(57)【要約】本発明は、ＲＥＴ遺伝子の突然変異が介在するかまたはこれを特徴とする病気または甲状腺癌、特にＲＥＴ突然変異を含む甲状腺癌に罹患した温血動物、特にヒトの処置方法であって、上皮増殖因子(ＥＧＦ)の活性を減少させる化合物、特に本明細書記載の化合物の治療有効量を上記動物に投与することを含む方法に関するものである。
2005531488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺癌処置用医薬の製造を目的とする上皮増殖因子(ＥＧＦ)の活性を減少させる化合物の使用。
【請求項２】
甲状腺癌がＲＥＴ突然変異を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
甲状腺癌が遺伝性甲状腺髄様癌である、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
甲状腺癌が放射線被曝により誘発される、請求項１〜３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
ＲＥＴ遺伝子における突然変異が介在するかまたはこれを特徴とする病気を処置するための医薬の製造を目的とする上皮増殖因子の活性(ＥＧＦ)を減少させる化合物の使用。
【請求項６】
ＥＧＦの活性を減少させる化合物が、ＰＫＩ１６６、ＯＳＩ７７４、Ｃ２２５、ＣＩ−１０３３、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ−７２０００、ＩＲＥＳＳＡ(イレッサ、登録商標)およびＭＤＸ−４４７から選択されるＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
処置を必要とする温血動物に上皮増殖因子(ＥＧＦ)の活性を減少させる化合物の治療有効量を投与することを含む、甲状腺癌の処置方法。
【請求項８】
甲状腺癌がＲＥＴ突然変異を含む、請求項８記載の方法。
【請求項９】
甲状腺癌が遺伝性甲状腺髄様癌である、請求項８または９記載の方法。
【請求項１０】
甲状腺癌が放射線被曝により誘発される、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
処置を必要とする温血動物に上皮増殖因子(ＥＧＦ)の活性を減少させる化合物の治療有効量を投与することを含む、ＲＥＴ遺伝子における突然変異が介在するかまたはこれを特徴とする病気の処置方法。
【請求項１２】
温血動物がヒトである、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
ヒトが１８歳より若い、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＥＧＦの活性を減少させる化合物が、ＰＫＩ１６６、ＯＳＩ７７４、Ｃ２２５、ＣＩ−１０３３、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ−７２０００、ＩＲＥＳＳＡ(イレッサ、登録商標)およびＭＤＸ−４４７から選択されるＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項７〜１３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＲＥＴ遺伝子における突然変異が介在するかまたはこれを特徴とする病気または甲状腺癌、特にＲＥＴ突然変異を含む甲状腺癌に罹患した温血動物、特にヒトの処置方法であって、上記動物に上皮増殖因子(ＥＧＦ)の活性を減少させる化合物、特に本明細書記載の化合物の治療有効量を投与することを含む方法に関するものである。
【０００２】
染色体１０ｑ１１.２に局在するヒトＲＥＴ遺伝子は、タンパク質チロシンキナーゼファミリーの貫膜受容体をコード化する。この遺伝子は２１のエキソンにより構成され、それらは少なくとも３つのｍＲＮＡ変異型に転写される。成熟グリコシル化タンパク質は、１７０ｋＤのサイズであり、３つの主要ドメイン：カドヘリン様および高システイン領域から成るリガンド結合に関与する細胞外ドメイン、貫膜ドメイン、および２７アミノ酸挿入により分離されるチロシンキナーゼドメイン(ＴＫ)を含む細胞内部分を含む。
【０００３】
