(57)【要約】（ａ）少なくとも１つの試験化合物を選択する段階と、（ｂ）該化合物の抗腫瘍効果を検定する段階と、（ｃ）ＧｎＲＨ受容体によって少なくとも部分的に調節される少なくとも１つの特徴的な細胞内事象を選択する段階と、（ｄ）選択した細胞内事象を調節しない前記試験化合物の能力について試験する段階と、（ｅ）抗腫瘍効果を選択的に示し、前記の他の選択した細胞内事象を調節しない試験化合物を選択する段階とを含む、無関係の伝達シグナルを著しく活性化することなく、抗腫瘍効果を有する試験化合物を特定する方法。（ａ）少なくとも１つの試験化合物を選択する段階と、（ｂ）試験化合物がＧαｉを介してシグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、（ｄ）Ｇαｑを介するシグナル伝達を調節しない前記化合物の能力を試験する段階と、（ｅ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を調節しない試験化合物を選択する段階とを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−４−ＣｌＰｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−１−ＭｅＰａｌ−Ｄ−イソプロピルＬｙｓ−Ｌｅｕ−イソプロピルＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−ＡｌａＮＨ２を含み、癌及び生殖組織過形成に対処する際に有用である、方法により選択される化合物。
2005531331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの試験化合物を選択する段階と、
（ｂ）該化合物の抗腫瘍効果を検定する段階と、
（ｃ）ＧｎＲＨ受容体によって少なくとも部分的に調節される、少なくとも１つの特徴的な細胞内事象を選択する段階と、
（ｄ）選択した細胞内事象を調節しない前記試験化合物の能力を試験する段階と、
（ｅ）抗腫瘍効果を選択的に示し、かつ前記の他の選択した細胞内事象を調節しない試験化合物を選択する段階とを含む、無関係の伝達シグナルを有意に活性化することなく、抗腫瘍効果を有する試験化合物を特定する方法。
【請求項２】
段階（ｂ）において、試験化合物が癌性組織におけるＩ型ＧｎＲＨ受容体の腫瘍特異的伝達経路を活性化するか否かを判定することにより、抗腫瘍効果を検定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）において、試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定することにより抗腫瘍効果を検定する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｂ）において、試験化合物が腫瘍細胞においてプロアポトーシス効果を有するか否かを判定することにより抗腫瘍効果を検定する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ホスファチジルセリンの細胞外発現を判定することにより、プロアポトーシス効果を検定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｃ）において、特徴的な細胞内事象が、下垂体で活性化されるＩ型ＧｎＲＨ受容体経路の活性化である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｃ）において、特徴的な細胞内事象がＧｎＲＨ受容体媒介性Ｇαｑシグナル伝達経路の活性化である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）少なくとも１つの試験化合物を選択する段階と、
（ｂ）試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、
（ｄ）Ｇαｑを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を調節しない前記化合物の能力を試験する段階と、
（ｅ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を調節しない試験化合物を選択する段階とを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ｄ）試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、
（ｅ）試験化合物がＧαｑを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、
（ｆ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化しない試験化合物を選択する段階とを含む、試験化合物を治療薬候補又は薬物様化合物又はリード化合物として選択する方法。
【請求項１０】
試験化合物を生殖組織の癌又は過形成の治療に適する化合物として、又は薬物様化合物もしくはリード化合物として選択する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験化合物が、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体に結合することが知られているか、あるいは該受容体に結合する能力のために選択される、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法により選択される化合物。
【請求項１３】
医薬品として使用するための請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の化合物及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
腫瘍又は子宮類線維腫を含む生殖組織過形成に対処するための医薬品の製造における、請求項１２に記載の化合物、又は（ａ）ＧｎＲＨ受容体に結合し、（ｂ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化せず、（ｃ）良性前立腺過形成細胞において基礎レベルと比較してＥｒｋ１／２リン酸化の２倍以上の増加をもたらす化合物の使用。
【請求項１６】
請求項１２に記載の化合物、又は（ａ）ＧｎＲＨに結合し、（ｂ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化せず、（ｃ）良性前立腺過形成細胞において基礎レベルと比較してＥｒｋ１／２リン酸化の２倍以上の増加をもたらす化合物を投与することを含む、患者の腫瘍又は生殖組織過形成に対処する方法。
【請求項１７】
化合物がＡｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−４−ＣｌＰｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−１−ＭｅＰａｌ−Ｄ−イソプロピルＬｙｓ−Ｌｅｕ−イソプロピルＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−ＡｌａＮＨ２である、請求項１５に記載の使用又は請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
生殖組織過形成が子宮類線維腫又は良性前立腺過形成（ＢＰＨ）である、請求項１５に記載の使用又は請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
本明細書に開示するように、無関係の伝達シグナルを有意に活性化せずに、抗腫瘍効果を有する試験化合物を特定する、任意の新規な方法。
【請求項２０】
本明細書に開示するように、生殖組織の癌又は過形成の治療に適する治療薬候補として試験化合物を選択する、任意の新規な方法。
【請求項２１】
腫瘍又は生殖組織過形成に対処する任意の新規な方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌又は生殖組織過形成の治療に有用な活性化合物を選択するための新規のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧｎＲＨ（性腺刺激ホルモン放出ホルモン）は、ほとんどの既知の動物種の生殖軸の調節において中心的な役割を果たすデカペプチドである。それは、視床下部から拍動的に放出され、下垂体前葉における特異的受容体に作用して、黄体形成ホルモン（ＬＨ）及び卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を調節する。これらの２種のホルモンは、生殖機能の一次制御因子である。
【０００３】
第２の型のＧｎＲＨであるＧｎＲＨ−ＩＩは、多くの脊椎動物の中脳において同定されてきた。その結果として、最初の型のＧｎＲＨはＧｎＲＨＩと名称が変更された。
【０００４】
ＧｎＲＨ受容体は、多くのヒト悪性腫瘍、例えば、乳癌、卵巣癌及び子宮内膜癌における自己調節細胞増殖過程における不可欠の構成要素であることが示されてきた。数人の研究者がある種のＧｎＲＨ受容体相互作用リガンド（アゴニスト及びアンタゴニスト）が生殖組織腫瘍由来の細胞系に対して用量依存的抗増殖作用を及ぼすことを示した。下垂体前葉におけるＧｎＲＨ受容体と異なり、生殖組織におけるこれらの末梢受容体の活性化が別個のシグナル伝達様式を活性化し、古典的アンタゴニスト及びアゴニストに対して正の応答をするように思われる。細胞のシグナル伝達挙動が異なるにもかかわらず、末梢ＧｎＲＨ受容体のクローン化配列は下垂体ＧｎＲＨ受容体のそれと同じであると思われる。従って、下垂体ＧｎＲＨにより活性化されるものと対立するものとしての、癌性組織における腫瘍特異的伝達経路を特異的に活性化する新規のＧｎＲＨ受容体リガンドを選択する方法が非常に望ましいと思われる。我々は現在のＧｎＲＨ受容体を基礎とする療法は良性からより悪性のステロイド非依存的表現型への腫瘍の進行を誘発することから最適に満たないものと考えているので、そのような方法により、高い選択性を有するＧｎＲＨ受容体のリガンドの選択が可能になり、さらにＧｎＲＨ療法により誘発される副作用が減少すると思われる。ここで、伝統的なＧｎＲＨ受容体を基礎とする抗腫瘍薬はステロイドの血清濃度を減少させることにより主として作用し、それにより、生殖組織腫瘍のステロイド依存性成長を減少させる。古典的なＧｎＲＨ受容体を基礎とする療法を用いる遅延療法は、最初は腫瘍の退縮がもたらされるが、最終的にはより攻撃性の型の腫瘍の成長が促進される。
【０００５】
ＧｎＲＨアゴニストは、性ホルモン依存性癌の治療に広範に用いられている。支配的な作用機序は、下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞の脱感作によると考えられている。しかし、一連の実質的な証拠は、これらの癌細胞に対するＧｎＲＨ類似体の直接的阻害作用であることを示している。これらの作用は、性腺刺激ホルモン産生細胞におけるＧαｑ共役とは異なり、Ｇαｉ  Ｇタンパク質により媒介されると考えられる。Ｇαｑ共役と異なり、Ｇαｉ共役はアゴニストとアンタゴニストの両方により活性化され得る。これは、癌細胞に関与する受容体は性腺刺激Ｉ型ＧｎＲＨ受容体でないことを我々に示唆するものであった。ＧｎＲアゴニストと特定のアンタゴニストにより活性化することができるＩＩ型ＧｎＲＨ受容体がマーモセットにおいて同定されたことは、この受容体が癌細胞における抗増殖作用のメディエーターであることを示唆するものであった。しかし、ヒトにおけるこの受容体を同定する広範な試みがなされたが、完全長の機能性受容体に翻訳されうる通常のＩＩ型受容体転写物の存在を確認することはできなかった。癌細胞に存在する唯一の完全長転写物は、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体をコード化する。従って、我々は抗増殖作用の薬理（アゴニスト及び特定のアンタゴニストの活性）の差異は、異なる細胞内シグナル伝達経路（例えば、Ｇαｉを介する）と共役するときのＩ型受容体の活性化の薬理の差異に起因していると結論した。我々はここで、生殖路癌細胞、良性過形成細胞及びＩ型ＧｎＲＨ受容体を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞における抗増殖及びアポトーシスを媒介する分子経路に関する詳細な研究を報告する。これらの驚くべき結果は、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体を介して作用し、腫瘍及び過形成細胞において抗増殖性であるが、同時にＰＬＣβ活性化のような下垂体で認められるタイプのＩ型ＧｎＲＨ受容体媒介性経路に対する作用を実質的に有さない化合物を特定することが可能であることを初めて示している。理論に束縛されることなく、我々はこれらの化合物はＧαｑにではなく、Ｇαｉに共役する活性型のＧｎＲＨ受容体を安定化すると考えている。言い換えれば、我々はＧｎＲＨ受容体による差別的共役Ｇαｉ及びＧαｑが存在し、化合物がＧαｉ媒介経路に作用し、Ｇαｑ媒介経路に作用しないと考えている。
【発明の開示】
【０００６】
従って、本発明の目的は、下垂体で起こるＧαｑ−ＰＬＣ−βカスケードのような無関係の伝達シグナルを有意に活性化することなく、抗腫瘍効果を有する試験化合物、好ましくはＧｎＲＨ受容体リガンドを特定する方法を提供することである。第１の態様において、この方法は以下の段階を含む。
ａ）好ましくはＩ型ＧｎＲＨ受容体リガンドである少なくとも１つの試験化合物を選択する段階、
ｂ）抗腫瘍効果の有無について化合物を検定する段階、
ｃ）ＧｎＲＨ受容体により少なくとも部分的に調節される少なくとも１つの明らかな細胞内事象を選択する段階、
ｄ）選択した細胞内事象を調節しない前記化合物の能力について試験する段階、及び
ｅ）抗腫瘍効果を選択的に示し、少なくとも前記選択された細胞内事象を調節しない化合物を選択する段階。
【０００７】
この方法は、抗腫瘍化合物としての能力を有するが、望ましくない伝達シグナルを活性化し、従って、無視すべきである試験化合物間の初期及びインビトロでの区別を可能にし、また、シグナル特異的であり、治療薬としてのより大きい能力を有する試験化合物の特定を可能にする。
【０００８】
この方法は既に知られているＧｎＲＨアゴニスト／アンタゴニストを区別するのに用いることができるが、他の化合物を試験するのにも用いることができる。この場合、本発明の方法に、試験化合物をＧｎＲＨ受容体に結合及び／又は調節する能力について試験する予備的段階を含めることが有利である。ＧｎＲＨ受容体への結合に関して高い親和性を示す化合物を本発明の検定方法に用いることは有利である。一般的に、化合物は０．１〜１０ｎＭ（約１ｎＭ）のＧｎＲＨ受容体への結合に関するＫＤを有する。試験化合物がＧｎＲＨ受容体に結合するか否かは、競合的放射性リガンド結合アッセイのような当技術分野でよく知られている方法を用いて判定することができる。試験化合物は、任意の化合物であってよいが、一般的に１００〜１００００ダルトン、好ましくは５００〜５０００ダルトンの有機化合物である。一般的に、試験化合物は、コンビナトリアル・ケミストリー法を用いて構築されるような試験化合物のライブラリーにおける化合物である。また、一般的に試験化合物はＧｎＲＨ類似体である。
【０００９】
薬物スクリーニング法でありうる本明細書に記載する方法において、当業者によく知られている用語である選択される試験化合物は、薬物様化合物又は薬物様化合物の開発のためのリード化合物であってよいということは理解されよう。
【００１０】
