(57)【要約】少なくとも１つの連結要素がピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントである少なくとも１種のアセンブリ単位を含むナノ構造を作製する。ピリン含有アセンブリ単位は、２つのピリン誘導連結要素を有し得、そして構造要素、機能的要素またはその両方を含み得る。ナノ構造は、段階的なアセンブリ方法を使用して適切に調製され、この方法において、少なくとも１つの未結合要素を有するナノ構造中間体が、複数の異なる連結要素を有するアセンブリ単位と接触される。アセンブリ単位の連結要素のうちのいずれも、それら自体とも、同じアセンブリ単位の別の連結要素とも相互作用し得ない。しかし、連結要素のうちの１つは、ナノ構造中間体の未結合連結要素と相互作用し得、その結果、このアセンブリ単位は、ナノ構造中間体に非共有結合される。
2005518455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ構造の段階的アセンブリのための方法であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの未結合連結要素を含むナノ構造中間体を、複数の異なる連結要素を含むアセンブリ単位と接触させる工程であって、ここで：
（ｉ）該複数の異なる連結要素のうちの連結要素のいずれも、それ自体とも、該複数のものの別の連結要素とも相互作用し得ず；そして
（ｉｉ）該複数の単一の連結要素、および該ナノ構造中間体の単一の未結合連結要素が、相補的連結要素である、工程、
であって、ここで、該アセンブリ単位は、該ナノ構造中間体に非共有結合されて、引き続くサイクルにおいて使用するための新たなナノ構造中間体を形成する、工程；
（ｂ）未結合アセンブリ単位を除去する工程；ならびに
（ｃ）ナノ構造を形成するために十分なサイクル数にわたって、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、
を包含し、ここで、少なくとも１つのサイクルにおいて、該相補的な連結要素は、ピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを含む、方法。
【請求項２】
前記ナノ構造中間体が、表面結合した開始アセンブリ単位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらなる工程：
（ｄ）前記ナノ構造を１つ以上のキャップ単位でキャップする工程、
を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つのサイクルにおいて使用される第一のアセンブリ単位が、ピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを含む第一の連結要素に共有結合した少なくとも１つの構造的要素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記構造的要素が、前記第一の連結要素および第二の連結要素に共有結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第二の連結要素が、ピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一のアセンブリ単位が、第二の構造的要素に結合して安定な複合体を形成する第一の構造的要素を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記アセンブリ単位が、機能的要素をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのサイクルにおける第一のアセンブリ単位が、機能的要素を含み、そしてピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを含む結合要素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
相補的連結要素の特異的な非共有結合相互作用の、共有結合へのアセンブリ後転換の工程をさらに包含し、これによって、該結合が安定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アセンブリ単位が、複数のサブアセンブリ単位を含み、該サブアセンブリ単位が互いに結合して、安定な複合体を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのサイクルにおける前記連結要素が、ピリンタンパク質であり、そして配列番号１〜１０からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのサイクルにおける前記連結要素がハイブリッドピリンタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、配列番号１、３、５、７、および９からなる群から選択されるＮ末端伸長配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、配列番号２、４、６、８および１０からなる群から選択されるピリンタンパク質本体配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、第１のピリンタンパク質のピリンアミノ末端伸長および第２のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体を含み、そして該第１のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体および該第２のピリンタンパク質のピリンアミノ末端伸長を欠損し、ここで、該第１のピリンタンパク質のアミノ末端伸長は、該第２のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体に結合しない、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
複数の異なる連結要素を含む、複数の種のアセンブリ単位から形成されるナノ構造であって、該アセンブリ単位は、少なくとも１種のアセンブリ単位を含み、ここで、第１の連結要素は、ピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを含む、ナノ構造。
【請求項２０】
前記第１の連結要素が、配列番号１〜１０からなる群から選択されるピリンタンパク質を含む、請求項１９に記載のナノ構造。
【請求項２１】
前記ピリンタンパク質が、ハイブリッドピリンタンパク質である、請求項１９に記載のナノ構造。
【請求項２２】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、配列番号１、３、５、７、および９からなる群から選択されるＮ末端伸長配列を含む、請求項２１に記載のナノ構造。
【請求項２３】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、配列番号２、４、６、８および１０からなる群から選択されるピリンタンパク質本体配列を含む、請求項２１に記載のナノ構造。
【請求項２４】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、第１のピリンタンパク質のピリンアミノ末端伸長および第２のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体を含み、そして該第１のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体および該第２のピリンタンパク質のピリンアミノ末端伸長を欠損し、ここで、該第１のピリンタンパク質のアミノ末端伸長は、該第２のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体に結合しない、請求項２１に記載のナノ構造。
【請求項２５】
前記第１のアセンブリ単位が、機能的要素をさらに含む、請求項１９に記載のナノ構造。
【請求項２６】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項２５に記載のナノ構造。
【請求項２７】
前記第１のアセンブリ単位が、構造的要素をさらに含む、請求項１９に記載のナノ構造。
【請求項２８】
前記第１のアセンブリ単位が、機能的要素をさらに含む、請求項２７に記載のナノ構造。
【請求項２９】
前記機能的要素が、光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子を含む、請求項２８に記載のナノ構造。
【請求項３０】
ハイブリッドピリンタンパク質であって、該ハイブリッドピリンタンパク質が、第１のピリンタンパク質のピリンアミノ末端伸長および第２のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体を含み、そして該第１のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体および該第２のピリンタンパク質のピリンアミノ末端伸長を欠損し、ここで、該第１のピリンタンパク質のアミノ末端伸長は、該第２のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体に結合しない、ハイブリッドピリンタンパク質。
【請求項３１】
光活性分子、光子ナノ粒子、無機イオン、無機ナノ粒子、磁性イオン、磁性ナノ粒子、電子的ナノ粒子、金属製ナノ粒子、金属酸化物ナノ粒子、金ナノ粒子、金被覆ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ナノ結晶ナノワイヤ、量子ドット、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、酵素、ハプテン、抗原、ビオチン、ジゴキシゲニン、レクチン、毒素、放射性標識、発蛍光団、発色団、または化学発光分子からなる群から選択される機能的要素をさらに含む、請求項３０に記載のハイブリッドピリンタンパク質。
【請求項３２】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、配列番号１、３、５、７、および９からなる群から選択されるＮ末端伸長配列を含む、請求項３０に記載のハイブリッドピリンタンパク質。
【請求項３３】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、配列番号２、４、６、８および１０からなる群から選択されるピリンタンパク質本体配列を含む、請求項３２に記載のハイブリッドピリンタンパク質。
【請求項３４】
前記ハイブリッドピリンタンパク質が、配列番号２、４、６、８および１０からなる群から選択されるピリンタンパク質本体配列を含む、請求項３０に記載のハイブリッドピリンタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピリンタンパク質を含むナノ構造のアセンブリのための方法、このようなナノ構造の構築において使用するためのピリンタンパク質アセンブリ単位、およびピリンタンパク質アセンブリ単位を含むナノ構造に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ナノ構造は、ナノメートル範囲（約１〜１００ｎｍ）の１つ以上の特徴的な寸法を有する個々の成分を有する構造である。成分がナノメートル範囲の物理的寸法を有する構造をアセンブルする利点が、科学者によって４０年以上にわたって考察および熟考されてきた。これらの構造の利点は、Ｆｅｙｎｍａｎ（１９５９，Ｔｈｅｒｅ’ｓ  Ｐｌｅｎｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｏｍ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｂｏｔｔｏｍ，Ａｎ  Ｉｎｖｉｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｅｎｔｅｒ  ａ  Ｎｅｗ  Ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ（講義）、Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２９，１９５９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて再版，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９６０，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）によって最初に指摘され、そしてＤｒｅｘｌｅｒ（１９８６，Ｅｎｇｉｎｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｅａｔｉｏｎ，Ｇａｒｄｅｎ  Ｃｉｔｙ，Ｎ．Ｙ．：Ａｎｃｈｏｒ  Ｐｒｅｓｓ／Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ）によって大きく展開された。これらの科学者は、非常に小さい特徴的寸法を有する構造の創出において、多大な有用性を想定した。ナノテクノロジーの潜在的な適用は、広がる傾向にあり、そして社会に対する予測された影響は大きい（例えば、２０００，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ：ＩＷＧＮ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  Ｒｅｐｏｒｔ；Ｖｉｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒ＆Ｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｄｅｃａｄｅ；Ｍ．Ｃ．Ｒｏｃｏ，Ｒ．Ｓ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＰ．Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ編，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。非常に多数のナノスケールのデバイスおよび構造（電子部品および光部品；医療用センサ；新規材料；生体適合性デバイス；ナノエレクトロニクスおよびナノ回路；ならびにコンピュータ技術を含む）についての潜在的な適用が存在すことが予測される。
【０００３】
ナノ構造の物理的性質および化学的性質は、このナノ構造が作製される構築ブロックに依存する。例えば、これらの構築ブロックのサイズおよびこれらが連結する角度、ならびに機能的要素が配置され得る位置は、ナノ構造の特性を決定する際に重要な役割を果たす。当該分野は、ナノ構造において使用され得る異なる型の材料の多数の例を提供しており、これには、以下が挙げられる：ＤＮＡ（米国特許第５，４６８，８５１号、同第５，９４８，８９７号および同第６，０７２，０４４号；ＷＯ  ０１／００８７６）、バクテリオファージＴ−平坦（ｅｖｅｎ）テイル繊維（米国特許第５，８６４，０１３号および同第５，８７７，２７９号ならびにＷＯ  ００／７７１９６）、ヒトエラスチンおよび他の繊維状タンパク質でモデル化された自己整列ペプチド（米国特許第５，９６９，１０６号）、ならびに人工ペプチド認識配列（米国特許第５，７１２，３６６号）。それにもかかわらず、ナノ構造についての全ての潜在的適用を満たすために必要とされ得る多様性を提供するために、さらなる型の構築ブロックが継続して必要とされている。本願は、このクラスのみの構築ブロックを含む均質なナノ構造中、または他のクラスの構築ブロックと組み合わせて不均一ナノ構造中で使用され得る、構築ブロックのさらなるクラスを提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、複数の種のアセンブリ単位から形成されたナノ構造を提供する。いくつかの例外（例えば、キャップ単位）があるものの、これらのアセンブリ単位は、複数の異なる連結要素を含む。本発明のナノ構造において、このナノ構造は、少なくとも１つの連結要素がピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを含む、少なくとも１種のアセンブリ単位を含む。ピリン含有アセンブリ単位は、２つのピリン誘導連結要素を有し得る。さらに、ピリン含有アセンブリ要素単位は、構造的要素、機能的要素またはその両方を含み得る。
【０００５】
本発明のナノ構造は、段階的アセンブリ法を使用して適切に調製される。この方法において、少なくとも１つの未結合の連結要素を含むナノ構造中間体は、複数の異なる連結要素を含むアセンブリ単位と接触させられ、この方法において、
（ｉ）この複数の異なる連結要素の連結要素は、それ自体にもこの複数の連結要素の別の連結要素にも相互作用し得ず、そして
（ｉｉ）この複数の連結要素の単一の連結要素と、このナノ構造中間体の単一の未結合の連結要素とは、相補的な連結要素である。
結果として、アセンブリ単位は、ナノ構造中間体と非共有結合して、引き続くサイクルにおいて使用するための新たなナノ構造中間体を形成する；
（ｂ）未結合のアセンブリ単位を除去する；そして
（ｃ）ナノ構造を形成するのに十分な数のサイクルにわたって工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す。
本発明の方法において、少なくとも１つのサイクルにおける相補的な連結要素は、ピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントを含む。
【０００６】
本発明は、さらに、本発明のナノ構造を形成する際に有用であるハイブリッドピリンタンパク質を提供する。ハイブリッドピリンタンパク質は、第１のピリンタンパク質のピリンアミノ末端伸長および第２のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体を含み、そして第１のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体および第２のピリンタンパク質のピリンアミノ末端伸長を欠いており、ここで、この第１のピリンタンパク質のアミノ末端伸長は、第２のピリンタンパク質のピリンタンパク質本体に結合しない。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本願における用語は、当該分野におけるその通常の意味と一致した様式で一般に使用される。しかし、明確さを提供するために、当該分野で一致しない場合においては、以下の定義が支配する。
