(57)【要約】本発明は、ヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害することができる化合物を同定する方法であって、Ａｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現する細胞を前記化合物と接触させる工程と、前記化合物の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定する工程と、測定された活性を、調節された条件下で、前記化合物の非存在下において測定された活性と比較し、活性が減少していれば、前記化合物が前記活性を阻害できるものと同定する工程とを備えた方法に関する。治療及び診断用途についても記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害することができる化合物を同定する方法であって、
（iv）Ａｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現する細胞を前記化合物と接触させる工程と、
（ｖ）前記化合物の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定する工程と、
（vi）工程（ii）で測定された活性を、調節された条件下で前記化合物の非存在下において測定された活性と比較し、活性が減少していれば、前記化合物が前記活性を阻害できるものと同定する工程と、
を備えた方法。
【請求項２】
測定される活性が、Ａｘｌ受容体の基質のチロシンリン酸化である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定される活性が、Ａｘｌ受容体の自己リン酸化である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞を前記化合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物と接触させる前記細胞が、メサンギウム細胞であり、測定される活性が、前記メサンギウム細胞の増殖である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物と接触させる前記細胞が、腎臓繊維芽細胞であり、測定される活性が、前記腎臓繊維芽細胞の増殖である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物と接触させる前記細胞が、腎臓繊維芽細胞であり、測定される活性が、前記腎臓繊維芽細胞の細胞外マトリックスにおけるコラーゲンの沈着である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物と接触させる前記細胞が、腎尿細管細胞であり、測定される活性が、前記腎尿細管細胞の増殖である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物と接触させる前記細胞が、腎尿細管細胞であり、測定される活性が、筋繊維芽細胞へのトランス分化（transdifferentiation）である、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触工程（ｉ）における前記細胞が、Ａｘｌ遺伝子によって予めトランスフェクトされている、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記トランスフェクトされる細胞が、一過性又は安定的にトランスフェクトされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（iii）における前記調節された条件が、活性なＡｘｌ遺伝子を欠く細胞を接触させて測定することを備える、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、不活性型の変異Ａｘｌ遺伝子を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ａｘｌ受容体が、配列番号５に記載されている配列の連続したアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ａｘｌ受容体が、配列番号２又は配列番号４の何れかに記載されている配列の連続したアミノ酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ａｘｌ受容体が、細胞内ドメインの生物学的に活性な部分を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がＡｘｌ受容体の活性を阻害する効率が、チロシンキナーゼ受容体ＦＧＦＲ１の活性を阻害する効率より少なくとも２倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物がＡｘｌ受容体の活性を阻害する効率が、ＶＥＲ４、ＫＩＮ２４、ＨＧＦｒ、ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１ｒ、ＩｎｓＲ、及びＡｂｌからなるチロシンキナーゼ受容体群のうちの１以上の活性を阻害する効率より少なくとも２倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記阻害の効率が少なくとも１００倍高い、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
腎症の治療のための医薬の調製における、請求項１に記載の方法によって同定された化合物の使用。
【請求項２１】
前記受容体を前記化合物と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ａｘｌ受容体が固定化されている、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉ）の前に、Ａｘｌ受容体を、Ａｘｌを結合することが知られている第二の化合物と接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ａｘｌ受容体又は前記第二の化合物のいずれかが固定化されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組成物を調製する方法であって、
（iii）請求項１に記載の方法を用いて、ヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害する化合物を同定する工程と、
（iv）前記化合物を担体と混合する工程と、
を備えた方法。
【請求項２６】
前記担体が薬学的に有効な担体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記担体と混合された前記化合物が、薬学的に有効な量で存在する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ある被検体における腎症を診断する方法であって、前記被検体から得たサンプルにおける、Ａｘｌ受容体ポリペプチドのレベルを測定することを備え、腎症に罹患していない被検体における前記レベルに比べて、前記ポリペプチドのレベルが高ければ腎症であることの指標となる方法。
【請求項２９】
前記Ａｘｌ受容体が、配列番号５に記載されている配列の連続したアミノ酸を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ａｘｌ受容体が、配列番号２又は配列番号４の何れかに記載されている配列の連続したアミノ酸を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記腎症が糖尿病性腎症である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記腎症が腎繊維症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが体液から採取される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記体液が血液又は尿である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
複数の化合物をスクリーニングすることによって、ヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害することができる化合物を同定する方法であって、
（ｉ）Ａｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現する細胞を前記複数の化合物と接触させる工程と、
（ii）前記複数の化合物の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定する工程と、
（iii）工程（ii）で測定された活性を、調節された条件下で、前記複数の化合物の非存在下において測定された活性と比較し、活性が減少していれば、前記複数の化合物が前記活性を阻害できるものと同定する工程と、
（ｖ）前記複数の化合物中に存在する何れの化合物がヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害するかを個別に決定する工程と
を備えた方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、２００２年２月１２日に出願された米国仮出願第６０／３５６，３７４号の一部継続出願であって、その利益を享受するものであり、本出願の内容は、参考文献として、その内容が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、腎臓の様々な病変において発現が変化するポリヌクレオチド配列の同定及び単離、これらの単離されたポリヌクレオチドの診断用プローブとしての使用、治療法をスクリーニングするためのプローブとしての使用、並びに繊維症一般、特に腎繊維症や糸球体硬化症（糖尿病性腎症の主徴）を不活化するための標的としての使用に関する。
【発明の背景】
【０００３】
細胞外マトリックスの蓄積と繊維芽細胞の増殖が、繊維症の大きな特徴である。サイトカインと増殖因子、特にβ型トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）の分泌のため、繊維芽細胞の表現型が変化して、細胞外マトリックスタンパク質の蓄積が増加する。損傷の反復により、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織阻害物質のアップレギュレートが引き起こされると、細胞外マトリックスの蓄積が生じやすくなる（Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  ２００１  １１：１４２９−１４４１）。繊維症は数多くの組織（例えば、腎臓、肝臓、肺、心臓）で起こることが知られており、かかる組織中では、損傷その他特定の刺激が初期の段階で急性の炎症を引き起こした後に瘢痕が形成され、通常末期の病状に至る。
【０００４】
サイトカインは、発熱、創傷治癒、炎症、組織修復、繊維症など数多くの基礎的なホメオスタシスプロセスや病態生理的プロセスにとって不可欠である。サイトカインは、増殖、遊走、マトリックス合成など細胞機能の制御において重要な役割を果たしている。創傷や組織繊維症の開始、進行、及び消散の制御において重要な役割を果たしているのは、これらの媒介物質やその下流の標的タンパク質間の複雑な相互作用のバランスないし総合効果であると考えられる。
【０００５】
糖尿病性腎症
糖尿病性腎症（糸球体硬化症と腎繊維症の主徴）は、現代における末期腎臓病の最も一般的な原因であり、透析を受けている集団のうち、糖尿病患者が最も多くを占めている。このような治療は費用がかかり、理想とは程遠い。移植を用いれば、さらによい結果が得られるが、ドナーが著しく不足しているという問題を抱えている。これらの病変の基礎を成す分子的機序の多くが不明であるために、糖尿病性腎症（並びに他の腎臓病変）に狙いを定めた治療法は開発されていない。このような疾病でモジュレートされ、糖尿病性腎症の症状の重篤さに影響を及ぼす必須の標的機能遺伝子を同定することは、診断面および治療面で有用な価値を有する。
【０００６】
腎臓内での病変過程の多くは、糸球体硬化症や繊維症という類似又は同一の形態的変化に至ることが知られている。このことは、種類の異なる損傷が同じ単一の遺伝的プログラムに収斂し、繊維芽細胞の増殖と同細胞による結合組織の様々なタンパク質成分の過剰産生（繊維症の２つの主徴である）とをもたらすことを意味している。さらに、糸球体の基底膜の肥厚には、間質性繊維症が伴い、糸球体硬化症に至る。腎繊維症と糸球体硬化症に関与するタンパク質をコードしている遺伝子は、大まかには、２つのグループに分けることができる。
１．その発現により、これらの変化を惹起させる遺伝子。これらの遺伝子は、病状ごとに特異的であると思われる。
２．その発現が「繊維症又は硬化症プログラム」の実行に必要とされる遺伝子。これらは、繊維症と糸球体硬化症をもたらす全ての腎臓病変に共通であると思われる。
【０００７】
第２グループに属する遺伝子を同定すれば、繊維芽細胞とメサンギウム細胞の増殖及び過分泌を伴う分子的機序を理解するのに役立つはずであり、腎不全を抑制するための薬物を開発するための標的遺伝子となるであろう。このような薬物を用いれば、繊維症と糸球体硬化症の進行を抑制し、遅延させ、防止し、阻止し、又は軽減することが期待される。
【０００８】
糖尿病性腎症の発症を判定する最良の方法は、確立された本疾病の動物モデル中で遺伝子発現の性質を決定することであることが明白である。このようなモデルの例としては、１）ｆａ／ｆａラット（遺伝的にレプチン受容体を欠損しており、進行性の糖尿病性腎症を伴うインスリン抵抗性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）を発症する動物）、２）ＧＫラット（遺伝子操作を施したＮＩＤＤＭ表現型ラット）が挙げられる。腎繊維症が顕著であるが糖尿病の背景は存在しない別の動物モデルは片側性尿管閉塞となり、閉塞から数日以内に間質性繊維症が急速に起こる。
【０００９】
他には、糖尿病性腎臓内の細胞微小環境の様々なパラメータを模倣した条件下におけるヒト繊維芽細胞のインビトロ培養などインビトロモデル系に基づく研究が考えられる。これらには、高濃度のグルコースによる処理（高血糖のモデル化）、低濃度のグルコース、低酸素症（何れも、繊維症と糸球体硬化症後に腎臓に生じる虚血性症状のモデル化）、ＴＧＦ−β（繊維症時に認められる病原因子の１つ）による処理が含まれる。このようなモデル系は、３つの重要な点で、動物モデルを補完するであろう。
１．この系は繊維芽細胞特異的である。このため、数多くの種類の細胞が含有される複雑な組織でしばしば見られる干渉作用が全く存在しない。
２．細胞がヒト由来のものである（動物モデルとは異なる）。
３．損傷が特定しており、かつ様々な密度と持続時間であるため、急性反応と慢性反応の両方を調べることが可能である。
【００１０】
Ａｘｌ受容体
Ａｘｌは、受容体チロシンキナーゼサブファミリーに属する。Ａｘｌは形質膜内在性タンパク質であり、免疫グロブリンλ（ＩｇＬ）とＦＮＩＩＩドメインが並置された細胞外領域及び細胞内ドメイン（そのうちの一部がキナーゼドメインである）を含有する細胞内領域という独特の構造を有している。ＡｘｌはビタミンＫ依存性タンパク質であるＧａｓ６に結合することができ、これによりシグナルを細胞質内に伝達している。Ａｘｌの細胞外ドメインは切断することができ、６５ｋＤａの可溶性細胞外ドメインが放出され得る。切断により受容体のターンオーバーが増大し、部分的に活性化されたキナーゼが生じる(O’Bryan JP, Fridell YW, Koski R, Varnum B, Liu ET.(1995) J Biol Chem.270(2):551-557)。しかし、切断されたドメインの機能は不明である。
【００１１】
Ｇａｓ６リガンドと相互作用すると、Ａｘｌは自己リン酸化され、シグナル伝達現象のカスケードが起こる。このカスケードに関与していることが知られているのは、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｓｒｃ、Ｂａｄ，１４−３−３、ＰＬＣ、ＥＲＫ、Ｓ６Ｋ（分裂促進因子によって制御されるキナーゼ）、及びＳＴＡＴである（これらは各々、異なる細胞株及び／又は系で調べられた）。
【００１２】
ＡｘｌのリガンドであるＧａｓ６は、γ−カルボキシグルタミン酸（ＧＬＡドメイン）が豊富な領域を有しており、本領域によってＣａ＋＋依存性の膜リン脂質への結合が可能となる。Ｇａｓ６は弱い分裂促進因子であり、ＴＮＦによって誘発された細胞毒性によるストレスが付与された又は増殖因子が除去されたＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中で抗アポトーシス効果を有する。ＮＩＨ３Ｔ３では、Ｇａｓ６がＡｘｌに結合することにより、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｓｒｃ、Ｂａｄの活性化がもたらされる。
【００１３】
メセンギアル細胞では、Ｇａｓ６は細胞分裂促進作用を有することが明らかとなっており、糸球体硬化症の進行に何らかの役割を果たしている可能性が示された。さらに、最近、Ｇａｓ６は、メセンギアル細胞の自己分泌増殖因子であること、及び糸球体腎炎のメセンギアル増殖モデル中でＧａｓ６媒介性経路を特異的に遮断することにより、抗凝固因子であるワルファリンはＡｘｌの細胞外ドメインと共同してメサンギアル細胞の増殖を阻害することが示された(Yanagita M, Ishimoto Y., Arai H., Nagai K., Ito T., Nakano T., Salant D.J., Fukatsu A., Doi T. and Kita T.(2002) The Journal of Clinical Investigation 110(2)239-246)。また、Ｇａｓ６は、内皮細胞の生存を促進し、バルーンによる傷害を受けたラットの頚動脈（動脈傷害のモデル）中で６時間から７２時間にわたってアップレギュレートされる。
【００１４】
アンギオテンシンＩＩは、そのＡＴ１受容体を介して、血管平滑筋細胞中のＡｘｌ  ｍＲＮＡとタンパク質受容体を増加させることが示されている(Melaragno MG, Wuthrich DA, Poppa V, Gill D, Lindner V, Berk BC, Corson MA.(1998) Circ Res.83(7):697-704)。ＡＴ１受容体のアンタゴニストであるロサルタンは、Ａｘｌ発現に対するアンギオテンシンの刺激効果を遮断した。３２Ｄ骨髄細胞株中では、Ａｘｌが発現されると、Ｇａｓ６刺激に応じて、細胞が凝集される。この反応には、Ａｘｌキナーゼ活性は不要なので、ヘテロタイプな細胞間機序によって凝集が媒介されるものと推測され、細胞に結合したＧａｓ６は、かかる機序により、隣接細胞上のＡｘｌ受容体と相互作用するものと考えられる。
【００１５】
