(57)【要約】新規ポリペプチドをコードする核酸配列を開示する。これらの核酸配列によりコードされるポリペプチド、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、ならびに該新規ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは該ポリペプチドに特異的な抗体の誘導体、変種、変異体またはフラグメントも開示する。該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを製造するためのベクター、宿主細胞、抗体および組み換え方法、ならびに該ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法も包含する。さらに本発明は、これらの核酸および蛋白のいずれかが関与している疾病の診断、治療および予防のための治療的、診断的および研究的方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２ｎからなる群より選択される配列決定された成熟型のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし１４１の整数であるポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし１４１の整数であるポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし１４１の整数であるポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列における１またはそれ以上の保存的置換を含むアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、ｎが１ないし１４１の整数である、ポリペプチド。
【請求項５】
天然に存在する、請求項１のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１のポリペプチドおよび担体を含む組成物。
【請求項７】
１またはそれ以上の容器中に請求項６の組成物を含むキット。
【請求項８】
ヒト疾患に付随する症候群を処置するための医薬の製造における治療剤の使用であって、該疾患が請求項１のポリペプチドと連関する病理から選択され、該治療剤が請求項１のポリペプチドを含むものである使用。
【請求項９】
試料中の請求項１のポリペプチドの存在または量を決定する方法であって、
（ａ）当該試料を提供し、
（ｂ）当該試料を、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入し、次いで
（ｃ）当該ポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定し、それによって当該試料中のポリペプチドの存在または量を決定する、
ことを含む方法。
【請求項１０】
第一の哺乳動物対象中の請求項１のポリペプチドの発現の変更レベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法であって、
ａ）第一の哺乳動物対象からの試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定し、次いで
ｂ）工程（ａ）の試料中の当該ポリペプチドの発現を、当該疾患を有しない、または素因がないと知られる第二の哺乳動物対象からの対照試料中に存在するポリペプチドの発現と比較する、
ことを含み、対照試料と比較したときの第一の対象におけるポリペプチドの発現のレベルの変化が当該疾患の存在または素因を指摘するものである方法。
【請求項１１】
請求項１のポリペプチドに結合する剤を同定する方法であって、
（ａ）当該剤に当該ポリペプチドを導入し、次いで
（ｂ）当該剤が当該ポリペプチドに結合するか否か決定する
ことを含む方法。
【請求項１２】
該剤が細胞性レセプターまたは下流エフェクターである請求項１１の方法。
【請求項１３】
病理の処置における潜在的治療剤を同定する方法であって、該病理が請求項１のポリペプチドの異常発現または異常生理学的相互作用に関連するものであり、
（ａ）請求項１のポリペプチドを発現する、かつ該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を有する細胞を提供し、
（ｂ）該細胞を、候補物質を含む組成物と接触させ、次いで
（ｃ）該物質が該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を変更するか否か決定することを含み、
上記工程を行うことにより、細胞が該物質不存在の組成物と接触させられた場合に、該物質の存在下で観察される変化が観察されないならば、該物質が潜在的な治療剤として同定されるものである方法。
【請求項１４】
請求項１のポリペプチドに連関する病理の活性または潜在または素因のモジュレーターをスクリーニングする方法であって、下記工程を含むものであり：
（ａ）試験化合物を、請求項１のポリペプチドと連関する病理の増加リスクにある、試験動物に投与し、ここで当該試験動物は請求項１のポリペプチドを組み換え的に発現するものであり、
（ｂ）工程（ａ）の化合物の投与後、当該試験動物における当該ポリペプチドの活性を測定し、次いで
（ｃ）当該試験動物における当該ポリペプチドの活性を、当該ポリペプチドを投与されていない対照動物における当該ポリペプチドの活性と比較し、当該対照動物について当該試験動物における当該ポリペプチドの活性の変化が、試験化合物が請求項１のポリペプチドと連関する病理の活性または潜在または素因のモジュレーターであることを指摘するものである方法。
【請求項１５】
当該試験動物が、試験タンパク質トランスジーンを発現するものであるか、あるいは野生型試験動物についての増加レベルにあるプロモーターの制御下の当該トランスジーンを発現するものであり、かつ、当該プロモーターが当該トランスジーンの本来の遺伝子プロモーターではない、請求項１４の方法。
【請求項１６】
請求項１のポリペプチドの活性を調節する方法であって、請求項１のポリペプチドを発現する細胞試料を、該ポリペプチドの活性を調節するに十分量の、当該ポリペプチドに結合する化合物と接触させることを含む方法。
【請求項１７】
請求項１のポリペプチドと連関する病理を処置または予防する方法であって、そのような処置または予防が望まれる対象に、対象における病理を処置または予防するのに十分量の請求項１のポリペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１８】
該対象がヒトである請求項１７の方法。
【請求項１９】
哺乳動物の病理学的状態を処置する方法であって、病理学的状態を緩和するのに十分である量のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含み、該ポリペプチドが配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列またはその生物学的活性フラグメントを有するポリペプチドであり、ここでｎが１ないし１４１の整数である方法。
【請求項２０】
配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子であって、ｎが１ないし１４１の整数である分子。
【請求項２１】
請求項２０の核酸分子であって、天然に存在する分子。
【請求項２２】
核酸分子であって、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列とは単一ヌクレオチドによって異なっており、ｎが１ないし１４１の整数である分子。
【請求項２３】
配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコードする単離核酸分子であって、ｎが１ないし１４１の整数である分子。
【請求項２４】
配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸を含む単離核酸分子であって、ｎが１ないし１４１の整数である、分子。
【請求項２５】
請求項２０の核酸分子であって、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列または当該ヌクレオチド配列の相補物にストリンジェント条件下でハイブリダイズするものであり、ｎが１ないし１４１の整数である分子。
【請求項２６】
請求項２０の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
該核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターを含む請求項２６の方法。
【請求項２８】
請求項２６のベクターを含む細胞。
【請求項２９】
請求項１のポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体。
【請求項３０】
モノクローナル抗体である請求項２９の抗体。
【請求項３１】
ヒト化抗体である請求項２９の抗体。
【請求項３２】
試料中の請求項２０の核酸分子の存在または量を決定する方法であって、
（ａ）該試料を提供し
（ｂ）該試料を、当該核酸分子に結合するプローブに導入し、次いで
（ｃ）該核酸分子に結合する当該プローブの存在または量を決定する
ことを含み、当該試料中の核酸の存在または量が決定される方法。
【請求項３３】
核酸分子の存在または量が細胞または組織型についてのマーカーとして使用される請求項３２の方法。
【請求項３４】
該細胞または組織型が癌性である請求項３３の方法。
【請求項３５】
第一の哺乳動物対象における請求項２０の核酸分子の発現の変更レベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法であって、
ａ）該第一の哺乳動物対象からの試料中の核酸の発現のレベルを測定し、次いで
ｂ）工程（ａ）の試料中の当該核酸の発現のレベルを、該疾患を有しないまたは素因がないと知られる第二の哺乳動物対象からの対照試料に存在する核酸の発現のレベルと比較する
ことを含み、ここで該対照試料と比較した場合の第一の対象における核酸の発現のレベルの変化が該疾患の存在または素因を指摘するものである方法。
【請求項３６】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、該ポリペプチドの発現につながる条件下で細胞を培養することを含み、ここで当該細胞が配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含むものであり、ｎが１ないし１４１の整数である方法。
【請求項３７】
該細胞が細菌細胞である請求項３６の方法。
【請求項３８】
該細胞が昆虫細胞である請求項３６の方法。
【請求項３９】
該細胞が酵母細胞である請求項３６の方法。
【請求項４０】
該細胞が哺乳動物細胞である請求項３６の方法。
【請求項４１】
請求項２のポリペプチドの生産方法であって、ポリペプチドの発現につながる条件下で細胞を培養することを含み、当該細胞が配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列を含む単離核酸分子を含むベクターを含むものであり、ｎが１ないし１４１の整数である方法。
【請求項４２】
該細胞が細菌細胞である請求項４１の方法。
【請求項４３】
該細胞が昆虫細胞である請求項４１の方法。
【請求項４４】
該細胞が酵母細胞である請求項４１の方法。
【請求項４５】
該細胞が哺乳動物細胞である請求項４１の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、小分子薬物の標的であり、かつ細胞、組織、器官または生物の生化学的または生理学的応答の刺激に関する特性を有する新規ポリペプチドに関する。より具体的には、新規ポリペプチドは、新規遺伝子の遺伝子産物であり、またはその特異的生物学的活性フラグメントまたは誘導体である。使用の方法は、診断および予後アッセイ手法並びに広範な病理学的状態を処置する方法を包含する。
【０００２】
（背景技術）
真核細胞は、通常の条件下では細胞の維持および増殖を達成するために精妙にバランスを受けている、生化学的および生理学的方法を特色とする。そのような細胞が脊椎動物のような多細胞生物、またはさらに特別には哺乳動物のような生物の構成要素であるとき、生化学的および生理学的方法の調節には精緻な情報伝達経路を伴う。しばしば、そのような情報伝達経路は、細胞外の情報伝達タンパク質、情報伝達タンパク質に結合する細胞性受容体、および細胞内に局在する情報伝達構成要素に関与する。
【０００３】
情報伝達タンパク質は、内分泌性エフェクター、パラクリンエフェクターまたはオートクリンエフェクターに分類され得る。内分泌性エフェクターは特定の器官により循環系中に分泌される情報伝達分子であり、これは次いで遠隔の標的器官または標的組織へと輸送される。標的細胞は内分泌性エフェクターの受容体を含み、内分泌性エフェクターが結合すると情報伝達カスケードが誘導される。パラクリンエフェクターには、互いに近傍にある分泌細胞と受容細胞、例えば同じ組織または器官内の２つの異なるクラスの細胞が関与する。あるクラスの細胞がパラクリンエフェクターを分泌し、これが次いで、例えば細胞外液を介する拡散により、第２のクラスの細胞に到達する。第２のクラスの細胞はパラクリンエフェクターに対する受容体を含有しており、エフェクターの結合は情報伝達カスケードを誘導し、これが対応する生化学的または生理学的作用を誘起する。オートクリンエフェクターは、オートクリンエフェクターを分泌する同じタイプの細胞が受容体をも含有していること以外は、パラクリンエフェクターと高度の類似性を有している。かくして、オートクリンエフェクターは、同じ細胞上でまた同じ近接する細胞上で受容体に結合する。次いで、結合過程は特色的な生化学的または生理学的作用をひき起こす。
【０００４】
情報伝達過程は細胞および組織に対し、これらに限定されない例として、細胞または組織の増殖の誘導、成長または増殖の抑制、細胞または組織の分化または成熟の誘導、および細胞または組織の分化または成熟の抑制を含む多様な影響をひき起こし得る。
【０００５】
多くの病理学的状態には、重要なエフェクタータンパク質の発現の調節不全が関与している。特定のクラスの病態においては、調節不全は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の縮減または抑制レベルとして現れる。病理の他の種類では、非調節は、タンパク質エフェクターの合成および分泌の増加または上方調節レベルとして明示される。臨床現場において、対象が興味のあるタンパク質エフェクターレベルの増加または過多によりもたらされる異常に罹患していることを疑うことがある。それ故に、そのような対象由来の生物学的試料中の興味のあるタンパク質エフェクターのレベルをアッセイし、そしてそのレベルを非病態的状態に特色的なものと比較する必要がある。また、製造の産物としてタンパク質エフェクターを提供する必要性がある。その必要のある対象にエフェクターを投与することは、病理学的状態の処置に有用である。よって、興味あるタンパク質エフェクターの縮減または抑制レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法のための必要性がある。加えて、興味の対象となるタンパク質エフェクターの増加または上方調節レベルによってもたらされる病理学的状態の処置の方法の必要性がある。さらに、興味の対象となるタンパク質エフェクターの増大または上方調節されたレベルにより引き起こされる病理学的状態の治療方法に対する必要性がある。
【０００６】
抗体は、特異的に特定の抗原に結合し、同種の抗原でない物質にはほとんど結合しないか、あるいは全く結合しない多鎖蛋白である。抗体は軽鎖とよばれる２本の短い鎖および重鎖とよばれる２本の長い鎖を含む。これらの鎖は免疫グロブリンドメインを構成しており、それらのドメインは、一般的には、２つのクラスがある：それらは１本の鎖あたり１個の可変ドメイン、軽鎖中の１個の不変ドメイン、および重鎖中の３個またはそれ以上の不変ドメインである。免疫グロブリン分子の抗原特異的部分は可変ドメイン中にあり；１本の軽鎖および１本の重鎖の可変ドメインが互いに結合して抗原結合部分を形成する。免疫特異的に同属または標的抗原に結合する抗体は高いアフィニティーで結合する。したがって、試料中の抗原の存在に関して特異的にアッセイすることにおいてそれらは有用である。さらに、それらは抗原の活性を不活性化させる潜在能力を有する。
【０００７】
それゆえ、かかる対象からの生物学的試料中の興味の対象である蛋白エフェクターのレベルをアッセイし、このレベルを病理学的状態にないことを特徴とするレベルと比較する必要がある。特に、抗原に免疫特異的に結合する抗体を用いることに基づくかかるアッセイに対する必要性がある。さらに、病理学的状態が上昇したあるいは過剰なエフェクターのレベルから生じる場合において、エフェクターに免疫特異的に結合する抗体の使用に基づいて蛋白エフェクターの活性を阻害する必要がある。よって、製造結果物としての抗体に対する必要性がある。さらに、抗体を対象に投与することに基づく、興味の対象である蛋白の上昇したあるいは過剰なレベルにより生じる病理学的状態の治療方法に対する必要性もある。
【０００８】
(発明の要約)
本発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドの発見に一部基づき、ここでｎは、１と１４１の間の整数である。新規核酸及びポリペプチドはＮＯＶＸまたはＮＯＶ１、ＮＯＶ２、ＮＯＶ３など核酸およびポリペプチドとしてここに言及する。これらの核酸及びポリペプチド並びにその誘導体、相同物、類似体およびフラグメントは、以後集合的に「ＮＯＶＸ」核酸またはポリペプチド配列として命名する。
【０００９】
発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型の変異体に一部基づき、ここでｎは、１と１４１の間の整数であり、ここで成熟型の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化している。ただし、成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸残基はそのように変化している。他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここでｎは、１と１４１の間である。他の実施態様では、発明はまた、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の変異体を含み、ここでｎは、１と１４１の間の整数であり、ここで選択された配列中に特定される任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化している。ただし、配列中の１５％を超えないアミノ酸残基が、そのように変化している。発明はまた、配列番号２ｎからなる群から選択されるアミノ酸配列の成熟型のいずれかのフラグメント、またはこの群から選択される任意の他のアミノ酸配列に関係し、ここでｎは１と１４１の間の整数である。発明は、残基の１５％までが変化しているこれらの群からのフラグメントを含む。
【００１０】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択される配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であるポリペプチドを含み、ここで、ｎは１と１４１の間の整数である。これらの対立遺伝子変異体は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列からの単一ヌクレオチドによって異なる核酸配列の翻訳物である、アミノ酸配列を含み、ここでｎは１と１４１の間である。変異体ポリペプチドは、選択された配列で任意のアミノ酸が変化している場合、変化して保存置換を提供する。
【００１１】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、および薬学的許容可能担体に関係する医薬組成物を含む。他の実施態様では、発明は、１または２以上の容器中にこの医薬組成物を含む、キットに関係する。
【００１２】
他の実施態様では、発明は、ヒト疾患に随伴する症候群を処置する医薬の製造における治療剤の用途を含み、該疾患は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと連関する病理から選択され、ここでｎは、１と１４１の間での整数であり、ここで当該治療剤は、この群から選択されるポリペプチドである。
【００１３】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの存在または量を決定する方法を含み、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法は、試料を提供すること；試料を、ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体に導入すること；およびポリペプチドに結合した抗体の存在または量を決定し、それによって試料中のポリペプチドの存在または量を決定することに関係する。
【００１４】
別の実施態様では、発明は、第一の哺乳動物対象において、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの変化したレベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法を含み、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法は、第一の哺乳動物対象からの試料中のポリペプチドの発現のレベルを測定すること；およびこの試料中の該ポリペプチドの量を、該疾患を有しない、または素因がないと知られる第二の哺乳動物対象からの対照試料中に存在する該ポリペプチドの量と比較することに関係し、ここで該対照試料と比較した場合の、該第一の対象のポリペプチドの発現レベルの変化は、該疾患の存在または素因を指摘する。
【００１５】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する薬剤を同定する方法に関係し、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法は、該薬剤へ該ポリペプチドを導入すること；および該薬剤が該ポリペプチドに結合するか否か決定することを含む。該薬剤は、細胞性レセプターまたは下流エフェクターでありうる。
【００１６】
他の実施態様では、発明は、病理の処置における使用のための潜在的治療薬剤を同定する方法に関係し、ここで該病理は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの異常発現または異常生理学的相互作用に関し、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法は、発明のポリペプチドを発現するおよび該ポリペプチドに帰すべき特性または機能を有する細胞を提供する；該細胞を、候補物質を含む組成物と接触する；および物質がポリペプチドに帰すべき特性または機能を変化させるか決定する；それによってもし物質の存在下観察される変化が、細胞を物質のない組成物と接触させたときに観察されないならば、該物質は、潜在的治療的剤として同定される。
【００１７】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに連関する病理の活性または潜在または素因のモジュレーターについてのスクリーニング方法に関係し、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法は、発明のポリペプチドと連関する病理の増加リスクのある試験動物へ試験化合物を投与すること、ここで該試験動物は、発明のポリペプチドを組み換え的に発現し；試験化合物を投与後の、試験動物におけるポリペプチドの活性を測定すること；および試験動物のタンパク質の活性を、ポリペプチドを投与してない対照動物のポリペプチドの活性と比較すること、ここで試験動物におけるポリペプチドの活性の、対照動物に対する変化は、発明のポリペプチドと連関する病理の潜在または素因のモジュレーターであることを指摘する。組み換え体試験動物は、野生型試験動物に対する増加レベルの、タンパク質トランスジーンまたはプロモーターの制御下のトランスジーンを発現しうる。
【００１８】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列のポリペプチドの活性を調節する方法に関し、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法はポリペプチドの活性を調節するために十分な量の、ポリペプチドに結合する化合物と、該ポリペプチドを発現する細胞試料を導入することを含む。
【００１９】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと連関する病理を処置または予防する方法に関係し、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法は、そのような処置または予防が、該対象の病理を処置または予防するため十分の量で望まれる対象に、ポリペプチドを投与することを含む。対象はヒトを包含しうる。
【００２０】
他の実施態様では、発明は、哺乳動物の病理学的状態を処置する方法に関係し、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分量のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含み、ここで該ポリペプチドは、配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその生物学的活性フラグメントであり、ここでｎは、１と１４１の間の整数である。
【００２１】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子、ここでｎは１と１４１の間の整数である；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟型の変異体、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、ここで選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化されている。ただし成熟型の配列中の１５％を超えないアミノ酸残基はそのように変化している；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列、ここでｎは１と１４１の間の整数である；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列の変異体、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、ここに選択された配列中に特定される任意のアミノ酸は異なるアミノ酸に変化される。ただし配列中の１５％を超えないアミノ酸残基は、そのように変化している；配列番号２ｎからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸フラグメント、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、またはポリペプチドの任意の変異体であり、ここで選択の配列の任意のアミノ酸は、異なるアミノ酸に変化される。ただし、配列中の１０％を超えないアミノ酸残基は、そのように変化される；および核酸分子のいずれかの相補物に関係する。
【００２２】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、ここで核酸分子は、天然に存在する対立遺伝子核酸変異体のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子に関係し、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、それは変異体ポリペプチドをコードし、ここで該変異体ポリペプチドは、天然存在ポリペプチド変異体のポリペプチド配列を有する。
【００２４】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、ここで核酸分子は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される核酸配列と単一ヌクレオチドによって相違し、ここでｎは１と１４１の間の整数である。
【００２５】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、ここで核酸分子は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み；ここでヌクレオチド配列中の１または２以上のヌクレオチドが配列番号２ｎ−１からなる群より選択される、ここでｎは１と１４１の間の整数である、ヌクレオチド配列が、選択された配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチドに変化している。ただし１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化する；配列番号２ｎ−１からなる群より選択される配列の核酸フラグメント、ここでｎは１と１４１の間の整数である；およびここでヌクレオチド配列中の１または２以上のヌクレオチドが、配列番号２ｎ−１からなる群より選択される、ここでｎは１と１４１の間の整数である、核酸フラグメントが、選択配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチドに変化している。ただし１５％を超えないヌクレオチドがそのように変化する。
【００２６】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、ここで該核酸は、配列番号２ｎ−１からなる群より選択されるヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列の相補物に、厳密（ストリンジェント）条件下でハイブリダイズし、ここでｎは１と１４１の間の整数である。
【００２７】
他の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を有する単離核酸分子を含み、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、ここで核酸分子はヌクレオチド配列を有し、ここに選択されたヌクレオチド配列のコーディング配列中に特定される任意のヌクレオチドは、選択配列からなる群より選択されるものから、異なるヌクレオチド（ただし、選択されたコーディング配列中の、１５％を超えないヌクレオチドは、そのように変化されている）、第一のポリヌクレオチドの相補物である単離された第二のポリヌクレオチド、またはそれらいずれかのフラグメントに変化される。
【００２８】
他の実施態様では、発明は、配列番号２に与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子を含むベクターを含み、ここでｎは１と１４１の間の整数である。このベクターは核酸分子に作動可能に連結されるプロモーターを有することができる。このベクターは、細胞内に位置することができる。
【００２９】
別の実施態様では、発明は、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子の存在または量を決定する方法に関係し、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法は、試料を提供すること；試料を、核酸分子に結合するプローブに導入すること；および核酸分子に結合したプローブの存在または量を決定し、それによって試料中の核酸分子の存在または量を決定することを含む。核酸分子の存在または量を細胞または組織型のためのマーカーとして使用する。細胞型は、がんであってもよい。
【００３０】
別の実施態様では、発明は、第一の哺乳動物対象において、配列番号２ｎに与えるアミノ酸配列の成熟型からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を有する核酸分子の変化レベルと連関する疾患の存在または素因を決定する方法に関し、ここでｎは１と１４１の間の整数であり、該方法は、第一の哺乳動物対象からの試料中の核酸の量を測定すること；および工程（ａ）の試料中の核酸の量を、疾患を有しないまたは素因がないと知られる第二の哺乳動物対象からの対照試料中に存在する核酸の量を比較することを含み；ここで対照試料と比較した場合の、第一の対象中に存在する核酸のレベルの変化は、疾患の存在または素因を指摘する。
【００３１】
さらに本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。ＮＯＶＸ  抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、または完全なヒト抗体であってよい。好ましくは、抗体は、それに対するＮＯＶＸポリペプチドの結合に関して１ｘ１０−９Ｍ未満の解離定数を有する。より好ましくは、ＮＯＶＸ抗体はＮＯＶＸポリペプチドの活性を中和するものである。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに関連したヒトの疾病に関連した症候群の処置にための医薬の製造における治療薬の使用を提供する。好ましくは、治療薬はＮＯＶＸ抗体である。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、疾病を治療または予防するに十分な量のＮＯＶＸ抗体を対象に投与することによる、ＮＯＶＸ関連疾病の治療または予防方法、哺乳動物における病理学的状態の治療方法、ならびにポリペプチドに関連した病気の治療または予防方法を提供する。
【００３４】
特に規定されない限り、本明細書で使用する全ての技術的および科学的用語は本発明が属する技術分野に通常の技能を有する業者により普通に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で説明されるものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許申請、特許、および他の参考文献は全体的な出典明示により本明細書の一部とする。抵触がある場合には本明細書が、定義を含め優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示的なものであって限定することを意図しない。
【００３５】
本発明の他の特性および利点は以下の発明の開示および請求項より明らかであろう。
【００３６】
（発明の開示）
本発明は、新規ヌクレオチドおよびそれによりコードされたポリペプチドを提供する。本発明は、新規核酸配列、それらのコードされたポリペプチド、抗体、および他の関連化合物を含む。本明細書において、配列を「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」と総称し、対応するコードされたポリペプチドを「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」と称する。別段の記述がない限り、「ＮＯＶＸ」は本明細書に開示される任意の新規配列を指すことを意味する。表ＡにＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドの要約を示す。
【００３７】
表Ａ：配列および対応する配列番号
【表１】
2005520496.tif 000002
【表２】
2005520496.tif 000003
【表３】
2005520496.tif 000004
【表４】
2005520496.tif 000005
【表５】
2005520496.tif 000006
【表６】
2005520496.tif 000007
【表７】
2005520496.tif 000008
【００３８】
表ＡはＮＯＶＸポリペプチドの既知のタンパク質ファミリーとの相同性を示す。従って、表１の第１欄で特定されるＮＯＶＸに対応する本発明に従う核酸およりポリヌクレオチド、抗体および関連化合物は、例えば、表Ａの第５欄に特定される既知タンパク質ファミリーに関連する病変および疾患に関係する治療的応用および診断的応用において有用である。
【００３９】
ＮＯＶＸ配列と連関する病理、疾患、障害および状態などは、限定しないが、例えば以下のものを含む：心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、先天性心疾患、大動脈弁狭窄、心房中隔欠損症（ＡＳＤ）、房室（Ａ−Ｖ）管欠損、動脈管、肺動脈弁狭窄症、大動脈弁下部狭窄、心室中隔欠損症（ＶＳＤ）、弁疾患、結節硬化症、強皮症、肥満、肥満に連関する代謝妨害、移植、副腎白質萎縮症、先天性副腎過形成、前立腺癌、糖尿病、代謝障害、新生物；腺癌、リンパ腫、子宮癌、受胎能、血友病、凝固性亢進、特発性血小板減少性紫斑病、免疫不全、移植片対宿主疾患、ＡＩＤＳ、気管支喘息、クローン病；多発性硬化症、Albright遺伝性骨ジストロフィー（Ostoeodystrophy）、感染性疾患、食欲不振、癌連関悪液質、癌、神経変性性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害であって自己免疫障害を含むもの、造血障害、および種々の異常脂血症、代謝症候群Ｘおよび慢性疾患および種々の癌、並びに状態例えば移植、神経保護、繁殖及び生殖と連関する消耗性障害。
【００４０】
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、前記タンパク質とのドメインおよび配列関連性の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを用いて、ＮＯＶＸポリペプチドが属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定し得る。
【００４１】
表Ａの第５欄で特定されるタンパク質ファミリーの他の既知のメンバーと一致して、本発明のＮＯＶＸポリペプチドは、そのようなタンパク質ファミリーの他のメンバーに相同性を示し、そしてそれらを特徴とするドメインを含有する。それぞれのＮＯＶＸについての配列関連性分析およびドメイン分析の詳細を実施例Ａに示す。
【００４２】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸの活性または機能を阻害または促進する分子をスクリーニングするのに使用し得る。特に、本発明に従う核酸およびポリペプチドは、表Ａに掲げたタンパク質ファミリーと関連する疾患を調整または阻害する低分子の同定用の標的として使用され得る。
【００４３】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドはまた、特定の細胞タイプを検出にも有用である。ＮＯＶＸそれぞれに対する発現分析の詳細を実施例Ｃに示す。従って、本発明に従うＮＯＶＸ核酸、ポリペプチド、抗体および関連化合物は、正常組織対疾患組織、例えば、種々のがん、において異なる発現を有する種々の疾患の検出における診断的応用および治療的応用を有する。
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドのさらに別の利用法が本明細書に開示される。
【００４４】
ＮＯＶＸクローン
ＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、種々の応用および状況において有用である。本発明に従う種々のＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、上記該タンパク質と関連するドメインおよび配列の存在に従うタンパク質ファミリーの新規メンバーとして有用である。加えて、ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドが所属するファミリーのメンバーであるタンパク質を同定するために使用し得る。
【００４５】
ＮＯＶＸ遺伝子およびそれらの対応するコードされたタンパク質は、例えば、タンパク質治療または遺伝子治療により、医学的状態を予防、処置または緩和するのに有用である。病態を、試料中の新規タンパク質の量を測定または新規遺伝子中の変異の存在を測定することにより診断し得る。ＮＯＶＸ遺伝子が最も高発現する組織に基づいて、それぞれのＮＯＶＸ遺伝子に対する特異的な使用を説明する。使用は、種々の疾患および障害を診断または処置するための産物を開発することを含む。
【００４６】
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は、潜在的な診断応用および治療応用、および研究ツールとして有用である。これらは、特異的または選択的核酸、またはタンパク質、診断マーカーおよび／または予後マーカーとして役立つことを含む。ここで核酸またはタンパク質の存在または量、ならびに以下のような潜在的な治療応用を評価する：（ｉ）タンパク質治療薬、（ｉｉ）低分子薬の標的、（ｉｉｉ）抗体の標的（治療的、診断的、薬のターゲティング／細胞毒性抗体）、（ｉｖ）遺伝子治療（遺伝子デリバリー／遺伝子手術）に有用な核酸、および（ｖ）インビトロおよびインビボでの組織再生を促進する組成物、（ｖｉ）生物学的防衛兵器。
【００４７】
一つの特定の実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体、但し、成熟型中の任意のアミノ酸は、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ変異体、但し、選択された配列で特定される任意のアミノ酸は、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている；およびｅ）ａ）ないしｄ）のいずれかのフラグメント、からなる群から選択したアミノ酸配列を含有する単離ポリペプチドを含む。
【００４８】
もう一つの特別な実施態様では、本発明は、(ａ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）を与えられたアミノ酸配列を持つ成熟型；(ｂ)配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ成熟型の変異体であり、選択された配列の成熟型中の任意のアミノ酸が、成熟型の配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；(ｃ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列；(ｄ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列の変異体であり、選択された配列中の特定されるアミノ酸が、配列中のアミノ酸残基の１５％以下が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、変異体；および(ｅ) 配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも一部分、または選択された配列の任意のアミノ酸が、配列においてアミノ酸残基の１０％未満が変更を受けるという条件で異なるアミノ酸に変更されている、ポリペプチドの任意の変異体をコードする核酸のフラグメント；および(ｆ) 核酸分子のいずれかの相補的分子、からなる群より選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子を含む。
【００４９】
なおもう一つの特別な実施態様では、本発明は単離核酸分子を含む。ここで該核酸分子は、(ａ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列；(ｂ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されているヌクレオチド配列；(ｃ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択される配列を持つ核酸フラグメント；および(ｄ) 配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）からなる群から選択されるヌクレオチド配列中で一つまたはそれ以上のヌクレオチドが、選択された配列からなる群から選択されるものから、ヌクレオチドの１５％以下が変更を受けるという条件で異なるヌクレオチドに変更されている核酸フラグメント、からなる群より選択したヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド
本発明の一つの態様は、ＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子に関する。また、本発明は、ＮＯＶＸをコードする核酸(例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ)を同定するためのハイブリダーゼーションプローブとしての使用に十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅および／または変異用のＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントを含む。本明細書において使用する用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子(例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ)、ＲＮＡ分子(例えば、ｍＲＮＡ)、ヌクレオチド類似体を用いて生成されたＤＮＡ類似体またはＲＮＡ類似体、およびそれらの誘導体、フラグメントおよび相同体を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５１】
ＮＯＶＸ核酸は成熟ＮＯＶＸポリペプチドをコードし得る。本明細書において使用するように、本発明に開示するポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型とは、天然に存在するポリペプチド、または前駆体、またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、限定されない例として、対応する遺伝子によりコードされる全長遺伝子産物を含む。これに代えて、本明細書に説明するＯＲＦによりコードするポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義し得る。産物の「成熟」型は、限定されない例として、遺伝子産物を生じる細胞(例えば、宿主細胞)内で起こり得る一つまたはそれ以上の天然に存在するプロセシングステップの結果として生じる。ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型を導くそのようなプロセシングステップの例として、ＯＲＦの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を挙げる。従って、残基１がＮ末端メチオニンである１〜Ｎの残基を有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟型は、Ｎ末端メチオニン除去後に残存する残基２〜Ｎを有する。これに代えて、残基１〜残基ＭからＮ末端シグナル配列を切断する、残基１〜Ｎを有する前駆ポリペプチドまたはタンパク質より生じる成熟型は、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎからの残基を有する。さらに本明細書において使用するように、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟」型はタンパク質分解による切断事象以外の翻訳後の工程により生じ得る。そのようなさらに別な方法は、限定されない例として、グリコシル化、ミリストイル化、またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質を、これらの方法のただ一つ、またはそれらのいずれかの組合せの操作によりもたらし得る。
【００５２】
本明細書において使用する用語「プローブ」は、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド(ｎｔ)から約１００ｎｔの間、または特定の使用によっては約、例えば６０００ｎｔもの長さである可変的長さの核酸配列を指す。プローブを、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出に使用し得る。より長いプローブを天然または組換え供給源から一般的に得る。より長いプローブは、特異性が高くより短い長さのオリゴマーのプローブよりハイブリダイズするのが遅い。プローブは、一本鎖または二本鎖でもよく、そしてＰＣＲ、メンブレン−ベースのハイブリダイゼーション技術、またはＥＬＩＳＡ様技術において特異性を有するようにデザインされ得る。
【００５３】
本明細書において使用する用語「単離」核酸分子は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸である。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列(即ち核酸の５'末端および３'末端に位置する配列)を有しない。例えば、種々の実施態様において、単離ＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞／組織(例えば、脳、心臓、肝臓、脾臓等)のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０.５ｋｂ、０.１ｋｂ以下、またはそれ未満のヌクレオチド配列を含有し得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、他の細胞性物質、培地、または化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５４】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列の相補物を、標準的分子生物学の技術および本明細書に示す配列情報を用いて単離し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術(例えば、Sambrook, et al., (eds.), MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; and Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載されるように)を用いてＮＯＶＸ分子を単離し得る。
【００５５】
本発明の核酸は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはこれに代えてゲノムＤＮＡを使用して標準的ＰＣＲ増幅技術にしたがって適切なオリゴヌクレオチドプライマーで増幅し得る。そのように増幅した核酸を、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成技術、例えば自動ＤＮＡ合成装置の使用、により調製し得る。
【００５６】
本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結するヌクレオチド残基を指す。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るし、またはそれらからデザインし得る。そして短いオリゴヌクレオチド配列を使用して、特定の細胞または組織の同一、類似、または相補的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在を増幅し、確認し、または明らかにする。オリゴヌクレオチドは、長さ約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ｎｔ、好ましくは長さ約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列を含む。本発明の一つの実施態様では、長さ１００ｎｔ未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の少なくとも６個の連続したヌクレオチド、またはそれらの相補物をさらに含む。オリゴヌクレオチドを、化学的に合成し、プローブとして使用し得る。
【００５７】
もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）に示すヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部(例えば、ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分をコードするプローブ、プライマー、またはフラグメントとして使用し得るフラグメント)の相補物である核酸分子を含む。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）を示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）を示すヌクレオチド配列に十分に相補的であるものであり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）を示すヌクレオチド配列と殆どミスマッチなしでまたは全くミスマッチ無しで水素結合し得。そのため核酸分子は安定な二本鎖を形成する。
【００５８】
本明細書において使用する用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を指し、用語「結合」は、２個のポリペプチドまたは化合物、または関連するポリペプチドまたは化合物またはそれらの組合せ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン、非イオン、ファン・デル・ワールス、疎水性相互作用等を含む。物理的相互作用は直接的または間接的であり得る。間接的相互作用は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因るものであり得る。直接的結合は、他のポリペプチドまたは化合物の作用を介したまたはこれに因り起こるのではなく、代わりに他の実質的な化学的仲介物無しで起こる相互作用を指す。
【００５９】
本明細書で提供する「フラグメント」は、核酸の場合特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さ、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識に十分な長さである、少なくとも６個の(連続した)核酸または少なくとも４個の(連続した)アミノ酸の配列として定義され、そして全長より短いほとんどの或る一部である。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分から由来するものであり得る。
【００６０】
全長ＮＯＶＸのクローンを、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびインフレームの停止コドンを含有するとして同定する。ＡＴＧ開始コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、それ故にれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断（truncated）型Ｃ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の５'方向へ伸長することを要求する。インフレームの停止コドンを欠く任意の開示するＮＯＶＸヌクレオチド配列は、同様にそれぞれのＮＯＶＸポリペプチドの切断型Ｎ末端フラグメントをコードし、対応する全長ｃＤＮＡが開示する配列の３'方向へ伸長することを要求する。
誘導体は、もとの化合物から直接、修飾によりまたは部分的置換によるいずれかで生成した核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、もとの化合物に類似しているが同一ではない構造を有する核酸配列またはアミノ酸配列であり、例えば、それらは特定の成分または側鎖に関して天然化合物と異なっている。類似体は、合成であり得るし異なる進化起源を由来とし得るし、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。相同体は、異なる種を由来とする特定の遺伝子の核酸配列またはアミノ酸配列である。
【００６１】
誘導体および類似体は全長または全長以外であり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体または類似体は、同一サイズの核酸またはアミノ酸配列に亘って、または当該分野において公知のコンピューター相同性プログラムによりアラインメントしたアラインメント配列と比較した際、種々の実施態様において、少なくとも約７０％、８０％、または９５％の同一性(好ましくは、８０〜９５％の同一性)で本発明の核酸またはタンパク質に実質的に相同である領域を含む分子、またはそれらのコードする核酸が本発明のタンパク質をコードする配列の相補物に厳密、中等度に厳密、または低い厳密度の条件下でハイブリダイズ可能である分子を含むが、これらに限定されない。例えば、Ausubel, et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および以下を参照されたい。
【００６２】
「相同な核酸配列」または「相同なアミノ酸配列」またはそれらの変異体は、上述のようにヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性を特徴とする配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードするこれらの配列を含む。アイソフォームを、例えばＲＮＡの選択的スプライシングの結果として同じ生物の異なる組織において発現し得る。これに代えて、アイソフォームを、異なる遺伝子によりコードし得る。本発明では、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、脊椎動物を含むが脊椎動物に限定されない。よって例えば、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、および他の生物を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、本明細書に示すヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子変異体および突然変異体を含むが、これらに限定しない。しかしながら、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の保存的アミノ酸置換(下記参照)をコードする核酸配列ならびにＮＯＶＸの生物活性を有するポリペプチドを含む。ＮＯＶＸタンパク質の種々の生物学的活性を、以下に説明する。
【００６３】
ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸ核酸のオープンリーディングフレーム(「ＯＲＦ」)によりコードされる。ＯＲＦは、ポリペプチドに潜在的に翻訳し得るヌクレオチドに対応する。ＯＲＦを含む一連の核酸を、停止コドンにより中断しない。全長タンパク質をコードする配列を表すＯＲＦは、ＡＴＧ「開始」コドンで始まり、３種の「停止」コドン即ちＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡの一つで終わる。本発明の目的のため、ＯＲＦは、開始コドン、停止コドン、またはその両方があってもなくてもよい、コード化配列の任意の部分であり得る。ＯＲＦを真正の細胞性タンパク質をコードする良好な候補として考えるために、最小限の要件、例えば、５０個のアミノ酸またはそれ以上をコードする一連のＤＮＡ、がしばしば定められる。
【００６４】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定するヌクレオチド配列は、他の細胞タイプ、例えば他の組織由来のＮＯＶＸ相同体、ならびに他の脊椎動物由来のＮＯＶＸ相同体を同定および／またはクローニングする際の使用のためにデザインするプローブおよびプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを典型的に含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００個の連続したセンス鎖のヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の天然に存在する変異体に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を典型的に含む。
【００６５】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出するのに使用し得る。種々の実施態様において、プローブは検出可能な標識がつけられており、例えば、標識は放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素のコファクターであり得る。かかるプローブは、対象由来の細胞試料中のあるＮＯＶＸコード化核酸のレベルを測定することによるように、あるＮＯＶＸタンパク質を誤って発現している細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部として使用し得る、例えば、ＮＯＶＸのｍＲＮＡを検出するかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異または欠失をしたか否かを測定する。
【００６６】
「ＮＯＶＸポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的分析において測定するような成熟型を含み、本発明のポリペプチドの活性に類似な、しかし必ずしも同一ではない活性を用量依存性の有無を問わず発揮するポリペプチドを指す。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントを、あるＮＯＶＸの生物活性(ＮＯＶＸタンパク質の生物活性を以下に説明する)を有するポリペプチドをコードする配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の一部を単離し、ＮＯＶＸタンパク質のコードする部分を発現し(例えば、インビトロ組換え発現により)、ＮＯＶＸのコードする部分の活性を評価するすることにより調製し得る。
【００６７】
ＮＯＶＸ核酸およびポリペプチド変異体
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重により配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）に示すヌクレオチド配列と異なっており、従って配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）に示すヌクレオチド配列によりコードするのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子を包含する。もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００６８】
配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）に示すヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列の多型が、集団(例えばヒトの集団)中に存在し得ることを当業者は理解する。ＮＯＶＸ遺伝子のかかる遺伝子多型は、天然の対立遺伝子変異に因り集団の中の個体間に存在し得る。本明細書において使用する用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは脊椎動物のＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む核酸分子を指す。かかる天然の対立遺伝子変異は、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列中に１〜５％の変異を典型的にもたらす。天然の対立遺伝子変異の結果でありＮＯＶＸポリペプチドの機能活性を変化しない任意のおよび全てのかかるヌクレオチド変異およびそこで得られるＮＯＶＸポリペプチド中のアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００６９】
さらに、他の種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子、および従ってヒト配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。本発明のＮＯＶＸｃＤＮＡの天然の対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子は、厳密なハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとしてヒトｃＤＮＡまたはその一部を用いて、本明細書に開示するヒトＮＯＶＸ核酸との相同性に基づいて単離し得る。
【００７０】
従って、もう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子は少なくとも６ヌクレオチド長であり、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子に厳密な条件下でハイブリダイズする。もう一つの実施態様では、核酸は少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００またはそれ以上のヌクレオチド長である。なおもう一つの実施態様では、本発明の単離核酸分子はコード化領域にハイブリダイズする。本明細書において用いる用語「厳密な条件下でハイブリダイズする」は、お互いに少なくとも約６５％相同なヌクレオチド配列がお互いに典型的にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション条件および洗滌条件を記載することを意図する。
【００７１】
相同体(即ち、ヒト以外の生物種由来のＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸)または他の関連配列(例えばパラログ)を、核酸のハイブリダイゼーションおよびクローニングの当該分野において周知の方法を用いて特定のヒト配列の全部または一部をプローブとし、低度、中度、または高度に厳密なハイブリダイゼーションにより得られる。
【００７２】
本明細書において使用する用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。厳密な条件は配列依存性であり、異なる環境で差がある。より長い配列は、より短い配列よりもより高温で特異的にハイブリダイズする。一般的に、厳密な条件を、一定のイオン強度およびｐＨにおいて、特定の配列の融解温度(Ｔｍ)より約５℃低いように選択する。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする温度(規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で)である。標的配列はＴｍにおいて一般的に過剰に存在するので、プローブの５０％を平衡時に占める。典型的に、厳密な条件はｐＨ７.０〜８.３で塩濃度が約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０.０１〜１.０Ｍナトリウムイオン(または他の塩)であり、温度は短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド(例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ)に対して少なくとも約３０℃であり、より長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である。厳密な条件を、フォルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【００７３】
厳密な条件は当業者に公知であり、Ausubel, et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.に見出すことができる。好ましくは、条件は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が互いに典型的にハイブリダイズしたままであるようなものである。厳密なハイブリダイゼーションの限定されない例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.０２％ＢＳＡおよび５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液中６５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで０.２×ＳＳＣ、０.０１％ＢＳＡ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌する。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の配列に厳密な条件下でハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書において使用する用語「天然に存在する」核酸分子は、天然に(例えば、天然のタンパク質をコードする)存在する核酸配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を指す。
【００７４】
第２の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と中度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。中度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、６×ＳＳＣ、５×Reinhardtの溶液、０.５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中５５℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中３７℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用され得る他の中度に厳密な条件は当該分野内で周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Krieger, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.を参照されたい。
【００７５】
第３の実施態様では、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、類似体または誘導体と低度に厳密な条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。低度に厳密なハイブリダイゼーション条件の限定されない例は、３５％フォルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.５)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.０２％ＰＶＰ、０.０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０.２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、１０％(ｗｔ／ｖｏｌ)硫酸デキストラン中４０℃でハイブリダイゼーションを行い、引き次いで２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ７.４)、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０.１％ＳＤＳ中５０℃で１回またはそれ以上洗滌することである。使用し得る他の低度に厳密な条件(例えば種間ハイブリダイゼーションに使用する)は当該分野において周知である。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, and Kriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY.；Shilo and Weinberg, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照されたい。
【００７６】
保存的変異
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子変異に加えて、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のヌクレオチド配列中に変異により変換を導入することができ、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能活性を変えること無しに、コードするＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くことができることを当業者はさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換に導くヌクレオチド置換を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の配列中で行い得る。「非必須」アミノ酸残基は、ＮＯＶＸタンパク質の野生型の配列をそれらの生物活性を変化させることなく変えることのできる残基であるが、一方で「必須」アミノ酸残基をそのような生物活性に必要とする。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質中で保存するアミノ酸残基を、特に変換に耐えられないと予想する。保存的置換が行われ得るアミノ酸は当該分野内で周知である。
【００７７】
本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基中に変化を含有するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。かかるＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）とアミノ酸配列において異なっているが、生物活性を依然保持している。一つの実施態様では、単離核酸分子はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここでタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）のアミノ酸配列と少なくとも約５０％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸分子によりコードするタンパク質は、配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）に少なくとも約７０％相同であり；さらに好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）に少なくとも約８０％相同であり；それよりさらにより好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）に少なくとも約９０％相同であり；最も好ましくは、配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）に少なくとも約９５％相同である。
【００７８】
配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）のタンパク質に相同なあるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離核酸分子を、１個またはそれ以上のアミノ酸の置換、付加または欠失をコードするタンパク質内に導入するように配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のヌクレオチド配列の中に１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を導入することにより創成し得る。
【００７９】
突然変異を、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の中に、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ仲介性突然変異誘発のような、標準的技術により導入し得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、予想する１個またはそれ以上の非必須アミノ酸残基において行う。「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるアミノ酸残基中の一つである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーを当該分野内で定義された。これらのファミリーは、塩基性側鎖をもつアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷のない側鎖をもつアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、無極性側鎖をもつアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ位側鎖をもつアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、ならびに芳香族側鎖をもつアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。従って、ＮＯＶＸタンパク質中に予想する非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換する。これに代えて、もう一つの実施態様では、突然変異を、飽和突然変異誘発のように、あるＮＯＶＸコード化配列の全部または一部に沿って無作為に導入し得るし、得られた突然変異体をＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングして活性を保持する変異体を同定し得る。配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）の突然変異誘発に引き続いて、コードされたタンパク質を当該分野において公知の任意の組換え技術で発現し、タンパク質の活性を測定し得る。
【００８０】
アミノ酸ファミリーの関連性を、側鎖の相互作用に基づいても決定し得る。置換したアミノ酸は、十分に保存された「強い」残基または十分に保存された「弱い」残基であり得る。保存したアミノ酸残基の「強い」群は、次の群のいずれか一つであり得る：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷであり、ここでアミノ酸の一文字表記は、互いに置換し得るアミノ酸でグル−プ分けする。同様に、保存した残基の「弱い」群は、次のいずれか一つであり得る：ＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＨＦＹであり、ここでそれぞれの群の文字はアミノ酸の一文字表記を表す。
【００８１】
一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、(i)他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質またはそれらの生物学的活性部位と相互作用するタンパク質：タンパク質を形成する活性、(ii)変異ＮＯＶＸタンパク質とあるＮＯＶＸリガンド間の複合体形成、または(iii)細胞内標的タンパク質またはそれらの生物学的活性部位に結合する変異ＮＯＶＸタンパク質の活性についてアッセイし得る；(例えば、アビジンタンパク質)。
なおもう一つの実施態様では、変異ＮＯＶＸタンパク質を、特定の生物学的機能を調節する活性(例えば、インスリン分泌の調節)についてアッセイし得る。
【００８２】
妨害性ＲＮＡ
本発明の１の態様において、ＮＯＶＸ遺伝子発現をＲＮＡ妨害により弱めることができる。当該分野においてよく知られた１のアプローチは、短い妨害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される遺伝子サイレント化であり、該アプローチにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子転写物の少なくとも１９ないし２５ヌクレオチドの長さのセグメントに対して相補的であり、５’非翻訳（ＵＴ）領域、ＯＲＦ、または３’ＵＴ領域を含む、特異的な２本鎖ＮＯＶＸ由来のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列により、ＮＯＶＸ遺伝子発現産物が標的とされる。例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ００／４４８９５、ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ０１／７５１６４、ＷＯ０１／９２５１３、ＷＯ０１／２９０５８、ＷＯ０１／８９３０４、ＷＯ０２／１６６２０、およびＷＯ０２／２９８５８参照（それぞれを参照により本明細書に一体化させる）。標的化される遺伝子はＮＯＶＸ遺伝子であってもよく、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターであってもよい。ＮＯＶＸ遺伝子の上流または下流モジュレーターの非限定的な例は、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子プロモーターに結合する転写因子ＮＯＶＸポリペプチドと相互作用するキナーゼまたはホスファターゼ、ならびにＮＯＶＸ調節経路に含まれるポリペプチドである。
