(57)【要約】哺乳動物被検体において、生物学的活性剤の粘膜搬送を増進させるのに有効な、生物学的活性剤および浸透化剤を含む、組成物および方法を提供する。浸透化剤は、典型的には、被検体において、粘膜上皮表面で、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進する。この影響は、典型的には、隣接する上皮細胞の上皮膜接着タンパク質間のホモ型結合または異型結合の、浸透化剤による阻害を伴う。ホモ型結合または異型結合のこの遮断の標的タンパク質は、多様な関連接合部接着分子（ＪＡＭ類）、オクルディン類、またはクローディン類から選択可能である。浸透化剤は、典型的には、ペプチドまたはペプチド類縁体またはペプチド模倣体であり、しばしば哺乳動物ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の細胞外ドメインから選択されるか、または該タンパク質に由来する。
2005537244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的活性剤および粘膜搬送を増進させるのに有効な量の浸透化ペプチドを含んでなる医薬組成物であって、前記ペプチドが、哺乳動物被検体における上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進するものであり、かつ前記ペプチドが、接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディンから選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合を有効に阻害するものである医薬組成物。
【請求項２】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項４】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、あるいは哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項５】
前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す、請求項４の医薬組成物。
【請求項６】
前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示す、請求項５の医薬組成物。
【請求項７】
前記浸透化ペプチドがヒトＪＡＭペプチドであり、そして前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、同じヒトＪＡＭタンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）が、異なるヒトＪＡＭタンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同ＪＡＭタンパク質に同定される、構造的特徴に相当する、請求項５の医薬組成物。
【請求項８】
前記浸透化ペプチドがヒトＪＡＭ−１ペプチドであり、そして前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、ヒトＪＡＭ−１タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）が、ヒトＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３タンパク質に同定される構造的特徴に相当する、請求項５の医薬組成物。
【請求項９】
前記浸透化ペプチドがヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３ペプチドであり、そして前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、それぞれ、ヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）が、それぞれ、ネズミ、ラット、またはウシＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３タンパク質に同定される構造的特徴に相当する、請求項５の医薬組成物。
【請求項１０】
前記浸透化ペプチドが、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そしてヒトＪＡＭ−１ペプチド、ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＴＧＩＴＦＫＳＶＴ（配列番号６）、ＩＴＡＳ（配列番号７）、ＳＶＴＲ（配列番号８）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、またはＧＦＳＳＰＲＶＥＷ（配列番号１０）、ヒト・クローディン・ペプチドＹＡＧＤＮＩＶＴＡＱ（配列番号５７）、ＭＴＰＶＮＡＲＹＥＦ（配列番号５８）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬ（配列番号５９）、ＶＰＤＳＭＫＦＥＩＧ（配列番号６０）、ＤＩＹＳＴＬＬＧＬＰ（配列番号５５）、ＧＦＳＬＧＬＷＭＥＣ（配列番号５６）、ＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰ（配列番号５４）、ＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭ（配列番号６３）、ＶＡＳＧＱＫＲＥＭＧ（配列番号５９）、ＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬ（配列番号６１）、またはＶＰＶＳＱＫＹＥＬＧ（配列番号６２）、あるいはヒト・オクルディン・ペプチドＧＶＮＰＴＡＱＳＳ（配列番号３３）、ＧＳＬＹＧＳＱＩＹ（配列番号３４）、ＡＡＴＧＬＹＶＤＱ（配列番号３２）、ＡＬＣＮＱＦＹＴＰ（配列番号３５）、またはＹＬＹＨＹＣＶＶＤ（配列番号４２）から選択される１以上の隣接配列要素を含む、請求項１の医薬組成物。
【請求項１１】
前記浸透化ペプチドが、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そして：
ＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基Ｉ、Ｖ、またはＡの１つで代表されることが可能である；
（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）、ここで該モチーフの第１位は、代替アミノ酸残基Ｖ、ＡまたはＩの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第４位は、代替アミノ酸残基ＳまたはＴの１つで代表されることが可能である；および
ＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＳの１つで代表されることが可能であり、該モチーフの第７位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＲの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第９位は、代替残基ＭまたはＥの１つで代表されることが可能である
から選択される１以上の隣接配列モチーフを含む、請求項１の医薬組成物。
【請求項１２】
前記生物学的活性剤が、小分子薬剤、ペプチド、タンパク質、およびワクチン剤から選択される、請求項１の医薬組成物。
【請求項１３】
前記生物学的活性剤が、オピオイド（ｏｐｏｉｄ）、オピオイド・アンタゴニスト、コルチコステロン、抗炎症剤、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスチン、筋弛緩剤、血管拡張剤、抗ヒスタミン剤、ヒスタミン受容体部位遮断剤、鎮咳剤、抗癲癇剤、抗真菌剤、抗細菌剤、癌療法剤、酸化防止剤、不整脈治療剤、抗高血圧剤、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、および療法ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含んでなるＲＮＡベクター、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターから選択される、請求項１の医薬組成物。
【請求項１４】
前記生物学的活性剤が療法タンパク質またはペプチドから選択される、請求項１の医薬組成物。
【請求項１５】
前記療法タンパク質またはペプチドが、組織プラスミノーゲン・アクチベーター（ＴＰＡ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ酸性または塩基性）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−アルファまたはベータ）、血管作動性腸管ペプチド、腫瘍壊死因子（ＴＧＦ）、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＦ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、エンドルフィン類、グルカゴン、カルシトニン、オキシトシン、カルベトシン、アルドエテコン（ａｌｄｏｅｔｅｃｏｎｅ）、エンケファリン類、ソマトスチン（ｓｏｍａｔｏｓｔｉｎ）、ソマトトロピン、ソマトメジン、性腺刺激ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルファ−メラニン形成細胞刺激ホルモン、非天然存在オピオイド類、リドカイン、ケトプロフェン、サフェンタニル（ｓｕｆｅｎｔａｉｎｉｌ）、テルブタリン、ドロペリドール、スコポラミン、ゴナドレリン、シクロピロックス、オラミン、ブスピロン、カルシトニン、クロモリン・ナトリウムまたはミダゾラム、シクロスポリン、リシノプリル、カプトプリル、デラプリル、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、スーパーオキシド・ジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ・リボヌクレアーゼ、トリプシン、ケモトリプシン（ｃｈｅｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、パパイン、ボンベシン、サブスタンスＰ、バソプレッシン、アルファ−グロブリン類、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ベータ−リポタンパク質類、ベータ−グロブリン類、プロトロンビン、セルロプラスミン、アルファ２−糖タンパク質類、アルファ２−グロブリン類、フェチュイン、アルファ−リポタンパク質類、アルファ−グロブリン類、アルブミン、およびプレアルブミンから選択される、請求項１４の医薬組成物。
【請求項１６】
前記療法タンパク質またはペプチドが、増血剤、サイトカイン剤、抗感染剤、抗痴呆症剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、抗うつ剤、向精神剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、抗高血圧剤、抗糖尿病剤、抗凝血剤、コレステロール低下剤、ホルモン剤、抗骨粗鬆症剤、抗生物質剤、ワクチン剤、または細菌トキソイドとして有効である、請求項１４の医薬組成物。
【請求項１７】
前記生物学的活性剤および前記浸透化ペプチドが：
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨ調節剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘液溶解剤または粘液一掃剤；
（ｆ）繊毛抑制（ｃｉｌｉｏｓｔａｔｉｃ）剤；
（ｇ）（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、または（ｘ）コレステロール合成阻害剤から選択される、膜浸透増進剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）に列挙した膜浸透増進剤の組み合わせいずれか；
（ｈ）上皮接合部生理機能の第二の調節剤；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増進剤；および
（ｋ）安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種であって、該物質と生物学的活性剤が有効に組み合わされ、会合し、含有され、被包され、または結合した結果、増進した粘膜搬送のため、活性剤が安定化される、前記安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種
から選択される１以上の粘膜搬送増進剤と組み合わせて投与される、ここで、前記の１以上の粘膜搬送増進剤が、（ａ）〜（ｋ）に列挙する、いずれか１つまたはいずれかの組み合わせの２以上の前記粘膜搬送増進剤を含んでなり、そして前記粘膜搬送増進剤と前記生物学的活性剤の配合物が、哺乳動物被検体の粘膜表面に搬送される生物学的活性剤の生物学的利用能を増加させる、請求項１の医薬組成物。
【請求項１８】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項１９】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項２０】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、または哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項２１】
前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、哺乳動物オクルディン・タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す、請求項２０の医薬組成物。
【請求項２２】
前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、哺乳動物オクルディン・タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示す、請求項２１の医薬組成物。
【請求項２３】
前記浸透化ペプチドがヒト・オクルディン・ペプチドであり、そして前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、同じヒト・オクルディン・タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）が、異なるヒト・オクルディン・タンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同オクルディン・タンパク質に同定される、構造的特徴に相当する、請求項２１の医薬組成物。
【請求項２４】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項２５】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項２６】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、または哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１の医薬組成物。
【請求項２７】
前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、哺乳動物クローディン・タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す、請求項２６の医薬組成物。
【請求項２８】
前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、哺乳動物クローディン・タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示す、請求項２７の医薬組成物。
【請求項２９】
前記浸透化ペプチドがヒト・クローディン・ペプチドであり、そして前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、同じヒト・クローディン・タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）が、異なるヒト・クローディン・タンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同クローディン・タンパク質に同定される、構造的特徴に相当する、請求項２７の医薬組成物。
【請求項３０】
鼻内投与のために配合される、請求項１の医薬組成物。
【請求項３１】
鼻内スプレーまたは粉末として配合される、請求項１の医薬組成物。
【請求項３２】
前記生物学的活性剤および前記浸透化ペプチドが：
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨ調節剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘液溶解剤または粘液一掃剤；
（ｆ）繊毛抑制剤；
（ｇ）（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、または（ｘ）コレステロール合成阻害剤から選択される、膜浸透増進剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）に列挙した膜浸透増進剤の組み合わせいずれか；
（ｈ）上皮接合部生理機能の第二の調節剤；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増進剤；および
（ｋ）安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種であって、該物質と生物学的活性剤が有効に組み合わされ、会合し、含有され、被包され、または結合した結果、増進した鼻内搬送のため、活性剤が安定化される、前記安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種
から選択される１以上の鼻内搬送増進剤とともに、鼻内投与のために配合される、ここで、前記の１以上の鼻内搬送増進剤が、（ａ）〜（ｋ）に列挙する、いずれか１つまたはいずれかの組み合わせの２以上の前記鼻内搬送増進剤を含んでなり、そして前記の１以上の鼻内搬送増進剤と前記生物学的活性剤の配合物が、哺乳動物被検体の鼻粘膜表面に搬送される生物学的活性剤の生物学的利用能を増加させる、請求項１の医薬組成物。
【請求項３３】
前記組成物が、前記被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、前記被検体への粘膜投与後、２５％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の前記生物学的活性剤のピーク濃度（Ｃｍａｘ）を生じる、請求項１の医薬組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、前記被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、前記被検体への粘膜投与後、５０％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の前記生物学的活性剤のピーク濃度（Ｃｍａｘ）を生じる、請求項３３の医薬組成物。
【請求項３５】
前記組成物が、前記被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）に比較した際、前記被検体への粘膜投与後、２５％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の前記生物学的活性剤のＡＵＣを生じる、請求項１の医薬組成物。
【請求項３６】
前記組成物が、前記被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）に比較した際、前記被検体への粘膜投与後、５０％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の前記生物学的活性剤のＡＵＣを生じる、請求項３５の医薬組成物。
【請求項３７】
前記組成物が、前記被検体への粘膜投与後、０．１〜１．０時間の間に、被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）における前記生物学的活性剤の最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）を生じる、請求項１の医薬組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、前記被検体への粘膜投与後、０．２〜０．５時間の間に、被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）における前記生物学的活性剤の最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）を生じる、請求項３７の医薬組成物。
【請求項３９】
前記組成物が、前記被検体の血漿中の前記生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、前記被検体への粘膜投与後、１０％以上である、被検体の中枢神経系（ＣＮＳ）組織または液中の前記生物学的活性剤のピーク濃度を生じる、請求項１の医薬組成物。
【請求項４０】
前記組成物が、前記被検体の血漿中の前記生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、前記被検体への粘膜投与後、２０％以上である、被検体の中枢神経系（ＣＮＳ）組織または液中の前記生物学的活性剤のピーク濃度を生じる、請求項３９の医薬組成物。
【請求項４１】
前記組成物が、前記被検体の血漿中の前記生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、前記被検体への粘膜投与後、４０％以上である、被検体の中枢神経系（ＣＮＳ）組織または液中の前記生物学的活性剤のピーク濃度を生じる、請求項３９の医薬組成物。
【請求項４２】
生物学的活性剤が、性的機能不全の治療に有効である、請求項１の医薬組成物。
【請求項４３】
生物学的活性剤が、男性勃起障害の治療に有効である、請求項４２の医薬組成物。
【請求項４４】
生物学的活性剤が、女性性的機能不全の治療に有効である、請求項４３の医薬組成物。
【請求項４５】
生物学的活性剤がドーパミン受容体アゴニストである、請求項４２の医薬組成物。
【請求項４６】
生物学的活性剤が、アポモルヒネあるいはその薬学的に許容しうる塩または誘導体である、請求項４４の医薬組成物。
【請求項４７】
生物学的活性剤が、インターフェロン−α、インターフェロン−β、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、インスリン、ヘパリン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アセチルコリン・エステラーゼ（ＡＣＴＨ）、アミロイドペプチド、ベータ−シート遮断ペプチド、ナトリウム利尿ペプチド、ケトプロフェン、およびオレアミドから選択される、請求項４４の医薬組成物。
【請求項４８】
治療に敏感に反応する哺乳動物被検体において、生物学的活性療法剤の療法的投与によって、疾患または状態を治療するかまたは防止する方法であって、粘膜搬送を増進させるのに有効な量の浸透化ペプチドを含んでなる医薬組成物であって、前記ペプチドが、被検体において、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進し、前記ペプチドが、接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディンから選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合を有効に阻害する、前記医薬組成物を、前記被検体に粘膜投与し、そして生物学的活性療法剤を協調して投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４９】
前記浸透化ペプチドが、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そしてヒトＪＡＭ−１ペプチド、ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＴＧＩＴＦＫＳＶＴ（配列番号６）、ＩＴＡＳ（配列番号７）、ＳＶＴＲ（配列番号８）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、またはＧＦＳＳＰＲＶＥＷ（配列番号１０）、ヒト・クローディン・ペプチドＹＡＧＤＮＩＶＴＡＱ（配列番号５７）、ＭＴＰＶＮＡＲＹＥＦ（配列番号５８）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬ（配列番号５３）、ＶＰＤＳＭＫＦＥＩＧ（配列番号６０）、ＤＩＹＳＴＬＬＧＬＰ（配列番号５５）、ＧＦＳＬＧＬＷＭＥＣ（配列番号５６）、ＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰ（配列番号５４）、ＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭ（配列番号６３）、ＶＡＳＧＱＫＲＥＭＧ（配列番号５９）、ＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬ（配列番号６１）、またはＶＰＶＳＱＫＹＥＬＧ（配列番号６２）、あるいはヒト・オクルディン・ペプチドＧＶＮＰＴＡＱＳＳ（配列番号３３）、ＧＳＬＹＧＳＱＩＹ（配列番号３４）、ＡＡＴＧＬＹＶＤＱ（配列番号３２）、ＡＬＣＮＱＦＹＴＰ（配列番号３５）、またはＹＬＹＨＹＣＶＶＤ（配列番号４２）から選択される１以上の隣接配列要素を含む、請求項４８の方法。
【請求項５０】
前記浸透化ペプチドが、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そして：
ＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基Ｉ、Ｖ、またはＡの１つで代表されることが可能である；
（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）、ここで該モチーフの第１位は、代替アミノ酸残基Ｖ、ＡまたはＩの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第４位は、代替アミノ酸残基ＳまたはＴの１つで代表されることが可能である；および
ＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＳの１つで代表されることが可能であり、該モチーフの第７位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＲの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第９位は、代替残基ＭまたはＥの１つで代表されることが可能である
から選択される１以上の隣接配列モチーフを含む、請求項４８の方法。
【請求項５１】
前記浸透化ペプチドが、ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、またはＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）から選択される配列を有する、請求項４８の方法。
【請求項５２】
前記粘膜投与が、前記被検体の鼻粘膜表面に前記配合物を搬送することを伴う、請求項４８の方法。
【請求項５３】
ドーパミン受容体アゴニストが、アポモルヒネあるいはその薬学的に許容しうる塩または誘導体である、請求項４８の方法。
【請求項５４】
生物学的活性剤の増進した粘膜搬送のための協調投与法であって：
粘膜搬送を増進させるのに有効な量の浸透化ペプチドとの協調投与プロトコルで、少なくとも１つの生物学的活性剤の粘膜有効量を哺乳動物被検体に投与することを含んでなり、前記浸透化ペプチドが、被検体において、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進し、前記ペプチドが、接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディンから選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合を有効に阻害する、前記投与法。
【請求項５５】
前記生物学的活性剤を、前記浸透化ペプチドの協調投与の前に、投与と同時に、または投与後に投与する、請求項５４の協調投与法。
【請求項５６】
前記浸透化ペプチドを、前記生物学的活性剤の投与前の有効投与前期間に投与して、粘膜上皮傍細胞輸送の増進を生じる、請求項５５の協調投与法。
【請求項５７】
前記生物学的活性剤および前記浸透化ペプチドを、混合物において、または同時に適用される別個の配合物中で、本質的に同時に投与する、請求項５４の協調投与法。
【請求項５８】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項５４の協調投与法。
【請求項５９】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項５４の協調投与法。
【請求項６０】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、あるいは哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項５４の協調投与法。
【請求項６１】
前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す、請求項６０の協調投与法。
【請求項６２】
前記浸透化ペプチドがヒトＪＡＭ−１ペプチドであり、そして前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、ヒトＪＡＭ−１タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）がヒトＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３タンパク質に同定される構造的特徴に相当する、請求項６０の協調投与法。
【請求項６３】
前記浸透化ペプチドがヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３ペプチドであり、そして前記浸透化ペプチドの前記アミノ酸配列が、それぞれ、ヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）が、それぞれ、ネズミ、ラット、またはウシＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３タンパク質に同定される構造的特徴に相当する、請求項６０の協調投与法。
【請求項６４】
前記浸透化ペプチドが、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そしてヒトＪＡＭ−１ペプチド、ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＴＧＩＴＦＫＳＶＴ（配列番号６）、ＩＴＡＳ（配列番号７）、ＳＶＴＲ（配列番号８）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、またはＧＦＳＳＰＲＶＥＷ（配列番号１０）、ヒト・クローディン・ペプチドＹＡＧＤＮＩＶＴＡＱ（配列番号５７）、ＭＴＰＶＮＡＲＹＥＦ（配列番号５８）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬ（配列番号５３）、ＶＰＤＳＭＫＦＥＩＧ（配列番号６０）、ＤＩＹＳＴＬＬＧＬＰ（配列番号５５）、ＧＦＳＬＧＬＷＭＥＣ（配列番号５６）、ＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰ（配列番号５４）、ＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭ（配列番号６３）、ＶＡＳＧＱＫＲＥＭＧ（配列番号５９）、ＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬ（配列番号６１）、またはＶＰＶＳＱＫＹＥＬＧ（配列番号６２）、あるいはヒト・オクルディン・ペプチドＧＶＮＰＴＡＱＳＳ（配列番号３３）、ＧＳＬＹＧＳＱＩＹ（配列番号３４）、ＡＡＴＧＬＹＶＤＱ（配列番号３２）、ＡＬＣＮＱＦＹＴＰ（配列番号３５）、またはＹＬＹＨＹＣＶＶＤ（配列番号４２）から選択される１以上の隣接配列要素を含む、請求項５４の協調投与法。
【請求項６５】
前記浸透化ペプチドが、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そして：
ＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基Ｉ、Ｖ、またはＡの１つで代表されることが可能である；
（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）、ここで該モチーフの第１位は、代替アミノ酸残基Ｖ、ＡまたはＩの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第４位は、代替アミノ酸残基ＳまたはＴの１つで代表されることが可能である；および
ＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＳの１つで代表されることが可能であり、該モチーフの第７位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＲの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第９位は、代替残基ＭまたはＥの１つで代表されることが可能である
から選択される１以上の隣接配列モチーフを含む、請求項５４の協調投与法。
【請求項６６】
前記生物学的活性剤が、小分子薬剤、ペプチド、タンパク質、およびワクチン剤から選択される、請求項５４の協調投与法。
【請求項６７】
前記生物学的活性剤が、オピオイド、オピオイド・アンタゴニスト、コルチコステロン、抗炎症剤、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスチン、筋弛緩剤、血管拡張剤、抗ヒスタミン剤、ヒスタミン受容体部位遮断剤、鎮咳剤、抗癲癇剤、抗真菌剤、抗細菌剤、癌療法剤、酸化防止剤、不整脈治療剤、抗高血圧剤、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、および療法ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含んでなるＲＮＡベクター、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターから選択される、請求項５４の協調投与法。
【請求項６８】
前記生物学的活性剤が、組織プラスミノーゲン・アクチベーター（ＴＰＡ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ酸性または塩基性）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−アルファまたはベータ）、血管作動性腸管ペプチド、腫瘍壊死因子（ＴＧＦ）、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＦ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、エンドルフィン類、グルカゴン、カルシトニン、オキシトシン、カルベトシン、アルドエテコン、エンケファリン類、ソマトスチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、性腺刺激ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルファ−メラニン形成細胞刺激ホルモン、非天然存在オピオイド類、リドカイン、ケトプロフェン、サフェンタニル、テルブタリン、ドロペリドール、スコポラミン、ゴナドレリン、シクロピロックス、オラミン、ブスピロン、カルシトニン、クロモリン・ナトリウムまたはミダゾラム、シクロスポリン、リシノプリル、カプトプリル、デラプリル、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、スーパーオキシド・ジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ・リボヌクレアーゼ、トリプシン、ケモトリプシン、パパイン、ボンベシン、サブスタンスＰ、バソプレッシン、アルファ−グロブリン類、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ベータ−リポタンパク質類、ベータ−グロブリン類、プロトロンビン、セルロプラスミン、アルファ２−糖タンパク質類、アルファ２−グロブリン類、フェチュイン、アルファ−リポタンパク質類、アルファ−グロブリン類、アルブミン、およびプレアルブミンから選択される、療法タンパク質またはペプチドである、請求項５４の協調投与法。
【請求項６９】
前記生物学的活性剤が、増血剤、サイトカイン剤、抗感染剤、抗痴呆症剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、抗うつ剤、向精神剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、抗高血圧剤、抗糖尿病剤、抗凝血剤、コレステロール低下剤、ホルモン剤、抗骨粗鬆症剤、抗生物質剤、ワクチン剤、または細菌トキソイドとして有効な療法タンパク質またはペプチドである、請求項５４の協調投与法。
【請求項７０】
前記生物学的活性剤および前記浸透化ペプチドが：
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨ調節剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘液溶解剤または粘液一掃剤；
（ｆ）繊毛抑制剤；
（ｇ）（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、または（ｘ）コレステロール合成阻害剤から選択される、膜浸透増進剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）に列挙した膜浸透増進剤の組み合わせいずれか；
（ｈ）上皮接合部生理機能の第二の調節剤；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増進剤；および
（ｋ）安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種であって、該物質と生物学的活性剤が有効に組み合わされ、会合し、含有され、被包され、または結合した結果、増進した粘膜搬送のため、活性剤が安定化される、前記安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種
から選択される１以上の粘膜搬送増進剤と組み合わせて投与される、ここで、前記の１以上の粘膜搬送増進剤が、（ａ）〜（ｋ）に列挙する、いずれか１つまたはいずれかの組み合わせの２以上の前記粘膜搬送増進剤を含んでなり、そして前記粘膜搬送増進剤と前記生物学的活性剤の配合物が、哺乳動物被検体の粘膜表面に搬送される生物学的活性剤の生物学的利用能を増加させる、請求項５４の協調投与法。
【請求項７１】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項５４の協調投与法。
【請求項７２】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、または哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項５４の協調投与法。
【請求項７３】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる、請求項５４の協調投与法。
【請求項７４】
前記浸透化ペプチドが、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、または哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項５４の協調投与法。
【請求項７５】
前記生物学的活性剤および前記浸透化ペプチドを鼻内投与する、請求項５４の協調投与法。
【請求項７６】
前記生物学的活性剤および前記浸透化ペプチドを：
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨ調節剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘液溶解剤または粘液一掃剤；
（ｆ）繊毛抑制剤；
（ｇ）（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、または（ｘ）コレステロール合成阻害剤から選択される、膜浸透増進剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）に列挙した膜浸透増進剤の組み合わせいずれか；
（ｈ）上皮接合部生理機能の第二の調節剤；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増進剤；および
（ｋ）安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種であって、該物質と生物学的活性剤が有効に組み合わされ、会合し、含有され、被包され、または結合した結果、増進した鼻内搬送のため、活性剤が安定化される、前記安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種
から選択される１以上の鼻内搬送増進剤と協調して投与するか、または組み合わせて配合する、ここで、前記の１以上の鼻内搬送増進剤が、（ａ）〜（ｋ）に列挙する、いずれか１つまたはいずれかの組み合わせの２以上の前記鼻内搬送増進剤を含んでなり、そして前記の１以上の鼻内搬送増進剤と前記生物学的活性剤の協調投与または組み合わせ配合物が、哺乳動物被検体の鼻粘膜表面に搬送される生物学的活性剤の生物学的利用能を増加させる、請求項５４の協調投与法。
【請求項７７】
前記被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、２５％以上である、前記被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の前記生物学的活性剤のピーク濃度（Ｃｍａｘ）を生じる、請求項５４の協調投与法。
【請求項７８】
前記被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）に比較した際、２５％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の前記生物学的活性剤のＡＵＣを生じる、請求項５４の協調投与法。
【請求項７９】
０．２〜０．５時間の間で、被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の前記生物学的活性剤の最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）を生じる、請求項５４の協調投与法。
【請求項８０】
被検体の血漿中の前記生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、１０％以上である、被検体の中枢神経系（ＣＮＳ）組織または液中の前記生物学的活性剤のピーク濃度を生じる、請求項５４の協調投与法。
【請求項８１】
生物学的活性剤が、インターフェロン−α、インターフェロン−β、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、インスリン、ヘパリン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アセチルコリン・エステラーゼ（ＡＣＴＨ）、アミロイドペプチド、ベータ−シート遮断ペプチド、ナトリウム利尿ペプチド、ケトプロフェン、およびオレアミドから選択される、請求項５４の協調投与法。
【請求項８２】
接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディンから選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合を有効に阻害することにより、哺乳動物被検体において、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を増進させる浸透化ペプチドであって、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−３、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の細胞外ドメインの野生型配列の約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、あるいは哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−３、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の細胞外ドメインの野生型配列の約４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、前記浸透化ペプチド。
【請求項８３】
哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、あるいは哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項８２のペプチド。
【請求項８４】
哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す、請求項８３のペプチド。
【請求項８５】
哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の前記の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示す、請求項８４のペプチド。
【請求項８６】
同じヒトＪＡＭタンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）が、異なるヒトＪＡＭタンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同ＪＡＭタンパク質に同定される、構造的特徴に相当する、請求項８４のペプチド。
【請求項８７】
ヒトＪＡＭ−１ペプチドである、請求項８４のペプチド。
【請求項８８】
ヒトＪＡＭ−１タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）がヒトＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３タンパク質に同定される構造的特徴に相当する、請求項８４のペプチド。
【請求項８９】
ヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３ペプチドである、請求項８４のペプチド。
【請求項９０】
それぞれ、ヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示す、ヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３ペプチドであり、前記突然変異（単数または複数）が、それぞれ、ネズミ、ラット、またはウシＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３タンパク質に同定される構造的特徴に相当する、請求項８４のペプチド。
【請求項９１】
長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そしてヒトＪＡＭ−１ペプチド、ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＴＧＩＴＦＫＳＶＴ（配列番号６）、ＩＴＡＳ（配列番号７）、ＳＶＴＲ（配列番号８）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、またはＧＦＳＳＰＲＶＥＷ（配列番号１０）、ヒト・クローディン・ペプチドＹＡＧＤＮＩＶＴＡＱ（配列番号５７）、ＭＴＰＶＮＡＲＹＥＦ（配列番号５８）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬ（配列番号５３）、ＶＰＤＳＭＫＦＥＩＧ（配列番号６０）、ＤＩＹＳＴＬＬＧＬＰ（配列番号５５）、ＧＦＳＬＧＬＷＭＥＣ（配列番号５６）、ＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰ（配列番号５４）、ＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭ（配列番号６３）、ＶＡＳＧＱＫＲＥＭＧ（配列番号５９）、ＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬ（配列番号６１）、またはＶＰＶＳＱＫＹＥＬＧ（配列番号６２）、あるいはヒト・オクルディン・ペプチドＧＶＮＰＴＡＱＳＳ（配列番号３３）、ＧＳＬＹＧＳＱＩＹ（配列番号３４）、ＡＡＴＧＬＹＶＤＱ（配列番号３２）、ＡＬＣＮＱＦＹＴＰ（配列番号３５）、またはＹＬＹＨＹＣＶＶＤ（配列番号４２）から選択される１以上の隣接配列要素を含む、請求項８４のペプチド。
【請求項９２】
長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そして：
ＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基Ｉ、Ｖ、またはＡの１つで代表されることが可能である；
（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）、ここで該モチーフの第１位は、代替アミノ酸残基Ｖ、ＡまたはＩの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第４位は、代替アミノ酸残基ＳまたはＴの１つで代表されることが可能である；および
ＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＳの１つで代表されることが可能であり、該モチーフの第７位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＲの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第９位は、代替残基ＭまたはＥの１つで代表されることが可能である
から選択される１以上の隣接配列モチーフを含む、請求項８４のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
注射による薬剤投与の主要な不都合な点は、薬剤を投与するのに、しばしば、訓練された人材を必要とすることである。自分で投与する薬剤に関して、患者の多くは、定期的に自分で注射を行うのを躊躇するか、または自分では行い得ない。注射はまた、感染リスク増加にも関連する。薬剤注射の他の不都合な点には、個体間で搬送結果が多様であることとともに、薬剤作用の有効性および期間が予測不能であることが含まれる。
【０００２】
これらの顕著に不都合な点にもかかわらず、注射は、重要な多くの療法化合物の集団の唯一認可された搬送様式でありつづけている。これらには、慣用的な薬剤とともに、ペプチドおよびタンパク質生物学的療法剤の迅速に拡大するリストが含まれる。代替投与経路、例えば経口、鼻および他の粘膜経路を介したこれらの化合物の搬送は、しばしば、変動する結果および副作用を生じ、そして適切な生物学的利用能を提供するのに失敗する。特に巨大分子種、特にペプチドおよびタンパク質療法剤に関しては、不活性化を受けやすく、そして粘膜バリアを渡る吸収が劣っているため、代替投与経路は限定される。
【０００３】
療法化合物の粘膜投与は、しばしば、注射および他の投与様式に勝る、ある利点を提供することも可能であり、この利点は、例えば、搬送が簡便でそして迅速であることとともに、注射による搬送に伴う、コンプライアンスの問題および副作用を減少させるか、または除外することによる。しかし、生物学的活性剤の粘膜搬送は、粘膜バリア機能および他の要因によって限定される。これらの理由により、粘膜薬剤投与は、典型的には、注射による投与より、多量の薬剤を必要とする。巨大分子薬剤、ペプチドおよびタンパク質を含む、他の療法化合物は、しばしば、粘膜搬送に抵抗性である。
【０００４】
薬剤が粘膜表面に浸透する能力は、搬送増進剤によって補助されない場合、分子量、脂質可溶性、およびイオン化を含む、いくつかの要因に関連するようである。約３００〜１，０００ダルトン未満の小分子は、しばしば、粘膜バリアに浸透可能であるが、分子サイズが大きくなるにつれて、浸透性は迅速に減少する。脂質可溶性化合物は、一般的に、非脂質可溶性分子より、粘膜表面を通じてより浸透性である。ペプチドおよびタンパク質は、ほとんど脂質可溶性でなく、そしてしたがって粘膜表面を渡る吸収特性は劣っている。
【０００５】
生得的な浸透性が劣っているのに加えて、タンパク質およびペプチドを含む巨大分子薬剤は、しばしば、拡散が限定されがちであるとともに、管腔酵素および細胞酵素に分解され、そして粘膜部位で迅速に一掃されがちである。これらの粘膜部位は、一般的に、粘膜表面と接触する病原体および他の不都合な環境剤に対する宿主防御の第一線として働く。粘膜組織が、巨大分子の自由な拡散に対する実質的なバリアを提供する一方、粘膜分泌物に存在する酵素活性が、療法剤、特にペプチドおよびタンパク質の生物学的利用能を非常に制限しうる。特定の粘膜部位、例えば鼻粘膜で、搬送されたタンパク質および他の巨大分子種の典型的な居留時間は、迅速に粘膜繊毛で一掃されるため、例えば約１５〜３０分以下に制限される。
【０００６】
要約すると、小分子薬剤およびタンパク質療法剤を含む療法化合物を、粘膜経路を介して成功裡に搬送しようとする先の試みは、いくつかの重要でそして混乱させる欠陥に苦しんできた。これらの欠陥は、当該技術分野において、標的とされる組織および生理学的区画、例えば中枢神経系に対するものを含めて、安定で、そしてよく許容され、そして増進した粘膜搬送を提供する、薬剤配合物、および療法化合物を投与する方法に対する必要性が長期間満たされずにあることを指摘する。より具体的には、哺乳動物被検体において、疾患および他の不都合な状態の治療のため、療法化合物を粘膜搬送するための、安全で、そして信頼しうる方法および組成物が、当該技術分野で必要とされる。療法量で、１以上の粘膜経路を介して、巨大分子薬剤の効率的な搬送を提供するであろう方法および組成物であって、迅速に作用し、容易に投与され、そして粘膜刺激または組織損傷などの不都合な副作用が限定されたものである、前記方法および組成物に対して、関連する必要性が存在する。
【０００７】
これらの必要性に関連して、当該技術分野には、粘膜上皮バリア機構を克服するであろう生物療法化合物の粘膜搬送を増進する方法および組成物に対して、特に困難な必要性が依然としてある。粘膜上皮の選択的浸透性は、これまで、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質を含む、療法巨大分子の粘膜搬送に対して、大きな障害を提示してきた。したがって、生物療法化合物の粘膜搬送を促進する、新規の方法およびツールに対して、当該技術分野には、実質的に満たされない必要性が依然としてある。特に、これまで、粘膜バリアを渡る搬送に抵抗性であると証明されてきた生物療法化合物の粘膜搬送を促進する、新規方法および配合物に対して、当該技術分野には、切実な必要性がある。
【発明の説明】
【０００８】
本発明は、生物学的活性剤および浸透化剤を含む新規医薬組成物であって、該浸透化剤が、哺乳動物被検体において、生物学的活性剤の粘膜搬送を増進させるのに有効である、前記医薬組成物を提供することによって、前述の必要性を満たし、そしてさらなる目的および利点を実現させる。浸透化剤は、典型的には、被検体において、粘膜上皮表面で、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進する。この影響は、典型的には、浸透化剤による、隣接する上皮細胞の上皮膜接着タンパク質間のホモ型結合または異型結合の阻害を伴う。ホモ型結合または異型結合のこの遮断の標的タンパク質は、多様な関連接合部接着分子（ＪＡＭ類）、オクルディン類、またはクローディン類から選択可能である。
【０００９】
上皮細胞は、外部環境、並びに粘膜組織および粘膜下組織、並びに細胞外区画間の重要な接触面である。粘膜上皮細胞の最も重要な機能の１つは、粘膜浸透性を決定し、そして制御することである。この背景において、上皮細胞は、異なる生理学的区画間に選択的浸透性バリアを生成する。選択的浸透性は、細胞質を通り抜ける分子の制御された輸送（経細胞経路）および細胞間空間の制御された浸透性（傍細胞経路）の結果である。
【００１０】
上皮細胞間の細胞間接合部は、上皮バリア機能の維持および制御、並びに細胞−細胞接着の両方に関与することが知られる。上皮細胞および内皮細胞の密着結合（ＴＪ）は、傍細胞経路の浸透性を制御する、特に重要な細胞−細胞接合部であり、そしてまた、細胞表面を頂端区画および側底区画に分ける。密着結合は、上皮細胞間に連続した外周細胞間接触を形成し、そして水、溶質および免疫細胞の傍細胞移動に対する、制御されたバリアを生成する。これらはまた、頂端膜ドメインおよび側底膜ドメイン間の膜脂質の交換を制限することによって細胞極性に寄与する、第二の種類のバリアも提供する。
【００１１】
密着結合は、細胞間シールを生成して、傍細胞経路を通り抜ける溶質の拡散に対する一次バリアを生じることによって、そして頂端形質膜ドメインおよび側底形質膜ドメイン間の境界として作用して、細胞極性を生成し、そして維持することによって、それぞれ、上皮細胞のバリア機能およびフェンス機能に直接関与すると考えられる。密着結合はまた、炎症部位に到達する白血球の遊出にも関連付けられている。白血球は、化学誘引物質に反応して、内皮を横断することによって血液から遊出し、そして粘膜感染の場合は、炎症上皮を横断する。遊出は、主に、傍細胞経路に沿って起こり、そして非常に協調した、そして可逆的な方式で密着結合の開放および閉鎖を介して制御されているようである。
【００１２】
ＴＪと関連して多くのタンパク質が同定されてきており、これらには、内在性形質膜タンパク質および表在性形質膜タンパク質両方が含まれる。これらのタンパク質の複雑な構造および相互作用する機能の現在の理解は限定されたものである。上皮接合部に関連する多くのタンパク質の中で、上皮接合部の生理学的制御において機能しうる、経上皮膜タンパク質のいくつかのカテゴリーが同定されてきている。これらには、いくつかの「接合部接着分子」（ＪＡＭ類）、並びにオクルディン類、クローディン類、およびゾヌリンと称する、他のＴＪ関連分子が含まれる。
【００１３】
ＪＡＭ類、オクルディン、およびクローディンは、傍細胞空間に伸長し、そしてこれらのタンパク質は特に、隣接する上皮細胞間の上皮バリアおよび上皮細胞層を貫く制御可能チャネルを生成する候補と目されてきている。１つのモデルにおいて、オクルディン、クローディン、およびＪＡＭは、同種親和性結合パートナーとして相互作用して、上皮細胞間の水、溶質、および免疫細胞の傍細胞移動に対する、制御されたバリアを生成すると提唱されてきている。
【００１４】
ネズミ接合部接着分子−１（ＪＡＭ−１）をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、そして該ｃＤＮＡは、予測されるＩ型膜貫通タンパク質（単一膜貫通ドメインを含んでなる）に対応し、分子量は、およそ３２ｋＤである（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３６：１１７５−１１８８  １９９９；Ｇｕｐｔａら，  ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ，  ５０：５１−５６，  ２０００；Ｏｚａｋｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：５５３−５５７，  １９９９；Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４２：１１７−１２７，  １９９８）。該分子の細胞外セグメントは、アミノ末端「ＶＨ型」およびカルボキシ末端「Ｃ２型」カルボキシ末端βサンドイッチフォールドと記載される、２つのＩｇ様ドメインを含んでなる（Ｂａｚｚｏｎｉら，  Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８：１４３−１５２，  ２００１）。ネズミＪＡＭ−１はまた、Ｎ−グリコシル化を２部位、および１つの細胞質ドメインも含有する。ＪＡＭ−１タンパク質は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーであり、そして上皮細胞および内皮細胞両方の密着結合に局在する。超構造研究によって、ＪＡＭ−１が、オクルディンおよびクローディンの原線維を含有する膜領域に限定されていることが示される。
【００１５】
ネズミＪＡＭ−１をコードするｃＤＮＡをＣＨＯ細胞にトランスフェクションすると、細胞−細胞接触に、ＪＡＭ−１タンパク質が局在し、これは、隣接する細胞がＪＡＭを発現する、集密単層でしか起こらない。混合培養において、ＪＡＭトランスフェクタントが対照トランスフェクタントと接触していると、タンパク質は拡散したままであり、ＪＡＭクラスター形成が同種親和性相互作用によるものであることが示唆される（Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４２：１１７−１２７，  １９９８）。
【００１６】
実験的証拠によって、ＪＡＭ−１がホモ型接着を仲介し、そして異型接着相互作用および脱接着（ｄｅ−ａｄｈｅｓｉｖｅ）相互作用を介して、単球遊出に影響を及ぼしうることが示唆される。ネズミＪＡＭ−１に対するモノクローナル抗体は、内皮細胞を渡る白血球の遊出、および皮膚炎症反応のｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける白血球の遊出を阻害する（Ｍａｒｔｉｎ−Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４２：１１７−１２７，  １９９８）。抗ネズミＪＡＭ−１抗体はまた、サイトカイン誘導髄膜炎において、脳脊髄液中の白血球の集積も阻害する。これらの影響がどのように仲介されるのかは未知である。１つのモデルにおいて、抗体は、ＪＡＭ−１および白血球受容体間の異型相互作用を阻害しうる（例えばＤｅｌ  Ｍａｓｃｈｉｏら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９０：１３５１−１３５６，  １９９９を参照されたい）。あるいは、抗ＪＡＭ−１抗体は、隣接細胞間の同種親和性ＪＡＭ仲介相互作用を安定化し、そしてそれによって、接合部複合体の解離を阻害しうる（例えば、Ｂａｌｄａら，  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖｅｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１：２８１−２８９，  ２０００を参照されたい）。
【００１７】
ＪＡＭ−１活性の１つのモデルは、ＪＡＭ−１の細胞外ドメインが、細胞間接着相互作用に関与すると提唱する。ＪＡＭ−１二量体の形成は、安定な、そして非共有である相互作用のためであると考えられる。高イオン強度および酸性ｐＨで、ＪＡＭ−１二量体が単量体サブユニットに解離すると報告される。この一般的なモデルにおいて、ＪＡＭ−１二量体は、ＪＡＭ−１依存性同種親和性接着のビルディングブロックとして作用すると仮定される。特に、ＪＡＭ−１は、シス相互作用で二量体化し、１つの細胞表面に位置する平行ホモ二量体を生じることも可能であり、そしてシス二量体化は、相対する細胞表面上のＪＡＭ−１分子間の同種親和性接着相互作用に利用可能な接触面を曝露させることも可能である。このモデルは、集密内皮単層または集密上皮単層内の隣接細胞間のホモ型接着を説明しうる。さらに、遊出白血球上に発現されるＪＡＭ−１二量体は、内皮細胞上に発現されるＪＡＭ−１二量体と相互作用し、したがって、白血球経内皮遊走中に起こる接着および脱接着事象を説明すると提唱される（Ｄｅｊａｎａら，  Ｔｈｒｏｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８６：３０８−３１５，  ２００１）。
【００１８】
ネズミＪＡＭ−１タンパク質の組換え可溶性型（「ｒｓＪＡＭ」と称される、分子の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）細胞外領域）の結晶構造が記載されてきている（Ｋｏｓｔｒｅｗａら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０：４３９１−４３９８，  ２００１）。ｒｓＪＡＭ構築物は、コンホメーション的に拘束された短いリンカーによって連結される、２つの免疫グロブリン様ドメインからなると提唱される。２つのＪＡＭ分子は、報告によれば、それぞれのｒｓＪＡＭ構築物間の２つの塩架橋を含む、相補的相互作用によって、Ｕ型の二量体を形成する。報告によって、提唱される保存的「二量体化モチーフ」に相当する、ｒｓＪＡＭの中央の三ペプチド（Ａｒｇ５８−Ｖａｌ５９−Ｇｌｕ６０）がさらに同定されている。この保存的モチーフ「Ｒ（Ｖ、Ｉ、Ｌ）Ｅ」は、溶液におけるｒｓＪＡＭ二量体の形成を仲介することが示唆される。著者らは、Ｒ（Ｖ、Ｉ、Ｌ）Ｅモチーフとともに、隣接残基Ｔｒｐ６１、Ｌｙｓ６２、Ｃｙｓ７３、およびＴｙｒ７４は、ネズミ、ウシおよびヒトＪＡＭ−１の公表された配列において保存されていると指摘している。さらに、配列Ｒ（Ｖ、Ｉ、Ｌ）Ｅは、Ｊａｍ−２およびＪＡＭ−３でもやはり保存されていると指摘している。
【００１９】
提唱される二量体化モチーフ（Ｇｌｕ６０Ａｒｇ）に破壊的点突然変異が導入されるように操作した突然変異体ｒｓＪＡＭの研究によって、この突然変異が、ｒｓＪＡＭのホモ型凝集を遮断することが示唆されている（Ｋｏｓｔｒｅｗａら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２０：４３９１−４３９８，  ２００１）。これらの突然変異体研究およびｒｓＪＡＭの結晶パッキングの解析に基づいて、ＪＡＭの同種親和性接着に関して、より詳細なモデルが提唱されてきている。このモデルでは、ＪＡＭシス二量体が、細胞表面上で形成されると考えられ、そしてシス二量体化は、相対する細胞表面上の二量体化したＪＡＭ分子間の接着性トランス相互作用に必要な前駆体であると提唱される。
【００２０】
さらなる研究によって、ネズミＪＡＭ−１のヒト、ラット、およびウシ対応物の同定が報告されてきている（例えばＬｉｕら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １１３：２３６３−２３７４，  ２０００；Ｏｚａｋｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：５５３−５５７，  １９９９；Ｗｉｌｉａｍｓら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：１１７５−１１８８，  １９９９；およびＳｏｂｏｃｋａら，  Ｂｌｏｏｄ  ９５：２６００−２６０９，  ２０００を参照されたい）。これらの異なるＪＡＭ−１相同体は、ネズミＪＡＭ−１タンパク質配列と、６８％〜７５％の間の全体のアミノ酸同一性を示す。膜貫通領域および細胞質テール領域には特に特筆すべき配列類似性があり、これらのタンパク質の重要でそして保存される機能は、おそらく、細胞質接触面のタンパク質相互作用を伴うと示唆されると言われている（例えばＷｉｌｌｉａｍｓら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：１１７５−１１８８，  １９９９）を参照されたい）。また、細胞外構造に関して、これらの異なるＪＡＭ−１相同体間に一般的な構造保存があることも注目に値し、これらの細胞外構造は、各々、タンデムＶＨ型およびＣ２型Ｉｇ様ドメインに相当すると提唱される、アミノ末端およびカルボキシ末端βサンドイッチフォールドを提示する（例えば、Ｄｅｊａｎａら（Ｔｈｒｏｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８６：３０８−３１５，  ２００１）を参照されたい）。
【００２１】
最近、抗ヒトＪＡＭ−１抗体を生成するため、ヒトＪＡＭ−１の推定上の細胞外ドメインが融合タンパク質として発現され、該抗体は、一過性カルシウム枯渇に仲介される密着結合破壊後、Ｔ８４細胞単層において、経上皮抵抗性回復（ＴＥＲ）を阻害した（Ｌｉｕら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １１３：２３６３−２３７４，  ２０００）。特に、抗ＪＡＭ−１抗体は、カルシウムが仲介する破壊後、ＪＡＭ−１およびオクルディンがＴＪに再分布するのを阻害する。しかし、これらの著者らは、細胞外ドメインを含有する精製組換えヒトＪＡＭ−１は、ネズミＪＡＭ−１に関して公表されている結果と対照的に、密着結合破壊後、ＴＥＲを阻害しないと報告している。これに基づいて、このデータは、細胞外ホモ型相互作用または異型相互作用が、ヒトＪＡＭ−１細胞外ドメインによって仲介されるモデルを支持しない可能性があると見なされる。ヒトＪＡＭ−１の構造／機能を調べる別の研究において、Ｗｉｌｉａｍｓら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：１１７５−１１８８，  １９９９）は、ネズミおよびヒトＪＭ  Ｆｃキメラ、並びにトランスフェクションＣＯＳ細胞がどちらも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、該タンパク質のホモ型接着を示すのに失敗し、「ｉｎ  ｖｉｖｏでは、しっかりした接着は、この分子の機能ではない可能性がある」ことが示唆されると報告している。別個の研究において、Ｌｉａｎｇら（Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７９：１７３３−１７４３，  ２０００）は、ヒトＪＡＭ−１の組換え可溶性型が、ＴＪのトリプシン−ＥＤＴＡ破壊後、ＴＥＲの回復を阻害すると報告している。
【００２２】
ＪＡＭ−１に相同性があると見られる、さらなる分子が同定されてきている。最近同定されたＪＡＭ２  ｃＤＮＡは、細胞外ドメインの２つのＩｇ様フォールドおよび３つのＮ連結グリコシル化部位を特徴とする、３４ｋＤと予測されるＩ型内在性膜タンパク質に相当する。単一のプロテインキナーゼＣリン酸化コンセンサス部位およびＰＤＺ結合モチーフが、短い細胞質テール中に予測されている。ノーザンブロット解析によって、ＪＡＭ２が心臓で優先的に発現されることが示唆される（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７５：３４７５０−３４７５６，  ２０００）。関連する国際公報（ＷＯ  ０１／１４４０４）では、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍは、ＪＡＭ−２がＪＡＭ−１と異なり、末梢血白血球では発現を示さず、そしてＪＡＭ−２がホモ型相互作用において機能するかどうかは未知であると解説している。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍは、ＪＡＭ−２細胞外配列およびマウス／ヒトＩｇＧのＦｃ領域間の融合を使用して：ＪＡＭ−２リガンドをスクリーニングするか；ＪＡＭ−２異型相互作用の小分子阻害剤をスクリーニングするか；あるいは異型相互作用またはホモ型相互作用いずれかにおいて、ＪＡＭ−２機能を中和することが可能でありうると推測している。
【００２３】
「血管内皮接合部会合分子」（ＶＥ−ＪＡＭ）と称される別のＪＡＭファミリーメンバーは、２つの細胞外免疫グロブリン様ドメイン、膜貫通ドメイン、および比較的短い細胞質テールを含有する。ＶＥ−ＪＡＭは、主に、内皮細胞の細胞間境界に局在する（Ｐａｌｍｅｒｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：１９１３９−１９１４５，  ２０００）。ＶＥ−ＪＡＭは、小静脈の内皮細胞によって高発現され、そしてまた他の血管の内皮によっても発現される。報告される別のＪＡＭファミリーメンバー、ＪＡＭ−３は、ＪＡＭ−２およびＪＡＭ−１に、それぞれ３６％および３２％同一性を示す、予測されるアミノ酸配列を有する。ＪＡＭ−３は、広く分布する組織発現を示し、腎臓、脳、および胎盤でより高いレベルであるようである。細胞レベルでは、ＪＡＭ−３転写物は、内皮細胞内に発現される。ＪＡＭ−３およびＪＡＭ−２は、結合パートナーであると報告されている。特に、ＪＡＭ−３外部ドメインは、ＪＡＭ２−Ｆｃに結合すると報告されている。ＪＡＭ−３タンパク質は、活性化後、末梢血白血球上で上方制御される（Ｐｉａ  Ａｒｒａｔｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７６：４５８２６−４５８３２，  ２００１）。
【００２４】
上皮密着結合制御に関与すると提唱される別の膜貫通接着タンパク質は、オクルディンである。オクルディンは、およそ６５ｋＤのＩＩ型膜貫通タンパク質であり、４つの膜貫通ドメイン、２つの細胞外ループ、および大きなＣ末端細胞質ゾル・ドメインで構成される（Ｆｕｒｕｓｅら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２３：１７７７−１７８８，  １９９３；Ｆｕｒｕｓｅら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２７：１６１７−１６２６，  １９９４）。このトポロジーは、抗体接近可能性研究によって確認されている（Ｖａｎ  ＩｔａｌｌｉｅおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １１０：１１１３−１１２１，  １９９７）。細胞外ループは、化学的に別個である。第一の細胞外ループは、およそ６５％のチロシンおよびグリシン残基を含有する。現在クローニングされている、異なる動物種由来の総数５つのオクルディン相同体において、交互のチロシンおよびグリシン残基の存在が保存されているが、この特定の配列の機能的重要性は明らかでない（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ．  １０８：３４４３−３４４９，  １９９５）。
