(57)【要約】本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝、および本発明において開示したタンパク質を同定およびをコード化するポリヌクレオチドの調節を行なうミニブレイン相同タンパク質を開示する。また、本発明は、代謝疾患および障害の診断、研究、予防、および治療における、これらの配列の使用法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミニブレイン相同タンパク質および（または）その機能的断片、ミニブレイン相同タンパク質をコードする核酸分子および（または）その機能的断片および（または）当該核酸分子の修飾因子／エフェクターおよび（または）当該タンパク質から成り、医薬用に許容できるキャリア、希釈液および（または）添加物と共に提供される医薬品組成物。
【請求項２】
核酸分子が脊椎動物または昆虫のミニブレイン核酸、特に表１に記載のヒトタンパク質をコードする核酸、および（または）それに対して相補的な核分子またはその機能的断片またはその変異型である請求項１の組成物。
【請求項３】
当該核酸分子が下記から成る群から選択されるような１または２の請求項に記載の組成物：
（ａ）  表１に示したポリペプチドをコードする核酸分子、または当該ポリペプチドのアイソフォーム、断片または変異体；
（ｂ）  表１に示した核酸分子から成る核酸分子か、または表１に示した核酸分子である核酸分子；
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）で定義した核酸配列に対する遺伝子暗号の結果として変性される核酸分子；
（ｄ）  ５０℃にて、１ｘ  ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含んだ溶液中において、請求項２で定義した核酸分子、または（ａ）〜（ｃ）において定義した核酸分子および（または）それに対して相補的な核酸分子にハイブリダイズする核酸分子；
（ｅ）  ポリペプチドをコード化する核酸分子であり、少なくとも８５％、望ましくは少なくとも９０％、より望ましくは少なくとも９５％、より望ましくは少なくとも９８％、および最大で９９，６％までの同一性を、表１に記載または請求項２において定義したヒトタンパク質または（ａ）において定義したポリペプチドに対して持つ核酸分子；および
（ｆ）  当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、重複または早期停止を引き起こす突然変異によって（ａ）〜（ｅ）の核酸分子と異なる核酸分子。
【請求項４】
核酸分子がＤＮＡ分子、特に相補ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである請求項１〜３の任意の１項の組成物。
【請求項５】
当該核酸がポリペプチドををコードし、エネルギー恒常性および（または）中性脂肪の代謝の調節に寄与するような請求項１〜４の任意の１項の成分。
【請求項６】
当該核酸分子が修飾核酸分子である請求項１〜５の任意の１項の組成物。
【請求項７】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項１〜６の任意の１項の組成物。
【請求項８】
ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項１〜５の任意の１項の組成物。
【請求項９】
当該修飾ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項８の組成物。
【請求項１０】
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項１〜７の任意の１項の組成物。
【請求項１１】
診断用組成物である請求項１〜１０の任意の１項の組成物。
【請求項１２】
治療用組成物である請求項１〜１０の任意の１項の組成物。
【請求項１３】
検出および（または）検証用、代謝症候群、肥満症、および（または）糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、細胞、細胞塊、器官臓器および（または）被検体における摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および（または）予防用の薬剤の製造のための請求項１〜１２の任意の１項の組成物。
【請求項１４】
生体内で利用するための特許請求の範囲１〜１３の任意の一項に記載の組成物。
【請求項１５】
試験管内で利用するための特許請求の範囲１〜１３の任意の一項に記載の組成物。
【請求項１６】
肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群の治療用の医薬品製造のため、およびミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項３に記載のポリペプチドによって影響および（または）修飾される遺伝子および（または）遺伝子産物の機能を管理のためのミニブレイン相同タンパク質またはアイソフォーム、機能的断片またはその変異体、具体的には表１に記載した核酸分子コードする核酸分子の使用法、特に請求項３による核酸分子（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）、および（または）それによってコード化されたポリペプチドおよび（または）機能的断片および（または）当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異体および（または）当該核酸分子またはポリペプチドの修飾因子／エフェクターの使用法。
【請求項１７】
ミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項３に記載のポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するための、ミニブレイン相同タンパク質またはアイソフォーム、機能的断片またはその変異体、具体的には表１に記載した核酸分子をコードする核酸分子の使用法、特に請求項３（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載の核酸分子、および（または）それによってコード化されたポリペプチドおよび（または）機能的断片および（または）当該核酸分子または当該ポリペプチドの変異体および（または）当該核酸分子または当該ポリペプチドの修飾因子／エフェクターの使用法。
【請求項１８】
ミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項３によるポリペプチドの修飾発現を示す非ヒト遺伝子導入動物。
【請求項１９】
ミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項３によるポリペプチドの発現が増加および（または）減少する請求項１８に記載の動物。
【請求項２０】
ミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項３によるポリペプチドの修飾発現を示す組換え宿主細胞。
【請求項２１】
ヒト細胞である請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
哺乳動物におけるエネルギー恒常性および（または）中性脂肪の代謝に関与する（ポリ）ペプチドを同定する方法の手順は下記の通りである。
（ａ）  当該（ポリ）ペプチドの結合を可能にする条件下での、ミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項３によるポリペプチドまたはその機能的断片を用いた（ポリ）ペプチドの回収にコンタクトする手順；
（ｂ）  結合しない（ポリ）ペプチドを除去するステップ、および
（ｃ）  当該ミニブレイン相同ポリペプチドまたはその断片に結合する（ポリ）ペプチドを同定する手順。
【請求項２３】
ミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項  ３  によるポリペプチド結合標的との相互作用を調節／影響する薬剤のための、下記の手順から成るスクリーニング方法
（ａ）  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
（ａａ）  ミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項３によるポリペプチドまたはその機能的断片；
（ａｂ）  当該ポリペプチドまたはその機能的断片の結合標的および薬剤；および
（ａｃ）  当該ポリペプチドまたはその機能的断片が基準親和性で特異的に当該結合標的と薬剤に結合する条件下の候補薬剤；
（ｂ）  薬剤の親和性を決定するため、当該結合標的に対する当該ポリペプチドまたはその機能的断片の結合親和性を検出する手順；および
（ｃ）  薬剤の親和性と基準親和性間の差異を確定する手順。
【請求項２４】
ミニブレイン相同ポリペプチド、特に請求項３によるポリペプチドの活性を調節および影響する薬剤の、下記の手順から成るスクリーニング方法。
（ａ）  下記から成る混合物をインキュベートするステップ。
（ａａ）  当該ポリペプチドまたはその機能的断片；
（ａｂ）  当該ポリペプチドまたはその機能的断片が基準活性を持つ条件下の
候補薬剤；
（ｂ）  薬物の存在における活性を確定するための、当該ポリペプチドまたはその機能的断片の活性を検出する手順；および
（ｃ）  本薬剤の存在下の活性と標準活性間の差を確定する手順。
【請求項２５】
医薬用に許容できるキャリア、希釈剤およびおよび（または）添加剤を有する請求項２２または２４に記載の方法によって同定された（ポリ）ペプチド、または請求項２３の方法によって同定された薬剤を含む組成物を作り出す方法。
【請求項２６】
当該組成物が、肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の防止、軽減または治療するための医薬品組成物である請求項２５の方法。
【請求項２７】
肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈性心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および（または）予防用の医薬品組成物の調製ための、請求項２２の方法によって同定する（ポリ）ペプチドの使用法、または請求項２３または２４の方法によって同定する薬剤の使用法。
【請求項２８】
肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および（または）予防のための薬物の調整のための請求項１〜６または１０の任意の項において定義した核酸分子の使用法。
【請求項２９】
肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および（または）予防のための薬物の調整のための請求項１〜６、８または９の任意の項において定義したポリペプチドの使用法。
【請求項３０】
肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および（または）予防のための薬物の調整のための請求項７において定義したベクターの使用法。
【請求項３１】
肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、または胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の治療、軽減および（または）予防のための薬物の調整のための請求項２０または２１において定義した宿主細胞の使用法。
【請求項３２】
ミニブレイン相同遺伝子産物を過剰発現または低発現する非ヒト導入遺伝子動物の産生のための、ミニブレイン相同核酸分子の使用法またはその機能的断片の使用法。
【請求項３３】
少なくとも下記の１つを備えたキット。
（ａ）  ミニブレイン相同核酸分子またはその機能的断片；
（ｂ）  ミニブレイン相同アミノ酸分子または機能的断片またはそのアイソフォーム；
（ｃ）  （ａ）の核酸を備えているベクター；
（ｄ）  （ａ）の核酸または（ｃ）のベクターから成る宿主細胞；
（ｅ）  （ａ）の核酸によってコード化されたポリペプチド；
（ｆ）  （ａ）の核酸によってコード化された融合ポリペプチド；
（ｇ）  （ａ）の核酸、および（または）（ｂ）、（ｅ）、および（または）（ｆ）のポリペプチドの抗体、アプタマーおよび（または）別の修飾因子／エフェクター、および
（ｇ）  （ａ）の核酸の抗センスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体重調節、例えば、限定するものではないが、代謝疾患に関連する疾患および障害または肥満症、糖尿病および（または）代謝症候群のような機能障害、同様に、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈性心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症または肝臓線維症のような関連障害の診断、研究、予防、および治療におけるミニブレイン相同タンパク質をコードする核酸配列の使用法、およびそれによってコード化されたポリペプチドの使用法、およびタンパク質の修飾因子／エフェクターおよびポリヌクレオチドの使用法に関するものである。
【０００２】
エネルギー消費量に対して摂取熱量がアンバランスであるというエネルギー不均衡に関連するヒトおよび動物代謝のさまざまな代謝疾患、例えば肥満や体重の激減が存在する。肥満は世界に最も蔓延している代謝障害の１つであり、西側諸国にとってますます問題となっているヒトの疾病であるが、その本質は依然としてほとんど理解されていない。肥満とは、理想体重の２０％以上を超える体重として定義され、多くの場合著しい健康障害をもたらす。肥満は、脂肪過多症または肥満の指標である体重指数によって測定することが可能である。肥満を定義するためのさらなるパラメータとしては、ウエストサイズ、皮下脂肪の厚さとバイオインピーダンスを挙げられる。
【０００３】
肥満は心血管疾病、高血圧、糖尿病、高脂血症のリスクの増大および高い死亡率に関連する。肥満に悩む個人は、病気にかかる深刻なリスクを抱えている上に、多くの場合、社会的に孤立している。
【０００４】
肥満は、遺伝的要因、代謝因子、生化学的要因、心理学的要因、および行動要因によって影響を受け、そして非インスリン依存型糖尿病、中性脂肪の増加、炭水化物接合エネルギーの増加および低エネルギー消費のような異なる原因に起因し得る。そのような事情から、肥満は持続可能な好ましい臨床結果を達成するために、さまざまな分野で取り組まなくてはならない複合障害である。肥満は単一の障害として考慮されるべきではなく、（潜在的）複合原因による症状の混成群であると考慮されるべきであり、また、空腹時の血中インスリン値の上昇および経口グルコース摂取に対する過度のインスリン反応も特徴とする（Ｋｏｌｔｅｒｍａｎｎ  Ｏ．Ｇ．，（１９８０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  ６５：１２７２−１２８４）。２型糖尿病における肥満症の明らかな関与が確認されている（Ｋｏｐｅｌｍａｎ  Ｐ．Ｇ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６３５−６４３）。
【０００５】
高脂血症および遊離脂肪酸の上昇は、肥満症およびインスリン耐性を始めとするさまざまな疾患間の連鎖として定義される「代謝症候群」と明確に相関する。これは多くの場合、同一患者において生じ、そして２型糖尿病および心血管疾病の発生の主要な危険因子である。脂質値および血糖値のコントロールが、２型糖尿病、心臓病、およびその他の代謝症候群を治療するために必要であることが示されている（例えば、Ｓａｎｔｏｍａｕｒｏ  Ａ．Ｔ．らの（１９９９）Ｄｉａｂｅｔｅｓ、４８：１８３６−１８４１およびＬａｋｋａ  Ｈ．Ｍの（２００２）ＪＡＭＡ  ２８８：２７０９−２７１６を参照）。
【０００６】
「代謝症候群」症候群ｘ、インスリン耐性症候群、死の四重奏）のコンセプトは、１９６６年にＣａｍｕｓによって初めて記載され、１９８８年にＲｅａｖｅｎによって再導入された（Ｃａｍｕｓ  Ｊ．Ｐ．の（１９６６）Ｒｅｖ  Ｒｈｕｍ  Ｍａｌ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｉｃ  ３３：１０−１４；Ｒｅａｖｅｎ  Ｇ．Ｍ．らの（１９８８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３７：１５９５−１６０７）。今日、代謝症候群は、高血圧、腹部肥満、中性脂肪高値および空腹時血糖値、さらには、ＨＤＬ  コレステロール低値などの心血管系危険因子の集積として一般的に定義されている。インスリン耐性は代謝症候群の発生の危険を大幅に増加する（Ｒｅａｖｅｎ  Ｇ．，（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：２８６−２８８）。代謝症候群は多くの場合、２型糖尿病および心疾患の発生に先行する（前出のＬａｋｋａ  Ｈ．Ｍ．，２００２）。
【０００７】
