(57)【要約】本発明は、例えばHPV16、HPV18、HPV30、HPV31、HPV32、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58等の子宮頸癌に関与するパピローマウイルスのE6及び／又はE7タンパク質に由来するペプチドの混合物、並びに、医薬製品（インビボでの抗HPV CD4+ Tリンパ球の生産を誘導することができ、従って、子宮癌及びその他の癌に対するワクチン接種に有用である免疫原性組成物）、若しくは、HPV特異的Tリンパ球の診断試薬として、特に患者の免疫状態を評価するためのその使用に関する。本発明はまた、HPV10、HPV3、HPV4等の皮膚の良性障害（例えば、疣贅）に関与するパピローマウイルスのE6及び／又はE7タンパク質に由来するペプチドの混合物、並びに、医薬製品としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頸癌又は皮膚の良性障害に関与するHPVのE6タンパク質及び／又はE7タンパク質に由来するペプチドの混合物であって、
該混合物に含まれる各ペプチドが、その頻度が白人個体群において５％を超える少なくとも1つのHLA-DRB1（第1遺伝子）分子、及び、所望により、少なくとも1つのHLA-DRB3、HLA-DRB4又はHLA-DRB5（第2遺伝子）分子に、結合活性<1000nM、好ましくは<800nMで結合するものであり、
該ペプチドの混合物が、その頻度が白人個体群において5%を超え、アレレHLA DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301及びDRB1*1501（DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13及びDR15分子）（第1遺伝子）、並びに、アレレDRB3*0101、DRB4*0101及びDRB5*0101（B3、B4及びB5）（第2遺伝子）の群から選択されるアレレによりエンコードされる少なくとも8つのHLAクラスII分子に結合するものである
ことを特徴とするペプチドの混合物。
【請求項２】
HPVのE6タンパク質に由来するペプチドが、HPV16に由来し：
HPV16のE6タンパク質の
(a) 位置14及び16に間に含まれ、位置14〜34に相当するペプチド及び位置14〜46に相当するペプチド（SEQ ID Nos.8、19）の群から選択されるペプチド、
(b) 位置30〜50に相当するペプチド（SEQ ID No. 10）、
(c) 位置44及び67の間に含まれ、位置45〜67に相当するペプチド及び位置44〜67に相当するペプチド（SEQ ID Nos.26、27）の群から選択されるペプチド、
(d) 位置61〜80に相当するペプチド（SEQ ID No. 11）、
(e) 位置76及び119の間に含まれ、位置76〜95に相当するペプチド、位置91〜110に相当するペプチド及び位置91〜119に相当するペプチド（SEQ ID Nos.12、35、13）の群から選択されるペプチド、
(f) 位置118〜140の間に含まれ、位置118〜140に相当するペプチド及び位置121〜140に相当するペプチド（SEQ ID Nos.40、41）の群から選択されるペプチド、
(g) 位置135〜158に相当するペプチド（SEQ ID No. 44）、並びに、
(h) (a)〜(g)で規定したペプチドと少なくとも60%の相同性若しくは少なくとも80%の類似性、好ましくは少なくとも70%の相同性若しくは少なくとも99%の類似性を有するアミノ酸配列を示す、好ましくは15〜20個のアミノ酸のペプチドであって、該ペプチドが、大きさが同一であり、(a)〜(g)で規定したペプチド若しくはこれらのペプチドと完全に若しくは部分的にオーバーラップするその他のペプチドに含まれるものであり、HPV16のE6タンパク質の位置15〜44、46〜67、80〜108及び118〜139に相当するペプチド（SEQ ID Nos. 53〜56）を除くペプチド
の群から選択される
ことを特徴とする請求項1に記載のペプチドの混合物。
【請求項３】
E7タンパク質に由来するペプチドが、HPV16に由来し、
HPV16の該E7タンパク質の位置1〜20に相当するペプチド、位置7〜27に相当するペプチド、位置65〜87に相当するペプチド及び位置78〜98に相当するペプチド、並びに、
該ペプチドと少なくとも60%の相同性若しくは少なくとも80%の類似性、好ましくは少なくとも70%の相同性若しくは少なくとも99%の類似性を有するアミノ酸配列を示す、好ましくは15〜20個のアミノ酸のペプチドであって、該ペプチドが、大きさが同一であるか、又は、前記ペプチド若しくはこれらのペプチドと完全に若しくは部分的にオーバーラップするその他のペプチドに含まれるものであり、HPV16のE7タンパク質の位置3〜25及び79〜97に相当するペプチド（SEQIDNos.57、58）を除くペプチド
の群から選択される
ことを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチドの混合物。
【請求項４】
以下の混合物の群から選択される
ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか1つに記載のペプチドの混合物：
* 位置14〜34又は位置14〜46に相当するペプチド、位置30〜50に相当するペプチド及び位置44〜67又は位置45〜67に相当するペプチドからなる：HPV16のE6タンパク質に由来するペプチドの混合物；
* 位置61〜80に相当するペプチド、位置76〜95に相当するペプチド及び位置91〜119に相当するペプチドからなる：HPV16のE6タンパク質に由来するペプチドの混合物；
* 位置1〜20に相当するペプチド及び位置7〜27に相当するペプチドからなる：HPV16のE7タンパク質に由来するペプチドの混合物；
* 位置65〜87に相当するペプチド及び位置78〜98に相当するペプチドからなる：HPV16のE7タンパク質に由来するペプチドの混合物；
* 並びに、HPV16のE6タンパク質に由来するペプチドの混合物の1つ、及び、HPV16のE7タンパク質に由来する混合物の1つからなる混合物。
【請求項５】
少なくとも１つの医薬上受容な媒体、及び、所望により少なくとも１つのアジュバントと組み合わせた請求項1〜4のいずれか1つに記載のHPVのE6タンパク質に由来するペプチドの混合物及び／又はHPVのE7タンパク質に由来するペプチドの混合物からなる
ことを特徴とする免疫原性抗HPV16組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、リポペプチドの形態であるか、組換えウイルス又は遺伝子治療のためのウイルスベクターに組み込まれているか、タンパク質に包含されているか、化学的に修飾されているかのいずれかである
ことを特徴とする請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドの混合物が：
−1つ以上のCD8+エピトープ、より特異的にはHPVタンパク質、特にHPV16タンパク質に由来するCD8+エピトープを含む1つ以上のペプチド若しくはリポペプチド、及び／又は、
−破傷風毒素TTペプチド(位置830〜846)、インフルエンザヘマグルチニンHAペプチド（位置307〜319）、PADRE、プラスモディウムファルシパルムLSA3ペプチド等の多価CD4+エピトープからなるその他のペプチド、及び／又は、
−1つ以上のBエピトープ、より特異的にはHPV16タンパク質に由来するBエピトープを含む1つ以上のペプチド若しくはリポペプチド
と組み合わされる
ことを特徴とする請求項5又は請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
請求項1〜4で規定したペプチドをエンコードする配列を好適に含む
ことを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項９】
請求項5〜8のいずれか1つに記載の免疫原性組成物を含む
