(57)【要約】  発明は自己免疫病理例に於いて内因性タンパク質に対し、または患者、特にタンパク質の欠失を原因とする病理に関連した患者に投与される外因性前記タンパク質に対し発生しうる抗体と結合するペプチドデコイまたは偽ペプチドデコイの使用に関する。前記ペプチドデコイまたは偽ペプチドデコイのアミノ酸配列は、前記抗体が認識するエピトープの配列とは異なっている。より具体的には、発明は前記自己免疫病理の予防または治療、あるいは前記外因性タンパク質に対する抗体の出現に関連する問題の予防または治療を目的とする医薬の調製への前記デコイの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫病理の予防もしくは治療または外因性タンパク質に対する抗体の出現と関連した疾患の予防または治療を目的とする医薬の調製のための、前記自己免疫病理の枠組み内の内因性タンパク質に対して、または、特にタンパク質の欠損を原因とする病理の枠組み内で患者に投与される外因性タンパク質に対して生ずる可能性のある抗体に結合するペプチドデコイまたは偽ペプチドデコイであって、アミノ酸配列が前記抗体の認識するエピトープのアミノ酸配列とは異なるペプチドデコイまたは偽ペプチドデコイの使用。
【請求項２】
約６個〜約２０個の間の天然または非天然アミノ酸（そして好ましくは約８個〜約１６個の間のアミノ酸）を含み：
−自己免疫病理または患者へのタンパク質の投与を必要とする病理の枠組みの中で抗体により特異的に認識される前記タンパク質への抗体の結合をインビトロおよびインビボで阻害する能力、
−前記抗体存在下に前記タンパク質の活性をインビトロおよびインビボで回復する能力、
に対して前記デコイが選択される、請求項１記載のペプチドデコイまたは偽ペプチドデコイの使用。
【請求項３】
−以下のような自己免疫病理：
・重症筋無力症、
・インスリンに対する自己抗体の出現、
・血友病ＡまたはＢそれぞれの自己免疫変異形の枠組み内にある、特に血友病Ａの場
合には妊娠女性での第VIIIまたはIX因子に対する自己抗体の出現、
・不妊の特定症例の原因である抗−精子自己抗体の出現、または、
−外因性タンパク質に対する、または遺伝子治療の目的で合成された内因性の組換え体タンパク質に対する抗体の出現に関連した疾患であって、血友病ＡまたはＢの様なタンパク質の欠損を原因とする病理の治療の枠組み内で前記タンパク質が投与される疾患、
の予防または治療を目的とする医薬の調製のためのデコイの、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
血友病Ａの枠組みの中で投与される組換え体もしくは非組み換え体の内因性第VIII因子に対する、または外因性第VIII因子もしくは誘導体に対する抗体の出現に関連した疾患の予防または治療を目的とする医薬の調製のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のデコイの使用。
【請求項５】
ペプチドライブラリーを発現するベクターから得られたペプチドデコイの、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
抗体が認識するタンパク質のエピトープと相同性を有さないか、または約１０％〜約３０％を含む弱い相同性でさえも有するデコイであって、またミモトープデコイを意味するデコイの、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
第VIII因子のミモトープデコイの、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
次式（Ｉ）：
【化１】
2005515177.tif 000027
（式中：
−ｎ１およびｎ２は相互に独立に０または１を表し、
−Ｘ1およびＸ2は相互に独立に天然または非天然アミノ酸を表し、
−Ｘａは８個〜１０個の天然または非天然アミノ酸の鎖を表す。）
の第VIII因子のミモトープデコイの、請求項７記載の使用。
【請求項９】
式（Ｉ）中の：
−Ｘ1がＹ、Ｅ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｋ、ＮまたはＴより選択され、
−Ｘ2がＲ、Ｔ、Ｈ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、Ｄ、Ｋ、Ａ、ＱまたはＩより選択される式（Ｉ）のミモトープデコイの、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
式（Ｉ）中のＸａが次の配列：
【表１】
2005515177.tif 000028
を表す式（Ｉ）のミモトープデコイの、請求項８または９記載の使用。
【請求項１１】
次式：
【表２】
2005515177.tif 000029
のミモトープデコイの、請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
式（Ｉ）中のＸａが次式の配列：
（Ｘ3）n3−Ｘ4−Ｘ5−Ｇ−Ｋ−Ｔ−Ｘ6−Ｌ
（式中、
−ｎ３は０または１を表し、
−Ｘ3はアミノ酸を表し、
−Ｘ4は疎水性アミノ酸を表し、
−Ｘ5は芳香族アミノ酸を表し、
−Ｘ6は疎水性アミノ酸を表す。）
を表す式（Ｉ）のミモトープデコイの、請求項８または９記載の使用。
【請求項１３】
−Ｘ3がＩ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＫより選択され、
−Ｘ4がＶ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＹより選択され、
−Ｘ5がＦまたはＹより選択され、
−Ｘ6はがＡ、Ｍ、Ｙ、Ｐ、ＴまたはＶより選択される、
ことを特徴とするミモトープデコイの、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
次式：
【表３】
2005515177.tif 000030
のミモトープデコイの、請求項１２または１３記載の使用。
【請求項１５】
式（Ｉ）中のＸａが次式の配列：
【化２】
2005515177.tif 000031
（式中、
−ｎ１２およびｎ１３は相互に独立に０または１を表し、
−Ｘ7〜Ｘ13はアミノ酸を表し、
−必要の場合ＷをＦに置換える。）
を表す式（Ｉ）のミモトープデコイの、請求項８または９記載の使用。
【請求項１６】
−Ｘ7がＨ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ＱまたはＧより選択され、
−Ｘ8がＴ、Ａ、Ｋ、Ｒ、ＱまたはＥより選択され、
−Ｘ9がＳ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｖ、ＧまたはＴより選択され、
−Ｘ10がＲ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、ＩまたはＡより選択され、
−Ｘ11がＳ、Ｔ、Ｖ、Ｋ、Ｒ、Ｙ、ＭまたはＤより選択され、
−Ｘ12がＳ、ＲまたはＬより選択され、
−Ｘ13がＩ、ＨまたはＷより選択される、
ことを特徴とするミモトープデコイの、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
次式：
【表４】
2005515177.tif 000032
から選択されるミモトープデコイの、請求項１５または１６記載の使用。
【請求項１８】
次式：
【表５】
2005515177.tif 000033
のミモトープデコイの、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
次式：
