(57)【要約】本発明は、生体系の代謝適応能および／または好気的要求度を評価するための生化学的方法に関する。特に、組織または生物の好気的能力および／または好気的要求度を測定するためにミトコンドリアの分子成分の合成速度および代謝回転が用いられる。この手段による代謝適応能および／または好気的要求度の直接的な測定は、運動トレーニング計画または他の治療的介入の効力の指数として用いたり、心血管疾患、糖尿病、死または他の健康状態の結果の危険性を予測するための医学的な危険因子として用いたり、あるいは、代謝適応能、デコンディショニング、および酸化生物学の領域での創薬について製薬会社を支援するために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体系の代謝適応能および好気的要求度を評価する方法であって、
a)  生体系にアイソトープ標識前駆体分子を、該アイソトープ標識前駆体分子の標識が該生体系のミトコンドリア分子に取り込まれるのに十分な時間にわたり投与すること、
b)  該ミトコンドリア分子のアイソトープ含有量、アイソトープパターン、アイソトープ含有量の変化速度、またはアイソトープパターンの変化速度を測定すること、
c)  該ミトコンドリア分子の合成速度または分解速度を計算して該生体系の代謝適応能および好気的要求度を評価すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
アイソトープ標識前駆体分子が安定したアイソトープで標識されている、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
アイソトープ標識前駆体が、2H標識グルコース、13C標識グルコース、2H標識アミノ酸、15N標識アミノ酸、13C標識アミノ酸、2H標識酢酸、13C標識酢酸、2H標識リボヌクレオシド、13C標識リボヌクレオシド、15N標識リボヌクレオシド、2H標識デオキシリボヌクレオシド、13C標識デオキシリボヌクレオシド、15N標識デオキシリボヌクレオシド、2H標識脂肪酸、および13C標識脂肪酸からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
アイソトープ標識前駆体分子が2H2Oである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
アイソトープ標識前駆体分子が13Cグリシンである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
アイソトープ標識前駆体の標識が放射性アイソトープである、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
アイソトープ標識前駆体分子が、3H標識グルコース、14C標識グルコース、3H標識アミノ酸、14C標識アミノ酸、3H標識酢酸、14C標識酢酸、3H標識リボヌクレオシド、14C標識リボヌクレオシド、3H標識デオキシリボヌクレオシド、14C標識デオキシリボヌクレオシド、3H標識脂肪酸、および14C標識脂肪酸からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
ミトコンドリア分子がデオキシリボ核酸（DNA）である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
ミトコンドリア分子がリボ核酸（RNA）である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
RNAがリボソームRNA、トランスファーRNA、およびメッセンジャーRNAからなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
RNAがメッセンジャーRNAである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ミトコンドリア分子がタンパク質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質がシトクロムcオキシダーゼのサブユニット、F0 ATPアーゼのサブユニット、F1 ATPアーゼのサブユニット、シトクロムcレダクターゼのサブユニット、およびNADH-CoQレダクターゼのサブユニットからなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ミトコンドリア分子が脂質である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
脂質がリン脂質である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
リン脂質がカルジオリピン、ホスファチジルコリン、ホンファチジルエタノールアミン、およびこれらの混合物からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
生体系が組織である、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
組織が筋肉である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
筋肉が骨格筋または心筋である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
組織が脂肪組織である、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
アイソトープ含有量、アイソトープパターン、アイソトープ含有量の変化速度、またはアイソトープパターンの変化速度を測定するステップが質量分析、NMR分析、または液体シンチレーション計数により行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
アイソトープ標識前駆体分子を経口投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
生体系が動物である、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
動物が哺乳動物である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物がげっ歯類である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物がヒトである、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
生体系が細胞である、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が血小板である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
細胞がハイスループットスクリーニング検定系における培養細胞である、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
生体系の代謝適応能または好気的要求度を改変することができる薬剤を同定する方法であって、
a)  請求項1に記載の方法に従って生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価すること、
b)  該生体系に薬剤を投与すること、
c)  請求項1に記載の方法に従って該生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価し、その際、薬剤の投与前と投与後において該生体系の代謝適応能または好気的要求度が変化していれば、該薬剤を、生体系の代謝適応能または好気的要求度を改変することができる薬剤として同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項３１】
生体系が哺乳動物である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物がヒトである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
哺乳動物がげっ歯類である、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
生体系が細胞である、請求項30に記載の方法。
【請求項３５】
細胞がハイスループットスクリーニング検定系における培養細胞である、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
アイソトープ標識前駆体分子を細胞培養培地と接触させる、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
生体系のデコンディショニングを予防する能力について薬剤を試験する、請求項30に記載の方法。
【請求項３８】
運動または他のトレーニング計画に応答して代謝適応能または好気的要求度を高める能力について薬剤を試験する、請求項30に記載の方法。
【請求項３９】
生体系の代謝適応能または好気的要求度を改変することができる薬剤を同定する方法であって、
a)  請求項1に記載の方法に従って第1の生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価すること、ただし、前記第1の生体系には薬剤が投与されていないこと、
b)  請求項1に記載の方法に従って第2の生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価すること、ただし、前記第2の生体系には薬剤が投与されていること、
c)  前記第1および第2の生体系における代謝適応能または好気的要求度を比較し、その際、第1および第2の生体系の代謝適応能または好気的要求度が変化していれば、該薬剤を、生体系の代謝適応能または好気的要求度を改変することができる薬剤として同定すること、
を含んでなる方法。
【請求項４０】
生体系が哺乳動物である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
哺乳動物がヒトである、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
哺乳動物がげっ歯類である、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
生体系が細胞である、請求項39に記載の方法。
【請求項４４】
細胞がハイスループットスクリーニング検定系における培養細胞である、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
アイソトープ標識前駆体分子を細胞培養培地と接触させる、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
生体系のデコンディショニングを防止する能力について薬剤を試験する、請求項39に記載の方法。
【請求項４７】
運動または他のトレーニング計画に応答して代謝適応能または好気的要求度を高める能力について薬剤を試験する、請求項39に記載の方法。
【請求項４８】
生体系の代謝適応能を評価するためのキットであって、
a)  1種以上のアイソトープ標識前駆体分子、および
b)  該キットの使用説明書、
を含んでなり、代謝適応能を測定するために用いられる上記キット。
【請求項４９】
アイソトープ標識前駆体分子を投与するための器具をさらに含む、請求項48に記載のキット。
【請求項５０】
被験者からサンプルを取得するための器具をさらに含む、請求項48に記載のキット。
【請求項５１】
アイソトープ標識前駆体分子がアイソトープで標識した水である、請求項48に記載のキット。
【請求項５２】
請求項30に記載の方法により同定された薬剤。
【請求項５３】
請求項39に記載の方法により同定された薬剤。
【請求項５４】
単離されたアイソトープ摂動ミトコンドリアDNA。
【請求項５５】
単離されたアイソトープ摂動カルジオリピン。
【請求項５６】
1以上の単離されたアイソトープ摂動ミトコンドリオン。
【請求項５７】
アイソトープ標識前駆体分子。
【請求項５８】
宿主生物にアイソトープ標識前駆体分子を、該アイソトープ標識前駆体分子のアイソトープ標識がミトコンドリア分子に取り込まれるようになるのに十分な時間にわたり投与することによって調製される、単離されたアイソトープ標識ミトコンドリア分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酸化生物学（oxidative biology）の分野に関するものである。特に、ミトコンドリアのDNA、RNA、タンパク質、またはリン脂質の合成速度を測定することによって代謝適応能（metabolic fitness）を調べるための方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