「薬物様化合物」という用語は、当業者によく知られており、医学における使用に適する特性、例えば、医薬品における有効成分としての特性を有する化合物の意味を含んでいてよい。従って、例えば、薬物様化合物は、有機化学の技術によるか、それより好ましくはないが、分子生物学又は生化学の技術により合成される分子であってよく、１５０００ダルトン未満で、水溶性であってよい小分子であることが好ましい。薬物様化合物は、さらに生物学的利用能の機能を示すものであってよい。
【００１１】
「リード化合物」という用語は、同様に当業者によく知られており、それ自体薬物としての使用に適さない（例えば、その所期の標的に対して弱い効力を示すにすぎず、その作用が非選択的で、不安定で、溶解性に乏しく、合成が困難又は不十分な生物学的利用能を有する）が、その化合物がより望ましい特性を有する他の化合物の設計の出発点を与えるものであるという意味を含みうる。
【００１２】
本発明の第１の態様の方法の段階（ｂ）における抗腫瘍効果に関する検定は、ＧｎＲＨリガンドを評価するために当技術分野で既に用いられているものであってよい。例えば、下記のように、リガンドは、絨毛癌細胞培養に対するそれらの抗増殖作用について評価してもよい。化合物の抗腫瘍活性は、試験化合物が抗増殖作用につながるＩ型ＧｎＲＨ受容体腫瘍特異的伝達経路を活性化することができるかどうかを判定することによっても容易に評価することができることは理解されよう。一般的に、細胞をリガンドで処理し、細胞成長に対するその効果を例えば、５日間にわたる数的な細胞成長を遅延させる能力として測定することができる。例えば、トリパンブルー色素を効率的に排除できる細胞を計数することにより、生細胞のみを計数する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の好ましい実施形態において、試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定することにより、抗腫瘍効果を検定する。Ｇαｉは、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質である。一般的に、Ｇαｉは酵素アデニル酸シクラーゼを阻害する。用語Ｇαｉにより、主として中枢神経系に見いだされるＧαｏを含むＧαｉサブファミリーの任意のメンバーも含まれる。試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かは、当技術分野でよく知られている方法により判定することができる。例えば、また実施例１においてより詳細に記述するように、これは、試験化合物が、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体を形質移入した適切な細胞（十分なＧαｉを有し、実験を促進するためのアデニル酸シクラーゼが存在する）におけるフォルスコリン（ＦＳＫ）刺激性細胞内ｃＡＭＰ蓄積に拮抗することができるかどうかを判定することによって行うことができる。従って、一実施形態において、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体を安定に発現する細胞（例えば、ヒト胚腎（ＨＥＫ）細胞）を試験化合物とともにプレインキュベートし、次いで、フォルスコリンで刺激し、ｃＡＭＰを比色法により測定する。これを、同等の細胞をフォルスコリンで処理したが、試験化合物で処理しなかった場合に生成したｃＡＭＰの量と比較する。試験化合物がＧαｉを活性化するものである場合に、それらの細胞内のｃＡＭＰレベルの減少がある。Ｇαｉの活性化は、受容体との直接結合によって測定してもよいが、代謝回転（例えば、ｃＡＭＰ産生）を測定する方法と比較して好ましくない。シグナル伝達事象におけるＧαｉの介入は、Ｇαｉを不活性化する百日咳毒素を用いて評価することができる。言い換えれば、Ｇαｉによって媒介されるシグナル伝達事象は、百日咳毒素感受性である。
【００１４】
ＪＮＫ及び／又はｐ３８αリン酸化は、抗腫瘍効果及びＧαｉシグナル伝達のマーカーとしても用いることができ、従って、試験化合物の効果を検定するのに用いることができる（実施例１ならびに図７及び８の説明文を参照）。同様に、例えばＪＮＫ及びｐ３８αリン酸化に関連して記載されたのと同様な方法（例えば、リン酸化ＥＲＫ１に対して選択的抗体を用いる）を用いる百日咳毒素（ＰＴＸ）感受性ＥＲＫアッセイも用いることができる。一般的に、刺激の前に細胞を２００ｎｇ／ｍｌのＰＴＸとともに１６時間プレインキュベートする。刺激期間は、一般的に４〜５分である。これは、良性前立腺過形成細胞においてＥｒｋ１／２リン酸化の基礎値よりも２倍以上の増加をもたらすことができる試験化合物を選択する場合に特に好ましい。
【００１５】
さらに、ＧｎＲＨリガンドは腫瘍細胞におけるプロアポトーシス性表現型を誘導することができることが明らかにされ、これは、間接的であるが、化合物の抗腫瘍効果を評価する別の方法である。従って、この方法には、有利なことに、培養細胞におけるプロアポトーシス状態を誘導する能力についてＧｎＲＨリガンドを検定する段階を含めることができる。特に、試験化合物がプロアポトーシス作用を有するか否かを判定することは、抗腫瘍効果を評価する他の手段とともに有用であると思われる。その理由は、試験化合物がインビボで薬物様である場合に、この検定は強い指標を提供するからである。実施例１では、ホスファチジルセリン（ＰＳ）リン脂質の細胞外発現が細胞アポトーシスを示すものとして選択された細胞事象であった。ＰＳの細胞外発現は、ＰＳに選択的に結合する標識化（例えば、蛍光により標識化）Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖを用いて容易に測定することができる。カスパーゼ又はプロカスパーゼの測定は、試験化合物がプロアポトーシス性であるか否かを判定するのに有用である。そのような測定は、適切な酵素基質を用いて高処理量スクリーニング方式で行うことができる。
【００１６】
試験化合物が抗腫瘍効果を有するか否かを評価するために複数の方法を用いることができ、また、そのような複数の方法を用いることは有利であることは理解されよう。例えば、Ｇαｉを活性化する試験化合物の能力は上記のｃＡＭＰ蓄積アッセイを用いて測定することができ、また、培養細胞におけるプロアポトーシス状態を誘導する試験化合物の能力は例えばＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ結合によりＰＳの細胞外発現を測定することにより評価することができる。
【００１７】
好ましくは、段階（ｃ）において、ＧｎＲＨ受容体により少なくとも部分的に調節される少なくとも１つの明らかな細胞内事象は、下垂体において活性化されるＩ型ＧｎＲＨ受容体経路の活性化である（下垂体機能の大部分はＧαｑ媒介性である）。好ましくは、明らかな細胞内事象はＧαｑシグナル伝達経路の活性化である。Ｇαｑは、酵素ホスホリパーゼＣβを特異的に活性化するグアニンヌクレオチド結合タンパク質である。Ｇαｑとは、我々は様々な細胞のバックグラウンドの中で、ホスホリパーゼＣβの活性化のためにＧαｑの代用にできるＧα１１及びＧα１６を含める。段階（ｄ）において、試験化合物を、当技術分野でよく知られている方法を用いて選択される細胞内事象（例えば、Ｇαｑシグナル伝達経路）を調節しない能力について試験する。例えば、実施例１に記載するように、Ｇαｑシグナル伝達経路の活性化は、ホスホリパーゼＣβ（ＰＬＣβ）産生（ＧαｑのＩ型ＧｎＲＨ受容体媒介性活性化後）により媒介されるイノシトールリン酸の産生を測定することにより判定することができる。ＰＬＣβは、Ｕ７３１２２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州から入手可能）により阻害される。
【００１８】
高レベルの受容体刺激においては、ＧαｉはＰＬＣβの活性化を引き起こすことができ、従って、ＰＬＣβの活性化がＧαｑにより媒介されるのであって、Ｇαｉにより媒介されないことを示すために、ＰＴＸを用いてＧαｉを阻害する。従って、ＰＴＸ抵抗性イノシトールリン酸の発生はＰＬＣβの活性化のＧαｑ媒介性活性化を示唆している。従って、Ｇαｑを活性化しない化合物を選択することを容易に行うことができる。
【００１９】
段階（ｅ）において、抗腫瘍効果を選択的に示し、少なくとも前記選択した細胞内事象を調節しない試験化合物をさらなる研究のために選択する。これは、Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を調節しない化合物を選択する場合に特に好ましい。
【００２０】
「抗腫瘍効果」とは、我々は観察可能及び／又は測定可能な効果を意味する。Ｇαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を用いて抗腫瘍効果を評価する場合、観察可能及び／又は測定可能な効果は、本明細書に記載するような下流事象であってよい。培養細胞におけるプロアポトーシス状態の誘導を用いて抗腫瘍効果を評価する場合、観察可能及び／又は測定可能な効果は、例えばＡｎｎｅｘｉｎ結合を用いた死滅しつつある細胞の表面のＰＳの測定を含む、本明細書に記載するような下流事象であってよい。
【００２１】
ＪＮＫ及び／又はｐ３８αリン酸化をマーカーとして用いる場合、観察可能かつ測定可能な効果は、蛍光ラジオイムノアッセイプレートアッセイの使用、又は、発現が少なくとも一部がＪＮＫ及び／又はｐ３８α応答性リポーター要素により調節されるルシフェラーゼのようなマーカー遺伝子の細胞内発現を含む。
【００２２】
「少なくとも前記選択した細胞内事象を調節しない」とは、我々は試験化合物が前記事象を実質的に調節しないことを意味する。試験化合物は前記事象に対する効果を有する可能性があるが、その効果は本発明の状況において本質的ではないということは理解されよう。例えば、選択した細胞内事象がＧαｑシグナル伝達経路の活性化である場合、後続の試験のために選択される試験化合物は、この経路を実質的に活性化しないものである。選択された試験化合物がＩ型受容体媒介性Ｇαｑシグナル伝達事象のアンタゴニストである場合、これが特に好ましい。しかし、試験化合物がＧαｉ経路の活性化に関して高い有効性を有するものであることは特に好ましい。
【００２３】
本発明の特に好ましい実施形態において、Ｇαｉ刺激のアゴニストとして高い効力を有し、Ｇαｑ刺激に対して低い効力を有する試験化合物を選択する。従って、例えば、所与の細胞増殖（Ｇαｉ刺激により媒介される）に関して、又はＰＬＣ−βのＰＴＸ非感受性活性化（Ｇαｑにより媒介される）に関して、以下の表は、望ましい特性を有する試験化合物の選択の理解に有用である。
【００２４】
【表１】
2005531331.tif 000003
【００２５】
最も望ましい物質は、高いＧαｉ効力を有するが、Ｇαｑ刺激の効力が最も低い物質Ｂであろう。
【００２６】
選択された試験化合物は、Ｉ型受容体媒介性Ｇαｑシグナル伝達事象のアゴニストでない、又はＧαｑ経路を活性化する無視できる能力を有するものであることは理解されよう。例えば、ＧｎＲＨＩは細胞成長を減少させる能力を示すが、下垂体からの性腺刺激ホルモンの分泌を引き起こすことができるという不都合を有する（すなわち、Ｉ型受容体媒介性Ｇαｑシグナル伝達事象のアゴニストである）。従って、選択された試験化合物は末梢腫瘍部位ではＧｎＲＨＩのように挙動するが、下垂体レベルではＧｎＲＨＩのように挙動しないことは理解できよう。
【００２７】
当方法において選択される試験化合物は、一般的にＧαｑ  ＥＣ５０／Ｇαｉ  ＥＣ５０の高い比を示すものである。ＥＣ５０は、Ｇαｑ又はＧαｉ活性化の最大反応の５０％をもたらす試験化合物の濃度を意味する。ＥＣ５０が小さいほど効力が高い。Ｇαｑ  ＥＣ５０／Ｇαｉ  ＥＣ５０比が１０を超える試験化合物、より好ましくは比が５０を超えるものを選択するならば、これが好ましい。
【００２８】
好ましい態様において、本発明は、
（ａ）試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、
（ｂ）試験化合物がＧαｑを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、
（ｃ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化しない試験化合物を選択する段階とを含む、試験化合物を治療薬候補又は薬物様化合物又はリード化合物として選択する方法を含む。
【００２９】
「Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化しない」とは、Ｇαｑを介するシグナル伝達を有意には活性化しないという意味であることは理解されよう。従って、選択された試験化合物はＧαｑ経路を活性化する無視できる活性を有するものである。好ましくは、当方法を、生殖組織の癌又は過形成の治療に適する、あるいはこれらの適応のための少なくとも薬物様又はリード化合物である試験化合物を選択するのに用いる。本発明の方法又は検定法は、ＧｎＲＨ受容体の異なる活性化状態を試験し、定義するための、また特定の状態により誘発される生物学的経路を正確に示すための研究手段としても用いることができる。これは、ひいては、薬物設計、特に、望ましくない副作用を誘発しない候補化合物の選択における重要かつ明らかな医療上の意味をもつ。
【００３０】
特に好ましい実施形態において、化合物を抗腫瘍効果について検定すること（例えば、試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定することにより）及び選択した細胞内事象を調節しない前記試験化合物の能力について試験すること（例えば、試験化合物がＧαｑを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する）は、上記の方法を用いて同じ細胞系について同時に行うことができる。一般的に、多数の細胞を数枚の増殖用プレートに分割し、並行Ｇαｉ（例えば、フォルスコリン誘発ｃＡＭＰ蓄積の阻害）及びＧαｑ（ＰＬＣβ活性化）アッセイを同時に実施する。有利なことに、この方法は、高処理能力スクリーニングシステムに用いることができるものである。例えば、上記のアッセイの両方を市販のラジオイムノアッセイベースのマルチウェルプレート方式で行うことができるものである。
【００３１】
この方法により選択された試験化合物を、動物モデル系のようなモデル系におけるそれらの抗腫瘍効果についてさらに試験することができることは理解されよう。試験化合物は、臨床試験において生殖組織腫瘍又は過形成の治療における有効性についてさらに試験することができる。
【００３２】
さらに、又は別法として、試験化合物を、さらなる薬物設計の基礎である薬物様化合物又はリード化合物として用いることができる。
【００３３】
さらなる実施形態において、試験化合物を合成し、包装し、医薬品として提供し、及び／又は薬剤組成物に調製することができる。
【００３４】
本発明の方法により選択したＧｎＲＨ受容体リガンドも本発明の目的である。
【００３５】
本発明の方法を用いて選択される好ましい化合物は、（ａ）ＧｎＲＨ受容体に結合し、（ｂ）選択的にＧαｉを介するシグナル伝達を活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化しない化合物であることは理解されよう。選択された化合物が下垂体からのＧｎＲＨ媒介性（Ｇαｑ活性化を介する）性腺刺激ホルモン放出を阻害し、特に非ステロイド耐性腫瘍における腫瘍細胞成長に直接効果を及ぼす、ＧｎＲＨ受容体相互作用性薬剤である化合物であるならば、これも好ましい。
【００３６】