ＲＥＴプロトオンコジーンは、神経堤起始の細胞の増殖、生存、分化および移動の調節に関与する。ＲＥＴについては４種のリガンド：グリア細胞株由来神経栄養因子、ニュールツリン、パーセフィンおよびアルテミンが同定されている。リガンド結合後、ＲＥＴの二量体化が誘導されることにより、受容体のキナーゼ活性の活性化、選択されたチロシン残基における自己リン酸化、および受容体の特異的チロシン−リン酸化ドメインとエフェクターの相互作用を通じた細胞内シグナリングの開始が誘発される。甲状腺髄様癌または甲状腺乳頭癌の発生に関与するＲＥＴ遺伝子における突然変異は、構成的活性受容体をコードし、そこでその活性化を制御する鍵となる調節機能の一つが破壊される。散発性甲状腺乳頭癌では、そのチロシンキナーゼ機能の構成的活性化をもたらすＲＥＴの再配列(ＲＥＴ／ＰＴＣ)が観察された。チログロブリン遺伝子プロモーターにより甲状腺におけるＲＥＴ／ＰＴＣの発現がターゲッティングされたマウスにおける乳頭癌の発生により立証されたところによると、このオンコジーンヒットは、病気の因果関係に関与すると思われる。
【０００４】
米国では毎年約１８０００の甲状腺癌の新たな症例が診断されている。これらのうち、約９０％は甲状腺小胞細胞から生じる甲状腺乳頭癌(ＰＴＣ)である。甲状腺髄様癌(ＭＴＣ)は、カルシトニン分泌性小胞周縁Ｃ細胞から生じ、全甲状腺癌の５〜１０％に相当する。甲状腺髄様癌の約２５％は、多発性内分泌腺腫症２型(ＭＥＮ２)または家族性甲状腺髄様癌(ＦＭＴＣ)の一部として遺伝性である。ＲＥＴプロト‐オンコジーンの生殖系列突然変異は、常染色体優性伝達モードを通して、ＭＴＣの全遺伝性形態に疾病素質を付与する。
【０００５】
上皮増殖因子(ＥＧＦ)についての受容体のチロシンキナーゼ活性は、ヒト細胞、特に上皮細胞、免疫系細胞および中枢および末梢神経系細胞を含む多数の哺乳類細胞におけるシグナル伝達においてある一定の鍵となる役割を演じる。例えば、様々な細胞型において、受容体関連タンパク質チロシンキナーゼのＥＧＦ誘導活性化は、細胞分裂、従って細胞集団の増殖についての先行必要条件である。ＥＧＦの活性を減少させる若干の化合物が当業界では公知である。
【０００６】
驚くべきことに、ＥＧＦの活性を減少させる化合物、特にＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤は、ＲＥＴ遺伝子における突然変異が介在するかまたはこれを特徴とする病気および特に甲状腺癌を処置するための治療剤として使用され得ることが見出された。
【０００７】
このため、本発明は、甲状腺癌処置用医薬の製造を目的とする上皮増殖因子(ＥＧＦ)の活性を減少させる化合物の使用および甲状腺癌、特にそのチロシンキナーゼ機能の構成的活性化をもたらすＲＥＴ突然変異を含む甲状腺癌の処置方法であって、処置を必要とする温血動物、好ましくはヒト、さらに好ましくは男性にＥＧＦ活性を減少させる化合物の治療有効量を投与することを含む方法に関するものである。
【０００８】
ＥＧＦの活性を減少させる化合物は、好ましくは国際公開第９７／０２２６６号またはＰＣＴ／ＥＰ０２／０８７８０に開示されているＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤、非常に好ましくはＰＫＩ１６６、ＯＳＩ７７４、Ｃ２２５(セツキシマブ)、ＣＩ−１０３３、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＥＭＤ−７２０００、ＩＲＥＳＳＡ(イレッサ、登録商標)およびＭＤＸ−４４７から選択されるＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤、さらに好ましくはＰＫＩ１６６、ＯＳＩ７７４、Ｃ２２５およびＩＲＥＳＳＡ(イレッサ、登録商標)である。最も好ましくは、使用されるＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤は、ＰＫＩ１６６である。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、特に小児甲状腺癌の処置方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、放射線被曝により誘発される甲状腺癌の処置方法を提供する。さらに、本発明は、遺伝性甲状腺髄様癌、特にＭＥＮ２およびＦＭＴＣの処置方法を提供する。
【００１０】
本明細書で使用されている「甲状腺癌」の語は、限定されるわけではないが、甲状腺髄様癌および甲状腺乳頭癌を包含する。