食物摂取と体重のバランスを調節する分子因子は完全に理解されていない。たとえ、レプチンまたはペルオキシソーム増殖活性の受容体ガンマ活性化補助因子のような体重／重量を調節する恒常性システムに影響を及ぼすはずの候補遺伝子についての記述がいくつかあるとしても、肥満調整または体重／重量の調節に影響を及ぼす特有の分子機構および（または）分子は知られていない。加えて、マウスに肥満症をもたらすさまざまな単一遺伝子の突然変異体が記載されており、肥満症の病因における遺伝的な因子を意味づけている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｊ．Ｍ．およびＬｅｉｂｅｌ  Ｒ．Ｌ．、（１９９２），Ｃｅｌｌ  ６９：２１７−２２０））。肥満（ｏｂ）マウスにおいては、単一遺伝子の突然変異（肥満）は、糖尿病を伴う深刻な肥満症を結果としてもたらす（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  Ｊ．Ｍ．らの（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：１０５４−１０６２）。
【０００８】
以上の点から、本発明の根底にある技術的問題は、体重調節および（または）エネルギー恒常性経路に影響を及ぼす（病理学的な）代謝状態の調節のための手段と方法を提供することにあった。当該技術的問題に対する解決は、請求項において特徴付けられた実施例を提供することによって達成する。
【０００９】
従って、本発明は、体重調節、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症において、これらをコードするタンパク質および核酸の新規機能に関連するものである。本明細書で開示したタンパク質およびこれらのタンパク質コードするポリヌクレオチドは、代謝疾患および障害を調査研究するために好適である。さらに本発明では、記載したような代謝疾患および障害の診断、治療および予後に有用な新規組成物を提供する。
【００１０】
第一態様では、本発明は、ミニブレイン相同タンパク質および（または）その機能的断片、ミニブレイン相同タンパク質をコードする核酸分子および（または）その機能的断片および（または）当該核酸分子および（または）当該タンパク質修飾因子／エフェクターから成り、医薬用に許容できるキャリア、希釈液および（または）添加物と共に提供される医薬品組成物。具体的には、核酸分子は脊椎動物または昆虫のミニブレイン核酸、特に表１に記載のヒトタンパク質をコードする核酸、および（または）それに対して相補的な核分子またはその機能的断片またはその変異型である。
【００１１】
これまでは、本発明のタンパク質または相同タンパク質がエネルギー恒常性の調節および体重調節および関連障害に関与することは記載されておらず、従って上記のような代謝疾患および機能障害およびその他の疾患における機能は記述されていない。本発明では、本発明のタンパク質の正しい遺伝子投与量がエネルギー恒常性の維持にとって必須であることを実証する。遺伝子学的スクリーニングを用いて、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の突然変異が、代謝、特に肥満症に関連する代謝において、主要なエネルギー貯蔵物質である中性脂肪含有量における著しい変化を反映する変化を引き起こすことを同定した。
【００１２】
本タンパク質、ヌクレオチド配列、および方法について以下に説明するが、記載した特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクターおよび試薬によって本発明が限定されるものではなく、改変し得ることは当然のことながら共通認識とする。また、本詳細書で使用した用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求範囲のみに限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことながら共通認識とする。本明細書で使用した全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有するものとする。本明細書中に記載した方法および材料に類似または等価な方法および材料は、本発明の実践または検査で用いることができるが、好適な方法、装置、および材料はここに記載する。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関連して使用され得る刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明がこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００１３】
本発明は、ミニブレイン（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ７８２６）相同タンパク質（本明細書中では「本発明のタンパク質」と呼ぶ）がエネルギー恒常性および脂肪代謝、特に中性脂肪、および本発明において開示したタンパク質を同定およびコードするポリヌクレオチドの代謝と保管を調節することを開示する。また、本発明は、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを作り出すためのベクター、宿主細胞、および組換え方法に関連するものでもある。また、本発明は、肥満症、糖尿病を始めとする代謝疾患または機能障害、、および（または）代謝症候群、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈性心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、または肝臓線維症のような関連障害の診断、研究、予防、および治療における、これらの化合物およびその修飾因子／エフェクター、例えば、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子またはリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識する低分子量有機化合物のような抗体、生物活性核酸の使用法にも関するものである。
【００１４】
ミニブレイン遺伝子により、昆虫類からヒトにいたるまで進化的に保存されるタンパク質キナーゼの新規ファミリーがコード化される。キイロショウジョウバエのミニブレイン遺伝子により、後胚神経発生において重要な役割を有するセリン  トレオニンタンパク質キナーゼがコード化される。ヒト相同分子種  タンパク質ＤＹＲＫ１Ａ（二重特異性  Ｙａｋ  １−ｒｅｌａｔｅｄ  キナーゼ  １Ａ）はプロリン指向性であり、ＤＹＲＫ１Ｂはアルギニン指向性のセリン／トレオニン  キナーゼである。Ｄｙｒｋ１ａが染色体２１のダウン症候群（ＤＳ）臨界領域内でマッピングされているため、そしてＤＳ胚脳において過剰発現されるため、トリソミー２１患者またはダウン症候群患者の神経欠陥の一部におけるＤｙｒｋ１ａの介入が示唆された。ダウン症候群は知的障害、低緊張および発育の遅れの主要な原因である（米国特許６，２５１，６６４をも参照）。Ｄｙｒｋ１機能が欠乏したマウスは一般に成長の遅れを呈し、妊娠中期に死亡した。突然変異（Ｄｙｒｋ１Ａ（＋／−））にヘテロ接合性のマウスは、新生児生存率の低下と出生から成体に成長するまでに顕著な固体サイズの減少を示した。Ｆｏｔａｋｉ  Ｖ．らの（２００２）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２２：６６３６−６６４７によって示されたデータは、マウスおよびハエ両者における正常な発育と脳の大きさを決定する作用の保存モードを示唆する。Ｄｙｒｋ１ａを過剰発現するトランスジェニックマウスは、神経支配の発育における機能的影響による頭尾方向への成熟の遅れを示する。海馬機能障害および前頭前野機能障害を示す空間学習および認識柔軟性は大幅に低下する（Ａｌｔａｆａｊ  Ｘ．らの（２００１）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ．１０：１９１５−１９２３）。
【００１５】
ミニブレインのヒトオーソログの明らかな生物学的機能に関する記載は存在しないが、最近になってＤｙｒｋ１Ａがエンドサイトーシス装置のアセンブリを管理する制御因子として機能する可能性が示唆されている。Ｄｙｒｋ１Ａがダイナミン１のＡｍｐｈｉｐｈｙｓｉｎ１（神経終末タンパク質）との相互作用の調節において二役を演じている可能性があることが示唆された。Ｄｙｒｋ１Ａのリン酸化によってダイナミンとエンドフィリン  １の相互作用が低下される一方、同じリン酸化によってダイナミン  １アダプタータンパク質Ｇｒｂ２の結合も促進された（Ｃｈｅｎ−Ｈｗａｎｇ  Ｍ．Ｃ．らの（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：１７５９７−１７６０４）．
【００１６】
また、Ｄｙｒｋ１ａは、インスリンによる遺伝子発現制御に関与すると同時に、生存因子によるアポトーシス調節にも関与している横紋筋肉腫（ＦＫＨＲ）のフォークヘッド型転写因子を始めとする、種々の基質のリン酸化において役割を果たすものとしても記載されている（Ｗｏｏｄｓ  Ｙ．Ｌ．らの（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３５５：５９７−６０７）。Ｄｙｒｋ１ａは、ＧＳＫ３標的タンパク質のグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）の共リン酸化（プライミング）のために必要である（Ｗｏｏｄｓ  Ｙ．Ｌ．らの（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３５５：６０９−６１５）。
【００１７】
Ｄｙｒｋ１ｂはマイトジェン活性化タンパク質キナーゼの基質である。活性化した細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）により、Ｄｙｋｒ１ｂタンパク質レベルは下方制御され、ＥＲＫ活性化が阻止されると、Ｄｙｒｋ１ｂタンパク質レベルは２０倍に増加した（Ｌｅｅ  Ｋ．らの（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３６３１−３６３７）。ＭＡＰＫキナーゼＭＫＫ３はタンパク質キナーゼとしてＤｙｒｋ１ｂを活性化することが明らかにされている（Ｌｉｍ  Ｓ．らの（２００２）Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７：２５０４０−２５０４６）。
【００１８】
Ｙａｋ１ｐと呼ばれるサッカロマイセスセレヴィシエ（出芽酵母）の異なるメンバーは、グルコース反応転写調節因子Ｐｏｐ２ｐのリン酸化に関与すると記載されている。Ｐｏｐ２ｐはグルコース量に応答して細胞の成長（細胞分解）を制御する（グルコースセンシングシステム）（Ｍｏｒｉｙａ  Ｈ．らの（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５（１０）：１２１７−１２２８）。
【００１９】
従って、ミニブレイン相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または各種脊椎動物、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、相同核酸、特に表１に記載の本発明のヒト相同タンパク質をコードする核酸、および（または）当該タンパク質のアイソフォーム、断片または変異体である。
【００２０】
本発明は、エネルギー恒常性および中性脂肪の代謝調節に寄与するポリペプチドをコードする核酸分子に特に関連するものであり、その点で、当該核酸分子は下記から成る。
【００２１】
（ａ）  ショウジョウバエミニブレインをコードするヌクレオチド配列、または特に表  １  に記載したヒトタンパク質、および（または）それに対して相補的な配列、
（ｂ）  ５０℃  にて、１ｘ  ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含む溶液中で（ａ）の配列に対してハイブリダイズするヌクレオチド配列、
（ｃ）  遺伝暗号の変性内における（ａ）または（ｂ）の配列に対応する配列、
（ｄ）  ポリペプチドをコード化する配列であって、少なくとも８５％、望ましくは少なくとも９０％、より望ましくは少なくとも９５％、より望ましくは少なくとも９８％および最大で９９，６％までの同一性を、ミニブレインタンパク質、望ましくは表１に記載の該ヒト相同タンパク質、特にヒトタンパク質のアミノ酸配列に対して持つ配列。
【００２２】
（ｅ）  突然変異によって（ａ）〜（ｄ）の核酸分子と異なる配列であり、当該突然変異がコード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製および（または）早期停止を引き起こす配列、または
（ｆ）  少なくとも１５塩基、望ましくは少なくとも２０塩基、より望ましくは少なくとも２５塩基および最も望ましくは少なくとも５０塩基、具体的には１５〜２５塩基、望ましくは２５〜３５塩基、より望ましくは３５〜５０塩基および最も望ましくは少なくとも５０塩基の長さを有する（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列の任意の部分的配列。
【００２３】
本発明は、ミニブレインおよび（または）相同タンパク質およびこれらをコードするポリヌクレオチドが中性脂肪保管の調節に関与し、従って、エネルギー恒常性にも関与するというと知見に基づく。
【００２４】
また、本発明では、肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする代謝疾患および機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、肝臓線維症、または、胆石症のような関連障害の診断、研究、予防、または治療におけるこれら組成物の使用法を記述する。
【００２５】
従って、本発明は、体重調節、エネルギー恒常性、代謝、および肥満症、当該遺伝子の機能的断片、当該遺伝子またはその機能的断片によってコード化されたポリペプチドコード、およびその修飾因子／エフェクター、例えばアンチセンス分子、ＲＮＡｉ分子、または当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを認識するリボザイム、アプタマー、ペプチドまたは低分子量有機化合物のような抗体、生物学的に活性な核酸において新規機能を有する遺伝子に関するものである。
【００２６】
キイロショウジョウバエのようなモデル個体のゲノムを操作およびスクリーニングする能力は、遺伝子、細胞プロセス、および経路の有意な進化的保存に起因する、より複雑な脊椎動物個体に対する直接的な関連性を有する生物学的および生化学的プロセスを分析するための強力なツールを提供する（例えば、Ａｄａｍｓ  Ｍ．Ｄ．らの（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２１８５−２１９５を参照）。モデル個体における新規遺伝子機能の同定は、哺乳動物（ヒト）における反応経路の解明、そしてその調整方法の解明に直接的に貢献する。病理モデル（例：肥満症を始めとする代謝症候群の徴候としての中性脂肪値の変化）とハエ遺伝子の修飾発現との関係によって、ヒト相同分子種と特定のヒト疾病との関連を同定することができる。
【００２７】
一実施例では、フォーワード遺伝子スクリーニングを、既知の遺伝子の異所性発現に起因する変異表現型を示すハエにおいて実施されている（Ｓｔ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  Ｄ．，（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３：１７６−１８８；Ｒｏｒｔｈ  Ｐ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：１２４１８−１２４２２  を参照）。本発明においては、遺伝子スクリーニングを用いて、中性脂肪値の著しい変化を反映する体重変化の原因となる突然変異を同定した。
【００２８】
肥満患者は、主に中性脂肪含有量の著しい増加を示す。中性脂肪は細胞における最も効果的なエネルギー貯蔵場所である。エネルギー恒常性において機能を有する遺伝子を分離するため、長期にわたる食餌期間後に、数千のＥＰ系統の中性脂肪含有量を検査した（詳細は実施例を参照）。さらなる分析のための好ましい候補として中性脂肪含有量が顕著に変化したＥＰ系統を選択した。遺伝子機能の損失による中性脂肪含有量の変化は、中性脂肪としてエネルギー貯蔵量を制御する投与量依存型の様式において、エネルギー恒常性における遺伝子活性を示唆する。
【００２９】
本発明において、同一遺伝子型を有するハエ集積の中性脂肪含有率を、長期にわたる給餌後、中性脂肪測定法を使用して分析した。ショウジョウバエ系統ＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３のベクター統合に対してヘミ接合性の雄バエを、これらのハエの中性脂肪含有量を測定するアッセイで分析し、その詳細を実施例部に図示した。中性脂肪含有量の分析結果を図１に示す。
