(57)【要約】カノーラまたはその他の油料種子タンパク質単離物の調製におけるカノーラ油料種子粕およびその他の油料種子粕からのタンパク質の回収が、約５０℃より低い温度で空気溶媒除去した粕の使用によって、従来のトースト済み粕と比較して改良される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質単離物を調製する方法であって、
（ａ）油料種子を圧砕してそこから油および油料種子粕を形成し、
（ｂ）油料種子粕を溶媒抽出してそこから残留油を回収し、
（ｃ）抽出した油料種子粕から約５０℃未満の温度で溶媒を除去して溶媒除去油料種子粕を提供し、
（ｄ）溶媒除去油料種子粕を抽出して前記溶媒除去油料種子粕中のタンパク質の可溶化を生じさせ、約５から約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成し、
（ｅ）タンパク質水溶液を残渣油料種子粕から分離し、
（ｆ）選択性膜技術を使用してイオン強度を実質的に一定に維持しながら、前記タンパク質水溶液のタンパク質濃度を増加させて濃縮タンパク質溶液を得、
（ｇ）前記濃縮タンパク質溶液を約１５℃未満の温度を有する冷水中に希釈して、水相に少なくとも一部がミセルの形態をした離散したタンパク質粒子を形成させ、
（ｈ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形、粘着性、ゼラチン状、グルテン様のタンパク質ミセル塊を形成し、および
（ｉ）タンパク質ミセル塊が、乾燥重量基準で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質ミセル塊を上澄みから回収すること
を含む方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｄ）からステップ（ｉ）がバッチモードの操作される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｄ）からステップ（ｉ）が半連続モードの操作で実施される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｄ）から（ｉ）が連続モードの操作で実施される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記油料種子粕の前記抽出が、少なくとも約０．１０のイオン強度および約５から約６．８のｐＨを有する塩水溶液を用いて実施され、前記タンパク質水溶液が約５から約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量を有する請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記塩溶液が、約０．１５から約０．６のイオン強度を有する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記塩溶液が、約５．３から約６．２のｐＨを有する請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記油料種子粕の前記抽出が、前記塩水溶液を約１０から約３０分間撹拌することにより実施される請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記抽出ステップ中の塩水溶液中の油料種子粕の濃度が、約５から約１５％ｗ／ｖである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抽出ステップから得られる前記タンパク質水溶液が、約１０から約３０ｇ／Ｌの濃度を有する請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記抽出ステップが、
（ｉ）油料種子粕を、約５℃から約６５℃の温度で、少なくとも約０．１０のイオン強度および約５から約６．８のｐＨを有する塩水溶液と連続的に混合すること、および
（ｉｉ）油料種子粕からタンパク質を抽出しながら最大で約１０分までの時間、前記混合物をパイプを通して連続的に搬送して、約５から約４０ｇ／Ｌのタンパク質含量を有するタンパク質水溶液を形成することによって実施される請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩溶液が、約０．１５から約０．８のイオン強度を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
塩溶液が、約５．３から約６．２のｐＨを有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合ステップにおける前記塩水溶液中の油料種子粕の濃度が約５から約１５％ｗ／ｖである請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記温度が、少なくとも約３５℃である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質水溶液が、約１０から約３０ｇ／Ｌのタンパク質含量を有する請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記油料種子粕の前記抽出が、少なくとも約０．１０のイオン強度および約３から約５または約６．８から約９．９のｐＨを有する塩水溶液で実施され、タンパク質水溶液の残渣油料種子粕からの前記分離に続いて、タンパク質水溶液のｐＨが、約５から約６．８に調節される請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩溶液が、約０．１５から約０．６のイオン強度を有する請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質水溶液のｐＨが５．３から約６．２のｐＨに調節される請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記油料種子粕がカノーラ油料種子粕であり、タンパク質水溶液の残渣カノーラ種子粕からの前記分離のステップに続いて、タンパク質水溶液が色素除去ステップにかけられる請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記色素除去ステップが、タンパク質水溶液の膜分離精製により実施される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記色素除去ステップが、色素吸着剤をタンパク質水溶液と混合し、次いで色素吸着剤をタンパク質水溶液から除去することにより実施される請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
色素吸着剤が、粉末の活性炭である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記油料種子粕が水で抽出され、次いで得られたタンパク質水溶液に塩を加えて、少なくとも約０．１０のイオン強度を有するタンパク質水溶液を与える請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記濃縮ステップが、少なくとも約２００ｇ／Ｌのタンパク質含量を有する濃縮タンパク質溶液を製造するため限外濾過により実施される請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記濃縮ステップが、少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質含量を有する濃縮タンパク質溶液を製造するために行なわれる請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記濃縮タンパク質溶液が、濃縮タンパク質溶液の粘度を下げるために、少なくとも約２０℃、しかしそれより高いと濃縮タンパク質溶液の温度がミセルの形成を不可能にする温度を超えない温度に加熱される請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記濃縮したタンパク質溶液が、約２５℃から約４０℃の温度に加熱される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記濃縮したタンパク質溶液が、所望の希釈度を達成するために必要な体積を有する水中に、濃縮したタンパク質溶液を加えることによって約１５倍以下に希釈される請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
