(57)【要約】本発明は、特定の細胞タイプの細胞においてプロアポトーシス活性またはアンチアポトーシス活性について細胞性ポリペプチドをスクリーニングする方法であって、ａ．前記特定の細胞タイプの細胞を非アポトーシス条件下で培養し、前記特定の細胞タイプの細胞をアポトーシス条件下で培養すること；およびｂ．前記培養細胞における前記細胞性ポリペプチドのサブ細胞性局在を決定することを含み；細胞性ポリペプチドが非アポトーシス条件下において培養細胞の脂質ラフトに局在すること、および前記細胞性ポリペプチドがアポトーシス条件下において培養細胞の脂質ラフトから分離することが、前記細胞性ポリペプチドが前記特定の細胞タイプにおいてプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス活性を有することの指標である方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の細胞タイプの細胞においてプロアポトーシス活性またはアンチアポトーシス活性について細胞性ポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ．前記特定の細胞タイプの細胞を非アポトーシス条件下で培養し、前記特定の細胞タイプの細胞をアポトーシス条件下で培養すること；および
ｂ．前記培養細胞における前記細胞性ポリペプチドのサブ細胞性局在を決定すること
を含み；
細胞性ポリペプチドが非アポトーシス条件下において培養細胞の脂質ラフトに局在すること、および前記細胞性ポリペプチドがアポトーシス条件下において培養細胞の脂質ラフトから分離することが、前記細胞性ポリペプチドが前記特定の細胞タイプにおいてプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス活性を有することの指標である方法。
【請求項２】
スクリーニングされる前記細胞性ポリペプチドが、Bcl-2ファミリーに属し、それらのサブ細胞性局在が、BHドメインを特異的に認識する分子の使用により決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スクリーニングされる前記細胞性ポリペプチドが、BHドメインを特異的に認識する分子の使用により、非アポトーシス条件で培養された前記細胞の生化学的に単離された脂質ラフトから単離される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
スクリーニングされる前記細胞性ポリペプチドが、ミリストイル化ポリペプチドを特異的に認識する分子の使用により更に単離される、請求項２〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記細胞タイプが、Badタンパク質の産生により特徴づけられ（Bad+細胞タイプ）、好ましくは免疫系の細胞から構成され、最も好ましくはＴ細胞株から構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
スクリーニングされる前記細胞性ポリペプチドが、非アポトーシス条件下で培養された前記細胞の生化学的に単離された脂質ラフトから単離され、Badタンパク質と物理的に相互作用する細胞性ポリペプチドのなかから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記BHドメインがBH4ドメインである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記BHドメインがBH3ドメインである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
細胞を非アポトーシス条件下で培養したときに脂質ラフトに位置するプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドを産生する細胞において、アポトーシスを調整する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ．前記細胞を、非アポトーシス条件を維持するための増殖培地で培養すること；
ｂ．前記培養細胞を候補化合物と接触させること；
ｃ．脂質ラフトと結びついた一または数個のプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドのレベルを決定すること；および
ｄ．一または数個のプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドと脂質ラフトとの結びつきに介入する化合物であってアポトーシスを調整する能力を有する化合物を選択すること
を含む方法。
【請求項１０】
細胞においてアポトーシスを促進する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ．細胞の非アポトーシス条件下において脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質を産生する哺乳類細胞を、非アポトーシス条件を維持するための増殖培地で培養すること；
ｂ．前記培養細胞を候補化合物と接触させること；
ｃ．前記培養細胞において脂質ラフトの存在または非存在を決定すること；および
ｄ．脂質ラフトが存在する場合、任意に、脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質のレベルを決定すること
を含み、
前記候補化合物とインキュベートした細胞の原形質膜における脂質ラフトの非存在、または決定された場合には、脂質ラフトにおけるプロアポトーシスタンパク質レベルの低下が、前記化合物がアポトーシスを促進することの指標である方法。
【請求項１１】
細胞のアポトーシスを阻害または妨害する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ．非アポトーシス条件下において脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質を産生する細胞を、非アポトーシス条件を維持するための増殖培地で培養すること；
ｂ．前記細胞を候補化合物と接触させること；
ｃ．アポトーシス条件下において細胞を培養すること；
ｄ．脂質ラフトの存在または非存在を決定すること；
ｅ．脂質ラフトが存在する場合、任意に、脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質のレベルを決定すること
を含み、
前記候補化合物とインキュベートした細胞の原形質膜における脂質ラフトの存在、および任意に、脂質ラフトにおけるプロアポトーシスタンパク質レベルの維持が、前記候補化合物がアポトーシスを阻害または妨害することの指標である方法。
【請求項１２】
増殖条件下において脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質が、Badタンパク質である、請求項９、１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
Badタンパク質を産生する前記細胞が、免疫系に特徴的な細胞、好ましくはＴ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
脂質ラフトの存在または非存在が、共焦点顕微鏡により視覚化される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
脂質ラフトの存在または非存在が、以下の工程により決定される、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法：
ｉ）前記候補化合物とインキュベートした培養細胞を回収し、サブ細胞性分画に適したバッファー、たとえば勾配スクロースバッファーに前記細胞を再懸濁する工程；
ii）分別された細胞を超遠心分離する工程；
iii）脂質ラフトを含有するはずのサブ細胞性分画を回収する工程；
iv）回収されたサブ細胞性分画が、ガングリオシドおよび/または脂質ラフト関連分子を含有するか否かを決定する工程。
【請求項１６】
脂質ラフトの存在または非存在が、ガングリオシドまたはラフト関連分子を特異的に認識するマーカーの使用により決定される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記マーカーが、コレラ毒素サブユニットＢ（CTx）、抗Bad抗体、または抗Lck抗体のなかから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記非アポトーシス条件が増殖条件である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記増殖培地が、繁殖性増殖培地を維持するために必要なサイトカインまたは増殖因子を少なくとも含む、請求項９〜１３、１５〜１８および１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
工程ｃ）の前記アポトーシス条件が、細胞からサイトカインまたは増殖因子を欠如させる（deprive）ことにより得られる、請求項１１、１７および２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
繁殖性増殖条件を維持するために必要なサイトカインまたは増殖因子が、インターロイキンであり、好ましくはIL-4、IL-2またはIL-9、またはその混合物のなかから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細胞死の調節の欠陥により誘導されるかまたはそれと関連する障害、または細胞死が少なくとも治療の一部であり得る任意の特定の病状を治療するための医薬の調製における、脂質ラフト形成を調整することができる化合物の使用。
【請求項２４】
前記調節の欠陥が、Badタンパク質を産生する細胞に影響を及ぼす、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記調節の欠陥が、免疫系の細胞に影響を及ぼす、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記化合物が、脂質ラフトを破壊することができ、前記細胞死の調節の欠陥が、細胞死の異常な減少という結果に至る、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記細胞死の異常な減少が、がん疾患、とりわけリンパ増殖性がん、感染性疾患、とりわけウイルス性疾患、炎症性疾患、または自己免疫疾患と関連する、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
脂質ラフトを破壊することができる化合物が、メチル−β−シクロデキストリンまたはフィリピンである、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記化合物が、細胞の原形質膜において脂質ラフトを再構成することができ、前記アポトーシスの調節の欠陥が、細胞死の異常な増大という結果に至る、請求項２３に記載の使用。
