(57)【要約】本発明は、特定の感染性物質に血清陽性である個体において、これらの感染性物質に由来するエピトープを投与することによって、標的抗原に対する免疫寛容を誘導する方法を提供する。エプスタインバーウイルスおよびサイトメガロウイルスなど、そのゲノム中にインターロイキン10(IL-10)の相同体を有するウイルスに由来するエピトープは、これらの目的に特に適している。EBV LMP1タンパク質およびそのエピトープの使用は特に好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性物質由来の試験ペプチド配列の寛容原性を評価する方法であって、
(i) 細胞集団を前記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 前記細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iii) ステップ(ii)の結果を、前記配列の寛容原性と相関させるステップ
を含み、前記細胞集団が、前記感染性物質に事前に感染しているドナーから得た単核白血球を含む、前記方法。
【請求項２】
上記細胞集団が少なくとも1つのタイプの抗原提示細胞を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
上記単核白血球が少なくともTリンパ球、Bリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージまたは樹状細胞を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
上記単核白血球が少なくともCD4+Tリンパ球を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
上記単核白血球がさらに抗原提示細胞の少なくとも1つのタイプを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
(i)(a) 上記感染性物質に事前に感染していないドナーから得た類似の細胞集団を、上記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii)(a) 前記細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(ii)(b) ステップ(ii)による結果と、ステップ(ii)(a)による結果を比較するステップ
をさらに含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
上記感染性物質がウイルスである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
上記ウイルスがウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルスである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
上記ウイルスがEBVである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
上記試験ペプチド配列がEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
上記試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列が、配列P1〜P75または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
感染性物質由来の試験ペプチド配列の、標的抗原に対する寛容原性を評価する方法であって、
(i) 細胞集団を、(a)前記試験ペプチド配列、および(b) 標的抗原と接触させて、試験組成物を生成するステップと、
(ii) 前記試験組成物から得た細胞集団を、前記標的抗原と再接触させるステップと
を含み、前記細胞集団が、前記感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む、前記方法。
【請求項１３】
(iii) 上記標的抗原に対する上記細胞集団の応答を評価するステップと、場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、上記試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップ
をさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(iii)が細胞増殖の評価、またはIL-4、IL-2、IL-12、もしくはIFN-γの発現の評価を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ(ii)の前に、新たな抗原提示細胞を添加するステップをさらに含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
上記細胞集団を、上記試験配列にも、または上記標的抗原にも関係のない確認用抗原と接触させるステップをさらに含む、請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
上記感染性物質がウイルスである、請求項12〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
上記ウイルスがウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルスである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
上記ウイルスがEBVである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
上記試験ペプチド配列がEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
上記試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列が、配列P1〜P75または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
試験ペプチド配列の寛容原性を評価する方法であって、
(i) 第1細胞集団を前記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 第2細胞集団を対照ペプチド配列と接触させるステップと、
(iii) 前記細胞集団のそれぞれで、IL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、前記試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップと
を含み、前記細胞集団のそれぞれが、感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含み、前記対照ペプチド配列が前記感染性物質に由来するものである、前記方法。
【請求項２３】
上記対照ペプチド配列が上記感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む細胞集団においてIL-10の発現を誘導すると事前に同定されているものである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
上記第1細胞集団および第2細胞集団が同一のドナーに由来するものである、請求項21または22に記載の方法。
【請求項２５】
上記第1細胞集団および第2細胞集団が対照ペプチドに応答して増殖できるT細胞クローンを含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
上記感染性物質がEBVである、請求項22〜25のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２７】
上記対照ペプチドがLMP1またはLMP2に由来するものである、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
上記対照ペプチドが配列P1〜P75および配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
細胞集団を標的抗原に対して免疫寛容にする方法であって、前記細胞集団を、
(a) 感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列と接触させること、または、試験ペプチド配列が前記細胞集団で発現されるように前記試験ペプチド配列をコードする核酸と接触させること、および
(b) 標的抗原と接触させること、または試験ペプチド配列が前記細胞集団で発現されるように前記試験ペプチド配列をコードする核酸と接触させること
を含み、前記細胞集団が、前記感染性物質に対して血清陽性である被験者から得た単核白血球を含む、前記方法。
【請求項３０】
抗原提示細胞集団を、上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させるステップと、次いで上記細胞集団を前記抗原提示細胞集団と接触させるステップとを含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
上記単核白血球を、in vitroで上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させる、請求項29または30に記載の方法。
【請求項３２】
上記細胞集団またはそのサブセットを、上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させた後に、上記被験者に再投与する、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
上記抗原提示細胞集団を、in vitroで上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させ、さらに上記細胞集団を、in vivoで前記抗原提示細胞集団と接触させる、請求項30に記載の方法。
【請求項３４】
上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原を、上記被験者に直接投与する、請求項29に記載の方法。
【請求項３５】
上記感染性物質がウイルスである、請求項29〜34のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３６】
上記ウイルスがウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルスである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
上記ウイルスがEBVである、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
上記寛容原性ペプチド配列がEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
上記寛容原性ペプチド配列が、配列P1〜P75または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
被験者を標的抗原に対して免疫寛容にするための医薬組成物であって、感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列、または感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列をコードする核酸を、薬学的に許容される担体との混合物として含む、前記医薬組成物。
【請求項４１】
上記寛容原性ペプチド配列がEBVに由来するものである、請求項40に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
上記寛容原性ペプチド配列がLMP1またはLMP2に由来するものである、請求項41に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
上記寛容原性ペプチド配列が、ペプチド配列P1〜P75またはペプチド配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項42に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
上記標的抗原をさらに含む、請求項40〜43のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
EBVに事前に感染した個体に投与するための、請求項41〜44のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
標的抗原に対して指向された免疫応答によって媒介される症状を予防または治療するための医薬の調製における、EBV LMP1、LMP2、またはそれらのフラグメントもしくはミメティクス、あるいはそれらをコードする核酸の使用。
【請求項４７】
標的抗原または標的抗原をコードする核酸との併用投与用に上記医薬を製剤化する、請求項46に記載の使用。
【請求項４８】
上記医薬が、標的抗原または標的抗原をコードする核酸を含む、請求項46または47に記載の使用。
【請求項４９】
上記症状が、1型糖尿病、腹腔疾患、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症、アトピー反応もしくはアレルギー、または治療用製品に対する応答である、請求項46〜48のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５０】
上記標的抗原が細胞である、請求項46〜48のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５１】
上記細胞が移植用細胞である、請求項50に記載の使用。
【請求項５２】
上記細胞が、寛容原性ペプチド配列をコードする核酸を含む、請求項48と組み合わせた請求項51に記載の使用。
【請求項５３】
EBVに事前に感染した個体に投与するために上記医薬を製剤化する、請求項46〜52のいずれか1項に記載の使用。
【請求項５４】
P1〜P75、およびP1'〜P96'のいずれか1つの配列を有するペプチド。
【請求項５５】
P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P20、P22、P23、P24、P25、P26、P27、P29、P30、P32、P34、P35、P39、P68、P71、P72のいずれか1つの配列を有する、請求項54に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫寛容の誘導に関するものであり、特に、感染性物質に対して血清陽性である個体において、他の抗原に対する免疫寛容を誘導するための感染性物質由来のエピトープの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫介在性クリアランスを回避するために、ウイルスは広くさまざまな戦略を用いるが、これらは3つの主要機構、すなわち逃避、耐性、および反撃のうちの1つに属すると考えることができる(Xuら、2001年)。ウイルスは、抗原提示経路を破壊し(Lorenzoら、2001年)、さらにエピトープ突然変異(Ericksonら、2001年)を行うことによって、免疫認識から逃れる。耐性は、ウイルス感染細胞のアポトーシスを抑制することによって媒介される。反撃には、エフェクターT細胞(Muellerら、2001年)の死滅が含まれる。エプスタイン-バーウイルス(EBV)は、このような機構によって、検出およびクリアランスを回避することが示されている。例えば、バーキットリンパ腫では、そのリンパ腫細胞によるMHCクラスI分子および接着性分子の発現レベルが極めて低いことで、検出から逃れ(Gregoryら、1988年)、またエプスタイン-バー核抗原1は、そのNH2端末のGly/Ala反復ドメインを介してMHCクラスI提示から逃れる(Levitskayaら、1995年、1997年)。EBVは、そのBcl-2相同体であるBHRF-1(Xuら、2001年)を介して、またLMP1によって誘導される抗アポトーシスタンパク質A20の発現(Friesら、1996年)を介しても、アポトーシスに対する耐性によって免疫応答を回避する。しかし、これらの機構や、他の機構によって、EBVが検出およびクリアランスを回避することは示されているが、このウイルスがどのようにしてこれほどうまく潜伏感染を維持するのかはまだ明らかでない。
【０００３】
EBVは、90%以上の成人により潜伏感染して保菌されているヒトγヘルペスウイルスであり、B細胞中および鼻咽頭上皮細胞中(Kieff, 1996年)で複製する。急性感染は、主として、EBV核抗原3A、3B、および3C(Kieff, 1996年)に対する細胞傷害性応答によって制御されるが、すべての場合で、ウイルスはB細胞中で潜伏状態に入る(Kieff, 1996年)。LMP1は、潜伏中に、そして、ホジキン病および鼻咽頭癌を含めたいくつかのEBV関連悪性腫瘍において発現される、限られたパネルの遺伝子の一部である(Horikawaら、2000年; Pallesenら、1991年)。このタンパク質は、構成的に活性化された腫瘍壊死因子受容体として働き、核因子κBおよび抗アポトーシスタンパク質A20を含めた複数の分子の活性化によって、細胞を形質転換する(Eliopoulosら、1996年、1997年; Huenら、1995年; Mosialosら、1995年; Youngら、1998年)。
【０００４】
免疫応答の性質および有効性を調節する際に、CD4+Tヘルパー(Th)細胞の異なったサブセットが果たす役割に対して、認識がますます高まっている(Christensenら、2001年; Grouxら、1997年; LevingsおよびRoncarolo, 2000年; Roncaroloら、2000年、2001年; Shevachら、1998年; StephensおよびMason, 2000年; Thomsenら、2001年)。当初、γ-インターフェロン(γ-IFN)と、IL-4とをそれぞれ産生する、Th1細胞およびTh2細胞間の相互拮抗に注意が集まったが(MossmanおよびCoffman, 1989年)、現在さらに、免疫調節および免疫寛容で重要な役割をもつT調節性(Tr)細胞亜集団が定義されている(Grouxら、1997年; LevingsおよびRoncarolo, 2000年; Roncaroloら、2000年、2001年; Shevachら、1998年; StephensおよびMason, 2000年)。具体的には、Tr1サイトカインIL-10の産生は、齧歯動物を多くの免疫介在性疾患から防御することができ(Grouxら、1997年; LevingsおよびRoncarolo, 2000年)、一方、Th3細胞によるトランスフォーミング成長因子βの分泌は、自発的自己免疫を防止し(GorelikおよびFlavell、2000年)、さらにある形態の経口寛容も媒介する(Weiner, 1997年)。また、CD25の発現によって特徴づけられる調節性細胞亜集団が齧歯動物から(SeddonおよびMason, 2000年; Shevach, 2000年)、そしてより最近にはヒト末梢血から(Jonuleitら、2001年; Levingsら、2001年)単離されたが、ほとんどの報告において、これらの細胞がもつ抑制効果は非特異的であり、かつサイトカイン産生に非依存的である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
