(57)【要約】本発明は、特に、Mycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGに起因する感染症からMycobacterium tuberculosis株の大部分に起因する感染症を識別することができるヌクレオチド配列の同定である。本発明の主題はまた、これらの配列の発現産物によって問題の配列を検出する方法、およびこれらの方法を実施するためのキットである。さらに、本発明の主題は、新規なワクチンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記からなる群より選択される、単離または精製した核酸：
ａ．  配列番号１、
ｂ．  配列番号１に完全に相補的な配列を有する核酸、
ｃ．  最適アライメント後に、ａ）またはｂ）に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
ｄ．  ストリンジェント条件下で、ａ）またはｂ）に記載の核酸とハイブリダイズする核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の少なくとも１個の核酸で構成される少なくとも８〜２０００の連続的ヌクレオチドを含んでなる、核酸断片。
【請求項３】
配列番号１に特異的なプローブまたはプライマーとして用いることが可能な、請求項２に記載の核酸断片。
【請求項４】
配列番号１７、配列番号１８からなる群より選択される、請求項２に記載の核酸断片。
【請求項５】
プライマーである配列番号１７および配列番号１８の対を用いる、配列番号１の特異的増幅によって得られる、請求項２に記載の核酸断片。
【請求項６】
核酸断片が、
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisのゲノムから特異的に欠失し、かつ
Mycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacteriurn bovis、Mycobacteriuna bovis BCGのゲノムに含まれているものである、
請求項２に記載の核酸断片。
【請求項７】
ａ）  配列番号４、
ｂ）  配列番号４に完全に相補的な配列を有する核酸、
ｃ）  最適アライメント後に、ａ）またはｂ）に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
ｄ）  ストリンジェント条件下でａ）またはｂ）に記載の核酸とハイブリダイズする核酸
からなる群より選択される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の核酸断片。
【請求項８】
請求項７に記載の少なくとも１個の核酸の少なくとも８〜２０００の連続的ヌクレオチドを含んでなる、核酸断片。
【請求項９】
配列番号１および配列番号４に特異的なプローブまたはプライマーとして用いることが可能な、請求項２または８に記載の核酸断片。
【請求項１０】
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６からなる群より選択される、請求項９に記載の核酸断片。
【請求項１１】
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６からなる群より選択される１対のプライマーを用いる、配列番号１または配列番号４の特異的増幅によって得られる、請求項９に記載の核酸断片。
【請求項１２】
プライマーの対である配列番号１３および配列番号１４を用いる、配列番号１または配列番号４の特異的増幅によって得られる、請求項９に記載の核酸断片。
【請求項１３】
プライマーの対である配列番号１５および配列番号１６を用いる、配列番号１または配列番号４の特異的増幅によって得られる、請求項９に記載の核酸断片。
【請求項１４】
核酸が請求項６、７および８のいずれか一項に記載の核酸断片の少なくとも１個の欠失を含んでなる、請求項１に記載の単離または精製した核酸。
【請求項１５】
請求項１、２、６、７、８および１４のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる、単離または精製したポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２２、およびそれらの断片の配列を有するポリペプチドから選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドをコードする、単離または精製した核酸。
【請求項１８】
核酸が、
配列番号６のポリペプチドをコードする配列番号５、
配列番号８のポリペプチドをコードする配列番号７、
配列番号１０のポリペプチドをコードする配列番号９、
配列番号１２のポリペプチドをコードする配列番号１１、
配列番号２２のポリペプチドをコードする配列番号２１、および
それらの断片から選択される、請求項１７に記載の単離または精製した核酸。
【請求項１９】
請求項１、２、３、５、６、７、８、９、１１、１２、１３または１４のいずれか一項に記載の核酸から選択される核酸配列を含んでなる、組換えベクター。
【請求項２０】
２００２年２月１８日にＣＮＣＭにＩ−２７９９で寄託された組換えEscherichia coliに導入されたＸ２２９という名称のベクターからなる、請求項１９に記載の組換えベクター。
【請求項２１】
１、２、３、５、６、７、８、９、１１、１２、１３または１４のいずれか一項に記載の核酸から選択される核酸配列、または請求項１９または２０に記載のベクターを含んでなる、組換え細胞。
【請求項２２】
２００２年２月１８日にＣＮＣＭにＩ−２７９９で寄託された組換えEscherichia coliからなる、請求項２１に記載の組換え細胞。
【請求項２３】
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisと、
生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGと
を区別して検出し同定する方法であって、
ａ）  分析を行う生物学的試料からＤＮＡを単離し、または生物学的試料のＲＮＡからのｃＤＮＡを産生し、
ｂ）  上記生物学的試料に含まれるマイコバクテリウムの核酸配列を検出し、
ｃ）  請求項６、７または８のいずれか一項に記載の核酸断片の存在または非存在を分析する
工程を含んでなる、方法。
【請求項２４】
マイコバクテリウムのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を用いて検出する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
マイコバクテリウムのＤＮＡ配列をプライマーを用いてこれらの配列を増幅することによって検出する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
プライマーが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisと、
生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGと
を区別して検出し同定する方法であって、
ａ）  分析を行う生物学的試料を請求項２５または２６に記載の少なくとも１対のプライマーと接触させ、この試料に含まれるＤＮＡを、適当な場合には、予めハイブリダイゼーションに利用できるようにし、
ｂ）  マイコバクテリウムのＤＮＡを増幅し、
ｃ）  ＤＮＡ断片の増幅を可視化する
工程を含んでなる、方法。
【請求項２８】
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisと、
生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGと
を区別して検出し同定するためのキットであって、下記の因子：
ａ）  請求項２５または２６に記載の少なくとも１対のプライマー、
ｂ）  ＤＮＡ増幅反応を行うのに必要な試薬、
ｃ）  必要に応じて、増幅した断片の配列および／または大きさを明らかにしまたは比較することができる必要な成分
を含んでなる、キット。
【請求項２９】
Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium africanum、Mycobacterium canettii、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovisまたはMycobacterium bovis BCGからのＤＮＡ配列を増幅するための、請求項２５または２６に記載の少なくとも１対のプライマーの使用。
【請求項３０】
Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium africanum、Mycobacterium canettii、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovisまたはMycobacterium bovis BCGからのＤＮＡ配列を増幅するための、請求項２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４のいずれか一項に記載の少なくとも１対のプライマーまたは少なくとも１個の核酸断片の使用。
【請求項３１】
請求項６、７または８のいずれか一項に記載の核酸断片の全部または一部の発現産物。
【請求項３２】
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisに対して特異的な抗体と、
生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGに対して特異的な抗体と
をイン・ビトロで区別して検出する方法であって、
ａ）  生物学的試料を請求項３１に記載の少なくとも１個の産物と接触させ、
ｂ）  形成した抗原−抗体複合体を検出する
工程を含んでなる、方法。
【請求項３３】
Mycobacterium bovis BCGを用いる予防接種、M. bovis、M. caraettii、M. microti、M. africanum、または遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosis株による感染症と、哺乳類の遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisによる感染症とをイン・ビトロで区別して検出する方法であって、
ａ）  細胞、より詳しくは上記哺乳類の免疫系の細胞、更に詳しくはＴ細胞を調製し、
ｂ）  工程ａ）の生物学的試料を、請求項３１に記載の少なくとも１個の産物と共にインキュベーションし、
ｃ）  上記産物に対する哺乳類の予備増感を示す細胞反応、特に細胞増殖および／またはγ−インターフェロンのようなタンパク質の合成を検出する
工程を含んでなる、方法。
【請求項３４】
Mycobacterium bovis BCGを用いる予防接種、M. bovis、M. caraettii、M. microti、M. africanumと、哺乳類における遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosis株による感染症と、哺乳類の遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くM. tuberculosisによる感染症とをイン・ビトロで区別して診断するためのキットであって、
ａ）  請求項３１に記載の産物、
ｂ）  適当な場合には、免疫反応に適する培地を構成するための試薬、
ｃ）  免疫反応によって産生した抗原−抗体複合体を検出することができる試薬、
ｄ）  適当な場合には、上記産物によって認識された抗体を含まない参照用生物学的試料（ネガティブコントロール）、
ｅ）  適当な場合には、上記産物によって認識された抗体の予定量を含む参照用生物学的試料（ポジティブコントロール）
を含んでなる、キット。
【請求項３５】
請求項３１に記載の産物を特異的に認識することができる、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、そのキメラ断片またはキメラ抗体。
【請求項３６】
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くMycobacterium tuberculosisの抗原と、生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGまたは遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosisの抗原の存在を区別して検出する方法であって、
ａ）  生物学的試料を請求項３５に記載の抗体と接触させ、
ｂ）  形成した抗原−抗体複合体を検出する
工程を含んでなる、方法。
【請求項３７】
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くMycobacterium tuberculosisの抗原と、生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGまたは遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosisの抗原の存在を区別して検出するためのキットであって、
ａ）  請求項３５に記載の抗体、
ｂ）  免疫反応に適する培地を構成するための試薬、
ｃ）  免疫反応によって産生した抗原−抗体複合体を検出することができる試薬
の工程を含んでなる、キット。
【請求項３８】
少なくとも１個の請求項３１に記載の産物を含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項３９】
少なくとも１個の請求項３１に記載の産物を、薬学上適合性のビヒクル、および適当な場合には、１種類以上の適当な免疫アジュバントと組み合わせて含んでなる、ワクチン。
【請求項４０】
生物学的試料中の遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを検出し同定するイン・ビトロ法であって、
ａ）  分析を行う生物学的試料からＤＮＡを単離しまたは生物学的試料のＲＮＡからｃＤＮＡを産生し、
ｂ）  上記生物学的試料に含まれるマイコバクテリウムの核酸配列を検出し、
ｃ）  請求項６、７または８のいずれか一項に記載の核酸断片の存在または非存在について分析を行う
工程を含んでなる、イン・ビトロ法。
【請求項４１】
生物学的試料中の遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを検出し同定するイン・ビトロ法であって、
ａ）  分析を行う生物学的試料を、請求項１〜１４、１７または１８のいずれか一項に記載の核酸から選択される、更に好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択されるプライマーから選択される、少なくとも１対のプライマーと接触させ、試料に含まれるＤＮＡを、適当な場合には、予めハイブリダイゼーションを行うことができるようにしておき、
ｂ）  マイコバクテリウムのＤＮＡを増幅し、
ｃ）  ＤＮＡ断片の増幅を可視化する
工程を含んでなる、イン・ビトロ法。
【請求項４２】
生物学的試料において、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを検出し同定するためのキットであって、下記の因子：
ａ）  請求項１〜１４、１７または１８のいずれか一項に記載の核酸から選択される、更に好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択される、少なくとも１対のプライマー、
ｂ）  ＤＮＡ増幅反応を行うのに要する試薬、