【表６】
2005515177.tif 000034
のミモトープデコイの、請求項８または９記載の使用。
【請求項２０】
式（Ｉ）中のＸａが次式の配列：
【化３】
2005515177.tif 000035
（式中、
−ｎ１４およびｎ１９は相互に独立に０または１を表し、
−Ｘ14〜Ｘ19はアミノ酸を表す。）
を表す式（Ｉ）のミモトープデコイの、請求項８または９記載の使用。
【請求項２１】
−Ｘ14がＫを表し、
−Ｘ15がＲまたはＧを表し、
−Ｘ16がＮまたはＳを表し、
−Ｘ17がＲまたはＡを表し、
−Ｘ18がＡまたはＲを表し、
−Ｘ19がＲを表す、
ことを特徴とするミモトープデコイの、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
次式：
【表７】
2005515177.tif 000036
のミモトープデコイの、請求項１９〜２０に記載の使用。
【請求項２３】
抗体が認識するタンパク質中に存在するエピトープに対応するペプチドデコイであって、そのペプチド配列が少なくとも１個のアミノ酸の削除、置換または付加により修飾されており、エピトープ変異体を意味するペプチドデコイの、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
第VIII因子のエピトープ変異体の、請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
式ＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤ（配列番号３６）のペプチドを除く、次式（II）：
【化４】
2005515177.tif 000037
（式中：
−ｎ１およびｎ２は相互に独立に０または１を表し、
−Ｘ1〜Ｘ5はアミノ酸を表す。）
の第VIII因子のエピトープ変異体の、請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
−Ｘ1がＤまたはＡを表し、
−Ｘ2がＤまたはＡを表し、
−Ｘ3がＤまたはＡを表し、
−Ｘ4がＦ、ＹまたはＷを表し、
−Ｘ5がＤまたはＡを表す、
ことを特徴とするエピトープ変異体の、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
次式：
【表８】
2005515177.tif 000038
のエピトープ変異体の、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載されるデコイを、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２９】
請求項８〜２２のいずれか１項に記載される式（Ｉ）のペプチド配列。
【請求項３０】
請求項２５〜２８のいずれか１項に記載される式（II）のペプチド配列。
【請求項３１】
血友病Ａを患う患者の出血事故の治療または予防の枠組みの中で、第VIII因子補充療法において、配合生成物として同時に、別々にまたは長期にわたって使用される、
＊請求項２９記載の式（Ｉ）のペプチド配列の少なくとも１つ、および／または請求項３０記載の式（II）のペプチド配列の少なくとも１つ、および
＊ヒトまたは動物起源の抽出型または組換え体型第VIII因子もしくはその他誘導体から選択された少なくとも１つの化合物、
を含む生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は自己免疫病理、または自己免疫病理または患者への外因性タンパク質の投与を必要条件とする病理の治療の枠組み内で使用される組換え体または非組換え体である、外因性タンパク質に対する抗体の出現に関連した疾患の予防または治療を目的とする薬剤の調製のための病原性抗体に対するペプチドデコイである。
【背景技術】
【０００２】
血友病Ａは機能的な第VIII因子（FVIII）を欠くかまたは不足することを原因とする（重症の）病理である。組換え体または血漿由来の第VIII因子濃縮製剤を投与することで患者の凝固能は回復される。
【０００３】
第VIII因子治療を受けている血友病Ａ患者の相当の割合（約１５〜２５％）で、自己免疫プロセスが投与された第VIII因子の凝血促進機能を阻害する抗FVIII抗体を出現させ、患者の治療をより一層複雑にしていることが知られている。これら抗体はFVIIIタンパク質の複数の領域（または構造ドメイン）、特にＣ２、Ａ２およびａ３−Ａ３−Ｃ１ドメインに結合する。
【０００４】
抗体反応は、投与されたFVIIIの凝血促進活性を阻害する効果を有しており、そのためこれら血友病の治療を非常に困難にしている。
【０００５】
この問題を完全に解決する治療法は現在ない；第VIII因子の大量投与による「免疫学的寛容」は保健行政にとって大きな経済的負担であり、より費用対効果的な方法を開発する研究が必要となっている。
【０００６】
抗体がパラトープと呼ばれる特殊な分子構造を有し、このパラトープが抗体に重要な生物機能：抗原の認識を実行可能にしていることが知られている。抗体のパラトープは、その選択性の源となる抗原の限定部位（「エピトープ」と呼ばれる）だけでなくこの抗原のより小さい断片、具体的にはエピトープに対応するペプチド（「エピトープペプチド」と呼ばれる）、エピトープと関連性のある配列もしくは化学構造の修飾を有するペプチド（「エピトープ変種」と呼ばれる）、または抗原に相同的な配列を持たない分子（「ミモトープ」と呼ばれる）も認識できる。
【０００７】
FVIIIに対する抗体反応はポリクローナルであり、その特異性は多様であるが［Gilles et al., 1993, Blood、2452〜61］、阻害抗体により認識される領域（エピトープ）は第VIII因子分子の少数の主要ゾーンに限定されることが観察されている。最初にＡ２ドメインとＣ２ドメインがFVIIIのタンパク質分解断片を利用したイムノドット法により同定された［Fulcher et al., 1985, PNAS USA 82, 7728〜32］、続いてFVIIIのヌクレオチド配列が決定された時点（Vehar et al., 1984, Nature 312, 337〜342; Gitschier et al.,  Nature 312, 326〜336）および組換え体断片が調整された時点［Scandella et al., 1988, PNAS 86(4), 1387; Scandella et al., 1989, Blood 74, 1618〜26］に確認された。具体例の一つでは、マウスモノクローナル阻害抗体のエピトープを、ヒトおよびブタ第VIII因子の配列間のハイブリッドを上手く利用して、Ａ２領域（残基４８４〜５０８）の２５アミノ酸配列に絞り込むことができた［Healey et al., 1995, J.Biol.Chem. 270, 14505〜9］。血友病患者のＢリンパ細胞からヒト抗体をクローニングすることで、この抗体がＣ２ドメインを認識し、おそらくは強い親和性でフォン・ウィルブラント因子の結合部位に結合することでFVIIIの機能を阻害することを示すことができた［Jacquemin et al., 1998, Blood 92, 496〜506］。最終的にはａ３−Ａ３−Ｃ１領域も阻害抗体に認識されると思われている。
【０００８】
これら抗体の作用との闘いの枠組み内で現在行われている治療的アプローチの主たるものは次の通りである：
−デスモプレシンを用いた、中程度の血友病でのFVIII産生促進［Kesteven et al., 1984、Thromb.Haemost. 52, 50〜2］；
−プロトロンビン複合体濃縮製剤による凝固カスケードの活性化［Lusher et al., 1983, Blood 62, 1135〜8］；
