(57)【要約】可変数縦列反復（ＶＮＴＲ）配列は、特定の大腸菌Ｏ１５７；Ｈ７株のゲノムで同定されている。ＶＮＴＲ配列は異なる遺伝子座で長さの多型を表すことが発見されている。ＶＮＴＲの多遺伝子座サイズ分析に基づくサブタイピングシステムは、本発明の新規分子サブタイピングシステムの基礎である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌ＤＮＡサンプル中のＶＮＴＲ反復アレイを観測することおよび記録することを含む、大腸菌用分子サブタイピングシステム。
【請求項２】
（ａ）大腸菌ＤＮＡサンプルからのＶＮＴＲ遺伝子座を増幅するためのプライマーであって、観測可能なインジケーターを含む、プライマー、
（ｂ）該プライマーおよびＶＮＴＲ遺伝子座ＤＮＡを増幅させて単位複製配列を形成する手段、
（ｃ）該プライマーおよびＶＮＴＲ遺伝子座から形成された単位複製配列をサイズ分離する手段、
（ｄ）前記分離された単位複製配列上の前記インジケーターを観測する手段、および
（ｅ）前記大腸菌ＤＮＡ中の前記ＶＮＴＲ反復アレイを計算する手段
を含む請求項１に記載の分子サブタイピングシステム。
【請求項３】
配列番号０１６３〜０３２０からなる群より選択される配列を含む、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７をサブタイピングするためのＶＮＴＲ遺伝子座。
【請求項４】
ＰＣＲにより増幅された、請求項３に記載の遺伝子座。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子座を増幅するためのプライマー。
【請求項６】
配列番号０００１〜０１６２からなる群より選択される、請求項４に記載のプライマー。
【請求項７】
請求項５に記載のプライマーおよび配列番号０３２１〜配列番号０４７８からなる群より選択される大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７由来のＶＮＴＲ配列を含む遺伝子座を含む単位複製配列。
【請求項８】
配列番号００１１＋００１３、０１０３＋０１０５、００３５＋００３７、００３９＋００４３、００９１＋００９３、００９９＋０１０１、０１１５＋０１１７、００２３＋００２５、００１９＋００２１、００５３＋００５５、０１２７＋０１２９、０１０７＋０１０９、００２７＋００２９、００７３＋００７５、００１５＋００１７、００８３＋００８５、００６９＋００７１、００４７＋００５１、００７７＋００７９、０１１１＋０１１３、０１１９＋０１２１、００６５＋００６７、０００７＋０００９、００８７＋００８９、０１２３＋０１２５、０１３９＋０１４１、０１５９＋０１６１、００５７＋００６１、０００１＋０００３、００３１＋００３３、００９５＋００９７、０１３１＋０１３３、０１３５＋０１３７、１４３＋０１４５、０１４７＋０１４９、０１５１＋０１５３、および０１５５＋０１５７からなる群より選択される、請求項３に記載の遺伝子座を増幅するためのプライマー対。
【請求項９】
前記対の一員は、観測可能なインジケーターを有する、請求項８に記載のプライマー。
【請求項１０】
前記インジケーターは蛍光色素である、請求項９に記載のプライマー。
【請求項１１】
前記蛍光色素は、ＨＥＸ、ＦＡＭ、ＮＥＤ、またはＲＯＸである、請求項１０に記載のプライマー。
【請求項１２】
請求項９に記載のプライマーを２つまたはそれより多く含む、請求項３に記載の遺伝子座のマルチプレックス増幅用マルチプレックスカクテル。
【請求項１３】
配列番号００１１および００１３、配列番号０１０３および０１０５、配列番号００３５および００３７、配列番号００３９および００４３のプライマーを含むセット番号１、
配列番号００９１および００９３、００９９および０１０１、０１１５および０１１７、００２３および００２５、００１９および００２１を有するプライマーを含むセット番号２、
配列番号００５３＋００５５、０１２７＋０１２９、０１０７＋０１０９、００２７＋００２９、００７３＋００７５、００１５＋００１７を有するセット番号３、
配列番号００８３＋００８５、００６９＋００７１、００４７＋００５１、００７７＋００７９、０１１１＋０１１３を有するセット番号４、
配列番号０１１９＋０１２１、００６５＋００６７、０００７＋０００９、００８７＋００８９、０１２３＋０１２５、０１３９＋０１４１を有するセット番号５、および
配列番号０１５９＋０１６１、００５７＋００６１、０００１＋０００３のプライマーを含むセット番号６
からなる群より選択されるプライマーセットを含む、請求項１２に記載のマルチプレックスカクテル。
【請求項１４】
ＰＣＲによる大腸菌の分子サブタイピング用キットであって
（ａ）大腸菌中のＶＮＴＲ遺伝子座用プライマー、
（ｂ）大腸菌株由来のＤＮＡを用いたＰＣＲ機器でのハイブリダイゼーションおよび増幅条件を維持する増幅試薬
を含む、前記キット。
【請求項１５】
ＰＣＲによる大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株の分子サブタイピング用キットであって、
（ａ）請求項９に記載の１つまたは複数のプライマー、および
