(57)【要約】本教示は、配列情報を評価し、推定されるヘテロ接合性インデル変異を特徴付けるための方法を開示する。変異分析方法３００、４００は、配列情報およびトレース情報５０４を利用して、対立遺伝子の相違により生じる混合塩基存在５１０を同定する。これらの混合塩基存在５１０を順方向および逆方向で両方向的に評価することで、これらの方法３００、４００は、一塩基多型、挿入、欠失、および他の変異事象を同定および解明するために適用され得る。
2005522223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的配列中の推定変異部位を同定する方法であって、該方法が、以下：
順方向配列情報および逆方向配列情報を含む、該標的配列についての配列情報を収集する工程；
第１の混合塩基シグネチャーに対しては該順方向配列情報を、第２の混合塩基シグネチャーに対しては該逆方向配列情報をスキャンする工程であって、該混合塩基シグネチャーは該標的配列の選択される局所に由来する、工程；および
該第１混合塩基シグネチャーと該第２混合塩基シグネチャーとの比較によって、該推定変異を同定する工程であって、混合塩基頻度の増大によって特徴付けられる転移領域が、推定変異部位に関連する、工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第１混合塩基シグネチャーおよび前記第２混合塩基シグネチャーが、高い頻度の混合塩基を有する混合塩基領域が後に続く、比較的低い頻度の混合塩基を有する純粋塩基領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１混合塩基シグネチャーの前記純粋塩基領域および前記混合塩基領域が、前記第２混合塩基シグネチャーの前記純粋塩基領域および前記混合塩基領域に対して、実質的に反対に配向する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各混合塩基シグネチャー中の転移領域が、実質的に前記第１混合塩基シグネチャーおよび前記第２混合塩基シグネチャーにおける前記純粋塩基領域と前記混合塩基領域との間の接合部に位置する少なくとも１つの塩基によって同定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、第１の混合塩基シグネチャーに対しては順方向配列情報を、第２の混合塩基シグネチャーに対しては逆方向配列情報をスキャンする工程が、以下：
パターン検出操作を実行して、前記順方向配列情報および前記逆方向配列情報中の混合塩基ストレッチを評価する工程；および
前記推定変異部位を、前記標的配列中の位置と関連付ける工程であって、前記順方向および前記逆方向の該混合塩基ストレッチが、実質的に反対に整列される、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項６】
前記パターン検出操作が、前記順方向配列情報および前記逆方向配列情報に対して、ガウス平滑化操作および重畳評価を実施する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記第１混合塩基シグネチャーまたは前記第２混合塩基シグネチャーによって支持される１つ以上のシフト仮説を同定するために、前記順方向配列情報および前記逆方向配列情報を使用する複数のインデル検索を実行することによって解明されるインデル変異の予測サイズに対応する複数のシフト仮説を形成することによって、前記推定変異部位に関連付けられる特徴的サイズを有するインデル変異を同定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項８】
前記シフト仮説の少なくとも１つが、前記推定変異部位に挿入された場合、前記第１混合塩基シグネチャーまたは前記第２混合塩基シグネチャーによって支持される配列シグネチャーを生じるように、選択されるサイズを有する推定挿入を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記推定挿入の選択されるサイズが、約１〜５０塩基対の長さである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記シフト仮説の少なくとも１つが、前記推定変異部位から欠失された場合、前記第１混合塩基シグネチャーまたは前記第２混合塩基シグネチャーによって支持される配列シグネチャーを生じるように、選択されるサイズを有する推定欠失を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記推定欠失の選択されるサイズが、約１〜５０塩基対の長さである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
各シフト仮説が、前記第１混合塩基シグネチャーまたは前記第２混合塩基シグネチャーによって示される支持の相対程度を示す値に関連する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記各シフト仮説に関連する値が、前記第１混合塩基シグネチャーまたは前記第２混合塩基シグネチャーとの相対適合度を表す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記各シフト仮説に関連する値が、前記シフト仮説を支持する前記混合塩基シグネチャー中のベースコールの値を増大させ、前記シフト仮説を支持しない前記混合塩基シグネチャー中のベースコールの値を減少させることにより決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記インデル変異が、最も大きい合計値を有する前記各シフト仮説に関連する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記インデル検索が、前記推定変異部位で始まり、前記推定変異部位の約２０〜１００塩基対下流まで実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記インデル検索が、前記推定変異部位で始まり、前記推定変異部位の約２０〜１００塩基対上流まで実行される、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記順方向配列情報に関連する前記第１混合塩基シグネチャーの組成および前記逆方向配列情報に関連する前記第２混合塩基シグネチャーの組成を評価することにより、前記インデル変異の配列を同定する工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記各混合塩基シグネチャー中の混合塩基を評価し、前記インデル変異を含む配列フラグメントと関連する配列情報と前記インデル変異を欠く配列フラグメントとの間の識別を行うことにより、前記インデル変異配列がさらに同定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記インデル変異配列の決定によって、対立遺伝子の区別を実行するための手段が提供される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対立遺伝子の区別を実行するための方法であって、該方法が、以下：
選択される標的配列遺伝子座についての配列情報を収集する工程；
混合塩基シグネチャーに対して該配列情報をスキャンすることによって、該選択される標的配列の遺伝子座中に位置する推定変異事象を同定する工程；および
該混合塩基シグネチャーによって支持される１つ以上のシフト仮説を同定するために、該配列情報を使用して複数のインデル検索を実行することによって解明された該推定変異事象の予測サイズに対応する、複数のシフト仮説を形成することによって該推定変異事象のサイズを同定する工程
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記混合塩基シグネチャーが、高い頻度の混合塩基を有する配列情報領域が後に続く、低い頻度の混合塩基を有する該配列情報領域を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記配列情報が、順方向配列情報および逆方向配列情報を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
混合塩基シグネチャーが、以下：
高い頻度の混合塩基が後に続く低い頻度の混合塩基を有する、前記順方向配列情報中の配列情報の第１領域；および
高い頻度の混合塩基が後に続く低い頻度の混合塩基を有する、前記逆方向配列情報中の配列情報の第２領域
をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１領域および前記第２領域が、標的配列遺伝子座に関して、互いに実質的に反対方向に整列される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記推定変異事象が、以下：
前記第１領域において、低い頻度の混合塩基と高い頻度の混合塩基との間で、第１転移点を同定する工程；
