(57)【要約】ペプチド模倣物タンパク質結合アレイ、その製造、使用、適用が提供される。本発明のタンパク質結合アレイ要素としては、安定したアンカーを通した固体支持体に連結されたペプチド模倣物セグメントが挙げられる。本発明は、ペプチド模倣物アレイ要素ライブラリー合成、アレイ要素の固体平面基材への配置およびスポッティング、複雑なタンパク質混合物の標識、ならびにアレイへの差異のあるタンパク質結合の解析を含む。本発明は、アレイスクリーンにより差異があると同定されるタンパク質の、その後のシークエンスまたは構造解析も可能にする。本発明に従ったプロテオミクスマイクロアレイを含めたキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固体支持体の表面に安定して結合されるタンパク質結合剤のアレイであって、
有機化学的に修飾された誘電体コーティング反射金属を含む、実質的に平面の表面を有する、固体基材、
該基材に結合した複数の異なるタンパク質結合剤であって、該タンパク質結合剤のそれぞれが、以下：
基材表面に安定して結合する、固着セグメント、
ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、および
該固着セグメントおよびペプチド模倣物セグメントを結合および分離する、リンカーセグメント、
を含む、タンパク質結合剤、
を含む、タンパク質結合剤のアレイ。
【請求項２】
前記基材は、前記固着セグメントの下のガラス表面に、有機化学的に修飾された誘電体コーティング反射金属を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記金属が、アルミニウム、金、またはチタンである、請求項２に記載のアレイ。
【請求項４】
前記金属はアルミニウムであり、前記誘電体はＳｉＯ２であり、前記修飾有機化合物はアミノシランである、請求項２に記載のアレイ。
【請求項５】
前記アミノシランは、マレイミドで官能化されている、請求項４に記載のアレイ。
【請求項６】
前記ペプチド模倣物セグメントはペプトイドである、請求項２に記載のアレイ。
【請求項７】
前記リンカーセグメントは、Ｃ２〜Ｃ１００脂肪鎖、ポリエチレンオキシド、および直交ペプチド模倣物またはペプチドオリゴマーからなる群ら選抜される、請求項２に記載のアレイ。
【請求項８】
前記固着セグメントはチオールである、請求項２に記載のアレイ。
【請求項９】
さらに、非タンパク質、ポリマーまたはオリゴマーの化学ブロッキング剤をアレイ要素の間の基材表面上に含む、請求項１で記載のアレイ。
【請求項１０】
前記化学ブロッキング剤は、ポリエチレングリコール、または基材表面に結合するために１つ以上の末端修飾を有するアナログ、および非特異的タンパク質結合を阻害するペプトイドベースポリマーまたはオリゴマーからなる群から選択される、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１１】
前記化学ブロッキング剤は、タンパク質ブロッキング剤と合わされる、請求項９に記載のアレイ。
【請求項１２】
固体支持体の表面と安定して会合される複数の異なるタンパク質結合剤を含むアレイを作製する方法であって、該方法は、
有機化学的に修飾された誘電体コーティング反射金属を含む、実質的に平面の表面を有する固体基材を接着するために調製する工程；および
複数の異なるタンパク質結合剤と該基材とを、該タンパク質結合剤が該基材表面に結合するために十分な条件下において接触させる工程であって、該タンパク質結合剤のそれぞれが、以下：
基材固着セグメント、
ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、および
該固着セグメントとペプチド模倣物セグメントを結合および分離する、リンカーセグメント、を含み、それにより該アレイが作製される、工程、
を包含する、アレイを作製する方法。
【請求項１３】
前記接触する工程は、前記タンパク質結合剤のそれぞれの溶液の液滴を前記基材表面上の異なる位置に、該タンパク質結合剤の該基材表面に対する結合が、該小滴が蒸発する前に完全になるような条件下でスポッティングする工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記基材は、前記固着セグメントの下のガラス表面上の有機化学的に修飾された誘電体コーティング反射金属を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記金属は、アルミニウム、金、チタン、白金、銅、またはロジウムのうちの１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記金属はアルミニウムであり、前記誘電体はＳｉＯ２であり、前記修飾有機化学物質はアミノシランである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノシランは、マレイミドで官能化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチド模倣物セグメントはペプトイドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンカーセグメントは、Ｃ２〜Ｃ１００脂肪鎖、ポリエチレンオキシド、および直交ペプチド模倣物またはペプチドオリゴマーからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記固着セグメントはチオールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、非タンパク質ポリマー化学ブロッキング剤をアレイ要素の間の前記基材表面に適用する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記化学ブロッキング剤が、ポリエチレングリコール、または前記基材表面に結合するために１つ以上の末端修飾を有するアナログ、および非特異的タンパク質結合ペプトイドベースポリマーからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学ブロッキング剤が、タンパク質ブロッキング剤と合わせられる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
差示的結合アッセイを行う方法であって、該方法は、以下：
タンパク質含有生物学的サンプル溶液中のタンパク質を標識する工程；
該標識されたタンパク質含有生物学的サンプル溶液のアリコートを、請求項１に記載のアレイと接触させる工程；および
該アレイを解析して、該アレイのタンパク質結合剤に対する該サンプル中にあるタンパク質の差示的結合を決定する工程、
を包含する、差示的結合アッセイを行う方法。
【請求項２５】
前記アレイにおいて、前記金属はアルミニウムであり、前記誘電体はＳｉＯ２であり、前記修飾有機化学物質はアミノシランである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アミノシランは、マレイミドで官能化される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アレイにおいて、前記ペプチド模倣物セグメントはペプトイドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、非タンパク質ポリマー化学ブロッキング剤を、アレイ要素の間の前記基材表面上に適用する工程を包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学ブロッキング剤が、ポリエチレングリコール、前記基材表面上に結合するために１つ以上の末端修飾を有するアナログ、および非特異的タンパク質結合ペプトイドベースポリマーからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学ブロッキング剤は、タンパク質ブロッキング剤と合わせられる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記アレイにおいて、前記金属は、ガラススライド上に被覆されたアルミニウムであり、前記ＳｉＯ２コーティングは、約８００Åの厚さの二酸化ケイ素である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記金属は、ガラススライド上に被覆されたアルミニウムであり、前記ＳｉＯ２コーティングは約８００Åの厚さの二酸化ケイ素である、請求項５に記載のアレイ。
【請求項３３】
前記金属は、ガラススライドに被覆されたアルミニウムであり、ＳｉＯ２コーティングは約８００Åの厚さの二酸化ケイ素である、請求項９に記載のアレイ。
【請求項３４】
前記アレイにおいて、前記金属は、ガラススライド上に被覆されたアルミニウムであり、前記ＳｉＯ２コーティングは約８００Åの厚さの二酸化ケイ素である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
前記アレイにおいて、前記金属は、ガラススライド上に被覆されたアルミニウムであり、前記ＳｉＯ２コーティングは約８００Åの厚さの二酸化ケイ素である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
差示的結合アッセイを実行する際に使用するためのキットであって、
該キットは、以下：
アレイであって、以下：
有機化学的に修飾された誘電体コーティング反射金属を含む実質的に平面の表面を有する、固体基材；
該基材に結合された複数の異なるタンパク質結合剤であって、該タンパク質結合剤のそれぞれが、
該基材表面に安定して結合される、固着セグメント、
ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、
該固着セグメントおよびペプチド模倣物セグメントを連結および分離する、リンカーセグメント、
を含む、タンパク質結合剤；ならびに
結合アッセイ試薬、
を含む、キット。
【請求項３７】
前記アレイにおいて、前記金属はアルミニウムであり、前記誘電体はＳｉＯ２であり、前記修飾有機化学物質はアミノシランである、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記アミノシランは、マレイミドで官能化される、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記アレイにおいて、前記ペプチド模倣物セグメントはペプトイドである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
さらに、アレイ要素間の前記基材表面に結合される非タンパク質ポリマー化学ブロッキング剤を含む、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記化学ブロッキング剤は、ポリエチレングリコール、または前記基材表面に結合するために１つ以上の末端修飾を有するアナログ、および非特異的タンパク質結合ペプトイドベースポリマー、からなる群から選択される、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記化学ブロッキング剤は、タンパク質ブロッキング剤と合わせられる、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記アレイにおいて、前記金属はガラススライド上に被覆されたアルミニウムであり、前記ＳｉＯ２コーティングは約８００Åの厚さの二酸化ケイ素である、請求項４０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、細胞産物解析および材料に関する。１つの実施形態では、本発明は、プロテオミクスマイクロアレイおよびプロテオミクス解析を実施するためのそれらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロアレイ技術が、専門的下位分野から、分子生物学、微生物学、薬学、農学、およびその他多くのバイオテクノロジーにおける基礎研究ならびに応用研究のための重要な道具に発達してきた。ＤＮＡマイクロアレイ技術は、生物または細胞のゲノムを発現された表現型あるいはタンパク質機能に関連付けることを試みるものである。
【０００３】
マイクロアレイ技術に関する圧倒的な出版物および特許文献は、ガラススライドといった固体表面（しばしば「チップ」と称される）に提示される、ＤＮＡのアレイ（またはｃＤＮＡあるいはＲＮＡといったその他の核酸の形態）を記載する。アレイになったＤＮＡは、代表的には短いオリゴヌクレオチド（例えば、約８〜２５塩基）またはより長いクローンあるいはＰＣＲ産物（約５００〜２０００塩基）の形態をとる。前者は代表的には固体支持体上に合成され、一方、後者はアレイフォーマットの固体支持体へ機械的に「スポットされる」。
【０００４】
固体表面上のペプチドおよびタンパク質アレイの報告はあるものの、これらはＤＮＡアレイと比較してこれまで注意を引くことがあまりなかった。これは、界面および複雑な生物学的マトリクスの存在下でこれらの物質が本質的に不安定であることによると思われる。例えば、固体表面との接触によって多くのタンパク質が変性することは、周知である。タンパク質と同様、ペプチドも、解析される生物サンプル中に存在し得る任意のプロテアーゼによる加水分解を受けやすい。加えて、ペプチドアレイは、代表的には光リソグラフィー法を使って固体表面にインサイチュで合成される。これらの技術には、各チップのために設計され、製造されなければならない高価な特注のマスクの使用が、必要とされる。さらに、作製される微量のペプチドに起因して、表面合成ペプチドの化学的な特徴付けを実施することは、ほぼ不可能である。
【０００５】
現在、生物サンプルのプロテオーム解析の最も一般的な方法は、二次元電気泳動を行うことである。この方法は、結果が実験プロトコール（例えば、ゲルの展開時間（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｔｉｍｅ）およびその他のパラメーター）に非常に左右されやすいので、問題がある。そのため、二次元電気泳動ゲルから再現性のあるデータを得ることは非常に難しい。それらのゲルに使われる銀染色の感度は制限されていて、マイクロアレイ技術で使用される蛍光標識の感度よりも低い。
【０００６】
このように、タンパク質の状況において有用な効果的なマイクロアレイ技術の発達が、非常に必要とされる。多くの場合、機能的な経路は、特定の遺伝子と直接関連付けることは出来ない。タンパク質はしばしば様々な翻訳後修飾、相互作用、または分解を受け、それらが最終的に機能を決定する。タンパク質量の一見単純な評価ですら、対応するｍＲＮＡのレベルと直接相関され得ない。唯一の解決法は、タンパク質レベルにおける細胞、組織、または生物の状態を評価することである。それゆえ、細胞、組織、血清などの複雑な混合物におけるタンパク質の差異の迅速な表示を可能にする高スループット形式が、ＤＮＡマイクロアレイ技術に対する強力な対照物および補完物を提供すると思われる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
上述したことを達成するため、本発明は、ペプチド模倣タンパク質結合アレイ、その製造、使用、および適用を提供する。本発明のタンパク質結合アレイ要素は、ペプチド模倣物セグメント、アンカーセグメント、ならびにペプチド模倣物セグメントとアンカーセグメントを接続するリンカーセグメントを含む。本発明は、ペプチド模倣物アレイ要素ライブラリー合成、固体平面基材へのアレイ要素の配置およびスポッティング、複雑なタンパク質混合物の標識、ならびにアレイに対する差示的タンパク質結合の解析を企図する。本発明はまた、アレイスクリーンによって差示的であると同定されるタンパク質の、濃縮または精製、およびその後の配列決定または構造解析も可能にする。本発明に従ったプロテオミクスマイクロアレイを含むキットも、提供される。
