(57)【要約】ここに提供されるものは新規で有用なＧタンパク質共役型受容体であり、それは炎症性及び生理的免疫応答について信号伝達に関与するものである。また、当該受容体の活性を調節し得る化合物をスクリーニングするために当該受容体を使用する方法をも提供する。そのような化合物は、多くの炎症性及び免疫の関与する病気及び障害の治療に容易に利用し得るものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１（配列番号１）のＤＮＡ配列を含んでいる単離された核酸分子。
【請求項２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において請求項１の単離された核酸分子にハイブリッド可能な単離された核酸分子、又は請求項１の単離された核酸分子に相補的なハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項３】
図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項１又は２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも３０％の同一性を示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする請求項２の単離された核酸分子。
【請求項５】
検出可能に標識されている請求項１又は２に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
検出可能な標識が酵素、放射性同位元素又は蛍光を発生する化学物質を含んでいる、請求項５に記載の検出可能に標識されている単離された核酸分子。
【請求項７】
図２（配列番号２）のアミノ酸配列を含んでいる精製されたポリペプチド。
【請求項８】
請求項７に記載の精製されたポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項９】
検出可能に標識されている請求項７に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項１０】
検出可能な標識が酵素、放射性同位元素、又は蛍光を発生する化学物質を含んでいる、請求項９に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項７に記載の精製したポリペプチドを免疫原として有する抗体。
【請求項１２】
抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はキメラ抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
検出可能に標識されている請求項１１に記載の抗体。
【請求項１４】
検出可能な標識は酵素、放射性同位元素又は蛍光を発生する化学物質を含んでいる、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
発現調節因子と作動可能に会合し、請求項１に記載の単離された核酸分子を含んでいる発現ベクター。
【請求項１６】
発現調節因子と作動可能に会合し、請求項２に記載の単離された核酸分子を含んでいる発現ベクター。
【請求項１７】
発現調節因子は構成的制御配列、細胞特異的制御配列、及び誘導的制御配列から構成される群から選択される、請求項１５又は１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
発現調節因子がプロモーターである請求項１７の発現ベクター。
【請求項１９】
プロモーターは、ｈＣＭＶの極初期プロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、アデ
ノウイルスの初期プロモーター、ワクシニアの初期プロモーター、ポリオーマの初期プロモーター、ＳＶ４０の後期プロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアの後期プロモーター、ポリオーマの後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、λファージの主要なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、又は酵母のα接合因子のプロモーターを含んでいる、請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１５又は１６に記載の発現ベクターでトランスフォーム又はトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞が原核細胞又は真核細胞である請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
宿主細胞は、大腸菌（E．coli）、シュードモナス（Pseudomonas）、バシラス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、酵母、ＣＨＯ、Ｒ１.１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０又はＳｆ９細胞を含む、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
以下の工程：
ａ） 請求項２０の宿主細胞を、単離されたポリペプチドが発現するような条件下で培
養すること；及び
ｂ） 当該宿主、当該培養、又はそれらの組合せから当該単離されたポリペプチドを回
収すること
から成る請求項７の精製されたポリペプチドを生産する方法。
【請求項２４】
潜在的アゴニストをＧＡＶＥ１９を発現している細胞に接触させること、及び当該潜在的アゴニストの存在中のＧＡＶＥ１９の信号化活性が当該潜在的アゴニスト不在中のＧＡＶＥ１９の活性に比較して増大するか否かを測定すること、から成るＧＡＶＥ１９のアゴニストを同定する方法。
【請求項２５】
潜在的インバースアゴニストをＧＡＶＥ１９を発現している細胞に接触させること、及び当該潜在的インバースアゴニストの存在中ＧＡＶＥ１９の活性が当該潜在的インバースアゴニストの不在中のＧＡＶＥ１９の活性に比較して減少するか否か、そして内因性リガンド又はアゴニストの存在中で減少するか否かを測定すること、から成るＧＡＶＥ１９のインバースアゴニストを同定する方法。
【請求項２６】
潜在的アンタゴニストをＧＡＶＥ１９を発現している細胞に接触させること、及び当該潜在的アンタゴニストの存在中のＧＡＶＥ１９の信号化活性が内因性リガンド又はアゴニストの存在中のＧＡＶＥ１９の活性に比較して減少するか否かを測定すること、から成るＧＡＶＥ１９のアンタゴニストを同定する方法。
【請求項２７】
ＧＡＶＥ１９信号化活性又は伝達を調節することができるＧＡＶＥ１９のアゴニスト、アンタゴニスト、又はインバースアゴニストから構成される治療用組成物。
【請求項２８】
ＧＡＶＥ１９信号化活性又は伝達を調節することができるＧＡＶＥ１９のアゴニスト、アンタゴニスト、又はインバースアゴニストを含む治療用組成物を治療を必要とする患者に投与することから成る疾病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来未知のＧタンパク質共役型受容体であるＧＡＶＥ１９をコードする新規な核酸分子、当該核酸分子及びＧＡＶＥ１９の使用に一般的に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内信号伝達に関与する内在性膜タンパク質の大ファミリーである。ＧＰＣＲは、神経伝達物質、ホルモン、発臭剤及び光を含む種々の細胞外信号に応答し、変換し、そして細胞内における二次メッセンジャー応答を開始する。多くの治療薬はＧＰＣＲを標的としているが、その理由はこれらの受容体が、炎症、血管拡張、心拍数、気管支拡張、内分泌及び蠕動を含む多種多様な生理的応答を仲介しているからである。
【０００３】
ＧＰＣＲは、細胞外ドメイン、７回膜貫通型ドメイン及び細胞内ドメインにより特徴付けられている。
リガンド結合及びＧタンパク質との相互作用のような当該受容体が演じる作用の幾つかは、あるアミノ酸が決定的な位置に存在しているということと関係している。例えば、種々の研究により、ＧＰＣＲにおけるアミノ酸配列の相違が自然リガンド或いは低分子のアゴニスト又はアンタゴニストのいずれかに対する親和力の相違を引き起こすことが明らかとなっている。言い換えれば、当該配列における微少の相違が結合親和力及び活性の相違を引き起こす（例えば、Meng et al., J. Biol. Chem. (1996) 271 (50): 32016-20; Burd et al., J. Bio. Chem. (1998) 273 (51): 34488-95; 及びHurley et al., J. Neurochem (1999) 72 (1): 413-21参照）。殊に、幾つかの研究により第３細胞内ドメインにおけるアミノ酸配列の相違が結果として活性の相違となることが明らかにされている。Myburgh等によりゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）放出ホルモン受容体の細胞内ループ３のアラニン２６１がＧタンパク質共役及び受容体インターナリゼーション（受容体依存性エンドサイトーシス）にとって極めて重要であることが見い出されている（Biochem J (1998) 331 (Part3): 893-6）。Wonerow等はチロトロピン（甲状腺刺激ホルモン）受容体について研究し、細胞内第３ループの欠損が構造的受容体活性に影響することを実証している（J Bio Chem (1998) 273 (14): 7900-5)。
【０００４】
一般的に、内因性リガンドが受容体に結合することにより、受容体の細胞内ドメインの立体配座に変化が起こり、細胞内ドメインと細胞内物質（例えばＧタンパク質）との間の共役を可能とする結果となる。Ｇタンパク質には、Ｇq，Ｇs，Ｇi，Ｇz及びＧoのような
幾つかのものが存在する（例えば、Dessauer et al., Clin Sci (Colch) (1996) 91 (5):
527-37参照）。
ＩＣ−３ループは当該受容体のカルボキシ末端と同様にＧタンパク質と相互作用をする(Pauwels et al., Mol Neurobiol (1998) 17 (1-3): 109-135及びWonerow et. al., 上述)。ある種のＧＰＣＲはＧタンパク質との関係が混然としている。即ち一つのＧＰＣＲが一つ以上のＧタンパク質と相互作用をすることができる（例えば、Kenakin, Life Science (1988) 43: 1095参照）。
【０００５】
リガンドにより活性化されたＧＰＣＲがＧタンパク質と共役することにより信号のカスケード経路が始まる（「信号伝達（信号増幅）」と呼ばれる）。このような信号伝達が最終的に細胞活性又は細胞阻害を生ずる結果となる。
【０００６】
ＧＰＣＲは「不活性」及び「活性」という二つの異なる立体配座間で平衡を保って細胞膜の中に存在している。不活性状態の受容体は生物応答を引き起こす細胞内信号伝達経路
に連結することはできない（例外は、伝達細胞における受容体の過剰発現中にみられる。例えば、www.Creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.参照）。
【０００７】
立体配座を活性状態に調節することにより伝達経路（Ｇタンパク質経由）に連結し、そして生物応答を生ずることが可能となる。アゴニストが結合することにより活性な立体配座となることが最もありそうなことである。しかしながら、しばしば、いかなるアゴニストが存在していないにも拘らず、既に可成りの程度の応答があり、そのような受容体は構成的活性と呼ばれている（即ち、既に活性な立体配座にあるか、リガンド非依存性であるか、又は自律的活性状態である）。このような系にアゴニストを添加した場合、応答の増大が通常は観察される。しかし、古典的アンタゴニストを添加した場合はそのような分子による結合は何ら影響を生じない。他方、ある種のアンタゴニストは受容体の構成的活性の阻害をもたらすことより、後者に属する薬物は、厳密な解釈によればアンタゴニストではなく、負の固有の活性を有するアゴニストであることを示唆している。これらの薬物はインバースアゴニスト（反作用薬）と呼ばれている（www.Creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.）。
【０００８】
受容体に関する伝統的研究は、アンタゴニスト及び他の受容体エフェクター分子（効果分子）の同定を行うという発見の前に先ず内在性リガンドが同定されるべきであるという前提の下に着手されている。例えアンタゴニストが先に発見されるようなことがあるとしても、教義上の応答は内在性リガンドを同定することである（ＷＯ ００／２２１３１）
。しかしながら、活性状態が検定スクリーニング目的にとって最も役立つことから、構成的活性を有する受容体、殊にＧＰＣＲを得ることは、内在性リガンドについての情報のない状況下においては、アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト及びアンタゴニストの容易な単離を可能とするものである。更に、受容体活性の障害に由来する病気においては、構成的活性の阻害を生じるような、或いはより特異的には効果的に活性化された受容体の濃度を減少させるような薬剤は、自律的活性状態における受容体を用いた検定により、更に容易に発見され得るものと思われる。例えば、病気の治療のために患者にトランスフェクトされた受容体の場合、そのような受容体の活性は、当該検定により発見されたインバースアゴニストにより微調整され得ることが考えられる。
【０００９】
喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）及び関節リウマチ（ＲＡ）のような病気は、一般にヘルパーＴ細胞、単球マクロファージ及び好酸球の関与する炎症性病因によるものと考えられている。今日のステロイド剤による抗炎症治療は喘息には効果的ではあるが、しかし、代謝的及び内分泌的副作用を伴うものである。同様のことは、肺又は鼻腔粘膜を通して吸収される吸入製剤の場合でもおそらく事実であろう。ＲＡ又はＣＯＰＤに対する満足な経口治療は目下のところ存在しない。
【００１０】
好酸球はアレルギー及び喘息における気道機能障害の大部分を仲介する。インターロイキン５（ＩＬ−５）は好酸球の成長及び活性化するサイトカインである。
気道過剰反応性をもたらす組織好酸球増加症及び好酸球仲介組織障害にとって、ＩＬ−５は不可欠であるという研究がある（Chang et al., J Allergy Clin Immunol (1996) 98
(5 pt 1): 922-931，及びDuez et al., Am J Respir Crit Care Med (2000) 161 (1): 200-206）。ＩＬ−５はアトピー性喘息において、アレルゲン(例えば、家屋ほこりのダニ
抗原)にさらされることによりヘルパーＴ細胞−２（Ｔｈ２）によって産生される。
【００１１】
ＲＡは冒された滑膜における活性化マクロファージの蓄積の結果であると信じられている。インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、種々の炎症促進性の特性を有するヘルパーＴ細胞−１（Ｔｈ１）由来のサイトカインである。それは最も有力なマクロファージ活性化サイトカインであり、そして、樹状突起細胞様の表現型に寄与するＭＨＣクラスII遺伝子転写を誘導する。
【００１２】
リポポリサッカライド（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の細胞壁の構成成分であり、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）放出を含む炎症性応答を引き出すものである。
ＲＡにおける静脈内抗−ＴＮＦα治療の効能は臨床的に実証されている。ＣＯＰＤも、また肺におけるマクロファージ蓄積の結果であると思われており、マクロファージは好中球化学誘引物質を産生する（例えば、ＩＬ−８：de Boer et al., J Pathol (2000) 190 (5): 619-626）。マクロファージと好中球は共にカテプシンを放出し、肺胞壁崩壊の原因となる。肺上皮は炎症性細胞の化学誘引物質及び他の炎症性細胞活性化物質の重要な材料となり得るものであると信じられている（例えば、Thomas et al., J Virol (2000) 74 (18): 8425-8433）; Lamkhioued et al., Am J Respir Crit Care Med (2000) 162 (2 Pt. 1): 723-732; 及びSekiya et al., J Immunol (2000) 165 (4): 2205-2213参照)。
【００１３】
ＧＰＣＲが病気に関与し、ＧＰＣＲの活性を調節することによって病気を治療する可能性があるならば、従来未知のＧＰＣＲを同定し特性を明らかにすることは、ＧＰＣＲ活性が関与する病気の状態に対する治療のための新しい組成物及び方法の開発を提供することができる。それ故、必要とされるものは、従来未知のＧＰＣＲをコードする新規でかつ有用な核酸分子の発見、単離及び特性の解明である。
【００１４】
更に必要とされるものは、ＧＰＣＲに対して潜在的なアゴニストやアンタゴニストとして作用することができる化合物を同定するために、従来未知のＧＰＣＲを利用する検定法である。これらの化合物はin vivoにおけるＧＰＣＲ活性を調節するための治療薬剤とし
て直ちに応用できるものであり、それ故、ＧＰＣＲ活性に関する多くの病気の治療に使用することができる。
【００１５】
ここに引用するいかなる文献も、即刻応用できる「先行文献」として可能なものであるとして採用したことを意味するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は新規な構成的活性なネズミのＧＰＣＲ、ＧＡＶＥ１９、を同定し、及び発現の特性を解明し、並びに関連する病気の同定及び治療のための発見に応用される組成物及び方法を提供するものである。
【００１７】
このように広範囲には、本発明は図１（配列番号１）のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子、そのバリアント（変異体）、そのフラグメント（断片）、又はその類似物若しくは誘導体に及ぶものである。本発明のバリアントとしては、対立遺伝子バリアント、縮重遺伝子バリアント又は配列における縮重的変化の結果としての対立遺伝子バリアントがある。
【００１８】
更に本発明は配列番号１の単離された核酸分子、又はそのバリアントとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド可能な単離された核酸分子にも及ぶものである。尚その上に、本発明は配列番号１のＤＮＡ配列に相補的な核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド可能な単離された核酸分子にも及ぶものである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は後述する。
更に本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含んでいる単離された核酸分子にも及ぶものである。
【００１９】
場合によっては、上述した本発明の単離された核酸分子は検出可能に標識されたものであってもよい。検出可能な標識としてここで用いられる例としては、酵素、放射性同位元素、又は蛍光を発光する化学物質が含まれるが、しかしながらこれらに限定されない。検
出可能な標識の特別な例は後述する。
【００２０】
ある種のポリペプチドもまた本発明に包含される。例えば、本発明は、配列番号２、その保存的バリアント、又はその類似体若しくは誘導体のアミノ酸配列を含む精製したポリペプチドにも及ぶものである。場合によっては本発明のポリペプチドは検出可能に標識されていてもよい。
【００２１】
加えて、本発明は、本発明に係るポリペプチドが抗体産生に使用された免疫原である場合の抗体にも及ぶものである。これらの抗体はモノクローナルであっても又はポリクローナルであってもよい。更に抗体は「キメラ」であってもよく、例えば、異なる種における本発明に係る精製したポリペプチドに対して生じた抗体のタンパク質ドメインを含んでいてもよい。勿論、本発明に係る抗体は検出可能に標識されていてもよい。ここに用いられている検出可能な標識の特別な例は後述する。
【００２２】
本発明は更に配列番号１、そのバリアント、その類似体又は誘導体、或いは発現制御因子が作動可能に会合しているフラグメント（断片）のＤＮＡ配列を含む核酸分子を含んでいる発現ベクターにも及ぶものである。尚その上、本発明に係る発現ベクターは、発現制御因子が作動可能に会合している配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド可能な単離された核酸分子を含んでいてもよく、或いは、配列番号１のＤＮＡ配列を含む単離された核酸分子に相補的であるハイブリダイゼーションプローブ（ここで、ハイブリダイゼーションプローブは発現制御因子と作動可能に会合している）とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド可能である。ここに用いられている発現制御因子の特別な例はプロモーターである。本発明に利用可能な特別なプロモーターの例としては、ｈＣＭＶの初期プロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、アデノウイルスの初期プロモーター、ワクシニアの初期プロモーター、ポリオーマの初期プロモーター、ＳＶ４０の後期プロモーター、アデノウイルスの後期プロモーター、ワクシニアの後期プロモーター、ポリオーマの後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、λファージの主要なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、酸性ホスファターゼプロモーター、又は酵母α接合因子のプロモーターを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
本発明に係る発現ベクターを用いて、宿主細胞にトランスフェクト又はトランスフォームすることができ、そして配列番号２のアミノ酸配列又はそのバリアントを含むポリペプチドを産生することができる。宿主細胞は原核細胞又は真核細胞のいずれでもよい。ここで用いられる単細胞の特別な例としては、大腸菌（E．coli）シュードモナス（Pseudomonas）、バシラス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、酵母（yeast）、ＣＨＯ、Ｒ１.１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０及びＳｆ９細胞等が含まれる。
【００２４】
更に本発明は配列番号２のアミノ酸配列、そのバリアント、又はそのフラグメントを含む精製したポリペプチドを産生する方法にも及ぶものである。そのような方法は精製したポリペプチドの発現に適した条件下で、本発明に係る発現ベクターを用いてトランスフォーム又はトランスフェクトした宿主細胞を培養すること、及び精製したポリペプチドを単細胞宿主、宿主細胞の培地、又はその双方から採集することから構成されている。
【００２５】
本発明はまたＧＡＶＥ１９の活性を調節することができる化合物を同定する検定にも及ぶものである。そのような化合物は、ＧＡＶＥ１９のアゴニスト、アンタゴニスト又はインバースアゴニストであり得る。それ故に、本発明は、内在性リガンドの存在下でＧＡＶ
Ｅ１９を発現する細胞に潜在的アゴニストを接触させること、及び潜在的アゴニストの存在下のＧＡＶＥ１９の信号化活性が潜在的アゴニストのない条件下のＧＡＶＥ１９の信号化活性に比較して増大するか否かを測定することから成るＧＡＶＥ１９のアゴニストを同定する方法にも及ぶものである。
【００２６】
同様に、本発明はＧＡＶＥ１９のインバースアゴニストを同定する方法にも及ぶものである。その方法は潜在的インバースアゴニストをＧＡＶＥ１９を発現している細胞に接触させること、及び潜在的インバースアゴニスト及び内在性リガンド又はアゴニストの存在下のＧＡＶＥ１９の信号化活性が、内在性リガンド又はアゴニストは存在しているが潜在的インバースアゴニストのない条件下のＧＡＶＥ１９の信号化活性に比較して減少するか否かを測定することから成るものである。
【００２７】
勿論、本発明はＧＡＶＥ１９のアンタゴニストを同定する方法にも及ぶものである。その方法は潜在的アンタゴニストをＧＡＶＥ１９を発現している細胞に接触させること、及び当該潜在的アンタゴニスト存在下のＧＡＶＥ１９の信号化活性が、内在性リガンド又はアゴニストの存在下におけるＧＡＶＥ１９の活性に比較して減少するか否かを測定する工程から成るものである。
【００２８】
それ故、本発明の一局面はＧＡＶＥ１９タンパク質、そのフラグメント又はそのバリアントをコードする単離された核酸配列を提供するものである。
本発明の一局面は、また配列番号１のＤＮＡ配列及びストリンジェントな条件下で配列番号１にハイブリッドすることが可能なＤＮＡ分子を含む核酸分子のバリアントを提供するものである。
【００２９】
更に本発明の一局面は、ＧＡＶＥ１９のアミノ酸配列、そのバリアント、そのフラグメント又はその類似体若しくは誘導体を提供するものである。
更に本発明の一局面は、ＧＡＶＥ１９、そのバリアント、そのフラグメント又はその類似体若しくは誘導体をコードするＤＮＡ配列（そのＤＮＡ配列は発現制御因子に作動可能に会合している）を含んでいる発現ベクターを提供するものである。
尚更に、本発明は免疫原としてＧＡＶＥ１９、そのバリアント、その類似体若しくは誘導体、又はそのフラグメントを有している抗体を提供するものである。
【００３０】
更にその上、本発明はＧＡＶＥ１９タンパク質を調節することができる化合物を同定する方法をも含むものである。そのような調節物質はＧＡＶＥ１９のアンタゴニスト、ＧＡＶＥ１９のアゴニスト又はＧＡＶＥ１９のインバースアゴニストであるかも知れない。尚、その上、マウスにおいてＧＡＶＥ１９の発現又は活性を調節する化合物は、例えば種々の炎症性の病気、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及び関節リウマチのような多くの病気又は障害を治療するのに利用されるかも知れない。
【００３１】
本発明のこれらの、また他の局面は、添付の図面及び詳細な説明を参照することによってより良く理解することができるものと思われる。
【００３２】
〔詳細な説明〕
上述の通り、本発明はここにおいてＧＡＶＥ１９と命名された従来未知のＧタンパク質共役型受容体をコードする従来未知のマウス核酸分子についての驚異的で意外な発見に関するものである。特に、意外なことはＧＡＶＥ１９は免疫組織又は腎臓、肝臓及び小腸のような器官において発現されているという事実が明らかとなったことである。それ故、ＧＡＶＥ１９は、喘息、関節リウマチ、ＣＯＰＤ等の種々の炎症性病気の治療のための医薬品組成物の開発の対象として直ちに役立つものである。
【００３３】
本発明を記載するために詳細な説明及び特許請求の範囲を通して使用されている種々の用語及び熟語は以下の通りである。
ここで使用されている用語「モジュレーター（調節因子）」とは、ＧＡＶＥ１９の活性を調節するもの（例えば、リガンド及び候補化合物、但しこれらに限定されない）をいう。本発明のモジュレーター（調節因子）としては、ＧＡＶＥ１９のアゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、又はインバースアゴニストが考えられる。
【００３４】
ここで使用されている用語「アゴニスト」とは、受容体に結合したときに細胞内応答を活性化するもの、又は膜に対するＧＴＰ結合を増大させるもの（例えばリガンド及び候補化合物、但しこれらに限定されない）をいう。
【００３５】
ここに使用されている用語「部分アゴニスト」とは、受容体に結合したときに細胞内応答を活性化するが、その程度／範囲がアゴニストに比べて小さいもの、又は膜に対するＧＴＰ結合を増大させるが、その程度／範囲がアゴニストに比べて小さいもの（例えば、リガンド及び候補化合物、但しこれらに限定されない）をいう。
【００３６】
ここに使用されている用語「アンタゴニスト」とは、アゴニストが結合する部位と同じ部位の受容体に競合的に結合するもの（例えば、リガンド及び候補化合物、但しこれらに限定されない）をいう。しかしながら、アンタゴニストは受容体の活性型により開始される細胞内応答を活性化せず、それ故、アゴニスト又は部分アゴニストによる細胞内応答を阻害することができる。関連した局面において、アンタゴニストはアゴニスト又は部分アゴニストの存在しないときのベースライン細胞内応答を低下させない。
【００３７】
ここに使用されている用語「インバースアゴニスト」とは、構造的に活性な受容体に結合し、ベースライン細胞内応答を阻害するもの（例えば、リガンド及び候補化合物、但しこれらに限定されない）をいう。ベースライン応答は、アゴニスト又は部分アゴニストが存在しない或いは膜に対するＧＴＰ結合が少ないときに観察されるもので、受容体の活性型が正常の活性基準値以下の場合に開始される。