前記第２領域において、低い頻度の混合塩基と高い頻度の混合塩基との間で、第２転移点を同定する工程；
該第１転移点および該第２転移点を比較し、該第１転移点および該第２転移点に実質的に対応する、選択される標的遺伝座中の位置を同定する工程；ならびに
該推定変異事象を、該第１転移点および該第２転移点に実質的に対応する位置と関連付ける工程、
によってさらに同定される、方法。
【請求項２７】
混合塩基頻度を評価するパターン検出操作を実行することによって、前記第１転移点および前記第２転移点が同定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記パターン検出操作が、前記第１領域および前記第２領域に対して、ガウス平滑化操作および重畳評価を実施する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のシフト仮説の少なくとも１つが、推定挿入に対応する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数のシフト仮説の少なくとも１つが、推定欠失に対応する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数のインデル検索を解明する工程が、およそ前記推定変異事象の位置に隣接する第１混合塩基から始まるインデル検索を実行する工程であって、各シフト仮説について、前記シフト仮説のサイズとおよそ同等の間隔で配置される前記配列情報中に位置するベースコールが、評価され、シフト仮説の支持の相対的程度が決定される工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記シフト仮説の支持の相対的程度が、前記シフト仮説と前記混合塩基シグネチャーとの間の適合度に対応する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
各シフト仮説が、前記シフト仮説についての支持の相対的程度を示す値と関連する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記各シフト仮説と関連する値が、前記シフト仮説を支持する前記混合塩基シグネチャー中のベースコールの値を増大させ、前記シフト仮説を支持しない前記混合塩基シグネチャー中のベースコールの値を減少させることにより決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記推定変異事象が、最も大きな値を有する前記シフト仮説と相関する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
１つ以上の支持される前記シフト仮説に関連する混合塩基組成を評価することによって、前記各推定変異事象の配列を同定する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
変異分析のためのシステムであって、以下：
順方向配列情報および逆方向配列情報を含む標的配列についての配列情報を受容する、配列収集モジュール；
該配列情報をスキャンし、該順方向配列情報と関連する第１混合塩基シグネチャーおよび該逆方向配列情報と関連する第２混合塩基シグネチャーを同定する、スキャンモジュール；および
該第１混合塩基シグネチャーを該第２混合塩基シグネチャーに対して評価し、１つ以上の推定変異部位を同定するシグネチャー相関付けモジュール、
を備える、システム。
【請求項３８】
前記第１混合塩基シグネチャーおよび前記第２混合塩基シグネチャー中に存在する少なくとも１つの転移領域を同定することによって、前記シグネチャー相関付けモジュールが、１つ以上の推定変異部位を同定する、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記第１混合塩基シグネチャーおよび前記第２混合塩基シグネチャーが、高い頻度の混合塩基を有する混合塩基領域が後に続く、比較的少ない混合塩基を有する純粋塩基領域を含む、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４０】
前記第１混合塩基シグネチャーの前記純粋塩基領域および前記混合塩基領域が、前記第２混合塩基シグネチャーの前記純粋塩基領域および前記混合塩基領域に対して、反対に配向する、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記シグネチャー相関付けモジュールが、前記第１重複混合塩基シグネチャーおよび前記第２重複混合塩基シグネチャーについて、前記純粋塩基領域と前記混合塩基領域との間の転移領域中の１つ以上の推定変異部位を同定する、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
パターン検出操作を実行して、前記順方向および前記逆方向中の混合塩基ストレッチを評価することによって、前記スキャンモジュールが、前記混合シグネチャーを同定し、前記順方向および前記逆方向中の該混合塩基ストレッチが、実質的に反対に整列される転移領域において、前記シグネチャー相関付けモジュールが、前記推定変異を同定する、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４３】
前記第１混合塩基シグネチャーまたは前記第２混合塩基シグネチャーによって支持される１つ以上のシフト仮説を同定するために、前記順方向配列情報および前記逆方向配列情報を使用する複数のインデル検索を実行することによって解明されたインデル変異の予測サイズに対応する、複数のシフト仮説を形成することによって、前記シグネチャー相関付けモジュールが、前記推定変異部位の近位に位置する関連するサイズを有するインデル変異をさらに同定する、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４４】
前記シグネチャー相関付けモジュールによる前記１つ以上の推定変異部位の同定によって、前記配列情報内の対立遺伝子の相違を同定するための手段が提供される、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４５】
前記シグネチャー相関付けモジュールが、前記推定変異部位に関連する変異の種類を同定するための手段をさらに提供する、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４６】
前記変異の種類が、挿入、欠失、および置換からなる群から選択される、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４７】
変異分析のための方法であって、以下：
順方向配列情報および逆方向配列情報を含む、標的配列についての配列情報を収集する工程；
該配列情報をスキャンし、該順方向配列情報に関連する第１混合塩基シグネチャーおよび該逆方向配列情報に関連する第２混合塩基シグネチャーを同定する工程；および
該第１混合塩基シグネチャーを該第２混合塩基シグネチャーに対して評価し、１つ以上の推定変異部位を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
前記１つ以上の推定変異部位の同定が、前記第１混合塩基シグネチャーおよび前記第２混合塩基シグネチャー内に存在する少なくとも１つの転移領域を同定する工程を包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１混合塩基シグネチャーおよび前記第２混合塩基シグネチャーが、高い頻度の混合塩基を有する混合塩基領域が後に続く、比較的少ない混合塩基を有する純粋塩基領域を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１混合塩基シグネチャーの前記純粋塩基領域および前記混合塩基領域が、前記第２混合塩基シグネチャーの前記純粋塩基領域および前記混合塩基領域に対して、反対に配向する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１重複混合塩基シグネチャーおよび前記第２重複混合塩基シグネチャーについて、前記１つ以上の推定変異部位が、前記純粋塩基領域と前記混合塩基領域との間の転移領域中で同定される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
パターン検出操作を実行して、前記順方向および前記逆方向中の混合塩基ストレッチを評価することによって、前記混合シグネチャーが同定され、前記順方向および前記逆方向中の該混合塩基ストレッチが、実質的に反対に整列される転移領域において、前記シグネチャー相関付けモジュールが、前記推定変異部位を同定する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１混合塩基シグネチャーまたは前記第２混合塩基シグネチャーによって支持される１つ以上のシフト仮説を同定するために、前記順方向配列情報および前記逆方向配列情報を使用して複数のインデル検索を実行することによって解明されたインデル変異の予測サイズに対応する、複数のシフト仮説を形成することによって、関連するサイズを有するインデル変異が、前記推定変異部位の近位で同定される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