【０００８】
１つの局面では、本発明は、固体支持体の鏡面表面に安定して結合されたタンパク質結合剤のアレイに関する。アレイは、有機化学的に修飾された誘電体コーティング反射金属を含む実質的に平面な表面を有する固体基材、および基材に結合された、複数の異なるタンパク質結合剤を含む。それぞれのタンパク質結合剤は、基材表面に安定して結合された固着セグメント、ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、ならびに固着セグメントとペプチド模倣物セグメントを接続および分離するリンカーセグメントを含む。アレイは、アレイ上に展開されるサンプル内のタンパク質の非特異的結合を防止するために、化学ブロッキング剤を包含し得る。
【０００９】
別の局面では、本発明は鏡面固体支持体の表面と安定して会合される、複数の異なるタンパク質結合剤を含むアレイ作製法に関する。この方法には、有機化学的に修飾された、誘電体コーティング反射金属を含む実質的に平面の表面を有する固体基材を結合するために調製する工程、およびタンパク質結合剤が基材表面に結合されるために十分な条件下において、複数の異なるタンパク質結合剤の基材とを接触させる工程が包含される。それぞれのタンパク質結合剤は、基材表面に安定して結合された固着セグメント、ペプチド模倣タンパク質結合剤、および固着セグメントとペプチド模倣物セグメントを接続および分離するリンカーセグメントを含む。アレイに展開されたサンプル内のタンパク質の非特異的結合を防止するように設計された化学ブロッキング剤も、アレイに適用され得る。
【００１０】
本発明の、これらおよびその他の特徴ならびに利点は、本発明の以下の明細書、および本発明の原理を例示する添付の図の中で、より詳細に示される。
【００１１】
（発明の具体的実施形態の説明）
本発明の、材料、関連技術および関連装置は、本明細書中にいくつかの実施形態を参考にして記載されることになる。記載される実施形態の重要な特性および特徴は、本文の構造および付随の図に示される。本発明は、これらの実施形態に関連して記述されることとなるが、本発明が、これらの実施形態に限定されることを意図していないことは理解されよう。逆に、改変、修飾、および同等のものを、本発明の趣旨および範囲の中に含まれ得るものとして保護することが、意図される。以下の記載では、複数の具体的詳細が、本発明の全体の理解を提供するために、示される。本発明は、これらの特定の詳細のいくつかまたは全ての範囲外で実施され得る。他の例において、周知の過程操作は、本発明を不必要に不明確にしないために、詳細には記載されていない。
【００１２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」（１つの）、「ａｎ］（１つの）、および「ｔｈｅ」（その）は、その内容が明確に別のことを記載する場合以外は、複数の言及を包含する。別の状況で規定されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術的および学術的用語は、本発明の属する当該分野の当業者に普通に理解されているものと同一の意味を有する。
【００１３】
（導入）
本発明は、ペプチド模倣タンパク質結合アレイを、その製造、使用、および適用の方法とともに提供する。本発明のタンパク質結合アレイ要素は、安定なアンカーを用いて固体支持体に連結された、ペプチド模倣物セグメント（例えば、ペプトイド）を含む。１つの実施形態では、本発明は、ペプチド模倣物アレイ要素ライブラリー合成、固体平面基材へのアレイ要素の配置およびスポッティング、複雑なタンパク質混合物の標識、ならびに標識された純粋なタンパク質または複雑なタンパク質子混合物をペプチド模倣物アレイに接触させることによる、単一のタンパク質結合または差示的タンパク質結合の解析を提供する。そのような解析は、がん、ＨＩＶ、または糖尿病といった疾患に関連した新規治療標的の同定を導き得る。その後、これらの新規標的は、新規の薬物候補を探索するために、ハイプットスルースクリーニングアッセイで使用され得る。本発明は、アレイスクリーンによって差示的であると同定されるタンパク質の、濃縮または精製、およびその後の配列決定または構造解析も可能にする。アレイは、（タンパク質精製あるいはハイプットスルーアッセイの発達のため、）目的のタンパク質に対する新規合成リガンドまたは目的の抗体に対する合成抗原を同定するためにも使用され得る。それらは、新規の酵素阻害剤もしくは薬物標的のその他の高親和性リガンドを探索するために、または新規治療法のための最初の足場としても使用され得る。本発明に従ったプロテオミクスマイクロアレイを包含するキットも、提供される。
【００１４】
（１．タンパク質結合剤アレイ）
本発明に従ったペプチド模倣物アレイは、固体支持体の表面に結合されたタンパク質結合剤を含む多くの異なるアレイ要素から構成される。異なるタンパク質結合剤アレイ要素はそれぞれ、基材表面に結合された固着セグメント、ペプチド模倣タンパク質結合セグメント、ならびに固着セグメントとペプチド模倣物セグメントを接続および分離するリンカーセグメントを含む。本明細書中で使用されるように、「ペプチド模倣物」は、アッセイ条件下でタンパク質−タンパク質間またはタンパク質−ペプチド間の物理的および／または化学的相互作用に類似の様式で、タンパク質または受容体と検出可能に相互作用する、非ペプチド合成ポリマーまたはオリゴマーを指す。固着セグメントは、代表的には、固着基と基材表面の間の会合、従って基材表面上のタンパク質結合剤の濃度および密度が、例えば、本明細書中に記載されたように、マイクロアレイが通常の操作条件でさらされる処理過程で維持されるように基材表面に結合される。アレイの表面に存在するタンパク質結合剤の異なる化学種の数は、少なくとも２、または少なくとも１０、または少なくとも１００であり、さらに多く、一般に少なくとも約１，０００、または少なくとも約５，０００、約５０，０００までであり得、例えば、さらに本明細書の下項に記載したように、約５，０００から約１０，０００の間であり得る。
【００１５】
図１Ａおよび１Ｂは、そのようなアレイ要素の表示および本発明に従ったアレイを提供する。図１Ａでは、タンパク質結合アレイ要素１００は、３つのセグメントを包含する：ペプチド模倣物セグメント１０２、アンカーセグメント１０４、およびリンカーセグメント１０６。アレイ要素は、そのアンカーセグメント１０４と基材表面１１０との間の結合によって、固体支持体または基材１０８に結合される。いくらかの場合では、基材は、積層体を形成している複数の層１１２ａ、１１２ｂ、１１２ｃから構成され得る。図１Ｂでは、タンパク質結合アレイは、図１Ａに図示したように、平面の基材１０８に結合された、複数の異なるアレイ要素１００を包含する。アレイのそれらの要素のそれぞれは、別々に以下により詳細に記述される。
【００１６】
（Ａ．基材）
本発明に従ってアレイに使用される固体支持体（図１Ａおよび１Ｂ、要素１０８）は、作製されるべき製品の意図される使用に依存して、大きく異なり得る。固体支持体は、アレイが使用される任意の解析法にも適合する、タンパク質結合剤を結合するための任意の適切な材料であり得る。適合性は、表面または材料化学の分野の当業者に公知の方法および材料を用いて決定され得る。１つの実施形態では、固体支持体は、不透水性の硬い材料を含む。適切な材料としては、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリカーボネートといったポリマー、および、例えば、塩化ビニル／プロピレンポリマー、塩化ビニル／酢酸ビニルポリマー、スチレンコポリマーなどの前述のポリマーのコポリマーといったプラスチックが挙げられる。適切な材料としては、石英から形成されるようなガラス、またはシリコン；および、例えば、金、白金、銀、銅、アルミニウム、チタン、クロムなどの金属（合金も含む）も挙げられる。
【００１７】
上述のように、目的の多くの実施形態では、固体支持体または基材１０８は、２層以上の異なる材料の層の複合材であり得る。ここで、その組成は、例えば、図１Ａの要素１１２ａにより表示されるように少なくとも１つの基材材料、および図１Ａの要素１１２ｂおよび１１２ｃによって表示されるように１つ以上の表面コーティング材料を含む。例えば、目的の１つの実施形態は、ガラスといった基材材料１１２ａを包含し、これは、金属層１１２ｂ（例えば、金またはアルミニウム（二酸化珪素でオーバーコーティングされる）あるいはチタン（二酸化珪素でオーバーコーティングされる））および官能化された有機層１１２ｃ（例えば、アミノ改変チオールまたはアミノ改変シラン）でコーティングされる。平面の固体支持体は、例えば、大きさが標準的な３インチ×１インチ（３”×１”）の顕微鏡のスライドであり得るし、半径が３インチ（３”）または５インチ（５”）の円形のウェハの形状であってよい。その他の形態は、表面化学分野または材料化学分野の当業者に明らかである。
【００１８】
固体支持体材料または基材は、材料の意図される使用に応じて、様々な異なる形態を取り得る。このように、最も広い意味で、支持体または基材材料は、プレート、シート、円錐型、チューブ、ウェル、ビーズ、ナノ粒子（例えば、約５〜１００ｎｍ）、ウェーハーなどの形態であってよい。いくつかの実施形態では、基材支持材料は、例えば、プレート、スライド、シート、ディスクなどの状態で見られるように、少なくとも１つの実質的に平面の表面を有するものである。これらの実施形態では、長方形またはディスクの形態といった、全体がスライドまたはプレートの形態を有する支持体が、使用される。
【００１９】
上述のスライドの、平面で矩形の実施形態では、支持体の長さは、一般に少なくとも約１ｃｍであり、約４０ｃｍ以上の長さであり得るが、通常は約３０ｃｍを超えず、しばしば約２０ｃｍを超えないこともある。支持体の幅は、一般に、少なくとも約１ｃｍであり、約４０ｃｍほどの幅であり得るが、通常は３０ｃｍを超えず、しばしば約２０ｃｍを超えない。支持体の高さは、硬い基材が加工される材料および必要な硬さを提供するために必要とされる材料の厚さに少なくとも部分的に依存して、一般に約０．０１ｍｍ〜約１０ｍｍの範囲である。多くの実施形態では、標準的な顕微鏡のスライドの大きさを有する支持体が、特に目的にかなう。代表的な基材の大きさは、約２．５４ｃｍ×７．６２ｃｍおよび厚さ約１〜２ｍｍである。しかし、任意の適切な寸法が、使用され得る。
【００２０】
支持体がビーズ、ナノ粒子またはミクロ粒子の場合は、支持体の直径は、代表的には、約５ｎｍ〜約１０００μｍの範囲であり、特に約１０ｎｍ〜約５００μｍの範囲である。
【００２１】
タンパク質結合剤は、（以下の図４Ａを参照して、より詳細に図示および記載するように）無機固体表面層１１２ａまたは１１２ｂに直接接着するか、（以下の図４Ｂを参照して、より詳細に図示および記載するように）官能化有機層１１２ｃを用いて結合され得る。後者の場合は、層の有機分子の非基材結合末端は、後に結合されたタンパク質結合剤の固着基に結合し得る反応基で官能化される。適切な末端反応基は、アンカーの官能基に応じて、例えば、マレイミド、ヒドラジド、アミノオキシ、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、無水物、アルデヒド、ジスルフィド、チオール、アジド、ホスフィン、またはアビジン、ストレプトアビジン、ニュートロアビジン、またはビオチンを結合するタンパク質アビジンのその他の改変体であり得る。
【００２２】
ガラスといった基材支持体材料の表面が、アルミニウム、金、チタンといった金属の薄層でコーティングされるそれらの実施形態では、金属層の厚さは、一般に、約３００Å〜約１０，０００Åの範囲、より具体的には約７５０Å〜約２，０００Åの範囲、さらに具体的には約１，０００Å〜約１，５００Åの範囲である。金属層は、当業者に公知のように、電子ビーム蒸着、蒸着、スパッタリングなどを含む、任意の適切なプロトコールを使用して基材表面上に被覆され得る。接着金属層（ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｅｔａｌ  ｌａｙｅｒ）は、金属層と基材との間に存在し得る。ここで、目的の接着金属としては、チタン、クロムなどが挙げられる。存在時には、接着金属層の厚さは、代表的には、約５Åと約１００Åの間の範囲、通常は、約２５Åと約７５Åとの間の範囲、多くの実施形態では、約５０Åである。いくつかの実施形態では、上述の接着層は、分子接着層であり得る。本発明に従って分子接着層を形成するために適切な材料の例としては、当該分野で公知のように、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｅｔｈｙｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、その他のメルカプトアルコキシシラン（例えば、メルカプトプロピルトリメトキシシラン、メルカプトプロピルトリクロロシラン、またはメルカプトヘキシルトリエトキシシランなどのその他の鎖長のもの、およびその他のメルカプトヘキシルアルコキシシランが挙げられる。接着層が分子接着層である場合、接着層の厚さは、代表的には約５Å〜約５０Åｍｐ範囲である。
【００２３】
タンパク質結合剤の固着基は、無機基材表面（例えば、金属またはガラス）にタンパク質結合剤を直接結合するために、使われ得る。例えば、チオール固着基は、金、銀、銅、または白金などの金属に、介入する官能化層（例えば、マレイミド／アミン／チオール）なしで直接結合するために使用され得る。または、アンカー基が、活性化シラン（つまり、他の有機種、例えば、加水分解性シラン、またはヒドロキシルもしくは他のシランと縮合して、シロキサン結合を形成し得る修飾シラン（例えば、クロロシランまたはアルコキシシラン）と反応性であるように改変されている）である場合、タンパク質結合剤は、ガラスまたは他の酸化物表面（例えば、酸化チタン、酸化ケイ素、または酸化アルミニウム）に直接結合され得る。この目的のための他の活性化シランとしては、トリエトキシシラン、トリクロロシラン、トリメトキシシランまたは他のトリアルコキシシランが挙げられる。それぞれの分類の範囲内で、鎖長は、例えば、３原子〜約１８原子までであり得る。
【００２４】
より詳細に以下に記載されるように、基材の無機表面へ直接タンパク質結合剤を結合する場合、（ペプチド模倣物とアンカーとの間の）タンパク質結合剤のリンカーセグメントは、その表面が、ペプチド模倣物で（その後）起こるタンパク質結合を妨害しないように、ペプチド模倣物を、硬い基材表面から十分に離れたままにするに十分な長さであるべきである。その長さは、例えば、約２原子〜約２００原子、または約２Å〜約３００Åであり得る。代表的なリンカーセグメントは、約２〜約３０原子の間、好ましくは約６〜約１２原子の骨格を持ち得る。リンカーセグメントは、例えば、安定して誘導体化された脂肪鎖（例えば、アミノヘキサン酸などのアミノアルカン酸、（例えば図１Ｃに示したような）エチレンオキシド、スルホキシド、またはアレイの各要素に対して一定のままにする「非結合」（直交）短鎖ペプトイドもしくはペプチド要素（例えば、グリシンへプタマー）、あるいはそれらの要素のいくつかの組み合わせから構成され得る。
【００２５】
