(57)【要約】本発明は、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物及びＣＯＸ−２選択的阻害剤を含む組み合わせを投与することによる新生物の治療又は予防に有用な方法及び組成物を提供する。さらに、新生物の治療及び予防のための組成物、薬剤組成物及びキッドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物障害の治療又は予防を必要とする対象における新生物障害の治療又は予防方法であって、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグとの組み合わせの治療有効量で、該対象を治療することを含む方法。
【請求項２】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノンが、式：
【化１】
2005530781.tif 000064
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項１記載の方法。
（式中、Ｒ１は、Ｈ又はアルキルであり；Ｒ２は、Ｏ又はＳであり；Ｒ３は、水素であり；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２ＮＲＲ’、ＳＯ３Ｒ、ＳＲ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ、及びＣＯＮＲＲ’から成る群から選択される；
Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３，４−オキサトリアゾール、１，２，３，５−オキサトリアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，２，３，４−チアトリアゾール、１，２，３，５−チアトリアゾール及びテトラゾールから成る群から選択される五員ヘテロアリール環であり、場合によっては、１つ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２ＮＲＲ’、ＳＯ３Ｒ、ＳＲ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ、及びＣＯＮＲＲ’によって置換される；
ｎは、０〜３であり；Ｒは、Ｈ、アルキル又はアリールであり；Ｒ’は、Ｈ、アルキル又はアリールである。）
【請求項３】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物が、３−［（３−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３，４−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（２−メチルチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−｛［４−（２−メトキシカルボニルエチル）−３−メチルピロル−５−イル）］メチレン｝−２−インドリノン；３−［（４，５−ジメチル−３−エチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（５−メチルイミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；５−クロロ−３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン；３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；５−クロロ−３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；又は３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；又はこれらの薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物が、３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該新生物が、末端性ほくろ性黒色腫、日光性角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星状細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細管、類癌腫、癌腫、癌肉腫、海綿状、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌腫、明細胞癌、嚢胞状腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質部肉腫、子宮内膜腺癌、上衣、類上皮、ユーイング肉腫、層状化線維、限局性結節性過形成、ガストリン産生腫瘍、胚細胞腫瘍、グリア芽細胞腫、グルカゴノーマ、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症（hepatic adenomatosis）、肝細胞癌、インシュリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平細胞新生物、浸潤性扁平細胞腫、大細胞癌、平滑筋肉腫、悪性ほくろ性黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽細胞腫、骨髄上皮腫、黒色腫、髄膜、中皮（mesothelial）、転移性癌、粘類表皮癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞（origodendroglial）、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、乳頭状漿液性腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫（retinoblastoma）、横紋筋肉腫、肉腫、重篤癌(serious caricnoma)、小細胞癌、軟組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、中皮下（submesothelial）、表在拡大型黒色腫(superficial spreading melanoma)、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、ビポーマ、分化癌（well differentiated carcinoma）、及びウィルムス腫瘍から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該組み合わせを逐次的に投与する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該組み合わせを実質的に同時に投与する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの量が、約０．０１〜約２０ｍｇ／日の範囲内である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量を経口投与する、請求項１記載の新生物治療方法。
【請求項１０】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量が、約０．０１〜約２０ｍｇ／日である、請求項９記載の新生物治療方法。
【請求項１１】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量を、溶液剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、懸濁液剤又はエマルジョン剤として、局所投与する、請求項１記載の新生物治療方法。
【請求項１２】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量が、約０．０１％〜約１０％である、請求項１１記載の新生物治療方法。
【請求項１３】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量を静脈内投与する、請求項１記載の新生物治療方法。
【請求項１４】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量が、約０．０１〜約２０ｍｇ／日である、請求項１３記載の新生物治療方法。
【請求項１５】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量を直腸投与する、請求項１記載の新生物治療方法。
【請求項１６】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量が、約０．０１〜約２０ｍｇ／日である、請求項１５記載の新生物治療方法。
【請求項１７】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグが、約０．２μｍｏｌ／Ｌ未満のシクロオキシゲナーゼ−２  ＩＣ５０を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグが、少なくとも約１μｍｏｌ／Ｌのシクロオキシゲナーゼ−１  ＩＣ５０を有する、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグが、少なくとも約１０μｍｏｌ／Ｌのシクロオキシゲナーゼ−１  ＩＣ５０を有する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、式：
【化２】
2005530781.tif 000065
で示される６−［［（５−（４−クロロベンゾイル）−１，４−ジメチル−１Ｈ−ピロル−２−イル］メチル］−３（２Ｈ）−ピリダジノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、クロメンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、一般式：
【化３】
2005530781.tif 000066
［式中、ＧはＯ又はＳ又はＮＲａから成る群から選択される；Ｒａはアルキルである；Ｒ１はＨ及びアリールから成る群から選択される；Ｒ２はカルボキシル、アミノカルボニル、アルキルスルホニルアミノカルボニル及びアルコキシカルボニルから成る群から選択される；Ｒ３は、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル及びアリールから成る群から選択され、場合によっては、アルキルチオ、ニトロ及びアルキルスルホニルから選択される１つ以上のラジカルによって置換される；Ｒ４はＨ、ハロ、アルキル、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールアルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニル、ヘテロアラルキルアミノスルホニル、ヘテロシクロスルホニル、アルキルスルホニル、ヒドロキシアリールカルボニル、ニトロアリール、場合によっては置換されるアリール、場合によっては置換されるヘテロアリール、アラルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アリールカルボニル、アミノカルボニル、及びアルキルカルボニルから選択される１つ以上のラジカルから成る群から選択される；又は、Ｒ４は環Ｅと共にナフチル・ラジカルを形成する］
で示される、置換したベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン又はジヒドロナフタレン又はその異性体から成り、それらのジアステレオマー、エナンチオマー、ラセメート、互変異性体、塩、エステル、アミド、薬学的に許容される塩及びプロドラッグを包含する群から選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、式：
【化４】
2005530781.tif 000067
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項１記載の方法。
（式中、
Ｙは、Ｏ又はＳ又はＮＲｂから成る群から選択される；Ｒｂはアルキルである；Ｒ５は、カルボキシル、アミノカルボニル、アルキルスルホニルアミノカルボニル及びアルコキシカルボニルから成る群から選択される；Ｒ６は、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル及びアリールから成る群から選択され、この場合、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル及びアリールは、それぞれ独立に、アルキルチオ、ニトロ及びアルキルスルホニルから成る群から選択される１つ以上のラジカルによって場合によっては置換される；Ｒ７は、ヒドリド、ハロ、アルキル、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ、ヘテロアリールアルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニル、ヘテロアラルキルアミノスルホニル、ヘテロシクロスルホニル、アルキルスルホニル、場合によっては置換されるアリール、場合によっては置換されるヘテロアリール、アラルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アリールカルボニル、アミノカルボニル、及びアルキルカルボニルから成る群から選択される１つ以上のラジカルである；又はＲ７は、環Ａと共にナフチル・ラジカルを形成する。）
【請求項２４】
該式において、Ｙが、酸素及び硫黄から成る群から選択され；Ｒ５が、カルボキシル、低級アルキル、低級アラルキル及び低級アルコキシカルボニルから成る群から選択され；Ｒ６が、低級ハロアルキル、低級シクロアルキル及びフェニルから成る群から選択され；Ｒ７が、ヒドリド、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、低級アルキルスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル、及び低級アルキルカルボニルから成る群から選択される１つ以上のラジカルであるか、又はＲ７が、環Ａと共に、ナフチル・ラジカルを形成する化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該式において、Ｒ５がカルボキシルであり；Ｒ６が、低級ハロアルキルであり；Ｒ７が、ヒドリド、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級アルキルスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル、及び低級アルキルカルボニルから成る群から選択される１つ以上のラジカルであるか、又はＲ７が、環Ａと共に、ナフチル・ラジカルを形成する化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
該式において、Ｒ６が、フルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、ジクロロプロピル、ジフルオロメチル、及びトリフルオロメチルから成る群から選択され；Ｒ７が、ヒドリド、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ−フェニルメチルアミノスルホニル、Ｎ−フェニルエチルアミノスルホニル、Ｎ−（２−フリルメチル）アミノスルホニル、ニトロ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−メチルアミノスルホニル、Ｎ−エチルスルホニル、２，２−ジメチルエチルアミノスルホニル、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチルアミノスルホニル、Ｎ−（２−メチルプロピル）アミノスルホニル、Ｎ−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、２，２−ジメチルプロピルカルボニル、フェニルアセチル及びフェニルから成る群から選択される１つ以上のラジカルであるか；又はＲ２が、環Ａと共に、ナフチル・ラジカルを形成する化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
該式において、Ｒ６が、トリフルオロメチル及びペンタフルオロエチルから成る群から選択され；Ｒ７が、ヒドリド、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、Ｎ−フェニルメチルアミノスルホニル、Ｎ−フェニルエチルアミノスルホニル、Ｎ−（２−フリルメチル）アミノスルホニル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル、Ｎ−メチルアミノスルホニル、Ｎ−（２，２−ジメチルエチル）アミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、２−メチルプロピルアミノスルホニル、Ｎ−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル及びフェニルから成る群から選択される１つ以上のラジカルであるか；又はＲ７が、環Ａと共に、ナフチル・ラジカルを形成する化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、
（ａ１）８−アセチル−３−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニル）フェニル−イミダゾ（１，２−ａ）ピリジン；
（ａ２）５，５−ジメチル−４−（４−メチルスルホニル）フェニル−３−フェニル−２−（５Ｈ）−フラノン；
（ａ３）５−（４−フルオロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ピラゾール；
（ａ４）４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１−フェニル−３−（トリフルオロメチル）ピラゾール；
（ａ５）４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
（ａ６）４−（３，５−ビス（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
（ａ７）４−（５−（４−クロロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
（ａ８）４−（３，５−ビス（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
（ａ９）４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
（ａ１０）４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ１）４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（５−クロロ−２−チエニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ２）４−（４−クロロ−３，５−ジフェニル−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ３）４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ４）４−［５−フェニル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ５）４−［５−（４−フルオロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ６）４−［５−（４−メトキシフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ７）４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（ジフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ８）４−［５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ９）４−［４−クロロ−５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｂ１０）４−［３−（ジフルオロメチル）−５−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ１）４−［３−（ジフルオロメチル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ２）４−［３−（ジフルオロメチル）−５−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ３）４−［３−シアノ−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ４）４−［３−（ジフルオロメチル）−５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ５）４−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ６）４−［４−クロロ−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾル−１−イル｝ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ７）４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ８）４−［５−（４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｃ９）５−（４−フルオロフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン；
（ｃ１０）４−［６−（４−フルオロフェニル）スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン−５−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｄ１）６−（４−フルオロフェニル）−７−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［３．４］オクタ−６−エン；
（ｄ２）５−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン；
（ｄ３）４−［６−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｄ４）５−（３，５−ジクロロ−４−メトキシフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン；
（ｄ５）５−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン；
（ｄ６）４−［６−（３，４−ジクロロフェニル）スピロ［２．４］ベンゼンスルホンアミド；
（ｄ７）２−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）チアゾール；
（ｄ８）２−（２−クロロフェニル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）チアゾール；
（ｄ９）５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−メチルチアゾール；
（ｄ１０）４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−トリフルオロメチルチアゾール；
（ｅ１）４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−（２−チエニル）チアゾール；
（ｅ２）４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−ベンジルアミノチアゾール；
（ｅ３）４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−（１−プロピルアミノ）チアゾール；
（ｅ４）２−［（３，５−ジクロロフェノキシ）メチル］−４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］チアゾール；
（ｅ５）５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−トリフルオロメチルチアゾール；
（ｅ６）１−メチルスルホニル−４−［１，１−ジメチル−４−（４−フルオロフェニル）シクロペンタ−２，４−ジエン−３−イル］ベンゼン：
（ｅ７）４−［４−（４−フルオロフェニル）−１，１−ジメチルシクロペンタ−２，４−ジエン−３−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｅ８）５−（４−フルオロフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−４，６−ジエン；
（ｅ９）４−［６−（４−フルオロフェニル）スピロ［２．４］ヘプタ−４，６−ジエン−５−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｅ１０）６−（４−フルオロフェニル）−２−メトキシ−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−ピリジン−３−カルボニトリル；
（ｆ１）２−ブロモ−６−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−ピリジン−３−カルボニトリル；
（ｆ２）６−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−フェニル−ピリジン−３−カルボニトリル；
（ｆ３）４−［２−（４−メチルピリジン−２−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｆ４）４−［２−（５−メチルピリジン−３−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｆ５）４−［２−（２−メチルピリジン−３−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｆ６）３−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ピリジン；
（ｆ７）２−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ピリジン；
（ｆ８）２−メチル−４−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン；
（ｆ９）２−メチル−６−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン；
（ｆ１０）４−［２−（６−メチルピリジン−３−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｇ１）２−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール；
（ｇ２）４−［２−（４−メチルフェニル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｇ３）２−（４−クロロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−メチル−１Ｈ−イミダゾール；
（ｇ４）２−（４−クロロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−フェニル−１Ｈ−イミダゾール；
（ｇ５）２−（４−クロロフェニル）−４−（４−フルオロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール；
（ｇ６）２−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール；
（ｇ７）１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−フェニル−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール；
（ｇ８）２−（４−メチルフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール；
（ｇ９）４−［２−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｇ１０）２−（３−フルオロ−５−メチルフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール；
（ｈ１）４−［２−（３−フルオロ−５−メチルフェニル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｈ２）２−（３−メチルフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール；
（ｈ３）４−［２−（３−メチルフェニル）−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｈ４）１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−（３−クロロフェニル）−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール；
（ｈ５）４−［２−（３−クロロフェニル）−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｈ６）４−［２−フェニル−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｈ７）４−［２−（４−メトキシ−３−クロロフェニル）−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｈ８）１−アリル−４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール；
（ｈ１０）４−［１−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｉ１）Ｎ−フェニル−［４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］アセトアミド；
（ｉ２）エチル［４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］アセテート；
（ｉ３）４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１−（２−フェニルエチル）−１Ｈ−ピラゾール；
（ｉ４）４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１−（２−フェニルエチル）−５−（トリフルオロメチル）ピラゾール；
（ｉ５）１−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール；
（ｉ６）５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール；
（ｉ７）４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（２−チオフェニル）−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール；
（ｉ８）５−（４−フルオロフェニル）−２−メトキシ−４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−６−（トリフルオロメチル）ピリジン；
（ｉ９）２−エトキシ−５−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−６−（トリフルオロメチル）ピリジン；
（ｉ１０）５−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−（２−プロピニルオキシ）−６−（トリフルオロメチル）ピリジン；
（ｊ１）２−ブロモ−５−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−６−（トリフルオロメチル）ピリジン；
（ｊ２）４−［２−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−４，５−ジフルオロフェニル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｊ３）１−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］ベンゼン；
（ｊ４）５−ジフルオロメチル−４−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−フェニルイソオキサゾール；
（ｊ５）４−［３−エチル−５−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｊ６）４−［５−ジフルオロメチル−３−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｊ７）４−［５−ヒドロキシメチル−３−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｊ８）４−［５−メチル−３−フェニル−イソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｊ９）１−［２−（４−フルオロフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｊ１０）１−［２−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｋ１）１−［２−（４−クロロフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｋ２）１−［２−（２，４−ジクロロフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｋ３）１−［２−（４−トリフルオロメチルフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｋ４）１−［２−（４−メチルチオフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｋ５）１−［２−（４−フルオロフェニル）−４，４−ジメチルシクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｋ６）４−［２−（４−フルオロフェニル）−４，４−ジメチルシクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｋ７）１−［２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｋ８）４−［２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｋ９）４−［２−（４−フルオロフェニル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｋ１０）４−［２−（４−クロロフェニル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｌ１）１−［２−（４−メトキシフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｌ２）１−［２−（２，３−ジフルオロフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｌ３）４−［２−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｌ４）１−［２−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン；
（ｌ５）４−［２−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｌ６）４−［２−（２−メチルピリジン−５−イル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｌ７）エチル２−［４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］オキサゾル−２−イル］−２−ベンジル−アセテート；
（ｌ８）２−［４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］オキサゾル−２−イル］酢酸；
（ｌ９）２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］オキサゾール；
（ｌ１０）４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−フェニルオキサゾール；
（ｍ１）４−（４−フルオロフェニル）−２−メチル−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］オキサゾール；及び
（ｍ２）４−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−トリフルオロメチル−４−オキサゾリル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｍ３）６−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｍ４）６−クロロ−７−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｍ５）８−（１−メチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｍ６）６−クロロ−７−（１，１−ジメチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｍ７）６−クロロ−８−（１−メチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｍ８）２−トリフルオロメチル−３Ｈ−ナフトピラン−３−カルボン酸；
（ｍ９）７−（１，１−ジメチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｍ１０）６−ブロモ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ１）８−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ２）６−トリフルオロメトキシ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ３）５，７−ジクロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ４）８−フェニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ５）７，８−ジメチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ６）６，８−ビス（ジメチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ７）７−（１−メチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ８）７−フェニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ９）６−クロロ−７−エチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｎ１０）６−クロロ−８−エチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ１）６−クロロ−７−フェニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ２）６，７−ジクロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ３）６，８−ジクロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ４）２−トリフルオロメチル−３Ｈ−ナフト［２．１−ｂ］ピラン−３−カルボン酸；
（ｏ５）６−クロロ−８−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ６）８−クロロ−６−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ７）８−クロロ−６−メトキシ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ８）６−ブロモ−８−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ９）８−ブロモ−６−フルオロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｏ１０）８−ブロモ−６−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ１）８−ブロモ−５−フルオロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ２）６−クロロ−８−フルオロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ３）６−ブロモ−８−メトキシ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ４）６−［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ５）６−［（ジメチルアミノ）スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ６）６−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ７）６−［（４−モルホリノ）スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ８）６−［（１，１−ジメチルエチル）アミノスルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ９）６−［（２−メチルプロピル）アミノスルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｐ１０）６−メチルスルホニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ１）８−クロロ−６−［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ２）６−フェニルアセチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ３）６，８−ジブロモ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ４）８−クロロ−５，６−ジメチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ５）６，８−ジクロロ−（Ｓ）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ６）６−ベンジルスルホニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ７）６−［［Ｎ−（２−フリルメチル）アミノ］スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ８）６−［［Ｎ−（２−フェニルエチル）アミノ］スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ９）６−ヨード−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｑ１０）７−（１，１−ジメチルエチル）−２−ペンタフルオロエチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸；
（ｒ１）５，５−ジメチル−３−（３−フルオロフェニル）−４−（４−メチル−スルホニル）−２（５Ｈ）−フラノン；
（ｒ２）６−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾチオピラン−３−カルボン酸；
（ｒ３）４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｒ４）４−［５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｒ５）４−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−３−（ジフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｒ６）３−［１−（４−メチルスルホニル）フェニル］−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン；
（ｒ７）２−メチル−５−［１−（４−メチルスルホニル）フェニル］−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン；
（ｒ８）４−［２−（５−メチルピリジン−３−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｒ９）４−［５−メチル−３−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｒ１０）４−［５−ヒドロキシメチル−３−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｓ１）［２−トリフルオロメチル−５−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−オキサゾリル］ベンゼンスルホンアミド；
（ｓ２）４−［２−メチル−４−フェニル−５−オキサゾリル］ベンゼンスルホンアミド；又は
（ｓ３）４−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル−２−トリフルオロメチル）−４−オキサゾリル］ベンゼンスルホンアミド；
又はこれらの薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２９】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的的阻害剤が、式：
【化５】
2005530781.tif 000068
［式中、Ｘは、Ｏ及びＳから成る群から選択される；Ｒ８は、低級ハロアルキルであり；Ｒ９は、ヒドリド及びハロから成る群から選択される；Ｒ１０は、ヒドリド、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルコキシ、低級アラルキルカルボニル、低級ジアルキルアミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級ヘテロアラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、及び六員窒素含有ヘテロシクロスルホニルから成る群から選択される；Ｒ１１は、ヒドリド、低級アルキル、ハロ、低級アルコキシ及びアリールから成る群から選択される；Ｒ１２は、ヒドリド、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ及びアリールから成る群から選択される］
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
該式において、Ｒ８が、トリフルオロメチル及びペンタフルオロエチルから成る群から選択され；Ｒ９が、ヒドリド、クロロ及びフルオロから成る群から選択され；Ｒ１０が、ヒドリド、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、メチル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフルオロメトキシ、メトキシ、ベンジルカルボニル、ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、フェニルエチルアミノスルホニル、メチルプロピルアミノスルホニル、メチルスルホニル及びモルホリノスルホニルから成る群から選択され；Ｒ１１が、ヒドリド、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、クロロ、メトキシ、ジエチルアミノ、及びフェニルから成る群から選択され；Ｒ１２が、ヒドリド、クロロ、ブロモ、フルオロ、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシ、及びフェニルから成る群から選択される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、一般構造式：
【化６】
2005530781.tif 000069
［式中、Ｚは、部分的不飽和又は不飽和ヘテロサイクリル及び部分的不飽和又は不飽和炭素環から成る群から選択される；Ｒ１３は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールから成る群から選択され、この場合、Ｒ１３は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ及びアルキルチオから選択される１つ以上のラジカルによって置換される；Ｒ１４は、メチル又はアミノから成る群から選択される；及びＲ１５は、Ｈ、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、Ｎ−アリールアミノカルボニル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、Ｎ−アリールアミノアルキル、Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、Ｎ−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノスルホニルから選択されるラジカルから成る群から選択される］
で示される三環式シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグのクラスから選択される物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、下記構造式：
【化７】
2005530781.tif 000070
で示されるバルデコキシブ又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、構造式：
【化８】
2005530781.tif 000071
で示される化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、セレコキシブ、ＪＴＥ−５２２、デラコキシブ、クロメン、クロマン、パレコキシブ、バルデコキシブ、エトリコキシブ、ロフェコキシブ、Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド、ＣＯＸ１８９、ＡＢＴ９６３、メロキシカム、これらのいずれもの薬学的に許容される塩、これらのいずれものプロドラッグ、及び上記の混合物から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、セレコキシブ又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、一般構造式：
【化９】
2005530781.tif 000072
［式中、Ｒ１６はメチル又はエチルであり；Ｒ１７はクロロ又はフルオロであり；Ｒ１８は水素又はフルオロであり；Ｒ１９は水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシであり；Ｒ２０は水素又はフルオロであり；Ｒ２１はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチル又はメチルである、但し、Ｒ１６がエチルでありＲ１９がＨである場合、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９及びＲ２０の全てがフルオロになるということはない］
で示されるフェニル酢酸誘導体、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３７】
該式において、Ｒ１６がエチルであり；Ｒ１７とＲ１９がクロロであり；Ｒ１８とＲ２０が水素であり；Ｒ２１がメチルであるフェニル酢酸誘導体、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、ジアリールメチリデンフラン誘導体を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３９】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、一般式：
【化１０】
2005530781.tif 000073
で示されるジアリールメチリデンフラン誘導体、又はその異性体、薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、請求項３８記載の方法。
（式中、環ＴとＭは、独立に、フェニル・ラジカル、ナフチル・ラジカル、５〜６員を含み１〜４個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルである；置換基Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１又はＬ２の少なくとも１つは、−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｒ（式中、ｎは０、１若しくは２に等しい整数であり、Ｒは、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル若しくは１〜６個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである）、又は−ＳＯ２ＮＨ２基であって、パラ位置に位置する；他の置換基は、水素原子、ハロゲン原子、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、トリフルオロメチル・ラジカル、又は１〜６個の炭素原子を有する低級Ｏ−アルキル・ラジカルである；或いは、Ｑ１とＱ２又はＬ１とＬ２はメチレンジオキシ基である；Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６及びＲ２７は、独立に、水素原子；ハロゲン原子；１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル；１〜６個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル；又はフェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである；或いは、Ｒ２４、Ｒ２５若しくはＲ２６、Ｒ２７は酸素原子であるか、又はＲ２４、Ｒ２５若しくはＲ２６、Ｒ２７は、それらが結合する炭素原子と共に、３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。）