−活性化ヒト組換え体FVIIの投与［Hedner et al., 1993, Transfus. Med Rev. 7, 78〜83］；
−ブタVIIIの利用［Hay et al., 1996, Vox Sang 70, 68〜9］、
−活性化プロトロンビン濃縮製剤の利用（US Patent 4,160,02(1979); Method for producing a blood-coagulation-promoting preparation for human blood plasma; US Patent 4,357,321(1982): Method and composition for treating clotting factor inhibitors; US Patent 4,663,164(1987): Aqueous compositions for treating blood clotting inhibitors）、
−第VIII因子断片の利用（US Patent 4,649,132(1987): Treatment of factor VIII inhibitors; US Patent 4,769,336(1987): Treatment of factor VIII inhibitors; US Patent 5,149,637(1992): Recombinant factor VIII fragments）、
−免疫複合体の利用（US Patent 5,543,145(1996): Pharmaceutical composition and method for the suppression of factor VIII inhibitor production）、
−ハイブリッドヒト／ブタ第VIII因子分子の利用（US Patent 5888974: Hybrid human/animal factor VIII）。
【０００９】
最近、ペプチドまたはペプチド誘導体に基づかない分子デコイを使ったアプローチの概念が液性媒介によるヒト病理の２種類のモデル：糖尿病および重症筋無力症の中で紹介されている。この２種類のアプローチでは、ヒト自己抗体を表すモノクローナル抗体に特異的に結合するそれらの能力について短いＲＮＡ配列が選択された［Lee et al., 1997, Nat.Biotechnol. 15, 41〜5; Lee et al., 1996, J.Exp.Med.184,315〜24; Hay et al., 1996、上記］。いずれの例でも著者は、選択したデコイが患者由来の幾つかの血清が、それらの標的（それぞれインスリン受容体とアセチルコリン受容体）に結合することを阻害したことを示すことに成功している。しかしこれらの観察はそれら病理の動物モデルでは検証されていない。この方法の弱点の一つは、ＲＮＡが代謝的に不安定なことである；これら研究の一部ではヌクレアーゼに対しより耐性である修飾型ＲＮＡが用いられているが、この種の分子の血漿半減期は極めて短く、デコイは作用する機会を失う。
【００１０】
本発明は、発明者がエピトープ変異体またはミモトープに対応するペプチドもしくは偽ペプチドが抗FVIII抗体の第VIII因子への結合を妨害することで、抗FVIII抗体の部位に結合できることを証明したこと、そして結果としてこの抗体の抗凝固活性を低下させることができることを証明したことの結果である。
【００１１】
本発明は自己免疫病理、または患者にタンパク質投与を必要とする病理の枠組みの中にある生物に存在する抗体との闘いのための新規な手段であって、この分野で現在実施されている治療のコストを大きく抑えることができ、且つ現在の治療方法に比べ同等以上の効果を持つ手段を提供することを目的としている。
【００１２】
本発明の主題は、自己免疫病理の予防または治療を目的とする、或いは外因性タンパク質に対する抗体の出現に関連した疾患の予防または治療を目的とする医薬の調製のための、自己免疫病理の枠組みの中にある内因性タンパク質に対して、または特にタンパク質の欠損による病理の枠組み内にある患者に投与される外因性タンパク質に対して生ずる可能性のある抗体に結合するペプチドデコイまたは偽ペプチドデコイであって、アミノ酸配列が前記抗体によって認識されるエピトープのアミノ酸配列とは異なる前記ペプチドデコイまたは偽ペプチドデコイの使用である。
【００１３】
本発明のより具体的な主題は、約６〜約２０個の天然若しくは非天然アミノ酸（そして好ましくは約８〜約１６個のそれらアミノ酸）を含み、前記デコイが：
−自己免疫病理、またはタンパク質を患者に投与することを必要とする病理の枠組み内で抗体によって特異的に認識される前記タンパク質への前記抗体の結合をインビトロ（in vitro）およびインビボ（in vivo）で阻害する能力、
−前記抗体存在下に前記タンパク質の活性をインビトロおよびインビボで回復させる能力、
に対して選択される上記に規定されたペプチドデコイまたは偽ペプチドデコイの上記の使用である。
【００１４】
抗体が上記内因性または外因性タンパク質よりもむしろペプチド若しくは偽ペプチドデコイを優先して認識する利点がある。
【００１５】
本発明は：
−次のような自己免疫病理：
．重症筋無力症
．インスリンに対する自己抗体の出現
．血友病ＡまたはＢそれぞれの自己免疫の変異形の範囲内に入る、特に血友病Ａの場合の妊婦での第VIIIまたはIX因子に対する自己抗体の出現、
．特定の不妊症例の原因である抗−精子自己抗体の出現、または
−外因性タンパク質に対する、若しくは遺伝子治療を目的として合成された内因性の組換え体タンパク質に対する抗体の出現に関連した疾患であって、前記タンパク質が血友病ＡまたはＢの様な、これらタンパク質の欠損を原因とする病理の治療の枠組み内で投与される疾患、
の予防または治療を目的とする医薬の調製のための、上記規定のデコイの上記の使用に関する。
【００１６】
本発明の目的は、より具体的には、血友病Ａの枠組み内で投与される組み換え体若しくは非組換え体である内因性の第VIII因子に対する、または外因性の第VIII因子もしくはその誘導体に対する抗体の出現に関連した疾患の予防または治療を目的とする医薬品の調製に関する上記に規定したデコイの使用である。
【００１７】
発明はまた例えばペプチドライブラリーを発現するベクターより得た上記規定のペプチドデコイの前記使用に関する。
【００１８】
故に本発明の主題は、より具体的には、前記抗体により認識される前記タンパク質のエピトープと相同性を有さないか、または約１０％〜約３０％を含む弱い相同性でさえも有するデコイであって、前記デコイがまたミモトープデコイを表すものであるデコイの前記使用である。
【００１９】
発明は、より具体的には第VIII因子のミモトープデコイの前記使用に関する。
【００２０】
発明の主題は、より具体的には次式（Ｉ）：
【００２１】
【化５】
2005515177.tif 000002
（式中：
−ｎ１およびｎ２は互いに独立に０または１を意味し、
−Ｘ1およびＸ2は互いに独立に天然または非天然型アミノ酸を意味し、
−Ｘaは８個〜１０個の天然または非天然アミノ酸の鎖を表す。）
の第VIII因子のミモトープデコイの使用である。
【００２２】
発明はより具体的には、式（Ｉ）中の：
−Ｘ1はＹ、Ｅ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｎ又はＴより選択される、
−Ｘ2はＲ、Ｔ、Ｈ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、Ｄ、Ｋ、Ａ、Ｑ又はＩより選択される、
式（Ｉ）の上記規定したミモトープデコイの上記使用に関する。