【０００８】
（アセンブリ単位）アセンブリ単位は、構造的要素、連結要素および／または機能的要素を含む原子および／または分子の集合である。好ましくは、アセンブリ単位は、特異的非共有結合相互作用の形成を介して、単一の単位としてナノ構造に付加される。アセンブリ単位は、２つ以上のサブアセンブリ単位であり得る。アセンブリ単位は、１つ以上の構造的要素を含み得、そしてさらに、１つ以上の機能的要素および１つ以上の連結要素を含み得る。アセンブリ単位が機能的要素を含む場合、この機能的要素は、連結要素に結合され得るかもしくは連結要素内に組み込まれ得、または特定の実施形態においては構造的要素に結合され得るかもしくは構造的要素内に組み込まれ得る。１つの構造的要素および１つまたは複数の非相互作用連結要素を含み得るこのようなアセンブリ単位は、特定の実施形態において、構造的に剛性であり得、そして十分規定された認識特性および結合特性を有し得る。
【０００９】
（アセンブリ単位、開始剤）開始アセンブリ単位は、本発明の段階的アセンブリ法によって形成されるナノ構造に組み込まれ得る最初のアセンブリ単位である。これは、段階的アセンブリプロセスの第一工程として、共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって、固体基板または他のマトリクスに結合され得る。開始アセンブリ単位はまた、「開始単位」としても公知である。
【００１０】
（ボトムアップ（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ））構造（例えば、ナノ構造）のボトムアップアセンブリは、例えば、自己アセンブリまたは段階的アセンブリを使用してサブ構造を一緒に連結することによる、その構造の形成である。
【００１１】
（キャップ単位）キャップ単位は、最大で１つの連結要素を含むアセンブリ単位である。キャップ単位が一旦ナノ構造中に組み込まれると、キャップ単位との相互作用を介してさらなるアセンブリ単位がナノ構造中に組み込まれることはできない。
【００１２】
（結合誘導体）特定のタンパク質（例えば、ピリンタンパク質）の誘導体は、特定のタンパク質の結合機能を維持するが、基本タンパク質に関して変更がなされる。一次配列の変化の結果として、ここで、（１）機能的に等価なアミノ酸残基は、サイレントな変化を生じる配列内の残基と置換されるか、あるいは（２）目的のピリンタンパク質もしくはその結合フラグメントに実質的に相同である（例えば、種々の実施形態において、同じサイズのアミノ酸配列に関して、あるいはアライメント配列（当該分野で公知のコンピューターホモロジープログラムによってアライメントが実施される）と比較した場合に、少なくとも６０％または７０％または８０％または９０％または９５％同一性）か、またはそれらのコード核酸が、高ストリンジェントまたは中程度ストリンジェントな条件下で目的のタンパク質をコードする配列にハイブリダイズし得るタンパク質またはペプチド領域を産生する。
【００１３】
配列内の機能的に等価なアミノ酸残基は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００１４】
（結合フラグメント）ペプチドエピトープまたはピリンタンパク質のような分子の結合フラグメントは、結合フラグメントが由来する、ペプチドエピトープまたはピリンタンパク質の結合特異性を示すフラグメントである。
【００１５】
（第一のアセンブリ単位、第一の要素）明確さのために、アセンブリ単位または要素は、時折、「第一」または「第二」のような標識を用いて参照される。これは、単に、慣習的な標識であり、決してナノ構造内の、参照されるアセンブリ単位または要素の位置を示すものではない。
【００１６】
（機能的要素）機能的要素は、任意の所望の物理的特性、化学的特性または生物学的特性を示す部分であり、ナノ構造中の十分規定された部位において、特異的な共有結合相互作用または非共有結合相互作用によって構築、結合または配置され得る。あるいは、機能的要素は、所望の物理的特性、化学的特性または生物学的特性を有する部分についての結合部位を提供するために使用され得る。機能的要素の例としては、限定ではなく、ペプチド、タンパク質（例えば、酵素）、タンパク質ドメイン、低分子、無機ナノ粒子、原子、原子クラスター、磁性ナノ粒子、光ナノ粒子もしくは電子ナノ粒子、またはマーカー（例えば、放射性分子、発色団、発蛍光団、化学発光分子もしくは酵素マーカー）が挙げられる。このような機能的要素は、二次元ナノ構造および三次元ナノ構造を形成するために、線状の一次元ナノ構造を架橋するためにも使用され得る。
【００１７】
（連結要素）連結要素は、アセンブリ単位に結合特性を付与する、アセンブリ単位の一部であり、これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：結合ドメイン、ハプテン、抗原、ペプチド、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、ポリマーもしくは他の部分、またはこれらの組み合わせ（これらは、特異的な非共有結合相互作用を介して、別の連結要素と相互作用し得る）。
【００１８】
（連結要素、相補的）相補的連結要素は、特異的な非共有結合相互作用を介して、互いに相互作用する２つの連結要素である。
【００１９】
（連結要素、非相補的）非相補的連結要素は、互いに特異的に相互作用せず、そして互いに特異的に相互作用する傾向を全く実証しない、２つの連結要素である。
【００２０】
（連結対）連結対は、２つの相補的連結要素である。
【００２１】
（ナノ構成要素）ナノ構成要素は、ナノ構造の下部構造または一部である。
【００２２】
（ナノ材料）ナノ材料は、ナノ粒子の、結晶性集合から作製されるか、部分的に結晶性集合から作製されるか、または非結晶性集合から作製される、材料である。
【００２３】
（ナノ粒子）ナノ粒子は、一緒に結合してナノメートル範囲（１〜１０００ｎｍ）の寸法を有する構造を形成する、原子または分子の集合である。この粒子は、均質であっても不均質であってもよい。単一の結晶ドメインを含むナノ粒子は、ナノ結晶とも呼ばれる。
【００２４】
（ナノ構造またはナノデバイス）ナノ構造またはナノデバイスは、アセンブリ単位（すなわち、構造的要素、機能的要素および／または連結要素）を含む原子および／または分子の集合である。これらの要素は、ナノメートル範囲の少なくとも１つの特徴的長さ（寸法）を有し、ここで、互いに対するアセンブリ単位の位置は、規定された形状で確立される。ナノ構造またはナノデバイスはまた、これに結合した官能性置換基を有して、特定の官能性を提供し得る。
【００２５】
（ナノ構造中間体）ナノ構造中間体は、さらなるアセンブリ単位が付加され得る、ナノ構造のアセンブリ中に形成される中間体サブ構造である。最終工程において、この中間体とナノ構造とは同じである。
【００２６】
（非共有結合相互作用、特異的）特異的非共有結合相互作用は、例えば、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間で生じる相互作用である。
【００２７】
（タンパク質）本願において、用語「タンパク質」は、複数のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をいうように一般に使用され、そしてアミノ酸の最小数をいずれも示すことを意図しない。
【００２８】
（除去）未結合のアセンブリの除去は、物理的に除去されるかされないかによらず、これらが、成長中のナノ構造とのさらなる反応に関与することができないようにされる場合に達成される。
【００２９】
（自己アセンブリ）自己アセンブリは、規則正しい構造への、成分の自発的組織化である。自律的アセンブリとしても知られる。
【００３０】
（ナノ構造の段階的アセンブリ）ナノ構造の段階的アセンブリは、ナノ構造のアセンブリのためのプロセスであり、ここで、一連のアセンブリ単位は、固体マトリクスまたは固体基板上に代表的には固定化された開始単位で始まる、予め指定された順番で付加される。各工程は、中間体サブ構造（ナノ構造中間体という）の形成を生じ、次いでこれに、さらなるアセンブリ単位が付加され得る。アセンブリ工程は、以下の工程を包含する：（ｉ）連結工程（ここで、アセンブリ単位は、付加されるべき次のアセンブリ単位を含む溶液中の結合した開始単位またはナノ構造中間体との、マトリクスまたは基板のインキュベーションによって、開始単位またはナノ構造中間体に連結される）；ならびに（ｉｉ）除去工程（例えば、洗浄工程（ここで、過剰なアセンブリ単位は、中間体構造または完成したナノ構造の近位から除去される））。段階的アセンブリは、ナノ構造の所望の設計に従って全てのアセンブリ単位がナノ構造に組み込まれるまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）を反復することによって継続される。アセンブリ単位は、特異的な非共有結合の形成を介して、開始単位またはナノ構造中間体に結合する。アセンブリ単位の連結要素は、ナノ構造中間体上の予め指定された部位にのみ結合するように、選択される。アセンブリ単位の形状、構造的要素、ならびに連結要素および機能的要素の相対的配置、そしてアセンブリ単位がナノ構造に付加される順序は、全て、機能的単位がこの構造において互いに対して予め指定された位置に配置され、それによって完全にアセンブリされたナノ構造に所望の機能を付与するように、設計される。
【００３１】
（構造的要素）：構造的要素は、連結要素間に構造的連結または幾何学的連結を提供し、それによって隣接するアセンブリ単位間に幾何学的連結を提供するアセンブリ単位の部分である。構造的要素は、これらが一部分であるナノ構造についての構造的枠組みを提供する。
【００３２】
（サブアセンブリ）：サブアセンブリは、一緒に結合される複数のアセンブリ単位からなり、そしてアセンブリ中間体（例えば、ナノ構造中間体）に全体として加えられ得る原子または分子の集合である。本発明の多くの実施形態において、構造的要素はまた、アセンブリ単位の機能的要素を支持する。
【００３３】
（上から下へ）：構造（例えば、ナノ構造）の上から下へのアセンブリは、例えば、リソグラフィー技術を使用する、大きな最初の構造の処理を介する構造の形成である。
【００３４】
（ピリンアセンブリ単位）
本発明は、ナノ構造の製造において使用され得るアセンブリ単位の新しい種類を提供する。これらの「ピリンアセンブリ単位」は、ピリンタンパク質またはその結合誘導体もしくはフラグメントである、少なくとも１つの連結要素を含む。さらに、このアセンブリ単位は、構造的要素（これは、ピリンタンパク質の一部分であり得る）および／または機能的要素を含み得る。
【００３５】
ピリンは、細菌接着線毛を構成するタンパク質単位である。細菌接着線毛（「Ｐ−ｐｉｌｉ」）は、ピリンの重合化によって形成される（例えば、ＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ、１９９５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｉｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：１６４−６７；ＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ、１９９８，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｉｌｉ  ａｒｅ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｏｆ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｕｎｉｔｓ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｊ．７４：６２３−３２を参照のこと）。線毛単位は、インビトロでアセンブリされ得る（例えば、Ｂｕｌｌｉｔｔら、１９９６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｉｌｕｓ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｓｕｂ−ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｕｎｃａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ  ｚｉｐｐｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１２８９０−９５を参照のこと）。
【００３６】
Ｅ．ｃｏｌｉの表面に発現されたＰ−ｐｉｌｉは、直径６．８ｎｍで、長円体の中心空洞２．５ｎｍ×１．５ｎｍを有し、らせん状の軸のまわりに巻いているらせん状フィラメントであり、線毛の表面に伸びる放射状チャネルに結合している（ＨｕｌｔｇｒｅｎおよびＮｏｒｍａｒｋ、１９９１、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｐｉｌｕｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１：３１３−１８；Ｈｕｌｔｇｒｅｎら、１９９３，Ｐｉｌｕｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｉｌｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｎｓ：ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ  ７３（５）：８８７−９０１；ＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ，１９９５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｉｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：１６４−６７）。各線毛は、約１０００コピーのメジャーピリンであるＰａｐＡ、ならびに１個または数個のコピーのマイナーピリンであるＰａｐＨ、ＰａｐＫ、ＰａｐＥ、ＰａｐＦ、およびＰａｐＧを含む。らせんのＰａｐＡ含有コイルドロッド領域において、らせんの１ターンあたり３．２９サブ単位（１サブ単位あたり７．６Åのぼる）が存在する（ＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ，１９９５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｉｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：１６４−１６７）。線毛の遠位頂部の原線維構造は、４つの異なるが、相同なピリンから構成される（図１）。ｐａｐＡの遠位末端は、ｐａｐＡまたはｐａｐＫの近位末端で相互作用する。ｐａｐＫの近位末端は、ｐａｐＡとのみ相互作用する；その遠位はｐａｐＥとのみ相互作用する；そしてその注目すべき構造によって必要とされる。これらの特異的な相互作用を、表１にまとめる。
【００３７】
【表１】
2005518455.tif 000003
【００３８】
これらの天然の結合親和性は、本発明のナノ構造物および方法において活用される。ピリンタンパク質間の相互作用は、Ｐ−ｐｉｌｉにすぐに隣接するピリンタンパク質に結合する各ピリンタンパク質のＮ末端拡張によって媒介され、線毛にかなりの機械的強度を提供する拡張した分子間インターフェイスを生じる（Ｓａｕｅｒら、１９９９，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｉｌｕｓ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１０５８−６１；Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９９９，Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｄｈｅｓｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１０６１−６６）。この結合の親和性および特異性は、隣接するピリンタンパク質上の拡張したＮ末端アームと溝との間の相互作用によって決定される（図２Ａ）。結果として、あるピリンのＮ末端アームと別のピリンのＮ末端アームの置換（「ハイブリッド」ピリンタンパク質または「キメラ」ピリンタンパク質を形成する）は、ピリン単位の結合の特異性を変更させる手段を提供し、そしてピリンアセンブリ単位の設計を可能にする。
【００３９】
ピリンは、それらのＮ末端拡張部のＣ末端およびピリン本体のＮ末端にわたる領域において相同性が高い。この領域の相同性は、あるピリンのＮ末端拡張部と他のピリンの本体から構成されるハイブリッドピリンの設計用の指針を提供する。ハイブリッドピリンは、あるピリンからのＮ末端拡張部と別のピリンの本体を含み、そして段階的アセンブリにおける構造的要素および／または連結要素として使用され得る。ここで、あるピリンのＮ末端および本体は、２量体およびポリマーを形成するように相互作用しない（図２Ｂ）。Ｐ−ｐｉｌｉを構成する全ピリンの配列比較は、ピリンタンパク質の本体をＮ末端拡張部に結合する領域が、ピリンに共通して高く保存されること、および異種ピリン部分を融合するための位置がその相同性に基づいて十分に規定されることが示される。
【００４０】
種々のピリンタンパク質のＮ末端拡張部、およびＮ末端拡張部を欠いている種々のピリンタンパク質本体のＮ末端アミノ酸配列の非限定的な例を、以下の表２に示す。あるピリンに由来するＮ末端拡張部および別のピリンの本体を含むハイブリッドピリンは、当該分野で一般に知られている方法によって発現および精製され得る（例えば、ＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ、１９９５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｉｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：１６４−６７；Ｂｕｌｌｉｔｔら、１９９６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｉｌｕｓ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｓｕｂ−ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｕｎｃａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ  ｚｉｐｐｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１２８９０−９５）。
