(57)【要約】本発明は、磁性および／または金属コロイドを含み、その物理構造が、磁性誘導または力の適用の手法により改変することができる感熱性ポリマー、その製造方法および診断および治療目的でのそのようなポリマーの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理構造が磁性誘導またはエネルギー供給によって変化しうることを特徴とする、磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２】
ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド、ポリ−Ｎ−置換メタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミドおよびＮ−置換メタクリルアミドを含む群からのモノマーのコポリマー、または前記ポリマーおよび／またはコポリマーの混合物から構成されることを特徴とする、請求項１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項３】
ポリマーが、前記のモノマーとは別に、１種または２種以上のコモノマー、好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸などのカルボキシル基を含むモノマー、またはアクリル酸塩、アクリル酸塩誘導体、メタクリル酸塩、メタクリル酸塩誘導体、アクロレイン、アクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミドおよび酢酸ビニルからなる群から選択されるものを含む、１種又は２種以上のコポリマーまたはブロックコポリマーを含むことを特徴とする、請求項２に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項４】
ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリアクロレイン、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、Ｎ−置換ポリアクリルアミドおよびそれらの混合物から選択される１種又は２種以上のコポリマーまたはブロックコポリマーを含むことを特徴とする、請求項２または３に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項５】
ポリマーが、ナノ粒子またはマイクロ粒子であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項６】
磁性誘導が、高周波交互性磁界より構成されることを特徴とする、請求項１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項７】
物理構造の変化が、ポリマーの幾何学的形態への変化で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項８】
幾何学的形態の変化が、熱により引き起こされる形態変化前にポリマーにより表示される原型に戻る（「形状記憶ポリマー」）ことにより構成されることを特徴とする、請求項７に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項９】
物理的構造の変化が、ポリマー粒子サイズの拡大または縮小により構成されることを特徴とする、請求項１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１０】
磁性コロイドが、強磁性粒子、超常磁性粒子、フェリ磁性粒子、低温フェライトまたは粒子サイズが１μｍより小さいフェロ流体から構成されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１１】
低温フェライトが、３０〜１００℃の範囲のキュリー温度を有することを特徴とする、請求項１０に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１２】
金属性コロイドが、第８、９、１０または１１属（１９８６年IUPAC新提案のグループ分類）からの元素により構成されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１３】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが、それらを取り囲むコアポリマー形態として存在することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１４】
コアポリマーが、５０〜１０００ｎｍの粒子サイズを有することを特徴とする、請求項１３に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１５】
コアポリマー中に封入される磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが、分散コロイド形態で存在することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１６】
封入するコアポリマーが、キトサン、デキストラン、スターチ、ポリアクリル酸、多糖類、シリカゲル、シリコーン誘導体、セルロース、タンパク質、アルブミン、アガロース、アルギン酸塩、ポリスチレン、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩、ポリシアノアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒアルロン酸、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクロレインおよびそれらのコポリマーの群からのものであることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１７】
ポリマーが、ポロゲンを０．１〜３０質量％含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１８】
ポロゲンが、シリカゲル、タンパク質、核酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドおよび多糖類の群からのものであることを特徴とする、請求項１７に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１９】
ポリマーが、二または三官能性架橋剤で架橋されていることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２０】
架橋剤が、すべてのモノマー含有量に対して０．１〜１０％の濃度を有することを特徴とする、請求項１９に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２１】
ポリマーが、生体高分子を結合する反応性基を有することを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２２】
結合基が、アフィニティリガンド、ペプチド、タンパク質、抗体、抗原、酵素、細胞レセプタ抗体、腫瘍マーカーに対する抗体、抗体フラグメント、人工抗体、修飾抗体、抗体複合体、オリゴサッカリド、グリコプロテイン、レクチン、核酸、ストレプトアビジンまたはビオチンと反応することを特徴とする、請求項２１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２３】
ポリマーが、封入された活性剤を含むことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２４】
封入された活性剤が、ホルモン、細胞増殖抑制剤、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、サイトカイン、免疫調整剤、抗原、タンパク質、ペプチド、レクチン、グリコプロテイン、アンチセンス核酸、オリゴサッカリド、抗生物質または一般薬剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２５】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが分散しているモノマー溶液が、多官能性架橋剤およびラジカル開始剤の添加により、急進的に固形物に重合されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項２６】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが分散している水性モノマー溶液が、多官能性架橋剤およびラジカル開始剤の添加後、水に溶解しない有機相中で機械的粉砕により懸濁され、急進的にナノ−またはマイクロ粒子状に重合されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項２７】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが分散している水性モノマー溶液が、多官能性架橋剤の添加後、水に溶解しない有機相中で機械的粉砕により懸濁され、ラジカル開始剤の添加による懸濁プロセス中に、急進的にナノ−またはマイクロ粒子状に重合されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項２８】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミド、Ｎ−置換メタクリルアミドまたはそれらの混合物が、モノマーとして使用されることを特徴とする、請求項２５〜２７のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項２９】
０．０５〜３０モル％のコモノマーがモノマー溶液に添加されることを特徴とする、請求項２５〜２８のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３０】
コモノマーが、アクリル酸塩誘導体、メタクリル酸塩誘導体、アクリル酸、アクロレイン、メタクリル酸、アクリルアミド、酢酸ビニルまたはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項２９に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３１】
強磁性物質、超常磁性物質もしくはフェリ磁性物質、または低温フェライトあるいは粒子サイズが１μｍより小さいフェロ流体がモノマー溶液に添加されることを特徴とする、請求項２５〜３０のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３２】
強磁性物質、超常磁性物質もしくはフェリ磁性物質または低温フェライトがコロイドとして、または粉末形態で存在することを特徴とする、請求項２５〜３１のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。  
【請求項３３】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが分散して封入されるナノ−またはマイクロ粒子コアポリマーが、モノマー溶液に添加されることを特徴とする、請求項２６または２７に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３４】
コアポリマーが、キトサン、デキストラン、スターチ、ポリアクリル酸、多糖類、シリカゲル、シリコーン誘導体、セルロース、タンパク質、アルブミン、ポリアクリル酸、アガロース、アルギン酸塩、ポリスチレン、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩、ポリシアノアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ヒアルロン酸、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクロレインまたはそれらのコポリマーから形成されることを特徴とする、請求項３３に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３５】
有機相として使用される溶媒が、５〜１０（cal/cm3）1/2の極性溶解パラメータを有することを特徴とする、請求項２６または２７に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３６】
１種または２種以上の表面活性物質が、０．０５〜１５質量％有機相に添加されることを特徴とする、請求項２６または２７に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３７】