【請求項４０】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド及び（Ｅ）−４−［（４−メチルフェニル）（テトラヒドロ−２−オキソ−３−フラニリデン）メチル］ベンゼンスルホンアミドから成る群から選択される化合物を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミドを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、（Ｅ）−４−［（４−メチルフェニル）（テトラヒドロ−２−オキソ−３−フラニリデン）メチル］ベンゼンスルホンアミドを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４３】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、ニメスリド、フロスリド、ＮＳ−３９８、Ｌ−７４５３３７、ＲＷＪ−６３５５６、Ｌ−７８４５１２、ダルブフェロン、ＣＳ−５０２、ＬＡＳ−３４４７５、ＬＡＳ−３４５５５、Ｓ−３３５１６、ＳＤ−８３８１、ＢＭＳ−３４７０７０、Ｓ−２４７４、これらの任意の２つ以上の混合物、これらの薬学的に許容される塩及びプロドラッグから成る群から選択される物質を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４４】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの量が、対象の体重１ｋｇにつき約０．０１〜約１００ｍｇ／日の範囲内である、請求項８記載の方法。
【請求項４５】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの量が、対象の体重１ｋｇにつき約１〜約２０ｍｇ／日の範囲内である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ及びシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む、新生物の治療又は予防のための組成物。
【請求項４７】
３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ；及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬剤組成物。
【請求項４８】
該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物が、３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグである、請求項４７記載の薬剤組成物。
【請求項４９】
新生物の治療、予防又は抑制に用いるために適したキットであって、３−ヘテロアリール−２−インドリノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む第１投与形、及びシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを含む第２投与形を、新生物の治療又は予防のための該化合物の組み合わせの治療有効量を構成する量で含むキット。
【請求項５０】
該シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が、請求項２０〜４３のいずれかに記載したシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５１】
新生物障害の治療、予防又は抑制を必要とする対象における新生物障害の治療、予防又は抑制用の組成物であって、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを第１量で、及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第２量で含み、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記対象における新生物障害の治療、予防又は抑制のための治療有効量を構成する組成物。
【請求項５２】
前記ＣＯＸ−２阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、約５μｍｏｌ／Ｌ未満のＣＯＸ−２  ＩＣ５０を有する、請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
前記ＣＯＸ−２阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、少なくとも約１．５のＣＯＸ−２阻害のＣＯＸ−１阻害に対する選択比率を有する、請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
前記ＣＯＸ−２阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、約１μｍｏｌ／Ｌ未満のＣＯＸ−２  ＩＣ５０と、少なくとも約１００のＣＯＸ−２阻害のＣＯＸ−１阻害に対する選択比率とを有する、請求項５３記載の組成物。
【請求項５５】
前記ＣＯＸ−２阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、少なくとも約１μｍｏｌ／ＬのＣＯＸ−１  ＩＣ５０を有する、請求項５１記載の組成物。
【請求項５６】
前記ＣＯＸ−２阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、少なくとも約２０μｍｏｌ／ＬのＣＯＸ−１  ＩＣ５０を有する、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
新生物障害の治療、予防又は抑制を必要とする対象における新生物障害の治療、予防又は抑制用の組成物であって、置換ベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン及びジヒドロナフタレンから成る群から選択されるシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はその薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを第１量で、及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第２量で含み、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記対象における新生物障害の治療、予防又は抑制のための治療有効量を構成する組成物。
【請求項５８】
新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を第１量で、及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第２量で投与することを含む、新生物障害の治療のための組成物であって、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記ＣＯＸ−２阻害剤及び前記３−ヘテロアリール−２−インドリノンの治療有効量であり、前記ＣＯＸ−２阻害剤が、式（Ｉ）：
【化１１】
2005530781.tif 000074
［式中、ＧはＯ又はＳ又はＮＲａであり；Ｒａはアルキルであり；Ｒ１はＨ又はアリールであり；Ｒ２はカルボキシル、アミノカルボニル、アルキルスルホニルアミノカルボニル又はアルコキシカルボニルであり；Ｒ３は、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル又はアリールであり、場合によっては、アルキルチオ、ニトロ及びアルキルスルホニルから選択される１つ以上のラジカルによって独立に置換される；ｎは、１、２、３又は４である整数であり；各Ｒ４は、独立に、Ｈ、ハロ、アルキル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ，ヘテロアリールアルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、モノ−若しくはジアルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニル、ヘテロアラルキルアミノスルホニル、ヘテロシクロスルホニル、アルキルスルホニル、ヒドロキシアリールカルボニル、ニトロアリール、アラルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アリールカルボニル、アミノカルボニル、アルキルカルボニル、アリール又はヘテロアリールであり；前記アリール及びヘテロアリール・ラジカルは、場合によっては、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ又はアルキルチオである１つ以上のラジカルによって独立に置換される；又はＲ４は、環ＥのＲ４が結合する原子及び残りの原子と一緒にナフチル・ラジカルを形成する］
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである組成物。
【請求項５９】
ＧがＯ又はＳであり；Ｒ２がカルボキシル、低級アルキル、低級アラルキル及び低級アルコキシカルボニルであり；Ｒ３が低級ハロアルキル、低級シクロアルキル及びフェニルであり；１つ以上のＲ４の各々が、Ｈ、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アラルキルカルボニル、低級アルキルカルボニル及び、フェニル（場合によっては、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ又はアルキルチオから成る群から選択される１つ以上のラジカルによって独立に置換される）であるか、又は、Ｒ４は、環ＥのＲ４が結合する原子及び残りの原子と一緒にナフチル・ラジカルを形成する、請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
Ｒ２がカルボキシルであり；Ｒ３が低級ハロアルキルであり；１つ以上のＲ４の各々が、独立に、Ｈ、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級アルキルスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル、又は低級アルキルカルボニルであるか、或いはＲ４は、環ＥのＲ４が結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する、請求項５９記載の組成物。
【請求項６１】
前記低級ハロアルキルＲ３が、フルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、ジクロロプロピル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチルであり；Ｒ４の各々又は１つ以上が、独立に、Ｈ、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ−フェニルメチルアミノスルホニル、Ｎ−フェニルエチルアミノスルホニル、Ｎ−（２−フリルメチル）アミノスルホニル、ニトロ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、Ｎ−エチルスルホニル、２，２−ジメチルエチルアミノスルホニル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、Ｎ−（２−メチルプロピル）アミノスルホニル、Ｎ−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、２，２−ジメチルプロピルカルボニル、フェニルアセチル又はフェニルであるか；或いは、Ｒ４は、環ＥのＲ４が結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する、請求項６０記載の組成物。
【請求項６２】
Ｒ３がトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり；１つ以上のＲ４の各々が、独立に、Ｈ、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ−フェニルメチルアミノスルホニル、Ｎ−フェニルエチルアミノスルホニル、Ｎ−（２−フリルメチル）アミノスルホニル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル、Ｎ−メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、Ｎ−（２，２−ジメチルエチル）アミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、２−メチルプロピルアミノスルホニル、Ｎ−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、又はフェニルであるか；又はＲ４は、環ＥのＲ４が結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する、請求項６１記載の組成物。
【請求項６３】
Ｒ３がトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり；１つ以上のＲ４の各々が、独立に、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、メチル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフルオロメトキシ、メトキシ、ベンジルカルボニル、ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、Ｎ−メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、フェニルエチルアミノスルホニル、メチルプロピルアミノスルホニル、メチルスルホニル、モルホリノスルホニル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、又はフェニルである、請求項６２記載の組成物。
【請求項６４】
新生物障害の治療を必要とする対象における新生物障害の治療、予防又は抑制のための組成物であって、三環式ＣＯＸ−２阻害剤から成る群から選択されるシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤又はその薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを第１量で、及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第２量で含み、前記第１量が、前記第２量と一緒に、前記対象における新生物障害の治療、予防又は抑制のための治療有効量を構成する組成物。
【請求項６５】
新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を第１量で、及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第２量で投与することを含む、新生物障害の治療のための組成物であって、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記ＣＯＸ−２阻害剤及び前記３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量であり、前記ＣＯＸ−２阻害剤が、式（ＩＩ）：
【化１２】
2005530781.tif 000075
で示される化合物、又はその薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである組成物。
（式中、Ｄは、部分的不飽和若しくは飽和ヘテロサイクリル環又は部分的不飽和若しくは飽和炭素環であり；Ｒ１３は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールであり、この場合に、Ｒ１３は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ又はアルキルチオである１つ以上のラジカルによって置換される；Ｒ１４は、メチル又はアミノであり；及び、Ｒ１５は、Ｈ、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、Ｎ−アリールアミノカルボニル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、Ｎ−アリールアミノアルキル、Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、Ｎ−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、又はＮ−アルキル−Ｎ−アリールアミノスルホニルである。）
【請求項６６】
前記ＣＯＸ−２阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグが、約５μｍｏｌ／Ｌ未満のＣＯＸ−２  ＩＣ５０を有する、請求項６５記載の組成物。
【請求項６７】
前記ＣＯＸ−２阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグにおいて、ＣＯＸ−２阻害のＣＯＸ−１阻害に対する選択比率が少なくとも約１．５である、請求項６６記載の組成物。
【請求項６８】
前記ＣＯＸ−２阻害剤又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグにおいて、ＣＯＸ−２  ＩＣ５０が約１μｍｏｌ／Ｌ未満であり、ＣＯＸ−２阻害のＣＯＸ−１阻害に対する選択比率が少なくとも約１００である、請求項６６記載の組成物。
【請求項６９】
シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を第１量で及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第２量で含む、新生物障害を治療するための組成物であって、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記ＣＯＸ−２阻害剤及び前記３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量であり、前記ＣＯＸ−２阻害剤が、式（ＩＩＩ）：
【化１３】
2005530781.tif 000076
［式中、Ｒ１６はメチル又はエチルであり；Ｒ１７はクロロ又はフルオロであり；Ｒ１８は水素又はフルオロであり；Ｒ１９は水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシであり；Ｒ２０は水素又はフルオロであり；Ｒ２１はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチル又はメチルである、但し、Ｒ１６がエチルでありＲ１９がＨである場合には、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９及びＲ２０の全てがフルオロになるということはない］
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである組成物。
【請求項７０】
Ｒ１６がエチルであり；Ｒ１７とＲ１９がクロロであり；Ｒ１９とＲ２０が水素であり；Ｒ２１がメチルである、請求項６９記載の組成物。
【請求項７１】
新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を第１量で及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第２量で投与することを含む新生物障害の治療のための組成物であって、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記ＣＯＸ−２阻害剤及び前記３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量であり、前記ＣＯＸ−２阻害剤が、式（ＩＶ）：
【化１４】
2005530781.tif 000077
［式中、ＸはＯ又はＳであり；Ｊは炭素環又は複素環であり；Ｒ２２はＮＨＳＯ２ＣＨ３又はＦであり；Ｒ２３はＨ、ＮＯ２又はＦであり；Ｒ２４はＨ、ＮＨＳＯ２ＣＨ３又は（ＳＯ２ＣＨ３）Ｃ６Ｈ４である］
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである組成物。
【請求項７２】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、ニメスリド（Ｂ−２１２）、フロスリド（Ｂ−２１３）、ＮＳ−３９８（Ｂ−２６）、Ｌ−７４５３３７（Ｂ−２１４）、ＲＷＪ−６３５５６（Ｂ−２１５）又はＬ−７８４５１２（Ｂ−２１６）である、請求項７１記載の組成物。
【請求項７３】
新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を第１量で及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグを第２量で投与することを含む新生物障害の治療のための組成物であって、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記ＣＯＸ−２阻害剤及び前記３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグの治療有効量であり、前記ＣＯＸ−２阻害剤が、式（Ｖ）：
【化１５】
2005530781.tif 000078
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグである組成物。
（式中、ＴとＭは、独立に、フェニル、ナフチル、５〜６員を含み１〜４個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルであり；Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１又はＬ２は、独立に、水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル、トリフルオロメチル、又は１〜６個の炭素原子を有する低級メトキシであり：及びＱ１、Ｑ２、Ｌ１又はＬ２の少なくとも１つは、パラ位置に存在し、−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｒ（式中、ｎは０、１若しくは２であり、Ｒは、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、１〜６個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである）、又は−ＳＯ２ＮＨ２である；或いは、Ｑ１とＱ２はメチレンジオキシであるか；又は、Ｌ１とＬ２はメチレンジオキシである；Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７及びＲ２８は、独立に、水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、１〜６個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル又は、フェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである；或いは、Ｒ２５とＲ２６がＯであるか、又はＲ２７とＲ２８がＯである、或いは、Ｒ２５、Ｒ２６は、それらが結合する炭素原子と一緒に、３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する、又はＲ２７、Ｒ２８は、それらが結合する炭素原子と一緒に、３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。）
【請求項７４】
前記ＣＯＸ−２阻害剤がＮ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド、又は（Ｅ）−４−［（４−メチルフェニル）（テトラヒドロ−２−オキソ−３−フラニリデン）メチル］ベンゼンスルホンアミドである、請求項７３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新生物(neoplasm)を治療するための、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物とシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）選択的阻害剤との組み合わせを用いる組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
新生物、又は腫瘍は、細胞成長の異常で、調節されておらず、組織の乱れた増殖である。新生物は、破壊的に成長する性質、侵襲性及び転移性を有する場合には、悪性又は癌性である。侵襲性は、周囲組織の浸潤又は破壊による新生物の局部的広がり(local spread)を意味し、典型的には、組織の境界を定義する基底層を突破することによって、しばしば身体の循環系に侵入する。転移は、通常は、リンパ管又は血管による腫瘍細胞の播種(dissemination)を意味する。転移はさらに、漿膜腔又はクモ膜下腔又は他の空隙(spaces)を通じた直接の伸展による腫瘍細胞の移動を意味する。転移の経過を通して、身体の他の領域への腫瘍細胞の移動が、最初の出現部位から離れた領域における新生物を確立する。
【０００３】
癌は、今や、合衆国における第２の主要死亡原因であり、合衆国では、８，０００，０００を超える人々が何らかの形の癌と診断されている。１９９５年には、癌は合衆国における全ての死亡の２３．３％を占めている（U.S.Dept of Health and Human Services,National Center for Health Statistics,Health United Sates 1996-97 and Injury Chartbook 117(1997)を参照のこと）。
【０００４】
癌は、分子レベルで完全に理解されているとは言えない。例えば、ある種のウイルス、化学物質又は放射線のような発癌物質に細胞を暴露させると、“サプレッシブ”遺伝子を不活化するか、又は、“癌遺伝子(oncogene)”を活性化するＤＮＡ変化をもたらすことは、知られている。サプレッシブ遺伝子は成長調節遺伝子であり、これは、突然変異すると、もはや細胞増殖を抑制することができなくなる。癌遺伝子は、最初は正常な遺伝子（癌原遺伝子と呼ばれる）であるが、突然変異又は発現環境の変化によって、トランスフォーミング遺伝子になる。トランスフォーミング遺伝子の産物は、不適当な細胞増殖を惹起する。２０種類以上の正常な細胞遺伝子が、遺伝子変化(genetic alteration)によって癌遺伝子になりうる。形質転換細胞(transformed cell)は、細胞の形態構造、細胞間相互作用、膜含有物(membrane content)、細胞骨格構造、タンパク質分泌、遺伝子発現及び死亡率を含めた、多くの点で正常細胞とは異なる（形質転換細胞は、無制限に増殖しうる）。
【０００５】
癌は、現在、３種類の療法：手術、放射線及び化学療法の１つ又は組み合わせによって主として治療されている。手術は、患部組織の大部分の除去を意味する。手術は、ある一定の部位、例えば、乳房(breast)、結腸及び皮膚に位置する腫瘍の除去に時には有効であるが、例えば背骨のような他の領域に位置する腫瘍の治療には、手術を用いることができないし、例えば白血病のような播種性新生物状態の治療にも用いることができない。
【０００６】
化学療法は、細胞複製又は細胞代謝を破壊することを意味する。化学療法は、乳癌、肺癌及び睾丸癌の治療に、最も頻繁に用いられる。新生物疾患の治療に用いられる全身性化学療法の副作用は、癌の治療を受ける患者によって最も恐れられている。これらの副作用のなかで、吐き気と嘔吐は最も一般的で、重度な副作用である。他の不利な副作用は、骨髄救助（bone marrow rescue）又は放射線療法と共に高用量の化学療法を受けた患者における血球減少症、感染、悪液質、粘膜炎；脱毛症（ヘア・ロス）；皮膚併発症（化学療法剤に対する皮膚反応に関して、M. D. Abeloff, et al : Alopecia and Cutaneous Complications. P. 755-56.In Abeloff, M. D. , Armitage, J.O., Lichter, A. S. , and Niederhuber, J. E. (eds) Clinical Oncology,Churchill Livingston, New York, 1992を参照のこと）、例えば、心因性掻痒症、蕁麻疹及び血管性浮腫；神経併発症；放射線又は化学療法を受けた患者における肺及び心臓併発症；並びに生殖及び内分泌併発症を包含する。
【０００７】
化学療法誘導副作用は、患者のクオリティ・オブ・ライフに重大に影響を与え、治療による患者コンプライアンスに劇的に影響を及ぼす可能性がある。
さらに、化学療法剤に関連した不利な副作用は、一般に、これらの薬物の投与における主要な用量制限毒性（ＤＬＴ）である。例えば、粘膜炎は、代謝拮抗物質の細胞傷害性薬剤５−ＦＵ、メトトレキセート及び例えばドキソルビシンのような抗腫瘍性抗生物質を含めた、幾つかの抗癌剤に対する主要な用量制限毒性である。これらの化学療法誘導副作用の多くは、重度であり、入院を招来するか、又は痛覚の治療のために鎮痛剤による処置を必要とする可能性がある。
【０００８】
化学療法剤及び放射線療法によって誘導される、不利な副作用は、癌患者の臨床管理にとって非常に重要になってきている。
米国特許第５，８４３，９２５号は、７−［置換アミノ］−９−［（置換グリシル）アミド］−６−デメチル−６−デオキシテトラサイクリンを用いた、血管形成及び内皮細胞増殖を阻害する方法を記載する。
【０００９】
米国特許第５，８５４，２０５号は、内皮細胞増殖及び血管形成の阻害剤である単離エンドスタチン・タンパク質を記載している。
米国特許第５，８６３，５３８号は、化学療法及び放射線と組み合わせて、免疫及び成長因子に基づく試薬を用いる、充実性腫瘍の腫瘍脈管構造を標的とするための方法及び組成物を記載している。
【００１０】
米国特許第５，８３７，６８２号は、内皮細胞増殖阻害剤、アンギオスタチンのフラグメントの使用を記載している。
米国特許第５，８６１，３７２号は、凝集内皮細胞阻害剤、アンギオスタチンの使用と、血管形成の抑制におけるその使用を記載している。
【００１１】
ＰＣＴ／ＵＳ９７／０９６１０は、腫瘍及び血管形成に関連する疾患の治療に用いるための少なくとも１種類の血管形成阻害剤又は抗腫瘍薬にコンジュゲートする、抗エンドギン・モノクローナル抗体(anti-endogin monoclonal antibody)の投与を記載している。
【００１２】
ＰＣＴ／ＩＬ９６／０００１２は、癌の治療のためのＴｈｒｏｍｂｉｎ  Ｂ鎖のフラグメントを記載している。
ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６８５５は、組換えウイルス・ベクターを用いる、特定腫瘍細胞を殺す組成物及び方法を記載している。
【００１３】
Ｒａｖａｕｄ，Ａ．らは、転移腎細胞癌を有する患者におけるインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロンα−２ａ及びフルオロウラシルの効力及び耐性(tolerance)を述べている、J.Clin.Oncol.16,No.8,2728-32,1998.
Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｗ．Ｍ．らは、転移腎細胞癌を有する患者における皮下インターロイキン−２及びインターフェロンαの外来患者処方計画に加えられる経口１３−シス−レチノイン酸の反応速度及び毒性を述べている、J.Clin.Oncol.16,No.5,1820-25,1998.
Ｒｏｓｅｎｂｅｇ，Ｓ．Ａ．らは、転移黒色腫を有する患者に関し、シスプラチン、ダカルバジン及びタモキシフェン単独で又はインターロイキン−２及びインターフェロンα−２ｂと組み合わせた治療を述べている、J.Clin.Oncol.17,No.3,968-75,1999.
Ｔｏｕｒａｎｉ，Ｊ−Ｍらは、インターロイキン−２及びインターフェロンα−２ｂの、フルオロウラシルと組み合わせた投与を用いる腎細胞癌の治療を述べている、J.Clin.Oncol.16,No.7,2505-13,1998.
Ｍａｊｅｗｓｋｉ，Ｓ．は、抗血管形成及び抗増殖効果に関連した、レチノイド、ビタミンＤ３及びサイトカイン（インターフェロン及びインターロイキン−１２）の抗癌作用を述べている、J.Invest.Dermatol.108,No.571,1997.
Ｒｙａｎ，Ｃ．Ｗ．は、経口シスレチノイン酸に加え、ＧＷ−ＣＳＦ、インターロイキン−２及びインターフェロン−αによる、転移腎細胞癌を有する患者の治療を述べている、J.Invest.Med.46,No.7,274A,1998.
Ｔａｉ−Ｐｉｎｇ，Ｄ．は、可能な抗血管形成療法を述べている、Trends Pharmacol. Sci. 16, No. 2,57-66, 1995.
Brembeck, F. H. は、ＵＩＣＣステージＩＩＩ／ＩＶ膵臓癌を治療するための１３−１シスレチノイン酸及びインターフェロン−αの使用を述べている、Gastroenterology 114, No. 4, Pt. 2, A569,1998．
Brembeck, F. H.は、進行した膵臓癌を有する患者における１３−シスレチノイン酸及びインターフェロン−αの使用を述べている、 Cancer 83, No. 11,2317- 23,1998．
Mackean, M. J.は、進行した悪性黒色腫又は腎癌を有する患者におけるロキニメックス(Linomide)及びαインターフェロンの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, No. 12,1620-23, 1998．
Jayson, G. C. は、進行した腎癌におけるインターロイキン−２及びインターロイキン−インターフェロンαの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, No.3, 366-69, 1998．
Abraham, J. M. は、転移腎癌を有する患者におけるインターロイキン−２、インターフェロンα及び５−フルオロウラシルの使用を述べている、Br. J. Cancer 78, Suppl. 2, 8,1998．
Soori, G. S. は、非ホジキン・リンパ腫を有する患者におけるクロラムブシル及びαインターフェロンによる化学−生物学的療法の使用を述べている、Blood 92, No. 10, Pt. 2 Suppl. 1,240b, 1998．
Enschede, S. H. は、低悪性度及び中間悪性度の非ホジキン・リンパ腫の治療におけるアントラサイクリンに基づく治療計画に加えたインターフェロンαの使用を述べているBlood 92, No. 10, Pt. 1 Suppl. 1,412a, 1998．
Schachter, J. は、インターフェロンα、４薬物化学療法計画及びＧＭ−ＣＳＦによる逐次多重薬物化学療法及び生物学的療法の使用を述べている、Cancer Biother. Radiopharm. 13, No. 3,155-64, 1998．
Mross, K. は、転移乳癌患者におけるレチノイン酸、インターフェロンα及びタモキシフェンの使用を述べている、J. Cancer Res. Clin. Oncology. 124Suppl. 1 R123, 1998．
Muller, H. は、進行した及び転移した膵臓癌の治療におけるスラミン及びタモキシフェンの使用を述べている、Eur. J. Cancer 33,Suppl. 8, S50, 1997．
Rodriguez, M. R. は、転移乳癌の治療におけるタキソールとシスプラチン、及びタキソテレとビノレルビンの使用を述べている、 Eur. J. Cancer 34,Suppl. 4,S17-S18, 1998．
Formenti, C. は、局所進行乳癌患者におけるパクリタキセルと放射線との併用療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S39,1998．
Durando, A. は、転移乳癌のためのパクリタキセル（Ｔ）及びエピルビシン（Ｅ）による複合療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S41,1998．
Osaki, A.は、進行乳癌のためのセカンドライン療法としてのマイトマイシン−Ｃ、エトポシド、ドキシフルリジン及びメドロキシプロゲステロン・アセテートによる複合療法を述べている、Eur. J. Cancer 34,Suppl. 5, S59,1998．
Lode, H. らは、自発的腫瘍転移を撲滅する、抗血管形成性インテグリンαｖアンタゴニストと、抗体−サイトカイン融合タンパク質との相乗効果を述べている、Proc. Nat. Acad. Sci. USA. , 96 (4), 1591-1596,1999．
Giannis, A. らは、血管形成の阻害剤としてのインテグリン・アンタゴニスト及び他の低分子量化合物：癌療法における新規な薬物を述べている、Angew. Chem. int. Ed. Engl. 36 (6), 588-590,1997．
Takada, Y.らは、インテグリンの構造及び機能を述べている、Jikken Igaku 14 (17), 2317-2322,1996．
Varner, J.らは、腫瘍血管形成及び血管細胞インテグリンαｖβ３の役割を述べている、Impt. Adv.Onc., 69-87 Ref: 259.1996．
シクロホスファミド、ＣＤＤＰ又はチオテーパ(thiotepa)と組み合わせた、ＴＮＰ−４７０及びミノサイクリンの使用が、１つの前臨床充実性腫瘍モデルにおいて腫瘍成長遅延を実質的に高めることが観察されている(Teicher, B. A. etal., Breast Cancer Research and Treatment, 36 : 227-236, 1995)．さらに、該抗血管形成剤をシクロホスファミド及び分割放射線療法と組み合わせて用いた場合に、改良された結果が観察されている、(Teicher, B. A.et al., European Journal of Cancer 32A (14) : 2461-2466,1996)．
Neri らは、癌の治療のためのカルボプラチン及びタキソールと組み合わせたＡＧ−３３４０の使用を検討した(Neri etal., Proc Am Assoc Can Res, Vol 39,89 meeting, 302 1998)．
米国特許第５，８３７，６９６号は、癌成長を抑制するためのテトラサイクリンの使用を記載している。
【００１４】
ＷＯ９７／４８，６８５は、メタロプロテアーゼを阻害する、種々な置換化合物を記載している。
ＥＰ４８／９，５７７は、腫瘍細胞の転移及び浸潤を防止するために用いられるペプチジル誘導体を記載している。
【００１５】
ＷＯ９８／２５，９４９は、メタロプロテイナーゼ酵素を阻害するためのＮ５−置換５−アミノ−１，３，４−チアジアゾール−２−チオールの使用を記載している。
ＷＯ９９／２１，５８３は、野性型ｐ５３が主として発現する癌を有する患者における転移を、放射線療法と選択的マトリックス・メタロプロテイナーゼとの組み合わせを用いて抑制する方法を記載している。
【００１６】
ＷＯ９８／３３，７６８は、癌の治療におけるアリールスルホニルアミノヒドロキサム酸誘導体を記載している。
ＷＯ９８／３０，５６６は、癌の治療に有用な環状スルホン誘導体を記載している。
【００１７】
ＷＯ９８／３４，９８１は、癌の治療に有用なアリールスルホニルヒドロキサム酸誘導体を記載している。
ＷＯ９８／３３，７８８は、腫瘍の治療のためのカルボン酸誘導体又はヒドロキサム酸誘導体の使用を記載している。
【００１８】
ＷＯ９７／４１，８４４は、ヒト患者における血管新生の予防及び／又は治療のために止血性化合物組み合わせを用いる方法を記載している。
ＥＰ４８／９，５７９は、癌の治療において、腫瘍転移を制御するために有用であると考えられる選択的ゲラチナーゼ作用を有するペプチジル誘導体を記載している。
【００１９】
ＷＯ９８／０３，５１６は、癌の治療に有用な、ホスフィネートに基づく化合物を記載している。
ＷＯ９３／２４，４７５は、スルファミド誘導体が、癌の治療において転移の発生を制御するために有用でありうると、記載している。
【００２０】
ＷＯ９８／１６，２２７は、新生物の治療及び予防に［ピロゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミドを用いる方法を記載している。
ＷＯ９８／２２，１０１は、抗血管形成剤として［ピロゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミドを用いる方法を記載している。
【００２１】
ＷＯ９６／０３，３８５は、単独で又は、癌の治療に有用であると考えられるＮＳＡＩＤｓ、ステロイド、５−ＬＯ阻害剤、ＬＴＢ４アンタゴニスト若しくはＬＴＡ４ヒドロラーゼ阻害剤と組み合わせて投与される３，４−二置換ピラゾール化合物を記載している。
【００２２】
ＷＯ９８／４７，８９０は、単独で又は他の有効成分と組み合わせて用いられうる置換ベンゾピラン誘導体を記載している。
シクロオキシゲナーゼ−２酵素を選択的に阻害する化合物が、発見されている。これらの化合物は、ＣＯＸ−２の活性を、ＣＯＸ−１の活性よりも大きな程度に選択的に阻害する。該新規なＣＯＸ−２阻害剤は、ＣＯＸ−１の阻害に関連した、有害な副作用を回避しながら、炎症を予防又は軽減する能力を包含する利点を提供すると考えられる。したがって、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、療法に、特に、例えば関節炎の痛覚及び炎症の制御のためのような長期間投与を必要とする療法に用いるために非常に有用であると判明している。シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤の同定に関する他の情報は、(1)Buttgereit, F.et al., Am. J.Med., 110 (3 Suppl. 1) :13-9 (2001); (2) Osiri, M.et al, Arthritis Care Res., 12(5) : 351-62 (1999); (3) Buttar, N. S.et al., Mayo Clin. Proc. , 75(10) : 1027-38 (2000); (4) Wollheim, F. A., Current Opin.Rheumatol., 13 : 193-201 (2001); (5) U. S. Patent Nos. 5,434, 178 (１，３，５−三置換ピラゾール化合物); (6) 5,476, 944 (環状フェノールチオエーテル誘導体); (7) 5,643, 933 (置換スルホニルフェニル複素環) ; 5,859, 257 (イソオキサゾール化合物); (8) 5,932, 598 (ベンゼンスルホンアミド含有ＣＯＸ−２阻害剤のプロドラッグ); (9) 6,156, 781 (置換ピラゾリルベンゼンスルホンアミド) ; 及び(10) 6,110, 960 (ジヒドロベンゾピランと関連化合物に関して)に見出すことができる。
【００２３】
炎症の治療のためのシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤の効力及び副作用が、報告されている。参考文献は、Hillson, J. L.et al., Expeff Opin. Pharmacother., 1 (5) : 1053-66 (2000),(ロフェコキシブ、VioxxO, Merck & Co.,Inc.に関して) ; Everts, B. et al.,Clin. Rheumatol., 19 (5) : 331-43 (2000), (セレコキシブ、Celebrex（登録商標） Pharmacia Corporation及びロフェコキシブに関して); Jamali, F. , J. Pharm. Pharm.Sci., 4 (1) :1-6 (2001),(セレコキシブに関して) ; U. S. Patent Nos. 5,521, 207 及び 5,760, 068 (置換ピラゾリルベンゼンスルホンアミドに関して) ; Davies, N. M. et al.,Clinical.Genetics,Abstr.at.http://www.mmhc.com/cg/articles/CG0006/davies.html (メロキシカム、セレコキシブ、バルデコキシブ、デラコキシブ及びロフェコキシブに関して）； http ://www. celebrex. com (セレコキシブに関して) ;
http : //www. docguide. com/dg.nsf/PrintPrint/F1F8DDD2D8B009408525698F00742187, 5/9/2001 (エトリコキシブ、 MK-663, Merck & Co., Inc.に関して) ; Saag, K. et al., Arch. Fam.Med., 9 (10) : 1124-34 (2000), (ロフェコキシブに関して); 国際特許公開 No. WO 00/24719 (ABT 963, Abbott Laboratoriesに関して)を包含する。
【００２４】
ＣＯＸ−２阻害剤はまた、癌の治療(W098/16227) 及び腫瘍の治療( EP 927,555,及び Rozic et al., Int. J. Cancer, 93 (4) : 497-506 (2001)参照)に関して記載されている。Celecoxib（登録商標）、ＣＯＸ−２の選択的阻害剤は、ラットにおける線維芽細胞増殖因子誘導角膜血管形成に強力な阻害を発揮した(Masferrer et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Research 1999, 40 : 396)。ＷＯ９８／４１５１１は、癌の治療に用いられる５−（４−スルフニル−フェニル）−ピリダジノン誘導体を記載している。ＷＯ９８／４１５１６は、癌の治療に用いることができる（メチルスルホニル）フェニル−２−（５Ｈ）−フラノン誘導体を記載している。Kalgutkar, A. S.ら, Curr. Drug Targets,2(1) : 79-106 (2001)は、ＣＯＸ−２選択的阻害剤を用いて、腫瘍の生存性、成長及び転移に影響を及ぼすことによって、癌を治療する又は予防することができることを示唆している。Masferrer らは、Ann.NYAcad.Sci., 889: 84-86 (1999)において、数種類の癌における可能な治療的有用性を有する抗血管形成剤としてのＣＯＸ−２選択的阻害剤を述べている。臨床的癌予防におけるＣＯＸ−２阻害の有用性は、結腸癌に対する化学予防剤としてのＣＯＸ−２選択的阻害剤の可能性を述べている、Oncology, 15 (3) : 21-26 (2001)におけるLynch, P. M.と、Biofactors 2000,12 (1-4) : 129-133 (2000)におけるWatanabeらによって説明されている。
【００２５】
さらに、ＣＯＸ−２阻害剤を用いた種々な複合療法が、癌の治療のための他の選択された複合治療計画と共に、報告されている。例えば、ＦＲ２７７１００５（癌及び他の疾患の治療のために用いられる、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤及びＮ−メチル−ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニストを含有する組成物）；ＷＯ９９／１８９６０（結腸直腸癌及び乳癌の治療に用いることができる、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤及び誘導酸化窒素シンターゼ阻害剤（ｉＮＯＳ）を含む組み合わせ）；ＷＯ９９／１３７９９（シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤とオピオイド鎮痛剤との組み合わせ）；ＷＯ９７／３６４９７（癌の治療に有用な、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤及び５−リポキシゲナーゼ阻害剤を含む組み合わせ）；ＷＯ９７／２９７７６（ロイコトリエンＢ４受容体アンタゴニスト及び免疫抑制薬と組み合わせて、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤を含む組成物）；ＷＯ９７／２９７７５（ロイコトリエンＡ４ヒドラーゼ阻害剤及び免疫抑制薬と組み合わせた、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤の使用）；ＷＯ９７／２９７７４（癌の治療に有用な、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤と、プロスタグランジン又は抗潰瘍薬との組み合わせ）；ＷＯ９７／１１７０１（結腸直腸癌の治療に有用な、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤及びロイコトリエンＢ４受容体アンタゴニストから成る組み合わせ）；ＷＯ９６／４１６４５（シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤及びロイコトリエンＡヒドラーゼ阻害剤から成る組み合わせ）；ＷＯ９６／０３３８５（癌の治療のために、単独で又はＮＳＡＩＤｓ、ステロイド、５−ＬＯ阻害剤、ＬＴＢ４アンタゴニスト又はＬＴＡ４ヒドラーゼ阻害剤と組み合わせて投与される３，４−二置換ピラゾール化合物）；ＷＯ９８／４７８９０（単独で又は他の有効成分と組み合わせて用いることができる置換ベンゾピラン誘導体）；ＷＯ００／３８７３０（新生物の治療における複合療法としての、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤及び１種類以上の抗新生物薬の使用方法）；Mann, M.etal, Gastroenterology, 120 (7): 1713-1719 (2001) (ＣＯＸ−２及びＨＥＲ−２の新規な阻害剤による組み合わせ治療が、結腸直腸癌の増殖を減じた）を参照のこと。
【００２６】
このように、新生物の治療及び予防のために新規な又は改良された方法を開発することが、望ましい。
【発明の開示】
【００２７】
発明の概要
それ故、簡単に言えば、本発明は、新生物障害の治療又は予防を必要とする対象における新生物障害の治療又は予防の新規な方法であって、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はそのプロドラッグと、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む組み合わせを該対象に投与することを含む方法に関する。
【００２８】
１つの実施態様では、本発明の３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物は、式：
【００２９】
【化１】
2005530781.tif 000002
【００３０】
で示される化合物を包含する。
（式中、
Ｒ１は、Ｈ又はアルキルであり；
Ｒ２は、Ｏ又はＳであり；
Ｒ３は、水素であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール(alkaryl)、アルカリールオキシ(alkaryloxy)、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２ＮＲＲ’、ＳＯ３Ｒ、ＳＲ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ３）ｎＣＯ２Ｒ、及びＣＯＮＲＲ’から成る群から選択される；
Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３，４−オキサトリアゾール、１，２，３，５−オキサトリアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，２，３，４−チアトリアゾール、１，２，３，５−チアトリアゾール及びテトラゾールから成る群から選択される五員ヘテロアリール環であり、場合によっては、１つ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２ＮＲＲ’、ＳＯ３Ｒ、ＳＲ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ、及びＣＯＮＲＲ’によって置換される；
ｎは、０〜３であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル又はアリールであり；
Ｒ’は、Ｈ、アルキル又はアリールである。）
本発明の該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物は、３−［（３−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３，４−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（２−メチルチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−｛［４−（２−メトキシカルボニルエチル）−３−メチルピロル−５−イル）］メチレン｝−２−インドリノン；３−［（４，５−ジメチル−３−エチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（５−メチルイミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；５−クロロ−３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン；３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；５−クロロ−３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；及び３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；並びにこれらのプロドラッグを包含するが、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様では、該化合物は、３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）又はそのプロドラッグである。
本発明はまた、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はそのプロドラッグ及びシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む、新生物の治療又は予防のための新規な組成物にも関する。