【００４１】
【表２】
2005518455.tif 000004
【００４２】
上の表２において記載されるように、ｐａｐＡのＮ末端拡張は、第１の２０アミノ酸を含む。この拡張は、他のピリンにおけるよりも長い。ＰａｐＨは、特に長い拡張を有する。なぜなら、これはこの拡張がＥ．ｃｏｌｉの外膜に固定するのに必要とされるためである。結果として、この長いｐａｐＨ拡張は、本発明の好ましい実施形態において使用されない。Ｎ末端拡張の後半を含む領域およびピリンタンパク質本体のＮ末端部分の領域における配列のピリンに共通する保存の例示が、表２に挙げられる。Ｎ末端拡張における類似性は、拡張が同じ方法で使用され、同様の様式において近位のピリンと相互作用することを示す。Ｎ末端拡張の配列における差異が、結合特異性における違いの原因である。
【００４３】
複数のピリンタンパク質のフラグメントを含むピリンアセンブリ単位が製造され得、ここで各々のピリン単位は、ペプチドエピトープである連結要素を含む。同種の抗体によるこのようなエピトープの認識は、連結要素としてピリンタンパク質を使用するための１つの方法を提供する。しかし、好ましくは、１つのアセンブリ単位の連結要素は、上記の様に、特定の他のピリンタンパク質によって認識され、結合されるピリンＮ末端ペプチドドメインである。ピリンＮ末端ドメインおよびピリンＣ末端ドメインを含む連結の使用は、ナノ構造の構築において選択を提供する。なぜなら、このようなアセンブリ単位の連結要素は、アセンブリ前には完全に剛性ではなく、従って結合前に可撓性であるタンパク質−タンパク質相互作用を可能にするからである。ピリンタンパク質は、別のピリンタンパク質の可撓性拡張を認識し、結合し、従って、本発明に従うナノ構造の段階的アセンブリにおける使用のために適切な連結要素として働き得る。結合後、Ｎ末端拡張は、近接する同種のピリンタンパク質への結合を介して固く保持され、段階的アセンブリに必要とされる剛性を提供する。従って、ピリンタンパク質は、同じアセンブリ単位において連結要素および構造的要素の両方として機能し得る。
【００４４】
一般に、ピリンタンパク質フラグメントは、フラグメントが実質的に全てのピリンタンパク質を含まない限り、その構造を適切に保って他のピリンタンパク質との特異的かつ強固な相互作用を提供しそうにない。しかし、本発明の特定の実施形態において、全体構造、構造的剛性または認識特性を妨害することなく、ピリンの一つ以上のβターンに対して、２〜３のアミノ酸が、変更、付加、削除されてもよく、それにより、機能的要素の挿入に適切な１つ以上の部位を提供する。機能性が、以下のように同定される位置にてピリンサブ単位に付加され得る：（ｉ）サブ単位の表面上；（ｉｉ）互いのサブ単位の相互作用に重要でない；ならびに（ｉｉｉ）サブ単位自体の安定性に対して重要でない。多くのタンパク質において、大きなループ挿入が許容され、多くの再設計が、安定で活性な構造にうまくフォールディングするタンパク質を生成してきたことが示されている。いくつかの再設計は、完全に調査者の選択であり、一方、他の再設計は、ランダム化工程および選択工程に組み込まれて、最適な配列を同定した（Ｒｅｇａｎ，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｄｅｓｉｇｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：４９４−９９）。再設計に従う１つの領域は、ｇｌｙ１０７−ａｌａ１０８−ｇｌｙ１０９から構成されるｐａｐＡ上の表面ループである。このループは、異種ペプチドがうまく挿入され得る位置により適合されなければならない基準を満足する。例えば、ＲＡＳＭＯＬ（Ｓａｙｌｅら、１９９５，ＲａｓＭｏｌ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  ａｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（ＴＩＢＳ）２０（９）：３７４−３７６；Ｓａｑｉら、１９９４，ＰｄｂＭｏｔｉｆ−−ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０（５）：５４５−４６）のような公共のドメインタンパク質可視化コンピュータプログラムを使用する、３次元原子座標が利用可能な場合、タンパク質における表面ループの位置を決定することが、タンパク質またはそのホモログの３次元的構造の試験により実行される。この様式において、表面ループに含まれるアミノ酸およびこれらの表面ループの相対的空間位置が、決定され得る。
【００４５】
以下は、本発明の組成物および方法における使用のために操作され得るハイブリッドピリンアセンブリ単位の非限定的な実施例である：
（ｉ）ｐａｐＫのアミノ末端を有するｐａｐＨ。標準的方法を使用して、ｐａｐＨのアミノ末端拡張をコードするＤＮＡ配列が、ｐａｐＨを過剰生産するように設計されたプラスミド中でｐａｐＫのアミノ末端拡張をコードするＤＮＡ配列と置換される。
【００４６】
（ｉｉ）付加されたエピトープを有するｐａｐＨ−ｐａｐＫハイブリッド：ＲａｓエピトープをコードするＤＮＡ（ＥＥＹＳＡＭＲＤＱＹＭＲＴＧＥＬ；配列番号１１、モノクローナル抗体Ｙ１３−２５９により認識される）が、ｐａｐＨのアミノ酸１２１〜１２６（ｐａｐＡにおける表面ループに対応する位置にて）をコードする２つのコドンの間のｐａｐＨについての遺伝子中に挿入される。例えば、ＲＡＳＭＯＬ（Ｓａｙｌｅら、１９９５，Ｒａｓｍｏｌ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  ａｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（ＴＩＢＳ）２０（９）：３７４−３７６；Ｓａｑｉら、１９９４，ＰｄｂＭｏｔｉｆ−−ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０（５）：５４５−４６）のような公共のドメインタンパク質可視化コンピュータプログラムを使用する、３次元原子座標が利用可能な場合、タンパク質における表面ループの位置を決定することが、タンパク質またはそのホモログの３次元的構造の試験により実行される。この様式において、表面ループに含まれるアミノ酸およびこれらの表面ループの相対的空間位置が、決定され得る。
【００４７】
（ｉｉｉ）ｐａｐＡのアミノ末端を有するｐａｐＥ：組換えＤＮＡ技術の標準的方法を使用して、ｐａｐＥのアミノ末端拡張をコードするＤＮＡ配列が、ｐａｐＥを過剰生産するように設計されたプラスミド中でｐａｐＡのアミノ末端拡張をコードするＤＮＡ配列と置換される。
【００４８】
（ｉｖ）ｐａｐＦのアミノ末端を有するｐａｐＫ：組換えＤＮＡ技術の標準的方法を使用して、ｐａｐＫのアミノ末端拡張をコードするＤＮＡ配列が、ｐａｐＫを過剰生産するように設計されたプラスミド中でｐａｐＦのアミノ末端拡張をコードするＤＮＡ配列と置換される。
【００４９】
（ｖ）ｐａｐＥのアミノ末端を有するｐａｐＨ。組換えＤＮＡ技術の標準的方法を使用して、ｐａｐＨのアミノ末端拡張をコードするＤＮＡ配列が、ｐａｐＨを過剰生産するように設計されたプラスミド中でｐａｐＥのアミノ末端拡張をコードするＤＮＡ配列と置換される。
【００５０】
（ｖｉ）付加されたエピトープを有するｐａｐＨ−ｐａｐＥハイブリッド：ＲａｓエピトープをコードするＤＮＡが、ｐａｐＨのアミノ酸１２１〜１２６（ｐａｐＡにおける表面ループに対応する位置にて）をコードする２つのコドンの間のｐａｐＨについての遺伝子中に挿入される。
【００５１】
ピリンタンパク質は、当該分野で一般に公知の方法によって発現および精製され得る（例えば、ＢｕｌｌｉｔｔおよびＭａｋｏｗｓｋｉ，１９９５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐｉｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：１６４−６７；Ｂｕｌｌｉｔｔら、１９９６，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｉｌｕｓ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｓｕｂ−ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｕｎｃａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｂｅｔａ  ｚｉｐｐｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１２８９０−９５）。操作されているタンパク質の３次元構造が未知であるが、近縁のホモログの３次元構造が既知の場合（例えば、本質的に全ての抗体分子についての場合）、目的の分子のアミノ酸配列またはその一部は、その３次元構造が既知である分子のアミノ酸配列と整列され得る。この比較（例えば、以下を使用して行われる：ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７，Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）またはＬＡＬＩＧＮ（ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ，１９９１，Ａ  ｔｉｍｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｉｎｅａｒ−ｓｐａｃｅ  ｌｏｃａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１２：３３７−３５７））は、既知の３次元構造のタンパク質中の表面ループ（βターン）を構成するアミノ酸に対応する、目的のタンパク質中の全てのアミノ酸の同定を可能にする。２つのタンパク質間に高い配列類似性が存在する領域において、この同定は、高レベルの確実性で実施される。一旦本明細書中に開示される方法に従って、推定ループが同定され、そして変更されると、得られた構築物は、それが予測された特性を有するか否かを決定するために試験される。この分析は、ループの同定が高度に信頼性がある場合でさえ、例えば、その決定が、既知の３次元タンパク質構造に基づく場合でさえ、実行される。
【００５２】
本発明の特定の実施形態において、アセンブリ単位は、構造的要素を構成する。上記のように、ピリンアセンブリ単位中の構造的要素は、ピリンタンパク質から誘導され得る。より一般的には、この構造的要素は、一般的に、剛性構造を有する（以下に記載される特定の実施形態においては、この構造的要素は、非剛性であり得る）。この構造的要素は、好ましくは、少なくとも約５０アミノ酸、そして一般には２０００アミノ酸未満を含む、既知のサイズおよび構造の、規定されたペプチド、タンパク質またはタンパク質フラグメントである。天然に存在するペプチド、タンパク質およびタンパク質フラグメントは、タンパク質の異なる面の間の安定な空間的関係を提供する構造化されたコアを有する、十分規定された構造を有するので、ペプチド、タンパク質およびタンパク質フラグメントが好ましい。この特性により、構造的要素がアセンブリ単位の連結要素と機能的要素との間の予め設計された幾何学的関係、ならびにこの構造的要素が結合したアセンブリ単位の相対的な位置および化学量論を維持することが可能となる。
【００５３】
構造的要素としてのタンパク質の使用は、無機ナノ粒子のような他の選択肢を超える、特定の利点を有する。無機ナノ粒子のほとんどの集団は、非均質であり、ナノ構造のアセンブリにとってこの無機ナノ粒子を魅力のないものにしている。ほとんどの集団において、各無機ナノ粒子は、切子面と結晶面との間の異なる幾何的関係、ならびに欠損および不純物を有して、異なる数の原子から作製される。対照的に、比較できるサイズのタンパク質集団は、非常に均質であり、各タンパク質は同数のアミノ酸から構成され、その各々は、ほぼ同じ方法で整列され、そしてほとんどの部分については、熱ゆらぎの影響のみによって、配置が異なる。結果として、互いに相互作用するように設計された２つのタンパク質は、同じ形状で常に相互作用し、予測可能な形状および化学量論の複合体の形成を生じる。この特性は、ナノ構造の「下から上への（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ）」大まかな（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ）平行のアセンブリに必須である。
【００５４】
構造的要素は、ナノ構造の連結要素と機能的要素との間の幾何学的関係を維持するために使用され得る。このように、剛性の構造的要素は、一般に、本明細書中に記載される段階的アセンブリ方法を使用したナノ構造の構築に好ましい。この剛性は、多くのタンパク質に代表的であり、そしてタンパク質を形成する二次構造的要素（例えば、αヘリックスおよびβシート）の特性を介して、タンパク質に付与され得る。
【００５５】
構造的要素は、その３次元構造が既知であるか、または最初から設計され得る、タンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチドの構造に基づき得る。アセンブリ単位中の構造的要素として利用され得るタンパク質またはタンパク質フラグメントの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体ドメイン、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、単鎖抗体可変ドメインおよび細菌ピリン）。
【００５６】
いくつかの実施形態において、構造的要素、連結要素および機能的要素は、十分規定された程度のものであり得、例えば、グリシンリンカーによって分離され得る。他の実施形態において、連結要素は、構造的要素の一体的部分であるペプチドまたはタンパク質セグメントを含み得るか、または（例えば、抗体可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）の場合）構造的要素の１つの末端における複数のループを含み得る（Ｋａｂａｔら、１９８３，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。ＣＤＲは、抗体の可変ドメインの一体的な部分である連結要素である。可変ドメインは、構造的要素を示し、そして構造的要素と連結要素を構成するＣＤＲとの間の境界は、（多くの抗体配列の比較に基づいて文献中で十分規定されているものの）、常に完全に構造的に明白であるわけではない。構造的要素と連結要素との間に常に十分規定された境界が存在するわけではなく、これらのドメイン間の境界は、そのそれぞれの有用性に基づいて十分規定されているものの、空間的に不明瞭であり得る。
【００５７】
本発明の構造的要素は、例えば、天然に存在するタンパク質のコア構造的要素を含み、このコア構造的要素は、次いで、連結要素、機能的要素および／または可撓性ドメイン（例えば、トリグリシン、テトラグリシンまたはペンタグリシン）を取り込むために改変され、それによって、有用なアセンブリ単位を提供する。結果的に、特定の実施形態において、既存のタンパク質の構造は、そのタンパク質またはタンパク質部分の剛性構造に実質的に影響を与えることなく、タンパク質のその部分または改変され得るその一部を同定するために分析される。
【００５８】
本発明のピリンアセンブリ単位は、連結要素として、少なくとも１つのピリンまたはその結合誘導体もしくはフラグメントを含む。ピリンアセンブリ単位中のさらなる連結要素は、アセンブリ単位に結合特性を付与する任意の連結要素であり得、これには、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ピリン連結要素、ハプテン、抗原、ペプチド、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、ポリマーもしくは他の部分、またはそれらの組み合わせ（これらは、特異的な非共有結合的相互作用を介して、別の連結要素と相互作用し得る）。
【００５９】
特定の実施形態において、２つより多い連結要素を有するアセンブリ単位が、ナノ構造を構築するために使用される。例えば、以下として、さらなる連結要素が使用され得る：（ｉ）機能的要素または機能的部分の付加または挿入のための結合点として（上記の表１を参照のこと）；（ｉｉ）固体基材への開始剤の結合点として；または（ｉｉｉ）サブアセンブリのための結合点として。
【００６０】
本発明において使用されるピリンアセンブリ単位はまた、機能的要素を組み込み得る。機能的要素は、アセンブリ単位に組み込まれ得、そして最終的には、このような様式で、１次元、２次元および３次元のナノ構造へと組み込まれて、機能的要素間の十分規定された関係を提供し得る。これらの機能的要素間の十分規定された空間的関係により、これらが、協調して作用して、個々にかまたは非構造体化混合物として達成不能である活性および特性を提供することを可能にする。
【００６１】
本発明の１つの局面において、機能的要素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、低分子、無機ナノ粒子、原子、原子のクラスター、磁気ナノ粒子、光ナノ粒子または電気的ナノ粒子。特定の機能的要素（この要素は、一般的にこの要素が結合しているアセンブリ単位の構造的特質から独立している）に関連している特異的な活性または特性が、以下が挙げられるが、これに限定されない非常に大きな範囲の可能性のある機能のセットから選択され得る：タンパク質によって与えられるような生物学的特性（例えば、転写、翻訳、結合、改変または触媒的特性）。別の実施形態において、アセンブリ単位に化学的、有機的、物理電気的（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ）、光学的、構造的、機械的、計算機的、磁気的およびセンサー的な特性を与える官能基が、用いられ得る。