ｃ）  必要に応じて、増幅した断片の配列および／または大きさを明らかにしまたは比較することができる必要な成分
を含んでなる、キット。
【請求項４３】
生物学的試料において、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisに対して特異的な抗体をイン・ビトロで検出する方法であって、
ａ）  生物学的試料を請求項３１に記載の少なくとも１個の産物と接触させ、
ｂ）  形成した抗原−抗体複合体を検出する
工程を含んでなる、方法。
【請求項４４】
Mycobacterium群のMycobacterium株を識別するための遺伝子マーカーとしてのＴｂＤ１の使用。
【請求項４５】
Mycobacterium群のMycobacterium株を識別するための遺伝子マーカーとしてのｍｍｐＬ６５５１多型の使用。
【請求項４６】
ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ３、ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ６、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１１、ＲＤ１３、ＲＤ１４、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４、ＲｖＤ５、ｋａｔＧ４６３、ｇｙｒＡ９５、ｏｘｙＲ'２８５、ｐｎｃＡ５７、ｍｍｐＬ６５５１、Mycobacterium株をMycobacterium群と区別するためのM. canettiiの特異的挿入因子から選択される少なくとも１個の遺伝子マーカーに関連した請求項４４に記載の遺伝子マーカーの使用。
【請求項４７】
生物学的試料中のMycobacteria群からマイコバクテリアを検出して同定するためのイン・ビトロ法であって、
ｃ）  請求項６、７または８のいずれか一項に記載の配列の核酸断片の存在または非存在について分析し、
ｄ）  ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ３、ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ６、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１１、ＲＤ１３、ＲＤ１４、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４、ＲｖＤ５、ｋａｔＧ４６３、ｇｙｒＡ９５、ｏｘｙＲ'２８５、ｐｎｃＡ５７、ｍｍｐＬ６５５１、M. canettiiの特異的挿入因子から選択される少なくとも１個の追加遺伝子マーカーを分析する
工程を含んでなる、イン・ビトロ法。
【請求項４８】
２個の追加マーカー、好ましくはＲＤ４およびＲＤ９を用いる、請求項４７に記載のイン・ビトロ法。
【請求項４９】
３個の追加マーカー、好ましくはＲＤ４、ＲＤ９およびＲＤ１２を用いる、請求項４７に記載のイン・ビトロ法。
【請求項５０】
分析を配列ハイブリダイゼーション、核酸増幅、抗原−抗体複合体から選択される手法によって行う、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
生物学的試料中のMycobacteriun群からマイコバクテリアを検出し同定するためのキットであって、下記の因子：
ａ）  請求項１〜１４、１７または１８のいずれか一項に記載の核酸から選択される、更に好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択されるプライマーから選択される少なくとも１対のプライマー、
ｂ）  ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ３、ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ６、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１１、ＲＤ１３、ＲＤ１４、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４、ＲｖＤ５、ｋａｔＧ４６３、ｇｙｒＡ９５、ｏｘｙＲ'２８５、ｐｎｃＡ５７、ｍｍｐＬ６５５１、M. canettiiの特異的挿入因子から選択される遺伝子マーカーに特異的な少なくとも１対のプライマー、
ｃ）  ＤＮＡ増幅反応を行うのに要する試薬、
ｄ）  必要に応じて、増幅した断片の配列および／または大きさを明らかにしまたは比較することができる必要な成分
を含んでなる、キット。
【請求項５２】
下記の因子を含んでなる、請求項５１に記載のキット：
ａ）  請求項１〜１４、１７または１８のいずれか一項に記載の核酸から選択される、更に好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択されるプライマーから選択される少なくとも１対のプライマー、
ｂ）  遺伝子マーカーＲＤ４に特異的な１対のプライマー、
ｃ）  遺伝子マーカーＲＤ９に特異的な１対のプライマー、
ｄ）  ＤＮＡ増幅反応を行うのに要する試薬、
ｅ）  必要に応じて、増幅した断片の配列および／または大きさを明らかにしまたは比較することができる必要な成分。
【請求項５３】
配列番号２２の配列のポリペプチドを含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項５４】
配列番号２２の配列のポリペプチドを、薬学上適合性のビヒクルと、適当な場合には、１種類以上の適当な免疫アジュバントと組み合わせて含んでなる、ワクチン。
【請求項５５】
Mycobacterium群のMycobacterium株を識別するための、ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ３、ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ６、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１１、ＲＤ１３、ＲＤ１４、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４、ＲｖＤ５、ＴｂＤ１、ｋａｔＧ４６３、ｇｙｒＡ９５、ｏｘｙＲ'２８５、ｐｎｃＡ５７、M. canettiiの特異的挿入因子から選択される少なくとも１個の遺伝子マーカーに関連した、請求項４５に記載の遺伝子マーカーの使用。
【請求項５６】
M. canettiiの株に特異的に存在し且つMycobacterium群の他の総ての構成員には存在せず、配列番号１９の３９９位〜２３７８位の配列を有する、核酸。
【請求項５７】
Mycobacterium群のMycobacterium株を識別するための遺伝子マーカーとしての、請求項５３に記載の核酸の使用。
【請求項５８】
ストリンジェント条件下で、ＲＤ１、ＲＤ４、ＲＤ９およびＴｂＤ１遺伝子マーカーの少なくとも８〜２０個のヌクレオチドとハイブリダイゼーションすることができる少なくともポリヌクレオチド配列を含んでなる、マイコバクテリア感染症を同定するための試薬。
【請求項５９】
同一免疫原性分子またはその断片に対して生じた抗体または免疫血清と反応することができるＲＤ１、ＲＤ４、ＲＤ９およびＴｂＤ１遺伝子マーカーのそれぞれによってコードされる少なくとも１個のポリペプチドを含んでなる、マイコバクテリア感染症を同定するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学の分野に関し、さらに具体的には、本発明の主題は、Mycobacterium tuberculosisに起因する感染症を、Mycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGに起因する感染症から識別することができるヌクレオチド配列の同定である。本発明の主題は、これらの配列の発現産物により問題の配列を検出する方法、およびこれらの方法を行うためのキットでもある。最後に、本発明の主題は、新規なワクチンである。
【０００２】
背景技術
結核の病原菌であるMycobacterium tuberculosisの発見以来１世紀以上の研究がなされているにも拘わらず、この疾患はヒトの死亡率の主要な原因の一つのままである。M.tuberculosisにより年間３百万人が死亡すると予測されており（Snider, 1989 Rev. Inf. Dis.S335）、毎年新たな罹患患者数は増加しており、８．８百万人と推定されている。これらの大半は発展途上国の人々であるが、この疾患は西欧諸国においてホームレス人口の増加、ＡＩＤＳ流行の影響、世界的な人口移動の変化、および旅行様式により新たな重要性を呈しつつある。
【０００３】
初期の結核は、他の総ての点では健康な人では築かれないままであることが多い。古典的な初期の診断法としては、抗酸性のマイコバクテリアについての顕微鏡下での喀痰塗抹および肺のＸ線の検討が挙げられる。しかしながら、ほとんどの場合に、喀痰塗抹検査は疾患の初期段階ではマイコバクテリアに対して陰性であり、感染後数ヶ月までは肺の変化はＸ線上では明らかにならないことがある。もう一つの複雑にする要因は、喀痰塗抹中の抗酸菌が他の種のマイコバクテリアであることが多いことである。結核の治療に用いられる抗生物質には無視できない副作用があり、３剤以上の併用として６−１２ヶ月間服用しなければならない。更に、薬剤耐性結核の出現を誘発する可能性により、診断を支持するしっかりした証拠なしに投与する治療を行うことができない。現在、唯一の絶対的に信頼の置ける診断方法は、臨床標本からM.tuberculosisを培養し、それを形態学的および生化学的に同定することに基づいている。これには、通常は約３−６週間ガリウム、その間に患者の病気が悪化したり、他の人々に感染する可能性がある。従って、M.tuberculosisの存在を確実に検出することができる迅速試験が、早期の検出および治療に極めて重要である。最近になり、幾つかの分子的試験、例えばGen-Probe「増幅したMycobacterium tuberculosis直接試験」がM.tuberculosisの迅速検出および同定の目的で開発されており、この試験では呼吸器標本からのM.tuberculosis １６ＳリボソームＲＮＡを増幅し、化学ルミネッセンスプローブを用いて約９１％の報告された感度で増幅産物を検出する。ＩＳ６１１０挿入因子の発見（Cave et al., Eisenach et al., 1990 J. Infectious Diseases 161:977-981; Thierry et al. 1990 J. Clin. Microbiol. 28:2668-2673)、およびこの因子がMycobacterium群（M. tuberculosis、M. bovis、M. bovis-BCG、M. africanum、M. canettiiおよびM. microti）でのみ存在することができるという確信から、全シリーズの迅速診断法が生まれた（Br
isson-Noel et al., 1991 Lancet 338:364-366; Clarridge et al. 1993, J. Clin. Microbiol. 31:2049-2056; Cormican et al. 1992 J. Clin. Pathology 1992, 45:601-604; Cousins et al., 1992 J. Clin. Microbiol. 30:255-258; Del Portillo et al. 1991 J. Clin. Microbiol. 29:2163-2168; Folgueira et al., 1994 Neurology 44:1336-1338; Forbes et al. 1993, J. Clin. Microbiol. 31:1688-1694; Hermans et al. 1990 J. Clin. Microbiol. 28:1204-1213; Kaltwasser et al. 1993 Mol. Cell. Probes 7:465-470; Kocagoz et al. 1993 J. Clin. Microbiol. 31:1435-1438; Kolk et al. 1992 J. Clin. Microbiol. 30:2567-2575; Kox et al. 1994 J. Clin. Microbiol. 32:672-678; Liu et al. 1994 Neurology 44:1161-1164; Miller et al. 1994 J. Clin. Microbiol. 32:393-397; Reischl et al. 1994 Biotechniques 17:844-845; Schluger et al. 1994 Chest 105:1116-1121; Shawar et al. 1993 J. Clin. Microbiol. 31:61-65; Wilson et al 1993 J. Clin. Microbiol. 28:2668-2673）。これらの試験は様々な手法を用いて、喀痰からＤＮＡを抽出している。ＰＣＲを用いて、抽出したＤＮＡからＩＳ６１１０  ＤＮＡ配列を増幅する。このＤＮＡの増幅の成功は、M.tuberculosis感染症の存在を示すものと考えられている。米国特許第５，１６８，０３９号および第５，３７０，９９８号が、結核の検出に基づくＩＳ６１１０に対してCrawford et al.に発行されている。欧州特許第０，４６１，０４５号明細書は、結核の検出に基づくＩＳ６１１０に対してGuesdonに発行されている。
【０００４】
従って、M.tuberculosisの検出に用いられるこれらの分子分析法は、ＩＳ６１１０挿入配列（約１０コピー）または１６ＳリボソームＲＮＡ（数千コピー）によって変化する。しかしながら、これらの方法は、マイコバクテリアのサブタイプに関する情報は提供しない。実際に、数十種のMycobacteriaが知られており、ほとんどはヒトに対して非病原性であるが、結核は通常はM.tuberculosisによる感染によって引き起こされ、若干の症例はM.bovis、M.canettii、およびM.africanumによって引き起こされる。適当な治療法を選択して疫学的検討を行うには、単離物を迅速且つ正確に同定できること、すなわち潜在的結核患者に由来するMycobacterium群のマイコバクテリアのサブタイプを識別できることが絶対に必要である。これが、本発明が解決しようとする問題である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、Mycobacterium群から単離しまたは精製した核酸であって、
ａ）  ＴｂＤ１領域と呼ばれる配列番号ｌ、
ｂ）  配列番号１に完全に相補的な配列を有する核酸、
ｃ）  配列番号１の少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００の連続的ヌクレオチドを含んでなる核酸断片、
ｄ）  最適アライメント後に、ａ）またはｂ）に記載の配列と塗少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
ｅ）  ストリンジェント条件下で、ａ）またはｂ）に記載の核酸とハイブリダイズする核酸
からなる群より選択される核酸を提供する。
【発明の具体的説明】
【０００６】