免疫介在疾患の制御におけるTr細胞の重要性は、このような調節が、免疫クリアランスから逃れるための第4の主要機構として、ウイルスによって利用されているのではないかという見通しを提起する。EBVに潜伏感染している細胞がLMP1を発現しているとすれば、問題は何故この抗原によって防御的細胞傷害性免疫が引き起こされないかに関するものであり(Chapmanら、2001年; Khannaら、1998年)、LMP1に特異的な細胞傷害性T細胞が、感染個体に存在しないことは注目に値する(Chapmanら、2001年)。最近、Dukersら(2000年)は、LMP1が末梢血単核細胞に対して直接免疫抑制効果を及ぼすことができるペプチドモチーフを含むことを示唆している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、特定の感染性物質が寛容原性ペプチド配列を含む抗原をコードすることを見いだした。「寛容原性」のペプチド配列とは、免疫系細胞に標的抗原と共に投与されると、その細胞をこの標的抗原に対して免疫寛容にする配列を意味する。
【０００７】
寛容原性配列および標的抗原に曝露されることによって、後でこの標的抗原にチャレンジ(challenge)された際、後続のチャレンジにおいて寛容原性配列が存在するかどうかにかかわらず、その細胞がこの標的抗原に対して免疫応答を起こす能力が阻害される。しかし、このような処理をされた細胞集団は、標的抗原に対しては免疫寛容になっているが、他の抗原に対しては、寛容原性配列の不在下において、応答を引き起こす能力を保持する。
【０００８】
このようにして阻害できる免疫応答のタイプには、自己免疫疾患およびアレルギー性疾患で見られる「病原性」の免疫応答と同様、治療用に投与されたものを含めた外来抗原に対する「防御的な」免疫応答も含まれる。これらの応答はしばしば、リンパ球増殖、IL-4またはγ-IFNなどのサイトカインの発現、および抗体応答の誘導を特徴とする。
【０００９】
免疫寛容にされる細胞は、寛容原性ペプチドが由来する感染性物質に、事前に感染した個体からのものであろう。
【００１０】
すなわちこれら寛容原性配列は、標的抗原に対する、単核白血球の抗原特異的免疫寛容を誘導することができる。したがってこの活性は、例えば、レトロウイルスエンベロープタンパク質(Haraguchiら、1995年)およびEBV LMP1タンパク質(Dukersら、2000年)など、いくつかのウイルス由来ペプチドが原因と考えられている、非特異的免疫抑制効果とは対照的である。
【００１１】
本発明者らは、適当な感染性物質に対して血清陽性であるドナーから得た細胞で、IL-10の発現を誘導する能力を試験することによって、そのような配列を同定できることを示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
したがって、第1の態様において本発明は、感染性物質由来の試験ペプチド配列の寛容原性を評価する方法であって、
(i) 細胞集団を前述の試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 前述の細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iii) ステップ(ii)の結果を、この配列の寛容原性と相関させるステップと
を含み、前述の細胞集団が、前述の感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む方法を提供する。
【００１３】
本明細書において使用する「単核白血球」という用語は、Tリンパ球(CD4+Tリンパ球、およびCD8+Tリンパ球を含む)、Bリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞、単核食細胞(単球およびマクロファージ)、および樹状細胞を包含するものである。したがってこの細胞集団は、これらの細胞型の1つまたは複数を含む。
【００１４】
この細胞集団は、少なくともTリンパ球、好ましくはCD4+リンパ球を含むか、または少なくとも1つのタイプの抗原提示細胞(APC)を含むことが好ましい。この細胞集団は、少なくともTリンパ球、好ましくはCD4+リンパ球、および少なくとも1つのタイプの抗原提示細胞を含むことがより好ましい。抗原提示細胞は、MHCクラスII分子のコンテクストにおいて、Tリンパ球に抗原を提示できる任意の細胞である。したがって、Bリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞、単核食細胞(単球およびマクロファージ)、および樹状細胞は、すべてAPCであると考えられる。ただし有核細胞の大部分は、例えばプロ炎症性サイトカインにさらされた際など、適当な条件下ではAPCとして機能でき、したがって、この細胞集団は、単核白血球とは通常見なされないAPCをさらに含むことができる。
【００１５】
この細胞集団は、適当な感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む。この感染性物質にドナーが事前に免疫応答を起こしたことを、適切なアッセイによって実証できることが好ましく、これは例えば、ドナーが感染性物質に対して血清陽性であること、すなわち、この感染性物質に対して特異的な循環抗体をもっていることでもよい。例えば、抗体を検出可能なレベルまで引き上げるのに十分な時間が感染以来経過していない場合、または、感染以来かなりの時間が経過しており、抗体レベルが検出可能性の閾値の下まで低下している場合など、特定の状況下では、ドナーは感染性物質に特異的な循環抗体をもっていない場合がある。それでも、「血清陽性」という用語は、本明細書全体において、実際の血清学的状態にかかわらず、適当な感染性物質に事前に感染したどんな個体について言及するのにも用いられるだろう。また、「血清陰性」という用語は、これに従って解釈するべきであり、すなわち、その感染性物質に事前に感染していない個体のことをいうと解釈するべきである。
【００１６】
この方法は、
(i)(a) 前述の感染性物質に事前に感染していないドナーから得た類似の細胞集団を、前述の試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii)(a) 前述の細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、さらに場合により、
(ii)(b) ステップ(ii)による結果と、ステップ(ii)(a)による結果を比較するステップと
をさらに含むことができる。
【００１７】
ステップ(iii)では、ステップ(ii)、(ii)(a)、および(ii)(b)のいずれから得た個々の結果、または結果のいずれの組合せも、この配列の寛容原性と相関させることができる。一般的には、試験ペプチドによって血清陽性の集団で誘導されたIL-10の発現のレベルが大きいほど、試験ペプチドは寛容原性である可能性が高いと考えられる。
【００１８】
IL-10の発現が増強されているか否かは、いずれの適切な方法で判定してもよい。好適な方法には、例えば、ELISA(Deverauxら、2000年)、フローサイトメトリー(Kreftら、1992年)、非競合的フローイムノアッセイ(Kjellstromら、2000年)、免疫蛍光法(Scheffoldら、2000年)、もしくは免疫ブロットなどによるIL-10タンパク質の特異的検出;例えば、RT-PCR(Blaschkeら、2000年; Demayら、1996年)もしくはノーザンブロットなどによるIL-10mRNAの検出; または、IL-10活性のバイオアッセイ(Schlaakら、1994年)が含まれる。
【００１９】
本発明は、感染性物質由来の試験ペプチド配列の、標的抗原に対する寛容原性を評価する方法であって、
(i) 細胞集団を、(a)前述の試験ペプチド配列、および(b)標的抗原と接触させて、試験組成物を生成するステップと、
(ii) 前述の試験組成物から得た細胞集団を、前述の標的抗原と再接触させるステップと
を含み、前述の細胞集団が、前述の感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む方法をさらに提供する。この細胞集団は、少なくとも1つのタイプのAPCを含むことが好ましく、このAPCは、上述のように、単核白血球でもよいし、そうでなくてもよい。
【００２０】
一般的には、この細胞集団は、ステップ(ii)において試験ペプチドと再接触させないだろう。
【００２１】
この方法は、
(iii) 前述の標的抗原に対する前述の細胞集団の応答を評価するステップと、
さらに場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップと
をさらに含むことができる。
【００２２】
標的抗原への第2のチャレンジに対する細胞集団の応答は、免疫寛容になった集団を、免疫寛容にされていない集団から識別できるいずれの方法で評価してもよい。例えば、免疫寛容にされていない集団の、外来抗原に対する応答には、例えば、細胞増殖(通常リンパ球増殖)、ならびに、IL-4、IL-2、IL-12、およびγ-IFNなどの1つまたは複数のサイトカインの発現(IL-10を除く)のうち1つまたは複数が含まれると予測されるであろう。したがってステップ(iii)は、これらのマーカーのいずれか1つ、または他の好適なマーカーの評価を含むことができる。
【００２３】
この方法は、in vivoで行っても、またはin vitroで行ってもよい。この方法は、in vitroで、例えば、培養中で行うのが好ましい。しかしこの方法は、in vivoの任意の好適なモデルで行ってもよい。
【００２４】
ステップ(ii)で細胞を標的抗原に再接触させる目的は、ステップ(i)の初期接触によって、細胞が標的抗原に対して免疫寛容になったことを確認することである。
【００２５】
したがって、ステップ(ii)では、試験組成物が測定可能な量の試験ペプチド配列、または、細胞自体によって産生された寛容原性因子もしくは免疫抑制性因子を依然として含有しないことが望ましい。これらは、ステップ(ii)で標的抗原によって刺激されるいずれの反応も妨害しうるものである。したがってこの方法は、ステップ(i)とステップ(ii)との間に細胞の休息を可能にするステップを含むことができ、それによって、試験組成物中の試験ペプチドの活性が減少し、細胞がステップ(ii)におけるいずれの反応も妨害するであろう寛容原性因子を依然として発現せず、さらに、初期寛容原性チャレンジ中または初期寛容原性チャレンジに応答して、細胞によって産生された残余寛容原性因子の活性が減少している。ここでは、ステップ(i)におけるPBMCによって産生される寛容原性因子マーカーとして、IL-10活性を用いる。
【００２６】
in vitroで行う場合、この方法は、ステップ(ii)の前に細胞を洗浄するステップを、追加として、または別法として、含むことができる。洗浄は、従来法で行うことができる。通常は、洗浄後に細胞を休息させるであろう。ステップ(ii)で細胞を標的抗原に再接触させる前に、新たな抗原提示細胞を添加してもよい。
【００２７】
どのような特定の理論にも拘束されるものではないが、免役寛容が誘導される際IL-10は、エフェクターとしての役割をもつことができ、したがって、特異的な中和によって、例えば、抗IL-10中和抗体などの中和因子を細胞に添加することによって、IL-10活性の減弱が実現できると考えられている。
【００２８】
この方法は、前述の細胞集団を、前述の試験配列にも、または前述の標的抗原にも関係のない確認用抗原と接触させるステップをさらに含むことができ、それによって、これらの細胞が、標的抗原に対するその反応性が改変されているが、一般的な反応能力を保持していることが確認される。
【００２９】
いずれの好適な抗原も、標的抗原として、または確認用抗原として用いることができる。これらの抗原は、初回抗原であっても、またはリコール(recall)抗原であってもよく、すなわち、アッセイにおける細胞は、事前にそれらの抗原に曝露されていても、または曝露されていなくてもよい。アッセイに使用するための典型的な初回抗原は、KLH(スカシガイヘモシアニン)であり、ドナーがカルメット‐ゲラン杆菌(BCG)で事前に免疫化されている場合には、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)からの精製タンパク質誘導体(PPD)が好適なリコール抗原である。通常、コンカナバリンAなどのT細胞マイトジェンは、T細胞の活性化において比較的非特異的であると見なされるが、本発明の意味の枠内で、標的抗原または確認用抗原として用いることができる。本明細書に記載された技法によって、PBMCを、ConA、PPD、および他の抗原または刺激に対して非応答性にすることが可能であること、そして、それでもなおこれらの細胞は他の抗原に対する応答性を保持していることが明らかになった。
【００３０】
上述のように、血清陽性細胞におけるIL-10発現および/または抗原特異的免疫寛容を誘導できる試験ペプチド配列は、「寛容原性ペプチド配列」とみなすことができる。
【００３１】
したがって、寛容原性ペプチド配列は、好適な血清陽性単核白血球に標的抗原と共に投与することによって、in vivoまたはin vitroで、免疫応答をモジュレートするのに用いることができる。この技法には、多くの適用がある。例えば、標的抗原に対する炎症応答が引き続き発展するのを防止するために、または標的抗原に対する先在免疫反応を抑制するために、この技法を予防的に用いることができる。
【００３２】
したがってさらに別の態様では、本発明は、細胞集団を標的抗原に対して免疫寛容にする方法であって、前述の細胞集団を
(a) 感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列と、
(b) 標的抗原と
に接触させることを含み、前述の細胞集団が、前述の感染性物質に対して血清陽性であるドナーから得た単核白血球を含む方法を提供する。
【００３３】
この細胞集団は、寛容原性ペプチド配列および/または標的抗原に直接接触させることができる。あるいは、この細胞集団を寛容原性ペプチド配列および/または標的抗原に間接的に、例えば、上述のような、通常、単核白血球とはみなされないAPCを介して接触させてもよい。すなわち、APC集団を寛容原性ペプチド配列および/または標的抗原と接触させ、次に、前述の細胞集団をこのAPC集団と接触させることができる。
【００３４】
寛容原性ペプチドおよび標的抗原は、前述の細胞集団に、またはAPC集団に、一緒に、または別々に、そしていずれの順番でも投与することができる。したがって、寛容原性ペプチド配列および標的抗原は、必ずしも同時に投与しなければならないものではない。
【００３５】
記載したいずれのステップ、または全てのステップを、in vitroで、in vivoで、またはex vivoで行うことができる。
【００３６】
したがって、記載したすべてのステップを、in vitroで、例えば、培養において行うことができる。
【００３７】
ある実施形態では、寛容原性ペプチド配列および標的抗原を、例えば適当な感染性物質に事前に感染した個体など、試験被験者または治療被験者に直接投与することができる。したがって、本発明は、標的抗原に対する免疫応答に媒介された疾患または症状を治療する方法であって、寛容原性ペプチド配列を前述の症状または疾患を患っている個体に投与することを含む方法を提供する。この標的抗原も、寛容原性ペプチド配列と共に投与しても、または別々に投与してもよい。
【００３８】
別の実施形態では、寛容原性ペプチド配列および標的抗原を、そのような個体から得た単核白血球を含む細胞集団に、in vitroで投与できる。これらの細胞はその後、例えば、これらの細胞を本来得た被験者など、試験被験者または治療被験者に導入することができる。
【００３９】
別の実施形態では、寛容原性ペプチド配列および標的抗原を、APC集団に、in vitroで投与できる。このAPC集団は、その後、感染個体からの単核白血球を含む細胞集団と、in vitroで接触させることができる。次いでその細胞集団またはそのサブセット、例えば、いくつかの、またはすべての単核白血球は、例えば、これらの細胞を本来得た被験者など、試験被験者または治療被験者に導入することができる。
【００４０】
あるいは、このAPC集団を、例えば、これらの細胞を本来得た被験者など、試験被験者または治療被験者に投与することもできる。この場合、前述の細胞集団と、寛容原性ペプチド配列および標的抗原との接触は、in vivoでAPCを介して起こる。
【００４１】
したがって、ドナー個体、または治療すべき個体から細胞または組織を摘出し、これらを寛容原性ペプチド配列および標的抗原で処理し、さらにドナーに再導入することができる。好適な細胞または組織には、特定のタイプの抗原提示細胞、異種細胞集団、例えば末梢血リンパ球またはそのサブセット、リンパ節などが含まれる。
【００４２】
細胞集団は、少なくともTリンパ球、好ましくはCD4+Tリンパ球を含むことが好ましい。細胞集団は、少なくともTリンパ球、好ましくはCD4+Tリンパ球、および少なくとも1つのタイプのAPCを含むことがより好ましい。免疫寛容にされる細胞集団は、ある実施形態では、試験被験者または治療被験者においてin situで細胞を含むとみなすことができることが、上記の説明から理解できる。
【００４３】
試験被験者または治療被験者は、通常、哺乳動物であり、ヒトである場合もある。ある実施形態では、試験被験者が、例えば、齧歯動物や、ウサギなど、非ヒト哺乳動物であってもよく、通常は、感染性物質に対して血清陽性であろう。
【００４４】
ある種の感染性物質には、簡単に扱える動物モデルがない。例えば、ヒト病原体EBVには、動物モデルがない。したがって、試験被験者は、感染性物質に対して血清陽性である適当な生物種のドナーから得たリンパ球を含有する重症複合型免疫不全の非ヒト哺乳動物であってもよい。「重症複合型免疫不全」とは、リンパ球成熟の欠陥を意味し、したがって、この疾患を患っている動物は、成熟したTリンパ球および/またはBリンパ球を、低いレベルか、または検出不可能なレベルしかもたない。ここで、哺乳動物は、齧歯動物、例えば、SCIDマウスなどのマウスまたはラットでもよい。好ましい実施形態では、重症複合型免疫不全の非ヒト哺乳動物は、EBVに対して血清陽性であるヒトリンパ球、例えば、血清陽性のドナーから得たヒトリンパ球によって再構成される。好適な技法は、Mosierら(1988年)、McCuneら(1988年)、Kamel-Reidら(1988年)、およびRoweら(1991年)に記載されている。他の症状の動物モデルを作製するために、類似の技法を適用することもできる。
【００４５】
本発明のいずれの実施形態でも、標的抗原は、上述した好適な試験抗原であってもよく、または、それに対して不適当もしくは望ましくない免疫応答が起こるか、もしくは起こる可能性が高い抗原であってもよい。したがって標的抗原は、疾患状態に関連づけられているもの、例えば、慢性関節リウマチなどの自己免疫症状または花粉症などのアレルギー状態に関連づけられている自己抗原などであってもよい。標的抗原は、タンパク質、タンパク質エピトープを含めたポリペプチドもしくはペプチド、または、多糖、脂質、高分子複合体、細胞など、免疫反応を引き起こすことができるいかなる他の好適な実体であってもよい。
【００４６】