表面活性物質が、アルキルスルホスクシネート、ポリオキシエチレンアリールエーテル、ポリオキシエチレエン、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレン付加物、ポリエチレンプロピレンオキシドブロックコポリマー、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、脂肪族アルコールポリエチレングリコールエーテル、ポリグリセロールエステル、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン酸およびそれらの混合物の群からのものであることを特徴とする、請求項３６に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３８】
モノマー溶液が、有機相の分散前に５〜１２０秒間前重合されることを特徴とする、請求項２６に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３９】
アフィニティリガンド、ペプチド、タンパク質、抗体、抗原、酵素、細胞レセプタ抗体、腫瘍マーカーに対する抗体、腫瘍抗原に対する抗体、抗体フラグメント、人工抗体、修飾抗体、抗体複合体、オリゴサッカリド、グリコプロテイン、レクチン、核酸、ストレプトアビジンまたはビオチンが、ポリマーに結合されることを特徴とする、請求項２５〜３８のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４０】
活性剤が、ポリマーに封入されることを特徴とする、請求項２５〜３９のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４１】
活性剤が、ホルモン、細胞増殖抑制剤、抗体、サイトカイン、免疫調整剤、抗原、タンパク質、ペプチド、レクチン、グリコプロテイン、核酸、アンチセンス核酸、オリゴサッカリド、抗生物質または一般薬剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４２】
０．１〜２０質量％の多価アルコール、ポリビニルアルコール、ゼラチンまたは炭化水素が活性剤に添加されることを特徴とする、請求項４０または４１に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４３】
多価アルコールまたは炭化水素が、イノシット、マンニット、ソルビット、アルドニット、エリスリット、スクロース、グリセリン、キシライト、フルクトース、グルコース、ガラクトースおよびマルトースの群からのものであることを特徴とする、請求項４２に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４４】
封入された活性剤が、磁性誘導またはエネルギー供給の結果として放出されることを特徴とする、請求項４０〜４３のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４５】
ＮＭＲ診断でのコントラスト増強媒体、薬物療法および診断における活性剤のキャリア、反応物質の制御可能なキャリア、微小流体プロセスのコントロール媒体、カラムクロマトグラフィーでの分離媒体、膜での孔サイズの調整および管理媒体、血管封鎖媒体、人工細胞キャリアならびに核酸、細胞、タンパク質、ステロイド、ウイルスまたはバクテリアの分離媒体としての、請求項１〜２４のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、封入された磁性コロイドおよび／または金属性コロイドによって、磁性誘導により加熱されることができ、したがってそれらの物理的構造または形態の変化を与えられ得る感熱性ポリマーに関する。加熱に伴う形態の変化は、制御可能な持続性薬剤の製造、ＮＭＲ診断のコントラスト増強媒体、操縦可能なミクロツール、血管封鎖媒体および膜製造における制御可能なポロゲン（porogen）として使用される。
【０００２】
本発明は、コロイドを含有する磁化可能物質および／または金属性物質、または磁性および／または金属性コアポリマーが重合され、熱または高周波交互性磁界の導入を通して選択的に加熱することができ、これにより物理構造および／またはポリマーキャリアの形状の変化をもたらし、該ポリマーのin-vivo適用を可能とする、種々の幾何学的形状(geometries)および粒子サイズのポリマーキャリアに関する。本発明はまた、ポリマーキャリアの製造及び使用に関する。
【０００３】
誘導により加熱されうる磁性ポリマー粒子は、種々の出版物および特許で開示されている。たとえば、DE-OS 3502998、DE-OS 4201461、DE-OS 4412651およびDE-OS 19800294は、腫瘍治療、AIDS治療および分子生物学用途において、誘導的に加熱されうる磁性ポリマー粒子を記載する。
Jordanらは、J. Magnet. Mag. Mat., Vol. 225, 118, 2001およびInt. J. of hyperthermia, Vol 9, 51, 1993において、腫瘍の熱温処置用に誘導的に加熱されうる種々の被覆の磁性コロイドを使用する。類似の方法で、Mitsumoriらによる、Int. J. of Hyperthermia, Vol. 10, 785, 1994およびMasukoらによるBiol. Pharm Bull., Vol. 18, 1802, 1995では、誘導により加熱され得る磁性粒子および腫瘍細胞を過熱（発熱療法）する磁性リポソームを使用する。
【０００４】
米国特許4,735,796および4,662,359は、腫瘍治療との関連で、発熱療法としても又使用される磁性粒子を記載する。ここで引用する媒体及び方法の一般的な特徴は、磁性誘導は、細胞または生物学上の生命体を過熱により破壊するために、もっぱら粒子を加熱することにのみ使用される。誘導の助力による、物理的構造又は形態の変化は、既知のキャリアでは起こり得ない。
【０００５】
好ましくは分析、診断または医薬用途の磁性マイクロおよびナノ粒子は、全体が参照として本明細書に取り込まれ、特許PCT/WO 97/04862、PCT/WO 89/11154、PCT/WO 92/22201、PCT/WO 90/07380、PCT/WO 99/62079および米国特許6,020,210、5,141,740、4,827,945、4,647,447、3,917,538、4,628,037、4,827,945、4,861,705、4,169,804、4,115,534、4,345,588、4,070,246、3,970,518、4,230,685、4,654,267、4,452,773、4,396,226、4,357,259、4,861,705、4,247,406、4,267,234、3,652,761、4,675,173から既知である。
【０００６】
デキストラン、アガロース、デキストリン、アルブミン、シリカゲル、ポリスチレン、ゼラチン、ポリグルタルアルデヒド、アガロース−ポリアルデヒド合成物、リポソーム、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクロレイン、タンパク質およびポリオキシエチレンは、前述の方法でのポリマーマトリックスおよび抗原、抗体、タンパク質，細胞、DNAフラグメント、ウイルスまたはバクテリアの形態での親和力の原則により、連結するバイオリガンドおよび／またはレセプターを経由して検体を結合することができる生成物として、生化学−医学分析および診断の関連で使用されている。
異なるポリマーで被覆したさらなる磁性粒子の概観および生医学の分野での用途は、”Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers”, Haefeli et al., published by Plenum Press, New York, 1997に記載される。
【０００７】
前述の生成物のすべてについての一般的な特徴は、マトリックスに結合するバイオリガンドまたはレセプターと分析される物質との補完的な相互作用から、専らそれらの機能を導き出す。したがって、それらの使用用途は、生体高分子の分離及び分析、または親和力の原則を使用する特定の細胞のマーキングという既知の分野に限定される。
参照としてここに引用する磁性ポリマーキャリアは、また、感熱性ではないというその化学的構造の理由により、本発明の媒体とは異なる。すなわち、それらは、外部の熱的刺激に基づいて、その物理的構造または幾何学的形態を代えることはできない。しかしながらこの特性は、操縦可能なまたは制御可能なミクロまたはナノキャリアおよび／またはツールとしてのポリマーキャリアを使用するための、基本的な条件である。
【０００８】
最も一般的に使用される感熱特性を有するポリマーは、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドであり、該ポリマーは約２７℃の温度で有意な収縮をするゲル状ポリマーである。この収縮は可逆性であり、即ち、３０℃より低く冷却した場合、ポリマーは事実上元の形態を取り戻す。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの特別な特性および、例えば、持続性薬剤、バイオセンサー、細胞培養基質、細胞封入マトリックス、作動装置またはバルブなどの興味深い用途は、長い間知られているものであり、多くの出版物および特許に反映されている。
【０００９】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドまたはコポリマーと、例えばアクリル酸、メタクリル酸、ポリエチレンオキサイドまたはキトサンとの重合および膨張特性、ならびにシリコーン樹脂またはポリビニルアルコールとのグラフト共重合は、ParkおよびHoffman, J. Biomed. Mat. Res., Vol. 24, 21, 1990, Zhangら, Langmuir, Vol. 18, 2013, 2002, LeeおよびChen, J, Appl. Polymer Sci., Vol. 82, 2487, 2001, ZhuおよびNapper, Langmuir, Vol. 16, 8543, 2000, Liら, Radiat. Phys. Chem., Vol. 55, 173, 1999, ZhangおよびZhuo, Eur, Polym J., Vol. 36, 2301, 2000, Serizawaら, Macromolecules, Vol. 35, 10, 2002, Kanazawaら, Anal. Sci., Vol. 18, 45, 2002, Asanoら, Polym. Gels & Networ, Vol. 3, 281, 1995, SayilおよびOkay, Polym. Bull., Vol. 45, 175, 2000, Xueら, Ploymer, Vol. 42, 3663,2001, Maolinら, Radiat. Phys. Chem., Vol. 57, 481, 2000, ならびにEbaraら, J. Appl. Polymer Sci., Vol. 39, 335, 2001に開示される。
ベースポリマーとしてのポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの対応するナノ粒子またはマイクロ粒子は、GanおよびLyon, J. am. Chem. Soc., Vol. 123, 7517, 2001, Wanら, J. Am. Chem. Soc., Vol. 123, 11284, 2001, Gilanyiら, Langmuir, Vol. 17, 4764, 2001, WestおよびHalas, Curr. Opinion. biotech., Vol. 11, 215, 2000, Matsuokaら, Polym. Gels & Networks, Vol. 6, 319, 1998およびJonesおよびLyon, Macromolecules, Vol. 33, 8201, 2000に開示される。    
【００１０】
KondoおよびFukuda, J. Ferment. Bioeng., Vol. 84, 337, 1997による研究の対象は、磁性ナノ粒子を含むＮ−イソプロピルアクリルアミドコポリマーである。しかしながら、該文献に記載される方法は、透明磁性粒子封入および球状粒子のどちらも提供するものではない。Kondoら, Appl. Microbiol. Biotech., Vol. 41, 99, 1994,は、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−メチルアクリル酸コポリマーの、時間を要する２段階重合において封入される磁性ポリスチレンポリマーを開示する。生成物は、抗体を分離することにのみ適している。本発明の対象であるのと同様に、誘導的にコントロールされた放出に関連する活性剤用途は、どちらの生成物でも、実現されることはできない。
【００１１】
米国特許第4,832,466号、第6,165,389号、第6,187,599号、第5,898,004号、第5,854,078号、第6,094,273号、第6,097,530号、第5,711,884号および第6,014,346号は、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのナノ粒子を用いたフィルターまたはスイッチの形態での感熱性光学システムを開示する。