本明細書で用いられる本発明により「単離」および「精製」したという用語は、最新の手法を用いて達成することができる純度のレベルを表す。本発明の分子は完全に純粋である（すなわち、他の細胞の巨大分子の分子を絶対的に含まない）必要はないが、当業者がそれらが本来見出される環境（すなわち、細胞中間）には最早存在しないことを認めるほどに十分に純粋であるべきである。従って、本発明による精製または単離した分子は、それが見出される自然環境に存在する少なくとも１種類の他の巨大分子から除去されているものである。更に好ましくは、本発明の分子は本質的に精製および／または単離されており、これは、それらが存在する組成物が、本発明の分子が本来見出される環境に見出される他の巨大分子をほとんど完全にまたは完全に含まないことを意味している。従って、単離および精製は、塩、溶媒または周期律表の元素の添加または除去によって起こらないが、少なくとも幾つかの巨大分子の除去を含まなければならない。本発明に包含される核酸は、当業者に知られている適当な手法によって精製および／または単離される。このような手法は広く知られており、普通に実施され、十分に当業者の技術範囲内にあるものである。本明細書で用いられる  「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列のようなポリヌクレオチド配列を表し、このようなポリヌクレオチド配列は単離、精製または合成されおり、且つ天然または非天然ヌクレオチドで構成されていることがある。好ましい態様では、本発明のＤＮＡ分子は二本鎖ＤＮＡ分子である。本明細書で用いられる「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」という用語は同一の意味を有し、区別なく用いられる。
【０００７】
本発明で用いられる「Mycobacterium群」という用語は、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacteriurn bovis、Mycobacterium africanum、Mycobacterium microti、Mycobacterium canettii、およびワクチン株Mycobacterium bovis BCGである結核を引き起こすマイコバクテリアの群を意味する。
【０００８】
本発明は、配列番号１の全配列、その相補体およびその二本鎖形態だけでなく、この配列、の任意の断片、その相補体、およびその二本鎖形態を包含する。
【０００９】
態様では、配列番号１の断片は少なくとも約８個のヌクレオチドを含んでなる。例えば、この断片は約８〜３０個のヌクレオチドであることができ、且つポリヌクレオチド合成のプライマーとしてデザインすることができる。もう一つの好ましい態様では、配列番号１の断片は約１，５００〜約２，５００個のヌクレオチドを含んでなり、更に好ましくは配列番号４に対応する２，１５３個のヌクレオチドを含んでなる（図５参照）。本明細書で用いられる「ヌクレオチド」とは、一本鎖核酸についてのヌクレオチドの数に関して用いられる。しかしながら、この用語は、二本鎖分子も包含する。従って、本発明による２，１５３個のヌクレオチドを含んでなる断片は２，１５３個のヌクレオチドを含んでなる一本鎖分子であり、また２１５３個の塩基対（ｂｐ）を含んでなる二本鎖分子でもある。
【００１０】
好ましい態様では、本発明の核酸断片は、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisのゲノムから特異的に欠失し、Mycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacteriurn bovis，Mycobacteriuna bovis BCGのゲノムに含まれている。「ゲノムに挿入された僅かのＩＳ６１１０」という用語は、Mycobacterium tuberculosisのゲノムにおける１０未満のコピー、更に好ましくは５未満のコピー、例えば２未満のコピーを意味する。
【００１１】
本発明の核酸断片は、好ましくは
ａ）  配列番号４、
ｂ）  配列番号４に完全に相補的な配列を有する核酸、
ｃ）  配列番号４の少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００の連続的ヌクレオチド含んでなる核酸断片、
ｄ）  最適アライメント後に、ａ）またはｂ）に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸、
ｅ）  ストリンジェント条件下で、ａ）またはｂ）に記載の核酸とハイブリダイズする核酸
からなる群より選択される。
【００１２】
態様では、本発明による配列を決定するストリンジェント条件は、５Ｘ  ＳＳＰＥ、２Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、および６５℃における０．５％（重量／容量）ドデシル硫酸ナトリウムと同様にストリンジェントな条件である。通常の熟練者であれば、一層ストリンジェントな条件を用いることができ、所定の分析に適当な条件は不相応なまたは過度の実験を行うことなく容易且つ速やかに決定することができる。例示態様として、本発明によるポリヌクレオチドを特異的に検出するのに用いられるストリンジェントハイブリダイゼーション条件は好都合には下記の通りである：
予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、
−  ５Ｘ  ＳＳＰＥ（１Ｘ  ＳＳＰＥは３Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸三ナトリウムである）、
−  ２Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、
−  ０．５％（重量／容量）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、
−  １００μｇ  ｍｌ−ｌサケ精子ＤＮＡ、
を含む混合物中で６５℃で行う。洗浄は、
−  実験室温度（約２１〜２５℃）で、２Ｘ  ＳＳＰＥおよび０．１％  ＳＤＳの存在下にて１０分間２回洗浄、および
−  ６５℃で１Ｘ  ＳＳＰＥおよび０．１％  ＳＤＳの存在下にて１５分間
行う。
【００１３】
本発明は、本発明の単離または精製した核酸であって、上記の核酸断片の少なくとも１個の欠失を含んでなる核酸も包含する。好ましくは、このような本発明の単離または精製した核酸は、配列番号４が欠失している（存在しない）配列番号１に対応する配列番号２１である。
【００１４】
本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている配列を用いてそれらが示す同一性の割合によって特徴決定することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチド、特に配列リストの配列と９０％の同一性を有するポリヌクレオチドは、本発明によって包含される。好ましくは、この配列は、配列リストのものと少なくとも９０％の同一性を示す。更に好ましくは、それらは少なくとも９２％の同一性、例えば９５％または９９％の同一性を示す。熟練技術者であれば、本発明による配列を配列分析ソフトウェアを用いることによって同定することができる（例えば、Coffin et al.監修，「レトロウイルス（Retroviruses）」，Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 723- 755を参照されたい）。同定率は、ＮＣＢＩ（ＮＩＨ）から発売されているＢＬＡＳＴ配列分析プログラムセット，第２版を用いて計算される。総てのデフォルトパラメーターが用いられる。ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）は、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ分析ソフトウェアセットを通して利用可能なプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって用いられる帰納的検索アルゴリズムである。これらのプログラムは、有意性をKarlin and Altschulの統計学的方法を用いる発見に（１９９０，１９９３）によるものとしており、若干の向上が見られる。この公的に利用可能な配列分析プログラムセットを用いると、熟練技術者であれば、本発明によるポリヌクレオチドを容易に同定することができる。
【００１５】
本発明の核酸配列の領域を同定することは当業者の完全に技術の範囲内にあり、これはプローブ、プライマー、または他の実験上、診断上または治療上の補助として用いられる。例えば、当業者であれば、広く利用可能な配列分析プログラムのいずれかを用いて、サザンブロット、ノーザンブロット、ＤＮＡ結合分析、および／またはイン・ビトロ、イン・シテューまたはイン・ビボハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーション分析法に有用なこれらの配列の領域（断片）を選択することができるであろう。更に、当業者であれば、本発明の配列を用いて、広く利用可能な配列分析プログラムを用いて、プローブおよびプライマーとして、並びにアンチセンス分子のデザインに用いることができる領域を同定することができる。当業者によって選択された断片についての唯一の実際的制限は、それを選択する目的に対する断片の有用性である。例えば、当業者がハイブリダイゼーションプローブを選択しようとすれば、有意な結果を得るのに十分な長さおよび十分な安定性の一つの選択法を知るであろう。選択される条件は、近似的な選択された長さの核酸断片について開発されたハイブリダイゼーション分析法で典型的に用いられるものである。
【００１６】
従って、本発明は、プローブおよびプライマーとして有用な短いオリゴヌクレオチドを提供する。態様では、プローブおよび／またはプライマーは、本発明によるポリヌクレオチドまたはそれに相補的なポリヌクレオチドの８〜３０個の連続的ヌクレオチドを含んでなる。有利には、本明細書に記載の断片の長さは少なくとも８ヌクレオチドであり、これは特異的ハイブリダイゼーションを行う目的で決定されたほぼ最小限の長さである。好ましくは、核酸断片は、長さが少なくとも１２ヌクレオチドであり、更に好ましくは、配列番号１または配列番号４のいずれかの２０個の連続的ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの配列は、本発明による多数の可能な配列のいずれかであることができる。好ましくは、配列は、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８の群から選択される。更に正確には、プライマーである配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６が核酸断片配列番号４に含まれる。プライマー配列番号１７および配列番号１８は核酸配列である配列番号１に含まれ、配列番号４の核酸断片に隣接している（図５参照）。
【００１７】
従って、配列番号１および配列番号４のポリヌクレオチドおよびそれらの断片を用いて、特に、更に記載される増幅反応のような増幅反応のヌクレオチドプライマーを選択することができる。
【００１８】
ＰＣＲは米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載されており、その内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。増幅断片は、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、キャピラリー電気泳動によって、あるいはクロマトグラフィー法（ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィー）によって同定することができる。増幅の特異性は、核酸プローブとして配列番号１または配列番号４のポリヌクレオチド、およびそれらの断片、これらのポリヌクレオチドまたはその断片に相補的なオリゴヌクレオチド、またはそれらの増幅産物自身を用いる分子ハイブリダイゼーションによって、および／またはＤＮＡシークエンシングによっても確保することができる。
【００１９】
核酸増幅に関する下記の他の手法を用いることもでき、また一般にＰＣＲ法に好ましい。鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification (ＳＤＡ)）法は、制限酵素が（ヘミホスホチオエート形態下にある）認識位置における鎖の１本を開裂することができること、および制限酵素によって生成した３’ＯＨ末端からの新たな鎖の合成を開始するＤＮＡポリメラーゼの特性、および下流に局在化されている以前に合成された鎖を変位させるこのＤＮＡポリメラーゼの特性に基づく等温増幅法である。ＳＤＡ増幅法はＰＣＲ（１個だけの恒温水槽装置が必要）より容易に行われ、他の増幅法より速やかである。従って、本発明は、ＳＤＡ法によるＤＮＡまたはＲＮＡ増幅の方法における本発明による核酸断片（プライマー）の使用も含んでなる。
【００２０】
検出を行うターゲットポリヌクレオチドがＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡであるときには、逆転写酵素を増幅反応の前に用いて、生物学的試料に含まれるＲＮＡからのｃＤＮＡを得る。次に、生成したｃＤＮＡを、本発明による増幅工程または検出工程で用いられるプライマーまたはプローブの核酸ターゲットとして用いる。
【００２１】
本発明の非標識ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、プローブとして直接用いることができる。しかしながら、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは一般に放射性元素（３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）または非同位体分子（例えば、ビオチン、アセチルアミノフルオセン、ジゴキシゲニン、５−ブロモデソキシウリジン、フルオレセイン）によって標識され、多くの用途で有用なプローブを生成する。核酸断片の非放射性標識の例は、仏国特許第ＦＲ  ７８  １０９７５号明細書、およびUrdea et al.(1988, Nucleic Acids Research 11:4937-4957)またはSanchez-Pescador et al.(1988, J. Clin. Microbiol. 26 (10):1934-1938)に記載されており、上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。仏国特許第ＦＲ ２ ４２２ ９５６号明細書およびＦＲ ２ ５１８ ７５５号明細書に記載されているような他の標識法を用いることもできる。ハイブリダイゼーション段階は、様々な方法で行うことができる。例えば、Matthews et al., 1988, Anal. Biochem. 169:1-25を参照されたい。一般的方法は、生物学的試料から抽出した核酸を基剤（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、ポリスチレン）上で固定した後、定義された条件でターゲット核酸をプローブと共にインキュベーションすることを含んでなる。ハイブリダイゼーション段階の後に、過剰量の特異的プローブを廃棄して、形成したハイブリッド分子を適当な方法（放射能、蛍光または酵素活性測定など）によって検出する。
【００２２】
増幅したヌクレオチド断片は、特に本発明による１個のポリヌクレオチドの存在を検出しまたは突然変異を検出するためのハイブリダイゼーション反応で用いられるプローブとして有用である。プライマーをオリゴヌクレオチドプローブとして用いて、本発明によるポリヌクレオチドを特異的に検出することもできる。
【００２３】