上述のように、タンパク質結合剤は、官能化有機層（図１Ａ、要素１１２ｃ）、例えば、アミノ改変チオール（アミノチオール）（いくつかの金属基材表面で使用するため）またはアミノ改変シラン（アミノシラン）（ガラス、金属もしくは他の酸化物基材表面で使用するため）を使用して接着され得る。そのような有機層が使われる場合、層の有機分子の末端は、一方の末端が基材表面に安定して結合し得る反応基、もう一方の末端が本発明に従うその後結合されるタンパク質結合剤のアンカーセグメントに安定して結合し得る反応基で官能化される。適切な末端基としては、例えば、アンカーに存在するチオールとの反応時に共有結合を形成し得るマレイミドが挙げられる。そのような合成固着システムのさらなる利点は、長期の保存期間を付与するそれらの安定性である。基材上にあり得る他の末端基としては、ヒドラジド（アンカーのアルデヒド部分またはケトン部分と共有結合を形成するために反応できる）；アミノオキシ（アンカーのケトン部分と共有結合を形成するために反応できる）；アルデヒド；ジスルフィド；チオール；アジド；ホスフィンが挙げられる。
【００２６】
別の実施形態では、アビジン、ストレプトアビジン、または他のアナログのようなタンパク質は、固体支持体のためのコーティングとして使用され得る。この場合、ビオチンが、表面上でのアビジンとの安定な非共有結合複合体を形成するために、タンパク質結合剤の固着部分として使用される。特定の作用理論により結合されることが望まれない場合、この形式は、特に生体適合性の環境の中で、提示分子とそれらの隣接する分子との間の望ましい距離、および提示分子と固体表面との間の望ましい距離をもって、タンパク質結合剤を提示していると考えられる。十分に低分子固着基を結合するのであれば、他のタンパク質コーティングも使用され得る。それらとしては、抗ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン、抗ジニトロフェノール／ジニトロフェノール、または当該分野で公知の多くの他のタンパク質／低分子対が挙げられ得る。アビジン／ビオチンは、その非常に安定な結合相互作用のため、特に価値がある。加えて、実質的なシグナル増加は、本発明に従った他の適切な固定化技術と比較して、（例えば、チオール／マレイミドより１０００倍高いことが）ビオチン／アビジン固定化について観察されている。適切な合成高分子はまた、このようなタンパク質スペーサーの模倣物として使用され得る。これらとしては、ポリエチレンイミン、デンドリマー、ポリアクリル酸、ポリリジンなどのような高分子量ポリマーが挙げられ得る。
【００２７】
当然、この特性（すなわち、上述のように、マイクロアレイが、通常の操作条件下にさらされる過程の間、結合を維持するために十分に適切な）他の適切な結合の組み合わせも、可能である。加えて、表面化学分野の当業者は、ペプトイド上の上記に列挙した固着基が表面上の反応基として機能し得、この反応性表面基が、ペプチド模倣固着基としても機能し得ることが理解される。
【００２８】
本発明の１つの実施形態では、アルミニウムスライドは、約５００Å〜約２，０００Åの間の厚さを有する二酸化ケイ素または一酸化ケイ素の層でコーティングされ得る。厚さは、放出光または励起光の波長の１／４におよそ対応するように選択される。アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）といったアミノアルキルトリアルコキシシラン、トリクロロシラン、トリメトキシシラン、および任意の他のトリアルコキシシランの層は、酸化物の表面にコーティングされる。加えて、他のアミノシランが、例えば、表面化学分野の当業者により理解されるように、より秩序立てられたシラン層を形成し得る、より長いアルキル基（例えば、オクチル、デシル、ヘキサデシルなど）を有する化合物が、使用されうる。このシラン層の厚さは、約３Å〜約１００Å、より好ましくは約５Å〜約５０Å、さらに好ましくは７Å〜約２０Åであり得る。１つの適切な例は、厚さ約７ÅのＡＰＳ層である。アミノ改変Ａｌ表面は、タンパク質結合剤上のアンカー官能基に結合する反応基で官能化され得る。１つの実施形態では、その官能基は、マレイミドであり得る。別の実施形態では、その官能基は、アビジンといったタンパク質全体であり得る。アビジン提示基材の実行は、以下の実施例３の図７Ａおよび７Ｂを参照して記載される。
【００２９】
別の実施形態では、金被膜の基材スライド（またはＡｇ、Ｐｔ、またはＣｕといった金属−チオール結合を形成できる任意の金属で表面を被覆したスライド）は、マレイミドといったタンパク質結合剤上のアンカー官能基に結合する基で官能化されるアミノチオール層でコーティングされ得る。しかし、アンカー官能基および表面結合反応基は、直交反応性を有するように選択されるべきである。上述のように、これらのアンカーおよび基材結合基は、当業者により容易に理解され得るように、交換され得る。
【００３０】
一般に、官能化有機層１１２ｃは、実質的に均一の疎水性表面を有することによって特徴付けられる。均一とは、層の表面が、割れ目、ピンホールなどの不均質性を実質的に含まないことを意味する。層１１２ｃの厚さは、相当に変えることができ、ここでこの厚さは、約５，０００Å未満、通常約２，０００Å未満であり得るが、さらに薄くし得、特に約５Å〜約１００Å、約２０Å〜約５０Åの間であり得る。
【００３１】
支持体材料が官能化された有機層の下に金属層を含む、例えば、支持体材料が上述のように金コーティング顕微鏡スライド上のアミノ改変チオール層である、少なくともそれらの実施形態では、有機層の厚さは、有意なシグナルのクエンチング（すなわち、シグナルの意味のある検出を効率的に妨害するに十分な大きさのシグナルクエンチング）が生じないように、基材表面上の金属層から十分な距離で表面に存在し得る、任意の蛍光標識された部分を分離するために、層１１２ｃが少なくとも十分に厚いように選択される。これらの実施形態では、官能化された有機層は、少なくとも約３０Åであり、通常は少なくとも約５０Å、さらに通常は少なくとも約１００Åである厚さを有し得る。あるいは、クエンチングが起こる場合には、スライドを、０．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．０８５Ｍクエン酸ナトリウムといった高濃度の塩溶液で処理し得る（例えば、ＰＴＣ出願ＷＯ０１／０１１４２号を参照のこと）。
【００３２】
アレイが、蛍光で標識された標的とともに使用されるそれらの実施形態では、下記により詳細に記載されるように、官能化されたアミノ改変チオール層の厚さが、放射シグナルおよび反射シグナルの最大増幅を提供するために選択され得る。米国特許第５，０５５，２６５号を参照のこと（その開示は本明細書中で参考として援用される）。そのような実施形態では、有機層の厚さは、標識からの放射光の波長の約１／４である。有機層の実際の厚さは、使用される特定の標識に応じて、変化するが、その厚さは、一般に、約５０Å〜約３００Åの範囲であり、通常は約１００Å〜約２００Åの範囲であり、さらに通常は約１２５Å〜約１５０Åの範囲である。
【００３３】
１つの実施形態では、官能化アミノ改変チオール層１１２ｃは、少なくとも１つの自己アセンブリ単層（ＳＡＭ）を包含し得る。そのように、層が１つより多い自己アセンブリ単層を含む場合（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０１１４２号を参照のこと）、官能化有機層は、連続して互いにグラフト化された、１つ以上の異なる自己アセンブリ単層を含み得る。
【００３４】
上述の基材の中には、反射金属（例えば、アルミニウム、金など）の表面を有するもの（「鏡面基材」）がある。上述のように、本発明に従うアレイの使用のための適切な基材は、誘電体でコーティングされた鏡面表面を有し得る。基材は、一般に、複数の異なる材料の層の複合材である。この場合、その組成は、基部となる硬い、実質的に平面の固体支持体材料、および固体支持体上の複数の層を含む。固体支持体は、（反射金属の場合には）反射金属層を有し、または反射金属層でコーティングされる。「反射金属」とは、目的の波長領域（一般に可視（４００〜８００ｎｍ）、おそらく８００〜１１００ｎｍといった近赤外のより長い波長を含む）の入射光を少なくとも９０％反射し、殆ど（０％またはそれに近い）の光は媒質中に屈折しない金属のことを意味する。適切な例としては、アルミニウム、クロム、銅、金、銀、白金、チタン、ロジウムなどが挙げられる。
【００３５】
反射金属は、誘電体（例えば、酸化ケイ素または二酸化ケイ素（シリカ）またはアルミナまたはＭｇＦ２といったフッ化物または二酸化チタン）でオーバーコーティングされる。二酸化ケイ素は、多くの実施形態において好ましい。この層の厚さは、国際特許出願第ＷＯ９８／５３３０４号（あらゆる目的のために、本明細書中で参考として援用される）において詳述されている通り、蛍光種からのシグナルを最適化するように適合され得る。誘電体層（例えば、二酸化ケイ素）は、基材１０６へのアレイ要素１００の結合を容易にするに適切である、二官能性有機表面層（例えば、アミノ改変シラン）で官能化される。適切なアルミニウム／酸化物／アミノ−プロピルシラン（ＡＰＳ）でコーティングされたガラススライドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ）より市販されている。
【００３６】
以下の例１０に記載されるように、これらの鏡面基材は、特により従来からのガラススライド基材と比較して、増加した感受性に関して、性能上の利益があることが分かった。
【００３７】
（Ｂ．タンパク質結合剤）
上述の通り、本発明のタンパク質結合剤は、３つのセグメントから構成される：ペプチド模倣物セグメント、アンカーセグメント、およびペプチド模倣物セグメントとアンカーセグメントを連結しているリンカーセグメント。
【００３８】
本明細書中に使用されている通り、「ペプチド模倣物」は、アッセイ条件下でタンパク質−タンパク質間またはタンパク質−ペプチド間の物理的化学的相互作用に類似の様式で、タンパク質またはレセプターと検出可能に相互作用する、非ペプチド合成ポリマーまたはオリゴマーを表す。ペプチド模倣物は、一般にプロテアーゼ耐性であり、例えば、ペプトイドといったオリゴマー種、β−ペプチド、およびＡ．Ｅ．ＢａｒｒｏｎおよびＲ．Ｎ．Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ、Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ：ｉｎ−ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｌａｓｔｉｃｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １９９９、３（６）：６８１−７ならびにＫ  Ｋｉｒｃｈｅｎｂａｕｍ，Ｒ．Ｎ．ＺｕｃｋｅｒｍａｎｎおよびＫ．Ａ．Ｄｉｌｌ、Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｔｈｅ  ｍｉｍｉｃ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １９９９  ９（４）：５３０−５（このそれぞれの全体が本明細書中にあらゆる目的で参考として援用される）に記載される他のもの、ならびに拘束された環状分子（例えば、環状ペプチドおよび複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｌｅ））が挙げられる。いくつかの場合には、ペプチド模倣物は、天然タンパク質のフォールディングもまね得る。本発明に従うペプチド模倣物は、一般にわずか約５００マーを含有し、より具体的にはわずか約１００マーを含有し、代表的にはわずか５０マーを含有し、通常は約１０〜２０マーを含有し、より具体的には約１２〜約１６マーを含有する。本明細書中に提供されるパラメーターを考慮すれば、当業者は、過度の実験なくして、所定の適用に適切なペプチド模倣物の長さを選択することが出来る。
【００３９】
ペプチド模倣物ライブラリーならびにその設計および合成の例は、Ｆａｈａｄ  Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９８、９：２０５−２２３；Ｖｉｃｔｏｒ  Ｊ．Ｈｒｕｂｙら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １９９７、１：１１４−１１９；ならびにＡｍｙ  Ｓ．Ｒｉｐｋａら、Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １９９８、２：４４１−４５２（本明細書中で全ての目的でその全体が参考として援用される）の中に見出され得る。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、タンパク質結合剤のペプチド模倣物セグメントは、ペプトイドである。本明細書中で使用されるように、用語「ペプトイド」は、米国特許第５，８３１，００５号、同第５，８７７，２７８号、同第５，９７７，３０１号、同第５，８７１，３８７号、同第５，９８６，６９５号および同第５，７１９，０４９号；ならびに同時係属中の米国特許出願第０８／３４０，０７３号、同第０８／８３６，１６７号、同第０８／９２０，２０５号、同第０８／１２６，５３９号、同第０８／２７７，２２８号、同第０８／４５４，５１１号、同第０８／４８５，１０６号、同第０９／１３２，８２８号、同第０８／４８４，９２３号、同第０９／７０４，４２２号；ならびにＰＣＴ公開番号９６／１５１４３号および同第９３／０９１１７号（これらのそれぞれは、その全体が、全ての目的で、本明細書中に参考として援用される）に記載されているように、Ｎ−置換アミドを含むポリマーを表す。
【００４１】
固着セグメントは、固体表面へのアレイ要素の適切な結合を提供する。この官能基は、固体表面に提示され、リガンドに存在する側鎖に直交する（すなわち、実質的に側鎖とは反応しない）相補基に対して反応性であるように選択される。固着基の重要な特徴は、表面へのアンカー基の反応が、十分に容易であり、その結果、自動アレイスポッターにより表面へ被覆される液滴の平均寿命内で反応が完了する。例えば、表面がマレイミドを提示する場合、適切な固着基は、チオールであり、湿度約６０％で約１５〜２０分が、約１０ｎＬの液滴が蒸発する前に、結合反応の完了に必要とされる。もちろん、小滴の寿命は、温度、湿度、および他の条件によって変化し、より長いまたは短い反応時間が起こり得る。上述のように、その他の表面提示／アンカーの組み合わせが可能であり、アルデヒド固着基またはケトン固着基を有するヒドラジドの表面基が挙げられる。または、固着基はあまた、ビオチン分子であり得、アビジンタンパク質を提示する表面に強力に（しかし、非共有的に）結合する。
【００４２】
固着基は、ペプチド模倣物のどちらかの末端に結合され得る（ペプトイドの場合は、Ｃ末端またはＮ末端のどちらか）。アンカー基は、サブモノマー（ｓｕｂｍｏｎｏｍｅｒ）（例えば、置換アミン）として、または合成後のペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）側鎖の改変としてのいずれかで結合され得る。あるいは、別の例では、固着基は、ビーズにした固体支持体にペプトイドを連結するリンカーとして存在し得、この固体支持体の上にリンカーが合成される。このリンカーは、容易に利用できる固着基を提供するため、ペプトイドとともに樹脂から開裂される。いくつかの例は、標題Ｐｅｐｔｏｉｄｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ（２００１年４月６日出願）の同時係属中の米国特許出願第６０／２８２１１５号（これは、その全体が全ての目的で本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００４３】