米国特許出願第20020032246号、第20020031841号、第20010026946号は、例えば、巨大分子分離用、検体の比色検知または化学物質の決定用センサーとしてのＮ−イソプロピルアクリルアミドを基準とする他の感熱性ハイドロゲルの中のものを開示する。他のもの、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ヒドロキシアルキルセルロース、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、アルキルセルロース、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ポリアクリル酸、エチレンジアミンのブロックポリマーからの感熱性およびｐＨ感応性ポリマーの、例えば、生物学的に活性な物質のキャリアとしての用途は、米国特許第5,674,521号、第5,441,732号、第5,252,318号、第5,599,534号、第5,618,800号および第5,840,338号において言及される。
【００１２】
他のアクリレート、アクリルアミド、ウレタンまたはメタクリレートおよびポリオキシエチレンまたはポリオキシプロピレンのブロックコポリマーからなる、浸透性のポリマーネットワークの感熱性およびｐＨ感応性ポリマーは、米国特許第5,939,485号の主題である。米国特許第5,998,588号は、アッセイまたは分離用ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの、感熱性およびｐＨ感応性な相互作用する刺激反応共役（conjugate）を開示する。ｐＨ、光および熱−感応性マイクロ粒子、ならびに持続性薬剤としてのＮ−置換ポリアクリルアミドのマイクロ粒子およびリポソームが、また米国特許第5,753,26号、第5,226,902号および第5,053,228号に開示される。
【００１３】
検体検知のための固相キャリアとしての、レーヨン、紙、ポリアクリルアミドおよびアガロースビーズ等の多孔性キャリア媒体は、米国特許第5,013,66号に開示される。可逆的な溶解度を有するアクリレートキャリア上への酵素固定化は、米国特許第4,783,409号の主題である。薬剤、ホルモン、ビタミン、タンパク質、代謝物、細胞、ウイルス、微生物および抗体の検知のためのポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを用いた、熱誘導相分離免疫測定法は、米国特許第4,780,409号に開示される。
【００１４】
免疫学測定との関連で、ならびに分析目的でのアクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに基づく抗体−ポリマー共役の統合及び適用は、米国特許第4,752,638号および第4,609,707号に開示される。熱−感応性ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドまたは活性剤を他のものから放出できる、受容体、抗体、タンパク質、薬剤または核酸を含むポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドコポリマーは、米国特許第4,912,032号の主題である。経口持続性薬剤としてのアルギネートビーズは、米国特許第5,451,411号に開示される。硬質および軟質ポリマー部分ならびに、ガラス温度より高く加熱することにより元の形状に戻すことができることから構成される生分解性形状記憶ポリマーは、米国特許第6,160,084号の主題である。
【００１５】
本明細書に参照として掲載される全ての媒体は、共通する１つの事情を有する、即ち、それらが非磁性ポリマーキャリアの場合、物理的な構造または形態の変化のみが、外部から直接的に適用される熱により誘引され得て、それらが磁性キャリアの場合、それらの構造は、決して、外部刺激や外部から適用されるエネルギーにより変えることはできない。さらに、当業者に既知の”刺激反応”キャリアは、活性剤（薬剤）のキャリアとして、ＮＭＲ診断（磁気共鳴断層撮影装置）のコントラスト媒体として、分子分離用媒体としてまたはin vivo用途の制御可能なマイクロツールとして適しない、不規則なナノ粒子またはより大きな容積ポリマーのいずれかである。
【００１６】
本発明の目的は、ナノ粒子またはマイクロ粒子形態ならびにエネルギー供給により選択的に刺激されうる他の幾何学様式（geometries）、例えば、磁性誘導、平行誘導（induce a parallel）、温度上昇によりもたらされるポリマーマトリックスの物理構造の特徴づけられた変化を有するポリマーマトリックスおよび／またはポリマーキャリアの提供にある。
定義によれば、「物理構造の変化」とは、本明細書ではポリマーキャリアの幾何学的形状、体積または粒子サイズの変化を意味するものと理解される。体積の変化は、例えば、収縮での変化または孔サイズの平行変化を伴う膨潤プロセスまたはポリマーの外部形状（幾何学的）の変化であることが明白である。物理構造の変化は、加熱または冷却（冷却プロセス）により一時的に変化するポリマーが、元の形態に戻ることもまた意味しうる（形状記憶ポリマー）。
【００１７】
これらのポリマーの相転移温度（臨界溶液温度も同様）は、２７〜３８℃の範囲、即ち、体温範囲（３７℃）であり、収縮プロセスがすでに該温度で発生したか、および／またはキャリアがこれ以上加熱され得ないので、これらのキャリアはin-vivoでまだ使用することはできない。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドおよびＮ−置換アクリルアミドに基づくキャリアを、治療、分析および診断型の活性剤のキャリアとしてin-vivo適用が有益であるように製造するため、本発明の目的は、さらにポリマーキャリア中に活性剤を封入することおよび対応するin-vivo投与後、磁性誘導により選択的かつ制御可能にこれらを適用することである。
【００１８】
磁界で誘導される熱と物理構造の平行変化の組み合わせおよび／またはキャリアの幾何学様式は、元のポリマーキャリアを超えて持続する特性範囲を創作するであろう。
本発明の目的は、磁性誘導により、例えば、高周波交互性磁界に外的に適用することにより特定のポリマーを加熱し、磁界からエネルギーを吸収できる磁性物質および／または金属性物質を封入することにより解決され、およびこれによりポリマーを加熱できる。
本発明の目的は、それらの物理構造の変化による熱的刺激に反応する、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドおよびＮ−置換アクリルアミドに基づく特定のポリマーおよびコポリマーを合成することにより解決される。
【００１９】
感熱性ポリマーを製造するための初期の生成物は、高い磁化を示し、交互する磁界で誘導的に加熱することができる、強磁性、フェリ磁性または超常磁性のナノ粒子またはマイクロ粒子の形態の磁性コロイドである。この目的のために好ましい物質は、マグネタイト（Fe3O4）またはγ- Fe２O３である。そのような化合物の製造は、一般的な技術水準: shinkaiら, Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991, Kondoら, Appl. Microbiol. Biotechnol., Vol. 41, 99, 1994, Khalafallaおよびreimers, IEEE Trans. Magn., vol. 16, 1278, 1980, Leeら, IEEE Trans. Magn., Vol. 28, 3180, 1992, Buskeら, Colloids & Surfaces, Vol. 12, 195, 1984から既知である。
【００２０】
安定剤の使用なしでのマグネタイトまたはγ- Fe２O３のコロイド状分散は、Kangら, Chem. Master., Vol. 8, 2209, 1996により出版された。主としてマグネタイト（Fe3O4）、酸化鉄（Fe2O3）またはオキシ水酸化鉄(FeOOH)から構成され、５〜１００ｎｍの粒子サイズを有し、ＮＭＲ診断のコントラスト媒体として、情報貯蔵媒体、封止剤、抑制剤として、または細胞マーキングとして他のものの中で使用される同様の磁性コロイドは、参照として本明細書に取り込まれる以下の特許：米国特許第5,492,814号、第5,221,322号、第4,647,447号、第4,827,945号、第4,329,241号、第3,215,572号、第3,917,538号、DE-OS 350 8000、DE-OS 39 33 210、欧州特許0 275 285、PCT/IL99/00275、欧州特許0 586 052で見つけることができる。前述の特性および従って例えば、ポリマーマトリックス中で封入のために適する他の物質は、Mが二価の金属イオンまたは２種類の二価の金属イオンの混合物または金属ニッケルまたはコバルトである、一般式MOFe2O3を有するフェライトを含む。
【００２１】
種々のモル比の鉄（III）および鉄（II）食塩水は（2:1, 0.5:1〜4:1）、マグネタイトまたはγ−Fe2O3を製造するための基盤を形成し、これらは塩基の添加または熱の適用により、対応するコロイド状磁性分散物に変換される（”磁性コロイド”）。細かな磁性粒子のファンデルワールス力による集塊を防止するため、”テンサイド(tenside)”、”乳化剤”または”安定剤”という名で一般に知られ、特に水性分散物中でコロイドの沈殿を防止する、表面活性剤を添加しうる。そのような安定化コロイド状分散物はまた、”フェロ流体(ferrofluid)”という名で知られる（KaiserおよびMiskolczy, J. Appl. Phys., 413, 1064, 1970）。これらは又、商業的に入手できる（Ferrofluidics Corp., USA; Advanced Magnetics, USA; Taiho Co, Japan; Liquids Research Ltd., Wales; Schering AG, Germany）。使用される安定剤は、陽イオン、陰イオンまたは非イオン性のいずれでもよい。これらのための適当な化合物は、例えば、陰イオン性物質としてアルキルアリールポリエーテルサルフェート、ラウリルスルホネート、アルキルアリールポリエーテルスルホネート、リン酸エステル、アルコールエーテルサルフェート、クエン酸塩、オレイン酸、アルキルナフタレンスルホネート、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸または石油スルホネート、陽イオン性物質としてドデシルトリメチルアンモニウムクロライドおよび非イオン性物質としてノニルフェノキシポリグリシドール、ポリビニルアルコール、ケロシン、アルキルアリールオキシポリエトキシエタノール、ノニルフェノールまたはポリエチレングリコールである。前述の製造方法により製造される磁性コロイドの粒子サイズは、一般的に知られているが（引用文献参照）、鉄塩比、塩基濃度、ｐＨ値および温度などの種々の試験パラメータに依存する。
【００２２】
本発明による媒体に適する磁性コロイドはすべて、５〜１０００ｎｍの粒子サイズ、特に１０〜５００ｎｍのサイズを有する。これは磁性コロイドが、その後の封入の間、ポリマーマトリックス中で細かに分散した形態で存在することを保証する。適当なコロイドの対応量の、選択的で測定された添加により、ポリマーキャリアの磁性特性および同様の加熱特性は、明確に制御しうる。モノマー処方中の磁性コロイド濃度は、普通１０〜３０容量％であり、モノマー相に比して磁性物質の固形分は一般に５〜４０質量％、好ましくは１０〜３０％である。
【００２３】
磁性コロイドとは別に、金属性コロイドもまた、代替物としてポリマーマトリックス中に封入されうる。高周波交互性磁界中で誘導的に加熱され得る、コロイド状または細かに分散した形態での全ての金属性物質は、本質的に適当である。本発明の媒体の生理学的な用途は本質的な側面を表すため、誘導的に加熱されうり、生理学的に無害および／または化学的−物理学的に不活性であるこれらの金属性コロイドは、好ましく使用される。これらは第８〜１１属の金属（１９８６年IUPAC定義）を含み、金、銀、パラジウムおよびプラチナコロイドまたは対応する粉体は、それらの生体適合性の理由により好ましく使用される。本発明の媒体として使用される金属コロイドは、普通５〜３００ｎｍの粒子サイズを有する。生物学的分析において、可視範囲でのそれらの特別な吸収特性の理由で、タンパク質および核酸の決定に長く使用されるそのようなコロイド、中でも金コロイドの製造は、技術的な状態: Ackermanら, J. Histochem. cytochem., Vol. 31, 433, 1983, Geoghandenら, J. Histochem. cytochem.,Vol. 24, 1187, 1977, Wanら, Histochem., Vol. 83, 109, 1985, birellら, J. Histochem. cytochem., Vol. 35, 843, 1987, Koehlerら, Sensors & Actuators B, Vol. 76, 166, 2001, Moeremansら, Anal. Biochem., Vol. 145, 315, 1985, Englebienne, Analyst, Vol. 123, 1599, 1998, および米国特許第6,361,944号から十分に知られている。当該分野の専門家が知るように、これらはすべて、対応する金属塩の還元によりまたは金属噴霧法により製造される。金属コロイドまたは粉体の大部分はまた、商業的に入手可能である（Sigma, Aldlich, Fluka）。