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは、基材上に固定されたプローブのマトリックスライブラリーを含んでなる検出装置で用いることもでき、所定の長さのそれぞれのプローブの配列は１または数個の塩基のシフトに局在しており、一方、マトリックスライブラリーのそれぞれのプローブはこれによりターゲット核酸の異なる配列に相補的である。必要に応じて、マトリックスの基剤は電子供与体として作用することができる材料であることができ、ハイブリダイゼーションが起こったマトリックス一の検出が次に電子装置によって決定される。プローブのこのようなマトリックスライブラリーおよびターゲット核酸を特異的に検出する方法は、欧州特許出願第０ ７１３ ０１６号明細書（Affymax technologies）および米国特許第５，２０２，２３１号明細書（Drmanac）にも記載されている。マイコバクテリアの染色体のほぼ全長はＢＡＣに基づくゲノムＤＮＡライブラリーによって被覆されている（すなわち、M.tuberculosis染色体の９７％はＢＡＣライブラリーＩ−１９４５によって被覆されている）ので、これらのＤＮＡライブラリーは、ＢＡＣの規範的セットをハイブリダイゼーション研究のマトリックスとして用いることができるマイコバクテリア遺伝子発現研究のような多数のゲノム後の応用において重要な役割を果たす。従って、核酸細片、更に正確には本発明の核酸またはポリペプチドをそれぞれ含んでなるＤＮＡ細片またはタンパク質細片を提供することも本発明の範囲にある。
【００２４】
本発明は、本発明の単離ＤＮＡ分子を含んでなるベクターも提供している。「ベクター」とは、別のポリヌクレオチドセグメントが付着して、付着したセグメントに複製および／または発現を生じさせるレプリコンである。ベクターは、１以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位であって、ＤＮＡ配列をベクターの本質的な生物学的機能を喪失することなく確定可能なやり方で切断することができ且つＤＮＡ断片をスプライシングしてその複製およびクローニングを生じさせることができる部位を有することができる。ベクターは、更にプライマー位置（例えば、ＰＣＲのための）、転写および／または翻訳開始および／または調節位置、組換えシグナル、レプリコン、選択可能マーカーなどを提供することができる。相同組換えまたは制限酵素を用いて所望なＤＮＡ断片をベクターに挿入することの他に、ＰＣＲ断片のＵＤＧクローニング（米国特許第５，３３４，５７５号明細書）、Ｔ：Ａクローニングなどを応用することもできる。クローニングベクターは、このクローニングベクターを用いて形質転換した細胞の同定に用いるのに適当な選択可能マーカーを含むこともできる。
【００２５】
ベクターは当業者に知られている任意の有用なベクターであることができ、クローニングベクター、挿入ベクター、または発現ベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターの例としては、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、酵母の人工染色体（ＹＡＣ）、細菌の人工染色体（ＢＡＣ）、ヒトの人工染色体（ＨＡＣ）、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびイン・ビトロまたは宿主細胞で複製するまたは複製させることができまたは所望なＤＮＡセグメントを宿主細胞中の所望な位置に送達することができる他のＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２６】
本発明の好ましい態様によれば、組換えベクターはＢＡＣ ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１であって、M. tuberculosis H37Rvのゲノムの座１，７６０，７５３ｂｐ〜１，８３０，３６４ｂｐに対応する領域にわたるMycobacterium bovis-BCGのゲノム領域がＨｉｎｄIII制限部位に挿入されているものであり、この組換えベクターはＸ２２９と命名されている。この領域において、本発明者らは、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisのほとんどにおいて配列番号４に対応する２１５３ｂｐの断片の欠失を示した。それが、本発明者らがこの欠失を２１５３ｂｐ  ＴｂＤ１（「M.tuberculosis特異的欠失１」）と命名した理由である。ＴｂＤ１には、配列GGC CTG GTC AAA CGC GGC TGG ATG CTGおよびAGA TCC GTC TTT GAC ACG ATC GAC Gが隣接している。ＴｂＤ１の外側のこのような配列またはそれに相補的な配列とハイブリダイズする外部プライマーをＴｂＤ１の増幅に用いて、ＴｂＤ１の欠失の存在または非存在をチェックすることができる。本発明者らは、例えば、下記のプライマー：
5'-CTA CCT CAT CTT CCG GTC CA-3' （配列番号１７）
5'-CAT AGA TCC CGG ACA TGG TG-3' （配列番号１８）
をデザイしている。ハイブリダイゼーション実験用の特異的な５００ｐｂのプローブを得るために、ＴｂＤ１に含まれる断片のＰＣＲ増幅をプラスミドＸ２２９をマトリックスとして用いて実現することができる。ＴｂＤ１に含まれる約５００ｂｐの断片の増幅は、下記のプライマー：
5'-CGT TCA ACC CCA AAC AGG TA-3' （配列番号１３）
5'-AAT CGA ACT CGT GGA ACA CC-3' （配列番号１４）
を用いて行うことができる。ＴｂＤ１に含まれる約２０００ｂｐの断片の増幅は、下記のプライマー
5'-ATT CAG CGT CTA TCG GTT GC-3' （配列番号１５）
5'-AGC AGC TCG GGA TAT CGT AG-3' （配列番号１６）
を用いて行うことができる。ＰＣＲ条件は下記の通りである：９５℃で１分間変性した後、３５サイクルの増幅［９５℃で３０秒間、５８℃で１分間］、次いで７２℃で４分間伸長。
【００２７】
従って、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたは組換えベクターを含む組換え細胞宿主にも関する。細胞宿主をポリヌクレオチドまたは組換えベクターで形質転換またはトランスフェクションして、所望なポリヌクレオチドを一過的、安定的または制御して発現することができる。例えば、目的とするポリヌクレオチドをプラスミド中のプロモーターから下流のクローニング位置における発現プラスミドにサブクローニングすることができ、プラスミドを発現が起こり得る宿主細胞に導入することができる。組換え宿主細胞は、真核細胞または微生物のような当業者に知られている任意の適当な宿主であることができる。例えば、宿主は、Escherichia coli、Bacillzrs subtilis、昆虫細胞、および酵母から選択される細胞であることができる。本発明の好ましい態様によれば、組換え細胞宿主は、以前に記載されたＸ２２９と命名したＢＡＣを含む市販のEscherichia coli DH10B (Gibco)である。このＸ２２９と命名したＢＡＣを含むEscherichia coli DH10B (Gibco)は、２００２年２月１８日にCollection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur，パリ，フランスにＣＮＣＭＩ−２７９９の番号で寄託されている。
【００２８】
本発明のもう一つの態様は、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つ上記のようにゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisのゲノムから特異的に欠失した核酸断片などの本発明による核酸の全部または一部の発現の産物である。「発現の産物」という表現は、上記ヌクレオチド配列の全部または一部の発現から生じる任意の単離または精製したタンパク質、ポリペプチドまたはポリペプチド断片を意味するものと理解される。それらの発現の産物の中では、配列番号６に対応する膜タンパク質ｍｍｐＬ６、配列番号３または配列番号１０に対応する膜タンパク質ｍｍｐＳ６（２つの配列番号３および配列番号１０は同一である）、および本発明による核酸断片の欠失によるそれらの切り詰めまたは再編成形態を挙げることができる。例えば、配列番号８はｍｍｐＬ６タンパク質の切り詰め形態であり、配列番号１２はｍｍｐＳ６タンパク質の切り詰め形態であり、配列番号２２はいずれも再編成したｍｍｐＬ６およびｍｍｐＳ６タンパク質の融合産物［ｍｍｐＳ６−ｍｍｐＬ６］である。
【００２９】
従って、プラスミド、ファージおよびファージミドのような発現ベクターを用いる遺伝子工学の手法によってタンパク質を多量に産生することが容易である。本発明のポリペプチドは適当なポリヌクレオチドをベクター中の適当な位置の適当な発現ベクターに挿入することによって産生することができる。このようなポリヌクレオチドの操作は周知であり、当業者によって広く実施されている。ポリペプチドは、これらの組換えベクターからイン・ビトロまたはイン・ビボで産生することができる。本発明のポリペプチドをコードする総ての単離または精製した核酸は、本発明の範囲にある。本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のストリンジェント条件下で配列番号１または４のいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。
【００３０】
更に好ましくは、本発明による上記の単離または精製した核酸は、
−  配列番号１に含まれ且つ配列番号６のタンパク質ｍｍｐＬ６をコードする、配列番号５の配列のｍｍｐＬ６遺伝子、
−  配列番号４のＴｂＤ１に含まれ且つ配列番号８の配列のｍｍｐＬ６タンパク質の切り詰め形態をコードする配列番号７の配列のｍｍｐＬ６遺伝子の切り詰め形態、
−  配列番号１に含まれ且つ配列番号１０の配列のｍｍｐＳ６遺伝子をコードする、配列番号９のｍｍｐＳ６遺伝子、
−  配列番号４の配列のＴｂＤ１に含まれ且つ配列番号１２のｍｍｐＳ６タンパク質の切り詰め形態をコードする、配列番号１１の配列のｍｍｐＳ６遺伝子の切り詰め形態、
−  遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosis株を除くM. tuberculosisのゲノムからＴｂＤ１の欠失による切り詰めｍｍｐＳ６およびｍｍｐＬ６遺伝子の融合によって生じた配列番号２１のキメラ遺伝子、
から選択される。このキメラ遺伝子は、配列番号２２の配列の融合ポリペプチド［ｍｍｐＳ６−ｍｍｐＬ６］をコードする。
【００３１】
本発明は、
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを
生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canettii、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCG
と区別して検出し同定する方法であって、
ａ）  分析を行う生物学的試料からＤＮＡを単離し、または生物学的試料のＲＮＡからのｃＤＮＡを産生し、
ｂ）  生物学的試料に含まれるマイコバクテリウムの核酸配列を検出し、
ｃ）  前記したように、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisをゲノムから特異的に欠失した核酸断片の存在または非存在を分析する
工程を含んでなる、方法も提供する。
【００３２】
本発明による生物学的試料とは、特に喀痰、唾液、血漿、尿または精液のような生物学的流体、または生験材料のような組織を表す。
【００３３】
所望な配列の分析は、例えば、アガロースゲル電気泳動によって行うことができる。予想した位置に移動するＤＮＡ断片の存在が見られる場合には、分析した試料はマイコバクテリアＤＮＡを含んでいたと結論することができる。この分析は、核酸プローブを用いる分子ハイブリダイゼーション法によって行うこともできる。このプローブは、非放射性（コールドプローブ）または放射性元素で標識されているのが有利である。マイコバクテリアＤＮＡ配列の検出は、上記ＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を用いて行うのが有利である。例えば、それらは標識または未標識ヌクレオチドプローブを包含することができ、増幅用プライマーを包含することもできる。用いられる増幅法はＰＣＲでよいが、ＳＤＡ鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification）法、ＴＡＳ法（転写に基づく増幅システム）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）法、またはＴＭＡ（転写依存性増幅）法のような他の代替手法を用いることもできる。
【００３４】
本発明によるプライマーは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。プライマー配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６は配列番号４の核酸断片に含まれ、プライマー配列番号１７および配列番号１８は配列番号１の核酸に含まれるが配列番号４の核酸断片には含まれない。
【００３５】
異なる態様では、本発明の主題は、
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを、
生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGと
区別して検出し同定する方法であって、
ａ）  分析を行う生物学的試料を上記で定義した少なくとも１対のプライマーと接触させ、この試料に含まれるＤＮＡを、適当な場合には、予めハイブリダイゼーションに利用できるようにし、
ｂ）  マイコバクテリウムのＤＮＡを増幅し、
ｃ）  ＤＮＡ断片の増幅を可視化する
工程を含んでなる方法でもある。
【００３６】
増幅断片は、アガロースまたはポリアクリルアミド原子電気泳動によって、キャピラリー電気泳動によって、またはクロマトグラフィー的手法（ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー）によって同定することができる。増幅の仕様は、プローブ、これらの配列を含むプラスミド、または増幅のそれらの産物を用いる分子ハイブリダイゼーションによって制御することができる。増幅したヌクレオチド断片をハイブリダイゼーション反応における試薬として用いて、生物学的試料における上記増幅ヌクレオチド断片の配列に相補的な配列を有するターゲット核酸の存在を検出することができる。これらのプローブおよびアンプリコンは、放射性元素、または酵素または蛍光成分のような非放射性分子で標識することができる。
【００３７】
本発明の主題は、
遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを、
生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGと
区別して検出し同定するためのキットであって、下記の因子
ａ）  上記で定義した少なくとも１対のプライマー、
ｂ）  ＤＮＡ増幅反応を行うのに必要な試薬、
ｃ）  必要に応じて、増幅した断片の配列および／または大きさを明らかにしまたは比較することができる必要な成分
を含んでなる、キットでもある。
【００３８】
実際に、本発明に関連して、用いるプライマーの対によっては、非常に異なる結果を得ることができる。例えば、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６のようなＴｂＤ１欠失に含まれるプライマーを用いて、増幅産物が遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くM. tuberculosisで検出されず、且つ増幅産物がMycobacterium africanum、Mycobacterium canettii、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCG、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosisで検出可能であるようにする。配列番号１７および配列番号１８のようなＴｂＤ１欠失の外側で１対のプライマーを用いると、同様にMycobacterium africanum、Mycobacterium canettii、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCG、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosisに約２１００ｂｐのアンプリコンを生じ、一方ＴｂＤ１欠失の外側で１対のプライマーを用いると、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くM. tuberculosisで約数ｂｐのアンプリコンを生じる。