ことを特徴とするワクチン。
【請求項１０】
HPV、特にHPV16のE6タンパク質及び／又はHPV、特にHPV16のE7タンパク質に由来するペプチドであって：
−請求項1〜6で規定したように、白人個体群において主要である少なくとも1つのHLA II （HLA−DR）分子について<1000nM、好ましくは<800nMの結合活性を有することができ、該ペプチドに特異的なCD4+ Tリンパ球により認識されることができ、該ペプチドに特異的なCD4+ Tリンパ球を誘導することができるCD4+エピトープを含み、
−HPV16のE6タンパク質の以下のペプチド：ペプチドE6（14〜34若しくは14〜45）、ペプチドE6（30〜50）、ペプチドE6（61〜80）、ペプチドE6（76〜95）、ペプチドE6（91〜119）及びペプチドE6（20〜34、24〜38、28〜42、31〜45、36〜50、42〜56、50〜64、55〜69、76〜90、78〜92、81〜95、84〜98、89〜103、93〜107、97〜111、101〜115、124〜138、130〜144）、又は、HPV16のE7タンパク質の以下のペプチド：ペプチドE7（1〜20）ペプチドE7（7〜27）、ペプチドE7（60〜74）ペプチドE7（65〜87）、ペプチドE7（78〜98）及びペプチドE7（6〜20、9〜23、13〜27、65〜79、67〜81、72〜86、77〜91、84〜98）にそれぞれ相当する配列SEQ ID Nos.8〜18、21〜25、28〜34、36〜39、42〜43及び45〜52の断片の群から選択される
ことを特徴とするペプチド。
【請求項１１】
請求項1〜4で規定したペプチド又は請求項10に記載のペプチドの群から選択され、
該ペプチドが、多量体の複合体の形態にあり、任意にラベルされているか複合化されている
ことを特徴とする診断試薬。
【請求項１２】
ELISPOTアッセイ、T細胞増殖アッセイ若しくは多量体の複合体を用いるアッセイを用いて請求項1〜4で規定したE6及び／又はE7ペプチドに特異的なCD4+ T細胞の存在を検出する段階を含む
ことを特徴とする個体の免疫状態の評価方法。
【請求項１３】
少なくとも以下の段階を含む
ことを特徴とするHPV16特異的Tリンパ球の選別方法：
−選別されることとなる細胞の懸濁物をインキュベーションするか、又は、請求項1〜4及び10で規定したE6及び／若しくはE7ペプチド／溶解性のビオチン化HLA II分子で構成される多量体の複合体から形成され、フルオロクロムでラベルされたストレプトアビジンに結合された１つ以上の四量体とともに1〜3時間接触させる、
−フローサイトメトリーにより分析する、並びに、
−四量体でラベルされた細胞を選別する。
【請求項１４】
h)で規定した前記ペプチドが、HPV16のE6タンパク質の位置20〜34、24〜38、28〜42、31〜45、36〜50、42〜56、50〜64、55〜69、76〜90、78〜92、81〜95、84〜98、89〜103、93〜107、97〜111、101〜115、124〜138及び130〜144（SEQID Nos.21〜25、28〜34、36〜39、42〜43）にそれぞれ相当するペプチドの群から選択される
ことを特徴とする請求項2に記載のペプチドの混合物。
【請求項１５】
前記ペプチドが、HPV16のE7タンパク質の位置6〜20、9〜23、13〜27、65〜79、67〜81、72〜86、77〜91及び84〜98にそれぞれ相当するペプチド（SEQID Nos.45〜52）の群から選択される
ことを特徴とする請求項3に記載のペプチドの混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、HPV16（パピローマウイルス遺伝子型16）、HPV18、HPV30、HPV31、HPV32、HPV33、HPV34、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58等の子宮頸癌に関与するパピローマウイルスのE6及び／又はE7タンパク質に由来するペプチドの混合物、並びに、医薬製品（インビボでの抗HPV CD4+ Tリンパ球の生産を誘導することができ、従って、子宮頸癌及びその他の癌に対する免疫感作に有用である免疫原性組成物）、若しくは、HPVに特異的なTリンパ球の診断のため、特に患者の免疫状態を評価するための試薬としてのその使用に関するものである。
本発明はまた、HPV10、HPV3、HPV4等の皮膚の良性障害（例えば、疣贅）に関与するパピローマウイルスのE6及び／又はE7タンパク質に由来するペプチドの混合物、並びに、医薬製品としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（HPV）は、皮膚及び粘膜の良性障害を誘発するが、悪性障害の誘発にも関与する。これらは主に、世界中で女性の癌による死因の2番目に多い原因を構成する子宮頸癌に関与する。
これらはまた、陰茎、肛門及び口腔咽頭のある種の癌の発達にも寄与する。これらのウイルスのDNAは、実際、患者からの生検におけるPCRにより非常によく検出される（1）。陰茎癌の20〜50%、及び、肛門癌の70%が、HPV DNAの存在を示す。
【０００３】
パピローマウイルスは、実際、100を超える異なる遺伝子型があり、それぞれ独自の病原性を有する。HPVへの感染と子宮頸癌との関連は、実際、遺伝子型によって異なる。HPV6、HPV11ウイルス等の低い又はゼロの悪性転換危険性種は、HPV16、HPV18ウイルス等の高危険性種と区別される。どの国においても、HPV16は子宮頸癌の40〜60%に見られるが、HPV18は、事例の10〜20%に存在する。子宮頸癌に苦しむ他の患者の多くは、HPV31、HPV33又はHPV45に感染している。
患者の1%については、パピローマウイルスのDNAは検出されない。
【０００４】
HPV DNAによるケラチノサイトの不死化（immortalization）の実験によると、２つの遺伝子（E6及びE7）が主に細胞の形質転換の原因であることが示された。これらの実験では、高危険性ウイルス種に由来するDNAは細胞を形質転換することができるが、低危険性種はこれを行うことができない。E6タンパク質は、腫瘍抑制活性を有するp53に結合し、その分解を誘発する。E7タンパク質は、腫瘍抑制活性を有するpRbタンパク質に結合する。これらの活性は、高危険性種のE6及びE7タンパク質のほうが低危険性種のものより高い。加えて、pRb及びp53遺伝子は変異を起こし、感染したラインではそうではないが、HPVに感染していない子宮頸細胞ラインにおいて不活性である。これらすべての観察結果は、E6及びE7タンパク質がHPV感染並びに癌性状態の誘導について重要な成分であることを強く示唆する。
【０００５】
HPV感染に特異的な抗ウイルス治療がない場合、抗HPVワクチンは、これらのウイルスにより誘導される癌の種と戦うための見込みのある取り組みの一つを構築する。
しかしながら、弱毒化した、又は、不活性化した種のウイルスの使用は、第一に、ウイルスの生産手段が現行で欠失していることから、第二に、形質転換の遺伝子がそのゲノムに存在していることから、適用することが困難である。
よって、ペプチド又はサブユニットに基づくアプローチは、非常に有用であると思われる。特に、適切に選択されたペプチドは、細胞毒性Tリンパ球（CTL）及び形質転換細胞に特異的に向けられたTh1タイプのヘルパーTリンパ球の両方を漸増することができることが知られている。
この関係において、E6及びE7タンパク質は、これらが細胞の癌化に直接寄与することから、好ましい標的を構築し、感染後すぐに発現して、形質転換細胞中に存在し続ける。
【０００６】
従って、これら２つのタンパク質に由来するペプチドを用いる種々の免疫感作のストラテジーが推奨されている。
これらのストラテジーは、CD4+ Tリンパ球が、特にCTLの免疫応答を確立することに主要な役割を担うという事実に基づく。最近の研究では、これらが、CD40分子を介して、特異的CTLの誘導に必要な樹状抗原提示細胞の活性化に関与していることを示している（J.P.Ridgeら、Nature、1998、393、474；S.P.Schoenbergerら、Nature、1998、393、480；S,R. Bennettら、Nature、1998、393、478；R.E M. Toesら、Semin. Immunol.、1998、10、443）。
