(57)【要約】本発明は、血管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１のアミノ酸配列中の１２１４位にチロシンを含むエピトープの、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定におけるマーカーとしての使用、および該エピトープを認識する抗体などのプローブに関する。本発明は、更に、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の検出および／またはそのレベルの測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の使用、およびＹ１２１４エピトープの使用を利用する検定、および該検定に由来する化合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の使用。
【請求項２】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の検出および／またはそのレベルの測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の使用。
【請求項３】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に向けられたプローブ。
【請求項４】
プローブが抗体である請求項３に記載のプローブ。
【請求項５】
請求項４に記載の抗体を生じる方法であって、
（ｉ）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４を含むペプチドで哺乳動物を免疫感作し；そして
（ii）該哺乳動物から抗体を単離すること、を含む方法。
【請求項６】
マーカーとしてＹ１２１４を利用して、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化を測定する検定方法。
【請求項７】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定のための検定方法であって、
（ａ）生体試料と、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に向けられた一つまたはそれを超えるプローブを含む検定混合物とを混合し；そして
（ｂ）ホスホリレーション状態または未ホスホリレーション状態にあるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の割合に比例しているシグナルを測定すること、を含む方法。
【請求項８】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体を検出する、そのレベルを測定する、および／またはその活性化状態の変化を測定する診断用キットであって、請求項３に記載のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に向けられたプローブを含む検定混合物を製造するための試薬と、それらの使用についての取扱説明書を含むキット。
【請求項９】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の阻害剤の有効量を決定する方法であって、
（ａ）一またはそれを超えるヒトまたは他の哺乳動物に、一定範囲のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体阻害剤濃度を投与し；
（ｂ）該ヒトまたは他の哺乳動物から生体試料を単離し；
（ｃ）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態に比例するシグナルを、請求項６に記載の検定方法を用いて測定し；そして
（ｄ）該測定されたシグナルから阻害剤の有効量を計算すること、を含む方法。
【請求項１０】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体阻害剤の医薬組成物を製造する方法であって、
（ａ）請求項９に記載の阻害剤の有効量を決定し；そして
（ｂ）該有効量範囲内の量の阻害剤および薬学的に許容しうる添加剤を含む単位用量の阻害剤を製造することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１０の記載により製造された医薬組成物。
【請求項１２】
ある化合物が、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体チロシンキナーゼ活性の in vivo 阻害剤であるかどうか決定する方法であって、該化合物を投与された被検対象から得られる生体試料中のＹ１２１４のリン酸化度を測定することを含む方法。
【請求項１３】
ある化合物のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体チロシンキナーゼ阻害活性の代理マーカーとしての、Ｙ１２１４のリン酸化度の使用。
【請求項１４】
薬剤の製造における、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に結合する抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体（receptor）のＹ１２１４エピトープの使用に関する。本発明は、更に、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の検出および／またはそのレベルの測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の使用、およびＹ１２１４エピトープの使用を利用する検定、およびそれら検定に由来する化合物に関する。
【０００２】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１は、血管新生（angiogenesis）の過程に関与している増殖因子である血管内皮増殖因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）を結合する受容体の一つである。ＶＥＧＦを結合する３種類の受容体、すなわち、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１としても知られる）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲまたはＦｌｋ−１としても知られる）およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４としても知られる）が識別されている。ＶＥＧＦによって結合した受容体に関するより多くの情報について、読者は、次の概説論文を参照する。Clauss, 2000 Seminars in Thrombosis and Hemostasis 26:561-569; McMahon 2000, The Oncologist 5: 310; and Karkkainen & Petrova, 2000, Oncogene 19: 5598-5605。