タンパク質結合剤分子のリンカーセグメントは、ペプチド模倣物と分析物溶液（マイクロアレイが接触される溶液）の成分との相互作用を容易にするのに十分な、固体表面とペプチド模倣物セグメントとの分離を提供するように、例えば、表面上に提示されるペプチド模倣物リガンドへのタンパク質結合部位（特に深い結合ポケットを有するタンパク質）のペプチド模倣物の接近のときに（後に）存在するタンパク質結合を表面が妨害しないように、基材表面とペプチド模倣物との間の分離を提供することによって選択される。リンカーは、表面上のペプチド模倣物をそれぞれから分離するためにも機能し得、よってリガンドとタンパク質結合ポケットとの間の立体的障害の可能性を軽減する。代表的なリンカーセグメントは、約２〜約２００原子の間、好ましくは約６〜約３０原子の骨格を有し得る。
【００４４】
リンカーセグメントは、例えば、脂肪族鎖（例えば、アミノヘキサン酸といったアミノアルカン酸）、エチレンオキシド、スルホオキシドまたは「非結合」（「直交」）の短いペプトイドあるいはペプチドの要素から構成され得、これらのリンカーセグメントは、アレイの各要素、またはこれらの要素のいくつかの組み合わせに対して一定のままである。１つの実施形態において、２個の炭素のリンカーが使用され得る。別の実施形態においては、３つのエチレンオキシドが、使用され得る。非結合の短いペプトイドの例は、２マー〜１２マーであり、例えば、各タンパク質結合剤に対して一定のままである４マーのメトキシエチル側鎖であるが、一方、ペプチド模倣物セグメントは、可変である。適切な直交ペプチドリンカーは、２マー〜１２マーであり、例えば、５マーのグリシンである。
【００４５】
いくつかの実施形態では、有機層は基材表面に存在し、スペーサーの官能基は、有機層に確立され得る。そのような場合は、基材表面層のスペーサーおよびタンパク質結合剤のリンカーは、硬質の基材表面からのペプチド模倣物の所望の間隔に集合的に貢献し得る。さらに、立体障害の減少は、特に生体適合性様式（例えば、（タンパク質結合剤上のビオチン固着基とカップリングされる）アビジンタンパク質）を提供する表面コーティングの選択によっても達成され得る。
【００４６】
図３Ａは、ペプチド模倣タンパク質結合セグメント３０２が１２マーのペプトイドであり、リンカー３０４が短い脂肪族鎖であり、固着基３０６がチオールである、アレイ要素３００の小さなセットの例を図示したものである。図３Ａに図示されたペプチド模倣物セグメントは、本発明の１つの実施形態に従って、ペプチド模倣物セグメントとしてペプトイドを使用して達成可能な親和性特性の範囲の部分を図示する。
【００４７】
上述のように、アレイ表面に存在する異なるタイプの結合剤の数は、少なくとも２つである。「異なる」とは、２つの異なるタンパク質結合剤の２つの異なるペプチド模倣物の間のモノマー単位の配列が、同一でないことを意味する。アレイ表面に存在する異なる種のタンパク質結合剤の数は、少なくとも２、少なくとも約１０、少なくとも約５０、または少なくとも約１００であるが、数は、代表的には、さらに大きくてよく、一般に少なくとも約１，０００、通常は少なくとも約５，０００、さらに通常は約１０，０００である。その数は、５００，０００と同じかそれ以上であってよいが、代表的には、約１００，０００を超えず、通常は約５０，０００を超えない。
【００４８】
タンパク質結合アレイ要素の周囲の表面領域は、バックグラウンドのタンパク質非特異的結合を最小化するように改変され得、これにより、複雑なサンプル（例えば、溶解物または血清）を単一の工程で検査できる。表面は、親水性末端（例えば、アルコール、炭水化物、アミノ酸、スルホキシド、アクリルアミド、またはエーテル）によって化学的にブロックされ得る。アルコール末端基の例は、マレイミド処理表面の場合は、例えば、メルカプトエタノール、メルカプトへキサノール、メルカプトオキサノールである。これらは、表面上の未反応マレイミドをブロックする。表面は、リン酸緩衝化生理食塩水中、１％〜１０％のウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）またはヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）、あるいは１％〜１０％の脱脂粉乳、または１％〜１０％のカゼイン、ゼラチン、もしくはその他の適切なブロッキングタンパク質の溶液といったタンパク質を使用してもブロッキングされ得る。いくつかの場合には、ブロッキングタンパク質溶液への界面活性剤添加は、都合が良い。例えば、０．０１％〜０．５％のＴｗｅｅｎ−２０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（特に０．０５％）、０．１％〜２％のＳＤＳの添加は、アッセイ開発または表面化学分野において周知である。
【００４９】
（Ｃ．アレイの一般的特徴）
代表的には、アレイは、固体基材上に複数のタンパク質結合剤のスポットを有することにより特徴付けられる。この固体基材上で、各スポットは、支持体表面に結合された、１つ以上の、通常は複数の同一の結合剤を有することにより特徴付けられる。アレイ表面上の別個のスポットの数は、アレイ上の異なるタンパク質結合剤の数と同一であってもよいし、そうでなくてもよい。例えば、同一のタンパク質結合剤は、アレイ表面上の２つ以上のスポットに示され得る。１つの実施形態では、各タンパク質結合剤は、アレイにおいて複製して（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）提供される。結合剤の性質、支持体表面の大きさ、製造法およびアレイの意図される使用に依存して、アレイ表面上の別個のスポットの数は、大きく変わり得る。支持体表面は、標準の顕微鏡スライド（約３インチ×１インチ）の大きさである場合、支持体表面のスポットの数は、代表的には、少なくとも約３，０００、通常は少なくとも約６，０００、およびさらに一般的には少なくとも約１０，０００〜５０，０００であり得る。その数は、１００，０００またはそれ以上であり得るが、代表的には約７５，０００を超えず、通常は約５０，０００を超えない。
【００５０】
各スポットの直径は、代表的には、約１００μｍ〜約３００μｍの範囲であり、通常は、約２００μｍ〜約３００μｍの範囲である。任意の２つの所定のスポットの間隔は、一般に約１μｍ〜約５０μｍの間である。スポットの密度は、一般に約１スポット／ｃｍ２〜約５，０００スポット／ｃｍ２の範囲であり、通常は約１００スポット／ｃｍ２〜約２，０００スポット／ｃｍ２の範囲である。代表的には、スポットは、一定のパターンでスペーサー層の表面にわたって配置される。
そのパターンは、スポットの組織化された行および列の形態（例えば、基材表面にわたるスポットのグリッド、基材表面にわたる一連の曲線列（例えば、スポットの一連の同心円または同心の半円）など）にあり得る。密度をさらに増大させるために、そのスポットはまた、六角形に配置され得る。スポットのなお他の配置は、本発明の範囲内である。
【００５１】
（２．本発明のタンパク質結合剤アレイを作製する方法）
本発明のアレイは、任意の従来のプロトコルを使用して調製され得る。本発明の１つのプロトコルは、１）タンパク質結合剤の結合のために活性化された表面を有する固体支持体の獲得（ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ）；および２）２以上の異なるタンパク質結合剤が固体支持体表面と安定して結合するような条件下での、そのタンパク質結合剤とその固体支持体との接触、を包含する。
【００５２】
（Ａ．固体支持体の製作）
この固体支持体は、任意の都合の良い方法論を使用して製作され得、この方法論は、その固体支持体の特定の性質に依存して変化する。本発明の一実施形態に従って、ガラス支持体は、金属（例えば、アルミニウムまたは金）の層でコーティングされる。金属層でコーティングされたガラスの固体支持体を調製するために、そのガラスの表面は、上記のような厚みで金属（例えば、金、銀、白金、銅、チタン、またはアルミニウムなど）の薄層でコーティングされる。この金属層は、任意の都合の良いプロトコルを使用して基材表面に蒸着され得る。ここで適切なプロトコルとしては、ｅ−ビーム蒸着、蒸着（ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、スパッタリングなどが挙げられ、当業者に公知である。例えば、Ｍｏｔｅｓｈａｒｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８）１２０：１３２８−１３３６；Ｂａｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９８９）１１１：７１５５−７１６４；Ｌｅｅら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９８）１４：６４１９−６４２３；Ｆｏｌｋｅｒｓら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９２）８：１３３０−１３４１を参照のこと。都合がよい場合、接着金属層が、金属層と基材との間に存在し得、ここで目的の接着金属としては、チタン、クロムなどが挙げられ、上記のような厚みで蒸着される。さらに、酸化物のオーバーレイ（例えば、二酸化ケイ素または一酸化ケイ素）が、金属層の頂部にｅ−ビーム蒸着またはスパッタリング蒸着により蒸着され得る。
【００５３】
一例において、金基材の調製の後に、タンパク質結合剤の固着基（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）がチオールであり、連結基が（上記で例示されるように）十分に長い場合、本発明に従うアレイは、露出した、清浄な金の上にチオール提示タンパク質結合剤をスポットすることによって形成され得る。この基材の金の表面は、クロム酸清浄溶液（例えば、硫酸中の酸化クロムまたは二クロム酸ナトリウム（例えば、Ｆｉｓｈｅｒから市販されるＮｏｃｈｒｏｍｉｘ（１２Ｎ  硫酸中の５０〜８０％  二クロム酸ナトリウム））を使用して洗浄され得、ＨＰＬＣ等級の水ですすがれる。このことは、表面官能化工程の回数を減少させるという利点を有する。
【００５４】
別の実施形態において、タンパク質結合剤の固着基が、官能化改変シラン（例えば、一官能性シラン、二官能性シランまたは三官能性シラン（例えば、クロロシラン、アルコキシシラン、ジクロロシランもしくはジアルコキシシラン、またはトリクロロシランもしくはトリアルコキシシラン））である場合、その固着基は、オキシド含有表面（例えば、ガラス、酸化チタン、または酸化アルミニウム）に直接結合され得る。本発明のこれらの実施形態に従うアレイは、酸化基材表面に活性シラン提示タンパク質結合剤をスポットすることによって形成され得る。ガラス基材は、この結合に利用可能な表面ヒドロキシルを有する。金属基材表面は、例えば、熱処理または化学処理によって酸化され得る。例えば、アルミニウムは、当該分野で周知であるように、電気化学的に、熱により、または化学的に（例えば、Ｈ２Ｏ２で）酸化され得る。さらに、二酸化ケイ素または酸化チタンの層は、アルミニウム上に被覆され得る。酸化物はまた、アルミニウムまたはシリコンで存在するように、天然の薄層として存在し得る。次いで、この天然酸化物は、アミノ−シランによって誘導体化され得る。
【００５５】
本発明のなお別の実施形態において、金属（例えば、金またはアルミニウム）基材表面は、まず、秩序立てられた単層を形成する官能化有機分子で官能化される。その有機分子の末端は、アンカーの官能基に依存して、タンパク質結合剤の適切な固着基に結合し得る反応性基で官能化される。適切な末端基は、アンカーの官能基に依存して、例えば、マレイミド、ヒドラジド、アミノオキシ、活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、無水物、アルデヒド、ジスルフィド、チオール、アジド、ホスフィンまたはアビジン）であり得る。
【００５６】
一実施形態において、官能化有機分子は、アミノ改変チオール分子である。金属表面をチオール分子で官能化するために、金属表面を有する基材は、アミノ改変チオールの溶液中に浸漬され得る；そのアミノ改変チオール溶液は、次いで、基材の表面に被覆され得る。他の都合の良いプロトコルが使用され得る。代表的には、金基材が、アミノ改変チオール分子が基材表面の単層に組織化する条件でかつ十分な時間にわたって、アミノ改変チオール溶液に浸漬される。接触が行われる温度は、代表的には、約１０℃〜約１００℃、通常、約１５℃〜約８０℃の範囲である。接触は、自己組織化単層が金表面に形成するに十分な時間にわたって維持される。ここで接触は、代表的には、少なくとも約２０分、通常は少なくとも約４時間、およびより通常は少なくとも約１６時間にわたって維持される。
【００５７】
あるいは、そのアミノチオールはまた、真空オーブン中でまたはスピンコーティングによって蒸着により被覆され得る。例えば、揮発性溶媒（例えば、イソプロパノール、メタノール、ＴＨＦ）中のチオールの１〜１０％（例えば、５％）溶液が調製され得る。スライドを、約１０００〜８０００ｒｐｍ（例えば、５０００ｒｐｍ）でスピンして、チオールの一様な被覆を提供し得る。次いで、ヘテロ二官能性分子（例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはＬＣ（長鎖）−−ＳＭＣＣ）（これは、一端が活性化エステルであり、他方がマレイミドである）を、アミノ基と接触させて、マレイミド末端化表面を作製し得る。他のヘテロ二官能性架橋剤もまた、一端のＮＨＳエステルと他端のマレイミドとの間の異なる長さのスペーサー（例えば、長いエチレンオキシドスペーサー（例えば、２〜４ユニット）とともに使用され得る。上記のように、基材上のスペーサーは、タンパク質結合剤における「リンカー」と同じ目的を果たす。
【００５８】
別の実施形態において、アルミニウムスライドが使用され得る。アルミニウム金属は、ｅ−ビーム蒸着により、清浄なガラス基材の上に被覆され得る。そのアルミニウムは、次いで、放射光または励起光の波長の１／４以下の厚みで、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）または一酸化ケイ素によりオーバーコーティングされる。約６００〜１０００Åの酸化物の厚みが使用され得る。なぜなら、これらは、結合実験を行う前に酸化物を薄くする必要性を排除するからである。このアルミニウム／酸化物表面は、アミノ改変シランで処理され得る。例えば、８００〜１，４００Å層の二酸化ケイ素で新たにコーティングされたアルミニウムスライドは、イソプロパノール中の３％〜４０％  アミノプロピルトリエトキシシラン（これは、０．２μＭフィルタ膜を通して予め濾過してある）の浴にすぐに浸漬され得、１時間までの間、シラン化され得、続いて、すすがれ、乾燥される。あるいは、シラン（ＡＰＳ）でコーティングされたアルミニウムスライドは、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄから入手され得る（および国際特許出願ＷＯ９８／５３３０４に記載される）。いくつかの場合において、このような市販のスライドは、酸化物の層を、結合実験を行う前に約２００Åと約１，０００Åとの間、より具体的には約９００Åと約１，０００Åとの間へと薄くして、シグナル−対−ノイズ比を改善することが必要とされ得る。この最終的なアミノ改変Ａｌ表面は、ＳＭＣＣで官能化されて、マレイミド官能基を提示する表面を与え得る。ここで繰り返すと、そのシランはまた、上記のように、蒸着され得るかまたはスピンコーティングされ得る。揮発性溶媒（例えば、イソプロパノール、メタノール、ＴＨＦ）中のシランの例えば、１〜１０％（例えば、５％）溶液が調製され得る。そのスライドは、１，０００〜８，０００ｒｐｍ（例えば、５，０００ｒｐｍ）でスピンされて、シランの一様な被覆を提供し得る。次いで、ヘテロ二官能性分子（例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣまたはＬＣ−ＳＭＣＣ））（これは、一端が活性化エステルであり、他端がマレイミドである）を、アミノ基と接触させて、マレイミド末端化表面を作製し得る。他のヘテロ二官能性架橋剤もまた、一端のＮＨＳエステルと他端のビオチンまたはマレイミドとの間の異なる長さのスペーサー（例えば、長いエチレンオキシドスペーサー（例えば、２〜４ユニット）とともに使用され得る。上記のように、基材上のスペーサーは、タンパク質結合剤中の「リンカー」と同じ目的を果たし得る。
