(57)【要約】本発明は腫瘍学分野に属する。本発明は、ＣＤ４４遺伝子の変種エクソンｖ６によってコードされるエピトープに特異的な特徴的配列を有する抗体および前記抗体の誘導体に関する。本発明はまた、前記抗体タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明はさらに、前記抗体タンパク質を製造する方法に関する。本発明はまた、前記抗体タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、癌治療用医薬の製造における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子。
【請求項２】
前記重鎖可変領域が、配列番号１のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る抗体分子。
【請求項３】
配列番号２に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子。
【請求項４】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る抗体分子。
【請求項５】
配列番号３に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が、配列番号３のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る抗体分子。
【請求項７】
配列番号１に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖可変領域を含み、さらに配列番号２に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖可変領域またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１および３に記載の抗体分子。
【請求項８】
前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成り、さらに前記軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る、請求項２および４に記載の抗体分子。
【請求項９】
配列番号１に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖可変領域を含み、さらに配列番号３に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖可変領域またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１および５に記載の抗体分子。
【請求項１０】
前記重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成り、さらに前記軽鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る、請求項２および６に記載の抗体分子。
【請求項１１】
配列番号４に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子。
【請求項１２】
前記重鎖可変領域が配列番号４に示す核酸配列によってコードされる抗体分子。
【請求項１３】
配列番号５に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子。
【請求項１４】
前記軽鎖可変領域が配列番号５に示す核酸配列によってコードされる抗体分子。
【請求項１５】
配列番号６に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子。
【請求項１６】
前記軽鎖可変領域が配列番号６に示す核酸配列によってコードされる抗体分子。
【請求項１７】
配列番号４に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域を含み、さらに配列番号５に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１１および１３に記載の抗体分子。
【請求項１８】
前記重鎖可変領域が配列番号４に示す核酸配列によってコードされ、さらに前記軽鎖可変領域が配列番号５に示す核酸配列によってコードされる請求項１２および１４に記載の抗体分子。
【請求項１９】
配列番号４に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域を含み、さらに配列番号６に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１１および１５に記載の抗体分子。
【請求項２０】
前記重鎖可変領域が配列番号４に示す核酸配列によってコードされ、さらに前記軽鎖可変領域が配列番号６に示す核酸配列によってコードされる請求項１２および１６に記載の抗体分子。
【請求項２１】
前記可変軽鎖領域および前記可変重鎖領域の各々がヒト定常領域に別々に結合されることを特徴とする請求項１から２０のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項２２】
前記軽鎖のヒト定常領域がヒトカッパ定常領域である請求項２１の抗体分子。
【請求項２３】
前記重鎖のヒト定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である請求項２１または２２の抗体分子。
【請求項２４】
配列番号７に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖を含み、さらに配列番号８に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１から２３のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項２５】
前記重鎖が配列番号７のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成り、さらに前記軽鎖が配列番号８のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る、請求項１から２４のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項２６】
配列番号７に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖を含み、さらに配列番号９に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１から２５のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項２７】
前記重鎖が配列番号７のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成り、さらに前記軽鎖が配列番号９のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る、請求項１から２６のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項２８】
配列番号１０に示す核酸配列によってコードされる重鎖を含み、さらに配列番号１１に示す核酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１から２７のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項２９】
前記重鎖が配列番号１０の核酸配列によってコードされ、さらに前記軽鎖が配列番号１１の核酸配列によってコードされる請求項１から２８のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３０】
配列番号１０に示す核酸配列によってコードされる重鎖を含み、さらに配列番号１２に示す核酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１から２９のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３１】
前記重鎖が配列番号１０の核酸配列によってコードされ、さらに前記軽鎖が配列番号１２の核酸配列によってコードされる請求項１から３０のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３２】
配列番号１３に示す核酸配列によってコードされる重鎖を含み、さらに配列番号１４に示す核酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１から３１のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３３】
前記重鎖が配列番号１３の核酸配列によってコードされ、さらに前記軽鎖が配列番号１４の核酸配列によってコードされる請求項１から３２のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３４】
配列番号１３に示す核酸配列によってコードされる重鎖を含み、さらに配列番号１５に示す核酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１から３３のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３５】
前記重鎖が配列番号１３の核酸配列によってコードされ、さらに前記軽鎖が配列番号１５の核酸配列によってコードされる請求項１から３４のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３６】
配列番号１６に示す核酸配列によってコードされる重鎖および軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む、請求項１から３５のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３７】
前記重鎖および軽鎖が配列番号１６の核酸配列によってコードされる請求項１から３６のいずれかに記載の抗体分子。
【請求項３８】
前記抗体タンパク質が治療薬剤と結合される請求項１から３７のいずれかに記載の抗体タンパク質。
【請求項３９】
前記治療薬剤が、放射性同位元素、毒素、類毒素、炎症剤および化学療法剤から成る群から選択される治療薬剤である請求項３８の抗体タンパク質。
【請求項４０】
前記治療薬剤が、ＭＡＧ−３ＧＡＢＡ、ＭＡＧ−２ＧＡＢＡおよびＮ２Ｓ２の群から選択されるリンカーを介して前記抗体タンパク質と結合される請求項３９の抗体タンパク質。
【請求項４１】
前記治療薬剤がＭＡＧ−２ＧＡＢＡを介して前記抗体タンパク質と結合される請求項４０の抗体タンパク質。
【請求項４２】
前記放射性同位元素がβ線放出放射性同位元素である請求項３８から４１のいずれかに記載の抗体タンパク質。
【請求項４３】
前記放射性同位元素が186レニウム、188レニウム、131ヨウ素および90イットリウムから成る群から選択される請求項４２の抗体タンパク質。
【請求項４４】
前記放射性同位元素が186レニウムである請求項４３の抗体タンパク質。
【請求項４５】
前記抗体タンパク質が約０．５から約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５から約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約５ｍＣｉ／ｍｇ、極めて好ましくは２から６ｍＣｉ／ｍｇまたは１から３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する請求項３９から４４のいずれかに記載の抗体タンパク質。
【請求項４６】
前記抗体タンパク質が標識されていることを特徴とする請求項１から３７のいずれかに記載の抗体タンパク質。
【請求項４７】
前記標識が検出可能なマーカーである請求項４６の抗体タンパク質。
【請求項４８】
前記検出可能なマーカーが、酵素、染料、放射性同位元素、ジゴキシゲニンおよびビオチンから成る群から選択される検出可能マーカーである請求項４７の抗体タンパク質。
【請求項４９】
画像化剤と結合される請求項１から３７のいずれかに記載の抗体タンパク質。
【請求項５０】
前記画像化剤が放射性同位元素である請求項４９の抗体タンパク質。
【請求項５１】
前記放射性同位元素がγ線放出放射性同位元素である請求項５０の抗体タンパク質。
【請求項５２】
前記放射性同位元素が125Ｉである請求項５１の抗体タンパク質。
【請求項５３】
請求項１から４５のいずれかに記載の抗体タンパク質および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５４】
前記抗体タンパク質が請求項３９から４４のいずれかに記載の放射性同位元素と結合され、さらに約０．５から約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５から約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約５ｍＣｉ／ｍｇ、極めて好ましくは２から６ｍＣｉ／ｍｇまたは１から３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
患者に適用される医薬組成物中の前記放射能標識抗体の量が１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍＣｉ／ｍ2である請求項５３また５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
患者に適用される医薬組成物中の前記放射能標識抗体の量が５０ｍＣｉ／ｍ2である請求項５３また５４に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
アスコルビン酸、ゲンチシン酸、レダクチン酸、エリトロルビン酸、ｐ−アミノ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、ニコチンアミド、２−５−ジヒドロキシ１，４−ベンゼンジスルホン酸、ポビドン、イノシトールおよび／またはクエン酸塩の群から選択される１つまたは２つ以上の放射能保護物質をさらに含む請求項５３から５６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５８】
前記放射能保護物質がアスコルビン酸である請求項５３から５７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記抗体タンパク質が、ＭＡＧ−２ＧＡＢＡを介して１８６レニウムに結合されてある、請求項８、１０、１８、２０、２４、２５、２８、２９、３２、３３、３６、３７の抗体分子の群から選択される抗体分子を含み、前記医薬組成物がさらに放射能保護アスコルビン酸を含む請求項５３から５８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６０】
癌治療用医薬の製造における請求項１から４５のいずれかに記載の抗体タンパク質の使用。
【請求項６１】
前記癌が、大腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌および脳の転移性癌から成る群から選択される請求項６０に記載の抗体タンパク質の使用。
【請求項６２】
前記抗体タンパク質が請求項３９から４４のいずれかに記載の放射性同位元素に結合され、さらに約０．５から約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５から約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約５ｍＣｉ／ｍｇ、極めて好ましくは２から６ｍＣｉ／ｍｇまたは１から３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する、請求項６０または６１のいずれかに記載の抗体タンパク質の使用。
【請求項６３】
患者に適用される医薬組成物中の前記放射能標識抗体の量が１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍＣｉ／ｍ2である請求項６２に記載の抗体タンパク質の使用。
【請求項６４】
患者に適用される医薬組成物中の前記放射能標識抗体の量が５０ｍＣｉ／ｍ2である請求項６２に記載の抗体タンパク質の使用。
【請求項６５】
請求項１から４５のいずれかに記載の抗体タンパク質がそれを必要とする個体に１回から数回投与され、前記抗体タンパク質が選択的にＣＤ４４ｖ６に結合し、前記抗体タンパク質に結合された治療薬剤を介して腫瘍細胞を破壊し、さらに前記治療の成功がモニターされる癌の治療方法。
【請求項６６】
前記腫瘍が、大腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌および脳の転移性癌から成る癌群から選択される腫瘍である請求項６５の方法。
【請求項６７】
請求項１から３７のいずれかに記載の抗体タンパク質をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項６８】
請求項６７に記載の核酸を含むことを特徴とするリコンビナントＤＮＡベクター。
【請求項６９】
発現ベクターであることを特徴とする請求項６８に記載のリコンビナントＤＮＡベクター。
【請求項７０】
ベクターｐＡＤ−ＣＭＶまたはその機能的誘導体であることを特徴とする請求項６８または６９に記載のリコンビナントＤＮＡベクター。
【請求項７１】
ベクターＮ５ＫＧ１Ｖａｌまたはその誘導体であることを特徴とする請求項６８から７０のいずれかに記載のリコンビナントＤＮＡベクター。
【請求項７２】
請求項６８から７１のいずれかに記載のベクターを含むことを特徴とするホスト。
【請求項７３】
真核細胞であることを特徴とする請求項７２に記載のホスト。
【請求項７４】
哺乳類細胞であることを特徴とする請求項７２または７３に記載のホスト。
【請求項７５】
ＢＨＫ、ＣＨＯまたはＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項７２から７４のいずれかに記載のホスト。
【請求項７６】
バクテリオファージであることを特徴とする請求項７２に記載のホスト。
【請求項７７】
原核細胞であることを特徴とする請求項７２に記載のホスト。
【請求項７８】
以下の工程を含むことを特徴とする請求項１から３７のいずれかに記載の抗体タンパク質の製造方法：請求項７２から７７のいずれかに記載のホストを前記ホスト細胞によって前記抗体タンパク質が発現される条件下で培養し、前記抗体タンパク質を単離する。
【請求項７９】
前記ホストが哺乳類細胞、好ましくはＣＨＯまたはＣＯＳ細胞であることを特徴とする請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ホスト細胞が、軽鎖または重鎖発現ユニットを保有する２つのプラスミドで同時にトランスフェクトされることを特徴とする請求項７８または７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は腫瘍学分野に属する。本発明は、ＣＤ４４遺伝子の変種エクソンｖ６によってコードされるエピトープに特異的な特徴的配列を有する抗体および前記抗体の誘導体に関する。本発明はまた、前記抗体タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明はさらに、前記抗体タンパク質を製造する方法に関する。本発明はまた、前記抗体タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、癌治療用医薬の製造における使用に関する。
【０００２】
背景技術
表面糖タンパク質ＣＤ４４の変種の発現が、非転移性ラット線維肉腫細胞株と同様にラット膵臓非転移性腺癌細胞株のいわゆる偶発的転移の惹起のために必要にして十分であることが最近示された（Geunther et al., 1991）。最小のＣＤ４４アイソフォーム（標準型ＣＤ４４またはＣＤ４４ｓｔｄ）は種々の組織（上皮細胞を含む）で普遍的に発現されるが、一方、ある種のＣＤ４４スプライス変種（ＣＤ４４ｖ、ＣＤ４４ｖａｒ）は上皮細胞サブセットでのみ発現される。ＣＤ４４変種は、１０個のエクソン（ｖ１−ｖ１０）がＣＤ４４で完全に削られるが、異なる組合せのより大きな変種として出現できるようにまた別のスプライシングによって生成される（Screaton et al., 1992; Toelg et al., 1993; Hofmann et al., 1991）。前記変種は、そのタンパク質の細胞外部分の一定の部位に種々のアミノ酸配列が挿入されるという点で異なっている。そのような変種は、ヒトの腫瘍組織と同様に種々のヒト腫瘍細胞で検出される。したがって、大腸癌発生の過程におけるＣＤ４４変種の発現が最近調べられている（Heider et al., 1993a）。ＣＤ４４変種の発現は正常なヒト結腸上皮には認められず、陰窩の増殖細胞で微弱な発現が検出されるだけである。腫瘍形成後期には、例えば腺癌では全ての悪性物は変種ＣＤ４４を発現する。組織の変種ＣＤ４４の高レベル発現はまた急速進行性非ホジキンリンパ腫でも示された（Koopman et al., 1993）。
【０００３】
エクソンｖ６は特に転移による拡散過程で特別な役割を果たすようである（Rudy et al., 1993）。動物モデルでは、ｖ６特異的エピトープに対する抗体は転移細胞の定着および転移物の増殖を防ぐことができた（Seiter et al., 1993）。大腸癌では、ｖ６の発現は腫瘍の進行と相関する（Wielenga et al., 1993）。胃癌では、ｖ６の発現は、腸管型腫瘍と拡散型腫瘍とを区別する重要な診断マーカーである（Heider et al., 1993b）。後者の２つの文献では、ｖ６の発現はｖ６特異的エピトープに対する抗体を用いて決定された。
ＣＤ４４ｖ６はヒトの腫瘍および正常組織で発現促進パターンをもつ癌関連抗原であることが示されたので（Heider et al., 1995; Heider et al., 1996）、抗体利用診断および治療手段に供されてきた（Heider et al., 1996; WO95/33771; WO97/21104）。
【０００４】
非ヒト抗体をヒトに用いるときに生じる重大な問題は、それら抗体が抗非ヒト抗体反応を急速に引き起こし、前記反応によって前記非ヒト抗体の効能が患者で低下し、さらに継続投与を損なうということである。前記問題を克服するために、非ヒト抗体をヒト化するという考えが当技術分野で発達した。最初のアプローチでは、非ヒト抗体のヒト化の試みは、非ヒト／ヒトキメラ抗体の構築によって実施され、非ヒト可変領域がヒト定常領域と結合された（G.L. Boulianne, N. Hozumi and M.J. Shulman (1984) Production of Functional chimeric mouse/human antibody, Nature 312:643）。このようにして生成されたキメラ抗体は本来の非ヒト抗体の結合特異性および親和性を保持している。しかしながら、キメラ抗体は、マウス抗体よりもはるかに改善されているがやはり、ヒトで抗キメラ反応を誘発する（A.F. LoBuglio, R.H. Wheeler, J. Trang, A. Haynes, K. Rogers, E.B. Harvey, L. Sun, J. Ghrayeb and M.B. Khazaeli (1989) Mouse/human chimeric monoclonal antibody in mann: Kinetics and Immune response. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:4220）。前記アプローチは、非ヒト可変領域からその相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域へ移植し、続いてこれら“再形成したヒト”可変領域をヒトの定常領域に結合させて、非ヒト配列の量をさらに減少させることによって後に洗練された（L. Riechmann, M. Clark, H. Waldmann and G. Winter (1988) Reshaping human antibodies for therapy, Nature 332:323）。ＣＤＲ移植または再形成ヒト抗体は、マウス抗体に由来すると認識されるタンパク質配列をほとんどまたは全く含んでいない。ＣＤＲ移植によってヒト化された抗体は、天然のヒト抗体でさえ認めることができる何らかの免疫反応（例えば抗アロタイプまたは抗イディオタイプ反応）を誘発するが、ＣＤＲ移植抗体はマウス抗体よりも免疫原性が極めて低く、したがってより長期にわたる患者の治療が可能である。
【０００５】
しかしながら、ＣＤＲ移植だけでは十分な結合親和性を有する抗体が得られないということがまもなく明らかになった。ＣＤＲ移植抗体は、それらの親の非ヒト抗体と比較して相対的に貧弱な結合特性を有する。なぜならば、ＣＤＲ内のアミノ酸よりも多くのアミノ酸が抗原結合に必要とされるからである。結果として、結合親和性が低いＣＤＲ移植抗体が治療に有用であるとは考えられない。したがって、ＣＤＲ移植抗体の低い免疫原性と非ヒト親抗体の良好な結合特性が組み合わされた抗体を作製する試みが為された。ＣＤＲの移植に加えて、結合親和性を保持するためにげっ歯類ドナー由来の残基としてヒト化フレームワーク領域内に１つから数個のアミノ酸が維持される必要があるという考え方が発達した（Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:10029-10033）。
診断および治療でそのような抗体が示す高い潜在的有用性のために、ヒトの癌治療に適した改善された特性を有する抗体が希求される。本発明の主要な目的は、公知のＣＤ４４ｖ６特異的抗体と比較したときはるかに良好な特性を有する抗体を提供することである。
【０００６】
発明が解決しようとする課題
上記見出しの技術的な問題は、本発明の請求の範囲および発明の開示で特徴を明らかにされる実施態様によって解決される。前述した当技術の欠点は本発明の請求の範囲および発明の開示によって克服される。
上述の問題を解決するために、本発明は、ＢＩＷＡ８と称するＣＤ４４Ｖ６特異的ヒト化抗体をデザインし作製した。本抗体はＣＤＲ移植およびフレームワーク変異の両方を有し、高い親和性と低い免疫原性が組み合わされている。
しかしながら、本発明者らは、ＢＩＷＡ４と称するさらにいっそう優れた治療的有用性をもつ抗体を作製することができた。本抗体はＢＩＷＡ８と較べて結合親和性は低いが、驚くべきことにin vivoで投与されたとき極めて好ましい生体分布および腫瘍への取り込みを示す。
本発明は、腫瘍学の分野に属する。本発明は、ＣＤ４４遺伝子の変種エクソンｖ６によってコードされるエピトープに特異的である特徴的配列を有する抗体および前記抗体の誘導体に関する。本発明はまた、前記抗体タンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明はさらに、前記抗体タンパク質を製造する方法に関する。本発明はまた、前記抗体タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明はさらに、癌治療用医薬の製造における使用に関する。
【０００７】
発明を実施するための最良の形態
本発明を実施する前に注記しなければならないことは、本明細書および添付の請求の範囲で用いられるように、別に特に明示されないかぎり単数形は複数形を含むということである。したがって、例えば“１つの抗体”は複数のそのような抗体を含み、“細胞”とは１つまたは２つ以上の細胞、および当業者に公知の同等物を指す云々。別に特定しないかぎり、本明細書で用いられる全ての技術的および学術的用語は、本発明が属する分野の通常の技術を有する者のいずれもが普通に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似するかまたは同等ないずれの方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法、装置および材料はこれらから説明する。本明細書に記載した全ての刊行物は、細胞株、ベクターおよび、本発明に関連して使用することが可能な刊行物に記載された方法を説明する目的で参照により本明細書に含まれる。本明細書中のいずれの刊行物も、先行発明を理由として本発明がそのような発明に先行しないと認容するものと解釈されるべきではない。
【０００８】
本明細書で用いられるように、“抗体分子”または“抗体タンパク質”または“抗体”という用語は同等と考えられる。
“モノクローナル抗体の相補性決定領域”は、Chothia and Leskの論文（Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917）に関連してKabat（E.A. Kabat, T.T. Wu, H.M. Perry, K.S. Gottesman and C. Foeller (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th Ed.)  NIH publication No.91-3242. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.）のいう特異的な抗原結合に必要なアミノ酸配列であると考えられる。
本明細書で用いられるように、“フレームワーク改変”という用語は、個々の相補性決定領域の周辺に存在する可変領域内の１つまたは多数のアミノ酸の交換、欠失または付加を指す。フレームワーク改変は、抗体タンパク質の免疫原性、製造性、または結合特異性に強い影響を有するであろう。
本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖可変領域またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子を提供する。抗体ＢＩＷＡ４およびＢＩＷＡ８は両方とも、アミノ酸配列番号１の特徴を示す重鎖可変領域を含む。