【００３２】
本発明はさらに、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はそのプロドラッグ、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はそのプロドラッグ、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、新規な薬剤組成物にも関する。好ましくは、該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物は、３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）又はそのプロドラッグである。
【００３３】
本発明はまた、新生物の治療又は予防に用いるために適する新規なキットであって、３−ヘテロアリール−２−インドリノン又はそのプロドラッグを含む第１投与形及びシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む第２投与形を、新生物障害の治療又は予防のための該化合物の治療有効量を構成する量で含むキットにも関する。
【００３４】
詳細な説明
“アルキル”は、直鎖、分枝鎖又は環状の飽和脂肪族炭化水素を意味する。好ましくは、アルキル基は１〜１２個の炭素を有する。さらに好ましくは、該アルキル基は、炭素数１〜７、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルキルである。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等を包含する。該アルキル基は、場合によっては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ３）２アミノ及びＳＨから成る群から選択される１つ以上の置換基で置換されることも可能である。
【００３５】
“アルケニル”は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する、直鎖、分枝鎖又は環状の不飽和炭化水素基を意味する。好ましくは、該アルケニル基は、１〜１２個の炭素を有する。さらに好ましくは、該アルケニル基は、炭素数１〜７、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルケニルである。該アルケニル基は、場合によっては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ３）２、アミノ及びＳＨから成る群から選択される１つ以上の置換基によって置換されうる。
【００３６】
“アルキニル”は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する、直鎖、分枝鎖又は環状の不飽和炭化水素を意味する。好ましくは、該アルキニル基は、１〜１２個の炭素を有する。さらに好ましくは、該アルキニル基は、炭素数１〜７、より好ましくは炭素数１〜４の低級アルキニルである。該アルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ３）２、アミノ及びＳＨから成る群から選択される１つ以上の置換基によって置換されうる。
【００３７】
“アルコキシ”は、“Ｏ−アルキル”基を意味する。
“アリール”は、共役ｐｉ電子系を有する環を少なくとも１つ有する芳香族基を意味し、炭素環アリール、複素環アリール及びビアリール基を包含する。該アリール基は、場合によっては、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、ＮＯ２、アミン、チオエーテル、シアノ、アルコキシ、アルキル及びアミノから成る群から選択される１つ以上の置換基によって置換されうる。
【００３８】
“アルカリール”は、アリール基に共有結合したアルキルを意味する。好ましくは、該アルキルは低級アルキルである。
“炭素環アリール”は、環原子が炭素であるアリール基を意味する。
【００３９】
“複素環アリール”は、環原子として、１〜３個のヘテロ原子を有し、環原子の残りが炭素であるアリール基を意味する。ヘテロ原子は、酸素、硫黄及び窒素を包含する。したがって、複素環アリール基は、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル等を包含する。
【００４０】
“アミド”は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である）を意味する。
“チオアミド”は、−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒ（式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素である）を意味する。
【００４１】
“アミン”は、−Ｎ（Ｒ’）Ｒ”（式中、Ｒ’とＲ”は、アルキル、アリール及びアルキルアリールから成る群から独立に選択される）を意味する。
“チオエーテル”は、−Ｓ−Ｒ（式中、Ｒはアルキル、アリール又はアルキルアリールである）を意味する。
【００４２】
“スルホニル”は、−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ（式中、Ｒは、アリール、Ｃ（ＣＮ）＝Ｃ−アリール、ＣＨ２ＣＮ、アルキアリール(alkyaryl)、スルホンアミド、ＮＨ−アルキル、ＮＨ−アルキルアリール又はＮＨ−アリールである）を意味する。
【００４３】
本明細書で用いる限り、“３−ヘテロアリール−２−インドリノン”なる用語は、その薬学的に許容される塩を包含する。
本明細書で用いる限り、３−ヘテロアリール−２−インドリノン・プロドラッグは、ｉｎ  ｖｉｖｏで親化合物の３−ヘテロアリール−２−インドリノンに転化する作用物質(agent)を意味する。プロドラッグは、状況によっては、親薬物よりも投与し易い可能性がある。例えば、プロドラッグは、経口投与によってバイオアベイラブル(bioavailable)であるが、親薬物はそうではない、又は、プロドラッグは、溶解性を改良して、静脈内投与を可能にすることができる。３−ヘテロアリール−２−インドリノンのプロドラッグのクラスは、米国特許第６，３１６，６３５号に記載されている。本明細書における“インドリノン”、“オキシンドール”、“３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物”等への言及は、状況がプロドラッグを排除しない限り、それらのプロドラッグを包含する。
【００４４】
本発明は、新生物の治療又は予防を必要とする対象における新生物を治療又は予防する方法であって、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はそのプロドラッグ及びシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む組み合わせを該対象に投与することを含む方法を提供する。
【００４５】
本発明の方法及び組み合わせは、末端性ほくろ性黒色腫、日光性角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星状細胞腫、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細管(capillary)、類癌腫、癌腫、癌肉腫、海綿状(cavernous)、胆管癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌腫、明細胞癌、嚢胞状腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質部肉腫、子宮内膜腺癌、上衣(ependymal)、類上皮(epitheloid)、ユーイング肉腫、層状化線維(fibrolamellar)、限局性結節性過形成、ガストリン産生腫瘍、胚細胞腫瘍、グリア芽細胞腫、グルカゴノーマ、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症（hepatic adenomatosis）、肝細胞癌、インシュリノーマ、上皮内新生物、上皮間扁平細胞新生物、浸潤性扁平細胞腫、大細胞癌、平滑筋肉腫、悪性ほくろ性黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、髄芽細胞腫、髄上皮腫、黒色腫、髄膜、中皮（mesothelial）、転移性癌、粘類表皮癌、神経芽細胞腫、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、燕麦細胞癌、乏突起膠細胞 (oligodendroglial)、骨肉腫、膵臓ポリペプチド、乳頭状漿液性腺癌、松果体細胞、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫（retinoblastoma）、横紋筋肉腫、肉腫、重篤癌（serious carcinoma）、小細胞癌、軟組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌、扁平上皮細胞癌、中皮下(submesothelial)、表在拡大型黒色腫（superficial spreading melanoma）、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、いぼ状癌、ビポーマ、分化癌（well differentiated carcinoma）、及びウィルムス腫瘍を包含する新生物障害の治療又は予防のために用いることができる。
【００４６】
１実施態様では、本発明の３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物は、式：
【００４７】
【化２】
2005530781.tif 000003
【００４８】
で示される化合物を包含する。
（式中、
Ｒ１は、Ｈ又はアルキルであり；
Ｒ２は、Ｏ又はＳであり；
Ｒ３は、水素であり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に、水素、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール(alkaryl)、アルカリールオキシ(alkaryloxy)、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２ＮＲＲ’、ＳＯ３Ｒ、ＳＲ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ３）ｎＣＯ２Ｒ、及びＣＯＮＲＲ’から成る群から選択される；
Ａは、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、２−スルホニルフラン、４−アルキルフラン、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１，２，３，４−オキサトリアゾール、１，２，３，５−オキサトリアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、１，３，４−チアジアゾール、１，２，３，４−チアトリアゾール、１，２，３，５−チアトリアゾール及びテトラゾールから成る群から選択される五員ヘテロアリール環であり、場合によっては、１つ以上の位置において、アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、アルカリール、アルカリールオキシ、ハロゲン、トリハロメチル、Ｓ（Ｏ）Ｒ、ＳＯ２ＮＲＲ’、ＳＯ３Ｒ、ＳＲ、ＮＯ２、ＮＲＲ’、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ（Ｏ）Ｒ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、（ＣＨ２）ｎＣＯ２Ｒ、及びＣＯＮＲＲ’によって置換される；
ｎは、０〜３であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル又はアリールであり；
Ｒ’は、Ｈ、アルキル又はアリールである。）
本発明の該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物は、３−［（３−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３，４−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（２−メチルチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−｛［４−（２−メトキシカルボニルエチル）−３−メチルピロル−５−イル）］メチレン｝−２−インドリノン；３−［（４，５−ジメチル−３−エチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（５−メチルイミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；５−クロロ−３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン；３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；５−クロロ−３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン；及び３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン；並びにこれらのプロドラッグを包含するが、これらに限定されない。３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物の詳細な説明に関しては米国特許第５，７９２，７８３号を参照のこと。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様では、該３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物は、３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）又はそのプロドラッグである。
【００５０】
他の実施態様では、新生物を治療、予防又は抑制するためにＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせる該インドリノン化合物は、ピロール置換２−インドリノン又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグであり、これらはタンパク質キナーゼの活性をモジュレートする。このようなインドリノン、及びそれらを供給する又は調製する方法は、係属中で許可通知が出されている(has been allowed)米国特許第０９／３２２，２９７号、及び国際公開第ＷＯ９９／６１４２２号に詳しく記載されており、これらの参考文献は本明細書に援用される。好ましい実施態様では、該インドリノンは、３−［３，５−ジメチル−４−（２−カルボキシエチル）ピロル−２−イルメチリデン］−２−インドリノン（ＳＵ−６６６８）である。
【００５１】
本明細書で挙げる３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物の化学式は、互変異性又は構造異性の現象を示すことがある。例えば、本明細書に記載する該化合物は、Ｓ−インドリノン３−置換基をインドリノン環に結合させる二重結合に関してシス又はトランスのコンフォーメーションをとってもよく、シス異性体とトランス異性体との混合物であってもよい。本明細書内に描いた式は、１つの可能な互変異性体又は構造異性体形を表すことができるに過ぎないので、本発明が、チロシン・キナーゼのシグナル伝達又は細胞増殖を調節する、抑制する及び／又はモジュレートする能力を有する、任意の互変異性体若しくは構造異性体形又はこれらの混合物を包含するものであり、式の図に用いられた、いずれか１つの互変異性体若しくは構造異性体形に限定されないことを理解すべきである。
【００５２】
上記化合物及びそれらの薬学的に許容される塩の他に、本発明のインドリノンは、適用可能である場合には、細胞増殖を調節する及び／又はモジュレートする能力を有する化合物の溶媒和形（例えば、水和形）を非溶媒和形と同様に包含する。
【００５３】
本明細書に記載した３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物は、化学的に関連した化合物の調製に適用可能であることが知られた任意の方法によって調製することができる。適当な方法は、実施例において説明する。必要な出発物質は、有機化学の標準的な手段によって得ることができる。
【００５４】
受容体チロシンキナーゼ媒介シグナル伝達に影響を及ぼす作用物質としての、個々の化合物の関連活性及び効力は、利用可能な手法を用いて測定することができる。優先的に、化合物に一連のスクリーニングを行なって、細胞増殖をモジュレートする、調節する及び／又は抑制する、該化合物の能力を測定する。これらのスクリーニングは、それらが行なわれる順序で、生化学アッセイ、細胞増殖アッセイ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験を包含する。
【００５５】
好ましくは、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物又はそのプロドラッグは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤と組み合わせて、低用量で、即ち、単独で投与される個別化合物の各々の、臨床状況で慣用的に用いられる用量よりも低い用量で投与される。
【００５６】
対象に投与される、本発明の化合物、組成物、剤、及び療法の用量を低減することの利点は、高い投与量に付随する有害作用(adverse effect)の発生率の低下を包含する。例えば、Ｓｕｇｅｎ５４１６のような化学療法剤の投与量を低減することによって、より高い投与量において観察される副作用の頻度及び重症度に比べて、該頻度及び重症度の減少が生じる。本明細書に記載する、他の３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物をＣＯＸ−２選択的阻害剤と組み合わせて用いることに関しても、同様な利点が考えられる。
【００５７】
有害作用の発生率を低減することによって、治療を受ける患者のクオリティ・オブ・ライフの改善が考えられる。有害作用の発生率を低減することのさらなる利点は、患者コンプライアンスの改善、有害作用の治療のために必要な入院回数の減少、及び該不利な副作用に関連した痛みの治療のために必要な鎮痛剤の投与の減少を包含する。
【００５８】
本明細書に記載した、ＣＯＸ−２選択的阻害剤と３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物との組み合わせは、細胞増殖障害、線維形成障害(fibrotic disorders)及び代謝障害を含めた、調節されない（unregulated）チロシンキナーゼ・シグナル伝達に関連した障害の治療に有用である。このような疾患の治療に３−ヘテロアリール−２−インドリノンを使用できることは、これらの化合物が、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）及び／又は非受容体チロシンキナーゼの酵素活性に影響を及ぼして、このようなタンパク質によって伝達されるシグナルを妨害することによって、チロシンキナーゼのシグナル伝達を調節する、モジュレートする及び／又は抑制すると言う事実に由来する。
【００５９】
チロシンキナーゼのシグナル伝達は、細胞増殖、分化及び代謝に重要な役割を果たす。異常な細胞増殖は、例えば癌腫のような新生物、肉腫、白血病、グリア芽細胞腫、血管腫、乾癬、アテローム硬化症、関節炎及び糖尿病性網膜症（又は、制御されない血管形成及び／又は脈管形成に関連した、他の障害）の発生を含めた、広範囲な障害及び疾患を生じる可能性がある。したがって、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物を含有する、本明細書に開示した組み合わせは、例えば、異常なチロシンキナーゼ・シグナル伝達に起因する疾患の治療に有用である。
【００６０】
本発明によって治療することができる、又はさらに研究することができる細胞増殖障害は、癌の他に、血管増殖障害及びメサンギウム細胞増殖障害を包含する。
血管増殖障害は、一般に血管の異常な増殖を生じる血管形成障害及び脈管形成障害を意味する。血管の形成及び延展(spreading)、又は脈管形成及び血管形成は、それぞれ、例えば胚発育、黄体形成、創傷治癒及び器官再生のような、多様な生理的プロセスに重要な役割を果たしている。これらは、さらに、癌発生に極めて重要な役割を果たしている。血管増殖障害の他の例は、新しい毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎、及び、網膜中の新しい毛細血管が硝子体に侵入し、出血し、盲目を惹起する糖尿病性網膜症等の眼疾患を包含する。逆に、例えば再狭窄のような、血管の収縮、狭窄(contraction)又は閉塞に関連した障害も、包含される。
【００６１】
線維形成障害は、細胞外マトリックスの異常な形成を意味する。線維形成障害の例は、肝硬変及びメサンギウム細胞増殖障害を包含する。肝硬変は、肝臓瘢痕の(hepatic scar)の形成をもたらす細胞外マトリックス構成成分(constituents)の増加を特徴とする。肝硬変は、例えば、肝臓の硬変のような疾患を惹起しうる。肝臓瘢痕をもたらす細胞外マトリックスの増加は、例えば肝炎のような、ウイルス感染症によっても惹起されうる。類洞周囲脂質細胞(lipocytes)が、肝硬変に重要な役割を果たすように思われる。関与する他の線維形成障害は、アテローム硬化症を包含する（以下参照）。
【００６２】
メサンギウム細胞増殖障害は、メサンギウム細胞の異常な増殖によってもたらされる障害を意味する。メサンギウム細胞増殖障害は、種々なヒト腎臓疾患、例えば、腎炎、糖尿病性腎症、悪性腎硬化症、血栓性細小血管障害症候群、移植片拒絶、及び糸球体症等を包含する。ＰＤＧＦ−Ｒは、メサンギウム細胞増殖の維持に関連付けられている。Floege et al., 1993, Kidney International 43: 47S-54S.
ＰＴＫｓは、このような細胞増殖障害に関連付けられている。例えば、ＲＴＫファミリーの一部のメンバーは、癌の発達に関連した。ＥＧＦＲ(Tuzi etal., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233; Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719)、ＨＥＲ２／ｎｅｕ(Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) 及びＰＤＧＦ−Ｒ(Kumabe et al.,1992, Oncogene 7: 627-633)のような、上記受容体の幾つかが多くの腫瘍に過度発現される、及び／又は自己分泌ループによって永続的に活性化される。実際に、最も一般的で、重度な癌においては、これらの受容体の過度発現(Akbasak and Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci. 111: 119-133; Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249-273; Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352-1360)及び自己分泌ループ(Lee and Donoghue, 1992, J.Cell. Biol. 118: 1057-1070; Korc et al., supra; Akbasak and Suner-Akbasak et al., supra)は、実証されている。例えば、ＥＧＦＲ受容体は、扁平上皮癌、星状細胞腫、グリオ芽細胞腫、頭頚部癌、肺癌及び膀胱癌に関連付けられている。ＨＥＲ２は、乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、膵臓癌及び膀胱癌に関連付けられている。ＰＤＧＦ−Ｒは、グリオ芽細胞腫、肺癌、卵巣癌、黒色腫及び前立腺癌に関連付けられている。ＲＴＫｃ−ｍｅｔは一般に、肝発癌、したがって肝細胞癌に関連付けられている。さらに、ｃ−ｍｅｔは悪性腫瘍形成に関連付けられている。さらに具体的には、ＲＴＫｃ−ｍｅｔは、他の癌のなかでも、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌及び胃癌、白血病及びリンパ腫に関連付けられている。さらに、Ｈｏｄｇｋｉｎｓ疾患、Ｂｕｒｋｉｔｔｓ疾患及びリンパ腫細胞株を有する患者に、ｃ−ｍｅｔ遺伝子の過度発現が検出されている。
【００６３】
ＩＧＦ−ＩＲは、栄養支持及びＩＩ型糖尿病に関係付けられている他に、数種類の癌に関連付けられている。例えば、ＩＧＦ−Ｉは、数種類の腫瘍型、例えばヒト乳癌の癌細胞(Arteaga etal., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418-1423) 及び小肺腫瘍細胞(Macauley et al., 1990, Cancer Res. 50: 2511-2517)に対する自己分泌増殖刺戟因子(autocrine growth stimulator)として関係付けられている。さらに、神経系の正常な成長及び分化に一体的に関連するＩＧＦ−Ｉは、ヒト神経膠腫の自己分泌刺戟因子であると思われる。Sandberg-Nordqvist etal., 1993, Cancer Res. 53: 2475-2478．細胞増殖におけるＩＧＦ−ＩＲとそのリガンドの重要性は、培養中の多くの細胞種類（線維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、Ｔ−リンパ球、骨髄性細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨髄の幹細胞）がＩＧＦ−Ｉによって増殖を刺戟されると言う事実によって、さらに支持される。Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression 1: 301-326．一連の最近の刊行物では、Ｂｅｓｅｒｇａはさらに、ＩＧＦ−Ｉ−Ｒが形質転換の機構に主要な役割を果たし、このようなものとして、広範囲なヒト悪性腫瘍に対する治療的介入のための好ましい標的になりうることを示唆している。Baserga, 1995, Cancer Res. 55: 249-252; Baserga, 1994, Cell 79: 927-930; Coppola etal., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 4588-4595．
しかし、ＲＴＫｓにおける異常性と疾患との関係は、癌にのみ限定される訳ではない。例えば、ＲＴＫｓは、乾癬、糖尿病、創傷治癒、炎症及び神経変性疾患のような代謝性疾患に関連付けられている。例えば、ＥＧＦ−Ｒは、角膜及び皮膚創傷治癒に適応される。インシュリン−Ｒ及びＩＧＦ−ＩＲにおける欠陥(defects in the Insulin-R and the IGF-IR)は、ＩＩ型糖尿病に適応される。特定のＲＴＫｓとそれらの治療的適応症とのより完全な相互関係は、Plowman etal., 1994, DN & P 7: 334- 339.に記載されている。
【００６４】
受容体型チロシンキナーゼのみでなく、 src, abl, fps, yes, fyn,lyn, lck, blk, hck, fgr, yrk を含めた、多くの細胞チロシンキナーゼ(Bolen et al., 1992, FASEB J. 6: 3403-3409によって概説されている)が、増殖及び代謝シグナル伝達経路に、したがって、本発明の適応症に関与している。例えば、突然変異したsrc(v-src)は、ニワトリにおけるオンコタンパク質(oncoprotein)（ｐｐ６０ｖ−ｓｒｃ）として実証されている。さらに、その細胞同族体、プロト−癌遺伝子ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃは、多くの受容体の癌遺伝子シグナルを伝達する。例えば、腫瘍におけるＥＧＦ−Ｒ又はＨＥＲ２／ｎｅｕの過度発現は、正常細胞には存在しないｐｐ６０ｃ−ｓｒｃの構成的活性化を生じ、悪性細胞に特徴的である。他方では、c-srcの発現が不充分であるマウスは、大理石骨病の表現型を示し、c-srcが破骨細胞機能に重要に関与し、関連障害に関与する可能性があることを実証している。同様に、Ｚａｐ７０は、Ｔ−細胞シグナリングに関与する。
【００６５】
その上、ＲＴＫ向けブロッカー(RTK aimed blocker)によって増強する又は該ブロッカーと相乗作用さえするＣＴＫモジュレーティング化合物(CTK modulating compounds)の同定は、本発明の態様である。
【００６６】
最後に、ＲＴＫｓ及び非受容体型キナーゼの両方が、過免疫障害に関連付けられている。
したがって、本発明の複合療法は、新生物の治療に用いられる他に、例えば、血管増殖障害、線維形成障害、メサンギウム細胞増殖障害及び代謝疾患のような疾患の治療に用いることができる。
【００６７】
本明細書に用いる限り、“シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤”なる用語は、シクロオキシゲナーゼ−１に比べてシクロオキシゲナーゼ−２を選択的に阻害する化合物を包含し、さらに、これらの化合物の薬学的に許容される塩又はエステルをも包含する。
【００６８】
実際に、ＣＯＸ−２阻害剤の選択性は、試験が行なわれる条件及び試験される阻害剤に依存して、変化する。しかし、本明細書のために、ＣＯＸ−２阻害剤の選択性は、ＣＯＸ−２の阻害に関するＩＣ５０値によって割り算したＣＯＸ−１阻害に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏＩＣ５０値の比率（ＣＯＸ−１  ＩＣ５０／ＣＯＸ−２  ＩＣ５０）として測定することができる。シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、ＣＯＸ−１  ＩＣ５０のＣＯＸ−２  ＩＣ５０に対する比率が１より大きい、好ましくは２より大きい、より好ましくは５より大きい、さらにより好ましくは１０より大きい、なおより好ましくは５０より大きい、より好ましくはさらに１００より大きい、任意の阻害剤である。
【００６９】
本明細書で用いる限り、“ＩＣ５０”なる用語は、シクロオキシゲナーゼ活性の５０％阻害を生じるために必要である化合物の濃度を意味する。
本発明の好ましいシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、約１μＭ未満、より好ましくは約０．５μＭのシクロオキシゲナーゼ−２  ＩＣ５０を有する。
【００７０】
好ましいシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、約１μＭより大きい、より好ましくは２０μＭより大きい、シクロオキシゲナーゼ−１ＩＣ５０を有する。
このような、好ましい選択性は、一般的なＮＳＡＩＤ誘導副作用の発生率を減ずる可能性を示すと考えられる。
【００７１】
シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤のプロドラッグとして作用する化合物も、本発明の範囲内に包含される。ＣＯＸ−２選択的阻害剤に関連し、本明細書で用いる限り、“プロドラッグ”なる用語は、対象の体内で代謝プロセス又は単純な化学的プロセスによって、活性なＣＯＸ−２選択的阻害剤に転化されうる化学化合物を意味する。ＣＯＸ−２選択的阻害剤のプロドラッグの１例は、パレコキシブ(parecoxib)であり、これは三環状シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤バルデコキシブ(valdecoxib)の治療的に有効な（therapeutically effective）プロドラッグである。好ましいＣＯＸ−２選択的阻害剤プロドラッグの例は、パレコキシブ・ナトリウムである。ＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグのクラスは、米国特許第５，９３２，５９８号に記載されている。本明細書における“シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤”、“ＣＯＸ−２選択的阻害剤”等への言及は、文脈がプロドラッグを排除しない限り、それらのプロドラッグを包含する。
【００７２】
１つの実施態様では、本明細書に記載する方法及び組成物に用いるＣＯＸ−２阻害剤は、一般式（Ｉ）：
【００７３】
【化３】
2005530781.tif 000004
【００７４】
で示される、置換したベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン若しくはジヒドロナフタレン、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグから成る群から選択され。
（式中、ｎは、０、１、２、３又は４である整数であり；
ＧはＯ又はＳ又はＮＲａであり；
Ｒａはアルキルであり；
Ｒ１は、Ｈ及びアリールから成る群から選択され；
Ｒ２は、カルボキシル、アミノカルボニル、アルキルスルホニルアミノカルボニル及びアルコキシカルボニルから成る群から選択され；
Ｒ３は、ハロアルキル、アルキル、アラルキル、シクロアルキル及びアリールから成る群から選択され、場合によっては、アルキルチオ、ニトロ及びアルキルスルホニルから選択される１つ以上のラジカルによって置換される；
各Ｒ４は、独立に、Ｈ、ハロ、アルキル、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロアラルキルオキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、ヘテロアリールアミノ，ヘテロアリールアルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニル、ヘテロアラルキルアミノスルホニル、ヘテロシクロスルホニル、アルキルスルホニル、ヒドロキシアリールカルボニル、ニトロアリール、場合によっては置換されるアリール、場合によっては置換されるヘテロアリール、アラルキルカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アリールカルボニル、アミノカルボニル及びアルキルカルボニルから成る群から選択される；又は
Ｒ４は、環ＥのＲ４が結合する原子及び残りの原子と一緒にナフチル・ラジカルを形成する。）
他の実施態様では、本発明に用いるＣＯＸ−２阻害剤は、一般式（ＩＩ）：
【００７５】
【化４】
2005530781.tif 000005
【００７６】
で示されるＣＯＸ−２阻害剤、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグである。
（式中、Ｄは、部分的不飽和若しくは飽和ヘテロサイクリル環及び部分的不飽和若しくは飽和炭素環から成る群から選択され；
Ｒ１３は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールから成る群から選択され、この場合に、Ｒ１３は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ及びアルキルチオから選択される１つ以上のラジカルによって置換される；
Ｒ１４は、メチル又はアミノであり；
Ｒ１５は、Ｈ、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、Ｎ−アリールアミノカルボニル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、Ｎ−アリールアミノアルキル、Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、Ｎ−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、又はＮ−アルキル−Ｎ−アリールアミノスルホニルである。）
他の実施態様によると、本発明はさらに、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を第１量で及び３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物を第２量で、新生物障害の治療を必要とする対象に投与することを含む新生物障害の治療、予防又は抑制用の組成物であって、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記ＣＯＸ−２阻害剤及び前記３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物の治療有効量であり、前記ＣＯＸ−２阻害剤が、一般式（ＩＩＩ）：
【００７７】
【化５】
2005530781.tif 000006
【００７８】
［式中、Ｒ１６はメチル又はエチルであり；
Ｒ１７はクロロ又はフルオロであり；
Ｒ１８は水素又はフルオロであり；
Ｒ１９は水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシであり；
Ｒ２０は水素又はフルオロであり；
Ｒ２１はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチル又はメチルである、但し、Ｒ１６がエチルでありＲ１９がＨである場合には、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９及びＲ２０の全てがフルオロになるということはない］
で示されるフェニル酢酸誘導体又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを含む組成物に関する。
【００７９】
他の実施態様では、本発明の組成物及び方法に有用なＣＯＸ−２阻害剤は、式（ＩＶ）：
【００８０】
【化６】
2005530781.tif 000007
【００８１】
［式中、ＸはＯ又はＳであり；
Ｊは炭素環又は複素環であり；
Ｒ２２はＮＨＳＯ２ＣＨ３又はＦであり；
Ｒ２３はＨ、ＮＯ２又はＦであり；
Ｒ２４はＨ、ＮＨＳＯ２ＣＨ３又は（ＳＯ２ＣＨ３）Ｃ６Ｈ４である］
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである。
【００８２】
他の実施態様によると、本明細書に記載するＣＯＸ−２阻害剤は、構造式（Ｖ）：
【００８３】
【化７】
2005530781.tif 000008
【００８４】
で示される化合物又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグである。
（式中、ＴとＭは、独立に、フェニル、ナフチル、５〜６員を含み１〜４個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルであり；
Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１又はＬ２は、独立に、水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル、トリフルオロメチル、又は１〜６個の炭素原子を有する低級メトキシであり：
Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１又はＬ２の少なくとも１つは、パラ位置に存在し、−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｒ（式中、ｎは０、１若しくは２であり、Ｒは、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル若しくは１〜６個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである）、又は−ＳＯ２ＮＨ２である；或いは、
Ｑ１とＱ２はメチレンジオキシであるか；又は、
Ｌ１とＬ２はメチレンジオキシである；
Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７及びＲ２８は、独立に、水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、１〜６個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル又は、フェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである；或いは、
Ｒ２５とＲ２６がＯであるか、又は
Ｒ２７とＲ２８がＯである、或いは、
Ｒ２５、Ｒ２６は、それらが結合する炭素原子と一緒に、３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する、又は
Ｒ２７、Ｒ２８は、それらが結合する炭素原子と一緒に、３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。）
本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、例えば、ＣＯＸ−２選択的阻害剤メロキシカム、式Ｂ−０(CAS registry number 71125-38-7)、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグでありうる。
【００８５】
【化８】
2005530781.tif 000009
【００８６】
本発明の他の実施態様では、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、ＣＯＸ−２選択的阻害剤ＲＳ５７０６７、６−［［５−（４−クロロベンゾイル）−１，４−ジメチル−１Ｈ−ピロル−２−イル］メチル］−３（２Ｈ）−ピリダジノン、式Ｂ−２(CAS registry number 179382-91-3)、又はその薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグでありうる。
【００８７】
【化９】
2005530781.tif 000010
【００８８】
本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、例えば、式Ｂ−１で示されるＣＯＸ−２選択的阻害剤［２−（２，４−ジクロロ−６−エチル−３，５−ジメチル−フェニルアミノ）−５−プロピル−フェニル］−酢酸、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
【００８９】
【化１０】
2005530781.tif 000011
【００９０】
本発明の好ましい実施態様では、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、置換ベンゾピラン又は置換ベンゾピラン類似体であるクロメン構造クラスのものであり、さらにより好ましくは、本明細書に示す一般式Ｉで示される構造を有する置換ベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン又はジヒドロナフタレンから成る群から選択され、例として、表１に開示した構造を、それらのジアステレオマー、エナンチオマー、ラセメート、互変異性体、塩、エステル、アミド及びプロドラッグを含めて有するが、これらに限定されない。
【００９１】
さらに、本発明の実施に有用なベンゾピランＣＯＸ−２選択的阻害剤は、米国特許第６，０３４，２５６号及び第６，０７７，８５０号に記載されている。
シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤はさらに、式（Ｉ）［式中、ｎは、０、１、２、３又は４である整数であり；
Ｇは酸素又は硫黄であり；
Ｒ１はＨであり；
Ｒ２はカルボキシル、低級アルキル、低級アラルキル又は低級アルコキシカルボニルであり；
Ｒ３は低級ハロアルキル、低級シクロアルキル又はフェニルであり；
各Ｒ４は、Ｈ、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、ニトロ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、低級アルキルスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル又は低級アルキルカルボニルである；或いは、
Ｒ４は、環Ｅのそれが結合する炭素原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する］で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
【００９２】
シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤はさらに、式（Ｉ）［式中、Ｒ２はカルボキシルであり；
Ｒ３は低級ハロアルキルであり；
各Ｒ４は、Ｈ、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルキルアミノ、アミノ、アミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、五員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、六員ヘテロアリールアルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級アルキルスルホニル、六員窒素含有ヘテロシクロスルホニル、場合によっては置換されるフェニル、低級アラルキルカルボニル又は低級アルキルカルボニルである；或いは、Ｒ４は、環Ｅと一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する］で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
【００９３】
シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤はさらに、式（Ｉ）［式中、ｎは、０、１、２、３又は４である整数であり；
Ｒ３は、フルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチル、ジクロロプロピル、ジフルオロメチル又はトリフルオロメチルであり；各Ｒ４が、Ｈ、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ、Ｎ−フェニルメチルアミノスルホニル、Ｎ−フェニルエチルアミノスルホニル、Ｎ−（２−フリルメチル）アミノスルホニル、ニトロ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル、アミノスルホニル、Ｎ−メチルアミノスルホニル、Ｎ−エチルスルホニル、２，２−ジメチルエチルアミノスルホニル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル、Ｎ−（２−メチルプロピル）アミノスルホニル、Ｎ−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、２，２−ジメチルプロピルカルボニル、フェニルアセチル又はフェニルであるか；或いは、
Ｒ４は、環Ｅのそれが結合する炭素原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する］で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる。
【００９４】
シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤はさらに、式（Ｉ）［式中、ｎは、０、１、２、３又は４である整数であり；
Ｒ３はトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり；
各Ｒ４は、独立に、Ｈ、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、Ｎ−フェニルメチルアミノスルホニル、Ｎ−フェニルエチルアミノスルホニル、Ｎ−（２−フリルメチル）アミノスルホニル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル、Ｎ−メチルアミノスルホニル、Ｎ−（２，２−ジメチルエチル）アミノスルホニル、ジメチルアミノスルホニル、２−メチルプロピルアミノスルホニル、Ｎ−モルホリノスルホニル、メチルスルホニル、ベンジルカルボニル、又はフェニルであるか；或いは、
Ｒ４は、環Ｅのそれがが結合する原子及び残りの原子と一緒に、ナフチル・ラジカルを形成する］で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでありうる。
【００９５】
本発明の方法(単数又は複数)に関連して用いられるシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、式（Ｉ）の構造［式中、ｎ＝４；
ＧはＯ又はＳであり；
Ｒ１はＨであり；
Ｒ２はＣＯ２Ｈであり；
Ｒ３は低級ハロアルキルであり；
Ｒ９に相当する第１のＲ４はヒドリド又はハロであり；
Ｒ１０に相当する第２のＲ４は、Ｈ、ハロ、低級アルキル、低級ハロアルコキシ、低級アルコキシ、低級アラルキルカルボニル、低級ジアルキルアミノスルホニル、低級アルキルアミノスルホニル、低級アラルキルアミノスルホニル、低級ヘテロアラルキルアミノスルホニル、五員窒素含有ヘテロシクロスルホニル又は六員窒素含有ヘテロシクロスルホニルであり；
Ｒ１１に相当する第３のＲ４は、Ｈ、低級アルキル、ハロ、低級アルコキシ又はアリールであり；
Ｒ１２に相当する第４のＲ４は、Ｈ、ハロ、低級アルキル、低級アルコキシ又はアリールである］で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる；この場合、式（Ｉ）は、式（Ｉａ）：
【００９６】
【化１１】
2005530781.tif 000012
【００９７】
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグを包含する。
本発明の(単数又は複数)に関連して用いられるシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤はさらに、式（Ｉａ）の構造［式中、Ｒ８はトリフルオロメチル又はペンタフルオロエチルであり；
Ｒ９はＨ、クロロ又はフルオロであり；
Ｒ１０は、Ｈ、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード、メチル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリフルオロメトキシ、メトキシ、ベンジルカルボニル、ジメチルアミノスルホニル、イソプロピルアミノスルホニル、メチルアミノスルホニル、ベンジルアミノスルホニル、フェニルエチルアミノスルホニル、メチルプロピルアミノスルホニル、メチルスルホニル又はモルホリノスルホニルであり；
Ｒ１１は、Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、クロロ、メトキシ、ジエチルアミノ又はフェニルであり；
Ｒ１２は、Ｈ、クロロ、ブロモ、フルオロ、メチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチル、メトキシ又はフェニルである］で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグでもありうる。
【００９８】
本発明はさらに、新生物障害の治療を必要とする対象に、BMS-347070 (B-74), ABT 963 (B-25), NS-398 (B-26), L-745337 (B- 214), RWJ-63556 (B-215), 又は L-784512 (B-216).を含むシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤の治療有効量を投与することを含む、新生物障害を治療するための新規な方法に関する。
【００９９】
ＣＯＸ−２阻害剤のなかで、表１に挙げたＣＯＸ−２阻害剤は、以下に示すような、クロメンＣＯＸ−２阻害剤である：
表１．クロメンＣＯＸ−２選択的阻害剤の例
【０１００】
【化１２】
2005530781.tif 000013
【０１０１】
【化１３】
2005530781.tif 000014
【０１０２】
【化１４】
2005530781.tif 000015
【０１０３】
【化１５】
2005530781.tif 000016
【０１０４】
本発明の他の好ましい実施態様では、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、インドリノンと組み合わせて用いる場合に、式（ＩＩ）の一般構造：
【０１０５】
【化１６】
2005530781.tif 000017
【０１０６】
で示される三環状シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤のクラス、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグから選択することができる。
（式中、Ｄは、部分的不飽和若しくは飽和ヘテロサイクリル及び部分的不飽和若しくは飽和炭素環から成る群から選択され；
Ｒ１３は、ヘテロサイクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリールであり、この場合に、Ｒ１３は、場合によっては、置換可能な位置において、アルキル、ハロアルキル、シアノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、ハロアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ニトロ、アルコキシアルキル、アルキルスルフィニル、ハロ、アルコキシ及びアルキルチオから選択される１つ以上のラジカルによって置換される；
Ｒ１４は、メチル又はアミノから成る群から選択され；
Ｒ１５は、Ｈ、ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、オキソ、シアノ、カルボキシル、シアノアルキル、ヘテロサイクリルオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アルキルカルボニル、シクロアルキル、アリール、ハロアルキル、ヘテロサイクリル、シクロアルケニル、アラルキル、ヘテロサイクリルアルキル、アシル、アルキルチオアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルケニル、アルコキシアルキル、アリールチオアルキル、アリールオキシアルキル、アラルキルチオアルキル、アラルコキシアルキル、アルコキシアラルコキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニル、アミノカルボニルアルキル、アルキルアミノカルボニル、Ｎ−アリールアミノカルボニル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノカルボニル、アルキルアミノカルボニルアルキル、カルボキシアルキル、アルキルアミノ、Ｎ−アリールアミノ、Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノ、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、Ｎ−アリールアミノアルキル、Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アラルキルアミノアルキル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノアルキル、アリールオキシ、アラルコキシ、アリールチオ、アラルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、Ｎ−アリールアミノスルホニル、アリールスルホニル、Ｎ−アルキル−Ｎ−アリールアミノスルホニルから選択されるラジカルから成る群から選択される。
