(57)【要約】  修飾ヌクレオシドトリホスフェートが、核酸合成の際にラベルされたヌクレオシドトリホスフェートより有効にかつ特異的に組み込まれる、合成後ラベルされ得る核酸のための、アッセイを提供する。より望ましい具体的態様において、ヌクレオシドα−チオトリホスフェートが用いられる。マレイミドまたはヨードアセトアミド・コンジュゲート部分は、合成後に結合され得る。コンジュゲート部分は、レポーター基を含み得る。新規の一塩基多型を検出する方法もまた開示される。
2005512544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸と、マイクロアレイ上に固定化されたプローブを、該標的核酸と該プローブの間でハイブリダイゼーションが可能な条件下で、接触させることを含む発現アッセイであって、該標的核酸が少なくとも１個のホスホロチオエート部分を有するアッセイ方法。
【請求項２】
レポーター分子を該ホスホロチオエート部分にコンジュゲートすることによって、該標的核酸をラベルすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ラベリング段階が、特に該ホスホロチオエート部分と反応するコンジュゲート部分と、該標的核酸を反応させた後、特にコンジュゲート部分と反応するラベリング部分と反応させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ラベリング段階の後、接触段階を行う、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該レポーター分子が、求電子性部分である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
該コンジュゲート部分が、求電子性部分である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
該求電子性部分が、マレイミドおよびヨード アセトアミドからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該レポーター分子が、フルオロフォア、還元部分、および電気化学的に活性な試薬からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
該レポーター分子が、ＴＭＲ−マレイミド、ＴＭＲ−ヨード アセトアミド、および ALEXAFLUOR−マレイミドからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのヌクレオチドがリボヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該標的核酸が、少なくとも３つの異なるチオ リボヌクレオチドを有し、該チオ リボヌクレオチドが、アデノシン チオホスフェート、シチジン チオホスフェート、グアノシン チオホスフェート、チミジン チオホスフェート、およびウリジン チオホスフェートからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該標的核酸が、少なくとも３つの異なるチオ デオキシリボヌクレオチドを有し、該チオ デオキシリボヌクレオチドが、アデニン デオキシアデノシンチオホスフェート、デオキシシチジン チオホスフェート、デオキシグアノシンチオホスフェート、およびチミジン チオホスフェートからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該標的核酸が、ｃＲＮＡおよびｃＤＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ジデオキシヌクレオシド α−チオトリホスフェート、およびアシクロヌクレオシド α−チオトリホスフェートからなる群から選択される化合物を組み込むことによって、標的にハイブリダイズさせたプローブを、正確に１塩基だけ伸張させることを含む、一塩基多型を検出する方法。
【請求項１６】
伸張されたプローブを、組み込まれた化合物のチオ部分に、レポーター部分をコンジュゲートすることによって、ラベリングすることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該レポーター分子が、ＴＭＲ−マレイミド、ＴＭＲ−ヨード アセトアミド、Alexafluor−マレイミド、および bromo-bimane からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該ジデオキシヌクレオシド α−チオトリホスフェートが、ジデオキシアデノシン α−チオトリホスフェート、ジデオキシシチジン α−チオトリホスフェート、ジデオキシグアノシン α−チオトリホスフェート、３’−デオキシチミジン α−チオトリホスフェート、および ジデオキシウリジン α−チオトリホスフェートからなる群のうち少なくとも１つである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
アデノシン チオホスフェート基、デオキシアデノシン チオホスフェート基、シチジン チオホスフェート基、デオキシシチジン チオホスフェート基、グアノシン チオホスフェート基、デオキシグアノシン チオホスフェート基、チミジン チオホスフェート基、およびウリジン チオホスフェート基からなる群のうち少なくとも１つの基、および 少なくとも１つの該基に結合する少なくとも１つの部分であって、該部分がマレイミド およびヨード アセトアミドからなる群から選択される部分を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
該部分が、ＴＭＲ−マレイミド、ＴＭＲ−ヨード アセトアミド、および Alexafluor−マレイミドからなる群から選択される、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
それにハイブリダイズさせたプローブをさらに含む、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
該プローブがマイクロアレイ支持体に結合している、該ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブをさらに含む請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
該ポリヌクレオチドがｃＲＮＡである、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
該プローブが、チオ ジデオキシヌクレオチド、およびチオ アシクロヌクレオチドからなる群から選択される部分で停止している、分子プローブ。
【請求項２５】
該プローブが核酸プローブである、請求項２４に記載のプローブ。