Ａｘｌ受容体を発現するトランスジェニックマウスは、ＧＭ−ＵＳＦプロモーターの下で、非インシュリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）に伴う表現型特性（高血糖および高インシュリン血症、深刻なインシュリン抵抗性、進行性の肥満、肝リピドーシス、膵島形成不全など）を示す。これらのマウスは、高レベルのＴＮＦ−αを発現することが示された。Ａｘｌのタンパク分解による切断産物（Ａｘｌの細胞外ドメイン（ＥＣＤ））は、さらに重い症状のＮＩＤＤＭ表現型をトランスジェニックマウスにもたらした(Augustine KA, Rossi RM, Van G, Housman J, Stark K, Danilenko D, Varnum B, Medlock E.(1999) J Cell Physiol.181(3):433-447)。
【００１６】
Ａｘｌは、細胞接着、細胞増殖、免疫系のホメオスタシスの制御に関わっていることが示されている(Lu Q and Lemke G(2001) Science 293(5528):306-311)。Ａｘｌが活性化されることにより、以下の現象、すなわち、アポトーシスの阻害、「正常」細胞（形質転換されていない細胞）の増加、繊維芽細胞及び内皮細胞の延命、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の遊走（Ａｘｌキナーゼの不活化により遊走が阻害される）、血管壁内での新生内膜形成の増大(Melaragno MG, Fridell YW, Berk BC。(1999) Trends Cardiovasc Med.(Review)9(8):250-253)、並びに病変形成とアテローム性動脈硬化の進行への関与が観察されている。ノックアウトマウス中にＧａｓ６が欠如すると、急性刺激後の腎毒性が軽減されるので、Ａｘｌは、ＧＡＳ６に対する主要リガンドとして、正常な腎臓中で本プロセスに関わっている可能性が示唆される。さらに、メサンギアル細胞に対するＧＡＳ６の分裂促進効果は、Ａｘｌを介したシグナル伝達によって行われている可能性がある。
【００１７】
Ａｘｌ遺伝子に関して知られていること
Ａｘｌの異名：ＵＦＯ、ＡＲＫ（マウス）
ヒトＡｘｌ遺伝子と遺伝子産物に関連する構造的な情報
ａ．ヌクレオチド配列：
５０１５ｂｐのバリアント１  ｇｉ：１１８６３１２２
４９８６ｂｐのバリアント２  ｇｉ：１１８６３１２４
ｂ．オープンリーディングフレーム：
８９４ａａ（４６１−３１４５ｂｐ）−バリアント１
８８５ａａ（４５９−３１１３ｂｐ）−バリアント２
ｃ．タンパク質配列：８８５ａａ  ｍｗ  １４０ｋＤａ（ヒト）ｇｉ：４５０２３３５
ドメイン：ｇｉ：４５０２３３５、ＳＭＡＲＴにより決定：
ａ．細胞外領域：１−３３ａａ：シグナルペプチド
４１−１３６と１４５−２２４ａａ：（Ｉｇ）
２２５−３１８と３３４−４１５ａａ：２ＦＮＩＩＩドメイン
ｂ．膜貫通ドメイン：４４１−４６３ａａ
ｃ．細胞内ドメイン：配列番号４の５２７−７９４ａａ
細胞内ドメインは、モチーフＬｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ：配列番号６を有するチロシンキナーゼドメインが含有されている（全てのＴｒｙｏ３ファミリーのメンバー中に存在する）。細胞内ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有していることに留意されたい。
Ｔｒｙｏ３ファミリー（Ａｘｌの他に、Ｔｙｒｏ３（Ｓｋｙ又はＲＳＥとも称される）やＭＥＲタンパク質が含まれる）の受容体チロシンキナーゼへの相同性が示されている。
【００１８】
組織分布：本発明の発明者らは、Ａｘｌは、後期胚形成段階にあるマウスの幅広い発育中組織内並びに成体において臓器カプセル及び結合組織構造を形成する細胞内に、異なる構造で発現していることを見出した。
【００１９】
疾病関連パターン：Ａｘｌは、慢性骨髄性白血病関連性の癌遺伝子であり、大腸癌や黒色腫とも関連している。
【００２０】
胚／胎児の発育時の発現パターン：Ａｘｌ遺伝子は、脊椎動物種間で進化学的に保存されており、発育時に間充組織中に発現される。
メサンギウム細胞の増殖は、糸球体の硬化に先行して起こる重要な病理現象と思われる。メサンギウム細胞は細胞外マトリックスを産生するので、糖尿病の腎臓における繊維硬化的な変化に寄与する。Ｇａｓ６は、実験的な糸球体腎炎において、Ａｘｌを介してメサンギウム細胞の増殖を制御することが明らかとなった。Ｇａｓ６のＡｘｌとの相互作用を阻害すると、タンパク尿とメサンギウム細胞の増殖が軽減され、腎機能が回復した（Yanagita M et al., (1999) J Am Soc Nephrol 10:2503-2509;Yanagita M et al., (2001)Am J Pathol, 158:1423-1432）。以下の特許文献、すなわち、米国特許第５，４６８，６３４号、米国特許第６，０８７，１４４号、米国特許第５，５３８，８６１号、米国特許第５，９６８，５０８号、米国特許第６，２１１，１４２号、米国特許第６，２３５，７６９号、ＷＯ９９／４９８９４号、ＷＯ００／７６３０９号、ＷＯ０１／１６１８１号、ＷＯ０１／３２９２６号もＡｘｌその他のチロシンキナーゼ受容体に関する。
Ａｘｌ受容体のモジュレーションが腎疾患、あるいは、より具体的には糖尿病性腎症の診断及び治療に有用であることを教示し又は示唆する従来技術は全く存在していない。
【発明の概要】
【００２１】
本発明の主たる目的は、繊維症を治療するための薬物の開発や事前及び事後診断用途の開発に使用できる新規遺伝子標的を同定し、単離することである。腎疾患を治療するための薬物、より具体的には糖尿病性腎症を治療するための薬物を開発するための新規遺伝子標的を同定単離すること、及びこのような標的を事前診断や事後診断のためのツールとして使用することが、本発明のさらなる目的である。糖尿病性腎疾患の主徴（すなわち、糸球体硬化症と腎繊維症）を治療する薬物を開発するための新規遺伝子標的を同定単離することも本発明のさらなる目的である。
【００２２】
本発明は、インビボとインビトロで、腎症、より具体的には糖尿病性腎症と腎繊維症モデルにおける遺伝子発現のマイクロアレイによる大規模な分析を用いて、新規治療手段と診断手段を開発するためのこれらの新規標的を提供する。好ましくは、本発明は、繊維性の腎臓疾患とその関連病態との間に直接の因果関係を有する遺伝子治療、診断法、治療法のためのアップレギュレーター又はダウンレギュレーター（レスポンダー）遺伝子を同定する。より好ましくは、本発明はＡｘｌ遺伝子を上記モデルにおけるアップレギュレーター遺伝子として同定する。
【００２３】
本発明は、さらに、本明細書においてモジュレータ（すなわち、Ａｘｌに結合し、又はＡｘｌ発現若しくはＡｘｌ活性に対して阻害効果を有する中和抗体、ペプチド、ペプチドミメティクス、小分子、及びその他の薬物などの候補又は化合物又は物質）を同定するためのスクリーニングアッセイと称される方法を提供する。
【００２４】
上記スクリーニングアッセイによって発見されるＡｘｌ受容体を介したシグナル伝達を阻害する化合物又は物質は、メサンギアル細胞増殖をダウンレギュレートし、糸球体硬化症の進行を遅らせるため若しくは抑制するため、又は繊維芽細胞の増殖を抑えるため、細胞外マトリックスの蓄積を阻害するため、腎臓中の繊維性領域の形成を抑え若しくは制限するために、糖尿病性腎症において使用することができるであろう。好ましくは、本発明は、疾病とその関連病態との間に直接の因果関係を有する遺伝子治療、診断法、治療法のためのアップレギュレーター又はダウンレギュレーター（レスポンダー）遺伝子を同定する。より好ましくは、本発明は、上記用途のためにＡｘｌ遺伝子を同定する。
【発明の詳細な説明】
【００２５】
本発明では、精製され、単離され、クローニングされた核酸配列、具体的には、Ａｘｌ受容体をコードし、腎症（より具体的には糖尿病性腎症）並びに繊維症及び糸球体硬化症の腎臓に付随し、本明細書に明記された配列又はこれと相補的な配列若しくは対立遺伝子配列変異を有する核酸配列が開示される。さらに、腎症と関連し、本明細書の配列番号２と４をコードする配列を有する精製され、単離され、クローニングされた核酸配列も開示される。データベースには、
転写物バリアント１：ＮＭ ０２１９１３  ＧＩ：１１８６３１２２
転写物バリアント２：ＮＭ ００１６９９  ＧＩ：１１８６３１２４
という２つの転写バリアントが提供されている。
【００２６】
本明細書で使用する「Ａｘｌ遺伝子」という用語は、配列番号１及び配列番号３のアミノ酸コード領域と好ましくは９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性、さらに好ましくは９８％の相同性を有するＡｘｌ遺伝子のあらゆる相同体又は極めてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（本分野において周知である（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland(1988)、1995年と1998年に更新））でＡｘｌ遺伝子に結合する核酸配列と定義される。配列番号１と配列番号３ともに、ＡＴＧの１８ヌクレオチド上流はアミノ酸コード領域中に存在せず、停止シグナルの下流に存在する多数のヌクレオチドもアミノ酸コード領域中には存在しないことに留意されたい。
【００２７】
本明細書で使用される「Ａｘｌ」又は「Ａｘｌポリペプチド」又は「Ａｘｌ受容体」という用語は、配列番号２、配列番号４、又は配列番号５と好ましくは９０％の相同性、より好ましくは９５％の相同性、さらに好ましくは９８％の相同性を有するＡｘｌポリペプチドのあらゆる相同体として、完全長又はそれらの断片又はそれらのドメインとして、変異体又はスプライスバリアント核酸配列によってコードされるポリペプチドとして、他のポリペプチドとのキメラとして定義される（但し、上述したものはいずれも、Ａｘｌ受容体と同一又は実質的に同一の生物機能を有するものとする）。Ａｘｌポリペプチド又はＡｘｌポリペプチド相同体は、可溶性タンパク質、膜結合型（精製された膜調製物または細胞表面上の何れでもよい）、ビーズ結合型、又はＡｘｌタンパク質又はこれに由来する断片及びポリペプチドを提示する他のあらゆる形態などの様々な形態で存在することができる。Ａｘｌポリペプチド又はＡｘｌ受容体は、配列番号５で表される細胞内ドメインを有している。
【００２８】
Ａｘｌポリペプチドの具体的な断片には、配列番号２及び４のアミノ酸１−５０、５１−１００、１０１−１５０、１５１−２００、２０１−２５０、２５１−３００、３０１−３５０、３５１−４００、４０１−４５０、４５１−５００、５０１−５５０、５５１−６００、６０１−６５０、６５１−７００、７０１−７５０、７５１−８００、８０１−８５０、及び配列番号２のアミノ酸８５１−８９４と配列番号４のアミノ酸８５１−８８５が含まれる。Ａｘｌポリペプチドの具体的な断片には、さらに、配列番号２及び４のアミノ酸２５−７４、７５−１２４、１２５−１７４、１７５−２２４、２２５−２７４、２７５−３２４、３２５−３７４、３７５−４２４、４２５−４７４、４７５−５２４、５２５−５７４、５７５−６２４、６２５−６７４、６７５−７２４、７２５−７７４、７７５−８２４、８２５−８７４、及び配列番号２のアミノ酸８７５−８９４と配列番号４のアミノ酸８７５−８８５が含まれる。
【００２９】
本発明は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、及びＭｅｒを含むＴｙｒｏ３ファミリーに属する他の任意のメンバーを阻害することによって、Ａｘｌの阻害により観察されたものと同様の治療結果が得られ得ることも想定している。
【００３０】
配列が部分配列である場合には、繊維症においてアップレギュレートされた遺伝子のマーカー／プローブとして使用できるであろう。「発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）」と表記されるこれらの部分配列は、一般に、インビボで実際に発現されている遺伝子のマーカーであり、本明細書の実施例の部で確認される。一般に、ＥＳＴは、核コードｍＲＮＡの一部に対応するＤＮＡ配列を備えている。ＥＳＴは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が可能な長さを有しており、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され、ＥＳＴと（一般には、少なくとも９５％の塩基対合を得るのに十分なストリンジェンシーを有する条件下で）ハイブリダイズする遺伝子の一意的な指標となる。ＥＳＴとＥＳＴの機能的有用性についての詳細と総説については、ＷＯ  ９３／００３５３号（参考文献としてその内容全体を本明細書に援用する）をご覧いただきたい。さらに、ＷＯ  ９３／００３５３号には、ＥＳＴ配列をどのように用いて転写された遺伝子を同定することができるかについて記載されている。
【００３１】
本明細書で使用する「標的分子」とは、実際に、Ａｘｌ又はＡｘｌ遺伝子ファミリーのメンバーが結合し、又は相互作用し、又はリン酸化し、又は活性化する分子、例えば、Ａｘｌを発現する細胞の表面上に存在する分子、別の細胞の表面上に存在する分子、細胞膜の内面と会合する分子又は細胞質内分子をいう。Ａｘｌの標的分子は、細胞膜を通じて、Ａｘｌから生じた細胞外シグナル（例えば、Ａｘｌのリガンドが膜結合Ａｘｌ分子に結合することよって生じたシグナル）の細胞中への伝導を促進するシグナル伝達経路の成分であることが多い。前記標的は、例えば、Ａｘｌ由来の下流シグナル伝達を媒介する別の細胞間タンパク質であり得る。
【００３２】
本明細書で使用される「化合物」という用語は、任意の小化学分子、抗体、中和抗体、アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド及びペプチド（ペプチドミメティクスを含む）、ドミナントネガティブ、発現ベクターを含むものと定義される。
【００３３】
ある実施形態では、本発明は、Ａｘｌに結合し、Ａｘｌの活性をモジュレートし、Ａｘｌの発現レベルをモジュレートする候補物質又は化合物をスクリーニングするためのアッセイが提供される。本発明の化合物は、生物ライブラリー（タンパク質、ペプチド等）、空間位置指定可能なパラレル固相又は溶液相ライブラリー、合成ライブラリー法、天然産物ライブラリー等の本分野で公知のコンビナトリアル及び非コンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのうち何れを用いても得ることができる。
【００３４】
Ａｘｌ発現（転写又は翻訳）又はポリペプチド活性のモジュレータは、とりわけ、一般に、２０００ダルトン未満の分子量、より好ましくは１０００ダルトン未満の分子量、さらに好ましくは５００ダルトン未満の分子量を有する小さい化学分子であり得る。これ以外のモジュレータとしては、抗体（好ましくは中和抗体）又は一本鎖抗体を含む抗体の断片、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子、タンパク質、ポリペプチド、及びペプチド（ペプチドミメティクス及びドミナントネガティブを含む）、及び発現ベクターがあり得る。これらのモジュレータは、以下のようにして作用することができる。小さい分子は、発現及び／又は活性に影響を及ぼし得る。抗体−活性のみ。あらゆる種類のアンチセンスは、Ａｘｌ発現に影響を及ぼし得る。ドミナントネガティブとペプチドミメティクス−活性のみ。発現ベクターは、特にアンチセンス又はドミナントネガティブのデリバリーのために用いることができる。
【００３５】
タンパク質に直接結合でき、タンパク質の機能を変化させるために使用できる小分子を用いるアプローチが最近開発された（総説として、Ｂ．Ｒ．  Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１，１１６−１２５）。上述したように、低分子量の有機化合物は、標的細胞の形質膜を相対的に容易に透過できるので、それらを合成するための方法が開発されている。次いで、これらの合成により、多くのタンパク質に対するリガンドを含有するライブラリーが得られる。最近の進歩により、創造的に選択された非常に多様性が増大した新規小有機分子が得られており、これらは、生物系を擾乱するための強力なツールとして用いることができるものと思われる。このような小分子は、タンパク質ファミリーの特定のメンバーを活性化又は不活化するために使用することができる。
【００３６】
分子ライブラリーを合成する方法の例は、例えば、DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909;Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422;Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37:2678;Cho et al.(1993)Science 261:1303;Carrell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061、Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37:1233に記載されている。
【００３７】
化合物のライブラリーは、溶液中（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、又はビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌上（Ｌａｎｄｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、芽胞上（Ｌａｎｄｅｒ  米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１８６５−１８６9)、又はハ゛クテオリオファーシ゛上(Scott and Smith(1990)Science 249:386-390; Devlin(1990)Science 249: 404-406; Cwirla et al.(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382;Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-310)に提示することができる。
【００３８】
本発明の別の実施形態では、前記アッセイは細胞を用いたアッセイであり、本アッセイでは、哺乳動物由来の細胞がキナーゼ活性を有するＡｘｌ構築物によってトランスフェクトされている。前記細胞を化合物に接触させ、化合物がＡｘｌ活性を阻害する能力を調べる。
【００３９】
さらに別の実施形態では、前記アッセイは、活性なＡｘｌを過剰発現する細胞を第二の分子（好ましくはＡｘｌ標的）とともにインキュベートして、アッセイ混合物を形成させることを備える。次いで、本発明のスクリーニング法のうち何れかによって同定した化合物とともにこのアッセイ混合物をインキュベートし、同定された化合物がその標的に対するＡｘｌ活性を阻害する能力を調べる。