【００２３】
発明の主題は、より具体的には式（Ｉ）中のＸａが以下の配列：
【００２４】
【表９】
2005515177.tif 000003
である式（Ｉ）の上記規定のミモトープデコイの前記使用である。
【００２５】
故に、本発明の主題はまた、より具体的には次式：
【００２６】
【表１０】
2005515177.tif 000004
のミモトープデコイの上記の使用である。
【００２７】
発明はまた式（Ｉ）中のＸａが次式の配列；
【００２８】
【化６】
2005515177.tif 000005
（式中：
−ｎ３は０または１を意味し、
−Ｘ3はアミノ酸を意味し、
−Ｘ4は疎水性アミノ酸を意味し、
−Ｘ5は芳香族アミノ酸を意味し、
−Ｘ6は疎水性アミノ酸を表す。
を表す式（Ｉ）のミモトープデコイの前記使用に関する。
【００２９】
発明の主題は、より具体的には、
−Ｘ3がＩ、Ｑ、Ｒ、ＴまたはＫより選択され、
−Ｘ4がＶ、Ｔ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、ＷまたはＹより選択され、
−Ｘ5がＦまたはＹより選択され、
−Ｘ6がＡ、Ｍ、Ｙ、Ｐ、ＴまたはＶより選択される、
ことを特徴とする、式（Ｉ）の上記ミモトープデコイの前記使用に関する。
【００３０】
故に発明は、より具体的には次式：
【００３１】
【表１１】
2005515177.tif 000006
の上記ミモトープデコイの上記の使用に関する。
【００３２】
発明の主題はまた式（Ｉ）中のＸａが次式の配列：
【００３３】
【化７】
2005515177.tif 000007
（式中、
−ｎ１２およびｎ１３はお互いに独立に０また１を意味し、
−Ｘ7〜Ｘ13はアミノ酸を意味し、
−必要の場合にはＷはＦで置換される。）
を表す式（Ｉ）のミモトープデコイの上記の使用である。
【００３４】
発明の主題は、より具体的には、
−Ｘ7がＨ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、ＱまたはＧより選択され、
−Ｘ8がＴ、Ａ、Ｋ、Ｒ、ＱまたはＥより選択され、
−Ｘ9がＳ、Ａ、Ｈ、Ｆ、Ｖ、ＧまたはＴより選択され、
−Ｘ10がＲ、Ｋ、Ｌ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、ＩまたはＡより選択され、
−Ｘ11がＳ、Ｔ、Ｖ、Ｋ、Ｒ、Ｙ、ＭまたはＤより選択され、
−Ｘ12がＳ、ＲまたはＬより選択され、
−Ｘ13がＩ、ＨまたはＷより選択される、
ことを特徴とする、式（Ｉ）の上記規定のミモトープデコイの前記使用である。
【００３５】
故に発明の主題は、より具体的には、次式：
【００３６】
【表１２】
2005515177.tif 000008
より選択された式（Ｉ）の上記規定のミモトープデコイの前記使用である。
発明の主題は、より具体的には、次式：
【００３７】
【表１３】
2005515177.tif 000009
のミモトープデコイの前記使用でもある。
【００３８】
本発明の主題は、次式：
【００３９】
【表１４】
2005515177.tif 000010
のミモトープデコイの前記使用でもある。
【００４０】
発明はまた式（Ｉ）中のＸａが次式の配列：
【００４１】
【化８】
2005515177.tif 000011
（式中、
−ｎ１４とｎ１９は相互に独立に０または１を意味し、
−Ｘ14〜Ｘ19はアミノ酸を表す。）
を表す式（Ｉ）の上記規定のミモトープデコイの上記の使用に関する。
【００４２】
発明は、より具体的には、
−Ｘ14がＫを意味し、
−Ｘ15がＲまたはＧを意味し、
−Ｘ16がＮまたはＳを意味し、
−Ｘ17がＲまたはＡを意味し、
−Ｘ18がＡまたはＲを意味し、
−Ｘ19がＲを意味する、
ことを特徴とする、式（Ｉ）の上記規定のミモトープデコイの前記使用に関する。
【００４３】
故に本発明の主題は、より具体的には次式：
【００４４】
【表１５】
2005515177.tif 000012
より選択されたミモトープデコイより選択された、式（Ｉ）の上記規定のミモトープデコイの前記使用である。
【００４５】
発明はまた抗体によって認識される前記タンパク質中に存在するエピトープに対応するペプチドデコイであって、そのペプチド配列が少なくとも１個のアミノ酸の削除、置換または付加によって修飾されている、エピトープ変異体を意味する前記ペプチドデコイの使用にも関係する。
【００４６】
発明の主題は、より具体的には、第VIII因子のエピトープ変異体の前記使用である。
【００４７】
発明の主題は、より更に具体的には、式ＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤ（配列番号３６）のペプチドを除く、次式（II）：
【００４８】
【化９】
2005515177.tif 000013
（式中、
−ｎ１およびｎ２は相互に独立に０または１を意味し、
−Ｘ1〜Ｘ5はアミノ酸を意味する。
の第VIII因子のエピトープ変異体の前記使用である。
【００４９】
発明は、より具体的には、
−Ｘ1がＤまたはＡを意味し、
−Ｘ2がＤまたはＡを意味し、
−Ｘ3がＤまたはＡを意味し、
−Ｘ4がＦ、ＹまたはＷを意味し、
−Ｘ5がＤまたはＡを意味する、
ことを特徴とする、式（II）の上記規定エピトープ変異体の前記使用に関する。
【００５０】
故に発明の主題は、より具体的には次式：
【００５１】
【表１６】
2005515177.tif 000014
の上記規定のエピトープ変異体の前記使用である。
【００５２】
発明はまた、上記規定のデコイを薬学的に受け入れ可能な賦形剤と組み合わせて含むことを特徴とする、医薬組成物に関する。
【００５３】
発明の医薬組成物は非経口経路または経口経路により投与することができる形状で存在する利点がある。
【００５４】
前記医薬組成物の用量は、約１〜約５mg/kg/日の上記規定の式（Ｉ）または（II）の化合物を含むことが好ましい。
【００５５】
発明はまた規定の式（Ｉ）のペプチド配列にも関する。
【００５６】
発明の主題はまた上記規定の式（II）のペプチド配列にも関する。
【００５７】
発明はまた、血友病を患うＡ患者の出血事故の治療または予防の枠組み内で、第VIII因子補充療法において同時に、別々に若しくは長期にわたって用いられる配合生成物として、
＊上記規定の式（Ｉ）のペプチド配列の少なくとも１つ、および／または上記規定の式（II）のペプチド配列の少なくとも１つ、ならびに
＊ヒトまたは動物起源の抽出型または組換え体型第VIII因子もしくはその他誘導生成物から選択された少なくとも１つの化合物、
を含む生成物に関する。
【００５８】
発明の主題はまた上記規定の式（Ｉ）および（II）のペプチド配列より誘導される偽ペプチド、特に前記ペプチド配列のペプチドの１もしくはそれ以上、または全てをＤアミノ酸に変換して得られる偽ペプチドに関するが、この変換により偽ペプチドを原ペプチドに比べタンパク質分解に対しより耐性になる［Kramer et al., 1998、Protein Eng 11, 941〜8］。
【００５９】
式（Ｉ）または（II）の上記化合物の合成に関しては、後者は次の方法で実施するのが好都合である。
【００６０】
ポリペプチドの固相合成の手法では、所望のポリペプチドはベンズヒドリル−アミンまたはクロロメチル化樹脂（架橋型ポリスチレンより誘導されたもので、化学製品供給業者より入手できる）の様な不溶性支持体をはじめにして合成する。
【００６１】
合成するポリペプチドのＣ末端にあるアミノ酸、そのα窒素および反応部位は保護基で保護し、一般に用いられる強力なカップリング技術を用い樹脂に結合する。アミン官能基の保護基を配列中にある次のアミノ酸（それ自体も適当な保護基を有している）が結合等するような方法で脱保護する（その他の保護基がある場合にはそのままの形で残す）。ポリペプチドが完全に合成されたら、ポリペプチドをその支持体の樹脂から分離し、全ての保護基を取り除いてからポリペプチドを回収する。