【請求項２６】
該プローブがマイクロアレイ支持体に結合している、請求項２４に記載のプローブ。
【請求項２７】
該プローブが核酸プローブであり、標的核酸にハイブリダイズされる、請求項２６に記載のプローブ。
【請求項２８】
少なくとも１つの分子プローブを含むマイクロアレイであって、該プローブがチオ ジデオキシヌクレオチド、およびチオ アシクロヌクレオチドからなる群から選択される部分で停止している、マイクロアレイ。
【請求項２９】
アデノシン チオホスフェート基、デオキシアデノシン チオホスフェート基、 シチジン チオホスフェート基、デオキシシチジン チオホスフェート基、グアノシン チオホスフェート基、デオキシグアノシン チオホスフェート基、チミジン チオホスフェート基、および ウリジン チオホスフェート基からなる群のうち、少なくとも３つの基を含む核酸。
【請求項３０】
アデノシン チオホスフェート基、デオキシアデノシン チオホスフェート基、シチジン チオホスフェート基、デオキシシチジン チオホスフェート基、グアノシン チオホスフェート基、デオキシグアノシン チオホスフェート基、チミジン チオホスフェート基、およびウリジン チオホスフェート基からなる群のうち、少なくとも４つの基を含む、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３１】
少なくとも１つの該基中のチオホスフェート部分にコンジュゲートするラベリング部分を含む、請求項２９に記載の核酸。
【請求項３２】
チオホスフェート ヌクレオチドを有するｃＲＮＡを含む核酸。
【請求項３３】
アデノシン チオホスフェート基、シチジン チオホスフェート基、グアノシン チオホスフェート基、ウリジン チオホスフェート基からなる群から選択される、少なくとも１つの基を含むｃＲＮＡ。
【請求項３４】
ラベリング試薬およびヌクレオチド試薬を含む発現アッセイ・キットであって、該ラベリング試薬がチオ反応性化合物を含み、かつ該ヌクレオチド試薬がヌクレオシド α−チオトリホスフェートを含む発現アッセイ・キット。
【請求項３５】
該ヌクレオチド試薬が、アデノシン α−チオトリホスフェート、シチジン α−チオホスフェート、グアノシン α−チオホスフェート、およびウリジン α−チオホスフェートからなる群のうちの少なくとも１つである、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
該チオ反応性化合物が、マレイミドおよびヨウ化アルキルからなる群から選択される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
ラベリング試薬とヌクレオシド トリホスフェートを含む一塩基多型アッセイ・キットであって、該ラベリング試薬がチオ反応性化合物を含み、該ヌクレオシド トリホスフェートが、ジデオキシヌクレオシド α−チオトリホスフェート、およびアシクロヌクレオシド α−チオトリホスフェートからなる群から選択される化合物を含む、一塩基多型アッセイ・キット。
【請求項３８】
ジデオキシアデノシン チオホスフェート基、ジデオキシグアノシン チオホスフェート基、ジデオキシシチジン チオホスフェート基、３'−デオキシチミンチオホスフェート基、およびジデオキシウリジン チオホスフェート基からなる群から選択される基で停止している核酸をラベルする方法であって、該核酸をチオ反応性化合物と反応させることを含む方法。
【請求項３９】
アシクロアデノシン チオホスフェート基、アシクログアノシン チオホスフェート基、アシクロシチジン チオホスフェート基、３'−アシクロチミン チオホスフェート基、アシクロウリジン チオホスフェート基からなる群から選択される基で停止している核酸をラベルする方法であって、該核酸をチオ反応性化合物と反応させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜本発明の分野＞
本発明は、一般的に、生体分子検出の分野および核酸合成に関し、さらに詳しくは、関連化合物を含めた核酸の検出および合成のための技術ならびに生体分子の検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜関連分野の記載＞
生体分子、例えばポリ核酸およびタンパク質を検出するための技術は、実用レベルまで検出限界を拡大するために、ラベルの使用を含む。例えば、フルオロフォア・ラベルは、対象の生体分子へ酵素で導入し得、蛍光によって検出され得る。核酸合成において、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリメラーゼは、ラベルされたプライマーまたはラベルされたヌクレオシド トリホスフェートの何れかを、ポリヌクレオチド鎖に組み込むために用いられ得る。このような使用のための ラベルまたは“レポーター基”で置換されたヌクレオシド トリホスフェートは、Trevisiol, E., et al., Synthesis of Nucleoside Triphosphates that Contain an Aminooxy Function for “post-Amplification Labeling”, Eur. J. Org. Chem., 2000, 211-17; Fidanza, et al., Functionalization of Oligonucleotides by the Incorporation of Thio-Specific Reporter Groups, Methods in Molecular Biology, Volume 26, Protocols for Oligonucleotide Conjugates:  Ed. Agrawal, S., 1994, 121-143; Temsamani, J. et al., Enzymatic Labeling of Nucleic Acids, Molecular Biotechnology 1996, 5, 223-32;b) Qin et al., Site-Specific Labeling of RNA with Fluorophores and Other Structural Probes, Methods:  A Companion to Methods in Enzymology 1999, 18, 60-70; Hodges, R. R. et al., “Post-Assay” Covalent Labeling of Phosphorothioate-Containing Nucleic Acids with Multiple Fluorescent Markers, Biochemistry 1989, 28, 261-67 において報告されている。
【０００３】