【請求項３０】
細胞死の異常な増大という結果に至る病状が、老化に関連した疾患、神経変性疾患、アルツハイマー、ＡＩＤＳ、虚血性細胞死、または創傷治癒である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
脂質ラフトを再構成することができる化合物が、エデルフォシン（edelfosine）である、請求項２９または３０のいずれかに記載の使用。
【請求項３２】
個体の細胞のサンプルにおいてアポトーシスの調節の欠陥を検出するためのインビトロにおける方法であって、前記細胞において脂質ラフトの存在または非存在を決定することを含み、前記脂質ラフトの非存在がアポトーシスの調節の欠陥の指標である方法。
【請求項３３】
前記細胞が、リンパ性増殖性疾患に罹患した個体の免疫系の細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
脂質ラフトの存在または非存在が、細胞の非アポトーシス条件下において脂質ラフトに位置することが知られているプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質の存在または非存在を検出することにより決定される、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
非アポトーシス条件下において脂質ラフトに位置することが知られているプロアポトーシスタンパク質が、Badタンパク質である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項３２〜３５の何れか１項に記載のインビトロ検出方法における、脂質ラフトの存在を検出するのに適した化合物の使用。
【請求項３７】
脂質ラフトの存在を検出するのに適した化合物が、Badタンパク質、Lckタンパク質、またはガングリオシドGM1を特異的に認識する化合物である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記化合物が、コレラ毒素サブユニットＢ（CTx）、抗Bad抗体、および抗Lck抗体のなかから選択される、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
細胞死の調節の欠陥により誘導されるかまたはそれと関連する障害、または細胞死が少なくとも治療の一部であり得る任意の特定の病状を治療するための医薬の調製のための、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質のラフト局在を調整することができる化合物の使用。
【請求項４０】
前記化合物が、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質の脂質ラフトからの分離を促進する、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記化合物が、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質の脂質ラフトにおける局在を促進する、請求項３９に記載の使用。
【請求項４２】
個体の細胞のサンプルにおいてアポトーシスの調節の欠陥を検出するためのインビトロにおける方法であって、前記細胞において脂質ラフトの存在または非存在を決定することを含み、正常細胞と比較して多数の脂質ラフトが存在することが、アポトーシスの調節の欠陥の指標である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類細胞におけるアポトーシスの調整に関する。より具体的には、本発明は、新規なプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス細胞性ポリペプチドを同定するための方法、アポトーシスを調整する化合物をスクリーニングする方法、および当該アポトーシスプロセスの初期のイベントを検出する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスすなわちプログラムされた細胞死は、特定の細胞死シグナルに応答して、または細胞の生存シグナルの非存在下で、細胞が自己破壊を誘導する活性なプロセスである。この活性なプロセスは、多細胞生物の正常な発生およびホメオスタシスに現に不可欠である。これは、環境における重大な有害な変化の結果として起こる細胞死である壊死とは対照的である。
【０００３】
細胞のアポトーシスは、
−  核の崩壊を伴うが膜は保護される細胞の急速な凝縮；または
−  アガロースゲル電気泳動により特徴的なはしごパターンとして容易に視覚化することができるフラグメントを産生するための、ヌクレオソーム間のリンカー領域における核ＤＮＡの切断
により少なくとも特徴づけることができる。
【０００４】
生物の病変細胞においてアポトーシスの調節の欠陥または異常により種々の病状が起こる。たとえば、組織の定常状態を維持するのに必要な正常レベルと比較して、組織におけるアポトーシスレベルの低下につながる欠陥は、組織において細胞量の異常な増加を促進することができる。このことは、正常な速度で細胞が死滅しないために腫瘍の形成が起こる種々の癌で観察されている。また、エプスタイン‐バーウイルス、アフリカ豚コレラウイルスおよびアデノウイルスなどの幾つかのＤＮＡウイルスは、アポトーシスを阻害または調整し、これにより細胞死を抑制し、宿主細胞にウイルス複製を継続させる。
【０００５】
一方、組織における細胞死の増大につながる欠陥は、細胞が再生するよりも速い速度で細胞が死滅する変性障害と関連し得る。このことは、ＡＩＤＳ、老化、および神経変性疾患などの種々の障害において観察される。
【０００６】
アポトーシスを正または負に調整する化合物は、これら障害を治療または予防するための手段を提供することができる。その結果、アポトーシス経路の描写により、アポトーシスシグナルまたは細胞生存シグナルに対する細胞の応答を調整するために使用することができる治療剤の開発のためのターゲットが提供される。
【０００７】
細胞外、細胞内および細胞表面のアポトーシス調節分子を同定することにおいて進展している。以前の研究は、特定の細胞死シグナルの同定（たとえば、増殖因子の欠如（deprivation）、ＦＡＳ/ＴＮＦシステム、遺伝子毒性剤、グルココルチコイド．．．）、Bcl-2ファミリーのメンバー、およびＩＣＥタイプのプロテアーゼに関心が集まっている。しかし、アポトーシス経路における重大な工程は同定されていない。
【０００８】
よって、アポトーシス経路に関与する細胞性メカニズムを同定し、細胞アポトーシスを調整するために使用することができる治療剤の開発のためのターゲットを同定する必要性がなお残っている。
【０００９】
様々なトランスデューシング剤のうち、Bcl-2ファミリータンパク質は、アポトーシス経路において細胞内チェックポイントとして機能する。このファミリーは、２つの機能的グループに分けられる（medecine/sciences 97; 13: 384-6）：細胞死を抑制するタンパク質（アンチアポトーシスメンバー、たとえばBcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bag-1、Mcl-1、A1）、および細胞死を促進するタンパク質（プロアポトーシスメンバー、たとえばBim、Nix、Hzk、Bax、Bak、Bcl-xS、Bad、Bik）。Bcl-2ファミリーは、BCLホモロジー領域と称される特定の保存モチーフ（BH1、BH2、BH3およびBH4ドメイン）に基く配列ホモロジーにより規定されている。BH1、BH2およびBH3ドメインは、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化において、およびアポトーシスの調整において重要であることが示されている。アンチアポトーシス分子は、特定のBH4ドメインを有する。
【００１０】
細胞で発現されるアンチアポトーシスメンバーに対するプロアポトーシスメンバーの比率が、当該細胞がアポトーシスシグナルに応答するか否かを決めると提案されている。実際、プロアポトーシスメンバーおよびアンチアポトーシスメンバーは、不活性なヘテロ二量体を形成することにより互いを中和し（Oltvai et al., 1993, Cell 74: 609-619）、結果として、そのバランスのみが、細胞に対してアポトーシスに至ることを促進または妨害する。
【００１１】
より近年、Bcl-2タンパク質のリン酸化も、その活性を調整できることが示された。実際、様々なアンチアポトーシス経路は、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）、AktキナーゼおよびRas活性化キナーゼを伴って、増殖因子により活性化される傾向がある。とりわけ、IL-3およびNGFで細胞を刺激すると、プロアポトーシスBadタンパク質（Bcl-xL/Bcl-2 Associated cell Death regulator, Downward, 1999, Nature Cell Biol 1: 33-35）は、セリンがリン酸化され、その結果14-3-3タンパク質と関連するようになる（Hsu et al., 1997, Mol Endocrinol 11: 1858-1867）。かかる相互作用は、リン酸化Badがミトコンドリア膜からサイトゾル区画へトランスロケートすることを容易にし、それをそこに隔離し、これにより他のアンチアポトーシスBcl-2メンバーとの更なる相互作用を妨害することが提案された（US Pat No. 5,856,445）。14-3-3タンパク質のBadとの結びつき（association）は、Badのセリン155リン酸化に依存することが更に示された（WO 0110888, Apoptosis Technology Inc., 2001）。
【００１２】
本発明において開示される結果は、とりわけBcl-2ファミリーのプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質の幾つかが、原形質膜に形成される脂質ラフト（lipid rafts）にある、新たに同定されたサブ細胞性局在を介して調節されることを示す。この観察により、細胞死または細胞生存シグナルに応答したプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス分子の調節に役割を果たし得る、新規で一般的な細胞アポトーシス調節メカニズムへの道が提供される。
【００１３】