（ｂ）大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株由来のＤＮＡを用いたＰＣＲ機器でのハイブリダイゼーションおよび増幅条件を維持する増幅試薬
を含む、前記キット。
【請求項１６】
請求項１３に記載のマルチプレックスカクテルおよびマルチプレックス機器での大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株由来のＤＮＡを用いたハイブリダイゼーションおよび増幅条件を維持する増幅試薬を備えた、マルチプレックスによる大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株の分子サブタイピング用キット。
【請求項１７】
大腸菌株のサブタイピング法であって、
（ａ）ＶＮＴＲを含む遺伝子座を増幅させるための１つまたは複数のプライマーを得る工程であって、該プライマーは観測可能なインジケーターを有する前記工程、
（ｂ）サブタイピングされる予定の大腸菌サンプルから一本鎖サンプルＤＮＡを得る工程、
（ｃ）ＰＣＲ機器でのハイブリダイゼーションおよび増幅条件下、前記プライマー、前記サンプルＤＮＡ、および増幅試薬を混合して、前記プライマーおよび前記ＶＮＴＲを含む単位複製配列を形成する工程、
（ｄ）該単位複製配列をサイズで分離する工程、
（ｅ）分離された単位複製配列の数およびサイズを見積もる工程、および
（ｅ）該見積もりを、既知の大腸菌株からＰＣＲにより得られた単位複製配列の見積もりと比較する工程
を含む前記方法。
【請求項１８】
前記プライマーが、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７中のＶＮＴＲ遺伝子座を増幅するように設計される、マルチプレックスによる大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株をサブタイピングする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記単位複製配列がゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動により分離される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
疫学的データベース用の離散的な遺伝子データを生成する請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
調査道具としての請求項３に記載のＶＮＴＲ配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年１２月１１日出願の米国仮特許出願第６０／３３９，６８７号の優先権を主張し、その開示は参照としてその全体を本明細書の記載の一部とする。
【発明の分野】
【０００２】
本発明は、一般的に、可変数縦列反復(variable
number tandem repeat)（ＶＮＴＲ）配列の遺伝子分析による細菌の分子サブタイピングに関する。より詳細には、本発明は、多遺伝子座(multiple-locus)可変数縦列反復分析（ＭＬＶＡ）による病原性大腸菌(E.coli)のＤＮＡサブタイピング用システムに、および本システムにより生成されたデータ１５から構築される(constructed
15from data)１５疫学的データベースに関する。
【背景】
【０００３】
最近の肉関連食品の騒ぎに関連して、大腸菌汚染により引き起こされる食品の安全性に対する一般の懸念は増大し続けている。Ｏ１５７：Ｈ７病原性株に伴う疾患発生率は、それが最初に出血性大腸炎に伴った１９８０年代から上がっている（１８）。その後も世界中で多くの発生(outbreak)が報告されているが、米国においては、ワシントン州ファーストフードチェーンでの発生がその出現としてよく知られている（９）。メディアから一般へのこの発表が不正であったため、これには数件の非常に大規模なパック詰め肉のリコール（３、４）、デイケアセンターでの発生（１）が伴い、そしてアミューズメントパークでの飲料水媒介感染さえも伴った（２０、５、１２）。
【０００４】
異なる時間および場所での大腸菌感染の発生の間の重大な疫学的関連は、疾患の拡散を防ぐ助けとなるだろう。この挑戦は、株を同定してそれを源と関連させることである。分子タイピングは、長い間、病原同定および制御の一部であった。従来、病原性を伴う重要な細胞コンポーネントを同定するために血清タイピング(serotyping)が用いられてきた。より新規なアプローチとして、多遺伝子座酵素電気泳動、ＤＮＡタイピング、およびリボタイピング(ribotyping)が挙げられる。多遺伝子座配列タイピング（ＭＬＳＴ）などの比較遺伝子配列決定は、種間および株間両方で識別するために用いられてきており、そして十分なヌクレオチド多様性を表すこれらの細菌をサブタイピングするのに有用である。
【０００５】
