(57)【要約】折り畳みのような温度に依存性する分子配置を分析するための装置と方法であって、多チャネルのフロースルー型チップ（１２）を含み、それに沿って分析対象の分子が通過する。チップの長さに沿って温度勾配が維持される。分子がチャネルに沿って通過するとき、変化する温度に応じてそれらは折り畳み型または折り畳み解消型になる。これら変化する分子配置は、分子がＵＶ光を吸収する量またはそれらが蛍光発光する量を同時に測定することによって調べられる。吸収および蛍光の情報はリアルタイムの分析のためにコンピュータシステム（２６）へと供給される。
2005506550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度に依存性する分子配置を分析する装置であって、
（ａ）長さ方向に沿って延びる複数のチャネルを有するマルチレーンチップを含み、各々のチャネルが分析対象の分子の通過のために配置されているマルチレーンチップと、
（ｂ）前記チャネルに沿って温度分布を作り出し、それにより、前記チャネルに沿って通過する分子を対応する温度変化にさらすための、チップに関連した加熱素子と、
を含むことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記温度分布を測定するために各々のチャネルの前記長さに沿って間隔を置かれた温度センサを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記分子が前記チャネルに沿って通過するとき該分子の光学特性を測定する検出器を含む、ことを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記光学特性は蛍光であり、前記検出器は、前記分子が前記チャネルに沿って通過するときにＵＶ照射に応答してそれらの蛍光発光を検出する、ことを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記検出器はハイブリッドフォトダイオードまたはマルチアノード型の光電子増倍管である、ことを特徴とする請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記光学特性はＵＶ吸収であり、前記検出器は透過ＵＶ照射の減衰を、分子吸収の結果として検出する、ことを特徴とする請求項３に記載の装置。
【請求項７】
前記検出器は電荷結合デバイスまたはフォトダイオードアレイであることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記電子が前記チャネルに沿って通過するとき前記分子の第１の光学特性および第２の光学特性をそれぞれ同時に測定する第１の検出器および第２の検出器を含む、ことを特徴とする請求項１または２に記載の装置。
【請求項９】
前記第１の検出器はＵＶ照射に応答する前記分子の蛍光発光を検出し、前記第２の検出器は透過ＵＶ照射の減衰を分子吸収の結果として検出する、ことを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記ＵＶ照射を作り出すためのＵＶ光源を含む、ことを特徴とする請求項３から７のいずれか一項または請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記チップは、前記分子が重力の影響下で前記チャネルに沿って通過するように配向される、ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記分子は前記チャネルに沿ってポンプで送られるか、または電気力によって推進される、ことを特徴とする請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
コンピュータ分析手段を含み、前記検出器もしくは各々の検出器の出力を受け、かつ前記出力もしくは複数出力を分子温度の関数として分析するように構成されている、ことを特徴とする請求項３から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記コンピュータ分析手段の出力に依存して前記装置の動作を自動的に制御するように構成された装置制御部を含む、ことを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記装置制御部は、選択された分子のサンプルをあるチャネルから自動的に収集するために分子収集メカニズムを作動させる、ことを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記分子収集メカニズムは、前記チャネルのサイドブランチへ前記サンプルをスイッチさせるための電圧スイッチング手段を含む、ことを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記コンピュータ分析手段は、制御チャネル内の判っている分子を表わす出力もしくは複数出力と、他のチャネル内の分析対象の分子を表わす出力もしくは複数出力との間の相互相関を計算する、ことを特徴とする請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１８】