前記水が、約１０℃未満の温度を有する請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記濃縮したタンパク質溶液が、約１０倍以下に希釈される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記濃縮したタンパク質溶液が、前記冷水と連続的に混合されて濃縮したタンパク質溶液が約１５倍以下に希釈される請求項３に記載の方法。
【請求項３３】
前記冷水が、約１０℃未満の温度を有する請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記希釈が、約１０倍以下である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
回収したタンパク質ミセル塊がタンパク質粉末に乾燥される請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記回収したタンパク質ミセル塊が、少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記油料種子粕が、カノーラ種子粕であり、そこからのタンパク質ミセル塊の回収に続いて、上澄みを、バッチ式、半連続式または連続式で処理し、そこからさらなる量のタンパク質単離物を回収する請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
上澄みを約１００から約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００から約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮し、濃縮した上澄みを乾燥することによって、前記さらなる量のタンパク質単離物を上澄みから回収する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上澄みを約１００から約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００から約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮し、濃縮した上澄みを回収したタンパク質ミセル塊と混合し、その混合物を乾燥することによって、前記さらなる量のタンパク質単離物が上澄みから回収される請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
上澄みを約１００から約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００から約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮し、濃縮した上澄みの一部を少なくとも一部の回収したタンパク質ミセル塊と混合し、得られた混合物を乾燥することによって、前記さらなる量のタンパク質単離物が上澄みから回収される請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
濃縮した上澄みの残りを乾燥し、回収したタンパク質ミセル塊の任意の残分を乾燥する請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記希釈、沈降および回収のステップの別法として、濃縮したタンパク質溶液を、その食塩含量を減少させ、かつタンパク質ミセルを形成させるために透析し、乾燥重量基準で少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有する透析して濃縮したタンパク質溶液からタンパク質単離物を回収する請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質単離物の回収が、透析して濃縮したタンパク質溶液を乾燥することにより実施される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記油料種子粕がカノーラ油料種子粕である請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
カノーラ油料種子粕が、低温で圧砕したカノーラ油料種子粕である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
カノーラ油料種子粕が、遺伝子組み換えではないカノーラ油料種子に由来する請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
油料種子粕が、菜種粕である請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記油料種子粕が、カラシ種子粕である請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記溶媒除去ステップが約１５℃から約２５℃の温度における空気溶媒除去法により実施される請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記溶媒除去ステップが真空下で実施される請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、油料種子タンパク質、特にカノーラ油料種子タンパク質からのタンパク質の回収に関する。
【０００２】
本出願は、２００２年６月２１日に出願した米国特許仮出願第６０／３９０，１２６号および２００２年８月８日に出願した第６０／４０１，７８２号から、３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）のもとでの優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
カノーラ油料種子は、そこからのカノーラ油の回収のために広範な処理が行われている。カノーラ油料種子を圧砕して殆どの油を除去し、残った粕（ミール）は、残りの油を回収するために、一般的にはヘキサンを使用して高温の溶媒抽出をする。その溶媒抽出からの残渣粕は、残留ヘキサンを含有しており、通常は「白色フレーク」ミールとして、または一般的ではないが「マーク」ミールとして知られている。その溶媒は、その油料種子粕が圧砕機によって処理される前に再使用のためにその粕から回収される。その溶媒回収処理の中でその油料種子粕は、多くの場合「トースティング」と呼ばれる処理の中で約１２０℃から１４０℃の高温に加熱される。その結果得られた粕を「トースト済み粕（ｔｏａｓｔｅｄ  ｍｅａｌ）」または「高温生成粕（ｈｉｇｈ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｍｅａｌ）」と称する。
【０００４】
圧砕機によって処理されて残った油料種子粕は、かなりの量のタンパク質を含有しており、しばしば動物の飼料として採用される。その残った油料種子粕からカノーラタンパク質の単離物の形態のカノーラタンパク質を回収する先行の処方が存在している。
【０００５】
本特許の譲受人に譲渡され、参照によりその開示が本明細書に組み込まれている米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号（「Ｍｕｒｒａｙ  ＩＩ」）には、かなりの脂肪分を有する油料種子粕であって、同様の脂肪分を有するカノーラ油料種子粕を含むものから、タンパク質単離物を単離する方法が記載されている。この方法で必要となるステップとしては、油料種子粕からのタンパク性物質を可溶化し、さらにその粕中の脂肪も可溶化するステップと、その結果得られたタンパク質の水溶液から脂肪を除去するステップとを含む。そのタンパク質の水溶液は、脂肪除去ステップの前または後に、残った油料種子粕から分離することができる。脱脂したタンパク質溶液は、次に、イオン強度を実質的に一定に維持しながら、濃縮してタンパク質濃度を増し、その後その濃縮されたタンパク質溶液は、さらなる脂肪除去のステップにかけることができる。その濃縮したタンパク質溶液は、続いてミセルの形をした分離したタンパク質の液滴としての高度に凝集したタンパク質分子の雲のような物体を形成させるために希釈する。そのタンパク質ミセルを、沈降するままにして、凝集させて、合体し、高密度で無定形の粘稠なグルテン様の、「タンパク質ミセル塊（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｅｌｌａｒ  ｍａｓｓ）」またはＰＭＭと呼ばれるタンパク質単離物の塊を形成し、それを残った水相から分離して乾燥させる。