【００３８】
ここに使用されている用語「候補化合物」とは、スクリーニング技術に適用可能なもの（例えば、化学的合成化合物、但しこれに限定されない）をいう。或る実施例においては、この用語はＧＡＶＥ１９のアゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト又はアンタゴニストから成る群から選択された化合物として公知のものは含まない。これらの化合物は伝統的な薬物発見方法によって同定されたものであり、その方法には、受容体に特異的な内因性リガンドの同定、及び／又は受容体に対する候補化合物のスクリーニングが含まれるが、そのようなスクリーニングは効果を評価するためには競合的検定が必要とされる。
【００３９】
ここに使用されているように、用語「構造的に活性化された受容体」又は「自律的に活性な受容体」は、ここでは相互に代替可能なものとして使用されており、リガンドの存在しない条件下で活性化の対象となる受容体を意味する。そのような構造的に活性化された受容体は内因性（例えばＧＡＶＥ１９）、又は非内因性、即ちＧＰＣＲの場合、組換え技術により野生型ＧＰＣＲの突然変異による構造的型を産生するように修飾することができる（例えばEP 1071701；WO 00／22129；WO 00／22131；及びU.S. Pat. Nos. 6,150,393及び6,140,509参照。ここに文献としてそのままの全部が含まれている）。
【００４０】
ここに使用されているように、用語「構成的受容体活性化」とは、内因性リガンド又はその化学的均等物との受容体結合以外の方法により、活性状態における受容体の安定化を意味する。
【００４１】
ここに使用されているように、用語「リガンド」とは、他の分子に結合するものをいい、ホルモン又は神経伝達物質を含むが、これらに限定されるものではなく、そして更に受容体に対し立体的選択性をもって結合するものをいう。
【００４２】
ここに使用されているように、本発明のタンパク質又は核酸について用いられる用語「ファミリー」とは、外観上共通の構成ドメインを有し、かつここで定義されているように十分なアミノ酸又はヌクレオチド配列の同一性を有している二つ又はそれ以上のタンパク質又は核酸分子を意味する。そのようなファミリー構成物は自然に発生し、そして同種又は異種の双方から由来するものである。例えば、一つのファミリーは、ヒト起源の第一タンパク質及びそのタンパク質のマウス起源の相同体、同様に第二タンパク質としてヒト起源の別のタンパク質及びマウス起源のその第二タンパク質の相同体とを含むことができる。また一つのファミリーの構成物は共通の作用特性を有することもある。
【００４３】
ここで使用されているように、用語「ＧＡＶＥ１９活性」、「ＧＡＶＥ１９の生物活性」及び「ＧＡＶＥ１９の作用活性」とは、標準的技術に基づいてin vivo又はin vitroで測定されたＧＡＶＥ１９応答細胞におけるＧＡＶＥ１９タンパク質、ポリペプチド又は核酸分子によって影響を受けた活性を意味する。ＧＡＶＥ１９活性は、第二タンパク質の酵素活性に会合したような直接的活性或いは、ＧＡＶＥ１９タンパク質と第二タンパク質との相互作用により仲介される細胞信号化活性のような間接的活性であってもよい。特別な実施例において、ＧＡＶＥ１９活性は次の活性を少なくとも一つ又はそれ以上含むものであるが、但し、それらに限定されない：（ｉ）ＧＡＶＥ１９信号化経路においてタンパク質と相互作用する能力；（ii）ＧＡＶＥ１９リガンドと相互作用する能力；及び（iii）細胞内標的タンパク質と相互作用する能力。
【００４４】
更に、本発明に従い、技術水準における通常の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術を採用することができる。そのような技術は文献において完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (以下「Sambrook et al., 1989」という); DNA Cloning; A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B.Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausbel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。
それ故、ここに表わされている限り、以下の用語は下記に呈示する定義を有するものである。
【００４５】
「ベクター」とは、例えばプラスミド、ファージ又はコスミドのようなレプリコンをいい、他のＤＮＡセグメントが連結することができ、その結果として連結されたセグメントの複製を生じさせることができる。ここで、「レプリコン」とは、in vivoにおけるＤＮ
Ａ複製の自律的単位、即ち、それ自身の制御下において複製可能な作用を有するあらゆる遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）をいう。ベクターの特殊な実施例は後述する。
【００４６】
「カセット」とは、特異的制限部位においてベクターに挿入され得るＤＮＡセグメントを意味する。このＤＮＡセグメントは、目的のポリペプチドをコードしており、カセットと制限酵素認識部位は、転写及び翻訳に関して正しい読み取りフレームになるようにカセットが挿入されることが保証できるように設計されている。
【００４７】
外来性又は異種ＤＮＡが細胞内部に取り入れられたときに、細胞は「トランスフェクト」されたという。そしてトランスフェクトされたＤＮＡが表現型変化に影響を及ぼすとき、細胞は外因性又は異種ＤＮＡによって「トランスフォーム」されたという。好ましくは、トランスフォームするＤＮＡは染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合によって連結し）細胞のゲノムに仕上げられるべきである。
【００４８】
「異種」ＤＮＡとは、細胞の中に自然の状態では存在していない、又は細胞の染色体中に存在していないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡには細胞にとっては外来の遺伝子を含むものである。
【００４９】
「相同的組換え」とは、ベクターの外来ＤＮＡ配列を染色体へ挿入することをいう。特に、ベクターは相同的組換えのために染色体の特異部位を標的とする。特異的相同的組換えのためには、ベクターは相補的結合と染色体へのベクターの取込みのために、染色体配列に対して相同関係のある十分に長い領域を含んでいる必要がある。相同関係のある領域が長ければ長い程、また配列の相同性の程度が大きければ大きい程、相同的組換えの効率は増大する。
【００５０】
本発明に係る単離された核酸分子
一局面において、本発明は図１（配列番号１）のＤＮＡ配列、そのバリアント、そのフラグメント又はその類似体若しくは誘導体を含む単離された核酸分子に及ぶものである。
【００５１】
「核酸分子」とは、リボヌクレオチド（アデノシン、グアノシン、ウリジン又はシチジン；「ＲＮＡ分子」）又はデオキシリボヌクレオチド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン又はデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルのポリマー型、或いはそれらのホスホロチオエート及びチオエステルのようなリン酸エステル類似体をいい、一本鎖型又は二本鎖ヘリックスのどちらであってもよい。また二本鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、及びＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスであってもよい。核酸分子、特にＤＮＡ又はＲＮＡ分子の用語は、これら分子の一次及び二次構造のみをいい、そしてそれはいかなる特別な三次構造に限定するものではない。このように、この用語は二本鎖ＤＮＡ、なかでも線状又は環状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、プラスミド及び染色体を含むものである。特別な二本鎖ＤＮＡ分子構造について論じると、配列はここでは転写されていないＤＮＡ鎖に沿って５′から３′方向への配列（即ち、ｍＲＮＡに対して相同な配列を有する鎖）としてのみ与えられる通常の取決めに従って記載されている。「組換えＤＮＡ分子」とは、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子を意味する。
【００５２】
「単離された」核酸分子とは、核酸の天然材料の中に存在している他の核酸分子から分離されたものをいう。特に「単離された」核酸とは、核酸起源の器官のゲノムＤＮＡにおいてＧＡＶＥ１９をコードする核酸の両端に自然の状態で存在する配列（即ち、核酸の５′及び３′末端に位置する配列）を含まない。いくつかの実施例においては、単離されたＧＡＶＥ１９核酸分子は核酸起源の細胞のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子の両端に自然状態で存在するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ又は０.１ｋｂよりも小さいものを含むことができる。更に、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は組換え技術で作成された場合は他の細胞成分又は培地を実質的に含んでいないこと、或いは化学合成で作成された場合は化学前駆体又は他の化合物を実質的に含んでいないことを意味する。
【００５３】
本発明に係る核酸分子、例えば配列番号１のヌクレオチド配列、又はそのヌクレオチド配列のあらゆるフラグメント若しくは相補体、又はその類似体若しくは誘導体は、標準的分子生物学技術及びここに提供された配列情報を用いて単離することができる。配列番号
１の核酸配列の全部又は部分をハイブリッドプローブとして用いることにより、ＧＡＶＥ１９核酸分子は標準的ハイブリッド及びクローニング技術（例えば、Sambrook等の記載のような）により単離することができる。
【００５４】
本発明の核酸分子は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを、そして適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、標準的ＰＣＲ増幅技術に従って、増幅することができる。そのようなプライマーは配列番号１から得られる情報及び通常の実験技術を用いて容易に作成することができる。更にＧＡＶＥ１９ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは標準的合成技術、例えば自動化ＤＮＡシンテサイザーを用いて調製することもできる。
【００５５】
ＧＡＶＥ１９ ＤＮＡとハイブリッド可能な単離された核酸分子
本発明は更に、ＧＡＶＥ１９ ＤＮＡにハイブリッド可能な、ストリンジェントなハイ
ブリッド条件下でＧＡＶＥ１９ ＤＮＡに対して相補的なハイブリッドプローブにハイブ
リッド可能な、又はストリンジェントなハイブリッド条件下で双方にハイブリッド可能な単離された核酸分子に及ぶものである。特に本発明は、配列番号１のＤＮＡ配列を含んでいる核酸分子とストリンジェントなハイブリッド条件下でハイブリッド可能な単離された核酸分子、又は配列番号１のＤＮＡ配列を含んでいる単離された核酸分子に対して相補的であるプローブにも及ぶものである。
【００５６】
核酸分子の一本鎖型を適当な温度及び溶液イオン強度（後述のSambrook等参照）条件下で他の核酸分子とアニールさせることができるときに、核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡのような他の核酸分子と「ハイブリッド可能」という。温度及びイオン強度の条件がハイブリッドの「ストリンジェンシー」を決定する。
【００５７】
相同な核酸の一次スクリーニングとしては、Ｔm ５５℃に相当する低いストリンジェンシーのハイブリッド条件を用いることができる（例えば、５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、
０.２５％ミルク、ホルムアミドは無添加；又は３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ）。高めのＴmに相当する中程度のストリンジェンシーのハイブリッド条件としては、例えば４０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＳＣを用いることができる。最も高いＴmに相当する高いストリンジェンシーのハイブリッド条件としては、例えば５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＳＣを用いることができる。
【００５８】
ハイブリッドには二つの核酸が相補的配列を含んでいることが要求されるが、ハイブリッドのストリンジェンシーによっては、塩基間でのミスマッチも起こり得る。核酸のハイブリッドにとって適当なストリンジェンシーは核酸の長さ及び相補性の度合いに依存して、変更可能であることは、技術常識としてよく知られている。二つのヌクレオチド配列間の類似性又は相同性の程度が高ければ高い程、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴm値は高いものとなる。核酸の相対的安定度（より高いＴmに対応する）は、次の順で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さとして１００ヌクレオチド以上のハイブリッドの場合、Ｔmを計算するための平衡定数は導き出されている（後述のSambrook等、９.５０−０.５１参照）。より短い核酸即ちオリゴヌクレオチドを用いたハイブリッドの場合は、ミスマッチの位置はより重要となり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定することとなる（後述のSambrook等、１１.７−１１.８参照）。ハイブリッド可能な核酸分子の最短長は、少なくとも約２０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチドである。本発明の特別な実施例において、ハイブリッド可能な核酸分子は長さとして少なくとも３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００、６００、６５０、７００、８００、９００、１０００又は１１００ヌクレオチドであり、そして配列番号１、その相補体又はそのフラグメントのヌクレオチド配列、好ましくはコード配列を含んでいる核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリッドすることである。
【００５９】
ここで使用されているように、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリッドする」とは、ヌクレオチド配列が少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、そして好ましくは７５％、或いはより相補的に互いに典型的にハイブリッドを維持するようなハイブリッド及び洗浄の条件を記述していることを意味する。このようなストリンジェンシーの条件は、技術水準として既知のものであり、「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見い出すことができる。ストリンジェ
ントなハイブリッド条件の好ましい、但し限定的ではない例としては、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリッドし、０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中５０〜６５℃で１回又はそれ以上洗浄することが挙げられる。好ましくは、配列番号１の配列にストリンジェントな条件下でハイブリッドする本発明の単離された核酸分子又はその相補体は自然発生の核酸分子に対応するを挙げることができる。ここに使用されているように「自然発生」の核酸分子とは、自然界で発生したヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ分子を意味する（例えば、天然タンパク質をコードするもの）。当業者であれば、当該条件は配列特異的変動性（例えば、長さ、Ｇ−Ｃ含有率等）の観点から変更することができることを理解するであろう。
【００６０】
本発明は、類似特性を有するＧＡＶＥ１９類縁分子の診断薬として使用され得るＧＡＶＥ１９の核酸フラグメントを包含することを意図する。この診断用フラグメントは両端の配列を含むＧＡＶＥ１９遺伝子のいかなる部分に由来するものであってもよい。このフラグメントは既知の方法を実践するライブラリープローブとして使用することができる。
【００６１】
更に本発明の核酸分子は、ＧＡＶＥ１９をコードする核酸配列の一部分に過ぎないもの、例えば、プローブ又はプライマーとして使用することができるフラグメント、ＧＡＶＥ１９の生物学的に活性な一部分をコードするフラグメントをも含むものである。例えば、そのようなフラグメントは配列番号２の約１から約１４までのアミノ酸残基をコードする領域を含むことができるが、但しこれらに限定されない。
【００６２】
ヒトＧＡＶＥ１９遺伝子のクローニングにより決定されたヌクレオチド配列により、他の細胞型、例えば他の組織のＧＡＶＥ１９相同体及び他の動物由来のＧＡＶＥ１９相同体の同定及び／又はクローニングのためのプローブ及びプライマーを作成することができる。このプローブ／プライマーは十分に精製したオリゴヌクレオチドを典型的に含んでいる。このオリゴヌクレオチドは配列番号１のセンス又はアンチセンス配列、又は自然発生の配列番号１の突然変異体の少なくとも約１２、好ましくは２５、より好ましくは５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０又は４００の連続したヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリッドするヌクレオチド配列の領域を典型的に含んでいる。ＧＡＶＥ１９ヌクレオチド配列に基づくプローブは、類似の又は同一のタンパク質をコードする転写産物又はゲノム配列を検定するのに使用することができる。
【００６３】
ここで使用されているように、本発明に係る単離された核酸分子の「フラグメント」又は「一部分」という用語は、少なくとも１２、好ましくは約２５、より好ましくは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０又は４００の連続したヌクレオチドを含んでいることを意味する。それ故、本発明に係る単離された核酸分子の「フラグメント」が単に１又は２個のヌクレオチドであるということはない。
【００６４】
同様に、本発明に係るポリペプチドの「フラグメント」又は「一部分」は、少なくとも９個の連続したアミノ酸残基を含んでいる。本発明に係るポリペプチドフラグメントの特
別な実施例は、ＧＡＶＥ１９抗体、又はそのフラグメントに結合するエピトープを含んでいる。
【００６５】
「ＧＡＶＥ１９の生物学的に活性な一部分」をコードする核酸フラグメントは、ＧＡＶＥ１９生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列番号１の一部分を単離すること、ＧＡＶＥ１９タンパク質のコードされた一部分を発現すること（例えばin vitroでの組換え発現）、及びＧＡＶＥ１９のコードされた一部分の活性を測定することにより調製することができる。
本発明は更に、遺伝暗号の縮重により配列番号１のヌクレオチド配列とは相違し、そしてそれ故に配列番号１に示したヌクレオチド配列によってコードされたと同様のＧＡＶＥ１９タンパク質をコードする核酸分子を含むものである。
【００６６】
相同核酸分子
本発明は更にＧＡＶＥ１９ ＤＮＡ分子に相同な単離された核酸分子、例えば配列番号
１のＤＮＡ配列を有する単離された核酸分子に相同なものにも及ぶ。長さが明示されたＤＮＡ配列のヌクレオチドの中、少なくとも約５０％（好ましくは少なくとも約７５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％又は９５％）が対をなすとき、２本のＤＮＡ配列は「実質的に相同」又は「実質的に類似」である。
【００６７】
実質的に相同である配列は、デフォルトパラメーターを用いた配列データバンク、又は例えば特殊なシステムのために定義されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において使用可能な標準的ソフトウェアを用いて配列を比較することによって同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の決定については技術水準の範囲内である。例えば後述するManiatis 等; 後述するＤＮＡ Cloning Vols. I & II; 後述するNucleic Acid Hybridizationを参照。
更に、他の種（ＧＡＶＥ１９相同体）由来のＧＡＶＥ１９タンパク質を、ヒトＧＡＶＥ１９とは異なるヌクレオチド配列を用いてコードする核酸分子も、本発明の請求範囲に属することを意図している。
【００６８】
本発明に係る単離された核酸分子のバリアント
本発明は、また配列番号１のＤＮＡ配列を含んでいる単離された核酸分子のバリアントにも及ぶ。そのようなバリアントとは、縮重したもの、対立遺伝子、又はそれらの組合せである。
【００６９】
本発明に係るＧＡＶＥ１９ ｃＤＮＡの自然対立遺伝子バリアント及び相同体に対応す
る核酸分子は、ストリンジェントなハイブリッド条件下で標準的ハイブリッド技術に従って、ハイブリダイゼーションプローブとしてマウスのｃＤＮＡ又はその一部分を用いて、ここに開示されているマウスのＧＡＶＥ１９核酸との同一性に基づいて単離することができる。
【００７０】
ここで使用されている用語「相当する」とは、類似性又は相同性を測定した分子から正確な位置が同一又は相違しているかに関わらず、類似する又は相同な配列をいうものとする。このように、用語「相当する」とは、配列の類似性をいうものであって、アミノ酸残基又はヌクレオチド塩基の数についていうものではない。
【００７１】
更に、遺伝暗号におけるコドンの縮重する特性により、本発明に係るＧＡＶＥ１９タンパク質は幾つもの単離された核酸分子によってコードされる。「縮重特性」とは、遺伝暗号に応じてある特定のアミノ酸を特定する異なった３文字コドンの使用を意味する。以下のコドンがそれぞれの特定アミノ酸のコードに相互変換可能的に使用されることは技術水準として良く知られている。
【００７２】
フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）：ＵＵＵ又はＵＵＣ
ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）：ＵＵＡ又はＵＵＧ又はＣＵＵ又はＣＵＣ又はＣＵＡ又はＣＵＧ
イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）：ＡＵＵ又はＡＵＣ又はＡＵＡ
メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）：ＡＵＧ
バリン（Ｖａｌ又はＶ）：ＧＵＵ又はＧＵＣ又はＧＵＡ又はＧＵＧ
セリン（Ｓｅｒ又はＳ）：ＵＣＵ又はＵＣＣ又はＵＣＡ又はＵＣＧ又はＡＧＵ又はＡＧＣ
プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）：ＣＣＵ又はＣＣＣ又はＣＣＡ又はＣＣＧ
トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）：ＡＣＵ又はＡＣＣ又はＡＣＡ又はＡＣＧ
アラニン（Ａｌａ又はＡ）：ＧＣＵ又はＧＣＧ又はＧＣＡ又はＧＣＧ
チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）：ＵＡＵ又はＵＡＣ
ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）：ＣＡＵ又はＣＡＣ
グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）：ＣＡＡ又はＣＡＧ
アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）：ＡＡＵ又はＡＡＣ
リシン（Ｌｙｓ又はＫ）：ＡＡＡ又はＡＡＧ
アスパラキン酸（Ａｓｐ又はＤ）：ＧＡＵ又はＧＡＣ
グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）：ＧＡＡ又はＧＡＧ
システイン（Ｃｙｓ又はＣ）：ＵＧＵ又はＵＧＣ
アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）：ＣＧＵ又はＣＧＣ又はＣＧＡ又はＣＧＧ又はＡＧＡ又はＡＧＧ
グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）：ＧＧＵ又はＧＧＣ又はＧＧＡ又はＧＧＧ
トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）：ＵＧＧ
【００７３】
終止コドン  ＵＡＡ（オーカー）、又はＵＡＧ（アンバー）又はＵＧＡ（オパール）
上記に特定されているコドンはＲＮＡ配列に対するものである。対応するＤＮＡコドンはＵをＴに置き換えたものである。
【００７４】
配列番号１に見られるマウスのＧＡＶＥ１９ヌクレオチド配列に加えて、ＧＡＶＥ１９のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列多型が一つの集団の中に存在するかも知れないということは当業者に理解されるものと思われる。ＧＡＶＥ１９遺伝子におけるそのような遺伝的多型は、自然対立遺伝子変異により一つの集団の個々の中にも存在するかも知れない。対立遺伝子とは同一遺伝子座において選択的に起こる遺伝子群の一つをいう。ここで使用されている用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」とは、ＧＡＶＥ１９タンパク質、好ましくは哺乳類ＧＡＶＥ１９タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（読取り枠）を含んでいる核酸分子をいう。ここで使用されている熟語「対立遺伝子バリアント」とは、ＧＡＶＥ１９遺伝子座で起こるヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドをいう。選択的対立遺伝子は多数の異なった個体中の興味ある遺伝子の配列分析によって同定することができる。それは種々の個体における同一遺伝子座を同定するためのハイブリダイゼーションプローブを用いて容易に行うことができる。いかなる、そして全てのそのようなヌクレオチド変異及びその結果としてのアミノ酸多型、並びに、自然対立遺伝子変異の結果によるＧＡＶＥ１９の変異で、ＧＡＶＥ１９の機能的活性を変更しないものも、本発明の範囲内である。
【００７５】
更に、本発明に係る単離された核酸分子のバリアントは、通常の実験技術、例えば位置指定突然変異誘発を用いた技術水準の一つによって容易に調製することができる。
【００７６】
アンチセンスヌクレオチド配列
本発明は、またアンチセンス核酸分子即ち、タンパク質をコードするセンス核酸に対し
て相補的、例えば、二重鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的又はｍＲＮＡ配列に対して相補的である分子にも及ぶものである。それ故アンチセンス核酸はセンス核酸と水素結合で結合することができる。アンチセンス核酸は全部のＧＡＶＥ１９コード鎖又はその一部分のみ、例えばタンパク質コード領域（即ち、オープンリーディングフレーム）の全部又は一部分に対して相補的である。アンチセンス核酸分子はＧＡＶＥ１９をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域に対してアンチセンスであり得る。非コード領域（「５′及び３′非翻訳領域」）は、コード領域に隣接する５′及び３′配列であり、そしてアミノ酸へ翻訳されない。
【００７７】
ここに開示されたＧＡＶＥ１９をコードするコード鎖配列（例えば配列番号１）について、本発明に係るアンチセンス核酸は、ワトソン−クリック型塩基対の規則に従ってデザインすることができる。アンチセンス核酸分子はＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡの全コード領域
に対して相補的であり得るが、しかしより好ましくは、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡのコード
鎖又は非コード鎖の一部分に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺
領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０ヌクレオチドの長さである。本発明に係るアンチセンス核酸は、技術水準として公知の工程を用いて、化学合成及び酵素的連結反応により構成することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然のヌクレオチド、或いは、生物活性を増大させるために、又はアンチセンスとセンス核酸間に形成される二重構造の物理的安定度を高めるために、例えばホスホロチオエート誘導体、ホスホネート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを用いて化学的に修飾した種々のヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる。
【００７８】
アンチセンス核酸の作成に使用できる修飾ヌクレオチドの例としては、
５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ6−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシ
ン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチル
シトシン、５−メチルシトシン、Ｎ6−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミ
ノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ワイブトシン、
プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２,６−ジアミノプリン
が挙げられる。
或いはまた、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向（即ち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、興味ある標的核酸に対してアンチセンス配向にある）にサブクローンされた発現ベクターを用いて生物学的に作成することもできる。
【００７９】
本発明に係るアンチセンス核酸は、典型的には対象物に投与され又はその場で（in situ）発生させ、その結果、ＧＡＶＥ１９タンパク質をコードする細胞質ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡにハイブリッドし又は結合し、それによって、転写及び／又は翻訳を阻害することによって該タンパク質の発現を阻害する。このハイブリダイゼーションは慣用的なヌクレオチド相補性によって安定な二重構造を形成し、或いは、例えばＤＮＡ二重構造に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの主要溝中で又はＧＡＶＥ１９の制御領域に対する特異的相互作用により、安定な二重構造を形成する。
【００８０】
本発明に係るアンチセンス核酸分子の投与経路の一例としては、組織部位への直接注入が挙げられる。或いはまた、アンチセンス核酸分子は選択した細胞を標的とするように修飾し、そして全身性投与することができる。例えば、全身性投与のためには、例えば細胞表面の受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体にアンチセンス核酸分子が連結することにより選択した細胞表面で発現した受容体又は抗原に特異的に結合するようにアンチセンス分子を修飾することができる。
【００８１】
アンチセンス核酸分子はまた、ここに記載したベクターを用いて細胞中へ配達することができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子を、強力なｐｏｌ II又はｐｏｌ IIIプロモーターの制御下でベクター中に配置する
ことが好ましい。
【００８２】
本発明に係るアンチセンス核酸分子は、α−アノマー型核酸分子であることができる。α−アノマー型核酸分子は相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、そこでは鎖は互いに平行に走っている（Gaultier et al., Nucleic Acids Res (1987) 15: 6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまたメチルリボヌクレオチド（Inoue et al., Nucleic Acids Res (1987) 15: 6131-6148）、又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue et al., FEBS Lett (1987) 215: 327-330）を含んでいてもよい。
【００８３】
リボザイム（ＲＮＡ酵素）
本発明はまたリボザイム（ＲＮＡ酵素）にも及ぶ。リボザイムとは、リボヌクレアーゼ活性をもった触媒性ＲＮＡ分子であり、リボザイムにハイブリッドするｍＲＮＡのような一本鎖の核酸を切断することができる。このように、リボザイムは（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（Haselhoff et al., Nature (1988) 334: 585-591に記載）、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するのに用いることができ、そしてＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる。ＧＡＶＥ１９をコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、ここに開示されているＧＡＶＥ１９ ＤＮＡのヌクレオチド配列（例えば、配列番号１）に基づいてデザインすることができる。例えば、テトラヒメナ（Tetrahymena）Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を、その活性部位のヌクレオチド配列がＧＡＶＥ１９をコードするｍＲＮＡへ切断されるヌクレオチド配列に対して相補的であるように構成することができる。例えば、U.S. Patent Nos. 4,987,071及び5,116,742参照）。或いはまた、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡを特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒的ＲＮＡをＲＮＡ分子のプールから選択するのに使用することができる（例えばBartel et al., Science (1993) 261: 1411〜1418参照）。
【００８４】
本発明の三重らせん核酸分子及びペプチド核酸
本発明はまた三重らせん構造を形成する核酸分子にも及ぶ。例えば、ＧＡＶＥ１９遺伝子発現は、ＧＡＶＥ１９の制御領域（例えば、ＧＡＶＥ１９プロモーター及び／又はエンハンサー）に相補的な標的ヌクレオチド配列によって阻止され、標的細胞におけるＧＡＶＥ１９遺伝子の転写を阻止する三重らせん構造を形成する（概論として、Helene, Anticancer Drug Des (1991) 6 (6) : 569; Helene Ann NY Acad Sci (1992) 660: 27; 及びMaher, Bioassays (1992) 14 (12): 807参照）。
【００８５】
特別な実施例としては、本発明の核酸分子は、例えば分子の安定度、ハイブリッド形成又は溶解度を改善するために、塩基残基、糖残基又はリン酸骨格を修飾することができる。例えば、核酸のデオキシリボース リン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸（Hyrup et al., Bioorgamic & Medicinal Chemistry (1996) 4: 5）が生じるようにすることができる。ここに使用されているように、用語「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」とは、核酸模倣品（mimics）を意味し、例えば、ＤＮＡ模倣品の場合、デオキシリボースのリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換されていて、四つの天然型ヌクレオ塩基のみが維持されているものをいう。このＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度条件下において、ＤＮＡ及びＲＮＡに対して特異的ハイブリダイゼーションを許容することが明らかにされている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、後述するHyrup et al., (1996); Perry-O'Keefe et al., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93: 14670に記載されている標準的固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施することができる。
【００８６】
ＧＡＶＥ１９のＰＮＡは、また治療的又は診断的応用に使用することができる。例えば、ＰＮＡは、例えば転写阻止又は翻訳阻止を誘導することにより、或いは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス又はアンチ遺伝子試薬として使用することができる。ＧＡＶＥ１９のＰＮＡもまた使用することができる。例えば、ＰＮＡを遺伝子における単一塩基対突然変異の分析に用いることができ、例えばＰＮＡ指向ＰＣＲクランプ法で、他の酵素、例えばＳ１ヌクレアーゼ（後述のHyrup et al. (1996)）との組合せで用いる場合は人工的制限酵素として、或いはＤＮＡ配列法及びハイブリダイゼーションにおけるプローブ又はプライマーとして使用することができる（後述のHyrup et al. (1996); 後述のPerry- O'Keefe et al. (1996)）。
【００８７】
他の実施例において、ＧＡＶＥ１９のＰＮＡは例えば安定度、特異性又は細胞内取込みを高めるために修飾することができるが、それは親油性又はその他の有用な基をＰＮＡに結合させることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、或いは既存のリポゾーム又はドラッグデリバリーの他の技術を用いて行うことができる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は以下の文献に記載されているようにして行うことができる（後述のHyrup et al. (1996), Finn et al., Nucleic Acids Res (1996) 24 (17): 3357-63, Mag et al., Nucleic Acids Res (1989) 17: 5973; 及びPeterser et al., Bioorganic Med Chem Lett (1975) 5: 1119）。
【００８８】
ＧＡＶＥ１９タンパク質
更に、本発明は図２（配列番号２）のアミノ酸配列、そのバリアント、そのフラグメント、又はその類似体若しくは誘導体を含んでいる単離されたポリペプチドにも及ぶ。
【００８９】
配列番号２とは異なる配列、例えばそのバリアントを有するＧＡＶＥ１９タンパク質をコードする単離された核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列中へ、一つ又はそれ以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失を導入し、その結果一つ又はそれ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失をコードすべきタンパク質へ導入することによって作成することができる。
【００９０】
特別な実施例においては、ＧＡＶＥ１９タンパク質の突然変異体は、（１）ＧＡＶＥ１９信号化経路におけるタンパク質とタンパク質−タンパク質相互作用を生ずる能力、（２）ＧＡＶＥ１９リガンドと結合する能力、又は（３）細胞内標的タンパク質に結合する能力を検定するのに用いることができる。
更に他の実施例においては、ＧＡＶＥ１９突然変異体は細胞増殖又は細胞分化を調節する能力を検定するのに用いることができる。
【００９１】
生（naitive）のＧＡＶＥ１９タンパク質は、標準的タンパク質精製技術を用いた適当
な精製操作によって細胞又は組織材料から単離することができる。或いはまたＧＡＶＥ１９タンパク質は組換えＤＮＡ技術によって容易に産生することができる。尚、本発明に係る他の方策としては、標準的なペプチド合成技術を用いてＧＡＶＥ１９タンパク質又はポリペプチドを化学的に合成することもできる。
【００９２】
「単離された」又は「精製された」タンパク質、又はそれらの生物学的に活性な部分は、細胞内物質又はＧＡＶＥ１９タンパク質起源の細胞又は組織源に由来する汚染タンパク質を実質的に含んでおらず、或いは化学合成の場合は、合成前駆物質又は他の化学物質を実質的に含んでいない。ここで熟語「細胞内物質を実質的に含んでいない」には、タンパク質が単離された又は組換え技術で産生された細胞の細胞成分を含まないＧＡＶＥ１９タンパク質の調製を含むものである。このように細胞内物質を実質的に含んでいないＧＡＶＥ１９タンパク質は、非ＧＡＶＥタンパク質（ここでは「汚染されているタンパク質」ともいう。）の約３０％、２０％、１０％又は５％以下、或いはそれ以下（乾燥重として）を有するＧＡＶＥ１９タンパク質の調製をも含む。
【００９３】
ＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的に活性な部分が組換え技術で産生された場合は、好ましくは培地を実質的に含んでいないこと、即ちタンパク質調製物の容積の約２０％、１０％又は５％以下、或いはそれ以下の培地を含むに過ぎないことを意味する。ＧＡＶＥ１９タンパク質が化学合成で作成された場合は、好ましくは合成前駆体又は他の化学物質を実質的に含んでいないこと、即ち、タンパク質合成に関与した合成前駆体又は他の化学物質から分離されていることを意味する。それ故、そのようなＧＡＶＥ１９タンパク質の調製品は約３０％、２０％、１０％又は５％以下、或いはそれ以下（乾燥重量として）の合成前駆体又は非ＧＡＶＥ１９化学物質を含むに過ぎない。
【００９４】
ＧＡＶＥ１９タンパク質の生物学的に活性な部分又はフラグメントは、ＧＡＶＥ１９タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に表されているアミノ酸配列）に対し十分に同一性のある又はそれ由来のアミノ酸配列を含むペプチドを含んでいて、ＧＡＶＥ１９タンパク質の全長よりも少ないアミノ酸を含み、かつＧＡＶＥ１９タンパク質の少なくとも一つの活性を表している。典型的には、生物学的に活性な部分は、ＧＡＶＥ１９タンパク質の少なくとも一つの活性に対するドメイン又はモチーフを含んでいる。ＧＡＶＥ１９タンパク質の生物学的に活性な部分は、長さとして例えば１０、２５、５０、１００又はそれ以上のアミノ酸から成るポリペプチドであり得る。特定の生物学的に活性なポリペプチドは一つ又はそれ以上の同定されたＧＡＶＥ１９構造ドメインを含んでいる。
【００９５】
更に、他の生物学的に活性なＧＡＶＥ１９タンパク質の部分で、その中で他のタンパク質領域が欠失しているものは、組換え技術で調製することができ、また生のＧＡＶＥ１９タンパク質の機能的活性の一つ又はそれ以上を評価することができる。
他の有用なＧＡＶＥ１９タンパク質は、配列番号２と実質的に同一なものであり、自然の対立遺伝子変異又は突然変異によりアミノ酸配列に相違があっても、配列番号２の有するＧＡＶＥ１９タンパク質の機能的活性は維持している。例えば、そのようなＧＡＶＥ１９タンパク質及びポリペプチドは、ここに記載された生物学的活性の少なくとも一つを有している。
【００９６】
それ故、有用なＧＡＶＥ１９タンパク質とは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約４５％、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、配列番号２の有するＧＡＶＥ１９タンパク質の機能的活性を維持しているタンパク質である。特別な実施例においては、ＧＡＶＥ１９タンパク質は、配列番号２の有するＧＡＶＥ１９タンパク質の機能的活性を維持している。
【００９７】
二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列の同一性百分率を決定するために、配列を最適比較の目的に合うように一列に並べる必要がある（例えば、第二アミノ酸又は核酸配列と最適な並びを得るために第一アミノ酸又は核酸の配列にギャップを導入することができる）。次にアミノ酸配置又は核酸配置に対応するアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第二配列の配置に対応して、第一配列の配置が同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められたとき、その分子はその配置において同一性であると考えられる。二つの配列の同一性百分率は配列によって占められる同一性を有する配置の数の関数である（即ち、同一性百分率＝同一性を有する配置の数／配置の合計数（例えば、重複している配置）×１００）。
【００９８】
一つの実施態様においては、二つの配列は同じ長さである。二つの配列間の同一性百分率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。二つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの特定の例として次のものがあるが、但し、これらに限定されない。Karlin等のアルゴリズム、Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 2264、及びKarlin 
等の改変アルゴリズム-、Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 5873-5877。そのようなアルゴリズムはAltschul等のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組込まれている（Altschul et al., J Mol Bio (1990) 215: 403）。本発明のＧＡＶＥ１９核酸分子に相同なヌクレオチド配列を求めるためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて、例えばスコア＝１００、ワードレングス＝１２にセットして操作することができる。本発明のＧＡＶＥ１９タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を求めるためには、ＢＬＡＳＴプロテインサーチを、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、スコア＝５０、ワードレングス＝３にセットして操作することができる。比較目的のためのギャップの並びを求めるためには、Gapped ＢＬＡＳＴをAltschul等の記載通りに操作することができる（Altschul et al., Nucleic Acids Res (1997) 25: 3389）。或いはまた、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、２分子間のかすかな相互作用を探索するために反復探索として操作することができる（上記のAltschul et al. (1997)）。ＢＬＡＳＴ、Gapped ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用するときは、それぞれのプログラムのデフォルトパラメターズ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を用いることができる（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照）。
【００９９】
配列比較に使用される数学的アルゴリズムの他の特別な例としては、Myers等のアルゴ
リズム（Mayers et al., CABIOS (1988) 4: 11〜17）があるが、但し、これに限定されるものではない。そのようなアルゴリズムはＧＣＧ配列並びソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ヴァージョン２.０）に組み込まれている。アミノ酸配列
の比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用するときは、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長さペナルティ１２及びギャップ長さペナルティ４を用いることができる。
２本の配列間の同一性百分率は、ギャップがあるかないかに関わらず、上記に記載したものと同様の技術を用いて決定することができる。同一性百分率を計算するに当っては、エグザクトマッチ（正確に対をなすもの）のみを計算に入れるべきである。
【０１００】
本発明は更にまたＧＡＶＥ１９キメラ又は融合タンパク質にも及ぶものである。ここで使用されているように、ＧＡＶＥ１９「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、非ＧＡＶＥ１９ポリペプチドに作動可能に連結したＧＡＶＥ１９ポリペプチドを含むものである。「ＧＡＶＥ１９ポリペプチド」とは、ＧＡＶＥ１９に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。「非ＧＡＶＥ１９ポリペプチド」とは、ＧＡＶＥ１９タンパク質と本質的には同一ではないタンパク質、例えば、同種又は異種の生物から由来し、ＧＡＶＥ１９タンパク質とは異なるタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＧＡＶＥ１９融合タンパク質については、ＧＡＶＥ１９ポリペプチドはＧＡＶＥ１９タンパク質の全て又は一部と対応できるものであり、好ましくは、ＧＡＶＥ１９タンパク質の生物学的に活性な部分の少なくとも一つと対応できるものである。
【０１０１】
ＧＡＶＥ１９融合タンパク質に関しては、ＧＡＶＥ１９ポリペプチドはＧＡＶＥ１９タンパク質の全て又は一部と対応することができるものであり、好ましくは、ＧＡＶＥ１９タンパク質の生物学的に活性な部分の少なくとも一つと対応できるものである。融合タン
パク質に関しては、用語「作動可能に連結」とは、ＧＡＶＥ１９ポリペプチドと非ＧＡＶＥ１９ポリペプチドが互いに枠内で融合していることを意味する。非ＧＡＶＥ１９ポリペプチドはＧＡＶＥ１９ポリペプチドのＮ−末端又はＣ−末端に融合することができる。一つの有用な融合タンパク質は、ＧＡＶＥ１９配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ−末端へ融合したＧＳＴ−ＧＡＶＥ１９である。そのような融合タンパク質は、組換えＧＡＶＥ１９の精製を容易にするものである。
【０１０２】
他の実施態様において、本発明に係る融合タンパク質は、ＧＡＶＥ１９の全部又は一部分が免疫グロブリンタンパク質ファミリーの一メンバー由来の配列に融合したＧＡＶＥ１９−免疫グロブリン融合タンパク質にも及ぶ。本発明に係るＧＡＶＥ１９−免疫グロブリン融合タンパク質は、細胞表面におけるＧＡＶＥ１９リガンドとＧＡＶＥ１９タンパク質間の相互作用を阻害し、それによってin vivoにおけるＧＡＶＥ１９−仲介信号変換を抑制するために、医薬品組成物中に混合して被検者に投薬することができる。ＧＡＶＥ１９−免疫グロブリン融合タンパク質はＧＡＶＥ１９と同種（コグネイト）なリガンドの利用可能な量に作用するように使用することができる。ＧＡＶＥ１９リガンド−ＧＡＶＥ１９相互作用の阻害は、増殖及び分化の障害の治療及び細胞生存の調節（例えば、促進又は阻止）の双方にとって治療的に有用である。更に本発明に係るＧＡＶＥ１９−免疫グロブリン融合タンパク質は、被検体における抗−ＧＡＶＥ１９抗体産生の免疫原として、ＧＡＶＥ１９リガンドの精製に、及びＧＡＶＥ１９とＧＡＶＥ１９リガンドとの相互作用を阻止する分子同定のスクリーニング検定に使用することができる。
【０１０３】
特別な実施態様において、本発明に係るＧＡＶＥ１９キメラ又は融合タンパク質は、標準的な組換え技術により作成することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、通常の技術、例えば連結のために平滑末端又は付着末端の使用、適切な末端を提供するための制限酵素による消化、適切となるように付着末端の埋め込み、不適切な結合を回避するためのアルカリ性ホスファターゼ処理、及び酵素による連結反応に従って枠内において連結させることができる。他の実施態様においては、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡシンテサイザーを含む通常の技術によって合成することができる。
【０１０４】
或いはまた、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、二本の共役する遺伝子フラグメント間に、相補的な突き出しを作り、続いてアニールして、そして再増幅することによりキメラ遺伝子配列を作成させるアンカープライマーを用いて実施することができる（例えば上述のAusubel et al.参照）。
【０１０５】
更に、融合対象物を既にコードしている多くの発現ベクターが市場で入手可能である（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。ＧＡＶＥ１９コードされた核酸はそのような発現ベクターへクローン化することができ、融合対象物はＧＡＶＥ１９タンパク質に対して枠内において連結される。
【０１０６】
バリアント
上記に説明したように、本発明は更にＧＡＶＥ１９タンパク質のバリアントにも及ぶものである。例えば、突然変異は位置指定突然変異誘発及びＰＣＲ介在突然変異誘発のような標準的技術を用いて配列番号２のアミノ酸配列へ導入することができる。更に保存性のアミノ酸置換は一つ又はそれ以上の予想される非不可欠なアミノ酸残基において作成することができる。「保存性のアミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものをいう。例えば、一つ又はそれ以上のアミノ酸が類似極性を有するアミノ酸で置換されて、機能的均等として作用するため、その結果サイレント変異（沈黙変異）となる。本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸から選択することもできる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含んでいる。芳香族環構造を含むアミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンがある。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む。陽性荷電（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む。陰性荷電（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。そのような変換はポリアクリルアミドゲル電気泳動又は等電点により測定される外見上の分子量に影響を与えるものとは思われない。
【０１０７】
特に好ましい置換は、以下の通りである。
−  ＡｒｇをＬｙｓで置換、又はその逆で、陽性荷電は維持されている；
−  ＡｓｐをＧｌｕで置換、又はその逆で、陰性荷電は維持されている；
−  ＴｈｒをＳｅｒで置換、遊離−ＯＨは維持されている；及び
−  ＡｓｎをＧｌｎで置換、遊離ＮＨ2は維持されている。
【０１０８】
尚、アミノ酸置換は特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換するためにも導入することができる。例えば、Ｃｙｓはもう一つのＣｙｓとジスルフィド架橋を形成する可能性のある部位に導入することができる。Ｈｉｓは特に「触媒」部位に導入することができる（即ち、Ｈｉｓは酸としても塩基としても作用することができ、そして生物化学的触媒として最も良く用いられているアミノ酸である）。Ｐｒｏは特にその平面的構造故にタンパク質構造におけるβ−ターンを誘発させるために導入することができる。
【０１０９】
突然変異もまた、ＧＡＶＥ１９コード配列の全体又は一部分に沿って、例えば飽和（saturation）突然変異誘発によりランダムに誘発させることができ、発生した突然変異体はＧＡＶＥ１９生物学的活性について、その活性を維持している突然変異体を同定するために、スクリーニングすることができる。突然変異誘発に続いて、コードされたタンパク質は組換え技術によって発現し、そしてタンパク質の活性を測定することができる。
【０１１０】
本発明に係るバリアントはＧＡＶＥ１９アゴニスト（擬態（mimetic）の）又はＧＡＶ