【０００７】
CD4+ Tリンパ球の活性化は、抗原提示細胞（APC）により行われるHLA II分子によるウイルスペプチドの提示を介して起こる。これらのペプチドは、Tエピトープと呼ばれ、APCによるウイルス抗原のタンパク質分解により得られる。これらの長さは種々異なって、通常13〜25アミノ酸であり、これらがHLA II分子に結合することができるようにする配列を有する。
【０００８】
今回、ペプチドであるTエピトープが、天然の抗原と同じ程度に、それに特異的なCD4+ Tリンパ球をインビトロで誘導したり、インビボでそれらを漸増したりできることが確立される。
【０００９】
よって、Tエピトープは、CD4+応答を誘導するのに充分である。しかしながら、これらのペプチドの使用を制限する主な問題のうちの一つは、抗原提示細胞（APC）上に発現するヘテロダイマーであり、上記抗原のTエピトープをCD4+ Tリンパ球に提示するHLA II分子の多形性のために、これらの配列が個体ごとに異なることである。これらの分子は、抗原あたり多くのペプチドをT細胞に提示することを可能にする、非常に異なる配列を有するペプチドの考えられるレパートリー（repertoire）に結合することができる。
【００１０】
個体あたり4つの異なるタイプのHLA II分子が存在する：2つのHLA-DR、1つのHLA-DQ及び1つのHLA-DP；そのβ鎖がDRB1遺伝子（第1遺伝子）によりエンコードされるHLA-DR分子は、もっとも多く発現する。現在、以下の表1にまとめられているように、種々の抗原やタイプを規定する、DBR1について200を超える異なるアレレが列挙されている。
【００１１】
【表１】
2005505503.tif 000002
【００１２】
各アレレは、独特の結合特性を有する；HLA II分子の広い特異性と、多くのイソ型及び多形性の存在は、各個体が、抗原内において、その性質がそれを特徴づけるHLA II分子に依存するペプチドの集合を認識することを意味する。多数のHLA IIアレレが存在するので、各アレレに特異的な多数のTエピトープが、与えられた抗原に対して存在する。
【００１３】
加えて、与えられた個体群におけるアレレの分布は、均質ではない：例えば、主に白人個体群に相当するフランス人の個体群では、DRB1遺伝子座の7つのアレレだけが5%を超える；これらは、アレレ：DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301及びDRB1*1501であり、個体群の64%に相当する（4）。これらの同じアレレはまた、他の欧州人個体群において大多数であり、その頻度は、53%（スペイン）〜82%（デンマーク）の範囲であり、北アメリカでもそうである（55〜58%）。
【００１４】
β鎖がDRB1遺伝子によりエンコードされていないHLA-DR分子であるHLA-DRB3、-DRB4及び-DRB5分子（第2遺伝子）もまた、種々の白人個体群において、高いアレリック頻度で存在する： DRB3*0101（B3）について9.2%、DRB4*0101 （B4）について28.4%、及び、DRB5*0101（B5）について7.9%である。よって、これらは、これら自身により白人個体群におけるアレリック頻度の45%をカバーする。
【００１５】
ペプチド配列中に存在し、これら全てのアレレに結合するペプチドは、白人個体群の大多数のTエピトープを含む。
ヘルパーCD4+ Tエピトープを規定するために最もよく使用される手段の一つは、ペプチドが、考慮される抗原と接触している個体の単核細胞の増殖を起こす能力を測定することである。
【００１６】
いくつかの数の文献が、ワクチンの製造に使用できる、HPV16のE6又はE7タンパク質に由来するエピトープの選択を提案している：
−国際出願WO 00/14244（Connaught Laboratories Ltd）は、発癌性形質転換の危険性を生じることなく特異的免疫性を得るためには、E6及びE7の両方に由来するTエピトープのいくつかがともに連結されている構築物（ベクター）の使用を推奨している。より正確には、抗原は、タンパク質全体又はTエピトープの形態であることが可能である。例えば、E6タンパク質のTエピトープは、上記タンパク質の位置29〜38に相当するエピトープであることが好ましく、E7タンパク質の好ましいエピトープは、それぞれ、位置：11〜20、49〜57、82〜90、86〜93に相当するものであり；Rbタンパク質結合部位の欠失により解毒化したE7タンパク質の使用もまた構想されている。
【００１７】
−出願EP 0 451 550（Behringwerke）は、血清活性（seroactive）エピトープ、特にHPV16のE6タンパク質又はE7タンパク質に由来するエピトープについて記載し、１つ以上の上記エピトープを含有するワクチンについても記載している。
−特許EP 0 561 885 （University of Queensland及びCSL Ltd）は、他のエピトープよりも非常に大きい免疫応答を誘導すると考えられる、E7タンパク質のDRAHYNI配列（位置48〜54）を含む、HPV16パピローマウイルスに対するサブユニットワクチンについて記載している。
【００１８】
−特許出願0 386 734（Behringwerke）は、位置12〜27及び36〜52にそれぞれ相当する、HPV16のE7タンパク質における２つの主な免疫原性領域、並びに、検出のための試薬へのその使用について記載している。
−Luxtonらは、HPVによる性器の感染のコントロールにおける細胞免疫性の重要性を強調し、結果として、HPV感染への増殖性T応答を研究している；HPV16のE6及びE7タンパク質に由来するペプチドによるマウスの免疫化がHPV16形質転換癌性細胞で構成される毒性の攻撃に対して防御する範囲においては、彼らは、特に、HPV16のE7タンパク質の有利性を示しており、このタンパク質におけるTエピトープを同定しようとしている。これを行うために、E7タンパク質の全配列に相当するペプチドの一群を得るために、その配列が5アミノ酸オーバーラップする15アミノ酸の合成ペプチドを作成している。彼らは、増殖性T応答が患者の状態に依存し、無症状の個体においては、N-及びC-末端領域に位置するペプチド（ペプチド1〜34及び70〜98）が免疫応答を誘導するが、子宮頸部形成異常を示す患者ではそうではないことを示している。彼らは主に、HPV16遺伝子型のE7ペプチド80〜94が、試験した7のうち6個体において細胞の増殖を引き起こすことを示している（J. Gen. Virol.、1996、77、1585）（以下の表2参照）。
【００１９】
−G. Strangらは、HPV16の4つのTエピトープを規定しており、そのうちの一つはE6に存在する（J. Gen. Virol.、1990、71、423）。
−A. Altmannらは、E7特異的Tリンパ球ラインを2人の患者から単離し、確認されたペプチドの特性決定を行った（Eur. J. Cancer、1992、28、326）。研究は、E7タンパク質の全配列に相当するペプチドの一群を得るために、その配列が10アミノ酸オーバーラップする14アミノ酸の合成ペプチドを用いて行われた。
【００２０】
−T. Tsukuiらは、種々の段階の病変を有する140人のHPV16+患者において、血中の細胞によるIL2の分泌を研究している（Cancer Res.、1996、56、3967）。
−M.Nakagawaらは主に、HPV16遺伝子型のE6のペプチド24〜45が試験した63のうち13個体の細胞において増殖を引き起こすことを観察している（Immunol.、1996、3、205）。彼らはまた、E7タンパク質を用いて観察される応答について研究し、このタンパク質を用いては、ほとんど応答が観察されないことを示している。
【００２１】
−A.S.Kadishらは、E6及びE7ペプチドに対するHPV16+患者の細胞の増殖応答について研究している（Cancer Inst.、1997、89、1285）。