【００３０】
ＥＰベクター（本明細書中ではＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３）統合に局在するゲノムＤＮＡ配列を分離した。それら分離したゲノム配列を用いて、Ｂｅｒｋｅｌｅｙショウジョウバエゲノムプロジェクト（ＧａｄＦｌｙ；ＦｌｙＢａｓｅ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：８５−８８も参照）のような公共データベースをスクリーニングし、それによってベクター統合部位、および実施例の項においてより詳細に記載した対応遺伝子を同定した。本遺伝子の分子構造を図２に示した。
【００３１】
それによってコード化された、中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質は、公的に利用できる配列データベースで分析し（詳細は実施例を参照）、哺乳動物のホモログを同定した。
【００３２】
エネルギー恒常性における哺乳動物ホモログの機能（作用）は、異なる組織における転写物の発現の分析によって本発明でさらに確証した。発現プロファイリングの研究（詳細は実施例を参照）により、本発明のタンパク質の特定の関連性は哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子として確認される。さらに、本発明のタンパク質が、絶食および遺伝的に誘発された肥満によって調整されることを明らかにする。本発明では、本発明のタンパク質の発現を研究するために、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスなどのインスリン耐性および（または）糖尿病のマウスモデルを使用した（例えば、ｏｂ（レプチン）マウスまたはｄｂ（レプチン受容体）マウス）。そのような糖尿病の典型的な症状を呈するマウスは肝脂質蓄積を示し、高い頻度で血漿脂質レベルを増加した（Ｂｒｕｎｉｎｇ  Ｊ．Ｃ．らの（１９９８）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．２：５５９−５６９を参照）。
【００３３】
また、本発明には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコード化するポリヌクレオチド配列が包含される。従って、本発明のタンパク質のアミノ酸配列または相同タンパク質をコード化する任意の核酸配列を用いて、本発明または相同タンパク質のタンパク質を発現する組換え分子を作成することができる。特定の実施形態では、本発明には、ショウジョウバエのミニブレイン、またはヒトのミニブレインホモログ、望ましくは本明細書中で「本発明のタンパク質」と呼ぶ、表１に記載したヒト相同タンパク質をコードする核酸が包含される。当業者にとっては当然のことながら、遺伝暗号の縮重の結果、そのタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列（一部は既知であり天然の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する）を作り出すことが可能である。本発明には、可能なコドン選択に基づく組合せの選択によって作り得るありとあらゆる種類のヌクレオチド配列変異体を網羅することができる。
【００３４】
また、本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列、特にミニブレイン、または相同タンパク質、望ましくは表１に記載のヒトホモログのタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする能力を持つポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Ｗａｈｌ  Ｇ．Ｍ．らの（１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９−４０７）およびＫｉｍｍｅｌ  Ａ．Ｒ．の（１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７−５１１）  で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度（Ｔｍ）に基づいており、明確なストリンジェントでの使用が可能である。望ましくは、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、１時間１  ｘ  ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて５０℃にて、望ましくは５５℃にて、より望ましくは６２℃にて、および最も望ましくは６８℃にて、特に１時間０．２ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）中で５０℃にて、望ましくは５５℃にて、より望ましくは６２℃にて、および最も望ましくは６８℃にて洗浄後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが認められることを意味する。本発明に包含されるそのタンパク質をコードする改造核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入または置換が含まれ、機能的に同一または等価なタンパク質をコード化するポリヌクレオチドを結果としてもたらす。
【００３５】
また、コードされたタンパク質には、サイレント変化を作り出し、機能的に等価なタンパク質を結果としてもたらすアミノ酸残基の欠損、挿入または置換が含まれることもある。計画的アミノ酸交換は、タンパク質の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および（または）両親媒性の類似性に基づいて行うことができる。さらに本発明は、タンパク質のペプチド断片またはその誘導体、例えば、少なくとも４長、望ましくは少なくとも６長、最大で５０長のアミノ酸を有する環状ペプチド、ペプチド擬態のレトロ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチドなどに関するものである。
【００３６】
また、本発明の範囲内には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子の対立遺伝子も含まれる。本明細書で使用した「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、核酸配列において少なくとも１つの突然変異から生じ得る、遺伝子の別の形である。対立遺伝子は、構造または機能を改変し得るかどうかわからない変性ｍＲＮＡまたはポリペプチドを結果としてもたらすことがある。任意の遺伝子には、対立遺伝子形態が含まれない場合も、１つ以上の対立遺伝子形態が含まれる場合もある。対立遺伝子を作り出す一般の突然変異変化は通常、ヌクレオチドの自然欠損、付加または置換に帰する。これらの各変化は、単独、またはその他の変化と共に、所定の配列内で１回以上生じることがある。
【００３７】
本発明のタンパク質および相同タンパク質をコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知の種々の方法を使用することによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することが可能である。例えば、使用可能な方法の１つである「制限部位」ＰＣＲ法は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知配列を読み出す方法である（Ｓａｒｋａｒ  Ｇ．らの（１９９３）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：３１８−３２２）。また、逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく分岐プライマーを利用して、配列を増幅または延長することも可能である（Ｔｒｉｇｌｉａ  Ｔ．らのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６）。また、別の使用可能な方法としては、ヒトおよび酵母菌の人工染色体ＤＮＡにおける既知の配列に近傍するＤＮ断片のＰＣＲ増幅を伴うキャプチャＰＣＲ法があげられる（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．らの（１９９１）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１１９）。未知配列を読み出すために使用可能な別の方法としては、Ｐａｒｋｅｒ  Ｊ．Ｄ．らの（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：  ３０５５−３０６０  の方法が挙げられる。加えて、ＰＣＲ  法、ネステッドプライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリを用いて、ゲノムＤＮＡ内に入ることも可能である（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）。このプロセスは、ライブラリをスクリーニングすることを回避し、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるために有用である。
【００３８】
生物学的に活性なタンパク質を発現するために、本発明のタンパク質または機能的等価物をコード化するヌクレオチド配列を、好適な発現ベクター、すなわち、挿入コーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することが可能である。当業者に周知の方法を用いて、タンパク質をコードする配列、好適な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、試験管内組換えＤＮＡ技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。これらの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らの（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．らの（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【００３９】
本発明のさらに別の実施例によれば、天然の核酸配列、修飾核酸配列または本発明のタンパク質および相同タンパク質をコードする組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコードすることが可能である。異種配列は、望ましくは融合タンパク質の  Ｎ  終端および（または）Ｃ終端に位置する。
【００４０】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、タンパク質または融合タンパク質をコードする配列を保持および発現することが可能である。これらには、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系などの微生物等が含まれているが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明のタンパク質または試料中の相同タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の存在は、当該ポリヌクレオチドのプローブまたは部分または断片を用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出することが可能である。核酸増幅系アッセイには、対応タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを含んだ形質転換体を検出するために、その遺伝子に特異的な配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用が含まれる。本明細書で使用した「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、少なくとも約１０のヌクレオチド、そして約６０もの数のヌクレオチド、望ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、およびより望ましくは約２０〜２５のヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプライマーとして使用することが可能である。
【００４２】
多岐にわたる標識技術および共役技術が当業者には周知であり、種々の核酸およびアミノ酸測定法において使用することが可能である。ポリヌクレオチド配列を検出するために標識化されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを産出する手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、標識化されたＲＮＡプローブの末端標識化、標識化されたヌクレオチドを用いたＰＣＲ増幅、または酵素性合成が含まれる。このような手順は、市販されている種々のキット（ミシガン州カラマズーのＰｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）、およびＵ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ社（オハイオ州クリーブランド））を用いて実行することが可能である。
【００４３】
試料における本発明のタンパク質の存在は、免疫学的な方法または活性測定によって確定することができる。タンパク質活性を判定するためのタンパク質または試薬に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、タンパク質の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは当分野で周知である。実施例には、酵素免疫測定（吸着）法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、および蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）が含まれる。タンパク質上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル系免疫測定法は好適ではあるが、競合結合実験を使用することも可能である。これらを含めた他のアッセイは、Ｈａｍｐｔｏｎ、Ｒ．らの（ミネソタ州セントポール市、１９９０；Ｓｅｒ  ｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ）およびＭａｄｄｏｘ、Ｄ．Ｅ．らの（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２２６）の諸所に記載されている。
【００４４】
使用可能な好適レポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほかに、基質、補助因子、阻害剤、磁力粒子なども含まれる。
【００４５】
本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からの当該タンパク質の発現および回収に好適な条件下で培養することが可能である。組換え細胞によって作り出されたタンパク質は、使用する配列および（または）ベクターにもよるが、分泌または細胞内含有させることが可能である。タンパク質をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するタンパク質の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。その他の組換え構造を用いて、本タンパク質をコードする配列を水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製を促進する領域には、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファン分子などの金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質Ａ領域、およびＦＬＡＧ伸長／親和性の精製装置（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ社，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）で利用される領域などが含まれるが、これらによって限定されるものではない。精製ドメインと所望のタンパク質との間にあるＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（腸活素）（カリフォルニア州のサンディエゴ市のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対して特異的であるような切断可能リンカー配列の包括を用いて精製を促進することが可能である。