【００２５】
オクルディンは、Ｃａ２＋依存性細胞間接着分子であると提唱されている。内因性オクルディンを欠く線維芽細胞で発現させると、オクルディンは、発現されるオクルディンのレベルに比例した接着性を与える。この人工的に与えられた接着性は、オクルディンの２つの細胞外ループのいずれかに相当するペプチドによって、遮断されると報告されている。にもかかわらず、オクルディンがホモ型接着分子であるか、またはまだ同定されていないカウンターレセプターを有するかは、決定されないままである（Ｃｈｅｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １３８：８９１−８９９，  １９９７；Ｆａｎｎｉｎｇら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｓｏｃ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ．  １０：１３３７−１３４５，  １９９９）。オクルディンはまた、おそらく膜二重層内の、側面会合を通じた、側面オリゴマー化も可能である。その接着特性を考慮すると、オクルディンは、膜中で側面重合して、細胞間接着の連続する線を生成することによって、傍細胞バリアを生成することも可能である。
【００２６】
免疫フリーズフラクチャー電子顕微鏡で観察すると、オクルディンは、密着結合原線維内に直接濃縮されている（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０８：３４４３−３４４９，  １９９５）。免疫蛍光局在によって、側膜に沿って、オクルディンが少量、さらにプールされていることが明らかになり、これは、非イオン性界面活性剤中でより容易に抽出され、よりリン酸化されておらず、そして原線維に組み立てられない（Ｓａｋａｋｉｂａｒａら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １３７：１３９３−１４０１，  １９９７；Ｃｏｒｄｅｎｏｎｓｉら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１０：３１３１−３１３９，  １９９７）。考えられる限りでは、側面プールは、接合部複雑性の動的に制御される拡大に利用可能なサブユニットの貯蔵庫に相当する。
【００２７】
密着結合の２つのさらなる内在性膜タンパク質、クローディン−１およびクローディン−２は、ニワトリ肝臓から、接合部が濃縮されている膜を、直接生化学的に分画することによって、同定された（Ｆｕｒｕｓｅら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４１：１５３９−１５５０，  １９９８）。クローディン−１およびクローディン−２は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動上、およそ２２ｋＤの広いゲルバンドとして、オクルディンとともに精製されることが見出された。マウスｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた、２つの緊密に関連するタンパク質の推定される配列は、４つの膜貫通らせん、２つの短い細胞外ループ、および短い細胞質Ｎ末端およびＣ末端を持つと予測される。オクルディンと類似のトポロジーにもかかわらず、これらは配列相同性をまったく共有しない。続いて、さらに６つのクローディン遺伝子産物（クローディン−３〜クローディン−８）がクローニングされ、そして免疫金フリーズフラクチャー標識によって決定されるように、密着結合原線維内に局在することが示されてきている（Ｍｏｒｉｔａら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：５１１−５１６，  １９９９）。オクルディンの非存在下で、バリアが存在し続けることを考慮して、クローディン−１〜クローディン−８は、細胞外空間の主なシール形成要素の候補と見なされてきている。この役割と一致して、クローディン−１またはクローディン−２いずれかが線維芽細胞で発現されている場合、これらのタンパク質は、上皮細胞の密着結合における編成を連想させる、長い分枝する原線維に集合することが可能である。対照的に、オクルディンは、トランスフェクション線維芽細胞において、原線維に自己編成する能力が限定されているが、クローディンが同時トランスフェクションされた場合は、原線維に加わるであろう（Ｆｕｒｕｓｅら，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４３：３９１−４０１，  １９９８）。
【００２８】
上皮接合部に局在している他の細胞質タンパク質には、ゾヌリン、シンプレキン（ｓｙｍｐｌｅｋｉｎ）、チングリン（ｃｉｎｇｕｌｉｎ）、および７Ｈ６が含まれる。ゾヌリン類は、オクルディンの細胞質テールに結合する細胞質タンパク質であると報告される。タンパク質のこのファミリーを代表するのは、「ＺＯ−１、ＺＯ−２、およびＺＯ−３」である。ゾヌリンは、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来閉鎖帯毒素（ＺＯＴ）のヒトタンパク質類縁体と仮定されている。
【００２９】
ゾヌリンは、組織形態形成、腸管腔および間質間の体液、巨大分子および白血球の移動、並びに炎症／自己免疫障害を含む、発生プロセス、生理学的プロセス、および病的プロセス中、密着結合制御において、役割を果たすようである（例えば、Ｗａｎｇら，  Ｊ．  ＣｅｌｌＳｃｉ．，  １１３：４４３５−４０，  ２０００；Ｆａｓａｎｏら，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５５：１５１８−９，  ２０００；Ｆａｓａｎｏ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ９１５：２１４−２２２，  ２０００を参照されたい）。密着結合が開放され、そして浸透性が増加する臨床状態であるセリアック病の急性期中に、ゾヌリン発現が、腸組織で増加する。ゾヌリンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、非ヒト霊長類腸上皮において、密着結合脱集合およびそれに続く腸浸透性増加を誘導する。
【００３０】
活性コレラ菌ＺＯＴ断片およびヒト・ゾヌリンのアミノ酸比較によって、２つのタンパク質のＮ末端領域内の推定上の受容体結合ドメインが同定された。ＺＯＴ生物学的活性ドメインは、哺乳動物細胞受容体と相互作用し、続いて細胞内シグナル伝達を活性化し、細胞間密着結合の脱集合を導くことによって、腸浸透性を増加させる。ＺＯＴ生物学的活性ドメインは、該タンパク質のカルボキシ末端に向かって位置決定され、そしてコレラ菌に生成されると予測される切断産物と一致する。このドメインは、ＺＯＴ哺乳動物類縁体であるゾヌリンと、推定上の受容体結合モチーフを共有する。ＺＯＴ活性断片およびゾヌリン間のアミノ酸比較と、部位特異的突然変異誘発実験を組み合わせると、プロセシングされたＺＯＴのアミノ末端およびゾヌリンのアミノ末端に向かう、８ペプチド受容体結合ドメインが示唆される（Ｄｉ  Ｐｉｅｒｒｏら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２７６：１９１６０−１９１６５，  ２００１）。ＺＯ−１は、アクチン、ＡＦ−６、ＺＯ関連キナーゼ（ＺＡＫ）、フォドリン、およびα−カテニンに結合すると報告されている。
【００３１】
本発明のより詳細な態様において、浸透化剤は、ペプチド、あるいはペプチド類縁体またはペプチド模倣体である。典型的な浸透化ペプチドは、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる。あるいは、浸透化ペプチドは、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなることも可能である。さらなる態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、あるいは哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。特定の態様において、浸透化ペプチドのアミノ酸配列は、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す。例えば、浸透化ペプチドは、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示しうる。こうした機能するペプチド類縁体または変異体は、例えば、同じヒトＪＡＭタンパク質（例えばヒトＪＡＭ−１）の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を有することも可能であり、前記突然変異（単数または複数）は、異なるヒトＪＡＭタンパク質（例えばヒトＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３）に同定される、あるいは異なる種に見られる相同ＪＡＭタンパク質（例えばネズミ、ラット、またはウシＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３タンパク質）に同定される、相異するアミノ酸残基または配列に相当する。
【００３２】
より詳細な態様において、本発明の方法および組成物は、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そして：ＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）；（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）；またはＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）から選択される１以上の隣接配列要素を含む浸透化ペプチドを取り込む。１つのこうした態様において、ペプチドは、保存配列モチーフＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）を含み、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基Ｉ、Ｖ、またはＡの１つで代表されることが可能である。別のこうした態様において、ペプチドは、保存配列モチーフ（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）を含み、ここで該モチーフの第１位は、代替アミノ酸残基Ｖ、ＡまたはＩの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第４位は、代替アミノ酸残基ＳまたはＴの１つで代表されることが可能である。さらに別のこうした態様において、ペプチドは、保存配列モチーフＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）を含み、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＳの１つで代表されることが可能であり、該モチーフの第７位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＲの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第９位は、代替残基ＭまたはＥの１つで代表されることが可能である。典型的な態様において、浸透化ペプチドは、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そして野生型ヒトＪＡＭ−１ペプチド配列、ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＴＧＩＴＦＫＳＶＴ（配列番号６）、ＩＴＡＳ（配列番号７）、ＳＶＴＲ（配列番号８）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、および／またはＧＦＳＳＰＲＶＥＷ（配列番号１０）から選択される１以上の隣接配列要素を含む。
【００３３】
本発明のさらなる側面内で、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる浸透化ペプチドを使用する、医薬組成物および方法を提供する。別の態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる。特定の側面において、浸透化ペプチドは、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、または哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。典型的な態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物オクルディン・タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す。しばしば、こうしたペプチド「類縁体」は、哺乳動物オクルディン・タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示すであろう。関連する態様において、浸透化ペプチドはヒト・オクルディン・ペプチドであり、そして浸透化ペプチドのアミノ酸配列は、同じヒト・オクルディン・タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）は、異なるヒト・オクルディン・タンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同オクルディン・タンパク質に同定される、構造的特徴（例えば相異する並列残基または残基の配列）に相当する。
【００３４】
本発明の他の側面内で、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる浸透化ペプチドを使用する、医薬組成物および方法を提供する。別の態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる。特定の側面において、浸透化ペプチドは、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、または哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。典型的な態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物クローディン・タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す。しばしば、こうしたペプチド「類縁体」は、哺乳動物クローディン・タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示すであろう。関連する態様において、浸透化ペプチドはヒト・クローディン・ペプチドであり、そして浸透化ペプチドのアミノ酸配列は、同じヒト・クローディン・タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、前記突然変異（単数または複数）は、異なるヒト・クローディン・タンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同クローディン・タンパク質に同定される、構造的特徴（例えば相異する並列残基または残基の配列）に相当する。
【００３５】
本発明の関連する側面において、医薬組成物には、浸透化剤、並びに小分子薬剤、ペプチド、タンパク質、およびワクチン剤から選択される１以上の生物学的活性剤（単数または複数）が含まれる。より詳細な側面において、生物学的活性剤（単数または複数）は、オピオイド（ｏｐｏｉｄ）、オピオイド・アンタゴニスト、コルチコステロン、抗炎症剤、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスチン、筋弛緩剤、血管拡張剤、抗ヒスタミン剤、ヒスタミン受容体部位遮断剤、鎮咳剤、抗癲癇剤、抗真菌剤、抗細菌剤、癌療法剤、酸化防止剤、不整脈治療剤、抗高血圧剤、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、および／または療法ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含んでなるＲＮＡベクター、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターから選択される。他の詳細な側面において、生物学的活性剤（単数または複数）は、療法タンパク質またはペプチド、例えば、組織プラスミノーゲン・アクチベーター（ＴＰＡ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ酸性または塩基性）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−アルファまたはベータ）、血管作動性腸管ペプチド、腫瘍壊死因子（ＴＧＦ）、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＦ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、エンドルフィン類、グルカゴン、カルシトニン、オキシトシン、カルベトシン、アルドエテコン（ａｌｄｏｅｔｅｃｏｎｅ）、エンケファリン類、ソマトスチン（ｓｏｍａｔｏｓｔｉｎ）、ソマトトロピン、ソマトメジン、性腺刺激ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルファ−メラニン形成細胞刺激ホルモン、非天然存在オピオイド類、リドカイン、ケトプロフェン、サフェンタニル（ｓｕｆｅｎｔａｉｎｉｌ）、テルブタリン、ドロペリドール、スコポラミン、ゴナドレリン、シクロピロックス、オラミン、ブスピロン、カルシトニン、クロモリン・ナトリウムまたはミダゾラム、シクロスポリン、リシノプリル、カプトプリル、デラプリル、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、スーパーオキシド・ジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ・リボヌクレアーゼ、トリプシン、ケモトリプシン（ｃｈｅｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、パパイン、ボンベシン、サブスタンスＰ、バソプレッシン、アルファ−グロブリン類、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ベータ−リポタンパク質類、ベータ−グロブリン類、プロトロンビン、セルロプラスミン、アルファ２−糖タンパク質類、アルファ２−グロブリン類、フェチュイン、アルファ−リポタンパク質類、アルファ−グロブリン類、アルブミン、およびプレアルブミンのタンパク質または活性ペプチド断片または融合体から選択される。
【００３６】
さらにさらなる態様において、本発明は、浸透化ペプチドなど、上述のような浸透化剤、および１以上の療法タンパク質（単数または複数）またはペプチド（単数または複数）を使用する方法および医薬組成物であって、前記療法タンパク質またはペプチドが、増血剤、サイトカイン剤、抗感染剤、抗痴呆症剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、抗うつ剤、向精神剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、抗高血圧剤、抗糖尿病剤、抗凝血剤、コレステロール低下剤、ホルモン剤、抗骨粗鬆症剤、抗生物質剤、ワクチン剤、および／または細菌トキソイドとして有効である、前記方法および医薬組成物を提供する。
【００３７】
本発明の特定の態様において、生物学的活性剤および上述のような浸透化剤を、１以上の粘膜搬送増進剤（単数または複数）と組み合わせて投与する。より詳細な態様において、粘膜搬送増進剤（単数または複数）は：
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨ調節剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘液溶解剤または粘液一掃剤；
（ｆ）繊毛抑制（ｃｉｌｉｏｓｔａｔｉｃ）剤；
（ｇ）（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、または（ｘ）コレステロール合成阻害剤から選択される、膜浸透増進剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）に列挙した膜浸透増進剤の組み合わせいずれか；
（ｈ）上皮接合部生理機能の第二の調節剤；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増進剤；および
（ｋ）安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種であって、該物質と生物学的活性剤が有効に組み合わされ、会合し、含有され、被包され、または結合した結果、増進した粘膜搬送のため、活性剤が安定化される、前記安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種
から選択され、前記の１以上の粘膜搬送増進剤は、（ａ）〜（ｋ）に列挙する、いずれか１つまたはいずれかの組み合わせの２以上の前記粘膜搬送増進剤を含んでなり、そして前記粘膜搬送増進剤と前記生物学的活性剤の配合物が、哺乳動物被検体の粘膜表面に搬送される生物学的活性剤の生物学的利用能を増加させる。
【００３８】
本発明のより詳細な態様において、上に示す医薬組成物は鼻内投与のために配合される。典型的な態様において、配合物は、鼻内スプレーまたは粉末として提供される。鼻内投与を増進するため、これらの配合物は、生物学的活性剤および浸透化剤を：
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨ調節剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘液溶解剤または粘液一掃剤；
（ｆ）繊毛抑制剤；
（ｇ）（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、または（ｘ）コレステロール合成阻害剤から選択される、膜浸透増進剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）に列挙した膜浸透増進剤の組み合わせいずれか；
（ｈ）上皮接合部生理機能の第二の調節剤；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増進剤；および
（ｋ）安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種であって、該物質と生物学的活性剤が有効に組み合わされ、会合し、含有され、被包され、または結合した結果、増進した鼻内搬送のため、活性剤が安定化される、前記安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種
から選択される、１以上の鼻内搬送増進剤と組み合わせることも可能であり、前記の１以上の鼻内搬送増進剤は、（ａ）〜（ｋ）に列挙する、いずれか１つまたはいずれかの組み合わせの２以上の前記鼻内搬送増進剤を含んでなり、そして前記の１以上の鼻内搬送増進剤と前記生物学的活性剤の配合物が、哺乳動物被検体の鼻粘膜表面に搬送される生物学的活性剤の生物学的利用能を増加させる。
【００３９】
他の関連する側面において、浸透化剤、例えば浸透化ペプチド、および生物学的活性剤を含んでなる医薬組成物は、哺乳動物被検体への粘膜投与後、療法化合物の増進された生物学的利用能を生じるのに有効であり、これは例えば、被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、約２５％以上である、被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤のピーク濃度（Ｃｍａｘ）を生じることによる。特定の態様において、医薬組成物は、同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤のピーク濃度に比較して、粘膜投与後、約５０％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の生物学的活性剤のピーク濃度（Ｃｍａｘ）を生じる。
【００４０】
本発明の別の態様において、浸透化剤および生物学的活性剤を含んでなる医薬組成物は、粘膜投与後、療法化合物の増進された生物学的利用能を生じるのに有効であり、これは、被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）に比較した際、約２５％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の生物学的活性剤のＡＵＣを生じることによる。特定の態様において、医薬組成物は、被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）に比較した際、約５０％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の生物学的活性剤のＡＵＣを生じる。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、浸透化剤および生物学的活性剤を含んでなる医薬組成物は、粘膜投与後、増進された生物学的利用能を生じるのに有効であり、これは、約０．１〜１．０時間の間で、被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の前記生物学的活性剤の最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）を生じることによる。特定の態様において、組成物は、約０．２〜０．５時間の間で、被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤の最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）を生じる。
【００４２】
本発明の他の態様において、浸透化剤および生物学的活性剤を含んでなる医薬組成物は、粘膜投与後、ＣＮＳにおいて活性剤の増進された生物学的利用能を生じるのに有効であり、これは例えば、被検体の血漿中の生物学的活性剤のピーク濃度に比較して、１０％以上である、被検体のＣＮＳ組織または液中の生物学的活性剤のピーク濃度を生じることによる（例えば、ＣＮＳおよび血漿濃度を、粘膜投与後、同じ被検体において、同時に測定する）。特定の態様において、本発明の組成物は、被検体の血漿中の生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、２０％、４０％、またはそれより高い、被検体のＣＮＳ組織または液中の該活性剤のピーク濃度を生じる。
【００４３】
本発明のより詳細な側面において、浸透化剤および生物学的活性剤を使用する医薬組成物および方法は、哺乳動物被検体における性的機能不全の治療に有効である。特定の態様において、組成物および方法は、男性および／または女性性的機能不全の治療に有効である。典型的な態様において、組成物および方法は、男性および／または女性勃起障害の治療に有効であり、これは例えば、男性および／または女性被検体の勃起性組織の充血を刺激することによる。関連する態様において、方法および組成物は、男性および／または女性性的欲望、性行為を完了する能力、および／またはオルガスムを含む性的刺激反応を達成する能力を増進するのに有効である。より詳細な側面において、性的機能不全を治療するための本発明の組成物および方法は、生物学的活性剤として、ドーパミン受容体アゴニストあるいはその薬学的に許容しうる塩または誘導体を使用することも可能である。例えば、生物学的活性剤は、アポモルヒネあるいはその薬学的に許容しうる塩または誘導体であることも可能である。これらの方法および組成物は、ドーパミン受容体アゴニストの療法的投与による治療を受け入れやすい疾患または状態の治療および防止に有効であり、これは例えば、男性または女性勃起性組織の充血を刺激し、そして／または前記勃起性組織の神経刺激潜在能力を増進することによるか、性的欲望を増進することによるか、あるいは性的刺激中、オルガスムに到達する被検体の能力を増加させることによる。本発明のさらなる態様において、ドーパミン受容体アゴニストを、本明細書記載の組成物および方法にしたがって投与して、哺乳動物被検体において、パーキンソン病の症状を有効に治療するかまたは防止することも可能である。
【００４４】
本発明の特定の典型的な態様において、生物学的活性剤（単数または複数）は、インターフェロン−α、インターフェロン−β、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、インスリン、ヘパリン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、アミロイドペプチド、ベータ−シート遮断ペプチド、ナトリウム利尿ペプチド、ケトプロフェン、およびオレアミド、オキソイトシン（ｏｘｏｙｔｏｃｉｎ）、カルボトシン（ｃａｒｂｏｔｏｃｉｎ）、５−ヒドロキシトリプトファン（セロトニン（ｓｅｒｅｔｏｎｉｎ））から選択され、そして組成物および方法は、前述の活性剤（単数または複数）の粘膜投与による治療を受け入れやすい疾患、状態および障害の治療に有効である。
【００４５】
本明細書に同定する１以上の生物学的活性剤の療法的投与による治療を受け入れやすい、哺乳動物被検体における疾患または状態を治療するかまたは防止するための本発明の方法は、一般的に、生物学的活性剤（例えばドーパミン受容体アゴニスト）および上述のように、生物学的活性剤の粘膜搬送を増進させるのに有効な量の浸透化剤（例えば浸透化ペプチド）を含んでなる薬剤配合物を、前記被検体に協調して粘膜投与することを含んでなる。浸透化剤の協調投与は、被検体の標的粘膜上皮において、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進する。典型的には、浸透化剤は、接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディンから選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合または異型結合を有効に阻害する。特定の態様において、協調粘膜投与の工程（単数または複数）は、被検体の粘膜表面への生物学的活性剤の搬送前、搬送後、または搬送と同時に（例えば組み合わせ配合物）、浸透化剤の搬送を伴う。より詳細な態様において、浸透化剤は、例えば、組み合わせた、または別個の鼻スプレー、ゲルまたは粉末配合物（単数または複数）において、前記被検体の鼻粘膜表面に、生物学的活性剤とともに協調して投与される。典型的な態様において、浸透化剤を生物学的活性剤と協調して投与して、生物学的活性剤の粘膜上皮傍細胞輸送の増進を生じる。特定の典型的な態様において、浸透化ペプチドは、上述のような哺乳動物ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５、または約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなるか、あるいは哺乳動物ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の細胞外ドメインの対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示す、匹敵する長さのペプチドを含んでなる。
【００４６】
本発明のさらなる協調投与法内で、生物学的活性剤および浸透化剤は：
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨ調節剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘液溶解剤または粘液一掃剤；
（ｆ）繊毛抑制剤；
（ｇ）（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、または（ｘ）コレステロール合成阻害剤から選択される、膜浸透増進剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）に列挙した膜浸透増進剤の組み合わせいずれか；
（ｈ）上皮接合部生理機能を調節する第二の浸透化剤；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増進剤；および
（ｋ）安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種であって、該物質と生物学的活性剤が有効に組み合わされ、会合し、含有され、被包され、または結合した結果、増進した粘膜搬送のため、活性剤が安定化される、前記安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種
から選択される、１以上の粘膜搬送増進剤と組み合わせて投与され、前記の１以上の粘膜搬送増進剤は、（ａ）〜（ｋ）に列挙する、いずれか１つまたはいずれかの組み合わせの２以上の前記粘膜搬送増進剤を含んでなり、そして前記粘膜搬送増進剤と前記生物学的活性剤の配合物が、哺乳動物被検体の粘膜表面に搬送される生物学的活性剤の生物学的利用能を増加させる。
【００４７】
本発明の関連する側面において、浸透化剤および生物学的活性剤の協調投与は、被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の生物学的活性剤のピーク濃度に比較した際、２５％以上である、被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤のピーク濃度（Ｃｍａｘ）を生じる。さらなる態様において、浸透化剤および生物学的活性剤の協調投与は、被検体に同等の濃度または用量の活性剤を筋内注射した後の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）に比較して、２５％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ中の生物学的活性剤のＡＵＣを生じる。他の態様において、浸透化剤および生物学的活性剤の協調投与は、０．２〜０．５時間の間で、被検体の血漿または脳脊髄液（ＣＮＳ）中の生物学的活性剤の最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）を生じる。さらに他の態様において、浸透化剤および生物学的活性剤の協調投与は、被検体の血漿中の生物学的活性剤のピーク濃度に比較して、１０％以上である、被検体の中枢神経系（ＣＮＳ）組織または液中の生物学的活性剤のピーク濃度を生じる。
【００４８】
さらに詳細な態様において、本発明は、粘膜上皮傍細胞輸送を増進するための浸透化ペプチド、並びにペプチド類縁体およびペプチド模倣体を提供する。対象のペプチド、並びにペプチド類縁体およびペプチド模倣体は、典型的には、哺乳動物被検体において、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、本発明の組成物および方法内で働く。特定の態様において、ペプチド、並びにペプチド類縁体およびペプチド模倣体は、接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディンから選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合および／または異型結合を有効に阻害する。より詳細な態様において、浸透化ペプチドまたはペプチド類縁体は、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−３、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の細胞外ドメインの野生型配列の約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、あるいは哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−３、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の細胞外ドメインの野生型配列の約４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。典型的な態様において、浸透化ペプチドまたはペプチド類縁体は、野生型アミノ酸配列を有するか、または同じヒトＪＡＭタンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示すヒトＪＡＭペプチド（例えばヒトＪＡＭ−１）であって、前記突然変異（単数または複数）は、異なるヒトＪＡＭタンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同ＪＡＭタンパク質に同定される、構造的特徴に相当する。
【００４９】
より詳細な態様において、浸透化ペプチドは、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そして：ＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）；（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）；またはＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）から選択される１以上の隣接配列要素を含む。１つのこうした態様において、ペプチドは、保存配列モチーフＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）を含み、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基Ｉ、Ｖ、またはＡの１つで代表されることが可能であろう。別のこうした態様において、ペプチドは、保存配列モチーフ（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）を含み、ここで該モチーフの第１位は、代替アミノ酸残基Ｖ、ＡまたはＩの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第４位は、代替アミノ酸残基ＳまたはＴの１つで代表されることが可能であろう。さらに別のこうした態様において、ペプチドは、保存配列モチーフＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）を含み、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＳの１つで代表されることが可能であり、該モチーフの第７位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＲの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第９位は、代替残基ＭまたはＥの１つで代表されることが可能であろう。典型的な態様において、浸透化ペプチドは、長さ約４〜２５アミノ酸の間であり、そして野生型ヒトＪＡＭ−１ペプチド配列、ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、および／またはＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）から選択される１以上の隣接配列要素を含む。
【００５０】
本発明内で使用するための浸透化ペプチドには、天然または合成、療法的または予防的に活性であるペプチド（２以上の共有結合したアミノ酸で構成される）、タンパク質、ペプチド断片またはタンパク質断片、ペプチド類縁体またはタンパク質類縁体、ペプチド模倣体またはタンパク質模倣体、および活性ペプチドまたはタンパク質の化学的に修飾された誘導体または塩が含まれる。したがって、本明細書において、用語「浸透化ペプチド」は、しばしば、これらの活性種、すなわちペプチドおよびタンパク質、ペプチド断片およびタンパク質断片、ペプチド類縁体およびタンパク質類縁体、ペプチド模倣体およびタンパク質模倣体、並びに活性ペプチドまたはタンパク質の化学的に修飾された誘導体および塩を含むと意図されるであろう。しばしば、浸透化ペプチドまたはタンパク質は、天然存在または天然（ｎａｔｉｖｅ）（例えば野生型、天然存在突然変異体、または対立遺伝子変異体）ペプチド配列またはタンパク質配列内のアミノ酸の部分的置換、付加、または欠失によって容易に得ることが可能な突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）である。さらに、天然ペプチドまたは天然タンパク質の生物学的活性断片が含まれる。こうした突然変異体誘導体および断片は、実質的に、天然ペプチドまたは天然タンパク質の望ましい生物学的活性を保持する。炭水化物鎖を有するペプチドまたはタンパク質の場合、これらの炭水化物種の改変によって特徴付けられる生物学的活性変異体もまた、本発明内に含まれる。
【００５１】
本発明の方法および組成物内で使用するための浸透化ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体は、しばしば、哺乳動物被検体において、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進する、粘膜搬送を増進するかまたは浸透化するのに有効な量の浸透化ペプチド、タンパク質、類縁体または模倣体を含んでなる医薬組成物中に配合される。
【００５２】
本発明のより詳細な態様において、浸透化剤は、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸のペプチドを含んでなる。あるいは、浸透化ペプチドは、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなることも可能である。さらなる態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、あるいは哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。特定の態様において、浸透化ペプチドのアミノ酸配列は、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の対応する参照配列（例えば対応する野生型配列）に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す。例えば、浸透化ペプチドは、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示しうる。こうした機能するペプチド類縁体または変異体は、例えば、同じヒトＪＡＭタンパク質（例えばヒトＪＡＭ−１）の対応する参照配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を有することも可能であり、前記突然変異（単数または複数）は、異なるヒトＪＡＭタンパク質（例えばヒトＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３）に同定される、または異なる種に見られる相同ＪＡＭタンパク質（例えばネズミ、ラット、またはウシＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２またはＪＡＭ−３タンパク質）に同定される、相異するアミノ酸残基または配列に相当する。
【００５３】
より詳細な態様において、本発明の方法および組成物は、哺乳動物ＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸、または約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる浸透化ペプチドを取り込む。本明細書において、哺乳動物被検体において、生物学的活性剤の粘膜搬送を改善するため、粘膜浸透性を増進することが立証される典型的な浸透化ペプチドは、ペプチドＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＴＧＩＴＦＫＳＶＴ（配列番号６）、ＩＴＡＳ（配列番号７）、ＳＶＴＲ（配列番号８）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、およびＧＦＳＳＰＲＶＥＷ（配列番号１０）に例示されるように、ヒトＪＡＭ−１タンパク質の細胞外ドメインの部分配列を含んでなる。
【００５４】
これらの配列および他の典型的な配列を含んでなる、長さ約４〜２５アミノ酸の間のペプチドは、浸透化剤として直接使用可能であるし、または他の粘膜搬送増進剤と組み合わせた配合物中で組み合わせ可能である。さらに、これらの典型的なペプチドは、本明細書に記載するように、修飾可能である（例えばアミノ末端またはカルボキシ末端一部切除、あるいは対応する天然タンパク質由来の隣接アミノ酸配列の付加、別のペプチド、キャリアー、ポリマー、または生物学的活性部分へのコンジュゲート化、化学的修飾あるいは誘導体化などによる）。本発明内の有用なペプチドにはまた、前述の典型的なペプチドの機能可能な配列変異体、例えば置換、欠失、または挿入突然変異タンパク質も含まれる。例えば、ヒトおよび非ヒトＪＡＭタンパク質の相同配列を並列させることによって（多様な表、および本明細書に援用される参考文献を参照されたい）、粘膜浸透性を増進させるための以下の典型的な候補ＪＡＭ−１ペプチドが提供される：ＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）；（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）；またはＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）、ここで括弧内の残基は、機能する代替変異体に相当し、これは例えば、突然変異を受け入れやすい部位、および相異するＪＡＭ相同体に存在する代替残基を同定する、ヒトおよび非ヒトＪＡＭタンパク質の並列によって予測されている。代替候補ペプチドのこの合理的設計には、以下により詳細に記載するように、特定のＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の天然存在突然変異体、対立遺伝子変異体の並列、および異なるＪＡＭタンパク質（例えばＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−３）の比較によるものなどが含まれることが可能である。
【００５５】
これらの合理的設計法にしたがって、典型的な浸透化ＪＡＭ−１ペプチド候補には、限定されるわけではないが、ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＲＶＰ（配列番号１１）、ＶＲＡＰ（配列番号１２）、ＰＶＲＩＰＥ（配列番号１３）、ＰＥＶＲＩＰＥＮ（配列番号１４）、ＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮ（配列番号１５）、ＳＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮＰ（配列番号１６）、ＳＳＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮＰＶ（配列番号１７）、ＨＳＳＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮＰＶＫ（配列番号１８）、ＶＨＳＳＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮＰＶＫＬ（配列番号１９）、およびＴＶＨＳＳＥＰＥＶＲＩＰＥＮＮＰＶＫＬＳ（配列番号２０）が含まれる。さらなる典型的な浸透化ＪＡＭ−１ペプチド候補には、限定されるわけではないが、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＡＫＬＳＣＡＹ（配列番号２１）、ＩＫＬＳＣＡＹ（配列番号２２）、ＶＫＬＴＣＡＹ（配列番号２３）、ＡＫＬＴＣＡＹ（配列番号２４）、およびＩＫＬＴＣＡＹ（配列番号２５）が含まれる。さらなる典型的な浸透化ＪＡＭ−１ペプチド候補には、限定されるわけではないが、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＥ（配列番号２５）、ＥＤＴＧＴＹＲＣＭ（配列番号２６）、ＥＤＴＧＴＹＲＣＥ（配列番号２７）、ＥＤＳＧＴＹＴＣＭ（配列番号２８）、ＥＤＳＧＴＹＴＣＥ（配列番号２９）、ＥＤＳＧＴＹＲＣＭ（配列番号３０）、ＥＤＳＧＴＹＲＣＥ（配列番号３１）が含まれる。
【００５６】
典型的な浸透化ＪＡＭ−１ペプチド内の保存的アミノ酸置換は、ヒト由来（ＡＦ１１１７１３；Ｏｚａｋｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：５５３−５５７，  １９９９；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３６：１１７５−１１８８，  １９９９；Ｌｉｕら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｓｃｉ． １１３：２３６３−２３７４，  ２０００；Ｓｏｂｏｃｋａら，  Ｂｌｏｏｄ ９５：２６００−２６０９，  ２０００）、ネズミ由来（Ｕ８９９１５；Ｍａｒｔｉｎ−Ｐａｄｕｒａら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ． １４２：１１７−１２７，  １９９８；Ｍａｌｅｒｇｕｅら，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３５：１１１１−１１１９，  １９９８）、ウシ由来（ＡＦ１１１７１４；Ｏｚａｋｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６３：５５３−５５７，  １９９９）およびラット由来（ＡＦ２７６９９８、ＥＮＴＲＥＺ／ＧｅｎＢａｎｋデータベース、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに直接提出）（以下のテーブル１を参照されたい）のＪＡＭ−１細胞外ドメイン内の保存配列の比較によって決定可能である。
【００５７】
テーブル１にさらに要約されるように、ヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、およびＪＡＭ−３の命名法は、Ｄｅｊａｎａら，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ８６：３０８−３１５，  ２００１に明らかにされる。ヒトＪＡＭ−２配列は、ＡＪ３４４４３１（Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓ、ＥＮＴＲＥＺ／ＧｅｎＢａｎｋデータベース、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに直接提出）、ＡＦ３５６５１８（Ｐｉａ  Ａｒｒａｔｅら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２７６：４５８２６−４５８３２，  ２００１）、およびＡＸ０３６０４９〜ＡＸ０３６０６５（Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓ、ＷＯ  ００／５３７４９）に見出される。マウスＪＡＭ−２は、ＡＪ３００３０４（Ａｕｒｒａｎｄ−Ｌｉｏｎｓら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２７６：２７３３−２７４１，  ２００１）に見出される。ヒトＪＡＭ−３は、ＡＦ２５５９１０（Ｐａｌｍｅｒｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２７５：１９１３９−１９１４５，  ２０００）、およびＡＹ０１６００９（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２７５：３４７５０−３４７５６，  ２０００）に見出される。マウスＪＡＭ−３は、ＡＦ２５５９１１（Ｐａｌｍｅｒｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２７５：１９１３９−１９１４５，  ２０００）に見出される。
【００５８】
テーブル１：ＪＡＭタンパク質の参考文献調査
【００５９】
【表１】
2005537244.tif 000003
【００６０】
本発明のさらなる側面内で、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる浸透化ペプチドを使用する、医薬組成物および方法を提供する。別の態様において、別の態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる。特定の側面において、浸透化ペプチドは、哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、または哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。典型的な態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物オクルディン・タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す。しばしば、こうしたペプチド類縁体は、哺乳動物オクルディン・タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示すであろう。関連する態様において、浸透化ペプチドはヒト・オクルディン・ペプチドであり、そして浸透化ペプチドのアミノ酸配列は、同じヒト・オクルディン・タンパク質の対応する参照配列（例えば野生型配列）に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、該突然変異（単数または複数）は、異なるヒト・オクルディン・タンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同オクルディン・タンパク質に同定される、構造的特徴（例えば相異する並列残基または残基の配列）に相当する。
【００６１】
哺乳動物被検体において、粘膜浸透性を増進して、生物学的活性剤の搬送を促進する有効性を示す、典型的なオクルディン・ペプチドは、機能可能なペプチドに例示されるように、ヒト・オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる：ＡＡＴＧＬＹＶＤＱ（配列番号３２）、ＧＶＮＰＴＡＱＳＳ（配列番号３３）、ＧＳＬＹＧＳＱＩＹ（配列番号３４）、ＡＬＣＮＱＦＹＴＰ（配列番号３５）、およびＹＬＹＨＹＣＶＶＤ（配列番号３６）。
【００６２】
これらの機能可能なペプチドの最初のものを参照配列として、このペプチドを含んでなり、そして場合によって天然オクルディン細胞外ドメイン配列由来の他の残基も含むことも可能なさらなるペプチドには、例えば：ＡＡＴＧＬＹＶＤＱ（配列番号３２）、ＰＡＡＴＧＬＹＶＤＱＹ（配列番号３７）、ＴＰＡＡＴＧＬＹＶＤＱＹＬ（配列番号３８）、ＹＴＰＡＡＴＧＬＹＶＤＱＹＬＹ（配列番号３９）、ＦＹＴＰＡＡＴＧＬＹＶＤＱＹＬＹＨ（配列番号４０）、ＱＦＹＴＰＡＡＴＧＬＹＶＤＱＹＬＹＨＹ（配列番号４１）、ＹＬＹＨＹＣＶＶＤ（配列番号４２）、ＱＹＬＹＨＹＣＶＶＤＰ（配列番号４３）、ＤＱＹＬＹＨＹＣＶＶＤＰＱ（配列番号４４）、ＶＤＱＹＬＹＨＹＣＶＶＤＰＱＥ（配列番号４５）、ＹＶＤＱＹＬＹＨＹＣＶＶＤＰＱＥＡ（配列番号４６）、ＬＹＶＤＱＹＬＹＨＹＣＶＶＤＰＱＥＡＩ（配列番号４７）、ＡＡＴＧＬＹＶＤＱ（配列番号４８）、ＡＴＧＬＹＶＤ（配列番号４９）、ＴＧＬＹＶＤ（配列番号５０）、ＴＧＬＹＶ（配列番号５１）およびＧＬＹＶ（配列番号５２）が含まれるであろう。
【００６３】
本発明の他の側面内で、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなる浸透化ペプチドを使用する、医薬組成物および方法を提供する。別の態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約６〜１５の隣接アミノ酸を含んでなる。特定の側面において、浸透化ペプチドは、哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸を含んでなるか、または哺乳動物クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの４〜２５の隣接アミノ酸の対応する参照配列と少なくとも８５％のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる。典型的な態様において、浸透化ペプチドは、哺乳動物クローディン・タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を示す。しばしば、こうしたペプチド類縁体は、哺乳動物クローディン・タンパク質の対応する参照配列に比較して、１以上の保存的アミノ酸置換を示すであろう。関連する態様において、浸透化ペプチドはヒト・クローディン・ペプチドであり、そして浸透化ペプチドのアミノ酸配列は、同じヒト・クローディン・タンパク質の対応する野生型配列に比較して１以上のアミノ酸突然変異を示し、該突然変異（単数または複数）は、異なるヒト・クローディン・タンパク質に同定される、または異なる種に見られる相同クローディン・タンパク質に同定される、構造的特徴（例えば相異する並列残基または残基の配列）に相当する。
【００６４】
本発明のより詳細な側面において、哺乳動物被検体において、生物学的活性剤の粘膜搬送を増進するための、典型的な浸透化ペプチドは、ヒト・クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの約４〜２５のアミノ酸を含んでなり、ヒト・クローディン・タンパク質の細胞外ドメインの生物学的活性ペプチド類縁体またはタンパク質類縁体を含む。典型的な浸透化ペプチドは、ヒト・クローディン−１、クローディン−２、クローディン−３、クローディン−４、クローディン−５、クローディン−６、クローディン−７、クローディン−８．クローディン−９、クローディン−１０、クローディン−１１、クローディン−１２、クローディン−１３、クローディン−１４、クローディン−１５、クローディン−１６、クローディン−１７、クローディン−１８、クローディン−１９、またはクローディン−２０の細胞外ドメインのアミノ酸を含んでなる。哺乳動物被検体において、粘膜浸透性を増進して、生物学的活性剤の搬送を促進する有効性を示す、本発明のこの側面内の典型的な浸透化ペプチドには、限定されるわけではないが：ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬ（配列番号５３）、ＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰ（配列番号５４）、ＤＩＹＳＴＬＬＧＬＰ（配列番号５５）、ＧＦＳＬＧＬＷＭＥＣ（配列番号５６）、ＹＡＧＤＮＩＶＴＡＱ（配列番号５７）、ＭＴＰＶＮＡＲＹＥＦ（配列番号５８）、ＶＡＳＧＱＫＲＥＭＧ（配列番号５９）、ＶＰＤＳＭＫＦＥＩＧ（配列番号６０）、ＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬ（配列番号６１）、ＶＰＶＳＱＫＹＥＬＧ（配列番号６２）、およびＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭ（配列番号６３）が含まれる。
【００６５】
これらの機能可能なペプチドの最初のものを参照配列として、このペプチドを含んでなり、そして場合によって天然オクルディン細胞外ドメイン配列由来の他の残基も含むことも可能なさらなるペプチドには、例えば：ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬ（配列番号５３）、ＨＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬＶ（配列番号６４）、ＬＨＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬＶＰ（配列番号６５）、ＮＬＨＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬＶＰＤ（配列番号６６）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬＶＰＤＳ（配列番号６７）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬＶＰＤＳＭ（配列番号６８）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬＶＰＤＳＭＫ（配列番号６９）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬＶＰＤＳＭＫＦ（配列番号７０）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬＶＰＤＳＭＫＦＥ（配列番号７１）、ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬ（配列番号５３）、ＩＬＲＤＦＹＳＰ（配列番号７２）、ＬＲＤＦＹＳ（配列番号７３）、ＲＤＦＹＳ（配列番号７４）、およびＲＤＦＹ（配列番号７５）が含まれる。ヒト・クローディン・タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸を含んでなる、さらなる典型的な浸透化ペプチドには、限定されるわけではないが：ＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬ（配列番号６１）、ＨＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬＶ（配列番号７６）、ＡＨＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬＶＡ（配列番号７７）、ＴＡＨＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬＶＡＳ（配列番号７８）、ＷＴＡＨＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬＶＡＳＧ（配列番号７９）、ＳＷＴＡＨＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬＶＡＳＧＱ（配列番号８０）、およびＶＳＷＴＡＨＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬＶＡＳＧＱＫ（配列番号８１）が含まれる。ヒト・クローディン・タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸を含んでなる、さらなる典型的な浸透化ペプチドには、限定されるわけではないが：ＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭ（配列番号６３）、ＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧ（配列番号８２）、ＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧＡ（配列番号８３）、ＹＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧＡＧ（配列番号８４）、ＦＹＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧＡＧＬ（配列番号８５）、ＤＦＹＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧＡＧＬＹ（配列番号８６）、ＲＤＦＹＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧＡＧＬＹＶ（配列番号８７）、およびＩＲＤＦＹＮＰＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭＧＡＧＬＹＶＧ（配列番号８８）が含まれる。
【００６６】
哺乳動物被検体において、生物学的活性剤の粘膜搬送を増進する典型的な浸透化ペプチド（例えばヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−３、ヒト・クローディン−１〜クローディン２０、またはヒト・オクルディン・タンパク質類）は、典型的には、粘膜上皮に対して、有意な浸透化効果を示すであろう。例えば、この効果は、上皮バリア機能性のモデルとして、当該技術分野に広く許容されるＥｐｉＡｉｒｗａｙＴＭ細胞膜モデル系などの、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ上皮浸透性モデルにおいて、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）に対する効果として、立証可能である。典型的な浸透化ペプチドは、有効対照（例えば浸透化ペプチドの非存在下）に比較して、ＥｐｉＡｉｒｗａｙＴＭ細胞膜におけるＴＥＲの減少を示す。ヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−３、非ヒトＪＡＭ、クローディンまたはオクルディン細胞外ドメイン配列に相当する典型的な浸透化ペプチド、あるいはその活性類縁体または模倣体は、典型的には、これらのモデル系において、しばしば、対照ＴＥＲ値に比較して、少なくとも８５％以下へのＴＥＲの測定可能な減少を引き起こすであろう。しばしば、本発明の浸透化ペプチドは、対照値に比較して、少なくとも７５％以下へのＴＥＲ値の減少を生じるであろう。特定の態様において、浸透化ペプチドは、対照値に比較して、少なくとも６０％以下へのＴＥＲ値の減少を生じるであろう。さらにより有効な態様において、ヒトＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、ＪＡＭ−３、非ヒトＪＡＭ、クローディンまたはオクルディン・ペプチド、あるいはその活性類縁体および模倣体は、対照値に比較して、少なくとも５０％以下へのＴＥＲ値の減少を生じるであろう。
【００６７】
ヒトＪＡＭ−１は、２９９アミノ酸のポリペプチドであり、アミノ酸２８〜２３５と予測される細胞外ドメインを有する（図１の下線）。約４〜２５アミノ酸の間の長さを有し、そしてＪＡＭ−１細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な候補浸透化ペプチドを、以下のテーブル２〜５に示す。テーブル２は、ヒトＪＡＭ−１の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの４つのパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。これらの方法によって、ヒトＪＡＭ−１の上述の典型的な浸透化ペプチド（ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＴＧＩＴＦＫＳＶＴ（配列番号６）、ＩＴＡＳ（配列番号７）、ＳＶＴＲ（配列番号８）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、およびＧＦＳＳＰＲＶＥＷ（配列番号１０））を同定した。本明細書の説明および解説にしたがって、さらなる浸透化ペプチド（すなわち、例えばＴＥＲを減少させ、そして／または培養中の粘膜上皮細胞層を渡る、またはｉｎ  ｖｉｖｏの粘膜組織を渡る、そして／または哺乳動物被検体の選択される組織または生理学的区画への、巨大分子の輸送率を増加させることによって、粘膜上皮浸透性を測定可能に増加させるよう機能するペプチド）が容易に同定され、そして本発明の方法および組成物内に取り込まれるであろう。
【００６８】
テーブル２．ヒトＪＡＭ−１の候補浸透化ペプチド（スキャンペプチド）
【００６９】
【表２】
2005537244.tif 000004
【００７０】
ヒトＪＡＭ−１の上述の典型的な浸透化ペプチド（ＶＲＩＰ（配列番号４）、ＶＫＬＳＣＡＹ（配列番号５）、ＴＧＩＴＦＫＳＶＴ（配列番号６）、ＩＴＡＳ（配列番号７）、ＳＶＴＲ（配列番号８）、ＥＤＴＧＴＹＴＣＭ（配列番号９）、およびＧＦＳＳＰＲＶＥＷ（配列番号１０））に加えて、本明細書に記載するこれらのペプチドの多様な類縁体および模倣体を提供する。テーブル３〜５は、本発明の方法および組成物内で、特に活性であることが示された典型的なヒトＪＡＭ−１ペプチドに基づく、３つの典型的なペプチド類縁体パネルを示す。粘膜浸透性を増加させるこれらのペプチド類縁体候補のパネルには、例えばヒトおよび非ヒトＪＡＭタンパク質の相同配列を並列させることによって機能可能であると予測される、前述の典型的なペプチドの配列変異体が含まれる。これらの並列から、保存モチーフ：ＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）；（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）；またはＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）に例示されるような、保存ペプチドモチーフが決定される。上述のように、これらのモチーフは、厳密に保存される残基、および機能するＪＡＭ−１ペプチド類縁体を生じるように交換可能であると予期される、相異する残基（括弧内に示す）を共有する。
【００７１】
これらの合理的設計法にしたがって、本発明の特定の態様には、保存配列モチーフＶＲ（Ｉ、Ｖ、Ａ）Ｐ（配列番号１）を含んでなるＪＡＭ浸透化ペプチドが含まれ、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基Ｉ、Ｖ、またはＡの１つで代表されることが可能であろう。別のこうした態様において、ペプチドは、保存配列モチーフ（Ｖ、Ａ、Ｉ）ＫＬ（Ｓ、Ｔ）ＣＡＹ（配列番号２）を含み、ここで該モチーフの第１位は、代替アミノ酸残基Ｖ、ＡまたはＩの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第４位は、代替アミノ酸残基ＳまたはＴの１つで代表されることが可能であろう。さらに別のこうした態様において、ペプチドは、保存配列モチーフＥＤ（Ｔ、Ｓ）ＧＴＹ（Ｔ、Ｒ）Ｃ（Ｍ、Ｅ）（配列番号３）を含み、ここで該モチーフの第３位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＳの１つで代表されることが可能であり、該モチーフの第７位は、代替アミノ酸残基ＴまたはＲの１つで代表されることが可能であり、そして該モチーフの第９位は、代替残基ＭまたはＥの１つで代表されることが可能であろう。これらの解説にしたがって、テーブル３〜５は、３つのこうしたペプチド類縁体の典型的なパネルを示す。ペプチド類縁体のこれらのパネルに含まれるのは、文書化された参照ＪＡＭ−１ペプチドに比較して、アミノ末端またはカルボキシ末端伸長を含むペプチドであり、該伸長は、典型的には、示すように、天然ＪＡＭ−１タンパク質の対応する隣接配列に相当するであろう。
【００７２】
テーブル３．ヒトＪＡＭ−１の典型的な浸透化ペプチド
【００７３】
【表３】
2005537244.tif 000005
【００７４】
テーブル４．ヒトＪＡＭ−１の典型的な浸透化ペプチド
【００７５】
【表４】
2005537244.tif 000006
【００７６】
テーブル４．ヒトＪＡＭ−１の典型的な浸透化ペプチド（続き）
【００７７】
【表５】
2005537244.tif 000007
【００７８】
テーブル５．ヒトＪＡＭ−１の典型的な浸透化ペプチド
【００７９】
【表６】
2005537244.tif 000008
【００８０】
テーブル５．ヒトＪＡＭ−１の典型的な浸透化ペプチド（続き）
【００８１】
【表７】
2005537244.tif 000009
【００８２】
ヒトＪＡＭ−２は、３１０アミノ酸のポリペプチドであり、アミノ酸３１〜２４１と予測される細胞外ドメインを有する。ＪＡＭ−２の全長配列を図２に提供し、そして細胞外ドメインを下線で示す。テーブル６は、ヒトＪＡＭ−２の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの４つのパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。本明細書の説明および解説にしたがって、浸透化ＪＡＭ−２ペプチド（すなわち、例えばＴＥＲを減少させ、そして／または培養中の粘膜上皮細胞層を渡る、またはｉｎ  ｖｉｖｏの粘膜組織を渡る、そして／または哺乳動物被検体の選択される組織または生理学的区画への、巨大分子の輸送率を増加させることによって、粘膜上皮浸透性を測定可能に増加させるよう機能するペプチド）が容易に同定され、そして本発明の方法および組成物に取り込まれるであろう。
【００８３】
テーブル６．ヒトＪＡＭ−２の候補浸透化ペプチド（スキャンペプチド）
【００８４】
【表８】
2005537244.tif 000010
【００８５】
ヒトＪＡＭ−３は、２９８アミノ酸のポリペプチドであり、アミノ酸２８〜２３６と予測される細胞外ドメインを有する。ＪＡＭ−３の全長配列を図３に提供し、そして細胞外ドメインを下線で示す。テーブル７は、ヒトＪＡＭ−３の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの４つのパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。本明細書の説明および解説にしたがって、浸透化ＪＡＭ−３ペプチドが容易に同定され、そして本発明の方法および組成物に取り込まれるであろう。
【００８６】
テーブル７．ヒトＪＡＭ−３の典型的な浸透化ペプチド（スキャンペプチド）
【００８７】
【表９】
2005537244.tif 000011
【００８８】