【０００３】
通常の血管新生は、胚発生、創傷治癒およびいくつかの雌性生殖機能構成要素を含めたいろいろな過程において重要な役割を果たしている。しかしながら、血管新生は、多くの疾患状態にも関与している。例えば、望ましくないまたは病理学的血管新生は、糖尿病性網膜症、乾癬、癌、慢性関節リウマチ、アテローム、カポージ肉腫および血管腫を含めた疾患状態に関連している（Fan et al, 1995, Trends Pharmacol. Sci. 16: 57-66; Folkman, 1995, Nature Medicine 1: 27-31）。ＶＥＧＦは、血管透過性への作用も有し、通常のおよび病理学的双方の生理学的過程においてある役割を果たしていると考えられる（Cullinan-Bove et al, 1993, Endocrinology 133: 829-837;  Senger et al, 1993, Cancer and Metastasis Reviews, 12: 303-324）。
【０００４】
血管新生が、多くの疾患状態に関与しているという知見は、血管新生のモジュレーションによって疾患を処置するために行われる多数のアプローチをもたらしてきている。これらアプローチの一つは、ＶＥＧＦを結合する受容体の活性の阻害剤を開発することであった。ＶＥＧＦ受容体は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）と称される受容体ファミリーに属する。ＲＴＫは、細胞の原形質膜（plasma membrane）を越えた生化学的シグナルの伝達において重要である。これら膜貫通分子は、特徴的に、原形質膜中のセグメントを介して細胞内チロシンキナーゼドメインに連結した細胞外リガンド結合ドメインから成る。受容体へのリガンドの結合は、受容体上および他の細胞内分子上双方のチロシン残基のリン酸化をもたらす、受容体関連チロシンキナーゼ活性の刺激を引き起こす。チロシンリン酸化におけるこれら変化は、種々の細胞応答をもたらすシグナリングカスケード（signalling cascade）を開始する。（ＲＴＫの概説について、読者は、Schlessinger , 2000, Cell,103:211-255 を参照する。ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ（ＶＥＧＦ  ＲＴＫ）の阻害剤の例は、次の特許出願に見出されうる。国際出願公開ＷＯ９７／４２１８７号および国際出願公開ＷＯ９８／１３３５０号。
【０００５】
ＶＥＧＦ  ＲＴＫの阻害剤への要求に加えて、ＶＥＧＦ  ＲＴＫの活性化および失活を特性決定する手段への要求もある。このような手段は、例えば、ＶＥＧＦ  ＲＴＫの生化学を特性決定する研究において、およびその受容体の阻害剤の臨床研究の際のＶＥＧＦ  ＲＴＫの活性化状態の変化の測定において有用であるので、それら阻害剤の治療効果の指標を与えると考えられる。
【０００６】
このような手段の開発への一つのアプローチは、ＶＥＧＦ  ＲＴＫの活性化の際にリン酸化されるＶＥＧＦ受容体上のアミノ酸エピトープを探すことである。このようなエピトープは、例えば、ＶＥＧＦ  ＲＴＫの活性化および失活の状態を追跡する場合に用いられうる。Takahashi et al, 2001, EMBO Journal 20:27682778 は、ＶＥＧＦ受容体のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１サブタイプ上の二つのエピトープを識別しており、これらは、ＫＤＲ／ＦＬｋ−１受容体のアミノ酸配列中の１１７５位および１２１４位にあるチロシン残基である（以下、それぞれＹ１１７５およびＹ１２１４と称される）。この論文において、著者は、これら二つのエピトープを特性決定して、そしてＹ１２１４ではなくＹ１１７５が、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体へのＶＥＧＦの結合によって間接的に活性化される生化学的経路の下流の重要なタンパク質であるＭＡＰキナーゼの活性化に関連している主要なホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣγ）結合部位であるということを認めた。したがって、その著者は、Ｙ１２１４ではなくＹ１１７５が、内皮細胞中のＭＡＰキナーゼ経路およびＤＮＡ合成へのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体からのシグナル伝達において決定的な役割を果たしていると結論づけた。したがって、Ｙ１２１４ではなくＹ１１７５が、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化を追跡するのに重要なマーカーであると考えられた。本発明者は、Ｙ１２１４エピトープに対して抗体を生じさせたが、驚くべきことに、本発明者は、このエピトープを用いて、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化を追跡して、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１  ＲＴＫの阻害剤によるＹ１２１４のリン酸化の阻害を認めうるということを発見した（以下の図１に示される）。本発明者は、更に、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１  ＲＴＫの阻害剤が、Ｙ１２１４エピトープのリン酸化の阻害と平行して、ＭＡＰキナーゼのリン酸化も阻害するということを発見した。したがって、驚くべきことに、本発明者は、Ｙ１２１４が、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化を追跡するのに重要なマーカーであるということを発見した。
【０００７】
したがって、本発明の第一の側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の使用を提供する。
【０００８】
Ｙ１２１４エピトープは、生体試料中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の存在を検出するのにおよび生体試料中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のレベルを測定するのに用いられうる。したがって、本発明の第一の側面のもう一つの特徴により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の検出および／またはそのレベルの測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の使用を提供する。