【００２４】
金属コロイドおよび対応する粉体の両方が、本発明の媒体および方法に使用されうる；これらは重合前にモノマー処方に望ましい濃度で混合される。ポリマーおよび／または粒子中の金属割合は、普通５〜４０質量％である。コロイドの添加後、コロイドの細かな分散を確実にすべく、超音波棒（finger）または超音波槽を用いてコロイド−モノマー混合物に一時的に超音波照射することがしばしば有利である。コロイドの均一な分配は、ポリマーマトリックス中の対応する熱のよりよい損失を可能とし、それが次に、封入された活性剤の連続的な放出を保証する。
【００２５】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドおよび／またはＮ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、プロピルメタクリルアミドならびにアクリロイルピロリドンまたはＮ−アクリロイルピペリジンなどのＮ−置換アクリルアミドは、ポリマーマトリックスおよびナノ粒子またはマイクロ粒子キャリアの感熱性モノマーとして使用される。知られるように（文献参照）、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、その特定の化学構造の理由で、２７〜３８／４０℃の相転移温度を有し、これは、ゲル中、当該温度で明確な収縮プロセスを誘発する。一般に５〜３０％溶液として使用される関越性ポリマーを製造するために、２つの基礎的な方法がその形態に依存して使用され、ポリマーキャリアの使用を意図する：
a)溶液中のラジカル重合
b)分散状態でのラジカル重合
【００２６】
後者は、細かに分散したポリマー粒子を製造するための、パール重合、懸濁重合、乳化重合スプレー重合および沈殿重合（precipitation polymerization）などのよく知られている方法を含む。分散物または懸濁液中での重合は、本発明の媒体を製造するために特に有利であることが証明されるものであり、該発明のモノマー混合物を、水と混合できない有機相中で対応するコロイドとともに攪拌することにより懸濁させ、これによってラジカル的に重合される（逆（inverse）懸濁重合）。
【００２７】
懸濁重合で使用されるそのような有機相の例は、一般的に知られている：JohanssonおよびMosbach, Biochem. Biophys. acta, Vol. 370, 339, 1974。トルエンまたはベンゼンなどの芳香族炭化水素、塩素化炭化水素、脂肪族炭化水素または鉱物油および植物油が、本発明においては第一に使用される。
【００２８】
驚くことに、５〜１０（cal/cm3）1/2の極性溶解パラメータ（polar solubility parameter）を有する炭化水素が、本発明の媒体および方法に特に適していることが証明され、K. L. Hoy(「溶解パラメータ一覧」,Union carbide Corporation, South Charleston, 1969)により引用された溶解パラメータが、本発明の基礎として利用された。発明の意味での例は、１，２−ジクロロプロパン、１，１，２−トリクロロエタン、トリクロロエチレン、ブロモトリクロロメタン、テトラクロロメタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、クロロホルム、２，３−ジクロロプロパノール、１，２，３−トリクロロプロパンである。対応する有機溶媒の使用とは別に、分散性（dispersibility）に関するポリマー粒子の品質は、特定の活性剤物質の添加により促進される。本発明を限定しないこれらの例は、ポリオキシエチレン付加物誘導体、アルキルスルホスクシネート、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリエチレンプロピレンオキサイドブロックコポリマー、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、脂肪族アルコールグリコールエーテルリン酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルスクロースステアレートパルミテート、脂肪族アルコールポリエチレングリコールエーテル、ポリグリセロールエステル、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレン酸を含む。懸濁方法により製造されるポリマー滴を１μｍより小さくするために、０．３〜１５質量％、好ましくは０．５〜５質量％の１または２種以上の活性剤を、分散相に通常添加する。
【００２９】
これらの粒子サイズは、とりわけ生物医学的なin vivo用途に適する。２０〜２００ｎｍのサイズを有する粒子は、好ましくは、DNA診断でのコントラスト媒体として、および孔幅が調整可能な膜を製造するためのポロゲンとして使用され、１００〜５００ｎｍのものは特に活性剤、例えば、治療用、診断用または予防用薬の形態で、選択的に適用される持続性薬剤として使用される。これらの粒子サイズは、in-vivo用途で組織浸透能力を持続的に指示する。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド粒子が、膜の孔幅を確定する媒体として使用される場合、類似の状況で適用される。ランダムなプラスチックマトリックス中にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルミドナノ粒子を挿入することにより、誘導的な加熱及びその後の冷却を通じて、そのサイズを１０〜８０％の間で減少および拡大可能な孔を創作しうる。
【００３０】
分散プロセスは、通常慣用のＫＰＧスターラーまたは分散機で行う。攪拌速度が６００〜１５００ｒｐｍの間の慣用のプロペラ型混合器  は、１０〜５００μｍの粒子サイズに適当である。１０μｍより小さい粒子サイズは、１５００ｒｐｍより大きい攪拌速度で実現される。一方、２０００ｒｐｍより大きい混合速度を有する分散機のみが、１０μｍより小さい粒子サイズに必要とされる。ロータ−ステイター原理により働くすべての攪拌機は、本目的に使用される。高い混合速度で、分散品質に永久的に影響しうる空気の導入を主として除外すべく、アルゴンもしくは窒素雰囲気下または真空で実験を好ましく行う。
【００３１】
特に生物医学分野での用途において、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド単独のホモポリマーがin-vivo用途で使用できないことが、立証されうる。これは、通常２７〜３８℃である相転移温度の製造上の理由に関連する。この温度はすでに普通体温より低いので、用いようとする、または適用するポリマーゲルでの物理構造変化がすでに起こってしまったことを意味する。in-vivo用途で使用されるにもかかわらず、これらの特定の特性を許容するために、カルボキシル基を含むコモノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミドを共重合させることにより、相転移温度を上昇しうることが驚くことに示された。本発明の媒体の機能は、誘発的な加熱と併せて完全に利用しうる。
【００３２】
従って、コモノマー含有量が０．０２〜３モル％の間である、ナノ粒子およびマイクロ粒子アクリル酸およびメタクリル酸コモノマーは、４０℃より高い温度で最大の収縮を示す。部分的に荷電された（charged）カルボキシル基を組み込んだ結果として、ゲルの収縮を通常引き起こす疎水性相互作用力が、温度の上昇により非常に減少するような、ポリマーゲルの基礎的な膨潤が存在する。平均粒子サイズが３．４μｍであり、アクリル酸含有量が１モル％であるマイクロ粒子は、中性ｐＨ条件下、３８℃、４分後、室温での値と比較して１８％の流体力学的な粒子直径の減少を示し、一方、同じキャリアは、４５℃より高い温度で、他は同一の条件で、４０％を超える収縮率を示す。
【００３３】
収縮の程度とは別に、より高い温度はまた、収縮動力学(shrinkage kinetics)を促進する。従って、４５℃での収縮プロセスは、３５℃より１．５〜３の因数（by the factor）で通常より速くなる。カルボキシル基を含むコモノマーによるポリマーゲルの膨潤現象はまた、個々の封入の責務を負う孔サイズおよび孔構造を最適化して使用されうる。５００ｋＤａより大きい分子量を有する、ＩｇＭ抗体または酵素ガラクトシダーゼのようなより高分子の生体高分子は、妥当な時間長さ（数分）でＮ−イソプロピルアクリルアミドホモポリマーから一般に拡散することができない。この場合の孔チャネルは、とても小さい。しかしながらカルボキシル基を有するコモノマーとの記載の共重合により、孔はそのような生体高分子が拡散できるよう広げることもまたできる。０．０１〜２モル％のコモノマー含有量は、必要な構造的および特性様式を促すのに、通常十分である。
【００３４】
共重合とは別に、収縮の動力学を支持するパラメータ、重合前にモノマー混合物に加えられる特定の物質は、収縮プロセスにおいて孔膨張および促進に寄与しうる。通常２〜３０質量％、好ましくは２〜２０質量％の濃度で存在するこの型の物質は、例えば、ナノ−スケールのシリカ粒子であり、例えば、該粒子はStoeberら, J. Colloid Interface Sci., Vol. 26, 62, 1968からの方法により製造でき,ならびにいずれの場合も２００〜５００の間の分子量を有するポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキサイド、さらにまた５００〜１０００の間の分子量を有する多糖類または修飾された多糖類である。従って、ポリエチレングリコール（分子量４００）を含む、５〜１５容量％（モノマー溶液に対して）のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド粒子（平均粒子サイズ１８μｍ）は、４５℃より高い温度で加熱した場合、３分以内に水の５〜２０％を失うのに対し、ポリエチレングリコール含有量が３０％より多い同じ粒子は、他が同一の条件下で、３分以内にそれらの水含有量の５０〜８０％を失う。ポリエチレングリコール含有量の増加による水損失の増加は、ポリマーキャリア中の封入された活性剤の放出力学に直接影響を与える、収縮の動力学での同様の増加にもまた同伴する。従って、活性剤の放出は、そのようなポロゲンの添加により１．５〜５の因数で一般的に促進されうる。
【００３５】
ナノ粒子およびマイクロ粒子ポリマーキャリアを製造するさらなる方法は、あらかじめ合成した球状磁性ポリマーコアにＮ−イソプロピルアクリルアミドをグラフトする、または重合プロセス中にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドで取り囲むおよび封入するものである。上記に記載した懸濁重合とは別に、沈殿重合および乳化重合などの他の重合変法は、本発明の媒体を製造するのに使用されうることを意味する。これはまた、特に乳化重合などにより製造される、理想的な球形および単分散キャリアを得る可能性を広げるものである。新規な製造物の特性は又、新規なキャリアの適用範囲を著しく広げる、該プロセスおよび製造物の組み合わせを用いて実現されうる。例えば、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリグリシジルメタクリレート、シリカゲル、ポリアミドおよびポリエステルなどの硬いコアポリマーは、これらがカラムクロマトグラフィー用のキャリア媒体として使用されうるように、ポリマーキャリアの機械特性の向上に役立つ。
【００３６】
カラム分離材料の誘発的な加熱を通じて、ポリマーは、元の非常に大きな疎水性から比較的大きな疎水性にその物理特性が変化する。該変化は、キャリア媒体の分離および溶離挙動に著しい影響を有する。親水性−疎水性相転移の結果、アルブミン、フィブロネクチン、フィブリノゲンおよびＩｇＧ抗体などのタンパク質は６０％を超えるまで、相転移前より分離カラムに通常保持される。加えて、分離媒体の分離特徴は、磁界におくことによる通行（passage）中、著しく変化させることができ、その結果、他の分離が困難である物質とのよりよい分離品質を可能とするのに使用される。本明細書での例は、タンパク質、わずかに分子量が異なるオリゴヌクレオチドの分離、ならびに相転移温度を超える温度でのその保持時間が、通常７０％まで増加するステロイドの分離を含む。
【００３７】