膜を含む別個のサブ細胞性区画に対するタンパク質の局在は、複数の細胞性経路において重大なイベントである。多くの細胞タイプの原形質膜は、大部分の原形質膜とは生化学的に異なる、脂質ラフトと一般に称されるミクロドメインを含有する（Brown and London, 1998, Annu Rev Cell Dev Biol 14: 111-136）。これらドメインは、スフィンゴ脂質およびコレステロールのダイナミックな集合体から成る。より具体的には、スフィンゴ脂質における飽和炭化水素鎖の存在が、コレステロールがタイトに挿入されることを許容し、別個の液体オーダー相（liquid-ordered phase）の存在につながり、これにより更に流動的な脂質二重層の存在につながる。脂質ラフトは、Hacki et al.（Oncogene 2000 19: 2286-2295）およびMillan et al.（Eur J Immunol 1998 28: 2675-3684）に記載される方法に従って、サブ細胞性分画および密度勾配超遠心分離により単離することができる。また、脂質ラフトは、たとえばガングリオシドGM1に結合する蛍光標識コレラ毒素サブユニットＢ（CTx）を用いて、共焦点顕微鏡により完全な細胞で視覚化することができる（Harder et al., 1998, J Cell Biol 141: 929-942）。脂質ラフトの一つの重要なエレメントは、脂質ラフトが種々の程度にタンパク質を含有または除外できることである。
【００１４】
Ｔ細胞において、シグナル伝達に関与する多くのタンパク質、たとえばIcK、Latは、スクロース勾配で単離された脂質ラフトとともに精製する。種々の方法によるラフトの完全な状態の破壊は、初期の活性化イベントを阻害し、シグナリングの漸増、これによる細胞表面レセプターからのシグナル伝達において、これらドメインに対して重大な役割を支援する。たとえば、抗腫瘍エーテル脂質、1-O-オクタデシル-2-O-メチル-rac-グリセロ-3-ホスホコリン（ET-18-OCH3；edelfosine）は、Fasの脂質ラフトへのトランスロケーション、その後の脂質ラフトによるFasの漸増を介してアポトーシスを誘発することが示された（Gajate and Mollinedo, Blood, 2001, 98: 3860-3863）。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、非アポトーシス条件下（たとえば増殖条件下または細胞が分裂しない条件下）においてプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス分子が脂質ラフトへトランスロケートすることによる、細胞内のこれら分子の活性の細胞性調節メカニズムを新たに発見したことに起因する。
【００１６】
実際、本発明者らは、プロアポトーシスタンパク質、たとえばBadタンパク質のラフトとの相互作用が、サイトカインまたは増殖因子により調節される活性なプロセスであることを驚くべきことに見出した。また本発明者らは、サイトカインまたは増殖因子の欠如した（deprived）細胞における当該分子のラフトからの分離は、アポトーシスの誘導に関与し、ラフトの組織破壊と関連することを示した。
【００１７】
よって、本発明は、特定の細胞タイプにおいてプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス活性を有する細胞性ポリペプチドを同定するための方法を提供する。
【００１８】
また本発明は、新たに同定されたアポトーシス調節メカニズムに介入する（interfere）アポトーシス調整化合物をスクリーニングするための手段を提供する。この点において候補化合物は、非アポトーシス条件下で脂質ラフトにおける一または数個のプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドのトランスロケーションを遮断するか、妨害するか、または刺激することにより介入してもよい。更にまたは択一的に、候補化合物は、非アポトーシス条件下で脂質ラフトに位置するプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドを正常に産生する細胞において脂質ラフトを破壊するか、または再構成することにより介入してもよい。別の態様によれば、更にまたは択一的に、候補化合物は、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドを脂質ラフトから分離することにより介入してもよい。
【００１９】
また本発明は、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトとの結びつき（association）を調整することができる化合物を提供する。
また本発明は、脂質ラフトと別の細胞性局在との間におけるプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの転移を調整することができる化合物を提供する。
【００２０】
また本発明は、細胞死の調節の欠陥により誘導されるかまたはそれと関連する障害、並びに感染細胞または脱調節細胞の死が少なくとも治療技術であり得る特定の病状を予防および/または治療するための医薬の調製における、脂質ラフトの形成を調整することができるか、またはプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質のラフトにおけるトランスロケーションを調整することができる化合物の使用を提供する。
【００２１】
本発明の方法の幾つかの利点のうち、細胞のアポトーシスまたは非アポトーシス状態は、脂質ラフト組織を分析することにより、本発明の方法に従って比較的短期間に決定できることに注目すべきである。とりわけ、特定の遺伝子発現を定量する必要がない。よって本発明の方法は、アポトーシス調整化合物をルーチンに従ってハイスループットスクリーニングするのに特に適している。
【００２２】
更に本発明は、細胞におけるアポトーシスプロセスの初期イベントを検出するための方法を提供する。
【００２３】
本発明の第一の目的は、特定の細胞タイプの細胞においてプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス活性について細胞性ポリペプチドをスクリーニングする方法であって、
ａ．前記特定の細胞タイプの細胞を非アポトーシス条件下で培養し、前記特定の細胞タイプの細胞をアポトーシス条件下で培養すること；および
ｂ．前記哺乳類の培養細胞における前記細胞性ポリペプチドのサブ細胞性局在を決定すること
を含み；
細胞性ポリペプチドが非アポトーシス条件下で培養された細胞において脂質ラフトに局在すること、および前記細胞性ポリペプチドがアポトーシス条件下で培養された細胞において脂質ラフトから分離することが、前記細胞性ポリペプチドが前記特定の細胞タイプにおいてプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス活性を有することの指標である方法である。
【００２４】
特定の態様において、前記培養細胞は、哺乳類細胞である。
好ましい態様において、非アポトーシス条件下で培養される細胞は、増殖条件下で培養される。本発明の方法によれば、細胞培養においてアポトーシスプロセスを受ける細胞の比率が時間の経過にともなって比較的安定で、（細胞タイプに依存するが）全細胞集団の１０％を超えない、好ましくは１％を超えないとき、「非アポトーシス条件下で」細胞が培養されると考えられる。
【００２５】
好ましい態様において、非アポトーシス条件は、増殖条件である。
対照的に、アポトーシスプロセスを受ける細胞の比率が、時間の経過にともなって劇的に増大し、増殖または繁殖因子を欠如させる（deprive）ことにより、またはアポトーシス因子の使用により、一定期間の後、とりわけ約２４時間後に、全細胞集団の５０％を超えるとき、「アポトーシス条件下で」細胞が培養されると考えられる。
【００２６】
アポトーシスプロセスを受けた細胞は、たとえばアガロースゲル電気泳動で視覚化することができる核ＤＮＡの特異的切断により、特徴づけることができる。
【００２７】
本明細書で使用される「細胞性ポリペプチド」の用語は、遺伝子発現により細胞内に産生される任意のポリペプチドを指す。これは、とりわけネイティブ遺伝子により前記細胞内に天然にコードされるポリペプチドであってもよいし、または前記細胞内に天然にコードされないポリペプチドであってもよく、前記ポリペプチドをコードする遺伝子または前記同定遺伝子に由来するコード配列が、細胞のゲノムに再結合し、発現していることを意味する。これは、天然に存在するポリペプチドの突然変異形態であってもよく、より具体的には、前記突然変異が、増殖成長条件下における前記ポリペプチドのサブ細胞性局在の異常に関与する突然変異形態であってもよい。
【００２８】
本明細書で使用される「脂質ラフト」は、別個の液体オーダー相（liquid-ordered phase）を備えたミクロドメインを形成する、原形質膜におけるスフィンゴ脂質およびコレステロールのダイナミックな集合体を指し、ここでミクロドメインは、ガングリオシドまたはポリペプチド、たとえばLckなどの特定の構造を安定して保持する。脂質ラフトは、Hacki et al.（Oncogene 2000 19: 2286-2295）およびMillan et al.（Eur J Immunol 1998 28: 2675-3684）並びに下記実施例に記載される方法に従って、サブ細胞性分画および密度勾配超遠心分離により生化学的に単離することができる。また、脂質ラフトは、たとえば脂質ラフトに蓄積するガングリオシドGM1に結合する蛍光標識コレラ毒素サブユニットＢ（CTx）を用いて、共焦点顕微鏡により完全な細胞で視覚化することができる（Harder et al., 1998, J Cell Biol 141: 929-942）。より具体的には、脂質ラフトにおける特定のポリペプチドのサブ細胞性局在は、脂質ラフトを検出する標識マーカーおよび局在するポリペプチドを検出する別の標識マーカーを用いて、二重免疫蛍光検査法により決定される。また、脂質ラフトを含有するサブ細胞性分画において前記ポリペプチドの存在を分析することにより決定することもできる。
【００２９】
特定の態様において、本発明の方法は、特定の細胞タイプにおいてプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス活性について、その構造は公知であるがその機能は未知であるポリペプチドをスクリーニングするのに適している。とりわけ、当業者は、本発明の方法を使用して、特定の構造ドメインなどの特定の特徴に従ってアポトーシス調節に関与することが疑われるポリペプチドをスクリーニングすることができる。しかし、細胞性ポリペプチドのスクリーニングは、公知の構造の細胞性ポリペプチドに必ずしも限定されない。
【００３０】
幾つかのプロアポトーシスタンパク質が、これまでに同定されているが、これらタンパク質の発現パターンは、細胞のタイプに依って変化し得る。よって、当該スクリーニング方法は、ある細胞タイプでプロアポトーシスまたはアンチアポトーシス作用を示すことが公知である推定細胞性ポリペプチドが、別の細胞タイプでアポトーシス調整に関与するか否かを決定する際にも有用である。
【００３１】