Ｅ１９アンタゴニストとして作用することができる。ＧＡＶＥ１９タンパク質のバリアントは、突然変異、即ちＧＡＶＥ１９タンパク質の個別の点突然変異又は短縮化（truncation）によって、発生させることもできる。ＧＡＶＥ１９タンパク質のアゴニストは、自然発生のＧＡＶＥ１９タンパク質の生物学的活性と同一の又はサブセットを実質的に維持することができる。例えば、ＧＡＶＥ１９タンパク質のアンタゴニストは、ＧＡＶＥ１９タンパク質を含む細胞内信号化カスケードの下流方向又は上流方向経路に競合的に結合することができ、そしてＧＡＶＥ１９タンパク質の自然発生型の活性の一つ又はそれ以上を阻害することができる。このようにして、特異的な生物学的効果は、制限された機能を有するバリアントを処理することによって引き出すことができる。ＧＡＶＥ１９タンパク質の自然発生型の生物学的活性のサブセットを有するバリアントによる被検体への処置は、ＧＡＶＥ１９タンパク質の自然発生型による処置に比較してより少ない副作用を被検体に与える。
【０１１１】
ＧＡＶＥ１９アゴニスト（擬態の）又はＧＡＶＥ１９アンタゴニストのいずれかの作用を有するＧＡＶＥ１９タンパク質のバリアントは、突然変異体のスクリーニングコンビナトリアルライブラリー、例えば、ＧＡＶＥ１９アゴニスト又はアンタゴニスト活性に対するＧＡＶＥ１９タンパク質の短縮化（truncation）突然変異体によって同定することができる。在る実施態様においては、ＧＡＶＥ１９バリアントの多彩なライブラリーは、核酸レベルにおけるコンビナトリアル突然変異誘発によって生じさせることができ、そして多彩な遺伝子ライブラリーによってコードすることができる。ＧＡＶＥ１９バリアントの多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチド混合物を潜在的ＧＡＶＥ１９配列
の縮重セットをそれぞれのポリペプチドに、或いはまたＧＡＶＥ１９配列のセットをそこに含んでいるより大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレイ）のセットとして発現している遺伝子配列に酵素的に連結して作成することができる。
【０１１２】
縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的ＧＡＶＥ１９バリアントのライブラリーを作成するのに用いられる方法には、種々のものがある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で合成し、その後合成された遺伝子を適当な発現ベクターに連結させることによって作成することができる。遺伝子の縮重セットを用いることにより、潜在的ＧＡＶＥ１９配列の望ましいセットをコードする配列の全てを、一つの混合物として準備することができる。縮重オリゴヌクレオチドの合成法は技術水準として既知である（例えば、Narang, Tetrahedron (1983) 39: 3; Itakura et al., Ann Rev Biochem (1984) 53: 323; Itakura et al., Science (1984) 198: 1056; Ike et al., Nucleic Acid Res (1983) 11: 477参照）。
【０１１３】
加えて、ＧＡＶＥ１９タンパク質のコード配列のフラグメントのライブラリーは、ＧＡＶＥ１９タンパク質のバリアントのスクリーニング及びその後の選択に用いるため、ＧＡＶＥ１９フラグメントの雑多な集団を発生させるのに使用することができる。ある実施態様においては、配列フラグメントをコードしているライブラリーは、ＧＡＶＥ１９コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをニック（切れ目）が分子当たり約１個起こるような条件下でヌクレアーゼを処理し、二本鎖ＤＮＡを変性した後、異なるニック処理物からのセンス／アンチセンス対を含む二本鎖ＤＮＡを形成するように、ＤＮＡを再生し、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により再生した二重体から一本鎖部分を除去して得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターへ連結させることによって作成することができる。この方法により、発現ライブラリーは、ＧＡＶＥ１９タンパク質の種々の大きさのＮ−末端及び細胞内フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【０１１４】
点突然変異又は短縮化（truncation）によって作られたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニング及び選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための幾つかの技術は技術水準として既知である。そのような技術はＧＡＶＥ１９タンパク質のコンビナトリアル突然変異誘発により作成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用することができる。巨大な遺伝子ライブラリーのスクリーニングのハイスループット分析に使用可能なものとして最も広く用いられている技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、そのライブラリーを有するベクターを適当な細胞へトランスフォームすること、及び、求めている活性の検出方法が（その生産物を検出すべき）遺伝子をコードしているベクターの単離を容易にする条件下におけるコンビナトリアル遺伝子の発現を典型的に含んでいる。
【０１１５】
リカーシブアンサンブル（recursive ensemble）突然変異誘発（ＲＥＭ）、ライブラリーにおいて機能的突然変異の頻度を高める技術は、ＧＡＶＥ１９バリアントを同定するスクリーニング検定と組み合せて使用することができる（Arkin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 7811-7815; Delgrave et al., Protein Engineering (1993) 6 (3): 327-331）。
【０１１６】
ＧＡＶＥ１９の類似体及び誘導体
更に、本発明は、化学的修飾により作成されたＧＡＶＥ１９の誘導体又は類似体を含む。本発明に係るＧＡＶＥ１９タンパク質は一つ又はそれ以上の化学成分を当該タンパク質成分に結合させることによって誘導化することができる。
【０１１７】
誘導化のための化学成分：誘導化に適する化学成分は水溶性ポリマーの中から選択することができるが、それはＧＡＶＥ１９類似体又は誘導体が生理的環境のような水溶性環境に
おいて沈殿しないためである。場合によっては、ポリマーは薬剤としても許容される。当業者は、有望なポリマーを、ポリマー／成分の結合が薬剤として使用されるか否か、そしてもしそうであれば望ましい投与量、循環時間、タンパク質分解耐性、及びその他を考慮して選択することができる。
【０１１８】
ＧＡＶＥ１９についてのこれらの要件は、ここに提示された検定法を用いることによって確認することができる。ここで利用される水溶性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１,３−ジオキソラン、ポリ−１,３,６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれでもよい）、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレンの多価アルコール等が挙げられるが、但しこれらに限定されるものではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定度により、工業的生産において有利であると思われる。
【０１１９】
ポリマーはいかなる分子量でもよく、また分枝鎖又は直鎖のいずれでもよい。ポリエチレングリコールの場合は、取扱い及び生産の容易さから好ましい分子量は約２ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲である（用語「約」とは、ポリエチレングリコール合成において、或る分子は記載された分子量よりも大きく、また或る分子はそれよりも小さいことを意味する）。
【０１２０】
他の大きさのものは、所望される薬剤の局面に依存して使用することができる（例えば、所望する放出維持時間、効能がある場合はその生物活性、取扱い易さ、免疫原性の程度又はその欠損、及びその他の治療タンパク質又はその類似体に対するポリエチレングリコールの既知の効果）。
多数のポリマー分子がＧＡＶＥ１９に結合するため、当業者であれば作用に対する影響を確認することができると思われる。或る分子はモノ誘導体であり、また或る分子はジ−、トリ−、テトラ−誘導体、又は同一若しくは異なる化学残基の組合せによる誘導体である（例えば、異なる分子量のポリエチレングリコールのようなポリマー）。ＧＡＶＥ１９分子に対するポリマー分子の比率は、反応混合物の濃度によって異なる。一般的には、最適比率（過剰な無反応成分及びポリマーが存在しないという意味での反応効率の用語として）は、誘導化の所望する程度（例えば、モノ、ジ−、トリ−等）、選択したポリマーの分子量、ポリマーが分枝鎖か直鎖か、及び反応条件のような要因によって決定される。
【０１２１】
ポリエチレングリコール分子（又は他の化学成分）は、ＧＡＶＥ１９の機能又は抗原ドメインへの影響を考慮してＧＡＶＥ１９に結合すべきである。幾つかの結合方法が当業者にとって可能であり、例えばＥＰ ０ ４０１ ３８４中に文献として記載されているもの
（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧカップリング）、及びMalik et al., 1992, Exp. Hematol. 20: 1028-1035（塩化トレシル（tresyl chloride）を用いたＧＭ−ＣＳＦのぺジレーションが報告されている）を参照することができる。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノ酸又はカルボキシ基のような活性基により、アミノ酸残基に共有結合で結合することができる。ここで活性基とは、活性化したポリエチレングリコール分子が結合し得るもののことである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リシン残基及びＮ末端アミノ酸残基を含み、また遊離カルボキシ基を有するアミノ酸残基は、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、及びＣ末端アミノ酸残基を含む。スルフヒドリル基（−ＳＨ基）もまたポリエチレングリコール分子を結合する活性基として使用することができる。治療目的としては、Ｎ末端又はリシン基における結合のようなアミノ基における結合が好ましい。
【０１２２】
特異的にはＮ末端が化学的修飾を受けたＧＡＶＥ１９が望ましい。本組成物の説明のようにポリエチレングリコールを用いて、種々のポリエチレングリコール分子から（分子量、分枝鎖等により）、反応混合物におけるＧＡＶＥ１９分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、実施すべきペジレーション反応の型、及び選択的Ｎ末端ぺジル化タンパク質を得る方法を選択することができる。Ｎ末端ペジル化調製を得る方法（即ち、必要な場合は、この分子を他のモノペジル化分子から分離）は、ペジル化タンパク質分子の集団からＮ末端ペジル化分子を精製することによって行うことができる。選択的Ｎ末端化学修飾は、ＧＡＶＥ１９誘導化に可能な第一アミノ基の相違（リシン対Ｎ末端）の特異的反応性を活用する還元的アルキル化によって行うことができる。適当な反応条件下において、カルボニル基を含んでいるポリマーによるＮ末端におけるＧＡＶＥ１９の実質的に選択的誘導化を達成することができる。例えば、リシン残基のε−アミノ基とＧＡＶＥ１９のＮ末端残基のα−アミノ基との間のｐＫａ相違を利用できるようなｐＨにおいて反応を行うことによりＧＡＶＥ１９の選択的Ｎ末端ペジル化を行うことができる。そのような選択的誘導化により、ＧＡＶＥ１９に対する水溶性ポリマーの結合は調節される：ポリマーとの接合はＧＡＶＥ１９のＮ末端において優勢的に起こり、リシン側鎖のアミノ基のような他の活性基の修飾はほとんど起こらない。還元的アルキル化を用いた場合、水溶性ポリマーは上記のタイプに該当し、ＧＡＶＥ１９にカップリングするためには一つの活性なアルデヒドを持たなければならない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは一つの活性なアルデヒドを含んでいるから使用することができる。
【０１２３】
ＧＡＶＥ１９抗体、そのバリアント、そのフラグメント又はその類似体若しくは誘導体
単離されたＧＡＶＥ１９タンパク質若しくは小部分又はそのフラグメントは、ポリクローナル又はモノクローナル抗体調製の標準的技術を用いて、ＧＡＶＥ１９に結合する抗体を製造するための免疫原として使用することができる。ここで用いる用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ちＧＡＶＥ１９又はそのフラグメントのような抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含んでいる分子をいう。ＧＡＶＥ１９に特異的に結合する分子は、ＧＡＶＥ１９には結合するが、しかしながら例えばＧＡＶＥ１９を自然に含んでいる生物学的標品中の他の分子には実質的には結合しない分子をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、抗体に例えばペプシンのような酵素を処理して得られるＦ(ab)及びＦ(ab′)2フラグメントが挙げられる。本発明はＧＡＶＥ１９、そのバリアント、そのフラグメント又はその類似体若しくは誘導体を免疫原として有するポリクローナル、モノクローナル及びキメラ抗体を提供する。
【０１２４】
完全長のＧＡＶＥ１９タンパク質を用いることができ、また代わりに本発明は免疫原として用いるためにＧＡＶＥ１９の抗原ペプチドフラグメントを提供するものである。ＧＡＶＥ１９の抗原ペプチドは配列番号２に提示されたアミノ酸配列の少なくとも８個（好ましくは１０、１５、２０、３０又はそれ以上）のアミノ酸残基を含み、かつＧＡＶＥ１９と特異な免疫複合体を形成するペプチドに対して抗体を生じさせるＧＡＶＥ１９のエピトープを含んでいる。
【０１２５】
ＧＡＶＥ１９免疫原は典型的には、当該免疫原を適当な動物（例えば、兎、山羊、マウス又はその他の哺乳類）に免疫感作させて抗体を調製するのに使用することができる。適当な免疫原調製物には例えば組換え技術で発現させたＧＡＶＥ１９タンパク質又は化学的に合成したＧＡＶＥ１９ポリペプチドを含むものでもよい。
調製は更に完全若しくは不完全フロイントアジュバンドのようなアジュバンド又は同様の免疫促進物質を含むことができる。適当な動物にＧＡＶＥ１９免疫原調製物を用いて免疫感作することによりポリクローナル抗−ＧＡＶＥ１９抗体応答が誘発される。
本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はキメラ抗体である。ここで使用されている用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、ＧＡＶＥ１９の特異的なエピトープと免疫反応することができる一種類の抗原結合部位を含んでいる抗体分子の集団をいう。モノクローナル抗体組成物は、このように典型的には特異なＧＡＶＥ１９タンパク質エピトープに対し単一の結合アフィニティを提示する。
【０１２６】
ポリクローナル抗−ＧＡＶＥ１９抗体は、上記の記載の如く、適当な動物をＧＡＶＥ１９免疫原を用いて免疫感作することにより調製することができる。免疫感作した動物における抗−ＧＡＶＥ１９抗体の力価は、固定化ＧＡＶＥ１９を用いたエンザイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような標準的技術により経時的に測定することができる。必要な場合は、ＧＡＶＥ１９に対する抗体分子は、哺乳類（例えば、血液から）から単離することができ、更にＩｇＧ画分を得るためにはタンパク質Ａクロマトグラフィーのような既知の技術により精製することができる。免疫感作後の適当な時間に、例えば抗−ＧＡＶＥ１９抗体力価が最高に達した時、抗体産生細胞を被検体から採集し、そしてKohler等により最初に記載されたハイブリドーマ技術 (Kohler et al., Nature (1975) 256: 495-497)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kohler et al., Immunol Today (1983) 4: 72）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, (1985), Alan R. Liss, Inc., pp. 77〜96）又はトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を調製するのに用いることができる。ハイブリドーマを産生する技術はよく知られている（概説としてCurrent Protocols in Immunology (1994) Coligan et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY参照）。簡単に言えば、不死化細胞系（典型的にはミエローマ）を上記の記載の如くＧＡＶＥ１９免疫原で免疫した哺乳類由来のリンパ球（典型的には脾臓細胞）に融合し、そして得られたハイブリドーマの培養液の上澄をスクリーニングして、ＧＡＶＥ１９に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定することである。
【０１２７】
リンパ球と不死化細胞系の融合に用いられる多くの既知のプロトコールのいかなるものも、抗−ＧＡＶＥ１９モノクローナル抗体を生成する目的に利用することができる（例えば、Current Protocols in Immunology, 上記；Galfre et al., Nature (1977) 266: 550-552; Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); 及びLerner, Yale J Biol Med (1981) 54: 387-402参照）。更に、当業者であれば、そのような方法には多くの変法があり、それらもまた有用なものであると理解するであろう。典型的には不死化細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）は、リンパ球と同種の哺乳類に由来するものである。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原調製で免疫したマウス由来のリンパ球を、不死化マウス細胞系、例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含んでいる培地に対して感受性であるミエローマ細胞系とを融合して作成することができる。
多くのミエローマ細胞系のいかなるものも、（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８.６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ系）標準的技術に従って融合の相手として使用することができる。これらのミエローマ系はＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ−感受性ネズミミエローマ細胞はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてネズミ脾臓細胞と融合させる。融合により得られたハイブリドーマ細胞は、非融合又は非生産的融合の細胞を死滅させるＨＡＴ培地を用いて選択することができる（トランスフォームされないため、非融合スプレノサイトは数回後に死滅する）。本発明に係るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ＧＡＶＥ１９に結合する抗体を含んでいるハイブリドーマ培養の上澄のスクリーニング（例えば、標準的ＥＬＩＳＡ法）を用いて検出することができる。
【０１２８】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製する代りに、モノクローナル抗−ＧＡＶＥ１９抗体は、ＧＡＶＥ１９に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単
離するために、ＧＡＶＥ１９との組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることによって同定し及び単離することができる。ファージディスプレイライブラリーの作成及びスクリーニングのキットは市場にて入手可能である（例えば、the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01;及びthe Stratagene「SURFZAP」Phage Display Kit, Catalog No. 240612）。
【０１２９】
加えて、抗体ディスプレイライブラリーの作成及びスクリーニングに特に使用することができる方法及び試薬の例としては、例えば、U.S. Patent No. 5,223,409; PCT Publication No. WO 92／18619; PCT Publication No. WO 91／17271; PCT Publication No. WO 92／20791; PCT Publication No. WO 92／15679; PCT Publication No. WO 93／01288; PCT Publication No. WO 92／01047; PCT Publication No. WO 92／09690; PCT Publication No. WO 90／02809; Fuchs et al., Bio／Technology (1991) 9: 1370〜1372; Hay et al., Hum Antibody Hybridomas (1992) 3: 81〜85; Huse et al., Science (1989) 246; 1275〜1281; 及びGriffiths et al., EMBO J (1993) 25 (12): 725〜734が挙げられる。
【０１３０】
尚更に、組換え抗−ＧＡＶＥ１９抗体は、例えばモノクローナル及びキメラ抗体を含めて、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作成することができる。そのような抗体は、技術水準として既知の組換えＤＮＡ技術、例えばPCT Publication No. WO 87／02671; Europe Patent Application No. 184,187; Europe Patent Application No. 171,496; Europe Patent Application No. 173,494; PCT Publication No. WO 86／01533; U.S. Patent No. 4,816,567; Europe Patent Application No. 125,023; Better et al., Science (1988) 240: 1041〜1043; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84: 3439〜3443; Lin et al., J Immunol (1987) 139: 3521〜3526; Sun et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84: 214-218; Nishimura et al., Canc Res (1987) 47: 999〜1005; Wood et al., Nature (1985) 314: 446〜449; Shaw et al., J Natl Cancer Inst (1988) 80: 1553〜1559;: Morrison, Science (1985) 229: 1202〜1207; Oi et al., Bio／Techniques (1986) 4: 214; U.S. Patent No. 5,225,539; Jones et al., Nature (1986) 321: 552〜525; Verhoeyan et al., Science (1988) 239: 1534; 及びBeidler et al., J Immunol (1988) 141: 4053〜4060に記載されている方法を用いて作成することができる。
【０１３１】
抗−ＧＡＶＥ１９抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティクロマトグラフィー又は免疫沈降法のような標準的技術によりＧＡＶＥ１９を単離するのに使用することができる。抗−ＧＡＶＥ１９抗体は、細胞からの自然ＧＡＶＥ１９及び組換え技術で作成したＧＡＶＥ１９を発現した宿主細胞からの精製を容易にすることができる。
更に、抗−ＧＡＶＥ１９抗体は、ＧＡＶＥ１９タンパク質の発現の数及びパターンを評価するために、ＧＡＶＥ１９タンパク質（例えば、細胞溶解物又は細胞上澄画分中の）を検出するのに用いることができる。抗−ＧＡＶＥ１９抗体は、臨床的検査手順の一部として、例えば、与えられた治療法の効果を判定するために、組織におけるタンパク質レベルをモニターする診断に使用することができる。検出は、抗体を後述する検出可能な物質（標識）とカップリングすることによって容易化することができる。
【０１３２】
検出可能な標識
場合によっては、本発明に係る単離された核酸分子、本発明に係るポリペプチド及び本発明に係る抗体、並びにそれらのフラグメントは、検出可能に標識することができる。適当な標識としては、酵素、蛍光体（例えば、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド（ＴＲ）、ロダミン、遊離又はキレートランタニド系塩、特にＥｕ3+等の蛍光体）、発色団、放射性同位元素、キレート剤、染料、金コロイド、ラテックス粒子、リガンド（例えば、ビオチン）、生物発光体、及び化学発光試薬を挙げることができる。
【０１３３】
対照マーカーを採用するときは、同一の又は相違する標識を受容体及び対照マーカーに使用することができる。同位元素3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Ｃｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58
Ｃｏ、59Ｆｅ、90Ｙ、125Ｉ、131Ｉ及び186Ｒｅのような放射性活性標識を使用する場合
は、既知で現在使用可能な計測方法を利用することができる。標識が酵素の場合は、検出は、現在使用されている技術水準として既知の比色分析、分光分析、蛍光分光分析、電流測定又は気体定量法のいかなるものによってでも遂行することができる。
【０１３４】
直接標識は、本発明に従って使用することができる標識の一つの例である。直接標識とは、自然の状態において、肉眼で又は光学フィルター及び／又は例えば蛍光を発生させる紫外線のような利用促進の助けを得て容易に目視することのできるものと定義される。本発明に従って使用することができる有色標識の例には、金属ゾル粒子があり、例えばLeuvering (U.S. Patent 4,313,734)の記載のような金ゾル粒子、 Gribnau等(U.S. Patent 4,373,932) 及びMay 等 (WO 88／08534)の記載のような染料ゾル粒子、May(上述)、Snyder (EP-A 0 280 559 及び0 281 327)記載のような染色ラテックス、又はCampbell 等 (U.S. Patent 4,703,017)記載のようなリポソームにカプセル化された染料が挙げられる。他の直接標識としては、放射性ヌクレオチド、蛍光体、又は発光体がある。これら直接標識の方法に加えて、酵素を含む間接標識も本発明に従って使用することができる。エンザイムイムノアッセイの種々のタイプは技術水準としてよく知られており、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース−６−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼがあり、これら及びその他のものは、Eva Engvall 著, Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT in Methods in Enzymology, 70. 419〜439, 1980 及び U.S. Patent 4,857,453において詳細に議論されている。
【０１３５】
本発明で使用される他の標識には、磁気ビーズ、又は磁気共鳴イメージング標識が含まれる。
【０１３６】
他の実施態様においては、32Ｐで標識するために、リン酸化部位が本発明に係る単離されたポリペプチド、本発明に係る抗体又はそれらのフラグメント上に作成されているが、それらは、Foxwell等に対して１９９５年１０月１７日に発行されたEuropean Patent No.