【００６２】
この目的に合った保護基の例としては：アルファアミノ、ベータまたはガンマ基についてはフルオレニルメチルオキシカルボニルが、アスパラギン酸およびグルタミン酸についてはtert−ブチルエステルが、リジンおよびトリプトファンについてはtert−ブチルオキシカルボニルが、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびヒスチジンについてはトリチルを、セリンおよびスレオニンについてはtert−ブチルが、アルギニンについては２、２、４、６、７−ペンタジヒドロベンゾフランが挙げられる。
【００６３】
発明を、式（Ｉ）および（II）の上記化合物の生産および、それら化合物の抗第VIII因子抗体阻害能の実証がわかる詳細な説明を用いて更に例示する。
【実施例】
【００６４】
Ｉ）材料と方法
１）エピトープ−変異体型ポリペプチドデコイに関する技術
スポット技術の原理
このスポットメンブレン上で並行してペプチドを合成する方法（Frank, R.(1992) Spot Synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support, tetrahedron.48, 9217〜9232）により多数の多様なペプチドを平坦なセルロース支持体の上にまとめて同時に短時間で得ることが可能になった。ペプチドは固定化した形で、スポット当たり５０nmのオーダーのスケールで調製される。セルロースのシート（１２〜８cm）の上には化学的に反応性である、直径約５mmの円（スポット）が作られ、これがペプチドのＣ末端アミン酸を結合する固定点の役割を果たす。ペプチド鎖の伸長は、エステル化反応によりＣ末端からＮ末端に向けてアミン酸を連続的に付加することで行われる。カップリング中は使用する残基のアミノ化官能基は、塩基性溶媒中に取り除かれる不安定な基（９−フルオレニルメチルオキシカルボニルまたはＦｍｏｃ基）で一時的に保護する。合成期の間、反応性側鎖は安定基でブロックし、アッセンブリ終了時に脱保護する。合成サイクルは４段階で行われる；第１には、既に固定されているアミノ酸のＮＨ2と次のアミノ酸のＣＯＯＨとの間にペプチド結合を形成するが、前記ＣＯＯＨはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびＮ，Ｎジイソプロピルカルボジイミドで前もって活性化しておく。第２に、短ペプチドの形成を回避するために未反応の遊離のＮＨ2官能基をアセチル化する。第３にピペリジンを使って新しいアミノ酸のＦｍｏｃ保護基を塩基性溶媒中に取り除く。第４に、こうして得たアミノ化官能基の位置をブロモフェノールブルーを使って確認する。このサイクルを必要なだけ繰り返す。合成終了時、アミノ酸の側鎖の脱保護を行ってから、メンブレンと共有結合し続けているペプチドを間接比色免疫アッセイで分析する。
【００６５】
ａ）メンブレンの調製
第VIII因子の完全配列を、ドメインＢを除いて、スポット法に従い２残基づつ枠をずらした一部が重複するペンタデカペプチドの形にセルロースメンブレンの上に合成した。一般的なプロトコルはMolinaらが既に報告している（Molina, F., Laune, D., Gougat, C., Pau, B. & Granier, C. (1996) Improved performances of spot multiple peptide synthesis, Pept Res. 9, 151〜5）。メンブレンはAbimed（Legenfeld, Germany）により市販されている。Ｆｍｏｃアミノ酸とＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールはNovabiochemより購入した。異なるカップリング段階を実行するロボットはＡＳＰ２２２（Abimed）である。ペプチドは全てそれらのＮ末端をアセチル化した。ペプチドを合成した後、側鎖の保護基をトリフルオロ酢酸で処理し脱保護した。
【００６６】
ｂ）間接比色免疫学試験
ブロッキング液中でメンブレンを飽和した後、一般には０．１〜１μg/mlの濃度で使用される試験対象の阻害抗体の溶液にメンブレンを浸してペプチドの反応性を評価した。洗浄後、アルカリホスファターゼ標識された抗−Ｆｃ抗体（Sigma）を１：１０００で用い、その基質（BCIP-MTT-MgCl2 Sigma）存在下にインキュベーションしてペプチドと抗体を相互作用させ、試験対象の抗体と結合したペプチドの度合いを示す青色の沈殿を生成した。次に、別の試験に備え青色の沈殿と結合した抗体を除いてメンブレンを再生した。
【００６７】
ｃ）類似エピトープの製造
エピトープが同定された後、反応配列のそれぞれの位置を１９種類のアミノ酸（システインを除く）で置換し、スポット合成により一連の類似ペプチドを調製した。スルフィド結合の付加により拘束を導入しても類似エピトープを得ることができる。
【００６８】
２）「ミモトープ」型ペプチドデコイに関する技術
ファージディスプレイ技術の原理
ペプチドリガンドは、それらの持つ抗体との結合能のおかげで、ファージディスプレイ技術（Smith, G.P. (1985) Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface, Science. 228, 1315〜7）を用い、繊維状ファージの表面にランダムにペプチドを提示させることで、容易に得ることができた。これらペプチドはファージのｐIIIタンパク質の表面（最大数５コピー）またはｐVIIIタンパク質の表面（最大数２７００コピー）のいずれかに露出させることができる。これらペプチドは様々なサイズ（６ＡＡ〜３０ＡＡまで）を持ち、直線型、またはサルファーブリッジ（Sulpher bridge）により拘束されていてもよい。
【００６９】
ａ）使用した各種ペプチドファージライブラリー
ランダムペプチドのスクリーニングを実施するために、各種ライブラリーを用いた：
＊ランダムペプチドがファージのｐVIIIの表面に発現している（直線型１５mer、拘束型１２mer、半拘束型１７merおよび直鎖型３０mer）４ペプチドライブラリ。最後のものはL.L.C.Bonnycastle (University Burnaby, BC, Canada)(Bonnycastle, L.L., Mehroke, J.S., Rashed, M., Gong, X. & Scott, J.K.(1996) Probing the basis of antibody reactivity with a panel of constrained peptide libraries displayed by filamentous phage, J Mol Biol. 258, 747〜62）に記載されており、約１０13TU/mlより構成され、ｆｄ−ｔｅｔファージから誘導されたｆ８８．４ベクターをはじめにして作られた。
＊ランダムペプチドがファージのｐIIIの表面に発現している（直線型９merおよび拘束型１２mer）２ペプチドライブラリー。最後のものはDr Mazzuccheli L(Mazzucchelli, L., Burritt, J. B., Jesaitis, A. J., Nusrat, A., Liang, T. W., Gewirtz, A. T., Schnell, F. J. & Parkos, C. A. (1999) Cell-specific peptide binding by human neutrophils, Blood. 93, 1738〜48）により記載され、その多様性は１０9TU/mlのオーダーである。