【０１０７】
本発明のさらにより好ましい実施態様では、本発明の方法（単数又は複数）に関連して、インドリノンと組み合わせて用いるための三環状シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤（単数又は複数種類）は、上記式（ＩＩ）で示され、セレコキシブ（Ｂ−１８）、バルデコキシブ（Ｂ−１９）、デラコキシブ（Ｂ−２０）、ロフェコキシブ（Ｂ−２１）、エトリコキシブ（ＭＫ−６６３；Ｂ−２２）、ＪＴＥ−５２２（Ｂ−２３）、又はこれらの異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグから成る、表２に例示した化合物の群から選択される。
表２．三環状ＣＯＸ−２選択的阻害剤の例
【０１０８】
【化１７】
2005530781.tif 000018
【０１０９】
【化１８】
2005530781.tif 000019
【０１１０】
本発明のさらにより好ましい実施態様では、ＣＯＸ−２選択的阻害剤は、インドリノンと組み合わせて用いる場合に、セレコキシブ、ロフェコキシブ及びエトリコキシブから成る群から選択される。
【０１１１】
本発明の他の好ましい実施態様では、三環状シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤バルデコキシブ（Ｂ−１９）の治療有効なプロドラッグであるパレコキシブ（Ｂ−２４）が、本発明の方法（単数又は複数）に関連して、シクロオキシゲナーゼ阻害剤の供給源(source)として有利に用いられうる（例えば、米国特許５，９３２，５９８参照のこと）。
【０１１２】
【化１９】
2005530781.tif 000020
【０１１３】
パレコキシブの好ましい形は、ナトリウム・パレコキシブである。
本発明の他の好ましい実施態様では、国際公開第ＷＯ００／２４７１９号に既に記載されている、式（Ｂ−２５）で示される化合物ＡＢＴ−９６３は、本発明の方法（単数又は複数）に関連して有利に用いられうる、もう１つの三環状シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤である。
【０１１４】
【化２０】
2005530781.tif 000021
【０１１５】
本発明の方法（単数又は複数）に関連して用いられる、もう１つの好ましいシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、Ｂ−２６として以下に示す構造を有するＮ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）−メタンスルホンアミド（ＮＳ−３９８）である。この化合物の用途は、例えば、 Yoshimi, N.et al.によって,Japanese J. Cancer Res., 90 (4) : 406-412 (1999)中に;Faigueyret, J. -P. et al.によって, Science Spectra,（ http://www.gbhap. com/Science~Spectra/20-1-article. htm (06/06/2001)で入手可能）中に;及びIwata, K.et al.によって, Jpn. J. Pharmacol., 75 (2) : 191-194 (1997)中に記載されている。
【０１１６】
【化２１】
2005530781.tif 000022
【０１１７】
本発明の方法（単数又は複数）に関連してシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として有用である、他の化合物は、非限定的に、下記化合物を包含する：
６−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−２７）；
６−クロロ−７−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−２８）；
８−（１−メチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−２９）；
６−クロロ−８−（１−メチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３０）；
２−トリフルオロメチル−３Ｈ−ナフト［２，１−ｂ］ピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３１）；
７−（１，１−ジメチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３２）；
６−ブロモ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３３）；
８−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３４）；
６−トリフルオロメトキシ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３５）；
５，７−ジクロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３６）；
８−フェニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３７）；
７，８−ジメチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３８）；
６，８−ビス（ジメチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−３９）；
７−（１−メチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４０）；
７−フェニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４１）；
６−クロロ−７−エチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４２）；
６−クロロ−８−エチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４３）；
６−クロロ−７−フェニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４４）；
６，７−ジクロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４５）；
６，８−ジクロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４６）；
６−クロロ−８−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４７）；
８−クロロ−６−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４８）；
８−クロロ−６−メトキシ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−４９）；
６−ブロモ−８−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５０）；
８−ブロモ−６−フルオロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５１）；
８−ブロモ−６−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５２）；
８−ブロモ−５−フルオロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５３）；
６−クロロ−８−フルオロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５４）；
６−ブロモ−８−メトキシ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５５）；
６−［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５６）；
６−［（ジメチルアミノ）スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５７）；
６−［（メチルアミノ）スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５８）；
６−［（４−モルホリノ）スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−５９）；
６−［（１，１−ジメチルエチル）アミノスルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６０）；
６−［（２−メチルプロピル）アミノスルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６１）；
６−メチルスルホニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６２）；
８−クロロ−６−［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６３）；
６−フェニルアセチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６４）；
６，８−ジブロモ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６５）；
８−クロロ−５，６−ジメチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６６）；
６，８−ジクロロ−（Ｓ）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６７）；
６−ベンジルスルホニル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６８）；
６−［［Ｎ−（２−フリルメチル）アミノ］スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−６９）；
６−［［Ｎ−（２−フェニルエチル）アミノ］スルホニル］−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−７０）；
６−ヨード−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−７１）；
７−（１，１−ジメチルエチル）−２−ペンタフルオロエチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−７２）；
６−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾチオピラン−３−カルボン酸（Ｂ−７３）；
３−［（３−クロロ−フェニル）−（４−メタンスルホニル−フェニル）−メチレン］−ジヒドロ−フラン−２−オン若しくはＢＭＳ−３４７０７０（Ｂ−７４）；
８−アセチル−３−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニル）フェニル−イミダゾ（１，２−ａ）ピリジン（Ｂ−７５）；
５，５−ジメチル−４−（４−メチルスルホニル）フェニル−３−フェニル−２−（５Ｈ）−フラノン（Ｂ−７６）；
５−（４−フルオロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−３−（トリフルオロメチル）ピラゾール（Ｂ−７７）；
４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１−フェニル−３−（トリフルオロメチル）ピラゾール（Ｂ−７８）；
４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−７９）；
４−（３，５−ビス（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８０）；
４−（５−（４−クロロフェニル）−３−フェニル−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８１）；
４−（３，５−ビス（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８２）；
４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８３）；
４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８４）；
４−（５−（４−クロロフェニル）−３−（５−クロロ−２−チエニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８５）；
４−（４−クロロ−３，５−ジフェニル−１Ｈ−ピラゾル−１−イル）ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８６）；
４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８７）；
４−［５−フェニル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８８）；
４−［５−（４−フルオロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−８９）；
４−［５−（４−メトキシフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９０）；
４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（ジフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９１）；
４−［５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９２）；
４−［４−クロロ−５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９３）；
４−［３−（ジフルオロメチル）−５−（４−メチルフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９４）；
４−［３−（ジフルオロメチル）−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９５）；
４−［３−（ジフルオロメチル）−５−（４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９６）；
４−［３−シアノ−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９７）；
４−［３−（ジフルオロメチル）−５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９８）；
４−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−９９）；
４−［４−クロロ−５−フェニル−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１００）；
４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１０１）；
４−［５−（４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）フェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１０２）；
５−（４−フルオロフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン（Ｂ−１０３）；
４−［６−（４−フルオロフェニル）スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン−５−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１０４）；
６−（４−フルオロフェニル）−７−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［３．４］オクタ−６−エン（Ｂ−１０５）；
５−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン（Ｂ−１０６）；
４−［６−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン−５−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１０７）；
５−（３，５−ジクロロ−４−メトキシフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン（Ｂ−１０８）；
５−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン（Ｂ−１０９）；
４−［６−（３，４−ジクロロフェニル）スピロ［２．４］ヘプタ−５−エン−５−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１１０）；
２−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）チアゾール（Ｂ−１１１）；
２−（２−クロロフェニル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）チアゾール（Ｂ−１１２）；
５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−メチルチアゾール（Ｂ−１１３）；
４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−トリフルオロメチルチアゾール（Ｂ−１１４）；
４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−（２−チエニル）チアゾール（Ｂ−１１５）；
４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−ベンジルアミノチアゾール（Ｂ−１１６）；
４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−（１−プロピルアミノ）チアゾール（Ｂ−１１７）；
２−［（３，５−ジクロロフェノキシ）メチル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］チアゾール（Ｂ−１１８）；
５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−トリフルオロメチルチアゾール（Ｂ−１１９）；
１−メチルスルホニル−４−［１，１−ジメチル−４−（４−フルオロフェニル）シクロペンタ−２，４−ジエン−３−イル］ベンゼン（Ｂ−１２０）；
４−［４−（４−フルオロフェニル）−１，１−ジメチルシクロペンタ−２，４−ジエン−３−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１２１）；
５−（４−フルオロフェニル）−６−［４−（メチルスルホニル）フェニル］スピロ［２．４］ヘプタ−４，６−ジエン（Ｂ−１２２）；
４−［６−（４−フルオロフェニル）スピロ［２．４］ヘプタ−４，６−ジエン−５−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１２３）；
６−（４−フルオロフェニル）−２−メトキシ−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−ピリジン−３−カルボニトリル（Ｂ−１２４）；
２−ブロモ−６−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−ピリジン−３−カルボニトリル（Ｂ−１２５）；
６−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−フェニル−ピリジン−３−カルボニトリル（Ｂ−１２６）；
４−［２−（４−メチルピリジン−２−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１２７）；
４−［２−（５−メチルピリジン−３−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１２８）；
４−［２−（２−メチルピリジン−３−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１２９）；
３−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン（Ｂ−１３０）；
２−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン（Ｂ−１３１）；
２−メチル−４−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン（Ｂ−１３２）；
２−メチル−６−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン（Ｂ−１３３）；
４−［２−（６−メチルピリジン−３−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１３４）；
２−（３，４−ジフルオロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１３５）；
４−［２−（４−メチルフェニル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１３６）；
２−（４−クロロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−メチル−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１３７）；
２−（４−クロロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−フェニル−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１３８）；
２−（４−クロロフェニル）−４−（４−フルオロフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１３９）；
２−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１４０）；
１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−フェニル−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１４１）；
２−（４−メチルフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１４２）；
４−［２−（３−クロロ−４−メチルフェニル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１４３）；
２−（３−フルオロ−５−メチルフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１４４）；
４−［２−（３−フルオロ−４−メチルフェニル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１４５）；
２−（３−メチルフェニル）−１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１４６）；
４−［２−（３−メチルフェニル）−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１４７）；
１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−（３−クロロフェニル）−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１４８）；
４−［２−（３−クロロフェニル）−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１４９）；
４−［２−フェニル−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１５０）；
４−［２−（４−メトキシ−３−クロロフェニル）−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１５１）；
１−アリル−４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール（Ｂ−１５２）；
４−［１−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−３−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１５３）；
Ｎ−フェニル−［４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］アセトアミド（Ｂ−１５４）；
エチル［４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］アセテート（Ｂ−１５５）；
４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１−（２−フェニルエチル）−１Ｈ−ピラゾール（Ｂ−１５６）；
４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−１−（２−フェニルエチル）−５−（トリフルオロメチル）ピラゾール（Ｂ−１５７）；
１−エチル−４−（４−フルオロフェニル）−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール（Ｂ−１５８）；
５−（４−フルオロフェニル）−４−（４−メチルスルホニルフェニル）−２−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１５９）；
４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−５−（２−チオフェニル）−２−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール（Ｂ−１６０）；
５−（４−フルオロフェニル）−２−メトキシ−４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−６−（トリフルオロメチル）ピリジン（Ｂ−１６１）；
２−エトキシ−５−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−６−（トリフルオロメチル）ピリジン（Ｂ−１６２）；
５−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−（２−プロピニルオキシ）−６−（トリフルオロメチル）ピリジン（Ｂ−１６３）；
２−ブロモ−５−（４−フルオロフェニル）−４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−６−（トリフルオロメチル）ピリジン（Ｂ−１６４）；
４−［２−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）−４，５−ジフルオロフェニル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１６５）；
１−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］ベンゼン（Ｂ−１６６）；
５−ジフルオロメチル−４−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−フェニルイソオキサゾール（Ｂ−１６７）；
４−［３−エチル−５−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１６８）；
４−［５−ジフルオロメチル−３−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１６９）；
４−［５−ヒドロキシメチル−３−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１７０）；
４−［５−メチル−３−フェニル−イソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１７１）；
１−［２−（４−フルオロフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１７２）；
１−［２−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１７３）；
１−［２−（４−クロロフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１７４）；
１−［２−（２，４−ジクロロフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１７５）；
１−［２−（４−トリフルオロメチルフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１７６）；
１−［２−（４−メチルチオフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１７７）；
１−［２−（４−フルオロフェニル）−４，４−ジメチルシクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１７８）；
４−［２−（４−フルオロフェニル）−４，４−ジメチルシクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１７９）；
１−［２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１８０）；
４−［２−（４−クロロフェニル）−４，４−ジメチルシクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１８１）；
４−［２−（４−フルオロフェニル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１８２）；
４−［２−（４−クロロフェニル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１８３）；
１−［２−（４−メトキシフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１８４）；
１−［２−（２，３−ジフルオロフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１８５）；
４−［２−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１８６）；
１−［２−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）シクロペンテン−１−イル］−４−（メチルスルホニル）ベンゼン（Ｂ−１８７）；
４−［２−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１８８）；
４−［２−（２−メチルピリジン−５−イル）シクロペンテン−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１８９）；
エチル２−［４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］オキサゾル−２−イル］−２−ベンジル−アセテート（Ｂ−１９０）；
２−［４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］オキサゾル−２−イル］酢酸（Ｂ−１９１）；
２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］オキサゾール（Ｂ−１９２）；
４−（４−フルオロフェニル）−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２−フェニルオキサゾール（Ｂ−１９３）；
４−（４−フルオロフェニル）−２−メチル−５−［４−（メチルスルホニル）フェニル］オキサゾール（Ｂ−１９４）；
４−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−トリフルオロメチル−４−オキサゾリル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−１９５）；
６−クロロ−７−（１，１−ジメチルエチル）−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−１９６）；
６−クロロ−８−メチル−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３−カルボン酸（Ｂ−１９７）；
５，５−ジメチル−３−（３−フルオロメチル）−４−メチルスルホニル−２（５Ｈ）−フラノン（Ｂ−１９８）；
６−クロロ−２−トリフルオロメチル−２Ｈ−１−ベンゾチオピラン−３−カルボン酸（Ｂ−１９９）；
４−［５−（４−クロロフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２００）；
４−［５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２０１）；
４−［５−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）−３−（ジフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２０２）；
３−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン（Ｂ−２０３）；
２−メチル−５−［１−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−４−トリフルオロメチル−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ピリジン（Ｂ−２０４）；
４−［２−（５−メチルピリジン−３−イル）−４−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾル−１−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２０５）；
４−［５−メチル−３−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２０６）；
４−［５−ヒドロキシメチル−３−フェニルイソオキサゾル−４−イル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２０７）；
［２−トリフルオロメチル−５−（３，４−ジフルオロフェニル）−４−オキサゾリル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２０８）；
４−［２−メチル−４−フェニル−５−オキサゾリル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２０９）；
４−［５−（２−フルオロ−４−メトキシフェニル）−２−トリフルオロメチル−４−オキサゾリル］ベンゼンスルホンアミド（Ｂ−２１０）；
［２−（２−クロロ−６−フルオロ−フェニルアミノ）−５−メチル−フェニル］酢酸若しくはＣＯＸ１８９（Ｂ−２１１）；
Ｎ−（４−ニトロ−２−フェノキシ−フェニル）−メタンスルホンアミド若しくはニメスリド(nimesulide)（Ｂ−２１２）；
Ｎ−［６−（２，４−ジフルオロ−フェノキシ）−１−オキソ−インダン−５−イル］−メタンスルホンアミド若しくはフロスリド(flosulide)（Ｂ−２１３）；
Ｎ−［６−（２，４−ジフルオロ−フェニルスルファニル）−１−オキソ−インデン−５−イル］−メタンスルホンアミド、ナトリウム塩若しくはＬ−７４５３３７（Ｂ−２１４）；
Ｎ−［５−（４−フルオロ−フェニルスルファニル）−チオフェン−２−イル］−メタンスルホンアミド若しくはＲＷＪ−６３５５６（Ｂ−２１５）；
３−（３，４−ジフルオロ−フェノキシ）−４−（４−メタンスルホニル−フェニル）−５−メチル−５−（２，２，２−トリフルオロエチル）−５Ｈ−フラン−２−オン若しくはＬ−７８４５１２若しくはＬ−７８４５１２（Ｂ−２１６）；
（５Ｚ）−２−アミノ−５−［［３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）−４−ヒドロキシフェニル］メチレン］−４（５Ｈ）−チアゾロン若しくはダルブフェロン(darbufelone)（Ｂ−２１７）；
ＣＳ−５０２（Ｂ−２１８）；
ＬＡＳ−３４４７５（Ｂ−２１９）；
ＬＡＳ−３４５５５（Ｂ−２２０）；
Ｓ−３３５１６（Ｂ−２２１）；
ＳＤ−８３８１（Ｂ−２２２）；
Ｌ−７８３００３（Ｂ−２２３）；
Ｎ−［３−（ホルミルアミノ）−４−オキソ−６−フェノキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−７−イル］−メタンスルホンアミド若しくはＴ−６１４（Ｂ−２２４）；
Ｄ−１３６７（Ｂ−２２５）；
Ｌ−７４８７３１（Ｂ−２２６）；
（６ａＲ，１０ａＲ）−３−（１，１−ジメチルヘプチル）−６ａ，７，１０、１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−６Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］ピラン−９−カルボン酸若しくはＣＴ３（Ｂ−２２７）；
ＣＧＰ−２８２３８（Ｂ−２２８）；
４−［［３，５−ビス（１，１−ジメチルエチル）−４−ヒドロキシフェニル］メチレン］ジヒドロ−２−メチル−２Ｈ−１，２−オキサジン−３（４Ｈ）−オン又はＢＦ−３８９（Ｂ−２２９）；
ＧＲ−２５３０３５（Ｂ−２３０）；
６−ジオキソ−９Ｈ−プリン−８−イル−ケイ皮酸（Ｂ−２３１）；又はＳ−２４７４（Ｂ−２３２）；或いは、これらの、それぞれの異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はプロドラッグ。
【０１１８】
本発明の他の好ましい実施態様では、本発明の方法（単数又は複数）に関連して用いられるシクロオキシゲナーゼ阻害剤は、式（ＩＩＩ）の一般構造：
【０１１９】
【化２２】
2005530781.tif 000023
【０１２０】
で示されるフェニル酢酸誘導体のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグのクラスから選択することができる；
（式中、Ｒ１６はメチル又はエチルであり；
Ｒ１７はクロロ又はフルオロであり；
Ｒ１８は水素又はフルオロであり；
Ｒ１９は水素、フルオロ、クロロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ又はヒドロキシであり；
Ｒ２０は水素又はフルオロであり；Ｒ２１はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチル又はメチルである、但し、Ｒ１６がエチルでありＲ１９がＨである場合には、Ｒ１７、Ｒ１８，Ｒ１９及びＲ２０の全てがフルオロになるということはない。）
本発明の方法（単数又は複数）に関連して用いられる、特に好ましいフェニル酢酸シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ＣＯＸ１８９（Ｂ−２１１）の名称を有し、式（ＩＩＩ）［式中、Ｒ１６はエチルであり；Ｒ１７とＲ１９はクロロであり；Ｒ１８とＲ２０は水素であり；Ｒ２１はメチルである］で示される構造を有する化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである。
【０１２１】
他の実施態様によると、本発明は、新生物障害の治療を必要とする対象に、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤を第１量で、及びインドリノンを第２量で投与することを含み、前記第２量と一緒にした前記第１量が、前記ＣＯＸ−２阻害剤及びインドリノンの治療有効量である新生物障害の治療方法であって、前記ＣＯＸ−２阻害剤が、式（ＩＶ）：
【０１２２】
【化２３】
2005530781.tif 000024
【０１２３】
［式中、ＸはＯ又はＳであり；Ｊは炭素環又は複素環であり；Ｒ２２はＮＨＳＯ２ＣＨ３又はＦであり；Ｒ２３はＨ、ＮＯ２又はＦであり；Ｒ２４はＨ、ＮＨＳＯ２ＣＨ３又は（ＳＯ２ＣＨ３）Ｃ６Ｈ４である］
で示される化合物、その異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである治療方法に関する。
【０１２４】
式Ｂ−２６で示される構造を有するＮ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド（NS-398,CAS RN 123653-11-2)の用途に関するさらなる情報は、例えば、Yoshimi, N.et al.によって、Japanese J. Cancer Res.,90(4):406-412 (1999)に;Falgueyret, J. -P. et al.によって、Science Spectra（http://www. gbhap.com/Science~Spectra/20-1-article. htm (06/06/2001)に;及びIwata, K.et al.によって、Jpn.J.Pharmacol., 75 (2) : 191-194 (1997)に記載されている。
【０１２５】
炎症のイヌ・モデルにおけるシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤、ＲＷＪ６３５５６の抗炎症活性の評価は、Kirchner et al.によって、J Pharmacol Exp Ther 282, 1094-1101 (1997)に記載されている。
【０１２６】
他の実施態様によると、インドリノンと組み合わせて用いられるＣＯＸ−２阻害剤は、構造式（Ｖ）：
【０１２７】
【化２４】
2005530781.tif 000025
【０１２８】
で示される化合物、又はその異性体、薬学的に許容される塩、エステル若しくはプロドラッグである。
（式中、ＴとＭは、独立に、フェニル、ナフチル、５〜６員を含み１〜４個のヘテロ原子を有する複素環に由来するラジカル、又は３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に由来するラジカルであり；
Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１又はＬ２は、独立に、水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル、トリフルオロメチル、又は１〜６個の炭素原子を有する低級メトキシであり：
Ｑ１、Ｑ２、Ｌ１又はＬ２の少なくとも１つは、パラ位置に存在し、−Ｓ（Ｏ）ｎ−Ｒ（式中、ｎは０、１若しくは２であり、Ｒは、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、若しくは１〜６個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカルである）、又は−ＳＯ２ＮＨ２である；或いは、
Ｑ１とＱ２はメチレンジオキシであるか；又は、
Ｌ１とＬ２はメチレンジオキシである；
Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７及びＲ２８は、独立に、水素、ハロゲン、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキル・ラジカル、１〜６個の炭素原子を有する低級ハロアルキル・ラジカル又は、フェニル、ナフチル、チエニル、フリル及びピリジルから成る群から選択される芳香族ラジカルである；或いは、
Ｒ２５とＲ２６がＯであるか、又は
Ｒ２７とＲ２８がＯである、或いは、
Ｒ２５、Ｒ２６は、それらが結合する炭素原子と一緒に、３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する、又は
Ｒ２７、Ｒ２８は、それらが結合する炭素原子と一緒に、３〜７個の炭素原子を有する飽和炭化水素環を形成する。）
この化合物のファミリーに包含され、本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として役立ちうる特定の物質は、Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド及び（Ｅ）−４−［（４−メチルフェニル）（テトラヒドロ−２−オキソ−３−フラニリデン）メチル］ベンゼンスルホンアミドを包含する。
【０１２９】
化合物のこのファミリーに包含され、本発明のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤として役立ちうる特定の物質は、Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシニトロフェニル）メタンスルホンアミド及び（Ｅ）−４−［（４−メチルフェニル）（テトラヒドロ−２−オキソ−３−フラニリデン）メチル］ベンゼンスルホンアミドを包含する。
【０１３０】
本発明に有用である、好ましいシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、ダルブフェロン（Pfizer)、ＣＳ−５０２（Sankyo)、ＬＡＳ３４４７５(Almirall Profesfarma)、ＬＡＳ３４５５５(Almirall Profesfarma)、Ｓ−３３５１６(Servier)、ＳＤ８３８１(Pharmacia、米国特許第６，０３４，２５６号に記載）、ＢＭＳ−３４７０７０(Bristol Myers Squibb)、米国特許第６，１８０，６５１号に記載）、ＭＫ−９６６(Merck)、Ｔ−６１４(Toyama)、Ｄ−１３６７(Chiroscience)、Ｌ−７４８７３１(Merck)、ＣＴ３(Atlantic Pharmaceutical)、ＣＧＰ−２８２３８(Novartis)、ＢＦ−３８９(Biofor/Scherer)、ＧＲ−２５３０３５(Glaxo Wellcome)、６−ジオキソ−９Ｈ−プリン−８−イル−ケイ皮酸(Glaxo Wellcome)及びＳ−２４７４(Shionogi)を包含する。
【０１３１】
上記Ｓ−３３５１６に関する情報は、Current Drugs Headline News, at http://www. current-drugs. com/NEWS/Inflam1. htm, 10/04/2001に見出すことができ、この文献では、Ｓ−３３５１６が、シクロオキシゲナーゼ−１及びシクロオキシゲナーゼ−２に対して、それぞれ、０．１ｍＭ及び０．００１ｍＭのＩＣ５０値を有するテトラヒドロイソインデ(tetrahydroisoinde)誘導体であることが報告されている。ヒト全血において、Ｓ−３３５１６がＥＤ５０＝０．３９ｍｇ／ｋｇを有することが報告されている。
【０１３２】
上記シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、本明細書では、総称して、ＣＯＸ−２選択的阻害剤又はシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤と呼ぶことができる。
本発明に有用であるシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、任意の供給源から、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤が薬学的に許容される限り、供給されることが可能である。シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、天然の供給源から単離し、精製することができ、又は合成することができる。シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤は、医薬品に用いるために慣用的に売買されるような、品質及び純度であるべきである。
【０１３３】
本明細書に用いる限り、“有効量”とは、対象へ投与される用量若しくは有効量及び対象への投与回数を意味し、当業者によって既知手法を用いて、同様な環境下で得られた結果を観察することによって容易に決定される。患者へ投与される用量若しくは有効量及び対象への投与回数は、当業者によって既知手法を用いて、同様な環境下で得られた結果を観察することによって容易に決定されうる。有効量又は用量を決定する場合に、用いる化合物の効力及び作用の持続期間；治療すべき病気の性質及び重症度；並びに治療される患者の性別、年齢、体重、全身の健康及び個人的の応答性；並びにその他の関連する状況を包含する、多くの要因が、主治医である診断者によって考慮されるが、これらに限定されない。
【０１３４】
“治療的に有効(therapeutically-effective)”なるフレーズは、作用物質が、代わりの療法に典型的に付随する不利な副作用を回避しつつ、障害を予防する、又は障害の重症度を改善する可能性を意味する。“治療的に有効”なるフレーズが、“治療又は予防のために有効”なるフレーズと同等であることを理解すべきであり、両方共が、代わりの療法に典型的に付随する不利な副作用を回避しつつ、各作用物質の単独の治療に比べて、新生物の重症度及び発生率を改良すると言う目標を達成する併用療法に用いるための各作用物質の量を限定するように意図される。
【０１３５】
当業者は、投与量がGoodman &Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), AppendixII, pp. 1707-1711からの指導によっても決定されうることを理解するであろう。
【０１３６】
本発明の方法に用いる３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物に関して、任意の組み合わせに含有される治療有効量は、最初に、細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば、細胞培養で測定されるＩＣ５０（即ち、ＰＴＫ活性の最大半減（half-maximum）阻害を達成する試験化合物濃度）を包含する循環濃度範囲に達するように、用量を動物モデルで策定することができる。このような情報を用いて、ヒトにおける有効な用量をより正確に決定することができる。
【０１３７】
本明細書に記載する任意の組み合わせに含有される３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物の毒性効果及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致命的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）の測定に関して、細胞培養及び動物実験において標準製薬方法(standard pharmaceutical procedure)によって評価することができる。
毒性効果と治療効果との用量比率が治療指数であり、これは、ＬＤ５０とＥＤ５０との比率として表現することができる。
【０１３８】
高い治療指数を有するインドリノン化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量範囲の策定に用いることができる。このような化合物の投与量は、ＥＤ５０を包含し毒性が殆ど又は全くない循環濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、この範囲内で、用いる投与形及び用いる投与経路に依存して変化しうる。正確な処方、投与経路及び投与量は、個々の医師が患者の状態を考慮して選択することができる(例えば、Fingl et al., 1975, in"The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1参照)。
【０１３９】
投与量及び投与間隔は、キナーゼ調節効果(kinase modulating effect)又は最小有効濃度（ＭＥＣ）を維持するために充分である活性部分の血漿レベルを与えるように、個々に調節することができる。ＭＥＣは各化合物で変化するが、in vitroデータから；例えば、本明細書に記載したアッセイを用いて、キナーゼの５０〜９０％阻害を達成するために必要な濃度から算出することができる。ＭＥＣに達するために必要な投与量は、個人的な特徴及び投与経路に依存する。しかし、ＨＰＬＣアッセイ又はバイオアッセイを用いて、血漿濃度を測定することができる。
【０１４０】
投与間隔も、ＭＥＣ値を用いて、決定することができる。ＭＥＣを超える血漿レベルを該時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％間維持する投与計画を用いて、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物を投与すべきである。局所投与又は選択的摂取の場合には、該薬物の有効局所濃度を、血漿濃度に関連付けることができない。
【０１４１】
組成物の投与量は、当然、治療される対象、対象の体重、苦痛(affliction)の重症度、投与形式及び処方医(prescribing physician)の判断に依存する。
本発明の方法では、用いる３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物の量は、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤と共に投与した場合に、該組み合わせの有効量を構成するために充分であるような量である。該組み合わせの投与量が治療有効量を構成することが好ましい。
【０１４２】
治療の１回投与量のためにシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤と組み合わせて用いられる３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物の量は約０．００１ｍｇ／ｋｇ対象の体重から約２００ｍｇ／ｋｇまでの範囲内であることが、好ましい。該量が約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇであることがより好ましく、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１２ｍｇ／ｋｇであることがさらにより好ましく、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであることがなおいっそう好ましい。