心疾患、糖尿病、および総死亡については、ヒトの身体適応能（代謝適応能、心肺適応能）のレベルから、かなりの程度まで予測できることがわかってきた。最近の疫学調査からは、肥満に代わって身体適応能が総死亡を予測する際の最も正確な危険因子でありうることが提唱されている（Blairら, Changes in Physical Fitness and All-Cause Mortality, JAMA 273(14):1093-1098 (1998)およびLeeら, Cardiorespiratory Fitness, Body Composition, and All-Cause and Cardiovascular Disease Mortality in Men, Am J Clin Nutr 69(3):373-380 (1999)）。こうした結論は、太りすぎであるが代謝的には適応している幾人かの個体が、痩せているものの代謝的に不適応の個体より良好な健康状態の予後を示したことを実証するデータに基づいて証明されている（Leeら, 前掲を参照のこと）。したがって、太りすぎであることは、真の危険因子そのものというよりは、潜在的にすわりっきりのライフスタイルや代謝的に不適応な状態のマーカーとして主に役に立つと考えられる。
【０００３】
かかる知見には奥深い臨床上および公衆衛生上の意味が含まれている。モニタリングすべき鍵となるものが代謝適応能である場合には、患者の体脂肪に集中している医師の関心を違った方向に向ける可能性がある。同様に、健康増進用の薬剤を探し求めている製薬会社は、体脂肪量を減少させる薬剤ではなく、組織の酸化的（好気的）能力を高める薬剤について研究するようにアドバイスされる可能性がより高くなる。しかしながら、生物体の代謝適応能を評価するための現在利用しうる方法（例えば、運動試験）は、おおざっぱで、非生化学的であり、再現性が低く、実施するのが難しいものである。
【０００４】
例えば、運動試験は、トレッドミルや定置自転車のような装置で個体に運動をさせ、同時に心電図と血圧を連続してモニタリングする必要がある。一般的には、個体が運動を続けられなくなるまで、または個体の最大心拍数の85％に達するまで、コントロールされたプログラムのもとで運動を継続する（Hutter, A.M., Jr. (1991)“Ischemic Heart Disease: Angina Pectoris,” Scientific American Medicine中のSection 1, E. RubensteinおよびD.D. Federman編, Scientific American, Inc., p.4）。このようなプロトコルでは、精神的な病気、呼吸器や筋肉の疾患のような病因による身体的障害、患者ごとにばらつきのある肉体的努力を含めて、多数の要因が試験結果に影響を及ぼしうることが容易に見てとれる。さらに、このプロトコルにはいくつかのリスクが伴うことがある（すなわち、激しい活動が要求される）。その上、運動負荷試験は観察者間で広範に変わりやすく（実施者のやり方の相違および標準化の困難性による）、また、医院に簡単には保管しておけない大きな装置を使用する必要がある。
【０００５】
したがって、外来患者が使用するのにもっと便利で、代謝適応能を客観的かつ信頼できるように測定する新しい方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
これらの必要性を満たすために、本発明は、生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価する方法を提供する。一つの態様においては、生体系にアイソトープ標識前駆体分子を、該アイソトープ標識前駆体分子の標識が該生体系のミトコンドリア分子に取り込まれるのに十分な時間にわたり投与すること、1種以上のミトコンドリア分子を該生体系から取得すること、該ミトコンドリア分子のアイソトープ含有量、アイソトープパターン、アイソトープ含有量の変化速度、またはアイソトープパターンの変化速度を測定すること、および、該ミトコンドリア分子の合成または分解速度を算出して該生体系の代謝適応能および好気的要求度を評価すること、を含んでなる生体系の代謝適応能および好気的要求度を評価するための方法を開示する。一つの実施形態では、アイソトープ標識前駆体分子が安定したアイソトープで標識される。別の実施形態では、アイソトープ標識前駆体が、2H標識グルコース、13C標識グルコース、2H標識アミノ酸、15N標識アミノ酸、13C標識アミノ酸、2H標識酢酸、13C標識酢酸、2H標識リボヌクレオシド、13C標識リボヌクレオシド、15N標識リボヌクレオシド、2H標識デオキシリボヌクレオシド、13C標識デオキシリボヌクレオシド、15N標識デオキシリボヌクレオシド、2H標識脂肪酸、および13C標識脂肪酸のうちの1種以上でありうる。さらなる実施形態においては、アイソトープ標識前駆体分子が2H2Oである。また、アイソトープ標識前駆体分子は13Cグリシンであってもよい。
【０００７】
別の実施形態において、前記標識は放射性アイソトープである。別の実施形態では、アイソトープ標識前駆体が、3H標識グルコース、14C標識グルコース、3H標識アミノ酸、14C標識アミノ酸、3H標識酢酸、14C標識酢酸、3H標識リボヌクレオシド、14C標識リボヌクレオシド、3H標識デオキシリボヌクレオシド、14C標識デオキシリボヌクレオシド、3H標識脂肪酸、および14C標識脂肪酸のうちの1種以上でありうる。
【０００８】
さらなる実施形態において、ミトコンドリア分子はミトコンドリオンの任意の分子または巨大分子成分でありうる。ミトコンドリア分子の例としては、DNA分子、RNA分子、タンパク質、または脂質が挙げられる。一つの実施形態では、ミトコンドリア分子がRNA分子であり、さらなる実施形態において、RNA分子は1種以上のリボソームRNA、トランスファーRNA、またはメッセンジャーRNAでありうる。別の実施形態において、ミトコンドリア分子は、シトクロムcオキシダーゼのサブユニット、F0 ATPアーゼのサブユニット、F1 ATPアーゼのサブユニット、シトクロムcレダクターゼのサブユニット、またはNADH-CoQレダクターゼのサブユニットのようなタンパク質であってもよい。別の実施形態において、ミトコンドリア分子はリン脂質のような脂質であってもよい。リン脂質は、カルジオリピン、ホスファチジルコリン、ホンファチジルエタノールアミン、またはこれらの混合物の1種以上でありうる。
【０００９】
別の態様において、生体系は組織である。組織には、骨格筋や心筋のような筋肉組織および脂肪組織が含まれる。
【００１０】
また、生体系は動物であってもよい。動物は哺乳動物でありうる。哺乳動物はげっ歯類でありうる。哺乳動物はヒトであってもよい。
【００１１】
また、生体系は細胞である。さらなる実施形態において、細胞は血小板である。別の実施形態では、細胞がハイスループットスクリーニング検定系における培養細胞でありうる。
【００１２】
さらなる態様において、アイソトープ含有量、アイソトープパターン、アイソトープ含有量の変化速度、またはアイソトープパターンの変化速度を測定するステップは、質量分析、NMR分析、または液体シンチレーション計数により行われる。
【００１３】
別の実施形態では、アイソトープ標識前駆体分子を経口投与する。
【００１４】
別の態様において、前記方法は生体系の代謝適応能または好気的要求度を改変することができる薬剤を同定する方法に向けられる。一つの実施形態では、この方法は、生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価すること、該生体系に薬剤を投与すること、および、該生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価し、その際、薬剤の投与前と投与後において該生体系の代謝適応能または好気的要求度が変化していれば、該薬剤を、生体系の代謝適応能または好気的要求度を改変することができる薬剤として同定すること、を含んでなる。別の実施形態では、この方法は、第1の生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価すること（ただし、前記第1の生体系には薬剤が投与されていないこと）、第2の生体系の代謝適応能または好気的要求度を評価すること（ただし、前記第2の生体系には薬剤が投与されていること）、および、前記第1および第2の生体系における代謝適応能または好気的要求度を比較し、その際、第1および第2の生体系の代謝適応能または好気的要求度が変化していれば、該薬剤を、生体系の代謝適応能または好気的要求度を改変することができる薬剤として同定すること、を含んでなる。生体系はヒトやげっ歯類のような哺乳動物でありうる。生体系は細胞であってもよく、例えば、ハイスループットスクリーニング検定系における培養細胞でありうる。さらなる実施形態では、アイソトープ標識前駆体分子を細胞培養培地と接触させる。別の実施形態では、生体系のデコンディショニング（脱調節）を防止する能力について薬剤を試験する。さらに他の実施形態では、運動または他のトレーニング計画に応答して代謝適応能または好気的要求度を高める能力について薬剤を試験する。別の実施形態では、本発明は上記方法により同定された薬剤に関する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は生体系の代謝適応能を評価するためのキットに関する。このキットは、1種以上のアイソトープ標識前駆体分子、および該キットの使用説明書を含みうる。別の実施形態では、キットはアイソトープ標識前駆体分子を投与するためのツールをさらに含むことができる。さらなる実施形態では、キットは被験者からサンプルを取得するための器具を含みうる。さらに別の実施形態では、アイソトープ標識前駆体分子がアイソトープで標識した水である。
【００１６】
別の態様において、本発明は、単離されたアイソトープ摂動（perturbed）ミトコンドリアDNA、単離されたアイソトープ摂動カルジオリピン、1以上の単離されたアイソトープ摂動ミトコンドリオン、または1以上のアイソトープ標識前駆体分子に関する。別の態様において、本発明は、宿主生物にアイソトープ標識前駆体分子を、該アイソトープ標識前駆体分子のアイソトープ標識がミトコンドリア分子に取り込まれるようになるのに十分な時間にわたり投与することによって調製される、単離されたアイソトープ標識ミトコンドリア分子に関する。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、組織のミトコンドリア内のデオキシリボ核酸（DNA）、リボ核酸（RNA）、タンパク質、もしくは脂質のようなミトコンドリア分子のミトコンドリアでの合成速度または分解速度を測定することによって代謝適応能を生化学的に評価する方法を提供する。合成速度または分解速度は、アイソトープで標識した水を含めて、１種以上のアイソトープ標識前駆分子の投与またはそれとの接触（その際アイソトープ標識がミトコンドリア分子に取り込まれる）の後に測定される、ミトコンドリア分子のアイソトープ含有量および/またはアイソトープパターン、あるいはアイソトープ含有量の変化速度および/またはアイソトープパターンの変化速度に基づく。
【００１８】
一般的な技術
他に指示されない限り、本発明の実施には通常、当業界の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術が利用されるであろう。このような技術は、例えばCell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis編、1998); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelら編、1987); Short Protocols in Molecular Biology (WileyおよびSons, 1999); Mass Isotopomer Distribution Analysis: A Technique for Measuring Biosynthesis and Turnover of Polymers (Hellersteinら、Am J Physiol 263 (Endocrinol Metab 26): E988-E1001 (1992)); ならびにMass Isotopomer Distribution Analysis at Eight Years: Theoretical, Analytic, and Experimental Considerations (Hellersteinら、Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab 39): E1146-E1170 (1999)) などの文献において十分に説明されている。また市販のアッセイキットおよび試薬を用いる方法は一般的に、他に表記されない限り、製造メーカーが示したプロトコルに従って使用されるであろう。