【００４０】
このように、本実施形態では、同定された化合物が、Ａｘｌ標的分子（すなわち、前記第二の化合物）と比べて、Ａｘｌに優先的に結合できる能力を測定することによって（すなわち、拮抗的結合の測定）、同定された化合物がＡｘｌと相互作用する能力が調べられる。
【００４１】
別の実施形態では、アッセイは、細胞を利用したアッセイであり、Ａｘｌ受容体又はその断片を発現する細胞をある化合物と接触させることと、前記化合物がＡｘｌの活性をモジュレートする（すなわち、刺激又は阻害する）能力を調べることとを備える。前記化合物がＡｘｌの活性をモジュレートする能力は、例えば、Ａｘｌの酵素活性を測定することによって行うことができる。Ａｘｌの酵素活性の測定は、Ａｘｌ（又はＡｘｌ標的分子）の下流にある細胞タンパク質のチロシンリン酸化を追跡することによって、又は、例えば、代謝によって放射性（３２Ｐ又は３３Ｐのうち何れでもよい）リンで標識されたＡｘｌ発現細胞を測定し、Ａｘｌ標的分子によって刺激された細胞のホスホチロシン特異的な免疫沈降物中への放射活性の蓄積を追跡するレポーターをベースとしたアッセイにより、又はＡｘｌ活性を検出するために蛍光偏光を用いることによって直接行うことができる。
【００４２】
あるいは、Ａｘｌの活性測定は、Ａｘｌの細胞セカンドメッセンジャー及び／又はその下流エフェクターの誘導を検出することによって（すなわち、細胞内遊離Ｃａ２＋イオン、ジアシルグリセロール産生、ＩＰ３生成の増加など）、適切な内在若しくは外在性基質を用いて標的の触媒／酵素活性を検出することによって、（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作用可能に連結されたＡｘｌ反応性の制御要素を備えた）レポーター遺伝子の誘導を検出することによって、又は細胞の応答（例えば、細胞の生存、細胞の分化、又は細胞の増殖）を検出することによって、間接的に行うこともできる。
【００４３】
さらに別の実施形態では、前記アッセイは、組換えＡｘｌ又はその断片を化合物とインキュベートすることと、前記化合物がＡｘｌに結合する能力を測定することとを備えた無細胞アッセイである。前記化合物のＡｘｌへの結合は、上述のように、直接的に又は間接的に測定することができる。例えば、前記アッセイは、Ａｘｌを結合する既知の化合物（すなわち、Ａｘｌ標的分子）とともにＡｘｌをインキュベートして、アッセイ混合物を形成させることを備える。このアッセイ混合物は、さらに、化合物とともにインキュベートされ、前記化合物が、前記既知の化合物（すなわち、標的分子）に比べて、Ａｘｌに優先的に結合する能力が測定される。
【００４４】
さらに、本発明の別の実施形態では、前記アッセイは、Ａｘｌを化合物とともにインキュベートすることと、前記化合物がＡｘｌの活性をモジュレートする（例えば、刺激又は阻害する）能力を測定することとを備えた無細胞アッセイである。前記化合物がＡｘｌの活性をモジュレートする能力の測定は、Ａｘｌの自己リン酸化を追跡することによって、又は、例えば放射性標識された（３２Ｐ又は３３Ｐのうち何れでもよい）ＡＴＰを用いてインビトロでキナーゼアッセイを行い、リン酸化された基質中への放射能の蓄積を測定することによりＡｘｌ基質のチロシンリン酸化を追跡することによって、又は、例えば市販のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓキットを用いて蛍光偏光を使用することによって行うことができる。
【００４５】
本発明の無細胞アッセイには、可溶型のＡｘｌ、膜結合型のＡｘｌ、固定型のＡｘｌを何れも使用することができる。膜結合型のＡｘｌを備えた無細胞アッセイの場合には、膜結合型のＡｘｌが溶液中に維持されるように、可溶化剤を用いることが望ましいであろう。このような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００、ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１１４、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）、又は３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳＯ）などの非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
【００４６】
上記アッセイ法の実施形態の中には、Ａｘｌ又はその標的分子を固定化して、複合化形態の前記タンパク質の一方又は双方を非複合化形態と分離し易いようにするとともに、アッセイの自動化を可能とすることが望ましいものがある。Ａｘｌへの化合物の結合、又は化合物の存在下及び／又は非存在下におけるＡｘｌの標的分子との相互作用は、反応物を含有させるのに適した任意の容器中で行うことができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、微量遠心管が挙げられる。ある実施形態では、前記タンパク質の一方又は双方がマトリックスに結合できるようにするドメインを添加した融合タンパク質を与えてもよい。例えば、グルタチオンセファロースビーズ又はグルタチオンで誘導化したマイクロタイタープレート上に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ａｘｌ融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を吸着させることができ、次いで、前記化合物及び吸着されていない標的タンパク質又はＡｘｌにこれを加えて、複合体の形成に適した条件下で前記混合物をインキュベートすることができる。インキュベーションを行った後、前記ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して未結合の成分を全て除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定化して、例えば、上述のように複合体の形成を直接又は間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、標準的な技術を用いてＡｘｌ結合又は活性のレベルを測定することも可能である。
【００４７】
マトリックス上にタンパク質を固定化するための別の技術も本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、Ａｘｌ又はその標的分子は、ビオチンとストレプトアビジンの抱合を用いて固定化することができる。ビオチン化されたＡｘｌ又は標的分子は、本分野で周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＲａｃｋＦｏｒｄ  Ｉｌｌ）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド）から調製することができ、ストレプトアビジンでコートされた９６ウェルプレートのウェル中に固定化することができる（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ）。あるいは、Ａｘｌ又は標的分子と反応するが、標的分子へのＡｘｌの結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに結合させ、抗体抱合により、前記ウェル中に遊離の標的又はＡｘｌを捕捉することもできる。ＧＳＴ固定化複合体に関して上述した方法以外に、このような複合体を検出する方法としては、Ａｘｌ又は標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出の他、Ａｘｌの酵素活性の検出又はＡｘｌ若しくはその標的分子に付随する酵素活性の検出に依拠した酵素結合アッセイを挙げることができる。
【００４８】
別の実施形態では、Ａｘｌ発現のモジュレータは、細胞を化合物に接触させ、細胞サンプル中でのＡｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を測定する方法で同定される。候補化合物の存在下でのＡｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを、候補化合物の非存在下でのＡｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較する。次いで、この比較に基づいて、候補化合物をＡｘｌ発現のモジュレータとして同定することが可能となる。例えば、候補化合物の非存在下に比べて、候補化合物の存在下でのＡｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が多ければ、該候補化合物はＡｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の刺激物質と同定される。あるいは、候補化合物の非存在下に比べて、候補化合物の存在下でのＡｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が少なければ、該候補化合物はＡｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質発現の阻害物質と同定される。細胞内でのＡｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルは、Ａｘｌ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の検出について本明細書に記載されている方法によって測定することができる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態は、ヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害することができる化合物を同定する方法であって、
（ｉ）Ａｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現する細胞を前記化合物に接触させる工程と、
（ii）前記化合物の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定する工程と、
（iii）工程（ii）で測定された活性を、調節された条件下で前記化合物の非存在下において測定された活性と比較し、活性が減少していれば、前記化合物が前記活性を阻害できるものと同定する工程と、
を備えた、方法を提供する。
【００５０】
本発明のある実施形態では、上述の方法で測定された活性は、Ａｘｌ受容体の基質のチロシンリン酸化又はＡｘｌ受容体の自己リン酸化である。別の実施形態では、前記化合物と接触される細胞はメサンギウム細胞であって、測定される活性は前記メサンギウム細胞の増殖であり、又は前記化合物と接触される細胞は腎臓繊維芽細胞であって、測定される活性は前記腎臓繊維芽細胞の増殖である。さらなる実施形態では、前記化合物と接触される細胞は腎臓繊維芽細胞であって、測定される活性は前記腎臓繊維芽細胞の細胞外マトリックスにおけるコラーゲンの沈着である。さらなる実施形態では、前記化合物と接触される細胞は腎臓の尿細管細胞であって、測定される活性は前記腎臓の尿細管細胞の増殖である。さらに、別の実施形態では、前記化合物と接触される細胞は腎臓の尿細管細胞であって、測定される活性は筋繊維芽細胞へのトランス分化（transdifferentiation）である。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、上記方法の接触工程（ｉ）における前記細胞は、Ａｘｌ遺伝子によって予めトランスフェクト（一過性のトランスフェクトでもよいし、安定的なトランスフェクトでもよい）される。さらに、別の実施形態では、工程（iii）の前記調節された条件は、活性なＡｘｌ遺伝子を欠く細胞を接触させて測定を行う。さらなる実施形態では、工程（ii）の前記調節された条件は、活性なＡｘｌ遺伝子が存在しない類似の細胞又は不活性型の変異Ａｘｌ遺伝子を有する類似の細胞を接触させて比較を行う。
【００５２】
本発明の別の実施形態では、上記方法のＡｘｌ受容体は、配列番号５、又は配列番号２又は配列番号４の何れかに配列が記載されている連続したアミノ酸を有する。さらなる実施形態では、前記Ａｘｌ受容体は、細胞内ドメインの生物的に活性な部分を備える。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、上述した方法の何れかによって同定された化合物は、チロシンキナーゼ受容体であるＦＧＦＲ１、ＶＥＲ４、ＫＩＮ２４、ＨＧＦｒ、ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−１ｒ、ＩｎｓＲ、及びＡｂｌ活性の阻害に比べて少なくとも２倍、より好ましくは５倍、さらに好ましくは１００倍、最も好ましくは２００倍、Ａｘｌ受容体の活性を阻害する。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態では、上記方法によって同定された化合物は、腎症を治療するための医薬の調製に使用することができる。
【００５５】
本発明のさらなる実施形態では、Ａｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現している細胞を前記化合物に接触させる前に、Ａｘｌを結合することが知られている第二の化合物にＡｘｌ受容体を接触させる。別の実施形態では、Ａｘｌ受容体又は第二の化合物のうち何れかを固定化させる。
【００５６】
本発明のある実施形態では、Ａｘｌ遺伝子発現のレベルを減少させることができる化合物を同定する方法であって、
（ｉ）Ａｘｌ受容体を発現することができる細胞を前記化合物に接触させる工程と、
（ii）前記化合物の存在下でＡｘｌ遺伝子の発現レベルを測定する工程と、
（iii）工程（ii）で測定されたレベルを、調節された条件下で、前記化合物の非存在下において測定されたレベルと比較し、レベルが減少していれば、前記化合物が前記活性を阻害できるものと同定する工程と、
を備えた、方法を提供する。
【００５７】
別の実施形態では、上記方法の接触工程（ｉ）における前記細胞は、Ａｘｌ遺伝子によってトランスフェクト（一過性のトランスフェクトでもよいし、安定的なトランスフェクトでもよい）される。さらに、別の実施形態では、工程（iii）の前記調節された条件では、前記化学的化合物の非存在下で同一の細胞を接触させて比較を行う。さらなる実施形態では、工程（ii）の前記調節された条件では、活性なＡｘｌ遺伝子が存在しない類似の細胞又は不活性型の変異Ａｘｌ遺伝子を有する類似の細胞を接触させたときに比較を行う。別の実施形態では、工程（ii）の前に、工程（ｉ）の細胞を、腎症に関連した少なくとも１つの損傷に曝露する。前記損傷は、高血糖、低酸素症、低グルコース濃度、ＴＧＦからなる群から選択することができる。本発明において、前記化合物に曝露される前記細胞は、メサンギウム細胞、腎繊維芽細胞、腎尿細管細胞からなる群から選択することができる。本発明のさらなる実施形態では、上記方法によって同定される化合物は、腎症を治療するための医薬の調製において使用することができる。
【００５８】
本発明の目的は、さらに、ある被検体における腎症を診断する方法であって、前記被検体から得たサンプルにおける、Ａｘｌ受容体をコードするポリヌクレオチドのレベルを測定することを備え、腎症に罹患していない被検体における前記ポリヌクレオチドのレベルに比べて、前記ポリヌクレオチドのレベルが高ければ腎症であることの指標となる方法を提供することである。ある実施形態では、前記診断される腎症は糖尿病性腎症又は腎繊維症であり、前記サンプルは腎臓組織から採取される。
【００５９】
本出願は、複数の化合物をスクリーニングすることによって、ヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害することができる化合物を同定する方法であって、
（ｉ）Ａｘｌ受容体又はＡｘｌ受容体を発現する細胞を前記複数の化合物に接触させる工程と、
（ii）前記複数の化合物の存在下でＡｘｌ受容体活性を測定する工程と、
（iii）工程（ii）で測定された活性を、調節された条件下で、前記複数の化合物の非存在下において測定された活性と比較し、活性が減少していれば、前記複数の化合物が前記活性を阻害できるものと同定する工程と、
（iv）前記複数の化合物中に存在する何れの化合物がヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害するかを個別に決定する工程と、
を備えた方法に関する。
【００６０】
本発明のさらに別の形態では、Ａｘｌタンパク質をツーハイブリッドアッセイ又はスリーハイブリッドアッセイにおける「ベイトタンパク質」として使用して（例えば、米国特許第５，２８３，  ３１７号、Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054 ; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696 ; Brent WO 94/10300）、Ａｘｌに結合し又はＡｘｌと相互作用する他のタンパク質（「Ａｘｌ結合タンパク質」）、Ａｘｌ活性をモジュレートする他のタンパク質を同定するために使用することができる。このようなＡｘｌ結合タンパク質も、例えば、Ａｘｌシグナル伝達経路の上流又は下流要素のように、Ａｘｌによるシグナルの伝達に関わるものと思われる。
【００６１】
ツーハイブリッドシステムは、分割可能なＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとからなる多くの転写因子のモジュラー的な性状に立脚している。要約すると、該アッセイでは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。第一の構築物では、Ａｘｌをコードする遺伝子が、公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合されている。第二の構築物では、未知のタンパク質（「プレイ」又は「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリーから得られるＤＮＡ配列が公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合されている。「バイト」と「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、Ａｘｌ依存性の複合体を形成すれば、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインが近接することになる。これにより、前記転写因子に対して反応性を有する転写制御部位に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能となる。レポーター遺伝子の発現を検出し、機能的な転写因子を含有する細胞コロニーを単離して、Ａｘｌと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用することができる。