式：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−４−ＣｌＰｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−１−ＭｅＰａｌ−Ｄ−イソプロピルＬｙｓ−Ｌｅｕ−イソプロピルＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−ＡｌａＮＨ２（式中、ＭｅＰａｌは１−メチル−３−［３’−ピリジル］−アラニンである）を有するリガンド１３５−２５は、インビトロで強力かつ選択的な抗腫瘍活性を示し、本発明の方法により選択された。従って、リガンド１３５−２５（以下でＡｎｔ  １３５−２５とも称する）、腫瘍、性ホルモン依存性癌又は生殖組織過形成の治療用の医薬組成物、及び特に薬物の製造におけるその使用が本発明の他の目的である。
【００３７】
従って、本発明のさらなる態様は、薬剤として使用するための本発明の方法により選択される化合物を提供する。適宜、化合物を、例えば患者におけるその使用に関する指示書とともに包装し、薬剤としての使用のために提供する。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法により選択される化合物と製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物又は製剤を提供する。担体は、本発明の化合物と適合性があり、その受容者に有害でないという意味で「許容可能な」ものでなければならない。一般的に、担体は、無菌で、発熱物質を含まない水又は食塩水である。
【００３９】
好ましくは、製剤は、有効成分の１日の投与量又は単位、１日の部分投与量あるいはその適切な分割量を含む単位用量のものである。
【００４０】
さらなる目的は、患者に有効な量のリガンド１３５−２５又は本発明の方法により選択される他の化合物を投与する段階を含む、性ホルモン依存性癌又は生殖組織過形成の治療の方法である。
【００４１】
さらに、本明細書に記載する試験から、ＧｎＲＨ受容体に結合し、Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化しない１３５−２５のような化合物はこれらの疾患の治療に有用であることが示されている。特に、その化合物は、実施例１の図５に記載するＢＰＨ−１細胞のような良性前立腺過形成細胞におけるＥｒｋ１／２リン酸化の基礎値と比較して２倍以上の増加をもたらす（その最大作用を有する濃度で）能力を有するものでもある。一般的に、Ｅｒｋ１／２リン酸化の基礎値と比較して２倍以上の増加は、上記のようにＰＴＸで前処理した細胞（すなわち、化合物の投与前に２００ｎｇ／ｍｌのＰＴＸとの１６時間のプレインキュベーションを用いる）において測定する。
【００４２】
従って、本発明のさらなる態様は、本発明により選択した化合物、又は（ａ）ＧｎＲＨ受容体に結合し、（ｂ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化せず、また（ｃ）良性前立腺過形成細胞におけるＥｒｋ１／２リン酸化の基礎値と比較して２倍以上の増加をもたらす化合物を投与することを含む、特に患者における腫瘍又は子宮類線維腫を含む生殖組織過形成に対処する方法を提供する。
【００４３】
好ましくは、化合物は、ＧｎＲＨＩによってもたらされるのと非常に類似した良性過形成細胞におけるＥｒｋ１／２リン酸化の増加をもたらすことができる。好ましくは、化合物は１３５−２５である。
【００４４】
本発明の方法は獣医学又はヒト医学において使用され、、従って、患者は動物（一般的に、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ又はブタのような哺乳動物）又はヒトであってよい。好ましくは、該方法はヒトを治療するために用いる。一般的に、本発明の方法は、乳房、前立腺、卵巣、子宮内膜又は精巣の腫瘍（又は癌）のような性ホルモン依存性腫瘍を治療するのに用いる。
【００４５】
生検の後に、高度のステロイド非依存性を有する腫瘍を有することが示される患者を治療することは特に有利であると思われる。
【００４６】
既存療法は、腫瘍からそれらの成長に必要なステロイドを奪うが、腫瘍細胞を直接破壊することに関するおそらく無視できる効力を有する。本発明の方法に用いられる（及びスクリーニング法を用いて特定できる）化合物は、下垂体ホルモン分泌を制御し、腫瘍細胞を直接破壊する能力を有する。既存療法の直接的な抗腫瘍有効性については特に選択されていないので、ステロイドと無関係に成長する新生物は、既存の療法に対して著しい抵抗性を有する。さらに、従来のアゴニストを用いる腫瘍療法は、初期に過剰な下垂体ホルモンが放出する「フレア」の望ましくない副作用を誘発する。これは、本明細書に記載し、また本明細書におけるスクリーニング法を用いて特定することができる化合物を用いて避けられると我々は考えている。これらの化合物は主として腫瘍に対して作用するので、脱感作は起こらず、化合物は化合物に対する耐性をもたらすとは考え難い。
【００４７】
過形成を治療する場合、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）又は子宮類線維腫（平滑筋腫としても知られている）を治療することが特に好ましい。
【００４８】
本発明治療方法に用いる化合物は、無毒性の有機もしくは無機の酸もしくは塩基付加塩の形態であってもよい、有効成分を含む製薬上許容できる剤形の製剤の形で、非経口投与経路により通常投与することができる。治療する疾患及び患者ならびに投与経路に応じて、組成物を様々な用量で投与することができる。特に、本発明の治療方法に用いる化合物は、子宮裏層に直接適用することができる。
【００４９】
ヒトの治療においては、本発明の治療方法に用いる化合物は、単独で投与することができるが、目的とする投与経路及び標準製薬規範を考慮して選択した適切な医薬品添加物、希釈材又は担体との混合物として一般的に投与する。
【００５０】
本発明の治療方法に用いる化合物は、非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内又は皮下（好ましい投与経路）投与することもでき、あるいは注入技術により投与することができる。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張性にするのに十分な塩類又はブドウ糖を含んでいてよい無菌水溶液の形で用いるのが最もよい。水溶液は、必要な場合、適宜緩衝剤を添加すべきである（好ましくは３〜９のｐＨとなるように）。無菌的条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者によく知られている標準的製薬技術により容易に遂行される。
【００５１】
非経口投与に適する製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び製剤を対象とする受容者の血液と等張性にする溶質を含んでいてよい水性及び非水性無菌注射溶液ならびに懸濁剤及び増粘剤を含んでいてよい水性及び非水性無菌懸濁液などである。製剤は、単位用量又は複数回用量容器、例えば、密閉アンプル及びバイアル入りで提供することができ、また、使用直前に無菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で貯蔵することができる。即時注射溶液及び懸濁液は、前述の製剤の無菌散剤、粒剤及び錠剤から調製することができる。
【００５２】
ヒト患者への非経口投与については、本発明の化合物の１日投与量は通常、成人あたり１〜１０００ｍｇ（すなわち、約０．０１５〜１５ｍｇ／ｋｇ）で、１回又は分割投与する。いずれにしても、医師は、個々の患者の年齢、体重及び反応により異なる、個々の患者に最も適する実際の用量を決定することができる。上述の用量は平均的なケースを例示したものである。より高い又は低い用量範囲が正当である個々の例はもちろん存在し得るものであり、係る用量も本発明の範囲内にある。
【００５３】
本発明の治療方法に用いる化合物は、鼻腔内に、又は吸入で投与することもでき、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４  Ａ３）又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７  ＥＡ３）等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素又は他の適切なガスを用いた加圧容器、ポンプ、噴霧器もしくはネブライザーから、乾燥粉末吸入剤もしくはエアゾール噴霧状の形態で適宜送達される。加圧エアゾールの場合には、計量された量を送達するためのバルブを装備することにより用量単位を決定することができる。加圧容器、ポンプ、噴霧器もしくはネブライザーは、潤滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンをさらに含んでいてよい、例えば、溶媒としてのエタノールと噴射剤との混合物を用いた活性化合物の溶液又は懸濁液を含んでいてよい。吸入器又は注入器に用いるカプセル及びカートリッジ（例えば、ゼラチン製）は、本発明の化合物とラクトース又はデンプンのような適切な粉末基剤との粉末混合物を含むように調剤することができる。
【００５４】
エアゾール又は乾燥粉末は、各計量用量すなわち「一吹き量」が患者に送達する本発明の化合物を少なくとも１ｍｇ含むように調製することが好ましい。エアゾールの総１日投与量は患者ごとに異なり、１日１回又は通常、分割して投与することができることは理解できよう。
【００５５】
あるいは、本発明の治療方法に用いる化合物は、坐剤又はペッサリーの形態で投与することができ、あるいはローション、溶液、クリーム、軟膏又は粉剤の形態で局所適用してもよい。本発明の化合物は、例えば、皮膚パッチを用いて経皮投与することもできる。
【００５６】
皮膚に局所投与するために、本発明の治療方法に用いる化合物は、例えば、一又は複数の以下のもの：鉱油、液状ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン混合物、乳化ワックス及び水との混合物に、懸濁又は溶解した活性化合物を含む適切な軟膏剤として調剤することができる。あるいは、例えば、次の一又は複数の以下のもの：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水との混合物に懸濁又は溶解した適切なローション又はクリームとしても調剤することができる。
【００５７】
獣医学用途については、本発明の治療方法に用いる化合物は、通常の獣医学規範に従った適切に許容できる製剤として投与する。獣医は個々の動物に最も適する投与法と投与経路を決定する。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、腫瘍又は生殖組織過形成に対処するための医薬品の製造における本発明により選択した化合物又は（ａ）ＧｎＲＨ受容体に結合し、（ｂ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化せず、（ｃ）良性形成細胞における基礎レベルと比較してＥｒｋ１／２リン酸化の２倍以上の増加をもたらす化合物の使用を提供する。
【００５９】
本発明の治療方法は、抗癌薬のような別の薬剤の患者への投与を含むことがあることは理解できよう。
【００６０】
癌化学療法薬剤は、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルフラン（Ｌ−サルコリシン）及びクロラムブシルのようなナイトロジェンマスタード；チオペタ、ヘキサメチルメラミンのようなメチルメラミン及びエチレンイミン；ブスルファンのようなアルキルスルホネート；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）及びストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）のようなニトロソ尿素；ならびにデカルバジン（ＤＴＩＣ、ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）のようなトリアゼンを含むアルキル化剤；メトトレキサート（アメトプテリン）のような葉酸類似体；フルオロウラシル（５−フルオロウラシル、５−ＦＵ）のようなピリミジン類似体；フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン、ＦＵｄＲ）及びシタラビン（シトシンアラビノシド）のようなピリミジン類似体ならびにメルカプトプリン（６−メルカプトプリン、６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン、ＴＧ）及びペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）のようなプリン類似体及び関連阻害薬を含む代謝拮抗剤などを含む。天然物としては、ビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチンのようなビンカアルカロイド；エトポシド及びテニポシドのようなエピポドフィロトキシン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビノマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びマイトマイシン（マイトマイシンＣ）のような抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼのような酵素ならびにインターフェロンアルフェノームのような生物学的反応修飾物質などがある。種々の薬剤としては、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）及びカルボプラチンのような白金配位錯体；ミトキサントロン及びアントラサイクリンのようなアントラセンジオン；ヒドロキシ尿素のような置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）のようなメチルヒドラジン誘導体；ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）及びアミノグルテチミドのような副腎皮質抑制薬；タキソール及び類似体／誘導体；ならびにフルタミド及びタモキシフェンのようなホルモンアゴニスト／アンタゴニストなどがある。その他の薬剤としては、パクリタキセル、ボンベシン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）アンタゴニスト及びイレッサ（ゲフィチニブ、ＥＧＦアンタゴニスト）などがある。
【００６１】
以下の図及び非限定的実施例の参照により、本発明をさらに詳細に説明することとする。
【００６２】
図１にヒトＪＥＧ−３絨毛癌細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドの抗増殖作用を示す。低細胞密度のＪＥＧ−３細胞継代培養を、１０％ＦＣＳ、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを補足したダルベッコ改良イーグル培地に直接加えた表示用量のＧｎＲＨＩ（ａ）、ＧｎＲＨＩＩ（ｂ）、アンタゴニスト１３５−１８（ｃ）又はアンタゴニスト１３５−２５（ｄ）で５日間にわたり連続的に処理した。リガンドは２４時間ごとに交換した。刺激期間の終了時に、細胞を成長プレートからトリプシンを用いて除去し、トリパンブルー色素（非生細胞に入る）と混合した。生細胞のみを血球計を用いて各リガンドの用量ごとに４回ずつ計数した。各ヒストグラムにおけるバーは、ｎ＝４の実験の平均値±標準誤差平均値を表す。ＧｎＲＨＩとＧｎＲＨＩＩは、ＪＥＧ−３細胞に対する強力かつ用量依存的抗増殖作用を示した。アンタゴニスト１３５−２５（Ａｎｔ１３５−２５）は、ＧｎＲＨＩ及びＩＩと同様な効力と有効性を示したのに対して、アンタゴニスト１３５−１８（Ａｎｔ１３５−１８）は、１３５−２５、ＧｎＲＨＩ及びＩＩと比較してはるかに低い効力と有効性を示した。