【００４６】
診断および治療
本発明において開示したデータは、本発明の核酸およびタンパク質およびそのエフェクター／修飾因子が、関連する診断目的および治療目的、例えば、限定するものではないが、肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、真性糖尿病、高血圧、冠動脈心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎および（または）胆石症、または肝臓線維症のような関連障害において有用であることを明らかにする。従って、本発明のタンパク質核酸およびタンパク質の診断目的および治療目的は、例えば、これらに限定されるものではないが、次の通りである：（ｉ）タンパク質療法、（ｉｉ）小分子薬剤標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療、診断、薬剤ターゲッティング／細胞毒性抗体）、（ｉｖ）診断および（または）予後マーカー、（ｖ）遺伝子療法（遺伝子送達と遺伝子除去）、（ｖｉ）研究ツール、および（ｖｉｉ）試験管内および生体内における組織再生（これらの組織に由来する組織型および細胞型を構成する全ての組織型および細胞型の再生）。
【００４７】
本発明の核酸とタンパク質およびその修飾因子／エフェクターは、下記のように、種々の用途に関与する診断目的および治療目的において特に有用である。例えば、限定するものではないが、本発明のタンパク質をコードする相補ＤＮＡおよび特にそのヒトホモログは、遺伝子療法において有用であり、また、本発明のタンパク質および特にそのヒトホモログは、それを必要とする被検体に投与されたときに有用であり得る。例証として、本発明の組成物は、例えば、限定するものではないが、上記のような代謝障害に苦しむ患者の治療に対して有効性を有するであろう。
【００４８】
本発明の核酸またはその断片は、核酸またはそのタンパク質の存在または量が評価される診断適用例においてもさらに有用であり得る。さらに、本発明の新規物質に対して免疫特異的に結合する抗体を治療または診断方法において使用することも可能である。
【００４９】
例えば一実施態様によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異な抗体は、修飾因子／エフェクター、例えばアンタゴニストとして直接的に用いるか、またはタンパク質を発現する細胞または組織に薬剤をもたらすターゲッティング機構または輸送機構として間接的に用いることが可能である。その抗体は当分野で周知の方法を用いて作成することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリによって産生された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体（すなわち、二量体形成を阻害する抗体）は特に治療用に望ましい。
【００５０】
抗体産生のため、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒトなどを含む種々の宿主は、本ンパク質または免疫抗原性の特性を有する任意の断片またはそのオリゴペプチドを注入することによって免疫化することが可能である。宿主の種類にもよるが、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることが可能である。本タンパク質に対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約５のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約１０のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。
【００５１】
本タンパク質に対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を作り出す任意の技術を用いて作ることが可能である。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．の（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ．らの（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８１：３１−４２；Ｃｏｔｅ  Ｒ．Ｊ．らの（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０；Ｃｏｌｅ  Ｓ．Ｐ．らの，（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１０９−１２０）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
加えて、「キメラ抗体」を作り出すために開発された技術である、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．らの（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  Ｍ．Ｓ．らの（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  Ｓ．らの（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２−４５４）。あるいは、一本鎖抗体を作り出すために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異的な一本鎖抗体を作り出すことが可能である。関連特異性を有するが、固有イディオタイプ組成物の一部でもある抗体は、ランダムな組み合わせの免疫グロブリンライブラリからのチェーンシャフリングによって作成することが可能である（Ｋａｎｇ  Ａ．Ｓ．らの（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−１１１２３）。抗体はまた、リンパ球集団における生体内産生を誘導することによって作り出すことが可能であり、または組換え免疫グロブリンライブラリまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによって作り出すことも可能である（Ｏｒｌａｎｄｉ  Ｒ．らの（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３−３８３７；Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．の（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９）。
【００５３】
また、タンパク質に対する特異的な結合部位を含む抗体断片も得ることが可能である。例えば、そのような断片には、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって作り出すことができるＦ（ａｂ′）２断片、およびＦ（ａｂ′）２のスルフィド架橋を還元することによって作成できるＦａｂ断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定することができる（Ｈｕｓｅ  Ｗ．Ｄ．らの（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１）。
【００５４】
種々の免疫測定法をスクリーニングに対して用い、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合結合および免疫放射定量測定法のための幾多のプロトコルは、当分野では周知である。通常このような免疫学的測定法には、タンパク質とその特異性抗体との間の複合体形成の計測が関与する。２つの非干渉性タンパク質エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナル系免疫測定法が望ましいが、競合結合実験を用いることも可能である（前出のＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら）。
【００５５】
本発明の別の実施例によれば、本発明のポリヌクレオチドまたはその断片またはアンチセンス分子またはリボザイムのような核酸エフェクター分子を治療目的のために使用することが可能である。一実施態様において、アンチセンス分子は、ｍＲＮＡの転写を阻止することが望ましい状況において使用することが可能である。具体的には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードするポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することが可能である。このように、アンチセンス分子を用いて、タンパク質活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、タンパク質をコードする配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクチニアウィルスまたは種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団に送達することができる。当業者に公知の方法を用いて、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌらの（前出）両文献に記載されている。本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする遺伝子は、本発明のタンパク質または相同タンパク質またはその機能的断片をコード化する高レベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターを有する細胞または組織の形質転換によってオフにすることができる。そのような構成物を用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することが可能である。ＤＮＡへの組み込みが不在の場合でさえ、そのようなベクターは、ＲＮＡ分子が内因性ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）によって使用不可能になるまで継続してＲＮＡ分子を転写することが可能である。一過性の発現は、非複製ベクターによって１ヶ月以上持続することが可能であり、さらに適切な複製要素がそのベクター系の一部である場合には、より一層長く持続することが可能である。
【００５６】
上述したとおり、遺伝子発現の修飾は、アンチセンス分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを、本発明のタンパク質または相同タンパク質、すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロンをコードする遺伝子の制御領域に対して設計することによって得ることができる。転写開始部位（例えば始動部位から−１０〜＋１０の間）由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制することもできる。三重らせん対合が有用であるのは、三重らせん対合は、ポリメラーゼ、転写調節因子または調節分子の結合に対して二重らせんが十分に開くような能力を阻害するためである。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療における進歩は文献に記載されている（Ｇｅｅ  Ｊ．Ｅ．らの（１９９４）Ｇｅｎｅ  １４９：１０９−１１４；Ｈｕｂｅｒ  Ｂ．Ｅ．およびＣａｒｒ  Ｂ．Ｉ．の（１９９４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  社、Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，Ｎ．Ｙ．）。また、アンチセンスは、転写物のリボソームに対する結合を防止することによって、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する目的で設計することも可能である。
【００５７】
酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために使用することが可能である。リボザイム作用のメカニズムには、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションが含まれる。使用することが可能な実施例には、本発明のタンパク質または相同タンパク質をコードする配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異性リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することによって最初に同定する。ひとたび同定すると、標的遺伝子の領域に対応し、切断部位を含む１５〜２０リボヌクレオチド間の短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造的特徴に対して評価することが可能となる。また、候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護試験法（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性を検査することによって行うことができる。
【００５８】
核酸エフェクター分子、例えば本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で周知の任意の方法を用いて作ることが可能である。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、ＤＮＡ配列の試験管内および生体内転写によってＲＮＡ分子を産出することも可能である。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６のような好適なＲＮポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクターに組み込むことが可能である。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれら相補ＤＮＡ構成物は、細胞株、細胞または組織の内に導入することができる。ＲＮＡ分子を修飾して、細胞内の安定性および半減期を向上することが可能である。可能な修飾には、本分子の５′末端および（または）３′末端でのフランキング配列の追加、または核酸塩基、砂糖および（または）リン酸塩部分、例えば分子の背骨連鎖内のホスホジエステラーゼ連鎖ではなく、ホスホロチオエートまたは２′Ｏ−メチルの使用が含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念は、ＰＮＡの作成に固有のものであり、例えばイノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンに類似の修飾態様なども含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子に適用することができる。
【００５９】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が提供されており、それらの方法は生体内、試験管内および生体内外交通の使用に同程度に適している。生体内外交通治療では、ベクターは患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法を用いて行うことが可能である。上記の治療方法はいずれも、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も望ましくはヒトなどの哺乳動物を始めとする好適な被検体に適用することが可能である。
【００６０】
本発明の追加実施例は、医薬用に許容できるキャリアと共に、上述の任意の治療効果のための医薬品組成物の投与に関するものである。そのような医薬品組成物は、核酸および（または）本発明のタンパク質、および（または）相同核酸および（または）タンパク質、本発明のタンパク質に対する抗体、および（または）相同タンパク質、擬態、アゴニスト、アンタゴニストおよび（または）本発明のタンパク質の阻害剤、および（または）相同タンパク質および（または）核酸配列で構成され得る。本組成物は単独で投与することができるが、少なくとも１つの安定化化合物のような他剤と共に投与することもでき、その場合には、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、Ｄ形グルコース（ブドウ糖）および水など（これらに限定されるものではない）の滅菌した生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与することが可能である。本組成物は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤またはホルモンと共に投与することも可能である。本発明に用いられる医薬品組成物は、幾つもの経路によって投与することができ、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸があるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