前記１つ以上の推定変異部位の同定によって、前記配列情報内の対立遺伝子の相違を同定するための手段が提供される、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本教示は、一般的に核酸分析に関し、種々の実施形態においては、ヘテロ接合性インデル（ｉｎｄｅｌ）変異を同定および検出するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
同種の生物間でゲノム配列上の相違を含む対立遺伝子バリエーションは、比較的高い頻度で生じることが見出されている。例えば、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と言われる対立遺伝子改変は、３００塩基対につき約１つは生じると推定されており、ヒトゲノムに置き換えると、推定される総数は１０００万よりも多い。対立遺伝子改変の頻度および分布を評価することは、疾患関連遺伝子座の同定において有用であり得、そして、種々の疾患（遺伝性血友病、嚢胞性繊維症、および癌が挙げられる）に対する遺伝的感受性を決定するための診断ツールとして作用し得る。対立遺伝子変異体を同定する既存の方法は、一般的に、大量のヌクレオチドフラグメントまたはヌクレオチド鎖の配列決定を必要とし、これは、有意な塩基の相違を同定するためにふるいわけされなければならない巨大な量のデータを生成する。従来のデータ分析アプローチを使用する場合、特定の配列改変の存在および本質の同定において、困難がしばしば発生する。例えば、２つの対立遺伝子間の相違は、１つ以上の塩基の挿入、欠失、または置換の結果であり得る。コンピューターベースの分析を介する自動化された様式での、これらの種類のバリエーション間の同定および区別は、正確性および信頼性について、さらに問題がある。この点について、改良された程度の信頼性および正確性で対立遺伝子改変を同定するための、ハイスループットの配列決定方法の使用に適応され得る、より強固な分析アプローチが必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
（要旨）
種々の実施形態において、本教示は、直接的な配列決定情報を使用して、ヘテロ接合性インデル変異を検出するための方法を記載する。標的配列内の混合塩基の数および分布を評価することによって、変異的挿入または変異的欠失の特徴（位置、サイズおよび組成が挙げられる）が、予測され得る。さらに、変異遺伝子座の順配列情報および逆配列情報の両方を評価することにより、変異的事象を実験的ノイズおよび他の全身性の改変から区別する能力が改良される。本明細書中に記載の方法は、対立遺伝子の区別および連鎖不均衡分析において、さらに使用され得る。
【０００４】
本教示によって記載される方法は、コンピューターベースの分析用途に容易に適応され得、多数の配列決定および／またはサンプルアセンブリソフトウェアプログラム（ＳｅｑＳｃａｐｅＴＭソフトウェア分析パッケージ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）が挙げられる）の任意のものに統合され得ることが考えられる。これらの方法を適用することによって、さらなる機能性が、直接的な配列決定情報を使用する配列分析（改変または変異の同定が挙げられる）の間に得られ得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１つの局面において、本発明は、標的配列内の推定変異部位を同定するための方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）順方向配列情報および逆方向配列情報を含む、標的配列についての配列情報を収集する工程；（ｂ）第１混合塩基シグネチャー（混合塩基シグネチャーは、選択される標的配列中の局所性に由来する）については、この順方向配列情報を、第２混合塩基シグネチャーについては、この逆方向配列情報をスキャンする工程；および（ｃ）この第１混合塩基シグネチャーと第２混合塩基シグネチャーを比較することによって、推定変異部位を同定する工程（混合塩基頻度の増大によって特徴付けられる転移領域は、推定変異部位と関連する）。
【０００６】
別の局面において、本発明は、対立遺伝子の区別を実行するための方法を含み、この方法は、以下の工程を含む：（ａ）選択される標的配列遺伝子座についての配列情報を収集する工程；（ｂ）混合塩基シグネチャーに対してこの配列情報をスキャンすることによって、この選択される標的配列遺伝子座内に位置する推定変異事象を同定する工程；（ｃ）およびこの混合塩基シグネチャーによって支持される１つ以上のシフト仮説を同定するために、この配列情報を使用して複数のインデル検索を実行することによって解明されたこの推定変異事象の予測サイズに対応する、複数のシフト仮説を形成することによってこの推定変異事象のサイズを同定する工程。
【０００７】
また別の局面において、本発明は、変異分析のためのシステムを含み、このシステムは、以下をさらに含む：順方向配列情報および逆方向配列情報を含む、標的配列情報を受容するための配列収集モジュール；この配列情報をスキャンし、この順方向配列情報と関連する第１混合塩基シグネチャーおよびこの逆方向配列情報と関連する第２混合塩基シグネチャーを同定するスキャンモジュール；およびこの第１混合塩基シグネチャーをこの第２混合塩基シグネチャーに対して評価し、１つ以上の推定変異部位を同定するシグネチャー相関付けモジュール。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、変異分析の方法を含み、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）順方向配列情報および逆方向配列情報を含む、標的配列情報を受容する工程；（ｂ）この配列情報をスキャンし、この順方向配列情報と関連する第１混合塩基シグネチャーおよびこの逆方向配列情報と関連する第２混合塩基シグネチャーを同定する工程；および（ｃ）この第１混合塩基シグネチャーをこの第２混合塩基シグネチャーに対して評価し、１つ以上の推定変異部位を同定する工程。
【０００９】
（特定の実施形態の説明）
ここで、図面が参照され得る。ここで、図面を通して、同じ番号は、同じ要素を言う。本明細書中で使用される場合、「標的」、「標的ポリヌクレオチド」、「標的配列」および「標的塩基配列」などは、多数の配列決定方法の内の任意のものに供され得、その組成（例えば、配列）が決定される、特定のポリヌクレオチド配列を言う。標的配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらのアナログ、またはそれらの組合せから構成され得る。標的は、さらに一本鎖または二本鎖であり得る。配列決定プロセスにおいて、配列決定プライマーとハイブリダイゼーション二本鎖を形成する標的ポリヌクレオチドは、「テンプレート」とも言われ得る。テンプレートは、相補的ポリヌクレオチドの合成のためのパターンとして作用する（Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、(１９９６)  ＣＰＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗｂｕｒｙ、ＵＫ)。標的配列は、任意の生存する生物またはかつて生存していた生物（原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルスが挙げられるが、これらに限定はされない）、ならびに合成標的配列および／または組換え標的配列に由来し得る。
【００１０】
さらに、本明細書中で使用される場合、「サンプルアセンブリ」および「アセンブリ」は、標的配列の少なくとも一部を含み得る個々の配列決定されたサンプルから生じる、より小さいヌクレオチド配列またはヌクレオチドフラグメントの再組立て分析またはコンセンサス分析を言う。これらのフラグメントから得られた情報を合わせることにより、標的配列の実験的に決定された組成を反映する「コンセンサス配列」が、同定され得る。
【００１１】
本教示に従う、核酸配列決定は、酵素的ジデオキシ鎖終結法を使用することで実行される。簡単に述べると、これらの方法は、目的の標的配列上の部位に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを利用する。４つの可能な塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン）のそれぞれについて、標的配列の少なくとも一部に相補的な標識されたフラグメントの混合集団が、プライマーの酵素的伸長によって精製される。次いで、各集団に含まれるフラグメントは、電気泳動方法（例えば、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動）を使用して、相対サイズによって分離され得、特徴的パターンまたは、トレースを生成する。各反応について生成されたトレース情報を伴うオリゴヌクレオチドプライマーの末端塩基組成の知識を使用することにより、標的配列を推測することが可能となる。配列決定の方法論のより詳細な記載については、読者は、ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｓａｎｇｅｒら、（１９７７）およびＡ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｐｒｏｂｅｒら（１９８７）を参照のこと。