【００１９】
定義
本明細書において「代謝適応能」、「身体適応能」、および「心肺適応能」という用語は同義的に使用され、生体系の酸化的代謝または好気的活性の能力を表す。
【００２０】
「生体系」とは本明細書では細胞、細胞株、組織、器官および生物を含む任意の生命体を意味する。生物の例としては任意の動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトが含まれる。哺乳動物の例としてはヒト以外の霊長類、家畜、イヌやネコなどの愛玩動物、マウスやラットなどの研究動物、およびヒトが含まれる。ヒトは健康であってもよく、あるいは疾患もしくは障害を患っているか、またはそれと診断されることもあり得る。
【００２１】
「好気的要求度」とはin vivoにおいて細胞、組織、または生物に課せられる酸化的要求を指す。
【００２２】
「アイソトープ」とは、本明細書では同一の陽子数を有する原子であり、したがって同一の元素であるが、異なる中性子数を有する原子（例えば1Hに対する2Hまたは3H）を意味する。当技術分野において周知のように、「D」という記号は2Hという記号と同義的に用いられ、重水素を指す。
【００２３】
「アイソトープにより標識された前駆体分子」および「アイソトープ標識前駆体分子」は同義的に用いられ、アイソトープ標識が生体系のミトコンドリア分子内に取り込まれる、任意のアイソトープ標識前駆体分子を指す。アイソトープ標識前駆体分子の例としては、2H2O、3H2O、2H-グルコース、2H標識アミノ酸、2H標識有機分子、13C標識有機分子、14C標識有機分子、13CO2、14CO2、15N標識有機分子および15NH3を含むが、それに限定されない。
【００２４】
「アイソトポログ」（isotopologue）とはアイソトープ同族体、または同一の元素的および化学的組成を有するがアイソトープ含有量の異なる分子種（例えば上記の例ではCH3NH2に対するCH3NHDなど）を指す。アイソトポログはそれらのアイソトープ組成によって定義され、従ってそれぞれのアイソトポログは固有の精密質量を有するが、特有の構造をもたなくてもよい。アイソトポログは通常、分子上でのアイソトープの位置によって異なる一群のアイソトープ異性体（アイソトポマー）から成る（例えばCH3NHDとCH2DNH2は同一のアイソトポログであるが、異なるアイソトポマーである）。
【００２５】
「精密質量」とは、分子の化学式中のすべてのアイソトープの精密質量を合計することによって計算される質量を指す（例えばCH3NHDについては32.04847）。
【００２６】
「名目質量」とは、分子の精密質量を四捨五入することによって得られる整数の質量を指す。
【００２７】
「質量アイソトポマー」とは、アイソトープ組成ではなく名目質量に基づいて分類されるアイソトープ異性体の群を指す。アイソトポログとは異なり、質量アイソトポマーは異なるアイソトープ組成の分子を含みうる（例えばCH3NHD、13CH3NH2、CH315NH2は同一の質量アイソトポマーの一部であるが、異なるアイソトポログである）。操作上の見地からは、質量アイソトポマーは質量分析計によって分離されないアイソトポログ群である。四重極質量分析計において、これは一般的に質量アイソトポマーが名目質量を共有するアイソトポログ群であることを意味する。したがって、アイソトポログCH3NH2およびCH3NHDは名目質量が異なり、異なる質量アイソトポマーとして区別されるが、アイソトポログCH3NHD、CH2DNH2、13CH3NH2、およびCH315NH2はすべて同じ名目質量であり、それゆえ同一の質量アイソトポマーである。したがってそれぞれの質量アイソトポマーは通常、2種以上のアイソトポログから成り、2つ以上の精密質量を持つ。アイソトポログと質量アイソトポマー間の区別は実際に有用である。なぜならば、個々のアイソトポログすべてが四重極質量分析計によって分離されるわけではなく、より高い質量分解能を実現する質量分析計によっても分離されない可能性があるからである。それゆえに、質量分析データからの計算はアイソトポログではなく質量アイソトポマーの存在度について行わねばならない。質量が最も低い質量アイソトポマーはM0で表され、ほとんどの有機分子に関して、これはすべて12C、1H、16O、14N等を含む分子種である。他の質量アイソトポマーはその質量の違いによってM0と区別される（M1、M2等）。所与の質量アイソトポマーの場合、その分子内のアイソトープの配置または位置は特定されず、さまざまに変化しうる（すなわち「位置アイソトポマー」は識別されない）。
【００２８】
「質量アイソトポマーエンベロープ」とは、モニタリングされた各分子またはイオン断片に関連した群を含む質量アイソトポマーのセットを指す。
【００２９】
「質量アイソトポマーパターン」とは、ある分子の質量アイソトポマー存在度のヒストグラムを指す。慣習的に、そのパターンは相対的な存在度パーセント（存在度のすべてが最も豊富な質量アイソトポマーの存在度に対して標準化され、最も豊富なアイソトポマーが100％とされる）として表される。しかし、質量アイソトポマー分布解析（MIDA）のような確率解析を含む好ましい応用形態は比率または割合量であり、各分子種が全存在度に対して寄与する割合が用いられる。「アイソトープパターン」という用語は「質量アイソトポマーパターン」という用語と同義に使用されうる。
【００３０】
「モノアイソトピック質量」（monoisotopic mass）とは、すべて1H、12C、14N、16O、32S等を含む分子種の精密質量を指す。C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br、およびIを含むアイソトポログに関して、最低の質量を持つアイソトポログのアイソトープ組成は特有で明白である。なぜならば、これらの元素の最も豊富なアイソトープもまた質量が最低であるからである。モノアイソトピック質量はm0と略され、他の質量アイソトポマーの質量はm0とのそれらの質量差によって確認される（m1、m2等）。
【００３１】
「アイソトープ摂動」（isotopically perturbed）とは、天然で最も一般的に見いだされる分布とは異なるアイソトープの分布を有する元素または分子の明白な取り込みから生じる元素または分子の状態を指し、そこでは天然においてあまり豊富でない量のアイソトープが過剰に（濃縮されて）または不足して（枯渇されて）存在する。
【００３２】
「単離する」とは1つの成分を成分混合物中の1種以上の余分な成分から分離することを表す。例えば、生化学的成分の単離とは1つの生化学的成分を生化学的成分の混合物から分離することを表す。微量の余分な生化学的成分が単離された生化学的成分中に存在してもよい。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、「前駆体サブユニット」、「前駆体分子」、および「前駆体」という用語は同義的に用いられ、特定の分子のポリマー合成の際に用いられる代謝前駆体を指す。前駆体サブユニットの例としては、アセチルCoA、リボ核酸、デオキシリボ核酸、アミノ酸、グルコース、およびグリシンが含まれる。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「標識した水」とはアイソトープを含む水を指す。標識した水の例には、2H2O、3H2O、およびH218Oが含まれる。本明細書で用いられる場合、「アイソトープ標識した水」という用語は「標識した水」と同義的に用いられる。
【００３５】
「アイソトープ含有量」とは、天然状態（すなわち、アイソトープ標識前駆体サブユニットの投与もしくは接触前）の1分子または分子の集合体中のアイソトープの含有量に対する、1分子または分子の集合体中のアイソトープの含有量を指す。「アイソトープ濃縮」という用語は本明細書においてアイソトープ含有量と同義的に用いられる。
【００３６】
「アイソトープパターン」とは、1分子または分子の集合体内のアイソトープ標識の内部関係を指し、例えば、分子内のアイソトープの絶対的含有量ではなく、異なるアイソトープ含有量をもつ分子種の相対的比率、分子構造内の異なる化学的位置にアイソトープ標識をもつ分子の相対的比率、もしくは内部パターンの他の特徴などを表す。
【００３７】
「分子流動速度」とは細胞、組織、または生物内での分子の合成速度および/または分解速度を指す。また「分子流動速度」は分子プールへの分子の投入または分子プールからの分子の除去を表し、したがって、該分子プールへの流入またはそこからの流出と同義である。
【００３８】
「酸化的代謝」とは、細胞、組織、または生物において酸化的リン酸化装置(電子伝達系または呼吸酵素系)と相互作用する分子酸素の関与を最終的に必要とする、細胞、組織、生物、または他の生体系による燃料の全てのエネルギー生成生化学的変換の総和を指す。
【００３９】
「薬剤」、「医薬品」、および「薬物」は同義的に用いられ、任意の化学種、既知の薬剤または治療法、認可された薬剤または治療法、生物学的物質（例えば、遺伝子配列、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体、サイトカイン、およびホルモン）を指す。薬剤は、例えば、The merck Index第13版（U.S. publication, Whitehouse Station, N.J., USA；参照により本明細書にその全体を組み入れる）などに開示される化合物または組成物を含むが、それらに限定されない。
【００４０】
「ミトコンドリア分子」とは、巨大分子などのミトコンドリオンの分子を指す。ミトコンドリア分子の例は、DNA、RNA、タンパク質、脂質および糖質を含むが、それらに限定されない。ミトコンドリア分子はミトコンドリオン内で合成または分解されてもよく、ミトコンドリオン外で合成または分解されてもよく、またはミトコンドリオンに取り込まれてもそこから輸送されてもよい。ミトコンドリア分子がミトコンドリオン内に取り込まれる場合、ミトコンドリア分子はミトコンドリア空間で一度さらにプロセシングされてもされなくてもよい。同様に、ミトコンドリア分子がミトコンドリオンから輸送されたら、そのミトコンドリア分子はさらにプロセシングされてもされなくてもよい。
【００４１】
好気的要求度に対するミトコンドリアの適応
ミトコンドリアは酸化的リン酸化の細胞小器管であり、ほぼすべての真核細胞に存在する。細胞内のミトコンドリア量(すなわち、DNA、RNA、タンパク質、脂質、および他のミトコンドリア分子を含むミトコンドリア成分の総量)は、細胞の種類および様々な生理的要因に依存する。静止状態の様々な細胞型においてミトコンドリア量の大きな差異が実証されているが、それぞれの特定の細胞型のミトコンドリア量は代謝適応能の特性を示している。ミトコンドリア量は通常、酸化的代謝もしくは好気的活動のための細胞または組織の能力を反映する。
【００４２】
しかし、例えば、骨格筋または心筋などの組織に課せられた有酸素トレーニングによる好気的要求度の変化は、ミトコンドリア量の変化として同定されてきた。一般に、ミトコンドリア量は、例えば、有酸素運動トレーニングプログラムに応答して増加し、ベッドでの療養のような無活動の場合に起こるデコンディショニングに応答して減少する。組織に課せられた好気的要求度に対するこのミトコンドリア量の適応能（それにより、酸化的代謝のための組織の能力(その好気的能力)を調節する）は、酸化生物学の基本的特性である。ミトコンドリアの適応能は、国際的に起こっているような工業化および都市化に関連した漸増的な座りがちなライフスタイルの状況において、ヒトの健康に対して重要な意味を持つ。
【００４３】