その活性成分に加えて、これらの医薬品組成物は、医薬用に使用することができる、活性化合物の製剤への処理を促進する賦形剤および助剤を備えている好適な医薬用に許容できるキャリアを包含し得る。および投与に関する技術の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ペンシルベニア州イーストンのＭａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社）の最新版を参照。
【００６２】
本発明の医薬品組成物は、当分野で周知であるような方法で製造することができ、それらの態様としては、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥プロセス等があげられる。本医薬品組成物は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができる。本医薬品組成物を調製した後には、適切な容器に充填し、適応条件の治療のために標識する。本タンパク質投与のための標識には、投与の量、頻度、および方法が明記される。
【００６３】
本発明に好適な医薬品組成物には、活性成分が所望の目的を達成するために有効な量で含有されているような成分が含まれる。有効投与量の定量は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物の場合には、細胞培養試験法、例えば前脂肪細胞の細胞株の細胞培養試験法おいて、または通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタなどの実験動物においてのいずれかを用いて、治療に有効な投与量を初期に推定することができる。また、動物モデルを好適な濃度範囲および投与経路を決定するために使用することも可能である。次にはこのような情報を用いて、ヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。治療に有効な投与量とは、活性成分、例えば、核酸または本発明のタンパク質または相同タンパク質または核酸またはその断片、本発明のタンパク質の抗体または相同タンパク質の、特定の状態を治療するために十分な量のことである。治療効力および毒性は、細胞培養または実験用動物における標準調剤手順、例えばＥＤ５０（５０％の集団における治療に有効な用量：５０％有効量）およびＬＤ５０（５０％の集団に対して致死的な用量：５０％致死量）によって確定し得る。治療効果と毒性効果間の投与量の比は、治療指数、すなわちＬＤ５０／ＥＤ５０比率として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品組成物が望ましい。細胞培養試験法および動物実験から得たデータは、ヒト用のさまざまな投与量の製剤に使用する。そのような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆ど持たないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、投与量の使用元、患者の感受性、および投与の経路によって、本範囲内で変わる。正確な投与量は、治療を必要とする被検体に関する要因を考慮して、現場の医師が決定することになる。投与量および投与法は、十分なレベルの活性部を提供するため、または所望の効果を維持するために調節する。配慮されるべき要因には、疾患の重症度、患者の身体全体の健康状態、患者の年齢、患者の体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品組成物は、個別製剤の半減期およびクリアランス率にもよるが、３〜４日毎、１週間毎または２週間毎に１回の間隔で投与することが可能である。通常の投与量は、投与経路にもよるが、約０．１〜１００，０００マイクログラムと異なり、合計投与量は最大で約１グラムまでとする。特定の投与量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、通常、当分野の実務家に提供されている。当業者であれば、タンパク質または抑制剤とは異なったヌクレオチドの製剤を利用するであろう。さらにポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達も、個別の細胞、状態、位置などに対して特異的なものとなる。
【００６４】
別の実施例では、本タンパク質に特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質または相同タンパク質の過剰発現または低発現に関連することを特徴とする状態または疾患の診断のため、または本発明のタンパク質または相同タンパク質、またはそのエフェクター、例えばアゴニスト（作用薬）、アンタゴニストまたは阻害（抑制）剤で治療を受けている患者を監視するための測定法において使用することが可能である。診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にある本タンパク質を検出する方法が含まれる。抗体は、その修飾の有無に拘わらず使用することが可能であり、その抗体を共有的または非共有的のいずれかでレポーター分子と結合することによって標識化することが可能である。当分野で周知の種々のレポーター分子を用いることが可能であり、そのさまざまなレポーター分子を上述した。
【００６５】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびＦＡＣＳを始めとするタンパク質を測定するための種々のプロトコルは当分野では周知であり、改変または異常レベルの遺伝子発現を診断する基準を提供する。遺伝子発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物である被検体、望ましくはヒトから採取した体液または細胞を本タンパク質に対する抗体と結合させることによって決定する。標準複合体の形成量は、種々の方法によって定量化することが可能であるが、測光的な手段を用いることが望ましい。生検細胞の制御サンプルおよび疾患サンプル中に発現したタンパク質の量を標準値と比較する。標準値と被検体値の偏差は、疾患を診断するためのパラメータを樹立する。
【００６６】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質または相同タンパク質に特定のポリヌクレオチドを診断のために用いることも可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ分子とＤＮＡ分子、およびＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、検体における遺伝子発現が疾患と相関し得るような該検体における遺伝子発現を検出および定量することが可能である。診断アッセイを用いて、遺伝子発現の不在、存在および過剰を区別すること、および治療介入中のタンパク質レベルの調節を監視することが可能である。
【００６７】
一実施形態によれば、本発明のタンパク質および相同タンパク質または近縁の分子をコードするゲノム配列を始めとするポリヌクレオチド配列を検出する能力を持つプローブを用いたハイブリダイゼーションを用いて、それぞれのタンパク質をコードする核酸配列を同定することが可能である。本発明のハイブリダイゼーションプローブはＤＮＡまたはＲＮＡであり、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に由来するか、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然遺伝子のイントロンを始めとしたゲノム配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することができ、その例としては３２Ｐまたは３５Ｓ等の放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブと共役したアルカリホスファターゼ等の酵素標識等が挙げられる。
【００６８】
本発明のタンパク質および相同性を有する核酸に特異的なポリヌクレオチド配列は、タンパク質の発現に関連する状態または疾患の診断のために使用することが可能である。そのような状態または疾患の例には、肥満症および糖尿病を始めとする代謝疾患および障害が含まれるが、それらに限定されるものではない。本発明のタンパク質または相同タンパク質に特異的なポリヌクレオチド配列を用いて、肥満症および糖尿病を始めとする代謝の疾患と障害に対して治療を受けている患者の進渉状況を監視することができる。ポリヌクレオチド配列は、変性遺伝子発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、定性アッセイまたは定量アッセイ、例えばサザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜系の技術、およびＰＣＲ法、またはディップスティック法、ピンＥＬＩＳＡ法またはチップアッセイにおいて使用することが可能である。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質に特異的なヌクレオチド配列および相同核酸は、肥満症、糖尿病、および（または）代謝症候群を始めとする種々の代謝疾患または機能障害、さらには、摂食障害、悪質液、高血圧、冠動脈性心疾患、高コレステロール血症、異脂肪血症、骨関節炎、胆石症、または肝臓線維症のような関連障害における活性または誘発を検出するアッセイにおいて有用であり得る。ヌクレオチド配列は、標準法で標識化されることが可能であり、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液または組織の試料に添加することが可能である。好適なインキュベーション期間の後には、その試料を洗浄し、そしてそのシグナルを定量化して標準値と比較する。生検サンプルまたは抽出サンプルにおけるシグナル量が類似サンプルのシグナル量と比べて著しく変化している場合は、サンプル内のヌクレオチド配列でハイブリダイゼーションを行なうと、そのサンプル中の本発明のタンパク質および相同タンパク質をコードするヌクレオチド配列の変異レベルの存在は、関連疾患の存在を示す。また、このようなアッセイを用いて、動物実験、臨床試験または個々の患者の治療監視において、特定の治療上療法の有効性を評価することも可能である。
【００７０】
本発明のタンパク質および相同タンパク質の発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常プロフィールまたは標準プロフィールを樹立する。これは、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被検体から抽出した体液または細胞を、本発明のタンパク質および相同核酸をコードする核酸に特異的な配列またはその断片と結合させることによって達成し得る。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被検体から得た値を、既知量の十分に精製したポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことができる。正常試料から得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得た試料から得た値と比較することが可能である。標準値と被検者値間の偏差を用いて疾病の存在を確定する。ひとたび疾患の存在を樹立して、治療プロトコルを開始した時点では、患者の発現レベルが正常患者において観察されるレベルに近づき始めるかどうかを評価するために、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返すことが可能である。連続アッセイから得た結果を用いて、数日〜数ヶ月の期間にわたる治療効果を明らかにすることができる。
【００７１】
上記のような代謝疾患に関して、個人の生検組織における異常な量の転写物の存在は、疾患の発生に対する素因を示すかまたは実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する手段を提供することが可能である。この種のより一層信頼のおける診断により、医療の専門家が予防措置または積極的な早期治療を施し、膵臓の疾病および障害の発生またはさらなる進行を防止することが可能となる。本発明のタンパク質および相同タンパク質をコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドの診断上での追加用途は、ＰＣＲ法の使用に関与し得る。このオリゴマーは、化学的に合成しても良いし、酵素的に作成するか、または組換えソースから作り出しても良い。オリゴマーは望ましくは２つのヌクレオチド配列から構成され、１つはセンス方向（５′．ｆｗｄａｒｗ．３′）、他の１つアンチセンス方向（３′．ｒａｒｗ．５′）で、特定遺伝子または条件の識別のために、最適化された条件下で用いられる。オリゴマーのネスト化したセットまたは縮重オリゴマーの集積である２つの同一オリゴマーを、あまりストリンジェントでない条件下で用いて、緊密に関連したＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の検出および（または）定量化を行なうことができる。
【００７２】
本発明のタンパク質または相同タンパク質の発現を定量化するために使用可能な方法には、放射標識またはビオチンヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる（Ｍｅｌｂｙ  Ｐ．Ｃ．らの（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１５９：２３５−２４４；Ｄｕｐｌａａ  Ｃ．らの（１９９３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：２２９−２３６）。複数試料の定量化速度は、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にあるＥＬＳＡ形態のアッセイを実行することによって加速し得る。
【００７３】
また、本発明の別の実施例によれば、核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするために有用であるハイブリダイゼーションプローブを作成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または周知の方法を用いて染色体の特異的な領域にマッピングすることが可能である。このような技術には、Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．（１９９３）Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．７：１２７−１３４およびＴｒａｓｋ，Ｂ．Ｊ．（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７：１４９−１５４．ＦＩＳＨ（Ｖｅｒｍａらの（１９８８）Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載のとおり）などの文献で論評されているように、ＦＩＳＨ、ＦＡＣＳまたは酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌Ｐ１構築または単一染色体相補ＤＮＡライブラリが含まれる。この結果は、他の物理的な染色体マッピング技術および遺伝マップデータと相関し得る。遺伝地図データの例は、１９９４Ｇｅｎｏｍｅ  ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２６５：１９８１ｆ）にある。物理的染色体地図上の本発明のタンパク質をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するＤＮＡの領域を画定するのに役立ち得る。
【００７４】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、または感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することが可能である。確定した染色体マーカーを使用する、染色体標本および連鎖分析のような物理的マッピング技術のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を用いて、遺伝地図を拡張することが可能である。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上への遺伝子の配置は、多くの場合、特定のヒト染色体の数またはアームが未知の場合でさえも、関連するマーカーを明らかにすることが可能である。新配列は、物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これによって、位置クローニングまたは他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を探索する研究者にとって貴重な情報が提供される。ひとたび疾患または症候群を、例えばＡＴ  ｔｏ  １１ｑ２２−２３（Ｇａｔｔｉ  Ｒ．Ａ．らの（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３６：５７７−５８０）などの特定ゲノム領域への遺伝的連鎖によって大まかに位置決めを行なうと、その領域に対してマッピングする任意の配列が、さらなる調査のための関連遺伝子または調節遺伝子に相当し得る。また、本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転などに起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することもできる。