−T.D.deGruijlらは、HPVで感染した患者からの細胞の増殖について研究し、HPV16ウイルスのE7タンパク質の配列をカバーするペプチドのうち、ペプチド67〜98が大多数の患者の細胞を誘導することを示している（Cancer Res.、1998、58、1700）。
【００２２】
患者において、Tエピトープとして同定された全てのE6及びE7配列を、表2で説明する。
【００２３】
【表２】
2005505503.tif 000003
【００２４】
【表２−１】
2005505503.tif 000004
【００２５】
研究の間で顕著な違いが観察され、このアプローチが比較的不正確であることを反映している。実際、観察される応答の多様性の観点から、個体群全体のTエピトープ配列を規定することは困難である。これらの配列は、これらの研究に含まれた患者にのみ適合する。応答におけるこれらの違いは、まず、試料の代表性により説明することができるが、それは評価されていない。特に、患者がそのHLA分子で分類されない研究においては、種々のアレレが一般的な個体群中の頻度に従って表されているかについて、だれもわからない。多くの患者に共通の、特定のペプチドに対する応答は、従って、サンプリングの偏りによるものであって、全ての患者により認識されることとなるペプチドの有効な能力によるものではないであろう。さらに、HPVによる感染の場合、HPVのE7タンパク質を形質転換したマウスモデルにおいて示されている（T.Doanら、J. Virol.、1999、73、6166）ように、抗原の持続は、T細胞により最もよく認識される、ウイルスのTエピトープに対する免疫寛容の状態を誘導する。この点で、応答は、感染した患者に比べてウイルスを除去した患者のほうがしばしば弱いことが注目されるであろう（T.Tsukuiら、1996、上記）。このような関係において、より少ない刺激決定因子では維持されるが、ウイルスの除去においては継続しないであろう最も好適なエピトープは、免疫応答から消滅しているであろう。
【００２６】
これらの増殖アッセイは、従って、全個体群について適切な配列を規定するには不充分である。
よって、ヘルパーTリンパ球が認識するペプチドは、HLA II分子の多形性のために規定することが困難であることが種々の研究から明らかである。
【００２７】
加えて、現在までのところ、女性において抗HPV免疫性を誘導するための免疫感作試験では、臨床上満足な結果が得られていない。子宮頸癌を患う8人の患者を、E6及びE7タンパク質をエンコードする遺伝子で組換えを行ったワクシニアウイルスの一回の用量で免疫感作した（L.K.Borysiewiczら、Lancet.、1996、347、1523）。細胞毒性応答は一過的にのみ、一人の患者においてだけ検出された。
【００２８】
ペプチドについて得られた結果もまた非常に決定的ではなく、臨床上の効率性はゼロである。M.E.Ressingら（J. Immunother.、2000、23、255）及びW.J.Van Drielら（Eur. J. Cancer、1999、35、946）は、2つのHPVペプチドとウイルスに特異的ではなく一般的なヘルパーペプチドとの組合せを用いている。細胞毒性応答は誘導されなかった。応答の欠失は、おそらく、構築物がHPV特異的ヘルパーCD4+ Tリンパ球とCD8+リンパ球との両方の誘導を誘発することができないことによるものであろう。
【００２９】
結果として、現在までに提案されている全てのペプチドはTエピトープに相当し、特定の個体にのみ特異的である；実際、Tエピトープの個体間の多様性が存在し、HPV16に対する大量免疫化に適した分子の選択を困難にしている；結果として、上述したペプチドは、抗HPV16 CD4+ Tリンパ球を誘導し、防御されることとなる個体には関係なく防御免疫応答を起こすことができる免疫原性及び免疫化組成物の調製には適さないが、それは、これらが、処理される個体の全てにおいては防御CD4+ T応答を誘導することができないからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
この理由から、発明者らは、ウイルスの成分に対する特異的増殖応答を効果的に誘導するために、欧州及び北アメリカの白人の個体の大多数において、免疫原性組成物に入れることができ、抗HPV CD4+ Tリンパ球を誘導することができるペプチドの一群を提供することをねらいとした。
【００３１】
このような一群は、多数の個体において有効であるという特性を有する一方、従来技術のペプチドはある個体において活性であり、他のほとんどの個体では不活性であるがこれは、後者は同一の決定因子を介してはHPV16のE6及びE7タンパク質を認識していないからである。
【００３２】
これを行うために、発明者らは、白人の個体群の中で優占であるHLA II分子に関して制限される上述のHPVのうちの一つ、特にHPV16のE6及びE7タンパク質に由来するペプチドを選択し、さらに、組み合わせると、選択されたペプチドが多数の個体において免疫原性の防御応答を効果的に誘導することを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
従って、本発明の主題は、子宮頸癌又は皮膚の良性障害に関与するHPVのE6タンパク質及び／又はE7タンパク質に由来するペプチドの混合物であって、上記混合物に含まれる各ペプチドが、その頻度が白人個体群において5%を超える少なくとも1つのHLA-DRB1（第1遺伝子）分子、及び、所望により、少なくとも1つのHLA-DRB3、HLA-DRB4又はHLA-DRB5（第2遺伝子）分子に、結合活性<1000 nM、好ましくは<800 nMで結合するものであり、上記ペプチドの混合物は、その頻度が白人個体群において5%を超え、アレレHLA DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301及びDRB1*1501（DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13及びDR15分子）（第1遺伝子）、並びに、アレレDRB3*0101、DRB4*0101及びDRB5*0101（B3、B4及びB5）（第2遺伝子）の群から選択されるアレレによりエンコードされる少なくとも8つのHLAクラスII分子に結合するものであることを特徴とするペプチドの混合物である。
【００３４】
このようなペプチドの混合物は、驚くべきことに、防御されることとなる全てのHPVが関与する白人個体群の大多数において、増殖性CD4+ T応答（CD4+ Tリンパ球の誘導）と、CTL応答の誘導を得ることを可能にする；従って、このような混合物は、ワクチンに用い得る「普遍的な」免疫原性組成物への第一段階を構成すると考えられるであろう。
【００３５】
上記混合物の好適な態様によると、HPVのE6タンパク質に由来するペプチドが、HPV16に由来し：
HPV16のE6タンパク質の
(a) 位置14及び16の間に含まれ、位置14〜34に相当するペプチド及び位置14〜46に相当するペプチド（SEQ ID Nos.8、19）の群から選択されるペプチド、
(b) 位置30〜50に相当するペプチド（SEQ ID No. 10）、
(c) 位置44及び67の間に含まれ、位置45〜67に相当するペプチド及び位置44〜67に相当するペプチド（SEQ ID Nos.26、27）の群から選択されるペプチド、
(d) 位置61〜80に相当するペプチド（SEQ ID No. 11）、
(e) 位置76及び119の間に含まれ、位置76〜95に相当するペプチド、位置91〜110に相当するペプチド及び位置91〜119に相当するペプチド（SEQ ID Nos.12、35、13）の群から選択されるペプチド、
(f) 位置118〜140の間に含まれ、位置118〜140に相当するペプチド及び位置121〜140に相当するペプチド（SEQ ID Nos.40、41）の群から選択されるペプチド、
(g) 位置135〜158に相当するペプチド（SEQ ID No. 44）、並びに、