【００６２】
本発明の別の局面において、機能的要素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：金属ナノ粒子または金属酸化物ナノ粒子（Ａｒｇｏｎｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｆｏｒｄ，ＦＬ；ＮａｎｏＥｎｅｒｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｎｇｍｏｎｔ、ＣＯ；Ｎａｎｏｐｈａｓｅ  Ｔｈｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｍｅｏｖｉｌｌｅ，ＩＬ；Ｎａｎｏｔｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ；ＴＡＬ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；金ナノ粒子または金でコーティングされたナノ粒子（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ；Ｎａｎｏｓｐｅｃｔｒａ  ＬＬＣ，Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）；免疫結合体（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ）；非金属ナノ粒子（Ｎａｎｏｔｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）；セラミックナノファイバー（Ａｒｇｏｎｉｄｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｆｏｒｄ，ＦＬ）；フラーレンまたはナノチューブ（例えば、カーボンナノチューブ）（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ；Ｎａｎｏｌａｂ，Ｂｒｉｇｈｔｏｎ  ＭＡ；Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ；Ｃａｒｂｏｎ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）；ナノ結晶（ＮａｎｏＧｒａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ）；シリコンもしくはシリ酸のナノ結晶もしくは粉末（ＭＴＩ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）；ナノワイヤ（Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）；または量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ）（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ  ＣＡ；Ｎａｎｏｓｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）。
【００６３】
機能的要素はまた、任意の当該分野で公知の検出可能なマーカーを含み得る。このマーカーとしては，以下が挙げられる：３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなどの様な放射能標識；発色団；発蛍光団；化学ルミネセンス分子；または酵素マーカー。
【００６４】
本発明の特定の実施形態において、機能的要素は、発蛍光団である。標識として選択され得る例示的な発蛍光団部分を、表３に示す。
【００６５】
（表３：機能的要素として使用され得る発蛍光団部分）
４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸
アクリジンおよび誘導体：
アクリジン
アクリジンイソチオシアネート
５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）
４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＶＳ）−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド
アントラニルアミド
Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ
クマリンおよび誘導体：
クマリン
７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １２０）
７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  １５１）
Ｃｙ３
Ｃｙ５
シアノシン（ｃｙａｎｏｓｉｎｅ）
４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）
５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホンフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）
７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン
ジエチレントリアミン  ペンタアセテート
４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸
４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸
５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ，ダンシルクロリド）
４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）
４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）
エオシンおよび誘導体：
エオシン
エオシンイソチオシアネート
エリトロシンおよび誘導体：
エリトロシンＢ
エリトロシンイソチオシアネート
エチジウム
フルオレセインおよび誘導体：
５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）
５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）
２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）
フルオレセイン
フルオレセインイソチオシアネート
ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ）
フルオレスカミン
ＩＲ１４４
ＩＲ１４４６
Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎイソチオシアネート
４−メチルウベリフェロン
オルト  クレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラローザニリン
Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ
Ｂ−フィコエリトリン
ｏ−フタルジアルデヒド
ピレンおよび誘導体
ピレン
ピレンブチレート
スクシンイミジル  １−ピレン  ブチレート
Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）
ローダミンおよび誘導体：
６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）
６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
リスアミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢスルホニルクロリド
ローダミン（Ｒｈｏｄ）
ローダミンＢ
ローダミン１１０
ローダミン１２３
ローダミンＸイソチオシアネート
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）
テトラメチルローダミン
テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）
リボフラビン
ロゾール酸
テルビウムキレート誘導体。
【００６６】
他の実施形態において、機能的要素は、ルミノール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＯＬＤＴＭ  ＡＰＢ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）、Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）などのような化学ルミネセンス基質である。
【００６７】
別の実施形態において、機能的要素は、酵素である。特定の実施形態において、酵素アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような酵素は、特定の化学反応が行なわれるとき、検出可能なシグナルを生成し得る。
【００６８】
別の実施形態において、機能的要素は、ハプテンまたは抗原（例えば、ｒａｓ）である。さらに別の実施形態において、機能的要素は、ビオチン（これに対して、標識されたアビジン分子またはストレプトアビジンが結合し得る）またはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）（これに対して、標識された抗ジゴキシゲニン抗体が結合し得る）のような分子である。
【００６９】
別の実施形態において、機能的要素は、ピーナッツレクチンまたはダイズ凝集素のようなレクチンである。さらに別の実施形態において、機能的要素は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素のような毒素である（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、１９８９，Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９（６２２３）：３９４−９７）。
【００７０】
ペプチド、タンパク質またはタンパク質ドメインは、当該分野で一般に公知の分子生物学の手段を用いてタンパク様のアセンブリ単位に加えられ、融合タンパク質（このタンパク質中で、機能的要素が、タンパク質のＮ末端、タンパク質のＣ末端またはタンパク質中のループ中に、タンパク質のフォールディングを妨害しないような方法で導入される）を産生し得る。非ペプチド機能的要素が、前記機能的要素に対する特異性を示すペプチドまたはタンパク質部分とアセンブリ単位のタンパク様部分に組み込むことによって、アセンブリ単位に加えられ得る。
【００７１】
特定の実施形態において、機能的単位は、アセンブリ単位のタンパク質様部分へとタンパク質ドメインまたはペプチドをスプライシングすることによって結合され得る。このような実施形態において、アセンブリ単位の結合特異性および親和性は、アセンブリ単位の正確に折り畳む能力に依存するので、挿入の位置は、タンパク質単位の折り畳みを崩壊しないように選択されなければならない。また好ましくは、挿入が付加される部位は、タンパク質単位の折り畳みの崩壊を引き起こさない。好ましくは、挿入部位は、タンパク質の残部とほとんど相互作用を有さない表面ループである。タンパク質の三次元構造が既知である場合、例えば、ピリンｐａｐＫの場合において、このような部位は、コンピューターグラフィックプログラム（例えば、ＲａｓＭｏｌ（Ｓａｙｌｅら，１９９５，ＲａｓＭｏｌ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｆｏｒ  ａｌｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．（ＴＩＢＳ）２０（９）：３７４−７６））を使用して、タンパク質構造の可視的な検査によって同定され得る。ｐａｐＫの原子の三次元位置を規定する座標は、ＰＤＢファイル１ＰＤＫに含まれ、これはまた、解析された結晶構造においてｐａｐＫと複合化されるシャペロンｐａｐＤの三次元構造を提供する。このような分析の際、残基１０９〜１１３（ＰＤＢファイルに従って、配列ＮＫＧＱＧＥ（配列番号１２））（これは、ｒａｓ抗原のようなペプチドの挿入を受容するのに高い可能性を有する部位を示す）を含む表面ループが存在することが明らかとなる。
【００７２】
特定の実施形態において、１つ以上の機能的要素が、以下であるとして同定される位置にてピリンタンパク質を含むアセンブリ単位に加えられる：（ｉ）単位の表面上；（ｉｉ）単位の、他のピリン含有アセンブリ単位との相互作用に重要でない；および（ｉｉｉ）単位自体の安定性に対して重要でない。大きなループの挿入が許容され、安定で活性なタンパク質構造に首尾良くフォールディングし得る多くの組み替えタンパク質が発現されてきたことが示されている。いくつかの例において、このような組み替えタンパク質が、さらなる遺伝子操作なしに設計され、産生されているが、他のアプローチが、最適な配列変化を同定するためにランダム化および選択の工程を組み込んできた（Ｒｅｇａｎ，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｄｅｓｉｇｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：４９４−９９）。例えば、再操作に従う１つのピリン領域は、配列ｇｌｙ１０７−ａｌａ１０８−ｇｌｙ１０９を含むｐａｐＡ上の表面ループである。このループは、異種ペプチドが挿入され得る位置としての全ての上記の基準を満たす。
【００７３】
別の実施形態において、完全抗体可変領域ドメイン（例えば、単鎖可変ドメイン）が、機能的要素についてのアフィニティ標的として働くために、アセンブリ単位中に（例えば、その連結要素または構造的要素中に）組み込まれる。完全抗体可変ドメインが例えば、連結要素またはその構造的要素の表面ループ中に挿入される、この実施形態において、可撓性のセグメント（例えば、ポリグリシンペプチド配列）が、好ましくは可変ドメイン配列の各々の側に加えられる。このポリグリシンリンカーは、組換え融合タンパク質の合成後に、元のタンパク質のフォールディングを促進する可撓性のスペーサーとして働く。この抗体ドメインは、機能的要素に対する結合特異性について選択され、この機能的要素としては、以下があり得るが，これらに限定されない：タンパク質もしくはペプチドまたは無機材料。
【００７４】
本発明の別の実施形態において、機能的要素は、所望の光学特性を有する量子ドット（半導体ナノ結晶、例えば、ＱＤＯＴＴＭ、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）であり得る。量子ドットは、特定の種類の量子ドットに対して特異性を有するペプチドを介してナノ構造中に組み込まれ得る。当業者に明らかであるように，特定の型の量子ドットに対する必要とされる親和性を有するこのようなペプチドの同定が、当該分野で周知の方法を使用して実行される。例えば、このようなペプチドは、アフィニティー精製方法を使用してファージディスプレイされたペプチドの大きなライブラリから選択される。適切な精製方法としては、例えば、バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）（Ｗｈａｌｅｙら、２０００，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（６７８７）：６６５−６８）および親和性カラムクロマトグラフィーが挙げられる。各々の場合において、標的の量子ドットは、固定化され、組換えファージディスプレイライブラリーは、固定化された量子ドットに対してインキュベートされる。数回のバイオパニングが実行され、量子ドットに対して親和性を示すファージが、標準的方法によって同定され、その後ペプチドの特異性が標準ＥＬＩＳＡ方法を使用して試験される。
【００７５】
代表的に、アフィニティー精製は、いくつかのアフィニティー精製工程を使用する反復性プロセスである。アフィニティー精製を使用して、特定の金属および半導体に対する親和性を有するペプチドを同定し得る（Ｂｅｌｃｈｅｒ，２００１，Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｔ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｍａｙ  １８−２０，２００１；Ｂｅｌｃｈｅｒら、２００１，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  Ｐａｐｅｒｓ，２２２ｎｄ  ＡＣＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ２６−３０，２００１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
【００７６】
代替の方法は、ファージディスプレイされた単鎖可変ドメインのライブラリーの使用および同じ型の選択プロセスの実行に指向される。従って、特定の実施形態において、機能的要素は、所望の特性を有する非タンパク質様ナノ粒子がナノ構造に結合される連結要素（相互作用部位）の使用を介してナノ構造に取り込まれる。２つの非限定的な例において、このような連結要素は、抗体可変ドメインの相補性決定領域または親和性選択ペプチドに由来する。
【００７７】
ナノ結晶（単一のナノ粒子）の電子的特性とナノ粒子のアセンブリとを比較するのに一般的に使用される電子的な機能的要素および光機能的要素についての慣用的な試験（Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０）は、本明細書に開示される組成物および方法を使用して組み立てられたナノ構造の分析のために使用される。
【００７８】
特定の実施形態において、半導体ナノ結晶の独特な調製可能な特性は、これらの半導体ナノ結晶を、ナノデバイス（光伝導性ナノデバイスおよび発光ダイオードを含む）における使用に好ましくする。個々のナノ構造の電気的特性は、測定するのが困難であり、従って、光伝導性は、これらのナノ構造の特性の測定として使用される。光伝導性は、半導体および有機固体の特性の分析について使用される周知の現象である。光伝導性は、他の点では、絶縁性の有機固体中の弱く相互作用する分子の間で電子を輸送するのに長く使用されてきた。
