(57)【要約】  本発明は、細胞によって産生される、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯのレベルを、対応する全長熱ショックタンパク質によってもたらされるレベルよりも増加させることができる熱ショックタンパク質断片に関する。また本発明は、疾患の治療または予防における該断片の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞によって産生される、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯのレベルを、対応する全長熱ショックタンパク質によってもたらされるレベルよりも増加させることができる、熱ショックタンパク質断片。
【請求項２】
ヒト熱ショックタンパク質断片である、請求項１に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項３】
前記熱ショックタンパク質断片は、対応する全長熱ショックタンパク質の大きさの８０％未満である、請求項１または２に記載の熱ショックタンパク質。
【請求項４】
ヒトＨＳＰ７０の断片である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項５】
前記断片がヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３５９〜６２５または３５９〜６１０に対して少なくとも４０％の相同性を有する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項６】
前記断片がヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３５９〜４５９に対して少なくとも６０％の相同性を有する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項７】
前記断片がヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３９６〜４２６に対して少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項８】
ヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３５９〜６２５、３５９〜６１０、３５９〜４５９、または３９６〜４２６からなる熱ショックタンパク質断片。
【請求項９】
前記１つまたは複数のサイトカインは、インターロイキンおよびＴＮＦ−αからなる群から選択される、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項１０】
前記１つまたは複数のケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−α、またはＭＩＰ−βである、請求項１０に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項１１】
前記サイトカインは、ＩＬ−１２および／またはＴＮＦ−αである、請求項９に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項１２】
ＣＤ４０結合部位を含む、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項１３】
１つまたは複数の異種ペプチドをさらに含む、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の異種ペプチドは免疫原性ペプチドである、請求項１４に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項１６のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１ないし１４のいずれか１項の熱ショックタンパク質断片または請求項１５の核酸を、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、アジュバントまたは媒体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１ないし１４のいずれか１項の熱ショックタンパク質断片の、治療における使用。
【請求項２０】
疾患の治療用または予防用医薬の製造における、請求項１ないし１４のいずれか１項の熱ショックタンパク質断片の使用。
【請求項２１】
請求項１ないし１４の熱ショックタンパク質断片の有効用量を、必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
【請求項２２】
前記疾患は、微生物感染、ウィルス感染、免疫系疾患または癌である、請求項２０の使用または請求項２１の方法。
【請求項２３】
請求項１ないし１４のいずれか１項の熱ショックタンパク質断片と細胞を接触させることを含む、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの産生を、対応する全長熱ショックタンパク質によってもたらされる産生レベルよりも増加させる方法。
【請求項２４】
１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの産生を、対応する全長熱ショックタンパク質によってもたらされるレベルよりも増加させるための、請求項１ないし１４のいずれか１項の熱ショックタンパク質断片の使用。
【請求項２５】
免疫応答をＴｈ１応答に分極させるための、請求項１ないし１４のいずれか１項の熱ショックタンパク質断片の使用。
【請求項２６】
ワクチンと組み合わせた、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の熱ショックタンパク質断片。
【請求項２７】
前記熱ショックタンパク質をワクチンと組み合わせて用いる、請求項２５または２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０のＣ末端領域のアミノ酸残基３５９〜６２５を含むポリペプチド。
【請求項２９】
前記熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０のＣ末端領域のアミノ酸残基３５９〜６１０を含むポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載のポリペプチドを含むアジュバント。
【請求項３１】
抗原と共有結合または非共有結合した、請求項３０に記載のアジュバント。
【請求項３２】
請求項３１に記載のアジュバントを含むワクチン。
【請求項３３】
請求項３１に記載のアジュバントを含む抗ＨＩＶワクチン。
【請求項３４】
請求項２８または２９に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ分子。
【請求項３５】
図４に記載の配列を有する、請求項３４に記載のＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカインおよび／またはＣＣケモカインおよび／または一酸化窒素（ＮＯ）の細胞による産生を増加させるための熱ショックタンパク質断片の使用に関する。また、本発明は、熱ショックタンパク質断片の、ワクチンアジュバントとしての、特に、ＨＩＶや他の微生物感染に対する予防的または治療的ワクチンの構築における使用に関する。
【０００２】
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、微生物ならびに哺乳動物細胞において、高度に保存され、広く分布する。熱ショックタンパク質は、いくつかの重要な生物学的性質、特に、タンパク質の細胞内シャペロンとしての性質を有しており、細胞がストレスを受けた場合にタンパク質が凝集するのを防止する。ＨＳＰは、合成ペプチドと結合した場合は、担体分子およびアジュバントとして用いられてきた。