【００７０】
ｂ）ファージライブラリーのスクリーニング（バイオパニング）
バイオパニング技術は、Smithらにより記載の上記プロトコルに従って実施した。選択と増幅を、ｐIIIとｐVIIIライブラリーについて並行して３回行った。各選択サイクルについては、、最初の２回には１〜５μg/mlの濃度の、３回目には０．１〜０．５μg/mlの濃度の各種阻害抗体の炭酸バッファー（ＮａＨＣＯ3、１００mM、pH８．６）溶液を１０×１．５cmのペトリ皿（Falcon 1029）上に一晩、４℃で攪拌しながら吸着させた。０．０５％ＴＢＳ−Ｔ（Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水：１．３７ＭのＮａＣｌ／２６．８mMのＫＣｌ／０．５ＭのＴｒｉｓ塩基−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０／ｐＨ７）による２分間の洗浄を５回行って過剰の抗体を取り除いた後、非特異部位を事前に濾過しておいた０．１％  ＴＢＳ−Ｔ−３％ＢＳＡ溶液を使って２時間、３７℃で飽和した。この最後の溶液を０．０５％ＴＢＳ−Ｔによる２分間、５回の洗浄により取り除いた後、２．１０11TU（形質導入単位）、即ち各ライブラリーの多様度の１００倍である各一次ライブラリー、または選択サイクルより得たファージ溶出液を一晩、４℃で攪拌しながらインキュベーションした。保持されなかったファージを、０．５％ＴＢＳ−Ｔによる２分間、１０回と０．０５％ＴＢＳ−Ｔによる２分間、５回の洗浄で取り除いた。それから保持されたファージを酸性溶出液（ＨＣｌ  ０．１Ｍ／グリシン／ＢＳＡ１mg／ml／pH２．２の事前濾過しておいた溶液３mlを３０分間攪拌しながらＡＴでインキュベーションした後２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，pH９の１５０μlで中和した）を使って溶出するか、またはFVIIIとの競合（４℃でのＯＮインキュベーションにより）による溶出を利用して溶出した。次に各種溶出液を使ってＥ．Ｃｏｌｉ  Ｋ９１細胞を感染させて増幅した。この増幅は２段階で行われた：対数増幅期の細菌懸濁液（５５０nmの吸光度で１．８）５mlを各溶出液に加えた。攪拌しないで１０分間、３７℃でインキュベーションした後、テトラサイクリン（Ｔｃ）（ｐVIIIライブラリーズ）０．２μg/mlまたはカナマイシン（Ｋａ）０．７５μg/ml（ｐIIIライブラリーズ）を含むLuria-Bertani培地（ＬＢ）９３mlを加え、２２５rpmにて３０分間、３７℃でインキュベーションした。次に濃度をＴｃについては２０μg/mlに、Ｋａについては７５μg/mlに調整し、続いて懸濁液を一晩、２２５rpm、３７℃でインキュベーションした。次にこれら各種細菌懸濁液を４℃、４０００rpmで２５分間遠心分離し、さらに８０００rpmにて１２分間遠心分離して細菌を沈殿した。ファージを含む上清を、上清１００ml当たり１５mlの割合で、ポリ（エチレングリコール）８０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌに取り；一晩、４℃で沈殿させた。４℃、８０００rpm、４０分間の遠心分離後、沈査を５０mMのＴＢＳ／ＮａＣｌ３ml内に取り、３７℃、３０分間、１５０rpmにてインキュベーションした。中身を３本のエッペンドルフチューブに移し、１５０００rpmで１０分間、４℃にて遠心分離して細胞破砕物を除いてから、無菌の１．５ml−バイアルに移して−８０℃に保管した。
【００７１】
各選択段階では、増幅ファージの量を力価測定により評価し、同時に関連ファージの濃縮を、ＥＬＩＳＡを使って評価した。選択段階を３回繰り返した後、３回のクローニング段階によって固体培地（ＬＢ−寒天−Ｔｃ培地２０μg/ml、またはＫａ７５μg/ml）上に単離した細菌のコロニーを得ることができた。次に各種クローンの阻害抗体に対する特異的結合能をＥＬＩＳＡで試験した。
【００７２】
ｃ）ダイレクトＥｌｉｓａ：ファージによる阻害抗体認識についての試験
ライブラリーのスクリーニングに用いた各種阻害抗体をＮａＨＣＯ3バッファー中１μg/mlにしてマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）上に一晩、４℃で固定化した。ウエルを０．１％ＰＢＳ−Ｔ−２％ミルクで１時間３０分、３７℃で飽和した。次いで各種パニングに由来するファージを０．１％ＰＢＳ−Ｔ−２％ミルクバッファーで１／２５に希釈して１時間３０分、３７℃でインキュベーションした。これらインキュベーションのそれぞれの間に０．１％ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を、飽和後を除き３回行った。結合したファージを１：３０００に希釈したペルオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体（Amersham Boehringer）を使い、１時間、３７℃でインキュベーションして検出した。５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質（ＯＰＤ）を加えた。暗所で３０分間反応してから、４５０nmで吸光度測定を行った。４ＮのＨ2ＳＯ4を加えて反応を停止してから、４９０nmで再度測定を行った。
【００７３】
ファージの特異性は、無関係な抗体とは反応しないことで示した。
【００７４】
ｄ）オリゴヌクレオチド配列の決定
ファージ由来のＤＮＡの配列決定は、自動シークエンサ（ＥＵＲＯＧＥＮＴＥＣ）で行った。用いたプライマーはｐIIIについては５′  ＧＴＴ  ＴＴＧ  ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ３′であり、ｐVIIIについては５′  ＴＣＧ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ３′であり、ペプチド挿入体の下流に位置している。
【００７５】
３）可溶型のエピトープまたはミモトープ変異体ペプチドのインビトロおよびエキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）でのそれら阻害抗体に対する阻害能
ａ）可溶性ペプチドの合成
次にスポット法で同定された各種エピトープ、またはファージディスプレー技術で決定されたミモトープを、可溶性相のＦｍｏｃ化学（Gausepohl, H., Boulin, C., Kraft, M. & Frank, R.W.(1992) Automated multiple peptide synthesis, Pept Res. 5, 315〜20）に基づくAbimed AMS422合成装置を用いて可溶性合成ペプチドの形で合成した。ペプチドを脱保護し、適当なスカベンジャー存在下にトリフルオロ酢酸で処理して樹脂から切り外した。次にペプチドを凍結乾燥し、その純度をＨＰＬＣで調べた。必要に応じて９０％を越える均一度を得るために、ＨＰＬＣを用いてペプチドを精製した。
【００７６】
ｂ）デコイのインビトロ中和能