前記加熱素子は、使用者が規定する温度分布を前記チャネルに沿って作り出すように制御可能である、ことを特徴とする前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記加熱素子は、前記チャネルに沿って単調に上昇または下降する温度分布を作り出すように制御される、ことを特徴とする請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記加熱素子は、前記チャネルに沿って多値の温度分布を作り出すように制御される、ことを特徴とする請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
温度に依存性する分子配置を分析する方法であって、
（ａ）チャネルの長さ方向に沿って温度分布を規定する工程、
（ｂ）分析対象の分子を前記チャネルに沿って通過させる工程、
（ｃ）前記分子の光学特性を、それらが前記チャネルに沿って通過するときに検出する工程、および
（ｄ）前記検出された光学特性を温度の関数として分析する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記光学特性は、前記チャネルに沿った位置の関数として分析され、各々の位置は前記分布に従ってその位置の温度を独自に規定する、ことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記光学特性は分子の蛍光である、ことを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記光学特性は前記分子のＵＶ吸収の容量である、ことを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
第１の光学特性および第２の光学特性の同時検出を含む、ことを特徴とする請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の光学特性は分子の蛍光であり、前記第２の光学特性は前記分子のＵＶ吸収の容量である、ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出された光学特性を温度の関数として分析した結果に依存して選択された分子を自動的に収集する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
分析対象の分子を運ぶ前記チャネルに隣接した制御チャネルに沿って制御分子を通過させる工程、前記制御分子の対応する光学特性もしくは複数特性を検出する工程、および前記分析対象の分子の前記光学特性もしくは複数特性を前記対応する光学特性もしくは複数特性と比較する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記光学特性もしくは複数特性と前記対応する光学特性もしくは複数特性との間の相互相関を計算する工程を含む、ことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記分析対象の分子は高分子である、ことを特徴とする請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記分析対象の分子はタンパク質である、ことを特徴とする請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
分子の折り畳みを温度の関数として分析する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
分子結合を温度の関数として分析する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
分子の安定性を温度の関数として分析する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出された光学特性を使用して前記分子の折り畳みのパターン、または折り畳み事象のシーケンスを判定する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出された光学特性を使用して折り畳みの中に含まれる前記分子の残分を識別する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記分子はタンパク質であり、前記残分はアミノ酸である、ことを特徴とする請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記分析対象の分子はタンパク質／生物学的ファクタまたはタンパク質／タンパク質複合体である、ことを特徴とする請求項２１〜３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記生物学的ファクタは糖、ホルモン、リガンド、レセプタまたは核酸であることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法を使用することによりタンパク質と生物学的ファクタもしくはタンパク質の相互作用に必要なドメインを判定する、ことを特徴とする使用方法。