【０００９】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のこのような検出および／または測定を可能にする一つのアプローチは、Ｙ１２１４エピトープへのプローブを開発することであり、これらは、リン酸化したエピトープかまたは脱リン酸化したエピトープへと開発されうる。したがって、本発明の第二の側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に向けられたプローブを提供する。このようなプローブの例には、抗体などの結合性タンパク質が含まれる。
【００１０】
本発明の第二の側面のもう一つの特徴により、エピトープＹ１２１４に特異的に結合する抗体を提供する。Ｙ１２１４エピトープを含むＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のペプチドフラグメントは、Ｙ１２１４に特異的に結合する抗体を製造するのに利用することができる。このような抗体製造の具体的な例は、本明細書中の実施例１に記載されている。
【００１１】
多クローン性抗体は、いろいろな源、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから、当該技術分野において周知の方法を用いて容易に生じさせることができる。概して、Ｙ１２１４エピトープを含むペプチドを、宿主動物に、典型的には、非経口注射によって投与する。Ｙ１２１４エピトープを含むペプチドの免疫原性は、アジュバント、例えば、フロイント（Freund）の完全または不完全アジュバントの使用によって増強することができる。ブースター免疫感作後、少量の血清試料を集め、Ｙ１２１４エピトープへの反応性について調べる。このような決定に有用な各種検定の例には、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 に記載されたもの；更には、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、放射性免疫沈降法（radioimmunoprecipitation）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロット検定法およびサンドイッチ検定法などの方法が含まれ、米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号を参照されたい。
【００１２】
単クローン性抗体は、周知の方法を用いて容易に製造することができ、例えば、本明細書中に各々援用される、米国特許ＲＥ３２，０１１号、第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号および第４，４１１，９９３号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), (1980) に記載された方法を参照されたい。
【００１３】
本発明の単クローン性抗体は、本明細書中に各々援用される、Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990) によって記載されたものなどの別の技法を用いて生じることができる。同様に、結合パートナーは、組換えＤＮＡ技術を用いて、特異的結合抗体をコードしている遺伝子の可変領域を組み込むように構築することができる。このような技法は、本明細書中に援用される、Larrick et al., Biotechnology, 7: 394 (1989) に記載されている。単クローン性抗体は、その抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子がトランスフェクションされたＣＨＯ細胞若しくはＮＳ０細胞などの細胞系または細菌若しくは酵母などの微生物を用いて生じさせることもできる。このような方法の例は、本明細書中に各々援用される、ＵＳ６３３１４１５号、ＵＳ５８７６９６１号、ＵＳ５５４５４０３号およびＵＳ５８０７７１５号に見出されうる。
【００１４】
したがって、本発明のもう一つの側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に特異的に結合する単クローン性抗体を提供する。
本発明のもう一つの側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に特異的に結合する抗体、好ましくは、単クローン性抗体を生じるハイブリドーマを提供する。
【００１５】
本発明のもう一つの側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に特異的に結合する抗体の重鎖および軽鎖の発現のためのｃＤＮＡでトランスフェクションされたリコンビナント細胞系を提供する。
【００１６】
いったん単離され且つ精製されると、Ｙ１２１４に対するこれら抗体は、確立された検定プロトコールを用いて試料中のＹ１２１４の存在を検出するのに用いることができる。更に、このような抗体は、試料中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のレベルを測定するのに用いられうる。更に、本発明の抗体は、治療的に用いられて、Ｙ１２１４エピトープに結合し且つその活性を in vivo で阻害することができる。
【００１７】
したがって、本発明のもう一つの側面により、薬剤、好ましくは、癌の処置用薬剤の製造における、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に結合する抗体の使用を提供する。
【００１８】
本発明のもう一つの側面により、処置方法であって、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に結合する抗体を用いる、好ましくは、癌の処置方法を提供する。
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の使用への別のアプローチは、放射性ホスフェートで標識された（例えば、リン３２で標識された）アデノシン三リン酸の存在下において活性化されたＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のホスホリレーション状態を測定すること、およびＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の放射能レベル、好ましくは、Ｙ１２１４を含むＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のペプチドフラグメントにおける放射能レベルを決定することである。