【０００６】
そのタンパク質単離物は、少なくとも約９０重量％のタンパク質含量（Ｋｊｅｌｄａｈｌ法または同等の方法でＮ×６．２５により測定して）を有しており、実質的に無変性であり（示差走査熱量測定法により測定して）、そして低い脂肪分の残りを有する。本明細書で使用する「タンパク質含量」という用語は、乾燥重量を基準として示すタンパク質単離物中のたんぱく質の量を指す。この方法を使用して得たタンパク質単離物の収率は、乾燥タンパク質単離物として回収される油料種子粕から抽出されるタンパク質の割合に関しては、一般に４０重量％未満であり、典型的にはおよそ２０重量％である。
【０００７】
上記の特許に記載されている方法は、その開示が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，２０８，３２３号（Ｍｕｒｒａｙ  ＩＢ）に記載されている油料種子を含むさまざまなタンパク源材料からタンパク質単離物を形成するための方法に対して修正およびそれについて改良するものとして開発された。米国特許第４，２０８，３２３号が発行されたときの１９８０年に入手可能であった油料種子粕は、Ｍｕｒｒａｙ  ＩＩの特許の時のカノーラ油料種子粕の脂肪汚染の水準は有しておらず、結果として、米国特許第４，２０８，３２３号の方法は、Ｍｕｒｒａｙ  ＩＩの方法によって処理したかかる油料種子粕からは９０重量％より多いタンパク質含量を有するタンパク質物質を製造することができない。米国特許第４，２０８，３２３号には、出発材料として菜種（カノーラ）の粕を使用して実施した具体的な記載は何もない。
【０００８】
米国特許第４，２０８，３２３号それ自身は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，１６９，０９０号および第４，２８５，８６２号（Ｍｕｒｒａｙ  ＩＡ）に記載されている方法を、ＰＭＭを形成するための希釈の前に濃縮のステップを導入することによって改良するために企画された。その濃縮のステップは、Ｍｕｒｒａｙ  ＩＡ法に対しておよそ２０％からのタンパク質単離物の収率の向上に寄与した。
【０００９】
すべて本特許の譲受人に譲渡され、参照によりその開示が本明細書に組み込まれている同時係属の、２００１年５月４日に出願された米国特許出願第６０／２８８，４１５号、２００１年１０月５日に出願された同第６０／３２６，９８７号、２００１年１１月７日に出願された同第６０／３３１，０６６号、２００１年１１月２６日に出願された同第６０／３３３，４９４号、２００２年４月２４日に出願された同第６０／３７４，８０１号、および２００２年５月３日に出願された米国特許出願第１０／１３７，３９１号（国際公開第０２／０８９５９７号）には、少なくとも約１００重量％のタンパク質（Ｎ×６．２５）を含有する高純度のタンパク質単離物を製造する方法が記載されている。上記の米国特許出願においては、タンパク質単離物は、油料種子粕を食品用の塩溶液で抽出し、得られたタンパク質溶液を、必要な場合は最初に色素吸着剤で処理した後、少なくとも約２００ｇ／Ｌのタンパク質含量まで濃縮し、そしてその濃縮したタンパク質溶液を冷水中に希釈してタンパク質ミセルを形成し、それを沈降するままにして、凝集、合体させ、高密度で無定形の、粘稠なグルテン様の「タンパク質ミセル塊（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｅｌｌａｒ  ｍａｓｓ）」またはＰＭＭと呼ばれるタンパク質単離物の塊を形成し、それを残った水相から分離し、そのまままたは乾燥させて使用する。
【００１０】
上で記載し、そして特に米国特許出願第６０／３２６，９８７号、第６０／３３１，０６６号、第６０／３３３，４９４号、第６０／３７４，８０１号および第１０／１３７，３９１号に記載されている方法の１実施形態においては、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄みは、湿体のＰＰＭおよび上澄みから乾燥したタンパク質を含むタンパク質単離物を回収するための処理をする。この方法は、最初に上澄みを限外濾過膜を用いて濃縮し、その濃縮した上澄みを湿体のＰＭＭと混合し、その混合物を乾燥することにより実施することができる。得られるカノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）の高純度のタンパク質を有する。
【００１１】
上で記載し、そしてことさら特に出願第６０／３３１，０６６号、第６０／３３３，４９４号、第６０／３７４，８０１号および第１０／１３７，３９１号に記載されている方法の他の実施形態においては、ＰＭＭ沈降ステップからの上澄みは、その上澄みからタンパク質を回収するための処理をする。この方法は、最初に上澄みを、限外濾過膜を用いて濃縮し、その濃縮物を乾燥することにより実施することができる。得られるカノーラタンパク質単離物は、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）の高純度のタンパク質を有する。
【００１２】
上記の米国特許出願に記載されている方法は、基本的にバッチ式方法である。本特許の譲受人に譲渡され、参照によりその開示が本明細書に組み込まれている同時係属の、２００１年１１月２０日に出願された米国特許出願第６０／３３１，６４６号、２００２年５月３０日に出願された同第６０／３８３，８０９号、および２００２年１１月１９日に出願された同第１０／２９８，６７８号に、カノーラタンパク質単離物を製造する連続法が記載されている。それによれば、カノーラ油料種子粕は、塩溶液と連続的に混合され、その混合物は、パイプを通して搬送し、その間にカノーラ油料種子粕からタンパク質を抽出してタンパク質の水溶液を形成し、そのタンパク質の水溶液は残渣のカノーラ油料種子粕から連続的に分離され、そのタンパク質の水溶液は連続的に搬送されて選択性膜操作を経て、その間実質的に一定のイオン強度を維持しているタンパク質の水溶液のタンパク質含量を少なくとも約２００ｇ／Ｌまで増加し、得られたその濃縮タンパク質溶液を冷水と連続的に混合してタンパク質ミセルの形成を引き起こし、そのタンパク質ミセルを連続的に沈降させ、その間上澄みは、所定量のＰＭＭが沈降槽に堆積するまでオーバーフローさせる。そのＰＭＭは沈降槽から取り出して乾燥させることができる。そのＰＭＭは、少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは約１００重量％のタンパク質含量を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記の先行する米国特許出願に記載されている実験は、従来の溶媒除去装置のトースティング操作で溶媒除去した市販の油料種子粕について行う。油料種子タンパク質単離物生産用の油料種子粕としての上記の材料の使用は、おそらくは高温の溶媒除去操作によるタンパク質の変性のために、抽出の結果が油料種子中に存在するタンパク質の約３０重量％未満となる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
驚いたことに、カノーラ油料種子タンパク質粕から抽出することができるタンパク質の量は、抽出を周囲温度で溶媒除去した粕について実施する場合には著しく増加することができることが今や見出された。粕からより多くのタンパク質を抽出する能力は、その方法の全体としての経済性を改良する。加えて、品質が改良された製品が得られる。
【００１５】