組織ミトコンドリア量の適応的変化の生化学についていくつかの特有な特徴がある（Attardiら、Biogenesis of mitochondria, Ann Rev Cell Biol 4:289-333 (1988)）。第一に、ミトコンドリアDNAは核に存在する真核細胞のDNAの残りの部分から分離されて、明確に区別されている。加えて、ミトコンドリアゲノムは、核内の染色体に線状に配置されるのではなく環状であり、核DNAと比較して小さく（動物では16〜20kB)、イントロンをほとんど完全に欠失しており、核に存在するものとは異なるDNAポリメラーゼ（DNAポリメラーゼγ）を用いて合成され、母性遺伝して、核の有糸分裂または減数分裂とは無関係に遺伝する。さらに、ミトコンドリアDNA合成はミトコンドリアRNA合成にリンクしている。すなわち、前者（DNA複製）はDNAに基づいたRNA転写によるプライミングに依存する（Clayton D., Replication and Transcription of Vertebrate Mitochondrial DNA, Ann Rev Cell Biol 7:453-478 (1991)）。この複製の転写に対する依存は、細胞がより多くのミトコンドリアRNA合成の必要性を示している時、ミトコンドリアDNA合成の増加の協調的な誘導を引き起こす。最後に、ミトコンドリアタンパク質および脂質は、ミトコンドリアDNAとは異なり、ほとんど完全にミトコンドリア外での合成により誘導される。ミトコンドリアタンパク質の90％以上は、核DNAコード配列に由来する細胞質メッセンジャーRNA鋳型から合成される。細胞質で合成されたタンパク質はその後ミトコンドリア内に輸送される(LeeらおよびAttardiら、前掲を参照のこと)。ミトコンドリア酸化的代謝の少数の(必須の）酵素だけがミトコンドリアDNAによりコードされる。ミトコンドリアDNAに由来するミトコンドリアRNA転写産物の大部分は、メッセンジャーRNAにではなくタンパク質合成装置（例えば、リボソームRNAまたはトランスファーRNA）に用いられる。
【００４４】
また、個別のミトコンドリアが存在し、数えられる「ミトコンドリア数」があるとするモデルは、過度の単純化であり不正確であると次第に考えられてきていることにも留意すべきである（Robinら、Mitochondrial DNA Molecules and Virtual Number of Mitochondria Per Cell in Mammalian Cells, J Cell Physiol 136:507-513 (1988)）。細胞内のミトコンドリアは、おそらく成分間で物質の流れを可能にする細網によって三次元的につながっている。ミトコンドリアDNAは見かけのミトコンドリア「ユニット」あたり多コピー数で存在する小さな環状ゲノムとして存在するので、ミトコンドリア細網のDNA含量でさえもおそらく成分間で交換可能である。
【００４５】
ミトコンドリア量または活性を測定するために現在利用可能な技術は、すべて１つの基本的な観点、すなわち、それらは動的プロセスの反映ではなく事実上静的であるという点に限定される。一般的に、これらの技術はミトコンドリアの酸化酵素(例えば、クエン酸合成酵素）またはミトコンドリアDNAもしくはRNAのような因子のレベルを測定するものであるが、それらはその時点で存在する濃度を明らかにするだけである。しかし、好気的要求度に応答したミトコンドリア量の適応は、動的変化(すなわち、ミトコンドリア成分の合成速度または異化速度を含む分子流動速度の変化)を必要とする。しかし、最近までミトコンドリア成分の合成速度または分解速度を評価する方法はまったく存在せず、したがって、基礎的なミトコンドリア量の動態もしくはミトコンドリア量の軌跡(変化の方向)、または組織の酸化的要求度に応答したミトコンドリアの動態を評価する方法はなかった。一つの側面では、ミトコンドリア量はミトコンドリア分子の合成および/または分解に応答して変化する。
【００４６】
代謝適応能を評価する方法
本発明は、様々なミトコンドリア分子の合成速度または分解速度を測定することにより代謝適応能を評価する方法を提供する。ミトコンドリア分子の例は、DNA、RNA、脂質、糖質、およびタンパク質を含むがそれに限定されない。RNAはリボソームRNA、トランスファーRNA、およびメッセンジャーRNAを含む。脂質はリン脂質を含む。タンパク質は、電子伝達系を含む酸化的リン酸化(有気呼吸)に関与する様々な巨大分子複合体のサブユニットを含む。これらのサブユニットには、シトクロムcオキシダーゼのサブユニット、F0 ATPアーゼのサブユニット、F1 ATPアーゼのサブユニット、シトクロムcレダクターゼのサブユニット、およびNADH-CoQレダクターゼのサブユニットが含まれる。
【００４７】
一つの態様においては、生体系にアイソトープ標識前駆体分子を、該アイソトープ標識前駆体分子の標識がミトコンドリア分子に取り込まれるのに十分な時間にわたり投与すること、1種以上のミトコンドリア分子を該生体系から取得すること、該ミトコンドリア分子のアイソトープ含有量、アイソトープパターン、アイソトープ含有量の変化速度、またはアイソトープパターンの変化速度を測定すること、および、該ミトコンドリア分子の合成または分解速度を計算して該生体系の代謝適応能および好気的要求度を評価することにより、生体系の代謝適応能および好気的要求度を評価するための方法を開示する。
【００４８】
A. 生体系へのアイソトープ標識前駆体分子の投与
1. 標識前駆体分子
a. アイソトープ標識
図１で説明するように、生合成、分解、および/または代謝回転速度の測定の第一段階はアイソトープ標識前駆体分子を生体系に投与することを含む。アイソトープ標識前駆体分子は安定したアイソトープまたは放射性アイソトープでありうる。使用され得るアイソトープ標識は、2H、13C、15N、18O、3H、14C、35S、32P、125I、131I、または他の生体系に存在する元素のアイソトープを含むがそれに限定されない。
【００４９】
一つの実施形態では、アイソトープ標識は2Hである。
【００５０】
b. 前駆体分子
前駆体分子は体内で代謝されてミトコンドリア分子を形成する任意の分子でありうる。アイソトープ標識はアイソトープ標識前駆体分子を形成するために本明細書で開示されるすべての前駆体分子を修飾するために使用されうる。
【００５１】
前駆体分子の全体が１種以上のミトコンドリア分子(例えば、ミトコンドリア分子）に組み込まれてもよい。あるいは、前駆体分子の一部のみが１種以上のミトコンドリア分子に組み込まれてもよい。
【００５２】
前駆体分子はCO2、NH3、グルコース、乳酸、H2O、酢酸、脂肪酸を含むがそれに限定されない。
【００５３】
i. 前駆体分子としての水
水はタンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、糖質、それらの修飾物または組合せ物、および他のミトコンドリア分子の前駆体である。このように、標識した水は本明細書において教示される方法での前駆体としての役割を果たす。
【００５４】
標識した水は容易に商業的に入手されうる。例えば、2H2OはCambridge Isotope Labs （Andover, MA）から購入でき、3H2Oは例えばNew England Nuclear, Incから購入されうる。一般に、2H2Oは非放射性であり、したがって、放射性の3H2Oより毒性の懸念が低いことを示す。2H2Oは、例えば体内総水分量のパーセントにして、例えば消費体内総水分量の1％が摂取されうる（例えば、１日あたり消費される水が3リットルとすると、30μlの2H2Oが摂取される)。3H2Oを利用する場合には、当業者によって容易に決定される非毒性量が投与される。
【００５５】
体内水分の比較的高い2H2O濃縮（例えば、体内総水分量の1〜10％が標識される)は本発明の方法を用いて達成されうる。この水分アイソトープ濃縮は、そのレベルが数週間または数ヵ月間ヒトまたは実験動物においてなんら毒性の証拠なしに維持されるので、比較的一定していて安定である。多数のヒト被験者（100人超）におけるこの発見は、高投与量の2H2Oの毒性に関する以前の懸念に相反する。本発明者らは、体内水分のアイソトープ濃縮の急速な変化を（例えば、少量の分割した投与量での初期投与によって）回避する限り、高い2H2Oの体内水分濃縮は毒性なしに維持され得ることを発見した。例えば、低コストの市販の2H2Oは、比較的低い経費で1〜5％の範囲の濃縮を長期間維持することを可能にする（例えば、計算によると、2％2H2O濃縮での2ヶ月間の標識（それにより、アラニン前駆体プールでは7〜8％の濃縮）は、10％遊離ロイシン濃縮での2H-ロイシンの12時間の標識（それにより、その期間のロイシン前駆体プールでは7〜8％の濃縮）より低いコストですむ）。
【００５６】
18Oアイソトープは毒性がなく、結果として重大な健康上の危険性を示さないので、H218Oの投与での比較的高く比較的一定した体内水分濃縮もまた達成されうる。
【００５７】
標識した水は、ほぼ普遍的な前駆体としてほとんどの種類のミトコンドリア分子に対して使用することができる。
【００５８】
ii. タンパク質、オリゴ/ポリヌクレオチド、脂質、および糖質前駆体
別の実施形態では、前駆体分子はタンパク質、ポリヌクレオチド、脂質、および糖質の前駆体である。
【００５９】
(a)タンパク質の前駆体
前駆体分子は、当技術分野において公知の任意のタンパク質前駆体分子でありうる。これらの前駆体分子は、CO2、NH3、グルコース、乳酸、H2O、酢酸、および脂肪酸でありうる。
【００６０】
また、タンパク質の前駆体分子は１種以上のアミノ酸を含んでもよい。前駆体は任意のアミノ酸でありうる。前駆体分子は単一にまたは多重に重水素化されたアミノ酸であってもよい。前駆体分子は１種以上の13C-リジン、15N-ヒスチジン、13C-セリン、13C-グリシン、2H-ロイシン、15N-グリシン、13C-ロイシン、2H5-ヒスチジン、および任意の重水素化されたアミノ酸である。標識アミノ酸は、例えば非重水素化アミノ酸によって希釈せずに投与することができる。すべてのアイソトープ標識前駆体は、例えばCambridge Isotope Labs (Andover, MA)から商業的に購入しうる。
【００６１】
前駆体分子には、翻訳後または翻訳前の修飾アミノ酸の前駆体も含まれる。これらの前駆体は、グリシン、セリン、またはH2Oなどのメチル化の前駆体; H2OまたはO2などの水酸化の前駆体; リン酸、H2OまたはO2などのリン酸化の前駆体; 脂肪酸、酢酸、H2O、エタノール、ケトン体、グルコース、またはフルクトースなどのプレニル化の前駆体; CO2、O2、H2Oまたはグルコースなどのカルボキシル化の前駆体; 酢酸、エタノール、グルコース、フルクトース、乳酸、アラニン、H2O、CO2、またはO2などのアセチル化の前駆体; および当技術分野において公知の他の翻訳後修飾の前駆体を含むが、それらに限定されない。
【００６２】
遊離アミノ酸に存在する標識の程度は実験的に測定することができ、また、アミノ酸の標識化部位の数に基づいて予測することもできる。例えば、水素アイソトープを標識として用いる場合、遊離アミノ酸の、またはより特定的にはtRNA-アミノ酸のC-H結合に存在する標識は、体内水分中の2H2Oへの暴露の間に同定されうる。それぞれの非必須アミノ酸におけるC-H結合の総数は、例えばアラニンでは4、グリシンでは2などと、公知である。
【００６３】
タンパク質の前駆体分子は水でありうる。ペプチドおよびタンパク質のO-H結合ならびにN-H結合は水溶液中では不安定であるので、C-H結合上の水素原子が2H2O由来のタンパク質合成を測定するために有用なアミノ酸上の水素原子となる。2H2O由来の2H標識のO-H結合またはN-H結合への交換は、それ自体、上述のように遊離アミノ酸からのタンパク質の合成なしに起こる。C-H結合は、特異的な酵素触媒による中間代謝反応の間にH2Oからの遊離アミノ酸への取り込みを受ける。したがって、2H2O投与後のタンパク質結合アミノ酸のC-H結合における2H標識の存在は、タンパク質が2H2O暴露の期間中に遊離型であったアミノ酸から組み立てられたこと、すなわち、タンパク質が新たに合成されたことを意味する。分析的には、使用されたアミノ酸誘導体はC-H結合をすべて含まなくてはならないが、すべての混入の可能性があるN-H結合およびO-H結合を除去しなくてはならない。
【００６４】
体内水分由来の水素原子は遊離アミノ酸に取り込まれうる。標識した水由来の2Hまたは3Hは、中間代謝反応を介して細胞内の遊離アミノ酸に入ることができるが、2Hまたは3Hは、ペプチド結合中に存在するまたはトランスファーRNAに結合されたアミノ酸に入ることはできない。遊離の必須アミノ酸は体内水分由来の1個の水素原子をα炭素のC-H 結合に、急速な可逆的アミノ基転移反応を介して、取り込みうる。もちろん、遊離の非必須アミノ酸はより多数の代謝的に交換可能なC-H結合を含み、したがって、新たに合成されたタンパク質中に、分子あたりより高い2H2O由来のアイソトープ濃縮値を示すことが期待される。