最近、腸内病原をサブタイピングするために最も世界に広まっているアプローチは、制限断片長多型のパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）検出である（１９）。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）は、非常に長く、そして時として多型のＤＮＡ制限酵素断片を分解し得る。米国中の何百という研究室により、ＰＦＧＥデータが現在生成されており、これが、発生の疫学的モニタリングのために設立されたデータベースであるＰｕｌｓｅＮｅｔに貢献している（１９）。しかしながら、ＰＦＧＥは、扱いにくい技法であり、これは非常に大量のサンプルの組を容易に取り扱うことができない。また、ＰＦＧＥデータも、フラグメントサイズの連続性のためにデータベース比較によく適してはいないので、密接に関連した単離菌(isolates)についての識別能力が限定されている。そのうえ、ＰＦＧＥデータセットは、公衆衛生コミュニティー全体に受け渡すための標準化が容易ではない。けれどもＰＦＧＥは、プライマー設計のためのゲノム情報をあらかじめ必要とはしない、任意の細菌で有効な「普遍的」技法である。少なくとも近未来に関して、ＰＦＧＥは役に立ち、そして巨大な統合されたユーザーコミュニティーがこれを選りすぐりの技法と考える。しかしながら、相補的な分析アプローチを提供するために、より高度な識別化サブタイピング法が模索されている。
【０００６】
ポリメラーゼ(Polymerization)連鎖反応（ＰＣＲ）法は、ＰＦＧＥ技法を超える多くの技術的利点を提供する。ＰＣＲは、少量の特定のＤＮＡ配列を容易に観測され得るレベルまで増幅させることにより、それを検出する。ＰＣＲに基づく方法は、分子タイピングの試みにますます重要になってきている。これらのアプローチとして、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、反復エレメント多型(repetitive
element polymorphisms)−ＰＣＲ、不特定増幅多型(randomly amplified polymorphic)ＤＮＡ、および任意プライム(arbitrarily
primed)ＰＣＲが挙げられる。ＰＣＲに基づく方法の力は、それらが多くの細菌性病原およびその多遺伝子座識別に応用され得ることの容易さである。しかしながら、ゲノム全ての分析は現在のＰＣＲ機器では不可能である。分子サブタイピングを提供するより識別性の高い方法が模索されている。
【０００７】
可変数縦列反復ＶＮＴＲ配列と称される小さな多型ゲノム領域が、分子タイピングのための敏感かつ信頼できる基礎を提供することが最近発見された（７、１４、１５）。ＶＮＴＲは、大腸菌を含む大部分の細菌のゲノムに存在する。多くのアレル状態が多様な株の中のＶＮＴＲで観測されており、そして特徴的な回帰パターンが株のサブタイピングおよび同定の基礎となる。ＶＮＴＲ遺伝子座は、細菌ゲノムにおいて最も多様であるものの１つであるようにみえる（２１）。結果として、ＶＮＴＲはより大きな多様性を、したがって、他のどのような型の分子タイピングシステムよりも大きな識別能力を含んでいるようにみえる。
【０００８】
細菌をサブタイピングする速度および効率は、多遺伝子座ＶＮＴＲ分析（ＭＬＶＡ）で改善される。ＭＬＶＡにおいて、複数の異なる単離菌の中の関連する細菌株を識別するために複数のマーカーが用いられる(Keim anthrax paper)。米国特許第６，４７９，２３５号は、マルチプレックス技法を開示しており、これは複数の遺伝子座でのＤＮＡの速度同時分析に使用され得る。ＭＬＶＡは、他では識別不能な株型を分解するために、およびそれらを他の近い単離菌と比較して系統学的に定義するために使用され得る（１４、１５、７）。
【０００９】
ＭＬＶＡシステムによる大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７病原性株のＤＮＡサブタイピングは、有用な疫学的アプローチである。大腸菌の高度に単型性の分子性のため、ＭＬＶＡは、この病原の多様性、進化、および分子疫学を研究するための、唯一の合理的方法かもしれない。しかしながら、ＭＬＶＡ分析は、目的の細菌において適したマーカーＤＮＡの同定を必要とし、かつマーカーＤＮＡを増幅するための特定プライマーを必要とする。
【概要】
【００１０】
可変数縦列反復（ＶＮＴＲ）配列は、特定の大腸菌株のゲノムで同定されている。ＶＮＴＲ配列は異なる遺伝子座で長さの多型を表すことが発見されている。ＶＮＴＲの多遺伝子座サイズ分析に基づくサブタイピングシステムは、本発明の新規分子サブタイピングシステムの基礎である。
【００１１】
大腸菌ＤＮＡサンプル中の複数の遺伝子座でのＶＮＴＲ配列が同時に分析され、次いでサイズが見積もられる、分子タイピングシステムが提供される。各サブ株に特徴的な離散的データがこれにより生成される。
【００１２】
ゲノムＤＮＡ全体と比較してＶＮＴＲのサイズが小さいことは、現在の技術でＤＮＡサンプル中で配列を直接観測することを難しくしている。しかしながら、ＰＣＲ法は周知であり、そしてＶＮＴＲを含む小遺伝子座を、サイズを見積もるのに十分な量へ増幅するために用いられ得る。
【００１３】