【００６２】
本発明は、さらに、上述したスクリーニングアッセイによって同定された新規物質と、腎疾患を治療するための、より具体的には、腎症、特に本明細書に記載されているような糖尿病性腎症を治療するための前記物質の使用とに関する。
【００６３】
本発明は、さらに、Ａｘｌ遺伝子発現のレベルを減少させることができる腎症の治療に有用な化合物を同定する方法を提供する。本方法によれば、Ａｘｌ受容体を発現することができる細胞をある化合物と接触させた後、腎症と関連する少なくとも１つの損傷（ｉｎｓｕｌｔ）又は生理的パラメータに細胞を曝露する。Ａｘｌ遺伝子発現のレベルを対照によって得られたレベルと比較することによって、Ａｘｌ活性に対する前記化合物の阻害効果を知ることができる。
【００６４】
本発明は、さらに、本発明によって同定された発現可能な遺伝子、特にＡｘｌ受容体をコードする遺伝子を少なくとも１つ担持するトランスジェニック動物と細胞株とを提供する。本発明は、さらに、ノックアウト真核生物を提供し、該生物の中では、本発明のプローブによって同定され、以下に記載されているように調製された少なくとも１つの核酸配列がノックアウトされている。
【００６５】
本発明は、腎症の治療を必要とする患者の腎症を治療するの使用するための薬物を発見する方法を提供する。これらの薬物は、治療的に有効な量において、少なくとも１つのタンパク質のアンタゴニストであり、とりわけ、前記核酸によってコードされ又は本明細書中に明記されているアミノ酸配列若しくは本発明のプローブによって与えられるＡｘｌ受容体のアンタゴニストであろう。これらの薬物は、腎繊維症の治療に適しているが、肝臓、肺、心臓など他の繊維症の治療にも有用であろう。これらの薬物は、再狭窄を治療又は予防するため、すなわち平滑筋細胞の増殖を防止又は低減するために使用できるものと思われる。これらの薬物は、内皮細胞の増殖を抑制又は低減することが望まれる癌その他の症状を治療するための抗脈管形成薬として使用することもできるであろう。
【００６６】
本発明のスクリーニングアッセイは何れも、本アッセイにおいて陽性を示す（上述した）化合物を同定する工程を備えることができ、このようにして同定された化合物を医薬として製造する工程をさらに備えることもできる。前記スクリーニングアッセイは、前記化合物が所望の活性を増加するように改良した後に、改良された化合物を医薬に取り込ませる工程を備えることもできる。このような化合物を有する医薬は本発明の一部であるとみなされる。
【００６７】
本発明は、さらに、組成物を調製する方法であって、
（ｉ）少なくとも１つの上記方法によって、ヒトＡｘｌ受容体の活性を阻害する化合物を同定する工程と、
（ii）前記化合物を担体と混合する工程と、
を備えた方法を提供する。
【００６８】
本発明のある実施形態では、上記方法の担体は薬学的に有効な担体であり、前記担体と混合される前記化合物は薬学的に有効な量で存在する。
【００６９】
さらに、本発明は、治療的に有効な量の少なくとも１つの前記核酸配列に対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチド又はＡｘｌ配列若しくはＡｘｌタンパク質に対して誘導されたドミナントネガティブペプチドを患者に投与することによって、繊維症関連病変の治療を必要としている患者の繊維症関連病変を制御する方法を提供する。
【００７０】
本明細書で使用する「ネガティブドミナントペプチド」とは、タンパク質の一部、すなわちペプチドをコードする部分ｃＤＮＡ配列を意味する(Herskowitz I. (1987) Nature(Review)329(6136):219-222)。本ペプチドは、ペプチドを与えたタンパク質とは異なる機能を有することがある。本ペプチドは、野生型タンパク質標的と相互作用してその活性を阻害することができ、あるいは、他のタンパク質と相互作用して、前記野生型標的タンパク質に応じてそれらの活性を阻害することができる。具体的には、ネガティブドミナントとは、細胞中に通常存在する天然タンパク質の活性を阻害して細胞の表現型をモジュレートする（すなわち、細胞の抵抗性を向上させたり、死滅させ易くする）ペプチドの能力を意味する。治療的介入を行う場合には、薬学的組成物の活性成分としてペプチドそのものをデリバーするか、あるいは、ＡＳデリバリーと同じ方法を用いてｃＤＮＡを細胞にデリバーすることも可能である。
【００７１】
アンタゴニスト／制御物質／活性成分は投薬され、本明細書の以下に記載されているように、薬学的に許容される担体中に入れてデリバーされる。本明細書で使用される「アンタゴニスト又は拮抗する」という用語は、最も広い意味で解釈される。拮抗には、遺伝子活性又は遺伝子産物の阻害、不活化、遮断、又は減少をもたらす任意の機序又は治療が含まれ得る。遺伝子又は遺伝子産物の阻害によって、該遺伝子又は遺伝子産物が制御している対応した機能が増加する場合があることに留意すべきである。拮抗工程では、遺伝子産物に対する細胞受容体の遮断や以下に記載されているＡＳ処置を行うことができる。
【００７２】
多くの総説に、ＡＳ技術の主要な特徴とその莫大な治療的可能性が論説されている(Anazodo et al.(1995) Gene 166(2):227-232)。急速に発展している本技術の化学的側面(Crooke ST (1995) Hematol Pathol. (Review) 9(2):59-72; Uhlmann et al. (2000) Methods Enzymol. 313: 268-284.)、細胞的側面(Wagner RW (1994) Nature (Review) 372 (6504) :333-335)、治療的側面(Hanania et al. (1995) Am J Med. (Review) 99(5): 537-552; Scanlon et al. (1995) FASEB J. (Review) 9(13): 1288-1296; Gewirtz AM (1993) Leuk Lymphoma. 1993 ; 11 Suppl 1 : 131-137)に関する総説が存在する。培養された初代細胞及び細胞株においてＡＳヌクレオチド配列をインビトロで使用すること、並びに特定のプロセスを抑圧し、体機能を一過性に変化させるためにこのようなヌクレオチド配列をインビボで投与することに関する豊富な情報が比較的短期間のうちに蓄積した。特定の遺伝子の発現に対してＡＳによる介入を行うには、合成ＡＳオリゴヌクレオチド配列を使用することができる（最近の報告としては、Lefebvre-d’Hellencourt et al. (1995) Eur Cytokine Netw. (Review) 6(1): 7-19; Agrawal S (1996) Trends Biotechnol. (Review) 14(10): 376-387; Lev-Lehman et al. (1997) Blood 89(10): 3644-3653を参照されたい）。本明細書に上述したＡＳ配列に代えて、リボザイムを使用してもよい。これは、化学量論的な条件によりＡＳ療法が制約される場合（Sarver et al. (1990) Gene Regulation and Aids, pp. 305-325）に特に必要とされる。次いで、同じ配列を標的とするリボザイムを使用することができる。リボザイムは、ＲＮＡ触媒能を保有し（Cech TR(1993) Gene(Review)135(1-2):33-36を参照されたい）、標的ＲＮＡ分子中の特定部位を切断するＲＮＡ分子である。
【００７３】
本発明に用いられるリボザイムのタイプは、本分野で知られているとおりに選択される。ヘアピンリボザイムは現在臨床試験中であり、好ましいタイプである。一般にリボザイムは、３０−１００ヌクレオチドの長さである。
【００７４】
ヌクレオチドの治療特性を向上させるために、ヌクレオチドの修飾物又は類縁体を導入することができる。向上した特性には、ヌクレアーゼ耐性の増加及び／又は細胞膜透過能の増加が含まれる。
【００７５】
ヌクレアーゼ耐性が必要な場合には、使用とデリバリーの方法に必要とされるＡＳオリゴデオキシ−ヌクレオチド、ｃＤＮＡ及び／又はリボザイムの生物活性を妨害しない、本分野で公知のあらゆる方法によってヌクレアーゼ耐性が与えられる(Eckstein F (1985) Annu Rev Biochem. (Review) 54:367-402; Spitzer S and Eckstein F (1988) Nucleic Acids Res. 16(24):11691-11704; Woolf et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(7): 1763-1769)。ヌクレアーゼ耐性を増大させるためにオリゴヌクレオチドに施すことができる修飾には、リン酸骨格中のリン又は酸素複素原子を修飾することが含まれる。これらには、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、モルホリノオリゴマーの調製が含まれる。ある実施形態では、４乃至６個の３’末端ヌクレオチド塩基間を連結するホスホロチオエート結合が与えられる。あるいは、全てのヌクレオチド塩基がホスホロチオエート結合によって連結される。生物活性が維持されるが、ヌクレアーゼに対する安定性が実質的に増加される場合には、文献に記載されているその他の修飾を用いてもよい。
【００７６】
本発明には、前記ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの機能に対して実質的に影響を及ぼさない本発明のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドのあらゆる類縁体又は修飾物が含まれる。前記ヌクレオチドは、天然に存在する塩基又は合成によって修飾された塩基から選択することができる。天然に存在する塩基には、アデンン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルが含まれる。オリゴヌクレオチドの修飾塩基には、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル、２−プロピル、及びその他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシン、及び６−アザチミン、プソイドウラシル、４−チオウラシル（４−ｔｈｉｕｒａｃｉｌ）、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、その他８位が置換されたアデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、その他置換されたグアニン、他のアザ及びデアザアデニン、他のアザ及びデアザアデニン、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンが含まれる。
【００７７】
さらに、ヌクレオチドの構造が基本的に改変され、さらに治療又は実験試薬として適する場合には、ヌクレオチドの類縁体を調製することができる。ヌクレオチド類縁体の例は、ＤＮＡ（又はＲＮＡ）中のデオキシリボース（又はリボース）リン酸骨格がペプチド中に見られるものと同様のポリアミド骨格に置換されているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類縁体は、酵素による分解に対して抵抗性を有し、インビボ及びインビトロでの寿命が延長されることが示されている。さらに、ＰＮＡは、ＤＮＡ分子よりも相補的ＤＮＡ配列に強く結合することが示されている。この観察は、ＰＮＡ鎖とＤＮＡ鎖間には電荷の反発が存在しないことが原因であると考えられる。オリゴヌクレオチドに施すことができるその他の修飾には、ポリマー骨格、環状骨格、又は非環式骨格（ａｃｙｃｌｉｃ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）が含まれる。
【００７８】
前記薬学的組成物の活性成分には、本発明を実施するために必要なヌクレアーゼ耐性のあるオリゴヌクレオチド、又は適切な配列及び／又はリボザイムに対して同じ効果を有することが示されたその断片が含まれ得る。ＡＳ配列の組み合わせなど、本発明に開示されている活性成分を組み合わせて使用してもよい。
【００７９】
本発明のＡＳオリゴヌクレオチド（及び／又はリボザイム）及びｃＤＮＡは、リボ核酸又はデオキシリボ核酸ヌクレオチドについて公知のあらゆる方法によって合成することができる。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３８０Ｂ  ＤＮＡ合成装置を使用することができる。断片を使用する場合には、２以上のこのような配列を合成して、本発明で使用するために相互に連結させることができる。
【００８０】
本発明のヌクレオチド配列は、直接又はウイルス若しくは非ウイルスベクターを用いてデリバーすることができる。直接デリバーする場合には、配列にヌクレアーゼ耐性を付与するのが通常である。あるいは、以下に記載されているごとく、前記配列が細胞中で発現されるように、発現カセット又は構築物中に前記配列を取り込ませることができる。前記構築物には、適切な制御配列又はプロモーターを含有させて、標的細胞中で配列が発現できるようにするのが一般である。
【００８１】
本発明のポリペプチドは組換えによって作製することができ（概説として、Marshak et al., 1996 “Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual.”Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996を参照）、類縁体は翻訳後プロセッシングによって作製することができる。グリコシル化の差によって、ポリペプチド類縁体を与えることができる。
【００８２】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの他に、ペプチド及び完全なタンパク質並びにそれらの一又は複数の断片を表す。
【００８３】
本明細書で使用する「機能的に適切な（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ）」とは、分子の生物学的特性を表し、この文脈では、天然に存在するポリペプチド又は核酸分子によって直接又は間接に実施されるインビボエフェクター又は抗原機能又は活性を意味する。エフェクター機能には、受容体結合、任意の酵素活性若しくは酵素調節活性、あらゆる担体結合活性、あらゆるホルモン活性、細胞外マトリックス若しくは細胞表面分子への細胞の接着を促進若しくは阻害する任意の活性、又は任意の構造的な役割、並びに前記核酸配列が機能的タンパク質をコードし、発現可能にすることが含まれるが、これらに限定されるものではない。抗原機能とは、原則的に、天然に存在するタンパク質に対する抗体と交叉反応することが可能なエピトープ又は抗原部位を保有していることを意味する。生物学的に活性な類縁体は、さらに抗原機能を保有することができる（但し、保有する必要はない）ネイティブポリペプチドのエフェクター機能を共有している。
【００８４】
診断において、前記サンプルは、体液から又は組織（好ましくは、腎組織）から採取される。体液は、血液、リンパ液、腹水、漿液、胸水、痰、脳脊髄液、涙液、滑液、唾液、便、精液、尿からなる液体の群から選択され、好ましくは血液又は尿から選択される。Ａｘｌポリペプチドのレベルの測定は、免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、抗体マイクロアレイハイブリダイゼーション、分子標的イメージングからなる群から選択される方法によって行うことができる。このような方法は本分野において周知であり、例えば、免疫組織化学については、M.A. Hayat (2002) Microscopy, Immunohistochemistry and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy, Kluwer Academic Publishers; Brown C (1998):“Antigen retrieval methods for immunohistochemistry”, Toxicol Pathol ; 26(6): 830-1、ウェスタンブロッティングについては、Laemmeli UK (1970):“Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of a bacteriophage T4”, Nature ; 227: 680-685; Egger & Bienz (1994) “Protein (western) blotting”, Mol Biotechnol ; 1(3): 289-305、ELISAについては、Onorato et al. (1998)“Immunohistochemical and ELISA assays for biomarkers of oxidative stress in aging and disease”, Ann NY Acad Sci 20; 854: 277-90、抗体マイクロアレイハイブリダイゼーションについては、Huang (2001) “Detection of multiple proteins in an antibody-based protein microarray system, Immunol Methods 1;255 (1-2): 1-13、分子標的イメージングについては、Thomas (2001). Targeted Molecular Imaging in Oncology, Kim et al (Eds). , Springer Verlagを特に参照されたい。
【００８５】
Ａｘｌポリヌクレオチドのレベルの測定は、ＲＴ−ＰＣＲ分析、インシチュハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドマイクロアレイ、ノーザンブロッティングから選択される方法によって行うことができる。このような方法は本分野において周知であり、例えば、インシチュハイブリダイゼーションについては、Andreeff & Pinkel (Editors) (1999), “Introduction to Fluorescence インシチュ Hybridization: Principles and Clinical Applications”, John Wiley & Sons Inc.、ノーザンブロッティングについては、Trayhurn (1996) “Northern blotting”, Proc Nutr Soc; 55 (1B) : 583-9 and Shifman & Stein (1995) “A reliable and sensitive method for non-radioactive Northern blot analysis of nerve growth factor mRNA from brain tissues”, Journal of Neuroscience Methods ; 59: 205-208を特に参照されたい。