【００１９】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定におけるマーカーとしてのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の使用へのもう一つのアプローチは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）を用いて、Ｙ１２１４のホスホリレーション状態（phosphorylation state）の変化を追跡することである。
【００２０】
本発明のもう一つの側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のＹ１２１４エピトープに向けられたプローブを生じる方法を提供する。好ましくは、抗体の生成。
本発明のもう一つの側面により、抗体を生じる方法であって、
（ｉ）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４を含むペプチドで哺乳動物を免疫感作し；そして
（ii）その哺乳動物から抗体を単離することを含む方法を提供する。
【００２１】
当業者は、Ｙ１２１４エピトープの重要性についての知見に基づき、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体を検出する、そのレベルを測定する、および／またはその活性化状態の変化を測定する検定法を開発するための多数の検定技術を入手できると考えられる。このような検定技術の例には、蛍光定量検定、色素原検定、放射性標識検定または化学発光検定が含まれる。したがって、本発明の第三の側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体を検出する、そのレベルを測定する、および／またはその活性化状態の変化を測定する検定方法であって、Ｙ１２１４をマーカーとして利用して、好ましくは、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化を測定する方法を提供する。
【００２２】
生物学的検定の設計のための指針について、当業者は、多数の標準的な研究を承知しているであろう。このような標準的な研究の例には、Knight (1995) Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes, Methods in Enzymology 248, 1834; Chard (1978) An Introduction to Radioimmunoassay and related techniques, Elsevier/North-Holland Biomedical Press; and Basic Methods in Molecular Biology. First author Leonard G Davis. 1986 Elsevier Science Publishing Co. Inc., Amsterdam が含まれる。
【００２３】
本発明の第三の側面のもう一つの特徴により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定のための検定方法であって、
（ａ）生体試料と、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に向けられた一つまたはそれを超えるプローブを含む検定混合物とを混合し；そして
（ｂ）ホスホリレーション状態または未ホスホリレーション状態にあるＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の割合に比例しているシグナルを測定することを含む方法を提供する。
【００２４】
本発明の第三の側面のもう一つの特徴により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態の変化の測定のための検定方法であって、
（ａ）生体試料と、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に向けられた一つまたはそれを超えるプローブを含む検定混合物とを混合し；そして
（ｂ）生体試料中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態を測定することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明の第四の側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体を検出する、そのレベルを測定する、および／またはその活性化状態の変化を測定する診断用キットであって、本発明のプローブを含む検定混合物を製造するための試薬と、それらの使用についての取扱説明書を含むキットを提供する。好ましくは、この診断用キットは、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態を測定することに向けられている。
【００２６】
本発明の第四の側面のもう一つの特徴により、本発明の方法で用いるための、生体試料中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体を検出する、そのレベルを測定する、および／またはその活性化状態の変化を測定する診断用キットであって、検定混合物を製造するための試薬と、それらの使用についての取扱説明書を含む診断用キットを提供する。
【００２７】
本発明の第四の側面のもう一つの特徴により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の阻害剤の有効量を決定する方法であって、
（ａ）一またはそれを超えるヒトまたは他の哺乳動物、好ましくは、一またはそれを超えるヒトに、一定範囲のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体阻害剤濃度を投与し；
（ｂ）それらヒトまたは他の哺乳動物から生体試料、好ましくは、細胞試料を単離し；
（ｃ）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態に比例するシグナルを、本発明の検定方法を用いて測定し；そして
（ｄ）その測定されたシグナルから阻害剤の有効量を計算することを含む方法を提供する。