【００８３】
本発明の方法によれば、妨害性ＲＮＡを用いてＮＯＶＸ遺伝子発現がサイレント化される。本発明のＮＯＶＸポリヌクレオチドはｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを包含する。ＮＯＶＸポリヌクレオチド配列を用いて、例えば、ショウジョウバエ抽出物（これに限らない）のごとき無細胞系でＮＯＶＸポリヌクレオチド配列をプロセッシングすることにより、あるいは組み換え型２本鎖ＮＯＶＸ ＲＮＡの転写により、あるいはＮＯＶＡ配列に相同的なヌクレオチド配列を合成することにより、かかるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを得ることができる。例えば、Tuschul, Zamire, Lehmann, Bartel and Sharp (1999), Genes & Dev. 13: 3191-3197参照（参照により本発明系に一体化させる）。合成する場合、典型的な０．２マイクロモラースケールのＲＮＡ合成により約１ミリグラムのｓｉＲＮＡが得られ、それは２４ウェルの組織培養プレートフォーマットを用いる１０００回のトランスフェクション実験に十分なものである。
【００８４】
最も効率的なサイレント化は、一般的には、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するように対合された２１ヌクレオチドのセンス鎖および２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて観察される。２ヌクレオチドの３’オーバーハングの配列は、ｓｉＲＮＡの標的認識の特異性にさらなる小さな貢献をする。特異性に対する貢献は最初に対合した塩基に隣接した未対合ヌクレオチドに局在化される。１の実施態様において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはリブヌクレオチドである。別の実施態様において、３’オーバーハング中のヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。３’オーバーハング中の２’−デオキシリボヌクレオチドを用いることはリボヌクレオチドの使用として有効であるが、デオキシリボヌクレオチドはしばしば合成費用が安く、よりヌクレアーゼ耐性である可能性が最も高い。
【００８５】
本発明の企図される組み換え型発現ベクターは、両方の鎖の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にするような様式でＮＯＶＸ配列に作動可能に連結された近接調節配列を含む発現ベクター中に組み込まれたＮＯＶＸ ＤＮＡ分子を含む。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子は第１のプロモーター（例えば、クローン化ＤＮＡの３’プロモーター配列）により転写され、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子が第２のプロモーター（クローン化ＤＮＡの５’プロモーター配列）により転写される。センスおよびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイゼーションして、ＮＯＶＸ遺伝子のサイレント化のためのｓｉＲＮＡ構築物を生じる。別法として、２つの構築物を用いて、ｓｉＲＮＡ構築物のセンスおよびアンチセンス鎖を作成することもできる。結局、クローン化ＤＮＡは第２の構造を有する構築物をコードするものであり得、単一の転写物は、標的遺伝子（複数も可）由来のセンスおよび相補的アンチセンス配列を有するものである。この実施態様の一例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物は標的遺伝子のすべてまたは一部に対して相同的である。もう１つの例において、ヘアピンＲＮＡｉ産物はｓｉＲＮＡである。ＮＯＶＸ配列に近接した調節配列は、それらの発現が独立してモジュレーションされ、あるいは時間的または位置的にモジュレーションされうるならば、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００８６】
特別な実施態様において、例えば、より小型の核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ Ｈ１に由来するＲＮＡｐｏｌ ＩＩＩ転写ユニットを含むベクター中にＮＯＶＸ遺伝子鋳型を組み込むことにより、ｓｉＲＮＡは細胞内で転写される。ベクター系の１例はGeneSuppressorTM RNA Interference kit （Imgenexから市販されている）である。Ｕ６およびＨ１プロモーターはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターのタイプＩＩＩクラスのメンバーである。Ｕ６様プロモーターの＋１ヌクレオチドは常にグアノシンであるが、Ｈ１プロモーターの＋１はアデノシンである。これらのプロモーターのターミネーションシグナルは５個の連続したチミジンにより定義される。典型的には、転写物を２つ目のウリジンの後ろで開裂させる。この位置での開裂は、発現されたｓｉＲＮＡ中に３’ＵＵオーバーハングを生じさせ、それは合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似である。長さ４００ヌクレオチド未満の配列をこれらのプロモーターにより転写させることができ、それゆえ、それらは約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを例えば約５０ヌクレオチドのＲＮＡステムループ転写物中に発現させることに理想的に適したものである。
【００８７】
長時間の発現ノックダウンが必要な場合に、ｓｉＲＮＡベクターは合成ｓｉＲＮＡよりも有利であると考えられる。ｓｉＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクションされた細胞は安定で、長時間のｍＲＮＡ阻害をこうむるであろう。対照的に、外来性合成ｓｉＲＮＡでトランスフェクションされた細胞は、典型的には７日以内あるいは１０ラウンドの細胞分裂の間にｍＲＮＡサプレッションから回復する。ｓｉＲＮＡ発現ベクターの長時間の遺伝子サイレント化能は遺伝子治療への適用を可能にしうる。
【００８８】
一般的には、ｓｉＲＮＡは、ＤＩＣＥＲと呼ばれるＡＴＰ依存性リボヌクレアーゼにより、より長いｄｓＲＮＡから切断される。ＤＩＣＥＲは２本鎖ＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのメンバーである。ｓｉＲＮＡは細胞蛋白とともに集合してエンドヌクレアーゼ複合体となる。ショウジョウバエにおけるインビトロでの研究は、ｓｉＲＮＡ／蛋白複合体（ｓｉＲＮＰ）がその後ＤＩＥＣＲとは異なるエンドリボヌクレアーゼを含むＲＮＡ誘導サイレンス化複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる第２の酵素複合体に転移されることを示唆している。ＲＩＳＣはｓｉＲＮＡ鎖によりコードされる配列を用いて相補的配列のｍＲＮＡを見つけて破壊する。かくしてｓｉＲＮＡはガイドとして作用し、２本のｓｉＲＮＡ鎖の一方に相補的なｍＲＮＡのみを開裂するようにリボヌクレアーゼを制限する。
【００８９】
ｓｉＲＮＡにより標的化されるべきＮＯＶＸ ｍＲＮＡ領域は、一般的には、スタートコドンの５０ないし１００ヌクレオチド下流から開始する所望ＮＯＶＸ配列から選択される。別法として、５’または３’ＵＴＲおよびスタートコドン付近の領域を用いることができるが、一般的には避けられる。なぜならこれらは調節蛋白結合部位において豊富だからである。ＵＴＲ結合蛋白および／または翻訳開始複合体はｓｉＲＮＰまたはＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。選択されたｓｉＲＮＡ配列に関する最初のＢＬＡＳＴ相同性サーチを利用可能なヌクレオチド配列ライブラリーに対して行って、ただ１つの遺伝子が標的化されることを確実にする。ｓｉＲＮＡ２本鎖による標的認識特異性は、ｓｉＲＮＡの対合領域に存在する単一の点突然変異が標的ｍＲＮＡの分解を妨げるに十分であることを示す。Elbashir et al. 2001 EMBO J. 20(23):6877-88参照。それゆえ、所望遺伝子を標的化する場合、ＳＮＰ、多型、対立遺伝子変種または種特異的変化をうまく考慮すべきである。
【００９０】
１の実施態様において、完全なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ実験は正しい負の対照を用いるものである。一般的には、負の対照ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を有するが、ゲノムに対して有意な配列相同性を欠いている。典型的には、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をスクランブルし、相同性検索を行って、それが他のいすれの遺伝子とも相同性を欠いていることを確認する。
【００９１】
２つの独立したＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖を用いて標的ＮＯＶＸ遺伝子をノックダウンすることができる。このことはサイレント化効果の特異性を制御することを助ける。さらに、等しい濃度の異なるＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子またはポリペプチドのレギュレーターに関するＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを用いることにより、２つの独立した遺伝子の発現を同時にノックダウンすることができる。ｓｉＲＮＡ結合蛋白の利用可能性は標的ｍＲＮＡアクセス可能性よりも限定的であると考えられる。
【００９２】
典型的には、標的化されたＮＯＶＸ領域は、１９個（Ｎ１９）の残基のスペーサー領域により分けられた２個のアデニン（ＡＡ）および２個のチミジン（ＴＴ）である（例えば、ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ）。望ましいスペーサー領域は約３０〜７０％、より好ましくは約５０％のＧ／Ｃ−含量を有する。配列ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴが標的配列中に存在しない場合、別の標的領域はＡＡ（Ｎ２１）であろう。ＮＯＶＸセンスｓｉＲＮＡの配列は（Ｎ１９）ＴＴまたはＮ２１にそれぞれ対応する。後者の場合、かかる配列が本質的にＮＯＶＸポリヌクレオチド中に存在しないならば、センスｓｉＲＮＡの３’末端のＴＴｈへの変換を行うことができる。この配列変換の論理的解釈は、センスおよびアンチセンス３’オーバーハングの配列組成に関して対称な２本鎖を生じさせることである。対称な３’オーバーハングは、センスおよびアンチセンス標的ＲＮＡ−開裂ｓｉＲＮＰの適切な等しい割合でｓｉＲＮＰが形成されることを確実ならしめることを助けることができる。例えば、Elbashir, Lendeckel and Tuschl (2001). Genes & Dev. 15: 188-200参照（参照により本明細書に一体化させる）。ｓｉＲＮＡ２本鎖のセンス配列のオーバーハングの修飾が標的化されたｍＲＮＡの認識に影響するとは考えられない。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖は標的認識をガイドするからである。
【００９３】
別法として、ＮＯＶＸ標的ｍＲＮＡが適当なＡＡ（Ｎ２１）配列を含まない場合、配列ＮＡ（Ｎ２１）をサーチしてもよい。さらに、センス鎖およびアンチセンス鎖の配列を５’（Ｎ１９）ＴＴとして合成してもよい。なぜならアンチセンスｓｉＲＮＡの３’側の大部分のヌクレオチドの配列は特異性に貢献しないからである。アンチセンスまたはリボザイム法とは違って、標的ｍＲＮＡの２次構造はサイレンス化に強く影響するとは考えられない。Harborth, et al. (2001) J. Cell Science 114: 4557-4565参照（参照により本明細書に一体化させる）。
【００９４】
標準的な核酸トランスフェクション法、例えば、OLIGOFECTAMINE Reagent（Invitrogenから市販されている）を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ２本鎖のトランスフェクションを行うことができる。一般的には、ＮＯＶＸ遺伝子サイレンシングに関するアッセイをトランスフェクションから約２日後に行う。トランスフェクション試薬の不存在下においてはＮＯＶＸ遺伝子サイレント化は観察されず、野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析が可能であった。特別な実施態様において、２４ウェルプレートの１つのウェルには通常約０．８４μｇのｓｉＲＮＡ２本鎖で十分である。典型的には、細胞を前日に撒き、約５０％集密になったところでトランスフェクションする。細胞培地および培養条件の選択は等業者が通常行うことであり、細胞タイプの選択により変更されるであろう。トランスフェクションの効率は細胞タイプのみならず細胞の継代数および集密度に依存する。ｓｉＲＮＡ−リポソーム複合体の形成時間および方法（例えば、倒置かボルテックスか）も重要である。低いトランスフェクション効率はＮＯＶＸサイレント化の不成功の最大の原因である。使用する新たな細胞系に関してトランスフェクション効率を注意深く調べることが必要である。好ましい細胞は哺乳動物由来であり、より好ましくはラットまたはマウスのごときげっ歯類由来であり、最も好ましくはヒト由来である。治療的処置に使用する場合、好ましくは細胞は自己由来のものであるが、非−自己由来の細胞ソースも本発明の範囲内とされる。
【００９５】
対照実験に関し、０．８４μｇの１本鎖センスＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡのトランスフェクションはＮＯＶＸサイレント化に影響せず、０．８４μｇのアンチセンス ｓｉＲＮＡは、０．８４μｇの２本鎖ｓｉＲＮＡと比較すると弱いサイレント化効果を有する。対照実験はさらに野生型およびサイレント化ＮＯＶＸ表現型の比較分析を可能にする。トランスフェクション効率を制御するために、典型的には通常蛋白の標的化を行う。例えば、ラミンＡ／Ｃの標的化あるいはＣＭＶにより駆動されるＥＧＦＰ発現プラスミド（例えば、Clontechから市販されている）のトランスフェクションを行う。上例において、イムノフルオレッセンス、ウェスタンブロット、ノーザンブロットあるいは蛋白発現または遺伝子発現に関する他の類似のアッセイのごとき方法により、細胞中のラミンＡ／Ｃノックダウンのフラグメントを翌日に行う。ラミンＡ／Ｃモノクローナル抗体をSanta Cruz Biotechnologyから得た。
【００９６】
細胞中の標的化ＮＯＶＸポリヌクレオチドの豊富さおよび半減期（またはターンオーバー）にもよるが、１〜３日後あるいはその後にノックダウン表現型が明らかにされうる。ＮＯＶＸノックダウン表現型が観察されない場合には、トランスフェクションされたｓｉＲＮＡ２本鎖により標的ｍＲＮＡ（ＮＯＶＸまたはＮＯＶＸ上流または下流遺伝子）が効果的に破壊されたかどうかを分析することが望ましいかもしれない。トランスフェクションから２日後、全ＲＮＡを調製し、標的特異的プライマーを用いて逆転写し、少なくとも１つのエキソン−エキソンジャンクションを変換するプライマーペアーを用いてＰＣＲ増幅を行ってプレ−ｍＲＮＡの増幅を制御する。非標的化ｍＲＮＡのＲＴ／ＰＣＲも対照として必要である。ｍＲＮＡの効果的な枯渇であるが検出できない標的蛋白の減少は、安定なＮＯＶＸ蛋白の大きなリザーバーが細胞中に存在することを示しうる。標的蛋白が最終的に枯渇して表現型が明らかにされうるに至るには、十分に長いインターバルでの複数回のトランスフェクションが必要であるかもしれない。複数回のトランスフェクション工程が必要な場合、トランスフェクションから２〜３日後に細胞を分ける。分けた直後に細胞をトランスフェクションしてもよい。
【００９７】
本発明の治療方法は、増加あるいは逸脱したＮＯＶＸ発現または活性を補正するための治療としてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ構築物を投与することを企図する。上記のごとく、ＮＯＶＸリボポリヌクレオチドを得て、ｓｉＲＮＡフラグメントにプロセッシングするか、あるいはＮＩＶＸ ｓｉＲＮＡを合成する。上記のごとく、既知の核酸トランスフェクション法を用いてＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与する。ＮＯＶＸ遺伝子に特異的なＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡはＮＯＶＸ転写産物を減少またはノックダウンし、そのことはＮＯＶＸポリペプチド生成を減少させ、細胞または組織中のＮＯＶＸポリペプチド活性を低下させる。
【００９８】
また本発明は、個体におけるＮＯＶＸ蛋白の存在に関連する疾病または症状の治療方法を包含し、該方法は、分解されるべき蛋白のｍＲＮＡ（該蛋白をコードするｍＲＮＡ）を標的化するＲＮＡｉ構築物を個体に投与することを特徴とする。特別なＲＮＡｉ構築物はｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡにプロセッシングされる２本鎖遺伝子転写物を含む。治療により、標的蛋白が産生されなくなるか、あるいは治療を行わない場合よりも産生の程度が低下する。
【００９９】
ＮＯＶＸ遺伝子機能が既知表現型と相関関係を有しない場合、健康個体由来の細胞または組織の対照試料により、ＮＯＶＸ発現レベルを決定するためのリファレンス標準が提供される。説明したアッセイ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等を用いて発現レベルを検出する。疾病状態にある哺乳動物、好ましくはヒト対象から細胞または組織の試料を採取する。細胞または組織中への核酸のトランスフェクションに関して説明した方法によりＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを細胞または組織に投与することによってこれらの細胞または組織を処理し、説明したアッセイを用いて対象試料中のＮＯＶＸポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現の変化を観察し、対照試料のものと比較する。このＮＯＶＸ遺伝子ノックダウン法は、治療対象試料中のＮＯＶＸマイナス（ＮＯＶＸ−）表現型を決定するための迅速法を提供する。かくして、治療対象試料中において観察されたＮＯＶＸ−表現型は、治療中の疾病状態の経過観察のためのマーカーとして役立つ。
【０１００】
特別な実施態様において、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡを治療に用いる。ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡの生成および使用方法は等業者に知られている。方法の例を以下に示す。
【０１０１】
ＲＮＡの生成
ＲＮＡ発現ベクターにおける転写のごとき既知方法を用いてＮＯＶＸのセンスＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびアンチセンス（ａｓＲＮＡ）を得る。最初の実験において、センスおよびアンチセンスＲＮＡはそれぞれ約５００塩基の長さである。得られたｓｓＲＮＡおよびａｓＲＮＡ（０．５μＭ）を２０ｍＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で９５℃にて１分間加熱し、次いで、冷却し、室温で１２ないし１６時間アニーリングさせる。ＲＮＡを沈殿させ、溶解バッファー（下記）中に再懸濁させる。アニーリングをモニターするために、ＴＢＥバッファー中の２％アガロースゲル中でＲＮＡを電気泳動させ、臭化エチジウムで染色する。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.(1989)参照。
【０１０２】
溶解物の調製
製造者（Ambion）の指示に従って未処理ウサギ網状赤血球溶解物を集める。ｄｓＲＮＡを溶解物中３０℃で１０分間インキュベーションし、次いで、ｍＲＮＡを添加する。その後、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを添加し、さらに６０分インキュベーションを続ける。２本鎖ＲＮＡとｍＲＮＡとのモル比は約２００：１である。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを放射性標識し（既知方法を用いて）、その安定性をゲル電気泳動によりモニターする。
【０１０３】
同じ条件で平行して行う実験において、３２Ｐ−ＡＴＰを用いて２本鎖ＲＮＡを内部で放射性標識する。２ＸプロテイナーゼＫバッファーにより反応を停止させ、すでに記載されているようにして（Tuschl et al., Genes Dev., 13: 3191-3197）脱蛋白する。適当なＲＮＡ標準を用いて１５％または１８％ポリアクリルアミド配列決定用ゲル中での電気泳動により生成物を分析する。ゲルを放射活性についてモニターすることにより、２本鎖ＲＮＡからの１０ないし２５ヌクレオチドのＲＮＡの自然な生成を調べることができる。
【０１０４】
約２１〜２３ｂｐの２本鎖ＲＮＡのバンドを溶出する。これらの２１〜２３量体ＮＯＶＸ転写抑制の有効性を、各アッセイにつき５０ナノモラーの２本鎖２１〜２３量体を用いて上記と同じウサギ網状赤血球を用いてインビトロにてアッセイする。次いで、これらの２１〜２３量体の配列を標準的な核酸配列決定法を用いて決定する。
【０１０５】
ＲＮＡの調製
上で決定された配列に基づいて、Expedite RNA phosphoramidites and thymidine phosphoramidite（Proligo, Germany）２１を用いてヌクレオチドのＲＮＡを化学合成する。合成オリゴヌクレオチドを脱保護し、ゲル精製（Elbashir, Lendeckel, & Tuschl, Genes & Dev. 15, 188200 (2001)）し、次いで、Sep-Pak C18 cartridge（Waters, Milford, Mass., USA）で精製（Tuschl, et al., Biochemistry, 32:1165811668 (1993)）する。
これらのＲＮＡ（２０μＭ）１本鎖をアニーリングバッファー中、９０℃で１分間インキュベーションし、次いで、３７℃で１時間インキュベーションする。
【０１０６】
細胞培養
ＮＯＶＸを規則的に発現させるための当該分野において知られた細胞培養を、標準的条件を用いて行う。トランスフェクションの２４時間前に、約８０％集密において、細胞をトリプシン処理し、抗生物質不含の新鮮培地で１：５に希釈（１〜３ｘ１０５個／ｍｌ）し、２４ウェルプレートに移す（５００ｍｌ／ウェル）。市販リポフェクションキットを用いてトランスフェクションを行い、陽性および陰性対照を付して標準的方法を用いてＮＯＶＸ発現をモニターする。陽性対照は本来的にＮＯＶＸを発現する細胞であり、陰性対照はＮＯＶＸを発現しない細胞である。オーバーハング３’を有する塩基対合した２１および２２ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、溶解物および細胞培養において、効果的な配列特異的ｍＲＮＡ分解を媒介する。異なる濃度のｓｉＲＮＡを用いる。哺乳動物細胞培養の場合のインビトロでのサプレッションに効果的な濃度は２５ｎＭないし１００ｎＭの最終濃度である。このことは、慣用的なアンチセンスまたはリボザイム遺伝子標的化実験に用いる濃度よりも数オーダー低い濃度のｓｉＲＮＡが有効であることを示す。
【０１０７】
上記方法は、ＮＯＶＸ ｓｉＲＮＡ配列の推論およびかかるｓｉＲＮＡのイオンビトロサプレッションへの使用の両方のための方法を提供する。よく知られたインビボトランスフェクションまたは遺伝子治療トランスフェクション法を用い、同じｓｉＲＮＡを用いてインビボサプレッションを行ってもよい。
【０１０８】
アンチセンス核酸
本発明のもう一つの態様は、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそれらのフラグメント、相同体または誘導体、とハイブリダイズ可能なまたは相補的な単離アンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な(例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード化鎖に相補的な、またはｍＲＮＡ配列に相補的な)ヌクレオチド配列を含む。特別な態様では、少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、または５００のヌクレオチドまたは全ＮＯＶＸコード化鎖に相補的な配列、またはそれらの一部のみにを含むアンチセンス核酸分子を提供する。配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）のあるＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、相同体、誘導体および類似体をコードする核酸分子、または配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）のあるＮＯＶＸ核酸配列に相補的なアンチセンス核酸を加えて提供する。
【０１０９】
一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、あるＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「コード化領域」は、アミノ酸残基に翻訳するコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。もう一つの実施態様では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列のコード化鎖の「非コード化領域」に対するアンチセンスである。用語「非コード化領域」は、アミノ酸に翻訳しないコード化領域に隣接する５'配列および３'配列を指す(即ち、５'非翻訳領域および３'非翻訳領域とも呼ぶ)。
【０１１０】
本明細書に開示するＮＯＶＸタンパク質をコードするコード化鎖の配列を与えると、本発明のアンチセンス核酸をWatsonとCrickまたはHoogsteenの塩基対の規則にしたがってデザインし得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの全コード化領域と相補的であり得るが、さらに好ましくは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡのコード化または非コード化領域の一部のみに対するアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳開始部位を囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さ約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸を、当該分野において公知の手順を用いる化学合成または酵素ライゲーション反応を用いて構築し得る。例えば、アンチセンス核酸(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成する二本鎖の物理的安定性を増加するようデザインした様々に修飾したヌクレオチドを用いて、化学合成し得る(例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを使用しうる)。
【０１１１】
アンチセンス核酸を作成に使用し得る修飾ヌクレオチドの例として以下のものを挙げる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、５−メトキシウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸(ｖ)、５−メチル−２−チオウラシル、３−(３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、および２、６−ジアミノプリン。これに代えて、アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンスの配向(即ち、挿入した核酸から転写したＲＮＡが、興味ある標的核酸に対するアンチセンスの配向であり、以下の小節でさらに説明する)においてサブクローニングする発現ベクターを使用して生物学的に生産し得る。
【０１１２】
本発明のアンチセンス核酸分子を、それらがあるＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合し、それにより(例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより)タンパク質発現を阻害するように典型的に対象に投与するか、または組織で作成する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成する従来のヌクレオチドの相補性によるものでもあり得る。または、例えば、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸の場合には、二本鎖の大溝での特異的相互作用を介するものであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位への直接の注射を挙げる。これに代えて、アンチセンス核酸分子を、選択した細胞標的へ修飾しそこで全身性に投与し得る。例えば、全身性投与のために、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上に発現する受容体または抗原に特異的に結合するように(例えば、ペプチドにアンチセンス核酸分子を連結させることまたは細胞表面受容体または抗原に結合する抗体により)修飾し得る。アンチセンス核酸分子をまた、本明細書に説明するベクターを用いて細胞に送達し得る。十分な核酸分子を送達するために、アンチセンス核酸分子を強力なｐｏｌＩＩプロモーターまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターの調節下に置くベクター構造が好ましい。
【０１１３】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβユニットとは反対で鎖が互いに並行に走行する。例えば、Gaultier, et al., 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641を参照されたい。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド(例えば、Inoue, et al. 1987. Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148を参照)またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体(例えば、Inoue, et al., 1987. FEBS Lett. 215: 327-330を参照)を含み得る。
【０１１４】
リボザイムおよびＰＮＡ部分
核酸の修飾は、非限定的な例として、修飾した塩基、および糖リン酸主鎖を修飾または誘導した核酸を挙げる。これらの修飾を少なくとも部分的に行い、例えば対象への治療応用において核酸へ結合するアンチセンスとして使用し得るように修飾した核酸の化学的安定性を増強する。
【０１１５】
１の実施態様では、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、それらが相補的領域を有するｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断する能力のあるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒活性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム(例えば、Haselhoff and Gerlach 1988. Nature 334: 585-591に記載されているようなハンマーヘッドリボザイム)を使用して、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによりＮＯＶＸのｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に対する特異性を有するリボゾームは、本明細書に開示するあるＮＯＶＸｃＤＮＡのヌクレオチド配列(即ち、配列番号２ｎ−１（ｎは１〜１４１の整数である）)に基づいてデザインし得る。例えば、その中で活性部位のヌクレオチド配列がＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ中で切断し得るヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymenaＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築し得る。例えば、Cech, et al.の米国特許第４,９８７,０７１号およびCech, et al.の米国特許第５,１１６,７４２号を参照されたい。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡをまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するのに使用し得る。例えば、Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418を参照されたい。
【０１１６】
一方、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸ核酸の調節領域(例えば、ＮＯＶＸプロモーターおよび／またはエンハンサー)に相補的なヌクレオチド配列を標的とすることで阻害し、標的細胞中のＮＯＶＸ遺伝子の転写を阻止するトリプルヘリカル構造を形成し得る。例えば、Helene, 1991. Anticancer Drug Des. 6: 569-84; Helene, et al. 1992. Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27-36; Maher, 1992. Bioassays 14: 807-15を参照されたい。
【０１１７】
種々の実施態様において、ＮＯＶＸ核酸を塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格部分において修飾し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸を生成し得る。例えば、Hyrup, et al., 1996. Bioorg Med Chem 4: 5-23を参照されたい。本明細書において使用する用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格を擬似ペプチド骨格で置換し、４個の核酸塩基のみを保持する核酸模倣体(例えばＤＮＡ模倣体)を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることを示す。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14670-14675に記載されているように、標準固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施し得る。
【０１１８】
ＮＯＶＸのＰＮＡを治療的応用および診断的応用に使用し得る。例えば、ＰＮＡを、例えば転写または翻訳停止を誘導することまたは複製を阻害することにより、遺伝子発現の配列特異的調整のためのアンチセンスまたは抗原薬剤として使用し得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えば、遺伝子中の単塩基対変異の分析(例えば、ＰＣＲ固定を指示するＰＮＡ；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ、との組合せで使用し得る人工的制限酵素として(Hyrup, et al., 1996.supraを参照)；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして(Hyrup, et al., 1996, supra; Perry-O'Keefe, et al., 1996. supraを参照))にも使用し得る。
【０１１９】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸのＰＮＡを修飾して、例えば、ＰＮＡに親油性なまたは他の補助的な基をＰＮＡに結合することにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの生成により、またはリポソームまたは当該分野において公知の他の薬剤送達技術の使用によりそれらの安定性または細胞への取り込みを増強し得る。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有益な性質を結合し得るＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成し得る。かかるキメラは、ＤＮＡ認識酵素(例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ)がＤＮＡ部分と相互作用し、一方でＰＮＡ部分が結合高親和性および結合高特異性を提供することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基結合、ヌクレオチド塩基間の結合数および配向について選択した適当な長さのリンカーを使用して結合し得る(Hyrup, et al., 1996. supraを参照)。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Hyrup, et al., 1996. supra and Finn, et al., 1996. Nucl Acids Res 24: 3357-3363に記載のように実施し得る。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準ホスホラミダイトカップリング化学反応を使用して固相支持体上で合成し得る。そして修飾したヌクレオシド類似体、例えば、5'-(4-メトキシトリチル)アミノ-5'-デオキシチミジンホスホラミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端間で使用し得る。例えば、Mag, et al., 1989. Nucl Acid Res 17: 5973-5988を参照されたい。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングし、５'ＰＮＡセグメントおよび３'ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する。例えば、Finn, et al., 1996. supraを参照されたい。これに代えて、キメラ分子を５'ＤＮＡセグメントおよび３'ＰＮＡセグメントで合成することもできる。例えば、Petersen, et al., 1975. Bioorg. Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124を参照されたい。
【０１２０】
他の実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような添付群(例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的とするため)、または細胞膜(例えば、Letsinger, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照)または血液脳関門(例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照)を横切る輸送を促進する薬剤を含み得る。加えて、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤(例えば、Krol, et al., 1988. BioTechniques 6:958-976を参照)または挿入剤(例えば、Zon, 1988. Pharm. Res. 5: 539-549を参照)で修飾し得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドを、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤等と複合し得る。
【０１２１】
ＮＯＶＸポリペプチド
本発明に従うポリペプチドは、配列が配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）において提供するＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む。本発明はまた、その任意の残基が、配列番号２ｎ（ｎは１〜１４１の整数である）に示す対応する残基から変換し得る一方で、そのＮＯＶＸ活性および生理機能を保持するタンパク質、またはそれらの機能的フラグメントを依然コードする変異タンパク質または変種タンパク質を含む。
【０１２２】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するあるＮＯＶＸ変異体は、配列中の特定部位の残基を他のアミノ酸で置換する任意の変異体を含み、親タンパク質の２個の残基間にもう一残基または複数残基を挿入する可能性ならびに親配列から１個またはそれ以上の残基を欠失する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失を本発明に包含する。好ましい状況では、置換は上で定義した保存的置換である。
【０１２３】
本発明の一つの態様は、単離ＮＯＶＸタンパク質およびそれらの生物活性部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、類似体、または相同体に関する。また、抗ＮＯＶＸ抗体産生用の免疫源としての使用に適当なポリペプチドフラグメントも提供し得る。一つの実施態様では、細胞または組織供給源から標準タンパク質精製技術を使用する適当な精製スキームにより天然のＮＯＶＸタンパク質を単離し得る。もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質を、組換えＤＮＡ技術により生産する。組換え発現に代えて、あるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成技術を使用して化学的に合成し得る。
【０１２４】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはタンパク質またはそれらの生物活性部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞供給源または組織供給源の細胞性物質または他の混入タンパク質を実質的に含まず、または化学的に合成したと際化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞性物質が実質的に含まれていない」という用語は、タンパク質を単離または組換え的に生産した元の細胞の細胞成分からタンパク質を分離したＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。一つの実施態様では、「細胞原料が実質的に含まれていない」という用語は、約３０％(乾燥重量比)未満の非ＮＯＶＸタンパク質(ここでは「混入タンパク質」とも言う)、さらに好ましくは約２０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非ＮＯＶＸタンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＮＯＶＸタンパク質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはそれらの生物活性部分を組換え的に生産する際には、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まず、即ち、培地はＮＯＶＸタンパク質標本の容積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは５％未満を表す。
【０１２５】
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、ＮＯＶＸタンパク質の標本を含み、ここでタンパク質を、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離する。一つの実施態様では、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語は、約３０％未満(乾燥重量比)の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、なおさらに好ましくは約１０％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質、および最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を有するＮＯＶＸタンパク質の標本を含む。
【０１２６】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含有しＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を示すＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)に十分相同なアミノ酸配列またはＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列)に由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的に、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。あるＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば１０、２５、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の長さのポリペプチドであり得る。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分を、組換え技術で調製しそして天然のＮＯＶＸタンパク質の機能活性の一つまたはそれ以上について評価し得る。
【０１２７】
一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)に示すアミノ酸配列を有する。他の実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)に実質的に相同であり、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)のタンパク質の機能活性を保持するが、なお以下に詳述するように天然の対立遺伝子の変異体または変異に因りアミノ酸配列を異にする。従って、もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)のアミノ酸配列と少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)のＮＯＶＸタンパク質の機能活性を保持するタンパク質である。
【０１２８】
２個またはそれ以上の配列間の相同性の測定
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の相同性の割合を測定するために、配列を至適な比較目的でアラインメント(例えば、ギャップを、２番目のアミノ酸または核酸配列と至適なアラインメントになるように第１のアミノ酸配列または核酸配列の中に入れ得る)。対応するアミノ酸部位または核酸部位におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次いで比較する。第１の配列の部位を、第２の配列の対応する部位と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占めると、両分子はその部位において相同である(即ち、本明細書において使用するように、アミノ酸または核酸の「相同性」はアミノ酸または核酸の「同一性」と同等である)。
【０１２９】
核酸配列の相同性を、２個の配列間の同一性の程度として測定し得る。相同性は、ＧＣＧプログラムパッケージに提供されるＧＡＰソフトウエアのような、当該分野において公知のコンピュータープログラムを使用して測定し得る。Needleman and Wunsch, 1970. J Mol Biol 48: 443-453を参照されたい。以下のセッティング：ＧＡＰ生成ペナルティー５．０またはＧＡＰ伸長ペナルティー０．３で、ＧＣＧ ＧＡＰソフトウエアを使用して、上述の類似核酸配列のコード化領域は、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)に示すＤＮＡ配列のＣＤＳ(コード化)部分と好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性の程度を示す。
【０１３０】
用語「配列同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列が比較の特定領域に亘って残基毎に同一である程度を指す。用語「配列同一性の百分率」を、比較の領域に亘って至適にアラインメントした２個の配列を比較し、一致部位の数を求め同一の核酸塩基(例えば、核酸の場合には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列中に存在する部位数を測定して、一致部位の数を比較領域の部位の総数(即ち、ウインドウサイズ)で除し、商を１００倍して、配列同一性の百分率を得ることにより計算しうる。本明細書において使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の特性を意味する。ここでポリヌクレオチドは、比較領域に亘って標準配列と比較して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、およびしばしば９０〜９５％の配列同一性、さらに通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１３１】
キメラタンパク質または融合タンパク質
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において使用するように、あるＮＯＶＸ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動し得るように連結したあるＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)のあるＮＯＶＸタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す一方で、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質と実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば、ＮＯＶＸタンパク質と異なり同一または異なる生物由来であるタンパク質を指す。あるＮＯＶＸ融合タンパク質内では、ＮＯＶＸポリペプチドはあるＮＯＶＸタンパク質の全部または一部に対応し得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質はあるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分を含む。もう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも二つの生物学的に活性な部分を含む。なおもう一つの実施態様では、あるＮＯＶＸ融合タンパク質は、あるＮＯＶＸタンパク質の少なくとも三つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質内では、用語「作動し得るように連結した」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドがお互いにインフレームで融合していることを示すものとする。非ＮＯＶＸポリペプチドを、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し得る。
【０１３２】
一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列がＧＳＴ(グルタチオンＳ転移酵素)のＣ末端に融合する。そのような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸポリペプチドの精製を容易にし得る。
【０１３３】
もう一つの実施態様では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含有するあるＮＯＶＸタンパク質である。特定の宿主細胞(例えば、哺乳動物の宿主細胞)において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌を異種シグナル配列の使用を介して増強し得る。
【０１３４】
なおもう一つの実施態様では、融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質である。ここでＮＯＶＸ配列は、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列と融合している。本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を、医薬組成物中に組み入れ、対象に投与し、細胞上でのＮＯＶＸリガンドとあるＮＯＶＸタンパク質との相互作用を阻害し、それによりインビボでのＮＯＶＸ仲介性の情報伝達を抑制し得る。ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、あるＮＯＶＸと同種のリガンドの生物学的利用性に影響を及ぼし得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖および分化障害の処置ならびに細胞生存を調整(例えば増強または阻害)のために治療上有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を使用して、対象中で抗ＮＯＶＸ抗体を生産し、ＮＯＶＸリガンドを精製し、そしてスクリーニングアッセイにおいて、ＮＯＶＸのあるＮＯＶＸリガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得る。
【０１３５】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術により生産し得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、例えば、連結のための平滑末端化または互い違い末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素による切断、適切に粘着末端の充填、望ましくない結合を防止するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的結合などの従来の方法にしたがってインフレームで一緒に連結する。もう一つの実施態様では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成機を含む従来の技術により合成し得る。これに代えて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２個の連続する遺伝子フラグメント間で相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行い、それらを引き続いてアニールし、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成し得る(例えば、Ausubel, et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992を参照)。さらに、融合部分を既にコードする多くの発現ベクター(例えば、ＧＳＴポリペプチド)が市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸を、融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレームで結合するように、そのような発現ベクターの中にクローン化することができる。
【０１３６】
ＮＯＶＸアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト(即ち、ミメティクス)またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体を含む。ＮＯＶＸタンパク質の変異体は、突然変異(例えば、ＮＯＶＸタンパク質の点突然変異または切断)により生成し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同一な生物学的諸活性またはそのサブセットを保持する。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む、細胞の情報伝達カスケードの下流または上流メンバーに拮抗的に結合することにより、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質の一つまたはそれ以上の活性を阻害し得る。従って、特異的な生物学的作用を、限定された機能を有する変異体での処置により発揮することができる。一つの実施態様では、天然に存在する形のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体による対象の処置は、天然に存在する形のＮＯＶＸタンパク質による処置と比べて対象における副作用がより少ない。
【０１３７】
ＮＯＶＸアゴニスト(即ちミメティック)またはＮＯＶＸアンタゴニストのどちらかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の変異体は、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異体(例えば切断突然変異体)の組換えライブラリーをＮＯＶＸタンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることにより同定し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーを、核酸レベルでの組換え（コンビナトリアル）変異誘発によって生成し、そして変化に富む遺伝子ライブラリーによりコードする。ＮＯＶＸ変異体の変化に富むライブラリーは、例えば、潜在的ＮＯＶＸ配列の縮重したセットが個別のポリペプチドとして発現可能であるように、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することにより、またはこれに代えて、その中にＮＯＶＸ配列のセットを含有するさらに大きい融合タンパク質(例えば、ファージディスプレー用に)のセットとして、生成し得る。縮重したオリゴヌクレオチド配列から潜在的ＮＯＶＸ変異体のライブラリーを使用して生成し得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機により行い、次いで、合成遺伝子を適切な発現ベクター内に連結し得る。遺伝子の縮重セットの使用は、潜在的ＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列の全ての、一つの混合物の提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野内において周知である。例えば、Narang, 1983. Tetrahedron 39: 3; Itakura, et al., 1984. Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura, et al., 1984. Science 198: 1056; Ike, et al., 1983. Nucl. Acids Res. 11: 477を参照されたい。
【０１３８】
ポリペプチドライブラリー
加えて、ＮＯＶＸタンパク質コード化配列のフラグメントライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の変異体のスクリーニングおよびそれに続く選択のためにＮＯＶＸフラグメントの変化に富む集団を生成し得る。一つの実施態様では、コード化配列フラグメントのライブラリーを、あるＮＯＶＸコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子あたりたった約１回生じる条件でヌクレアーゼ処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを異なるニッキング産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼの処理で再生成した二重らせんから単鎖部分を除去し、そして得られたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することにより、生成し得る。この方法によって、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端または内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【０１３９】
点突然変異または切断により作成した組換え（コンビナトリアル）ライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする、および選択した性質を有する遺伝子産物のためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする種々の技術は、当該分野において公知である。かかる技術は、ＮＯＶＸタンパク質の組換え（コンビナトリアル）突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするハイスループット分析に適用可能な最も広く使用する技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、そして、所望の活性の検出がその生産物を検出する遺伝子をコードするベクターの単離を容易する条件で、組換え（コンビナトリアル）遺伝子を発現することを典型的に含む。ライブラリー中の機能的変異の頻度を増大する新しい技術である繰り返しアンサンブル変異誘発(ＲＥＭ)をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＮＯＶＸ変異体を同定し得る。例えば、Arkin and Yourvan, 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave, et al., 1993. Protein Engineering 6:327-331を参照されたい。
【０１４０】
抗ＮＯＶＸ抗体
ＮＯＶＸタンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに対する抗体は本発明に含まれる。本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン(Ｉｇ)分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する(と免疫学的に反応する)抗原結合部位を含有する分子を指す。かかる抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ' およびＦ(ａｂ')2フラグメントならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げるが、これらに限定しない。一般に、ヒトから得る抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、これらは分子中に存在するＨ鎖の性質によりお互いに異なる。特定のクラスは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2およびその他のような、サブクラスを同様に有する。さらに、ヒトにおいて、Ｌ鎖は、ｋ鎖またはλ鎖であり得る。本明細書における抗体への参照は、ヒト抗体種の全てのそのようなクラス、サブクラスおよびタイプへの参照を含む。
【０１４１】
抗原として使用することを意図した本発明の単離タンパク質、またはその部分またはフラグメントを免疫源として使用しポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製の標準的技術を使用し、抗原に免疫特異的に結合する抗体を生成し得る。全長のタンパク質を使用し得るが、またはこれに代えて、本発明は、免疫源として使用するための抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。抗原性ペプチドフラグメントは、配列番号２ｎ(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)に示すアミノ酸配列のような全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸残基を含み、そしてペプチドに対して育成した抗体が、エピトープを含有する全長タンパク質または任意のフラグメントと特異的な免疫複合体を形成するようそのエピトープを包含する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、または少なくとも１５個のアミノ酸残基、または少なくとも２０個のアミノ酸残基、または少なくとも３０個のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより包含する好ましいエピトープは、表面に局在するタンパク質領域であり；これらは通常親水性領域である。
【０１４２】
本発明の特定の実施態様において、抗原性ペプチドにより包含される少なくとも一つのエピトープは、タンパク質の表面に局在するＮＯＶＸ領域、例えば、親水性領域である。ヒトＮＯＶＸタンパク質配列の疎水性分析は、ＮＯＶＸポリペプチドのどの領域が特に親水性であり、したがって抗体生産を目標とするために有用な表面残基をコードする可能性が高いかを示す。抗体生産を目標とするための手段として、親水性および疎水性領域を示すハイドロパシープロットを、例えば、どちらもフーリエ変換を用いるかまたは用いないで、Kyte DoolittleまたはHopp Woods方法を含む当該分野において周知の任意の方法で生成し得る。例えば、Hopp and Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828; Kyte and Doolittle 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-142(いずれも全体的な出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体内の一つまたはそれ以上のドメインに特異的である、抗体はまた、本明細書において提供する。
【０１４３】
用語「エピトープ」には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合し得る全てのタンパク質決定基(部位）が含まれる。エピトープ様決定基（部位）は、通常、化学的に活性な分子（例えば、アミノ酸もしくは糖側鎖など）表面群を含み、通常、特定の三次元的構造特性、に加えて特定電荷特性を示す。あるＮＯＶＸポリペプチドまたはそれらのフラグメントは、少なくとも１つの抗原エピトープを持つ。アッセイ（例えば、当業者には既知のラジオリガンド結合アッセイまたは類似のアッセイ）によって測定されるような、平衡結合定数ＫＤが、＜１μＭ、好ましくは＜１００ｎＭ、より好ましくは＜１０ｎＭ、もっとも好ましくは＜１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、抗原ＮＯＶＸに特異的に結合するという。
【０１４４】
本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログを、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の生成において免疫源として利用することができる。
【０１４５】
当該分野内において公知の種々の方法を、本発明のタンパク質、またはその誘導体、フラグメント、類似体、相同体、またはオーソログ、に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の生産に使用し得る(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。これらの抗体の幾つかについて以下に考察する。
【０１４６】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の生産には、種々の適当な宿主動物(例えばウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物)を、天然タンパク質、その合成変異体、または前述の誘導体を1回またはそれ以上注射して免疫を行い得る。適切な免疫原性製剤としては、例えば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を代表する化学的に合成したポリペプチド、または組換え的に発現した免疫原性タンパク質を挙げ得る。さらに、タンパク質を、免疫する哺乳動物において免疫原性であることが知られている第２のタンパク質と複合体を形成してもよい。かかる免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシン阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。製剤はさらにアジュバントを含有し得る。免疫応答を増大するために使用する種々のアジュバントとしては、フロイントの(完全および不完全)アジュバント、鉱物ゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性剤(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノール等)、カルメット-ゲラン杆菌およびコリネバクテリウム-パルヴムのようなヒトに使用可能なアジュバント、または類似の免疫促進剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用し得るアジュバントのさらに別な例としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント(モノホスホリルリピドＡ、合成ジコリノミコール酸トレハロース)を挙げ得る。
【０１４７】
免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体を、哺乳動物から(例えば、血液から)単離して、免疫血清中の主としてＩｇＧ画分を提供するプロテインＡまたはプロテインＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような、公知の技術を用いてさらに精製し得る。引き続いて、またはこれに代えて、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原、またはそのエピトープ、をカラム上に固相化して、イムノアフィニティークロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製し得る。免疫グロブリンの精製を、例えば、D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により考察する。
【０１４８】
モノクローナル抗体
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」(ＭＡｂ)または「モノクローナル抗体組成物」は、特徴的なＬ鎖遺伝子産物および特徴的なＨ鎖遺伝子産物より成る抗体分子の１分子種のみを含有する抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは、それに対する特徴的な結合活性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある抗原結合部位を含有する。
【０１４９】
モノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載するような、ハイブリドーマ方法を用いて調製し得る。ハイブリドーマ方法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に免疫化剤で免疫することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生産するかまたは生産する能力のあるリンパ球を誘発する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫することができる。
【０１５０】
免疫化剤としては典型的に、タンパク質抗原、それらのフラグメントまたはその融合タンパク質が挙げられる。一般的に、ヒト由来の細胞を所望するならば、末梢血リンパ球を使用し、またはヒト以外の哺乳動物源を所望するならば、脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用するかのいずれかである。次いで、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を生成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株を使用し得る。ハイブリドーマ細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する一つまたはそれ以上の物質を好ましくは含有する適切な培地中で培養し得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ)を欠くならば、ハイブリドーマ用の培地は典型的に、その物質がＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を阻止する、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む(“ＨＡＴ培地”)。
【０１５１】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択した抗体生産細胞による抗体の高レベル発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。さらに好ましい不死化細胞株は、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手し得るマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生産用に記載する（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63）。
【０１５２】
ハイブリドーマが培養する培地を次いで、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイし得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産したモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)または酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)のような、インビトロ結合アッセイによって測定する。そのような技術またはアッセイは当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析により測定し得る。標的抗原に対して高度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することは、モノクローナル抗体の治療的応用において特に重要な目的である。
【０１５３】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈法でサブクローン化して、標準方法で増殖し得る(Goding,1986)。この目的のための適当な培地としては、例えば、Dulbecco's Modified Eagle's Medium培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地を挙げ得る。これに代えて、ハイブリドーマ細胞を哺乳動物中で腹水としてインビボで増殖し得る。
【０１５４】
サブクローンにより分泌したモノクローナル抗体を、培地または腹水から、例えば、プロテイン−Ａセファローズ、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により単離または精製し得る。
【０１５５】
モノクローナル抗体をまた、米国特許第４,８１６,５６７号に記載するような組換えＤＮＡ方法により作り得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力のある、オリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)容易に単離し配列決定し得る。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置し、それを次いでサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、またはそうしなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を取得し得る。ＤＮＡをまた、例えば相同なマウスの配列の代わりにヒトのＨ鎖およびＬ鎖の通常ドメインに対するコード化配列を置換することにより(米国特許第４,８１６,５６７号; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994))、または非免疫グロブリンペプチドに対するコード化配列の全部または一部を免疫グロブリンのコード化配列に共有結合することにより、修飾し得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の通常ドメインに対して置換することができるか、または本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに対して置換して、キメラ２価抗体を創成することができる。
【０１５６】
ヒト化抗体
本発明のタンパク質抗原に対する抗体はさらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与した免疫グロブリンに対してヒトによる免疫応答を惹き起こすことなくヒトに投与するのに適している。抗体のヒト化型は、主としてヒト免疫グロブリンの配列より成って、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらのフラグメント(Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２または抗体の他の抗原結合サブ配列)である。ヒト化は、Winterまたは共同研究者(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))の方法にしたがって、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより、実施し得る。(また、米国特許第５,２２５,５３９号を参照)場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレーム枠の残基を対応する非ヒト残基により置換し得る。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはＣＤＲまたはフレーム枠配列にも見出さない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、また典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ここでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてフレーム枠領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は至適にはまた、免疫グロブリンの通常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む(Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992))。
【０１５７】
ヒト抗体