【００６３】
図２にヒト良性前立腺過形成（ＢＰＨ−１）細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドの抗増殖作用を示す。低細胞密度のＢＰＨ−１細胞継代培養を、１０％ＦＣＳ、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ１６４０培地に直接加えた表示用量のＧｎＲＨＩ（ａ）、ＧｎＲＨＩＩ（ｂ）、アンタゴニスト１３５−１８（ｃ）又はアンタゴニスト１３５−２５（ｄ）で５日間にわたり連続的に処理した。リガンドは２４時間ごとに交換した。刺激期間の終了時に、細胞を成長プレートからトリプシンを用いて除去し、トリパンブルー色素（非生細胞に入る）と混合した。生細胞のみを血球計を用いて各リガンドの用量ごとに４回ずつ計数した。各ヒストグラムにおけるバーは、ｎ＝４の実験の平均値±標準誤差平均値を表す。ＧｎＲＨＩと程度のより低いＧｎＲＨＩＩは、ＪＥＧ−３細胞に対する強力かつ用量依存的抗増殖作用を示した。アンタゴニスト１３５−２５は、ＧｎＲＨ  Ｉと同様な効力と有効性を示したのに対して、Ａｎｔ１３５−１８は、Ａｎｔ１３５−２５及びＧｎＲＨＩと比較してはるかに低い効力と有効性を示した。
【００６４】
図３にＩ型ヒトＧｎＲＨＲを発現するヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドの抗増殖作用を示す。図１と同じ細胞成長を測定する方法を用いた。ＳＣＬ６０細胞（ヒトＩ型ＧｎＲＨＲを安定に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞）におけるＧｎＲＨＲ発現のレベルがはるかに大きいため、ＧｎＲＨＩ（ａ）、ＧｎＲＨＩＩ（ｂ）及びＡｎｔ１３５−２５（ｄ）について、より大きい抗増殖有効性が認められた。しかし、Ａｎｔ１３５−１８（ｃ）は他のリガンドと比較して低い有効性を示している。
【００６５】
図４にＪＦＧ−３及びＢＰＨ−１細胞におけるＧｎＲＨ誘発性アポトーシス事象を示す。ａ）ホスファチジルセリンのＧｎＲＨ誘発性形質膜輸送をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ組換えタンパク質染色を用いて測定した。全１２パネルは、位相差（１、４、７、１０）、共焦点レーザー顕微鏡（２、５、８、１１）又は位相差／共焦点合併像（３、６、９、１２）のいずれかを示す。パネル１〜３に、ＧｎＲＨＩ（１００ｎＭ）で２４時間処理したパネル４〜６における細胞に対する無処理対照ＪＥＧ−３細胞を示す。すべての細胞を生存時に、ＦＩＴＣ発蛍光団に結合させたアネキシンＶ組換えタンパク質に曝露させた。アネキシンＶは、形質膜脂質二重層の細胞内側にのみ通常発現するホスファチジルセリン（ＰＳ）脂質にのみ特異的に結合する。アポトーシスの初期の徴候は、これらのＰＳ脂質の膜の細胞内側から二重層の外側への輸送である。パネル２又は５においてみられるように、形質膜の細胞外表面上のアネキシンＶ反応性ＰＳの有意な発現は存在しない。パネル１０〜１２にＧｎＲＨＩに４８時間曝露させた細胞を示し、パネル７〜９に示す細胞は非刺激同時対照とする。パネル１１においてＪＥＧ−３細胞膜上にアネキシンＶ反応性ＰＳの有意な発現が存在することは明らかである。同じ結果がＢＰＨ−１細胞の同様なＧｎＲＨＩ処理により得られた（データはさらなる図に示す）。ＧｎＲＨＩは、ＪＥＧ−３細胞（ｂ）及びＢＰＨ−１細胞（ｃ）におけるプロアポトーシス性プロテアーゼ切断カスパーゼ３及びプロカスパーゼ３の発現の増加を誘発する。カスパーゼ３及びプロカスパーゼ３の細胞レベルを、記述した時間にわたりＧｎＲＨＩで連続的に刺激した細胞からのＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１全細胞（ｗ−ｃ）溶解物の特異的イムノブロッティングにより評価した。
【００６６】
図５にＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドがＢＰＨ−１及びＪＦＧ−３細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）を刺激することを示す。ａ）ＧｎＲＨＩはＢＰＨ−１細胞におけるＥＲＫ１／２の強くかつ用量依存的活性化を誘導する。パネルに刺激済みＢＰＨ−１細胞抽出物の抗ホスホＥＲＫ１／２ｗ−ｃ溶解産物の代表的イムノブロットを示す。ホスホ特異的抗血清はＥＲＫ１／２の活性化型のみを同定し、一方、抗ＥＲＫ２血清はＥＲＫ２の不活性及び活性型と同等に反応する。ＪＥＧ−３細胞について同様な試験を実施したとき、同様な結果が得られ、ＧｎＲＨ誘導性ＪＥＧ−３細胞活性化の他の試験を確認するものとなっている。パネルｂ）にいくつかのＧｎＲＨＲ相互作用性リガンド（すべて１００ｎＭの用量で１０分間）により誘発されたＪＥＧ−３細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化及び従って活性化の程度を示す。ヒストグラムの各バーは、３〜４回の実験の平均値±標準誤差を表す。ＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５は、ＥＲＫ１／２を同程度に活性化し、ＧｎＲＨＩＩは有効性がより低く、Ａｎｔ１３５−１８は有効性が最も低い。パネルｃ）にＧｎＲＨＩ、ＩＩ、Ａｎｔ１３５−２５及びＡｎｔ１３５−１８との刺激により誘発されたＢＰＨ−１細胞におけるＥＲＫ１／２の活性化の程度を示す。ＪＥＧ−３と同様なＢＰＨ−１細胞のリガンド活性化のパターンが認められた。ヒストグラムの各バーは、３〜４回の実験の平均値±標準誤差を表す。
【００６７】
図６にＢＰＨ−１細胞におけるＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドによるイノシトールリン酸の蓄積の誘発を示す。リガンド刺激（６０分）の前に、ＢＰＨ−１細胞を３Ｈ−ミオイノシトール（１μＣｉ／ｍｌ）とともに４８時間プレインキュベートした。リガンド刺激性イノシトールリン酸産生を１０ｍＭ  ＬｉＣｌの存在下で測定した。パネルａ〜ｄに、高用量のＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５のみがイノシトールリン酸の任意の有意な蓄積を誘発したことから、Ｉ型ＧｎＲＨＲの発現がこれらの細胞では支配的であることが示唆されることを示す。これは、ＲＴ−ＰＣＲにより確認され（データには示されない）、イノシトールリン酸の蓄積時のＧｎＲＨＩＩの不十分な活性は、おそらく高度に増幅されたＥＲＫ１／２活性化アッセイと比較してイノシトールリン酸アッセイの感度が低いためであると考えられる。有意なイノシトールリン酸の蓄積を誘発するために高用量のＧｎＲＨＩが必要であったことは、ＰＬＣ−β活性化の主要なエフェクターであるＧαｑは、イノシトールリン酸の蓄積が誘発される機構でないことを示唆することであった。ＰＬＣ−βの活性化はＰＴＸ抵抗性であるので、ＩＰ蓄積はＧαｑ活性化のリードアウト／マーカーとして用いることができる。パネルｅに、Ｇαｉメカニズムがこの高用量ＧｎＲＨＩ効果の原因である可能性があることを示す。従って、高用量のＧｎＲＨＩ（５０μＭ）がイノシトールリン酸の蓄積を誘発する能力は、ＢＰＨ−１細胞と２００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素（ＰＴＸ）との１６時間のプレインキュベーションにより排除された。誘発されたイノシトールリン酸の蓄積と対照的に、強力な細胞マイトジェンであるリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）はＰＴＸプレインキュベーションに対して非感受性であった。このことは、これらの細胞におけるＬＰＡ  ＧＰＣＲがＧαｉとは無関係にＰＬＣ−βの活性化を刺激することができることを示唆している。
【００６８】
図７にＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞におけるＪＮＫ及びｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼのＧｎＲＨ誘発性活性化を示す。他の２つの型のマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化をＪＮＫ２又はｐ３８のｍｙｃ標識構成体を過剰発現させることによりＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞において試験した。いずれかの細胞系のＧｎＲＨＲ−リガンド刺激の後のこれらの構成体の免疫沈降により、活性なリン酸化型のキナーゼに対して特異的な血清を用いてキナーゼの活性化の程度を評価することが可能であった。両細胞系において、これらのＭＡＰＫｓの強力な刺激が存在したが、刺激されたキナーゼの細胞依存性があるように思われ、ＪＥＧ−３では免疫沈降ｍｙｃ−ＪＮＫ２の有意な活性化のみが示され（パネルａ、ｐ３８αデータは示さず）、一方、ＢＰＨ−１細胞ではｍｙｃ−ｐ３８αの有意な活性化のみが検出された（パネルｂ、ＪＮＫ２データは示さず）。パネルａ及びｂにおいて、用いたＧｎＲＨＩの用量は１００ｎＭであった。各パネルにおけるヒストグラムは、３回の実験の時間経過の平均値±標準誤差平均値を表す。
【００６９】
図８にＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞におけるＪＮＫ又はｐ３８  ＭＡＰＫのリガンド特異的活性化を示す。パネルａは、ＧｎＲＨＩとＡｎｔ１３５−２５はｍｙｃ−ＪＮＫ２構成体を効率よく活性化することができる（活性化リン酸化状態により測定される）が、Ａｎｔ１３５−１８による同様な細胞刺激でＪＮＫが効率よく活性化されないことを示している。挿入図のイムノブロットは、免疫沈降したＪＮＫ２のリン酸化状態は増加しているが、非リン酸化総タンパク質のレベル（α−ＪＮＫ抗血清により検出される）は変化しないままであることを示している。下のヒストグラムは、上のウエスタンブロットの３回の実験の平均値±標準誤差平均値を示す。同じ範囲のリガンドによるＢＰＨ−１細胞の刺激（パネルｂ）により同様なパターンのＭＡＰＫ活性化が得られるが、この場合、ｐ３８αである。従って、ＧｎＲＨＩとＡｎｔ１３５−２５はｐ３８αを効率よく活性化するが、Ａｎｔ１３５−１８は効率よく活性化しない。挿入図のイムノブロットは、ｐ３８αのリン酸化は増加しているが、総ｐ３８αタンパク質は増加していないことを示している。下のヒストグラムは、上のウエスタンブロットの３回の実験の平均値±標準誤差平均値を示す。
【００７０】
図９にＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５がＧαｉ型Ｇタンパク質を活性化することを示す。ＢＰＨ−１及びＪＥＧ−３細胞において、ＧｎＲＨＩとＡｎｔ１３５−２５はフォルスコリン（ＦＳＫ）刺激性細胞内ｃＡＭＰ蓄積に拮抗することができる。パネルａ及びｂに、それぞれ比色Ｂｉｏｍｏｌ  ｃＡＭＰアッセイキットを用いて測定したＢＰＨ−１及びＪＥＧ−３細胞におけるｃＡＭＰの細胞内レベルに対するＦＳＫ、ＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５の効果を示す。パネルａ及びｂからわかるように、ＦＳＫ（２μＭ、１５分）による単一刺激により細胞内ｃＡＭＰレベルが著しく上昇する。しかし、ＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５への前曝露（１０、３０、６０分）の時間の延長に伴ってＦＳＫ刺激性ｃＡＭＰ蓄積の程度は有意に低下した。ＦＳＫ刺激性ｃＡＭＰ蓄積の最も強い阻害は、ＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５について６０分間の前曝露で認められた。パネルｃ（ＢＰＨ−１）及びｄ（ＪＥＧ−３）において、ＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５によるＦＳＫ刺激性ｃＡＭＰ蓄積の阻害（各場合に６０分間の前曝露）は、細胞の２００ｎｇ／ｍｌのＰＴＸとの１６時間のプレインキュベーションによって特に阻害することができる。パネルａないしｄにおける各ヒストグラムは、ｃＡＭＰ蓄積アッセイの３から４回の実験の平均値±平均値の標準誤差を示す。
【００７１】
図１０にＪＮＫ又はｐ３８のＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５活性化がＧαｉ刺激に依存することを示す。ＪＥＧ−３細胞におけるＪＮＫの刺激及びＢＰＨ−１細胞におけるｐ３８の刺激とＰＴＸへの前曝露に対するその感受性を、免疫沈降ｍｙｃ−ＪＮＫ２又はｍｙｃ−ｐ３８αのリン酸化を活性化する程度を測定することにより評価した。パネルａに、ＧｎＲＨＩ（１００ｎＭ）又はＡｎｔ１３５−２５（１００ｎＭ）で刺激したＪＥＧ−３細胞からの免疫沈降ｍｙｃ−ＪＮＫ２の代表的なウエスタンブロットを示す。ＪＮＫのリン酸化状態は、ＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５により上昇し、総免疫沈降ＪＮＫレベルの有意な変化はなかった（α−ｍｙｃ抗血清を用いたイムノブロットにより評価）。しかし、ＪＮＫリン酸化の増加は、ＰＴＸプレインキュベーション（１６時間、２００ｎｇ／ｍｌ）により阻害された。パネルｂ及びｃにおけるヒストグラムは、上のウエスタンブロット（パネルａ）の３回の実験の平均値±標準誤差平均値を示す。パネルｄに、免疫沈降ｍｙｃ−ｐ３８αのリン酸化状態を測定すること以外はパネルａと同じ実験を示す。ＪＥＧ−３細胞の場合と同様に、ＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５によるＭＡＰＫの活性化は、ＰＴＸの前曝露（１６時間、２００ｎｇ／ｍｌ）に対して著しく感受性が高い。パネルｅ及びｆにおけるヒストグラムは、上のウエスタンブロット（パネルｄ）の３回の実験の平均値±標準誤差平均値を示す。
【００７２】
図１１にＪＮＫ又はｐ３８  ＭＡＰＫｓの選択的阻害によるＧｎＲＨＩ媒介性アポトーシスの阻害を示す。ＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１細胞のプロアポトーシス性表現型（図４に示す）に対するＧｎＲＨ媒介ＪＮＫ又はｐ３８活性化の寄与を化学的ＭＡＰＫ阻害を用いて評価した。パネルａに、高用量（２０μＭ）のＳＢ２０３５８０の存在下又は非存在下で１００ｎＭのＧｎＲＨＩで刺激したＪＥＧ−３細胞の位相差顕微鏡像を示す。この用量のＳＢ２０３５８０はこれらの細胞におけるＪＮＫを刺激するＧｎＲＨＩの能力を消失させるが、ＥＲＫ１／２ＭＡＰＫｓの活性化に有意な影響を及ぼさない（データは示さず）。非刺激細胞（１、４、７）は、アネキシンＶ  ＦＩＴＣ染色を示さず、細胞膜の形態が正常であることが示唆される。４８時間の連続ＧｎＲＨＩ処理により細胞は抗アネキシンＶ−ＦＩＴＣ免疫反応性になり始め（２、５，８）、プロアポトーシス状態に入り始めたことが立証された。しかし、ＧｎＲＨＩをＳＢ２０３５８０の存在下でインキュベートしたとき、プロアポトーシス状態に入る細胞量が有意に低下する（３、６、９）。この試験のＢＰＨ−１細胞への移行に同様な実験アプローチを用いたが、これらの細胞における試験するＭＡＰＫがｐ３８であったとき、化合物がＪＮＫと比べてｐ３８に対してはるかに大きい阻害効力を有するので、はるかに低い用量のＳＢ２０３５８０（１μＭ）を用いることができた。パネルａと同様に、ＢＰＨ−１細胞におけるＧｎＲＨ媒介性ＥＲＫ活性化に対するこのＳＢ２０３５８０の濃度の影響は認められなかったが、この用量はｐ３８のＧｎＲＨ媒介性活性化を有意に鈍化させた（データは示さず）。ＪＥＧ−３細胞におけるＳＢ２０３５８０のＧｎＲＨとの同時インキュベーションの影響と同様に、化学的阻害因子を含めることにより、ＧｎＲＨがＢＰＨ−１細胞におけるプロアポトーシス状態を誘導することが妨げられた（２、５、８を３、６、９と比較）。