【００２８】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体阻害剤が、ＶＥＧＦなどのリガンドの受容体への結合によって、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化の阻害剤であるということは、当業者に明らかであると考えられる。これは、ＶＥＧＦ結合部位またはアロステリック部位で起こりうる。このような阻害剤には、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体チロシンキナーゼの阻害剤または受容体へのリガンドの結合をブロックする物質、例えば、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体に向けられた抗体が含まれる。好ましい阻害剤は、Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［（４−メチルピペリジン−１−イル）メトキシ］キナゾリン−４−アミンである。
【００２９】
本発明の第四の側面のもう一つの特徴により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体阻害剤の有効な治療的用量を決定する方法であって、
（ａ）一またはそれを超えるヒトまたは他の哺乳動物、好ましくは、一またはそれを超えるヒトに、一定範囲のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体阻害剤濃度を投与し；
（ｂ）それらヒトまたは他の哺乳動物から生体試料、好ましくは、細胞試料を単離し；
（ｃ）ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性化状態を、本発明の検定方法を用いて測定し；そして
（ｄ）その測定された活性化状態から阻害剤の有効な治療的用量を計算することを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明の第五の側面により、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体阻害剤の医薬組成物を製造する方法であって、
（ａ）本発明の方法によって阻害剤の有効量を決定し；そして
（ｂ）その有効量範囲内の量の阻害剤および薬学的に許容しうる添加剤を含む単位用量の阻害剤を製造することを含む方法を提供する。
【００３１】
本発明の第五の側面のもう一つの特徴により、医薬組成物を製造する方法であって、
（ａ）本発明の方法によってＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体阻害剤の有効な治療的用量を決定し；そして
（ｂ）その有効な治療的用量範囲内の量の阻害剤を、薬学的に許容しうる添加剤と混合することを含む方法を提供する。
【００３２】
本発明の第五の側面のもう一つの特徴により、医薬組成物を製造する上の方法の一つによって製造された医薬組成物を提供する。
本発明の第六の側面により、ある化合物が、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体チロシンキナーゼ活性の in vivo 阻害剤であるかどうか決定する方法であって、その化合物を投与された被検対象（subject）から得られる生体試料中のＹ１２１４のホスホリレーション度（degree of phosphorylation）を測定することを含む方法を提供する。
【００３３】
本発明の第七の側面により、ある化合物のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体チロシンキナーゼ阻害活性の代理マーカーとしての、Ｙ１２１４のリン酸化度の使用を提供する。
当業者は、この有効な治療的用量を、一定期間にわたって患者に与えられる一つまたはそれを超える製剤中で製剤化することができるということを理解するであろう。当業者は、有効量がいったん決定されたら、上の方法によって間接的に製造されているであろう更に別の医薬組成物を製造することができるということも理解するであろう。
【００３４】
本明細書中、次の用語は、次のように定義される。
「活性化状態」−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の分子コンホメーションの何等かの変化であって、動物またはヒト細胞の細胞膜またはいずれか他の部分中の別のタンパク質または他のタンパク質の活性の直接的または間接的モジュレーションをもたらす変化。
【００３５】
「抗体」には、多クローン性抗体、単クローン性抗体、およびいろいろなタイプの、例えば、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂおよび一本鎖Ｆｖのような抗体コンストラクトが含まれる。抗体は、Ｙ１２１４を約１０7Ｍ-1に等しいまたはそれを超えるＫaで結合する場合、特異的に結合すると定義される。結合親和性は、慣用的な技法、例えば、Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949) によって記載された技法を用いて決定することができる。
【００３６】
「検定混合物」は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の検出、そのレベルの測定、および／またはその活性化状態の変化の測定に適した試薬を含み；このような試薬は、当業者によって容易に選択可能である。例えば、好ましい検定混合物は、適当な緩衝剤、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に向けられた一つまたはそれを超える標識プローブ、および場合により、必要とされることがありうるいずれか他の補因子を含む。
【００３７】
「生体試料」は、何等かの動物体成分に由来する物質の試料である。このような物質には、血液、尿、組織切片および組織生検、好ましくは、組織生検または血液が含まれるがこれに制限されるわけではない。組織生検は、切片として検定することができるし、または細胞懸濁液として検定することができる。生体試料は、いろいろな動物種、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒト、サル、イヌ、モルモット、ラットまたはマウス、更に好ましくは、ラット、マウスまたはヒト、最も好ましくは、ヒトに由来してよい。当業者は、生体試料を使用前に精製または部分精製してよいということを理解するであろう。「生体試料」には、培養された細胞系およびそれに由来する物質も含まれる。好ましい生体試料は、腫瘍からの針生検材料（needle biopsy）である。
【００３８】