0372707又はU.S. Patent No. 5,459,240に記載されている。
【０１３７】
ここに例証したように、抗体を含めたタンパク質は代謝標識によって標識することができる。代謝標識は、［35Ｓ］−メチオニン又は［32Ｐ］−オルトリン酸のような代謝標識物を補足した培地の存在下でタンパク質を発現する細胞のin vitroインキュベーション中に行われる。［35Ｓ］−メチオニンを用いた代謝（又は生合成）標識に加えて、本発明は更に［14Ｃ］−アミノ酸及び［3Ｈ］−アミノ酸（不安定でない部位にトリチウムを置換
したもの）を用いた標識をも考慮に入れている。
【０１３８】
組換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明のもう一つの局面は、ベクター、特にＧＡＶＥ１９（又はその部分）をコードする核酸を含んでいる発現ベクターに関するものである。上記に説明したように、ベクターの一つのタイプは、「プラスミド」であり、それは他のＤＮＡ断片を連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループのことをいう。あるベクターは宿主細胞（例えば細菌性複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）の中で自律的複製が可能である。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞の中へ取り入れられて、宿主細胞のゲノム中へ組み込まれ、その結果宿主ゲノムに沿って複製される。尚、発現ベクターは、作動可能に連結した遺伝子の発現を支配することができる。一般に、組換えＤＮＡ技術において用いられる発現ベクターは、多くの場合プラスミド（ベクター）型で用いられる。しかしながら本発明は、同様の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターの他の型をも含むことを意図している。
【０１３９】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸発現に適する型の本発明に係る核酸分子を含んでいる。それは、本発明に係る組換え発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞を基礎として選択された一つ又はそれ以上の制御配列を含んでおり、そしてそれは発現すべき核酸に作動可能に連結している。組換え発現ベクターが「作動可能に連結している」とは、興味あるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を許容する態様（例えば、in vitro転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞中へ取り込まれたときは宿主細胞中において）で制御配列に連結していることを意味する。
【０１４０】
用語「制御配列」とは、プロモーター、エンハンサー及び他の発現制御因子（例えば、ポリアデニレーションシグナル）を含むことを意味する。そのような制御配列は、例えばGoeddel著Gene Expression Technology: Methods in Enzymology Vol. 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。制御配列は宿主細胞の多くのタイプにおけるヌクレオチド配列の直接構成的発現を含む（例えば、組織特異的制御配列）。当業者であれば、発現ベクターの設計は、トランスフォームする宿主細胞の選択、所望するタンパク質発現の程度等の要因に依存するものであることを理解できるものと思われる。本発明に係る発現ベクターは、ここに記載された核酸によってコードされたタンパク質又はペプチド（例えば、ＧＡＶＥ１９タンパク質、ＧＡＶＥ１９の突然変異体、融合タンパク質等）を産生するために、宿主細胞中へ取り込ませることができる。
【０１４１】
本発明に係る組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞、例えば大腸菌（E. coli
）のような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いて）、酵母細胞又は哺乳類細胞中で、ＧＡＶＥ１９を発現するように設計することができる。適当な宿主細胞については前述のGoeddelにおいて更に議論する。或いはまた、組換え発現ベクターは
、例えばＴ７プロモーター及び／又はＴ７ポリメラーゼのようなファージ制御因子及びタンパク質を用いて、in vitroで転写及び翻訳することができる。
【０１４２】
真核細胞におけるタンパク質発現は、融合又は非融合タンパク質の発現を支配する構成的又は誘導的プロモーターを含んでいるベクターを用いて、最も頻繁には大腸菌（E. coli）中で行われる。融合ベクターは多くのアミノ酸をそこでコードされたタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端へ付加する。そのような融合ベクターは典型的には三つの目的：１）組換えタンパク質の発現を増加させるため；２）組換えタンパク質の溶解度を増大させるため、及び３）アフィニティ精製においてリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助するために、役割を果たす。しばしば融合発現ベクターにおいては、タンパク質分解の切断部位を融合の接合部に導入し、融合体から組換えタンパク質の分離を可能とし、続いて融合タンパク質の精製を可能とする。そのような酵素及び同種の（cognate）識別配列は、Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターはpGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith et al., Gene (1988) 67: 31〜40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) 及びpRITS (Pharmacia, Piscataway, NJ)を含み、それらはグルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質へ融合させる。
【０１４３】
適当な誘導的非融合大腸菌（E. coli）発現ベクターは、pTrc (Amann et al., Gene (1988) 69: 301〜315) 及びpET lld (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, California (1990) 185: 60〜89)を含んでいる。ｐＴｒｃベクター由来の標的遺伝子発現はハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。
【０１４４】
大腸菌（E. coli）における組換えタンパク質発現を最適化する一つの方策は、組換え
タンパク質をタンパク質分解によって切断する能力を欠損した宿主においてタンパク質を発現させることである（Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymolygy, Academic Press, San Diego, California (1990) 185: 119〜128）。他のもう一つの方策は、発現ベクターへ挿入されるべき核酸分子の核酸配列を変更して、各アミノ酸に対する個々のコドンが大腸菌（E. coli）において好適に使用されるようにすることである（Wada et al., Nucleic Acids Res (1992) 20: 2111〜2118）。本発明に係る核酸分子のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術により行うことができる。
【０１４５】
他の実施態様において、ＧＡＶＥ１９発現ベクターは酵母発現ベクターである。パン酵母（S. cerevisiae）のような酵母における発現用のベクターの例としては、pYepSecl (Baldari et al., EMBO J (1987) 6: 229〜234)、pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30: 933〜943)、pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54: 113〜123)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 及び pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)が挙げられる。
【０１４６】
或いはまた、ＧＡＶＥ１９はバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞においても発現することができる。培養昆虫細胞においてタンパク質発現に使用可能なバキュロウイルスベクターには、pAc系(Smith et al., Mol Cell Biol (1983) 3: 2156〜2165) 及び
pVL 系 (Lucklow et al., Virology (1989) 170: 31〜39)が含まれる。
【０１４７】
尚他の実施態様において、本発明に係る核酸は哺乳類発現ベクターを用いて哺乳類細胞中でも発現される。ここで利用されている哺乳類発現ベクターの例としては、pCDM8 (Nature (1987) 329: 840参照)及びpMT2PC (Kaufman et al., EMBO J (1987) 6: 187〜195)が挙げられるが、但し、これらに限定されない。哺乳類細胞中で使用する場合は、発現ベクターの制御機能がしばしばウイルス制御因子によって提供される。例えば、よく使用されるプロモーターはポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０由来のものである。原核細胞及び真核細胞の双方に対する他の適当な発現系については、上記のSambrook等の文献第１６及び１７章を参照することができる。
【０１４８】
他のもう一つの実施態様において、本発明に係る組換え哺乳類発現ベクターは、好適には或る特殊な細胞型（例えば、組織特異的制限因子が核酸の発現に使用されているもの）において、核酸の発現を支配することができる。組織特異的制御因子は技術水準として既知のものである。適当な組織特異的プロモーターの例示列挙としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異性；Pinkert et al., Genes Dev (1987) 1: 268〜277）、リンパ球特異的プロモーター (Calame et al., Adv Immunol (1988) 43: 235〜275)、特にＴ細胞受容体のプロモーター (Winoto et al., EMBO J (1989) 8: 729〜733) 及び免疫グロブリン (Banerji et al., Cell (1983) 33: 729〜740; Queen et al., Cell (1983) 33: 741〜748)、ニューロン特異的プロモーター (例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne et al., Proc Natl Acad Sci USA (1989) 86: 5473〜5477)、膵臓特異的プロモーター (Edlund et al., Science (1985) 230: 912〜916) 及び乳腺特異的プロモーター (例えば、乳清プロモーター; U.S. Patent No. 4,873,316 及び Europe Application No. 264,166) を挙げることができる。発生制御プロモーターもまた含まれ、例えばマウスホックスプロモーター (Kessel et al., Science (1990) 249: 374〜379) 及びα−フェトプロテインプロモーター(Campes et al., Genes Dev (1989) 3: 537〜546)がある。
【０１４９】
本発明は更に発現ベクター中にアンチセンス配位にクローンした本発明に係るＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡに対してアンチ
センスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写により）を許容する態様で、ＤＮＡ分
子が制御配列に操作可能に連結している。アンチセンス配位にクローンした核酸に作動可能に連結された制御配列は、種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を支配するように選択することができる。例えば、ウイルスのプロモーター及び／又はエンハンサー又は制御配列は、アンチセンスＲＮＡの構成的組織特異的又は細胞型特異的発現を支配するように選択することができる。
アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率制御領域の調節の下に産生される、組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウイルスの型をしていて、その活性はベクターが導入された細胞型によって判定することができる。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の制御についての議論は、Weintraub等の文献（Reviews-Trends in Genetics, Vol 1 (1) 1986）を参照することができる。
【０１５０】
本発明の他のもう一つの局面は、本発明に係る組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関するものである。用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、ここでは相互に変換可能に用いられている。そのような用語は単に特別な対象細胞を意味するのではなく、またそのような細胞の子孫又はその潜在的子孫をも意味するものである。突然変異又は環境の影響のいずれかにより継代培養中にはいくつかの変化が起こり得るから、そのような子孫は実際には親細胞とは同一ではないかも知れないが、しかしながら尚ここで使用される用語の範囲内に含まれる。
【０１５１】
宿主細胞はいかなる原核細胞又は真核細胞であってもよい。例えば、ＧＡＶＥ１９タンパク質は大腸菌（E. coli）のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母又は哺乳類細胞（例えば
チャィニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、２９３細胞又はＣＯＳ細胞）中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者にとっては既知のものである。ベクターＤＮＡは通常のトランスフォーメーション又はトランスフェクション技術を用いて原核細胞又は真核細胞中へ導入することができる。ここで使用されている用語「トランスフォーメーション」及び「トランスフェクション」は、外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中へ導入するための技法として認知された各種の技術を意味し、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈殿、形質導入、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが含まれる。
【０１５２】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションのためには、使用する発現ベクター及びトランスフェクション技術にもよるが、細胞のほんの少数のもののみが外来性ＤＮＡをゲノム中へ組み込むに過ぎないことが知られている。この組込み体を同定し及び選択するためには、選択マーカー（例えば、抗生物質に耐性を与える）をコードしている遺伝子を一般に興味ある遺伝子と共に宿主細胞中へ取り込ませる。好適な選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ヒグロマイシン及びメトトレキサートのような薬剤耐性を付与するものがある。選択的マーカーをコードする核酸は、ＧＡＶＥ１９をコードしている同一ベクターを用いて、又は他のベクターを用いて、宿主細胞へ導入することができる。導入された核酸により安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって同定することができる（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞に死滅する）。
【０１５３】
培養されている原核細胞又は真核細胞のような本発明に係る宿主細胞は、ＧＡＶＥ１９タンパク質を産生（即ち、発現）するのに使用することができる。それ故、本発明は、本発明に係る宿主細胞を用いたＧＡＶＥ１９タンパク質を産生する方法をも提供するものである。或る実施態様においては、その方法は、ＧＡＶＥ１９タンパク質が生成されるような安定培地中で本発明に係る宿主細胞（ＧＡＶＥ１９をコードする組換え発現ベクターが既に導入されているもの）を培養することを含む。他の実施態様においては、その方法は、培地又は宿主細胞からＧＡＶＥ１９を単離することを更に含むものである。
【０１５４】
他のもう一つの実施態様においては、ＧＡＶＥ１９は、修飾された発現ベクターにサブ
クローンした他のタンパク質の組換え発現のための誘導的発現系を含んでいる。例えば、突然変異を起こしたＧタンパク質を含んでいる宿主細胞（例えば、酵母細胞、Ｙ２副腎皮質細胞及び-cyc S49, U.S. Pat. Nos. 6,168,927B1, 5,739,029 及び 5,482,835; Mitchell et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89 (19): 8933〜37 及び Katada et al., J Biol Chem (1984) 259 (6): 3586〜95参照）は、ＧＡＶＥ１９が宿主細胞中で機能的に発現しているＧＡＶＥ１９をコードしている核酸配列を含んでいるベクター第一発現ベクターで形質導入される。例え、発現されたＧＡＶＥ１９が構成的活性であっても、突然変異体は信号伝達を許容するものではない；即ち、下流カスケード方向のＧタンパク質の活性化は起こらない（例えば、アデニリルシクラーゼの活性化は起こらない）。それ故に、第二発現ベクターがＧＡＶＥ１９含有宿主細胞の形質導入に使用される。第二ベクターは宿主細胞のＧタンパク質突然変異に対して相補的な構造遺伝子（即ち、機能的な哺乳類又は酵母Ｇs、Ｇi、Ｇo、又はＧq、例えばＰＣＴ Publication No. WO 97／48820; U.S. Pat. Nos. 6,168,927 B1, 5,739,029及び5,482,835参照）を、誘導系によって発現させるべき興味ある遺伝子に加えて含んでいる。
第二ベクターの相補的構造遺伝子は誘導的であり、即ち、外因性的に添加された成分の調節下において (例えば、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、低分子等、上述のSambrook et al., 参照)、相補的構造遺伝子に作動可能に連結しているプロモーターを活性化する。インデューサー（誘導物質）に加えて、相補的構造遺伝子によりコードされたタンパク質は機能的に発現し、構成的活性なＧＡＶＥ１９は複合体を形成し、そして適当な下流経路の活性化を導く（例えば、二次メッセンジャーの形成）。二次ベクターを含んでいる興味ある遺伝子は、適当な二次メッセンジャー（例えば、ＣＲＥＢ、ＡＰ１因子）によって活性化された作動可能に連結しているプロモーターを有している。このように、二次メッセンジャーが蓄積するにつれて、興味ある遺伝子から上流のプロモーターは当該遺伝子産物を発現するように活性化される。誘導物質がないときは、興味ある遺伝子の発現は、スイッチオフとなる。
【０１５５】
特別な実施態様においては、誘発的発現系の宿主細胞としてはＳ４９（ｃｙｃ-）細胞
があるが、但し、これに限定されない。Ｇタンパク質突然変異を含むように意図した細胞系は、適当な突然変異は人工的に作成／構成することができる。（U.S. Pat. Nos. 6,168,927B1, 5,739,029及び5,482,835, 酵母細胞系、参照）。
【０１５６】
関連した局面として、配列番号２において説明したようにタンパク質をコードしている配列を含んでいるｃＤＮＡに作動可能に連結したベクターにより細胞はトランスフェクトされる。そのような系を含んでいる一次及び二次ベクターとしては、pCDM8 (Seed, Nature (1987) 329: 840) 及び pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J (1987) 6: 187〜195)、pYepSecl (Baldari et al., EMBO J (1987) 6: 229〜234)、pMFa (Kurjan et al., Cell (1982) 30: 933-943、pJRY88 (Schultz et al., Gene (1987) 54: 113〜123)、pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) 及び pPicZ (Invitrogen Corp, San Diego, CA)が挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【０１５７】
また関連した局面として、宿主細胞はそのような適当な方法によりトランスフェクトされ、トランスフェクションの結果として、機能的ＧＡＶＥ１９タンパク質が発現される（例えば、上述のSambrook et al., 及びKriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY, 1990）。そのような「機能的タンパク質」には、発現後にＧタンパク質と複合体を形成するが、そこではＧタンパク質が二次メッセンジャー形成を制御しているようなタンパク質が含まれるが、但し、これらに限定されない。ここで利用される宿主細胞にトランスフェクトする他の方法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション（電気穿孔）、マイクロインジェクション（微量注入）、トランスダクション（形質導入）、セルフュージョン（細胞融合）、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子ガンの使用、又はＤＮＡベクタートランスポーター（例えば、Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963〜967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621〜14624; Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311, filed March 15, 1990参照）が挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【０１５８】
本発明においては、プロモーターの多彩な利用法がある。実際本発明に係るポリペプチドの発現は、技術水準として既知のいかなるプロモーター／エンハンサー因子によってでも制御され得るが、しかしながらこれらの制御因子は発現のために選択された宿主中で機能的でなければならない。ＧＡＶＥ１９発現を調節するのに用いられるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Benoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304〜310）、ラウス肉腫ウイルスの３′末端の長いリピート配列中に含まれているプロモーター（Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787〜797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natle. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441〜1445）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinster et al., 1982, Nature 296: 39〜42）、β−ラクタマーゼプロモーターのような原核細胞の発現ベクター（Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727〜3731）又はｔａｃ プロモーター (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 80: 21〜25)が含まれるが、但し、これらに限定されない。尚、以下の文献をも参照することができる。「Useful proteins from recombinant bacteria」in Scientific American, 1980, 242: 74〜94; Ｇａｌ４プロモーターのような酵母又は他の菌類由来のプロモーター因子、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター; 組織特異性を有し、トランスジェニック動物に使用される動物転写調節領域: 膵小胞体細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swift et al., 1984, Cell 38: 639〜646; Ormitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399〜409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425〜515）; 膵臓β細胞中で活性なインスリン遺伝子調節領域 (Hanahan, 1985, Nature 315: 115〜122), リンパ球で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域 (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647〜658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533〜538; Alexander et al., 1987, Mol, Cell. Biol. 7: 1436-1444)、精巣、乳房、リンパ球及びマスト細胞中で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., 1986, Cell 45: 485〜495）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268〜276）、肝臓で活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639〜1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53〜58）、肝臓で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devil. 1: 161〜171）、骨髄細胞で活性なβ−グロビン遺伝子調節領域（Mogram et al., 1985, Nature 315: 338〜340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89〜94）、脳の乏突起膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readhead et al., 1987, Cell 48: 703〜712）、骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Sani, 1985, Nature 314: 283〜286）、及び視床下部で活性な性腺刺激ゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域（Mason et al., 1986, Science 234: 1372〜1378）。