本発明の１態様によれば、タンパク質単離物を調製する方法が提供され、その方法は、（ａ）油料種子を圧砕してそこから油および油料種子粕を形成し、（ｂ）油料種子粕を溶媒抽出してそこから残留油を回収し、（ｃ）抽出した油料種子粕から約５０℃未満の温度で溶媒を除去して溶媒除去油料種子粕を得、（ｄ）溶媒除去油料種子粕を抽出して溶媒除去油料種子粕中のタンパク質の可溶化を引き起こし、約５から約６．８のｐＨを有するタンパク質水溶液を形成し、（ｅ）タンパク質水溶液を残渣油料種子粕から分離し、（ｆ）選択性膜技術を使用してイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液のタンパク質濃度を増加させて濃縮タンパク質溶液を得、（ｇ）濃縮タンパク質溶液を約１５℃未満の温度を有する冷水中に希釈して、水相に少なくとも一部がミセルの形態をしたばらばらのタンパク質粒子を形成させ、（ｈ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形、粘着性、ゼラチン状、グルテン様のタンパク質ミセル塊を形成し、および（ｉ）タンパク質ミセル塊が、乾燥重量基準で少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質ミセル塊を上澄みから回収することを含む。
【００１６】
本発明は、約５０℃より低い穏やかな温度、好ましくは約１５℃から約３０℃で溶媒除去した白色フレークミールまたはマークミールを使用する。溶媒除去は、ミールを空気乾燥するかまたは真空ストリッピングすることによって実施する。
【００１７】
タンパク質は、上記の米国特許出願に一般的に記載されている、バッチ処理、半バッチ処理または連続処理のいずれかにより周囲温度で溶媒除去したミールから抽出および回収することができる。
【００１８】
本明細書の方法によって製造されたタンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、油の乳化、焼いた食品のボディー形成および気体を閉じ込める製品の起泡剤等、タンパク質単離物の通常の用途に使用することができる。加えて、タンパク質単離物は、肉の類似食品に有用なタンパク質繊維を形成することができ、卵白をつなぎとして使用する食品における卵白の代用または増量剤として使用することができる。カノーラタンパク質単離物は、栄養補助食品として使用することができる。カノーラタンパク質単離物には、他に、ペットフード、動物の飼料、工業用途および化粧品用途、パーソナルケア製品等の用途がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の方法は、油料種子、特にカノーラ油料種子で始めるが、その方法は、大豆、従来の菜種、従来の亜麻、リノラ（ｌｉｎｏｌａ）、ヒマワリおよびカラシナの油料種子粕等の他の油料種子にも適用できる。本発明を、本明細書ではカノーラ油料種子粕についてより詳しく説明している。
【００２０】
油料種子は、そこから油を回収するために洗浄する。油の分離に続いて、残った粕は通常はヘキサンを使用して溶媒抽出して残留量の油をその粕から回収する。その残留粕は、本発明により、約５０℃より低い温度、好ましくは約１５℃から約３０℃で溶媒除去をする。この方法で溶媒除去を実施することにより粕から抽出することができるタンパク質の量が著しく増加することが見出された。
【００２１】
このように処理される油料種子粕は、Ｍｕｒｒａｙ  ＩまたはＩＩの特許に記載されているように処理をして、油料種子粕からタンパク質単離物を回収することができ、その詳細はその中に記載されている。好ましくは、上記の同時継続の米国特許出願第６０／２８８，４１５号、第６０／３２６，９８７号、第６０／３３１，０６６号、第６０／３３３，４９４号、第６０／３７２，１６５号、第６０／３７４，８０１号および第１０／１３７，３９１号（国際公開第０２／０８９５６７号）に記載されている手法が採用されるが、それは、それにより、タンパク質単離物として回収される油料種子粕から抽出されるタンパク質の割合に関して、乾燥したタンパク質単離物の改良された収率が得られ、Ｋｊｅｌｄａｈｌ法により、窒素（Ｎ）パーセントに６．２５の係数を掛けることにより測定して、通常約１００重量％が得られるためである。別法では、の米国出願第６０／３３１，６４６号、第６０／３８３，８０９号および第１０／２９８，６７８号に記載されている連続法を採用することができる。カノーラタンパク質の単離に応用されるこれらの好ましい手順の詳細を以下で説明する。
【００２２】
油料種子を処理してそこから油を回収するのは、タンパク質単離物を油料種子粕から回収するのとは異なる施設で実施することができることは理解されよう。別法では、その操作は、単一の施設で組み合わせることができる。
【００２３】
カノーラタンパク質単離物を分離する方法の最初のステップとしては、カノーラ油料種子粕からタンパク質物質を可溶化するステップを含む。カノーラ種子粕から回収されるタンパク質材料は、カノーラ種子もしくはその他の油料種子中に天然に存在するタンパク質であるか、またはそのタンパク質材料は、遺伝子操作によって改質されているが、天然のタンパク質の特徴的な疎水性および極性の特性を所有するタンパク質であり得る。カノーラ油料種子は、菜種または油料種子菜種としても知られている。
【００２４】
タンパク質の可溶化は、塩の存在が、可溶性タンパク質の油料種子粕からの移動を促進するので、食品用塩溶液を使用することにより実施する。カノーラタンパク質単離物が、非食品用途を意図される場合は、非食品用の化学物質を採用してもよい。食品用の塩は、普通塩化ナトリウムであるが、他の塩、例えば塩化カリウムを使用することもできる。その食品用塩溶液は、有意量のタンパク質の可溶化の達成を可能にするために、少なくとも０．１０、好ましくは少なくとも０．１５のイオン強度を有する。塩水のイオン強度が増すと、油料種子粕中のタンパク質の可溶化の度合いは、最大値が得られるまで最初は増大する。その後はイオン強度を増加しても、全体の可溶化したタンパク質は増加しない。最大のタンパク質の可溶化を引き起こす食品用塩水のイオン強度は、関係した塩および選択した油料種子粕に依存する。
【００２５】
イオン強度が増すのに伴ってタンパク質の沈澱に対して大きな希釈の度合いが必要となるという観点で、通常は、約０．８未満、より好ましくは約０．１５から約０．６の値のイオン強度値を利用するのが好ましい。
【００２６】
バッチ処理においては、タンパク質の塩可溶化は、少なくとも５℃、好ましくは約３５℃までの温度で、好ましくは可溶化時間を短縮するために攪拌を伴わせ、通常は、約１０分から約６０分で実施する。その可溶化は、全般的な高い製品収量を提供するために、油料種子粕から実質的に最大量のタンパク質を抽出するように実施するのが好ましい。
【００２７】
約５℃の低温限界は、可溶化がこの温度より低いと非実際的に遅いためであり、一方高い方の好ましい温度限界の約３５℃が選択されるのは、バッチモードにおいてそれより高い温度水準ではその方法が非経済的になるためである。
【００２８】
連続処理においては、カノーラ油料種子粕からのタンパク質の抽出は、カノーラ油料種子粕からのタンパク質の連続抽出の実施と調和するどんな方法ででも実施される。１実施形態において、カノーラ油料種子粕は、塩溶液と連続的に混合され、その混合物は、本明細書に記載されているパラメータに合致するのに必要な抽出を達成するのに十分な滞留時間のための長さを有するパイプまたは溝をその流速で通って搬送される。上記の連続的方法においては、塩可溶化ステップは、約１０分までの時間内に好ましくはカノーラ油料種子粕から最大量のタンパク質を実質的に抽出する可溶化を達成するように、迅速に実施する。連続的方法における可溶化は、好ましくは約３５℃より上、一般に約６５℃およびそれ以上までの高温で好ましくは実施する。
【００２９】
食品用塩水およびカノーラ油料種子粕は、タンパク質単離物が、以下でより詳細に説明するようにミセルの経路により形成することを可能にするために、約５から約６．８の自然のｐＨを有する。
【００３０】
そのｐＨ範囲の限界のところおよびその付近においては、タンパク質単離物のミセルの経路による形成は部分的に起こるのみで、そのｐＨ範囲の他のところで得られるより収率が低い。その理由により、約５．３から約６．２のｐＨ値が好ましい。
【００３１】
食品用塩水のｐＨは、任意の便利な食品用酸、普通は塩酸、または食品用アルカリ、普通は水酸化ナトリウムを、必要なだけ使用することにより、抽出ステップ用の、約５から約６．８の範囲内の任意の望ましい値に調節することができる。カノーラタンパク質単離物が、非食品用途を意図するものである場合は、非食品用化学品を使用してもよい。
【００３２】
可溶化ステップの間の食品用塩水中の油料種子粕の濃度は、幅広く変化し得る。典型的な濃度の値は、約５から約１５％ｗ／ｖである。
【００３３】
塩水溶液によるタンパク質の抽出ステップは、カノーラ粕中に存在する可能性のある脂肪を可溶化するさらなる効果を有しており、そのときは水相中に脂肪が存在する結果となる。