「有効量」−疑わしさを避けるために、有効量は、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性の阻害が治療的に有益であると考えられる疾患の処置のための有効な治療的用量を意味する。当業者は、生体試料中のＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体の活性の阻害の程度から有効な治療的用量を計算することができると考えられる。
【００３９】
「ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４」−疑わしさを避けるために、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４の意味は、未リン酸化した形およびリン酸化した形双方のエピトープに関する。
【００４０】
「モジュレーション」−疑わしさを避けるために、モジュレーションは、活性の増加かまたは活性の減少に関することがありうる。
「プローブ」は、アミノ酸配列、例えば、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のＹ１２１４エピトープを含有する配列に特異的に結合するいずれかの部分に関する。
【００４１】
「シグナル」−疑わしさを避けるために、シグナルは、シグナルプローブに由来しうるし、または二つまたはそれを超えるプローブに由来する多数のシグナルでありうる。例えば、リン酸化したエピトープに向けられたプローブは、未リン酸化エピトープに向けられたプローブと組み合わせて用いられ、そして得られた二つのシグナルは、ホスホリレーション状態および未ホスホリレーション状態の受容体の割合を測定するのに用いられうる。
【００４２】
「代理マーカー（surrogate marker）」は、動物、好ましくは、ヒトの疾患状態の処置への化合物の効力を間接的に示す、生物学的活性または生化学的活性のいずれかの測定値に関する。
【００４３】
「Ｙ１２１４」は、成熟ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体のアミノ酸配列中の１２１４位にあるチロシン残基に関する。その配列は、Terman et al 1991, Biochem Biophys Research Commun 187(3), 1579-1586 に記載されている。Terman et al の配列中には、イニシエーターメチオニンが存在しているので、Ｙ１２１４は、その配列の１２１５位に示されている。このメチオニンは、転写されたタンパク質中には存在しないと考えられるので、本発明に関するチロシン残基は、１２１４位に存在すると考えられる。ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１の配列は、SwissProt 受託番号Ｐ３５９６８にも見出されうる。
【００４４】
本発明を、ここで、次の非制限実施例および添付の図面に関して詳しく説明する。
次の略語を用いる。
ＰＢＳＴ−ＰＢＳ中０．０５％ Tween ２０
ＢＳＡ−ウシ血清アルブミン；
ＨＵＶＥＣ−ヒト臍帯静脈内皮細胞
ＰＢＳ−リン酸緩衝化生理食塩水；および
ＯＶＡ−オボアルブミン
実施例１−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１エピトープＹ１２１４に向けられた多クローン性抗体の製造
マレイミドを用いたＯＶＡへのＫＤＲ／Ｆｌｋ−１ペプチドの結合
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１ペプチド「Ａｃ−ＣＤＰＫＦＨＹ（ｐ）ＤＮＴＡＧＩＳ−ＮＨ2」を、ＰＢＳ（０．１Ｍ  ｐＨ＝７．４）中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、そして凍結乾燥されたマレイミド活性化オボアルブミン（例えば、Pierce & Warriner  Cat. No. ７７１２６）を、ＰＢＳ中に１ｍｌ／ｍｇで溶解させた。次に、３ｍｌのペプチドを、３ｍｌのマレイミド活性化ＯＶＡと混合し、そして暗所において室温で、ローラー上で絶えず混合しながら４時間反応させた。４時間後、反応混合物を、１０リットルの撹拌されたＰＢＳに対して４℃で一晩透析した（１００００分画分子量）。透析後、反応混合物の容量を調整して、１ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度を与えた。次に、２００μｌのアリコートを−２０℃で貯蔵した。
【００４５】
ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１ペプチド結合体でのウサギの免疫感作
３羽の雌 New Zealand White ウサギを、ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１ペプチドのオボアルブミン複合体で免疫感作した。免疫感作は、皮下経路を用いて行われ、１ｍｌの全容量の各投与量を、ウサギの背面上の４部位に与えた。４回の投与量を４週間間隔で与えたが、５０μｇの複合体を含有する各投与量は、次の通りであった。
【００４６】
投与量１−ＰＢＳおよびフロイント完全アジュバントの１：１混合物を用いて調製されたエマルジョンとして与えられる；
投与量２−ＰＢＳおよびフロイント不完全アジュバントの１：１混合物を用いて調製されたエマルジョンとして与えられる；
投与量３−ＰＢＳおよびフロイント不完全アジュバントの１：１混合物を用いて調製されたエマルジョンとして与えられる；および
投与量４−ＰＢＳ単独で与えられる。
【００４７】
１回目の投与量の前と、その後の投与の各々１０日後に、予備採血（pre-bleed）を行った。血液は、被験動物の辺縁耳静脈から取り、室温で数時間凝固させた後、４℃で一晩貯蔵した。次に、それら試料を、ベンチトップ遠心機において１５〜３０分間回転させ、そしてペレットから血清を傾瀉した。次に、それら血清試料を−２０℃で凍結させ且つ貯蔵した。
【００４８】
リン酸化ペプチドで免疫感作されたウサギからの試験採血の検定
リン酸化    ［Ａｃ−ＣＤＰＫＦＨＹ（ｐ）ＤＮＴＡＧＩＳ−ＮＨ2］
非リン酸化  ［Ａｃ−ＣＤＰＫＦＨＹＤＮＴＡＧＩＳ−ＮＨ2］
検定は、９６ウェルポリスチレンプレート上で行った。プレートは、リン酸化（phosphorylated）ペプチドかまたは非リン酸化（non-phosphorylated）ペプチドを重炭酸緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌで被覆し、室温で８時間インキュベートした。次に、プレートを、ＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ＝７．４）で１回洗浄し、そして１２０μｌ／ウェルのＰＢＳ中１％脱脂粉乳溶液で４℃において一晩ブロックした。
【００４９】