【００７３】
図１２にＡｎｔ１３５−２５がＡｎｔ１３５−１８と比較して明らかな薬理学的プロファイルを有することを示す。単一ＧｎＲＨ受容体集団を発現する２つの細胞系を用いて、Ａｎｔ１３５−２５が、末梢腫瘍細胞におけるＧｎＲＨ作用の部位であると提唱されているＩＩ型ＧｎＲＨＲにおいて有意な生物学的活性を作用させないように思われることを示すことができる。パネルａ及びｂにおけるヒストグラムは、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体のみを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＳＣＬ６０）のイノシトールリン酸蓄積データを示す。パネルａにおいて、ＧｎＲＨＩ（１０ｎＭ）は、イノシトールリン酸の放出の有意な増加によって示されたように、その同種受容体において典型的なアゴニストとしての活性を示すが、高用量のＡｎｔ１３５−１８でさえもＩ型ＧｎＲＨ受容体において古典的アゴニストとしての能力をほとんど有さないように思われる。パネルｂにおいて、ＳＣＬ６０細胞を代わりにＡｎｔ１３５−２５ならびにＧｎＲＨＩで刺激している。この場合にも古典的なアゴニストとしての活性は示されていない。パネルｃ及びｄにおいて、生成したイノシトールリン酸の放出を、マーモセットＩＩ型ＧｎＲＨ受容体（αＴ４−ＩＩと称する）を安定に発現するプロトゴナドトロープ細胞（αＴ４）において測定した。パネルｃでは、ＧｎＲＨＩＩ（１０ｎＭ）による細胞の刺激によりＳＣＬ６０細胞に対するＧｎＲＨＩと同様な作用がもたらされたが、Ａｎｔ１３５−１８はこれらのＩＩ型ＧｎＲＨ受容体発現細胞に対して用量依存的なアゴニストとしての活性を明らかに示す。これに対してパネルｄでは、高用量でさえもＡｎｔ１３５−２５は遊離のイノシトールリン酸の放出を引き起こさない。両細胞系ＳＣＬ６０及びαＴ４−ＩＩにおいて、ここで測定した遊離イノシトールリン酸はＰＴＸに対して著しく鈍感に放出された。このことから、Ａｎｔ１３５−２５は、ＧｎＲＨ受容体（Ｉ型）が主としてＧαｉ型Ｇタンパク質に共役している細胞環境において主としてアゴニストとしての作用を及ぼすことがある程度示唆される。
【実施例１】
【００７４】
ＧｎＲＨを基礎とする抗腫瘍療法薬剤の開発
４種のＧｎＲＨ受容体リガンド（ＧｎＲＨＩ、ＧｎＲＨＩＩならびに２種の合成ＧｎＲＨアンタゴニスト１３５−１８及び１３５−２５）をスクリーニングした。
【００７５】
アンタゴニスト１３５−１８は次の式を有する：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−４−ＣｌＰｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｄ−イソプロピルＬｙｓ−Ｌｅｕ−イソプロピルＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−ＡｌａＮＨ２。
【００７６】
アンタゴニスト１３５−２５は次の式を有する：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−４−ＣｌＰｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−１−ＭｅＰａｌ−Ｄ−イソプロピルＬｙｓ−Ｌｅｕ−イソプロピルＬｙｓ−Ｐｒｏ−Ｄ−ＡｌａＮＨ２。
【００７７】
用いた略語は以下のとおりである。
Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）は、アセチル−Ｄ−２−ナフチルアラニンである。
Ｄ−４−ＣｌＰｈｅは、Ｄ−４−クロロフェニルアラニンである。
Ｄ−Ｐａｌは、Ｄ−ピリジルアラニンである。
Ｓｅｒは、セリンである。
ＭｅＰａｌは、メチルピリジルアラニンである。
Ｉｌｅは、イソロイシンである。
Ｄ−イソプロピルＬｙｓは、Ｄ−イソプロピルリシンである。
Ｌｅｕは、ロイシンである。
Ｐｒｏは、プロリンである。
Ａｌａは、アラニンである。
【００７８】
材料及び方法
これらは図の説明文に記述されている。
【００７９】
結果
ＧｎＲＨ及びリガンド類似体は癌性組織に対する抗増殖効果を媒介する
ＪＥＧ−３ヒト絨毛癌、ヒト良性前立腺過形成（ＢＰＨ−１）又はラットＩ型ＧｎＲＨ受容体を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＳＣＬ６０）の単層の連続処理により、これらの３つの細胞型のすべての細胞複製成長の遅延がもたらされた。各細胞型を最初の最小集密度（１０〜２０％）で平板培養し、５日目までに１００％細胞集密度が得られないと思われる、５日間にわたる継続的な正常細胞成長を行わせた。すべての実験濃度について３系列で、各リガンドを細胞単層とともに５日間インキュベートした。リガンドは１２時間ごとに交換した。刺激期間の終了時に、生細胞の数をトリパンブルー染色の取り込みを妨げる細胞の能力により推定した。図１で、ＧｎＲＨＩ（パネルａ）、ＧｎＲＨＩＩ（パネルｂ）及びアンタゴニスト１３５−２５（Ａｎｔ１３５−２５：パネルｄ）によるＪＥＧ−３細胞の細胞成長の阻害について明らかな用量反応関係があることが認められる。しかし、Ａｎｔ１３５−２５と化学的に類似したアンタゴニスト１３５−１８（Ａｎｔ１３５−１８）は、ＧｎＲＨＩ、ＧｎＲＨＩＩ又はＡｎｔ１３５−２５によってもたらされた抗増殖効果と同様な大きさの抗増殖効果を示さなかった。従って、これらのデータは、最近の報告（Ｇｒｕｎｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、第８７巻、１４２７〜１４３０頁）と異なり、ＧｎＲＨＩ及びＧｎＲＨＩＩは細胞増殖に対して同様な効果を及ぼすと薬理学的に思われることを示唆している。さらに、Ａｎｔ１３５−１８は、いくつかの動物種からクローンしたＩＩ型ＧｎＲＨＲｓに対する高度の部分的アゴニストとしての活性を有し（Ｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２年）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、第１６巻、１０７９〜１０８８頁）、ＩＩ型ＧｎＲＨＲｓにおけるアゴニストとしての活性を示さないＡｎｔ１３５−２５よりも大きい抗増殖作用を示さないことから、ＧｎＲＨに基づく抗増殖効果はＩＩ型ＧｎＲＨ受容体（ＧｎＲＨＲ）刺激を介して起こることはあり得ないと思われる。
【００８０】
ＧｎＲＨ及びリガンド類似体は過形成組織に対する抗増殖効果を媒介する
前の段落及び図１に示したのと同じ成長及び刺激方法を用いて、過形成細胞系ＢＰＨ−１を同じパネルのＧｎＲＨリガンド及びアンタゴニスト類似体に曝露させた（図２）。図１と同様に、両内因性ＧｎＲＨアゴニストは、５日間の刺激期間にわたるＢＰＨ−１細胞成長の用量依存的阻害に関して同様な様式の作用を及ぼす。しかし、ＪＥＧ−３細胞とわずかに異なる点は、ＧｎＲＨＩは細胞成長を抑制させる能力がＧｎＲＨＩＩよりも強いと考えられることである。この結果は、実際にＩＩ型ＧｎＲＨ受容体又は特異的ＧｎＲＨＩＩリガンド作用が腫瘍細胞に対するＧｎＲＨリガンドの抗増殖効果に重要な役割を果たしているという最近の主張と直接的な対照をなすものである。ＪＥＧ−３細胞に対するリガンド効果と同様に、Ａｎｔ１３５−２５は、ＢＰＨ−１細胞に対して抗増殖効果を及ぼし、その効力はＧｎＲＨＩと同様であるが、Ａｎｔ１３５−１８は再び低い抗増殖効力を示す。従って、これらの細胞で起こっている抗増殖効果は機能的ヒトＩＩ型ＧｎＲＨ受容体に対する直接的作用によるものでないという概念を増強するものである。
【００８１】
ＧｎＲＨ及びリガンド類似体は癌性非過形成組織に対する抗増殖効果を媒介する
我々はさらに、モデル細胞バックグラウンド、すなわち、ラットＩ型ＧｎＲＨＲを安定に発現するＳＣＬ６０  ＨＥＫ２９３細胞に対する我々のリガンドパネルの作用を試験することにより、ＧｎＲＨ受容体系の抗増殖効果のリガンド−受容体特異性の性質を判定した。ＧｎＲＨＩによるＳＣＬ６０細胞の継続的処理（図３、パネルａ）で、細胞成長速度の劇的な低下と総細胞数の有意な消失があった。ＢＰＨ−１細胞の場合と同様に、ＧｎＲＨＩＩリガンドは、ＳＣＬ６０細胞成長を抑制させる点がＧｎＲＨＩよりも効力が低いと考えられる。Ａｎｔ１３５−１８がＳＣＬ６０細胞増殖の阻害について比較的無効であることが証明され、一方、Ａｎｔ１３５−２５はＧｎＲＨＩ又はＧｎＲＨＩＩとほぼ同様に有効な効果を有していたという点で、２つの古典的なＧｎＲＨＲアンタゴニストは前の２つの細胞系におけると同様に挙動した。ＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１細胞と比較して、かなり大きい細胞成長の阻害と大きい程度の検出可能な細胞死が４８時間以後に認められる。我々は、ＳＣＬ６０細胞に対するＧｎＲＨＲリガンドのこのより大きい効果は、ＳＣＬ６０細胞における受容体発現のレベルがはるかに大きいことに帰していると考える。ごくわずかなレベルの細胞表面受容体発現がＪＥＧ−３細胞及びＢＰＨ−１細胞に認められ（Ｉ１２５−Ｈｉｓ５−Ｔｙｒ６−ＧｎＲＨＩの特異的２００ｃｐｍ以下）、一方、１０倍以上大きい発現レベルがＳＣＬ６０細胞で示されている。
【００８２】
ＧｎＲＨは癌及び過形成細胞におけるプロアポトーシス状態の発生を誘導する
我々はＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１の継続的なＧｎＲＨリガンド刺激により、細胞成長の遅延が起こることを示したが、我々は、最近いくつかの細胞系で起こることが報告された（Ｓｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．第８７巻、４５８０〜４５８６頁）細胞アポトーシスの真の誘導があったかどうかについて関心を持った。この目的のために、我々はいずれかの細胞系のＧｎＲＨリガンド刺激がアポトーシスの古典的シグナルの発生をもたらすかどうかを判定した。最初に我々は、細胞形質膜の超微細構造の完全性に対するＧｎＲＨ刺激の影響を測定した。アポトーシスにおける十分な証拠資料の裏づけがある初期の事象は、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のような多くの形質膜分子の極性の反転である。細胞アポトーシスの初期においては、形質膜の内側エンベロープから外側エンベロープへのＰＳの有意な転移がある。曝露されたＰＳに対するアネキシン−Ｖタンパク質の高い親和力を用いて、我々はＪＥＧ−３細胞の長期ＧｎＲＨ曝露がＧｎＲＨＩで刺激した細胞の外側エンベロープ上のアネキシン−Ｖ反応性ＰＳの発現をもたらすかどうかについて試験した。継代培養の２４時間後の非刺激ＪＥＧ−３細胞は、ＦＩＴＣ発蛍光団（１：１００希釈）にあらかじめ結合させたアネキシン−Ｖとの１時間のインキュベーションで細胞に関連した有意な緑色蛍光は存在しなかったことから、細胞外膜ＰＳは示さなかった（図４、パネルａ、像１〜３）。２４時間にわたる細胞の刺激とその後の細胞のアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣとのインキュベーションで、細胞外膜ＰＳの有意な発現がなかったことが示された（図４、パネルａ、像４〜６）。しかし、継続刺激の期間を長くした場合（４８時間）、かなりの量の外膜アネキシン−Ｖ反応性ＰＳが存在した（図４、パネルａ、像１０〜１２）。これに対して、同時培養非刺激細胞は外膜アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ染色を示さなかった（図４、パネルａ、像７〜９）。従って、４８時間の連続ＧｎＲＨＩ刺激（１００ｎＭ）後においてのみ、細胞外エンベロープＰＳの存在により示されたように、形質膜反転の誘導が存在した。同様な結果が、同様な期間のＧｎＲＨＩ刺激でＢＰＨ−１細胞について得られた（データは示さず）。初期の形質膜ＰＳ反転の発生に加えて、我々は長期ＧｎＲＨＩ曝露により細胞において誘導されたさらなるプロアポトーシス事象を示すこともできた。そこで、我々は多くの組織において細胞分解に関与しているプロアポトーシス性カスパーゼ酵素の発生を試験した。粗全細胞溶解産物抽出物をＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１細胞から調製し、プロカスパーゼ３又はその開裂活性副生成物カスパーゼ３の細胞レベルを特異的イムノブロットにより測定した。１００ｎＭ  ＧｎＲＨＩにより継続的に刺激したＪＥＧ−３細胞では、最初のリガンド刺激の２４〜４８時間後に明らかなプロカスパーゼ３の細胞レベルの有意な上昇があった（図４、パネルｂ）。活性カスパーゼ３の発生と細胞レベルの上昇は、発生するのにより長時間を必要とし、４８〜７２時間のＧｎＲＨＩインキュベーションでのみ有意に明らかであった。ＧｎＲＨＩ刺激時のＢＰＨ−１細胞におけるプロカスパーゼ及び開裂カスパーゼ３の時間依存的増加のＪＥＧ−３におけるそれと同様なパターンがＢＰＨ−１細胞において認められ（図４、パネルｃ）、開裂カスパーゼ３の発生のより速やかな開始とＧｎＲＨ継続刺激の開始時のプロカスパーゼのより大きい基礎レベルが存在していたように思われた。
【００８３】
ＧｎＲＨ受容体活性化は過形成及び癌組織におけるストレス活性化タンパク質キナーゼ経路を活性化する
多くの研究グループ（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、第１７０巻、１４３〜１５１頁、Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５９巻、５１３３〜５１４２頁）により腫瘍細胞系の刺激時に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーの細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）イソ型の強力かつ長期の刺激が存在することが示された。しかしながら、多くの組織においてＥＲＫの活性化の増殖作用が一般的に十分に実証されている（Ｇｕｔｋｉｎｄ（１９９８年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７３巻、１８３９〜１８４２頁）にもかかわらず、ＥＲＫのこの活性化と同時にＧｎＲＨ類似体の抗増殖作用の実証が存在する。従って、ＧｎＲＨ類似体が細胞成長及び増殖を阻害するが、ＥＲＫイソ型を強力に活性化するという点でパラドックスが存在する。最近のデータも表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）活性に対する阻害作用（Ｇｒｕｎｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１年）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１４２巻、２３６９〜２３８０頁）がＧｎＲＨ類似体の抗増殖作用に一部寄与していることを示している。しかし、末梢ＧｎＲＨ応答性腫瘍組織における持続性ＥＲＫ活性化の発生の重要な証拠が存在し、実際、我々の実験パラダイムにおいて我々は実際にＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞におけるＥＲＫ１／２キナーゼの再現性のあるＧｎＲＨＩによる活性化を認めた（図５）。他の内因性Ｇタンパク質共役受容体、例えば、ＬＰＡ応答性ＥＤＧタイプ受容体の刺激と比較して、ＥＲＫ１／２活性化の程度は比較的小さい（データは示さず）。細胞増殖に対する作用と同様に、我々はＧｎＲＨＩ、ＧｎＲＨＩＩ及びＡｎｔ１３５−２５と比較してＥＲＫ１／２活性化を刺激するＡｎｔ１３５−１８の効力はかなり小さいことに気づいた（図５、パネルｂ及びｃ）。末梢腫瘍細胞におけるＥＲＫ１／２ＭＡＰキナーゼの活性化に加えて、多くの報告がＧｎＲＨ刺激により誘発されるイノシトールリン酸代謝回転の欠如を示している。実際、我々も低用量のＧｎＲＨとその類似体（１ないし１μＭまで）を用いた場合に、測定可能なイノシトールリン酸の代謝回転は存在しなかったことを認めた（図６、パネルａ〜ｄ）。しかし、高用量（５０μＭまで）では、ＧｎＲＨＩ、ＧｎＲＨＩＩ及びＡｎｔ１３５−２５はイノシトールリン酸の蓄積を誘発するわずかな能力を示した。この代謝回転を活性化した用量は、その同種Ｇタンパク質（Ｇαｑ）によるＰＬＣ−βの活性化ではなく、イノシトール代謝回転の活性化が他のＧタンパク質、例えばＧαｉのＧβγサブユニットにより媒介されることを示唆するものであると思われる。従って図６のパネルｅに、我々はＧｎＲＨにより誘発された極めて小さいイノシトールリン酸の代謝回転は百日咳毒素（ＰＴＸ）による前処理に対して感受性を示したが、ＬＰＡ処理（Ｇαｑ共役受容体も活性化する）により誘発された頑健なイノシトールリン酸の代謝回転は百日咳毒素に対して完全に非感受性であったことを示した。従って、先行する報告による確証においてＧｎＲＨにより末梢腫瘍細胞において誘発される無視できるイノシトールリン酸の代謝回転が存在すると思われる。しかしながら、はるかに高い用量では、おそらくＰＬＣ−βのＧβγ媒介性活性化によるイノシトールリン酸の代謝回転を刺激するＰＴＸ感受性の能力が存在すると思われる。