【０１５９】
本発明に係る核酸分子を含んでいる発現ベクターは四つの一般的アプローチによって同定することができる：（ａ）所望するプラスミドＤＮＡ又は特異的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅、（ｂ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｃ）選択マーカー遺伝子機能の存在又は不存在、（ｄ）挿入された配列の発現。最初のアプローチでは、核酸は増幅産物の検出に供給するためにＰＣＲで増幅することができる。２番目のアプローチでは、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたマーカー遺伝子に相同な配列を含んでいるプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。３番目のアプローチでは、組換えベクター／宿主系は、ベクターに外来遺伝子を挿入することによって生じた或る「選択マーカー」遺伝子機能（例えば、β−ガラクトシダーゼ活性、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、トランスフォーメーション表現型、バキュロウイルスでの封入体（occlusion body）の形成等）の存在又は欠損に基づいて同定及び選択することができる。他の実施態様において、もしＧＡＶＥ１９タンパク質、そのバリアント、又はその類似体若しくは誘導体をコードしている核酸がベクターの「選択マーカー」遺伝子配列の中に挿入された場合、その挿入物を含んでいる組換え体はＧＡＶＥ１９遺伝子機能の欠損により同定することができる。４番目のアプローチでは、組換え発現ベクターは、発現したタンパク質は機能的に活性な立体配座であるという条件で、組換え体によって発現された遺伝子産物の活性、生化学的又は免疫学的特性を検定することにより同定することができる。
【０１６０】
本発明のＤＮＡ配列の発現には、種々の宿主／発現ベクター組合せを採用することができる。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列のセグメント（分節）から構成されている。適当なベクターとしては、ＳV４０の誘導体、及び細菌
プラスミドで、例えば、大腸菌（E. coli）プラスミドｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Smith et al., 1988,G ene 67: 31-40）、ｐＭＢ９及びそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡＳ、例えばλファージの種々の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、及び他のファージＤＮＡ、例えばＭ１３、及び一本鎖繊維状ファージＤＮＡ；２μプラスミド又はその誘導体のような酵母プラスミド；昆虫又は哺乳類細胞で有用なベクターのような真核細胞で有用なベクター；ファージＤＮＡと組合せるために修飾されたプラスミドのようなプラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されたベクター、又は他の発現調節配列等が挙げられる。
【０１６１】
例えば、バキュロウイルス発現系においては、非融合トランスファーベクターとしては、ｐＶＬ９４１（BamHIクローニング部位；Summers）、ｐＶＬ１３９３（BamHI, SmaＩ, XbaＩ, EcoRI, NotＩ, XmaIII, BglII, 及びPstＩクローニング部位; Invitrogen）、ｐＶＬ１３９２（BglII, PstＩ, NotＩ, XmaIII, EcoRI, XbaＩ, SmaＩ, 及びBamHIクローニング部位; Summers and Invitrogen）、及びｐＢｌｕｅＢａｃIII（BamHI, BglII, PstＩ, NcoＩ, 及びHindIIIクローニング部位、青色／白色組換えスクリーニング可; Invitrogen）、並びに融合トランスベクターとしては、ｐＡｃ７００（BamHI及びKpnＩクローニング部位、ここでBamHI認識部位は開始コドンにより開始する; Summers）、ｐＡｃ７０１及びｐＡｃ７０２（読取り枠以外はpAc700に同じ）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドリン開始コドンの下流３６塩基対のBamHIクローニング部位; Invitrogen (195)）、及びpBlueBacHisA、B、C（３種の異なる読取り枠、BamHI, BglII, PstＩ, NcoＩ, 及びHindIIIクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ精製のためのＮ末端ペプチド、及びプラークの青色／白色組換えスクリーニング; Invitrogen(220)）を使用することができるが、但し、これらに限定されない。
【０１６２】
本発明において使用され得る哺乳類発現ベクターには、シヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）のような誘発的プロモーター、例えば、ｐＥＤ（クローンされた遺伝子及びＤＨＦＲ双方を発現するベクターによるPstＩ，SalＩ，SbaＩ，SmaＩ，及びEcoRIクローニン
グ部位; Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)）のような
ＤＨＦＲ発現ベクター、又はＤＨＦＲ／メトトレキサート共役増幅ベクターのいかなる発現ベクターをも含む。或いはまた、ｐＥＥ１４（HindIII, XbaＩ, SmaＩ, SbaＩ, EcoＩ,
及びBclＩクローニング部位で、そこではベクターがグルタミンシンターゼ及びクローンされた遺伝子を発現している; Celltech）のようなグルタミンシンテターゼ／メチオニンスルホキシミン共役増幅ベクターが含まれる。
他の実施態様においては、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）の調節下のエピソーム発現を支配するベクター、例えばｐＲＥＰ４（BamHI, SfiＩ, XhoＩ, NotＩ, NheＩ, HindIII, NheＩ, PvuII，及びKpnＩクローニング部位, 構成的RSV−LTRプロモーター, ハ
イグロマイシン選択マーカー; Invitrogen）、ｐＣＥＰ４（BamHI, SfiＩ, XhoＩ, NotＩ
, NheＩ, HindIII, NheＩ, PvuII,及びKpnＩクローニング部位, 構成的hCMV極初期遺伝子, ハイグロマイシン選択マーカー; Invitrogen）、ｐＭＥＰ４（KpnＩ, PvuＩ, NheＩ, HindIII, NotＩ, XhoＩ, SfiＩ, BamHIクローニング部位, 誘発的メタロチオネインIia遺
伝子プロモーター, ハイグロマイシン選択マーカー; Invitrogen）、ｐＲＥＰ８（BamHI,
XhoＩ, NotＩ, HindIII, NheＩ, 及びKpnＩクローニング部位, RSV-LTRプロモーター, 
ヒスチジノール選択マーカー; Invitrogen）、ｐＲＥＰ９（KpnＩ, NheＩ, HindIII, NotＩ, XhoＩ, SfiＩ，及びBamHIクローニング部位, RSV−LTRプロモーター, G４１８選択マーカー; Invitrogen）、及びｐＥＢＶＨｉｓ（RSV-LTRプロモーター，ハイグロマイシン選択マーカー, ProBond 樹脂で精製されエンテロキナーゼで開裂されるＮ末端ペプチド; Invitrogen）が挙げられる。
本発明において使用される選択的哺乳類発現ベクターには、ｐＲｃ／ＣＭＶ（HindIII,
BstXI, NotＩ, SbaＩ, 及びApaＩクローニング部位, G418選択; Invitrogen)、ｐＲｃ／ＲＳＶ（HindIII, SpeＩ, BstXI, NotＩ, XbaＩクローニング部位, G418選択; Invitrogen)、 及びその他のものが含まれる。本発明に従って用いられるワクシニアウイルス哺乳類発現ベクター（上記のKaufman, 1991参照）には、ｐＳＣ１１(SmaＩクローニング部位, TK-及びβ-gel選択)、ｐＭＪ６０１（SalＩ, SmaＩ, AflＩ, NarＩ, BspMII, BamHI, ApaＩ, NheＩ, SacII, KpnＩ, 及びHindIIIクローニング部位; TK-及びβ-gel選択)、及びpTKgptF1S（EcoRI, PstＩ, SalＩ, AccＩ, HindII, SbaＩ, BamHI, 及びHpaクローニング部位, TK又はXPRT選択）が含まれるが、但しこれらに限定されない。
【０１６３】
酵母発現系も、本発明に基づいて、ＧＡＶＥ１９タンパク質、そのバリアント、或いはその類似体又は誘導体を発現するために使用することができる。例えば、非融合pYE32ベ
クター（XbaＩ, SphＩ, ShoＩ, NotＩ, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacＩ, KpnＩ及びHindIIIクローニング部位; Invitrogen)又は融合pYESHisA、B、C（XbaＩ, SphＩ, ShoＩ,
NotＩ, BstXI, EcoRI, BamHI, SacＩ, KpnＩ, 及びHindIIIクローニング部位, ProBond 樹脂で精製されエンテロキナーゼで開裂されるＮ末端ペプチド; Invitrogen）の二つを挙げることができるが、これらは本発明に従って使用することができる。
【０１６４】
一旦或る組換えＤＮＡ分子が同定されて単離されれば、技術水準として既知の数種の方法を増殖のために使用することができる。一旦適当な宿主系及び増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増殖して定量的に調製することができる。上記に説明したように、使用することができる発現ベクターは、以下のベクター又はそれらの誘導体を含むが、但し、これらに限定されない：ワクシニアウイルス又はアデノウイルスのようなヒト又は動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、並びにプラスミド及びコスミドＤＮＡベクターを挙げることができる。
【０１６５】
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調整し、或いは所望する特別な様態に遺伝子産物を修飾し及びプロセスするように選択することができる。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳及び翻訳後のプロセス及び修飾（例えば、グリコシル化、開裂（例えば、シグナル配列の)）のための特性及び特異的機構を有している。適当な細胞系又は宿主システムは発現された外来タンパク質の所望する修飾及びプロセスを確かなものとするように選択することができる。例えば、細菌システムにおける発現は、非グリコシル化のコアタンパク質産物を産生するように使用することができる。
【０１６６】
トランスジェニック動物
本発明に係る宿主細胞は、またトランスジェニック動物を作成するためにも使用することができる。例えば、或る実施態様においては、本発明の宿主細胞は、ＧＡＶＥ１９コード配列が導入された受精卵母細胞又は胚幹細胞であり、そのような宿主細胞は外因性ＧＡＶＥ１９配列がゲノム中へ導入されているヒト以外のトランスジェニック動物、又は内因
性ＧＡＶＥ１９配列が変異した相同組換え動物を創り出すために使用することができる。そのような動物は、ＧＡＶＥ１９の機能及び／又は活性を研究するのに、並びにＧＡＶＥ１９活性の修飾因子の同定及び／又は評価のために有用である。ここで使用されている「トランスジェニック動物」とは、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類で、その中で、一つ又はそれ以上の動物細胞が導入遺伝子を含んでいることをいう。トランスジェニック動物の例には、ヒト以外の霊長類、羊、犬、牛、山羊、鶏、ラット、両生類等が含まれる。
【０１６７】
ここで使用されている用語「導入遺伝子」とは、トランスジェニック動物が成長し、生体となってもゲノム中に維持されている細胞のゲノム中へ取り込まれた外因性ＤＮＡを意味する。導入遺伝子は、トランスジェニック動物の一つ又はそれ以上の細胞型又は組織中のコードされた遺伝子産物の発現を支配する。
ここで使用されている「相同組換え動物」とは、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳類で、その中では内因性ＧＡＶＥ１９遺伝子が相同組換えによって変異しているものをいう。そしてそれは、内因性遺伝子及び動物細胞（例えば、成体動物へと分化する以前の動物の胚細胞）中へ導入された外因性ＤＮＡ分子間において行われる。
【０１６８】
本発明に係るトランスジェニック動物は、上記のトランスフェクション方法の一つを用いて、ＧＡＶＥ１９をコードする核酸分子を受精卵母細胞の雄性前核中へ導入することによって創出することができる。そして卵母細胞は偽妊娠の雌の養親中で成長することができる。例えば、ＧＡＶＥ１９ ｃＤＮＡ配列、例えば配列番号1のものをヒト以外の動物のゲノム中へ導入遺伝子として導入することができる。
イントロン配列及びポリアデニル化信号もまた導入遺伝子発現の効率を高めるために、導入遺伝子の中に含ませることができる。組織特異的制御配列は、特別な細胞中でＧＡＶＥ１９タンパク質発現を支配するために、ＧＡＶＥ１９導入遺伝子へ作動可能に連結することができる。胚操作及び微量注入（マイクロインジェクション）によりトランスジェニック動物を発生させる方法は技術常識であり、例えば、U.S. Patent Nos. 4,736,866、及び4,870,009、及び4,873,191に記載されている、類似する他の方法も、動物の組織又は細胞中におけるゲノム中の導入遺伝子及び／又はＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡの発現により他のトランスジェニック動物の作成に使用することができる。そして初代のトランスジェニック動物は、当該導入遺伝子を持っている別の動物を繁殖するために使用することができる。尚その上、ＧＡＶＥ１９をコードする導入遺伝子を持っているトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を持つ他のトランスジェニック動物を作成するために交配することもできる。
【０１６９】
相同組換え動物を創出するために、ベクターは、例えばＧＡＶＥ１９遺伝子を機能的に変異させるために欠損、付加又は置換を導入したＧＡＶＥ１９遺伝子の少なくとも一部を含んでいるように調製する。特別な実施態様においては、ベクターは、相同組換え上で、内因性ＧＡＶＥ１９遺伝子が機能的に乱された（即ち、機能的タンパク質をもはやコードできない；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）ように設計することもできる。
【０１７０】
或いはまた、ベクターを、相同組換え体中で、内因性ＧＡＶＥ１９遺伝子が突然変異し、又は他の変異をしているが機能的タンパク質を依然としてコードしているように設計することもできる（例えば、上流の制御領域が変異し、その結果内因性ＧＡＶＥ１９タンパク質の発現が変異する）。
【０１７１】
相同組換えベクターにおいては、ＧＡＶＥ１９遺伝子の変異を受けた部分は、ＧＡＶＥ１９遺伝子の付加的核酸配列によって５′及び３′末端において縁取られており、ベクターにより運び込まれた外因性ＧＡＶＥ１９遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＧＡＶＥ１９遺伝子の間に起こる相同組換えを許容する。この付加的なＧＡＶＥ１９のフランキング核酸配列は、内因性遺伝子と良好な相同組換えのために十分な長さである。典型的には、数キロ塩基のフランキングＤＮＡ（５′及び３′末端の双方に）がベクター中に含まれている（例えば、相同組換えベクターの記載についてはThomas et al., Cell (1987) 51: 503参照）。
【０１７２】
ベクターを胚幹細胞系（例えば、電気穿孔により）に導入し、導入されたＧＡＶＥ１９遺伝子が内因性ＧＡＶＥ１９遺伝子と相同的に組換えした細胞を選択する（例えば、Li et al., Cell (1992) 69: 915）。そして選択した細胞を動物の胚盤胞中へ注入すると、集合キメラが形成される（例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL, Oxford, (1987) pp. 113〜152参照）。その後キメラ胚は適当な偽妊娠の雌の養親に移植し、そして胚を生産に至らしめる。胚細胞に相互組換えＤＮＡを有している子孫は動物の育種に使用することができ、その動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖細胞透過によって相同的に組み換えられたＤＮＡを含んでいる。
【０１７３】
相同組換えベクター及び相同組換え動物を作成する方法については、更に、Bradley, Current Opinion in Bio／Technology (1991) 2: 823〜829及びPCT Publication Nos. WO 90／11354、WO 91／01140、WO 92／0968及びWO 93／04169に記載されている。
【０１７４】
他のもう一つの実施態様において、非ヒトトランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を制御できるような選択的システムを含むように作成することができる。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムである。このｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムの記載については、例えばLakso et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 6232〜6236を参照することができる。レコンビナーゼシステムのもう一つの例としては、サッカロミセスセレビシェ（S. cerevisie）のＦＬＰレコンビナーゼシステムがある（O'Gorrnan et al., Science (1991) 251: 1351〜1355）。もし、ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムを導入遺伝子の発現制御に使用する場合は、ｃｒｅレコンビナーゼと選択したタンパク質の双方をコードする導入遺伝子を含んでいる動物が必要となる。そのような動物は「二重」トランスジェニック動物の作成によって供給され得るが、それは、例えば、一方は選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方はレコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含んでいる２匹のトランスジェニック動物を交配させることにより作成することができる。
【０１７５】
ここで記載した非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、またWilmut et al., Nature (1997) 385: 810〜813及びPCT Publication Nos. WO 97／07668及びWO 97／07669に記載されている方法に従っても作成することができる。簡単に説明すると、例えばトランスジェニック動物から体細胞を単離し、そして成長周期を脱してＧo期へ入るように誘導する。その後静止期の細胞を、例えば電気パルスを用いて、当該静止期の細胞が単離されたものと同種の動物からの除核卵母細胞に融合させることができる。そして再構成した卵母細胞を培養し、桑実胚又は胚盤胞にまで成長させ、その後偽妊娠の雌の養親に移植する。その雌の養親動物から生まれた子供は、例えば単離された体細胞由来の動物のクローンである。
【０１７６】
本発明の使用及び方法
本発明に係る核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、抗体及びそれらのフラグメントは以下の方法の一つ又はそれ以上に使用することができる：ａ）スクリーニング検定；ｂ）探知検定法（例えば、染色体マッピング、組織類別、法生物学）；ｃ）予測医学（例えば、診断検定、予後検定、臨床試験のモニタリング及び薬理ゲノム）：及びｄ）治療法（例えば、治療及び予防）。ＧＡＶＥ１９タンパク質は他の細胞内タンパク質と相互作用し、それ故（ｉ）細胞増殖の制御；（ii）細胞分化の制御；及び（iii）細胞生存の制御
に使用することができる。
本発明に係る単離された核酸分子は、ＧＡＶＥ１９タンパク質の発現（例えば、遺伝子治療の応用では宿主細胞中での組換え発現ベクターを経由して）のためＧＡＶＥ１９ ｍ
ＲＮＡの検出（例えば、生物学標品中の）又はＧＡＶＥ１９遺伝子における遺伝的傷害の検出のため、及びＧＡＶＥ１９活性の調節のために使用することができる。付言するに、ＧＡＶＥ１９タンパク質はＧＡＶＥ１９活性又は発現を調節する薬剤又は化合物のスクリーニングにも使用することができる。そのような薬剤又は化合物は、関節リウマチ、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）等のような炎症性の病気の治療に容易に利用することができる。ＧＡＶＥ１９野生型タンパク質に比べて低下した又は異常な活性を示すＧＡＶＥ１９タンパク質産生のスクリーニングも本発明を用いて行うことができる。加えて、本発明に係る抗−ＧＡＶＥ１９抗体は、ＧＡＶＥ１９タンパク質の検出及び単離にも、またＧＡＶＥ１９活性の調節にも使用することができる。本発明は更に上記スクリーニング検定によって同定された新規薬剤及びここに記載したような治療としてのその使用にも及ぶものである。
【０１７７】
スクリーニング検定
内因性リガンドの存在下におけるＧタンパク質の活性化は、Ｇタンパク質受容体複合体を形成し、そしてＧＴＰがＧタンパク質へ結合するように導く。Ｇタンパク質のＧＴＰアーゼドメインは徐々にＧＴＰをＧＤＰへと加水分解し、通常の条件においては、受容体は不活性化される。しかしながら、構成的に活性化された受容体はＧＴＰをＧＤＰへ加水分解し続ける。
【０１７８】
Ｇタンパク質による加水分解を受けない基質、［35Ｓ］ＧＴＰγＳは、構成的に活性化された受容体を発現する膜への結合の増強をモニターするのに使用することができる。TraynorとNahorskiは、［35Ｓ］ＧＴＰγＳを、リガンドの存在下及び不在下において、Ｇタンパク質が膜に結合するのをモニターするのに使用できることを報告している（Traynor et al., Mol Pharmacol (1995) 47 (4): 848〜54）。そのような検定システムの好ましい使用は、候補化合物の一次スクリーニングであり、その理由は、受容体に結合する特殊なＧタンパク質を考慮することなしに、全てのＧタンパク質共役型受容体に対してそのシステムは一般的に利用できるからである。
【０１７９】
Ｇs20は酵素アデニリルシクラーゼを刺激するが、Ｇi及びＧoはその酵素を阻害する。
技術常識として、アデニリルシクラーゼはＡＴＰをｃＡＭＰに変換するのを触媒することはよく知られている；それ故Ｇsタンパク質と共役する構成的に活性化されたＧＰＣＲは