【０００９】
本発明の“フラグメント”はより短い抗体分子、すなわち下記に開示されるものよりも短い核酸分子によってコードされるが、なおその結合活性を保持することを特徴とする任意のポリペプチドサブセットである。
本発明の抗体分子の“機能的変種”は、本発明の抗体分子と実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）、すなわち実質的に類似する基質特異性または基質の切断を有する抗体分子である。“機能的変種”にはまた“フラグメント”、“対立遺伝子変種”、“機能的変種”、“縮退核酸コードによる変種”または“化学的変種”が含まれる。そのような“機能的変種”は、例えば１つまたは数個の点変異、１つまたは数個の核酸の交換、欠失もしくは挿入、または１つまたは数個のアミノ酸の交換、欠失もしくは挿入を有することができる。前記機能的変種はなおその生物学的活性、例えば抗体結合活性を少なくとも部分的に保持し、場合によって前記生物学的活性は改善すらされてある。
本発明の抗体分子の機能的変種は、本発明の抗体分子と実質的に類似する生物学的活性（機能的または構造的のいずれか）、すなわち実質的に類似する標的分子結合活性を有する抗体分子である。“機能的変種”という用語にはまた“フラグメント”、“対立遺伝子変種”、“機能的変種”、“縮退核酸コードによる変種”または“化学的変種”が含まれる。
【００１０】
“対立遺伝子変種”は対立遺伝子の変種、例えばヒトの２つの対立遺伝子における相違による変種である。前記変種はなおその生物学的活性（例えば抗体の標的結合活性）を少なくとも部分的に保持し、場合によって前記生物学的活性は改善すらされてある。
“遺伝暗号の縮退による変種”は、ある種のアミノ酸はいくつかの異なるヌクレオチドトリプレットによってコードされるという事実による変種である。前記変種はなおその生物学的活性（例えば抗体結合活性）を少なくとも部分的に保持し、一方では前記生物学的活性は改善すらされてある。
“融合分子”は、例えばレポーター（例えば放射能標識）、化学的分子（例えば毒素または蛍光標識）または当分野で公知の他の分子と融合した本発明の抗体分子であろう。
本明細書で用いられるように、本発明の“化学的誘導体”は、化学的に改変されてあるか、または通常は当該分子の一部分ではない化学的な付加成分を含む本発明の抗体分子である。前記のような成分は、前記分子の活性、例えば標的破壊（例えば腫瘍細胞の死滅）を改善するか、または前記分子の可溶性、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。
ある分子は、別の分子ともし前記両分子が実質的に類似の構造または生物学的活性を有するならば“実質的に類似”する。したがって、２つの分子が類似の活性を有することを条件に、前記２つの分子は、たとえ前記分子の一方の構造が他方で見出されなくても、またはアミノ酸残基配列が同一でなくても、本明細書で用いられるように変種と考えられる。
【００１１】
本発明の抗体が使用される多くの場合、できるかぎり最小の抗原結合ユニット（すなわちＣＤ４４ｖ６結合ユニット）を有することが所望される。したがって別の好ましい実施態様では、本発明の抗体タンパク質はＦａｂフラグメント（Ｆａｂ＝Fragment antigen-binding）である。本発明のこれらＣＤ４４ｖ６特異的抗体タンパク質は両鎖の可変領域から成り、前記両鎖は近傍の定常領域によって１つにまとめられてある。これら抗体タンパク質は、通常の抗体から（例えばパパインによる）プロテアーゼ消化によって生成することができるが、同様なＦａｂフラグメントはまた場合によって遺伝子工学で生成することができる。別の好ましい実施態様では、本発明の抗体タンパク質はＦ（ａｂ’）2フラグメントであり、これはパパインによるタンパク質切断によって調製できる。
遺伝子工学的方法を用いて、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）領域のみから成る短縮抗体フラグメントを生成することができる。これらはＦｖフラグメントと称される（Ｆｖ＝Fragment vaiable＝fragment of the variable part（可変部分のフラグメント））。別の好ましい実施態様では、本発明のＣＤ４４ｖ６特異的抗体分子は前記のようなＦｖフラグメントである。これらＦｖフラグメントは定常鎖のシステインによる２つの鎖の共有結合を欠くので、前記Ｆｖフラグメントはしばしば安定化される。重鎖および軽鎖の可変領域を短いペプチドフラグメント（例えば１０から３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸を含む）により結合させることは利点を有する。このようにしてペプチドリンカーによって結合されたＶＨおよびＶＬから成るただ１つのペプチド鎖が得られる。この種類の抗体タンパク質は単鎖Ｆｖ（ｓａＦｖ）として知られている。従来技術で知られているこの種類のｓｃＦｖ抗体の例はHustonら（1998, PNAS 16:5879-5883）が記載している。したがって別の好ましい実施態様では、本発明のＣＤ４４ｖ６特異的抗体タンパク質は単鎖Ｆｖタンパク質（ｓｃＦｖ）である。
【００１２】
近年、マルチマー誘導体としてｓｃＦｖを調製する種々の方法が開発された。マルチマー誘導体の調製では、特に薬理動態および生体分布が改善されているだけでなく結合親和性が高められたリコンビナント抗体を得ることが意図されている。ｓｃＦｖのマルチマー化を達成するために、ｓｃＦｖはマルチマー化ドメインをもつ融合タンパク質として調製された。マルチマー化ドメインは、例えばＩｇＧのＣＨ３領域またはらせん状コイル構造（らせん構造）、例えばロイシンジッパードメインであろう。しかしながら、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域間の相互作用をマルチマー化（例えばジアボディ、トリアボディおよびペンタボディ）のために使用する方法もまた存在する。したがって、別の好ましい実施態様では、本発明の抗体タンパク質はＣＤ４４ｖ６特異的ジアボディ抗体フラグメントである。
当業者のジアボディとは二価ホモダイマーのｓｃＦｖ誘導体を指す（Hu et al., 1996, PNAS 16:5879-5883）。ｓｃＦｖ分子でリンカーを５−１０アミノ酸に短縮することによって、ＶＨ／ＶＬ鎖間重ね合わせを有するホモダイマーが生成される。ジアボディはジスルフィド架橋の取り込みによってさらに安定化させることができる。従来技術のジアボディ抗体タンパク質の例はPerisicら（1994, Structure 2:1217-1226）の論文で見出すことができる。
【００１３】
当業者のミニボディとは二価ホモダイマーのｓｃＦｖ誘導体を指す。前記は、ダイマー化領域として免疫グロブリン（好ましくはＩｇＧ、極めて好ましくはＩｇＧ１）のＣＨ３領域を含む融合体タンパク質から成る（前記ＣＨ３領域はヒンジ領域（例えばＩｇＧ１に由来する）およびリンカー領域を介してｓｃＦｖに連結される）。ヒンジ領域内のジスルフィド架橋は高等生物ではほとんどの場合形成されるが原核細胞では形成されない。別の好ましい実施態様では、本発明の抗体タンパク質はＣＤ４４ｖ６特異的ミニボディ抗体フラグメントである。従来技術のミニボディ抗体タンパク質の例はHuらの論文（1996, Cancer Res. 56:3055-61）で見出すことができる。
当業者のトリアボディは三価ホモトリマーのｓｃＦｖ誘導体を指す（Kortt et al., 1997, Protein Engineering 10:423-433）。リンカー配列無しにＶＨ−ＶＬが直接融合されているｓｃＦｖ誘導体によってトリマーが生成される。
当業者はまた二価、三価または四価構造を有し、ｓｃＦｖから誘導されるいわゆるミニ抗体について熟知しているであろう。マルチマー化はダイマー、トリマーまたはテトラマーのらせんコイル構造によって達成される（Pack et al., 1993, Biotechnology 11:1271-1277; Lovejoy et al., 1993, Science 259:1288-1293; Pack et al., 1995, J. Mol. Biol. 246:28-34）。したがって好ましい実施態様では、本発明の抗体タンパク質は、上記の抗体フラグメントをベースにしたＣＤ４４ｖ６特異的マルチマー化分子で、例えばトリアボディ、四価ミニ抗体またはペンタボディであろう。
【００１４】
より好ましい実施態様では、本発明は、重鎖の可変領域が配列番号１のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る抗体分子に関する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子に関する。本明細書で用いられる抗体ＢＩＷＡ４は、アミノ酸配列番号２で示される軽鎖可変領域を含む。
別のより好ましい実施態様では、本発明は、軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る抗体分子に関する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、配列番号３に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖可変領域またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子に関する。抗体ＢＩＷＡ８はアミノ酸配列番号３の特徴を示す軽鎖可変領域を含む。
別のより好ましい実施態様では、本発明は、軽鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る抗体分子に関する。
【００１５】
また別のより好ましい実施態様では、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖可変領域を含み、さらに配列番号２に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖可変領域またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子に関する。抗体ＢＩＷＡ４は、アミノ酸配列番号１の特徴を示す重鎖可変領域およびアミノ酸配列番号２に示す軽鎖可変領域を含む。
極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成り、さらに軽鎖可変領域が配列番号２のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る本発明の抗体分子に関する。
また別のより好ましい実施態様では、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖可変領域を含み、さらに配列番号３に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖可変領域またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子に関する。抗体ＢＩＷＡ８は、アミノ酸配列番号１の特徴を示す重鎖可変領域およびアミノ酸配列番号３に示す軽鎖可変領域を含む。
また別の極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号１のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成り、さらに軽鎖可変領域が配列番号３のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る本発明の抗体分子に関する。
【００１６】
別の好ましい実施態様では、本発明は、配列番号４に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子に関する。ＢＩＷＡ４およびＢＩＷＡ８の両抗体は、核酸配列番号４の特徴を示す重鎖可変領域を含む。
別のより好ましい実施態様では、本発明は重鎖可変領域が配列番号４に示す核酸配列によってコードされる抗体分子に関する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、配列番号５に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子に関する。本明細書で用いられる抗体ＢＩＷＡ４は、核酸配列番号５に示す軽鎖可変領域を含む。
別のより好ましい実施態様では、本発明は軽鎖可変領域が配列番号５に示す核酸配列によってコードされる抗体分子に関する。
別の好ましい実施態様では、本発明は、配列番号６に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む抗体分子に関する。抗体ＢＩＷＡ８は核酸配列番号６の特徴を示す軽鎖可変領域を含む。
【００１７】
別のより好ましい実施態様では、本発明は軽鎖可変領域が配列番号６に示す核酸配列によってコードされる抗体分子に関する。
別のより好ましい実施態様では、本発明は、配列番号４に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域を含み、さらに配列番号５に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子に関する。抗体ＢＩＷＡ４は、核酸配列番号４の特徴を示す重鎖可変領域および核酸配列番号５に示す軽鎖可変領域を含む。
また別の極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖可変領域が配列番号４に示す核酸配列によってコードされ、軽鎖可変領域が配列番号５に示す核酸配列によってコードされる本発明の抗体分子に関する。
別のより好ましい実施態様では、本発明は、配列番号４に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域を含み、さらに配列番号６に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子に関する。抗体ＢＩＷＡ８は、核酸配列番号４の特徴を示す重鎖可変領域および核酸配列番号６に示す軽鎖可変領域を含む。
【００１８】
ヒト化ＣＤ４４ｖ６特異的抗体タンパク質を生成するために、本開示核酸配列を当技術分野で公知の分子生物学的方法によって発現させた（以下および実施例を参照されたい）。
本発明の抗体タンパク質の可変領域は典型的には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域と連結される。ヒト定常領域のＤＮＡ配列は、種々のヒト細胞から（好ましくは不朽化Ｂ）周知の方法にしたがって単離できる（Kabat et al., 上掲書およびWO87/02671を参照されたい）。したがって本発明の抗体タンパク質は、それらがＣＤ４４ｖ６抗原との特異的結合を示すかぎり、定常領域の全てまたはほんの一部分を含むことができる。前記定常領域のタイプおよび範囲の選択は、エフェクターが補体の固定のように機能するのか、または抗体依存細胞毒性を所望するのかによって、さらに抗体タンパク質の所望される薬理学的特性にしたがって左右される。本発明の抗体タンパク質は、典型的には２つの軽鎖／重鎖対から成るテトラマーであるが、またダイマーであってもよく、すなわち１つの軽鎖／重鎖対から成る（例えばＦａｂまたはＦｖ）。
【００１９】
したがって、さらに別の実施態様では、本発明は、可変軽鎖領域および可変重鎖領域を有し、その各々がヒト定常領域と結合されていることを特徴とする本発明の抗体タンパク質に関する。特に、軽鎖可変領域はヒトのカッパ定常領域と結合し、重鎖可変領域はヒトガンマ−１定常領域と結合していた。軽鎖および重鎖をキメラ化させる他のヒト定常領域もまた当業者は利用することができよう。
ネズミ抗体の可変領域のヒト化は当技術分野で公知の方法を用いて実施できる。ＥＰ０２３９４００は、ネズミ可変領域のＣＤＲのヒト可変領域フレームワークへの移植を開示している。ＷＯ９０／０７８６１は、さらに別のフレームワーク改変を導入することによってＣＤＲ移植可変領域を再形成する方法を開示する。ＷＯ９２／１１０１８は、ドナーＣＤＲとアクセプターフレームワーク（ドナーフレームワークと高い相同性を有する）を結合させたヒト化Ｉｇを製造する方法を開示する。ＷＯ９２／０５２７４は、ネズミ抗体から出発するフレームワーク変異抗体の製造を開示している。ネズミモノクローナル抗体に関連するさらに別の先行技術の引用文献は、ＥＰ０３６８６８４；ＥＰ０４３８３１０；ＷＯ９２／０７０７５またはＷＯ９２／２２６５３である。
【００２０】
また別の好ましい実施態様では、本発明は、前記軽鎖可変領域および前記重鎖可変領域の各々が別々にヒト定常領域と結合していることを特徴とする本発明の抗体分子に関する。
また別のより好ましい実施態様では、本発明は、前記ヒト軽鎖定常領域がヒトのカッパ定常領域である本発明の抗体分子に関する。
別のより好ましい実施態様では、本発明は、前記ヒト重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域である本発明の抗体タンパク質に関する。
配列番号７のアミノ酸配列の特徴を有する重鎖および／または配列番号８のアミノ酸配列の特徴を有するか、または配列番号９のアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖を含む抗体もまた好ましい。
したがって、別の重要な実施態様は、配列番号７に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖および配列番号８に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子である。抗体ＢＩＷＡ４は、アミノ酸配列番号７の特徴を示す重鎖およびアミノ酸配列番号８に示す軽鎖可変領域を含む。
極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖が配列番号７のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成り、さらに軽鎖が配列番号８のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る本発明の抗体分子に関する。抗体ＢＩＷＡ４は、アミノ酸配列番号７（重鎖）およびアミノ酸配列番号８（軽鎖）に開示された配列から成る。ＢＩＷＡ４は、フレームワーク改変を含まないＣＤＲ移植抗体である。驚くべきことに、本抗体は、結合親和性が低いにもかかわらず、フレームワーク変異抗体ＢＩＷＡ８よりも優れた治療効果、良好な生体分布および腫瘍への取り込みを有する（実施例参照）。前記抗体は、上記で述べた抗体ＶＦＦ−１８（＝ＢＩＷＡ１）のヒト化型で、完全なヒトのフレームワーク内に存在するネズミモノクローナル抗体ＶＦＦ−１８の相補性決定領域およびヒト定常領域を有する。したがって前記はヒトで非常に低い免疫原性をもつ抗体であり、それは好ましい特質である。しかしながら前記抗体は、抗原結合を最適化するネズミのフレームワーク残基をもたないので、その親抗体ＶＦＦ−１８よりも極めて低い抗原結合親和性しかもたず、したがって治療薬として良好な候補物質とはみなされなかったであろう。予期に反して、ＢＩＷＡ４は、その貧弱な結合親和性にもかかわらず、非常に好ましい生体分布およびin vivoでの腫瘍への取り込みを示し、より高い結合親和性をもつ他のＶＦＦ−１８ヒト化型よりも優れたものになった。
【００２１】
別の重要な実施態様は、配列番号７に示すアミノ酸配列の特徴を有する重鎖を含み、さらに配列番号９に示すアミノ酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、糖化変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子である。抗体ＢＩＷＡ８は、アミノ酸配列番号７の特徴を示す重鎖およびアミノ酸配列番号９に示す軽鎖可変領域を含む。
極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖が配列番号７のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成り、さらに軽鎖が配列番号９のアミノ酸配列の特徴を有するアミノ酸から成る本発明の抗体分子に関する。抗体ＢＩＷＡ８は、アミノ酸配列番号７（重鎖）およびアミノ酸配列番号９（軽鎖）に開示された配列から成る。ＢＩＷＡ８はフレームワーク改変を含むＣＤＲ移植抗体である。前記抗体はＢＩＷＡ４よりも顕著に高い結合親和性を有する（実施例参照）。配列番号１０の核酸配列によってコードされる重鎖および／または配列番号１１の核酸配列の特徴を有するか、または配列番号１２の核酸配列の特徴を有する軽鎖を含む抗体もまた好ましい。前記配列は、ベクターｐＡＤ−ＣＭＶ１／ｐＡＤ−ＣＭＶ１９でクローニングされる非翻訳配列およびリーダー配列を含む。
【００２２】
したがって、別の重要な実施態様は、配列番号１０に示す核酸配列によってコードされる重鎖を含み、さらに配列番号１１に示す核酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子である。抗体ＢＩＷＡ４は、核酸配列番号１０によってコードされる重鎖および核酸配列番号１１によってコードされる軽鎖可変領域を含む。
極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖が配列番号１０の核酸配列によってコードされ、さらに軽鎖が配列番号１１の核酸配列によってコードされる本発明の抗体分子に関する。
別の重要な実施態様は、配列番号１０に示す核酸配列によってコードされる重鎖を含み、さらに配列番号１２に示す核酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子である。抗体ＢＩＷＡ８は、核酸配列番号１０によってコードされる重鎖および核酸配列番号１２によってコードされる軽鎖可変領域を含む。
極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖が配列番号１０の核酸配列によってコードされ、さらに軽鎖が配列番号１２の核酸配列によってコードされる本発明の抗体分子に関する。
配列番号１３の核酸配列によってコードされる重鎖および／または配列番号１４の核酸配列の特徴を有するか、または配列番号１５の核酸配列の特徴を有する軽鎖を含む抗体もまた好ましい。前記配列は、ベクターＮ５ＫＧ１ｖａｌでクローニングされるリーダー配列を含む。
【００２３】
したがって、別の重要な実施態様は、配列番号１３に示す核酸配列によってコードされる重鎖を含み、さらに配列番号１４に示す核酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子である。抗体ＢＩＷＡ４は、核酸配列番号１３によってコードされる重鎖および核酸配列番号１４によってコードされる軽鎖可変領域を含む。
極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖が配列番号１３の核酸配列によってコードされ、さらに軽鎖が配列番号１４の核酸配列によってコードされる本発明の抗体分子に関する。
別の重要な実施態様は、配列番号１３に示す核酸配列によってコードされる重鎖を含み、さらに配列番号１５に示す核酸配列の特徴を有する軽鎖またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子である。抗体ＢＩＷＡ８は、核酸配列番号１３によってコードされる重鎖および核酸配列番号１５によってコードされる軽鎖可変領域を含む。
極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖が配列番号１３の核酸配列によってコードされ、さらに軽鎖が配列番号１５の核酸配列によってコードされる本発明の抗体分子に関する。
極めて好ましいものは、配列番号１６の核酸配列によってコードされる重鎖および軽鎖を含む抗体タンパク質である。前記配列は、ベクターＮ５ＫＧ１ｖａｌでクローニングされるリーダー配列を含む。
したがって、別の極めて重要な実施態様は、配列番号１６に示す核酸配列によってコードされる重鎖および軽鎖、またはそのフラグメント、対立遺伝子変種、機能的変種、縮退核酸コードによる変種、融合分子もしくは化学的誘導体を含む本発明の抗体分子である。抗体ＢＩＷＡ４は、核酸配列番号１６によってコードされる重鎖および軽鎖を含む。
極めて好ましい実施態様では、本発明は、重鎖および軽鎖が配列番号１６の核酸配列によってコードされる本発明の抗体分子に関する。前記配列は完全な抗体ＢＩＷＡ４をコードする。
【００２４】
本発明の抗体タンパク質は、ＣＤ４４ｖ６抗原に治療薬剤を誘導する高度に特異的なツールを提供する。したがってさらに別の特徴では、本発明は、前記抗体タンパク質が治療薬剤と結合されてある本発明の抗体タンパク質に関する。当技術分野で公知の多くの治療薬剤のうちで、放射性同位元素、毒素、類毒素、炎症誘発剤、酵素、アンチセンス分子、ペプチド、サイトカインおよび化学療法剤から成る群から選択される治療薬剤が好ましい。放射性同位元素ではとりわけ、ガンマ線、ベータ線およびアルファ線放出放射性同位元素を治療薬剤として用いることができる。β線放出放射性同位元素が治療用放射性同位元素として好ましい。186レニウム、188レニウム、131ヨウ素および90イットリウムが、悪性腫瘍細胞の集中照射および破壊を達成するために特に有用なβ線放出同位元素であることが証明された。したがって、186レニウム、188レニウム、131ヨウ素および90イットリウムから成る群から選択される放射性同位元素が、本発明の抗体タンパク質に結合させる治療薬剤として特に好ましい。例えば、本発明の抗体を放射性ヨウ素化する場合、ＷＯ９３／０５８０４に開示された方法を用いることができる。
したがって、本発明のより好ましい特徴は、前記治療薬剤が放射性同位元素、毒素、プロドラッグおよび化学療法剤から成る群から選択される治療薬剤である本発明の抗体タンパク質である。
【００２５】
より好ましい本発明の特徴は、前記治療薬剤が以下の群から選択されるリンカーを介して抗体タンパク質に結合される本発明の抗体タンパク質である：ＭＡＧ−３（US5082930A; EP0247866B1（２ページ５５−５６行から３ページ１−２３行））；ＭＡＧ−２ＧＡＢＡ（US5681927A; EP0284071B1（６ページ９−２９行））；およびＮ２Ｓ２（＝フェンチオエート）（US4897255A; US5242679A; EP0188256B1（２ページ３８行から３ページ１８行））（これら全ての文献は参照により本明細書に含まれる）。
前記リンカーの式は以下のとおりである：
【００２６】
【化１】
2005504517.tif 000002
【００２７】
本発明のより好ましい特徴は、前記治療薬剤がＭＡＧ−２ＧＡＢＡを介して抗体タンパク質に結合される本発明の抗体タンパク質である。
本発明のより好ましい特徴は、前記放射性同位元素がβ線放出放射性同位元素である本発明の抗体タンパク質である。
本発明のより好ましい特徴は、前記放射性同位元素が、186レニウム、188レニウム、131ヨウ素および90イットリウムから成る群から選択される本発明の抗体タンパク質である。
本発明のより好ましい特徴は、前記放射性同位元素が186レニウムである本発明の抗体タンパク質である。
本発明のさらに好ましい特徴は、それらが標識されていることを特徴とする本発明の抗体タンパク質に関する。そのようなＣＤ４４ｖ６特異的標識抗体は、in vitroおよび／またはin vivoでのＣＤ４４ｖ６抗原の局在化および／または検出を可能にする。標識とは直接的または間接的に検出することが可能なマーカーと定義される。間接的マーカーは、単独では検出できないが、前記間接的マーカーに特異的なさらに別の直接検出可能マーカーを必要とするマーカーと定義される。本発明の実施に好ましい標識は検出可能なマーカーである。極めて多様なマーカーのうちで、酵素、染料、放射性同位元素、ジゴキシゲニンおよびビオチンから成る群から選択される検出可能マーカーがきわめて好ましい。
したがって、本発明のさらに好ましい特徴は、標識されていることを特徴とする本発明の抗体タンパク質である。より好ましいものは、前記標識が検出可能なマーカーである本発明の抗体タンパク質である。より好ましいものはまた、前記検出可能マーカーが、酵素、染料、放射性同位元素、ジゴキシゲニンおよびビオチンから成る群から選択される検出可能マーカーである本発明の抗体タンパク質である。
【００２８】
本発明のさらに別の特徴は、それらが画像化することができる薬剤と結合されていることを特徴とする本発明の抗体タンパク質に関する。多様な画像化可能薬剤、特に放射性同位元素を当技術状況で利用することができる。本発明を実施する場合、ガンマ線放出同位元素がより好ましい。極めて好ましいものは131ヨウ素である。
したがって本発明のより好ましい特徴は、画像化可能薬剤と結合された本発明の抗体タンパク質である。本発明のより好ましい特徴は、前記画像化可能な薬剤が放射性同位元素である本発明の抗体タンパク質である。本発明のより好ましい特徴は、前記放射性同位元素がγ線放出放射性同位元素である本発明の抗体タンパク質である。本発明のより好ましい特徴は、前記放射性同位元素が125Ｉである本発明の抗体タンパク質である。
したがって、本発明のより好ましい特徴は、上記で述べた放射性同位元素と結合されている抗体タンパク質であり、前記抗体タンパク質は約０．５から約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５から約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約５ｍＣｉ／ｍｇ、さらに極めて好ましくは２から６ｍＣｉ／ｍｇまたは１から３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施態様は、本発明の抗体および医薬的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物である。