【００６５】
当業者は、体内水分由来の標識された水素原子が他の生化学的経路によって他のアミノ酸内に取り込まれうることを認識するであろう。例えば、水由来の水素原子がクエン酸回路において前駆体α-ケトグルタル酸の合成を経てグルタミン酸に取り込まれることは当技術分野において公知である。グルタミン酸は、順に、グルタミン、プロリン、およびアルギニンの生化学的前駆体になることが知られている。別の例として、体内水分由来の水素原子は3-メチルヒスチジンのメチル基、ヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリジンのヒドロキシル基などのような翻訳後修飾されたアミノ酸に取り込まれる可能性がある。他のアミノ酸合成経路も当業者には公知である。
【００６６】
また、酸素原子（H218O）も酵素触媒反応を介してアミノ酸に取り込まれうる。例えば、酵素触媒反応の際にアミノ酸のカルボン酸部分への酸素交換が起こりうる。標識した酸素のアミノ酸への取り込みは当業者に公知である。また酸素原子は酵素触媒反応を介して18O2からアミノ酸（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、または他の翻訳後修飾アミノ酸を含む）に取り込まれる可能性がある。
【００６７】
標識した水に由来する水素および酸素の標識はまた、翻訳後修飾を介してアミノ酸に取り込まれうる。一つの実施形態では、翻訳後修飾は翻訳後修飾に先立つ生合成経路により標識された水素または酸素をすでに含むことができる。別の実施形態では、翻訳後修飾は翻訳後修飾ステップ（例えば、メチル化、水酸化、リン酸化、プレニル化、硫酸化、カルボキシル化、アセチル化または他の公知の翻訳後修飾）の前または後のいずれかに、体内水分由来の遊離の交換標識水素に関わる代謝誘導体からの標識された水素、酸素、炭素、または窒素を取り込むことができる。
【００６８】
(b)オリゴ/ポリヌクレオチドの前駆体
前駆体分子はオリゴまたはポリヌクレオチドの成分を含みうる（この文脈においてオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは同義的に用いられる）。ポリヌクレオチドはプリンおよびピリミジン塩基ならびにリボース・リン酸骨格を含む。前駆体分子は当技術分野において公知の任意のポリヌクレオチド前駆体分子でありうる。
【００６９】
ポリヌクレオチドの前駆体分子はCO2、NH3、尿素、O2、グルコース、乳酸、H2O、酢酸、ケトン体および脂肪酸、グリシン、コハク酸または他のアミノ酸、ならびにリン酸でありうる。
【００７０】
またポリヌクレオチドの前駆体分子は１種以上のヌクレオシド残基を含みうる。前駆体分子はまたヌクレオシド残基の１種以上の成分であってもよい。例えばグリシン、アスパラギン酸、グルタミン、およびテトラヒドロ葉酸はプリン環の前駆体分子として使用される。例えばカルバミルリン酸およびアスパラギン酸はピリミジン環の前駆体分子として使用されうる。アデニン、アデノシン、グアニン、グアノシン、シチジン、シトシン、チミン、またはチミジンはデオキシリボヌクレオチドのための前駆体分子として提供しうる。すべてのアイソトープ標識前駆体は、例えばCambridge Isotope Labs (Andover, MA)から商業的に購入することができる。
【００７１】
ポリヌクレオチドの前駆体分子は水でありうる。ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、およびヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体のC-H結合上の水素原子は、2H2Oからのポリヌクレオチド合成を測定するために用いることができる。C-H結合はH2Oからポリヌクレオチド前駆体への交換を受ける。したがって、2H2O投与後のポリヌクレオチド、ヌクレオシド、およびヌクレオチドまたはヌクレオシド前駆体のC-H結合における2H標識の存在は、ポリヌクレオチドがこの期間中に合成されたことを意味する。存在する標識の程度は実験的に測定することができ、また、ポリヌクレオチドもしくはヌクレオシドの標識化部位の数に基づいて推定することもできる。
【００７２】
体内水分由来の水素原子は遊離のヌクレオシドまたはポリヌクレオチド中に取り込まれうる。標識した水由来の2Hまたは3Hは中間代謝反応を介してこれらの分子に入ることができる。
【００７３】
当業者は、体内水分由来の標識された水素原子が様々な生化学的経路によって他のポリヌクレオチド、ヌクレオチド、またはヌクレオシド内に取り込まれうることを認識するであろう。例えばグリシン、アスパラギン酸、グルタミン、およびテトラヒドロ葉酸はプリン環の公知の前駆体分子である。例えばカルバミルリン酸およびアスパラギン酸はピリミジン環の公知の前駆体分子である。リボースおよびリボースリン酸、ならびにそれらの合成経路はポリヌクレオチド合成の公知の前駆体である。
【００７４】
また、酸素原子（H218O）も、上記に挙げられたものを含む酵素触媒による生化学反応を介してポリヌクレオチド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドに取り込まれうる。また18O2由来の酸素原子は、非酵素的な酸化反応を含む酸化反応（8-オキソグアニンおよび酸化型塩基または酸化型ヌクレオチドの形成のような酸化的傷害を含む）によってヌクレオチドに取り込まれうる。
【００７５】
アイソトープ標識前駆体はまた、複製後修飾においてポリヌクレオチド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドに取り込まれる。複製後修飾はDNA分子の合成後に起こる修飾を含む。その代謝誘導体はメチル化シトシンを含むがそれに限定されないメチル化塩基でありうる。その代謝誘導体はまた8-オキソグアノシンを含むがそれに限定されない酸化的に修飾された塩基でありうる。当業者は、標識が修飾の合成の間に取り込まれることを容易に認識するであろう。
【００７６】
(c)脂質の前駆体
脂質の標識前駆体は脂質生合成における任意の前駆体を含みうる。脂質の前駆体分子はCO2、NH3、グルコース、乳酸、H2O、酢酸、および脂肪酸でありうる。また前駆体は、脂肪酸、アシルグリセロールのグリセロール部分、コレステロールおよびその誘導体に対する前駆体である標識した水、好ましくは2H2O（重水素化水）; トリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステル、コアミドおよび他の脂質に対する前駆体である13Cまたは2H標識脂肪酸; 脂肪酸およびコレステロールに対する前駆体である13Cまたは2H-酢酸; 脂肪酸、コレステロール、アシルグリセリド、および（例えば脂肪酸に対する）酵素触媒反応もしくは非酵素的な酸化傷害のいずれかによって酸化修飾されたある種の脂肪酸（過酸化物など）に対する前駆体である18O2; アシルグリセリドに対する前駆体である13Cまたは2H-グリセロール; 内生的に合成された脂肪酸、コレステロール、およびアシルグリセリドに対する前駆体である13Cまたは2H標識酢酸、エタノール、ケトン体もしくは脂肪酸; ならびに2Hまたは13C標識コレステロールもしくはその誘導体（胆汁酸およびステロイドホルモンを含む）を含む。すべてのアイソトープ標識前駆体は、例えばCambridge Isotope Labs (Andover, MA)から商業的に購入することができる。
【００７７】
糖脂質およびセレブロシドなどの複合脂質もまた、（N-アセチルガラクトサミン、N-アセチルグルコサミン硫酸、グルクロン酸、およびグルクロン酸硫酸を含むがそれに限定されない）セレブロシドの糖部分、セレブロシドの脂肪酸アシル部分、ならびにセレブロシドのスフィンゴシン部分に対する前駆体である2H2O; セレブロシド、糖脂質および他の誘導体の脂肪酸アシル部分に対する前駆体である2Hまたは13C標識脂肪酸を含めて、前駆体から標識され得る。
【００７８】
前駆体分子は脂質の構成要素であってもよく、またはそれを含んでいてもよい。
【００７９】
(d)グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの前駆体
グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンは細胞外空間（例えば軟骨、細胞間質、および滑膜関節液）において重要な役割を担う複雑なクラスの生体分子である。これらのクラスの分子には、例えば、以下のものが含まれる：グリコサミノグリカン二糖類で構成された大きなポリマー、例えばグルクロン酸と結合したN-アセチルグルコサミンを含む二量体である、ヒアルロン酸（HA）二糖の最大50,000個の繰り返し単位から構成されるポリマーであるヒアルロナン; グルクロン酸と結合したN-アセチルガラクトサミン硫酸を含む二量体である、コンドロイチン硫酸（CS）二糖の繰り返し単位で構成されるコンドロイチン硫酸（CS）ポリマー; グルクロン酸と結合したN-アセチル（またはN-スルホ）グルコサミン硫酸の二量体である、ヘパラン硫酸の繰り返し単位で構成されるヘパラン硫酸ポリマー; ならびにガラクトースと結合したN-アセチルグルコサミン硫酸を含む二量体である、ケラタン硫酸二糖の繰り返し単位で構成されるケラタン硫酸ポリマー。プロテオグリカンは、ポリマーの中心ヒアルロナンに結合した追加のタンパク質と、その中心ヒアルロナン鎖から分岐する、CSのような他のグリコサミノグリカンとを含む。
【００８０】
グリコサミノグリカンおよびプロテオグリカンの標識前駆体には、2H2O（N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、グルクロン酸、様々なN-アセチルグルコサミンおよびN-アセチルガラクトサミンの硫酸塩、ガラクトース、イズロン酸等を含む糖鎖部分に取り込まれる）、13Cまたは2H-グルコース（糖鎖部分に取り込まれる）、2Hまたは13C-フルクトース（糖鎖部分に取り込まれる）、2Hまたは13C-ガラクトース（前記糖鎖部分に取り込まれる）、15N-グリシン、他の15N標識アミノ酸、または15N-尿素（N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン等のアミノ糖の窒素部分に取り込まれる）; 13Cまたは2H-脂肪酸、13Cまたは2H-ケトン体、13C-グルコース、13C-フルクトース、18O2、13Cまたは2H-酢酸（N-アセチルグルコサミンもしくはN-アセチルガラクトサミンのようなN-アセチル糖のアセチル部分に取り込まれる）、ならびに18Oまたは35S標識硫酸（コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸の硫酸部分、および他の硫酸部分に取り込まれる）が含まれ、それらに限定されない。すべてのアイソトープ標識前駆体は、例えばCambridge Isotope Labs (Andover, MA)から商業的に購入しうる。
【００８１】
(e)糖質の前駆体
糖質の標識前駆体は当技術分野において公知の任意の糖質生合成前駆体を含みうる。これらの前駆体分子には、限定するものではないが、以下のものが含まれる：H2O、単糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、グルクロン酸、グルコサミンおよびその誘導体、ガラクトサミンおよびその誘導体、イズロン酸、フルクトース、リボース、デオキシリボース、シアル酸、エリトロース、ソルビトール、アドール、ならびにポリオールを含む）、脂肪酸、酢酸、ケトン体、エタノール、乳酸、アラニン、セリン、グルタミンおよび他の糖原性アミノ酸、グリセロール、O2、CO2、尿素、デンプン、二糖類（スクロース、ラクトース等）、グルコースポリマーならびに（複合多糖類を含む）他の単糖類のポリマー。
【００８２】
前駆体分子は、単糖類に対する前駆体である標識した水、好ましくは2H2O、13C標識グルコース生成前駆体（グリセロール、CO2、糖原性アミノ酸、乳酸、エタノール、酢酸、ケトン体および脂肪酸を含む）、13Cまたは2H標識単糖類、13Cまたは2H標識デンプンもしくは二糖類、2Hまたは13Cで標識した糖質の他の成分、ならびに単糖類および複合多糖類に対する前駆体である18O2を含みうる。
【００８３】
2. 標識前駆体分子を投与する方法
標識前駆体は経口、非経口、皮下、静脈内、および腹腔内を含むがそれらに限定されない様々なin vivo方法によって生体系に投与することができる。
【００８４】