【００５９】
さらに、この実施形態に従って、本発明に従うマイクロアレイで行われるアッセイにおいて使用される蛍光シグナルの増幅が、市販の官能化されかつスポットされたアルミニウムスライド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をエッチングして、酸化物層の厚みを約２００Å〜約９００Å、好ましくは約５００Åに減少させることによって、増強され得ることが分かった。例えば、約０．１〜０．２％  ＳＤＳ／５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ／０．０８５Ｍ  クエン酸ナトリウム）および必要に応じて５ｍＭ  ＥＤＴＡのエッチング溶液が、約５０〜８０℃、好ましくは、約６０℃で約２〜４時間にわたって適用され得る。上記のように、適切な厚みの二酸化ケイ素層の手動による被覆は、スライドを薄くする必要性を排除し得る。
【００６０】
上記のように、基材表面が有機性の自己組織化単層を有する場合、最初の単層の自己組織化後に、１以上のさらなる単層が最初の単層の上に移植され得る。ここでさらなる層が、最初に被覆された単層（例えば、最初に被覆された単層がカルボキシ官能基の存在によって特徴づけられるアミノ官能基）の表面官能基への共有結合を提供する官能性を有する分子（例えば、アルキル）から作製される。あるいは、多成分スペーサーが、表面への結合の前に構築され得る。
【００６１】
（Ｂ．タンパク質結合剤の合成）
上記のように、本発明に従うタンパク質結合剤は、３つのセグメント：ペプチド模倣物、アンカー、およびこのペプチド模倣物とアンカーとをつなぐリンカーから構成される。
【００６２】
ペプチド模倣物は、それらが、天然のペプチドの生物学的効果を模倣し得る限り、種々の非ペプチドポリマー構造および特徴を有し得る。ペプチド模倣物構造への言及は、上記に提供されている。本発明の一実施形態において、このタンパク質結合剤のペプチド模倣物セグメントは、ペプトイドである。
【００６３】
ペプトイドのライブラリーは、ロボットによる固相合成技術（例えば、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡのＣｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発された技術）を使用して合成され得る。ライブラリーの多様性は、上記で援用された米国特許文書において記載されるように、ペプトイド合成において使用されるアミンサブモノマー（ブロモ酢酸および置換アミン）の性質および配置によって制御され得る。図２に例示されるように、ライブラリーは、混合および分割合成２０２、または平行合成を使用して、プロセス２００に従って調製され得る。その結果、複数のペプトイドが合成されるが、所定のビーズには、ただ１種のペプトイドが合成される（すなわち、各ビーズは、１つの特有の化合物を有し、多数回繰り返される）。１ビーズあたりの化合物の量は、約１〜１００ｎＭの範囲であり得、２０〜４０ｎＭが最も代表的である。１ビーズあたり約４０ｎＭが一般に得られる。このプロセスは、米国特許出願第０９／３０６，７００号にさらに記載される。その開示は、その全体が全ての目的で本明細書中に参考として援用される。この合成されたペプトイド（樹脂になお結合している）は、次いで、例えば、単に参照される米国特許出願に記載されるビーズ選抜技術を使用して、９６ウェルプレート（または他の複数ウェルプレート、例えば、３８４ウェルまたは１０２４ウェルプレート）２０４に分配され得る。「大ビーズ」樹脂（約５００μの直径を有する）の使用により、１ウェルあたり１ビーズの分配が可能になる。
【００６４】
次いで、そのペプトイドは乾燥され得、樹脂から切断され得（例えば、ジクロロメタン中の約２０〜９５％  ＴＦＡで；９５％が代表的である）、アセトニトリル／水中に再溶解され得、濾過または遠心分離され得、乾燥され得、そして５０％  ＤＭＳＯ／５０％  緩衝液中に再溶解され得る。５０％  ＤＭＦまたは５０％  ＮＭＰ（残りは、ＰＢＳ、ＴＢＳ、ホウ酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなど）のような他の溶媒／緩衝液系もまた、使用され得る。いくつかの場合において、還元剤（例えば、トリス−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ））もまた、スポッティングプレートのウェルに添加されて、ペプトイド上のチオールの酸化を阻害し得る。その結果、そのチオールは、基材表面上のマレイミドに対する反応性を保持する。ＴＣＥＰがウェルに添加される場合、リン酸緩衝液（例えば、ＰＢＳ）は避けられるべきであり、緩衝液（例えば、ＴＢＳ）が好ましい。この最終的な溶液は、スポッティングのために準備ができている。
【００６５】
本発明の一実施形態において、スポッティングプレートのウェル中のペプトイドの濃度は、約０．５〜２ｍＭの範囲にあるべきであり、２ｍＭが好ましい。その調製された平坦な固体支持体２０６上にスポッティングするために、ペプトイドは、以下にさらに詳細に記載されるように、濾過または遠心分離され、乾燥され、そして再懸濁される。スライド上にスポットされた材料が、マイクロアレイに適用される溶液中のプローブの量に対して過剰であることが有用である。これは、飽和蛍光シグナルを提供する量であり、その結果、シグナル強度の変化は、実質的にタンパク質レベルに起因する。
【００６６】
固着基およびリンカー基は、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかにおいてペプトイドに結合され得る。固着基およびリンカー基は、ペプトイド合成の間に、参考として援用される特許文書において上記で記載されるように、サブモノマー（例えば、米国特許第５，８７７，２７８号および上記で参照される同時係属中の米国特許出願第６０／２８２１１５号に記載される）として、または当業者に公知の手順に従って、インサイチュ活性化アミノ酸連結工程において合成後にペプトイドの改変としてのいうずれかで結合され得る。
【００６７】
Ｎ末端結合について、ペプトイドは、樹脂上で合成され得、次いで、リンカーおよびアンカー基は、分子全体が切断される前に添加され得る。例えば、ペプトイドは、予め本明細書中に参考として援用される同時係属中の出願番号０９／７０４，４２２号に例示および記載されるように、Ｒｉｎｋアミドポリスチレン樹脂上で調製され得る。合成手順はまた、Ｆｉｇｌｉｏｚｚｉ，Ｇ．Ｍ．，Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｒ．，Ｎｇ，Ｓ．Ｃ．，Ｂａｎｖｉｌｌｅ，Ｓ．Ｃ．，Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９６，２６７：４３７−４４７（この開示は、その全体が全ての目的で本明細書中に参考として援用される）に報告される。また、切断前に、１以上の（例えば、２〜４つ、好ましくは４つ）サブモノマー親水性リンカー基（例えば、メトキシエチルアミン）は、ペプトイドＮ末端に付加され得る。次いで、トリチル保護システアミンが、チオール固着基を提供するために付加される。結合されたリンカーおよび固着基を有するペプトイドは、次いで、樹脂から、例えば、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）中の９５％  ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を使用して切断され得る。得られた溶液は、次いで、本発明に従うマイクロアレイスライド上に適用する（スポッティングする）準備ができている。
【００６８】
別の実施形態において、ＦＭＯＣ保護β−アラニンを、ペプチド合成の分野の当業者に公知であるように、ＨｏｂｔおよびＤＩＣでのインサイチュ活性化によってペプトイドのＮ末端に結合する。このβ−アラニンは、ペプトイドとペプチドリンカーとの間のアダプター分子として機能する。β−アラニンの結合の後に、ペプチドリンカー（例えば、グリコールリンカー）上のＦＭＯＣ保護アミノ酸は、例えば、β−アラニンのＮ末端に結合される。最後に、ビオチンが、ペプチドカップリングによって、そのＮ末端に付加される。
【００６９】
チオールまたはビオチン固着基はまた、Ｃ末端においてペプトイドの末端に結合され得る。例えば、４−（ジフェニルヒドロキシメチル）安息香酸（Ｆｌｕｋａから入手可能）は、塩酸シスタミンと、酸触媒の存在下で処理される。次に、得られたアミンは、そのＮ−（９−フルレニルメトキシカルボニル（ｆｌｕｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ））（Ｎ−ＦＭＯＣ）誘導体として保護され、得られたＦＭＯＣ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｔｒ−ＣＯＯＨは、アミノメチル−大ビーズ（４００〜５００ミクロン、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ）にカップリングされる。そのペプトイドは、上記のように、脱保護アミン上で合成され、ＴＦＡでの処理は、樹脂からのチオール改変ペプトイドの切断を生じる一方で、そのトリチル保護基を樹脂上に残す。このような手順は、上記で参照された同時係属中の米国特許出願第６０／２８２１１５号に記載される。
【００７０】
（Ｃ．固体支持体とタンパク質結合剤との接触）
基材およびタンパク質結合剤を上記のように調製した後に、表面に結合されて、アレイを生成する２以上の目的の異なるタンパク質結合剤は、官能化されたかまたは他の方法で調製された（洗浄された、酸化されたなど）基材表面と接触される。接触とは、結合剤がそれらが基材層の表面に実質的に安定して付着されるかまたは結合されるように、表面と近位にされることを意味する。
【００７１】
結合剤と基材表面との接触にあたって、上記のような表面と結合剤とを接触させる（このことによって、表面と、結合剤スポットの所望のパターンが生じる）ための任意の都合の良い手段が、例えば、スポッティングによって使用され得る。上記のように、用語接触は、結合剤が支持体表面の極めて近くあるようにする任意の方法をいうために本明細書中で使用される。一般に、結合剤の水溶液（例えば、水、水／有機溶媒（例えば、５０／５０  水／ＤＭＳＯなど）は、接触の間に使用され、ここでこの溶液は、水および結合剤に加えて、１以上の成分（例えば、緩衝化剤、塩など）を含み得る。他のシステムは、５０／５０のＮＭＰ／ＴＢＳ、ＤＭＦ／ＴＢＳ、ＮＭＰ／ＰＢＳ、ＤＭＦ／ＰＢＳ、またはこれらの全ての、水と一緒になった溶媒を含む。この５０／５０ミックスはまた、調節され得る。例えば、水溶液のパーセンテージがより高い場合、その液滴サイズは、溶液のより高い表面張力が原因で小さい可能性がある。液滴サイズ（および従って密度）は、このようにしてある程度まで制御され得る。代表的には、接触は、異なる結合剤の溶液を、支持体表面の別個の位置に被覆することによって達成され、その結果、各異なる型の結合剤は、基材表面のそれ自体の特有の位置に被覆される。
【００７２】
この結合剤は、例えば、ピペッティングによって、任意の都合の良い手段を使用して、支持体表面に被覆され得る。多くのデバイスおよびプロトコルが、水溶液を支持体表面の正確な位置に被覆するために開発されており、本発明の方法において使用され得る。このようなデバイスは、「インクジェット」印刷デバイス、機械的被覆またはピペッティングデバイスなどを含む。例えば、米国特許第４，８７７，７４５号；同第５，３３８，６８８号；同第５，４７４，７９６号；同第５，４４９，７５４号；同第５，６５８，８０２号；同第５，７００，６３７号；および同第５，８０７，５５２号を参照のこと；これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。水溶液の用量を支持体表面の別個の領域の上に正確に被覆するためのロボットデバイス（すなわち、アレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ））はまた、多くの業者から市販されており、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ；Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；およびＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓが挙げられる。あるいは、バブルジェット（登録商標）技術（最近、Ｏｋａｍｏｔｏ，ＳｕｚｕｋｉおよびＹａｍａｍｏｔｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８（Ａｐｒｉｌ，２０００），４３８によって記載される）が使用され得る。
【００７３】
上記のように、本発明に従うプロセスの重要な特徴は、タンパク質結合剤の上の固着基と基材表面との反応が、ロボットアレイスポッターで表面に被覆される液滴の平均寿命内に完了するように、十分に容易でなければならないことである。例えば、表面が官能化され、かつマレイミドを提示する場合、適切な固着基は、チオールであり、約１５〜２０分、約６０％湿度が、結合反応の完了に必要とされる。上記のように、安定な、なお非共有結合を形成するもの（例えば、アビジンおよびビオチン）を含む、他の表面提示／アンカー組み合わせが可能である。
【００７４】
（Ｄ．チップのブロッキング）
ペプトイドライブラリーをアレイ基材（チップ）にスポットした後に、チップの残りのコーティングされていない表面は、親水性末端を提示する分子で官能化され得る。これらの親水性末端は、複雑な混合物中のタンパク質の非特異的結合を減少または排除することが理解される。この親水性部分は、アルコール、スルホキシド、炭水化物、アクリルアミドからなり得、親水性末端（例えば、アルコール、炭水化物、アミノ酸、スルホキシド、アクリルアミド、およびエーテルまたは他の低タンパク質結合基）を有する。その親水性提示分子は、既にスポットされたペプトイドと同じ様式でチップに固着される。例えば、ペプトイドライブラリーがスポットされたチップは、システイン、メルカプトエタノールまたは他の適切な親水性チオールで化学的にブロックされ得る。このチップはまた、または代わりに、タンパク質（例えば、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ，１０％  脱脂粉乳もしくは１％  カゼイン）で少なくとも１時間にわたってブロックされ得、水ですすがれ得、乾燥され得る。他の可能なブロッキング剤は、上記の通りである。このブロッキング剤は、当業者に周知の様式で、例えば、ブロッキング剤の溶液中にチップを浸漬することにより、チップの表面にブロッキング剤を塗布することにより、またはスピンコーティングにより、チップに適用され得る。
【００７５】