【００３９】
更に一般的には、本発明は、Mycobacterium tuberculosis、またはMycobacterium africanum、Mycobacterium canettii、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGであって、Mycobacterium tuberculosisが遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないものからのＤＮＡ配列の増幅の目的で上記で定義した通りの少なくとも１対のプライマーの使用に関する。
【００４０】
実際に、本発明の主題は、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosisを除くMycobacterium tuberculosisに対して特異的な抗体と、生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canettii、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCG、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosisに対して特異的な抗体とをイン・ビトロで区別して検出する方法であって、下記の
ａ）  生物学的試料を、上記で定義した通りに遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosisの株を除くM. tuberculosisで特異的に欠失した核酸断片の全部または一部の少なくとも１個の発現産物と接触させ、
ｂ）  生成した抗原−抗体複合体を検出する
工程を含んでなる方法でもある。
【００４１】
本発明の主題は、Mycobacterium bovis BCGを用いる予防接種、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. bovis、M. carettii、M. microti、M. africanum、またはM. tuberculosis株による感染症と、哺乳類の遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisによる感染症をイン・ビトロで区別して検出する方法であって、下記の
ａ）  細胞、更に具体的には上記哺乳類の免疫系の細胞、更に具体的にはＴ細胞を調製し、
ｂ）  工程ａ）の生物学的試料を、上記で定義した通り遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosisの株を除くM. tuberculosisにおいて特異的に欠失した核酸断片の全部または一部の少なくとも１個の発現産物と共にインキュベーションし、
ｃ）  上記産物に対する哺乳類の予備増感を示す細胞反応、特に細胞増殖および／またはγ−インターフェロンのようなタンパク質の合成を検出する
工程を含んでなる、方法でもある。細胞増殖は、例えば、３Ｈ−チミジンを組込むことによって測定することができる。
【００４２】
本発明は、M. bovis BCGを用いる予防接種、M. bovis、M. caraettii、M. microti、M. africanumによる感染症と、哺乳類における遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くM. tuberculosisによる感染症とをイン・ビトロで区別して診断するためのキットであって、
ａ）  上記で定義した通りの遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosisの株を除くM. tuberculosisで特異的に欠失した核酸断片の全部または一部の発現の産物、
ｂ）  適当な場合には、免疫反応に適する培地を構成するための試薬、
ｃ）  免疫反応によって産生した抗原−抗体複合体を検出することができる試薬、
ｄ）  適当な場合には、上記産物によって認識された抗体を含まない参照用生物学的試料（ネガティブコントロール）、
ｅ）  適当な場合には、上記産物によって認識された抗体の予定量を含む参照用生物学的試料（ポジティブコントロール）
を含んでなる、キットにも関する。
【００４３】
抗原−抗体複合体を検出することができる試薬はマーカーを有していることがあり、または次に更に具体的には用いられる抗体が標識されていない場合には、標識試薬によって認識されることができる。
【００４４】
本発明の主題は、本発明による発現の産物を特異的に認識することができるモノまたはポリクローナル抗体、それらのキメラ断片または抗体でもある。
【００４５】
従って、本発明は、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くMycobacterium tuberculosisの抗原と、生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canettii、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis-BCG、および遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosisの抗原の存在を区別して検出する方法であって、下記の
ａ）  生物学的試料を本発明の抗体と接触させ、
ｂ）  形成した抗原−抗体複合体を検出する
工程を含んでなる、方法にも関する。
【００４６】
本発明は、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosisの株を除くMycobacterium tuberculosisの抗原の存在と、生物学的試料中のMycobacterium africanum、Mycobacterium canetti、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCGまたは遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosisの抗原の存在を区別して検出するためのキットであって、下記の
ａ）  上記の通りの抗体、
ｂ）  免疫反応に適する培地を構成するための試薬、
ｃ）  免疫反応によって産生した抗原−抗体複合体を検出することができる試薬
の段階を含んでなる、キットにも関する。
【００４７】
上記の試薬は当業者には周知であり、彼らは本発明の状況に容易に適合させることができる。
【００４８】
本発明の主題は、本発明による少なくとも１個の発現産物を含んでなる免疫原性組成物でもある。このような免疫原性組成物を用いて、動物およびヒトをM. africanum、M. bovis、M. canettii、M. microtiおよびM. tuberculosisによる感染症から保護する。
【００４９】
特定の態様では、このような免疫原性組成物は、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisのゲノムで特異的に欠失した核酸断片の全部または一部の発現産物を含んでなる。また、好ましい態様では、このような免疫原性組成物はＴｂＤ１の全部または一部の発現産物を含んでなる。この場合に、このような免疫原性組成物を用いて、動物およびヒトをM. africanum、M. bovis、M. canettii、M. microtiおよび遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosisによる感染症から保護する。
【００５０】
他の特定の態様では、このような免疫原性組成物は配列番号２２の融合産物［ｍｍｐＳ６−ｍｍｐＬ６］を含んでなる。この融合産物は、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くM. tuberculosisにおいてＴｂＤ１が含まれていないことによる。この融合産物を含んでなる免疫原性組成物を用いて、特に、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していない株を除くM. tuberculosisのほとんどによる感染症から動物およびヒトを保護する。
【００５１】
本発明による免疫原性組成物は、薬学上許容可能なビヒクルと、必要に応じてミョウバンまたはムラミルペプチドのファミリーの代表的なモノまたは不完全フロイントアジュバントのような１種類以上の免疫アジュバントと組み合わせて提供されるときには、ワクチンの組成を扱うのが好都合である。
【００５２】
本発明は、少なくとも１個の本発明の発現産物を、薬学上適合性のビヒクル、および適当な場合には、１種類以上の適当な免疫アジュバントと組み合わせて含んでなる、ワクチンにも関する。
【００５３】
本発明は、生物学的試料中の遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを検出し同定するイン・ビトロ法であって、下記の
ａ）  分析を行う生物学的試料からＤＮＡを単離しまたは生物学的試料のＲＮＡからｃＤＮＡを産生し、
ｂ）  上記生物学的試料に含まれるマイコバクテリウムの核酸配列を検出し、
ｃ）  本発明の核酸断片の存在または非存在について分析を行う
工程を含んでなる、イン・ビトロ法も提供する。
【００５４】
もう一つの態様では、本発明は、生物学的試料中の遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを検出し同定するイン・ビトロ法であって、下記の
ａ）  分析を行う生物学的試料を、本発明の核酸断片から選択された、更に好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択されるプライマーから選択された少なくとも１対のプライマーと接触させ、試料に含まれるＤＮＡを、適当な場合には、予めハイブリダイゼーションを行うことができるようにしておき、
ｂ）  マイコバクテリウムのＤＮＡを増幅し、
ｃ）  ＤＮＡ断片の増幅を可視化する
工程を含んでなる、イン・ビトロ法を提供する。
【００５５】
本発明は、生物学的試料において、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisを検出し同定するためのキットであって、下記の因子：
ａ）  本発明の核酸断片から選択された、更に好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択されたプライマーから選択された少なくとも１対のプライマー、
ｂ）  ＤＮＡ増幅反応を行うのに要する試薬、
ｃ）  必要に応じて、増幅した断片の配列および／または大きさを明らかにしまたは比較することができる必要な成分
を含んでなる、キットも提供する。
【００５６】
本発明は、生物学的試料において、遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないMycobacterium tuberculosis株を除くMycobacterium tuberculosisに対して特異的な抗体をイン・ビトロで検出する方法であって、
ａ）  生物学的試料を遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosis株を除くM. tuberculosisで特異的に欠失した核酸断片の全部または一部の少なくとも１個の発現産物と接触させ、
ｂ）  形成した抗原−抗体複合体を検出する
工程を含んでなる、方法にも関する。
【００５７】
Mycobacterium群のMycobacterium株を識別するための遺伝子マーカーとしてのＴｂＤ１欠失の使用も、本発明の目的である。
【００５８】
Mycobacterium群のMycobacterium株を識別するための遺伝子マーカーしてのｍｍｐＬ６５５１多型の使用も、本発明の目的である。
【００５９】
ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ３、ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ６、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１１、ＲＤ１３、ＲＤ１４、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４、ＲｖＤ５、ｋａｔＧ４６３、ｇｙｒＡ９５、ｏｘｙＲ'２８５、ｐｎｃＡ５７、およびM. canettii (IS canettii)の特異的挿入因子から選択される少なくとも１個の遺伝子マーカーに関連した（複数の）遺伝子マーカーを使用することによって、Mycobacterium株をMycobacterium群と区別することができる（例４参照）。
【００６０】
本発明は、生物学的試料中のMycobacteria群からマイコバクテリアを検出して同定するためのイン・ビトロ法であって、
ａ）  生物学的試料を遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosis株を除くM. tuberculosisで特異的に欠失した核酸断片の存在または非存在について分析し、
ｄ）  ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ３、ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ６、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１１、ＲＤ１３、ＲＤ１４、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４、ＲｖＤ５、ｋａｔＧ４６３、ｇｙｒＡ９５、ｏｘｙＲ'２８５、ｐｎｃＡ５７、M. canettiiの特異的挿入因子から選択される少なくとも１個の追加遺伝子マーカーを分析する
工程を含んでなる、イン・ビトロ法を提供する。
【００６１】
好ましい態様では、２種類の追加マーカー、好ましくはＲＤ４およびＲＤ９を用いる。分析は、配列ハイブリダイゼーション、核酸増幅、抗原−抗体群から選択した手法によって行う。
【００６２】
本発明の目的は、生物学的試料中のMycobacteriun群からマイコバクテリアを検出し同定するためのキットであって、下記の因子：
ａ）  本発明の核酸断片から選択される、更に好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択されるプライマーから選択される少なくとも１対のプライマー、
ｂ）  ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ３、ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ６、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１１、ＲＤ１３、ＲＤ１４、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４、ＲｖＤ５、ｋａｔＧ４６３、ｇｙｒＡ９５、ｏｘｙＲ'２８５、ｐｎｃＡ５７、M. canettiiの特異的挿入因子から選択される遺伝子マーカーに特異的な少なくとも１対のプライマー、