【請求項４１】
治療薬剤のデザインに用いる、ことを特徴とする請求項４０に記載の使用方法。
【請求項４２】
前記方法は、分析対象の前記タンパク質／候補治療薬剤の複合体を運ぶチャネルに隣接した制御チャネルに沿って天然タンパク／生物学的ファクタもしくはタンパク質／タンパク質複合体を通過させる工程、天然タンパク／生物学的ファクタもしくはタンパク質／タンパク質複合体の対応する光学特性もしくは複数特性を検出する工程、および前記分析対象のタンパク質／候補治療薬剤複合体の前記光学特性もしくは複数特性を前記対応する光学特性もしくは複数特性と比較する工程を含む、ことを特徴とする請求項４１に記載の使用方法。
【請求項４３】
請求項２８〜３４に記載の方法を使用することにより、組み換え型タンパク質を分析し、前記制御制御分子は天然タンパクであり、かつ前記分析対象の分子は前記組み換え型タンパク質である、ことを特徴とする使用方法。
【請求項４４】
タンパク質の多形性を識別し、野生型タンパク質の前記検出された光学特性を候補タンパク質の前記検出された光学特性と比較する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記多形性はＳＮＰである、ことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項２１〜３４に記載の方法を使用することによりタンパク質が野生型もしくは変異種のいずれであるかを判定するものであって、前記タンパク質の前記検出された光学特性を前記野生型もしくは変異種のタンパク質のそれらと比較する工程を含む、ことを特徴とする使用方法。
【請求項４７】
疾病に付随する多形性を識別するために、非疾病個体から得た分子の前記検出された光学特性を疾病個体から得た対応する分子の前記検出された光学特性と比較する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１〜３４に記載の方法。
【請求項４８】
疾病を有するかまたはそれに敏感な個体を診断するために、前記個体から得た分子の前記検出された光学特性を前記疾病に付随すると知られている分子の形の前記検出された光学特性と比較する工程を含む、ことを特徴とする請求項２１から３４に記載の方法。
【請求項４９】
分析対象の前記分子がヒトまたは動物の体から取り出されたサンプルから由来する、ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記分子の第１の光学特性と第２の光学特性をそれぞれ測定する第１の検出器と第２の検出器を含む、ことを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項５１】
前記第１の検出器と前記第２の検出器は第１の波長の光と第２の波長の光をそれぞれ受け入れる、ことを特徴とする請求項５０に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、温度に依存性する(temperature-dependent)分子配置(molecular configuration)の分析法に関し、特に、限定はしないがタンパク質の折り畳み(folding of protein)および他の分子へのタンパク質の結合(binding of protein)に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質はアミノ酸と呼ばれるサブユニットの紐から作られており、その配列はタンパク質の一次構造として知られている。タンパク質の組織のこの最初のレベルはタンパク質をコードする遺伝子配列によって方向付けられ、遺伝子内の３つの核酸の配列（コドン）がいかなる特定の位置でもアミノ酸の性質を特定する。一次構造に加えて、殆どのタンパク質は高次レベルの構造組織もやはり示す。それはこの３方向もしくは三次の構造であって、タンパク質がその生物学的役割りの中で機能することを可能にする。細胞内の多くのタンパク質は２つ以上の折り畳みタンパク質もしくはサブユニットの凝集体として存在する。組織のこのレベルはタンパク質の四次構造と称される。
【０００３】
通常、タンパク質はいくつかの折り畳みドメイン(folded domain)、すなわち折り畳み構造の集約ドメイン(compact regions folded structure)で作られている。αヘリックス、βシートおよびβターンを含めていくつかのドメインの多様性が存在する。
【０００４】
折り畳みタンパク質(folded protein)はいくつかのタイプの結合によってその二次もしくは三次構造の中に保持される。これらには、一次構造を作り上げるアミノ酸の反対に帯電した側鎖間で生じる静電的相互作用、アミノ酸間の水素結合、非帯電化学基間の弱い相互作用（ファンデルワールス相互作用として知られている）、およびシステインのアミノ酸残分間のジスルフィド結合が含まれる。これらの相互作用を逆転することによってタンパク質の折り畳みを解消することはタンパク質の変性として知られており、その一次構造に戻る。これは、高温環境あるいはＳＤＳ溶液中にタンパク質を置くことによって達成されることが可能である。