さらなる背景情報は、米国特許第 4,908,307 号(Rodland et al.)；第 5,545,531 号(Rava et al)；第 5,702,925 号(Smith et al.)；第 5,741,644 号(Kambara et al.)；第 5,804,375 号(Gelfand et al.)；第 5,858,659 号(Sapolsky et al.)；第 6,087,095 号(Rosenthal et al.)；および第 6,183,970 号(Okano et al.)、およびＰＣＴ出願第 WO 98/56954 号(Chee)；第 WO 00/39345 号(Makrigiorgos)；および第 WO 00/79006 号(Petersdorf)、および下記の論文：Conway et al., “The Covalent Attachment of Multiple fluorophores to DNA Containing Phosphorothioate Diesters Results in Highly Sensitive Detection of Single-Stranded DNA,” Bioconjugate Chem., Vol. 2, No. 6, pp. 452-457, 1991; Eckstein, F., “Nucleoside Phosphorothioates”, Ann. Rev. Biochemistry, 54:367-402, 1985; Fidanza et al., “Introduction of Reporter Groups at Specific Sites in DNA,” J. Am. Chem. Soc., 111, pp. 9117-9119, 1989. Gupta, V., “Studies Aimed at Controlled Chemical Cleavage of DNA,” Department of Chemistry - The College of Arts and Sciences, University of Rochester, New York, 1997; and Scheit, “Nucleotide Analogs,” Synthesis and Biological Function, pp. 101-113, 1980 において見出され得る。
【０００４】
ハイブリダイゼーション・アッセイ
ハイブリダイゼーション・アッセイ、例えば発現アッセイにおいて、ＤＮＡもしくはＲＮＡ標的分子は、プローブにハイブリダイズされる。典型的には、標的核酸もしくはプローブの何れかは、塩基修飾されたヌクレオシド トリホスフェート、例えば 5-Cy3-dUTP、5-Cy3-dCTP、5-TMR-dUTP、および 7-biotin-7-deaza-dATP (ホスホリル化されたヌクレオシドもまた、ヌクレオチドとして記載する)を用いてラベルされる。ヌクレオシド トリホスフェートは、様々な位置で、例えば塩基もしくは糖で修飾される。しかしながら、修飾されたヌクレオチドの 合成ポリヌクレオチドへの 酵素による組み込みの速度および効率は、ラベル、および修飾されたヌクレオチドでラベルがどこに存在するかに依存する。標的もしくはプローブ生産の効率を増大させるためには、合成されたポリヌクレオチドへ効率よく組み込まれた 修飾されたヌクレオチドを使用することが有益である。ハイブリダイゼーション・アッセイの例は、核酸アレイ、サザン・ブロット法、ノーザン・ブロット法、およびＦＩＳＨ法の使用を含む。
【０００５】
一塩基多型（single nucleotide polymorphism）検出
集団の中の個人の遺伝子は、その集団中の他の何れかの個人の遺伝子の配列と、配列において異なっている。これらの違いの大部分は、集団における個人的特徴に寄与している。しばしば、これらの違いは、特定の位置で、一塩基の違いまでマッピングされ得る。これらの一塩基多型(ＳＮＰ)を検出する方法は、個人の遺伝子型 および可能性のあるその後の表現型を決定するのに有用である。ＳＮＰを検出する多くの方法が開発されている (Walburger et al., Mutat Res 2001 Jan;432(3-4):69-78; Kozlowski and Krzyzosiak, Nucleic Acids Res 2001 Jul 15;29(14):E73-3; Zhang et al., Anal Chem 2001 May 1;73(9):2117-25; Lareu et al., Forensic Sci Int 2001 May 15;118(2-3):163-8; Beaudet et al., Genome Res 2001 Apr;11(4):600-8)。
【０００６】
このような方法の１つにおいて、ＳＮＰ検出技術は、検出可能な基、例えば蛍光ラベルと結合した鎖停止ヌクレオチド(例えば２’，３’−ジデオキシヌクレオチド、アシクロヌクレオチド)を用いる。このようなヌクレオチドの酵素による組み込み、特に糖への修飾(例えば２’，３’−ジデオキシＮＴＰ、またはアシクロＮＴＰ) および塩基への修飾(フルオロフォアを有する)の、特異性および効率は、非常に低い。組み込みが悪いと、該アッセイのシグナル強度が減少する。
従って、生体分子、例えば核酸オリゴマーとポリマー、およびペプチドとタンパク質を検出するための改善されたアッセイ、キット、および技術の要請がある。
【発明の開示】
【０００７】
＜要約＞
核酸アッセイ
１つの具体的態様において、アッセイおよびキットは、酵素合成および合成後にラベルされ得る核酸の検出のために提供される。ここで、修飾されたヌクレオシド トリホスフェートは、核酸合成の際に、ラベルされたヌクレオシド トリホスフェートより効率的に かつ特異的に組み込まれるよう用いられる。修飾されたヌクレオシド トリホスフェートは、好ましくは放射性ラベルされておらず かつ修飾されていないヌクレオチドとほぼ同じ効率で、そしてほぼ同じ特異性で組み込まれる。望ましい具体的態様において、ヌクレオシド α−チオトリホスフェートが用いられる。合成方法は、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および別の化合物において用いられ得る。得られたオリゴマーもしくはポリマー中のホスホロチオエートのチオ部分は、チオ反応性化合物と反応し得、該化合物はラベルを含み得るか、またはラベルと結合し得る。
【０００８】
一塩基多型(ＳＮＰ)アッセイ
本発明の具体的態様において、１塩基伸張(ＳＢＥ)アッセイ中のプローブを、伸張反応（ここで、組み込まれた化合物の基は、チオ反応性化合物と反応する）において、ジデオキシ もしくはアシクロ チオヌクレオチド、または他の適切な鎖停止化合物の何れかを用いることによってラベルされ得る。鎖停止ヌクレオチドは、好ましくは、放射性ラベルされておらず かつ合成後にチオ反応性化合物と反応する部分を含まない鎖停止ヌクレオチドと、ほぼ同じ効率で、そしてほぼ同じ特異性で組み込まれる。チオ反応性化合物(例えばチオ部分を含む)と反応する部分を有する基を含む伸張されたプローブのみが、次に続くチオ反応性化合物との反応の際にラベルされる。