【０１４３】
投与回数は、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物の半減期にある程度依存する。３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物が短い半減期（例えば、約２〜１０時間）を有する場合には、１日に１回以上投与することが必要であると考えられる。或いは、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物が長い半減期（例えば、約２〜約１５日間）を有する場合には、１日に１回、１週間に１回、又は１か月若しくは2か月毎に1回でさえも投与することが必要であるに過ぎない。好ましい投与速度(dosage rate)は、上記投与量を対象に１日に1回投与することである。
【０１４４】
同様に、本発明の方法で用いるＣＯＸ−２選択的阻害剤の量は、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物と共に投与する場合に、該組み合わせの有効量を構成するために充分であるような量でありうる。このような量が該組み合わせの治療有効量を提供するために充分であることが好ましい。該治療有効量は、該組み合わせの新生物治療又は予防有効量として、本明細書に記載しうる。
【０１４５】
本発明の方法では、新規な治療方法に用いるＣＯＸ−２選択的阻害剤の量は、好ましくは、対象の体重１ｋｇにつき約０．０１〜約１００ｍｇ／日（ｍｇ／日・ｋｇ）、より好ましくは約０．１〜約５０ｍｇ／日・ｋｇ、さらにより好ましくは約１〜約２０ｍｇ／日・ｋｇの範囲である。
【０１４６】
ＣＯＸ−２選択的阻害剤がロフェコキシブを含む場合に、用いる量が約０．１５〜約１．０ｍｇ／日・ｋｇの範囲内であることが好ましく、約０．１８〜約０．４ｍｇ／日・ｋｇであることがさらにより好ましい。
【０１４７】
ＣＯＸ−２選択的阻害剤がエトリコキシブを含む場合に、用いる量が約０．５〜約５ｍｇ／日・ｋｇの範囲内であることが好ましく、約０．８〜約４ｍｇ／日・ｋｇであることがさらにより好ましい。
【０１４８】
ＣＯＸ−２選択的阻害剤がセレコキシブを含む場合に、用いる量が約１〜約１０ｍｇ／日・ｋｇの範囲内であることが好ましく、約１．４〜約８．６ｍｇ／日・ｋｇであることがさらにより好ましく、約２〜約３ｍｇ／日・ｋｇであることがなおいっそう好ましい。
【０１４９】
本発明の方法及び本発明の組成物では、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物をＣＯＸ−２選択的阻害剤と共に投与する、又は３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物をＣＯＸ−２選択的阻害剤と組み合わせる。対象に投与する３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物量のＣＯＸ−２選択的阻害剤量に対する重量比率は約０．０００１：１から約２０００：１までの範囲内であることが好ましく、約０．００２：１から約１２００：１までの範囲であることがより好ましく、約０．０１：１から約１：１までの範囲であることがさらにより好ましい。
【０１５０】
３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物とＣＯＸ−２選択的阻害剤との組み合わせは、新規な治療組成物の形態で供給することができ、この形態は本発明の範囲内であると考えられる。治療組成物の各成分の相対的量は変化することができ、直前に記載した通りでありうる。上述した３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物とＣＯＸ−２選択的阻害剤とは、各成分の好ましい量が例えば単一の投与、１回の注射若しくは単一のカプセルによって、又は４個まで若しくは４個より多くのの単一投与形によって供給されるように、治療組成物中に供与することができる。
【０１５１】
該新規な組み合わせを薬学的に許容されるキャリヤー又は賦形剤と共に供給する場合には、薬剤組成物が形成される。本発明の薬剤組成物は、チロシンキナーゼ・シグナル伝達に関連する疾患の予防又は治療に適した組成物を目的とする。該薬剤組成物は、薬学的に許容されるキャリヤー、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物及びシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤を含む。１つの好ましい実施態様では、３−ヘテロアリール−２−インドリノン化合物は３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）である。
【０１５２】
薬学的に許容される賦形剤は、生理食塩水、リンガー液、リン酸塩溶液若しくは緩衝液、緩衝化生理食塩水及び当該技術分野で知られた他のキャリヤーを包含するが、これらに限定されない。薬剤組成物はさらに、安定剤、酸化防止剤、着色剤及び希釈剤をも包含することができる。薬学的に許容されるキャリヤー及び添加剤は、薬剤化合物からの副作用が最少になり、該化合物の性能が、治療が無効になるような程度にまで、解消される又は阻害されることがないように選択される。
【０１５３】
“薬理有効量（pharmacologically effective amount）”なる用語は、研究者又は臨床医が求めている、組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的反応を誘出するような、薬物又は薬剤の量を意味することになる。この量が治療有効量でありうる。
【０１５４】
“薬学的に許容される”なる用語は、修飾された名詞が特定の医薬品に用いるために適当であることを意味するように、本明細書で用いられる。薬学的に許容されるカチオンは、金属イオン及び有機イオンを包含する。より好ましい金属イオンは、適当なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及び他の生理的に許容される金属イオンを包含するが、これらに限定されない。典型的なイオンは、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛をそれらの通常の原子価で包含する。好ましい有機イオンは、プロトン化第３級アミン及び第４級アンモニウム・カチオンを包含し、一部には、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、（Ｎ−メチルグルカミン）及びプロカインを包含する。典型的な、薬学的に許容される酸は、塩酸、ヨウ化水素酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサル酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸等を包含するが、これらに限定されない。
【０１５５】
本発明の組み合わせには、シクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤の異性体、互変異性体及び薬学的に許容される塩も包含される。具体的な薬学的に許容される塩は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸(mesylic acid)、ステアリン酸、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシル安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸(embonic acid)（パモ酸(pamoic acid)）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルゲン酸、β−ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸及びガラクツロン酸から調製される。
【０１５６】
本発明の化合物の、薬学的に許容される適当な塩基付加塩は、金属イオン塩及び有機イオン塩を包含する。より好ましい金属イオン塩は、適当なアルカリ金属（Ｉａ族）塩、アルカリ土類金属（ＩＩａ族）塩、及び他の生理的に許容される金属イオンを包含するが、これらに限定されない。このような塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛のイオンから製造されうる。好ましい有機塩は、第３級アミン及び第４級アンモニウム塩から製造されることができ、一部には、トリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、（Ｎ−メチルグルカミン）及びプロカインを包含する。上記塩の全ては、当業者によって、本発明の対応化合物から慣用的な手段によって調製することができる。
【０１５７】
“治療する(treating)”又は“治療すること(to treat)”なる用語は、症状を軽減する、一時的若しくは永久的な規模で原因を除去する、又は症状の発現を予防する若しくは遅延させることを意味する。“治療（treatment）”なる用語は、新生物の緩和、原因の除去又は新生物の予防を包含する。ヒトの治療のために有用であることの他に、これらの組み合わせは、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ等を含めた哺乳動物の治療のためにも有用である。
【０１５８】
治療の目的のための“対象(subject)”なる用語は、特定の治療を必要とする、特に新生物の予防を必要とする、又はこのような障害に罹患している、任意のヒト又は動物の対象を包含する。該対象は、通常、ヒトである。“哺乳動物”なる用語は、本明細書で用いる限り、ヒト、家畜及び飼育場動物、並びに動物園、スポーツ又はペット動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を含めた哺乳動物として分類される任意の動物を意味する。好ましくは、該哺乳動物はヒトである。
【０１５９】
予防方法に関して、対象は任意のヒト又は動物対象であり、好ましくは、新生物の予防及び／又は治療を必要とする対象である。該対象は、例えば新生物のような障害又は状態について危険状態にあるヒト対象でありうる。該対象は、遺伝的素因、坐ることの多い生活様式、食事、障害誘導作用物質への露出、病原性作用物質への露出等によって危険状態にある可能性がある。
【０１６０】
本発明の薬剤組成物は、経腸的に(enterally)又は非経口的に投与することができる。非経口的投与は、皮下、筋肉内、皮内、乳房内、静脈内、及び当該技術分野で知られた他の投与方法を包含する。経腸的投与は、溶液、錠剤、持続放出カプセル、腸溶性被覆カプセル及びシロップを包含する。投与したときに、該薬剤組成物は体温又はほぼ体温になりうる。
【０１６１】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤とインドリノンとの使用の定義における“併用療法(combination therapy)”、“同時投与(co-administration)”、“一緒に投与(adminiration with)”又は“同時療法(co-therapy)”なるフレーズは、薬物組み合わせの有利な効果をもたらす投与計画において各作用物質を連続形式で投与することを包含するように意図され；例えば、これらの活性作用物質を一定比率で有する単一カプセル若しくは投与デバイスで、又は各作用物質の別々の複数カプセル若しくは投与デバイスでのように、これらの作用物質を実質的に同時形式で同時投与することも包含するように意図される、この場合、該別々のカプセル若しくは投与デバイスは同時に一緒に摂取されてもよく、該組み合わせの両方の成分作用物質からの有利な効果を受容するために充分な時間内に摂取されてもよい。
【０１６２】
本発明の組み合わせは、３−ヘテロアリール−２−インドリノン成分及びシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤成分をそれぞれの成分の各々の有効時間内(within an effective time)に投与することを包含しうるが、それぞれの成分の両方を同時に投与することが好ましく、それぞれの成分の両方を単一デリバリー量(single delivery dose)として投与することがさらに好ましい。
【０１６３】
特に、本発明の組み合わせは、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣錠(dragee)、トローチ剤、菱形剤、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末若しくは顆粒、エマルジョン、硬質若しくは軟質カプセル剤、シロップ剤又はエリキシル剤として、経口投与することができる。経口用に意図された組成物は、薬剤組成物の製造のために当該技術分野で知られた任意の方法によって調製することができ、このような組成物は、薬剤的に的確で、口当たりの良い製剤を提供するために、甘味剤、フレーバー剤(flavoring agent)、着色剤及び保存剤から成る群から選択される１つ以上の作用物質を含有することができる。錠剤は、有効成分を、錠剤の製造に適した非毒性で薬学的に許容される賦形剤との混合物として含有する。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム若しくはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；例えば、トウモロコシ・デンプン若しくはアルギン酸のような、顆粒化剤及び崩壊剤；例えば、デンプン、ゼラチン若しくはアラビアゴムのような結合剤；及び例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸若しくはタルクのような潤滑剤でありうる。錠剤は被覆しなくてもよく、錠剤を既知手法によって被覆して、胃腸管内での崩壊及び吸着を遅延させ、それによって長期間にわたって持続作用を与えてもよい。例えば、グリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートのような時間遅延物質(time delay material)を用いることができる。
【０１６４】
経口用の製剤はさらに、有効成分が不活性固体希釈剤（例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリン）と混合されている硬質ゼラチンカプセルとして、或いは有効成分がそれ自体として、又は水若しくは油媒質、例えば落花生油、液体パラフィン若しくはオリーブ油との混合物として存在する軟質ゼラチンカプセルとしても提示されうる。
【０１６５】
活性物質を水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物として含有する水性懸濁液を製造することができる。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、ナトリウム・カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアラビアガムである；分散剤又は湿潤剤は、天然生成ホスファチド、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトール・モノオレエート、又はエチレンオキシドと、脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン・モノオレエートでありうる。
【０１６６】
水性懸濁液はさらに、１種類以上の保存剤、例えば、エチル若しくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種類以上の着色剤、１種類以上のフレーバー剤、又は１種類以上の甘味剤、例えばスクロース若しくはサッカリンを含有しうる。
【０１６７】
油性懸濁液は、ω−３脂肪酸、植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、胡麻油若しくはココナッツ油中に、又は鉱物油、例えば液体パラフィン中に有効成分を懸濁させることによって、処方することができる。該油性懸濁液は、増粘剤、例えば、みつろう、固形パラフィン(hard paraffin)又はセチルアルコールを含有することができる。
【０１６８】
例えば上述したような甘味剤及びフレーバー剤を加えて、口当たりの良い製剤を提供することができる。これらの組成物は、例えばアスコルビン酸のような酸化防止剤の添加によって、保存することができる。
【０１６９】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性散剤及び顆粒剤は、有効成分を、分散剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤及び１種類以上の保存剤との混合物として供給する。適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、既に上述したものによって例示される。付加的な賦形剤、例えば、甘味剤、フレーバー剤及び着色剤も存在しうる。
【０１７０】
該新規な組み合わせを含有するシロップ及びエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、ソルビトール又はスクロースを加えて処方することができる。このような製剤は、粘滑剤(demulcent)、保存剤、フレーバー剤及び着色剤をも含有することができる。
【０１７１】
本発明の組み合わせは、非経口的に、皮下、若しくは静脈内、若しくは筋肉内、若しくは胸骨内のいずれかに、又は注入法によって、無菌水性若しくは油性懸濁液の形態で投与することができる。このような懸濁液は、上記に挙げたような、適当な分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁化剤又は他の許容される作用物質を用いて、既知技術にしたがって処方することができる。無菌の注射可能な製剤はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のように、非毒性で非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液でもありうる。使用可能な許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンガー液及び等張性塩化ナトリウム溶液が存在する。さらに、無菌の不揮発性油が溶媒又は懸濁化媒質として慣用的に用いられる。この目的のために、合成モノ−又はジグリセリドを含めた、任意のブランドの不揮発性油を用いることができる。さらに、ｎ−３ポリ不飽和脂肪酸を注射可能物質の調製に用いることができる。
【０１７２】
本発明の組み合わせはさらに、エアゾール若しくはネブライザー用溶液として吸入によって投与してもよく、常温で固体であるが直腸温度では液体になり、そのために直腸内で溶融して薬物を放出する適当な無刺激性賦形剤と薬物を混合することによって調製される座薬として直腸投与してもよい。このような物質は、カカオ脂及びポリエチレングリコールである。
【０１７３】
該新規な組成物はさらに、クリーム、軟膏、ゼリー、洗眼剤(collyrium)、溶液又は懸濁液として局所投与することができる。
１日投与量は、広い範囲内で変化することができ、各特定の場合に個々の必要条件に合わせて調節される。一般に、成人への投与について、適当な１日投与量は上述したが、好ましいとして同定した範囲は、必要に応じて超えてもよい。該１日投与量は、単一投与として又は分割投与量で投与することができる。
【０１７４】
種々なデリバリー系は、例えば、カプセル、錠剤及びゼラチン・カプセルを包含する。
本発明はさらに、上記したような新生物の治療又は予防方法の実施に用いるために適当であるキットを含む。１つの実施態様では、該キットは、３−ヘテロアリール−２−インドリノン又は関連化合物を含む第１投与形と、１種類以上のシクロオキシゲナーゼ−２選択的阻害剤又はそのプロドラッグを含む第２投与形とを、本発明の方法を実施するために充分な量で含有する。好ましくは、該第１投与形及び該第２投与形は一緒に、新生物の治療又は予防のための治療有効量の化合物を含む。
【０１７５】
下記実施例は、本発明の実施態様を記載する。本明細書の特許請求の範囲内の他の実施態様は、本明細書に開示した本発明の明細又は実施の検討から、当業者に明らかであると思われる。該明細書は、実施例と共に、例示に過ぎないと見なすように意図され、本発明の範囲及び要旨は、実施例に続く特許請求の範囲によって表示される。
【実施例】
【０１７６】
実施例１
一般的合成：
方法Ａ
エタノール（１〜２ｍｌ／１ｍｍｏｌオキシインドール）中の適当なオキシインドール（２−インドリノン）（１当量）、適当なアルデヒド（１．２当量）及びピペリジン（０．１当量）の反応混合物を、９０℃で３〜５時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、目標化合物を得た。
【０１７７】
方法Ｂ
Ｖｉｓｍｅｉｅｒ反応による適当なアルデヒドの調製．  １，２−ジクロロエタン（２．０ｍｌ／１．０ｍｍｏｌ出発物質）中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．２当量）の溶液に、オキシ塩化リン（１．２当量）を０℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物をさらに３０分間撹拌した。適当な出発物質（１．０当量）を上記溶液に少量ずつ(portionwise)加え、該反応混合物を５０〜７０℃で５時間〜２日間撹拌した。反応混合物を氷冷１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に注入し（混合後に、ｐＨ＝９）、得られた混合物を室温において１時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層をブラインでｐＨ＝７になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上でクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルとヘキサンとの溶媒混合物で溶出して、標題化合物を得た。
【０１７８】
３−置換−２−インドリノン類似体の合成．  エタノール（１〜２ｍｌ、１ｍｍｏｌオキシインドール）中の適当なオキシインドール（２−インドリノン）（１当量）、適当なアルデヒド（１．２当量）及びピペリジン（０．１当量）の反応混合物を９０℃で３．５時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、目標化合物を得た。
【０１７９】
３−ベンジリデン−２−インドリノン（ＳＵ４９２８）の合成
３−ベンジリデン−２−インドリノンの好ましい合成方法は、次の通りである：メタノール２．０ｍｌ中のオキシインドール１３７．０ｍｇの溶液に、ベンズアルデヒド１２３．２μｌとピペリジン４０μｌを加える。この反応混合物を３時間還流させ、氷−水浴中で該混合物を冷却する。得られた沈殿を濾過し、冷メタノールで洗浄し、４０℃のオーブン中で一晩乾燥させる。このようなプロトコールを用いて、化合物約１２９．０ｍｇが得られた。
【０１８０】
３−［（ピリダ−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５２１２）の合成
３−［（ピリダ−４−イル）メチレン］−２−インドリノンの好ましい合成方法は、次の通りである：メタノール２．０ｍｌ中のオキシインドール１３８．０ｍｇの溶液に、４−ピリジンカルボキサルデヒド(4-pyridinecarboxaldehyde)１１７．０μｌとピペリジン４０μｌを加える。この反応混合物を３時間還流させ、氷−水浴中で冷却した。得られた沈殿を濾過し、冷メタノールで洗浄し、４０℃のオーブン中で一晩乾燥させて、該化合物１３４．５ｍｇを得た。
【０１８１】
３−［４−（モルホリン−４−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ４９８１）の合成（方法Ｂ）：
４−（モルホリン−４−イル）ベンズアルデヒド．  １，２−ジクロロエタン５０ｍｌ中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１５ｍｌの溶液に、オキシ塩化リン１０ｍｌを０℃で加えた。氷−水浴を除去し、反応混合物をさらに３０分間撹拌した。上記溶液に４−フェニルモルホリン（１６．３ｇ）を少量ずつ加えて、反応混合物を２日間還流させた。トリエチルアミン（２．５ｍｌ）を上記反応混合物に加えて、この反応を２日間還流させた。この反応混合物を氷冷１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に注入し（混合後に、ｐＨ＝９）、反応混合物を室温において１時間撹拌した。有機層を分離し、水層をジクロロメタン２ｘ２０ｍｌで抽出した。一緒にした有機層をブラインでｐＨ＝７になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとの溶媒混合物で溶出して、標題化合物１２．９５ｇ（６８％）を白色固体として得た。
【０１８２】
３−［４−（モルホリン−４−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ４９８１）
エタノール５０ｍｌ中のオキシインドール６．６６ｇ、４−（モルホリン−４−イル）ベンズアルデヒド１１．５０ｇ及びピペリジン５ｍｌの反応混合物を９０℃で５時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過し、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物１５．０ｇ（９８％）を黄色固体として得た。
【０１８３】
３−［４−（４−ホルミルピペラジン−イル）ベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４９８４）の合成（方法Ｂ）：
４−（４−ホルミルピペラジン−１−イル）ベンズアルデヒド．  １，２−ジクロロエタン２０ｍｌ中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３．９ｍｌ（３０ｍｍｏｌ）の溶液に、オキシ塩化リン３．０ｍｌ（３．９ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物をさらに１５分間撹拌した。１−フェニルピペラジン（１６．０ｇ、１０ｍｍｏｌ）を溶液に少量ずつ加え、反応混合物を５０℃で１時間撹拌した。この反応混合物を氷冷１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に注入して、室温で１時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル２０ｍｌで２回抽出した。一緒にした有機層をブラインでｐＨ＝７になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとの混合物で溶出して、標題化合物９．０ｇ（４１％）を淡黄色固体として得た。
【０１８４】
３−［４−（４−ホルミルピペラジン−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ４９８４）
エタノール２ｍｌ中のオキシインドール１３３．１５ｍｇ、４−（ピペラジン−イル）ベンズアルデヒド２２８．３ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で５時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物１９９．５ｍｇ（６５％）を黄色固体として得た。
【０１８５】
３−［４−（ピペリジン−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５４５０）の合成（方法Ｂ）
４−（ピペリジン−１−イル）ベンズアルデヒド．  １，２−ジクロロエタン１０ｍｌ中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２．３ｍｌ（ｍｍｏｌ）の溶液に、オキシ塩化リン２．８ｍｌ（３０ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物を１５分間撹拌した。１−フェニルピペリジン（３．２ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）を上記溶液に少量ずつ加え、反応混合物を一晩還流させた。この反応混合物を氷冷２Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に注入して、室温で１時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチル２ｘ２０ｍｌで抽出した。一緒にした有機層をブラインでｐＨ＝７になるまで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲル・カラム上で分離し、酢酸エチルとヘキサンとで溶出して、標題化合物１．５ｇ（４０％）を白色固体として得た。
【０１８６】
３−［４−（ピペリジン−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５４５０）
エタノール２ｍｌ中のオキシインドール１３４．０ｍｇ、４−（ピペリジン−１−イル）ベンズアルデヒド２２６．８ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で５時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物２６８．５ｍｇ（８８％）を黄色固体として得た。
【０１８７】
３−［２−クロロ−４−メトキシベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５４８０）の合成
２−クロロ−４−メトキシベンズアルデヒド．  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１０ｍｌ中の２−クロロ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド１．０ｇ（６．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム４．４ｇ（３２ｍｍｏｌ）及びヨウ化メチル１．４ｇ（９．６ｍｍｏｌ）の反応混合物を、７０℃で２時間撹拌して、氷水中に注入した。沈殿を濾過し、水で洗浄して、真空オーブン中、４０℃で一晩乾燥させて、標題化合物７５０ｍｇ（６８％）を薄いピンク色固体として得た。
【０１８８】
３−［２−クロロ−４−メトキシベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５４８０）
エタノール５ｍｌ中のオキシインドール４８７．９ｍｇ（３．７ｍｍｏｌ）、２−クロロ−４−メトキシベンズアルデヒド７５０ｍｇ（４．３ｍｍｏｌ）及びピペリジン４滴の反応混合物を、９０℃で２時間加熱し、室温に冷却した。黄色沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、真空オーブン中、４０℃で一晩乾燥させて、標題化合物６８０．２ｍｇ（６２％）を得た。
【０１８９】
３−［（４−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０１）の合成
エタノール３ｍｌ中のオキシインドール１３３．０ｍｇ、４−メチルチオフェン−２−カルボキサルデヒド１５１．２ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で３時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物１４７．３ｍｇ（６１％）を黄色固体として得た。
【０１９０】
３−［（３−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０４）の合成
エタノール２ｍｌ中のオキシインドール１３３．０ｍｇ、３−メチルピロール−２−カルボキサルデヒド１３０．９ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で３時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物１５０．９ｍｇ（６７％）を黄色固体として得た。
【０１９１】
３−［（３，４−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０６）の合成
３−［（３，４−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンをJ.Heterocyclic Chem.13:1145-1147(1976)に記載されているように合成した。
【０１９２】
エチル４−メチルピロール−３−カルボキシレート．  ２：１エーテル／ジメチルスルホキシド５００ｍｌ中のエチルクロトネート１１．８６ｇ（０．１ｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホニルメチルイソシアニド１９．５０ｇ（０．１ｍｏｌ）との溶液を、エーテル中の水素化ナトリウム６．８ｇの懸濁液（６０％鉱油分散液、０．１７ｍｏｌ）中に室温で滴加した。添加の完了時に、反応混合物を３０分間撹拌し、水４００ｍｌで希釈した。水層をエーテル３ｘ１００ｍｌで抽出した。一緒にしたエーテル抽出物をアルミナ・カラムに通過させ、該カラムをジクロロメタンで溶出した。有機溶媒を蒸発させ、得られた残渣は放置すると凝固した。該固体をヘキサンで洗浄して、真空オーブン中、４０℃で一晩乾燥させて、標題化合物１２．３８ｇ（８０％）を得た。
【０１９３】
３，４−ジメチルピロールの調製．  ナトリウムジヒドロビス（２−メトキシエトキシアルミネート）２３ｇ（８０ｍｍｏｌ）の溶液に、窒素雰囲気下、室温で、ベンゼン５０ｍｌ中のエチル４−メチルピロール−３−カルボキシレート５ｇ（３４ｍｍｏｌ）の溶液を滴加した。この反応混合物を１８時間撹拌した。この反応混合物に水（１００ｍｌ）を加えた。有機層を分離して、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を除去して、残渣を蒸留して、標題化合物１．２ｇ（４４％）を得た。
【０１９４】
３，４−ジメチルピロール−２−カルボキサルデヒドの調製．  １，２−ジクロロエタン  ｍｌ中のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド０．９２ｍｌ（１２ｍｍｏｌ）の溶液に、オキシ塩化リン１．０ｍｌ（１２ｍｍｏｌ）を０℃で滴加した。氷浴を除去し、反応混合物をさらに３０分間撹拌した。上記溶液に、３，４−ジメチルピロール（９６０．０ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加え、反応混合物を５０℃で５時間撹拌した。反応混合物を氷冷１Ｎ水酸化ナトリウム溶液中に注入し（混合後に、ｐＨ＝９）、反応混合物を室温で１時間撹拌した。有機層を分離し、水層を酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層をｐＨ＝７になるまでブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣をシリカゲルカラム上でクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチルとヘキサンとの溶媒混合物で溶出して、標題化合物６１０ｍｇ（５０％）を得た。
【０１９５】
３−［（３，４−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０６）
２中のオキシインドール６７．０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）、３，４−ジメチルピロール−２−カルボキサルデヒド７３．０ｍｇ（０．６ｍｍｏｌ）及びピペリジン２滴の反応混合物を、９０℃で３時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物８７．７ｍｇ（３７％）を黄色固体として得た。
【０１９６】
３−［（２，４−ジメチル−３−エトキシカルボニルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０８）の合成
エタノール３ｍｌ中のオキシインドール１３４．０ｍｇ、４−エトキシカルボニル−３，５−ジメチルピロール−２−カルボキサルデヒド２３４．３ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で３時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物２４４．６ｍｇ（７９％）を黄色固体として得た。
【０１９７】
３−［（２，４−ジメチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１６）の合成
エタノール２ｍｌ中のオキシインドール１３４．０ｍｇ、３，５−ジメチルピロール−２−カルボキサルデヒド１４７．８ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で３時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物１３６．７ｍｇ（５７％）を黄色固体として得た。
【０１９８】
３−［（２−メチルメルカプトチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１９）の合成
エタノール２ｍｌ中のオキシインドール１３４．０ｍｇ、５−メチルメルカプトチオフェン−２−カルボキサルデヒド１８９．９ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で３時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物２４６．６ｍｇ（９０％）を橙色固体として得た。
【０１９９】
３−［（２−メチルチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２４）の合成
エタノール２ｍｌ中のオキシインドール１３４．０ｍｇ、５−メチルチオフェン−２−カルボキサルデヒド１５１．４２ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で３時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物２３７．８ｍｇ（９９％）を黄色固体として得た。
【０２００】
３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２７）の合成
エタノール２ｍｌ中のオキシインドール１３４．０ｍｇ、３−メチルチオフェン−２−カルボキサルデヒド１５１．４ｍｇ及びピペリジン３滴の反応混合物を、９０℃で３時間撹拌した。冷却後に、沈殿を濾過して、冷エタノールで洗浄し、乾燥させて、標題化合物１５７．８ｍｇ（６５％）を黄色固体として得た。
【０２０１】
３−（２，５−ジメトキシベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４７９３）の合成
３−（２，５−ジメトキシベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２０２】
３−（２，３−ジメトキシベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４７９４）の合成
３−（２，３−ジメトキシベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２０３】
３−（３−ブロモ−６−メトキシベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４７９６）の合成
３−（３−ブロモ−６−メトキシベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２０４】
３−［４−（４−ｔ−ブチルカルボニル−ピペラジン−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５３９３）の合成
３−［４−（４−ｔ−ブチルカルボニル−ピペラジン−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノンを方法Ｂによって合成する。
【０２０５】
３−［（フラン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ４７９８）の合成
３−［（フラン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
３−（４−アセトアミドベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４７９９）の合成
３−（４−アセトアミドベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２０６】
３−（２−クロロ−４−ヒドロキシベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４９３２）の合成
３−（２−クロロ−４−ヒドロキシベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２０７】
３−（４−ブロモベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４９４２）の合成
３−（４−ブロモベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
３−（４−アセチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４９４４）の合成
３−（４−アセチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２０８】
３−（２−メトキシベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４９４９）の合成
３−（２−メトキシベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−１−メチル−２−インドリノン（ＳＵ４９５２）の合成
３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−１−メチル−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２０９】
３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４３１２）の合成
３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノンは、MNaybridge Chemical Co.Ltd.から入手可能である。
【０２１０】
３−（４−ブロモベンジリデニル）−１−メチル−２−インドリノン（ＳＵ４９５６）の合成
３−（４−ブロモベンジリデニル）−１−メチル−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２１１】
５−クロロ−３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４９６７）の合成
５−クロロ−３−（４−ジメチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２１２】
３−（４−ブロモベンジリデニル）−５−クロロ−２−インドリノン（ＳＵ４９７２）の合成
３−（４−ブロモベンジリデニル）−５−クロロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２１３】
３−（４−ジエチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４９７８）の合成
３−（４−ジエチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２１４】
３−（４−ジ−ｎ−ブチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４９７９）の合成
３−（４−ジ−ｎ−ブチルアミノベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２１５】
１−メチル−３−［４−（モルホリン−４−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ４９８２）の合成
１−メチル−３−［４−（モルホリン−４−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノンを方法Ｂによって合成する。
【０２１６】
５−クロロ−３−［４−（モルホリン−４−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ４９８３）の合成
５−クロロ−３−［４−（モルホリン−４−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノンを方法Ｂによって合成する。
【０２１７】
３−（３，４−ジクロロベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ５２０１）の合成
３−（３，４−ジクロロベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２１８】
３−（２−エトキシベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ５２０４）の合成
３−（２−エトキシベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
３−（４−フルオロベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ５２０５）の合成
３−（４−フルオロベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２１９】
３−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンの合成（ＳＵ５２０８）
３−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
３−（２−メトキシベンジリデニル）−２−インドリノンの合成
３−（２−メトキシベンジリデニル）−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２２０】
３−［２−［（３，５−ジ−（トリフルオロメチル）フェニル）フラン−５−イル］メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５２１７）の合成
３−［２−［（３，５−ジ−（トリフルオロメチル）フェニル）フラン−５−イル］メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２２１】
２，６−ジ−（ジメチルアミノ）−３，５−ジ−［（インドリン−２−オン−３−イリデニル）メチル］−フェニルシアニド（ＳＵ５２１８）の合成
２，６−ジ−（ジメチルアミノ）−３，５−ジ−［（インドリン−２−オン−３−イリデニル）メチル］−フェニルシアニドを方法Ａによって合成する。
【０２２２】
３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０２）の合成
３−［（３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法  によって合成する。
【０２２３】
３−［（３，４−ジブロモ−５−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０３）の合成
３−［（３，４−ジブロモ−５−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ｂによって合成する。
【０２２４】
３−［（３，４−ジメチル−２−ホルミルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０５）の合成
３−［（３，４−ジメチル−２−ホルミルピロル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２２５】
３−｛［４−（２−メトキシカルボニルエチル）−３−メチルピロル−５−イル］メチレン｝−２−インドリノン（ＳＵ５４０７）の合成
３−｛［４−（２−メトキシカルボニルエチル）−３−メチルピロル−５−イル］メチレン｝−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２２６】
３−［（２−ヨードフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４０９）の合成
３−［（２−ヨードフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２２７】
３−［（３−エトキシカルボニル−２−メチルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１０）の合成
３−［（３−エトキシカルボニル−２−メチルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２２８】
３−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４１８）の合成
３−［（３−ブロモチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２２９】
３−［（２−クロロチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２０）の合成
３−［（２−クロロチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３０】
３−［（２，３−ジメチルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２１）の合成
３−［（２，３−ジメチルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３１】
３−［（５−ニトロチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２２）の合成
３−［（５−ニトロチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３２】
３−［（２−カルボキシチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２３）の合成
３−［（２−カルボキシチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３３】
３−［（２−ブロモチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２５）の合成
３−［（２−ブロモチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３４】
３−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２６）の合成
３−［（４−ブロモチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３５】
３−［（２−スルホニルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン・ナトリウム塩（ＳＵ５４２８）の合成
３−［（２−スルホニルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン・ナトリウム塩を方法Ａによって合成する。
【０２３６】
３−［（フラン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４２９）の合成
３−［（フラン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
３−［（２−メチルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４３０）の合成
３−［（２−メチルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３７】
３−［（２−エチルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４３１）の合成
３−［（２−エチルフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３８】
３−［（２−ニトロフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４３２）の合成
３−［（２−ニトロフラン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２３９】
３−［（５−ブロモフラン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４３８）の合成
３−［（５−ブロモフラン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４０】
３−［（２−エチルチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４５１）の合成
３−［（２−エチルチエン−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４１】
３−［（４，５−ジメチル−３−エチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４５３）の合成
３−［（４，５−ジメチル−３−エチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４２】
３−［（５−エトキシカルボニル−４−エトキシカルボニルエチル−３−エトキシカルボニルメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４５４）の合成
３−［（５−エトキシカルボニル−４−エトキシカルボニルエチル−３−エトキシカルボニルメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４３】
３−［（５−カルボキシ−３−エチル−４−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４５５）の合成
３−［（５−カルボキシ−３−エチル−４−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを      によって合成する。
【０２４４】
３−［（３，５−ジヨード−４−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４５６）の合成
３−［（３，５−ジヨード−４−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４５】