【０００５】
タンパク質をその最終的で機能的な構造へと折り畳むことはタンパク質生成の最後の工程の１つである。それは複雑なシステムの中の極めて重要な工程であり、その工程の中のいかなる誤りも大規模な生理学的問題を誘導する可能性がある。例えば、狂牛病（ＢＳＥ: Bovine Spongiform Encephalopathy）が折り畳み誤りのタンパク質から起因することを示唆する強力な証拠が存在する（非特許文献１）。タンパク質の折り畳みと安定性を理解することは疾病の原因に一層明瞭な識見を与え、したがって疾病に関してさらに優れた治療もしくは予防的対策の開発を可能にするであろう。
【０００６】
タンパク質を研究するためのいくつかの科学技術が存在する。これらにはＸ線結晶学（非特許文献２）、ＮＭＲ（非特許文献３）、示差走査熱量法（非特許文献４）、および非自然界アミノ酸工学（非特許文献５）が含まれる。
【０００７】
Ｘ線結晶学はタンパク質の三次元構造を判定するための好ましい方法である。しかしながら、この技術は、タンパク質が結晶化しているときにのみ使用されることが可能であるという基本的な問題を有し、これは常に容易ではなく、あるいは可能ですらない。これはタンパク質の構造上の変化、環境の変化に反応した折り畳みの変化、または他の要素との相互作用を調べる容量に制限を課す。
【０００８】
タンパク質中のある光学的に活性なアミノ酸による蛍光および吸収もやはりタンパク質の構造上の変化をモニタすること、およびタンパク質濃度を測定することに使用されてきた（非特許文献６）。これらのアミノ酸は、その遷移的幾何学形状がアミノ酸の光学活性に起因するインドール発色団を含む（非特許文献７、８および９）。これに寄与する主なアミノ酸はトリプトファンとチロシンであり、その一方でフェニルアラニンおよびシステイン残分間のジスルフィド結合もやはりある程度の蛍光を示す。
【０００９】
【非特許文献１】
Horwich et al, Cell 89 499-510 (1997)
【非特許文献２】
Blundell et al, Protein Crystallography London: Academic Press (1976)
【非特許文献３】
Clore et al, Progress in NMR Spectroscopy 23 43-92 (1991)
【非特許文献４】
Blaber et al, protein structure and Stability Florida State University (1995)
【非特許文献５】
Mendel et al, Science 256 (5065) 1798-1802 (1992)
【非特許文献６】
Chen et al, Biochemistry 37 9976-9982 (1998)
【非特許文献７】
Callis et al, Chemical Physics Letters 244 53-58 (1995)
【非特許文献８】
Fender et al, Chemical Physics Letters 262 343-348 (1996)
【非特許文献９】
Fender et al, Chemical Physics Letters 239 31-37 (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述の技術のすべてに直面する問題は、それらがリアルタイムのタンパク質の折り畳み分析(real-time protein folding analysis)を行うことが可能でないことである。これはタンパク質の折り畳みと安定性の分析に、したがって疾病の診断と予防および／または治療にも大幅な束縛を課す。さらに、現在のシステムはしばしば、利用可能な折り畳みの動力学と静的な構造情報の間の関係について殆ど明らかにしない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、タンパク質の折り畳みおよび／または安定性、リガンド類、レセプタ類、糖類、ホルモン類、核酸類および治療薬剤類を含む生物学的ファクタとタンパク質の相互作用を分析することが望ましいいかなる方法にも有用であろう。他の長鎖または高分子もまた、それらが折り畳み可能である限り、またはそうでなければ温度変化に応答してそれらの物理学的構造を変える限り、調べられることが可能である。
【００１２】
本発明によると、温度に依存性する分子配置を分析するための装置が提供され、それは
（ａ）その長さ方向に沿って延びる複数のチャネルを有するマルチレーンチップを含み、各々のチャネルが分析対象の分子の通過のために配置され、
（ｂ）チャネルに沿った温度分布を作り出し、それにより、チャネルに沿って通過する分子を対応する温度変動にさらすためにチップに関連した加熱素子を含む。