【００８４】
しかし、１ｍＭのＬＰＡによるＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１細胞の連続処理では、細胞成長が有意に減少せず、５日間の連続処理後に細胞数のわずかな増加が常に引き起こされた。従って、ＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１細胞のＧｎＲＨによる刺激の能力はそれらの抗増殖作用と相関しないと思われる。我々はさらに、ＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１のＧｎＲＨ刺激が他のＭＡＰＫイソ型の有意な活性化をもたらすかどうかを評価した。ＥＲＫ５（又はＢＭＫ）のキナーゼ活性型に対する特異血清を用いた場合、我々はこの型のＭＡＰＫの特異的活性化を認めなかったが、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）又はｐ３８ＭＡＰＫの活性型を特異的に認識する抗血清を用いた場合、我々はＪＥＧ−３細胞におけるＪＮＫの強力であるが、遅延性のＧｎＲＨ誘発性活性化があったことと、ＢＰＨ−１細胞におけるｐ３８の同様に開始の遅い活性化を認めた。これらの細胞における内因性ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＳＡＰＫｓ）の活性化のレベルは比較的小さかったが、ＧｎＲＨ活性化ＥＲＫレベルより大きかった。認められたＳＡＰＫ活性化の妥当性をさらに判定するために、我々は腫瘍細胞系にｍｙｃ標識ＪＮＫ２又はｐ３８αＭＡＰＫイソ型をトランスフェクトし、細胞をＧｎＲＨで刺激し、抗ｍｙｃ血清で免疫沈降させ、総ＪＮＫ／ｐ３８タンパク質及び活性ＪＮＫ／ｐ３８の免疫沈降をウエスタンブロットした。図７（パネルａ）において、ＧｎＲＨは免疫沈降性ＪＮＫ２の明白な時間依存的かつ長期の活性化をもたらす。ＪＮＫ２の活性化は、一般的にＧｎＲＨＩ刺激の３０分後に起こった。ＢＰＨ−１細胞では、ＧｎＲＨＩによる刺激は免疫沈降性ｍｙｃ−ｐ３８αの長期活性化ももたらした。ＪＥＧ−３細胞におけるＪＮＫの活性化と同様に、一般的に発生し、ＧｎＲＨリガンドの投与の２０分以内にピークに達するＥＲＫシグナル伝達事象と異なり、ｐ３８活性化の開始のかなりの遅延が認められた（図７、パネルｂ）。
【００８５】
ストレス活性化プロテインキナーゼ経路のＧｎＲＨによる活性化はプロアポトーシス状態の誘発に関与する
我々はＳＡＰＫ経路を活性化するＧｎＲＨの能力とアポトーシスの初期の徴候の観察される発生、例えば、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣタンパク質複合体との反応性をもたらす、形質膜エンベロープの内面から外面へのＰＳの転移との間に関連性があるかどうかを判定した。この目的のために、我々は、低用量（１μＭ）ではｐ３８ＳＡＰＫ活性の強力な阻害物質として作用するが、高用量（２０μＭ）ではＳＡＰＫタンパク質のＪＮＫファミリーに対して付加的な阻害活性を作用させる（Ｍａｎｇｏｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００年）、Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、第１８巻、６９３〜７０４頁）ＳＡＰＫ阻害物質ＳＢ２０３５８０を用いた。４８時間にわたる２０μＭのＳＢ２０３５８０及びＧｎＲＨＩとＪＥＧ−３細胞との同時インキュベーションにより、形質膜の外面のアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ染色の程度の有意な減少がもたらされた（図１１、パネルａ、４〜６、７〜９と比較）。ＳＢ２０３５８０で処理した細胞の一般的な成長パターンと肉眼的形態には、ＧｎＲＨのみで処理した細胞又は非刺激細胞と比べて有意な差はないことが認められた。ＳＢ２０３５８０処理に対するＤＭＳＯ溶媒対照を実施したが、これらは細胞成長又は形態に対する有意な影響を示さなかった（データは示さず）。より低く、より特異的な用量のＳＢ２０３５８０（１μＭ）を用いた並行実験において、ＢＰＨ−１細胞をＳＢ２０３５８０の存在下又は非存在下でＧｎＲＨＩと４８時間にわたり同時インキュベートした。図１１のパネルｂ像４〜６に示すように、外側形質膜エンベロープ上のアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ反応性の有意な誘発が認められ、これはＧｎＲＨＩ＋１μＭ  ＳＢ２０３５８０の同時処理によりほぼ完全に阻害された。ＪＥＧ−３細胞における実験と同様に、ＳＢ２０３５８０処理細胞又はＤＭＳＯ溶媒処理細胞について細胞形態及び成長速度の有意な観察できる変化はなかった。従って、ＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞におけるＧｎＲＨ誘導ＳＡＰＫ経路の阻害により、これらの２つの細胞系における細胞増殖を阻害するＧｎＲＨＲ活性化の能力を低下させることができると思われる。
【００８６】
ＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞におけるＳＡＰＫ経路のＧｎＲＨリガンド活性化はＧαｉに基づく受容体機構を介して起こる
我々は、両細胞系、すなわちＪＥＧ−３及び過形成細胞系ＢＰＨ−１においてＩ型ＧｎＲＨＲ活性化時にＳＡＰＫ経路の著しい活性化が存在し、これらのプロテインキナーゼが両モデルにおけるプログラム細胞死の初期の徴候の発生に関連することを示した。多くの実験グループにより末梢腫瘍組織において発現するＧタンパク質共役ＧｎＲＨ受容体は下垂体の場におけるそれと比較して異常であることが示された。下垂体では、刺激されたＧｎＲＨＲの主要なＧタンパク質共役事象は、ＧαｑタイプのＧタンパク質を介するものであり、細胞内Ｃａ２＋の増加と結果として起こるプロテインキナーゼＣイソ型の活性化をもたらす。しかし、これと対照的に、末梢組織では、主要なＧｎＲＨＲ  Ｇタンパク質共役事象は百日咳毒素感受性Ｇαｉ  Ｇタンパク質経路を介すると思われる。これらの細胞系において唯一の型のＧｎＲＨ受容体、すなわち、Ｉ型ＧｎＲＨＲが存在すると示されているにもかかわらず、これが起こる。従って、我々は、我々の実験パラダイムにおいて細胞のＧｎＲＨリガンド活性が、Ｇαｉ型Ｇタンパク質経路を経るアポトーシスの初期の徴候の発生に関与することが以前に示唆されたＳＡＰＫ経路の刺激をもたらすかどうかを試験した。さらに、我々はある種のＧｎＲＨに基づくペプチドアンタゴニスト（Ａｎｔ１３５−２５）のＧｎＲＨＩ様抗増殖能と非定型Ｇαｉ  Ｇタンパク質経路を刺激する能力との間に相関があるかどうかを解明することに興味を持った。
【００８７】
我々は最初に、ＧｎＲＨ及びＡｎｔ１３５−２５刺激時に両細胞系にＧαｉタンパク質の実際の活性化が存在したことを示した。我々はサイクリックアデノシン一リン酸レベル（ｃＡＭＰ）を市販の蛍光アッセイシステム（Ｂｉｏｍｏｌ）を用いて測定したとき、フォルスコリン（ＪＥＧ−３では１μＭ、ＢＰＨ−１では３μＭ、各場合に５０％Ｒｍａｘ反応をもたらすのに十分）の能力は１００ｎＭ  ＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５による長時間の前処理（１０〜６０分）により鈍化したことを認めた（図９、パネルａ−ＢＰＨ、パネルｂ−ＪＥＧ）。図９のパネルｃ（ＢＰＨ）及びパネルｄ（ＪＥＧ）において、フォルスコリン媒介ｃＡＭＰ蓄積を阻害する６０分のＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５の能力は２００ｎｇ／ｍｌのＰＴＸによる１６時間の前処理により減少した。従って、両リガンドは、試験した両細胞モデルにおけるＧαｉのアデニル酸シクラーゼ阻害活性を効率的に活性化することができると思われる。
【００８８】
ＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１細胞中のＳＡＰＫ経路を刺激するＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５の能力を、このＳＡＰＫ経路の活性化が非定型Ｇαｉ型Ｇタンパク質経路を介するものか否かに関して評価した。そこで、ｍｙｃ−ＪＮＫ２をＪＥＧ−３細胞に、ｍｙｃ−ｐ３８αをＢＰＨ−１細胞にトランスフェクトした細胞を用いて、Ａｎｔ１３５−２５によるＪＮＫ又はｐ３８刺激の程度を評価した。図１０（パネルａ及びｄ）に示すように、代表的なウエスタンブロットはＧｎＲＨＩ（１００ｎＭ、３０分）又はＡｎｔ１３５−２５（１００ｎＭ、３０分）刺激時にそれぞれＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞における同様なレベルのＪＮＫ２又はｐ３８の活性化が存在することを示している。２００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素（ＰＴＸ）との１６時間のプレインキュベーションにより、ＳＡＰＫ経路を活性化するＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５の有意な阻害が認められ、実際に両リガンドがＧαｉ型Ｇタンパク質経路を活性化していることが示唆される。図１０のパネルｂ及びｃに、ＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５によるＪＮＫ２の活性化に対するＰＴＸ前処理の阻害作用に関するＪＥＧ−３細胞において集計された平均データを示す。パネルｅ及びｆに、ｐ３８αのＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５刺激がＧαｉ  ＰＴＸ感受性経路により起こることを再び示している、ＢＰＨ−１細胞において実施されたｐ３８α活性化実験から収集された同様なデータを示す。
【００８９】
アンタゴニスト１３５−２５はＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞におけるＳＡＰＫ経路の活性化を強力に刺激し、アンタゴニスト１３５−１８は刺激しない
我々はＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５による継続的刺激時にＪＥＧ−３及びＢＰＨ−１細胞はその成長速度を減速し、初期アポトーシス状態の徴候を示すことを示した。しかし、これらの実験をＡｎｔ１３５−２５と化学的に関連性のある薬剤、すなわち、Ａｎｔ１３５−１８を用いて並行して実施した場合、この薬剤で認められた抗増殖効果は、最も強力なＡｎｔ１３５−２５と構造が類似しているにもかかわらず極めて小さかった。従って、我々はＡｎｔ１３５−１８の抗増殖効力が低いというこの現象がＧαｉ−ＳＡＰＫ経路を活性化するその能力にあるのかどうかを判定した。ＪＥＧ−３細胞におけるＪＮＫ２又はＢＰＨ−１細胞におけるｐ３８αを活性化するその能力について試験したとき、Ａｎｔ１３５−１８は、ＳＡＰＫイソ型を活性化することに関して、ＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５よりも劇的に低い有効性を示した（図８）。従って、我々はＡｎｔ１３５−２５は、ＧｎＲＨＩと同様にＪＥＧ−３又はＢＰＨ−１細胞におけるＧαｉ型経路を十分に活性化することができるのに対して、化学的に関連するＡｎｔ１３５−１８は、この型の非定型ＧｎＲＨ受容体活性化に関して、はるかに低い効力を有する。従って、我々は、これらのモデル細胞系におけるＧｎＲＨＲとＧαｉ  Ｇタンパク質経路との間の生産的共役をＡｎｔ１３５−１８が誘導することができないことが、その不十分な抗増殖効力の中心にあるということを提言することができよう。
【００９０】
アンタゴニスト１３５−２５は選択的なＧｎＲＨ受容体活性化プロファイルを示す
我々はＡｎｔ１３５−１８とＡｎｔ１３５−２５との間に高度の類似性があるにもかかわらず、特定の型のＧｎＲＨ受容体活性を刺激する、ひいては３種の腫瘍及び過形成細胞系に対する抗腫瘍効果を及ぼす能力の有意な差があることを示した。最近の報告で、末梢生殖組織腫瘍系に認められた非定型ＧｎＲＨ受容体の薬理学的特性は、Ｍｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９８巻、９６３６〜９６４１頁により最初にクローン化されたものと類似したＩＩ型ヒトＧｎＲＨ受容体の発現に起因することが示唆された。我々は以前に、哺乳動物ＩＩ型（マーモセット）及び非哺乳動物ＧｎＲＨ受容体に対して、古典的ＧｎＲＨ  Ｉ型受容体アンタゴニストは様々な程度の部分アゴニスト活性を有することを示した。しかし、実際に本試験に用いたモデル細胞に対するＧｎＲＨ及び関連リガンドの末梢抗増殖作用があるならば、Ａｎｔ１３５−１８は、非哺乳動物（データは示さず）及び哺乳動物ＩＩ型ＧｎＲＨ受容体（図１２）に対してはＡｎｔ１３５−２５よりもるかに大きい部分アゴニスト活性を有するので、Ａｎｔ１３５−２５よりもはるかに大きい抗増殖有効性を有することになる。従って、ラットＩ型ＧｎＲＨ受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞（ＳＣＬ６０）において比較したとき、両アンタゴニストＡｎｔ１３５−１８及びＡｎｔ１３５−２５は古典的アンタゴニスト活性を示し、部分アゴニスト活性を示さない（図１２、パネルａ及びｂ）。しかし、２つのアンタゴニストをマーモセットＩＩ型のみを発現する細胞バックグラウンド、すなわちマーモセットＩＩ型ＧｎＲＨ受容体を安定に発現するαＴ４プロトゴナドトロープ細胞（Ｍｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９８巻、９６３６〜９６４１頁）において比較するとき、Ａｎｔ１３５−１８はかなりの部分アゴニスト活性を示した（図１２、パネルｃ）が、Ａｎｔ１３５−２５はＩＩ型マーモセットＧｎＲＨ受容体に対して部分アゴニスト活性を全く示さなかった（図１２、パネルｄ）。従って、薬理学的及び分子生物学的観点からは、ＧｎＲＨＩ又はＡｎｔ１３５−２５の抗増殖作用が新規のヒトＩＩ型ＧｎＲＨ受容体の刺激を介して起こるということは極めて考えがたい。