あるいは、アレイ要素を取り囲む表面領域は、タンパク質のバックグラウンドの非特異的結合を最小にして、複雑なサンプル（例えば、溶解物または血清）が単一の工程で試験されることを可能にするように、ポリマーまたはオリゴマーの化学的ブロッキング剤で改変され得る。その表面は、アレイ要素のスポッティングの後に、アレイへの非特異的タンパク質結合を減少または排除する、化学的に親水性のポリマーまたはオリゴマーの分子で化学的にブロックされ得る。従来のタンパク質ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡおよびカゼイン）とは対照的に、ポリマーまたはオリゴマーの化学的ブロッキング剤は、単独またはタンパク質ブロッキング剤と一緒に使用され得る合成分子である。特定の実施形態において、化学的ブロッキング剤およびタンパク質ブロッキング剤は、一緒に使用され得る。例えば、化学的ブロッキング剤、続いてタンパク質ブロッキング剤を順番に、または化学的ブロッキング剤をタンパク質ブロッキング剤と混合して、次いで、スポッティングの後にアレイ表面に適用される。ポリマーまたはオリゴマーの化学的ブロッキング剤は、スポッティングの後にスライドをブロッキング剤に浸漬することによって、アレイに結合され得る。
【００７６】
例えば、特定の実施形態において、その化学的ブロッキング剤は、アレイ要素によって占有されていない有機官能化基材表面と反応し、結合するように、少なくとも一方の末端が改変されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アナログである。例えば、マレイミド官能化表面のための化学的ブロッキング剤は、チオール改変ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。１つの具体例は、例えば、約３４００〜５０００の分子量を有するジチオール改変ＰＥＧ（ＳＨ−ＰＥＧ−ＳＨ）（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓから市販される）である。このブロッキング剤は、以下に記載されるように、アレイ要素のスポッティングが完了した後に、または予め工程においてカゼインとともに適用され得る。ブロッキング剤末端についてのこのあり得る官能基は、上記のアダプターについての官能基と同じであり、例えば、ビオチン、アミン、活性化エステルなどであり得る。
【００７７】
本発明に従う別の型の化学的ブロッキングは、種々の表面官能基に容易に結合し得るように、親水性側鎖で誘導体化したＮ−置換グリシン（ペプトイド）の十分に規定された単分散性オリゴマーによって提供される。適切な側鎖は、タンパク質吸着に耐え得る、１以上のエチレングリコール単位を有し得るか、またはヒドロキシル、スルホキシド、または他の親水性基（例えば、上記）からも構成され得る。これらの分子は、タンパク質結合に耐えるように設計され、タンパク質アレイ（例えば、抗体、融合タンパク質など）の特定のタンパク質結合分子で中断される。これらの化学的ブロッキング剤は、タンパク質部分に耐性であり、従って、非特異的タンパク質結合（ＮＳＢＰ）に対する改善された耐性を提供する高密度充填に最適であり得る。
【００７８】
これらの化学的ブロッカーオリゴマーは、上記のサブモノマーペプトイド合成法を使用して調製され得る。ペプトイドベースの化学的ブロッキング剤について、適切なＮ−置換は、非特異的タンパク質結合に非常に耐えることが公知の部分（例えば、エチレンオキシド、スルホキシド、ヒドロキシルなど）である。そのＮ末端は、先に記載されるように、種々の表面固定化基（例えば、ビオチン、チオール、ヒドラジド、アルデヒド、エポキシド、トリエトキシシランなど）で改変され得る。
【００７９】
ペプトイドブロッキング剤の長さは、約２〜１００まで容易に変化され得、ここで１５〜３０が実践的であり、さらなる精製工程なしで純粋物質を生じる。側鎖の長さは、１〜１０の間で変化され得、１〜５が、ペプトイド骨格に対する容易なカップリングを提供する。さらに、Ｃ末端およびＮ末端の両方が、種々の化学的連結試薬で改変され得る。分子量は、５００〜５０００、一般には、約２０００〜３０００の範囲内にあり得る。
【００８０】
合成が完了した後に、このペプトイドは、従来の切断試薬（例えば、９５％  ＴＦＡ／５％  水）を使用して切断され得る。この方法は、多グラム量のＮＳＰＢ−ペプトイドを生じ得、この量は、かなり大きなバッチ（例えば、２００ｍＬのコーティング溶液を使用して一度に２０スライド）でマイクロアレイスライドをコーティングするために容易に使用され得る。マイクロアレイ結合実験の過程において、ＮＳＰＢ−ペプトイドは、タンパク質ブロッキング溶液（例えば、カゼイン、脱脂粉乳、ＢＳＡなど）に直接組み込まれ得る。あるいは、このＮＳＰＢ−ペプトイドは、タンパク質ブロッキングの前または後に、別個のコーティング工程として使用され得る。マイクロアレイ要素（例えば、ペプトイド）の表面への結合の様式は、おそらく、使用されるＮＳＰＢ−ペプトイドのモチーフを決定する。例えば、ビオチン化タンパク質がアビジンコーティングスライドへのロボットによるスポッティングを介して結合される場合、ビオチン化ＮＳＰＢ−ペプトイドは、ＮＳＰＢをブロックするためのコーティングとして使用される。
【００８１】
図３Ｂは、本発明に従うペプトイドベースの化学的ブロッキング剤を例示する。このペプトイドベースのポリマーまたはオリゴマーである化学的ブロッキング剤は、水和されたままであり、かつタンパク質の非特異的結合に耐えるように設計される。図面において、Ｒ’＝ＨまたはＭｅ、ｍ＝２〜１００、ｎ＝１〜１０である。
【００８２】
（Ｅ．まとめ）
図４Ａおよび４Ｂは、上記の手順に従って本発明のいくつかの実施形態についてのタンパク質結合剤アレイを作製するためのプロセスを簡単に例示する。図４Ａにおいて、タンパク質結合剤が改変されていない（ｂａｒｅ）平らな基材の無機表面に直接結合されるアレイを作製するためのプロセス（４００）が記載される。金またはアルミニウムの表面を有する平らな基材４１２が、提供される（４１０）。その表面は、上記のように結合ために調製される（洗浄される）。チオール固着基４３４を有するタンパク質結合剤４２２は、基材４１２（４２０）上にスポットされる。一旦、タンパク質結合剤の結合が完了すると、ブロッキング剤４３２、すなわち、親水性基（例えば、アルコール）またはタンパク質が、タンパク質結合剤４２２が未だ結合していない基材４１２の表面に適用される（４３０）。
【００８３】
図４Ｂにおいて、タンパク質結合剤が平らな基材の表面に有機性表面層を介して結合されるアレイを作製するためのプロセス（４５０）が記載される。金またはアルミニウムの表面を有する平坦な基材４６２が提供される（４６０）。その表面は、上記のように、官能化アミノ改変チオールまたはアミノ改変シラン層４６４を適用することによって結合のために調製される。この層４６４は、チオールまたはシラン官能基４６６を含み、これらは、基材４６２の金またはアルミニウムの表面および実質的に結合したタンパク質結合剤のための結合官能基４６８（例えば、マレイミド）に結合する。基材表面層結合官能性４６８に相補的なアンカー基官能性４７４を有するタンパク質結合剤４７２は、基材上にスポットされる（４７０）。一旦、タンパク質結合剤の結合が完了すると、ブロッキング剤４８２、すなわち、親水性基（例えば、アルコール）またはタンパク質は、タンパク質結合剤４７２が未だ結合していない（４８０）基材の表面に適用される。
【００８４】
（３．本発明のタンパク質結合剤アレイを使用する方法）
本発明のアレイは、そのアレイの結合剤を結合した表面と、試験サンプル中の目的の分析物との間の結合事象が検出される、種々の異なる適用における使用が見いだされる。言い換えると、本発明のアレイは、結合アッセイにおける使用が見いだされる。このような適用において、結合剤を結合した支持体は、一般に、試験サンプル中の分析物「プローブ」についての「標的」として作用する。この分析物プローブは、代表的には、標識されている（例えば、ここで標識は、直接的に検出可能な標識（例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識など）であり得るかまたは間接的に検出可能な標識（例えば、シグナル生成系（例えば、標識抗体に対するリガンド）のメンバーであり、ここで標識は、基質を色素生成産物に変換する酵素的なものなどであり得、標識抗体は、二次標識抗体であり得る）。その結果、結合事象は、容易に検出され得る。
【００８５】
特に、本発明に従うアレイは、複雑なタンパク質サンプルのプロテオミクス分析を行うにあたって有用である。本明細書中で記載される場合、プロテオミクスとは、サンプル中の１以上のタンパク質の分離および／または定量および／または同定である。このサンプルは、細胞（例えば、細胞のサイトゾル、膜または細胞外タンパク質）、組織（例えば、切除されたまたはレーザーで微量切除された）、体液（例えば、尿、血液、髄液）または任意の他のタンパク質含有サンプルに由来し得る。このような分離／定量／同定の結果は、薬物スクリーニングについての新規なタンパク質標的、診断用タンパク質、またはアッセイもしくはタンパク質生成のための新規な合成リガンドを生成し得る。このアレイは、差示的なタンパク質結合アッセイにおいて非常に効率的に使用され得る。例えば、複雑なタンパク質混合物の２つの（またはそれ以上の）色の蛍光標識、および蛍光画像化によるアレイへの差示的なタンパク質結合の分析が行われ得る。以下に記載されるように、このアレイを他の技術とともに使用して、目的の差示的に発現されるタンパク質またはペプチドを同定、配列決定および構造的に特徴付け得る。このアレイは、ＤＮＡアレイと平行して行われ得、差示的結合結果が、遺伝子活性とタンパク質発現との間の相関を同定するために比較される。また、混合アレイ（ここでアレイを構成する分子は、抗体などを含む）が調製され得、結合アッセイを行うために使用され得る。
【００８６】
種々の技術が、本発明に従うアレイ（「プロテオミクスマイクロアレイ」）を使用する差示的な結合アッセイを行うために使用され得る。これらの技術のうちのいくつかは、本発明の実施形態において使用される場合、以下に記載される。
【００８７】
（Ａ．タンパク質標識）
複雑なタンパク質サンプルは、標準的な技術を使用して標識される。そのうちの多くが、タンパク質混合物の２−Ｄゲル分析のために開発されてきた。例えば、サンプルＡが、アミノ反応性シアニン３色素（「Ｃｙ  ３」）（λｅｘ＝５５０ｎｍ／λｅｍ＝５７０ｎｍ）で標識され得、サンプルＢが、アミノ反応性シアニン５色素（Ｃｙ  ５）（λｅｘ＝６５０／λｅｍ＝６７０ｎｍ）で標識される（色素試薬は、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。サンプルＡおよびＢは、例えば、それぞれ、正常または罹患した、処理（処置）または未処理（未処置）などの、組織または細胞株に由来し得る。未反応色素は、ゲル濾過、透析などのような標準的な方法を使用して、標識タンパク質から分離され得る。当然のことながら、上記のように、当業者に周知であるような種々の異なる標識としては、テトラメチルローダミン−イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、およびそれらのスクシンイミジルエステル誘導体、またはアミノ酸側鎖（例えば、アミン側鎖（リジン）、チオール側鎖（システイン）もしくは他の適切な官能基）を介してタンパク質に反応され得る任意の他の色素分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
（Ｂ．結合アッセイおよびチップ読み取り）
標識タンパク質サンプルは、プロテオミクスマイクロアレイチップと一定時間にわたって、およびアレイの要素に対する種々のタンパク質の親和性を調節することが理解されるｐＨ、塩濃度、および温度の種々の条件下でインキュベートされる。一般に、そのサンプルは、適切な容量の流体サンプルとアレイ表面上への導入によってマイクロアレイと接触され、ここで導入は、表面をサンプルで満たすこと、サンプルを表面上に（例えば、ピペットで）堆積させること、アレイ全体をサンプル中に浸すことなどであり得る。多くの実施形態において、溶液は、表面上に堆積され、次いで、カバースリップの下にまたはシールされたチャンバ中でサンドイッチされる。
【００８９】
例えば、２５μＬ〜１００μＬ（代表的には、５０μＬ）アリコートの各プローブ溶液が、代表的な顕微鏡用スライドサイズのチップの表面にアプライされ得、一番上に清浄なカバースリップが置かれ、チップ表面上にプローブ溶液のサンドイッチを形成する。次いで、そのタンパク質溶液は、少なくとも１時間、または一晩にわたって、チップと共に同時インキュベートされ得る。インキュベーション後、そのカバースリップは取り外され、例えば、１×ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎまたは他の適切な界面活性剤を含有する緩衝液中でチップが洗浄される。そのチップは、ストリンジェンシーが減少または増大した種々の条件を用いて洗浄され得る。これらの条件は、繰り返すと、例えば、最も強く結合したタンパク質のみを保持することを可能にするようにカスタマイズされ得る。すなわち、場合が補償し得る場合、低ストリンジェントの洗浄条件が使用されて、比較的弱く結合したタンパク質の可視化を可能にし得る。その選択は、そのチップの上に提示されるペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）アレイの複雑さおよび多様性、ならびにタンパク質混合物の性質によって決定される可能性が高い。洗浄されたチップは、次いで、例えば、アルゴンまたは窒素の流れの下で乾燥される。
【００９０】
適切な洗浄の後、そのチップは、例えば、当該分野で周知のアレイスキャナで読み取られる。各スポットのＣｙ  ３：Ｃｙ  ５の比は、市販のソフトウェアを用いて決定される。１よりもかなり大きいかまたはかなり小さな比を示すスポットが観察されると、「差示的である」とみなされる。
【００９１】
図５は、上記の手順に従う本発明の一実施形態についてのタンパク質結合剤アレイを使用する差示的なプロテオミクス結合アッセイを行うためのプロセスを簡単に例示する。図５において、プロセス（５００）は、２つの生物学的サンプルの獲得で始まって、例えば、「未処理」細胞株５０２ａと「処理」細胞株５０２ｂとを比較する。細胞溶解物５０４ａ、ｂは、その細胞株サンプルから単離される。その溶解物は標識され、例えば、「未処理」細胞溶解物５０４ａは、蛍光緑色色素で標識される一方、「処理」細胞溶解物５０４ｂは、蛍光赤色色素で標識される。次いで、これらの標識サンプル５０６ａ、ｂは、本発明（例えば、ペプトイドのアレイ）に従って、タンパク質結合アレイチップ５０８上で同時インキュベートされる。サンプル中のタンパク質は、変性されるか、ネイティブであるかのいずれかであり得る。例えば、１〜２％  ＳＤＳを添加すると、サンプル中のタンパク質は、変性され得、クラスターまたは疎水性相互作用が最小化または排除され得る。あるいは、そのクラスター（これは、タンパク質−タンパク質結合経路を解明するにあたって重要であり得る）およびタンパク質は、それらのネイティブな状態において維持され得、結果が研究され得る。次いで、そのチップは、アレイスキャナで読み取られる。
【００９２】
（Ｃ．ライブラリー配列決定）
差示的に発現されたタンパク質を結合するペプチド模倣物の配列は、ライブラリー配列決定技術によって決定され得る。これは、例えば、アミド骨格に沿ってペプトイドのフラグメント化を可能にするＭＳ／ＭＳ法によって達成され得る。これらの方法は、同時係属中の米国特許出願第０９／５８０，３８０号（この開示は、全ての目的のために本明細書中に参考として援用される）（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／７２００４もまた参照のこと）において記載される。フラグメント化生成物の質量から、その単離されたペプトイドの構造および配列が決定され得る。
【００９３】