特異的抗原が、潜在的な病原性を有意にもつものとして同定されている自己免疫性疾患の例には、多発性硬化症(ミエリン塩基性タンパク質)、インシュリン依存性糖尿病(グルタミン酸脱炭酸酵素)、インシュリン抵抗性糖尿病(インシュリン受容体)、腹腔疾患(グリアジン)、水疱性類天疱瘡(XVII型コラーゲン)、自己免疫性溶血性貧血(Rhタンパク質)、自己免疫性血小板減少症(GpIIb/IIIa)、重症筋無力症(アセチルコリン受容体)、グレーブズ病(甲状腺刺激ホルモン受容体)、グッドパスチュア病(α3(IV)NC1コラーゲン)などの糸球体腎炎、および悪性貧血(内因子)が含まれる。したがって、これらの抗原、またはその特定フラグメントもしくはエピトープは、好適な標的抗原となりうる。
【００４７】
標的抗原は、宿主組織に損傷も与える応答を刺激する外因性抗原であってもよい。例えば、急性リウマチ熱は、連鎖球菌抗原に対する抗体応答によって引き起こされるが、この抗体応答が心筋細胞抗原と交差反応する。標的抗原は、例えば、花粉(花粉症に関連づけられている、例えば、オオアワガエリ花粉)、ハウスダストマイト(house dust mites)(喘息)、化粧品、虫刺されを介して投与されるアレルゲン、ナッツアレルゲン、または、第VIII因子、第IX因子、血液型抗原、もしくはモノクローナル抗体などの治療用製品など、アトピー応答またはアレルギー応答を引き起こすものでもよい。
【００４８】
本発明の方法は、一次および二次混合リンパ球反応、移植片拒否反応、および対宿主性移植片病を含めた、同種異系または異種の細胞または組織に対する応答を抑制するのに用いることができる。したがって、細胞移植を受けることが意図されている被験者を、これらの細胞によって発現される抗原に対して免疫寛容にすることができる。あるいは、この移植は、受容者をこれらの細胞に対して免疫寛容にするために、本明細書に記載の寛容原性ペプチド配列、またはそのようなペプチド配列をコードする核酸と共に与えることもできる。好ましい実施形態では、移植されるべき細胞のいくつかまたは全てを、寛容原性ペプチドを発現するように遺伝子操作することができる。したがって、移植される細胞は、寛容原性ペプチド配列を発現できるように、本発明による寛容原性ペプチド配列をコードする核酸を含むことができる。最適な方法は、遺伝子操作される細胞のアイデンティティによるであろう。例えば樹状細胞などの抗原提示細胞は、寛容原性ペプチド配列を、それがプロセシングされ、さらにその細胞自体のMHC II分子のコンテクストで提示されるような様式で発現するように遺伝子操作することができる。他の細胞型では、発現された配列が近傍のAPCによって提示されることが可能となるように、細胞がその配列を分泌するように遺伝子操作することができる。
【００４９】
本明細書に記載するすべての態様において、試験または寛容原性ペプチド配列が由来する感染性物質は、ウイルスでありうる。好ましい実施形態では、このウイルスは、ウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルス、好ましくはEBVである。
【００５０】
試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列は、EBVタンパク質に由来するものでもよく、好ましくはEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである。したがって、本発明の方法は、寛容原性ペプチド配列を含むLMP1タンパク質、LMP2タンパク質、またはその部分もしくはフラグメントの使用にもおよぶ。
【００５１】
試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列は、配列P1〜P75、または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含むことができる。望ましい場合には、2以上の試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列を、同時に、または逐次に投与することができる。
【００５２】
本発明は、標的抗原に対する免疫応答に媒介された疾患を治療する方法であって、(a) 感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列と、(b) 標的抗原とを、前述の感染性物質に対して血清陽性である個体に投与するステップを含む方法も提供する。
【００５３】
試験ペプチドまたは寛容原性ペプチド、および/または標的抗原をコードする核酸は、本発明のすべての方法において、有用でありうる。細胞にペプチドを投与する代替の手段として、このペプチドをコードし、さらにその発現を支持できる核酸を、代わりに用いることができる。例えば、DNAワクチン接種法は、MorおよびEliza (2001年); Smith (2000年); Schleefら(2000年);ならびにApostolopoulosおよびPlebanski (2000)に総説されているように、当業者に周知のものである。したがって、本明細書に記載のいずれの方法においても、ペプチド配列の投与が言及されている場合、そのペプチド配列をコードする核酸配列の投与も想定されている。したがって、細胞集団、または抗原提示細胞の集団をペプチド配列と接触させることには、適当な細胞を適当な核酸と接触させることが含まれるとみなされる。
【００５４】
したがって本発明は、例えば、細胞集団を標的抗原に対して免疫寛容にする方法であって、前述の細胞集団を、
(a) 前述の試験ペプチド配列が前述の細胞集団で発現されるように、前述の試験ペプチド配列をコードする核酸と接触させること、および
(b) 標的抗原と接触させること
を含み、前述の細胞集団が、前述の感染性物質に対して血清陽性であるドナーから得た単核白血球を含む方法を、さらに提供する。
【００５５】
標的抗原がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである場合、標的抗原が前述の細胞集団で発現されるように、標的抗原をコードする核酸を投与することができる。しかしこれは、必ずしも、標的抗原がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである必要性を含意すると取るべきではない。
【００５６】
この方法での核酸の使用は、必要に応じて変更を加えて、そこでペプチド配列の投与が言及されている本発明のいずれの対応する実施形態にも、適用可能であると考えられる。標的抗原がタンパク質またはペプチドである場合も同様に、適当なコード配列を有する核酸を代わりに投与することができる。関連した実施形態では、適当なペプチドを発現して、さらにそれらを分泌するか、またはMHC分子のコンテクストでそれらを提示するように遺伝子操作された細胞と接触させることによって、細胞をペプチドと接触させることができる。
【００５７】
本発明は、感染性物質由来の寛容原性ペプチド配列、および標的抗原を、薬学的に許容される担体との混合物として含む医薬組成物をさらに提供する。
【００５８】
好ましい実施形態では、寛容原性ペプチド配列は、EBVに由来するもの、例えば、上述のLMP1またはLMP2に由来するものである。したがって、この組成物は、寛容原性ペプチド配列を含むEBV LMP1タンパク質、LMP2タンパク質、またはそれらいずれかの部分もしくはフラグメントを含むことができる。
【００５９】
好ましい実施形態では、寛容原性ペプチド配列は、本明細書に記載したLMP1ペプチド配列P1〜P75の1つまたは複数、および/またはLMP2ペプチド配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含むことができる。
【００６０】
本発明は、EBV LMP1タンパク質およびLMP2タンパク質、ならびにそれらいずれかの部分またはフラグメント、例えば、寛容原性ペプチド配列を含むペプチド配列P1〜P75、またはペプチド配列P1'〜P96'を、さらに、医療方法において使用するために提供する。
【００６１】
本発明は、EBV LMP1タンパク質およびLMP2タンパク質、ならびにそれらの部分またはフラグメント、例えば、寛容原性ペプチド配列を含むペプチド配列P1〜P75、またはペプチド配列P1'〜P96'を、さらに、標的抗原に対して指向された免疫応答によって媒介された症状の治療において使用するために提供する。
【００６２】
本発明は、EBV LMP1タンパク質およびLMP2タンパク質、ならびにそれらの部分またはフラグメント、例えば、寛容原性ペプチド配列を含むLMPIペプチド配列P1〜P75、およびLMP2ペプチド配列P1'〜P96'を、さらに、標的抗原に対して指向された免疫応答によって媒介された症状を治療するための医薬を調製するのに提供する。この医薬は、標的抗原をさらに含むことができる。この医薬は、通常、EBVに事前に感染している個体に投与するために製剤化されるだろう。
【００６３】
本発明のこれらの態様、および他の態様において、好ましいペプチドには、P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P20、P22、P23、P24、P25、P26、P27、P29、P30、P32、P34、P35、P39、P68、P71、P72が含まれる。特に好ましいペプチドには、P2、P4、P7、P14、P15、P18、P20、P22、P23、P24、およびP32が含まれる。
【００６４】
前述の症状は、例えば、1型糖尿病、腹腔疾患、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血および血小板減少症、アトピー応答、例えば花粉症もしくは喘息、または、例えば医薬製品またはナッツアレルゲンなどのアレルゲンに対する他のアレルギー、または同種異系免疫応答、例えば移植片拒否反応、対宿主性移植片病、または第VIII因子、またはモノクローナル抗体療法などの治療用製品に対する応答でありうる。上述の標的抗原は、これらの症状の治療に有用でありうる。
【００６５】
本明細書に記載の組成物および医薬は、必要に応じて、寛容原性ペプチドおよび/または標的抗原をコードする核酸を含むことができる。
【００６６】
受容者に移植するための細胞を、薬学的に許容される担体との混合物として含む、医薬組成物も提供する。前述の細胞は本発明に記載の寛容原性ペプチドをコードする核酸を含み、そのため、前述の寛容原性ペプチド配列を前述の細胞によって発現させることができる。
【００６７】
この核酸は、EBVタンパク質、例えば、寛容原性ペプチド配列を含むLMP1もしくはLMP2、またはそのフラグメントをコードすることが好ましい。
【００６８】
寛容原性ペプチド配列および標的抗原は、一緒に投与しても、または別々に投与してもよい。好ましい実施形態では、これらを一緒に投与する。これらは、別々の成分の混合物として、複合体として、または共有結合で連結させて、供給することができる。標的抗原がタンパク質である場合、寛容原性ペプチド配列および標的抗原は、融合タンパク質として供給することができる。このような融合タンパク質の使用は、本発明のすべての態様において適用できる。
【００６９】
本発明の上記態様のいずれでも、免疫寛容にされるべき細胞集団は、好適な種から得られた単核白血球を含むことができる。好ましい実施形態では、この単核白血球は哺乳動物由来であり、例えば、ウマ、ウシなどの家畜動物由来、またはイヌ、ネコなどの家庭的動物由来、またはヒト由来である。同様に、本発明の方法で治療されるべき個体は、哺乳動物、例えば、ウマ、ウシなどの家畜動物、イヌ、ネコなどの家庭的動物、およびヒトであることが好ましい。
【００７０】
本明細書で使用される「ペプチド配列」という用語は、試験ペプチド配列か、または寛容原性ペプチド配列であるかにかかわらず、本質的に、または排他的にその配列からなる遊離ペプチドのみのことをいうと解釈するべきではない。ただし、このようなペプチドも本発明に含まれる。いずれの特定の理論に拘束されるものでもないが、本発明の方法は、適当な配列が集団内の抗原提示細胞によってT細胞に提示可能である限り、有効であると考えられている。したがって、試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列は、MHC分子のコンテクストにおいてT細胞に提示されることが可能である点で、T細胞エピトープを構成することができると考えられている。したがって、試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列は、好ましくは長さが少なくとも6アミノ酸であり、より好ましくは長さが少なくとも8アミノ酸である。
【００７１】
試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列は、MHCクラスII拘束性T細胞エピトープとして作用できることが好ましい。ペプチドがT細胞エピトープとして作用できる可能性は、MHC II分子の抗原結合溝に対する結合能を評価することによって判定できる。特定のMHC対立遺伝子に結合するペプチドモチーフは公知であり、タンパク質配列内のそのようなモチーフを同定することができるコンピュータプログラムが利用可能である(Sturnioloら(1999年); SinghおよびRaghava(2001年))。
【００７２】
当業者ならば、所与のペプチドに応答するいずれのT細胞も、MHC結合またはT細胞受容体認識に重要でない残基に置換を含有する他のペプチドに対しても同様に応答でき、重要な残基に置換を有するペプチドでさえ、特定のものには応答できることを分かっているだろう。ペプチドのそのような免疫学的交差反応性は、特定のT細胞が2以上のペプチドに対して応答できることを示すことで実証できる。そのような実験は、T細胞クローンを用いて行いうる。T細胞をクローニングする技法は、当技術分野で周知である。いずれの特定の理論に拘束されるものでもないが、Tr1表現型のT細胞は、本明細書に記載した方法の基礎となる機構に関与していると考えることができる。そのようなT細胞は、刺激に応答した増殖を有意には行わず、また他の細胞の増殖も抑制するため、クローニングするのは困難であるかもしれない。しかし、好適な技法は公知である。例えばMacDonaldら(2002年)を参照されたい。
【００７３】
本明細書に記載したか、または本明細書の方法を用いて同定した感染性物質に由来する寛容原性ペプチドは、類似したT細胞集団か、または重複しているT細胞集団を刺激することによって類似した寛容原性効果を引き起こす免疫学的交差反応性ペプチドを得るためのスクリーニングに用いることができる。そのような交差反応性のペプチドは、本明細書に記載した感染性物質由来の寛容原性ペプチドの「ミメティクス(mimetics)」とみなすことができる。したがって本発明は、試験ペプチド配列の寛容原性を評価する方法であって、
(i) 第1細胞集団を前述の試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 第2細胞集団を対照ペプチド配列と接触させるステップと、
(iii) 前述の細胞集団のそれぞれでIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、前述の試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップと
を含み、前述の細胞集団のそれぞれが、感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含み、前述の対照ペプチド配列が前述の感染性物質に由来するものである方法を提供する。したがって、対照ペプチド配列は、通常、前述の感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む細胞集団において、IL-10の発現を誘導することが事前に示されているものであろう。
【００７４】
第1細胞集団および第2細胞集団は、同一のドナー個体に由来するものであることが好ましい。好ましい実施形態では、第1細胞集団および第2細胞集団は、T細胞クローン、好ましくは、APCによって適切に提示された際に対照ペプチドに対して応答することが示されているTr1 T細胞クローンを含む。
【００７５】
対照ペプチドは、本明細書に記載したペプチドP1〜P75および/またはペプチドP1'〜P96'の1つまたは複数を含むことができる。
【００７６】
当業者であるならば、MHCの多型的性質のため、ほとんどのペプチドは、すべてのMHC分子に対して結合可能であるわけではないであろうことも分かっているであろう。したがって、本発明での使用に供する組成物は、特定の個体のMHCに結合する可能性が高いペプチドを選択することによって、その個体に合わせたものにすることができる。あるいは、これら組成物は、より広い範囲の活性を有して、より広い範囲の集団に対して適用可能であるように設計することもできる。これは、2以上のMHC対立遺伝子と結合可能なペプチドを組み込むこと、および/または、それぞれがMHCに対する異なった特異性を有する2以上の試験ペプチドまたは寛容原性ペプチドを組み込むことによって実現できる。これらのペプチドは、いずれの適当な形態でも、例えば、別々のペプチドの混合物として、または融合タンパク質として、供給できる。
【００７７】
したがって、試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列は、より長いペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の一部として投与することができる。例えば、この配列は、完全長天然タンパク質の全体または一部のコンテクストにおいて用いることができる。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、いずれの適当な形態、例えば、天然の立体配置でも、または変性立体配置でも、投与することができる。
【００７８】
いずれのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質も、本発明の意味の枠内において、2以上の寛容原性ペプチド配列を含むことができると理解されるであろう。例えば、EBV LMP1タンパク質は、下記の実施例においてより十分に記載されるように、標的抗原に対する免疫寛容を、EBV血清陽性のPBMCに誘導できる個々のペプチド配列を多数含むと考えられている。さらに、1つまたは複数の寛容原性エピトープを含むペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、標的抗原との混合物として利用可能であり、または、例えば、化学結合によって、もしくは、標的抗原がタンパク質である場合には融合タンパク質として、標的抗原と共有結合で結合して供給することもできる。
【００７９】
本発明の方法または組成物での使用に供する、融合タンパク質を含めた、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成および組換え発現を含めた、いずれの適切な方法で作製してもよい。
【００８０】
本発明は、本明細書に記載した配列P1〜P75および配列P1'〜P96'のいずれか1つを有する個々のペプチドをさらに提供する。好ましいペプチドは、P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P20、P22、P23、P24、P25、P26、P27、P29、P30、P32、P34、P35、P39、P68、P71、P72の配列を有する。特に好ましいペプチドは、P2、P4、P7、P14、P15、P18、P20、P22、P23、P24、およびP32の配列を有する。