【００１３】
本発明のさらなる態様によると温度に依存性する分子配置を分析する方法が提供され、それは、
（ａ）チャネルの長さに沿って温度分布を規定する工程、
（ｂ）分析対象の分子をチャネルに沿って通過させる工程、
（ｃ）分子がチャネルに沿って通過するときにそれらの光学特性を検出する工程、および
（ｄ）検出した光学特性を温度の関数として分析する工程を含む。
【００１４】
本発明を使用してタンパク質の折り畳みを分析するために、上述したようにタンパク質は温度勾配に沿って通される。タンパク質の通過と共に温度が低下すると、通常、それが折り畳まれ、その二次、三次または四次構造を導入することを可能にするであろう。対照的に、タンパク質の経路に沿った温度の上昇は、通常、タンパク質が変性を受けて折り畳みを解消する原因となるであろう。折り畳みまたは折り畳みの解消が生じるときにタンパク質によって発射される蛍光および吸収される光が測定され、折り畳みパターンを例証する一連の信号を作り出すために使用される。作り出された信号（検出光学特性(detected optical characteristic)とも称される）は折り畳みに重要なアミノ酸の位置、および結果的に最終構造につながる折り畳み事象のシーケンス(sequence of folding event)を示すであろう。
【００１５】
勾配を横切る温度の範囲は分析されるタンパク質の性質によって決まり、タンパク質のタイプに従って、および／または望まれる折り畳みもしくは折り畳み解消の程度に従って調節される可能性がある。通常では、温度範囲は２０℃から２００℃の領域であろう。いかなる特定の分子についても当該技術で利用可能な技術を使用して正確な範囲が容易に決定されることが可能である。
【００１６】
上記の段落で述べたような本発明は組み換え型によって生成されるタンパク質の品質を、特にその正確に折り畳みとなり、それにより適切に機能する容量、および安定性の観点からモニタするために有用であろう。例えば、組み換えタンパク質（または人間の手によっていかなる方式でも作り出されるそれら）の折り畳みのときに生じる信号が、生物学的に活性であると知られていることが好ましい同じタイプの天然タンパクによって生じるそれらと比較される可能性がある。この方式で、天然タンパクと実質的に同じ信号出力を共有しないタンパク質が廃棄され、正しく折り畳みになったタンパク質が識別されることが可能である。同様に、構造と安定性の点で天然タンパクと異なるようにデザインされたタンパク質が、本発明を使用して匹敵する技術によって識別されることが可能である。
【００１７】
本発明の背景では、「天然(native)」タンパク質または他の生物学的な要素もしくは高分子は自然にインビボで、すなわちヒトもしくは動物の体、植物またはその他の生命体で見出されるものである。
【００１８】
付け加えると、タンパク質と生物学的ファクタおよび／または他のタンパク質の相互作用が分析されることが可能である。相互作用する要素もしくはタンパク質の存在下でタンパク質を折り畳みもしくは折り畳み解消を行うことにより、相互作用に重要な部位が識別されることが可能となる。これは、温度勾配に沿ってタンパク質／タンパク質または生物学的ファクタ／タンパク質複合体を通過させ、タンパク質の折り畳みもしくは折り畳み解消のときに発射される蛍光および吸収される光をモニタすることによって達成される。発生した信号は生物学的ファクタもしくは他のタンパク質が存在しないときに同じタンパク質によって生じるそれらと比較されることが可能である。データの比較は相互作用にとって重要なアミノ酸と折り畳みのドメイン、および複合体が解体する温度を示す。
【００１９】
この態様は、相互作用を再生、促進、または阻害する目的で、治療薬剤のような生物学的ファクタのデザインに特に有用であろう。特に、いったんタンパク質および／または相互作用に重要な生物学的ファクタのドメインが確立されると、この情報は新たな生物学的ファクタをデザインするために使用されることが可能である。タンパク質とのこれらの相互作用、および折り畳みもしくは安定性に対するそれらの影響は本発明を使用して検査されることが可能である。タンパク質と自然の生物学的ファクタの複合体によって発生される信号はタンパク質および／または候補の生物学的ファクタによって発生されるそれらと比較されることで相互作用が同じであるかどうか、もしも同じでない場合、どの程度異なるかを判定するのが好ましい。
【００２０】
本発明のこの態様は治療薬剤の生産に特に有用である。こうして、最適の薬剤または生物学的ファクタで生じる信号のパターンを比較することによって所望の相互作用を有さない候補の治療薬剤が識別され、破棄されることが可能である。
【００２１】
本発明はまた、タンパク質の変異種を識別することにも有用であろう。通常、変異タンパク質は「野生型(wild type)」または一次構造で基準のタンパク質と異なるものであり、結果的に弱まった生物学的機能を有する可能性があり、かつ／または疾病に関するマーカとして役立つ可能性がある。野生型または基準のタンパク質は機能的に、生物学的に活性な種類である。