医薬的に許容できる担体には、例えばＡＭＰＡグルタメートレセプター作動物質、拮抗物質または調節物質を安定化させるために、または前記の吸収を高めるために作用する生理学的に許容できる化合物を含むことができる。そのような生理学的に許容できる化合物には、例えば炭水化物（例えばグルコース、シュクロースまたはデキストラン）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸またはグルタチオン）、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定化剤もしくは賦形剤が含まれる（例えば以下もまた参照されたい：Remington's Pharmaceutical Science (1990), 18th ed. Mack Publ., Easton）。医薬的に許容できる担体（生理学的に許容できる化合物を含む）は、例えば前記組成物の投与経路に左右されることは当業者には理解されよう。
動物またはヒトの身体では、治療される疾患または問題のタイプおよび由来に応じて、上記のような医薬組成物を静脈内ルートまたは他のルートにより（例えば全身的または局所的に）問題の組織または器官に適用することが有利であることが判明した。例えば、全身的な自己免疫疾患、またはアレルギー、または外来器官もしくは組織の移植、または拡散性もしくは局在させることが困難な腫瘍の場合のように、種々の器官または器官系を治療する必要があるとき、全身的な作用態様が所望される。新形成作用または免疫学的作用が局所的にのみ出現しているときには、局所的な作用態様が考えられるであろう。
本発明の抗体タンパク質を含む医薬組成物は、当業者に公知の多様な適用ルートで、とりわけ静脈内注射または標的組織への直接注射によって適用することができる。全身的適用のためには、静脈内、脈管内、筋肉内、動脈内、腹腔内、経口または硬膜下腔内ルートが好ましい。より局所的な適用は皮下、経皮、心室内、肺葉内、脊髄内、肺内または治療されるべき組織（例えば結合組織、骨組織、筋肉組織、上皮組織）に直接またはその近くで実施することができる。所望の治療期間または治療効果に応じて、抗体組成物を１回もしくは数回または間歇的に、例えば数日間、数週間または数ヶ月間毎日、種々の用量で投与することができる。
【００３０】
上記に記載した適用で使用する抗体調製物を含む適切な医薬組成物を調製するために、当業者は公知の注射可能な生理学的に許容される滅菌溶液を用いることができる。非経口的な注射または輸液用の調製済み溶液を作製するために、等張水溶液、例えば食塩水または対応する血漿タンパク質溶液を容易に入手することができる。前記医薬組成物は凍結乾燥物または乾燥調製物として（例えばパーツ集合キットとして）得ることができる（前記は公知の注射用溶液を用いて使用直前に滅菌状態で再構成できる）。本発明の抗体組成物の最終的調製物は、生理的に許容できる滅菌溶液（公知の担体物質および／または添加物（例えば血清アルブミン、デキストロース、重亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ）を補充することができる）と本発明の精製抗体を混合することによって、注射、輸液または灌流のために調製される。
適用される抗体の量は疾患の性質に左右される。癌患者では、本発明の医薬組成物に含まれる“そのままの”（naked）抗体の適用用量は、適用１箇所につき０．１から１００ｍｇ／ｍ2、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍ2、好ましくは１０ｍｇ／ｍ2から約４０ｍｇ／ｍ2、好ましくは１０ｍｇ／ｍ2から約３０ｍｇ／ｍ2、また好ましくは２０ｍｇ／ｍ2から約３０ｍｇ／ｍ2、および極めて好ましくは約２５ｍｇ／ｍ2体表面積である。極めて好ましい抗体タンパク質の用量はまた約５０ｍｇ／ｍ2体表面積である。
【００３１】
各投与につき患者に適用される放射能腺量は有効であるために十分高くなければならないが、線量限界毒性（dose limiting toxicity, ＤＬＴ）より低くなければならない。例えば186レニウムによる放射能標識抗体を含む医薬組成物の場合、最大許容線量（ＭＴＤ）を決定しなければならない（治療設定で前記線量を超えてはならない）。続いて放射能標識抗体の癌患者への適用は、ＭＴＤより低い線量を（月単位でまたは週単位で）繰返し静脈内輸液することによって実施できる（Welt et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12:1193-1203）。多数回投与が好ましい（一般的には１週間間隔で）が、放射能標識物質はより長い間隔で、すなわち４−２４週間離して、好ましくは１２−２０週間離して投与されるべきである。しかしながら、当業者は、投与を２回または３回以上の適用に分割することを選択できる。前記の投与は各々の後すぐに、また予め定めたまた別の（例えば１日から１週間の範囲の）間隔で適用してもよい。さらにまた、適用される放射能線量は下記に概略するガイドラインに一致するであろう。一般的に、各投与あたりの放射能線量は３０から７５ｍＣｉ／ｍ2体表面積（ＢＳＡ）であろう。したがって、患者に適用されるべき本発明の医薬組成物中の放射能標識抗体の量は１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍＣｉ／ｍ2、好ましくは５０ｍＣｉ／ｍ2である（前記は好ましくは186レニウム、188レニウム、99mテクネチウム、131ヨウ素または90イットリウムで、極めて好ましくは186レニウムで標識されている）。好ましい実施態様では、本発明は、前記放射能標識抗体の線量がＭＴＤ、好ましくは５０ｍＣｉ／ｍ2である医薬組成物に関する。前記は実施例３から６で設定した臨床試験で重点的に実証される。
【００３２】
前記抗体タンパク質が約０．５から約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５から約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約５ｍＣｉ／ｍｇ、さらに極めて好ましくは２から６ｍＣｉ／ｍｇまたは１から３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する、上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質を含む本発明の医薬組成物もまた好ましい。
前記抗体または抗体誘導体が約７から約８のｐＨにある水溶液中で約０．５から約２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質を含む本発明の医薬組成物もまた好ましい。
好ましい実施態様は、アスコルビン酸、ゲンチシン酸、レダクチン酸、エリトロルビン酸、ｐ−アミノ安息香酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ニコチン酸、ニコチンアミド、２−５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジスルホン酸、ポビドン、イノシトールおよび／またはクエン酸塩の群から選択される１つまたは２つ以上の放射能保護物質をさらに含む本発明の医薬組成物である。
好ましいものは前記放射能保護物質がアスコルビン酸である本発明の医薬組成物である。
【００３３】
別の好ましい実施態様は、前記抗体タンパク質が、ＭＡＧ−２ＧＡＢＡを介して186レニウムと結合されてある、上記記載抗体分子ＢＩＷＡ４またはＢＩＷＡ８の群から選択される抗体分子を含み、さらに放射能保護物質のアスコルビン酸を含む本発明の医薬組成物である。
本発明の別の好ましい実施態様は、癌治療用医薬の製造における本発明の抗体タンパク質の使用である。好ましい実施態様では、本発明は、癌の治療を目的として上記に記載した治療薬剤と結合されてある本発明の抗体タンパク質の使用に関する。癌には悪性増殖を伴なう任意の疾患、例えば固形腫瘍、肉腫および白血病が含まれる。前記疾患についての必須条件はＣＤ４４ｖ６の発現である。
本発明の指す癌には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：
１）乳房、肺、結腸直腸、頭頸部、膵、卵巣、膀胱、胃、皮膚、子宮内膜、精巣、食道、前立腺および腎原発を含む上皮の癌；
２）骨および軟組織の肉腫：骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、平滑筋肉腫；
３）造血細胞性悪性疾患：ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病；
４）神経外胚葉性腫瘍：末梢神経腫瘍、星状細胞腫、メラノーマ；
５）中皮腫。
【００３４】
固形腫瘍を伴なう癌性症状の例には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：大腸癌、非小細胞性肺癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌および脳の転移性癌。
したがって好ましい実施態様は、前記癌が大腸癌、非小細胞性肺癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌および脳の転移性癌から成る群から選択される、本発明の抗体タンパク質の使用である。
また好ましいものは、各適用あたりの抗体タンパク質の量が０．１から１００ｍｇ／ｍ2、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍ2、好ましくは１０ｍｇ／ｍ2から約４０ｍｇ／ｍ2、好ましくは１０ｍｇ／ｍ2から約３０ｍｇ／ｍ2、また好ましくは２０ｍｇ／ｍ2から約３０ｍｇ／ｍ2、および極めて好ましくは約２５ｍｇ／ｍ2体表面積である、癌治療用医薬の製造における上記に示した本発明の抗体タンパク質の使用である。また好ましいものは、各投与あたりの放射能用量が３０から７５ｍＣｉ／ｍ2体表面積（ＢＳＡ）である、癌治療用医薬の製造における上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質の使用である。好ましいものは、本発明の抗体タンパク質が、186レニウム、188レニウム、99mテクネチウム、131ヨウ素または90イットリウムで放射能標識されてある、極めて好ましくは186レニウムで標識されてある、癌治療用医薬の製造における上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質の使用である。さらに別の好ましい態様では、本発明は、前記抗体用量が１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍＣｉ／ｍ2、極めて好ましくは５０ｍＣｉ／ｍ2である、癌治療用医薬の製造における上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質の使用に関する。前記は実施例３から６で設定した臨床試験で重点的に実証される。
【００３５】
さらにまた好ましいものは、前記抗体タンパク質が、約０．５から約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５から約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約５ｍＣｉ／ｍｇ、さらに極めて好ましくは２から６ｍＣｉ／ｍｇまたは１から３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する、癌治療用医薬の製造における上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質の使用である。
さらにまた好ましいものは、前記抗体または抗体誘導体が約７から約８のｐＨにある水溶液中で約０．５から約２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、癌治療用医薬の製造における上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質の使用である。
本発明はさらに、本発明の抗体タンパク質がその必要がある個体に１回から数回投与され、前記抗体タンパク質がＣＤ４４ｖ６と選択的に結合し、前記抗体タンパク質に結合された治療薬剤により腫瘍細胞を破壊し、さらに治療の成功がモニターされる癌の治療方法に関する。前記抗体タンパク質はそのまま／未改変の抗体タンパク質として存在していてもよいし、改変タンパク質として、例えば融合タンパク質または治療薬剤結合抗体タンパク質として存在してもよい。前記方法は腫瘍を有効量の前記抗体と接触させることを含む。上記に記載した腫瘍の治療方法はin vitroまたはin vivoで有効である。癌は上記に記載した全ての癌である。
【００３６】
適用される前記抗体の量は疾患の性質に左右される。癌患者では、“そのまま”の抗体の適用用量は、各適用あたり０．１から１００ｍｇ／ｍ2、好ましくは５から５０ｍｇ／ｍ2、好ましくは１０ｍｇ／ｍ2から約４０ｍｇ／ｍ2、好ましくは１０ｍｇ／ｍ2から約３０ｍｇ／ｍ2、また好ましくは２０ｍｇ／ｍ2から約３０ｍｇ／ｍ2、および極めて好ましくは約２５ｍｇ／ｍ2体表面積である。約５０ｍｇ／ｍ2体表面積の抗体タンパク質用量もまたきわめて好ましい。
各投与につき患者に適用される放射能線量は有効であるために十分高くなければならないが、線量限界毒性（ＤＬＴ）より低くなければならない。例えば186レニウムで放射能標識された抗体のために最大許容線量（ＭＴＤ）を決定しなければならない（治療の設定では前記線量を超えてはならない）。続いて放射能標識抗体の癌患者への適用は、ＭＴＤより低い線量を（月単位でまたは週単位で）繰返し静脈内輸液することによって実施できる（例えば以下を参照されたい：Welt et al., 1994, J. Clin. Oncol. 12:1193-1203）。多数回投与が好ましいが（一般的には１週間間隔）、放射能標識物質はより長い間隔で、すなわち４−２４週間離して、好ましくは１２−２０週間離して投与されるべきである。しかしながら、当業者は、投与を２回または３回以上の適用に分割することを選択できる。前記の投与は各々の後すぐに、また予め定めたまた別の（例えば１日から１週間の範囲の）間隔で適用してもよい。
さらにまた、適用される放射能線量は下記に概略するガイドラインと一致するであろう。一般的に、各投与あたりの放射能線量は３０から７５ｍＣｉ／ｍ2体表面積（ＢＳＡ）であろう。したがって、患者に適用されるべき放射能標識抗体の量は１０、２０、３０、４０、５０または６０ｍＣｉ／ｍ2、好ましくは５０ｍＣｉ／ｍ2である（前記抗体は好ましくは186レニウム、188レニウム、99mテクネチウム、131ヨウ素または90イットリウムで、極めて好ましくは186レニウムで標識される）。好ましい実施態様では、本発明は、上記に記載した放射能標識抗体が癌を罹患する患者に投与され、前記放射能標識抗体の用量がＭＴＤ、好ましくは５０ｍＣｉ／ｍ2であり、それによって前記癌が予防または治療される治療方法に関する。前記は実施例３から６で設定される臨床試験で重点的に実証される。
また好ましいものは、上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質が、約０．５から約１５ｍＣｉ／ｍｇ、または約０．５から約１４ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約１０ｍＣｉ／ｍｇ、好ましくは約１から約５ｍＣｉ／ｍｇ、さらに極めて好ましくは２から６ｍＣｉ／ｍｇまたは１から３ｍＣｉ／ｍｇの比活性を有する、本発明の癌治療方法である。
さらにまた好ましいものは、上記に示した本発明の放射性同位元素結合抗体タンパク質が約７から約８のｐＨにある水溶液中で約０．５から約２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する本発明の癌治療方法（上記参照）である。
好ましくは、本発明は、前記腫瘍が大腸癌、非小細胞性肺癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌および脳の転移性癌から成る癌群から選択される本発明の方法に関する。
【００３７】
本発明のさらに別の特徴は、本発明の抗体タンパク質をコードすることを特徴とする核酸である。前記核酸はＲＮＡでもよいが、好ましくはＤＮＡである。前記ＤＮＡ分子は化学的に合成してもよい。最初に、適切なオリゴヌクレオチドを当技術分野で公知の方法により合成し（例えば、M.J. Gait, Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK）、前記オリゴヌクレオチドを用いて合成遺伝子を製造することができる。合成遺伝子を作製する方法は当技術分野で公知である（例えば、Stemmer et al. 1995, Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides, Gene 164(1):49-53; Ye et al. 1992, Gene synthesis and expression in E. coli for pump, a human matrix metalloproteinsse, Biochem Biophys Res Commun 186(1):143-9; Hayden and Mandecki 1988, Gene synthesis by serial cloning of oligonucleotides, DNA 7(8):571-7）。これらの方法を用いて、本出願に開示した任意のＤＮＡ分子、例えばＢＩＷＡ４をコードするＤＮＡを合成することができる。
好ましくはまた、本発明の核酸は５’もしくは３’非翻訳領域または５’および３’非翻訳領域を含むことを特徴とする。本発明の核酸は、上流および／または下流の他の非翻訳領域を含んでいてもよい。前記非翻訳領域は調節エレメント、例えば転写開始ユニット（プロモーター）またはエンハンサーを含むことができる。前記プロモーターは、例えば構成的プロモーターでも、誘発性プロモーターでも、または発育によって制御されるプロモーターであってもよい。好ましくは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫（ＲＳＶ）の構成的プロモーターが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）および単純ヘルペスプロモーターと同様好ましいが、他の公知のプロモーターも排除されない。本発明の誘発性プロモーターは、抗生物質耐性プロモーター、熱ショックプロモーター、ホルモン誘発性“乳癌ウイルスプロモーター”およびメタロチオネインプロモーターを含む。好ましくはまた、本発明の核酸は本発明の抗体タンパク質のフラグメントをコードすることを特徴とする。フラグメントとは本発明のポリペプチドの一部分を指す。
【００３８】
好ましくは、本発明の核酸は、配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５および／または１６に開示した核酸である。きわめて好ましくは、前記核酸は配列番号１６の核酸である。
本発明のまた別の重要な特徴は、本発明の核酸を含むことを特徴とするリコンビナントＤＮＡベクターである。好ましくは、前記ベクターは、配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５および／または１６の特徴を有する核酸を含む。きわめて好ましくは、前記ベクターは配列番号１６の特徴を有する核酸を含む。
前記の例はウイルスベクター、例えばワクシニア、セムリキ森林ウイルスおよびアデノウイルスである。
ＣＯＳ細胞で使用されるベクターはＳＶ４０複製起点を有し、高コピー数プラスミドの達成を可能にする。昆虫細胞で使用されるベクターは、例えば大腸菌（E. coli）トランスファーベクターであり、例えばプロモーターとしてポリヘドリンをコードするＤＮＡを含んでいる。
本発明の別の好ましい特徴は、発現ベクターであることを特徴とする本発明のリコンビナントＤＮＡベクターである。
本発明の別の好ましい特徴は、ｐＡＤ−ＣＭＶまたはその機能的誘導体であることを特徴とする本発明のリコンビナントＤＮＡベクターである。前記の誘導体は例えばｐＡＤ−ＣＭＶ１、ｐＡＤ−ＣＭＶ１９またはｐＡＤ−ＣＭＶ２５である。
本発明の別の好ましい特徴は、配列番号１７またはその機能的誘導体であることを特徴とする本発明のリコンビナントＤＮＡベクターである。
本発明の別の好ましい特徴は、配列番号１８またはその機能的誘導体であることを特徴とする本発明のリコンビナントＤＮＡベクターである。
【００３９】
好ましくはまた、前記ベクターは、１つまたは数個の、配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５および／または１６の特徴を有する核酸分子を含む。
また好ましいものは、本発明のヌクレオチド配列を含むＵＳ５６４８２６７ＡまたはＵＳ５７３３７７９Ａで開示されたベクターである。好ましくはまた、前記ベクターは、１つまたは数個の、配列番号４、５、６、１０、１１、１２、１３、１４、１５および／または１６の特徴を有する核酸分子を含む。本発明の別の好ましい特徴は、ベクターＮ５ＫＧ１Ｖａｌまたはその誘導体であることを特徴とする本発明のリコンビナントＤＮＡベクターである。
また別の重要な特徴は、本発明のベクターを含むことを特徴とするホストである。
また別の重要な特徴は、真核ホスト細胞であることを特徴とする本発明のホストである。本発明の真核ホスト細胞には、真菌（例えばピキア＝パストリス（Pichia pastoris）ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミケス（Schizosaccharomyces）、トリコデルマ（Trichoderma））、昆虫細胞（例えばスポドプテラ＝フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）Ｓｆ−９由来のもの、バキュロウイルス発現系を含むもの）、植物細胞（例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）由来のもの）、哺乳類細胞（例えばＣＯＳ細胞、ＢＨＫ、ＣＨＯまたはミエローマ細胞）が含まれる。ヒトの身体で抗体タンパク質を産生する免疫系細胞から派生した細胞では、本発明の抗体タンパク質は特に良好に折り畳まれ、糖化される。哺乳類のホスト細胞、好ましくはＣＨＯまたはＣＯＳ細胞、例えばＣＨＯＤＧ４４（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77(7):4216-20(1980)）、またはＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL-61）細胞が好ましい。したがって、別の好ましい特徴は、ＢＨＫ、ＣＨＯまたはＣＯＳ細胞、きわめて好ましくはＣＨＯＤＧ４４またはＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL-61）細胞であることを特徴とする本発明のホストである。
別の好ましい特徴は、バクテリオファージであることを特徴とする本発明のホストである。
別の好ましい特徴は、原核ホスト細胞であることを特徴とする本発明のホストである。原核ホスト細胞の例は大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトマイセス（Streptomyces）またはプロテウス＝ミラビリス（Proteus mirabilis）である。
【００４０】
本発明はさらに、以下の工程を含むことを特徴とする本発明の抗体タンパク質の製造方法に関する：本発明のホストを前記抗体タンパク質が前記ホスト細胞によって発現される条件下で培養し、さらに前記抗体タンパク質を単離する。本発明の抗体は以下のように製造することができる。軽鎖および重鎖をコードする核酸分子を標準的な方法で化学的および酵素的に合成することができる。最初に、適切なオリゴヌクレオチドは当技術分野で公知の方法を用いて合成できる（詳細は上記）。オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を作製する方法は当技術分野で公知である（詳細は上記）。抗体の重鎖および軽鎖をコードするこれら核酸分子を発現ベクターで（両鎖を１つのベクター分子で、または各鎖を別個のベクター分子で）クローニングし、続いて前記ベクターをホスト細胞に導入する。好ましくは、前記ホスト細胞は、哺乳類ホスト細胞（詳細は上記）、例えばＣＯＳ、ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。続いて前記ホスト細胞を前記抗体が産生される条件下で適切な培養液中で培養し、さらに前記抗体を標準的な方法にしたがって培養から単離する。リコンビナントＤＮＡからホスト細胞で抗体を製造する方法および対応する発現ベクターは当分野では周知である（例えば以下を参照されたい：WO94/11523; WO97/9351; EP0481790）。
本発明は好ましくは、前記ホストが哺乳類細胞、好ましくはＣＨＯまたはＣＯＳ細胞であることを特徴とする本発明の方法に関する。
本発明は好ましくは、前記ホスト細胞を軽鎖または重鎖のための発現ユニットを含む２つのプラスミドで同時トランスフェクトすることを特徴とする本発明の方法に関する。
以下の実施例は本発明をさらに説明するために供されるが、前記を本明細書に開示した本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【００４１】
実施例１
放射能免疫療法
材料と方法
モノクローナル抗体：ｍＭＡｂＢＩＷＡ１＝ＶＦＦ１８（前記はハイブリドーマ細胞株によって分泌される。前記細胞株は１９９４年６月７日にアクセッション番号ＤＳＭＡＣＣ２１７４により下記に寄託された：DSM-Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg1b, D-38124 Braunscweig, Deutschland; WO95/33771もまた参照されたい）は、ヒトＣＤ４４ドメインｖ３−ｖ１０を含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質を用いてＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することによって作製された（Heider et al. 1996）。ＢＩＷＡ１によって認識されるエピトープは、ＣＤ４４のドメインｖ６（番号付与はKugelmannら（1992）の論文にしたがう）のアミノ酸３６０−３７０にマッピングされた。本実験に用いたバッチはプロテインＧ−セファロースで精製し、さらにＰＢＳに対して透析した後で得られた。
ＭＡｂＵ３６（ＩｇＧ１）はＨＮＳＣＣ細胞株ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂでマウスを免疫した後で得られ、ＢＩＷＡ１とは異なるＣＤ４４ｖ６内のエピトープを認識した。Ｕ３６は濃縮組織培養上清からプロテインＡ−セファロースでアフィニティークロマトグラフィーによって精製され、さらにＱ−セファロースで精製された。
【００４２】
キメラＭＡｂおよびヒト化ＭＡｂの作製：ｍＲＮＡをＢＩＷＡ１ハイブリドーマ細胞株からクイックプレップ（QuickPrep）ｍＲＮＡ精製キット（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を用いて単離した。可変重鎖（ＶH）および可変軽鎖（ＶL）のｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって生成した。
前記フラグメントをＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩ（Invitrogen, Groningenn, The Netherlands）でクローニングし、配列を決定した。プラスミドｐＡＤＣＭＶ１（Himmler et al.1990）に由来する、それぞれヒトガンマ１の定常領域およびヒトカッパ軽鎖の定常領域を含む２つの発現ベクターを構築した。続いて、ＢＩＷＡ１のＶHおよびＶLフラグメントを対応する発現ベクターでその定常領域の前でクローニングした。前記キメラ抗体をｃＭＡｂＢＩＷＡ２と呼んだ。ＢＩＷＡ１重鎖および軽鎖可変領域のヒト化型（ＣＤＲ移植によって作製）を上記の発現ベクターの免疫グロブリンの定常領域の前でクローニングした。ヒト化抗体の構築のために使用したヒト可変領域は、重鎖についてはデータバンクＧｅｎＰｅｐｔのヒト免疫グロブリンフラグメントアクセッション番号Ｓ３１６６９から、軽鎖についてはヒト免疫グロブリンＨＵＭＩＧＫＡＸ（再配置抗ミエリンカッパ鎖）（GenBankアクセッション番号M29469）から得た。得られたＭＡｂはそれぞれｈＭＡｂＢＩＷＡ４およびＢＩＷＡ８と称した。ＢＩＥＡ８はネズミの親抗体の２つのアミノ酸を軽鎖フレームワーク２の中に含み、一方、ＢＩＷＡ４はフレームワーク内にネズミの残基を含くまなかった。
リコンビナントＭＡｂは、重鎖および軽鎖発現プラスミドの電気穿孔によりジヒドロホレートレダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞で安定的に発現された。細胞を９６ウェルのマイクロタイタープレートで５００および１００細胞／ウェルの密度で選別培養液（１０％の透析ウシ胎児血清添加α−ＭＥＭ）中に播種した。コロニーが見えるようになったとき（約１４日後）培養上清をそのＩｇＧ含有量について調べ、最良の産生細胞を増殖させた。遺伝子増幅は、メトトレキセートの濃度を高めながら（２０−５００ｎＭ）培養することによって実施した。
実験室規模でのキメラＭＡｂおよびヒト化ＭＡｂの製造を１％ウシ胎児血清含有標準培養液で実施した。プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィーを用いて組織培養上清からＩｇＧ分画を精製した。純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび高速サイズ選別クロマトグラフィーによって調べた。