ヒト・クローディン−１は、２１１アミノ酸のポリペプチドであり、３つの予測される細胞外ドメインを有する。約４〜２５アミノ酸の間の長さを有し、そしてクローディン−１細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な候補浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。２つのクローディン−１細胞外ドメインを図４に下線で示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−１の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−１の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。これらの方法によって、ヒト・クローディン−１の上述の典型的な浸透化ペプチド（ＹＡＧＤＮＩＶＴＡＱ（配列番号７１７）およびＭＴＰＶＮＡＲＹＥＦ（配列番号７１８））を同定した。本明細書の説明および解説にしたがって、さらなる浸透化ペプチド（すなわち、例えばＴＥＲを減少させ、そして／または培養中の粘膜上皮細胞層を渡る、またはｉｎ  ｖｉｖｏの粘膜組織を渡る、そして／または哺乳動物被検体の選択される組織または生理学的区画への、巨大分子の輸送率を増加させることによって、粘膜上皮浸透性を測定可能に増加させるよう機能するペプチド）が容易に同定され、そして本発明の方法および組成物内に取り込まれるであろう。
【００８９】
ヒト・クローディン−２は、２３０アミノ酸のポリペプチドであり、３つの予測される細胞外ドメインを有する。２つの細胞外ドメインを図５に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−２細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−２の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−２の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。これらの方法によって、ヒト・クローディン−２の上述の典型的な浸透化ペプチド（ＧＩＬＲＤＦＹＳＰＬ（配列番号５３）、ＶＰＤＳＭＫＦＥＩＧ（配列番号６０）、ＤＩＹＳＴＬＬＧＬＰ（配列番号５５）、およびＧＦＳＬＧＬＷＭＥＣ（配列番号５６））を同定した。本明細書の説明および解説にしたがって、クローディン−２のさらなる浸透化ペプチド（すなわち、粘膜上皮浸透性を測定可能に増加させるよう機能するペプチド）が容易に同定され、そして本発明の方法および組成物内に取り込まれるであろう。
【００９０】
ヒト・クローディン−３は、２２０アミノ酸のポリペプチドである。２つの細胞外ドメインを図６に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−３細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−３の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−３の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。これらの方法によって、ヒト・クローディン−３の上述の典型的な浸透化ペプチド（ＮＴＩＩＲＤＦＹＮＰ（配列番号５４）およびＶＶＰＥＡＱＫＲＥＭ（配列番号６３））を同定した。本明細書の説明および解説にしたがって、クローディン−３のさらなる浸透化ペプチド（すなわち、粘膜上皮浸透性を測定可能に増加させるよう機能するペプチド）が容易に同定され、そして本発明の方法および組成物内に取り込まれるであろう。
【００９１】
ヒト・クローディン−４は、２０９アミノ酸のポリペプチドである。細胞外ドメインを図７に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−４細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−４の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−４の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。これらの方法によって、ヒト・クローディン−４の上述の典型的な浸透化ペプチド（ＶＡＳＧＱＫＲＥＭＧ（配列番号５９）およびＮＩＩＱＤＦＹＮＰＬ（配列番号６１））を同定した。本明細書の説明および解説にしたがって、クローディン−４のさらなる浸透化ペプチドが容易に同定され、そして本発明の方法および組成物内に取り込まれるであろう。
【００９２】
ヒト・クローディン−５は、２１８アミノ酸のポリペプチドである。細胞外ドメインを図８に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−５細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−５の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−５の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。これらの方法によって、ヒト・クローディン−５の上述の典型的な浸透化ペプチド（ＶＰＶＳＱＫＹＥＬＧ（配列番号６２））を同定した。本明細書の説明および解説にしたがって、クローディン−５のさらなる浸透化ペプチドが容易に同定され、そして本発明の方法および組成物内に取り込まれるであろう。
【００９３】
ヒト・クローディン−６は、２２０アミノ酸のポリペプチドである。細胞外ドメインを図９に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−６細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−６の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−６の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。
【００９４】
ヒト・クローディン−７は、２１１アミノ酸のポリペプチドである。細胞外ドメインを図１０に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−７細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−７の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−７の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。
【００９５】
ヒト・クローディン−８は、２２５アミノ酸のポリペプチドである。細胞外ドメインを図１１に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−８細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−８の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−８の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。
【００９６】
ヒト・クローディン−９は、２１７アミノ酸のポリペプチドである。細胞外ドメインを図１２に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−９細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−９の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−９の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。
【００９７】
ヒト・クローディン−１０は、２２８アミノ酸のポリペプチドである。細胞外ドメインを図１３に下線で示す。４〜２５アミノ酸の間であり、そしてクローディン−１０細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な浸透化ペプチドを、以下のテーブル８に示す。テーブル８は、ヒト・クローディン−１０の第一の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの２つのパネル、およびヒト・クローディン−１０の第二の細胞外ドメイン由来のスキャンペプチドの１つの典型的なパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。
【００９８】
テーブル８．ヒト・クローディン１〜１０の典型的な浸透化ペプチド（スキャンペプチド）
【００９９】
【表１０】
2005537244.tif 000012
【０１００】
【表１１】
2005537244.tif 000013
【０１０１】
テーブル８．ヒト・クローディンの典型的な浸透化ペプチド（スキャンペプチド）（続き）
【０１０２】
【表１２】
2005537244.tif 000014
【０１０３】
【表１３】
2005537244.tif 000015
【０１０４】
ヒト・オクルディンは、５２２アミノ酸のポリペプチドである。ヒト・オクルディンの２つの細胞外ドメインを図１４に下線で示す。約４〜２５アミノ酸の間の長さを有し、そしてヒト・オクルディン細胞外ドメインの部分を含んでなる、典型的な候補浸透化ペプチドを、以下のテーブル９に示す。２つのオクルディン細胞外ドメインを図１４に下線で示す。テーブル９は、ヒト・オクルディンの第一の細胞外ドメインおよび第二の細胞外ドメインの各々に由来するスキャンペプチドの２つのパネルを示し、ここから候補浸透化ペプチドをスクリーニングし、そして本発明内で使用するために正当であることを確認する。これらの方法によって、ヒト・オクルディンの上述の典型的な浸透化ペプチド（ＧＶＮＰＴＡＱＳＳ（配列番号３３）、ＧＳＬＹＧＳＱＩＹ（配列番号３４）、ＡＡＴＧＬＹＶＤＱ（配列番号３２）、ＡＬＣＮＱＦＹＴＰ（配列番号３５）、およびＹＬＹＨＹＣＶＶＤ（配列番号３６））を同定した。本明細書の説明および解説にしたがって、ヒト・オクルディンのさらなる浸透化ペプチド（すなわち、例えばＴＥＲを減少させ、そして／または培養中の粘膜上皮細胞層を渡る、またはｉｎ  ｖｉｖｏの粘膜組織を渡る、そして／または哺乳動物被検体の選択される組織または生理学的区画への、巨大分子の輸送率を増加させることによって、粘膜上皮浸透性を測定可能に増加させるよう機能するペプチド）が容易に同定され、そして本発明の方法および組成物内に取り込まれるであろう。
【０１０５】
テーブル９．ヒト・オクルディンの典型的な浸透化ペプチド（スキャンペプチド）
【０１０６】
【表１４】
2005537244.tif 000016
【０１０７】
典型的な態様において、粘膜搬送を増進させるのに有効な量の浸透化ペプチドと組み合わせて、鼻内投与された生物学的活性剤、例えばインターフェロン−βの哺乳動物被検体の血清内への取り込みを測定する。浸透化ペプチドは、哺乳動物被検体において、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進する。浸透化ペプチドは、一般的に、接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディン・タンパク質から選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合を有効に阻害する。
【０１０８】
本発明のＪＡＭ−１、クローディン−２、またはオクルディンの浸透化ペプチドを含んでなる薬剤配合物における、生物学的活性剤、例えばインターフェロン−β−１ａの鼻内搬送の薬物動態学的データは、多様な方法によって測定可能である。典型的な態様において、本発明の薬剤配合物の鼻内搬送３時間後、血清中のインターフェロン−β最大濃度（Ｃｍａｘ）を測定し、そしてこの濃度は、およそ５．０ＩＵ／ｍｌ以上、典型的には６．０ＩＵ／ｍｌ以上、または１０．０ＩＵ／ｍｌ以上であろう。
【０１０９】
血清中のインターフェロン−β最大血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）は、インターフェロン−β−１ａの皮下搬送または筋内搬送に比較して、本発明の配合物および方法によって加速される。典型的な態様において、本発明の配合物の鼻内搬送のｔｍａｘは、およそ０．４時間以下、典型的には０．３時間以下である。
【０１１０】
本発明の他の詳細な側面内で、インターフェロン−β「薬物動態学的マーカー」を測定することによって、本発明の方法および組成物にしたがった投与後のインターフェロン−βの生物学的利用能を測定する。本明細書において、薬物動態学的マーカーには、１以上のインターフェロン−β化合物、または本明細書に開示する他の生物学的活性剤（単数または複数）の粘膜搬送の薬物動態学をモデル化するのに有用なｉｎ  ｖｉｔｒｏ系またはｉｎ  ｖｉｖｏ系で検出可能な許容される生物学的マーカーがいずれも含まれ、本明細書の方法および配合物にしたがったインターフェロン−β化合物（単数または複数）の投与後に、望ましい標的部位で検出されるマーカー（単数または複数）のレベルは、その標的部位に搬送されたインターフェロン−β化合物（単数または複数）のレベル（単数または複数）と合理的に相関する概算値を提供する。この背景において、当該技術分野に許容される多くのマーカーの中には、インターフェロン−β化合物（単数または複数）または他の生物学的活性剤（単数または複数）の投与によって、標的部位で誘導される物質が含まれる。例えば、１以上のインターフェロン−β化合物の有効量を、本発明にしたがって鼻粘膜に搬送すると、被検体において、免疫学的応答が刺激され、これは限定されるわけではないが、ネオプテリン、β２−ミクログロブリン、および２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼを含む薬物動態学的マーカーの産生によって測定可能である。
【０１１１】
インターフェロン−βの当該技術分野に許容される薬物動態学的マーカー、例えば血清β−２ミクログロブリン、血清ネオプテリンまたは血清２’，５’−オリゴアデニル酸シンテターゼは、例えば血清、ＣＮＳ組織または区画、ＣＳＦあるいは別の選択される生理学的区画または標的組織における、マーカー（単数または複数）のピーク血漿レベル（Ｃｍａｘ）によって測定されるように、投与後に測定可能である。これらのマーカーデータおよび他のこうしたマーカーデータは、ｉｎ  ｖｉｖｏで直接は検出不能である可能性があるインターフェロン−β化合物の薬物動態学と合理的に相関すると、当該技術分野に認められる。特定の側面において、インターフェロン−βマーカーによって測定されるようなインターフェロン−βの増進した生物学的利用能は、例えば、血漿またはＣＳＦのおよそ１．７ｍｇ／ｍｌ、あるいは血漿またはＣＳＦのおよそ２．０ｍｇ／ｍｌ、あるいは血漿またはＣＳＦのおよそ４．０ｍｇ／ｍｌ以上の血清β−２ミクログロブリンの相関するＣｍａｘによって立証されるであろう。血漿またはＣＳＦのおよそ８ｎｍｏｌ／ｌ、血漿またはＣＳＦのおよそ１０ｎｍｏｌ／ｌ、血漿またはＣＳＦのおよそ２０ｎｍｏｌ／ｌ、血漿またはＣＳＦのおよそ３０ｎｍｏｌ／ｌ、あるいは血漿またはＣＳＦのおよそ４０ｎｍｏｌ／ｌ以上の血清ネオプテリンのＣｍａｘ。
【０１１２】
さらなる詳細な側面内で、前記被検体への粘膜投与後、本明細書に開示するような医薬組成物は、前記被検体へのインターフェロン−βの同等の濃度または用量の筋内注射、インターフェロン−β単独の鼻内搬送、および／または以前に記載された方法および配合物を用いたインターフェロン−βの粘膜搬送後の血漿あるいはＣＮＳ組織または液中のネオプテリンまたはβ２−ミクログロブリンのピーク濃度に比較した際、典型的には２５％以上、または７５％以上、または１５０％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ組織または液中の薬理学的マーカー、ネオプテリンまたはβ２−ミクログロブリンのピーク濃度（Ｃｍａｘ）を生じる。
【０１１３】
本発明の他の詳細な側面内で、インターフェロン−βの生物学的利用能は、インターフェロン−β薬物動態学的マーカー、例えば血清β−２ミクログロブリンまたは血清ネオプテリンを測定して、血清、ＣＮＳ、ＣＳＦあるいは別の選択される生理学的区画または標的組織中のマーカー（単数または複数）の濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を概算することによって、決定されるであろう。この背景において、インターフェロン−βマーカーによって決定されるようなインターフェロン−βの生物学的利用能は、例えば、血漿またはＣＳＦのおよそ２００μＩＵ・時間／ｍｌの血清β−２ミクログロブリンのＡＵＣ０−９６時間、血漿またはＣＳＦのおよそ５００μＩＵ・時間／ｍｌまでのβ−２ミクログロブリンのＡＵＣ０−９６時間、血漿またはＣＳＦのおよそ２００ｎｇ・時間／ｍｌの血清ネオプテリンのＡＵＣ０−９６時間、血漿またはＣＳＦのおよそ５００ｎｇ・時間／ｍｌまでの血清ネオプテリンのＡＵＣ０−９６時間であろう。
【０１１４】
さらなる詳細な側面内で、本明細書に開示するような医薬組成物は、前記被検体へのインターフェロン−βの同等の濃度または用量の筋内注射、インターフェロン−β単独の鼻内搬送、および／または以前に記載された方法および配合物を用いたインターフェロン−βの粘膜搬送後の血漿あるいはＣＮＳ組織または液中のネオプテリンまたはβ２−ミクログロブリンの濃度曲線下面積（ＡＵＣ０−９６時間）に比較した際、前記被検体への粘膜投与後、典型的には２５％以上、または７５％以上、または１５０％以上である、被検体の血漿またはＣＮＳ組織または液中の薬理学的マーカー、ネオプテリンまたはβ２−ミクログロブリンのＡＵＣ０−９６時間を生じる。
【０１１５】
本発明のさらなる詳細な側面内で、本明細書の方法および配合物によって達成される、インターフェロン−β薬物動態学的マーカー、例えば血清β−２ミクログロブリンまたは血清ネオプテリンの生物学的利用能は、血清、ＣＮＳ、ＣＳＦあるいは別の選択される生理学的区画または標的組織中の最大濃度までの時間（ｔｍａｘ）によって測定される。血清β−２ミクログロブリンのｔｍａｘは、例えば、本明細書記載の方法および配合物によるインターフェロン−βの鼻内投与後、約４５時間以下、典型的には３５時間以下、または典型的には２５時間以下であろう。血清ネオプテリンのｔｍａｘは、例えば、本明細書記載の方法および配合物によるインターフェロン−βの鼻内投与後、約４０時間以下、典型的には３０時間以下、または典型的には２５時間以下であろう。
【０１１６】
さらなる詳細な側面内で、本明細書に開示するような医薬組成物は、前記被検体への粘膜投与後、被検体の血漿あるいはＣＮＳ組織または液において、典型的には約２５〜４５時間の間、または約２５〜３５時間の間である、薬理学的マーカー、ネオプテリンまたはβ２−ミクログロブリンの最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）を生じる。
【０１１７】
結果によって、インターフェロン−βの有意な血漿レベル（Ｃｍａｘ）が、１以上の鼻内搬送増進剤、例えば本発明の浸透化ペプチド、ＪＡＭ、クローディン、またはオクルディンと組み合わせたインターフェロン−βの薬剤配合物の鼻内投与後に達成されることが示される。鼻内搬送による最大血漿濃度までの時間（ｔｍａｘ）は、皮下注射または筋内注射に比較した際、同様の血漿レベル（Ｃｍａｘ）を達成するのに、少なくとも５〜１０倍加速される。本発明の薬剤配合物の鼻内投与によるインターフェロン−βの搬送率（Ｃｍａｘおよびｔｍａｘによって測定されるようなもの）は、インターフェロン−βの筋内注射または皮下注射による搬送率に比較した際、有意に増加している。
【０１１８】
本発明の浸透化ペプチド、例えばＪＡＭ、クローディン、またはオクルディン・ペプチドを含んでなる薬剤配合物を、インターフェロン−β配合物の鼻内投与１０分前、２０分前、または３０分前に鼻内投与すると、インターフェロン−βのＣＮＳまたは血清への搬送（Ｃｍａｘおよびｔｍａｘ）が、インターフェロン−β配合物単独の鼻内投与に比較して、５〜１０パーセント、１０〜１５パーセント、または１５〜２０パーセント改善されるという利点が提供される。
【０１１９】
本発明の浸透化ペプチドを含んでなる薬剤配合物により、インターフェロン−βの一貫した療法血中レベルおよびＣＮＳレベルを搬送し、そして維持する潜在能力によって、筋内投与または皮下投与用の現存する配合物を越える、明確な利点が提供される。明確な利点は、血清中の最大濃度に到達するのに４時間以上を必要とする皮下投与に比較した際、血清最大濃度が達成される０．５〜１時間の時間枠内で鼻内投与を反復することによって、インターフェロン−βの一貫した療法血中レベルおよびＣＮＳレベルを維持することにある。インターフェロン−β活性の薬力学的マーカーは、ＩＦＮ−βマーカー、ネオプテリンおよびβ２−ミクログロブリンの最大濃度が、本発明の浸透化ペプチドを含んでなる薬剤配合物による、インターフェロン−βの鼻内投与後、およそ４５時間以下、典型的には３０時間以下、または典型的には２２時間以下で達成されることを示す。
【０１２０】
生物学的活性剤
本発明の方法および組成物は、哺乳動物被検体において、広い範囲の生物学的活性剤の粘膜搬送、例えば鼻内搬送を増進して、療法的結果、予防的結果または他の望ましい生理学的結果を達成することに向けられる。本明細書において、用語「生物学的活性剤」は、本明細書の方法および組成物にしたがって、哺乳動物被検体に粘膜的に投与した際、生理学的応答を生じるいかなる物質も含む。この背景において、有用な生物学的活性剤には、臨床医学のすべての主要な分野に適用される療法剤または予防剤とともに、栄養素、補因子、酵素（内因性または外来（ｆｏｒｅｉｇｎ））、酸化防止剤等が含まれる。したがって、生物学的活性剤は、水溶性または水不溶性であることも可能であり、そして高分子量タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、脂質、および／または糖脂質、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、および他の活性剤を含むことも可能である。
【０１２１】
本発明の方法および組成物内で有用な薬学的剤には、小分子量薬剤、ペプチド、タンパク質、およびワクチン剤を含む、広い範囲の化合物を含む、薬剤および巨大分子療法剤または予防剤が含まれる。本発明内で使用するための典型的な薬学的剤は、被検体において、選択される疾患または状態の治療または予防のため、生物学的に活性である。この背景において、生物学的活性は、実際の患者、細胞培養、試料アッセイ、または許容しうる動物モデルを伴う、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系またはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系によって評価されるような、対象の疾患または状態に関連する、生理学的パラメーター、マーカー、または臨床症状に対する、有意な（すなわち測定可能で統計的に有意な）影響いずれかとして測定可能である。
【０１２２】
本発明の方法および組成物は、哺乳動物被検体において、疾患および他の状態の治療のための予期されぬ利点を提供し、この利点は、例えば被検体において、療法化合物および予防化合物が、選択される生理学的区画に（例えば鼻粘膜内にまたは鼻粘膜を渡って、全身循環または中枢神経系（ＣＮＳ）内に、あるいは被検体内の選択される標的臓器、組織、体液または細胞区画もしくは細胞外区画いずれかに）到達する速度、期間、忠実性または調節の増進を提供することによって、仲介される。
【０１２３】
多様な典型的な態様において、本発明の方法および組成物は：
オピオイドまたはオピオイド・アンタゴニスト、例えばモルヒネ、ヒドロモルホン、オキシモルホン、レボルファノール（ｌｏｖｏｒｐｈａｎｏｌ）、レバロルファン、コデイン、ナルメフェン、ナロルフィン、ナロゾン（ｎａｌｏｚｏｎｅ）、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、およびナルブフィン；
コルチコステロン、例えばコルチゾン、ヒドロコルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈｏａｓｏｎｅ）、ベタメタゾン（ｂｅｔａｍｅｔｈｏａｓｏｎｅ）、パラメタゾン（ｐａｒａｍｅｔｈｏｓｏｎｅ）、およびフルオシノロン；
他の抗炎症剤、例えばコルヒチン、イブプロフェン、インドメタシン、およびピロキシカム；抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、リバビリン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）、トリフルオロチミジン（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｔｈｙｒｉｄｉｎｅ）、Ａｒａ−Ａ（アラビノフラノシルアデニン）、アシルグアノシン、ノルデオキシグアノシン、アジドチミジン、ジデオキシアデノシン、およびジデオキシシチジン；抗アンドロゲン、例えばスピロノラクトン；
アンドロゲン、例えばテストステロン；
エストロゲン、例えばエストラジオール；
プロゲスチン類；
筋弛緩剤、例えばパパベリン；
血管拡張剤、例えばニトログリセリン、血管作動性腸管ペプチドおよびカルシトニン関連遺伝子ペプチド；
抗ヒスタミン剤、例えばシプロヘプタジン；
ヒスタミン受容体部位遮断活性を持つ剤、例えばドキセピン、イミプラミン、およびシメチジン；
鎮咳剤、例えばデキストロメトルファン；神経安定剤、例えばクロザリル；不整脈治療剤；
抗癲癇剤；
酵素、例えばスーパーオキシド・ジスムターゼおよびニューロエンケファリナーゼ；
抗真菌剤、例えばアンホテリシンＢ、グリセオフルビン、ミコナゾール、ケトコナゾール、チオコナゾール、イトラコナゾール、およびフルコナゾール；
抗細菌剤、例えばペニシリン類、セファロスポリン類、テトラサイクリン類、アミノ配糖体類、エリスロマイシン、ゲンタマイシン類、ポリミキシンＢ；
抗癌剤、例えば５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、メトトレキセート、およびヒドロキシ尿素、ジデオキシイノシン、フロクスウリジン、６−メルカプトプリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、Ｉ−ダルビシン（ｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、タキソールおよびパクリタキセル（場合によって、例えば２００２年８月２日にＱｕａｙによって出願された米国特許出願第０９／６３１，２４６号に記載されるような、二様式エマルジョン中で提供される）；
酸化防止剤、例えばトコフェロール類、レチノイド類、カロテノイド類、ユビキノン類、金属キレーター類、およびフィチン酸；
不整脈治療剤、例えばキニジン；および
抗高血圧剤、例えばプラゾシン、ベラパミル、ニフェジピン、およびジルチアゼム；鎮痛剤、例えばアセトアミノフェンおよびアスピリン；
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ヒト化抗体、および抗体断片を含む；
アンチセンス・オリゴヌクレオチド；並びに
療法ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含んでなるＲＮＡベクター、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクター
から選択される１以上の生物学的活性剤（単数または複数）を取り込むことも可能である。
【０１２４】
活性剤のこれらの典型的な種類および種に加えて、本発明の方法および組成物は、哺乳動物被検体において、選択される疾患または状態の治療または予防のための本発明の方法および組成物内で、個々に有効であるか、または組み合わせて有効である、上述のまたは本明細書の別の箇所に記載される、あるいは当該技術分野に知られる、生理学的活性剤いずれかとともに、多数の活性剤の組み合わせいずれかも含む（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ａ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｔｔｏｎ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ発行を参照されたい）。
【０１２５】
使用する化合物の種類に関わらず、本発明内で使用する生物学的活性剤は、被検体に対する有意な許容し得ない毒性または他の副作用を伴わず、望ましい生理学的影響を提供するのに十分な量で、本発明の組成物および方法中に存在するであろう。すべての生物学的活性剤の適切な投薬レベルは、当業者によって、過度の実験を伴わずに容易に決定されるであろう。本発明の方法および組成物は、生物学的活性剤（単数または複数）の搬送増進を提供するため、慣用的な投薬レベルより有意に低い投薬レベルが使用可能である。一般的に、活性物質は、使用する特定の物質に応じて、鼻内配合物総重量の約０．０１％〜約５０％、しばしば約０．１％〜約２０％、そして一般的に約１．０％〜５％または１０％の量で、組成物中に存在するであろう。
【０１２６】
ペプチド剤およびタンパク質剤
医薬品における生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の価値は、当該技術分野に古くから認識されてきている。ペプチドおよびタンパク質は、作用が特異的であり、比較的低い濃度で、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効であり、そして迅速に触媒する活性を持つことから、潜在的に理想的な療法剤と目されてきている。長年、ペプチドおよびタンパク質の産業的な製造プロセスがないために、療法剤としての使用は限定されてきた。しかし、近年、バイオテクノロジーおよび遺伝子操作の分野が劇的に進歩してきたため、多くのこうした療法剤を臨床的使用のため利用可能にすることが可能になってきた（例えばＳｗａｎｎ，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １６：８２６−８３４，１９９８を参照されたい）。
【０１２７】
不運なことに、タンパク質は、生物学的利用能の低さおよび化学的安定性の問題などの特性を所持し（Ｐｕｔｎｅｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６：１５３−１５７，  １９９８）、こうした特性は特定の疾患の治療に対する使用を限定しうる。体へのペプチドおよびタンパク質の搬送は、通常、頻繁に注射することによって行われる。これによって、血清濃度レベルの迅速な増加、そしてそれに続く迅速な減少が生じ、これは、副作用の出現を導きうる。したがって、この分野の主要な困難は、標的組織または生理学的区画で、有効な期間に渡って、活性剤の有効な濃度を維持することが可能な系を設計することであり、そして投与しなければならない用量の数を最低限にすることである。
【０１２８】
本明細書において、用語、生物学的活性「ペプチド」および「タンパク質」は、多様な大きさのポリペプチドを含み、そして本発明をいかなる特定の大きさのアミノ酸ポリマーにも限定しない。タンパク質またはペプチドが特定の生理学的、免疫学的、療法的、または予防的効果または応答を引き出す背景において、生物学的に活性である限り、長さ数アミノ酸と同程度に小さいペプチドから、いかなる大きさでもよいタンパク質とともに、ペプチド−ペプチド融合体、タンパク質−タンパク質融合体およびタンパク質−ペプチド融合体が本発明に含まれる。
【０１２９】
多くのペプチドおよびタンパク質が、例えばタンパク質不全（例えばヒト成長ホルモン、インスリン）に関連する状態の治療；免疫応答の増進（例えば抗体、サイトカイン）；癌の治療（例えばサイトカイン、Ｌ−アスパラギナーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、モノクローナル抗体）；過剰または不適切な酵素活性に関連する状態の治療（例えばアルファ−１−アンチトリプシンを用いたエラスターゼの阻害、アンチトロンビン−ＩＩＩでの凝血の制御）；血液置換療法（例えばヘモグロビン）；内毒素ショックの治療（例えば殺菌性浸透性増加（ＢＰＩ）タンパク質）；および創傷治癒（例えば増殖因子類、エリスロポエチン）で使用するために単離され、そして開発されてきている。前述の例は、浮上しつつあるペプチド療法およびタンパク質療法の分野の非常に多様な可能性の代表でしかない。
【０１３０】
比較的高分子量のペプチドおよびタンパク質薬剤の配合および搬送は、こうしたペプチドおよびタンパク質が、伝統的な、より小さい分子量の薬剤に比較して壊れやすいため、特定の問題を提示しうる。ペプチド薬剤およびタンパク質を薬剤として成功裡に使用するため、その配合および有効な投与に関連する多くの搬送および安定性の問題を理解することが必須である。ペプチドおよびタンパク質は、薬剤としての有効性の減少または損失を導きうる、多様な分子内および分子間化学反応を経る。これらには、酸化、脱アミド化、ベータ−脱離、ジスルフィド・スクランブル、加水分解、イソペプチド結合形成、および凝集が含まれる。化学的安定性に加え、ペプチドおよびタンパク質は、療法剤としての生物学的活性を維持するため、しばしば、その三次元構造を保持しなければならない。ペプチドおよびタンパク質の天然コンホメーションが失われると、しばしば、生物学的活性の減少または損失につながるばかりではなく、共有凝集または非共有凝集などのさらなる有害なプロセスに対する感受性が増加する。さらに、タンパク質凝集物の形成は、可溶性減少および免疫原性増加など、非経口搬送に関連する他の問題につながる（例えばＨ．Ｒ．  Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８３：１６６２−１６６９，  １９９４を参照されたい）。
【０１３１】
本発明は、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の粘膜搬送増進のための新規配合物および協調投与法を提供する。本発明内で使用するための療法ペプチドおよびタンパク質の実例となる例には、限定されるわけではないが：組織プラスミノーゲン・アクチベーター（ＴＰＡ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ酸性または塩基性）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−アルファまたはベータ）、血管作動性腸管ペプチド、腫瘍壊死因子（ＴＧＦ）、視床下部放出因子、プロラクチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＦ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、エンドルフィン類、グルカゴン、カルシトニン、オキシトシン、カルベトシン、アルドエテコン、エンケファリン類、ソマトスチン、ソマトトロピン、ソマトメジン、性腺刺激ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルファ−メラニン形成細胞刺激ホルモン、非天然存在オピオイド類、リドカイン、ケトプロフェン、サフェンタニル、テルブタリン、ドロペリドール、スコポラミン、ゴナドレリン、シクロピロックス、オラミン、ブスピロン、カルシトニン、クロモリン・ナトリウムまたはミダゾラム、シクロスポリン、リシノプリル、カプトプリル、デラプリル、シメチジン、ラニチジン、ファモチジン、スーパーオキシド・ジスムターゼ、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニン・デアミナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ・リボヌクレアーゼ、トリプシン、ケモトリプシン、およびパパインが含まれる。有用なペプチドのさらなる例には、限定されるわけではないが、ボンベシン、サブスタンスＰ、バソプレッシン、アルファ−グロブリン類、トランスフェリン、フィブリノーゲン、ベータ−リポタンパク質類、ベータ−グロブリン類、プロトロンビン、セルロプラスミン、アルファ２−糖タンパク質類、アルファ２−グロブリン類、フェチュイン、アルファ−リポタンパク質類、アルファ−グロブリン類、アルブミン、プレアルブミン、並びに他の生物活性タンパク質および組換えタンパク質産物が含まれる。
【０１３２】
本発明のさらに詳細な側面において、現存する疾患または状態を治療する（すなわち症状を取り除く、あるいはその症状の出現または重症度を減少させる）ため、あるいは対象の疾患または状態のリスクがあると同定される被検体において、疾患または状態の開始を防止するため、特定の生物学的活性ペプチドまたはタンパク質療法剤の粘膜搬送を増進させる方法および組成物を提供する。本発明のこれらの側面内で有用な生物学的活性ペプチドおよびタンパク質には、限定されるわけではないが、増血剤；抗感染剤；抗痴呆症剤；抗ウイルス剤；抗腫瘍剤；解熱剤；鎮痛剤；抗炎症剤；抗潰瘍剤；抗アレルギー剤；抗うつ剤；向精神剤；強心剤；抗不整脈剤；血管拡張剤；抗高血圧剤、例えば降圧利尿剤；抗糖尿病剤；抗凝血剤；コレステロール低下剤；骨粗鬆症の療法剤；ホルモン；抗生物質；ワクチン等が含まれる。
【０１３３】
本発明のこれらの側面内で使用するための生物学的活性ペプチドおよびタンパク質には、限定されるわけではないが、サイトカイン；ペプチドホルモン；増殖因子；心臓血管系に作用する因子；細胞接着因子；中枢神経系および末梢神経系に作用する因子；体液性電解質および血管有機物質に作用する因子；骨および骨格成長または生理機能に作用する因子；胃腸系に作用する因子；腎臓および泌尿器に作用する因子；結合組織および皮膚に作用する因子；感覚器官に作用する因子；免疫系に作用する因子；呼吸系に作用する因子；生殖器官に作用する因子；および多様な酵素が含まれる。
【０１３４】
例えば、本発明の方法および組成物内で投与可能なホルモンには、アンドロゲン、エストロゲン、プロスタグランジン、ソマトトロピン、性腺刺激ホルモン、インターロイキン、ステロイドおよびサイトカインが含まれる。
【０１３５】
本発明の方法および組成物内で投与可能なワクチンには、細菌およびウイルスワクチン、例えば肝炎ウイルス、インフルエンザ・ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザ・ウイルス（ＰＩＶ）、結核、カナリア痘瘡ウイルス、水疱瘡ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、肺炎、およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のワクチンが含まれる。
【０１３６】
本発明の方法および組成物内で投与可能な細菌トキソイドには、ジフテリア、破傷風、シュードモナスおよびミコバクテリア結核が含まれる。
本発明内で使用可能な特定の心臓血管剤または血栓剤の例には、ヒルゲン、ヒルロスおよびヒルジンが含まれる。
【０１３７】
本発明内で有用に投与される抗体試薬には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片、融合体および多量体、並びに免疫グロブリンが含まれる。
本発明の方法および組成物内で使用するための典型的なサイトカインには、リンホカイン、モノカイン、造血因子等が含まれ、例えばインターロイキン（例えばインターロイキン２〜１１）、インターロイキン−１、腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦ−アルファおよびベータ）、および悪性白血球阻害因子（ＬＩＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）並びにマクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）が含まれる。
【０１３８】
本発明の方法および組成物内で使用するための骨および骨格筋代謝に作用するペプチドおよびタンパク質因子の例には、骨ＧＬａペプチド、副甲状腺ホルモンおよびその活性断片、オステオスタチン、カルシトニン（例えば２００２年８月２日にＱｕａｙによって出願された米国特許出願第０９／６８６，４５２号を参照されたい）並びにヒストンＨ４関連骨形成および増殖ペプチドが含まれる。
【０１３９】
本発明の方法および組成物内で使用するための典型的な増殖因子には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血小板由来細胞増殖因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）等が含まれる。
【０１４０】
本発明の方法および組成物内で使用するための典型的なペプチドホルモンには、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、アミリン、オキシトシンおよびカルベトシン（例えば、それぞれ２０００年１月１１日および２０００年１０月３日にＱｕａｙによって出願された米国特許出願第０９／４８１，０５８号および米国特許出願第０９／６７８，５９１号を参照されたい）等が含まれる。
【０１４１】
心臓血管系に作用する因子に関して、本発明の方法および組成物内で使用するための典型的なペプチドおよびタンパク質には、生物学的に活性であって、血圧、動脈硬化症、並びに他の心臓血管系の疾患および状態を調節するものが含まれ、エンドセリン、エンドセリン阻害剤、およびエンドセリン・アンタゴニスト（例えばＥＰ  ４３６１８９、ＥＰ  ４５７１９５、ＥＰ  ４９６４５２およびＥＰ  ５２８３１２を参照されたい）、エンドセリン産生酵素阻害剤、バソプレッシン、レニン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、アンギオテンシンＩＩＩ、アンギオテンシンＩ阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、抗不整脈ペプチドなどに例示される。
【０１４２】
本発明の方法および組成物内で使用するための中枢神経系および末梢神経系に作用する典型的なペプチドおよびタンパク質因子には、オピオイド・ペプチド（例えばエンケファリン、エンドルフィン、キョートルフィン（ｋｙｏｔｏｒｐｈｉｎ））、向神経因子（ＮＴＦ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、甲状腺ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、ＴＲＨの塩および誘導体（例えば日本公開第５０−１２１２７３／１９７５号；米国特許第３，９５９，２４７号；日本公開第５２−１１６４６５／１９７７号；米国特許第４，１００，１５２号）、ニューロテンシン等が含まれる。
【０１４３】
本発明の方法および組成物内で使用するための胃腸系に作用する典型的なペプチドおよびタンパク質因子には、セクレチンおよびガストリンが含まれる。
本発明の方法および組成物内で使用するための体液性電解質および血液有機物質に作用する典型的なペプチドおよびタンパク質因子には、赤血球凝集、血漿コレステロールレベルまたは金属イオン濃度を調節する既知の因子、例えばカルシトニン、アポタンパク質Ｅおよびヒルジンが含まれる。
【０１４４】
本発明の方法および組成物内で使用するための典型的な細胞接着因子には、ラミニン、および細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）が含まれる。
本発明の方法および組成物内で使用するための腎臓および尿道に作用する典型的なペプチドおよびタンパク質因子には、腎臓の機能を制御する因子、例えばウロテンシンが含まれる。
【０１４５】
本発明の方法および組成物内で使用するための免疫系に作用する典型的なペプチドおよびタンパク質因子には、炎症および悪性新生物を調節する既知の因子とともに、感染性微生物を攻撃する因子、例えば走化性ペプチドおよびブラジキニン類が含まれる。
【０１４６】
本発明内で使用するための生物学的活性ペプチドおよびタンパク質には、天然起源の酵素および組換え酵素がさらに含まれ、これらには、限定されるわけではないが、スーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ）、アスパラギナーゼ、カリクレイン類等が含まれる。
【０１４７】
本発明内で使用するための生物学的活性ペプチドおよびタンパク質は、鼻粘膜内に、または鼻粘膜を渡って、容易に吸収されるペプチドまたはタンパク質であることも可能であるが、より典型的には、慣用的な鼻内搬送／配合法後、（例えば全身循環への）吸収が劣るかまたはまったく吸収されないものであることも可能である。後者の場合、ペプチドまたはタンパク質の鼻内搬送は、活性のため、標的区画（例えば全身循環）で、ペプチドまたはタンパク質の療法的または予防的有効濃度を引き出すのに失敗する。
【０１４８】
典型的には、本発明内で使用するためのペプチドは、約１００〜２００，０００の範囲の分子量、より一般的には、約２００〜１００，０００の分子量、そして頻繁に約２００〜５０，０００の範囲内の分子量を有する。
【０１４９】
ペプチドおよびタンパク質類縁体および模倣体
本発明内で使用するための生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の定義内に含まれるのは、天然または合成、療法的または予防的に活性であるペプチド（２以上の共有結合したアミノ酸で構成される）、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質断片、ペプチドまたはタンパク質類縁体、および活性ペプチドまたはタンパク質の化学的に修飾された誘導体または塩である。しばしば、ペプチドまたはタンパク質は、天然存在または天然（例えば野生型、天然存在突然変異体、または対立遺伝子変異体）ペプチドまたはタンパク質配列内のアミノ酸の部分的置換、付加、または欠失によって容易に得られる突然変異タンパク質である。さらに、天然ペプチドまたは天然タンパク質の生物学的活性断片が含まれる。こうした突然変異体誘導体および断片は、実質的に、天然ペプチドまたは天然タンパク質の望ましい生物学的活性を保持する。炭水化物鎖を有するペプチドまたはタンパク質の場合、これらの炭水化物種の改変によって特徴付けられる生物学的活性変異体もまた、本発明内に含まれる。
【０１５０】
さらなる態様において、本発明内で使用するためのペプチドまたはタンパク質は、ポリエチレングリコールなどの合成ポリマー、ヒアルロン酸などの天然ポリマー、または場合による糖（例えばガラクトース、マンノース）、糖鎖、または非ペプチド化合物の付加またはコンジュゲート化によって修飾可能である。こうした修飾によってペプチドまたはタンパク質に付加される物質は、特定の受容体または抗体への結合を指定するかまたは増進し、あるいは粘膜搬送、活性、半減期、細胞もしくは組織特異的標的化、またはペプチドもしくはタンパク質の他の有益な特性を別の方式で増進することも可能である。例えば、こうした修飾は、例えばリン脂質または脂肪酸の付加またはコンジュゲート化によって達成可能であるように、ペプチドまたはタンパク質をより親油性にすることも可能である。本発明の方法および組成物内にさらに含まれるのは、２以上のペプチド、タンパク質断片または機能ドメイン（例えば細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、リガンド結合領域、活性部位ドメイン、免疫原性エピトープ等）の連結（例えば化学的結合）によって調製されるペプチドおよびタンパク質であり、例えば単一のコードされる分子内に、複数の異なるペプチドまたはタンパク質の機能要素を取り込むように組換え的に産生された融合ペプチドおよびタンパク質がある。
【０１５１】
本発明の方法および組成物内で使用するための生物学的活性ペプチドおよびタンパク質には、したがって、天然または「野生型」ペプチドおよびタンパク質、並びにこれらの分子の天然存在変異体、例えば天然存在対立遺伝子変異体および突然変異体タンパク質が含まれる。やはり含まれるのは、合成ペプチド、例えば化学的または組換え的に操作されたペプチドおよびタンパク質とともに、ペプチド「類縁体」およびタンパク質「類縁体」、並びに天然存在ペプチドおよびタンパク質の化学的に修飾された誘導体、断片、コンジュゲート、およびポリマーである。本明細書において、用語、ペプチド「類縁体」またはタンパク質「類縁体」は、選択されるペプチドまたはタンパク質、あるいは選択されるペプチドまたはタンパク質の結合ドメイン、断片、免疫原性エピトープ、または構造モチーフの天然アミノ酸配列に比較した際、１以上のアミノ酸置換、挿入、再編成または欠失を取り込む、修飾ペプチドおよびタンパク質を含むことを意味する。こうして修飾されたペプチド類縁体およびタンパク質類縁体は、対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質のものに匹敵する、実質的に保存された生物学的活性を示し、これは、対応する天然タンパク質または天然ペプチドの活性レベルに比較して、少なくとも５０％、典型的には少なくとも７５％、しばしば８５％〜９５％以上のレベルの活性（例えばＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・タンパク質、あるいはこうしたタンパク質を発現している細胞への特異的結合、特異的リガンドまたは受容体結合活性）を意味する。
【０１５２】
本発明の目的のため、用語、生物学的活性ペプチドまたはタンパク質「類縁体」には、天然ペプチドまたは天然タンパク質の誘導体または合成変異体、例えばアミノ末端および／またはカルボキシル末端欠失および融合とともに、単一または複数のアミノ酸の配列内挿入、置換または欠失がさらに含まれる。挿入アミノ酸配列変異体は、１以上のアミノ酸残基が、タンパク質のあらかじめ決定された部位に導入されるものである。生じた産物を適切にスクリーニングすれば、無作為挿入もまた可能である。欠失変異体は、配列からの１以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。置換アミノ酸変異体は、配列中の少なくとも１つの残基が除去され、そしてその代わりに異なる残基が挿入されるものである。
【０１５３】
天然ペプチドまたは天然タンパク質がアミノ酸置換によって修飾される場合、アミノ酸は一般的に、同様の保存的に関連する化学的特性、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、小側鎖または大側鎖等を有する他のアミノ酸と交換される。したがって、天然ペプチドまたは天然タンパク質配列と同一でない残基位は、同様の化学的特性、例えば電荷または極性を有するアミノ酸と交換され、ここで、こうした変化はペプチド類縁体またはタンパク質類縁体の特性に実質的に影響を及ぼす可能性が低い。これらの改変および他の重要でない改変は、典型的には、生物学的活性（例えば接着分子、あるいは他のリガンドまたは受容体への結合）、免疫同一性（例えば天然ペプチドまたは天然タンパク質を認識する１以上のモノクローナル抗体による認識）、および対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質の他の生物学的特性を含む、修飾ペプチドまたはタンパク質の生物学的特性を実質的に維持するであろう。
【０１５４】
本明細書において、用語「保存的アミノ酸置換」は、同様の側鎖を有するアミノ酸残基の一般的な互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一般的に交換可能な群は、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの非極性（疎水性）残基の互いの置換が含まれる。同様に、本発明は、アルギニンおよびリジン間、グルタミンおよびアスパラギン間、並びにスレオニンおよびセリン間などの極性（親水性）残基の置換を意図する。さらに、リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの塩基性残基の互いの置換、あるいはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの酸性残基の互いの置換もまた意図される。典型的な保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【０１５５】
用語、生物学的活性ペプチド類縁体またはタンパク質類縁体には、２０の慣用的アミノ酸のステレオ異性体（例えばＤ−アミノ酸）、またはα，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸などの非天然アミノ酸を取り込む、天然ペプチドまたは天然タンパク質の修飾型がさらに含まれる。これらの非慣用的アミノ酸または他の非慣用的アミノ酸もまた、本発明内で有用な天然ペプチドおよび天然タンパク質内で置換または挿入可能である。非慣用的アミノ酸の例には：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。さらに、生物学的活性ペプチド類縁体またはタンパク質類縁体には、対象のペプチドまたはタンパク質の構造構成要素として天然または人工的に存在するか、あるいはペプチドまたはタンパク質に結合するかまたは別の方式で関連する、炭水化物、脂質および／またはタンパク質性部分の単一または複数の置換、欠失および／または付加が含まれる。
【０１５６】
本発明内のペプチド類縁体およびタンパク質類縁体の産生および使用を容易にするため、種、属、科または他の分類学的群の異なるメンバー間で保存されるおよび相異するタンパク質構造要素および機能要素を特徴付ける分子系統発生研究を参照することも可能である（例えば異なるヒトＪＡＭ、クローディン、またはオクルディン・タンパク質ファミリーメンバー、対立遺伝子変異体、および／または天然存在突然変異体間、あるいはヒト、ネズミ、ラットおよび／またはウシＪＡＭ−１などの異なる種に見られるＪＡＭ、クローディン、またはオクルディン・タンパク質間）。これに関連して、本明細書に開示するペプチドおよびタンパク質の大部分を修飾するため、細かい分子レベルでの構造−機能関係の詳細な評価を、利用可能な研究が提供して、ＪＡＭなどの膜接着タンパク質の類縁体、並びに本発明内で使用するための本明細書に開示する他の生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の類縁体を含む、機能可能なペプチド類縁体およびタンパク質類縁体の産生および選択を容易にする。これらの研究には、例えば、対象の膜接着ペプチドまたはタンパク質の多数のアイソフォームまたは種または対立遺伝子変異体の間で保存されるおよび相異する構造要素を同定する詳細な比較が含まれる。これらの保存されるおよび相異する構造要素は各々、望ましい構造変化および／または機能変化を与える天然ペプチドおよび天然タンパク質を修飾するのに有用な標的を指摘することによって、本発明の実施を容易にする。
【０１５７】
この背景において、現存する配列並列を解析し、そして慣用的な配列並列法を使用して、解析のための配列比較を得て、例えば種内のタンパク質ファミリーメンバー間、および目的のタンパク質の種変異体間の、対応するタンパク質領域およびアミノ酸位を同定することも可能である。これらの比較は、目的の保存されるおよび相異する構造要素を同定するのに有用であり、後者はしばしば、生物学的活性ペプチドまたはタンパク質において、機能する類縁体を生じる取り込みに有用であろう。典型的には、異なる参照ペプチド配列において、相異する目的の構造要素を特徴付ける１以上のアミノ酸残基が、機能するペプチド類縁体またはタンパク質類縁体内に取り込まれる。例えば、天然ＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・ペプチドまたはタンパク質をコードするｃＤＮＡを、１以上の対応するアミノ酸位（単数または複数）（すなわち、対象のＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・ペプチドまたはタンパク質のアイソフォーム、種変異体もしくは対立遺伝子変異体、または合成突然変異体などの、異種参照ペプチドまたは異種参照タンパク質配列における、目的の構造要素を特徴付ける残基に、許容される並列法にしたがって類似である、並列配列要素にマッチするかまたは該要素に渡る、対応する位）で、天然ペプチドまたは天然タンパク質中の対応する残基（単数または複数）を改変するアミノ酸欠失、置換、または挿入をコードするように組換え的に修飾して、参照ペプチドまたは参照タンパク質と類似の構造要素および／または機能要素を有する、本発明内の機能可能なペプチド類縁体またはタンパク質類縁体を生じることも可能である。
【０１５８】
生物学的活性ペプチド類縁体およびタンパク質類縁体を構築するためのこの合理的設計法内で、異種参照ペプチドまたは異種参照タンパク質における目的の構造要素に対応するアミノ酸位で、残基（単数または複数）の天然または野生型同一性を、参照ペプチドまたは参照タンパク質における対応するアミノ酸残基（単数または複数）と同一の同一性、または保存的に関連する残基同一性に改変することも可能である。しかし、しばしば、対応する参照タンパク質残基（単数または複数）に関して、天然アミノ酸残基を非保存的に改変することが可能である。特に、多くの非保存的アミノ酸置換、特に、修飾をより受け入れやすいことが示唆される相異する部位での置換は、穏やかな機能障害または中性的な影響を生じうるし、あるいは天然ペプチドまたは天然タンパク質の機能に比較して、選択される生物学的活性を増進することさえありうる。
【０１５９】
有用なペプチド類縁体およびタンパク質類縁体および模倣体を予測する配列並列および比較は、当該技術分野に知られるコンピュータ・モデリング法と組み合わせて、天然生物学的活性タンパク質およびペプチドの結晶構造の解析（例えばＬｏｅｂｅｒｍａｎｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ． １７７：５３１−５５６，  １９８４；Ｈｕｂｅｒら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：８９５１−８９６６，  １９８９；Ｓｔｅｉｎら，  Ｎａｔｕｒｅ ３４７：９９−１０２，  １９９０；Ｗｅｉら，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ １：２５１−２５５，  １９９４を参照されたい）によってさらに精錬されるであろう。これらの解析によって、本発明の方法および組成物内で使用するための天然ペプチドまたは天然タンパク質のものに匹敵する、実質的な活性を示すであろうペプチドおよびタンパク質類縁体および模倣体に取り込むのに望ましい構造要素および修飾を同定する、詳細な構造−機能マッピングが可能になる。
【０１６０】
本発明の生物学的活性ペプチド類縁体およびタンパク質類縁体は、典型的には対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質配列に実質的な配列同一性を示す。用語「実質的な配列同一性」は、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなどで、デフォルトギャップペナルティを用いて、最適に並列させた際、２つの対象アミノ酸配列が、少なくとも６５パーセントの配列同一性、一般的に８０パーセントの配列同一性、しばしば少なくとも９０〜９５パーセント以上の配列同一性を共有することを意味する。「アミノ酸同一性パーセント」は、最適に並列させた際、ほぼ指定されたパーセントの同一アミノ酸を有する２つのペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の比較を指す。配列比較は、一般的に、少なくとも１０残基位の比較ウィンドウに渡って、しばしば少なくとも１５〜２０アミノ酸のウィンドウに渡って、参照配列に対して行われ、配列同一性パーセントは、参照配列を第二の配列に比較することによって計算され、後者は、例えば比較ウィンドウに渡って、全体で参照配列の２０パーセント、典型的には５〜１０％未満の１以上の欠失、置換または付加を含むペプチド類縁体配列に相当しうる。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えばＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・タンパク質のセグメントであることも可能である。比較ウィンドウを並列させるための、配列の最適並列（例えばヒトＪＡＭ−１とヒトＪＡＭ−２および／またはＪＡＭ−３、または別の哺乳動物ＪＡＭタンパク質の並列）は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ． ２：４８２，  １９８１）の局所相同性アルゴリズムにしたがって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ． ４８：４４３，  １９７０）の相同性並列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８５：２４４４，  １９８８）の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムのコンピュータ化遂行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、および／またはＴＦＡＳＴＡ、例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩに提供されるようなもの）によって、実行可能である。
【０１６１】
ペプチド類縁体またはタンパク質類縁体を、対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質と並列させることによって、そして適切なアッセイ、例えば接着タンパク質または受容体結合アッセイを用いて、選択される生物学的活性を測定することによって、本発明の方法および組成物内で使用するための機能可能なペプチド類縁体およびタンパク質類縁体を容易に同定可能である。機能可能なペプチド類縁体およびタンパク質類縁体は、典型的には、対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質に対して作成した抗体と特異的に免疫反応性である。同様に、機能可能なペプチド類縁体およびタンパク質類縁体をコードする核酸は、対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質をコードする核酸に、上述のような実質的な配列同一性を共有し、そして典型的には、対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質、あるいはその断片をコードする部分的または完全核酸配列に、許容される穏やかなストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  ２００１を参照されたい）下で、選択的にハイブリダイズするであろう。句、「選択的にハイブリダイズする」は、例えば標的配列が総細胞ＤＮＡまたはＲＮＡなどの異種調製中に存在する場合、特定の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に優先的にハイブリダイズするか、二重鎖形成するかまたは結合する核酸プローブ間の選択的相互作用を指す。一般的に、生物学的活性ペプチド類縁体およびタンパク質類縁体をコードする核酸配列、またはその断片は、ストリンジェントな条件下（例えば対象配列に対して定義されるイオン強度およびｐＨの熱融点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される、ここでＴｍは、定義されるイオン強度およびｐＨで、５０％の相補配列または標的配列が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度である）で、対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質をコードする核酸配列にハイブリダイズするであろう。核酸プローブ設計およびアニーリング条件の考察に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第３版，  Ｖｏｌ．１−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ２００１またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ニューヨーク，  １９８７を参照されたい。典型的には、ストリンジェントな条件または選択的条件は、塩濃度が、ｐＨ７で少なくとも約０．０２モルであり、そして温度が少なくとも６０℃であるものであろう。よりストリンジェントでない選択的ハイブリダイゼーション条件もまた、選択可能である。他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに有意に影響を及ぼすことも可能であり、これらには、とりわけ、塩基組成および相補鎖のサイズ、有��溶媒の存在および塩基ミスマッチの度合いが含まれ、パラメーターの組み合わせが、いかなる１つの特定の測定値よりも重要である。
【０１６２】
本発明のさらなる側面内で、選択される天然ペプチドまたは天然タンパク質機能ドメイン（例えば結合モチーフまたは活性部位）の三次元結合構造および活性を模倣するペプチドまたは非ペプチド分子を含んでなる、ペプチド模倣体を提供する。これらのペプチド模倣体には、組換え的または化学的に修飾されたペプチドとともに、以下にさらに詳細に記載するように小分子薬剤模倣体などの非ペプチド剤が含まれる。
【０１６３】
１つの側面において、２０の遺伝的にコードされるアミノ酸（またはＤアミノ酸）の１以上の天然存在側鎖を、他の側鎖、例えばアルキル、低次アルキル、環状４員、５員、６員、または７員アルキル、アミド、アミド低次アルキル、アミドジ（低次アルキル）、低次アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、および低次のそのエステル誘導体などの基、および４員、５員、６員、または７員複素環と交換することによって、本発明内で有用なペプチド（ポリペプチドを含む）を修飾して、ペプチド模倣体を産生する。例えば、プロリン類縁体を作成可能であり、ここで、プロリン残基の環サイズは、５員から４員、６員、または７員に変化する。環状基は飽和または不飽和であることも可能であり、そして不飽和の場合、芳香族または非芳香族であることも可能である。複素環基は、１以上の窒素、酸素、および／またはイオウ・ヘテロ原子を含有可能である。こうした基の例には、フラザニル、フリル、イミダゾリジニル、イミダゾリル、イミダゾリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、モルホリニル（例えばモルホリノ）、オキサゾリル、ピペラジニル（例えば１−ピペラジニル）、ピペリジル（例えば１−ピペリジル、ピペリジノ）、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル（例えば１−ピロリジニル）、ピロリニル、ピロリル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、チオモルホリニル（例えばチオモルホリノ）、およびトリアゾリルが含まれる。これらの複素環基は、置換または未置換であることも可能である。基が置換される場合、置換基は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、酸素、あるいは置換または未置換フェニルであることも可能である。
【０１６４】
ペプチドおよびタンパク質とともに、ペプチドおよびタンパク質類縁体および模倣体はまた、米国特許第４，６４０，８３５号；米国特許第４，４９６，６８９号；米国特許第４，３０１，１４４号；米国特許第４，６７０，４１７号；米国特許第４，７９１，１９２号；または米国特許第４，１７９，３３７号に示される方式で、１以上の多様な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルケン類に共有結合可能である。
【０１６５】
本発明内の他のペプチドおよびタンパク質類縁体および模倣体には、グリコシル化変異体、および他の化学部分との共有コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートが含まれる。共有誘導体は、当該技術分野に周知の手段によって、アミノ酸側鎖に見られる基に、あるいはＮ末端またはＣ末端で、官能性を連結することによって、調製可能である。これらの誘導体には、限定されるわけではないが、カルボキシ末端の、またはカルボキシ側鎖を含有する残基の脂肪族エステルまたはアミド、ヒドロキシル基含有残基のＯ−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基、例えばリジンもしくはアルギニンのＮ−アシル誘導体が含まれる。アシル基は、Ｃ３〜Ｃ１８の通常のアルキルを含む、アルキル部分の基から選択され、それによってアルカノイル・アロイル種が形成される。キャリアータンパク質、例えば免疫原性部分への共有結合もまた、使用可能である。
【０１６６】
これらの修飾に加えて、合成およびプロセシング中、またはさらなるプロセシング工程において、例えばペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質のグリコシル化改変を実行可能である。これを達成するのに特に好ましい手段は、こうしたプロセシングを通常提供する細胞由来のグリコシル化酵素、例えば哺乳動物グリコシル化酵素に、ペプチドを曝露することによるものである。脱グリコシル化酵素もまた、本発明内の有用な修飾ペプチドおよびタンパク質を生じるのに使用可能である。やはり含まれるのは、リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを含む、他の重要でない修飾、あるいはリボシル基または架橋剤を含む他の部分を有する天然一次アミノ酸配列の型である。
【０１６７】
ペプチド模倣体はまた、リン酸化、スルホン化、ビオチン化、あるいは他の部分、特にリン酸基と類似の分子形状を有するものの付加または除去によって、化学的に修飾されているアミノ酸残基も有しうる。いくつかの態様において、修飾は、有用な標識試薬であるか、または精製標的、例えばアフィニティー・リガンドとして働くであろう。
【０１６８】
本発明内のペプチド模倣体の主なグループは、天然ペプチドまたは天然タンパク質、またはその断片と、他のタンパク質またはペプチドとの共有コンジュゲートを含んでなる。これらの誘導体を、Ｎ末端融合体またはＣ末端融合体のように、組換え培養中で合成するか、あるいは、反応性側鎖を通じてタンパク質を架橋する際のその有用性が当該技術分野で知られる剤の使用によって、合成することも可能である。架橋剤による標的化に好ましいペプチドおよびタンパク質誘導体化部位は、遊離アミノ基、炭水化物部分、およびシステイン残基である。
【０１６９】
生物学的活性ペプチドまたはタンパク質、および他の相同または異種ペプチドおよびタンパク質間の融合ポリペプチドもまた提供する。多くの増殖因子およびサイトカインは、ホモ二量体実体であり、そしてこれらの分子またはその活性断片の反復構築物は、タンパク質分解的分解に対する感受性の減少を含む、多様な利点を生じるであろう。ＪＡＭ、オクルディン、およびクローディンを含む膜接着タンパク質の反復構築物および他の融合構築物は、本発明の方法および組成物内で同様の利点を生じる。したがって、本発明内で有用なペプチドおよびタンパク質を含んでなる、多様な代替多量体構築物を提供する。特定の態様において、例えば１以上の本発明の生物学的活性ペプチドまたはタンパク質を、異種多量体化ポリペプチドまたはタンパク質、例えば免疫グロブリン重鎖定常部、または免疫グロブリン軽鎖定常部と連結することによって、米国特許第６，０１８，０２６号、第５，８４３，７２５号、第６，２９１，６４６号、第６，３００，０９９号、および第６，３２３，３２３号に記載されるように、生物学的活性ポリペプチド融合体を提供する。こうして構築される生物学的活性多量体化ポリペプチド融合体は、１以上のＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・タンパク質またはペプチド要素（単数または複数）を含んでなるヘテロ多量体またはホモ多量体、例えばヘテロ二量体またはホモ二量体であることも可能であり、各々、本発明内で機能可能な１以上の別個の生物学的活性ペプチドまたはタンパク質を含んでなることも可能である。他の異種ポリペプチドを活性ペプチドまたはタンパク質と組み合わせて、誘導体タンパク質の特性または活性の組み合わせを示す融合体を生じることも可能である。他の典型的な例は、融合ペプチドまたはタンパク質の位置決定を容易にする、レポーター・ポリペプチド、例えばＣＡＴまたはルシフェラーゼと、本明細書記載のペプチドまたはタンパク質の融合体である（例えばＤｕｌｌら、米国特許第４，８５９，６０９号を参照されたい）。この背景において有用な他の融合パートナーには、細菌ベータ−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、ベータ−ラクタマーゼ、アルファ・アミラーゼ、アルコール・デヒドロゲナーゼ、および酵母アルファ接合因子（例えばＧｏｄｏｗｓｋｉら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：８１２−８１６，  １９８８を参照されたい）が含まれる。
【０１７０】
本発明はまた、化学部分との共有結合または凝集結合によって修飾された、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチドおよびタンパク質を含む、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の使用も意図する。これらの誘導体は、一般的に３つの種類に属する：（１）塩、（２）側鎖および末端残基共有修飾、および（３）吸着複合体、例えば細胞膜との吸着複合体。こうした共有誘導体または凝集誘導体は多様な目的に有用であり、例えば、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・タンパク質間のホモ型結合または異型結合の遮断のため、免疫原として、イムノアッセイの試薬として、あるいはリガンドまたは他の結合リガンドのアフィニティー精製などの精製法において、有用である。例えば、当該技術分野に周知の方法によって、活性ペプチドまたはタンパク質を、共有結合により、臭化シアン活性化セファロースなどの固体支持体に固定するか、あるいは活性ペプチドまたはタンパク質に特異的に結合する抗体のアッセイまたは精製に使用するため、グルタルアルデヒド架橋を伴いまたは伴わず、ポリオレフィン表面上に吸着させることも可能である。活性ペプチドまたはタンパク質を検出可能基で標識することも可能であり、標識ペプチドまたはタンパク質の鼻内投与を伴うアッセイを含む、診断アッセイで使用するため、例えばクロラミンＴ法で放射性ヨウ素標識するか、希土類キレートに共有結合させるか、または別の蛍光部分にコンジュゲート化させることも可能である。
【０１７１】