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含むＬ鎖およびＨ鎖の全配列がヒトの遺伝子より生じる、抗体分子に本質的に関する。かかる抗体は本明細書では、「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」と呼称する。ヒトモノクローナル抗体を、トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照)およびＥＢＶハイブリドーマ技術により調製し、ヒトモノクローナル抗体を生産し得る(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)。ヒト化モノクローナル抗体を、本発明の実施に利用し得て、そしてヒトハイブリドーマを用いて(Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照)またはヒトＢ細胞をインビトロでEpstein Barrウイルスにより形質転換することによって(Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照)生産し得る。
【０１５８】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))を含むさらに別な技術を用いて生産し得る。同様に、ヒト抗体を、ヒト免疫グロブリンの遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、マウスに導入することによって作り得る。ここで内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的にまたは完全に不活化する。チャレンジによって、遺伝子再配列、アセンブリー、および抗体レパトリ−を含む全ての面でヒトにおいて見られるのと非常に良く似たヒト抗体生産を観察する。このアプローチは、例えば、米国特許第５,５４５,８０７号; ５,５４５,８０６号; ５,５６９,８２５号; ５,６２５,１２６号; ５,６３３,４２５号; ５,６６１,０１６号、ならびに Marks et al. (Bio/Technology 10, 779-783 (1992))、Lonberg et al. (Nature 368 856-859 (1994))、Morrison ( Nature 368, 812-13 (1994))、Fishwild et al,( Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996))、Neuberger (Nature Biotechnology 14, 826 (1996))、 Lonberg and Huszar (Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))に記載されている。
【０１５９】
ヒト抗体を、抗原によるチャレンジに応答して動物の内在性抗体ではなく完全なヒト抗体を生産するように修飾したトランスジェニック非ヒト動物を用いて、付加的に生産し得る(ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照)。非ヒト宿主中の免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖をコードする内在性遺伝子を無能にし、そしてヒト免疫グロブリンのＨ鎖およびＬ鎖をコードする活性遺伝子座を宿主のゲノムの中に挿入する。ヒトの遺伝子を、例えば、必要なヒトＤＮＡセグメントを含有する酵母の人工染色体を用いて組み入れ得る。全ての所望の修飾を提供する動物は次いで、修飾の全相補物より少ない相補物を含有する中間トランスジェニック動物を交雑育種することにより子孫として得られる。そのような非ヒト動物の好ましい実施態様はマウスであり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３４０９６号に開示されているようにXenomouse[登録商標]と呼称する。この動物は、完全なヒト免疫グロブリンを分泌する、Ｂ細胞を生産する。抗体は、興味のある免疫原で免疫後、動物から、例えば、ポリクローナル抗体の標本として、直接得ることも、またはこれに代えて、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマのような、動物由来の不死化Ｂ細胞から得ることもできる。これに加えて、ヒトの可変領域を持つ免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収し、発現して、抗体を直接得ることもでき、またはさらに修飾して、例えば、単鎖Ｆｖ分子のような抗体の類似体を得ることができる。
【０１６０】
内在性免疫グロブリンのＨ鎖の発現を欠失する、マウスとして例証した、非ヒト宿主を生産する方法の実施例は、米国特許第５,９３９,５９８号、に開示されている。それは、遺伝子座の再配列を阻止するためにそして再配列した免疫グロブリンＨ鎖の遺伝子座の転写物生成を阻止するために、胚性幹細胞中の少なくとも一つの内在性Ｈ鎖の遺伝子座からＪセグメントを欠失させ、この欠失は選択マーカーをコードする遺伝子を含有するターゲティングベクターによりもたらされ、そして体細胞または胚細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含有するトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から生産することを含む方法により得られる。
【０１６１】
ヒト抗体のような興味のある抗体を生産する方法は、米国特許第５,９１６,７７１号、に開示されている。それは、Ｈ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを一つの培養哺乳動物宿主細胞に導入すること、Ｌ鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクターをさらに別な哺乳動物宿主細胞に導入すること、および２個の細胞を融合してハイブリッド細胞を生成することを含む。ハイブリッド細胞は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含有する抗体を発現する。
【０１６２】
この手順のさらなる改良において、免疫原上の臨床的に関係のあるエピトープを同定する方法、および関係のあるエピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する相関的方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示されている。
【０１６３】
Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体
本発明にしたがって、技術を、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生産に適合することができる(例えば米国特許第４,９４６,７７８号を参照)。加えて、方法を、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に適合し(例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281、を参照)、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効果的な同定を可能し得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含有する抗体フラグメントを、当該分野において公知の技術により生産し得て、それは、(i)抗体分子のペプシン消化により生産するＦ(ａｂ')２フラグメント；(ii)Ｆ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元して得られるＦａｂフラグメント；(iii)抗体分子をパパインおよび還元剤で処置して生成するＦａｂフラグメント；ならびに(iv)Ｆｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１６４】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトのまたはヒト化の抗体である。本明細書においては、結合特異性の一つは本発明の抗原タンパク質に対するものである。２番目の結合標的は、任意の他の抗原であって、有利に細胞表面タンパク質または受容体または受容体サブユニットである。
【０１６５】
二重特異性抗体の作成方法は当該分野において公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２個のＨ鎖が異なる特異性を有する２個の免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づく(Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンＨ鎖およびＬ鎖のランダムな組合せのため、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生産し、そのうちの一つだけが正しい２重特異性構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィーにより行う。類似の方法が、１９９３年５月に公開されたＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１６６】
所望の結合特異性を持つ抗体の可変ドメイン(抗体−抗原結合部位)を、免疫グロブリンの通常ドメイン配列に融合し得る。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリンＨ鎖の通常ドメインと共にある。少なくとも融合の一つの中に存在するＬ鎖結合に必要な部位を含有する第１のＨ鎖通常領域(ＣＨ１)を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖の融合をコードするＤＮＡ、および所望ならば、免疫グロブリンＬ鎖を別々の発現ベクター中に挿入し適当な宿主生物中に形質移入する。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１６７】
ＷＯ９６／２７０１１に記載されたもう一つのアプローチによれば、一対の抗体分子間の境界面を改変して、組換え細胞培地から回収するヘテロダイマーの百分率を最大にし得る。好ましい境界面は、抗体の通常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の境界面の一つまたはそれ以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖(例えばチロシンまたはトリプトファン)で置換する。大きな側鎖(複数を含む)と同一または類似のサイズの代償的な「空隙」を、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの(例えばアラニンまたはスレオニン)で置換することにより第２の抗体分子の境界面に生成する。これは、ホモダイマーのような他の望ましくない最終産物以上にヘテロダイマーの収量を増加する機構を提供する。
【０１６８】
二重特異性抗体を、抗体の全長または抗体フラグメント(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。抗体フラグメントから二重特異性抗体を生成する技術は文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体フラグメントを、化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science 229:81 (1985)は、完全な抗体をタンパク質分解酵素で切断してＦ(ａｂ')２フラグメントを生成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化させて、分子間ジスルフィド形成を阻止する。次いで、生成したＦａｂ'フラグメントをチオニトロ安息香酸(ＴＮＢ)誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢの一つをメルカプトエチルアミンとの還元によりＦａｂ'−チオールに再変換し、そして等量の他のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。生成した二重特異性抗体を酵素の選択的固定化剤として使用し得る。
【０１６９】
これに加えて、Ｆａｂ'フラグメントを大腸菌から直接回収して、化学的にカップリングして、二重特異性抗体を生成し得る。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、完全にヒト化した二重特異性抗体のＦ(ａｂ')２分子の生産を記載している。それぞれのＦａｂ'フラグメントを大腸菌から別々に分泌し、インビトロで指向性化学カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。従って形成した二重特異性抗体を、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常ヒトＴ細胞に結合することができ、ならびにヒト乳腺腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０１７０】
組換え細胞培地から直接二重特異性抗体を作成し単離する種々の技術をまた記載する。例えば、二重特異性抗体をロイシンジッパーを用いて生産する。Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーを遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ'部分に結合した。抗体のホモダイマーをヒンジ領域において還元して、モノマーを形成し、次いで再酸化して、抗体のヘテロダイマーを形成した。この方法をまた、抗体のホモダイマーの生産に利用することができる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載されている「diabody」技術は、二重特異性抗体フラグメント作成のさらに別の機構を提供する。フラグメントは、リンカーによりＬ鎖可変領域(ＶＬ)に連結したＨ鎖可変領域(ＶＨ)を含むが、リンカーが短いため同じ鎖の上の２個のドメイン間での対形成を可能にしない。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは強制的にもう一つのフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対を形成し、それにより二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)のダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメント作成のもう一つの戦略がまた報告されている。Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１７１】
３価以上の結合価をもつ抗体も考得る。例えば、３重特異性抗体を調製し得る。例えば、Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
典型的な二重特異性抗体は、少なくとも一つが本発明のタンパク質抗原に由来する二つの異なるエピトープに結合し得る。これに代えて、免疫グロブリン分子の抗−抗原アームを、白血球上でＴ細胞受容体分子(例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７)またはＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)およびＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)のような、ＩｇＧに対するＦｃ受容体(Ｆｃγ)のような誘発性分子に結合するアームと組み合わせて、特定の抗原を発現する細胞に対する細胞性防御機構に焦点を当て得る。二重特異性抗体をまた使用して、特定の抗原を発現している細胞に細胞障害性物質を指向し得る。これらの抗体は、抗原結合アームおよび細胞障害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡのような放射性核種キレート化剤と結合するアームを所有する。興味のあるもう一つの二重特異性抗体は、本明細書に説明するタンパク質抗原と結合して、さらに組織因子(ＴＦ)と結合する。
【０１７２】
ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体はまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は、共有結合で結合した二つの抗体より成る。そのような抗体は、例えば、好ましくない細胞に免疫系の細胞を標的化するため(米国特許第４,６７６,９８０号)、およびＨＩＶ感染の処置のため(ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９)に提案されている。これらの抗体を、架橋剤を伴うものを含むタンパク質合成化学の既知の方法を用いてインビトロで調製し得ると考えられている。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することより、イムノトキシンを構築することができる。この目的のために適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートならびに、例えば、米国特許第４,６７６,９８０号に開示されているものを挙げ得る。
【０１７３】
エフェクター機能工学
例えば、がんの処置における抗体の有効性を増強するために、本発明の抗体をエフェクター機能に関して修飾することが望ましい。例えば、システイン残基(複数を含む)をＦｃ領域に導入し、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にし得る。かくして生成したホモダイマーの抗体は、改善した内部移行能および／または増強した補体仲介性細胞殺害ならびに抗体依存性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)を有し得る。Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい。増強した抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体はまた、Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されているように、ヘテロ２機能性架橋剤を用いて調製し得る。これに代えて、２重のＦｃ領域を有して、それにより増強した補体依存性細胞溶解およびＡＤＣＣ能を有する抗体を工学操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい。
【０１７４】
免疫複合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらのフラグメント)または放射性同位体(即ち、放射性複合体)のような細胞毒性物質と複合した抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１７５】
そのような免疫複合体の生成に有用な化学療法剤を上述する。使用できる酵素的に活性な毒素およびそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、内毒素Ａ鎖(Pseudomonas aeruginosa由来)、リシンＡ鎖、アビリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Aleurites fordii(シナアブラギリ)タンパク質、ディアンティンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ)、momoridica charantia(ツルレイシ)阻害剤、クルシン、クロチン、sapaonaria officinalisc阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種を放射性複合抗体の生産に利用できる。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅを挙げ得る。
【０１７６】
抗体と細胞障害性薬剤との複合体を、Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオール)プロピオネート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの２機能性誘導体(ジメチルアジピイミデートＨＣＬのような)、活性エステル(ジサクシンイミジルスベレートのような)、アルデヒド(グルタルアルデヒドのような)、ビスアジド誘導体(ビス−(ｐ−アジドベンゾイル)−ヘキサンジアミンのような)、ビスジアゾニウム誘導体(ビス−(ｐ−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミンのような)、ジイソシアネート(トリエン２、６−ジイソシアネートのような)、およびビス活性フッ素化合物(１,５−ジフルオロ２,４−ジニトロベンゼンのような)のような種々の２機能性タンパク質カップリング剤を用いて作る。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載のように調製することができる。炭素１４で標識した１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＭＸ−ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドを抗体に結合するための典型的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０１７７】
もう一つの実施態様では、抗体を、腫瘍をプレターゲティンブのための「受容体」(ストレプトアビジンのような)に結合することができて、そこでは抗体−受容体複合体を患者に投与し、引き続いて未結合の複合体を除去剤を用いて血液循環から除去し、次いで今度は細胞障害性薬剤に複合した「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１７８】
イムノリポソーム
本明細書で開示される抗体をまた、イムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームリポソームは、Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl  Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); ならびに米国特許第４,４８５,０４５号および第４,５４４,５４５号に記載されているような、当該分野において公知の方法で調製する。増大した循環時間を持つリポソームリポソームは、米国特許第５,０１３,５５６号に開示されている。
【０１７９】
特に有用なリポソームリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ−ＰＥ)を含む脂質組成物を用いて逆相蒸発法により生成し得る。リポソームリポソームを定められた孔径のフィルターを通して押し出して、所望の直径のリポソームリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ'フラグメントを、Martin et al ., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームリポソームに結合し得る。化学療法剤(ドキソルビシンのような)を任意にリポソーム内に含有する。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照されたい。
【０１８０】
本発明のタンパク質に対して指向した抗体の診断応用
１実施態様では、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法は限定しないが、エライザ（ＥＬＩＳＡ）および他の当業者既知免疫学的介在技法を含む。具体的実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに特異的である抗体の選択は、そのようなドメインを保有するＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成によって容易化される。かくして、ＮＯＶＸタンパク質、その誘導体、フラグメント、類似体、または相同物に特異的で合える抗体をまたここに提供する。
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して指向化された抗体を、ＮＯＶＸタンパク質の局在化及び／または定量に関する当業界内既知方法で使用し得る（例えば適当な生理学的サンプル内のＮＯＶＸタンパク質のレベルの測定における使用のため、診断方法における使用のため、タンパク質の画像化における使用のためなど）。所定の実施態様では、ＮＯＶＸ、その誘導体、フラグメント、類似体または相同物に特異的な抗体であって、抗体由来抗原結合ドメインを含むものは、薬理学的活性化合物として利用する（以後「治療剤」と称する）。
【０１８１】
本発明のＮＯＶＸタンパク質に対して特異的な抗体を（例えばモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、イムノアフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術により、ＮＯＶＸポリペプチドを単離するために使用し得る。ＮＯＶＸポリペプチドへの抗体を、細胞由来の天然タンパク質および宿主細胞で発現する組換え的に生産したＮＯＶＸ抗原の精製を容易にし得る。さらに、そのような抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、抗原性ＮＯＶＸタンパク質の存在量または発現パターンを評価するために抗原性ＮＯＶＸタンパク質(例えば、細胞溶解物または細胞上清中の)を検出することができる。ＮＯＶＸタンパク質に対して指向した抗体を診断的に使用して、例えば、与えられた処置法の有効性を測定するために臨床検査の手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニターすることができる。抗体を検出可能な物質にカップリング(即ち物理的に連結)することにより、検出を促進し得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、配合群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を挙げる。適当な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを挙げ得る；適当な配合群の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを挙げ得る；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレッセイン、フルオレッセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレッセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを挙げ得る；発光物質の例としては、ルミノールを挙げ得る；生物発光物質の例としてはルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを挙うるし、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈを挙げ得る。
【０１８２】
抗体治療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全なヒト抗体を含む本発明の抗体を治療薬として使用し得る。そのような薬剤を一般的に、対象の疾患または病変の治療または予防に使用する。抗体製剤、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するものを対象に投与して、一般的に標的への結合に因る効果を有する。そのような効果は、与えた抗体分子と問題とする標的抗原との間の相互作用の特異的性質に依存する２種類のうちの一つである。第１の場合では、抗体の投与は、標的の本来結合する内在性リガンドとの結合を阻止または阻害し得る。この場合には、抗体は標的に結合して、リガンドがエフェクター分子として作用する、天然に存在するリガンドの結合部位をマスクする。かくして、受容体はリガンドが役割を担う情報伝達経路を仲介する。
【０１８３】
これに代えて、作用は、抗体が標的分子上のエフェクター結合部位への結合により生理的結果を誘発するものであり得る。この場合には、疾患または病変においては存在しないかまたは欠陥のあり得る内在性リガンドを有する受容体である標的を、代替のエフェクターリガンドとしての抗体と結合して、受容体に基づく情報伝達事象を受容体により開始する。
【０１８４】
本発明の抗体の治療的に有効な量は一般的に、治療目的を達成するのに必要とされる量に関する。上述のように、これは、特定の場合には標的の機能を阻害し、そして他の場合には生理的応答を促進する抗体およびその標的抗原との間の結合相互作用であり得る。投与に必要な量はさらに、特定の抗原に対する抗体の結合親和性に依存するし、そしてまた投与した抗体が投与した対象の自由体積から除去し得る速度に依存する。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療的に有効な投与量の通常の範囲は、限定されない例として、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。通常の投与回数は、例えば、１日２回から１週１回の範囲であり得る。
【０１８５】
抗体の医薬組成物
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体、ならびに本明細書に開示するスクリーニングアッセイにより同定する他の分子を、医薬組成物の形で種々の障害の処置のために投与し得る。そのような組成物の調製に関与する原理および考慮事項、ならびに成分の選択の指針は、例えば、The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995、Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends,  Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994、および Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker,  New Yorkに提供されている。
【０１８６】
抗原タンパク質が細胞内にあり、完全な抗体を阻害剤として使用するならば、内部移行性抗体が好ましい。しかしながら、リポソームを使用して、抗体または抗体フラグメントを細胞内に送達し得る。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づいて、標的タンパク質の配列に結合する能力を保持するペプチド分子をデザインし得る。そのようなペプチドを、化学的および／または組換えＤＮＡ技術により合成し得る。例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい。本明細書における処方はまた、処置する特定の適応のために必要なニつ以上の活性化合物、好ましくはお互いに悪影響を及ぼし合わない相補的活性を持つものを含有し得る。これに代えて、またはこれに加えて、組成物は、その機能を増強する薬剤、例えば、細胞障害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤を含有していてもよい。そのような分子は好都合には、意図する目的にとって効果的な量で組み合わされて存在する。
【０１８７】
活性成分を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製したマイクロカプセル中で、例えば、ハイドロキシメチルセルローズまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタクリレート)マイクロカプセル中で、それぞれ、コロイド状薬送達システム(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に閉じ込め得る。
【０１８８】
インビボ投与に使用する製剤は無菌でなければならない。このことを、無菌ろ過膜によるろ過により容易に達成する。
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適当な例としては、抗体を含有する固相の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルのような造形品の形をしている。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル(例えば、ポリ(２−ヒドロキシエチル−メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３,７７３,９１９号)、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌグルタミン酸エステルの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT[登録商標](乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドより成る注射用マイクロスフェア)のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体が挙げられる。酢酸エチレンビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間に亘って分子を放出することができるが一方、特定のヒドロゲルはより短期間でタンパク質を放出する。
【０１８９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
アナライトのタンパク質を検出する薬剤は、アナライトのタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナルでもよく、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ)２)を使うことができる。用語「標識」とは、プローブまたは抗体に関して、プローブまたは抗体に検出可能な物質をカップリングする(即ち、物理的に連結する)ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接に標識するもう一つの薬剤との反応性によるプローブまたは抗体の間接標識を包含するものとする。間接標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することが挙げられる。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むものとする。それ故に、用語「生物学的試料」の範囲には血液および血清、血漿、またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分を含み得る。即ち、本発明の検出法を使用して、生物学的試料中のアナライトのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをインビトロならびにインビボで検出することができる。例えば、アナライトのｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションを挙げ得る。アナライトのタンパク質のインビトロ検出技術としては、酵素結合免疫吸着検査法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を挙げ得る。アナライトのＤＮＡのインビトロ検出技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。イムノアッセイを実施する手順は、例えば、「ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology」, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995、「Immunoassay」, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996、および「Practice and Thory of Enzyme Immunoassays」, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、アナライトのタンパク質のインビボ検出のための技術は、標識化した抗アナライトタンパク質抗体を対象に導入することを含む。例えば、対象中での存在または局在が標準的な造影技法で検出できる放射性マーカーで、抗体を標識し得る。
【０１９０】
ＮＯＶＸ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質またはその誘導体、フラグメント、類似体または相同体をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書において使用する用語「ベクター」とは、それに結合しているもう一つの核酸を運搬する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは、さらに別なＤＮＡセグメントが結合した環状の二重鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう一つのタイプはウイルスベクターであり、ここではさらに別なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムの中に結合し得る。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞中で自律増幅することができる(例えば、細菌の複製起点を持つ細菌のベクターおよび哺乳動物のエピゾームベクター)。他のベクター(例えば、哺乳動物の非エピゾームベクター)は、宿主細胞中への導入に際し宿主細胞のゲノム中に組み込まれて、それにより宿主ゲノムと一緒に複製し得る。さらに、特定のベクターは、それらが作動し得るように連結した遺伝子の発現を指示する能力がある。そのようなベクターを、本明細書において「発現ベクター」と呼称する。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をしている。プラスミドはベクターの最も通常に使用する形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用し得る。しかしながら、本発明は、同等の機能を有するウイルスベクター(例えば、複製能を欠いたレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)のような他の形の発現ベクターを含むこととする。
【０１９１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中における核酸の発現に適した形での本発明の核酸を含み、これは組換え発現ウイルスを、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択した発現すべき核酸配列に作動し得るように連結した一つまたはそれ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内において、「作動し得るように連結した」とは、興味のある核酸配列が核酸配列の発現を可能にする様式で(例えばインビトロ転写／翻訳システムでまたはベクターを宿主細胞に導入する場合には宿主細胞中で)調節配列に結合していることを意味するものとする。
【０１９２】
用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。そのような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞中でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの(例えば、組織特異的調節配列)を挙げ得る。発現ベクターのデザインが、形質転換する宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等のような要因に依存し得ることを当業者は理解する。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、それにより本明細書に説明するように核酸によりコードする融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチド(例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の突然変異型、融合タンパク質等)を生産し得る。
【０１９３】
本発明の組換え発現ベクターを、原核のまたは真核の細胞中におけるＮＯＶＸタンパク質発現用にデザインし得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、Escherichia coliのような細菌細胞、昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用して)、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現し得る。適当な宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに考察されている。これに代えて、組換え発現ベクターを、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写して、翻訳し得る。
【０１９４】
真核細胞中におけるタンパク質の発現は最もしばしば、Escherichia coli中で融合タンパク質または非融合タンパク質のどちらかの発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。融合ベクターは、その中にコードしたタンパク質に多数のアミノ酸を、通常には組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。そのような融合ベクターは典型的に三つの目的に役立つ：(i)組換えタンパク質の発現を増大するため；(ii)組換えタンパク質の溶解性を増加するため；および(iii)アフィニティークロマトグラフィーにおけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を助けるため。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解による切断部位を融合部分および組換えタンパク質の接合部に導入して、融合部分から組換えタンパク質の分離に引き続いて融合タンパク質の精製を可能にする。そのような酵素、およびそれらと同種の認識配列としては、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを挙げ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えタンパク質に融合させるｐＧＥＸ(Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40)、ｐＭＡＬ (New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５ (Pharmacia, Piscataway, N.J.) を挙げ得る。
【０１９５】
適当な誘導性非融合E. coli発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ(Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315)およびｐＥＴ１１ｄ (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)を挙げ得る。
【０１９６】
E. coliにおけるタンパク質発現を最大にする一つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力を障害した宿主細胞中でタンパク質を発現することである。Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照されたい。もう一つの戦略は、それぞれのアミノ酸に対する個別のコドンをE. coliで優先的に使用するものとなるように、発現ベクターに挿入する核酸の核酸配列を変更することである(例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照)。本発明の核酸配列のそのような変更は標準的ＤＮＡ合成技法により行い得る。
【０１９７】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸ発現ベクターは酵母の発現ベクターである。酵母のSaccharomyces cerivisae中の発現ベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１ (Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234)、ｐＭＦａ(Kurjan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943)、ｐＪＲＹ８８ (Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123)、ｐＹＥＳ２(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.)、およびｐｉｃＺ(InVitrogen Corp, San Diego, Calif.)を挙げ得る。
【０１９８】
これに代えて、ＮＯＶＸをバキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞中で発現し得る。培養昆虫細胞(例えば、ＳＦ９細胞)中でのタンパク質発現に利用可能なバクロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ(Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165) およびｐＶＬシリーズ(Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39)を挙げ得る。
【０１９９】
なおもう一つの実施態様では、本発明の核酸を、哺乳動物の発現ベクターを用いて哺乳動物細胞中で発現し得る。哺乳動物の発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８(Seed, 1987. Nature 329: 840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195)を挙げ得る。哺乳動物細胞中で使用するときには、発現ベクターの制御機能はしばしば、ウイルスの調節要素により提供される。例えば、普通に使用するプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０に由来する。原核のおよび真核の細胞両方にとって適当な他の発現系については、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい。
【０２００】
もう一つの実施態様では、組換え哺乳動物表現ベクターは、特定の細胞タイプ中で優先的に核酸の発現を指示する能力がある(例えば、組織特異的調節要素を核酸を発現するために使用する)。組織特異的調節要素は当該分野において公知である。適当な組織特異的プロモータの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター(肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277)、リンパ系特異的プロモーター(Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275)、特にT細胞受容体(Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733)および免疫グロブリン (Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748)のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター(例えば、ニューロフィラメントプロモーター; Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916)、ならびに乳腺特異的プロモーター(例えば、乳漿；米国特許第４,８７３,３１６号及びヨーロッパ出願公開第２６４,１６６号)を挙得る。例えば、マウスのｈｏｘプロモーター(Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379)およびα−フェトプロテインプロモーター(Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546)の発生的に調節されるプロモーターも包含する。
【０２０１】
本発明はさらに、発現ベクターの中にアンチセンスの配向でクローン化した本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。即ち、ＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現(ＤＮＡ分子の転写による)を可能にするような様式で、調節配列に機能し得るように結合する。種々の細胞タイプ中のアンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指示するアンチセンスの配向にクローン化した核酸に機能し得るように結合した調節配列、例えば、ウイルスのプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができるか、またはアンチセンスＲＮＡの組織特異的または細胞タイプ特異的な構成的発現を指示する調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターを導入した細胞タイプにより活性を決定する高効率調節領域の制御下で、アンチセンス核酸を生産する組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形であり得る。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節の考察については、例えば、Weintraub, et al., 「Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis」 Reviews-Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986を参照されたい。
【０２０２】
本発明のもう一つの態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入する宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」を、本明細書においては互換的に使用する。そのような用語は、特定の対象の細胞のみならずそのような細胞の子孫または潜在的子孫をまた指すことを理解する。突然変異または環境の影響により後の世代に特定の修飾が生じるかもしれないため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書において使用する用語の範囲内になお含まれる。
【０２０３】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質を、E. coliのような細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞(チャイニーズハムスター卵巣細胞(ＣＨＯ)またはＣＯＳ細胞)のような細菌の細胞中で発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者に周知である。
【０２０４】
ベクターＤＮＡを、従来の形質転換または形質移入技術により原核細胞または真核の細胞の中に導入することができる。本明細書において使用する用語「形質転換」および「形質移入」とは、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性形質移入、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む外来の核酸(例えばＤＮＡ)を宿主細胞に導入するために当該分野で認める種々の技術を指すものとする。宿主細胞を形質転換しまたは形質移入するための適当な方法は、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)および他の実験室マニュアルに見出すことができる。
【０２０５】
哺乳動物細胞の安定的な形質移入については、使用される発現ベクターおよび形質移入の技法に依存して、細胞のごく小数のフラクションが外来性ＤＮＡをそのゲノムの中に組み込み得る。これらの組み込み体を同定し選択するために、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質に対する抵抗性)が一般的に、興味のある遺伝子と一緒に宿主細胞に導入される。種々の選択可能なマーカーとしては、Ｇ４１８,ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬剤に抵抗性を与えるものが挙げられる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、ＮＯＶＸをコードするものと同一のベクター上で宿主細胞に導入することができか、または別のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定に形質移入された細胞は、薬剤選択により同定されることができる(例えば、選択可能なマーカーを組み込んでいる細胞は生き残る一方で、他の細胞は死ぬ)。
【０２０６】
培地中の原核細胞または真核細胞のような本発明の宿主細胞を用いて、ＮＯＶＸタンパク質を生産する(即ち、発現する)ことができる。したがって、本発明は、本発明の宿主細胞を用いるＮＯＶＸタンパク質の生産方法をさらに提供する。一つの実施態様では、その方法は、本発明の宿主細胞(その中にＮＯＶＸタンパク質をコードする組換え発現ベクターを導入する)を、ＮＯＶＸタンパク質を生産するような適当な培地中で培養することを含む。もう一つの実施態様では、その方法は、培地または宿主細胞からＮＯＶＸタンパク質を単離することをさらに含む。
【０２０７】
トランスジェニックＮＯＶＸ動物
本発明の宿主細胞をまた使用して、非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、その中にＮＯＶＸタンパク質コード化配列を導入する受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、その中で外来性のＮＯＶＸ配列をゲノムの中に導入する非ヒトトランスジェニック動物、またはその中で内在性のＮＯＶＸ配列を変更する相同な組換え動物を創成することができる。そのような動物は、ＮＯＶＸタンパク質の機能および／または活性の研究にならびにＮＯＶＸタンパク質活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において使用する「トランスジェニック動物」とは、その中で動物の一つまたはそれ以上の細胞が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはラットまたはマウスのようなげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両棲類等を挙げ得る。導入遺伝子は、それからトランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムの中に取り込まれ、そして成熟動物のゲノム内に残存して、それによりトランスジェニック動物の一つまたはそれ以上の細胞タイプまたは組織中におけるコード化遺伝子産物の発現を指令する外来性ＤＮＡである。本明細書において使用する「相同の組換え動物」とは、その中で内在性ＮＯＶＸ遺伝子が内在性遺伝子および、動物の細胞、例えば、動物の胚細胞の中に動物の発生前に導入された外来性ＤＮＡ分子との間で相同組換えにより変更した非ヒト動物、好ましくは哺乳類、さらに好ましくはマウスである。
【０２０８】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を受精卵母細胞の雄性前核の中に(例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染により)導入して、卵母細胞を偽妊娠雌性仮親動物の体内で発生することを可能にすることにより、創成することができる。配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)のヒトＮＯＶＸｃＤＮＡ配列を、非ヒト動物のゲノム内に導入遺伝子として導入することができる。これに代えて、マウスＮＯＶＸ遺伝子のようなヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体を、ヒトＮＯＶＸのｃＤＮＡとのハイブリダイゼーション(上にさらに詳述)に基づいて単離して、導入遺伝子として使用し得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた、導入遺伝子の発現効率を増加するために導入遺伝子中に含み得る。組織特異的調節配列をＮＯＶＸ導入遺伝子に機能し得るように結合して、特定の細胞にＮＯＶＸタンパク質の発現を指示し得る。胚の操作およびマイクロインジェクションによる、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物の作成方法は当該分野において従来的となってきており、例えば、米国特許第４,７３６,８６６号; ４,８７０,００９号; および４,８７３,１９１号;ならびにHogan, 1986. In: MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載されている。類似の方法を他のトランスジェニック動物の生産に用い得る。初代トランスジェニック動物を、ゲノム内のＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／または動物の組織または細胞中におけるＮＯＶＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて、同定し得る。次いで、初代トランスジェニック動物を、導入遺伝子を保持する追加的動物の繁殖に使用し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質をコードする導入遺伝子を保持するトランスジェニック動物を使用して、他の導入遺伝子を保持するさらに別なトランスジェニック動物を繁殖し得る。
【０２０９】
相同の組換え動物を創成するために、その中に欠失、付加または置換を導入していて、それによりＮＯＶＸ遺伝子を変化させる例えば機能的に破壊するあるＮＯＶＸ遺伝子の少なくとも一部を含有するベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子は、ヒト遺伝子(例えば配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)のｃＤＮＡ)であり得るが、さらに好ましくはヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウス相同体を使用して、マウスゲノム中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適する相同組換えベクターを構築することができる。一つの実施態様では、ベクターを、相同組換えにより、内在性遺伝子を機能的に破壊する(即ち、もはや機能的なタンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターとも呼称する)ようにデザインする。
【０２１０】
これに代えて、ベクターは、相同組換えにより内在性ＮＯＶＸ遺伝子を変異するかまたは他のように変更するが、依然機能性タンパク質をコードする(例えば、上流の調節領域を変更してそれにより内在性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更する)ようにデザインし得る。相同組換えベクターでは、ＮＯＶＸ遺伝子の変更したタンパク質は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらに別な核酸により５'末端または３'末端に隣接して、ベクターにより保持する外来性ＮＯＶＸ遺伝子および胚性幹細胞中の内在性ＮＯＶＸ遺伝子の間で相同組換えが起こることを可能にする。さらに別な隣接ＮＯＶＸ核酸は、内在性遺伝子と成功裏に相同組換えが起きるように十分な長さを持つ。典型的には、数キロ塩基の隣接ＤＮＡ(５'末端および３'末端の両方とも)をベクターに含み得る。相同組換えベクターの記載については、例えば、Thomas, et al., 1987. Cell 51: 503を参照されたい。次いで、ベクターを胚性幹細胞株に(例えば、エレクトロポレーションにより)導入し、そしてその中で導入したＮＯＶＸ遺伝子を内在性ＮＯＶＸ遺伝子と相同的に組み換えた細胞を選択する。例えば、Li, et al., 1992. Cell 69: 915を参照されたい。
【０２１１】
次いで、選択した細胞を動物(例えば、マウス)の胚盤胞の中に注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Bradley, 1987. In: TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS: A PRACTICAL APPROACH, Robertson, ed. IRL, Oxford, pp. 113-152を参照されたい。次いで、キメラ胚を適当な偽妊娠雌性仮親動物に植え込んで、胚を満期出産する。生殖細胞内に相同組換えしたＤＮＡを保持している子孫を用いて、その中で動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列を介した伝達により相同組換えＤＮＡを含有する動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Bradley, 1991. Curr. Opin. Biotechnol. 2: 823-829; ＰＣＴ国際公開第: ＷＯ９０／１１３５４号；ＷＯ９１／０１１４０号；ＷＯ９２／０９６８号;およびＷＯ９３／０４１６９号にさらに記載される。
【０２１２】
もう一つの実施態様では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択したシステムを含有する非ヒトトランスジェニック動物を生産し得る。そのようなシステムの一つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの記載については、例えば、Lakso, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236を参照されたい。リコンビナーゼシステムのもう一つの例は、Saccharomyces cerevisiaeのＦＬＰリコンビナーゼシステムである。O'Gorman, et al., 1991. Science 251:1351-1355を参照されたい。もしｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを用いて導入遺伝子の発現を調節するならば、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要となる。そのような動物は、例えば、一つは選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、他はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する二つのトランスジェニック動物を交配させることによる「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供し得る。
【０２１３】
本明細書に説明した非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Wilmut, et al., 1997. Nature 385: 810-813に記載された方法にしたがって生産することができる。略述すれば、トランスジェニック動物から細胞(例えば体細胞)を単離し、誘導して、増殖サイクルから抜け出てＧ０期に入ることができる。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により静止細胞を単離したのと同じ種類の動物由来の脱核した卵母細胞と融合することができる。次いで、再構成した卵母細胞を、それを桑実胚または胚盤胞にまで発生させて、次いで擬妊娠雌性仮親動物に導入するように培養する。この雌性仮親動物から生まれた子孫は、細胞(例えば体細胞)を単離する動物のクローンである。
【０２１４】
医薬組成物
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、抗−ＮＯＶＸ抗体(本明細書では「活性化合物」ともいう)、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、類似体および相同体を投与に適する医薬組成物の中に組込み得る。典型的に、そのような組成物は核酸分子、タンパク質または抗体およびおよび医薬的に許容され得る担体を含む。本明細書において使用する「医薬的に許容され得る担体」とは、医薬品投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗かび剤、等張および吸収遅延剤等を含むことを意図する。適当な担体は、この分野で標準的な参照テキストであるRemingtonの薬剤学の最新版(出典明示により本明細書の一部とする)に記載されている。そのような担体または賦形剤の好ましい例としては、水、食塩水、フィンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンを挙げるが、それらに限定しない。リポソームおよび脂肪油のような非水溶性ビークルもまた使用する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤は当該分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物に適合しない限りでなければ、組成物内のそれらの使用を意図する。補助的な活性化合物をまた、組成物の中に組込み得る。
【０２１５】
本発明の医薬組成物を、その意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口の、例えば、静脈の、皮内の、皮下の、経口の(例えば、吸入)、経皮の(即ち局所の)、経粘膜のおよび直腸の投与を挙げ得る。非経口の、皮内のまたは皮下の応用に使用する溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水のような無菌賦形剤、食塩水溶液、脂肪油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のようなキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような等張性を調整する薬剤。塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いてｐＨを調整することができる。非経口性製剤を、ガラスまたはプラスチックで作るアンプル、使い捨て注射器、または多回使用バイアルの中に封入し得る。
【０２１６】
注射用に適する医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性である場合)または分散液および無菌注射用の溶液または分散液の必要に応じて調合する製剤用の無菌粉末を挙げ得る。静脈投与のためには、適当な担体としては、生理食塩水、静菌性水、Cremophor EL[登録商標] (BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)を挙げ得る。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。それは製造および保管の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液性ポリエチレングリコール等)ならびにそれらの適当な混合液を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性を、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により、保持し得る。微生物作用の保護は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等、により達成される。多くの場合に、組成物中に、等張性薬剤、例えば、砂糖、マニトールのようなポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成剤の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらせ得る。
【０２１７】
無菌注射用溶液を、適切な溶媒の中に一つまたは上で列挙した成分の組合せと共に必要な量で活性化合物(例えば、あるＮＯＶＸタンパク質または抗ＮＯＶＸ抗体)を組み込み、ついでろ過滅菌を行なうことにより調製することができる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒体および上で列挙したものから必要な他の成分を含有する無菌ビークルの中に活性化合物を組み込むことにより調製することができる。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合には、調製方法は、活性成分の粉末プラス前もって無菌ろ過されたその溶液からの任意のさらに別の望ましい成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０２１８】
一般的に、経口の組成物は、不活性賦形剤または食用の担体を含む。それらをゼラチンカプセル中に封入するかまたは錠剤に打錠することができる。経口治療投与の目的には、活性化合物を添加物と共に組込んで錠剤、トローチまたはカプセルの形状で使用することができる。経口の組成物をまた、うがい薬としての使用のために液体担体を用いて調製し得るが、そこでは液体担体中の化合物を経口的に塗布し、さっと取り除いて、吐き出すか飲み込む。薬学的に適合する結合剤、おおび／またはアジュバント材料を組成物の一部として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は任意の以下の成分または同様な性質を持つ化合物を含有し得る：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたは乳糖のような添加剤、アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロートのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑り剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；またはハッカ、サルチル酸メチル、オレンジ香料のような着香剤。
【０２１９】
吸入による投与のためには、化合物を、適当な噴射剤、例えば二酸化炭素のようなガスを含有する加圧容器またはディスペンザー、またはネブライザーからエアゾールスプレイの形式で送達し得る。
【０２２０】
全身的投与はまた、経粘液または経皮手段により得る。経粘液または経皮投与のためには、透過すべきバリアーに適切な浸透剤を処方に使用する。そのような浸透剤は当該分野において一般的に公知であり、そして、例えば、経粘液投与のためには、洗剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を挙げ得る。経粘液投与は鼻腔スプレーまたは坐剤の使用により達成され得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏剤、ゲルまたはクリームの中に処方される。
【０２２１】
化合物をまた、直腸送達のために坐薬(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤用基材と共に)または保持浣腸剤の形式で調製し得る。
【０２２２】
一つの実施態様において、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、化合物を身体からの迅速な排泄から防止する担体と共に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸のような、生物分解性で生体適合性のポリマーを使用し得る。そのような製剤を調製する方法は当業者に明らかである。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から市販で入手可能である。リポソームの懸濁液(モノクローナル抗体を持つ感染した細胞からウイルス抗体に至って標的化したリポソームを含む)をまた、医薬的に許容され得る担体として使用することができる。これらを、例えば米国特許第４,５２２,８１１号に記載のように、当業者に公知の方法に従い調製し得る。
【０２２３】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、経口性または非経口性の組成物を単位投与剤型で処方することが特に有益である。本明細書で使用する単位投与剤型とは、処置する対象に対して単一の投与量として適する物理学的に分離した単位を指し；それぞれの単位は、必要な薬学的な担体と一緒に望ましい治療効果を生じるように計算した予め決められた量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与剤型の規格は、活性化合物の特異な特色および達成するべき特別な治療効果、ならびにそのような活性化合物を個体の処置のために配合する当該分野に固有の制限により指示されかつ直接に依存する。
【０２２４】
本発明の核酸分子をベクターの中に挿入して遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターを、例えば、静脈注射、局所投与により(例えば、米国特許第５,３２８,４７０号を参照)または走触性注射(例えば、Chen, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057を参照)により送達し得る。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容される賦形剤の中に遺伝子治療ベクターを含むか、またはその中に遺伝子治療ベクターを埋め込んだ持続性マトリックスを含み得る。これに代えて、完全な遺伝子治療ベクターを組換え細胞、例えばレテロウイルスベクターから無傷で生産し得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを生産する一つまたはそれ以上の細胞を含み得る。
医薬製剤を、投与指示書と共に、容器、パックまたはディスペンサーの中に含み得る。
【０２２５】
スクリーニングおよび検出の方法
以下に詳述するように、本発明の単離核酸分子を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を発現し(例えば、遺伝子治療応用において宿主細胞中で組換え発現ベクターを介して)、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡ(例えば、生物学的試料中の)またはＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的欠損を検出し、そしてＮＯＶＸ活性を調整することができる。加えて、ＮＯＶＸタンパク質を用いて、ＮＯＶＸタンパク質の活性または発現を調整する薬または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分なまたは過剰な生産、またはＮＯＶＸの野生型タンパク質と比較して低下または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質型の生産を特徴とする疾患(例えば；糖尿病(インスリン放出を調節する)；肥満(脂質に結合し輸送する)；肥満に関連した代謝障害、代謝的シンドロームＸならびに慢性障害および種々のがんに随伴する食欲不振および消耗性障害、ならびに感染性疾患(抗微生物活性を有する)および種々の異脂肪血症を処置し得る。加えて、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を検出しかつ単離し、そしてＮＯＶＸ活性を調整し得る。なおさらなる態様では、本発明を方法で使用して、食欲、栄養の吸収および代謝基質の処分を正および負の両方の様式で影響させることができる。
本発明はさらに、本明細書に説明するスクリーニングアッセイで同定する新規な薬剤および上述の処置のためのそれらの使用に関する。
【０２２６】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、即ち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、または、例えばＮＯＶＸタンパク質の発現またはＮＯＶＸタンパク質の活性に促進的または阻害的作用を有する候補または試験化合物または薬剤(例えば、ペプチド、ペプチドミメティクス、低分子または他の薬)を同定する方法(本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼称する)を提供する。本発明はまた、本明細書に説明するスクリーニングアッセイにおいて同定した化合物を含む。
【０２２７】
一つの実施態様では、本発明は、膜結合型のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分に結合するかまたは活性を調整する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物を、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス参照可能な並列の固相または液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成的ライブラリー方法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー方法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー方法：を含む、当該分野において周知のコンビナトリアルライブラリーにおける数多くのアプローチのいずれを用いても得られる。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定される一方で、他の４種のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である。例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照されたい。
【０２２８】
本明細書において使用する「低分子」とは、約５ｋＤ未満の、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。低分子は、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティクス、炭水化物、脂質または他の有機のまたは無機の分子であり得る。化学的および／または、真菌、細菌、または藻類の抽出物のような、生物学的混合物は当該分野において公知であり、本発明の任意のアッセイを用いてスクリーニングすることができる。
【０２２９】
分子ライブラリー合成方法の例を、例えば、DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909、Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422、Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678、Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059、Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061、およびGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233における当該分野に見出し得る。
【０２３０】