【００４３】
抗体の親和性の評価：リコンビナント抗原を用いたカイネティック定数およびアフィニティー定数の測定はビアコア２０００システム（BIAcore AB, Uppsala, Sweden）で実施した。ヒトＣＤ４４のドメインｖ３−ｖ１０を含むグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（ＧＳＴ／ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０；２０μｇ／ｍＬ）をＣＭ５センサーチップにアミンカップリング法を用い製造元の指示にしたがって固定した。カップリング緩衝液として１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を用いた。ＨＢＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ビアコア界面活性剤Ｐ２０）中で種々の濃度（８−６７ｎＭ）のＭＡｂ３５μＬを抗原被覆表面に流速５μＬ／分で注入した。ＭＡｂの解離は緩衝液（ＨＢＳ）流の中で５分間調べた。分析と分析の間でチップの表面を１５μＬのＨＣｌ（３０ｍＭ）の１回パルスで再生させた。データの分析およびカイネティック定数の計算はビアコアのビアエバリュエーション（BIAevaluation）ソフト、ヴァージョン２．１で実施した。結合速度（ｋa）、解離速度（ｋd）および解離定数（Ｋd）を全ての抗体について調べた。
相対的結合親和性もまた競合的細胞ＥＬＩＳＡによって測定した。ヒトＡ４３１細胞（陰門の類上皮癌に由来し、高レベルのＣＤ４４ｖ６を発現することが判明している）を９６ウェルの組織培養プレートの各ウェルあたり２００μＬの１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ１６４０に２．５−５ｘ１０5細胞／ｍＬの密度で播種した。空気中に５％のＣＯ２を含む湿潤インキュベーターで前記プレートを一晩３７℃でインキュベートした。培養液を除去した後で細胞を１回ＰＢＳで洗浄し、９６％エタノールで１分固定し、再度ＰＢＳで洗浄した。ｃＭＡｂＢＩＷＡ２、ｈＭＡｂＢＩＷＡ４およびｈＭＡｂＢＩＷＡ８（予め１０μｇ／ｍＬに予備希釈）をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％トゥイーン２０）を用いて１００μＬ／ウェルとして１：２の段階希釈を実施し（８段階）、室温で３０分インキュベートした。１００μＬの予備希釈したｍＭＡｂＢＩＷＡ１（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加し、さらに前記プレートを室温で２時間軌道シェーカー上でインキュベートした。コントロールサンプルは、予備希釈サンプルのみでＢＩＷＡ１を含まないか（０％コントロール）、またはＢＩＷＡ１のみで競合抗体を全く含まない（１００％コントロール）。ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０（洗浄緩衝液）で３回洗浄した後、ｍＭＡｂＢＩＷＡ１の検出のために１００μＬの二次抗体（ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＦｃ、アッセイ緩衝液（DAKO, Copenhagen, Denmark）で１：１５０００に希釈）を添加し、プレートを室温で１時間軌道シェーカーでインキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、プレートを１００μＬ／ウェルのテトラメチルベンジジン基質溶液（Kierkegaad and Perry Laboratories, Gaithersburg, USA）で反応させた。反応は５０μＬ／ウェルのリン酸（１Ｍ）により停止させた。吸収をＥＬＩＳＡプレート読取り装置で４５０ｎｍで測定した（リファレンス６１０−６９０ｎｍ）。
【００４４】
抗体の放射性ヨウ素化：ＭＡｂのヨウ素化は本質的には文献（Haisma et al. 1986）に記載されたように実施し、125Ｉ（１００ｍＣｉ／ｍＬ）または131Ｉ（２００ｍＣｉ／ｍＬ）のいずれかを用いた（両者ともアマーシャム（Amersham, Aylesbury, England）から購入）。１ｍｇのＭＡｂＩｇＧを５００μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、１ｍＣｉの125Ｉまたは131Ｉを７５μｇのヨードゲン（Iodogen）（ Pierce, Oud Bijerland, The Netherlands）で被覆したバイアル中で混合した。室温で５分インキュベートした後、遊離のヨウ素をＰＤ１０カラム（Pharmacia-LKB, Woerden, The Netherlands）のゲルろ過で除去した。未結合の125Ｉまたは131Ｉを除去した後、放射化学的純度は、以前に報告された（Van Gog et al. 1997a）ＴＬＣおよびＨＰＬＣにより測定したとき９７％を常に超えていた。ＨＰＬＣ分析で調べたとき凝集もフラグメントも見出されなかった。
レニウム−１８６−標識ＭＡｂの調製：186Ｒｅ標識ＭＡｂは、以前（Van Gog et al. 1997a）に報告されたようにキレートＳ−ベンゾイルメルカプトアシルトリグリシン（Ｓ−ベンゾイル−ＭＡＧ３）を用いて多段法にしたがって調製した。この方法では、186Ｒｅ−ＭＡＧ３を調製する固態合成に続いて、２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（ＴＦＰ）によるエステル化および反応性186Ｒｅ−ＭＡＧ３−ＴＦＰエステルのＭＡｂへの共役が実施される。
共役後、186Ｒｅ標識ＭＡｂをＰＤ１０カラムで精製した。未結合186Ｒｅの除去後、放射化学的純度は常に９８％を越えていた。
【００４５】
放射能標識抗体のための結合アッセイ：生体分布実験および治療実験で使用される標識ＭＡｂのin vitro結合特性を本質的には以前（Van Gog et al. 1997a）に報告されたように免疫反応性アッセイで測定した。ヨウ素化または186Ｒｅ標識ＭＡｂの結合を調べるために、０．１％グルタールアルデヒド固定ＵＭ−ＳＣＣ−１１Ｂ細胞を用いた。ＵＭ−ＳＣＣ−１１Ｂ細胞はDr. T.E. Carey（University of Michigan, Ann Arbor, MI）から贈与された。５つの連続希釈物（５ｘ１０6細胞／試験管から３．１ｘ１０5細胞／試験管の範囲）を１％ＢＳＡのＰＢＳ液で調製した。もっとも低濃度の細胞を含む第二の試験管に過剰な非標識ＭＡｂＩｇＧを添加して非特異的結合を決定した。１００００ｃｐｍの125Ｉ、131Ｉまたは186Ｒｅを各試験管に添加し、前記サンプルを一晩４℃でインキュベートした。細胞を遠心して沈澱させ、ペレットおよび上清の放射能をガンマカウンター（LKB-Wallace 1282 CompuGamma, Kabi Pharmacia, Woerden, The Netherlands）で測定し、結合放射能と遊離放射のパーセンテージを計算した。データは改変ラインウィーバー−バークプロットで図表により分析し、免疫反応性は無限の抗原過剰を表す条件に対して直線的に外挿して求めた。
【００４６】
ＨＮＳＣＣ担癌ヌードマウスにおける生体分布実験：生体分布実験のために、皮下移植したヒトＨＮＳＣＣ異種移植片（ＨＮＸ−ＯＥ）をもつヌードマウスを以前（Van Gog et al. 1997a）に報告されたように用いた。雌のマウス（Ｈｓｄ：無胸腺ｎｕ／ｎｕ、２５−３２ｇ）（Harlan CPB, Zeist, The Netherlands）は実験時には８−１０週齢であった。３通りの生体分布実験を、３０から４７０ｍｍ3の範囲の１つまたは２つの腫瘍をもつマウスで実施した。第一の実験では、１０μＣｉ（５０μｇ）の131Ｉ標識ｍＭＡｂＵ３６を１０μＣｉ（５０μｇ）の125Ｉ標識ｍＭＡｂＢＩＷＡ１と同時に１３３±２８ｍｍ3の腫瘍をもつマウスに注射した（ｎ＝２０匹のマウス、３７個の腫瘍）第二の実験では、１０μＣｉ（５０μｇ）の131Ｉ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４および１０μＣｉ（５０μｇ）の125Ｉ標識ｃＭＡｂＢＩＷＡ２を１６７±３１ｍｍ3の腫瘍をもつマウスに同時に注射した（ｎ＝２１マウス、３２腫瘍）。第三の実験では、１０μＣｉ（５０μｇ）の131Ｉ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４および１０μＣｉ（５０μｇ）の125Ｉ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ８を１３０±２１ｍｍ3の腫瘍をもつマウスに同時注射した（ｎ＝２３マウス、４０腫瘍）。共役物は、０．９％のＮａＣｌで希釈した後１００μＬの容積で静脈内に注射した。同時注射したＭＡｂの比較可能な血中／体内クリアランスを得るために、同一のネズミまたはヒトのアイソタイプをもつＭＡｂのみを一緒にした。前記抗体用量（総用量は１００μｇ／マウス）は、ＭＡｂの血中からの急速なアイソタイプ関連除去を防止するために十分高く（Sharkey et al. 1991, Van Gog et al. 1997b）、さらに腫瘍内での抗原飽和を防止するために十分低く選択された。
注射の後表示した時点でマウスを麻酔し失血させて殺し切開した。腫瘍の他に以下の器官を取り出した：肝臓、脾臓、腎臓、心臓、胃、回腸、結腸、膀胱、胸骨、筋肉、肺臓、皮膚および舌。重量を測定した後、腫瘍、血液および器官内の放射能を二種同位元素ガンマカウンター（LKB-Wallace 1282 CompuGamma）（125Ｉのウィンドー設定で131Ｉコンプトンに対する自動修正つき）で計測した。前記組織における放射能の取り込みは、組織１グラムあたりの注射線のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）として計算した。
ＭＡｂ投与日まで、マウスは、湿度および温度が制御されている清潔な部屋（連邦基準２０９ｄによる等級２０００）の中の滅菌ケージで特定の病原体が存在しない条件下で通常のように飼育された。注射の日にマウスを放射性核種センター（Radio Nuclide Center）に移送し、滅菌した放射性共役物を層流フード内の無菌的条件下で注射した。
【００４７】
ヌードマウスの放射能免疫療法実験：ＲＩＴ動物実験を実施して、186Ｒｅで標識した種々のＭＡｂの治療効果を比較した。前記共役物の免疫反応性分画は常に７５％を越えていた。１つまたは２つのＨＮＸ−ＯＥ腫瘍（４５から１９５ｍｍ3の範囲）をもつマウスを用いて３通りの治療実験を実施した。186Ｒｅの量は最大許容線量（ＭＴＤ）レベル（すなわち４００μＣｉ）またはそれより低い線量（３００μＣｉ）を選択した。ＭＴＤレベルは５−１５％の体重低下を生じる線量と定義される。第一の実験では、マウスは３００μＣｉ（１００μｇ）の186Ｒｅ標識ｍＭＡｂＵ３６または３００μＣｉ（１００μｇ）の186Ｒｅ標識ｍＭＡｂＢＩＷＡ１のいずれかを１回静注された。第二の実験では、３００μＣｉ（１００μｇ）の186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４または３００μＣｉ（１００μｇ）の186Ｒｅ標識ｃＭＡｂＢＩＷＡ２のいずれかが投与され、第三の実験では、４００μＣｉ（１００μｇ）の186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４または４００μＣｉ（１００μｇ）の186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ８のいずれかが投与された。平均腫瘍容積は全ての実験群で同様であった。実験１：186Ｒｅ−ｍＭＡｂＵ３６処置群については９５ｍｍ3±３４ｍｍ3（ｎ＝７マウス、１２腫瘍）、186Ｒｅ−ｍＭＡｂＢＩＷＡ１処置群については９１ｍｍ3±１５ｍｍ3（ｎ＝７マウス、１２腫瘍）、およびコントロール群については９９ｍｍ3±５４ｍｍ3（ｎ＝６マウス、１１腫瘍）。実験２：186Ｒｅ−ｈＭＡｂＢＩＷＡ４処置群については１０１ｍｍ3±３５ｍｍ3（ｎ＝７マウス、１２腫瘍）、186Ｒｅ−ｃＭＡｂＢＩＷＡ２処置群については９２ｍｍ3±４３ｍｍ3（ｎ＝７マウス、１２腫瘍）、一方コントロール群は実験１と同じであった。実験３：186Ｒｅ−ｈＭＡｂＢＩＷＡ４処置群については１０５ｍｍ3±４３ｍｍ3（ｎ＝８マウス、１３腫瘍）、186Ｒｅ−ｈＭＡｂＢＩＷＡ８処置群については１００ｍｍ3±４２ｍｍ3（ｎ＝８マウス、１３腫瘍）、およびコントロール群については１１０ｍｍ3±４６ｍｍ3（ｎ＝７マウス、１１腫瘍）。治療の間、腫瘍を週に２回測定し、治療開始時の腫瘍容積に対する腫瘍容積比を計算した。毒性は週に２回体重を測定することによってモニターした。腫瘍の１つが１０００ｍｍ3を越えたときマウスを殺した。
統計：対を形成するデータのためのスチューデントｔ検定を用いて、同時注射したＭＡｂ間の組織取り込みにおける差異を各時点について統計的に分析した。種々のＲＩＴ処置群間の平均腫瘍容積における差異は、独立サンプルのためのスチューデントｔ検定を用いて各時点について統計的に分析した。
【００４８】
結果
ＣＤ４４ｖ６特異的ＭＡｂのin vitro結合特性：５つのＭＡｂの結合親和性をリコンビナント抗原およびヒト腫瘍細胞株を用いて分析した。固定抗原としてＧＳＴ／ＣＤ４４ｖ３−ｖ１０を用い、カイネティック定数およびアフィニティー定数を表面プラズモン共鳴によって算定した。表１は結合速度（ｋa）、解離速度（ｋd）および解離定数（Ｋd）を示す。同一の可変領域を含むｍＭＡｂＢＩＷＡ１およびＢＩＷＡ２は、類似するｋa、ｋdおよびＫdを有し、もっとも高い親和性を示す。対照的に、ｍＭＡｂＵ３６およびｈＭＡｂＢＩＷＡ４はより低いｋaおよびより高いｋdを有し、結果としてきわめて低い解離定数（それぞれ係数が３５．０および１０．５）を有する。軽鎖のフレームワーク領域２にネズミの残基を含むｈＭＡｂＢＩＷＡ８はｋdの顕著な低下を示し、結果として親和性が上昇した。
【表１】
2005504517.tif 000003
ｃＭＡｂおよびｈＭＡｂの相対的結合親和性もまた、ヒトＡ４３１腫瘍細胞を用いた競合的細胞ＥＬＩＳＡで調べた（図１）。リコンビナント抗原に対する親和性測定と一致し、ｃＭＡｂＢＩＷＡ２はもっとも有効な競合物質であり、その後にｈＭＡｂＢＩＷＡ８およびｈＭＡｂＢＩＷＡ４が続いた。同様な結果（データは示されていない）が２つの他のヒトＨＮＳＣＣ細胞株（ＦａＤｕおよびＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＮ５）でも得られた。
【００４９】
ＨＮＳＣＣ担癌ヌードマウスにおける生体分布：ＨＮＸ−ＯＥ異種移植片保持ヌードマウスで生体分布実験を実施した。同一のネズミおよびヒトアイソタイプをもつ２つのＭＡｂを125Ｉまたは131Ｉで標識し、同時に注射した（各々５０μｇ、１０μｇ）。親和性の段階的低下を提供するために以下のＭＡｂ対をそれぞれ選択した：ｍＭＡｂＵ３６はｍＭＡｂＢＩＷＡ１よりも３５．０倍低い親和性を有する（実験１）；ｈＭＡｂＢＩＷＡ４はｃＭＡｂＢＩＷＡ２よりも１４．０倍低い親和性を有する（実験２）；ｈＭＡｂＢＩＷＡ４はｈＭＡｂＢＩＷＡ８よりも４．０倍低い親和性を有する。全てのヨウ素化ＭＡｂの免疫反応性分画は、外挿後少なくとも７４％であった（表２）。
【表２】
2005504517.tif 000004
a免疫反応性は無限の抗原過剰を表す条件に対して直線的に外挿することによって求めた（材料と方法の項を参照されたい）。
実験１の生体分布は注射後１、２、３および７日目に決定し、実験２および３の生体分布は注射後１、２、４および７日目に決定した。前記３実験の全ての算出された腫瘍の平均％ＩＤ／ｇは表３に示されている。
【表３】
2005504517.tif 000005
１*：共役物Ａは131Ｉ−ｍＭＡｂＵ３６、共役物Ｂは125Ｉ−ｍＭＡｂＢＩＷＡ１
２*：共役物Ａは131Ｉ−ｈＭＡＢＩＷＡ４、共役物Ｂは125Ｉ−ｃＭＡｂＢＩＷＡ２
３*：共役物Ａは131Ｉ−ｈＭＡＢＩＷＡ４、共役物Ｂは125Ｉ−ｈＭＡｂＢＩＷＡ８
【００５０】
同時注射した各ＭＡｂ対について、腫瘍および血液への取り込み比が示されている。注射後３日目（実験１）または４日目（実験２および３）の腫瘍、血液および種々の器官の平均％ＩＤ／ｇおよびｓ．ｅ．ｍ．は図２に示されている。
２つのネズミＭＡｂの直接比較では、低親和性のＵ３６の腫瘍への取り込みは、全ての時点で高親和性のＢＩＷＡ１の取込みよりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）（表３）。対照的に、注射後１、２および３日目の血液および正常組織のこれらＭＡｂの取り込み値には有意な相違は認められなかった。注射後７日目で、血液およびほとんどの器官のＢＩＷＡ１レベルはＵ３６レベルよりも有意に低く（ｐ＜０．０５）、ＢＩＷＡ１の血中／体内からのより迅速なクリアランスを示している。ＢＩＷＡ１と比較して、注射後３日目のＵ３６の５０％高い腫瘍への取り込みは図２Ａに示されている。
同様な関係が他の２つのＭＡｂ対の調査でも認められた。ｈＭＡｂＢＩＷＡ４はより低い親和性を有するが、全ての時点でｃＭＡｂＢＩＷＡ２およびｈＭＡｂＢＩＷＡ８よりも有意に高い腫瘍の取り込みを示した（ｐ＜０．００１）（表３）。対照的に、血液および正常組織のＭＡｂレベルは、これらＭＡｂ対について注射後１、２および４日目で同様であった。注射後７日目では、血液およびほとんどの器官のＢＩＷＡ２およびＢＩＷＡ８レベルはＢＩＷＡ４レベルよりも有意に低く（ｐ＜０．０５）、これらＭＡｂの血中／体内からのクリアランスはより迅速であることを示している。輸液後４日の時点について、ＢＩＷＡ２と比較したときＢＩＷＡ４の腫瘍への取り込みは４５％高いことが図２Ｂに示されているが、一方、ＢＩＷＡ８と比較したときＢＩＷＡ４の腫瘍への取り込みは２０％高いことが図２Ｃに示されている。
131Ｉ−ＢＩＷＡ４／125Ｉ−ＢＩＷＡ８の代わりに125Ｉ−ＢＩＷＡ４／131Ｉ−ＢＩＷＡ８と放射能標識を入れ換えたまた別の実験でも（データは示されていない）一致した結果が得られた。後者の実験データによって、放射能標識のタイプが標識ＭＡｂの薬理学的消長に影響を与えたという可能性が排除される。
【００５１】
ＨＮＳＣＣをもつ担癌ヌードマウスの放射能免疫療法：前記３つの生体分布実験から、低親和性ＭＡｂは高親和性ＭＡｂよりも大量で選択性も高い腫瘍の取り込みを示し、したがってＲＩＴとして優れている可能性があることが判明した。この可能性を調べるために、ＨＮＸ−ＯＥ異種移植片をもつマウスによるＲＩＴ実験で以下の処置群を比較した：
実験１：３００μＣｉの186Ｒｅ−Ｕ３６もしくは３００μＣｉ186Ｒｅ−ＢＩＷＡ１またはコントロールとして食塩水；実験２：３００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４もしくは３００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ２またはコントロールとして食塩水；実験３：４００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４もしくは４００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ８またはコントロールとして食塩水。
図３では、コントロールおよび処置群の平均腫瘍容積（０日目の腫瘍容積にパーセンテージとして）が時間に対して表示されている。３つの実験の全てでコントロール群のマウスの腫瘍は指数関数的な増殖を示し、腫瘍容積のダブリングタイムは約７日であった。186Ｒｅ標識ＭＡｂ処置群では、共役物の注射後まもなく腫瘍は増殖を停止させ、いくつかの事例では腫瘍の退縮を伴なった。しかしながら全ての腫瘍は最終的には再び増殖した。
実験１では、３００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ１の投与によって腫瘍の増殖速度が低下したが、平均腫瘍サイズは減少しなかった。しかしながら、３００μＣｉの186Ｒｅ−Ｕ３６の投与は、注射後７日目から１７日目の間に平均腫瘍容積を１８５ｍｍ3から１２０ｍｍ3に低下させ、その後腫瘍は再び増殖を開始した。186Ｒｅ−Ｕ３６処置群の中間の相対的腫瘍容積は、１４日目以降186Ｒｅ−ＢＩＷＡ１処置群のそれより有意に小さかった（ｐ＜０．００１）。
実験２では、３００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４または３００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ２のいずれの投与も、注射後７日目での腫瘍増殖の停止および１７日目での再増殖開始をもたらした。ＢＩＷＡ４は１４日目以降ＢＩＷＡ２よりもＲＩＴで有効であったが、相対的腫瘍容積中間値における有意な相違は注射後１４日目で認められただけであった（ｐ＜０．０５）。
実験３では、マウスは４００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ１またはＢＩＷＡ８のいずれかで処置され、その結果、１９日目に相対的腫瘍容積はそれぞれ最小８０±６２％および９８±８１％まで減少した。その後腫瘍は再増殖を開始した。
これらのデータは、ＲＩＴで低親和性ＭＡｂＢＩＷＡ４は、高親和性ＭＡｂｃＢＩＷＡ２およびＢＩＷＡ８よりも有効であることを示している。
【００５２】
参考文献
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【００５３】
実施例２
本実施例は配列の詳細、例えばクローニング部位の位置、リーダー領域及び非翻訳領域を示している。
略語：ａａ＝アミノ酸；ｎｔ＝ヌクレオチド配列
【００５４】
【化２】
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【００５５】
【化３】
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【００５６】
【化４】
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【００５７】
【化５】
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【００５８】
【化６】
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【００５９】
【化７】
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【００６０】
【化８】
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【００６１】
【化９】
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【００６２】
【化１０】
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【００６３】
【化１１】
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【００６４】
【化１２】
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【００６５】
【化１３】
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【００６６】
【化１４】
2005504517.tif 000018
【００６７】
【化１５】
2005504517.tif 000019
【００６８】
実施例３
臨床実験１１７０．１
１．略語および用語の定義リスト
ＡＤＣＣ：抗体依存細胞仲介細胞毒性
ＡＥ：副作用
ＡＬＴ：アラニンアミノトランスフェラーゼ
ａ．ｐ．：腹側背側
ＡＰ：アルカリ性ホスファターゼ
ＡＳＴ：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
ＡＵＣ：濃度−時間曲線内面積
Ｂｑ：ベクレル、放射能の強さを示すベクレルのＳＩ単位（１ベクレル＝１崩壊／秒）
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＤ４４ｖ６：ＣＤ４４変種アイソフォームｖ６
ＣＤＳ：薬剤安全協会（Corporate Drug Safety）
ｃＧｙ：放射能の強さの単位、センチグレイ
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞
Ｃｉ：キューリー、放射能の強さの単位、１Ｃｉ＝３７ｘ１０9崩壊／秒＝３７ＧＢｑ
ＣＬ：完全体内クリアランス
ｃＭＡｂ：キメラモノクローナル抗体
ｃｍ：センチメートル
Ｃmax：観察される最大薬剤濃度
ｃｐｍ：カウント／分
ＣＲＦ：事例報告書／記録書（Case Report/Record Form）
ＣＴ（スキャン）：コンピューター支援断層撮影法
ＣＴＣ：一般毒性基準
ＣＶ：変動係数
ＤＬＴ：線量限界毒性（Dose Limiting Toxicity）
ＥＣＧ：心電図
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥＮＴ：耳鼻咽喉
ｆ：雌、女性
ＦＤＡ：米国食品医薬品局
ｇ：グラム
ＧＢｑ：放射能の強さのＳＩ単位、ギガベクレル（１ＧＢｑ＝１０9崩壊／秒）
ＧＣＰ：臨床試験実施基準
ＧＧＴ：ガンマグルタリルトランスフェラーゼ
ＧＭＰ：医薬品製造実施基準
Ｇｙ：グレイ
ＨＡＨＡ：ヒト抗ヒト抗体
Ｈｂ：ヘモグロビン
ＨＥＲ２：ヒト上皮増殖因子レセプター２
ｈＭＡｂ：ヒト化モノクローナル抗体
ＨＮＳＣＣ：頭頸部扁平上皮癌
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ｈｒ／ｈ：時間
ｈｒｓ：時間
Ｈｔ：ヘマトクリット
131Ｉ：ヨウ素−１３１（半減期８．０５日）
ＩＣＨ：ハーモナイゼーション国際委員会（International committee on harmonization）
ＩＤ：注射用量
ＩＥＣ：独立倫理委員会（Independent Ethics Committee）
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＩＮＮ：国際的一般名称（International Non Proprietary Name）
ＩＲＢ：機関内監査委員会（Institutional Review Board）
ＩＴＴ：治療意図（Intent-To-Treat）
ｉ．ｖ．：静脈内（注射）
ＫｅＶ：キロ電子ボルト
ｌ／Ｌ：リットル
ｍ：雄、男性
ｍ2:平方メートル
ＭＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＡＧ２ＧＡＢＡ−ＴＦＰ：メルカプトアセチルグリシルグリシル−ガンマ−アミノブチレート−テトラフルオロフェノールエステル（ＭＡＧ２ＧＡＢＡ−ＴＦＰ）、モノクローナル抗体に186Ｒｅをカップリングさせるために用いられるキレート（後に使用される方法）
ＭＡＧ３：メルカプトアセチルトリグリシン。モノクローナル抗体に99mＴｃおよび186Ｒｅをカップリングさせるために用いられるキレート。
ＭＢｑ：放射能の強さを示すＳＩ単位、メガベクレル（１ＭＢｑ＝１０6崩壊／秒）
ｍＣｉ：ミリキューリー、放射能の強さの単位、１ｍＣｉ＝３．７ｘ１０7崩壊／秒＝３７ＭＢｑ
ＭＣＶ：中間血球体積
ｍＧｙ：ミリグレイ
μｇ：マイクログラム
ｍｇ：ミリグラム
ｍｉｎ：分
ｍｌ／ｍＬ：ミリリットル
ｍＭＡｂ：ネズミモノクローナル抗体
ｍｍＨｇ：ミリメートル水銀
μｍｏｌ：マイクロモル
ｍｍｏｌ：ミリモル
ＭＲＩ：磁気共鳴画像化
ＭＲＴ：平均滞留時間
ｍＳｖ：ミリシーベルト
ＭＴＤ：最大許容線量
ＮＡ／ｎ．ａ．：適用不能
ＮＣＩ：米国国立癌研究所
ＮＤ：実施せず
ｎｇ：ナノグラム
Ｎｏ／Ｎ：番号
ｎｏｓ：他の明確な記述なし
ＮＳＣＬＣ：非小細胞肺癌
ｎ．ｙ．ｒ．：未だ回復に至らず
ｐ．ａ．：背側腹側
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ｐ．ｉ．：輸液後
ｐ．ｏ．：経口的に
ＰＰ：プロトコルにしたがって
Ｐｔ．／Ｐａｔ：患者
Ｐｔｓ．：患者
186Ｒｅ：レニウム−１８６、放射性核種、半減期は３．７日（β粒子の組織貫通は約１．２ｍｍ）
Ｒｅｃｏｖ．：回復
ＲＥＳ：細網内皮系
ＲＩＳ：放射性イムノシンチグラフィー
ＲＩＴ：放射性免疫療法
ＲＯＩ：問題の領域
ＳＡＥ：重篤な副作用
ＳＣＣ：扁平上皮癌
ｓＣＤＤ４４ｖ６：可溶性ＣＤＤ４４ｖ６
ＳＤ：症状の安定
ｓＧＯＴ：血清グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ
ｓＧＰＴ：血清グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ
ＳＯＣ：系統的器官クラス
ＳＯＰ：標準操作方法
ＳＰＥＣＴ：単光子放出コンピューター支援断層撮影法
ｔ1/2：排除半減期
99mＴＣ：テクネチウム９９ｍ（半減期６時間）
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
Ｔmax：最大薬剤濃度が観察される時点
ＴＮＭ：腫瘍の病期決定のための腫瘍結節転移系
ＴＳＨ：甲状腺刺激ホルモン
ＵＩＣＣ：国際癌撲滅協会（Union Internationale Contre le  Cancer）
ｕｎｋ：不明
Ｖss：定常状態下での見かけの分布容積
Ｖz：末期の見かけの分布容積
ＷＢＣ：白血球数
ＷＨＯ：世界保健機構
【００６９】
２．実験の目的
２．１全般的目標／臨床的目的
本実験の全般的な目標は、静脈投与された99mＴｃおよび186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の安全性および許容性を調べること、99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の腫瘍における優先的蓄積を確認すること、186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の最大許容放射線量を決定すること、およびフェースＩＩに進むために安全な線量を提示することであった。前記目標に到達するために臨床実験を２つの部分に分割した。