（Ｄ．アレイ後のプロセシング：タンパク質単離、精製および同定）
一旦、タンパク質またはタンパク質セットが、サンプルＡとＢとの間で差示的であると決定されると、そのタンパク質またはタンパク質セットは、チップ上で同定された同じペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）から構成されるクロマトグラフィー支持体を調製することによって単離され得る。ペプトイドベースのクロマトグラフィー支持体、それらの調製およびそれらの使用は、米国特許出願第０９／７０４，４２２号（予め、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００９４】
その開示の一実施形態に従って、チップ上で差異を生じるペプトイド配列は、ペプトイド合成の間に疎水的に「マスクされた」親水性樹脂の上で合成され得る。合成後、樹脂は、「マスクが外され」て、生物学的溶液と適合性の親水性基を現す。このような樹脂は、タンパク質結合／単離実験にすぐに利用可能である。
【００９５】
一旦タンパク質が単離されると、その配列は、標準的な技術（例えば、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ質量分析法またはトリプシン消化）を使用して決定され得る。
【００９６】
図６は、上記および以下に記載される手順に従って、アレイ後のプロセシングの局面を簡単に例示する。図６において、プロセス（６００）は、本発明に従って、プロテオミクスマイクロアレイを使用して行われたプロテオミクス差示的結合アッセイにおいて、目的のものとして同定されたペプチド模倣物因子６０１（例えば、ペプトイド）を使用するクロマトグラフィー分離カラム６０２の調製で始まる。マイクロアレイ上で初めに実施されるその複雑なサンプルのアリコートは、次いで、カラムを通して実施される。目的のタンパク質は、カラムに優先的に結合し、それにより、サンプルの他の成分から分離される。結合したタンパク質は、溶出され、次いで、さらなる分析６０４（例えば、タンパク質配列決定、三次元構造決定など）において使用され得る。さらに、タンパク質の同定に関連するデータは、さらなる研究のためにバイオインフォマティクスデータベースに登録され得る。
【００９７】
あるいは、差示的に発現されたタンパク質を結合した同じペプトイドは、チップ上に繰り返しスポットされ得、同じ溶解物のアリコートとインキュベートされる。同じタンパク質は、アレイに結合されるべきであるが、元のチップ上のただ１つのスポットより遙かに大きな面積で結合されるべきである。レーザー脱着質量分析法が、次いで、チップからタンパク質を直接配列決定するために使用され得る。
【００９８】
（Ｅ．他の適用）
本発明に従うプロテオミクスマイクロアレイチップの予期される用途は、広い。一般に、適用は、互いに対して（または存在／非存在、例えば、診断タンパク質の場合において）１つの複雑な混合物中で過剰発現されているかまたは過小発現されている、タンパク質またはタンパク質セットの同定を同様に有する。当業者は、本発明の実施形態がサンドイッチアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を含む広範な種々のアッセイ形式と適合性であることを認識する。
【００９９】
上記のように、プロテオミクスマイクロアレイは、比較される２以上のタンパク質溶液を選択肢的に標識する（例えば、一方のサンプルについてはＣｙ  ３およびもう一方についてはＣｙ  ５）ことによって、複雑な溶液中でのタンパク質の差次的な発現を決定するために使用され得る。チップは、後の高スループットスクリーニングアッセイのための新規なタンパク質標的を見出すために使用され得る。別の特に強力な適用において、その方法論は、特定の宿主（例えば、酵母またはバキュロウイルス）において過剰発現される組換えタンパク質を精製するために使用され得る。発現されたタンパク質を含むサンプルは、チップ上の選択肢的に標識されたサンプルを同時結合し、差異を探索することによって、これらのタンパク質を含まないサンプルに対して比較される。その手順は、その発現されたタンパク質に対する合理的な親和性および特異性と結合するアレイ上のペプトイドを同定する。次いで、これらの同じペプトイドは、目的の組換えタンパク質の単離および精製のためのクロマトグラフィー樹脂を生成するために使用される。
【０１００】
類似の様式で、そのプロテオミクスマイクロアレイチップは、特定の疾患状態（例えば、癌、ＨＩＶ、または糖尿病）の診断となり得る、血漿または血清中のタンパク質マーカーを見出すか、または薬物スクリーニングのための新規な標的を見出すために使用され得る。また、一旦リガンドのセットがタンパク質の特定の基について同定されると、これらのタンパク質の発現レベルをモニターして、薬物作用の機構を解読することが可能である。その点で、新たなリガンドは、抗体が現在使用されて、タンパク質量が決定される等式と同様に、タンパク質量のプローブとして使用され得る。さらに、細菌またはウイルスのビルレント株および非ビルレント株に由来するタンパク質を試験することによって、感染性疾患を生じる特有のビルレンス因子が決定され得る。一旦これらのビルレンス因子が同定されると、これらのタンパク質は、新たな抗細菌薬物または抗ウイルス薬物をスクリーニングするための標的として使用され得る。あるいは、本発明によって提供されるチップはまた、種々のペプチド、抗原、またはタンパク質模倣物を発見するために使用され得る。例えば、新規な模倣細胞性接着分子、模倣性薬物候補、またはタンパク質模倣物は、クロマトグラフィー支持体として使用され得る。さらに、チップ上にスポットした材料は、それ自体、潜在的な薬物候補であり得るか、または新たな薬物候補を設計するための最初の足場として機能し得る。このような実施形態において、潜在的な治療剤を同定するための高スループットアッセイは、チップ上で直接行われ得る。
【０１０１】
一実施形態において、本発明のプロテオミクスマイクロアレイは、ＤＮＡアレイと平行して実施され、互いから得られた差次的な結合結果は、遺伝子活性およびタンパク質発現における相関を同定するために比較される。例えば、差次的な結合アッセイは、プロテオミクスアレイおよびＤＮＡアレイの両方で、複雑な生物学的サンプルのために行われる。サンプルからの別個のアリコートが標識され、本発明に従うプロテオミクスマイクロアレイおよびＤＮＡマイクロアレイ（例えば、当該分野で周知）と接触される。プロテオミクスアレイに対する結合結果によって証明される差次的なタンパク質発現は、ＤＮＡアレイについての結合結果と比較した場合、タンパク質発現と遺伝子ファミリー（その活性化が、発現に必要とされる）との間の関係を解明し得る。
【０１０２】
本発明の別の実施形態において、本発明の「混合アレイ」チップが提供される。チップ表面に結合したペプトイドまたは他のペプチド模倣結合要素は、抗体またはタンパク質結合要素と混合され得、その結果、両方の型の結合要素は、同じチップ上に存在する。抗体は、陽性コントロールとして働き得るか、または分析される混合物中の特異的タンパク質のレベルをモニターするための手段として働き得る。そのペプトイドは、未知のタンパク質における差異に対するデータを提供するのに対して、チップ上の抗体スポットは、既知のタンパク質の差示的レベルに対するデータを提供する。例えば、細胞が特定の薬物で処理される場合、そのタンパク質レベルは、上下に変化し得る。それらのタンパク質が既知の抗体を有する場合、抗体差異に伴うこれらの変化をモニターしながら、同時にペプトイド差異に伴って未知のタンパク質における変化を探索することが可能である。
【０１０３】
この技術の一例において、抗体溶液は、ペプトイド溶液と同じマイクロタイタープレート中であるが、異なるウェル中で調製される。そのペプトイドは、チオール固着基で既に官能化されている。その抗体は、還元剤と反応されて、抗体ヒンジ領域およびFｃ領域中のジスルフィド結合が還元され（例えば、Lｅｖｉｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．ら（１９６９）Ｅｘｐｅｒｅｎｔｉａ，ｖｏｌ  ２５，１２６−１２７およびＢｌａｕｅｎｓｔｅｉｎ，Ｐ．ら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄ．，ｖｏｌ  ２２，６９０−６９８）に記載されるように）、従って、抗体上にチオールが生成される。このことは、同じスポッティングセッションで、ペプトイドおよび抗体の両方のスポッティングを可能にする。それによって、「混合チップ」が作製される。あるいは、抗体は、チップ表面上に固定化されたプロテインＡまたはプロテインＧに結合され得る一方で、ペプトイドは、アビジンまたはストレプトアビジンに結合され、ディスプレイのための混合した表面を提示する。すなわち、抗体は、単純にビオチン化され得、ビオチン化ペプトイドまたはペプチドと一緒にアビジンコーティングチップ上にスポットされ得る。
【０１０４】
本発明のプロテオミクスマイクロアレイ技術と合わせられ得る別の技術は、上記で参照された米国特許出願第０９／５８０，３８０号（予め、本明細書中に参考として援用される）に記載されるＭＳ／ＭＳ高分子構造分析技術である。このようにして、技術の組み合わせが使用されて、目的のタンパク質が同定され得、これが富化および単離され得、タンパク質が配列決定され得、その三次元タンパク質構造の局面が解明され得る。
【０１０５】
目的のタンパク質の同定およびアレイ後プロセシングに関連するデータはまた、バイオインフォマティクスデータベースに登録され得る。そのデータは、さらなる研究のために、そのデータベース中にある他の生物学的データと相関され得る。
【０１０６】
（４．キット）
本発明によって提供されるのはまた、本発明のアレイを使用するプロテオミクス結合アッセイを行うためのキットである。本発明に従うこのようなキットは、本発明に従うアレイを少なくとも含む。このキットは、分析目的または診断目的で構成され得、アレイが意図される方法において使用される、１以上のさらなる試薬をさらに含み得る。例えば、そのキットは、種々の容器、標識、緩衝溶液、ツールおよびプロテオミクス結合アッセイを行うために必要な任意の他の材料を含み得る。本発明に従うキットはまた、分析のためのサンプルを受容し、その後、さらにユーザーが操作することを必要とせずに、本発明に従う結合アッセイに必要な工程を行うように構成され得る。
【０１０７】
（実施例）
以下の実施例は、本発明に従うプロテオミクスアレイの合成および特徴、それらの成分、および応用に関する詳細を提供する。以下は、代表に過ぎず、本発明がこれらの実施例に記載される詳細によって限定されないことが理解されるべきである。
【０１０８】
（実施例１：１ウェルあたり１化合物を含むマイクロタイタープレートの調製）
１：１  ＤＭＳＯ／ＰＢＳ溶液中、９６の単一の化合物（０．８ｍＭ）を含む１つの９６ウェルプレートの調製：シリコン処理バイアル（８ｍｌ、２ドラム）に、１化合物／ビーズライブラリー（Ｒｉｎｋポリスチレンマクロビーズ固体支持体（６６ｍｇ，約１３２０ビーズ、４０ナノモル／ビーズ、０．７５ｍｍｏｌ／ｇ、４２５〜５００μｍ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上に合成した）を充填した（これは、合計１２１個のあり得る化合物を含む）。そのビーズを、ジクロロエタン（ＤＣＥ，４ｍｌ）中で２４時間膨張させ、ステンレス鋼メッシュ（６００μｍ）に対して篩いにかけた。得られたジクロロエタンビーズスラリーを使用して、９６ビーズを、個々に拾い上げ、９６ウェルに対して、１ウェルあたり１ビーズを得るために、ポリプロピレン９６ウェルプレート（２００μＬ、円錐型底）に再配置した。得られた９６ウェルプレート（祖母プレート）を、９６ウェルプレートキャリアローターを装備した高速真空エバポレーターＳａｖａｎｔ  ＡＥＳ２００に移し、残りのＤＣＥをプレートから除去した。次いで、切断カクテル（ＴＦＡ／ＴＥＳ／Ｈ２Ｏ／ＤＣＥ、４６：２：２：５０、７５μＬ）を、プレート中の各ビーズを含有するウェルに添加した。１時間後、そのプレートを、高速真空エバポレーターに移して、プレートから大部分の揮発性物質を除去した。各ウェルを、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ、１０μｌ）で処理し、マイクロタイタープレート振盪機を使用して１０分間攪拌した。そのプレートを、高速真空エバポレーターに移し、残りの揮発性物質を、１０分間、プレートから除去した。各ウェル中の全ての単一の化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２５μＬ）に溶解し、ポリプロピレン膜（０．４５μｍ）を備えたポリスチレンから作製された９６ウェルフィルタプレート中に再配置した。その９６ウェルフィルタプレートを、ポリプロピレン９６ウェルプレート（２００μＬ、円錐型底）の上に重ね、そのアセンブリを、１５℃にて３０００ＲＰＭ（約２０００Ｇ）で５分にプログラムされたＢｅｃｋｍａｎ  ＧＳ−６Ｒ遠心分離機に移した。
【０１０９】
この手順により、９６ウェル中の１つの化合物の濾過された９６個のＤＭＳＯ溶液（１．６ｍＭ）から構成された「母」プレートが提供された。「娘プレート」（スポッティングのために使用される）を形成するために、全てのＤＭＳＯ溶液（５μＬ）のアリコートを、ポリプロピレン９６ウェルプレート（２００μＬ、円錐型底）に移した。次いで、娘プレートの全てのウェルを、脱気溶液ＰＢＳ（５μＬ）と混合し、−２０℃で保存した。あるいは、各ウェル中の各化合物を、２０μｌの５０％  ＤＭＳＯ／水中に溶解し得る。円錐型底のプレートの場合、プレートを１，８００ｒｐｍで５分間遠心分離して、円錐型ウェルの底にあるビーズを固定し得る。その後、１０μＬの清浄な上清を、スポッティングのために準備ができている娘プレートに再配置する。
【０１１０】
同じことが、３８４ウェルプレートの３８４ビーズに関して、または１，０２４ウェルプレートの１，０２４ビーズなどに関して行われ得る。スポッティングのために、任意の適切なスポッティングデバイス（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩスポッター（９６ウェルプレートに関して）またはＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＩＩスポッター（３８４ウェルに関して））が使用され得る。
【０１１１】
（実施例２：スポッティングのための固体支持体の官能化）
金またはアルミニウムの反射性顕微鏡用スライドを、ペプトイドのライブラリーをスポッティングするための基材として使用した。一例において、ペプチドを、チオール末端基で官能化し、この表面を、マレイミドで官能化する。スポッティングの際に、ペプトイド上のチオールは、表面上のマレイミドと反応して、チオエーテル共有結合を形成する。マレイミドで活性化された金表面を、以下のように調製した：１）金コーティング顕微鏡用スライド（１２００ÅのＡｕ、３０〜５０ÅのＴｉまたはＣｒ）を、クロム酸洗浄溶液で１５分間洗浄し、ＨＰＬＣ等級の水ですすいだ。２）金スライドを、１〜５ｍＭ  アミノ改変チオール（１−メルカプトウンデシルジエトキシアミド；Ｃ−１１アルキル、２種類のエチレンオキシド、およびアミン；あるいは、Ｃ−２〜Ｃ−２０アルキル基および／またはエトキシもしくはトリエトキシ基を、このような化合物中で使用し得る）に室温または４５もしくは６０℃にて、１〜２４時間浸漬する。このスライドを無水エタノール中で４回すすぎ、窒素流下で乾燥させた。３）アミノ改変金スライドを、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）の溶液（５０〜１００μＭ）中に浸漬して、マレイミド官能基を提示する表面を与えた。