化合物のライブラリーを、溶液中で(例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421)、またはビーズ上で(Lam, 1991. Nature 354: 82-84)、チップ上で(Fodor, 1993. Nature 364: 555-556)、バクテリア(Ladner, 米国特許第５,２２３,４０９号)、胞子 (Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)、プラスミド (Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869)上でまたはファージ上で(Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406、Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382、Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310、Ladner, 米国特許第５,２３３,４０９号)で提供し得る。
【０２３１】
ある実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、そこでは膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触させ、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定する。細胞は、例えば、哺乳動物由来または酵母細胞であり得る。試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力を測定することは、例えば、試験化合物を放射性同位元素または酵素標識とカップリングして、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分への試験化合物の結合を、複合物中の標識化合物を検出することにより測定できるようにする。例えば、試験化合物を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで直接的にまたは間接的に標識し、そして放射性同位元素を放射線放射の直接計数またはシンチレーション計数により検出する。これに代えて、試験化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼにより酵素的に標識し、そして適切な基質の生産物への変換の測定により酵素標識を検出する。ある実施態様では、アッセイは、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を、ＮＯＶＸに結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成して、アッセイ混合物を試験化合物と接触し、そして試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に、既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２３２】
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞に基づくアッセイであり、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面に発現する細胞を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む。試験化合物がＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調整する活性を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することにより達成し得る。本明細書において使用する「標的分子」とは、自然界であるＮＯＶＸタンパク質が結合または相互作用する分子、例えば、あるＮＯＶＸと相互作用するタンパク質を発現する細胞表面の分子、２番目の細胞表面の分子、細胞外の環境中の分子、細胞膜の内側表面と会合している分子または細胞質の分子である。ＮＯＶＸの標的分子は、非ＮＯＶＸ分子または本発明のあるＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドであり得る。一つの実施態様では、あるＮＯＶＸの標的分子は、細胞外のシグナル(例えば、膜結合ＮＯＶＸ分子への化合物の結合により発生するシグナル)を細胞膜を通してかつ細胞内への伝達を促進する情報伝達経路の成分である。標的は、例えば、触媒活性を有する２番目の細胞内タンパク質または下流のシグナル分子とＮＯＶＸとの会合を促進するタンパク質であり得る。
【０２３３】
ＮＯＶＸタンパク質をあるＮＯＶＸの標的分子と結合するかまたは相互作用をする能力を測定することは、直接的な結合を測定する上述の方法の一つにより達成し得る。一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子と結合または相互作用する能力を測定することは、標的分子の活性を測定することにより達成することができる。例えば、標的分子の活性を、標的の細胞性第二のメッセンジャー(即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３等)の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を検出すること、受容体遺伝子(検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼ、をコードする核酸に機能し得るように結合したＮＯＶＸ応答性調節要素を含む)の誘導を検出すること、または細胞応答、例えば、細胞の生存、細胞の分化、または細胞の増殖、を検出することにより測定し得る。
【０２３４】
なおもう一つの実施態様では、本発明のアッセイは無細胞アッセイであって、あるＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を測定することを含む。ＮＯＶＸタンパク質への試験化合物の結合を、上述のように、直接的または間接的のどちらかで測定することができる。一つのそのような実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸと結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、および試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に既知化合物と比較して優先的に結合する能力を測定することを含む。
【０２３５】
なおもう一つの実施態様では、アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を試験化合物と接触し、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質の活性を調整する(例えば促進または阻害する)能力を測定することを含む無細胞アッセイである。ＮＯＶＸの活性を調整する試験化合物の能力を測定することは、例えば、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に結合する活性を直接な結合を測定するために上述した方法の一つにより達成することができる。さらに別の実施態様では、試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質がさらにあるＮＯＶＸの標的分子を調整する能力を測定することにより達成することができる。例えば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性を上述のように測定することができる。
【０２３６】
なおもう一つの実施態様では、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分をＮＯＶＸタンパク質と結合する既知の化合物と接触して、アッセイ混合物を形成すること、アッセイ混合物を試験化合物と接触すること、そして試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することを含むが、そこでは試験化合物があるＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を測定することは、ＮＯＶＸタンパク質があるＮＯＶＸの標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調整する能力を測定することを含む。
【０２３７】
本発明の無細胞アッセイは、可溶性型または膜結合型のＮＯＶＸタンパク質の両方に使用することができる。膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を含む無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＮＯＶＸタンパク質を溶液中に維持するように、可溶化剤を利用するのが望ましい。そのような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１００、Ｔｒｉｔｏｎ[登録商標]Ｘ-１１４、Ｔｈｅｓｉｔ[登録商標]、イソトリデシポリ(エチレングリコールエーテル)ｎのような非イオン性界面活性剤、Ｎ−ドデシル−Ｎ,Ｎ−ジメチル−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳ)、または３−(３−クロルアミドプロピル)ジメチルアミニオール−２ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を挙げ得る。
【０２３８】
本発明の上記のアッセイ法の二つ以上の実施態様において、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子を固相化して、一つまたは両方のタンパク質の非複合型から複合型の分離を容易にし、ならびにアッセイの自動化に適合することができる。試験化合物のＮＯＶＸタンパク質への結合、または候補化合物存在下および非存在下でのＮＯＶＸタンパク質と標的分子との相互作用は、反応物質を含有するのに適する任意の容器において達成することができる。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心チューブを挙げ得る。一つの実施態様では、一つまたは両方のタンパク質をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供し得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質をグルタチオンセファローズビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)またはグルタチオンで誘導体化したマイクロタイタープレート上に吸着し、これを次いで試験化合物、または試験化合物および非吸着標的タンパク質またはＮＯＶＸタンパク質のどちらかと結合し、そして混合物を複合体形成を促進する条件下で(例えば、塩およびｐＨに関して生理的な条件で)インキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレート穴を洗滌して、非結合成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化し、複合体を例えば上述のように、直接的にまたは間接的に測定する。これに代えて、複合体をマトリックスから解離し、そしてＮＯＶＸタンパク質の結合または活性レベルを標準的技術を用いて測定することもできる。
【０２３９】
マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術をまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用し得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化することができる。ビオチニル化ＮＯＶＸタンパク質または標的分子をビオチン−ＮＨＳ(Ｎ−ヒドロキシ−サクシンイミド)から当該分野内で周知の技術(例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)を用いて調製して、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴プレート(Pierce Chemical)の穴に固定化することができる。これに代えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応性であるが、ＮＯＶＸタンパク質のその標的タンパク質への結合を妨害しない抗体をプレートの穴に誘導体化して、非結合標的またはＮＯＶＸタンパク質を抗体との結合により穴に捕捉することができる。そのような複合体を検出する方法としては、ＧＳＴ−固定化複合体について上述したものに加えて、ＮＯＶＸタンパク質または標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸタンパク質または標的分子に関連した酵素活性を検出することに依存する酵素結合アッセイを挙げ得る。
【０２４０】
もう一つの実施態様では、ＮＯＶＸタンパク質発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触し、細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を測定する方法で同定する。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、候補化合物を、この比較に基づいてＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質のモジュレータとして同定し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも多い(即ち統計的に有意に多い)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤として同定する。これに代えて、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下での方がその非存在下でよりも少ない(即ち統計的に有意に少ない)ときには、候補化合物を、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤として同定する。細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のレベルを、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書で説明する方法により測定することができる。
【０２４１】
本発明のなおもう一つの態様では、ＮＯＶＸタンパク質は２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイ(例えば米国特許第5,283,317号、Zervos, et al., 1993. Cell 72: 223-232、Madura, et al., 1993. J. Biol. Chem. 268: 12046-12054、Bartel, et al., 1993. Biotechniques 14: 920-924、Iwabuchi, et al., 1993. Oncogene 8: 1693-1696、および Brent 第ＷＯ９４／１０３００号を参照)おける「ベイトタンパク質」として使用して、ＮＯＶＸと結合または相互作用をしてＮＯＶＸ活性を調整する他のタンパク質(「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」)を同定し得る。そのようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流の要素としてＮＯＶＸタンパク質によるシグナルの増幅に関与する可能性が高い。
【０２４２】
２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインより成る殆どの転写因子のモジュール構成的性質に基づく。略述すれば、アッセイには２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子を既知の転写因子(例えば、ＧＡＬ−４)のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合する。他の構築物においては、未同定のタンパク質(「プレイ」または「試料」)をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡを、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合する。もし「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用してＮＯＶＸ依存性複合体を形成することができれば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近くに引き寄せ得る。この近接は、転写因子に応答性の転写調節部位に機能し得るように結合したレポーター遺伝子(例えば、ＬａｃＺ)の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的転写因子を含有する細胞コロニーを単離し、そしてこれを用いてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
本発明はさらに前述のスクリーニングアッセイにより同定する新規薬剤および本明細書に説明する処置へのその使用に関する。
【０２４３】
検出アッセイ
本明細書で同定するｃＤＮＡの一部またはフラグメント(および対応する完全な遺伝子配列)をポリヌクレオチド試薬として種々の方式で使用することができる。例として、限定は無しに、これらの配列を：(i)染色体上にそれぞれの遺伝子をマップし；かくして遺伝的疾患に関連した遺伝子領域を位置決定する；(ii)微量の生物学的試料から個体を同定する(組織タイピング)；および(iii)生物学的試料の法医学的同定を助けるために用い得る。これらの応用の幾つかを以下のサブセクションで説明する。
【０２４４】
染色体マッピング
一旦遺伝子の配列(または配列の一部)を単離すれば、この配列を用いて、染色体上の遺伝子の位置をマップすることができる。この方法を染色体マッピングと呼ぶ。したがって、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)であるＮＯＶＸ配列の一部またはフラグメント、またはそれらのフラグメントまたは誘導体を用いて、染色体上のＮＯＶＸ遺伝子の位置をそれぞれマップし得る。染色体へのＮＯＶＸ配列のマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と相関づける重要な第一歩である。
【０２４５】
略述すれば、ＮＯＶＸ遺伝子を、ＮＯＶＸ配列からＰＣＲプライマー(好ましくは１５−２５ｂｐ長)を調製することにより染色体にマップし得る。ＮＯＶＸ配列のコンピューター分析を使用して、そのため増幅プロセスを複雑にする、ゲノムＤＮＡ中の二つ以上のエキソンに亘らないプライマーを迅速に選択し得る。次いで、これらのプライマーを、個別のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに使用し得る。ＮＯＶＸ配列に対応するヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドのが、増幅したフラグメントを生成する。
【０２４６】
体細胞ハイブリッドは、異なる哺乳動物由来の体細胞(例えば、ヒトおよびマウスの細胞)を融合することにより調製する。ヒトおよびマウスの細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するうちに、それらはヒト染色体をランダムな順序で徐々に欠失するが、マウスの染色体を保持する。特定の酵素を欠くためマウス細胞は増殖できないが、ヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とする酵素をコードする遺伝子を含有する一つのヒト染色体を保持する。種々の培地を使用することにより、ハイブリッド細胞株のパネルを樹立し得る。パネル中のそれぞれの細胞株は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体、および完全なセットのマウス染色体を含有し、個別の遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマップすることを可能にする。例えば、D'Eustachio, et al., 1983. Science 220: 919-924を参照されたい。ヒト染色体のフラグメントのみを含有する体細胞ハイブリッドをまた、転座および欠失を持つヒト染色体を用いることにより生産し得る。
【０２４７】
体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に対応付ける迅速な手順である。単一のサーマルサイクラーを用いて、１日に３個以上の配列を対応付けることが可能である。ＮＯＶＸ配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーをデザインすることにより、特定の染色体由来のフラグメントのパネルを用いて細かな局在部位の特定化を達成し得る。
【０２４８】
分裂中期の染色体スプレッドへのＤＮＡ配列の蛍光インシツハイブリダイゼーション(ＦＩＳＨ)をさらに用いて、正確な染色体上の位置を１ステップで提供し得る。染色体スプレッドを、コルセミドのような紡錘体を破壊する化学物質により細胞分裂を分裂中期でブロックされている細胞を用いて作成し得る。染色体を短時間トリプシンで処理し、次いでギムザ染色し得る。明暗のバンドのパターンがそれぞれの染色体上に出現し、それにより染色体を個別に同定し得る。ＦＩＳＨ技術を５００または６００塩基と短いＤＮＡ配列で使用し得る。しかしながら、１,０００塩基より大きなクローンは、簡単な検出に十分なシグナル強度で特定の染色体上の位置に結合する可能性がより高い。好ましくは１,０００塩基、そしてさらに好ましくは２,０００塩基が合理的な時間に良好な結果を得るのに十分である。この技術の総説については、Verma, et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES (Pergamon Press, New York 1988を参照されたい。
【０２４９】
染色体マッピング用の試薬を個別に使用して、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位を標識すること、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体を標識するために使用し得る。遺伝子の非コード化領域に対応する試薬が実際には、マッピングの目的には好ましい。コード化領域を遺伝子ファミリー内で保存する可能性がより高く、かくして染色体マッピングの間に交叉ハイブリダイゼーションのチャンスが増大する。
【０２５０】
一旦配列を正確な染色体上の位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップのデータと関連づけ得る。そのようなデータを、例えば、in McKusick, Mendelian Inheritance in Man (Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出す。同じ染色体部位にマッピングした遺伝子と疾患との間の関係を、次いで、例えば、Egeland, et al., 1987. Nature, 325: 783-787に記載する関連分析(物理的に隣接している遺伝子の同時遺伝)により同定し得る。
【０２５１】
さらに、ＮＯＶＸ遺伝子に関連した疾患に罹患している個体と罹患していない個体の間のＤＮＡ配列の差を測定し得る。もし変異を罹患している個体のいくらかまたは全部で観察するが、罹患していない個体のいずれでも観察しないならば、変異は特定の疾患の原因剤である可能性が高い。罹患した個体と罹患していない個体の比較は一般的に、まず染色体スプレッドから視認可能な欠失または転座のような染色体の目に見える構造変化、またはそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲの使用で検出可能な構造変化の探索を伴う。最後に、数人の個体由来の遺伝子の完全なシークエンシングを行って、変異の存在を確認し、そして変異を多型性と区別し得る。
【０２５２】
組織タイピング
本発明のＮＯＶＸ配列をまた使用して、微量な生物学的試料から個体を同定し得る。この技術では、個体のゲノムＤＮＡを一つまたはそれ以上の制限酵素で消化して、サザンブロット上でプローブ結合し、同定用のユニークなバンドを生成する。本発明の配列は、ＲＦＬＰ(制限断片長多型、米国特許第５,２７２,０５７号に記載)のさらに別なＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２５３】
さらに、本発明の配列を使用して、個体のゲノムの選択した部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を測定するさらに別な技術を提供し得る。かくして、本明細書に説明したＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５'末端および３'末端から二つののＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを用いて、個体のＤＮＡを増幅し、引き続いてこれをシークエンシングし得る。
【０２５４】
それぞれの個体は、対立遺伝子の違いによるそのようなＤＮＡの特徴的セットを有するため、この様式で調製した個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、特徴的個体の同定を提供し得る。本発明の配列を使用して、個体および組織由来のそのような同定配列を得ることができる。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を特徴的に表現する。対立遺伝子の変異は、これらの配列のコード化領域中にある程度起こり、そして非コード化領域中にはより大きな程度で起こる。個別のヒト間の対立遺伝子の変異は、５００塩基に約１個の頻度で起こるとみつもられる。対立遺伝子変異の多くは、制限断片長多型(ＲＦＬＰ)を含む単一ヌクレオチド多型(ＳＮＰ)に因る。
【０２５５】
本明細書に説明する配列のそれぞれを、個体由来のＤＮＡを同定の目的で比較し得る標準として、ある程度、使用し得る。非コード化領域にはより多くの遺伝子多型が起こるため、個体を識別するにはより少ない配列が必要である。非コード化配列は、それぞれが１００塩基の非コード化増幅配列を生じる多分１０〜１０００個のプライマーのパネルにより個体の明白な同定を無理なく提供し得る。もし配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)の配列のような予想するコード化配列を使用すれば、明白な個体の同定のためのさらに適切なプライマーの数は５００〜２０００である。
【０２５６】
予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、および臨床試験のモニタリングを予後的(予測的)目的で使用し、それにより個体を予防的に処置する、予測医学の分野に関する。したがって、本発明の１つの態様は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現ならびにＮＯＶＸ活性を生物学的試料(例えば、血液、血清、細胞、組織)との関連で測定して、それにより個体が異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害に罹患しているか、または障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための診断アッセイに関する。障害としては、代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を挙げ得る。本発明はまた、個体がＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を発症するリスクを有しているか否かを測定するための予後的(予測的)アッセイを提供する。例えば、あるＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を生物学的試料中でアッセイし得る。そのようなアッセイを、予後的または予測的目的に使用し、それによりＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または生物学的活性を特徴とするかまたはこれと関連する障害の発生に先立って個体を予防的に処置し得る。
【０２５７】
本発明のもう一つの態様は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸発現または活性を測定し、それによりその個体にとって適切な治療的または予防的な薬剤を選択する方法(本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼称する)を提供する。薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型に基づいた個体の治療的または予防的処置のための薬剤(例えば薬)の選択を可能にする(例えば、個体の遺伝子型を検査して、個体が特定の薬剤に応答する能力を測定する)。
【０２５８】
本発明のなおもう一つの態様は、薬剤(例えば、薬、化合物)が臨床試験においてＮＯＶＸの発現または活性に与える影響をモニタリングすることに関する。
これらおよび他の薬剤については以下のセクションで詳細に説明する。
【０２５９】
診断的アッセイ
生物学的試料中におけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出する例示的な方法は、被験対象から生物学的試料を得ること、および生物学的試料をＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する能力のある化合物または薬剤と接触し、ＮＯＶＸの存在が生物学的試料中で検出できるようにすることを伴う。ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの検出用の薬剤は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズする能力のある標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号２ｎ−１(ここで、ｎは１〜１４１の整数である)の核酸のような全長ＮＯＶＸ核酸、または少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長でそして厳密な条件下でＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドの一部である。本発明の診断的アッセイにおいて使用するための他の適当なプローブを本明細書で説明する。
【０２６０】
ＮＯＶＸタンパク質検出用の薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力のある抗体、好ましくは検出可能な標識を持つ抗体である。抗体は、ポリクローナル、またはさらに好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント(例えば、ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用し得る。プローブまたは抗体に関する用語「標識」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングする(即ち物理的に連結する)ことによりプローブまたは抗体を直接的に標識すること、ならびに直接標識したもう一つの試薬との反応性によりプローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する。間接的な標識の例としては、蛍光標識した第２抗体を用いた第１抗体の検出、および蛍光標識したストレブトアビジンで検出し得るように、ビオチンでＤＮＡプローブを末端標識することを挙げ得る。用語「生物学的試料」とは、対象から単離した組織、細胞および生物学的流体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含む。即ち、本発明の検出法を使用して、インビトロおよびインビボで生物学的試料中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインシツハイブリダイゼーションを挙げ得る。ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光を挙げ得る。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションを挙げ得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中へ標識抗ＮＯＶＸ抗体を導入することを含む。例えば、抗体を、対象中のその存在および位置を標準的な造影技術で検出し得る放射活性マーカーで標識することができる。
【０２６１】
一つの実施態様では、生物学的試料は被験対象由来のタンパク質分子を含有する。これ代えて、生物学的試料は、被験対象由来のｍＲＮＡ分子または被験対象由来のゲノムＤＮＡ分子を含有し得る。好ましい生物学的試料は、対象より従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。
【０２６２】
もう一つの実施態様では、方法は、対照対象から対照の生物学的試料を得ること、対照試料をＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する能力のある化合物または薬剤と、ＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を生物学的試料中で検出するように接触すること、および対照試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を試験試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することをさらに伴う。
【０２６３】
本発明はまた、生物学的試料中のＮＯＶＸの存在を検出するキットを包含する。例えば、キットは：生物学的試料中のＮＯＶＸタンパク質またはｍＲＮＡを検出する能力のある標識化合物または薬剤；試料中のＮＯＶＸの量を測定する手段；および試料中のＮＯＶＸの量を標準と比較する手段を含み得る。化合物および薬剤を適当な容器中に包装し得る。キットは、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するキットの使用のための使用説明書をさらに含み得る。
【０２６４】
予後アッセイ
さらに、本明細書に説明する診断方法を利用して、異常ＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。例えば、先行の診断アッセイおよび以下のアッセイのような、本明細書で説明するアッセイを利用して、ＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現または活性に関連した障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。これに代えて、予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象を同定し得る。かくして、本発明は、試験試料を対象から得て、そして異常なＮＯＶＸタンパク質または核酸(例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ)を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を同定する方法を提供し、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を有するかまたは発症するリスクにある対象に対する診断になる。本明細書において使用する「試験試料」とは、興味のある対象から得られる生物学的試料を指す。例えば、試験試料は生物学的流体(例えば血清)、細胞試料、または組織であり得る。
【０２６５】
さらに、本明細書に説明する予後アッセイを使用して、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または障害を処置するために、対象に薬剤(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の医薬候補物)を投与することができるか否かを決定し得る。例えば、そのような方法を使用して、対象の疾患を薬剤により有効に処置するか否かを決定し得る。かくして、本発明は、試験試料を得て、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出する異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を薬剤により対象を有効に処置し得るか否かを決定する方法を提供する(例えば、そこではＮＯＶＸタンパク質または核酸の存在は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した障害を処置するために薬剤を投与され得る対象に対する診断になる)。
【０２６６】
本発明の方法をまた使用してあるＮＯＶＸ遺伝子中の遺伝的損傷を検出し、それにより損傷のある遺伝子を有する対象が異常な細胞増殖および／または分化を特徴とする障害のリスクにあるか否かを決定し得る。種々の実施態様において、これらの方法は、対象由来の細胞試料中において、あるＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす少なくとも一つの変更、またはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を特徴とする遺伝的損傷の存在または不在の検出を含む。例えば、そのような遺伝的損傷を、(i)あるＮＯＶＸ遺伝子からの一つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失；(ii)あるＮＯＶＸ遺伝子への一つまたはそれ以上のヌクレオチドの付加；(iii)あるＮＯＶＸ遺伝子の一つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv)あるＮＯＶＸ遺伝子の染色体上の移動、(v)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルの変化、(vi)ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのようなあるＮＯＶＸ遺伝子の異常修飾、(vii)あるＮＯＶＸ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、(viii)あるＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、(ix)あるＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子欠失、および(ｘ)あるＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾の少なくとも一つの存在の確認により検出し得る。本明細書に説明するあるＮＯＶＸ遺伝子の損傷を検出するために使用し得る当該分野において公知の多数のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的試料は、対象から従来の手段で単離した末梢血白血球試料である。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞を含む有核細胞を含有する任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２６７】
特定の実施態様では、損傷の検出は、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(例えば米国特許第４,６８３,１９５号および第４,６８３,２０２号を参照)におけるかまたはこれに代えて、連結連鎖反応(ＬＣＲ)(例えば、Landegran, et al., 1988. Science 241: 1077-1080、およびNakazawa, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 360-364を参照)におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、後者はＮＯＶＸ遺伝子中の点突然変異検出に特に有用であり得る(Abravaya, et al., 1995. Nucl. Acids Res. 23: 675-682を参照)。この方法は、患者から細胞試料を集め、試料の細胞から核酸(例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方)を単離し、ＮＯＶＸ遺伝子(もし存在するならば)のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、あるＮＯＶＸ遺伝子と特異的にハイブリダイズする一つまたはそれ以上のプライマーと核酸試料を接触し、そして増幅産物の存在または不在を検出し、または増幅産物のサイズを検出し、そして対照試料と長さを比較するステップを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に説明する変異の検出に使用する任意の技術と一緒に予備的増幅ステップとして使用するのが望ましい。
【０２６８】
さらに別な増幅法としては：自己保持配列複製(Guatelli, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874-1878を参照)、転写増幅システム(Kwoh, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177を参照); Ｑβレプリカーゼ(Lizardi, et al, 1988. BioTechnology 6: 1197を参照)、または任意の他の核酸増幅法に引き続いて当業者に周知の技術を用いる増幅分子の検出を挙げ得る。これらの検出スキームは、核酸分子がごく少数で存在するならば、そのような分子の検出に特に有用である。
【０２６９】
さらに別の実施態様では、試料細胞由来のあるＮＯＶＸ遺伝子中の変異を、制限酵素切断パターンの変化により同定し得る。例えば、試料および対照のＤＮＡを単離し、増幅し(任意に)、一つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼで処理し、そしてフラグメントのサイズをゲル電気泳動で測定して比較する。試料と対照のＤＮＡ間のフラグメントサイズの差は試料ＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム(例えば、米国特許第５,４９３,５３１号を参照)を使用して、リボザイム切断部位の発生または消失により特異的な変異の存在を評価し得る。
【０２７０】
他の実施態様では、ＮＯＶＸ中の遺伝的突然変異は、試料および対照の核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを数百または数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイにハイブリダイズすることにより同定することができる。例えば、Cronin, et al., 1996. Human Mutation 7: 244-255、Kozal, et al., 1996. Nat. Med. 2: 753-759を参照されたい。例えば、ＮＯＶＸ中の遺伝的変異を、上述のCronin, et al.に記載するように光を発生するＤＮＡプローブを含有する２次元アレイ中で同定し得る。略述すれば、プローブの１番目のハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料と対照中の長い一続きのＤＮＡをスキャンして、一連の重なり合うプローブの線形アレイを作成することにより配列間の塩基変化を同定し得る。このステップは点突然変異の同定を可能にする。これに、検出した全ての変異体または突然変異に相補的なさらに小さな特別のプローブアレイを用いることにより特定の変異の特徴化を可能にする２番目のハイブリダイゼーションを行う。それぞれの変異アレイは、一つは野生型遺伝子に相補的で、他は突然変異遺伝子に相補的な並行なプローブのセットから成る。
【０２７１】
なおもう一つの実施態様において、当該分野において公知の種々のシークエンシング反応のいずれかを使用してＮＯＶＸ遺伝子を直接にシークエンシングして、試料のＮＯＶＸの配列を対応する野生型(対照)配列と比較することにより変異を検出し得る。シークエンシング反応の例としては、Maxim and Gilbert, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560またはSanger, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463により開発された技術に基づくものを挙げ得る。質量分析によるシークエンシング(例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号; Cohen, et al., 1996. Adv. Chromatography 36: 127-162およびGriffin, et al., 1993. Appl. Biochem. Biotechnol. 38: 147-159を参照)を含む種々の自動化シークエンシング方法のいずれも診断アッセイの実施に際して利用され得ることをまた考え得る(例えば、Naeve, et al., 1995. Biotechniques 19: 448を参照)。
【０２７２】
ＮＯＶＸ遺伝子中の変異を検出する他の方法としては、切断剤からの保護を用いてＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法を挙げ得る。例えば、Myers, et al., 1985. Science 230: 1242を参照されたい。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型ＮＯＶＸ配列を含有する(標識した)ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料より得る潜在的突然変異体のＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることにより形成したヘテロ二重鎖を提供することから始まる。二重鎖を、対照および試料の鎖の間の塩基のミスマッチのために存在する二重鎖の単鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮａｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処置し、ミスマッチ領域を酵素的に処理し得る。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖のどちらかをヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理し得る。ミスマッチ領域の処理の後、得られた材料を次いで変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズにより分離して変異の部位を決定する。例えば、Cotton, et al., 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397、Saleeba, et al., 1992. Methods Enzymol. 217: 286-295を参照されたい。一つの実施態様では、対照のＤＮＡまたはＲＮＡを検出用に標識し得る。
【０２７３】
なおもう一つの実施態様では、ミスマッチ切断反応は、細胞の試料より得られたＮＯＶＸｃＤＮＡ中で点突然変異を検出しマッピングするために、規定したシステム中で二重鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する一つまたはそれ以上のタンパク質(いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素)を使用する。例えば、E. coliのｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチのＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシダーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを切断する。例えば、Hsu, et al., 1994. Carcinogenesis 15: 1657-1662を参照されたい。例示的な実施態様によれば、あるＮＯＶＸ配列、例えば、野生型ＮＯＶＸ配列に基づくプローブを、試験細胞(複数を含む)由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリダイズする。この二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理して、切断生産物をもしあれば電気泳動のプロトコール等から検出し得る。例えば、米国特許第５,４５９,０３９号を参照されたい。
【０２７４】
他の実施態様では、電気泳動上の移動度の変化を用いて、ＮＯＶＸ遺伝子の突然変異を同定する。例えば、単鎖コンフォーメーション多型(ＳＳＣＰ)を使用して、突然変異体および野生型核酸の間の電気泳動移動度の差を検出し得る。例えば、Orita, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 86: 2766、Cotton, 1993. Mutat. Res. 285: 125-144、Hayashi, 1992. Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73-79を参照されたい。試料および対照のＮＯＶＸ核酸の単鎖ＤＮＡフラグメントを変性し、復元することを可能にする。単鎖核酸の二次構造は配列により異なり、電気泳動上の移動度のそこで得る変化はたとえ１個の塩基変化の検出をも可能にする。ＤＮＡフラグメントを標識プローブで標識または検出し得る。アッセイの感度を、２次構造が配列変化により感受性であるＲＮＡ(ＤＮＡよりもむしろ)を使用することにより増大し得る。一つの実施態様では、主題の方法は、ヘテロ二重らせん分析を利用して、電気泳動の移動度の変化に基づいて二重らせんへテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Keen, et al., 1991. Trends Genet. 7: 5を参照されたい。
【０２７５】
なおもう一つの実施態様では、ある勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲル中での突然変異体または野生型フラグメントの移動を、変性濃度勾配ゲル電気泳動(ＤＧＧＥ)を用いてアッセイする。例えば、Myers, et al., 1985. Nature 313: 495を参照されたい。ＤＧＧＥを分析法として使用する際、ＤＮＡを修飾し、例えば、凡そ４０ｂｐの高融点ＧＣ富化ＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲで付加することにより、それが完全に変性しないことを保証する。さらなる実施態様では、変性勾配に代えて温度勾配を使用して、対照および試料のＤＮＡの移動度の差を同定する。例えば、Rosenbaum and Reissner, 1987. Biophys. Chem. 265: 12753を参照されたい。
【０２７６】
点突然変異を検出するための他の技術の例として、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を挙げ得るが、これらに限定しない。例えば、既知の変異を中央に置いたオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを認める条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズする。例えば、Saiki, et al., 1986. Nature 324: 163、Saiki, et al., 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230を参照されたい。オリゴヌクレオチドをハイブリダイズ用膜に付着して、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズする際、そのような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡまたはある数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２７７】
これに代えて、選択的ＰＣＲ増幅に基づく対立遺伝子特異的増幅技術を本発明と一緒に使用し得る。特異的増幅のためのプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、興味のある変異を分子の中央で(増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存するように；例えば、Gibbs, et al., 1989. Nucl. Acids Res. 17: 2437-2448を参照)または適切な条件下で、ミスマッチがポリメラーゼ伸長を阻止または低減できる(例えば、Prossner, 1993. Tibtech. 11: 238を参照)一つのプライマーの３'最末端において保持していてもよい。加えて、切断に基づく検出を創成するために、変異の領域に新規制限部位を導入するのが望ましい。例えば、Gasparini, et al., 1992. Mol. Cell Probes 6: 1を参照されたい。特定の実施態様では、増幅はまた、増幅のためのＴａｑリガーゼを使用して実施され得ることを予想する。例えば、Barany, 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189を参照されたい。このような場合には、５'末端配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ連結が起こり、増幅の存在または不在を調べることにより特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０２７８】
本明細書に説明する方法を、例えば、本明細書に説明する少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含むプレパック診断キットを利用することにより実施し得る。これを、例えば、臨床の場においてＮＯＶＸ遺伝子の関与する疾患または疾病の症状を示すかまたは家族歴のある患者を診断するのに簡便に使用し得る。
【０２７９】
さらに、ＮＯＶＸを発現する任意の細胞タイプまたは組織、好ましくは末梢血白血球を本明細書に説明した予後アッセイに利用し得る。しかしながら、例えば、頬粘膜細胞の有核細胞を含む任意の生物学的試料を使用し得る。
【０２８０】
薬理ゲノミクス
本明細書に説明したスクリーニングアッセイにより同定するようなＮＯＶＸ活性(例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現)に促進的または阻害的効果を有する薬剤またはモジュレータを個体に投与し、障害を(予防的にまたは治療的に)処置することができる。障害としては、限定しないが、表Ａに要約するような代謝障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、がん関連悪液質、がん、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、および造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、慢性疾患および種々のがんに関連した代謝性シンドロームＸならびに消耗性疾患を挙げ得る。
【０２８１】
そのような処置と一緒に、個体の薬理ゲノミクス(即ち、個体の遺伝子型および外来性化合物または薬に対するその個体の応答との間の関係の研究)を考慮し得る。治療薬の代謝の差は、薬理学的に活性な薬の用量と血中濃度の関係を変えることにより、重症の毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、個体の薬理ゲノミクスは、個体の遺伝子型の考慮に基く予防的または治療的処置ための有効な薬剤(例えば薬)の選択を許容する。そのような薬理ゲノミクスをさらに用いて、適切な投与量および治療方法を決定し得る。したがって、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異の含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置に適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。
【０２８２】
薬理ゲノミクスは、罹患した人における変化した薬剤分布および異常な作用に因る薬への応答における臨床的に有意な遺伝的変異を取り扱う。例えば、Eichelbaum, 1996. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 23: 983-985; Linder, 1997. Clin. Chem., 43: 254-266を参照されたい。一般に、二つのタイプの薬理遺伝学的異常を区別し得る。薬が身体に作用する方式を変える単一の因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬剤作用)または身体が薬に作用する方式を変える単一因子として伝達する遺伝的異常(変化した薬物代謝)がある。これらの薬理遺伝学的異常は、稀な欠陥または多型性のどちらかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素(Ｇ６ＰＤ)欠乏症は、よくみられる遺伝性酵素異常症であり、そこでは主な臨床的合併症は、酸化剤の薬(抗マラリア剤、スルホンアミド剤、鎮痛剤、ニトロフラン類)摂取後またはソラマメ摂食後の溶血である。
【０２８３】
例示的実施態様として、薬の代謝酵素の活性は、薬の作用の強度および持続の両者の主たる決定因子である。薬の代謝酵素の遺伝的多型性(例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２(ＮＡＴ２)ならびにチトクローム妊娠帯前駆タンパク質酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９)の発見は、なぜ或る患者は標準かつ安全用量の薬物摂取後に期待した薬の効果を得られないかまたは過大な薬の応答および重篤な毒性を示すのかについての説明を提供する。これらの多型性を、人口集団で高代謝群(ＥＭ)および低代謝群(ＰＭ)の２つの表現型で表現する。ＰＭの存在比率は異なる集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型性で、そして幾つかの変異が、機能的なＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらすＰＭを同定する。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝群は、標準的な用量の投与を受けた際、極めて頻繁に過剰な薬の応答および副作用を経験する。代謝物が活性な治療成分であるならば、ＣＹＰ２Ｄ６が生成する代謝物モルヒネにより仲介するコデインの鎮痛作用について実証するように、ＰＭは治療応答を示さない。それと全く正反対なのが、標準の用量に応答しないいわゆる超高速代謝群である。最近、超高速代謝群の分子的根拠をＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に因ると確認する。
【０２８４】
従って、個体のＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、またはＮＯＶＸ遺伝子の変異含量を測定し、それにより個体の治療的処置または予防的処置のために適切な薬剤(複数を含む)を選択し得る。加えて、薬理遺伝学的研究を用いて、薬の代謝酵素をコードする遺伝子多型の対立遺伝子の遺伝子型決定を、個体の薬の応答性の表現型の同定に応用し得る。この知識を投与量および薬の選択に応用する際、本明細書で説明する例示的スクリーニングアッセイの一つにより同定したモジュレータのようなＮＯＶＸモジュレータで対象を処置する際に、有害作用または治療失敗を避け、かくして治療的または予防的効率を増強し得る。
【０２８５】
臨床試験の作用モニタリング
ＮＯＶＸの発現または活性(例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調整する活性)に対する薬剤(例えば、薬、化合物)の影響をモニタリングすることは、基礎的な薬のスクリーニングに応用できるだけでなく、また臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に説明したようにスクリーニングアッセイにより、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加し、またはＮＯＶＸ活性を上方調節すると決定した薬剤の有効性を、低下したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または下方制御されたＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。これに代えて、ＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベルを減少し、またはＮＯＶＸ活性を下方調節すると決定した薬剤の有効性を、増加したＮＯＶＸ遺伝子発現、タンパク質レベル、または上方制御したＮＯＶＸ活性を示す対象の臨床試験でモニターし得る。そのような臨床試験において、ＮＯＶＸ、および、好ましくは、例えば、細胞増殖または免疫障害に関係する他の遺伝子の発現または活性を、特定の細胞の免疫応答性の「読み出し」またはマーカーとして使用し得る。
【０２８６】
限定しない例として、ＮＯＶＸ活性(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定する)を調整する薬剤(例えば、化合物、薬または低分子)を用いた処置により細胞中で調整するＮＯＶＸを含む遺伝子を同定し得る。従って、細胞増殖障害に対する薬剤の効果を、例えば、臨床試験において検討するために、細胞を単離してＲＮＡを調製し、そして障害に関連すると思うＮＯＶＸおよび他の遺伝子の発現レベルを分析し得る。遺伝子発現レベル(即ち、遺伝子発現パターン)を、本明細書に説明するようにノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲにより、またはこれに代えて本明細書で説明する方法の一つにより生産したタンパク質の量を測定することにより、またはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性レベルを測定することにより、定量することができる。この様式においては、遺伝子発現パターンは、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとしての役割を果たす。したがって、薬剤による個体の処置の前および処置中の種々の時点で、この応答状態を測定し得る。
【０２８７】
一つの実施態様において、本発明は、薬剤(例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、低分子、または本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した他の薬候補物)で対象を処置することの有効性をモニターする方法を提供し、その方法は、(i)薬剤投与前に対象から投与前試料を得て、(ii)投与前試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出し、(iii)対象から一つまたはそれ以上の投与後の試料を得て、(iv)投与後の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを検出し、(v)投与前の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを投与後のひとつまたは複数の試料中のＮＯＶＸタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し、そして(vi)それにしたがって対象への薬剤の投与を変更するステップを含む。例えば、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより高レベルに増加するためには、即ち、薬剤の有効性を増加するためには、薬剤の増加した投与が望ましい。これに代えて、ＮＯＶＸの発現または活性を検出したより低レベルに減少する、即ち、薬剤の有効性を減少するためには、薬剤の減少した投与が望ましい。
【０２８８】
処置方法
本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患のリスクにある(感受性)かまたは疾患を有する対象を処置する予防的方法および治療的方法の両方を提供する。障害としては、上記疾病、疾患および症状などがあり、より詳細には、表ＡにまとめられたようなＮＯＶＸ蛋白のホモログに関連した疾病、疾患、または症状などがある。
これらの処置法を以下にさらに詳細に考察する。
【０２８９】
疾患および障害
増加したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性に拮抗する(即ち、低下するかまたは阻害する)治療薬で処置し得る。活性に拮抗する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、(i)前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメントまたは相同体；(ii)前述のペプチドに対する抗体；(iii)前述のペプチドをコードする核酸；(iv)アンチセンス核酸および前述のペプチドの内在的機能を相同組換えにより「ノックアウト」するのに使用する「機能障害性」である核酸(即ち、前述のペプチドに対するコード化配列のコード化配列内への異種挿入に因る)の投与(例えば、Capecchi, 1989. Science 244: 1288-1292を参照)；または(v)前述のペプチドおよびその結合相手との相互作用を変化するモジュレータ(即ち、本発明のさらに別なペプチドのミメティックまたは本発明のペプチドに特異的な抗体を含む阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２９０】
減少したレベル(疾患または障害に罹患していない対象と比べて)または生物学的活性を特徴とする疾患および障害を、活性を増加する(即ち、アゴニストである)治療薬で処置し得る。活性を上方制御する治療薬を、治療的様式または予防的様式で投与し得る。利用し得る治療薬としては、前述のペプチド、またはその類似体、誘導体、フラグメント、または相同体；またはバイオアベイラビリティーを増加するアゴニストを挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２９１】
増加または減少したレベルを、患者の組織試料(例えば、生検組織から)を得て、インビトロでＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現したペプチド(または前述のペプチドのｍＲＮＡ)の構造および／または活性をアッセイすることにより、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することにより容易に検出し得る。当該分野内で周知の方法としては、イムノアッセイ(例えば、ウエスタンブロット分析、免疫沈降とそれに引き続くドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学、等)および／またはｍＲＮＡ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インシツハイブリダイゼーション、等)を挙げ得るが、これらに限定しない。
【０２９２】
予防的方法
一つの態様では、異常なＮＯＶＸ発現または少なくともあるＮＯＶＸ活性を調整する薬剤を対象に投与することにより、本発明は、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連した疾患または異常を、対象において予防する方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性が原因または一因となって生じる疾患のリスクを有する対象を、例えば、本明細書で説明するように診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれかまたはそれらの組合せによって同定し得る。疾患または障害を予防し、または、これに代えて、その進行を遅らせるようにＮＯＶＸ異常に特徴的な症状の出現に先立って予防的薬剤の投与を行い得る。ＮＯＶＸ異常のタイプに依存して、例えば、あるＮＯＶＸアゴニストまたはＮＯＶＸアンタゴニストである薬剤を対象の処置に使用し得る。適切な薬剤を、本明細書で説明するスクリーニング法に基づいて決定することができる。本発明の予防的方法をさらに以下のサブセクションで考察する。
【０２９３】
治療的方法
本発明のもう一つの態様は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調整する方法に関する。本発明の調整方法は、細胞を細胞に関連するＮＯＶＸタンパク質活性の一つまたはそれ以上の活性を調整する薬剤と接触することを含む。ＮＯＶＸタンパク質活性を調整する薬剤は、核酸またはタンパク質、あるＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同属のリガンド、ペプチド、あるＮＯＶＸペプチドミメティック、または低分子のような本明細書に説明する薬剤であり得る。一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を促進する。そのような促進的薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質および細胞中に導入したＮＯＶＸをコードする核酸分子を挙げ得る。もう一つの実施態様では、薬剤は一つまたはそれ以上のＮＯＶＸタンパク質活性を阻害する。そのような阻害的薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子および抗−ＮＯＶＸ抗体を挙げ得る。これらの調整方法は、インビトロで(例えば、細胞を薬剤と共に培養することにより)または、これに代えて、インビボで(例えば、薬剤を対象に投与することにより)実施し得る。このように、本発明はあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一つの実施態様では、その方法は、薬剤(例えば、本明細書で説明するスクリーニングアッセイで同定した薬剤)またはＮＯＶＸの発現または活性を調整する(例えば、上方制御または下方制御する)薬剤の組合せを投与することを伴う。もう一つの実施態様では、その方法は減少または異常なＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療としてあるＮＯＶＸタンパク質または核酸分子を投与することを伴う。
【０２９４】
ＮＯＶＸが異常に下方制御されているかおよび／または増加したＮＯＶＸ活性が有益な効果を有すると思われる状況では、ＮＯＶＸ活性を促進することが望ましい。そのような状況の一つの例は、対象が異常な細胞増殖および／または分化(例えば、がんまたは免疫関連疾患)を特徴とする障害を有する場合である。そのような状況のもう一つの例は、対象が妊娠性疾患(例えば、子癇前症)を有する場合である。
【０２９５】
治療薬の生物学的効果の測定
本発明の種々の実施態様において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを実施して、特定の治療薬の効果およびその投与を罹患している組織の処置に適応があるか否かを決定する。
【０２９６】
種々の特定の実施態様において、患者の障害に関与する代表的なタイプ(複数を含む)の細胞についてインビトロアッセイを実施して、投与した治療薬が細胞タイプに所望の効果を発揮するかどうかを測定し得る。治療に使用する化合物を、ヒト対象での試験に先立って、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を限定することなく含む適切な動物モデルシステムで試験し得る。同様に、インビボ試験でも、ヒト対象への投与に先立って、当該分野において公知の動物モデルシステムのいずれかを使用し得る。
【０２９７】
本発明の組成物の予防的使用および治療的使用
本発明のＮＯＶＸ核酸およびタンパク質は：代謝性障害、糖尿病、肥満、感染性疾患、食欲不振、癌関連、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、免疫障害、造血障害、ならびに種々の異脂肪血症、肥満に伴う代謝障害、代謝性シンドロームＸならびに慢性疾患および種々のがんに関連した消耗性疾患を限定することなく、含み、種々の障害に関連する潜在的で予防的応用および治療的応用に有用である。
【０２９８】
例として、本発明のＮＯＶＸタンパク質をコードするｃＤＮＡは、遺伝子治療に有用であり得、そしてタンパク質は、それを必要とする対象に投与する際に有用であり得る。非限定的な例として、本発明の組成物は、本明細書に挙げた疾病、疾患、症状等に苦しむ対象の処置のための効験を有するであろう。
【０２９９】
ＮＯＶＸタンパク質をコードする新規核酸、および本発明のＮＯＶＸタンパク質の両方、またはそれらのフラグメントはまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する診断的応用にも有用であり得る。さらなる使用は、抗細菌分子(即ち、或るペプチドは抗細菌的性質を有することが見出されている)としてであるかもしれない。これらの物質は、治療的または診断的方法に使用するための本発明の新規物質に免疫特異的に結合する抗体の作成にさらに有用である。
本発明を、以下の実施例でさらに記載し、これらはクレームに記載の発明の範囲を限定しない。
【０３００】
実施例
実施例Ａ：ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列、ならびにホモロジーのデータ。
【０３０１】
実施例１
ＮＯＶ１クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１Ａに示す。
【０３０２】
【表８】
2005520496.tif 000009
【表９】
2005520496.tif 000010
【表１０】
2005520496.tif 000011
【表１１】
2005520496.tif 000012
【０３０３】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表１Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０３０４】
【表１２】
2005520496.tif 000013
【０３０５】
ＮＯＶ１ａタンパク質のさらなる解析によって、表１Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０３０６】
【表１３】
2005520496.tif 000014
【０３０７】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む独自のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１タンパク質の検索によって、表１Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０３０８】
【表１４】
2005520496.tif 000015
【０３０９】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１ａタンパク質は、表１ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０３１０】
【表１５】
2005520496.tif 000016
【０３１１】
ＰＦａｍ解析によって、ＮＯＶ１ａタンパク質は、表１Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０３１２】
【表１６】
2005520496.tif 000017
【０３１３】
実施例２
ＮＯＶ２クローンを解析し、このヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド配列を表２Ａに示す。
【０３１４】
【表１７】
2005520496.tif 000018
【表１８】
2005520496.tif 000019
【表１９】
2005520496.tif 000020
【表２０】
2005520496.tif 000021
【０３１５】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表２Ｂに示される以下の配列関係が得られる。
【０３１６】
【表２１】
2005520496.tif 000022
【０３１７】
ＮＯＶ２ａタンパク質のさらなる解析によって、表２Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０３１８】
【表２２】
2005520496.tif 000023
【０３１９】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ２ａタンパク質の検索によって、表２Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０３２０】
【表２３】
2005520496.tif 000024
【０３２１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２ａタンパク質は、表２ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０３２２】
【表２４】
2005520496.tif 000025
【０３２３】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ２ａタンパク質は、表２Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０３２４】
【表２５】
2005520496.tif 000026
【０３２５】
実施例３
ＮＯＶ３クローンを解析して、このヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表３Ａに示す。
【０３２６】
【表２６】
2005520496.tif 000027
【表２７】
2005520496.tif 000028
【表２８】
2005520496.tif 000029
【表２９】
2005520496.tif 000030
【０３２７】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表３Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０３２８】
【表３０】
2005520496.tif 000031
【０３２９】
ＮＯＶ３ａタンパク質のさらなる解析によって、表３Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０３３０】
【表３１】
2005520496.tif 000032
【０３３１】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ３ａタンパク質の検索によって、表３Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０３３２】
【表３２】
2005520496.tif 000033
【０３３３】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ３ａタンパク質は、表３ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０３３４】
【表３３】
2005520496.tif 000034
【０３３５】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ３ａタンパク質は、表３Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０３３６】
【表３４】
2005520496.tif 000035
【０３３７】
実施例４
ＮＯＶ４クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表４Ａに示す。
【０３３８】
【表３５】
2005520496.tif 000036
【表３６】
2005520496.tif 000037
【表３７】
2005520496.tif 000038
【表３８】
2005520496.tif 000039
【０３３９】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表４Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０３４０】
【表３９】
2005520496.tif 000040
【０３４１】