したがって、本発明の好適な実施態様において、ＶＮＴＲを含む多遺伝子座がＰＣＲにより、好ましくはマルチプレックスで、同時増幅され、次いでサイズで分離される、分子タイピングシステムが提供される。サイズ分離は、好ましくは、ゲルまたはキャピラリー電気泳動による。ＶＮＴＲ配列を含む各遺伝子座用に設計された標識化プライマーは、遺伝子座の識別およびゲノムアレルへの各増幅ＶＮＴＲ配列の割り当てを可能にする。
【００１４】
本発明の重要な態様において、ＶＮＴＲを含む大腸菌遺伝子座を増幅するためにプライマーが提供される。ＶＮＴＲ配列を含む大腸菌由来遺伝子座を増幅するためのプライマーの代表的なサンプルとして、以下のプライマー対、配列番号．．および配列番号が挙げられるが、それに限定されない。
【００１５】
本サブタイピングシステムで使用するため、プライマーは、観測可能なインジケーターを備え、これにより、増幅した、ＶＮＴＲ配列を含む遺伝子座が同定可能になる。好ましくは、インジケーターはプライマー対の一員に結合した着色色素であり、最も好ましくは、ＨＥＸからなる群より選択される蛍光色素である。
【００１６】
本発明の特定の実施態様において、サンプル大腸菌ＤＮＡ中のＶＮＴＲを含む多遺伝子座の同時増幅のため、２つまたはそれより多いプライマーを含むマルチプレックスカクテルが提供される。適したマルチプレックスカクテルとして、配列番号．．．を有する以下のプライマーセットが例示されるが、それに限定されない。
【００１７】
本発明の重要な態様において、ＰＣＲにより大腸菌をサブタイピングするのに用いるため、キットが提供される。特定の好適な実施態様において、キットはＶＮＴＲ配列を含む大腸菌遺伝子座用に設計されたプライマーを備える。特定の他の好適な実施態様において、キットはマルチプレックスカクテルを備える。キットはまた、ＰＣＲ機器での分析の間、増幅条件を作成するための増幅試薬を備える。一般に、増幅試薬は、ポリメラーゼ、好ましくはｔａｑポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＴＰＳから選択されるｄｎｔｐ、ならびに増幅反応条件を維持するのに適した塩および緩衝液を備える。特定の例において、キットはまた、参照サンプルＤＮＡを備えてもよい。特定の他の例において、キットは、サイズ分離および増幅産物の分析用の試薬および材料を備えてもよい。
【００１８】
本発明のさらに別の重要な態様において、ＰＣＲを用いた大腸菌株のサブタイピング法であって、
（ａ）ＶＮＴＲ配列を含む大腸菌株での遺伝子座に特定の１つまたは複数のプライマーを得る工程であって、該プライマー対は観測可能なインジケーターを有する前記工程、
（ｂ）サブタイピングされる予定の大腸菌サンプルから一本鎖サンプルＤＮＡを得る工程、
（ｃ）ＰＣＲ機器でのハイブリダイゼーションおよび増幅条件下、上記プライマー、上記サンプルＤＮＡ、および増幅試薬を混合して、上記プライマーおよび上記マーカーＤＮＡを含む単位複製配列を形成する工程、
（ｄ）該単位複製配列をサイズで分離する工程、
（ｅ）分離された単位複製配列でのインジケーターの観測により遺伝子座を見積もる工程および、
（ｅ）該見積もりを、標準の大腸菌株の見積もりと比較する工程
を含む前記方法が提供される。
【００１９】
本発明の重要な態様において、本発明のＶＮＴＲ配列は、急速に進化する大腸菌株に存在する可変性ＶＮＴＲ配列により産生される、新規分子種、特にタンパク質を同定するための調査道具として提供される。
【００２０】
本発明のさらに別の重要な態様において、疫学的データベース用の離散的な遺伝子データの作成法が提供される。本発明の分子サブタイピングシステムで生成したデータは、ＶＮＴＲのサイズおよびアレル位置について離散的な整数の形にある。この離散的な情報を含むデータベースは、長い時間をかけて世界規模で構築され得る。データベースは、疾患の拡散を含むものについて強力な道具となるだろう。
【発明の詳細】
【００２１】
１つの態様において、本発明は、ＶＮＴＲ遺伝子座の分析に基づく大腸菌用分子サブタイピングシステムを提供する。ＶＮＴＲ遺伝子座は、複数の塩基対の、短い反復配列エレメントからなる。特定遺伝子座における繰り返し単位の数の多様性(Variation)が、ＶＮＴＲ遺伝子座で観測される、観測された多型の原因であり、そして本サブタイピングシステムの基礎である。未知の大腸菌株中の繰り返しアレイが観測され、そして既知の株と比較される。ＶＮＴＲ遺伝子座繰り返しサイズは、容易に規定され、連続ではなく離散的なデータセット中の特定アレルの指定を可能にする。このことは、数年に渡り複数の研究室から集められた結果であるデータベースにとって大きな利点である。
【００２２】
ＶＮＴＲ遺伝子座は、２つの大腸菌全ゲノム配列において同定されており、そして大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株をサブタイピングするために使用されている。本発明によるＶＮＴＲ遺伝子座配列の代表的なサンプルとして、配列番号０１６３〜０３２０が挙げられるが、これに限定されない。これらの配列において特定の置換が自然に生じるが、そのような置換は本サブタイピングシステムで使用するためのＶＮＴＲ遺伝子座の機能性を妨げることが理解されるべきである。したがって、配列番号０１６３〜０３２０と機能的に等価なＶＮＴＲ遺伝子座は、群の一員として含まれることが意図される。