次に、試験採血を次のように検定した。次に、プレートを、ＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、ウェルに試料を１００μｌ／ウェルで加え；純血清で出発する二重の二倍希釈後、室温で３時間インキュベートした。次に、プレートを、ＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、そしてＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ７．４）で１／４０００に希釈されたペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Sigma Chemical Co, Poole, Dorset, UK Catalogue Number：Ａ−０５４５）を１００μｌ／ウェルで加えた。次に、プレートを室温で３時間インキュベートした。次に、プレートを、ＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ７．４）で４回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ基質である６００μｇ／ｍｌのオルトフェニレンジアミン＋０．０２％尿素Ｈ2Ｏ2（クエン酸リン酸ｐＨ５中）基質を、１００μｌ／ウェルでプレートに加え、室温でインキュベートした。１５分後、５０μｌ／ウェルの０．１Ｍクエン酸の添加によって反応を止めた。
【００５０】
次に、プレートを、分光測光プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読み取った。
「SulfolinkTM」を用いたリン酸化ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１ペプチドおよび非リン酸化ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１ペプチドのアフィニティーカラムの製造
SulfolinkTMは、スルフヒドリル含有ペプチドを固定するための固定化ヨードアセチル基を含む６％架橋ビーズアガロースゲルである。（Source: Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, USA）。
【００５１】
１０ｍｌの「Sulfolink」スラリーを、追加のレザバーを室温で装着された使い捨て５ｍｌ（ベッド容量）ポリプロピレンカラムに加え、２時間沈降させた。次に、そのカラムを、２５ｍｌの５０ｍＭトリス＋５ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ  ｐＨ８．５で２回洗浄した。ペプチドを、５ｍｌ中１ｍｇのトリス／ＥＤＴＡ（同上）で溶解させた。
【００５２】
アフィニティーカラムを、リン酸化ペプチドかまたは非リン酸化ペプチドの５ｍｌ溶液を加えることによって調製後、長針を用いてそれらカラムを充分に混合し、キャップをし、振とう機上で１５分間混合した。１５分後、カラムを垂直にし、３０分間静置させた。次に、カラムを排水させ、そして６ｍｌのトリス／ＥＤＴＡ中５０ｍＭシステインを、各々のカラム中に流した。次に、カラムにキャップをし、針で充分に混合し、１５分間混合した。次に、カラムを垂直にし、３０分間静置させた。次に、４０ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌを各々のカラムに通過させた後、３０ｍｌの０．０５％アジ化ナトリウムを通過させた。次に、カラムを４℃で貯蔵した。
【００５３】
非リン酸化ペプチドおよびリン酸化ペプチドのアフィニティーカラムを用いた抗体の精製
カラムクロマトグラフィーの前に、血清試料を、５０％硫酸アンモニウムを用いた沈殿によって精製した。沈殿物を、約１０ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、１０リットルのＰＢＳに対して４℃で一晩透析した（１０，０００分画分子量）。次に、硫酸アンモニウムで精製された試料を、リン酸化ペプチドアフィニティーカラム上のクロマトグラフィー後、非リン酸化ペプチドカラム上のクロマトグラフィーによって更に精製した。リン酸化ペプチドまたは非リン酸化ペプチドで上記のように調製されたアフィニティーカラムを、使用前に室温にし、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。
【００５４】
カラムクロマトグラフィーは、次のように行った。
（ｉ）リン酸化ペプチドアフィニティーカラム
１０ｍｌの硫酸アンモニウムで精製された物質を、ＰＢＳで５０ｍｌとし、リン酸化ペプチドアフィニティーカラムの上部に加え、通過させた後、１５ｍｌのＰＢＳでカラムを洗浄した。次に、カラムを、約１０ｍｌの１００ｍＭグリシンｐＨ３．０で溶離し、１０個の１ｍｌ画分を集め、１００μｌの１ＭトリスｐＨ８．９を、画分４〜１０の採集バイアルに加えた。カラムからの溶離は、分光光度計において画分の光学濃度を２８０ｎｍで測定することによって検査した。次に、カラムを、１０ｍｌの１００ｍＭグリシンｐＨ２．５の後、２０ｍｌのＰＢＳを加えることによって再生させ、カラムを４℃で貯蔵した。
【００５５】
（ii）非リン酸化ペプチドアフィニティーカラム
画分３〜８をプールし、非リン酸化ペプチドカラムに加えた後、１０ｍｌのＰＢＳを加えた。カラムを通過した物質を全て、１ｍｌずつの画分に集め、２８０ｎｍでの光学濃度を分光光度計で測定検査した。次に、画分２〜７をプールし、ＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。透析後、それら試料を、即時使用に４℃でまたは貯蔵用に−２０℃で貯蔵した。
【００５６】
リン酸化ペプチドおよび非リン酸化ペプチドのアフィニティーカラムからのウサギ画分の検定
９６ウェルプレートを、０．１Ｍ重炭酸緩衝液ｐＨ９．６中に２μｇ／ｍｌのペプチドで、室温において４時間被覆した。次に、それらプレートを、ＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ＝７．５）で１回洗浄し、そして２００μｌ／ウェルの１％脱脂粉乳溶液で室温において１時間ブロックした。次に、プレートを、ＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ７．５）で１回洗浄し、ウェルに試料を１００μｌ／ウェルで加えた。画分は、２５ｕｇ／ｍｌのタンパク質で出発する二倍希釈で検定した（２８０ｎｍでの光学濃度による）。次に、プレートを４℃で一晩インキュベートした。
【００５７】