ＮＯＶ４Ａタンパク質のさらなる解析によって、表４Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０３４２】
【表４０】
2005520496.tif 000041
【０３４３】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ４ａタンパク質の検索によって、表４Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０３４４】
【表４１】
2005520496.tif 000042
【０３４５】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ４ａタンパク質は、表４ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０３４６】
【表４２】
2005520496.tif 000043
【０３４７】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯ４ａタンパク質は、表４Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０３４８】
【表４３】
2005520496.tif 000044
【０３４９】
実施例５
ＮＯＶ５クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表５Ａに示す。
【０３５０】
【表４４】
2005520496.tif 000045
【表４５】
2005520496.tif 000046
【表４６】
2005520496.tif 000047
【０３５１】
ＮＯＶ５ａタンパク質のさらなる解析によって、表５Ｂに示される以下の特性が得られる。
【０３５２】
【表４７】
2005520496.tif 000048
【０３５３】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ５ａタンパク質の検索によって、表５Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られる。
【０３５４】
【表４８】
2005520496.tif 000049
【０３５５】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ５ａタンパク質は、表５ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０３５６】
【表４９】
2005520496.tif 000050
【０３５７】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ５ａタンパク質は、表５Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０３５８】
【表５０】
2005520496.tif 000051
【０３５９】
実施例６
ＮＯＶ６クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表６Ａに示す。
【０３６０】
【表５１】
2005520496.tif 000052
【表５２】
2005520496.tif 000053
【０３６１】
ＮＯＶ６ａタンパク質のさらなる解析によって、表６Ｂに示される以下の特性が得られた。
【０３６２】
【表５３】
2005520496.tif 000054
【０３６３】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ６ａタンパク質の検索によって、表６Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０３６４】
【表５４】
2005520496.tif 000055
【０３６５】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ６ａタンパク質は、表６ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０３６６】
【表５５】
2005520496.tif 000056
【０３６７】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ６ａタンパク質は、表６Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０３６８】
【表５６】
2005520496.tif 000057
【０３６９】
実施例７
ＮＯＶ７クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表７Ａに示す。
【０３７０】
【表５７】
2005520496.tif 000058
【表５８】
2005520496.tif 000059
【表５９】
2005520496.tif 000060
【表６０】
2005520496.tif 000061
【０３７１】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表７Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０３７２】
【表６１】
2005520496.tif 000062
【０３７３】
ＮＯＶ７ａタンパク質のさらなる解析によって、表７Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０３７４】
【表６２】
2005520496.tif 000063
【０３７５】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ７ａタンパク質の検索によって、表７Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０３７６】
【表６３】
2005520496.tif 000064
【０３７７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ７ａタンパク質は、表７ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０３７８】
【表６４】
2005520496.tif 000065
【０３７９】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ７ａタンパク質は、表７Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０３８０】
【表６５】
2005520496.tif 000066
【０３８１】
実施例８
ＮＯＶ８クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表８Ａに示す。
【０３８２】
【表６６】
2005520496.tif 000067
【表６７】
2005520496.tif 000068
【０３８３】
ＮＯＶ８ａタンパク質のさらなる解析によって、表８Ｂに示される以下の特性が得られた。
【０３８４】
【表６８】
2005520496.tif 000069
【０３８５】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ８ａタンパク質の検索によって、表８Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０３８６】
【表６９】
2005520496.tif 000070
【０３８７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ８ａタンパク質は、表８ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０３８８】
【表７０】
2005520496.tif 000071
【０３８９】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ８ａタンパク質は、表８Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０３９０】
【表７１】
2005520496.tif 000072
【０３９１】
実施例９
ＮＯＶ９クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表９Ａに示す。
【０３９２】
【表７２】
2005520496.tif 000073
【表７３】
2005520496.tif 000074
【表７４】
2005520496.tif 000075
【表７５】
2005520496.tif 000076
【表７６】
2005520496.tif 000077
【表７７】
2005520496.tif 000078
【表７８】
2005520496.tif 000079
【表７９】
2005520496.tif 000080
【０３９３】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表９Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０３９４】
【表８０】
2005520496.tif 000081
【０３９５】
ＮＯＶ９ａタンパク質のさらなる解析によって、表９Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０３９６】
【表８１】
2005520496.tif 000082
【０３９７】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ９ａタンパク質の検索によって、表９Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られる。
【０３９８】
【表８２】
2005520496.tif 000083
【０３９９】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ９ａタンパク質は、表９ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４００】
【表８３】
2005520496.tif 000084
【０４０１】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ９ａタンパク質は、表９Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４０２】
【表８４】
2005520496.tif 000085
【０４０３】
実施例１０
ＮＯＶ１０クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１０Ａに示す。
【０４０４】
【表８５】
2005520496.tif 000086
【表８６】
2005520496.tif 000087
【０４０５】
ＮＯＶ１０ａタンパク質のさらなる解析によって、表１０Ｂに示される以下の特性が得られた。
【０４０６】
【表８７】
2005520496.tif 000088
【０４０７】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１０ａタンパク質の検索によって、表１０Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４０８】
【表８８】
2005520496.tif 000089
【０４０９】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１０ａタンパク質は、表１０ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４１０】
【表８９】
2005520496.tif 000090
【０４１１】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１０ａタンパク質は、表１０Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４１２】
【表９０】
2005520496.tif 000091
【０４１３】
実施例１１
ＮＯＶ１１クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１１Ａに示す。
【０４１４】
【表９１】
2005520496.tif 000092
【表９２】
2005520496.tif 000093
【０４１５】
ＮＯＶ１１ａタンパク質のさらなる解析によって、表１１Ｂに示される以下の特性が得られた。
【０４１６】
【表９３】
2005520496.tif 000094
【０４１７】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１１ａタンパク質の検索によって、表１１Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４１８】
【表９４】
2005520496.tif 000095
【０４１９】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１１ａタンパク質は、表１１ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４２０】
【表９５】
2005520496.tif 000096
【０４２１】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１１ａタンパク質は、表１１Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４２２】
【表９６】
2005520496.tif 000097
【０４２３】
実施例１２
ＮＯＶ１２クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１２Ａに示す。
【０４２４】
【表９７】
2005520496.tif 000098
【表９８】
2005520496.tif 000099
【表９９】
2005520496.tif 000100
【表１００】
2005520496.tif 000101
【０４２５】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表１２Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０４２６】
【表１０１】
2005520496.tif 000102
【０４２７】
ＮＯＶ１２ａタンパク質のさらなる解析によって、表１２Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０４２８】
【表１０２】
2005520496.tif 000103
【０４２９】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１２ａタンパク質の検索によって、表１２Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４３０】
【表１０３】
2005520496.tif 000104
【０４３１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１２ａタンパク質は、表１２ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４３２】
【表１０４】
2005520496.tif 000105
【０４３３】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１２ａタンパク質は、表１２Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４３４】
【表１０５】
2005520496.tif 000106
【０４３５】
実施例１３
ＮＯＶ１３クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１３Ａに示す。
【０４３６】
【表１０６】
2005520496.tif 000107
【表１０７】
2005520496.tif 000108
【０４３７】
ＮＯＶ１３ａタンパク質のさらなる解析によって、表１３Ｂに示される以下の特性が得られる。
【０４３８】
【表１０８】
2005520496.tif 000109
【０４３９】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１３ａタンパク質の検索によって、表１３Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４４０】
【表１０９】
2005520496.tif 000110
【０４４１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１３ａタンパク質は、表１３ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４４２】
【表１１０】
2005520496.tif 000111
【０４４３】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１３ａタンパク質は、表１３Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４４４】
【表１１１】
2005520496.tif 000112
【０４４５】
実施例１４
ＮＯＶ１４クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１４Ａに示す。
【０４４６】
【表１１２】
2005520496.tif 000113
【表１１３】
2005520496.tif 000114
【０４４７】
ＮＯＶ１４ａタンパク質のさらなる解析によって、表１４Ｂに示される以下の特性が得られた。
【０４４８】
【表１１４】
2005520496.tif 000115
【０４４９】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１４ａタンパク質の検索によって、表１４Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４５０】
【表１１５】
2005520496.tif 000116
【０４５１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１４ａタンパク質は、表１４ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４５２】
【表１１６】
2005520496.tif 000117
【０４５３】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１４ａタンパク質は、表１４Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４５４】
【表１１７】
2005520496.tif 000118
【０４５５】
実施例１５
ＮＯＶ１５クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１５Ａに示す。
【０４５６】
【表１１８】
2005520496.tif 000119
【表１１９】
2005520496.tif 000120
【表１２０】
2005520496.tif 000121
【表１２１】
2005520496.tif 000122
【表１２２】
2005520496.tif 000123
【表１２３】
2005520496.tif 000124
【表１２４】
2005520496.tif 000125
【表１２５】
2005520496.tif 000126
【０４５７】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表１５Ｂに示される、以下の配列関係が得られた。
【０４５８】
【表１２６】
2005520496.tif 000127
【０４５９】
ＮＯＶ１５ａタンパク質のさらなる解析によって、表１５Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０４６０】
【表１２７】
2005520496.tif 000128
【０４６１】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１５ａタンパク質の検索によって、表１５Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４６２】
【表１２８】
2005520496.tif 000129
【０４６３】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１５ａタンパク質は、表１５ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４６４】
【表１２９】
2005520496.tif 000130
【０４６５】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１５ａタンパク質は、表１５Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４６６】
【表１３０】
2005520496.tif 000131
【０４６７】
実施例１６
ＮＯＶ１６クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１６Ａに示す。
【０４６８】
【表１３１】
2005520496.tif 000132
【表１３２】
2005520496.tif 000133
【表１３３】
2005520496.tif 000134
【表１３４】
2005520496.tif 000135
【表１３５】
2005520496.tif 000136
【表１３６】
2005520496.tif 000137
【表１３７】
2005520496.tif 000138
【表１３８】
2005520496.tif 000139
【表１３９】
2005520496.tif 000140
【表１４０】
2005520496.tif 000141
【０４６９】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表１６Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０４７０】
【表１４１】
2005520496.tif 000142
【０４７１】
ＮＯＶ１６ａタンパク質のさらなる解析によって、表１６Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０４７２】
【表１４２】
2005520496.tif 000143
【０４７３】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１６ａタンパク質の検索によって、表１６Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４７４】
【表１４３】
2005520496.tif 000144
【０４７５】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１６ａタンパク質は、表１６ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４７６】
【表１４４】
2005520496.tif 000145
【０４７７】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１６ａタンパク質は、表１６Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４７８】
【表１４５】
2005520496.tif 000146
【０４７９】
実施例１７
ＮＯＶ１７クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１７Ａに示す。
【０４８０】
【表１４６】
2005520496.tif 000147
【表１４７】
2005520496.tif 000148
【表１４８】
2005520496.tif 000149
【表１４９】
2005520496.tif 000150
【表１５０】
2005520496.tif 000151
【表１５１】
2005520496.tif 000152
【表１５２】
2005520496.tif 000153
【表１５３】
2005520496.tif 000154
【０４８１】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表１７Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０４８２】
【表１５４】
2005520496.tif 000155
【０４８３】
ＮＯＶ１７ａタンパク質のさらなる解析によって、表１７Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０４８４】
【表１５５】
2005520496.tif 000156
【０４８５】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１７ａタンパク質の検索によって、表１７Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４８６】
【表１５６】
2005520496.tif 000157
【０４８７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１７ａタンパク質は、表１７ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４８８】
【表１５７】
2005520496.tif 000158
【０４８９】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１７ａタンパク質は、表１７Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０４９０】
【表１５８】
2005520496.tif 000159
【０４９１】
実施例１８
ＮＯＶ１８クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１８Ａに示す。
【０４９２】
【表１５９】
2005520496.tif 000160
【表１６０】
2005520496.tif 000161
【０４９３】
ＮＯＶ１８ａタンパク質のさらなる解析によって、表１８Ｂに示される以下の特性が得られた。
【０４９４】
【表１６１】
2005520496.tif 000162
【０４９５】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１８ａタンパク質の検索によって、表１８Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０４９６】
【表１６２】
2005520496.tif 000163
【０４９７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１８ａタンパク質は、表１８ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０４９８】
【表１６３】
2005520496.tif 000164
【０４９９】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１８ａタンパク質は、表１８Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０５００】
【表１６４】
2005520496.tif 000165
【０５０１】
実施例１９
ＮＯＶ１９クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表１９Ａに示す。
【０５０２】
【表１６５】
2005520496.tif 000166
【表１６６】
2005520496.tif 000167
【０５０３】
ＮＯＶ１９ａタンパク質のさらなる解析によって、表１９Ｂに示される以下の特性が得られた。
【０５０４】
【表１６７】
2005520496.tif 000168
【０５０５】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ１９ａタンパク質の検索によって、表１９Ｃに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０５０６】
【表１６８】
2005520496.tif 000169
【０５０７】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ１９ａタンパク質は、表１９ＤにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０５０８】
【表１６９】
2005520496.tif 000170
【０５０９】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ１９ａタンパク質は、表１９Ｅに示されるドメインを含むことが予測される。
【０５１０】
【表１７０】
2005520496.tif 000171
【０５１１】
実施例２０
ＮＯＶ２０クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表２０Ａに示す。
【０５１２】
【表１７１】
2005520496.tif 000172
【表１７２】
2005520496.tif 000173
【表１７３】
2005520496.tif 000174
【表１７４】
2005520496.tif 000175
【表１７５】
2005520496.tif 000176
【表１７６】
2005520496.tif 000177
【０５１３】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表２０Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０５１４】
【表１７７】
2005520496.tif 000178
【０５１５】
ＮＯＶ２０ａタンパク質のさらなる解析によって、表２０Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０５１６】
【表１７８】
2005520496.tif 000179
【０５１７】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ２０ａタンパク質の検索によって、表２０Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０５１８】
【表１７９】
2005520496.tif 000180
【０５１９】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２０ａタンパク質は、表２０ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０５２０】
【表１８０】
2005520496.tif 000181
【０５２１】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ２０ａタンパク質は、表２０Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０５２２】
【表１８１】
2005520496.tif 000182
【０５２３】
実施例２１
ＮＯＶ２１クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表２１Ａに示す。
【０５２４】
【表１８２】
2005520496.tif 000183
【表１８３】
2005520496.tif 000184
【表１８４】
2005520496.tif 000185
【表１８５】
2005520496.tif 000186
【表１８６】
2005520496.tif 000187
【表１８７】
2005520496.tif 000188
【表１８８】
2005520496.tif 000189
【表１８９】
2005520496.tif 000190
【表１９０】
2005520496.tif 000191
【表１９１】
2005520496.tif 000192
【表１９２】
2005520496.tif 000193
【表１９３】
2005520496.tif 000194
【表１９４】
2005520496.tif 000195
【表１９５】
2005520496.tif 000196
【表１９６】
2005520496.tif 000197
【表１９７】
2005520496.tif 000198
【表１９８】
2005520496.tif 000199
【表１９９】
2005520496.tif 000200
【表２００】
2005520496.tif 000201
【表２０１】
2005520496.tif 000202
【０５２５】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表２１Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０５２６】
【表２０２】
2005520496.tif 000203
【０５２７】
ＮＯＶ２１ａタンパク質のさらなる解析によって、表２１Ｃに示される以下の特性が得られる。
【０５２８】
【表２０３】
2005520496.tif 000204
【０５２９】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ２１ａタンパク質の検索によって、表２１Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られる。
【０５３０】
【表２０４】
2005520496.tif 000205
【０５３１】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２１ａタンパク質は、表２１ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【表２０５】
2005520496.tif 000206
【０５３２】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ２１ａタンパク質は、表２１Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０５３３】
【表２０６】
2005520496.tif 000207
【０５３４】
実施例２２
ＮＯＶ２２クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表２２Ａに示す。
【０５３５】
【表２０７】
2005520496.tif 000208
【表２０８】
2005520496.tif 000209
【表２０９】
2005520496.tif 000210
【表２１０】
2005520496.tif 000211
【表２１１】
2005520496.tif 000212
【表２１２】
2005520496.tif 000213
【表２１３】
2005520496.tif 000214
【表２１４】
2005520496.tif 000215
【表２１５】
2005520496.tif 000216
【表２１６】
2005520496.tif 000217
【０５３６】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表２２Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０５３７】
【表２１７】
2005520496.tif 000218
【０５３８】
ＮＯＶ２２ａタンパク質のさらなる解析によって、表２２Ｃに示される以下の特性が得られる。
【０５３９】
【表２１８】
2005520496.tif 000219
【０５４０】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ２２ａタンパク質の検索によって、表２２Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られる。
【０５４１】
【表２１９】
2005520496.tif 000220
【０５４２】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２２ａタンパク質は、表２２ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０５４３】
【表２２０】
2005520496.tif 000221
【０５４４】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ２２ａタンパク質は、表２２Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０５４５】
【表２２１】
2005520496.tif 000222
【０５４６】
実施例２３
ＮＯＶ２３クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表２３Ａに示す。
【０５４７】
【表２２２】
2005520496.tif 000223
【表２２３】
2005520496.tif 000224
【表２２４】
2005520496.tif 000225
【表２２５】
2005520496.tif 000226
【表２２６】
2005520496.tif 000227
【表２２７】
2005520496.tif 000228
【表２２８】
2005520496.tif 000229
【表２２９】
2005520496.tif 000230
【表２３０】
2005520496.tif 000231
【表２３１】
2005520496.tif 000232
【表２３２】
2005520496.tif 000233
【表２３３】
2005520496.tif 000234
【表２３４】
2005520496.tif 000235
【表２３５】
2005520496.tif 000236
【表２３６】
2005520496.tif 000237
【表２３７】
2005520496.tif 000238
【表２３８】
2005520496.tif 000239
【表２３９】
2005520496.tif 000240
【表２４０】
2005520496.tif 000241
【表２４１】
2005520496.tif 000242
【表２４２】
2005520496.tif 000243
【表２４３】
2005520496.tif 000244
【表２４４】
2005520496.tif 000245
【表２４５】
2005520496.tif 000246
【表２４６】
2005520496.tif 000247
【表２４７】
2005520496.tif 000248
【表２４８】
2005520496.tif 000249
【表２４９】
2005520496.tif 000250
【表２５０】
2005520496.tif 000251
【表２５１】
2005520496.tif 000252
【表２５２】
2005520496.tif 000253
【表２５３】
2005520496.tif 000254
【表２５４】
2005520496.tif 000255
【表２５５】
2005520496.tif 000256
【表２５６】
2005520496.tif 000257
【表２５７】
2005520496.tif 000258
【表２５８】
2005520496.tif 000259
【表２５９】
2005520496.tif 000260
【表２６０】
2005520496.tif 000261
【表２６１】
2005520496.tif 000262
【表２６２】
2005520496.tif 000263
【表２６３】
2005520496.tif 000264
【表２６４】
2005520496.tif 000265
【表２６５】
2005520496.tif 000266
【表２６６】
2005520496.tif 000267
【表２６７】
2005520496.tif 000268
【表２６８】
2005520496.tif 000269
【表２６９】
2005520496.tif 000270
【表２７０】
2005520496.tif 000271
【表２７１】
2005520496.tif 000272
【表２７２】
2005520496.tif 000273
【表２７３】
2005520496.tif 000274
【表２７４】
2005520496.tif 000275
【表２７５】
2005520496.tif 000276
【表２７６】
2005520496.tif 000277
【表２７７】
2005520496.tif 000278
【表２７８】
2005520496.tif 000279
【表２７９】
2005520496.tif 000280
【表２８０】
2005520496.tif 000281
【表２８１】
2005520496.tif 000282
【表２８２】
2005520496.tif 000283
【表２８３】
2005520496.tif 000284
【表２８４】
2005520496.tif 000285
【表２８５】
2005520496.tif 000286
【０５４８】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表２３Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０５４９】
【表２８６】
2005520496.tif 000287
【表２８７】
2005520496.tif 000288
【０５５０】
ＮＯＶ２３ａタンパク質のさらなる解析によって、表２３Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０５５１】
【表２８８】
2005520496.tif 000289
【０５５２】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ２３ａタンパク質の検索によって、表２３Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０５５３】
【表２８９】
2005520496.tif 000290
【０５５４】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２３ａタンパク質は、表２３ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０５５５】
【表２９０】
2005520496.tif 000291
【０５５６】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ２３ａタンパク質は、表２３Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０５５７】
【表２９１】
2005520496.tif 000292
【０５５８】
実施例２４
ＮＯＶ２４クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表２４Ａに示す。
【０５５９】
【表２９２】
2005520496.tif 000293
【表２９３】
2005520496.tif 000294
【表２９４】
2005520496.tif 000295
【表２９５】
2005520496.tif 000296
【表２９６】
2005520496.tif 000297
【表２９７】
2005520496.tif 000298
【表２９８】
2005520496.tif 000299
【表２９９】
2005520496.tif 000300
【表３００】
2005520496.tif 000301
【表３０１】
2005520496.tif 000302
【０５６０】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表２４Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０５６１】
【表３０２】
2005520496.tif 000303
【０５６２】
ＮＯＶ２４ａタンパク質のさらなる解析によって、表２４Ｃに示される以下の特性が得られる。
【０５６３】
【表３０３】
2005520496.tif 000304
【０５６４】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ２４ａタンパク質の検索によって、表２４Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０５６５】
【表３０４】
2005520496.tif 000305
【０５６６】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２４ａタンパク質は、表２４ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０５６７】
【表３０５】
2005520496.tif 000306
【０５６８】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ２４ａタンパク質は、表２４Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０５６９】
【表３０６】
2005520496.tif 000307
【０５７０】
実施例２５
ＮＯＶ２５クローンを解析し、そしてこのヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドの配列を表２５Ａに示す。
【０５７１】
【表３０７】
2005520496.tif 000308
【表３０８】
2005520496.tif 000309
【表３０９】
2005520496.tif 000310
【表３１０】
2005520496.tif 000311
【表３１１】
2005520496.tif 000312
【表３１２】
2005520496.tif 000313
【表３１３】
2005520496.tif 000314
【表３１４】
2005520496.tif 000315
【表３１５】
2005520496.tif 000316
【表３１６】
2005520496.tif 000317
【表３１７】
2005520496.tif 000318
【表３１８】
2005520496.tif 000319
【表３１９】
2005520496.tif 000320
【表３２０】
2005520496.tif 000321
【表３２１】
2005520496.tif 000322
【表３２２】
2005520496.tif 000323
【表３２３】
2005520496.tif 000324
【表３２４】
2005520496.tif 000325
【表３２５】
2005520496.tif 000326
【表３２６】
2005520496.tif 000327
【表３２７】
2005520496.tif 000328
【表３２８】
2005520496.tif 000329
【表３２９】
2005520496.tif 000330
【表３３０】
2005520496.tif 000331
【表３３１】
2005520496.tif 000332
【表３３２】
2005520496.tif 000333
【表３３３】
2005520496.tif 000334
【表３３４】
2005520496.tif 000335
【表３３５】
2005520496.tif 000336
【表３３６】
2005520496.tif 000337
【表３３７】
2005520496.tif 000338
【表３３８】
2005520496.tif 000339
【表３３９】
2005520496.tif 000340
【表３４０】
2005520496.tif 000341
【表３４１】
2005520496.tif 000342
【表３４２】
2005520496.tif 000343
【表３４３】
2005520496.tif 000344
【表３４４】
2005520496.tif 000345
【表３４５】
2005520496.tif 000346
【表３４６】
2005520496.tif 000347
【表３４７】
2005520496.tif 000348
【表３４８】
2005520496.tif 000349
【表３４９】
2005520496.tif 000350
【表３５０】
2005520496.tif 000351
【表３５１】
2005520496.tif 000352
【表３５２】
2005520496.tif 000353
【表３５３】
2005520496.tif 000354
【表３５４】
2005520496.tif 000355
【表３５５】
2005520496.tif 000356
【表３５６】
2005520496.tif 000357
【表３５７】
2005520496.tif 000358
【表３５８】
2005520496.tif 000359
【表３５９】
2005520496.tif 000360
【表３６０】
2005520496.tif 000361
【表３６１】
2005520496.tif 000362
【表３６２】
2005520496.tif 000363
【表３６３】
2005520496.tif 000364
【表３６４】
2005520496.tif 000365
【表３６５】
2005520496.tif 000366
【表３６６】
2005520496.tif 000367
【０５７２】
上記のタンパク質配列の配列比較によって、表２５Ｂに示される、以下の配列関係が得られる。
【０５７３】
【表３６７】
2005520496.tif 000368
【表３６８】
2005520496.tif 000369
【０５７４】
ＮＯＶ２５ａタンパク質のさらなる解析によって、表２５Ｃに示される以下の特性が得られた。
【０５７５】
【表３６９】
2005520496.tif 000370
【０５７６】
特許および特許刊行物に公表された配列を含む、固有のデータベースであるＧｅｎｅｓｅｑデータベースに対するＮＯＶ２５ａタンパク質の検索によって、表２５Ｄに示されるいくつかの相同なタンパク質が得られた。
【０５７７】
【表３７０】
2005520496.tif 000371
【０５７８】
公的配列データベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＮＯＶ２５ａタンパク質は、表２５ＥにおけるＢＬＡＳＴＰデータにおいて示されるタンパク質に対してホモロジーを有することが見出された。
【０５７９】
【表３７１】
2005520496.tif 000372
【０５８０】
Ｐｆａｍ解析によってＮＯＶ２５ａタンパク質は、表２５Ｆに示されるドメインを含むことが予測される。
【０５８１】
【表３７２】
2005520496.tif 000373
【０５８２】
実施例２６
ＮＯＶ２６
ＮＯＶ２６は、新規なエンドゼピン関連前駆体様タンパク質（ｅｎｄｏｚｅｐｉｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および１７個の変異体を含む。この開示された配列はＮＯＶ２６ａ〜ｒと命名されている。
【０５８３】
ＮＯＶ２６ａ
ＮＯＶ２６ａは、以下に開示される新規なエンドゼピン関連タンパク質を含む。新規なエンドゼピン関連タンパク質をコードする、１７４７ヌクレオチドの開示されたＮＯＶ２６ａ核酸（ＣＧ５１５２３〜０５とも呼ばれる）を表２６Ａに示す。オープンリーディングフレームが同定されたが、これは、ヌクレオチド３６〜３８のＡＴＧ開始コドンで開始している。表２６Ａにおいて、開始コドン上流の推定の非翻訳領域に下線を付している。開始コドンは太文字である。
【０５８４】
【表３７３】
2005520496.tif 000374
【０５８５】
配列番号２１によってコードされる、開示されたＮＯＶ２６ａポリペプチド（配列番号２２）は、５２３アミノ酸残基を有しており、１文字アミノ酸コードを用いて表２６Ｂに示される。
【０５８６】
【表３７４】
2005520496.tif 000375
【０５８７】
開示されたＮＯＶ２６ａタンパク質の全アミノ酸配列は、特許ＷＯ００７８８０２由来の配列２３の５３４アミノ酸残基のｐｔｎｒ：ＲＥＭＴＲＭＢＬ−ＡＣＣ：ＣＡＣ２４８７７タンパク質と、５３４アミノ酸残基のうち５１８（９７％）同一であり、５３４アミノ酸残基のうち５２０（９７％）類似であるアミノ酸残基を有することが見出された。公的なアミノ酸データベースとして、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＤＢおよびＰＩＲが挙げられる。
【０５８８】
ＮＯＶ２６ａは、少なくとも以下の組織において発現される：脳、結腸、包皮、腎臓、喉頭、肺、乳腺／乳房、卵巣、膵臓、胎盤、網膜、小腸、脾臓、精巣、視床および子宮。
【０５８９】
ＮＯＶ２６ａのアミノ酸配列は、表２６Ｃに示されるように、他のタンパク質に対して高いホモロジーを有した。
【０５９０】
【表３７５】
2005520496.tif 000376
【０５９１】
開示されたＮＯＶ２６ａポリペプチドはまた、表２６Ｄに挙げられるＢＬＡＳＴＰデータに示されるアミノ酸配列に対するホモロジーを有する。
【０５９２】
【表３７６】
2005520496.tif 000377
【０５９３】
ＰＲＯＳＩＴＥ、ＤＯＭＡＩＮ、Ｂｌｏｃｋｓ、Ｐｆａｍ、ＰｒｏＤｏｍａｉｎ、およびＰｒｉｎｔｓのようなソフトウエアアルゴリズムを用いる検索によって、次いでＩｎｔｅｒｐｒｏウエブサイト（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｔｅｒｐｒｏ）を用いて、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ数にドメインマッチ（または数）を掛けて決定することによって、ＮＯＶ２６ａにおける同定可能なドメインの存在を決定した。表３０に開示されるように、ＮＯＶ２ａおよびその変異体についてのＤＯＭＡＩＮの結果を、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＬＡＳＴ解析を用いてＣｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）から補正した。このＢＬＡＳＴ解析ソフトウエアは、ＳｍａｒｔおよびＰｆａｍコレクションに見出されたドメインをサンプリングする。表３０および全ての連続するＤＯＭＡＩＮ配列アラインメントについて、完全に保存された単一の残基は黒い影かまたは（｜）の印で示し、そして「強力な（ｓｔｒｏｎｇ）」半保存残基は、灰色の影かまたは（＋）の印で示す。保存されたアミノ酸残基の「強力な」群は、以下のアミノ酸の群のうちのいずれか１つであってもよい：ＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ、ＦＹＷ。
【０５９４】
表２６Ｅは、ＮＯＶ２６ａに対するＤＯＭＡＩＮ解析結果に由来するドメインの詳細を列挙する。これによって、ＮＯＶ２６ａ配列は、このドメインを含むことが既知である他のタンパク質の特性と同様の特性を有することが示される。
【０５９５】
【表３７７】
2005520496.tif 000378
【０５９６】
ＮＯＶ２６ｂ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｆに示される、１４３２個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｂ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７８６０４２とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｂ変異体は、位置１７０、３７４、４０３、および４９３においてＮＯＶ２６ａと異なる。
【０５９７】
【表３７８】
2005520496.tif 000379
【表３７９】
2005520496.tif 000380
【０５９８】
ＮＯＶ２６ｃ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｈに示される、１４０１個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｃ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７３２４７９とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｃ変異体は、位置７１、１７０、３１３および４０３において、そして位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸の挿入によってＮＯＶ２６ａと異なる。
【０５９９】
【表３８０】
2005520496.tif 000381
【表３８１】
2005520496.tif 000382
【０６００】
ＮＯＶ２６ｄ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｊに示される、１４０１個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｄ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７３２５０６とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｄ変異体は、位置１７０、２９２および４０３において、そして位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸の挿入によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６０１】
【表３８２】
2005520496.tif 000383
【表３８３】
2005520496.tif 000384
【０６０２】
ＮＯＶ２６ｅ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｌに示される、１４０１個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｅ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７３２６９３とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ａ変異体は、位置１７０および４０３においてタンパク質レベルで、そして位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸の挿入によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６０３】
【表３８４】
2005520496.tif 000385
【表３８５】
2005520496.tif 000386
【０６０４】
ＮＯＶ２６ｆ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｎに示される１３６８個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｆ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７３２７０９とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｆ変異体は、位置１７０、４０３、４４９、および４８５においてタンパク質レベルでＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６０５】
【表３８６】
2005520496.tif 000387
【表３８７】
2005520496.tif 000388
【０６０６】
ＮＯＶ２６ｇ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｐに示される、１５８６個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｇ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７１８１８９とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｇ変異体は、位置１７０および４０３において２アミノ酸ずつＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６０７】
【表３８８】
2005520496.tif 000389
【表３８９】
2005520496.tif 000390
【０６０８】
ＮＯＶ２６ｈ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｒに示される、１６１８個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｈ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７１８１９３とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｈ変異体は、最初の２０個のアミノ酸で、そして位置１７０、１８２および４０３における３個のアミノ酸でＮＯＶ２６ａと異なる。さらに、ＮＯＶ２６ｈは、位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸の挿入によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６０９】
【表３９０】
2005520496.tif 000391
【表３９１】
2005520496.tif 000392
【０６１０】
ＮＯＶ２６ｉ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｔに示される、１５８６個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｉ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７１８１９７とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｉ変異体は、位置１７０、４０３、４２２および４６６における４個のアミノ酸でＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６１１】
【表３９２】
2005520496.tif 000393
【表３９３】
2005520496.tif 000394
【０６１２】
ＮＯＶ２６ｊ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｖに示される、１５１７個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｊ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７１８２０５とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｊ変異体は、位置３５、１２１、１７０および４０３における４個のアミノ酸で、そして位置３５０における２３個のアミノ酸の欠失でＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６１３】
【表３９４】
2005520496.tif 000395
【表３９５】
2005520496.tif 000396
【０６１４】
ＮＯＶ２６ｋ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｘに示される、１３６１個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｋ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７１８２０９とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｋ変異体は、位置２０８における６８個のアミノ酸欠失、および２アミノ酸変化でＮＯＶ２６ａと異なる。さらに、位置１６２において、１１個のアミノ酸配列が１８個のアミノ酸配列に入れ代わる。
【０６１５】
【表３９６】
2005520496.tif 000397
【表３９７】
2005520496.tif 000398
【０６１６】
ＮＯＶ２６ｌ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６Ｚに示される、１６１９個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｌ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６４７１８２１３とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｌ変異体は、５個のアミノ酸変化および位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸の挿入によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６１７】
【表３９８】
2005520496.tif 000399
【表３９９】
2005520496.tif 000400
【０６１８】
ＮＯＶ２６ｍ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６ＡＢに示される、１６１９個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｍ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６６１９０４５２とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｍ変異体は、４個のアミノ酸変化、および位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸挿入によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６１９】
【表４００】
2005520496.tif 000401
【表４０１】
2005520496.tif 000402
【０６２０】
ＮＯＶ２６ｎ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６ＡＤに示される、１６１９個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｎ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６６１９０４６７とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｎ変異体と同様、ＮＯＶ２６ｎ変異体は、４個のアミノ酸変化、および位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸挿入によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６２１】
【表４０２】
2005520496.tif 000403
【表４０３】
2005520496.tif 000404
【０６２２】
ＮＯＶ２６ｏ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６ＡＦに示される、１６１９個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｏ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６６１９０４７５とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｏ変異体は、位置１７０、３７２および４０３における３個のアミノ酸変化、ならびに位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸挿入によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６２３】
【表４０４】
2005520496.tif 000405
【表４０５】
2005520496.tif 000406
【０６２４】
ＮＯＶ２６ｐ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６ＡＨに示される、１６１９個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｐ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６６１９０４９８とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｐ変異体は、位置１７０および４０３における２個のアミノ酸変化、ならびに位置１６１〜１６２における１１個のアミノ酸挿入によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６２５】
【表４０６】
2005520496.tif 000407
【表４０７】
2005520496.tif 000408
【０６２６】
ＮＯＶ２６ｑ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６ＡＪに示される、１５８６個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｑ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６６１９０４６０とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｑ変異体は、位置１７０、２３１および４６３における３個のアミノ酸変化によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６２７】
【表４０８】
2005520496.tif 000409
【表４０９】
2005520496.tif 000410
【０６２８】
ＮＯＶ２６ｒ
別の実施形態において、ＮＯＶ２６変異体は、表２６ＡＬに示される、１５８６個のヌクレオチドのＮＯＶ２６ｒ（ＣＧ５１５２３−０５＿１６６１９０４８３とも呼ばれる）である。ＮＯＶ２６ｒ変異体は、位置１７０、３４２、３９６、４０３および４５２における５個のアミノ酸変化によって、ＮＯＶ２６ａと異なる。
【０６２９】
【表４１０】
2005520496.tif 000411
【表４１１】
2005520496.tif 000412
【０６３０】
実施例Ｂ：ＮＯＶＸクローンの配列決定方法論および同定
１．ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：これは、ＣｕｒａＧｅｎに開発され、Ｓｈｉｍｋｅｔｓら「Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ａ  ｇｅｎｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｑｕｅｒｙ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：１９８〜８０３（１９９９）に記載された、２つ以上のサンプルの間をプロファイリングする、示差的遺伝子発現を実施する独自の方法である。ｃＤＮＡは、異なるドナー由来の多様な組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、ならびに発達状態を示す、種々のヒトサンプルに由来した。サンプルは組織全体、初代細胞または組織培養した初代細胞もしくは細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生理学的因子または化学的因子、例えば、増殖因子、ケモカインまたはステロイドを用いて処置されてもよかった。このようにして得たｃＤＮＡを、１２０対程度までの制限酵素を用いて消化して、制限酵素の各々の特定の対についてリンカー−アダプターの対を適切な末端に連結した。この制限消化によって、固有のｃＤＮＡ遺伝子フラグメントの混合物を生成する。１つのプライマーがビオチン化されており、もう一方が蛍光標識されているリンカーアダプター配列に対して相同なプライマーを用いて、制限されたＰＣＲ増幅を実施する。この二重標識された材料を単離して、蛍光標識された一本鎖をキャピラリーゲル電気泳動によって分離する。コンピューターアルゴリズムによって、各々の制限消化についての実験群およびコントロール群由来の電気泳動図を比較する。これと、さらなる配列由来の情報を用いて、種々の遺伝子データベースを用いて、各々の示差的に発現される遺伝子フラグメントの同一性を予測する。遺伝子フラグメントの同一性は、さらなる遺伝子特異的競合ＰＣＲによって、またはこの遺伝子フラグメントの単離および配列決定によって確認される。
【０６３１】
２．ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｃＤＮＡは、異なるドナー由来の多様な組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、ならびに発達状態を示す、種々のヒトサンプルに由来した。サンプルは組織全体、初代細胞または組織培養した初代細胞もしくは細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生理学的因子または化学的因子、例えば、増殖因子、ケモカインまたはステロイドを用いて処置されてもよかった。次いで、このようにして得たｃＤＮＡを、ＣｕｒａＧｅｎの固有のＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ技術を用いて配列決定した。配列のトレースを手動で評価して、必要に応じて補正のために編集した。全てのサンプル由来のｃＤＮＡ配列（時々、公的なヒト配列を含む）を一緒にアセンブルしたが、これにはバイオインフォマティックプログラムを用いて、各々のアセンブリについてのコンセンサス配列を生成した。各々のアセンブリは、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含まれる。配列は、別の成分との同一性の程度が、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合に、アセンブリのための成分として含まれた。各々のアセンブリは、遺伝子またはその部分に相当し、そしてスプライシング型一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の配列バリエーションのような変異体の情報を含む。
【０６３２】
３．ＰａｔｈＣａｌｌｉｎｇ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＮＯＶＸ核酸配列は、ツーハイブリッドアプローチによるｃＤＮＡライブラリーの実験室スクリーニングに由来する。ｃＤＮＡ配列の全長もしくはその配列の一部、または両方をカバーするｃＤＮＡフラグメントを配列決定する。インシリコにおける予測は、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの固有の配列データベースにおいて、または公的なヒト配列データベースにおいて利用可能な配列に基づき、そして全長ＤＮＡ配列またはそのいくつかの部分を提供した。
【０６３３】
以下にまとめた方法を用いて、実験室スクリーニングを実施した：
ｃＤＮＡライブラリーは、異なるドナー由来の多様な組織型、正常および疾患状態、生理学的状態、ならびに発達状態に相当する種々のヒトサンプルに由来した。サンプルは組織全体、初代細胞または組織培養した初代細胞もしくは細胞株として得た。細胞および細胞株は、遺伝子発現を調節する生理学的因子または化学的因子、例えば、増殖因子、ケモカインまたはステロイドを用いて処置されてもよかった。次いでこのようにして得たｃＤＮＡを、適切なツーハイブリッドベクター（Ｇａｌ４−活性化ドメイン（Ｇａｌ４−ＡＤ）融合）中に直接クローニングした。次いで、このようなｃＤＮＡライブラリー、およびＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）由来の商業的なｃＤＮＡライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉから、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの所有の酵母株に移入した（その全体が参考として本明細書において援用される、米国特許第６，０５７，１０１号および同第６，０８３，６９３号に開示される）。
【０６３４】
ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ所有のライブラリーのヒト配列のＧａｌ４−結合ドメイン（Ｇａｌ４−ＢＤ）融合を用いて、多様なＧａｌ４−ＡＤ融合ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、その各々においてＧａｌ４−ＡＤ融合が個々のｃＤＮＡを含む酵母ハイブリッド二倍体の選択を行なう。ｃＤＮＡ挿入の境界において非特異的なプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、各々のサンプルを増幅した。このようなＰＣＲ産物を配列決定した；配列トレースを手動で評価して、必要に応じて補正のために編集した。全てのサンプル由来のｃＤＮＡ配列（時々、公的なヒト配列を含む）を一緒にアセンブルしたが、これにはバイオインフォマティックプログラムを用いて、各々のアセンブリについてのコンセンサス配列を生成した。各々のアセンブリは、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースに含まれる。配列は、別の成分との同一性の程度が、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合に、アセンブリのための成分として含まれた。各々のアセンブリは、遺伝子またはその部分に相当し、そしてスプライシング型一塩基多型（ＳＮＰ）、挿入、欠失、および他の配列バリエーションのような変異体の情報を含む。
【０６３５】
物理的クローン：スクリーニング手順に由来するｃＤＮＡフラグメントであって、オープンリーディングフレーム全体をカバーするフラグメントを、組み換えＤＮＡとして、ｐＡＣＴ２プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングして、ｃＤＮＡライブラリーを作製するのに用いる。この組み換えプラスミドを宿主に挿入して、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ所有の酵母株Ｎ１０６’およびＹＵＬＨの両方の交配によってスクリーニング手順の間に生成した酵母ハイブリッド二倍体によって選択する（米国特許第６，０５７，１０１号および同第６，０８３，６９３号）。
【０６３６】
４．ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端の急速増幅（ＲＡＣＥ）のようなポリメラーゼ連鎖反応に基づく技術を用いて、本発明のｃＤＮＡの予測配列を単離または完了させた。通常、１つ以上のヒトサンプルから多様なクローンを配列決定して、フラグメントの配列を誘導した。異なるドナー由来の種々のヒト組織サンプルをＲＡＣＥ反応に用いた。これらの手順から誘導された配列は、前の段落に記載されたＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリプロセスに含まれた。
【０６３７】
５．エキソン連結：本発明において同定されたＮＯＶＸ標的配列を、エキソン連結プロセスに供して、このプロセスを確認した。ＰＣＲプライマーを、フォワードプライマーについては、利用可能な最も上流の配列で開始して消化し、リバースプライマーについては利用可能な最も下流の配列で開始して消化した。各々の場合、配列を試験したが、これは、特有であるかもしくは高度に選択性である適切な配列に出会うまで、またはリバースプライマーの場合は、終止コドンに達するまで、コード配列に向かってそれぞれの末端から内向きにウォーキングした。標的配列の全長ｃＤＮＡ、ＤＮＡもしくはタンパク質の配列の一部（１つ以上のエキソン）についてのインシリコの予測に基づいて、または他の種と密接に関連したヒト配列に対する予測されたエキソンの翻訳されたホモロジーによって、このようなプライマーを消化した。次いでこれらのプライマーを、ヒトｃＤＮＡの以下のプールに基づくＰＣＲ増幅において使用した：副腎、骨髄、脳−扁桃体、脳−小脳、脳−海馬、脳−黒質、脳−視床、脳−全脳、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、リンパ腫−ラージ、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、甲状腺、気管、子宮。一般に、得られたアンプリコンをゲル精製し、クローニングして、高い重複性に対して配列決定した。エキソン連結に由来するＰＣＲ産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１ベクター中にクローニングした。得られた細菌のクローンは、ｐＣＲ２．１ベクター中にクローニングされたオープンリーディングフレーム全体をカバーする挿入物（インサート）を有する。全てのクローンから得られた配列を、それら自体と、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのデータベースにおける他のフラグメントと、および公的ＥＳＴとアセンブルした。フラグメントおよびＥＳＴは、アセンブリの別の成分との同一性の程度が、５０ｂｐにわたって少なくとも９５％である場合に、このアセンブリのための成分として含まれた。さらに、配列トレースを手動で評価して、必要に応じて補正のために編集した。これらの手順によって、本明細書で報告された配列が提供される。