【００７９】
光電流スペクトル応答をまた使用して、ナノ構造におけるナノ結晶の吸収スペクトルをマップし、そして個々のナノ結晶の光電流スペクトル応答と比較し得る（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０を参照のこと）。さらに、光学スペクトルおよび光ルミネセンススペクトルをまた使用して、ナノ構造の光学特性を研究し得る（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０：５４５−６１０を参照のこと）。
【００８０】
制御がナノ粒子のアレイの形成により大きく影響すると、生成されるアレイの光学、電気的および磁性現象が広がる。ナノ粒子が三次元的に正確に取り込まれるナノ構造の段階的アセンブリを用いて、形成される固体の特性を三次元において制御することが可能であり、それによって、ナノデバイスの設計に有用な多くの異方性の特性を生じる。これらの集合の特性を特徴付けるための慣用的な試験および方法は、当該分野において周知である（例えば、Ｍｕｒｒａｙら、２０００，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｓｅ−ｐａｃｋｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓｃｉ．３０：５４５−６１０を参照のこと）。
【００８１】
例えば、タンパク質および量子ドットの組み合わせから作製されるバイオセンサーは、市販されている（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓら、１９９６，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ「ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：６０９−１１；Ｗｅｉｓｓら、米国特許第６，２０７，３９２号、表題「Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｃｈ  ｐｒｏｂｅｓ」（２００１年３月２７日に発行された））。高特異性生物学的分子（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは抗体分子）と量子ドットとを複合体化する能力は、分子の標的に対するスペクトルフィンガプリントを提供する。異なるサイズの量子ドット（各々非常に異なるスペクトル特性を有する）を使用して、異なる特異性を有する分子に複合体化された各々は、同時に構成成分の複数の検出を可能にする。
【００８２】
無機構造体（例えば、金属または半導体の量子ドットおよびナノ結晶）は、アセンブリされたナノ構造の分枝の末端としてナノ構造の段階的アセンブリに使用され得る。一旦、このような無機構造体を付加すると、さらなる基はこれらに結合し得ない。なぜなら、無機構造体は、ナノ構造へと操作される結合部位の任意のセットについての不確定な化学量論を有するからである。これは、アセンブリ単位が付加され、段階的アセンブリによって組み立てられたナノ構造を形成する配列に影響する。例えば、一旦特定のナノ結晶がナノ構造に付加されると、その型のナノ結晶を、認識しそして結合する連結要素を有するさらなるアセンブリ単位を付加することは一般的に好ましくない。なぜなら、ナノ結晶に対するこのようなアセンブリ単位の位置決めを制御することは、一般的に可能でないからである。従って、ナノ結晶を最後または少なくともその特定の型のナノ結晶を結合するアセンブリ単位の全てを付加した後に添加する必要があり得る。好ましい実施形態において、ナノ結晶は、マトリクスになお結合され、そして十分に分離されるナノ構造に付加され、その結果各ナノ結晶は、単一のナノ構造にのみ結合し得、それによってナノ構造の複数架橋を防止する。
【００８３】
１つの実施形態において、本発明の段階的アセンブリ方法に従って組み立てられた、剛性ナノ構造は、ナノ構造レバーアームの末端に機能的な要素として結合した磁性ナノ粒子を含み、この磁性ナノ粒子は、局所的な磁場の非常に敏感なセンサーとして作用する。磁場の存在は、磁性ナノ粒子の位置を変えるように作用し、ナノ構造レバーアームを結合した固体基板に対して曲げる。特定の実施形態において、レバーアームの位置は、例えば、ナノ構造レバーアームに沿って他の位置（アセンブリ単位）に機能的要素として結合した光学ナノ粒子の位置の変化を通して検出され得る。レバーアームの移動の程度は較正され、磁場の測定を提供する。
【００８４】
他の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ方法に従って組みたてられたナノ構造は、特定化された機能的要素の非存在下で所望の特性を有する。このような実施形態において、段階的アセンブリプロセスは、例えば、微小液体システムにおいて粒子を濾過するために使用され得る、小さな（ナノメートルスケール）、正確なサイズの十分に規定された孔を有する二次元ナノ構造または三次元構造を提供する。この実施形態のさらなる局面において、このように十分に規定された孔だけでなく、ナノ構造の分離特性を増強する機能的要素もまた含むナノ構造がアセンブリされ、分離される分子のサイズに基づくだけでなく、電荷ならびに／または親水性特性および／または疎水性特性に関しても分離可能にする。このようなナノ構造は、ＨＰＬＣ分離に使用され得、非常に均一な充填物質およびこれらの物質に基づく分離を提供する。このような機能的要素の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：所望のクロマトグラフィー分離に使用されるｐＨで正または負に荷電した１つ以上の側鎖を含むペプチド配列；および疎水性側鎖または親油性側鎖を有する１つ以上のアミノ酸を含むペプチド配列。
【００８５】
結合は、シリコンベースの電子チップなどのような超小型回路において「スウィッチポイント」として働き得る構築的な構造である。特定の実施形態において、多価の抗体あるいはその結合誘導体または結合フラグメントは、結合構造として使用され、そして本発明の方法を使用してナノ構造へと取り込まれる。これらのナノ構造結合を含む生物電子工学デバイスおよび生物コンピューター（ｂｉｏｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ）デバイスの１つの非限定的な例は、量子セルオートマトン（ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ：ＱＣＡ）である。
【００８６】
（ナノ構造の段階的アセンブリ）
ピリンアセンブリ単位がアセンブリされ得、一実施形態において、第６章（実施例１）に開示される方法を使用する段階的アセンブリによってナノ構造を形成する。この実施形態はまた、図３に示され、そして形成されたナノ構造中間体の概略図を提供する。
【００８７】
段階的アセンブリは、有機部分および無機部分が予め設計された三次元構築中に正確かつ精密に配置される、複合非断続性複数次元ナノ構造の超並列合成を可能にする。段階的アセンブリにおいて、一連のアセンブリ単位は、開始単位および／またはナノ構造中間体に、所定の予め設計された順番で添加される。多数の同一の開始が使用され、そしてサブ単位は、同時に全ての開始／中間体に添加されるので、段階的アセンブリは、超並行様式で複数の同一のナノ構造を組み立てる。好ましい実施形態において、開始単位は、固体基板、支持体またはマトリクスに結合される。さらなるアセンブリ単位は、連続的に、固相ポリマー合成に類似の手順で添加される。アセンブリされながら、開始単位上で形成された結合アセンブリ単位を含むナノ構造の中間段階は、ナノ構造中間体または単にナノ構造のいずれかとして一般的に記載される。各アセンブリ単位の、アセンブリ中のナノ構造中間体への添加は、先に添加されたアセンブリ単位によって提供される連結要素の性質に依存し、そして次いで添加されたアセンブリ単位に関係ない。従って、アセンブリ単位は、アセンブリ中のナノ構造中間体上に曝露された連結要素のみに結合し得る；すなわち、添加されたアセンブリ単位は、自己相互作用をせず、そして／または重合しない。
【００８８】
単一アセンブリ単位の連結要素は非相補的であり、従って、互いと相互作用しないので、未結合アセンブリ単位は、二量体またはポリマーを形成しない。添加されるべきアセンブリ単位は、完了まで中間体とのその反応を駆動するために、好ましくは、開始単位またはナノ構造中間体に対してモル過剰で提供される。段階的アセンブリ中の未結合アセンブリ単位の除去は、未結合アセンブリ単位がアセンブリプロセスの各サイクルにおいて洗浄され得るように、固体−基板−結合開始を使用して、段階的アセンブリを実行することによって促進される。
【００８９】
このスキームは、相対的に低い非交差反応性の、相補的な連結対を使用する複雑なナノ構造のアセンブリを提供する。限定された数の連結要素のみが、アセンブリプロセスにおける任意の１つの工程でアセンブリ中間体の表面上に曝露されるので、低い連結対のみが使用される必要がある。相補的な連結要素を有するアセンブリ単位が、添加され、そしてナノ構造中間体についてインキュベートされ、アセンブリサイクルの間に、さらなるアセンブリ単位をナノ構造中間体に結合させ得る。次いで、過剰のアセンブリ単位を洗浄し、アセンブリプロセスの引き続く工程の間、これらが他のアセンブリ単位と所望でない相互作用を形成することを防止し得る。ナノ構造の各位置は、段階的アセンブリのプリセスによって独自に規定され得、そして異なる機能的要素は、任意の所望の位置で添加され得る。本発明の段階的アセンブリ法は、複合性ナノ構造の大量の平行製造を可能にし、そして異なる複合体ナノ構造は、階層的な様式において、より高次の構築にさらに自己アセンブリされ得る。
【００９０】
図４は、一次元における本発明の段階的アセンブリ法の実施形態を示す。工程１において、開始単位は、固体基板上に固定化される。工程２において、アセンブリ単位は、開始に添加され（すなわち、マトリクス結合開始単位）、２つの単位で構成されたナノ構造中間体を生じる。単一のアセンブリ単位のみが、この工程において付加される。なぜなら、第２のアセンブリ単位は、自己と相互作用（すなわち重合）し得ないからである。
【００９１】
開始単位（すなわち、キャップ単位を含む段階的アセンブリの間に引き続いて添加される任意のアセンブリ単位）は、さらなる機能的要素を含み得、そして／または先に添加した単位と異なる長さの構造単位を含み得る。例えば、図４の工程３において、機能的要素を含む第３のアセンブリ単位が添加される。工程４および５において、それぞれ設計された官能基を有するさらなるアセンブリ単位を添加する。従って、図４に示される段階的アセンブリの実施形態において、第３、第４および第５のアセンブリ単位の各々は、独特の機能要素を保有する（図においてアセンブリ単位の上部から突き出す幾何学的形状によって示される）。
【００９２】
図４に示される段階的アセンブリの実施形態は、２つの非交差反応性の相補的な連結対のみを必要とする。工程５の最終で構造の自己アセンブリが停止する場合、構造の自己アセンブリは、４つの非交差反応の相補的な連結対を必要とする。必要とされる連結対の数のこの相対的に適度な増加は、構造のサイズが増大するにつれてさらに大きくなる。例えば、図４に図示される５つの工程の伸長によって組み立てられたＮ単位の線形構造について、段階的アセンブリは、なお、２つの非交差反応の相補的な連結対のみを必要とするのに対し、自己アセンブリは、（Ｎ−１）個の非交差反応の相補的な連結対を必要とする。
【００９３】
組み立てられたナノ構造の数は、マトリクスに結合される開始単位の数によって決定されるが、一次元ナノ構造の各々の長さは、実行されるアセンブリサイクルの数の関数である。１つ以上の異なる機能的要素を有するアセンブリ単位を使用する場合、組み立ての順番は、他の機能的要素に対して各機能的要素の相対的な空間的配向を規定する。
【００９４】
本発明の段階的アセンブリの方法における各工程の後、過剰の未結合アセンブリ単位を、除去工程（例えば、洗浄工程）によって、結合したナノ構造中間体から除去する。基板結合ナノ構造中間体は、適切な溶媒（例えば、水溶液または緩衝液）で洗浄され得る。溶媒は、相補的な連結要素の特異的な相互作用を破壊することなく非特異的相互作用によって維持されるサブ単位を除去し得なくてはならない。適切な溶媒は、使用されるアセンブリ単位によって必要とされる場合、ｐＨ、塩濃度、化学組成物などによって変更し得る。
【００９５】
ナノ構造中間体を洗浄するために使用される緩衝液は、例えば、ＥＬＩＳＡプロトコルにおいて実行される洗浄工程に使用される緩衝液（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第２章，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，２．１節「Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００１，Ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｓｅｒｉｅｓ  Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃｏｉｃｏを参照のこと）に記載される緩衝液）であり得る。
【００９６】
特定の実施形において、アセンブリされたナノ構造は、「キャップ単位（ｃａｐｐｉｎｇ  ｕｎｉｔ）」の添加によって「キャップ」され、このキャップ単位は、単一の連結要素のみを保有するアセンブリ単位である。さらに、開始単位が、切断可能結合を介して固体基板に結合される場合、ナノ構造は、固体基板から除去され、そして単離され得る。しかし、いくつかの実施形態おいて、完全なナノデバイスは、固体基板に結合される間、機能的であり、そして除去される必要がなくなる。
【００９７】
アセンブリ単位を添加する上記の工程は、完全なナノ構造がアセンブリされるまで、反復性の様式で繰り返され得、この後、完全なナノ構造は、開始単位内で設計された放出部分（例えば、プロテアーゼ部位）でマトリクスから第１のアセンブリ単位を固定化した結合を破壊することによってか、または放出について予め設計されたプロセス（例えば、ｐＨの低下）を使用することによって放出し得る。図２および３に図示されるように、段階的アセンブリのプロセスは、段階的アセンブリに企図される最も単純な実施形態の１つである。他の実施形態において、さらなる連結要素を有するアセンブリ単位を使用して、より複雑なアセンブリを作製し得る。アセンブリ単位は、個々に添加され得るか、特定の実施形態において、サブアセンブリとして添加され得る（図５）。結果は、所望の設計パラメータを満足するために、互いに関連して空間的に分散される機能的要素を有する完全に規定されたナノ構造である。本明細書中に開示される組成物および方法は、これらの複合性の設計されたナノ構造のアセンブリ手段、および大きな構造の１つまたは複数のナノ構造の段階的アセンブリによって形成されたより複合性のナノデバイスのアセンブリ手段を提供する。多次元的なナノ構造の組みたては、例えば、個々の一次元ナノ構造にさらなる連結要素（これらのさらなる連結要素は、個々のナノ構造を一緒に結合する適切な交差連結試薬によって認識され、そして結合され得る）を含む正確に間隔を空けられたアセンブリ単位を取り込むことによって達成され得る。特定の好ましい実施形態において、このような交差連結は、例えば、抗体またはその結合誘導体もしくは結合フラグメントであり得る。
【００９８】
本発明の段階的アセンブリ法のいくつかの実施形態において、開始単位が固体支持体に係留される。このような係留は、ランダムではなく（すなわち、アセンブリ単位の可塑性のビオチン化またはランダムなビオチン化に対するタンパク質の非特異的結合（その後、固定化ストレプトアビジンの結合が続く）ではなく）、マトリックスまたは基板への開始単位の特定の元素の結合を伴う。この段階的アセンブリプロセスは、方向性のプロセスであって、次のアセンブリ単位の結合のために、開始単位上に妨害されていない連結要素を必要とする。基板への開始単位のランダムな結合は、ある場合には、次のアセンブリ単位の結合に必要とされる連結要素の妨害をもたらし、従って、ナノ構造が組み立てられる際における開始単位の数を低減させる。
【００９９】
本発明の段階的アセンブリ法の他の実施形態において、開始単位は、固体基板に固定されない。この場合、除去工程（例えば、洗浄工程）が、以下：
（１）磁性ナノ粒子を開始単位に結合させること、および磁場をかけることによって非結合性のアセンブリ単位からナノ構造中間体を分離すること；
２）より大きいナノ構造中間体を、非結合性のアセンブリ単位から、遠心分離、沈殿または濾過によって分離すること；あるいは
３）ナノ構造中間体またはアセンブリナノ構造が、破壊的な処理（例えば、プロテアーゼ処理もしくは化学的分解）に対してより耐性であるような場合には、未結合のアセンブリ単位が選択的に破壊されること；
によって、非固定化または係留されていない開始単位上に構築されたナノ構造上で実施され得る。
【０１００】
タンパク質は、明確な結合特性を有し、そしてタンパク質の分子間の相互作用を操作するための技術は、当該分野で周知である（Ｈａｙａｓｈｉら、１９９５、Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｇｅｎｅ  １６０（１）：１２９〜３０；Ｈａｙｄｅｎら、１９９７、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（２）：２０１〜１２；Ｊｕｎｇら、１９９９、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４（１）：１６３−８０；Ｖｉｔｉら、２０００、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４８０〜５０５；Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４、Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜５５）。しかし、企図されたナノ構造の段階的アセンブリは、特異的な認識特性を有する生物学的分子（例えば、タンパク質および核酸）から主に構成される成分に限定される必要は無い。無機元素または無機分子の光学的特性、磁性特性または電気的特性は、段階的アセンブリによって組み立てられたナノ構造のいくつかの実施形態に必要とされる。
【０１０１】