生体系は動物でありうる。また生体系はヒトであってもよい。
【００８５】
一例として、ある実施形態では、標識前駆体は生体系により（例えば飲食または静脈内注入によって）摂取される2H2Oである。別の実施形態では、標識前駆体は生体系により（例えば飲食または静脈内注入によって）摂取される13C1-リジンである。別の実施形態では、標識前駆体は生体系により（例えば飲食または静脈内注入によって）摂取される13C1-グリシンである。別の実施形態では、標識前駆体は生体系により（例えば飲食または静脈内注入によって）摂取される2H3-ロイシンである。別の実施形態では、標識前駆体は生体系により（例えば飲食または静脈内注入によって）摂取される2H2-グルコースである。
【００８６】
標識前駆体が投与される時間の長さは、前駆体分子が生合成経路に取り込まれることを可能にするのに十分なものでありうる。またアイソトープ標識前駆体分子は、該アイソトープ標識前駆体分子の標識が1種以上のミトコンドリア分子に取り込まれ、その後、1種以上のミトコンドリア分子の1種以上の標識代謝誘導体および非標識代謝誘導体の形で放出されるのに十分な時間にわたり生体系に導入されうる。この時間は事前に定められた長さの時間であってよい。この必要とされる時間は、（例えば代謝回転の速いミトコンドリア分子に対しては）数分または数時間から（例えば代謝回転の遅いミトコンドリア分子に対しては）数週間または数ヶ月にまで変動しうる。
【００８７】
前駆体分子は連続的にまたは繰り返し投与することができる。前駆体の投与は様々な方法で達成され得る。最大のアイソトーププラトー値またはアイソトープ濃縮に近づく（すなわち標識前駆体の濃度が時間経過にわたって相対的に一定となる）ように十分な量の前駆体を投与するために、前駆体分子を連続的にまたは繰り返し投与する。連続的な標識期間がミトコンドリア分子の4〜5半減期もの長い間維持される場合、到達する漸近線およびこの漸近線に近づくアイソトープ濃縮または含有量曲線の形は、「真の前駆体」アイソトープ濃縮または含有量、ならびにミトコンドリア分子産物の部分置換速度を明らかにするであろう。安定した前駆体プール濃縮を維持しながらプラトーにまで標識することによって、細胞代謝産物プールの生物学的複雑さを克服することができる。
【００８８】
前駆体分子は断続的に投与することもできる。断続的標識法の場合、ある量の標識前駆体分子を測定し、1回以上投与し、その後標識前駆体分子への暴露を中断して、体内前駆体プールからの標識前駆体分子の除去を行う。その後ミトコンドリア分子の分解の経時変化を、生体サンプルの代謝誘導体中の標識の消失または代謝誘導体への標識取り込みの減衰（減少もしくは衰弱）を測定することによってモニターする。
【００８９】
アイソトープ標識した水または他のアイソトープ標識前駆体サブユニット分子を被験者に投与した後、アイソトープは通常ミトコンドリア分子に取り込まれる。ミトコンドリア分子の例はDNA、RNA、タンパク質、および脂質（例えばリン脂質）を含むが、それらに限定されない。
【００９０】
本発明の方法は一般的に哺乳動物被験体、好ましくはヒトにおいて実施される。哺乳動物は、霊長類、家畜、競技用動物、マウス、およびラットを含むがそれらに限定されない。しかし必要であれば、アイソトープ標識前駆体サブユニット分子（標識した水を含む）は、例えば細胞または組織の培養物に接触させるために、in vitro系において使用してもよい。この変形形態において、培養した細胞または組織の代謝適応能を評価する方法は、1）細胞または組織を標識した水もしくは他のアイソトープ標識前駆体サブユニットと接触させること、2）標識を新たに合成されるミトコンドリア分子に十分な時間取り込ませること、3）培養した細胞もしくは組織からミトコンドリアおよび/またはミトコンドリア分子を単離すること、4）ミトコンドリア分子のアイソトープ含有量および/もしくはアイソトープパターン、またはアイソトープ含有量の変化速度および/もしくはアイソトープパターンの変化速度を測定すること、5）ミトコンドリア分子の合成速度または分解速度を計算すること、を含む。
【００９１】
標識した水または他のアイソトープ標識前駆体サブユニットは通常、事前に定められた容量およびアイソトープ濃度で投与される。アイソトープ濃度は一般的に、例えばアイソトープ標識前駆体サブユニットの投与プロトコルの開始（すなわち被験者への「開始投与」）またはアイソトープ標識前駆体サブユニットの投与プロトコルの維持（すなわち被験者への「持続投与」）などの目的に応じて変化する。開始投与として与えられる場合、例えば重水素化水は体内水分において十分な濃度範囲を達成するように投与される。また維持目的のためには、重水素化水を含む水は日用量（例えば1日あたり70mL）または飲用水の一部（例えば飲用水中4％の2H2O）として投与される。標識した水または他のアイソトープ標識前駆体サブユニットは、任意に、対象の細胞、組織または生物において取り込み期間にわたり比較的安定したまたは一定したレベル（すなわち定常状態レベル）を達成するのに十分な持続期間にわたって投与される。被験者への標識した水または他のアイソトープ標識前駆体サブユニットの投与は経口経路または非経口経路、例えば血管内注入、皮下、筋内、もしくは腹腔内投与によって行われる。
【００９２】
B. 1種以上のミトコンドリア分子の取得
標識した水またはアイソトープ標識前駆物質サブユニットを投与した後、ミトコンドリアは目的の１つ以上の細胞型または１つ以上の組織サンプルから当技術分野において周知の技術により単離される（参考として本明細書に組み入れられるCollins ML, Eng S, Hoh R, Hellerstein MK. J Appl Physiol. 2003 Jun; 94(6):2203-11を参照のこと)。好ましくは、ミトコンドリアは血液細胞、例えば、血小板もしくは顆粒球およびリンパ球のような白血球、あるいは骨格筋または心筋のような組織から単離される。血液細胞から単離する場合、細胞は静脈穿刺または針吸引などの方法によって取得しうるが、それに限定されない。加えて、組織サンプルは、針吸引、針生検、内視鏡生検、直視下生検、および当技術分野において公知の他の外科的生検処置を含むがそれらに限定されない方法によっても取得することができる。
【００９３】
必要であれば、ミトコンドリア分子（例えばDNA）はアイソトープ含有量および/またはアイソトープパターンを測定することができる形に変換される。その後ミトコンドリア分子のアイソトープ含有量および/またはアイソトープパターンを、質量分析、核磁気共鳴分光法、近赤外レーザー分光法、液体シンチレーション計数または当分野において公知の他の方法を含むがそれらに限定されない方法によって測定する。最適には、ミトコンドリア分子中のアイソトープ含有量および/またはアイソトープパターンは、生合成前駆体プール（そこからミトコンドリア分子が細胞、組織、または生物において合成される）のアイソトープ含有量および/またはアイソトープパターンを表す基準値と比較される。その後、ミトコンドリア分子の合成速度は、参照により本明細書に完全に組み入れられる前掲のHellersteinら（1999）によって記載されたように、生合成前駆体プールにおけるアイソトープ含有量および/またはアイソトープパターンに対して補正した後、アイソトープ含有量および/またはアイソトープパターンならびにアイソトープ標識前駆体サブユニットへの暴露の持続期間に基づいて、前駆体-産物の関係に従って計算することができる。あるいは、ミトコンドリア成分の分解速度は、標識前駆体サブユニットの除去または洗浄（すなわち「チェイス」)の後、ミトコンドリア分子のアイソトープ含有量および/またはアイソトープパターンの減衰の経時変化に基づいて計算することができる。計算されたミトコンドリア分子の合成速度および/または分解速度はその後、分析した細胞もしくは組織の代謝適応能を表すために使用される。
【００９４】
本発明の方法を実施する際に、一つの態様では、対象となる標的分子を、当技術分野で公知の方法に従って細胞、組織、または生物から取得する。その方法は個々のミトコンドリア分子に特異的でありうる。対象の分子は生体サンプルから取得することができる。
【００９５】
複数の対象の分子を細胞、組織、または生物から取得してもよい。1以上の生体サンプルは、例えば採血、採尿、生検、または当技術分野において公知の他の方法によって取得できる。1以上の生体サンプルは1以上の体液でありうる。ミトコンドリア分子はまた、筋肉、肝臓、副腎組織、前立腺組織、子宮内膜組織、血液、皮膚、および乳房組織のような特定の器管または組織から取得してもよい。対象の分子は、腫瘍細胞または線維芽細胞のような特定の細胞の群から取得しうる。また対象の分子は、当技術分野において公知の標準的な生化学的方法を用いて生体サンプルから取得し、場合により、部分精製または単離を行ってもよい。
【００９６】
生体サンプル採取の頻度は様々な要因によって変化し得る。このような要因としては、限定するものではないが、対象の分子の性質、サンプル採取の容易さおよび安全性、ミトコンドリア分子の合成速度および分解/除去速度、ならびに化学物質または薬剤の半減期が含まれる。
【００９７】
また対象の分子は、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、高速液体クロマトグラフィー（FPLC）、化学的抽出、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および/または当業者に公知の他の分離法を含む従来の精製法によって部分精製することができ、場合により単離することもできる。
【００９８】
別の実施形態では、対象の分子は加水分解または別の方法で分解して、より小さい分子を形成させてもよい。加水分解法は、化学的加水分解（酸加水分解など）および生化学的加水分解（ペプチダーゼ分解など）を含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法を含む。加水分解または分解は対象の分子の精製および/もしくは単離の前後いずれかに行うことができる。また対象の分子は、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、高速液体クロマトグラフィー（FPLC）、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および/または当業者に公知の他の任意の化学的および/または生化学的化合物の分離法を含む従来の精製法によって部分精製することができ、場合により単離することもできる。
【００９９】
C. 生化学的分析
薬剤の生物学的作用を確認するために使用される現在利用可能な技術（静的方法）は、細胞または細胞内小器官（例えばミトコンドリア）における分子の組成、構造、もしくは濃度のみを測定し、一時点でそれを行うにすぎない。しかし、本発明の方法はミトコンドリア分子（例えばDNA、RNA、タンパク質、脂質）の分子流動速度の測定を可能にし、様々な病態におけるそれらの経時的変化、ならびに、公式もしくは非公式の運動、特定のトレーニング計画、無活動、ベッドでの療養、ライフスタイルの変化、または他の行動要因に応答した、あるいは薬剤または薬剤の組合せへの暴露に応答したそれらの経時的変化の測定を可能にする。これは、ミトコンドリア分子の合成または分解を達成することができ、したがってミトコンドリア生合成の直接評価を行うことができるので、広範囲の生理的および薬理条件下での生体系の適応状態（すなわち代謝適応能）および/または好気的能力のより正確な評価を可能にする。対照的に、ミトコンドリア分子の全くの静的測定はミトコンドリア生合成の評価において有用な情報をほとんど提供せず、したがって生体系の適応状態（すなわち代謝適応能）および/または好気的能力の評価における実用的価値をほとんど持たない。
【０１００】
1. 質量分析
ミトコンドリア分子のアイソトープ濃縮は、ガスクロマトグラフフィー/質量分析（GC-MS）、同位体比質量分析、GC-同位体比-燃焼-MS、GC-同位体比-熱分解-MS、液体クロマトグラフ-MS、エレクトロスプレーイオン化-MS、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型-MS、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴-MS、サイクロイド-MSを含むがそれらに限定されない、質量分析などの様々な方法によって測定することができる。
【０１０１】