【００３４】
抽出ステップの結果得られるタンパク質溶液は、一般に約５から約４０ｇ／Ｌ、好ましくは、約１０から約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３５】
抽出ステップの結果得られる水相は、次に、真空濾過、続いて遠心分離および／または残渣粕を除去する濾過等、任意の適当なやり方を採用することにより残渣カノーラ粕から分離することができる。分離した残渣粕は、廃棄のために乾燥する。
【００３６】
最終的なタンパク質単離物の色は、薄くて強度の低い黄色い色を得るために、粉末の活性炭またはその他の色素吸着剤を分離したタンパク質水溶液と混合し、続いてその吸着体を都合よく濾過により除去してタンパク質溶液を得ることにより改良することができる。濃縮前または後の分離したタンパク質水溶液の膜分離精製も、以下で説明するように、色素除去のために使用することができる。
【００３７】
上記の色素除去のステップは、任意の都合のよい条件下、一般的には分離したタンパク質水溶液の周囲温度において、適当な色素吸着剤を採用して実施することができる。粉末活性炭に対しては、約０．０２５％から約５％ｗ／ｖ、好ましくは約０．０５％から約２％ｗ／ｖを採用する。
【００３８】
カノーラ種子粕がかなりの量の脂肪を含有している場合は、上記の米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載されているように、そのときはそこに記載されている脱脂肪のステップを、分離したタンパク質水溶液および以下で述べる濃縮したタンパク質水溶液について実施することができる。色改良のステップを行うときは、そのステップは最初の脱脂肪のステップの後で実施する。
【００３９】
食品用塩水を用いて油料種子粕を抽出する別法として、水単独の使用は、食品用塩水より油料種子粕から抽出するタンパク質は少ない傾向があるけれども、上記抽出を、水単独を使用して行うことができる。上記の別法を採用する場合は、下記の濃縮のステップの間溶液のタンパク質を維持するために、上で述べた食品用の塩を、残留油料種子粕から分離した後のタンパク質溶液中に加えることができる。色除去のステップおよび／または最初の脂肪除去のステップを行う場合は、その食品用塩は、上記操作の完了後に加える。
【００４０】
他の別の方法は、油料種子粕を約６．８より高く、一般に約９．８までの比較的高いｐＨ値において食品用塩水により抽出するものである。食品用塩水のそのｐＨは、水酸化ナトリウム水溶液等、任意の適当な食品用アルカリの使用によってアルカリ側のｐＨ値に調節することができる。上記の別法を採用する場合、油料種子粕抽出のステップから得られる水相は、次いで残渣カノーラ粕から、真空濾過、続いて遠心分離および／または残渣粕を除去する濾過等、任意の適当なやり方を採用することにより残渣カノーラ粕から分離する。分離した残渣粕は、廃棄のために乾燥する。
【００４１】
高ｐＨ抽出のステップから得られるタンパク質水溶液は、次に、下記のさらなる処理に先立って、上記のように、約５から６．８、好ましくは約５．３から約６．２のｐＨの範囲にｐＨ調整する。上記のｐＨ調整は、塩酸等の任意の適当な食品用酸を使用して実施することができる。
【００４２】
そのタンパク質水溶液は、次に、そのタンパク質濃度を増すためにそのイオン強度をその間実質的に一定に維持しながら濃縮する。上記の濃縮は、一般に、少なくとも約２００ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する濃縮タンパク質溶液を提供するために実施する。
【００４３】
その濃縮のステップは、異なる膜材料および構造を考慮し、そして連続操作に対してはタンパク質水溶液が膜を通過するのに望ましい程度の濃度を可能にする大きさにした、約３０００から約５０，０００ダルトンといった適当な分子量カットオフの中空繊維膜またはスパイラル膜を用いる限外濾過または膜分離精製等、任意の適当な選択性膜技術を採用することによる等のバッチ操作または連続操作と合致する任意の適当なやり方で実施することができる。
【００４４】
その濃縮のステップは、一般に約２０℃から６０℃の任意の適当な温度で、望ましい程度の濃度が達成されるまでの時間実施することができる。使用する温度および他の条件は、ある程度、濃縮および溶液の所望のタンパク質濃度を達成するために使用する膜装置に依存する。
【００４５】
このステップにおいて約２００ｇ／Ｌより上の濃度までタンパク質溶液を濃縮することによって、乾燥したタンパク質単離物として回収される抽出タンパク質の割合に関して、約４０％を超え、好ましくは約８０％を超える水準まで歩留まりが向上するばかりでなく、乾燥後の最終的なタンパク質単離物の塩濃度も減少する。単離物の塩濃度を制御できることは、塩濃度の変動が特定の食品用途において機能および味覚特性に影響する場合の単離物の用途では重要である。
【００４６】
よく知られているように、限外濾過および類似の選択性膜技術は、低分子量の種類がそこを通過することを可能とし、高分子量の種類がそうすることを防ぐ。その低分子量の種類としては、食品用塩のイオン種ばかりでなく、原料物質から抽出された炭水化物、色素および栄養阻害因子、ならびに低分子量の形のタンパク質が含まれる。膜の分子量カットオフは、通常は、異なる膜材料および構造を考慮して汚染物質が通過するのを可能にしながら、溶液中のかなりの割合のタンパク質の保持を確保するように選択する。
【００４７】
濃縮のステップにおいて採用する温度に依存して、その濃縮されたタンパク質溶液は、少なくとも約２０℃、そして約６０℃まで、好ましくは約２５℃から約４０℃に温めて、その後の希釈のステップおよびミセル形成の遂行を容易にするために濃縮したタンパク質溶液の粘度を低下させる。その濃縮したタンパク質溶液は、その濃縮したタンパク質溶液の温度が冷水による希釈に際してそれより上ではミセルを生じさせない温度を超えて加熱してはならない。その濃縮したタンパク質溶液は、必要な場合、上記の米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号に記載されているように、さらなる脱脂肪の操作にかけることができる。
【００４８】
濃縮のステップおよび場合による脱脂肪のステップから得られた濃縮したタンパク質溶液は、次に、その濃縮したタンパク質溶液を、必要な希釈の度合いを達成するために必要な容量を有する冷水と混合することにより希釈して、ミセルの形成を果たす。ミセルの経路により得ることが望ましいカノーラタンパク質の割合および上澄みからの割合によって、濃縮したタンパク質溶液の希釈の度合いは変化し得る。希釈のレベルが高いと、一般に、大きい割合のカノーラタンパク質が、水相に残存する。
【００４９】
ミセルの経路によってタンパク質の最高の割合を提供することが望ましいときは、濃縮したタンパク質溶液は、約１５倍以下、好ましくは約１０倍以下で希釈する。
【００５０】
濃縮したタンパク質溶液と混合する冷水は、約１５℃未満、一般に約３℃から約１５℃、好ましくは１０℃未満の温度を有するが、それは、使用する希釈係数においてこれらの低温によってタンパク質ミセル体塊の形のタンパク質単離物の改良された収率が得られるためである。
【００５１】
バッチ操作においては、濃縮したタンパク質溶液を、上で述べた必要量を有する冷水の静置した本体に加える。濃縮したタンパク質溶液の希釈およびその結果起こるイオン強度の低下が、ミセルの形をして分離しているタンパク質の液滴の形のタンパク質分子が高度に集合した雲のような塊を形成させる。バッチ式処方においては、タンパク質ミセルは、冷水中に沈降するままにし、凝集して、合体し、高密度で無定形の、粘稠なグルテン様のタンパク質ミセル塊ＰＭＭを生じるようにさせる。その沈降は、遠心分離等により補助することができる。上記の誘導された沈降は、タンパク質ミセル塊の液体含量を減少し、それにより、全体のミセル塊の一般に約７０重量％乃至約９５重量％から、一般に約５０重量％ないし約８０重量％の値に水分含量を減少する。このようなミセル塊の水分含量の減少により、ミセル塊の吸蔵されている塩含量も減少し、したがって、乾燥した単離物の塩含量も減少する。
【００５２】
別法では、希釈操作は、濃縮したタンパク質溶液をＴ型パイプの１つの入り口に連続的に通し、一方希釈水をＴ型パイプの他の入り口に供給してパイプ内で混合できるようにすることにより連続的に行うことができる。その希釈水は、希釈の望ましい度合いの達成を満たす比率でＴ型パイプに供給する。