タンパク質で構成されていない成分が有利に利用される、本発明の多くの実施形態が存在する。他の実施形態において、有機物質と無機物質の両方から構成されるナノ構造を構築するためにタンパク質または核酸の分子相互作用特性を利用することが可能であり得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、無機ナノ粒子が、本発明の段階的アセンブリ法を用いて、ナノ構造中に組み立てられる成分に付加される。これは、無機粒子への結合のために特異的に選択された連結要素を用いて行われ得る。例えば、Ｗｈａｌｅｙおよび共同研究者は、半導体結合表面に特異的に結合するペプチドを同定した（Ｗｈａｌｅｙら、２０００、Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ  ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：６６５〜６８）。１つの実施形態において、これらのペプチドは、本明細書中に記載されたタンパク質成分中に、標準的なクローニング技術を用いて挿入される。タンパク質の段階的アセンブリは、本明細書中に開示されるように構築され、強固で明確な三次元アレイ中に、これらの結合部位を分配する手段を提供する。
【０１０３】
一旦、無機ナノ粒子の特定の型についての結合部位が全て配置されると、これらの無機ナノ粒子は、タンパク質様アセンブリ単位を付加するのに使用されるサイクルに類似した段階的アセンブリのサイクルを用いて付加され得る。これを達成するために、特定の実施形態において、無機ナノ粒子の溶解性を提供するために、ナノ構造中間体がインキュベートされる溶液条件を調整することが必要であり得る。一旦、無機ナノ粒子がナノ構造中間体に付加されると、この無機ナノ粒子に、さらなる単位を管理された方法で付加することは不可能である。なぜなら、任意の集団の無機ナノ粒子に固有の微小不均一性のためである。これらの不均一性は、さらなる相互作用の幾何学および化学量論が制御不可能であることを示す。
【０１０４】
図６は、本発明の段階的アセンブリ法に従うナノ構造へのタンパク質単位および無機元素の付加を示す図である。工程１において、開始単位を固体基板に結合させる。工程２において、アセンブリ単位を開始単位に特異的に結合させる。工程３において、さらなるアセンブリ単位を組み立てられたナノ構造に結合させる。このアセンブリ単位は、特定の無機元素に特異的な、操作された結合部位を構成する。工程４において、無機元素（クロスハッチされた楕円（ｃｒｏｓｓ−ｈａｔｃｈｅｄ  ｏｖａｌ）として示す）をこの構造に付加し、そして操作された結合部位に結合させる。工程５は、第２の型の無機元素に特異的に操作された結合部位を有する別のアセンブリ単位を付加し、そして第２の無機元素（長菱形（ｈａｔｃｈｅｄ  ｄｉａｍｏｎｄ）として示す）を工程６において付加させる。
【０１０５】
アセンブリ単位が付加される順序は、所望の構造および／または活性（アセンブリプロセスに用いられる生成物ナノ構造、および交差反応する連結要素対の数を最小化する必要性）によって決定される。従って、アセンブリの順序の決定は、段階的アセンブリによって組み立てられるべきナノ構造の設計の不可欠な部分である。連結要素が設計によって選択され、所望のナノ構造の段階的アセンブリを可能にする。連結要素の選択は、ナノ構造中に組み込まれるべき機能要素と一般的に無関係であり、これらの連結要素は、必須の機能要素および連結要素（所望の空間的位置に機能要素の配置を規定する）を有するアセンブリ単位を組み立てるのに必要とされるように混合されそしてマッチングされる。
【０１０６】
例えば、２つの連結要素（３つの連結対を作る６つの連結要素を用いて設計された）を構成するアセンブリ単位は、相互作用しない任意の１８対の連結要素を含み得る。連結要素の２１対の可能な対が存在するが、これらの対のうちの３対は相互作用し（例えば、Ａ−Ａ’）、そしてアセンブリ単位におけるこれらの対の使用により、互いに同一のアセンブリ単位の自己会合を引き起こす。以下に示した実施例において、連結要素は、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、ＣおよびＣ’として示され、ここで、ＡおよびＡ’、ＢおよびＢ’、ならびにＣおよびＣ’は、連結要素の相補的対（連結対）（すなわち、互いに特異的に結合するが、示された他の４つの連結要素のいずれにも結合しない）である。６つの代表的なアセンブリ単位（各々が２つの連結要素を含み、ここで各々の連結要素は、非同一な非相補的な連結要素を含む）が、以下に示される。この描写において、各々のアセンブリ単位は、固有の機能要素（６つのセットの１つ）をさらに含み、Ｆ１〜Ｆ６として表される。これらの慣習に従って、６つの可能なアセンブリ単位が、以下のように設計され得る：
【０１０７】
【化１】
2005518455.tif 000005
【０１０８】
本明細書中に開示される方法に従う段階的アセンブリは、以下に例証される線形の一次元ナノ構造を組み立てるために使用され得、各々のアセンブリ単位の順序および相対的なベクトル方向は、機能要素（記号
【０１０９】
【化２】
2005518455.tif 000006
【０１１０】
は、開始剤が付加される固体基板を表して使用され、そしてダブルコロンは、アセンブリ単位間の特異的相互作用を表す）の順序と無関係である：
【０１１１】
【化３】
2005518455.tif 000007
【０１１２】
この図から明らかなように、多数の固有のアセンブリ単位が少数の相補的な連結要素を用いて構築され得る。さらに、アセンブリ単位の１つの型のみが、各々の段階的アセンブリサイクルに付加されるので、少数の相補的な連結要素のみが、多数の固有の複雑なナノ構造の組み立てに必要である。従って、連結要素が、完成したナノ構造内部のアセンブリ単位の位置に両義性を付与することなく繰り返し使用され得る。
【０１１３】
上記の場合の各々において、２つまたは３つの連結対のみが使用される。これらの構造の任意の自己アセンブリは、７つの非交差反応連結対の使用を必要とする。これらの線形構造がＮ単位の大きさであって、段階的アセンブリを用いて組み立てられる場合、２つまたは３つの連結対が依然として必要とされるのみであるが、自己アセンブリのためには、これらの線形構造は、（Ｎ−１）非交差反応する相補的連結対を必要とする。
【０１１４】
本発明の別の局面において、上に示したアセンブリ単位の２つの連結要素の位置を交換することによって、付加された機能要素の空間的位置および配向が、組み立てられたナノ構造の全体的な構造内で変更される。本発明のこの局面は、本明細書中に開示されるように、ナノ構造の段階的アセンブリによって付与される設計柔軟性のさらに別の局面を明らかにする。
【０１１５】
開始剤またはナノ構造中間体への各アセンブリ単位の付加は、開始剤またはナノ構造中間体によって運ばれるアセンブリ単位の１つの連結要素と１つ以上の非結合相補的連結要素との間の特異的連結対相互作用の形成によって、媒介される。多数の実施形態において、単一の非結合相補的連結要素のみが、開始剤またはナノ構造中間体上に存在する。しかし、他の実施形態において、複数の同一のアセンブリ単位を、同一の連結要素を含むアセンブリ中間体上の複数の部位に付加することは、有利であり得る。これらの実施形態において、段階的アセンブリは、アセンブリ単位の並列付加によって進行するが、単一単位のみが中間体上の任意の１部位に付加され、そして関連する全ての部位でのアセンブリは、予め設計されたベクトル様式で生じる。
【０１１６】
ナノ構造の構造完全性は、段階的アセンブリのプロセスにわたって決定的な重要性があり、そしてこれらのアセンブリ単位は、好ましくは非共有結合性の相互作用によって連結される。特異的非共有結合性の相互作用は、例えば、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間に生じる相互作用である。特異的相互作用は、アセンブリ単位とナノ構造中間体との間の複合体に、段階的アセンブリプロセス全体に渡って安定な相互作用を維持するのに十分な安定性を与えるために、適切な親和性を示すべきである。非共有結合性の特異的相互作用は、付加されたアセンブリ単位が、そのアセンブリ単位と相互作用するように設計された連結要素とのみ安定な相互作用を形成するように、適切な特異性を示すべきである。本明細書中に開示された段階的アセンブリプロセスの間、要素間に生じる相互作用は、好ましくは、操作可能には「逆転できない（不可逆である）」。この要求を満たす結合定数は、明確には定義され得ない。なぜなら、「不可逆性」は動力学的概念であり、結合定数が平衡特性に基づくからである。それにもかかわらず、１０−７以下の桁（すなわち、より高い親和性および典型的なダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）−エピトープ複合体のＫｄに類似）のＫｄ’での相互作用は、目的のタイムスケールで（すなわち、ナノ構造の段階的アセンブリの間）、代表的に「不可逆的に」作用する。
【０１１７】
しかし、分子間の相互作用は、ナノ構造の利用のタイムスケール（すなわち、その有効期限予測値または可使時間予測値）に「不可逆的に」作用する必要はない。ある実施形態において、本明細書中に開示される段階的アセンブリ法に従って組み立てられたナノ構造は、続いて、化学固定（例えば、パラホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒドを用いた固定）によって安定化されるか、または架橋結合によって安定化される。２つのタンパク質を架橋結合するための最も一般的なスキームは、１つのアセンブリ単位上のアミノ基の第２アセンブリ単位上のチオール基に対する間接的なカップリングを含む（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第８版、２章、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｌｏｓｔｅｒら、１９９７、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．６９９（１〜２）：４３９−６１；Ｐｈｉｚｉｃｋｙら、１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９（１）：９４〜１２３を参照のこと）。
【０１１８】
本発明のある実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法によるナノ構造のアセンブリは、アセンブリ単位間の非共有結合性の相互作用を用いて、比較的強固な連結および安定なアセンブリ単位に関与する。それにもかかわらず、有用なアセンブリ単位に組み込まれる連結要素は、むしろ混乱し（つまり、安定でも強固でもない）、その後、第２の連結要素と相互作用して、安定な、好ましくは強固な連結対を形成し得る。したがって、本発明のある実施形態において、個々のアセンブリ単位は、アセンブリ前に、不安定な可撓性のドメイン含み得、これは、アセンブリ後には、より強固である。好ましい実施形態において、本明細書中に開示された組成物および方法を用いて組み立てられたナノ構造は、強固な構造である。
【０１１９】
本発明の方法に従って、ナノ構造の剛性の分析、ならびに任意の構造的不備または欠陥の同定が、当該分野で周知の方法（例えば、電子顕微鏡検査法）を用いて実施される。
【０１２０】
別の実施形態において、構造的剛性は、固体表面に完成したナノ構造の一端を直接的に付着させることによって（すなわち、可撓性係留を用いることなく）、試験され得る。次いで、ナノ構造の他端（または、多分岐構造である場合、ナノ構造の末端分岐）は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）チップに接着され、可動である。チップを動かす目的で、チップに力が適用される。ナノ構造が可撓性である場合、適用された力とナノ構造の偏向によって認められたチップ移動との間には、おおよその比例関係が存在する。対照的に、ナノ構造が強固である場合、ナノ構造偏向およびチップ移動はほとんど無いかまたは全くない。なぜなら、適用される力のレベルが、強固なナノ構造が破壊される点まで増加するからである。その時点では、これ以上の力は適用されないにもかかわらず、ＡＦＭチップの大きな移動がある。２つの末端の接着点がナノ構造よりも強い限りは、この方法は、剛性の有用な測定値を提供する。
【０１２１】
本発明によると、ナノ構造中の各位置は、全ての他の位置と区別可能である。なぜなら、各アセンブリ単位が、その隣接単位と密に、かつ特異的に、かつ固有に相互作用するように設計され得るからである。各アセンブリ単位は、このナノ構造内の位置とは異なる活性および／または特性を有し得る。このナノ構造中の各位置は、段階的アセンブリプロセスによって、ならびに各アセンブリ単位および／または所望の位置で加えられる機能的要素の特性によって、固有に規定される。さらに、本明細書中に開示される段階的アセンブリ法およびアセンブリ単位は、十分に規定されたサイズ、形状および機能の複雑なナノ構造を構築するための大規模な大量並列自動化製造プロセスに供することができる。
【０１２２】
本発明の方法および組成物は、本明細書中で用いられるアセンブリ単位の構築において使用されるタンパク質が可能である正確な寸法、均一性、および空間形状の多様性を利用する。さらに、本明細書中以下に記載されるように、本発明の方法は有利である。なぜなら、遺伝子操作技術が、本明細書中に開示される本発明の方法において使用される生物学的材料の特性を改変および変更するため、ならびに微生物中で多量のこのような材料を合成するために使用され得るからである。
【０１２３】
本発明はまた、目的のタンパク質（例えば、抗体またはピリンタンパク質）のフラグメントを含むアセンブリ単位を利用する、ナノ構造の段階的アセンブリを提供する。本発明の特定の実施形態において、目的のタンパク質のフラグメントからなるか、またはこのフラグメントを含むタンパク質は、目的のタンパク質の少なくとも４つの連続するアミノ酸からなる。他の実施形態において、このフラグメントは、目的のタンパク質の、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３５個、または５０個の連続するアミノ酸からなる。特定の実施形態において、このようなフラグメントは、３５アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、または３５０アミノ酸以下である。
【０１２４】
本発明はまた、融合タンパク質を含むアセンブリ単位を利用する、ナノ構造の段階的アセンブリを提供する。融合タンパク質産物またはキメラタンパク質産物（ペプチド結合を介して（異なるタンパク質の）異種タンパク質配列に結合した所望のタンパク質（例えば、ＩｇＧ）、フラグメント、アナログ、または誘導体を含む）。このようなキメラタンパク質産物は、当該分野において公知の方法によって、適切なリーディングフレームで、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結し、そして当該分野において通常公知の方法によって、キメラ産物を発現させることによって、作製され得る。あるいは、このようなキメラ産物は、タンパク質合成技術によって（例えば、ペプチド合成機の使用によって）作製され得る。
【０１２５】
（開始アセンブリ単位）
開始アセンブリ単位は、本発明の段階的アセンブリ法によって形成されるナノ構造に組み込まれた第１のアセンブリ単位である。開始アセンブリ単位は、特定の実施形態において、共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用によって、固体基板または他のマトリクスに結合され得る。開始アセンブリ単位は、「開始単位」としても公知である。
【０１２６】
ナノ構造の段階的アセンブリは、選択されたアセンブリ単位の開始単位への非共有結合的な方向性付加によって始まる。本発明の方法によると、アセンブリ単位が、（ｉ）開始単位のインキュベーションによって、開始単位に付加され、この開始単位は、いくつかの実施形態において、付加されるべき次のアセンブリ単位を含む溶液中で、マトリクスまたは基板に固定される。このインキュベーション工程の後に、（ｉｉ）除去工程（例えば、洗浄工程）が続き、ここで過剰のアセンブリ単位が、開始単位の付近から除去される。
【０１２７】
アセンブリ単位は、特異的な非共有結合の形成によって、開始単位に結合する。次のアセンブリ単位の連結要素は、これらの連結要素が開始単位上の予め指定された部位のみに結合するように選択される。１つのアセンブリ単位のみが、第１の段階的アセンブリサイクルの間に、開始単位上の標的連結要素に付加され得、そしてこのアセンブリ単位の標的開始単位への結合は、方向性である。所望のアセンブリ単位の全てがナノ構造の所望の設計に従ってナノ構造に組み込まれるまで、工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すことによって、段階的アセンブリが続く。
【０１２８】
本発明の段階的アセンブリ法の好ましい実施形態において、開始単位が、基板に固定され、そしてさらなる単位が、固相ポリマー合成と類似の手順で、連続的に付加される。
【０１２９】
開始単位は、アセンブリ単位のカテゴリーであり、従って、本発明のアセンブリ単位で含まれると本明細書中以下に記載される構造的連結要素および／または機能的要素のいずれかを含み得る。従って、開始単位は、以下の分子、またはそれらの結合誘導体もしくは結合フラグメントのいずれかを含み得る：モノクローナル抗体；多重特異的抗体、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）；二重特異的、キメラまたは二重特異的なヘテロ二量体Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディまたは多量体ｓｃＦｖフラグメント；細菌ピリンタンパク質、ロイシンジッパー型コイルドコイル、４へリックス束、ペプチドエピトープまたはＰＮＡ、あるいは本明細書中に開示される任意の他の型のアセンブリ単位。
【０１３０】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの連結要素を含む開始アセンブリ単位を提供する。他の実施形態において、本発明は、２つ以上の連結要素を有する開始アセンブリ単位を提供する。
【０１３１】