感熱性ポリマーを製造するのに適する他の磁性コアポリマーは、生分解性または高い生物適合性を有する基質である。これは、特にキャリアマトリックスのin-vivo用途が著しく改良されうることを意味する。そのような基質の例は、デキストラン、ゼラチン、ポリラクチド、ポリグリコリド、シリカゲル、スターチ、キトサン、アルブミン、ポリシアンアクリレート、アルギン酸塩、ポリビニルアルコール、アガロース、ポリエチレングリコールおよびポリエチレンオキサイドである。そのような磁性基礎ポリマーの製造は、前述の文献で説明される。
【００３８】
磁性コアポリマーは、２つの異なる方法でマトリックスに導入される：
a)Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのラジカルグラフトまたは放射線誘発グラフトによる導入、およびb)合成中のコアポリマーの簡単な重合を通じた導入。
セリウム（ＩＶ）塩の存在下での、放射線誘発およびラジカルグラフトの手法によるポリマー基質の被覆は、通常の技術水準により知られている。０．２〜１Ｍｒａｄ（２〜１０ｋＧｙ）の放射線量を用いてまたは０．０５〜０．４モルのセリウム（ＩＶ）食塩水の存在下で、通常１０〜３０％水性Ｎ−イソプロピルアクリルアミド溶液で行われる。対応する方法は、DE-OS 4129901, DE-OS 3811042, Mueller-SchulteおよびThomas, Radiat. Phys. Chem., Vol. 7, 77, 1982, Mueller-SchulteおよびThomas, Radiat. Phys. Chem., Vol. 35, 93, 1990, Mueller-SchulteおよびThomas, Radiat. Phys. Chem., Vol. 42, 891, 1993, Tripathyら, J. Appl. Polymer Sci., Vol. 81, 3296, 2001, Guptaら, Biomacromolecules, Vol. 2, 239, 2001, Matsuokaら, Polym. Gels & Networks, Vol. 6, 319, 1999で見いだすことができるため、これらは、いつでも当該分野の専門家によって使用されうる。
【００３９】
逆懸濁重合を使用するポリマーキャリアの製造と同様に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをグラフトする間に、アクリル酸またはメタクリル酸などのカルボキシル基を含むモノマーのコグラフトが特に有利であることが、驚くことに発見されたが、これは、導入されるカルボキシル基が、純粋なグラフトポリマーと比較して、収縮の動力学を劇的に向上させるように導くためである。従って、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリグリシジルメタクリレートなどの水で膨潤されることのないコアポリマーに、４０％より高いグラフト程度で、１〜５モル％アクリル酸の割合で、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをグラフトしたものは、３０〜４５℃に加熱すると５０〜７５％の収縮値を有するのに対し、アクリル酸含有量が１モル％より小さいものの収縮値は、すべて５０％を下回る。グラフト処方において、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリル酸モル比以外は一定のものの収縮程度は、全体的なグラフト程度が増加すると、増加する。
【００４０】
コアポリマーは、既知の乳化、懸濁もしくは沈殿重合、または以下の出版物：Liら, J. Microencapsulation, Vol. 15, 163, 1998, Quellecら, J. Biomed. Mat. Res. Vol. 42, 45, 1998, Huaら, J. Master. Sci. Vol. 36, 731, 2001, Kriwetら, J. Contr. Release, Vol. 56, 149, 1998, Chuら, Polym. Bull., Vol. 44, 337, 2000, "Methods In Enzymology", Vol. 112, Part A, WidderおよびGreen 編集, Academic Press, Inc., Orland, 1985に記載される懸濁架橋による手法で製造される。コアポリマーの１粒のサイズは、要求に応じて、５０ｎｍ〜１０００ｎｍの間に固定しうる。      
【００４１】
本発明の本質的な特徴は、初期混合物の組成を通じての、磁性特性、機能性または孔隙率などのポリマーキャリアの望ましい特性の定義にある。封入された活性剤の放出挙動の重要な影響を与える変数である孔隙率は、モノマー処方中の架橋剤の濃度により、第一に決定される。モノマー処方は、通常、０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％の架橋剤（モノマー含有量に対し）を含む。１％より低い架橋剤濃度は、通常、非常に多孔性のキャリア（５０ｎｍより大きい孔幅）を製造するのに使用される。一般に、モノマー混合物と静的な（static）コポリマーを形成する二または三官能性モノマーは、架橋剤として使用されうる。そのような二または三官能性モノマーの例としては、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコールジメタクリレート、１，１，１−トリス−（ヒドロキシメチル）プロパントリアクリレート、３−（アクリロイルオキシ）−２−ヒドロキシルプロピルメタクリレート、メタクリル酸アリルエステルおよびアクリル酸ビニルエステルを含む。
【００４２】
一般的に知られるラジカル剤は、重合を開始するのに使用される。重合は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）および過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）の組みあわされた添加により、著しく促進されうる。ＴＥＭＥＤおよびＡＰＳのモノマー相に対する濃度は（通常１０〜４０％の水溶液）、ＴＥＭＥＤでは２〜８容量％、ＡＰＳでは２〜１０容量％であり、ＴＥＭＥＤおよびＡＰＳの濃度の上昇は、通常重合速度の比例した上昇に伴う。この様にして、重合およびそれによるポリマー粒子形成が、通常の技術状態では２４時間まで要する反応を、せいぜい数分以内に完了し得る。
【００４３】
生物医学的用途では、カップリングに適する基を有する官能性ビニルモノマーとポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの共重合が、有利であることが立証された。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合することができ、アミノ、カルボキシ、エポキシ、ヒドロキシ、イソチオシアネート、イソシアネートまたはアルデヒド機能の形でカップリングに適する基を有するコモノマーは、本明細書中でも適当である。本発明を限定しないこれらの例は、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−イソシアネートエチルメタクリレート、アクロレイン、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−カルボキシイソプロピルアクリルアミドを含む。
【００４４】
共重合のこれらの型は、抗体、細胞レセプタ、坑−細胞レセプタ抗体（anti-cell receptor antibodies）、核酸、オリゴサッカリド、レクチンおよび抗原などの生物学的に密接な関連にある（bioaffine）リガンドを、ポリマーキャリアにカップリングする可能性を広げるものであり、該感熱性キャリアは、細胞、生体高分子、ウイルス、バクテリアまたは組織区分などの特定の対象物質に方向付けることができ、および／または親和性の原理によりこれらの対象器官に選択的に付着しうる。ポリマーキャリアは、従って、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ１４，ＣＤ１５、ＣＤ３４およびＣＤ４５（”分化クラスター(clustered differentiation”）などの細胞表面構造に対し方向付けられる抗体をカップリングすることにより、リンパ球、単球、顆粒球、親細胞および白血球に特異的に付着しうる。
【００４５】
外部から制御可能な構造変化に伴い、本発明のポリマーキャリアの用途は、驚くことに、新規で欠くことのできない活発な組み合わせを利用する可能性を広げる。これらは、ＮＭＲ診断の状況でのコントラスト増強媒体の新規な型としてのポリマー粒子の使用、および活性剤の制御可能な用途での基礎としてこれらに平行するものから構成される。技術状況から既知であり（DE-OS 3508000, 米国特許第5,492,814号および第4,647,447号）、超常磁性、強磁性または常磁性物質が、ＮＭＲ診断の状況で、撮影中コントラストの十分な強化を導き（例えば、磁気共鳴断層撮影装置、ＭＲＴ）、病理学的過程のよりよい局在化および分離を通じて、より正確な診断を可能とする（例えば、初期段階および極小転移での腫瘍検知）。
【００４６】
分析される（細胞）組織でのポリマー粒子の明確な濃縮を許容する、生物学的に密接な関連にあるリガンドのポリマーマトリックスへのカップリングに伴い、本発明の媒体は、治療用活性剤ならびに高官能性診断指示薬の両方のキャリアとして、ほとんど同時に使用されうる。
【００４７】
腫瘍細胞抗原に対し適応させた抗体または抗体区分のカップリングは、最初腫瘍組織中で選択的な濃縮の前提条件を創作し、腫瘍細胞にこれを付着させる。本発明を限定しないこのような腫瘍マーカーおよび／または抗原の例は、腫瘍関連移植抗原（ＴＡＴＡ）、腫瘍胎児抗原、腫瘍特異性移植抗原（ＴＳＴＡ）、ｐ５３−タンパク質、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ｂ２、ＤＡＭ−６、ＤＡＭ−１０）、ムチン（ＭＵＣ１）、ヒト表皮抗原（ＨＥＲ−２）、アルファ−フェトプトテイン（ＡＦＰ）、ヘリコース（helicose）抗原（ＨＡＧＥ）、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ−Ｅ７）、カスパーゼ−８（ＣＡＳＰ−８）、ＣＤ３、ＣＤ１０、ＣＤ２０、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ２５、ＣＤ６４、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、ＧＤ２抗原、メラノコルチン受容体（ＭＣＩＲ）、１３８Ｈ１１抗原を含む。対応する抗体は、モノクロナールもしくはポリクロナール抗体として、抗体フラグメントとして（ＦａｂＦ（ａｂ’）２）、単鎖状分子として（ＳｃＦｖ）、”ディアボディ（diabodies）”、”トリアボディ(triabodies)”、”ミニボディ(minibodies)”または二重特異性抗体として任意に使用されうる。
【００４８】
腫瘍の平行治療のために、癌治療から既知の腫瘍剤および腫瘍増殖抑制剤をポリマー粒子に封入する。これらの例は、メトトレキサート、シス−白金、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、フルオロウラシル、ドキソルビシン、フトラフール（ftorafur）またはタンパク質、ペプチド、抗体または抗体フラグメントとこれらの物質との結合を含む。これらの型の結合は、技術状態：”Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Reisfeld and sell, editors, Alan R. Riss, Inc., New York, 1985”から既知である。
【００４９】
タンパク質、ペプチド、オリゴサッカリドまたは核酸などの生物活性物質の固体キャリアへのカップリングの既知の方法は、生物学的および親和性リガンドまたは受容体のポリマーキャリアへの共有結合に使用される（参照、"Method in Enzymology" , mosbach, editor, Vol. 135, Part B, Academic Press, 1987）。本発明で使用されるカップリング剤は、例えば、塩化トレシル（tresyl）、塩化トシル、臭化シアン、カルボジイミド、エプクロルヒドリン、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、２−フルオロ−１−メチル−ピリジニウム−トルエン−４−スルホネート、１，４−ブタンジオール−ジグリシジルエーテル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、クロリンカルボネート、イソニトリル、ヒドラジド、グルタルアルデヒド、１，１’−カルボニル−ジイミダゾールを含む。
【００５０】