ｃ）  ＤＮＡ増幅反応を行うのに要する試薬、
ｄ）  必要に応じて、増幅した断片の配列および／または大きさを明らかにしまたは比較することができる必要な成分
を含んでなる、キットを提供することでもある。
【００６３】
好ましい態様では、このキットは、下記の因子：
ａ）  本発明の核酸断片から選択される、更に好ましくは配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８を含んでなる群から選択されるプライマーから選択される少なくとも１対のプライマー、
ｂ）  遺伝子マーカーＲＤ４に特異的な１対のプライマー、
ｃ）  遺伝子マーカーＲＤ９に特異的な１対のプライマー、
ｄ）  ＤＮＡ増幅反応を行うのに要する試薬、
ｅ）  必要に応じて、増幅した断片の配列および／または大きさを明らかにしまたは比較することができる必要な成分
を含んでなる。
【００６４】
下記の図および例は、当業者に対する更に別の指針として提供されるものであり、本発明を制限するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００６５】
１．  材料および方法：
１．１．  細菌株：
１００個の結核菌群株は、３０カ国で単離された４６種のM. tuberculosis株、１４種のM. africanum株、５カ国に由来する２８種のM. bovis株、２種のM. bovis BCGワクチン株(PasteurおよびJapan)、５種のM. microti株、および５種のM. canettii株から構成された。これらの株はヒトおよび動物供給源から単離し、多中心研究（８）で用いた６０株を包含する広い多様性を示すように選択した。M. africanum株はWadsworth Center， New York State Department of Health, Albany, New Yorkのコレクションから得て、M. bovis単離物の大部分はUniversity of Zaragoza, スペインのコレクションから入手した。４種類のM. canettii株は、Institut Pasteur, Paris, フランスのカルチャーコレクションからのものである。株は、リファレンスタイピング法、すなわちＩＳ６１１０制限断片長多型（ＲＦＬＰ）タイピングおよびスポリゴタイピングによって徹底的に特性決定した。M. tuberculosis H37Rv、M. tuberculosis H37Ra、M. tuberculosis CDC1551、M. bovis AF2122/97、M. microti OV254、およびM. canettii CIPT 140010059が、リファレンス株として包含された。ＤＮＡは、上記の方法で調製した（１０）。
【００６６】
１．２．  ゲノム比較およびプライマーデザイン
M. tuberculosisとM. bovisのゲノムの予備的比較には、ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/TubercuList/およびhttp://www.sanger.ac.uk/Projects/M_bovis/、並びに社内データベースを用いた。プライマーデザインには、ＲＤおよびＲｖＤ領域内部またはこれに隣接する配列を、同じウェブサイトから得た。プライマーは、リファレンス株における約５００塩基対断片を増幅するプライマー３ウェブサイトhttp://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgiを用いてデザインした（表１）。
【００６７】
１．３．  ＲＤ−ＰＣＲ分析
反応は９６穴プレートで行い、反応当たり１．２５μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液（６００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．８、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１７０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール）、１．２５μｌの２０ｍＭヌクレオチドミックス、５０ｎＭのそれぞれのプライマー、１〜１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、１０％ＤＭＳＯ、０．２単位のＴａｑポリメラーゼ(Gibco-BRL)を含み、滅菌蒸留水を加えて１２．５μｌとした。熱循環を、ＰＴＣ−１００増幅装置（MJ Inc.）で、９５℃で９０秒間の初期変性段階の後、９５℃で３０秒間、５８度で１分間および７２℃で４分間の３５サイクルを行った。
【００６８】
１．４．  接合領域（ＲＤｓ、ＴｂＤ１）、ｋａｔＧ、ｇｙｒＡ、ｏｒｙＲおよびｐｎｃＡ遺伝子シークエンシング
ＰＣＲ産物は、上記のように、表１に挙げたプライマーを用いて得た。
プライマー除去については、６μｌのＰＣＲ産物をシュリンプアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ）  １単位、エキソヌクレアーゼＩ（ＵＳＢ）１０単位、および５ｘ緩衝液（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．８、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２μｌと共に３７℃で１５分間インキュベーションした後、８０℃で１５分間インキュベーションした。この反応混合物にＢｉｇ  Ｄｙｅシークエンシングミックス（Applied Biosystems）２μｌ、プライマー２μｌ（２μＭ）、および５ｘ緩衝液（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ８．８）３μｌを加え、３５サイクル（９６℃で３０秒間；５６℃で１５秒間；６０℃で４分間）をサーモサイクラー（MJ- research Inc., Watertown, MA）で行った。ＤＮＡを７６％エタノール８０μｌを用いて沈澱させ、７０％エタノールで濯いで、乾燥した。反応物をホルムアミド／ＥＤＴＡ緩衝液２μｌに溶解し、変性して、４８ｃｍの４％ポリアクリルアミドゲルに装填し、電気泳動を３７７自動化ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems）で１０〜１２時間行った。あるいは、反応物を０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、３７００ ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems）で自動化シークエンシングを行った。反応物は、一般に５００〜７００ｂｐの明確な配列を生じた。
【００６９】
１．５．  受領番号
遺伝子ｍｍｐＳ６およびｍｍｐＬ６を含む祖先M. tuberculosis株Ｎｏ．７４（参考文献８）からのＴｂＤ１領域の配列を、ＥＭＢＬに受領番号ＡＪ４２６４８６で寄託した。ＢＣＧにおいてＲＤ４、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９およびＲＤ１０に接している配列は、それぞれ受領番号ＡＪ００３１０３、ＡＪ００７３０１、ＡＪ１３１２１０、Ｙ１８６０４、およびＡＪ１３２５５９で入手可能である。
【００７０】
２．  実験データ：  
結核菌のゲノムにおける挿入−欠失事象から生じる２０可変領域の分布を、全部で１００株のMycobacterium tuberculosis、M. africanum、M. canettii、M. microti、およびM. bovisで評価した。この方法は、これらの多型の大部分は結核菌群の異なる株では独立して起きないが、共通の祖先株における古い不可逆的遺伝事象から生じる。M. tuberculosisの特異的欠失（ＴｂＤ１）の有無に基づいて、M. tuberculosis株を祖先および「近代」株に分類し、後者がBeijing、HaarlemおよびAfrican M. tuberculosis群のような主要な流行病の代表的なものを構成することができる。更に、ＦＤ９によって反映されるＤＮＡの連続的喪失とそれに続く他の欠失を同定して、進化系統をＴｂＤ１が起こる前に現在のM. tuberculosis株の祖先から分岐したM. africanum、M. microtiおよびM. bovisによって表わした。これらの知見は、ヒト結核の病原体であるM. tuberculosisがウシの疾患の病原体であるM. bovisから進化したというしばしば提出される仮説と矛盾する。これらの欠失領域を全く欠いていないM. canettiiおよび先祖のM. tuberculosis株は、M. africanum->M. bovis系統がM. tuberculosis系統から分離する前に存在した結核菌の直接の子孫であると思われる。これは、結核菌の共通の先祖がM. tuberculosisまたはM. canettiiに似ており、既に十分にヒトの病原体となっていたことを示唆している。
【００７１】
結核菌群に分類されたマイコバクテリアはヌクレオチドレベルおよび同一１６ＳｒＲＮＡ配列で９９．９％の同一性を有することを特徴とするが（１，２）、それらの宿主親和性、表現型、および病原性に関しては大きく異なっている。それらが総て共通の祖先に由来すると仮定すると、幾つかはもっぱらヒト（M. tuberculosis、M. africanum、M. canettii）または齧歯類の病原体（M. microti）であるが、他のものは広い宿主スペクトルを有する（M. bovis）ことは興味深いことである。結核菌の最後の共通の祖先の遺伝子構成はどのようなものであり、またどの宿主で生きられたのか。どのような遺伝学的事象が、宿主スペクトルが非常に異なっており且つしばしば特異的であるという事実に影響したのであろうか。どこでいつ、M. tuberculosisは進化したのか。これらの疑問に対する回答は、結核の病原性と包括的疫学のより一層理解する上で重要であり、この疾患の将来の趨勢を予測する助けとなることがある。
【００７２】
それらのハウスキーピング遺伝学の保存度が著しく高いため、結核菌群の菌は約１５，０００〜２０，０００年前に起きたと推定される種形成時に進化を妨げられたことが示唆されている（２）。動物の病原体をヒト宿主に特異的に適合することによって、ヒト結核の最も広範囲に存在するM. tuberculosisはウシの病原体であるM. bovisから進化したとも推定されている（３）。しかしながら、いずれの仮説も、M. tuberculosisの全ゲノム配列（４）が利用可能となる前に且つ比較ゲノム学（comparative genomics）により結核菌群の菌における幾つかの可変ゲノム領域が発見される前に提案されたものであった。示差的ハイブリダイゼーション配列により、M. tuberculosis H37Rvに関してBCG Pasteurには欠けている２〜１２．７ｋｂの大きさの１４の領域（ＲＤ１−１４）を同定した（５，６）。同時に、結核菌群の他の菌に関してM. tuberculosis H37Rvゲノムを欠いている６個の領域、ＲｖＤ１−５およびＴｂＤ１が、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）法（５，７）、およびほぼ完全なM. bovis AF2122/97ゲノム配列とM. tuberculosis H37Rv配列のイン・シリコ比較を用いる比較ゲノム法によって明らかにされた。
【００７３】
本研究では、本発明者らは、結核菌群に属する１００株の代表的且つ様々な組におけるゲノムの周りに配置されたこれら２０個の可変領域（表１）の分布を分析した。株は、様々な宿主、広範囲の地理学的起源から単離し、ＩＳ６１１０のような広いタイピング特性のスペクトルとスポリゴタイプハイブリダイゼーションパターンまたはマイコバクテリア散在性反復単位の可変数縦列反復配列（ＭＩＲＵ−ＶＮＴＲ）を示す（８，９）。本発明者らは、ある種の可変ゲノム領域の欠失は、Mycobacterium群の様々な株で独立して起こらない顕著な証拠を見出し、この群の様々な系統間の染色体セグメントにはほとんどまたは全く組換えがないことを仮定すれば、本発明者らはMycobacterium群の進化およびヒト結核の起源に全く新たなシナリオを提案できる。
【００７４】
可変ゲノム領域および結核菌M. tuberculosis群の菌におけるそれらの存在
４６のM. tuberculosis、１４のM. africanum、５のM. canettii、５のM. microti、２８のM. bovisおよび２のＢＣＧ株中の２０の可変領域（表１）についてのＰＣＲスクリーニング分析では、既知のＲＤｓおよびＲｖＤｓに対して内部のオリゴヌクレオチド、並びにこれらの領域に隣接するオリゴヌクレオチド（表１）を用いた。この方法は、内部プライマーを用いて得たＰＣＲアンプリコンは隣接プライマー対を有する適当な大きさのアンプリコンの非存在と相関し、逆もまた同じであるので、上部で信頼性の高い大きなデータセットを生じた。
【００７５】
可変領域に隣接する接合配列が保存されることにより、３種類の領域であってそれぞれが進化マーカーとして異なる重要性を有するものが識別された。第一のタイプはプロファージｐｈｉＲｖ１（ＲＤ３）およびｐｈｉＲｖ２（ＲＤ１１）および挿入配列ＩＳ１５３２（ＲＤ６）およびＩＳ６１１０（ＲＤ５）のような可動性遺伝因子を包含し、結核菌におけるその分布は極めて多岐にわたっていた（表２）。第二のタイプの欠失は介在ＤＮＡセグメント（ＲｖＤ２、ＲｖＤ３、ＲｖＤ４およびＲｖＤ５（７））の喪失を生じる隣接ＩＳ６１１０挿入因子間の相同組換えによって伝達され、且つ株毎に可変である（表２）。
【００７６】
第三のタイプは、境界を定めているゲノム領域が典型的には反復配列を含まない欠失を包含する。このタイプの欠失は、M. tuberculosis群の他の株において完全なままである遺伝学の切り詰めを生じるコード領域で起こることが多かった。このタイプの欠失を生じる正確な機構は未だよく知られていないが、ＤＮＡポリメラーゼのまれに起こる可能性がある鎖のずれの誤差がこの事象に寄与している可能性がある。下記に詳細に示すように、ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ４、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１２、ＲＤ１３、ＲＤ１４およびＴｂＤ１がこの第三の群の代表的なものであり、１００株中の分布から結核菌群の菌についての進化のシナリオが提案され、結核菌の共通の祖先に極めて近接した関連のあるものとしてM. tuberculosisおよび／またはM. canettiiが同定された。
【００７７】
２．１．  M. tuberculosis株：
欠失分析による４６のM. tuberculosis株の検討によって、ほとんどのＲＤ領域が試験を行った総てのM. tuberculosis株に存在することが明らかになった（表２）。M. tuberculosis Ｈ３７Ｒｖの２種類のプロファージｐｈｉＲｖ１およびｐｈｉＲｖ２に対応する領域ＲＤ３およびＲＤ１１（４）、挿入配列ＩＳ１５３２を含むＲＤ６、およびＩＳ６１１０のコピーが隣接しているＲＤ５（５）のみが、幾つかの株に含まれていなかった。M. tuberculosis株はＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ４、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１２、ＲＤ１３およびＲＤ１４に関して高度に保存され且つこれらのＲＤはM. tuberculosis株をそれらの地理学的起源およびそれらのタイピング特性から独立して結核菌群のある種の他の菌から区別できる領域を表すことを示唆するので、これは重要な観察である。