パートＡ：
目的：
＊静脈投与した99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の単回輸液の安全性および許容性を頭頸部の進行扁平上皮癌患者で決定すること。
＊種々のＢＩＷＡ４用量レベルでの99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の単回輸液の生体分布を頭頸部の進行扁平上皮癌患者で決定すること。
＊単回輸液した99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の薬理学的消長を調べること。
パートＢ：
目的：
＊186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の定性的および定量的毒性作用を決定すること、および前記毒性副作用の予見性、開始、持続時間、強さ、回復性および用量関係を調べること。
＊静脈投与した186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の最大許容放射線量を頭頸部癌患者で決定すること。
＊静脈投与した186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の薬理学的消長を頭頸部扁平上皮癌患者で調べること。
＊二次的な目的は186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の予備的治療効果を決定すること。
【００７０】
本プロトコルに概略した以下の目的はこの臨床試験実施中にとりかかることはできなかった。99mＴｃおよび186Ｒｅをモノクローナル抗体にカップリングさせるために用いられるリンカーキレート、メルカプトアセチルトリグリシン（ＭＡＧ３）を使用するプログラムの進行は中止され、したがってこの臨床試験は終了した。ＢＩＷＡ４を用いるプログラムの進行は、リンカー、メルカプトアセチルグリシルグリシル−ガンマ−アミノブチレート−テトラフルオロフェノールエステル（ＭＡＧ２ＧＡＢＡ−ＴＦＰ）を用いることによって継続されるであろう。
＊より多くの患者を登録して186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４による第二の処置のためのＭＴＤを特定する前に、単回投与処置のためのＭＴＤを先ず初めに特定するべきであった。
＊更なる実験のために186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４による第一回目の輸液および連続輸液の安全用量を提唱すること。
＊反復投与のための用量スケジュールに対する初期結果を得ること。
２．２主要測定項目
＊安全性：通常臨床検査、ヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）の測定、生命徴候の測定および副作用。
＊有効性：生検による生体分布データ（パートＡのみ）および放射性イムノシンチグラフ画像（パートＡおよびＢ（本臨床試験のパートＢの線量測定を含む））。
＊薬理学的消長の結果
２．３二次的測定項目
＊本実験の二次的測定項目は腫瘍の反応であった（パートＢのみ）
３．実験計画
３．１全体的実験デザインおよびプランの説明
本臨床試験は２つの部分で実施された。パートＡでは、コールドＢＩＷＡ４の最適用量を調べさらに腫瘍への取り込みを定量し、一方、パートＢでは186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の最大許容線量を調べた。
３．１．１パートＡ：
本臨床試験のこの部分は条件無しの連続用量増加群による試験であった。パートＡは、頭頸部癌をもつ患者において、99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の単回輸液の安全性および許容性に関する初期データを提供し、生体分布のパターンおよびレベルを調べ、さらにｈＭＡｂＢＩＷＡ４の薬理学的消長プロフィルを確立するためにデザインされた。本実験のパートＡでは、各用量レベルで治療するように計画した３人の患者で３通りのタンパク質用量のｈＭＡｂＢＩＷＡ４を用いた。
患者は耳鼻咽喉科で日常的な検査を受け腫瘍の程度が判定された。前期検査には、健康診断、コンピューター支援断層撮影（ＣＴ）または頭頸部のＭＲＩスキャンおよび汎用内視鏡検査（任意）が含まれる。これらの検査の間に、腫瘍が疑われる組織サンプルを採取し、扁平上皮癌の存在について調べた。前記検査の結果をもとにして、患者の外科手術（頸部切開を含む）を実施することを決定した。
放射能標識抗体を注射し、副作用の発生について患者を観察した。手術前に放射性イムノシンチグラフィースキャンを輸液後２１時間で実施した。患者は放射能標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の輸液後４８時間で手術を受けた。頸部切開標本は病理技師によって精査され、正確な腫瘍負荷が決定された。さらにまた、手術標本の腫瘍部位および正常組織から得られた生検の99mＴｃ量を測定した。免疫組織化学的技術によって、腫瘍部位および腫瘍浸潤結節をＣＤ４４ｖ６の存在について調べた。第一の３人の患者には、２０ｍＣｉの99mＴｃで標識した２ｍｇのｈＭＡｂＢＩＷＡ４および２３ｍｇの非標識ｈＭＡｂＢＩＷＡの混合物が投与された。３人の測定可能患者を含む第二の群には、２０ｍＣｉの99mＴｃで標識した２ｍｇのｈＭＡｂＢＩＷＡ４および４８ｍｇの非標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の混合物が投与され、第三群には２ｍｇの標識抗体および９８ｍｇの非標識抗体の混合物が投与された。
薬理学的消長の評価は特定の時点で実施した。
【００７１】
３．１．２パートＢ：
本臨床試験のこの部分は条件無しの自由な線量増大試験であった。本パートＢは、他の治療方法が利用できない頭頸部癌患者で、186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の安全性および許容性を調べるために、静脈内投与した186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の最大許容線量（ＭＴＤ）を決定するために、さらに186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の予備的治療効果を決定するためにデザインされた。さらに186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の薬理学的消長プロフィルを調べた。
本臨床試験のこの部分に登録された全ての患者は、本実験のパートＡの結果をもとにして選択したｈＭＡｂＢＩＷＡ４用量を投与された。前記ｈＭＡｂＢＩＷＡ４は増大線量の186Ｒｅで標識された。低い線量レベルでは（観察された毒性はグレード１を超えない）、２人の患者を各線量群に登録し、より高いレベルでは（毒性はグレード２以上）最低３人の患者を各線量群に登録した。全ての患者を調べて投与したｈＭＡｂＢＩＷＡ４の安全性を決定した。
患者に耳鼻咽喉科で日常的検査を実施し、腫瘍の程度を判定した。前期検査には健康診断および腫瘍場所のＣＴまたはＭＲＩスキャンニングが含まれていた。
186Ｒｅ標識抗体を放射線量を増大させながら注射した：第一の線量群の患者は２０ｍＣｉ／ｍ2の放射線量を与えられ、それ以降、後続の線量群の患者の線量は１０ｍＣｉ／ｍ2ずつＭＴＤに到達するまで増大させた。患者を副作用の出現について観察した。放射性イムノシンチグラフィースキャンを実施した。
【００７２】
３．１．３各診察における試験方法
３．１．３．１診察スケジュール
ａ）スクリーニング診察
この試験に登録する前に、各患者を適格性についてスクリーニングした。身上調書および関連病歴を記録し、併用されている治療を記録し、一般的な健康診断を実施しさらに体重を測定した。カルノフスキー日常動作スコアを決定した。書面によるインフォームドコンセントを得る必要があった。妊娠検査は妊娠の可能性がある女性について要求された。１２リードの心電図（ＥＣＧ）を作製し、血液および尿の一般検査を実施した。ＨＡＨＡ検査のための血液サンプルも採取した。胸部Ｘ線写真を撮影し、さらに完全な疾患検査（ＣＴ／ＭＲＩ、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）検査）を実施した。
この診察の最後に、要求された調査の結果を評価し、包含基準および排除基準を確認し、さらに手術の割り当て（パートＡのみ）を作製した。
ｂ）診察２：試験日数１−７
パートＡおよびＢ：
試験第一日目に（スクリーニング診察後３週間を越えない）患者を入院させた。輸液前に、スクリーング診察では得られなかった必要な開始時基礎検査の全てを実施しこれを評価した。さらに適格性基準は満たされていなければならなかった。全ての併用治療を記録した。書面によるインフォームドコンセントの署名の後で開始した全ての副作用は必ず患者のカルテおよび事例報告書（ＣＲＦ）に記録した。
抗体投与前の治療日に、血液サンプルを薬理学的消長動態（可溶性ＣＤ４４ｖ６の算定を含む）のために採取し、さらに生命徴候を記録した。最初の２４時間の間に尿を０−４時間、４−８時間、８−１２時間および１２−２４時間で採取し、続いて２４時間間隔で４８時間および９６時間までそれぞれパートＡおよびパートＢのための輸液後に採取した。
前記抗体は放射線科または病院の指定の部屋で投与された。抗体は必ずできるかぎり近位の上肢末梢静脈から投与された。全ての事例で、輸液は１０ｍＬの食塩水をフラッシュさせた後、流入が自由な管から５分間かけて投与した。再現性のある薬理学的消長の結果を得るために、必ず注射筒用ポンプを用いた。したがって前記容積の０．９％ＮａＣｌによる希釈は２０ｍＬまでであることが要求された。前記抗体輸液の後１０ｍＬの食塩水でフラッシュした。溢血の疑いは全てＣＲＦに記載し、患者のシンチグラフ画像を作製した。
アナフィラキシ−のおそれに対処するために、蘇生装置、抗ヒスタミン剤、コルチコステロイドおよびエピネフリンが利用できる救急ユニットを手の届く範囲に置いた。副作用および併用治療の変更は毎日記録した。
【００７３】
パートＡ：
生命徴候は輸液後１０、６０および１２０分で記録した。一般検査用および可溶性ＣＤ４４ｖ６検査用血液サンプルは輸液後２１、４８および１４４時間後に採取した。
薬理学的消長検査用血液サンプルは、輸液終了時、並びに輸液終了後５、１０、３０分後および１、２、４、１６、２１、４８、７２時間後に、さらに７日目（輸液後１４４時間、ＨＡＮＡおよび可溶性ＣＤ４４ｖ６測定のための血清サンプルを含む）に採取した。
薬理学的消長検査のための尿は、最初の２４時間の間は０−４時間、４−８時間、８−１２時間および１２−２４時間に採取し、さらに輸液後４８時間までは２４時間サンプルを採取した。
全身のシンチグラフ画像を輸液直後および輸液後２１時間で作製した。輸液後２１時間には全身画像の他に、単光子放出コンピューター支援断層撮影（ＳＰＥＣＴ）および頭頸部領域の平面画像も作製した。
患者の手術は輸液後４８時間で実施し、術後管理のために入院を継続させた。
７日目（輸液後１４４時間）に一般検査用尿サンプルを採取した。
副作用および併用治療の変更は毎日記録した。
【００７４】
パートＢ：
生命徴候は輸液後１０、６０および１２０分に記録した。一般検査用および可溶性ＣＤ４４ｖ６検査用血液サンプルは輸液後２１、４８および１４４時間後に採取した。ＨＡＨＡ測定用血液サンプルは輸液後１４４時間に採取した。一般検査用尿サンプルもまた輸液後１４４時間に採取した。
薬理学的消長検査用血液サンプルは、輸液終了時、並びに輸液終了後５分および３０分後、さらに１、２、４、１６、２１、４８、７２時間後および７日目（輸液後１４４時間）に採取した。初めに予定した１０分後のサンプルは補正１に示したとおり省略した。
薬理学的消長検査のための尿は、最初の２４時間の間は０−４時間、４−８時間、８−１２時間および１２−２４時間に採取し、さらに輸液後９６時間までは２４時間サンプルを採取した。
全身のシンチグラフ画像を輸液直後および輸液後２１、４８、７２および１４４時間に、さらに計測が統計学的に許容される場合には２週間後に作製した。
輸液後２１、４８（任意）、７２および１４４時間で、さらに計測が統計学的に許容される場合は輸液２週間後に頭頸部領域の平面画像を作製した。
ＳＰＥＣＴ画像化は輸液７２時間後にのみ実施した。
副作用および併用治療の変更は毎日記録した。
患者は３日後に退院を許可された。
ｃ）診察３：経過観察診察：
パートＡ：
患者は輸液から６週間後に外来診療所で診察を受けた。健康診断を実施し、一般検査用血液および尿サンプルを採取し、体重および生命徴候を測定し、さらに副作用を記録した。薬理学的消長、ＨＡＮＡ測定および可溶性ＣＤ４４ｖ６検査用血液サンプルもまた採取した。妊娠の可能性がある女性については妊娠検査が要求された。副作用の経過観察を記録した。併用治療の変更は全て記録した。
パートＢ：
患者は少なくとも６週間、副作用の記録および一般検査用血液サンプル採取のために毎週外来診療所で診察を受けた。薬理学的消長検査用血液は輸液後２４０時間および３３６時間で採取した。初めに予定した輸液後６週間のサンプルは修正１のとおり省略した。併用治療の変更もまた全て記録した。開始時に実施した疾患評価を輸液後６週間で（表示されている場合はその後も）再度実施した（前記評価はプロトコルで一度述べたように４週間後ではなく６週間後に実施した）。輸液後６週間で、一般検査用、ＨＡＮＡおよび可溶性ＣＤ４４ｖ６検査用血液サンプルを採取し、生命徴候を記録し体重を測定した。健康診断をこの診察時に実施した。一般検査用尿サンプルを採取した。妊娠検査は妊娠の可能性がある女性で要求された。
ｄ）診察４および５：二回目の処置（パートＢ）
最初のプロトコルに概略した二回目の処置は、リンカーを変更したことによる不完全な臨床試験の終了のために実施されなかった。その代わりに、186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の最初の用量に反応した患者を第二回目の投与に選んだ。前記の患者は最初の投与の場合と同じ診察スケジュールにしたがった。
【００７５】
３．２試験デザインの考察（コントロール群の選択を含む）
この試験の目的は、進行した頭頸部癌をもつ患者で、腫瘍への優先的な99mＴｃ標識ＢＩＷＡ４の蓄積を測定すること、および186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の最大許容線量とともにＢＩＷＡ４の薬理学的消長を調べることであった（パートＡおよびパートＢ）。
このタイプの癌治療におけるフェースＩ臨床試験で一般的に実施されているように自由なデザインを用いた。より低い放射線量群では最低限２人の患者、およびより高い放射線量群では３人の患者が本臨床試験のパートＢに含まれていた。薬剤関連の一般毒性基準（ＣＴＣ）でグレード４の血液学的毒性およびグレード３の非血液学的毒性が発生した場合には、さらに別の３人の患者を対応する線量群で処置した（さらに詳細な線量決定についてはセクション３．４．４および３．４．５を参照されたい）。
投与されるＢＩＷＡ４の用量はＭＡｂＢＩＷＡ１に関する先の実験の結果（用量５０ｍｇは腫瘍組織の選択的で高い取り込みをもたらし、一方非腫瘍組織では低い取り込みをもたらすことを示した）および本臨床試験のパートＡの結果（セクション３．４．４．１もまた参照されたい）をもとにしている。
選択した放射能の強さの出発線量レベルは、２０ｍＣｉ／ｍ2の線量が安全な線量であろうということを示唆する先のデータをもとにしていた（セクション３．４．４．２もまた参照されたい）。
適用される有効性基準は、許容性判定基準と同様に本患者集団について良好に確立されてあり、自由デザインでもまた用いることができる。
【００７６】
３．３実験集団の選別
３．３．１包含基準
＊頭頸部の扁平上皮癌が組織学的に確認された患者、
＊頸部切開による外科手術が必要な患者、または
＊別の治療選択肢が利用できない末梢性および／または局所性再発症状、または遠位性転移が見られる患者。腫瘍の存在は、臨床的にまたは１つもしくは２つ以上の放射能技術（ＣＴ、ＭＲＩ、骨シンチグラフィー）によって測定する必要があった。
ＲＩＴはより小さなサイズの腫瘍でより効果的であると予想されたので、最大寸法が＜３ｃｍの病巣をもつ患者が所望された（パートＢ）
＊年齢が１８歳を越える患者、
＊年齢が８０歳より低い患者、
＊“書面によるインフォームドコンセント”を提示した患者、
＊良好な日常行動状態を維持している患者：カルノフスキー＞６０。
３．３．２排除基準
＊生命の危険がある感染、アレルギー体質、器官不全（ビリルビン＞３０μｍｏｌ／Ｌおよび／またはクレアチニン＞１５μｍｏｌ／Ｌ）、またはＥＣＧで証明された最近の心筋梗塞、または不安定狭心症、
＊閉経前の女性（実験の開始が最後の月経から１年以内）：
−外科手術によって不妊ではないこと（子宮摘出、卵管結紮）、および
−許容される避妊手段を実施していない（または試験を通して避妊を継続させる予定がないこと）。許容される避妊方法には経口、埋め込み用または注射用避妊薬が含まれる。
＊開始時の妊娠検査で血清が陽性であった女性、
＊試験に参加する前４週間以内に化学療法または放射線療法を受けている、
＊白血球細胞数＜３０００／ｍｍ3、顆粒球数＜１５００／ｍｍ3または血小板数＜１０００００／ｍｍ3、
＊血液学的異常、うっ血性心不全、気管支喘息、食物または接触アレルギー、重篤なアトピーまたはアレルギー。
【００７７】
３．３．３治療または評価から対象者の除外
３．３．３．１対象者の治療の停止基準
患者が頻脈（心拍数は１２０／分を越える）、低血圧（収縮期血圧が１０ｍｍＨｇ未満）、呼吸困難、胸部痛、または患者にとって耐えがたいいずれかの症状を生じた場合は必ず、直ちに輸液を停止した。
３．３．３．２脱退および停止
患者はいつでも本実験の参加を中止することができる。
放射能標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４を評価することは、患者が自由意志で脱退したことによって中途で実験から除外された場合は適切でないと考えた。適切な経過情報が得られない場合はその事例は評価不能と考えた。評価不能であった患者はいずれも代替することが計画された。
患者が初期に実験を中止した場合は、その理由は必ずＤＲＦに記載した。患者がＨＡＮＡ測定用または薬理学的消長検査用輸液後血液サンプル採取に戻ってこなかった場合は、その理由は必ず書面に記載した。患者が重篤な副作用（ＳＡＥ）を生じた場合は必ず、前記重篤な副作用に応じて可能な限り厳密に実験スケジュールに従った。
【００７８】
３．４治療
３．４．１与えられる治療
パートＡの患者は、２０ｍＣｉの放射能線量で99mＴｃ−ＢＩＷＡ４を投与された。投与されたＢＩＷＡ４の用量は、３人の患者の各々について２５ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇであった。薬剤は単回投与として静脈内から投与された。
パートＢの患者は、レニウム１８６で標識された５０ｍｇのＢＩＷＡ４を投与された。もっとも低い放射能線量は２０ｍＣｉ／ｍ2で、これは１０ｍＣｉ／ｍ2の線量ずつ増加させた。この臨床試験の薬剤は単回投与として静脈内に投与された。
３．４．２臨床試験用製品の特定
パートＡ：
2005504517.tif 000020
2005504517.tif 000021
ＢＩＷＡ４は99mＴｃを結合させた放射能共役物として投与した。リンカー分子はＭＡＧ３であった。ＭＡＧ３はマリンクロット（Mallinckrodt, Petten, The Netherlands）から購入した。
99mＴｃは、前記放射能共役物を調製する下記の研究室からその近くに発注された：laboratory of Prof. Dr. van Dongen, Section Tumor Biology, Department of Otorhinolaryngology / Head and Neck Surgery, Vrije Universiteit  University Medical Center, De Boelelaan 1117, 1081 HV Amersham, The Netherlands。
【００７９】
パートＢ：
2005504517.tif 000022
ＢＩＷＡ４は186Ｒｅを結合させた放射能共役物として投与した。リンカー分子はＭＡＧ３であった。ＭＡＧ３はマリンクロット（Mallinckrodt, Petten, The Netherlands）から購入した。
186Ｒｅは、前記放射能共役物を調製する下記の研究室から近くに発注された：laboratory of Prof. Dr. van Dongen, Section Tumor Biology, Department of Otorhinolaryngology / Head and Neck Surgery, Vrije Universiteit  University Medical Center, De Boelelaan 1117, 1081 HV Amersham, The Netherlands。
【００８０】
３．４．２．１臨床試験薬の特徴および品質
抗体の特徴
ｈＭＡｂＢＩＷＡ４によって認識される抗原は、細胞の外側表面に位置するトランスメンブレン糖タンパク質であり、極めてわずかな部分（＜２０％）が内部に存在する。更なる分析によって、ｈＭＡｂＢＩＷＡ４はＣＤ４４の変種エクソンｖ６によってコードされるエピトープを認識することが明らかになった。前記抗原は、原発性の頭頸部腫瘍の全て（ｎ＝５４）およびこれら腫瘍内の細胞の大半で発現されることが示された。類似する発現が、頸部切開標本から得られた６８個の腫瘍浸潤リンパ節について観察された（Ｒ９７−２０５４）。ヒト正常組織でのｈＭＡｂＢＩＷＡ４の反応性パターンは本プロトコルの添付文書ＩＩＩに提示されている。ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の反応性は扁平上皮に本質的に限定されることが判明した。ネズミモノクローナル抗体（ｍＭＡｂ）ＢＩＷＡ１を用いた先のＲＩＳ実験によって明らかにされたように、正常な扁平上皮との反応性は、腫瘍による取り込みに関する腫瘍への集中における有用性を制限する要因ではなかった。
【００８１】
99mＴｃ標識または186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の品質管理
抗体は、Fritzbergらの記載した方法（Ｒ９６−２１０６：プロトコル添付文書ＩＶを参照されたい）をVisserらにしたがって改変した方法を用いて99mＴｃまたは186Ｒｅで標識した。
ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の99mＴｃまたは186Ｒｅによる本放射能標識方法は、調製された共役物の最終的品質により実証された。本プロトコルの添付文書ＩＶに記載した方法にしたがって実施した５つの別個の標識実験で、抗体に結合した標識のパーセンテージは９６−９９％であることが判明した。
本臨床試験では、調製した各99mＴｃまたは186Ｒｅ標識抗体バッチの放射能化学的純度は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＰＤ−１０ゲルろ過カラムの通過によって評価し、患者への投与を許容するためには９０％を越えていなければならなかった。
各99mＴｃ／186Ｒｅ標識抗体バッチの免疫反応性分画は実証された方法を使用して投与後に確認し、６０％を超えていなけれればならなかった。簡単に記せば、分析は本質的にLindmoら（Ｒ９６−２１０４）が記載した方法にしたがって実施した。ＵＭ−ＳＣＣ１１Ｂ細胞（ヒト喉頭癌）（ＣＤ４４ｖ６抗原を含む）を０．１％グルタールアルデヒドで固定した。５ｘ１０6細胞／試験管から３．１ｘ１０5細胞／試験管の範囲の６希釈を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて作製した。
前記試験管に８００００カウント／分（ｃｐｍ）の99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４または１００００ｃｐｍの186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４を添加し、室温で一晩インキュベートした。
最後のサンプルには過剰の非標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４を添加し非特異的結合を決定した。細胞を遠心沈澱させ、ペレットおよび上清の放射能をガンマカウンターで測定し、結合および遊離放射能標識ＭＡｂのパーセンテージを計算した（LKB-Wallac 1218 CompuGamma）。
改変ラインウィーバー−バーク図表でデータ−をグラフにより分析し、無限抗原過剰を示す条件に対して直線的に外挿することによって免疫反応性分画を決定した。
この結合アッセイで放電レベルが６０％に達しない場合は、輸液用調製物は第二の結合アッセイで再評価した。この目的のために、抗体調製物は131Ｉで標識した。免疫反応性分画は、評価されるべき各患者に対し、さらに次ぎの患者で継続される試験のために両アッセイの少なくとも１つで６０％を越えていなければならなかった。
【００８２】
抗体の安全性
この試験で99mＴｃおよび186Ｒｅによる標識に用いられるＢＩＷＡ４は性状がよく調べられたモノクローナル抗体である。前記はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の大量培養によって製造された。マスターセルバンクは医薬品製造基準（ＧＭＰ）の条件にしたがって設立し、微生物学に関する状態（細菌、真菌、マイコプラズマ）およびウイルスに関する状態（アデノウイルス、レトロウイルス）について完全に調べた。内因性レトロウイルス（ほとんどのＣＨＯ細胞に存在することが判明している）を除いて夾雑因子は検出されなかった。
臨床試験フェースＩで患者に使用されるＭＡｂに関する、食品医薬品局の１９９４年の“考慮すべき項目”の文書にしたがって、標準的なダウンストリーム精製方法（前記方法は効果的なウイルス除去として実証された）をＢＩＷＡ４材料の精製に用いた。４つのモデルウイルス（ＭｕＬＶ、ＰｓＲＶ、ＲＥＯ−３、ＳＶ４０）を前記の実証に含めた。濃縮バルク収集物をレトロウイルス力価について調べ、以後のダウンストリーム精製方法によってレトロウイルスが適切に除去できるかを確認した。内毒素の除去に関するデータは許容範囲内にあり（≦０．０１ＥＵ／ｍｇ）、前記バルク生成物のために利用することができた。さらにまた、欧州薬局方ガイドラインによる発熱物質試験も良好に実施された。
更なる放射能標識に用いられる最終的なｈＭＡｂＢＩＷＡ４はきわめて詳細に分析され、高度に純粋であることが証明された（ＳＤＳＰＡＧＥ、等電点電気泳動）。滅菌溶液は最小限の内毒素レベル（≦０．０１ＥＵ／ｍｇ）を含んでいた。発熱物質についての検査結果は欧州薬局方基準に適合した。前臨床および臨床用供給物の製造から得られたＢＩＷＡ４生成物の均質性は分析結果によって示された。
99mＴｃまたは186ＲｅによるｈＭＡｂＢＩＷＡ４の放射能標識は、標準操作方法（ＳＯＰ）にしたがい、Vrije Universiteit University Medical Centerの耳鼻咽喉科および頭頸部外科によって実施された。最終製品の無菌性は保証された。University Hospital Nijmegenで患者に薬剤を投与するために、適切な量の放射能標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４を調製直後に特別の容器に入れてNijmegenの臨床試験センターに移送した。化合物の標識と患者への投与の間に２４時間を見越した。
各レニウムバッチの患者への配分については添付文書１６．１．６も参照されたい。
【００８３】
３．４．２．２包装、標識および供給
ＢＩＷＡ４はベーリンガーインゲルハイム（The Netherlands）によって供給された。前記抗体はベーリンガーインゲルハイム（Germany）によってＧＭＰに適合する製造および精製方法を用いて製造され、無菌的な発熱物質非含有溶液としてバイアルに充填された。前記バイアルは２５ｍｇのｈＭＡｂＢＩＷＡ４を５ｍＬの等張なＰＢＳ（ｐＨ７．２）中に含んでいた。そのままの抗体および標識された抗体のバイアルのラベルの例は臨床実験マニュアルに包含されている。
総量２７ｇのｈＭＡｂＢＩＷＡ４を含む１つのバッチが製造され、バイアルに充填された。99mＴｃまたは186Ｒｅによる標識は、Vrije University University Medical Center（Amsterdam）のクラスＢ認定放射線実験室で実施された。
３．４．２．３貯蔵条件
未標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４は必ず、臨床試験材料のための前記病院の立ち入り制限区域の調剤室（温度は＋２から＋８℃の間でモニターされている）で保存された。
３．４．３治療群への患者の振り分け
任意抽出は用いなかった。患者は包含のための手続きにしたがって種々の用量群に割り当てられた。
【００８４】
３．４．４臨床試験での用量の選択
３．４．４．１ＢＩＷＡ４用量の選択
パートＡ：
ｈＭＡｂＢＩＷＡ４は以前に患者に投与されたことがなかったので、ＲＩＴ臨床試験を開始する前に前記抗体の安全性と生体分布について患者に告知しなければならなかった。その生体分布は、腫瘍に誘導するために用いられるＭＡｂの用量に大きく左右される可能性があり、注意深い考慮が必要とされるであろう。低親和性の抗ＣＤ４４ｖ６ｍＭＡｂＵ３６および高親和性の抗ＣＤ４４ｖ６ｍＭＡｂＢＩＷＡ１を用いたＭＡｂタンパク質増大実験をもとにして、最適な用量は２５−１００ｍｇの範囲で、ｍＭＡｂＵ３６については５０ｍｇが最適であろうと予測された。
この用量がまた中間的親和性のｈＭＡｂＢＩＷＡ４についても適切であることを確認するために、さらに腫瘍への取り込みの変動性に関する初期情報を得るために、２５、５０および１００ｍｇの総ｈＭＡｂＢＩＷＡ４で生体分布を調べ、３人の評価可能な患者をこれらの用量レベルの各々で処置するように計画した。