特定の態様において、スクリーニングされるポリペプチドは、Bcl-2ファミリーに属する。上述したとおり、Bcl-2ファミリーメンバーは、BCL-ホモロジー領域と称される特定の保存モチーフ（BH1、BH2、BH3およびBH4ドメイン）に基く配列ホモロジーにより特徴づけられる。したがって、これらのサブ細胞性局在は、BHドメインを特異的に認識する分子を使用することにより決定することができる。かかる分子は、たとえばBHドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む。BH3モチーフと相互作用する分子の一例は、PP1aである（Ayllon et al. 2000. EMBO J.; 19: 2237-2246）。BH4モチーフと相互作用する分子の例は、Admas, J.M. and Cory, S. (1998) Science, 281, 1322に概説される。特定の態様において、BH4ドメインを特異的に認識する分子は、好ましくはアンチアポトーシス分子についてスクリーニングするために使用される。別の特定の態様において、BH3ドメインを特異的に認識する分子は、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシス分子についてスクリーニングするために使用される。また、異なるBHドメインを認識する分子の組み合わせは、たとえば、BH3ドメインのみを有するプロアポトーシス分子についてスクリーニングするために使用することができる。
【００３２】
また、本発明の方法は、その構造および機能が少なくとも一部未知であるがそのBHドメインの分子認識を用いて容易に単離することができるBcl-2ファミリーの新規ポリペプチドをスクリーニングするのに適している。その結果、好ましい態様において、スクリーニングされる前記細胞性ポリペプチドは、BHドメインを特異的に認識する分子を使用することにより、増殖条件下で培養された哺乳類細胞の生化学的に単離された脂質ラフトからまず単離される。より具体的には、単離された脂質ラフトに存在するポリペプチドは、ゲルで分離し、BHドメインを認識する抗体を用いたウェスタンブロット分析により、または同様のタンパク質分析方法により分析することができる。当該技術分野で周知の通常の方法に従って、BHドメインにより認識されるポリペプチドを単離することができ、単離された各ポリペプチドを認識する抗体を作成することができる。その後、一以上の単離されたポリペプチドのサブ細胞性局在が、かかる特異的抗体を用いて本発明の方法に従って決定され、アポトーシス活性についてスクリーニングされる。
【００３３】
脂質ラフトと関連するタンパク質は、膜貫通ドメインを有していてもよいし、あるいはミリストイル化などの翻訳後修飾を受けていてもよい。別の特定の態様において、スクリーニングされる前記細胞性ポリペプチドは、ミリストイル化されたポリペプチドを特異的に認識する分子を使用することにより更に単離される。
【００３４】
好ましい態様において、当該方法は、Badタンパク質の産生により特徴づけられる細胞タイプ、すなわちBad+細胞タイプの細胞性ポリペプチドをスクリーニングするために行われる。別の好ましい態様によれば、細胞は免疫系に特徴的なものであり、もっとも好ましくはＴ細胞株である。
【００３５】
実際、後述の実施例において、プロアポトーシス性Badタンパク質は、IL-4で刺激されたＴ細胞の脂質ラフトに隔離され、IL-4欠如（deprived）Ｔ細胞においてラフトから分離することが示されている。
【００３６】
より具体的には、実施例において、Badは、非アポトーシス条件下（とりわけ増殖条件下）において細胞から、サブ細胞性分画および密度勾配超遠心分離により脂質ラフトとともに精製できることが示されている。これらの結果は、Badが、増殖条件などの非アポトーシス条件下で培養された細胞において脂質ラフトと強く関連していることを示す。
【００３７】
このように、Bad+細胞の単離された脂質ラフトにおいてBadタンパク質と物理的に相互作用する細胞性ポリペプチドは、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシス活性についてスクリーニングされる好ましい推定ポリペプチドを構成する。よって、好ましい態様において、スクリーニングされる細胞性ポリペプチドは、増殖条件下で培養されたBad+細胞の単離された脂質ラフトから単離され、Badタンパク質と物理的に相互作用するポリペプチドのなかから選択される。
【００３８】
当然、本発明は、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシス活性を有する新たに同定された細胞性ポリペプチド、並びにこれらポリペプチドを発現する細胞（たとえば哺乳類細胞）においてアポトーシスを調整するための手段を提供する際のこれらポリペプチドの使用にも関する。
【００３９】
本発明の別の目的は、細胞を非アポトーシス条件下で培養したときに脂質ラフトに位置するプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドを産生する細胞において、アポトーシスを調整する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）前記細胞を、非アポトーシス条件を維持する増殖培地で培養すること；
ｂ）前記培養細胞を候補化合物と接触させること；
ｃ）脂質ラフトと結びついた一または数個のプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドのレベルを決定すること；
ｄ）一または数個のプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトとの結びつきに介入する化合物であってアポトーシスを調整する能力を有する化合物を選択すること
を含む方法を提供することである。
【００４０】
化合物が前記結びつきを改変するとき、たとえば、化合物が前記結びつきの化学的および/または物理的性質を変えるとき、または化合物が、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトからの分離を引き起こすかもしくは当該分離に影響を及ぼすとき、または化合物が前記結びつきを妨害するとき、または化合物が脂質ラフトの崩壊に作用し、とりわけ当該崩壊を促進するか、またはより一般的には脂質ラフトの構成を変えるとき、化合物は、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの結びつきに介入している。
【００４１】
更に本発明は、細胞においてアポトーシスを促進する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞の非アポトーシス条件下において脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質を産生する細胞を、非アポトーシス条件を維持する増殖培地で培養すること；
ｂ）前記培養細胞を候補化合物と接触させること；
ｃ）前記培養細胞において脂質ラフトの存在または非存在を決定すること；
ｄ）脂質ラフトが存在する場合、任意に、脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質のレベルを決定すること
を含み、
前記候補化合物とインキュベートした細胞の原形質膜における脂質ラフトの非存在、または決定された場合には、脂質ラフトにおけるプロアポトーシスタンパク質レベルの低下が、前記化合物がアポトーシスを促進することの指標である方法に関する。
【００４２】
また本発明は、細胞のアポトーシスを阻害または妨害する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）非アポトーシス条件下において脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質を産生する細胞を、非アポトーシス条件を維持するための増殖培地で培養すること；
ｂ）前記細胞を候補化合物と接触させること；
ｃ）アポトーシス条件下において細胞を培養すること；
ｄ）脂質ラフトの存在または非存在を決定すること；
ｅ）脂質ラフトが存在する場合、任意に、脂質ラフトに位置するプロアポトーシスタンパク質のレベルを決定すること
を含み、
前記候補化合物とインキュベートした細胞の原形質膜における脂質ラフトの存在、および任意に、脂質ラフトにおけるプロアポトーシスタンパク質レベルの維持が、前記候補化合物がアポトーシスを阻害または妨害することの指標である方法に関する。
【００４３】
好ましい態様において、細胞は、繁殖性増殖条件を維持するために必要なサイトカインまたは増殖因子を少なくとも含む増殖培地で培養され、当該方法の工程ｃ）は、繁殖性増殖条件を維持するために必要な前記サイトカインまたは増殖因子を細胞から欠如させること（depriving）を含む。
【００４４】
ここで使用される「化合物」の用語は、天然（単離された）または合成の無機または有機の化学的または生物学的化合物をいい、とりわけ、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、グリコペプチド、脂質、リポタンパク質および炭水化物を包含する。
【００４５】
プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質が、脂質ラフトでトランスロケートされ得る任意の細胞を、本発明の方法で使用することができる。本発明の方法の好ましい態様において、細胞は哺乳類細胞である。
【００４６】
化合物をスクリーニングする当該方法において使用される哺乳類細胞は、その生存が特定のサイトカインまたは増殖因子によってコントロールされ得る任意の哺乳類細胞とすることができる。上記方法の好ましい態様において、哺乳類の培養細胞は、プロアポトーシスタンパク質としてBadタンパク質を産生するもののなかから選択される。より具体的には、Badタンパク質を産生する好ましい哺乳類細胞は、免疫系に特徴的な細胞のなかから選択され、より好ましくはＴ細胞のなかから選択される。
【００４７】
ここで使用される「サイトカインまたは増殖因子」の用語は、培養細胞のアポトーシスプロセスを妨害するため、および/または細胞の増殖を促進するために増殖培地に存在することが必要な任意の分子をいう。公知のサイトカインには、任意のインターロイキンが含まれる。公知の増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＦＧＦ６、肝細胞増殖因子ＨＧＦ/ＳＦ、表皮増殖因子、ＥＧＦ、およびその他の特徴づけられた増殖因子、たとえばＩＧＦ−１、ＰＤＧＦ、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＧＦｂ、ＴＮＦａ、ＮＧＦ、ＢＭＰ、ニューレグリン、トロンボポエチンおよび成長ホルモンが挙げられる。また、本発明による増殖因子としては、プロゲスタゲン（progestagenes）およびその誘導体（プロゲステロン）、エストロゲンおよびその誘導体（エストラジオール）、アンドロゲン（テストステロン）、鉱質コルチコイドおよびその誘導体（アルドステロン）、ＬＨ、ＬＨ−ＲＨ、ＦＳＨ et ＴＳＨホルモン、Ｔ３、Ｔ４、およびレチノイド酸（retinoidic acid）、カルシトニンＥ２およびＦ２/アルファプロスタグランジンを挙げることができる。また、糖質コルチコイド（天然または半合成、すなわちヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロンまたはトリアムシノロン）を使用することもできる。