【００２２】
一次配列の変化はタンパク質をコードする遺伝子配列の相違に起因する。そのような相違は多形性として知られており、制限断片長多形、可変性縦列重複変数、超可変領域、二もしくは多ヌクレオチド重複、挿入因子およびヌクレオチドの欠失、追加もしくは置換として明示される。単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）は単一のヌクレオチド残分(residue)によって占められる部位の配列の変異である。単一ヌクレオチド多形は多形部位でのヌクレオチドの置換、欠失、または挿入から生じる。単一ヌクレオチド多形はアミノ酸配列への対応する変化に結果的につながる可能性がある。例えば、ヌクレオチド残分の置換はコドンを変化させ、結果的にアミノ酸の変化につながる可能性がある。同様に、核酸配列内の３つの連続する塩基の欠失または挿入は結果的にアミノ酸残分の挿入または欠失につながる可能性がある。
【００２３】
一次配列の変化の結果として、変異タンパク質は野生型のタンパク質と比べて異なる折り畳みパターンまたは安定性を有する可能性があり、あるいは異なった相互作用を生物学的ファクタと示す可能性がある。発生する信号を本発明を使用して比較することによって、折り畳みパターン、安定性または生物学的ファクタとの相互作用の観点からタンパク質が野生型のタンパク質と比較されることが可能である。この方式で、タンパク質は変異種、または野生型として識別されることが可能である。
【００２４】
付け加えると、本発明はタンパク質でＳＮＰを検出するのに使用されることが可能である。タンパク質中の特定の位置のアミノ酸配列のいかなる変化も、野生型の配列のその位置のアミノ酸によって生じる信号を分析対象のタンパク質のその位置のアミノ酸によって生じる信号と比較することによって検出されることが可能である。アミノ酸変化を引き起こすＳＮＰ以外の多形性がこの方式で検出されることが可能である。
【００２５】
本発明はまた、多形性を疾病と相関させることに使用されることが可能である。例えば、疾病個体から由来するタンパク質が正常個体から由来する同じタンパク質と比較されることが可能であり、生じた信号の差異が疾病に付随するタンパク質の多形性に関するマーカとして使用されることが可能である。本発明のこの態様は、疾病を有するかまたはそれに敏感であると個体を診断するのに使用されることが可能である。この方式で個体の表現型を判定することによって、どのような治療の効能も評価されることが可能である。
【００２６】
本発明はいくつかの方式で実用に移される可能性があり、ここで範例の方式で、添付の図面を参照しながら１つの特定の実施形態を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
図１に示された装置の心臓部はマルチレーンチップ１０であり、複数のレーンは複数の狭く、平行の面を有する上部開放型のチャネル１２によって規定される。各々のチャネルの幅は１マイクロメートルから数百マイクロメートルの画分の間のどのようなものであってもよく、１マイクロメートルから数千マイクロメートルの画分の間の深さである。好ましい実施形態では、チャネルは約５０マイクロメートルの幅で約２００マイクロメートルの深さである。チャネルはまた、チップ本体内の（閉鎖系の）微細毛細管によって規定されることも可能である。
【００２８】
本チップはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作製されることが可能であるが、しかし他の安定で非反応性で温度抵抗性の材料もやはり使用される可能性がある。本チップは「フロースルー」タイプであることが可能であり、そこでは分析対象の分子を含むバッファが引き込み線（図示せず）を介してチャネルの一方の端部へと連続的に供給される。その後、バッファと分子はチャネルに沿って通過して他方の端部に出る。チップ１０は、分子とバッファが単純に重力下でチャネル沿いに通過するように角度をつけられることが好ましいが、しかしポンプもしくはその他の圧力システムもやはり考えられる可能性がある。分子を輸送するための動電学的手段を使用することもやはり可能であろう。
【００２９】
チャネル１２の下に配置され、かつそれに直角にあるものは一連の加熱用ストリップ１４（簡明化するためにそのうちの２本だけが図１に示されている）である。これら加熱用ストリップの温度は熱制御部１６によって変えられることが可能であり、それにより、チャネルの長さに沿って温度勾配が導入される。熱制御部１６は着手される分析のタイプに従って温度勾配を変更することが可能である。ときには、例えば、温度はチャネルの長さに沿って（分子の移動の方向で）単調に上げられる可能性があり、それに対してその他では単調に下げられる可能性がある。いくつかのタイプの分析に関すると、多値の勾配が有用であり、例えばチャネルの端部で低温度が維持され中央部で高温度が維持される。
【００３０】