【００７８】
対照的に、M. tuberculosis株におけるＲｖＤ領域の有無は可変性であった。試験した４６のM. tuberculosis株の中の１８はＲｖＤ２を持たなかったので、最大の可変性を示す領域はＲｖＤ２領域であった。ＩＳ６１１０の高いコピー数（＞１４）を有する株では、コピー数が僅かな株よりも領域ＲｖＤ２−ＲｖＤ５がないことが多い。例えば、Ｂｅｉｊｉｎｇ群に属する６個総ての試験した株（８）は、領域ＲｖＤ２およびＲｖＤ３を欠いていた。これは、この欠失事象におけるＩＳ６１１０の２つの隣接コピーの組換えについて提案された関連と一致する（７）。
【００７９】
しかしながら、ＲｖＤ領域に関して最も意外な知見は、Haarlem、BeijingおよびAfrica群のような主要な伝染病由来の代表的株を含む試験を行ったM. tuberculosis株の４０には含まれなかったことであった（８）。この結果を強調するため、本発明者らはこの領域を「M. tuberculosis特異的欠失１」（ＴｂＤ１）と命名した。M. tuberculosis H37RvとM. bovis AF2122/97の対応する部分とのイン・シリコ配列比較によって、M. bovisでは、この座は大きなファミリーに属する膜タンパク質をコードする２個の遺伝子を含んでなり、一方、M. tuberculosis H37Rvでは、これらの遺伝子の一つ（ｍｍｐＳ６）は含まれておらず、第二のものは切り詰められていた（ｍｍｐＬ６）。ＲｖＤ２−ＲｖＤ５欠失とは異なり、ＴｂＤ１領域はM. tuberculosis H37RvにおけるＩＳ６１１０のコピーが隣接しておらず、挿入因子２１５３ｂｐ断片の欠失には関与していないことが示唆された。ＴｂＤ１領域を欠いている４０のM. tuberculosis株がM. tuberculosis H37Rvと同じこの座のゲノム構成を有するかどうかを更に検討するため、様々な株のＴｂＤ１−接合領域を、欠失領域に隣接するプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した（表１）。この方法は、複数の株から得たアンプリコンの大きさが均一であることを示し（図１）、次のＰＣＲ産物の配列分析により、試験を行った総てのＴｂＤ１欠失株では、接合領域の配列はM. tuberculosis H37Rvの配列と同一であることが明らかになった（図２）。地理的に極めて多岐にわたるＴｂＤ１欠失株の接合配列が完全に保存されることは、欠失を生じた遺伝事象がが共通の祖先で起きたことを示唆している。しかしながら、６個のM. tuberculosis株であって、いずれもＩＳ６１１０および互いに類似しているスポリゴタイプのコピー数が極めて少数であるかまたは全くないことを特徴とするものは（図３）、未だにＴｂＤ１領域が存在している。興味深いことには、これらの６個の株は、ＭＩＲＵ−ＶＮＴＲ分析によって１群にまとめられた（９）。
【００８０】
異なる結核菌間で可変であると記載されているｏｘｙＲ、ｐｎｃＡ、ｋａｔＧ、およびｇｙｒＡの部分遺伝子配列の分析によって（２、１１、１２、１３）、試験を行った総てのM. tuberculosis株はM. tuberculosisに典型的なｏｘｙＲおよびｐｎｃＡ部分配列を示すことが明らかになった（ｏｘｙＲ−ヌクレオチド２８５（ｏｘｙＲ２８５）：Ｇ、ｐｎｃＡ−コドン５７（ｐｎｃＡ５７：ＣＡＣ）。ｋａｔＧコドン４６３（ｋａｔＧ４６３）およびｇｙｒＡコドン９５（ｇｙｒＡ９５）配列多型に基づいて、Sreevatsanと共同研究者ら（２）は、結核菌からの３群であって、群１がｋａｔＧ４６３ ＣＴＧ（Ｌｅｕ）、ｇｙｒＡ９５ ＡＣＣ  Ｔｈｒ）を示し、群２がｋａｔＧ４６３ ＣＧＧ（Ａｒｇ）、ｇｙｒＡ９５ ＡＣＣ（Ｔｈｒ）を示し、群３がｋａｔＧ４６３ ＣＧＧ（Ａｒｇ）、ｇｙｒＡ９５ ＡＧＣ（Ｓｅｒ）を示すものを定義した。この略図によれば、本発明者らの研究では、試験を行った４６のM. tuberculosis株の１６が群１に属し、２７株が群２に属し、３個の単離株のみが群３に属した。領域ＴｂＤ１を欠失した４０株の中の９株が群１の特徴を示し、Ｂｅｉｊｉｎｇ群に属する株を包含し、群２の２８がＨａａｒｌｅｍおよびＡｆｒｉｃａ群由来の株を包含し、群３の３はＨ３７ＲｖおよびＨ３７Ｒａを包含した。最も興味深いことには、ＴｂＤ１領域が欠失していない６種類総てのM. tuberculosis株はｋａｔＧ４６３にロイシンを含み、これは先祖のM. tuberculosis株に特徴的であると記載された（群１）（２）。図４に示されるように、M. tuberculosisの進化の際に、領域ＴｂＤ１を欠失した先祖株でコドン４６３でｋａｔＧ突然変異ＣＴＧ（Ｌｅｕ）−＞ＣＧＧ（Ａｒｇ）が起きたことを示唆している。この提案は、群１に属する株が欠失領域ＴｂＤ１を有しまたは持たないことがあり、一方群２および３に属する３０総ての株はＴｂＤ１を欠いていたという知見によって支持される（図４）。更に、群２および３の総ての株は直接反復（ＤＲ）領域においてスペーサー配列３３〜３６を特徴的に欠いていた（図３）。このようなスペーサーは喪失するが得られないことがあると思われる（１４）。従って、ＴｂＤ１欠失株は、以後は「近代」M. tuberculosis株と表す。
【００８１】
２．２．  M. canettii：
M. canettiiは、通常はアフリカ出身またはアフリカに関連した患者から単離されるM. tuberculosisの極めてまれなスムーズ変異体である。M. canettii株はMycobacterium群の他の菌と同一の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列を共有するが、ある種のハウス・キーピング遺伝子における多型、ＩＳ１０８１コピー数、コロニー形態、および細胞壁の脂質含量など多くの点で異なっている（１５，１６）。従って、本発明者らはM. canettiiにおいて、プロファージ（ｐｈｉＲｖ１，ｐｈｉＲｖ２）を除く総てのＲＤ、ＲｖＤ、およびＴｂＤ１領域が存在することを見出したことに驚愕した。対照的に、本発明者らは、ＲＤ１２と部分的に重複した５個総てのM. canettii株から本質的に存在しない領域（ＲＤｃａｎ）を同定した（図４）。
【００８２】
多くの記載および観察された差に関してM. canettiiのゲノムにおいてＲＤ、ＲｖＤ、およびＴｂＤ１領域が保存されることは、結核菌の系統においてＲＤ、ＲｖＤ、およびＴｂＤ１が起こる前にM. canettiiがMycobacterium群の共通の先祖から分岐したことを示唆している（図４）。この仮説は、M. canettiiが直接反復配列領域に２６のユニークスペーサー配列を有することが示され、この配列はMycobacterium群の任意の他の菌には最早存在しないという知見によって支持される。M. canettiiの他の特有の特徴は、Mycobacterium群（M. tuberculosis、M. bovis、M. africanumおよびM. microtiなど）の他の菌株では成功しなかったＰＣＲおよびハイブリダイゼーション法を用いることによる配列を探索した挿入因子の存在である。この挿入因子は、２個の逆方向反復配列によって枠に嵌められた推定的トランスポザーゼをコードするＯＲＦを含んでいた。この挿入因子の配列は図６および配列番号１９に表されており、これは３９９位で始まり、２３７８位で終わっている。推定的トランスポザーゼのアミノ酸配列を、配列番号２０に示す。この挿入因子自体は、同じＴｂＤ１、ＲＤ４およびＲＤ９プロフィールを示すことがあるM. tuberculosis先祖株とM canettii株とを区別するのに用いることができる。従って、M. canettiiは魅力的な結核菌であり、その詳細なゲノム分析によりMycobacterium群の進化を更に洞察することができる。
【００８３】
２．３．  M. africanum：
本明細書で検討したM. africanumと呼ばれる単離物は西および東アフリカに起源がある。１１株はシエラレオーネ、ナイジェリアおよびギニアで単離され、２株はウガンダで単離された。１株は、オランダに由来する。
【００８４】
１１株の西アフリカ単離物について、ＲＤ分析したところ、これらの株はいずれもｃｏｂＬを含むＲＤ９領域を欠くことを示していた。ＲＤ９接合領域の配列分析は、西アフリカ株におけるこの座の遺伝子構成は、ｃｏｂＬの５’部分並びに遺伝子Ｒｖ２０７３ｃおよびＲｖ２０７４ｃがない点においてM. bovisおよびM. microtiのモノと同一であることを示した。更に、６個の株（２個はシエラレオーネ由来、４個はギニア由来）もＲＤ７、ＲＤ８およびＲＤ１０を欠いていた（表２）。ＲＤ９についての接合配列と同様に、ＲＤ７、ＲＤ８およびＲＤ１０と境を接している接合配列は、M. bovisおよびM. microti株のものと同一であった。２個のプロファージｐｈｉＲｖ１およびｐｈｉＲｖ２に関して、西アフリカ株はいずれもｐｈｉＲｖ２を含んでいたが、ｓｐｈｉＲｖ１はなかった。変動性は、ＲｖＤ領域については見られなかった。ＲｖＤ１−ＲｖＤ５およびＴｂＤ１は、試験した総ての西アフリカ株に存在した。これは、西アフリカで流行しているM. africanumは、領域ＲＤ９が存在せず且つ領域ＴｂＤ１するという少なくとも２個の可変遺伝子マーカーによって「近代的」(modern) M. tuberculosisから区別することができることを示している。
【００８５】
対照的に、東アフリカのM. africanumおよびオランダに由来する単離物については、それらをM. tuberculosis株と区別することができる遺伝子マーカーは見出されなかった。プロファージｐｈｉＲｖ１  （ＲＤ３）を除き、ウガンダおよびオランダに由来する３株は、ＲＤ欠失を全く示さなかったが、「近代的」M. tuberculosis株と同様にＴｂＤ１領域を欠いていた。ＴｂＤ１領域がないことは、ＴｂＤ１接合領域の配列分析によっても明らかにされ、これはＴｂＤ１欠失M. tuberculosis株のものと同一であることが見出された。これらの結果は、これらの株のM. tuberculosisに極めて近接した遺伝学的関連性を示しており、それらはM. africanumよりはむしろM. tuberculosisと見なすべきであることを示唆している。
【００８６】
２．４．  M. microti：
M. microti株は、１９３０年代にハタネズミから単離され（１７）、更に最近では免疫抑制患者から単離された（１８）。これらの株は同一の特徴的なスポリゴタイプを有することを特徴とするが、それらのＩＳ６１１０プロフィールは異なっている。ハタネズミおよびヒト単離物はいずれも領域ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９およびＲＤ１０、並びにM. microtiから特異的に欠失した領域（ＲＤｍｉｃ）を欠いていた。ＲＤｍｉｃは、M. microti Bacterial Artificial Chromosome(BAC)ライブラリー由来のクローンを用いるM. microtiの詳細な比較ゲノム学的検討によって明らかにされた（１９）。ＲＤｍｉｃは、部分的にＢＣＧ由来のＲＤ１と重複している（データは示さず）。更に、ハタネズミ単離物はＲＤ５領域の一部を欠いているが、この領域はヒト単離物には存在する。M. microtiにおけるＲＤ５の接合領域はＢＣＧのものとは異なっているので（データは示さず）、ＲＤ５は進化マーカーとして用いなかった。
【００８７】
２．５．  M. bovisおよびM. bovis BCG：
M. bovisは、ヒトを含む多くの哺乳動物種に感染する極めて大きな宿主スペクトルを有する。ＲＤおよびＲｖＤ領域についてスクリーニングしたM. bovis株のコレクションは、３個のヤギ単離物、３個のアザラシ単離物、２個のオリックス単離物、および一層多数のＩＳ６１１０のコピーを提供するヒト由来の２個のM. bovis株の他に、２個のＢＣＧ株と一般的にウシ由来のＩＳ６１１０の１または２コピーを特徴とする１８個の「古典的」(classical) M. bovis株からなっていた。
【００８８】
プロファージを除き、ＲＤの分布により、試験を行ったM. bovis株から５個の主要な群を区別することができた。第一の群は、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９およびＲＤ１０を欠いている株によって形成された。この群の典型的ｎＭのは３個のアザラシ単離物、およびＩＳ６１１０のコピーを３〜５個含む２個のヒト単離物である（データは示さず）。ＩＳ６１１０のコピーを１７〜２０個含む２個のオリックス単離物は、ＲＤ７−ＲＤ１０の他にＲＤ５を欠き、M. microti単離物に極めて類似している第二の群を形成した。しかしながら、それらはM. microti株に特徴的な欠失であるＲＤｍｉｃを示さなかった（データは示さず）。群１および２に属する株由来の部分ｏｘｙＲおよびｐｎｃＡ配列の分析では、M. tuberculosis株に特徴的な配列多型を示した（ｏｘｙＲ２８５：Ｇ、ｐｎｃＡ５７：ＣＡＣ、参考文献１２，１３）。
【００８９】
群３は、領域ＲＤ５、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１２およびＲＤ１３を欠いているヤギ単離物からなっている。Ａｒａｎａｚと共同研究者らによって以前に報告されているように、これらの株は「古典的」M. bovis株に特異的なｏｘｙＲ偽遺伝子の２８５位にアデノシンを示したが、ｐｎｃＡ５７多型の配列はM. tuberculosisの配列と同一であった（２０）。これは、配列分析からの本発明者らの結果（表２）、およびＲＤ４を除いて、ヤギ単離物は「古典的」M. bovis株と同じ欠失を示すという知見と良好な一致を示す。まとめると、これは、ＲＤ４が失われる前に、ｏｘｙＲ２８５突然変異（Ｇ->Ａ）がM. bovis株で起きたことを示唆している。興味深いことには、アルゼンチン、オランダ、英国およびスペイン産のウシ、並びにヒトから単離した最も普通のM. bovis株（「古典的」M. bovis（２１））（例えば、スペインからの多剤耐性M. bovis（２２））は最大数のＲＤ欠失を示し、M. tuberculosis群の他の菌に関してＤＮＡの損失が最大になると思われる。これらは領域ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ６、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１２およびＲＤ１３を欠き、リファレンス株で得た結果が確認された（５，６）。これらの株は２個のＢＣＧ株と共に、M. bovisに特徴的なｏｘｙＲ２８５突然変異（Ｇ->Ａ）の他にｐｎｃＡ５７多型ＧＡＣ（Ａｓｐ）を示した唯一のものであった。ＢＣＣ株の分析では、明らかに減衰過程中または後に起きたＲＤ１、ＲＤ２およびＲＤ１４の他に「古典的」M. bovis株と同じＲＤ領域をＢＣＧが欠いていたことを示している（図４）（６，２３）。
【００９０】
ＲＤとは対照的に、ＲｖＤ領域はM. bovis株では高度に保存されていた。ＲｖＤ２、ＲｖＤ３およびＲｖＤ４を欠く２個のＩＳ６１１０リッチオリックス単離物をのぞき、他の総ての株は５個のＲｖＤ領域を有した。ＴｂＤ１が総てのM. bovis株に存在したことは特に注目に値する。
【００９１】
しかしながら、群１からのＩＳ６１１０の３〜５コピーを含む２個のヒト単離物を除き、M. bovisと命名された株は、コドンＡＡＣを特徴とするM. canettii、M. africanumおよび先祖M. tuberculosisに対して、ｍｍｐＬ６遺伝子のコドン５５１（ＡＡＧ）のＴｂＤ１領域において単一のヌクレオチド多型を示した。M. tuberculosisのようなｏｘｙＲまたはｐｎｃＡ座を有し且つ古典的M. bovis株より欠失領域が少ないアザラシおよびオリックスから単離した株であっても、M. bovis株およびM. microtiに典型的なｍｍｐＬ６５５１ＡＡＧ多型を示した（表２、図４）。この多型それ自体は、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９およびＲＤ１０を欠き且つM. bovisまたはM. africanumとして分類されている株の区別に極めて有用な遺伝子マーカーとして訳だったが、同一分類群の他の株とは異なることがある。