【００２３】
ＶＮＴＲ遺伝子座は他の大腸菌でも発見され、そして最終的には世界的大腸菌分子サブタイピングシステムの基礎を提供することが見込まれる。本記載は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７用サブタイピングシステムの詳細を提供することを意図し、これは他の大腸菌株をサブタイピングするために使用されるべきシステムの例である。
【００２４】
本発明の好適な実施態様において、分子サブタイピングシステムは、
（ａ）大腸菌ＤＮＡサンプルからのＶＮＴＲ遺伝子座を増幅するためのプライマーであって、観測可能なインジケーターを含む前記プライマー、
（ｂ）該プライマーおよびＶＮＴＲ遺伝子座ＤＮＡを増幅させて単位複製配列を形成する手段、
（ｃ）単位複製配列をサイズ分離する手段、
（ｄ）分離された該単位複製配列上のインジケーターを観測する手段、および
（ｅ）大腸菌ＤＮＡ中のＶＮＴＲ反復アレイを計算する手段
を含む。
【００２５】
重要な態様において、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７由来のＶＮＴＲ遺伝子座をＰＣＲ中、好ましくはマルチプレックスで増幅するためにプライマーが存在する。本発明によるＶＮＴＲ遺伝子座配列を増幅するためにこれらの遺伝子座周りで設計されているプライマーの代表的なサンプルとして、配列番号０００１〜０１６２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
操作において、これらのプライマーは以下の群から選択される対で使用される。
【００２７】
【化１】
2005517396.tif 000002
【００２８】
本方法において、大腸菌由来のＶＮＴＲ遺伝子座の増幅は、プライマー対およびＶＮＴＲ遺伝子座のＤＮＡを含む単位複製配列をもたらす。プライマーおよび大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７由来のＶＮＴＲ遺伝子座を含む単位複製配列の代表例は、配列番号０３２１〜配列番号０４７８からなる群より選択される。
【００２９】
大腸菌のサブタイピングで使用するために、プライマーは観測可能なインジケーターを有する。好ましくは、インジケーターはプライマーに結合した色素である。増幅されるときに、色素は単位複製配列中に組込まれ、そして単位複製配列のサイズ分離後、分離された単位複製配列それぞれのＶＮＴＲ遺伝子座を指示する。したがって、ＶＮＴＲのアレルアレイは、各大腸菌株の特徴でありそして株の同定を可能にする離散的データを伴う。
【００３０】
商業的に使用される蛍光色素は、本サブタイピングシステムでインジケーターとして使用するのに適したインジケーターである。好適な蛍光色素は、Applied Biosystems社(Foster City, CA)から入手可能なＨＥＸ、ＦＡＭ、ＮＥＤ、ＲＯＸ、およびBeckman,
Inc.社(Fullerton, CA)により供給される色素である。
【００３１】
本発明の好適な実施態様は、多ＶＮＴＲ遺伝子座配列を同時に分析するＭＬＶＡ法に関する。本発明の好適な実施態様において、「マルチプレックス」増幅法と称されるＰＣＦ技法が用いられる。この技法において、２種またはそれより多くの標識化プライマー対を含むマルチプレックスカクテルが調製され、そしてサンプルＤＮＡ中の多ＶＮＴＲ遺伝子座を同時に決定するために使用される。この技法は、一回の増幅から大量のデータを生成させ、したがって識別力の損失なしに効率とコスト削減を提供する。
【００３２】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７をサブタイピングするためのマルチプレックスカクテルが提供される。カクテルは、
配列番号００１１および００１３、配列番号０１０３および０１０５、配列番号００３５および００３７、配列番号００３９および００４３のプライマーを含む、セット番号１、
配列番号００９１および００９３、００９９および０１０１、０１１５および０１１７、００２３および００２５、００１９および００２１を有するプライマーを含む、セット番号２、
配列番号００５３＋００５５、０１２７＋０１２９、０１０７＋０１０９、００２７＋００２９、００７３＋００７５、００１５＋００１７を有する、セット番号３、
配列番号（Ｄ  Ｎｏ）００８３＋００８５、００６９＋００７１、００４７＋００５１、００７７＋００７９、０１１１＋０１１３を有する、セット番号４、
配列番号０１１９＋０１２１、００６５＋００６７、０００７＋０００９、００８７＋００８９、０１２３＋０１２５、０１３９＋０１４１を有する、セット番号５、および
配列番号０１５９＋０１６１、００５７＋００６１、０００１＋０００３のプライマーを含むセット番号６
からなる群より選択されるプライマーセットを備える。
【００３３】