FVIIIを４℃でＯＮプレート上に固定化した。同時に阻害抗体とそのエピトープペプチドとを、ＯＮレンジの中、４℃、０．１％ＰＢＳ−Ｔ−２％ミルク中で前インキュベーションした。１時間０．１％ＰＢＳ−Ｔ−２％ミルクで飽和した後、抗体（Ａｂ）−ペプチド混合液を固定化FVIIIと２時間、３７℃でインキュベーションした。これらインキュベーションのそれぞれの間で、飽和後を除き０．１％ＰＢＳ−Ｔを用い３回づつ洗浄を行った。FVIII−抗体複合体の検出は、１：３０００に希釈したペルオキシダーゼ結合マウスまたはヒト抗−ＩｇＧと１時間、３７℃でインキュベーションすることで達成された。０．１％ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質（ＯＰＤ）を加えた。暗所で３０分間反応してから４５０nmで吸光度測定を行った。Ｈ2ＳＯ4  ４Ｎを加え反応を停止した後、更に４９０nmで吸光度を測定した。
【００７７】
ｃ）機能試験（Bethesda Test）でのデコイの中和能
この機能試験（Kasper, C. K. & Pool, J. G.(1975) Letter: Measurement of mild factor VIII inhibitors in Bethesda units, Thromb Diath Haemorrh. 34, 875〜6）は完全な凝固を行うために各種凝固因子（FIXａ、FVIII、リン脂質、カルシウム等）から構成される混合物に必要な時間を測定することから成る。抗体の阻害効果は、この種の試験では凝固時間の延長から特徴浸けられ、抗体の阻害能が高いほど凝固時間の延長も長くなる。抗体の阻害特性はBethesda単位で表されるが、これはFVIIIの凝固活性の５０％を中和するのに必要な抗体濃度の逆数である。逆にペプチドの中和作用は、阻害剤の非存在時に得られる初めの凝固時間に戻す変換である。
【００７８】
次の機能試験はKasperが記載した上記試験に由来する。抗FVIIIモノクローナル抗体を０．０５Ｍイミダゾールバッファー、pH７．３中に希釈した。この調製液（２５０μl）と、等量のイミダゾール（０．１Ｍ、pH７．４）で緩衝化された正常血清とを混合し、２時間、３７℃でインキュベーションした。同様に、イミダゾールで緩衝化した正常血漿とコントロールを構成する非特異的抗体とを混合した。抗体の阻害活性は、FVIIIの残存活性と阻害活性間の関係を表す片対数グラフから読み取った。
【００７９】
ペプチドの阻害抗体中和能を示すために、５０％の残存FVIIIを得ることができる濃度の阻害抗体を、４℃、イミダゾール緩衝液中にペプチド濃度を上げながらＯＮ前インキュベーションした。次にこの混合液を上記同様に処理した。
【００８０】
II）詳細な説明
１）抗体の選択：
次のものを使用した：
・以後ＥＳＨ８と呼ぶ、FVIIIの凝固促進活性に対し極めて強力な中和活性（6300 Besthesda 単位/mg [Scandella et al., 1995, Blood 86, 1811〜9]）を有するマウスモノクローナル抗体。この抗体は第VIII因子のＣ２ドメインへのヒト抗体の結合を良い見本であり、
・２Ｃ１１ヒトモノクローナル抗体（Jacquemin et al., 1998、上記）、
・以後Ｆ７Ｂ４、Ｆ２９Ｆ１１、Ｆ１４Ａ１２、Ｆ１８Ｂ１、Ｆ１９Ｃ２およびＦ２１Ｃ１と呼ぶ複数のマウスモノクローナル抗体で、上記先頭の３つは第VIII因子のａ１酸性領域へのヒト抗体の結合のモデルを、そして残りはａ３酸性領域へのヒト抗体結合のモデルである。
【００８１】
２）デコイを得る方法：
「エピトープ変異体」型ペプチドデコイは、エピトープのアミノ酸配列の変異を導入するためのスポット技術を用いて得た。エピトープ変異体デコイは抗体との反応性を保持しているか、またはエピトープより強い反応性を示すことができる。例えば抗FVIII  Ｆ７Ｂ４抗体のＤ356ＶＶＲＦ360エピトープに関するその種のアプローチでは、反応性を失うことなくＦ360を２種類の別の芳香族アミノ酸ＷおよびＹと置換できることが示される。別の例では、環状型エピトープの例としてＣＤＤＤＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＤＣペプチドが評価され、そしてＡＡＡＬＴＤＳＥＭＤＶＶＲＦＡペプチドを使って負電荷の重要性が研究されている。これら「エピトープ変異体」型デコイは全て標準的なペプチド合成法を使い得て、そして抗第VIII因子抗体への結合能を測定した。
【００８２】
「ミモトープ」型ペプチドデコイは組換え体ファージライブラリー技術により得た。配列のランダムライブラリーからのペプチドの選択方法は記載されている［Smith et al., 1993, Methods Enzymol. 217, 228〜257］。繊維状ファージがそのエンベロープタンパク質（ｐVIIIまたはｐIII）表面に保持するペプチドが使用できる：例えば１５アミノ酸のペプチドをコードしているライブラリー、および２個のシステイン残基が常に存在することで構造的拘束を受けている１２アミノ酸のペプチドをコードする別のライブラリー。使用するファージの選別条件は既報の条件である（具体的には[Ferrieres et al., 2000, Eur. J. Biochem. 267, 1819〜1829]）。抗体により特異的に捕捉されたファージの溶出は、酸処理または過剰抗原による置換により実施した。選択した各ペプチドのアミノ酸配列は、Ferrieres et alにより具体的に記載されている様にして決定できる。例えばＥＳＨ８抗体および２Ｃ１１ヒト抗体のミモトープペプチドを得ることができる。得られるコンセンサスモチーフは用いた溶出条件によって変わった。酸溶出では、いずれも１２個のアミノ酸の拘束ライブラリーに由来する２つのグループの配列が得られた：第１のグループはミモトープ型で、ＹＣＮＰＳＩＧＤＫＮＣＲの単一配列を含み、３クローンがこの配列を示し、第２のエピトープ型のグループはあるコンセンサスモチーフ：Ｘ−Ｃ−Ｘ−疎水性芳香族（Ｙ／Ｆ）−Ｇ−Ｋ−Ｔ−Ｘ−Ｌ−Ｃ−Ｘ（ここではＸはいずれかのアミノ酸を意味する）を特徴とし、これは因子のＣ２ドメインに相同な配列を有した。このコンセンサスモチーフは６種類の配列にかさなって見いだされた：ＥＣＩＶＹＧＫＴＡＬＣＴ（１回）、ＱＣＱＴＦＧＫＴＭＬＣＴ（４回）、ＳＣＲＬＦＧＫＴＹＬＣＨ（１回）、ＳＣＴＶＹＧＫＴＰＬＣＧ（１１回）、ＲＣＫＴＦＧＫＴＴＬＣＳ（１回）およびＲＣＴＶＹＧＫＴＶＬＣＬ（１回）。抗原を用いた溶出では、単一の配列が得られており、それは１５アミノ酸ＫＰＧＥＶＰＲＨＲＶＴＤＦＤＲの直線型ライブラリーに由来し、４回示された。
【００８３】
これら配列がファージ由来のものでなく、ＥＳＨ８抗体とまだ反応することを立証するために、スポット技術を用いてメンブレン上にこれら配列を合成した。全ての配列がその反応性を保持していることが明らかになった。次にＥＳＨ８／ペプチド結合の重要残基を決定するために、ペプチドの各アミノ酸を別の１９のアミン酸（システインを除く）で置換し、１）どのアミノ酸がＥＳＨ８／ペプチド結合にとって不可欠な残基か、２）一般的特徴（例えば疎水性または芳香族特性、長側鎖の存在）の放棄を可能にする許容される置換を決定した。グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）およびロイシン（Ｌ）といった残基を置換することは許容されず、一方疎水性残基に関してはバリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）およびロイシン（Ｌ）がより反応的な要素であったが、完全に受け入れられたのはスレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）といった残基であった。芳香族残基に関しては、主にフェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）を受け入れたが、トリプトファンの受入度は低かった。