【０６３８】
６．物理的（ｐｈｙｓｉｃａｌ）クローン：ホモロジーによってエキソンを予測して、標準的な遺伝子規則を用いて、イントロン／エキソン境界を決定した。エキソンをさらに選択して、多様なＢＬＡＳＴ（例えば、ｔＢｌａｓｔＮ、ＢｌａｓｔＸ、およびＢｌａｓｔＮ）検索、およびある場合にはＧｅｎｅＳｃａｎおよびＧｒａｉｌを用いる、類似性決定手段によって絞り込んだ。遺伝子配列のさらなる絞り込みおよび完了に利用可能である場合、公的データベースおよび私有のデータベースの両方から発現された配列をまた加えた。次いでＤＮＡ配列を明らかな矛盾について手動で補正して、これによって全長タンパク質をコードする配列を得る。
【０６３９】
エキソン連結に由来するＰＣＲ産物であって、オープンリーディングフレーム全体をカバーする産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１ベクターにクローニングして、発現およびスクリーニング目的のために用いられるクローンを得た。
【０６４０】
実施例Ｃ：種々の細胞および組織におけるクローンの定量的発現解析
リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴＱ  ＰＣＲ）を用い、種々の正常なそして病理的な細胞、細胞株および組織由来のＲＮＡサンプルを含むマイクロタイタープレートを用いて、種々のクローンの定量的発現を評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００またはＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで、ＲＴＱ  ＰＣＲを実施した。サンプルの種々のコレクションをプレート上でアセンブルしてパネル１（正常な組織およびガン細胞株を含む）、パネル２（正常な供給源およびガン供給源由来の組織由来のサンプルを含む）、パネル３（ガン細胞株を含む）、パネル４（正常組織および炎症状態に関連する細胞由来の細胞および細胞株を含む）、パネル５Ｄ／５Ｉ（代謝疾患に対する重要性を有するヒト組織および細胞株を含む）、ＡＩ＿包括的＿パネル（ＡＩ＿ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ＿ｐａｎｅｌ）（自己免疫疾患／自己炎症性疾患由来の正常な組織およびサンプルを含む）、パネルＣＮＳＤ．０１（正常な脳および疾患脳由来のサンプルを含む）、およびＣＮＳ＿神経変性性＿パネル（ＣＮＳ＿ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ＿ｐａｎｅｌ）（正常およびアルツハイマー病の脳由来のサンプルを含む）と呼ぶ。
【０６４１】
ガイドとして２８Ｓおよび１８ＳのリボソームＲＮＡ染色強度比（２：１〜２．５：１  ２８ｓ：１８ｓ）を用いるアガロースゲル電気泳動図の視覚的評価、および分解産物の指標である低分子量ＲＮＡの非存在によって、全てのサンプル由来のＲＮＡの完全性を品質について管理する。単一のエキソンのスパンにまたがって増幅するように設計されたプローブおよびプライマーセットを用いて、逆転写酵素の非存在下で行なったＲＴＱ  ＰＣＲ反応によって、サンプルをゲノムＤＮＡの混入に対して管理する。
【０６４２】
第一に、構成的に発現された遺伝子（例えば、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ）のような参照（reference）核酸に対してＲＮＡサンプルを正規化した。正規化されたＲＮＡ（５ｕｌ）をｃＤＮＡに変換し、そして製造業者の指示に従ってＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを用いて、ＲＴＱ−ＰＣＲによって解析した。
【０６４３】
他の場合には、製造業者の指示に従って、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｏｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；カタログ番号１８０６４−１４７）およびランダムヘキサマーを用いて、正規化されていないＲＮＡサンプルを、一本鎖のｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）に変換した。２０μｌの容積中で１０μｇまでの総ＲＮＡを含有する反応を実施して、４２℃で６０分間インキュベートした。この反応を最終容積１００μｌ中で総ＲＮＡ５０μｇまでスケールアップしてもよい。次いで、製造業者の指示に従って、１Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２４０２０）を用いて、以前に記載されたような参照核酸に対してｓｓｃＤＮＡサンプルを正規化した。
【０６４４】
入力として標的配列を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ａｐｐｌｅ  ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ  Ｐｏｗｅｒ  ＰＣについてバージョンＩ）または同様のアルゴリズムによって、各々のアッセイのためにプローブおよびプライマーを設計した。反応条件についてデフォールト設定を用い、そしてプライマーを選択する前に以下のパラメーターを設定した：プライマー濃度＝２５０ｎＭ、プライマー融解温度（Ｔｍ）範囲＝５８°〜６０℃、プライマー至適Ｔｍ＝５９℃、最大プライマー相違＝２℃、プローブは５’Ｇを有さず、プローブのＴｍはプライマーのＴｍよりも１０℃大きくなければならず、アンプリコンサイズは７５ｂｐ〜１００ｂｐである。Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ、ＵＳＡ）によって、選択されたプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）を合成した。ＨＰＬＣによってプローブを二回精製して、未結合の色素を除き、質量分析によって評価して、このプローブのそれぞれ５’および３’末端に対するレポーターおよびクエンチャー色素の結合を確実にした。それらの最終濃度は以下であった：フォワードプライマーおよびリバースプライマー、各々９００ｎＭ、そしてプローブ、２００ｎＭ。
【０６４５】
ＰＣＲ条件：ＲＮＡサンプルを用いた作業の場合、各々の組織および各々の細胞株から正規化されたＲＮＡを、９６ウェルまたは３８４ウェルのＰＣＲプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかの各々のウェルにスポットした。ＰＣＲカクテルは、単一遺伝子特異的プローブおよびプライマーのセット、または２つの多重化プローブおよびプライマーのセット（標的プローブで多重化された標的クローンおよび別の遺伝子特異的セットの特異的なセット）のいずれかを含んだ。製造業者の指示に従ってＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号４３１３８０３）を用いて、ＰＣＲ反応を設定した。以下のような増幅／ＰＣＲサイクルによって４８℃で３０分間、逆転写を実施した：９５℃１０分、次いで９５℃１５秒の４０サイクル、６０℃１分。結果は、対数目盛りを用いてＣＴ値（所定のサンプルが蛍光の閾値レベルに交わるサイクル）として記録した。この時、所定のサンプルと最低のＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の相違は、デルタＣＴの乗数に対して２と表される。次いで、このＲＮＡ相違の逆数ととって、１００を掛けることによって、相対パーセントの式を得る。
【０６４６】
ｓｓｃＤＮＡサンプルを使用する場合、ＲＮＡサンプルについて前記されたとおり、正規化されたｓｓｃＤＮＡを用いた。１または２セットのプローブおよびプライマーを含有するＰＣＲ反応を、製造業者の指示に従って、１Ｘ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３２４０２０）を用いて、以前に記載のとおり設定した。ＰＣＲ増幅を以下のとおり実施した：９５℃１０分、次いで９５℃１５秒の４０サイクル、６０℃１分間。結果を解析して、以前に記載のとおり処理した。
【０６４７】
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄ
パネル１、１．１、１．２および１．３Ｄについてのプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４のウェルを含む。これらのパネルにおけるサンプルは、２つのクラスに分けられる：培養された細胞株に由来するサンプルおよび初代正常組織に由来するサンプル。細胞株は、以下のタイプのガンに由来する：肺癌（ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、ＣＮＳ癌（ＣＮＳ  ｃａｎｃｅｒ）、扁平上皮細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）および膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）。これらのパネルで用いた細胞株は、培養された細胞株のための貯蔵庫である、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から広く入手可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を用いて培養された。これらのパネル上で見出された正常な組織は、単一の成体個体または胎児由来の主な器官系全ての由来するサンプルからなる。これらのサンプルは以下の器官由来である：成体骨格筋、胎児骨格筋、成体心臓、胎児心臓、成体腎臓、胎児腎臓、成体肝臓、胎児肝臓、成体肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。
【０６４８】
パネル１、１．１、１．２、および１．３Ｄの結果において、以下の略号を用いる：
ｃａ．＝癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）
＊＝転移から樹立された
ｍｅｔ＝転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）
ａ  ｃｅｌｌ  ｖａｒ＝小細胞変異体（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｖａｒｉａｎｔ）
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小細胞（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ）
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮の（ｓｑｕａｍｏｕｓ）
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水（ｐｌｅｕｒａｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ）
ｇｌｉｏ＝神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）
ａｓｔｒｏ＝星細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）。
【０６４９】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４、ｖ１．５およびｖ１．６
パネル１．４、ｖ１．５およびｖ１．６のプレートは、２つのコントロールウェル（ゲノムＤＮＡコントロールおよび化学コントロール）および種々のサンプル由来のｃＤＮＡを含有する９４のウェルを含む。パネル１．４、ｖ１．５およびｖ１．６におけるサンプルは、２つのクラスに分けられる：培養された細胞株に由来するサンプルおよび初代正常組織に由来するサンプル。細胞株は、以下のタイプのガンに由来する：肺癌、乳癌、黒色腫、結腸癌、前立腺癌、ＣＮＳ癌、扁平上皮細胞癌、卵巣癌、肝臓癌、腎臓癌、胃癌および膵臓癌。パネル１．４、ｖ１．５およびｖ１．６で用いた細胞株は、培養された細胞株のための貯蔵庫である、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）（ＡＴＣＣ）から広く入手可能であり、ＡＴＣＣによって推奨される条件を用いて培養された。パネル１．４、ｖ１．５およびｖ１．６上で見出された正常な組織は、２〜５の異なる成体個体または胎児の主要な器官系の全てに由来するサンプルのプールからなる。これらのサンプルは以下の器官由来である：成体骨格筋、胎児骨格筋、成体心臓、胎児心臓、成体腎臓、胎児腎臓、成体肝臓、胎児肝臓、成体肺、胎児肺、脳の種々の領域、脾臓、骨髄、リンパ節、膵臓、唾液腺、脳下垂体、副腎、脊髄、胸腺、胃、小腸、結腸、膀胱、気管、乳房、卵巣、子宮、胎盤、前立腺、精巣および脂肪。略号はパネル１、１．１、１．２および１．３Ｄに記載されたとおりである。
【０６５０】
パネル２Ｄ、２．２、２．３および２．４
パネル２Ｄ、２．２、２．３および２．４のプレートは一般に、２つのコントロールウェル、および９４個の試験サンプルであって、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＣＨＴＮ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＮＤＲＩ）との密接な協力による外科的作業によって獲得されたヒト組織から、またはＡｒｄａｉｓもしくはＣｌｉｎｏｍｉｃｓから単離されたＲＮＡまたはｃＤＮＡから構成されるサンプルを含む。この組織はヒト悪性腫瘍に由来し、そして示された多くの悪性組織が「適合した縁（ｍａｔｃｈｅｄ  ｍａｒｇｉｎ）」を有する場合は、この腫瘍にすぐ隣接する非癌性組織から得られる。これらは、正常な隣接組織と命名されて、以下の結果において「ＮＡＴ」と表示される。この腫瘍組織および「適合した縁」は、２つの独立した病理学者によって評価される（外科的病理学者およびここでもやはりＮＤＲＩ／ＣＨＴＮ／Ａｒｄａｉｓ／Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓにおける病理学者によって）。悪性腫瘍なしの組織（正常組織）由来の適合しないＲＮＡサンプルをまた、ＡｒｄａｉｓまたはＣｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。この解析によって、腫瘍分化段階の組織病理学的評価が得られる。さらに、ほとんどのサンプルはもとの外科病理学的報告を含み、これが患者の臨床段階に関する情報を提供する。これらの適合した縁は、周囲の組織（すなわちすぐ近位）から手術の領域（表ＲＲにおける正常な隣接組織について「ＮＡＴ」と呼ばれる）にわたって採取される。さらに、高齢の人または突然死の犠牲者（事故など）で行なった生検に由来する種々のヒト組織から、ＲＮＡおよびｃＤＮＡサンプルを得た。これらの組織が疾患を有さないことを確認して、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのような種々の商業的供給源から購入した。一般的な腫瘍学スクリーニングパネル＿ｖ＿２．４は、パネル２Ｄの最新バージョンである。
【０６５１】
ＨＡＳＳパネルｖ１．０
ＨＡＳＳパネルｖ１．０プレートは、９３個のｃＤＮＡサンプルおよび２つのコントロールから構成される。特に、これらのサンプルの８１個は、血清飢餓、アシドーシス、および無酸素状態に種々の時間供された培養ヒト癌細胞株、ならびにこれらの処理についてのコントロール、ヒト初代細胞の３つのサンプル、悪性脳癌の９つのサンプル（４つの髄芽腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）および５つのグリア芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ））および２つのコントロールに由来する。ヒト癌細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られ、以下の組織群におさまる：乳癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌およびＣＮＳ癌細胞株。これらのガン細胞は全て、標準的な推奨条件下で培養される。用いられる処理（血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素状態）は、科学文献において以前に公表されている。初代ヒト細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得られ、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓによって推奨される培地および条件で増殖された。悪性脳癌サンプルは、共同研究の一部として得られ（Ｈｅｎｒｙ  Ｆｏｒｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）、そしてＣｕｒａＧｅｎがサンプルを受け取る前に病理学者によって評価される。標準的な手順を用いてこれらのサンプルからＲＮＡを調製した。ゲノムコントロールおよび化学的なコントロールウェルは以前に記載されている。
【０６５２】
ＡＲＤＡＩＳパネルｖ１．０
ＡＲＤＡＩＳパネルｖ１．０についてのプレートは一般に、２つのコントロールウェルおよびＡｒｄａｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとの密接な協力における外科的作業によって獲得されたヒト組織から単離されたＲＮＡから構成される２２個の試験サンプルを含む。この組織は、ヒト肺悪性腫瘍（肺腺癌または肺扁平上皮癌）に由来し、そして示された多くの悪性組織が「適合した縁」を有する場合は、この腫瘍にすぐ隣接する非癌性の肺組織から得られる。これらの適合した縁は、以下の結果において、周囲の組織（すなわちすぐ近位）から手術の領域（正常な隣接組織について「ＮＡＴ」と呼ばれる）にわたって採取される。この腫瘍組織および「適合した縁」は、独立した病理学者によって（外科的病理学者およびここでもやはりＡｒｄａｉｓの病理学者によって）評価される。肺由来の適合しない悪性ＲＮＡおよび非悪性のＲＮＡサンプルをまたＡｒｄａｉｓから得た。Ａｒｄａｉｓからのさらなる情報によって、腫瘍分化の程度および段階の全体的な組織病理学的評価が得られる。さらにほとんどのサンプルは、もとの外科的病理学的報告を含み、これが患者の臨床状態に関する情報を提供する。
【０６５３】
パネル３Ｄ、３．１および３．２
パネル３Ｄ、３．１および３．２は、９４個のｃＤＮＡサンプルおよび２つのコントロールサンプルから構成される。詳細には、これらのサンプルのうち９２個が、培養されたヒト癌細胞株に由来し、ヒト初代小脳組織の２つのサンプルおよび２つのコントロールである。このヒト細胞株は一般に、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＣＩまたはドイツ腫瘍細胞バンクから得られ、そして以下の組織群におさまる：舌の扁平上皮細胞癌腫、乳癌、前立腺癌、黒色腫、類表皮癌（ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、膀胱癌腫、膵臓癌、腎臓癌、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）／リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）、卵巣／子宮／子宮頚部、胃、肺およびＣＮＳの癌細胞株。さらに、小脳の２つの独立したサンプルが存在する。これらの細胞は全て、標準的な推奨される条件下で培養されて、標準的な手順を用いてＲＮＡが抽出される。パネル３Ｄ、３．１、３．２、１、１．１、１．２、１．３Ｄ、１．４、１．５および１．６の細胞株は、科学文献において用いられる最も通常の細胞株である。
【０６５４】
パネル４Ｄ、４Ｒおよび４．１Ｄ
パネル４は、炎症状態に関連する種々のヒト細胞または組織から単離されたＲＮＡ（パネル４Ｒ）またはｃＤＮＡ（パネル４Ｄ／４．１Ｄ）から構成される９６ウェルプレート（２コントロールウェル、９４試験ウェル）上にサンプルを含む。結腸および肺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ならびに胸腺および腎臓（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のようなコントロールの正常な組織由来の総ＲＮＡを使用した。肝硬変患者の肝臓組織および狼蒼（ｌｕｐｕｓ）患者の腎臓に由来する総ＲＮＡを、ＢｉｏＣｈａｉｎ（Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）から入手した。クーロン病および潰瘍を有すると診断された患者由来のＲＮＡ調製物ついての腸組織を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から入手した。
【０６５５】
星状細胞、肺線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、冠動脈平滑筋細胞、末梢気道上皮、気管支上皮、微小血管真皮内皮性細胞、微小血管肺内皮細胞、ヒト肺動脈内皮細胞、ヒト臍静脈内皮細胞は全て、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入して、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓからこれらの細胞型のために供給された培地中で増殖させた。これらの初代細胞型は、示されたとおり、種々のサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを用いて６時間および／または１２〜１４時間活性化された。以下のサイトカインを用いた；ＩＬ−１β（約１〜５ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＮＦγ（約２０〜５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−４（約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−９（約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１３（約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）。内皮細胞をときどき、０．１％血清を有するＣｌｏｎｅｔｉｃｓの基礎培地中での培養によって種々の時間、飢餓させた。
【０６５６】
Ｆｉｃｏｌｌを用いて、ＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの従業員の血液からモノクローナル細胞を調製した。ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびインターロイキン２における４〜６日間の培養によって、これらの細胞からＬＡＫ細胞を調製した。次いで、細胞を１０〜２０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡおよび１〜２μｇ／ｍｌイオノマイシン、ＩＬ−１２（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（２０〜５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１８（５〜１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて６時間活性化した。ある場合には、単核球細胞を４〜５日間、ＰＨＡ（フィトヘムアグルチニン）またはＰＷＭ（ヤマゴボウマイトジェン）（約５μｇ／ｍｌ）とともに、ＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＲＮＡ調製のためにサンプルを２４時間、４８時間および７２時間で採取した。２つのドナーから血液を採取すること、Ｆｉｃｏｌｌを用いて単核球細胞を単離すること、および単離された単核球細胞を、ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール（５．５×１０−５Ｍ）（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中において約２×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で１：１に混合することによって、ＭＬＲ（混合リンパ球反応）サンプルを得た。このＭＬＲを培養して、ＲＮＡ調製のために１〜７日に及ぶ種々の時点でサンプルを採取した。
【０６５７】
製造業者の指示に従って、ＣＤ１４  Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ（Ｂｅａｄ）、＋ｖｅ  ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを用いて単核球細胞から単球を単離した。ＤＭＥＭ５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＧＭＣＳＦおよび５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４中での５〜７日間の培養によって単球を樹状細胞に分化させた。ＤＭＥＭ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０％ＡＢ  Ｈｕｍａｎ  ＳｅｒｕｍまたはＭＣＳＦ（約５０ｎｇ／ｍｌ）中での５〜７日間の単球の培養によってマクロファージを調製した。リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を１００ｎｇ／ｍｌで用いて６時間および１２〜１４時間、単球、マクロファージおよび樹状細胞を刺激した。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１０μｇ／ｍｌで用いて、樹状細胞をまた、６時間および１２〜１４時間刺激した。
【０６５８】
製造業者の指示に従って、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ５６  Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズ、陽性ＶＳ選択カラムおよびＶａｒｉｏ  Ｍａｇｎｅｔを用いて、単核球細胞から、ＣＤ４リンパ球、ＣＤ８リンパ球およびＮＫ細胞をまた、単離した。ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９  Ｍｉｌｔｅｎｙｉビーズおよび陽性選択を用いて、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ１４およびＣＤ１９細胞の単核球細胞を枯渇することによって、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離した。次いでＣＤ４５ＲＯビーズを用いて、ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４リンパ球である残りの細胞とともにＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球を単離した。ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４およびＣＤ８リンパ球を、ＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）に入れて、０．５μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および３μｇ／ｍｌ抗ＣＤ３（ＯＫＴ３，ＡＴＣＣ）を含有するＰＢＳを用いて一晩コーティングしたＦａｌｃｏｎ  ６ウェル組織培養プレート上に１０６細胞／ｍｌでプレートした。６時間後および２４時間後、ＲＮＡ調製のためにこの細胞を収集した。慢性的に活性なＣＤ８リンパ球を調製するために、本発明者らは、抗ＣＤ２８および抗ＣＤ３でコートしたプレート上で４日間、単離されたＣＤ８リンパ球を活性化し、次いでこの細胞を収集して、ＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２中でそれらを増殖させた。次いで、増殖されたＣＤ８細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合したプレートを用いて４日間、再度活性化し、前述のように増殖させた。第二の活性化後６時間および２４時間、そして第二の増殖培養の４日後、ＲＮＡを単離した。単離されたＮＫ細胞を、ＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２中で４〜６日間培養させて、その後ＲＮＡを調製した。
【０６５９】
Ｂ細胞を得るために、ＮＤＲＩから扁桃を入手した。滅菌解剖ハサミを用いて、この扁桃を切断し、次いで篩を通過させた。次いで、扁桃細胞をスピンダウンして、ＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で１０６細胞／ｍｌに再懸濁した。この細胞を活性化するために、本発明者らは、ＰＷＭ（５μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ４０（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（約１０μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５〜１０μｇ／ｍｌ）を用いた。ＲＮＡ調製のために、２４時間、４８時間および７２時間で細胞を収集した。
【０６６０】
初代および二代目のＴｈ１／Ｔｈ２およびＴｒ１細胞を調製するために、１０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および２μｇ／ｍｌ  ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ）を用いて、６ウェルのＦａｌｃｏｎプレートを一晩コーティングし、次いでＰＢＳを用いて２回洗浄した。臍帯血ＣＤ４リンパ球（Ｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎ  Ｔｏｗｎ，ＭＤ）を、ＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（４ｎｇ／ｍｌ）中で１０５〜１０６細胞／ｍｌで培養した。Ｔｈ１に対してはＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ−４（１μｇ／ｍｌ）を用いたが、Ｔｈ２に対してはＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮγ（１μｇ／ｍｌ）を用い、そしてＴｒ１に対しては、ＩＬ−１０を５ｎｇ／ｍｌで用いた。４〜５日後、活性化されたＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１リンパ球を、ＤＭＥＭ中で１回洗浄して、ＤＭＥＭ  ５％  ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）およびＩＬ−２（１ｎｇ／ｍｌ）中で４〜７日間増殖させた。この後、活性化されたＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１リンパ球を、上記のように抗ＣＤ２８／ＯＫＴ３およびサイトカインを用いて５日間再刺激したが、ただしこのとき抗ＣＤ９５Ｌ（１μｇ／ｍｌ）の添加によってアポトーシスを防いだ。４〜５日後、Ｔｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１リンパ球を洗浄し、次いでＩＬ−２を用いて４〜７日間再度増殖した。活性化されたＴｈ１およびＴｈ２リンパ球をこの方法で最大３サイクル維持した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８  ｍＡｂの結合したプレートによる第二および第三の活性化の後６時間および２４時間後に、そしてインターロイキン２における第二および第三の増殖培養への４日後に、初代および二代目のＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｒ１からＲＮＡを調製した。
【０６６１】
ＡＴＣＣから、以下のリンパ球細胞株を得た：Ｒａｍｏｓ、ＥＯＬ−１、ＫＵ−８１２。５×１０５細胞／ｍｌで８日間の０．１ｍＭ  ｄｂｃＡＭＰ中での培養、３日ごとにこの培地を交換すること、および細胞濃度を５×１０５細胞／ｍｌに調節することによって、ＥＯＬ細胞をさらに分化させた。これらの細胞の培養のために、本発明者らは、５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ（ＡＴＣＣによって推奨される）を用いた。休止中の細胞または１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡおよびイオノマイシン１μｇ／ｍｌで６時間および１４時間活性化された細胞からＲＮＡを調製した。ケラチノサイト株ＣＣＤ１０６および気道上皮腫瘍株ＮＣＩ−Ｈ２９２をまた、ＡＴＣＣから得た。この両方をＤＭＥＭ  ５％ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、メルカプトエタノール５．５×１０−５Ｍ（Ｇｉｂｃｏ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＣＣＤ１１０６細胞を、約５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βを用いて、６時間および１４時間活性化し、一方ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞は以下のサイトカインを用いて６時間および１４時間活性化した：５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−９、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１３、および２５ｎｇ／ｍｌ  ＩＦＮγ。
【０６６２】
これらの細胞株および血液細胞のために、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて約１０７細胞／ｍｌを溶解することによってＲＮＡを調製した。要するに、ブロモクロロプロパン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の１／１０容積をＲＮＡサンプルに添加し、ボルテックスして、１０分後に室温で、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローター中で１４，０００ｒｐｍで、このチューブをスピンした。水相を除去して１５ｍｌ  Ｆａｌｃｏｎ  Ｔｕｂｅに入れた。等容積のイソプロパノールを添加して、一晩−２０℃に置いた。沈殿したＲＮＡを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローターで１５分間９，０００ｒｐｍでスピンダウンして、７０％エタノールで洗浄した。このペレットを、ＲＮＡｓｅを含有しない３００μｌの水に再溶解して、３５μｌ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｌ  ＤＴＴ、７μｌ  ＲＮＡｓｉｎおよび８μｌ  ＤＮＡｓｅを添加した。このチューブを３７°で３０分間インキュベートして、含有するゲノムＤＮＡを除き、フェノールクロロホルムで１回抽出して、１／１０容積の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容積の１００％エタノールを用いて再沈殿させた。このＲＮＡをスピンダウンさせて、ＲＮＡｓｅを含有しない水に入れた。ＲＮＡを−８０℃で保管した。
【０６６３】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０（ＡＩ＿ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐａｎｅｌ＿ｖ１．０）
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０のプレートは、２つのコントロールウェルおよび８９個の試験サンプルであって、Ｂａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、およびＣｌｉｎｏｍｉｃｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から得られた外科的なおよび死後のヒト組織から単離したｃＤＮＡからなるサンプルを含む。ＣｕｒａＧｅｎの施設において、Ｂａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ由来の組織サンプルから、総ＲＮＡを抽出した。他の組織由来の総ＲＮＡは、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。
【０６６４】
Ｂａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにおいて、人工膝関節または人工股関節手術を受けている患者から、滑膜液、滑膜、骨および軟骨を含む結合組織を得た。液体窒素中で組織サンプルを直ちに急速凍結させて、単離されたＲＮＡが適当な量であって分解されていないことを保証する。変形性関節症（ｏｓｔｅｏｒａｒｔｈｒｉｔｉｓ）および関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）の結合組織のさらなるサンプルをＣｌｉｎｏｍｉｃｓから得た。正常なコントロール組織は、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから供給されて、これは外傷の犠牲者の生検の間に得られた。
【０６６５】
乾癬の組織および隣接する適合した組織の外科的標本は、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから総ＲＮＡとして提供された。２５歳〜４７歳の間で、２例の男性患者および２例の女性患者を選択した。サンプルを単離した時点で、処方された薬物を服用していた患者はいなかった。
【０６６６】
潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）およびクローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）を有する患者由来の疾患状態の結腸の外科的標本および隣接する適合した組織を、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。４１〜６９歳の間の３例の女性および３例の男性のクローン病患者由来の腸の組織を用いた。２例の患者は医薬を処方されていなかったが、他の患者はデキサメタゾン、フェノバルビタール、またはタイレノールを服用していた。潰瘍性大腸炎組織は、３例の男性患者および４例の女性患者に由来した。患者のうち４例は、レブビド（ｌｅｂｖｉｄ）を服用しており、２例はフェノバルビタールを服用していた。
【０６６７】
疾患も気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）も、喘息（ａｓｔｈｍａ）もＣＯＰＤも有さない外傷の犠牲者の死亡後の肺組織由来の総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから購入した。気腫の患者は年齢４０〜７０歳に及び、全てが喫煙者であった。この年齢範囲は、喫煙関連の気腫を有する患者に集中するように、かつα１抗トリプシン欠損症（ａｌｐｈａ−１  ａｎｔｉ−ｔｒｙｐｓｉｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）を有する患者を避けるように選択された。喘息患者は、３６〜７５歳に及んだが、それらの患者がＣＯＰＤも有し得ることを防ぐために喫煙者を排除した。ＣＯＰＤ患者は、３５〜８０歳に及び、そして喫煙者および非喫煙者の両方を含んだ。ほとんどの患者はコルチコステロイドおよび気管支拡張薬を服用していた。
【０６６８】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０における組織を同定するために使用される表示では、以下の略号を用いる：
ＡＩ＝自己免疫（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）
Ｓｙｎ＝滑膜の（Ｓｙｎｏｖｉａｌ）
Ｎｏｒｍａｌ＝明白な疾患なし（Ｎｏ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）
Ｒｅｐ２２／Ｒｅｐ２０＝個々の患者
ＲＡ＝関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）
Ｂａｃｋｕｓ＝Ｂａｃｋｕｓ病院由来（Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）
ＯＡ＝変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）
（ＳＳ）（ＢＡ）（ＭＦ）＝個々の患者
Ａｄｊ＝隣接組織
適合コントロール＝隣接組織
−Ｍ＝男性（雄性）
−Ｆ＝女性（雌性）
ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）
【０６６９】
ＡＩ．０５軟骨肉腫（Ｃｈｏｎｄｒｏｓａｒｃｏａ）
ＡＩ．０５軟骨肉腫プレートは、血清飢餓、およびＭＭＰ（１、３および１３）合成を誘導することが公知のサイトカイン（例えば、ＩＬ１β）を用いる処理に供されたＳＷ１３５３細胞から構成される。これらの処置としては、以下が挙げられる：ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β＋ＴＮＦα（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β＋オンコスタチン（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＰＭＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）。ＳＷ１３５３細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手して、全てを標準的な推奨される条件下で培養した。ＳＷ１３５３細胞を、６ウェルプレート中に３×１０５細胞／ｍｌ（１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地）でプレートした。この処理を６時間および１８時間、３連で行なった。ＭＭＰ１、３、および１３産生の解析のため、およびＲＮＡ抽出物のために上清を収集した。標準的な手順を用いてこれらのサンプルからＲＮＡを調製した。
【０６７０】
パネル５Ｄおよび５Ｉ
パネル５Ｄおよび５Ｉのプレートは、２つのコントロールウェル、および代謝疾患に重要なヒト組織および細胞株から単離された種々のｃＤＮＡを含む。妊娠性糖尿病研究に登録された患者から、代謝組織を得た。ヒト間葉肝細胞由来の脂肪細胞の分化における種々の段階の間に細胞を得た。ヒトの膵島も得た。
【０６７１】
妊娠性糖尿病研究において、被験体は若い（１８〜４０歳）であり、さもなければ、慣用的な（選択性の）帝王切開を受けている妊娠性糖尿病の有および無の健康な女性である。乳児の分娩の後、外科的な切開を修復／閉鎖しているとき、産科医は、各々の外科的レベルの閉鎖の間、露出された代謝組織の小サンプル（＜１ｃｃ）を取り出した。生検材料を滅菌生理食塩水中でリンスして、ブロットして、取り出しから５分以内に急速凍結させた。次いでこの組織を液体窒素中で急速凍結させて、滅菌ねじ蓋付きチューブ中に個々に保管して、ＣｕｒａＧｅｎへ運搬するかまたはＣｕｒａＧｅｎによって受け取られるようにドライアイス上で保持した。目的の代謝組織としては、子宮壁（平滑筋）、内臓脂肪、骨格筋（直筋）および皮下脂肪が挙げられる。
患者の詳細は以下のとおりである：
患者２      糖尿病ラテンアメリカ系、肥満、インスリン非依存
患者７〜９  非糖尿病白人および肥満（ＢＭＩ＞３０）
患者１０    糖尿病ラテンアメリカ系、肥満、インスリン依存
患者１１    非糖尿病アフリカ系アメリカ人および肥満
患者１２    インスリン依存の糖尿病性ラテンアメリカ系
【０６７２】
脂肪細胞分化は、三連でＯｓｉｒｕｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ／Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒの部門）から得られたドナー前駆細胞において誘導された。ただし、ドナー（Ｄｏｎｏｒ）３Ｕについては２連のみであった。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓの科学者は、Ｍａｒｋ  Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら、Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｐｒ  ２  １９９９：１４３〜１４７に見出される公表されたプロトコールに基づいて、ＣｕｒａＧｅｎのためにヒト間葉幹細胞（ＨｕＭＳＣ）を単離し、増殖して、分化させた。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓは、ｍＲＮＡ単離およびｄｓ  ｃＤＮＡ産生に適切なＴｒｉｚｏｌ溶解物または凍結ペレットを提供した。各々のドナーの一般的説明は以下のとおりである：
ドナー２および３Ｕ：間葉幹細胞、未分化脂肪
ドナー２および３  ＡＭ：脂肪、中途分化脂肪
ドナー２および３  ＡＤ：脂肪、分化脂肪
【０６７３】
ヒト細胞株は一般に、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＮＣＩまたはドイツ腫瘍細胞バンクから得られ、以下の組織群におさまる：腎臓近位尿細管、子宮平滑筋細胞、小腸、肝臓ＨｅｐＧ２ガン細胞、心臓初代間質細胞、および副腎皮質腺腫細胞。これらの細胞は全て標準的な推奨される条件下で培養され、そして標準的な手順を用いてＲＮＡが抽出された。全てのサンプルはＣｕｒａＧｅｎで処理されて、一本鎖ｃＤＮＡが得られた。
【０６７４】
パネル５Ｉは、以前に記載された全てのサンプルを含んでおり、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（マイアミ医科大学）のＤｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（糖尿病研究所）から入手した５８歳女性患者由来の膵島を追加している。島組織は、外部供給源の総ＲＮＡに対して処理して、パネル５Ｉに加えるためにＣｕｒａＧｅｎに送付した。
【０６７５】
５Ｄおよび５Ｉパネルにおける組織を同定するために使用した表示では、以下の略号を用いる：
ＧＯ  Ａｄｉｐｏｓｅ＝大網脂肪（Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｏｍｅｎｔｕｍ  Ａｄｉｐｏｓｅ）
ＳＫ＝骨格筋（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｍｕｓｃｌｅ）
ＵＴ＝子宮（子宮）
ＰＬ＝胎盤（Ｐｌａｃｅｎｔａ）
ＡＤ＝分化した脂肪（Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）
ＡＭ＝中途分化した脂肪（Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｍｉｄｗａｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）
Ｕ＝未分化幹細胞（Ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ）
【０６７６】
パネル  ＣＮＳＤ．０１
パネルＣＮＳＤ．０１のプレートは、２つのコントロールウェルおよび９４個の試験サンプルであってＨａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手された死亡後ヒト脳組織から単離されたｃＤＮＡから構成されるサンプルを含む。死後４時間〜２４時間の間のドナーの頭蓋冠から脳を取り出し、神経解剖学者によって切片にして、液体窒素相中で−８０℃で凍結する。全ての脳を切片にして、神経病理学者によって検査して、関連する明白な神経病理学の診断を確認する。
【０６７７】
疾患の診断を患者の記録から取る。このパネルは、以下の診断の各々に由来する２つの脳を含む：アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｐｅｒｎｕｃｌｅａｒ  Ｐａｌｓｙ）、抑うつ（Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）および「正常コントロール（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」。これらの脳の各々において、以下の領域が示される：帯状回、側頭極、淡蒼球、黒質、ブロードマン領域４（一次運動片）、ブロードマン領域７（頭頂葉皮質）、ブロードマン領域９（前前頭皮質）およびブロードマン領域１７（後頭皮質）。全ての脳領域が全ての場合に示されるのではない；例えば、ハンチントン病は、淡蒼球における神経変性によって一部は特徴付けられ、従ってこの領域を確認されたハンチントン病症例から得ることはできない。同様にパーキンソン病は黒質の変性によって特徴付けられ、これによってこの領域を得ることがさらに困難になる。正常なコントロール脳を、神経病理学について検査したところ、神経変性に一致するいかなる病理も有さないことが見出された。
【０６７８】
ＣＮＳパネルにおいて組織を同定するために使用した表示では、以下の略号を用いている：
ＰＳＰ＝進行性核上麻痺（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｓｕｐｅｒｎｕｃｌｅａｒ  Ｐａｌｓｙ）
Ｓｕｂ  Ｎｉｇｒａ＝黒質（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａ  ｎｉｇｒａ）
Ｇｌｏｂ  Ｐａｌｌａｄｕｓ＝淡蒼球（Ｇｌｏｂｕｓ  ｐａｌｌａｄｕｓ）
Ｔｅｍｐ  Ｐｏｌｅ＝側頭極（Ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｐｏｌｅ）
Ｃｉｎｇ  Ｇｙｒ＝帯状回（Ｃｉｎｇｕｌａｔｅ  ｇｙｒｕｓ）
ＢＡ  ４＝ブロードマン領域４（Ｂｒｏｄｏｍａｎ  Ａｒｅａ  ４）
【０６７９】
パネル  ＣＮＳ＿神経変性性＿Ｖ１．０
パネル  ＣＮＳ＿神経変性性＿Ｖ１．０のプレートは、２つのコントロールウェル、および４７個の試験サンプルであって、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭｃＬｅａｎ  Ｈｓｏｐｉｔａｌ）およびＨｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＶＡ  Ｇｒｅａｔｅｒ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）から入手した死後のヒト脳組織から単離したｃＤＮＡから構成されるサンプルを含む。死後４時間〜２４時間の間のドナーの頭蓋冠から脳を取り出し、神経解剖学者によって切片にして、液体窒素相中で−８０℃で凍結する。全ての脳を切片にして、神経病理学者によって検査して、関連する明白な神経病理学の診断を確認する。
【０６８０】
疾患の診断を患者の記録から取る。このパネルは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者由来の６つの脳、および死亡の前に痴呆の証拠を示さなかった「正常コントロール（Ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」由来の８つの脳を含む。８つの正常なコントロール脳は以下の２つの範疇に分けられる：痴呆およびアルツハイマー様の病理（コントロール）のないコントロール、ならびに痴呆はないが重篤なアルツハイマー様の病理の証拠があるコントロール（詳細には、老人斑負荷は、０〜３のスケールではレベル３とみなされた；０＝斑の証拠なし、３＝重篤なＡＤ老人斑負荷）。これらの脳の各々において、以下の領域が示される：海馬、側頭皮質（ブロードマン領域２１）、頭頂葉皮質（ブロードマン領域７）、および後頭皮質（ブロードマン領域１７）。これらの領域は、ＡＤにおける神経変性の全てのレベルを包含するように選択された。海馬はＡＤにおける早期のかつ重篤な神経損失の領域である；側頭皮質は、海馬の後にＡＤで神経変性を示すことが公知である；頭頂葉皮質は、この疾患の後期段階で中度の神経死を示す；後頭皮質は、ＡＤにおいては、容赦され、従ってＡＤ患者においての「コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）」領域として作用する。脳領域の全てが全ての場合に示されるのではない。
【０６８１】
ＣＮＳ＿神経変性＿Ｖ１．０パネルにおいて組織を同定するために使用した表示では、以下の略号を用いている：
ＡＤ＝アルツハイマー病の脳；患者は痴呆になって生検の際ＡＤ様の病理を示した
Ｃｏｎｔｒｏｌ＝コントロール脳；痴呆になっていない患者であって、神経病理を示さない
Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐａｔｈ）＝コントロール脳；患者は痴呆になっていないが重篤なＡＤ様病理を示す
Ｓｕｐ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｔｘ＝上側側頭皮質（Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ）
Ｉｎｆ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｔｘ＝下側側頭皮質（ＩｎｆｅｒｉｏｒＴｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｒｔｅｘ）
【０６８２】
Ａ．ＣＧ１０３３２２−０２：ＣＤ８２  ＡＮＴＩＧＥＮ
遺伝子ＣＧ１０３３２２−０２の発現を、表ＡＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ６８５８を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＡＢに示す。ＣＧ１０３２２−０２が、全長の物理的クローンに相当することに注意のこと。
【０６８３】
表AA. プローブ名 Ａge 6835
【表４１２】
2005520496.tif 000413
表 AB. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.6
【表４１３】
2005520496.tif 000414
【表４１４】
2005520496.tif 000415
【０６８４】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．６まとめ：Ａｇ６８５８
この遺伝子は、このパネルにおいてほとんどのガン細胞株で低レベルで発現され、最高の発現は腎臓ガン細胞株ＵＯ−３１（ＣＴ＝３０．０３）である。これは、発現のマーカーとして用いられてもよい。
【０６８５】
ＣＧ１０３３２２−０２は、前立腺癌の転移抑制因子として文献に最初に記載された（Ｄｏｎｇ，Ｊ．−Ｔ．；Ｌａｍｂ，Ｐ．Ｗ．；Ｒｉｎｋｅｒ−Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ，Ｃ．Ｗ．；Ｖｕｋａｎｏｖｉｃ，Ｊ．；Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｔ．；Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．Ｔ．；Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃ．：ＫＡＩ１，ａ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１ｐ１１．２．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：８８４〜８８６，１９９５）遺伝子である、ＣＤ８２／ＫＡＩ１の欠失スプライス変異体である。
【０６８６】
Ｂ．ＣＧ１５１５７５−０２：新規な多回貫通膜タンパク質（Ｍｉｌｔｉ−ｐａｓｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）
遺伝子ＣＧ１５１５７５−０２の発現は、表ＢＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ７６２１を用いて評価された。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果は表ＢＢに示される。
【０６８７】
表 BA. プローブ名Ag7621
【表４１５】
2005520496.tif 000416
表 BB. パネル 4.1D
【表４１６】
2005520496.tif 000417
【表４１７】
2005520496.tif 000418
【０６８８】
ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ７６２１、この遺伝子の発現は、このパネル上の全てのサンプルにわたって低いか／検出不能（ＣＴｓ＞３５）である。
【０６８９】
パネル４．１Ｄまとめ：Ａｇ７６２１、この遺伝子の低発現は主に、ＩＦＮγ処理されたＮＣＩ−Ｈ２９２において検出される（ＣＴ＝３４．６）。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株は、ムチンを生成するヒト気道上皮細胞株である。この遺伝子の発現は、得られた細胞に比べてＩＦＮγ刺激されたＮＣＩ−Ｈ２９２において、より高い。従って、この遺伝子は、気道上皮の増殖または活性化に重要であり得る。粘液の過剰産生は、気管支喘息および慢性閉塞性肺疾患のサンプルの重要な特徴である。従って、この遺伝子によってコードされたタンパク質を用いてデザインされた治療剤は、慢性閉塞性肺疾患、喘息、アレルギーおよび気腫において肺上皮の炎症によって生じる症状を軽減または排除し得る。
【０６９０】
Ｃ．ＣＧ１５３０１１−０１：スシドメイン含有膜タンパク質（Ｓｕｓｈｉ  Ｄｏｍａｉｎ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）
遺伝子ＣＧ１５３０１１−０１の発現を、表ＣＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ６９６６を用いて評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＣＢに示す。ＣＧ１５３０１１−０１が、全長の物理的クローンに相当することに注意のこと。
【０６９１】
表 CA. プローブ名Ag6966
【表４１８】
2005520496.tif 000419
表 CB. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.6
【表４１９】
2005520496.tif 000420
【表４２０】
2005520496.tif 000421
【０６９２】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．６まとめ：Ａｇ６９６６、この遺伝子の最高発現は、腎臓癌７８６−０細胞株において検出される（ＣＴ＝３０．８）。この遺伝子の発現の中度のレベルはまた、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、および脳腫瘍（ｂｒａｉｎ  ｃａｎｃｅｒ）に由来する癌細胞株のクラスターにおいてもみられる。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして用いることができた。さらにこの遺伝子の発現または機能の治療調節は、胃癌、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、および脳腫瘍の処置に有効であり得る。
【０６９３】
さらに、この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、脳皮質および脊髄を含む、検査された中枢神経系の全ての領域で中度〜低レベルで発現される。従って、この遺伝子産物の治療調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、統合失調症（精神分裂病）（ｓｃｈｉｚｏｐｈｅｒｅｎｉａ）および抑うつのような中枢神経系の障害の処置に有用であり得る。
【０６９４】
Ｄ．ＣＧ１５３１７９−０１：膜タンパク質
表ＤＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ６８６３を用いて、遺伝子ＣＧ１５３１７９−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＤＢに示す。ＣＧ１５３１７９−０１が、全長の物理的クローンに相当することに注意のこと。
【０６９５】
表 DA. プローブ名Ag6863
【表４２１】
2005520496.tif 000422
表 DB. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.6
【表４２２】
2005520496.tif 000423
【表４２３】
2005520496.tif 000424
【０６９６】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．６まとめ：Ａｇ６８６３発現は、胎児骨格筋由来のサンプルに限定される（ＣＴ＝３４．７）。興味深いことに、この遺伝子は、成体の骨格筋（ＣＴ＝４０）に比べて、胎児においてかなり高いレベルで（ＣＴ＝３４．７）発現される。この観察によって、この遺伝子の発現を用いて、このパネルにおいて成体骨格筋および他のサンプルから胎児を識別することができることが示唆される。さらに、胎児骨格筋におけるこの遺伝子の相対的な過剰発現によって、このタンパク質産物が胎児における筋の増殖または発達を増強し得、従って成体における再生能においても働き得るということが示唆される。従ってこの遺伝子によってコードされたタンパク質の治療調節は、筋関連疾患の処置において有用であり得る。より詳細には、この遺伝子によってコードされるタンパク質を用いた弱い筋肉またはジストロフィーの筋肉の処置は、筋肉の量または機能を修復することができた。
【０６９７】
Ｅ．ＣＧ１５３４０３−０２：Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質−４前駆体
表ＥＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ７１７６を用いて、遺伝子ＣＧ１５３４０３−０２の発現を評価した。ＣＧ１５３４０３−０１が、全長の物理的クローンに相当することに注意のこと。
【０６９８】
表 EA. プローブ名Ag7176
【表４２４】
2005520496.tif 000425
【０６９９】
ＣＮＳ＿神経変性性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ７１７６、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７００】
パネル４．１Ｄのまとめ：Ａｇ７１７６、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７０１】
Ｅ．ＣＧ１５７７６０−０２：ＰＬＡＣ１
表ＦＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ７１５３を用いて、遺伝子ＣＧ１５７７６０−０２の発現を評価した。ＣＧ１５７７６０−０２が、全長の物理的クローンに相当することに注意のこと。
【０７０２】
表 FA. プローブ名Ag7153
【表４２５】
2005520496.tif 000426
【０７０３】
ＣＮＳ＿神経変性性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ７１５３、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７０４】
パネル４．１Ｄのまとめ：Ａｇ７１５３、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７０５】
Ｇ．ＣＧ１５８１１４−０１：黒色腫関連抗原ｇｐ１００のスプライス変異体
表ＧＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ５３３５を用いて、遺伝子ＣＧ１５８１１４１−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＧＢおよびＧＣに示す。
【０７０６】
表 GA. プローブ名Ag5335
【表４２６】
2005520496.tif 000427
表 GB. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.5
【表４２７】
2005520496.tif 000428
【表４２８】
2005520496.tif 000429
表 GC. パネル 4.1D
【表４２９】
2005520496.tif 000430
【表４３０】
2005520496.tif 000431
【０７０７】
ＣＮＳ＿神経変性性＿ｖ１．０まとめ：この遺伝子のＡｇ５３３５発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７０８】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５まとめ：Ａｇ５３３５、この遺伝子は、２つの黒色腫癌細胞株サンプルにおいて非常に高度に発現される（ＣＴｓ＝２２）。この新規な遺伝子は、メラニン形成において重要な役割を果たし、そして黒色腫の免疫治療のための標的として活発に検討される、メラニン形成細胞タンパク質Ｐｍｅｌ  １７に対して相同であるタンパク質をコードする（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｅｓｐａｒｚａ  Ｍ，Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２０００  Ａｐｒ；１３（２）：１２０〜６）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネル上のこれらのサンプルと他のサンプルとの間の識別すること、およびマーカーとして用いて黒色腫の存在を検出することができた。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、黒色腫の処置において有効であり得る。
【０７０９】
代謝機能を有する組織のなかでも、この遺伝子は、膵臓、ならびに成体および胎児の肝臓において、低いが有意なレベルで発現される。これらの組織の間のこの発現によって、この遺伝子産物が正常な神経内分泌および代謝機能において役割を果たし得ること、ならびにこの遺伝子の発現の調節不全は、肥満および糖尿病のような神経内分泌障害または代謝性疾患の一因となり得るということが示唆される。
【０７１０】
パネル４．１Ｄまとめ：Ａｇ５３３５最高発現はＩＬ−９処理したＮＣＩ−Ｈ２９２杯細胞に由来するサンプル中でみられる（ＣＴ＝３３．５）。ＩＬ−４、ＩＬ−１３で処理したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、または未処理の細胞、ならびにＰＭＡ／イオノマイシン処理したＬＡＫ細胞、未処理のＮＫ細胞、初代活性化Ｔｈ１およびＴｒ２細胞、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ４リンパ球および休止中二次ＣＤ８リンパ球において、低いが有意な発現がまたみられる。この発現によって、この遺伝子産物は、喘息、気腫およびアレルギーを含む肺の炎症性状態に関与し得ることが示唆される。
【０７１１】
Ｈ．ＣＧ１５８５５３−０１：エリスロポエチンレセプター前駆体
表ＨＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ５４４６を用いて、遺伝子ＣＧ１５８５５３−０１の発現を評価した。
【０７１２】
表 HA. プローブ名Ag5446
【表４３１】
2005520496.tif 000432
【０７１３】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０まとめ（ＡＩ＿ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐａｎｅｌ＿ｖ１．０  Ｓｕｍｍａｒｙ）：この遺伝子のＡｇ５４４６発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７１４】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５まとめ：Ａｇ５４４６、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７１５】
パネル４．１Ｄまとめ：Ａｇ５４４６、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７１６】
Ｉ．ＣＧ１５８９８３−０１、ＣＧ１５８９８３−０２およびＣＧ１５８９８３−０３：クロライドチャネル
表ＩＡおよびＩＢに記載のプライマー−プローブセットＡｇ５８９２およびＡｇ６１８６を用いて、遺伝子ＣＧ１５８９８３−０１、ＣＧ１５８９８３−０２およびＣＧ１５８９８３−０３の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦ、ＩＧおよびＩＨに示す。ＣＧ１５８９８３−０３がＣＧ１５８９８３−０２遺伝子の全長の物理的クローンに相当し、これによってこの遺伝子配列の予測が確証されることに注意のこと。
【０７１７】
表 IA. プローブ名Ag5892
【表４３２】
2005520496.tif 000433
表 IB. プローブ名Ag6186
【表４３３】
2005520496.tif 000434
表 IC. AI.05 軟骨肉腫
【表４３４】
2005520496.tif 000435
表 ID. AI_包括的＿パネル_v1.0
【表４３５】
2005520496.tif 000436
【表４３６】
2005520496.tif 000437
【表４３７】
2005520496.tif 000438
表 IE. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.5
【表４３８】
2005520496.tif 000439
【表４３９】
2005520496.tif 000440
表 IF. パネル 4.1D
【表４４０】
2005520496.tif 000441
【表４４１】
2005520496.tif 000442
表 IG. パネル 5島（Islet）
【表４４２】
2005520496.tif 000443
【表４４３】
2005520496.tif 000444
表 IH. 一般腫瘍学的スクリーニングパネル_v_2.4
【表４４４】
2005520496.tif 000445
【０７１８】
ＡＩ．０５＿軟骨肉腫まとめ：Ａｇ５８９２、この遺伝子の最高の発現は、未処理の血清飢餓された軟骨肉腫細胞株（ＳＷ１３５３）において検出される（ＣＴ＝３２．２）。興味深いことに、この遺伝子の発現は、変形性関節症（ＯＡ）において観察された軟骨の破壊に関与する炎症促進性サイトカインおよびマトリックスメタロプロテイナーゼの強力な活性化因子である、ＩＬ−１を用いた処置の際にわずかに下方制御（ダウンレギュレート）されるらしい（ＣＴｓ＝３３４〜３５）。従って、軟骨細胞におけるこの転写の発現の調整は、ＯＡにおいて観察される軟骨の変性を防止するのに重要であり得る。
【０７１９】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ５８９２の最高の発現は、潰瘍性大腸炎に隣接する正常な組織由来のサンプルにおいてみられる（ＣＴ＝２７．７）。さらに、関節リウマチ由来のサンプルのクラスターにおいて、およびＯＡサンプルにおいて、顕著なレベルの発現がみられる。従って、この遺伝子の発現を用いて、他のサンプルからこれらのサンプルを識別すること、およびこれらの疾患のマーカーとして用いることができる。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、これらの疾患の処置において有用であり得る。このプローブおよびプライマーを用いた第二の実験であるｒｕｎ２４７８４２３１からの結果にＡｇ５８９２は含まれない。このａｍｐプロットによって、この試行（ｒｕｎ）は実験上困難であることが示される。この遺伝子のＡｇ６１８６発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７２０】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５まとめ：Ａｇ５８９２の最高の発現は、胃癌細胞株で見られる（ＣＴ＝２８）。中度のレベルの発現がまた乳房、卵巣および黒色腫の癌、ならびに正常な甲状腺、胎児肺および胎盤に由来する細胞株のクラスターにおいてもみられる。さらに、この遺伝子は、胎児肺組織において（ＣＴ＝３０）、成体の対応物における発現（ＣＴ＝４０）に比べて、かなり高いレベルで発現される。従って、この遺伝子の発現を用いて、この組織の胎児供給源と成体供給源との間を識別することができる。
【０７２１】
パネル４．１Ｄまとめ：Ａｇ５８９２、この遺伝子の顕著な発現は、未処理の末梢気道上皮において、ならびにＴＮＦ−αおよびＩＬ−１ｂで処理した末梢気道上皮においてみられる（ＣＴｓ＝２８〜２９）。さらに、低いが有意なレベルの発現が肺および皮膚線維芽細胞に由来するサンプルのクラスターにおいて、ならびにＮＣＩ−Ｈ２９２杯細胞においてみられる。従って、この遺伝子の発現は、同様に末梢気道上皮のマーカーとして用いることができる。さらに、この遺伝子の発現または機能の調節は、アレルギー、気腫および喘息を含む、肺の炎症性状態の処置において有用であり得る。この遺伝子のＡｇ６１８６発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７２２】
パネル５島のまとめ：Ａｇ５８９２、この遺伝子の発現は、パネル１．５における発現と一致して胎盤において顕著である（ＣＴｓ＝２８〜３０）。従ってこの遺伝子の発現を、この組織のマーカーとして用いることができる。
【０７２３】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル＿ｖ＿２．４まとめ：Ａｇ５８９２、この遺伝子の最高の発現は、前立腺癌においてみられる（ＣＴ＝３０）。この遺伝子の中度のレベルの発現が結腸、肺、腎臓、黒色腫および皮膚細胞癌腫瘍においてみられる。従ってこの遺伝子の発現は、これらおよび他の癌、詳細には乳癌のようなホルモン依存性癌のマーカーとして有用であり得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の調節は、癌の処置において有用であり得る。
【０７２４】
Ｊ．ＣＧ１５９０１５−０１、ＣＧ１５９０１５−０２、およびＣＧ１５９０１５−０３：新規な分泌タンパク質。
表ＪＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ５９６２を用いて、遺伝子ＣＧ１５９０１５−０１、ＣＧ−１５９０１５−０２およびＣＧ１５９０１５−０３の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＪＢおよびＪＣに示す。ＣＧ１５９０１５−０３が全長の物理的クローンに相当することに注目のこと。
【０７２５】
表 JA. プローブ名Ag5962
【表４４５】
2005520496.tif 000446
表 JB. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.5
【表４４６】
2005520496.tif 000447
【表４４７】
2005520496.tif 000448
表 JC. パネル 5 島（Islet）
【表４４８】
2005520496.tif 000449
【表４４９】
2005520496.tif 000450
【０７２６】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５まとめ：Ａｇ５９６２、この遺伝子の最高の発現は、脳腫瘍ＳＮＢ−７５細胞株で検出される（ＣＴ＝２５．２）。この遺伝子の中度〜高度のレベルの発現がまた、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫および脳腫瘍に由来するガン細胞株のクラスターにおいてみられる。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして用いることができる。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫および脳腫瘍の処置において有効であり得る。
【０７２７】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間でも、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、脳下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において中度のレベルで発現される。従って、この遺伝子の活性の治療的な調節は、肥満および糖尿病のような、内分泌／代謝的に関連した疾患の処置において有用であることが証明され得る。
【０７２８】
さらにこの遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、脳皮質および脊髄を含む、検査された中枢神経系の全ての領域で中度のレベルで発現される。従って、この遺伝子産物の治療調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、統合失調症（精神分裂病）（ｓｃｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）および抑うつのような中枢神経系の障害の処置において有用であり得る。
【０７２９】
パネル５島まとめ：Ａｇ５９６２、この遺伝子の最高の発現は、島細胞において検出される（ＣＴ＝２７．７）。この遺伝子は、このパネルにおいて広範な発現を示し、これは脂肪、骨格筋、子宮、胎盤、小腸、心臓間質細胞および腎臓において中度の発現である。従って、この遺伝子の活性の治療的な調節は、肥満およびＩＩ型糖尿病を含む糖尿病のような、内分泌／代謝的に関連した疾患の処置において有用であり得る。
【０７３０】
Ｋ．ＣＧ５０３８７−０３：コネキシン４６
表ＫＡ、ＫＢおよびＫＣに記載される、プライマー−プローブセットＡｇ２５９７、Ａｇ５２３４およびＡｇ５２３５を用いて、遺伝子ＣＧ５０３８７−０３の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＫＤおよびＫＥに示す。
【０７３１】
表 KA. プローブ名Ag2597
【表４５０】
2005520496.tif 000451
表 KB. プローブ名Ag5234
【表４５１】
2005520496.tif 000452
表 KC. プローブ名Ag5235
【表４５２】
2005520496.tif 000453
表 KD. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.5
【表４５３】
2005520496.tif 000454
【表４５４】
2005520496.tif 000455
【表４５５】
2005520496.tif 000456
表 KE. パネル 4.1D
【表４５６】
2005520496.tif 000457
【表４５７】
2005520496.tif 000458
【表４５８】
2005520496.tif 000459
【０７３２】
ＣＮＳ＿神経変性性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ２５９７／Ａｇ５２３４／Ａｇ５２３５、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７３３】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５まとめ：Ａｇ５２３４／Ａｇ５２３５、２つの異なるプローブ−プライマーセットを用いる２つの実験は良好に一致している。この遺伝子の最高の発現は、結腸癌細胞株由来のサンプル中で検出される（ＳＷ４８０）（ＣＴｓ＝３０）。さらに、２つの他の結腸癌細胞株、膵臓癌細胞株、２つの肺癌細胞株、乳癌細胞株、２つの黒色腫細胞株、およびいくつかのガン細胞株のクラスターに関連する実質的な発現が存在する。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルにおいて他のサンプルから上記のサンプルを識別することができる。さらに、低分子薬物、抗体またはタンパク質治療剤の使用を通じた、この遺伝子の治療用の調整は、卵巣、結腸、膵臓、肺、乳房の癌または黒色腫の処置に有用であり得る。
【０７３４】