本発明の重要な態様において、ＰＣＲ機器中ＶＮＴＲ遺伝子座を増幅するために必要なサブタイピング試薬を供給するためにキットが提供される。キットは、目的の細菌中のＶＮＴＲ遺伝子座用の、プライマーまたはプライマーのセットを供給する。キットはまた、ＰＣＲ実行中のハイブリダイゼーションおよび増幅条件を作成するために必要な試薬を供給する。好ましくは、試薬は、増幅剤、最も好ましくはｔａｑポリメラーゼ、組立ブロックとしてのｄｎｔｐ、ならびに反応用の塩および緩衝液を備える。キットの市販性は、本大腸菌分子システムの開発および使用を助長するだろう。キットの使用が容易であること、およびＰＣＲ技法がさらに簡単になることにより、世界の遠隔地であってさえも、研究者および臨床医が、本サブタイピングシステムによる感染株を分析することが可能になるだろう。このことは、世界規模で、発生地点での疾患の封じ込めを改善させるだろう。
【００３４】
この態様の好適な実施態様において、ＰＣＲ増幅に使用するための、大腸菌をサブタイピングするためのキットが提供される。特定の例において、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７をサブタイピングするためのキットはである。これらのキットは、この株由来のＶＮＴＲ遺伝子座をＰＣＲにより増幅するための、本発明のプライマーを備える。他の好適な実施態様において、本明細書中上記に記載されるようなマルチプレックスカクテルを備えるキットが、マルチプレックス化のために提供される。
【００３５】
本発明の重要な態様において、大腸菌株のサブタイピング法が提供される。本方法は、
（ａ）ＶＮＴＲを含む遺伝子座を増幅させるための１つまたは複数のプライマーを得る工程であって、該プライマーは観測可能なインジケーターを有する前記工程、
（ｂ）サブタイピングされる予定の大腸菌サンプルから一本鎖サンプルＤＮＡを得る工程、
（ｃ）ＰＣＲ機器でのハイブリダイゼーションおよび増幅条件下、上記プライマー、上記サンプルＤＮＡ、および増幅試薬を混合して、前記プライマーおよび前記ＶＮＴＲを含む単位複製配列を形成する工程、
（ｄ）該単位複製配列をサイズで分離する工程、
（ｅ）分離された単位複製配列の数およびサイズを見積もる工程、および
（ｅ）該見積もりを、既知の大腸菌株からＰＣＲにより得られた単位複製配列の見積もりと比較する工程
を含む。
【００３６】
本方法は、目的の株をサブタイピングするために、既知の株で同定されたＶＮＴＲ遺伝子座に特異的なプライマーを用いることにより修飾されてもよい。好適な実施態様において、本方法は、配列番号０１６３〜０３２０を有するプライマーを用いることにより、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７をサブタイピングするために使用され得る。配列番号０１６３〜０３２０を有するＶＮＴＲ遺伝子座を増幅するために使用することができる任意のプライマーまたはマルチプレックスカクテルが本方法で使用され得る。
【００３７】
本発明の好適な実施態様において、単位複製配列は、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動によりサイズ分離されている。
【００３８】
本発明のさらに別の重要な態様において、サブタイピング法は、疫学的データベース用の離散的な遺伝子データを作成するために使用され得る。本方法は大腸菌の特定のアレル中のＶＮＴＲアレイに関する情報を生成する。このデータは、離散的な数字の形で提供され、これは既知の大腸菌株およびサブ株の分析から生成した数字と比較可能である。既知株のデータベースは、集計され、そして臨床用単離菌からの未知の株の同定は既知株との比較により可能になる。細菌感染により引き起こされる疾患の世界的制御についてのこのデータベースの疫学的価値は意味深い。
【００３９】
本発明のさらに別の重要な態様において、調査道具として使用するための特定のＶＮＴＲ遺伝子座配列が提供される。特定の大腸菌株は急速に進化し、そしてこれがＶＮＴＲ遺伝子座の可変性多型に反映されることが既知である。本発明の方法および手段は、発現した分子を研究するための、これらの遺伝子座の同定および増幅に使用され得る。
【００４０】
本発明は、下記の実施例を参照してより良く理解され得るが、これは例示のみを目的とし、そして本明細書に添付される特許請求の範囲により定義されるとおりの本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１
この実施例は、マルチプレックスによるサンプルＤＮＡの分子サブタイピングのための本発明の方法を示す。
【００４２】
単一コロニーからの単一全細胞熱溶解物として、純粋な培養物の単一のコロニーからＤＮＡを調製した。これは、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ中大腸菌のコロニーを２０分間煮沸し、次いで遠心分離によって細胞片を除去することを含む。残液には、このシステムで使用するのに適した粗ＤＮＡ抽出物が含まれる。
【００４３】
ＰＣＲに使用する全ての試薬は、他に記載されない限り、Life Technologies社から入手した。全ての混合物についてのＰＣＲ条件には、１０ｕｌの全反応体積中最終濃度、１Ｕの白金Ｔａｑ、１Ｘ
ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭのＭｇＣｌ2、および０．２ｍＭのｄＮＴＰｓを用いる。各マルチプレックスミックスについてのプライマー濃度は以下のとおりである。ミックス１は、それぞれ０．１、０．６、０．２、および０．３ｍＭの最終濃度で、配列番号００１１／００１３、０１０３／０１０５、００３５／００３７、および００３９／００４３のプライマー対を有する。ミックス２は、それぞれ０．０５、０．１、０．１、０．５、および０．４ｍＭの最終濃度で配列番号００９１／００９３、００９９／０１０１、０１１５／０１１７、００２３／００２５、および００１９／００２１のプライマー対を有する。ミックス３は、それぞれ０．１、０．２、０．１、０．４、０．０５、および０．３ｍＭの最終濃度で配列番号００５３／００５５、０１２７／０１２９、０１０７／０１０９、００２７／００２９、００７３／００７５、および００１５／００１７のプライマー対を有する。ミックス４は、それぞれ０．１、０．３、０．２、０．４、および０．１ｍＭの最終濃度で配列番号００８３／００８５、００６９／００７１、００４７／００５１、００７７／００７９、および０１１１／０１１３のプライマー対を有する。ミックス５は、それぞれ０．２、０．３、０．２、０．１、０．１、および０．６ｍＭの最終濃度で配列番号０１１９／０１２１、００６５／００６７、０００７／０００９、００８７／００８９、０１２３／０１２５、および０１３９／０１４１のプライマー対を有する。そして、ミックス６は、それぞれ０．２、０．０５、および０．６ｍＭの最終濃度で配列番号０１５９／０１６１、００５７／００６１、０００１／０００３のプライマー対を有する。残りの、配列番号００３１／００３３、００９５／００９７、０１３１／０１３３、０１３５／０１３７、１４３／０１４５、０１４７／０１４９、０１５１／０１５３、および０１５５／０１５７を有するプライマー対は、ここではマルチプレックス化されていないが、各プライマーについて０．２ｍＭの最終濃度が用いられることを除いて上記のマルチプレックスミックスと同一条件下で実行(run)される。さらなる計画は、これらの最終マーカーを現存のマルチプレックス中に組込むことを含む。ＰＣＲ反応用のマスターミックス各９ｕｌに、１ｕｌの熱溶解物ＤＮＡの１／１０希釈物を加えた。熱サイクルパラメーターは、ＰＣＲ混合物を、５分間９４℃の開始温度に上昇させ、９４℃で２０秒間、６５℃で２０秒間、および７２℃で２０秒間のサイクルを合計で３５回、そして７２℃で５分間の最終伸長工程であった。ＰＣＲ産物を５倍に希釈してから、ＲＯＸ標識マップマーカー１０００(BioVentures,
Inc.社)カスタムサイズ標準と等しく合わせた。蛍光標識したＰＣＲ産物を、Perkin-Elmer Applied Biosystems社の３７７ＤＮＡシークエンサーでのポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて可視化した。ＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｅｎｏｔｙｐｅｒ分析ソフトウェア
(Perkin-Elmer, ABI)を用いてフラグメントサイジングを行った。
【００４４】
実施例２
この実施例は、サブタイピングに有用なＶＮＴＲ配列の検出を示す。
【００４５】
縦列反復構造を、Ｋ−１２、ＥＤＬ９３３  Ｏ１５７：Ｈ７、Ｓａｋａｉ  Ｏ１５７：Ｈ７の完全ゲノム中、ならびにＮＣＢＩゲノムウェブサイトから入手したプラスミドｐＯ１５７およびｐＯＳＡＫ１配列中で検出した。２つのソフトウェアプログラムを使用して、反復を見いだした。小（１〜１０ｂｐモチーフ）完全反復を、ＳＳＲ  Ｆｉｎｄｅｒ(Gur-Arie et. al. 2000)を用いて検出した。より大きな（＞８ｂｐ）完全反復および不完全反復を、ＧｅｎｅＱｕｅｓｔ(DNAstar
software; LaserGene, Inc.社, Madison, Wis.)を用いて見いだした。アレイがＯＲＦに位置するかどうかを予備的に決定するためにもこのプログラムを用いたが、最終確認はＮＣＢＩウェブサイトのサーバーで注釈を付けられたゲノムに対して配列をブラスティング(blasting)することによりなされた。ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ(DNAstar
software) またはＯｌｉｇｏ(ver. 6.52, Molecular Biology Insights, Inc.社)を用いて、有望なＶＮＴＲに関してプライマーを設計した。６８〜７２℃のＴｍ範囲でプライマーを設計した。
【００４６】
図１に示されるとおり、大腸菌ゲノムには数千の有望なＶＮＴＲ遺伝子座がある。反復サイズおよびコピー数に基づいて、６７の有望なＶＮＴＲ遺伝子座を選択し、そしてＰＣＲによりスクリーニングして電気泳動アッセイへの識別力および適性を最大化した。それらのうち、３７が、強力なＰＣＲ増幅を発生させ、そして顕著なサイズ可変型株を表した。図２は、遺伝子座Ｏ１５７−３９（＃）が単一型であったが、ｐＯＳＡＫ１の有無診断マーカーとして有用であったことを示す。フラグメントサイズ多様性に加えてｎｕｌｌ状態アレルを含むマーカーは、星印（＊）で示される。縞模様の棒で示される３つのマーカーは、プラスミドに位置する。