全ての評価可能な患者に、２０ｍＣｉの99mＴｃ（投与直前に放射線検定系によって測定）で標識した２ｍｇのｈＭＡｂＢＩＷＡ４を１回だけ静脈内に輸液した。２５ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇの投与を予定された患者は、それぞれ２３ｍｇ、４８ｍｇまたは９８ｍｇの非標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４を投与された（前記非標識抗体は２０ｍＣｉの99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４（２ｍｇ）と一緒に投与された）。
【００８５】
パートＢのためのＢＩＷＡ４用量の選択：
理論的見地から５０ｍｇのｈＭＡｂＢＩＷＡ４用量が更なる進展に最適であると計算された。この試験のパートＡを実施して、腫瘍へのｈＭＡｂＢＩＷＡ４の優先的取り込みが調べた３通りの用量レベル（２５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００ｍｇ）で確認された。これら３通りの用量レベルについて、腫瘍への取り込み（キログラム当たりの％注射用量（％ＩＤ／ｋｇ）として表現）および腫瘍への取り込み対非腫瘍への取り込み比は大きくは異ならないであろうと予測された。そのとおりであるならば、パートＢ実験で用いられるべきｈＭＡｂＢＩＷＡ４の用量は５０ｍｇであろう。しかしながらこれらの用量レベル間に臨床的に問題となる相違が存在する場合には（ある用量レベルが他方の用量レベルに勝る場合）、最良の分布パターンを示す用量レベルが選択されるであろう。
この場合、臨床的に問題となる差は、腫瘍への取り込み（腫瘍への取り込みの平均）対骨髄への取り込み比（骨髄への取り込みの平均＝細胞分画および上清）が５０％を越える差と定義される。
最終的には選択された用量はパートＡの結果をもとにして５０ｍｇのｈＭＡｂＢＩＷＡ４であった。
【００８６】
３．４．４．２放射線出発線量の選択
パートＢ：
この試験のパートＡで選択した用量のｈＭＡｂＢＩＷＡ４を186Ｒｅの線量を増大させながら標識した。
186Ｒｅ標識ネズミＭＡｂＮＲ−ＬＵ−１０の最大許容線量は重厚に予備処置された患者では９０ｍＣｉ／ｍ2であったが、一方、線量限界骨髄抑制は１２０ｍＣｉ／ｍ2で観察されることが報告された。キメラＭＡｂＮＲ−ＬＵ−１３（ＮＲ−ＬＵ−１０と同じ抗原を認識する）では、可逆的な骨髄抑制は６０ｍＣｉ／ｍ2で生じた。ｃＭＡｂＵ３６による実験（Vrije University University Medical Centerで実施された）では、線量限界骨髄抑制は４１ｍＣｉ／ｍ2で観察された。
上記の結果を考慮して、186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４として投与される２０ｍＣｉ／ｍ2の放射線量が安全な開始線量と考えられた。
前記線量を１０ｍＣｉ／ｍ2ずつ増加させた。より低い線量レベルでは２人の評価可能な患者を登録した。ＣＴＣでグレード２以上の薬剤関連毒性が観察されるときは、最低限３人の患者を各線量レベルで処置した。
次ぎに高い線量レベルに患者を登録する前に、実行中の線量レベルが以下にように定義される線量限界毒性（ＤＬＴ）を示していないことを必ず確認した：薬剤関連ＣＴＣグレード３の非血液学的毒性または薬剤関連ＣＴＣグレード４の血液学的毒性（吐き気および適切な抗嘔吐薬の処置がない場合の嘔吐を除く）。この目的のために、そのような実行中の線量レベルにある全ての患者を必ず十分に長期にわたって観察し誘発される可能性のある毒性が可逆的であることを確認した。
実行中の線量レベルで一人の患者がＤＬＴを示したときは、該当する線量レベルで処置されている患者総数を最大で６人に増やした。６人の患者のうちで１人がＤＬＴを示したときは、線量を次ぎのレベルに増大させた。２人または３人以上の患者がＤＬＴを示したときは、次に低い線量レベルで患者の総数を６人に拡大し（以前に実施されていない場合）、ＭＴＤおよびフェースＩＩの安全な推奨線量を確立した。
該当線量レベルで許容可能な毒性の場合（ＤＬＴを示す患者が２人未満）は、さらに追加の患者を登録し、前記患者に前記線量および低いほうの第二の増大線量を投与できることを最初に計画していた。この計画はリンカーの変更のために実施されなかった。ＭＡＧ３はＭＡＧ２ＧＡＢＡ−ＴＦＰ（類似のリンカーであるがより便利な結合方法を有する）で置き換えられるであろう。ＭＡＧ３を用いるこの開発プログラムは終了した。
また別に、186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の最初の投与に反応し、さらに耐性を示す患者は、５０ｍＣｉ／ｍ2の186ＲｅＢＩＷＡ４による第二の投与に適格であるとされた。
【００８７】
３．４．５各対象者に対する線量の選択とタイミング
３．４．５．１投薬および治療スケジュール
本研究者らは任意の時期に本治験薬を投与することを許可された。しかしながら、放射能標識と投与との間の時間は２４時間を越えることはできない。
３．４．６盲検
本臨床試験は自由な条件無しの試験であった。盲検は実施されなかった。
３．４．７先行治療および併用治療または方法
３．４．７．１救急治療および追加治療
アナフィラキシーはもっとも重篤な潜在的副作用と考えられ、直ちに抗体輸液の中止および適切な蘇生手段の確立が指示されるであろう。講じた予防措置は手の届く範囲内に蘇生備品（抗ヒスタミン剤、コルチコステロイドおよびエピネフリン）を置くことであった。このタイプの副作用を生じた患者は更なるモノクローナル抗体の投与は許可されなかった。
患者は、本臨床試験による指示のためにまたは包含および排除基準を与える無関係の疾患のために他の治療を受けることができる。全ての併用治療は必ずＣＲＦに記録された。
重篤な血液学的毒性（ＣＴＣグレード４）が生じた場合には、骨髄への毒性を軽減させるためにサイトカインによる措置または他の方法が許可された。
３．４．７．２制限
別に追加される化学療法または放射線療法は許可されず、最後の化学療法または放射線療法は本臨床試験に入る４週間より前に中止されていなければならない。
３．４．８治療に対するコンプライアンス
本臨床試験での投薬はただ１回の静脈内輸液であった。コンプライアンスは薬理学的消長検査および放射能免疫シンチグラフィー画像で立証された。
３．５有効性／臨床薬理学的および安全性測定項目
３．５．１有効性／薬理学的動態および実施された安全性測定法並びにフローチャート
フローチャート：
パートＡ
パートＡで実施した試験および対応するその時期の詳細は下記のフローチャートに示されている。前記試験の説明は以下のセクションで提示される。
【００８８】
【表４】
2005504517.tif 000023
【００８９】
*：輸液前の検査は実際の輸液前３週間を越えない。
ｘ1：血液サンプルは以下について検査された：グルコース、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、クレアチニン、総タンパク質、アルブミン、血清グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ｓＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ｓＧＰＴ）、アルカリ性ホスファターゼ、ガンマグルタリルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ビリルビン、尿素、尿酸、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ヘマトクリット（Ｈｔ）、平均血球体積（ＭＣＶ）、網状赤血球、白血球、好中球、バンド、リンパ球、好塩基球、好酸球、単球および血小板をスクリーニング診察時または輸液前の１日目並びに輸液後２１、４８および１４４時間、および６週間。
ｘ2：ＨＡＨＡは、スクリーニング診察時、並びに輸液後１週間（１４４時間）および輸液後６週間に採取した血清サンプルで検査した。
ｘ3：生命徴候は、スクリーニング診察時、輸液前、輸液後１０、６０および１２０分並びに輸液後６週間で検査した。
ｘ4：全身スキャンは輸液直後および輸液後２１時間で実施した。
ｘ5：ＳＰＥＣＴスキャンおよび平面画像スキャン（planar scan）は輸液後２１時間に一度実施した。
ｘ6：薬理学的消長検査用血液サンプルは、輸液前、輸液終了時、輸液終了後５、１０、３０分、１、２、４、１６、２１、４８、７２および１４４時間並びに６週間で採取した。血液サンプルは免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および放射能活性の測定のために採取された（詳細はセクション９．５．４．１を参照されたい）。尿は、輸液後最初の２４時間では０−４時間、４−８時間、８−１２時間および１２−２４時間で、さらに輸液後４８時間までの残りの時間については２４時間サンプルとして採集された。
ｘ7：可溶性ＣＤ４４ｖ６は、輸液前、輸液後２１、４８および１４４時間並びに輸液後６週間で採取された血清サンプルで測定された。
６：６週
【００９０】
パートＢ
実施した検査および対応する時期は下記のフローチャートに示されている。個々の検査は以下のセクションでさらに詳細に記載されている。
【００９１】
【表５】
2005504517.tif 000024
【００９２】
*：輸液前の検査は実際の輸液前３週間を越えない。
ｘ1：血液サンプルは以下について検査された：グルコース、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、クレアチニン、総タンパク質、アルブミン、ｓＧＯＴ、ｓＧＰＴ、アルカリ性ホスファターゼ、ＧＧＴ、ビリルビン、尿素、尿酸、ＴＳＨ、Ｈｂ、Ｈｔ、ＭＣＶ、網状赤血球、白血球、好中球、バンド、リンパ球、好塩基球、好酸球、単球および血小板をスクリーニング診察時または輸液前の１日目並びに輸液後２１、４８および１４４時間。輸液後２−６週間には一般血液検査サンプルは少なくとも１週間に１回採取された。
ｘ2：ＨＡＨＡは、スクリーニング診察時、並びに輸液後１４４時間および輸液後６週間に採取した血清サンプルで検査した。
ｘ3：生命徴候は、スクリーニング診察時、輸液前、輸液後１０、６０、１２０および２４０分並びに６週間に１回検査した。
ｘ4：全身スキャンは輸液直後、輸液後２１、４８、７２、１４４時間および場合によって輸液後２週間に実施した。
ｘ5：平面画像スキャンは輸液後２１、４８（任意）、７２、１４４時間および場合によって２週間後に実施した。ＳＰＥＣＴスキャンは輸液後７２時間で実施した。
ｘ6：薬理学的消長検査用血液サンプルは、輸液前、輸液終了時、輸液終了後５、３０分、１、２、４、１６、２１、４８、７２、１４４、２４０および３３６時間で採取した。血液サンプルはＥＬＩＳＡおよび放射能活性の測定のために採取された。尿は、最初の２４時間には０−４時間、４−８時間、８−１２時間および１２−２４時間で、さらに輸液後９６時間までの残りの時間については２４時間サンプルとして採集された。
ｘ7：可溶性ＣＤ４４ｖ６は、輸液前、輸液後２１、４８および１４４時間、並びに輸液後６週間で採取された血清サンプルで測定された。
ｘ8：症状の評価は、経過観察するべき症状の進行または消失まで６週間毎に繰返した。胸部ＣＴは基準時に実施し、異常があった場合は経過観察で繰り返した。
【００９３】
３．５．１．１放射能免疫シンチグラフィーおよびドシメトリー
放射能免疫シンチグラフィー（ＲＩＳ）から得られたデータは、パートＡおよびＢの両方について定性的に（すなわち腫瘍、骨髄、肝臓、肺臓、腸、腎臓および追加の器官の取り込みは低い、中または高いと表現された）、さらにパートＢについては定量的に提示された。
定性的評価のために、等級は数字に変換された（０は取り込み無し、１は低い取り込み、２は中等度の取り込み、３は高い取り込み）。平均値を計算し提示した。
パートＢのためにＲＩＳの結果の定量的表示は、以下のパラメーターを包含することによって本プロトコルのセクション５．１．４で概略したようにドシメトリーの計算を使用した：
＊メガベクレルで表されるある時点の実際の器官の放射能
＊時間で表される器官内の放射能滞留時間
＊ｍＧｙ／ＭＢｑで表される吸収（放射線）線量
＊ｍＳｖで表される有効（放射線）線量
ドシメトリー分析に関する更なる詳細はドシメトリーレポート（２００１年１１月２１日付け）で見出すことができる。
ｅ）放射能免疫シンチグラフィーの方法
パートＡおよびＢで用いた方法および時期に関する説明は下記のセクションで提示される。
パートＡ
低エネルギーコリメーターを搭載した大視野用二重雲台付き（dual headed）ガンマカメラを用いて全身のデジタル画像（腹側背側（ａ．ｐ．）および背側腹側（ｐ．ａ．））を、輸液直後および輸液後２１時間に得た。輸液後２１時間に頭頸部の平面画像およびＳＰＥＣＴ画像を得た。検量線源もまた入手した。データは定量分析を可能にするために保存した。
パートＢ
低エネルギーコリメーターを搭載した大視野用二重雲台付きガンマカメラを用いて全身のデジタル画像（ａ．ｐ．およびｐ．ａ．）を、放射能免疫共役物の投与直後、前記投与後２１、４８、７２および１４４時間に得た。さらにまた頭頸部の平面画像を輸液後２１、４８（任意）、７２および１４４時間に得た。場合によってさらに追加の（全身および平面）画像を輸液後２週間で得た。アダムズファントムに挿入した検量線源（すなわち１０ｍＬバイアル中の注射用量の既知の分画を含む部分標本）を、全身スキャン中に患者の下腿の間に必ず置いた。検量線源の最初の放射能は１００−２００ＭＢｑ１８６Ｒｅでなければならず、この線源は全ての全身画像化試験の間に必ず用いた。エネルギーウィンドウおよびピークの設定、スキャン速度、スキャンの長さ、スキャンの日付、スキャン開始の時間およびスキャンの持続時間を必ず記録した。頸部および腹部の腹側−背側の厚さを必ず測定し、一方患者はスキャンニング台上で仰臥位に置いた。
各画像化セッションで腹側および平面静止画像を必ず入手し、前記画像の直前または直後に静止画像をアダムズ−ファントムの検量線源から入手した。
輸液後７２時間に、頸部のＳＰＥＣＴ検査を必ず実施した。再構成に用いた方法およびカットオフ頻度を含むフィルターの性能は必ず報告した。
【００９４】
単光子放出コンピューター支援断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）
ＳＰＥＣＴ画像は低エネルギーコリメーターを搭載した二重雲台を有する回転ガンマカメラを用いて得られた。捕捉には少なくとも３０分を要した。２０％対称ウィンドウを１３７ｋｅＶの光子ピークで中心にくるように調整した。
平面およびＳＰＥＣＴデータ捕捉パラメーター
平面画像化には以下の最小限の要件が含まれていた：マトリックス１２８ｘ１２８（細部）または２５６ｘ２５６（全身）および最小４０００００カウントで最大捕捉時間は細部については１０分および全身については６０分。
ＳＰＥＣＴ画像化には以下の最小限の要件が含まれていた：６４画像、マトリックスサイズ６４ｘ６４、３６０度の円軌道、単位角度につき６０秒の捕捉。
データの分析
輸液後２１時間の腹側の全身画像で、問題の四角の領域（ＲＯＩ）を全身と検量線源の周りに描いた。さらにまた186Ｒｅを蓄積する器官（例えば肝臓、脾臓および左の腎臓）の周囲および腫瘍の周囲の不規則なＲＯＩも必ず描いた。１つまたは２つ以上の代表的なバックグラウンド領域を必ず描いた。これらの領域は背側の画像に反映されねばならない。最初は背側画像上の仙骨の周囲にＲＯＩ描くことを計画した。この計画は本臨床試験の間実施されなかった。全ての領域はコンピューター上に保存し、これらのＲＯＩを他の時点で画像に投影させねばならない。各領域中のピクセルの数およびピクセル当たりのカウントを必ず記録した。全ての画像化の時点について領域中のカウント数をスプレッドシートにデジタルで記録した。
【００９５】
器官の吸収線量の計算
器官、腫瘍および全身の放射能の量は、腹側面および背側面のＲＯＩ内のジオメトリー平均カウントから計算した。表示されているときは、バックグラウンドおよび減弱補正が適用された。尿の放射能は最初に予定したとおり、膀胱内の吸収線量の概算に用いられなかった。その代わりに動的膀胱モデルを用いた。前記器官および身体の残りの滞留時間を計算してＭＩＲＤＯＳＥ３プログラムに移入した。
要求される品質管理試験
平面画像化：
日常的な品質管理を放射線医学科（department of nuclear medicine）で毎週実施した：
１）１００Ｍフラッドテーブル
２）低エネルギーコリメーターをもつ外部57Ｃｏフラッドを毎週得た。
ＳＰＥＣＴ画像化：
ＰＥＣＴＳ画像化系の品質管理はローテーション決定センターを含む必要があった。
断層撮影方法
ランプフィルム使用断層撮影画像再構成にフィルター付きバックプロジェクションアルゴリズムを用いた。
データの保存
全ての平面画像および断層撮影データは必ず磁気テープまたは光学ディスクに永久的に保存した。断層撮影試験のために、最初の投影画像および再構成試験は必ずバックアップテープに書き込んだ。
画像および報告の写し
全ての関連する画像、病理および外科手術の報告の写しは全患者のために要求された。ＭＲＩおよびＣＴの報告の写しも必要であった。
【００９６】
３．５．１．２99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の生検内分布（パートＡ）
この試験のパートＡに登録された患者は放射能標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の輸液後外科手術を受けた。手術標本内の腫瘍部位および正常組織（可能なかぎり多く）の生検を得た。さらにまた全身麻酔下で骨生検および骨髄吸引物を得た。前記骨髄吸引物を遠心沈澱させ上清（血漿）および沈殿物（細胞分画）中の放射能を検定した。
全ての生検の重量を測定し、さらに99mＴｃの量を測定した。腫瘍への放射能の特異的取り込みは腫瘍の％ＩＤ／ｋｇを正常組織の％ＩＤ／ｋｇと比較することによって調べた。
ＣＤ４４ｖ６抗原の発現を凍結切片を用いて免疫組織化学的に調べた。凍結切片を先ずｍＭＡｂＢＩＷＡ１とインキュベートし、続いて抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）二次試薬でインキュベートした。外科標本および生検は組織病理学的／細胞病理学的に調べた。
外科標本および生検の精査
外科標本を受け取った後、標本を以下の時間的流れで処理した。
１．標本の写真を撮影する。ポラロイド写真は正面を、スライド写真は正面および背面を撮影した。
２．前記外科標本のサイズを測定した。
３．原発腫瘍、疑いのあるリンパ節の生検、（および可能な場合には外科標本中の正常な粘膜のような正常組織由来の生検）、正常なリンパ節、脂肪および筋肉の生検を採取した。全ての生検の重量を測定し、99mＴｃの量を測定した。全てのデータを％注射線量／ｋｇ組織に変換した。腫瘍への放射能の特異的取り込みを、％ＩＤ／ｋｇ腫瘍と％ＩＤ／ｋｇ正常組織とを比較することにより査定した。
４．次に標本を釘で板に固定し、４％のホルムアルデヒドで少なくとも３６時間固定した。
５．胸骨鎖骨乳頭様筋（高い放射線濃度をもつ構造）を切開した後、標本のＸ線写真を作製し、含まれるリンパ節の正確なサイズおよび位置を示した。このＸ線写真は、９６％エタノール（脂肪と同じようにＸ線を吸収する）に標本を浸漬している間に作製した。
６．Ｘ線で可視化した前記の全リンパ節をポラロイド写真および標本のＸ線写真に表示した。
７．外科標本の精査およびＸ線写真により見つけられた全てのリンパ節を外科標本から切り出した。
８．肉眼的に陰性の全リンパ節を顕微鏡検査のために完全に処理し、ただ１つの切片を査定した。肉眼的に陽性であった全てのリンパ節から２つまたは３つ以上の薄片を作製した。腫瘍壊死の有無についての肉眼的証拠を記録した。
９．さらにまた、含まれるリンパ節の数、並びに腫瘍含有リンパ節の数、位置およびリンパ節レベル（スローンケタリング記念癌センターの分類（Memorial Sloan Kettering Cancer Center Classification）にしたがう）を記録した。
【００９７】
３．５．１．３腫瘍の反応（パートＢ）
本放射能免疫治療の有効性パラメーターは腫瘍の反応であった。腫瘍反応は、臨床的査定および／またはＣＴ、ＭＲＩまたは骨シンチグラフィーによる精査にしたがって腫瘍を調べることによって査定した。査定は世界保健機構（ＷＨＯ）の反応基準にしたがって実施した。本プロトコルの添付文書ＶＩ（Ｒ９６−０９４１）を参照されたい。
３．５．１．４健康診断
本臨床試験に加える前に、各患者の症状の状況をＥＮＴ−検査（触診を含む）およびＣＴまたは腫瘍部位のＭＲＩによって査定した。
全ての頭頸部病巣は頸部の側面毎に記載した。
触診
全ての患者は基準時に耳鼻咽喉科医師／頭頸部外科医が診察した。前記医師は、頭頸部領域の全ての触診可能リンパ節の数、サイズ、位置、可動性を査定した。前記リンパ節の特徴は以下のように記載された：疑いなし、疑いあり、または腫瘍浸潤。頸部リンパ節の状況は、国際癌撲滅協会（ＵＩＣＣ）の腫瘍病期判定のための腫瘍結節転移系（Tumour Node Metastasis system）にしたがって診断時に分類した。
【００９８】
放射線検査
腫瘍部位の分布にしたがって、１つまたは２つ以上の以下の検査が要求された：ＣＴ、ＭＲＩ、骨シンチグラフィー。頭頸部領域の腫瘍が含まれる場合はＭＲＩが一般に好ましい。骨病巣が存在する場合はＣＴが好ましい。パートＢについては、基準時に得られた全ての放射性診断パラメーターは、輸液後６週間および経過観察終了まで６週間毎に繰り返された。本臨床試験のパートＢに登録された患者では、基準時に胸部ＣＴを実施し、胸部に腫瘍病巣が存在する場合は経過観察で繰り返した。超音波診断は腫瘍画像化の追加技術として用いることができる。精密検査のガイドラインは以下に提示されている：
原発腫瘍／移動性限局性（loco-regional）再発
本臨床試験のパートＡに参加する患者および移動性限局性再発を示す患者（パートＢ）の場合、ＣＴスキャンおよび／または頭頸部領域のＭＲＩを必ず実施した。
コンピューター支援断層撮影
頭頸部領域のコンピューター支援断層撮影：ダイナミックＣＴがスパイラルＣＴより好ましい。しかしながら、スパイラルＣＴは協力的に動くことができない患者には有用であろう。
患者の検査は、必ず仰臥位で、首はわずかに伸ばし、頭部は固定し、肩の力をぬいて下方に押して実施した。患者は胸部の筋肉ではなく腹部の筋肉を使って静かに呼吸することを要求される。スキャンする領域は横向きの投影で作製した最初の全体像から判断した。スキャンの面は必ず声帯の面に対して平行でなければならない。３ｍｍの連続するスライスを常に用いなければならない。画像化は頭蓋基底から上部縦隔まで実施した。
磁気共鳴画像化
患者は必ず、首をわずかに浸透させ頭部を固定して仰臥位で検査した。患者は検査中静かに呼吸することを要求され、胸部筋肉ではなく腹部筋肉を使用するように指示された。頸部を解剖学的に示し、原発病巣の範囲および拡散したリンパ節の存在を査定することができる適切な画像が得られた。前記のような画像は頭蓋基底から上部縦隔にわたって入手しなければならない。
【００９９】
遠位転移
本臨床試験のパートＢに参加する全ての患者で、胸部のＣＴスキャンを基準時に実施した。転移を可視化するためのまた別の精密検査（例えば骨シンチグラフィーまたは腹部ＣＴ）も場合によって実施された。
胸部ＣＴ
スパイラルＣＴスキャンを実施した。患者は仰臥位で腕を頭の上に挙げて検査された。患者は、胸部筋肉ではなく腹部筋肉を使用して静かに呼吸することを要求された。スキャンは肺のすぐ上から副腎位まで実施した。画像は縦隔と肺をセットとして撮影されねばならない。
腹部ＣＴ
スパイラルスキャンを実施した。患者は仰臥位で腕を頭の上に挙げて検査された。患者は静かに呼吸することを要求された。全ての患者で経口用コントラストを使用した。画像は腹部と肝臓をセットとして撮影されねばならない。
骨シンチグラフィー
最大６００ＭＢｑの99mＴｃ標識ＨＤＰ／ＭＤＰの静脈内輸液後、患者は十分な液体を摂取し、頻繁に排泄するように要求された。以下の静止画像を輸液後３時間に得た：１枚の全身像および必要な場合にはさらに３枚の細部像。疑いのある病巣はＣＴおよび／またはＭＲＩによるより厳密な分析が必要であろう。
骨転移反応の報告は、別個の反応基準群にしたがって実施する予定であった。そのようなデータは提供されなかった。
【０１００】
３．５．１．５可溶性ＣＤ４４ｖ６
可溶性ＣＤ４４ｖ６（ｓＣＤ４４ｖ６）は血清で必ず測定した。濃度は有効な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。前記アッセイは、市販の検査キットを用い、現在の国際的ガイドライン（Boehringer Ingellheim Department of Pharmacokinetics and Drug Metabolism, Biberach, Germany）にしたがって実施した。５ｍＬの血液サンプル（処理して血清を得る）を輸液前、輸液後２１、４８および１４４時間、さらに輸液後６週間で得た。サンプルを凝血させ、遠心分離して血清を調製した。保存および輸送条件：ＥＬＩＳＡ測定用サンプルは凍結用試験管に入れ、個々に識別できるように慎重にラベルを付し、放射能が減少するまで−２０℃で保存し（186Ｒｅ：４週間、99mＴｃ：３日間）、バッチとして４週間毎にベーリンガーインゲルハイムの施設（Boehringer Ingellheim Department of Pharmacokinetics and Drug Metabolism, Biberach, Germany）に送った。前記血清サンプルはドライアイスに入れて輸送した。
【０１０１】
３．５．１．６安全性
対象者の保護
全ての患者を放射能標識モノクローナル抗体投与中または投与後注意深くモニターした。そのために少なくとも試験担当者の少なくとも１人が立ち会った。
臨床検査
血液サンプルは、以下の時点でグルコース、ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化物、クレアチニン、総タンパク質、アルブミン、血清グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ｓＧＯＴ）、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ｓＧＰＴ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、ガンマグルタリルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、ビリルビン、尿素、尿酸、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ヘマトクリット（Ｈｔ）、平均血球体積（ＭＣＶ）、網状赤血球、白血球、好中球、バンド、リンパ球、好塩基球、好酸球、単球および血小板用に採集した：
−スクリーニング診察時または輸液前の１日目並びに
−輸液後２１、４８および１４４時間。
−パートＡの場合は輸液後６週間、パートＢの場合は臨床試験中の第２、３、４、５および６週目に少なくとも周に１回（毒性が認められる場合にはさらに頻繁に）。
輸液前の基準時臨床検査は、スクリーニング診察時または試験１日目に実施したが、ただしサンプルは放射能標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の輸液前２１日を越えず、さらに全ての必要な検査が実施されることを条件とした。資格のある医師が全ての要求された臨床検査結果を概覧し、抗体輸液前に患者の適格性について確認した。同様なことが本臨床試験のパートＢでの第二のｈＭＡｂＢＩＷＡ４の投与でも適用された。
尿サンプルは以下の時点で標準的な臨床スクリーニングのために（タンパク質、血液およびグルコース）採集された。
−スクリーニング診察
−輸液後１週間（輸液後１４４時間）
−輸液後６週間
妊娠検査は、スクリーニング診察および試験終了時に妊娠の可能性がある女性について必要であった。
【０１０２】
ヒト抗ヒト抗体測定
ＨＡＮＡの存在および／または出現は血清サンプルで調べられた。したがって５ｍＬの血液（血清を得るために処理）をスクリーニング診察時、抗体の輸液後１週間（１４４時間）および６週間に採取した。本臨床試験のパートＢで２回のＢＩＷＡ４投与を受けた患者の場合は、さらに追加のＨＡＨＡサンプルを２回目の投与の前に採集した。血清レベルは有効なＥＬＩＳＡ方法で調べた。
サンプルは凝血させ遠心分離して血清を調製した。
保存および輸送条件：ＥＬＩＳＡ測定用サンプルは凍結用試験管に入れ、個々に識別できるように慎重にラベルを付し、放射能が減少するまで−２０℃で保存し（186Ｒｅ：４週間、99mＴｃ：３日間）、バッチとして４週間毎にベーリンガーインゲルハイムの施設（Boehringer Ingellheim Department of Pharmacokinetics and Drug Metabolism, Biberach, Germany）に送った。前記血清サンプルはドライアイスに入れて輸送された。
一切のヒト抗ヒト抗体の上昇は患者の起こりえる副作用と併せて事例毎に注意深く比較した。このデータを収集し、本臨床試験の進行中に遡及的に分析した。
副作用
全ての副作用をＣＲＦに記録した。副作用は米国立癌研究所ＣＴＣ（ＮＣＩ−ＣＴＣ）ヴァージョン２．０にしたがって等級を付与した（前記ヴァージョンの文書は下記のサイトでインターネットからダウンロードする必要がある：http://ctep.info.nih.gov/CTC3/ctc.htm）。全てのＳＡＥは必ず報告された。
【０１０３】
免疫原性および毒性
本臨床試験の実施前には、ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の安全性および免疫原性に関するヒトのデータは存在しなかった。元のネズミ抗体ＢＩＷＡ１で実施した以前の試験では、臨床的に顕著な毒性は認められなかった。そのままの（naked）ｈＭＡｂＢＩＷＡ４抗体単独による毒性は予期されなかった（in vitroでの抗体依存性細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）エフェクター作用無し；予想される抗原発現細胞の増殖に対する干渉無し）。ｈＭＡｂＢＩＷＡ４はマウス（異種移植試験）およびサル（毒性試験）に安全に投与できることが示された。３とおりの局所毒性試験で良好な局所耐性が示された。