【００４８】
免疫系に特徴的な細胞は、都合よくは、繁殖性増殖条件を維持するためのインターロイキンによる刺激の下で培養することができる。とりわけ、この状況においてＩＬ−４、ＩＬ−２またはＩＬ−９インターロイキン、またはその混合物を使用することができる。
【００４９】
しかし、任意の有用なアポトーシスモデルを使用して、本方法で使用される細胞タイプおよび非アポトーシス条件のための因子、たとえば増殖因子またはサイトカインを選択することができる。ここで使用される「アポトーシスモデル」の用語は、非アポトーシス条件のための特定の因子（たとえば特定のサイトカインまたは増殖因子またはその混合物）を使用することにより特定の細胞タイプの細胞培養において細胞アポトーシスをコントロールする手法を提供する任意の教示を含む。かかるアポトーシスモデルは、たとえば、ＩＬ−４で刺激されたＴ細胞株、ＩＬ３および造血性前駆体、ＰＣ１２およびＣＲＨ（副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン）、ＨＮ９．１０のコントロールである。
【００５０】
候補化合物は、前記プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトとの結びつきを阻害または妨害することによりアポトーシスを調整し得る。この状況において、脂質ラフトにおける前記プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドのサブ細胞性局在は、化合物とインキュベートしなかった細胞と比較すると、化合物とインキュベートした細胞では観察されにくく、あるいは少なくとも、前記プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトのサブ細胞性局在は、化合物とインキュベートしなかった細胞と比較すると有意に減少する。
【００５１】
本発明の別の目的は、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトとの結びつきを調整することができる化合物を提供することである。
【００５２】
これら化合物の幾つかは、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトとの結びつきを妨害することにより、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトからの分離を促進することにより、または脂質ラフトの崩壊を促進することにより、アポトーシスを調整し得る。
【００５３】
これら化合物の幾つかは、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトからの分離を妨害することにより、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトとの結びつきを促進することにより、または脂質ラフトの構成を促進することにより、アポトーシスを調整し得る。
【００５４】
本発明の別の目的は、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトと別の細胞性局在との間の転移を調整することができる化合物を提供することである。
【００５５】
これら化合物の幾つかは、脂質ラフト以外の細胞性局在から脂質ラフトへの、または脂質ラフトから別の細胞性局在への、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの転移を妨害することによりアポトーシスを調整し得る。
【００５６】
これら化合物の幾つかは、脂質ラフト以外の細胞性局在から脂質ラフトへの、または脂質ラフトから別の細胞性局在への、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの転移を促進することによりアポトーシスを調整し得る。
【００５７】
好ましい態様において、アポトーシスを調整する本発明の化合物は、Bcl-2ファミリーのプロアポトーシスタンパク質（とりわけBad）の脂質ラフトとの結びつき、または脂質ラフトと別の細胞性局在との間の前記タンパク質の転移を調整することができる。
【００５８】
前記化合物の幾つかは、Badの脂質ラフトとの結びつきを妨害することにより、Badの脂質ラフトからの分離を促進することにより、または脂質ラフトの崩壊を促進することにより、Bad産生細胞においてアポトーシスを促進し得る。
【００５９】
前記化合物の幾つかは、Badの脂質ラフトとの結びつきを促進することにより、Badの脂質ラフトからの分離を妨害することにより、または脂質ラフトの構成を促進することにより、Bad産生細胞においてアポトーシスを阻害し得る。
【００６０】
特定の態様において、本発明の化合物は、Badが脂質ラフトから分離した後、Badのミトコンドリアへの転移を妨害することにより、Bad産生細胞のアポトーシスを阻害し得る。かかる化合物は、Badが脂質ラフトに結びつくことを許容する脂質ラフトモチーフに類似のモチーフにより、Badと相互作用し得る。
【００６１】
前記プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトのサブ細胞性局在は、当該技術分野で有用な任意の定量的分析方法により定量することができる。プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドのレベルが、候補化合物とインキュベートした細胞において、または候補化合物とインキュベートしなかった細胞と比較して、少なくとも５０％、好ましくは９０％に低下したとき、脂質ラフトのサブ細胞性局在の有意な低下が観察される。
【００６２】
候補化合物は、前記プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトからの分離を遮断または妨害することにより、アポトーシスを調整し得る。この状況において、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質の分離を促進する条件（たとえばプロアポトーシスタンパク質のためのアポトーシス条件）下で培養された細胞の脂質ラフトにおける前記プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドのサブ細胞性局在は、化合物とインキュベートしなかった細胞と比較すると、化合物とインキュベートした細胞では引き続き観察されたままであり、前記プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトのサブ細胞性局在は、化合物とインキュベートしなかった細胞と比較すると、有意に維持されている。
【００６３】
前記プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトのサブ細胞性局在は、当該技術分野で有用な任意の定量的分析方法により定量することができる。候補化合物とインキュベートした細胞において、または候補化合物とインキュベートしなかった細胞と比較して、プロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドのレベルは、少なくとも５０％、好ましくは９０％維持されたとき、有意な維持が観察される。
【００６４】
「脂質ラフトの非存在を決定する」とは、候補化合物とインキュベートした細胞において脂質ラフトが、検出されないか、または少なくとも、僅かに検出されるか、またはコントロールとして候補化合物とインキュベートしなかった細胞の培養物と比較した場合に、本発明で開示される方法を用いて有意に低下したレベル（すなわち最低２０％未満）で検出されることと解される。細胞における脂質ラフトの比率は、当該技術分野で有用な任意の定量的分析方法を用いて細胞培養物の間で比較することができる。コントロールに対し、候補化合物とインキュベートした細胞において、その比率が２０％から低下し、好ましくは、少なくとも５０％、好ましくは９０％まで低下したとき、脂質ラフトの有意な低下が観察される。たとえば、共焦点顕微鏡分析で、候補化合物とインキュベートした細胞および候補化合物とインキュベートしなかった細胞を画像解析することにより、蛍光のプロファイルを定量することができる。
【００６５】
同様に、「脂質ラフトの存在を決定する」とは、候補化合物とインキュベートした細胞において脂質ラフトが、コントロールとして候補化合物とインキュベートしなかった細胞の培養物と比較した場合、実質的に同量検出されることと解される。
【００６６】
脂質ラフトを単離する方法は、以下に記載される。より具体的には、スクロース勾配上で細胞分画を行い、ラフトを含有するサブ細胞性分画を同定するためにラフトに特異的なマーカーを用いてサブ細胞性分画を免疫ブロッティングすることにより、哺乳類細胞から脂質ラフトを単離することができる。よって、脂質ラフトの存在または非存在は、特定の態様において、以下の工程により決定することができる
ｉ）前記化合物とインキュベートした培養細胞を回収し、サブ細胞性分画に適したバッファー（たとえば勾配スクロースバッファー）に前記細胞を再懸濁する工程；
ii）分画された細胞を超遠心分離する工程；
iii）脂質ラフトを含有するはずのサブ細胞性分画を回収する工程；および
iv）回収されたサブ細胞性分画が、ガングリオシドおよび/または脂質ラフト関連分子を含有するか否かを決定する工程。
【００６７】
ここで使用される「脂質ラフトを含有するはずのサブ細胞性分画」は、非アポトーシス条件下で培養された細胞を用いて得られた勾配における脂質ラフトを含有する勾配のバンド状細胞小器官に相当するサブ細胞性分画である。当然、アポトーシス条件において、対応する細胞分画は、脂質ラフトをずっと少量含有する。
【００６８】
また、脂質ラフトおよびプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスポリペプチドの脂質ラフトサブ細胞性局在は、ラフト関連分子またはガングリオシドに特異的に結合する分子マーカーを用いて共焦点顕微鏡により、完全な細胞で直接的に視覚化することができる。
【００６９】
かかる好ましい分子マーカーは、たとえば、ガングリオシドGM1を特異的に認識するコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴｘ）、抗Bad抗体または抗Lck抗体である。より一般的には、上述の本発明の方法に従って新たに同定された任意の細胞性ポリペプチドに対する任意の抗体を、ラフトに対して特異的な分子マーカーとして使用することができる。
【００７０】
また本発明は、当該スクリーニングにより同定された化合物に関する。