(h) (a)〜(g)で規定したペプチドと少なくとも60%の相同性若しくは少なくとも80%の類似性、好ましくは少なくとも70%の相同性若しくは少なくとも99%の類似性を有するアミノ酸配列を示す、好ましくは15〜20個のアミノ酸のペプチドであって、上記ペプチドが、大きさが同一であり、(a)〜(g)で規定されたペプチド若しくはこれらのペプチドと完全に若しくは部分的にオーバーラップするその他のペプチドに含まれるものであり、HPV16のE6タンパク質の位置15〜44、46〜67、80〜108及び118〜139に相当するペプチド（SEQ ID Nos. 53〜56）を除くペプチド
の群から選択される。
【００３６】
参考配列についての配列の相同性は、互いに最大に一致するように2つの配列を並べた場合、同一であるアミノ酸残基の割合の関数として評価される。
Y個のアミノ酸を含む参考配列と少なくともX%の相同性を有するアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明において、参考配列のY個のアミノ酸あたりY−X'個までの変更を含むことができる配列のペプチドとして定義され、100個のアミノ酸の配列について再公式化される。
【００３７】
参考配列についての配列の類似性は、互いに最大に一致するように2つの配列を並べた場合、同一であるか又は同類置換により異なるアミノ酸残基の割合の関数として評価される。本発明の目的において、「同類置換」という語は、同様の化学的特性（大きさ、電荷又は極性）を示す他のアミノ酸への置換であって、ペプチドの機能的特性を、通常、変更しないものを意味することを意図する。
好適には、上記混合物のHPVのE6タンパク質に由来するペプチドは、(h)で規定したように：
−位置14〜34に相当するか又はこのペプチドとオーバーラップするペプチドに含まれ、位置20〜34、24〜38及び28〜42にそれぞれ相当するペプチド（SEQ ID Nos. 21〜23）から選択される15個のアミノ酸のペプチド、
−位置30〜50に相当するか又はこのペプチドとオーバーラップするペプチドに含まれ、位置31〜45及び36〜50にそれぞれ相当するペプチド（SEQ ID Nos. 24〜25）から選択される15個のアミノ酸のペプチド；
−位置45〜67に相当するか又はこのペプチドとオーバーラップするペプチドに含まれ、位置42〜56、50〜64及び55〜69にそれぞれ相当するペプチド（SEQ ID Nos. 28〜30）から選択される15個のアミノ酸のペプチド；
−位置76〜95に相当するか又はこのペプチドとオーバーラップするペプチドに含まれ、位置76〜90、78〜92、81〜95及び84〜98にそれぞれ相当するペプチド（SEQ ID Nos. 31〜34）から選択される15〜17個のアミノ酸のペプチド；
−位置91〜110に相当するか又はこのペプチドとオーバーラップするペプチドに含まれ、位置89〜103、93〜107、97〜111及び101〜115にそれぞれ相当するペプチド（SEQ ID Nos. 36〜39）から選択される15個のアミノ酸のペプチド；
−位置121〜140に相当するか又はこのペプチドとオーバーラップするペプチドに含まれ、位置124〜138及び130〜144にそれぞれ相当するペプチド（SEQ ID Nos. 42〜43）から選択される15個のアミノ酸のペプチド
の群から選択される。
【００３８】
上記混合物の他の好適な態様によると、E7タンパク質に由来するペプチドが、HPV16に由来し、HPV16の上記E7タンパク質の位置1〜20に相当するペプチド、位置7〜27に相当するペプチド、位置65〜87に相当するペプチド及び位置78〜98に相当するペプチド（SEQ ID Nos. 14、15、17、18）、並びに、上記で規定したペプチドと少なくとも60%の相同性若しくは少なくとも80%の類似性、好ましくは少なくとも70%の相同性若しくは少なくとも99%の類似性を有するアミノ酸配列を示す、好ましくは15〜20個のアミノ酸のペプチドであって、上記ペプチドが、大きさが同一であるか、又は、上記で規定したペプチド若しくはこれらのペプチドとオーバーラップする他のペプチドに含まれるものであり、HPV16のE7タンパク質の位置3〜25及び79〜97に相当するペプチド（SEQ ID Nos.57、58）を除くペプチドの群から選択される。
【００３９】
好適には、上記で規定したペプチド（SEQ ID Nos.14、15、17、18）又はこれらのペプチドとオーバーラップする他のペプチドに含まれる、上記混合物のE7タンパク質に由来するペプチドは、HPV16のE7タンパク質の位置6〜20、9〜23、13〜27、65〜79、67〜81、72〜86、77〜91及び84〜98にそれぞれ相当するペプチド（SEQ ID Nos.45〜52）の群から選択される。
【００４０】
特に好適には、本発明の上記ペプチドの混合物は、以下の混合物の群から選択される：
* 位置14〜34又は位置14〜46に相当するペプチド、位置30〜50に相当するペプチド及び位置44〜67又は位置45〜67に相当するペプチドからなる：HPV16のE6タンパク質に由来するペプチドの混合物；
* 位置61〜80に相当するペプチド、位置76〜95に相当するペプチド及び位置91〜119に相当するペプチドからなる：HPV16のE6タンパク質に由来するペプチドの混合物；
* 位置1〜20に相当するペプチド及び位置7〜27に相当するペプチドからなる：HPV16のE7タンパク質に由来するペプチドの混合物；
* 位置65〜87に相当するペプチド及び位置78〜98に相当するペプチドからなる：HPV16のE7タンパク質に由来するペプチドの混合物；
* 並びに、上記で規定したように、HPV16のE6タンパク質に由来するペプチドの混合物のうちの1つ、及び、HPV16のE7タンパク質に由来する混合物のうちの1つからなる混合物。
【００４１】
特に：
−ペプチドE6（14〜34）は、DRB1*0301、0701及び1501分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE6（30〜50）は、DRB1*0101、0301、0401、1101、1301及び1501、DRB5*0101並びにDRB4*0101分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE6（61〜80）は、DRB1*0301、1101及び1501、DRB3*0101並びにDRB5*0101分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE6（76〜95）は、DRB1*0101、1101、1301及び1501、DRB5*0101並びにDRB4*0101分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE6（91〜119）は、DRB1*0101、0301、0401、0701及び1501並びにDRB5*0101分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE7（1〜20）は、DRB1*0101、0301、0401、1101、1301及び1501、DRB5*0101並びにDRB4*0101分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE7（7〜27）は、DRB1*0101、0301、0401、1101及び1301、DRB3*0101、DRB5*0101並びにDRB4*0101分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE7（60〜74）は、DRB1*0701及びDRB5*0101分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE7（65〜87）は、DRB1*0101、0301、0401、0701及び1501並びにDRB3*0101分子と良好な親和性で結合し、
−ペプチドE7（78〜98）は、DRB1*0101、0701、1101及び1501、DRB5*0101並びにDRB4*0101分子と良好な親和性で結合する。