【００８１】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、本発明の試験配列および寛容原性配列をコードする単離核酸分子を提供する。このオープンリーディングフレームは、上述の融合タンパク質をコードするために、望ましい標的抗原をコードするオープンリーディングフレームと連続させることができる。
【００８２】
さらに別の態様では、本発明は、発現を指令する制御配列に機能的に連結した、上記寛容原性配列をコードする核酸を含む発現ベクター、ならびにこのベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。本発明は、前述の態様のペプチドを生成する方法であって、宿主細胞を培養すること、およびそのようにして生成された寛容原性ペプチドを単離することを含む方法も包含する。
【００８３】
試験配列、寛容原性配列、または標的抗原配列をコードする核酸の発現を得るために、これらの配列は、コードしている核酸に機能的に連結してその発現を制御する制御配列を有するベクターに組み込むことができる。このベクターは他の配列も含むことができ、挿入された核酸の発現を駆動するプロモーターまたはエンハンサー、寛容原性配列のペプチドが、例えば、1つもしくは複数の他のそのような寛容原性配列との融合体として、または1つもしくは複数の標的抗原との融合体として産生されるようにする核酸配列、および/あるいは、宿主細胞中で生成したペプチドが細胞から分泌されるようにする分泌シグナルをコードする核酸などを含むことができる。ペプチド/ポリペプチド/タンパク質は、その後、ベクターがその中で機能的となる宿主細胞中に、ベクターを形質転換すること、ペプチドが産生されるように宿主細胞を培養すること、およびペプチドを宿主細胞または周囲の培地から回収することによって得ることができる。大腸菌(E.coli)、酵母、および、COS細胞またはCHO細胞などの真核細胞の株を含めた、原核細胞および真核細胞がこの目的に当技術分野で用いられる。
【００８４】
プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および他の配列を含めた、適当な調節配列を、必要に応じて含有する好適なベクターを、選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じて、プラスミドでも、ウイルスベクター、例えば「ファージ」、またはファージミドでもよい。さらに詳しくは、例えば、「Molecular Cloning: a Laboratory Manual」: 第2版、Sambrookら、1989年、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。
【００８５】
折り畳み構造および/またはジスルフィド架橋の形成を可能にするか、または促進するように、細胞および技法を選択することができる(例えば、「Protein Folding」、R. Hermann著、1993年出版、欧州特許庁 、The Hague, Netherlands, ISBN 90-9006173-8を参照)。
【００８６】
ペプチドは、いずれの好適な方法で合成してもよく、例えば、完全固相法によって、部分的固相法によって、フラグメント縮合によって、または古典的な溶液カップリングによって合成できる。従来の溶液相ペプチド合成では、ペプチド鎖を一連のカップリング反応によって調製することができるが、この反応中、構成アミノ酸が延長するペプチド鎖に、所望の配列で添加されるのである。
【００８７】
簡潔に述べると、N-α保護されたアミノ酸無水物を、結晶形状で調製するか、または溶液中に新たに調製し、N末端での連続的なアミノ酸添加に使用する。各残基添加の際に、延長するペプチド(固体支持体上)を酸処理して、N-α保護基を除去し、残りの酸を除去するために、また反応媒体へのペプチド末端の接触性を促進するために何度か洗浄する。その後、ペプチドをN保護された活性化アミノ酸対称無水物と反応させ、固体支持体を洗浄する。アミノ酸付加反応は、反応を行って延長するペプチド分子の割合を増大させるために、各残基添加ステップで、合計2回または3回の独立した付加反応を反復することができる。通常、最初の12残基を添加するためには、1〜2 反応サイクルを用い、残りの残基には、2〜3 反応サイクルを用いる。
【００８８】
溶液中での反応を実行するための、様々なN-保護基、様々なカップリング試薬、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、またはカルボニルジイミダゾール、様々な活性エステル、例えば、N-ヒドロキシフタルイミドまたはN-ヒドロキシスクシンイミドのエステル、および様々な開裂試薬の使用は、それに続く中間代謝物の単離および精製と共に、周知の古典的ペプチド方法論である。古典的な溶液合成は、論文「Methoden der Organischen Chemie(Houben-Weyl): Synthese von Peptiden」, E. Wunsch (編集)(1974年)Georg Thieme Verlag, Stuttgart, W. Ger.に詳細に記載されている。完全固相合成法は、教科書「Solid-Phase Peptide Synthesis」、StewartおよびYoung, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984年に記載されており、さらに米国特許第4,105,603号の開示で例示されている。フラグメント縮合法による合成は、米国特許第3,972,859号に例示されている。他の利用可能な合成法は、米国特許第3,842,067号、および第3,862,925号に例示されている。
【００８９】
ペプチドは、メリフィールド固相合成法を用いて調製することが好ましいが、前述の通り、当技術分野で公知の他の同等な化学合成法を用いることもできる。そのような固相合成は、保護されたα-アミノ酸を好適な樹脂にカップリングさせることによって、ペプチドのC末端から開始される。そのような出発物質は、クロロメチル化樹脂もしくはヒドロキシメチル樹脂へのエステル結合によって、またはベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂もしくはパラメチルベンズヒドリルアミン(MBHA)樹脂へのアミド結合によって、αアミノ保護されたアミノ酸を結合させて調製することができる。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Bodanskyら、Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966年)に記載されている。クロロメチル化樹脂は、Bio Rad Laboratories, Richmond, Calif. およびLab. Systems, Inc.から市販されている。そのような樹脂の調製は、上記のStewartら、「Solid Phase Peptide Synthesis」に記載されている。
【００９０】
C末端に遊離酸をもつペプチドを合成するとき、適切な場合、C末端アミノ酸は、Bocおよび側鎖保護基で保護され、最初に、Chemistry Letters, K. Horikiら、165-168 (1978年)に記載の方法によって、撹拌しながら約60℃のKFを含むDMF中で24時間用いて、クロロメチル化樹脂にカップリングさせることができる。
【００９１】
特定のαアミノ保護基を除去するための条件は、SchroderおよびLubke, 「The Peptides」, 1 pp 72-75, Academic Press (1965年)の記載のものを用いることができる。
【００９２】
ペプチドカップリングでの活性化試薬およびそれらの使用は、SchroderおよびLubke, 上記、第III章、ならびにKapoor, J. Phar. Sci., 59, pp 1-27 (1970年)に記載されている。
【００９３】
手動で行う場合、合成の各段階でのカップリング反応の成功は、ニンヒドリン反応によって、E. Kaiserら、Anal. Biochem. 34, 595 (1970年)の記載のように、モニターすることが好ましい。カップリング反応は、Beckman 990自動合成機で、Rivierら、Biopolymers, 1978年、17, pp 1927-1938に報告されたようなプログラムを用いて行うことができるように、自動的に行うこともできる。
【００９４】
ペプチド鎖の伸長が完了した後、保護されているペプチド樹脂を液体フッ化水素酸で処理して、非ブロック化し、支持体からペプチドを放出する。アミド化ペプチドを調製するには、合成で用いた樹脂支持体を、樹脂からペプチドを切断した後に、C末端アミドを供給するために選択する。フッ化水素を除去した後に、ペプチドを1M酢酸溶液中に抽出し、凍結乾燥する。
【００９５】
ペプチドは、ゲル濾過による初期分離で単離することができ、それによって、ペプチド二量体およびより高分子量重合体を取り除き、また望ましくない塩も取り除くことができる。
【００９６】
試験ペプチド配列および寛容原性ペプチド配列は、免疫寛容にするPBMCが由来する宿主を感染させる物質のアミノ酸配列に正確に対応している必要はない。感染性物質の野生型単離株から得たタンパク質をその感染性物質の参照単離株の配列と比較した場合、しばしばそれに相違が含まれることは周知である。しかしながら、参照配列によって合成したペプチドを使用すれば、通常、望ましい寛容原性効果が提供されるであろう。
【００９７】
状況によっては、試験配列または寛容原性配列として、宿主を感染させる物質に由来するものを用いるのではなく、関連物質に由来するものを用いることが、その物質が免疫学的交差反応性を起こすのに十分密接に関連しており、望ましい免疫寛容を誘導する限り、望ましくかつ適切である場合がある。
【００９８】
あるいは、野生型単離株または参照単離株のどちらかと比較して、配列突然変異を故意に導入することも望ましいかもしれない。例えば、いずれの特定の理論に拘束されるものでもないが、試験配列/寛容原性配列は、抗原提示細胞によって、Tr1表現型(3)のT細胞に提示されることで、それらの効果を示すのであろうと考えられている。したがって、より広い範囲のMHC分子に結合することを可能にし、それによって、集団のより多くの部分を標的抗原に対して免疫寛容にするのに用いることが可能となるように、所与の感染性物質由来の寛容原性ペプチドに突然変異を導入することが望ましいかもしれない。
【００９９】
感染性物質タンパク質における対応する領域の既知配列または野生型配列と異なる試験ペプチドまたは寛容原性ペプチドは、それらが十分な寛容原性能力を保持する限り、使用することができる。これは、本発明の方法を用いることで、容易に判定することができる。
【０１００】
変異体ペプチドは、保存的な変異、すなわち、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの疎水性残基のあるものから別のものへの置換、または、アルギニンからリシンへの置換、グルタミン酸からアスパラギン酸への置換、もしくはグルタミンからアスパラギンへの置換などの極性残基のあるものから別のものへの置換の混成によって作製することができる。当業者には周知であるように、保存的置換でポリペプチドの一次構造を変化させても、その配列に挿入されたアミノ酸の側鎖が、置換されたアミノ酸の側鎖と類似の結合および接触を形成できる可能性があるため、そのペプチドの活性をあまり改変させない場合がある。これは、その置換がペプチド立体配座の決定において重要な領域にある場合でさえ当てはまる。非保存性置換を有する変異体も含まれる。当業者には周知であるように、ペプチドの立体配座を決定するのにあまり重要でない領域での置換は、ペプチドの三次元構造を大きく変化させないため、活性に大きな影響を与えない可能性があり、したがって、望ましい活性(例えば、MHC結合)にも影響を与えない可能性がある。ペプチドの立体配座または活性を決定するために重要な領域では、そのような変化によって、有利な特性がポリペプチドに与えられるかもしれない。実際、上記のような変化は、例えば改変された安定性または特異性など、わずかに有利な特性をペプチドに与えるかもしれない。
【０１０１】
通常変異体ペプチドは、N末端またはC末端で延長することができ、またC末端をアミド化するか、遊離酸形態にすることができる。
【０１０２】
アミノ酸配列変異体であるペプチドは、通常、適当な感染性物質由来の野生型配列または参照配列と、少なくとも約50%、60%、70%、80%、90%または、さらに高い配列同一性を共有するであろう。これに関連して、「配列同一性」とは、比較される配列間の厳密なアミノ酸同一性を意味する。
【０１０３】
上述のようにアミノ酸置換または他の改変がいったん行われれば、そのペプチドは、上述のように、必要な寛容原性活性に関してスクリーニングされる。
【０１０４】
上述のように、本発明の組成物は、寛容原性ペプチド配列および場合による標的抗原に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者に周知の他の物質を含むことができる。そのような物質は、非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨げないべきである。担体または他の物質の正確な性質は、例えば、経口経路、静脈内経路、皮膚もしくは皮下経路、鼻腔内経路、筋肉内経路、腹腔内経路などの投与経路に依存するかもしれない。
【０１０５】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末薬、または液体形態でよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバンドなどの固形担体を含むことができる。液体医薬組成物は、通常、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油、または合成油などの液体担体を含んでいる。必要に応じて、生理的食塩水、ブドウ糖もしくは他の糖溶液、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含むこともできる。
【０１０６】
本発明の組成物は、活性物質としてペプチドを含むため、有効成分が、発熱因子を含まず、好適なpH、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態にあるだろうときには、通常それらの組成物は、他の経路、例えば、静脈内注射、皮膚注射もしくは皮下注射、または患部注射で送達されるであろう。当業者であるならば、例えば塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液(Lactated Ringer's Injection)などの等張媒体を用いることで好適な溶液を調製することが十分にできる。保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤、および/または、他の添加物を必要に応じて含めることができる。
【０１０７】
遅延放出するためには、例えば寛容原性ペプチド配列および標的抗原などの活性物質を、例えば、生体適合ポリマーから形成されたマイクロカプセル中や、当技術分野で公知の方法によるリポソーム担体システム中など、遅延放出用に製剤化された医薬組成物中に含めることができる。
【０１０８】
ペプチドを持続放出するためには、米国特許第5,320,840号に記載されているように、ペプチドを両親媒性ブロック共重合体から得られたポリラクチドもしくは生物分解性ヒドロゲルなどの水溶性重合体に共有結合によって結合させることができる。米国特許第5,024,841号に記載されているものなど、コラーゲンベースのマトリクスインプラントも、ペプチド治療薬の持続的送達に有用である。自己硬化性で、液体形状で送達させた後にin situでインプラントを形成する生分解性重合体を含む組成物も、特に皮下遅延放出送達用に有用である。そのような組成物は、例えば米国特許第5,278,202号に記載されている。
【０１０９】
したがってさらに別の態様では、本発明は、寛容原性ペプチドをコードする核酸分子を含む医薬組成物と、治療方法または診断方法におけるその使用とを提供する。この組成物は、標的抗原をコードする核酸分子をさらに含むことができ、この核酸分子は、寛容原性ペプチドをコードする核酸分子と連続的でありうる。
【０１１０】
さらに別の態様では、本発明は、上で定義された1つまたは複数の寛容原性ペプチド配列を含む医薬組成物と、治療方法または診断方法におけるその使用とを提供する。この組成物は1つまたは複数の標的抗原をさらに含むことができる。
【０１１１】
さらに別の態様では、本発明は、治療用医薬の調製に使用するための、上記寛容原性ペプチド配列と、それをコードする核酸分子とを提供する。
【０１１２】
ペプチドは、経皮イオン導入によって、好適に投与することができる。経皮送達は、化合物を送達するのに特に有用な手段の1つである。この形態での送達は、当技術分野で公知の方法に従って実現することができる。経皮送達には、通常、経皮「パッチ」の使用が含まれるが、これは皮膚の選択された領域における化合物の遅延送達を可能にするものである。通常、そのようなパッチは、化合物を全身送達するのに用いられる。経皮パッチ送達システムの例は、米国特許第4,655,766号(浸透圧駆動性流体吸収システム)、および米国特許第5,004,610号(速度制御経皮送達システム)によって提供されている。
【０１１３】
ペプチドを経皮送達するためには、米国特許第5,032,109号(電解経皮送達システム)、および米国特許第5,314,502号(電力イオン導入送達装置)に記載されているものなどのイオン導入法を用いて、経皮送達を実行することが好ましい。
【０１１４】
経皮送達するためには、脂溶性物質(例えば、脂肪族カルボン酸、脂肪族アルコール)、または水溶性物質(例えば、エチレングリコール、1,3-プロパンジオール、グリセロール、プロピレングリコールなどのアルカンポリオール)などの浸透促進物質を含むことが望ましいこともある。さらに、米国特許第5,362,497号に記載されているように、「超吸水性樹脂」を、経皮送達をさらに促進するために、経皮製剤に添加することができる。そのような樹脂の例には、ポリアクリレート、鹸化酢酸ビニル-アクリル酸エステルコポリマー、架橋ポリビニルアルコール-マレイン酸無水物共重合体、鹸化ポリアクリロニトリルグラフト重合体、デンプンアクリル酸グラフト重合体などが含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような製剤は、閉鎖包帯として目的の領域に提供することができ、または上述の経皮パッチ構造の1つもしくは複数に供給することもできる。
【０１１５】
他の治療方法では、当技術分野で公知の方法に従って、モジュレーターを経口で、または経鼻吸入法で与えることができる。ペプチドを投与するためには、当技術分野で公知の方法に従って、経口送達または鼻腔内送達に適したマイクロカプセルに、そのようなペプチドを組み込むことが望ましいかもしれない。
【０１１６】