ネズミおよびキメラＭＡｂＵ３６（特定のオーバーラップエピトープ特異性を有する抗ＣＤ４４ｖ６エピトープ）は、ＨＮＳＣＣ患者でこれまでのところ安全であった；骨髄毒性（186Ｒｅによって生じる）を除いて、毒性は、ｃＭＡｂＵ３６を用いたフェースＩ線量増大ＲＩＴ試験では認められなかった。放射能標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４に対する過敏反応が生じる可能性は理論的には可能であった。モノクローナル抗体は診断のために数千人の患者に投与されている。
ありそうなことではないが、静脈内に投与されたＢＩＷＡ４に対する潜在的な反応には低血圧、一過性の発熱および冷感、皮膚の発疹、呼吸困難、痒み、吐き気およびアナフィラキシーが含まれる。
生命徴候（血圧、体温、脈拍および呼吸数）はしたがってスクリーニング診察時および以下の時点で記録された：輸液前並びに輸液後１０、６０、１２０分および６週間。さらに追加の生命徴候は、パートＢに参加した患者についてのみ輸液後２４０分に記録された。
本臨床試験では放射性核種が使用された。ガンマ線放出核種99mＴｃ（この試験では２０ｍＣｉ）に付随する放射線負荷は多くの通常の放射線治療方法で遭遇するものと類似しており、小さなものであることが判明していた。膀胱および腎臓への放射能被爆を最小限にするために、患者には十分に水分が補給され、さらに最初の４８時間（186Ｒｅ標識抗体の輸液後９６時間）頻繁に排泄するように要請した。
ベータおよびガンマ線放出核種186Ｒｅの場合、Breitzら（Ｒ９８−２４５９）は、大量に予備処置された患者では186Ｒｅ標識ＭＡｂＩｇＧの最大許容線量は９０ｍＣｉ／ｍ2であることを見出した。この試験の目的の１つは、他の選択治療が利用できない末梢および／または局所の再発症状をもつか、または遠位転移をもつ患者での186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の毒性を調べることであった。骨髄、甲状腺、腎臓および肝臓に対する毒性が発生する可能性があるので、器官の機能検査のための血液サンプルをセクション３．５．１．６に記載したように採取した。
体重低下または体重増加の発生をモニターするために、体重をスクリーニング診察時、輸液前および６週間後に記録した。
患者は末梢での毒性出現についてモニターされた。末梢の毒性を示すいずれの徴候も副作用として記録した。
【０１０４】
３．５．２測定法の適切性
用いた測定法はこのタイプの臨床試験にとって良好であることが認められている。
３．５．３主要有効性／薬理動態における測定項目
３．５．３．１臨床試験パートＡ
本臨床試験のパートＡで決定される主要な有効性の測定項目は生検における分布および放射能免疫シンチグラフィーであった。前記データを得るための方法の説明はセクション３．５．１．１および３．５．１．２に示されている。
正常組織および腫瘍における取り込みを外科標本の生検で測定し、前記取り込みをｋｇ当たりの注射線量のパーセント（％ＩＤ／ｋｇ）として表した。腫瘍および他の組織における取り込みのタイムコースを調べ、種々の用量のＢＩＷＡ４について比較した。
３．５．３．２臨床試験パートＢ
有効性についての主要パラメーターは放射能免疫シンチグラフィーおよびドシメトリーの分析であった。
３．５．４薬剤濃度測定法／薬理学的消長
放射能標識ＢＩＷＡ４の血中濃度を本臨床試験のパートＡおよびパートＢの両方で求めた。
３．５．４．１サンプル採集の方法とタイミング
患者の血液サンプルは以下のように採集し取り扱った：７ｍＬの血液（ＥＤＴＡカリウム含有試験管に３．５ｍＬおよび凝固用試験管に３．５ｍＬ：必要とされるミリリットル量は修正１に示されている）を輸液部位とは反対の腕の末梢静脈から指定の時点でサンプル採取した（すなわち抗体投与の直前、輸液終了時、および輸液終了後５、１０、３０分、１、２、４、１６、２１、４８、７２時間、さらに輸液後１日（１４４時間）および６週間）。輸液終了時をｔ＝０とみなした。
輸液後１０分および６週間での予定サンプルは臨床試験のパートＢでは省略した。その代わりに修正１に示したように輸液後２４０および３６６時間にサンプルを採集した。
尿は、99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４輸液後４８時間の間および186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４輸液後９６時間の間で採集した。尿は最初の２４時間では０−４時間、４−８時間、８−１２時間および１２−２４時間で、さらに残りの時間には２４時間サンプルとして採集した。尿サンプルの放射能を計測して放射能の排泄を測定した。
血液サンプルは遠心分離して血清を調製した。処理前に、全血の放射能を測定した。放射能はまた血清でも測定した。血液の冷蔵保存は必須であったが、凍結されてはならない。共役調製物から得た部分標本を用いて、患者に注射した用量で構成された、重量測定稀釈物を標準物として調製した。患者のサンプルと標準物の計測を現地のＳＯＰにしたがって実施した。結果をＣＲＦの適切なセクションに記録した。放射能核種の含有量は注射線量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｋｇとして表現）として報告した。放射能計測とは別に、全てのサンプルをＨＰＬＣ分析によって免疫複合体の存在について分析した。
全てのサンプル試験管に以下の情報を含むラベルを付した：試験番号、患者番号、サンプルの特定（すなわち血清、血漿または血液）、輸液に対する時間、実際の時間、実際の日付および放射性同位元素（すなわち99mＴｃまたは186Ｒｅ）。各尿サンプルの容積を測定し記録した。全ての尿サンプルに以下の情報を含むラベルを付した：試験番号、患者番号、総サンプル容積、採集間隔、実際の日時および放射性同位元素（すなわち99mＴｃまたは186Ｒｅ）。
日時および全ての薬理学的消長測定サンプルの放射能測定結果をＣＲＦに記録した。
ＥＬＩＳＡ測定用血漿サンプルは凍結用試験管に移し、個々の識別が可能なように慎重にラベルを付し、放射能が減少するまで（186Ｒｅ：４週間、99mＴｃ：３日）−２０℃で保存し、ベーリンガーインゲルハイムの施設（Department of Pharmacokinetics and Drug metabolism, Biberach, Germany）へバッチとして４週間毎に輸送した。血漿サンプルはドライアイスに入れて送った。
【０１０５】
３．５．４．２分析測定
血漿サンプルは、有効性が実証されたＥＬＩＳＡ方法によりベーリンガーインゲルハイムの施設（Department of Pharmacokinetics and Drug metabolism, Biberach, Germany）で測定された。サンプルの放射能計測は全血、血清および尿で試験者によって実施された。
３．５．４．３パラメーターおよび査定
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ３．１プロフェッショナル（Pharsight Corporation, Mountain View, CA）を用いて以下の薬理学的消長パラメーターを全血、血漿、血清レベルおよび画像化データから以下に記載したように求めた：
主要薬理学的消長パラメーターは、最大薬剤濃度（Ｔmax）が観察される時点、観察された最大薬剤濃度（Ｃmax）、濃度時間曲線内の面積（ＡＵＣ）0→∞、末端排除半減期（ｔ1/2）、分布体積（終末期および予想される安定状態）、全身クリアランス（ＣＬ）および平均滞留時間（ＭＲＴ）0→∞である。
薬理学的消長分析の主要目的は以下のとおりであった：
99mＴｃ標識（パートＡ）および186Ｒｅ標識（パートＢ）ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の単回投与後の総放射能および免疫反応性ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の分布を決定することおよび比較すること。
画像化データおよび血中分布データから、試験中に肝臓および腎臓に到達する注射された放射能の分画を算出すること。この目的を達成するために、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）ソフトウェアパッケージを用いて、静脈内投与後の免疫反応性ｈＭＡｂＢＩＷＡ４および血中総放射能レベルの血漿濃度対時間のプロフィルに対する非区画化（non-compartmental）薬理学的消長分析を時間の関数として実施した。
結果は統計の要旨として報告される。
【０１０６】
３．５．５薬理学的消長／薬理学的動態の関係
ヒトでの186Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４の分布および代謝を記載するために先ず初めに区画化（compartmental）薬理学的消長モデルを考えた。ＢＩＷＡ４血漿レベル、全血および血清の放射能測定、全身画像および問題の特定領域の放射能、186Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４投与線量、非標識ＢＩＷＡ４の投与量、可溶性ＣＤ４４ｖ６レベルおよび輸液前の放射能標識抗体の測定から得たデータを一緒にすることが意図された。
結果は統計の要旨として報告しようとしたが、合理的なモデルとして使用するには変動性は高すぎた。
３．５．６主要な安全性測定項目
最大許容線量の決定および安全性の評価が本臨床試験のパートＢの主要目的であった。
３．５．６．１線量限界毒性および最大許容線量
ＤＬＴは、薬剤関連ＣＴＣのグレード３の非血液学的毒性または薬剤関連ＣＴＣのグレード４の血液学的毒性（適切な抗嘔吐剤治療を施されない場合の吐き気および嘔吐を除く）と定義された。
ＭＴＤは、６人の患者のうち２人が薬剤関連ＤＬＴを生じる線量レベルと定義された。
３．６データの質の保証
本臨床試験は一般的には、適切な規制およびそれら規制を反映した企業の標準操作方法（standard operating procedures）で明確に指定されている臨床試験実施基準（Good Clinical Practice）の原則にしたがって実施された。
本臨床試験の全過程で、ベーリンガーインゲルハイムオランダの代表者が本臨床試験現場と連絡をとり、および／または現場を訪れて、試験の進行をモニターした。データ監査（出発資料と事例報告書との比較および薬剤評価のチェックを含む）を目的として、頻繁な試験者らとの接触および現場訪問が実施された。試験者または試験者が指名した者は、ベーリンガーインゲルハイムオランダの代表者が現場を訪問したときには必ず接触することができる状態であった。
適切に記入されたＣＲＦは規則的に収集された。データは当該組織内で記入されたダブルデータであった。データの検閲を実施し、信じがたいデータは試験者に質問した。
重篤な副作用はプロトコルおよびＣＲＦに規定されたガイドラインにしたがって、さらにベーリンガーインゲルハイムのＳＯＰにしたがって報告された。
【０１０７】
３．７プロトコルで予定された統計の方法およびサンプルサイズの決定
３．７．１統計計画および分析計画
３．７．１．１統計のデザイン／モデル
本臨床試験で使用したデザインは、腫瘍臨床試験のフェースＩで一般的に用いられている。
パートＡ
本臨床試験フェースＩのパートＡは、頭頸部の進行した扁平上皮細胞癌の患者で、99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の単回輸液の安全性、許容性、生体分布および薬理学的消長を決定するための条件無しの連続的用量増加群試験であった。
本臨床試験のこの部分では、３通りのｈＭＡｂＢＩＷＡ４用量レベルを各用量レベルで予定された３人の患者で用いた。すべての患者は頭頸部の腫瘍が証明され、外科手術を予定されていた。
パートＢ
本フェースＩ試験のパートＢは、頭頸部の進行した扁平上皮細胞癌の患者であって別の治療方法が利用できない場合に、186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の単回輸液の安全性、許容性、ＭＴＤ、薬理学的消長および予備的治療効果を決定するための自由な、条件無しの線量増大試験であった。
本臨床試験のこの部分では放射線量を増大させた。グレード２未満のＣＴＣ毒性が認められる線量レベルで２人の患者を処置した。グレード２以上の毒性が認められる場合には、各線量群につき少なくとも３人の患者を処置した。
安全性および許容性の評価（パートＡ＋パートＢ）
本臨床試験の安全性および許容性は一般検査パラメーターの変化、生命徴候、ＨＡＮＡの発生および副作用出現傾向によって査定した。結果は、各線量レベルについて個々に報告するだけでなく、全体的な手段によっても報告した。
生体分布の評価（パートＡ）
固形組織中の99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の生体分布を、放射能免疫シンチグラフィー（セクション３．５．１．１を参照されたい）によって、さらに生検標本の放射能測定（セクション３．５．１．１および３．５．１．２を参照されたい）によって査定した。各線量レベルにつき最大３人の患者が登録されただけであるので、記載的統計のみが可能であった。
免疫シンチグラフィーによる画像化の評価（パートＡ＋パートＢ）
放射能標識抗体の投与後ある時点で、免疫シンチグラフィー画像を得た（セクション９．５．１．１を参照されたい）。繰り返せば記載的統計のみが利用可能であった。
薬理学的消長の評価（パートＡ＋パートＢ）
以下の薬理学的消長のパラメーターは、血漿または血清、尿レベルおよび画像化データから下記に記載したように決定した。
一次パラメーター（非区画化）
Ｔmax、Ｃmax、ＡＵＣ（０−無限大の時間）、末端排除半減期、分布体積（終末期Ｖzおよび予想される安定状態Ｖss）、ＣＬおよびＭＲＴ（０−無限大の時間）。時間経過における放射能の累積尿中排出が総排出尿から決定された。
二次パラメーター（区画化）
ヒトで186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の分布および代謝を明らかにするために、区画化薬理学的消長モデルを開発しようと計画した。前記モデルによって、血清および尿の放射能測定、全身および問題の特定領域の画像から得られた放射能、投与された186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４線量、コールドのｈＭＡｂＢＩＷＡ４投与用量、可溶性ＣＤ４４ｖ６、並びに輸液前の放射能標識抗体の検定から得られたデータが照合された。
結果は、各線量レベルについて別個に、および統計の要旨を用いて報告することが計画された。
治療効果の評価（パートＢ）
腫瘍の反応は治療の有効性のパラメーターであった。腫瘍反応はＷＨＯのガイドラインにしたがって判定した。全測定腫瘍病巣の垂線の最大長の合計は腫瘍反応の一次パラメーターであった。骨病巣の反応の判定については別個の基準が存在した。
【０１０８】
３．７．１．２ゼロ仮説およびまた別の仮説
本臨床試験での全ての分析は性質として記載的および探査的であった。全ての統計的検査は、結果を考察し更なる調査の計画を支援する統計的フレームワークを提供するためにのみ実施された。正式な統計的推論は予測されず、したがって統計的検査は実施されなかった。
３．７．１．３計画された分析
以下の２つの集団が区別された：
＊治療意図サブセットは、放射能標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の輸液を受け、さらに基準時以後のデータが利用可能な全ての患者から成る；
＊パープロトコルサブセットは評価可能な患者から成る。患者が以下の基準を満たす場合、前記患者は評価可能である：
パートＡ：
１．治療意図（intention to treat）サブセットのための基準を満たした。
２．副作用、生命徴候並びに一般検査用血液および尿サンプルに関する経過観察が適切であった。
３．実施された両アッセイのうち少なくとも１つで免疫反応性分画が６０％を越えていた。
４．適切な生検およびシンチグラフィー画像が生体分布の判定のために利用可能であった。
パートＢ：
１．治療意図サブセットのための基準を満たした。
２．副作用、生命徴候並びに一般検査用血液および尿サンプルに関する経過観察が適切であった。
３．実施された両アッセイのうち少なくとも１つで免疫反応性分画が６０％を越えていた。
４．反応：適切な腫瘍測定が基準時に得られ、さらに患者が少なくとも６週間にわたって追跡された場合、患者は反応について判定可能である。症状の進行が前記６週間以内に観察された場合、患者はまた反応について判定可能であった。
一次分析
一次分析はパープロトコルサブセットについて実施した。
判定不能患者は置き換えた。したがってパートＡについては、判定可能サブセットは９人の患者から成るように計画され、治療意図サブセットは少なくとも９人の患者から成っていた。パートＢについては、患者の数は出現する毒性に左右される。毒性について判定可能であるが反応については判定不能であった患者は代替されなかった。
薬理学的消長データ：
薬理学的消長データの分析は、Dr. Thomas R. MacGregor（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. Ridgefield CT, USA）によって実施された。
薬理学的消長分析の主要な目的は以下のとおりであった：
１．99mＴｃ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４および186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の単回投与後の総放射能および免疫反応性ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の分布を決定し比較すること。
２．適切なコールド含有ｈＭＡｂＢＩＷＡ４用量を特定すること。
３．２回目の186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の線量の分布を算定すること。
４．画像化データおよび血中分布データから、試験中に肝臓および脾臓に到達する注射放射能の分画を算出すること。前記目的を達成するために、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）ソフトウェアパッケージを用いて、静脈内投与に続いて免疫反応性ｈＭＡｂＢＩＷＡ４および総血中放射能レベルの血漿濃度対時間プロフィルについて時間を関数として非区画化薬理学的消長分析を実施した。放射能に関係する全ての測定は、輸液前にタンパク結合性および免疫反応性の放射能標識分画に対して標準化した。作製された特異的な薬理学的消長パラメーターには以下が含まれていた：Ｔmax、Ｃmax、ＡＵＣ（０−∞の時間）、末端排除半減期、分布体積（終末期および予想される安定状態）、全身クリアランスおよび平均滞留時間（０−無限大の時間）。時間に対する放射能の累積尿中排出を総排出尿から決定した。
ヒトでの186Ｒｅ標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の分布および代謝を示す薬理学的消長モデルを開発するという二次的な薬理学的消長分析の目的は、データの高い変動性（特に放射能シンチグラフィーデータ）のために達成できなかった。
二次分析
二次分析は、本臨床試験のパートＢに参加した患者の治療意図サブセットについて実施された。
本二次分析は以下の主要終了点に限定された：例えば反応速度、反応持続時間、進行時間。
中間分析
中間分析は実施されなかった。
３．７．１．４欠落データの取り扱い
本臨床試験フェースＩでは、ほとんどのデータが分析に利用できることが予想された。欠落データの事例では、欠落の原因は結果に無関係である可能性がきわめて高かった。欠落データは帰属させなかった。
【０１０９】
３．７．２サンプルサイズの決定
パートＡでは、各線量レベルにつき３人の患者が、ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の安全および５０ｍｇの非標識ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の予想修正用量に関する情報を提供する。
パートＢでは、６人の患者がＤＬＴの決定に十分であると考えられた。表３．７．２：１は、全患者集団における仮定されるいくつかの潜在的ＤＬＴ率について、観察される６人の患者のうちで２人または３人以上がＤＬＴをもつ確率を示している。
【表６】
2005504517.tif 000025
(根拠:確率は、ｎ＝６および異なる患者による二項分布の累積分布関数から計算した。)
本臨床試験の増大試験計画に関しては、ＤＬＴに達する患者の個々の潜在的確率が４２％またはそれより大きい場合は、２人または３人以上の患者がＤＬＴを示す確率は少なくとも８０％であった。
３．８臨床試験または計画された分析の実施における変更
プロトコルの以下の変更は修正により実施した。
血液サンプルの採集時点は、１９９９年９月１日付けの修正Ｎｏ．１によって調整された。輸液後１０分および６週間のサンプルは中止され、一方、追加のサンプルは臨床試験のパートＢの輸液終了後２４０および３３６時間で採集された。本来の血液サンプリングスケジュールは、臨床試験のパートＡで観察された５０時間の仮定半減期を適切にカバーするには十分ではないことが判明した。合計３．５ｍＬの血液はＥＤＴＡカリウム試験管に採取し、さらに３．５ｍＬは凝固用試験管に採取した。
本プロトコルには、最大許容線量を決定した後、患者に第二回目の186Ｒｅ−ｈＭＡｂＢＩＷＡ４を投与できることが記載されていた。前記方法は修正２によって改変された。患者が第一回の186Ｒｅ−ｈＭＡｂＢＩＷＡ４の投与に反応して副作用を示さなかったか、または副作用から回復し、さらにＨＡＨＡ抗体を生じなかった場合に、患者は第二回目の治療サイクルに対し適格性を有すると考えられた。反応は、症状の安定（すなわち変化がない）、部分的回復または完全な回復と定義された。第二回目の投与線量は常に５０ｍＣｉ／ｍ2であった。リンカーの変更のために、本臨床試験は、プロトコルに記載した投薬試験による第二の線量を調べる前に終了させた。反応を示した患者の治療をとにかく可能にするために、修正２が提出された。
臨床試験は、リンカーの変更のためにＭＴＤに達した後で完了し終了させた。ＭＡＧ３は、ＢＩＷＡ４プロジェクトの以降の開発でＭＡＧ２ＧＡＢＡ−ＴＦＰで置換されるであろう。
サンプルは、最初に予定された時点よりも多くの時点でｓＣＤ４４ｖ６決定のために入手可能であった。
データを評価し、臨床試験チーム内で検討した後で以下の変更が実施された。
％ＩＤ／ｋｇ腫瘍対％ＩＤ／ｋｇ非腫瘍組織比は結果の変動性のために骨髄でのみ実施された。
腫瘍サイズの評価についても同様であった。測定は不完全で、したがって合理的な評価は不可能であった。したがって正式な分析は実施されなかった。
【０１１０】
４．試験の対象者
４．１対象者の配置
スクリーニングを実施した３３人の患者のうち、３人の患者が治験薬の投与前に副作用のために臨床試験を中止した（表６．１：１）。前記３人の患者は分析には含まれなかった。総計３０人の患者を登録し臨床試験で治療した。
パートＡ
治療される３０人の患者のうち１０人の患者がパートＡに含まれ、各々について３人の患者がそれぞれ２５ｍｇおよび１００ｍｇの99mＴｃ−ＢＩＷＡ４を投与され、一方、４人の患者が５０ｍｇの99mＴｃ−ＢＩＷＡ４を投与された。パートＡの全患者が本臨床試験を終了した。
パートＢ
パートＢで治療された２０人の患者のうち２人は副作用のために試験を中止した（２人の患者は死亡した）。３人の患者は５０ｍＣｉ／ｍ2の第二の線量を投与された。
【表７】
2005504517.tif 000026
（原資料：添付書類１６．１．９．２表１．１）
４．２プロトコル逸脱
プロトコル違反の大半は、血液および／または尿のサンプリングに関してプロトコルに提示したタイムウィンドウからの逸脱（＞±１０％）であった。影響を受けた患者は分析から除外しなかったが、尿または血液採取の実際の時間を血液、血漿、血清および尿濃度の決定に用いた。
【０１１１】
５．有効性／薬理学臨床評価
パートＡの結果から、治療に最適な用量として５０ｍｇのＢＩＷＡ４が確認された。パートＢのデータは、ＤＬＴが認められる線量より低い放射線量で186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４治療において患者は臨床的効果を得ることができることを示した。
測定されたＢＩＷＡ４の濃度は用量に比例し、投与用量の中等度の量が腎臓から排出された。
５．１分析データセット
治験薬の少なくとも１回投与を受けた全ての患者が治療意図分析に含まれた。パートＡの７人の患者がパープロトコル分析に含まれた。パートＢについてはパープロトコル分析は実施されなかった。
５．２身上調査および他の基準時の特徴
含まれた全患者の平均年齢は５６歳（３７から７８歳の範囲）であった。１９人の患者が男性で１１人が女性であった（表５．２：１）。
パートＡで治療された３人の患者は全く喫煙せず、一方７人が現在も喫煙者であった（喫煙年数は１９から４７）。頻繁なアルコール消費が８人の患者で報告され、一方、２人が全く飲酒しない（表５．２：１）。
パートＢの全ての患者が以前に喫煙者であったかまたは現在も喫煙者であり（表５．２：１）、平均喫煙年数は３５であった（１０から８６の範囲）。６人の患者が飲酒せず、一方、残りの患者は頻繁にアルコールを摂取した（表５．２：１）。
病期はパートＡに含まれる全ての患者について局所性で手術可能であり、一方、パートＢでは再発（１５人）および／または転移があった（３人）。１人の患者では局所性で手術不能であった。１人の患者では情報が欠落していた。
併発疾患または関連する病歴が２８人の患者で報告された（表５．２：１）。併用療法は全ての患者で必要であった。もっとも頻繁に用いられた医薬は鎮痛剤、鎮静剤、ラクツロース、Ｈ2ブロッカー、鎮吐剤および抗菌剤であった。
【０１１２】
【表８】
2005504517.tif 000027
パートＡの患者では疾患の最初の診断は試験に参加する１ヶ月前に判明し、一方、パートＢに含まれる患者は平均して２年間疾患を抱えていた（０．１から１７．５年、表５．２：２）。カルノフスキーのスコアはパートＡの患者では７０から１００の範囲であった。パートＢの患者のカルノフスキースコアは７０から９０であった（表５．２：２）。
診断時の転移は本臨床試験のパートＢの１人の患者について報告された。
パートＢの全ての患者は以前に放射線療法および／または化学療法を受けたことがあり、一方、パートＡの患者は以前に化学療法も放射線療法も受けていないことが報告された（表５．２：２）。シスプラチン、メトトレキセートおよびフルオロウラシルはもっとも頻繁に使用された全身性抗癌剤であった。
以前に外科手術を受けたパートＢの１３人の患者のうち１１人では前記外科手術は根治的療法であった。パートＡの１人の患者のみが以前に手術を受けていた（表５．２：２）。
腫瘍の病巣サイズ（転移を含む）は１４ｍｍ2から１０３０４ｍｍ2の範囲であった。患者の大半で原発腫瘍部位は中等度に分化していた。リンパ節は１３人の患者で障害を有していた（表５．２：２）。
【表９】
2005504517.tif 000028
【０１１３】
５．３治療に対するコンプライアンスの程度
全ての薬剤は試験者またはその指名した者の監督下で投与された。血液はＢＩＷＡ４の薬理学的消長を決定するために採集された。全ての患者は検出可能レベルのＢＩＷＡ４を有していた。
５．４有効性／臨床薬理学の結果
６人の患者のうち３人は５０ｍＣｉ／ｍ2の最大許容線量で症状の安定を示した。臨床試験のパートＡで、５０ｍｇのＢＩＷＡ４用量が血液濃度および選択的腫瘍の取り込みに関して最適な用量であることが確認された。ＢＩＷＡ４の血漿濃度は、パートＡではＢＩＷＡ４の２５ｍｇから１００ｍｇの範囲で用量に比例し、ピークは０．９時間であり、末端排除半減期はパートＡおよびパートＢについてそれぞれ５４−７４時間および９４時間であった。
５．４．１有効性の分析／薬理学的動態
５．４．１．１一次終了点
有効性についての一次終了点はパートＡでは99mＴｃ−ＢＩＷＡ４の生体分布であった。さらに別の一次終了点は、本臨床試験のパートＡおよびパートＢについて、それぞれ放射能免疫シンチグラフィー画像の分析および薬理学的消長の分析（セクション５．４．２に記載）であった。ドシメトリーはパートＢでのみ実施された。
パートＡでの99mＴｃ−ＢＩＷＡ４の生体分布
組織サンプルは外科手術中に得られ、99mＴｃ−ＢＩＷＡ４の取り込みは％注射線量（ＩＤ）／ｋｇ組織として表された。
治療意図（ＩＴＴ（intent-to-treat））サブセット：99mＴｃ−ＢＩＷＡ４の相対的生体分布は３通りの投与群全てにおいて腫瘍できわめて高かった（患者１（２５ｍｇのＢＩＷＡ４）、患者５（５０ｍｇのＢＩＷＡ４、腫瘍細胞無し）および患者９（１００ｍｇのＢＩＷＡ４）をそれぞれ除く）。腫瘍への取り込みは、２５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００ｍｇの用量群でそれぞれ６から１７％ＩＤ／ｋｇ、５から２８％ＩＤ／ｋｇ、および１３から１７％ＩＤ／ｋｇの範囲であった。腫瘍取り込み対骨髄取り込みの算出平均比は、２５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００ｍｇの用量群でそれぞれ１．７、２．６および２であった（表７．２：１および７．２：２）。
パープロトコル（ＰＰ（per-protocol））サブセット：99mＴｃ−ＢＩＷＡ４の相対的生体分布は３通りの投与群全てにおいて腫瘍できわめて高かった（患者１（２５ｍｇのＢＩＷＡ４）を除く）。腫瘍への取り込みは、２５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００ｍｇの用量群でそれぞれ６から１７％ＩＤ／ｋｇ、２３から２８％ＩＤ／ｋｇ、および１６％ＩＤ／ｋｇの範囲であった。腫瘍取り込み対骨髄取り込みの算出平均比は、２５ｍｇ、５０ｍｇおよび１００ｍｇの用量群でそれぞれ１．７、３．２および２．５であった（表７．２：１および７．２：３）。