【００１２】
上述の配列決定の方法論は、自動化されたルーチンに適応され得、標的配列またはサンプル配列の組成の迅速な同定が可能となる。例示的な自動化された適用において、標的配列に対応するポリヌクレオチドフラグメントは、蛍光染料で標識され、結合反応における４つの塩基のそれぞれが区別され、独立して解明される。１つの局面において、各染料の励起波長に調整されたレーザーが、選択される電気泳動解明／分離方法と共に使用され得、各塩基について区別可能なシグナルを生成し得る。次いで、検出器が、発光シグナル情報または強度シグナル情報を、サンプル配列の組成を表す配列決定トレースに変換し得る。次いで、その結果得られるデータが、コンピューターを使用する方法により後処理され得、サンプルの配列を決定する。従来の自動化配列決定システムのより詳細な記載については、読者は、ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｇｕｉｄｅ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）およびＳｅｑＳｃａｐｅＴＭ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ）を参考のこと。
【００１３】
比較配列決定操作を実行する場合、遺伝子またはヌクレオチド鎖の２つ以上の代替的形態（例えば、染色体遺伝子座の塩基の相違により生じる）に対応する２つ以上の対立遺伝子が、単一の配列決定の実行中に存在し得る。電気泳動図分析の間、特定の配列位置で異なる多数の対立遺伝子が、各対立遺伝子に対応する異なるシグナルの存在によって、同定され得る。１つの局面では、結果として得られるシグナルプロフィールは、混合塩基シグネチャーと言われ得る。
【００１４】
２つ以上の対立遺伝子が、特定のヌクレオチド位置に関して異なり、多型を生じる場合に、対立遺伝子改変の１つの例示的発生例が観察され得る。例えば、例示的な２０マー配列「ＧＧＡＣＴＣＡＴＣ（Ａ）ＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧ」は、第２のヌクレオチド配列「ＧＧＡＣＴＣＡＴＣ（Ｔ）ＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧ」に対して異なる、第１のヌクレオチド配列の一部を示し得る。対応する相違（第１の配列の「Ａ」から第２の配列の「Ｔ」への置換）は、配列決定操作の間の１つの種類の対立遺伝子の相違を例示する。配列間のこのような相違は、多型の位置で、電気泳動図または配列決定トレースにおいても、さらに観察され得、２つ以上の区別可能なシグナルが同じ塩基位置で観察される
対立遺伝子はまた、１つ以上の塩基の挿入または欠失によって、互いに異なり得る。例えば、多型的挿入は、第２の２５マーのヌクレオチド配列「ＧＧＡＣＴＣＡＴＣ（ＡＡＡＡＡ）ＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧ」に対して異なる第１のヌクレオチド配列の一部を示す例示的２０マー配列「ＧＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧ」によって特徴付けられ得る。一塩基多型のように、挿入または欠失に対応する対立遺伝子が、生物学的供給源に存在する場合、それらは、混合塩基シグネチャーの形態で、電気泳動図トレースにおいて観察可能であり得る。この種類の対立遺伝子の相違は、一般的にヘテロ接合性インデル変異（ＨＩＭ）と言われ得る。
【００１５】
本教示の文脈においては、ＨＩＭはさらに、２つ以上の対立遺伝子間の配列の相違をいい得る。さらに、ＨＩＭは、ヌクレオチド配列が、タンパク質またはアミノ酸配列に翻訳される場合にフレームシフトを引き起こし得る変異（例えば、翻訳されるコドン配列のシフトに対応する、３の倍数ではない挿入または欠失）を含み得る。ＨＩＭは、必ずしもフレームシフトを引き起こすわけではない変異（従って、翻訳されるコドン配列の対応するシフトを有さない、３の倍数の挿入または欠失を含む）をさらに含み得る。本教示はまた、得られた翻訳されたタンパク質またはアミノ酸配列に、変化を引き起こしても引き起こさなくてもよい、単一点変異（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））の場合に適用され得ることがさらに考えられる。
【００１６】
図１Ａは、上述の様式で配列決定に供され得るサンプルポリヌクレオチドについての、例示的な電気泳動トレースまたは配列決定トレースあるいはクロマトグラム１００の一部を示す。このトレースは、各塩基についての一連のピーク１１０に翻訳された蛍光情報を含み、各ピーク１１０は、４つのヌクレオチド塩基（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の１つについての検出されたシグナルまたは強度を表す。この情報は、時間の関数としてプロットされ得、この標的配列の組成は、クロマトグラム１００のピーク１１０の出現の順番を決定することにより、同定され得る。同様の位置領域にある他のピークに対する各ピークの強度を評価することにより、ベースコール（ｂａｓｅｃａｌｌ）１２０が作成され得、これにより、選択された位置に存在することが予測または計算される塩基が同定される。一般的に、クロマトグラム上の各塩基位置は、サンプル配列内のその位置の塩基に関連し得る単一の主なピークに対応する。例えば、「ＧＧＡＡＴＧＣＣ」に対応する塩基配列１２５が、トレース１００によって同定される。
【００１７】
任意の選択されたピーク位置についての配列分析の間、１つ以上の塩基に対応するシグナルが存在し得る。従って、選択されたピーク位置１３０について、Ｇシグナル成分１４０、Ａシグナル成分１４１、Ｔシグナル成分１４２、および／またはＣシグナル成分１４３に対応する複数のシグナル成分１４０〜１４３が、観察され得る。検出された各塩基成分の強度は、多くの因子に関連し、そしてノイズ、配列決定反応のバリエーション、および標的配列についての１つよりも多い対立遺伝子の存在を含み得る。１つの局面において、配列分析アプリケーションおよび／またはソフトウェアが、トレース情報を評価するため、および選択されたピーク位置についてあり得る塩基組成を決定するために使用され得る。１つの局面において、このようなアプリケーションおよび／またはソフトウェアはさらに、シグナル強度を評価するため、およびノイズと実験的変動と実際の塩基シグナルとの間を区別するために使用され得る。
【００１８】
図１Ｂは、選択されたピーク位置１３５（ここには、Ｇシグナル成分１６０およびＡシグナル成分１６１が存在する）について、２つ以上の同定可能なピークを有する例示的トレース１５０を示す。各シグナル成分１６０〜１６１の強度は、サンプル配列内のこの位置についての「真の」ベースコールが、すぐには明らかではないものであり得る。示す実施形態において、選択されたピーク位置１３５についてのベースコールは、「Ｇ」および／または「Ａ」のいずれかとして解釈され得る。さらなるデータがない場合、そのために、「Ｒ」の値が、選択されたピーク位置１３５に割り当てられ得、これは選択されたピーク位置１３５が、単一よりも多くの塩基によって占められていることを示す。上記の例に従って、選択されたピーク位置１３５における塩基の同一性が不確実であるか、または容易に単一の塩基が決定され得ない場合、１つ以上の構成塩基が同定され得、複合ベースコールまたは混合ベースコールを生成し、ここで、さらなる混合塩基命名法１６５が、種々の混合塩基組成間の区別をするために使用される。
【００１９】
図１Ｃにおいて、選択されたピーク位置１７２において候補混合塩基「Ｓ」を有する例示的クロマトグラム１７０が、２つのサンプル配列、「ＧＧＡＡＴＧＣＣ」および「ＧＧＡＡＴＣＣＣ」から生じ得る。この例において、同定された各ピーク成分１７０、１７５は、別個の塩基を示し得、その両方が、選択された位置においてサンプル中に存在し得る。上記のような混合塩基の存在は、２つ以上の別の配列を生じる、サンプル中の対立遺伝子改変および／または遺伝子のヘテロ接合性から生じ得ることが理解される。混合塩基の同定および分析に関連する方法論のより詳細な記載は、「Ａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｃａｌｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｐｅｒ−Ｂａｓｅ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｖａｌｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」と題された同一人に譲渡された米国特許出願第１０／２７９７４６中に見出され得る。