【００５３】
濃縮したタンパク質溶液と希釈水のパイプ中の混合により、タンパク質ミセルの形成が起こり、その混合物は、Ｔ型パイプからの出口から沈降槽に供給され、一杯になったときそこから上澄みをオーバーフローさせる。混合物は、好ましくは液体本体内の乱れを最小限にするように沈降槽内の液体本体中に供給する。
【００５４】
連続処理においては、タンパク質ミセルを沈降槽内で沈降させておき、凝集し、合体した、高密度、無定形、粘着性、グルテン様のタンパク質ミセル塊（ＰＭＭ）を生じさせ、その処理を、目的とする量のＰＭＭが沈降槽の底に堆積するまで続け、その後に堆積したＰＭＭを沈降槽から取り出す。
【００５５】
タンパク質溶液の、少なくとも約２００ｇ／Ｌのタンパク質含量への濃縮のプロセスパラメータと約１５未満の希釈係数の使用の組合せにより、前述の米国特許出願に述べられている既知の従来技術によるタンパク質単離物を形成する手順のいずれを使用して達成されるよりも、最初の粕抽出物からのタンパク質ミセル塊の形のたんぱく質の回収に関して、高い収率、それもしばしば著しく高い収率と、タンパク質の内容に関して、はるかに純粋な単離物がもたらされる。
【００５６】
沈降した単離物は、残留水相の沈降した塊からのデカンテーションまたは遠心分離等の方法により、残留水相または上澄みから分離する。そのＰＭＭは、湿った形で使用してもよいし、あるいは、噴霧乾燥、冷凍乾燥または真空ドラム乾燥等の従来のいずれかの技術によって乾燥形態まで乾燥することができる。乾燥ＰＭＭは、タンパク質が約９０重量％を上回り、好ましくはタンパク質が少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有しており、実質的に変性されていない（示差走査熱量測定法により測定して）。脂肪油種子粕から単離された乾燥ＰＭＭは、また、前述の米国特許第５，８４４，０８６号および第６，００５，０７６号の手順を採用した場合に低い残留脂肪含量を有しており、それは、約１重量％未満であり得る。
【００５７】
ＰＭＭの形成および沈降のステップに由来する上澄みは、希釈のステップで沈澱しなかったかなりの量のたんぱく質を含有しており、そこからカノーラタンパク質単離物を回収するために処理をする。希釈のステップによる上澄みは、ＰＭＭの除去に続いて、そのタンパク質濃度を増すために濃縮する。上記の濃縮は、カノーラタンパク質は溶液中に保持しながら、食品用塩およびその他のタンパク質原料から抽出された非タンパク質の低分子量物質を含む低分子量の種類が膜を通過することを許容する適当な分子量カットオフの膜を使用する限外濾過等の選択性膜技術を使用して実施する。異なる膜材料および構造を考慮して、約３０００から約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を使用することができる。この方法による上澄みの濃縮は、また、タンパク質を回収するために乾燥する必要のある液体量を減少することもできる。その上澄みは、一般に、乾燥の前に、約１００から約４００ｇ／Ｌ、好ましくは約２００から約３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する。上記の濃縮操作は、タンパク質溶液の濃縮のステップに対して上で記載したように、バッチモードまたは連続操作で行うことができる。
【００５８】
その濃縮した上澄みは、噴霧乾燥、冷凍乾燥または真空ドラム乾燥等の従来のいずれかの技術によって乾燥形態まで乾燥し、さらなるカノーラタンパク質単離物を提供することができる。上記のさらなるカノーラタンパク質単離物は、タンパク質が約９０重量％を上回り、好ましくはタンパク質が少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有しており、実質的に変性されていない（示差走査熱量測定法により測定して）。
【００５９】
必要な場合は、湿体のＰＭＭの少なくとも一部を濃縮した上澄みの少なくとも一部と混合し、その後その混合したタンパク質の流れを任意の適当な技術により乾燥させて、１発明による組み合わされたカノーラタンパク質組成物を提供することができる。互いに混合するタンパク質材料の相対的比率は、望ましいプロフィールの２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓのタンパク質を有するカノーラタンパク質単離物組成物を提供するように選択することができる。別法では、混合物に任意の望ましい特定の２Ｓ／７Ｓ／１２Ｓのタンパク質プロフィールを提供するために乾燥したタンパク質単離物を任意の望ましい比率で組み合わせることができる。その組み合わせたカノーラタンパク質単離物組成物は、タンパク質が約９０重量％を上回り、好ましくはタンパク質が少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５として計算）の高いタンパク質含量を有しており、実質的に変性されていない（示差走査熱量測定法により測定して）。
【００６０】
他の別の手順において、濃縮した上澄みの一部のみをＰＭＭの一部のみと混合して得られた混合物を乾燥する場合は、濃縮した上澄みの残りを、ＰＭＭの残りと同様に、乾燥することができる。さらに、乾燥したＰＭＭと乾燥した上澄みは、また、上で述べたように任意の望ましい相対的比率で乾式混合することもできる。
【００６１】
このやり方で操作することにより、乾燥したＰＭＭ、乾燥した上澄みおよび一般に重量で約５：９５から約９５：５までのさまざまな重量比の乾燥したＰＭＭおよび上澄みの混合物の形で多数のカノーラタンパク質単離物を回収することができ、それは、異なる機能および栄養の特性を得るために望ましい。
【００６２】
上記のように、濃縮したタンパク質溶液を冷水中に希釈し、得られた沈澱および上澄みを処理する別法として、濃縮したタンパク質溶液を透析してそれの塩含量を減少することによって、タンパク質を濃縮したタンパク質溶液から回収することができる。濃縮したタンパク質溶液の塩含量の減少によって、透析管内にたんぱく質ミセルの形成が生じる。透析に続いて、そのタンパク質ミセルは、上で述べたように、沈降、収集および乾燥することができる。タンパク質ミセルの沈降のステップによる上澄みは、上述のように処理することが可能で、そこからさらなるタンパク質を回収することができる。別法では、透析管の内容物を、直接乾燥することができる。後者の別法の手順は、実験室規模の少量のタンパク質が必要な場合に役立つ。
【実施例】
【００６３】
実施例１
この実施例は、本発明の方法を説明する。
【００６４】
周囲温度（２０℃）で空気溶媒除去したカノーラ油料種子粕の７５ｇのサンプルを、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液の５００ｍｌのサンプル中に周囲温度すなわち室温（ＲＴ）、５５℃、６０℃および６５℃で加え、溶液の温度を実質的に一定に維持しながら３０分間攪拌し、タンパク質水溶液を用意した。分析用として５、１０、１５、２０および３０分毎にタンパク質水溶液のサンプルを採取した。使用済み粕は、１０，０００×ｇで遠心分離に５分間かけて分離し、冷凍乾燥した。
【００６５】
この実験で得られたさまざまなタンパク質水溶液のタンパク質濃度を測定し、その結果は、次の表Ｉに現わす。
【００６６】
【表１】
2005530854.tif 000002
【００６７】
このデータから分かるように、高温における抽出は室温におけるよりも早く進行する。最大タンパク質濃度に関する抽出は高温においては５分以内に平衡に到達したが、室温における抽出は普通で１０分かかった。抽出温度が室温から６０℃上がると、抽出物のタンパク質濃度は、１０％を超えて増加するが、さらに温度を上げるとわずかに減少した抽出率となった。
【００６８】
表１に示したタンパク質濃度のデータに基づいてタンパク質抽出率を計算し、その結果は、次の表２に現わす。
【００６９】
【表２】
2005530854.tif 000003
【００７０】
このデータから分かるように、カノーラ油料種子粕中のタンパク質の抽出率は試験したすべての温度で５０重量％を超え、市販のトースト済みカノーラ油料種子粕による最大の３０重量％を超えるかなりの改良が達成された。
【００７１】
実施例２
この実施例は、タンパク質抽出率に対するある一定のパラメータの効果を示す。
【００７２】