開始単位は、種々の方法でマトリクスに連結され得る。連結方法の選択は、いくつかの設計要因（開始単位のタイプ、最終のナノ構造がマトリクスから除去されるべきか否か、最終のナノ構造の化学などが挙げられるが、これらに限定されない）によって決定される。可能な連結方法としては、開始エピトープへの抗体の結合、Ｈｉｓタグ化開始剤、マトリクス結合ドメイン（例えば、キチン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン）を含む開始単位、抗体または抗体由来開始単位については、抗体結合タンパク質（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ）、ビオチン化開始剤のストレプトアビジン結合、ＰＮＡ係留、および開始剤のマトリクスへの特異的な共有結合的連結が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
特定の実施形態において、開始単位は、固体基板に固定される。開始単位は、抗体または抗原の固定のための当該分野で一般的に使用される方法を使用して、固体基板に固定され得る。抗体または抗原の固定のための当該分野で周知の多数の方法がある。これらの方法としては、プラスチックＥＬＩＳＡプレートへの非特異的吸着；タンパク質のビオチン化、その後の、プラスチック基板にすでに吸着されたストレプトアビジンまたはアビジンに結合することによる固定（例えば、Ｓｐａｒｋｓら、１９９６、Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｂ．Ｋ．Ｋａｙ，Ｊ．ＷｉｎｔｅｒおよびＪ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２２７−５３を参照のこと）が挙げられる。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに加えて、タンパク質は、多数の他の固体支持体（例えば、セファロース（Ｄｅｄｍａｎら、１９９３，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８；２３０２５−３０）、または常磁性ビーズ（Ｓｐａｒｋｓら、１９９６，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｂ．Ｋ．Ｋａｙ，Ｊ．ＷｉｎｔｅｒおよびＪ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２２７−５３））に固定され得る。使用され得るさらなる方法としては、アミンを含有する生物学的分子の、アルデヒドを含有する固体支持体上での還元的アミノ化（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐ．１８６）、ジメチルピメリミデート（ｐｉｍｅｌｉｍｉｄａｔｅ）（ＤＭＰ）の使用、およびいずれかの末端にイミドエステル基を有するホモ二官能性架橋剤の使用（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，１９９６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．２０５−０６）が挙げられる。この試薬は、結合プロテインＡを含む不溶性支持体に抗体分子を固定する際の使用が見出されている（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９８２，Ａ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｍｕｎｏｍａｔｒｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７，１０７６６−６９）。
【０１３３】
特定の実施形態において、開始単位は、係留化ドメイン（Ｔ）（これは固定された抗原／ハプテンを認識し、そしてこれらに結合する）および対向するドメイン（Ａ）（続いて、このドメインに、段階的アセンブリ中にさらなるアセンブリ単位が付加する）を含むダイアボディである。抗体８Ｆ５（これは、抗原性ペプチドＶＫＡＥＴＲＬＮＰＤＬＱＰＴＥ（配列番号１３）に由来するヒトライノウイルス（血清型２）ウイルスキャプシドタンパク質Ｖｐ２に対して指向される）は、Ｔドメインとして使用される（Ｔｏｒｍｏら、１９９４，Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｉｒａｌ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ２，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３（１０）：２２４７−５６）。Ａドメインは、ダイアボディ単位１について先に記載された同じリゾチーム抗イデオトープ抗体（Ｅ５．２）である。従って、完全開始アセンブリ単位は、８Ｆ５×７３０．１．４（Ｔ×Ａ）を対向するＣＤＲとして含む。開始単位が、構築され、そしてダイアボディを含む連結要素および／または構造的要素を特徴付けるための本明細書中で記載された方法を使用して機能的に特徴付けされる。
【０１３４】
開始単位を固体支持体マトリクスに固定するために、ライノウイルス抗原性ペプチドが、第Ｘａ因子の配列ＩＥＧＲのＮ末端（ＮａｇａｉおよびＴｈｏｇｅｒｓｅｎ，１９８４，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０９（５９７１）：８１０−１２）で、ならびに第Ｘａ因子の配列と抗原性ペプチド配列との間で、スプライシングされた短い可撓性リンカーを介して、プロテアーゼ認識ペプチド第Ｘａ因子に融合され得る。この融合ペプチドは、ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（６炭素長のスペーサーアームを有し、１級アミンを介するカップリングを許容するセファロース誘導体）に共有結合され得る。（あるいは、カルボキシル基を介する共有結合のためのセファロース誘導体が使用され得る）。共有結合された融合タンパク質は、開始単位（Ｔ×Ａ）中の係留化ドメイン「８Ｆ５」の認識エピトープとして働く。
【０１３５】
一旦、開始剤が固定されると、続いて、さらなるダイアボディ単位（ダイアボディアセンブリ単位１および２）が、結合ドメインＡ’から一方向で、段階的アセンブリに付加され得る。段階的アセンブリが完了すると、ナノ構造は、支持体マトリクスに架橋され得るか、またはプロテアーゼ第Ｘａ因子の付加の際に、このマトリクスから放出され得る。このプロテアーゼは、共有結合された抗原性／第Ｘａ因子の融合ペプチドを切断し、支持体マトリクスからインタクトなナノ構造を放出する。なぜなら、設計によって、設計されたタンパク質アセンブリ単位のいずれにも、第Ｘａ因子認識部位が含まれないからである。
【０１３６】
第Ｘａ因子の付加を必要としない固体支持体マトリクスからのペプチド融合物の切断の代替方法もまた、実行され得る。この方法は、セファロースマトリクスに結合した切断可能なスペーサーアームを使用する。抗原ペプチドは、フェニルエステル結合を介してマトリクスに共有結合される。一旦、固定された抗体が開始アセンブリ単位に結合すると、この開始アセンブリ単位は、ｐＨ７．４（開始単位／抗原複合体（および関連のナノ構造）が支持体マトリクスから放出される点）におけるイミダゾールグリシン緩衝液を用いるスペーサーアームの化学的切断まで、この支持体マトリクスに連結されたままである。
【０１３７】
（連結要素を特徴付けする方法）
（Ｘ線結晶学を用いる、連結要素相互作用を特徴付けるための方法）
多くの場合、タンパク質間またはタンパク質とペプチドとの間の分子認識は、実験的に決定され得る。本発明の１つの局面において、連結要素相互作用を規定するタンパク質−タンパク質相互作用は、結合対の形成に重要であり、当該分野で一般的に公知のＸ線結晶学的方法によって特徴付けおよび同定される。このような特徴付けにより、当業者は、本発明の組成物および方法において有用であり得る結合対相互作用を認識することができる。
【０１３８】
（連結要素の特異性および親和性を特徴付けるための方法）
２つの相補的連結要素が特異的に相互作用するという検証は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、分析用超遠心分離、またはＢＩＡｃｏｒｅ方法論（Ａｂｒａｈａｍら，１９９６，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．９（５−６）：４５６−６１；Ａｔｗｅｌｌら，１９９６，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ｄｉｍｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ  ａｎｄ  Ｎ９  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３（１７−１８）：１３０１−１２；Ｍｕｌｌｅｒら（１９９８），Ａ  ｄｉｍｅｒｉｃ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｔｗｏ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｖｉｄｉｔｙ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３２（１−２）：４５−４９）、または当該分野で周知の他の類似の方法を使用して確立され得、これらは、分子間結合相互作用の強度を実証および／または定量するのに適している。
【０１３９】
（構造的要素、連結要素および機能的要素の設計および操作）
規定された結晶構造、または高度に相同性のタンパク質の既知の結晶構造に基づく相同性モデリングにより明らかにされるように、本発明の構造的要素、連結要素および機能的要素の設計、ならびにこれらを含むアセンブリ単位の設計は、所望の結合相互作用におけるそれらのアミノ酸残基の分析および決定によって容易にされる。例えば、ピリン−ペプチド複合体の結晶構造を使用して、構造およびピリン−ピリン相互作用の配置を予測し得る。２つのピリンタンパク質間の複合体は、まだ結晶化されていないが、エネルギー計算および固体モデリングを使用して、複数のピリンから作製される複合体の構造を予測し得る（Ｓａｕｅｒら，１９９９，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｉｌｕｓ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１０５８−１０６１；Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，１９９９，Ｘ−ｒａｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＦｉｍＣ−ＦｉｍＨ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｄｈｅｓｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  ｕｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１０６１−１０６６）。
【０１４０】
１つ以上の機能的要素を含む有用なアセンブリ単位の設計は、好ましくは、以下の工程の幾つかまたは全部を含み得るが、これらに限定されない、一連の決定および分析を包含する：
（ｉ）ナノ構造の所望の全体的な機能に基づく、組み込まれるべき機能的要素の選択；
（ｉｉ）標的機能に基づく所望の形状の選択、特に、機能的要素の相対的位置の決定；
（ｉｉｉ）これらのペプチドまたはタンパク質の決定、同定または選択を介する連結要素の選択（例えば、コンビナトリアルライブラリから）であり、これらのペプチドまたはタンパク質は、所望のナノ構造に組み込まれるべき機能的ナノ粒子に対する特異性を有する、選択；
（ｉｖ）例えば、量子ドットなどのようなナノ粒子を含む、機能的要素間の必要とされる分離に基づく、正確な寸法を有する適切に剛性の構造を提供しかつ正確な形状および化学量論を有する連結要素の組み込みのための位置を有する構造的要素の選択；
（ｖ）工程（ｉｉｉ）からの、ペプチドまたはタンパク質連結要素および工程（ｉｖ）において選択された構造的要素を組み込む融合タンパク質の設計であって、それにより、アセンブリ単位の構造的要素および連結要素の折り畳みが、破壊されない（例えば、βターンにおける組み込みを介する）、設計；
（ｖｉ）ナノ構造の全体的な設計の状況において生じる融合タンパク質のコンピューターモデリングおよび機能的仕様によって必要とされる場合に構造的寸法を最適化するための設計の精錬；または
（ｖｉｉ）段階的アセンブリのためのアセンブリ順序の設計。
【０１４１】
構造的要素タンパク質の改変は、通常、例えば、問題のタンパク質のアミノ酸配列の挿入、欠失、または改変を含む。多くの場合、改変は、ネイティブのタンパク質において現存しない連結要素を加えるための挿入または置換を含む。挿入変異の成功を決定するための慣用的な試験の非限定的な例は、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルである。生じる融合変異体タンパク質のＣＤスペクトルが、ネイティブのタンパク質のＣＤと比較され得る。
【０１４２】
挿入が小さい場合（例えば、短いペプチド）、適切に折り畳まれた挿入変異体のスペクトルは、ネイティブのタンパク質のスペクトルに非常に類似する。挿入がタンパク質ドメイン全体である場合（例えば、単鎖可変ドメイン）、融合タンパク質のＣＤスペクトルは、個々の成分（すなわち、ネイティブのタンパク質ならびにネイティブのタンパク質および機能的要素を含む融合タンパク質の成分）のＣＤスペクトルの合計に対応するはずである。この対応は、融合タンパク質の２つの成分の正確な折り畳みについての慣用的な試験を提供する。
【０１４３】
好ましくは、融合タンパク質の首尾よい操作の更なる試験がなされる。例えば、融合タンパク質がその標的の全てに結合し、それゆえに、全ての結合対と首尾よく相互作用する能力の分析がなされ得る。これは、多くの適切なＥＬＩＳＡアッセイを使用して実施され得る；少なくとも１つのＥＬＩＳＡを実施して、ナノ構造を形成するのに必要とされる各々の結合対に対する、改変されたタンパク質の親和性および特異性を試験する。
【０１４４】
（段階的アセンブリ法の使用およびそれにより構築されたナノ構造の使用）
本発明の段階的アセンブリ法およびアセンブリ単位は、無数のナノ構造の構築における用途を有する。このようなナノ構造の使用は、容易に明らかとなり、この使用としては、一次元、二次元、および三次元の構造（例えば、繊維、ケージ、または固体）の高度に規則正しい十分に規定されたアレイを必要とする適用が挙げられ、これらの構造は、それらが他の物質と会合できるようにする特定の結合部位を含み得る。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法により製造されたナノ構造は、一次元構造である。例えば、段階的アセンブリにより製造されたナノ構造は、他の物質（例えば、エアロゲル、紙、プラスチック、セメントなど）の構造的補強材のために使用され得る。特定の実施形態において、長い一次元繊維の形態を採るように段階的アセンブリにより製造されるナノ構造は、例えば、製造の間、紙、セメントまたはプラスチックに組み込まれて、加えられた湿潤引張り強度および乾燥引張り強度を提供する。
【０１４６】
別の実施形態において、ナノ構造は、同定または認識の目的のために使用され得るパターン化またはマーキングされた繊維である。このような実施形態において、ナノ構造は、例えば、蛍光色素、量子ドット、または酵素などのような機能的要素を含み得る。
【０１４７】
さらなる実施形態において、特定のナノ構造は、偽造に対するマーカーとして紙および織物に含浸される。この場合、（例えば、キットで市販される）単一の色が関連する抗体反応を使用して、物質の起源を検証する。あるいは、このようなナノ構造は、組み込みの前または後のいずれかに色素、インクもしくは他の物質と結合して、紙もしくは織物を染色し得るか、または、他の方法でそれらの外観もしくは特性を改変し得る。
【０１４８】
別の実施形態において、ナノ構造は、例えば、製造の間にインクまたは色素に組み込まれて、可溶性または混和性を増大させる。
【０１４９】
別の実施形態において、一次元構造のナノ構造（例えば、繊維）は、所望の位置に１つ以上の酵素機能的要素または触媒機能的要素を保有する。このナノ構造は、酵素反応または触媒反応のための支持構造または足場として機能し、その効率を増大させる。このような実施形態において、ナノ構造を使用して、所望の反応順序で酵素または他の触媒を「取り付ける」か、または位置付けし、反応「アセンブリライン」を提供し得る。
【０１５０】
別の実施形態において、一次元のナノ構造（例えば、繊維）は、アセンブリジグとして使用される。２つ以上の成分（例えば、機能的単位）がナノ構造に結合され、それにより、空間的配向を提供する。これらの成分は、結合または融合され、次いで、生じた融合生成物は、ナノ構造から放出される。
【０１５１】
別の実施形態において、ナノ構造は、一次元、二次元または三次元の構造であり、この構造は、ナノ粒子（例えば、熱特性、電気的特性または磁気特性を有する金属粒子または他の粒子）を規定された間隔で取り付けるための支持体または枠組みとして使用され、そして、この構造は、ナノワイヤまたはナノ回路を構築するために使用される。
【０１５２】
別の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法を使用して、一次元ナノ構造（繊維）の金属での無電極めっきを達成し、規定されたサイズおよび／または形状を有するナノワイヤを構築する。例えば、機能的要素として金属粒子を含むナノ構造が構築され得る。
【０１５３】
別の実施形態において、機能的要素として磁気粒子を含む一次元ナノ構造（例えば、繊維）は、外部磁場により整列されて、ナノ構造を通って流れる流体を制御する。別の実施形態において、外部磁場を使用して、ＬＣＤ型ディスプレイにおいて使用するために、機能的要素として光学部分を含むナノ構造（例えば、繊維）を整列または脱整列させる。
【０１５４】
別の実施形態において、ナノ構造は、電子顕微鏡のためのサイズ標準物質または正確な寸法のマーカーとして使用される。
【０１５５】
他の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法により製造されたナノ構造は、二次元または三次元構造である。例えば、１つの実施形態において、ナノ構造は、規定された孔サイズを有するメッシュであり、二次元ふるいまたはフィルターとして機能し得る。