【００１１】
コード番号、属名または登録商標名により識別される有効成分の構造は、標準大要“The Merck Index”の現行版またはデータベース、例えばPatents International(例、IMS World Publications)から知ることができる。対応するその内容は、出典明示により援用する。当業者であれば、十分に有効成分を同定することができ、これらの参考文献に基き、それらを製造し、インビトロおよびインビボの両標準試験モデルにおいて医薬の適応症および特性を試験できるはずである。
【００１２】
本明細書で使用されている「ＥＧＦの活性を減少させる化合物」の語は、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害する化合物、ＥＧＦ受容体を阻害する化合物およびＥＧＦに結合する化合物であり、特に国際公開第９７／０２２６６号(式Ｉの化合物について記載)、ＰＣＴ／ＥＰ０２／０８７８０、欧州特許第０５６４４０９号、国際公開第９９／０３８５４号、欧州特許第０５２０７２２号、欧州特許第０５６６２２６号、欧州特許第０７８７７２２号、欧州特許第０８３７０６３号、米国特許第５７４７４９８号、国際公開第９８／１０７６７号、国際公開第９７／３００３４号、国際公開第９７／４９６８８号、国際公開第９７／３８９８３号および特に国際公開第９６／３３９８０号に包括的および具体的に開示された化合物であって、それぞれの場合における特に化合物クレームおよび実施例の最終生成物であり、これらの出版物について出典明示により援用する。同様に、そこに開示された対応する立体異性体および対応する結晶修飾体、例えば溶媒和物および多型も包含される。本発明において有効成分として使用される化合物は、それぞれ引用された文献に記載されている要領で製造および投与され得る。
【００１３】
本明細書で使用されている「処置」の語は、甲状腺癌に罹患しているかまたは上記疾患の前段階にある患者の処置であって、上記患者における病気の進行を遅延させる処置を含む。
【００１４】
広い意味で、本発明は、ＲＥＴ遺伝子における突然変異が介在するかまたはこれを特徴とする病気の処置方法であって、処置を必要とする温血動物に上皮増殖因子(ＥＧＦ)の活性を減少させる化合物の治療有効量を投与することを含む方法およびＲＥＴ遺伝子における突然変異が介在するかまたはこれを特徴とする病気の処置をする医薬の製造を目的とするＥＧＦの活性を減少させる化合物の使用に関するものである。
【００１５】
若干のペプチドは、ＥＧＦの活性に影響を及ぼすと報告されている。ペプチドは、生理学的条件、特に温血動物の血液または胃で見出される条件下で容易に加水分解されるという不利な点を有する。したがって、上記化合物は、ペプチドではないため、本発明においては好ましい。
【００１６】
ＥＧＦチロシンキナーゼを阻害する化合物の効力は、例えば、最適化された緩衝液および塩条件を用いて、[33Ｐ]−ＡＴＰおよび人工基質の存在下でチロシンキナーゼと化合物をインキュベーションすることにより評価され得る。次いで、基質におけるリン酸化チロシンは、β‐シンチレーション計数管により検出される。本明細書で記載されているＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害する化合物のＥＧＦ酵素活性を５０％阻害するのに必要とされる薬剤濃度(ＩＣ５０値)は、典型的には１０と１５０ｎＭの間、好ましくは約１５と５０ｎＭの間である。
【００１７】
特記しない場合、本明細書において、「低級」と示された有機基および化合物は、７個以下、好ましくは４個以下の炭素原子を含む。
【００１８】
本発明の一実施態様において、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害する化合物は、特に式(Ｉ)
【化１】
2005531488.tif 000003
［式中、
ｑ'は、０または１であり、
ｑ'が０のとき、ｎ'は１〜３であり、ｑ'が１のときｎ'は０〜３であり、
ＲＥは、ハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノまたはトリフルオロメチルであり、幾つかの基Ｒが分子に存在するときこれらの基は同一または異なり得、
ａ)ＲＥ１およびＲＥ２は、各々互いに独立して、