よりよい定量は、様々な修飾されたヌクレオチドが同様のレベルで組み込まれているので、本発明のポリヌクレオチドおよびＳＮＰ検出アッセイの結果得られる。
【０００９】
マイクロアレイ
本発明の具体的態様に従って製造される核酸は、マイクロアレイ(プローブ・チップ、バイオチップ、および同様の用語でも呼ばれる)上の、プローブにハイブリダイズされ得、新規のマイクロアレイ生成物を製造する。１つの具体的態様において、本発明に従って製造される核酸および他の合成生成物は、マイクロアレイ・プローブでハイブリダイゼーションを行う前にラベルされる。一方、別の具体的態様において、ラベリングは、ハイブリダイゼーション後に行われる。具体的態様において、マイクロアレイは、放射性ラベルされていないジデオキシヌクレオシド チオホスフェート基、またはアシクロヌクレオシド チオホスフェート基によって停止しているプローブを有することが開示されている。
【００１０】
新規核酸およびヌクレオチド
少なくとも３つ もしくは少なくとも４つの異なるヌクレオシド チオホスフェート基を含む新規の核酸が開示されている。放射性ラベルされていないジデオキシヌクレオシド α−チオトリホスフェート、およびアシクロヌクレオシド α−チオトリホスフェート、それらの合成方法、および末端の放射性ラベルされていないジデオキシヌクレオシド チオホスフェートまたはアシクロヌクレオシド チオホスフェートを含む核酸もまた開示されている。下記の例示的な図、および詳細な記載は、さらに前述の本発明の要約を補う。
【００１１】
＜図面の簡単な説明＞
図１は、本発明に従って行われる新規の発現アッセイを説明する図である。
図２は、本発明に従って行われる新規のＳＮＰアッセイを説明する図である。
【００１２】
＜詳細な説明＞
ヌクレオシド トリホスフェート
本発明で使用するための修飾されたヌクレオシド トリホスフェートの非制限的な例は、α−チオトリホスフェート、例えばアデノシン α−チオトリホスフェート、シチジン α−チオトリホスフェート、グアノシン α−チオトリホスフェート、チミジン α−チオトリホスフェート、およびウリジン α−チオトリホスフェート、およびそれらのアナログ(例えば２−アミノ−Ａ)を含む。塩基 アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、およびチミンがヌクレオシドもしくはヌクレオチドに組み込まれた場合、それらの対応するスペルは、一般的に、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、およびチミジンに変化させる。
【００１３】
本発明の１つの具体的態様において、以下の式：
【化１】
2005512544.tif 000003
を有するチオ置換ヌクレオシド トリホスフェートが用いられる。
Ｒは、ＯＨ、Ｈ、ＮＨ２、Ｆ、ＯＣＨ３、またはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり得る。本発明に従う望ましいチオ置換ヌクレオシド トリホスフェート（“ｓＮＴＰ”または“α−チオ ＮＴＰ”）は、核酸(例えばリボ核酸(ＲＮＡ)、またはデオキシリボ核酸(ＤＮＡ))のポリマーもしくはオリゴマーの合成において、天然由来のＮＴＰと実質的に同様の様式で反応する化合物である。従って、本発明に従う 望ましいチオ置換ポリヌクレオチドは、式：
【化２】
2005512544.tif 000004
を有する。
【００１４】
ジデオキシ− および アシクロ−ヌクレオチド
本発明の新規の一塩基多型アッセイにおいて、ジデオキシヌクレオシド α−チオトリホスフェート(すなわちＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇおよびそのアナログ)が用いられる。これは、ジデオキシヌクレオチドが３'−ヒドロキシル基を持たず、そのために、伸張するポリヌクレオチドへの組み込まれるとさらなる鎖の伸張が妨げられるためである。望ましいジデオキシヌクレオチドは、放射性ラベルされていない。
【００１５】
チオ置換ジデオキシヌクレオシド トリホスフェートを製造する方法は、既知である (Krieger et al., “Synthesis and biological applications of 2',3'-dideoxynucleoside-5'-O-(α-thio)triphosphates,” Nucleosides Nucleotides 8(5-6):849-53 (1988); 本明細書中で言及することによって組み込まれる)。
【００１６】
アシクロヌクレオシド α−チオトリホスフェート (すなわち、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、[Ｕ]、およびそれらのアナログ) もまた、本明細書中で開示されている。アシクロヌクレオシドを製造する方法は、当業界で周知である (Gao and Mitra, “Synthesis of Acyclovir, Ganciclovir and Their Prodrugs:  A Review,” Synthesis Stuttgart 3:329-351 (2000); Harnden and Serafinowska, “Synthesis and Properties of S-Phosphates of Some Antiviral Acyclonucleosides,” Nucleosides and Nucleotides 13(4):903 (1994); 共に言及することによって組み込まれる)。
【００１７】
ラベルおよびコンジュゲート部分
“ラベル”という用語は、検出可能な物理的性質を有する何れかの化学的な基もしくは部分、または検出可能な物理的性質を示す化学的な基もしくは部分をもたらし得る何れかの化合物、例えば基質の検出可能な生成物への変換を触媒する酵素を指すよう用いられる。“ラベル”という用語はまた、特定の物理的性質の発現を示す化合物を含む。ラベルはまた、結合対の一方のメンバーである化合物であってもよく、結合対の他方のメンバーは、検出可能な物理学的性質を持っている。
【００１８】