【００８４】
これら配列を特定した後、標準的なペプチド合成によりデコイを得た。
【００８５】
３）デコイの遮断活性を決定する工程：
デコイの遮断活性はＥＬＩＳＡ試験によりインビトロで検証できる。用いたフォーマットは、加えるデコイの濃度を上げることで阻害抗体の第VIII因子への結合の阻害を示すことを可能にする。デコイの中和能は、Bethesda試験のような機能試験（Kasperの方法、[Kasper et al., 1975, Thromb. Diath. Haemorrh. 34, 875〜6]）で確認できる。
【００８６】
次：
【００８７】
【表１７】
2005515177.tif 000015
の７種類の可溶性ミモトープペプチドについてよる詳しく調べた。
【００８８】
発明者は以下の方法で、これら可溶性ペプチドがインビトロのＥＬＩＳＡ試験に於ける第VIII因子への２Ｃ１１抗体の結合を阻害する能力について研究した：FVIIIを固定化し、２Ｃ１１と所定範囲（２００μM、２０μM、２μM、２００nM、２０nM、２nM）の可溶性ペプチドとを４℃、一晩前インキュベーションし、次にこの前混合液をFVIII上にインキュベーションしてから２Ｃ１１抗体を発色させた。得られた結果を以下に示す。
【００８９】
【表１８】
2005515177.tif 000016
【００９０】
試験した全てのペプチドが２Ｃ１１抗体／FVIII結合を阻害し、ペプチド１０７が最も効果的であることが証明された。
【００９１】
４）機能分析およびインビボ分析でのペプチド１０７（ＳＣＨＡＷＳＮＲＲＴＣＲ）の２Ｃ１１抗体中和能
ペプチド１０７がFVIII−２Ｃ１１抗体結合の阻害に比較的効果的なペプチドでることが証明されたことから、発明者は２Ｃ１１の阻害活性に対するその中和能に強い興味を持った。
【００９２】
最初に発明者は、機能的凝固試験（Bethesda試験）の中で２Ｃ１１存在下でのFVIIIの凝固促進活性回復に関するペプチド１０７の能力について評価した。図２はペプチド１０７により２Ｃ１１の阻害活性が用量依存的に中和されることを示している。２Ｃ１１濃度３．５nMでは、FVIIIの活性の９８％が阻害され（図１）、１００μMのオーダーのペプチド１０７濃度でその阻害作用は完全に中和され、ＩＣ50は１９μMであった。同一濃度範囲内で使用したコントロールペプチドには中和作用はなかった（図２）。ペプチド１０７をFVIIIのみとインキュベーションしても、FVIIIの凝固促進活性は全く変化しなかった（図２）。ペプチド（１０３、１０４、１０５、１０６、１０８および１０９）も２Ｃ１１の阻害活性を効果的に中和できた。しかしペプチド１０７と同等の効果を発揮するにはより高いペプチド濃度が必要であった（データ未提示）。
【００９３】
２番目にマウスのFVIII欠失モデルを使ってペプチド１０７の中和特性をインビボで調べた。予備研究から、この種のマウスに０．５ＵＩのヒト組換え体FVIIIを静脈投与すると０．３IU/mlのオーダーの血漿FVIII値を得ることができ、この値が少なくとも１時間安定することを明らかにすることができた。このことを確定してから単独でインキュベーションした、ペプチ１０７ドまたはコントロールペプチド存在下（それぞれ６５０μMおよび７００μM）にインキュベーションした２Ｃ１１抗体（１６．７nM）をそれぞれ３グループのマウスの尾静脈に注射した。３０分後に０．５ＵＩのヒトFVIIIを注射してこれらマウスの血漿FVIII値を元に戻し、５０分後に血漿の凝固促進活性を測定した。図３より２Ｃ１１単独投与では注射したFVIIIの凝固促進活性が完全に阻害されたが、ペプチド１０７存在下に２Ｃ１１抗体を投与されたマウスではFVIIIの凝固促進活性の５２％が維持されていることが分かる。コントロールペプチドには中和作用が全くないことから、ペプチド１０７の中和活性は極めて特異的であった。
【００９４】
従って、これらのデータはインビトロ実験で示唆されている、FVIIIに対する２Ｃ１１抗体の阻害を中和するペプチド１０７の能力が血友病Ａに似たインビボ条件下でも確認できたことを示している。
【００９５】
３番目に発明者は２Ｃ１１に対するペプチド１０７の中和特性を、阻害因子を持つ他の血友病患者の血清に応用できるか調べた。予備実験より、阻害因子を持つ患者の１２血清中２つの血清がペプチド１０７と反応することが示され、血友病Ａの別の患者でも２Ｃ１１に似たFVIII阻害因子が産生されていることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１はBethesda試験により評価された第VIII因子の活性に及ぼす２Ｃ１１抗体の影響を示す。第VIII因子を２Ｃ１１抗体３．５nM存在下に２時間、３７℃でインキュベーションし、凝固計を使い第VIII因子の残存活性を一工程で測定した。  第VIII因子の残存活性のパーセンテージをＹ軸に示した。バーＡは第VIII因子単独時の活性（１００％）を表し、バーＢは２Ｃ１１抗体３．５nM存在下での第VIII因子活性を表している。３．５nMの２Ｃ１１が存在する時、第VIII因子の活性はほぼ完全に阻害された。
【図２】図２は３．５nMの２Ｃ１１抗体存在下にBethesda試験により評価し、ペプチド濃度の関数として第VIII因子の活性の変化を示す。２Ｃ１１抗体を各種濃度のコントロールペプチドまたはペプチド１０７（ＳＣＨＡＷＳＮＲＲＴＣＲ）存在下に一晩、４℃でインキュベーションした。次に第VIII因子をこれらペプチド−抗体混合液またはペプチド１０７単独と共に２時間、３７℃でインキュベーションしてから凝固計を使ってその残存活性を一工程で測定した。  第VIII因子の残存活性のパーセンテージをＹ軸に表し、ペプチド濃度をＸ軸に表した（μM）。黒塗りの三角はペプチド１０７単独存在下、その濃度を増加した時の第VIII因子の残存活性の変化を表す。黒塗りの丸はペプチド１０７および２Ｃ１１抗体の混合の存在下にその濃度を上げた時の第VIII因子の残存活性の変化を表しており、白塗りの菱形はコントロールペプチド及び２Ｃ１１の混合の抗体存在下に、その混合液の濃度を上げた時の第VIII因子残存活性の変化を表している。  ペプチド１０７は２Ｃ１１抗体の作用の中和を可能にする。
【図３】図３はペプチド１０７もしくはコントロールペプチド非存在下または存在下での２Ｃ１１注射の、第VIII因子欠失マウスおよびそのヒト第VIII因子が投与された第VIII因子欠失マウスの血液凝固に対する効果を示している。  ２Ｃ１１抗体（１６．５nM）または２Ｃ１１抗体（１６．５nM）またはペプチド１０７（６５０μM）もしくはコントロールペプチド（７００μM）を含む混合物を、２Ｃ１１抗体２．５μg、ペプチド１０７を１mgおよびコントロールペプチド１mgの割合で第VIII因子欠失「ノックアウト」マウスの尾静脈に注射した。３０分後、ヒト第VIII因子０．５ＵＩを注射してから１５分後に発色試験を使い血漿凝固促進活性を測定した。  第VIII因子の残存活性のパーセンテージをＹ軸に表した。バーＡは抗体を事前注射せずに第VIII因子を注射した時の効果を表している（残存活性１００％）。バーＢは第VIII因子注射前の２Ｃ１１抗体単独注射の効果を表している。バーＣは第VIII因子注射前の２Ｃ１１抗体とペプチド１０７混合液の注射の効果を表す。バーＤは第VIII因子注射前の２Ｃ１１抗体とコントロールペプチドの混合液注射の効果を表す。  ペプチド１０７はインビボで２Ｃ１１抗体の効果を特異的に中和する。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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