上記本発明の方法により同定されるかかる化合物は、細胞死の調節の欠陥により誘導されるかもしくはそれと関連する障害、または感染細胞もしくは脱調節細胞の死が少なくとも治療の一部であり得る特定の病状を予防および/または治療するために有効である。
【００７１】
更に本発明は、細胞死の調節の欠陥により誘導されるか、またはそれと関連する障害を治療するための医薬の製造における、脂質ラフトの形成を調整することができる化合物の使用を提供する。
好ましい態様において、前記調節の欠陥は、Badタンパク質を産生する細胞、より好ましくは免疫系の細胞、最も好ましくはＴ細胞に影響を及ぼす。
【００７２】
前記細胞死の調節の欠陥が、細胞死の異常な減少という結果に至るとき、使用される化合物は、好ましくは、脂質ラフトを破壊し、これによりアポトーシスを促進することができる化合物である。かかる化合物は、たとえば、メチル-β-シクロデキストリンまたはフィリピンである。細胞死の異常な減少という結果に至る障害の例は、がん疾患、とりわけリンパ増殖性がん、感染性疾患、とりわけウイルス性疾患、炎症性疾患または自己免疫疾患である。
【００７３】
反対に、アポトーシスの調節の欠陥が、細胞死の異常な増大という結果に至るとき、使用される化合物は、好ましくは、細胞の原形質膜において脂質ラフトを再構成し、これによりアポトーシスを妨害することができる化合物、たとえばエデルフォシン（edelfosine）である。細胞死の異常な増大という結果に至る障害の例は、老化に関連した疾患、神経変性疾患、たとえばアルツハイマー病、虚血性細胞死、創傷治癒またはＡＩＤＳである。
【００７４】
本発明は、アポトーシスプロセスの初期イベントを検出するための新規手段を提供する。とりわけ、本発明は、脂質ラフトが存在するか否かを決定することにより、細胞のアポトーシス状態を同定することを可能にする。したがって、本発明の別の目的は、ある個体の細胞のサンプルにおいて、アポトーシスの調節の欠陥をインビトロで検出する方法であって、前記細胞に脂質ラフトが存在するか否かを決定することを含み、前記脂質ラフトの非存在が、アポトーシス調節の欠陥の指標である方法である。
【００７５】
細胞に脂質ラフトが存在するか否かを決定するための方法の例は、既に上述したとおりである。好ましい態様において、脂質ラフトの存在または非存在は、繁殖性増殖条件下において脂質ラフトに位置することが知られているプロアポトーシスまたはアンチアポトーシスタンパク質、たとえばBadタンパク質、または任意の他のタンパク質、とりわけ前述の本発明の方法に従って同定される細胞性ポリペプチドの存在または非存在を検出することにより決定される。
【００７６】
特定の態様において、前記単離された細胞は、リンパ増殖性疾患に罹患した個体の免疫系に特徴的な細胞である。
当然、本発明は、上述のインビトロ検出方法において、脂質ラフトの存在を検出するのに適した化合物の使用にも関する。
【００７７】
脂質ラフトの存在を検出するのに適した化合物の例は、Badタンパク質、Lckタンパク質またはガングリオシドGM1を特異的に認識する化合物である。特定の態様において、当該インビトロ検出方法で使用される前記化合物は、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴｘ）、抗Bad抗体および抗Lck抗体のなかから選択される。
【実施例】
【００７８】
１．材料および方法
１．１  細胞、リンフォカインおよび試薬
TS1αβは、IL-2、IL-4またはIL-9でそれぞれ増殖させることができるマウスＴ細胞株である。細胞は、以前に記載されるとおりRPMI-1640で培養した（Pitton et al., 1993, Cytokine 5, 362-371）。マウスIL-4の供給源として、マウスrIL-4またはPKCRIL-4.neoでトランスフェクトしたHeLaサブラインの上清を使用した。フルオレセインイソチオシアネート（FITC-）標識コレラ毒素（CTx）Ｂサブユニット、CTx-ビオチンおよびメチル-β-シクロデキストリン（M-β-CD）は、Sigma-Aldrich（St.Louis, MO）から入手した。Cy-3およびCy-2結合二次抗体は、Molecular Probes（Eugene, OR）から購入した。抗ミトコンドリア血清（mito 2813, ピルビン酸デヒドロゲナーゼ）は、Dr A. Serrano（CNB, Madrid, Spain）から寄贈された。
【００７９】
１．２  免疫沈降およびウェスタンブロット
細胞（1×107）をIL-4で刺激するか、またはIL-4を欠如させ（deprive）、溶解バッファー（50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Nonidet P-40, 137 mM NaCl. 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10% グリセロールおよびプロテアーゼ阻害剤の混合物）中で、4℃で20分間溶解させた。溶解物を、対応の抗体（Calbiochem Transduction Laboratory）を用いて免疫沈降させた。プロテインＡ−セファロースを4℃で1時間添加し、洗浄後、免疫沈降物をSDS-PAGEにより分離した。あるいは、細胞をLaemmliサンプルバッファー中で溶解させ、タンパク質抽出物をSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロースに移し、Tris緩衝化食塩水（TBS, 20 mM Tris HCl pH 7.5, 150 mM NaCl）中の5%無脂肪ドライミルクでブロックし、TBS/0.5% 無脂肪ドライミルク中で一次抗体とインキュベートした。膜をTBS中の0.05% Tween 20で洗浄し、PO結合二次抗体とインキュベートした。洗浄後、タンパク質をECLシステムを用いて展開した。
【００８０】
１．３  細胞周期分析
M-β-CDで処理された、または処理されなかったトータル２×1015のIL-4刺激細胞を洗浄し、PBSに再懸濁し、0.1% Nonidet P-40で透過させ、50 μg/mLプロピジウムイオダイド（PI）で染色した。様々な時間に、EpicsXLフローサイトメーター（Coulter, Hialeah, FL）を用いてサンプルを分析した。アポトーシスを、低二倍体のＤＮＡ含量を有する蛍光スケールのサブG1領域における細胞のパーセンテージとして測定した。また細胞周期は、アネキシン染色により分析した。トータル2×103の細胞を、氷冷の結合バッファーで希釈した氷冷PBSで洗浄し、アネキシンおよびプロピジウムイオダイドで染色した。サンプルは、氷上で10分間暗所に維持し、その後フローサイトメトリーにより分析した。
【００８１】
１．４  サブ細胞性分画
サブ細胞性分画は、以前に記載されたとおり実施した（Hacki et al., 2000, Oncogene 19, 2286-2295; Millan and Alonso, 1998, Eur. J. Immunol. 28, 3675-3684）。要するに、IL-4刺激細胞またはIL-4欠如（deprived）細胞をPBSで洗浄し、その後2分間抽出バッファーSTE（10 mM Hepes pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.25 mM スクロース, 2μg/mL アプロチニン、10 μg/mL ロイペプチン, 1 mM PMSF, 1μg/mLペプスタチン）に再懸濁した。抽出物を顕微鏡の下で調べ、細胞の95％以上を溶解させた。ホモジネートを直線的勾配スクロース（0.73〜1.9 M）に適用し、一晩20,000 gで超遠心分離した。バンド状の細胞小器官をシリンジにより回収し、同体積の10 mM Hepesバッファーで希釈し、各々の細胞小器官について割り当てた速度で沈殿させた。細胞小器官の純度を、特定のマーカーに対する抗体を用いてウェスタンブロットにより決定した：ミトコンドリアについては抗シトクロムＣ、ラフトについては抗LckおよびCTx-ビオチン、小胞体（ER）については抗カルネキシン、およびサイトゾルについては抗カスパーゼ3。サイトゾルの調製については、ホモジネートを750 gで10分間予め遠心分離して核および未破壊の細胞を除去し、その後100,000 gで1時間遠心分離して膜を除去した。
【００８２】
１．５  CTx-FITC標識
IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞を、1% パラホルムアルデヒドを用いて5分間氷上で固定し、透過させ、その後CTx-FITC（20分、6μg/mL）とともに、そして抗Bad抗体とともに1時間PBS-BSA中でインキュベートした。Cy-3標識二次抗体を添加し、1時間インキュベートした。最後に、数回の洗浄工程の後、細胞を-20℃で10分間メタノールとともにインキュベートし、Vectashield培地で増殖させ、共焦点顕微鏡により分析した。サンプルの定量のために使用したプログラムは、Leica TSC NTバージョン1.5.451（Leica, Lasertechnik, Heidelberg, Germany）であった。
【００８３】
１．６  コレステロール減損
IL-4で刺激された血清欠如細胞を、37℃で30分間、10 mM Ｍ-β-ＣＤで処理し、洗浄し、その後、上述のとおりCTx-FITCおよび抗Badまたは抗Lck抗体とともにインキュベートした。二次抗体を添加し、１時間インキュベートした。最後に、細胞を-20℃で10分間メタノールとともにインキュベートし、上述のとおり増殖させた。
【００８４】
１．７  Triton X-100浮選
IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞を、プロテアーゼ阻害剤混合物を含有するTXNEバッファー（50 mM Tris HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.2% Triton X-100）中で溶解させた。洗浄剤不溶性膜を、以前に記載されたとおりOptiprepの30〜35％勾配で超遠心分離（17,000 g, 4h, 4℃）により単離した（Manes et al., 1999, EMBO J. 18, 6211-6220）。
【００８５】
１．８  ミトコンドリアおよびS-100分画の単離
ミトコンドリアを、Yang et al., 1997, Science 275: 1129に記載される方法を改変して単離した。要するに、20×106細胞をIL-4で刺激するか、またはIL-4を欠如させ、収穫し、氷冷PBSで洗浄した。細胞の沈殿物を、プロテアーゼ阻害剤を添加した5 vol.氷冷バッファーＡ（20 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 250 mM スクロース）に懸濁した。細胞をDounceホモジナイザー（Kontes, Vineland, NJ）で破壊し、核を遠心分離し（1,000×g, 10 min, 4℃）、上清を更に遠心分離した（1,000×g, 15 min, 4℃）。得られたミトコンドリアの沈殿物をバッファーＡに再懸濁し、-80℃で保存した。上清を遠心分離し（100,000×g, 1h, 4℃）、得られたS-100分画を-80℃で保存した。