本発明に従って製造される 望ましい核酸は、チオ反応性化合物とコンジュゲートする部分を少なくとも１つ有する基を含む。本発明に従って製造される 望ましいＳＮＰプローブは、チオ反応性化合物とコンジュゲートする部分を有する基で停止している。コンジュゲート部分は、ラベルを含むか、またはラベルと結合し得るチオ反応性化合物であり得る。チオ反応性化合物は、求電子基を含む。本発明で使用するための求電子剤の非制限的な例は、ヨウ化アルキル、マレイミド、ハロゲン化アリールメチル、ヨード アセトアミド、ブロモエチルケトン、および bromobimane を含み、これらはホスホロチオエートと反応し、コンジュゲートし得、生物学的分子への、例えば蛍光色素へのコンジュゲート部分として作用する。別の具体的態様において、望ましい求電子剤は、ラベルまたはレポーター部分を組み込んでいる。本発明は如何なる特定の理論あるいはメカニズムにも制約されることなく、核酸中のホスホロチオエート結合が、高い特異性を有して、特定の求核剤、例えばヨード アセトアミドやマレイミドと反応すると考えられる。
【００１９】
１つの具体的態様において、マレイミドは、ヨード アセトアミドよりも望ましい。ラベル または“レポーター基”を有する 望ましいヨード アセトアミドおよびマレイミドは、ＴＭＲ−マレイミド、ＴＭＥ−ヨード アセトアミド、および Alexafluor−マレイミド(全て Molecular Probes より市販されている)を含む。ＴＭＲは、Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチル−６−カルボキシローダミンの略号である。１つの具体的態様において、ＴＭＲ色素は、Alexafluor 色素より望ましい。
【００２０】
ＴＭＲ−ヨード アセトアミドの式を以下に示す。
【化３】
2005512544.tif 000005
【００２１】
ＴＭＲ−マレイミドの式を以下に示す。
【化４】
2005512544.tif 000006
【００２２】
色素ラベルされたヨードアセトアミドと、本発明のチオ置換ポリヌクレオチドの反応を、以下に説明する。該反応は、様々な条件下で行われ得る。例えば、ｐＨは６から１２の間であり得、８〜９．５が望ましい。ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、またはリン酸緩衝液を、１〜１００ｍＭの濃度で用い得、５０ｍＭが望ましい。温度は、１５〜５０℃であり得、環境温度が望ましい。また、反応は暗所で行うことが望ましい。さらに、溶媒、例えばＤＭＦおよびＤＭＳＯは、必要に応じて用いられ得る。
【化５】
2005512544.tif 000007
【００２３】
色素ラベルされたマレイミドと、本発明のチオ置換ポリヌクレオチドの反応を、以下に説明する。
【化６】
2005512544.tif 000008
【００２４】
核酸合成とラベリング
“核酸”という用語は、とりわけ一本鎖、二本鎖、三本鎖、直鎖および環状の形態を含む何れかの形態の、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)およびリボ核酸(ＲＮＡ)を言うよう用いられる。それはまた、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸のキメラ、およびそれらのアナログを含む。本明細書で記載された修飾された核酸は、周知のデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドからなり、これらは塩基：アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルから、またはこれらの塩基のアナログもしくは誘導体からなり、これらは本発明に従って合成後にラベリングされ得るよう適当に修飾され得る。
【００２５】
典型的な核酸合成とラベリングの具体的態様の第１段階において、ポリヌクレオチドは、１個以上のヌクレオシド チオホスフェート基を組み込んで合成され、例えば、アデノシン α−チオトリホスフェート、シチジン α−チオトリホスフェート、グアノシン α−チオトリホスフェート、チミジン α−チオトリホスフェート、および／または ウリジン α−チオトリホスフェートとの反応によって形成されるものであり、これらに制限されない。１つの具体的態様において、アデノシン α−チオトリホスフェート、シチジン α−チオトリホスフェート、グアノシン α−チオトリホスフェート、チミジン α−チオトリホスフェート、およびウリジン α−チオトリホスフェートからなる群のうち、少なくとも３つの、より好ましくは４つが、合成反応で含まれる。
【００２６】
第２の もしくは求核反応の段階において、ポリ核酸は、求核剤と、例えばヨード アセトアミドまたはマレイミド(これらに制限されない)と反応する。第３もしくはラベリングの段階において、求核反応段階の生成物は、検出可能な部分に、例えば蛍光色素にコンジュゲートされる。第３段階は、求核剤が合成された核酸と反応する前にラベルにコンジュゲートするならば、省略され得る。従って、ｃＲＮＡ転写物、またはｃＤＮＡは、合成後に様々なラベルとコンジュゲートされ得る。
【００２７】
検出
本発明に従って製造された ラベルされたポリヌクレオチドは、本質的に、ポリヌクレオチドを検出するための何れかの方法を用いて検出され得る。好ましくは、ラベルされたヌクレオチドは、少なくともラベルされたヌクレオチドに相補的な部分を含む ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって検出される。望ましい具体的態様において、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件で行われる。最も好ましくは、検出は、マイクロアレイ法またはマイクロフルイディック・デバイスを用いる。例えば、合成された チオｃＤＮＡもしくはｃＲＮＡ(すなわち１個以上のチオヌクレオチド基を組み込んだ核酸)は、マイクロアレイ上でプローブにハイブリダイズされ、ラベルによって得られるシグナル、例えば蛍光を検出することによって検出される。合成後に用いられ得る検出部分の別の非制限的な例は、還元部分、例えばフェロセン、および電気化学的に活性な薬剤、例えばルテニウム錯体を含む。
【００２８】
得られた核酸オリゴマーとポリマーは、天然由来のＮＴＰ(すなわちＮＴＰ基)を含む核酸オリゴマーおよびポリマーと実質的に同じ様式で、相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ鎖にハイブリダイズすることが望ましい。ポリ核酸は、当業者に既知の特定の環境下で、ペプチド配列もしくはポリペプチド配列に結合し得、本発明のこのような使用は意図され、本明細書中に組み込まれると解される。例えば、本発明の核酸は、SELEX法(米国特許第 5,567,588 号；言及することによって本明細書中に組み込まれる)で用いられ得る。ポリペプチドとその他の部分を組み込んだ核酸は、同様に意図され、本発明に組み込まれる。
【００２９】