実験の最初の設定においては、（ａ）周囲温度（２０℃）で空気溶媒除去したカノーラ油料種子粕、または（ｂ）従来のトースティングにより溶媒除去した市販のカノーラ油料種子粕（トースト済み市販粕）の５０ｇのサンプルを、０．０５Ｍまたは０．１０ＭのＮａＣｌ溶液の５００ｍｌのサンプルに室温（２０℃）で加え、１５分間攪拌した。そのスラリーを５０００×ｇで１０分間遠心分離にかけて残渣粕を除去した。
【００７３】
実験の２番目の設定においては、塩を加えていない５００ｍｌの水を最初にホットプレートスターラ上で６０℃に加熱し、次いで、（ａ）周囲温度（２０℃）で空気溶媒除去したカノーラ油料種子粕（マーク粕）の５０ｇ、または（ｂ）従来のトースティングにより溶媒除去した市販のカノーラ油料種子粕（トースト済み市販粕）を加え、１５分間その温度を維持して攪拌した。抽出物を、５０００×ｇで１０分間の遠心分離により、残った粕から分離した。
【００７４】
この実験で得られたさまざまなタンパク質水溶液のタンパク質濃度が測定されて次の表５に現わす。
【００７５】
【表３】
2005530854.tif 000004
【００７６】
粕からのタンパク質抽出率を、表５のタンパク質濃度のデータから計算し、そのデータを表６に示す。
【００７７】
【表４】
2005530854.tif 000005
【００７８】
表６は、マーク粕の両方の塩濃度におけるタンパク質抽出率が、１５重量％の粕および０．１５Ｍの塩濃度の室温におけるものと同程度であることを示している（上の表２参照）。０．０５ＭのＮａＣｌにおけるマーク粕のタンパク質抽出率は、０．１０Ｍにおけるものと同程度であった。塩を加えていない場合は、そのタンパク質抽出率は、０．０５Ｍおよび０．１０Ｍの塩を室温で使用するものより高温においても大幅に低かった。しかしながら、すべての場合で、タンパク質抽出率およびタンパク質濃度は、トースト済み市販粕で得られるより著しく高かった。
【００７９】
３番目の設定の実験は、塩濃度が、０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍおよび０．０５Ｍである以外は上記の室温の実験と同様にして室温で実施した。各抽出物に対してタンパク質抽出率を測定し、その結果は次の表７に示す。
【００８０】
【表５】
2005530854.tif 000006
【００８１】
表７に示したデータから分かるように、０．０４Ｍと０．０５Ｍの塩濃度の間でタンパク質抽出率のかなりの低下が見られ、抽出物溶液中のタンパク質の良好な収率を得る最低の塩濃度が、０．０５Ｍであることを示している。
【００８２】
直径５ミクロン、穴の大きさが２９０オングストロームの親水性結合シリカの硬い支持媒体を含有し、５，０００から７００，０００ダルトンまでの大きさの球状タンパク質を分離することができる３０ｃｍのＢｉｏＳｅｐ  Ｓ３０００サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムを用いるＶａｒｉａｎの高速液体クロマトグラフィーカラム（ＨＰＬＣ）をタンパク質源の一連の標準を用いて作動させ、Ａ２８０ｎｍのところで、１．０ｍｌ／分の溶出の流速で測定した各成分の滞留時間（ＲＴ）を測定した。ＢｉｏＲａｄの標準タンパク質は、１，３５０ダルトンの低分子量マーカーとしてビタミンＢ１２が添加されており、１７，０００ダルトン（ミオグロブリン）から６７０，０００ダルトン（サイログロブリン）までの範囲をカバーする。各成分は、２８０ｎｍのところで、１．０ｍｌ／分の溶出の流速で測定する。ｐＨを調節し、抗菌剤としてアジ化ナトリウムを含有する食塩水をカラム溶媒として、および乾燥サンプルを溶解するために使用した。溶離液は、ラン当り２５から５０マイクロリットルのサンプルしか必要としないためＵＶ検知した後は廃棄した。ＨＰＬＣ  Ｐｒｏｓｔａｒシステムは、保持時間およびピーク面積を自動的に計算し、要点の報告をプリントアウトした。
【００８３】
本実施例に記載した用意した抽出物のサンプルを各カラムに流した。ピーク面積のカウントを各ピークの百分率に転化した。異なるランのすべてのピークを計算に取り込み次いで３つの主なタンパク質の画分、１２Ｓ、７Ｓ、および２Ｓを別々に再計算した。得られた結果を、図１から３のグラフデータに示す。
【００８４】
各クロマトグラムは、７Ｓカノーラタンパク質画分を表す明確なピークおよび１２Ｓカノーラタンパク質画分の小さな隆起を示した。２Ｓカノーラタンパク質画分のピークは、抽出物の他の成分のピークの中に存在した。クロマトグラムの低分子量側の末端のピークは適切に識別されなかったが、短鎖ペプチドおよび遊離のアミノ酸等の非タンパク質窒素化合物、ならびにフェノール化合物、グルコシノラートおよびフィタート等の他の粕成分に相当するようである。
【００８５】
実施例３
本実施例は、空気溶媒除去したカノーラ油料種子粕を用いるカノーラタンパク質単離物の調製についてさらに説明する。
【００８６】
２０℃で空気溶媒除去したマークカノーラミールの１６０ｋｇを、１６０２Ｌの０．１５ＭのＮａＣｌに１７．６℃で加え、３０分間攪拌して、２１．４ｇ／Ｌのタンパク質含量を有するタンパク質水溶液を用意した。その抽出時間の１５分後、０．０５重量％のアスコルビン酸を加えた。抽出した粕中のタンパク質の百分率は、５１．６％であった。
【００８７】
残ったカノーラ粕を取り出し、真空フィルターベルト上で洗浄した。得られたタンパク質溶液を遠心分離および濾過によって浄化し、１６．２ｇ／Ｌのタンパク質含量を有する浄化したタンパク質溶液の１２７０Ｌを生成した。
【００８８】
タンパク質抽出溶液の１２７０Ｌを、５０００ダルトンの分子量カットオフの膜を使用する限外濾過システムにかけて濃縮することにより７１Ｌまで量を減らした。そのタンパク質抽出溶液を、次に、５０００ダルトンの分子量カットオフ膜を使用し、０．０５重量％のアスコルビン酸を含有する０．１５Ｍの食塩水の５０００Ｌ（５保持液体積）による膜分離精製システムにかけて膜分離精製をし、タンパク質含量が２２６ｇ／Ｌの３１Ｌの最終容量にした。その保持液は、６０℃で１０分間の低温殺菌をした。
【００８９】
その濃縮し、膜分離精製した溶液を、それぞれ３０Ｌ，３０Ｌおよび８Ｌの３つのバッチに分割した。３０℃の最初のバッチを１：１５で４℃の４５０Ｌの濾過した水に希釈した。タンパク質ミセルの白雲がすぐに形成され、沈降するままにした。上側の希釈水は取り除いた。この手順を２番目および３番目のバッチについても繰り返した。沈澱した高粘度で粘着性の塊（ＰＭＭ）を容器の底から取り出した。乾燥したタンパク質は乾燥重量基準で１０２．４重量％のタンパク質含量（Ｎ×６．２５）を有することが分かった（窒素の百分率の値は、Ｌｅｃｏ  ＦＰ  ３２８窒素分析装置（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を使用して測定した）。その製品には、ＢＷ−ＡＡ０２０−Ｃ１７−０３Ａ−Ｃ３００の記号表示を与えた。
【００９０】
タンパク質ミセル形成による上澄みの９８８Ｌを、５０００ダルトンの分子量カットオフの膜を使用する限外濾過システムにかけて３８Ｌまで濃縮した。その濃縮した上澄みを、次に、５０００ダルトンの分子量カットオフ膜を使用し、１３０Ｌの水（４保持液体積）による膜分離精製システムにかけて膜分離精製をし、タンパク質含量が１９４ｇ／Ｌの３８Ｌの最終容量にした。
【００９１】
その濃縮し、膜分離精製した溶液を、ポンプ輸送できるコンシステンシーまで希釈し次いで噴霧乾燥した。その乾燥タンパク質は、乾燥重量基準で９７．６重量％のタンパク質含量（Ｎ×６．２５）を有することが分かった。その製品には、ＢＷ−ＡＡ０２０−Ｃ１７−０３Ａ−Ｃ２００の記号表示を与えた。
【００９２】
本開示を要約すれば、本発明は、周囲温度で溶媒除去した粕を使用することにより、その粕からの高度なタンパク質の抽出が提供されて、経済的な利点につながる油料種子粕から油料種子タンパク質単離物を製造する改良された方法を提供する。本発明の範囲内で修正は可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】空気溶媒除去したカノーラ油料種子粕の室温で、０．０５ＭのＮａＣｌを用いて得た抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図２】空気溶媒除去したカノーラ油料種子粕の、室温で０．１０ＭのＮａＣｌを用いて得た抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】空気溶媒除去したカノーラ油料種子粕の、６０℃で塩なしで得た抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１】