質量分析計はタンパク質、脂質、糖質、核酸、および有機代謝産物などの分子を高速移動する気体イオンに変換し、質量対電荷比に基づいてそれらを分離するものである。したがって、イオンもしくはイオン断片のアイソトープまたはアイソトポログの分布を用いて、複数のミトコンドリア分子のアイソトープ濃縮を測定することができる。
【０１０２】
一般に、質量分析計はイオン化手段および質量分析器を含む。多数の異なるタイプの質量分析器が当技術分野において知られている。これらには、磁場型分析器、エレクトロスプレーイオン化、四重極、イオントラップ、飛行時間型質量分析器、およびフーリエ変換分析器が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０３】
また質量分析計は多数の異なるイオン化方法を含む。これらには、電子衝撃、化学イオン化、電界イオン化などの気相イオン化源、ならびに、電界脱離、高速原子衝撃、マトリックス支援レーザー脱離イオン化、および表面増強レーザー脱離イオン化などの脱離源が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０４】
さらに、2以上の質量分析器を連結（MS/MS）して、最初に前駆体イオンを分離し、次に気相断片イオンを分離して測定してもよい。これらの装置はタンパク質の一連の初期のイオン断片を生成し、次に初期イオンの二次断片を生成する。その結果生じる重複配列は、重複する「パズルのピース」（pieces of the puzzle）をともにつなぎ合わせることによって、(コンピュータ解析時間を加えて）数分間以内の単一質量分析に基づいて、タンパク質の完全な配列決定を可能にする。
【０１０５】
タンパク質の質量分析によって生じるMS/MSペプチド断片化パターンおよびペプチドの正確な分子量決定は、タンパク質のアミノ酸配列に関して特有の情報を提供し、本発明において有用である。未知のタンパク質は、単一の質量分光分析の実行によって、数分のうちに配列決定および同定を行うことができる。現在利用可能なペプチド配列およびタンパク質断片化パターンのライブラリーは、ほぼ確実に複雑な混合物の構成成分を同定する機会を提供する。
【０１０６】
また、当技術分野においては様々なイオン化方法も公知である。一つの重要な進歩は、タンパク質およびポリヌクレオチドをはじめとする大きな不揮発性の巨大分子をイオン化するための技術の発達であった。このタイプの技術にはエレクトロスプレーイオン化（ESI）およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）が含まれる。これらは、液体クロマトグラフィーおよびキャピラリーゾーン電気泳動などの強力なサンプル分離導入技術とMSとを併用することを可能にする。
【０１０７】
さらに、質量分析計は、ガスクロマトグラフィー（GC）および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの分離法と連結してもよい。ガスクロマトグラフフィー/質量分析（GC/MS）では、ガスクロマトグラフからのキャピラリーカラムが、場合によりジェットセパレーターを用いて、質量分析計と直接連結される。このような応用例では、ガスクロマトグラフィー（GC）カラムがサンプル気体混合物からサンプル成分を分離し、分離した成分を質量分析計でイオン化して化学的に分析する。
【０１０８】
GC/MS（または、小さい無機気体よりもむしろタンパク質、核酸、脂質、および有機代謝産物のイオンを分析する他の質量分析計）を使用して有機分子の質量アイソトポマー存在度を測定する場合、アイソトープ標識水からの水素標識アイソトープの取り込みは、in vivoでアイソトープ標識水から有機分子に取り込まれた水素原子の数に応じて、3〜7倍に増幅される。
【０１０９】
通常、ミトコンドリア分子に対するベースラインの質量アイソトポマー頻度分布を決定するために、アイソトープ標識前駆体の注入の前にそのようなサンプルを採取する。このような測定は、細胞、組織または生物におけるミトコンドリア分子の質量アイソトポマーの自然発生頻度を確立するための一つの方法である。細胞、組織または生物が同様の環境履歴を有する被験者集団の一部である場合、集団アイソトポマー頻度分布はこのようなバックグラウンド測定のために使用されうる。さらに、このようなベースラインアイソトポマー頻度分布は、アイソトープの既知の平均的な自然存在度を用いて推定することもできる。例えば自然界では、有機体炭素に存在する13Cの自然存在度は1.11％である。このようなアイソトポマー頻度分布を決定する方法は以下で述べる。一般的には、ミトコンドリア分子のサンプルを、アイソトープ標識前駆体の被験者への投与前後に採取し、以下に記載するようにアイソトポマー頻度を分析する。
【０１１０】
1. 相対的および絶対的な質量アイソトポマー存在度の測定
測定した質量スペクトルピークの高さ、あるいはピーク下面積は、親（ゼロ質量アイソトープ）アイソトポマーに対する比率として表すことができる。サンプル中のアイソトポマーの存在度についての相対値および絶対値を提供する計算方法はどれも、本発明の目的のため、そのようなデータの記載に使用できることが理解されよう。
【０１１１】
2. 対象の分子の標識：非標識比の計算
次に対象の標識分子および非標識分子の比率を計算する。実施者はまず単離したアイソトポマー分子種について測定された過剰なモル比を決定する。次に実施者は測定された過剰な比の内部パターンを理論上のパターンと比較する。このような理論上のパターンは、米国特許第5,338,686号、第5,910,403号、および第6,010,846号（参照により本明細書に完全に組み入れられる）に記載されるような二項分布または多項分布の関係を用いて計算できる。その計算には質量アイソトポマー分布分析（MIDA）が含まれる。質量アイソトポマー分布分析（MIDA）組合せアルゴリズムの変形が、当業者に公知の多数の異なる出典において論じられている。その方法はさらにHellersteinおよびNeese（1999）、ならびにChinkesら（1996）、KelleherおよびMasterson（1992）、および米国特許出願第10/279,399号によっても論じられており、これらすべてを参照により本明細書に完全に組み入れるものとする。
【０１１２】
前掲の文献に加えて、その方法を実行する計算ソフトウェアがカリフォルニア大学バークレー校のMarc Hellerstein教授から公表されて利用可能である。
【０１１３】
過剰なモル比と理論上のパターンとの比較は、対象の分子に対して作成された表を用いて、または決定された関係を用いてグラフ的に行うことができる。これらの比較から、前駆体サブユニットプール中の1つのサブユニットの質量アイソトープ濃縮の確率を表すp値のような数値を決定する。次いで、この濃縮を用いて、各質量アイソトポマーについて新たに合成された分子の濃縮を表すAx*値のような数値を決定して、すべてのアイソトポマーが新たに合成されたならば存在すると予想されるアイソトポマーの過剰比を明らかにする。
【０１１４】
その後、部分存在度を計算する。個々のアイソトープ（元素について）の部分存在度または質量アイソトポマー（分子について）の部分存在度は、その特定のアイソトープまたは質量アイソトポマーによって表される全存在度に対する割合である。これは、相対存在度（最も豊富な化学種に100という数値を与え、他のすべての種を100に対して標準化し、相対存在度パーセントとして表される）とは区別される。質量アイソトポマーMxに関しては、次式のとおりである：
【数１】
2005539069.tif 000002
［ここで、0からnは、存在度が生じる最低質量（M0）の質量アイソトポマーと比較した名目質量の範囲である］。
【数２】
2005539069.tif 000003
［ここで、下付き文字のeは濃縮された存在度を指し、bはベースラインまたは自然存在度を指す］。
【０１１５】
前駆体の投与期間中に実際に新たに合成された分子の割合を決定するために、測定された過剰モル比（EMx）を計算された濃縮値Ax*（各質量アイソトポマーについて新たに合成された生体高分子の濃縮を表す）と比較して、すべてのアイソトポマーが新たに合成されたならば存在すると予想されるアイソトポマー過剰比を明らかにする。
【０１１６】
3. 分子流動速度の計算
合成速度を決定する方法は、分子前駆体プールに存在する質量アイソトープ標識サブユニットの比率を計算すること、この比率を用いて少なくとも1種の質量アイソトープ標識サブユニットを含む対象の分子の期待頻度を計算することを含む。次にこの期待頻度を実際の実験的に測定された対象の分子のアイソトポマー頻度と比較する。これらの数値から、所定の取り込み期間に添加されたアイソトープ標識前駆体から合成される対象の分子の比率が決定できる。したがって、このような期間の合成速度もまた決定される。
【０１１７】
その後、前駆体-生成物の関係を当てはめることができる。連続標識法においては、アイソトープ濃縮は漸近的な（すなわち最大値の可能性の）濃縮と比較され、動的なパラメータ（例えば合成速度）は前駆体-生成物の式から計算される。部分合成速度（ks）は連続標識用の前駆体-生成物の次式を適用することによって決定されうる：
ks = [-ln(1-f)]/t
［ここでf = 部分合成 = 生成物濃縮/漸近的な前駆体/濃縮、およびt = 研究される系において接触させる標識投与の時間である］。
【０１１８】
不連続標識法においては、アイソトープ濃縮の減衰速度が計算され、対象の分子の動的なパラメータは指数関数的減衰方程式から計算される。この方法を実施するには、生体高分子は好ましくは複数の質量アイソトープ標識前駆体を含む質量アイソトポマーに濃縮される。これらの対象分子のより高い質量アイソトポマー、例えば3または4個の質量アイソトープ標識前駆体を含む分子は、天然の質量アイソトープ標識前駆体の存在度が相対的に低いため、外因性の前駆体の非存在下ではごくわずかな量しか形成されないが、分子前駆体取り込みの期間には多量に形成される。細胞、組織、または生物から連続的な時点で採取された対象の分子を質量分析によって解析し、高い質量アイソトポマーの相対頻度を決定する。高い質量アイソトポマーはほぼ例外なく第一の時点以前に合成されるので、2つの時点間でのその減衰は対象分子の減衰速度の直接的な測定を提供する。
【０１１９】
好ましくは、第一の時点は、前駆体の投与を中断した後、投与方法に応じて、質量アイソトープ標識サブユニットの比率が前駆体投与後の最高レベルから実質的に減衰することを確実にするのに十分なほど長くする。一つの実施形態では、次の時点は一般的に第一の時点の1〜4時間後であるが、このタイミングは生体高分子プールの置換速度に依存するであろう。
【０１２０】
対象の分子の減衰速度は対象の3アイソトープ分子に対する減衰曲線から決定される。減衰曲線がいくつかの時点によって規定される場合には、減衰速度はその曲線を指数関数的な減衰曲線に適合させ、これから減衰定数を求めることにより決定することができる。
【０１２１】
分解速度定数（kd）は指数関数的または他の速度論的減衰曲線に基づいて計算することができる：
kd = [-ln f]/t
【０１２２】
記載されるように、この方法は質量アイソトープ標識され得る2つ以上の同一のサブユニットから成る実質的にあらゆる生体高分子のサブユニットプールの組成ならびに合成および減衰速度を決定するために使用される。分子の流動速度および対象の代謝経路を介した流動速度を計算するために、他の公知の計算法および実験的標識化または脱標識化アプローチを使用することができる（例えば、Wolfe, R.R. Radioactive and Stable Isotope Tracers in Biomedicine: Principles and Practice of Kinetic Analysis. John Wiley & Sons; (March 1992)を参照されたい)。
【０１２３】
本発明方法の適用
本発明の方法は様々な目的に使用することができる。第一に、本方法は被検者の代謝適応能を評価するために用いられる。次に、被験者の代謝適応能は、心血管病や糖尿病などの病状または一般的には死亡について、その被験者の危険性を調べるために使用されうる。ひとたび特定の危険性が評価されたら、適切な治療が推奨される。
【０１２４】