【００７５】
本発明の別の実施例によれば、本発明のタンパク質、それらの触媒作用断片または免疫抗原断片またはそのオリゴペプチド、試験管内モデル、遺伝子操作を受けた細胞または動物を用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物、例えば、ペプチドまたは低分子量有機化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。１つ以上の本発明のタンパク質の作用に結合、乃至は該作用を調節または模倣する修飾因子／エフェクター、例えば受容体、酵素、タンパク質、リガンドまたは基質を同定することができる。そようなスクリーニングに用いるタンパク質またはその機能的断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、または細胞内に位置していても良い。タンパク質とテストされる薬剤との間の結合複合物の形成を測定することも可能である。また、薬剤が直接的または間接的に本発明のタンパク質の活性に影響を及ぼすことも可能である。
【００７６】
生体内では、基質に対するミニブレイン相同キナーゼの無修飾ポリペプチドの酵素性キナーゼ活性を測定することができる。そのキナーゼの活性化は、シグナル伝達分子または環境的な影響のような細胞外のまたは細胞内の刺激によって天然の状況において誘導することが可能である。ミニブレイン相同キナーゼを含むシステムは、それが細胞または無細胞の環境の生物体、組織、培養であれ、外因的にこの刺激を適用することによって、または種々の技術でこの刺激を模倣することによって作成することが可能であり、さらにその一部を以下に記載した。ミニブレイン相同キナーゼを含んだシステムは、（ｉ）体重調節および熱産生、例えば、限定するものではないが、代謝疾患に関連する疾患および障害の診断、試験、予防、および治療の目的のため、（ｉｉ）本発明の遺伝子またはそれらのコード化されたポリペプチに影響を及ぼす治療薬候補、医薬品または薬物を同定または確証する目的のため、（ｉｉｉ）本発明の遺伝子によってコードした活性化ポリペプチドを含んだ細胞可溶化液を作成する目的のため、（ｉｖ）本発明の遺伝子によってコードしたこのソース活性化ポリペプチドから分離する目的のため産生することが可能である。
【００７７】
本発明の一実施例によれば、上記の当該目的のため、天然刺激に非依存性の活性化したミニブレイン相同キナーゼを、例えば下記によって産生することが可能であるできるが、これらに限定されるものではない。（ｉ）天然刺激を模倣する薬剤；（ｉｉ）既存または将来に開発され得るミニブレイン相同キナーゼの活性化剤、ミニブレイン相同キナーゼ自体の構成型活性対立遺伝子のような天然刺激の下流の役割を果たす薬剤；（ｉｉｉ）構成型活性形態を作り出すためのミニブレイン相同キナーゼ配列内での単一または複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入の導入；（ｉｖ）ミニブレイン相同キナーゼの分離断片の使用。加えて、このシステムに、活性化組成物を同時転移することによって、異所性システム、真核または原核、生体内または試験管内において酵素的に活性なミニブレイン相同キナーゼを作成することが可能である。
【００７８】
加えて、その生理的基質またはその誘導体に対するミニブレイン相同キナーゼの活性は細胞系アッセイにおいて測定し得る。また、薬剤は、リン酸化および脱リン酸、ファルネシル化、パルミトイル化、アセチル化、アルキル化、ユビキチン結合、蛋白分解性処理、細胞内局在性および劣化のようなのような本発明のタンパク質の翻訳後の修飾を妨害する可能性もある。その上、薬剤は、本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響し、または異種様式で、他のタンパク質、例えば、限定するものではないが、ドッキングタンパク質、酵素、受容体、オンチャンネル、脱共役タンパク質、または翻訳因子を備えた本発明のタンパク質の二量体化またはオリゴマー形成に影響を及ぼし得る。また、薬剤は、タンパク質機能（作用）、例えば、限定するものではないが、下流のシグナル伝達に必要とされる他のタンパク質を備えた本発明のタンパク質の物理的相互作用に作用することがある。
【００７９】
タンパク質間の相互作用を判定するための方法は当分野で周知である。例えば、本発明のタンパク質に由来する蛍光標識ペプチドの結合タンパク質への結合は、分極の変化によって検出し得る（その逆の場合も同様）。結合相手は完全長タンパク質であっても、完全長タンパク質としての結合相手の１つであっても、単なるペプチドであってよいが、その両方の結合相手が共に蛍光標識される場合、その結合は、蛍光色素の他の蛍光色素への蛍光エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって検出することができる。加えて、種々の市販されている、タンパク質間相互作用の検出のために好適なアッセイ原理は当分野で周知であり、例えば、限定するものではないがＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）またはＡｍｅｒｓｈａｍ社のシンチレーション近接測定法（ＳＰＡ）が挙げられる。あるいは、本発明のタンパク質の細胞タンパク質との相互作用は、両タンパク質が蛍光標識され、両タンパク質の相互作用が、限定するものではないが、例えばＣｅｌｌｏｍｉｃｓ社またはＥｖｏｔｅｃＯＡＩ社の開発による細胞イメージング読取装置を用いて両タンパク質の同時転座分析によって検出される細胞を利用したスクリーニングアッセイの基盤であり得る。すべての場合において、２つの以上の結合相手は互いに異なるタンパク質であり、その結合相手の１つは本発明のタンパク質であるか、または二量体化および（または）オリゴマー形成の場合は本発明のタンパク質自体であリ得る。１つ（唯一ではない）の対象標的機構がそのようなタンパク質／タンパク質相互作用である本発明のタンパク質は、ミニブレイン相同キナーゼである。
【００８０】
本発明のタンパク質の酵素活性、キャリア活性、またはイオンチャンネル活性を判定する測定法は当分野で周知である。また、当技術分野で周知なものには、受容体リガンド結合を測定するための種々のアッセイフォーマットもある。
【００８１】
特に興味深いのは、哺乳動物の細胞に対して低毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。本明細書で使用した用語「薬剤」とは、１つ以上の本発明のタンパク質の生理機能を改変または模倣する能力を有する任意の分子、例えばタンパク質または医薬品のことである。候補薬剤は、典型的には有機分子であり、望ましくは５０〜約２，５００ドルトンの分子量を有する小有機化合物であるが、幾多の化学的クラスを包含する。候補薬剤には、タンパク質、特に水素結合との構造上での相互作用に必要な機能グループが含まれ、そして典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、望ましくは少なくとも２つの機能化学グループが含まれる。候補薬剤には、多くの場合、炭素環式構造または複素環式構造、および（または）１つ以上の上記機能グループと置換された芳香族構造またはポリ芳香族構造が包含される。
【００８２】
候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、核酸および誘導体、構造上の類似体またはその組み合わせを含んだ生体分子間に見出される。候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを始めとするさまざまな原料から取得する。例えば、任意に抽出されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を始めとして、さまざまな有機化合物および生体分子のランダム合成および特異的合成のための多くの手段が提供されている。或いは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物形態の天然化合物のライブラリは入手可能であるか、または容易に作り出すことができる。その上、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を介して、天然または合成的に作り出したライブラリおよび化合物は容易に修飾でき、それらを用いて組み合わせライブラリを作り出すことが可能である。アシル化、アルキル化、エステル化、アミジン化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などのような公知の薬剤は、構造上での類似体を作り出すために、特異的またはランダムな化学的修飾の対象となり得る。スクリーニングアッセイが結合実験である場合、１つ以上の分子が標識に結合することが可能であり、その標識は直接的または間接的に検出可能な信号を提供する。
【００８３】
また、候補薬剤を、さらに以下に記載したように修飾を含むかまたは含まないタンパク質、ペプチド、脂質、または有機化合物のようなキナーゼ基質などが本発明のタンパク質またはタンパク質断片によってリン酸化されるキナーゼアッセイにおいて見出すことも可能である。本キナーゼは、本発明のタンパク質（例えば、ミニブレイン相同キナーゼ）またはその活性が本発明のタンパク質によって影響されるキナーゼであり得る。治療薬候補は、本発明のタンパク質の酵素性活性を増加または減少する能力によって同定することが可能である。キナーゼ活性は、リン酸化に起因する基質の化学的、物理的または免疫学的な特質の変化によって検出することが可能である。一実施例としては、放射性同位体的に標識したリン酸基を適切なドナー分子から本発明のポリペプチドによって触媒したキナーゼ基質への転移が挙げられるであろう。基質のリン酸化に継いで、当技術分野で周知の技術を用いて基質オートラジオグラフィーを検出することが可能である。
【００８４】
さらに別の実施例によれば、そのリン酸化に起因する基質の質量変化は、質量分析技術によって検出することが可能である。また、基質のリン酸化状態と非リン酸化状態とを区別する分析物を有する基質のリン酸化状態を検出することもできる。そのような分析物は、基質のリン酸化形態とび非リン酸化形態に対して異なる親和性を有することによって、またはリン酸基に対して特定の親和性を有することによって作用することがある。そのような分析物は、限定するものではないが、抗体または抗体誘導体、組換え（型）の抗体様構造、タンパク質、核酸、分子を含んだ複合型の金属イオン、アニオン交換クロマトグラフィーマトリックス、親和性クロマトグラフィーマトリックスまたはその他任意の基質に対してリン酸化依存選択性を有する分子であり得る。
【００８５】
そのような分析物は、酵素性反応中またはその後に固形担体上に固定したキナーゼ基質を検出するために利用することができる。分析物が抗体である場合、その基質に対する結合は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９９８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＣＳＨ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ．において記載されているように、種々の技術によって検出することができる。分析物分子が抗体でない場合には、その結合はその化学的、物理的または免疫学的な特質が内生的にその結合に関連することによって、またはその結合に対して人工的に操作することによって検出することが可能である。
【００８６】
さらに別の実施例によれば、キナーゼ基質は、基質のリン酸化状態の分析に好適な信号を作成するために、結合または検出を促進する目的で設計された特色または内因性の特色を有することが可能である。これらの特色は、限定するものではないが、ビオチン分子またはその誘導体、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ部分、６以上の連続したヒスチジン残基の１部分、アミノ酸配列またはエピトープ（抗原決定基）タグとしての機能（作用）に対するハプテン、蛍光色素、酵素または酵素断片であり得る。キナーゼ基質は、これらまたは他の特色に対して、立体障害を回避するために分子のスペーサアームを用いて連鎖することが可能である。
【００８７】
一実施例によれば、キナーゼ基質は蛍光色素を用いて標識することが可能である。溶液中における標識基質に対する分析物の結合後に、文献  （例えば、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｓ．らの（１９９９）Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔｉｃｓ（ＳＰＩＥ）３６０３：２６１；Ｐａｒｋｅｒ  Ｇ．Ｊ．らの（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．５：７７−８８；Ｗｕ  Ｐ．らの（１９９７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：２９−３６を参照）において記載されているように蛍光偏光の技術を行うことが可能である。この実施例の変形例によれば、蛍光性トレーサー分子は、分析物がキナーゼ活性を検出するために、当業者であれば間接蛍光偏光として公知の技術によって基質と競合することが可能である。
【００８８】
使用可能な別の薬剤スクリーニング技術は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ８４／０３５６４に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングを提供する。この方法においては、本発明のタンパク質に対して適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物をプラスチックピンまたは他表面などの固体基質上で合成する。試験用化合物は、本発明のタンパク質またはその断片と反応させ洗浄した。次に、結合したタンパク質を、当分野で周知の方法で検出した。精製したタンパク質は、前記した薬剤スクリーニング技術で使用するプレート上で直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。
【００８９】
別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いてもよく、このアッセイ中では、ミニブレイン相同キナーゼを結合する能力を持つ中和抗体が、ミニブレイン相同キナーゼ結合用の試験化合物と特異的に競合する。この方法では抗体を用いて、ミニブレイン相同キナーゼと１つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。
【００９０】
本発明のタンパク質をコードする核酸を用いて、遺伝子導入動物または部位特定の遺伝子改変を細胞株において作成することができる。これらの遺伝子導入非ヒト動物は、生体内における当該タンパク質の機能および調節の研究において有用である。遺伝子導入動物、特に哺乳動物の遺伝子導入動物は、ヒトに共通する多くの発生プロセスおよび細胞プロセスの検討のためのモデル系として役立つことができる。代謝障害を有する種々の非ヒトモデルを用いて、本発明のタンパク質の修飾因子／エフェクターを検査することができる。本発明のタンパク質の異所性発現（例えば過剰発現または発現の欠如）、特定の給餌条件、および（または）生物学的活性化合物の投与により、代謝障害のモデルを作ることができる。
【００９１】
本発明の一実施例によれば、そのようなアッセイでは、レプチン経路遺伝子においてノックアウトを保有しているマウスのようなインスリン耐性および（または）糖尿病のマウスモデルが使用される（例えば、ｏｂ（レプチン）またはｄｂ（レプチン受容体）マウス）。そのような糖尿病の典型的な症状を呈するマウスは肝脂質蓄積を示し、高い頻度で血漿脂質レベルを増加した（Ｂｒｕｎｉｎｇ  Ｊ．Ｃ．らの（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５５９−５６９を参照）。感受性の野生型マウス（例えばＣ５７Ｂｌ／６）は、高脂肪食を与えた場合、類似の症状を示す。そのようなマウス菌株における本発明のタンパク質の発現の検査に加えて（「実施例」セクションを参照）、これらのマウス用いて、候補修飾因子／エフェクターの投与が、例えば肝臓、血漿、または脂肪組織における脂質蓄積を改変するかどうかを、ＦＰＬＣ、比色法、血糖検査、インスリン耐性検査などのようなおよびその他のような当技術分野で周知の標準アッセイを用いて検査することもできる。