【００９１】
試験に供した４種の主要な薬剤が異所発現したＩ型又はＩＩ型ＧｎＲＨＲを活性化する能力を試験した（図１２）。ＧｎＲＨＲ刺激により活性化される古典的なシグナル伝達カスケードは、Ｇαｑ−ＰＬＣ−βカスケードである。Ｉ型及びＩＩ型受容体は、Ｇαｑ−ＰＬＣタイプのＧタンパク質を刺激し、ホスファチジルイノシトール二リン酸（ＰＩＰ２）をイノシトール三リン酸（ＩＰ３）、他のより低いイノシトールリン酸（ＩＰｎ）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）に分裂させるＰＬＣ−βを活性化することができる。ＩＰ３の主な機能は細胞内Ｃａ２＋を上昇させることであり、一方、ＤＡＧは特異的ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）イソ型の活性化をもたらす。これらのＩＰｎｓの発生を測定して、我々はＩ型及びＩＩ型ＧｎＲＨＲｓが内因性リガンド（Ｉ型及びＩＩ型ＧｎＲＨ）により活性化されたことを示した。しかし、ＩＩ型受容体のみが１３５−１８により活性化され、Ｉ型受容体におけるＰＬＣ−βシグナルの活性化は認められなかった（データは示さず）。これに対して、化学的に類似した薬剤１３５−２５は異所発現したＩ型又はＩＩ型ＧｎＲＨＲｓにおいてＩＰｎの発生能力を示さなかった（図１２）。
【００９２】
図１２のパネルａ及びｂに、Ｉ型ＧｎＲＨＲを発現するＨＥＫ２９３細胞及びマーモセットＩＩ型ＧｎＲＨＲを発現するαＴ４プロトゴナドトロープ細胞の形質膜上の遊離細胞質３Ｈ−ミオイノシトールの発生を示す。アゴニスト刺激の前に、各細胞を、１μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−ミオイノシトールを添加したイノシトール不含有増殖培地中で４８時間インキュベートした。Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）によるＰＬＣ−βの活性化により、ＰＩＰ２（トリチウム３Ｈを取り込む）の遊離のより低いイノシトールリン酸（ＩＰｎｓ）への分裂がもたらされた。ＧｎＲＨＩ又はＧｎＲＨＩＩによるそれぞれＩ型又はＩＩ型ＧｎＲＨＲｓの刺激により、遊離のトリチウム化イノシトールリン酸の増加がもたらされる。しかしながら、アンタゴニスト１３５−２５（１０ｐＭ〜１μＭ）によるいずれかの受容体の刺激により、有意な遊離イノシトールリン酸の発生はもたらされなかった。従って、１３５−２５アンタゴニストは、Ｉ型及びＩＩ型ＧｎＲＨＲｓに対して高い結合親和力（データは示さず）と高い抗増殖有効性を示すにもかかわらず、ＧαｑタイプのＧタンパク質を活性化することが特にできないと思われる。
【００９３】
従って、１３５−２５は、他のＧｎＲＨＲシグナル伝達モダリティに対して有意な作用を有することなく、腫瘍細胞増殖を減弱させる能力を有するように思われる。用いた２つのアンタゴニスト１３５−２５及び１３５−１８は化学組成がわずかに異なっている（すなわち、１３５−２５の位置５のＭｅＰａｌ残基と１３５−１８のＩｌｅが異なっている）が、腫瘍細胞増殖に対する異なる効力を有するので、それらの物理化学的な差がＧｎＲＨリガンドの抗腫瘍能力を高めるためにこの部位における修飾の有用な標的を示している可能性がある。
【００９４】
考察
本試験において我々は、ＧｎＲＨＩのような内因性ＧｎＲＨリガンドと同様に、一般的に記述されている「アンタゴニスト」が末梢腫瘍細胞に対して、これらの細胞における受容体の薬理学的プロファイルの変化のため、アゴニストとして作用することができることを示した。抗増殖作用に関する効力がＡｎｔ１３５−１８と比べてＡｎｔ１３５−２５のほうが高いことは、Ｇαｉに有効に共役することができる活性型の受容体を安定化する２つのペプチドの相対的な能力によるものと思われる。従って、ＧｎＲＨ受容体「アンタゴニスト」としてのＡｎｔ１３５−２５の名称は、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体のＧαｑ選択型／状態を活性化／安定化するその能力を記述するにすぎないので、いくぶん見せかけである。従って、我々は本質的にＡｎｔ１３５−２５は、Ｇαｑ共役型の受容体に対して無効であると同時にＧαｉ共役型のＩ型ＧｎＲＨ受容体を活性化するその選択的能力のため、強力な抗増殖作用を及ぼすと述べた。
【００９５】
下垂体におけるＧｎＲＨ応答部位と末梢生殖組織におけるそれとの間のシグナル伝達の相違の性質に関する最初の仮説は、これらの末梢部位に存在する受容体は性腺刺激細胞における受容体と異なる性質のものであるということであった。しかし、最近の証拠は、２つの受容体部位は実際には同じであるが、それらの関連するシグナル伝達機構は明らかに異なっていることを示唆するものであった（Ｃｈｅｇｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、第８１巻、３２１５〜３２２１頁、Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８年）、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．第６２巻、２０１５〜２０２３頁、Ｃｈａｔｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、第５６巻、２０５５〜２０６５頁）。子宮内膜及び卵巣癌細胞の増殖がＧｎＲＨのアゴニスト及びアンタゴニスト類似体により抑制することができる（Ｅｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、第８巻、３３５〜３６２頁）ので、この二分法は下垂体型のＧｎＲＨシグナル伝達のアゴニスト及びアンタゴニストの作用にも拡大された。この問題の解決はＩｍａｉら（（１９９６年）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，Ｍｅｔａｂ．、第７７巻、１３２〜１３７頁）により提案され、彼らはおそらくＧｎＲＨ受容体をエフェクターに共役させるＧタンパク質αｉが末梢腫瘍と下垂体前葉との応答の差異に寄与している可能性があると推測した。興味深いことに、我々の試験と同様に、機能的ＬＰＡ媒介Ｇαｑ共役活性がこれらの腫瘍細胞に存在し（Ｇｒｕｎｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１年）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１４２巻、２３６９〜２３８０頁）、従って、Ｇタンパク質の病態生理学的喪失は受容体シグナル伝達の逆説的変化を説明することができないことが示された。本試験では、ＧαｑのＧｎＲＨ媒介活性化はほとんど認められなかったが、他のグループは最近、Ｉｓｈｉｋａｗａ細胞のような他の生殖腫瘍系においてＧｎＲＨはＧαｑへの共役を誘導することができることを示した（Ｇｒｕｎｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１年）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１４２巻、２３６９〜２３８０頁）。しかし、このグループは、この実存のＧαｑシグナル伝達はＧｎＲＨの抗増殖作用の発生に関与していなかったことを見いだした。従って、末梢腫瘍部位におけるＧｎＲＨ受容体を含む機能的シグナル伝達複合体は受容体を特異的Ｇαｉに共役させることができ、下垂体における複合体はできないということは確からしい。機能のこのような変化にどのようなタンパク質中間体が寄与していようとも、別の受容体相互作用性因子により、所与のリガンドが細胞環境に、明らかに異なる物理的終点と共にそのシグナルを向けることができる方法が劇的に変化し得ることは明らかである。従って、受容体のこのような差別的共役は、我々がこれらの末梢腫瘍部位のＧｎＲＨ受容体とリガンドとの相互作用の性質に関する我々の用語を再評価することを必要とするものである。従って、我々は、Ａｎｔ１３５−２５は、下垂体前葉レベルではＧαｑに基づくシグナル伝達機構の活性化に関してアンタゴニストとして十分に記述することができるが、既���のＧαｉ共役Ｉ型ＧｎＲＨ受容体の刺激にほぼ同等に有効であると思われるので、末梢細胞においては真のアゴニストとして挙動することを示した。さらに、我々は、末梢及び下垂体におけるこれらの２つの作用の間の分離は、ＧｎＲＨ受容体ペプチドリガンドの一次配列の変化により実現することができることを明確に示した。従って、Ａｎｔ１３５−１８とＡｎｔ１３５−２５との間の１アミノ酸の差異の転換が、Ｇαｉ共役末梢ＧｎＲＨ受容体における薬剤の効力の劇的な上昇をもたらしたが、下垂体Ｇαｑ共役受容体におけるＧｎＲＨの作用を機能的に阻害するその能力の変化はもたらさなかった。
【００９６】
ＧｎＲＨ類似体（アゴニスト及びアンタゴニスト）の使用は、婦人科学、生殖医療及び腫瘍学における適用に関して現在広く受け入れられている。これらの療法の大部分の作用機序は、下垂体前葉及び生殖腺の阻害に基づいている。古典的な「拮抗性」ＧｎＲＨ受容体リガンドは、初回投与直後に性腺刺激ホルモン及び性ステロイドの分泌を阻害し、反復投与を必要とするＧｎＲＨアゴニストよりも速やかな治療効果が得られるため、ＧｎＲＨ作動性ペプチドと比べて利点を有する（Ｓｃｈａｌｌｙ  Ａ．Ｖ．（１９９９年）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、第２０巻、１２４７〜１２６２頁）。アゴニストへの反復暴露が必要である理由は、下垂体前葉ＧｎＲＨシグナル伝達システムの機能的ダウンレギュレーションを誘導する必要があるためである。前立腺癌のような状態については、ＧｎＲＨの古典的な「アンタゴニスト」分子がアゴニストよりも好ましい。その理由は、特に、アゴニストを単剤として投与するときに約１０〜２０％の患者に発生するいわゆる「フレア」という障害を回避できるためである（Ｓｃｈａｌｌｙ  Ａ．Ｖ．  ＆  Ｃｏｍａｒｕ−Ｓｃａｌｌｙ  Ａ．Ｍ．（１９９７）Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｉｎ：Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｊ．Ｆ．、Ｆｒｕｉ  Ｅ．、Ｂａｓｔ  Ｒ．Ｃ．，Ｋｕｆｅ  Ｄ．Ｅ．、Ｍｏｒｔｏｎ  Ｄ．Ｌ．、Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ  Ｒ．Ｒ．、ｅｄｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４ｔｈ  Ｅｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  １０６７〜１０８６頁）。生殖組織腫瘍に対する従来のアンタゴニスト療法は、ある種の状況でアンドロゲン依存性前立腺癌の成長を減じることが示されたセトロレリックス（Ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）の投与を必要とした（Ｒｅｄｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２年）、Ｃａｎｓｅｒ  Ｒｅｓ．、第５２巻、２５３８〜２５４４頁、Ｋｏｒｋｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、第８８巻、８８４〜８８８頁）。しかし、アンドロゲン抵抗性腫瘍細胞の成長を減弱させるには著しく高い用量を必要とした（Ｊｕｎｇｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７年）、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、第３２巻、１６４〜１７２頁、Ｊｕｎｇｗｉｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７年）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、第３３巻、１１４１〜１１４８頁）ことから、その直接的抗増殖有効性はアンドロゲン感受性腫瘍からその成長持続性ステロイドを奪うと思われる下垂体前葉性腺刺激ホルモン放出を減弱させるその能力よりも著しく低い可能性があることが示唆される。従って、腫瘍成長を直接減弱させる能力は攻撃性アンドロゲン非感受性前立腺腫瘍を軽減することを目的とする薬剤にとって特に望ましいと思われ、そのため、我々は拮抗性薬剤Ａｎｔ１３５−２５の直接的抗増殖効力を上昇させることを試みた。実際我々の場合、セトロレリックスは、ＰＴＸ感受性／Ｇαｉ依存性ＭＡＲＫイソ型活性化を刺激する能力がＡｎｔ１３５−２５と比較して著しく低かった（データはしめさず）。さらに、セトロレリックスはＧｎＲＨ受容体を発現するすべての生殖組織腫瘍に対する真性かつ顕著な抗増殖作用を有さないと思われる。例えば、ＬＮＣａＰ前立腺細胞に対するトリプトレリン（ＧｎＲＨアゴニスト）の抗増殖作用はセトロレリックスの存在下で効率的に阻害された（Ｒａｖｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００年）、Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．、第２１巻、５４９〜５５７頁）。従って、セトロレリックスはトリプトレリンよりも著しく低い抗増殖効力を有し、従って、その存在下ではその作用の機能的アンタゴニストとして作用する可能性がある。他の実験パラダイムにおいて、他の古典的ＧｎＲＨアンタゴニスト、例えば、アンタイド（Ａｎｔｉｄｅ）は古典的ＧｎＲＨアゴニストの抗増殖作用を機能的に阻害することが示された（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００年）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、第１４１巻、７２〜８０頁）。従って、既存の療法の大部分はステロイド抵抗性腫瘍に対して望ましいと思われる著しく強力な直接的抗腫瘍効果を有さない可能性がある。それらの効力が不十分であるのは、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体のＧαｉ選択的立体配座／状態の安定化／誘導に関するそれらの効力が低いためであると思われる。従って、我々は、低い直接抗増殖効力を有するアンタゴニスト（Ａｎｔ１３５−１８）を１残基により修飾することにより、末梢生殖組織腫瘍に認められるＧαｉ型のＧｎＲＨシグナル伝達を強力に活性化することを可能にして、その抗増殖効力を著しく増加させたことを示した。Ａｎｔ１３５−１５のような薬剤は、生殖組織腫瘍の現在のＧｎＲＨに基づくペプチド療法より優れたものとするいくつかの特性、すなわち、アゴニストでなく、疾患の初期の「激発」が存在しない（Ｓｃｈａｌｌｙ  Ａ．Ｖ．  ＆  Ｃｏｍａｒｕ−Ｓｃａｌｌｙ  Ａ．Ｍ．（１９９７）Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｉｎ：Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｊ．Ｆ．、Ｆｒｅｉ  Ｅ．、Ｂａｓｔ  Ｒ．Ｃ．，Ｋｕｆｅ  Ｄ．Ｅ．、Ｍｏｒｔｏｎ  Ｄ．Ｌ．、Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ  Ｒ．Ｒ．、ｅｄｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、４ｔｈ  Ｅｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  １０６７〜１０８６頁）、下垂体におけるその阻害作用が性ステロイドの血清レベルを低下させ、それにより、ステロイド感受性腫瘍の成長を減弱させ、最後に、その高い直接的抗腫瘍効果が腫瘍に存在する可能性のあるステロイド抵抗性細胞に対して直接的に細胞障害性となる特性を有すると考えられる。