【００８６】
２．結果
２．１  IL-4刺激細胞における脂質ラフトとのBadの結びつき
IL-3の刺激後、Badはリン酸化され、14-3-3タンパク質と結びつくことが示されている。ごく最近、IL-2はBadのリン酸化を誘導するが、14-3-3タンパク質と結びつかないことが示されている（Ayllon et al., 2001, J. Immunol. 166, 7345-7352）。図１は、IL-4で刺激しても、IL-4を欠如させても、Badが14-3-3タンパク質に結びつかないことを示す。内部コントロールとして、Rafと14-3-3タンパク質の相互作用を示す（図１）。
【００８７】
IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞においてBadのサブ細胞性分布を分析した。IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞を溶解させ、スクロース勾配上に分画した。勾配プロトコールを確認するため、分画（１〜４）を、ラフト（LckおよびGM1ガングリオシド）、ミトコンドリア（シトクロムＣ）、小胞体（カルネキシン）、およびサイトゾル（カスパーゼ3）のマーカーを用いて、免疫ブロットした。核の分画（分画５）は、核にBadが局在しないため、ブロットで示さない。ラフトは、抗Lck抗体、およびGM1ガングリオシドを認識するCTx-ビオチンを用いて分画１においてウェスタンブロットにより検出した（図２Ａ）。Badのほとんどは、ラフトに見出されたが（分画１）、ごく小さな分画がミトコンドリア（分画４）、サイトゾルおよび小胞体（分画２）にも存在した。内部コントロールとして、BadはIl-4刺激細胞のトータル抽出物で観察された。最後に、脂質ラフトで隔離されるBadの分画は、脱リン酸化されることが観察された。
【００８８】
Bcl-2は、IL-2刺激細胞で発現され、Bcl-xLは、IL-4培養細胞で発現されることが以前に報告されている（Gomez, J. et al., 1998, Oncogene 17: 1235）。IL-4維持細胞がリンフォカインを欠如すると、アポトーシスに至る。IL-4欠如から早くも４時間後に、〜9%の細胞がアポトーシスに至り、24時間で40％に到達したが、コントロールのIL-4刺激細胞は、有意なアポトーシスレベルは示さなかった。
【００８９】
IL-4欠如は、ラフトの組織崩壊を誘導し（分画１）、これは、抗Lck抗体またはCTx-ビオチンの何れを用いても検出されない。同様の密度を有する他の細胞性構造も含有するミトコンドリアマーカーは、分画４で観察され、低分子量の新規タンパク質を仮定すると、カスパーゼ３のほとんどが分割される（cleave）。さらに興味深いことに、Badはサイトゾルでほとんど検出されず、ラフトは、ミトコンドリアおよび同様の密度を有する細胞性構造に相当する分画４で観察されるだけである（図２Ａ）。この結果から、BadはIL-4に依存してラフトと結びつくこと、IL-4の欠如によりミトコンドリアにトランスロケートされることが強く示唆される。またラフトを、Triton X-100浮選勾配により単離した。図２Ｂに示されるとおり、BadおよびLckは、脂質ラフトに相当するIL-4刺激細胞の洗浄剤不溶性分画（I）で検出される。IL-4欠如細胞において、BadおよびLckは、可溶性タンパク質（S）に相当する分画で検出される。翻訳後のミリストイル化は、ラフトに結びついたBadをターゲットとすることが観察された（データ示さず）。
【００９０】
また、Badのサブ細胞性局在を、IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞のミトコンドリア分画およびサイトゾル分画において分析した。Badは、IL-4刺激細胞のミトコンドリアにおいて検出された。ミトコンドリアと結びついたBadの量は、IL-4欠如により増大した。微量のBadが、IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞のサイトゾル分画において検出された。アンチアポトーシス分子Bcl-XLは、IL-4刺激細胞のミトコンドリア分画で弱く検出され、IL-4の欠如後、増大した。タンパク質分画の内部コントロールとして、抗カスパーゼ３（サイトゾルマーカー）、抗ミトコンドリアMito2813（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ミトコンドリアマーカー）、および抗カルネキシンを用いてブロットを調査し、ミトコンドリア調製物に小胞体のコンタミネーションがないことを示した。トータル抽出物（レーンＴ）を、カルネキシン発現のポジティブコントロールとして使用した。最後に、幾つかのBcl-2ファミリーメンバーとBadの結びつきを調査した。特定の抗体を用いてIL-4刺激条件下またはIL-4欠如条件下において細胞質タンパク質の同時免疫沈降（coimmunoprecipitation）実験を行った。Badは、IL-4刺激細胞の抗Bcl-xL免疫沈降物において、ウェスタンブロットにより検出され、分析した飢餓の期間を通して減少した。抗Bcl-xL抗体を用いた膜のプロービングにより、すべての分析条件で同様のレベルが示された。
【００９１】
また、IL-4刺激細胞においてBadのラフトへの結びつきを、共焦点顕微鏡により完全な細胞で分析した（図３Ａ）。IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞を、抗Bad抗体または抗Lck抗体で二次標識する前に、ラフトマーカーのコレラ毒素Ｂサブユニット（CTx-FITC）とインキュベートした。抗BadおよびCTx-FITCを用いた二重免疫蛍光分析により、IL-4刺激細胞の表面にBadのラフト局在が示された。著しく対照的に、IL-4欠如細胞ではラフトの組織崩壊が観察され、その結果、IL-4欠如細胞においてBadのラフト局在は観察されなかった（図３Ａ）。抗LckおよびCTx-FITCを用いた二重免疫蛍光分析を、IL-4刺激細胞の膜ラフトにおけるLck局在のポジティブコントロールとして使用した。ラフトと結びついたLckは、IL-4欠如細胞では検出されなかった（図３Ａ）。
【００９２】
緑色および赤色蛍光の同時局在（colocalization）のプロファイルは、Leicaの定量ソフトウェアを用いて分析した（TCS NT; Leica, Rockleigh, NJ）。緑色および赤色の同時局在のピークは、CTx-LckまたはCTx-Badで染色されたIL-4刺激細胞の膜で多数観察された。対照的に、緑色および赤色蛍光の同時局在のレベルは、IL-4欠如細胞で大きく低下した。
【００９３】
この結果は、Badが、IL-4刺激細胞において脂質ラフトに優先的に局在し、IL-4欠如細胞において原形質膜から隔離されることを示唆する。
Badの脂質ラフトとの同時局在についての同様の結果が、マウスから新たに単離された胸腺細胞を用いて観察された。
【００９４】
また、IL-4欠如細胞においてBadのミトコンドリアとの結びつきを、共焦点顕微鏡により完全な細胞で分析した（図３Ｂ）。抗Bad抗体および抗ミトコンドリア抗体を用いた二重免疫蛍光分析によれば、IL-4刺激細胞では、Badのミトコンドリアとの弱い結びつきが示されるが、IL-4欠如細胞では、ミトコンドリアに結びついたBadの分画が多く存在する（図３Ｂ）。このBadのラフトからの分離は、細胞性分画および共焦点顕微鏡により示されるとおり、IL-4欠如細胞においてBadがミトコンドリアへトランスロケートすることと関連する（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００９５】
また、緑色および赤色蛍光の同時局在のプロファイルを、定量ソフトウェア（Leica）を用いて分析し、抗Bad抗体および抗ミトコンドリア抗体で染色したIL-4刺激細胞において、緑色および赤色の同時局在ピークが中程度に示された。両蛍光の同時局在のレベルは、IL-4欠如細胞において大きく増大した。
【００９６】
２．２  Badの脂質ラフトへの結びつきは、アポトーシス妨害のために必要である
細胞性コレステロールの減損は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）-アンカータンパク質が脂質ラフトと結びつく能力を低減する。Badのラフトとの結びつきに関して同様にコレステロールが必要であるか否かを調査するため、IL-4刺激細胞を、血清フリー培地において10 mM メチル-β-シクロデキストリン（M-β-CD）により、またはそれなしで、30分間処理し、細胞性コレステロールを使い尽くした。その後、細胞をCTx-FITCとインキュベートし、抗Bad抗体または抗Lck抗体で標識した。血清の除去は、LckまたはBadの脂質ラフトへの結びつきをわずかに破壊するだけである（図４Ａ）。しかし、IL-4刺激細胞において、M-β-CD処理は、ラフト形成並びにLckおよびBadのラフトとの結びつきを大規模に破壊する（図４Ａ）。この結果から、IL-4刺激細胞において、コレステロール減損によるラフト形成の破壊は、BadおよびLckのラフトからの分離を誘導することが示される。
【００９７】
IL-4欠如アポトーシス細胞においてもラフトからBadの排除が観察されたと考え（図３Ａ）、Badのラフトとの結びつきおよびその完全な状態がアポトーシスの妨害に必要であるか否かを分析した。この目的のため、IL-4刺激細胞を、血清フリー培地においてM-β-CDにより、またはそれなしで、30分間処理し、その後洗浄し、IL-4補充完全培地に再懸濁し、様々な時間にアポトーシスの誘導について分析した（図４Ｂ）。M-β-CD処理細胞は、コントロールの非処理細胞と比較して、高レベルのアポトーシスを示し、M-β-CD処理から５時間後、最も高いレベルに達した。処理８時間目には、血清の添加により膜の脂質組成が回復したため、処理細胞または非処理細胞で検出されたアポトーシス細胞の量は同様であった。
【００９８】
この結果は、Badのラフトからの分離が、アポトーシスの誘導に関与することを示唆している。リン酸化などのBadの翻訳後修飾、およびラフトまたはミトコンドリアにBadが局在することに対する翻訳後修飾の役割について、更に分析した。図５Ａは、IL-4が、Badのセリン136リン酸化を誘導するが、セリン112および155リン酸化を誘導しないことを示す。更に、IL-4欠如は、Badのセリン136脱リン酸化を誘導する。IL-4がセリン136リン酸化を誘導すると考え、ウェスタンブロットを、抗Badセリン136抗体を用いて図２Ａから再度調査した。図５Ｂは、IL-4刺激細胞においてBadのほとんどがラフトに局在するが、Badの弱いサイトゾル分画だけがセリン136でリン酸化されることを示す。IL-4欠如細胞では、サイトゾルおよびミトコンドリアでわずかなセリン136リン酸化が観察される。この結果によれば、脱リン酸化Badはラフトで隔離され、IL-4欠如は分離およびミトコンドリアへのトランスロケーションを誘導することが示唆される。