【０１１２】
アルミニウムスライドを作製するか、またはＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入し、１０００〜１４００Å層の二酸化ケイ素、およびアミノプロピルシラン（ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｓｉｌａｎｅ）（ＡＰＳ）の層でコーティングした。アミノ改変Ａｌ表面を、上記のようにＳＭＣＣで官能化する。
【０１１３】
いくつかの場合において、ペプトイドライブラリーをスポッティングした後に、そのアルミニウムスライドを、６０℃で２時間、０．１％  ＳＤＳ／５×ＳＳＣの溶液中でエッチングした。このエッチングしたスライドは、減少されたオキシド層の厚み（２００〜９００Å）を示して、Ｃｙ５シグナルおよびＣｙ３シグナル両方の増幅を可能にする。
【０１１４】
（実施例３：アルミニウム／ＳｉO２表面のアビジンでの誘導体化）
アミノシランでコーティングしたアルミニウムスライドを、図７Ａに示されるように、ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（「ＬＣ」とは、６−アミノヘキサノイルをいい、「ＮＨＳ」とは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）（Ｐｉｅｒｃｅから市販される）をいう）の溶液（ＰＢＳ緩衝液中０．３９ｍＭ）に浸漬した。そのスライドを、１．５時間、８０ｒｐｍで振盪しながらコーティングした。ビオチンを結合した後に、そのスライドを、水ですすぎ、次いで、ＰＢＳ緩衝液中１μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌのアビジン、ストレプトアビジンまたはニュートロアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）の溶液に、７０ｒｐｍで攪拌しながら２時間浸漬した。そのスライドを水ですすぎ、ビオチン化ペプチドまたはペプトイドをスポッティングするための準備をした。図７Ｂは、本発明の一実施形態に従ってビオチン化タンパク質結合剤でスポットした、アビジン誘導体化アルミニウムスライドの代表例を示す。
【０１１５】
種々の表面改変工程を、楕円偏光法を使用して追跡して、厚みの変化を書き留める。４０〜４５Åの厚みの変化の増大は、表面層にアビジンを添加した後に、再現可能に記録された。
【０１１６】
（実施例４：タンパク質標識）
タンパク質溶液を、０．１Ｍ  炭酸ナトリウム（ｐＨ９．３）中に１ｍｇ／ｍＬの濃度および０．１〜１ｍＬの容量に調節し、二官能性または一官能性のアミン反応性シアニン色素（Ｃｙ３またはＣｙ５、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と混合した。そのタンパク質を、５ｃｍの長さ、１．７ｃｍ直径のカラムに詰めたＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（１ｍLロード、０．５ｍＬ画分、および希釈率３．５）によって未反応色素から精製した。
【０１１７】
図８は、その成分のサイズ排除クロマトグラフィーが標識タンパク質を未反応色素から効率的に分離することを例示する結果のグラフを示す。そのグラフは、タンパク質（ＢＳＡ標準）および色素分子についての異なる溶出プロフィールを示す。
【０１１８】
（実施例５：チップ結合実験）
いくつかの例において、ペプトイドライブラリーをスポットしたチップを、システイン、メルカプトエタノールまたは他の適切な親水性チオールで化学的にブロックする。そのチップを、タンパク質（例えば、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ、１０％  脱脂粉乳または１％  カゼイン）で、少なくとも１時間ブロッキングし、水ですすぎ、乾燥する。標識したタンパク質プローブ溶液を、応じてブロッキング溶液で希釈する（代表的には、２０〜１０００ｎｇ総タンパク質）（エッチングしたＡｌスライドについては、数ピコグラムの検出限界が観察されている）。そのプローブ溶液の３０〜１００  Ｌのアリコートを、そのチップ表面に適用し、清浄なカバースリップを上に載せ、チップ表面上にプローブ溶液のサンドイッチを形成する。タンパク質溶液を、少なくとも１時間チップとともにインキュベートする。そのカバースリップを、１×ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎまたは界面活性剤を含む他の適切な緩衝液中で取り外す。次いで、そのチップを、１×ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎまたは他の適切な緩衝液／界面活性剤系中で洗浄する。そのチップを、水でさらにすすぎ、アルゴンまたは窒素流下で乾燥し、スキャンする。
【０１１９】
（実施例６：サンプルチップ）
１，０００個のペプトイドベースのタンパク質結合剤のライブラリーを有するマイクロアレイチップを、本発明に従って調製した。ストレプトアビジンを、ｗｎｔ経路においてタンパク質を発現するように誘導した細胞、およびコントロール細胞溶解物に加え、混合物全体を、Ｃｙ３（コントロール）またはＣｙ５（ｗｎｔ）で標識した。次いで、この混合物を、ビオチンディスプレイペプトイドをその左上角に有したチップ（６．３ｎｇ総タンパク質／チップ；３１ｐｇ  ストレプトアビジン／チップ）とともにインキュベートした。図９Ａおよび９Ｂは、インキュベートしたチップの１／６を示す。示されるように、ビオチンペプトイドスポットに加えて、多くの他のペプトイドスポットは、溶解物中のタンパク質に結合している。Ｃｙ５およびＣｙ３のチャネルからの相対シグナルを比較することによって、差異が同定され得る。図９Ｃはまた、ストレプトアビジンのみのコントロールチップの１／２を示す（３１ｐｇストレプトアビジン／チップ）。ビオチンペプトイドスポットは、左上角に見える。
【０１２０】
（実施例７：実演チップ）
図１０に例示されるように、「抗ｇｌｕ」抗体に対する、異なるかつ既知の親和性の、ビオチン固着基およびヘプタマーグリシル（ｇｙｃｙｌ）リンカーを有するヘキサマーペプチドを合成した。本発明の概念を証明するために、ビオチン化ペプチドを、本開示において記載されるように、アビジン処理スライドにスポットした。そのスライドを、カゼインでブロッキングし、Ｃｙ５標識抗ｇｌｕ抗体でプローブした。シグナル強度の漸次的移行は、そのペプチドとそれらのコグネイト抗体プローブとの間の親和性における既知の差異（例えば、直接液ＥＬＩＳＡによって測定される）と相関する。
【０１２１】
（実施例８：表面結合系の比較）
図１１は、シグナル強度が基材へのタンパク質結合剤の表面結合の様式に依存することを示す。この例において、チオール／マレイミドと比較して、１０００×のシグナル増加がビオチン／アビジン固定化について観察される（シグナル結果は、上記の表面結合の記載および分子構造を示した）。
【０１２２】
（実施例９：抗体ディスプレイのためのタンパク質コーティングスライド表面の調製）
プロテインＡ改変またはプロテインＧ改変側面を調製するために、アビジンでコーティングしたスライド（上記のように調製した）を、ビオチン化プロテインＡまたはプロテインＧ（ＰＢＳ緩衝液中０．５〜１ｍｇ／ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅから購入、製品番号２９９８９ｚｚおよび２９９８８ｚｚ）の溶液中に室温にて２時間浸した。次いで、そのスライドを、脱イオン化蒸留水ですすぎ、窒素またはアルゴンを吹き付けて乾燥させた。
【０１２３】
（実施例１０：ガラスおよび鏡面スライド（ｍｉｒｒｏｒｅｄ  ｓｌｉｄｅ）の比較）
Ａｌ／ＳｉＯ２／ＡＰＴＥＳスライドを、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入するか、またはクラス１００のクリーンルームで自作した。スライドを、反射性アルミニウムコーティングにより調製し、これをさらに、薄い二酸化ケイ素誘電体、続いてＡＰＴＥＳでオーバーコーティングした。その自作のスライドを、液体界面活性剤中、１０分間超音波処理することによって予め洗浄し、脱イオン水ですすぎ、次いで、Ｎｏｃｈｒｏｍｉｘ／Ｈ２ＳＯ４の溶液中でさらに洗浄した。脱イオン水ですすいだ後に、そのスライドを、イソプロパノール中に５分間浸し、乾燥した。回転装置（ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｐｌａｎｅｔａｒｉｅｓ）を装備したＭｏｄｅｌ  ＣＨ−ＳＥＣ−６００−ＲＡＰ  ｅ−ビームを、１０００Åのアルミニウムおよび８００ÅのＳｉＯ２（商品名）の被覆の前に２×１０−６トルに減圧した。次いで、そのスライドを、２５ｍＬのＡＰＴＥＳを含む１００で真空オーブン中に入れ、−２３ｍｍＨｇに減圧した。スライドを、さらなる処理なしで使用した。ｃＤＮＡクローンを、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎ  ＩＩＩ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｐｏｔｔｅｒを使用して、１：１  水／ＤＭＳＯ溶液から、基材にロボットによりスポットした。
【０１２４】
図１２を、ＡＰＴＥＳコーティングガラス顕微鏡用スライドから得られる画像と、ＡＰＴＥＳコーティングアルミニウムスライドの画像との比較を示す。同量の蛍光標識分析物サンプルを、各表面に適用した。異なる投入量のｍＲＮＡを使用したが、最上行は、加えたコントロールの標準セットを示す。
スポット１のシロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ｍＲＮＡを、Ａｌスライドについては２５ｎｇで添加し、ガラススライドについては２５０ｎｇで添加したが、なおシグナルは、アルミニウムスライドについて２倍大きい。最上行の第２のスポットに、１細胞につき１コピーの当量を加えた。ガラス基材については、シグナルは、Ａｌ基材を使用する、約２０倍大きい強いシグナルに比較して、わずかに検出可能である。バックグラウンドの非特異的結合は、スポット２０〜２２（細菌遺伝子）およびスポット２６〜２９（ＤＭＳＯ）およびスポット３１〜３３（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子）について明らかなバックグラウンドによって示されるように、両方の場合において最小である。そのＡｌ／ＳｉＯ２基材は、Ｃｙ３／Ｃｙ５タグ化ｃＤＮＡからのシグナルを、対応するガラス基材に対して約１０〜４０倍増幅する。
【０１２５】
従って、Ａｌ／ＳｉＯ２（鏡面）スライドは、シグナル強度、ならびにスポット形態および均質性に関して、それらの平面ガラス対応物より優れたアレイ画像を生じる。
【０１２６】
（むすび）
前述の発明は、理解を明瞭にする目的で幾分詳細に記載されてきたが、特定の変更および改変が本発明の範囲内で実施され得ることは明らかである。例えば、本開示は、タンパク質結合アレイ要素のペプチド模倣物セグメントとして、ペプトイドの使用が強調されているが、本発明の範囲は、そのように限定されず、本明細書中に記載の適切な特性および機能を有する他の分子もまた使用され得ることが理解されるべきである。本発明のプロセスおよび装置の両方を実施する多くの代替的方法があることにも留意すべきである。従って、本実施形態は、例示であって、限定として解釈されるべきではなく、本発明は、本明細書中に記載のような詳細に限定されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１Ａ】図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の１つの実施形態に従って、それぞれタンパク質結合剤およびアレイの一部の構造の概略図である。
【図１Ｂ】図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の１つの実施形態に従って、それぞれタンパク質結合剤およびアレイの一部の構造の概略図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明の１つの実施形態に従って、エチレンオキシドからなるタンパク質結合剤連結セグメントの分子構造を図示したものである。
【図２】図２は、本発明の１つの実施形態に従って、固体支持体の表面に安定して会合された複数の異なるタンパク質結合剤を有するアレイの作製過程の概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の１つの実施形態に従った、６つの１２マーのペプチドアレイ要素の分子構造の概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、タンパク質の非特異的結合を阻害するために設計された、本発明に従ったペプトイドを元にした化学ブロッキング剤を図示したものである。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、本発明の１つの実施形態に従って、タンパク質結合剤を固体支持体に結合させる方法の、代わりの形式の概略図である。
【図５】図５は、本発明の１つの実施形態に従った、差異のあるタンパク質結合アッセイを実施するための過程の概略図である。
【図６】図６は、本発明の実施形態に従って同定されたタンパク質を同定、特徴付けるための様々な過程の概略図である。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の１つの実施形態に従って基材として使用されるために、アルミニウムスライドを被覆するために溶液中で使用されるＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンの化学式を図示したものである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、本発明の１つの実施形態に従って、ビオチン化されたタンパク質結合剤とともにスポットされるアビジン誘導化アルミニウムの表現を図示したものである。
【図８】図８は、本発明の実施形態に従って、標識化タンパク質サンプルのマイクロアレイへの適用に先立ち、標識化タンパク質を未反応色素から分離するために実施されるサイズ排除クロマトグラフィーの結果のグラフを図示したものである。
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、本発明の着想を証明するために使用される、１，０００のペプトイドを元にしたタンパク質結合剤のライブラリーを持つマイクロアレイチップのスキャンを図示したものである。
【図１０】図１０は、ビオチン化ヘキサマーペプチド（ＡからＥ）、およびビオチン化ペプチドがアビジン処理スライドにスポットされ、カゼインでブロックされ、Ｃｙ５標識の抗ｇｌｕ抗体（ａｎｔｉｇｌｕ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）で調査された場合に得られる、その対応するシグナル強度を図示したものである。
【図１１】図１１は、本発明に従った表面接着の２つの形式に対して、ペプチドの表面接着形式へのシグナル強度の依存性を図示したものである。
【図１２】図１２は、本発明に従って、反射基材アレイの利点を詳細に示すために、比較実験の中でガラス対反射基材由来のシグナルの相違を図示したものである。
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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