分子がチャネルに沿って移動するとき、それらが異なる温度体制に晒されるとそれらの物理学的構造は変化する。図２に最もよく示されているように、例えば上昇する温度体制では、本来折り畳み状態１７にあるタンパク質は徐々に１８で示されたように折り畳み解消されるであろう。特定の分子の折り畳み解消の配列を折り畳みの配列と比較しようとする研究では上述した多値の温度勾配が有用である可能性がある。最も基本的なレベルでは、温度上昇によっていったん分子が折り畳み解消されると、それは温度が下がると再び自然に折り畳みになるかどうかを知ることを使用者は単純に希望する可能性がある。
【００３１】
熱電対２０のような温度検出器のアレイが、チャネルに沿った距離（ｚ）の関数として各々のチャネルの温度を定常的にモニタする。これは、いったん特定の分子の位置（ｚ）がチャネル内で判ると、その後、その温度が独自に判定されるように１つ１つのマップ化が維持されることを可能にする。それゆえに、特定の分子の構造の温度に伴う変化を調べるために大部分の分子のサンプルの温度を極めて近接して制御する必要はもはやなくなり、その代わりに、ｚの関数として分子がどのようにその構造を変化させるかを単純に観察すればよい。
【００３２】
チャネルに沿って分子が移動するとき、それらはＵＶ光源２２から放射するＵＶ照射に上方から暴露される。ＵＶ光が分子を通過するとそれは選択的に吸収され、その吸収の量は分子の物理学的構造に従って変化する。
【００３３】
通常、折り畳み解消された分子１８は折り畳み分子１７よりも少ないＵＶ光を吸収するであろう。ＵＶ光は（実質的にＵＶ透過性の）ＰＤＭＳチップ１０を通り抜け、下にある光検出器アレイ２４によって検出される。例えばこれはフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）または電荷結合デバイス（ＣＣＤ）である。検出器アレイ２４の出力は記憶と分析のためにコンピュータシステムへと供給される。多チャネルの高速でリアルタイムの分析は極めてプロセッサ集約型であるので、コンピュータシステム２６はハードウェアを基本とするデータ収集と分析を含む可能性がある。好ましい手法では、データ収集ユニット（図示せず）は生情報を書替え可能ゲートアレイ（ＦＰＧＡ）によって制御される複数のデジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）へと供給する。もちろん、他のデータ収集と分析のシステムが考えられる可能性がある。しかしながら、コンピュータシステム２６はリアルタイムで（すなわち分析される分子がチャネルに沿って移動しているときに）分析を実行することが可能であることが好ましい。
【００３４】
光源２２から出るＵＶ照射は分子が蛍光発光する原因となり、この蛍光２６はチップの上に配置された１つまたは複数のハイブリッドフォトダイオードアレイ（ＨＰＤ）２８によって検出される。各々のＨＰＤは基本的に多チャネルの光電子増倍管アレイであり、これは一度に多数の分子から入る蛍光を検出すること、および各々の分子についてそれがあるチャネルとそのチャネル内のその位置（ｚ）の両方を判定することが可能である。スレショルド効果と時間分解過程を観察するのに充分な程度に狭く温度を規定するために、ｚは充分正確に測定される。こうして基本的にチップの長さと幅にわたってとられる蛍光のマップであるＨＰＤの出力は分析のためにコンピュータシステム２６へと送られる。同様の考え方がデータ収集および上記で検出器アレイ２４に関して検討したような分析にも当てはまる。
【００３５】
蛍光の代わりに散乱光が検出される可能性がある。ＨＰＤを使用するのではなく、蛍光または散乱光はマルチアノードの光電子増倍管によって検出される可能性がある。
【００３６】
一実施形態（図示せず）では、二波長吸収および／または蛍光／散乱が測定される可能性がある。これは調査対象の２つの分子間の引力および／または結合の研究を可能にする。例えば、タンパク質に対する糖の結合の研究では、吸収／蛍光／散乱光はタンパク質と糖の両方に調節した波長で検出される可能性がある。そのような手法が使用される場合、二波長ＩＲ源が適切な二波長検出器（図示せず）と共に供給される。
【００３７】
ＵＶ吸収の測定は分子の静特性を少なくとも部分的に示すものであるが、それに対して蛍光測定は動特性を少なくとも部分的に示すものであると考えられる（しかし出願人の知る限りではこれについて包括的な研究はまだなされていない）。両方の測定を同じ分子に同時に行うことによって、独自に行われるいずれかの測定を上回って大幅な追加の情報が温度の関数として導き出される可能性がある。
【００３８】
チップ内のチャネルのいくつかは制御用(control)として使用される可能性があり、知られているタイプのタンパク質または他の分子を供給される可能性がある。制御チャネル(control channel)とテストチャネル(test channel)の出力を比較することによって、使用者は異なるタンパク質もしくは他の分子間の小さな変化がその折り畳み特性に影響を与えることが可能な方式で研究することが可能である。
【００３９】