翌朝、プレートを、ＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ７．５）で３回洗浄し、そしてＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ７．５）で１／２０００に希釈されたヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ抗体（Sigma Chemical Co, Poole, Dorset, UK Catalogue Number：Ａ−０５４５）を１００μｌ／ウェルで加えた。次に、プレートを４℃で４時間インキュベートした。４時間後、プレートを、ＰＢＳ／Tween ２０（０．５％）（ｐＨ７．５）で４回洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ基質オルトフェニレンジアミン＋尿素Ｈ2Ｏ2（クエン酸リン酸緩衝液ｐＨ＝５中）を１００ｕｌ／ウェルで加えた。３分後、１００ｕｌ／ウェルの０．１Ｍクエン酸の添加によって反応を止めた。次に、プレートを、分光測光プレートリーダーにおいて４５０ｎｍで読み取った。
【００５８】
実施例２−ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１受容体チロシンキナーゼの阻害剤でのヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の処置
ＨＵＶＥＣを、ＴＣＳ Cellworks, Buckingham, UK（カタログ番号ＺＨＳ８９６５）より入手し、そして Large Vessel Endothelial Cell Basal Medium ＋ＴＣＳ Cellworks（カタログ番号ＺＨＭ２９５１およびＺＨＳ８９６５）より入手される推奨補足物（recommended supplements）中で培養した。細胞は、３ｘ７５ｃｍ2の組織培養フラスコ中にほぼ密集した時点で用いた。阻害剤での処置前に、細胞を、補足物不含の Basal Medium 中で一晩培養した。
【００５９】
ＨＵＶＥＣを、次のように阻害剤で処置した。阻害剤を、Basal Medium 中で希釈し、培養物に１μＭの最終濃度で加え、細胞を３７℃で８２分間インキュベートした。８２分後、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを細胞に加え、それら細胞を３７℃で更に８分間インキュベートした。この追加のインキュベーション後、培地を細胞から除去し、細胞を２．５ｍｌの試料緩衝液［試料緩衝液：４部のＮｕＰａｇｅ試料緩衝液（Novex，ＮＰ０００７，Invitrogen, Paisley, Scotland）対１部の蒸留水］で溶解させた。その溶解産物を集め、３μｌのβ−メルカプトエタノールを加え、９５℃で１０分間加熱して、確実に完全に還元させ且つ変性させた。溶解産物は、分析されるまで−２０℃で貯蔵することができる。
【００６０】
実施例３−溶解産物のＳＤＳ  ＰＡＧＥ
溶解産物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて分析して、溶解産物中のタンパク質を分離した。電気泳動は、４〜１２％ＮｕＰａｇｅビストリスゲル（Invitrogen, Paisley, Scotland, UK，カタログ番号ＮＰ０３２１）およびＮｕＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ Running Buffer（Invitrogen, Paisley, Scotland, UK, カタログ番号ＮＰ０００１）を用いて行った。電気泳動後、タンパク質を、ゲルからニトロセルロース膜へと、Novex ブロッティングモジュールを製造者の指示（Invitrogen, Paisley, Scotland, UK, カタログ番号ＬＣ２００１）によって用いて移した。次に、それら膜を、Ponceau Ｓ（Sigma, Poole, Dorset, UK. カタログ番号Ｐ−７１７０）で染色し、密封バッグ中において４℃で保管自然乾燥（store air-dried）させた。
【００６１】
実施例４−抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体でのニトロセルロース膜の処置
ニトロセルロース膜を、ＰＢＳＴ［Marvel／ＰＢＳＴ］中５％脱脂粉乳溶液中において室温で１時間インキュベートした。１時間後、その膜を、Marvel／ＰＢＳＴ中で１：１００に希釈された抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体と一緒に室温で２〜３時間インキュベートした。この時間後、膜をＰＢＳＴで少なくとも５分間４回洗浄後、膜を適当な二次抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した抗ウサギ抗体ＮＥＢ；１：２０００の希釈で用いられる）と一緒に室温で１時間インキュベートした。次に、膜を、少なくとも４回交換するＰＢＳＴを用いて３０分間洗浄し、Lumiglo 試薬（Cell Signaling Technology Inc,Cummings Center, Beverly, MA. USA）と一緒に指示通りインキュベートした。次に、それら膜をＸ線フィルムに露出させ、フィルムを現像して、抗ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１抗体に反応性のバンドを示した。Lumiglo は、西洋ワサビペルオキシダーゼの作用によって化学発光化合物に変換される基質を含有する試薬の所有者混合物（proprietory mixture）である。これによる光を、写真フィルム、例えば、Kodak Biomax ＭＬによって検出する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、ＫＤＲ受容体チロシンキナーゼ阻害剤４−［（４−フルオロ−２−メチル−１Ｈ−インドール−５−イル）オキシ］−６−メトキシ−７−（３−ピペリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリンの増加濃度に応答したＹ１２１４エピトープのリン酸化の用量依存性減少を示し；列Ｏ＝未処置ＨＵＶＥＣ細胞溶解産物、列Ｖ＝ＶＥＧＦ被処置ＨＵＶＥＣ細胞溶解産物であり、残りの列は、ＶＥＧＦ被処置細胞への０．００７〜５．０ｕＭ化合物の作用を示している。矢印は、膜上のＫＤＲの位置を示す。
【配列表】
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【図１】
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【国際調査報告】
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