【００９２】
３．  討論
３．１．  ヒト結核の起源
多年の間、ヒト結核は動物の病原体をヒト宿主に適合させることによってウシ疾患から進化したと考えられていた（３）。この仮説は、M. tuberculosisの特性がほぼ全くヒト病原体のみであり、一方M. bovisはずっと広い宿主範囲を有することに基づいている。しかしながら、この研究からの結果はM. tuberculosisと比較してM. bovisが多くの欠失を行ってきたことを明白に示している。これは、ウシから単離された「古典的」M. bovis株であるM. bovis AF2122/97のほぼ完全なゲノム配列の予備分析によって確かめられ、M. bovisに特異的に閉じ込められた新たな遺伝子クラスターを示さなかった。これは、M. bovisのゲノムがM. tuberculosisのゲノムより小さいことを示している（２４）。M. bovisは、M. tuberculosis単離物の先祖から分岐したM. africanum（ＲＤ９）、M. microti（ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０）およびM. bovis（ＲＤ４、ＲＤ５、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ９、ＲＤ１０、ＲＤ１２、ＲＤ１３）（２５）によって表される別系統の最後の菌であることが妥当と思われる。ＤＮＡの連続的喪失は、クローン伸長およびある種の新たな宿主における更に順当な病原体の出現の一員となる可能性がある。
【００９３】
M. africanum->M. bovis系統がM. tuberculosis系統から分離したときには、現存するM. tuberculosis株の先祖が既に病原体であるかどうかが考察の主題である。しかしながら、これがその通りであると信ずるに足る２つの理由がある。第一は、M. tuberculosisおよびM. africanumの分離前の最後の共通祖先に類似している６個の祖先M. tuberculosis株（ＴｂＤ１＋，ＲＤ９＋）（図３）が総てヒト病原体であることである。第二に、M. tuberculosis群の任意の他の既知の菌の前の今日のM. tuberculosis株の共通祖先から分岐したと思われるM. canettiiも、ヒト病原体であることである。まとめて考えれば、これは、M. tuberculosisの祖先に極めて類似していると考えられる結核菌がヒト病原体であり且つ動物病原体ではないことを意味する。また、興味深いことには、これらの株のほとんどはアフリカまたはインド起源であった（図３）。これらの祖先株は主に固有病巣に由来し（１５，２６）、一方ＴｂＤ１を喪失した「近代的」M. tuberculosis株は流行性結核の世界的蔓延の結果として更に最近同じ地理学的地域に導入された流行性M. tuberculosis株であることがある。
【００９４】
３．２．  結核菌群の進化期間
ハウスキーピング遺伝子で配列が高度に保存されるので、Sreevatsan et al.は、以前に結核菌が１５，０００〜２０，０００年以前に主要な隘路にであったと仮定した（２）。試験を行った総てのＴｂＤ１欠失株でのＴｂＤ１接合配列の保存が単一クローンに由来することを示唆しているので、ＴｂＤ１欠失は、今日の結核症例の大半を説明する「近代的」M. tuberculosis株は確実にこのような隘路を経験した後に世界中に広がったことを完全に示している。
【００９５】
結果の節で詳細に説明したように、本発明者らの分析は、Sreevatsanと共同研究者らが提案した結核菌の進化経路の群２および３を命名するのに用いたkatG463CTG->CGGおよびそれに続くgyrA95ACC->AGC突然変異（２）が、既にＴｂＤ１を喪失しているM. tuberculosis株の系統で起こったことを示した（図４）。欠失は反転を受けることがある点突然変異より安定なマーカーであるが、欠失と点突然変異の完全な相関を試験株について見出した。
【００９６】
この知見は、１８および１９世紀の自然にミイラ化したハンガリー人村民から増幅したM. tuberculosis DNAがｋａｔＧ４６３／ｇｙｒＡ９５群２および３に属することを示したＦｌｅｃｈｅｒと共同研究者による最近の研究結果と一緒になって、ＴｂＤ１欠失が１８世紀以前にM. tuberculosisの系統で起こったことを示唆している。これは、結核の症例が１８世紀以後にヨーロッパで劇的に増加したことが主として「近代的」M. tuberculosis株が伴うことを意味する可能性があった。更に、結核はM. tuberculosisによって引き起こされ且つM. bovisによっては引き起こされないことを示しており、この事実は田舎の中世的英国での場合についても記載されている（２８）。
【００９７】
マイコバクテリア感染症は数千年前にヒトで起こったという良好な証拠がある。ファラオの治世中のエジプトで結核があったことが知られており、結核に特徴的な脊髄および肋骨の病巣がその時代からのミイラで同定されているからである（２９）。ペルーのミイラからの抗酸性桿菌並びにＰＣＲ増幅の同定（３０）も、結核が中央および南アメリカのコロンブス以前の社会に存在したことを示唆している。ＴｂＤ１隘路がいつ起きたかを推定する目的で、エジプトおよび南アメリカのミイラのＴｂＤ１が欠失しているかまたはまたは欠失していないM. tuberculosis  ＤＮＡを有するかどうかを知ることは極めて興味深いことであろう。
【００９８】
M. africanum->M. microti->M. bovis系統の菌について起こったと思われる他の主要な隘路は、ＲＤ９、およびそれに続くＲＤ７、ＲＤ８およびＲＤ１０欠失によって示される（図４）。これらの欠失は、今日では、アフリカのヒト、オークニー諸島（英国）のハタネズミ、アルゼンチンのアザラシ、スペインのヤギ、および英国のアナグマと同様に多様な天然宿主スペクトルを示す結核菌の先祖で起こったと思われる。このため、ＲＤ９欠失菌のそれらの特異的宿主への蔓延および適合は、M. tuberculosis群の種分化の推定１５，０００〜２０，０００年中に生じた可能性があると想像することは困難である。
【００９９】
しかしながら、この問題を更なる洞察は、１７，０００年前の野牛の骨格から単離した古代のＤＮＡ試料、例えばマイコバクテリアＤＮＡのＲＤ分析によって行うことができた（３１）。ＤＮＡを増幅したマイコバクテリアは、M. africanumのパターンに極めて近接した関連を有し且つ系統M. africanum->M. bovisの初期の典型的ｎＭのであった可能性があるスポリゴタイプを示した。本発明者らが本明細書で供給するＴｂＤ１およびＲＤ９接合配列を用いると、古代ＤＮＡのＰＣＲ分析を極めて集中して行い、M. tuberculosis群の菌が進化した期間について更に学ぶことができる。
【０１００】
３．３．  結論
本発明者らの研究は、広汎な結核菌の可変領域の多様性および保存の全体像を提供する。様々な宿主および国由来の１００株の欠失分析により、ほとんどがアフリカ起源の幾つかの進化的に「古い」(old) M. canettii、M. tuberculosisおよびM. africanum株、並びに「近代的」M. tuberculosis株であって、北京、ハールレムおよびアフリカのような主要な流行クラスターからの典型的なものなどを同定した。特異的突然変異の分子タイピングおよび分析と共同した欠失分析の使用は、結核菌の進化の研究および進化マーカーの同定のための極めて強力な方法であることが示された。更に実際的な観点では、これらの領域、主としてＲＤ９およびＴｂＤ１であるが、ＲＤ１、ＲＤ２、ＲＤ４、ＲＤ７、ＲＤ８、ＲＤ１０、ＲＤ１２、およびＲＤ１３も、M. tuberculosis群の菌を迅速且つ明確に同定するための強力な診断手段の発展のための極めて興味深い候補である（３２）。この発生学的な区別の方法を用いて、M. tuberculosis群の混乱することが多い伝統的な分類を厳密に確定した亜種とすることができる。
【０１０１】
更に、機能分析により、ＴｂＤ１欠失が「近代的」M. tuberculosisに幾らかの選択的利点を付与するかどうか、または他の環境がＴｂＤ１を欠失したM. tuberculosis株の世界的流行の一員となるかどうかが示される。
【０１０２】
例４
M. tuberculosis群の菌は異常なほど高い保存度を共有しており、市販の核酸プローブおよび増幅分析ではこれらの生物を区別することはできない。その上、従来の同定法は曖昧で、扱い難く、生物の増殖が遅いため時間がかかることが多い。
【０１０３】
本発明では、本発明者らは、M. tuberculosis群中で分化の目的で臨床マイコバクテリア学実験室が直面した問題を欠失分析によって解決する。
【０１０４】
この方法は、ＴｂＤ１を含む少なくとも３個のマーカーを用いることによって生物学的流体について診断を行うことができる。下表３は、マイコバクテリア群の菌を識別するのに十分な組合せを示す。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
その上、ＴｂＤ１マーカー、好ましくは少なくとも２個の他のマーカーを用いるべきである。文献で入手可能なこのような追加マーカーを、下表１に示す。
【０１０７】
Mycobacterium tuberculosisの先祖株は全Mycobacterium tuberculosis株の５％に過ぎないが、Mycobacterium tuberculosisの先祖株をMycobacterium canettiiの株から区別することに興味のある者は、遺伝子マーカーＲＤ１２を表３に記載の３個のマーカーと組み合わせて用いることを考察することができる。領域ＲＤｃａｎはMycobacterium canettiiのゲノムにおいてＲＤ１２と部分的に重複しているので、表１に記載のフランキングプライマーはMycobacterium canettiiのゲノムＤＮＡでハイブリダイズしない。従って、これらのフランキングプライマーを用いるＰＣＲ増幅によりMycobacterium tuberculosisで２．８ｋｂ  ＰＣＲ産物を生じ、Mycobacterium canettiiではＰＣＲ産物を生成しない。
【０１０８】
Mycobacterium tuberculosisの先祖株をMycobacterium canettiiから識別する他の方法は、M. canettii株に特異的であり且つ配列番号１９に対応する挿入因子の検出である。
【０１０９】
【表２】
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【０１１０】
この表で用いたＲＤ命名法はBrosch et al. (2000)（参考文献２５）が用いた命名法に基づいており、Behrと共同研究者らによって提案されたものとは異なる(1999) （参考文献６）。プライマー配列は、５’->３’方向で示す。
＊  フランキング反復領域および／または可動性遺伝因子により、フランキングプライマーよりもむしろ内部プライマーの第二の対を用いた領域。
【０１１１】
参考文献
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】存在または欠失が示されたゲノム領域を有する株から得たアンプリコン。それぞれの群におけるアンプリコンの大きさは均一である。数字は、Kremer et al. (1999, J. Clin Microbiol. 37:2607-2618)（参考文献８）およびSupply et al (2001, J. Clin. Microbiol. 39:3563-3571)（参考文献９）で用いた株の名称に対応する。
【図２】様々な地理学的地域の株から得たＴｂＤ１領域の配列。  ＊は、Sreevatsanと共同研究者によって定義されたｋａｔＧｃ４６３／ｇｙｒＡｃ９５配列に基づく群を表す（参考文献２）。数字は、Kremer et al. (1999, J. Clin Microbiol. 37:2607-2618) （参考文献８）およびSupply et al (2001, J. Clin. Microbiol. 39:3563-3571)（参考文献９）で用いた株の名称に対応する。
【図３】選択したM. tuberculosisおよびM. bovis株のスポリゴ型（spoligotypes）。数字は、Kremer et al. (1999, J. Clin Microbiol. 37:2607-2618) （参考文献８）およびSupply et al (2001, J. Clin. Microbiol. 39:3563-3571)（参考文献９）で用いた株の名称に対応する。
【図４】所定の系統（灰色ボックス）におけるＤＮＡの連続的喪失を示す結核菌の進化経路を提案した略図。この略図は、保存された欠失領域の有無および５個の選択した遺伝子での配列多型に基づいている。ある分岐間の距離は、他の方法で計算した実際の系統発生的差に対応しないことがある。  黒塗り矢印は、群１に典型的なｋａｔＧｃ４６３ CTG (Leu)、ｇｙｒＡｃ９５ ACC (Thr)を特徴とする株を示す。白線を有する矢印は、ｋａｔＧｃ４６３ CGG (Arg)、ｇｙｒＡｃ９５ ACC (Thr)を特徴とする群２に属する株を示す。白抜きボックスを有する矢印は、Sreevatsanと強度研究者(Sreevastan et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 151:9869-9874)（参考文献２）によって定義されたｋａｔＧｃ４６３ CGG (Arg)、ｇｙｒＡｃ９５ AGC (Ser)を特徴とする群３に属する株を示す。
【図５】Mycobacterium複合体におけるＴｂＤ１欠失および周囲の領域の略図。  Ａ：  M. bovis、M. bovis BCG、M. africanum、M. canettii、M. microti、および遺伝子ｋａｔＧのコドン４６３に配列ＣＴＧを有し且つゲノムにはＩＳ６１１０配列を全く挿入していないかまたはごく僅かしか挿入していないM. tuberculosisの先祖株のゲノムにおけるＴｂＤ１および周囲の領域の略図。ｍｍｐＬ６遺伝子、ｍｍｐＳ６遺伝子、異なるプライマー、それらによってコードされる異なる核酸断片およびポリペプチドは、近似的にこの領域に配置されている。M. tuberculosisの祖先株を除くM. tuberculosisで特異的に欠失したＴｂＤ１と呼ばれる２１５３ｐｂの欠失は、その２個の末端点によって明確に設定されている。  Ｂ：  M. tuberculosisの祖先株を除くM. tuberculosisのゲノムにおけるＴｂＤ１および周囲の領域の略図。M. tuberculosis H37Rv株のゲノムにおけるＴｂＤ１欠失および配列番号１の配列の位置は、図の下部に印を付けている。ＴｂＤ１の非存在から生じるキメラＯＲＦ［ｍｍｐＳ６−ｍｍｐＬ６］は引き抜かれ、このキメラＯＲＦの配列である配列番号２１およびコードされたポリペプチドの配列である配列番号２２は、図の上部に近似的に配置されている。
【図６】Mycobacteriurm canettii株のゲノムにおける特異的挿入因子の配列。この挿入因子の開始は３９９位であり、この挿入因子の終わりは２３７８位である。この挿入因子は、Mycobacterium smegmatisのトランスポザーゼと有意な相同性を示す推定的トランスポザーゼのコード配列（５１７位から２３０７位までの太文字の配列）を含む。このコード配列は２個の２０ｂｐ逆方向反復配列（３９９−４１８位および２３５９−２３７８位の下線を施した配列）の枠に嵌められている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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