１つの具体的態様において、ラベルは、相補的なＤＮＡもしくはＲＮＡ鎖にハイブリダイズする前もしくはした後に、チオ置換された核酸オリゴマーとポリマーにコンジュゲートされる。従って、例えば、求電子基は、チオ置換されたポリヌクレオチドと反応し得、ここで、求電子基は、ラベルされたポリヌクレオチドを作成するためにレポーター基に前もってコンジュゲートされ得るか、中間のコンジュゲート部分をポリヌクレオチド チオ置換基に結合させ、次いで、ハイブリダイズする前もしくはした後にラベルと反応させる。１個以上のタイプのラベルもしくはコンジュゲート中間体が本発明に従って合成されたポリヌクレオチドに結合し得ることが意図されている。コンジュゲートする中間体の例は、ハプテン(抗体)、ビオチン(アビジン／ストレプトアビジン)、およびリガンド(受容体)を含む。
【００３０】
マイクロアレイ
固体の支持体上のオリゴヌクレオチド、ペプチド、および他のポリマー配列の高密度アレイは、市販されている。望ましい具体的態様において、マイクロアレイは、３Ｄヒドロゲル・アレイである。ヒドロゲル・アレイは、市販されている(CODELINK; Motorola Life Sciences, Northbrook, IL.)。ヒドロゲル・アレイの製造方法および該アレイへの核酸の結合方法は、WO 01/01143 に記載されている(言及することによって、その全体が本明細書中に組み込まれている)。
【００３１】
ヒドロゲル・アレイに替わって、オリゴヌクレオチド・アレイは、光学的に制御された化学カップリングおよび機械的に制御されたカップリングを含む(これらに制限されない)様々な方法によって、固体の支持体上に合成され得る。Pirrung et al., 米国特許第 5,143,854 号(PCT 出願番号 WO 90/15070 もまた参照のこと)、および Fodor et al., PCT 公開番号 WO 92/10092 および WO 93/09668 を参照のこと（これらは、例えば光指向性合成法を用いて、ペプチド、オリゴヌクレオチド、および他の分子の莫大な数のアレイを形成する方法を開示している）。Fodor et al., Science, 251, 767-77 (1991); 米国特許第 5,700,637 号; 米国特許第 6,054,270 号を参照のこと。これらのポリマー・アレイの合成手順は、VLSIPS 法(very large scale immobilized polymer synthesis)として記載されている。VLSIPS 法を用いて、１つのポリマーの不均一なアレイは、多くの反応部位での同時カップリングを介して、異なる不均一なアレイに変換され得る。Lockhart らは、米国特許第 6,040,138 号において、多様な遺伝子の発現を分析するためのオリゴヌクレオチド・アレイの使用、および該アレイの構築を記載している。
【００３２】
望ましい具体的態様において、3D-Link (商標) Activated Slides (Motorola Life Sciences, Northbrook, Illinois, USA より市販されている)が、マイクロアレイを形成するための、プローブを固定化する支持体として用いられ得る。
【００３３】
新規の発現アッセイ法
図１に記載されているように、本発明に従って行われる発現アッセイにおいて、段階の概略図を説明する。概略図の冒頭には、ＤＮＡテンプレートが、４つの天然のヌクレオシド トリホスフェート および α−チオ ヌクレオシド トリホスフェートと共に、in vitro 転写(ＩＶＴ)を行うために用いられる。反応は、合成を最大にし、望ましい鎖長を達成し、クエンチなどのラベル相互作用を最小にし、そして／またはα−チオ試薬を節約するよう最適化される。ホスホロチオエートを含む 得られたｃＲＮＡは、次にラベルと反応させ、次にラベルされたｃＲＮＡをマイクロアレイ上に適切なストリンジェントな条件および洗浄条件下でハイブリダイズさせる。次に、結合した ラベルされたｃＲＮＡを検出する。あるいは、ホスホロチオエートを含むｃＲＮＡを、始めにマイクロアレイ上でハイブリダイズさせ、これらの得られたハイブリダイズされたペアを次にラベルと反応させる。さらに、反応生成物をマイクロフルイディック・デバイスで分析し得る。
【００３４】
一塩基多型検出
本発明の具体的態様において、１個もしくはそれ以上のα−チオ置換ヌクレオチドは、一塩基多型(ＳＮＰ)を検出する方法に用いられる。ＳＮＰ検出は、集団中の個々人の間の多くの遺伝子を比較することを可能にする。ＳＮＰを検出する方法の幾つかは、当業界で既知である (Kwok P.Y., “High-throughput genotyping assay approaches,” Pharmacogenomics 1(1):95-100 (2000); 言及することによって本明細書中に組み込まれる)。このような異なる方法は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション法、対立遺伝子特異的プライマー伸張法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド ライゲーション法、および対立遺伝子特異的フラップ・プローブ切断法を含む。本開示に照らせば、当業者は、本発明の組成物および方法が、上記の方法の何れにおいても利用され得ることを認めるであろう。
【００３５】
望ましい具体的態様において、対立遺伝子特異的プライマー伸張法を利用する。図２に記載されているように、本発明に従って行われるＳＮＰ検出の段階の概略図が記載されている。概略図の冒頭では、プローブがマイクロアレイに結合し、そして標的がマイクロアレイに適用される。標的とプローブがハイブリダイズした二本鎖を形成する。次に、好ましくはα−チオ置換ジデオキシヌクレオチド（例えばｄｄＮＴＰαＳ）またはアシクロ化合物（例えばアシクロ ＮＴＰαＳ）を用いて、１塩基伸張(ＳＢＥ)を行い、プローブを伸張する。当然、幾つかの具体的態様においては、１個以上のヌクレオチドが組み込まれ得る。この場合において、非停止ヌクレオチド(ｄＮＴＰ)をジデオキシ−もしくはアシクロ−α−チオヌクレオチドと共に用いる。その後、ラベリング反応を行い、プローブをラベルする。望ましい具体的態様において、色素でラベルされたマレイミドを、ＳＮＰアッセイのための反応性ラベルとして用いる。ラベルされたプローブは、次に、当業者に既知の標準的な方法を用いて検出される。
【００３６】
別の具体的態様において、プローブは、ＳＮＰを含む標的にハイブリダイズされる。ここで、ＳＮＰ塩基は、プローブの３’末端から１塩基離れた位置にある。それぞれ同じ配列の４個の別個のプローブを有し、かつ標的、ポリメラーゼ、および４個のラベルされたｄｄＮＴＰのうちの１つを添加することによって、ＳＮＰを識別する[ｄｄＮＴＰがヌクレオチドの組み込みによってプローブに蛍光を持たせることによる]ことが可能となる。本方法は、米国特許第 5,679,524 号, “Ligase/polymerase mediated genetic bit analysis of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis”, Nikiforov et al において完全に記載されている。本方法を用いる望ましい具体的態様において、チオ ｄｄＮＴＰをチオ反応性色素でタグを付けることを必要とする。