３−［（５−クロロ−３−メトキシカルボニル−４−メトキシカルボニルメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４５９）の合成
３−［（５−クロロ−３−メトキシカルボニル−４−メトキシカルボニルメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４６】
３−［（３−アセチル−５−エトキシカルボニル−４−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４６０）の合成
３−［（３−アセチル−５−エトキシカルボニル−４−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４７】
３−｛［１−（３，５−ジクロロフェニル）ピロル−２−イル］メチレン｝−２−インドリノン（ＳＵ５４６１）の合成
３−｛［１−（３，５−ジクロロフェニル）ピロル−２−イル］メチレン｝−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４８】
３−［１−（４−クロロフェニル）ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４６２）の合成
３−［１−（４−クロロフェニル）ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２４９】
３−［（４−エトキシカルボニル−３−メチル）ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４６３）の合成
３−［（４−エトキシカルボニル−３−メチル）ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５０】
３−［（１−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４６４）の合成
３−［（１−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５１】
３−［（５−エトキシカルボニル−３−エトキシカルボニルエチル−４−エトキシカルボニルメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４６５）の合成
３−［（５−エトキシカルボニル−３−エトキシカルボニルエチル−４−エトキシカルボニルメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５２】
３−［４−（ピロリジン−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５４６６）の合成
３−［４−（ピロリジン−１−イル）ベンジリデニル］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５３】
３−［（５−メチルイミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４６８）の合成
３−［（５−メチルイミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５４】
３−［（５−メチルチアゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４６９）の合成
３−［（５−メチルチアゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５５】
３−［（３−メチルピラゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４７２）の合成
３−［（３−メチルピラゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５６】
３−［（イミダゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４７３）の合成
３−［（イミダゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５７】
３−［（４−クロロピラゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４７４）の合成
３−［（４−クロロピラゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５８】
３−［（４−ブロモ−１−（４−クロロベンジル）ピラゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４７５）の合成
３−［（４−ブロモ−１−（４−クロロベンジル）ピラゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２５９】
３−［（４−クロロ−１−メチルピラゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４７６）の合成
３−［（４−クロロ−１−メチルピラゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２６０】
３−［（４−エチル−３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４７７）の合成
３−［（４−エチル−３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ｂによって合成する。
【０２６１】
３−［（５−エチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４７８）の合成
３−［（５−エチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ｂによって合成する。
【０２６２】
３−［３，５−ジメチル−４−（プロペン−２−イル）ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５４７９）の合成
３−［３，５−ジメチル−４−（プロペン−２−イル）ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ｂによって合成する。
【０２６３】
５，６−ジメトキシ−３−［２，３−ジメトキシベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５４９５）の合成
５，６−ジメトキシ−３−［２，３−ジメトキシベンジリデニル］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２６４】
３−［２，４，６−トリメトキシベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５６０７）の合成
３−［２，４，６−トリメトキシベンジリデニル］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２６５】
５−クロロ−３−［（ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６１２）の合成
５−クロロ−３−［（ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２６６】
５−クロロ−３−［（３−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６１３）の合成
５−クロロ−３−［（３−メチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２６７】
３−（４−イソプロピルベンジリデニル）−２−インドリノン（ＳＵ４３１３）の合成
３−（４−イソプロピルベンジリデニル）−２−インドリノンは、Maybridge Chemical Co.Ltd.から入手可能である。
【０２６８】
５−クロロ−３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６１４）の合成
５−クロロ−３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２６９】
３−［（ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ４３１４）の合成
３−［（ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンは、Maybridge Chemical Co.Ltd.から入手可能である。
【０２７０】
５−クロロ−３−［（インドル−３−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６１５）の合成
５−クロロ−３−［（インドル−３−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７１】
５−クロロ−３−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６１６）の合成
５−クロロ−３−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７２】
５−クロロ−３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６１７）の合成
５−クロロ−３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７３】
５−クロロ−３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６１８）の合成
５−クロロ−３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７４】
５−クロロ−３−［（５−エチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６１９）の合成
５−クロロ−３−［（５−エチルチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７５】
５−クロロ−３−［（５−メチルメルカプトチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６２０）の合成
５−クロロ−３−［（５−メチルメルカプトチエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７６】
５−クロロ−３−［（イミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６２１）の合成
５−クロロ−３−［（イミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７７】
３−［２，４−ジメトキシ−６−メチルベンジリデニル］−２−インドリノン（ＳＵ５６２３）の合成
３−［２，４−ジメトキシ−６−メチルベンジリデニル］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７８】
５−ニトロ−３−［（ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６２４）の合成
５−ニトロ−３−［（ピロル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２７９】
３−［（３−メチルピロル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン（ＳＵ５６２５）の合成
３−［（３−メチルピロル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８０】
３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン（ＳＵ５６２６）の合成
３−［（３，５−ジメチルピロル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８１】
３−［（インドル−３−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン（ＳＵ５６２７）の合成
３−［（インドル−３−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８２】
５−ニトロ−３−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＳＵ５６２８）の合成
５−ニトロ−３−［（チエン−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８３】
３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン（ＳＵ５６２９）の合成
３−［（３−メチルチエン−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８４】
３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン（ＳＵ５６３０）の合成
３−［（５−メチルチエン−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８５】
３−［（５−エチルチエン−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン（ＳＵ５６３１）の合成
３−［（５−エチルチエン−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８６】
３−［（５−メチルメルカプトチエン−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン（ＳＵ５６３２）の合成
３−［（５−メチルメルカプトチエン−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８７】
３−［（イミダゾル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノン（ＳＵ５６３３）の合成
３−［（イミダゾル−２−イル）メチレン］−５−ニトロ−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８８】
３−［（オキサゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１２７）の合成
３−［（オキサゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２８９】
３−［（オキサゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１２８）の合成
３−［（オキサゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９０】
３−［（オキサゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１２９）の合成
３−［（オキサゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９１】
３−［（チアゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３０）の合成
３−［（チアゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９２】
３−［（チアゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３１）の合成
３−［（チアゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９３】
３−［（チアゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３２）の合成
３−［（チアゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９４】
３−［（イミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３３）の合成
３−［（イミダゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９５】
３−［（ピラゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３５）の合成
３−［（ピラゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９６】
３−［（ピラゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３６）の合成
３−［（ピラゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９７】
３−［（イソオキサゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３７）の合成
３−［（イソオキサゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９８】
３−［（イソオキサゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３８）の合成
３−［（イソオキサゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０２９９】
３−［（イソオキサゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１３９）の合成
３−［（イソオキサゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３００】
３−［（イソオキサゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１４０）の合成
３−［（イソオキサゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３０１】
３−［（イソチアゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１４１）の合成
３−［（イソオキサゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３０２】
３−［（イソチアゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１４２）の合成
３−［（イソオキサゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３０３】
３−［（１，２，３−トリアゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１４３）の合成
３−［（１，２，３−トリアゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３０４】
３−［（１，３，４−トリアゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１４４）の合成
３−［（１，３，４−トリアゾル−２−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３０５】
３−［（５−フェニル−１，２，４−オキサジアゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１４５）の合成
３−［（５−フェニル−１，２，４−オキサジアゾル−３−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３０６】
３−［（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１４６）の合成
３−［（３−フェニル−１，２，４−オキサジアゾル−５−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３０７】
３−［（３−フェニル−１，２，５−オキサジアゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノン（ＣＳ７１４７）の合成
３−［（３−フェニル−１，２，５−オキサジアゾル−４−イル）メチレン］−２−インドリノンを方法Ａによって合成する。
【０３０８】
実施例２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＴＫアッセイ
下記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、１つ以上のＲＴＫに対する本発明の種々な化合物の活性及び効果のレベルを測定することができる。同様なアッセイを、当該技術分野で周知の手法を用いて、任意のチロシンキナーゼに対する同じ系統に沿って設計することができる。
【０３０９】
酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
酵素結合イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、チロシン・キナーゼ活性の存在を検出し、測定することができる。ＥＬＩＳＡは、例えば、Voller, et al.,1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,": Manual of Clinical Immunology, 第２版 , Rose 及びFriedman編集、359-371頁 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C.に記載されている既知プロトコールに従って行なうことができる。
【０３１０】
開示されたプロトコールを、特定のＲＴＫに対する活性の測定に適応させることができる。例えば、特定のＲＴＫｓに対するＥＬＩＳＡ実験を行なうための好ましいプロトコールを以下に提供する。ＲＴＫファミリーの他のメンバー並びに非受容体チロシンキナーゼに対する化合物の活性を測定するためにこれらのプロトコールを適応させることは、当業者の範囲内である。
【０３１１】
ＦＬＫ−１ＥＬＩＳＡ
ＦＬＫ−１受容体のキナーゼ活性、より具体的には、ＦＬＫ−１受容体に対するタンパク質チロシンキナーゼ活性の阻害又は活性化を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを行なった。詳しくは、下記アッセイを行なって、ＦＬＫ−１／ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＦＬＫ−１受容体のキナーゼ活性を測定した。
【０３１２】
物質と方法
物質．下記試薬及び購入品を用いた：
ａ．Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Corning Catalog No. 25805-96)；
ｂ．Ｃａｐｐｅｌ  ヤギ抗ウサギＩｇＧ(catalog no. 55641)；
ｃ．ＰＢＳ(Gibco Catalog No. 450-1300EB)；
ｄ．ＴＢＳＷバッファー(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ(ｐＨ７．２)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ 及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０);
ｅ．エタノールアミン・ストック（１０％エタノールアミン（ｐＨ７．０）、４℃で貯蔵）；
ｆ．ＨＮＴＧバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び１０％グリセロール）；
ｇ．ＥＤＴＡ（０．５Ｍ（ｐＨ７．０）、１００Ｘストックとして）；
ｈ．オルト・バナジン酸ナトリウム（１００Ｘストックとして、０．５Ｍ）；
ｉ．ピロリン酸ナトリウム（１００Ｘストックとして、０．２Ｍ）；
ｊ．ＮＵＮＣ  ９６穴Ｖ底ポリプロピレン・プレート (Applied Scientific Catalog No. AS-72092）；
ｋ．ＮＩＨ３Ｔ３  Ｃ７＃３細胞（ＦＬＫ−１発現細胞）；
ｌ．１Ｘ高グルコースＬグルタミンを含むＤＭＥＭ(catalog No.11965-050)；
ｍ．ＦＢＳ，Ｇｉｃｏ（catalog no.16000-028)；
ｎ．Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ（catalog no.25030-016)；
ｏ．ＶＥＧＦ、PeproTech, Inc. (catalog no. 100-20) (Milli-Q dH2O 中１μｇ／１００μｌストックとして維持、−２０℃で貯蔵）。アフィニティ精製抗ＦＬＫ−１抗血清、Enzymology Lab, Sugen, Inc.；
ｑ．ホスホチロシンに特異的なＵＢ４０モノクローナル抗体、Enzymology Lab, Sugen, Inc. (Fendly, et al., 1990, Cancer Research 50: 1550-1558参照)；
ｒ．ＥＩＡグレード・ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ(BioRad catalog no. 172-1011)；
ｓ．２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）溶液（１００ｍＭクエン酸（無水）、２５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ４．０）、０．５ｍｇ／ｍｌＡＢＴＳ（Sigma catalog no.A-1888)、溶液は、使用の準備ができるまで、暗所で４℃において貯蔵すべきである；
ｔ．Ｈ２Ｏ２（３０％溶液）(Fisher catalog no.H325)；
ｕ．ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２（１５ｍｌＡＢＴＳ溶液、２μｌＨ２Ｏ２）、使用の５分間前に調製して、室温に放置する；
ｖ．Ｈ２Ｏ中０．２Ｍ  ＨＣｌストック；
ｗ．ジメチルスルホキシド（１００％）(Sigma Catalog No.D-8418)；及び
ｙ．トリプシン−ＥＤＴＡ(Gibco BRL Catalog No.25200-049)。
【０３１３】
プロトコール．  アッセイの実施に下記プロトコールを用いた：
１．Ｃｏｒｎｉｎｇ９６穴ＥＬＩＳＡプレートに、０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）中のＣａｐｐｅｌ抗ウサギＩｇＧ抗体１．０μｇ／穴を被覆する。最終量を１５０μｌ／穴にする。プレートを４℃で一晩被覆する。４℃で貯蔵した場合に、プレートを２週間まで維持することができる。
２．適当な培養皿において増殖培地（２．０ｍＭＬ−グルタミン、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）中で細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で集密になるまで、増殖させる。
３．トリプシン処理によって細胞を回収し、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ２５８５０ポリスチレン９６穴丸底細胞プレートに、増殖培地２００μｌ中２５，０００細胞／穴で接種する。
４．細胞を３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも１日間増殖させる。
５．細胞をＤ−ＰＢＳ  １Ｘで洗浄する。
６．スターベーション培地（ＤＭＥＭ、２．０ｍＭｌ−グルタミン  ０．１％ＦＢＳ）２００μｌ／穴を加えて、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。
７．ポリプロピレン９６穴プレート中で、スターベーション培地を用いて、化合物／抽出物を１：２０に希釈する。対照穴に用いるためにジメチルスルホキシドを１：２０に希釈する。
８．スターベーション培地を９６穴細胞培養プレートから除去して、各穴に新鮮なスターベーション培地１６２μｌを加える。
９．細胞刺戟後の１：２００の最終希釈のために、１：２０希釈した化合物／抽出物希釈物（工程７から）１８μｌを各穴に加え、さらに、対照穴（＋／−ＶＥＧＦ）に１：２０ジメチルスルホキシド希釈物を加える
１０．プレートを反転させて、液体を除去することによって、ＥＬＩＳＡプレートから未結合抗体を除去する。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン（ｐＨ７．０）によって３回洗浄する。プレートをペーパータオル上で軽く叩いて、過剰な液体及び泡を除去する。
１１．プレートをＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン（ｐＨ７．０）１５０μｌ／穴でブロックする。プレートを、マイクロタイター・プレート・シェーカー上で振とうしながら、３０分間インキュベートする。
１２．プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。
１３．アフィニティ精製抗ＦＬＵ−１ポリクローナル・ウサギ抗血清０．５μｇ／穴を加える。ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン（ｐＨ７．０）によって、最終量を１５０μｌ／穴にする。プレートを振とうしながら３０分間インキュベートする。
１４．細胞にスターベーション培地１８０μｌを加え、１０．０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム２０μｌ／穴とＶＥＧＦ５００ｎｇ／ｍｌとによって、３７℃、５％ＣＯ２において８分間、細胞を刺激する（最終濃度は１．０ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ／穴となる）。負の対照穴には、スターベーション培地のみを加える。
１５．８分間後に、培地を細胞から取り出し、ＰＢＳ２００μｌ／穴で１回洗浄する。
１６．室温で５分間振とうしながら、ＨＮＴＧ１５０μｌ／穴中で細胞を溶解する。ＨＮＴＧ製剤はオルトバナジン酸ナトリウム、ピロリン酸ナトリウム及びＥＤＴＡを包含する。
１７．ＥＬＩＳＡプレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。
１８．細胞溶解物(cell lysate)を細胞プレートからＥＬＩＳＡプレートに移し、２時間振とうしながらインキュベートする。細胞溶解物を移すためには、穴をこすりながら、ピペットを上下させる。
１９．プレートを工程１０に記載したように３回洗浄する。
２０．ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン中のＵＢ４０  ０．０２μｇ／穴を加えて、ＥＬＩＳＡプレートをインキュベートする。最終量を１５０μｌ／穴にする。３０分間振とうしながら、インキュベートする。
２１．プレートを、工程１０に記載したように、３回洗浄する。
２２．ＴＢＳＷ＋０．５％エタノールアミン（ｐＨ７．０）中の１：１０，０００希釈ＥＩＡグレードヤギ抗マウスＩｇＧコンジュゲート・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを加えて、ＥＬＩＳＡプレートをインキュベートする。最終量を１５０μｌ／穴にする。３０分間振とうしながら、インキュベートする。
２３．プレートを工程１０に記載したように洗浄する。
２４．ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２  １００μｌを穴に加える。振とうしながら、１０分間インキュベートする。
２５．発色反応を停止させるために、最終０．１Ｍ  ＨＣｌにするように０．２Ｍ  ＨＣｌ  １００μｌを加える。室温において１分間振とうする。ゆっくりとした空気流で泡を除去し、ＥＬＩＳＡプレート・リーダーにおいて４１０ｎｍでＥＬＩＳＡプレートを読み取る。
【０３１４】
ＨＥＲ−２ＥＬＩＳＡ
アッセイ１：全細胞(whole cell)でのＥＧＦ受容体−ＨＥＲ２キメラ受容体アッセイ．全ＥＧＦＲ−ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＨＥＲ２キナーゼ活性を、以下に記載するように測定した。
【０３１５】
物質と試薬．  下記物質と試薬を用いて、アッセイを行なった：
ａ．ＥＧＦ：ストック濃度＝１６．５ＩＬＭ；ＥＧＦ２０１；TOYOBO,Co.,Ltd.日本。
ｂ．０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体）。
ｃ．抗ホスホチロシン抗体（抗pＴｙｒ）（ポリクローナル）(Fendley,et al.,上記文献）。
ｄ．検出抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート、TAGO,Inc.,Burlingame,Calif.
ｅ．ＴＢＳＴバッファー：
【０３１６】
【表１】
2005530781.tif 000026
【０３１７】
ｆ．ＨＮＴＧ  ５×ストック：
【０３１８】
【表２】
2005530781.tif 000027
【０３１９】
ｇ．ＡＢＴＳストック：
【０３２０】
【表３】
2005530781.tif 000028
【０３２１】
＊（２，２−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸））．使用まで溶液を暗所、４℃に保存する。
ｈ．ＥＤＴＡ  １００ｍＭ（ｐＨ７．０）、Ｎａ３ＶＯ４  ０．５Ｍ、及びＮａ４（Ｐ２Ｏ７）０．２Ｍのストック試薬。
方法．  下記プロトコールを用いた：
Ａ．ＥＬＩＳＡプレートをプレコート(precoat)する。
１．ＥＬＩＳＡプレート（Corning,96 well,Cat.#25805-96)に０５−１０１抗体をＰＢＳ中０．５ｇ／穴で、１００μｌ最終量／穴まで塗布して、４℃で一晩貯蔵する。被覆したプレートは、４℃で貯蔵する場合に、１０日間まで良好である。
２．使用当日、被覆バッファーを除去して、ブロッキング・バッファー（5%Carnation Instant Non-Fat Dry Milk in PBS)１００μｌと交換する。プレートを室温（約２３℃〜２５℃）において３０分間振とうしながら、インキュベートする。使用直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートをＴＢＳＴバッファーで４回洗浄する。
【０３２２】
Ｂ．細胞を接種する。
１．ＥＧＦＲ細胞外ドメイン及び細胞外ＨＥＲ２キナーゼを含有する、キメラ受容体を過度発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞系をこのアッセイに用いることができる。
２．実験のために８０〜９０％集密度を有する皿を選択する。細胞をトリプシン処理して、１０％ウシ胎仔血清を加えて、反応を停止させる。細胞をＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ  ＤＭＥＭ培地）中に懸濁させ、室温において５分間、１５００ｒｐｍで１回遠心分離する。
３．接種培地（ＤＭＥＭ、０．５％ウシ血清）中に細胞を再懸濁させて、トリパン・ブルーを用いて細胞をカウントする。９０％を超える生存率が許容される。９６穴マイクロタイター・プレートにおいて、細胞を１００μｌ／穴、１０，０００細胞／穴の密度でＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）に接種する。接種した細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で約４０時間インキュベートする。
【０３２３】
Ｃ．アッセイ方法
１．接種した細胞を、倒立顕微鏡を用いて、汚染に関してチェックする。薬物ストック（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈して、次に、最終薬物希釈が１：２００の及び最終ＤＭＳＯ濃度が１％とするため、５μｌをＴＢＳＴ穴に移す。対照穴には、ＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ２中、３７℃で２時間インキュベートする。
２．ＥＧＦリガンドを調製する：希釈ＥＧＦ（１：１２希釈）１０μｌを移したときに１００ｎＭの最終濃度が得られるように、ストックＥＧＦをＤＭＥＭ中で希釈する。
３．新鮮なＨＮＴＧを、１００μｌ／穴に充分に調製して；氷上に置く。
【０３２４】
【表４】
2005530781.tif 000029
【０３２５】
４．薬物と共に１２０分間インキュベートした後に、調製したＳＧＦリガンドを細胞に、１０μｌ／穴で、１００ｎＭの最終濃度まで加える。対照穴には、ＤＭＥＭのみを加える。室温で振とうしながら５分間インキュベートする。
５．薬物、ＥＧＦ及びＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄する。ＨＮＴＧ＊を細胞に、１００μｌ／穴で移す。氷上に５分間置く。その間に、他のＥＬＩＳＡプレートからブロッキング・バッファーを除去して、上述したようにＴＢＳＴで洗浄する。
６．マイクロピペッターに固定されたピペットチップで、プレートから細胞をこすり落として、ＨＮＴＧ＊溶解バッファー(lysis buffer)の吸引及び分配を繰り返して、細胞物質を均質化する。被覆し、ブロックし、洗浄したＥＬＩＳＡプレートに、溶解物(lysate)を移す。室温において１時間、振とうしながらインキュベートする。
７．溶解物を取り出し、ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗ｐＴｙｒ抗体をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／穴で移す。抗ｐＴｙｒ抗血清（ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で、室温において３０分間振とうしながらインキュベートする。
８．抗ｐＴｙｒ抗体を取り出し、ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡＧＯ抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／穴で移す。室温で振とうしながら３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）。
９．ＴＡＧＯ検出抗体を取り出し、ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液をＥＬＩＳＡプレートに、１００μｌ／穴で移す。室温で振とうしながら２０分間インキュベートする（ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液：ＡＢＴＳストック１０ｍｌ中３０％Ｈ２Ｏ２  １．０μｌ）。
１０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（任意）５０μｌを加えて、反応を停止させ、４１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。
１１．正対照から負対照を控除することによって、最大ホスホチロシン・シグナルを算出する。次に、抽出物含有穴のホスホチロシン含量の阻害％を、負対照の控除後に算出する。
【０３２６】
アッセイ２：ＨＥＲ２−ＢＴ４７４  ＥＬＩＳＡ．全細胞ＨＥＲ２活性を測定するために、第２アッセイを行なうことができる。このようなアッセイは下記のように行なうことができる：
物質と試薬．  下記物質と試薬を用いた：
ａ．ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ  ＨＢＴ２０）、高レベルのＨＥＲ２キナーゼを発現するヒト乳房腫瘍
ｂ．インキュベーター中で５％ＣＯ２、３７℃におけるＢＴ−４７４の増殖に用いるための、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ＧＭＳ−Ｇ（Ｇｉｂｃｏサプルメント）＋グルタミンを含む増殖培地
ｃ．モノクローナル抗ＨＥＲ２抗体
ｄ．Ｄ−ＰＢＳ：
【０３２７】
【表５】
2005530781.tif 000030
【０３２８】
ｅ．ブロッキング・バッファー：ＴＢＳＴプラス５％Ｍｉｌｋ(Carnation Instant Non-Fat Dry Milk)．
ｆ．ＴＢＳＴバッファー：
【０３２９】
【表６】
2005530781.tif 000031
【０３３０】
この場合、ＴＥＳストック溶液（１０×）を調製して、ＴｒｉｔｏｎＸ−１０を該バッファーに希釈中に加える。
ｇ．ＨＮＴＧバッファー（５×）：
【０３３１】
【表７】
2005530781.tif 000032
【０３３２】
ストック溶液（５×）を調製して、４０℃において保存する。
ｈ．ＥＤＴＡ−ＨＣｌ：５００×ストックとして、０．５Ｍ、ｐＨ７．０（１０Ｎ  ＨＣｌ）。
ｉ．Ｎａ３ＶＯ４：１００×ストックとしての０．５Ｍをアリコートとして−８０℃に保存する。
ｊ．Ｎａ４（Ｐ２Ｏ７）：１００×ストックとして、０．２Ｍ。
ｋ．ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン。
ｌ．ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）コンジュゲート（検出抗体）、Ｔａｇｏ(Cat. No. 4520; Lot No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, Calif.
ｍ．ＡＢＴＳ溶液：
【０３３３】
【表８】
2005530781.tif 000033
【０３３４】
この場合、ＡＢＴＳは２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）である。このアッセイのために、ＡＢＴＳ溶液は暗所で４℃に保存するべきである。該溶液は、緑色に変色したならば、廃棄するべきである。
ｎ．Ｈ２Ｏ２：３０％溶液を暗所、４℃に保存する。
方法．  下記工程の全ては、特に指定のない限り、室温及び無菌下で行なわれる。全てのＥＬＩＳＡプレート洗浄は、蒸留水で３回とＴＢＳＴで１回のすすぎ洗いによる。
【０３３５】
Ａ．細胞の接種
１．ＢＴ４７４細胞を組織培養皿(Corning 25020-100)中で、８０〜９０％集密度まで増殖させて、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ(0.25%,GIBCO)を用いて回収する。
２．該細胞を新鮮な培地中に再懸濁させ、９６穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、約２５，０００〜５０，０００細胞／穴で移す（１００μｌ／穴）。該細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートする。
【０３３６】
Ｂ．ＥＬＩＳＡプレートの塗布とブロッキング
１．ＥＬＩＳＡプレート(Corning 25806-96)を、ＰＢＳ１５０μｌ中０．５μｇ／穴の抗ＨＥＲ２抗体で、４℃において一晩被覆し、パラフィンでシールする。抗体塗布プレートは、４℃で貯蔵した場合に、２週間まで使用可能である。
２．使用当日に、塗布溶液を除去して、ブロッキング・バッファー２００μｌと交換する、プレートを振とうし、次に、細胞溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
【０３３７】
Ｃ．アッセイ方法
１．無血清状態下のＴＢＳＴ、薬物。薬物を加える前に、古い培地を無血清ＲＰＭＩ（９０μｌ／穴）と交換する。
２．薬物ストック（１００％ＤＭＳＯ中）をＲＰＭＩで１：１０に希釈し、この溶液１０μｌ／穴を細胞に移し、１％の最終薬物ＤＭＳＯ濃度を得る。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートする。
３．新鮮な細胞溶解バッファー（ＨＮＴＧ＊）の調製
【０３３８】
【表９】
2005530781.tif 000034
【０３３９】
４．薬物の２時間のプレインキュベーション後に、該プレートから全ての溶液を除去して、ＨＮＴＧ＊（１００μｌ／穴）を細胞に移し、１０分間振とうする。
５．１２−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物をＥＬＩＳＡプレートに移し、１時間振とうする。
６．溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗ｐＴｙｒ（ＴＢＳＴによって１：３，０００）１００μｌ／穴を加えて、３０分間振とうする。
７．抗ｐＴｙｒを取り出し、プレートを洗浄して、ヤギ抗ウサギＩｇＧ結合抗体（１：５，０００、ＴＢＳＴによる）を１００μｌ／穴で加えて、３０分間振とうする。
８．抗ウサギＩｇＧ抗体を取り出し、プレートを洗浄し、該プレートに新鮮なＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２（ＡＢＴＳ１０ｍｌにＨ２Ｏ２１．２μｌ）を１００  ｌ／穴で加えて、発色を開始させる、これは通常２０分間要する。
９．ＯＤ４１０ｎｍを測定する、Dynatec MR5000.
【０３４０】
ＰＤＧＦ−Ｒ  ＥＬＩＳＡ
全ての細胞培養培地、グルタミン及びウシ胎仔血清は、特に指定しない限り、Gibco Life Technologies (Grand Island, N.Y.)から購入した。全ての細胞は、９０〜９５％空気及び５〜１０％ＣＯ２の湿った雰囲気中、３７℃で増殖させた。全ての細胞系はルーチンに週２回継代培養し、Ｍｙｃｏｔｅｃｔ方法(Gibco)での測定によってマイコプラズマに関して陰性であった。
【０３４１】
ＥＬＩＳＡアッセイのために、細胞（Ｕ１２４２、Joseph Schlessinger, NYUから入手）を増殖培地（１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、１ｍＭ  ＮａＰｙｒ及び２ｍＭ  ＧＬＮを含むＭＥＭ）中で８０〜９０％集密度まで増殖させ、９６穴組織培養プレートの０．５％血清中に２５，０００〜３０，０００細胞／穴で接種した。０．５％血清含有培地中で一晩インキュベートした後に、細胞を無血清培地に移して、試験化合物によって５％ＣＯ２、３７℃インキュベーター中で２時間処理した。次に、細胞をリガンドによって５〜１０分間刺激し、次いで、ＨＮＴＧ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び２ｍＭ  ＮａＰｙｒ）によって溶解(lysis)した。細胞溶解物（０．５ｍｇ／穴、ＰＢＳ中）を、受容体特異性抗体を予め被覆し、ＴＢＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中５％Ｍｉｌｋで室温において３０分間ブロックしたＥＬＩＳＡプレートに移した。溶解物を振とうしながら室温において１時間インキュベートした。該プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、次に、ポリクローナル抗ホスホチロシン抗体と共に室温において３０分間インキュベートした。該プレートをＴＢＳＴで４回すすぎ洗いすることによって過剰な抗ホスホチロシン抗体を除去した。ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を該ＥＬＩＳＡプレートに室温において３０分間加えてから、次に、ＴＢＳＴでさらに４回すすぎ洗いした。ＡＢＴＳ（１００ｍＭクエン酸、２５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び０．５ｍｇ／ｍｌの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸））プラスＨ２Ｏ２（ＡＢＴＳ１０ｍｌに対して３０％Ｈ２Ｏ２１．２ｍｌ）を該ＥＬＩＳＡプレートに加えて、発色を開始させた。
ＡＢＴＳの添加後約１５〜３０分間に、６３０ｎｍの基準波長で、４１０ｎｍでの吸光度を記録した。
【０３４２】
ＩＧＦ−Ｉ  ＥＬＩＳＡ
下記プロトコールを用いて、ＩＧＦ−Ｉ受容体上のホスホチロシン・レベルを測定することができる該ホスホチロシン・レベルは、ＩＧＦ−Ｉ受容体キロシンキナーゼ活性を示す。
【０３４３】
物質と試薬．  下記物質と試薬を用いた：
ａ．このアッセイに用いた細胞系は、３Ｔ３／ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−Ｉ受容体を過度発現する細胞系である。
ｂ．ＮＩＨ３Ｔ３／ＩＧＦ−ＩＲをインキュベーター中で、５％ＣＯ２、３７℃において増殖させる。増殖培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活化）＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミンである。
ｃ．１７−６９と名付けられた抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を用いる。抗体はthe Enzymology Lab,SUGEN,Inc.によって精製される。
ｄ．Ｄ−ＰＢＳ：
【０３４４】
【表１０】
2005530781.tif 000035
【０３４５】
ｅ．ブロッキング・バッファー：ＴＢＳＴプラス５％Ｍｉｌｋ(Carnation Instant Non-Fat Dry Milk)。
ｆ．ＴＢＳＴバッファー：
【０３４６】
【表１１】
2005530781.tif 000036
【０３４７】
ＴＢＳ（１０×）ストック溶液を調製して、該バッファーに希釈中にＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加える。
ｇ．ＨＮＴＧバッファー：
【０３４８】
【表１２】
2005530781.tif 000037
【０３４９】
ストック溶液（５×）を調製して、４℃で保存する。
ｈ．ＥＤＴＡ／ＨＣｌ：１００×ストックとして０．５Ｍ、ｐＨ７．０（ＮａＯＨ）。
ｉ．Ｎａ３ＶＯ４：１００×ストックとして０．５Ｍ、アリコートを−８０℃で保存する。
ｊ．Ｎａ４Ｐ２Ｏ７：１００×ストックとして０．２Ｍ。
ｋ．インスリン様増殖因子−Ｉ、Promegsから(Cat# G5111)。
ｌ．ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン：Enzymology Lab.,SUGEN Inc.によって生成されたウサギ血清。
ｍ．ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＰＯＤコンジュゲート（検出抗体）、Tago (Cat. No.4520, Lot No. 1802):Tago,Inc.,Burlingame, CA.
ｎ．ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸））溶液：
【０３５０】
【表１３】
2005530781.tif 000038
【０３５１】
ＡＢＴＳ溶液は、暗所で、４℃において保存するべきである。該溶液は、緑色に変色したならば、廃棄するべきである。
ｏ．過酸化水素：３０％溶液を暗所で、４℃において保存する。
方法．  全ての下記工程は、特に指定しない限り、室温において行なう。全てのＥＬＩＳＡプレート洗浄は、プレートを水道水で３回すすぎ洗いして、次にＴＢＳＴすすぎ洗い１回で行なう。プレートをペーパータオルで軽く叩いて乾燥させる。
【０３５２】
Ａ．細胞の接種：
１．組織培養皿(Corning 25020-100)中で８０〜９０％集密度まで増殖させた細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ(0.25%,0.5ml/D-100,GIBCO)によって回収する。
２．該細胞を新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中に再懸濁させ、９６穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、２０，０００細胞／穴で移す（１００μｌ／穴）。１日間インキュベートしてから、培地を無血清培地（９０μｌ）に取り替えて、５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートする。
【０３５３】
Ｂ．ＥＬＩＳＡプレートの塗布とブロッキング：
１．ＥＬＩＳＡプレート(Corning 25806-96)を抗ＩＧＦ−Ｉ抗体で、ＰＢＳ１００μｌ中の０．５μｇ／穴で、少なくとも２時間被覆する。
２．塗布溶液を除去して、ブロッキング・バッファー１００μｌと交換し、３０分間振とうする。溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
【０３５４】
Ｃ．アッセイ方法
１．薬物を無血清状態下で試験する。
２．薬物ストック（１００％ＤＭＳＯ中）を、９６穴ポリプロピレン・プレート中で、ＤＭＥＭで１：１０に希釈し、この溶液１０μｌ／穴を細胞に移し、最終薬物希釈１：１００及び１．０％の最終ＤＭＳＯ濃度を得る。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で、２時間インキュベートする。
３．新鮮な細胞溶解バッファー（ＨＮＴＧ＊）の調製
【０３５５】
【表１４】
2005530781.tif 000039
【０３５６】
４．薬物の２時間インキュベーション後に、ＰＢＳ中２００ｎＭ  ＩＧＦ−Ｉリガンド１０μｌ／穴を細胞に移し（最終濃度＝２０ｎＭ），５％ＣＯ２、３７℃において１０分間インキュベートする。
５．培地を除去し、ＨＮＴＧ＊１００μｌ／穴を加えて、１０分間振とうする。細胞を顕微鏡下で観察して、細胞が充分に溶解しているかどうかを調べる。
６．１２−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物を抗体塗布ＥＬＩＳＡプレートに移して、１時間振とうする。
７．溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗ｐＴｙｒ（ＴＢＳＴによって１：３，０００）を１００μｌ／穴で移して、３０分間振とうする。
８．抗ｐＴｙｒを除去し、該プレートを洗浄して、Ｔａｇｏ（１：３，０００、ＴＢＳＴによる）を１００μｌ／穴で移して、３０分間振とうする。
９．検出抗体を除去して、該プレートを洗浄し、新鮮なＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２（ＡＢＴＳ１０ｍｌに対してＨ２Ｏ２１．２μｌ）を１００μｌ／穴でプレートに移して、発色を開始させる。
１０．Ｉｎｇｒｅｓに接続するＤｙｎａｔｅｃ  ＭＲ５０００において、ＯＤを測定する。
【０３５７】
ＥＧＦ受容体ＥＬＩＳＡ
全細胞中のＥＧＦ受容体キナーゼ活性（ＥＧＦＲ−ＮＩＨ３Ｔ３アッセイ）を以下に記載するように測定した：
物質と試薬．  下記物質と試薬を用いた。
ａ．ＥＧＦリガンド：ストック濃度＝１６．５μＭ；ＥＧＦ２０１、TOYOBO,Co.,Ltd.日本。
ｂ．０５−１０１（ＵＢＩ）（ＥＧＦＲ細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体）。
ｃ．抗ホスホチロシン抗体（抗ｐＴｙｒ）（ポリクローナル）。
ｄ．検出抗体：ヤギ抗ウサギＩｇＧホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・コンジュゲート、TACO, Inc., Burlingame,Calif.