【００９２】
遺伝子導入動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の正常な遺伝子座を改変する場合、非ヒト胚幹細胞における相同組換えを介して作ることが可能である。別法としては、本発明のタンパク質をコードする核酸構成物を卵母細胞に注入し、ゲノムにランダムに統合する。安定した統合のベクターには、プラスミド、レトロウィルスなど動物ウィルス、酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）などが含まれる。修飾された細胞または動物は、本発明のタンパク質の機能および調節の研究において有用である。例えば、一連の小欠失および（または）置換を、本発明のタンパク質をコードする遺伝子において行い、膵臓の分化などにおけるタンパク質の特定のドメイン、機能の役割を決定することが可能である。
【００９３】
その上、所定の特異的構成物様の本発明の遺伝子変異体には、本発明のタンパク質の発現または優性阻害型突然変異の発現を阻止するアンチセンス分子が含まれる。本発明の遺伝子発現の上方制御が表現型における変化の容易な検出を結果としてもたらす場合、例えば、ｌａｃ−Ｚまたはルシフェラーゼのような検出可能なマーカーを本発明の遺伝子の遺伝子座に導入することが可能である。
【００９４】
また、通常には発現されない細胞や組織、または異常発生中の細胞や組織においては、本発明の遺伝子の発現またはその変異体を提供することも可能である。加えて、本発明のタンパク質の発現を、通常には産生されない細胞中に提供することによって、細胞行為の変化を誘引することが可能である。
【００９５】
相同組換えＤＮＡ構成物には、所望の遺伝的な修飾を有する本発明の遺伝子の一部が少なくとも含まれており、標的遺伝子座に対するホモロジー領域も含まれる。ランダム統合のためのＤＮＡ構成物には、組換えを仲介するための相同領域が含まれる必要はない。都合よく、ポジティブ選択およびネガティブ選択用のマーカーを含む。ランダム統合のためのＤＮＡ構成物には、本発明のタンパク質、調節エレメント（プロモーター）、イントロンおよびポリアデニル化信号をコードする核酸から成る。相同組換えを通して標的遺伝子修飾を有する細胞を作成する方法は当分野で周知である。非ヒト胚幹（ＥＳ）細胞は、ＥＳ細胞株を用いても良いし、または胚細胞を宿主、例えばマウス、ラット、モルモットなどから新たに取得しても良い。そのような細胞は、適切な線維芽細胞−支持細胞層の上で増殖さしめてから、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で増殖する。
【００９６】
非ヒトＥＳまたは胚細胞または体細胞の多能性ヒト幹細胞を形質移入する場合、それらの細胞を用いて遺伝子導入動物を作り出すことが可能である。形質移入後、細胞を適切な培地の支持細胞層にプレーティングする。その構成物を含んでいる細胞は、選択培地を用いることによって選択することが可能である。コロニーを十分な時間をかけて増殖した後、コロニーを摘出し、相同組換えまたは構成物の統合の発生率を分析する。陽性反応を示すコロニーは、胚操作および桑実胚凝集に用いることが可能である。つまり、桑実胚を４〜６週間目の過排卵雌から取得し、透明帯を除去し、桑実胚を組織培養皿の小凹部に入れる。ＥＳ細胞をトリプシン処理し、そしてその修飾細胞は桑実胚に密接して凹部に置く。次の日には、凝集体を偽妊娠の雌の子宮角に移す。次に、雌に出産せしめる。キメラの子孫は、外殻の変化によって容易に検出することができ、引き続いて突然変異の次世代への伝達のためにスクリーニングする（Ｆ１世代）。Ｆ１−世代の子孫を修飾遺伝子の存在に対してスクリーニングし、修飾した雄および雌を交尾させ、ホモ接合性の子孫を作り出す。その遺伝子改変が成長の過程における死亡率の原因となる場合には、組織または器官は、同種間移植用または類遺伝子性移植用、または移植、または体外培養用として維持することができる。遺伝子導入動物は、実験動物、家畜など、例えばマウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ウシ、ブタなどのような任意の非ヒト哺乳動物であり得る。遺伝子導入動物は、機能的研究、薬物スクリーニングおよび他の用途において用いることが可能であり、そして生体内における本発明タンパク質の機能および調節の研究に有用である。
【００９７】
また、最終的に、本発明は少なくとも下記の  １  つから成るキットに関するものである。
【００９８】
（ａ）  本発明のタンパク質またはその機能的断片の核酸分子コーディング；
（ｂ）  本発明のタンパク質または機能的断片またはそのアイソフォーム；
（ｃ）  （ａ）の核酸を備えているベクター；
（ｄ）  （ａ）の核酸または（ｃ）のベクターから成る宿主細胞；
（ｅ）  （ａ）の核酸によってコード化されたポリペプチド；
（ｆ）  （ａ）の核酸によってコード化された融合ポリペプチド；
（ｇ）  （ａ）の核酸、または（ｂ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリペプチドの抗体、アプタマーまたは別の修飾因子／エフェクター、および
（ｈ）  （ａ）の核酸アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【００９９】
本キットは、上述のように、診断用または治療用またはスクリーニング用に使用することが可能である。本キットには、さらに取扱説明書が含まれる場合がある。
【０１００】
各図が示すのは下記のとおりである：
図１は、ショウジョウバエミニブレイン（Ｇａｄｆｌｙアクセッション番号ＣＧ７８２６）変異体の中性脂肪含有量を示す。ここに示したのは、ＥＰコレクション（「ＥＰ対照」と呼ぶ、コラム１）のすべてのハエを含有する対照群と比較した、Ｐベクターの注釈された相補ＤＮＡ（「ＨＤ−ＥＰ１１２０３」と呼ぶ、コラム２）のイントロン（ＬＤ３４８４６の第１エキソンの２１７塩基対３′）への生存能力のあるヘミ接合性の統合によって引き起こされるＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３ハエの中性脂肪含有量の変化である。
【０１０１】
図  ２はミニブレイン遺伝子座の分子構造を示す。
【０１０２】
図３は、ミニブレイン遺伝子産物（クエリ）のＢＬＡＳＴＰ検索結果を、３つの最もよくマッチするヒトホモログ（参照）と共に示す。
【０１０３】
図４は、哺乳動物（マウス）組織における  ２  つのミニブレインホモログの発現を示す。
【０１０４】
図４Ｂは、野生型マウス組織における二重特異性−（Ｙ）−リン酸化調節キナーゼ１ａ（Ｄｙｒｋ１ａ）発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【０１０５】
図４Ｂは、異なるマウスモデルにおけるＤｙｒｋ１ａ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【０１０６】
図４Ｃは、高脂肪食を与えたマウスにおけるＤｙｒｋ１ａ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を、標準食を与えたマウスと比較して示す。
【０１０７】
図４Ｄは、３Ｔ３−Ｌ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＤｙｒｋ１ａ発現のリアルタイムＰＣＲ分析示す。
【０１０８】
図４Ｅは、野生型マウス組織における二重特異性−（Ｙ）−リン酸化調節キナーゼ１ｂ（Ｄｙｒｋ１ｂ）発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【０１０９】
図４Ｆは、異なるマウスモデルにおけるＤｙｒｋ１ｂ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【０１１０】
図４Ｇは、高脂肪食を与えたマウスにおけるＤｙｒｋ１ｂ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を、標準食を与えたマウスと比較して示す。
【０１１１】
図４Ｈは、３Ｔ３−Ｌ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＤｙｒｋ１ｂ発現のリアルタイムＰＣＲ分析示す。
【０１１２】
各実施例は本発明を図解するものである。
【０１１３】
実施例１：ショウジョウバエにおける中性脂肪含有量の測定
変異体ハエはハエ変異在庫コレクションから取得する。ハエは当業者であれば公知の標準条件下で増殖する。実験の過程で、追加給餌をパン酵母（サッカロミセスセレビジエ）とともにＥＰ系統ＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３に与えた。ＥＰベクターを生存能力のあるヘミ接合性統合として含有するショウジョウバエの中性脂肪含有量の平均変化を対照ハエ（図１を参照）と比較検討した。中性脂肪含有量の定量のため、ハエを５分間、９０℃にて水溶性の緩衝液中において水浴を用いてインキュベートした後に熱抽出を行なった。さらなる５分間、９０℃にてインキュベーションし、マイルドな遠心分離を行なった後、Ｓｉｇｍａ社の中性脂肪（ＩＮＴ３３６−１０または−２０）アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って光学的な濃度における変化を測定することによって、ハエ抽出物の中性脂肪含有量を確定した。基準としてＢＩＯ−ＲＡＤ  ＤＣタンパク質アッセイを使用し、製造者のプロトコルに従って同一抽出のタンパク質含有量を測定した。このアッセイを何度か繰り返した。
【０１１４】
ＥＰコレクション（「ＥＰ対照」と呼ぶ）のすべてのハエの平均中性脂肪値は、図１の第１コラムに１００％として示した。測定値の標準偏差は細いバーとして示した。
【０１１５】
ＨＤ−ＥＰ．１１２０３ヘミ接合性ハエは、対照と比べて常に高い中性脂肪含有量を示す（図１におけるコラム２、「ＨＤ−ＥＰ１１２０３」）。以上の点から、遺伝子活性の減少は、エネルギー貯蔵中性脂肪の代謝における変化の原因となる。
【０１１６】
実施例２：中性脂肪代謝に関連するショウジョウバエ遺伝子の同定
本発明のタンパク質をコードする核酸を、プラスミド救出技術を用いて同定した。ＥＰ  ベクター（本明細書中ではＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３）統合に直接的に隣接して局在するゲノムＤＮＡ配列を分離した。これらの分離されたゲノム配列を用いて、Ｂｅｒｋｅｌｅｙショウジョウバエゲノムプロジェクト（ＧａｄＦｌｙ）のような公共データベースをスクリーニングし、それによって、ミニブレイン（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号  ＣＧ７８２６）として同定される、ＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３のＬＤ３４８４６（ＬＤ３４８４６２１７の第１エキソンの塩基対３′）のイントロンへの生存能力のあるヘミ接合性統合部位、センス方向においてショウジョウバエ遺伝子の配列とオーバーラップする転写配列を確認した。図２はこの遺伝子座の分子構造を示す。ＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３のベクター統合の染色体局在部位は遺伝子座Ｘ，１６Ｅ４−Ｆ１にある。図２では、ゲノムＤＮＡ配列を、ＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３の統合部位を含む図の中間における縮尺した黒の二重矢印としてのアセンブリによって表した。チェックマークは、ゲノムＤＮＡ（チェックマークにつき１００００塩基対）の塩基対における長さに相当する。図上部の灰色矢印はＢＡＣクローンを表し、図最上部の黒色矢印は染色体断面図を表す。ショウジョウバエ系統におけるＰエレメント挿入部位は三角形で示し、標識化する。予測遺伝子（ＢｅｒｋｅｌｅｙショウジョウバエゲノムプロジェクトＧａｄＦｌｙおよびＭａｇｐｉｅによって予測されたように）の相補ＤＮＡ配列は濃灰色バー（エキソン）として示し、濃灰色線（イントロン）によって連鎖し、標識化する（図下部キーも参照）。ミニブレイン遺伝子（ｍｎｂと呼ぶ）の予測相補ＤＮＡは図の下半分に示した。加えて、ミニブレイン遺伝子とオーバーラップするＬＤ３４８４６の転写配列は図の下半分に示し、標識化する。以上の点から、ミニブレインをコードする相補ＤＮＡの発現はＨＤ−ＥＰ（Ｘ）１１２０３系統のベクター統合によって影響され、エネルギー貯蔵中性脂肪量の変化につながり得る。
【０１１７】
実施例３：哺乳動物の相同遺伝子およびタンパク質の同定
それによってコード化された中性脂肪代謝の調節機能を有するショウジョウバエ遺伝子およびタンパク質を、ＢＬＡＳＴアルゴリズム探索を用いて、公的に利用できる配列データベースにおいてさらに分析し、そして哺乳動物のホモログを同定した（図３）。
【０１１８】
用語「ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号に示されたヌクレオチド配列から成るポリヌクレオチド」とは、対応するＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号下に保管されるヌクレオチド配列の発現可能な遺伝子に関するものである。用語「ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号」とは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋデータベースエントリに関するものである（Ｂｅｎｓｏｎ  Ｄ．Ａ．らの（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：１５−１８を参照）。配列に対して相同を有するショウジョウバエのミニブレインは、公的に利用できる全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の非重複タンパク質データベースのプログラムＢＬＡＳＴＰ  ２．２．３を用いて同定した（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．らの（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照）。
【０１１９】
表１：ショウジョウバエ（Ｄｍ）  遺伝子のヒトホモログ
【０１２０】
【表１】
2005537794.tif 000002
【０１２１】
従って、ミニブレイン相同タンパク質および核酸分子コーディングは、昆虫または各種脊椎動物、例えば、哺乳動物または鳥から入手可能である。特に好適なのは、表１に記載の核酸である。
【０１２２】
図３に示したように、ショウジョウバエミニブレイン（ＧａｄＦｌｙアクセッション番号ＣＧ７８２６、相補ＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０７８６６８、タンパク質のＡＡＦ４８７７７）の遺伝子産物は、ヒト二重特異性チロシン−（Ｙ）−リン酸化調節キナーゼ１Ａ、アイソフォーム１（タンパク質のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１３８７、相補ＤＮＡのＮＭ＿００１３９６；また、米国特許５，９８１，２５０、米国特許６，１０７，０７４、および米国特許６，２５１，６６４、さらには、ＷＯ０１／８８１８８およびＷＯ０１／１９４６２９（９８％の同一性）においても開示されている）に対して９１％相同であり、ヒトＢＣ３３１００４＿１タンパク質（タンパク質のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ２８９１４．１、相補ＤＮＡのＡＣ００５３９３）に対して８４％相同であり、およびヒト二重特異性チロシン−（Ｙ）−リン酸化調節キナーゼ１Ｂアイソフォーム（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４７０５．１タンパク質の、ＮＭ＿００４７１４相補ＤＮＡの）に対して８７％相同である。また、ショウジョウバエミニブレインは、ヒトＤＹＲＫ１Ａ（相補ＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１０１３９５、ＮＭ＿１３０４３６、ＮＭ＿１３０４３７、およびＮＭ＿１３０４３８、タンパク質のＮＰ＿５６７８２４、ＮＰ＿５６９１２０、ＮＰ＿５６９１２１、ＮＰ＿５６９１２２、ＢＡＡ３３９７５、ＢＡＡ３３９７６、ＢＡＡ３３９７７、ＡＡＤ３１１６９、ＣＡＡ０５０５９、ＣＡＡ０５０６０、ＢＡＡ１２８６６、ＢＡＡ１３１１０、ＡＡＢ１８６３９、ＡＡＣ５０９３９、ＣＡＡ８０９１０）のさらなるアイソフォームに対してタンパク質レベル上に相同性も示す。また、ショウジョウバエミニブレインは、ヒトＤＹＲＫ１Ｂ（相補ＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４７１４、ＮＭ＿００６４８３、ＮＭ＿００６４８４、タンパク質のＮＰ＿００４７０５、ＮＰ＿００６４７４、ＮＰ＿００６４７５、ＡＡＦ１５８９３、ＡＡＨ１８７５１、ＡＡＨ２５２９１、ＣＡＡ７６９８９、ＣＡＡ７６９９０、ＣＡＡ７６９９１）のさらなるアイソフォームに対してタンパク質レベル上に相同性も示す。また、ショウジョウバエミニブレインは、さらなるヒトタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ２８９１４）に対してタンパク質レベル上に相同性も示す。また、ショウジョウバエミニブレインは、マウスＤｙｒｋ１ａ（相補ＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿１２８３３６）およびマウスＤｙｒｋ１ｂ（相補ＤＮＡのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１００９２）に対してタンパク質レベル上に相同性も示す。