【００３７】
１つの具体的態様において、ジデオキシアデノシン α−チオトリホスフェート、ジデオキシシチジン α−チオトリホスフェート、ジデオキシグアノシン α−チオトリホスフェート、ジデオキシチミジン α−チオトリホスフェート、およびジデオキシウリジン α−チオトリホスフェートからなる群のうちの少なくとも４個をプローブ伸張反応に加える。プローブは、次にラベルされ、マイクロアレイを処理し、標的にハイブリダイズさせた ラベルされたプローブを変性させ、プローブを検出する。
【００３８】
ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションは、プローブとその相補的な標的が相補塩基対を介して安定なハイブリッド二本鎖を形成し得る条件下で変性させた、プローブと標的核酸を提供することを含む。ハイブリッド二本鎖を形成しない核酸は、次に洗浄して除き、ハイブリダイズされた核酸を残し、典型的には結合した検出可能なラベルの検出によって検出する。
【００３９】
核酸は、温度を上げることによって、または核酸を含む緩衝液の塩濃度を減少させることによって、変性することが、一般的に認められている。低ストリンジェント条件下(例えば低温 および／または高塩)で、アニールされた配列が完全に相補的ではないハイブリッド二本鎖(例えばＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ、またはＲＮＡ：ＤＮＡ)さえ形成される。従って、ハイブリダイゼーションの特異性は、より低位のストリンジェントでは減少する。逆に、より高位のストリンジェント(例えばより高い温度、またはより低い塩)では、成功したハイブリダイゼーションが、よりミスマッチを少なくする。当業者は、ハイブリダイゼーション条件がどの程度ストリンジェントかを選択し得ることが認められるであろう。さらに、当業者は、分子のハイブリダイズした部分の長さとＧ：Ｃ含量が、適当な変性またはハイブリダイゼーション条件を決定する際に考慮されるべきであると認めるであろう。
【００４０】
ハイブリダイゼーション条件を最適化する方法は、当業者に周知である(例えば Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., (1993))。望ましい具体的態様において、ハイブリダイゼーションは、“3D-Link (商標) Protocol Information,” Motorola Life Sciences, Northbrook, Illinois, USA (2001) に含まれる手順に従って行われる。
【００４１】
シグナル検出
マイクロアレイ・プローブにハイブリダイズされた、ラベルされた標的(サンプル)核酸を検出する方法は、当業者に既知である。従って、例えば比色ラベルは、十分にラベルされたサンプルが存在する場合に直接可視化され得る。放射活性ラベルを付したプローブは、写真フィルムもしくは固相検出器で検出され得る。
【００４２】
望ましい具体的態様において、標的核酸は、蛍光ラベルでラベルされており、当業界で既知の標準的な方法を用いて検出される。例えば、アレイ上のラベルの位置の特定は、顕微鏡で行われ得る。ハイブリダイズされたアレイは、特定の蛍光ラベルの励起波長で、光源で励起され得、放出波長で得られた蛍光を検出され得る。例えば、励起光源は、蛍光ラベルの励起に適切なレーザーであり得る。検出は、コンピューター制御された状態で自動化され、全アレイを自動的にスキャンされ得る。自動化データ取得システムに繋がれた さらなる装置、例えば光トランスデューサー(例えば光倍増器、固相アレイ、カメラなど)は、蛍光シグナルを自動的に記録するために用いられ得る。該自動化システムは、米国特許第 5,143,854 号およびＰＣＴ出願 WO 92/10092 に詳細に記載されている。
【実施例】
【００４３】
実施例
本発明の新規のα−チオ ヌクレオチドに最適な求核剤およびラベルを見出すために、試験は、本発明に従って合成されたｃＲＮＡを用いて行われ、次に様々な色素でラベリング反応が行われる。
【００４４】
実施例１：ｃＲＮＡの合成
直線化したプラスミドＤＮＡを、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーターを有する in vitro 転写(ＩＶＴ)反応におけるテンプレートとして用いた。Ｃｙ３−ラベルｃＲＮＡを、ＡＴＰ（５ｍＭ）と、ＧＴＰ（５ｍＭ）と、ＣＴＰ（３．７５ｍＭ）と、ＵＴＰ（３．７５ｍＭ）と、Ｃｙ３−ＵＴＰ（０．５ｍＭ）と、Ｃｙ３−ＣＴＰ（０．５ｍＭ）の存在下で、１０× 反応緩衝液(Gibco)とＳＰ６ ＲＮＡ ポリメラーゼ(キット, Ambion より)中で、１μｇのＤＮＡをインキュベートすることによって合成した。混合物を３７℃で６時間インキュベートし、次に RNeasy columns (Qiagen)を用いて精製した。Ｃｙ３−ラベル ヌクレオシド トリホスフェートを、それぞれ１個もしくは４個全てα−チオ ヌクレオシド トリホスフェート(Amersham Biosciences, また PerkinElmer からも市販されている)で、１．５mMの濃度で置換することによって、ホスホロチオエート−ｃＲＮＡを合成した。天然のｃＲＮＡを、天然のヌクレオチドのみを用いて、それぞれ５mMで製造した。合成されたＲＮＡを、確立されたプロトコル(すなわち、３０mM Ｍｇ２+で、９４℃で１５分間処理する)を用いて、フラグメント化した。
【００４５】
予備的実施例２：反応性色素でのラベリング
３つの異なる化合物：ＴＭＲ−マレイミド(前記の式)、ＴＭＲ−ヨード アセトアミド(前記の式)、および Alexafluor−マレイミド(Molecular Probes より購入)を、ラベリング色素として試験した。ｃＲＮＡのサンプル(４０μｇ, ３０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ中， ｐＨ ８．０）を、反応性色素溶液（ＤＭＦ中１０ｍＭ）で処理し、最終濃度を１ｍＭとした。混合物を５０℃で２４時間保ち、未反応の色素を microspin G-6 columns (Amersham)を用いて除去した。ｃＲＮＡ生成物を、“3D-Link (商標) protocol Information,” Motorola Life Sciences, Northbrook, Illinois, USA (2001) の手順に従って、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーション試験に直接用いた。
【００４６】
実施例３：ゲル分析