ｅ．ＴＢＳＴバッファー：
【０３５８】
【表１５】
2005530781.tif 000040
【０３５９】
ｆ．ＨＮＴＧ５×ストック：
【０３６０】
【表１６】
2005530781.tif 000041
【０３６１】
ｇ．ＡＢＴＳストック：
【０３６２】
【表１７】
2005530781.tif 000042
【０３６３】
溶液を、使用するまで、暗所で４℃において保存する。
ｈ．ストック試薬：
ＥＤＴＡ  １００ｍＭ  ｐＨ７．０
Ｎａ３ＶＯ４  ０．５Ｍ
Ｎａ４（Ｐ２Ｏ７）  ０．２Ｍ
方法．  下記プロトコールを用いた：
Ａ．ＥＬＩＳＡプレートをプレコートする。
１．ＥＬＩＳＡプレート(Corning, 96 well, Cat.#25805-96)に０５−１０１抗体を、ＰＢＳ中０．５μｇ／穴、１５０μｌ最終量／穴で被覆して、４℃で一晩保存する。被覆したプレートは、４℃で保存した場合に、１０日間まで良好である。
２．使用当日に、被覆バッファーを除去して、ブロッキング・バッファー(PBS中5% Carnation Instant Non Fat Dry Milk)と交換する。該プレートを室温（約２３℃〜２５℃）において３０分間インキュベートした。使用する直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートをＴＢＳＴバッファーで４回洗浄する。
【０３６４】
Ｂ．細胞を接種する。
１．このアッセイのために、ＮＩＨ３Ｔ３／Ｃ７細胞(Honegger,et al.,Cell 51: 199-209,1987)を用いることができる。
２．実験のために、８０〜９０％集密度を有する皿を選択する。細胞をトリプシン処理して、１０％ＣＳ  ＤＭＥＭ培地を加えて、反応を停止する。細胞をＤＭＥＭ培地（１０％ＣＳ  ＤＭＥＭ培地）中に懸濁させて、１０００ｒｐｍで１回遠心分離し、室温において１回５分間遠心分離する。
３．細胞を接種培地（ＤＭＥＭ、０．５％ウシ血清）中に再懸濁させ、トリパンブルーを用いて細胞をカウントする。９０％を超える生存率が許容される。９６穴マイクロタイター・プレートにおいてＤＭＥＭ培地（０．５％ウシ血清）中に細胞を、１０，０００細胞／穴、１００μｌ／穴で接種する。接種した細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で約４０時間インキュベートする。
【０３６５】
Ｃ．アッセイ方法
１．接種した細胞を、倒立顕微鏡を用いて、汚染に関してチェックする。薬物ストック（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）をＤＭＥＭ培地中で１：１０に希釈して、次に、最終薬物希釈が１：２００及び最終ＤＭＳＯ濃度が１％とするため、５μｌを試験穴に移す。対照穴には、ＤＭＳＯのみを加える。５％ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベートする。
２．ＥＧＦリガンドを調製する：希釈ＥＧＦ（１：１２希釈）１０μｌを移したときに、２５ｎＭの最終濃度が得られるように、ストックＥＧＦをＤＭＥＭ中で希釈する。
３．１００μｌ／穴のために充分な、新鮮なＨＮＴＧ１０ｍｌを調製する、この場合、ＨＮＴＧ＊は、ＨＮＴＧストック（２．０ｍｌ）、ｍｉｌｌｉ−Ｑ・Ｈ２Ｏ（７．３ｍｌ）、ＥＤＴＡ，１００ｍＭ，ｐＨ７．０（０．５ｍｌ）、Ｎａ３ＶＯ４０．５Ｍ（０．１ｍｌ）及びＮａ４（Ｐ２Ｏ７），０．２Ｍ（０．１ｍｌ）を含む。
４．氷上に置く。
５．薬物と共に２時間インキュベートした後に、調製したＥＧＦリガンドを細胞に、１０μｌ／穴で、２５ｎＭの最終濃度まで加える。対照穴には、ＤＭＥＭのみを加える。室温で振とうしながら５分間インキュベートする。
６．薬物、ＥＧＦ及びＤＭＥＭを除去する。細胞をＰＢＳで２回洗浄する。ＨＮＴＧ＊を細胞に、１００μｌ／穴で移す。氷上に５分間置く。その間に、他のＥＬＩＳＡプレートからブロッキング・バッファーを除去して、上述したようにＴＢＳＴで洗浄する。
７．マイクロピペッターに固定されたピペットチップで、プレートから細胞をこすり落として、ＨＮＴＧ＊溶解バッファーの吸引及び分配を繰り返して、細胞物質を均質化する。被覆し、ブロックし、洗浄したＥＬＩＳＡプレートに、溶解物を移す。室温において１時間、振とうしながらインキュベートする。
８．溶解物を取り出し、ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈した抗ｐＴｙｒ抗体をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／穴で移す。抗ｐＴｙｒ抗血清（ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）の存在下で、室温において３０分間振とうしながらインキュベートする。
９．抗ｐＴｙｒ抗体を取り出し、ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに希釈したＴＡＧＯ  ３０抗ウサギＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／穴で移す。室温で振とうしながら３０分間インキュベートする（抗ウサギＩｇＧ抗体：ＴＢＳＴ中１：３０００希釈）。
１０．検出抗体を取り出し、ＴＢＳＴで４回洗浄する。新たに調製したＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液をＥＬＩＳＡプレートに、１００μｌ／穴で移す。室温で２０分間インキュベートする。ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液：ＡＢＴＳストック１０ｍｌ中３０％Ｈ２Ｏ２  １．２μｌ。
１１．Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（任意）５０μｌを加えて、反応を停止させ、４１０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定する。
１２．正対照から負対照値を控除することによって、最大ホスホチロシン・シグナルを算出する。次に、抽出物含有穴のホスホチロシン含量の阻害％を、負対照の控除後に算出する。
【０３６６】
細胞インスリン受容体ＥＬＩＳＡ
下記プロトコールを用いて、本発明の化合物がインスリン受容体チロシンキナーゼ活性を有するかどうかを判定した。
物質と試薬．  下記物質と試薬を用いて、インスリン受容体上のホスホチロシン・レベル（インスリン受容体チロシンキナーゼ活性を示す）を測定した。
１．好ましい細胞系は、インスリン受容体を過度発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞系（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１６５８）であった（Ｈ２５細胞）；
２．Ｈ２５細胞をインキュベーター中で５％ＣＯ２、３７℃において増殖させる。増殖培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（熱不活化）＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミンである；
３．ＥＬＩＳＡプレートの被覆のために、ＢＢＥと名付けられたモノクローナル抗ＩＲ抗体を用いる。該抗体は、Enzymology Lab,SUGEN,Inc.によって精製された；
４．Ｄ−ＰＢＳは下記を含む：
【０３６７】
【表１８】
2005530781.tif 000043
【０３６８】
５．ブロッキング・バッファー：ＴＢＳＴプラス５％Ｍｉｌｋ(Carnation Instant Non-Fat Dry Milk)；
６．ＴＢＳＴバッファーは、下記を含む：
【０３６９】
【表１９】
2005530781.tif 000044
【０３７０】
注：ＴＢＳ（１０×）ストック溶液を調製して、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を希釈中に該バッファーに加える；
７．ＨＮＴＧバッファー、下記を含む：
【０３７１】
【表２０】
2005530781.tif 000045
【０３７２】
注：ストック溶液（５×）を調製して、４℃で保存する。
８．ＥＤＴＡ  ＨＣｌ：１００×ストックとして、０．５Ｍ  ｐＨ７．０（ＮａＣｌ）；
９．Ｎａ３ＶＯ４：１００×ストックとして０．５Ｍ、アリコートを−８０℃で保存する；
１０．Ｎａ４Ｐ２Ｏ７：１００×ストックとして０．２Ｍ；
１１．ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ(Cat#18125039)からのインスリン；
１２．ポリクローナル抗血清抗ホスホチロシン：Enzymology Lab.,SUGEN Inc.によって生成されたウサギ血清；
１３．検出抗体、好ましくは、ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＰＯＤコンジュゲート、Ｔａｇｏ(Cat.No.4520:Lot No.1802):Tago,Inc.,Burlingame,CA;
１４．ＡＢＴＳ溶液、下記を含む：
【０３７３】
【表２１】
2005530781.tif 000046
【０３７４】
この場合、ＡＢＴＳは、２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）であり、暗所で、４℃において保存し、緑色に変色する場合には、廃棄する。
１５．過酸化水素：３０％溶液を暗所に、４０℃で保存する。
プロトコール．  全ての下記工程は、特に指定しない限り、室温において行なう。全てのＥＬＩＳＡプレート洗浄は、プレートを水道水で３回すすぎ洗いして、次にＴＢＳＴすすぎ洗い１回で行なう。使用前に、プレートをペーパータオルで軽く叩いて乾燥させる。
【０３７５】
Ａ．細胞の接種：
１．組織培養皿(１０ｃｍ、Corning 25020-100)中で８０〜９０％集密度まで増殖させて、細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ(0.25%,0.5ml/D-100,GIBCO)によって回収した。
２．該細胞を新鮮なＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン中に再懸濁させ、９６穴組織培養プレート(Corning 25806-96)に、２０，０００細胞／穴で移す（１００μｌ／穴）。次に、細胞を１日間インキュベートする。このようなインキュベーション後に、古い培地を０．０１％血清培地（９０μｌ）に取り替えて、細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートする。
【０３７６】
Ｂ．ＥＬＩＳＡプレートの被覆とブロッキング：
１．ＥＬＩＳＡプレート(Corning 25806-96)を抗ＩＲ抗体で、ＰＢＳ１００μｌ中の０．５μｇ／穴で、少なくとも２時間被覆する。
２．被覆溶液を除去して、ブロッキング・バッファー１００μｌと交換し、３０分間振とうする。溶解物を加える直前に、ブロッキング・バッファーを除去して、プレートを洗浄する。
【０３７７】
Ｃ．アッセイ方法
１．薬物を無血清状態下で試験する。
２．薬物ストック（１００％ＤＭＳＯ中）を、９６穴ポリプロピレン・プレート中で、ＤＭＥＭで１：１０に希釈し、この溶液１０μｌ／穴を細胞に移し、最終薬物希釈１：１００及び１．０％の最終ＤＭＳＯ濃度を得る。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で、２時間インキュベートする。
３．新鮮な細胞溶解バッファー（ＨＮＴＧ＊）の調製
【０３７８】
【表２２】
2005530781.tif 000047
【０３７９】
４．薬物の２時間インキュベーション後に、ＰＢＳ中１μＭインスリン１０μｌ／穴を細胞に移し（最終濃度＝１００ｎＭ），５％ＣＯ２、３７℃において１０分間インキュベートする。
５．培地を除去し、ＨＮＴＧ＊１００μｌ／穴を加えて、１０分間振とうする。細胞を顕微鏡下で観察して、細胞が充分に溶解しているかどうかを調べる。
６．１２−チャンネル・ピペットを用いて、細胞をプレートからこすり落とし、吸引と分配を繰り返して、該溶解物を均質化する。全ての溶解物を抗体被覆ＥＬＩＳＡプレートに移して、１時間振とうする。
７．溶解物を取り出し、プレートを洗浄し、抗pＴｙｒ（ＴＢＳＴによって１：３，０００）を１００μｌ／穴で移して、３０分間振とうする。
８．抗ｐＴｙｒを除去し、該プレートを洗浄して、Ｔａｇｏ（１：３，０００、ＴＢＳＴによる）を１００μｌ／穴で移して、３０分間振とうする。
９．検出抗体を除去して、該プレートを洗浄し、新鮮なＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２（ＡＢＴＳ１０ｍｌに対してＨ２Ｏ２１．２μｌ）を１００μｌ／穴でプレートに移して、発色を開始させる。
１０．Ｉｎｇｒｅｓに接続するＤｙｎａｔｅｃ  ＭＲ５０００において、ＯＤを測定する。
【０３８０】
ＥＬＩＳＡアッセイからの実験結果
上記プロトコールを用いた、本発明による種々な化合物に関する実験結果を表１に示す：
表１
【０３８１】
【表２３】
2005530781.tif 000048
【０３８２】
表１続き
【０３８３】
【表２４】
2005530781.tif 000049
【０３８４】
表１続き
【０３８５】
【表２５】
2005530781.tif 000050
【０３８６】
細胞増殖アッセイ
下記アッセイを行うことにより、特許請求の範囲の化合物と１つ以上のＲＴＫｓとの相互作用の結果として、細胞増殖に対する該化合物及び組み合せの効果を測定することができる。特に指定しない限り、下記アッセイを、任意の特定のＲＴＫに対する化合物の活性を測定するために一般的に適用することができる。以下に記載するアッセイが特定のＲＴＫに関する範囲で、当業者は、開示されたプロトコールを、第２のＲＴＫの活性の測定に用いるように適応させることができると考えられる。
【０３８７】
軟寒天アッセイ
軟寒天を用いて、細胞増殖に対する物質の効果又は該物質を含有する組み合わせの効果を測定することができる。他に記載しない限り、軟寒天アッセイは下記のように行なった：
物質と試薬．  下記物質と試薬を用いた：
ａ．３９℃に設定した水浴及び３７℃のもう１つの水浴。
ｂ．２×アッセイ培地は、以下の：２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭグルタミン・アミン及び２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ非必須アミノ酸（１００×ストックから１：５０）を補助した、２×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ５改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Gibco Cat. &num; CA400-4AN03)から構成される。
ｃ．１０％ＦＢＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、非必須アミノ酸（１００×ストックから１：１００）を補助した１×ＤＭＥＭから製造される１×アッセイ培地
ｄ．オートクレーブ・ボトル入りの１．６％ＳｅａＰｌａｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅ
ｅ．滅菌した３５ｍｍ  Ｃｏｒｎｉｎｇプレート(FMC Bioproducts Cat.#50102)。
ｆ．滅菌した５ｍｌガラスピペット（個別に包装）
ｇ．滅菌した１５ｍｌと５０ｍｌの円錐状遠心分離管
ｈ．ピペットと滅菌したチップ
ｉ．滅菌した微小遠心分離管
ｊ．Ｔ７５フラスコ中の細胞：ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ７７）
ｋ．０．２５％トリプシン溶液(Gibco #25200-015)
方法．  下記方法を用いて、軟寒天アッセイを行なった：
Ａ．基層(base layer)の製造方法
１．３７℃水浴中で全ての培地を加温する。
２．１×のアッセイ培地＋０．８％寒天を製造するために；２×アッセイ培地によって溶融寒天（３９℃に冷却）を１：２（ｖｏｌ：ｖｏｌ）希釈する。
３．寒天を含む培地の全てを、使用しないときには、３９℃水浴中で温かく保持する。
４．１×アッセイ培地＋０．８％寒天１ｍｌを皿に分配して、プレートを穏やかに撹拌して、均一な基層を形成する。気泡は避けるべきである。
５．基層を冷蔵して、凝固させる（約２０分間）。基層を冷蔵庫で一晩保存することができる。
【０３８８】
Ｂ．細胞の回収方法
１．インキュベーターから細胞系に当り１フラスコを取り出す；培地を吸い出し；ＰＢＳで１回洗浄して、吸い出し；トリプシン溶液３ｍｌを加える。
２．全ての細胞がフラスコから解離した後に、１×アッセイ培地３ｍｌを加えて、トリプシン活性を阻害する。細胞をピペットで上下させて、次に、該懸濁液を１５ｍｌ管中に移す。
３．Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて細胞濃度を、トリパンブルー排除によって生存率を測定する。
４．プレート当り３３００生存細胞を接種するために必要な適当量を取り出して、これを１×アッセイ培地で１．５ｍｌに希釈する。
【０３８９】
Ｃ．上部０．４％アガロース層の製造方法
１．ＴＢＳＴ化合物を所望の最終アッセイ濃度の２倍で加える；１×アッセイ培地１０％ＦＢＳ中の細胞懸濁液＋１．５ｍｌ；１×アッセイ培地＋０．８％アガロース＊＋１．５ｍｌ：合計＝３．０ｍｌの１×培地＋０．４％アガロース、３３００生存細胞／ｍｌ、ＴＢＳＴ化合物を含む及び含まない場合。
＊（上記基層方法について、１．６％寒天３０により、２×培地を１：２希釈によって製造）
２．アッセイ・ミックス１ｍｌを基層１ｍｌ上に加える(plate)。該３ｍｌ量から、２通りに加える。
３．該皿を１００％湿度の１０％ＣＯ２インキュベーター中で、２〜３週間インキュベートする。
４．６０ミクロン以上であるコロニーを、陽性(positive)と記録する。
【０３９０】
スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）増殖アッセイ
ＳＲＢアッセイを用いて、細胞増殖に対する物質の効果を測定することができる。該アッセイは下記のように行なう。
【０３９１】
アッセイ１：３Ｔ３／Ｅ／Ｈ＋ＴＧＦ−ａ（Ｔ）細胞増殖ＳＲＢアッセイ
物質：
９６穴平底滅菌プレート
９６穴丸底滅菌プレート
滅菌２５ｍｌ又は１００ｍｌレサバー
ピペット、マルチ−チャンネル・ピペットマン
滅菌ピペットチップ
滅菌１５ｍｌ管と５０ｍｌ管
試薬：
１％酢酸中０．４％ＳＲＢ
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基
１０％ＴＣＡ
１％酢酸
滅菌ＤＭＳＯ(Sigma)
ＤＭＳＯ中の化合物（１００ｍＭ以下のストック溶液）
細胞解離溶液(cell dissociation solution)(Sigma)中の２５％トリプシン−ＥＤＴＡ
細胞系と増殖培地：
３Ｔ３／Ｅ／Ｈ＋ＴＧＦ−ａ（Ｔ）（ＥＧＦ−Ｒ／ＨＥＲ２キメラ及びＴＧＦ−ａを発現するＮＩＨ３Ｔ３クローン７細胞、腫瘍由来自己分泌ループ細胞）
２％子ウシ血清／ＤＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン
プロトコール：
０日目：細胞プレーティング(plating):
アッセイのこの部分は、層流フード(laminar flow hood)中で行なう。
１．細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液１００μｌをイソトン１０ｍｌに移す。細胞をＣｏｕｌｔｅｒカウンターでカウントする。
２．細胞を増殖培地中で６０，０００細胞／ｍｌに希釈する。細胞１００μｌを９６穴平底プレートの各穴に移し、６０００細胞／穴を得る。
３．各化合物に対してプレートの半分（４列）と、各化合物濃度に対して４通りの穴を用い、培地対照に対して４穴のセット及びＤＭＳＯ対照に対して４穴のセットを用いる。
４．プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
５．１０％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において該プレートをインキュベートする。
【０３９２】
１日目：化合物の添加
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
１．９６穴丸底プレートにおいて、増殖培地１２５μｌをカラム３〜１１に加える。このプレートを用いて、化合物を、化合物につき４列を滴定する(titrate out)。
２．滅菌１５ｍｌ管において、１：２５０希釈のために合計２ｍｌ増殖培地に化合物８μｌを加えることによって、化合物の最高濃度の２×溶液を製造する。この希釈で、ＤＭＳＯ濃度は、２×溶液では０．４％であり、細胞上の１×溶液では０．２％である。化合物の出発濃度は通常１００μＭであるが、この濃度は、化合物の溶解性に依存して変化しうる。
３．２×出発化合物溶液を９６穴丸底プレートのカラム１２の４通りの穴に移す。カラム１２からカラム１１へ、カラム１１から１０へ、以下同様に１２５μｌを移すことによって、該プレートを右から左へ１：２連続希釈を行なう。化合物希釈物１００μｌを、９６穴平底プレートの対応する穴中の細胞上の１００μｌ培地上に移す。穴当りの合計量は２００μｌになるべきである。
４．ビヒクル対照として、増殖培地中０．４％ＤＭＳＯで、ＤＭＳＯの２×溶液を調製する。該ＤＭＳＯ溶液を適当な穴の細胞に加える。ＤＭＳＯの最終濃度は０．２％である。
５．培地対照穴のために、適当な穴の細胞に増殖培地１００μｌ／穴を加える。
６．該プレートをインキュベーターに戻し、４日間インキュベートする。
【０３９３】
５日目：アッセイの進行
アッセイのこの部分は、実験台(bench)上で行なう。
１．培地を吸い出す又は注ぎ出す。冷１０％ＴＣＡ２００μｌを各穴に加えて、細胞を固定する。プレートを４℃で、少なくとも６０分間インキュベートする。
２．ＴＣＡを捨て、穴を水で５回すすぎ洗いする。プレートをペーパータオル上で逆さにして乾燥させる。
３．細胞を０．４％ＳＲＢ１００μｌ／穴で１０分間染色する。
４．ＳＲＢを注ぎ出し、穴を１％酢酸で５回すすぎ洗いする。プレートをペーパータオル上で逆さにして、完全に乾燥させる。
５．染料を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基１００μｌ／穴によって、シェーカー上で５〜１０分間可溶化する。
６．Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡプレート・リーダー上で、５７０ｎｍにおいて、６３０ｎｍを基準にしてプレートを読み取る。
【０３９４】
アッセイ２：３Ｔ３／ＥＧＦ−Ｒ＋ＴＧＦ−ａ（Ｔ）細胞増殖ＳＲＢアッセイ
物質と試薬：アッセイ１に関すると同じである。
細胞系と増殖培地：
３Ｔ３／ＥＧＦ−Ｒ＋ＴＧＦ−ａ（Ｔ）（ＥＧＦ−Ｒ及びＴＧＦ−ａを発現するＮＩＨ３Ｔ３クローン７細胞、腫瘍由来自己分泌ループ細胞）、２％子ウシ血清／ＤＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン
プロトコール：
０日目：細胞プレーティング(plating):
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
１．細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液１００μｌをイソトン１０ｍｌに移す。細胞をＣｏｕｌｔｅｒカウンターでカウントする。
２．細胞を増殖培地中で６０，０００細胞／ｍｌに希釈する。細胞１００μｌを９６穴平底プレートの各穴に移し、６０００細胞／穴を得る。
３．各化合物に対してプレートの半分（４列）と、各化合物濃度に対して４通りの穴を用い、培地対照に対して４穴のセット及びＤＭＳＯ対照に対して４穴のセットを用いる。
４．プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
５．１０％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において該プレートをインキュベートする。
１日目：化合物の添加：アッセイ１に関すると同じ。
５日目：アッセイの進行：アッセイ１に関すると同じ。
【０３９５】
アッセイ３：３Ｔ３／ＰＤＧＦ−βＲ／ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｔ）細胞増殖ＳＲＢアッセイ
細胞系と増殖培地：
３Ｔ３／ＰＤＧＦ−βＲ／ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｔ）（ＰＤＧＦβ−受容体及びＰＤＧＦ−ＢＢを発現するＮＩＨ３Ｔ３クローン７細胞、胸腺欠損マウスから切除した腫瘍から）、２％子ウシ血清／ＤＭＥＭ＋２ｍＭグルタミン
プロトコール：
０日目：細胞プレーティング:
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
１．細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液２００μｌをイソトン１０ｍｌに移す。細胞をＣｏｕｌｔｅｒカウンターでカウントする。
２．細胞を増殖培地中で６０，０００細胞／ｍｌに希釈する。細胞１００μｌを９６穴平底プレートの各穴に移し、６０００細胞／穴を得る。
３．各化合物に対してプレートの半分（４列）を、各化合物濃度に対して４通りの穴を用い、培地対照に対して４穴のセット及びＤＭＳＯ対照に対して４穴のセットを用いる。
４．プレートを穏やかに振とうして、プレートに細胞を均一に付着させる。
５．１０％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において該プレートをインキュベートする。
１日目：化合物の添加：アッセイ１に関すると同じ。
５日目：アッセイの進行：アッセイ１に関すると同じ。
【０３９６】
アッセイ４：ヒト平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖ＳＲＢアッセイ
物質と試薬：アッセイ１に関すると同じである。
細胞系と増殖培地：
ヒト大動脈平滑筋細胞(Clonetics)
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ’ｓ  Ｂｕｌｌｅｔキット：平滑筋基礎培地（ＳｍＢＭ）、これは、ウシ胎児血清（５％）、ｈＦＧＦ（２ｎｇ／ｍｌ）、ｈＥＧＦ（０．１ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５．０ｎｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びアンホテリシンＢ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する改変ＭＣＤＢ１３１である。
プロトコール：
０日目：細胞プレーティング:
アッセイのこの部分は、層流フード中で行なう。
１．細胞を通常のようにトリプシン処理する。細胞懸濁液２００μｌをイソトン１０ｍｌに移す。細胞をＣｏｕｌｔｅｒカウンターでカウントする。
２．細胞を増殖培地中で２０，０００細胞／ｍｌに希釈する。細胞１００μｌを９６穴平底プレートの各穴に移し、２０００細胞／穴を得る。
３．各化合物に対してプレートの半分（４列）を、各化合物濃度に対して４通りの穴を用い、培地対照に対して４穴のセット及びＤＭＳＯ対照に対して４穴のセットを用いる。
４．プレートを穏やかに振とうして、細胞を均一に付着させる。
５．１０％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃において該プレートをインキュベートする。
１日目：化合物の添加：アッセイ１に関すると同じ。
５日目：アッセイの進行：アッセイ１に関すると同じ。
【０３９７】
３Ｔ３細胞増殖アッセイ
アッセイ１：ＰＤＧＦ誘導ＢｒｄＵ組み込みアッセイ(PDGF-induced BrdU Incrporation Assay)
物質と試薬：
（１）ＰＤＧＦ：ヒトＰＤＧＦ  Ｂ／Ｂ；1276-956、Boehringer Mannheim, Germany．
（２）ＢｒｄＵ標識試薬：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍＭ、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（使用できる状態）、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（４）Ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（６）ＰＢＳ洗浄溶液：１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４、社内で製造
（７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）：フラクションＶ粉末；A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール：
（１）３Ｔ３改変細胞系(3T3engineered cell line)：３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７．
（２）細胞を９６穴プレートにおいて、ＤＭＥＭ、１０％ＣＳ、２ｍＭＧｌｎ中に８０００細胞／穴で接種する。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートする。
（３）２４時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含む０％ＣＳ  ＤＭＥＭ）中で２４時間血清欠如させる(serum starved)。
（４）３日目に、リガンド（ＰＤＧＦ＝３．８ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で調製）と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加え；正対照穴には、リガンド（ＰＤＧＦ）を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は９６穴プレートにおいてリガンドと共に無血清ＤＭＥＭ中に用意し、７つの試験濃度に連続希釈する。
（５）リガンド活性化の２０時間後に、希釈したＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ、０．１％ＢＳＡ中で１：１００）を加えて、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）と共に１．５時間インキュベートする。
（６）標識試薬と共にインキュベートした後に、デカンティング(decanting)と逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって、培地を除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において４５分間インキュベートする。
（７）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え（ＰＢＳ中５％乾燥乳、２００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において３０分間インキュベートする。
（８）該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をＰＢＳによって１回洗浄する。ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で１：１００希釈、）を加え（１００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において９０分間インキュベートする。
（９）デカンティングと、穴をＰＢＳによって５回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
（１０）ＴＭＢ基質溶液を加えて（１００μｌ／穴）、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、２０分間インキュベートする。
（１１）Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を４１０ｎｍにおいて測定する（基準波長としての４９０ｎｍにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで）。
【０３９８】
アッセイ２：ＥＧＦ誘導ＢｒｄＵ組み込みアッセイ(EGF-induced BrdU Incorporation Assay)
物質と試薬：
（１）ＥＧＦ：マウスＥＧＦ、２０１；Toyobo,Co.,Ltd.日本．
（２）ＢｒｄＵ標識試薬：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍＭ、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（使用できる状態）、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（４）Ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（６）ＰＢＳ洗浄溶液：１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４、工場内で製造
（７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）：フラクションＶ粉末；A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール：
（１）３Ｔ３改変細胞系：３Ｔ３／ＥＧＦＲｃ７．
（２）細胞を９６穴プレートにおいて、ＤＭＥＭ中の１０％ＣＳ、２ｍＭ  Ｇｌｎに８０００細胞／穴で接種する。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートする。
（３）２４時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含む０％ＣＳ  ＤＭＥＭ）中で２４時間血清欠如させる。
（４）３日目に、リガンド（ＥＧＦ＝２ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で調製）と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加え；正対照穴には、リガンド（ＥＧＦ）を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は９６穴プレートにおいてリガンドと共に無血清ＤＭＥＭ中に用意し、７つの試験濃度に連続希釈する。
（５）リガンド活性化の２０時間後に、希釈したＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ、０．１％ＢＳＡ中で１：１００）を加えて、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）と共に１．５時間インキュベートする。
（６）標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において４５分間インキュベートする。
（７）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え（ＰＢＳ中５％乾燥乳、２００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において３０分間インキュベートする。
（８）該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をＰＢＳによって１回洗浄する。ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で１：１００希釈、）を加え（１００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において９０分間インキュベートする。
（９）デカンティングと、穴をＰＢＳによって５回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
（１０）ＴＭＢ基質溶液を加えて（１００μｌ／穴）、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、２０分間インキュベートする。
（１１）Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を４１０ｎｍにおいて測定する（基準波長としての４９０ｎｍにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで）。
【０３９９】
アッセイ３：ＥＧＦ誘導Ｈｅｒ２由来ＢｒｄＵ組み込み(EGF-induced Her2-driven BrdU Incorporation)
物質と試薬：
（１）ＥＧＦ：マウスＥＧＦ、２０１；Toyobo,Co.,Ltd.日本．
（２）ＢｒｄＵ標識試薬：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍＭ、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（使用できる状態）、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（４）Ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（６）ＰＢＳ洗浄溶液：１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４、工場内で製造
（７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）：フラクションＶ粉末；A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール：
（１）３Ｔ３改変細胞系：
３Ｔ３／ＥＧＦｒ／Ｈｅｒ２／ＥＧＦｒ（Ｈｅｒ２キナーゼ・ドメインを有するＥＧＦｒ）．
（２）細胞を９６穴プレートにおいて、ＤＭＥＭ、１０％ＣＳ、２ｍＭ  Ｇｌｎに８０００細胞／穴で接種する。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートする。
（３）２４時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含む０％ＣＳ  ＤＭＥＭ）中で２４時間血清欠如させる。
（４）３日目に、リガンド（ＥＧＦ＝２ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で調製）と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加え；正対照穴には、リガンド（ＥＧＦ）を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は９６穴プレートにおいてリガンドと共に無血清ＤＭＥＭ中に用意し、７つの試験濃度に連続希釈する。
（５）リガンド活性化の２０時間後に、希釈したＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ、０．１％ＢＳＡ中で１：１００）を加えて、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）と共に１．５時間インキュベートする。
（６）標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において４５分間インキュベートする。
（７）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え（ＰＢＳ中５％乾燥乳、２００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において３０分間インキュベートする。
（８）該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をＰＢＳによって１回洗浄する。ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で１：１００希釈、）を加え（１００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において９０分間インキュベートする。
（９）デカンティングと、穴をＰＢＳによって５回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
（１０）ＴＭＢ基質溶液を加えて（１００μｌ／穴）、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、２０分間インキュベートする。
（１１）Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を４１０ｎｍにおいて測定する（基準波長としての４９０ｎｍにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで）。
【０４００】
アッセイ４：ＩＧＦ１誘導ＢｒｄＵ組み込みアッセイ(IGF1-induced BrdU Incorporation Assay)
物質と試薬：
（１）ＩＧＦ１リガンド：ヒト、組換え体；G511,Promega Corp,USA.
（２）ＢｒｄＵ標識試薬：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍＭ、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（使用できる状態）、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（４）Ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（６）ＰＢＳ洗浄溶液：１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４、工場内で製造
（７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）：フラクションＶ粉末；A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール：
（１）３Ｔ３改変細胞系：３Ｔ３／ＩＧＦ１ｒ
（２）細胞を９６穴プレートにおいて、ＤＭＥＭ、１０％ＣＳ、２ｍＭ  Ｇｌｎに８０００細胞／穴で接種する。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートする。
（３）２４時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含む０％ＣＳ  ＤＭＥＭ）中で２４時間血清欠如させる。
（４）３日目に、リガンド（ＩＧＦ１＝３．３ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で調製）と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加え；正対照穴には、リガンド（ＩＧＦ１）を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は９６穴プレートにおいてリガンドと共に無血清ＤＭＥＭ中に用意し、７つの試験濃度に連続希釈する。
（５）リガンド活性化の１６時間後に、希釈したＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ、０．１％ＢＳＡ中で１：１００）を加えて、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０ＡＭ）と共に１．５時間インキュベートする。
（６）標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において４５分間インキュベートする。
（７）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え（ＰＢＳ中５％乾燥乳、２００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において３０分間インキュベートする。
（８）該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をＰＢＳによって１回洗浄する。ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で１：１００希釈、）を加え（１００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において９０分間インキュベートする。
（９）デカンティングと、穴をＰＢＳによって５回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
（１０）ＴＭＢ基質溶液を加えて（１００μｌ／穴）、プレート・シェーカー上で室温において、発色が測光的検出のために充分になるまで、２０分間インキュベートする。
（１１）Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を４１０ｎｍにおいて測定する（基準波長としての４９０ｎｍにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで）。
【０４０１】
アッセイ５：インスリン誘導ＢｒｄＵ組み込みアッセイ(Insulin-induced BrdU Incorporation Assay)
物質と試薬：
（１）インスリン：結晶、ウシ、亜鉛；13007,Gibco BRL,USA.
（２）ＢｒｄＵ標識試薬：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０ｍＭ、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（３）ＦｉｘＤｅｎａｔ：固定溶液（使用できる状態）、Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany．
（４）Ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ：ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスモノクローナル抗体、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（５）ＴＭＢ基質溶液：テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、使用できる状態、Cat. No. 1 647 229,Boehringer Mannheim, Germany.
（６）ＰＢＳ洗浄溶液：１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４、社内で製造
（７）アルブミン、ウシ（ＢＳＡ）：フラクションＶ粉末；A-8551,Sigma Chemical Co.,USA.