当業者は、対応する天然ペプチドまたは天然タンパク質と同一のまたは類似の望ましい生物学的活性を持つが、天然ペプチドまたは天然タンパク質よりもより好ましい活性、例えば可溶性、安定性、および／または加水分解またはタンパク質分解感受性の改善された特性を持つペプチド模倣体およびタンパク質模倣体を構築するため、多様な技術が利用可能であることを認識する（例えばＭｏｒｇａｎおよびＧａｉｎｏｒ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ． ２４：２４３−２５２，  １９８９を参照されたい）。特定のペプチド模倣体化合物は、本発明内で使用するため、本明細書に記載するタンパク質およびペプチドのアミノ酸配列に基づき、こうしたアミノ酸配列には、ＪＡＭ、オクルディン、およびクローディン・タンパク質およびペプチドの配列が含まれる。典型的には、ペプチド模倣体化合物は、例えば、選択されるペプチドまたはタンパク質の一次、二次、および／または三次構造特性、および／または電気化学特性、あるいはその構造ドメイン、活性部位、または結合領域（例えばホモ型または異型結合部位、触媒活性部位またはドメイン、受容体またはリガンド結合接触面またはドメインなど）を模倣する、（模倣化合物の少なくとも一部の）三次元構造を有する合成化合物である。ペプチド模倣体構造または部分構造（ペプチド模倣体化合物のペプチド模倣「モチーフ」とも称する）は、天然ペプチドまたは天然タンパク質と望ましい生物学的活性を共有し、例えば１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・タンパク質間のホモ型または異型結合を遮断する活性、受容体結合活性および／または活性化活性、免疫原活性（１つまたは多数のハプロタイプのＭＨＣ分子に結合し、そしてＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋  Ｔを活性化するなど）を共有するであろう。典型的には、模倣化合物の対象の生物学的活性は、模倣体がモデルとした天然ペプチドの活性と比較して、実質的に減少せず、そしてしばしば、これと同程度であるかまたはこれより高い。さらに、ペプチド模倣体化合物は、増加した細胞浸透性、より高い親和性および／またはアビディティー、および延長された生物学的半減期など、療法適用を増進する、他の望ましい特性もまた、有しうる。本発明のペプチド模倣体は、ときに、部分的にまたは完全に非ペプチドである「主鎖」を有するが、この場合、ペプチド模倣体がモデルとしたペプチドまたはタンパク質に存在するアミノ酸残基の側鎖と同一の側鎖を有するであろう。いくつかの種類の化学結合、例えばエステル、チオエステル、チオアミド、レトロアミド、還元カルボニル、ジメチレンおよびケトメチレン結合が、プロテアーゼ耐性ペプチド模倣体の構築において、ペプチド結合の一般的に有用な置換物であることが知られる。
【０１７２】
以下は、Ｎ末端アミノ基、Ｃ末端カルボキシル基で修飾され、そして／またはペプチドの１以上のアミド結合を非アミド結合に変化させたペプチド模倣体およびタンパク質模倣体を調製する方法を記載する。１つのペプチドまたはタンパク質模倣構造中で、２以上のこうした修飾をカップリング可能であることが理解される（例えばＣ末端カルボキシル基での修飾およびペプチド中の２アミノ酸間の−−ＣＨ２−−カルバメート連結の包含）。Ｎ末端修飾に関しては、ペプチドは、典型的には、遊離酸として合成されるが、上述のように、アミドまたはエステルとして容易に調製可能である。ペプチド化合物のアミノ末端および／またはカルボキシ末端を修飾して、本発明内で有用な他の化合物を産生することもまた、可能である。アミノ末端修飾には、メチル化（すなわち−−ＮＨＣＨ３または−−ＮＨ（ＣＨ３）２）、アセチル化、カルボベンゾイル基の付加、またはＲＣＯＯ−−（式中、Ｒはナフチル、アクリジニル、ステロイジル、および類似の基からなる群より選択される）に定義される、カルボキシレート官能性を含有する遮断基いずれかでのアミノ末端の遮断が含まれる。カルボキシ末端修飾には、カルボキサミド基での遊離酸の置換、または構造的束縛を導入する、カルボキシ末端での環状ラクタムの形成が含まれる。アミノ末端修飾は、上に列挙されるとおりであり、そしてアルキル化、アセチル化、カルボベンゾイル基の付加、スクシニミド基の形成などが含まれる。Ｎ末端アミノ基をその後、以下のように反応させることも可能である：
（ａ）酸ハロゲン化物［例えばＲＣ（Ｏ）Ｃｌ］または酸無水物と反応させることによって、式ＲＣ（Ｏ）ＮＨ−−（式中、Ｒは上述のように定義される）のアミド基を形成する。典型的には、反応中に生成される酸を除去するため、好ましくはジイソプロピルエチルアミンなどの第三アミンを過剰に（例えば約１０等量）含有する不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中でほぼ等モルまたは過剰量（例えば約５等量）の酸ハロゲン化物を、ペプチドに接触させることによって、反応を行うことも可能である。反応条件は、ほかの点では慣用的である（例えば室温３０分間）。末端アミノをアルキル化して、低次アルキルＮ置換を提供し、その後、上述のように酸ハロゲン化物と反応させると、式ＲＣ（Ｏ）ＮＲ−−のＮ−アルキルアミド基が提供されるであろう；
（ｂ）無水コハク酸と反応させることによって、スクシニミド基を形成する。先のように、ほぼ等モル量のまたは過剰な（例えば約５等量）無水コハク酸が使用可能であり、そして適切な不活性溶媒（例えばジクロロメタン）中のジイソプロピルエチルアミンなどの第三アミンを過剰に（例えば１０等量）使用することを含む、当該技術分野に周知の方法によって、アミノ基をスクシニミドに変換する（例えばＷｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、米国特許第４，６１２，１３２号を参照されたい）。コハク酸基を例えばＣ２〜Ｃ６アルキルまたは−−ＳＲ置換基で置換可能であることが理解され、これらは慣用的な方式で調製され、ペプチドのＮ末端で置換スクシニミドを提供する。こうしたアルキル置換基はＷａｌｌｅｎｂｅｒｇら（米国特許第４，６１２，１３２号）に記載される方式で、無水マレイン酸と低次のオレフィン（Ｃ２〜Ｃ６）を反応させることによって調製され、そして−−ＳＲ置換基は、無水マレイン酸とＲＳＨ（式中、Ｒは上に定義するとおりである）を反応させることによって調製される；
（ｃ）反応中に生成される酸を除去するため、好ましくは、第三アミンを含有する適切な不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中で、ほぼ等量のまたは過剰なＣＢＺ−Ｃｌ（すなわち塩化ベンジルオキシカルボニル）または置換ＣＢＺ−Ｃｌと反応させることによって、ベンジルオキシカルボニル−−ＮＨ−−基または置換ベンジルオキシカルボニル−−ＮＨ−−基を形成する；
（ｄ）適切な不活性希釈剤（ジクロロメタン）中で、等量のまたは過剰な（例えば５等量）Ｒ−Ｓ（Ｏ）２Ｃｌ（式中、Ｒは上に定義するとおりである）と反応させて、末端アミンをスルホンアミドに変換することによって、スルホンアミド基を形成する。好ましくは、不活性希釈剤は、反応中に生成される酸を除去するため、ジイソプロピルエチルアミンなどの第三アミンを過剰に（例えば約１０等量）含有する。反応条件は、ほかの点では慣用的である（例えば室温３０分間）。
【０１７３】
（ｅ）適切な不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中で、等量のまたは過剰な（例えば５等量）Ｒ−ＯＣ（Ｏ）ＣｌまたはＲ−ＯＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｈ４−ｐ−ＮＯ２（式中、Ｒは上に定義するとおりである）と反応させて、末端アミンをカルバメートに変換することによって、カルバメート基を形成する。好ましくは、不活性希釈剤は、反応中に生成されるいかなる酸も除去するため、ジイソプロピルエチルアミンなどの第三アミンを過剰に（例えば約１０等量）含有する。反応条件は、ほかの点では慣用的である（例えば室温３０分間）。
【０１７４】
（ｆ）適切な不活性希釈剤（例えばジクロロメタン）中で、等量のまたは過剰な（例えば５等量）Ｒ−−Ｎ＝Ｃ＝Ｏと反応させて、末端アミンを尿素基（すなわちＲＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−−）に変換することによって、尿素基を形成する（式中、Ｒは上に定義するとおりである）。好ましくは、不活性希釈剤は、ジイソプロピルエチルアミンなどの第三アミンを過剰に（例えば約１０等量）含有する。反応条件は、ほかの点では慣用的である（例えば室温約３０分間）。
【０１７５】
Ｃ末端カルボキシル基がエステル（すなわち−−Ｃ（Ｏ）ＯＲ（式中、Ｒは上に定義するとおりである））に置換されるペプチド模倣体を調製する際、典型的には、ペプチド酸を調製するのに用いるような樹脂を使用し、そして塩基および適切なアルコール、例えばメタノールで側鎖保護ペプチドを切断する。その後、フッ化水素で処理することによって、通常の様式で側鎖保護基を取り除き、望ましいエステルを得る。
【０１７６】
Ｃ末端カルボキシル基がアミド−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４に置換されているペプチド模倣体を調製する際、ペプチド合成の固体支持体として、ベンズヒドリルアミン樹脂を用いる。合成が完了したら、フッ化水素で処理して支持体からペプチドを遊離させ、直接、遊離ペプチドアミド（すなわちＣ末端は−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２である）を生じる。あるいは、支持体から側鎖保護ペプチドを切断するアンモニアとの反応とカップリングさせた、ペプチド合成中に、クロロメチル化樹脂を使用して、遊離ペプチドアミドを生じ、そしてアルキルアミンまたはジアルキルアミンと反応させて、側鎖保護アルキルアミドまたはジアルキルアミド（すなわちＣ末端が−−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ１である（式中、ＲおよびＲ１は上に定義されるとおりである））を生じる。その後、フッ化水素で処理する通常の様式で側鎖保護を取り除き、遊離アミド、アルキルアミド、またはジアルキルアミドを生じる。
【０１７７】
本発明の別の態様において、カルボキシル基またはエステルの、それぞれ−−ＯＨまたはエステル（−−ＯＲ）をＮ末端アミノ基で内部置換することによって、生物学的活性ペプチドのＣ末端カルボキシル基またはＣ末端エステルが環状化するように誘導して、環状ペプチドを形成することも可能である。例えば、合成および切断してペプチド酸を生じた後、溶液中、例えば塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合物中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などの適切なカルボキシル基活性化剤によって、遊離酸を活性化エステルに変換する。その後、活性化エステルをＮ末端アミンで内部置換することによって、環状ペプチドを形成する。重合と対照的に、内部環状化は、非常に薄い溶液の使用によって増進可能である。こうした方法が当該技術分野に周知である。
【０１７８】
本発明内で使用するため、活性ペプチドを環状化するか、あるいはデスアミノまたはデスカルボキシ残基をペプチド末端で取り込んで、末端アミノ基またはカルボキシル基をなくし、プロテアーゼに対する感受性を減少させるか、またはペプチドのコンホメーションを制限することも可能である。本発明のペプチド類縁体およびペプチド模倣体中のＣ末端官能基には、アミド、アミド低次アルキル、アミドジ（低次アルキル）、低次アルコキシ、ヒドロキシ、およびカルボキシ、並びに低次のそのエステル誘導体、並びにその薬学的に許容しうる塩が含まれる。
【０１７９】
本発明の方法および組成物内で使用するためのペプチドおよびタンパク質誘導体および模倣体を作成する他の方法がＨｒｕｂｙら（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ． ２６８（２）：２４９−２６２，  １９９０）に記載される。これらの方法にしたがって、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質は、天然ペプチドまたは天然タンパク質と類似の生物学的活性を有する非ペプチド模倣体化合物の構造モデルとして働く。当業者は、リード・ペプチドまたはタンパク質化合物と同一のまたは類似の望ましい生物学的活性を持つ化合物、あるいは可溶性、安定性、並びに加水分解およびタンパク質分解に対する感受性などの望ましい特性に関して、リードより好ましい活性を有する化合物を構築するのに、多様な技術が利用可能であることを認識する（例えばＭｏｒｇａｎおよびＧａｉｎｏｒ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｐ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ． ２４：２４３−２５２，  １９８９を参照されたい）。これらの技術には、例えば、ホスホネート、アミデート、カルバメート、スルホンアミド、二級アミン、および／またはＮ−メチルアミノ酸で構成される主鎖で、ペプチド主鎖を置換することが含まれる。
【０１８０】
例えば、慣用的なペプチド合成中、合成中の適切な時点で、単にアミノ酸試薬の代わりに適切に保護されたアミノ酸類縁体を使用することによって、１以上のペプチジル連結［−−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−−］が、−−ＣＨ２カルバメート連結、ホスホネート連結、−−ＣＨ２スルホンアミド連結、尿素連結、二級アミン（−−ＣＨ２ＮＨ−−）連結、およびアルキル化ペプチジル連結［−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−−（式中、Ｒ６は低次アルキルである）］などの連結で置換されている、ペプチド模倣体およびタンパク質模倣体を調製する。適切な試薬には、例えば、アミノ酸のカルボキシル基が上記連結の１つを形成するのに適した部分で置換されている、アミノ酸類縁体が含まれる。例えば、ペプチド中の−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−−連結を−−ＣＨ２−−カルバメート連結（−−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−−）と交換し、その後、適切に保護されたアミノ酸のカルボキシル（−−ＣＯＯＨ）基を−−ＣＨ２ＯＨ−−基にまず還元し、これをその後、慣用的な方法によって−−ＯＣ（Ｏ）Ｃｌ官能性またはパラニトロカルボネート−−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−Ｃ６Ｈ４−ｐ−ＮＯ２官能性に変換する。固体支持体上に見られる部分的に組み立てられたペプチドのＮ末端上で、こうした官能基のいずれかを遊離アミンまたはアルキル化アミンと反応させると、−−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−−連結が形成される。こうした−−ＣＨ２−−カルバメート連結形成のより詳細な説明に関しては、例えばＣｈｏら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３−１３０５，  １９９３）を参照されたい。
【０１８１】
活性ペプチド中のアミド連結の−−ＣＨ２スルホンアミド連結での置換は、適切に保護されたアミノ酸のカルボキシル（−−ＣＯＯＨ）基を−−ＣＨ２ＯＨ基に還元することによって達成可能であり、そしてその後、慣用的な方法によって、ヒドロキシル基をトシル基などの適切な脱離基に変換する。例えばチオ酢酸と誘導体の反応後、加水分解し、そして酸化性塩素化することによって、−−ＣＨ２−−Ｓ（Ｏ）２Ｃｌ官能基が提供され、これはそのほかの点では適切に保護されているアミノ酸のカルボキシル基を置換する。ペプチド合成において、この適切に保護されたアミノ酸類縁体を使用すると、ペプチド中のアミド連結を置換する−−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−−連結が含まれ、それによってペプチド模倣体が提供される。アミノ酸のカルボキシル基の−−ＣＨ２Ｓ（Ｏ）２Ｃｌ基への変換に対する、より完全な説明に関しては、例えばＷｅｉｎｓｔｅｉｎおよびＢｏｒｉｓ（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｖｏｌ．７，  ｐｐ．２６７−３５７，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  ニューヨーク，  １９８３）を参照されたい。活性ペプチド中のアミド連結の尿素連結への置換は、例えば、米国特許出願第０８／１４７，８０５号に示される方式で達成可能である。
【０１８２】
例えば、アミド連結のカルボニル結合が慣用的な方法によってＣＨ２基に還元されている、適切に保護されたジペプチド類縁体を使用することによって、ペプチド中のアミド連結が−−ＣＨ２ＮＨ−−連結で置換されている二級アミン連結が調製可能である。例えば、ジグリシンの場合、アミドのアミンへの還元は、脱保護後に、Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２  ＣＯＯＨを生じ、これはその後、次のカップリング反応において、Ｎ脱保護型で用いられる。ジペプチド中のアミド連結のカルボニル基の還元による、こうした類縁体の調製が、当該技術分野に周知である。
【０１８３】
本発明の生物学的活性ペプチドおよびタンパク質剤は、対象ペプチドまたはタンパク質に存在しうるシステイン残基（単数または複数）のチオール基で形成されるジスルフィド結合がない単量体型で存在しうる。あるいは、２以上のペプチドまたはタンパク質上のシステインのチオール基間の分子間ジスルフィド結合を産生して、多量体（例えば二量体、四量体、またはより高次のオリゴマー）化合物を得ることも可能である。システインまたはホモシステイン残基のイオウによって脱離基を置換することを介して、特定のこうしたペプチドおよびタンパク質を環状化するか、または二量体化することも可能である（例えばＢａｒｋｅｒら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ． ３５：２０４０−２０４８，  １９９２；およびＯｒら，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ． ５６：３１４６−３１４９，  １９９１を参照されたい）。したがって、１以上の天然システイン残基をホモシステインで置換することも可能である。活性ペプチドおよびタンパク質の分子内または分子間ジスルフィド誘導体は、イオウの１つがＣＨ２基またはイオウの他のアイソスターで置換されている類縁体を提供する。これらの類縁体は、当該技術分野に知られる方法を用いて、分子内または分子間置換を介して作成可能である。
【０１８４】
本発明内で有用な剤と同定された、すべての天然存在、組換え、および合成ペプチドおよびタンパク質、並びにペプチドおよびタンパク質類縁体および模倣体を、スクリーニングに（例えばキットおよび／またはスクリーニングアッセイ法において）使用して、上皮浸透性を増進させる膜接着タンパク質間のホモ型結合または異型結合の阻害剤としてを含む、本発明の方法および組成物内で機能するであろう他のペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体を含む、さらなる化合物を同定可能である。短時間で数万の化合物をスクリーニングすることを可能にするため、近年、自動化アッセイのいくつかの方法が開発されてきている（例えばＦｏｄｏｒら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３，  １９９１、およびＦｏｄｏｒらに対して発行された米国特許第５，６７７，１９５号；第５，８８５，８３７号；第５，９０２，７２３号；第６，０２７，８８０号；第６，０４０，１９３号；および第６，１２４，１０２号を参照されたい）。例えばＷＯ  ９５／１２６０８、ＷＯ  ９３／０６１２１、ＷＯ  ９４／０８０５１、ＷＯ  ９５／３５５０３、およびＷＯ  ９５／３０６４２に記載されるコード合成ライブラリー（ＥＳＬ）によって、化合物の大きなコンビナトリアル・ライブラリーを構築することも可能である。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレー法によっても生成可能である（例えばＤｅｖｌｉｎ、ＷＯ  ９１／１８９８０を参照されたい）。
【０１８５】
本発明内で使用するための新規生物学的活性剤（例えば小分子薬剤ペプチド模倣体）をスクリーニングする１つの方法は、活性ペプチドまたはタンパク質、例えばＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・ペプチドまたはタンパク質を発現する組換えＤＮＡ分子で安定に形質転換されている真核または原核宿主細胞を利用する。こうした細胞は、生存型または固定型で、標準的アッセイ、例えばリガンド／受容体結合アッセイ（例えば、Ｐａｒｃｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：２４３−２４７，  １９８９；およびＯｗｉｃｋｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８７：４００７−４０１１，  １９９０を参照されたい）に使用可能である。競合アッセイ、例えばペプチドリガンドに、既知の結合親和性を有する標識受容体または抗体、および結合親和性を測定しようとする試験化合物または試料と細胞を接触させ、そしてインキュベーションする、競合アッセイが特に有用である。その後、結合したおよび未結合の標識結合構成要素を分離して、リガンド結合の度合いを評価する。結合した試験化合物の量は、既知の供給源への標識受容体結合の量に反比例する。多くの技術のいずれか１つを用いて、未結合リガンドから結合リガンドを分離して、リガンド結合の度合いを評価することも可能である。この分離工程は、フィルターへの接着後に洗浄するか、プラスチックへの接着後に洗浄するか、または細胞膜を遠心分離するなどの慣用法を伴いうる。
【０１８６】
本発明内の薬剤スクリーニングの別の技術は、標的分子、例えばＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・タンパク質に適切な結合親和性を有する化合物に関するハイスループット・スクリーニングを提供するアプローチを伴い、そしてこうしたアプローチは、Ｇｅｙｓｅｎ、欧州特許出願８４／０３５６４、１９８４年９月１３日公開に詳細に記載される。まず、多数の異なる試験化合物、例えば小ペプチドを、固体支持体上、例えばプラスチックピンまたはいくつかの他の適切な表面で合成する（例えばＦｏｄｏｒら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３，  １９９１、およびＦｏｄｏｒらに対して発行された米国特許第５，６７７，１９５号；第５，８８５，８３７号；第５，９０２，７２３号；第６，０２７，８８０号；第６，０４０，１９３号；および第６，１２４，１０２号を参照されたい）。その後、すべてのピンを本発明の可溶化ペプチド剤と反応させ、そして洗浄する。次の工程は、結合したペプチドの検出を伴う。
【０１８７】
合理的薬剤設計はまた、本発明の方法内で作用すると決定された、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の分子形状の構造的研究に基づくことも可能である。ペプチドおよびタンパク質の構造的特徴を性質決定し、マッピングし、翻訳し、そして再生して、新規ペプチド模倣体の産生および選択の指針とするための多様な方法が利用可能であり、そして当該技術分野に周知であり、これには例えばｘ線結晶解析および二次元ＮＭＲ技術が含まれる。これらの方法および他の方法は、例えば、選択されるペプチドまたはタンパク質に存在するどのアミノ酸残基が、特異性および活性に必要な分子接触領域を形成するかを理路整然と予測することを可能にするであろう（例えばＢｌｕｎｄｅｌｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９７６を参照されたい）。
【０１８８】
ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤の機能可能な類縁体および模倣体は、天然ペプチド、タンパク質または未修飾化合物に比較して、部分的活性、完全な活性、または増進された活性を保持する。例えば、ＪＡＭの類縁体または模倣体は、対応する天然または野生型ＪＡＭタンパク質またはペプチドが示すホモ型結合または異型結合に関して、部分的活性または完全な活性を示すであろう。これに関連して、本発明内で使用するための機能可能な類縁体および模倣体は、選択される天然ペプチドまたは天然タンパク質、あるいは未修飾化合物に対して観察される同じ活性と比較した際、１以上の選択される活性を、少なくとも５０％、しばしば７５％、そして９５〜１００％またはそれより高いレベルで保持するであろう。例えばＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン類縁体または模倣体が、対応する天然タンパク質のホモ型結合または異型結合を遮断する能力、および／またはｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで粘膜上皮細胞の浸透性を増加させる能力を測定することによって、改変されたペプチドまたは非ペプチド模倣体のこれらの生物学的特性を測定可能である。
【０１８９】
本明細書の説明にしたがって、本発明の化合物は、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・タンパク質の性質および機能を解析するユニークなツールとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで有用であり、そしてしたがって、粘膜上皮浸透性を増進し、そして粘膜薬剤搬送を促進する、さらなるペプチド剤および非ペプチド剤（例えば小分子薬剤）を設計する多様なプログラムにおけるリードとしてもまた、働くであろう。
【０１９０】
さらに、本明細書に開示するＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体は、例えば対応する天然タンパク質間のホモ型結合または異型結合を遮断し、そして／または粘膜上皮細胞の浸透化を達成するのに有用であろう抗体および関連剤を生成するため、免疫原、または免疫原の構成要素として有用である。ペプチドを、典型的にはコンジュゲートの形（例えば多量体ペプチド、またはペプチド／キャリアーまたはペプチド／ハプテン・コンジュゲート）で、免疫原として投与して、高親和性またはアビディティーで免疫ペプチド（単数または複数）またはペプチド・コンジュゲート（単数または複数）に結合するが、非関連ペプチドを同様には認識しない抗体を生成する。
【０１９１】
したがって、本発明は、ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・ペプチドまたはタンパク質に対して向けられる、モノクローナル抗体を含む診断抗体および療法抗体もまた提供し、これらには、ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の特定の部分またはドメイン（例えばホモ型結合接触面）に対する抗体が含まれる。抗体は、ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の官能部分を特異的に認識し、そしてしたがって、これらのタンパク質間の相互作用を遮断するか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与した場合、粘膜上皮標的細胞を浸透化するのに有用である。これらの免疫療法試薬には、ヒト化抗体が含まれることも可能であり、そして療法使用のため、例えば慣用的な薬学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤、例えば免疫原性アジュバント中で、本明細書に開示されるようなさらなる活性成分または不活性成分と、そして場合によって、抗レトロウイルス薬剤などの付属活性剤または組み合わせて活性である剤と組み合わせることも可能である。ヒト化抗体、抗体断片、および他の関連剤を含む、機能する抗体を生成する方法が当該技術分野に周知である（例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＣＳＨＰ，  ニューヨーク，  １９８８；Ｑｕｅｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３，  １９８９およびＷＯ  ９０／０７８６１を参照されたい）。ファージ−ディスプレー法を用いて、ヒト抗体を得ることも可能である（例えばＤｏｗｅｒら、ＷＯ  ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ  ９２／０１０４７を参照されたい）。同様に、活性抗体断片を産生する方法が周知であり、これらには、別個の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および一本鎖抗体を生成する方法が含まれる。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記に記載されるものなどの標準法を用いて、損なわれていない免疫グロブリンを酵素的または化学的に分離することによって、断片を産生可能である。限定還元によって、Ｆ（ａｂ’）２断片から、または還元剤の存在下、パパインで消化することによって完全抗体から、Ｆａｂ断片を得ることも可能である。組換えＤＮＡ技術によっても断片を産生可能である。全長コード配列を制限酵素で消化することによって、または新規合成によって、選択される断片をコードする核酸セグメントを産生する。しばしば、断片は、ファージ−コート融合タンパク質の形で発現される。この発現方式は、抗体の親和性増進に好都合である。
【０１９２】
本発明の抗ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン抗体はまた、上述のように、ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・タンパク質の結合相互作用に干渉するか、またはこうした相互作用を遮断する、そして／または粘膜上皮細胞における浸透性増加を誘導する活性を有するさらなる化合物を同定するため、薬剤スクリーニング組成物および方法において、一般的に使用可能である。この目的のため、多様なスクリーニング法および形式が利用可能であり、そして上に論じるように、当該技術分野に周知である。こうしたアッセイにおいて、本発明のペプチドおよび抗体化合物は修飾なしで使用可能であるし、また多様な方式で修飾可能である；修飾は例えば、直接または間接的に検出可能シグナルを提供する部分を共有結合または非共有結合するなどの標識による。直接標識の可能性には：放射標識、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（例えば米国特許第３，６４５，０９０号；および米国特許第３，９４０，４７５号を参照されたい）などの酵素、並びに蛍光標識などの標識基が含まれる。間接的標識の可能性には、１つの構成要素のビオチン化に続く上記標識基の１つにカップリングしたアビジンへの結合が含まれる。化合物を固体支持体に付着させようとする場合、化合物はまた、スペーサーまたはリンカーを含むことも可能である。
【０１９３】
本発明のペプチドおよび抗体および他の化合物はまた、多様な医学的研究および診断使用のための商業的試薬としても利用可能である。こうした使用には、限定されるわけではないが：（１）多様な機能アッセイにおける、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチドおよびタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの活性を定量化するための較正標準としての使用；（２）ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチドおよびタンパク質の構造解析における使用；および（３）ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチドおよびタンパク質の作用機構を調べるための使用が含まれる。
【０１９４】
水含量を有効に調節して、タンパク質安定性を増進する、多様な添加剤、希釈剤、塩基および搬送ビヒクルを本発明内で提供する。この意味で、抗凝集剤として有効な、これらの試薬およびキャリアー物質には、例えば、多様な官能性のポリマー、例えばポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、およびカルボキシメチルセルロースが含まれ、これらはこれらと混合されるかまたはこれらに連結されたペプチドおよびタンパク質の安定性を有意に増加させ、そして固相凝集を有意に減少させる。いくつかの例では、ペプチドまたはタンパク質薬剤の水性溶液への多様な添加剤によってもまた、タンパク質の活性または物理的安定性が増進可能である。例えば、ポリオール（糖を含む）、アミノ酸、コラーゲンおよびゼラチンなどのタンパク質、並びに多様な塩などの添加剤が使用可能である。
【０１９５】
特定の添加剤、特に糖および他のポリオールはまた、乾燥した、例えば凍結乾燥したタンパク質に、有意な物理的安定性を与える。これらの添加剤はまた、本発明内で、凍結乾燥中だけでなく、乾燥状態での保存中にも、凝集に対してタンパク質を保護するのに使用可能である。例えば、スクロースおよびＦｉｃｏｌｌ７０（スクロース単位のポリマー）は、多様な条件下の固相インキュベーション中、ペプチドまたはタンパク質凝集に対して、有意な保護を示す。これらの添加剤はまた、ポリマー・マトリックス内に包埋された固体タンパク質の安定性も増進可能である。
【０１９６】
さらなる添加剤、例えばスクロースは、本発明の特定の徐放配合物で起こりうるような、上昇した温度で湿った大気中、固体状態の凝集に対して、タンパク質を安定化させる。この背景において、ゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質もまた、安定化剤または充填剤として働いて、不安定なタンパク質の変性および凝集を減少させる。これらの添加剤は、本発明内のポリマー融解プロセスおよび組成物中に取り込むことも可能である。例えば、上述の多様な安定化添加剤を含有する溶液を単に凍結乾燥させるか、またはスプレー乾燥させることによって、ポリペプチド微小粒子を調製可能である。それによって、非凝集ペプチドおよびタンパク質の徐放が、延長された期間にわたって得られうる。
【０１９７】
多様なさらなる調製構成要素および方法とともに、特定の配合添加剤が本明細書に提供され、該添加剤は、凝集傾向があるペプチドおよびタンパク質の粘膜搬送用の配合物を生じ、ここでペプチドまたはタンパク質は、実質的に純粋な非凝集型で安定化される。これらの方法および配合物内で使用するため、ある範囲の構成要素および添加剤が意図される。これらの抗凝集剤の典型は、シクロデキストリン（ＣＤ）の連結二量体であり、これらは、ポリペプチドの疎水性側鎖に選択的に結合する（例えばＢｒｅｓｌｏｗら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２０：３５３６−３５３７；Ｍａｌｅｔｉｃら，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３５：１４９０−１４９２を参照されたい）。これらのＣＤ二量体は、凝集を有意に阻害する方式で、タンパク質の疎水性パッチに結合することが見出されてきている（Ｌｅｕｎｇら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：５０５０−５０５３，  ２０００）。この阻害は、ＣＤ二量体および関与するタンパク質両方に関して選択的である。タンパク質凝集のこうした選択的阻害は、本発明の鼻内搬送法および組成物内で、さらなる利点を提供する。この背景において使用するためのさらなる剤には、ペプチドおよびタンパク質の凝集を特異的に遮断するリンカーによって調節される多様な幾何配置を持つ、ＣＤ三量体および四量体が含まれる（Ｂｒｅｓｌｏｗら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１８：１１６７８−１１６８１，  １９９６；Ｂｒｅｓｌｏｗら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４：１１１５６−１１１５８，  １９９７；Ｂｒｅｓｌｏｗら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２８８７−２８９０，  １９９８）。
【０１９８】
本発明内に取り込まれるさらなる抗凝集剤および方法は、タンパク質−タンパク質相互作用を選択的に遮断するペプチドおよびペプチド模倣体の使用を伴う。１つの側面において、ＣＤ多量体に関して報告される疎水性側鎖の特異的結合を、タンパク質凝集を同様に遮断するペプチドおよびペプチド模倣体の使用を介して、タンパク質に拡張する。広い範囲の適切な方法および抗凝集剤が、本発明の組成物および方法内に取り込むために利用可能である（Ｚｕｔｓｈｉら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２：６２−６６，  １９９８；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２１：４３２５−４３３３，  １９９９：Ｚｕｔｓｈｉら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１９：４８４１−４８４５，  １９９７；Ｇｈｏｓｈら，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ５：４３９−４４５，  １９９７；Ｈａｍｕｒｏら，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ３６：２６８０−２６８３，  １９９７；Ａｌｂｅｒｇら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：２４８−２５０，  １９９３；Ｔａｕｔｏｎら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１８：１０４１２−１０４２２，  １９９６；Ｐａｒｋら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２１：８−１３，  １９９９；Ｐｒａｓａｎｎａら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：６８８３−６８９３，  １９９８；Ｔｉｌｅｙら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１９：７５８９−７５９０，  １９９７；Ｊｕｄｉｃｅら，  ＰＮＡＳ，  ＵＳＡ  ９４：１３４２６−１３４３０，  １９９７；Ｆａｎら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２０：８８９３−８８９４，  １９９８；Ｇａｍｂｏｎｉら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１２１８９−１２１９４，  １９９８）。簡潔には、これらの方法は、選択される生物学的活性ペプチドまたはタンパク質間の相互作用を有効に遮断し、それによって、粘膜配合物において、該生物学的活性ペプチドまたはタンパク質の凝集を有意に減少させる、ペプチドおよび模倣体の合理的設計および選択を伴う。こうして同定される抗凝集ペプチドおよび模倣体を、組み合わせ配合物において、生物学的活性ペプチドまたはタンパク質と協調して投与するか、または混合するか、または組み合わせ配合物中でコンジュゲート化して、該活性ペプチドまたはタンパク質の吸収および／または生物学的利用能を有意に増進する方式で、該活性ペプチドまたはタンパク質の凝集を有効に阻害する。
【０１９９】
本明細書に開示するペプチドおよびタンパク質操作の他の技術は、本発明の粘膜搬送法および配合物において、タンパク質凝集および不安定性の度合いをさらに減少させるであろう。この背景において、ペプチドまたはタンパク質修飾の有用な方法の一例は、ＰＥＧ化である。ポリペプチド薬剤の安定性および凝集の問題は、ポリペプチドとＰＥＧなどの水溶性ポリマーを共有的にコンジュゲート化することによって、有意に改善可能である。別の例は、例えば末端または内部付加、欠失または置換（例えばシステイン残基の欠失あるいはアラニンまたはセリンによる置換）によって、１以上の残基の同一性または位置に関して、ペプチドまたはタンパク質アミノ酸配列を修飾して、凝集潜在能力を減少させることである。これらの方法によって達成される、安定性および凝集潜在能力に関する改善によって、本発明の方法内で、療法的に有効なポリペプチドまたはタンパク質組成物の有効な粘膜搬送が可能になる。
【０２００】
電荷修飾およびｐＨ調節剤および方法
疎水性粘膜バリアをわたる搬送を増進させるために生物学的活性剤（例えば巨大分子薬剤、ペプチドまたはタンパク質）の輸送特性を改善するため、本発明はまた、本明細書に記載する、選択される生物学的活性剤または搬送増進剤を電荷修飾するための技術および試薬もまた、提供する。これに関連して、巨大分子の相対的浸透性は、一般的に、その分配係数に関連する。分子のイオン化の度合いは、分子のｐＫａおよび粘膜表面でのｐＨに依存するが、これもまた、分子の浸透性に影響を及ぼす。粘膜搬送のための本発明のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチドおよび類縁体を含む、生物学的活性剤および浸透化剤の浸透および分配は、活性剤または浸透化剤の電荷改変または電荷拡散によって促進されることも可能であり、これは例えば、荷電官能基の改変によって、活性剤を搬送する搬送ビヒクルまたは溶液のｐＨを修飾することによって、あるいは電荷またはｐＨ改変試薬を活性剤と協調投与することによって、達成可能である。
【０２０１】
本発明の粘膜搬送配合物および方法内で使用するための電荷およびｐＨ修飾法を評価するためのモデル化合物は、ニコチンである。ｐＨの関数としてのこのモデル療法剤の荷電状態が、皮膚および吸収粘膜の多様な搬送部位で調べられてきている（例えばＮａｉｒら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８６：２５７−２６２，  １９９７を参照されたい）。
【０２０２】
これらの一般的な解説と一致して、本発明の方法および組成物内の、ＪＡＭ、オクルディン、およびクローディン・ペプチド、並びに他の生物学的活性ペプチドおよびタンパク質を含む、荷電巨大分子種の粘膜搬送は、活性剤が、実質的に非イオン化された、または中性の電荷状態の粘膜表面に搬送される際に、実質的に改善される。
【０２０３】
ＪＡＭ、オクルディン、およびクローディン・ペプチド、並びに他の生物学的活性ペプチド、タンパク質、およびペプチド類縁体およびペプチド模倣体の等電点の計算を容易に行って、本発明内の粘膜配合物のｐＨおよび他の値の選択の指針とし、該配合物は、場合によって、実質的に非イオン化状態で、粘膜表面に荷電巨大分子を搬送するか、または薬剤作用の標的部位での粘膜搬送後に、荷電巨大分子を搬送する。両性分子のｐＩは、純電荷がゼロのｐＨと定義される。ｐＨでの純荷電の変動は、電気泳動、等電点電気泳動、クロマトフォーカシングおよびイオン交換クロマトグラフィーなどの電荷依存分離法において重要である。したがって、天然ペプチドおよび天然タンパク質の等電点（ｐＩ）を概算する方法が周知であり、そして本発明の方法および組成物内で容易に導入される（例えばＣａｍｅｓｅｌｌｅら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｅｄｕｃ．  １４：１３１−１３６，  １９８６；Ｓｋｏｏｇら，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５：８２−８３，  １９８６；Ｓｉｌｌｅｒｏら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７９：３１９−２５，  １９８９；Ｅｎｇｌｕｎｄら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １０６５：１８５−１９４，  １９９１；Ｂｊｅｌｌｑｕｉｓｔら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．  １４：１０２３−１０３１，  １９９３；Ｍｏｓｈｅｒら，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  ６３８：１５５−１６４，  １９９３；Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １５：５２９−５３９，  １９９４；Ｗａｔｔｓら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １６：２２−２７，  １９９５を参照されたい）。
【０２０４】
本発明内で使用するための粘膜配合物の特定のＪＡＭ、オクルディン、およびクローディン・ペプチド、並びに他の生物学的活性ペプチドおよびタンパク質構成要素は、電荷修飾されて、ペプチドまたはタンパク質の陽性電荷の増加を生じるであろう。これらの修飾はまた、本明細書に開示するペプチドおよびタンパク質コンジュゲート、キャリアー並びに他の搬送型のカチオン化にも拡張される。カチオン化は、本発明内のタンパク質および巨大分子の生体分布特性および輸送特性を改変する慣用的な手段を提供する。カチオン化は、活性剤の生物学的活性を実質的に保持し、そして組織損傷および毒性を含む副作用を潜在的に制限する方式で行われる。多くの場合、カチオン化分子は、非カチオン化型に比較して、より高い臓器取り込みおよび浸透を有する（例えばＥｋｒａｍｉら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８４：４５６−４６１，  １９９５；Ｂｅｒｇｍａｎら，  Ｃｌｉｎ．  Ｓｃｉ．  ６７：３５−４３，  １９８４；Ｔｒｉｇｕｅｒｏら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２５８：１８６−１９２，  １９９１を参照されたい）。いくつかの場合、カチオン化タンパク質は、天然タンパク質によっては浸透不能とみなされる生理学的バリアに浸透可能である。例えば、カチオン化アルブミン（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２５５：８９３−８９９，  １９９１）、およびカチオン化ＩｇＧ（Ｔｒｉｇｕｅｒｏら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ８６：４７６１−４７６５，  １９８９）は、天然アルブミンおよび天然ＩｇＧよりはるかに高い度合いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで脳毛細血管内皮に結合し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで血液−脳関門を横断することが立証されている。カチオン化タンパク質はまた、一般的に、天然タンパク質よりも高い度合いで肺に取り込まれる（Ｂｅｒｇｍａｎら，  Ｃｌｉｎ．  Ｓｃｉ．  ６７：３５−４３，  １９８４；Ｔｒｉｇｕｅｒｏら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２５８：１８６−１９２，  １９９１；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２５１：８２１−８２６，  １９８９）。単離され、灌流されたラット肺において、組織レベルで、カチオン化フェリチン（ＣＦ）が肺内皮に結合し、そしてトランスサイトーシスされることが立証されており（Ｐｉｅｔｒａら，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ４９：５４−６１，  １９８３；Ｐｉｅｔｒａら，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５９：６８３−６９１，  １９８８）、一方、天然フェリチンは、肺内皮には結合せず、そして少ない度合いでしかこのバリアを渡ってトランスサイトーシスされない。Ｂｅｒｇｍａｎら（Ｃｌｉｎ．  Ｓｃｉ．  ６７：３５−４３，  １９８４）は、ヒト血清アルブミンのカチオン化レベルおよび電荷密度を増加させる（天然アルブミンのｐＩ値における変化によって測定されるように）ことによって、ラットにおけるｉｖ投与後、肺によるカチオン化アルブミンの取り込みが増加可能であることを立証した。Ｐａｒｄｒｉｄｇｅらもまた、カチオン化ＩｇＧおよび生理学的カチオン性ヒストン（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２５１：８２１−８２６，  １９８９）が、それぞれ天然ＩｇＧおよびウシ・アルブミンに比較して、肺において、より高い取り込みを有することを立証した。しかし、いくつかの研究は、天然タンパク質と比較して、カチオン化タンパク質の肺取り込みがより高いことを立証するのに失敗した。例えば、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２５５：８９３−８９９，  １９９１）およびＴａｋａｋｕｒａら（Ｔａｋａｋｕｒａら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ７：３３９−３４６，  １９９０）は、動物におけるｉｖ生体分布研究後、天然アルブミンに比較して、カチオン化アルブミンの肺取り込みがより低いことを報告している。
【０２０５】
分解酵素阻害剤および方法
ＪＡＭ、オクルディン、およびクローディン・ペプチドを含む、生物学的活性剤の有効な粘膜搬送に対する主要な障害は、これらが粘膜酵素による分解にさらされうることである。療法化合物の経口投与経路に特に問題があり、これは、胃での加水分解に加えて、胃の酸性が高いことによって、意図する薬剤作用標的部位に到達する前に、粘膜搬送配合物の多くの活性および不活性構成要素が破壊されるためである。活性のさらなる障害は、胃酵素および膵臓酵素の作用、並びに腸管刷子縁膜のエキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼの作用によって、そして浸透バリアが粘膜を渡る活性剤の通過を実質的に遮断する場所である腸粘膜の代謝によって、起こる。
【０２０６】
酵素分解への感受性に加えて、多くの療法化合物、特に、比較的低分子量のタンパク質、およびペプチドは、循環に導入されると、腎臓によって、哺乳動物被検体から迅速に一掃される。この問題は、反復投与を通じて、療法化合物を多量に投与することによって、部分的に克服可能である。しかし、タンパク質またはペプチド構成要素を含有する療法配合物がより高い用量であると、抗体が誘発される可能性があり、抗体は、タンパク質に結合し、そしてタンパク質を不活性化し、そして／または被検体の体からのタンパク質のクリアランスを促進しうる。療法タンパク質またはペプチドを含有する配合物の反復投与は、本質的に無効であり、そしてアレルギー反応または自己免疫反応を誘発しうるため、危険でありうる。
【０２０７】
療法ペプチド、タンパク質および他の化合物の代謝不安定性の問題には、部分的に、合理的薬剤設計を通じて、取り組むことが可能である。しかし、医化学者は、薬理学的活性を保持しつつ、高い細胞膜浸透性を達成するように、ペプチドおよびタンパク質構造を操作するのにそれほど成功してきていない。不運なことに、薬理学的結合パートナーに対する親和性および特異性を分子に与えるペプチドおよびタンパク質の多くの構造的特徴（例えば遊離Ｎ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシル基、並びに側鎖カルボキシル基（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ）、アミノ基（例えばＬｙｓ、Ａｒｇ）およびヒドロキシル基（例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ））は、細胞膜浸透性を制限する望ましくない物理化学特性（例えば電荷、水素結合ポテンシャル）もまた分子に与える。したがって、ペプチドおよびタンパク質療法剤の鼻内配合物および搬送には、別の戦略を考慮する必要がある。
【０２０８】
薬剤搬送に対するいわゆる酵素バリアを克服する試みには、リポソーム（Ｔａｋｅｕｃｈｉら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １３：８９６−９０１，  １９９６）およびナノ粒子（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら，  Ｎａｔｕｒｅ．  ３８６：４１０−４，  １９９７）の使用が含まれ、これらは、取り込まれたインスリンを酵素攻撃から保護し、そして酵素活性が比較的低い結腸に標的化された搬送系の発展を提供すると報告される（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．  ４６：５９−７３，  １９９７）。さらに、プロテアーゼ阻害剤の同時投与は、多様な研究において、インスリンの経口生物学的利用能を改善すると報告されてきている（Ｆｕｊｉｉら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３７：５４５−９，  １９８５；Ｙａｍａｍｏｔｏら，  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  １１：１４９６−６００，  １９９４；Ｍｏｒｏｓｈｉｔａら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ７８：９−１６，  １９９２）。
【０２０９】
プロテアーゼ阻害の領域においては、ペプチドおよびタンパク質療法剤を含む生物療法化合物の搬送を増進するための、より最近の研究努力は、薬剤キャリアー・マトリックスとして用いる粘液接着ポリマー上の酵素阻害剤の共有固定に焦点を当ててきている（例えばＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｒｍ．  ２３：７３３−４０，  １９９７；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ４７：１１３−２１，  １９９７；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇ．  ７：５５−６３，  １９９９を参照されたい）。これらの解説と組み合わせて、本発明は、より詳細な側面において、場合によって１以上のさらなる生物学的活性剤または搬送増進剤と協調して投与される、ＪＡＭ、オクルディン、およびクローディン・ペプチド、並びに他の生物学的活性ペプチド類縁体およびペプチド模倣体の粘膜搬送のための一般的なキャリアーまたはビヒクルとともに配合される酵素阻害剤を提供する。場合によって、酵素阻害剤は、キャリアーまたはビヒクルと共有結合する。特定の態様において、キャリアーまたはビヒクルは、生物分解性ポリマー、例えば生物接着ポリマーである。したがって、例えば、トリプシンおよびα−キモトリプシンに阻害効果を示すＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（ＢＢＩ）などのプロテアーゼ阻害剤（Ｂｉｒｋ  Ｙ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ２５：１１３−３１，  １９８５）、またはエラスターゼ特異的な低分子量阻害剤、エラスタチナールを、本明細書に記載するような粘液接着ポリマーに共有結合させることも可能である。生じるポリマー−阻害剤コンジュゲートは、単独で、あるいは他の生物学的活性剤またはさらなる搬送増進剤と組み合わせて配合されるかまたは搬送される、ペプチドおよび他の生物学的活性剤の粘膜搬送ビヒクルとして、実質的な有用性を示す。
【０２１０】
本発明の粘膜搬送配合物および方法内で有用な、典型的な粘液接着ポリマー−酵素阻害剤複合体には、限定されるわけではないが：カルボキシメチルセルロース−ペプスタチン（抗ペプシン活性を持つ）；ポリ（アクリル酸）−Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）−キモスタチン（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；カルボキシメチルセルロース−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；ポリカルボフィル−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；キトサン−アンチパイン（抗トリプシン）；ポリ（アクリル酸）−バシトラシン（抗アミノペプチダーゼＮ）；キトサン−ＥＤＴＡ（抗アミノペプチダーゼＮ、抗カルボキシペプチダーゼＡ）；キトサン−ＥＤＴＡ−アンチパイン（抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ）が含まれる（例えばＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ５２：１−１６，  １９９８を参照されたい）。以下にさらに詳細に記載されるように、本発明の特定の態様は、場合によって、新規キトサン誘導体またはキトサンの化学的修飾型を取り込むであろう。本発明内で使用するためのこうした新規キトサンの１つは、β−［１→４］−２−グアニジノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコース・ポリマー（ポリＧｕＤ）である。
【０２１１】
近年、経口投与した療法ペプチドおよびタンパク質に対する酵素バリアを克服する酵素阻害剤の使用がかなりの興味を集めてきている（詳細な概説に関しては、Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，  Ａ．  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ５２：１−１６，  １９９８を参照されたい）。しかし、長期療法に用いるペプチドおよびタンパク質薬剤に関しては特に、酵素阻害剤の同時投与は、これらの剤が引き起こす副作用のため、問題が多いままである。経口搬送法による酵素阻害剤の同時投与には、全身性中毒、栄養タンパク質消化の妨害、およびフィードバック制御に基づく膵臓の肥大とともに過形成などのいくつかの副作用が付随しうる。全身性の毒性副作用および腸粘膜損傷が排除可能であったとしても、膵臓プロテアーゼの酵素阻害剤はなお、これらの消化酵素自体の阻害によって引き起こされる毒性潜在能力を有する。栄養タンパク質消化の妨害に加えて、フィードバック制御によって引き起こされるプロテアーゼ分泌の刺激を阻害剤が誘導することも予期しうる［Ｒｅｓｅｌａｎｄら，  Ｈｕｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  １２６：６３４−６４２（１９９６）］。多くの研究が、Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤、ダイズ（ｓｏｙｂｅａｎ）トリプシン阻害剤（Ｋｕｎｉｔｚトリプシン阻害剤）およびカモスタットなどの阻害剤でのこのフィードバック制御を、ラットおよびマウスで調べている。これらによって、このフィードバック制御が膵臓の肥大および過形成を迅速に導くことが立証されている。さらに、Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤およびダイズ・トリプシン阻害剤を長期間経口投与すると、多くの新生物病巣が発展し、これはしばしば侵襲性癌腫に進行する［Ｏｔｓｕｋｉら，  Ｐａｎｃｒｅａｓ  ２：１６４−１６９，  １９８７；Ｍｅｌｍｅｄら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  ４２１：２８０−２８８，  １９７６；ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓら．  Ｓｃａｎｄ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｎｅｔｅｒｏｌ．  １７：２７３−２７７，  １９８２；Ｇｅら，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  ７０：３３３−３４５（１９９３）］。薬剤放出およびそれに続く吸収が起こる、腸の限定された領域に、阻害剤（単数または複数）を濃縮しておく薬剤搬送系の開発によって、このフィードバック制御の減少または排除さえ可能でありうる。経口ペプチド薬剤搬送の背景における、より近年の酵素阻害剤戦略の一般的な概説に関しては、例えばＭａｒｓｃｈｕｔｚら，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２１：１４９９−１５０７，  （２０００）を参照されたい。
【０２１２】
本発明は、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体を含む、生物学的活性剤と、酵素阻害剤の協調投与に向けられる、協調投与法および／または組み合わせ配合物を提供する。粘膜環境には多様な分解酵素が存在するため、本発明の予防および療法組成物および方法を容易に修飾して、生物学的活性剤（例えば生理学的活性ペプチドまたはタンパク質）に、プロテアーゼ阻害剤などの酵素阻害剤を添加するか同時投与して取り込み、それによって活性剤の生物学的利用能を改善する。例えば、療法活性阻害ペプチドおよびタンパク質の場合、１以上のプロテアーゼ阻害剤（単数または複数）を、タンパク質分解酵素の１以上の阻害剤を含む本発明の配合物または方法において、場合によって組み合わせて、または協調して投与する。特定の態様において、酵素阻害剤を生物学的活性剤とともに、共通のキャリアーに混合するか、または結合させる。例えば、タンパク質分解酵素の阻害剤を本発明の療法または予防配合物に取り込んで、タンパク質分解から生物学的活性タンパク質またはペプチドを保護し、そしてそれによって活性タンパク質またはペプチドの生物学的利用能を増進することも可能である。
【０２１３】
酵素活性を阻害して生物学的活性剤（単数または複数）を保護するいかなる阻害剤も、本発明の組成物および方法において、有用に使用可能である。生物学的活性タンパク質およびペプチドの保護に有用な酵素阻害剤には、例えば、ダイズ・トリプシン阻害剤、膵臓トリプシン阻害剤、キモトリプシン阻害剤、並びにジャガイモ（ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌ．）塊茎から単離されたトリプシン阻害剤およびキモトリプシン阻害剤が含まれる。阻害剤の組み合わせまたは混合物が使用可能である。本発明内で使用するためのタンパク質分解酵素のさらなる阻害剤には、オボムコイド酵素、メシル酸ガバキサート、アルファ１−アンチトリプシン、アプロチニン、アマスタチン、ベスタチン、ピューロマイシン、バシトラシン、ロイペプシン、アルファ２−マクログロブリン、ペプスタチンおよび卵白またはダイズ・トリプシン阻害剤が含まれる。これらの阻害剤および他の阻害剤は、単独でまたは組み合わせて使用可能である。阻害剤（単数または複数）は、投薬型表面上にコーティングされたキャリアー、例えば親水性ポリマーに取り込まれるか、または結合することも可能であり、この投薬型は、生物学的活性剤と組み合わせて、または別個に投与される（例えばあらかじめ投与される）配合物中で、鼻粘膜に接触するか、または前記表面の表在相に取り込まれる。
【０２１４】
本発明の組成物に場合によって取り込まれる阻害剤、例えばタンパク質分解酵素阻害剤の量は、（ａ）特定の阻害剤の特性、（ｂ）分子に存在する官能基（反応して、ヒドロゲル形成単量体との共重合に必要なエチレン性不飽和を導入しうるもの）の数、および（ｃ）阻害剤分子に存在する、配糖体などのレクチン基の数に応じて、多様であろう。これはまた、投与しようと意図する特定の療法剤にも応じる可能性もある。一般的に言って、酵素阻害剤の有用な量は、配合物（すなわち別個のプロテアーゼ阻害剤配合物、または阻害剤および生物学的活性剤を含む組み合わせ配合物）の約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌ、しばしば約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、そしてより一般的には約０．５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。
【０２１５】
ありうる毒性副作用および他の有害な副作用を決定し、そして考慮する注意を払うことが必要であり、本発明の粘膜搬送法および組成物内で使用するため、プロテアーゼの多様な阻害剤が評価可能である。トリプシン阻害剤の場合、適切な阻害剤は、例えば、アプロチニン、ＢＢＩ、ダイズ・トリプシン阻害剤、鶏オボムコイド、鶏オボインヒビター、ヒト膵臓トリプシン阻害剤、メシル酸カモスタット、フラボノイド阻害剤、アンチパイン、ロイペプチン、ｐ−アミノベンズアミジン、ＡＥＢＳＦ、ＴＬＣＫ（トシルリジンクロロメチルケトン）、ＡＰＭＳＦ、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、およびポリ（アクリレート）誘導体から選択可能である。キモトリプシン阻害剤の場合、適切な阻害剤は、例えば、アプロチニン、ＢＢＩ、ダイズ・トリプシン阻害剤、キモスタチン、ベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＣＨＯ、ＦＫ−４４８、鶏オボインヒビター、糖ジフェニルボロン酸複合体、ＤＦＰ、ＰＭＳＦ、β−フェニルプロピオネート、およびポリ（アクリレート）誘導体から選択可能である。エラスターゼ阻害剤の場合、適切な阻害剤は、例えば、エラスタチナール、メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−クロロメチルケトン（ＭＰＣＭＫ）、ＢＢＩ、ダイズ・トリプシン阻害剤、鶏オボインヒビター、ＤＦＰ、およびＰＭＳＦから選択可能である。鼻内環境に存在する、または鼻内配合物の産生用の調製物質に存在する、さらなる既知の分解酵素の他の天然存在内因性酵素阻害剤は、本発明の方法および組成物内に取り込むため、当業者によって、容易に確認されるであろう。
【０２１６】
本発明内で使用するためのさらなる酵素阻害剤は、有効性および毒性の度合いが多様である、広い範囲の非タンパク質阻害剤から選択される（例えばＬ．  Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ニューヨーク州ニューヨーク，  １９８８を参照されたい）。以下にさらに詳細に記載するように、マトリックスまたは他の搬送ビヒクルへのこれらの付属剤の固定、あるいは化学的修飾類縁体の発展を容易に実行し、遭遇した際の毒性効果を減少するかまたは除外することさえ可能である。本発明内で使用するための候補酵素化合物のこの広い群の中に、有機リン阻害剤、例えばジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）があり、これらはセリンプロテアーゼ（例えばトリプシンおよびキモトリプシン）の強力な不可逆的阻害剤である。これらの化合物はさらにアセチルコリン・エステラーゼを阻害し、これによって調節されない搬送セッティングでは、非常に毒性となる（Ｌ．  Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ニューヨーク州ニューヨーク，  １９８８）。別の候補阻害剤、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）は、ＤＦＰおよびＰＭＳＦに匹敵する阻害活性を有するが、顕著に、より毒性でない。（４−アミノフェニル）−メタンスルホニルフルオリド塩酸（ＡＰＭＳＦ）は、トリプシンの別の強力な阻害剤であるが、調節されないセッティングでは毒性である。これらの阻害剤と対照的に、４−（４−イソプロピルピペラジノカルボニル）フェニル１，２，３，４−テトラヒドロ−１−ナフトエート・メタンスルホネート（ＦＫ−４４８）は、低毒性物質であり、キモトリプシンの強力でそして特異的な阻害剤を代表する。この化合物を同時投与すると、ラットおよびイヌにおいて、インスリンの腸吸収が増進し、血液グルコースレベルの減少が生じる。インスリンのこの生物学的利用能の増加は、消化酵素、特にキモトリプシンの阻害に関連することが見出された（Ｆｕｊｉｉら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３７：５４５−５４９，  １９８５）。阻害剤候補のこの非タンパク質群であり、そしてまた低毒性リスクを示すさらなる代表例が、メシル酸カモスタット（Ｎ，Ｎ’−ジメチルカルバモイルメチル−ｐ−（ｐ’−グアニジノ−ベンゾイルオキシ）フェニルアセテート・メタン−スルホネート）（Ｙａｍａｍｏｔｏら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１：１４９６−１５００，  １９９４）およびグリココール酸ナトリウム（Ｙａｍａｍｏｔｏら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１：１４９６−１５００，  １９９４；Ｏｋａｇａｖａら，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ５５：６７７−６８３，  １９９４）である。
【０２１７】
本発明の方法および組成物内で使用するための酵素阻害剤のさらに別の種類は、特定の療法化合物の酵素分解に干渉するアミノ酸および修飾アミノ酸である。この背景で使用するため、アミノ酸および修飾アミノ酸は、実質的に非毒性であり、そして安価に産生可能である。しかし、低分子サイズであり、そしてよく溶解するため、これらは容易に希釈され、そして粘膜環境において吸収される。にもかかわらず、適切な条件下では、アミノ酸がプロテアーゼ酵素の可逆的競合阻害剤として作用しうる（例えばＭｃＣｌｅｌｌａｎら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６１３：１６０−１６７，  １９８０を参照されたい）。特定の修飾アミノ酸は、はるかにより強い阻害活性を示しうる。この背景において、望ましい修飾アミノ酸は、「遷移状態」阻害剤として知られる。これらの化合物の強い阻害活性は、遷移状態幾何配置において、基質と構造的に類似であることに基づき、一方、これらは一般的に、基質自体よりも、酵素の活性部位にはるかにより強い親和性を有するように選択される。遷移状態阻害剤は、可逆的競合的阻害剤である。この種の阻害剤の例は、α−アミノボロン酸誘導体、例えばボロ−ロイシン、ボロ−バリンおよびボロ−アラニンである。これらの誘導体中のホウ素原子は、四面体ボロネートイオンを形成可能であり、これは、アミノペプチダーゼによる加水分解中のペプチドの遷移状態に似ていると考えられる。これらのアミノ酸誘導体は、アミノペプチダーゼの強力でそして可逆的な阻害剤であり、そしてボロ−ロイシンは、酵素阻害において、ベスタチンより１００倍以上有効であり、そしてピューロマイシンより１０００倍以上有効であると報告される（Ｈｕｓｓａｉｎら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ６：１８６−１８９，  １９８９）。強いプロテアーゼ阻害活性が報告されている別の修飾アミノ酸は、アミノペプチダーゼＮの酵素活性を阻害する、Ｎ−アセチルシステインである（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １４：１８１−１８５，  １９９７）。この付属剤はまた、粘液溶解特性も示し、この特性を本発明の方法および組成物内で使用して、粘液拡散バリアの影響を減少させることも可能である（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ  ２：３６１−３６３，  １９９６）。
【０２１８】
本発明の協調投与法および組み合わせ配合物内で使用するための、さらに他の有用な酵素阻害剤は、ペプチドおよび修飾ペプチド酵素阻害剤から選択可能である。この種の阻害剤の重要な代表は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）から得られる環状ドデカペプチド、バシトラシンである。バシトラシンＡは、１４２３Ｄａの分子量を有し、そしてトリプシンおよびペプシンのようなタンパク質分解酵素の作用に対して際立った抵抗性を示す（Ｈｉｃｋｅｙ，  Ｒ．Ｊ．，  Ｐｒｏｇ．  Ｉｎｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５：９３−１５０，  １９６４）。バシトラシンＡは、細菌ペプチドグリカン合成、哺乳動物トランスグルタミナーゼ活性、およびアミノペプチダーゼＮなどのタンパク質分解酵素を阻害する、いくつかの生物学的特性を有する。プロテアーゼ阻害活性があるため、バシトラシンＡは、インスリン、メトケファミド（ｍｅｔｋｅｐｈａｍｉｄ）、ＬＨ−ＲＨ、およびブセレリンなどの多様な療法（ポリ）ペプチドの分解を阻害するのに用いられてきている（Ｙａｍａｍｏｔｏら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１：１４９６−１５００，  １９９４；Ｌａｎｇｇｕｔｈら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４６：３４−４０，  １９９４；Ｒａｅｈｓら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５：６８９−６９３，  １９８８）。阻害活性に加えて、バシトラシンはまた、深刻な腸粘膜損傷を導くことなく、吸収増進効果も示す（Ｇｏｔｏｈら，  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  １８：７９４−７９６，  １９９５）。
【０２１９】
にもかかわらず、バシトラシンは、確立された腎毒性のため、特定の調節されない搬送セッティングでは有用でない可能性もある。現在まで、バシトラシンはほぼもっぱら、獣医学的医薬品で、そしてヒトにおいては、感染治療において、局所抗生物質として用いられてきている。粘液接着ポリマー（カルボマー）にバシトラシンを共有結合させると、キャリアー・マトリックス内で、化合物の阻害活性が保存されることが示されている（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １４：１８１−１８５，  １９９７）。
【０２２０】
これらの種類のペプチドに加えて、特定のジペプチドおよびトリペプチドは、いくつかのプロテアーゼに対して、弱い非特異的な阻害活性を示す（Ｌａｎｇｇｕｔｈら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４６：３４−４０，  １９９４）。アミノ酸から類推して、これらの阻害活性は、化学的修飾によって改善されうる。例えば、ホスフィン酸ジペプチド類縁体はまた、アミノペプチダーゼに対して強い阻害活性を持つ、「遷移状態」阻害剤である。これらは、報告によれば、鼻内投与されたロイシン・エンケファリンを安定化するのに用いられている（Ｈｕｓｓａｉｎら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ９：６２６−６２８，  １９９２）。遷移状態類縁体の別の例は、修飾ペンタペプチド・ペプスタチンであり（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３４：２２９８−２３００，  １９９１）、これは、ペプシンの非常に強力な阻害剤である。いくつかの合成類縁体の阻害活性を試験することによってペプスタチンの構造解析を行い、阻害活性に関与する分子の主な構造−機能特性が立証された（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ３４：２２９８−２３００，  １９９１）。同様の解析法を容易に適用して、選択される鼻内分解酵素を遮断するため、修飾アミノ酸およびペプチド類縁体を調製することも可能である。