さらにまた、バイオリガンドは、マトリックス（カルボキシル、ヒドロキシル、サルフヒドリル、アミノ基）ならびにバイオリガンドの両者の官能性基と化学的結合を結びうる、反応性ヘテロ二官能性化合物とまた結合しうる。本発明の意味の例としては、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイイミド−メチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート、４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシスクシンイミド、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジゾサリチルアミド）エチル−１，３’−ジチオプロピオナートである。当該分野の専門家は、”Ullmans Encyclopaedie der Technischen Chemie”, 4th Edition, Vol. 10, またはG. T. Hermanson, "Bioconjugate Techniques", Academic Press, San Diego, 1996での情報により、いつでもこれらのカップリング剤を使用できる。
【００５１】
ポリマー粒子の磁気特性は、モノマー相への分散前に、適当な磁性コロイドまたは金属コロイドまたは対応する粒子の直接的な混合により達成される。コロイドの正確な混合を通じて、ポリマー粒子の加熱挙動は、選択的に変化および／または調整されうる。従って、磁性コロイドが１０質量％の割合の水性分散物は、磁界振幅３０KA/m、振動数０．８MHz、３０秒以内で室温からおよそ４５℃まで加熱されうる。温度上昇（heat-up）値は、対応する磁性コロイドの割合が高くなるのと同様に上昇する。これらの測定は、分散物中で極めて詳細に記録された温度上昇率に関連する。ポリマー粒子中で実際に発生した熱は、必然的により高い。本発明の媒体の用途のために、数秒の非常に短い誘導期間のみで、加熱により誘因される刺激を作出するのに十分であることを意味する。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドゲルはすでに、２７℃より高い温度で、ゲルの組成に依存して、元の体積と比較して、８５％までの著しい収縮を示す。本明細書での収縮程度は、コモノマー含有量および上記に記載したコモノマーの種類、ならびに架橋の程度に依存する。従って、１モル％より小さい架橋程度のゲルは、６０〜８５％の収縮程度を有するのに対し、１モル％より大きい架橋程度のゲルは、６０％より低い。
【００５２】
前述の磁性および金属性物質ならびに化合物を、分析、治療及び診断用途に関係のある温度に加熱するために、磁界強度及び周波数に関して、磁界の特別なデザインが要求される。高周波ジェネレイターから送られる電流運搬（Current-carrying）コイルを通常使用する。この型のコイルおよび高周波ジェネレイターは最先端であり、商業的に入手可能である。コイル寸法は個々の試料のサイズに依存する：これらは、一般的に５〜３０ｃｍの直径、および５〜３０ｃｍの長さである。ＨＦジェネレイターの必要な出力は、一般に０．５〜１．５ｋＷである。原理上、２つのジェネレイターが磁性試料の加熱に使用されうる：a)２〜５０MHzの範囲の高周波で１００〜５００A/mの低磁界強度、またはb)０．２〜０．８MHzの低周波で１〜４５KA/mの高磁界強度の組合わせ、である。２つの磁界パラメータの組み合わせは、短い適用期間（１分より短い）で、十分な熱出力を保証する。例えば、体の特定部分での医薬活性剤を適用する場合など、キャリアを加熱するのに十分なエネルギーが、より大きな体積の放射エリア用のより大きなコイル幾何様式(直径30〜40ｃｍ)で、１５KA/mより大きな磁界強度中で、対応する増加により供給されうる。
【００５３】
生成物及び方法の特別な組合わせの理由により、本発明のポリマーキャリアは、特に活性剤の封入用マトリックスとして、および血管遮断用媒体として使用される。誘導的な加熱の使用を通じて、投与のための投薬システムおよび活性剤の適用が、医学分野または、特にそれらの自由に制御可能なコントラストにより特徴付けられる分析学で創作されうる。活性剤は、化学的、生物化学的または生理学的反応を何らかの形で誘引する物質を意味するものとして理解され、これにより治療、診断および／または予防効果を創作し、または分析機能を実行できる。例は、生物学的活性タンパク質またはペプチド、酵素、抗体、抗原、核酸、グリコプロテイン、レクチン、オリゴサッカリド、ホルモン、脂質、成長因子、インターロイキン、サイトカイン、ステロイド、ワクチン、坑凝血剤、細胞増殖抑制剤、免疫調整剤(immunomodulatory）または抗生物質を含む。
【００５４】
このために活性剤は、ポリマー粒子中に封入される。これは、モノマー混合物中に対応する活性剤を直接混合するか、または加熱処理により、あらかじめ収縮したポリマーキャリアで活性剤を培養することのいずれかにより行う。収縮プロセスにより製造されたポリマーゲルの方への濃度勾配は、活性剤のゲル内部への拡散を引き起こす。第一の封入変化の問題は、タンパク質、抗体またはホルモンなどの一部非常に繊細な活性剤が、重合条件により何らかの方法で損傷または不活性化されることである。この問題に対処するために、ポリアルコール、糖、血清アルブミンおよびゼラチンが、重合の効果に対し活性剤を永遠に安定化できるため、これらの添加が役立つことが、驚くことに見いだされた。モノマー処方中の該濃度が通常０．１〜５質量％であるそのような物質の例は、イノシット、ポリビニルアルコール、マンニット、ソルビット、アルドニット（aldonite）、エリスリット、スクロース、グリセリン、キシリトール、フルクトース、グルコース、ガラクトースまたはマルトースである。
【００５５】
このようにして製造された対応する活性剤を装填されたキャリアは、その後、注射、移植、浸透、拡散、ストリーミングまたは生検などの既知の投与の助けにより、作用の望ましい生理学的または生物分析的部位に適用しうる。磁性粒子の局所適用は、粒子を、電気または強永久磁石を用いて外部からの反応エリアまたは作用部位に置かれる、望ましい場所に実際に配置換えすることにより、更に増強されうる。ポリマー粒子がそれらの作用部位に一旦到達すると、それらは実際の作用部位および／またはポリマーキャリアの反応部位の外部に配置される、高周波交互性磁界を適用することにより対応する相点に温度まで加熱されうる。発生した熱は、ポリマーゲル中で、マトリックスから封入された活性剤の迅速な放出を引き起こす収縮プロセスを誘発する。
【００５６】
ゲルからの活性剤の拡散に必要とされる時間は、原則としてゲルのサイズ、活性剤の分子量、ゲルの温度およびキャリアの架橋度に依存する。低架橋度ゲル（０．１〜１％の架橋度）ならびにナノおよびマイクロ粒子は、高架橋度ゲル（１％より高い架橋度）または巨視的ゲルよりも活性剤のより速い拡散を許容する。従って、バソプレシン、インスリン、テストステロン、コルチゾンなどの低分子量ホルモンの８０％ならびに抗体、細胞増殖抑制剤（分子量＜１０kDa）は、４０℃より高く加熱したとき、１％の架橋度の平均粒子サイズ４３０ｎｍのナノ粒子から１分以内に分散したのに対し、およそ５μｍのゲル粒子では、同じ活性剤は、５〜１０分要する。アルブミン、ＩｇＧ−抗体、フィブリノーゲン、乳酸ジヒドロゲナーゼなどの高分子活性剤は、これに対応して、同様の条件下で、より長い時間：＞１０分を要する。活性剤の放出率を変えるために、上記に記載する本発明の媒体は、個々の責務の最適な調整を許容するキャリア媒体の特性を変えうる、粒子サイズ、コモノマー含有量、コモノマー種類、加熱および／または架橋度などの調整可能で、変更可能な多くのパラメータを提供する。
【００５７】
磁性誘導に関連して、これは、初めて無接触で、制御可能な活性剤用途を可能とするポリマーキャリアの構造特性の変化を活用する基礎を創作する。
本発明の媒体及び方法は、加熱によりあらかじめ大きく収縮したキャリアから出発して、相点に温度より低い冷却プロセスによりもとの膨潤形状および／または幾何様式にその後戻る、キャリアの膨潤挙動の逆の使用も又可能とする。この現象は、坑腫瘍対策の治療法との関連で適用しうる。腫瘍進行中の致命的な病理進行の１つは、血管形成である。これは一般的に、腫瘍組織中の血管の形成において、おおきな普及があるものと理解される。これまで第一に薬剤で（または手術で）処理された該病理プロセスを、本発明の媒体の助けにより、驚くことに抑圧または非常に遅延させうる。粒子、好ましくは０．３μｍ〜５μｍの粒子サイズで、あらかじめ誘導により４５℃より高く加熱し、従って、それらの最大収縮度に到達している粒子を、腫瘍組織に導入する。その後の体温への適合の結果、粒子は膨潤し始め、数分でそれらの平衡膨潤状態に達する。この膨潤状態で、ポリマキャリアは、塞栓機能、即ちそれらは血管を遮断し得、従って腫瘍の進行に対抗する、を有する。
【００５８】
この特別な機能は、特に相転移温度が、例えば共重合により増加したこれらのポリマーキャリアにより表示される。特に適するキャリアは、上記に説明するように、カルボキシル基を含むコモノマーを有するものである。０．０５〜１モル％のコモノマー含有量であり、その最大収縮温度が４０度を超えるキャリアが、この場合好ましいものである。特にそのサイズが広い範囲の粒子は、それらが同時に全ての幅の血管を遮断しうるので、実際に血管形成の対抗に適する。
本発明は、以下の例に基づいてより詳細に説明される。
【００５９】
例１
ｎ−ヘキサンから再結晶したＮ−イソプロピルアクリルアミド１５％、アクリルアミド５％およびＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．６％を含む、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍｌ、ｐＨ７．２、ならびにShinkaiら, Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991,からの仕様により製造された２．２ｍＭ／ｍｌの鉄（平均粒子サイズ２６ｎｍ）を含む水性磁性コロイド２．５ｍｌを混合し、超音波槽（２５０Ｗ）で、氷で冷却しながら５分間超音波を照射する。過度の酸素を除去すべく、その後混合物に１５分間窒素を導入する。０．１ｍｇの坑−ｐ５３−抗体（Roche Molecular Biochemicals）、０．０５％ヒト血清アルブミン、２％イノシットおよび０．５％ゼラチンからなる１ｍｌの水性溶液を、該混合物に添加する。氷で冷却しながら、さらに３０秒間超音波を照射する。水相を、その後、０．５％Ｉｇｅｐａｌ  ７２０を含む３０％過硫酸アンモニウム溶液（ＡＰＳ）２ｍｌと窒素存在下で混合し、その後、あらかじめ２０分間窒素を吹き込まれ、８０％のＳｐａｎ８５および２０％のＴｗｅｅｎ２０からなる混合物１．５％を含む、１５０ｍｌのトリクロロエチレンで、温度制御された分散容器（Ultra-Turrax LR 1000, IKA Werle）で、４℃で攪拌しながら（１５，０００ｒｐｍ）懸濁する。１ｍｌのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を、１０秒後添加する。懸濁プロセスを、一定の窒素供給および氷冷により、５分間続ける。
【００６０】
分散物を、重合のために１０℃で、攪拌なしでさらに２０分間放置する。分散物をその後、スチールウールで密に充填した、長さ５ｃｍ、円形形状のネオジム−ホウ素−鉄磁石で取り囲んだガラスカラム（充填容積：約１０ｍｌ；内部直径：０．５ｃｍ）に入れ、分散物をカラムを通して、ゆっくりと落下させる（０．５ｍｌ／分）。カラム通過後、１０％のエタノール、２％のイノシット、および１．５％のポリビニルアルコール（分子量、Ｍ：５０００）を含むおよそ２０ｍｌの硫酸ナトリウム緩衝液で１０回リンスする。続いて、蒸留水で５回洗浄し、０．０５Ｍリン酸ナトリウム／１％イノシット緩衝液、ｐＨ７．２で３回洗浄する。磁石を除去後、カラムの磁性ポリマー画分を０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、５ｍｌで、ついで溶離する。この様にして得られた溶離物を、その後凍結乾燥する。０．０５リン酸ナトリウム／０．１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）／０．１％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、Ｍ：１０００）緩衝液、ｐＨ７．５、２ｍｌに再分散後、１７０ｎｍの平均粒子サイズを有する磁性ポリマー粒子を得た。得られた粒子は、交互磁界での２分以内の以下の処理で、４３％のサイズが減少した（磁界：３０ｋＡ／ｍ、０．６ＭＨｚ；、コイル直径：５．５ｃｍ、８巻き（winding））。この様にして得られた粒子は、ＮＭＲ亜診断と関連するコントラスト増強媒体および腫瘍処置に用いうる。
【００６１】
例２