2005530854.tif 000007
【図２】
2005530854.tif 000008
【図３】
2005530854.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年2月15日(2005.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｉ）を特徴とするタンパク質単離物の製造方法；
（ａ）油料種子を粉砕して油と油料種子粕を生成させ、
（ｂ）その油料種子粕から溶媒抽出して残留油を回収し、
（ｃ）抽出した油料種子粕から脱溶媒された油料種子粕を与えるために５０℃未満の温度で溶媒を除去し、
（ｄ）前記脱溶媒された油料種子粕中のタンパク質の可溶化を生じさせてｐＨが５ないし６．８の水性タンパク質溶液を形成するために抽出し、
（ｅ）残留油料種子から水性タンパク質溶液を分離し、
（ｆ）選択性膜技術を使用することによって、イオン強度を実質的に一定に保ちながら、前記水性タンパク質溶液の濃度を増加させて、濃縮されたタンパク質溶液を得、
（ｇ）前記濃縮されたタンパク質溶液を、温度が１５℃未満の冷水中に稀釈して、少くとも部分的にミセルの形で分離したタンパク質粒子を形成させ、
（ｈ）タンパク質ミセルを沈降させて、無定形で、粘着性のある、ゼラチン状の、グルテン様タンパク質ミセル集塊物を形成させ、そして
（ｉ）乾燥重量ベースで少くとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少くとも１００重量％のタンパク質含量を有する、タンパク質ミセル集塊物を上澄液から回収する。
【請求項２】
前記プロセスがバッチモードで達成され、前記油料種子粕の抽出がイオン強度が少くとも０．１０，好ましくは０．１５〜０．６で、ｐＨが５〜６．８，好ましくは５．３〜６．２であり、そして前記水性タンパク質溶液が５〜４０ｇ／Ｌ，好ましくは１０〜３０ｇ／Ｌのタンパク値含量を有し、前記油料種子粕の抽出が好ましくは前記塩水溶液の攪拌を伴って１０〜３０分間，好ましくは前記抽出ステップの間、前記塩水溶液中の油料種子粕の濃度が５〜１５％ｗ／ｖであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロセスが連続式で実施され、前記抽出ステップが
（i）油料種子粕を、イオン強度が少くとも０．１０，好ましくは０．１５〜０．８で、ｐＨが５〜６．８，好ましくは５．３〜６．２の塩水溶液と、温度が５〜６５℃，好ましくは少くとも３５℃で、連続的に混合し、
（ii）その油料種子粕からタンパク質を抽出してタンパク質の含量が５〜４０
ｇ／Ｌ，好ましくは１０〜３０ｇ／Ｌのタンパク質の水溶液を形成すため１０分までの時間、前記混合物をパイプを通して連続的に搬送すること
によって実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記油料種子粕の前記抽出が、イオン強度が少くとも０．１０，好ましくは０．１５〜０．６，そしてｐＨが３〜５または６．８〜９．９を有する塩の水溶液を用いて実施され、次いで前記残渣油料種子粕からのタンパク質水溶液の分離の後に、タンパク質水溶液のｐＨが５〜６．８，好ましくは５．３〜６．２に調節されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記油料種子粕がカノーラ油料種子粕であり、そして残渣カノーラ種子粕からの水性タンパク質溶液の前記分離の後に、水性タンパク質溶液が色素除去ステップにかけられ、その色素除去ステップは、好ましくは水性タンパク質溶液の限外濾過によって実施されるか、または色素吸着剤、好ましくは活性炭と水性タンパク質溶液と混合し、次いで水性タンパク質溶液から色素吸収剤を分離することによって実施される、ことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記油料種子粕が水で抽出され、次いでその水性タンパク質溶液に塩を加えてイオン強度が少くとも０．１０を有する水性タンパク質溶液を得ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記濃縮ステップが、タンパク質含量が少くとも２００ｇ／Ｌ，好ましくは少くとも２５０ｇ／Lを有する濃縮タンパク質溶液を得るため限外濾過によって実施されることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記濃縮タンパク質溶液が、濃縮タンパク質溶液の粘度を下げるため、少くとも２０℃の温度，好ましくは２５〜４０℃の温度まで、しかしそれより高いと濃縮タンパク質溶液の温度がミセルの形成を不可能にする温度をこえることのないように加温されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
方法がバッチベースで行われ、前記濃縮されたタンパク質溶液が、溶液を所望の希釈度に達するために必要な体積を有し、温度が好ましくは１０℃未満の水の中に加えることにより、１５倍以下，好ましくは１０倍以下まで希釈されることを特徴とする請求項１，２および４ないし８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
方法が連続ベースで行われ、前記濃縮されたタンパク質溶液が、前記冷水、好ましくは１０℃未満の温度の冷水と連続的に混合されて１５倍以下，好ましくは１０倍以下の濃縮タンパク質溶液を与えることを特徴とする請求項１および３ないし８いずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
回収されたタンパク質ミセル塊がタンパク質粉末に乾燥される請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記油料種子粕がカノーラ種子粕であり、そして、上澄液からタンパク質ミセル塊が回収された後、上澄がバッチ、セミ連続または連続ベースで、好ましくは次のように；
（ａ）上澄を１００〜４００ｇ／Ｌ，好ましくは２００〜３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮し、そして濃縮された上澄を乾燥する、か
（ｂ）上澄を１００〜４００ｇ／Ｌ，好ましくは２００〜３００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮し、濃縮された上澄を回収したタンパク質ミセル塊とを混合し、その混合物を乾燥するか、または
（ｃ）上澄を１００〜４００ｇ／Ｌ，好ましくは２００〜３００ｇ／Ｌまで濃縮し、その濃縮された上澄と回収されたタンパク質ミセル塊の少くとも一部とを混合し、そして得られた混合物を乾燥する、
操作されて、さらなるタンパク質単離物を回収することを特徴とる請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記稀釈、沈降および回収ステップの代替法として、濃縮タンパク質溶液を透析してその塩含量を低下させ、タンパク質ミセルを形成させ、そして透析された濃縮タンパク質溶液から乾燥重量基準で少くとも１００重量％（Ｎ×６．２５）のタンパク質含量を有するタンパク質単離物を、好ましくは、透析された濃縮タンパク質を乾燥することによって回収することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記油料種子粕が、冷間圧縮カノーラ油料種子粕であるか、または非遺伝子的に改変されたカノーラ油料種子由来のもの：菜種粕：またはマスタード種子粕であることを特徴とする、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記溶媒除去ステップが、温度１５〜２０℃における空気−脱溶媒法によって実施されることを特徴とする請求項１ないし１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒除去ステップが真空下で実施されることを特徴とする請求項１ないし１５のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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