【００４２】
これらの種々のペプチドの配列を、以下の表3及び4に示す：
【００４３】
【表３】
2005505503.tif 000005
【００４４】
【表４】
2005505503.tif 000006
【００４５】
その他のペプチドは結合活性を示すが、限られた数の分子に対してである。
【００４６】
本発明の主題はまた、少なくとも１つの医薬上受容な媒体、及び、所望により少なくとも1つのアジュバントと組み合わせた、上記で規定したような、HPVのE6タンパク質に由来するペプチドの混合物及び／又はHPVのE7タンパク質に由来するペプチドの混合物からなることを特徴とする免疫原性抗HPV組成物である。
【００４７】
用いるアジュバントは、水酸化アルミナ、スクアレン等のワクチン組成物に従来用いられるアジュバントである。
上記免疫原性組成物の好ましい態様によると、上記ペプチドが、リポペプチドの形態であるか、組換えウイルス又は遺伝子治療のためのウイルスベクター（アデノウイルス等）に組み込まれているか、タンパク質、特に組換えタンパク質（Leclerc C.ら、Int. Rev. Immunol.、1994、11、2、123〜132；Janssen R.ら、Int. Rev. Immunol.、1994、11、2、113〜121）に包含されているか、化学的に修飾されているかのいずれかである。後者の場合、それらは、例えば、Dアミノ酸、擬ペプチド結合、C又はN末端の修飾等の不自然な修飾を含む。
【００４８】
リポペプチドの脂質部分は、特に、上記ペプチドのα-アミノ基又はペプチド部分のアミノ酸の側鎖の反応性基に脂質単位を添加することにより得られる；1つ以上の、所望により分岐した若しくは不飽和のC4〜C20脂肪酸由来鎖（パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、2-アミノヘキサデカン酸、ピメローチド（pimelautide）、トリメトーキシド（trimetauxide））、又は、ステロイドの派生物を含んでもよい。このようなリポペプチドの調製方法は、特に国際出願WO 99/40113及びWO 99/51630に記載されている。好ましい脂質部分は、特に、Nα-アセチル-リシンNε（パルミトイル）基により表され、また、Ac-K (Pam)とも呼ばれる。上記免疫原性組成物の他の好適な態様によると、上記ペプチドの混合物は：
−１つ以上のCD8+エピトープ（細胞毒性Tリンパ球により特異的に認識され、HLA I分子により提示される）、より特異的にはHPVタンパク質、特にHPV16タンパク質に由来するCD8+エピトープを含む1つ以上のペプチド若しくはリポペプチド（Ressingら、van Drielら）、及び／又は、
−破傷風毒素TTペプチド(位置830〜846)、インフルエンザ（Influenza）ヘマグルチニンHAペプチド（位置307〜319）、PADRE（Pan DR エピトープ、Alexandre J.ら、Immunity、1994、1、9、751〜761）、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）LSA3ペプチド等の多価CD4+エピトープからなるその他のペプチド、及び／又は、
−これらのエピトープに対する抗体により特異的に認識される1つ以上のBエピトープ、より特異的にはHPV16タンパク質に由来するBエピトープ（Tindleら）を含む１つ以上のペプチド若しくはリポペプチド
と組み合わされる。
【００４９】
混合物に含まれる、上記で規定したような本発明のE6及びE7タンパク質は、
−関心のHLA-DR分子、即ち、所定の個体群の5%を超えるものを含むものであり、特にHLA DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13及びDR15分子を精製し、
−種々の濃度のE6タンパク質又はE7タンパク質の配列を完全にカバーするオーバーラッピング断片と、試薬R1若しくはビオチン等の非放射性ラベルと結合させた、上記ペプチドとは異なる配列であるペプチド断片で構成されるトレーサーと、精製されたHLA-DR分子とをインキュベーションし；試薬R1若しくはトレーサーは、関心のHLA-DR分子の１つに関して親和性を示すような方法で、濃度< 200 nMの濃度で用いられるようにして選択され、
−得られた複合物を、全てのHLA-DRに対して特異的な抗体でプレコートしたELISAタイプのプレート上に移動し、
−プレートの底に付着したHLA-DR分子／試薬R1複合物を、ストレプトアビジン−ホスファターゼ等の適切な結合体と蛍光基質とにより明らかにし、
−異なるエピトープ、即ち、E6タンパク質又はE7タンパク質とHLA-DR分子との間の相互作用の種々の範囲の最もよい標本となるものを含むペプチドを選択し、
−試薬R1の結合の50%を阻害するこれらのペプチドの濃度（IC50）に相当する結合活性が< 1 000 nM、好ましくは< 800 nMを示すものに関するアレレの頻度の機能として最も適切なペプチドを選択する
ことからなるHLA-DR／ペプチド結合アッセイを用いて好適に選択される。
【００５０】
これらのアッセイは、第１遺伝子若しくは第２遺伝子の各アレレと、それに結合しうる、又は、逆に、それに結合しない断片の配列とを明白に関連付けることを可能にする。
このアプローチは、そのHLA分子が不明であっても、最大数の異なるHLA-DR分子に結合し、よって、患者の大多数にとって好適に防御的であろうペプチドを含む免疫原性組成物を規定することを可能にする。
【００５１】
このアプローチはまた、CD4+ Tリンパ球を誘導する能力を基にペプチドを選択して探すアプローチ（増殖アッセイ）に比べて、HPV16に関してより特異的なペプチドを選択することを可能にする点で利点を有する。
インキュベーションの条件は、各HLA-DR分子に特異的である（インキュベーション時間、pH、試薬R1、HLA-DR又はペプチドの濃度）。
【００５２】
試薬R1は、以下の配列の群から選択される：
・アレレ DRB1*0101、DRB1*0401、DRB1*1101に特異的なPKYVKQNTLKLAT （HA 306〜318）（SEQ ID No.1）、
・アレレDRB1*1501に特異的なEAEQLRAYLDGTGVE（A3 152〜166）（SEQ ID No.2）、
・アレレDRB1*0301に特異的なAKTIAYDEEARGLE (MT 2〜16) (SEQ ID No.3) 、
・アレレDRB1*0701に特異的なAAYAAAKAAALAA（YKL）（SEQ ID No.4）、
・アレレDRB1*1301に特異的なTERVRLVTRHIYNREE（B1 21〜36）（SEQ ID No.5）、
・アレレDRB3*0101に特異的なESWGAVWRIDTPDKLTGPFT（LOL 191〜210）（SEQ ID No.6）、及び、
・アレレDRB4*0101に特異的なAGDLLAIETDKATI（E2/E168）（SEQ ID No.7）。
その他の試薬R1、特に、Southwoodら（24）に記載されたものを用いることができる。
【００５３】
変形として、上記免疫原性組成物は、上記で規定したペプチドをエンコードする配列を好適に含む。
実際、免疫化のための裸のDNAの使用は、効果的なワクチンのアプローチを構成する：それは、ワクチンされる宿主生物に、タンパク質抗原をエンコードする裸のDNAを注射することにある；このDNAは、宿主細胞による抗原の合成の維持と、この抗原を免疫システムに提示することの長期継続とを可能にする。
【００５４】
本発明の主題はまた、上記で規定した免疫原性組成物を含むことを特徴とするワクチンである。
本発明の主題はまた：
−上記で規定したように、白人個体群において主要である少なくとも1つのHLA II (HLA-DR)分子（第1遺伝子及び／又は第2遺伝子）について<1 000 nM、好ましくは< 800 nMの結合活性を有することができ、上記ペプチドに特異的なCD4+ Tリンパ球により認識されることができ、上記ペプチドに特異的なCD4+ Tリンパ球を誘導することができるCD4+エピトープを含み、