【００２０】
１つの局面において、本教示は、混合塩基評価アプローチを使用するトレース分析によって、ヘテロ接合性インデル変異を検出および解明するための手段を提供する。種々の実施形態において、ヌクレオチド配列内での１つ以上のインデル変異の発生は、変異事象の下流での複数の混合塩基の観察に関連し得る。本明細書中の以下でより詳細に記載するように、配列決定トレースにおける混合塩基の存在および分布の評価は、標的配列内のインデル変異の存在についての重要な知見を提供するために使用され得る。
【００２１】
図２は、２つの別の対立遺伝子を含むヌクレオチド配列についての例示的トレースデータ２００を示す。１つの局面において、配列決定サンプル中の複数の対立遺伝子の存在は、配列の少なくとも一部について異なるようである２つ以上のヌクレオチド配列を示し得る。トレースデータ２００は、上述の標識および増幅の方法論に従って配列決定され得るサンプルポリヌクレオチドについての、２つの配列決定トレースまたはクロマトグラム２１０、２２０を含む。
【００２２】
例示的データにおいて、順トレース２１０は、順方向でのヌクレオチドサンプルの配列決定によって得られる配列情報に対応し、逆トレース２２０は、逆方向でのヌクレオチドサンプルの配列決定によって得られる配列情報に対応する。各トレース２１０、２２０はさらに、選択されたピーク位置について予測または計算された塩基組成を示す複数のベースコール２３０に関連し得る。１つの局面において、各ベースコール２３０はさらに、特定のベースコール２３０に関連する正確性の相対レベルを評価するための手段を提供し得る、品質値または信頼因子に関連し得る。例示として示すと、いくつかの例において、同定されたベースコールは、大文字（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇなど）に関連し得、これは、コンセンサス塩基が、サンプル塩基とは異なり得ることを示す。この場合において、サンプル中のベースコールは、上書きされ得る。１つの局面において、この様式の塩基同定は、コンセンサス分析の前に作製された元々のベースコール中の相違から、コンセンサス塩基読取り方法によって作製されたベースコール中の相違を区別するために使用され得る。さらに、コンセンサスベースコール２５０は、選択されたピーク位置に関連する１つ以上のベースコールを評価することによって、生成され得る。従って、選択されたピーク位置２６０について、順トレース２１０および逆トレース２２０についての個々のベースコール２３０および関連する品質値２７０は、評価され得、対応するコンセンサスベースコール２６５およびコンセンサス品質値２７０を生成する。
【００２３】
本教示に従って、変異事象および対立遺伝子の相違が、混合塩基ストレッチについてのトレースを評価することによって同定され得る。さらに、サンプル配列の順方向と逆方向とを比較することにより、変異事象または配列の相違の位置および種類が同定され得る。例示として、サンプル配列の例示的配列決定データの順方向２１０を評価する場合、かなりの数のベースコールが、選択される各ピーク位置について単一の主なシグナルが、一般に存在するような高程度の信頼性（例えば、高い品質値）で作製され得る、第１純粋塩基領域２８０が存在し得ることが観察され得る。純粋塩基領域は２８０は、１つ以上のベースコールが、１つ以上の混合塩基シグナルの存在から生じる減少した程度のベースコール信頼性を有し得る、第２混合塩基領域２８２によって隣接され得る。同様に、逆方向２２０の評価において、第２純粋塩基領域２８４および第２混合塩基領域２８６が、順方向２１０において観察された領域の近位に、さらに同定され得る。特定の例において、順方向および逆方向中の純粋塩基領域および混合塩基領域の位置は、実質的に逆であるか、または、互いに鏡像であるようである。
【００２４】
上記の特徴と類似の特徴を有する配列決定トレースプロフィールに、従来の配列分析適用が直面した場合に、混合塩基領域におけるベースコーリング（ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ）の信頼性にしばしば有意な減少がある。これは、各鎖または各配向についてのベースコーリングに影響を与えるのみならず、その結果生じるコンセンサスベースコールにも影響を与える。特に、従来のコンセンサスベースコーリングは、混合塩基ストレッチに直面した場合、塩基読取りのエラー頻度の増大に感受性であり得る。しばしば、さらなる配列決定反応が、コンセンサスベースコールが生成される前に作製されるベースコール数を増大させるために実行されねばならない。さらなる配列決定データがある場合であっても、従来の方法は、一般的に、複数の対立遺伝子がサンプル集団中に存在する場合、混合塩基ストレッチの存在を認識および解明できない。
【００２５】
本教示の望ましい特徴は、高い頻度の混合塩基を有する配列決定トレース中の推定変異事象または複数の対立遺伝子の存在を認識することによる、塩基読取りの信頼性を改良する能力である。本明細書の以下でより詳細に記載されるように、増大した混合塩基頻度を有するこれらの領域の配列データの評価は、配列決定サンプル中に存在し得る複数の対立遺伝子の組成を解明するために有用であり得、これによって、配列決定操作の全体的効率を改良する。
【００２６】
変異分析の例として、上記の様式で、順方向のトレース２１０および逆方向のトレース２２０を評価することによって、共通点または共通領域２８８が同定され得る。ここで、混合塩基シグナルが、順方向の共通点２８８の右であり、かつ逆方向の共通点２８８の左の位置に現れる。共通点２８８は、変異事象または対立遺伝子の相違（例えば、サンプル中に２つ以上の別の配列または対立遺伝子を生じる、標的配列内の挿入または欠失）を示し得る。混合塩基プロフィールを生じる、同じサンプル中に含まれる２つ以上の配列間の塩基の相違は、一般的に、従来の配列決定アプローチが解明するには、問題が多い。しかし、本教示に記載される方法を適用することにより、これらの領域は、サンプル中に存在する各対立遺伝子の塩基組成を決定する上で、有用であり得る。
【００２７】
混合塩基ストレッチの順方向（または、逆方向）を観察することに加えて、対立遺伝子の区別およびこれらの領域内の変異事象についてのさらなる情報が、順方向２１０および逆方向２２０を、互いに協調して評価することで、得られ得る。本明細書中の以下でより詳細に記載するように、配列決定データ１００を本様式で評価することで、変異事象の長さ、およびその推定塩基組成の決定が容易になり得る。
【００２８】
混合塩基シグナル評価を使用することによる、変異分析および対立遺伝子の区別のための上記のアプローチの１つの望ましい特徴は、サンプルが配列決定されている場合、このアプローチが、既存のデータ集合に適用され得、そして実行するために、新しい配列決定反応もさらなる配列決定反応も必ずしも必要としないことである。このアプローチは、広範囲の配列決定サンプルの種類についてさらに使用され、例えば、ウイルス、細菌、ヒト、または他のサンプル集団の変異を同定し得る。１つの局面において、本明細書に記載する方法論は、ゲノム規模で実行され得る、ハイスループットな直接的配列決定プロジェクトへの適応に、特に適している。特定の生物のゲノム配列を推定するために使用される実質的に同じ配列決定データを使用する場合、推定の対立遺伝子の相違および変異事象を有する領域を同定する、さらなる有用な情報が、同定され得る。
【００２９】
これらの方法は、疾患状態と変異事象との間の既知の関連性に基づいて、対立遺伝子の相違を有する領域を同定するための診断的アッセイを設計する場合の使用に、さらに適応され得る。例えば、１つ以上のフレームシフト変異を含む疾患対立遺伝子の１つは、コネキシン２６（遺伝子ＧＪＢ２）の３５ｄｅｌＧ変異である。この変異は、散発性の非症候性難聴の１０〜３０％の原因であると考えられている（しかし、正確なパーセントは、集団特異的であり得る）（Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔ．、１７５、１９１−１９４（２００１）およびＨｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１０６、５０−５７（２０００））。この領域で観察され得るさらなる変異は、１６７ｄｅｌＴ変異である。本明細書中の以下でより詳細に記載するように、これらの疾患関連変異は、特定の混合塩基配列シグネチャーに関連し得る。このために、選択されたゲノム領域を配列決定する場合の上記の様式での混合塩基分析の実行は、特定の疾患のリスクを有する固体を同定すること、または疾患にかかっている個体を診断することにおいて、望ましく助けになり得る。
【００３０】