【０２２１】
別の特別な種類の修飾ペプチドには、構造において、末端に位置するアルデヒド官能を持つ阻害剤が含まれる。例えば、配列ベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＣＨＯは、キモトリプシンの既知の一次および二次特異性必要条件を満たし、この標的プロテイナーゼの強力な可逆的阻害剤であることが見出されている（Ｗａｌｋｅｒら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２１−３２３，  １９９３）。末端に位置するアルデヒド官能を持つさらなる阻害剤、例えばアンチパイン、ロイペプチン、キモスタチンおよびエラスタチナールの化学構造もまた、当該技術分野に知られ、ホスホラミドン、ベスタチン、ピューロマイシンおよびアマスタチンなどの、他の既知の可逆的修飾ペプチド阻害剤の構造もまた知られる。
【０２２２】
分子量が比較的高いため、ポリペプチド・プロテアーゼ阻害剤は、より小さい化合物よりも、薬剤−キャリアー・マトリックス中の濃縮された搬送をより行いやすい。酵素阻害剤搬送のための、徐放キャリアー系の利点が、Ｋｉｍｕｒａら（Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  １９：  ８９７−９００，  １９９６）に論じられている。この研究において、粘液接着搬送系は、１時間におよそ１０％のプロテアーゼ阻害剤アプロチニンの望ましい放出速度を示し、これはポリペプチド薬剤の放出速度とほぼ同一速度であった。この搬送系を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ研究によって、薬剤の改善された生物学的利用能が示された（上記）。このため、そしてこれらの毒性が低く、そして阻害活性が強いため、ポリペプチド・プロテアーゼ阻害剤は、しばしば、本発明の方法および組成物内で使用するために選択されるであろう。
【０２２３】
本発明の配合物および方法内のプロテアーゼ阻害用のさらなる剤は、錯化剤の使用を伴う。これらの剤は、多くのプロテアーゼの補因子である二価カチオンを鼻内環境（あるいは調製組成物または療法組成物）から枯渇させることによって、酵素阻害を仲介する。例えば、適切な濃度で協調して投与するか、または組み合わせて配合する付属剤としての錯化剤ＥＤＴＡおよびＤＴＰＡは、選択されるプロテアーゼを阻害して、それによって、本発明にしたがって生物学的活性剤の鼻内搬送を増進するのに十分であろう。この種の阻害剤のさらなる代表は、ＥＧＴＡ、１，１０−フェナントロリンおよびヒドロキシキノリンである（Ｉｋｅｓｕｅら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ９５：１７１−９，  １９９３；Ｇａｒｎｅｒら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：３２２７−３２３３，  １９７４；Ｓａｎｇａｄａｌａら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：１００８８−１００９２，  １９９４；Ｍｉｚｕｍａら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ．  １３３５：１１１−１１９，  １９９７）。さらに、二価カチオンをキレートする傾向があるため、これらの錯化剤および他の錯化剤は、直接吸収促進剤として、本発明内で有用である（例えば、Ｌｅｅ，  Ｖ．Ｈ．Ｌ．，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １３：２１３−３３４，  １９９０）。
【０２２４】
本明細書の別の箇所により詳細に記載するように、本発明の協調投与、マルチプロセシングおよび／または組み合わせ配合法および組成物内の酵素阻害剤として、多様なポリマー、特に粘液接着ポリマーの使用も意図される。例えば、ポリ（アクリレート）誘導体、例えばポリ（アクリル酸）およびポリカルボフィルは、トリプシン、キモトリプシンを含む、多様なプロテアーゼの活性に影響を及ぼしうる。これらのポリマーの阻害効果はまた、Ｃａ２＋およびＺｎ２＋などの二価カチオンの錯化に基づきうる（Ｌｕｅｓｓｅｎら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １２：１２９３−１２９８，  １９９５）。これらのポリマーが、上述のようなさらなる酵素阻害剤のコンジュゲート・パートナーまたはキャリアーとして働きうることもさらに意図される。例えば、キトサン−ＥＤＴＡコンジュゲートが開発されてきており、そして該コンジュゲートは、本発明内で有用であり、亜鉛依存性プロテアーゼの酵素活性に対して強い阻害効果を示す。この背景において、他の酵素阻害剤の共有結合後、ポリマーの粘液接着特性は、実質的に危うくされるとは予期されず、また、本発明内の生物学的活性剤の搬送ビヒクルとしてのこうしたポリマーの一般的な有用性が減少するとは予期されない。対照的に、粘液接着機構によって提供される搬送ビヒクルおよび粘膜表面間の距離の減少によって、活性剤の前全身（ｐｒｅｓｙｓｔｅｍｉｃ）代謝が最小限になり、一方、共有結合酵素阻害剤は、薬剤搬送部位で濃縮されたままであり、阻害剤の望ましくない希釈効果とともに、それによって引き起こされる毒性および他の副作用が最小限になるであろう。この方式で、協調して投与される酵素阻害剤の有効量は、希釈効果の排除によって減少しうる。
【０２２５】
ペプチドおよびタンパク質療法剤の搬送を増進させるプロテアーゼ阻害の分野でのより最近の研究努力は、薬剤キャリアー・マトリックスとして用いられる粘液接着ポリマーに対するプロテアーゼ阻害剤の共有固定に焦点を当ててきている（例えばＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｒｍ．  ２３：７３３−４０，  １９９７；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ４７：１１３−２１，  １９９７；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇ．  ７：５５−６３，  １９９９を参照されたい）。これらの解説と組み合わせて、本発明は、より詳細な側面において、生物学的活性剤の鼻内搬送のための一般的なキャリアーまたはビヒクルとともに配合される酵素阻害剤を提供する。場合によって、酵素阻害剤は、キャリアーまたはビヒクルと共有結合する。特定の態様において、キャリアーまたはビヒクルは、生物分解性ポリマー、例えば生物接着ポリマーである。したがって、例えば、トリプシンおよびα−キモトリプシンに阻害効果を示すＢｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（ＢＢＩ）などのプロテアーゼ阻害剤（Ｂｉｒｋ  Ｙ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ２５：１１３−３１，  １９８５）、またはエラスターゼ特異的な低分子量阻害剤、エラスタチナールを、本明細書に記載するような粘液接着ポリマーに共有結合させることも可能である。生じるポリマー−阻害剤コンジュゲートは、本発明の方法および組成物にしたがった生物学的活性剤の鼻内搬送ビヒクルとして、実質的な有用性を示す。
【０２２６】
本発明の粘膜配合物および方法内で有用な、典型的な粘液接着ポリマー−酵素阻害剤複合体には、限定されるわけではないが：カルボキシメチルセルロース−ペプスタチン（抗ペプシン活性を持つ）；ポリ（アクリル酸）−Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋ阻害剤（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）−キモスタチン（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；カルボキシメチルセルロース−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；ポリカルボフィル−エラスタチナール（抗エラスターゼ）；キトサン−アンチパイン（抗トリプシン）；ポリ（アクリル酸）−バシトラシン（抗アミノペプチダーゼＮ）；キトサン−ＥＤＴＡ（抗アミノペプチダーゼＮ、抗カルボキシペプチダーゼＡ）；キトサン−ＥＤＴＡ−アンチパイン（抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ）が含まれる（例えばＢｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ５２：１−１６，  １９９８を参照されたい）。
【０２２７】
粘液溶解および粘液一掃剤および方法
鼻内投与を介した生物療法剤の有効な搬送は、粘液層で糖タンパク質への結合のため、薬剤が失われるのに加え、鼻粘膜の保護粘液裏打ちを渡る薬剤輸送率が減少することを考慮しなければならない。正常な粘液は、粘弾性的ゲル様物質であり、水、電解質、ムチン、巨大分子、および脱ぎ捨てられた上皮細胞からなる。粘液は、主に、下にある粘膜組織の細胞保護性でそして潤滑性のカバーとして働く。粘液は、鼻上皮および他の粘膜上皮に位置する、無作為に分布する分泌細胞によって分泌される。粘液の構造単位はムチンである。この糖タンパク質は、主に、粘液の粘弾性の性質に関与するが、他の巨大分子もまた、この特性に寄与しうる。気道粘液において、こうした巨大分子には、局所的に産生される分泌ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、リゾチーム、およびブロンコトランスフェリンが含まれ、これらはまた、宿主防御機構においても重要な役割を果たす。
【０２２８】
粘液の厚さは、臓器間および種間で多様である。しかし、異なる供給源から得られるムチン糖タンパク質は、全体のアミノ酸およびタンパク質／炭水化物組成が類似であるが、分子量が広く多様でありうる。ムチンは、セリン残基およびスレオニン残基のヒドロキシル基に対して、ガラクトースまたはＮ−アセチルグルコサミンのＯ−グリコシド連結を通じて付着した、オリゴ糖側鎖を含む、巨大タンパク質コアからなる。シアル酸またはＬ−フコースが、末端基の５０〜６０％を形成するシアル酸（２．８より大きいｐＨで負に荷電される）を含む側鎖オリゴ糖の末端基を形成する。ムチン・コアの端領域にシステインが存在すると、ジスルフィド架橋形成を介して、ムチン分子の架橋が促進される。
【０２２９】
現在まで、上皮浸透増進機構の解明において、すべての上皮表面を覆う粘液層の存在は、広く見過ごされてきた。これは、部分的に、ペプチド薬剤およびタンパク質薬剤の吸収における粘液の役割がまだよく確立されていないためである。しかし、比較的高分子量のこれらの薬剤および他の薬剤に関しては、鼻粘膜表面を覆う粘液層は、ほぼ乗り越えられないバリアに相当しうる。分子の半径が間接的に拡散係数と相関する、拡散係数を計算する慣用的な式によれば、粘液バリアはポリペプチド薬剤に関して非常に増加する。このいわゆる「拡散バリア」に焦点を当てた研究によって、およそ５ｋＤａより大きい分子量のタンパク質は、粘液層に最小限しか、またはまったく浸透しないことが立証されてきている（Ａｌｌｅｎら，  ’Ｍｕｃｕｓ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ’，  Ｅ．Ｎ．  Ｅｌｄｅｒ，  Ｊ．Ｂ．  Ｅｌｓｔｅｉｎ（監修）  ｐ．１１５，  Ｖｏｌ．  １４４，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９８２；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ２：３６１，  １９９６）。
【０２３０】
本発明の協調投与法は、場合によって、有効な粘液溶解剤または粘液一掃剤を取り込み、該剤は、鼻内粘膜表面からの薄い粘液または透明な粘液を分解するように働き、鼻内投与された生物療法剤の吸収を促進する。これらの方法内で、粘液溶解剤または粘液一掃剤は、生物学的活性剤の鼻内搬送を増進する付属化合物として協調して投与される。あるいは、有効量の粘液溶解剤または粘液一掃剤を、本発明のマルチプロセシング法内でプロセシング剤として、または本発明の組み合わせ配合物内で添加剤として取り込んで、鼻内粘液のバリア効果を減少させることによって、生物療法化合物の鼻内搬送を増進させ、改善された配合物を提供する。
【０２３１】
多様な粘液溶解剤または粘液一掃剤が、本発明の方法および組成物内に取り込むのに利用可能である（例えばＬｅｅら，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  ８：９１−１９２，  １９９１；Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，  ４９：７９９−８０３，  １９９９を参照されたい）。作用機構に基づいて、粘液溶解剤および粘液一掃剤は、しばしば、以下の群に分類可能である：ムチン糖タンパク質のタンパク質コアを切断するプロテアーゼ（例えばプロナーゼ、パパイン）；ムコタンパク質ジスルフィド連結を切るスルフィドリル化合物；および粘液内の非共有結合を切断する界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０）（例えばＡｌｌｅｎ，  Ａ．  ’Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｔｒａｃｔ．中  Ｌ．Ｒ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ（監修），  ｐ．６１７，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９８１を参照されたい）。この背景において、さらなる化合物には、限定されるわけではないが、胆汁酸塩および界面活性剤、例えばデオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、およびリゾホスファチジルコリンが含まれる。
【０２３２】
粘液の構造分解を引き起こす胆汁酸塩の有効性は、デオキシコレート＞タウロコレート＞グリココレートの順である。粘液粘性または接着を減少させ、本発明の方法にしたがって鼻内搬送を増進する他の有効な剤には、例えば短鎖脂肪酸、並びにキレート化によって働く粘液溶解剤、例えばＮ−アシルコラーゲンペプチド、胆汁酸、およびサポニン（後者は、部分的に、粘液層構造を維持するのに重要な役割を果たすＣａ２＋および／またはＭｇ２＋をキレートすることによって機能する）が含まれる。
【０２３３】
本発明の方法および組成物内で使用するためのさらなる粘液溶解剤には、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＡＣＳ）が含まれ、これは気管支肺粘液の粘性および接着両方を減少させ、そして麻酔ラットにおいて、ヒト成長ホルモンの鼻生物学的利用能を穏やかに増加させる（７．５％から１２．２％に）と報告される、強力な粘液溶解剤である（Ｏ’Ｈａｇｅｎら，  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，  ７：７７２，  １９９０）。生物学的活性剤の投与と協調させて、これらのおよび他の粘液溶解剤または粘液一掃剤を、典型的には約０．２〜２０ｍＭの濃度範囲で、鼻粘膜と接触させ、鼻内粘液の極性粘性および／または弾性を減少させる。
【０２３４】
さらなる他の粘液溶解剤または粘液一掃剤は、粘液糖タンパク質内のグリコシド結合を切断可能な、ある範囲のグリコシダーゼ酵素から選択可能である。α−アミラーゼおよびβ−アミラーゼがこの種の酵素の代表であるが、これらの粘液溶解効果は限定されている可能性がある（Ｌｅｉｂｅｒｍａｎ，  Ｊ．，  Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｄｉｓ．  ９７：６６２，  １９６７）。対照的に、細菌が宿主の粘液層に浸透するのを可能にする細菌グリコシダーゼ（Ｃｏｒｆｉｅｌｄら，  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．  １０：７２，  １９９３）は、非常に粘液溶解活性が高い。
【０２３５】
本発明の方法および組成物内で使用するための粘液溶解剤を選択するため、粘液溶解（または粘液一掃）剤および生物学的活性剤両方の化学的性質を考慮することが重要である。例えば、タンパク質分解酵素プロナーゼは、ｐＨ５．０とともに、ｐＨ７．２でも非常に強い粘液溶解活性を示す。対照的に、プロテアーゼ、パパインは、ｐＨ５．０では実質的な粘液溶解活性を示すが、ｐＨ７．２では検出可能な粘液溶解活性をまったく示さない。活性におけるこれらの相違の理由は、部分的に、パパインのｐＨ最適値が異なり、ｐＨ５と報告されることによって説明される（Ｋａｒｌｓｏｎ，  Ｐ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ，  Ｔｈｉｅｍｅ，  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８４）。したがって、本発明内で使用するための粘液溶解酵素および他の酵素は、典型的には、対象酵素のｐＨ最適値のｐＨまたはそれに近いｐＨを有する配合物中で搬送される。
【０２３６】
生物学的活性剤の化学的性質決定に関して、１つの注目に値する懸案事項は、プロテアーゼおよびスルフィドリルの分解活性に対するペプチドおよびタンパク質分子の脆弱性である。特に、ペプチドおよびタンパク質薬剤は、異なる種類の粘液溶解剤に攻撃されうる。１つの研究において、粘液溶解プロテアーゼ、プロナーゼおよびパパイン（各々、多数の結合で切断するエンドペプチダーゼ）は、ｐＨ７．２で、２〜３時間以内にインスリンを完全に分解することが示された（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ  ４９：７９９−８０３，  １９９９）。対照的に、ｐＨ２．５では、インスリンはまったく、またはわずかしか、プロナーゼおよびパパインに分解されず、これはどちらの酵素のｐＨ最適値も、ｐＨ２．５からは遠く離れていることによって説明可能である。プロナーゼは異常に非特異的なプロテアーゼを代表するが、パパインは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、およびＧｌｙの後で切断し（Ｋａｒｌｓｏｎ，  Ｐ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ，  Ｔｈｉｅｍｅ，  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８４）、これらはすべて、インスリンの一次構造中に含まれ、そして本発明内で粘液溶解剤および粘液一掃剤を選択する、さらなる指針として働く。
【０２３７】
ペプチドおよびタンパク質療法剤におけるシステイン残基およびジスルフィド結合の存在および数もまた、本発明内の粘液溶解剤または粘液一掃剤を選択する際に考慮すべき重要な要因である。分子構造内に３つのジスルフィド結合を提示するインスリンを、ジチオスレイトールまたはＮ−アセチルシステインとインキュベーションすると、ｐＨ７．２でインスリン・ポリペプチドが迅速に分解される。ｐＨ２．５では実質的に分解の度合いがより低く、これはこのｐＨ値では、反応性チオレート・アニオン（ジスルフィド結合に対する求核攻撃に関与する）の量が比較的少ないことに起因する（Ｂｅｒｎｋｏｐ−Ｓｃｈｎｕｒｃｈら，  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，  ４９：７９９−８０３，  １９９９）。
【０２３８】
ペプチド薬剤およびタンパク質薬剤と組み合わせて、プロナーゼまたはパパインなどの一般的なプロテアーゼを用いることは、一般的に禁忌であるが、より特異的なプロテアーゼの実用的な使用は、上記原理にしたがって、実行可能であり、スルフィドリル化合物の使用も実行可能である。一次構造内にシステイン部分をまったく示さない療法ポリペプチド（例えばシクロスポリン）に関しては、スルフィドリル化合物の使用は問題にならない。さらに、ジスルフィド結合を所持するタンパク質薬剤に関してさえ、スルフィドリル化合物の使用が達成可能であり、特にジスルフィド結合が、タンパク質のコンホメーションのため、チオール攻撃に関して接近可能でない場合、こうしたタンパク質薬剤はこの種の粘液溶解剤の存在下で安定なままであるはずである。
【０２３９】
ペプチド療法剤およびタンパク質療法剤を含む、本発明内の大部分の生物学的活性剤との組み合わせた使用のため、非イオノゲン性界面活性剤もまた、一般的に、粘液溶解剤または粘液一掃剤として有用である。これらの剤は、典型的には、療法ポリペプチドの活性を修飾しないか、または実質的に損なわないであろう。
【０２４０】
繊毛抑制（ｃｉｌｉｏｓｔａｔｉｃ）剤および方法
粘膜繊毛クリアランスによる特定の粘膜組織（例えば鼻粘膜組織）の自己除去能力は、保護機構として必要であるため（例えばほこり、アレルゲン、および細菌を取り除くため）、この機構は、粘膜投薬によって、実質的に損なわれるべきではないと一般的に見なされてきた。気道における粘膜繊毛輸送は、感染に対する特に重要な防御機構である（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ．，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７３：１７−１９，  １９８４）。この機構を達成するため、鼻通路および気道通路で繊毛がビートすること（ｂｅａｔｉｎｇ）によって、粘膜に沿って粘液が移動して、吸い込んだ粒子および微生物を取り除く。慢性気管支炎および慢性副鼻腔炎中、気管支および鼻粘膜繊毛クリアランスがしばしば損なわれる（Ｗａｎｎｅｒ．，  Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｄｉｓ．  １１６：７３−１２５，  １９７７）。これはおそらく、過剰な分泌（Ｄｕｌｆａｎｏら，  Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｄｉｓ．  １０４：８８−９８，  １９７１）、粘液粘性の増加（Ｃｈｅｎら，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  ９１：４２３−４３１，  １９７８）、ビート頻度（ｂｅａｔ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）が減少して引き起こされる繊毛活性の改変（Ｐｕｃｈｅｌｌｅら，  Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ  ２１：２６５−２７２，  １９８４）、繊毛上皮部分の損失（Ｃｈｏｄｏｓｈら，  Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｄｉｓ．  １０４：８８８−８９８，  １９７１）、またはこれらの要因の組み合わせによるためである。クリアランス減少は、おそらく、呼吸粘膜表面の細菌コロニー形成を支持し、被検体が感染する可能性を増加させる。この宿主防御系と干渉する能力は、病原性生物の毒性に有意に寄与しうる。
【０２４１】
多様な報告により、粘膜繊毛クリアランスが、粘膜投与薬剤によって、また浸透増進剤および保存剤を含む広い範囲の配合添加剤によって、損なわれうることが示されている。例えば、２％より高い濃度のエタノールは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ繊毛ビート頻度を減少させることが示されている。これは、部分的に、高濃度で繊毛抑制性であるカルシウムイオンの流動を間接的に増進する、膜浸透性増加によって、あるいは繊毛軸糸または繊毛抑止反応に関与する制御タンパク質の作動に直接影響することによって、仲介されうる。典型的な保存剤（メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート（０．０２％および０．１５％）、プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート（０．０２％）、およびクロロブタノール（０．５％））は、カエル口蓋モデルにおいて、繊毛活性を可逆的に阻害する。他の一般的な添加剤（ＥＤＴＡ（０．１％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）、クロルヘキシジン（０．０１％）、硝酸フェニル水銀（ｐｈｅｎｙｌｉｎｅｒｃｕｒｉｃ  ｎｉｔｒａｔｅ）（０．００２％）、およびホウ酸フェニル水銀（０．００２％））は、粘膜繊毛輸送を不可逆的に阻害することが報告されている。さらに、ＳＴＤＨＦ、ラウレス−９、デオキシコレート、デオキシコール酸、タウロコール酸、およびグリココール酸を含む、いくつかの浸透増進剤は、モデル系において、繊毛活性を阻害すると報告されている。
【０２４２】
繊毛抑制因子に起因すると考えられる粘膜繊毛クリアランスに対する副作用の可能性にもかかわらず、繊毛抑制剤は、本発明の方法および組成物内で、粘膜（例えば鼻内）投与されたＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する生物学的活性剤の居留時間を増加させるための使用を見出す。特に、本発明の方法および組成物内のこれらの剤の搬送は、粘膜細胞の繊毛活性を可逆的に阻害して、粘膜投与された活性剤（単数または複数）の居留時間に一時的な可逆的増加を提供する、１以上の繊毛抑制剤の協調投与または組み合わせ配合物によって、有意に増進される。本発明のこれらの側面内で使用するため、活性が特異的または間接的である、前述の繊毛抑制因子はすべて、投与粘膜部位で粘膜繊毛クリアランスの一過性（すなわち可逆的）減少または休止を生じて、許容し得ない副作用を伴わずに、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤の搬送を増進するように、適切な量（濃度、期間および搬送様式に応じる）で、繊毛抑制剤として使用して成功する候補である。
【０２４３】
より詳細な側面内で、特異的繊毛抑制因子を、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよび／またはクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに／あるいは本明細書に開示する他の生物学的活性剤を含む組み合わせ配合物または協調投与プロトコルにおいて、使用する。文献で単離され、そして性質決定された多様な細菌繊毛抑制因子を、本発明のこれらの態様内で使用可能である。例えば、最近、Ｈｉｎｇｌｅｙら（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ５１：２５４−２６２，  １９８６）は、細菌、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から繊毛抑制因子を同定してきている。これらは、培養上清において緑膿菌によって放出される熱安定性因子であり、上皮細胞培養において、繊毛機能を阻害することが示されてきている。これらの繊毛阻害構成要素の中で典型的なものは、フェナジン誘導体、膿化合物（２−アルキル−４−ヒドロキシキノリン類）、およびラムノリピド（溶血素としても知られる）である。これらの活性構成要素および他の活性構成要素の阻害濃度は、繊毛運動性およびビート頻度の定量的な測定値によって、確立された。膿化合物は、５０μｇ／ｍｌの濃度で繊毛抑制を生じ、そして明らかな超構造損傷を伴わなかった。フェナジン誘導体もまた、繊毛運動性を阻害するが、ある程度の膜破壊を引き起こし、しかしこれは４００μｇ／ｍｌの実質的により高い濃度の場合であった。気管支外植片をラムノリピドに限定曝露すると、繊毛抑制が生じ、これは繊毛膜の改変と関連した。より徹底的にラムノリピドに曝露すると、軸糸からのダイニンアームの除去と関連した。これらおよび他の細菌繊毛抑制因子は、緑膿菌をより容易にそして成功して哺乳動物宿主の気道にコロニー形成させるよう発展してきたと提唱される。これに基づいて、呼吸細菌は、本発明の方法および組成物内で使用するための適切な特異的繊毛抑制因子の同定に有用な病原体である。
【０２４４】
本発明の方法および組成物内の繊毛抑制剤の効果および使用を評価するため、粘膜抑制クリアランスを測定するいくつかの方法が利用可能である。鼻粘膜繊毛クリアランスは、インディア・インク、エディコール・オレンジ粉末、およびエディコール・スープラ・オレンジなどの可視トレーサーの消失を監視することによって測定可能である。これらのトレーサーは、直接観察することによって、または後検鼻法または双眼操作顕微鏡の補助で、追跡される。この方法は、単に、トレーサーが定義される距離を移動するのにかかる時間を測定する。より新しい技術において、放射標識トレーサーをエアロゾルとして投与して、そして適切な平行検出装置によって追跡する。あるいは、サッカリンなどの強い風味を持つ粒子を鼻通路内に置き、そしてアッセイして、粘膜繊毛クリアランスの指標として用いる、被検体が最初に風味を知覚するまでの時間を測定する。
【０２４５】
繊毛のビート活性を測定するためのさらなるアッセイが当該技術分野に知られる。例えば、気管支粘膜繊毛活性を測定するレーザー光散乱技術は、レーザー光の単色度、コヒーレンス、および方向性に基づく。ドップラーシフト散乱光の干渉のための強度ばらつきとして、繊毛運動度を測定する。光電子増倍管によって、動く繊毛からの散乱光を検出し、そして検出される光電流の自己相関関数を生じるシグナル相関器によってその周波数成分を解析する。この方式で、ビートする繊毛の頻度および同調性両方を連続して測定可能である。光ファイバー検鼻法を通じて、この方法はまた、鼻通路の末梢部分における繊毛活性の測定も可能にする。
【０２４６】
本発明内の配合物の繊毛抑制活性を評価するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイもまた利用可能である。例えば、この背景において、一般的に用いられ、そして許容されるアッセイは、ウサギ気道外植片系である（Ｇａｂｒｉｄｇｅら，  Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｒｅｓ．  １：３１−３５，  １９７９；Ｃｈａｎｄｌｅｒら，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２９：１１１１−１１１６，  １９８０）。他のアッセイ系は、単一の細胞または少数の細胞の繊毛のビート頻度を測定する（Ｋｅｎｎｅｄｙら，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １３５：１４７−１５６，  １９８１；Ｒｕｔｌａｎｄら，  Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ  ５６４−５６５，  １９８０；Ｖｅｒｄｕｇｏら，  Ｐｅｄｉａｔｒ．  Ｒｅｓ．  １３：１３１−１３５，  １９７９）。
【０２４７】
界面活性剤および方法
本発明のより詳細な側面内で、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤の粘膜搬送を増進するため、本発明の粘膜搬送法または配合物内で、１以上の膜浸透増進剤が使用可能である。この背景において、膜浸透増進剤は：（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、または（ｘ）コレステロール合成阻害剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）に列挙した膜浸透増進剤の組み合わせいずれかから選択可能である。
【０２４８】
特定の界面活性剤が、粘膜吸収増進剤として、本発明の粘膜搬送配合物および方法内に容易に取り込まれる。ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤と協調して投与するか、または組み合わせて配合することが可能なこれらの剤は、既知の界面活性剤の広い集団から選択可能である。界面活性剤は、一般的に３つの種類に属する：（１）非イオン性ポリオキシエチレンエーテル類；（２）グリココール酸ナトリウム（ＳＧＣ）およびデオキシコレート（ＤＯＣ）などの胆汁酸塩；および（３）タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）などのフシジン酸誘導体。これらの多様な種類の界面活性剤の作用機構には、典型的には、生物学的活性剤の可溶化が含まれる。しばしば凝集体を形成するタンパク質およびペプチドに関しては、これらの吸収促進剤の界面活性特性は、界面活性剤でコーティングされる単量体などのより小さい単位が、溶液中でより容易に維持可能であるように、タンパク質との相互作用を可能にしうる。これらの単量体は、おそらく、凝集体よりもより輸送可能な単位である。第二の潜在的機構は、粘膜環境におけるプロテアーゼによるタンパク質分解的分解からのペプチドまたはタンパク質の保護である。胆汁酸塩およびいくつかのフシジン酸誘導体は、どちらも、タンパク質吸収を増進するのに必要なものより低いかまたはそれと同等の濃度で、鼻ホモジネートによるタンパク質のタンパク質分解的分解を阻害すると報告される。このプロテアーゼ阻害剤は、生物学的半減期が短いペプチドに特に重要でありうる。
【０２４９】
脂肪酸およびコレステロール合成の分解酵素および阻害剤
本発明の関連する側面において、粘膜投与のためのＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤を、分解酵素、または代謝刺激剤または脂肪酸合成阻害剤、ステロールまたは他の選択される上皮バリア構成要素から選択される浸透増進剤と配合するか、または協調して投与する（例えば米国特許第６，１９０，８９４号を参照されたい）。１つの態様において、浸透性を増進する粘膜組織構成要素に作用する既知の酵素は、本発明のマルチプロセシング法内のプロセシング剤として、本発明の方法の組み合わせ配合物または協調投与に取り込まれる。例えば、ホスホリパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ノイラミニダーゼ、およびコンドロイチナーゼなどの分解酵素を使用して、粘膜バリアに不可逆的な損傷を引き起こさずに、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤の粘膜浸透を増進することも可能である（例えば、Ｓｑｕｉｅｒ  Ｂｒｉｔ．  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １１１：２５３−２６４，  １９８４；ＡｕｎｇｓｔおよびＲｏｇｅｒｓ  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ５３：２２７−２３５，  １９８９を参照されたい）。１つの態様において、本明細書に提供するような方法または組成物内でコンドロイチナーゼを使用して、粘膜の浸透性バリアの糖タンパク質構成要素または糖脂質構成要素を改変し、それによってＪＡＭ、オクルディンおよび／またはクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤の粘膜吸収を増進する。
【０２５０】
粘膜バリア構成要素合成の阻害剤に関して、遊離脂肪酸が上皮脂質重量２０〜２５％を占めることが注目される。遊離脂肪酸の生合成における２つの律速酵素は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼおよび脂肪酸シンテターゼである。一連の工程を通じて、遊離脂肪酸はリン脂質に代謝される。したがって、本発明の方法および組成物内で使用するための脂肪酸合成および代謝の阻害剤には、限定されるわけではないが、５−テトラデシルオキシ−２−フランカルボン酸（ＴＯＦＡ）などのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤；脂肪酸シンテターゼ阻害剤；ホスホリパーゼＡ阻害剤、例えばゴミシンＡ、２−（ｐ−アミルシンナミル）アミノ−４−クロロ安息香酸、臭化ブロモフェナシル、モノアリド、７，７−ジメチル−５，８−エイコサジエン酸、ニセルゴリン、セファランチン、ニカルジピン、クエルセチン、ジブチリル−環状ＡＭＰ、Ｒ−２４５７１、Ｎ−オレオイルエタノールアミン、Ｎ−（７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）ホスファチジルセリン、シクロスポリンＡ、ジブカインを含む局所麻酔剤、プレニルアミン、すべてトランスのレチノール酸および１３−シス−レチノール酸などのレチノイド類、Ｗ−７、トリフルオペラジン、Ｒ−２４５７１（カルミダゾリウム）、１−ヘキサドシル−３−トリフルオロエチル・グリセロ−ｓｎ−２−ホスホメントール（ＭＪ３３）；ニカルジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン、およびニモジピンを含むカルシウムチャネル遮断剤；キナクリン、メパクリン、クロロキンおよびヒドロキシクロロキンを含む抗マラリア剤；プロパナロールおよびラベタロールを含むベータ遮断剤；カルモジュリン・アンタゴニスト；ＥＧＴＡ；チメロサール；デキサメタゾンおよびプレドニゾロンを含むグルココルチコステロイド類；並びにインドメタシンおよびナプロキセンを含む非ステロイド抗炎症剤が含まれる。
【０２５１】
遊離ステロール、主にコレステロールは、上皮脂質重量２０〜２５％を占める。コレステロール生合成の律速酵素は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル（ＨＭＧ）ＣｏＡレダクターゼである。本発明の方法および組成物内で使用するためのコレステロール合成阻害剤には、限定されるわけではないが、シンバスタチン、ロバスタチン、フルインドスタチン（フルバスタチン）、プラバスタチン、メバスタチンなどの（ＨＭＧ）ＣｏＡレダクターゼの競合阻害剤とともに、オレイン酸コレステロール、硫酸コレステロールおよびリン酸コレステロールなどの他のＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、並びに２５−ＯＨコレステロールおよび２６−ＯＨコレステロールなどの酸素化コレステロール；スクアレン・シンテターゼ阻害剤；スクアレン・エポキシダーゼ阻害剤；２２，２５−ジアザコレステロール、２０，２５−ジアザコレステロール、ＡＹ９９４４、およびトリパラノールなどのＤＥＬＴＡ７またはＤＥＬＴＡ２４レダクターゼ阻害剤が含まれる。
【０２５２】
脂肪酸合成阻害剤またはステロール合成阻害剤は各々、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤と協調して投与するか、または組み合わせて配合し、活性剤（単数または複数）の上皮浸透増進を達成することも可能である。粘膜搬送の療法配合物または付属配合物におけるステロール阻害剤の有効な濃度範囲は、一般的に、総重量の約０．０００１％〜約２０％、より典型的には約０．０１％〜約５％である。
【０２５３】
一酸化窒素ドナー剤および方法
本発明の他の関連する側面内で、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤の粘膜搬送を増進する、膜浸透増進剤として、一酸化窒素（ＮＯ）ドナーが選択される。近年、Ｓａｌｚｍａｎら（Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６８：Ｇ３６１−Ｇ３７３，  １９９５）は、ＮＯドナーが、細胞生存度の喪失または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出なしに、Ｃａｃｏ−２細胞単層を渡る水溶性化合物の浸透性を増加させることを報告した。さらに、Ｕｔｏｇｕｃｈｉら（Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １５：８７０−８７６，  １９９８）は、ＮＯドナーの存在下でインスリンの直腸吸収が顕著に増進し、Ｃａｃｏ−２細胞における細胞剥離およびＬＤＨ放出研究によって評価した際、付随する細胞傷害性が低いことを立証した。
【０２５４】
多様なＮＯドナーが当該技術分野に知られ、そして本発明の方法および配合物内で有効な濃度で有用である。典型的なＮＯドナーには、限定されるわけではないが、ニトログリセリン、ニトロプルシド、ＮＯＣ５［３−（２−ヒドロキシ−１−（メチル−エチル）−２−ニトロソヒドラジノ）−１−プロパンアミン］、ＮＯＣ１２［Ｎ−エチル−２−（１−エチル−ヒドロキシ−２−ニトロソヒドラジノ）−エタンアミン］、ＳＮＡＰ［Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ＤＬ−ペニシラミン］、ＮＯＲＩおよびＮＯＲ４が含まれる。これらのＮＯドナーおよび他のＮＯドナーとともに、本明細書に開示する他の粘膜搬送増進剤が、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤を増進する有効性は、Ｕｔｏｇｕｃｈｉら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １５：８７０−８７６，  １９９８に記載されるように、既知の有効性および細胞傷害性アッセイ法（例えばカルボキシ−ＰＩＩＯなどのＮＯスカベンジャーの対照同時投与を伴う）にしたがって、日常的に評価可能である。
【０２５５】
本発明の方法および組成物内で、選択されるＮＯドナーの有効量を、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに／あるいは本明細書に開示する他の生物学的活性剤と、粘膜上皮内に、または粘膜上皮を通じて、協調して投与するか、または組み合わせて配合する。
【０２５６】
上皮接合部構造および／または生理機能を調節するさらなる剤
ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体に加えて、上皮接合部生理機能および／または上皮接合部構造を調節するさらなる剤が、本発明の方法および配合物内で使用するために意図される。上皮密着結合は、一般的に、本発明内に提供するような、実質的な接合部開放を刺激する接合部生理機能調節剤で処理しない限り、およそ１５オングストロームの半径を持つ分子に対して不透性である。本発明の方法および組成物内で二次生理学的調節の有用な標的として働くであろう、「二次」密着結合制御構成要素の中で、ＺＯ１−ＺＯ２ヘテロ二量体複合体は、粘膜上皮において、容易にそして有効に傍細胞浸透性を改変しうる外因性剤による生理学的制御を受けやすいことが示されている。こうした剤に関して、徹底的に研究されてきたのが、「閉鎖帯毒素」（ＺＯＴ）として知られる、コレラ菌由来の細菌毒素である。この毒素は、腸粘膜浸透性増加を仲介し、そして感染被検体において、下痢を含む疾患症状を引き起こす（Ｆａｓａｎｏら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８：５２４２−５２４６，  １９９１；Ｊｏｈｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  ３１／３：７３２−７３３，  １９９３；およびＫａｒａｓａｗａら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔ．  １０６：１４３−１４６，  １９９３）。ウサギ回腸粘膜に対して試験すると、ＺＯＴは、細胞間密着結合の構造を調節することによって、腸浸透性を増加させた。より最近、ＺＯＴが腸粘膜において、密着結合を可逆的に開放可能であることが見出された（例えばＷＯ  ９６／３７１９６；米国特許第５，９４５，５１０号；第５，９４８，６２９号；第５，９１２，３２３号；第５，８６４，０１４号；第５，８２７，５３４号；第５，６６５，３８９号を参照されたい）。ＺＯＴが鼻粘膜において、密着結合を可逆的に開放可能であることもまた、報告された（米国特許第５，９０８，８２５号）。したがって、ＺＯ１−ＺＯ２複合体を調節するＺＯＴおよび他の剤が、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに／あるいは本明細書に開示する他の生物学的活性剤と組み合わせて配合されるか、または協調して投与されるであろう。
【０２５７】
本発明の方法および組成物内で、ＺＯＴとともに、ＺＯＴ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する、ＺＯＴの多様な類縁体および模倣体は、鼻粘膜内への、そして鼻粘膜を渡る傍細胞吸収を増加させることによって、生物学的活性剤の鼻内搬送を増進するのに有用である。この背景において、ＺＯＴは、典型的には、接合部タンパク質ＺＯ１の改変された局在によって明らかになる、密着結合の構造的再編成を引き起こすことによって作用する。本発明のこれらの側面内で、ＺＯＴを、有効量で生物学的活性剤と協調して投与するか、または組み合わせて配合し、実質的な副作用を伴わずに鼻粘膜浸透性を可逆的に増加させることによって、活性剤の吸収を有意に増進させる。
【０２５８】
ＺＯＴ生物学的活性を決定するのに適した方法は、多様な既知のアッセイから選択可能であり、例えばＵｓｓｉｎｇチャンバー（例えばＦａｓａｎｏら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８：５２４２−５２４６，  １９９１に記載されるとおり）を用いて、組織または細胞培養抵抗性（Ｒｔ）の減少をアッセイするか、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて、腸上皮細胞単層の組織抵抗性（Ｒｔ）の減少をアッセイするか；またはｉｎ  ｖｉｖｏで粘膜表面を渡る療法剤の吸収増進を直接アッセイすることを伴う。
【０２５９】
ＺＯＴに加えて、粘膜上皮傍細胞浸透性を可逆的に増加させることによって、ＺＯＴの活性を模倣する、他の多様な密着結合調節剤を、本発明の方法および組成物内で使用可能である。これらには、特異的結合剤または遮断剤、例えば抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣体、細菌毒素、およびＺＯＴ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するか、あるいはＺＯ１−ＺＯ２複合体の生理機能を別の方式で改変する（例えば二量体化を遮断することによって）他の剤が含まれる。当然、これらのさらなる制御剤には、ペプチド類縁体が含まれ、天然ＺＯＴタンパク質の部位特異的突然変異体とともに、天然タンパク質の機能ドメインまたは活性部位をモデル化するタンパク質およびペプチド模倣体の一部切除活性型が含まれる。さらに、これらの剤には、天然哺乳動物タンパク質「ゾヌリン」が含まれ、ゾヌリンは、構造的側面および機能的側面両方でＺＯＴに類似の密着結合生理機能の内因性制御因子であると提唱されてきており（例えばＷＯ  ９６／３７１９６；ＷＯ  ００／０７６０９；米国特許第５，９４５，５１０号；第５，９４８，６２９号；第５，９１２，３２３号；第５，８６４，０１４号；第５，８２７，５３４号；第５，６６５，３８９号を参照されたい）、これはしたがって、ＺＯＴが、宿主進入を促進する内因性哺乳動物ゾヌリン制御機構を模範とした、コレラ菌の収束した進化的発展であることを示唆する。ゾヌリンおよびＺＯＴは、どちらも、「ＺＯＴ受容体」と称される特異的膜受容体に結合すると提唱され（例えば米国特許第５，８６４，０１４号；第５，９１２，３２３号；および第５，９４８，６２９号を参照されたい）、該受容体は、本発明内で、密着結合生理機能制御に関するＺＯＴ活性およびゾヌリン活性に対するさらなるアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに使用可能である。この背景において、ＺＯＴ受容体の構造―機能解析、並びにＺＯＴおよびゾヌリン間の比較は、例えばＺＯＴ受容体のＺＯＴまたはゾヌリン結合または活性化に関して、ＺＯＴまたはゾヌリン・アゴニストまたはアンタゴニストとして作用して、本発明の方法および組成物内で、密着結合生理機能を制御する、特異的結合剤または遮断剤（例えば抗体、抗体断片、ペプチド、ペプチド模倣体、さらなる細菌毒素、および他の剤）の産生および選択の指針となるであろう。
【０２６０】
血管拡張剤および方法
本発明の協調投与法および組み合わせ配合法および組成物内で、有益な有用性を示すさらに別の種類の吸収促進剤は、血管活性化合物、より具体的には血管拡張剤である。これらの化合物は、本発明内で、粘膜下血管系の構造および生理機能を調節し、粘膜上皮内への、または粘膜上皮を通り抜ける、および／または特定の標的組織または区画（例えば全身循環または中枢神経系）へのＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生理学的活性剤の輸送率を増加させるように機能する。
【０２６１】
本発明内で使用するための血管拡張剤は、典型的には、細胞質カルシウムの減少、一酸化窒素（ＮＯ）の増加いずれかによって、またはミオシン軽鎖キナーゼを阻害することによって、粘膜下血管弛緩を引き起こす。これらは、一般的に９種類に分けられる：カルシウム・アンタゴニスト、カリウムチャネル・オープナー、ＡＣＥ阻害剤、アンギオテンシン−ＩＩ受容体アンタゴニスト、α−アドレナリン作用アンタゴニストおよびイミダゾール受容体アンタゴニスト、β１−アドレナリン作用アゴニスト、ホスホジエステラーゼ阻害剤、エイコサノイドおよびＮＯドナー。
【０２６２】
化学的相違にもかかわらず、カルシウム・アンタゴニストの薬物動態特性は類似である。全身循環への吸収は高く、そしてこれらの剤はしたがって、肝臓によって、かなりの第一関門代謝を受け、薬物動態に個々の変動を生じる。ジヒドロピリジン型のより新たな薬剤（アモルジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニルバジピン、ニソルジピンおよびニトレンジピン）を除いて、カルシウム・アンタゴニストの半減期は短い。したがって、これらの多くに関して有効薬剤濃度を維持するには、本明細書の別の箇所に記載するような、多数の投薬、または徐放配合物による搬送が必要でありうる。カリウムチャネル・オープナー、ミノキシジルでの治療はまた、潜在的な副作用のため、投与方式およびレベルが制限される可能性もある。
【０２６３】
ＡＣＥ阻害剤は、アンギオテンシン−Ｉからアンギオテンシン−ＩＩへの変換を防止し、そしてレニン産生が増加する際に、最も有効である。ＡＣＥは、強力な内因性血管拡張ブラジキニンを不活性化するキニナーゼ−ＩＩと同一であるため、ＡＣＥ阻害は、ブラジキニン分解の減少を引き起こす。ＡＣＥ阻害剤は、動物モデルにおいて、心臓線維症および心室肥大を防止し、そして逆転させることによって、心臓保護効果および心臓修復効果の利点を追加する。大部分のＡＣＥ阻害剤の主な除去経路は、腎臓排出を介する。したがって、腎損傷は、除去減少と関連し、そして穏やかな腎損傷から重症腎損傷までを患う患者には、投薬量を２５〜５０％減少させることが推奨される。
【０２６４】
ＮＯドナーに関して、これらの化合物は、粘膜浸透性に対するさらなる効果のため、本発明内で特に有用である。上記ＮＯドナーに加えて、求核試薬とＮＯの複合体は、ＮＯ／求核試薬、またはＮＯＮＯエートと呼ばれ、生理学的ｐＨの水性溶液に溶解した際、自発的にそして非酵素的にＮＯを放出する（Ｃｏｒｎｆｉｅｌｄら，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．，  １３４（４）：４１９−４２５，  １９９９）。対照的に、ニトログリセリンなどのニトロ血管拡張剤は、ＮＯ放出のための特異的酵素活性を必要とする。ＮＯＮＯエートは、定義される化学量論で、そしてジエチルアミン／ＮＯ（ＤＥＴＡＮＯ）での＜３分間からジエチレントリアミン／ＮＯでのおよそ２０時間までの範囲に渡って、予測される速度でＮＯを放出する。
【０２６５】
本発明の特定の方法および組成物内で、生物学的活性剤（単数または複数）の粘膜吸収を増進し、被検体における標的組織または区画（例えば全身循環またはＣＮＳ）に到達させるのに有効な量で、選択される血管拡張剤を、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤（単数または複数）と協調して投与する（例えば全身性または鼻内、同時または組み合わせて有効な一時的会合）か、または組み合わせて配合する。
【０２６６】
選択的輸送増進剤および方法
本発明の特定の側面内で、生物学的活性剤の粘膜搬送は、選択的輸送機構を標的とし、そして巨大分子薬剤のエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシスを促進する方法および剤によって増進される。これに関連して、本発明の組成物および搬送法は、場合によって、１以上の生物学的活性剤の輸送を促進する選択的輸送増進剤を取り込む。これらの輸送増進剤は、本明細書に開示する、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体を含む、組み合わせ配合物または協調投与プロトコルにおいて、粘膜輸送バリアを渡る、１以上のさらなる生物学的活性剤（単数または複数）の搬送を協調して増進し、被検体において、活性剤（単数または複数）が標的組織または区画（例えば粘膜上皮、全身循環またはＣＮＳ）に到達する粘膜搬送を増進するのに使用可能である。あるいは、組み合わせ配合物または協調投与において、輸送促進剤を使用して、さらなる生物学的活性剤の搬送増進を伴い、または伴わず、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体の粘膜搬送を直接増進することも可能である。
【０２６７】
本発明のこの側面内で使用するための、典型的な選択的輸送増進剤には、限定されるわけではないが、配糖体、糖含有分子、およびレクチン結合剤などの結合剤が含まれ、これらは、上皮輸送バリア構成要素と特異的に相互作用することが知られる（例えばＧｏｌｄｓｔｅｉｎら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １：１−３９，  １９８５を参照されたい）。例えば、受容体が仲介する相互作用によって細胞表面糖部分に結合する、多様な植物および細菌レクチンを含む、特異的「生物接着」リガンドを、本発明内の生物学的活性剤の粘膜搬送、例えば鼻搬送を増進するキャリアーまたはコンジュゲート化輸送仲介因子として使用可能である。本発明内で使用するための特定の生物接着リガンドは、特殊化細胞輸送プロセス（エンドサイトーシスまたはトランスサイトーシス）によって、接着リガンドの選択的取り込みを誘発する生物学的シグナルの上皮標的細胞への伝達を仲介するであろう。これらの輸送仲介因子は、したがって、粘膜上皮内への、そして／または粘膜上皮を通り抜ける、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤（単数または複数）の選択的取り込みを刺激するかまたは指示する「キャリアー系」として、使用可能である。これらの選択的輸送増進剤および他の選択的輸送増進剤は、本発明内の巨大分子生物薬剤（特にペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドベクター）の粘膜搬送を有意に増進する。これらの輸送増進剤を利用するため、本明細書の別の箇所に記載するような、一般的なキャリアー配合物および／またはコンジュゲート化法を用いて、粘膜表面に選択的輸送増進剤（例えば受容体特異的リガンド）および生物学的活性剤を協調して投与して、それによって、輸送増進剤が、粘膜上皮内への、または粘膜上皮を渡る、そして／またはさらなる標的細胞（単数または複数）、組織（単数または複数）または区画（単数または複数）への活性剤のエンドサイトーシスまたはトランスサイトーシス増進を誘発するかまたは仲介するのに有効となる。
【０２６８】
レクチンは、真核細胞の糖タンパク質および糖脂質の表面上に見られる特定の糖に結合する植物タンパク質である。レクチンの濃縮溶液は、「粘膜牽引（ｍｕｃｏｔｒａｃｔｉｖｅ）」効果を有し、そして多様な研究によって、粘膜表面を渡る、レクチンおよびレクチン・コンジュゲート（例えばコロイド性金粒子とコンジュゲート化されたコンカナバリンＡ）の迅速な受容体仲介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）が立証されてきている。さらなる研究によって、レクチンの取り込み機構が、ｉｎ  ｖｉｖｏで腸薬剤標的化に利用可能であることが報告されてきている。これらの研究のあるものにおいて、ポリスチレン・ナノ粒子（５００ｎｍ）がトマト・レクチンに共有結合され、そしてラットへの経口投与後、全身取り込み改善を生じたことが報告された。
【０２６９】
植物レクチンに加えて、微生物接着および侵襲因子は、本発明の粘膜搬送法および組成物内で接着性／選択的輸送キャリアーとして使用するための候補の豊富な供給源を提供する（例えばＬｅｈｒ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒａｐ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  １１：１７７−２１８，  １９９５；Ｓｗａｎｎ，  ＰＡ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８２６−８３２，  １９９８を参照されたい）。細菌接着プロセスには、２つの構成要素、細菌「アドヘシン」（接着またはコロニー形成因子）および宿主細胞表面上の受容体が必要である。粘膜感染を引き起こす細菌は、上皮表面に付着する前に、粘液層に浸透することを必要とする。この付着は、通常、細菌フィンブリエまたはピリ繊毛構造に仲介されるが、他の細胞表面構成要素もまた、このプロセスにおいて役割を果たしうる。接着性細菌は、増殖、およびシグナル伝達機構を通じた（毒素の補助を伴うまたは伴わない）、標的細胞内部の一連の生化学反応の開始によって、粘膜上皮にコロニー形成する。これらの侵襲性機構と関連して、元来、多様な細菌およびウイルスに産生される非常に多様な生物接着タンパク質（例えばインベイシン、インターナリン）が知られる。これらは、宿主種および特定の標的組織に対してさえ、目覚しい選択性を持って、こうした微生物の細胞外付着を可能にする。こうした受容体−リガンド相互作用によって伝達されるシグナルは、エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシス・プロセスによる、上皮細胞内への、そして最終的に上皮細胞を通り抜ける、損なわれていない生存微生物の輸送を誘発する。こうした天然存在現象は、粘膜上皮内への、または粘膜上皮を渡る、そして／または薬剤作用の他の指定される標的部位への生物学的活性化合物の搬送増進のため、本明細書の解説にしたがって、利用可能である（例えばＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・ペプチドなどの生物学的活性剤をアドヘシンと複合体化することによって）。この戦略の１つの利点は、こうして使用される選択的キャリアーパートナーが基質特異的であり、他の溶質に対しては、上皮組織の天然バリア機能を損なわれないままにすることである（例えばＬｅｈｒ，  Ｄｒｕｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ，  ｐｐ．３２５−３６２，  ｄｅ  Ｂｏｅｒ監修，  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９４を参照されたい）。
【０２７０】
特異的なレクチン様方式で上皮表面に結合する、多様な細菌および植物毒素もまた、本発明の方法および組成物内で有用である。例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）は、ＲＭＥによって宿主細胞に迅速に進入する。同様に、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）熱不安定性毒素のＢサブユニットは、腸管上皮細胞の刷子縁膜に、非常に特異的なレクチン様方式で結合する。この毒素の取り込み、および腸細胞の基底外側へのトランスサイトーシスが、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで報告されてきている。他の研究は、マルトース結合融合タンパク質として、大腸菌において、ジフテリア毒素膜貫通ドメインを発現し、そしてこれを高分子量ポリＬ−リジンに化学的にカップリングしている。生じた複合体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでレポーター遺伝子の内在化を仲介するのに成功した。これらの例に加えて、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、スーパー抗原および毒素両方として作用する、一組のタンパク質（例えばブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、ＳＥＢ、毒性ショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１））を産生する。これらのタンパク質に関する研究は、Ｃａｃｏ−２細胞において、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−Ｉがトランスサイトーシスを用量依存的に促進したと報告している。
【０２７１】
大部分、リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）である多様な植物毒素が同定されてきており、これらは、ガラクトース単位を発現するいかなる哺乳動物細胞表面にも結合し、そして続いてＲＭＥによって内在化される。ニグリン（ｎｉｇｒｉｎ）ｂ、α−サルシン、リシンおよびサポリン、ビスクミン（ｖｉｓｃｕｍｉｎ）、およびモデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）は、経口投与すると非常に毒性である（すなわち迅速に内在化される）。したがって、これらの化合物の修飾された、より毒性でないサブユニットは、本発明内で、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体を含む、生物学的活性剤の取り込みを促進するのに有用であろう。
【０２７２】
ウイルス赤血球凝集素は、本発明の方法および組成物内で、生物学的活性剤の粘膜搬送を促進する輸送剤の別の種類を含んでなる。多くのウイルス感染の最初の工程は、粘膜細胞への表面タンパク質（赤血球凝集素）の結合である。これらの結合タンパク質は、ロタウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、アデノウイルス、ジャガイモ巻葉ウイルス（ｐｏｔａｔｏ  ｌｅａｆｒｏｌｌ  ｖｉｒｕｓ）、およびレオウイルスを含む、大部分のウイルスに関して同定されてきている。これらのおよび他の典型的なウイルス赤血球凝集素を、本明細書に論じる１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体との組み合わせ配合物（例えば混合配合物またはコンジュゲート配合物）または協調投与プロトコルに使用して、１以上のさらなる生物学的活性剤（単数または複数）の粘膜搬送を協調して増進させることも可能である。あるいは、ウイルス赤血球凝集素を、組み合わせ配合物または協調投与プロトコルで使用して、さらなる生物学的活性剤の増進した搬送を伴い、または伴わず、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体の粘膜搬送を直接増進することも可能である。
【０２７３】
多様な内因性選択的輸送仲介因子もまた、本発明内で使用するのに利用可能である。哺乳動物細胞は、特定の基質の内在化を促進して、そしてこれらを定義される区画に標的化する機構の組み合わせを発展させてきた。膜変形のこれらのプロセスは、集合的に「エンドサイトーシス」と称され、そして食作用、飲作用、受容体仲介エンドサイトーシス（クラスリン仲介ＲＭＥ）、およびポトサイトーシス（非クラスリン仲介ＲＭＥ）を含んでなる。ＲＭＥは、その名前が示すように、多様なリガンドが細胞表面受容体に結合し、そして続いて細胞内に内在化されて、そして輸送されることによる、非常に特異的な細胞生物学的プロセスである。多くの細胞において、エンドサイトーシスのプロセスは非常に活性であり、半時間未満で、すべての膜表面が内在化され、そして置き換えられる。
【０２７４】
ＲＭＥは、特異的リガンドが外部に配置された膜受容体に結合した際に開始される。結合は迅速に起こり、そして続いて、細胞内で内部小胞（初期エンドソーム、「レセプトソーム（ｒｅｃｅｐｔｏｓｏｍｅ）」、またはＣＵＲＬ（非カップリング受容体およびリガンドの区画））が形成されるまで、膜陥入が起こる。このプロセス中、局在膜タンパク質、脂質および細胞外溶質もまた、内在化される。リガンドが特異的受容体に結合する際、リガンド−受容体複合体は、コーティングされたピットに集積する。コーティングされたピットは、高濃度の細胞内クラスリン・サブユニットを含む膜領域である。コーティングされたピット上のクラスリン分子のアセンブリは、陥入プロセスを補助すると考えられる。アダプチンと呼ばれる特殊化コートタンパク質は、コーティングされたピット領域において、膜の至る所に横方向に移動する特異的膜受容体の細胞内カルボキシ末端のシグナル配列（Ｔｙｒ−Ｘ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ（配列番号８４５）（式中、Ｘ＝アミノ酸いずれかである））に結合することによって、該特異的膜受容体を捕捉する。このプロセスによって、コーティングされたピット領域で、正しい受容体が濃縮され、そして細胞に取り込まれる細胞外流体の量が最小限になることが確実になる。
【０２７５】
内在化プロセスに続いて、クラスリン・コートは、シャペロン・タンパク質の補助を通じて失われ、そしてプロトン・ポンプがエンドソームｐＨをおよそ５．５に低下させ、これによって受容体−リガンド複合体の解離が引き起こされる。ＣＵＲＬは、トランスサイトーシスに関与する受容体（例えばトランスコバ−ラミニン）からリサイクル受容体（例えばトランスフェリン）を分離する区画として働く。その後、エンドソームは、トランス・ゴルジ小胞体に到達するまで、無作為に、または微小管に沿った跳躍運動によって移動することも可能であり、ここでゴルジ構成要素または他の膜性区画と融合して、そして管状小胞複合体および後期エンドソームまたは多小胞体に変換されると考えられる。受容体およびリガンドの運命は、これらのソーティング小胞において決定される。いくつかのリガンドおよび受容体は、細胞表面に戻り、ここでリガンドは細胞外環境に放出され、そして受容体はリサイクルされる。あるいは、リガンドはリソソームに導かれて破壊され、一方、受容体は、細胞膜にリサイクルされる。分極上皮細胞のエンドサイトーシス・リサイクル経路は、一般的に、非分極細胞におけるより複雑である。これらの腸細胞において、頂端膜および側底膜両方から分子を受け取り、そして適切な膜または膜リサイクル区画にこれらを正しく戻す、共通のリサイクル区画が存在する。
【０２７６】
ＲＭＥ受容体構造および関連する構造−機能関係の現在の理解は、エンドサイトーシス受容体をコードするｍＲＮＡ配列をクローニングすることによって、有意に増進してきている。大部分のＲＭＥ受容体は、細胞外リガンド結合部位、単一疎水性膜貫通ドメイン（受容体が二量体として発現されない限り）、並びにエンドサイトーシスおよび他の機能シグナルをコードする細胞質テールなどの主な構造的特徴を共有する。細胞膜における方向に基づいて、２種類の受容体が提唱される；Ｉ型受容体のアミノ末端は、膜の細胞外側に位置し、一方、ＩＩ型受容体は、この同じタンパク質テールを細胞内環境に有する。
【０２７７】
上述のように、ポトサイトーシス、または非クラスリン・コーティング・エンドサイトーシスは、カベオラを通じて行われ、カベオラは、直径５０〜８０ｎｍの一様なオメガまたはフラスコ型膜陥入である。このプロセスは、ビタミン、葉酸の内在化機構として、最初に記載された。形態学的研究によって、ｉ）内皮細胞を渡る巨大分子のトランスサイトーシス；（ｉｉ）ＧＰＩ連結受容体分子および未知のアニオン輸送タンパク質を伴うポトサイトーシスを介した小分子の取り込み；（ｉｉｉ）アクチンに基づく細胞骨格との相互作用；および（ｉｖ）Ｇタンパク質カップリング受容体を含む、シグナル伝達に関与する特定のシグナル伝達分子の区画化に、カベオラが関連付けられてきている。カベオラは、ＶＩＰ２１−カベオリンと称される、内在性２２ｋＤａ膜タンパク質の存在に特徴付けられ、該タンパク質は、膜の細胞質表面をコーティングする。薬剤搬送の観点から、クラスリン・コーティングＲＭＥ経路に勝るポトサイトーシス経路の利点は、ｐＨ低下工程が存在せず、エンドソーム／リソソーム経路が回避されることにある。生物学的活性剤の選択的輸送因子仲介搬送のためのこの経路は、したがって、ｐＨ感受性巨大分子の搬送増進に特に有効である。
【０２７８】
本発明内で使用するためのポトサイトーシス輸送キャリアー機構で典型的なのは、葉酸キャリアー系であり、これは、葉酸受容体（ＦＲ）への特異的結合を介して、標的細胞内へのビタミン、葉酸（ＦＡ）の輸送を仲介する（例えばＲｅｄｄｙら，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒ．  Ｓｙｓｔ．  １５：５８７−６２７，  １９９８を参照されたい）。遊離葉酸の細胞取り込みは、葉酸受容体および／または還元葉酸キャリアーに仲介される。葉酸受容体は、カベオラ中にクラスター形成されるグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）係留３８ｋＤａ糖タンパク質であり、ポトサイトーシスによる細胞輸送を仲介する。還元葉酸キャリアーの発現は、真核細胞に偏在して分布する一方、葉酸受容体は、主に、ヒト腫瘍で過剰発現される。受容体の２つの相同アイソフォーム（αおよびβ）がヒトで同定されてきている。α−アイソフォームは、しばしば、上皮腫瘍で過剰発現されることが見出され、一方、β型は、しばしば、非上皮細胞系譜腫瘍で見られる。その結果、この受容体系は、癌細胞への薬剤標的化アプローチで用いられてきているが、タンパク質搬送、遺伝子搬送、および多様な細胞種へのアンチセンス・オリゴヌクレオチドの標的化にも用いられてきている。
【０２７９】
葉酸−薬剤コンジュゲートは、本発明の粘膜搬送内での使用によく適しており、これは該コンジュゲートが、もっぱらＦＲ仲介エンドサイトーシスを介して、標的細胞の浸透を可能にするためである。ＦＡが、例えばγ−カルボキシルを介して生物学的活性剤に共有結合している場合、ＦＲ結合親和性（ＫＤ〜１０-10Ｍ）は、有意に危うくされず、そしてエンドサイトーシスは比較的妨害されずに進行し、ＦＲ発現細胞による付着した活性剤の取り込みを促進する。ＦＲは、多くのヒト癌細胞（例えば卵巣癌、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、および骨髄造血細胞の癌）上で有意に過剰発現されるため、この方法論は、腫瘍に、広い範囲の療法剤とともに、診断剤を選択的に搬送することを可能にする。葉酸仲介腫瘍標的化は、本発明内で使用を見出す分子および分子複合体の以下の種類の搬送のため、今日まで活用されてきている：（ｉ）タンパク質毒素、（ｉｉ）低分子量化学療法剤、（ｉｉｉ）放射画像化剤、（ｉｖ）ＭＲＩ造影剤、（ｖ）放射療法剤、（ｖｉ）捕捉薬剤を含むリポソーム、（ｖｉｉ）遺伝子、（ｖｉｉｉ）アンチセンス・オリゴヌクレオチド、（ｉｘ）リボザイム、および（ｘ）免疫療法剤（例えばＳｗａｎｎ，  ＰＡ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８２６−８３２，１９９８を参照されたい）。実質的にすべての場合で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究によって、同じ薬学的剤の非標的化型に勝る有効性および／または癌細胞特異性の有意な改善が立証されている。
【０２８０】
葉酸受容体経路に加えて、本発明内のトランスサイトーシスを刺激する、多様なさらなる方法は、トランスフェリン受容体経路およびリボフラビン受容体経路に向けられる。１つの側面において、生物学的活性剤をリボフラビンにコンジュゲート化すると、ＲＭＥ仲介取り込みを達成可能である。本発明のさらなる態様は、標的細胞内に生物学的活性剤が進入するのを促進する、特殊化輸送タンパク質（例えばコンジュゲート化パートナー）としてのビタミンＢ１２（コバラミン）を利用する。特定の研究によって、この特定の系は、黄体形成ホルモン放出因子（ＬＨＲＨ）類縁体、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ、１８．８ｋＤａ）、エリスロポエチン（２９．５ｋＤａ）、α−インターフェロン、およびＬＨＲＨアンタゴニストＡＮＴＩＤＥの腸取り込みに使用可能であることが示唆される。
【０２８１】
本発明のさらに他の態様は、粘膜搬送される生物学的活性剤のキャリアーまたはＲＭＥ刺激因子として、トランスフェリンを利用する。トランスフェリンは、８０ｋＤａの鉄輸送糖タンパク質であり、ＲＭＥによって効率的に細胞に取り込まれる。トランスフェリン受容体は、大部分の増殖細胞の表面に見られ、赤芽球および多くの腫瘍種上で増加した数で見られる。腸鉄吸収の現在の知識によれば、トランスフェリンはアポトランスフェリンの形で腸管腔内に排出され、そして腸ペプチダーゼの攻撃に対して非常に安定である。大部分の細胞において、二鉄トランスフェリンは、１８０ｋＤａの二量体膜貫通糖タンパク質であるトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合し、そしてリガンド−受容体複合体は、クラスリン・コーティング小胞内でエンドサイトーシスされる。これらの小胞を酸性化すると、鉄がトランスフェリン／ＴｆＲ複合体から解離し、そして細胞質に進入して、ここでフェリチン（Ｆｎ）に結合される。最近の報告によって、トランスフェリンに共有結合したインスリンが、ＲＭＥによってＣａｃｏ−２細胞単層を渡って輸送されることが示唆される。他の研究によって、この複合体を、ストレプトゾトシン誘導糖尿病マウスに経口投与すると、血漿グルコースレベルが有意に減少し（〜２８％）、これはＢＦＡ前処理によってさらに増強されることが示唆される。トランスフェリン（Ｔｆ）およびトランスフェリン・コンジュゲートのトランスサイトーシスは、真菌代謝産物ブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）の存在下で増進されると報告される。他の研究では、ＢＦＡ処理は、ＭＤＣＫ細胞において、リシンおよびＨＲＰ両方の頂端エンドサイトーシスを迅速に増加させると報告されている。したがって、ＢＦＡおよび受容体仲介輸送を刺激する他の剤は、組み合わせ配合剤（例えばコンジュゲート化剤）および／または協調投与剤として、本発明の方法内で使用して、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体を含む、生物学的活性剤の受容体仲介輸送を増進可能である。