プロトコール：
（１）３Ｔ３改変細胞系：Ｈ２５
（２）細胞を９６穴プレートにおいて、ＤＭＥＭ、１０％ＣＳ、２ｍＭ  Ｇｌｎに８０００細胞／穴で接種する。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートする。
（３）２４時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、次に、無血清培地（０．１％ＢＳＡを含む０％ＣＳ  ＤＭＥＭ）中で２４時間血清欠如させる。
（４）３日目に、リガンド（インスリン＝１０ｎＭ、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ中で調製）と試験化合物とを細胞に同時に加える。負対照穴には、０．１％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭのみを加え；正対照穴には、リガンド（インスリン）を加えるが、試験化合物は加えない。試験化合物は９６穴プレートにおいてリガンドと共に無血清ＤＭＥＭ中に用意し、７つの試験濃度に連続希釈する。
（５）リガンド活性化の１６時間後に、希釈したＢｒｄＵ標識試薬（ＤＭＥＭ、０．１％ＢＳＡ中で１：１００）を加えて、細胞をＢｒｄＵ（最終濃度＝１０μＭ）と共に１．５時間インキュベートする。
（６）標識試薬と共にインキュベートした後に、培地を、デカンティングと、逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって除去する。ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を加え（５０μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において４５分間インキュベートする。
（７）ＦｉｘＤｅｎａｔ溶液を、デカンティングと逆さにしたプレートをペーパータオル上で軽く叩くことによって完全に除去する。ブロッキング溶液として、ミルクを加え（ＰＢＳ中５％乾燥乳、２００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において３０分間インキュベートする。
（８）該ブロッキング溶液をデカンティングによって除去し、穴をＰＢＳによって１回洗浄する。ａｎｔｉ−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ溶液（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ中で１：１００希釈、）を加え（１００μｌ／穴）、プレートをプレート・シェーカー上で室温において９０分間インキュベートする。
（９）デカンティングと、穴をＰＢＳによって５回すすぎ洗いすることによって、抗体コンジュゲートを完全に除去して、プレートをペーパータオル上で逆さにして、軽く叩くことによって乾燥させる。
（１０）ＴＭＢ基質溶液を加えて（１００μｌ／穴）、発色が測光的検出のために充分になるまで、プレート・シェーカー上で室温において２０分間インキュベートする。
（１１）Ｄｙｎａｔｅｃｈ  ＥＬＩＳＡプレート・リーダー上で、サンプルの吸光度を４１０ｎｍにおいて測定する（基準波長としての４９０ｎｍにおいてフィルター読み取りする、“二波長”モードで）。
【０４０２】
ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃアッセイ
下記プロトコールをさらに用いて、組成物の活性を測定することができる：
０日目：
１．ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（ヒト臍静脈内皮細胞(American Type Culture Collection ; catalogue no. 1730 CRL)）。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓリン酸塩緩衝化生理食塩水(D-PBS;Gibco BRLから入手; catalogue no. 14190-029)によって２回、組織培養フラスコの約１ｍｌ／１０ｃｍ２で洗浄する。非酵素性細胞解離溶液(Sigma Chemical Company; catalogue no.C-1544)中の０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡによってトリプシン処理する。０．０５％トリプシンは、０．２５％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ(Gibco; catalogue no. 25200- 049)を細胞解離溶液中で希釈することによって製造した。組織培養フラスコの約１ｍｌ／２５〜３０ｃｍ２で、３７℃において約５分間トリプシン処理する。細胞が該フラスコから剥離した後に、等量のアッセイ培地を加えて、５０ｍｌ滅菌遠心分離管(Fisher Scientific;catalogue no.05-539-6)に移す。
２．アッセイ培地を加えることによって、細胞を５０ｍｌ滅菌遠心分離管中のアッセイ培地約３５ｍｌによって洗浄し、上清を吸引し、訳２００Ｘｇで１０分間遠心分離し、Ｄ−ＰＢＳ３５ｍｌによって再懸濁させる。Ｄ−ＰＢＳによって、洗浄をさらに２回繰り返し、細胞を組織培養フラスコの約１ｍｌアッセイ培地／１５ｃｍ２中に再懸濁させる。アッセイ培地は、Ｆ１２Ｋ培地(Gibco BRL; catalogue no. 21127-014)＋０．５％熱不活化ウシ胎仔血清から成る。細胞をＣｏｕｌｔｅｒカウンター（RTM. v Coulter Electronics,Inc.)によってカウントして、アッセイ培地を該細胞に加えて、０．８〜１．０×１０５細胞／ｍｌの濃度を得る。
３．９６穴平底プレートに１００μｌ／穴で、又は０．８〜１．０×１０４細胞／穴で加える。３７℃、５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートする。
【０４０３】
１日目：
１．それぞれの９６穴プレートで２倍薬物滴定(two-fold drug titrations)を一般に５０μＭから０μＭまで構成する。上記０日目の工程２に記載したのと同じアッセイ培地を用いる。薬物９０μｌ／穴を２００μＭ（４×最終穴濃度）で、特定プレートカラムの先端穴(top well)に加えることによって、滴定を行なう。ストック薬物濃度は通常ＤＭＳＯ中２０ｍＭであるので、２００μＭ薬物濃度は２％ＤＭＳＯを含有する。それ故、薬物は希釈するけれどもＤＭＳＯ濃度は一定に維持するために、アッセイ培地（Ｆ１２Ｋ＋０．５％ウシ胎仔血清）中２％ＤＭＳＯに構成した希釈剤を、薬物滴定の希釈剤として用いる。この希釈剤を該カラム中の残りの穴に６０μｌ／穴で加える。該カラムの該先端穴中の２００μＭ薬物希釈物(drug dilution)１２０μｌから６０μｌを取り出し、該カラムの第２穴中の６０μｌと混合する。この穴から６０μｌを取り出し、該カラムの第３穴中の６０μｌと混合し、２倍滴定が完成するまで、以下同様に行なう。最後の穴の隣接穴を混合する場合に、この穴中の１２０μｌのうちの６０μｌを取り出し、これを捨てる。ＤＭＳＯ／培地希釈剤６０μｌを含む最後の穴は、薬物を含有しない対照として残す。それぞれ（１）ＶＥＧＦ(Pepro TechInc., catalogue no. 100-200から入手）、（２）内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）（酸性線維芽細胞増殖因子、又はＦＧＦとしても知られる）（Boehringer Mannheim Biochemica, catalogue no. 1439 600から入手)及びアッセイ培地対照のための３通りの穴に対して充分な、滴定済み（titrated）薬物の９カラムを作製する。ＥＣＧＦは、ナトリウム・ヘパリンを含む製剤(a preparation with sodium heparin)となる。
【０４０４】
２．０日目そして２０(from day 0 and 20)からのＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞を０．８〜１．０×１０４細胞／１００μｌ／穴で含有する９６穴アッセイ・プレートに、薬物希釈物５０μｌ／穴を移して、３７℃、５％ＣＯ２において約２時間インキュベートする。
３．８０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＣＧＦ又は培地対照を５０μｌ／穴で各薬物状態に加える。薬物と同様に、増殖因子濃度は４×目的最終濃度である。０日目工程２からのアッセイ培地を用いて、増殖因子の該濃度を作製する。３７℃、５％ＣＯ２において約２４時間インキュベートする。各穴は、５０μｌの薬物希釈物、５０μｌの増殖因子又は培地、及び１００μｌの細胞、全体で＝２００μｌ／穴を有することになる。したがって、４×濃度の薬物及び増殖因子は、総てのものを穴に加えると、１×になる。
【０４０５】
２日目：
１．３Ｈ−チミジン(Amersham; catalogue no. TRK-686)を１μＣｉ／穴（ＲＰＭＩ培地＋１０％熱不活化ウシ胎仔血清中に構成した１００μＣｉ／ｍｌ溶液を１０μｌ／穴）で加えて、３７℃、５％ＣＯ２において約２４時間インキュベートする。
【０４０６】
注：本出願人らが３Ｈ−チミジンを用いる他の出願の総てがＲＰＭＩ中で行なわれた実験を含むので、３Ｈ−チミジンをＲＰＭＩ培地中で構成する。この工程における培地の相違は恐らく重要ではない。ＲＰＭＩは、Gibco BRL, catalogue no.11875-051から入手した。
【０４０７】
３日目：
１．プレートを−２０℃において一晩冷凍する。
４日目：
１．プレートを解凍して、９６穴プレート回収装置(harvester)(Tomtec Harvester 96. RTM.)によってフィルターマット(Wallac ; catalogue no. 1205-401)上に回収して；Wallac BetaplateTM液体シンチレーション・カウンター上のカウントを読み取る。
【０４０８】
ＰＤＧＦ−Ｒ細胞アッセイ
ＰＤＧＦ細胞キナーゼ・アッセイを下記のように行なった：０．２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％Ｖ／Ｖグリセロール、０．０４％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭバナジン酸ナトリウム及び２ｍＭピロリン酸Ｎａ＋中で細胞を溶解する；次に、細胞溶解物を、抗ＰＤＧＦ受容体抗体(Genzyme)を被覆したＥＬＩＳＡプレートに加える；該溶解物を添加する前に、ＰＢＳ１５０μｌ中の抗体０．５μｇ／穴で、ＥＬＩＳＡプレートを４℃において１８時間被覆する；該溶解物を該被覆プレートにおいて１時間インキュベートしてから、ＴＢＳＴ（３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）中で４回洗浄し；抗ホスホチロシン抗体（ＰＢＳ中１００μｌ）を加えて、該混合物を室温において３０分間インキュベートする；次に、穴をＴＢＳＴ中で４回洗浄し、ＰＯＤ（ＴＡＧＯ）にコンジュゲートした第２抗体を各穴に加え、処理済み穴を室温において３０分間インキュベートする；次に、穴をＴＢＳＴ中で４回洗浄して、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２溶液を各穴に加え、該穴を２分間インキュベートする；次に、吸光度を４１０ｎｍにおいて測定する。
【０４０９】
細胞増殖アッセイの実験結果
上記アッセイから得られた、種々な化合物の結果を、以下の表に記載する：
表２．
【０４１０】
【表２６】
2005530781.tif 000051
【０４１１】
表２続き
【０４１２】
【表２７】
2005530781.tif 000052
【０４１３】
表２続き
【０４１４】
【表２８】
2005530781.tif 000053
【０４１５】
表２続き
【０４１６】
【表２９】
2005530781.tif 000054
【０４１７】
表３
【０４１８】
【表３０】
2005530781.tif 000055
【０４１９】
表３続き
【０４２０】
【表３１】
2005530781.tif 000056
【０４２１】
表４
【０４２２】
【表３２】
2005530781.tif 000057
【０４２３】
３Ｔ３／Ｅ／Ｈ＋ＴＧＦ−α（Ｔ）：ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２キメラとＴＧＦ−αを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞、腫瘍由来３Ｔ３／ＥＧＦＲ＋ＴＧＦ−α（Ｔ）：ＥＧＦＲとＴＧＦ−αを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞、腫瘍由来３Ｔ３／ＰＤＧＦＲ＋ＰＤＧＦ（Ｔ）：ＰＤＧＦ−βＲとＰＤＧＦ−ββを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞、腫瘍由来ＳＭＣ：Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓからのヒト平滑筋細胞
【０４２４】
細胞毒性の測定
治療用化合物は、細胞傷害性効果の発揮におけるよりも、受容体チロシンキナーゼ活性の阻害において大きい効力を有するべきである。化合物の有効性及び細胞毒性の指標(measure)は、治療指数：ＩＣ５０／ＬＤ５０の算出によって得ることができる。ＩＣ５０、５０％阻害を達成するために必要な用量は、例えば、本明細書に記載するような標準手法を用いて測定することができる。ＬＤ５０、５０％毒性を生じる用量も、標準手法(Mossman, 1983,J.Immunol.Methods,65:55-63)によって、放出されるＬＤＨ量の測定(Korzeniewski and Callewaert,1983,J.Immunol.Methods 64:313; Decker and Lohmann-Matthes,1988,J. Immunol.Methods 115:61)によって、又は動物モデルにおける致死量の測定によって測定することができる。大きい治療指数を有する化合物が好ましい。治療指数は、２より大、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも５０であるべきである。
【０４２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデル、異種移植動物モデル
胸腺欠損マウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ，ｎｕ／ｎｕ）において異種移植片として増殖するヒト腫瘍の能力は、ヒト腫瘍の治療法に対する生物学的反応を研究するための有用なｉｎ  ｖｉｖｏモデルを与える。胸腺欠損マウスへのヒト腫瘍の異物移植の最初の成功(Rygaard and Povisen,1969 Acta Pathol.Microbial Scand.77:758-760)以来、多くの種々なヒト腫瘍細胞系（例えば、乳房、肺、尿生殖器、胃腸、頭頚部、グリア芽細胞腫、骨、及び悪性黒色腫）が、ヌードマウスに移植されて、首尾よく増殖している。ＭＣＦ−７、ＺＲ７５−Ｉ及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を包含するヒト乳房腫瘍細胞系は、ヌードマウスにおける皮下異種移植片として確立されている(Warri et al.,1991,Int.J.Cancer 49: 616-623; Ozzello and Sordat,1980,Eur.J.Cancer 16:553-559; Osborne et al.,1985, Cancer Res.45:584-590; Seibert et al.,1983,Cancer Res. 43:2223-2239)。
【０４２６】
アッセイ１：ＨＥＲ２／異種移植動物モデル
ＨＥＲ２発現腫瘍に対する抗腫瘍薬候補の効果を研究するためには、該腫瘍細胞が、補充エストロゲンの不存在下で、増殖することができるべきである。多くの乳房細胞系は、ヌードマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ増殖に関して、エストロゲンに依存している（Osborne et al.,上記文献）、しかし、外因性エストロゲンはヌードマウスにおけるＨＥＲ２発現を抑制する(Warri et al.,上記文献、Dati et al.,1990,Oncogene 5:1001-1006).
例えば、エストロゲンの存在下では、ＭＣＦ−７、ＺＲ−７５−１及びＴ４７Ｄ細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで良好に増殖するが、非常に低レベルのＨＥＲ２を発現する(Warri et al.,上記文献、Dati et al.,上記文献）。
【０４２７】
下記種類の異種移植プロトコールを用いることができる：
（１）生後５〜６週間の雌Ｂａｌｂｆｃ  ｎｕ／ｎｕ胸腺欠損マウスの後脇腹に腫瘍細胞を移植する（皮下）；
（２）抗腫瘍化合物を投与する；
（３）腫瘍容積の測定によって腫瘍成長を測定する。
【０４２８】
Ｗｅｓｔｅｒｎ及び免疫組織化学的分析によって、例えばＨＥＲ２、ＥＧＦ又はＰＤＧＦのような、受容体の存在に関して、腫瘍をさらに分析することができる。当該技術分野に知られた手法を用いて、例えば、種々な治療計画の使用によって、当業者は上記方法を変えることができる。
【０４２９】
アッセイ２：ＦＬＫ−１／異種移植片モデル
ＳＣ異種移植片として確立されている、卵巣、黒色腫、前立腺、肺及び乳房腫瘍細胞系を阻害する、本発明の化合物の能力を試験した。これらの研究は、１〜７５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内の用量を用いて行なった。
【０４３０】
物質と方法．  腫瘍細胞を、指定系統のマウスの皮下に移植した。特に指定しない限り、移植後１日目に処置を開始した（例えば、Ａ３７５黒色腫細胞に関するＳＣＩＤマウスの治療は、９日目に開始した）。８〜１６匹のマウスが各試験グループを構成した。
【０４３１】
特異性：
動物．  雌胸腺欠損マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ｎｕ／ｎｕ）、ＢＡＬＢ／ｃマウス、Ｗｉｓｔａｒラット及びＦｉｓｈｅｒ３４４ラットは、Simonsen Laboratories (Gilroy,Calif.)から入手した。雌ＡＩマウスは、Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me.)から入手した。ＤＡラットは、B & K Universal,Inc.(Fremont,Calif.)から入手した。胸腺欠損Ｒ／Ｎｕラット、ＤＢＡ／２Ｎマウス及びＢＡＬＢ／ｃマウスは、Harlan Sprague Dawley (Indianapolis,Ind.)から入手した。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Taconic (Germantown, N.Y.)から入手した。総ての動物は、Ａｌｐｈａ−ｄｒｉ床敷きを有するＭｉｃｒｏ−ｉｓｏｌａｔｏｒケージで、クリーンルームの条件下に維持した。動物は、無菌のげっ歯類飼料と水を任意に摂取した。
総ての治療は、NIH Guide for the Care and Use Of Laboratory Animalsに従って行なった。
【０４３２】
皮下異種移植片モデル．  細胞系は、適当な培地中で上述したように増殖させた。細胞を集密又はほぼ集密で０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡによって回収し、４５０ｘｇにおいて１０分間ペレット化した。ペレットを滅菌したＰＢＳ又は培地（ＦＢＳ含まず）中に図の凡例(Figure legends)に示した適当な濃度に再懸濁し、該細胞をマウスの後脇腹中に移植した。腫瘍成長を、ベニール・ノギス(venier caliper)を用いて、３〜６週間にわたって測定し、特に指定しない限り、腫瘍容積を長さ×幅×高さの積として計算した。Ｐ値は、Ｓｔｕｄｅｎｔｓ’ｔ−検定を用いて算出した。
【０４３３】
賦形剤（ジメチルスルホキシド、ＰＢＴＥ、ＰＢＴＥ６Ｃ：Ｄ５Ｗ又はＰＢＴＥ：Ｄ５Ｗ）５０〜１００μｌ中の種々な濃度の化合物を、ＩＰ注入によってデリバリーした(delivered)。
【０４３４】
脳内異種移植片モデル．  マウスＩＣモデルに対しては、ラットＣ６神経膠腫細胞を回収して、滅菌ＰＢＳ中に２．５×１０７細胞／ｍｌの濃度で懸濁させて、氷上に置いた。細胞をＢＡＬＢ／ｃ、Ｎｕ／ｎｕマウスに下記方法で移植した：７０％エタノールによるスワビング(swabbing)の前に、必要に応じて、マウスの前頭頭頂部の頭皮を動物用クリッパーで剃った。動物をイソフルオランによって麻酔し、頭蓋を通して脳の左半球中に針を挿入した。３ｍｍのみの侵入を可能にするスリーブによって装着した３０ｇａ１／２インチ針を用いて、Ｈａｍｉｌｔｏｎガスタイトシリンジから細胞を分配した。細胞懸濁液４μｌを正確にデリバリーするために、反復ディスペンサー(repeater dispenser)を用いた。動物を健康に関して毎日モニターして、動物が約４０％の体重損失を示すか、及び／又は神経症状を示した場合には、動物を殺した。ラットＩＣモデルに対しては、ラット(Wistar,Sprague Dawley,Fisher344,又は胸腺欠損R/Nu,約200-400g（約3-400g））をケタセット(ketamine hydrochloride;Aveco,Fort Dodge,lowa)１００ｍｇ／ｋｇと、Ｒｏｍｐｕｎ(xylazine,2% solution;Bayer,Germany)５ｍｇ／ｋｇのＩＰ注入によって麻酔した。麻酔の開始後、頭皮を剃って、動物を定位固定装置(Stoelting,Wood Dale,lit.)に定位させた。切開部位の皮膚を、７０％エタノールと１０％Ｐｏｖｉｄｏｎｅ−ヨウ素との交互スワブ(alternating swabs)によって３回消毒した。滅菌外科ブレードを用いて、正中１．０〜１．５ｃｍ切開を頭皮に行なった。該皮膚を僅かに引き離して、頭蓋表面の縫合を露出するように、両側に引っ張った。歯科用ドリル（Stoelting,Wood Dale,Ill.)を用いて、ブレグマの約１ｍｍ前方及び２ｍｍ側方の頭蓋に小さい（直径１〜２ｍｍ）頭蓋骨孔を作製した。該細胞懸濁液を、２３又は２５ｇの標準ベベル針を装着した５０μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジに引き入れた。該シリンジを該頭蓋骨孔にくも膜のレベルで定位させ、該針の先端が脳構造中に３ｍｍ深さになるまで下げて、細胞懸濁液を徐々に注入した。細胞を注入した後に、該針を該頭蓋骨孔中に１〜２分間残して、細胞を完全にデリバリーさせた。頭蓋を消毒して(cleaned)、皮膚を２〜３個の縫合によって閉じた。動物を手術と麻酔からの回復に関して観察した。実験の間中、脳内腫瘍の進行に関連した症状の発生に関して、動物を毎日少なくとも２回観察した。進行した症状（痩せ(leaning)、平衡感覚の喪失(loss of balance)、脱水、食欲低下、協調性の喪失、グルーミング活動の停止及び／又はかなりの体重損失）を示した動物は、人道的に殺し、問題の器官及び組織を摘出した。
【０４３５】
腹腔内モデル．  細胞系を適当な培地中で増殖させた。細胞を回収し、滅菌ＰＢＳ又は、ＦＢＳを含まない培地中で洗浄し、適当な濃度に再懸濁させ、適当な系統のマウスの腹腔内に注入した。マウスを腹水形成の発生に関して毎日観察した。動物が４０％の体重増加を示したとき、又はＩＰ腫瘍負担が動物への不当なストレス若しくは痛覚を惹起し始めたときに、個々の動物を殺した。
【０４３６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＶＥＧＦペレット・モデル
下記実験では、ペレット・モデルを用いて、ＦＬＫ−１受容体に対する化合物の活性及び血管形成に関連した障害に対する化合物の活性を試験した。このモデルにおいて、ＶＥＧＦを徐放性ペレット(time-release pellet)中にパッケージし、ヌードマウスの腹部に皮下移植して、“発赤”反応及びその後の該ペレット周囲の腫脹(swelling)を誘導した。次に、可能性のあるＦＬＫ−１阻害剤をメチルセルロース中で、ＶＥＧＦペレット近くに移植して、このような阻害剤を発赤反応及びその後の腫脹を阻害するために用いることができるか否かを決定することができる。
【０４３７】
物質と方法：  下記物質を用いた：
（１）ＶＥＧＦ−ヒト組換え体凍結乾燥製品は商業的に入手可能であり、Peprotech,Inc.,Princeton Business Park,G2;P.O.box 275,Rocky Hill,N.J.08553から入手することができる。
（２）２１日放出ペレット(21day release pellets)中にパッケージされたＶＥＧＦを、Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3361 Executive Parkway, P. O. Box 2746, Toledo, Ohio 43606)から、特許化されたマトリックス・ドライブン・デリバリー・システム(patented matrix driven delivery system)を用いて入手した。ペレットは、０．２０、０．２１又は２．１μｇＶＥＧＦ／ペレットでパッケージした。これらの用量は、１０ｎｇ／日及び１００ｎｇ／日のＶＥＧＦ放出に近似する。
（３）メチルセルロース
（４）水（滅菌）
（５）メタノール
（６）適当な薬物／阻害剤
（７）１０ｃｍ培養プレート
（８）パラフィン
次に、下記プロトコールに従って、ＶＥＧＦペレット・モデルを処理する：
（１）Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから購入したＶＥＧＦを慣用的なペレット調製のためにInnovative Researchに送った；
（２）メチルセルロース、滅菌水中１．５％（ｗ／ｖ）に調製；
（３）薬物をメタノール中で可溶化した（通常濃度範囲＝１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）；
（４）滅菌パラフィンを滅菌１０ｃｍプレートに入れた；
（５）メタノール中の薬物１５０μｌを１．５％メチルセルロース１．３５ｍｌに加えて、よく混合した／渦流させた；
（６）該ホモジネートの２５μｌアリコートをパラフィン上に置き、ディスク状に乾燥させた；
（７）マウス（生後６〜１０週間、Ｂａｌｂ／ｃ胸腺欠損マウスｎｕ／ｎｕ、雌）をイソフルラン吸入で麻酔した；
（８）ＶＥＧＦペレットとメチルセルロース・ディスクを腹部に皮下移植した；並びに
（９）２４時間目と４８時間目に、マウスを発赤及び腫脹反応に関して記録した。
【０４３８】
この実施例に用いた特定の実験設計は下記に示す：
Ｎ＝４動物／グループ
対照：  ＶＥＧＦペレット＋薬物プラセボ、ＶＥＧＦプラセボ＋薬物ペレット、
実験結果．  本発明の化合物は、このアッセイによって活性を実証した。
【０４３９】
乳房脂肪体モデル(mammary fat pad model)
乳癌において多くのＲＴＫｓ（例えば、ＨＥＲ２受容体）が果たす確立された役割のために、このようなＲＴＫｓを阻害する化合物の効力の測定において、乳房脂肪体モデルが特に有用である。腫瘍細胞を問題の位置に直接移植することによって、その場モデル(in situ model)は腫瘍発生の生物学を、皮下モデルよりも正確に示す。ＭＣＦ−７を含めた、ヒト乳房細胞系は、胸腺欠損マウスの乳房脂肪体において増殖されている。Shafie and Grantham,1981,Natl.Cancer Instit.67:51-56; Gottardis et al.,1988,J.Steroid Biochem. 30: 311-314。より詳しくは、下記手段を用いて、ＨＥＲ２受容体に対する化合物の阻害効果を測定することができる：
（１）ＨＥＲ２をトランスフェクトされた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７細胞を、種々な濃度で、雌胸腺欠損マウスの腋窩乳房脂肪体(axillary mammary fat pad)中に移植する；
（２）化合物を投与する；並びに
（３）種々な時点で腫瘍成長を測定する。
【０４４０】
さらに、Ｗｅｓｔｅｒｎ及び免疫組織化学的分析によって、例えばＨＥＲ２のような受容体の存在に関して、腫瘍を分析することもできる。当該技術分野に知られた手法を用いて、当業者は、例えば種々な治療計画を用いて、上記方法を変えることができる。
【０４４１】
腫瘍浸潤モデル
下記腫瘍浸潤モデルが開発されており、問題の化合物の治療的価値(therapeutic value)及び効力を評価するために用いることができる。
方法：
生後８週間のヌードマウス（雌）(Simonsen Inc.)を実験動物として用いた。腫瘍細胞の移植は、層流フード内で行なった。麻酔のためには、キシラジン／ケタミン・カクテル（１００ｍｇ／ｋｇケタミン及び５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与する。正中線切開を行なって、腹腔を露出し（長さ、約１．５ｃｍ）、１００μｌ培地量中の１０７腫瘍細胞を注入する。細胞は、膵臓の十二指腸葉(duodenal lobe of pancreas)中、又は結腸の漿膜下のいずれかに注入する。腹腔と筋肉とを６−０シルク連続縫合糸によって閉じて、皮膚を創傷クリップを用いて閉じた。動物を毎日観察した。
【０４４２】
分析
２〜６週間後に、動物の肉眼観察に応じて、マウスを殺して、種々な器官（肺、肝臓、脳、胃、脾臓、心臓、筋肉）への局部腫瘍転移を摘出して、分析する（腫瘍サイズ、浸潤度、免疫化学及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成の測定）。
【０４４３】
結果
上記ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイから得られた種々な化合物の結果を以下の表５に記載する：
表５
【０４４４】
【表３３】
2005530781.tif 000058
【０４４５】
本発明は、例示した実施態様によって、範囲を限定されることはなく、該実施態様は本発明の１つの側面の例示として意図される。実際に、本明細書に記載したものに加え本発明の種々な改変が、上記説明から明らかであると思われる。このような改変は、特許請求の範囲内に入ると意図される。
本明細書に引用した総ての参考文献は、それらの全体で、本明細書に援用される。
【０４４６】
実施例３
ＣｅｌｅｃｏｘｉｂとＳＵ−５４１６との組み合わせは、ＨＮ１４８３腫瘍モデルにおいて腫瘍抑制を生じる
ヒト腫瘍異種移植ヌードマウス（ＨＮ１４８３）を、ＣｅｌｅｃｏｘｉｂとＳＵ−５４１６との組み合わせの腫瘍抑制効果の研究に用いた。頭頚部扁平上皮細胞癌（１４８３細胞系）のヒト腫瘍異種移植ヌードマウスは、ヒト上皮癌と同様に、腫瘍細胞及び脈管構造にＣＯＸ−２を発現する。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（３０％）を腫瘍成長の１００％発生をもたらす細胞懸濁液と混合する。このようにして、腫瘍細胞及び脈管構造にシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）を発現するＨＮ１４８３マウス・ヒト上皮癌は、ＣＯＸ−２阻害剤を包含する抗癌薬の効力をヒトにおける効力に相関づけるための良好なモデルである。
【０４４７】
ＨＮ１４８３プロトコール
物質と方法：
細胞培養：
１４８３ヒト頭頚部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）細胞を、３×１０６細胞、９０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する冷凍バイアル中に保存する。冷凍バイアルを取り出し、３７℃において素早く解凍して、１５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓバッファー、Ｌ−グルタミン、ピリドキシン塩酸塩及び１０％ＦＢＳと共にＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２培地(GibcoBRL)を含有するＴ−１６２ｃｍ２(Corning)中に入れた。細胞をインキュベーターにおいて５％ＣＯ２及び３７℃の温度で増殖させる。培地を隔日で変え、８０〜９０％集密度に達したときに、細胞を継代させる。細胞の継代のために、フラスコをリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌで洗浄し、吸引し、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％／１ｍＭ、GibcoBRL)２ｍｌを加えて、インキュベーターに戻し入れ、５分間後に、細胞は剥離する(detach)。上記培地８ｍｌをフラスコに加えて、リンスし(rinse)、滅菌した５０ｍｌ遠心分離管に移す。さらに３０ｍｌの培地を加えて、混合し、ヘマサイトメーター(hemacytometer)を用いて、細胞をカウントし、３〜４×１０６細胞を含有するＴ−１６２ｃｍ２中で細胞をプレートする(plate out)。
【０４４８】
１４８３動物モデル：
ヌードマウスに注入する前に、１４８３細胞の回収前２４時間に培地を変える。細胞培養の項で上述したように１４８３細胞をトリプシン処理する。細胞をカウントし、細胞数を決定する。細胞を室温で１０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離する。細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を（複数の５０ｍｌ遠心分離管が存在する場合には）１本の５０ｍｌ遠心分離管にＨａｎｋ’ｓ緩衝化生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ、GibcoBRL)と共にプールして、前述のように遠心分離する。追加の細胞(extra cell)は必要に応じて入手することができる。細胞をマウスに注入するように準備する。１４８３細胞を０．０３ｍｌ／マウス、全体量１００マウス×０．０３ｍｌ＝３ｍｌ中１×１０６細胞で注入する。細胞を、３０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ(Collaborative Biomedical Products)及び７０％ＨＢＳＳと共に注入する。プールしたペレットを冷ＨＢＳＳ２．１ｍｌ（７０％）によって再懸濁させ、次に、解凍済み液化冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ０．９ｍｌ（３０％）を加え、氷上で充分に混合する。この細胞準備物(cell prep)を、マウスに注入するまで常に、氷上に保存する。
【０４４９】
雄ヌードマウス生後４〜６週間を研究に用いた（Harlen)。マウスをＣＯ２／Ｏ２ガスを用いて麻酔し、マウスの右後足の中央に０．５ｃｃツベルクリン注射器(Beckerson & Dickerson)を用いて注入する。研究開始の基準重量として、注入日（０日目）にマウスの体重を計量する。７日目に開始して、マウスを計量し、プレチスモメーター(Stoelting Co.)を用いて、後足腫瘍容積のために右後足を測定する。プレチスモメーターは、水置換によって後足容積を測定する装置である。若干の注入されない左後足を測定し、バックグラウンド測定値として平均して、右の腫瘍含有後足から控除する。研究を通して、７、１０、１４、１７、２１、２４及び２８日目に、マウスを計量し、測定する。動物は、０日目に化合物治療（compound treatment）を開始してもよく（予防的）、又は約７日目に腫瘍の存在が確証されると化合物治療を開始してもよい（治療的）。約３０日目にビヒクル（対照）マウスは大きい腫瘍（約１．０〜１．５ｍｌ）を有し、体重が低下し始める、この時点で、ビヒクル動物を終了させることができる。
【０４５０】
Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、ＳＵ−５４１６及びこれらの組み合わせによるＨＮ１４８３マウスの治療プロトコール
結果：
（１）腫瘍成長、抑制
（２）健康評価としての体重
細胞を、３０％Ｍａｔｒｉｇｅｌを含むＨＢＳＳ中の１×１０６細胞／後足の濃度で、右後足に注入する。
【０４５１】
【表３４】
2005530781.tif 000059
【０４５２】
ＳＵ−５４１６は、毎日ｓ．ｃ．投与し、Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂは、半分は食餌中で、半分は強制栄養によって(by gavage)１１：００ａｍに投与される。動物の耳に切れ目を入れ、床敷きを含むポリカーブ(polycarbs)中に、４匹／ポリカーブで収容した。動物を到着時に標準Ｃｈａｗミールを与え、腫瘍のサイズが１００〜２００μｌになったときにＣｈａｗミール中の試験化合物を与えて、研究を通して化合物ミールを与え続けた。体重を週２回測定した。腫瘍容積を週２回プレチスモメーターを用いて測定した。
【０４５３】
処置したマウスの腫瘍容積に関するデータ
表６は、処置したマウスの腫瘍容積測定値を示す未加工データを例示する。
処置したＨＮ１４８３マウスの重量に関するデータ
Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、ＳＵ−５４１６及びこれらの組み合わせによって処置したＨＮ１４８３マウスの重量に関するデータを表７に再現する。
【０４５４】
表６
【０４５５】
【表３５】
2005530781.tif 000060
【０４５６】
表６続き
【０４５７】
【表３６】
2005530781.tif 000061
【０４５８】
表７
【０４５９】
【表３７】
2005530781.tif 000062
【０４６０】
表７続き
【０４６１】
【表３８】
2005530781.tif 000063
【国際調査報告】
2005530781.tif 000079