より小さな腫瘍サイズでより大きな取り込み傾向が２５ｍｇのＢＩＷＡ４用量群で存在するように思われた。同様な評価は、患者数の制限のために５０ｍｇおよび１００ｍｇのＢＩＷＡ４用量群については可能ではなかった（表７．２：４）。
高い％ＩＤ／ｋｇの取り込みが、患者１（２５ｍｇＢＩＷＡ４）を除いて骨髄上清（１７％ＩＤ／ｋｇまで）および血漿または血液（１３％ＩＤ／ｋｇまで）で観察された（前記はパープロトコル集団では常に腫瘍への取り込みより低かった）。皮膚および粘膜への取り込みは、パープロトコルサブセットでは常に原発腫瘍への取り込みより低かった。
パートＡの99mＴｃ−ＢＩＷＡ４の放射能免疫シンチグラフィー画像
輸液直後には腫瘍には放射能の取り込みは認められなかったが、２１時間後に中等度の取り込みが見出された。放射能免疫共役物の取り込みは、輸液直後および輸液後２１時間の両方で骨髄および腎臓で低いようであった。取り込みは肺では軽度から中等度であったが、肝臓はより高い取り込みを示した。
同様なパターンがパープロトコル集団について観察された。ただ１つの相違は腎臓におけるより高い取り込みのようであったが、一方、取り込みは治療意図集団と比較したとき肺でより低かった。
パートＢの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の放射能免疫シンチグラフィー画像
放射能免疫シンチグラフィー試験は輸液直後、輸液後２１、４８、７２、１４４および３３６時間で実施された。輸液直後には腫瘍への取り込みはほとんど全く観察されなかった。腫瘍への相対的取り込みは用量依存的のようにみえ、さらに時間の経過につれて増加し、７２から１４４時間後に中等度から高い取り込みに達し、３３６時間以降には減少した。
放射能の生体分布は、骨髄、肺臓、肝臓、腎臓および腸管で類似しており、同じ用量依存作用（腸管を除く）は示さなかった。さらにまた、放射能の相対的取り込みは定常的であるか、または時間の経過とともにわずかに減少し、全ての放射能線量でについて同様であった。骨髄への取り込みはほとんどの治療群で最低であった。
【０１１４】
５．４．１．２二次終了点
有効性の二次終了点は、それぞれパートＢの治療に対する腫瘍の反応およびパートＡの腫瘍におけるＣＤ４４ｖ６発現レベルであった。可溶性ＣＤ４４ｖ６発現は本臨床試験のパートＡおよびパートＢの両方について決定された。
パートＡにおける腫瘍のＣＤ４４ｖ６発現
ＣＤ４４ｖ６抗原発現の測定データは７人の患者について入手できた。ＣＤ４４ｖ６抗原発現は、５人の患者および２人の患者でそれぞれ腫瘍細胞の９０％および８０％以上で観察され、一方、リンパ節が評価のために利用可能であった４人の患者では、リンパ節転移の細胞の９０％でＣＤ４４ｖ６抗原発現が検出された。均質なＣＤ４４ｖ６抗原発現は全ての患者の粘膜で観察された。
パートＢにおける腫瘍反応
線量が４０ｍＣｉ／ｍ2までの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４で処置された患者は臨床的腫瘍反応を示さなかった。全ての患者で症状が進行した。１人の患者は途中で死亡したために評価できなかった。
５０ｍＣｉ／ｍ2の186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４で処置された６人の患者のうち３人は症状が安定するか、第一回目のサイクルの後変化を示さなかった。これら３人の患者（さらにもう１回、５０ｍＣｉ／ｍ2の186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４で処置された）のうちの２人は第２回目のサイクルの後で症状が進行した。症状の進行は、治験薬の最初の投与からそれぞれ合計１４８日後（患者１０９）および１２７日後（患者１１６）に観察された。
６０ｍＣｉ／ｍ2の186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４で処置された１人の患者は第１回目のサイクルの後症状が安定した。この患者は、５０ｍＣｉ／ｍ2の186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４による第２回目のサイクルの後（治験薬の最初の投与後１７３日で）症状が進行した。
治療に反応しなかった患者の症状進行の全体的時間は０から５５日で、平均は治療群に関係なく約５から６週間であった。
パートＡおよびパートＢの可溶性ＣＤ４４ｖ６
可溶性ＣＤ４４ｖ６は本臨床試験でＢＩＷＡ４で処置された全ての患者で測定された。
検出された可溶性ＣＤ４４ｖ６の量は、パートＢの試験中に186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４処置患者で増加する傾向にあり（表７．２：６）、一方、パートＡで99mＴｃ−ＢＩＷＡ４を処置された患者についてはそのような傾向を観察することはできなかった。
【０１１５】
５．４．２薬剤用量、薬剤濃度および反応との関係
ＢＩＷＡ４の薬理学的消長は、放射能標識が異なるのでパートＡおよびパートＢについてそれぞれ別個に提示されるであろう（パートＡ：99mＴｃ、パートＢ：186Ｒｅ）。
５．４．２．１ＢＩＷＡ４、ＨＡＮＡおよびＣＤ４４ｖ６に関する分析性能
有効性が実証されたアッセイが血漿サンプルの分析に用いられた。品質が管理されたサンプルの分析は高い正確性および精密性を示す結果をもたらした。
サンプルのガンマ計測に関する分析性能
ガンマカウンターのシンチレーションクリスタルのシグナル直線性は検査されなかった。前記直線性は、少なくとも本臨床試験に用いたエネルギー範囲については装置のタイプから予想された。線量検定サンプルは典型的には４０００−２０００００カウント／分を示し、対するバックグラウンドサンプルでは５０−１００カウント／分未満であった。線量検定標準物の７回の測定精度は規則正しく２％以内であった。同じ事が、血液、血清および尿における個々の３回の測定精度についても適用される。血液および血清サンプルは典型的に２０００から１０００００カウント／分の放射能を示した。
放射能計測のための品質管理サンプルはなかった。線量検定標準物および本臨床試験由来サンプルの反復測定の精度は、３回の測定精度が少なくとも２％よりも良好であることを示した。
【０１１６】
５．４．２．１薬理学的消長
パートＡ
パートＡは、一定の放射能線量（２０ｍＣｉの99mＴｃ）を含む２５から１００ｍｇの範囲のＢＩＷＡ４単回投与を受けた１０人の患者から成る。短時間の静脈内輸液に続いてＥＬＩＳＡによって測定されたＢＩＷＡ４に対する血漿中の薬理学的パラメーターは表５．４．２．２：１に示されている。
【表１０】
2005504517.tif 000029
観察されるＣmaxＢＩＷＡ４血漿濃度および曲線内の面積における増加は投与された用量と比例する（図４および５）。
放射能標識（99mＴｃ）の血清濃度もまた決定し、薬理学的消長パラメーターは表５．４．２．２：２に示されている。
【０１１７】
【表１１】
2005504517.tif 000030
静脈内輸液後のＥＬＩＳＡにより測定される血漿中ＢＩＷＡ４の半減期のジオメトリー平均は、パートＡの試験の治療群で５４から７３．８時間の範囲であった。同じサンプルの99mＴｃ標識ＢＩＷＡ４のジオメトリー平均はより短く、血清で３９．４時間および血中で４６．４時間であった。この２つの概算平均値間の矛盾は、放射能アッセイの制限のためにＢＩＷＡ４で可能なより長いサンプリング時間が原因と考えられた。
放射能は、表５．４．２．２：３に示した量で尿中に排出された。４８時間の間の不完全な採集のために（すなわち累積データは、採集期間の変動のために常に比較可能とは限らない）、この尿排出データから更なる判定は実施されなかった。完全な４８時間採集を実施した６人の患者に関しては、採集された平均放射能量は最初の線量の１０％であった。
【表１２】
2005504517.tif 000031
ｎ．ａ．＝適用不能、データ利用不可
【０１１８】
パートＢ：
パートＢは、２０−６０ｍＣｉ／ｍ2の範囲の種々の線量の放射能標識186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４とともに５０ｍｇのＢＩＷＡ４用量を投与された２０人の患者から成る。３人の患者は第二の静脈内輸液を受け、一方、他の１７人の患者は単回処置コースのみを受けた。
グラフでは、各患者について、さらに、186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４を２回投与された３人の患者内で血漿ＢＩＷＡ４濃度および血清放射能濃度間に一致が見られた。グラフ上で認められるこの一致は、データを（非区画化評価の）モデルにならって作製した場合のより長い放射能半減期の認識と対照的である。186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の放射能部分のジオメトリー半減期は１２２時間で、ＥＬＩＳＡで決定されたＢＩＷＡ４の血漿半減期９４時間より長かった。
投与された放射能の量によって薬理学的消長のパラメーターをグループ分けしたとき（表５．４．２．２：６および５．４．２．２：７）、増加した放射能線量によるいくらか長時間の暴露傾向が示された。しかしながら、各線量群における個体数が小さすぎて一定の結論を下すことはできない。
【表１３】
2005504517.tif 000032
（ *５０ｍＣｉ／ｍ2の線量を２回投与された患者を含む。）
【表１４】
2005504517.tif 000033
（*５０ｍＣｉ／ｍ2の線量を２回投与された患者を含む。）
５．４．２．２薬理学的消長／薬理学的動態分析
薬理学的消長／薬理学的動態分析は実施されなかった。
【０１１９】
５．４．３統計／分析に関する問題
この分析は最初に計画されたように実施した。詳細はセクション３．７．１．３に記載されている。
５．４．３．１一次終了点
適用不能。
５．４．３．２二次終了点
適用不能。
５．４．４薬剤−薬剤および薬剤−疾患相互作用
薬剤−薬剤または薬剤−疾患相互作用に関する検査は実施されなかった。
５．４．５二次的問題の表示
詳細についてはセクション６．４．２．２および６．４．２．３を参照されたい。
５．５有効性／臨床薬理学に関する結論
パートＡ：
パートＡの結果によって、血液濃度および組織の取り込みレベルから５０ｍｇのＢＩＷＡ４用量が治療に最適な用量として確認された。放射能シンチグラフィーおよび生検の測定によって判定された分布は、他の組織と比較してほとんど全ての事例で腫瘍で最も高かった。放射能の取り込みは時間の経過にしたがって腫瘍で増加した。ＣＤ４４ｖ６の発現は、原発腫瘍の細胞およびリンパ節転移の細胞のそれぞれ８０％以上および９０％以上、並びに得られた全ての粘膜標本で認められた。
可溶性ＣＤ４４ｖ６の量は、99mＴｃ−ＢＩＷＡ４投与の前後で一定であった。
測定されたＢＩＷＡ４の濃度は、２５ｍｇから１００ｍｇのＢＩＷＡ４の範囲で用量に比例していた。投与された用量の中等度の量が腎臓から排出された。尿中に排泄される％ＩＤは全ての用量群で同様であった。
パートＢ：
パートＢのデータは、患者はＭＴＤでの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４療法によって臨床的な利益を得ることができることを示した。６０ｍＣｉ／ｍ2で処置された５人の患者のうち１人は症状が安定した。６人の患者のうち３人は５０ｍＣｉ／ｍ2の最大許容線量で症状が安定した。５０ｍＣｉ／ｍ2の第二の投与を受けた患者では、症状進行までの時間は１２７日から１７３日の範囲であった。放射能免疫シンチグラフィーによって腫瘍組織への放射能の取り込みが示された。生体分布は線量に関係なく他の組織と類似していた。ドシメトリー分析では腫瘍以外の他の組織（精巣を除く）では予期せぬ高い吸収は示されなかった。しかしながら、観察された精巣の線量と受精能力の障害との関連性は現在のところ明らかではない。
検出された可溶性ＣＤ４４ｖ６の量は、186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４で処置された患者で増加する傾向にあった。
ＢＩＷＡ４の血漿濃度は０．９２時間で最高に達し、抗体は、ＥＬＩＳＡで測定したＢＩＷＡ４のジオメトリー平均半減期９４時間で排除された。ＣmaxおよびＡＵＣ値（ＥＬＩＳＡによる測定）は、５０ｍｇのＢＩＷＡ４用量群について本臨床試験のパートＡで得られた値と同様であった。
線量限界毒性は６０ｍＣｉ／ｍ2の線量で生じ、一方、５０ｍＣｉ／ｍ2の186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の線量は本臨床試験では最大許容線量であることが判明した。線量限界毒性は骨髄の副作用（すなわち血小板減少症および白血球減少症）であった。
【０１２０】
６．１暴露の程度
本臨床試験のパートＡで処置された１０人の患者は全て99mＴｃ−ＢＩＷＡ４を１回投与された。ＢＩＷＡ４の用量は２５ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇで、99mＴｃは２０ｍＣｉであった。
パートＢでは、患者は186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４を１回投与された。３人の患者は症状が安定した（症状に変化がない）ので、２回目の５０ｍＣｉ／ｍ2を投与された。ＢＩＷＡ４の用量は５０ｍｇで一定を保ち、一方186Ｒｅの放射能は１０ｍＣｉ／ｍ2体表ずつ増加させた。
線量は体表面積にしたがって計算した（表６．１：１）。
【表１５】
2005504517.tif 000034
（ｎ．ａ．＝適用不能、平均値および標準偏差が示されている。）
薬剤の放射化学的純度は９５％を越え、免疫反応性分画は８０％より高かった。
【０１２１】
６．２副作用（ＡＥ）
副作用は処置された全患者で報告された。２人の患者はパートＢの観察期間を副作用のために中止した。処置は完了していたので治験薬に関して措置は採られなかった。
パートＡ：
パートＡの患者の大半（５０％）は一体的身体（body as a whole）に由来する副作用を示し、前記はまた根底の外科手術および付随する痛みによるものであろう。特定の副作用パターンは報告されず、さらに薬剤関連と判定されるＣＴＣ基準３または４を示した患者はいない（表６．２．２：１および２）。
３人の患者は、セクション６．３．１に記載されている重篤な副作用を示した。
パートＢ：
系統的器官クラス（ＳＯＣ）の“一体的身体”（body as a whole）の副作用は患者の６５％で報告され、系統的器官クラスの“血小板、出血および凝固異常”（患者の６０％）および“白血球および細網内皮系異常”（患者の５０％）がこれに続いた。薬剤関連血小板減少症および白血球減少症は１１人（５５％）で発生し、１０人の患者で放射線免疫治療の開始後平均して２１日で発生し、一般的に６週間後に回復した。用量反応は前記の事象について観察された（表６．２．２：３）。
薬剤関連ＣＴＣグレード４と定義される血液学的線量限界毒性は３人の患者で報告された。
薬剤関連ＣＴＣグレード３または４の非血液学的毒性と定義される非血液学的線量限界毒性は４人の患者で発生した（３０ｍＣｉ／ｍ2では１人の患者が発赤およびクィンケ浮腫を示し、６０ｍＣｉ／ｍ2で２人の患者は発熱し、さらに６０ｍＣｉ／ｍ2で処置された患者は倦怠感を生じた）。
重篤な副作用を示した９人の患者のうち６人は死亡した。死亡と重篤な副作用はセクション１２．３．１に記載されている。
【０１２２】
６．２．２副作用の表示
パートＡ：
ＳＯＣ、好ましい用語、およびＢＩＷＡ４の３つの用量群によって分類される以下の副作用が本臨床試験のパートＡで１人を越える患者で報告された（表６．２．２：１）。更なる詳細および好ましい用語はセクション７．３．１に示されている。
【表１６】
2005504517.tif 000035
（１人を超える患者が報告されたＳＯＣおよび好ましい用語が示されている。括弧内の数字は処置された患者のパーセンテージを示す。）
試験者がＣＴＣ基準にしたがって等級付けした薬剤関連と考えられる副作用は表６．２．２：２に示されている。これら副作用はＣＴＣのグレード１であった。
【表１７】
2005504517.tif 000036
（ｓＧＯＴ＝血清グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ；ｓＧＰＴ＝血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）
パートＢ：
表６．２．２：３はＳＯＣ、好ましい用語および186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の放射線量群によって分類された副作用をもつ患者数を示す。
【表１８】
2005504517.tif 000037
（１人を超える患者が報告されたＳＯＣおよび好ましい用語が示されている；ｓＧＰＴ＝血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ；ＲＥＳ＝細網内皮系；括弧内の数字は処置された患者のパーセンテージを示す。）
薬剤関連副作用は７５％の患者で報告された。薬剤関連白血球減少症は５０％の患者で、血小板減少症は５５％の患者でそれぞれ報告された。
薬剤関連と考えられる副作用は表６．２．４：４に提供され、ＣＴＣにしたがって等級付けされている。
【表１９】
2005504517.tif 000038
（副作用の数が示されている；n.a.＝適用不能）
【０１２３】
６．２．３副作用の分析
パートＡ：
本臨床試験のパートＡで発生した副作用はいずれも薬剤関連とは考えられなかった（ただし中等度で可逆的なＣＴＣグレード１のＡＳＴおよびＡＬＴの上昇を示した１人の患者は除く）。
種々のＢＩＷＡ４用量を比較したとき、副作用プロフィルの相違は認められなかった。
パートＢ：
血小板減少症および白血球減少症は線量に依存し（表６．２．２：３および６．２．２：４）、さらに線量限界性であった。タイムコースはセクション６．４．２．１に示されている。
アレルギー性反応は２人の患者で報告されたが、１人は薬剤関連クィンケ浮腫および発赤（３０ｍＣｉ／ｍ2）を示し、１人の患者は（６０ｍＣｉ／ｍ2）血小板濃縮物の輸液後アレルギー反応を示した（後者は薬剤関連とは考えられなかった）。１人の患者は（２０ｍＣｉ／ｍ2）じんま疹を示し（これもまた薬剤関連とは考えられなかった）、１人の患者は（２０ｍＣｉ／ｍ2）薬剤関連の顔面浮腫を示した。
ＨＡＨＡは２人の患者で検出された（セクション１２．４．３参照）。
副作用による中止は２人の患者で発生した。前記両患者は死亡した。
副作用によって併用療法の開始が１７人の患者で必要となった。前記患者はセクション６．３．１に簡潔に記載されている。
６．３死亡、他の重篤な副作用および他の顕著な副作用
重篤な副作用は１２人の患者で報告された。前記のうち６人の患者が本臨床試験中またはその後の経過観察中に死亡した。死亡した全患者は本臨床試験のパートＢで処置された。パートＡで処置された患者はいずれも死亡していない。全ての死亡例は症状の進行によるものであった。
パートＢの２人の患者は、副作用（両患者１１２および１０５は死亡した）のために不完全に本臨床試験を中止した。
もっとも頻発した治療を必要とした副作用は、血小板減少症、白血球減少症および発熱であった。
【０１２４】
本文書に含まれるもの
７．１身上調査データ
身上調査の詳細は含まれていない。
７．２有効性／薬理学的動態データ
表７．２：１腫瘍対骨髄取り込み比−臨床試験パートＡ
表７．２：２腫瘍対骨髄取り込み比（ＩＴＴサブセット）−臨床試験パートＡ
表７．２：３腫瘍対骨髄取り込み比（ＰＰサブセット）−臨床試験パートＡ
表７．２：４腫瘍サイズおよび抗体の％取り込み−臨床試験のパートＡ（パープロトコル集団）
表７．２：５腫瘍および他の組織におけるＣＤ４４ｖ６抗原発現−臨床試験のパートＡ
表７．２：６血清中の可溶性ＣＤ４４ｖ６（平均値がｎｇ／ｍＬで示されている）
【表２０】
2005504517.tif 000039
（脚注：Ｎｏ＝番号；*＝パープロトコル分析に含まれる；％ＩＤ＝注射用量の％；算出はサンプルの重さの違いを考慮に入れて実施した。）
【表２１】
2005504517.tif 000040
（脚注：平均値が示されている；ＩＴＴ＝治療意図（intention to treat）；算出はサンプルの重さの違いを考慮に入れて実施した。）
【表２２】
2005504517.tif 000041
（脚注：平均値が示されている；ＰＰ＝パープロトコル（per protocol）；算出はサンプルの重さの違いを考慮に入れて実施した。）
【表２３】
2005504517.tif 000042
（脚注：Ｎｏ＝患者番号；ｎ．ａ．＝適用不能、長さまたは幅が示されているが、長さ及び幅の両方は示されていない；算出はサンプルの重さの違いを考慮に入れて実施した。）
【表２４】
2005504517.tif 000043
（脚注：Ｎｏ＝番号；*＝パープロトコル分析に含まれる；n.a.＝適用不能）
【表２５】
2005504517.tif 000044
（脚注：n.a＝適用不能；データには２回目の投与が含まれている）
【０１２５】
有効性の結果
パートＡ：
.パートＡの結果から、血中濃度および組織の取り込みレベルをもとに５０ｍｇの用量のＢＩＷＡ４が治療に最適な用量として確認された。放射能シンチグラフィーおよび生検の測定によって判定された分布は、他の組織と比較したときほぼ全ての事例で腫瘍でもっとも高かった。放射能の取り込みは時間の経過とともに腫瘍で増加した。ＣＤ４４ｖ６の発現は、原発腫瘍およびリンパ節転移の細胞のそれぞれ８０％および９０％以上、並びに得られた全ての粘膜標本で存在していた。
５０ｍｇのＢＩＷＡ４用量群では、腫瘍サイズと放射能の取込みとの間に相関性は観察されなかった。可溶性ＣＤ４４ｖ６の量は99mＴｃ−ＢＩＷＡ４投与の前後で一定のようであった。
測定されたＢＩＷＡ４濃度は２５ｍｇから１００ｍｇのＢＩＷＡ４の範囲では用量に比例していた。投与された用量の中等度の量が腎臓から排泄された。尿中に排泄されたパーセント注射用量（％ＩＤ）は全ての用量群で同様であった。
パートＢ：
パートＢのデータは、最大許容線量（ＭＴＤ）での186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４療法によって臨床的に利益を得ることができることを示した。６０ｍＣｉ／ｍ2で処置された５人の患者のうち１人は症状が安定した。再発進行までの時間は、５０ｍＣｉ／ｍ2の第二の投与を受けた患者で１２７日から１７３日の範囲であった。放射能免疫シンチグラフィーによって、腫瘍組織での放射能の取り込みが示された。生体分布は用量に関係なく他の組織と比較可能であった。ドシメトリー分析では、腫瘍以外の組織では予期せぬ高い吸収線量は示されなかった（ただし精巣を除く）。検出された可溶性ＣＤ４４ｖ６の量は、186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４処置患者について増加する傾向があった。ＢＩＷＡ４の血漿濃度は０．９２時間でピークに達し、前記抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による測定によって決定されるＢＩＷＡ４について９４時間のジオメトリー平均半減期で排除された。ＣmaxおよびＡＵＣ値（ＥＬＩＳＡ）は、５０ｍｇのＢＩＷＡ４用量群について本臨床試験のパートＡで得られたものと類似していた。
テクネチウム−９９の低い放射能線量と併用したＢＩＷＡ４の単回投与の許容性は容認できた。３つの重大な副作用のうちの２つは外科手術の結果としての合併症のためであった。
パートＢ：
最大許容線量（ＭＴＤ）は186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の５０ｍＣｉ／ｍ2であった。線量限界副作用は、個々の患者で線量依存性の可逆的血小板および白血球減少とそれに続く発熱であった。血小板減少症の臨床症状は軽度の点状出血であった。
粘膜炎は、より高い放射線量で処置された患者で観察されたが、線量限界性ではなかった。
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の相関性変化は本臨床試験中には認められなかった。
１２人の患者が重篤な副作用を示した。これら１２人のうち、６人の患者は本臨床試験のパートＢの過程で主として根幹の疾患の進行のために死亡した。
アレルギー性反応が稀に観察され、１人が重篤な薬剤関連性クィンケ浮腫を示した。薬剤の輸液中または輸液後しばらくはアレルギー反応は生じなかった。
２人の患者がＨＡＨＡを生じた。反復投与はＨＡＨＡの発生を誘発しなかった。
結論：
結果は、腫瘍組織への186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４の取り込みおよび頭頸部の進行した扁平上皮癌をもつ患者の臨床的利益を示した。安全性プロフィルは許容可能であるように思われる。ＢＩＷＡ４は用量に比例する薬理学的消長を示し、腫瘍への取り込みは５０ｍｇと１００ｍｇのＢＩＷＡ４用量の間では相関的な変化を示さなかった。
【０１２６】
実施例４
序文：進行期の頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）をもつ患者は、末梢局所での再発腫瘍および／または遠位転移を発する危険性が高くなる。このような患者では、有効な全身的アジュバント治療の開発が要求される。ＨＮＳＣＣは本質的に放射能に感受性が高いことを考えれば、放射能免疫治療の様式としてモノクローナル抗体を用いることによって、ＨＮＳＣＣに選択的に放射性核種を誘導することはより効果的な治療に役立つであろう。
目的：レニウム−１８６（186Ｒｅ）標識ヒト化モノクローナル抗体ＢＩＷＡ４のＨＮＳＣＣ患者での安全性、最大許容線量（ＭＴＤ）、免疫原性および有効性の決定。
患者および方法：他に選択できる治療方法がないＨＮＳＣＣ患者で、フェースＩ線量増大試験を実施した。総計２０人の患者に、静脈内に２０、３０、４０、５０または６０ｍＣｉ／ｍ2の線量で186Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４を投与した。３人の患者は、５０または６０ｍＣｉ／ｍ2の投与の少なくとも３ヵ月後に、５０ｍＣｉ／ｍ2の第二の線量を投与された。
結果：反復投与と同様に、単回投与は全て良好に許容され、急性副作用の徴候は全く認められなかった。より高い線量でのただ１つの重大な毒性の出現は、口腔の粘膜炎および血小板減少症および白血球減少症から成る線量限界性骨髄毒性であった。ＭＴＤは５０ｍＣｉ／ｍ2であることが確認された。１人の患者は、ただ１回の投与の後でヒト抗ヒト反応を生じた。症状の安定（４から１９週間持続した）は最高の線量レベルで処置された患者で観察された。
結論：186Ｒｅ標識ＢＩＷＡ４によるＨＮＳＣＣ患者の放射能免疫治療は安全であるように思われ、殺腫瘍線量を得ることができる。のみならず、免疫誘発率が低いことから、反復投与が可能であるように思われる。本臨床試験のフェースＩの結果によって、レニウム−１８６（186Ｒｅ）標識ヒト化モノクローナル抗体ＢＩＷＡ４による放射能免疫治療を頭頸部癌患者のアジュバント療法としてさらに開発することが大いに推奨される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】競合細胞ＥＬＩＳＡで調べた相対的結合親和性の判定を示す図である。ＩＣ50：ｍＭＡｂＢＩＷＡ４とＡ４３１細胞との結合が５０％減少するｃＭＡｂおよびｈＭＡｂの濃度。ＢＩＷＡ２に対するＩＣ50値が示されている。
【図２】125Ｉおよび131Ｉ標識ＣＤ４４ｖ６特異的ＭＡｂ（１０μＣｉ、５０μｇ）を同時注射されたＨＮＸ−ＯＥ異種移植片をもつ担癌マウスでの輸液後３日または４日の生体分布を示す図である。３群のマウスが以下のいずれかを投与された：（Ａ）131Ｉ−Ｕ３６（黒棒線）および125Ｉ−ＢＩＷＡ１（網かけ棒線）（ｎ＝５）；（Ｂ）131Ｉ−ＢＩＷＡ４（黒棒線）および125Ｉ−ＢＩＷＡ２（網かけ棒線）（ｎ＝６）；または（Ｃ）131Ｉ−ＢＩＷＡ４（黒棒線）および125Ｉ−ＢＩＷＡ８（網かけ棒線）（ｎ＝６）。輸液後３日（Ａ）または４日（Ｂ、Ｃ）でマウスから採血し、殺して解剖し、腫瘍、血液およびいくつかの器官の放射能レベル（％ＩＤ／ｇ±標準偏差）を判定した（Ｂｌｄ：血液、Ｔｕｍ：腫瘍、Ｌｉｖ：肝臓、Ｓｐｌ：脾臓、Ｋｉｄ：腎臓、Ｈｒｔ：心臓、Ｓｔｍ：胃、Ｉｌｍ：回腸、Ｃｌｎ：結腸、Ｂｌｒ：膀胱、Ｓｔｒ：胸骨、Ｍｓｃ：筋肉、Ｌｎｇ：肺臓、Ｓｋｎ：皮膚、Ｔｎｇ：舌）。
【図３】ＨＮＸ−ＯＥ異種移植片をもつ担癌ヌードマウスにおける186Ｒｅ標識ＣＤ４４ｖ６特異的ＭＡｂの治療的有効性を示す図である。マウスは以下を投与された：３００μＣｉの186Ｒｅ−Ｕ３６（図Ａ）、３００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ１（図Ａ）、３００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４（図Ｂ）、３００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ２（図Ｂ）、４００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ４（図Ｃ）、４００μＣｉの186Ｒｅ−ＢＩＷＡ８（図Ｃ）、またはコントロールとして食塩水（図Ａ、Ｂ、Ｃ）。図ＡおよびＢのコントロール群は同じである。腫瘍サイズは、処置開始時の平均腫瘍体積に対する処置中の平均腫瘍体積（±標準偏差）として表されている。
【図４】臨床試験のパートＡでＢＩＷＡ４の１０人の患者への輸液の後で観察されたＭＡｂの投与用量とＡＵＣとの関係を示す図である。
【図５】臨床試験のパートＡでＢＩＷＡ４の１０人の患者への輸液の後で観察されたＭＡｂの投与用量と最大血漿ＢＩＷＡ４濃度との関係を示す図である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005504517.tif 000198
2005504517.tif 000199
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