【０２８２】
免疫グロブリン輸送機構は、本発明の粘膜搬送法および組成物内で、取り込みのさらなる内因性経路および試薬を提供する。新生児小腸を渡る免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の受容体仲介トランスサイトーシスは、多くの新生児哺乳動物に受動的免疫を搬送するように働く。ラットにおいて、ミルク中のＩｇＧは、誕生後最初の３週間の間に、近位小腸細胞の表面上に発現される新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に選択的に結合する。ＦｃＲｎは、ｐＨ依存方式でＩｇＧに結合し、結合は十二指腸の管腔ｐＨ（およそ６〜６．５）で起こり、そして血漿のｐＨ（およそ７．４）で放出される。Ｆｃ受容体は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原と似ており、２つのサブユニットからなり、β２−ミクログロブリンと膜貫通糖タンパク質（ｇｐ５０）が会合している。成熟吸収細胞では、ＩｇＧのトランスサイトーシスを仲介する膜区画の各々に、どちらのサブユニットも同時局在する。ＩｇＧをｉｎ  ｓｉｔｕで投与すると、どちらのサブユニットも頂端形質膜の細胞内ピット内に濃縮されるようであり、リガンドがこの部位で受容体の再分布を引き起こすことが示唆される。これらの結果は、ＩｇＧが、両方のサブユニットとの複合体として、細胞を渡って輸送される輸送モデルを支持する。
【０２８３】
本発明の方法および組成物内で、ＩｇＧおよび他の免疫系関連キャリアー（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、並びにその多様な断片を含む）を、生物学的活性剤と協調投与して、典型的には受容体仲介輸送によって、生物学的活性剤の標的化搬送を提供することも可能である。例えば、生物学的活性剤（ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体を含む）をＩｇＧまたは他の免疫学的活性剤に共有結合させるか、あるいはリポソームまたは他のキャリアービヒクル中に配合して、これを次に修飾し（例えばコーティングするか、または共有結合させて）、ＩｇＧまたは他の免疫学的輸送増進剤を取り込むことも可能である。特定の態様において、標的上皮細胞のポリマー性免疫グロブリン受容体（ｐＩｇＲ）に結合するポリマー性ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ輸送剤を使用する。これらの方法内で、ｐＩｇＲの発現は、サイトカインによって増進可能である。
【０２８４】
本発明のさらに詳細な側面内で、抗体および他の免疫学的輸送剤は、それ自体、例えば本明細書の別の箇所に記載するように、粘膜搬送を増進するために修飾可能であり、抗体は、電荷修飾技術によって、本発明の方法および組成物内で、より有効に投与可能である。１つのこうした側面において、経内皮遊走および標的細胞エンドサイトーシス両方を促進する、抗体カチオン化を伴う抗体薬剤搬送戦略を利用する（例えば、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら，  ＪＰＥＴ  ２８６：５４８−５４４，  １９９８を参照されたい）。１つのこうした戦略において、タンパク質の表面カルボキシル基を、伸張した一級アミノ基に変換することによって、抗体のｐＩを増加させる。これらのカチオン化相同タンパク質は、測定可能な組織毒性を持たず、そして最小限の免疫原性を有する。さらに、モノクローナル抗体を、標的タンパク質への親和性を保持してカチオン化することも可能である。
【０２８５】
本発明内で使用するためのさらなる選択的輸送増進剤は、全細菌およびウイルスを含んでなり、遺伝子操作した細菌およびウイルスとともに、こうした細菌およびウイルスの構成要素を含む。慣用的な遺伝子搬送ベクター（例えばアデノウイルス）とは別に、本発明のこの側面には、例えば、Ｈｕｔｅｒら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６１：５１−６３，  １９９９に記載されるような、細菌ゴーストおよびサブユニット構築物の使用が含まれる。細菌ゴーストは、例えばグラム陰性細菌におけるバクテリオファージＰｈｉＸ１７４のプラスミドがコードする溶解遺伝子Ｅの調節発現によって産生されるような、非変性細菌細胞エンベロープである。タンパク質Ｅ特異的溶解は、細菌表面構造にいかなる物理的変性または化学的変性も引き起こさず、そしてしたがって、細菌ゴーストは、不活性化全細胞ワクチンの開発に有用である。アクチノバチルス・プレウロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）およびサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種から産生されるゴーストは、ワクチン接種実験において、成功が立証されている。組換え細菌ゴーストは、膜標的化配列に融合させた外来遺伝子の発現によって生成可能であり、そしてしたがって、エンベロープ内に係留された外来療法ペプチドおよびタンパク質を所持することも可能である。細菌ゴーストが、生存対応物のフィンブリエに似た生物接着構造を含む天然細胞壁を保持する事実から、これらは粘膜表面などの特定の標的組織への付着に適したものとなっている。細菌ゴーストは、マクロファージに容易に取り込まれることが示されており、したがって特定の組織へのゴーストの接着には、食細胞を通じた取り込みが続きうる。
【０２８６】
前記を考慮して、受容体仲介輸送機構に関与する非常に多様なリガンドが当該技術分野に知られ、そして本発明の方法および組成物内で多様に使用して（例えばコンジュゲート・パートナーまたは協調投与仲介因子として）、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤を含む、生物学的活性剤の受容体仲介輸送を増進可能である。一般的に、これらのリガンドには、ホルモンおよび増殖因子、細菌アドヘシンおよび毒素、レクチン、金属イオンおよびそのキャリアー、ビタミン、免疫グロブリン、全ウイルスおよび細菌またはその選択される構成要素が含まれる。これらの種類の中で典型的なリガンドには、例えば、カルシトニン、プロラクチン、上皮増殖因子、グルカゴン、成長ホルモン、エストロゲン、黄体形成ホルモン、血小板由来増殖因子、甲状腺刺激ホルモン、甲状腺ホルモン、コレラ毒素、ジフテリア毒素、大腸菌熱不安定毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡおよびＢ、リシン、サポリン、モデシン、ニグリン、サルシン、コンカナバリンＡ、トランスコバランチン、カテコールアミン類、トランスフェリン、葉酸、リボフラビン、ビタミンＢ１、低密度リポタンパク質、母性ＩｇＯ、ポリマー性ＩｇＡ、アデノウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、コレラ菌、キエブシエラ属（Ｋｉｅｂｓｉｅｌｌａ）株、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）株、パラインフルエンザ・ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびエンテロバクター株（例えばＳｗａｎｎ，  Ｐｈａｒｍｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８２６−８３４，１９９８を参照されたい）が含まれる。
【０２８７】
本発明の特定のさらなる態様において、膜浸透化ペプチド（例えば「アルギニン・リッチ・ペプチド」）を使用して、生物学的活性剤の搬送を促進する。これらのペプチドの作用機構は完全には解明されないままであるが、これらは本明細書の粘膜搬送組成物および方法内で使用するのに有用な搬送増進付属物を提供する。１つの例において、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１  Ｔａｔタンパク質由来の塩基性ペプチド（例えば残基４８〜６０）は、細胞膜を通り抜けて有効に転位置し、そして核に集積すると報告されてきており、この特徴は、細胞内への外因性タンパク質の搬送に利用可能である。Ｔａｔの配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号８４６）は、非常に塩基性で、そして親水性のペプチドを含んでなり、１３アミノ酸残基中に６つのアルギニン残基および２つのリジン残基を含有する。Ｔａｔ−（４８−６０）に非常に類似の転位置活性を有する多様な他のアルギニン・リッチ・ペプチドが同定されてきている。これらには、Ｄ−アミノ酸およびアルギニン置換Ｔａｔ−（４８−６０）、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖなどのウイルスタンパク質由来のＲＮＡ結合ペプチド、フロック・ハウス・ウイルス（ｆｌｏｃｋ  ｈｏｕｓｅ  ｖｉｒｕｓ）コートタンパク質、並びに癌関連タンパク質ｃ−Ｆｏｓおよびｃ−Ｊｕｎなどのロイシン・ジッパー・タンパク質のＤＮＡ結合セグメント、並びに酵母転写因子ＧＣＮ４が含まれる（例えばＦｕｔａｋｉら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６：５８３６−５８４０，  ２０００を参照されたい）。これらのペプチドは、いくつかのアルギニン残基を有すると報告され、これが同定されている唯一の共通の構造的特徴であり、アルギニン・リッチ・ペプチドに普遍的な、共通の内在化機構が示唆され、該機構は典型的なエンドサイトーシスによっては説明されない。（Ａｒｇ）n（ｎ＝４〜１６）ペプチドを用いて、Ｆｕｔａｋｉらは、効率的な転位置のためのアルギニン残基（ｎ〜８）の最適化を解説する。最近、ＨＩＶ−１  Ｔａｔおよびアンテナペディアなどのアルギニン・リッチ膜浸透性キャリアーペプチドの補助で、外因性タンパク質を生存細胞内に搬送する方法が開発されてきている（Ｆｕｔａｋｉら、上記、および該文献に引用される参考文献を参照されたい）。したがって、遺伝子的にまたは化学的に、これらのキャリアーペプチドと上述のような生物学的活性剤をハイブリダイズさせることによって、粘膜搬送を増進する、さらなる方法および組成物が本発明内で提供される。
【０２８８】
ポリマー搬送ビヒクルおよび方法
本発明の特定の側面内で、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、本明細書に開示する他の生物学的活性剤、並びに上述のような搬送増進剤は、個々にまたは組合せて、キャリアーまたは基剤として機能する生体適合ポリマーを含み、粘膜（例えば鼻内）投与される配合物内に取り込まれる。こうしたポリマー・キャリアーには、他のポリマー型の中で、ポリマー粉末、マトリックスまたは微小粒子搬送ビヒクルが含まれる。ポリマーは、植物、動物または合成起源のものであることも可能である。しばしば、ポリマーは架橋される。さらに、これらの搬送系において、生物学的活性剤（例えばＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体または模倣体）は、ポリマーに共有結合し、そして単純な洗浄によってはポリマーから分離不能であるようにしうる方式で、官能化可能である。他の態様において、生物学的活性剤（単数または複数）および／または搬送増進剤（単数または複数）を分解または不活性化しうる、酵素または他の剤の阻害剤で、ポリマーを化学的に修飾する。特定の配合物において、ポリマーは、部分的にまたは完全に水不溶性であるが、水膨張性であるポリマー、例えばヒドロゲルである。本発明のこの側面において有用なポリマーは、望ましくは水相互作用可能であり、そして／または性質が親水性でかなりの量の水を吸収し、そしてしばしば水との平衡に達するのに十分な期間、水または水性媒体と接触させると、ヒドロゲルを形成する。より詳細な態様において、ポリマーは、過剰な水と接触させると、室温で水に曝露した際、平衡状態で、少なくとも２倍の重量の水を吸収する（例えば米国特許第６，００４，５８３号を参照されたい）。
【０２８９】
生物分解性ポリマーに基づく薬剤搬送系が多くの生物医学適用において好ましく、これはこうした系が加水分解または酵素反応いずれかによって、非毒性分子に分解されるためである。分解速度は、生物分解性ポリマー・マトリックスの組成を操作することによって調節される。したがって、これらの種類の系は、生物学的活性剤の長期放出のための特定のセッティングで使用可能である。ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、およびポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの生物分解性ポリマーは、これらのポリマーの分解産物が、低毒性であることが見出されているため、ありうる薬剤搬送キャリアーとして、かなりの注目を集めてきた。体の通常の代謝機能の間、これらのポリマーは二酸化炭素および水に分解する（Ｍｅｈｔａら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ２９：３７５−３８４，  １９９４）。これらのポリマーはまた、優れた生体適合性も示している。
【０２９０】
ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤とともに、場合による搬送増進剤の生物学的活性を延長させるため、これらの剤を、ポリマー性マトリックス、例えばポリオルトエステル、ポリ無水物、またはポリエステル内に取り込むことも可能である。これによって、例えばポリマー・マトリックスの分解によって測定されるように、活性持続および活性剤（単数または複数）の放出が生じる（Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ｐｐ．２９２−３０５，  Ｃｌｅｌａｎｄら監修，  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５６７，  ワシントンＤＣ，  １９９４；Ｔａｂａｔａら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １０：４８７−４９６，  １９９３；およびＣｏｈｅｎら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ８：７１３−７２０，  １９９１）。生物療法分子を合成ポリマー内部に被包すると、保存および搬送中、該分子は安定化されうるが、ポリマーに基づく放出技術の最大の問題は、しばしば、熱、超音波処理または有機溶媒を伴う、配合プロセス中で、療法分子の活性が喪失することである（Ｔａｂａｔａら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １０：４８７−４９６，  １９９３；およびＪｏｎｅｓら，  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｓｓｕｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  Ｃｏｎｃｅｐｔ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ，  Ｖｏｌ．４，  ｐｐ．５７−６７，  Ｌｅｅら監修，  Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９５）。
【０２９１】
本発明内で使用するために意図される吸収促進ポリマーは、改変、修飾または混合が、水吸収、ヒドロゲル形成および／または有用な適用のための化学的安定性などの望ましい特性に不都合に影響を及ぼさない限り、天然存在または合成ポリマー、ゴム、樹脂、および他の剤に加えて、前述の種類のポリマーの誘導体および化学的または物理的修飾型とともに、これらの物質の互いの混合物または他のポリマーとの混合物を含むことも可能である。本発明のより詳細な側面において、ナイロン、アクリランおよび他の通常は疎水性の合成ポリマーなどのポリマーを、こうしたポリマーが水膨張性になり、そして／または水性媒体中で安定なゲルを形成する反応によって、十分に修飾することも可能である。
【０２９２】
本発明内で使用するのに適したポリマーは、一般的に、単独で、そして選択される生物学的活性剤（単数または複数）および粘膜配合物のさらなる構成要素と組み合わせて安定であり、そして約ｐＨ１〜ｐＨ１０のｐＨ条件範囲で安定なヒドロゲルを形成しなければならない。より典型的には、これらは、さらなる保護コーティングなしに、約３〜９の範囲のｐＨ条件下で、安定であり、そしてポリマーを形成しなければならない。しかし、望ましい安定特性は、搬送標的部位（例えば鼻粘膜または全身循環などの二次搬送部位）に特徴的な生理学的パラメーターに適応可能である。したがって、特定の配合物において、特定のｐＨで、そして選択される化学的環境または生物学的環境において、より高いまたはより低い安定性であることがより望ましいであろう。
【０２９３】
本発明の吸収促進ポリマーは、以下のビニル単量体の多様な組み合わせに基づく、ホモポリマーおよびコポリマー群由来のポリマーを含むことも可能である：アクリル酸およびメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレートまたはメタクリレート、ビニルピロリドン類とともにポリビニルアルコールおよびそのコポリマーおよびターポリマー、ポリビニルアセテート、上記単量体とのそのコポリマーおよびターポリマー、並びに２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ（登録商標））。非常に有用なのは、アクリルまたはメタクリルアミドアクリレートまたはメタクリレートエステルなどのコポリマー化可能な官能性単量体と上記単量体のコポリマーであり、ここで、エステル基は、直鎖または分枝鎖アルキル、１〜６炭素のアルキル置換基を含有可能な、４までの芳香環を有するアリール；ステロイド単量体、サルフェート単量体、ホスフェート単量体、またはカチオン性単量体、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアミノアルキルアクリルアミド（メタクリルアミド）、ジメチルアミノアルキルアクリレート（メタクリレート）、アクリル（メタクリル）オキシアルキルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリル（メタクリル）オキシアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド由来である。
【０２９４】
本発明内で使用するためのさらなる吸収促進ポリマーは、デキストラン、デキストリンとして分類されるものであり、そして天然ゴムおよび樹脂として分類される物質種に由来するか、または天然ポリマー種、例えばプロセシングされたコラーゲン、キトサン、プララン（ｐｕｌｌａｌａｎ）、ズーグラン（ｚｏｏｇｌａｎ）、アルギネート類および修飾アルギネート類、例えば「Ｋｅｌｃｏｌｏｉｄ（ポリプロピレングリコール修飾アルギネート）」ジェランゴム、例えば「Ｋｅｌｏｃｏｇｅｌ」、キサンチンゴム、例えば「Ｋｅｌｔｒｏｌ」、エスタチン、アルファ・ヒドロキシ酪酸、およびそのコポリマー、ヒアルロン酸およびその誘導体、ポリ乳酸およびグリコール酸に由来する。
【０２９５】
本発明内で適用可能な非常に有用なポリマー種は、少なくとも１つの活性化炭素−炭素オレフィン二重結合、および少なくとも１つのカルボキシル基を含有するオレフィン不飽和カルボン酸であり；すなわち酸または官能基は、オレフィン二重結合を含有する酸に容易に変換され、このオレフィン二重結合が、カルボキシル基に関してアルファ−ベータ位にあるか、または末端メチレン基の一部としてあるか、いずれかで、単量体分子に存在するために、重合において容易に機能する。この種のオレフィン不飽和酸には、アクリル酸自体、アルファ−シアノアクリル酸、ベータ・メタクリル酸（クロトン酸）、アルファ−フェニルアクリル酸、ベータ−アクリルオキシプロピオン酸、シンナミン酸、ｐ−クロロ・シンナミン酸、１−カルボキシ−４−フェニルブタジエン−１，３−イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、グルタコン酸、アコニット酸、マレイン酸、フマル酸、およびトリカルボキシエチレンに代表される、アクリル酸などの物質が含まれる。本明細書において、用語「カルボン酸」には、ポリカルボン酸および無水マレイン酸などのこうした酸の無水物が含まれ、無水物基は、同一カルボン酸分子上に位置する２つのカルボキシル基から水１分子を除去することによって形成される。
【０２９６】
本発明内の吸収促進剤として有用な代表的なアクリレートには、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸イソプロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸イソブチル、メタクリル酸メチル、エタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、アクリル酸オクチル、アクリル酸ヘプチル、メタクリル酸オクチル、メタクリル酸イソプロピル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ノニル、アクリル酸ヘキシル、メタクリル酸ｎ−ヘキシル等が含まれる。より高次のアルキルアクリル酸エステルは、アクリル酸デシル、メタクリル酸イソデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸ベヘニルおよびアクリル酸メリシルおよびそのメタクリル酸型である。２または３またはそれより多い長鎖アクリル酸エステルの混合物は、カルボン酸単量体の１つと重合可能である。他のコ単量体には、アルファ・オレフィンを含むオレフィン、ビニルエステル、ビニルエーテル、およびその混合物が含まれる。
【０２９７】
アクリロニトリルを含む他のビニリデン単量体もまた、本発明の方法および組成物内で吸収促進剤として用いて、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤（単数または複数）の搬送および吸収を増進可能であり、これには、被検体における標的組織または区画（例えば全身循環またはＣＮＳ）への活性剤（単数または複数）の搬送を増進することが含まれる。有用なアルファ、ベータ−オレフィン不飽和ニトリルは、好ましくは、アクリロニトリル、メタクリロニトリルなどの、３〜１０炭素原子を有する単オレフィン不飽和ニトリルである。最も好ましいのは、アクリロニトリルおよびメタクリロニトリルである。単オレフィン不飽和アミドを含む３〜３５炭素原子を含有するアクリル酸アミドもまた、使用可能である。代表的なアミドには、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ−シクロヘキシルアクリルアミド、より高次のアルキルアミド類が含まれ、ここで窒素上のアルキル基は８〜３２炭素原子を含有し、アクリル酸アミドには、４〜１０炭素原子を有するものを含む、アルファ、ベータ−オレフィン不飽和カルボン酸のＮ−アルキルオールアミドが含まれ、例えばＮ−メチルオールアクリルアミド、Ｎ−プロパノールアクリルアミド、Ｎ−メチルオールメタクリルアミド、Ｎ−メチルオールマレイミド、Ｎ−メチルオールマレアミド酸エステル、Ｎ−メチルオール−ｐ−ビニルベンズアミド等が含まれる。
【０２９８】
さらなる有用な吸収促進物質は、当業者に知られるように、２〜１８炭素原子、より好ましくは２〜８炭素原子を含有するアルファ−オレフィン類；４〜１０炭素原子を含有するジエン類；酢酸ビニルなどのビニルエステルおよびアリルエステル；スチレン、メチルスチレン、およびクロロ−スチレンなどのビニル芳香族；ビニルメチルエーテルおよびメチルビニルケトンなどのビニルおよびアリルエーテル類およびケトン類；クロロアクリレート類；アクリル酸アルファ−シアノメチル、およびアクリル酸アルファ−、ベータ−、およびガンマ−シアノプロピルなどのアクリル酸シアノアルキル；アクリル酸メトキシエチルなどのアルコキシアクリレート；アクリル酸クロロエチルなどのハロアクリレート；ハロゲン化ビニルおよび塩化ビニル、塩化ビニリデン等；ジビニルエーテル、ジアクリル酸ジエチレングリコール、ジメタクリル酸エチレングリコール、メチレン−ビス−アクリルアミド、アリルペンタエリスリトール等のジビニル、ジアクリレートおよび他の多官能単量体；並びにビス（ベータ−クロロエチル）ビニルホスホネートなどのビス（ベータ−ハロアルキル）アルケニルホスホネート等である。カルボキシ含有単量体が重要でない構成要素であり、そして他のビニリデン単量体が主要構成要素として存在する、コポリマーは、他の本明細書に開示する方法にしたがって容易に調製される。
【０２９９】
ヒドロゲルを本発明内で吸収促進剤として使用する場合、これらは、水相互作用性であり、そして水膨張性である、アクリル酸およびメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート（ＨＥＡ）またはヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、およびビニルピロリドン類の群由来の合成コポリマーで構成されることが可能である。特にペプチドまたはタンパク質の搬送に有用なポリマーの特別な実例となる例は、以下の種類のポリマーである：アクリル（メタクリル）アミドおよび０．１〜９９重量％のアクリル（メタクリル）酸；アクリル（メタクリル）アミドおよび０．１〜７５重量％のアクリル（メタクリル）オキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド；アクリル（メタクリル）アミドおよび０．１〜７５重量％のアクリル（メタクリル）アミド；アクリル酸および０．１〜７５重量％のアルキルアクリレート（メタクリレート）；アクリル（メタクリル）アミドおよび０．１〜７５重量％のＡＭＰＳ．ＲＴＭ．（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ  Ｃｏｒｐ．の登録商標）；アクリル（メタクリル）アミドおよび０〜３０重量％のアルキルアクリル（メタクリル）アミドおよび０．１〜７５重量％のＡＭＰＳ．ＲＴＭ．；アクリル（メタクリル）アミドおよび０．１〜９９重量％のＨＥＭＡ；アクリル（メタクリル）アクリルアミドおよび０．１〜７５重量％のＨＥＭＡおよび０．１〜９９重量％のアクリル（メタクリル）酸；アクリル（メタクリル）酸および０．１〜９９重量％のＨＥＭＡ；５０モル％のビニルエーテルおよび５０モル％の無水マレイン酸；アクリル（メタクリル）アミドおよび０．１〜７５重量％のアクリル（メタクリル）オキシアルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；アクリル（メタクリル）アミドおよび０．１〜９９重量％のビニルピロリドン；アクリル（メタクリル）アミドおよび５０重量％のビニルピロリドンおよび０．１〜９９．９重量％のアクリル（メタクリル）酸；アクリル（メタクリル）酸および０．１〜７５重量％のＡＭＰＳ．ＲＴＭ．および０．１〜７５重量％のアルキルアクリル（メタクリル）アミド。上記の例において、アルキルは、Ｃ1〜Ｃ30、好ましくはＣ1〜Ｃ22の直鎖および分枝アルキル、並びにＣ4〜Ｃ16環状アルキルを意味し；（メタクリル）を用いた箇所では、メチル基を含むおよび含まない単量体が含まれることを意味する。他の非常に有用なヒドロゲルポリマーは、膨張性であるが、不溶性型のポリ（ビニルピロリドン）デンプン、カルボキシメチルセルロースおよびポリビニルアルコールである。
【０３００】
本発明内で有用なさらなるポリマー性ヒドロゲル物質には、（ポリ）ヒドロキシアルキルアクリレート（メタクリレート）：アニオン性およびカチオン性ヒドロゲル：ポリ（電解質）複合体；アセテート残渣が少ないポリ（ビニルアルコール）：架橋寒天および架橋カルボキシメチルセルロースの膨張性混合物；控えめに架橋された寒天と混合されたメチルセルロースを含んでなる膨張性組成物；スチレン、エチレン、プロピレン、またはイソブチレンと無水マレイン酸の細かく分割されたコポリマーの分散によって産生される水膨張性コポリマー；Ｎ−ビニルラクタムの水膨張性ポリマー；カルボキシメチルセルロースの膨張性ナトリウム塩等が含まれる。
【０３０１】
本発明内で、生物学的活性剤の粘膜搬送のための親水性ヒドロゲルを形成するのに有用な、他のゲル化可能（ｇｅｌａｂｌｅ）で液体を吸収しそして保持するポリマーには、ペクチン；寒天、アラビアゴム、カラヤ、トラガカント、アルギン類およびグアール、並びにその架橋型などの多糖；アクリル酸ポリマー、コポリマーおよび塩誘導体、ポリアクリルアミド；水膨張性インデン無水マレイン酸ポリマー；デンプン・グラフト・コポリマー；元来の重量の約２〜４００倍の水吸収度を持つアクリレート型ポリマーおよびコポリマー；ポリグルカンのジエステル；架橋ポリ（ビニルアルコール）およびポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）の混合物；ポリオキシブチレン−ポリエチレンブロックコポリマーゲル；イナゴマメ（ｃａｒｏｂ）ゴム；ポリエステルゲル；ポリ尿素ゲル；ポリエーテルゲル；ポリアミドゲル；ポリイミドゲル；ポリペプチドゲル；ポリアミノ酸ゲル；ポリセルロースゲル；架橋インデン無水マレイン酸アクリレートポリマー；および多糖が含まれる。
【０３０２】
本発明内で使用するための合成ヒドロゲルポリマーは、いくつかの比で、いくつかの単量体の無限の組み合わせによって作成可能である。ヒドロゲルは架橋可能であり、そして一般的に、液体を吸収し、そして膨張するかまたは拡大されて増大した平衡状態になる能力を所持する。ヒドロゲルは、典型的には、鼻粘膜表面に搬送された際、その重量の約２〜５倍、５〜１０倍、１０〜５０倍、５０〜１００倍またはそれ以上の水を吸収して、膨張するか、または拡大される。規定のヒドロゲルの膨張度の最適な度合いは、ポリマー内に捕捉されるかまたは被包されて運ばれる活性剤の分子量、サイズ、可溶性および拡散特性、並びに個々のポリマー各々に関連する特定の間隔および協調した鎖の動きに応じて、異なる生物学的活性剤に関して決定されるであろう。
【０３０３】
本発明内で有用な親水性ポリマーは、水不溶性であるが、水膨張性である。こうした水膨張性ポリマーは、典型的にはヒドロゲルまたはゲルと称される。こうしたゲルは、好適に、適切な架橋剤でポリマーを架橋するプロセスによって、水溶性ポリマーから産生可能である。しかし、安定ヒドロゲルもまた、当該技術分野に既知の方法にしたがって、ｐＨ、温度および／またはイオン濃度の定義される条件下で、特定のポリマーから形成可能である。典型的には、ポリマーは架橋され、すなわちポリマーが優れた親水特性を所持し、改善された物理的完全性（同一種または類似種の非架橋ポリマーに比較して）を有し、そして目的の生物学的活性剤、およびサイトカインまたは酵素阻害剤などのそれと同時投与するさらなる化合物両方をゲルネットワーク内で保持しつつ、適切な位置および時間に活性剤（単数または複数）を放出する能力を保持する、改善された能力を示す度合いに架橋される。
【０３０４】
一般的に、本発明内で使用するためのヒドロゲルポリマーは、コポリマーを形成する単量体の重量に基づいて、０．０１〜２５重量パーセントの量の二官能性架橋剤、そしてより好ましくは、０．１〜２０重量パーセントの架橋剤、そしてよりしばしば０．１〜１５重量パーセントの架橋剤で架橋される。架橋剤の別の有用な量は０．１〜１０重量パーセントである。トリ、テトラまたはより高次の多官能架橋剤もまた使用可能である。こうした試薬を利用する際、同等の架橋密度、すなわち生物学的活性剤（単数または複数）を効果的に含有するのに十分な架橋の度合い、またはネットワーク特性を得るには、より少ない量が必要でありうる。
【０３０５】
架橋は、水含有液体の存在下で膨張する能力を所持するポリマーとの共有結合、イオン結合または水素結合であることも可能である。こうした架橋剤および架橋反応は当業者に知られ、そして多くの場合、ポリマー系に依存する。したがって、架橋ネットワークは、不飽和単量体のフリーラジカルコポリマー化によって形成可能である。ポリマー性ヒドロゲルはまた、アルコール、酸、アミンなどのポリマー上に見られる官能基と、グリオキサール、ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド、ビス無水物などの基を反応させることによって、あらかじめ形成されたポリマーを架橋することによっても形成可能である。
【０３０６】
ポリマーはまた、ポリエンいずれか、例えばデカジエンまたはトリビニルシクロヘキサン；Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス（アクリルアミド）などのアクリルアミド類；トリメチルオール・プロパン・トリアクリレートなどの多官能アクリレート類；あるいは、例えばジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、アクリル酸アリル等を含む、少なくとも２つの末端ＣＨ2＜基を含有する多官能ビニリデン単量体とも架橋可能である。特定の態様において、コポリマーを調製するのに使用する架橋単量体は、分子あたり１より多いアルケニルエーテル基を有するポリアルケニルポリエーテルであり、場合によって、オレフィン二重結合が末端メチレン基に付着して存在するアルケニル基（例えば少なくとも２つの炭素原子および少なくとも２つのヒドロキシル基を含有する多価アルコールのエーテル化によって作成）を所持することが可能である。この種の化合物は、塩化アリルまたは臭化アリルなどのハロゲン化アルケニルを、１以上の多価アルコールの非常にアルカリ性の水性溶液と反応させることによって、産生可能である。産物は、多様な数のエーテル基とポリエーテルの複合混合物であることも可能である。ポリエーテル架橋剤の有効性は、分子上の潜在的に重合可能な基の数とともに増加する。典型的には、分子あたり、平均２以上のアルケニルエーテル基を含有するポリエーテルを用いる。他の架橋単量体には、例えば、ジアリルエステル、ジメタリルエーテル、アクリル酸アリルまたはアクリル酸メタリル、およびアクリルアミド、テトラビニルシラン、ポリアルケニルメタン、ジアクリレートおよびジメタクリレート、ジビニルベンゼンなどのジビニル化合物、リン酸ポリアリル、ジアリルオキシ化合物およびホスファイトエステル等が含まれる。典型的な剤は、アリルペンタエリスリトール、アリル・スクロース、トリアクリル酸トリメチルオールプロパン、ジアクリル酸１，６−ジヘキサンジオール、トリメチルオールプロパン・ジアリルエーテル、トリアクリル酸ペンタエリスリトール、ジメタクリル酸テトラメチレン、ジアクリル酸エチレン、ジメタクリル酸エチレン、ジメタクリル酸トリエチレングリコール等である。アリルペンタエリスリトール、トリメチルオールプロパン・ジアリルエーテルおよびアリル・スクロースは、適切なポリマーを提供する。架橋剤が存在する場合、ポリマー混合物は、通常、他の単量体に加えて、カルボン酸単量体の総量に基づいて、架橋単量体を、重量にして、約０．０１〜２０重量パーセント、例えば１％、５％、または１０％以上含有する。
【０３０７】
本発明のより詳細な側面において、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤の粘膜搬送は、徐放、あるいは酵素的または生理学的に保護性であるキャリアーまたはビヒクル、例えば分解酵素の作用から活性剤を保護するヒドロゲル中に、活性剤（単数または複数）を保持することによって、増進される。特定の態様において、活性剤は、化学的手段によって、キャリアーまたはビヒクルに結合され、これにまた、酵素阻害剤、サイトカインなどのさらなる剤を混合するかまたは結合させることも可能である。キャリアーまたはビヒクル、例えばポリマー・マトリックス内で、十分な物理的捕捉を通じて、活性剤を交互に固定することも可能である。
【０３０８】
本発明内で有用なヒドロゲルなどのポリマーは、ともに配合される活性剤の鼻内生物学的利用能を増進させるポリマー内に化学的に取り込まれる配糖体などの機能する連結剤を取り込むことも可能である。こうした配糖体の例は、グルコシド、フルクトシド、ガラクトシド、アラビノシド、マンノシドおよびそのアルキル置換誘導体、並びにアルブチン、フロリジン、アミグダリン、ジギトニン、サポニン、およびインジカンなどの天然配糖体がある。典型的な配糖体をポリマーに結合しうる、いくつかの方法がある。例えば配糖体または他の類似の炭水化物のヒドロキシル基の水素をヒドロゲルポリマー由来のアルキル基で置き換えて、エーテルを形成することも可能である。また、配糖体のヒドロキシル基を反応させて、ポリマー性ヒドロゲルのカルボキシル基をエステル化して、ｉｎ  ｓｉｔｕでポリマー性エステルを形成可能である。別のアプローチは、アセトブロモグルコースと、マレイン酸のコポリマー上のコレスト−５−エン−３−ベータ−オールの縮合を使用することである。活性化ポリマーと、オメガ−アミノアルキル配糖体：（１）（炭水化物−スペーサー）（ｎ）−ポリアクリルアミド、「偽多糖」；（２）（炭水化物スペーサー）（ｎ）−ホスファチジルエタノールアミン（ｍ）−ポリアクリルアミド、ネオ糖脂質、ホスファチジルエタノールアミンの誘導体；（３）（炭水化物−スペーサー）（ｎ）−ビオチン（ｍ）−ポリアクリルアミドを反応させることによって、Ｎ−置換ポリアクリルアミドを合成可能である。これらのビオチン化誘導体を粘膜表面上のレクチンに付着させて、生物学的活性剤（単数または複数）、例えばポリマー被包ＪＡＭタンパク質またはペプチドの吸収を促進することも可能である。
【０３０９】
本発明のより詳細な側面内で、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに／あるいは本明細書に開示する他の生物学的活性剤は、場合によって、プロテアーゼ阻害剤（単数または複数）、サイトカイン（単数または複数）、細胞間接合部生理機能のさらなる調節因子（単数または複数）等の二次活性剤を含み、これを修飾してそしてポリマー性キャリアーまたはマトリックスに結合させる。例えば、これは、架橋ポリマーネットワーク内で、ペプチドまたはタンパク質活性剤および他の場合による剤（単数または複数）を化学的に結合することによって、達成可能である。配糖体含有分子などの相互作用剤を用いて、ポリマーを別個に化学修飾することも可能である。特定の側面において、生物学的活性剤（単数または複数）、および場合による二次活性剤（単数または複数）を官能化可能であり、すなわち、適切な反応基を同定するか、または活性剤（単数または複数）に化学的に付加する。最もしばしば、エチレン性重合可能基を付加し、そしてその後、溶液重合（通常、水中）、エマルジョン、懸濁物または分散重合などの標準重合法を用いて、官能化活性剤を単量体および架橋剤とコポリマー化する。しばしば、官能化剤は、活性剤（単数または複数）上のいくつかの部位が官能化されることを確実にするため、十分に高濃度の官能基または重合可能基とともに提供される。例えば、１６アミン部位を含んでなるポリペプチドにおいて、一般的に、少なくとも２、４、５、７、８までまたはそれより多い前記部位で官能化することが望ましい。
【０３１０】
官能化後、官能化活性剤（単数または複数）を、単量体および目的のポリマーを形成する試薬を含んでなる架橋剤と混合する。その後、この培体中で重合を誘導して、結合した活性剤（単数または複数）を含有するポリマーを生成する。その後、ポリマーを水または他の適切な溶媒で洗浄し、そして別の方式で精製して、微量の未反応不純物を取り除き、そして必要ならば、攪拌、メッシュへの押し付け、超音波または他の適切な手段などの物理的手段によって砕くかまたは破壊して、望ましい粒子サイズにする。その後、活性剤（単数または複数）を変性させず、または別の方式で分解させない方式で、溶媒、通常は水を除去する。１つの望ましい方法は、凍結乾燥（フリーズドライ）であるが、他の方法が利用可能であり、そして使用可能である（例えば真空乾燥、空気乾燥、スプレー乾燥など）。
【０３１１】
本発明内のペプチド、タンパク質および他の活性剤に重合可能基を導入するため、利用可能なアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基および他の反応基を、不飽和基を含有する求電子物質と反応させることが可能である。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル基、活性カーボネート、例えばｐ−ニトロフェニルカーボネート、トリクロロフェニルカーボネート類、トレシレート、オキシカルボニルイミダゾール類、エポキシド、イソシアネート類およびアルデヒド、並びに不飽和カルボキシメチルアジド類および不飽和オルトピリジル−ジスルフィドを含有する不飽和単量体が、試薬のこのカテゴリーに属する。不飽和試薬の実例となる例は、アリル・グリシジル・エーテル、塩化アリル、臭化アリル、ヨウ化アリル、塩化アクリロイル、アリル・イソシアネート、塩化アリルスルホニル、無水マレイン酸、無水マレイン酸およびアリルエーテルのコポリマー等である。
【０３１２】
すべてのリジン活性誘導体は、アルデヒドを除いて、一般的に、局所環境が、これらの基の求核性を増進させるならば、ヒスチジンのイミダゾール基およびチロシンのヒドロキシル基およびシスチンのチオール基などの他のアミノ酸と反応可能である。アルデヒド含有官能化試薬は、リジンに特異的である。リジン、システイン、チロシン由来の利用可能な基とのこれらの種類の反応は、文献に豊富に文書化され、そして当業者に知られる。
【０３１３】
アミン基を含有する生物学的活性剤の場合、こうした基を塩化アクリロイルなどの塩化アシロイルと反応させ、そして反応させた剤上に重合可能アクリル基を導入することが好適である。その後、ポリマー調製中、例えばアクリルアミドおよびアクリル酸のコポリマーの架橋中、官能化活性剤を、アクリル基を通じて、ポリマーに付着させ、そして結合させる。
【０３１４】
本発明のさらなる側面において、親水性部分、例えば直鎖ポリアルキレングリコールと、親油性部分の両方を一体化された部分として取り込むポリマーに、１以上の活性剤（単数または複数）を共有結合することによって、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、およびｉｎ  ｖｉｖｏで生物活性である他の分子を含む生物学的活性剤を、コンジュゲート化して安定化する（例えば米国特許第５，６８１，８１１号を参照されたい）。１つの側面において、生物学的活性剤を、（ｉ）直鎖ポリアルキレングリコール部分および（ｉｉ）親油性部分を含んでなるポリマーに共有結合させ、ここで、活性剤、直鎖ポリアルキレングリコール部分、および親油性部分は、活性療法剤が、酵素分解に対して、増進したｉｎ  ｖｉｖｏ抵抗性を有する（すなわちカップリングしたポリマーを欠く非コンジュゲート化型の同様の条件下での安定性に比較して）ように、互いに関してコンホメーション的に配置される。別の側面において、コンジュゲート化安定化配合物は、（ｉ）直鎖ポリアルキレングリコール部分および（ｉｉ）親油性部分を含んでなるポリソルベート複合体に共有結合した生物学的活性剤を含んでなる三次元コンホメーションを有し、ここで、活性剤、直鎖ポリアルキレングリコール部分、および親油性部分は、（ａ）親油性部分が三次元コンホメーション中、外部で利用可能であり、そして（ｂ）組成物中の活性剤が、酵素分解に対して、増進したｉｎ  ｖｉｖｏ抵抗性を有するように、互いに関してコンホメーション的に配置される。
【０３１５】
さらなる関連した側面において、マルチリガンドコンジュゲート化複合体を提供し、該複合体は、トリグリセリド主鎖部分の炭素原子で結合したポリアルキレングリコールスペーサー基を通じてトリグリセリド主鎖部分と共有結合した生物学的活性剤、およびトリグリセリド主鎖部分の炭素原子に直接共有結合するか、またはポリアルキレングリコールスペーサー部分を通じて共有結合した、少なくとも１つの脂肪酸部分を含んでなる（例えば米国特許第５，６８１，８１１号を参照されたい）。こうしたマルチリガンドコンジュゲート化療法剤複合体において、トリグリセリド生物活性部分のアルファ’およびベータ炭素原子は、直接共有結合するか、またはポリアルキレングリコールスペーサー部分を通じて間接的に共有結合することによって付着した脂肪酸部分を有しうる。あるいは、脂肪酸部分は、直接またはポリアルキレングリコールスペーサー部分を通じて、いずれかで、トリグリセリド主鎖部分のアルファおよびアルファ’炭素に共有結合可能であり、生物活性療法剤は、直接共有結合するか、またはポリアルキレンスペーサー部分を通じて間接的に共有結合するか、いずれかで、トリグリセリド主鎖部分のガンマ炭素と共有結合する。本発明の範囲内のトリグリセリド主鎖部分を含んでなるマルチリガンドコンジュゲート化療法剤複合体には、非常に多様な構造型、組成型およびコンホメーション型が可能であることが認識されるであろう。本発明の範囲内で、こうしたマルチリガンドコンジュゲート化療法剤複合体において、生物学的活性剤（単数または複数）は、アルキルスペーサー基、または他の許容しうるスペーサー基を通じて、トリグリセリド修飾主鎖部分と好適に共有結合可能であることがさらに注目される。こうした背景において用いられる際、スペーサー基の許容性は、立体的許容特性、組成的許容特性、および最終用途適用に特徴的な許容特性を指す。
【０３１６】
本発明のさらなる側面において、コンジュゲート化安定化複合体であって、アルファ、アルファ’およびベータ炭素原子に、官能化基が共有結合したトリグリセリド主鎖を含むポリソルベート部分を含んでなるポリソルベート複合体を含んでなる複合体を提供し、官能化基は、（ｉ）脂肪酸基；および（ｉｉ）生物学的活性剤または部分が共有結合したポリエチレングリコール基、例えば生物学的活性剤または部分がポリエチレングリコール基の適切な官能性に結合したポリエチレングリコール基を含む（例えば米国特許第５，６８１，８１１号を参照されたい）。こうした共有結合は、例えばポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端官能性に直接結合するものであることも可能であるし、または共有結合は、間接的であることも可能であり、例えば生じるキャップ化ポリエチレングリコール基が、生物学的活性剤または部分が共有結合可能な末端カルボキシ官能性を有するように、末端カルボキシ官能性スペーサー基を用いて、ポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端を反応性にキャップ化することによることも可能である。
【０３１７】
本発明のさらなる側面において、生理学的に適合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾糖脂質部分に共有結合した、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに／あるいは本明細書に開示する他の生物学的活性剤（単数または複数）を含んでなり、安定で水溶性である、コンジュゲート化安定化複合体を提供する。こうした複合体において、生物学的活性剤（単数または複数）の遊離アミノ酸基で、不安定な共有結合によって、生理学的に適合可能なＰＥＧ修飾糖脂質部分に共有結合させることも可能であり、ここで、不安定な共有結合は、生化学的加水分解および／またはタンパク質分解によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断可能である。生理学的に適合可能なＰＥＧ修飾糖脂質部分は、ポリソルベート・ポリマー、例えばモノパルミテート、ジパルミテート、モノラウレート、ジラウレート、トリラウレート、モノオレエート、ジオレエート、トリオレエート、モノステアレート、ジステアレート、およびトリステアレートからなる群より選択される脂肪酸エステル基を含んでなるポリソルベート・ポリマーを好適に含んでなることも可能である。こうした複合体において、生理学的に適合可能なＰＥＧ修飾糖脂質部分は、脂肪酸のポリエチレングリコールエーテル、および脂肪酸のポリエチレングリコールエステルからなる群より選択されるポリマーを適切に含んでなることも可能であり、ここで、脂肪酸は、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸およびステアリン酸からなる群より選択される脂肪酸を含んでなる。
【０３１８】
生物接着搬送ビヒクルおよび方法
本発明の特定の側面において、本明細書の組み合わせ配合物および／または協調投与法は、１以上の生物学的活性剤（単数または複数）の粘膜搬送を増進する付属化合物またはキャリアーとして、有効量の非毒性生物接着剤を取り込む。この背景において、生物接着剤は、標的とする粘膜の１以上の構成要素または表面に一般的なまたは特異的な接着を示す。生物接着剤は、生物学的活性剤の望ましい濃度勾配を維持して、大きな分子（例えばペプチドおよびタンパク質）さえも、粘膜上皮内に、または粘膜上皮を通り抜けて、浸透することを確実にする。典型的には、本発明の方法および組成物内の生物接着剤の使用は、粘膜上皮内へのまたは粘膜上皮を通り抜けるペプチドおよびタンパク質の浸透性において、２倍〜５倍、しばしば５倍〜１０倍の増加を生じる。上皮浸透のこの増進は、しばしば、大きな巨大分子の、例えば鼻上皮の基底部分への、あるいは隣接する細胞外区画内への、または全身循環またはＣＮＳへの有効な経粘膜搬送を可能にする。
【０３１９】
この増進した搬送は、生物活性ペプチド、タンパク質および他の巨大分子療法種搬送の有効性を非常に改善する。これらの結果は、部分的に、化合物の親水性に応じ、このため水不溶性化合物に比較して、親水性種で、より高い浸透が達成されるであろう。これらの効果に加えて、粘膜表面での薬剤持続を増進する生物接着剤の使用によって、持続した薬剤搬送のための貯蔵庫機構を引き出すことも可能であり、この機構のため、化合物は粘膜組織を渡って浸透するだけでなく、表面の物質が枯渇したら、粘膜表面に向かって拡散しなおすことも可能である。
【０３２０】
本発明の新規方法および組成物内で使用を見出す、経口投与に適した多様な生物接着剤が当該技術分野に開示されている（例えば米国特許第３，９７２，９９５号；第４，２５９，３１４号；第４，６８０，３２３号；第４，７４０，３６５号；第４，５７３，９９６号；第４，２９２，２９９号；第４，７１５，３６９号；第４，８７６，０９２号；第４，８５５，１４２号；第４，２５０，１６３号；第４，２２６，８４８号；第４，９４８，５８０号；米国特許再発行第３３，０９３号；およびＲｏｂｉｎｓｏｎ，１８  Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．７５（１９９１））。本発明の方法および組成物内の、粘膜搬送、例えば鼻搬送プラットホームとしての多様な生物接着ポリマーの潜在能力は、特異的生物学的活性剤、例えばＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・ペプチドまたはタンパク質を保持し、そして放出する能力を測定することによって、それとともに、活性剤の取り込み後、粘膜表面と相互作用する能力によって、容易に評価可能である。さらに、周知の方法を適用して、粘膜投与部位の組織と、選択されるポリマーの生体適合性を決定する。ポリマー生体適合性の１つの側面は、サイトカイン反応を誘導する、ポリマーに対する潜在的な影響である。特定の状況において、移植されたポリマーが、単球およびマクロファージなどの接着細胞から炎症性サイトカイン放出を誘導することが示されている。候補生物接着ポリマーと接触させた際の粘膜上皮細胞の類似の潜在的で不都合な反応は、日常的なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて決定されるであろう。上皮細胞は、いくつかのサイトカインを分泌する能力を有するため、上皮細胞におけるサイトカイン反応の誘導は、しばしば、選択されるポリマー搬送プラットホームの生体適合性の適切な測定値を提供するであろう。
【０３２１】
標的粘膜が粘液に覆われている場合（すなわち粘液溶解処理または粘液一掃処理の非存在下で）、粘液は、根底にある粘膜上皮に対する接続連結として働きうる。したがって、用語「生物接着剤」は、本明細書において、本発明内の生物学的活性剤の粘膜搬送を増進するのに有用な粘液接着化合物も含む。しかし、粘液ゲル層への接着を通じて仲介される粘膜組織への接着性接触は、特に迅速な粘液一掃が起こる鼻表面では、粘液層および根底にある組織間の付着が不完全であるか、または一過性であることによって、限定されうる。これに関連して、ムチン糖タンパク質は、連続して分泌され、そして細胞または腺から放出されると直ちに粘弾性ゲルを形成する。しかし、接着ゲル層の管腔表面は、機械的作用、酵素的作用および／または繊毛作用によって、連続して侵食される。こうした活性がより顕著である場合、またはより長い接着時間が望ましい場合、本発明の協調投与法および組み合わせ配合法は、上に開示するような粘液溶解および／または繊毛抑制の方法または剤をさらに取り込むことも可能である。
【０３２２】
本発明の方法および組成物内の生物接着剤および他の搬送増進剤は、有効レベルおよび毒性レベルの間の薬剤濃度を維持するのを補助することによって、搬送地点からの薬剤希釈を阻害し、そして薬剤の標的化および局在を改善することによって、治療の有効性を改善しうる。この背景において、生物接着は、薬剤含有ポリマーおよび粘膜表面間の接触の親密度および期間を増加させる。この増進した直接薬剤吸収、並びに拡散の減少および局在改善から生じる排出速度の減少を組み合わせた効果によって、薬剤の生物学的利用能が有意に増進され、そしてより少量の投薬量およびより頻繁でない投与が可能になる。
【０３２３】
典型的には、本発明内で使用するための粘液接着ポリマーは、天然または合成巨大分子であり、複雑だが非特異的な機構によって、湿った粘膜組織表面に接着する。これらの粘液接着ポリマーに加えて、本発明はまた、受容体仲介相互作用を含む特異的な相互作用によって、粘液よりも細胞表面に直接接着する生物接着剤を取り込む方法および組成物も提供する。この特異的方式で機能する生物接着剤の一例は、レクチンとして知られる化合物群である。これらは、鼻内上皮細胞膜の一部を形成し、そして「レクチン受容体」と見なすことも可能な、糖分子、例えば糖タンパク質または糖脂質を特異的に認識し、そして結合する能力を持つ糖タンパク質である。
【０３２４】
多様な態様において、本発明の協調投与法は、場合によって、粘膜表面で延長した居留時間を生じる生物接着物質を取り込む。あるいは、生物接着物質は、別の方式で、例えば活性の選択される標的部位（例えば血流またはＣＮＳ）への活性剤の局在を促進することによって、生物学的活性剤の粘膜吸収を促進可能である。さらなる側面において、本発明の方法および組成物内の生物接着剤の付属搬送または組み合わせ配合物は、標的粘膜と生物学的活性剤の接触を強化し、これには上皮浸透性を増加させることによるものが含まれる（例えば薬剤濃度勾配を有効に増加させる）。さらなる別の態様において、本明細書に開示する生物接着剤および他のポリマーは、生物学的活性剤を分解しうるタンパク質分解酵素または他の酵素を阻害するよう働く。本発明の協調投与、マルチプロセシングおよび／または組み合わせ配合法および組成物内で有用である生物接着に対する異なるアプローチの概説には、例えば、Ｌｅｈｒ  Ｃ．Ｍ．，  Ｅｕｒ  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ２１（２）：１３９−１４８，  １９９６を参照されたい。
【０３２５】
本発明の特定の側面において、生物学的活性剤の鼻内搬送を増進する生物接着物質は、湿った粘膜表面に接着可能な、親水性、例えば水溶性または水膨張性ポリマーまたはポリマー混合物を含んでなる。これらの接着剤は、軟膏、ヒドロゲル（上記参照）、薄膜、および他の適用型として配合可能である。しばしば、これらの接着剤は、活性剤の持続放出または局所搬送を達成するために混合した、生物学的活性剤を有する。いくつかは、さらなる成分と配合され、鼻粘膜を通り抜ける、例えば個体の循環系への活性剤の浸透を促進する。
【０３２６】
天然または合成両方の多様なポリマーが、生理学的条件下で、粘液および／または粘膜上皮表面に有意な結合を示す。この相互作用の強度は、機械的剥離または剪断試験によって容易に測定可能である。こうした目的を果たすのに適した多様な試験法および装置が当該技術分野に知られる（例えばＧｕら，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｓ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  ５：２１−６７，  １９８８；Ｄｕｃｈｅｎｅら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｒｍ．  １４：  ２８３−３１８，１９８８を参照されたい）。湿った粘膜表面に適用すると、多くの乾燥物質が、少なくともわずかに、自発的に接着するであろう。こうした最初の接触後、いくつかの親水性物質が、吸着、膨張または毛細管力によって水を誘引し、そしてこの水が、根底にある支持体から、またはポリマー−組織界面から吸収される場合、生物学的活性剤の粘膜吸収を増進する目的を達成するのに、この接着が十分でありうる（例えばＡｌ−Ｄｕｊａｉｌｉら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ３４：７５−７９，  １９８６；Ｍａｒｖｏｌａら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ７２：１０３４−１０３６，１９８３；Ｍａｒｖｏｌａら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ７１：９７５−９７７，  １９８２；およびＳｗｉｓｈｅｒら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ２２：２１９，  １９８４；Ｃｈｅｎら，  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ｐ．１７２，  Ｍａｎｌｙ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ロンドン，  １９７０を参照されたい）。こうした「水和による接着」は、非常に強い可能性があるが、この機構を使用するよう適応させた配合物は、投薬型が水和粘液に変形するに連れて膨張し続けなければならない。これは、水和前状態で適用された際は、一般的に非接着性である、本発明内で有用な多くの親水コロイド、特にいくつかのセルロース誘導体に関して推定されてきている。にもかかわらず、粘膜投与のための生物接着薬剤搬送系は、こうした物質を乾燥ポリマー粉末、微小球体の形、または膜型搬送型で適用した際、本発明内で有効である。
【０３２７】
他のポリマーは、乾燥した状態で適用した際のみでなく、完全に水和した状態で適用しても、そして過剰量の水の存在下でも、粘膜表面に接着する。したがって、粘液接着剤の選択は、組織への接触が形成されそして維持される、生理学的条件並びに物理化学的条件の十分な考慮を必要とする。特に、接着の意図される部位に通常存在する水または湿度の量、および一般的なｐＨは、異なるポリマーの粘液接着結合強度に大きな影響を及ぼすことが知られる。
【０３２８】
過去２０年の間に、いくつかのポリマー性生物接着薬剤搬送系が製造され、そして研究されてきているが、常に成功しているわけではない。しかし、こうした多様なキャリアーが、歯科、整形外科、眼科、および外科使用を伴う臨床適用で、現在用いられている。例えば、アクリル酸に基づくヒドロゲルは、生物接着装置に広く用いられてきている。アクリル酸に基づくヒドロゲルは、柔軟性および磨耗防止特性のため、部分的に膨張した状態で、生物接着に非常に適しており、接触した組織に対して損傷が引き起こす抵抗力低下を減少させる［Ｐａｒｋら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２：４７−５７（１９８５）］。さらに、膨張状態で浸透性が高いことから、重合後、未反応単量体、未架橋ポリマー鎖、およびイニシエーターがマトリックスから洗い流されるのを可能にし、これは、本発明内で使用するための生物接着物質選択のため、重要な特徴である。アクリル酸に基づくポリマー装置は、多様な既知の方法によって決定されるように、非常に高い接着結合強度を示す（Ｐａｒｋら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２：４７−５７，  １９８５；Ｐａｒｋら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ４：４５７−４６４，  １９８７；およびＣｈ’ｎｇら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ７４：３９９−４０５，  １９８５）。
【０３２９】
ペプチドおよびタンパク質薬剤の調節された粘膜搬送のため、本発明の方法および組成物は、場合によって、部分的に、タンパク質分解的分解から生物学的活性剤を保護するよう機能する一方、同時に鼻粘膜内へのまたは鼻粘膜を通り抜けるペプチドまたはタンパク質の浸透増進を提供する、キャリアー、例えばポリマー性搬送ビヒクルの使用を含む。この背景において、生物接着ポリマーは、経口薬剤搬送を増進するかなりの潜在能力を示した。例として、粘液接着性ポリ（アクリル酸）誘導体ポリカルボフィルの１％（ｗ／ｖ）生理食塩水分散物とともに、ラットに十二指腸内投与した、９−デスグリシンアミド、８−アルギニン・バソプレッシン（ＤＧＡＶＰ）の生物学的利用能は、このポリマーを含まない該ペプチド薬剤の水性溶液と比較して、３〜５倍増加していた（Ｌｅｈｒら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４４：４０２−４０７，  １９９２）。この研究において、薬剤は配合物中の粘液接着ポリマーと結合せず、または別の方式で一体化して関連せず、したがって粘膜表面への居留時間の延長または接触強化を介して、ペプチド吸収増進が生じるとは予期されなかった。したがって、本発明内で使用するための特定の生物接着ポリマーは、部分的に、活性剤、例えばペプチドまたはタンパク質を、酵素分解から保護することによって、上皮吸収バリアの浸透性を直接増進するのであろう。
【０３３０】
最近の研究によって、ポリ（アクリル酸）型の粘液接着ポリマーが、いくつかの腸プロテアーゼの強力な阻害剤であることが立証された（Ｌｕｅｓｓｅｎら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １２：１２９３−１２９８，  １９９５；Ｌｕｅｓｓｅｎら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ２９：３２９−３３８，  １９９４；およびＢａｉら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．  ８４：  １２９１−１２９４；  １９９５）。酵素阻害の機構は、トリプシンおよびキモトリプシンなどのメタロ−プロテイナーゼの必須補因子である、カルシウムまたは亜鉛などの二価カチオンに対するこの種のポリマーの強い親和性によって説明される。ポリ（アクリル酸）によってプロテアーゼの補因子を枯渇させると、酵素タンパク質の不可逆的な構造変化が誘導され、これには酵素活性損失が伴うことが報告された。同時に、他の粘液接着ポリマー（例えばいくつかのセルロース誘導体およびキトサン）は、特定の条件下で、タンパク質分解酵素を阻害しない可能性がある。比較的小分子である、本発明内での使用を意図する他の酵素阻害剤（例えばアプロチニン、ベスタチン）と対照的に、阻害ポリマーの経鼻吸収は、これらの分子のサイズを考慮すると、最小限であるようであり、そしてそれによって、ありうる副作用が排除される。したがって、粘液接着ポリマー、特にポリ（アクリル酸）型のものは、特に安全性の懸念を考慮する場合、ペプチドおよびタンパク質薬剤の調節された搬送を増進する吸収促進接着剤および酵素保護剤の両方として働きうる。
【０３３１】
酵素分解に対する保護に加えて、本発明内で使用するための生物接着剤および他のポリマー性または非ポリマー性吸収促進剤は、生物学的活性剤に対する粘膜浸透性を直接増加させうる。ペプチドおよびタンパク質など、巨大で、そして親水性の分子の鼻上皮バリアを渡る輸送を促進するため、粘液接着ポリマーおよび他の剤は、搬送系の粘膜前居留時間が延長されることによって説明される効果を越えて、増進した浸透効果を生じると仮定されている。例えば、粘液接着性デンプン微小球体の存在下で、非霊長類哺乳類にインスリンを鼻投与すると、急勾配で増進する初期吸収ピークの後に連続して減少が生じる（Ｂｊｏｒｋら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  ４７：２３３−２３８，  １９８８；Ｆａｒｒａｊら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  １３：２５３−２６２，  １９９０）。薬剤血漿濃度の時間経過によって、生物接着性微小球体が、鼻粘膜を渡るインスリン浸透性の急性であるが一過性の増加を引き起こすと示唆されることが報告された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養上皮細胞単層を用いた他の研究において（Ｂｊｏｒｋら，  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９５）、デンプン微小球体などの乾燥した膨張性物質が、密着結合の可逆的な限局的拡大を誘導し、傍細胞経路に沿った薬剤輸送増進を可能にすると報告された。この接着−脱水理論にしたがって、乾燥粉末として適用した親水性ポリマーは、上皮細胞が脱水され、そして細胞間の通常の密着細胞間結合が物理的に分離されるまで縮む方式で、粘膜組織から水を吸収する。この影響は、比較的短い期間のものであり、そして完全に可逆的であるようであるため、本発明の協調投与、マルチプロセシングおよび／または組み合わせ配合法および組成物内での取り込みのさらに別の有用なツールを提供する。
【０３３２】
本発明内で使用するための他の粘液接着ポリマー、例えばキトサンは、水性溶液またはゲルとして適用しても、特定の粘膜上皮の浸透性を増進させると報告された（Ｌｅｈｒら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．  ７８：４３−４８，  １９９２；Ｉｌｌｕｍら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１：１１８６−１１８９，  １９９４；Ａｒｔｕｒｓｓｏｎら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１：１３５８−１３６１，  １９９４；およびＢｏｒｃｈａｒｄら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ３９：１３１−１３８，  １９９６）。１つの研究において、直腸投与、膣投与および鼻投与後の、ポリ（アクリル酸）の水性ゲル基剤からのペプチド薬剤、インスリンおよびカルシトニン、並びに親水性化合物、フェノールレッドの吸収が報告された（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  １４：１４９−１５７，  １９８３；およびＭｏｒｉｍｏｔｏら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．  １０：８５−９１，  １９８７）。上皮浸透性に直接影響を及ぼすと報告される別の粘液接着ポリマーは、ヒアルロン酸である。特に、ヒアルロン酸ゲル配合物は、バソプレッシンおよびその類縁体のいくつかの鼻吸収を増進させると報告された（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ８：４７１−４７４，  １９９１）。ヒアルロン酸は、糖尿病のイヌにおいて、結膜からのインスリンの吸収を増加させるとも報告された（Ｎｏｍｕｒａら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４６：７６８−７７０，  １９９４）。ヒアルロン酸のエステル誘導体は、凍結乾燥微小球体の形で、インスリンの鼻搬送系として記載された（Ｉｌｌｕｍら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒ．  Ｒｅｌ．  ２９：１３３−１４１，  １９９４）。
【０３３３】
本発明の協調投与および／または組み合わせ配合法および組成物内で特に有用な生物接着剤は、キトサンとともにその類縁体および誘導体である。キトサンは、非毒性生体適合ポリマーおよび生物分解ポリマーであり、毒性が低く、そして生体適合性が優れている好ましい特性から、薬学的および医学的適用に広く用いられている（Ｙｏｍｏｔａ，  Ｐｈａｒｍ．  Ｔｅｃｈ．  Ｊａｐａｎ  １０：５５７−５６４，  １９９４）。キトサンは、アルカリでＮ−脱アセチル化することによって、キチンから調製される天然ポリアミノ糖である。例えば報告される創傷治癒特性、抗菌特性および止血特性に基づいて、過去２０年に渡って、キトサンの非常に多様な生物医学的使用が報告されてきている（Ｋａｓ，  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  １４：６８９−７１１，  １９９７）。キトサンはまた、慣用的な投薬型とともに、生物接着および経粘膜薬剤輸送を伴う新規適用において、薬学的賦形剤としても用いられてきている（Ｉｌｌｕｍ，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １５：１３２６−１３３１，  １９９８；およびＯｌｓｅｎら，  Ｃｈｉｔｉｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｓｏｕｒｃｅｓ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．８１３−８２８，  Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｋら監修，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  ロンドン，  １９８９）。さらに、キトサンは、動物モデルおよびヒト志願者において、鼻粘膜を通じて小さい極性分子並びにペプチドおよびタンパク質薬剤の吸収を促進すると報告されてきている（Ｉｌｌｕｍら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１：１１８６−１１８９，  １９９４）。他の研究によって、腸粘膜および培養Ｃａｃｏ−２細胞を渡る、化合物の浸透に対して増加した効果が示されてきている（Ｓｃｈｉｐｐｅｒら，  Ｐｈａｒｍ．  ｒｅｓ．  １４：２３−２９，  １９９７；およびＫｏｔｚｅら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  １５９：２４３−２５３，  １９９７）。キトサンはまた、経口粘膜薬剤搬送において使用する生物接着ポリマーとしても提唱されてきている（Ｍｉｙａｚａｋｉら，  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  １７：７４５−７４７，  １９９４；Ｉｋｉｎｃｉら，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｔｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｖｏｌ．４，  Ｐｅｔｅｒら監修，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｏｔｓｄａｍ，  印刷中；Ｓｅｎｅｌら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  １９３：１９７−２０３，  ２０００；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．  ２４：３９４−４００，  １９９７）。初期の研究によって、キトサンが口腔粘膜に延長された保持時間を有し（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．  ２５：７４−８２，  １９９８）、そしてその抗菌特性および生体適合性から、口腔粘膜炎治療の優れた候補であることが示された。より最近、Ｓｅｎｅｌら，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２１：２０６７−２０７１，  （２０００）は、キトサンが、生理活性ペプチド、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）の搬送のための有効なゲルキャリアーを提供することを報告した。
【０３３４】
本発明の方法および組成物内で使用する際、キトサンは、適用粘膜部位で、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤の保持を増加させる。これは、部分的に、キトサンに特徴的な陽性電荷によって仲介される可能性があり、この電荷は、表面からキトサンが物理的に除去された後であっても、上皮浸透性に影響を及ぼしうる（Ｓｃｈｉｐｐｅｒら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １４：２３−２９，  １９９７）。粘膜を渡る生物学的活性剤の輸送を改善するための、キトサンの別の作用機構は、極性化合物の浸透を可能にする、細胞膜中の密着結合の一過性開放に起因しうる（Ｉｌｌｕｍら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １１：１１８６−１１８９，  １９９４；Ｌｕｅｂｅｎら，  Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  ２９：３２９−３３８，  １９９４）。キトサンはまた、本発明の特定の配合物で用いる他の吸収促進剤の熱力学的活性も増加させ、増進した浸透を生じうる。最後に、キトサンは腸の脂質ミセルを分解することが報告されている（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉら，  ＥＵＣＨＩＳ’９９，  Ｔｈｉｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｈｉｔｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｂｏｏｋ，  ＯＲＡＤ−ＰＳ−０５９，  ドイツ・ポツダム，  １９９９）ため、その吸収促進効果は、部分的に、粘膜上皮の脂質編成との干渉による可能性もある。
【０３３５】