α)カルバモイル‐メトキシ、カルボキシ‐メトキシ、ベンジルオキシカルボニル‐メトキシ、低級アルコキシカルボニル‐メトキシ、フェニル、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノ、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノまたはニトロにより置換されたフェニル、
β)ＲＥ１およびＲＥ２が同時には水素を表し得ないという条件下で水素
γ)非置換またはハロ‐もしくは低級アルキル‐置換ピリジル、
δ)Ｎ−ベンジル−ピリジニウム−２−イル、ナフチル、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ−ベンジル−カルバモイル、ホルミル、低級アルカノイル、低級アルケニル、低級アルケニルオキシ、または
ε)
εα)ハロゲン、アミノ、低級アルキルアミノ、ピペラジノ、ジ低級アルキルアミノ、
εβ)非置換またはフェニル部分がハロゲン、低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルカノイルオキシ、低級アルコキシ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、シアノ、アミノ、低級アルカノイルアミノ、低級アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキルアミノまたはトリフルオロメチルにより置換されたフェニルアミノ、
εγ)ヒドロキシ、低級アルコキシ、シアノ、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイル、Ｎ,Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイル、メルカプトまたは
εδ)式ＲＥ３−Ｓ(Ｏ)ｍ'‐(式中、ＲＥ３は低級アルキルであり、ｍ'は０、１または２である)により示される基
により置換された低級アルキル、
であるか、または
ｂ)ｑ'が０のとき、基ＲＥ１およびＲＥ２の一方は非置換低級アルキルまたは非置換フェニルであって、基ＲＥ１およびＲＥ２の他方は水素以外の上記ａ)項記載の意味の一つを有するか、または
ｃ)ｑ'が１のとき、ＲＥ１およびＲＥ２は各々互いに独立して非置換フェニルであるか、またはａ)項記載の意味の一つを有し、
ＲＥ６は、水素、低級アルキル、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−低級アルキル−カルバモイルまたはＮ,Ｎ−ジ−低級アルキル−カルバモイルである］
で示される７Ｈ−ピロロ[２,３−ｄ]ピリミジン誘導体およびその塩類である。
【００１９】
式(Ｉ)の化合物の定義で使用されている基および記号は、国際公開第９７／０２２６６号に開示されたのと同じ意味を有し、この公開については、本出願において出典明示により援用する。
【００２０】
本明細書で使用されている「ＰＫＩ１６６」の語は、式(Ｉ)(ただし、ｑ'は１であり、ｎ'は０であり、ＲＥ１は水素であり、ＲＥ２は４−ヒドロキシにより置換されたフェニルであり、ＲＥ６はメチルである)のＥＧＦ受容体チロシン阻害剤を意味する。
【００２１】
式(Ｉ)で示される非常に好ましいＥＧＦ受容体チロシン阻害剤は、ＰＫＩ１６６{(Ｒ)−６−(４−ヒドロキシ−フェニル)−４−[(１−フェニル−エチル)−アミノ]−７Ｈ−ピロロ[２,３−ｄ]−ピリミジン)}である。
【００２２】
式(Ｉ)で示されるさらに好ましいＥＧＦ受容体チロシン阻害剤は、式(Ｉ)(ただし、ｑ'は１であり、ｎ'は０であり、ＲＥ１は水素であり、ＲＥ２はＣＨ３−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−により置換されたフェニルであり、ＲＥ６はメチルである)の化合物である。
【００２３】
本発明の別の実施態様において、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害する化合物は、特に式(II)
【化２】
2005531488.tif 000004
［式中、
ｚは１、２または３であり、各ＲＺ２は独立してハロゲン、トリフルオロメチルまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
ＲＺ３はＣ１−Ｃ４アルコキシであり、そして