【００８６】
本出願は、ある被検体における腎症（好ましくは糖尿病性腎症）又は腎繊維症を診断する方法であって、前記被検体から得たサンプル中のＡｘｌ受容体ポリペプチドのレベルを測定することを備え、腎症に罹患していない被検体中のレベルに比べてポリペプチドのレベルが高ければ、腎症であることの指標となる方法にも関する。好ましい実施形態では、前記Ａｘｌ受容体は、その配列が配列番号５、配列番号２、又は配列番号４に記載されている連続したアミノ酸を備える。前記サンプルは、体液、好ましくは血液又は尿から採取される。
【００８７】
上記論述は、腎症制御遺伝子を同定し、診断プローブを提供するために本発明の配列を用いることについて実際的な基礎を与える。用いる方法と本発明の有用性は、以下の非限定的な実施例によって実証される。
【００８８】
方法
分子生物学における一般的な方法
本分野で公知の標準的な分子生物学技術で具体的に説明がなされていないものは、概ね、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York and in Birren et al (eds) Genome Analysis : A Laboratory Manual Series, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、及び米国特許第４，６６６，８２８号；米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，８０１，５３１号；米国特許第５，１９２，６５９号、米国特許第５，２７２，０５７号に記載されている方法に従った（参考文献として、本明細書に援用される）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、概ね、PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA(1990)に記載のとおりに行った。インサイチュ（Ｉｎ  ｃｅｌｌ）ＰＣＲをフローサイトメトリーと組み合わせて、特定のＤＮＡとｍＲＮＡ配列を含有する細胞を検出するために使用することができる（Ｔｅｓｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｌｏｏｄ  ８７：３８２２）。
【００８９】
免疫学における一般的な方法
本分野で公知の標準的な免疫学の方法で具体的に説明がなされていないものは、概ね、Stites et al (eds), Basic and Clinical Immunology (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、及びMishell and Shiigi (eds), Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co. , New York (1980)に従っている。
【００９０】
イムノアッセイ
一般に、ＥＬＩＳＡは、必要に応じて、サンプルを評価するために用いられるイムノアッセイの一種である。ＥＬＩＳＡアッセイは、当業者に周知である。本アッセイには、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を使用することができる。必要に応じて、当業者に公知であるように、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの他のイムノアッセイを用いることもできる。利用可能なイムノアッセイが、特許及び科学文献に数多く記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号、第５，２８１，５２１号やSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor, New York, 1989を参照されたい。
【００９１】
抗体の作製
本明細書で使用する「抗体」という用語には、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）とポリクローナル抗体が含まれるほか、抗体機能活性を有し、抗体から調製することができる抗体断片も含まれ、当業者に公知の方法によって調製されるＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖとｓｃＦｖが含まれる（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）。抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、又は組換えであり得る。
【００９２】
抗体は、免疫原若しくはその一部、例えば、前記配列を基礎とした合成ペプチドに対して又はクローニング技術による組換えによって調製するのが便利であり、天然遺伝子産物及び／又はその一部を単離し、免疫原として使用してもよい。概ね、Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, and Borrebaeck (1992), Antibody Engineering-A Practical Guide, W.H. Freeman and Co. , NYに記載されているような当業者に周知の標準的な抗体作製技術によって、抗体を作製するために免疫原を使用することができる。当業者に公知の方法によって、抗体から抗体断片を調製することもでき、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖが含まれる。
【００９３】
ポリクローナル抗体を作製する場合、一般には、必要に応じて担体に結合させたアジュバントとともに、免疫原又は免疫原断片を用いてウサギ又はヤギなどの宿主を免疫し、免疫原に対する抗体を血清から採集する。さらに、ポリクローナル抗体が単一特異的となるようにポリクローナル抗体を吸収させることができる。すなわち、交叉反応性のある抗体が血清中に残存せず、抗体が単一特異的となるように、関連免疫原に対して血清を吸収させることができる。
【００９４】
モノクローナル抗体を作製する場合、適切なドナー（一般にはマウス）を免疫原により過剰免疫し、脾臓の抗体産生細胞を単離する技術が用いられる。これらの細胞を骨髄腫細胞などの不死化細胞に融合して、必要な抗体を分泌する不死化された融合細胞ハイブリッドを得る。次いで、細胞を大量に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取して使用する。
【００９５】
組換え抗体（概略は、Huston et al. (1991) “Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proteins”in Methods in Enzymology (JJ Langone, ed., Academic Press, New York, NY) 203: 46-88; Johnson and Bird (1991) "Construction of single-chain Fvb derivatives of monoclonal antibodies and their production in Eschericha coli" in Methods in Enzymology (JJ Langone, ed.; Academic Press, New York, NY) 203: 88-99; Mernaugh and Mernaugh (1995) "An overview of phage-displayed recombinant antibodies" in Molecular Methods In Plant Pathology (RP Singh and US Singh, eds.; CRC Press Inc. , Boca Raton, FL: 359-365）を作製する場合には、動物の抗体産生Ｂリンパ球又はハイブリドーマ由来のメッセンジャーＲＮＡを逆転写して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得る。抗体ｃＤＮＡ（完全長又は部分長の何れでもよい）を増幅し、ファージ又はプラスミド中にクローニングする。前記ｃＤＮＡは、分離され又はリンカーによって連結された重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの部分長であってもよい。適切な発現系を用いて、抗体又は抗体断片を発現させて組換え抗体を得る。抗体ｃＤＮＡは、適切な発現ライブラリーをスクリーニングすることによっても取得することができる。
【００９６】
前記抗体は、本分野において周知であるように、固相支持基材に結合させ若しくは検出可能な部分を抱合し又は結合と抱合の両方を施すことができる（蛍光部分又は酵素部分の抱合に関する一般的な論述については、Johnstone & Thorpe(1982), Immunochemistry in Prctice, Blackwell Scientific Publications, Oxfordを参照）。固相支持基材への抗体の結合も本分野において周知である（一般的な論述については、Harlow and Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, New York、Borrebaeck (1992), Antibody Engineering-A Practical Guide, W.H. Freeman and Co.を参照）。本発明で想定される検出可能な部分には、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、１４Ｃ及びヨウ素化などの蛍光、金属、酵素及び放射性マーカーが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
組換えタンパク質の精製
標準的な精製としては、Marshak et al.(1996), “Strategies for Protein Purification and Characterization. A laboratory course manual.”CSHL Pressを参照されたい。Ａｘｌタンパク質の作製に使用する具体的な精製プロトコールは、実施例の部に記載されている。
【００９８】
トランスジェニック及びノックアウト法
本発明は、トランスジェニック遺伝子及び多型遺伝子動物及び細胞（細胞株）モデル並びにノックアウトモデルを提供する。これらのモデルは、本分野において公知の標準的な方法を用いて、米国特許第５，４８７，９９２号、第５，４６４，７６４号、第５，３８７，７４２号、第５，３６０，７３５号、第５，３４７，０７５号、第５，２９８，４２２号、第５，２８８，８４６号、第５，２２１，７７８号、第５，１７５，３８５号、第５，１７５，３８４号、第５，１７５，３８３、第４，７３６，８６６号、並びにBurke and Olson (1991)“Preparation of Clone Libraries in Yeast Artificial- Chromosome Vectors” in Methods in Enzymology, 194, “Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology”, eds. C. Guthrie and G. Fink, Academic Press, Inc. , Chap.17: 251-270; Capecchi (1989) "Altering the genome by homologous recombination", Science, 244: 1288-1292; Davies et al. (1992) "Targeted alterations in yeast artificial chromosomes for inter-species gene transfer", Nucleic Acids Research, 20(11) :2693-2698 ; Dickinson et al. (1993) "High frequency gene targeting using insertional vectors", Human Molecular Genetics, 2(8): 1299-1302; Duff and Lincoln (1995) "Insertion of a pathogenic mutation into a yeast artificial chromosome containing the human APP gene and expression in ES cells", Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders Khalid Iqbal (Editor), James A. Mortimer (Editor), Bengt Winblad (Editor), Henry M. Wisniewski (Editor); Huxley et al. (1991) "The human HPRT gene on a yeast artificial chromosome is functional when transferred to mouse cells by cell fusion", Genomics, 9:742-750; Jakobovits et al. (1993)"Germ-line transmission and expression of a human-derived yeast artificial chromosome", Nature, 362:255-261 ; Lamb et al. (1993)"Introduction and expression of the 400 kilobase precursor amyloid protein gene in transgenic mice", Nature Genetics, 5:22-29; Pearson and Choi (1993) Expression of the human b-amyloid precursor protein gene from a yeast artificial chromosome in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90:10578-10582; Rothstein, (1991) "Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast" in Methods in Enzymology, 194, "Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology", eds. C. Guthrie and G. Fink, Academic Press, Inc. , NY, Chap. 19:281-301; Schedl et al.(1993) "A yeast artificial chromosome covering the tyrosinase gene confers copy number- dependent expression in transgenic mice", Nature, 362:258-261 ; Strauss et al. (1993) "Germ line transmission of a yeast artificial chromosome spanning the murine a1 (I) collagen locus", Science, 259: 1904-1907に記載されているように構築される。さらに、PCT特許出願WO 94/23049、WO 93/14200、WO 94/06908、WO 94/28123にも情報が提供されている。
【００９９】
さらに、ヒト導入遺伝子を直接与える代わりに、１つの親株には、導入遺伝子を近似するように、遺伝子ターゲッティングによって改変された相同的な内在遺伝子を与えてもよい。すなわち、内在遺伝子は、「ヒト化」及び／又は変異されている（Reaume et al.(1996) J Biol Chem.271(38):23380-23388）。動物とヒトの配列が実質的に相同であれば、「ヒト化」遺伝子は不要であることに留意しなければならない。トランスジェニック親は過剰発現された配列（非変異配列又は変異配列のうち何れでもよく、必要に応じてヒト化されているか、あるいはヒト化されていない）を担持することもできる。従って、本明細書において「導入遺伝子」という用語は、これらの可能性を全て表すものとして使用される。
【０１００】
さらに、各トランスジェニック親由来の導入遺伝子を担持し、本分野で知られているように初代細胞培養又は細胞株を確立するために使用される細胞をその子孫から単離することができる。
【０１０１】
適切な場合、親株は前記導入遺伝子に関してホモ接合となろう。さらに、必要に応じて、前記導入遺伝子に対して相同なゲノム中の内在性非導入遺伝子は、非発現性であろう。本明細書において、「非発現性（ｎｏｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅ）」という用語は、前記内在性遺伝子が発現されず、かかる非発現が子孫に遺伝することを意味する。例えば、本分野で公知の方法によって、前記内在性相同遺伝子を「ノックアウト」することができる。あるいは、前記導入遺伝子のうち１つを受け取った親株が内在性相同遺伝子に変異を担持して、これを非発現にすることもできる。
【０１０２】
遺伝子治療
本明細書において使用する「遺伝子治療」とは、目的の遺伝物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主に導入して、遺伝性又は後天性疾患又は症状表現型を治療又は予防することを意味する。前記目的の遺伝物質は、インビボでその産生が望まれる産物（例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能的ＲＮＡ、ＡＳ）をコードする。特に、アンチセンス分子（アンチＡｘｌポリヌクレオチド）の遺伝子治療における使用は、本発明の抗繊維症の形態に従って用いられる。
【０１０３】
本発明の遺伝子治療は、インビボ又はエキソビボで行うことができる。エキソビボ遺伝子治療には、患者細胞の単離と精製、治療遺伝子の導入、遺伝的に改変された細胞の患者内への再導入が必要とされる。改変されたレトロウイルスなどの複製欠損ウイルスは、このような細胞中に治療遺伝子を導入するために使用することができる。例えば、マウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）は、遺伝子治療の臨床試験において周知のベクターである。例えば、Boris-Lauerie et al., Curr.Opin.Genet.Dev.,3,102-109(1993)を参照。
【０１０４】