以下の表１に記載したように１０個のサンプルを１％ アガロース・ゲルで展開した。
【表１】
2005512544.tif 000009
【００４７】
始めに、ゲルは染色せず、Ｃｙ３−セッティングを用いた Fluorimager を用いて画像を撮った。次にゲルをエチジウム ブロマイド(EtBr)で染色し、ＥｔＢｒ−セッティングを用いて分析した。ゲルの画像は、何れのホスホロチオエートも含まない 天然のｃＲＮＡがマレイミドでラベルされないことを示した。サンプル３〜５において、ホスホロチオエート−ｃＲＮＡはラベルされなかったが、一方サンプル７〜９において、ホスホロチオエート−ｃＲＮＡはラベルされた。ゲルの画像は、ホスホロチオエート−ｃＲＮＡがアルキル化色素で処理した後にのみラベルされることを示した。
【００４８】
さらに、ＴＭＲ−マレイミド色素は、天然のｃＲＮＡ(サンプル１０)に対して、ホスホロチオ−ｃＲＮＡ(サンプル８)を選択的にラベルする。ＴＭＲ−ヨード アセトアミドは、天然のｃＲＮＡ(サンプル６)に対して、ホスホロチオ−ｃＲＮＡ(サンプル７)をラベルする際に選択性を示すが、その差は、ＴＭＲ−マレイミドの結果ほど大きくなかった。
【００４９】
予備的実施例４：マイクロアレイ分析
ＤＮＡマイクロアレイ上のｃＲＮＡの分析を行った。３つのマイクロアレイを調製した：
(１) Expression Analysis BioChip 上での in vitro 転写の際に、Ｃｙ３−ヌクレオシド トリホスフェートでラベルされたｃＲＮＡをハイブリダイズすることによって調製；
(２) Expression Analysis BioChip 上で、ＴＭＲ−マレイミドで、合成後にラベルされた、チオ ｃＲＮＡをハイブリダイズすることによって調製；そして
(３) Expression Analysis BioChip 上で、ＴＭＲ−マレイミドで、合成後にラベルされた、天然のラベルされていないｃＲＮＡをハイブリダイズすることによって調製。
【００５０】
マイクロアレイ分析は、ＴＭＲ−マレイミドを用いたα−チオ−ヌクレオシド トリホスフェートで合成されたｃＲＮＡの合成後のラベリングが、Ｃｙ３−ヌクレオチド直接組み込みで合成されたｃＲＮＡと同程度またはそれより効果的であることを示した。該分析は、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後に 非蛍光パターンが本質的に形成されないことから、ＴＭＲマレイミドでの天然のｃＲＮＡの非特異的ラベリングが、非常に制限されることを明示している。
【００５１】
実施例５：マイクロアレイおよびキット
プローブにおけるテンプレートは、市販されている。例えば、特定の人の遺伝子のセットは、Motorola Life Sciences, Northbrook, Illinois, USA から市販されている。プローブを製造し、支持体上に固定化し、マイクロアレイを形成する。in vitro 転写は、本発明に従う生体サンプル上で行われ得る(例えばチオ ヌクレオチドを用いて)。例えば、チオ ヌクレオチド基を有する核酸標的は、ラベルされ、マイクロアレイ上のプローブにハイブリダイズされ、検出され得る。
【００５２】
例示的な発現アッセイキットの組成を表２に示す。
【表２】
2005512544.tif 000010
【００５３】
望ましい発現アッセイ・キットは、少なくとも以下：
・マイクロアレイ支持体(プローブが結合しているもの またはしていないもの)；
・ラベル；および
・α−チオ ＮＴＰ試薬；
の構成のうち少なくとも２つを含む。
【００５４】
ＳＢＥを用いたＳＮＰ検出キットは、以下：
・放射性ラベルされていないα−チオ ジデオキシ ＮＴＰ、またはα−チオ アシクロ ＮＴＰ試薬；
・ラベル試薬；および
・マイクロアレイ支持体；
の構成のうち２つを含む。プローブは、支持体に結合し、マイクロアレイを形成し得る。ラベルは、発現キットとＳＮＰキットで異なり得る。
【００５５】
本発明の新規の発現アッセイは、非常に多くの利点を与える。例えばｃＲＮＡ転写物(またはｃＤＮＡ)は、合成後に様々な検出部分でラベルされ得る。ラベルされたｃＲＮＡは、標準的なマイクロアレイ法を用いて、またはマイクロフルイディック・デバイスで検出され得る。ｃＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡの分子はそれぞれ、ほぼ同数のα−チオホスフェート結合を有するため、ほぼ同等にラベルされ得る。このラベリング方法は、異なる遺伝子の相対発現レベルをよりよく予測し得、従ってよりよい“１分子計数”が可能となる。ＣＴＰまたはＴＴＰアナログのみを使用する現在の方法と同様に、全ての４つの天然のヌクレオチドの α−チオ ヌクレオシド トリホスフェートを、同じ反応に用い得る。従って、核酸は、アデノシン チオホスフェート基、シチジン チオホスフェート基、グアノシン チオホスフェート基、チミジン チオホスフェート基、およびウリジン チオホスフェート基からなる群の少なくとも３個もしくは４個の基を含むことが開示されている(基という用語は、本明細書中で、ポリマーを形成するのに用いられるモノマーに組み込まれた形態を言う)。さらに、その求核置換されたラベルされた形態も、ここに開示されている。
【００５６】
ラベリングが合成後に行われることから、多色素ラベリング・スキームが可能である。例えば１つの具体的態様において、幾つかのラベルされたヌクレオチドは、α−チオ ヌクレオシド トリホスフェートと共に、合成時に組み込まれ得る。さらに、１つの反応において得られたｃＲＮＡまたはｃＤＮＡは、幾つかの異なるラベリングおよび検出方法で用いられ得る。例えば、ポリヌクレオチドのサンプルを、別に分けて処理し得る。
【００５７】
本発明の新規の一塩基多型検出アッセイにおいて、α−チオ基を含む伸張されたプローブのみが、合成後の色素との反応の際にラベルされる。全ての修飾されたヌクレオチドの組み込みは、同様のレベルで制御され得、よりよい定量結果が得られる。
【００５８】
本発明の具体的態様が本明細書中の実施例として開示されているが、これらの具体的態様は、本発明から脱することなく広く変え得る。従って、前述の詳細な記載は本発明を制限するより、むしろ例示としてみなされることを意図しており、本発明の範囲を定義することを意図しているのは、全ての等価物(equivalent)を含む特許請求の範囲であると解される。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、本発明に従って行われる新規の発現アッセイを説明する図である。
【図２】図２は、本発明に従って行われる新規のＳＮＰアッセイを説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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