ＲＺ１は、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ジ−(Ｃ１−Ｃ４アルキル)アミノ−Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、ピロリジン−１−イル−Ｃ２−Ｃ４アルコキシ、ピペリジノ−Ｃ２−Ｃ４アルコキシ、モルホリノ−１−イル−Ｃ２−Ｃ４アルコキシ、ピペラジン−１−イル−Ｃ２−Ｃ４アルコキシ、４−Ｃ１−Ｃ４アルキルピペラジン−１−イル−Ｃ２−Ｃ４アルコキシ、イミダゾール−１−イル−Ｃ２−Ｃ４アルコキシ、ジ−[(Ｃ１−Ｃ４アルコキシ)−Ｃ２−Ｃ４アルキル]アミノ−Ｃ２−Ｃ４アルコキシ、チアモルホリノ−Ｃ２−Ｃ４アルコキシ、１−オキソチアモルホリノ−Ｃ２−Ｃ４アルコキシまたは１,１−ジオキソチアモルホリノ−Ｃ２−Ｃ４アルコキシであり、
そしてＮまたはＯ原子に結合されていないメチレン基を含む上記ＲＺ１置換基のいずれかは、所望により上記メチレン基にヒドロキシ置換基を有する］
で示されるキナゾリン誘導体またはその医薬上許容される塩である。
【００２４】
式(II)の化合物の定義で使用されている基および記号は、国際公開第９６／３３９８０号に開示されている意味を有し、この公開については、本出願において出典明示により援用する。
【００２５】
好ましくは、ＲＺ１およびＲＺ３が両方ともメトキシであり、ＲＺ２がブロモである式(II)の化合物またはその医薬上許容される塩を使用する。
【００２６】
さらに好ましくは、４−(３'−クロロ−４'−フルオロアニリノ)−７−メトキシ−６−(３−モルホリノプロポキシ)−キナゾリンである式(II)の化合物またはその医薬上許容される塩を使用する。
【００２７】
本発明のさらに別の実施態様において、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼを阻害する化合物は、特に式(III)
【化３】
2005531488.tif 000005
［式中、
Ｒ１およびＲ２は、各々互いに独立して、水素、非置換または置換アルキルまたはシクロアルキル、環炭素原子を介して結合した複素環基、または式Ｒ４−Ｙ−(Ｃ＝Ｚ)−(式中、Ｒ４は非置換、モノ−またはジ置換アミノまたはまたは複素環基であり、Ｙは存在しないかまたは低級アルキルであり、Ｚは酸素、硫黄またはイミノである)で示される基であるが、ただしＲ１およびＲ２が両方とも水素であることはないものとし、または
Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している窒素原子と一緒になって複素環基を形成し、  Ｒ３は複素環基または非置換または置換芳香族基であり、
Ｇは、Ｃ１−Ｃ７アルキレン、−Ｃ(＝Ｏ)−またはＣ１−Ｃ６アルキレン−Ｃ(＝Ｏ)−であって、カルボニル基はＮＲ１Ｒ２部分に結合しているものとし、
Ｑは、−ＮＨ−または−Ｏ−であるが、ただしＧが−Ｃ(＝Ｏ)−またはＣ１−Ｃ６アルキレン−Ｃ(＝Ｏ)である場合Ｑは−Ｏ−であるものとし、
Ｘは存在しないかまたはＣ１−Ｃ７アルキレンであるが、ただしＸが存在しない場合、複素環基Ｒ３は環炭素原子を介して結合されているものとする］
で示される化合物または上記化合物の塩である。
【００２８】
式(III)の化合物の定義で使用されている基および記号は、ＥＰ０２／０８７８０に開示されている意味を有し、この公開内容については、本出願において出典明示により援用する。
【００２９】
好ましくは、式(III)[ただし、Ｒ１およびＲ２はそれらが結合している窒素原子と一緒になって４−低級アルキル−ピペラジニル基を形成し、Ｒ３はフェニルであり、Ｇはメチレンであり、Ｑは−ＮＨ−であり、Ｘは−ＣＨ(ＣＨ３)−である化合物を使用し、これを本明細書においては「式(III)＊の化合物」またはその医薬上許容される塩と称する。
【００３０】
当然、方法の検討において、有効成分といえば、医薬上許容される塩類をも包含するものと考えられる。これらの有効成分が例えば少なくとも１個の塩基性中心を有する場合、それらは酸付加塩類を形成し得る。対応する酸付加塩類はまた、所望ならば追加的に存在する塩基性中心を有するものとして形成され得る。酸性基(例えばＣＯＯＨ)を有する有効成分はまた、塩基による塩類を形成し得る。有効成分またはその医薬上許容される塩はまた、水和物形態で使用されるかまたは結晶化に使用される他の溶媒を含み得る。
【００３１】