投与は、「予防上有効量」または「治療上有効量」(ただし場合によっては、予防も治療とみなされうる)であることが好ましく、これは個体に利益を与えるのに十分な量である。実際に投与される量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療されているものの性質および重篤度によるであろう。例えば、用量などの決定など、治療の規定は一般開業医および他の医師の責任の範囲にあり、通常、治療されるべき障害、個々の患者の症状、送達部位、投与方法、および開業医に公知の他の要因が考慮される。上述の技法およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol, A. (編集)、1980年に見いだすことができる。
【０１１７】
あるいは、特定タイプの細胞により特異的に活性物質を送達するために、抗体または細胞特異的リガンドなどのターゲッティングシステムを使用して、ターゲッティング療法を用いることもできる。ターゲッティングは、さまざまな理由で、例えば、薬剤が容認できないほど毒性である場合に、または別の方法では必要な用量が多くなり過ぎるであろう場合に、または別の方法では標的細胞に入ることができないであろう場合に望ましいかもしれない。
【０１１８】
これらの薬剤は、直接投与する代わりに、例えばウイルスベクターなどにおいて、標的細胞に導入された、コード遺伝子から発現することによって、標的細胞中で産生できるかもしれない。このベクターは、治療するべき特定の細胞にターゲッティングできるかもしれないし、または標的細胞で多かれ少なかれ選択的に作動される調節エレメントを含有できるかもしれない。
【０１１９】
組成物は、単独で投与してもよく、または、他の治療と併用して、治療しようとする症状に応じて、同時に、もしくは逐次的に投与してもよい。
【０１２０】
本発明の特定の実施形態を、添付図面を参考にして、限定的ではなく、例示として、さらに詳細に記載するであろう。
【実施例】
【０１２１】
LMP1は、EBV血清陽性ドナーから得たPBMCによる、高レベルのIL-10分泌を誘導するが、血清陰性ドナーでは誘導しない
10人のEBV血清陽性ドナーからの得たPBMCが、精製されたLMP1に対して、Thサイトカイン分泌または増殖のいずれかで応答する能力について試験した。すべての血清陽性ドナーにおいて、主に測定されたサイトカインはIL-10であり、増殖応答、γ-IFN応答、またはIL-4応答は、有意に測定されなかった。図1は、2人の血清陽性ドナーから得られた代表的な結果を示す。観測された応答が、事前のEBV感染によって生じたものであることを確認するために、2人のEBV血清陰性ドナーから得たPBMCを、精製されたLMP1に対する応答性に関して試験した。図1から、これらのドナーにおいて、LMP1がIL-10分泌も、または有意の増殖およびγ-IFN応答も誘導しなかったことも見ることができる。T細胞マイトジェンであるコンカナバリンA(Con A)および対照リコール抗原である結核菌精製タンパク質誘導体(PPD)によって、EBVの血清学的な状態にかかわらず、増殖およびγ-IFN産生を主とした応答が誘導されたため、両ドナーグループにおける前述の結果はLMP1に特異的なものである。
【０１２２】
EBV血清陽性ドナーから得たPBMCは、複数のLMP1ペプチドに対して、IL-10を分泌することで強く応答する
LMP1に対する免疫応答をさらに特徴づけるために、LMP1の全配列にまたがる、20-merの合成ペプチドからなるパネルで、20人の健康なEBV血清陽性ドナーから得たPBMCをスクリーニングすることによって、IL-10分泌を誘導したエピトープのマッピングを行った。1人のドナー(図2)から得られた代表的な結果は、複数のLMP1ペプチドによって、高濃度のIL-10分泌が誘導されたことを実証する。対照的に、増殖を誘導したのは、3つのペプチドのみであり、γ-IFNは5つのペプチド、IL-4は2つのペプチド、そしてこれら後者の応答はすべて弱いものであった。同様の応答性パターンが、合計20人の血清陽性のドナーで見いだされた(図3に概要)。きわだったことに、特定のペプチドが異なったドナー(p=2.2.10-7、ポアソン異質性検定)で、共通にIL-10応答を誘導し、例えば、ペプチド4(aa16〜35)は80%の個体でIL-10を誘導した。その上、これらの優性なIL-10誘導性ペプチドは、多数のMHCクラスII分子に対する結合モチーフに富んだ、このタンパク質のN末端側半分内に集中している。(http://imtech.res.in/raghava/propred/index.html; http://www.csd.abdn.ac.uk/~gjlk/MHC-Thread) (Sturnioloら(1999年); SinghおよびRaghava(2001年))。
【０１２３】
4人のEBV血清陰性ドナーから得たPBMCも、LMP1ペプチドのパネルでスクリーニングした。このグループでは応答性がほとんど見られず、IL-10応答が合計9つのみ、γ-IFN応答が1つ、増殖応答が1つで、そしてIL-4応答は1つもなかった。さらに、これらのすべての応答は比較的弱いものであった(データは示されていない)。
【０１２４】
LMP1およびLMP1ペプチドに対してIL-10分泌で応答する細胞はCD3+CD4+である
IL-10産生を行う細胞の表現型をフローサイトメトリーで測定し、4人の血清陽性個体に由来する、ペプチド刺激した培養と、刺激しなかった培養とを比較した。ほとんどのIL-10産生細胞は、T細胞のCD3マーカーを有し(平均= 83.9%、SD=9.4%)、これらの中では、大部分がCD4+ヘルパー表現型のものであった(平均= 90.6%、SD=8.9%)(図4)。同様に、CD69およびCD71の発現から判断されるところの活性化細胞も、ペプチドに応答して増殖したまれな培養においては、CD4+であった(データは示されていない)。
【０１２５】
LMP1およびLMP1ペプチドは、IL-10分泌性Tr1細胞を刺激することによって増殖応答およびγ-IFN応答を抑制する
IL-10分泌の傾向があるCD4+T細胞はTr1細胞と呼ばれるが、これらTr1細胞は、免疫調節において重要な役割を果たしているという証跡があり(Grouxら、1997年; LevingsおよびRoncarolo、2000年)、また炎症応答を阻害することが示されている(Grouxら、1997年; RoncaroloおよびLevings、2000年)。本発明者らは、LMP1およびペプチドパネルに対する応答が主としてTr1 細胞によって媒介されていると結論し、これらの細胞が抑制を媒介できることの確認を試みた。試験された10人の血清陽性ドナー全員において、T細胞マイトジェンCon A、リコール抗原PPD、および初回抗原スカシガイヘモシアニン(KLH)に対する増殖応答およびγ-IFN応答が、LMP1の添加により、強く、56-99%阻害された(図5)。PBMCを2人の対照血清陰性ボランティアから得た際にはそのような効果が見られなかったため(図5)、LMP1に対するIL-10応答、および関連した阻害は、EBVに感染したことのあるドナーに依存したものであった。IL-10誘導性LMP1ペプチドを、5人の血清陽性ドナーから得たPBMCの培養に添加したとき、精製されたLMP1タンパク質で得られたものに類似の結果が見出され、PPDに対する増殖応答およびγ-IFN応答が41〜99%抑制された(図6)。平行実験では、このペプチドによって、マイトジェンCon Aまたは初回抗原KLHに対する増殖応答およびγ-IFN応答も阻害された(結果は示されていない)。このサイトカインを誘導しなかったLMP1由来ペプチドを、PPDで刺激した培養に添加した際、抑制が見られなかったため、図6 は、阻害作用がIL-10に依存していることも実証する。さらに、抗IL-10抗体で処理された培養では、LMP1ペプチド媒介性の抑制が71%まで戻された(図6)。
【０１２６】
in vitroでのLMP1媒介性抑制は抗原特異的かつ持続的である
3人の血清陽性ドナーおよび1人の血清陰性ドナーから得たPBMCを、まず培養中で、マイトジェンCon A、リコール抗原PPD、初回抗原KLHによって、単独で、または精製されたLMP1と併用して、そして2つの場合ではLMP1誘導ペプチドと併用して刺激した。続いて細胞を7日間休息させ、抗原を除去するために洗浄し、抗原提示細胞の供給源として新しい照射された自己PBMCに添加した(Plebanskiら、1992年)。各グループの細胞を、その後、それぞれの刺激で再刺激した。結果を図7〜10に示す。
【０１２７】
血清陽性ドナーから得た細胞(図7、8、および9)は、初めにLMP-1と併用した刺激に曝露されたが、IL-10応答を有意に示し、IFN-γ応答および増殖応答の産生が低かった。LMP-1の不在下に、同じ刺激で再刺激された場合でも、これらの細胞はまだ増殖できず、またIFN-γも発現しなかった。しかし、これらの細胞は、他の刺激に対しては、増殖能およびIL-10産生能を保持し、これらの細胞が、最初にLMP-1と併用して投与された刺激に、特異的に免疫寛容にされていることを示した。LMP1由来ペプチドを用いた2人の血清陽性ドナーに関しても、同様の結果を得た(ペプチド4および18、それぞれ図7dおよび9dに示す)。さらに別のリコール抗原である破傷風トキソイドに関しても同様の結果を得た(データは示されていない)。
【０１２８】
血清陰性ドナーから得た細胞(図10)は、LMP-1の存在にもかかわらず、すべての刺激に対して典型的なIFN-γ応答および増殖応答で応答し、この免疫寛容誘導がこのタンパク質に固有の特性ではなく、細胞が事前にEBVに曝露されていることに依存することを示した。
【０１２９】
したがって、LMP1に対するTr1応答が、バイスタンダー抗原を認識するT細胞を、アネルギー性のIL-10分泌性表現型をとるように偏移させると仮定することができる。LMP1と共に同時発現される他のウイルス抗原に特異的な、そのようなアネルギーの誘導は、EBV潜伏の維持に重要であるかもしれない。
【０１３０】
抗原プロセシングの阻害はLMP1タンパク質によるIL-10分泌の誘導を阻止するが、合成LMP1ペプチドでは阻止しない
これらのLMP1ペプチドによって、CD4+T細胞からのIL-10分泌が誘導されることは、このタンパク質がプロセシングされ、抗原性ペプチドフラグメントとしてAPCによって提示された後に、LMP1全体がそのような応答を誘導する可能性があることが示唆される。しかし、他の病原体由来の分子は、プロセシングの後ではなく、生得的なパターン認識受容体との直接相互作用によってIL-10を誘導することが示されている(McGuirkら、2002年; Millsら、2002年; Urbanら、2001年)。
【０１３１】
従って、LMP1-媒介性抑制におけるプロセシングの必要性を調査するために、抗原負荷をクロロキンの添加によって阻害した。
【０１３２】
PBMC培養を、クロロキンまたは対照APCで処理し、精製したLMP1またはIL-10誘導性LMP1ペプチドで刺激した。結果(図11)は、抗原プロセシングの阻害は、精製したLMP1によって誘導されたIL-10分泌を阻止するが、LMP1ペプチドによって誘導されたIL-10分泌は阻止しないことを示す。
【０１３３】
Th1応答およびTh2応答の両方が、単一LMP1ペプチドまたはペプチドの組合せで阻害されうる
PPDおよびハウスダストマイト(HDM)アレルゲンに対する血清陽性PBMCの応答に対する、選択されたLMP1ペプチドおよびペプチドの組合せの効果を評価した。PPDは、Th1型応答の代表的応答を引き起こすため、これを選択し、一方HDMは、IL-4を主とする代表的な病原性アレルギー型Th2応答を引き起こすように選択した。ペプチド混合物は、その混合物で刺激した場合、所与のドナーでも、IL-10応答の産生を失敗する可能性ができるだけ低くなるように選択した。図12は1人の代表的ドナーからの結果を示す。予想されるように、PPDのみの投与は、IFN-γ分泌を伴う増殖を引き起こし、一方HDMのみでは増殖およびIL-4分泌を引き起こす。しかしどちらの場合でも、これらの反応は、3つのペプチド混合物すべてによって抑制された。
【０１３４】
LMP1ペプチドは、正常個体における、自己抗原および同種異系抗原に対する応答ならびに混合リンパ球反応において抑制する
自己免疫応答および同種異系免疫応答に関連づけられている抗原に対する、2人の正常個体から得たPBMCの応答を調べ、図13に示す。これらのドナーは、PPD、ConA、およびKLHに対して、予想どおりの反応を示し(ただしこのアッセイでは、通常とは異なり、KLH単独の刺激によって、有意な量のIL-10産生が引き起こされた)、これらの応答は、LMP1ペプチド混合物で抑制された。
【０１３５】
アカゲザルDタンパク質(RhD)は、自己免疫性溶血性貧血および多くの同種異系免疫性溶血性貧血の主要な自己抗原である。α3(IV)NC1 (a3)は、グッドパスチュア病における標的のコラーゲンである。有意な病原性を有するこれらの抗原の両方に対するTh1応答も、これらの個体で阻害されており、IL-10産生するように逸脱されていた。
【０１３６】
ドナー細胞との混合リンパ球反応(MLR)における刺激物質として、同種異系のPBMCを使用したところ、大規模な増殖と、かなりのγ-インターフェロンが分泌された。しかしなお、これらの非常に強い応答でさえ、LMP1ペプチド混合物によって、著しく阻害することができた。パネル(b)では、代わりにIL-10分泌があるのを見ることができる。パネル(a)では、やや減弱した阻害があるが、有意なIL-10産生はない(これは、間違った時点で試料採取したミスによる可能性がある)。これらのMLRは、HLA不適合移植状態のモデルとして役立つ。
【０１３７】
最後に、図13は、オオアワガエリ(TG)およびハウスダストマイト(HDM)の2つのアレルゲンで得られた結果を示す。パネル(b)では、中程度のアトピーに罹患しているドナーからの結果として、HDMによって、IL-4と、かなりのγ-インターフェロン/増殖と、比較的少量のIL-10とを伴う典型的なTh2応答が誘導されている。ペプチド混合物によって、Th2応答がなくなり、それらはIL-10応答に代えられる。TGは、「免疫寛容」およびTh1応答が入り交じった応答を引き起こす。ペプチド混合物は、後者をなくし、前者を増大させる。パネル(a)では、両抗原に対する免疫寛容が既にある。ただし、混合物は、増殖コンポーネントおよびγ-インターフェロンコンポーネントを阻害することができる。IL-10分泌が減弱しているが、その理由は明らかでない。したがって、改めて、LMP1ペプチドによってTh2応答が阻害されうることが実証された。
【０１３８】
アレルゲンに対するTh2応答の抑制は、抗原特異的かつ持続的である
正常なドナーから得たPBMCを、アレルゲンであるHDMおよびTGによって、単独で、またペプチド混合物1〜3と併用して刺激した。他の様々な抗原を対照として用いた。応答を図14パネル(a)に示す。パネル(b)はHDM、TG、およびPPDで再刺激した結果を示す。すべての場合で、初回刺激への応答は抑制されたが、細胞は、他の抗原に正常に応答する能力を保持した。したがって、アレルゲンに対するIL-4駆動性Th2応答の抑制は、抗原特異的であり、LMP1ペプチドの不在下でも持続している。
【０１３９】
LMP1ペプチドは、罹患個体から得た細胞のTh1型自己免疫応答を阻害できる
自己免疫性溶血性貧血の患者から得た細胞をRhD抗原のみで刺激したところ、IFN-γの分泌を伴う強い増殖応答が得られた。この応答のこれらTh1コンポーネントは、上述した3つのLMP1ペプチド混合物すべてによって著しく阻害された(図15)。
【０１４０】
LMP1ペプチドは、罹患個体から得た細胞のアレルギー応答を阻害することができる
HDMアレルゲンおよびTGアレルゲンに対する増殖応答およびIFN-γ応答は、花粉症および喘息を患っている患者から得たPBMCにおいて、LMP1ペプチド混合物によってほとんどバックグランドレベルまで減弱された(図16a)。これらの細胞では、IL-4分泌も阻害された。ただしこのアッセイで示されたIL-4バックグランドは非常に高い。ここでもまた、ペプチドの不在下に、これらの細胞をPPD、HDMおよびTGで再刺激したところ、初回刺激に対する細胞の応答は抑制されたが、他の抗原に応答する能力を保持していることが示された。
【０１４１】
実施例の考察
本明細書において仮定した新規の機構によって、エプスタイン-バーウイルス(EBV)は検出を回避するのではなく、代わりに、抑制サイトカインであるインターロイキン10(IL-10)を分泌する調節性CD4+T細胞を刺激することによって免疫応答を破壊する。そのような調節性T細胞は、十分に認識されているものだが(1〜3)、ウイルス持続(4〜6)における役割をもつことは知られていない。EBV血清陽性ドナーのすべてから得られたヒト末梢血単核細胞(PBMC)は、精製された潜伏性膜タンパク質1(LMP1)および対応する免疫優性ペプチドの両方に対して、CD4+T細胞による高レベルのIL-10分泌で応答し、しかし血清陰性ドナーからのものは応答しなかった。これらのIL-10応答は、T調節性1(Tr1)細胞に特有のものであるが、マイトジェンおよびリコール抗原の両方によって誘導されるT細胞増殖およびγ-インターフェロン(γ-IFN)分泌の阻害と同時に起こった。免疫応答を免疫寛容へと偏移させるこのウイルス抗原の能力は、潜伏性の維持、およびEBV関連腫瘍の維持にとって重要である可能性が高い。
【０１４２】
この研究は、EBVに潜伏感染した個体に、LMP1に対する防御的免疫応答が欠如していることに促されたものである。本発明者らのデータによる主な結論は、LMP1は免疫系によって認識されるが、この応答は、Tr1表現型の細胞(LevingsおよびRoncarolo、2000年)による高レベルのIL-10分泌の誘導を主とするものであるということである。さらに、このIL-10応答は、他の抗原およびポリクローナル刺激に対する増殖応答およびγ-IFN応答の両方を抑制することが可能であり、したがって、LMP1に対する防御的なTh1免疫および細胞傷害性免疫(Fiorentinoら、1991年)の発生を防ぐことが予想されるであろう。実際、そのようなIL-10分泌は、潜伏感染および関連腫瘍の両方で、同時発現される他のEBVタンパク質に対するTh1応答をアネルギー性にする(anergise)可能性もある。本発明者らによるTr1活性化の実証は、マイトジェン、抗原、およびCD3/CD28に刺激されたT細胞活性化;ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性;および抗原に誘導されたγ-IFN分泌を含めた免疫機能を組換えLMP1が阻害するという、以前に報告された知見(Dukersら、2000年)の機構を提供するものである。LMP1由来の1つのペプチドは、本発明者らのパネルにおけるペプチド7の配列(aa31-50)中に含まれているものであるが、これらの抑制性の特性を複製することが報告されており(Dukersら、2000年)、本明細書において、多くの有効なTr1 IL-10誘発物質の1つとして同定されている。
【０１４３】
LMP1がTr1細胞によるIL-10産生を誘導する傾向をもつことの可能な説明の1つは、IL-10が「条件付け」された結果として、LMP1に対する抑制性応答が確立、維持されるというものである。IL-10存在下でのCD4+T細胞の活性化は、Tr1細胞の発生を導く(Grouxら、1997年)。EBVは、このサイトカインの相同体であるウイルスIL-10(vIL-10)(Hsuら、1990年)をコードするウイルスの1つであり、これを溶菌サイクル感染中に発現する(Hayesら、1999年)。したがって、本発明者らは、EBVに対する免疫応答が起こっている間に、vIL-10の存在が、LMP1特異的なTh細胞の分化を、IL-10分泌性のTr1細胞になりやすいように偏移させ、この偏向がその後自己永続的になると提案する。LMP1に対する調節性応答が、EBV血清陽性ドナーに限定され、EBV血清陰性ドナーには見られないという発見は、この第2の説明を強く支持する。
