほとんどないことが例示される。アッセイにおいてバックグラウンドがほとんどないことは、より少ない偽陽性をもたらし、かつ、全体的により正確なアッセイをもたらす。
【０１０７】
先行技術のＯＭＰ調製物と比較して本発明の新規なアッセイをさらに分析するために、前記の２９個のサンプルの終点滴定値が下記の表で比較された。
【０１０８】
【表１６】
2005530998.tif 000017
2005530998.tif 000018
【０１０９】
２つのアッセイの比較により、本発明の新規な溶解物調製物のバックグラウンドノイズがほとんどないバックグラウンドノイズをもたらしたという予想外の結果が得られた。このことは、それにより、偽陽性がはるかに少なくなっているということを示している。サンプル１〜６は、すべてがネコからの採血前であり、本発明の新規な溶解物のもとでは予想されたように陰性であった。しかしながら、サンプル１〜６は、ＯＭＰ調製物のもとで処理されたとき、６例中５例で陽性の結果を示した。サンプル７〜１２を参照することにより、抗原の濃度が増大するに従い、新規な溶解物調製物およびＯＭＰ調製物から得られた結果がより匹敵し得るほどであることが例示される。この観測結果はサンプル１３〜１８によってさらに確認される。サンプル１９〜２７は、Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅに対して陰性な抗体であると予想されるサンプルであるが、先行技術のＯＭＰ調製物のもとでは９例中５例で陽性の結果が明らかにされ、しかし、新規な溶解物調製物のもとでは９例中９例で陰性の結果が明らかにされた。
【０１１０】
先行技術の調製物のもとでのさらなる誤った結合（偽陽性）がサンプル２８の陰性血清ウエルによって明らかにされた。先行技術のＯＭＰ調製物は陽性の読み取りをもたらし、これに対して、本発明の新規な溶解物調製物は、予想されたように陰性の読み取りをもたらした。
【０１１１】
従って、本発明の新規な溶解物調製物は、先行技術のＯＭＰ調製物と比較したとき、より低いバックグラウンド、および特異的な結合をもたらしている。
【実施例６】
【０１１２】
低希釈度での比較
さらなる実験が行われた。この実験では、３枚のプレート（プレート１、２および３）が炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）において１８７μｇ／ｍｌでのＢ．ｈｅｎｓｅｌａｅのＯＭＰ調製物で被覆され、別の３枚のプレート（プレート４、５および６）がＰＢＳ（ｐＨ７．４）において１：２Ｋの濃度でのＢ．ｈｅｎｓｅｌａｅ溶解物で被覆された。プレートの上側半分が抗原で被覆され、一方、下側半分がコントロールとして緩衝液のみで被覆された。すべてのプレートは４℃で一晩被覆され、その後、洗浄緩衝液で１回洗浄された。プレートを２００μｌ／ウエルの血清希釈液でブロッキング処理し、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、プレートを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
【０１１３】
上記からの血清サンプル１〜２９を、１：１００から始まって、プレートの上側半分および下側半分の両方で血清希釈液において４倍ずつ連続希釈した。プレートを３７℃で１時間インキュベーションして、４回洗浄した。二次抗体コンジュゲート（ＨＲＰ標識されたヤギ抗ネコＩｇＧ）を血清希釈液で１：２Ｋ希釈して加え、プレートを３７℃で１時間インキュベーションした。プレートを４回洗浄して、Ｋ＋Ｐ  ＴＭＰ基質を加えた。反応を、上記のように、１００μｌ／ウエルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で１０分後に停止させ、読み取りを４５０ｎｍ−５４０ｎｍで直ちに行った。下記の表１、表２および表３には、生データが含まれる：
Ａ．生データ
表１
表１は、サンプル１〜１２に対する先行技術ＯＭＰ調製物のアッセイから得られた生データである。
【０１１４】
【表１７】
2005530998.tif 000019
【０１１５】
表２
表２は、サンプル１３〜２４に対する先行技術ＯＭＰ調製物のアッセイから得られた生データである。
【０１１６】
【表１８】
2005530998.tif 000020
【０１１７】
表３
表３は、サンプル２５〜２９に対する先行技術ＯＭＰ調製物のアッセイから得られた生データである。
【０１１８】
【表１９】
2005530998.tif 000021
【０１１９】