本発明医薬組成物は、自体公知の方法で製造され得、ヒトを含む温血動物への腸溶、例えば経口または直腸、および非経口投与に適切であり、少なくとも１種の薬理学的有効成分の治療有効量を単独または特に腸溶または非経口適用に適切である１種またはそれ以上の医薬上許容される担体との組合わせとして含むものである。本発明の用量形態の好ましい投与経路は、経口経路である。
【００３２】
当業者であれば、関連性のある試験モデルを選択することにより、ＥＧＦの活性を減少させる化合物の、ＲＥＴ遺伝子における突然変異が介在するかまたはこれを特徴とする病気、例えば甲状腺癌に対する上記の有益な効果を十分証明できるはずである。かかる化合物の薬理学的活性は、例えば下記実施例、ヌードまたはトランスジェニックマウスにおけるインビボ試験または適切な臨床試験により立証され得る。適切な臨床試験は、例えば、転移性甲状腺髄様癌患者におけるオープンラベル非ランダム化投与量逐次漸増試験である。処置の効力は、これらの試験において、例えば６週間ごとの腫瘍の放射線医学的評価または有効成分に匹敵するプラセボで得られた対照を用い、適切な血清腫瘍マーカーにより測定される。
【００３３】
ＥＧＦ活性を減少させる化合物の有効量は、使用する特定化合物または医薬組成物、例えば投与方法、処置されている甲状腺癌のタイプまたは処置されている甲状腺癌の重症度により異なり得る。用量摂取法は、患者の腎機能および肝機能を含む様々なさらなる因子により選択される。通常レベルの技術をもつ開業医、臨床医または獣医であれば、病状の進行を予防、阻止または抑止するのに必要とされるＥＧＦ活性を減少させる化合物の有効量を容易に決定し、処方できるはずである。毒性を伴わずに効力を生じさせる範囲内における有効成分濃度の達成に最適な正確さは、標的部位に対する有効成分利用能の速度論に基いた摂取法を必要とする。式(Ｉ)の化合物の用量は、好ましくは約５０〜７００、さらに好ましくは約１００〜５００、そして最も好ましくは約１５０〜３００ｍｇ／日の範囲である。イレッサ(登録商標、ＺＤ１８３９)の適用される経口用量は、好ましくは腫瘍疾患処置についてのパッケージ挿入物に記載された用量である。
【００３４】
ＲＥＴキナーゼに対するＥＧＦ活性を減少させる化合物の活性を調べるためには、例えば、下記のテトラサイクリン(ドキシサイクリン)依存的方法でＲＥＴ／ＰＴＣ３またはＲＥＴ／ＰＣＴ１を条件的に発現する、十分に分化したクローン甲状腺セルライン、ＰＣＣＬ３が使用され得る。ＲＥＴ／ＰＴＣ１または３の発現の活性化により、二量体化、自己リン酸化、およびＳｈｃおよびＰＬＣγを含む若干のシグナリング中間体の随伴がもたらされる。
【００３５】
クーン培地／Ｆ１２高亜鉛に５％ＦＢＳ、０.３ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、１ｍｌＵ／ｍｌのＴＳＨ、１０μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのアポ‐トランスフェリン、１０ｎＭのヒドロコルチゾンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補ったものから成るＨ４完全培地において、ＰＣＣＬ３セルラインを維持する。使用される発現系は、Bujardおよび共同研究者により、ドキシサイクリンとエシェリキア・コリ(E.coli)ｔｅｔ リプレッサー‐オペレーターの相互作用の高特異性に基いてドキシサイクリン誘導性発現を送達するよう開発されたものであった。まず安定したトランスフェクションを実施することにより、トランスアクチベーターｒｔＴＡ(ｒｔｅｔＲ ＤＮＡ結合ドメインおよびＶＰ１６活性化ドメインの融合体により構成される)を構成的に発現するクローンラインを確立する。次いで、個々のｒｔＴＡ−発現性クローンを、ｔｅｔ−オペレーター制御下におけるルシフェラーゼリポーター構築物での一時的トランスフェクションによりドキシサイクリン誘導性発現について調べる。非常に低いかまたは検出不可能な基礎ルシフェラーゼ活性およびドキシサイクリンによる著しい(すなわち１００倍より大)誘導を示すｒｔＴＡのクローンを、ＲＥＴ／ＰＴＣ１またはＲＥＴ／ＰＴＣ３ ｃＤＮＡの上流にクローン化されたｔｅｔ−オペレーター配列を含む最小ＣＭＶプロモーターから成る構築物による安定した二次トランスフェクション用の宿主として選択する。
【００３６】