本明細書に提供する他の生物接着ゲルと同様に、キトサンの使用は、投与した生物学的活性剤の適用頻度および量を減少させつつ、有効な搬送量または用量を生じることも可能である。この投与様式はまた、患者コンプライアンスおよび許容度も改善しうる。キトサンおよび他の生物接着ゲルは密閉され、そして潤滑であるため、鼻粘膜の炎症、アレルギーおよび潰瘍状態の不快症状を減少させると予期される。さらに、キトサンは、真菌を含む特定の有害微生物に対して非特異的に作用し（Ｋｎａｐｃｚｙｋ，  Ｃｈｉｔｉｎ  Ｗｏｒｌｄ，  ｐｐ．５０４−５１１，  Ｋａｒｎｉｃｋｉら監修，  Ｗｉｒｔｓｃｈａｆｔｖｅｒｌａｇ  ＮＷ，  ドイツ，  １９９４）、そしてまた、損傷組織を修復し、そして生理学的に再構築する、誘導性プライマーとして作用することによって、細胞増殖および組織編制を有益に刺激しうる（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １０：５９８−６０３，  １９８９）。
【０３３６】
本明細書にさらに提供するように、本発明の方法および組成物は、場合によって、新規キトサン誘導体またはキトサンの化学的修飾型を含むであろう。本発明内で使用するためのこうした新規誘導体の１つは、β−［１→４］−２−グアニジノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースポリマー（ポリ−ＧｕＤ）と称される。キトサンは、キチンの脱アセチル化産物であり、経口および鼻内配合物用の微小球体を調製するのに広く用いられてきた、天然存在ポリマーである。キトサンポリマーはまた、浸透薬剤搬送の可溶性キャリアーとしても提唱されてきている。本発明の１つの側面内で、ｏ−メチルイソ尿素を用いて、キトサン・アミンをグアニジニウム部分に変換する。例えば、８．０を越えるｐＨでの等標準（ｅｑｕｉ−ｎｏｒｍａｌ）溶液のキトサンおよびｏ−メチルイソ尿素間の反応によって、グアニジニウム化合物を調製する。
【０３３７】
グアニジニウム産物は、−［１４］−グアニジノ−２−デオキシ−Ｄ−グルコースポリマーである。この背景において、該ポリマーは、ポリ−ＧｕＤと略される（キトサン中のアミンの単量体Ｆ．Ｗ．＝１６１；ポリ−ＧｕＤ中のグアニジニウムの単量体Ｆ．Ｗ．＝２０３）。
【０３３８】
本発明内で使用するための１つの典型的なポリ−ＧｕＤ調製法は、以下のプロトコルを伴う。
溶液：
０．５％酢酸溶液（０．０８８Ｎ）の調製：
２．５ｍｌ氷酢酸を５００ｍｌ体積測定フラスコにピペッティングし、精製水でこの体積まで希釈する。
【０３３９】
２Ｎ  ＮａＯＨ溶液の調製：
約２０ｇのＮａＯＨペレットを、約１５０ｍｌの精製水とともにビーカーに移す。溶解し、そして室温に冷却する。溶液を２５０ｍｌ体積測定フラスコに移し、精製水でこの体積まで希釈する。
【０３４０】
硫酸Ｏ−メチルイソ尿素（０．４Ｎ尿素基同等）の調製：
約４９３ｍｇの硫酸Ｏ−メチルイソ尿素を１０ｍｌ体積測定フラスコに移し、精製水で溶解し、そしてこの体積まで希釈する。
【０３４１】
溶液ｐＨは４．２である。
塩化バリウム溶液（０．２Ｍ）の調製：
約２．０８６ｇの塩化バリウムを５０ｍｌ体積測定フラスコに移し、精製水で溶解し、そしてこの体積まで希釈する。
【０３４２】
キトサン溶液（０．０６Ｎアミン同等）の調製：
約１００ｍｇのキトサンを５０ｍｌビーカーに移し、１０ｍｌの０．５％酢酸（０．０８８Ｎ）を添加する。攪拌して完全に溶解する。
【０３４３】
溶液ｐＨは約４．５である。
塩化Ｏ−メチルイソ尿素溶液（０．２Ｎ尿素基同等）の調製：
５．０ｍｌの硫酸Ｏ−メチルイソ尿素溶液（０．４Ｎ尿素基同等）および５ｍｌの０．２Ｍ塩化バリウム溶液をビーカーにピペッティングする。沈殿物が形成される。さらに５分間、溶液を混合し続ける。０．４５ｍフィルターを通じて溶液をろ過し、そして沈殿物を廃棄する。上清溶液中の塩化Ｏ−メチルイソ尿素の濃度は、０．２Ｎ尿素基同等である。
【０３４４】
溶液ｐＨは４．２である。
方法：
セクション２．５に記載するように調製した１．５ｍｌの２Ｎ  ＮａＯＨを１０ｍｌのキトサン溶液（０．０６Ｎアミン同等）に添加する。２Ｎ  ＮａＯＨで溶液のｐＨを約８．２〜８．４に調整する。溶液をさらに１０分間攪拌する。上述のように調製した塩化Ｏ−メチルイソ尿素溶液（０．２Ｎ尿素基同等）を３．０ｍｌ添加する。溶液を一晩攪拌する。
【０３４５】
０．５％酢酸（０．０８８Ｎ）で溶液ｐＨを５．５に調整する。
精製水を用いて、溶液を最終体積２５ｍｌに希釈する。
溶液中のポリ−ＧｕＤ濃度は５ｍｇ／ｍｌであり、０．０２５Ｎ（グアニジウム基）に同等である。
【０３４６】
本発明内で使用するための生物接着剤と分類されるさらなる化合物は、典型的には生物接着化合物および粘膜上皮表面の構成要素の相補構造間の「受容体−リガンド相互作用」と分類される、特異的相互作用を仲介することによって作用する。多くの天然の例は、レクチン−糖相互作用に例示されるように、特異的に結合する生物接着のこの形を例示する。レクチンは、多糖またはグリココンジュゲートに結合する、非免疫起源の（糖）タンパク質である。この結合潜在能力のため、レクチンは、細胞に結合するか、または細胞を凝集させることも可能である（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８５：６６，  １９８０）。レクチンは、一般的に植物起源または細菌起源であるが、哺乳動物を含む、より高次の動物によっても産生される（いわゆる「内因性」または「逆」レクチン）（Ｓｈａｒｏｎら，  Ｌｅｃｔｉｎｓ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  ロンドン，  １９８９；およびＰａｓｚｔａｉら，  Ｌｅｃｔｉｎｓ．  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  ロンドン，  １９９５）。
【０３４７】
ありうる薬学的吸収促進剤として、いくつかの植物レクチンが調べられてきている。１つの植物レクチン、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）赤血球凝集素（ＰＨＡ）は、ラットに与えると、１０％を越える、高い経口生物学的利用能を示す（Ｐｕｓｚｔａｉら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．  １７：８１−８２，  １９８８）。しかし、ＰＨＡは、経口投与後、消化管障害を引き起こすと報告されており、そしてこれらの副作用は、本明細書の鼻療法適用いずれかによって、最小限になるよう決定されなければならない。対照的に、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｕｔｕｍ）レクチン（ＴＬ）は、多様な投与様式に関して、安全であるようである。この糖タンパク質（およそ７０ｋＤａ）は、消化に抵抗し、そしていかなる有害な影響も伴わずに、ラット腸絨毛に結合する（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  １８５：５−１０，  １９８５；Ｗｏｏｄｌｅｙら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  １１０：１２７−１３６，  １９９４；およびＩｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  １０７：２２３−２３０，  １９９４）。しかし、ラットへの胃内投与後、この放射標識レクチンのＧＩ通過は、対照に比較して遅延されず、そして他の研究は、ＴＬが胃腸粘膜糖タンパク質と強い交差反応性を有することを示した（Ｌｅｈｒら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ９：５４７−５５３，  １９９２）。したがって、その好ましい安全プロフィールにもかかわらず、胃腸生物接着剤としてのＴＬの使用は、その作用が「特異的」である（すなわち受容体に仲介される）とはいえ、迅速なクリアランスを促進する、粘液との非特異的相互作用によって限定される。
【０３４８】
したがって、本発明は、粘膜細胞、例えば鼻上皮細胞に高い特異的親和性を有するが、粘液と低い交差反応性を有する、現存するレクチンを修飾することによって、同定されるかまたは得られる非毒性レクチンの協調投与または組み合わせ配合物を提供する。これに関連して、レクチン構造−活性関係に関する詳細な解説によって、療法目的で最適化されたレクチンを産生するため、非毒性で強い生物接着剤候補の選択が可能になり、この取り組みは、組換え遺伝子技術の方法によってさらに促進されるであろう（例えばＬｅｈｒら，  Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，  ｐｐ．１１７−１４０，  Ｐｕｓｔａｉら監修，  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，  ロンドン，  １９９５を参照されたい）。本発明のさらなる態様において、粘膜粘液への生物接着剤の非特異的結合の影響に対抗するため、粘液溶解剤および／または繊毛抑制剤を、生物学的活性剤およびレクチンまたは他の特異的結合生物接着剤とともに協調して投与するか、または組み合わせて配合する。
【０３４９】
レクチンの使用に加えて、特定の抗体またはアミノ酸配列が、細胞および粘膜表面上の相補要素への高親和性結合を示す。したがって、例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐなどの多様な接着性アミノ酸配列がキャリアー・マトリックスに付着すると、特異的細胞表面糖タンパク質と結合することによって、接着を促進するであろう。他の態様において、接着性リガンド構成要素を、特定の細胞種、または疾患標的組織に選択的に接着するキャリアーまたは搬送ビヒクルにおいて一体化させる。例えば、特定の疾患は、細胞表面糖タンパク質において変化を引き起こす。これらの別個の構造改変は、本発明内の薬剤搬送ビヒクルに結合させた相補アミノ酸配列によって、容易に標的とされうる。典型的な側面において、周知の癌特異的マーカー（例えばＣＥＡ、ＨＥＲ２）は、疾患細胞を標的とする特定の薬剤の相補抗体またはペプチドによって標的とされうる。
【０３５０】
要約すると、前述の生物接着剤は、本発明の組み合わせ配合物および協調投与法に有用であり、これは場合によって、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤の持続を延長するか、または別の方式で粘膜吸収を増加させる生物接着剤の有効量および有効な型を取り込む。生物接着剤は、本発明の組み合わせ配合物内で、付属化合物として、または添加剤として、協調して投与可能である。特定の態様において、生物接着剤は、「薬学的糊」として作用し、一方、他の態様において、生物接着剤の付属搬送配合物または組み合わせ配合物は、鼻粘膜と生物学的活性剤の接触を強化するよう働き、いくつかの場合は、上皮細胞「受容体」との特異的受容体−リガンド相互作用を促進することにより、そして他の場合は、上皮浸透性を増加させ、搬送標的部位（例えばＣＮＳまたは全身循環）で測定される薬剤濃度勾配を有意に増加させることによる。本発明内で使用するためのさらなる生物接着剤は、酵素（例えばプロテアーゼ）阻害剤として作用して、生物接着剤と協調して搬送されるか、または組み合わせ配合物中にある、粘膜投与される生物療法剤の安定性を増進させる。
【０３５１】
リポソームおよびミセル搬送ビヒクル
本発明の協調投与法および組み合わせ配合物は、場合によって、有効な脂質または脂肪酸に基づくキャリアー、プロセシング剤、または搬送ビヒクルを取り込んで、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤の粘膜搬送のための改善された配合物を提供する。例えば、粘膜搬送のため、リポソーム、混合ミセルキャリアー、またはエマルジョンと混合されるかまたはこれらに被包されるか、またはこれらと協調して投与される、ペプチドまたはタンパク質などの１以上のこれらの活性剤を含んでなり、粘膜搬送に際して、生物学的活性剤の化学的および物理的安定性を増進し、そして半減期を増加させる（例えばタンパク質分解、化学的修飾および／または変性に対する感受性を減少させることによって）、多様な配合物および方法を提供する。
【０３５２】
本発明の特定の側面内で、生物学的活性剤の特殊化搬送系は、リポソームとして知られる小さい脂質小胞を含んでなる（例えばＣｈｏｎｎら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６：６９８−７０８，  １９９５；Ｌａｓｉｃ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６：３０７−３２１，  １９９８；およびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １３：５２７−５３７，  １９９５を参照されたい）。これらは、典型的には、天然の生物分解性、非毒性、および非免疫原性脂質分子から作成され、そしてペプチドおよびタンパク質を含む薬剤分子を、その膜内または膜上に効率的に捕捉しうるか、またはこれらと結合しうる。本発明内のペプチドおよびタンパク質搬送系としてのリポソームの魅力は、被包タンパク質が、小胞内で好ましい水性環境中にとどまりうる一方、リポソーム膜がタンパク質分解および他の不安定化要因に対してこれらを保護する事実によって増加する。ユニークな物理的特性および化学的特性のため、既知のリポソーム調製法がすべて、ペプチドおよびタンパク質の被包を実現可能なわけではないが、いくつかの方法によって、実質的な脱活性化を伴わず、これらの巨大分子の被包が可能になる（例えばＷｅｉｎｅｒ，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２０１−２０９，  １９９４を参照されたい）。
【０３５３】
本発明内で使用するリポソームを調製するため、多様な方法が利用可能である（例えばＳｚｏｋａら，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ． ９：４６７，  １９８０；並びに米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号および第４，８３７，０２８号に記載されるようなもの）。リポソーム搬送で使用するため、生物学的活性剤は、典型的にはリポソームまたは脂質小胞内に捕捉されるか、あるいは小胞の外側に結合する。特定の組織および特定の細胞種にリポソームを標的化することによって、リポソーム仲介搬送の有効性を増加させる、いくつかの戦略が考案されてきた。カチオン性脂質を含有するものを含むリポソーム配合物は、ヒト患者において、安全でそしてよく許容されることが示された（Ｔｒｅａｔら，  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔ． ８２：１７０６−１７１０，  １９９０）。
【０３５４】
リポソーム同様、やはり粘膜吸収のため増進した活性を有する不飽和長鎖脂肪酸は、二層様構造を持つ閉鎖小胞（いわゆる「ウファソーム（ｕｆａｓｏｍｅ）」）を形成しうる。これらは、例えば、本発明内の粘膜搬送、例えば鼻内搬送のため、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質を捕捉するのに、オレイン酸を用いて、形成可能である。
【０３５５】
本発明内で使用するための他の搬送系を、ポリマーおよびリポソームの使用と組み合わせて、両方のビヒクルの好適な特性を連合させる。この種のハイブリッド搬送系の例として、モデルタンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含有するリポソームは、天然ポリマー、フィブリン内で有効に被包された（Ｈｅｎｓｃｈｅｎら，  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｐｐ．１７１−２４１，  Ｚｗａａｌら監修，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  アムステルダム，  １９８６）。生体適合性および生物分解性のため、フィブリンは、この背景において、薬剤搬送系の有用なポリマー・マトリックスである（例えばＳｅｎｄｅｒｏｆｆら，  Ｊ．  Ｐａｒｅｎｔｅｒ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ４５：２−６，  １９９１；およびＪａｃｋｓｏｎ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２：６３７−６３８，  １９９６を参照されたい）。さらに、この搬送系からの生物療法化合物の放出は、共有架橋の使用およびフィブリン・ポリマーへの抗線維素溶解剤の添加を通じて、調節可能である（Ｕｃｈｉｎｏら，  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ５：９３−９８，  １９９１）。
【０３５６】
本発明内で使用するための、より単純化された搬送系には、搬送ビヒクルまたはキャリアーとしてのカチオン性脂質の使用が含まれ、該脂質を有効に使用して、脂質キャリアー、並びにタンパク質およびポリアニオン核酸としてのこうした荷電生物学的活性剤の間の静電相互作用を提供しうる（例えばＨｏｐｅら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１−１４，  １９９８を参照されたい）。これによって、粘膜投与および／または全身区画への続く搬送に適した形に薬剤を効率的にパッケージングすることが可能になる。これらの系および関連する系は、例えば遺伝子構築物、アンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびリボザイムの形の、ポリマー性核酸の搬送に特によく適している。これらの薬剤は、大きく、通常、負に荷電した分子であり、分子量は、遺伝子での１０6の桁から、オリゴヌクレオチドでの１０3の桁までである。これらの薬剤の標的は細胞内であるが、物理的特性によって、慣用的な薬剤と同様の受動的拡散によって細胞膜を横断することが妨げられる。さらに、保護されないＤＮＡは、通常の血漿に存在するヌクレアーゼによって、数分以内に分解される。内因性ヌクレアーゼによる不活性化を回避するため、多様な既知の方法によって、アンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびリボザイムを化学的に修飾して、酵素抵抗性にすることも可能であるが、プラスミドＤＮＡは、通常、ウイルスまたは非ウイルス・エンベロープ中の被包によって、あるいはタンパク質またはカチオン性脂質小胞などのポリカチオンによる、緊密にパッキングされた微粒子型への凝縮によって、保護しなければならない。より最近、カチオン性脂質およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）で構成される小単層小胞（ＳＵＶ）を、プラスミドＤＮＡなどのポリ核酸のビヒクルとして使用して、形質膜を渡って、広い範囲の細胞の細胞質に活性ポリヌクレオチドを輸送可能な粒子を形成するのに成功してきている。このプロセス（リポフェクションまたはサイトフェクションと称される）は、現在、プラスミド構築物を細胞に導入して、一過性遺伝子発現の影響を研究する手段として、広く使用されている。本発明内で使用するためのこの種の典型的な搬送ビヒクルには、カチオン性脂質（例えばＮ−（２，３−（ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル・アンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ））、四級アンモニウム塩（例えばＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ））、コレステロールのカチオン性誘導体（例えば３β（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ−ジメチルアミノエタン−カルバモイル−コレステロール（ＤＣ−コル））、および多価頭部基に特徴付けられる脂質（例えばジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＧＳ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）として商業的に入手可能）が含まれる。
【０３５７】
本発明内で使用するためのさらなる搬送ビヒクルには、長鎖および中鎖の脂肪酸とともに、脂肪酸を含む界面活性剤混合ミセルが含まれる（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  ７：１−３３，  １９９０を参照されたい）。エステルの形の大部分の天然存在脂質は、粘膜表面を渡るそれ自体の輸送に関して、重要な暗示を有する。付着した極性基を有する遊離脂肪酸およびそのモノグリセリドは、混合ミセルの形で、腸バリアに対して浸透促進剤として作用することが立証されている。遊離脂肪酸（１２〜２０の炭素原子の間で多様な鎖長を持つカルボン酸）およびその極性誘導体のバリア修飾機能の発見によって、粘膜吸収増進剤としてのこれらの剤の適用に関する徹底した研究が刺激された。
【０３５８】
本発明の方法内で使用するため、長鎖脂肪酸、特に融合誘導脂質（オレイン酸、リノール酸、リノール酸、モノオレインなどの不飽和脂肪酸およびモノグリセリド）は、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤の粘膜搬送を増進する有用なキャリアーを提供する。中鎖脂肪酸（Ｃ６〜Ｃ１２）およびモノグリセリドもまた、腸薬剤吸収において増進した活性を有することが示され、そして本発明の粘膜搬送配合物および方法内で使用するため適用可能である。さらに、中鎖および長鎖脂肪酸のナトリウム塩は、本発明内の生物学的活性剤の粘膜搬送のため、有効な搬送ビヒクルおよび吸収増進剤である。したがって、脂肪酸は、ナトリウム塩の可溶性型で、または非毒性界面活性剤、例えばポリオキシエチル化水素化ヒマシ油、タウロコール酸ナトリウムなどの添加によって、使用可能である。天然存在不飽和長鎖脂肪酸（オレイン酸またはリノール酸）およびそのモノグリセリドと胆汁酸塩の混合ミセルは、腸粘膜に基本的には無害である、吸収増進能を示すことが示されてきている（例えばＭｕｒａｎｉｓｈｉ，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２：１０８−１１８，  １９８５；およびＣｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｔｈｅｒ．  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．  ７：１−３３，  １９９０）。本発明内で有用な他の脂肪酸および混合ミセル調製には、限定されるわけではないが、場合によってグリココレートおよびタウロコレートなどの胆汁酸塩と組み合わせた、カプリル酸ナトリウム（Ｃ８）、カプリン酸ナトリウム（Ｃ１０）、ラウリル酸ナトリウム（Ｃ１２）またはオレイン酸ナトリウム（Ｃ１８）が含まれる。
【０３５９】
ＰＥＧ化
本発明内で提供するさらなる方法および組成物は、ポリマー物質、例えばデキストラン、ポリビニルピロリドン、グリコペプチド、ポリエチレングリコールおよびポリアミノ酸の共有結合による、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の化学的修飾を伴う。生じたコンジュゲート化ペプチドおよびタンパク質は、生物学的活性および粘膜投与のための可溶性を保持する。別の態様において、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性ペプチドおよびタンパク質を、酸化ポリアルキレンポリマー、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲート化する（例えば米国特許第４，１７９，３３７号を参照されたい）。文献における多くの報告は、ＰＥＧ化ペプチドおよびタンパク質の潜在的な利点を記載し、これらはしばしば、タンパク質分解的分解に対する抵抗性の増加、血漿半減期の増加、可溶性の増加、並びに抗原性および免疫原性の減少を示す（Ｎｕｃｃｉら，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ ６：１３３−１５５，  １９９１；Ｌｕら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ． ４３：１２７−１３８，  １９９４）。Ｌ−アスパラギナーゼ、ストレプトキナーゼ、インスリン、インターロイキン−２、アデノシン・デアミダーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン・アルファ２ｂ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、ストレプトキナーゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ウリカーゼ、ヘモグロビン、ＴＧＦ−ベータ、ＥＧＦ、および他の増殖因子を含む、いくつかのタンパク質がＰＥＧにコンジュゲート化されており、そして療法剤としての改変された生化学特性に関して評価されてきている（例えばＨｏら，  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ １４：３４９−３５２，  １９８６；Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，  Ｐｒｅｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ． ９：２０５−２１１，  １９７９；およびＲａｊａｇｏｐａｉａｎら，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ． ７５：４１３−４１９，  １９８５、Ｎｕｃｃｉら，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ． ４：１３３−１５１，  １９９１）。ＰＥＧ化タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物学的活性は減少しうるが、活性のこの損失は、通常、血流中のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期増加によって相殺される（Ｎｕｃｃｉら，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ ６：１３３−１５５，  １９９１）。したがって、これらのおよび他のポリマー・カップリング・ペプチドおよびタンパク質は、本明細書の方法および配合物にしたがって粘膜投与した際、半減期延長および免疫原性減少などの増進された特性を示す。
【０３６０】
タンパク質およびペプチドへのＰＥＧの付着およびそれに続く精製に関して、いくつかの方法が報告されてきている（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２５２：３５８２−３５８６，  １９７７；Ｂｅａｕｃｈａｍｐら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３１：２５−３３，  １９８３）。さらに、Ｌｕら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ． ４３：１２７−１３８，  １９９４は、多様な技術的考慮を記載し、そしてペプチドに対してタンパク質のＰＥＧ化法を比較する（Ｋａｔｒｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８４：１４８７−１４９１，  １９８７；Ｂｅｃｋｅｒら，  Ｍａｋｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ． ３：  ２１７−２２３，  １９８２；Ｍｕｔｔｅｒら，  Ｍａｋｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ． １３：１５１−１５７，  １９９２；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ． ８５：２１４９−２１５４，  １９９３；Ｌｕら，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ． ６：１４２−１４６，  １９９３；Ｌｅｅら，  Ｂｉｏｃｏｎｉｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ． １０：９７３−９８１，  １９９９、Ｎｕｃｃｉら，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ． ６：  １３３−１５１，  １９９１；Ｆｒａｎｃｉｓら，  Ｊ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ３：３２１−３４０，  １９９６；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｉｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ． ６：  １５０−１６５，  １９９５；Ｃｌａｒｋら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２７１：２１９６９−２１９７７，  １９９６；Ｐｅｔｔｉｔら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２７２：２３１２−２３１８，  １９９７；Ｄｅｌｇａｄｏら，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ ７３：１７５−１８２，  １９９６；Ｂｅｎｈａｒら，  Ｂｉｏｃｏｎｉｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ． ５：３２１−３２６，  １９９４；Ｂｅｎｈａｒら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２６９：１３３９８−１３４０４，  １９９４；Ｗａｎｇら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ． ５３：４５８８−４５９４，  １９９３；Ｋｉｎｓｔｌｅｒら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ． １３：９９６−１００２，  １９９６、Ｆｉｌｐｕｌａら，  Ｅｘｐ．  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｐａｔｅｎｔｓ ９：２３１−２４５，  １９９９；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ． ９：２１６５−２１７５，  １９９８もまた参照されたい）。
【０３６１】
これらおよび当該技術分野の他の解説にしたがって、ポリエチレングリコールポリマーと生物学的活性ペプチドおよびタンパク質のコンジュゲート化は、容易に行われ、循環期が延長し、そして／または免疫原性が減少しつつ、ＰＥＧ化活性剤の活性の許容しうるレベルが維持される、予期される結果が得られる。本発明内で使用するためのアミン反応性ＰＥＧポリマーには、分子量２０００、５０００、１００００、１２０００および２００００のＳＣ−ＰＥＧ；Ｕ−ＰＥＧ−１００００；ＮＨＳ−ＰＥＧ−３４００−ビオチン；Ｔ−ＰＥＧ−５０００；Ｔ−ＰＥＧ−１２０００；およびＴＰＣ−ＰＥＧ−５０００が含まれる。これらのポリマー用の化学的コンジュゲート化化学反応が公開されてきている（例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ． ６：１５０−１６５，  １９９５；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ． ７：６３８−６４１，  １９９６；Ｍａｒｔｉｎｅｚら，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ． １９８：２４８９−２４９８，  １９９７；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．Ｔ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ｐｐ．６０５−６１８，  １９９６；Ｗｈｉｔｌｏｗら，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ． ６：９８９−９９５，  １９９３；Ｈａｂｅｅｂ，  Ａ．Ｆ．Ｓ．Ａ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４：３２８−３３６，  １９６６；Ｚａｌｉｐｓｋｙら，  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．３１８−３４１，  １９９７；Ｈａｒｌｏｗら，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｐｐ．５５３−６１２，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  ＮＹ，  １９８８；Ｍｉｌｅｎｉｃら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ． ５１：６３６３−６３７１，  １９９１；Ｆｒｉｇｕｅｔら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ ７７：３０５−３１９，  １９８５を参照されたい）。これらのプロトコルでは、リン酸緩衝液が共通に使用されるが、ホウ酸緩衝液を選択すると、ＰＥＧ化反応率および生じる産物に有益に影響を及ぼしうる。
【０３６２】
生物学的活性ペプチドおよびタンパク質のＰＥＧ化は、カルボキシル部位（例えばカルボキシ末端に加えて、アスパラギン酸またはグルタミン酸基）の修飾によって達成可能である。酸性条件下でのカルボジイミド活性化タンパク質カルボキシル基の選択的修飾におけるＰＥＧ−ヒドラジドの有用性が記載されてきている（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ． ６：１５０−１６５，  １９９５；Ｚａｌｉｐｓｋｙら，  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．３１８−３４１，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ワシントンＤＣ，  １９９７）。あるいは、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質の二官能ＰＥＧ修飾が使用可能である。いくつかの方法において、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸を含む荷電アミノ酸残基は、タンパク質表面上で、溶媒接近可能である顕著な傾向を有する。タンパク質のカルボン酸基へのコンジュゲート化は、タンパク質バイオコンジュゲート産生のため、より頻繁に探求されていないアプローチである。しかし、Ｚａｌｉｐｓｋｙおよび同僚らに記載されるヒドラジド／ＥＤＣ化学反応（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  Ｓ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ． ６：１５０−１６５，  １９９５；Ｚａｌｉｐｓｋｙら，  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．３１８−３４１，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  ワシントンＤＣ，  １９９７）は、タンパク質カルボキシル部位にＰＥＧポリマーを連結する実用的な方法を提供する。例えば、この代替コンジュゲート化化学反応は、生物学的活性を維持しつつ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のＰＥＧ化のためのアミン連結より優れていることが知られている（Ｗｕら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６：２５４−２５９，  １９９９）。Ｍａｅｄａおよび同僚らはまた、カルボキシルを標的とするＰＥＧ化が、ビリルビン・オキシダーゼ・コンジュゲート化の好ましいアプローチであることも見出した（Ｍａｅｄａら，  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｊ．  Ｍ．  Ｈａｒｒｉｓ監修，  ｐｐ．１５３−１６９，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９２）。
【０３６３】
しばしば、本発明内で使用するためのペプチドおよびタンパク質のＰＥＧ化は、ペプチドまたはタンパク質表面上のリジン残基と反応するであろう官能基を用いたＰＥＧの活性化を伴う。本発明の特定の代替側面内で、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質は、実質的な活性損失を伴わずに、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕなどの他の残基のＰＥＧ化によって修飾される。選択されるペプチドまたはタンパク質のＰＥＧ修飾が進行して完了すると、ペプチドまたはタンパク質の活性は、しばしば減少する。したがって、本明細書のＰＥＧ修飾法は、一般的に、ペプチドまたはタンパク質の部分的ＰＥＧ化に限定され、約５０％未満、より一般的には約２５％未満の活性損失を生じつつ、ＰＥＧ化活性剤の半減期（例えば血清半減期）の実質的な増加および有効用量必要性の実質的な減少を提供する。
【０３６４】
部分的ＰＥＧ修飾の結果、統計的に分布する分子あたりの結合ＰＥＧ基数を有するＰＥＧ化ペプチドまたはタンパク質の異種混合物が産生されることは回避不能である。さらに、ペプチドまたはタンパク質内のリジン残基の使用は無作為である。これらの２つの要因は、付着するＰＥＧ基の数および位置両方が異なるＰＥＧ化タンパク質の異種混合物の産生を生じる。例えば、アデノシン・デアミナーゼが最適に修飾される場合、該タンパク質がタンパク質あたり約１４ＰＥＧを有する際、活性損失は５０％であり、個々のタンパク質あたりのＰＥＧ部分の実際の数は広く分布し、そして用いられる実際のリジン残基の位置は広く分布する。異なって修飾されたタンパク質のこうした混合物は、薬剤使用には最適に適しているわけではない。同時に、ＰＥＧ化タンパク質クラス（例えば同数のＰＥＧ部分を含有するタンパク質）または単一種のＰＥＧ化タンパク質（例えば同数の部分を含有し、そして同一位置にＰＥＧ部分を有するタンパク質）の精製および単離は、時間がかかり、そして高額の方法を伴い、この結果、目的の特定のＰＥＧ化ペプチドまたはタンパク質の収量は全体として減少する。
【０３６５】
本発明の特定の代替側面内で、生物学的活性ペプチドおよびタンパク質は、活性化ＰＥＧ試薬を使用するＰＥＧ化法によって修飾され、該試薬はタンパク質のチオ基と反応し、システイン残基へのＰＥＧの共有結合を生じ、この残基がタンパク質の天然存在リジン残基の代わりに挿入されうる。例えば米国特許第５，１６６，３２２号に記載されるように、天然存在アミノ酸配列内の選択される部位で導入されるシステイン残基を有する、ＩＬ−３の特定の変異体が成功裡に産生されている。その後、ＩＬ−３変異体との反応によって、スルフィドリル反応性化合物（例えば活性化ポリエチレングリコール）をこれらのシステインに付着させる。さらに、米国特許第５，２０６，３４４号は、天然存在アミノ酸配列内の選択される部位に導入されるシステイン残基を含有する、特定のＩＬ−２変異体を記載する。該ＩＬ−２変異体を、続いて、活性化ポリエチレングリコール試薬と反応させて、この部分をシステイン残基に付着させる。
【０３６６】
ＰＥＧ化ペプチドおよびタンパク質を生成するため、本発明内で使用するさらなる方法は、タンパク質構造−機能の広い知識を必要としない（例えば生物学的活性に必須のアミノ酸残基のマッピング）。これらの方法の例として、米国特許第５，７６６，８９７号は、療法適用に適したシステイン−ＰＥＧ化タンパク質の産生法および性質決定法を記載する。これらは、タンパク質内のシステイン残基にポリエチレングリコールを付着させることによって、産生される。安定な生物学的活性化合物の望ましい結果を得るため、特定の方式で、しばしば通常グリコシル化される部位に、またはその近傍に存在するシステイン残基に、ＰＥＧを付着させる。典型的には、グリコシル化によって修飾される特定のアミノ酸（例えばＮ−連結グリコシル化におけるアスパラギン、あるいはＯ−連結グリコシル化におけるセリンまたはスレオニン）をシステイン残基と交換し、これを続いて、ＰＥＧの付着によって化学的に修飾する。この方法を使用するため、選択される生物学的活性ペプチドおよびタンパク質のシステイン含有突然変異体を生成することが有用である可能性があり、これは、例えば、当該技術分野に周知の方法を用いた部位特異的突然変異誘発によって容易に達成可能である（例えばＫｕｎｋｅｌ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ中，  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｆ．  Ｌｉｌｌｅｙ，  Ｄ．Ｍ．Ｊ．監修，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ベルリンおよびハイデルベルグ，  ｖｏｌ．２，  ｐ．１２４，  １９８８を参照されたい）。さらに、活性ペプチドまたはタンパク質が、構造的に関連するタンパク質ファミリーの１つのメンバーである場合、他のメンバーいずれかのグリコシル化部位を目的のタンパク質上のアミノ酸にマッチさせ、そしてポリエチレングリコールを付着させるため、アミノ酸をシステインに変化させることも可能である。あるいは、目的のタンパク質または関連タンパク質に関して、結晶構造が決定されている場合、活性部位または結合部位から離れた表面残基を、ポリエチレングリコールの付着のため、システインに変化させることも可能である。
【０３６７】
本発明内で使用するため、有用なＰＥＧ付着部位を同定するこれらの戦略は、タンパク質構造−機能の詳細に関する広い知識なしに、容易に実行される点で、好適である。さらに、これらの戦略はまた、グリコシル化残基の存在および位置が、しばしば、天然に進化してきた結果として、対象のペプチドまたはタンパク質の安定性および血清半減期の増加に関連している事実をうまく利用する。これらのグリコシル化残基をシステインと交換した後、システイン特異的ＰＥＧ化を行うと、通常、実質的な生物学的活性を保持しつつ、有意な安定性増加を示す修飾ペプチドおよびタンパク質が生じる。
【０３６８】
より高次のＰＥＧ修飾が必要な場合、および／または化学的に修飾しようとするペプチドまたはタンパク質が、通常、グリコシル化されない場合、他の溶媒接近可能残基をシステインに変化させ、そして生じたタンパク質をＰＥＧ化に供することも可能である。適切な残基は、当業者によって容易に決定可能である。例えば、目的のタンパク質または関連タンパク質の三次元構造が利用可能である場合、溶媒が接近可能なアミノ酸が容易に同定される。また、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの荷電アミノ酸は、ほぼもっぱらタンパク質表面に見られる。これらの残基の１つ、２つまたは多くをシステインで置換すると、ＰＥＧ付着のさらなる部位が提供されるであろう。さらに、抗体によって認識される天然タンパク質中のアミノ酸配列は、通常、タンパク質表面上にある。溶媒接近可能アミノ酸を決定するこれらの方法および他の方法が当業者に周知である。
【０３６９】
ＰＥＧでのペプチドおよびタンパク質の修飾はまた、増加した生物学的安定性および／または有効性を有するタンパク質、断片、および／またはペプチドの多量体複合体を生成するのに使用可能である。本発明のこれらの多量体ペプチドおよびタンパク質、例えばＪＡＭ、オクルディン、またはクローディン・ペプチドまたはタンパク質の二量体または四量体は、周知の方法にしたがって、合成的に産生可能である。あるいは、この方式で、天然存在二量体または多量体タンパク質である、他の生物学的活性ペプチドおよびタンパク質が産生可能である。例えば、本発明内で有用な二量体ペプチドおよびタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質を、２つのタンパク質反応性部分を有するＰＥＧで構成される試薬、（マレイミド）2−ＰＥＧと反応させることによって産生可能である。システイン−ＰＥＧ化ペプチドおよびタンパク質の場合、多量体架橋の度合いは、ペプチドまたはタンパク質に存在し、そして／またはこれらの中に設計されるシステインの数によって、そして反応混合物中に用いる試薬、例えば（マレイミド）2ＰＥＧの濃度によって、調節可能である。
【０３７０】
本発明内で使用するための生物学的活性ペプチドおよびタンパク質に存在するシステインのチオ基に他の基を付着させることをさらに意図する。例えば、ペプチドまたはタンパク質は、システイン残基のチオ基にビオチンを付着させることによって、ビオチン化可能である。本発明のシステイン−ＰＥＧ化タンパク質の例とともに、本発明にしたがってシステイン残基を介して共有結合させるＰＥＧ以外の基を有するタンパク質の例は、以下のとおりである：
活性剤の他の安定化修飾
ＰＥＧ化に加えて、本発明内で使用するためのペプチドおよびタンパク質などの生物学的活性剤を修飾して、他の既知の保護化合物または安定化化合物へのコンジュゲート化を介して、活性剤を保護することによって、例えば活性ペプチド、タンパク質、類縁体または模倣体が、１以上のキャリアータンパク質、例えば１以上の免疫グロブリン鎖に連結されている融合タンパク質を生成することによって、循環半減期を増進させることも可能である（例えば米国特許第５，７５０，３７５号；第５，８４３，７２５号；第５，５６７，５８４号および第６，０１８，０２６号を参照されたい）。これらの修飾は、活性剤の分解、隔離またはクリアランスを減少させ、そして生理学的環境において（例えば循環系において、または粘膜表面で）、より長い半減期を生じるであろう。これらのおよび他の安定化コンジュゲート化法によって修飾された活性剤は、したがって、有用であり、本発明の方法内で、増進された有効性を持つ。特に、こうして修飾された活性剤は、非修飾活性剤に比較して、搬送標的部位または作用標的部位で、より長い期間、活性が維持される。活性剤は、こうして修飾された際であっても、非修飾化合物の生物学的活性に比較して、実質的な生物学的活性を保持する。
【０３７１】
したがって、本発明の特定の側面において、本発明の方法にしたがった粘膜投与のためのＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の活性ペプチドおよびタンパク質を含む他の生物学的活性剤を、例えば循環半減期を増加させる増進した活性のため、他の既知の保護化合物または安定化化合物へのコンジュゲート化を通じて活性剤を保護することによって、あるいは１以上の免疫グロブリン鎖などの１以上のキャリアータンパク質に連結されたペプチド、タンパク質、類縁体または模倣体と融合タンパク質を生成することによって、修飾する（例えば米国特許第５，７５０，３７５号；第５，８４３，７２５号；第５，５６７，５８４号；および第６，０１８，０２６号を参照されたい）。これらの修飾は、活性ペプチドまたはタンパク質の分解、隔離またはクリアランスを減少させ、そして生理学的環境において（例えば鼻粘膜表面で、または全身循環において）、より長い半減期を生じるであろう。こうして修飾された活性ペプチドおよびタンパク質は、例えば非修飾ペプチド、タンパク質、類縁体または模倣体に比較して、搬送標的部位または作用標的部位で活性が増加するかまたは一時的に拡張されることによって、本発明の組成物および方法内で増加した有効性を示す。
【０３７２】
本発明の他の側面において、安定性増進のため、ペプチドおよびタンパク質療法化合物を、比較的低分子量の化合物、例えばアミノレシチン、脂肪酸、ビタミンＢ12、および配糖体にコンジュゲート化する（例えばＩｇａｒｉｓｈｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｉｎｔ．  Ｓｙｍｐ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ．  Ｒｅｌ．  Ｂｉｏａｃｔ．  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １７，３６６，  （１９９０）を参照されたい。本発明の組成物および方法内で使用するためのさらなる典型的な修飾ペプチドおよびタンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用のため、以下によって、有益に修飾されるであろう：
（ａ）哺乳動物シグナルペプチド（例えばＬｉｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ． ２７０：１４２５５，  １９９５を参照されたい）または細菌ペプチド（例えばＪｏｌｉｏｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ ８８：１８６４，  １９９１を参照されたい）を活性ペプチドまたはタンパク質に連結する化学的または組換えＤＮＡ法、該方法は、活性ペプチドまたはタンパク質を細胞質および細胞小器官膜を渡って導き、そして／または望ましい細胞区画に（例えばＣＴＬ誘導を増進するため、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の小胞体（ＥＲ）に）活性ペプチドまたはタンパク質を輸送するよう働く；
（ｂ）活性ペプチドまたはタンパク質へのビオチン残基の付加、これは細胞表面に存在する輸送体（Ｃｈｅｎら，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２７：１６８，  １９９５）に特異的に結合する（すなわち約１０6、１０7、１０8、１０9、または１０10Ｍ-1より高い結合親和性で）ため、細胞膜を渡って活性コンジュゲートを導くよう働く；
（ｃ）ｉｎ  ｖｉｖｏで安定性を増加させるための、活性ペプチドまたはタンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端いずれかまたは両方での遮断剤の付加。これは、活性ペプチドまたはタンパク質の末端が、細胞取り込み前にまたは細胞内輸送中にプロテアーゼによって分解される傾向がある状況において、有用でありうる。こうした遮断剤には、限定なしに、投与しようとする療法ポリペプチドまたはペプチドのアミノ末端残基および／またはカルボキシ末端残基に付着可能な、さらなる関連または非関連ペプチド配列が含まれうる。これは、ペプチド合成中に化学的に、または組換えＤＮＡ技術によって、いずれかで実行可能である。ピログルタミン酸または他の分子などの当業者に知られる遮断剤もまた、アミノ末端残基および／またはカルボキシ末端残基に付着可能であるし、あるいはアミノ末端のアミノ基またはカルボキシ末端のカルボキシル基を異なる部分で置換可能である。
【０３７３】
本発明の方法および組成物内で使用するため、ＰＥＧ化および他の安定化法によって修飾した生物学的活性剤は、非修飾活性剤、例えば天然ペプチドまたは天然タンパク質と関連する生物学的活性の、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは約５０％〜７５％の間、最も好ましくは１００％を保持するであろう。典型的には、修飾活性剤、例えばコンジュゲート化ペプチドまたはタンパク質は、例えば粘膜搬送後の血清において、由来する非修飾活性剤の半減期に比較して、増進した半減期（ｔ1/2）を有する。特定の側面において、本発明内で使用するための修飾活性剤（例えばＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性ペプチドおよびタンパク質）は、非修飾活性剤の半減期に比較して、少なくとも１．５倍〜２倍、しばしば約２倍〜３倍、他の場合、約５倍〜１０倍、そして１００倍以上まで増進される。
【０３７４】
プロドラッグ修飾
本発明内で有用なさらなる別のプロセシングおよび配合戦略は、プロドラッグ修飾戦略である。小有機分子のカルボキシル基、ヒドロキシル基、およびアミノ基などの基を一過性に（すなわち生体可逆的に）誘導体化することによって、分子の薬理学的特性を永久に改変することなく、これらの分子の望ましくない物理化学特性（例えば粘膜浸透を減少させる電荷、水素結合ポテンシャルなど）を「マスク」することも可能である。療法小分子薬剤の生体可逆的プロドラッグ誘導体は、多くの典型的な療法剤、特にヒドロキシル基およびカルボン酸基を含有するものの物理化学（例えば可溶性、親油性）特性を改善することが示されている。
【０３７５】
本発明のペプチドおよびタンパク質などのアミン含有活性剤のプロドラッグを作成するための１つのアプローチは、アミノ基のアシル化を通じる。場合によって、プロドラッグとしてのアミンのアシルオキシアルコキシカルバメート誘導体の使用が論じられてきている。３−（２’−ヒドロキシ−４’，６’−ジメチルフェニル）−３，３−ジメチルプロピオン酸は、アミンの直鎖エステラーゼ、ホスファターゼ、およびデヒドロゲナーゼ感受性プロドラッグを調製するのに使用されてきている（Ａｍｓｂｅｒｒｙら，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ８：４５５−４６１，  １９９１；Ｗｏｌｆｅら，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５７：６１３８，  １９９２）。これらの系は、２工程機構を通じて分解されることが示されており、第一の工程は、遅い律速酵素触媒（エステラーゼ、ホスファターゼ、またはデヒドロゲナーゼ）工程であり、そして第二の工程は迅速な（ｔ1/2＝１００秒、ｐＨ７．４，３７℃）化学工程である（Ａｍｓｂｅｒｒｙら，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ５５：５８６７−５８７７，  １９９０）。興味深いことに、最近、ｉｎ  ｖｉｖｏで有意な抗腫瘍活性を示す、ＴＡＸＯＬの非常に水溶性（１０ｍｇ／ｍｌより高い）のプロドラッグを調製するのに、ホスファターゼ感受性の系が使用されてきている。これらのおよび他のプロドラッグ修飾系および生じた療法剤は、本発明の方法および組成物内で有用である。
【０３７６】
本発明内で有用なペプチドのプロドラッグを調製する目的で、米国特許第５，６７２，５８４号は、生物学的活性ペプチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）の環状プロドラッグの調製および使用をさらに記載する。これらの環状プロドラッグを産生するため、生物学的活性ペプチドまたはＰＮＡのＮ末端アミノ基およびＣ末端カルボキシル基がリンカーを介して連結されるか、あるいはペプチドのＣ末端カルボキシル基がリンカーを介して側鎖アミノ基または側鎖ヒドロキシル基に連結されるか、あるいは前記ペプチドのＮ末端アミノ基がリンカーを介して側鎖カルボキシル酸基に連結されるか、あるいは前記ペプチドの側鎖カルボキシル基がリンカーを介して側鎖アミノ基または側鎖ヒドロキシル基に連結される。この背景において有用なリンカーには、３−（２’−ヒドロキシ−４’，６’−ジメチルフェニル）−３，３−ジメチルプロピオン酸リンカーおよびその誘導体、およびアシルオキシアルコキシ誘導体が含まれる。取り込まれる開示は、細胞膜浸透性および代謝安定性増進のため、好適な物理化学特徴（例えばサイズ減少、細胞内水素結合、および両親媒性特性）を示す、直鎖ペプチド、例えばオピオイド・ペプチドから合成される環状プロドラッグの産生および性質決定に有用な方法を提供する。ペプチド・プロドラッグ修飾のこれらの方法はまた、本発明の方法および組成物内で使用するための修飾ペプチド療法誘導体を調製するのに有用である。
【０３７７】
精製および調製
本発明にしたがった粘膜投与のための生物学的活性剤、例えばＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤は、一般的に、実質的に精製された型で被検体に直接投与するために提供される。用語「実質的に精製された」は、本明細書において天然会合タンパク質および他の混入物質から完全にまたは部分的に単離された、ペプチド、タンパク質、核酸または他の化合物を指すよう意図され、ここで、ペプチド、タンパク質、核酸または他の活性化合物は、天然存在状態に比較して、例えば細胞抽出物内での純度に比較して、測定可能な度合いに精製される。
【０３７８】
一般的に、本発明内で使用するための実質的に精製されたペプチド、タンパク質および他の活性化合物は、該ペプチド、タンパク質、または他の活性剤と、薬学的キャリアー、賦形剤、緩衝剤、吸収増進剤、安定化剤、保存剤、付属剤または他の補成分を、療法投与のための完全薬剤配合物中で混合または配合する前に、調製物に存在するすべての巨大分子種の８０％より多くを構成する。より典型的には、ペプチドまたは他の活性剤は、他の配合成分と混合する前に、精製調製に存在するすべての巨大分子種の９０％より多く、しばしば９５％より多くに相当するように精製される。他の場合、活性剤の精製調製物は、本質的に均質であることも可能であり、ここで、他の巨大分子種は、慣用技術によっては検出不能である。
【０３７９】
例えばＲ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：ニューヨーク，  １９８２を参照されたい。
【０３８０】
ＤＮＡ中のあらかじめ決定された部位で置換突然変異を作成する技術には、例えばＭ１３突然変異誘発が含まれる。置換変異体、挿入変異体、または欠失変異体を産生するＤＮＡ配列の操作は、別の箇所に好適に記載され、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９）などに記載される。
【０３８１】
多様な原核発現系を用いて、本発明内で使用するための生物学的活性ペプチドおよびタンパク質を発現可能である。例には、大腸菌、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）等が含まれる。発現されたペプチドの検出は、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降などの方法によって達成される。真核生物における発現に関して、本発明を実施する際に使用する宿主細胞には、哺乳動物、鳥類、植物、昆虫、および真菌細胞が含まれる。酵母の種（例えばサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種）または糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、アカパンカビ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種）を含む真菌細胞が、本発明内の宿主細胞として使用可能である。酵母、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株が使用可能である。
【０３８２】
配合物および投与
本発明の粘膜搬送配合物は、投与しようとする生物学的活性剤（例えば１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤）を、典型的には１以上の薬学的に許容しうるキャリアー、および場合によって他の療法成分と組み合わせて、含んでなる。キャリアー（単数または複数）は、配合物の他の成分と適合し、そして被検体において許容しえない有害な影響を引き出さないという意味で「薬学的に許容しうる」ものでなければならない。こうしたキャリアーは、上記に記載されるか、またはそうでなければ薬理学業の当業者に周知である。望ましくは、配合物は、投与しようとする生物学的活性剤が不適合であることが知られる酵素または酸化剤などの物質を含んではならない。配合物は、薬学業に周知の方法いずれによっても調製可能である。
【０３８３】
本発明の組成物および方法内で、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤は、経口、直腸、膣、鼻内、肺内、または経皮搬送によるか、あるいは目、耳、皮膚または他の粘膜表面への局所搬送によるものを含む、多様な粘膜投与様式によって、被検体に投与可能である。場合によって、ＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤は、筋内、皮下、静脈内、心房内、関節内、腹腔内、または非経口経路によるものを含む、非粘膜経路によって、協調して、または補助的に投与可能である。他の代替態様において、生物学的活性剤（単数または複数）は、哺乳動物被検体から派生する細胞、組織または臓器に直接曝露することによって、例えば適切な液体キャリアーまたは固体キャリアー中に生物学的活性剤を含有するｅｘ  ｖｉｖｏ組織または臓器治療配合物の構成要素として、ｅｘ  ｖｉｖｏ投与することも可能である。
【０３８４】
本発明にしたがった組成物は、しばしば、鼻スプレーまたは肺スプレーとして水性溶液中で投与され、そして当業者に知られる多様な方法によって、スプレー型で分配可能である。鼻スプレーとしての分配液体の好ましい系が、米国特許第４，５１１，０６９号に開示される。こうした配合物は、本発明にしたがった組成物を水に溶解して水性溶液を生じ、そして前記溶液を無菌にすることによって、好適に調製可能である。配合物は、多用量容器中に、例えば米国特許第４，５１１，０６９号に開示される密封分配系中に提示可能である。他の適切な鼻スプレー搬送系は、Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ，  Ｙ．Ｗ．  Ｃｈｉｅｎ監修，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ニューヨーク，  １９８５；および米国特許第４，７７８，８１０号に記載されている。さらなるエアロゾル搬送型には、例えば圧縮空気噴霧器、ジェット噴霧器、超音波噴霧器、および圧電噴霧器が含まれることも可能であり、これらは、薬学的溶媒、例えば水、エタノール、またはその混合物に溶解されたかまたは懸濁された生物学的活性剤を搬送する。
【０３８５】
本発明の鼻スプレー溶液および肺スプレー溶液は、典型的には、薬剤または投与しようとする薬剤であって、場合によって、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート−８０）などの界面活性剤、および１以上の緩衝剤とともに配合された前記薬剤を含んでなる。本発明のいくつかの態様において、鼻スプレー溶液は、噴霧剤をさらに含んでなる。鼻スプレー溶液のｐＨは、場合によって約ｐＨ６．８〜７．２の間であるが、望ましい場合、実質的にイオン化されていない状態で、荷電巨大分子種（例えば療法タンパク質またはペプチド）の搬送を最適化するよう、ｐＨを調整する。使用する薬学的溶媒はまた、わずかに酸性の水性緩衝液（ｐＨ４〜６）であることも可能である。これらの組成物内で使用するのに適した緩衝液は、上述のとおりか、またはそうでなければ当該技術分野に知られるとおりである。他の構成要素を添加して、化学的安定性を増進するかまたは維持することも可能であり、これらには、保存剤、界面活性剤、分散剤、またはガスが含まれる。適切な保存剤には、限定されるわけではないが、フェノール、メチルパラベン、パラベン、ｍ−クレゾール、チメロサール、塩化ベンジルアルコニマム等が含まれる。適切な界面活性剤には、限定されるわけではないが、オレイン酸、三オレイン酸ソルビタン、ポリソルベート類、レシチン、ホスファチジルコリン類、および多様な長鎖ジグリセリド類およびリン脂質類が含まれる。適切な分散剤には、限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸等が含まれる。適切なガスには、限定されるわけではないが、窒素、ヘリウム、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）類、ヒドロフルオロカーボン（ＨＦＣ）類、二酸化炭素、空気等が含まれる。
【０３８６】
代替態様内で、鼻内搬送のため、適切な粒子サイズまたは適切な粒子サイズ範囲内の乾燥型、通常、凍結乾燥型で、生物学的活性剤を含んでなる乾燥粉末配合物として、粘膜配合物を投与する。鼻通路または肺通路内の沈着に適した最小粒子サイズは、しばしば、約０．５μ空気動力学的中央粒子径（ＭＭＥＡＤ）、通常、約１μ  ＭＭＥＡＤ、そしてより典型的には約２μ  ＭＭＥＡＤである。鼻通路内の沈着に適した最大粒子サイズは、しばしば、約１０μ  ＭＭＥＡＤ、通常、約８μ  ＭＭＥＡＤ、そしてより典型的には約４μ  ＭＭＥＡＤである。ジェット・ミル、スプレー乾燥、溶媒沈殿、超臨界流体凝縮等の多様な慣用的技術によって、これらのサイズ範囲内の鼻内呼吸可能粉末を産生可能である。肺吸入または鼻吸入に際し、患者の呼吸に頼って、エアロゾル化した量に粉末を分散させる、慣用的な乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）を介して、適切なＭＭＥＡＤのこれらの乾燥粉末を、患者に投与することも可能である。あるいは、エアロゾル化した量に乾燥粉末を分散させる、外部動力供給源、例えばピストンポンプを用いる空気補助装置を介して、乾燥粉末を投与することも可能である。
【０３８７】
乾燥粉末装置は、典型的には、単一エアロゾル化用量（「パフ」）を産生するのに、約１ｍｇ〜２０ｍｇの範囲の粉末量を必要とする。生物学的活性剤の必要な量または望ましい用量が、この量より少ない場合、粉末活性剤は、典型的には、薬学的乾燥充填粉末と組み合わせて、必要な総粉末量を提供する。好ましい乾燥充填粉末には、スクロース、ラクトース、デキストロース、マンニトール、グリシン、トレハロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、およびデンプンが含まれる。他の適切な乾燥充填粉末には、セロビオース、デキストラン類、マルトトリオース、ペクチン、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等が含まれる。
【０３８８】
本発明内の粘膜搬送用に組成物を配合するため、生物学的活性剤を、多様な薬学的に許容しうる添加剤とともに、活性剤（単数または複数）の分散のための基剤またはキャリアーと組み合わせることも可能である。望ましい添加剤には、限定されるわけではないが、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸などのｐＨ調節剤が含まれる。さらに、局所麻酔剤（例えばベンジルアルコール）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えばＴｗｅｅｎ８０）、可溶性増進剤（例えばシクロデキストリン類およびその誘導体）、安定化剤（例えば血清アルブミン）、および還元剤（例えばグルタチオン）が含まれることも可能である。粘膜搬送用の組成物が液体である場合、配合物の弾力性（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）は、単一とされる０．９％（ｗ／ｖ）生理学的生理食塩水の弾力性を基準として測定した際、典型的には、投与部位の鼻粘膜で、実質的で不可逆的な組織損傷が誘導されないような値に調整される。一般的に、溶液の弾力性は、約１／３〜３、より典型的には１／２〜２、そして最もしばしば３／４〜１．７に調整される。
【０３８９】
生物学的活性剤は、基剤またはビヒクル中に分散可能であり、基剤またはビヒクルは、活性剤および望ましい添加剤いずれも分散させる能力を有する親水性化合物を含んでなることも可能である。基剤は、広い範囲の適切なキャリアーから選択可能であり、これらには、限定されるわけではないが、ポリカルボン酸またはその塩のコポリマー、無水カルボン酸（例えば無水マレイン酸）と他の単量体（例えばアクリル酸（メタクリル酸）メチル、アクリル酸など）のコポリマー、酢酸ポリビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの親水性ビニルポリマー、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにキトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、および非毒性金属塩などの天然ポリマーが含まれる。しばしば、生物分解性ポリマーが基剤またはキャリアーとして選択され、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシ酪酸ポリ（ヒドロキシ酪酸−グリコール酸）コポリマーおよびその混合物がある。あるいは、またはさらに、ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル等の合成脂肪酸エステルをキャリアーとして使用可能である。親水性ポリマーおよび他のキャリアーを単独でまたは組み合わせて用いて、そして部分的結晶化、イオン結合、架橋等によって、増進した構造完全性をキャリアーに与えることも可能である。キャリアーは、多様な型で提供可能であり、これらには、鼻粘膜への直接適用のための流体または粘性溶液、ゲル、ペースト、粉末、微小球体およびフィルムが含まれる。この背景において、選択されるキャリアーの使用は、生物学的活性剤の吸収促進を生じうる。
【０３９０】
生物学的活性剤を、多様な方法にしたがって、基剤またはキャリアーと組み合わせることも可能であり、そして活性剤の放出は、拡散、キャリアーの崩壊、または水チャネルの会合した配合によることも可能である。いくつかの状況において、適切なポリマー、例えば２−シアノアクリル酸イソブチル（例えばＭｉｃｈａｅｌら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ４３：１−５，  １９９１を参照されたい）から調製したミクロカプセル（ミクロ球体）またはナノカプセル（ナノ球体）中に活性剤を分散させ、そして鼻粘膜に適用する生体適合分散媒体中に分散させて、延長された期間、持続した搬送および生物学的活性を生じる。
【０３９１】
本発明内の薬学的剤の粘膜搬送をさらに増進するため、活性剤を含んでなる配合物はまた、基剤または賦形剤として、親水性低分子量化合物も含有可能である。こうした親水性低分子量化合物は、通路媒体を提供し、この媒体を通じて、生理学的活性ペプチドまたはタンパク質などの水溶性活性剤が基剤を通じて体表面に分散し、ここで吸収されることも可能である。親水性低分子量化合物は、場合によって、粘膜または投与大気中の水分を吸収し、そして水可溶性活性ペプチドを溶解する。親水性低分子量化合物の分子量は、一般的に１００００以下であり、そして好ましくは３０００以下である。典型的な親水性低分子量化合物には、ポリオール化合物、例えばオリゴ糖、二糖および単糖、例えばスクロース、マンニトール、ラクトース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−エリスロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、ラクツロース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセリンおよびポリエチレングリコールが含まれる。本発明内でキャリアーとして有用な親水性低分子量化合物の他の例には、Ｎ−メチルピロリドン、およびアルコール（例えばオリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール等）が含まれる。これらの親水性低分子量化合物は、単独で、あるいは互いに、または鼻内配合物の他の活性または不活性化合物と組み合わせて使用可能である。
【０３９２】
本発明の組成物は、あるいは、ｐＨ調整剤および緩衝剤、弾力性調整剤、湿潤剤などのおおよその生理学的条件に必要とされるような物質を、薬学的に許容しうるキャリアーとして含有し、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等を含有する。固体組成物には、慣用的な非毒性の薬学的に許容しうるキャリアーが使用可能であり、これらには、例えば薬剤等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。
【０３９３】
生物学的活性剤を投与するための療法組成物はまた、溶液、マイクロエマルジョン、または高濃度の活性成分に適した他の秩序だった構造として配合可能である。キャリアーは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることも可能である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散可能配合物の場合、望ましい粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持可能である。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むことが望ましいであろう。生物学的活性剤の持続した吸収は、組成物中に吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによって、達成可能である。
【０３９４】
本発明の特定の態様において、徐放配合物中で、例えば徐放ポリマーを含む組成物中で、生物学的活性剤を投与する。活性剤は、迅速な放出に対して保護するキャリアー、例えば制御放出ビヒクル、例えばポリマー、微量被包搬送系または生物接着ゲルとともに調製可能である。本発明の多様な組成物における活性剤の持続した搬送は、組成物において、吸収を遅延させる組成剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムヒドロゲルおよびゼラチンを含むことによって達成可能である。生物学的活性剤の制御放出配合物が望ましい場合、本発明にしたがって使用するのに適した制御放出結合剤には、いかなる生体適合性徐放物質も含まれ、該物質は、活性剤に対して不活性であり、そして生物学的活性剤を取り込むことが可能である。多くのこうした物質が当該技術分野に知られる。有用な制御放出結合剤は、鼻内搬送後の生理学的条件下で（例えば鼻粘膜表面で、または経粘膜搬送後、体液の存在下で）、ゆっくりと代謝される物質である。適切な結合剤には、限定されるわけではないが、徐放配合物において当該技術分野で先に用いられている、生体適合ポリマーおよびコポリマーが含まれる。こうした生体適合化合物は、取り巻く組織に対して、非毒性および不活性であり、そして鼻刺激、免疫応答、炎症等の有意な副作用を誘発しない。これらは代謝産物に代謝され、代謝産物はやはり生体適合性であり、そして体から容易に除去される。
【０３９５】