コンピュータシステム２６によって実行される正確な分析はもちろん着手される特定の研究に応じて決まるであろう。しかしながら、通常では、制御チャネル内の蛍光と吸収の測定と、１つまたは複数の試験区で同時に実行される同様の測定のいくつかの組み合わせの間の相互相関に使用者は興味を示すであろう。他のあり得る関心事の計算は単一チャネル内、蛍光と吸収の測定間の相互相関、ならびに自己相関の計算である可能性がある。熱制御部１６によって規定される固定の熱勾配について、およびある範囲の異なる熱勾配についてもまた計算が実行される可能性がある。このすべてはコンピュータシステム２６の制御下でなされる。
【００４０】
画像スクリーンまたはプリンタといった計算の出力部３０は着手される分析に対する分析出力を使用者に提供する。場合によっては、または追加的に制御部３２が供給され、これがリアルタイムの出力に応じて自動的に実験装置を制御することも可能である。例えば、制御部３２が自動的にＵＶ照射を変化させ、熱制御部を変え、またはハイブリッドフォトダイオード２８もしくは検出器アレイ２４の検出特性を変える可能性がある。また、制御部３２はリアルタイムの分析結果に応じて関心対象の特定の分子のサンプルの自動的収集を提供する可能性がある。これを行う１つの方式は図３に示されている。
【００４１】
図３は複数のチャネル１２のうちの１つの端部は（分子の流れの方向３１で）２つの出力チャネル３２、３４に分岐する。チャネル３２、３４の入り口の電極３６、３８は電位差がチャネル入り口の各々に印加されることを可能にし、それにより、分子のサンプルが２つのチャネルのいずれかへと選択的にスイッチさせられることを可能にする。収集されるべき特定の分子が２分岐点に到達すると、電極３８と主チャネル端部の電極４０の間に高電圧が印加され、それにより、サンプルをチャネル３４内へと迂回させる。いったんサンプルが収集されると高電圧は電極３８から電極３６へと切り換えられ、それにより、引き続くすべての分子はチャネル３２へと送られる。その後、チャネル３４内に収集されたサンプルは、例えば質量分析器またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time of Flight）によってさらに分析される可能性がある。
【００４２】
電極３６、３８の間の電圧の切り換えは制御部３２によって達成されることが可能であり、それはコンピュータシステム２６によって実行されるコンピュータ分析の結果でそれ自体で作動する。所望であれば制御部３２はまた、少なくとも部分的に吸収もしくは蛍光の生の情報または特性に応じて作動し、それにより、適用される熱勾配のタイプ、どのような熱勾配についてもその変化の時間、ＵＶ照射の強度、照射がオンに切り換えられた時間などといった装置の状態を規定することも可能である。概して、制御部３２は装置自体のいかなる変数にも、収集される生データ、または分析されたデータに応じて動作することが可能である。図３の特定の実施形態では、制御部３２はある程度特定の関心対象に見える特定の分子のサンプル（すなわちそれらはコンピュータシステム２６によって実行される分析のリアルタイムの結果に基づいた関心対象のいくつかの所定もしくは動的な判定基準に合致する）を収集するように自動的に作用する。
【００４３】
好ましい実施形態のシステムはタンパク質の分析において特定の用途を見出すと期待される。実行可能なあり得る分析の範囲は明らかに極めて広いが、それらにはタンパク質の熱安定性への研究、熱的折り畳みのメカニズムの分析、熱安定性に与える（タンパク質を発現する核酸のＳＮＰといった）変異の影響の評価、および分子の安定性に与える環境条件の影響の評価が含まれる。付け加えると、本システムは他のタンパク質がどのようにして分子に結合するか、およびこれが温度変化によってどのように影響を受けるかを調べることに使用される可能性がある。特に、本システムはタンパク質の熱安定性に対する変化がどのようにして小分子結合容量に影響を及ぼすかを調べるために使用される可能性がある。
【００４４】
説明した装置で実行可能な典型例の分析は、特定の薬剤の多様な投与量の効果に関する。例えば、極めて高い投与量の体制は望ましくないタンパク質の変化が患者に生じる原因になる可能性がある。これを調べるために、たんぱく質サンプルが異なる薬剤量で治療を受けている様々な患者から入手され、「ノーマル」プロテインに対応するタンパク質を含む制御チャネルを伴ってこれらのタンパク質がチャネル毎に比較される。そのような分析は特定の薬剤治療および投与量の体制の効能に極めて迅速な決定がなされることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の実施形態による、分子の折り畳みを分析するための装置を概略的に例示する図である。
【図２】図１の装置を通る縦方向の断面を概略的に示す図である。
【図３】特定のチャネルに沿って移動する分子がコンピュータの制御下でどのようにしてスイッチさせられるかをやはり概略的に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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