これに対して、インビボ遺伝子治療には、患者の細胞の単離と精製は不要である。治療遺伝子は、患者に投与するために、リポソームやBerkner, K.L., in Curr. Top. Microbiol. Immunol. , 158, 39-66 (1992)に記載されているようなアデノウイルス又はMuzyczka, N. , in Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992)及び米国特許第５，２５２，４７９号に記載されているようなアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどの複製欠損ウイルス中に「パッケージ」するのが通例である。別の実施形態では、宿主遺伝子に欠陥があれば、遺伝子をインシチュで修復する(Culver (1998)“Site-Directed recombination for repair of mutations in the human ADA gene” (Abstract) Antisense DNA & RNA based therapeutics, Coronado, CA)。別のアプローチは、血流又は筋肉組織中に治療用遺伝子を直接注入する「裸のＤＮＡ」の投与であり、例えば、治療用遺伝子は、ＤＮＡで被覆された金粒子を用いた微粒子銃によって標的組織中に導入される。遺伝子治療ベクターは、本分野で公知の方法、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）、又は定位的注入（例えば、Chen et al.(1994)PNAS 91:3054-3057）によって、概ね、Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, New York (1989, 1992), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995);Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995);Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988);及びGilboa, E et al. (1986) Transfer and expression of cloned genes using retroviral vectors. BioTechniques 4(6):504-512に記載されているように、被検体にデリバーすることができ、これらのベクターには、例えば安定的な又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、組換えウイルスベクターによる感染が含まれ得る。さらに、中枢神経系に関するベクターについては米国特許第４，８６６，０４２号を、陽性−陰性選択法については米国特許第５，４６４，７６４号及び５，４８７，９９２号も参照されたい。
【０１０５】
遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、許容される希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含ませることができ、あるいは、その中に遺伝子デリバリー賦形剤が埋め込まれた徐放マトリックスを備えることができる。あるいは、組換え細胞から無傷の完全な遺伝子デリバリーベクター（例えば、レトロウイルスベクター）を製造できる場合には、前記薬学的調製物は、遺伝子デリバリーシステムを生成する１以上の細胞を含むことができる。
【０１０６】
本発明の遺伝子治療に有用な細胞種には、リンパ球、肝細胞、筋芽細胞、繊維芽細胞、網膜細胞などのあらゆる眼の細胞、上皮及び内皮細胞が含まれる。好ましくは、前記細胞は、治療すべき患者から得たＴリンパ球、肝細胞、あらゆる眼の細胞又は呼吸器若しくは肺の上皮細胞である。肺の上皮細胞のトランスフェクションは、リポソーム、ＤＮＡ−タンパク質複合体又は複製欠損アデノウイスル中に存在するＤＮＡベクターの噴霧調製物を吸入することによって行うことができる。例えば、米国特許第５，２４０，８４６号を参照されたい。遺伝子治療の対象についての総説に関しては、一般に、教本“Gene Therapy”, August et al. Advances in Pharmacology 40, Academic Press, 1997を参照されたい。
【０１０７】
遺伝子産物／治療剤（化合物）のデリバリー
本発明の化合物は、各患者の臨床症状、投与の部位と方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重、医療従事者にとって公知のその他の要因を考慮に入れ、適正な医療行為に従って投与し、服用される。本明細書において薬学的に「有効な量」とは、このように、本分野で公知のかかる検討によって決定される。前記量は、生存率の改善若しくは回復の迅速化、又は症候や当業者によって適切な基準として選択されたその他の指標の改善若しくは消去など（これらに限定されない）の改善を達成するために有効な量でなければならない。
【０１０８】
本発明の方法では、本発明の前記化合物は、様々な方法で投与することができる。本発明の化合物は、化合物として又は薬学的に許容される塩として投与することができ、単独で又は薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、及び賦形剤と組み合わせた活性成分として投与することができることに留意しなければならない。前記化合物は経口、皮下、又は非経口的に投与することができ、非経口投与には、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内投与、並びにくも膜下内及び注入技術が含まれる。前記化合物のインプラントも有用である。治療を受ける前記患者は、温血動物であり、特に、ヒトを含む哺乳動物である。一般に、薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント及び賦形剤並びにインプラント担体とは、本発明の活性成分と反応しない不活性な無毒の固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質を指す。
【０１０９】
本明細書に例示されているマウスその他の実験動物に比べて、ヒトは長期にわたり治療を受けるのが一般的であり、治療の長さは、病気経過の長さや薬物の効力に比例する。投薬は、単回投薬でもよいし、あるいは、数日間にわたる複数回投薬でもよいが、単回投薬が好ましい。
【０１１０】
本発明の化合物を非経口的に投与する場合には、単位用量の注射可能な形態（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン）中に調合するのが一般的であろう。注射に適した薬学的調合物には、無菌水溶液又は分散液及び注射可能な無菌溶液又は分散液に戻すための無菌粉末が含まれる。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。
【０１１１】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散液の場合には必要とされる粒径を維持することによって、及び界面活性剤を用いることによって維持することができる。化合物組成物用の溶媒系として、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、又はピーナッツ油などの非水性賦形剤やミリスチン酸イソプロピルなどのエステルを使用してもよい。さらに、抗微生物防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、緩衝液など前記組成物の安定性、無菌性、等張性を増大させる様々な添加物を加えることもできる。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤や抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸）によって確保することができる。多くのケースで、例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましいであろう。吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを使用することによって、注射可能な医薬形態を長時間吸収させることができる。しかしながら、本発明では、使用する全ての賦形剤、希釈剤、又は添加剤が前記化合物に適合しなければならないであろう。
【０１１２】
無菌の注射可能な溶液は、所望により、他の様々な成分を加えた必要量の適切な溶媒中に、本発明を実施する際に使用される前記化合物を取り込ませることによって調製することができる。
【０１１３】
本発明の薬理学的調合物は、様々な賦形剤、アジュバント、添加物、希釈剤などの任意の適合的な担体を含有する注射可能な調合物中に入れて患者に投与することができ、あるいは、本発明で使用する化合物は、徐放性の皮下インプラント又は標的デリバリーシステム、たとえばモノクローナル抗体、ベクターによるデリバリー、イオン導入、ポリマーマトリックス、リポソーム、及びミクロスフェアの形態で、非経口的に患者に投与することができる。本発明において有用なデリバリーシステムの例には、米国特許第５，２２５，１８２号、第５，１６９，３８３号、第５，１６７，６１６号、第４，９５９，２１７号、第４，９２５，６７８号、第４，４８７，６０３号、第４，４８６，１９４号、第４，４４７，２３３号、第４，４４７，２２４号、第４，４３９，１９６号、及び第４，４７５，１９６号に記されているものが含まれる。これ以外のこのようなインプラント、デリバリーシステム、及びモジュールは、当業者に周知である。
【０１１４】
本発明で使用される前記化合物の薬理学的調合物は、患者に経口投与することができる。化合物を錠剤、懸濁液、溶液、エマルジョン、カプセル、粉末、シロップなどに入れて投与するなどの慣用法を使用することができる。前記化合物を経口又は静脈注射でデリバーし、生物活性を保持する公知の技術が好ましい。
【０１１５】
ある実施形態では、本発明の前記化合物は、血液レベルを適切なレベルにするためにまず静脈内注射によって投与することができる。次いで、患者の血液レベルを経口投薬形態によって維持するが、患者の症状に応じて、上述のように、他の投与形態を使用することも可能である。投与すべき量は、治療を受ける患者ごとに異なり、１日当り約１００ｎｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１０ｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまで変動する。
【０１１６】
本出願を通じて、様々な文献が著者と年度によって参照されており、米国特許を含む特許が番号によって参照されている。これらの文献と特許の開示内容全体は、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、本出願に参考文献として援用される。
本発明を例示的に説明してきたが、これまで使用してきた用語は、限定なものではなく記述的な性質で解釈されることを意図していることを理解しなければならない。
上記教示に照らして、本発明に数多くの修飾及び変形を加えることが可能であることが明らかである。従って、具体的に記載されていなくても、記載されている発明の範囲の中で、本発明を実施できることを理解しなければならない。
【実施例】
【０１１７】
例１
マイクロアレイハイブリダイゼーション実験によるＡｘｌ過剰発現の確認
本発明によって、マイクロアレイハイブリダイゼーション法を利用して、糖尿病性腎症および腎線維症で異なる制御を受けている遺伝子を探索した。
マイクロアレイに基づいた遺伝子発現の分析は、選択された刺激を与えて、線維症の主徴である細胞外コラーゲンの蓄積と増殖に変化が生じたヒト線維芽細胞の分析に基づくものであった。本発明においては、特異的な「線維症」ＤＮＡチップをまず調製し、次いで、１９種類の異なるプローブを用いてマイクロアレイハイブリダイゼーション実験を行った。独自のアルゴリズムによりその結果を分析し、バイオインフォマティクス及び科学文献を用いて、選択した遺伝子セットについて分析を行った。
【０１１８】
特異的「線維症」ＤＮＡチップの調製
譲受人のＳＤＧＩ法（ＰＣＴ特許公開番号  ＷＯ  ０１／７５１８０）に従って、増殖を停止させたヒト線維芽細胞から専用のヒト「線維症」ＤＮＡチップを調製した。下表１に記述した処理を行い、増殖を停止させた。
【０１１９】
【表１】
2005517412.tif 000002
【０１２０】
特に断らない限り、ヒト線維芽細胞（ＨＦ）は全て、処理前に１５回の継代を行ったものであった。処理を行った全ＨＦからＲＮＡを調製、保存し、このＲＮＡを用い、譲受人独自のＳＤＧＩ法によってライブラリーを調製した。このチップには、アポトーシス、細胞毒性及び複製する細胞の老化への関与が知られている遺伝子をコードするヒトＥＳＴも含有されていた。
【０１２１】
線維芽細胞の培養
正常ヒト胎児肺線維芽細胞（ＷＩ−３８、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ）を培養し、１０％不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで継代培養した。２５ｃｍ２の組織培養フラスコ中で、コンフルエントになるまで線維芽細胞を増殖させ、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃にてトリプシン処理（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含有しないハンクス平衡塩溶液に溶解させた０．５％トリプシン−ＥＤＴＡ）を行った後に、継代培養を行った。各フラスコに２ｍｌのトリプシンを添加し、５分間インキュベーションを行い、次に、その培養物を遠心（５分間、１０００ｒｐｍ）し、新鮮な培養液をペレットに添加した。スプリッティング条件は、１：４−１：６であった。
線維芽細胞増殖及び／又は細胞外マトリックス成分（主にコラーゲン）の合成促進が線維化疾患の主徴であるので、様々な処理方法で処理した線維芽細胞をインビトロで培養し、増殖とコラーゲン合成の速度をともに調べた。
【０１２２】
線維芽細胞増殖アッセイ
ニュートラルレッド（ＢｉｏＲａｄ）を用いた染色により、サブコンフルエント状態の線維芽細胞の増殖速度を評価した。２００μｌの成分補充済みＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳを添加した９６穴プレート（６Ｘ１０３／ウェル）に線維芽細胞を播種した。一晩培養した後、成分補充済みＤＭＥＭ／２％  ＦＢＳでウェルを２回洗浄した。次いで、２００μｌの成分補充済みＤＭＥＭ／２％  ＦＢＳ中に、ＴＧＦ−β（２−２０ｎｇ／ｍｌ）又は１００ｍＭの濃度のメシル酸デフェロキサミン（ＤＦＯ、化学的低酸素症を引き起こす）のうち何れかを、１６時間、２４時間、７２時間又は５日間にわたって添加した。
【０１２３】
グルコース処理の場合、一晩培養後、成分補充済みのグルコース非含有ＤＭＥＭ／２％  ＦＢＳを用いて、細胞を含有するウェルを２回洗浄した。無グルコースの成分補充済みＤＭＥＭ／２％ＦＢＳ中にストック溶液（１１０ｍＭ）を溶解させて、実験で用いる濃度（５．５ｍＭ、１５ｍＭ、２７．５ｍＭ、又は５５ｍＭ）のグルコースを調製した。調製したグルコース溶液を線維芽細胞培養物に添加して２４時間又は７２時間培養を行った。
【０１２４】
インキュベーション終了時に、細胞を１００μｌの１％ニュートラルレッドで２時間染色した。冷ＰＢＳで洗浄した後、２００μｌのエタノール−Ｓｏｒｅｎｓｏｎ緩衝溶液（１：１）で線維芽細胞単層を１０分間固定した。自動分光光度計で光学密度を測定した（λ＝５４０ｎｍ）。
【０１２５】
コラーゲン産生アッセイ
コラーゲンタンパク質への［３Ｈ］−プロリン取り込みにより、コンフルエントな線維芽細胞単層によるコラーゲン産生を評価した。２４ウェルの組織培養プレートに線維芽細胞を播種し（２Ｘ１０４ウェル）、１ｍｌの成分補充済みＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中でコンフルエントになるまで増殖させた。
【０１２６】
コンフルエント状態の線維芽細胞培養物を、調製した溶液とともに、２４時間又は４８時間インキュベートした。次に、［３Ｈ］−プロリン（１０μＣｉ／ウェル）を添加し、さらに２４時間培養をインキュベートした。インキュベーション終了時に、培養液を除去し、コラゲナーゼ存在下又は非存在下で１８時間インキュベートし、その後５０％及び１０％ＴＣＡで沈殿させた。コラゲナーゼを加えずにインキュベートしたサンプル中の総［３Ｈ］プロリン−含有タンパク質と、コラゲナーゼ消化後に残存した［３Ｈ］プロリン−含有タンパク質との差からコラーゲン産生量を求めた。各ウェル中の細胞数を求めるために、実験最終日に線維芽細胞をトリプシン処理により剥離させ、血球計算盤を用いて数えた。
【０１２７】
マイクロアレイハイブリダイゼーション用のプローブは、これらの処理済線維芽細胞から得た。本発明では、グルコース欠乏又は低酸素状態（繊維症の腎臓をもたらす虚血状態をモデル化したもの）、高グルコース（糖尿病性高血糖をモデル化したもの）及びＴＧＦ−β誘導（成長因子及びサイトカインのアンバランスを特徴とする線維化状態をモデル化したもの）など、糖尿病性腎症の進行に関連する処理を用いた。
【０１２８】
さらに具体的に述べると、ヒト線維芽細胞は、以下のように処理した。
１．４種類の濃度のグルコース（５．５、１５、２７．５、又は５５ｍＭ）で２４時間及び７２時間処理
２．２−２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで２４時間又は７２時間処理
３．５％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌのβ−アミノプロプリオニトリル、及び５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含有する０．５ｍｌのＤＭＥＭ（改変ＤＭＥＭ）中に溶解させた１００ｍＭの濃度のＤＦＯ、デフェロキサミンで２４、４８及び７２時間処理。
【０１２９】
これらの培養線維芽細胞の増殖速度分析から、無グルコース培地及び５５ｍＭ  グルコース中で２４時間線維芽細胞を培養すると、対照群の培養物と比較して、増殖速度がそれぞれ２０％及び３０％低下することが分かった。様々な濃度のグルコース（５．５ｍＭから２７．５ｍＭ）を添加しても、対照群と比較して線維芽細胞の増殖に対して実質的な影響はなかった。ＤＦＯを添加した後、線維芽細胞の増殖が顕著に低下した（インキュベーション１６時間後に２０％減少し、処置から５日後には８０％減少した）。２及び２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＧＦ−βを添加した場合、線維芽細胞の増殖速度は２４時間の処理後に、約６０％上昇した。
【０１３０】