【０１５６】
別の実施形態において、ナノ構造は、アセンブリ単位の三次元六角形アレイであり、この単位は、分子ふるいまたはフィルターとして使用され、サイズによって粒子を選択的に分離するための、正確な直径の規則的な垂直孔を提供する。このようなフィルターは、溶液の滅菌（すなわち、微生物またはウイルスを除去するため）に使用され得るか、または一連の分子量カットオフフィルターとして使用され得る。この実施形態において、孔のタンパク質成分（例えば、構造的要素または機能的要素）は、特定の表面特性（すなわち、親水性または疎水性、特定のリガンドを結合する能力など）を提供するように改変され得る。とりわけ、この型の濾過デバイスの利点は、孔の均質性および直線性であり、そしてマトリクスに対する孔の高い比率である。
【０１５７】
本明細書に開示される方法およびアセンブリ単位を使用して、種々の二次元および三次元構造（例えば、多角形構造（例えば、八角形））ならびに開放固体（例えば、三角形から形成される四面体、二十面体）、ならびに正方形および矩形から形成される箱型または立方体（例えば、節１１、実施例６に開示される立方体）を構築し得ることは、当業者に対して明らかである。この構造の範囲は、構造要素の異なる軸上で操作され得る連結要素および機能的要素の型によってのみ限定される。
【０１５８】
別の実施形態において、二次元または三次元のナノ構造を使用して、機能的単位として光学的部分、電気的部分、磁気的部分、触媒性部分、または酵素的部分を含む表面コーティングを構築し得る。このようなコーティングは、例えば、光学的コーティングとして使用され得る。このような光学的コーティングを使用して、コーティングされた物質の吸着特性または反射特性を変更し得る。
【０１５９】
本発明のナノ構造を使用して構築された表面コーティングはまた、電気的コーティングとして（例えば、静的遮蔽表面または（コーティングが光学的に透明である場合は）レンズ用の自己ダスティング表面として）使用され得る。この表面コーティングはまた、磁気コーティング（例えば、コンピュータハードドライブの表面のコーティング）として使用され得る。
【０１６０】
このような表面コーティングはまた、触媒コーティングまたは酵素コーティングとして（例えば、表面保護として）使用され得る。特定の実施形態において、このコーティングは、抗酸化剤コーティングである。
【０１６１】
別の実施形態において、このナノ構造は、機能的要素として光学的部分、電気的部分、磁性部分、触媒性部分、酵素部分を有する、開いた枠組みまたは足場を構築するために使用され得る。このような足場は、上記のような光学的部分、電気的部分、磁性部分、触媒性部分、または酵素部分のための支持体として使用され得る。特定の実施形態において、このような足場は、より厚いかまたはより密集した分子のコーティングを形成するために、あるいは所望の光学的特性、電気的特性、磁気的特性、触媒特性、または酵素特性を有する可溶性のミクロンサイズの粒子を支持するために配列される、機能的要素を構成し得る。
【０１６２】
別の実施形態において、ナノ構造は、酵素結合ドメインまたは抗体結合ドメインが結合して高密度の多価プロセシング部位を提供し得る、枠組みまたは足場として働く。この多価プロセシング部位は、結合しなければ不溶性である酵素を結合して可溶化するか、または種々の分子種をトラップし、保護し、そして送達する。
【０１６３】
別の実施形態において、ナノ構造は、アドレス可能な位置を有する高密度コンピュータメモリを構築するために使用され得る。
【０１６４】
別の実施形態において、ナノ構造は、人工ゼオライト（すなわち、水からイオンを吸収し得る天然鉱物）（含水ケイ酸塩）を構築するために使用され得、ここで、このナノ構造の設計は、開いた枠組みを通って流れる反応物の高効率のプロセシングを促進する。
【０１６５】
別の実施形態において、このナノ構造は、新素材のための基礎として働き得る開いた枠組みまたは足場を構築するために使用され得る。例えば、この枠組みは、特性（例えば、強度、密度、確定粒子充填および／または種々の環境中での安定性）の独特の調和性を保有し得る。
【０１６６】
特定の実施形態において、本発明の段階的アセンブリ法はまた、コンピュータアーキテクチャ（例えば、量子ドットの空間的に組織化されたアレイからなる量子セルラーオートマトン（ＱＣＡ））を構築するために使用され得る。ＱＣＡ技術において、論理状態は、電圧レベルによってではなく、空間的に配置された量子ドットからなるＱＣＡセルに含まれる個々の電子の位置によって符号化される。段階的アセンブリは、バイナリー情報の格納のために必要な幾何学的配置に従って、量子ドット粒子を空間的に組織化する順序で実施され得る。量子ドットセルラーオートマトンのためのＱＣＡセルの空間的配置および構築のための段階的アセンブリを使用して作製され得る、論理デバイスの例としては、ＱＣＡワイヤ、ＱＣＡインバータ、多数決ゲートおよび全加算器（Ａｍｌａｎｉら、１９９９、Ｄｉｇｉｔａｌ  ｌｏｇｉｃ  ｇａｔｅ  ｕｓｉｎｇ  ｑｕａｎｔｕｍ−ｄｏｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４（５４１２）；２８９−９１；ＣｏｗｂｕｒｎおよびＷｅｌｌａｎｄ，２０００、Ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７（５４５７）：１４６６−６８；Ｏｒｌｏｖら、１９９７、Ｒｅａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｕｍ−Ｄｏｔ  Ａｕｔｏｍａｔａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：９２８−３２）が挙げられる。
【０１６７】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、ここでさらに記載される。
【実施例】
【０１６８】
（実施例１：  ハイブリッドピリンアセンブリ単位の段階的アセンブリ）
本実施例において、ハイブリッドピリンアセンブリ単位は、本発明の段階的アセンブリ法の以下の工程を使用して構築される。
【０１６９】
固定化されたｐａｐＡおよび上記のように操作されたハイブリッドタンパク質を用いて、５つのピリン単位を含み、かつ、アセンブリにおける第２および第５の単位上にそれぞれが配置された２つのｒａｓエピトープを有するフィラメントを組み立てることが可能である（図３）。
【０１７０】
（１）第１の工程において、ｐａｐＡ単位を、当該分野で周知の方法を使用して、固体マトリクス上に固定化する。例えば、ビオチン部分を、ｐａｐＡのアミノ末端に付加し得；次いで、ｐａｐＡをストレプトアビジンによりコーティングされた表面の存在下でインキュベートする。ビオチンとストレプトアビジンとの非常に強い相互作用により、ｐａｐＡの表面への固定化が生じる。タンパク質を固体表面に固定化するための多くの他の方法が、当業者に利用可能であり、周知である。
【０１７１】
（２）第２の工程において、ｒａｓエピトープを表示するｐａｐＨ−ｐａｐＫハイブリッドタンパク質の溶液を、固定化されたｐａｐＡとインキュベートする。ｐａｐＨ−ｐａｐＫハイブリッドを可溶化するために、これとシャペロンｐａｐＤとを複合体化することが必要であり得る。インキュベーションの間、ｐａｐＤは、ハイブリッドタンパク質をｐａｐＡ上へ堆積させるために固定化されたｐａｐＡを交換する。適切なインキュベーション期間の後、ほとんどの場合において、一般的に、数秒〜数分後、そして、通常ではない場合において数時間を超える期間の後、任意の過剰なタンパク質を洗い流す。この工程の生成物は、ピリン二量体であり、これは、固定化されたｐａｐＡおよびｐａｐＨ−ｐａｐＫとｒａｓエピトープとのハイブリッドを含む。
【０１７２】
（３）第３の工程において、ｐａｐＥ−ｐａｐＡハイブリッドタンパク質（おそらく、ｐａｐＤとの複合体における）の溶液を、工程２の固定化された生成物とインキュベートする。インキュベート後、任意の過剰なタンパク質を洗い流す。この工程の結果は、ピリン三量体であり、これは、固定化されたｐａｐＡおよびｐａｐＨ−ｐａｐＫとｒａｓエピトープとのハイブリッドおよびハイブリッドｐａｐＥ−ｐａｐＡタンパク質を含む（図３）。
【０１７３】
（４）第４の工程において、ｐａｐＫ−ｐａｐＦハイブリッドタンパク質の溶液を、工程３において上記したように、工程３の固定化された生成物とインキュベートする。インキュベート後、任意の過剰なタンパク質を洗い流す。この工程は、ピリン四量体を生成し、これは、固定化されたｐａｐＡ、ｐａｐＨ−ｐａｐＫとｒａｓエピトープとのハイブリッド、ハイブリッドｐａｐＥ−ｐａｐＡタンパク質およびハイブリッドｐａｐＫ−ｐａｐＦタンパク質を含む（図３）。
【０１７４】
（５）第５の工程において、ｒａｓエピトープが挿入されたｐａｐＨ−ｐａｐＥハイブリッドタンパク質（おそらく、ｐａｐＤとの複合体における）の溶液を、工程４の固定化された生成物とインキュベートする。インキュベート後、任意の過剰なタンパク質を洗い流す。この工程の結果は、ピリン五量体であり、これは、固定化されたｐａｐＡ、ｐａｐＨ−ｐａｐＫとｒａｓエピトープとのハイブリッド、ハイブリッドｐａｐＥ−ｐａｐＡタンパク質およびハイブリッドｐａｐＫ−ｐａｐＦタンパク質、ｒａｓエピトープとのｐａｐＨ−ｐａｐＫハイブリッドを含む（図１７）。
【０１７５】
工程２〜５において使用される様式と類似の様式で、ピリン単位の連続的な付加により、より複雑な構造を構築することができる。
【０１７６】
（実施例２：多種特異的タンパク質アセンブリ単位を使用する段階的アセンブリのためのプロトコル）
段階的アセンブリの以下の工程は、図３に示される。得られるナノ構造は、図３の工程１１に示される。
【０１７７】
【表３−１】
2005518455.tif 000008
【０１７８】
【表３−２】
2005518455.tif 000009
【０１７９】
（実施例３：高分子ナノ構造の作製）
高分子アセンブリ体を構築するために、２つの組み立てられたナノ構造中間体が、本発明の段階的アセンブリ方法を使用して、互いに連結され得る。この実施例は、２つのナノ構造中間体からの高分子ナノ構造の作製を記載する。
【０１８０】
図８は、図３に示される段階的アセンブリプロトコルから作製された、２つのナノ構造中間体の段階的アセンブリを示す。ナノ構造中間体１は、図３において、工程１１として示される。ナノ構造中間体２は、図３において、工程８として示される。以下のプロトコルは、図８に示されるような、相補的な連結対の会合による、２つのナノ構造中間体の付加を記載する。得られる高分子ナノ構造は、図８の工程５に示される。
【０１８１】
【表４】
2005518455.tif 000010
【０１８２】
（実施例４：光散乱による重合の分析）
アセンブリ単位の広範な重合は、光散乱によって分析され得る。光散乱は、光散乱光度計（例えば、ＤＡＷＮ−ＤＳＰ光度計（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ））から測定して、重量平均分子量の決定、粒子のサイズ、形状および粒子−粒子対の相関の決定のための情報を提供する。
【０１８３】
（実施例５：スクロース勾配沈降による分子量決定（重合度））
異なる長さの結合したアセンブリ単位は、ゾーン超遠心分離において、スクロース勾配中で異なる速度で沈降する。次いで、重合度と、スヴェードベリ単位での沈降との間の量的関係が、計算される。この方法は、一般的には自己アセンブリの効率、および新たなアセンブリ単位の付加の各工程における、段階的アセンブリのプロセスを特徴付けるために有用である。
【０１８４】
（実施例６：電子顕微鏡検査による棒の形態および長さ）
スクロース勾配分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後に、棒を含む部分的に精製した画分が出現する。これらの形態を決定するために、適切な画分のサンプルをＥＭ格子に配置し、そして染色または影付けをして、電子顕微鏡検査を使用して、大きい構造体を探す。
【０１８５】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって、範囲を限定されない。実際に、本発明の種々の改変が、本明細書中に記載されたものに加えて、上記説明から、当業者に明らかになる。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０１８６】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、その全体が全ての目的で参考として援用されることが具体的にかつ個々に示されると同程度まで、その全体が、全ての目的で本明細書中に参考として援用される。
【０１８７】
任意の刊行物の引用は、出願日より前のその開示に対してであり、そして本発明は、先行技術の発明によって、このような刊行物より前日である権利がないという承認として、解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１。Ｐ線毛の構造の図。線毛は、ｐａｐＨのＮ末端膜アンカーを介して、Ｅ．ｃｏｌｉの外膜に係留される。線毛の大部分は、ｐａｐＡの多くのコピーから構成される。ロッドは、ロッド構造と薄い遠位構造（フィブリラム（ｆｉｂｒｉｌｌｕｍ）と呼ばれる）との間のアダプターとして作用するｐａｐＫの単一コピーによって終結する。フィブリラムは、ｐａｐＥの数個のコピー、続いて、ｐａｐＦの単一のコピーおよびｐａｐＧの単一のコピー（この構造の遠位端において付着因子として作用する）からなる。
【図２Ａ】図２（Ａ）。Ａ。２つのピリンの相互作用の図。これは、１つのピリン（図の右下に示される）のＮ末端伸長と他のピリン（図の左上に示される）の表面上の溝との密接な相互作用を示す。ピリンは、ピリンから隣接するピリンの本体への長いＮ末端伸長の結合を介して相互作用する。これは、有意な機械的な力を有する、延長された特異的相互作用を提供する。
【図２Ｂ】図２（Ｂ）。Ｂ。ｐａｐＥと、ｐａｐＡのタンパク質本体上にスプライスされたｐａｐＦのＮ末端アームから構築されたハイブリッドピリンとの相互作用の図。ピリンのＮ末端アームを異なるピリンのＮ末端アームで置き換えることによって、その結合特異性が変化する。ここで、ｐａｐＡは、ｐａｐＦのＮ末端アームによって置換されたｐａｐＡのＮ末端アーム（矢印）を有し、ｐａｐＦ−ｐａｐＥ相互作用を安定化するために通常使用される相互作用を使用することによって、ｐａｐＡがｐａｐＥと相互作用し得る。
【図３】図３。ハイブリッドピリンサブ単位の段階的アセンブリの図。示されたプロセスは、実施例１に記載される。図に示された工程に従って、ハイブリッドピリンサブ単位に付加が進行する。ハイブリッドピリンは、１つのピリン（例えば、大文字Ａ、Ｈ、Ｅ、Ｋで示される）のタンパク質本体および別のピリン（例えば、小文字ｋ、ａ、ｆ、ｅで示される）のＮ末端伸長から構成される。ｒａｓエピトープの位置を示す。
【図４】図４。アセンブリ単位の段階的アセンブリ。実際に、段階的アセンブリの各工程は、大量の平行様式で実施される。工程１において、開始単位が固体基板に固定される。ここで示される本発明の実施形態において、開始単位は、単一の連結要素を有する。工程２において、第２のアセンブリが追加される。第２の単位は、２つの非相補的な要素を有し、その結果、この単位は、溶液中で自己会合しない。第２のアセンブリ単位上の連結要素の１つは、開始単位上の連結要素に対して相補的である。未結合アセンブリ単位は、各工程の間に洗浄して除かれる（図示せず）。インキュベーション後、第２のアセンブリ単位は、開始単位に結合し、２つのアセンブリ単位から構成されるナノ構造中間体の形成を生じる。工程３において、第３のアセンブリ単位が追加される。この単位は、２つの非相補的な連結要素を有し、このうちの１つは、ナノ構造中間体上の不対連結要素のみに対して相補的である。この単位はまた、機能的単位（「Ｆ３」）を有する。機能的要素「Ｆ４」を有する第４のアセンブリおよび機能的要素「Ｆ５」を有する第５のアセンブリ単位は、それぞれ、工程２および３に対して正確に類似した様式で工程４および５において追加される。各々の場合において、連結要素の選択は、１つより多くの単位が一度に追加されることを妨げ、そして予め設計された位置に機能的単位のきっちりと制御されたアセンブリを導く。
【図５】図５。サブアセンブリからのナノ構造の作製。ナノ構造は、図４において上記されるように、個々のアセンブリ単位の付加のために使用される工程と類似の工程を使用して、サブアセンブリの連続的付加によって作製され得る。矢印は、成長しているナノ構造へのサブアセンブリの付加を示す。
【図６】図６。本発明の段階的アセンブリ方法に従う、ナノ構造へのタンパク質単位および無機元素の付加を示す図。工程１において、開始単位が固体基板に結合される。工程２において、アセンブリ単位が、開始単位へ特異的に結合する。工程３において、さらなるアセンブリ単位が、アセンブリを受けているナノ構造に結合される。このアセンブリ単位は、特定の無機元素に対して特異的な操作された結合部位を含む。工程４において、無機元素（斜交平行線をつけた卵形として示される）が、構造に付加され、そして操作された結合部位によって結合される。工程５は、第２の型の無機元素に対して特異的に操作された結合部位を有するアンカーアセンブリを追加し、そしてその第２の無機元素（斜線をつけた菱形として示される）が工程６において付加される。
【図７】図７。二次元ナノ構造を作製するために、４つの二重特異性アセンブリ単位および１つの四重特異性アセンブリ単位を利用する段階的アセンブリの１１工程の図。
【図８Ａ】図８（Ａ−Ｂ）。サブアセンブリとしてナノ構造中間体を利用する段階的アセンブリの図。工程１〜３において、ナノ構造中間体が構築され、２つの連結要素が、キャップされ、そしてナノ構造中間体が、固体基板から放出される。工程５において、工程３からのナノ構造中間体が、インタクトなサブアセンブリとして、アセンブリ中間体（固体基板に結合されて、工程４に示される）に付加される。
【図８Ｂ】図８（Ａ−Ｂ）。サブアセンブリとしてナノ構造中間体を利用する段階的アセンブリの図。工程１〜３において、ナノ構造中間体が構築され、２つの連結要素が、キャップされ、そしてナノ構造中間体が、固体基板から放出される。工程５において、工程３からのナノ構造中間体が、インタクトなサブアセンブリとして、アセンブリ中間体（固体基板に結合されて、工程４に示される）に付加される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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