コバルト−フェライトナノ粒子（ＣｏＦｅ２Ｏ３）を、水に分散したＣｏＣｌ２およびＦｅＣｌ３Oから、０．７５％ポリアクリル酸（Ｍ：５．５００）の存在下、３０秒間、高出力超音波棒（製造：Dr. Hielscher, 80%振幅）の助けを借りて、Satoら, J. Magn. Magn. Mat., Vol. 65, 252, 1987,からの仕様により製造する。平均粒子サイズ２１ｎｍの１．９ｍＭ／ｍｌの鉄を含むコロイド５ｍｌを、その後１５％のＮ−イソプロピルアクリルアミド、６％のアクリルアミド、１％のアクリル酸０．５％のＩｇｅｐａｌ  ５２０および０．８％のＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを溶解した、２０ｍｌの高純度脱気水と混合する。混合物を再度、１分間、氷で冷却しながら超音波棒で超音波を照射し、その後３０分間超音波槽に入れる。４０％のＡＰＳの２ｍｌ添加後、混合物を、Ｔｗｅｅｎ８０とＳｐａｎ８５（７２％：２８％）の混合物を６％含む３００ｍｌの１，１，１−トリクロロエタンに、分散機の助けにより（Ultra-Turrax, IKA Werke, 10,000rpm）、氷冷および窒素導入下で分散する。１ｍｌのＴＥＭＥＤを、１０秒後添加する。分散プロセスを５分間続ける。反応混合物を、１０℃で更に２０分間反応を完了するために放置する。生成物をその後分離し、例１と同様に洗浄する。０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、５ｍｌで溶離後、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、５ｌで、３日間透析する。２４５ｎｍの平均粒子サイズを有する磁性粒子が得られた。得られた磁性粒子画分の２ｍｌを、磁性分子カラム（例１参照）に入れ、０．０１ＭのＨＣｌ溶液で３回、高純水で５回洗浄する。磁石除去後、０．１Ｍの２−モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）２ｍｌ／０．５％のＰＥＧ（Ｍ：１０００）緩衝液、ｐＨ４．２を、磁性粒子を溶離するためにカラムに添加する。０．２ｍＭのＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）−カルボジイミド−メチル−ｐ−トルエンスルホネートが溶解した、０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．２、０．５ｍｌを溶離液に添加する。
【００６２】
混合物を、３０分間、室温で軽く振盪する。スチールウールを充填した分離カラムによるその後の通過は、過剰のＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルフォリノエチル）−カルボジイミド−メチル−ｐ−トルエンスルホネートを分離し、保持された磁性粒子画分を、その後５回、そのたび毎に１５ｍｌの冷水で洗浄する。磁石の除去後０．０５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ５．５、１．５ｍｌで溶離する。溶離物を、１．２５・１０−４ｎＭ  坑−ＣＤ３０−Ｆａｂ−フラグメントを溶解し、４℃で１２時間抗体フラグメントを結合させた、同じＭＥＳ緩衝液０．５ｍｌと混合する。共役（conjugate）物は、スチールウールで充填したカラムで分離し、そのたび毎、氷冷した０．０５Ｍリン酸ナトリウム／１％イノシット／０．１％ＨＳＡ緩衝液、ｐＨ７．２、１０ｍｌで、１０回リンスする。続いて、０．０５Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ１０．５で５回、蒸留水で２回洗浄する。ハンドマグネット除去後、磁性画分を０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５、２ｍｌで溶離する。溶離物を、１Ｍグリシンを含むＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５、３ｍｌで室温で、１２時間、残存するカルボジイミドを不活性化するために培養する。磁性画分を、その後磁性カラムで分離し、０．０５Ｍリン酸緩衝液／０．０５％ＨＳＡ、ｐＨ７．５で１０回リンスする。０．０５Ｍリン酸緩衝液／０．０５％ＨＳＡ、ｐＨ７．５、２ｍｌでの磁性共役物の成功した溶離後、磁性粒子を、ホジキンリンパ腫を診断するＮＭＲ診断に関連する、コントラスト増強媒体として既知の用途方法に使用しうる。
【００６３】
例３
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド２０％、アクリルアミド４％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド１％、および２−ヒドロキシエチル−メタクリレートを溶解した、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２、７．５ｍｌを、窒素で２０分間リンスし、その後２．５ｍｌのマグネタイト−フェロ流体（EMG507, FerroTec, USA）を混合する。混合物を、氷冷しながら、５分間超音波槽で超音波を照射する。０．１％のＨＳＡ（Insuman登録商標 Basal, 100IU/ml）を含む、１％のゼラチンおよびインスリン溶液２ｍｌを、その後添加する。３５％ＡＰＳ溶液１．２ｍｌを水相に添加後２．５％のＳｐａｎ６０および１％のＴｗｅｅｎ８０を含むトリクロロエチレン１３０ｍｌに、攪拌（１２００ｒｐｍ）、絶え間なく氷冷し、ならびに窒素の連続的な流れ下で分散する。２０秒後、ＴＥＭＥＤ０．５ｍｌを添加し、混合物を８分間１０℃で攪拌する。反応混合物を、反応完了のために、さらに２０分、１５℃で放置する。磁性相を分離し、保持された生成物を例１と同様に精製する。凍結乾燥、およびリン酸ナトリウム緩衝液／０．１％ＨＳＡ／０．５％ＰＥＧ（Ｍ：１０００）、ｐＨ７．２、２ｍｌに再び分散後、２３μｍの平均粒子サイズを有する磁性粒子が得られた。粒子の磁界への照射は（１５ｋＡ／ｍ；０．６ＭＨｚ、コイル内径：５．５ｃｍ、８巻き）、３分以内の５５％収縮を導き、これにより最初に添加したインスリンの５８％が放出される。ポリマーキャリアは、糖尿病の処置において、インスリン持続製剤として使用されうる。
【００６４】
Mueller-SchulteおよびBrunner, J. Chromtogr. A 711, Vol. 711, 53, 1995の仕様により製造された、マグネタイト（平均粒子サイズ２４５μｍ）を４０質量％含むポリビニルアルコール粒子１ｇを、２０％水性Ｎ−イソプロピルアクリルアミド溶液４ｍｌ、Ｎ−ビニルピロリドン０．５ｍｌ、アセトン３ｍｌおよびメタノール５ｍｌと混合する。混合物を、その後２０分間アルゴンでリンスし、続いてＣｓ１３７源（Gammacell 40）からのγ線を４５時間放射する(総合放射量３．４ｋＧｙ)。グラフトされた材料を、その後エタノールで２０時間抽出し、続いて水で１０時間抽出する。定量まで乾燥後、６７質量％のグラフト収率を得た（元のポリマーに対して）。４０℃への誘発的加熱は、６２％の収縮度を導く。この様にして得られたキャリアは、タンパク質を分離するカラムクロマトグラフィーに使用しうる。
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月6日(2004.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物理構造が磁性誘導またはエネルギー供給によって変化しうることを特徴とする、磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２】
ポリマーが、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ−置換アクリルアミド、ポリ−Ｎ−置換メタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミドおよびＮ−置換メタクリルアミドを含む群からのモノマーのコポリマー、または前記ポリマーおよび／またはコポリマーの混合物から構成されることを特徴とする、請求項１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項３】
ポリマーが、前記のモノマーとは別に、１種または２種以上のコモノマー、好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸などのカルボキシル基を含むモノマー、またはアクリル酸塩、アクリル酸塩誘導体、メタクリル酸塩、メタクリル酸塩誘導体、アクロレイン、アクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミドおよび酢酸ビニルからなる群から選択されるものを含む、１種又は２種以上のコポリマーまたはブロックコポリマーを含むことを特徴とする、請求項２に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項４】
ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリアクロレイン、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、Ｎ−置換ポリアクリルアミドおよびそれらの混合物から選択される１種又は２種以上のコポリマーまたはブロックコポリマーを含むことを特徴とする、請求項２または３に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項５】
ポリマーが、ナノ粒子またはマイクロ粒子であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項６】
磁性誘導が、高周波交互性磁界より構成されることを特徴とする、請求項１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項７】
物理構造の変化が、ポリマーの幾何学的形態への変化で構成されることを特徴とする、請求項１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項８】
幾何学的形態の変化が、熱により引き起こされる形態変化前にポリマーにより表示される原型に戻る（「形状記憶ポリマー」）ことにより構成されることを特徴とする、請求項７に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項９】
物理的構造の変化が、ポリマー粒子サイズの拡大または縮小により構成されることを特徴とする、請求項１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１０】
磁性コロイドが、強磁性粒子、超常磁性粒子、フェリ磁性粒子、低温フェライトまたは粒子サイズが１μｍより小さいフェロ流体から構成されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１１】
低温フェライトが、３０〜１００℃の範囲のキュリー温度を有することを特徴とする、請求項１０に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１２】
金属性コロイドが、第８、９、１０または１１属（１９８６年IUPAC新提案のグループ分類）からの元素により構成されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１３】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが、それらを取り囲むコアポリマー形態として存在することを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１４】
コアポリマーが、５０〜１０００ｎｍの粒子サイズを有することを特徴とする、請求項１３に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１５】
コアポリマー中に封入される磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが、分散コロイド形態で存在することを特徴とする、請求項１３または１４に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１６】
封入するコアポリマーが、キトサン、デキストラン、スターチ、ポリアクリル酸、多糖類、シリカゲル、シリコーン誘導体、セルロース、タンパク質、アルブミン、アガロース、アルギン酸塩、ポリスチレン、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩、ポリシアノアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアミド、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒアルロン酸、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクロレインおよびそれらのコポリマーの群からのものであることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１７】
ポリマーが、ポロゲンを０．１〜３０質量％含むことを特徴とする、請求項１〜１６のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１８】
ポロゲンが、シリカゲル、タンパク質、核酸、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシドおよび多糖類の群からのものであることを特徴とする、請求項１７に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項１９】