コラーゲン合成速度については、全ての処理（５５ｍＭ  グルコースを除く）によって、線維芽細胞によるコラーゲン産生が増加した。最も顕著な効果は、２−２０ｎｇ／ｍｌの濃度ＴＧＦ−βを添加した後に観察され、コラーゲン産生は１１０％−１８０％増加した。
【０１３１】
次の工程では、これらの処理済線維芽細胞からＲＮＡを抽出し、マイクロアレイハイブリダイゼーション用のプローブを調製するのに使用した。ハイブリダイゼーションの概要を下表２に示す。
【０１３２】
【表２】
2005517412.tif 000003
【０１３３】
プローブ１は、全ハイブリダイゼーション実験において同一であり、非処理ヒト線維芽細胞（継代数１５）から抽出したＲＮＡを用いて作製した。本プローブは、生物学的対照として機能するとともに、異なるハイブリダイゼーション実験から得られた結果の比較を可能とする共通の標準化プローブとして役立った。
【０１３４】
本発明においては、計１９のハイブリダイゼーション実験を行った。２つのハイブリダイゼーション実験（ＦＧ１及びＦＧ１９）において、共通の標準化プローブ（全ハイブリダイゼーション実験におけるプローブ１）をそれ自身とハイブリダイズさせた（すなわち、プローブ１はプローブ２と同一であった）。総じて、標識の質を調べ、共通の標準化プローブがチップ上にプリントされた殆どのｃＤＮＡクローンを検出する能力について評価するために、これらのハイブリダイゼーション実験を行った。
【０１３５】
遺伝子発現結果に対するバイオインフォマティクス分析
マイクロアレイハイブリダイゼーションの結果に対する譲受人独自の統計解析は、遺伝子発現の変化が様々な生理学的及び病理学的状態の変化に相関しており、多くの事例で、このような状態の原因になるという仮定に基づいている。従って、ある一連の実験において、ある処理方法／状態は、特定の遺伝子発現プロファイルと関連している。さらに、本発明者らは、異なる（病理学的）生理学的状態／処理法の間には、階層構造が存在する、すなわち、幾つかの状態は他の状態に比べて類似している場合があることを前提としている。
【０１３６】
このような分析の最終目標は、多数の症状に見られる遺伝子発現パターンを比較することにより（各パターンは、その特徴のうち幾つかを表している）、複雑な生物学的現象の根底を成す特異的な機序と一般的な機序の双方を解明することである。より具体的に述べると、本発明によって得られた一連のハイブリダイゼーションの結果において、様々なタイプの糖尿病性腎症関連症状（低酸素状態、高グルコース、ＴＧＦ−β）について、その発現が共通又は特有である遺伝子群が観察され、この場合、適用した処理に対する反応は急性又は慢性の何れでもあると本発明者らは予想した。
【０１３７】
ハイブリダイゼーション分析の結果
本発明において、インビトロで異なる処理を施したヒト線維芽細胞中に、４６種類の遺伝子群が同定されたが、それらの活性は様々な種類の処理を施すことによって著しくアップレギュレートされた。
【０１３８】
同定した遺伝子産物を異なる９つの機能群に分類した。
１．細胞外マトリックスタンパク質及び細胞外マトリックスタンパク質に対する受容体；
２．分泌された増殖因子と相互作用するタンパク質及び増殖因子受容体の候補；
３．シグナルト伝達アダプタータンパク質；
４．細胞骨格タンパク質（主としてアクチン細胞骨格機能に関連する）；
５．Ｃａ２＋−結合タンパク質；
６．ＥＲ−局在タンパク質；
７．核移入のメディエータ；
８．ＲＮＡ及びタンパク質の合成及びプロセシングに関連するタンパク質；
９．新規遺伝子。
【０１３９】
アップレギュレートされていることが明らかとなった４６個の遺伝子を以下のように分類した。
（ａ）１１の遺伝子は、線維症と関連すると認められている既知の機能を有する既知の遺伝子であった（コラーゲンタイプＩＩＩ及びＩ（α１及びα２）、フィブロネクチン、デコリン、β−ｉｇ−ｈ３、インテグリン、ＴＩＭＰ３、ＣＤ４４、平滑筋アクチン、及びＡｒｐ２／３（Ａｒｃ３４））；
（ｂ）２８の遺伝子は、既知の機能を有するが、これまでその機能が繊維症に関連することが知られていなかった既知の遺伝子であった。本発明の主題であるＡｘｌはこのカテゴリーに分類される；
（ｃ）２つの遺伝子は、未知の機能を有し、繊維症に関連することが知られていなかったタンパク質をコードする遺伝子であった；
（ｄ）５つの遺伝子は新規遺伝子であった。
マイクロアレイハイブリダイゼーション技術を用いて、ヒト線維芽細胞に対するＴＧＦ−β処理により、Ａｘｌの発現が少なくとも２倍誘導されることが明らかとなった。
【０１４０】
例２
インビトロ実験による、Ａｘｌ遺伝子のＴＧＦ−βによる誘導性（発現及びリン酸化状態）の検証
チップハイブリダイゼーションの結果を検証するために、ウェスタンブロッティング分析によりＴＧＦ−β刺激に対する内在性Ａｘｌ発現の応答をモニターした。様々な細胞株由来の全細胞タンパク質（このうちＲａｔ１細胞株は、ＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍｌで２４時間）によっても刺激した）を抽出し、ウェスタンブロット分析によりＡｘｌの発現を分析した。３０μｇの全細胞溶解液を８％ＳＤＳゲル上で電気泳動した。
この結果、Ｒａｔ１細胞でＴＧＦ−β刺激後に僅かにアップレギュレレートされることが示された（図１参照）。
【０１４１】
血清飢餓状態で２４時間培養した後、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−βで表記の時間（１５分間−２時間）にわたって刺激を与えるという実験をＲａｔ１細胞に対してさらに行った。
１５分間のＴＧＦ−β処理後、ＴＧＦ−βによりＡｘｌのタンパク質レベルの上昇が実際に誘導されるという結果が示された（図２）。また、リン酸化レベルの上昇も観察され（図３）、ＴＧＦ−βに反応してＡｘｌタンパク質が誘導され機能的に活性化されることが示唆される。
【０１４２】
例３
形態学、免疫染色及びインシチュハイブリダイゼーションを用いた腎線維症のインビボモデルの評価
形態学的手法
一般的な形態学的評価を行うために、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）により腎臓のパラフィン切片を染色した。シリウスレッド（ＳＲ）で染色して切片中のコラーゲンを可視化した。
【０１４３】
免疫染色
間質筋線維芽細胞の蓄積は、腎繊維症プロセスの進行における重要な初期段階であると考えられている。筋線維芽細胞を可視化するために、α−平滑筋アクチンに特異的なモノクローナル抗体（クローン１Ａ４）を用いて、腎臓パラフィン切片に対してペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）免疫染色を行った。増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を免疫染色するためにモノクローナル抗体ＰＣ−１０を用いた。十分なＰＣＮＡ免疫染色を達成するために、切片のパラフィンを除去し、ＰＡＰ染色を行う前に抗原回復処理を行った。
【０１４４】
インシチュハイブリダイゼーション
35Ｓ−標識リボプローブを合成し、標準的プロトコールに従い、腎臓パラフィン切片にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後の洗浄の後、切片を風乾させ、そのスライドをＸ線フィルムに一晩曝露して、マクロオートラジオグラフィーを行った。ミクロオートラジオグラフィーについては、スライドを核トラック乳剤（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｃｋ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に短時間浸し、４℃で遮光保存した。曝露したスライドを２−３週間後に現像し、ＨＥで切片を軽く対比染色し、顕微鏡観察を行うためにカバーグラスを載せた。
【０１４５】
インサイチュハイブリダイゼーション用プローブ
リボプローブ合成の鋳型として、ラットオステオポンチンのｃＤＮＡ、マウストランスフォーミング増殖因子β１のｃＤＮＡ、マウスプロコラーゲンα１（Ｉ）のｃＤＮＡ、およびマウストロンボスポンジン１のｃＤＮＡを用いた。
【０１４６】
結果：
ＺＤＦラット
９ヶ月齢のＺＤＦラット（ｚｕｃｋｅｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｒａｔｓ）のサンプルは、腎杯の拡張を伴う水腎を呈していた。顕微鏡観察では、これらのサンプルは、糸球体硬化症及び尿細管間質線維症の病像を示していた。これらの形態学的変化に従い、インシチュハイブリダイゼーションにより測定したところによれば、正常な腎臓と比較して、マーカー遺伝子（オステオポンチン（ＯＰＮ）、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）及びプロコラーゲンα１（Ｉ）（Ｃｏｌ１））の発現が顕著に変化した。皮質及び髄質の全ての管状構造ともに、強いＯＰＮ発現が検出された。ＴＧＦ−β１の発現は、広く間質細胞全体に見られた。上皮細胞の中には、ＴＧＦ−β１発現も示すものがあった。Ｃｏｌ１発現は、髄質中の殆どの間質細胞中に、インシチュハイブリダイゼーションにより検出可能であったが、皮質での発現は「局所的」であった。
【０１４７】
老齢ｆａ／ｆａ（肥満ｚｕｃｋｅｒ）ラット
１２ヶ月齢のｆａ／ｆａラットサンプルは、皮質及び髄質全体にわたって著しい糸球体硬化症とびまん性の尿細管間質線維症を呈していた。マーカー遺伝子発現のパターンは形態的変化と相関していた。皮質及び髄質中の管状構造によって、ＯＰＮが発現されていた。複数の間質細胞においてＴＧＦ−β１が発現されていた。重要なことに、皮質及び髄質ともに、複数の病巣と単一の間質細胞が強いＣｏｌ１発現を示していたため、Ｃｏｌ１−発現細胞数はＺＤＦサンプルにおけるよりもｆａ／ｆａサンプルの方が多いと思われる。
興味深いことに、シリウスレッド染色により明らかであるように、コラーゲンの蓄積が顕著であったにもかかわらず、ＺＤＦ又はｆａ／ｆａラットのいずれも糸球体においてはＣｏｌ１発現が検出されなかった。このことから、糸球体細胞では、定常状態でのＣｏｌ１  ｍＲＮＡのレベルが低いということが示唆された。
【０１４８】
老齢ＳＤ（正常）ラット
老齢ＳＤラットのサンプルでは、糸球体および間質腔でコラーゲンの蓄積が増加し、マーカー遺伝子の発現が増加していることが示された。注目すべきことに、線維化の変化の強度はサンプルごとに一定せず、実験を行った４サンプルのうち１つは若齢動物と比較してほとんど変化が見られず、別のサンプルでの線維化変化は、「極」領域に限定され、他の２つのサンプルでは、その切片全体にわたって、コラーゲンが均一に蓄積し、マーカー遺伝子の発現が上昇していた。
【０１４９】
Ｇｏｔｏ  Ｋａｋｉｚａｋｉ（ＧＫ）／Ｗｉｓｔａｒ（正常）４８週齢ラット
ＧＫ及びＷｉｓｔａｒ４８週齢ラットのサンプルともに、糸球体及び間質腔にコラーゲンが蓄積していることが示された。ＧＫラットサンプルへの蓄積の方がより顕著であった。ｍＲＮＡを単離するために、Ｃ９及びＧＫ９の２種類のサンプルを用いた。両者とも、ＩＧＦＢＰ４に特異的なプローブにハイブリダイズさせた。インシチュハイブリダイゼーションの結果から、ＧＫサンプルでこの遺伝子の発現が上昇していることが示された。
【０１５０】
永久的ＵＵＯ
既知の線維症モデル−一側尿管結紮（ＵＵＯ）を用いた。
尿管のうち１つを結紮し（下記参照）、結紮から１、５、１０、１５、２０及び２５日後に動物を屠殺した。
永久的ＵＵＯの結果、髄質及び皮質ともに、間質細胞によるコラーゲン合成が急激に活性化（ＵＵＯの５日後）された。ＵＵＯ２０−２５日後までに、間質腔の中に著しい量の間質コラーゲンが蓄積したが、糸球体へのコラーゲン蓄積は外側の被膜に限定されていた。このように、永久的ＵＵＯのサンプルは、顕著な糸球体硬化症様の変化を伴わない尿細管間質腎線維症の急性モデルを与えた。
記述されている任意のスクリーニングによって同定された阻害剤の治療効果を調べるモデルシステムとして上記モデルを使用することができる。
【０１５１】
例４
永久的一側尿管結紮（ＵＵＯ）のプロトコール
実験系
ラットの系統：オス、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（９週齢）
各群の匹数：手術を行うラット：ｎ＝５、シャム手術を行うラット：ｎ＝３
群数：シャム手術及びＵＵＯ手術を行うラットとも６群（すなわち、ＵＵＯ手術又はシャム手術後、１日、５日、１０日、１５日、２０日および２５日）
【０１５２】
操作
ラットをケタミン／キシラジンで麻酔し、腹腔を開いた。内部を露出させた後、右腎臓から来る尿管を縫合糸で完全に結紮した（ＵＵＯ）。シャム手術ラットの場合は、尿管を露出させたが結紮しなかった。
【０１５３】
実験の終了
ＵＵＯ操作又はシャム手術を行ってから２４時間、５日、１０日、１５日、２０日及び２５日後に実験を終了した。この時点で、右腎臓を回収するためにＣＯ２に曝露している状態で放血させてラットを屠殺した。被膜を除去した後、腎臓を横に切断していった。半分を１０％緩衝ホルマリンで固定し、残り半分を直ちにエッペンドルフチューブに移し、ＲＮＡ分析用に液体窒素中で凍結させた。
【０１５４】
例５
正常及びヒト線維化腎臓におけるＡｘｌ遺伝子発現の分析
ヒト腎組織サンプル由来の切片を用いてインシチュハイブリダイゼーションによりＡｘｌの発現パターンを調べた。この予備実験で分析したサンプルには、
１．正常ヒト腎臓（３２歳、女性）
２．糸球体硬化症及び尿細管間質線維症の徴候を示す糖尿病のヒト腎臓（６２歳、男性）
３．広範囲に及ぶびまん性線維症を伴う腎硬化（５６歳、女性）
４．血管硬化、リンパ球浸潤、糸球体硬化症及び瘢痕性の繊維症を示す、拒絶反応を引き起こした移植腎臓（４４歳、女性、移植２年後）
が含まれた。
【０１５５】
全サンプルの代表的な切片に対して、伸長因子１α（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １α）のｍＲＮＡ特異的なプローブに試験的にハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション可能なｍＲＮＡが存在することを確認し、最適なプレハイブリダイゼーション処理条件を確立した。
【０１５６】
この結果から、正常な腎臓においてＡｘｌの発現は非常に低いということが示される。一方、線維化腎臓を染色したところ、腎臓内の線維化領域の尿細管上皮細胞でＡｘｌ遺伝子のレベルがより高くなっていることが観察された。
従って、ヒト線維化サンプルを用いたこれらのインシチュハイブリダイゼーション実験から、腎臓の線維化領域における尿細管上皮細胞の増殖にＡｘｌ遺伝子が関わっていることが示唆された。
【０１５７】
例６
正常及び線維化ラット腎臓サンプルにおけるＡｘｌ遺伝子発現の分析
げっ歯類Ａｘｌに相補的なリボプローブを調製するための鋳型として、マウスＥＳＴクローン（受託番号：ＢＧ２９３４３５  ｇｉ： ４５０２１９４）を使用した。以下の切片に対して、放射性標識したプローブをハイブリダイズさせた。
１．シャムオペレーションから２５日後に固定した対照サンプルを含む永久的ＵＵＯのマルチブロック、及びＵＵＯから２４時間、５日、１０日及び２５日後に固定したサンプル（各時間点に対して１サンプル）
２．ラット慢性腎不全サンプル：２年齢、７ヶ月齢ラットの腎臓
３．ＺＤＦサンプル：４．５ヶ月齢（非線維化）及び９ヶ月齢（線維化が強い）ＺＤＦラット腎臓のサンプル
４．ｆａ／ｆａサンプル：３、６ヶ月齢（非線維化）及び１２ヶ月齢（線維化が強い）ｆａ／ｆａ腎臓のサンプル
５．ラット組織のマルチブロック。
【０１５８】
インシチュハイブリダイゼーション分析の結果、非線維化サンプル（シャム手術ＵＵＯサンプル及び、若齢ＺＤＦ及びｆａ／ｆａサンプル）においてはＡｘｌ発現のレベルが低いことが明らかになった。これらのサンプルでは、弱いハイブリダイゼーションシグナルが糸球体及び単一の間質細胞／血管周囲細胞に局限していた。興味深いことに、若齢ＺＤＦ及びｆａ／ｆａの腎臓のサンプルでは、尿細管上皮細胞中に発現を示す小さな点がいくつか観察された。これらの点では、浸潤リンパ球及び／又は間質細胞が少量蓄積していた。このような後者のタイプの細胞も、ハイブリダイゼーションシグナルを示した。
【０１５９】
尿細管結紮の結果、Ａｘｌハイブリダイゼーションシグナルの強度及びパターンが顕著に変化し、ＵＵＯから２４時間後に、ハイブリダイゼーションシグナルが、ヘンレ係蹄の太い上行脚の上皮層上と髄質外層の集合管に見られた。ハイブリダイゼーションシグナルは、皮質にも広がっており、皮質内では、集合管、集合尿細管及び遠位尿細管に顕著なハイブリダイゼーションシグナルが見られた。この発現パターンから、結紮に応じてネフロンの遠位部分で急速なＡｘｌ転写の活性化が起こったことが示唆された。この上皮の発現パターンは、ＵＵＯ後を通じて維持されていた。上皮でのシグナルに加えて、ＵＵＯから５日後以降のサンプルにおいて、いくらかの発現細胞の蓄積が間質細胞中に認められた。少なくとも、これらの間質細胞の中には、内皮性と同定され得るものがいくつか存在した。
【０１６０】
慢性線維化モデルを呈するサンプルにおいても、Ａｘｌ発現のパターンが顕著に変化していた。つまり、老齢ｆａ／ｆａサンプルにおいて、切片全体にＡｘｌ発現の強い病巣が複数存在した。形態学的に、これらの病巣では、例えば、間質細胞の蓄積及び尿細管上皮の増殖など顕著な尿細管間質線維症の徴候が示されていた。上皮細胞及び間質細胞ともに、ハイブリダイゼーションシグナルが見られた。同様のパターンは、老齢ＺＤＦサンプルでも観察された。尿細管間質の複数の発現箇所で、明白な萎縮の徴候を示す尿細管状態であったことは注目すべきことである。萎縮細胞は、Ａｘｌに対するハイブリダイゼーションシグナルを示した。老齢ＺＤＦサンプルでは、炎症浸潤領域の存在が顕著であった。浸潤細胞の中には、Ａｘｌに対するハイブリダイゼーションシグナルを示すものもあった。このようなＡｘｌの特徴は、７つのヒト線維化腎臓サンプルのうち４つに観察された。Ａｘｌ特異的ハイブリダイゼーションシグナルは、慢性腎不全のサンプル（２年齢、７ヶ月齢ラット）切片全体に広範囲に広がっていた。線維化を呈する他のサンプルにおけるように、発現が観察された構造には、萎縮及び「増殖」間質細胞及び炎症性細胞が見られた。
【０１６１】
このように、ラット腎臓サンプルにおけるＡｘｌ遺伝子のインシチュハイブリダイゼーション実験の結果から、非線維化腎臓組織では発現レベルが低いことが示された。疾患サンプルでは、尿細管上皮及びいくつかの間質細胞、血管細胞及び炎症性細胞においてこの遺伝子の発現が見られた。疾患サンプルの発現パターンは、前にヒト線維化腎臓において見られたパターンと酷似していた。このことから、ヒト及びラット腎臓繊維症に共通する病理学的機序へのＡｘｌ遺伝子産物の関与が示唆された。動物実験の結果から、線維化を引き起こす損傷（ＵＵＯ）の直後にＡｘｌ遺伝子の活性化が起こり、さらに進行した段階でも持続していることが明確に示されたことは重要である。このことは、Ａｘｌ遺伝子産物をターゲットとした治療的アプローチが慢性腎不全の何れの段階に対しても適用できる可能性があることを示唆している。さらに、ＵＵＯに反応して急激にＡｘｌ発現が活性化されることから、Ａｘｌが急性腎不全に関与することが示唆された（この可能性については、急性腎不全患者から得たサンプルのインシチュハイブリダイゼーション実験により容易に検証することができる）。これが正しいならば、Ａｘｌをターゲットとした治療は急性腎不全に対して有効でありうる。