ＥＧＦ−Ｒを安定して過剰発現するヒト扁平上皮癌セルラインＡ４３１を、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で１０％胎児ウシ血清を補ったＤＭＥＭにおいて増殖させる。ＲＥＴ／ＰＴＣ１およびＲＥＴ／ＰＴＣ３は、オリゴマー化し、構成的チロシンキナーゼ活性を呈する。インスリン受容体過剰発現性セルラインＣＨＯ−ｗｔ ＩＲを、１０％胎児ウシ血清を補ったハムＦ−１２培地で増殖させる。
【００３７】
実施例
実施例１：ＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤によるＥＧＦＲ(Ａ４３１細胞)またはＲｅｔＰＴＣ３−５(ＰＣＣＬ３)の自己リン酸化の阻害
密集成長Ｔ−７５フラスコを、０.２ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳで洗浄する。次いで、細胞を、４℃で２０分間一定して攪拌しながら冷ＲＩＰＡ緩衝液１.８ｍｌ(２０ｍＭのトリス、ｐＨ７.４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ノニデットＰ−４０、１％トウィーン２０、２０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、０.２ｍＭのＰＭＳＦ、およびシグマ・プロテアーゼ阻害剤ミックス)により溶解する。細胞ライゼートを、２６ゲージ針に通して大きな凝集体を分散させ、１０６００×Ｇ、４℃で３０分間遠心分離にかける。澄明上清を、抗ＲＥＴ抗体(サンタクルスヤギポリクローナル)または抗ＥＧＦＲ(サンタクルス)と４℃で２時間インキュベーションし、次いで、ＲＩＰＡ緩衝液で予め洗浄しておいたプロテインＡＧアガロース(サンタクルス)とインキュベーションする。免疫複合体をスピンさせ、洗浄緩衝液(５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.２、２０ｍＭのＭｎＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２)中で２回およびキナーゼ緩衝液(洗浄緩衝液＋０.５ｍＭのジチオトレイトール)で１回洗浄する。最終洗浄後沈澱した免疫複合体を、キナーゼ緩衝液に再懸濁し、反応管へアリコート化する。キナーゼ検定法を、指示濃度の阻害剤の存在または非存在下０.５％ＤＭＳＯを含む２０μｌインキュベーション緩衝液中で実施する。室温で２５分間比活性１４０ｎＣｉ／ｐｍｏｌのＰ３２‐ＡＴＰ(パーキン‐エルマー、＞６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ)を加えることにより、反応をデュプリケイトで実施する。ＳＴＯＰ緩衝液(１０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７、１％トリトンＸ−１００、０.１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのＥＤＴＡ、および５μｇ／ｍｌのアプロチニン)で２回洗浄することにより、反応を停止させる。第２洗浄後、１０分間３５μｌのラエムリ緩衝液中で沸騰させることによりタンパク質を溶離させる。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル(７.５％)にかけ、ニトロセルロース膜へ移動後、それらのリン酸化をホスホルイメージャーデンシトメーター法(モレキュラー・ダイナミクス、サニーベール、カリフォルニア)により測定する。次いで、リン酸化を、ヤギポリクローナル抗ＲＥＴ抗体(サンタクルス)を用いたウエスタン分析により測定されたＩＰにおいて総ＲＥＴタンパク質に対し正規化する。
【００３８】
ＲＥＴ／ＰＴＣ自己リン酸化に対するＰＫＩ１６６の効果を、癌タンパク質の発現を最大誘導する４８時間ドキシサイクリンで処理したＲＥＴ／ＰＴＣ３−５細胞からのＲＥＴ−ＩＰ抽出物の上記インビトロイムノキナーゼ検定法で調べる。非処理細胞ではＲＥＴ−ＩＰライゼートにおけるキナーゼ活性は全く観察されない。ＲＥＴ／ＰＴＣ３に対するＣＰＧ７５１６６のＩＣ５０は約１７.７ｎＭである。対照的に、Ａ４３１細胞のイムノキナーゼ検定法におけるＥＧＦ−Ｒ自己リン酸化に対する化合物のＩＣ５０は、８ｎＭである。ＰＫＩ６６は、ＣＨＯ−ｗｔ−ＩＲ細胞のイムノキナーゼ検定法においてインスリン受容体自己リン酸化に対する効果を全く示さない。
【００３９】
実施例２：ＲＥＴ／ＰＴＣによるＰＬＣγの活性化に対するＥＧＦ−Ｒチロシンキナーゼ阻害剤の効果