有意な生物学的表現型または疾患表現型と連結され得、本発明に従って、混合塩基シグネチャーの検出によって、さらに同定され得る、対立遺伝子の相違および変異事象のさらなる例はとしては、以下が挙げられる：（ａ）しばしば繰り返しストレッチ中（例えば、超可変領域ＩＩ中のＣ配列（Ｊ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ、４６、８６２−８７０（２００１））に生じるインデル変異から生じる、ｍｔＤＮＡ中の異形成；（ｂ）ＣＮＧＢ３に関連する変異事象から生じる全色盲の多型マーカー；（ｃ）リジンタンパク不耐症障害を生じるＳＬＣ７Ａ７の変異および（ｄ）タンジアー病を生じるＡＴＰ結合カセットトランスポーター１の変異。これらの例および他の例から、本教示に記載される変異事象の同定は、疾患マーカーの同定、感受性分析、および診断において重要な役割を果たし得ることが理解される。
【００３１】
図３および図４は、インデル変異が検出され得る方法論をさらに詳細に示す。これらのアプローチは、単一の事象変異（例えば、単一の挿入事象／欠失事象）および複数の事象変異（ここで、１つよりも多い変異が、分析される一般的遺伝子座に存在し得る）の両方の検出に適応され得ることが、理解される。種々の実施形態において、本教示の区別する特徴は、対立遺伝子の相違または変異的事象の存在を同定するためのみならず、その変異の種類または性質（例えば、挿入、欠失、および／または置換）ならびに、含まれる塩基のサイズおよび／または配列を同定するための能力でもある。当業者が理解するように、混合対立遺伝子の場合、挿入変異は、他の対立遺伝子に関しては、欠失として同定され得るし、その逆もあり得る。従って、欠失と比較して、挿入の定義は、互いに他方を排除しないで、利用可能な参照配列について、定義され得る。
【００３２】
本教示は、別の配列のトレースおよびベースコールを使用することによる、インデル変異の同定の主役を示しているが、トレースまたはベースコール配列がこのような様式で提示されることを必要とせず、替わりにベースコール（混合塩基および純粋塩基）および品質値情報を使用することで計算され得る、自動化された方法が開発され得ることが理解される。さらに、同定された変異のサイズおよび組成は変化し得、例示されるトレースに示される特性に必ずしも一致する必要はない。さらに、純粋塩基配列は、この領域内に多数の混合ベースコールを含み得、厳格に単一に同定可能な塩基を含む必要は必ずしもない。同様の様式で、混合塩基領域は、多数の非混合塩基を含み得、厳格に混合塩基を含む必要は必ずしもない。
【００３３】
図３Ａは、順方向および逆方向の評価アプローチを適用する、ヘテロ接合性インデル変異の検出のための方法３００を示す。この方法は、評価されるべき配列遺伝子座が同定されている、状態３１０で始まる。この配列遺伝子座は、サイズに関して制限されず、そのために、目的の短いヌクレオチド配列または単一の遺伝子を表し得る。あるいは、この配列遺伝子座は、非常に大きな規模（例えば、染色体規模または全ゲノム規模）であり得る。そのため、配列遺伝子座の同定により、所定の検索についての変異分析の範囲が規定され、十分な配列情報が、遺伝子座の境界間をまたいで利用可能かどうかを決定するための手段が提供される。自動化配列決定操作またはハイスループット配列決定操作の例において、配列遺伝座は、処理をされている現在のサンプルに基づいて、配列決定指示またはソフトウェアによって、自動的に同定され得る。
【００３４】
配列遺伝子座の同定に続いて、方法３００は、両方向の配列情報が配列遺伝子座について獲得され得る、状態３２０へ進行する。既に示したように、配列決定トレース、ベースコール情報、および／または品質値データを含み得る、順方向配列情報および逆方向配列情報の両方を収集することが、望ましいことであり得る。さらに両方向の配列情報が、配列遺伝子座に関して完全であることが望ましいことであり得る；しかし、本明細書中に記載される方法は、必要であるかまたは利用可能である場合、順方向および／または逆方向のいずれかの不完全な配列情報を利用するように、容易に適応され得る。
【００３５】
１つの局面において、変異分析に使用されるべき配列情報は、既存のデータベースまたは配列情報の集合体（例えば、公的データベースまたは私的データベース）に由来し得る。あるいは、配列情報は、適切な遺伝子座および配向中のサンプルの直接的な配列決定を通じて、実験的に生成され得る。さらに、実験的に得られた不完全な配列情報が、既存のデータベースまたは配列情報の集合由来の以前に保存されていた配列情報によって補足され得るし、その逆もあり得る。
【００３６】
一旦、両方向の配列情報が獲得されると、方法３００は、配列分析を実行し、閾値頻度の混合塩基を有する配列遺伝子座内の領域を同定する、状態３３０に進行する。１つの局面において、混合塩基頻度の検出は、配列遺伝子座の順方向および逆方向を評価し、混合塩基の数の任意の有意な増加を検出する工程を包含する。当業者に理解されるように、代表的な配列決定が行われている間、少なくともいくらかの程度の混合塩基の存在が、分析を受けている配列に分布することは、非一般的なことではない。実験バリエーションおよびアーチファクトから生じる混合塩基は、ランダムな頻度または散発的な頻度で発生し得、一般的に、配列中の長い配列にわたって、連続的に続かないかもしれない。しかし、特定の例において、混合塩基ストレッチが、配列遺伝子座の特定の方向中で生じ得、これは、変異事象の存在を示唆し得るが、実際は実験的異常または他の事象の結果である。
【００３７】
酵素スタッターは、望ましくは変異事象から区別される、このような実験的異常の例の１つである。この現象は、１つ以上の繰り返し塩基配列を含む配列テンプレートの増幅の間に、起こり得る。繰り返し配列の誤ったペア形成の結果として、１つ以上のヌクレオチドが、繰り返し領域から付加または欠失され得、変化可能な数およびサイズの繰り返しを含む混合集団が生成される。トレース分析の間、酵素スタッターは、変化可能な数の繰り返しを有する混合集団の存在に起因する変異事象に他のように類似し得る混合塩基ストレッチを生じ得る。
【００３８】
本教示の区別する特徴は、順配列情報および逆配列情報の両方を使用することによって、異常な混合塩基ストレッチまたは非変異的に関連する混合塩基ストレッチ（酵素スタッターの結果として生成されたものが挙げられる）が、順方向および逆方向の両方を試験することで区別され得ることである。従って、種々の実施形態において、本様式での両方向の評価は、散発性の混合塩基ストレッチまたは異常な混合塩基ストレッチは、一般的に、配列遺伝子座の両方向において、同様の様式でまたは類似の特徴を有しては、生じないかもしれない場合に、より正確に変異事象を評価するための手段を提供する。
【００３９】
図３Ｂに例として示すように、混合塩基ストレッチの両方向の評価が、パターン検出アプローチ３７０を使用して実行され得る。この方法は、順方向および逆方向の両方中の混合塩基の数の評価および位置決定を行う、状態３７５で始まる。その後、方法３７０は、マッチングフィルターを使用して、重畳評価が実行され、各配列方向についての重畳シグナルを生成する、状態３８０に進行し得る。その後、状態３８５において、このシグナルは、生成されたシグナルをフィルターするガウス工程機能を使用して、平滑化され得る。最終的に、状態３９０において、各配列方向についての混合塩基頻度が、検出され得る。ここで、平滑化シグナル中の最大ピークが同定される。種々の実施形態において、第１方向からの平滑化シグナルは、逆の方向から生じる他のシグナルと重畳され得、状態３９０の最大ピーク評価が、それから行われる。１つの局面において、上記の方法論に従う、混合塩基ストレッチの両方向の評価によって、望ましくは、配列遺伝子座内に存在する変異の自動化された検出および自動化された解明を、改良し得る。ガウス平滑化操作および重畳方法を適用する、他のシグナル処理アプローチの総説としては、読者は、（ＲＯ  Ｄｕｄａ、ＰＥ  Ｈａｒｔ、ＤＧ  Ｓｔｏｒｋ．Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ.Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．２００１）を参照すること。
【００４０】
配列遺伝子座中の混合塩基の数の同定および位置決定がされると、１つ以上の変異共通部分または変異領域２８８が、状態３４０において同定される。混合塩基の存在の増大する頻度に基づいて、共通部分２８８は、指標として作用し、そこでは、配列遺伝子座内に変異事象が生じ得る。例えば、図２において既に示したように、共通部分２８８は、順方向と逆方向中の混合塩基の存在を比較し、１つ以上の塩基が異なる対立遺伝子と関連し得る領域を同定することによって、同定される。
【００４１】
可能性のあるインデル変異の位置が、状態３４０で区別された後で、方法３００は、変異事象またはインデルのサイズが決定される、状態３５０に進行する。１つの局面において、この操作は、図４Ａ、４Ｂを参照して詳細に議論されるシフト仮説分析アプローチを使用して、実行される。簡単に記載すると、このシフト仮説アプローチは、選択された変異共通部分または変異領域２８８と関連する混合塩基ストレッチを評価し、異なる対立遺伝子中の１つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失により生じ得るインデルのサイズを予測する。この情報を使用することで、方法３００は、後の状態３６０において、この挿入または欠失の組成または配列を、さらに予測し得る。