【０１４４】
免疫系によるクリアランスを回避するために、病原体によって用いられる多数の方法は、記載されており、逃避、耐性または反撃に依存している(Xuら、2001年)。EBV LMP1に対するTr1応答の誘導は、さらに別の免疫回避機構を代表するものである。免疫検出を回避するよりむしろ破壊する類似の調節機構を、慢性感染を維持する能力を有する他の病原体によって利用される可能性も十分にあるだろう。このことは、サイトメガロウイルスなど、強力な免疫抑制効果を有する、IL-10相同体を同様にコードするウイルス(Spencerら、2002年)で特に可能性が高く、調節性のTr1型免疫応答も誘導するかもしれない。そのようなTr1応答を克服するための戦略設計により、EBV関連腫瘍を予防、または治療するワクチンの開発への革新的なアプローチが得られるであろう。逆に、バイスタンダーアネルギーのそのような特異的誘導を、免疫媒介性疾患における病原性応答を阻害するのに利用することが可能かもしれない。
【０１４５】
実験手順
ドナー
血液試料は、健常ボランティアのグループから静脈穿刺で得た。ドナーは、血清抗EBNA1 IgGに対するELISAによって、EBV血清陽性か、または血清陰性として分類した。陰性結果は、IgGおよびIgM抗ウィルスキャプシド抗体の免疫蛍光染色によって確認した。
【０１４６】
血液試料は、アレルギー性鼻炎の男性患者、アトピー性ぜん息の女性患者、および温式特発性自己免疫性溶血性貧血の男性患者からも静脈穿刺で得た。
【０１４７】
抗原およびマイトジェン
LMP1は、抗マウスIgG1でコーティングされた磁性ビーズ(Biomag、PerSeptive Biosystems)に結合された抗LMP1抗体CS1-4(Novocastra Laboratories)を用いて、溶解したEBV形質転換B細胞から、免疫精製した。
【０１４８】
76個の20-merペプチドからなり、15個のアミノ酸重複を有するパネルを合成した(Department of Biochemistry, University of Birmingham, UK or University of Bristol, UK) 。このパネルは、プロトタイプであるB細胞由来遺伝子(B95.8)配列(Hayesら、1999年)から判定されるように、63kD EBV LMP1の全長にまたがるものである。すべてのペプチドは、15μg/mlで培養を刺激するのに用いたが、応答は、以前のマッピング研究(Stottら、2000年)と同様に、広範囲の濃度(4〜50μg/ml)で類似のものであった。ペプチドの混合物が用いられた場合、アッセイ中に、それぞれのペプチドは15μg/mlで存在した。
【０１４９】
ペプチド配列は下記の通りである。 
P1     MEHDLERGPPGPRRPPRGPP    P39    HSDEHHHDDSLPHPQQATDD
P2     ERGPPGPRRPPRGPPLSSSL    P40    HHDDSLPHPQQATDDSGHES
P3     GPRRPPRGPPLSSSLGLALL    P41    LPHPQQATDDSGHESDSNSN
P4     PRGPPLSSSLGLALLLLLLA    P42    QATDDSGHESDSNSNEGRHH
P5     LSSSLGLALLLLLLALLFWL    P43    SGHESDSNSNEGRHHLLVSG
P6     GLALLLLLLALLFWLYIVMS    P44    DSNSNEGRHHLLVSGAGDGP
P7     LLLLALLFWLYIVMSDWTGG    P45    EGRHHLLVSGAGDGPPLCSQ
P8     LLFWLYIVMSDWTGGALLVL    P46    LLVSGAGDGPPLCSQNLGAP
P9     YIVMSDWTGGALLVLYSFAL    P47    AGDGPPLCSQNLGAPGGGPD
P10    DWTGGALLVLYSFALMLIII    P48    PLCSQNLGAPGGGPDNGPQD
P11    ALLVLYSFALMLIIIILIIF    P49    NLGAPGGGPDNGPQDPDNTD
P12    YSFALMLIIIILIIFIFRRD    P50    GGGPDNGPQDPDNTDDNGPQ
P13    MLIIIILIIFIFRRDLLCPL    P51    NGPQDPDNTDDNGPQDPDNT
P14    ILIIFIFRRDLLCPLGALCI    P52    PDNTDDNGPQDPDNTDDNGP
P15    IFRRDLLCPLGALCILLLMI    P53    DNGPQDPDNTDDNGPHDPLP
P16    LLCPLGALCILLLMITLLLI    P54    DPDNTDDNGPHDPLPQDPDN
P17    GALCILLLMITLLLIALWNL    P55    DDNGPHDPLPQDPDNTDDNG
P18    LLLMITLLLIALWNLHGQAL    P56    HDPLPQDPDNTDDNGPQDPD
P19    TLLLIALWNLHGQALFLGIV    P57    QDPDNTDDNGPQDPDNTDDN
P20    ALWNLHGQALFLGIVLFIFG    P58    TDDNGPQDPDNTDDNGPHDP
P21    HGQALFLGIVLFIFGCLLVL    P59    PQDPDNTDDNGPHDPLPHSP
P22    FLGIVLFIFGCLLVLGIWIY    P60    NTDDNGPHDPLPHSPSDSAG
P23    LFIFGCLLVLGIWIYLLEML    P61    GPHDPLPHSPSDSAGNDGGP
P24    CLLVLGIWIYLLEMLWRLGA    P62    LPHSPSDSAGNDGGPPQLTE
P25    GIWIYLLEMLWRLGATIWQL    P63    SSGSGGDDDDPHGPVQLSYYD
P26    LLEMLWRLGATIWQLLAFFL    P64    SDSAGNDGGPPQLTEEVENK
P27    WRLGATIWQLLAFFLAFFLD    P65    NDGGPPQLTEEVENKGGDQG
P28    TIWQLLAFFLAFFLDLILLI    P66    PQLTEEVENKGGDQGPPLMT
P29    LAFFLAFFLDLILLIIALYL    P67    EVENKGGDQGPPLMTDGGGG
P30    AFFLDLILLIIALYLQQNWW    P68    GGDQGPPLMTDGGGGHSHDS
P31    LILLIIALYLQQNWWTLLVD    P69    PPLMTDGGGGHSHDSGHGGG
P32    IALYLQQNWWTLLVDLLWLL    P70    DGGGGHSHDSGHGGGDPHLP
P33    QQNWWTLLVDLLWLLLFLAI    P71    HSHDSGHGGGDPHLPTLLLG
P34    TLLVDLLWLLLFLAILIWMY    P72    GHGGGDPHLPTLLLGSSGSG
P35    LLWLLLFLAILIWMYYHGQR    P73    DPHLPTLLLGSSGSGGDDDD
P36    LFLAILIWMYYHGQRHSDEH    P74    TLLLGSSGSGGDDDDPHGPV
P37    LIWMYYHGQRHSDEHHHDDS    P75    LFLAILIWMYYHGQRHSDEH
P38    YHGQRHSDEHHHDDSLPHPQ
【０１５０】
下記の配列を有するLMP2から、類似のペプチドパネルを調製した。 
P1'     MGSLEMVPMGAGPPSPGGDP    P49'    WRRLTVCGGIMFLACVLVLI
P2'     MVPMGAGPPSPGGDPDGYDG    P50'    VCGGIMFLACVLVLIVDAVL
P3'     AGPPSPGGDPDGYDGGNNSQ    P51'    MFLACVLVLIVDAVLQLSPL
P4'     PGGDPDGYDGGNNSQYPSAS    P52'    VLVLIVDAVLQLSPLLGAVT
P5'     DGYDGGMNSQYPSASGSSGN    P53'    VDAVLQLSPLLGAVTVVSMT
P6'     GNNSQYPSASGSSGNTPTPP    P54'    QLSPLLGAVTVVSMTLLLLA
P7'     YPSASGSSGNTPTPPMDEER    P55'    LGAVTVVSMTLLLLAFVLWL
P8'     GSSGNTPTPPNDEERESNEE    P56'    VVSMTLLLLAFVLWLSSPGG
P9'     TPTPPNDEERESNEEPPPPY    P57'    LLLLAFVLWLSSPGGLGTLG
P10'    NDEERESNEEPPPPYEDPYW    P58'    FVLWLSSPGGLGTLGAALLT
P11'    RESNEEPPPPYEDYWGNGD     P59'    SSPGGLGTLGAALLTLAAAL
P12'    EPPPPYEDPYWGNGDRHSDY    P60'    LGTLGAALLTLAAALALLAS
P13'    YEDPYWGNGDRHSDYQPLGT    P61'    AALLTLAAALALLASLILGT
P14'    WGNGDRHSDYQPLGTQDQSL    P62'    LAAALALLASLILGTLNLTT
P15'    RHSDYQPLGTQDQSLYLGLQ    P63'    ALLASLILGTLNLTTMFLLM
P16'    QPLGTQDQSLYLGLQHDGND    P64'    LILGTLNLTTMFLLMLLWTL
P17'    QDQSLYLGLQHDGNDGLPPP    P65'    LNLTTMFLLMLLWTLVVLLI
P18'    LGLQHDGNDGLPPPPYSPRD    P66'    MFLLMLLWTLVVLLICSSCS
P19'    DGNDGLPPPPYSPRDDSSQH    P67'    LLWTLVVLLICSSCSSCPLS
P20'    LPPPPYSPRDDSSQHIYEEA    P68'    VVLLICSSCSSCPLSKILLA
P21'    PPYSPRDDSSQHIYEEAGRG    P69'    CSSCSSCPLSKILLARLFLY
P22'    RDDSSQHIYEEAGRGSMNPV    P70'    SCPLSKILLARLFLYALALL
P23'    QHIYEEAGRGSMNPVCLPVI    P71'    KILLARLFLYALALLLLASA
P24'    EAGRGSMMPVCLPVIVAPYL    P72'    RLFLYALALLLLASALIAGG
P25'    SMNPVCLPVIVAPYLFWLAA    P73'    ALALLLLASALIAGGSILQT
P26'    CLPVIVAPYLFWLAAIAASC    P74'    LLASALIAGGSILQTNFKSL
P27'    VAPYLFWLAAIAASCFTASV    P75'    LIAGGSILQTNFKSLSSTEF
P28'    FWLAAIAASCFTASVSTVVT    P76'    SILQTNFKSLSSTEFIPNLF
P29'    IAASCFTASVSTVVTATGLA    P77'    NFKSLSSTEFIPNLFCMLLL
P30'    FTASVSTVVTATGLALSLLL    P78'    SSTEFIPNLFCMLLLIVAGI
P31'    STVVTATGLALSLLLLAAVA    P79'    IPNLFCMLLLIVAGILFILA
P32'    ATGLALSLLLLAAVASSYAA    P80'    CMLLLIVAGILFILAILTEW
P33'    LSLLLLAAVASSYAAAQRKL    P81'    IVAGILFILAILTEWGSGNR
P34'    LAAVASSYAAAQRKLLTPVT    P82'    LFILAILTEWGSGNRTYGPV
P35'    SSYAAAQRKLLTPVTVLTAV    P83'    ILTEWGSGNRTYGPVFMCLG
P36'    AQRKLLTPVTVLTAVVTFFA    P84'    GSGNRTYGPVFMCLGGLLTM
P37'    LTPVTVLTAVVTFFAICLTW    P85'    FMCLGGLLTMVAGAVWLTVM
P38'    VLTAVVTFFAICLTWRIEDP    P86'    GLLTMVAGAVMLTVMSNTLL
P39'    VTFFAICLTWRIEDPPFNSL    P87'    VAGAVWLTVMSNTLLSAWIL
P40'    ICLTWRIEDPPFNSLLFALL    P88'    WLTVMSNTLLSAWILTAGFL
P41'    RIEDPPFNSLLFALLAAAGG    P89'    SNTLLSAWILTAGFLIFLIG
P42'    PFNSLLFALLAAAGGLQGIY    P90'    SAWILTAGFLIFLIGFALFG
P43'    LFALLAAAGGLQGIYVLVML    P91'    TAGFLIFLIGFALFGVIRCC
P44'    AAAGGLQGIYVLVMLVLLIL    P92'    IFLIGFALFGVIRCCRYCCY
P45'    LQGIYVLVMLVLLILAYRRR    P93'    FALFGVIRCCRYCCYYCLTL
P46'    VLVMLVLLILAYRRRWRRLT    P94'    VIRCCRYCCYYCLTLESEER
P47'    VLLILAYRRRWRRLTVCGGI    P95'    RYCCYYCLTLESEERPPTPY
P48'    AYRRRWRRLTVCGGIMFLAC    P96'    YYCLTLESEERPPTPYRNTV
【０１５１】
対照抗原であるミコバクテリアPPD(Statens Seruminstitut)、T細胞マイトジェンCon A (Sigma)、および初回抗原スカシガイヘモシアニン(KLH)(Calbiochem)は、それぞれ10μg/mlで培養を刺激するのに用いた。ほとんどのイギリス国民はカルメット‐ゲラン杆菌(BCG)で免疫化されているため、PPDによって、in vitroリコールT細胞応答が容易に引き起こされる(Plebanskiら、1992年)。
【０１５２】
RhDタンパク質は、Hall, A.M., Ward, F.J., Vickers, M.A., Stott, L-M., Urbaniak, S.J.およびBarker, R.N. (2002年)に記載されているように調製された。インターロイキン10は、ヒト赤血球自己抗原上のエピトープに対する調節性T細胞応答を媒介した。Blood 100:4529-4536。RhDタンパク質は、培養に概算濃度5μg/mlで添加した。オオアワガエリ花粉抽出物およびハウスダストマイト(Dermatophagoides pteronyssinus) 抽出物(両方とも国際規格)は、National Institute for Biologicals and Controls, Potters Bar, UKから得て、2,500 IU/mlで培養に添加した。組換えα3(IV)NC1は、以前の記載(Ryan, J.J., Mason, P.J., Pusey, C.D., Turner, N. Recombinant alpha-chains of type IV collagen demonstrate that the amino terminal of the Goodpasture autoantigen is crucial for antibody recognition. Clin Exp Immunol. 113:17-27, 1998年)にあるように調製し、10μg/mlで培養を刺激するのに用いた。
【０１５３】
細胞増殖およびサイトカインアッセイ
他の記載(Stottら、2000年)にあるように、PBMCは、新しい血液試料から、密度勾配遠心で分離し、1ml容積中に、1.25×106細胞/mlの濃度で培養した。細胞増殖は、リコールT細胞応答が最大のとき(Plebanskiら、1992年)である抗原刺激5日後に、ウェルから採取した三重の100μlアリコート中での3H-チミジンの取込みから推算した。増殖結果は、三重の試料の平均毎分計数(CPM) +/- SDとして表示するか、または、刺激された培養対無刺激の対照培養の平均CPMの比として表される刺激指数(SI)として表示される。CPM>1000におけるSI>3は、有意の陽性応答を表すものと解釈される(Devereuxら、2000年)。Thサイトカインであるγ-IFN、IL-4、およびIL-10の産生は、培養の刺激5日後に採取した二重の100μlアリコートにおいて、高感度の細胞ELISA(Devereuxら、2000年)を用いて評価した。刺激されていない培養の2倍を越える産生を行ったサイトカイン応答を陽性であるとみなした(Devereuxら、2000年)。
【０１５４】
応答細胞の特徴づけ
抗原に応答して増殖するか、またはサイトカインを分泌する培養細胞の表現型はフローサイトメトリーで測定した。PBMCのアリコートを、応答性の培養から採取し、抗CD3-フィコエリトリン-テキサスレッド(登録商標)-Xおよび抗CD4-フルオレセインイソチオシアネートで、実験によっては、抗CD25フィコエリトリン-シアニン5.1(すべて、Beckman Coulter)で染色した。増殖培養中の活性化された細胞は、抗CD71-フィコエリトリン(PE)または抗CD69-PE(両方とも、Beckman Coulter)を用いて同定した。IL-10を合成する細胞は、ブレフェルジンA(Sigma)でタンパク質分泌を阻害し、イントラプレップ(商標)(Beckman Coulter)で透過化処理した後に、抗IL-10-PE(Pharmingen)とインキュベートすることによって標識した。染色した細胞は、EPICS XLサイトメータ(Beckman Coulter)および Expo v2分析ソフトウェア(Applied Cytometry Systems)を用いて分析した。
【０１５５】
APC抗原プロセシングの阻害
自己PBMCを照射し、その後37℃のPBS中で、10分間、100μMクロロキンとインキュベートした。細胞は、100μMクロロキン存在下のまま、LMP1またはIL-10誘導性LMP1ペプチドで3時間パルスし、その後3回洗浄した。次いでこれらの細胞を、増殖アッセイおよびサイトカインアッセイにおけるAPCの供給源として、106細胞/mlで用いた。
【０１５６】
本明細書に引用されたすべての文献は、当業者が本発明を実施するのに必要な程度において、参照により本明細書に組み込む。
【０１５７】
参考文献
Apostolopoulos V, Plebanski M. (2000) The evolution of DNA vaccines.  Curr Opin Mol Ther 2(4):441-7.