この背景において使用する典型的なポリマー物質には、限定されるわけではないが、加水分解可能エステル連結を有するコポリマー性およびホモポリマー性ポリエステル由来のポリマー性マトリックスが含まれる。これらのいくつかは、当該技術分野において、生物分解性であり、そしてまったく毒性を持たないか、低い毒性を有する分解産物を生じることが知られる。典型的なポリマーには、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸）（ＤＬ  ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ−乳酸−コグリコール酸）（Ｄ  ＰＬＧＡ）およびポリ（Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）（Ｌ  ＰＬＧＡ）が含まれる。他の有用な生物分解または生物侵食可能ポリマーには、限定されるわけではないが、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）、ポリ（イプシロン−アプロラクトン−ＣＯ−乳酸）、ポリ（イプシロン−アプロラクトン−ＣＯ−グリコール酸）、ポリ（ベータ−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（アルキル−２−シアノアクリレート）などのポリマー類、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）などのヒドロゲル類、ポリアミド類、ポリ（アミノ酸類）（すなわちＬ−ロイシン、グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン等）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（２−ヒドロキシエチルＤＬ−アスパルタミド）、ポリアセタールポリマー類、ポリオルトエステル類、ポリカーボネート、ポリマレアミド類、多糖類およびそのコポリマー類が含まれる。一般的に、こうした配合物を調製する多くの方法が当業者に知られる。他の有用な配合物には、ロイプロリド（登録名：Ｌｕｐｒｏｎ．ＲＴＭ．）の投与に関して、当該技術分野に知られるものなどの制御放出組成物、例えばミクロカプセル（米国特許第４，６５２，４４１号および第４，９１７，８９３号）、ミクロカプセルおよび他の配合物を作成するのに有用な乳酸−グリコール酸コポリマー（米国特許第４，６７７，１９１号および第４，７２８，７２１号）、並びに水溶性ペプチドの徐放組成物（米国特許第４，６７５，１８９号）が含まれる。
【０３９６】
本発明の粘膜配合物は、典型的には、製造、貯蔵および使用のすべての条件下で、無菌で、そして安定でなければならない。無菌溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙する成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶媒中に取り込み、その後、フィルター滅菌することによって、調製可能である。一般的に、分散物は、基本的な分散媒体および上に列挙するような必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に、活性化合物を取り込むことによって調製される。無菌粉末の場合、調製法には、真空乾燥および凍結乾燥が含まれ、これによって、先に無菌ろ過した溶液由来のさらなる望ましい成分いずれかが加わった、活性成分の粉末が生じる。微生物の作用の防止は、多様な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって達成可能である。
【０３９７】
本発明のさらに詳細な側面において、生物学的活性剤を安定化させ、被検体への搬送後の有効半減期を延長し、特に、生理学的環境内で（例えば鼻粘膜表面で、血流中で、または結合組織区画または液体充満体腔内で）活性状態の代謝永続を延長する。この目的のため、生物学的活性剤は、化学的手段、例えば化学的コンジュゲート化、Ｎ−末端キャップ化、ＰＥＧ化、または組換え手段、例えば部位特異的突然変異誘発または融合タンパク質の構築によって修飾可能であり、あるいは多様な安定化剤またはキャリアーと配合することも可能である。こうして安定化された、上述のように投与される活性剤は、非安定化型に比較して、生理学的条件下で、延長された期間、生物学的活性を保持する（例えば２〜３倍、５〜１０倍までのより高い安定性）。
【０３９８】
本発明の多様な治療法にしたがって、治療または予防が捜し求められている障害の管理に関与する慣用的方法論と一致した方式で、生物学的活性剤を哺乳動物被検体に搬送する。本明細書の開示にしたがって、予防的または療法的有効量の生物学的活性剤を、選択される疾患または状態あるいはその１以上の症状（単数または複数）を防止し、阻害し、そして／または改善するのに十分な時間および条件下の治療が必要な被検体に投与する。
【０３９９】
用語「被検体」は本明細書において、本発明の組成物を投与可能ないかなる哺乳動物患者も指す。本発明の組成物および方法を用いた治療に意図される典型的な被検体には、ヒトとともに、非ヒト霊長類および他の動物が含まれる。本発明の方法にしたがった予防または治療の対象患者を同定するため、許容されるスクリーニング法を使用して、上に論じるような標的とされるまたは疑われる疾患または状態と関連するリスク要因を決定するか、あるいは被検体において現存する疾患または状態の状況を決定する。これらのスクリーニング法には、例えば家族的、性的、薬剤使用、および標的とされるまたは疑われる疾患または状態に関連しうる他のリスク要因を決定する慣用的な試案とともに、疾患関連マーカーを検出し、そして／または性質決定するのに当該技術分野において利用可能であり、そして周知である、多様なＥＬＩＳＡイムノアッセイ法などの診断法が含まれる。これらおよび他の日常的な方法によって、臨床家が、本発明の粘膜法および配合物を用いる療法が必要な患者を選択することが可能になる。これらの方法および原理にしたがい、本明細書の解説にしたがって、独立の予防プログラムまたは治療プログラムとして、あるいは手術、ワクチン接種、免疫療法、ホルモン治療、細胞、組織、または臓器移植等を含む、他の治療に対する追跡補助または協調治療措置として、生物学的活性剤を粘膜投与可能である。
【０４００】
本発明にしたがった粘膜投与によって、投薬量および副作用を管理し、そして監視するため、十分な保護手段が適切である場合、患者による有効な自己投与治療が可能になる。粘膜投与はまた、注射などの、痛みを伴い、そして患者を感染可能性にさらし、そして薬剤生物学的利用能の問題を提示しうる、他の投与型の特定の欠点も克服する。鼻搬送および肺搬送のため、スプレーとしての療法液体の制御エアロゾル分配系が周知である。１つの態様において、特別に構築された機械的ポンプバルブ手段によって、活性剤の計測した用量を搬送する（米国特許第４，５１１，０６９号）。この手持ち搬送装置は、エアロゾル容器中の溶液の無菌性が、無期限に維持されるように、独自に、換気されない。
【０４０１】
投薬量
予防目的および治療目的のため、本明細書に開示する生物学的活性剤（単数または複数）は、単一多量（ｂｏｌｕｓ）搬送で、延長された期間にわたる連続搬送（例えば連続経皮搬送、粘膜搬送、または静脈内搬送）を介して、または反復投与プロトコルで（例えば時間ごと、日ごと、または週ごとの反復投与プロトコルによって）、被検体に投与可能である。この背景において、生物学的活性剤（単数または複数）の療法的に有効な投薬量には、上に示す標的とされる疾患または状態に関連する１以上の症状または検出可能な状態を軽減する、臨床的に有意な結果を生じるであろう、延長された予防措置または治療措置内の反復用量が含まれうる。この背景において、有効投薬量の決定は、典型的には動物モデル研究に基づき、その後、ヒト臨床試験が続き、そして被検体における標的とされる疾患症状または状態の発生または重症度を有意に減少させる有効な投薬量および投与プロトコルを決定することによって、導かれる。これに関連して適切なモデルには、例えば、ネズミ、ラット、ブタ、ネコ、非ヒト霊長類、および当該技術分野に知られる他の許容される動物モデル被検体が含まれる。あるいは、有効投薬量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル（例えば免疫学的および組織病理学的アッセイ）を用いて決定可能である。こうしたモデルを用いると、生物学的活性剤（単数または複数）の療法的有効量（例えば望ましい反応を引き出すため、鼻内投与で有効、経皮投与で有効、静脈内投与で有効、または筋内投与で有効である量）を投与するのに適した濃度および用量を決定するのに、典型的には、通常の計算および調整しか必要とされない。別の態様において、生物学的活性剤（単数または複数）の「有効量」または「有効用量」は、療法目的または診断目的いずれかで、上述のような疾患または状態に相関する１以上の選択される生物学的活性（単数または複数）を単に阻害するか、または増進することも可能である。
【０４０２】
生物学的活性剤の実際の投薬量は、もちろん、疾患徴候および被検体の特定の状態（例えば被検体の年齢、大きさ、適性、症状の度合い、感受性因子等）、投与時間および投与経路、同時に投与される他の薬剤または治療とともに、被検体において望ましい活性または生物学的反応を引き出す生物学的活性剤（単数または複数）の特定の薬理学などの要因に応じて、多様であろう。投薬措置を調整して、最適予防反応または療法反応を提供可能である。療法的に有効な量はまた、生物学的活性剤のいかなる毒性または有害副作用よりも、臨床的な意味で、療法的に有益な効果が上回るものである。本発明の方法および配合物内の生物学的活性剤の療法的に有効な量の限定されない範囲は、０．０１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より典型的には約０．０５〜５ｍｇ／ｋｇ、そして特定の態様において、約０．２〜２ｍｇ／ｋｇである。この範囲内の投薬量は、例えば１日あたり複数の投与、毎日または毎週の投与を含む、単一または複数の投与によって、達成可能である。投与あたり、生物学的活性剤（例えば１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに他の生物学的活性剤）の少なくとも１マイクログラム、より典型的には約１０μｇ〜５．０ｍｇ、そして特定の態様において、約１００μｇ〜１．０または２．０ｍｇを平均的なヒト被検体に投与することが望ましい。特定の被検体各々に対して、個々の必要性、並びに浸透化ペプチド（単数または複数）および他の生物学的活性剤（単数または複数）を投与するかまたはその投与を監督する個人の専門的な判断にしたがって、特定の投薬措置を評価し、そして時間に渡って調整すべきであることがさらに注目される。
【０４０３】
生物学的活性剤の投薬量は、標的部位で望ましい濃度を維持するため、主治医によって多様であることも可能である。例えば、血流またはＣＮＳ中の生物学的活性剤の選択される局所濃度は、被検体の状態および提示される反応または測定される反応に応じて、１リットルあたり約１〜５０ナノモル、ときに約１．０ナノモル〜１０ナノモル、１５ナノモルまたは２５ナノモルの間であることも可能である。搬送様式、例えば静脈内搬送または皮下搬送に対する、経皮搬送、直腸搬送、経口搬送、または鼻内搬送に基づいて、より高いまたはより低い濃度が選択可能である。投与された配合物の放出速度、例えば粉末に対する鼻スプレー、注射された微粒子または経皮搬送配合物に対する徐放経口配合物などの放出速度に基づいてもまた、投薬量を調整すべきである。同じ血清濃度レベルを達成するため、例えば、５ナノモルの放出速度の徐放粒子（標準的条件下）は、１０ナノモルの放出速度の粒子の投薬量の約２倍で投与されるであろう。
【０４０４】
本発明内で使用するための選択される生物学的活性剤の特定の投薬量に関するさらなる指針は、文献に広く見出されうる。これは、本明細書に開示する多くの療法ペプチドおよびタンパク質剤に関して当てはまる。例えば、毒性物質に中毒した個体の治療におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の投与に関する指針は、米国特許第５，１４０，００８号および第４，８１６，４３９号に見出されることが可能であり；局所潰瘍の治療におけるｈＧＨの投与に関する指針は、米国特許第５，００６，５０９号に見出されることが可能であり；汎血球減少症の治療のためのＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、およびマルチ−ＣＳＦの投与に関する指針は、米国特許第５，１９８，４１７号に見出されることが可能であり；新生物の治療のためのアスパラギナーゼの搬送に関する指針は、米国特許第４，４７８，８２２号および第４，４７４，７５２号に見出されることが可能であり；腫瘍の治療におけるＬ−アスパラギナーゼの投与に関する指針は、米国特許第５，２９０，７７３号に見出され；局所配合物における、プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、プロスタグランジンＦ２アルファ、プロスタグランジンＩ２、ペプシン、パンクレアチン、レンニン、パパイン、トリプシン、パンクレリパーゼ、キモパパイン、ブロメライン、キモトリプシン、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン・アクチベーター、フィブリノリジン、デオキシリボヌクレアーゼ、スティラインズ、コラゲナーゼ、アスパラギナーゼ、またはヘパリンの投与に関する指針は、米国特許第５，２６０，０６６号に見出されることが可能であり；リポソーム中のスーパーオキシド・ジスムターゼ、グルコセレブロシド類、アスパラギナーゼ、アデノシン・デアミナーゼ、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータ）、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）の投与に関する指針は、米国特許第５，２２５，２１２号に見出されることが可能であり；新生物病変の治療におけるアスパラギナーゼの投与に関する指針は、米国特許第４，９７８，３３２号に見出されることが可能であり；腫瘍増殖の減少におけるアスパラギナーゼの投与に関する指針は、米国特許第４，８６３，９１０号に見出されることが可能であり；移植拒絶の防止における抗体の投与に関する指針は、米国特許第４，６５７，７６０号および第５，６５４，２１０号に見出されることが可能であり；Ｔ細胞突然変異誘発、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導、ナチュラルキラー細胞活性の増大、インターフェロン−ガンマの誘導、細胞性免疫の回復または増進、および細胞仲介抗腫瘍活性の増大を含む、免疫調節状態の療法としてのインターロイキン−１の投与に関する指針は、米国特許第５，２０６，３４４号に見出されることが可能であり；腫瘍の治療におけるインターロイキン−２の投与に関する指針は、米国特許第４，６９０，９１５号に見出されることが可能であり；そして癌化学療法としての造血の刺激における、そして免疫障害の治療における、インターロイキン−３の投与に関する指針は、米国特許第５，１６６，３２２号に見出されることが可能である。前述の米国特許は、特定の生物学的活性の配合および投与に関して提供される指針に関する。
【０４０５】
キット
本発明はまた、上述の医薬組成物、活性成分、並びに／あるいは哺乳動物被検体において、疾患および他の状態の予防および治療に使用するため、前記物質を投与するための手段を含有する、キット、パッケージおよび多容器単位も含む。完結には、これらのキットは、粘膜搬送のための薬剤調製中に配合される、１以上のＪＡＭ、オクルディンおよびクローディン・ペプチド、タンパク質、類縁体および模倣体、並びに本明細書に開示する他の生物学的活性剤を含有する容器または配合物を含む。生物学的活性剤（単数または複数）は、場合によって、バルク分配容器あるいは単位投薬型または多単位投薬型に含有される。例えば肺または鼻内スプレーアプリケーターなど、場合による分配手段が提供可能である。パッケージング構成要素は、同時にパッケージングされる薬学的剤が、特定の疾患または状態を治療するかまたは予防するため、粘膜的に、例えば鼻内的に使用可能であることを示す、ラベルまたは取り扱い説明書を、場合によって含む。本発明のより詳細な態様において、キットには：（ａ）凝集阻害剤；（ｂ）電荷修飾剤；（ｃ）ｐＨ調節剤；（ｄ）分解酵素阻害剤；（ｅ）粘液溶解剤または粘液一掃剤；（ｆ）繊毛抑制剤；（ｇ）膜浸透増進剤（例えば（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉ）リン脂質または脂肪酸添加剤、混合ミセル、リポソーム、またはキャリアー、（ｉｉｉ）アルコール、（ｉｖ）エナミン、（ｖ）ＮＯドナー化合物、（ｖｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉ）小疎水性浸透増進剤；（ｖｉｉｉ）ナトリウムまたはサリチル酸誘導体；（ｉｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘ）シクロデキストリンまたはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉ）キレート剤、（ｘｉｉｉ）アミノ酸またはその塩、（ｘｉｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸またはその塩、（ｘｖ）選択された膜構成要素を分解する酵素、（ｉｘ）脂肪酸合成阻害剤、（ｘ）コレステロール合成阻害剤；あるいは（ｘｉ）（ｉ）〜（ｘ）の膜浸透増進剤の組み合わせいずれか）；（ｈ）上皮接合部生理機能の第二の調節剤、例えば一酸化窒素（ＮＯ）刺激剤、キトサン、およびキトサン誘導体；（ｉ）血管拡張剤；（ｊ）選択的輸送増進剤；および（ｋ）安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種であって、該物質と生物学的活性剤が有効に組み合わされ、会合し、含有され、被包され、または結合した結果、増進した粘膜搬送のため、活性剤が安定化される、前記安定化搬送ビヒクル、キャリアー、支持体または複合体形成種
から選択される１以上の粘膜搬送増進剤が含まれる。
【０４０６】
本発明は、以下の特定の実施例によってさらに例示され、この実施例は、いかなる点でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
（実施例１）
粘膜搬送−浸透動力学および細胞傷害性
１．器官型モデル
以下の方法は、哺乳動物被検体において、生物学的活性療法剤、並びに上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、可逆的に粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進する、浸透化ペプチドの粘膜搬送を増進させるのに有効な量に関して、粘膜搬送パラメーター、動力学および副作用を評価するのに一般的に有用である。浸透化ペプチドは、一般的に、接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディン・タンパク質から選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合を有効に阻害する。浸透化ペプチドは、本発明の配合物および方法内の、哺乳動物接合部接着分子（ＪＡＭ）、例えばＪＡＭ−１、ＪＡＭ−２、またはＪＡＭ−３の細胞外ドメイン、哺乳動物クローディン、例えばクローディン−１、クローディン−２、クローディン−３、クローディン−４、クローディン−５、クローディン−６、クローディン−７、クローディン−８、クローディン−９、またはクローディン−１０の細胞外ドメイン、あるいは哺乳動物オクルディンの細胞外ドメインの約４〜２５の隣接アミノ酸（あるいは、約６〜１５の隣接アミノ酸）由来である。
【０４０７】
浸透動力学および細胞傷害性はまた、哺乳動物ＪＡＭ、哺乳動物クローディン、または哺乳動物オクルディン・タンパク質の細胞外ドメインを含んでなる浸透化ペプチドを含む、組み合わせ配合物または協調投与のため、本明細書に開示する多様な粘膜搬送増進剤の有効性および特徴を決定するのにも有用である。１つの典型的なプロトコルにおいて、インターフェロン−βに例示される、生物学的活性療法剤と組み合わせて、上に開示するような浸透化ペプチドの鼻内搬送を増進させるのに有効な量に関して、浸透動力学および許容しえない細胞傷害性の欠如が立証される。
【０４０８】
呼吸管を裏打ちする擬似階層化上皮のモデルとして、ＥｐｉＡｉｒｗａｙTM系がＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ（マサチューセッツ州アッシュランド）に開発された。上皮細胞は、空気−液体界面で、底が多孔膜である細胞培養挿入物上で増殖され、これによって、細胞は非常に極性化された形態に分化する。頂端表面は、微小繊毛超構造で繊毛化され、そして上皮は粘液を産生する（イムノブロッティングによって、ムチンの存在が確認されている）。挿入物は、直径０．８７５ｃｍを有し、０．６ｃｍ2の表面面積を提供する。輸送のおよそ３週間前に、工場で、挿入物上に細胞を蒔く。１つの「キット」は２４ユニットからなる。
【０４０９】
Ａ．到着したら、ユニットを６ウェル・マイクロプレート中の無菌支持体上に置く。各ウェルには、５ｍｌの専売培地を入れる。このＤＭＥＭに基づく培地は、血清不含であるが、上皮増殖因子および他の因子が補充されている。培地は常に、鼻内搬送に関して考慮されるいかなるサイトカインまたは増殖因子の内因性レベルに関しても試験されているが、これまで、インスリンを除き、研究されたすべてのサイトカインおよび因子を含んでいない。５ｍｌ体積は、スタンド上のユニットの底に接触するのに十分であるが、上皮の頂端表面は、空気と直接接触を維持するようにされている。この工程およびユニットを液体含有ウェルに移すことを伴うすべての続く工程では、無菌ピンセットを用い、ユニットの底および培地の間に空気がまったく捕捉されないことを確実にする。
【０４１０】
Ｂ．プレート中のユニットを、空気中５％  ＣＯ2の大気において、インキュベーター中で３７℃に２４時間維持する。この期間の最後に、培地を新鮮な培地と交換し、そしてユニットをさらに２４時間、インキュベーターに戻す。
【０４１１】
２．実験プロトコル−浸透動力学
Ａ．２４のＥｐｉＡｉｒｗａｙTMユニットの「キット」を、５つの異なる配合物を評価するのに日常的に使用可能であり、配合物は各々、４つ組のウェルに適用される。各ウェルは、浸透動力学の決定（４つの時点）、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）、ＭＴＴ還元によって測定されるようなミトコンドリア・レダクターゼ活性、およびＬＤＨの放出によって測定されるような細胞溶解に使用される。さらなるセットのウェルを、対照として使用し、これは浸透動力学の決定中、偽処理するが、そうでなければ経上皮抵抗および生存度の決定のための試験試料含有ユニットと同一に取り扱う。対照の測定もまた、日常的に、４つ組のユニット上で行うが、時に、われわれは、対照に関して３つ組ユニットを使用し、そしてキット中の残った４つのユニットを、未処理ユニットに対する経上皮抵抗および生存度の測定にあてるか、または、総ＬＤＨレベルの測定用にユニットを凍結し、そして融解して、１００％細胞溶解の参照値として用いた。
【０４１２】
Ｂ．すべての実験において、研究しようとする粘膜搬送配合物を、全頂端表面を覆うのに十分である１００μｌの体積中、各ユニットの頂端表面に適用する。続いて、ＥＬＩＳＡまたは他の指定されたアッセイによって活性物質の濃度を測定するため、頂端表面に適用する濃度で、試験配合物の適切な体積（一般的に１００μｌより多くは必要とされない）を取り分けておく。
【０４１３】
Ｃ．実験のため、スタンドなしで、６ウェルプレート中にユニットを入れる：各ウェルは、０．９ｍｌの培地を含有し、これは、ユニットの多孔膜の底に接触するのに十分であるが、ユニットに対して、いかなる有意な上方静水圧も生じない。
【０４１４】
Ｄ．エラーの潜在的な元を最小限にし、そして濃度勾配のいかなる形成も回避するため、研究各時点で、ユニットを１つの０．９ｍｌ含有ウェルから別のウェルに移す。これらの移動は、１００μｌ体積の試験物質を頂端表面に適用したゼロ時点に基づいて、以下の時点で行う：１５分、３０分、６０分、および１２０分。
【０４１５】
Ｅ．各時点の間では、プレート中のユニットを３７℃インキュベーターに維持する。プレートを取り除き、そして無菌ピンセットを用いて、１つのウェルから別のウェルにユニットを移す短い期間中、温度に最小の変化しか起きないように、ウェルあたり０．９ｍｌ培地を含有するプレートもまた、インキュベーターに維持する。
【０４１６】
Ｆ．各時点の完了時、各ユニットを移したウェルから培地を取り除き、そして浸透した試験物質の濃度を測定するため、２つの試験管（一方の試験管には７００μｌを入れ、そしてもう一方には２００μｌを入れる）にアリコットし、そして試験物質が細胞傷害性である場合、上皮からの細胞溶解酵素、乳酸デヒドロゲナーゼの放出に関して測定する。アッセイを２４時間以内に行う場合、これらの試料を冷蔵庫中に維持するか、またはアッセイ用に、一度融解するまで、サブアリコットして、そして−８０℃に凍結して維持する。凍結−融解周期の反復は、避けるべきである。
【０４１７】
Ｇ．エラーを最小限にするため、すべての試験管、プレート、およびウェルは、実験を開始する前に、あらかじめラベルする。
Ｈ．１２０分時点の最後に、最後の０．９ｍｌ含有ウェルから、ウェルあたり０．３ｍｌ培地を含有する２４ウェル・マイクロプレートにユニットを移す。この体積はやはり、ユニットの底に接触するのに十分であるが、ユニットに上方静水圧を及ぼさない。経上皮抵抗の測定前に、ユニットをインキュベーターに戻す。
【０４１８】
３．実験プロトコル−経上皮電気抵抗
Ａ．呼吸気道上皮細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏとともにｉｎ  ｖｉｔｒｏで密着結合を形成し、そしてそれによって、組織を渡る溶質の流れを制限する。これらの結合は、切り出した気道組織において、数百オームｘｃｍ2の経上皮抵抗を与える。ＭａｔＴｅｋ  ＥｐｉＡｉｒｗａｙTMユニットにおいて、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）は、製造者によって、日常的に、ほぼ１０００オームｘｃｍ2であることが報告されている。本明細書で測定するデータによって、浸透研究工程の手順中、偽曝露された対照ＥｐｉＡｉｒｗａｙTMユニットのＴＥＲは、いくぶん低い（７００〜８００オームｘｃｍ2）ことが示されるが、小分子の浸透は、ＴＥＲの逆数に比例するため、この値は、なお、浸透に対して実質的なバリアを提供するのに十分に高い。細胞を含まない、底が多孔膜であるユニットは、逆に最小経膜抵抗しか提供しない（およそ５〜２０オームｘｃｍ2）。
【０４１９】
Ｂ．ＴＥＲの正確な測定は、オーム測定装置の電極が、膜の上および下の有意な表面面積に渡って配置され、そして膜からの電極の距離が、再生可能に制御されることを必要とする。ＭａｔＴｅｋに推奨され、そして本明細書のすべての実験に使用されるＴＥＲ測定法は、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．、フロリダ州サラソタの「ＥＶＯＭ」TM上皮ボルト・オーム測定装置および「ＥＮＤＯＨＭ」TM組織抵抗測定チャンバーを使用する。
【０４２０】
Ｃ．電極を平衡化するため、ＴＥＲ測定前の少なくとも２０分間、チャンバーをまず、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で満たす。
Ｄ．ＴＥＲの測定は、チャンバー中１．５ｍｌのＰＢＳ、および測定しようとする、底が膜であるユニット中３５０μｌのＰＢＳで行う。細胞を含有しない（が３５０μｌのＰＢＳを含有する）ユニットの膜のすぐ上の位置にあるように上部電極を調整し、そしてその後、再生可能な配置を確実にするため、固定する。細胞不含ユニットの抵抗は、典型的には、５〜２０オームｘｃｍ2である（「バックグラウンド抵抗」）。
【０４２１】
Ｅ．チャンバーを用意し、そしてバックグラウンド抵抗を記録したら、浸透測定にちょうど使用した２４ウェルプレート中のユニットをインキュベーターから取り除き、そしてＴＥＲ測定のため、個々にチャンバーに入れる。
【０４２２】
Ｆ．膜の底が湿っていることを確実にするため、各ユニットを、まず、ＰＢＳを含有するペトリ皿に移す。３５０μｌ  ＰＢＳのアリコットをユニットに添加し、そしてその後、注意深く吸引して、標識した試験管に入れ、頂端表面をリンスする。その後、３５０μｌ  ＰＢＳの２回目の洗浄液をユニットに適用し、そして同じ収集試験管中に吸引する。
【０４２３】
Ｇ．ユニットをチャンバー（新鮮な１．５ｍｌアリコットのＰＢＳを含有する）に入れる前に、外部表面の余分なＰＢＳのみを穏やかに拭き取ってなくす。上部電極をチャンバーに入れ、そしてＥＶＯＭ測定装置上でＴＥＲを読み取る前に、３５０μｌ  ＰＢＳのアリコットを、ユニットに添加する。
【０４２４】
Ｈ．ユニットのＴＥＲをＥＮＤＯＨＭチャンバー中で読み取った後、ユニットを取り除き、ＰＢＳを吸引して、そして保存しておき、そして空気界面が頂端表面上であるように、ユニットを、ウェルあたり０．３ｍｌの培地を含有する２４ウェルプレートに戻す。
【０４２５】
Ｉ．以下の順序でユニットを読み取る：すべて偽処理した対照、その後、すべて配合物処理した試料、その後、偽処理した対照各々の第二のＴＥＲ読み取り。すべてのＴＥＲ測定が完了した後、ＭＴＴ還元によって、生存度を決定するため、２４ウェル・マイクロプレート中のユニットをインキュベーターに戻す。
【０４２６】
４．実験プロトコル−ＭＴＴ還元による生存度
ＭＴＴは、損なわれていないミトコンドリア機能を持つ生存細胞によって、または呼吸バーストを生じうる細胞由来の非ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ活性によって、不溶性有色ホルマザンにミトコンドリア・デヒドロゲナーゼ活性によって還元される、細胞浸透性テトラゾリウム塩である。ホルマザンの形成は、上皮細胞の生存度の優れた指標であり、これは、これらの細胞が有意な呼吸バーストを生じないためである。われわれは、生存度を評価するため、これらのユニットに対して、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐによって調製されたＭＴＴ試薬キットを使用した。
【０４２７】
Ａ．ＭＴＴ試薬は濃縮物として供給され、そして生存度をアッセイしようとする日（典型的には、浸透動力学およびＴＥＲを午前中に測定し、その日の午後）に、ＤＭＥＭに基づく専売の希釈剤に希釈する。最終ＭＴＴ濃度は１ｍｇ／ｍｌである。
【０４２８】
Ｂ．最終ＭＴＴ溶液をウェルあたり３００μｌの体積で、２４ウェル・マイクロプレートのウェルに添加する。上述のように、この体積は、ＥｐｉＡｉｒｗａｙTMユニットの膜に接触するのに十分であるが、細胞に有意な陽性静水圧を課さない。
【０４２９】
Ｃ．ＴＥＲ測定後に、入れておいた２４ウェルプレートからユニットを取り出し、そしてユニットの外部表面からいかなる余分な液体も取り除いた後、ＭＴＴ試薬を含有するプレートに移す。その後、プレート中のユニットを、空気中５％  ＣＯ2の大気中、３７℃のインキュベーターに３時間入れる。
【０４３０】
Ｄ．３時間のインキュベーション終了時、生存細胞を含有するユニットは、目に見えて紫に変わっているであろう。不溶性ホルマザンは、ＭＴＴ還元の度合いを定量化するため、ユニット中の細胞から抽出しなければならない。ホルマザンの抽出は、先のように、ユニットの外部表面から余分な液体を取り除いた後、ウェルあたり２ｍｌの抽出溶液を含有する２４ウェル・マイクロプレートにユニットを移すことによって達成される。この体積は、ユニットの膜および頂端表面両方を完全に覆うのに十分である。光遮断チャンバー中、室温で一晩、抽出を進行させる。ＭＴＴ抽出物は、伝統的に、高濃度の界面活性剤を含有し、そして細胞を破壊する。
【０４３１】
Ｅ．抽出終了時、各ユニット内の液体および周りのウェルの液体を合わせ、そして試験管に移して、続いて９６ウェル・マイクロプレートにアリコットし（２００μｌアリコットが最適である）そしてＶＭａｘマルチウェル・マイクロプレート分光光度計上で、５７０ｎｍの吸光度を測定する。抽出されたユニットから生じる破片による濁度が吸光度に寄与しないことを確実にするため、ＶＭａｘにおいて、各ウェルに関して６５０ｎｍでの吸光度もまた測定し、そして５７０ｎｍでの吸光度から自動的に減じる。ホルマザン吸光度の測定の「ブランク」は、ユニットが曝露されていない抽出物の２００μｌアリコットである。この吸光度の値は、ゼロ生存度を構成すると仮定される。
【０４３２】
Ｆ．２４ＥｐｉＡｉｒｗａｙTMユニットの各キットから２つのユニットを、浸透動力学およびＴＥＲの測定中、処理しないまま放置する。これらのユニットは、１００％細胞生存度の陽性対象として使用される。行うすべての研究において、浸透動力学に関して偽処理し、そしてＴＥＲ測定を行った対照ユニットにおける細胞生存度と比較して、これらの未処理細胞における細胞生存度には、統計的に有意な相違はなかった。試験配合物で処理したすべてのユニットの吸光度は、ＭＴＴとのインキュベーション時、ユニット中の細胞の生存度パーセントに直線的に比例すると仮定される。このアッセイは、ＴＥＲ測定中、典型的には、頂端表面に試験物質を導入し、そして続いて、ユニットの頂端表面をリンスした４時間後より前には行われないことに注目すべきである。
【０４３３】
５．ＬＤＨ放出による生存度の測定
ＭＴＴ還元によるミトコンドリア・レダクターゼ活性の測定は、細胞生存度の高感度プローブであるが、このアッセイは必然的に細胞を破壊し、そしてしたがって、各研究の終了時にのみ実行可能である。細胞が壊死性溶解を経る際、細胞質ゾルの内容物が周囲の培地に流出し、そして乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などの細胞質ゾル酵素がこの培地中で検出可能である。培地中のＬＤＨに関するアッセイは、浸透動力学の２時間の測定の各時点で取り除かれる培地試料に対して実行可能である。したがって、かなりの時間が経過するまで発展しない、配合物の細胞傷害性の効果とともに、気道上皮への曝露の最初の数分間で細胞溶解を誘導する配合物の効果が検出可能である。
【０４３４】
Ａ．ＥｐｉＡｉｒｗａｙTMユニットの細胞溶解を評価するため推奨されるＬＤＨアッセイは、ＮＡＤからのＮＡＤＨ生成を伴う、ラクテートのピルベートへの変換に基づく。その後、ＮＡＤＨは、未精製「ジアフォラーゼ」調製によって触媒され、テトラゾリウム塩ＩＮＴの同時還元を伴って再酸化される。ＩＮＴの還元によって形成されるホルマザンは、可溶性であり、ＬＤＨ活性の全アッセイは、ラクテート、ＮＡＤ、ジアフォラーゼ、およびＩＮＴを含有する均質水性培地中で実行可能である。
【０４３５】
Ｂ．ＬＤＨ活性のアッセイは、ＥｐｉＡｉｒｗａｙTMユニットを取り巻き、そして各時点で収集される、「上清」培地の試料由来の５０μｌアリコットに対して行われる。これらの試料は、冷蔵庫で２４時間より長く保存されず、また収集数時間以内に凍結した後、融解されたかいずれかであった。各ＥｐｉＡｉｒｗａｙTMユニットは、試験物質を適用した１５分後、３０分後、１時間後、および２時間後に収集した上清培地の試料を生成する。アリコットをすべて、９６ウェル・マイクロプレートに移す。
【０４３６】
Ｃ．ユニットに曝露されていない培地の５０μｌアリコットは、０％細胞傷害性の「ブランク」または陰性対照として働く。アッセイ試薬混合物と未曝露培地の反応後に存在する「内因性」ＬＤＨの見かけのレベルは、浸透動力学研究を行うのに必要な２時間の全時間経過に渡って、すべて偽処理した対照ユニットに放出されるＬＤＨの見かけのレベルと、実験誤差内で同一である。したがって、実験誤差内で、これらの偽処理ユニットは、浸透動力学測定の時間経過に渡って、上皮細胞の細胞溶解をまったく示さない。
【０４３７】
Ｄ．ユニット中の細胞の１００％が溶解された後に放出されるＬＤＨのレベルを反映する上清培地試料を調製するため、いかなる前操作にもさらされていないユニットを、浸透動力学測定のプロトコルにおけるように、０．９ｍｌの培地を含有する６ウェル・マイクロプレートのウェルに添加し、ユニットを含有するプレートを−８０℃で凍結し、そしてその後、ウェルの内容物を融解させた。この凍結−融解周期は、細胞を効果的に溶解し、そしてＬＤＨを含むその細胞質ゾル内容物を上清培地中に放出させた。凍結および融解した細胞由来の培地５０μｌアリコットを、１００％細胞傷害性を反映する陽性対照として９６ウェルプレートに添加する。
【０４３８】
Ｅ．上清培地アリコットを含有する各ウェルに、ＬＤＨアッセイ試薬の５０μｌアリコットを添加する。その後、プレートを暗所で３０分間インキュベーションする。
Ｆ．１Ｍ酢酸の「停止」溶液を添加することによって、反応を終結させ、そして停止溶液を添加した１時間以内に、プレートの吸光度を４９０ｎｍで測定する。
【０４３９】
Ｇ．細胞溶解パーセントの計算は、吸光度および細胞溶解の間に線形関係があるという仮定に基づいて、培地のみから得られる吸光度を０％細胞溶解の参照値として利用し、そして凍結および融解したユニットを取り巻く培地を１００％細胞溶解の参照値として利用する。
【０４４０】
６．ＥＬＩＳＡ測定
本発明の浸透化ペプチドの協調投与または組み合わせ配合物と組み合わせて、活性剤の浸透増進を評価する試験物質として、生物学的活性剤の濃度を測定する方法は、一般的に上記のとおりであり、そして既知の方法、および各個々のアッセイに使用するＥＬＩＳＡキットの製造者の特定の取扱説明書にしたがう。生物学的活性剤の浸透動力学は、一般的に、生物学的活性剤を頂端上皮細胞表面と接触させた後（浸透化ペプチド（単数または複数）に頂端細胞表面を曝露するのと同時に、またはそれに続いてであることも可能）、多数の時点（例えば１５分、３０分、６０分、および１２０分）で測定値を得ることによって、測定される。
【０４４１】
ＥｐｉＡｉｒｗａｙTM組織膜をフェノールレッドおよびヒドロコルチゾン不含培地（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州アッシュランド）中で培養する。組織膜を３７℃で４８時間培養して組織を平衡化する。各組織膜を、０．９ｍｌの血清不含培地を含有する６ウェルプレートの個々のウェルに入れる。１００μｌの配合物（試験試料または対照）を膜の頂端表面に適用する。各試験試料（浸透化ペプチド（典型的には、ＪＡＭ、クローディンまたはオクルディンの１．０ｍＭ浸透化ペプチド濃度で；一般的に、生物学的活性剤（例えばインターフェロン−β）と組み合わせたおよそ０．１ｍＭ〜およそ１．２ｍＭの浸透化ペプチドの濃度範囲内、および対照（生物学的活性剤、インターフェロン−β単独））の３つ組または４つ組試料を、各アッセイで評価する。各時点で（１５分、３０分、６０分および１２０分）、新鮮な培地を含有する新規ウェルに組織膜を移す。底にある０．９ｍｌ培地試料を各時点で採取し、そしてＥＬＩＳＡおよび乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイで使用するため、４℃で保存する。
【０４４２】
ＥＬＩＳＡキットは、典型的には２工程サンドイッチＥＬＩＳＡである：研究する剤の免疫反応型はまず、９６ウェル・マイクロプレート上に固定された抗体に「捕捉」され、そしてウェルから未結合物質を洗浄した後、結合した免疫反応性剤と、「検出」抗体を反応させる。この検出抗体は、典型的には酵素（最もしばしば、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ）にコンジュゲート化され、そしてその後、色素原試薬を用いて活性をアッセイすることによって、免疫複合体中でプレートに結合した酵素の量を測定する。浸透動力学研究において、各時点で収集した上清培地の試料に加えて、動力学研究開始時にユニットの頂端表面に適用した配合物（すなわち対象の生物学的活性試験剤を含有する）の適切に希釈した試料もまた、製造者が提供する標準のセットとともに、ＥＬＩＳＡプレート中でアッセイする。各上清培地試料を、一般的に、ＥＬＩＳＡによって２つ組ウェル中でアッセイする（浸透動力学測定においては、各配合物に関して、４つ組ユニットを使用し、４つの時点すべてに渡って収集される、総数１６の上清培地試料が生成されることが想起されるであろう）。
【０４４３】
Ａ．上清培地試料において、またはユニットの頂端表面に適用した物質の希釈試料において、活性試験剤の見かけの濃度が、ＥＬＩＳＡ完了後、標準の濃度範囲の外側にあることが珍しくない。実験試料に存在する物質の濃度はいずれも、標準濃度を越えた外挿によっては決定されない；むしろ、試料を適切に再希釈して、反復ＥＬＩＳＡにおいて、標準間の内挿によって、より正確に測定可能な試験物質濃度を生成する。
【０４４４】
Ｂ．生物学的活性試験剤、例えばインターフェロン−βのＥＬＩＳＡは、設計および推奨されるプロトコルにおいて、ユニークである。大部分のキットと異なり、該ＥＬＩＳＡは２つのモノクローナル抗体を使用し、一方は捕捉用であり、そして他方は検出抗体として、生物学的活性試験剤、例えばインターフェロン−βの重複しない決定基に向けられる（この抗体は、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化されている）。アッセイ上限未満の試験剤濃度が実験試料中に存在する限り、製造者の指示にしたがってアッセイプロトコルを使用可能であり、これは、同時に存在する抗体両方とＥＬＩＳＡプレート上の試料のインキュベーションを可能にする。試料中の試験剤、例えばインターフェロン−βレベルがこの上限より有意に高い場合、免疫反応性インターフェロン−βのレベルは、インキュベーション混合物中の抗体の量を超える可能性もあり、そして結合した検出抗体がない、ある程度のインターフェロン−βが、プレート上に捕捉され、一方、結合した検出抗体を有する、ある程度のインターフェロン−βは、捕捉されない可能性もある。これは、試料中のインターフェロン−βの深刻な過小評価につながる（こうした試料中のインターフェロン−βレベルは、アッセイ上限より有意に低い位置であるように見えるだろう）。この可能性を排除するため、アッセイプロトコルを以下のように修飾した：
Ｂ．１．希釈試料をまず、いかなる検出抗体も非存在下で、固定した捕捉抗体を含有するＥＬＩＳＡプレート上で、１時間インキュベーションする。１時間インキュベーションした後、未結合物質が存在しないようにウェルを洗浄する。
【０４４５】
Ｂ．２．検出抗体をプレートと１時間インキュベーションして、すべての捕捉抗原を含む免疫複合体の形成を可能にする。検出抗体の濃度は、捕捉抗体が結合した生物学的活性試験剤の最大レベルと反応するのに十分である。その後、プレートを再び洗浄して、いかなる未結合検出抗体も除去する。
【０４４６】
Ｂ．３．ペルオキシダーゼ基質をプレートに添加し、そして１５分間インキュベーションして、発色が起こるのを可能にする。
Ｂ．４．「停止」溶液をプレートに添加し、そしてＶＭａｘマイクロプレート分光光度計において、４５０ｎｍとともに４９０ｎｍで吸光度を読み取る。４９０ｎｍでの有色産物の吸光度は、４５０ｎｍでの吸光度よりはるかに低いが、各波長での吸光度はなお、産物濃度に比例する。２つの読み取り値によって、吸光度がＶＭａｘ装置の作動範囲に渡って、結合した生物学的活性試験剤の量と線形に関連することが確実になる（われわれは、日常的に、範囲を０〜２．５ＯＤに限定したが、装置は、０〜３．０ＯＤの範囲に渡って正確であると報告されている）。典型的な試験剤としてのインターフェロン−βの場合、試料中のこの化合物のレベルは、ＥＬＩＳＡに含まれる異なる標準に関して得たＯＤ値の間の内挿によって決定される。標準に関して得られる範囲外のＯＤ読み取り値を持つ試料を、再希釈して、そして反復ＥＬＩＳＡを行った。
【０４４７】
結果
ＴＥＲアッセイによる経上皮抵抗の測定：
最終アッセイ時点後、０．３ｍｌの新鮮培地中、２４ウェル培養プレートの個々のウェルに膜を入れ、そしてＥＶＯＭ上皮ボルト・オーム測定装置およびＥｎｄｏｈｍチャンバー（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、フロリダ州サラソタ）を用いて、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）を測定した。上部電極を、膜上部表面に近いが接触しないように調整した。組織を１回に１つずつ、それぞれのウェルから取り除き、そして清浄ＰＢＳに浸すことによって、基底表面をリンスした。頂端表面をＰＢＳで穏やかに２回リンスした。組織ユニットをＥｎｄｏｈｍチャンバーに入れ、２５０μｌのＰＢＳを挿入物に添加し、上部電極を元に戻し、そして抵抗を測定して、そして記録した。測定後、ＰＢＳをデカントし、そして組織挿入物を培養プレートに戻した。すべてのＴＥＲ値を、組織表面面積の関数として報告する。
【０４４８】
最終の数字を以下のように計算した：
細胞膜のＴＥＲ＝（膜を含む挿入物の抵抗（Ｒ）−ブランク挿入物のＲ）ｘ膜面積（０．６ｃｍ2）。
【０４４９】
ＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜（粘膜上皮細胞層）を渡るＴＥＲによって測定されるような、鼻内搬送増進剤、例えばＪＡＭ、クローディン、またはオクルディンの浸透化ペプチドを含んでなる薬剤配合物の効果を、以下のテーブル１０および１１に示す。ＪＡＭ、クローディン、またはオクルディンの浸透化ペプチドを、１．０ｍＭの濃度で、ＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜に適用する。対照値に比較したＴＥＲ値の減少（対照＝およそ１０００オーム−ｃｍ2；１００に標準化）によって、細胞膜抵抗の減少および粘膜上皮細胞浸透性の増加が示される。
【０４５０】
典型的なＪＡＭ−１ペプチド、ＮＰ−Ａ、ＮＰ−Ｂ、ＮＰ−Ｃ、ＮＰ−Ｄ、ＮＰ−Ｅ、ＮＰ−８、およびＮＰ−２１（テーブル１０を参照されたい）は、ＴＥＲによって測定された際、アッセイした候補ＪＡＭペプチドの中で、細胞膜抵抗の最大の減少を示した。ＪＡＭ−１ペプチド、ＮＰ−Ａ、ＮＰ−Ｂ、ＮＰ−Ｃ、ＮＰ−Ｄ、ＮＰ−Ｅ、ＮＰ−８、およびＮＰ−２１は、対照のパーセントとして、それぞれ、４７．５％、５８．４％、７８．２％、７４．８％、７９．６％、８２．５％および７６．６％に減少したＴＥＲ測定値を示す（テーブル１１を参照されたい）。結果によって、これらの典型的なペプチドを粘膜上皮と接触させると、粘膜上皮細胞浸透性に有意な増加が生じることが示される。
【０４５１】
クローディン−１、−２、−３、−４、および−５由来の典型的なクローディン・ペプチド、ＮＰ−１０、ＮＰ−１７、ＮＰ−２７、ＮＰ−２８、ＮＰ−２９、ＮＰ−３０、ＮＰ−３１、ＮＰ−３２、ＮＰ−３３、ＮＰ−４１、およびＮＰ−４２（テーブル１０を参照されたい）は、ＴＥＲによって測定された際、試験した候補クローディン・ペプチドの中で、細胞膜抵抗の最大の減少を示した。クローディン・ペプチド、ＮＰ−１０、ＮＰ−１７、ＮＰ−２７、ＮＰ−２８、ＮＰ−２９、ＮＰ−３０、ＮＰ−３１、ＮＰ−３２、ＮＰ−３３、ＮＰ−４１、およびＮＰ−４２は、対照のパーセントとして、それぞれ、８４．４％、８３．０％、５１．５％、７５．４％、８２．８％、７４．１％、６３．４％、８７．３％、６２．４％、７６．０％、および７６．９％に減少したＴＥＲ測定値を示す（テーブル１１を参照されたい）。結果によって、これらの典型的なペプチドを粘膜上皮と接触させると、粘膜上皮細胞浸透性に有意な増加が生じることが示される。
【０４５２】
典型的なオクルディン・ペプチド、ＮＰ−２２、ＮＰ−２３、ＮＰ−２４、ＮＰ−２５、およびＮＰ−２６は、ＴＥＲによって測定された際、試験した候補オクルディン・ペプチドの中で、細胞膜抵抗の最大の減少を示した。結果によって、これらの典型的な配合物が、粘膜上皮細胞浸透性に有意な増加を生じることが示される。オクルディン・ペプチド、ＮＰ−２２、ＮＰ−２３、ＮＰ−２４、ＮＰ−２５、およびＮＰ−２６は、対照のパーセントとして、それぞれ、６５．０％、６５．２％、６７．０％、６６．５％、および６３．７％に減少したＴＥＲ測定値を示す。結果によって、これらの典型的なペプチドを粘膜上皮と接触させると、粘膜上皮細胞浸透性に有意な増加が生じることが示される。
【０４５３】
テーブル１０：鼻内搬送増進剤を含んでなる薬剤配合物中のＪＡＭ、クローディン、またはオクルディンの候補浸透化ペプチド
【０４５４】
【表１５】
2005537244.tif 000017
【０４５５】
【表１６】
2005537244.tif 000018
【０４５６】
テーブル１１：ＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜における経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）に対する、薬剤配合物中の鼻内搬送増進剤としてのＪＡＭ、クローディン、およびオクルディンの浸透化ペプチドの影響
【０４５７】
【表１７】
2005537244.tif 000019
【０４５８】
【表１８】
2005537244.tif 000020
【０４５９】
ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるような浸透動力学：
インターフェロン−β−１ａおよび鼻内搬送増進剤を含んでなる薬剤配合物、例えば、ＪＡＭ、クローディンまたはオクルディンの浸透化ペプチドを含む配合物の、ＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜（粘膜上皮細胞層）を渡るインターフェロン−βの浸透に対する影響を、上述のように測定する。ＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜を渡るインターフェロン−β−１ａの浸透をＥＬＩＳＡアッセイによって測定する。ＪＡＭ、クローディンまたはオクルディンの浸透化ペプチドは、一般的に、およそ０．１ｍＭ〜およそ１．２ｍＭの濃度範囲内で、または一般的に、およそ０．５ｍＭ〜およそ１．１ｍＭの濃度範囲内で、ＥＬＩＳＡアッセイ中に存在する。ＪＡＭ、クローディンまたはオクルディンの浸透化ペプチドは、典型的には、１．０ｍＭの濃度で、ＥＬＩＳＡアッセイ中に存在する。
【０４６０】
本発明の典型的な鼻内配合物に関して、インターフェロン−β（６０ＭＩＵ；３００μｇ）または別の生物学的活性剤と、１．０ｍＭの濃度のＪＡＭ−１ペプチド、ＮＰ−Ａ、ＮＰ−Ｂ、ＮＰ−Ｃ、ＮＰ−Ｄ、ＮＰ−Ｅ、ＮＰ−８、およびＮＰ−２１を、薬剤配合物中で組み合わせるか、または協調して投与すると、生物学的活性剤の浸透において、有意な増加が生じるであろう。典型的な態様において、浸透の増加は、例えばＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜を渡る浸透を測定するＥＬＩＳＡアッセイによって測定した際、対照値に比較して、２倍、しばしば５倍、ときに１０倍、そして２５倍、５０倍、または１００倍まで、あるいはそれを越えるであろう。
【０４６１】
本発明のさらなる典型的な鼻内配合物に関して、インターフェロン−β（６０ＭＩＵ；３００μｇ）または別の生物学的活性剤と、１．０ｍＭの濃度のクローディン・ペプチド、ＮＰ−１０、ＮＰ−１７、ＮＰ−２７、ＮＰ−２８、ＮＰ−２９、ＮＰ−３０、ＮＰ−３１、ＮＰ−３２、ＮＰ−３３、ＮＰ−４１、およびＮＰ−４２を、薬剤配合物中で組み合わせるか、または協調して投与すると、生物学的活性剤の粘膜浸透において、有意な増加が生じるであろう。典型的な態様において、浸透の増加は、例えばＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜を渡る浸透を測定するＥＬＩＳＡアッセイによって測定した際、対照値に比較して、２倍、しばしば５倍、ときに１０倍、そして２５倍、５０倍、または１００倍まで、あるいはそれを越えるであろう。
【０４６２】
本発明の他の典型的な鼻内配合物に関して、インターフェロン−β（６０ＭＩＵ；３００μｇ）または別の生物学的活性剤と、１．０ｍＭの濃度のオクルディン・ペプチド、ＮＰ−２２、ＮＰ−２３、ＮＰ−２４、ＮＰ−２５、およびＮＰ−２６を、薬剤配合物中で組み合わせるか、または協調して投与すると、生物学的活性剤の浸透において、有意な増加が生じるであろう。典型的な態様において、浸透の増加は、例えばＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜を渡る浸透を測定するＥＬＩＳＡアッセイによって測定した際、対照値に比較して、２倍、しばしば５倍、ときに１０倍、そして２５倍、５０倍、または１００倍まで、あるいはそれを越えるであろう。
【０４６３】
本発明の他の典型的な鼻内配合物に関して、インターフェロン−βまたは別の生物学的活性剤の薬剤配合物とＪＡＭ、クローディン、またはオクルディン・ペプチドを組み合わせて投与すると、浸透化ペプチドおよび生物学的活性剤の同時投与に比較して、ＪＡＭ、クローディン、またはオクルディン・ペプチドを、インターフェロン−βまたは別の生物学的活性剤を投与する１０分前、２０分前、または３０分前に投与した際、浸透に有意な増加を生じるであろう。典型的な態様において、浸透の増加は、例えばＥｐｉＡｉｒｗａｙTM細胞膜を渡る浸透を測定するＥＬＩＳＡアッセイによって測定した際、対照値に比較して、２倍、しばしば５倍、ときに１０倍、そして２５倍、５０倍、または１００倍まで、あるいはそれを越えるであろう。
【０４６４】
ＭＴＴアッセイ：
ＭａｔＴｅｋキット、ＭＴＴ−１００を用いて、ＭＴＴアッセイを行った。３００ｍｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加した。組織挿入物を清浄ＰＢＳで穏やかにリンスし、そしてＭＴＴ溶液に入れた。試料を３７℃で３時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞培養挿入物を、ウェルあたり２．０ｍｌの抽出溶液に浸して、各挿入物を完全に覆った。抽出プレートを覆い、そして密封して蒸発を減少させた。抽出は、暗所、室温で一晩進行させる。抽出期間が完了した後、抽出溶液を混合し、そして９６ウェル・マイクロタイタープレートにピペッティングした。各３つ組試料とともに、抽出ブランクを装填した。その後、光学密度プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上、５５０ｎｍで、試料の光学密度を測定した。
【０４６５】
療法生物学的剤、例えばインターフェロン−βの粘膜搬送増進のための本発明の典型的な配合物に対するＭＴＴアッセイを示す。浸透化ペプチド、例えばＪＡＭ−１ペプチド、ＮＰ−Ａ、ＮＰ−Ｂ、ＮＰ−Ｃ、ＮＰ−Ｄ、ＮＰ−Ｅ、ＮＰ−８、およびＮＰ−２１（テーブル１０を参照されたい）を含んでなる薬剤配合物に関する結果によって、これらの典型的なペプチドが粘膜上皮組織の生存度に対して最小限の毒性効果しかないことが示される。これらの典型的な配合物は、対照の８０％を越えるＭＴＴアッセイ結果によって判定すると、毒性ではなかった。
【０４６６】
浸透化ペプチド、例えばクローディン・ペプチド、ＮＰ−１０、ＮＰ−１７、ＮＰ−２７、ＮＰ−２８、ＮＰ−２９、ＮＰ−３０、ＮＰ−３１、ＮＰ−３２、ＮＰ−３３、ＮＰ−４１、およびＮＰ−４２（テーブル１０を参照されたい）を含んでなる薬剤配合物に関する結果によって、これらの典型的なペプチドが粘膜上皮組織の生存度に対して最小限の毒性効果しかないことが示される。これらの典型的な配合物は、対照の８０％を越えるＭＴＴアッセイ結果によって判定すると、毒性ではなかった。
【０４６７】
浸透化ペプチド、例えばオクルディン・ペプチド、ＮＰ−２２、ＮＰ−２３、ＮＰ−２４、ＮＰ−２５、およびＮＰ−２６を含んでなる薬剤配合物に関する結果によって、これらの典型的なペプチドが粘膜上皮組織の生存度に対して最小限の毒性効果しかないことが示される。これらの典型的な配合物は、対照の８０％を越えるＭＴＴアッセイ結果によって判定すると、毒性ではなかった。
【０４６８】
ＬＤＨアッセイ：
インターフェロン−β−１ａおよび他の生物学的活性剤の粘膜搬送増進に関する、本発明の典型的な浸透化ペプチド配合物のＬＤＨアッセイによって、典型的な態様、例えば浸透化ＪＡＭ−１ペプチド、ＮＰ−Ａ、ＮＰ−Ｂ、ＮＰ−Ｃ、ＮＰ−Ｄ、ＮＰ−Ｅ、ＮＰ−８、およびＮＰ−２１（テーブル１０を参照されたい）を含んでなる薬剤配合物の毒性効果が有意でないことが立証された。典型的な浸透化クローディン・ペプチド、ＮＰ−１０、ＮＰ−１７、ＮＰ−２７、ＮＰ−２８、ＮＰ−２９、ＮＰ−３０、ＮＰ−３１、ＮＰ−３２、ＮＰ−３３、ＮＰ−４１、およびＮＰ−４２（テーブル１０）に関して、同様の結果が決定され、これらは、粘膜上皮組織の生存度に対して、有意な副作用をまったく示さなかった。同様に、ＬＤＨアッセイによって、粘膜上皮組織の生存度に対して、典型的なオクルディン・ペプチド、ＮＰ−２２、ＮＰ−２３、ＮＰ−２４、ＮＰ−２５、およびＮＰ−２６の毒性効果が有意でないことがさらに示された。
（実施例２）
健康な男性志願者に投与した浸透化ペプチドとインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）の鼻配合物の投薬量の生物学的利用能および生物活性
本実施例は、粘膜搬送を増進させるのに有効な量の浸透化ペプチドと組み合わせて鼻内投与したインターフェロン−βの、健康な男性志願者の血流への取り込みを測定する、非盲検研究を提供する。浸透化ペプチドは、哺乳動物被検体において、上皮接合部構造および／または上皮接合部生理機能を調節することによって、粘膜上皮傍細胞輸送を可逆的に増進する。浸透化ペプチドは、一般的に、接合部接着分子（ＪＡＭ）、オクルディン、またはクローディン・タンパク質から選択される上皮膜接着タンパク質のホモ型結合を有効に阻害する。
【０４６９】
テーブル１２：インターフェロン−β−１ａおよび鼻内搬送増進剤を含んでなる配合物
【０４７０】
【表１９】
2005537244.tif 000021
【０４７１】
テーブル１３：インターフェロン−β−１ａおよび鼻内搬送増進剤を含んでなる配合物
【０４７２】
【表２０】
2005537244.tif 000022
【０４７３】
研究概要
本研究は、上述のような浸透化ペプチド、例えばＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａペプチド、オクルディンＮＰ−２６ペプチド、および／またはクローディン−２  ＮＰ−２７ペプチドの存在下で、本発明の典型的な配合物、配合物Ｆ９の鼻内有効量を投与して、被検体によるインターフェロン−β鼻内配合物の吸収および許容度を評価する。テーブル１２および１３を参照されたい。ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディンの浸透化ペプチドを含んでなる配合物は、配合物中、およそ０．１ｍＭ〜およそ１．０ｍＭのＪＡＭ、オクルディンまたはクローディン・ペプチドの浸透化ペプチドの濃度範囲を有する。本研究は、単一用量平行群薬物動態／薬力学研究であり、２つの投与経路：筋内および鼻内による、インターフェロン−β−１ａの吸収および許容度を評価する。本研究の目的は、筋内投与、皮下投与、あるいは１以上の鼻内搬送増進剤の存在下または非存在下で投与される、インターフェロン−β−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．、またはＲｅｂｉｆ（登録商標）、Ｓｅｒｅｎｏ）に対して、鼻内投与される本発明の１以上の鼻内搬送増進剤、例えば、ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディンの浸透化ペプチドと組み合わせた、インターフェロン−β−１ａの典型的な配合物の等モル用量の吸収、許容度および薬力学的パラメーターを評価することである。
【０４７４】
プロトコル：一般的に、３６人の健康な男性被検体、年齢１８歳〜５０歳を、研究に登録する。６人の被検体の群に、典型的には、各々３０μｇ／０．１ｍｌを含有する、０．１ｍｌスプレー２回として鼻内搬送する、配合物Ｆ９（６０μｇ；６．０ＭＩＵ；インターフェロン−β−１ａ）；配合物ＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａ（＝Ｆ９＋１．０ｍＭ  ＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａペプチド）；配合物クローディン−２  ＮＰ−２７（＝Ｆ９＋１．０ｍＭクローディン−２  ＮＰ−２７ペプチド）；または配合物オクルディンＮＰ−２６（＝Ｆ９＋１．０ｍＭオクルディンＮＰ−２６ペプチド）を投与する。６人の被検体には、筋内搬送する、６０μｇのインターフェロン−β−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））の単回用量を投与する。６人の被検体には、皮下搬送する、６０μｇのインターフェロン−β−１ａ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標）；Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）を投与する。
【０４７５】
該研究は、優良臨床規範規制に準拠して行い、そしてすべての研究開始前に、必要な規制および施設内治験審査委員会が整っていた。
本明細書の解説にしたがって、この研究および類似の研究が容易に実施され、本発明の粘膜搬送配合物および方法の新規で、そして驚くべき特性が立証されるであろう。特に、これらの研究は、ＪＡＭ、オクルディンまたはクローディンの浸透化ペプチドの使用を伴う、本発明の配合物および方法が、粘膜表面内への、そして粘膜表面を渡る、巨大分子薬剤の搬送を改善する点から見て、多くの利点を提供することを立証するであろう。インターフェロン−β−１ａの典型的な場合、これらの方法および配合物の重要性は、インターフェロン−β−１ａの注射可能製品でないものが、現在利用可能でないという事実によって、強調される。肺投与は、ある程度の成功を達成したが、患者の不便さおよび肺安全性に問題が多いことを含む不都合な点を有する。
【０４７６】
前述の解説にしたがって、以下のテーブル１４は、浸透化ペプチドを伴わない配合物Ｆ−９、インターフェロン−β−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標））の筋内搬送、または皮下搬送に比較した、本発明の薬剤配合物（例えばＪＡＭ−１、クローディン−２、またはオクルディンの浸透化ペプチドを加えた配合物Ｆ−９）中のインターフェロン−β−１ａの鼻内搬送に関して、提示される典型的な薬物動態学データを提供する。投薬３時間後の血清中のインターフェロン−βの最大濃度（Ｃmax）は、インターフェロン−β−１ａ（１２ＭＩＵ用量）の皮下搬送では５．１ＩＵ／ｍｌであり、またはインターフェロン−β−１ａ（１２ＭＩＵ用量）の筋内搬送では４．９〜５．２ＩＵ／ｍｌであったのに比較して、ＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａ配合物の鼻内搬送ではおよそ６．０ＩＵ／ｍｌ；クローディン−２  ＮＰ−２７配合物の鼻内搬送では５．６ＩＵ／ｍｌ、オクルディンＮＰ−２６配合物の鼻内搬送では４．５ＩＵ／ｍｌと提示される。
【０４７７】
血清中のインターフェロン−βの最大血清濃度までの時間（ｔmax）は、インターフェロン−β−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標））の皮下搬送または筋内搬送に比較して、本発明の配合物の鼻内搬送では、少なくとも５〜１０倍迅速であると提示される。典型的な態様において、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標）の筋内投与または皮下投与で３〜４時間のｔmaxであるのと比較して、ＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａ配合物の鼻内搬送でのｔmaxは、およそ０．３時間、またはクローディン−２  ＮＰ−２７配合物の鼻内搬送では０．３時間、またはオクルディンＮＰ−２６配合物の鼻内搬送では０．４時間と提示される。
【０４７８】
テーブル１４の結果は、本明細書の方法および配合物によって達成される、インターフェロン−β薬力学的マーカー、例えばβ−２ミクログロブリンおよびネオプテリンによって測定されるような、例えば血清、ＣＮＳ、ＣＳＦあるいは別の選択される生理学的区画または標的組織中の濃度曲線下の面積（ＡＵＣ）によって測定されるような、インターフェロン−βの生物学的利用能を例示する。インターフェロン−βマーカーによって測定されるようなインターフェロン−βの生物学的利用能は、例えば、およそ２００μＩＵ・時間／血漿またはＣＳＦ  ｍｌのβ−２ミクログロブリンのおよそのＡＵＣ0-96時間であろう。インターフェロン−βマーカーによって測定されるようなインターフェロン−βの生物学的利用能は、例えば、およそ２００ｎｇ・時間／血漿またはＣＳＦ  ｍｌのネオプテリンのおよそのＡＵＣ0-96時間であろう。
【０４７９】
本明細書の解説にしたがって、インターフェロン−βの有意な血漿レベル（Ｃmax）が、１以上のＪＡＭ、クローディン、またはオクルディンの浸透化ペプチドと組み合わせたインターフェロン−βの薬剤配合物の鼻内投与後に達成される。鼻内搬送による最大血清濃度までの時間（ｔmax）は、少なくともおよそ５〜１０倍加速され、皮下注射または筋内注射に比較した際、しばしば、同様の血漿レベル（Ｃmax）を達成するのに十分である。本発明の薬剤配合物の鼻内投与によるインターフェロン−βの搬送率（Ｃmaxおよびｔmaxによって測定されるようなもの）は、インターフェロン−βの筋内注射または皮下注射による搬送率に比較した際、有意に増加している。
【０４８０】
本発明の薬剤配合物が、インターフェロン−βの一貫した療法血中レベルおよびＣＮＳレベルを搬送し、そして維持する潜在能力によって、筋内投与または皮下投与用の現存する配合物を越える、明確な利点が提供される。明確な利点は、血清において最大濃度に到達するのに４時間以上を必要とする皮下投与に比較して、血清最大濃度が達成される０．５〜１時間の時間枠内で鼻内投与を反復することによって、インターフェロン−βの一貫した療法血中レベルおよびＣＮＳレベルを維持することにある。インターフェロン−β活性の薬力学的マーカーは、ＩＦＮ−βマーカー、ネオプテリンおよびβ2−ミクログロブリンの最大濃度が、本発明の薬剤配合物によるインターフェロン−βの鼻内投与後、３０時間以下、または典型的には２２時間以下で達成されることを示す。
【０４８１】
テーブル１４：薬物動態学的パラメーターおよび薬力学的パラメーターa
【０４８２】
【表２１】
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【０４８３】
前述の解説にしたがって、以下のテーブル１４は、インターフェロン−β−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標））の皮下搬送または筋内搬送、あるいは配合物Ｆ−９の鼻内投与に比較した、本発明の薬剤配合物（例えばＪＡＭ−１、クローディン−２、またはオクルディンの浸透化ペプチドを加えた配合物Ｆ−９）中のインターフェロン−β−１ａの鼻内搬送に関して、提示される典型的な薬物動態学データを提供する。テーブル１５に提示する結果は、インターフェロン−β−１ａの鼻内搬送に１０分間、２０分間または３０分間先行する、浸透化ペプチド、ＪＡＭ−１、クローディン−２、またはオクルディンの鼻内搬送に、インターフェロン−β−１ａおよび浸透化ペプチド、ＪＡＭ−１、クローディン−２、またはオクルディンの同時鼻内搬送を比較する。
【０４８４】
投薬３時間後の血清中のインターフェロン−βの最大濃度（Ｃmax）は、同時に投与する浸透化ペプチドＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａを加えた配合物Ｆ−９（ＩＦＮ−β−１ａ）の鼻内搬送では、およそ６．０ＩＵ／ｍｌと提示される。Ｃmaxは、配合物Ｆ−９の鼻内搬送に浸透化ペプチドＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａの鼻内搬送が１０分間先行すると、およそ６．１ＩＵ／ｍｌと提示され、あるいは配合物Ｆ−９の鼻内搬送に浸透化ペプチドＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａの鼻内搬送が２０分間または３０分間先行すると、およそ６．３ＩＵ／ｍｌと提示される。これらの値は、インターフェロン−β−１ａ（１２ＭＩＵ用量）の皮下搬送では５．１ＩＵ／ｍｌ、またはインターフェロン−β−１ａ（１２ＭＩＵ用量）の筋内搬送では４．９〜５．２ＩＵ／ｍｌであるのに比較される。
【０４８５】
血清中のインターフェロン−βの最大血清濃度までの時間（ｔmax）は、同時に投与した浸透化ペプチドＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａを加えた配合物Ｆ−９（ＩＦＮ−β−１ａ）の鼻内搬送では、およそ０．３時間と提示される。ｔmaxは、配合物Ｆ−９の鼻内搬送に浸透化ペプチドＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａの鼻内搬送が１０分間先行すると、およそ０．２５時間と提示され、または、配合物Ｆ−９の鼻内搬送に浸透化ペプチドＪＡＭ−１  ＮＰ−Ａの鼻内搬送が２０分間または３０分間先行すると、およそ０．２時間と提示される。これらの値は、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）またはＲｅｂｉｆ（登録商標）の筋内投与または皮下投与では３〜４時間のｔmaxであるのと比較される。
【０４８６】
薬力学的ＩＦＮ−βマーカー、ネオプテリンおよびβ2−ミクログロブリンによって測定されるように、インターフェロン−β配合物の鼻内投与の１０分前、２０分前、または３０分前に、本発明の浸透化ペプチド、例えばＪＡＭ、クローディン、またはオクルディン・ペプチドを含んでなる薬剤配合物を鼻内投与すると、ＣＮＳまたは血清へのインターフェロン−β搬送が、インターフェロン−β配合物Ｆ９単独の鼻内投与に比較して、５〜１０パーセント、１０〜１５パーセント、または１５〜２０パーセント改善される利点が提供される。
【０４８７】
テーブル１５：インターフェロン−β配合物の鼻内投与の１０分前、２０分前、または３０分前の、浸透化ペプチドの鼻内投与に関する薬物動態学的パラメーターおよび薬力学的パラメーター
【０４８８】
【表２２】
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【０４８９】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例として詳細に記載されているが、当業者には、特定の変化および修飾が開示に含まれ、そして付随する請求項の範囲内で、過剰な実験を伴わずに実行可能であり、これらは、例示のために提示され、限定のために提示されるのではないことが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０４９０】
【図１】図１はヒトＪＡＭ−１のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図２】図２はヒトＪＡＭ−２のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図３】図３はヒトＪＡＭ−３のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図４】図４はヒト・クローディン−１のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図５】図５はヒト・クローディン−２のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図６】図６はヒト・クローディン−３のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図７】図７はヒト・クローディン−４のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図８】図８はヒト・クローディン−５のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図９】図９はヒト・クローディン−６のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１０】図１０はヒト・クローディン−７のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１１】図１１はヒト・クローディン−８のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１２】図１２はヒト・クローディン−９のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１３】図１３はヒト・クローディン−１０のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１４】図１４はヒト・クローディン−２のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005537244.tif 000235
【図１０】
2005537244.tif 000236
【図１１】
2005537244.tif 000237
【図１２】
2005537244.tif 000238
【図１３】
2005537244.tif 000239
【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月1日(2005.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９０】
【図１】図１はヒトＪＡＭ−１のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図２】図２はヒトＪＡＭ−２のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図３】図３はヒトＪＡＭ−３のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図４】図４はヒト・クローディン−１のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図５】図５はヒト・クローディン−２のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図６】図６はヒト・クローディン−３のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図７】図７はヒト・クローディン−４のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図８】図８はヒト・クローディン−５のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図９】図９はヒト・クローディン−６のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１０】図１０はヒト・クローディン−７のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１１】図１１はヒト・クローディン−８のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１２】図１２はヒト・クローディン−９のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１３】図１３はヒト・クローディン−１０のアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【図１４】図１４はヒト・オクルディンのアミノ酸配列であり、細胞外ドメインを下線で示す。
【国際調査報告】
2005537244.tif 000241
2005537244.tif 000242