、ｃＡＭＰの増大した細胞内レベルと関係している。或いはまた、Ｇi（又はＧo）タンパク質と共役するかも知れない構成的に活性化されたＧＰＣＲは、ｃＡＭＰの低下した細胞内レベルと関係している。「Indirect Mechanism of Synaptic Transmission」, Chpt. 8, from Neuron to Brain (3rdEd.), Nichols et al. Sinauer Associates, Inc., 1992参照。それ故、ｃＡＭＰを検出する測定法は、候補化合物が受容体に対してインバースアゴニストであるか否かを決定するのに使用することができる。技術常識として知られている多くのアプローチがｃＡＭＰの測定に利用することができる。或る実施態様においては、抗−ｃＡＭＰ抗体がＥＬＩＳＡ−基本フォーマット中で使用される。他の実施態様では、全細胞二次メッセンジャーレポーターシステム検定法が考慮される（PCT Publication No. WO 00／22131参照）。
【０１８０】
関連した局面において、サイクリックＡＭＰは、ｃＡＭＰ応答ＤＮＡ結合タンパク質又は転写因子（ＣＲＥＢ）を刺激し、ｃＡＭＰ応答因子と呼ばれる特異な部位でプロモーターに結合させて、遺伝子の発現方向に向わせることによって、遺伝子発現を促進する。このようにして、レポーターシステムは多重ｃＡＭＰ応答因子を含んでいるプロモーターが例えばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子の前方になるように構成することができる。尚、構成的に活性化されたＧs−連結受容体がｃＡＭＰの蓄積を起こすにつれて、遺伝子及びレポータータンパク質の発現を活性化する。そしてβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼのようなレポータータンパク質は、標準的生化学的検定法により検出される（PCT Publication No. WO 00／22131）。
【０１８１】
Ｇo及びＧqのような他のＧタンパク質は、酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関係し、次いでリン脂質、ＰＩＰ２を加水分解して、２種の細胞内メッセンジャー: ジアセチルグリセロール（ＤＡＧ）及びイノシトール１,４,５−トリホスフェート（ＩＰ３）を放出する。ＩＰ３の蓄積増大はＧq−会合受容体及びＧo−会合受容体（PCT Publication No. WO 00／22131）の活性化に関係している。ＩＰ３蓄積を検出する検定法は候補化合物がＧq−
会合受容体又はＧo−会合受容体に対するインバースアゴニストであるか否かを判定する
のに使用することができる。Ｇq−会合受容体はＧq依存性ホスホリパーゼＣがＡＰ１因子を含んでいる遺伝子の活性化を起こすか否かを測定するＡＰ１レポーター検定法を用いても判定することができる。このようにして、活性化されたＧq−会合受容体は、インバー
スアゴニストが当該発現を低下させるのに対し、当該遺伝子の発現を増加させることが実証される。
【０１８２】
修飾因子即ちＧＡＶＥ１９タンパク質に結合する又は例えばＧＡＶＥ１９発現又はＧＡＶＥ１９活性を促進又は阻害する候補化合物、テスト化合物又は薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物（mimetics）、低分子、又はその他の薬剤等）を同定する方法（ここでは「スクリーニング検定」という）も提供される。
【０１８３】
或る実施態様において、本発明は、ＧＡＶＥ１９タンパク質、ポリペプチド又はそれらの生物学的に活性な部分の膜結合型に結合するか又はその活性を修飾する候補化合物又はテスト化合物の検定法を提供する。本発明のテスト化合物は、技術常識として知られているコンビナトリアルライブラリー法における数多くのいかなるアプローチをも用いて入手することができるが、ライブラリーには、生物学的ライブラリー；空間的に記憶可能な並列ライブラリー（固相又は液相）；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法; 「一ビーズ一化合物」ライブラリー法; アフィニティクロマトグラフィー選択を用いた合成ライブラリー法がある。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の低分子ライブラリー（Lam, Anticancer Drug Des (1997) 12: 145）に対しても利用可能である。
【０１８４】
分子ライブラリーの合成法の例は、技術常識として例えばDeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA (1993) 90: 6909; Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91: 11422; Zuckermann et al., J Med Chem (1994) 37: 2678; Cho et al., Science (1993) 261: 1303; Carrell et al., Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33: 2059; Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl (1994) 33: 2061; 及び Gallop et al., J Med Chem (1994) 37: 1233の文献中に記載されている。
【０１８５】
化合物のライブラリーは、溶液（例えば、Houghten Bio／Techniques (1992) 13: 41２〜421）又はビーズ (Lam, Nature (1991) 354: 8２〜84), チップス (Fodor, Nature (1993) 364: 555〜556), 細菌 (U.S. Patent No. 5,223,409), 胞子 (U.S. Patent Nos. 5,571,698; 5,403,484; 及び 5,223,409), プラスミド (Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 1865〜1869) 又はファージ (Scott et al., Science (1990) 249: 386〜390; Devlin, Science (1990) 249: 404〜406; Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 6378〜6382; 及び Felici, J Mol Biol (1991) 222: 301〜310)中で存在することができる。
【０１８６】
本発明の特別な実施態様において、検定法は細胞を基礎とした検定法であり、そこでは
細胞表面においてＧＡＶＥ１９タンパク質、又はその生物学的に活性な部分の膜結合型を発現している細胞がテスト化合物と接触し、そしてテスト化合物がＧＡＶＥ１９タンパク質に結合する能力が測定される。細胞は例えば酵母細胞又は哺乳類起源の細胞であってもよい。テスト化合物がＧＡＶＥ１９タンパク質に結合する能力の測定は、例えば、放射性同位元素又は酵素標識を有するテスト化合物との共役によって行うことができ、テスト化合物のＧＡＶＥ１９タンパク質、又はその生物学的に活性な部分との結合は複合体における標識化された化合物を検出することによって測定することができる。例えば、テスト化合物は125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ又は3Ｈで、直接的又は間接的に標識することができ、そして放射性同位元素は放射能放出の直接計測又はシンチレーション計測により検出することができる。或いはまた、テスト化合物は、例えば西洋ワサビペロキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼ等で酵素的に標識することもでき、そして酵素標識は適当な基質の生成物への変換を測定することによって検出することができる。
特別な実施態様において、検定法は、ＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的に活性な部分の膜結合型を発現している細胞表面に、ＧＡＶＥ１９に結合して検定混合物を形成する既知の化合物を接触させること、その検定混合物をテスト化合物に接触させること、及びＧＡＶＥ１９タンパク質と相互作用するテスト化合物の能力を測定することから成り、ここにおいてＧＡＶＥ１９タンパク質との相互作用するテスト化合物の能力の測定は、ＧＡＶＥ１９又はその生物学的に活性な部分に結合するテスト化合物の能力を既知化合物のものと比較することによって行うことができる。
【０１８７】
他の実施態様においては、検定法は、細胞を基礎とした検定法（cell-based assay）であり、ＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的に活性な部分の膜結合型を発現している細胞表面に、テスト化合物を接触させること、及びＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激する又は阻害する）テスト化合物の能力を測定することから成る。ＧＡＶＥ１９又はその生物学的に活性な部分の活性を調節するテスト化合物の能力測定は、例えばＧＡＶＥ１９タンパク質と結合する又はＧＡＶＥ１９標的分子と相互作用する能力を測定することによって行うことができる。ここで使用されている「標的分子」とは、ＧＡＶＥ１９タンパク質が実際に結合するか又は相互作用する分子をいい、例えばＧＡＶＥ１９タンパク質を発現している細胞表面上の分子、二次細胞の表面上の分子、細胞外液中の分子、細胞膜の内側表面に会合している分子、又は細胞質分子をいう。ＧＡＶＥ１９標的分子は、非ＧＡＶＥ１９分子であってもよく、或いは本発明に係るＧＡＶＥ１９タンパク質又はポリペプチドであってもよい。或る実施態様では、ＧＡＶＥ１９標的分子は、細胞外信号（例えば、化合物を膜結合ＧＡＶＥ１９分子に結合させることによって生じる信号）を細胞膜透過の及び細胞内への伝達を容易とする信号伝達経路の構成物である。標的は、例えば触媒活性を有する二次細胞内タンパク質又はＧＡＶＥ１９との下流信号分子との会合を容易にするタンパク質であってもよい。
【０１８８】
ＧＡＶＥ１９標的分子と結合又は相互作用するＧＡＶＥ１９タンパク質の能力測定は、直接的結合を測定する上記記載方法の一つを用いて行うことができる。特別な実施態様においては、ＧＡＶＥ１９標的分子と結合又は相互作用するＧＡＶＥ１９タンパク質の能力測定は、標的分子の活性を測定することにより行うことができる。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞内二次メッセンジャー（例えば、細胞内Ｃa2+、ジアシルグリセロール
、ＩＰ３等）の誘導の測定、適当な基質に対する標的の触媒／酵素活性の測定、レポーター遺伝子（例えば、検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼ、をコードする核酸に作動可能に連結しているＧＡＶＥ１９応答制御因子）の誘導の測定、又は細胞内応答、例えば細胞分化又は細胞増殖、の検出によって測定することができる。
【０１８９】
本発明は、更にＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的に活性な部分にテスト化合物を接触させること、及びＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的活性な部分に対するテスト化合物の結合能力の測定から成る無細胞系検定法にも及ぶものである。ＧＡＶＥ１９
タンパク質とテスト化合物の結合は上記記載の通り、直接的にも又は間接的にも測定することができる。好適な実施態様においては、検定法は、ＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的に活性な部分に、ＧＡＶＥ１９に結合して検定混合物を形成する既知の化合物を接触させること、その検定混合物をテスト化合物に接触させること、及びＧＡＶＥ１９タンパク質と相互作用するテスト化合物の能力を測定することを含み、ここにおいてＧＡＶＥ１９又はその生物学的に活性な部分に結合するテスト化合物の能力を既知化合物のものと比較することによって行うことができる。
【０１９０】
本発明に係る他の無細胞系検定法は、ＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的に活性な部分にテスト化合物を接触させること、及びＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的に活性な部分の活性を調節する（例えば、刺激する又は阻害する）テスト化合物の能力を測定することから成る。ＧＡＶＥ１９の活性を調節するテスト化合物の能力は、例えばＧＡＶＥ１９標的分子に対するＧＡＶＥ１９タンパク質の結合能力を直接結合を測定する上記記載の方法の一つを用いて測定することができる。他の実施態様においては、ＧＡＶＥ１９の活性を調節するテスト化合物の能力測定は、ＧＡＶＥ１９標的分子を更に調節するＧＡＶＥ１９タンパク質の能力を測定することによって行うことができる。例えば、適当な基質を用いたときの標的分子の触媒／酵素活性を上記記載のようにして測定することができる。
【０１９１】
尚、本発明に係る他の無細胞系検定は、ＧＡＶＥ１９タンパク質又はその生物学的活性部分にＧＡＶＥ１９と結合して検定混合物を作成する既知化合物を接触させること、その検定混合物をテスト化合物に接触させること、及びＧＡＶＥ１９タンパク質と相互作用するテスト化合物の能力を測定することから成る。ＧＡＶＥ１９タンパク質と相互作用するテスト化合物の能力を測定する工程は、ＧＡＶＥ１９タンパク質がＧＡＶＥ１９標的分子と好適に結合又は調節する能力を測定することを含んでいる。
【０１９２】
受容体は、必ずしもリガンド結合を阻害しないが、しかしＧタンパク質結合、そしておそらく活性化を引き起こす受容体凝集、二量体化又はクラスター化を可能とする受容体における構造的変化を引き起こす非リガンド分子によって活性化される。例えば、抗体は細胞表面にさらされたＧＡＶＥ１９の種々の部分において発生することができる。これらの抗体は、ｃＡＭＰレベル、又は細胞内Ｃａ2+レベルのモニターのような標準的検定法によって判定されるように、Ｇタンパク質のカスケードを経由して細胞を活性化することができる。分子マッピング及び特にエピトープマッピングが関与している故に、モノクローナル抗体がより好適である。モノクローナル抗体は細胞表面で発現された完全な受容体及び細胞表面で形成されることが知られているペプチドの双方に対して誘導される。Geysen et al., U.S. Pat. No. 5,998,577の方法は関連するペプチドの大多数を採集するのに使用することができる。ＧＡＶＥ１９を活性化することが知られている抗体は、補体結合反応のようなＧＡＶＥ１９活性化にとって異質な活性を最小限にするために修飾することができる。このように、抗体分子はＧＡＶＥ１９活性化以外の活性を最小限とする又は除去するために短縮化（truncated）又は変異化することができる。例えば、或る種の抗体は、抗原結合部分のみが必要とされる。このような場合は抗体のＦc部分は除去することができる。
【０１９３】
ＧＡＶＥ１９を発現している細胞は抗体にさらされることによってＧＡＶＥ１９を活性化するようになる。活性化された細胞は次に種々の分子にさらされることによりどの分子が受容体活性を調節するのかを同定することができ、その結果高い活性化レベル或いは低い活性化レベルであることが分かる。これらのゴールに達成した分子は、次に非活性化細胞に対する効果を観察するために、抗体なしでＧＡＶＥ１９を発現している細胞上で試験にかけることができる。標的分子は、次に既知の技術を用いて改変ＧＰＣＲ代謝の関係する障害の治療候補薬としてテストされ、そして修飾される。
【０１９４】
本発明に係る無細胞系検定は、ＧＡＶＥ１９の可溶型及び膜結合型の双方の型として使用することができる。ＧＡＶＥ１９の膜結合型から成る無細胞系検定の場合はＧＡＶＥ１９の膜結合型を溶液中に保持しておくために可溶化試薬を使用することが望ましい。そのような可溶化試薬としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１１４、ＴＨＥＳＩＴ、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）n、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、又はＮ−ドデシル＝Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートのような非イオン表面活性剤が含まれる。
【０１９５】
本発明に係る上記の検定法の一つ以上の実施態様において、ＧＡＶＥ１９又はその標的分子のいずれかを固定化することによって、当該タンパク質の一つ又は双方の非複合体から複合体を分離することを容易にし、また当該検定の自動化に対応できるようにすることが望ましい。候補化合物の存在又は不在下における、テスト化合物のＧＡＶＥ１９との結合又はＧＡＶＥ１９と標的分子との相互作用は、反応混合物を収容するのに適当ないかなる容器中においても行うことができる。そのような容器には、ミクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心管が含まれる。或る実施態様においては、マトリックスに一つ又は両方のタンパク質が結合するドメインを付加するのために、融合タンパク質を提供することもできる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＧＡＶＥ１９融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質をグルタチオンＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）に吸着させることができる
。
或いはまた、グルタチオン−誘導化ミクロタイタープレートをテスト化合物と結合させることもできる。その後、非吸着標識的タンパク質又はＧＡＶＥ１９タンパク質のいずれかと上記混合物とを、複合体形成を促す条件下（例えば、塩及びｐＨの生理的条件下）でインキュベートする。インキュベート後、ビーズ又はミクロタイタープレート穴を洗浄して非結合成分を全て除去し、そして複合体を形成したものを直接的又は間接的に測定する。或いはまた、複合体をマトリックスから解離させ、そしてＧＡＶＥ１９結合又は活性レベルを標準的技術を用いて測定することができる。
【０１９６】
マトリックス上におけるタンパク質固定の他の技術は、本発明に係るスクリーニング検定においても使用することができる。例えば、ＧＡＶＥ１９又はその標的分子のいずれかをビオチンとストレプトアビジンとの抱合化を利用して固定化することができる。ビオチン結合のＧＡＶＥ１９又は標的分子は、技術常識として良く知られている技術を用いて（例えばbiotinylation kit, Pierce Chemicals, Rockford, IL）ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミド）から調製することができ、そしてストレプトアビジンをコートした９６穴プレート（Pierce Chemicals）の各穴に固定することができる。或いはまた、ＧＡＶＥ１９又は標的分子と反応するが、しかしＧＡＶＥ１９タンパク質の標的分子への結合には干渉しない抗体をプレートの各穴に対し誘導化することができる。インキュベーションにつれて、非結合標的分子又はＧＡＶＥ１９は抗体抱合により各穴の中に捕えられる。そのような複合体の検出法にはＧＳＴ−固定複合体について上記に記載したものに加えて、ＧＡＶＥ１９又は標的分子と活性な抗体を使用した複合体の免疫検出法、並びに、ＧＡＶＥ１９又は標的分子と会合した酵素活性の検出に依存した固相酵素検定法がある。
【０１９７】
他の実施態様において、ＧＡＶＥ１９発現の修飾因子は、候補化合物が接触した細胞におけるＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ又はタンパク質を検出することによって同定することがで
きる。候補化合物の存在下におけるＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡの発現又はタンパク質のレベ
ルを候補化合物の不在下におけるＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡの発現又はタンパク質のレベル
と比較する。候補化合物は、その比較に基づいてＧＡＶＥ１９発現の修飾因子として同定することができる。例えば、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ発現又はタンパク質が候補化合物の
不在のときに比べて存在下の方がより大きければ（統計的には有意義により大きいこと）、候補化合物は、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の賦活物質又はアゴニストであると同定される。或いはまた、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡの発現又はタンパク質が候補化合物の不在のときに比べて存在下の方がより少ない（統計的には有意義により少ないこと）場合は、候補化合物は、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の阻害物質又はアンタゴニストであると同定される。もしＧＡＶＥ１９活性がリガンド又はアゴニスト存在下で減少するか、或いは構成的ＧＡＶＥ１９がベースラインよりも低ければ、候補化合物はインバースアゴニストであると同定される。細胞中のＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現のレベルは、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ又はタンパク質検出のためにここで記載されている方法によって検出することができる。
【０１９８】
本発明の他の局面において、ＧＡＶＥ１９タンパク質は二本ハイブリッド検定又は三本ハイブリッド検定（例えば、U.S. Patent No. 5,283,317; Zervos et al., Cell (1993) 72: 223〜232; Madura et al., J Biol Chem. (1993) 268: 12046〜12054; Bartel et al., Bio／Techniques (1993) 14: 920〜924; Iwabuchi et al., Oncogene (1993) 8: 1693〜1696; 及び PCT Publication No. WO 94／10300）において、ＧＡＶＥ１９と結合する（「ＧＡＶＥ１９−結合タンパク質」又は「ＧＡＶＥ１９−ｂｐ」）又は相互作用する、及びＧＡＶＥ１９活性を調節する他のタンパク質を同定するための「ベイトプロテイン（餌タンパク質）」として使用することができる。このようなＧＡＶＥ１９−結合タンパク質は、また例えばＧＡＶＥ１９経路の上流又は下流因子のようなＧＡＶＥ１９タンパク質による信号の伝播に関与しているものと思われる。
【０１９９】
本発明が純品のＧＡＶＥ１９の大量生産を可能とすることより、機能を発揮すると思われる領域の立体配座の物理的特性を合理的なドラッグデザイン（医薬設計）により確かめることができる。例えば、分子のＩＣ３領域及びＥＣドメインは特に興味のある領域である。一旦、その領域の形及びイオン配置が見分けられれば、これらの領域と相互作用する候補化合物は形造られて、そして完全な細胞、動物又は患者でテストされる。そのような３−Ｄ構造情報を引き出すことを可能とする方法には、Ｘ線結晶回折、ＮＭＲ分光法（核磁気共鳴分析）、モレキュラーモデリング（分子設計）等が含まれる。３−Ｄ構造はまた既知の薬剤が作用する部位が存在する他の既知のタンパク質における類似な立体配座部位の同定へと導くことができる。これらの薬剤又はそれらの誘導体は関節リウマチ又はＣＯＰＤ（慢性閉塞肺疾患）等の炎症性病気又は障害の治療における使用が見い出されるものと思われる。
【０２００】
本発明は更に上記に記載したスクリーニング検定によって同定される新規な薬剤及びそれらのここに記載したような治療のための使用にも及ぶものである。
【０２０１】
本発明に係る検定法
Ａ．探知検定法
本発明に係るＤＮＡ配列の部分又はフラグメントは、ポリヌクレオチド試薬として種々の方法において使用することができる。例えば、当該配列は（ｉ）染色体上の各遺伝子のマップ作成及び遺伝病と関係した遺伝領域の場所捜索；（ii）微小な生物標品からの個人の同定（ティッシュタイピング）；（iii）生物標品の法医学的同定の補助手段として使
用することができる。これらの利用については以下に詳述してある。
【０２０２】
１．染色体マッピング
一旦、遺伝子の配列（又は配列の一部）が単離されれば、その配列は染色体上のＧＡＶ
Ｅ１９遺伝子の配置をマップするのに使用することができる。それ故、ここに記載したＧＡＶＥ１９核酸分子又はそのフラグメントは、ゲノム中のＧＡＶＥ１９の配置をマップするのに使用することができる。ゲノムにおけるＧＡＶＥ１９配列の配置のマッピングは遺伝子が関係する病気と配列との因果関係を示す上で重要な一歩である。
【０２０３】
簡単に言えば、ＧＡＶＥ１９遺伝子は、ＧＡＶＥ１９配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５〜２５ｂｐの長さ）を調製することによってゲノム中にマップすることができる。そのプライマーは、個々のマウス染色体を含んでいる体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用される。そしてＧＡＶＥ１９配列に対応するマウス遺伝子を含んでいるハイブリッドのみが増幅されたフラグメントを作成する。
【０２０４】