この遺伝子はまた、胎児心臓において中度のレベルで（ＣＴ＝３１．１）、そして成体心臓において低レベルで（ＣＴ＝３４．５）発現される。従って、この遺伝子の発現を用いて、胎児心臓組織と成体心臓組織との間を識別することができる。さらに、胎児心臓における、より高い発現レベルによって、この遺伝子にコードされたタンパク質が、心臓の疾患の病因論、診断および／または処置に重要であり得ることが示唆される。
【０７３５】
パネル４．１Ｄまとめ：Ａｇ５２３４／Ａｇ５２３５、２つの異なるプローブ−プライマーセットを用いる２つの実験は良好に一致している。この遺伝子の最高の発現は、ＬＰＳで刺激された単球において主に検出される（ＣＴｓ＝３２）。細菌のＬＰＳを含む病原体による活性化の際、単球は、組織障害および炎症性サイトカイン放出の部位への遊走によって、生来のおよび特異的な免疫に寄与する。この放出は、炎症プロセスに寄与する。この転写物は、ギャップ結合および細胞内連絡に関与するタンパク質のファミリーである、コネキシン様タンパク質をコードする。従って、この転写物によってコードされるタンパク質は、活性化された単球と内皮との相互作用において、ある役割を有し得る。これは、障害された組織に対するこれらの細胞の遊走に必要な第一の段階である。従って、抗体または低分子による、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または機能の調節によって、単球の補充および炎症プロセスを妨げて、喘息、アレルギー、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）、紅斑性狼瘡（ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）または関節リウマチのような自己免疫疾患および炎症性腸疾患に罹患している患者の症状の改善をもたらすことができる。
【０７３６】
Ｌ．ＣＧ５２１１３−０１、ＣＧ５２１１３−０３、ＣＧ５２１１３−０４、ＣＧ５２１１３−０５およびＣＧ５２１１３−０６：ノッチ４様タンパク質（Ｎｏｔｃｈ  ４  ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
表ＬＡおよびＬＢに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２６６５およびＡｇ２７７８を用いて、遺伝子ＣＧ４２１１３−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＬＣ、ＬＤ、ＬＥおよびＬＦに示す。ＣＧ５２１１３−０５は、ＣＧ５２１１３−０１遺伝子の全長の物理的なクローンに相当し、これによってこの遺伝子配列の予測が確証されることに注目のこと。
【０７３７】
表 LA. プローブ名Ag2665
【表４５９】
2005520496.tif 000460
表 LB. プローブ名Ag2778
【表４６０】
2005520496.tif 000461
表 LC. CNS_神経変異性_v1.0
【表４６１】
2005520496.tif 000462
【表４６２】
2005520496.tif 000463
表 LD. パネル 1.3D
【表４６３】
2005520496.tif 000464
【表４６４】
2005520496.tif 000465
【表４６５】
2005520496.tif 000466
表 LE. パネル 2D
【表４６６】
2005520496.tif 000467
【表４６７】
2005520496.tif 000468
【表４６８】
2005520496.tif 000469
表 LF. パネル 4D
【表４６９】
2005520496.tif 000470
【表４７０】
2005520496.tif 000471
【表４７１】
2005520496.tif 000472
【０７３８】
ＣＮＳ＿神経変性性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ２６６５／Ａｇ２７７８、２つの異なるプローブ−プライマーセットを用いる４つの実験は良好に一致している。このパネルによって、個体の独立した群における脳でのこの遺伝子の低レベルの発現が確認される。この遺伝子は、アルツハイマー病患者の側頭皮質においてわずかにダウンレギュレート（下方制御）されることが見出される。従って、このレセプターに特異的なアゴニストを用いる、この遺伝子またはタンパク質産物のアップレギュレート（上方制御）また処理は、この疾患に関連する痴呆、記憶喪失および神経死を逆転するのに有用であり得る。
【０７３９】
パネル１．３Ｄまとめ：Ａｇ５２３４／Ａｇ５２３５、２つの異なるプローブ−プライマーセットを用いる２つの実験は良好に一致している。この遺伝子の最高の発現は、海馬および胎児骨格筋おいて検出される（ＣＴｓ＝２６〜２８．７）。この遺伝子は、扁桃、海馬、黒質、視床、小脳、脳皮質および脊髄を含む、検査された中枢神経系の全ての領域で中度のレベルで発現される。従って、この遺伝子産物の治療調節は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、統合失調症（精神分裂病）および抑うつのような中枢神経系の障害の処置において有用であり得る。
【０７４０】
この遺伝子の中度のレベルの発現はまた、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫および脳腫瘍に由来するガン細胞株のクラスターにおいてみられる。従って、この遺伝子の発現は、これらの癌の存在を検出するためのマーカーとして有用であり得る。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、黒色腫および脳腫瘍の処置において有効であり得る。
【０７４１】
代謝機能または内分泌機能を有する組織の間でも、この遺伝子は、膵臓、脂肪、副腎、甲状腺、脳下垂体、骨格筋、心臓、肝臓および胃腸管において中度のレベルで発現される。従って、この遺伝子の活性の治療的な調節は、肥満および糖尿病のような、内分泌／代謝的に関連した疾患の処置において有用であることが証明され得る。
【０７４２】
パネル２Ｄまとめ：Ａｇ２６６５／Ａｇ２７７８、２つの異なるプローブ−プライマーセットを用いる２つの実験は良好に一致している。この遺伝子の最高の発現は、正常な肺および転移性乳癌サンプルにおいて検出される（ＣＴｓ＝２７〜２８）。この遺伝子は、結腸、卵巣、膀胱、前立腺、肝臓、乳房、甲状腺、子宮、腎臓および肺に由来するガンおよび正常な組織のサンプルの両方において有意な発現を示す。この遺伝子の中度のレベルの発現がまた、代謝性黒色腫においてみられる。興味深いことに、この遺伝子のより高い発現は、対応するガンのサンプルに比べて正常な肺に一貫して関連している。従って、この遺伝子の発現を用いて、ガンと正常な肺との間を識別することができる。さらに、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的な調節は、転移性の黒色腫、結腸癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、乳癌、甲状腺癌、子宮癌、腎臓癌および肺癌の処置において有用であり得る。
【０７４３】
パネル４Ｄまとめ：Ａｇ２６６５／Ａｇ２７７８、２つの異なるプローブ−プライマーセットを用いる２つの実験は良好に一致している。この遺伝子の最高の発現は、肺微小血管内皮細胞においてである（ＣＴｓ＝２７〜２８）。この遺伝子の中度〜高度のレベルの発現は主に、内皮細胞でみられる。ＩＬ−１βおよびＴＮＦα処置によって、ＨＰＡＥＣ、ＨＵＶＥＣおよび肺微小血管ＥＣを含む内皮細胞において一貫してこの遺伝子の発現は減少する。従って、この遺伝子によってコードされたタンパク質を用いて設計された治療は、喘息、ＩＢＤおよび乾癬の間の炎症の主な要素である白血球血管外遊走を含む、内皮機能を調節することにおいて重要であり得る。
【０７４４】
さらに、この遺伝子の中度〜低レベルの発現がまた、好酸球、樹状細胞、休止期マクロファージ、活性化ＣＤ４５ＲＡ  ＣＤ４リンパ球、肺および真皮の線維芽細胞、ならびに結腸、肺、胸腺および腎臓によって示される正常な組織でもみられる。従って、この遺伝子産物の治療的な調節によって、乾癬、アレルギー、喘息、炎症成長疾患、関節リウマチおよび変形性関節症を含む自己免疫障害および炎症性腸障害に関連する症状／状態を緩和することができる。
【０７４５】
Ｍ．ＣＧ５７５４２−０１：カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ）
表ＭＡ、ＭＢおよびＭＣに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ３２３４、Ａｇ３２７９およびＡｇ６１６を用いて、遺伝子ＣＧ５７５４２−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＭＤ、ＭＥ、ＭＦ、ＭＧ、ＭＨ、ＭＩ、ＭＪ、ＭＫおよびＭＬに示す。
【０７４６】
表 MA. プローブ名Ag3234
【表４７２】
2005520496.tif 000473
表 MB. プローブ名Ag3279
【表４７３】
2005520496.tif 000474
表 MC. プローブ名Ag616
【表４７４】
2005520496.tif 000475
表 MD. CNS_神経変異性_v1.0
【表４７５】
2005520496.tif 000476
【表４７６】
2005520496.tif 000477
表 ME. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.4
【表４７７】
2005520496.tif 000478
【表４７８】
2005520496.tif 000479
表 MF. パネル 1.1
【表４７９】
2005520496.tif 000480
【表４８０】
2005520496.tif 000481
表 MG. パネル 1.2
【表４８１】
2005520496.tif 000482
【表４８２】
2005520496.tif 000483
表 MH. パネル 1.3D
【表４８３】
2005520496.tif 000484
【表４８４】
2005520496.tif 000485
表 MI. パネル 2.2
【表４８５】
2005520496.tif 000486
【表４８６】
2005520496.tif 000487
表 MJ. パネル 4D
【表４８７】
2005520496.tif 000488
【表４８８】
2005520496.tif 000489
【表４８９】
2005520496.tif 000490
表 MK. パネル CNS_1
【表４９０】
2005520496.tif 000491
【表４９１】
2005520496.tif 000492
表 ML. 一般腫瘍学的スクリーニングパネル_v_2.4
【表４９２】
2005520496.tif 000493
【０７４７】
ＣＮＳ＿神経変性性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ３２３４／Ａｇ３２７９、同じプローブおよびプライマーのセットを用いる２つの実験によって、良好に一致する結果が得られる。両方の実験によって、アルツハイマー病の死後の脳とこの遺伝子についてのコントロールとの間の、この遺伝子の発現の相違が示される。ＡＤを有する患者の脳の側頭皮質において（ａｇ３２３４についてｐ＝０．０１６、およびａｇ３２７９についてｐ＝０．０２４）および海馬において、発現は増大される。側頭皮質と海馬の両方が、ＡＤにおいて重篤な神経変性を示す領域である。対照的に、アルツハイマー病において変性しない領域である、後頭皮質における発現は調節不全されることはない。まとめると、これらのデータによれば、この遺伝子によってコードされるカドヘリンタンパク質は、アルツハイマー病に対する病因または応答に関与し得るということが示唆される。従って、これは、この疾患の処置のための有用な薬物標的であり得る。
【０７４８】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４まとめ：Ａｇ３２７９、この遺伝子の最高発現は、小脳においてである（ＣＴ＝２５．９）。有意なレベルの発現がまた、扁桃、海馬、大脳皮質、黒質および視床を含む脳の他の領域でみられる。カドヘリンは、軸索誘導および細胞接着タンパク質として、特に発生の間、および傷害に対する応答において機能し得る（引用文献１）。このタンパク質のレベルの操作は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、脊髄小脳失調、進行性核上麻痺、ＡＬＳ、頭部外傷、脳卒中、または神経損傷に関連する任意の他の疾患／状態における神経死に対して代償性シナプス形成応答を誘導するのに有用であり得る。
【０７４９】
さらに、この遺伝子は、脳下垂体、副腎、甲状腺、膵臓、成体および胎児の骨格筋、心臓および肝臓において高度に発現され、細胞間接着においてカドヘリンの広範な役割に影響する。この観察によって、この遺伝子が正常な代謝機能および神経内分泌機能において役割を果たすこと、およびこの遺伝子の調節の損なわれた発現が、代謝性疾患（例えば、肥満および糖尿病）または神経内分泌障害に寄与し得ることが示唆され得る。
【０７５０】
全体として、遺伝子発現は、ガン細胞株ではなく正常な組織に関連している。関連のＥカドヘリンタンパク質の機能の損失は、内分泌腺およびその標的系の腫瘍を含む多くの癌腫の侵襲性の増大および予後の低下をともなって、多くの腫瘍において記載されている（引用文献２）。従って、この遺伝子産物は同様に、種々の腫瘍を処置するためのタンパク質治療剤として有用であり得る。なぜなら、この産物は正常な細胞で見出されているがガン細胞には失われているからである。
【０７５１】
引用文献：
１．Ｒａｎｓｃｈｔ  Ｂ．（２０００）Ｃａｄｈｅｒｉｎｓ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ａｘｏｎ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｓｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：６４３〜６５１．ＰＭＩＤ：１０９７８８４２。
２．Ｐｏｔｔｅｒ  Ｅ．，Ｂｅｒｇｗｉｔｚ  Ｃ．，Ｂｒａｂａｎｔ  Ｇ．（１９９９）Ｔｈｅ  ｃａｄｈｅｒｉｎ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２０：２０７〜２３９．ＰＭＩＤ：１０２０４１１８。
【０７５２】
パネル１．１まとめ：Ａｇ６１６、カドヘリン相同体（ホモログ）である、この遺伝子の最高発現は、膵臓でみられる（ＣＴ＝２３．２）。副腎、胎児および成体の骨格筋、肝臓および心臓でも有意な発現がみられる。代謝機能を有する組織のなかでの、この広範な発現は、一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．４でみられる発現と一致している。代謝障害におけるこの遺伝子の有用性のさらなる考察についてはそのパネルを参照のこと。
【０７５３】
さらに、胎児肝臓における発現に比べた場合（ＣＴ＝３４．８）、成体肝臓においてより高い発現が存在する（ＣＴ＝２７）。従ってこの遺伝子の発現を用いて、胎児肝臓と成体肝臓との間を識別することができる。
【０７５４】
全体として、このパネルにおける発現は、前のパネルにおける発現と一致している。この遺伝子の有用性のさらなる考察についてはそのパネルを参照のこと。
【０７５５】
パネル１．２まとめ：Ａｇ６１６、このパネルにおけるこの遺伝子の発現は、パネル１．１および１．４における発現と一致している。この遺伝子の有用性のさらなる考察についてはこれらのパネルを参照のこと。
【０７５６】
パネル１．３まとめ：Ａｇ３２３４、このパネルにおけるこの遺伝子の発現は、パネル１．４における発現と一致している。さらなる考察についてはパネル１．４を参照のこと。
【０７５７】
パネル２．２まとめ：Ａｇ３２３４、この遺伝子の発現は、新規な卵巣組織由来のサンプルにおいて最高であると考えられる（ＣＴ＝３２．２）。さらに、肝臓癌由来の他のサンプルにおいて実質的な発現が存在するようである。さらに、悪性肺組織に比べた場合、正常な肺組織に特異的な発現が存在するようである。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネルにおける他のサンプルから正常な卵巣組織を識別することができる。さらに、低分子薬物、タンパク質治療剤または抗体の使用を通じた、この遺伝子の治療用の調整は、肝臓癌、卵巣癌または肺癌の処置において有利であり得る。
パネル４Ｄまとめ：Ａｇ３２３４／Ａｇ３２７９、カドヘリン２３様分子であるこの遺伝子は、休止中のおよび活性化された樹状細胞において、ならびに休止中および活性化されたマクロファージにおいて、中度のレベルで（ＣＴｓ＝２８．１〜３０．１）選択的に発現される。従って、低分子アンタゴニストまたは治療用抗体であって、この遺伝子によってコードされたカドヘリン２３様分子の機能をブロックするものは、樹状細胞およびマクロファージが抗原提示および他の機能において重要な役割を果たす、例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、慢性閉塞性肺疾患、喘息、気腫、関節リウマチ、紅斑性狼瘡または乾癬が挙げられるがこれらに限定されない自己免疫疾患および炎症性疾患を有する患者における症状の軽減または排除において有用であり得る。
【０７５８】
パネルＣＮＳ＿１まとめ：Ａｇ３２７９、このパネルによって、脳におけるこの遺伝子の発現を確認する。中枢神経系におけるこの遺伝子の有用性の考察についてはパネル１．４を参照のこと。
【０７５９】
一般的腫瘍学スクリーニングパネル＿ｖ＿２．４まとめ：Ａｇ３２３４／Ａｇ３２７９、同じプローブ−プライマーセットを用いる２つの実験は、良好に一致する。この遺伝子の最高の発現は、転移性メラノーマサンプルにおいて検出される（ＣＴｓ＝２７〜２９）。この遺伝子の高い発現は、転移性黒色腫および前立腺腺癌において検出される。従って、この遺伝子の発現を診断マーカーとして用いて、前立腺癌および転移性黒色腫の存在を検出することができる。さらに、この遺伝子の中度〜低レベルの発現はまた、結腸癌、肺癌および腎臓由来の正常サンプルおよび癌サンプルにおいても検出される。従って、タンパク質治療剤、抗体または低分子の使用を通じた、この遺伝子またはそのタンパク質産物の治療的な調整は、代謝性黒色腫、前立腺癌、結腸癌、肺癌および腎臓癌の処置において有用であり得る。
【０７６０】
Ｎ．ＣＧ８９２８５−０３：α−１−抗キモトリプシン
表ＮＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ５２２３を用いて、遺伝子ＣＧ８９２８５−０３の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＮＢに示す。
【０７６１】
表 NA. プローブ名Ag5223
【表４９３】
2005520496.tif 000494
表 NB. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.5
【表４９４】
2005520496.tif 000495
【表４９５】
2005520496.tif 000496
【０７６２】
ＣＮＳ＿神経変性性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ５２２３、この遺伝子の発現はこのパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７６３】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５まとめ：Ａｇ５２２３、この遺伝子の発現は、肝臓癌細胞株に由来するサンプル（ＣＴ＝３４．５）および正常な膀胱に制限される。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネル上のこのサンプルと他のサンプルとの間を識別し、そしてマーカーとして用いて肝臓癌の存在を検出することができる。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、肝臓癌の処置において有効であり得る。
【０７６４】
パネル４．１Ｄまとめ：Ａｇ５２２３、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７６５】
Ｏ．ＣＧ８９２８５−０４：α−１−抗キモトリプシン
表ＯＡに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ５２３１を用いて、遺伝子ＣＧ８９２８５−０４の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＯＢに示す。
【０７６６】
表 OA. プローブ名Ag5231
【表４９６】
2005520496.tif 000497
表 OB. 一般的_スクリーニング_パネル_v1.5
【表４９７】
2005520496.tif 000498
【表４９８】
2005520496.tif 000499
【０７６７】
ＣＮＳ＿神経変性性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ５２３１、この遺伝子の発現はこのパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７６８】
一般的＿スクリーニング＿パネル＿ｖ１．５まとめ：Ａｇ５２３１、この遺伝子の発現は、肝臓癌細胞株および正常な膀胱に由来するサンプルに限定される（ＣＴ３４．２〜３４．６）。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネル上のこのサンプルと他のサンプルとの間を識別し、そしてマーカーとして用いて肝臓癌の存在を検出することができる。さらに、この遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、肝臓癌の処置において有効であり得る。
【０７６９】
パネル４．１Ｄまとめ：Ａｇ５２３１、この遺伝子の発現は、このパネルの全てのサンプルにおいて低いか／検出不能である（ＣＴｓ＞３５）。
【０７７０】
Ｐ．ＣＧ５７０９４−０１：ＰＰＡＲ−γ
表ＰＡおよびＰＢに記載されるプライマー−プローブセットＡｇ２０１２およびＡｇ３８３を用いて、遺伝子ＣＧ５７０９４−０１の発現を評価した。ＲＴＱ−ＰＣＲ試行の結果を表ＰＣ、ＰＤ、ＰＥ、ＰＦ、ＰＧ、ＰＨ、ＰＩ、ＰＪおよびＰＫに示す。
【０７７１】
表 PA. プローブ名Ag2012
【表４９９】
2005520496.tif 000500
表 PB. プローブ名Ag383
【表５００】
2005520496.tif 000501
表 PC. AI_包括的＿パネル_v1.0
【表５０１】
2005520496.tif 000502
【表５０２】
2005520496.tif 000503
【表５０３】
2005520496.tif 000504
表 PD. Ardais パネル 1.1
【表５０４】
2005520496.tif 000505
表 PE. CNS_神経変異性_v1.0
【表５０５】
2005520496.tif 000506
【表５０６】
2005520496.tif 000507
表 PF. パネル 1
【表５０７】
2005520496.tif 000508
【表５０８】
2005520496.tif 000509
【表５０９】
2005520496.tif 000510
表 PG. パネル 1.3D
【表５１０】
2005520496.tif 000511
【表５１１】
2005520496.tif 000512
【表５１２】
2005520496.tif 000513
【表５１３】
2005520496.tif 000514
表 PH. パネル 2D
【表５１４】
2005520496.tif 000515
【表５１５】
2005520496.tif 000516
【表５１６】
2005520496.tif 000517
【表５１７】
2005520496.tif 000518
【表５１８】
2005520496.tif 000519
表 PI. パネル 3D
【表５１９】
2005520496.tif 000520
【表５２０】
2005520496.tif 000521
【表５２１】
2005520496.tif 000522
【表５２２】
2005520496.tif 000523
表 PJ. パネル 4D
【表５２３】
2005520496.tif 000524
【表５２４】
2005520496.tif 000525
【表５２５】
2005520496.tif 000526
【表５２６】
2005520496.tif 000527
表 PK. パネル 5 島（Islet）
【表５２７】
2005520496.tif 000528
【表５２８】
2005520496.tif 000529
【０７７２】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ２０１２、この遺伝子は、このパネルにおいて広範な発現を示し、これは正常および真関節炎（ｏｒｔｈｏａｒｔｈｉｔｉｓ）／関節リウマチの骨および隣接する骨、軟骨、滑膜および滑液のサンプルに由来するサンプルにおいて、正常な肺、ＣＯＰＤ肺、気腫、アトピー性喘息（ａｔｏｐｉｃ  ａｓｔｈｅｍａ）、喘息、アレルギー、クローン病（正常な適合したコントロールおよび疾患）、潰瘍性大腸炎（正常な適合したコントロールおよび疾患）、および乾癬（正常な適合したコントロールおよび疾患）に由来するサンプルにおいて、中度〜低度の発現である。この遺伝子は、変形性関節症を有する患者由来の骨、軟骨および滑膜のサンプルにおいて、対応する正常なサンプルにおける発現に比べて、アップレギュレート（上方制御）されるようである。従って、この遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、変形性関節症の処置において有効であり得る。
【０７７３】
Ａｒｄａｉｓパネル１．１まとめ：Ａｇ２０１２、この遺伝子の最高の発現は、肺癌（３５８）サンプルにおいて検出される（ＣＴ＝２６．６）。この遺伝子は、正常な肺組織および癌の肺組織の両方において発現される。この遺伝子のより高い発現は、正常な肺に比較して、癌に関連している。従って、この遺伝子の発現を、肺癌のための診断マーカーとして用いることができる。また、抗体の使用によるこの遺伝子の治療的な調節は、肺癌の処置において有用であり得る。
【０７７４】
ＣＮＳ＿神経変性＿ｖ１．０まとめ：Ａｇ２０１２、この遺伝子は、このパネルおよびパネル１．３Ｄにおける発現によって証明されるように、脳に存在する。アルツハイマー病に対する明白な関連は見られていない。しかし、従ってこの遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、神経学的疾患の処置において有効であり得る。
【０７７５】
パネル１まとめ：Ａｇ３８３、この遺伝子の最高の発現は、胎盤において検出される（ＣＴ＝２１．７）。この遺伝子は、パネル１．３Ｄにみられる発現に関連する、このパネルにおける広範な発現を示す。さらなる考察についてはパネル１．３Ｄを参照のこと。
【０７７６】
パネル１．３Ｄまとめ：Ａｇ２０１２、同じプローブおよびプライマーセットを用いる２つの実験は良好に一致している。この遺伝子の最高の発現は、腎臓癌細胞株および脂肪組織においてみられる（ＣＴｓ＝２８．７〜２９）。有意な発現がまた、乳房、脳、結腸、肝臓、腎臓および黒色腫癌細胞株でみられる。従って、この遺伝子の発現は、このパネル上の肺癌細胞株と他のサンプルとの間を識別するために、そしてこれらの癌についてのマーカーとして用いることができる。この遺伝子は、血管形成性であることが公知である、アンギオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｅｉｔｉｎ）関連タンパク質４（ＡＲＰ４）に対して同一である［１］。血管形成は、固体腫瘍の増殖及び転移に必須であるので、タンパク質治療剤または抗体の使用による、この遺伝子によってコードされたＡＲＰタンパク質の発現または機能の治療的な調節は、黒色腫、脳、結腸、腎臓および肝臓癌の処置において有効であり得る。
【０７７７】
代謝機能を有する組織のなかでも、この遺伝子は、脂肪において最も高く発現され、そして脳下垂体、脂肪、副腎、膵臓、甲状腺、ならびに成体および胎児の骨格筋、心臓および肝臓において中度のレベルである。これらの組織のなかでもこの広範な発現によって、この遺伝子産物が、正常な神経内分泌および代謝においてある役割を果たし得ること、ならびにこの遺伝子の発現の調節不全が、肥満および糖尿病のような神経内分泌障害または代謝疾患に寄与し得ることが示唆される。ＡＲＰ４は、脂肪生物学の状況で広範に研究されている［２］。絶食誘導性脂肪因子（ｆａｓｔｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）として公知であるマウス遺伝子は脂肪組織において優勢に発現されて、白色脂肪組織および肝臓において絶食によって強力にアップレギュレート（上方制御）される［３］。このＮ末端およびＣ末端部分は、特徴的なコイルドコイルドメインおよびフィブリノーゲン様ドメイン（アンギオポイエチンにおいて保存されている）を含む。ヒトおよびマウスの組織において、それは肝臓において特異的に発現され、そしてそれらは主に肝細胞に存在する［４］。ＣＯＳ−７細胞において発現される組み換えタンパク質は、分泌されてグリコシル化される。さらに、アンギオポイエチン−２は、脂肪組織の退行に関わっている［５］。この分子は、脂肪において高度に発現されるアンギオポイエチン相同体（ホモログ）であるので、この分子はまた、脂肪におけるアポトーシスの開始においてある役割を果たし得る。従って、この遺伝子の発現または機能の治療的な調節は、肥満の処置において有効であり得る。
【０７７８】
さらに、この遺伝子の発現は、成体腎臓における発現（ＣＴｓ３５〜３７）に比べて、胎児腎臓（ＣＴｓ＝３０〜３１）において高い。従って、この遺伝子の発現を用いて、成体腎臓と胎児腎臓との間を識別することができる。
【０７７９】
さらに、胎児腎臓および腎臓細胞癌腫由来の細胞株におけるこの遺伝子の発現、ただし成体腎臓においてはない、この遺伝子の発現によって、これが腎臓の発達および器官形成、ならびに腎臓における腫瘍形成にも関与し得ることが示唆される。
【０７８０】
引用文献：
１．  Ｋｉｍ  Ｉ、Ｋｉｍ  ＨＧ、Ｋｉｍ  Ｈ、Ｋｉｍ  ＨＨ、Ｐａｒｋ  ＳＫ、Ｕｈｍ  ＣＳ、Ｌｅｅ  ＺＨ、Ｋｏｈ  ＧＹ．Ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ／ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００  Ｍａｒ  １５；３４６  Ｐｔ  ３：６０３〜１０．ＰＭＩＤ：１０６９８６８５．
２．Ｙｏｏｎ  ＪＣ、Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇ  ＴＷ、Ｒｏｓｅｎ  ＥＤ、Ｄｕｓｓａｕｌｔ  Ｂ、Ｑｉｎ  Ｙ、Ｓｏｕｋａｓ  Ａ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＪＭ、Ｈｏｌｍｅｓ  ＷＥ、Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＢＭ．Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；２０（１４）：５３４３〜９．ＰＭＩＤ：１０８６６６９０  
３．Ｋｅｒｓｔｅｎ  Ｓ、Ｍａｎｄａｒｄ  Ｓ、Ｔａｎ  ＮＳ、Ｅｓｃｈｅｒ  Ｐ、Ｍｅｔｚｇｅｒ  Ｄ、Ｃｈａｍｂｏｎ  Ｐ、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＦＪ、Ｄｅｓｖｅｒｇｎｅ  Ｂ、Ｗａｈｌｉ  Ｗ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆａｓｔｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｆａｃｔｏｒ  ＦＩＡＦ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２０００  Ｓｅｐ  １５；２７５（３７）：２８４８８〜９３．ＰＭＩＤ：１０８６２７７２．
４．Ｒｅｉｎｍｕｔｈ  Ｎ、Ｓｔｏｅｌｔｚｉｎｇ  Ｏ、Ｌｉｕ  Ｗ、Ａｈｍａｄ  ＳＡ、Ｊｕｎｇ  ＹＤ、Ｆａｎ  Ｆ、Ｐａｒｉｋｈ  Ａ、Ｅｌｌｉｓ  ＬＭ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  ２００１  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；７  捕遺  ３：Ｓ１０９１９．ＰＭＩＤ：１１７７９０８１．
５．Ｃｏｈｅｎ  Ｂ、Ｂａｒｋａｎ  Ｄ、Ｌｅｖｙ  Ｙ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  Ｉ、Ｆｒｉｄｍａｎ  Ｅ、Ｋｏｐｏｌｏｖｉｃ  Ｊ、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  Ｍ．Ｌｅｐｔｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ．ＰＭＩＤ：１１１５２４４９．
【０７８１】
パネル２Ｄまとめ：Ａｇ２０１２、２つの異なるプローブおよびプライマーセットを用いる２つの実験によって、良好に一致する結果が得られ、これは腎臓癌において最高の発現である（ＣＴｓ＝２２〜２４）。従って、この遺伝子の発現は、このパネル上のこのサンプルと他のサンプルとの間を識別するために、そして腎臓癌の存在を検出するためのマーカーとして用いることができる。さらに、タンパク質治療剤または抗体の使用による、この遺伝子によってコードされたＡＲＰの発現または機能の治療的な調節は、腎臓癌の処置において有効であり得る。
【０７８２】
パネル３Ｄまとめ：Ａｇ２０１２、２つの異なるプローブおよびプライマーセットを用いる２つの実験によって、良好に一致する結果が得られ、これは胃癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌および肺癌の細胞株において最高の発現である。従って、この遺伝子の発現を用いて、このパネル上のこれらのサンプルと他のサンプルとの間を識別することができる。
【０７８３】
パネル４Ｄまとめ：Ａｇ２０１２、２つの異なるプローブおよびプライマーセットを用いる２つの実験によって、良好に一致する結果が得られ、これはＴＮＦαおよびＩＬ−１βを用いて処置した末梢気道において最高の発現である（ＣＴｓ＝２４．４）。従って、この遺伝子の発現を、活性化された上皮のマーカーとして用いることができる。興味深いことに、この遺伝子の発現は、気道上皮細胞および肺線維芽細胞のサイトカインによる免疫刺激の際に、対応する休止中の細胞に比較して、アップレギュレート（上方制御）される。さらに、ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて処置されたＬＡＫ細胞におけるこの遺伝子の発現はまた、休止中の細胞における発現に対してアップレギュレート（上方制御）される。これらのデータによって、ＡＲＰが、肺系の上記の細胞に関連する炎症においてある役割を果たし、それによってタンパク質および抗体治療剤、ならびに低分子薬剤による治療介入のための標的としてみなされるということが示される。例えば、ＡＲＰに関連するヒト抗体全体は、アレルギー、喘息または気腫を有する患者の症状を軽減し得る。
【０７８４】
さらに、この遺伝子は、健康および疾患における免疫応答において、かなりの広範な細胞型において有意なレベルで発現される。これらの細胞としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮細胞、マクロファージ／単球および末梢血単核球細胞ファミリーのメンバー、ならびに肺および皮膚由来の上皮および線維芽細胞型、ならびに結腸、肺、胸腺および腎臓によって示される正常な組織が挙げられる。従って、機能的な治療剤を用いたこの遺伝子産物の調節は、これらの細胞型に関連する機能の変更をもたらし得、そして喘息、アレルギー、炎症性腸疾患、紅斑性狼瘡、乾癬、関節リウマチおよび変形性関節症のような自己免疫疾患および炎症性疾患に罹患している患者の症状の改善をもたらし得る。
【０７８５】
パネル５島まとめ：Ａｇ２０１２、この遺伝子の最高の発現は、中途まで分化した脂肪組織において検出される。この遺伝子は、このパネルにおいて広範な発現を示し、これは脂肪、胎盤、骨格筋、子宮、腎臓および小腸において中度の発現である。興味深いことに、この遺伝子のより高度の発現は、未分化の脂肪および分化した脂肪に比べて、中途まで分化した脂肪においてみられる。アンギオポイエチン関連タンパク質は、脂肪分化に関連することが示されている。従って、この遺伝子またはこの遺伝子によってコードされたＡＲＰの治療的な調節は、肥満および糖尿病の処置において有用であり得る。
【０７８６】
実施例Ｄ：ＮＯＶＸ核酸配列における一塩基多型の同定
変異体配列がまたこの出願に含まれる。変異体配列としては、一塩基多型（ＳＮＰ）を挙げることができる。ＳＮＰは、ある場合には、「ｃＳＮＰ」と呼ばれてもよく、これは、ＳＮＰを含有するヌクレオチド配列がｃＤＮＡに起源することを示す。ＳＮＰは、いくつかの方法で生じ得る。例えば、ＳＮＰは、多型性部位における別々の１ヌクレオチドの置換に起因し得る。このような置換は、転移またはトランスバージョン（塩基転換）のいずれであってもよい。ＳＮＰはまた、参照の対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じてもよい。この場合、多型性部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子において特定のヌクレオチドに関するギャップを保有する部位である。遺伝子内に存在するＳＮＰは、このＳＮＰの位置でこの遺伝子によってコードされるアミノ酸の変更を生じ得る。遺伝子内のＳＮＰｓはまた、ＳＮＰを含むコドンが、遺伝子コードの重複性の結果として同じアミノ酸をコードする場合、サイレントであってもよい。遺伝子の領域の外側に存在するＳＮＰ、または遺伝子内のイントロンに存在するＳＮＰは、タンパク質のいずれのアミノ酸配列においても変化を生じないが、発現パターンの調節の変更は生じ得る。実施例は、一時的発現、生理学的応答調節、細胞型発現調節、発現の強度および転写されたメッセンジャーの安定性における変化を含む。
【０７８７】
エキソン連結プロセスによって生成されたＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリを選択して以下の基準を用いて拡大した。ヒトゲノムデータベースを照会するために関連の配列を用いるＢＬＡＳＴＮ検索によって、最初の配列または拡大配列の全てまたは一部に対して９８％同一性である領域を有するゲノムクローンを同定した。さらなる解析のために得られたゲノムクローンを選択した。なぜならこの同一性によって、これらのクローンがこれらのＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリについてのゲノム遺伝子座を含むということが示されるからである。推定コード領域ならびに公知のＤＮＡおよびタンパク質配列に対する類似性について、これらの配列を解析した。これらの解析のために用いたプログラムとしては、Ｇｒａｉｌ、Ｇｅｎｓｃａｎ、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＥＲ、ＦＡＳＴＡ、Ｈｙｂｒｉｄおよび他の関連のプログラムが挙げられる。
【０７８８】
いくつかのさらなるゲノム領域がまた、同定されている。なぜなら選択されたＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリはそれらの領域にマッピングするからである。このようなＳｅｑＣａｌｌｉｎｇ配列は、ホモロジーまたはエキソン予測によって規定される領域と重複していてもよい。それらはまた、含まれてもよい。なぜなら、このフラグメントの位置は、もとの予測された配列に含まれていた、類似性またはエキソン予測によって同定されたゲノム領域の近傍であったからである。このように同定された配列を手動でアセンブルして、次いでＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓのヒトＳｅｑＣａｌｌｉｎｇデータベースからとった１つ以上のさらなる配列を用いて拡大してもよい。包含のために適切なＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントは、ＣｕｒａＴｏｏｌｓ（商標）プログラム  ＳｅｑＥｘｔｅｎｄによって、または解析されたゲノムクローンの適切な領域に対するＳｅｑＣａｌｌｉｎｇフラグメントマッピングを同定することによって、同定された。
【０７８９】
次いで、上記の手順によって規定された領域を手動で組み込み、そして例えば、もとのフラグメントにおける誤った塩基から、または予測されたエキソン連結とＥＳＴ位置と配列類似性の領域との間の矛盾から、生じ得る見かけの不一致について補正して、本明細書において開示される最終配列を誘導する。必要に応じて、ＳｅｑＣａｌｌｉｎｇアセンブリおよびゲノムクローンを同定および解析するためのプロセスを反復して、全長配列を誘導する（Ａｌｄｅｒｂｏｒｎら、Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｂｙ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１０（８）１２４９〜１２６５，２０００）。
変異体を個々に報告するが、変異体の全てまたは選択サブセットの任意の組み合わせはまた、本発明の意図するＮＯＶＸの実施形態として包含される。
【０７９０】
表D1：ヌクレオチド配列CG52113-01
【表５２９】
2005520496.tif 000530
表 D2: ヌクレオチド配列の変異体 CG103322-02 
【表５３０】
2005520496.tif 000531
表 D3: ヌクレオチド配列の変異体 CG151575-02
【表５３１】
2005520496.tif 000532
表 D4: ヌクレオチド配列の変異体 CG152323-01
【表５３２】
2005520496.tif 000533
表 D5: ヌクレオチド配列の変異体 CG153011-01
【表５３３】
2005520496.tif 000534
表 D6: ヌクレオチド配列の変異体 CG153042-01
【表５３４】
2005520496.tif 000535
表 D7: ヌクレオチド配列の変異体 CG153179-01
【表５３５】
2005520496.tif 000536
表 D8: ヌクレオチド配列の変異体 CG157760-02 
【表５３６】
2005520496.tif 000537
表 D9: ヌクレオチド配列の変異体 CG158114-01
【表５３７】
2005520496.tif 000538
表 D10: ヌクレオチド配列の変異体 CG158553-01
【表５３８】
2005520496.tif 000539
表 D11: ヌクレオチド配列の変異体 CG158983-01
【表５３９】
2005520496.tif 000540
表 D12: ヌクレオチド配列の変異体 CG159015-01
【表５４０】
2005520496.tif 000541
表 D13: ヌクレオチド配列の変異体 CG173007-01
【表５４１】
2005520496.tif 000542
表 D14: ヌクレオチド配列の変異体 CG173357-01
【表５４２】
2005520496.tif 000543
表 D15: ヌクレオチド配列の変異体 CG50387-03
【表５４３】
2005520496.tif 000544
表 D16: ヌクレオチド配列の変異体 CG103134-02
【表５４４】
2005520496.tif 000545
表 D17: ヌクレオチド配列の変異体 CG57542-01
【表５４５】
2005520496.tif 000546
表 D18: ヌクレオチド配列の変異体 CG57774-01
【表５４６】
2005520496.tif 000547
表 D19: ヌクレオチド配列の変異体 CG89285-03
【表５４７】
2005520496.tif 000548
表 D20: ヌクレオチド配列の変異体 CG5709401  
【表５４８】
2005520496.tif 000549
【０７９１】
実施例Ｅ：ＮＯＶ２６変異体の分子クローニング
ＮＯＶ２６ｂについては、残基２１〜４９３のＮＯＶ２６ａのドメイン（ＣＧ５１５２３〜０５）をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによる「インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）」クローニングのために標的した。ＰＣＲテンプレートは、以前に同定されたプラスミド（利用可能な場合）、またはヒトｃＤＮＡ（単数または複数）に基づいた。ＮＯＶｓ２６ｃ〜２６ｆについて、残基４３〜４９４のＣＧ５１５２３〜０５のＤＯＭＡＩＮをコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによる「インフレーム」クローニングのために標的した。ＰＣＲテンプレートは、ヒトｃＤＮＡ（単数または複数）に基づいた。ＮＯＶｓ  ２６ｇ〜ｒについて、残基１〜５２３のＣＧ５１５２３〜０５の全長をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによって「インフレーム」クローニングのために標的した。ＰＣＲテンプレートは、ヒトｃＤＮＡ（単数または複数）に基づいた。
【０７９２】
表 E1: 標的cＤＮＡ配列のクローン化に用いたオリゴヌクレオチドプライマー:
【表５４９】
2005520496.tif 000550
【０７９３】
下流のクローニング目的のために、フォワードプライマーは、インフレームのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含み、そしてリバースプライマーは、インフレームでＸｈｏＩ制限部位を含む。
【０７９４】
各々の反応について、テンプレートとして全部で０．５〜１．０ｎｇのヒトのプールされたｃＤＮＡを用いて、２つの平行なＰＣＲ反応を設定した。このプールは、各々以下のヒト組織ｃＤＮＡの５ｍｇからなる：副腎、全脳、扁桃、小脳、視床、骨髄、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、心臓、腎臓、肝臓、リンパ腫、バーキットのＲａｊｉ細胞株、乳腺、膵臓、脳下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、甲状腺、気管、子宮。
【０７９５】
発現の組織が公知でありかつ利用可能である場合、上記のプライマーおよび以下のヒト組織ｃＤＭＡの１つの０．５ｎｇ〜１．０ｎｇを用いて、第二のＰＣＲを実施した：骨格筋、精巣、乳腺、副腎、卵巣、結腸、正常小脳、正常脂肪、正常皮膚、骨髄、脳扁桃、脳海馬、脳黒質、脳視床、甲状腺、胎児肺、胎児肝臓、胎児脳、腎臓、心臓、脾臓、子宮、脳下垂体、リンパ節、唾液腺、小腸、前立腺、胎盤、脊髄、末梢血、気道、胃、膵臓、視床下部。
【０７９６】
この反応混合物は、２μｌの各々のプライマー（もとの濃度：５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）および１μｌの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、５０μｌの反応容積中に含んだ。以下の反応条件を用いた：
ＰＣＲ条件１：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  ３０秒変性
ｃ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｄ）７２℃  ６分伸長
工程ｂ〜ｄを１５回繰り返す
ｅ）９６℃  １５秒変性
ｆ）６０℃  ３０秒、プライマーアニーリング
ｇ）７２℃  ６分伸長
工程ｅ〜ｇを２９回繰り返す
ｅ）７２℃  １０分最終伸長
ＰＣＲ条件２：
ａ）９６℃  ３分
ｂ）９６℃  １５秒変性
ｃ）７６℃  ３０秒、プライマーアニーリング、１サイクルについて１℃ずつ温度を下げる
ｄ）７２℃  ４分伸長
工程ｂ〜ｄを３４回繰り返す
ｅ）７２℃  １０分間最終伸長
【０７９７】
増幅された産物を、アガロースゲル電気泳動によって検出した。製造業者の推奨に従って、フラグメントをゲル精製して、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。ＰＣＲ１反応あたり１２個のクローンを拾い上げて、配列決定した。ベクター特異的Ｍ１３フォワードプライマーおよびＭ１３リバースプライマー、ならびに表の遺伝子特異的プライマーを用いてこのインサート（挿入物）を配列決定した。
【０７９８】
表 E2:  遺伝子特異的プライマー
【表５５０】
2005520496.tif 000551
【表５５１】
2005520496.tif 000552
【０７９９】
実施例Ｆ１：アンギオポイエチン関連タンパク質（ＡＲＰ）およびＡＲＰを用いる方法
本発明は、驚くべきことに明細胞腎細胞癌腫組織対正常な隣接する腎臓組織において示差的に発現されることが見出された遺伝子であるＡＲＰに関する。さらに、本発明は、ＡＲＰが、驚くべきことにＴＮＦαおよびＩＬ−１βによって活性化された末梢気道上皮において、そして未処置の肺線維芽細胞に比べて、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびインターフェロンγによって刺激された肺線維芽細胞によって、示差的に発現されることを実証する。最終的に、ＡＲＰの発現の顕著な予期されないアップレギュレーション（上方制御）が、休止期の細胞に対して、イオノマイシンと組み合わせてホルボールエステル：ホルボール−１２、１３−ミリスチン酸酢酸（ＰＭＡ）で処置したリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞において観察された。
本発明は、明細胞腎細胞癌腫を明らかにするための臨床マーカーとしてＡＲＰを用いる方法を開示する。さらに、刺激されたＬＡＫ細胞によるＡＲＰの発現の増大は、ＬＡＫ細胞による枯渇に対する腫瘍細胞の感受性の低下において役割を果たし得る。ＡＲＰが喘息、アレルギーおよび気腫に関連し得るということ、ならびにタンパク質治療剤、ＡＲＰに対する抗体、または低分子アンタゴニストによるＡＲＰの調節は、これらの肺障害の症状を軽減し得るということを本発明者らが初めて、開示している。本発明はまた、ＡＲＰ発現を調節することによって処置可能な病理、詳細には明細胞腎細胞癌腫を処置する方法を開示する。
【０８００】
実施例Ｆ２：明細胞腎細胞癌腫対正常な隣接組織における示差的な遺伝子発現
その発現が明細胞腎臓細胞癌腫において調節される遺伝子の包括的プロフィールを得るために、Ｓｈｉｍｋｅｔｓら（１９９９）に詳細に、そして米国特許第５８７１６９７号に記載されるＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（商標）技術を用いて、外科的な腎臓摘出術の間に、同じ患者から得られた、明細胞腎細胞癌腫組織と正常な隣接組織との遺伝子発現プロフィールを識別した。この組織は、ＩＲＢ承認プロトコールのもとでＮＤＲＩからＣｕｒａＧｅｎに提供された。ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（商標）技術は、所定のサンプルの遺伝子発現プロフィールを作成して、次いでコントロールに対してこれらのプロフィールのペアワイズ比較の示唆的発現解析を作成するための定量的発現解析に依存する。この実施例における比較は、全ての腫瘍組織対、全ての正常な組織のプールである。増幅が検出されることを防ぐ、競合する未標識のプライマーを添加して、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（商標）プロトコールに従ってＰＣＲ反応を実施することによって、示差的な発現を示すポリヌクレオチドを確認した。
【０８０１】
アンギオポイエチン関連タンパク質（Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＲＰ）は、３／５の明細胞腎細胞癌腫、０／２の乳頭腎細胞癌腫、および０／２の特徴付けられていない腎細胞癌腫において過剰発現される（パネル２Ｄ）。さらにＡＲＰは、胎児腎臓および腎細胞癌腫由来細胞株において発現されるが、成体腎臓においては発現されず（パネル１．３Ｄ）、これは、腎臓発達および器官形成および腎臓腫瘍形成に関与する遺伝子にしばしば関連する癌胎児性発現パターンの指標である。
【０８０２】
パネル４Ｄからのデータによって、気道上皮細胞および肺線維芽細胞の免疫刺激の際、ＡＲＰが増大したレベルで発現されることが示される。詳細には、本発明者らは、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βを用いて処置した末梢気道上皮細胞のＡＲＰの発現が、未処理の細胞に比べて約５．４倍にアップレギュレート（上方制御）されることを示す。さらに、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびインターフェロンガンマで処置した正常なヒト肺線維芽細胞における発現は、休止中の細胞における発現に比べて、それぞれ７．４、２、３．５および６．５倍にアップレギュレートされている。結局、ＰＭＡ／イオノマイシンで処理されたＬＡＫ細胞におけるＡＲＰの発現は、休止中の細胞における発現に比べて３５０倍を上回ってアップレギュレートされている。これらのデータによって、ＡＲＰが肺系の上記細胞に関して炎症において役割を果たし、これによってタンパク質および抗体治療剤ならびに低分子薬物による治療的介入のための標的とみなされることが示される。ＡＲＰに対するヒト抗体全体は、例えば、アレルギー、喘息または気腫を有する患者の症状を軽減し得る。喘息および炎症に対する関連する気道上皮細胞についての参考文献（およびそこにおける参考文献）は、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊ．Ｗａｌｔｅｒら（２００１）による、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９３巻、３３９〜３５１頁である。肺線維芽細胞ならびに喘息およびアレルギーの考察についての別の参考文献は、以下の概説に見出すことができる：（抄訳が含まれる）：１：Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９  Ｄｅｃ；１０４（６）：１１３９〜４６  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ａｓｔｈｍａ．Ｈｏｌｇａｔｅ  ＳＴ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ．
【０８０３】
パネル４Ｄ−図４に示されるように刺激されたＬＡＫ細胞のアップレギュレート（３５０倍より大きい）は、顕著でかつ驚くべきであった。ＬＡＫ細胞のＰＭＡ活性化についての以下の参考文献は、本発明と関連する：
１．）Ｃｏｒｒｅａｌｅ  Ｐ、Ｐｒｏｃｏｐｉｏ  Ａ、Ｃｅｌｉｏ  Ｌ、Ｃａｒａｇｌｉａ  Ｍ、Ｇｅｎｕａ  Ｇ、Ｃｏｐｐｏｌａ  Ｖ、Ｐｅｐｅ  Ｓ、Ｎｏｒｍａｎｎｏ  Ｎ、Ｖｅｃｃｈｉｏ  Ｉ、Ｐａｌｍｉｅｒｉ  Ｇら．
Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｎａｔｕｒａｌ−ｋｉｌｌｅｒ−  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ−ｋｉｌｌｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．
Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．１９９２；３４（４）：２７２〜８．
ＰＭＩＤ：１３７１４２７
２．）Ｍａｌｅｃｉ  Ａ、Ａｌｔｅｒｍａｎ  ＲＬ、Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ  Ｄ、Ｋｏｒｎｂｌｉｔｈ  ＰＬ，  Ｍｏｓｋａｌ  ＪＲ．
Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．
Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１９９０  Ｊｕｌ；７３（１）：９１〜７．
ＰＭＩＤ：２３５２０２７
３．）Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ、Ｂｕｒａｋｏｆｆ  ＳＪ、Ｈｅｒｒｍａｎｎ  ＳＨ．
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒ．
Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９  Ｍａｒ  １５；１４２（６）：２１５５〜６１．
ＰＭＩＤ：２６４６３７７。
【０８０４】
３）において考察された研究によって、ＰＭＡが（ＬＡＫ細胞におけるプロテインキナーゼＣ活性の不活性化による）ＬＡＫ細胞媒介細胞傷害性のダウンレギュレーション（下方制御）を誘導することが示される。ＡＲＰの正確な役割は、ＬＡＫ細胞においてはまだ公知ではないが、本発明において提示されたＴａｑＭａｎデータに基いて、ＡＲＰは、炎症において役割を果たし、そしてＬＡＫ細胞が腫瘍細胞を効果的に破壊する能力にも同様に関与し得る。従ってＡＲＰに対する治療用抗体（これによってＡＲＰがアップレギュレートされることを防ぐ）は、ＬＡＫ細胞の活性の増大が得られるので、癌の治療において治療的であり得る。
【０８０５】
実施例Ｆ３．ＡＲＰの発現と血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）発現との比較
Ｐａｒａｄｉｓおよび共同研究者は、通常の組織の予後因子および生存に関連付けて、大規模な一連の腎腫瘍の長期の追跡において、ＶＥＧＦ発現を評価した。彼らの研究によって、明細胞ＲＣＣの群において、ＶＥＧＦ発現が核異型度（Ｐ＝０．０５）および腫瘍のサイズ（Ｐ＝０．０５）の両方に正に相関することが明らかになった。さらに、ＶＥＧＦ発現と微小血管カウントとの間には有意な相関が観察された（Ｐ＝０．０４）。結局、累積生存率は、ＶＥＧＦを発現している明細胞ＲＣＣを有する患者の群では有意に低かった（ログランク検定、Ｐ＝０．０１）。Ｃｏｘモデルにおいて、ＶＥＧＦ発現は、結果ならびに段階および核異型度の有意に独立した予測因子であった（Ｐａｒａｄｉｓ  Ｖ、Ｌａｇｈａ  ＮＢ、Ｚｅｉｍｏｕｒａ  Ｌ、Ｂｌａｎｃｈｅｔ  Ｐ、Ｅｓｃｈｗｅｇｅ  Ｐ、Ｂａ  Ｎ、Ｂｅｎｏｉｔ  Ｇ、Ｊａｒｄｉｎ  Ａ、Ｂｅｄｏｓｓａ  Ｐ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ２０００  Ａｐｒ；４３６（４）：３５１−６）。ＶＥＧＦの発現プロフィールを、ＡＲＰの発現プロフィールと比較した。図３に示されるとおり、ＡＲＰ過剰発現は、ＶＥＧＦよりも高くかつより特異的であり、これによって、ＡＲＰをさらに良好な臨床マーカーとして用いることができること、そしてさらに有効でかつ特異的な治療剤が、ＡＲＰ発現を調節するのに関連し得ることが示される。これらの結果によってまた、ＶＥＧＦおよびＡＲＰの発現を同時に調節する処置が相乗効果を達成し得ることが示される。ＶＥＧＦおよびＡＲＰの両方の発現の効果を緩和し得る処置の例は、これらの標的の両方に対する二重特異性抗体である。本発明の特許請求の範囲内にあることが意図される二重特異性抗体は、クアドローマ技術によって、または単一特異性抗体（１つがＶＥＧＦに対して、もう一方がＡＲＰに対して）の化学的架橋、もしくは二重特異性単鎖抗体ダイマー（二量体）によって生成される抗体であってもよい。単鎖抗体の式としては、以下を挙げることができるがこれらに限定されない：ＶＬ（ａ）−リンカー−ＶＨ（ａ）−リンカー−ＶＬ（ｂ）−リンカー−ＶＨ（ｂ）。二重特異性抗体の例については、以下を参照のこと：Ｏｔｔｅｒｎｅｓｓらの米国特許第６，０３０，７９２号、その引用文献が本明細書において包含される、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、米国特許第５，８９２，０２０号、Ｍｅｚｅｓらの同第５，８７７，２９１号、Ｍｅｚｅｓらによる、米国特許第６，０７１，５１５号：Ｄｉｍｅｒ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、ならびに米国特許第６，１２１，４２４号：Ｗｈｉｔｌｏｗらによる、Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．
【０８０６】
ヒトＰＰＡＲγアンギポイエチン関連タンパク質（Ｈｕｍａｎ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
ヒトＰＰＡＲγアンギポイエチン関連タンパク質はまた、アンギポイエチン関連タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＦ１５３６０６）、ヒト肝臓アンギポイエチン関連タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＦ１６９３１２）、またはアンギポイエチン様タンパク質ＰＰ１１５８（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＦ２０２６３６）として公知である。組み換えＨＦＡＲＰは、血管内皮細胞のためのアポトーシス生存因子として働くが、Ｔｉｅ１にもＴｉｅ２にも（内皮細胞チロシンキナーゼレセプター）結合しない。これらの結果によって、ＨＦＡＲＰは、内分泌作用を通じて内皮細胞に対して防御機能を発揮し得ることが示唆される。
【０８０７】
（Ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ／ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｋｉｍ  Ｉ、Ｋｉｍ  ＨＧ、Ｋｉｍ  Ｈ、Ｋｉｍ  ＨＨ、Ｐａｒｋ  ＳＫ、Ｕｈｍ  ＣＳ、Ｌｅｅ  ＺＨ、Ｋｏｈ  ＧＹ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００  Ｍａｒ  １５；３４６  Ｐｔ３：６０３〜１０．）。
【０８０８】
ＰＧＡＲの転写的誘導は、最初期遺伝子に典型的な急速な時間経過に従い、そしてタンパク質合成の非存在下で生じる。ＰＧＡＲの発現は主に脂肪組織および胎盤に局在し、肥満の遺伝子モデルにおいて一貫して上昇される。ホルモン依存性脂肪細胞分化は、ＰＧＡＲ転写物の劇的な早期誘導と同時に生じる。栄養分およびレプチンの投与の変更によってインビボにおいてＰＧＡＲ発現が調節されることが見出される。まとめると、これらのデータによって、全身の脂質代謝またはグルコース恒常性の調節におけるＰＧＡＲの潜在的な役割が示唆される。（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｙｏｏｎ  ＪＣ、Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇ  ＴＷ、Ｒｏｓｅｎ  ＥＤ、Ｄｕｓｓａｕｌｔ  Ｂ、Ｑｉｎ  Ｙ、Ｓｏｕｋａｓ  Ａ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＪＭ、Ｈｏｌｍｅｓ  ＷＥ、Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＢＭ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；２０（１４）：５３４３〜９）。マウスオーソログ遺伝子は、絶食誘導性脂肪因子（ｆａｓｔｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｆａｃｔｏｒ）（ＦＩＡＦ）が、白色脂肪組織および肝臓における絶食によって強力にアップレギュレートされるとして公知である。さらにＦＩＡＦ  ｍＲＮＡは、ＰＰＡＲγ＋／−マウスの白色脂肪において減少されている。ＦＩＡＦタンパク質は、種々の組織および血漿において検出され得、このことはＦＩＡＦが、内分泌機能を有することを示唆する。その血漿量は、絶食によって増大されて、慢性の高脂肪食餌によって低下する。
【０８０９】
【表５５２】
2005520496.tif 000553
【表５５３】
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【表５５４】
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【表５５５】
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【０８１０】
実施例Ｆ５：Ｊｏｂ  ３６３２０からのＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ結果−全ての腎臓癌対全ての腎臓ＮＡＴ  
【０８１１】
【表５５６】
2005520496.tif 000557
【０８１２】
正常な隣接する腎臓組織に対して腎臓癌を比較するＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ  ｊｏｂ３６３２０の結果。ポリヌクレオチド（例えば、Ｂａｎｄ  ＩＤ  ｇ０ｃ０−１３１．２について）は、示差的に発現されると同定され、そして増幅が検出されることを妨げる、競合する未標識のプライマーを添加して、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇ（商標）のプロトコールに従って、ＰＣＲ反応を実施することによって確認された。そして上記のチャートでは、これを「Ｐａｓｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ」として表記している。
【０８１３】
【表５５７】
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【表５５８】
2005520496.tif 000559
【０８１４】
実施例Ｆ７：パネル２ｄにおけるＡＲＰ  ＴａｑＭａｎ発現とＱＥＡ電気泳動プロフィールとの比較
【０８１５】
【表５５９】
2005520496.tif 000560
【０８１６】
実施例Ｆ８：ＶＥＧＦおよびＡＲＰの比較
ＶＥＧＦ（Ａ）およびＡＲＰ（Ｂ）についてのＱＥＡ電気泳動プロフィール、ならびにＶＥＧＦ（Ｃ）およびＡＲＰ（Ｄ）についてＲＴＱ−ＰＣＲ発現プロフィール。ＣＧ５７０９４の示差的な発現プロフィールは、ＧｅｎｅＣａｌｌｉｎｇおよびＲＴ−ＰＣＲによって実証されるようにＶＥＧＦよりも良い。
【０８１７】
【表５６０】
2005520496.tif 000561
【０８１８】
実施例Ｆ９：ＨＡＳＳパネルｖ１．０における、血清飢餓、アシドーシスおよび無酸素状態に曝された腫瘍細胞における、ならびに脳腫瘍異種移植片ＲＴＱ−ＰＣＲにおける遺伝子発現
腫瘍内の微小血管は、正常な組織における微小血管とは有意に異なる。腫瘍内の多くの領域は、バランスのとれていない血液供給および重大な灌流の異質性に起因して一過性にまたは慢性的に低酸素状態である。これが酸を過剰生産するように腫瘍細胞の性質を悪化させ、これによって極めて酸性のｐＨ値が生じる。低酸素、栄養性限界および腫瘍の酸性度は、抗腫瘍治療に対して重要な合意を有しており、そしてさらに活発な転移性の表現型への腫瘍の進行に寄与し得る。あるセットの腫瘍細胞株を血清飢餓、アシドーシスおよび低酸素状態へ、種々の時間さらすことによって、本発明者らは、腫瘍の微小血管をモデリングしている。
【０８１９】
ＨＡＳＳパネルｖ１．０プレートは、９３個のｃＤＮＡサンプルおよび２つのコントロールから構成される。詳細には、これらのサンプルのうち８１個は、血清枯渇、アシドーシスおよび低酸素状態に対して種々の時間供された、培養されたヒト癌細胞株に由来し、そしてこれらの処置のためのコントロール、ヒト初代細胞の３サンプル、悪性脳腫瘍の９サンプル（４つが髄芽腫および５つがグリア芽細胞腫）および２つのコントロールである。ヒト癌細胞株は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られ、そして以下の組織群におさまる：乳癌、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌およびＣＮＳ癌細胞株。これらの癌細胞は全て、標準的な推奨される条件下で培養される。用いた処置（血清飢餓、アシドーシスおよび低酸素状態）は、科学文献において以前に公表されている。初代ヒト細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手して、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓによって推奨される培地および条件で増殖させた。悪性脳腫瘍サンプルは、共同研究（Ｈｅｎｒｙ  Ｆｏｒｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）の一部として入手して、ＣｕｒａＧｅｎがサンプルを受け取る前に病理学者が検査する。標準的手順を用いてこれらのサンプルからＲＮＡを調製した。ゲノムおよび化学のコントロールウェルは以前に記載されている。
【０８２０】
結果：
ＣＧ５７０９４は、低酸素およびアシドーシスに曝されたＵ８７細胞において最高レベルで発現される（ＣＴ＝２２．７）。この遺伝子の発現は、低い酸素濃度に曝されたＭＣＦ−７（乳癌細胞株）、Ｔ２４（膀胱癌細胞株）、ＣａＰａＮ（膵臓癌細胞株）、Ｕ８７（ＣＮＳ癌）、およびＬｎＣＡＰ（前立腺癌）細胞において誘導される。これによって、この遺伝子の発現は腫瘍の低酸素圧の領域で誘導され得ることが示される。この遺伝子はまた、髄芽腫に比べて神経膠腫において高レベルで発現され、そして異なる種類の脳腫瘍を識別するためのマーカーとして用いることができる。従って、低分子薬物または抗体の使用を通じたこの遺伝子活性の治療的な阻害は、上記に列挙された癌のタイプの処置において有用であり得る。
【０８２１】
【表５６１】
2005520496.tif 000562
表 F9:
【表５６２】
2005520496.tif 000563
【表５６３】
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【表５６４】
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【表５６５】
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【０８２２】
実施例１０：炎症に関連するヒトの疾患および正常な組織における発現および治療妥当性
ＣＧ５７０９４は、血管内皮細胞のためのアポトーシス生存因子として働く［Ｋｉｍ  Ｉ、Ｋｉｍ  ＨＧ、Ｋｉｍ  Ｈ、Ｋｉｍ  ＨＨ、Ｐａｒｋ  ＳＫ、Ｕｈｍ  ＣＳ、Ｌｅｅ  ＺＨ、Ｋｏｈ  ＧＹ．Ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ／ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０００  Ｍａｒ  １５；３４６  Ｐｔ  ３：６０３−１０］。興味深いことに、炎症促進性サイトカインで活性化された上皮細胞および線維芽細胞、ならびにＬＡＫ細胞は、高レベルのＣＧ５７０９４  ｍＲＮＡを発現した。上記の結果によって、ＣＧ５７０９４は、炎症の重要な調節因子であることが示唆される。本発明者らは、ＲＴＱ  ＰＣＲを用いて、ＡＩ包括的パネル上で示された炎症性組織においてＣＧ５７０９４  ｍＲＮＡの発現を試験した。
【０８２３】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０の説明
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０のプレートは、２つのコントロールウェルおよび８９個の試験サンプルであって、Ｂａｃｋｕｓ  ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＣｌｉｎｏｍｉｃｓ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から入手した外科的および死後のヒト組織から単離されたｃＤＮＡから構成されるサンプルを含む。ＣｕｒａＧｅｎの施設においてＢａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ由来の組織サンプルから総ＲＮＡを抽出した。他の組織由来の総ＲＮＡは、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。
【０８２４】
Ｂａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌで人工膝関節または人工股関節の置換手術を受けている患者から、滑液、滑膜、骨および軟骨を含む結合組織を入手した。組織サンプルを液体窒素中で直ちに急速凍結して、単離されたＲＮＡが最適の質であって分解されていないことを確実にした。変形性関節症および関節リウマチの結合組織のさらなるサンプルを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。正常なコントロール組織はＣｌｉｎｏｍｉｃｓによって供給され、そして外傷の犠牲者の生検の間に得られた。
【０８２５】
乾癬組織および隣接する適合した組織の外科的標本は、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓによって総ＲＮＡとして提供された。２例の男性患者および２例の女性患者を２５歳〜４７歳の間で選択した。サンプルを単離した時点では、どの患者も処方薬物は服用していなかった。
【０８２６】
潰瘍性大腸炎およびクローン病を有する患者由来の疾患の結腸および隣接する適合した組織の外科的標本は、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから入手した。４１〜６９歳の間の３例の女性および３例の男性のクローン患者由来の腸組織を用いた。２例の患者は、医薬を処方されていなかったが、他の患者はデキサメタゾン、ペントバルビタールまたはタイレノールを服用していた。潰瘍性大腸炎組織は、３例の男性患者および４例の女性患者由来であった。患者のうち４例はレブビド（ｌｅｂｖｉｄ）を、２例はフェノバルビタールを服用していた。
【０８２７】
疾患も気腫も、喘息もＣＯＰＤも有さない外傷の犠牲者由来の死後の肺組織からの総ＲＮＡを、Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓから購入した。気腫患者は、４０〜７０歳の年齢に及び、そして全てが喫煙者であった。この年齢範囲は、タバコに関連した気腫を有する患者に集中しかつα１抗トリプシン欠乏症を有する患者を避けるように選択した。喘息患者は、３６歳〜７５歳に及んだが、それらの患者がＣＯＰＤも有し得ることを防ぐために喫煙者を排除した。ＣＯＰＤ患者は、３５〜８０歳に及び、そして喫煙者および非喫煙者の両方を含んだ。ほとんどの患者はコルチコステロイドおよび気管支拡張薬を服用していた。
【０８２８】
ＡＩ＿包括的パネル＿ｖ１．０における組織を同定するために使用される表示では、以下の略号を用いる：
ＡＩ＝自己免疫（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）
Ｓｙｎ＝滑膜の（Ｓｙｎｏｖｉａｌ）
Ｎｏｒｍａｌ＝明白な疾患なし（Ｎｏ  ａｐｐａｒｅｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）
Ｒｅｐ２２／Ｒｅｐ２０＝個々の患者
ＲＡ＝関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）
Ｂａｃｋｕｓ＝Ｂａｃｋｕｓ病院由来（Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｕｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）
ＯＡ＝変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）
（ＳＳ）（ＢＡ）（ＭＦ）＝個々の患者
Ａｄｊ＝隣接組織
適合コントロール（Ｍａｔｃｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ）＝隣接組織（ａｄｊａｃｅｎｔｉｓｓｕｅ）
−Ｍ＝男性（雄性）
−Ｆ＝女性（雌性）
ＣＯＰＤ＝慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）
【０８２９】
結果
ＣＧ５７０９４、アンギオポエイチン関連タンパク質、ｍＲＮＡは、変形性関節炎患者組織型において明らかに過剰発現される（ＣＴ＝２６〜２９）。さらにＡＲＰは、関節リウマチ、乾癬、潰瘍性大腸炎、喘息、気腫およびクローン病の組織において中度のレベルで発現される。これによって、この遺伝子が、可能性としてキラーＴ細胞のような生存の潜在的に有害な細胞成分を促進することによって炎症の調節に関与することが示される。従って、低分子薬物または抗体の使用を通じたこの遺伝子産物の治療的な阻害は、上記で列挙された炎症性疾患の処置において有用であり得る。
【０８３０】
【表５６６】
2005520496.tif 000567
【０８３１】
実施例１１：腫瘍由来および等価な正常組織由来のヒト組織におけるＣｕｒａＣｈｉｐを用いる遺伝子発現解析
ＣｕｒａＧｅｎは、標的同定のための遺伝子マイクロアレイ（ＣｕｒａＣｈｉｐ１．２）を開発した。これは、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  Ｔｒａｃｔａｂｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ（ＰＴＧ）に相当するＣｕｒａＧｅｎのｃＤＮＡ配列のコレクションの全体的なｍＲＮＡ発現解析のハイスループット手段を提供する。この配列セットは、タンパク質治療剤へ開発され得るかまたは、抗体もしくは低分子治療剤を開発するのに用いられ得る遺伝子を含む。ＣｕｒａＣｈｉｐ１．２は、約８，５００の遺伝子座に相当する約１１，０００のオリゴを含み、この遺伝子座としては（限定はしないが）キナーゼ、イオンチャネル、Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）、核ホルモンレセプター、プロテアーゼ、トランスポーター、代謝酵素、ホルモン、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、補体および凝固因子、ならびに細胞表面レセプターが挙げられる。
【０８３２】
ＣｕｒａＣｈｉｐ  ｃＤＮＡを、ガラスマイクロチップ上で３０マーのオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）として示した。より長いＣｕｒａＣｈｉｐオリゴを用いるハイブリダイゼーション方法は、２５マーのオリゴを用いる方法に比べてより特異的である。ＣｕｒａＣｈｉｐオリゴをリンカーを用いて合成し、精製して短縮されたオリゴ（ハイブリダイゼーション強度および特異性に影響し得る）を除き、そしてガラススライド上にスポットした。オリゴｄＴプライマーを用いて、目的のサンプルからハイブリダイゼーションのためのｃＲＮＡプローブを生成した。ビオチン−アビジン結合体系を用いて、蛍光標識された二次抗体とハイブリダイズしたプローブを検出した。Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（登録商標）（Ｓｐｏｔｉｆｉｒｅ，Ｉｎｃ．，２１２  Ｅｌｍ  Ｓｔｒｅｅｔ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ  ０２１４４）のようなクラスタリングおよびコレクションのバイオインフォマティクスツール、ならびに多変量解析（ＭＶＡ）のような統計学的ツールを用いて遺伝子発現を解析した。
【０８３３】
（ＣｕｒａＣｈｉｐソフトウェアにおいて用いられた正規化方法）
各々のスポットの中央蛍光強度および各々のスポットのバックグラウンドを、０〜６５，０００のスケールで読み取る。ＣｕｒａＧｅｎの、社内で開発した、ＣｕｒａＣｈｉｐソフトウェアは、生データ（中央強度）または正規化データのいずれかを使用者に提示することができる。正規化されたデータを選択する場合、ＣｕｒａＣｈｉｐソフトウェアは、正規化を行なうためには以下の方法を用いる。正規化は、各々のスライド／実験に基づく。本発明者らの仮定は以下である：
・ｆｇ＿中央値（ｆｇ＿ｍｅｄｉａｎ）は、各々のスライド／実験についてのシグナル／フォアグラウンド中央値である；
・ｂｇ＿中央値は、各々のスライド／実験についてのバックグラウンド中央値である；
・オリジナル＿値（ｏｒｉｇｉｎａｌ＿ｖａｌｕｅ）は、ｆｇ＿中央値とｂｇ＿中央値との間の相違である；
・ｆｌａｇは、スポットの成功または失敗の指標であり、ここで０は、成功を意味し、１は失敗を意味する；
・ロウ＿ｆｇ＿平均値（ｒａｗ＿ｆｇ＿ｍｅａｎ）は、各々のスライド／実験についての未加工（生）のフォアグラウンド平均である；
・ロウ＿ｂｇ＿平均値（ｒａｗ＿ｂｇ＿ｍｅａｎ）は、各々のスライド／実験についての未加工のフォアグラウンド平均である；
・トリム＿パーセンテージ（ｔｒｉｍ＿ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）は、各々のスライド／実験についてのトリムパーセンテージである；これは、使用者によって規定することができる；現在、本発明者らは、各々のスライド／実験についてのトリムパーセンテージとして２％を用いている；
・ｎＳｐｏｔｓは、各々のスライドにおけるスポットの数である；
・ｎＳｌｉｄｅｓは、各々の実験におけるスライドの数である；
・ｆｇ＿平均値（ｆｇ＿ｍｅａｎ）は、各々のスライド／実験についてのトリムされたフォアグラウンド平均値である；
・ｂｇ＿平均値は、各々のスライド／実験についてのトリムされたバックグラウンド平均値である；
・ｍａｘ＿ｆｇ＿平均値（ｍａｘ＿ｆｇ＿ｍｅａｎ）は、全てのスライド／実験の間の定数、現在２２００．０である；