表４
表４は、サンプル１〜１２に対する新規な溶解物調製物のアッセイから得られた生データである。
【０１２０】
【表２０】
2005530998.tif 000022
【０１２１】
表５
表５は、サンプル１３〜２４に対する新規な溶解物調製物のアッセイから得られた生データである。
【０１２２】
【表２１】
2005530998.tif 000023
2005530998.tif 000024
【０１２３】
表６
表６は、サンプル２５〜２９に対する新規な溶解物調製物のアッセイから得られた生データである。
【０１２４】
【表２２】
2005530998.tif 000025
【０１２５】
Ｃ．調整後の値
上記の生データは、陰性側（緩衝液側）の光学濃度を陽性側の光学濃度から引くことによって、調整された値に変換された。
【０１２６】
カットオフ値が、コントロール（緩衝液）ウエルの平均値＋コントロールウエルの３標準偏差を採用することによって決定された。先行技術ＯＭＰ調製物のサンプル１〜１２に対するカットオフ値は０．０２５であった。先行技術ＯＭＰ調製物のサンプル１２〜２４に対するカットオフ値は０．０４１であった。先行技術ＯＭＰ調製物のサンプル２４〜２９に対するカットオフ値は０．０３９であった。本発明の新規な溶解物調製物のサンプル１〜１２に対するカットオフ値は０．０６８であった。本発明の新規な溶解物のサンプル１３〜２４に対するカットオフ値は０．０５８であった。本発明の新規な溶解物調製物のサンプル２５〜２９に対するカットオフ値は０．０５３であった。
【０１２７】
下記の表１から表６は、より低い濃度の光学濃度の生データの表１から表６に対応する。
【０１２８】
【表２３】
2005530998.tif 000026
【０１２９】
【表２４】
2005530998.tif 000027
【０１３０】
【表２５】
2005530998.tif 000028
【０１３１】
【表２６】
2005530998.tif 000029
2005530998.tif 000030
【０１３２】
【表２７】
2005530998.tif 000031
【０１３３】
【表２８】
2005530998.tif 000032
【０１３４】
Ｄ．実施例６
下記の表は、より低い血清希釈度におけるＯＭＰ調製物および本発明の新規な溶解物の直接的な比較である。
【０１３５】
【表２９】
2005530998.tif 000033
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【０１３６】
これらの調整後の値から、先行技術のＯＭＰ調製物では、プレートに対する（特異的および非特異的な）結合が、本発明の新規な溶解物調製物が示すよりも大きいことが明らかにされ、それにより、より多数の偽陽性がもたらされていることが例示される。具体的には、１、２、３、４、５、６、８、９、１４、１５、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７および２８の各サンプルは、≧１：１６００の希釈度で先行技術のＯＭＰ調製物を利用するカットオフよりも大きい光学濃度値をもたらした。これらのサンプルは、前の実施例から例示されるように、陰性であることが予想される。しかしながら、本発明の新規な溶解物は、これらのサンプルのすべてが≧１：１６００の希釈度で陰性であることを明らかにしている。
【０１３７】
本発明がその具体的な実施態様に関連して記載されているが、さらなる改変が可能であること、および、本出願は、一般には本発明の原理に従い、かつ、本発明が関連する技術分野における知られている実施または慣例的な実施に含まれるような、また、本明細書中上記に示される本質的な特徴に適用され得るような、また、添付された請求項の範囲において従うような、本開示からの逸脱を含む任意の変化、使用または適合化を包含することが意図されることが理解される。さらに、本明細書中で言及された特許はすべて、本明細書により参照して組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】本発明の方法および／または診断キットにおいて使用されるプレートの１つの実施態様を例示する。
【図２】本発明の方法および／または診断キットにおいて使用されるプレートの１つの実施態様に対する結合した抗原を例示する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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