【００４２】
一旦、上述の分析方法が実行されると、その後、予想されたヘテロ接合性インデル（ｉｎｄｅｌ）変異に関する関連情報が記憶され、ユーザに提示され得る。１つの局面において、この分析方法および相関関係は、改変体の同定のためのＳｅｑＳｃａｐｅＴＭソフトウェアアプリケーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のような既存の配列処理パッケージに容易に組み込まれ得る。さらに、予想された変異領域が、判断が容易なフォーマット（グラフ式表現フォーマットまたは変異の位置、サイズおよび／もしくは組成を列挙するテキストフォーマットを含む）でユーザに提示され得る。
【００４３】
図４Ａ、Ｂは、推定ヘテロ接合性インデル変異のサイズ決定のための例示的な方法４００を示す。１つの局面において、方法４００は、変異の推定位置の同定を伴って状態４１０で開始する。この情報は、代表的には、上記のように、順方向および逆方向の配向性分析を用いるトレース評価から同定され、混合塩基ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）が一般的に、順方向と逆方向の実質的に対向する配向で生じる位置を同定する。
【００４４】
付録Ａに示すＭＡＴＬＡＢ（登録商標）の説明書にコードされるコンピュータ関数によって例示されるように、変異の位置は、混合塩基頻度の実質的な増加についてサンプルアセンブリを走査することによって解明され得る。この関数の例示的な実行を、結果を合わせて図５にグラフ形式で示す。推定変異を有するサンプル配列を分析する場合、シグナル強度  対  塩基位置のプロットを用いて、サンプル配列中の各位置についてのシグナル強度の関数としてグラフ化される混合塩基頻度の増加を同定し得る。代表的には、このようなグラフは、１つ以上のピークを生じ、これは、混合塩基のストレッチが生じているサンプル配列内の領域を示す。この情報から、最大ピークに対応する最大シグナル強度は、変異事象の位置に関連し得る。図５に示す例示的な配列において、混合塩基頻度の強い増加が観察される、約３００塩基対の位置で生じる変異の挿入４５０が示される。
【００４５】
再び図４Ａを参照して、一旦、変異の推定位置が工程４１０で同定されると、方法は工程４２０に進み、ここで、複数のシフト仮説が形成される。各シフト仮説は、変異事象（変異が挿入であれ欠失であれ）の予想されたサイズに対応する。１つの局面において、シフト仮説の量は、約１〜５０ヌクレオチド以上のサイズ範囲に基づき得る。各シフト仮説は、さらに、投票総数に対応する値と相関し得、この値は、特定のシフト仮説が他のシフト仮説と比較して混合塩基プロフィールに適合するという可能性の定量化を示す。種々の実施形態において、各投票総数は、最初に０の値に設定され、その後、関連するシフト仮説のヌクレオチドの組成に基づいて選択された値によって増加され得るかまたは減少される。
【００４６】
状態４３０において、各シフト仮説は、シフト分解関数を適用することによって、増加または平行のいずれかに分解される。シフト分解を実施するためのＭＡＴＬＡＢの説明書にコードされる例示的なインストラクション関数を、付録Ｂに示す。この関数に従って、シフト分解は、シフト仮説中に含まれる第１の同定された混合塩基で開始する（図４Ｂ、状態４３２）。１つの局面において、関数は、選択された数のベースコール（ｂａｓｅｃａｌｌ）について増加して進み、本明細書中以下でより詳細に説明するように、投票合計を実行し得る。各シフト仮説内で検索されるベースコールの数は変動し得るが、約２０〜１００の間の選択された検索数は、上述のシフト分解関数とうまく組み合せて演算することが見出されている。
【００４７】
１つの局面において、シフト分解演算（図４Ｂ、状態４３４）は、順方向にて、配列に対する推定へテロ接合性インデル変異の位置に近接する第１の混合塩基の付近で開始する、インデルについての検索を含む。同じ様式で、推定変異位置に近接する第１の混合塩基の付近で開始するインデルについての検索は、逆方向（対向する方向）の配列について実行される。評価されるべき各シフト仮説「ｋ」について、ベースコール「ｋ」塩基が離れることが仮説を支持するかどうかを決定するためにチェックがなされる。１つの局面において、支持されたシフト仮説は、トレースの範囲内の選択された位置に存在する、予想されるシグナル強度または検出される塩基の例であり得る。選択された位置のベースコールが仮説を支持する場合、投票総数は、選択された値によって増加され得る。あるいは、ベースコールが仮説を支持しない場合、投票総数は、減少し得る。１つの局面において、支持されたベースコールは、１によって投票総数の増加を生じ、一方で、支持されていないベースコールは、２によって投票総数の減少を生じる。シフト仮説分析が完了すると、各シフト仮説についての投票総数が評価される（図４Ｂ、状態４３６）。１つの局面において、最多の投票を有する仮説が、インデルのサイズについての最良の近似として同定される。
【００４８】
図６は、サイズ決定関数の演算を示す。これは、順方向で、一塩基対挿入を有するサンプル配列についての例示的なトレース４８０に関する。サイズ決定関数のアプリケーションは、同定された変異開始位置４８５（三角で示す）の１塩基対右のピークで開始する。このピークは、混合塩基に対応し、この位置から、この関数は、支持される任意のシフト仮説を同定するために、右に走査する。トレースによって示されるように、変異開始位置４８５の右の１、３、４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５塩基対のシフト仮説についての支持が存在する。例示するトレースの枠の制限を越えて拡張される他のシフト仮説が可能であり得ることが、当業者に理解される。一般に、この場合において、この関数は変異開始位置４８５から遠く離れて、右に向ってより多くの塩基を拡張して進むので、可能なシフト仮説の迅速な縮小化が存在する。
【００４９】
シフト仮説がいかにしてアプローチ演算を支持するかをさらに例示するために、支持された仮説と支持されていない仮説との増加比較を用いる、トレース４８０に基づいた一連のサンプル分析を以下に記載する。トレースで同定された変異開始位置４８５に従って次の塩基から開始して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１４および１５のシフト仮説についての支持が存在する。同様に、その次の塩基から開始して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１のシフト仮説についての支持が存在する。同様に、次の塩基から開始して、１、３、４、５、６、７、８、９および１０のシフト仮説についての支持が存在する。各塩基位置についての同定されたシフト仮説に基づいて、得られた情報の比較は、インデル配列について計算されたサイズに到達するようになされ得る。走査されるシフト仮説の数および塩基の数は、１つの配列から次の配列へと変化し得、従って、上記の実施例において示される数およびサイズに限定されないことが理解される。
【００５０】
図７は、例示的なサンプル配列を用いる変異長同定関数のアプリケーションから得られた投票総数の結果を示す。互いに関する各シフト仮説についての投票総数を評価することによって、最大スコアを有するシフト仮説は、挿入または欠失の長さに相関し得る。図の場合、強いシグナル強度４９０が、予想された２塩基対の挿入長を支持する２塩基対シフト仮説に現れる。
【００５１】
図８〜１０は、開示された方法が標的配列内の変異事象を予測するために適用されている、例示的なトレースを示す。各標的配列について、順方向の配向５０２および逆方向の配向５０４を示す。各々のトレース５０２、５０４の中央に位置する指標５０６は、さらに、シフト仮説が形成される参照位置を示す。各実施例において２つのトレース５０２、５０４が示されているが、いずれかの配向からは廃校するさらなるトレースが、同定された変異の位置、サイズおよび組成の決定を補助して正確に分析され得ることが理解される。さらに、開示された方法は、互いに近接して存在する複数の変異を区別するのに用いられ、望ましくは、そうでなければ従来の方法で評価することが難しい、配列情報の領域を分解する、簡便な方法を提供し得る。
【００５２】
図８は、塩基配列「ＴＡ」を含む２塩基対欠失５１０を示す。上述のように、本明細書中で開示される変異同定のための方法は、シフト仮説スコア化に基づく変異事象の区別を補佐し得る。この例において、欠失は、変異事象の右側の混合塩基の頻度の付随する増加を伴って順方向の鎖で観察される。
【００５３】