・正規化された値（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ＿ｖａｌｕｅ）は、最終の正規化された値である；
・ｃｏｅｆｆは、正規化係数である；
・ＭＡＸ＿ＶＡＬＵＥは、最高の可能な蛍光読み取りに相当する定数、現在６５，０００である。
【０８３４】
ステップ１．トリムされたフォアグラウンドおよびバックグラウンドの平均を算出する
各々のスライド／実験について、本発明者らは最初に、全てのスポットのトリムされたフォアグラウンド平均およびトリムされたバックグラウンド平均を算出して、各々のスライドにおいて、ｎＳｐｏｔｓを推測する。各々のスポットについて、データが受容可能である場合（ｆｌａｇ＝０）、本発明者らは、各々のスポットについてのフォアグラウンド平均からバックグラウンド平均を差し引きすることによって、未加工（生）のフォアグラウンド平均およびバックグラウンド平均を算出する。これは、スポットの「オリジナル値（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｖａｌｕｅ）」として指定される（注記：ｆｌａｇ＝１の場合、全ての値は０に設定される）。
【０８３５】
【表５６７】
2005520496.tif 000568
【０８３６】
その後、本発明者らは、このデータセットから頂部および低部の２％のデータを取り除く（トリムする）。上記の算出後、本発明者らは、各々のスライド／実験のフォアグラウンド平均およびバックグラウンド平均のｎＳｐｏｔ数を有する。そして両方のリストをソートする。本発明者らは、以下のソートされたリストを仮定する：
【０８３７】
2005520496.tif 000569
【０８３８】
その後、本発明者らは、各々のスライド／実験についてトリムされたデータポイントを算出する。ａはトリムされたスタートデータポイントであり、ｂはトリムされたデータポイントであると、本発明者らは、仮定する：
【０８３９】
2005520496.tif 000570
【０８４０】
「バックグラウンド平均（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｍｅａｎ）」を、トリムされたデータセットについてバックグラウンド中央値から算出する。バックグラウンド平均について、本発明者らは、間隔［ａ，ｂ］において平均のバックグラウンド平均を単に算出し、次いでｂｇ＿平均（ｂｇ＿ｍｅａｎ）に指定する。
【０８４１】
2005520496.tif 000571
【０８４２】
「フォアグラウンド平均（ｆｏｒｅｇｒｏｕｎｄ  ｍｅａｎ）」を、「オリジナル値（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｖａｌｕｅｓ）」（すなわち、バックグラウンド−差引きしたスポットシグナル中央値）から算出する；５００より大きい「オリジナル値」のみを、この計算に用いる（このデータのトリムされた上部および下部の２％を排除する）。これらのフォアグラウンド平均の合計を、ｓｕｍ＿ｒａｗ＿ｆｇ＿ｍｅａｎであり、それらのフォアグラウンド平均の量はｋであると仮定する。
【０８４３】
2005520496.tif 000572
【０８４４】
明確化のために、Ｊａｖａにおけるｓｎｉｐｐｅｔコードは、以下のように見える。
【０８４５】
【表５６８】
2005520496.tif 000573
【０８４６】
全てのスライドについてのトリムされたフォアグラウンド平均およびバックグラウンド平均の算出が終了した後、本発明者らは、本発明者らの正規化手順を開始す
る。
【０８４７】
ステップ２．正規化データ
各々のスライドについて正規化係数を算出して、これによってスライドのフォアグラウンド平均と固定された最大フォアグラウンド平均（２２００）を比較する。この係数は以下である：
ｃｏｅｆｆ＝ｍａｘ＿ｆｇ＿ｍｅａｎ／ｆｇ＿ｍｅａｎ；
【０８４８】
次いで、スポットの「オリジナル値」と正規化係数とを掛けることによって、各々のスポットについての正規化値を算出する。この値が６５，０００の最大範囲よりも大きい場合、６５，０００の値を正規化された値として用いることに注意のこと。また、スポットの「オリジナル値」がバックグラウンド値よりも小さい場合、このバックグラウンド値を用いることに注意のこと。
【０８４９】
【表５６９】
2005520496.tif 000574
【０８５０】
各々のスポットについての正規化＿値（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ＿ｖａｌｕｅ）は、この解析で用いられる最終（正規化）値である。
【０８５１】
実施例Ｆ１２：ＣｕｒａＣｈｉｐデータ解析の閾値
多数のコントロールスポットが、有効性算出のため、および別の正規化方法を提供するためにＣｕｒａＣｈｉｐ１．２上に存在する。例えば、ＣｕｒａＣｈｉｐ１．２は、多数の空のまたは陰性のコントロールスポット、ならびに陽性のコントロールスポットであって、高度に発現された遺伝子Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤ）を検出するオリゴの一連の希釈を含むコントロールスポットを含む。全てのオリゴを用いる６７ハイブリダイゼーション由来の生データを用いて、スポットシグナルレベルの解析を実施した。６７のハイブリダイゼーションにまたがる各々のオリゴについての最大シグナル強度を決定して、この最大シグナルについてのバックグラウンドを上回る倍数を算出した（すなわち、バックグラウンド読み取りが２０であり、そして生のスポット強度が１００であれば、そのスポットについてのバックグラウンドを上回る倍数は５×である）。陰性コントロールまたは空のスポットは、時折、「ファイア（ｆｉｒｅ）」するか、またはバックグラウンドレベルを上回るシグナルを与える；しかしそれらは、極めて強力にファイアすることはなく、空のスポットファイアリングの７７．１％がバックグラウンドを＜３×上回り、９１．７％が＜５×である（以下の図における赤紫色のバーを参照のこと）。陽性コントロールスポット（ユビキチンおよびＧＡＰＤ、それぞれ淡青色および濃青色のバー）は常に、バックグラウンドより＞１００×でファイアした。実験的なオリゴ（ＣｕｒａＯｌｉｇｏ、以下の黄色）は、強度の全体的範囲にわたってファイアしたが、そのいくつかはバックグラウンド強度を超える倍数が低かった。陰性コントロールスポットは時折低レベルでファイアするので、本発明者らは、バックグラウンドの＞５×でデータ解析のための示唆された閾値を設定した。
【０８５２】
表 F12a: CuraChip 正規化データ
【表５７０】
2005520496.tif 000575
【０８５３】
ＰＴＧチップ１．２の結果：外科的に切開した腫瘍から得た組織、対応する器官由来の非疾患組織、およびヌードｎｕ／ｎｕマウスにおいて増殖された腫瘍異種移植片由来の１７８個のＲＮＡのサンプルを用いて、プローブを生成してＰＴＧ  Ｃｈｉｐ  １．２上で試行した。ＰＴＧ  Ｃｈｉｐ  １．２上のＣＧ５７０９４に相当するオリゴ（ｏｐｔｇ２＿００１０１８８）を、その発現プロフィールについて精査した。統計的解析によって、対応する正常な肺組織に比べて肺腫瘍のサブセットにおける有意な過剰な発現、ならびに黒色腫および乳癌（適合する正常な組織を有さない）における強力な発現を同定する。
【０８５４】
これによって、そのプロフィールに基づいて、この遺伝子の発現を、以前に開示されたような腎臓癌のサブセットに加えて、肺、黒色腫および乳癌のサブセットのためのマーカーとして利用できた。さらに、抗体または低分子薬物の使用による、この遺伝子の産物の活性の治療的な阻害は、ＣＧ５７０９４を発現し、かつそれらに依存する腎臓、肺、黒色腫および乳癌の治療において有用であり得る。
【０８５５】
2005520496.tif 000576
表 F12b: 腫瘍学的試料中のCG57094発現
【表５７１】
2005520496.tif 000577
【表５７２】
2005520496.tif 000578
【表５７３】
2005520496.tif 000579
【表５７４】
2005520496.tif 000580
【表５７５】
2005520496.tif 000581
【表５７６】
2005520496.tif 000582
【表５７７】
2005520496.tif 000583
【表５７８】
2005520496.tif 000584
【表５７９】
2005520496.tif 000585
【表５８０】
2005520496.tif 000586
【表５８１】
2005520496.tif 000587
【表５８２】
2005520496.tif 000588
【表５８３】
2005520496.tif 000589
【表５８４】
2005520496.tif 000590
【表５８５】
2005520496.tif 000591
【表５８６】
2005520496.tif 000592
【表５８７】
2005520496.tif 000593
【表５８８】
2005520496.tif 000594
【表５８９】
2005520496.tif 000595
【表５９０】
2005520496.tif 000596
【表５９１】
2005520496.tif 000597
【０８５６】
実施例Ｆ１３：サブクローニングおよびタンパク質発現
ＣＧ５７０９４は、シグナルペプチドと、それに続くコイル−コイル様ドメイン（オリゴマー形成のために必要）と、それに続くフィブリノーゲン様ドメイン（このレセプターに結合するために必要）から構成されるタンパク質をコードする。このタンパク質の成熟領域のみが発現される（シグナルペプチダーゼを除き、そしてそれをＩｇκシグナルペプチドと置換する）。なぜなら、それ自体のシグナルペプチドを有するこの全長配列は、十分な量を発現して分泌することがないからである。哺乳動物系における発現のために、方法において記載されたとおり、２つの組み換え配列、ＣＧ５７０９４−０２およびＣＧ５７０９４−０４を作製した。
【０８５７】
実施例Ｆ１４：ヒト胚性腎臓２９３細胞におけるＣＧ５７０９４−０４の発現。ＣＧ５７０９４−０４配列を含有する１１４３ｂｐ長のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化したｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ中にサブクローニングして、プラスミド７８９を生成した。製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬を用いて、得られたプラスミド７８９を、２９３細胞中にトランスフェクトした。細胞のペレットおよび上清をトランスフェクション後７２時間で回収して、抗Ｖ５抗体を用いてウエスタンブロット（還元状態）によってＣＧ５７０９４−０４発現について検査した。以下のゲルは、ＣＧ５７０９４−０４が発現されること、および３５ｋＤａタンパク質が２９３細胞によって分泌されることを示す。
【０８５８】
一過性の２９３トランスフェクションを、各々のスケールアップから、スケールアップして６Ｌの順化培地にし、バッチ３および４について材料を提供した。
【０８５９】
【表５９２】
2005520496.tif 000598
２９３細胞によって分泌されたＣＧ５７０９４−０４タンパク質
【０８６０】
実施例Ｆ１５：安定なＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＣＧ５７０９４−０２の発現。１１４３ｂｐ長のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントであってＣＧ５７０９４−０２配列を含有するフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ消化したｐＥＥ１４．４Ｓｅｃ中にサブクローニングして、プラスミド１６１４を生成した。製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ）の指示に従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬を用いて、得られたプラスミド１６１４をＣＨＯ−Ｋ１細胞中にトランスフェクトした。細胞ペレットおよび上清をトランスフェクションの７２時間後に収集して、抗Ｖ５抗体を用いてウエスタンブロット（還元条件）によってＣＧ５７０９４−０２発現について検査した。以下のゲルによって、ＣＧ５７０９４−０２が発現されること、および３３ｋＤａタンパク質が、一過性のレベルでＣＨＯ−Ｋ１細胞によって分泌されることが示される。
【０８６１】
培養培地は、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸であった。
【０８６２】
【表５９３】
2005520496.tif 000599
ＣＨＯ−Ｋ１細胞における一過性レベルでのＣＧ５７０９４−０２タンパク質発現
【０８６３】
ＧＳシステム（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を用いて、ＭＳＸ耐性クローンを選択した。選択プロセスにおける培養培地は、以下：グルタミン非含有ＤＭＥＭ（ＪＲＨ）、１０％透析ＦＢＳ、１×ＧＳ補充（ＪＲＨ）、２５μＭ  ＭＳＸ（ＪＲＨ）であった。
【０８６４】
１０Ｌ  Ｗａｖｅバイオリアクター中にスケールアップするために、高発現体クローンを選択した。２つのリアクターを接種した。３０Ｌ順化培地を各々のリアクターから収集して、バッチ２および３を得た。
【０８６５】
Ｗａｖｅバイオリアクターに接種した１２０時間後この培養培地を回収して、抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロット（還元条件）によってＣＧ５７０９４−０４発現について検査した。以下のゲルによって、サンプルのウエスタン解析が示される。
【０８６６】
【表５９４】
2005520496.tif 000600
ＷａｖｅバイオリアクターにおけるＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＣＧ５７０９４−０２タンパク質発現  
【０８６７】
予想どおり、分泌されたタンパク質は４５ｋＤａの分子であった。
【０８６８】
Ｗａｖｅバイオリアクターにおける培養培地は、以下：ＥＸ−Ｃｅｌｌ３０２培地、１０％透析ＦＢＳ、１×ＧＳ補充、１×ＨＴ補充、２５μＭ  ＭＳＸである。
【０８６９】
一過性および安定な細胞株のスケールアップ条件における分泌された分子の観察された分子量の間の相違は、２つの生成スキームにおいて用いられた異なる培養培地の結果である可能性が最も高い。
【０８７０】
実施例Ｆ１６：タンパク質の発現および精製
ＣＧ５７０９４変異体０２を、ＣＨＯ安定細胞系で発現して精製した。この方法は、全長タンパク質（ほぼ５４Ｋｄ）および３５Ｋｄのタンパク質分解性フラグメントの両方を、全長／フラグメントが約１：２の比で生じる。非還元条件（ウエスタンブロットにおいてみられるような）において、この全長タンパク質は、オリゴマー化を受ける。
【０８７１】
０２と同じタンパク質配列を有するＣＧ５７０９４変異体０４を、２９３一過性細胞系で発現して精製した。このタンパク質の９０％より多くがタンパク質分解性フラグメントとして精製され、従ってオリゴマー化を受けない。
【０８７２】
手順
１．Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  １において、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて、結合したＣＨＯ安定細胞中にトランスフェクトした。４時間後、５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地を用いて重層する。
２．３７℃で３、５および７日間のインキュベーション後に収集した。
【０８７３】
細胞溶解／タンパク質回収
手順
１．３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、０．２μｍの孔サイズを用いて濾過する。
【０８７４】
手順
１．金属アフィニティークロマトグラフィー−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ５０ｍｌおよび５ｍｌ金属キレート（Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ）−泳動緩衝液２０ｍＭ  リン酸、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ。２０ｍＭ、５０ｍＭおよび１００ｍＭのイミダゾールで洗浄する。５００ｍＭイミダゾールで溶出する。
２．ＨＳ陽イオン交換クロマトグラフィー−Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ  １．６ｍｌカラム−３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、０．０５％  ＣＨＡＰＳ。０〜２Ｍ  ＮａＣｌ勾配で溶出する。
３．透析−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して、４℃で、３，５００  ＭＷＣＯを用いる。
【０８７５】
タンパク質の品質管理
ウエスタンブロットの手順
抗体の名称、カタログ番号および供給業者：Ａｎｔｉ−Ｖ５−ＨＲＰ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体），４６−０７０８，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ），Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ＨＲＰ結合体、６９０４７，Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
抗体希釈緩衝液：ＰＢＳ／５％ミルク／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
洗浄緩衝液：ＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０
検出試薬：ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）
１．このブロットを抗体希釈緩衝液でカバーして、室温で１時間、振盪器でインキュベートした。
２．適切な量の結合体を含有する抗体希釈緩衝液を用いて、ブロッキング溶液を置換して、このブロットを室温で１時間、ロッキング（振盪）プラットフォームでインキュベートした。
３．抗体溶液をデカントして、洗浄緩衝液の２回の短時間リンスによって、このブロットを迅速に洗浄した。次いでこのブロットを、洗浄緩衝液を用いてカバーして、５分間ロッキングプラットフォームでインキュベートして、洗浄緩衝液をデカントした。このプロセスを２回繰り返し、全部で３回、５分洗浄した。
４．製造業者の指示に従って、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、このブロットを発色させ、次いでＫｏｄａｋ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｏｎで発光をデジタル化した。
【０８７６】
実施例Ｆ１７：ＣＧ５７０９４−０２バッチ２、プラスミド番号１６１４  ＣＨＯ安定細胞株
タンパク質の品質管理データ
【０８７７】
【表５９５】
2005520496.tif 000601
2005520496.tif 000602
【０８７８】
実施例Ｆ１８：ＣＧ５７０９４−０２  Ｂ３、プラスミド番号１６１４  ＣＨＯ安定細胞株
タンパク質の品質管理データ
【０８７９】
【表５９６】
2005520496.tif 000603
2005520496.tif 000604
【０８８０】
実施例Ｆ１９：ＣＧ５７０９４−０２バッチ３、２９３細胞一過性トランスフェクション
精製の方法
１．金属アフィニティークロマトグラフィー−ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ５０ｍｌ金属キレート（Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ）−２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ。２０ｍＭ、５０ｍＭおよび１００ｍＭのイミダゾールで洗浄する。５００ｍＭイミダゾールで溶出する。
２．金属アフィニティークロマトグラフィー−ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ５ｍｌ金属キレート−２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ。０〜５００ｍＭイミダゾール勾配に対して溶出する。
３．イオン交換クロマトグラフィー−Ｐｏｒｏｓ  ５０ＨＳカラム−０〜１Ｍ  ＮａＣｌ勾配を含有する３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、０．０５％  ＣＨＡＰＳに対して溶出する。
４．透析−２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して、４℃で、３，５００  ＭＷＣｕｔｏｆｆを用いる。
【０８８１】
【表５９７】
2005520496.tif 000605
ＣＧ５７０９４−０４  バッチ３  クーマシー染色およびウエスタンブロット
【０８８２】
実施例Ｆ２０：ＣＧ５７０９４−０４バッチ４、２９３細胞一過性トランスフェクション
【０８８３】
【表５９８】
2005520496.tif 000606
ＣＧ５７０９４−０４  バッチ４  クーマシー染色およびウエスタンブロット
【０８８４】
ＣＧ５７０９４−０４タンパク質調製についての解析の証明書において示されるとおり、発現および精製の間、この発現されたタンパク質は、自明でないタンパク質分解性切断を受けて、フラグメントペプチドを生成する。
【０８８５】
このペプチドのタンパク質配列は、ＬＰＥＭＡ  ＱＰＶＤＰ  ＡＨＸＶＳのＮ末端配列を生成するタンパク質調製物のＮ末端配列決定によって決定された。Ｐ．Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１，１００３５〜１００３８（１９８７）に記載のようにポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に対してタンパク質を転写すること、次いでＲ．Ｍ．Ｈｅｗｉｃｋ、Ｍ．Ｗ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｌ．Ｅ．ＨｏｏｄおよびＷ．Ｊ．Ｄｒｅｙｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６，７９９０〜７９９７（１９８１）に記載のような自動気相配列決定を実施することによって、この配列を決定した。発現構築物に含まれるタグ（Ｖ５およびＨｉｓペプチド）によってＣＯＯＨ末端を決定する。なぜなら、このタグは精製に用いられ、かつこの精製されたタンパク質は、ウエスタンブロットに見られるようにＶ５抗体に対して依然として反応性であるからである。従って、ＣＧ５７０９４タンパク質の正常なＣＯＯＨ末端は、精製されたタンパク質に存在する。
【０８８６】
このタンパク質分解性フラグメントの分子特徴は特に、ＣＧ５７０９４−０２およびＮＬ２の親の配列の特徴とは異なり、詳細にはこのタンパク質は、フィブリノーゲンドメインであるレセプター結合領域を保持したままであって、コイル−コイルドメインの損失に起因してオリゴマー化を受けない。これによって、Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ７８６−Ｏ  Ｃｅｌｌｓ  ｅｘａｍｐｌｅに示されるように、活性を保持したままで、発現かつ精製することが容易であるペプチドが得られる。これは、発現構築物および発現のために用いられる細胞株の自明でない結果に相当する。
【０８８７】
2005520496.tif 000607
【０８８８】
実施例Ｆ２１：ＰＥ５２ａ：細胞増殖
ＣＧ５７０９４は、内皮細胞増殖を誘導または阻害する抗血管形成促進（ｐｒｏ−ａｎｔｉ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）因子のアンギポイエチン様ファミリーに属する。従って、本発明者らは、本発明者らの調製物ＣＧ５７０９４−０２が上皮細胞増殖を誘導し得るか阻害し得るかを試験しようとした。ＣＧ５７０９４は、内皮細胞増殖を阻害しなかったが、１０μｇ／ｍｌの濃度でＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣの増殖を増大した。ただし増殖の程度は有意ではなかった。
【０８８９】
実施例Ｆ２２：ＨＵＶＥＣ増殖の阻害
ＨＵＶＥＣ細胞におけるＢｒｄＵ取り込み。１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌでＣＧ５７０９４−０２を用いる血清飢餓した培養細胞の処置、ならびにＤＮＡ合成の間のＢｒＤＵ取り込みの測定によって、増殖活性を測定する。ＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれ、１０％ウシ胎仔血清または１０％ウシ血清を用いて補充したＤＭＥＭ中で培養した。３７℃で１０％ＣＯ２／空気中でコンフルエンスまで細胞を増殖した。次いで細胞をＤＭＥＭ中で２４〜７２時間、飢餓させた。ｐＣＥＰ４ｓｅｃまたはｐＣＥＰ４ｓｅｃ／ＣＧ５７０９４−０２富化した順化培地を１８時間添加した（１０μＬ／培養１００μＬ）。次いで、ＢｒｄＵ（１０μＭ最終濃度）を添加して、細胞とともに５時間インキュベートした。ＢｒＤＵ取り込みを、製造業者の説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従ってアッセイした。
【０８９０】
１％ＦＢＳに加えて増殖因子でＨＵＶＥＣ細胞の増殖を刺激した。陽性コントロールとして用いたＴＮＦαの存在下で、ＨＵＶＥＣ細胞の増殖は、顕著に阻害され、そして無血清コントロールのレベルに匹敵した。ＣＧ５７０９４−０２は、１μｇおよび０．１μｇ／ｍｌの濃度ではこれらの内皮細胞の増殖に有意に影響しなかった。
【０８９１】
【表５９９】
2005520496.tif 000608
CG57094-02による HUVEC BrdUの阻害
【０８９２】
実施例Ｆ２３：ＨＭＶＥＣ増殖の阻害
ＨＵＶＥＣ細胞におけるＢｒｄＵ取り込み。１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌでＣＧ５７０９４−０２を用いる血清飢餓した培養細胞の処置、ならびにＤＮＡ合成の間のＢｒＤＵ取り込みの測定によって、増殖活性を測定する。ＨＭＶＥＣ細胞をそれぞれ、１０％ウシ胎仔血清または１０％ウシ血清を用いて補充したＤＭＥＭ中で培養した。３７℃で１０％ＣＯ２／空気中でコンフルエンスまで細胞を増殖した。次いで細胞をＤＭＥＭ中で２４〜７２時間飢餓させた。ｐＣＥＰ４ｓｅｃまたはｐＣＥＰ４ｓｅｃ／ＣＧ５７０９４−０２を富化した順化培地を１８時間添加した（１０μＬ／培養１００μＬ）。次いで、ＢｒｄＵ（最終濃度１０μＭ）を添加して、細胞とともに５時間インキュベートした。ＢｒｄＵ取り込みを、製造業者の説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従ってアッセイした。
【０８９３】
１％ＦＢＳに加えて増殖因子でＨＭＶＥＣ細胞の増殖を刺激した。陽性コントロールとして用いたＴＮＦαの存在下で、ＨＭＶＥＣ細胞の増殖は、顕著に阻害され、そして無血清コントロールのレベルに匹敵した。ＣＧ５７０９４−０２は、１μｇおよび０．１μｇ／ｍｌの濃度ではこれらの内皮細胞の増殖に有意に影響しなかった。
【０８９４】
【表６００】
2005520496.tif 000609
CG57094-02による HMVEC BrdU の阻害
【０８９５】
実施例Ｆ２４：ＣＰＡＥ増殖の阻害
ウシ肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ）におけるＢｒｄＵ取り込み。１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌでＣＧ５７０９４−０２を用いる血清飢餓した培養細胞の処置、ならびにＤＮＡ合成の間のＢｒＤＵ取り込みの測定によって、増殖活性を測定する。ＣＰＡＥ細胞をそれぞれ、１０％ウシ胎仔血清または１０％ウシ血清を用いて補充したＤＭＥＭ中で培養した。３７℃で１０％ＣＯ２／空気中でコンフルエンスまで細胞を増殖した。次いで細胞をＤＭＥＭ中で２４〜７２時間飢餓させた。ｐＣＥＰ４ｓｅｃまたはｐＣＥＰ４ｓｅｃ／ＣＧ５７０９４−０２を富化した順化培地を１８時間添加した（１０μＬ／培養１００μＬ）。次いで、ＢｒｄＵ（最終濃度１０μＭ）を添加して、細胞とともに５時間インキュベートした。ＢｒｄＵ取り込みを、製造業者の説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従ってアッセイした。
【０８９６】
１％ＦＢＳに加えて増殖因子でＣＰＡＥ細胞の増殖を刺激した。陽性コントロールとして用いたＴＮＦαの存在下で、ＣＰＡＥ細胞の増殖は、顕著に阻害され、そして無血清コントロールのレベルに匹敵した。ＣＧ５７０９４−０２は、１μｇおよび０．１μｇ／ｍｌの濃度ではこれらの内皮細胞の増殖に有意に影響しなかった。
【０８９７】
【表６０１】
2005520496.tif 000610
CG57094-02によるCPAE BrdUの阻害
【０８９８】
実施例Ｆ２５：ＨＵＶＥＣ細胞におけるＢｒｄＵ取り込み
１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌでＣＧ５７０９４−０２を用いる血清飢餓した培養細胞の処置、ならびにＤＮＡ合成の間のＢｒＤＵ取り込みの測定によって、増殖活性を測定する。ＨＵＶＥＣ細胞をそれぞれ、１０％ウシ胎仔血清または１０％ウシ血清を用いて補充したＤＭＥＭ中で培養した。３７℃で１０％ＣＯ２／空気中でコンフルエンスまで細胞を増殖した。次いで細胞をＤＭＥＭ中で２４〜７２時間、飢餓させた。ｐＣＥＰ４ｓｅｃまたはｐＣＥＰ４ｓｅｃ／ＣＧ５７０９４−０２を富化した順化培地を１８時間添加した（１０μＬ／培養１００μＬ）。次いで、ＢｒｄＵ（最終濃度１０μＭ）を添加して、細胞とともに５時間インキュベートした。ＢｒＤＵ取り込みを、製造業者の説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従ってアッセイした。１０ｎｇ／ｍｌでのＶＥＧＦ／ｂＦＧＦの組み合わせを陽性コントロールとして用いた・
【０８９９】
ＣＧ５７０９４は、１０μｇ／ｍｌの濃度ではＨＵＶＥＣの増殖を増大したが、増殖の程度は有意ではなかった。
【０９００】
【表６０２】
2005520496.tif 000611
CG57094-02によるHUVECの増殖刺激
【０９０１】
実施例Ｆ２６：ＨＭＶＥＣ細胞におけるＢｒｄＵ取り込み
１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌでＣＧ５７０９４−０２を用いる血清飢餓した培養細胞の処置、ならびにＤＮＡ合成の間のＢｒＤＵ取り込みの測定によって、増殖活性を測定する。ＨＭＶＥＣ細胞をそれぞれ、１０％ウシ胎仔血清または１０％ウシ血清を用いて補充したＤＭＥＭ中で培養した。３７℃で１０％ＣＯ２／空気中でコンフルエンスまで細胞を増殖した。次いで細胞をＤＭＥＭ中で２４〜７２時間飢餓させた。ｐＣＥＰ４ｓｅｃまたはｐＣＥＰ４ｓｅｃ／ＣＧ５７０９４−０２を富化した順化培地を１８時間添加した（１０μＬ／培養１００μＬ）。次いで、ＢｒｄＵ（１０μＭ最終濃度）を添加して、細胞とともに５時間インキュベートした。ＢｒｄＵ取り込みを、製造業者の説明書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従ってアッセイした。
【０９０２】
ＣＧ５７０９４は、１０μｇ／ｍｌの濃度ではＨＵＶＥＣの増殖を増大したが、増殖の程度は有意ではなかった。
【０９０３】
【表６０３】
2005520496.tif 000612
CG57094-02によるHMVECの増殖刺激
【０９０４】
実施例Ｆ２７：ＰＥ５２：細胞生存
ＣＧ５７０９４は、細胞性ストレス様飢餓の際に内皮細胞生存を誘導または阻害する抗血管形成促進（ｐｒｏ−ａｎｔｉ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）因子のアンギポイエチン様ファミリーに属する。従って、本発明者らは、本発明者らの調製物ＣＧ５７０９４−０２が内皮細胞生存を誘導し得るか阻害し得るかを試験しようとした。ＣＧ５７０９４は、０．０１μｇ／ｍｌまでの濃度でＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣの生存を増大したが、ＣＰＡＥについては有意ではなかった。
【０９０５】
細胞生存度アッセイ（ＷＳＴ１生存アッセイ）。ＣＧ５７０９４−０２は内皮細胞の強力な増殖を誘導しなかったので、本発明者らは、標的遺伝子（ＣＧ５７０９４−０２）が、飢餓の間に内皮細胞の生存を増大するか否かを試験した。Ｗｓｔ−１アッセイを用いて、細胞の生存度を測定した。血管形成または癌の新血管新生に関与する潜在的な細胞型に基づいて細胞株を選択した：ＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）、ＨＭＶＥＣ−Ｄ（内皮、真皮毛細血管）およびウシ肺動脈内皮細胞（ＣＰＡＥ）。９６ウェルプレート（平底）を１００μｌの付着因子（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）を用いてコーティングして、３７℃で１時間インキュベートした。付着因子を吸引して、０．１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（増殖因子なし）に、内皮細胞をプレートした。２４時間後、細胞を洗浄して、ｐＣＥＰ４ｓｅｃまたはｐＣＥＰ４ｓｅｃ／ＣＧ５７０９４−０２富化した順化培地を４８時間添加した（１０μＬ／培養１００μＬ）。精製したＣＧ５７０９４−０２タンパク質または順化培地を再度添加して、培地を交換することなく、さらに２４時間インキュベートした。Ｗｓｔ−１試薬（１０μｌ／ウェル）を添加して、３７℃で４５分〜１時間インキュベートした。プレートを４５０ｎｍの吸光度で読んだ。
【０９０６】
ＶＥＧＦ／ｂＦＧＦの存在下で、ＨＵＶＥＣ細胞のＨＵＶＥＣ生存は、飢餓した細胞に比べたＡ４５０読み取りにおける増大によって観察されるとおり、顕著に増大した。興味深いことに、ＣＧ５７０９４−０２は、２．５μｇ／ｍｌの濃度でまた、飢餓した細胞に比べてＨＵＶＥＣの生存度を増大させた。この傾向は、ＣＧ５７０９４−０２の０．０１μｇ／ｍｌ程度の低さの濃度でさえ同じく維持された。これらのデータの全てによって、ＣＧ５７０９４−０２は、内皮細胞の強力な生存因子であり得ることが示唆される。従って、モノクローナル抗体の中和によるＣＧ５７０９４−０２活性の阻害は、腫瘍および糖尿病網膜症の新血管新生を阻害し得る。
【０９０７】
【表６０４】
2005520496.tif 000613
CG57094-02によるHUVECの生存誘導
【０９０８】
ＣＧ５７０９４−０２は１μｇ／ｍｌで、図６に示される結果に一致して、飢餓した細胞に比べて、ＨＵＶＥＣ細胞生存における顕著な増大を示した。興味深いことに、より高いタンパク質濃度で、細胞は、生存度の低下を示し、５μｇ／ｍｌの濃度で最高の効果がみられた。
【０９０９】
【表６０５】
2005520496.tif 000614
CG57094-02によるHUVECの生存誘導
【０９１０】
ＨＵＶＥＣ細胞においてみられた結果と一致して、ＨＭＶＥＣ−ｄ細胞の生存はまた、より低い濃度でＣＧ５７０９４−０２によって増強された。興味深いことに、より高いタンパク質濃度で、細胞は、生存度の低下を示し、０．５μｇ／ｍｌの濃度で最高の効果がみられた。
【０９１１】
【表６０６】
2005520496.tif 000615
CG57094-02によるHMVEC-dの生存誘導
【０９１２】
ＶＥＧＦ／ｂＦＧＦは、飢餓した細胞に比べて、Ａ４５０読み取りにおける増大で観察されるとおり、ＣＰＡＥ細胞の生存を増大した。しかし、ＣＧ５７０９４−０２はまた、ＨＵＶＥＣおよびＨＭＶＥＣ−ｄ細胞の生存を増強した、それは、Ｗｓｔ−１試薬によって測定されるようにＣＰＡＥ細胞に対して影響を有さなかった。
【０９１３】
【表６０７】
2005520496.tif 000616
CPAE細胞の生存に対するCG57094-02の影響
【０９１４】
実施例Ｆ３２：細胞生存アッセイ７８６−Ｏ細胞
７８６−０は、腎臓癌腫由来のヒト細胞株であり、１つの対立遺伝子を欠き、そしてフォン・ヒッペル・リンドウ腫瘍（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  ｔｕｍｏｒ）サプレッサー遺伝子（ＶＨＬ）の第二の対立遺伝子から短縮された対立遺伝子（ＡＡ１−１０４）を発現する。ＶＨＬ遺伝子素因の不活性化によって、個体はヒトＶＨＬ癌症候群に対して罹患し、そしてこの不活性化は、散発性腎細胞癌（ＲＣＣ）および脳の血管芽細胞腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）に関連する。本発明者および他の当業者（Ｐａｕｓｅ  Ａ、Ｌｅｅ  Ｓ、Ｌｏｎｅｒｇａｎ  ＫＭ、Ｋｌａｕｓｎｅｒ  ＲＤ．Ｔｈｅ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｅｘｉｔ  ｕｐｏｎ  ｓｅｒｕｍ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９８  Ｆｅｂ  ３；９５（３）：９９３〜８）は、この細胞株が、腎臓癌腫における腫瘍形成機構を研究するための適切なインビトロモデルに相当すると考えている。
【０９１５】
詳細には、本実施例において、本発明者らは、ＣＧ５７０９４精製タンパク質を用いた７８６−０細胞処置が、そうでなければ細胞死を引き起こす血清なしの状態において、それらの生存にどのように影響するかを試験しようとした。
【０９１６】
方法：標準的試験方法（ＳＴＭ）ＣＶ−ＳＵＶ−００１
【０９１７】
表 F32a: 定義
【表６０８】
2005520496.tif 000617
表 F32b: 試薬、材料および装置 
【表６０９】
2005520496.tif 000618
【０９１８】
完全なＤＭＥＭ：
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ
飢餓培地：
ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ
無血清培地
ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ＋１％Ｐ／Ｓ
【０９１９】
手順
手順のまとめ：完全ＤＭＥＭを含有する９６ウェルプレートの内側の６０ウェルに細胞を入れた。その翌日、細胞をＳＦＭ中で洗浄して、０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中でＣｕｒａＰｒｏｔｅｉｎｓを用いて処理した。未処理の細胞は、ベースラインのコントロールとして機能する。１０％ＦＢＳ中で培養した細胞は、陽性コントロールとして機能する。処置の３日後に、ＭＴＳを培地に添加して細胞を０．５〜４時間インキュベートする。次いで、マイクロプレート吸光度リーダー（読取装置）を用いて、ウェルの吸光度を決定する。
【０９２０】
１日目：
Ａ．細胞を調製する
１．ＰＢＳを用いて（１×）７０〜８０％コンフルエントな細胞のフラスコを洗浄する。
２．細胞が培養フラスコの底から剥がされ得るまで、Ｔ１７５フラスコあたり５ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡを用いて約１分間細胞を処理する。
３．細胞が剥がされた後、フラスコに５ｍｌの完全ＤＭＥＭを添加する。
４．１５ｍｌの円錐底の遠心分離チューブに細胞懸濁物を移す。
５．４℃で、１２００ＲＰＭで５分間、細胞懸濁物を遠心分離する。
６．１０ｍｌの完全ＤＭＥＭを用いて細胞を再懸濁する。
Ｃ．血球計中でトリパンブルーを用いて生存細胞をカウントする。
Ｄ．完全ＤＭＥＭを用いて細胞を希釈して、必要とされる１プレートあたり１０ｍｌで、５，０００細胞／ウェルにする。
Ｅ．ブランクウェルについて、細胞なしで１００μｌの完全ＤＭＥＭを添加する。
Ｆ．１０％  ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃で一晩インキュベートする。
【０９２１】
２日目：
Ａ．ウェルからウェルのプレートの適切なコンフルエンシー、生存度およびコンシステンシーについてプレートを視察する。
１．ＳＦＭを用いてプレートを２回洗浄する。
Ｂ．ＣｕｒａＰｒｏｔｅｉｎｓおよびコントロールを適切なウェルに添加する。
１．陽性コントロールのために、ウェルに１００μｌの完全ＤＭＥＭを添加する。
２．陰性コントロールのために、ウェルに１００μｌの０．５％のＦＢＳ／ＤＭＥＭを添加する。
３．緩衝液コントロールのために、最高濃度のタンパク質処理において用いられる同様の量の緩衝液を添加する。
４．ブランクウェルのために、ウェルに１００μｌの完全ＤＭＥＭを添加する。
Ｃ．その後３日間、１０％  ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベートする。
【０９２２】
５日目：
Ａ．効果についてウェルを視覚的に検査し、次いで各々のウェルに２０μｌのＭＴＳを添加する。
Ｂ．０．５〜４時間の間、１０％  ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベートする。
Ｃ．ＰｏｗｅｒＷａｖｅ分光光度計で４９０ｎｍ、単一波長においてプレートを読み取る（ＫＣ４プログラム／プロトコール／ＭＴＳ４９０／ＭＳ  ＥＸＣＥＬ形式でファイルを保存）。
【０９２３】
ＣＶ−ＳＵＶ−００１の結果：種々の量のＣＧ５７０９４を用いて処理した細胞を比較する、上記のような処置の５日後、細胞のＭＴＳ活性を測定することによって結果を評価した：（１）血清刺激なしの細胞または０．５％血清（陰性コントロール）を用いて刺激した細胞に対して、および（２）後者の実験では、完全な培地（陽性コントロール）に対して。ＭＴＳ活性の増大が、統計学的に有意な様式で陰性コントロールよりも大きい場合、結果は陽性とみなされる。以下の結果は、血管新生促進治療における、そして詳細には心血管疾患における、ＣＧ５７０６４および潜在的に関連するポリペプチドの有用性の指標である。ＣＧ５７０９４の０４調製物のＩＣ５０は、約５μｇ／ｍｌであり、０２調製物については、５００ｎｇ／ｍｌ未満かつ１００ｎｇ／ｍｌを上回る。腎臓、肺、黒色腫および乳癌および細胞データから得られた腫瘍細胞および腫瘍組織におけるその過剰発現を考慮すれば、これによって、腫瘍細胞生存、特に腎臓癌細胞生存が、ＣＧ５７０９４によってどのように刺激されるかが明らかになっており、その活性の阻害は、ガンの治療において、そして詳細には腎臓癌、肺癌、黒色腫および乳癌を阻害するのにおいて有用性を有する。
【０９２４】
このセットの実験の結果は、米国特許第６，４５５，４９６号および米国特許第ＵＳ６０７４８７３号の両方によって開示されるような先行技術に照らして自明性ではない。
【０９２５】
これらの出願において、本発明者らは、本発明者らが発見したものに反する、内皮細胞に対する活性のみを開示した。ＵＳ６０７４８７３の実施例１０において、彼らは、彼らのＮＬ２調製物が、細胞生存と反対に、内皮細胞のアポトーシスを誘導したということを開示した。Ｋｉｍら（Ｋｉｍ，Ｉ；Ｋｉｍ，ＨＧ；Ｋｉｍ，Ｈ；Ｋｉｍ，ＨＨ；Ｐａｒｋ，ＳＫ；Ｕｈｍ，ＣＳ；Ｌｅｅ，ＺＨ；Ｋｏｈ，ＧＹ．Ｈｅｐａｔｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ／ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２０００  ３４６  Ｐｔ  ３：６０３〜６１０）は、内皮細胞のみに対する抗アポトーシス活性を、限定された効果（３０および４５％低下）で開示した。本発明者らが７８６−０で発見した活性は、１μｇ／ｍｌ未満の比活性の範囲を有し、その効果は実質的であって（５００〜１０００％）、抗体（ＣＧ５７０９４および関連のポリペプチドに結合し、そしてそれらの活性をブロックする抗体）を中和するためのスクリーニングアッセイを設定することが可能になる。
【０９２６】
図２２によって、ＣＧ５７０９４タンパク質の両方の調製物が７８６−０細胞の生存をコントロールに比べて刺激し得ることが、示される。０２調製物は、より高い比活性を有するようである。
【０９２７】
【表６１０】
2005520496.tif 000619
【表６１１】
2005520496.tif 000620
【表６１２】
2005520496.tif 000621
【０９２８】
ＣＧ５７０９４タンパク質の両方の調製物によって、この生存活性が反復された。０２調製物は、前よりも高い比活性を有するようである。
【０９２９】
【表６１３】
2005520496.tif 000622
【表６１４】
2005520496.tif 000623
【０９３０】
ＣＧ５７０９４タンパク質の同じ調製物の２つのバッチを用いて、この生存活性が反復された。調製物０２のバッチ０３は、より高い比活性を有した。
【０９３１】
【表６１５】
2005520496.tif 000624
【表６１６】
2005520496.tif 000625
【０９３２】
実施例Ｆ３３：Ｐｅ５２ａ１−活性化されたＴリンパ球およびマクロファージの細胞生存アッセイ
活性化されたＴリンパ球およびマクロファージにおいてアポトーシスを妨げる能力について、ＡＲＰタンパク質を試験する。なぜならこれらの細胞型は、膝の変形性関節症を有する患者由来の膝滑膜サンプルに存在することが示されたからである［Ｓａｉｔｏ  Ｉ、Ｋｏｓｈｉｎｏ  Ｔ、Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｋ、Ｕｅｓｕｇｉ  Ｍ、Ｓａｉｔｏ  Ｔ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｙｎｏｖｉａ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｋｎｅｅｓ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ．２００２  Ｆｅｂ；１０（２）：１５６〜６２．］。以下の方法は、Ｔ細胞およびマクロファージにおけるＡＰＲの効果の確証：細胞増殖の測定、関連のサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αなど）産生のために用いられる。さらに早期のアポトーシスマーカー（アネキシンＶ結合）を試験する。増大した細胞増殖およびサイトカイン産生によって、細胞生存に対するＡＲＰの正の効果が示される。低下したアネキシンＶ結合によってまた、アポトーシスの防止が示される。
【０９３３】
治療用の中和抗体のスクリーニングのために、同様の試験が用いられる。抗体選択の基準は以下のとおりである：
１．ＡＲＰに結合する（ＥＬＩＳＡ）
インビトロにおけるＡＲＰによって誘導される生存Ｔリンパ球およびマクロファージの阻害
【０９３４】
実施例Ｆ３４：ＣＧ５７０９４に結合する抗体の調製
上記のように、ＣＧ５７０９４活性を阻害すれば、ガンの治療において、詳細には腎臓癌、肺癌、黒色腫および乳癌の阻害において有用性がある。ＣＧ５７０９４のような分泌された因子に結合する抗体は、中和と呼ばれるプロセスでその活性を阻害するということが当該分野で公知である。詳細には、ＶＥＧＦに結合するモノクローナル抗体を中和することは、腫瘍誘導性の血管形成に対して作用する腫瘍増殖を阻害することが示されている（）。従って、ＣＧ５７０９４に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生は、ガンの治療において、詳細には腎臓癌、肺癌、黒色腫および乳癌の阻害において有用性を有する。腫瘍誘導性内皮細胞増殖および生存についてのみ必要であるＶＥＧＦと反対に、ＣＧ５７０９４は、内皮細胞および腫瘍細胞の両方による細胞増殖および生存の両方に必要であり、従ってＣＧ５７０９４活性の阻害は、より顕著な治療効果を有し得る。
【０９３５】
ＣＧ５７０９４−０４が、フィブリノーゲンドメインのみをコードするタンパク質分解性フラグメントを生成する方法を示す、タンパク質発現からの自明性でないこの結果のおかげで、本発明者らは、免疫のための抗原としてそのフラグメントを使用することを決定した。考察されたように、フィブリノーゲンドメインは、レセプターに結合する領域であるので、この領域に結合する抗体は好ましい。なぜならそれらは、中和される可能性が高いからである。
【０９３６】
方法：抗体を産生するための技術は、当該分野で公知であり、かつ例えば、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒに記載されている。ウサギおよびマウスの両方が、ポリクローナル抗体の産生に適切であるが、マウスはまたモノクローナル抗体の産生にも適切である。ヒト免疫グロブリン遺伝子がマウス免疫グロブリン遺伝子を置換しているマウスを用いて完全にヒトモノクローナル抗体を産生することができる。これらの抗体は、良好な薬学的な特徴を有し、治療有効性の損失を生じる、免疫反応に対する抗体が全くないかまたは最小であり、そして動物モデルにおける腫瘍を根絶することが示されている（Ｙａｎｇ  ＸＤ、Ｊｉａ  ＸＣ、Ｃｏｒｖａｌａｎ  ＪＲ、Ｗａｎｇ  Ｐ、Ｄａｖｉｓ  ＣＧ、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ａ  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｆｕｌｌｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９  Ｍａｒ  １５；５９（６）：１２３６〜４３）。本出願における特別な用途は、ＶＥＧＦに特異的な抗体単位およびＣＧ５７０９４に特異的な抗体単位からなる二重特異性抗体である。本発明者らは、腫瘍において、詳細には腎臓細胞癌腫瘍において、ＶＥＧＦとＣＧ５７０９４との発現の間に高い相関があることを開示している。腫瘍誘導性血管新生を増大することによって両方のタンパク質とも腫瘍形成を支持するので両方のタンパク質の活性を同時にブロックする抗体は、好ましい治療活性を有する。１例は、ＶＬ（ａ）−リンカー−ＶＨ（ａ）−リンカー−ＶＬ（ｂ）−リンカー−ＶＨ（ｂ）であり、ここでａは、ＶＥＧＦに対する抗体の可変領域セグメントであり、ｂは、ＣＧ５７０９４に対する抗体の可変領域セグメントであり、また逆も新である。二重特異性抗体の他の例は、ＣａｒｔｅｒのＩｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂａｓｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００１  Ｎｏｖ；１（２）：１１８〜２９に概説される。
【０９３７】
実施例Ｆ３５：ウサギポリクローナル抗体の生成
ウサギを、完全フロイントアジュバント中で乳化した免疫原を用いて免疫して、５０〜１０００μｇの量で皮下に、または腹腔内に、または筋肉内に注射する。次いで、免疫したウサギを、選択されたアジュバント中で乳化したさらなる免疫原を用いて１０〜１２日後にブースト（追加免疫）する。その後、数週間の間、ウサギをまたさらなる免疫原注射によってブーストする。ＥＬＩＳＡアッセイを試験して抗体を検出するために耳の採血によってウサギから定期的に血液サンプルを得てもよい。
【０９３８】
実施例Ｆ３６：抗体の結合を決定するためのＥＬＩＳＡプロトコール
溶液の調製
・コーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩、ｐＨ９．５）
・８．４ｇ，ＮａＨＣＯ３、３．５６ｇ、Ｎａ２ＣＯ３，ｐＨ〜９．５、そしてｄｄＨ２Ｏを用いて１Ｌに希釈する。
【０９３９】
アッセイ希釈液
・Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃２６４１１Ｅ
【０９４０】
プロトコール
・５０μｌのタンパク質を５μｇ／ｍｌの濃度で含有するコーティング緩衝液を用いて９６ウェルの高タンパク質結合ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ＃３５９０）を４℃で一晩コーティングする。
・翌日、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで５×２００〜３００μｌで細胞を洗浄する。
・２００μｌのアッセイ希釈液を用いて室温で少なくとも１時間プレートをブロックする。
・アッセイ希釈液中で抗体を希釈する
・ステップ２と同様にプレートを洗浄する。
・室温で少なくとも２時間、適切なウェルに５０μｌの各々の抗体希釈液を添加する。
・ステップ２と同様にプレートを洗浄する。
・５０μｌの二次抗体を添加して、室温で少なくとも１時間インキュベートする。
・ステップ２と同様にプレートを洗浄する。
・１００μｌのＴＭＢ基質溶液／ウェルを用いてアッセイを展開する。（溶液Ａ＋Ｂの１：１比）（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃２６４２ＫＫ）
・５０μｌの硫酸を用いて反応を停止する。
５５０ｎｍの補正を用いて４５０ｎｍでプレートを読み取る。
【０９４１】
結果：
ＣＧ５７０９４−０２精製したタンパク質調製物は、図２５〜２６〜２７におけるｅｌｉｓａのデータによって示されるように、強力な免疫反応を誘導することができた。ＣＧ５７０９４−０２コーティングプレートに対して、免疫血清のみが強力な反応性を示し、そして免疫前の血清は反応性を示さなかった（図２５〜２６）が、コーティングされていないプレートに対しては反応性は示されなかった（図２７）。
【０９４２】
このデータによって、ＣＧ５７０９４−０２精製タンパク質調製物が良好な免疫原であって、抗体を生成するために用いることができることが示される。
【０９４３】
【表６１７】
2005520496.tif 000626
表 F36a: 
【表６１８】
2005520496.tif 000627
【表６１９】
2005520496.tif 000628
表 F36b:
【表６２０】
2005520496.tif 000629
【表６２１】
2005520496.tif 000630
表 F36c:
【表６２２】
2005520496.tif 000631
【０９４４】
実施例Ｆ３７：ＣＧ５７０９４中和抗体の同定
７８６−Ｏ細胞の細胞生存アッセイに見られるように、精製されたＣＧ５７０９４は、７８６−０について生存活性を有し、これは、ＩＣ５０として、０４調製物について約５μｇ／ｍｌ、そして０２調製物について５００ｎｇ／ｍｌ未満および１００ｎｇ／ｍｌより上であった。
【０９４５】
以前に考察されたように、抗体であって、好ましくは完全にヒトモノクローナル抗体であって、ＣＧ５７０９４に結合しかつその活性を中和し、無血清状態から細胞をレスキューする能力を制限または排除する抗体の同定は、極めて有益である。なぜならこれらの抗体は、腫瘍に対して、詳細には腎臓癌、肺癌、黒色腫および乳癌に対して治療効果を有するからである。抗体がＣＧ５７０９４活性を中和し得るか否かを決定するため、種々の量のこのような抗体を、以下の方法に記載されたとおり７８６−Ｏ細胞についての細胞生存アッセイに添加する。その結果を、種々の量の抗体を用いて処理した細胞と比較して、以下に記載されたように処置の５日後に細胞のＭＴＳ活性を測定することによって、評価した：（１）非結合抗体を用いた処置と比較（陰性コントロール）、および（２）血清飢餓細胞と比較（陽性コントロール）。この結果は、ＭＴＳ活性の低下が、実質的に有意な様式で陰性コントロールよりも大きい場合に陽性であるとみなされる。
【０９４６】
少なくとも１０：１の抗体：ＣＧ５７０９４のモル比でＣＧ５７０９４活性を中和し得る抗体が治療剤として有用であり得るが、より低いモル比が好ましい。
【０９４７】
方法：標準的試験方法（ＳＴＭ）ＣＶ−ＡＮＴＳＵＶ−００１
【０９４８】
表 F37a: 定義 
【表６２３】
2005520496.tif 000632
表 F37b: 試薬、材料および装置 
【表６２４】
2005520496.tif 000633
【０９４９】
手順
手順のまとめ：完全ＤＭＥＭを含有する９６ウェルプレートの内側の６０個のウェルに細胞をプレートする。翌日、細胞をＳＦＭ中で洗浄して、０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭに含有されるＣｕｒａＰｒｏｔｅｉｎｓを用いて処置する。未処理の細胞はベースラインコントロールとして働く。１０％ＦＢＳ中で培養された細胞が、陽性コントロールとして働く。処置の３日後、ＭＴＳを培地に添加して細胞を０．５〜４時間インキュベートする。次いで、マイクロプレート吸光度リーダーを用いてウェルの吸光度を決定する。
１日目：
Ａ．細胞を調製する
１．７０〜８０％コンフルエントな細胞をＰＢＳ（１×）で洗浄する。
２．細胞が培養フラスコの底から剥がされ得るまでＴ１７５フラスコあたり５ｍｌのＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを用いて約１分間細胞を処理する。
３．細胞が剥がされた後、５ｍｌの完全ＤＭＥＭをフラスコに添加する。
４．細胞懸濁物を１５ｍｌの円錐底遠心分離チューブに移す。
５．４℃で５分間、１２００ＲＰＭで細胞懸濁液を遠心分離する。
６．１０ｍｌの完全ＤＭＥＭを用いて細胞を再懸濁する。
Ｃ．血球計でトリパンブルーを用いて生存細胞をカウントする。
Ｄ．完全ＤＭＥＭを用いて細胞を希釈し、必要とされる、１プレートあたり１０ｍＬで、５，０００細胞／ウェルを得る。
Ｅ．ブランクウェルについて、細胞なしで１００μｌの完全ＤＭＥＭを添加する。
Ｆ．１０％  ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃で一晩インキュベートする。
【０９５０】
２日目：
Ａ．ウェルからウェルのプレートの適切なコンフルエンシー、生存度およびコンシステンシーについてプレートを視察する。
１．ＳＦＭを用いてプレートを２回洗浄する。
Ｂ．ＣｕｒａＰｒｏｔｅｉｎｓおよびコントロールを適切なウェルに添加する。
１．陽性コントロールのために、ウェルに１００μｌの完全ＤＭＥＭを添加する。
２．陰性コントロールのために、ウェルに１００μｌの０．５％のＦＢＳ／ＤＭＥＭを添加する。
３．緩衝液コントロールのために、最高濃度のタンパク質処理において用いられる同様の量の緩衝液を添加する。
４．陰性抗体コントロールのために、１００μｌの陰性抗体を含有する０．５％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いる。また１００μｌの陰性抗体を用いて、適切な（予め決定した）濃度の生存因子を添加する。混合して、結合のために室温で１０〜２０分静置させ、次いで３つのウェル／処置の各々に１００μｌを添加する。
４．ブランクウェルのために、ウェルに１００μｌの完全ＤＭＥＭを添加する。
５．エッペンドルフチューブに適切な（予め決定した）濃度の生存因子と、１０μｇ／ｍｌの実験抗体とを添加し、第二のチューブに再度、生存因子および１μｇ／ｍｌの実験抗体を添加する。チューブを混合して、結合のために室温で１０〜２０分静置させ、次いで３つのウェル／処置の各々に１００μｌを添加する。
Ｃ．その後３日間、１０％  ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベートする。
【０９５１】
５日目：
Ａ．効果についてウェルを視覚的に検査し、次いで各々のウェルに２０μｌのＭＴＳを添加する。
Ｂ．０．５〜４時間の間、１０％  ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃でインキュベートする。
Ｃ．ＰｏｗｅｒＷａｖｅ分光光度計で４９０ｎｍ、単一波長においてプレートを読み取る（ＫＣ４プログラム／プロトコール／ＭＴＳ４９０／ＭＳ  ＥＸＣＥＬ形式でファイルを保存）。
【０９５２】
試薬の調製
完全ＤＭＥＭ：
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ
飢餓培地：
ＤＭＥＭ＋０．５％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓ
無血清培地：
ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ＋１％Ｐ／Ｓ
【０９５３】
実施例Ｆ３８：胸腺欠損ヌードマウスにおける、マトリゲルプラグ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｐｌｕｇ）７８６−０腎臓癌腫誘導性血管新生における、（ＣＲ０６４として規定されるような）、ＣＧ５７０９４−０４に結合する中和抗体の効果
精製されたＣＧ５０７９４−０２および０４は、細胞培養研究において内皮および７８６−０腫瘍細胞の生存を増大する能力を実証した。本発明者らは、ＣＲ０６４に対する中和抗体が、細胞培養研究において、内皮細胞および７８６−０腫瘍細胞の生存を阻害するはずであると仮定する。本発明者らは、これらの抗体が血管増殖のインビボモデルにおいて駆動された７８６−０において抗血管新生効果および抗腫瘍効果を提供し得ると仮定する。この活性は特定の細胞モデルに限定されないが、他の腫瘍細胞株、好ましくはＣＧ５０７９４ポリペプチドを天然に発現する細胞株による血管新生応答に関連するはずである。
【０９５４】
腫瘍誘導性血管新生マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）プラグモデルにおけるＣｒ０６４の効果を評価するために、７８６−０ヒト明細胞腎癌腫を用いる。このマトリゲルプラグアッセイは、ＣＲ０６４の抗血管新生および抗腫瘍効力を評価するためのスクリーニングとして、インビボ条件下で腫瘍誘導性抗血管新生応答の定量可能な測定を提供するように設計される。このようなストラテジーは既に、Ｌｉａｏらによって用いられており、脈管のＥカドヘリンに対する中和抗体が腫瘍誘導性血管新生を阻害したことを示している（Ｌｉａｏ  Ｆ、Ｄｏｏｄｙ  ＪＦ、Ｏｖｅｒｈｏｌｓｅｒ  Ｊ、Ｆｉｎｎｅｒｔｙ  Ｂ、Ｂａｓｓｉ  Ｒ、Ｗｕ  Ｙ、Ｄｅｊａｎａ  Ｅ、Ｋｕｓｓｉｅ  Ｐ、Ｂｏｈｌｅｎ  Ｐ、Ｈｉｃｋｌｉｎ  ＤＪ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｂｙ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２  Ｍａｙ  １；６２（９）：２５６７〜７５）。本発明者らの抗体は、好ましくは活性を有する。なぜなら、それは内皮細胞だけでなく、腫瘍細胞の生存にも影響するからである。
【０９５５】
組織学的評価は、皮下に移植されたマトリゲルプラグの総血管分布像、およびＣＲ０６４による任意の抗血管新生効果を評価する。このモデルにおけるこの抗体の有効性は、以下に記載される確立された組織学的方法によって測定される場合、７８６−０細胞誘導された血管新生の阻害として規定される。
【０９５６】
材料および方法
試験系
種／株：マウスＢａｌｂ／Ｃ無胸腺ホモ接合性ヌード（ｎｕ／ｎｕ）
生理学的状態：正常
年齢／体重の範囲（研究開始時点）：約６〜８週、１８〜２０ｇ
動物の数／性別：全部で２５匹の雌性マウスが必要。
同定：動物の番号を描写する尾の基部のドットによって動物を特定する。適切な色コードを用いて、プロトコール番号、群および動物番号を全てのケージに表示する。
無作為化：体重による
正当化：処置期間内に有意義な有効性結果を検出するのに十分な最小の実験動物を用いるようにこの研究を設計する。
交換：この研究の間に動物を入れ換えない。
【０９５７】
動物のハウジングおよび環境
ハウジング：動物は、ポリカーボネートのマイクロ隔離ケージ中で、ウッドチップの床で１ケージあたりマウス５匹で飼育され、食物および滅菌水ボトルを与えられる。このケージは、実験動物の飼育および使用に関するガイドに引用されるガイドライン、ならびに適用可能な標準的操作手順に従う。
順化：マウスを８日間慣れさせて、自由に食物および滅菌水を与える。適切な健康および適合性を評価するために研究の開始の前に動物を検査する。病気であるか適合していないことが発見される動物はこの研究には割り当てない。
環境状態：研究の経過の間、１２時間明野／１２時間暗野のサイクルを維持する。２０〜２３℃の公称温度範囲で、相対湿度３０％〜７０％をまた維持する。
食物／水および  Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄのげっ歯類食餌および滅菌水を自由に与える。
【０９５８】
Ｃｒ０６４抗体の投与
投与の経路および方法：Ｃｒ０６４は、１週に少なくとも２回ＩＰを服用する。
投与経路の正当化：この経路を用いてこのモデルにおける薬理学的有効性を評価する。
投与された用量：１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ
投与された容積：体重によって調節する、２０ｇマウス／０．２ｍｌ
正体およびロット番号：７８６−０腎臓明細胞腺癌；バッチ番号Ｐ１５ＩＣ
材料の説明：ヒト腎臓明細胞腺癌
供給源：ＡＴＣＣ
特徴／証明書ＡＴＣＣ
貯蔵条件：
安定性／有効期限：液体窒素中での長期保管。使用前４８時間で融解および培養。収集した細胞を、実験室と特別な無菌施設との移動の間４℃で保管する。
【０９５９】
実験のデザイン（設計）
マウスを無作為化して、５つの群に必要な腫瘍細胞株で再構成したマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を移植する。全部で０．５ｍｌの懸濁物を、無胸腺の雌性ヌードマウスの右脇腹に皮下注射する。７８６−０腎細胞癌腫（１．０×１０６細胞）を含有するマトリゲルを、さらなる動物に移植する。７８６−０細胞を含有するマトリゲルを移植した動物は、１日２回、１、５および１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ服用する。動物を７日間モニターして、屠殺し、そしてマトリゲルプラグを画像化して、さらなる組織学的評価のために収集する。
【０９６０】
表 F38a:
【表６２５】
2005520496.tif 000634
【０９６１】
臨床観察／兆候
服用の約６０分後に瀕死程度および死亡率について、マウスを毎日観察する
【０９６２】
体重
全てのマウスの個々の体重を、無作為化および投薬について、毎日記録する。
【０９６３】
動物の死亡または瀕死状態の発見
動物が検死の前に死んだ場合（死亡発見）、検死および組織学的データは含まれず、そして組織は収集されない。
【０９６４】
検死
検死の時点で、動物をＣＯ２窒息によって安楽死させる。覆っている皮膚フラップの外科的除去によってマトリゲルプラグ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｐｌｕｇ）を露出させる。次いで、マトリゲルのデジタル画像を記録する。次いで、マトリゲルプラグを外科的に除去して、以下に記載のように処理する。深い麻酔下でのマウスの頸部脱臼を行い、その後動物を最終処分する。
【０９６５】
次いで、マトリゲルプラグを注意深く切除して、３つの部分に切り分ける。
・１つの部分はＴｉｓｓｕｅＴｅｋ中で急速凍結してクリオカット（ｃｕｒｙｏｃｕｔ）切片に用いる。
・１つの部分は緩衝化ホルマリン中で固定し、次いで切片化のためにパラフィン中に包埋する。
・１つの部分はバックアップとして保管する。急速凍結して−８０℃で保管する。
【０９６６】
肉眼視および組織学
ホルマリン固定したマトリゲル切片：
５〜７μｍの厚みの、１マウスあたり３つの切片を切り取って、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。位相差顕微鏡で切片を検査する。代表的な顕微鏡写真を記録する［２フレーム（１０×および４０×）］。内皮細胞および血管の浸潤を記録する。
【０９６７】
免疫組織化学による血管染色：
凍結したマトリゲルプラグを、Ｃｒｙｏｃｕｔミクロトームで切片にする（５μｍ切片）。１マウスあたり３つの独立した切片を異なるレベルで作製して、染色に用いる。ＢＳＡ（０．１％）を用いて切片をブロックし、次いでフィコトリエンに結合体化したマウスＣＤ３１に対して反応性のモノクローナル抗体と反応させる（製造業者によって推奨されるような希釈）。洗浄した後、抗退色（ａｎｔｉ−ｆａｄｉｎｇ）試薬（Ｖｅｃｔａ  Ｓｈｉｅｌｄ）のもとで、切片を装着して、赤色フィルターを用いてＵＶ顕微鏡の下で観察する。代表的なデジタル画像を捉える（１００×および２００×の倍率の２つの画像）。
【０９６８】
血管密度の形態計測解析：ＣＤ３１染色の免疫蛍光画像を、Ｗｉｌｄら（１）に記載のＳｋｅｌｅｔｉｎｉｚａｔｉｏｎプログラムによって解析する。各々の群について平均の血管密度、節および長さを提供するためにデータを処理する。
【０９６９】
データ解析および報告
統計解析
最終報告  
研究の結論として、結果を完全に報告する。最終報告は、実験設計、局所および全身の効果の説明、体重、死亡率、ならびに肉眼的および組織病理学的知見の結果を含む。全ての原文の報告の形式であって、図、表および走査画像を含むものによってＣｕｒａＧｅｎ標準（ＣｕｒａＳｔａｎｄａｒｄｓ）を確認する。データ提示は以下を含む：
・代表的なカラー顕微鏡写真
・永久的な記録のためのデジタルファイル（ＪＰＥＧまたはＴＩＦＦまたはＰＤＢ）。
１．Ｗｉｌｄ、Ｒ．、Ｓ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｊ．Ｓｅｄｇｅｗｉｃｋ，  ａｎｄ  Ａ．Ｗ．Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ  ２０００．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｖｅｓｓｅｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｂｙ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＶＥＧＦ−ｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．５９：３６８〜７６。
【０９７０】
実施例Ｆ３９：ヌードマウスにおける異種移植片のような７８６−０ヒト腎臓細胞癌腫瘍株増殖に対するＣＵＲ６４の有効性評価
精製されたＣＧ５０７９４−０２および０４は、細胞増殖研究において内皮細胞および７８６−０腫瘍細胞の生存を増大させる能力が実証されている。本発明者らは、ＣＲ０６４に対する中和抗体が、細胞培養研究において内皮細胞および７８６−０腫瘍細胞の生存を阻害するはずであると仮定する。本発明者らは、これらの抗体が腫瘍異種移植片のインビボモデルにおいてもたらされた７８６−０において抗血管新生効果および抗腫瘍効果を提供し得ると仮定する。
【０９７１】
この腫瘍細胞株がヌードマウスにおいて異所性腫瘍異種移植片を生成する能力は、当該分野で公知であり、そしてこれを用いていくつかの因子の抗腫瘍活性が試験されている（Ｐｌｏｎｏｗｓｋｉ  Ａ、Ｓｃｈａｌｌｙ  ＡＶ、Ｎａｇｙ  Ａ、Ｋｉａｒｉｓ  Ｈ、Ｈｅｂｅｒｔ  Ｆ、Ｈａｌｍｏｓ  Ｇ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ＡＮ−２３８．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００  Ｊｕｎ  １；６０（１１）：２９９６〜３００１）。
【０９７２】
この活性は、この特定の細胞モデルに限定されないが、他の腫瘍細胞株、好ましくはＣＧ５０７９４ポリペプチドを天然に発現する細胞株に関連するはずである。
【０９７３】
皮下のインターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびインターフェロン２（ＩＬ−２）のような生物学的化合物と静脈内５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の併用療法は、現在の標準治療であって、転移性腎細胞癌腫を有する患者において長期生存の利点を達成するが、治療的ではなく患者のサブセットにしか影響しない。従って、単独療法としてまたは５−ＦＵとの併用療法において、全体的な応答率、長期生存およびクオリティーオブライフ（生存の質）を増大させる新しい因子を発見することが必要である。
【０９７４】
従って、本発明者らは、７８６−０腫瘍異種移植片単独および５−ＦＵ併用におけるＣＲ０６−４抗体の有効性を試験する。このモデルにおけるこの抗体の有効性は、以下に記載の確立された方法によって測定されるような、単独療法または併用療法としての腫瘍増殖の遅延または成長阻害として規定される。
【０９７５】
試験系
種／株：マウス／ｎｕ／ｎｕ
生理学的状態：正常
試験開始時点の約２０ｇの体重を有する５〜６週齢の動物
年齢／体重の範囲：
動物の供給業者：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ
動物の数／性別：６０／雌
同定：尾に個々に入れ墨をした
無作為化：動物を処置群の割り当ての前に無作為化する。
正当化：異種移植片腫瘍モデルは、抗癌剤の試験のために十分特徴付けられたシステムを示す。
交換：この研究の経過の間に動物を入れ換えない。
【０９７６】
動物のハウジングおよび環境
ハウジング：静置したマイクロアイソレータ。
順化：１週間
環境状態：２１〜２２℃（７０〜７２°Ｆ）および４０％〜６０％湿度で１２時間明野サイクル。
食物／水および  照射した標準的なげっ歯類食餌（ＮＩＨ３１  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）であって以下からなる：１８％タンパク質、５％脂肪；および５％線維；水（逆浸透、１ｐｐｍ  Ｃ１）を自由に。
【０９７７】
Ｃｒ０６４抗体の投与
投与の経路および方法：Ｃｒ０６４は、少なくとも３週間の間１週間に少なくとも２回ＩＰ投薬される。
投与経路の正当化：この経路を用いて、このモデルにおける薬理学的有効性を評価する。
投与用量：１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ
投与された容積：体重によって調節する、２０ｇマウス／０．２ｍｌ
正体およびロット番号：７８６−０腎臓明細胞腺癌；バッチ番号Ｐ１５ＩＣ
材料の説明：ヒト腎臓明細胞腺癌
供給源：ＡＴＣＣ
特徴／証明書ＡＴＣＣ
安定性／有効期限：液体窒素中での長期保管。使用前４８時間で融解および培養。収集した細胞を、実験室と特別な無菌施設との移動の間４℃で保管する。
【０９７８】
実験のデザイン（設計）
順化期間の後、マウスに７８６−０腫瘍の１×１ｍｍ３のフラグメントを皮下移植する。動物を無作為化して個々に特定する。腫瘍が６０〜１００ｍｍ３の容積に達する際に、処置を開始する。Ｃｒ０６４抗体を、以下の用量およびスケジュールで腹腔内に投与する（表１）。マウスを毎日観察して、試験期間全体にわたって毎週２回腫瘍および体重を記録する。
【０９７９】
表 F39a: 研究計画
【表６２６】
2005520496.tif 000635
表 F39b: 研究計画
【表６２７】
2005520496.tif 000636
【０９８０】
実験手順
腫瘍保有動物を処置の開始の前に無作為化する。マウスを体の状態および健康状態について毎日モニターする。触知可能なサイズの塊（６０〜１００ｍｍ３）が存在する時点でＣＲ０６４を用いた処置を開始する。処置スケジュールは、１４日間で毎日２回、１、５または１０ｍｇ／ｋｇのＩＰである。研究全体にわたって、ノギスを用いて週に２回、動物を腫瘍についてモニターする。処置期間中、毎日、そしてその後は毎週２回体重を記録する。
【０９８１】
腫瘍容積を残りの全ての動物について計算し、同様に体重も計算する。データ解析および報告の節に記載された方法論を用いて腫瘍容積を解析する。
【０９８２】
腫瘍移植
腫瘍を、健常な腫瘍保有動物から収集する。標準的な手順を用いて組織をホモジナイズする。トリパンブルーを用いて生存度について細胞をカウントして評価する。無血清培地に細胞を懸濁して、全部で５×１０６細胞をマウスの脇腹に皮下移植する。
【０９８３】
腫瘍測定および容積決定
ノギスを用いて腫瘍増殖を測定して、週に３回記録する。各々の腫瘍について長さおよび幅を測定する。以下の式を用いて腫瘍容積を決定する：
腫瘍重量（ｍｇ）＝ｗ２×ｌ／２
【０９８４】
臨床観察／兆候
有意な臨床兆候、瀕死度および死亡率について毎日動物を観察する。
【０９８５】
動物の死亡または瀕死状態の発見
研究時に動物の死亡率および死亡時間をあらゆる動物について記録する。以下の基準の１つ以上に合致する場合、マウスは瀕死であり屠殺されると規定され得る。
１）２週間内に２０％以上の体重損失。
２）摂食、飲用、運動性、ならびに排尿および／または排便の能力のような正常な生理学的機能を阻害する腫瘍
３）ノギスによって測定される場合、２０００ｍｇの最大寸法を超える腫瘍
４）潰瘍形成した腫瘍、滲出または出血を生じる腫瘍
５）体重減少をもたらす長期の下痢（ｄｉａｒｒｈｅａ）
６）持続性の喘鳴（ｗｈｅｅｚｉｎｇ）および呼吸困難
【０９８６】
動物はまた、うずくまる、猫背の姿勢、麻痺／不全麻痺、腹部膨張、潰瘍形成、膿瘍、痙攣および／または出血：のような臨床的観察によって規定されるように、長期または過度の疼痛また苦痛が存在する場合に、瀕死であるとみなされ得る。
【０９８７】
動物の死亡または瀕死状態の発見
任意の有害な効果または不測の死亡は、獣医におよびＣｕｒａＧｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに直ちに報告される。
【０９８８】
表Ｆ４０：ＰＥ２０１：トランスジェニックマウス作製
マウスにおけるヒト遺伝子のトランスジェニック発現は、得られたタンパク質産物が等価なレセプターに結合して活性化し保存された生物学的機能をもたらす場合に、この遺伝子の産物の機能を決定することを補助するための有用なツールである。ヒトタンパク質を発現するトランスジェニックマウスはまた、インビボにおけるヒトタンパク質に対する抗体の阻害性特性または活性化特性を研究するためのツールとして用いることができる。トランスジェニックマウスの作製および分子特徴は、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ（Ｃｒａｎｂｅｒｒｙ，ＮＪ）によって実施された。
【０９８９】
日本の熊本の熊本大学発生医学研究センターのヤマムラ（Ｙａｍａｍｕｒａ）博士の贈呈によるＳＡＰ（血清アミロイドＰ成分（ＳＡＰ））プロモーターによって駆動されるＣＧ５７０９４−０２遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを作製した。このプロモーターは、遺伝子の発現を駆動して、出生後のマウスにおけるわずかな発現を伴い肝臓におけるタンパク質を生成する。マウスの胚性幹細胞に、ＳＡＰプロモーターおよびＣＧ５７０９４−０２をコードする下流遺伝子からなる直線化ＤＮＡを微量注射した。ＣＧ５７０９４−０２配列は、ＩｇＫ分泌シグナル配列に５’側で隣接し、そしてＶ５／ＨｉｓエピトープをコードするＤＮＡに３’側で隣接する。マウス胚を移植して、遺伝子組み込みについて子孫を解析した。
【０９９０】
Ｓｈａｒｍａ  Ａ．Ｋｈｏｕｒｙ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ  ＡＭ．Ｗｈｉｔｅ  ＳＰ，Ｄｈａｎｊａｌ  ＮＫ，Ｈｕａｎｇ  
Ｗ．Ｐａｕｌｈｉａｃ  Ｃ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＥＪ，Ｍａｎｊｕｌａ  ＢＮ，Ｋｕｍａｒ  Ｒ．
関連記事、リンク
【０９９１】
Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｌｐｈａ−ｅｎｄｏｒｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｍａｇａｉｎｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：  ａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．（トランスジェニックマウスの胚細胞におけるヒトαエンドルフィンおよびマゲイニンの高効率の合成）
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９４  Ｓｅｐ  ２７；９１（２０）：９３３７〜４１。
【０９９２】
創始者（この遺伝子を組み込んだマウス）を、テールゲノムＤＮＡのＰＣＲにおって同定した。血清ＥＬＩＳＡのために４週齢でマウスの尾静脈から血清を採取して、分泌産物が予想される遺伝子の循環におけるタンパク質発現を検査した。二部位の形式で［Ｃｕｒａｍａｂ／ｐｏｌｙｍａｂ／抗Ｖ５タグ−発色におけるアッセイ］を用いて、血清ＥＬＩＳＡを実施した。血清タンパク質陽性マウスを繁殖させて、このタンパク質の比較的均一な発現を有する系統を得た。これらのマウスを表現型解析または疾患モデリングのために用いて、ＣＧ５７０９４−０２の役割およびＣＲ０６４  ｍＡｂの機能的特性またはＰＫの特性を決定することができる。
【０９９３】
他の実施形態
特定の実施形態を本明細書において詳細に開示してきたが、これは、例示のみの目的で例として行なっているのであって、以下の添付の特許請求の範囲に関して限定されるとは解釈されない。詳細には、種々の置換、変更および改変が、特許請求の範囲に規定されるような本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることを本発明者らは意図する。核酸の出発材料、目的のクローン、またはライブラリーの型の選択は、本明細書に記載の実施形態の知識を有する当業者には慣用的な問題であると考えられる。他の局面、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内であると考えられる。提示された特許請求の範囲は、本明細書に開示された本発明の代表である。他の特許請求されていない発明もまた意図される。出願人らは、特許請求の範囲内のこのような発明を遂行する権利を保持する。
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月6日(2004.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005520496000001.app