Baer, R., Bankier, A.T., Biggin, M.D., Deininger, P.L., Farrell, P.J., Gibson, T.J., Hatfull, G., Hudson, G.S., Satchwell, S.C., Seguin, C.ら (1984). DNA sequence and expression of the B95-8 Epstein-Barr virus genome. Nature 310, 207-11.
Blaschke V, Reich K, Blaschke S, Zipprich S, Neumann C. (2000) Rapid quantitation of proinflammatory and chemoattractant cytokine expression in small tissue samples and monocyte-derived dendritic cells: validation of a new real-time RT-PCR technology. J Immunol Methods 246(1-2):79-90.
Chapman, A.L.N., Rickinson A.B., Thomas W.A., Jarrett R.F., Crocker J.およびLee S.P. (2001). Epstein-Barr virus-specific cytotoxic T lymphocyte responses in the blood and tumor site of Hodgkin's disease patients: implications for a T-cell-based therapy. Cancer Res. 61, 6219-26.
Christensen, J.P., Bartholdy, C., Wodarz, D.およびThomsen, A.R. (2001). Depletion of CD4+ T cells precipitates immunopathology in immunodeficient mice infected with a noncytocidal virus.  J. Immunol. 166(5), 3384-91.
Demay F, Darche S, Kourilsky P, Delassus S. (1996) Quantitative PCR with colorimetric detection. Res Immunol 147(6):403-6.
Devereux, G., Hall, A.M.およびBarker, R.N. (2000). Measurement of T-helper cytokines secreted by cord blood mononuclear cells in response to allergens. J Immunol Methods. 234, 13-22.
Dieckmann, D., Plottner, H., Berchtold, S., Berger, T.およびSchuler, G. (2001). Ex vivo isolation and characterisation of CD4+CD25+ T cells with regulatory properties from human blood. J. Exp. Med. 193, 1303-1310.
Dukers, D.F., Meij, P., Vervoort, M.B., Vos, W., Scheper, R.J., Meijer, C.J., Bloemena, E.およびMiddeldorp, J.M. (2000). Direct immunosuppressive effects of EBV-encoded latent membrane protein 1. J Immunol. 165, 663-670.
Eliopoulos, A.G., Dawson, C.W., Mosialos, G., Floettmann, J.E., Rowe, M., Armitage, R.J., Dawson, J., Zapata, J.M., Kerr, D.J., Wakelam, M.J., Reed, J.C., Kieff, E.およびYoung, L.S. (1996). CD40-induced growth inhibition in epithelial cells is mimicked by Epstein-Barr Virus-encoded LMP1: involvement of TRAF3 as a common mediator. Oncogene. 13, 2243-2254.
Eliopoulos, A.G., Stack, M., Dawson, C.W., Kaye, K.M., Hodgkin, L., Sihota, S., Rowe, M.およびYoung, L.S. (1997). Epstein-Barr virus-encoded LMP1 and CD40 mediate IL-6 production in epithelial cells via an NF-kappaB pathway involving TNF receptor-associated factors. Oncogene. 14, 2899-2916.
Erickson, A.L., Kimura, Y., Igarashi, S., Eichelberger, J., Houghton, M., Sidney, J., McKinney, D., Sette, A., Hughes, A.L.およびWalker, C.M. (2001). The outcome of Hepatitis C virus infection is predicted by escape mutation in epitopes targeted by cytotoxic T lymphocytes. Immunity 15, 883-895.
Fiorentino, D.F., Zlotnik, A., Vieira, P., Mosmann, T.R., Howard, M., Moore, K.W., O'Garra, A. (1991) IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Th1 cells. J Immunol. 146, 3444-3451.
Fries, K.L., Miller, W.E.およびRaab-Traub, N. (1996). Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 blocks p53-mediated apoptosis through the induction of the A20 gene. J. Virol. 70, 8653-8659.
Gorelik, L.およびFlavell, R.A. (2000). Abrogation of TGF beta signalling in T cells leads to spontaneous T cell differentiation and autoimmune disease. Immunity 12, 171-181.
Gregory, C.D., Murray, R.J., Edwards, C.F.およびRickinson, A.B. (1988). Downregulation of cell adhesion molecules LFA-3 and ICAM-1 in Epstein-Barr virus-positive Burkitt’s lymphoma underlies tumor cell escape from virus-specific T cell surveillance. J. Exp. Med. 167, 1811-1824.
Groux, H., O'Garra, A., Bigler, M., Rouleau, M., Antonenko, S., de Vries, J.E.およびRoncarolo, M.G. (1997). A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and prevents colitis. Nature. 389 (6652), 737-742.
Haraguchi, S., Good, R.A.およびDay, N.K. (1995) Immunosuppressive retroviral peptides: cAMP and cytokine patterns. Immunol. Today 16, 595.
Hayes, D.P., Brink, A.A., Vervoort, M.B., Middeldorp, J.M., Meijer, C.J., van den Brule, A.J (1999) Expression of Epstein-Barr virus (EBV) transcripts encoding homologues to important human proteins in diverse EBV associated diseases. Mol Pathol. 52, 97-103.
Horikawa, T., Yoshizaki, T., Sheen, T.S., Lee, S.Y.,およびFurukawa, M. (2000). Association of latent membrane protein 1 and matrix metalloproteinase 9 with metastasis in nasopharyngeal carcinoma. Cancer. 89, 715-23.
Huen, D.S., Henderson, S.A., Croom-Carter, D.およびRowe, M. (1995). The Epstein-Barr virus latent membrane protein-1 (LMP1) mediates activation of NF-kappa B and cell surface phenotype via two effector regions in its carboxy-terminal cytoplasmic domain. Oncogene. 10, 549-560.
Jonuleit, H., Schmitt, E., Stassen, M., Tuettenberg, A., Knop, J.およびEnk, A. (2001). Identification and Functional Characterization of Human CD4+CD25+ T Cells with Regulatory Properties Isolated from Peripheral Blood. J. Exp. Med. 193, 1285-1294.
Kamel-Reid S, Dick JE. Engraftment of immune-deficient mice with human hematopoietic stem cells. Science 1988;242:1706-9.
Khanna, R., Burrows, S.R., Nicholls, J.およびPoulsen, L.M. (1998). Identification of cytotoxic T cell epitopes within Epstein-Barr virus (EBV) oncogene latent membrane protein 1 (LMP1): evidence for HLA A2 supertype-restricted immune recognition of EBV-infected cells by LMP1-specific cytotoxic T lymphocytes. Eur J Immunol. 28, 451-458.
Kieff, E. (1996) Epstein-Barr virus and its replication. In Fields Virology, Fields B. N., Knipe, D. M.およびHowley, P. M編 (Lipincott-Raven Publishers, Philadelphia),  pp2343-2396.
Kjellstrom S, Emneus J, Marko-Varga G. (2000) Flow immunochemical bio-recognition detection for the determination of interleukin-10 in cell samples. J Immunol Methods 246(1-2):119-30.
Kreft B, Singer GG, Diaz-Gallo C, Kelley VR. (1992) Detection of intracellular interleukin-10 by flow cytometry. J Immunol Methods 156(1):125-8.
Levings, M.K.およびRoncarolo, M.G. (2000). T-regulatory 1 cells: a novel subset of CD4 T cells with immunoregulatory properties. J Allergy Clin Immunol. 106, S109-112.
Levings, M.K., Sangregorio, R.およびRoncarolo, M.G. (2001). Human CD25+CD4+ T regulatory cells suppress naive and memory T cell proliferation and can be expanded in vitro without loss of function. J. Exp. Med. 193, 1295-1302.
Levitskaya, J., Coram, M., Levitsky, V., Imreh, S., Steigerwald-Mullen, P.M., Klien, G., Kurilla, M.G.およびMasucci, M.G. (1995). Inhibition of antigen processing by the internal repeat region of the Epstein-Barr virus nuclear antigen-1. Nature 375, 685-688.
Levitskaya, J., Sharipo, A., Leonchiks, A., Ciechanover, A.およびMasucci, M.G. (1997). Inhibition of ubiquitin/proteasome- dependent protein degradation by the Gly-Ala repeat domain of the Epstein-Barr virus nuclear antigen 1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12616-12621.
Lorenzo, M.E., Ploegh, H.L.およびTirabassi, R.S. (2001). Viral immune evasion strategies and the underlying cell biology. Semin Immunol. 13, 1-9.
MacDonald, AJ, Duffy, M, Brady, MT, McKiernan, S, Hall, W, Hegarty, J, Curry, MおよびMills KHG. CD4 T Helper Type 1 and Regulatory T Cells Induced against the Same Epitopes on the Core Protein in Hepatitis C Virus-Infected Persons. The Journal of Infectious Diseases (2002) 185:720-7.
McCune JM, Namikawa R, Kaneshima H, Shultz LD, Lieberman M, Weissman IL. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science 1988;241:1632-9.
McGuirk, P., C. McCannおよびK. H. G. Mills. 2002. Pathogen-specific T regulatory 1 cells induced in the respiratory tract by a bacterial molecule that stimulates interleukin 10 production by dendritic cells: a novel strategy for evasion of protective T helper type 1 responses by Bordetella pertussis. J. Exp. Med. 195:221.
Mills, K. H. G., O. Leavy, P. McGuirk, S. Higgins, E. McNeela, C. McCann, M. E. ArmstrongおよびE. Lavelle. 2002. Pathogen-derived immunomodulatory molecules: the bridge between innate and adaptive immunity. Immunology 107(補遺1):8.
Mor G, Eliza M. (2001) Plasmid DNA vaccines. Immunology, tolerance, and autoimmunity. Mol Biotechnol 19(3):245-50.
Mosialos, G., Birkenbach, M., Yalamanchili, R., VanArsdale, T., Ware, C.およびKieff, E. (1995). The Epstein-Barr virus transforming protein LMP1 engages signaling proteins for the tumor necrosis factor receptor family. Cell. 80, 389-399.
Mosier DE, Gulizia RJ, Baird SM, Wilson DB. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature 1988 335:256-9.
Mossman, T.R.およびCoffman, R.L. (1989). Heterogeneity of cytokine secretion patterns and functions of helper T-cells. Adv. Immunol. 46, 111-147.
Mueller, Y.M., De Rosa, S.C., Hutton, J.A., Witek, J., Roederer, M., Altman, J.D.およびKatsikis, P.D. (2001). Increased CD95/Fas-Induced apoptosis of HIV-Specific CD8+ T cells. Immunity 15, 883-895.
Pallesen, G., Hamilton-Dutoit, S.J., Rowe, M.およびYoung, L.S. (1991) Expression of Epstein-Barr virus latent gene products in tumour cells of Hodgkin's disease. Lancet. 337, 320-322.
Plebanski, M., Saunders, M., Burtles, S.S., Crowe, S.およびHooper, D.C. (1992). Primary and secondary human in vitro T-cell responses to soluble antigens are mediated by subsets bearing different CD45 isoforms. Immunology. 75, 86-91.
Roncarolo, M.およびLevings, M.K. (2000). The role of different subsets of T regulatory cells in controlling autoimmunity. Curr Opin Immunol. 12, 676-683.
Roncarolo, M.G., Levings, M.K.およびTraversari, C. (2001). Differentiation of T Regulatory Cells by Immature Dendritic cells. J. Exp. Med. 193, F5-F9.
Rowe M, Young LS, Crocker J, Stokes H, Henderson S, Rickinson AB. Epstein-Barr virus (EBV)-associated lymphoproliferative disease in the SCID mouse model: implications for the pathogenesis of EBV-positive lymphomas in man. J Exp Med 1991;173:147-58.
Scheffold A, Assenmacher M, Reiners-Schramm L, Lauster R, Radbruch A. (2000) High-sensitivity immunofluorescence for detection of the pro- and anti-inflammatory cytokines gamma interferon and interleukin-10 on the surface of cytokine-secreting cells. Nat Med 6(1):107-10.
Schlaak JF, Schmitt E, Huls C, Meyer zum Buschenfelde KH, Fleischer B. (1994) A sensitive and specific bioassay for the detection of human interleukin-10. J Immunol Methods 168(1):49-54.
Schleef M, Schmidt T, Flaschel E. (2000) Plasmid DNA for pharmaceutical applications. Dev Biol (Basel) 104:25-31.
Seddon, B.およびMason, D. (2000). The third function of the thymus. Immunol. Today 21, 95-99.
Shevach, E.M. (2000). Regulatory T cells in autoimmmunity. Ann. Rev. Immunol. 18, 423-449.
Shevach, E.M., Thornton A., Suri-Payer E., (1998). T lymphocyte-mediated control of autoimmunity. Novartis Found Symp. 215, 200-211.
Singh,H.およびRaghava,G.P.S.(2001) ProPred: Prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics,17(12), 1236-37.
Smith HA. (2000) Regulation and review of DNA vaccine products. Dev Biol (Basel) 104:57-62.
Spencer, J.V., Lockridge, K.M., Barry, P.A., Lin, G., Tsang, M., Penfold, M.E.T.およびSchall, T.J. (2002). Potent immunosuppressive activities of Cytomegalovirus encoded Interleukin-10. J. Virol. 76, 1285-1292.
Stephens, L.A.およびMason, D. (2000). CD25 is a marker for CD4+ thymocytes that prevent autoimmune diabetes in rats, but peripheral T cells with this function are found in both CD25+ and CD25- subpopulations. J. Immunol. 165, 3105-3110.
Stott, L.M., Barker, R.N.およびUrbaniak, S.J. (2000). Identification of alloreactive T-cell epitopes on the Rhesus D protein. Blood. 96, 4011-4019.
Sturniolo. T., Bono. E., Ding. J., Raddrizzani. L., Tuereci. O., Sahin. U., Braxenthaler. M., Gallazzi. F., Protti. M.P., Sinigaglia. F., Hammer. J., Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand database using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17. 555-561(1999).
Taylor, P.A., Noelle, R.J.およびBlazar, B.R. (2001). CD4+CD25+ immune regulatory cells are required for induction of tolerance to alloantigen via costimulatory blockade. J. Exp. Med. 193, 1311-1318.
Thomsen, A.R., (2001). The outcome of viral infection is determined by an interplay between CD4+ and CD8+ T cells. Immunology 104, (補遺1) 40.
Urban, B. C., N. WillcoxおよびD. J. Roberts. 2001. A role for CD36 in the regulation of dendritic cell function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:8750.
Weiner, H.L. (1997). Oral tolerance: Immune mechanisms and treatment of autoimmune diseases. Immunol. Today 18, 335-343.
Xu, X.-N., Screatom, G.R.およびMcMichael, A.J. (2001). Virus Infections: Escape, Resistance, and Counterattack. Immunity 15, 867-870.
Young, L.S., Eliopoulos, A.G., Gallagher, N.J.およびDawson, C.W. (1998). CD40 and epithelial cells: across the great divide. Immunol Today. 19, 502-506.