−HPV16のE6タンパク質の以下のペプチド：ペプチドE6（14〜34若しくは14〜45）、ペプチドE6（30〜50）、ペプチドE6（61〜80）、ペプチドE6（76〜95）、ペプチドE6（91〜119）及びペプチドE6（20〜34、24〜38、28〜42、31〜45、36〜50、42〜56、50〜64、55〜69、76〜90、78〜92、81〜95、84〜98、89〜103、93〜107、97〜111、101〜115、124〜138、130〜144）、又は、HPV16のE7タンパク質の以下のペプチド：ペプチドE7（1〜20）、ペプチドE7（7〜27）、ペプチドE7（60〜74）、ペプチドE7（65〜87）ペプチドE7（78〜98）及びE7（6〜20、9〜23、13〜27、65〜79、67〜81、72〜86、77〜91、84〜98）にそれぞれ相当する配列SEQID Nos.8〜18、21〜25、28〜34、36〜39、42〜43及び45〜52の断片の群から選択される
ことを特徴とするHPV、特にHPV16のE6タンパク質及び／又はHPV、特にHPV16のE7タンパク質に由来するペプチドである。
【００５５】
本発明の主題は、上記で規定したように、E6及びE7ペプチドの１つから選択され、上記ペプチドが、多量体の複合体の形態にあり、任意にラベルされているか複合化されていることを特徴とする診断試薬である。
【００５６】
本発明の主題はまた、上記で規定したようなE6及び／又はE7ペプチドに特異的なCD4+ T細胞の存在を検出する段階からなることを特徴とする個体の免疫状態の評価方法であって；上記検出は、以下のアッセイの１つを用いて好適に行われる：増殖アッセイ、ELISPOTアッセイ［例えば、国際出願WO99/51630若しくはGahery-Segardら（27）参照］又は上記E6及び／若しくはE7ペプチドから構成される多量体の複合体の存在下でのフローサイトメトリー。
【００５７】
より精密には：
*増殖アッセイに関して：
細胞の懸濁物（PBMC、CD8+細胞減少PBMC、本発明により選択されるペプチドとともにインビトロで培養する工程により予備強化されたTリンパ球、又は、クローン化されたTリンパ球）を、選択されたペプチドの存在下、及び、必要により、樹状細胞、自己の若しくは異種のPBMC、EBVウイルスや遺伝子的に修飾された細胞により感染した後に得られるもの等のリンパ芽球状細胞等の存在下で、3〜5日間培養する。細胞増殖は、細胞のDNA中へのトリチウム化チミジンの取り込みにより測定される。本発明により選択されたペプチドは、初期の懸濁において、これらのペプチドに対して特異的な細胞の存在を明らかにすることを可能にする。
【００５８】
*ELISPOTアッセイに関して：
ELISPOTアッセイは、本発明により選択されたペプチドに対して特異的であり、γ-IFNを分泌するT細胞の存在を明らかにすることを可能にする。
より精密には、T細胞は、Gahery-Segardら、2000（27）に記載の方法に従って、患者からのPBMCと本発明により選択されたペプチドとをインキュベーションした後のγ-IFNの分泌を測定することにより明らかにされる。
【００５９】
*多量体の複合体、特に四量体の複合体の使用に関して：
−生体試料、好ましくは末梢血単核細胞（PBMC）を、上記で規定したようなE6又はE7ペプチド  −  溶解性のビオチン化HLAクラスII分子で構成される多量体の複合体から製造される四量体の複合体と接触させる
−ラベルされた細胞は、フローサイトメトリーにより分析される。
【００６０】
好適には、生体試料を上記複合体と接触させる前に、上記試料を強化させるために抗CD4抗体と接触させることにより、CD4+ T細胞中において強化することが好ましい。
四量体は、例えば、E.J.Novakら（J.Clin. Investig.、1999、104、R63〜R67）又は M.J.Kurodaら（J.Virol.、2000、74、18、8751〜8756）で明記されるように調製される。
【００６１】
簡単に、四量体は、0.15 M NaClを含有する10mM クエン酸塩−リン酸塩バッファー中、pH 4.5〜7の間、37℃で72時間、溶解性のビオチン化HLA II分子と10倍過剰の本発明により特定され、選択されるE6又はE7ペプチドとをインキュベーションすることにより製造される。
【００６２】
四量体化された形態は、ストレプトアビジンラベルされたものをフルオロクロムとともに調製物中にHLA II分子の4倍少ない量（モル対モル）で添加することにより得られる。
混合物全体は、外界温度において、一晩インキュベーションされる。
【００６３】
これらの四量体を用いるために、細胞の懸濁物（PBMC、CD8+細胞減少PBMC、本発明により選択されるE6又はE7ペプチドとともにインビトロで培養する工程により予備強化されたTリンパ球、又は、クローン化されたTリンパ球）は、1つ以上の四量体（10〜20 mg/ml）とともに1〜3時間接触させられる。洗浄後、懸濁物は、フローサイトメトリーにより分析される：四量体での細胞のラベル化は、構築物が蛍光であるということにより視覚化される。
フローサイトメトリーは、四量体でラベルされた細胞とラベルされていない細胞とを分けることを可能にし、よって、細胞選別を行う。
【００６４】
よって、本発明の主題はまた、少なくとも以下の段階を含むことを特徴とするHPV16特異的Tリンパ球の選別方法である：
−選別されることとなる細胞の懸濁物をインキュベーションするか、又は、上記で規定したE6及び／若しくはE7ペプチド／溶解性のビオチン化HLA II分子複合体から形成され、フルオロクロムでラベルされたストレプトアビジンに結合された1つ以上の四量体とともに1〜3時間接触させる、
−フローサイトメトリーにより分析する、並びに、
−四量体でラベルされた細胞を選別する。
【００６５】
上記準備のほかにも、本発明は、本発明の主題である方法の履行の実施例、及び、添付の図に関連している以下の記載から現れるその他の準備を含み：
−図1は、ボウエノイド丘疹症を患い、感染が自然に消散された患者の細胞での増殖及びγ-IFN分泌を表す。患者は、DRB1*1601/1501 DRB5*0101である。ペプチドE6（45〜67）は、DRB1*1501の良好なリガンドであり、ペプチドE7（7〜27）は、DRB5*0101の良好なリガンドである（表10も参照）。
【００６６】
これらの実施例は、しかしながら、本発明の主題の説明のためにのみ示されるものであり、限定を構成するものではないことが明確に理解されるべきである。
【００６７】
実施例1：種々のHPV系統及びそれらのHPV16との相同性の割合
【００６８】
【表５】
2005505503.tif 000007
【００６９】
実施例2：結合アッセイの原理
−ペプチド合成
選択されたペプチドは、E6タンパク質又はE7タンパク質の配列をカバーする。全てのペプチドは、Fmocストラテジーに従って平行固相合成により合成され、HPLCにより精製され、質量分析法（ES-MS）により調節された。
・HLA-DR分子の精製
HLA-DR分子は、免疫親和性により種々の同型接合のEBVラインから精製された。Southwoodら（24）に記載の方法を特に用いることができる。これらの起源とこれらを特徴付ける種々のアレレを表6に示す。
【００７０】
【表６】
2005505503.tif 000008
【００７１】
HLA-DR分子に特異的な単形性の抗体は、特にSouthwoodら（24）に記載の、又は、Poschら（25）に記載のものである。抗体は、培養物上清から、プロテインA-セファロースカラム上で精製される。これらの抗体は、HLA-DR分子の精製のために、セファロース4B又はプロテインA-セファロースカラムに結合される。
【００７２】
・HLA-DR／ペプチド結合アッセイ
HLA-DR分子へのペプチドの結合のアッセイは、HLA-DR分子についてHillにより最初に開発された（26）免疫酵素的な新事実による競合アッセイである。これらは、96ウェルプレートで行われ、同一の実験により多くの試料を研究することが可能となる。簡単に、精製されたHLA-DR分子は、トレーサーとなるビオチン化ペプチドと、種々の濃度の試験するペプチドとともにインキュベーションされる。