【実施例２】
【００９７】
乳癌の治療
乳癌に罹患している患者に１〜１００ｍｇの化合物Ａｎｔ１３５−２５を１週間にわたり毎日静脈内投与する。
【実施例３】
【００９８】
良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の治療
ＢＰＨに罹患している患者に１〜１００ｍｇの化合物Ａｎｔ１３５−２５を１週間にわたり毎日静脈内投与する。
【実施例４】
【００９９】
前立腺癌に罹患している患者に化合物Ａｎｔ１３５−２５の送達用のデポー剤を投与する。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１ａ】ヒトＪＥＧ−３絨毛癌細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＧｎＲＨＩの抗増殖作用を示す図である。
【図１ｂ】ヒトＪＥＧ−３絨毛癌細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＧｎＲＨＩＩの抗増殖作用を示す図である。
【図１ｃ】ヒトＪＥＧ−３絨毛癌細胞に対するアンタゴニスト１３５−１８の抗増殖作用を示す図である。
【図１ｄ】ヒトＪＥＧ−３絨毛癌細胞に対するアンタゴニスト１３５−２５の抗増殖作用を示す図である。
【図２ａ】ヒト良性前立腺過形成（ＢＰＨ−１）細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＧｎＲＨＩの抗増殖作用を示す図である。
【図２ｂ】ヒト良性前立腺過形成（ＢＰＨ−１）細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＧｎＲＨＩＩの抗増殖作用を示す図である。
【図２ｃ】ヒト良性前立腺過形成（ＢＰＨ−１）細胞に対するアンタゴニスト１３５−１８の抗増殖作用を示す図である。
【図２ｄ】ヒト良性前立腺過形成（ＢＰＨ−１）細胞に対するアンタゴニスト１３５−２５の抗増殖作用を示す図である。
【図３ａ】Ｉ型ヒトＧｎＲＨＲを発現するヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＧｎＲＨＩの抗増殖作用を示す図である。
【図３ｂ】Ｉ型ヒトＧｎＲＨＲを発現するヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞に対するＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＧｎＲＨＩＩの抗増殖作用を示す図である。
【図３ｃ】Ｉ型ヒトＧｎＲＨＲを発現するヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞に対するアンタゴニスト１３５−１８の抗増殖作用を示す図である。
【図３ｄ】Ｉ型ヒトＧｎＲＨＲを発現するヒト胚腎（ＨＥＫ２９３）細胞に対するアンタゴニスト１３５−２５の抗増殖作用を示す図である。
【図４ａ】ホスファチジルセリンのＧｎＲＨ誘発性形質膜輸送をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ組換えタンパク質染色を用いて測定した、ＪＦＧ−３及びＢＰＨ−１細胞におけるＧｎＲＨ誘発性アポトーシス事象を示す図である。
【図４ｂ】ＪＥＧ−３細胞におけるカスパーゼ３及びプロカスパーゼ３の細胞レベルを示すイムノブロッティングである。
【図４ｃ】ＢＰＨ−１細胞におけるカスパーゼ３及びプロカスパーゼ３の細胞レベルを示すイムノブロッティングである。
【図５ａ】ＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドがＢＰＨ−１及びＪＥＧ−３細胞における細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）を刺激することを示す図である。
【図５ｂ】いくつかのＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドにより誘発されたＪＥＧ−３細胞におけるＥＲＫ１／２リン酸化すなわち活性化の程度を示す図である。
【図５ｃ】ＧｎＲＨＩ、ＩＩ、Ａｎｔ１３５−２５及びＡｎｔ１３５−１８により誘発されたＢＰＨ−１細胞におけるＥＲＫ１／２の活性化の程度を示す図である。
【図６】図６ａないし図６は、ＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＧｎＲＨＩ、ＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＧｎＲＨＩＩ、ＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＡｎｔ１３５−１８、及びＧｎＲＨＲ相互作用性リガンドＡｎｔ１３５−２５のそれぞれによるＢＰＨ−１細胞におけるイノシトールリン酸の蓄積の誘発を示す図であり、図６ｅはイノシトールリン酸の蓄積を誘発する高用量ＧｎＲＨＩ効果の原因がＧαｉ機構であることを示す図である。
【図７ａ】ＪＥＧ−３細胞におけるＪＮＫ及びｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼのＧｎＲＨ誘発性活性化を示す図である。
【図７ｂ】ＢＰＨ−１細胞におけるＪＮＫ及びｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼのＧｎＲＨ誘発性活性化を示す図である。
【図８ａ】ＪＥＧ−３細胞におけるＪＮＫ及びｐ３８  ＭＡＰＫのリガンド特異的活性化を示す図である。
【図８ｂ】ＢＰＨ−１細胞におけるＪＮＫ及びｐ３８  ＭＡＰＫのリガンド特異的活性化を示す図である。
【図９ａ】ＢＰＨ−１細胞におけるｃＡＭＰの細胞内レベルに対するＦＳＫ、ＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５の効果を示す図である。
【図９ｂ】ＪＥＧ−３細胞におけるｃＡＭＰの細胞内レベルに対するＦＳＫ、ＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５の効果を示す図である。
【図９ｃ】ＢＰＨ−１細胞におけるＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５によるＦＳＫ刺激性ｃＡＭＰ蓄積の阻害ならびにＰＴＸの効果を示す図である。
【図９ｄ】ＪＥＧ−３細胞におけるＧｎＲＨＩ及びＡｎｔ１３５−２５によるＦＳＫ刺激性ｃＡＭＰ蓄積の阻害ならびにＰＴＸの効果を示す図である。
【図１０ａ】ＧｎＲＨＩ（１００ｎＭ）又はＡｎｔ１３５−２５（１００ｎＭ）で刺激したＪＥＧ−３細胞からの免疫沈降ｍｙｃ−ＪＮＫ２の代表的なウエスタンブロットを示す図である。
【図１０ｂ】図１０ａのウエスタンブロットの３回の実験の平均値±平均値の標準誤差を示す図である。
【図１０ｃ】図１０ａのウエスタンブロットの３回の実験の平均値±平均値の標準誤差を示す図である。
【図１０ｄ】ＧｎＲＨＩ（１００ｎＭ）又はＡｎｔ１３５−２５（１００ｎＭ）で刺激したＪＥＧ−３細胞からの免疫沈降ｍｙｃ−ＪＮＫ２の代表的なウエスタンブロットを示す図である。
【図１０ｅ】図１０ｄのウエスタンブロットの３回の実験の平均値±平均値の標準誤差を示す図である。
【図１０ｆ】図１０ｄのウエスタンブロットの３回の実験の平均値±平均値の標準誤差を示す図である。
【図１１ａ】ＪＮＫ又はｐ３８  ＭＡＰＫｓの選択的阻害によるＧｎＲＨＩ媒介性アポトーシスの阻害を示す図である。
【図１１ｂ】ＪＮＫ又はｐ３８  ＭＡＰＫｓの選択的阻害によるＧｎＲＨＩ媒介性アポトーシスの阻害を示す図である。
【図１２ａ】Ｉ型ＧｎＲＨ受容体のみを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＳＣＬ６０）のイノシトールリン酸蓄積に対するＡｎｔ１３５−１８の作用を示す図である。
【図１２ｂ】Ｉ型ＧｎＲＨ受容体のみを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＳＣＬ６０）のイノシトールリン酸蓄積に対するＡｎｔ１３５−２５の作用を示す図である。
【図１２ｃ】マーモセットＩＩ型ＧｎＲＨ受容体を安定に発現するプロトゴナドトロープ細胞（αＴ４）において測定した生成したイノシトールリン酸の放出に対するＡｎｔ１３５−１８の影響を示す図である。
【図１２ｄ】マーモセットＩＩ型ＧｎＲＨ受容体を安定に発現するプロトゴナドトロープ細胞（αＴ４）において測定した生成したイノシトールリン酸の放出に対するＡｎｔ１３５−２５の影響を示す図である。
【図１ａ】
2005531331.tif 000004
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
2005531331.tif 000006
【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
2005531331.tif 000009
【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
2005531331.tif 000016
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
2005531331.tif 000020
【図５ｃ】
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【図６】
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【図７ａ】
2005531331.tif 000023
【図７ｂ】
2005531331.tif 000024
【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
2005531331.tif 000027
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０ａ】
2005531331.tif 000031
【図１０ｂ】
2005531331.tif 000032
【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１１ａ】
2005531331.tif 000037
【図１１ｂ】
2005531331.tif 000038
【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年7月21日(2004.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの試験化合物を選択する段階と、
（ｂ）該化合物の抗腫瘍効果を検定する段階と、
（ｃ）ＧｎＲＨ受容体によって少なくとも部分的に調節される、少なくとも１つの特徴的な細胞内事象を選択する段階と、
（ｄ）選択した細胞内事象を調節しない前記試験化合物の能力を試験する段階と、
（ｅ）抗腫瘍効果を選択的に示し、かつ前記の他の選択した細胞内事象を調節しない試験化合物を選択する段階とを含む、無関係の伝達シグナルを有意に活性化することなく、抗腫瘍効果を有する試験化合物を特定する方法。
【請求項２】
段階（ｂ）において、試験化合物が癌性組織におけるＩ型ＧｎＲＨ受容体の腫瘍特異的伝達経路を活性化するか否かを判定することにより、抗腫瘍効果を検定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）において、試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定することにより抗腫瘍効果を検定する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｂ）において、試験化合物が腫瘍細胞においてプロアポトーシス効果を有するか否かを判定することにより抗腫瘍効果を検定する、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ホスファチジルセリンの細胞外発現を判定することにより、プロアポトーシス効果を検定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階（ｃ）において、特徴的な細胞内事象が、下垂体で活性化されるＩ型ＧｎＲＨ受容体経路の活性化である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｃ）において、特徴的な細胞内事象がＧｎＲＨ受容体媒介性Ｇαｑシグナル伝達経路の活性化である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）少なくとも１つの試験化合物を選択する段階と、
（ｂ）試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、
（ｄ）Ｇαｑを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を調節しない前記化合物の能力を試験する段階と、
（ｅ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を調節しない試験化合物を選択する段階とを含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ｄ）試験化合物がＧαｉを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、
（ｅ）試験化合物がＧαｑを介するＧｎＲＨ受容体媒介性シグナル伝達を活性化するか否かを判定する段階と、
（ｆ）Ｇαｉを介するシグナル伝達を選択的に活性化し、Ｇαｑを介するシグナル伝達を活性化しない試験化合物を選択する段階とを含む、試験化合物を治療薬候補又は薬物様化合物又はリード化合物として選択する方法。
【請求項１０】
試験化合物を生殖組織の癌又は過形成の治療に適する化合物として、又は薬物様化合物もしくはリード化合物として選択する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試験化合物が、Ｉ型ＧｎＲＨ受容体に結合することが知られているか、あるいは該受容体に結合する能力のために選択される、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法により選択される化合物。
【請求項１３】
医薬品として使用するための請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の化合物及び製薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
腫瘍又は子宮類線維腫を含む生殖組織過形成に対処するための医薬品の製造における、請求項１２に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
請求項１２に記載の化合物を投与することを含む、患者の腫瘍又は生殖組織過形成に対処する方法。
【国際調査報告】
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