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図1は、精製されたLMP1に対する、健康なEBV血清陽性ドナーおよび血清陰性ドナーから得たPBMCのサイトカイン応答および増殖応答を示す。2人のEBV血清陽性ドナー(n=10)および2人の血清陰性ドナーから得られた代表的な結果を示す。
【図２】図2は、LMP1ペプチドのパネルに対する、EBV血清陽性ドナーから得たPBMCのサイトカイン応答および増殖応答を示す。サイトカインELISAアッセイ(IL-10、IL-4、γ-IFN)および増殖アッセイに関する、1人のドナー(n=20)から得られた代表的な結果を示す。各チャートの破線は、陽性応答とみなされる最低レベルを示す。
【図３】図3は、それぞれのLMP1ペプチドに対してサイトカイン分泌(IL-10、IL-4、γ-IFN)または増殖で応答したPBMCが得られたEBV血清陽性ドナー(n=20)の割合に関する概要を示す。参加可能であった18人のドナー全員を再試験することによって、この結果に再現性があることを実証した。
【図４】図4は、IL-10合成細胞の表現型に関するフローサイトメトリー解析(23)を示す。2人のEBV血清陽性ドナー(A+BおよびC+D)から得た培養細胞を、CD3+細胞にゲーティングした後、CD4およびIL-10の発現に関して分析した。二重陽性細胞の%をそれぞれのパネルの右上四分画に示す。A+Cは刺激されなかった培養から、B+DはそれぞれペプチドP14(aa66〜85)、およびP8(aa36〜55)で刺激された細胞から得た(これらのドナーでIL-10を誘導することが示されている)。
【図５】図5は、LMP1の存在下および不在下において、マイトジェン(Con A)、リコール抗原(PPD)、および初回抗原(KLH)に対して、EBV血清陽性ドナーから得たPBMCによる(しかし、EBV血清陰性ドナーから得たPBMCは示さない)増殖応答およびγ-IFN応答を示す。2人のEBV血清陽性ドナー(n=10)および2人の血清陰性ドナーから得られた代表的結果を示す。
【図６】図6は、EBV血清陽性ドナーから得たPBMCがリコール抗原(PPD)に対して示す増殖応答を、IL-10誘導性LMP1ペプチドが阻害することを示す。白い棒は、3人のEBV血清陽性ドナーから得たPBMCを、PPDによって、単独で、またはIL-10誘導性LMP1ペプチド(ドナー1にはP4、7、23、35、ドナー2には、P4および22、ドナー3にはP4、18、および31)、もしくは対照γ-IFN誘導性LMP1ペプチド(ドナー1にはP28、ドナー2にはP56、およびドナー3にはP33)と共に刺激した際に得られた増殖応答およびγ-IFN応答を示す。黒い棒は、二重の培養に抗IL-10中和抗体を0.5μg/mlで添加した際の効果を示す。
【図７ａ−ｄ】図7a〜dは、LMP1によって誘導された免疫寛容の特異性および持続性を例証する。図7a(パネル(a))は、所与のドナーから得たPBMCを、まず培養中で、マイトジェンCon A、リコール抗原PPD、または初回抗原KLHによって、単独で、または精製されたLMP1と組み合わせて刺激した際に得られた増殖応答、γ-IFN応答、およびIL-10応答を示す。図7aでは、LMP-1由来ペプチドと組み合わせて刺激を投与することも行った。細胞を7日間休息させ、抗原を除去するために洗浄し、抗原提示細胞の供給源として新しい照射された自己PBMCに添加した。図7b(パネル(b))は、3つの刺激それぞれで対照細胞を再刺激した結果を示す。図7c(パネル(c))は、最初にLMP-1の存在下で刺激した細胞を再刺激した結果を示す。図7d(パネル(d))は、最初にLMP-1由来ペプチドの存在下に刺激した細胞を再刺激した結果を示す。結果は、3人のEBV血清陽性ドナー(図7、8、および9)および1人の血清陰性ドナー(図10)に関して示されている。
【図８ａ−ｃ】図8a〜cは、LMP1によって誘導された免疫寛容の特異性および持続性を例証する。図8a(パネル(a))は、所与のドナーから得たPBMCを、まず培養中で、マイトジェンCon A、リコール抗原PPD、または初回抗原KLHによって、単独で、または精製されたLMP1と組み合わせて刺激した際に得られた増殖応答、γ-IFN応答、およびIL-10応答を示す。細胞を7日間休息させ、抗原を除去するために洗浄し、抗原提示細胞の供給源として新しい照射された自己PBMCに添加した。図8b(パネル(b))は、3つの刺激それぞれで対照細胞を再刺激した結果を示す。図8c(パネル(c))は、最初にLMP-1の存在下で刺激した細胞を再刺激した結果を示す。結果は、3人のEBV血清陽性ドナー(図7、8、および9)および1人の血清陰性ドナー(図10)に関して示されている。
【図９ａ−ｄ】図9a〜dは、LMP1によって誘導された免疫寛容の特異性および持続性を例証する。図9a(パネル(a))は、所与のドナーから得たPBMCを、まず培養中で、マイトジェンCon A、リコール抗原PPD、または初回抗原KLHによって、単独で、または精製されたLMP1と組み合わせて刺激した際に得られた増殖応答、γ-IFN応答、およびIL-10応答を示す。図9aでは、LMP-1由来ペプチドと組み合わせて刺激を投与することも行った。細胞を7日間休息させ、抗原を除去するために洗浄し、抗原提示細胞の供給源として新しい照射された自己PBMCに添加した。図9b(パネル(b))は、3つの刺激それぞれで対照細胞を再刺激した結果を示す。図9c(パネル(c))は、最初にLMP-1の存在下で刺激した細胞を再刺激した結果を示す。図9d(パネル(d))は、最初にLMP-1由来ペプチドの存在下に刺激した細胞を再刺激した結果を示す。結果は、3人のEBV血清陽性ドナー(図7、8、および9)および1人の血清陰性ドナー(図10)に関して示されている。
【図１０ａ−ｃ】図10a〜cは、LMP1によって誘導された免疫寛容の特異性および持続性を例証する。図10a(パネル(a))は、所与のドナーから得たPBMCを、まず培養中で、マイトジェンCon A、リコール抗原PPD、または初回抗原KLHによって、単独で、または精製されたLMP1と組み合わせて刺激した際に得られた増殖応答、γ-IFN応答、およびIL-10応答を示す。細胞を7日間休息させ、抗原を除去するために洗浄し、抗原提示細胞の供給源として新しい照射された自己PBMCに添加した。図10b(パネル(b))は、3つの刺激それぞれで対照細胞を再刺激した結果を示す。図10c(パネル(c))は、最初にLMP-1の存在下で刺激した細胞を再刺激した結果を示す。結果は、3人のEBV血清陽性ドナー(図7、8、および9)および1人の血清陰性ドナー(図10)に関して示されている。
【図１１】図11は、精製されたLMP1によるIL-10分泌の誘導に抗原プロセシングが必要であることを示す。プロセシング阻害剤クロロキンの存在下または不在下に、EBV血清陽性ドナーから得たPBMCを、精製されたLMP1またはIL-10誘導性LMP1ペプチドで刺激した際のIL-10応答を示す。陰影のついた棒は、クロロキンを含まない対照培養を示し、空白の棒はクロロキンを含む培養を示す。
【図１２】図12は、リコール抗原(PPD)およびアレルゲン(ハウスダストマイトアレルゲン-HDM)に対する応答が、単一LMP1ペプチドおよびペプチドの組合せの両方で阻害できることを示す。混合物1はLMP1ペプチドのP4、P14、P18、およびP23を含有している。 混合物2はLMP1ペプチドのP4、P7、P14、およびP32を含有している。混合物3はLMP1ペプチドのP7、P14、P18、およびP23を含有している。ペプチド混合物は、アッセイにおいて、それぞれのペプチドの最終濃度が15μg/mlとなるように投与した。
【図１３ａ−ｂ】図13a〜bは、2人のドナー(図13aおよびb(パネル(a)および(b)))から得たPBMCの抗原選択に対する応答、および同様に混合リンパ球反応(MLR)における応答へのLMP1ペプチドの効果を示す。抗原には、自己抗原アカゲザルDタンパク質(RhD)、α3(IV)NC1コラーゲン、ハウスダストマイトアレルゲン(HDM)、およびオオアワガエリ花粉(TG)が含まれており、PPDを陽性対照とした。ペプチド混合物1〜3は、図12と同様である。
【図１４ａ−ｂ】図14a〜bは、LMP1によって誘導されたアレルゲンHDMおよびTGに対する免疫寛容が抗原特異的であり、LMP1ペプチドの不在下でも持続することを示す。プロトコールは、図7〜10に関する上の記載と同様であった。図14a(パネル(a))は、抗原/アレルゲン単独での初回刺激、およびLMP1ペプチドとの併用での初回刺激を示し、図14b(パネル(b))は、HDM、TG、またはPPDで、HDM処理およびTG処理された細胞を再刺激した際の効果を示す。
【図１５】図15は、自己免疫性溶血性貧血の患者から得られたPBMCにおける自己抗原RhDに対する応答が、LMP1ペプチドの使用によって阻害されうることを示す。
【図１６ａ−ｂ】図16a〜bは、花粉症および喘息の患者から得たPBMCにおけるアレルゲンHDMおよびTGに対する応答が、LMP1ペプチドの使用によって阻害されうることを示す。図16a(パネル(a))は、アレルゲンまたは抗原単独での初回刺激、およびLMP1ペプチドとの併用での初回刺激を示す。HDM、TG、およびPPDで再刺激した結果を図16b(パネル(b))に示す。
【図１】
2005535619.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
2005535619.tif 000008
【図７ｂ】
2005535619.tif 000009
【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
2005535619.tif 000014
【図９ａ】
2005535619.tif 000015
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０ａ】
2005535619.tif 000019
【図１０ｂ】
2005535619.tif 000020
【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
2005535619.tif 000024
【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
2005535619.tif 000026
【図１４ｂ】
2005535619.tif 000027
【図１５】
2005535619.tif 000028
【図１６ａ】
2005535619.tif 000029
【図１６ｂ】
2005535619.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成16年7月8日(2004.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団を標的抗原に対して免疫寛容にする方法であって、前記細胞集団を、
(a) EBV LMP1またはLMP2タンパク質由来の寛容原性ペプチド配列と接触させること、または、前記寛容原性ペプチド配列が前記細胞集団で発現されるように前記寛容原性ペプチド配列をコードする核酸と接触させること、および
(b) 標的抗原と接触させること、または前記標的抗原が前記細胞集団で発現されるように前記標的抗原をコードする核酸と接触させること
を含み、前記細胞集団が、EBVに対して血清陽性である被験者から得た単核白血球を含む、前記方法。
【請求項２】
抗原提示細胞集団を、上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させるステップと、次いで上記細胞集団を前記抗原提示細胞集団と接触させるステップとを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
上記単核白血球を、in vitroで上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
上記細胞集団またはそのサブセットを、上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させた後に、上記被験者に再投与する、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
上記抗原提示細胞集団を、in vitroで上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原と接触させ、さらに上記細胞集団を、in vivoで前記抗原提示細胞集団と接触させる、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
上記寛容原性ペプチド配列および標的抗原を、上記被験者に直接投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
寛容原性ペプチド配列が、配列P2、P4、P7、P14、P15、P18、P20、P22、P23、P24およびP32の1つまたは複数を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
標的抗原に対して個体を免疫寛容にするための医薬の調製における、EBV LMP1、LMP2、それらの寛容原性ペプチド配列、またはそれらをコードする核酸の使用であって、前記医薬は標的抗原または標的抗原をコードする核酸をさらに含み、かつ個体はEBVに事前に感染している、前記使用。
【請求項９】
上記医薬が、標的抗原または標的抗原をコードする核酸を含む、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
上記標的抗原が細胞である、請求項8または9に記載の使用。
【請求項１１】
上記細胞が移植用細胞である、請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
上記細胞が、寛容原性ペプチド配列をコードする核酸を含む、請求項9と組み合わせた請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
寛容原性ペプチド配列が、配列P2、P4、P7、P14、P15、P18、P20、P22、P23、P24およびP32の1つまたは複数を含む、請求項8〜12のいずれか1項に記載の使用。
【請求項１４】
被験者を標的抗原に対して免疫寛容にするための医薬組成物であって、EBV LMP1、LMP2、それらの寛容原性ペプチド配列、および標的抗原または標的抗原をコードする核酸を、薬学的に許容される担体との混合物として含み、前記被験者はEBVに事前に感染している、前記医薬組成物。
【請求項１５】
感染性物質由来の試験ペプチド配列の寛容原性を評価する方法であって、
(i) 細胞集団を前記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 前記細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iii) ステップ(ii)の結果を、前記配列の寛容原性と相関させるステップ
を含み、前記細胞集団が、前記感染性物質に事前に感染しているドナーから得た単核白血球を含む、前記方法。
【請求項１６】
上記細胞集団が少なくとも1つのタイプの抗原提示細胞を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
上記単核白血球が少なくともTリンパ球、Bリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞、単球、マクロファージまたは樹状細胞を含む、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１８】
上記単核白血球が少なくともCD4+Tリンパ球を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
上記単核白血球がさらに抗原提示細胞の少なくとも1つのタイプを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
(i)(a) 上記感染性物質に事前に感染していないドナーから得た類似の細胞集団を、上記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii)(a) 前記細胞集団中でIL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(ii)(b) ステップ(ii)による結果と、ステップ(ii)(a)による結果を比較するステップ
をさらに含む、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
上記感染性物質がウイルスである、請求項15〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
上記ウイルスがウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルスである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
上記ウイルスがEBVである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
上記試験ペプチド配列がEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
上記試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列が、配列P1〜P75または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
感染性物質由来の試験ペプチド配列の、標的抗原に対する寛容原性を評価する方法であって、
(i) 細胞集団を、(a)前記試験ペプチド配列、および(b)標的抗原と接触させて、試験組成物を生成するステップと、
(ii) 前記試験ペプチド配列の不在下で、前記試験組成物から得た細胞集団を、前記標的抗原と再接触させるステップと、
(iii) 前記標的抗原に応答した前記細胞集団による細胞増殖またはIL-4、IL-2、IL-12もしくはγ-IFNの発現を評価するステップと、場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、前記試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップ
を含み、前記細胞集団が、前記感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む、前記方法。
【請求項２７】
ステップ(ii)の前に、新たな抗原提示細胞を添加するステップをさらに含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
上記細胞集団を、上記試験配列にも、または上記標的抗原にも関係のない確認用抗原と接触させるステップをさらに含む、請求項26または27に記載の方法。
【請求項２９】
上記感染性物質がウイルスである、請求項26〜28のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
上記ウイルスがウイルスIL-10相同体をコードするヘルペスウイルスである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
上記ウイルスがEBVである、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
上記試験ペプチド配列がEBV LMP1タンパク質またはLMP2タンパク質に由来するものである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
上記試験ペプチド配列または寛容原性ペプチド配列が、配列P1〜P75または配列P1'〜P96'の1つまたは複数を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
試験ペプチド配列の寛容原性を評価する方法であって、
(i) 第1細胞集団を前記試験ペプチド配列と接触させるステップと、
(ii) 第2細胞集団を対照ペプチド配列と接触させるステップと、
(iii) 前記細胞集団のそれぞれで、IL-10の発現が増強されているか否かを判定するステップと、場合により、
(iv) ステップ(iii)の結果を、前記試験ペプチド配列の寛容原性と相関させるステップと
を含み、前記細胞集団のそれぞれが、感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含み、前記対照ペプチド配列が前記感染性物質に由来するものである、前記方法。
【請求項３５】
上記対照ペプチド配列が上記感染性物質に事前に感染したドナーから得た単核白血球を含む細胞集団においてIL-10の発現を誘導すると事前に同定されているものである、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
上記第1細胞集団および第2細胞集団が同一のドナーに由来するものである、請求項34または35に記載の方法。
【請求項３７】
上記第1細胞集団および第2細胞集団が対照ペプチドに応答して増殖できるT細胞クローンを含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
上記感染性物質がEBVである、請求項34〜37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
上記対照ペプチドがLMP1またはLMP2に由来するものである、請求項39に記載の方法。
【請求項４０】
P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P20、P22、P23、P24、P25、P26、P27、P29、P30、P32、P34、P35、P39、P68、P71、P72のいずれか1つの配列を有するペプチド。
【国際調査報告】
2005535619.tif 000031
2005535619.tif 000032