特別な方法としては、マウス染色体を変性し、その後検出可能に標識されたＧＡＶＥ１９ ＤＮＡ分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で接触させることを含むが、但しこれらに限定されない。検出可能に標識されたＧＡＶＥ１９ ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーション及び配列決定は、マウス染色体中のＧＡＶＥ１９の位置を明らかとする。そのようなin situハイブリダイゼーション技術はFan et al., Proc Natl Acad Sci USA (1990) 87: 6223〜27に記載されているがその中には標識されたフローソートされた（flow-sorted）染色体によるプレスクリーニング及び染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーとのハイブリダイゼーションによるプレセレクションも含まれている。細胞分裂中期の染色体分散に対するＤＮＡ配列のin situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）もまた一段階で正確な染色体配置を提供するのに使用することができる。染色体分散は、有糸分裂の紡錘体形成を阻害する化合物、例えばコルセミドにより細胞分裂が中期で阻止されている細胞を用いて作成することができる。染色体はトリプシンを短時間処理し次いでギムザ（Giemsa）で染色される。明暗バンドパターンが各染色体上に展開し、その結果染色体は個別に同定することができる。ＦＩＳＨ法は、５００から６００塩基数以下の短いＤＮＡ配列についても行うことができる。しかしながら、１,０００塩基よりも長いクローンは独特な染色体配位に結合する高い可能性があり、その信号強度も簡単な検出法にとって十分なものである。好ましくは１,０００塩基及びより好ましくは２,０００塩基が、無理のない時間で良好な結果を得るために必要である。この技術を概観するには、Verma et al. ( Human Chromo somes: A Manual of Basic Techni-ques (Pergamon Press, New York, 1988))が参照される。染色体マッピングは、イン・シリコ（in silico）で推論することができるものであり、そしてロッドスコア法（lod scores）又は単に近接法（proximity）のような統計的考察を活用することができる。
【０２０５】
染色体マッピング用の試薬は、染色体上の単一部位を突きとめるために個々に使用することができる。更にまた、試薬のパネルは多重部位及び／又は多重染色体をマークするのに使用することができる。ＧＡＶＥ１９遺伝子が並んでいる領域に対応する試薬は、実際にマッピングの目的に好適である。コード配列は、遺伝子ファミリー内に保存されているものと思われ、それ故に染色体マッピング中の交差ハイブリダイゼーションの機会を増大させる。
【０２０６】
一旦配列が正確な染色体配位に対してマップされたときは、染色体における配列の物理的配位は、遺伝的マップデータと相関しているものである。同一染色体領域にマップされた遺伝子と病気との相関関係は、それ故例えばEgeland et al., Nature (1987) 325: 783〜787に記載されている連結分析（物理的に隣接している遺伝子の共同遺伝）により同定
することができる。
【０２０７】
尚、ＧＡＶＥ１９の関与する病気に患っている動物と患っていない動物間におけるＤＮＡ配列の相違も検出することができる。もし、ある突然変異が病気に患っている幾つかの又は全ての動物において観察されるが、しかし患っていない動物では観察されなければ、
その突然変異はその特別な病気の原因となるものと思われる。病気に患っている動物と患っていない動物との比較は、通常第一に染色体中の構造的変化を探すことであり、それは、例えば染色体分散から目視できる又はＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出できる欠損又は転移である。最後に、幾つかの動物からの遺伝子の完全配列を行うことによって突然変異の存在及び突然変異を多型から区別できることを確認することである。
【０２０８】
１．診断的検定法
生物標品中におけるＧＡＶＥ１９の存在又は不在を検出する模範的な方法は、テスト動物から生物標品を入手すること、及びＧＡＶＥ１９タンパク質又はＧＡＶＥ１９タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を検出することができて、その結果ＧＡＶＥ１９の存在を生物標品中で検出することができる化合物又は試薬に生物標品を接触させることから成る。ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するため
の好ましい試薬としては、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズす
ることができる標識された核酸プローブがある。この核酸プローブは、例えば配列番号１の核酸のような全長ＧＡＶＥ１９核酸又はその部分、例えば少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０又は５００或いはそれ以上のヌクレオチドを長さにおいて有するオリゴヌクレオチドで、ストリンジェントな条件下でＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。
【０２０９】
ＧＡＶＥ１９タンパク質を検出する特別な試薬は、ＧＡＶＥ１９タンパク質に結合することができる抗体であり、好ましくは、検出可能に標識された抗体である。抗体はポリクローナル、キメラ或いはより好ましくはモノクローナルである。完全な抗体又はそのフラグメント（例えばＦab又はＦ(ab′)2）を使用することができる。
用語「生物標品」とは、被検体から単離された組織、細胞及び細胞液をいうが、また、被検体中に存在している組織、細胞及び細胞液をも含む。即ち、本発明に係る検出方法は生物標品中のＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡ、タンパク質又はゲノムＤＮＡの検出をイン・ビボ
（in vivo）のみならずイン・ビトロ（in vitro）においても使用することができる。例
えば、ＧＡＶＥ１９ ｍＲＮＡを検出するイン・ビトロ法にはノーザン（Northern）ハイ
ブリダイゼーション及びイン・シトウ（in situ）ハイブリダイゼーションが含まれる。
ＧＡＶＥ１９ゲノムＤＮＡを検出するイン・ビトロ法にはサザン（Southern）ハイブリダイゼーションが含まれる。更にＧＡＶＥ１９タンパク質を検出するイン・ビボ法には、標識された抗−ＧＡＶＥ１９抗体の動物体内への導入が含まれる。例えば、抗体が放射性マーカーで標識され、動物体内におけるその存在及び位置が標準的イメージング法により検出することができる。
【０２１０】
他の実施態様において、生物標品はテスト動物由来のタンパク質分子を含んでいる。或いはまた生物標品はテスト動物由来のｍＲＮＡ分子又はテスト動物由来のゲノムＤＮＡ分子を含んでいる。ここで利用されている特殊な生物標品は動物体内から常法によって単離した末梢血の白血球標品である。
【０２１１】
他の実施態様においては、当該方法は更に対照動物から生物標品を入手すること、ＧＡＶＥ１９タンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出することができて、その結果ＧＡＶＥ１９タンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在及び量を生物標品中で検出することができる化合物又は試薬に生物標品を接触させること、及び対照標品中におけるＧＡＶＥ１９タンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在及び量をテスト標品中におけるＧＡＶＥ１９タンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在及び量と比較して、その化合物がＧＡＶＥ１９の発現又は活性を調節するか否かを決定することから成る。
【０２１２】
化学ライブラリーのハイスループット検定法
ＧＡＶＥ１９の活性を調節することができる化合物のいかなる検定法も高生産性スクリ
ーニングに適用できる。高生産性スクリーニングシステムは市場において入手可能である（例えば、Zymark Corp., HopKinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MＡ等参照）。これらのシステムは、標品及び試薬のヒペットでの採取、液体分与、時間設定インキュベーション、検定に適合する検出器におけるミクロプレートの最終読取りを含む全工程が典型的に自動化されている。これらの組合せ可能なシステムはハイスループット及び迅速な測定開始を可能とし、また高度な適応性及び受注生産を可能とする。そのようなシステムの製造会社は種々の高生産性の詳細なプロトコールを提供している。例えば、Zymark Corp.は遺伝子転写、リガンド結合、その他の調節を検出するためのスクリーニングシステムについて記載している技術報告書を提供している。
【０２１３】
キット
本発明はまた生物標品（テストサンプル）におけるＧＡＶＥ１９の存在を検出するためのキットにも及ぶものである。そのようなキットは、ある特定の化合物がＧＡＶＥ１９の発現又は活性を調節するか否かを判定するのに用いることができる。例えば、当該キットは生物標品中のＧＡＶＥ１９タンパク質又はｍＲＮＡを検出することができる標識された化合物又は試薬、及びその標品中のＧＡＶＥ１９の量を測定する方法（例えば抗−ＧＡＶＥ１９抗体又はＧＡＶＥ１９、例えば配列番号１をコードしているＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブ）とから構成されている。
【０２１４】
抗体を基礎とするキットの場合は、当該キットは、例えば（１）ＧＡＶＥ１９タンパク質に結合する一次抗体（例えば、固相支持体に結合した）；及び場合によっては（２）二次抗体で、ＧＡＶＥ１９タンパク質又は一次抗体に結合し且つ検出可能な試薬に共役している異なる抗体から構成されている。もし二次抗体が存在しないときは、一次抗体を検出可能に標識するか、又は一次抗体に結合する他の分子を検出可能に標識することができる。いずれにせよ、標識されて結合するものは、技術常識として知られているように、検出可能なレポーター分子としての役割を有する。
【０２１５】
オリゴヌクレオチドを基礎とするキットの場合は、本発明に係るキットは、例えば：（１）ＧＡＶＥ１９核酸配列とハイブリッドする検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド、又は（２）ＧＡＶＥ１９核酸分子を増幅するために有用な一対のプライマーから構成することができる。当該キットは更に例えば緩衝剤、保存剤又はタンパク質安定剤を含むことができる。当該キットはまた検出可能な試薬（例えば、酵素又は基質）を検出するために必要な成分を含むことができる。更にその上、当該キットはまた検定しそしてテストサンプルと比較するために対照サンプル又は対照サンプルシリーズをも含むことができる。
【０２１６】
２．薬理ゲノム学
ここに説明したように、ＧＡＶＥ１９発現は活性化された又は炎症状態に関係する細胞内において調節される。炎症と関係した障害には、アナフィラキシー状態、大腸炎、クローン病、浮腫状態、接触過敏症、アレルギー、関節炎の他の形態、髄膜炎及びその他の状態が含まれ、そこでは免疫システムが腫脹及び同様な状態になっている部位において血管拡張、熱感、集合細胞、液体及び同様の物による発作に対して反応する。このように、ここに記載されたスクリーニング検定法によって同定されたようにＧＡＶＥ１９活性（例えば、ＧＡＶＥ１９遺伝子発現）に刺激的又は阻害的効果を有する試薬又は調節因子は、障害（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患又は関節リウマチの関与する炎症）に対する処置（予防的又は治療的）として個々に投薬することができる。そのような処置との結びつきにおいて、個体の薬理ゲノム学（即ち、個体のゲノムタイプと外来性化合物又は薬剤に対する個体の応答間の相関関係の研究）が考慮される。治療剤の代謝における相違が、投薬量と薬理学的に活性な薬剤の血液濃度間の相関関係の変更により重症な副作用或いは治療不全を導くこととなり得る。このように、個体の薬理ゲノム学は、個人のゲノムタイプを考慮して、予防的又は治療的処置のための効果的な試薬（例えば、薬剤）の選択を可能とするものである。そのような薬理ゲノム学は、更に適当な投薬量及び治療法を決定するのにも使用することができる。
【０２１７】
薬理ゲノム学は、罹患者における薬物処理の変異及び異常作用による薬物応答の臨床上重要な遺伝的変異についても取り扱う。例えば、Linder, Clin Chem (1997) 43 (2): 254〜266参照。一般的に、薬理ゲノム学の条件には、二つのタイプを区別することができる
。薬剤が身体に対して作用する仕方を変動する単一の因子として継代される遺伝的条件は「薬剤作用変異」と呼ばれる。身体が薬剤に対して作用する仕方を変動する単一の因子として継代される遺伝的条件は「薬剤代謝変異」と呼ばれる。薬理ゲノム学の条件は希少な欠損又は多型のいずれかとして発生するる。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素欠損症（Ｇ６ＰＤ）は、よく知られた遺伝的酵素病であるが、そこにおける主要な臨床上の合併症は、酸化剤（抗マラリア薬、サルファ剤、鎮痛剤又はニトロフラン剤）の摂取及びソラマメ（fava beans）の食餌後の赤血球溶血である。
【０２１８】
説明的状態としては、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度及び時間双方の主要な決定事項である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）及びシトクロムＰ４５０酵素、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、何故ある患者は薬物の標準的そして安全投与量を摂取後に期待通りの効果又は過大な薬物応答及び重症な毒性を受けないのかという疑問に対する説明を与えている。多型は個体における二種の表現型、強力な代謝体（ＥＭ）及び微力な代謝体（ＰＭ）で表現される。ＰＭの罹患率は異なる個体間において相違している。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そして数種の突然変異がＰＭ中で同定されており、その全てが機能的ＣＹＰ２Ｄ６の欠如であることが知られている。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の微力な代謝体は標準的な投与量を摂取したときに、過大な薬物応答及び副作用を極めて頻繁に経験する。もしも代謝物が活性な治療剤であるならば、ＰＭは治療応答を示さないこととなるが、それはＣＹＰ２Ｄ６により生成した代謝物、モルヒネによって仲介されるコデインの鎮痛効果について実証されている。他の極端な例は、いわゆる超特急代謝体であり、それは標準的投与量に対して全く応答しない。最近、超特急代謝の分子基礎がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものであることが同定されている。
【０２１９】
個体中のＧＡＶＥ１９タンパク質の相同体の活性又はGAVE１９核酸の相同体であるＤＮＡ分子の発現は、個体の治療的又は予防的処置にとって適当な試薬を選択するために決定することができる。加えて、薬理ゲノム科学の研究は、個体の薬物応答表現型を同定するために薬物代謝酵素をコードしている多型対立遺伝子のゲノムタイピング（遺伝型分類）に利用するために使用することもできる。投薬量決定又は薬物選択に利用されたときの知見は、副作用又は治療不全を回避することができ、そしてそれ故にここで記載した模範的なスクリーニング検定法の一つを用いて同定された分子のような、ＧＡＶＥ１９分子を被検体に処置するときは、治療的又は予防的効果を増大させることができる。
【０２２０】
Ｄ．処置の方法
上記に説明したように、本発明はマウスにおけるＧＡＶＥ１９の発現を調節する薬剤又は試薬を同定するための検定法に及ぶものである。
ＧＡＶＥ１９の発現の側面、即ち、正常の脾臓における高度な発現により、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）のＲＡマウス脾臓における発現レベルは正常な脾臓に比べて２倍増加し、また、ＣＩＡ ＲＡマウスの肺においては正常な肺に比べて５倍以上も発現レベル
が上昇したことより、そのような薬剤又は試薬は、炎症性障害（例えば喘息）、慢性閉塞性肺疾患及び関節リウマチ等のような病気又は障害の処置に容易に利用され得るものである。
【０２２１】
１．予防法
或る局面において本発明は被検体にＧＡＶＥ１９発現又は少なくともＧＡＶＥ１９活性の一つを調節する薬剤を投与することにより、上記記載のような病気又は症状を予防するための方法を提供するものである。そのような処置から得られる利益を受けるものは、例えば当業者によく知られている診断又は予後判定のいかなる又はその組合せによって同定することができる。予防薬の投与は、病気又は障害の予防或いは進行を遅らせるためには、そのような病気又は障害の症状が顕在化する前に行うことによってできる。
【０２２２】
２．治療法
炎症性病気の処置に用いられる試薬、即ちマウスにおけるＧＡＶＥ１９タンパク質の活性を調節することができるものは、核酸又はタンパク質、ＧＡＶＥ１９タンパク質の自然発生の同種のリガンド、ペプチド、ＧＡＶＥ１９ペプチド様又は他の低分子のようなもので、ここに記載されているような試薬である。或る実施態様においては、当該試薬はＧＡＶＥ１９タンパク質の一つ又はそれ以上の生物学的活性を刺激する。そのような刺激剤の例としては、細胞中に取り込まれたＧＡＶＥ１９タンパク質及びＧＡＶＥ１９をコードする核酸分子が含まれる。他の態様においては、ＧＡＶＥ１９タンパク質の一つ又はそれ以上の生物学的活性を阻害する試薬がある。そのような阻害剤の例としては、アンチセンスＧＡＶＥ１９核酸分子及び抗−ＧＡＶＥ１９抗体がある。変形的な方法は、イン・ ビト
ロ（in vitro）（例えば、細胞を試薬と共に培養することにより）或いはイン・ビボ（in
vivo）（例えば、試薬を被検体に投与することにより）に行うことができる。そのよう
なものとして、本発明は試薬（例えば、ここに記載されているスクリーニング検定法で同定された試薬）又はマウスにおけるＧＡＶＥ１９の発現又は活性を調節する（例えば上流制御又は下流制御）試薬の混合剤を個体に投与することを含んでいる上記記載のような病気又は障害に苦しんでいる個体を治療する方法を提供するものである。他の態様としては、当該方法を治療としてＧＡＶＥ１９タンパク質又は核酸分子を投与することに関与するものである。
【０２２３】
本発明は、以下に限定列挙としてではなく掲げられている本発明の模範例によって、よりよく理解されるものと思われる。以下の例は本発明の好適な実施態様をより完全に説明するために提示している。しかしながら、本発明の範囲を制限することを意味するものではない。
【実施例】
【０２２４】
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の多くは、市場における今日の治療薬の約５０％が標的としているものである。ＧＰＣＲはペプチド、神経伝達物質、ホルモン、成長因子、アミン類、脂質、脂肪酸、発臭剤及び光を含む広範囲のリガンドによって活性化される。ＧＰＣＲ作用の不安定は多くの病理学的条件をもたらす。正常な脾臓において高度に発現するヒトＧＡＶＥ１８のオーソログ（ortholog）であるＧＡＶＥ１９は、正常な脾臓に比べて２倍も増加した発現レベルをコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）のＲＡマウス脾臓中で示し、また正常な肺に比べて５倍以上も上昇した発現レベルをＣＩＡのＲＡマウス肺で示した。このように、ＧＡＶＥ１９は、炎症性障害（例えば、喘息）、慢性閉塞性肺疾患及び関節リウマチ等の病気又は障害治療に用いる薬剤又は試薬を標的とする新規な医薬品を提供するものである。
【０２２５】
ＧＡＶＥ１９の同定及びクローニングは、またデ・オーファニング（de-orphaning）工程により、内因性リガンドを見付ける機会を提供するものである。デ・オーファニングにより同定した自然リガンド又は代用リガンドは、受容体の信号伝達を活性又は阻止し、それ故に細胞内生理又は細胞機能を変化させる分子をスクリーニングするための道具を提供するものである。
【０２２６】
材料及び方法
ＧＡＶＥ１９の同定及びクローニング：マウスのゲノムＤＮＡデータベースに重ね合せたヒトＧＡＶＥ１８ ＤＮＡ配列を用いても、マウス相同ＤＮＡ配列は明らかにできなかっ
た。そこで、コード領域を含んでいるヒトＧＡＶＥ１８ ＤＮＡをResearch GeneticsのマウスゲノムＢＡＣライブラリーをスクリーンするためのプローブとして使用した。ヒトＧＡＶＥ１８配列に従って設計した多重ＤＮＡプライマーをポジティブマウスＢＡＣを配列するために使用した。唯一のプライマー、５′ＧＧＣ ＴＴＣ ＣＣＣ ＣＡＡ ＡＧＡ Ｃ
ＡＡ ＡＧ３′(配列番号３)がマウスＧＡＶＥ１９ ＤＮＡ配列データを与えた。そこで、多重マウスＤＮＡ配列プライマーをマウスＧＡＶＥ１９コード領域の配列を決定するためのプライマーウォーキング（primer walking）用に設計した。
【０２２７】
マウス病気モデル及びＲＮＡの単離：各種の組織及び器官からのマウス全ＲＮＡの単離は、ＧＩＢＣＯ ＢＬＲのトリゾール（Trizol）試薬を用い、製造使用説明書に基づいて行った。全ＲＮＡは、ＡＢＩのMultiscribe ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて、ｃＤＮＡに変換した。
【０２２８】
ＴａｑＭａｎ分析：ＴａｑＭａｎ反応はマウス組織ｃＤＮＡを用いて二連で行い、そしてＧＡＰＤＨ遺伝子を内部対照として使用した。その後ＴａｑＭａｎの結果を、相対的発現として計算した。相対的発現は（2^(0-ddCt)）*1000で、ここでｄｄＣＴは（ＧＡＶＥ１
９平均値Ｃｔｓ−ＧＡＰＤＨ平均値Ｃｔｓ）−（ＧＡＶＥ１９平均値ＮＴＣ Ｃｔｓ−Ｇ
ＡＰＤＨ平均値ＮＴＣ Ｃｔｓ）である。ＴａｑＭａｎプローブは、Operon Technologiesにより、注文製で合成した。ＴａｑＭａｎプライマー配列１は：５′ＣＴＧ ＴＴＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＡ３′(配列番号４）及び配列２は、５′ＣＣＡ Ｔ
ＧＡ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＣＧ ＡＧＧ ＴＴ３′(配列番号５）である。ＴａｑＭａｎプローブ配列は５′(Ｆａｍ）−ＴＣＡ ＣＧＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＣＴ 
Ｇ−（Ｔｅｔ）３′(配列番号６）である。ＴａｑＭａｎ反応は９６穴プレートMicroAmp
光学チューブ（ＰＥ）中で行なった。
【０２２９】
結果の説明
ＴａｑＭａｎ発現プロフィールは、ＣＩＡ（コラーゲン誘発関節炎）ＲＡモデルの関節におけるＧＡＶＥ１９の発現レベルが、正常な対照サンプルからＲＡグレード４に至るまで、徐々に増加していることを示している。関節におけるＲＡグレードが高ければ高いほど、より高いＧＡＶＥ１９発現の相関関係を示している。ＧＡＶＥ１９はまた正常な対照肺及び脾臓に比べて、ＣＩＡ ＲＡ肺及び脾臓における発現レベルを顕著に増大している
ことも示している。多発性硬化症のマウスＥＡＥ（実験的アレルギー脳脊髄炎）モデルにおいては、ＧＡＶＥ１９は前臨床期中の脳における発現レベルと比較して、ＥＡＥピーク期中の脳における発現レベルを増大することを示している。
【０２３０】
【表１】
2005517398.tif 000002
【０２３１】
発現プロフィールデータはまた図３にグラフとして表示している。これら全てのデータはＧＡＶＥ１９が炎症関連疾患において重要な役割を演じていることを指摘している。
【０２３２】
論考
ヒトＧＡＶＥ１８とオーソログである新規なマウスＧ共役型受容体ＧＡＶＥ１９が同定されそしてクローンされた。当該ＤＮＡの全長コード領域及びそれから推論されるアミノ酸配列が特定された。当該受容体の組織分布は、正常な対照マウス及びコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）マウスにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析法によって分析した。ＧＡＶＥ１９の発現プロフィールは、ＧＡＶＥ１８（ヒトオーソログ）との類似性を示し、また関節リウマチのような炎症性病気におけるその重要な役割が指摘された。それ故、ここに記載された種々の検定法を用いることにより、ＧＡＶＥ１９は喘息、ＲＡ（関節リウマチ）、ＣＯＰＤ（慢性閉塞性肺疾患）のような炎症性病気に対する新しい医薬品標的を提供する。尚、本発明に係る検定法により見い出されたマウスにおけるＧＡＶＥ１９の発現及び／又は活性を調節する化合物及び試薬は、そのような病気の治療に容易に利用し得るものと思われる。
【０２３３】
本発明はここに記載されている特別な実施態様によって、その範囲が限定されるものではない。実際ここに記載されているものに加えて、本発明の数々の変形が前述の記載からまた随伴する図面から、当業者にとって明白なものとなるであろう。そのような変形は追
加された請求の範囲に属するものである。
【０２３４】
更に、核酸又はポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズ又はアミノ酸サイズ、及び全ての分子量又は分子質量値は、概数でありかつ説明のために提示されたものであると理解すべきである。
種々の文献がここにおいて引用されているが、それらは引用文献としてそっくりそのままの状態で開示してある。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】ＧＡＶＥ１９（配列番号１）をコードするＤＮＡ配列。
【図２】ＧＡＶＥ１９（配列番号２）のアミノ酸配列。
【図３Ａ】ＭＰＤ１.１.２によるＧＡＶＥ１９発現プロフィール。
【図３Ｂ】ＭＰＤ１.１.２によるＧＡＶＥ１９発現プロフィール。
【図４】ＧＡＶＥ１９（配列番号２）とヒトオーソログＧＡＶＥ１８（配列番号７）とのアミノ酸配列の比較。
【図１】
2005517398.tif 000003
【図２】
2005517398.tif 000004
【図３Ａ】
2005517398.tif 000005
【図３Ｂ】
2005517398.tif 000006
【図４】
2005517398.tif 000007
【配列表】
2005517398000001.app
【国際調査報告】
2005517398.tif 000008