【０１２３】
実施例４：哺乳動物（マウス）の組織におけるポリペプチドの発現
本発明において開示した哺乳動物組織におけるポリペプチドの発現を分析するため、さまざまなマウス菌株（望ましくは、標準モデル系における肥満症および糖尿病の研究である、マウス菌株Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ、Ｃ５７Ｂｌ／６ｏｂ／ｏｂおよびＣ５７Ｂｌ／ＫＳｄｂ／ｄｂ）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ（３３１７８Ｂｏｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒ  ｍａｎｙ）から購入し、一定の温度に維持し（望ましくは２２℃）、湿度を４０パーセントおよび望ましくは明暗サイクルを１４／１０時間とした。マウスには標準食を与えた（例えばｓｓｎｉｆｆ  Ｓｐｅｚｉａｌｉｔａｔｅｎ有限責任会社、製品番号ｎｉｆｆ  Ｍ−Ｚ  Ｖ１１２６−０００）。絶食実験（「絶食野生型マウス」）に関しては、野生型マウスを、食物を与えずに水のみを適時に与えるだけで４８時間飢えさしめた（例えば、Ｓｃｈｎｅｔｚｌｅｒ  Ｂ．らの１９９３，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：２７２−２８０，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｔ．Ｍ．らの１９９６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：３４３４−３４３８を参照）。さらなる実験では、野生型（ｗｔ）マウスに制限食（望ましくはＡｌｔｒｏｍｉｎ  Ｃ１０５７  ｍｏｄ制御、４．５％の粗脂肪）または高脂肪食（望ましくはＡｌｔｒｏｍｉｎ  Ｃ１０５７  ｍｏｄ．高脂肪、２３．５％の粗脂肪）を与えた。動物は６〜８週間目に達した時点で屠殺した。動物組織は、当業者であれば公知の標準手順に従って分離し、液体窒素で簡易冷凍し、必要となるまで−８０℃にて貯蔵した。
【０１２４】
本発明において開示した試験管内分化におけるタンパク質の役割を分析するため、哺乳動物細胞の培養細胞、前脂肪細胞の脂肪細胞への変換、哺乳動物の線維芽細胞（３Ｔ３−Ｌ１）細胞（例えば、Ｇｒｅｅｎ  Ｈ．およびＫｅｈｉｎｄｅ  Ｏ．，１９７４，Ｃｅｌｌ  １：  １１３−１１６）をＡｍｅｒｉｃａｎＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州ハナサスのＡＴＣＣ、；ＡＴＣＣ−ＣＬ  １７３）から入手した。３Ｔ３−Ｌ１細胞は線維芽細胞として維持し、従来技術に記述されているように脂肪細胞に分化した（例えば、Ｑｉｕ  Ｚ．らの２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１１９８８−１１９９５；Ｓｌｉｅｋｅｒ  Ｌ．Ｊ．らの１９９８、ＢＢＲＣ２５１：２２５−２２９）。つまり、細胞をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）中で、５０，０００細胞／ウェルにて、６ウェルのプラスチック皿に二通りにプレーティングし、５％のＣＯ２ａｔ３７℃加湿環境で培養した。密集日（第０日目と定義した：ｄ０）に細胞を、ＤＭＥＭ／ＨａｍＦ１２（３：１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フェチュイン（３００μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）、トランスフェリン（２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ社）、パントテン酸（１７μＭ；Ｓｉｇｍａ社）、ビオチン（１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）、およびＥＧＦ（０．８ｎＭ；Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社、Ｂａｓｅｌ、スイス）を含有する無血清（ＳＦ）培地に移した。分化は、デキサメサゾン（ＤＥＸ；１μＭ；Ｓｉｇｍａ社）、３−メチル−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＭＩＸ；０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ社）、およびウシインスリン（５μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加することによって誘導した。集密日（ｄ４）後の４日間は、分化が完了するまで、細胞をウシインスリン（５μｇ／ｍｌ）を含んだＳＦ培地中に保持した。分化手順の異なる時点、第０日目（密集日）を始めに、第２日目（ホルモン追加；例えば、デキサメタゾンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチンの追加）、および１０日間を最大とする分化中で、好適な細胞のアリコットを２日毎に採取した。
【０１２５】
ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（例えば、ドイツＫａｒｌｓｒｕｈｅのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して組織および細胞から分離し、さらにＲＮｅａｓｙキット（例えば、ドイツＱｉａｇｅｎ社製）と共にＤＮａｓｅ処理を使用し、製造者の指示に従って当業者であれば公知の方法で精製した。全ＲＮＡを逆転写（望ましくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツからのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＲＮａｓｅＨ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを利用する）し、全ＲＮＡをＴａｑｍａｎ分析の対象とし、望ましくはＴａｑｍａｎ２ｘＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ；このミックスには、製造者によれば、例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑゴールドＤＮポリメラーゼ、Ａｍｐｅｒ  ａｓｅ  ＵＮＧ、ｄＵＴＰを有するｄＮＴＰ、受動基準Ｒｏｘおよび最適化された緩衝液成分などが含まれる）をＧｅｎｅＡｍｐ５７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ）上に用いた。
【０１２６】
Ｔａｑｍａｎ分析は、望ましくは下記のプライマー／プローブペアを用いて実施した：
マウス二重特異性チロシン−（Ｙ）−リン酸化調節キナーゼ１ａ（Ｄｙｒｋ１ａ）配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ＿１２８３３６）の増幅用：
マウスＤｙｒｋ１ａフォーワードプライマー（配列識別番号：１）：５′−ＴＧＣ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＧＴ  −３′；マウスＤｙｒｋ１ａリバースプライマー（配列識別番号：２）：５′−ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡ  −３′；マウスＤｙｒｋ１ａ  Ｔａｑｍａｎプローブ（配列識別番号：３）：（５／６−ＦＡＭ）−ＴＴＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＣＴＣ−（５／６−ＴＡＭＲＡ）。
【０１２７】
マウス二重特異性チロシン−（Ｙ）−リン酸化調節キナーゼ１ｂ（Ｄｙｒｋ１ｂ）配列  （ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１００９２）の増幅用：
マウスＤｙｒｋ１ｂフォーワードプライマー（配列識別番号：４）：５′−ＴＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＴＧ  −３′；マウス  Ｄｙｒｋ１ｂ  リバースプライマー（配列識別番号：５）：５′−ＣＡＴ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＡＧＡ  ＧＣ  −３′；マウス  Ｄｙｒｋ１ｂ  Ｔａｑｍａｎ  プローブ（配列識別番号：６）：（５／６−ＦＡＭ）−ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  Ｔ  −（５／６−ＴＡＭＲＡ）。
【０１２８】
図４では相対ＲＮＡ発現をＸ軸上に示す。図４Ａ−Ｃおよび４Ｅ−Ｇにおいて、検査した組織はＸ軸上に示した。「ＷＡＴ」は白色脂肪組織を参照し、「ＢＡＴ」は茶色脂肪組織を参照する。図４Ｄおよび４Ｈでは、Ｘ軸は時間軸を表す。「ｄ０」は第０（ゼロ）日目（実験開始日）を指し、「ｄ２」〜「ｄ１０」は脂肪細胞分化の第２日目目〜第１０日目目を指す。
【０１２９】
代謝における本発明のタンパク質の機能（作用）は、異なる組織における転写物の発現の分析、および脂肪細胞分化における役割の分析によって、本発明でさらに確証した。発現プロファイリングの研究は、哺乳動物におけるエネルギー代謝の制御因子としてのＤｙｒｋ１ａおよびＤｙｒｋ１ｂの特定の関連性を確認する。
【０１３０】
本発明の一実施例では、本発明のタンパク質の発現を研究するため、レプチン経路に遺伝子ノックアウトを保有するマウスのような（例えば、ｏｂ／ｏｂ（レプチン）またはｄｂ／ｄｂ（レプチン受容体／リガンド）マウス）インスリン耐性および（または）糖尿病のマウスモデルを使用した。そのような糖尿病の典型的な症状を呈するマウスは肝脂質蓄積を示し、高い頻度で血漿脂質レベルを増加した（Ｂｒｕｎｉｎｇ  Ｊ．Ｃ．らの（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：５５９−５６９を参照）。
【０１３１】
また、さらなる発明の実施の形態では、本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡの発現も、高脂肪食を与えた場合に糖尿病、脂質蓄積、および血漿脂質高値の徴候を示す感受性の野生型マウス（例えば、Ｃ５７Ｂｌ／６）において検討した。
【０１３２】
Ｔａｑｍａｎ分析により、いくつもの哺乳動物組織においてＤｙｒｋ１ａが発現されることが明らかにされており、その発現レベルは、筋肉において最も高く、次いで、その他の組織、例えば、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、茶色脂肪組織（ＢＡＴ）、視床下部、脳、精巣、結腸、小腸、心臓、肺臓、脾臓、および腎臓において高いことが分かっている。その上、図４Ａに示したように、Ｄｙｒｋ１ａは、野生型マウスの肝臓、膵臓、および骨髄においても低いが強いレベルで発現される。発明者らは、例えば、Ｄｙｒｋ１ａが、野生型マウスと比較すると、遺伝的に誘発された肥満したマウス（ｏｂ／ｏｂ）の視床下部において僅かながら上方制御されることを見出した。その上、Ｄｙｒｋ１ａは、野生型マウスに比較すると、絶食マウスの骨髄において下方制御される（図４Ｂを参照）。高脂肪食を与えた野生型マウスでは、図４Ｃに示したようにＤｙｒｋ１ａの発現は筋肉においては上方制御され、肝臓および小腸においてはわずかに下方制御される。本発明では（図４Ｄを参照）、Ｄｙｒｋ１ａのｍＲＮＡが成熟脂肪細胞への分化中に発現されることを明らかにする。以上の点から、Ｄｙｒｋ１ａタンパク質が脂質生成において重要な役割を果たす可能性がある。
【０１３３】
野生型マウスの代謝活性組織におけるＤｙｒｋ１ａの発現も、代謝障害を研究するために使用される異なる動物モデルにおけるＤｙｒｋ１ａの調節も、この遺伝子がエネルギー恒常性において中枢的な役割を果たすことを示唆する。
【０１３４】
Ｔａｑｍａｎ分析により、Ｄｙｒｋ１ｂが、いくつもの哺乳動物組織において発現することが明らかにされており、その発現レベルは、精巣において最も高く、次いで、その他の組織、例えば、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、茶色脂肪組織（ＢＡＴ）、筋肉、視床下部、脳、心臓、肺臓、および腎臓において高いことが分かっている。その上、図４Ｅに示したように、Ｄｙｒｋ１ｂは、野生型マウス肝臓、結腸、小腸、および脾臓においても低いが強いレベルで発現される。発明者らは、例えば、野生型マウスと比較すると、Ｄｙｒｋ１ｂが遺伝的に誘発された肥満したマウス（ｏｂ／ｏｂ）のＷＡＴおよび骨髄において下方制御されることを見出した。その上、野生型マウスに比較すると、Ｄｙｒｋ１ｂが絶食マウスの心臓と骨髄において下方制御される（図４Ｆを参照）。高脂肪食を与えた野生型マウスでは、図４Ｇに示したように、Ｄｙｒｋ１ｂの発現は、筋肉において上方制御され、肝臓および小腸においてはわずかに下方制御される。本発明では（図４Ｈを参照）、Ｄｙｒｋ１ｂのｍＲＮＡが成熟脂肪細胞への分化中に発現および制御されることを明らかにする。以上の点から、Ｄｙｒｋ１ｂタンパク質が脂質生成において重要な役割を果たす可能性がある。
【０１３５】
野生型マウスの代謝活性組織におけるＤｙｒｋ１ｂの発現も、代謝障害を研究するために使用される異なる動物モデルにおけるＤｙｒｋ１ｂの調節も、この遺伝子がエネルギー恒常性において中枢的な役割を果たすことを示唆する。この仮説は、前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中の制御によって支持される。
【０１３６】
本発明のために、当事者にとっては当然のことだが、本明細書の至る所で言及した任意の機能の任意の組み合わせをここに明示的に開示する。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、ショウジョウバエミニブレイン（Ｇａｄｆｌｙアクセッション番号ＣＧ７８２６）変異体の中性脂肪含有量を示す
【図２】図２はミニブレイン遺伝子座の分子構造を示す
【図３】図３は、ミニブレイン遺伝子産物（クエリ）のＢＬＡＳＴＰ検索結果を、３つの最もよくマッチするヒトホモログ（参照）と共に示す
【図４Ａ】図４Ａは、野生型マウス組織における二重特異性−（Ｙ）−リン酸化調節キナーゼ１ａ（Ｄｙｒｋ１ａ）発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す
【図４Ｂ】図４Ｂは、異なるマウスモデルにおけるＤｙｒｋ１ａ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す
【図４Ｃ】図４Ｃは、高脂肪食を与えたマウスにおけるＤｙｒｋ１ａ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を、標準食を与えたマウスと比較して示す
【図４Ｄ】図４Ｄは、３Ｔ３−Ｌ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＤｙｒｋ１ａ発現のリアルタイムＰＣＲ分析示す
【図４Ｅ】図４Ｅは、野生型マウス組織における二重特異性−（Ｙ）−リン酸化調節キナーゼ１ｂ（Ｄｙｒｋ１ｂ）発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す
【図４Ｆ】図４Ｆは、異なるマウスモデルにおけるＤｙｒｋ１ｂ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す
【図４Ｇ】図４Ｇは、高脂肪食を与えたマウスにおけるＤｙｒｋ１ｂ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を、標準食を与えたマウスと比較して示す
【図４Ｈ】図４Ｈは、３Ｔ３−Ｌ１細胞の前脂肪細胞から成熟脂肪細胞への分化中のＤｙｒｋ１ｂ発現のリアルタイムＰＣＲ分析示す
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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