【００９９】
脂質ラフトまたはミトコンドリアとのダイナミックな相互作用によってどのようにBadの機能が調節され得るかは、Badのサブ細胞性局在により理解することができる。明らかなBad分布および機能は、細胞のIL-4刺激または欠如と直接関連している。
【０１００】
これらデータは、以前の報告に反して、14-3-3タンパク質が、Badのプロアポトーシスの役割をコントロールしないことを示す。この結果に基いて、IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞におけるBadのサブ細胞性分布を分析した。これらの結果は、ラフトマーカーを非ラフトマーカーと識別することに成功したため、様々な原形質膜の分画を、サブ細胞性分画スクロース超遠心分離勾配を用いて分離できることを示す。また、ラフトおよびミトコンドリアは、それぞれ、Triton X-100浮選勾配および分画遠心法により単離した。単一蛍光の脂質分子の動きに従って示された、可逆的なラフトの結びつきに関する先行技術がある（Schutz et al., 2000, EMBO J. 19, 892-901）。更に、リガンド結合による活性化の後、上皮増殖因子は、ラフトからバルク原形質膜に移動する（Mineo et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 30636-30643）。幾つかのタンパク質を、他のタンパク質との結びつきによってラフトから締め出すことができるため、タンパク質の脂質ラフトとの結びつきを調整することができる（Field et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9201-9205）。ラフトは、活性化の最終部位を構成しないため、Badのラフトとの結びつきは、Bad不活性化につながる工程に関与し得る。IL-4の欠如は、Badのラフトからの分離を誘導する。この結果は、二つの工程のアポトーシスプロセスを示唆する：第一の、アポトーシスを誘発するBadのラフトからの分離、並びに第二の、アポトーシスプロセスの間の脂質ラフトの組織崩壊。IL-4で刺激されM-β-CDで処理された細胞において、コレステロールリッチなラフトの破壊が、Badの結びつきを妨害しアポトーシスを誘導するという結果により、このアポトーシスプロセスは強く示唆される。IL-4補充培地に胎仔ウシ血清を添加することにより、原形質膜の脂質構成成分は回復し、アポトーシスの進行は妨害される。
【０１０１】
別のサブ細胞性分画へのタンパク質の局在は、アポトーシスを含む複数のシグナリング経路において必須の工程である。これにより、幾つかのシグナリング分子が、ラフトで隔離されることが示された。コレステロールの減損は、脂質ラフトを破壊し、Ｔリンパ球において複数のシグナリング経路の活性を調整する（Kabouridis et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30, 954-963）。これらの結果から、Badが14-3-3タンパク質に結びついてない場合、Badはラフトにおいて隔離され、プロアポトーシスの役割およびパートナーとの結びつきを避けることが強く示唆される。IL-4欠如により誘導されるBadのラフトからの分離は、ミトコンドリアへのトランスロケーションおよびアポトーシスの誘導と関連する。脂質ラフトにおける隔離による分子間相互作用の制限は、IL-2Rのα鎖についても記載されており、IL-2Rのα鎖はIL-2Rのβ鎖およびγ鎖との結びつきを避ける（Marmor, M; and M. Julius, 2001, Blood 98: 1489）。IL-4刺激細胞において、細胞性Badのほとんどが脱リン酸化された状態でラフトに局在するが、弱いサイトゾル分画はセリン136でリン酸化されていることに注目することは興味深い。これらの結果は、プロアポトーシスタンパク質の有用性をコントロールするメカニズムとして、プロアポトーシスタンパク質の脂質ラフトへの隔離をはじめて明らかにしたものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】Badの14-3-3タンパク質への結びつきに対するIL-4の影響。    10×106 のIL-4刺激細胞またはIL-4欠如（deprived）細胞に由来する細胞質抽出物を、抗Bad抗体または抗Raf抗体で免疫沈降させ、抗14-3-3、抗Rafおよび抗Badでブロットした。トータル抽出物（レーンＴ）は、14-3-3およびRaft発現のポジティブコントロールとして使用した。同様の結果が３回の独立した実験で得られた。
【図２Ａ】IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞におけるBadのサブ細胞性局在。    Ａ）IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞に由来するサブ細胞性分画の、抗Bad、抗Lck（ラフト）、CTx-ビオチン（GM1ガングリオシド、ラフト）、抗カスパーゼ3（サイトゾル）、抗カルネキシン（小胞体、ER）および抗シトクロムＣ（ミトコンドリア）イムノブロット分析。分画（１〜４）は、スクロース勾配超遠心分離により調製し、ミトコンドリア、ラフト、ERおよびサイトゾルに対する抗体を用いてその純度について試験した。核の分画は、ブロットで示さない（分画５）。各勾配分画においてウェルあたりロードされたタンパク質は、5×106細胞のタンパク質に相当する。トータル抽出物、30μgタンパク質。同様の結果が３回の独立した実験で得られた。
【図２Ｂ】IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞におけるBadのサブ細胞性局在。    Ｂ）IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞を、Triton X-100で抽出し、Optiprep浮選勾配で分画した。分画を、勾配のトップからボトムまで収集し、ウェスタンブロットにより分析した。最初の不溶性タンパク質（I）および最後の分画の可溶性タンパク質（S）だけを示す。同様の結果が２回の独立した実験で得られた。
【図３Ａ（１）】IL-4刺激細胞におけるBadのラフト局在。    IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞を、記載したようにCTx-FITCおよび抗Lck抗体または抗Bad抗体の何れかで染色し、次いでCy3標識二次抗体で染色し、共焦点顕微鏡で分析した。同様の結果が３回の独立した実験で得られた。単一の共焦点セクションは、緑色（FITC）および赤色（Cy3）の蛍光を示す。
【図３Ａ（２）】IL-4刺激細胞におけるBadのラフト局在。    IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞を、記載したようにCTx-FITCおよび抗Lck抗体または抗Bad抗体の何れかで染色し、次いでCy3標識二次抗体で染色し、共焦点顕微鏡で分析した。同様の結果が３回の独立した実験で得られた。単一の共焦点セクションは、緑色（FITC）および赤色（Cy3）の蛍光を示す。
【図３Ｂ】IL-4刺激細胞におけるBadのラフト局在。    IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞を、抗Bad抗体および抗ミトコンドリア抗体で染色し、次いでFITC-およびCy3-標識二次抗体で染色し、上述のとおり分析した。同様の結果が３回の独立した実験で得られた。
【図４Ａ（１）】メチル-β-シクロデキストリン（M-β-CD）処理は、Badのラフトへの結びつきを停止させ、アポトーシスを誘導する。    Ａ）IL-4刺激細胞を30分間血清飢餓にし、その後、37℃で30分間10 mM M-β-CDで、またはそれなしで処理し、CTx-FITCおよび抗Bad抗体または抗Lck抗体とインキュベートし、次いでCy3標識二次抗体とインキュベートした。その後、共焦点顕微鏡で細胞を分析した。同様の結果が２回の独立した実験で得られた。単一の共焦点セクションは、緑色（FITC）および赤色（Cy3）蛍光を示す。
【図４Ａ（２）】メチル-β-シクロデキストリン（M-β-CD）処理は、Badのラフトへの結びつきを停止させ、アポトーシスを誘導する。    Ａ）IL-4刺激細胞を30分間血清飢餓にし、その後、37℃で30分間10 mM M-β-CDで、またはそれなしで処理し、CTx-FITCおよび抗Bad抗体または抗Lck抗体とインキュベートし、次いでCy3標識二次抗体とインキュベートした。その後、共焦点顕微鏡で細胞を分析した。同様の結果が２回の独立した実験で得られた。単一の共焦点セクションは、緑色（FITC）および赤色（Cy3）蛍光を示す。
【図４Ｂ】メチル-β-シクロデキストリン（M-β-CD）処理は、Badのラフトへの結びつきを停止させ、アポトーシスを誘導する。    Ｂ）IL-4刺激細胞を30分間血清飢餓にし、その後、37℃で30分間10 mM M-β-CDで、またはそれなしで処理し、その後洗浄し、IL-4補充完全培地に移した。様々な時間に、アポトーシスを測定した。蛍光スケールのサブG1領域を使用して、アポトーシスの初期段階にある細胞のパーセンテージを決定した。同様の結果が２回の独立した実験で得られた。白いバー、コントロール細胞；グレーのバー、M-β-CD処理細胞。
【図５】Badのセリンリン酸化に対するIL-4の影響。    Ａ）IL-4刺激細胞またはIL-4欠如細胞に由来する細胞質抽出物を、抗Bad抗体で免疫沈降させ、抗Badセリン136、112および155でブロットした。内部コントロールとして、抗Badでブロットを展開した。セリン112および136リン酸化のポジティブコントロール、IL-2刺激細胞；Badのセリン155リン酸化のポジティブコントロール、BadトランスフェクトCOS細胞（Ｃ）。    Ｂ）図２Ａからのウェスタンブロットを、抗Badセリン136抗体を用いて確認した。対応するタンパク質の分子量を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ（１）】
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【図３Ａ（２）】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ（１）】
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【図４Ａ（２）】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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