別の変形形態では、本方法は、代謝適応能に対する薬剤の効果（すなわち、代謝適応能の増加もしくは減少により代謝適応能を変化させる能力、または代謝適応能の変化を妨げる能力）について、ハイスループット方式で、被験者、細胞培養、あるいは組織培養において医薬品候補のような薬剤をスクリーニングするために使用される。細胞培養系を用いる場合、本発明の方法はハイスループット系において医薬品または医薬品候補をスクリーニングするために使用できる。in vivoまたはin vitroのいずれに用いられても、代謝適応能に対する効果は、薬剤/医薬品またはその候補薬剤/医薬品の投与前後の代謝適応能を測定し、その後比較することによって決定される。その結果生じる代謝適応能の差異は、薬剤候補が対象の被検者、細胞、または組織にもたらす効果である。例えば、運動トレーニングは通常被験者の代謝適応能を改善する。その後の少なくとも約2週間の無活動（脱トレーニングまたはデコンディショニング）は一般的に代謝適応能の減少を招く。しかし、本発明の方法の使用は、脱トレーニングを予防し、それによって傷害、病気、拘束、または他の代謝適応能もしくは好気的要求度の変化のためにベッドでの療養を余儀なくされる人々において治療的有用性を備えた薬剤または薬剤候補の同定に役立つであろう。
【０１２５】
薬剤の効果は本明細書に記載される方法を用いて試験することができる。薬剤の投与された生体系および薬剤の投与されなかった生体系の代謝適応能または好気的要求度の変化は、その薬剤を生体系の代謝適応能または好気的要求度を変化させることが可能なものとして同定する。薬剤は同一の生体系または異なる生体系に投与してもよい。薬剤は当技術分野において公知の任意の化合物または組成物でありうる。薬剤は、例えば、参照により本明細書にその全体を組み入れられるThe Merck Index第13 版（a U.S. publication, Whitehouse Station, N.J., USA）に開示される任意の化合物または組成物を含むが、それらに限定されない。
【０１２６】
さらなる変形形態で、本発明は本発明の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、標識した水、1種以上の他のアイソトープ標識前駆体サブユニット、またはそれらの混合物などの構成成分を含むように作製される。標識した水または他のアイソトープ標識前駆体サブユニットは様々なアイソトープ濃度および事前に測定された容量で提供しうる。さらに、キットはキット構成成分の使用についての説明書および代謝適応能の計算の仕方についての説明書と共に包装することが好ましい。
【０１２７】
標識した水またはアイソトープ標識前駆体ユニットを投与するための器具（例えば、計量カップ、注射針、注射器、ピペット、IVチューブ）などの、他のキット構成要素をキットに含めてもよい。同様に、被検者、細胞、または組織培養からサンプルを得るための器具（例えば、メス、ピンセット、針、注射器、およびバキュテイナー真空採血管）もまた場合により提供されうる。
【０１２８】
以下の実施例は、本発明の方法が細胞、組織、または生物（ヒトを含む）の代謝適応能を評価するために使用しうることを示すために提供される。特定の実施形態が説明され記載されているが、それらは本発明の限定を意図しないことを、当業者は認識するであろう。
【実施例】
【０１２９】
実施例１
アイソトープ標識した水を投与した後のラットにおけるミトコンドリアDNAの部分合成（fractional synthesis）
ラット・ミトコンドリアDNAへの2Hの取り込みのためのプロトコルは図1Aの実験設計に示してある。ゼロ日目にラットの体内水分量の2％2H2Oを達成するように、Simonsen, Inc. Gilroy, CAから提供されるSprague Dawley雄ラットに、腹腔内注射によって100％2H2Oで投与を開始した(a)。その後、重水素化水（4％2H2O）を飲料水として約10週間ラットに投与した(b)。トレーニングを受ける群とトレーニングを受けない群の2群のラットが存在した。次に、動物を様々な時点で犠牲にし(c)、心筋および後肢筋から組織サンプルを得た。その後、ミトコンドリアを遠心分離によって回収し、ミトコンドリアDNAを超遠心分離法および当技術分野において公知の生化学的分離法を用いて単離した（Collins ML, Eng S, Hoh R, Hellerstein MK. J Appl Physiol. 2003 Jun;94(6):2203-11参照）。DNAを遊離デオキシリボヌクレオシドに加水分解し、当技術分野で公知の技術を用いて誘導体化した（Collinsら、前掲を参照）。
【０１３０】
図2Aに示すように、ミトコンドリアDNAへの2Hの取り込みをガスクロマトグラフィー／質量分析で測定した。1週間の運動のための運動トレーニング（トレッドミル・ランニング）計画を実行した動物は、ミトコンドリアDNAへの2Hの取り込みの著しい増加を示した。反対に、あまり動かない肥満したマウスはミトコンドリアDNA合成の減少を示した。
【０１３１】
シトクロムCオキシダーゼサブユニットIV含有量はトレーニングによって増加し（図5）、脱トレーニング（トレーニング中止）によって定着（静止状態）対照レベルに戻った（図6）。4週間の脱トレーニング後、以前にトレーニングを受けた群でのシトクロムCオキシダーゼ含有量は静止状態の対照の値と有意差がなかった（それぞれ0.15± 0.01および0.17 ± 0.04の平均相対的光学強度）（図6）。サブユニットIVはmtDNAによってコードされていないので、新たなmtDNAの合成はサブユニットIV含有量の増加を直接的に引き起こすことはできず、サブユニットIV含有量はmtDNAの複製または転写を直接表していない。本発明者らが本明細書においてトレーニング群と脱トレーニング群の両方で観察したmtDNA合成およびサブユニットIV含有量の協調的な増加は、核およびミトコンドリアのエレメントにより共有される調節と一致する（Williamsら、1986）。また、細胞のミトコンドリアにおいて、酸化酵素とmtDNAの含有量の比が相対的に一定に維持されるのであれば（Williamsら、1986）、サブユニットIV含有量を組織ミトコンドリア量のマーカーとして使用することができ、部分mtDNA合成を絶対的な生合成速度に変換することが可能となる。動的な変化は一般的に静的な測定の変化に先行し、より高感度であるため、この技術の適用は、シトクロムCオキシダーゼレベルのみの測定を越える潜在的な利点を有する。
【０１３２】
実施例２
アイソトープ標識した水を投与した後のヒト血小板から単離されたミトコンドリアDNAの部分合成
血小板由来のヒトミトコンドリアDNAへの2Hの取り込みのプロトコルは図1Bの実験設計に示してある。General Clinical Research Center of San Francisco General Hospitalからのヒト被験者は、ゼロ日目に3時間毎に24時間にわたって70mlを飲むことにより560mlの70％2H2Oで投与を開始し（a）、50 mlを1日に3回飲むことにより150 mlの70％2H2Oを約11日間与えた。その後、35 mlを1日に2回飲むことにより70 ml/日の70％2H2Oを次の約10週間投与した。血液を様々な時点で採取し（c）、血小板をサンプルから単離した。
【０１３３】
図2Bは、重水素化水の投与からの血小板ミトコンドリアDNAの濃縮が2H2O投与期間の増加に伴って増加することを示している（Collins ら、前掲を参照のこと）。
【０１３４】
実施例３
アイソトープ標識した水を投与した後のヒト筋生検から単離されたミトコンドリアDNAおよびリン脂質の部分合成
筋生検サンプルからのヒトミトコンドリアDNAへの2Hの取り込みのためのプロトコルは、図3Aの実験設計に示してある。外来患者として登録された5人のヒト被験者は70 mlの70％2H2Oを1日3回で5日間、次に1日2回で5日間摂取し、その後、50 mlを1日2回、8週間の研究期間の残りの期間にわたり摂取した。2週毎に、被験者から唾液サンプルを（体内2H2O濃縮の測定のために）採取した。8週目に、外科的状況下で直視下筋生検を行った。ミトコンドリアは切除した筋肉組織（1 g）から超遠心分離法により当技術分野で公知の方法を用いて単離した。ミトコンドリア（mt）DNAおよびリン脂質（PL）の単離は当技術分野で公知の方法により行なった。mt PLの部分合成の測定は上述の一般的方法および前掲のCollinsらに記述されたものと同様であった。測定された2H取り込み（EM1=その分子のM+1質量アイソトポマーの過剰存在度）およびmt DNAとmt PLの部分合成（f）を表１に示す。
【表１】
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【０１３５】
mt DNAおよびmt PLの部分合成のばらつきは健康な被験者の間で明白であり、運動パターンまたは筋肉の好気的要求度の違いを反映している。mt DNAおよびmt PLに対する異なる値はヒトミトコンドリアの異なる成分の異なる代謝回転を反映している可能性がある。mt DNAとmt PLの合成比率もまた、運動パターンまたは組織の好気的要求度についての情報を提供しうる。
【０１３６】
実施例４
アイソトープ標識した水を投与した後のラットでのミトコンドリアリン脂質の部分合成
ラット・ミトコンドリアリン脂質への2Hの取り込みのためのプロトコルは図4の実験設計に示してある。Simonsen, Inc. Gilroy, CAから提供されるSprague Dawley雌ラットをトレーニング群、定着（静止）対照群、急激な運動群の3群に分けた。「走る」および「運動する」という用語は図4では同義的に用いられる。ラットを実施例１に記述したように投与開始し、4％2H2Oで維持した。57日後、動物を犠牲にし、後肢筋または心筋のいずれかから組織サンプルを取得した。前述のようにミトコンドリアを単離し、前掲の実施例３に記載されたようにカルジオリピン（CL）、ホスファチジルコリン（PC）、およびホスファチジルエタノールアミン（PE）の部分合成についてのアッセイを行った。
【０１３７】
図4Aおよび4Bに示すように、CL、PCおよびPEへの2H取り込みは動物の運動群において最大であった。
【０１３８】
これらの研究の結果は、重水素化水の摂取およびミトコンドリアから単離した分子への重水素取り込みの測定を含む臨床検査が、代謝適応能および組織の酸化的要求度の指標として生理的/全身的運動負荷試験に取って代わることができることを実証している。
【０１３９】
本明細書において引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は参照により本明細書にその全体を組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１Ａ】アイソトープで標識した水（2H2O）を投与し、サンプルを回収するためのラットについてのプロトコルを示した概略図である。
【図１Ｂ】アイソトープで標識した水（2H2O）を投与し、サンプルを回収するためのヒト被験者についてのプロトコルを示した概略図である。
【図２Ａ】ガスクロマトグラフィー／質量分析で測定した、1週間の運動トレーニングを受けたラットから単離されたミトコンドリアDNAへの、投与された2H2O由来の2Hの取込みの増加を示す。
【図２Ｂ】ガスクロマトグラフィー／質量分析で測定した、ヒト筋生検材料から単離されたミトコンドリアDNAへの2Hの取込みを示す。
【図３Ａ】ヒト被験者が2H2Oを摂取した後に採取した筋生検材料から単離されたミトコンドリアにて測定される、ヒト被験者におけるミトコンドリアDNAおよびミトコンドリアリン脂質の合成速度を測定するための実験的プロトコルを示す。
【図３Ｂ】異なる運動計画がミトコンドリアリン脂質への投与された2H2O由来の2Hの取込みに及ぼす効果を示す。
【図４Ａ】自発的な運動を受けたラットの後肢の筋肉から単離されたミトコンドリアのカルジオリピン(CL)、ホスファチジルコリン(PC)、およびホスファチジルエタノールアミン(PE)への、投与された2H2O由来の2Hの取込みの増加を示す。
【図４Ｂ】日常的な運動を受けたラットの心筋から単離されたミトコンドリアのカルジオリピン(CL)、ホスファチジルコリン(PC)、およびホスファチジルエタノールアミン(PE)への、投与された2H2O由来の2Hの取込みの増加を示す。
【図５】トレーニングを1、2および6週間受けたラット（各時点につきn=6）由来の後肢の筋肉における平均シトクロムCオキシダーゼサブユニットIVの発現を、対照（各時点につきn=6）と比較して示す。データは±標準偏差。*は対照値に対する統計的有意性（p<0.05）を示す。
【図６】トレーニングを4週間中止したラット（n=6）からのシトクロムCオキシダーゼサブユニットIVの発現を、対照（n=6）と比較して示す。データは±標準偏差。グループ間に有意差は認められない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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