【００７３】
24〜72時間のインキュベーション後、これらの試料は中和され、次いで、100μlの各試料は、HLA-DR分子特異的単形性抗体によりプレコートされたELISAプレート上に移される。HLA-DR分子特異的単形性抗体を介してプレートの底に付着したHLA-DR分子／ビオチン化ペプチド複合体は、ストレプトアビジン−ホスファターゼ結合体と蛍光基質とを用いて明らかにされる。各ペプチドの活性は、ビオチン化ペプチドの結合の50%を阻害するこのペ
プチドの濃度（IC50）により特徴付けられる。
【００７４】
・結合アッセイの選択と最適化
アレレの選択（第1遺伝子）
研究したアレレは、その頻度が個体群の5%を超えるフランス人の個体群のアレレである。
これらは、アレレDRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301及びDRB1*1501（表1）である。これらは、これら自身により、白人個体群のアレレの53〜82%に相当し、HLA-DRシリーズの種々の特異性を構成する。
【００７５】
アレレの選択（第2遺伝子）
研究したアレレは、最も一般的に遭遇するアレレである。これらは、アレレHLA-DRB3*0101、HLA-DRB4*0101及びHLA-DRB5*0101である。
【００７６】
アッセイ特異性
ビオチン化ペプチドの選択は、アッセイ特異性の決定因子である。用いた細胞のほとんどは、両方ともHLA-DR分子特異的単形性抗体により精製され、両方とも同じ抗体により認識される2つの異なるHLA-DR分子（2つのアレレによりエンコードされる）を有する。DRB1アレレに対するペプチドの結合を明白に研究するためには、ビオチン化ペプチドがこのアレレに結合し、他のアレレの生成物に結合しないことを確実にすることが必要である。
この目的で、試薬R1として上記で定義されたペプチドを用いた。
【００７７】
アッセイ条件と感受性
各HLA-DRB1分子について、MHC II分子の濃度、ビオチン化ペプチドの濃度、インキュベーションpH及びインキュベーション時間は、以下の表7に明記のように最適化した。
【００７８】
【表７】
2005505503.tif 000009
【００７９】
各アッセイの感度は、トレーサーに相当するビオチン化されていないペプチドについて観察されたIC50値により反映され、得られた結果を以下の表8に示す。
【００８０】
【表８】
2005505503.tif 000010
【００８１】
記載された頻度は、フランスでのアレリック頻度であり、白人個体群のものに相当する。これらは、Colombani（22）に由来する。
以下の表9-1及び9-2は、上記で特定した条件下で測定された本発明のペプチドの結合活性を説明する。
【００８２】
【表９−１】
2005505503.tif 000011
【００８３】
【表９−２】
2005505503.tif 000012
【００８４】
結果は、最大結合の50%阻害を与える濃度の形態で表す。単位は、nMである。
【００８５】
実施例3：増殖アッセイ
本発明の免疫原性組成物を用いたCD4+ T細胞増殖の誘導を証明するため、インビトロで増殖アッセイを行う。
末梢血から抽出した細胞（PBMC）を、96ウェルマイクロプレートにおいて、最終容量200 μlの完全培地中、１ウェルあたり2×105個の細胞の割合で培養した。細胞を、10μg/mlの本発明のペプチドの混合物により誘導したか、又は、しなかった。37℃で5日間培養後、細胞を0.25 μCiの[3H]−チミジン（Amersham、Life technology）とともに一晩インキュベーションした。細胞を回収し、細胞のDNA内で [3H]−チミジンの取り込みを測定した。
CD4+ T細胞の誘導は、効果的に観察された。
【００８６】
その他の細胞を用いることができる：CD8+細胞減少PBMC、上記で規定したペプチドとともにインビトロで培養する工程により予備強化されたＴ細胞、又は、クローン化されたリンパ球。
【００８７】
簡単に、強化手順は以下のとおりである：
フィコール勾配で分離されたPBMCは、37℃で0.1〜10 mg/mlのペプチドの存在下、10%ヒト血清を添加したRPMI培地で培養する。培養7日目及び11日目に、50ユニットの組換えヒトIL-２を培養物に添加する。細胞を14日目に回収する。
【００８８】
実施例4：ELISPOT
ELISPOTは、ペプチドに特異的であり、所定のサイトカインを分泌する細胞を検出することを可能にする。
PBSバッファー中で4 μg/mlの濃度に希釈された50 μl／ウェルのマウス抗ヒトγ-IFN抗体を、底部がニトロセルロースである96ウェルプレートで、湿気のあるチャンバー内、4℃で一晩インキュベーションした。
【００８９】
ウェルをPBSで洗浄し、10%仔ウシ血清を含むRPMI完全培地により37℃、2時間飽和させる。
必要であれば、自己の又は異種のPBMC、EBVウイルス又は遺伝子的に修飾された細胞による感染後に得られるリンパ芽球状細胞等の適切な提示細胞を用い、ウェル中に分配する。本発明で規定したE6又はE7ペプチドは、次いで、種々の濃度（10、5及び1μg/ml）で添加される。
【００９０】
エフェクター細胞（PBMC、CD8+細胞減少PBMC、E6若しくはE7又は両方のペプチドとともにインビトロで培養する工程により予備強化されたT細胞、又は、クローン化されたリンパ球）を、20000細胞／ウェルの割合で96ウェルプレートに添加する。
培養は、5% CO2を含む大気中、37℃で24時間インキュベーションする。
【００９１】
次いで、プレートを洗浄し、100 μlのヒトγ-IFNに特異的なウサギ抗血清とともに2時間インキュベーションする。
洗浄後、ビオチンに結合した抗ウサギIgG抗体、次いで、アルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジンを連続して1時間で添加する。
最後に、スポットを、アルカリホスファターゼの発色性基質により明らかにする。これらのスポットを顕微鏡下で数える。ネガティブコントロールは、ペプチドを含まないウェルにより与えられる。ポジティブコントロールは、イオノマイシン（500 ng/ml）、フィトヘマグルチニン（PHA）（10 μg/ml）等の細胞分裂促進性の試薬を含むウェルにより与えられる。
【００９２】
実施例5：インビボアッセイ
上記で規定したようなペプチドの混合物は、ボウエノイド丘疹症を有する患者においてインビボで評価された。ボウエノイド丘疹症は、若い女性に影響するHPV16による皮膚−粘膜の感染であり；破壊的処置の使用に関わらず、慢性で再発性の疾患である。この疾患は、初期から外陰部上皮内新生物等級3（VIN 3）であり、侵食癌に進行しないという特殊性を有する。
多数のCD4+リンパ球による上皮細胞への無視できない浸入は、これらの細胞が疾患の段階を調節し、侵入を防止することに貢献することを示唆する。
【００９３】
感染が消散した患者において観察された結果を図１に例として示す。
ボウエノイド丘疹症を有する13人の患者からの細胞の増殖応答をペプチドに関して研究した。
増殖に関して、CD4+ Tリンパ球により認識されたペプチドを、各疾患について列挙した。
結果を、以下の表10に示す。
この表は、本発明にしたがって選択されたペプチドの利点を示す。
【００９４】
【表１０】
2005505503.tif 000013
【００９５】
【表１０−１】
2005505503.tif 000014
【００９６】
【表１０−２】
2005505503.tif 000015
【００９７】
関係書目の参照
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、ボウエノイド丘疹症を患い、感染が自然に消散された患者の細胞での増殖及びγ-IFN分泌を表す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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