Ｒｅｔ−ＰＴＣ３−５細胞を、６ウェルのコーニングプレートにおいて１×１０５細胞／ウェルで播種する。３日後、細胞を、２４時間溶媒に溶解した選択濃度の阻害剤の存在下ドキシサイクリンを用いるかまたは用いずに処理する。０.１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウムを含む冷ＰＢＳで細胞を２回すすぎ、氷冷ＲＩＰＡ緩衝液中で２０分間放置する。細胞ライゼートを、４℃での遠心分離により集め、２０分間１００００×ｇで沈澱させる。クーマシーブルー検定法(ピアス、ロックフォード、イリノイ)により上清のアリコートでタンパク質検定法を実施する。６５０μｇのタンパク質を抗ＰＬＣγ抗体(サンタクルス)または正常ＩｇＧと一晩インキュベーションする。上記と同様予めＲＩＰＡ緩衝液で洗浄しておいたプロテインＡＧアガロース(サンタクルス)により免疫複合体を沈澱させる。ＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄後、沈澱物を３０μｌの試料緩衝液中へ溶離させ、９５℃で１０分加熱し、ウエスタンブロット分析用ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかける。ブロットを最初に抗ホスホチロシンでプローブする。抗ＰＬＣγ抗体(サンタクルス)でプローブすることにより、ローディングを正規化する。
【００４０】
活性化されると、ＲＥＴはＰＬＣγと会合し、リン酸化することは以前に示された。ＲＥＴキナーゼ活性に対するＰＫＩ１６６の効果をさらに調べるため、ＰＬＣγリン酸化に対する化合物による前処理の影響を調べる。ドキシサイクリンの非存在下で増殖させたとき、検出可能なＰＬＣγリン酸化は全く存在しない。ＰＫＩ１６６による前処理は、用量依存的方式でＰＬＣγリン酸化を阻害し、ＩＣ５０は約４ｎＭである。
【００４１】
実施例３：ＮＩＨ３Ｔ３−ＲＥＴＣ６３４Ｌ細胞の成長に対するＰＫＩ１６６の効果
ＲＥＴＣ６３４Ｌは、ＲＥＴの構成的活性形態を安定発現する多発性内分泌腺腫症２Ａ型におけるＲＥＴの最もよくある生殖系列突然変異である。低血清条件での成長、軟寒天におけるコロニー形成およびヌードマウスにおける腫瘍形成により証明された通り、ＮＩＨ３Ｔ３−ＲＥＴＣ６３４Ｙ細胞は形質転換されている。ＰＫＩ１６６でこれらの細胞を処理することにより、細胞成長の強力な濃度依存的阻害が誘発される。ＰＫＩ１６６は、５％血清中で成長させた野生型ＮＩＨ３Ｔ３細胞の成長に全く影響を及ぼさない(図１)。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１の簡単な説明：  この図は、構成的活性ＲＥＴ Ｃｙｓ６３４Ｔｙｒを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖に対するＰＫＩ１６６の効果を説明している。  ＲＫＩ１６６は、ＲＥＴ−形質転換線維芽細胞の増殖を阻害する。示されたセルラインを６ウェルプレートにおいて一晩平板培養させる(５×１０４でＮＩＨ３Ｔ３細胞；２×１０４で３Ｔ３−ＲＥＴＣ６３４Ｙ)。次いで、それらをＰＫＩ１８８の非存在、２０ｎＭのＰＫＩ１６６または３０ｎＭのＰＫＩ１６６の存在下で９日間増殖させ、培地は３日ごとに交換する。横棒は、３独立実験における細胞総数のＸ±ＳＤを表す。初めの３棒線は、５％血清中におけるＮＩＨ３Ｔ３−ＲｅｔＣｙｓ６３４Ｔｙｒでの結果を示し、次の３棒線は、１％血清中におけるＮＩＨ３Ｔ３−ＲｅｔＣｙｓ６３４Ｔｙｒでの結果を示し、最後の２棒線は５％血清中におけるＮＩＨ３Ｔ３での結果を示す(賦形剤のみおよび３０ｎＭのＰＫＩ１６６)。
【図２】図２の簡単な説明：  この図は、Ａ４３１およびＲＥＴ ＰＴＣ３−５セルライン(ＲＥＴ／ＰＴＣ３のドキシサイクリン‐誘導性発現を伴うＰＣＣＬ３細胞)におけるＥＧＦ−ＲおよびＲＥＴキナーゼ活性に対する式(III)＊で示される化合物の効果を説明している。
【図３】図３の簡単な説明：  この図は、ＰＴＣ−１細胞(ＲＥＴ／ＰＴＣ−１の内在性活性化を伴う甲状腺乳頭癌セルライン)の増殖に対する示された化合物の効果を説明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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