【０１６２】
マルチブロック分析は、ラットの組織全体にかなり広範囲に広がったハイブリダイゼーションシグナルを示している。食道から結腸にいたる腸管の全区画の固有層中にハイブリダイゼーションシグナルがはっきりと見られる。形態学的に、陽性細胞は線維芽細胞及び組織球／マクロファージと同定しうる。
皮膚、唾液腺、心臓、前立腺、肝臓の門脈路など他の臓器の切片中に存在する結合組織中でも、同じ２種類の細胞がハイブリダイゼーションシグナルを呈していると思われる。
【０１６３】
脾臓の赤脾髄において顕著なハイブリダイゼーションシグナルが観察された。主として、マクロファージ及びいくつかのリンパ球にシグナルが局在していた。類似の発現パターン（リンパ球及びマクロファージ）は、大きなリンパ節の門周辺領域中のリンパ洞にも見られた。リンパ系の他の臓器である胸腺にも、陽性リンパ球が存在していた。陽性リンパ球の殆どが、髄質に集中しており、皮質では陽性細胞が１個ずつ散在していた。肺の切片では、強いハイブリダイゼーションシグナルを示す細胞が散在していた。陽性細胞の形態から、肺でのＡｘｌ遺伝子発現はマクロファージ及び肺上皮（タイプＩ）細胞群の一部に局在していることが示唆された。肺胞壁中と、肺胞及び気管支内腔内とに両タイプの発現細胞が認められる。この肺細胞の発現パターンから、Ａｘｌ発現の活性化がこれらのタイプの細胞の「放出」に先行するということが示唆された。
【０１６４】
前述の門脈路細胞に加えて、肝臓の洞様血管細胞の一部（内皮細胞、星細胞及び、クッパー細胞）にも、Ａｘｌ発現が見られた。精巣では、弱いハイブリダイゼーションシグナルが見られた。このシグナルは、セルトリ細胞の一部及び精子形成上皮の基底層内にある生殖細胞の一部に局在していた。
【０１６５】
正常ラット脳の矢状断面切片に対しても、Ａｘｌ特異的プローブはハイブリダイズした。このハイブリダイゼーションの結果から、ラット中枢神経系では発現レベルがかなり低いことが示唆された。「集中的」発現が顕著に見られた部位は、小脳のみであった。この領域における弱いハイブリダイゼーションシグナルは、分子層と顆粒層との境界に位置する細胞の「層」に局在していた。抗−ＭＡＰ２（神経マーカー）及び抗−ＧＦＡＰ（星状膠細胞のマーカー）で染色した同等の切片と比較することにより、この部位におけるＡｘｌの発現がグリアに特異的であることが示唆された。脳組織の他の領域を通じて、単一の上皮細胞及びグリア細胞と思われる細胞中に、弱いハイブリダイゼーションシグナルが検出された。
【０１６６】
このように、インシチュハイブリダイゼーション実験から、ラット組織におけるＡｘｌ発現がかなり広範囲に広がっていることが示唆された。発現部位は、多くの臓器中に存在する間質組織及び結合組織であった。細胞あたりの構成的発現レベルは、ＵＵＯ後又は慢性モデルにおける線維化腎臓組織の尿細管間質部分で見られるレベルより低いと思われる。
【０１６７】
例７
Ａｘｌ活性の検証と細胞内の線維化への関連性
インビトロにおけるＡｘｌの機能を調べるために、次に挙げるいくつかのアプローチを用いる。
１．ＥＧＦＲを欠損する細胞（ＮＩＨ３Ｔ３クローン  ２．２）におけるＥＧＦＲ−Ａｘｌキメラの過剰発現。過剰発現物質をＥＧＦで刺激した。繊維症に関連する細胞の反応（例えば、コラーゲン合成、フィブロネクチンの発現）をチェックする。
２．Ａｘｌの完全なオープンリーディングフレームを有する発現ベクター（Ｐｉｒｅｓ−Ａｘｌ）を用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞中でＡｘｌの過剰発現物質を得た。これらの細胞をさらに用いて、細胞の繊維化反応に対してＡｘｌの過剰発現が及ぼす影響を分析する。細胞の反応（例えば、コラーゲン合成、フィブロネクチン発現）をチェックする。
３．ＮＲＫ−４９Ｆ及びＮＲＫ−５２Ｅ細胞にも、Ａｘｌをトランスフェクトする。得られた過剰発現細胞を用いてコラーゲンアッセイを行い、ＦＡＣＳによってインテグリン発現を測定する。ＴＧＦ−β又はＧＡＳ−６のいずれかによる刺激（それぞれ、ＮＲＫ−Ｆ及びＮＲＫＥに対して用いた）後にこれらのアッセイを行った。
【０１６８】
例８
「概念の証明」のためのインビボモデル
腎線維症及び糸球体硬化症におけるインビボでのＡｘｌの機能的役割を明らかにするために、Ａｘｌ遺伝子が破壊されたマウスを用いる。これらのマウスは、コロンビア大学のＧｏｆｆ教授により作出され、Ａｘｌの機能的な確認のために得られる。これらのマウスは、腎繊維症及び糸球体硬化症の様々なモデル（例えば、ＵＵＯ）の後に、同一処理を行った正常な対照動物と比較して腎機能を評価するために使用されている。続いて、腎機能の指標として、平滑筋のアクチン発現及びコラーゲン発現を評価している。
【０１６９】
例９
ラット腎臓サンプルの抗−ＡＸＬ抗体による免疫染色
ＵＵＯマルチブロック（シャム手術対照、ＵＵＯから２４時間、５日、１０日、２０日、及び２５日後のサンプルなど）の切片と慢性腎不全（２年７月齢ラット）を、本発明者らが確立したプロトコール（方法の部を参照）に従って、抗ＡＸＬ抗体で免疫染色した。
対照（シャム手術）サンプルでは、免疫染色は全く観察されなかった。ＵＵＯサンプルでは、２４時間−５日後に陽性免疫染色が見られた。最も顕著な染色が観察されたのは、尿細管上皮細胞の先端部であった。ＵＵＯの５日後以降には、間質細胞中にも免疫染色が見られた。慢性腎不全の腎臓由来のサンプルでも、尿細管間質が顕著に免疫染色されているのが観察された。
【０１７０】
例１０
スクリーニング分析
Ａ．一次無細胞インビトロアッセイ
Ａｘｌタンパク質のキナーゼドメイン（ｈＣｙｔｏＡｘｌ）に基づいた無細胞アッセイ
化学ライブラリーのＨＴＳのために蛍光偏光（ＦＰ）を基にしたアッセイを開発し、Ａｘｌチロシンキナーゼ活性の小分子阻害剤を同定した。本アッセイは、基質のチロシンリン酸化によって生じる蛍光偏光（ＦＰ）の変化の検出を基礎としている。本アッセイでは、Ａｘｌによりリン酸化された基質(競合物質)が、蛍光標識されたホスホペプチド（トレーサー）のホスホチロシン特異的抗体（ｐＹ−Ａｂ）への結合と競合する。非結合トレーサーは偏光度が低いのに対して、そのホスホチロシン特異的抗体との複合体は、蛍光物質の回転が制限されるため高い偏光度を示す。従って、トレーサー−Ａｂ複合体に対して競合物質を添加すると蛍光偏光度が減少するので、これを検出することが可能となる。ＨＴＳに対する蛍光偏光度技術の長所としては、化学ライブラリー成分の自己蛍光又はその消光効果による蛍光強度の変化に対して相対的に影響を受けないことが挙げられる。さらに、ＦＰは、測定前にアッセイ成分を分離する必要がない均質な技術である。
【０１７１】
昆虫細胞（ＳＦ９細胞）中で組換えｈＣｙｔｏＡｘｌ（受容体チロシンキナーゼの細胞質ドメイン、ａａ  ４９５−８９４）を産生させた。精製にはＮｉＮＴＡマトリックスを用いた。本アッセイでは、ａｘｌ基質の候補として３種類の異なる基質を調べた。
ペプチド１−Ｂｉｏｔ−ＰＤＥＩＬＹＶＮＭＤＥ（主要なＡｘｌ自己リン酸化部位）
ペプチド２−Ｂｉｏｔ−ＬＳＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲ（Ａｘｌ活性化ループペプチド）
ＰＧＴ−ポリ（Ｇｌｕ：Ｔｙｒ）（４：１）−普遍的な、一般的に使用されるチロシンキナーゼ基質。
【０１７２】
昆虫細胞由来のｈＣｙｔｏＡｘｌをビーズ上に固定化した。このタンパク質結合ビーズを、ポリ（Ｇｌｕ：Ｔｙｒ）を基質として用いるインビトロ蛍光偏光に基づいたチロシンキナーゼアッセイに供し、蛍光偏光の測定を行った。固定化したタンパク質の活性を測定した。ペプチド１及びペプチド２を使用した実験については研究中である。可溶性精製タンパク質の活性についても実験中である。
【０１７３】
Ａｘｌタンパク質を昆虫細胞から産生させる代わりに、そのタンパク質を発現するバクテリアからもＡｘｌを調製する。組換えｈＣｙｔｏ  Ａｘｌ（受容体チロシンキナーゼの細胞質ドメイン、ａａ  ４９５−８９４）をクローニングした。
この目的のために、下記の３種類の構築物を作製した。
ＧＳＴ−Ｃｙｔｏ  Ａｘｌ
ＧＳＴ−Ｃｙｔｏ  Ａｘｌ−Ｈｉｓ
ＧＳＴ  Ｃｙｔｏ  Ａｘｌ  Ｋ５６７Ｒ （「キナーゼ不活性（ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ）」）−対照。
【０１７４】
構築物は全て、バクテリア中で高い発現を示した。精製にはグルタチオンアフィニティーレジン、又はＮｉ  ＮＴＡアフィニティーレジンの後にグルタチオンアフィニティーレジンを使用し、ｈＣｙｔｏＡｘｌ調製物特異性を確保した（他のキナーゼ類を欠く）。細菌由来の精製タンパク質は、昆虫細胞由来のＡｘｌタンパク質について上述したものと同じ基質及びプロトコールを利用するインビトロアッセイに用いる。
【０１７５】
完全長ｈＡｘｌタンパク質に基づく無細胞アッセイ
改良型時間分解蛍光アッセイの解離を基にした、広いダイナミックレンジで感度が高くなったＤＥＬＦＩＡ法（Ｗａｌｌａｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて、無細胞アッセイにおいてｈＡｘｌ阻害剤のスクリーニングを行った。これは、ｈＡｘｌによる基質ペプチドのチロシンリン酸化に基づくものである。
【０１７６】
この方法を確立した。使用したペプチドは、−ビオチン−ＫＫＩＹＮＧＤＹＹＲＱＧＲ（Ａｘｌ活性化ループ由来）であった。ｈＡｘｌ−ｃ−Ｍｙｃタンパク質（Ｃ末端にｍｙｃタグを有する完全長ｈＡｘｌ）を２９３細胞中で発現させた。細胞溶解後、９Ｂ１１（抗−ｃ−Ｍｙｃタグ抗体）及びタンパク質Ｇ−セファロースを用いて、ｈＡｘｌ−ｃ−Ｍｙｃを免疫沈降させた。キナーゼアッセイ緩衝液（２００μＭ  ＡＴＰに０．５μＭのビオチン化ペプチドを添加したもの）中でのインビトロキナーゼ反応に上記の免疫複合体を使用した。ＥＤＴＡを添加してキナーゼ反応（１時間）を停止させ、Ｄｅｌｐｈｉａアッセイを行った。本発明者らの結果は、本アッセイにおいて、固定化ｈＡｘｌ−ｃ−Ｍｙｃがその基質に対して高い活性を有していることを実証している。２９３細胞由来の可溶性タンパク質の活性については分析中である。
【０１７７】
Ｂ．細胞を利用した第二の分析
細胞系において阻害剤存在下でＡｘｌの活性を評価するために、いくつかのアプローチを採用した。
第一のアプローチでは、一過性アプローチとＳＴＡＴ３をレポーターアッセイ（ＳＴＡＴ３はＡｘｌの下流ターゲットである）用に使用し、ＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキメラ（Ａｘｌの細胞外ドメインをＥＧＦＲの細胞外ドメインに置き換えたもの）に基づくものである。アッセイ結果の読み出しは、ルミネセンス（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  ｋｉｔ−Ｐｒｏｍｅｇａ）によって行った。
【０１７８】
用いた細胞株はＮＩＨ／３Ｔ３  （２．２）（内在性ＥＧＦＲ発現を欠く）及び２９３Ｔであった。
これらは、Ａｘｌ活性誘導のレポーターとしてＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキメラ、ＳＴＡＴ３−ホタルルシフェラーゼレポーター（ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ  ｌｕｃ−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ＴＡ−Ｌｕｃベクターを対照とした）とＳＴＡＴ３によるシグナルの特異性を確保するためにウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬ−ＴＫ−Ｐｒｏｍｅｇａ）とを共トランスフェクトした細胞であった。ＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキナーゼ不活性（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ、ＫＤ）突然変異キメラ、ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ  ｌｕｃ−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ及びｐＲＬ−ＴＫ−Ｐｒｏｍｅｇａをトランスフェクトした細胞を特異性の対照として用いた。
【０１７９】
トランスフェクションから２４時間後、培地を「飢餓」培地（０．５％ＢＳＡを含有するＤＭＥＭ）に交換し、さらに２４時間培養した。血清中に存在するＥＧＦがＥＧＦＡ−ｈＡｘｌキメラのキメラ凝集を引き起こし、その活性化を誘導する可能性を最小限に抑えるために血清飢餓プロトコールを用いた。細胞をＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で３時間活性化した後（無血清培地）、細胞溶解を行った。細胞溶解液から採取したサンプルをホタルルシフェラーゼ基質とインキュベートした後、ウミシイタケルシフェラーゼ基質とともにインキュベートした（Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ／Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【０１８０】
この結果から、一過性にトランスフェクトされたＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキメラは自己リン酸化されるのに対して、ＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキメラキナーゼ不活性（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ、ＫＤ）突然変異キメラをトランスフェクトした細胞からは、ＥＧＦＲ−ｈＡｘｌの中でＡｘｌが活性を有することは示唆されなかった。ＥＧＦによる誘導可能なＡｘｌ活性化は、異なる血清飢餓プロトコールを用いること及びトランスフェクションパラメータを最適化することにより最適化されている。ＳＴＡＴ３−ルシフェラーゼレポーターシステムを用いたＥＧＦＲ−Ａｘｌキメラの一過性トランスフェクションプロトコールを最適化した後、ＥＧＦによるａｘｌ活性刺激を行ってから細胞を利用したアッセイに用いる。
【０１８１】
細胞を用いたアッセイに関する別のアプローチも、ＳＴＡＴ３レポーターを用いたアッセイを利用したものであるが、最初のアプローチとは異なり、自己リン酸化及びＥＧＦで誘導可能な反応を示す、安定的にトランスフェクトされたＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキメラ細胞クローンを用いる。２９３細胞とＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて、ＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキメラの安定的クローンを作製し、一過性アプローチには、ＳＴＡＴ３−ホタルルシフェラーゼレポーターシステムを用いる。ＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキナーゼ不活性（ｋｉｎａｓｅ−ｄｅａｄ（ＫＤ））突然変異キメラを安定的にトランスフェクトした２９３細胞及びＮＩＨ３Ｔ３細胞を、特異性の対照として用いる。これらは、上述のようなＳＴＡＴ３レポーターを用いたアッセイにおいて、ａｘｌ活性についても評価する。
【０１８２】
ＥＧＦＲ−ｈＡｘｌキメラに対する３つ目の代替的アプローチは、バイオアッセイを利用したもの（刺激としてＥＧＦ用いる）であり、ＧＡＳ６で刺激した完全長ｈＡＸＬを用いたバイオアッセイを評価する。
ＮＩＨ／３Ｔ３（２．２）にトランスフェクトし、ｈＡＸＬ及びｈＡＸＬ不活性キナーゼ突然変異体を発現する安定なクローンを作製した。これらのクローンでは、構成性のＡｘｌチロシンリン酸化は全く見られなかった。
【０１８３】
前記アッセイでは、安定なクローンに、ＳＴＡＴ３−ホタルルシフェラーゼレポーター（ｐＳＴＡＴ３−ＴＡ  ｌｕｃ−Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及びウミシイタケルシフェラーゼ（ｐＲＬ−ＴＫ−Ｐｒｏｍｅｇａ）を一過性にトランスフェクトする。トランスフェクション後、ＧＡＳ６を用いてＡｘｌ活性を刺激し、ルミネセンス（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  ｋｉｔ−Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定する。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】図１は、様々な細胞株中でＴＧＦ−β応じて内在性Ａｘｌが発現されることを示している（ウェスタンブロット分析）。レーン１：ＮＲＫ  ４９Ｆ細胞；レーン２：ＴＧＦ−β  ５ｎｇ／ｍｌを加えたＮＲＫ  ４９Ｆ細胞、２４時間；レーン３：Ｒａｔ１細胞；レーン４：ＴＧＦ−β  ５ｎｇ／ｍｌを加えたＲａｔ１細胞、２４時間；レーン５：ＷＩ３８細胞；レーン６：ＨｅＬａ細胞；レーン７：２９３細胞。
【図２】図２は、ＴＧＦ−βに応答して、Ａｘｌタンパク質がｒａｔ１細胞中でアップレギュレートされることを示している。ＴＧＦ−β刺激（５ｎｇ／ｍｌを１５分、３０分、６０分、２時間）を加えたＲａｔ１細胞由来の総細胞可溶化液をゲル上で展開し、抗Ａｘｌ  Ｃ２０抗体を用いてプローブした（ウェスタンブロット分析）。最初と最後のレーンのサンプルは、ＴＧＦ−β刺激を行わなかった細胞から得たものである。
【図３】図３は、ＴＧＦ−β依存性のＡｘｌ誘導に伴って、リン酸化されたＡｘｌのレベルが増加することを示している。ＴＧＦ−β刺激（５ｎｇ／ｍｌを１５分、３０分、６０分、２時間）を加えたＲａｔ１細胞を免疫沈降に使用した。Ａｘｌは、抗Ａｘｌ  Ｍ−２０で免疫沈降させた。ＴＧＦ−β処置（５ｎｇ／ｍｌ  １５分−２時間）の後に、抗ホスホチロシン抗体を用いてａｘｌのリン酸化状態をモニターした。最初と最後のレーンのサンプルは、ＴＧＦ−β刺激を行わなかった細胞から得たものである。
【図４】図４は、ラットにＵＵＯを施した後に、Ａｘｌポリペプチドのアップレギュレーションが起こることを示している。ＵＵＯモデルに引き続き、正常ＳＤラットの腎臓中のＡｘｌタンパク質発現をモニターした。レーン１：反対側（ｃｌ）の非処置腎臓中でのＡｘｌ発現、レーン２：閉塞された腎臓（ＵＵＯ、２５日間）でのＡｘｌ発現。
【図１】
2005517412.tif 000004
【図２】
2005517412.tif 000005
【図３】
2005517412.tif 000006
【図４】
2005517412.tif 000007
【配列表】
2005517412000001.app
【国際調査報告】
2005517412.tif 000008
2005517412.tif 000009