図９は、塩基配列「Ｃ」を含む１塩基対挿入５１５を示す。この例において、この挿入は、変異事象の左側の混合塩基の頻度の付随する増加を伴って、逆方向の鎖で観察される。１つの局面において、この変異同定法は、参照配列に関して得られた変異事象情報を比較することによって、変異の型（例えば、挿入、欠失および／または置換）の間の区別を補佐し得る。参照配列は、さらに、予想された情報、実験的に決定された情報または変異事象が観察される領域についての既知の配列情報を含み得る。参照配列情報を、変異同定法によって同定された配列情報と比較することによって、変異の型、サイズ、配向および／または組成についての決定がなされ得る。
【００５４】
図１０は、塩基配列「ＡＡＧＡＡ」を含む５塩基対挿入５２０を示す。この例において、この挿入は、変異事象の右側の混合塩基の頻度の付随する増加を伴って順方向の鎖で観察される。同様に、変異事象の左側の混合塩基の頻度の付随する増加は、逆方向の鎖で観察される。
【００５５】
本発明の技術のさらなる局面は、選択された配列座に適用された変異分析方法の確実性を推定するためのアプローチを含み、これによって、変異の予測および評価の質および／または精度を向上させる。種々の実施形態において、この様式での確実性の推定は、観察されたシグナルがバックグラウンドノイズまたは変異事象に無関係の混合塩基の存在に関する可能性を推定する工程を包含する。この点に関して実行可能であることが見出されている１つのアプローチが、混合塩基頻度シグナルのノイズの内部モデリングを提供する。１つの局面において、ノイズは、許容可能なレベルの一般性を保持しつつ、ガウス分布に従ってモデル化され得る。この場合において、ガウスノイズモデリングは、以下の等式１によって示されるＺスコアと相関し得る：
等式１：（Ｓ−μ）／σ。
【００５６】
この等式において、Ｓは、欠失シグナルの最大値を示し、μは、ノイズ分布の平均を表し、σは、ノイズ分布の標準偏差を表す。この概念は、シフト仮説シグナルに適用され、ノイズの区別を補佐し得る。さらに、このアプローチは、報告された結果の有意性を確立するのに有用であり得る。可能性の推定値を決定することで提供される１つの利点は、この推定値が、データが再解釈および／または目視検査に従い得、以前になされた変異予測を確認することの、ユーザへの指標として作用し得ることである。さらに、可能性推定関数の適用は、ユーザの介入なしのハイスループットな分類を補佐し得る。
【００５７】
図１１は、上記の変異検出法の種々の相関関係を実行する変異分析についての例示的なシステム７００を示す。１つの局面において、変異分析のためのシステムは、互いに相互運用する複数のモジュール７１０、７１５、７２０を備え、配列情報の分離および評価に関するタスクを実行する。これらのモジュールが、本発明の範囲から逸脱することなく多数の異なる方法で構成され得ることが、当業者により理解される。例えば、モジュール７１０、７１５、７２０は、本発明の技術に従って変異分析を実行するのに用いられ得る単一の一元モジュール、アプリケーション、またはハードウェアデバイスに合わせられ得る。これらのモジュールはまた、他のモジュールおよび／またはアプリケーションと組み合せられ得、本発明のシステム７００によって生成されるデータおよび情報に基づいて、さらなる配列分析相関関係を提供する。
【００５８】
種々の実施形態において、配列回収モジュール７１０は、配列情報７１２を得るのに使用され、変異を同定する目的について評価され得る。この配列情報７１２は、多数の供給源から得られ得、例えば、以下を含み得る；１つ以上のデータベースまたは情報集積所に格納された、アーカイブした配列情報、実験的な配列情報および／または参照配列情報。さらに、配列情報７１２は、迅速またはハイスループットの分析演算において用いられる計測から直接得られ得る。上述のように、配列情報は、トレースおよび／または電気泳動図のデータを含み得、そして生の形態または処理された形態で回収され得る。さらに、配列回収モジュール７１０は、システム７００の他のモジュールに提示するためのデータを再フォーマットおよび処理するための相関関係を提供し得る。
【００５９】
データの獲得の後、走査モジュール７１５を用いて得られた配列情報を処理し得る。１つの局面において、走査モジュール７１５は、上記のように混合塩基サインについて配列情報を走査するための相関関係を含む。混合塩基サインの評価の間、方向または配向依存性の評価が実行され、配列情報の順方向の配向に関する第１の混合塩基サインを同定し得、同じ様式で、第２の混合塩基サインが配列情報の逆方向の配向において同定され得る。上述のように、同定された第１および第２の混合塩基サインは、互いに関して実質的に逆方向であり得、推定変異部位は第１の混合塩基サインと第２の混合塩基サインとの間のおおよそ重なる部分で同定され得る。
【００６０】
１つ以上の推定変異部位を同定するために、互いに関連する混合塩基サインを評価するための相関関係が、さらに、サイン相関モジュール７２０に含まれ得る。サイン相関モジュール７２０はまた、推定変異部位に存在する配列を特徴付けることに関する演算を実行し得る。１つの局面において、変異の特徴は、混合塩基サインおよび得られた配列情報を配列回収モジュール７１０によってインポートされ得る参照配列に対して比較することによって決定され得、変異のサイズ、組成、および他の特性についてのさらなる情報を提供し得る。
【００６１】
本明細書中に開示される方法に関して記載される他の関数局面が、変異分析のためのシステム７００に容易に組み込まれ得ることが当業者により理解される。このため、本明細書中に記載される様式で同様の配列分析相関関係を提供する種々のシステムが本発明の技術のこれ以外の実施形態であると考えられる。上記の技術は、変異分析および対立形質の微分が実行され得る新規の方法を提示する。種々の実施形態において、これらの方法の使用は、ハイスループット配列分析のために設計される自動化システムの精度を向上し得る。これらの方法が多数の配列決定アプリケーション（ヘテロ接合性欠失、単一ヌクレオチド多型分析ならびに全体の配列アセンブリおよび変異分析タスクが挙げられるがこれらに限定されない）を用いる使用に適用され得ることが考えられる。さらに、これらの方法は、新規および既存の配列処理アプリケーション、ソフトウェアおよび手段に容易に組み込まれ得る。
【００６２】
本発明の上記の実施形態が示され、記載され、上記の実施形態に適用されるような本発明の基本的な新規の特徴を示しているが、示されているデバイス、システムおよび／または方法の詳細の、種々の省略、置換および形態の変化が本発明の範囲から逸脱することなく当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明の範囲は、上述の説明に限定されないが、添付の特許請求の範囲によって規定されるべきである。
【００６３】
（付録Ａ）
【００６４】
【数１】
2005522223.tif 000003
【００６５】
（付録Ｂ）
【００６６】
【数２】
2005522223.tif 000004
【００６７】
【数３】
2005522223.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００６８】
本教示のこれらまたは他の局面、利点、および新規の特徴は、以下の詳細な説明を読むことおよび添付図面を参照することによって明らかとなる。図面において、同じ要素は、同じ参照番号を有する。
【図１】図１のＡ、Ｂ、Ｃは、混合塩基分析に関連する例示的配列トレースを示す。
【図２】図２は、多数の対立遺伝子を含むサンプルについての例示的配列トレースを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ヘテロ接合性インデル変異を検出するための方法を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、混合塩基ストレッチを両方向評価のための方法を示す。
【図４】図４Ａは、ヘテロ接合性インデル変異をサイズ決定するための方法を示す。図４Ｂは、ヘテロ接合性インデル変異のサイズ決定において使用され得る、シフト解明プロセスを示す。
【図５】図５は、ヘテロ接合性インデル変異を検出するための方法から得られた例示的結果のグラフ表示である。
【図６】図６は、変異サイズ決定プロセスから得られた例示的結果のトレース分析を示す。
【図７】図７は、第１のインデル変異のシフト解明のグラフ表示を示す。
【図８】図８は、第２のインデル変異のシフト解明のグラフ表示を示す。
【図９】図９は、第３のインデル変異のシフト解明のグラフ表示を示す。
【図１０】図１０は、第４のインデル変異のシフト解明のグラフ表示を示す。
【図１１】図１１は、変異分析を実行するためのシステムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月22日(2005.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005522223000001.app
【国際調査報告】
2005522223.tif 000018
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2005522223.tif 000020