ポリマーが、二または三官能性架橋剤で架橋されていることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２０】
架橋剤が、すべてのモノマー含有量に対して０．１〜１０％の濃度を有することを特徴とする、請求項１９に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２１】
ポリマーが、生体高分子を結合する反応性基を有することを特徴とする、請求項１〜２０のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２２】
結合基が、アフィニティリガンド、ペプチド、タンパク質、抗体、抗原、酵素、細胞レセプタ抗体、腫瘍マーカーに対する抗体、抗体フラグメント、人工抗体、修飾抗体、抗体複合体、オリゴサッカリド、グリコプロテイン、レクチン、核酸、ストレプトアビジンまたはビオチンと反応することを特徴とする、請求項２１に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２３】
ポリマーが、磁界への曝露によりポリマーから周囲に放出される少なくとも１種の封入された活性剤を含むことを特徴とする、請求項１〜２２のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２４】
封入された活性剤が、ホルモン、細胞増殖抑制剤、抗体、抗体誘導体、抗体フラグメント、サイトカイン、免疫調整剤、抗原、タンパク質、ペプチド、レクチン、グリコプロテイン、アンチセンス核酸、オリゴサッカリド、抗生物質または一般薬剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【請求項２５】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが分散している水性モノマー溶液が、多官能性架橋剤およびラジカル開始剤の添加後、水に溶解しない有機相中で機械的粉砕により懸濁され、急進的にナノ−またはマイクロ粒子状に重合されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項２６】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが分散している水性モノマー溶液が、多官能性架橋剤の添加後、水に溶解しない有機相中で機械的粉砕により懸濁され、ラジカル開始剤の添加による懸濁プロセス中に、急進的にナノ−またはマイクロ粒子状に重合されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項２７】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミド、Ｎ−置換メタクリルアミドまたはそれらの混合物が、モノマーとして使用されることを特徴とする、請求項２５または２６に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項２８】
０．０５〜３０モル％のコモノマーがモノマー溶液に添加されることを特徴とする、請求項２５〜２７のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項２９】
コモノマーが、アクリル酸塩誘導体、メタクリル酸塩誘導体、アクリル酸、アクロレイン、メタクリル酸、アクリルアミド、酢酸ビニルまたはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項２８に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３０】
強磁性物質、超常磁性物質もしくはフェリ磁性物質、または低温フェライトあるいは粒子サイズが１μｍより小さいフェロ流体がモノマー溶液に添加されることを特徴とする、請求項２５〜２９のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。  
【請求項３１】
強磁性物質、超常磁性物質もしくはフェリ磁性物質または低温フェライトがコロイドとして、または粉末形態で存在することを特徴とする、請求項２５〜３０のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３２】
磁性コロイドおよび／または金属性コロイドが分散して封入されるナノ−またはマイクロ粒子コアポリマーが、モノマー溶液に添加されることを特徴とする、請求項２５または２６に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３３】
コアポリマーが、キトサン、デキストラン、スターチ、ポリアクリル酸、多糖類、シリカゲル、シリコーン誘導体、セルロース、タンパク質、アルブミン、ポリアクリル酸、アガロース、アルギン酸塩、ポリスチレン、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩、ポリシアノアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ヒアルロン酸、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクロレインまたはそれらのコポリマーから形成されることを特徴とする、請求項３２に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３４】
有機相として使用される溶媒が、５〜１０（cal/cm3）1/2の極性溶解パラメータを有することを特徴とする、請求項２５または２６に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３５】
１種または２種以上の表面活性物質が、０．０５〜１５質量％有機相に添加されることを特徴とする、請求項２５または２６に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３６】
表面活性物質が、アルキルスルホスクシネート、ポリオキシエチレンアリールエーテル、ポリオキシエチレエン、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリオキシエチレン付加物、ポリエチレンプロピレンオキシドブロックコポリマー、アルキルフェノキシポリエトキシエタノール、脂肪族アルコールポリエチレングリコールエーテル、ポリグリセロールエステル、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン酸およびそれらの混合物の群からのものであることを特徴とする、請求項３５に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３７】
モノマー溶液が、有機相への分散前に５〜１２０秒間前重合されることを特徴とする、請求項２５に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３８】
アフィニティリガンド、ペプチド、タンパク質、抗体、抗原、酵素、細胞レセプタ抗体、腫瘍マーカーに対する抗体、腫瘍抗原に対する抗体、抗体フラグメント、人工抗体、修飾抗体、抗体複合体、オリゴサッカリド、グリコプロテイン、レクチン、核酸、ストレプトアビジンまたはビオチンが、ポリマーに結合されることを特徴とする、請求項２５〜３７のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項３９】
好ましくは活性剤を磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含むモノマー溶液に添加することにより、活性剤がポリマーに封入されることを特徴とする、請求項２５〜３８のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４０】
活性剤が、ホルモン、細胞増殖抑制剤、抗体、サイトカイン、免疫調整剤、抗原、タンパク質、ペプチド、レクチン、グリコプロテイン、核酸、アンチセンス核酸、オリゴサッカリド、抗生物質または一般薬剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３９に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４１】
活性剤が、ホルモン、細胞増殖抑制剤、抗体、サイトカイン、免疫調整剤、抗原、タンパク質、ペプチド、レクチン、グリコプロテイン、核酸、アンチセンス核酸、オリゴサッカリド、抗生物質または一般薬剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４２】
０．１〜２０質量％の多価アルコール、ポリビニルアルコール、ゼラチンまたは炭化水素が活性剤に添加されることを特徴とする、請求項４０または４１に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４３】
多価アルコールまたは炭化水素が、イノシット、マンニット、ソルビット、アルドニット、エリスリット、スクロース、グリセリン、キシライト、フルクトース、グルコース、ガラクトースおよびマルトースの群からのものであることを特徴とする、請求項４２に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４４】
封入された活性剤が、磁性誘導またはエネルギー供給の結果として放出されることを特徴とする、請求項４０〜４３のいずれかに記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【請求項４５】
ＮＭＲ診断でのコントラスト増強媒体、薬物療法および診断における活性剤のキャリア、反応物質の制御可能なキャリア、微小流体プロセスのコントロール媒体、カラムクロマトグラフィーでの分離媒体、膜での孔サイズの調整および管理媒体、血管封鎖媒体、人工細胞キャリアならびに核酸、細胞、タンパク質、ステロイド、ウイルスまたはバクテリアの分離媒体としての、請求項１〜２４のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマーの使用。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月30日(2004.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
逆懸濁重合により製造することができ、磁性誘導により変化しうる物理構造を有することを特徴とする、磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４１】
０．１〜２０質量％の多価アルコール、ポリビニルアルコール、ゼラチンまたは炭化水素が活性剤に添加されることを特徴とする、請求項３９または４０に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４２】
多価アルコールまたは炭化水素が、イノシット、マンニット、ソルビット、アルドニット、エリスリット、スクロース、グリセリン、キシライト、フルクトース、グルコース、ガラクトースおよびマルトースの群からのものであることを特徴とする、請求項４１に記載の感熱性ポリマーの製造方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４３】
請求項１〜２４のいずれかに記載の感熱性ポリマー粒子または請求項２５〜４４のいずれかに記載の方法により製造された粒子が、磁性誘導のために、交互する磁界、好ましくは高周波交互磁界に、導入されることを特徴とする、活性剤含有粒子から活性剤を放出する方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４４】
磁性コロイドおよび／または金属コロイドを含有する感熱性ポリマーが、磁性誘導のために交互する磁界、好ましくは高周波交互磁界に導入されることを特徴とする、該ポリマー物理構造の変化、または該ポリマーの加温もしくは加熱方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４５】
ＮＭＲ診断でのコントラスト増強媒体、薬物療法および診断における活性剤のキャリア、反応物質の制御可能なキャリア、微小流体プロセスのコントロール媒体、カラムクロマトグラフィーでの分離媒体、膜での孔サイズの調整および管理媒体、血管封鎖媒体、人工細胞キャリアならびに核酸、細胞、タンパク質、ステロイド、ウイルスまたはバクテリアの分離媒体としての請求項１〜２４のいずれかに記載の磁性コロイドおよび／または金属性コロイドを含有する感熱性ポリマー、または請求項２５〜４４のいずれかに記載の方法で製造された粒子の使用であって、個々の場合において、交互する磁界、好ましくは高周波交互性磁界を用いる、前記使用。
【国際調査報告】
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