【００４７】
これらの有望なＶＮＴＲ遺伝子座を、５６の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７／ＨＮおよびＯ５５：Ｈ７株に対して、可変性についてスクリーニングした（表１）。本来の６７プライマーセットのうち、３７を最終分析での使用に選択した（表２）。
【００４８】
実施例３
この実施例は、本発明の大腸菌サブタイピングシステムが感染発生の迅速な同定および封じ込めを可能にするシナリオを示す。
【００４９】
食品媒介疾患発生が発生し、ここで食品は病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７で汚染されていた。公衆衛生、法執行機関または他の当局は、汚染された食品を食べた疾患の被害者からの臨床用大腸菌単離菌の診断研究施設を提供した。これら当局は、被害者の細菌単離菌が、汚染された食品で見いだされるもの、および特定の食品加工工場または飲食店からの大腸菌単離菌と同じサブタイプであるかどうかを決定しようとする。それぞれの生きた培養物が診断研究施設に提供される。各培養物の小部分を、少量の水性緩衝液と混合し、そして１０〜２０分間煮沸する。この培養物の溶解物を、多可変数縦列反復（ＶＮＴＲ）遺伝子座のＰＣＲ分析用のＤＮＡ源として用いる。プライマーおよび必要な増幅試薬を備えたキットが提供される。反応後、ＰＣＲ産物（単位複製配列）を、電気泳動によってサイズで分離し、そして各遺伝子座特異的プライマー対について１つのプライマーに結合された蛍光色素により検出する。ＰＣＲ単位複製配列サイズの見積もりにより、多ＶＮＴＲ遺伝子座での配列反復数を決定する。これらのサイズは多遺伝子座遺伝子型を表し、これは既知株遺伝子型の標準化されたデータベースと、および食品加工工場または飲食店で起こり得る汚染源と比較されるだろう。陽性株の同定は、工場または飲食店が、汚染された食品およびしたがって疾患の拡散を含む源を除去することを可能にするだろう。
【００５０】
【表１−１】
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【００５１】
【表１−２】
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【００５２】
【表１−３】
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【００５３】
【表２−１】
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【００５４】
【表２−２】
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【００５５】
【表２−３】
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【００５６】
【表２−４】
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【００５７】
【表３−１】
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【００５８】
【表３−２】
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【００５９】
【表３−３】
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【００８４】
本発明の特定の好適な実施態様が上記に記載され、そして具体的に説明されたが、本発明がそのような実施態様に限定されることは意図されない。様々な変更が、添付の特許請求の範囲に記載されるとおりの本発明の範囲および精神から逸脱することなく、これになされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】３つの大腸菌ゲノムに位置する縦列反復のヒストグラムである。
【図２】５６の大腸菌単離菌中の３０の多型ＶＮＴＲ遺伝子座についてのアレルおよび多様性価(diversity value)を示す。
【図３】本発明に記載される３０のＶＮＴＲマーカー遺伝子座の分析に基づく近隣結合系統樹(neighbor joining tree)での、５６の大腸菌単離菌間の遺伝的関連を表す。
【図４】大腸菌からの増幅マーカーＤＮＡの、サイズおよび着色プライマーによる分離パターンを示す電気泳動スラブゲルの写真である。大腸菌株は、ゲルで得られるパターンを既知の型の大腸菌株で得られるパターンと比較することによりサブタイピングされ得る。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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