【０００３】
ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９６は、腫瘍またはウィルス特異的ペプチドと非共有結合し、特異的な腫瘍またはウィルスに対して保護的効果を有することが示された（Udono et al., J. Exp. Med., 178, 139-1396, 1993；Nieland et al., PNAS USA, 93, 6135-6139, 1996；およびCiupitu et al., J. Exp. Med., 187, 685-691, 1998）。ＨＳＰのアジュバント活性のメカニズムは、全長ＨＳＰ７０によるＣＣケモカインの刺激を実証することによって解明された。ＣＣケモカインは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞およびマクロファージを次々に誘引する。
【０００４】
サイトカインは、免疫系の誘導および調節を媒介するタンパク質である。サイトカインは、炎症応答の開始や炎症細胞の活性化等の様々な作用を有している。また、サイトカインは、成長、活性化および分化を刺激することによってリンパ球に作用する。サイトカインは、活性化リンパ球や活性化マクロファージ等の様々な（a range of）細胞によって分泌される。また、サイトカインは幅広い標的細胞を有する。例えば、インターロイキン１２は、Ｂ細胞およびマクロファージによって分泌され、活性化Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞に作用する。サイトカインは、リンフォカインおよびモノカイン等の群にさらに分類され得る。
【０００５】
「ＣＣケモカイン」という用語は、化学誘引物質および炎症誘発性の性質を有する任意のタンパク質を指す。すなわち、ＣＣケモカインは免疫応答に必要な細胞を補充する。一般に、ＣＣケモカインは比較的低分子量（一般に、１０，０００未満）である。ＣＣケモカインは、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージや樹状細胞等の抗原提示細胞等の、様々な細胞型によって産生される。ＣＣケモカインは、貪食細胞およびリンパ球を誘引する。好ましくは、ＣＣケモカインはβケモカインである。ＣＣケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節される、発現・分泌された正常Ｔ細胞）、ＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症性タンパク質１α）およびＭＩＰ−１β（マクロファージ炎症性タンパク質１β）であることがさらに好ましい。ＣＣケモカインは、様々なＴ細胞やマクロファージ、およびＨＩＶおよび／またはＳＩＶ複製を抑制することができるＴ細胞サプレッサー因子を誘引する。したがって、ＣＣケモカインの産生増加は、微生物感染（ウィルス感染等）や悪性疾患等の感染性疾患の治療または予防をもたらし得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
国際特許出願ＷＯ０１／４５７３８号には、１つまたは複数のＣＣケモカインの細胞に
よる産生を増加させるための全長ＨＳＰの使用が記載されている。驚くべきことに発明者らは、ＨＳＰ断片が、細胞によるサイトカイン（特に、ケモカイン）産生を、対応する全長ＨＳＰよりも増加させることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第一の態様によると、本発明は、細胞によって産生される、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／または一酸化窒素（ＮＯ）のレベルを、対応する全長熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）によってもたらされるレベルよりも増加させることができる熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）断片を提供する。
【０００８】
本明細書において用いられる場合、「熱ショックタンパク質」という用語は、細胞がストレスに付された場合に細胞において発現の増加を示す、任意のタンパク質を指す。ＨＳＰは、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞由来である。ＨＳＰは、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ４０、ＨＳＰ２７、ＢｉＰ、ＧＰ９６、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０またはＨＳＰ９６であることがさらに好ましい。好ましくは、熱ショックタンパク質はヒトＨＳＰ７０である。ＨＳＰは修飾ＨＳＰであってもよい。この場合、ＨＳＰは、分解耐性の増加等の有利な特性を提供するために修飾されている。
【０００９】
「全長熱ショックタンパク質」という用語は、実質的に完全なＨＳＰアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。「全長熱ショックタンパク質」は、わずかなアミノ酸の欠失、付加または置換によって変更されていてもよい。例えば、変更がサイトカイン、ＣＣケモカインまたはＮＯの細胞による産生をもたらすＨＳＰの能力に影響を与えないならば、全長ＨＳＰは、１〜１０のアミノ酸の欠失、付加または置換によって変更されてもよい。
【００１０】
ＨＳＰは市販されている。例えば、ＨＳＰ７０はStressGen, Inc.およびLionex Diagnostics and Therapeutics, Brauschweig, Germanyから得られ、ＨＳＰ６５はStressGen, Inc.から得られ、ＨＳＰ４０はStressGen Biotechnologies, Victoria, British Colombiaから得られる。様々なＨＳＰをコードする遺伝子は、クローン化されて配列決定されている。例えば、ヒトＨＳＰ７０配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ２４７４３であり、マウスＨＳＰ７０はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ３５０２１であり、ヒトＨＳＰ６５はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ４２３８４であり、ヒトＨＳＰ４０はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｄ４９５４７である。ＨＳＰの既知の配列に基づき所望のＨＳＰを得ることは、当業者にとって通常のことである。多数のＨＳＰ７０タンパク質の配列は、表１に記載されている。
【００１１】
さらに、ＨＳＰの調製および精製は、Young et al., Mol. Microbial., 6, 133-145, 1992；Mehlert et al., Mol. Microbial., 3, 125-130, 1989；およびThole et al, Infect & Immune., 55, 1466-1475, 1987に記載されている。
【００１２】
本明細書で用いられる場合、「熱ショックタンパク質断片」という用語は、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯのレベルを、対応する全長ＨＳＰによって増加したレベルよりも増加させることができるＨＳＰの任意の断片を指す。ＨＳＰ断片は、対応する全長ＨＳＰの、好ましくは８０％未満、より好ましくは７０％未満、最も好ましくは５０％未満の大きさである。ＨＳＰ断片は、１０〜３００アミノ酸の大きさ、より好ましくは１０〜２００アミノ酸の大きさ、最も好ましくは１０〜１００アミノ酸の大きさであることが特に好ましい。
【００１３】
好ましくは、ＨＳＰ断片は、微生物（例えば、ヒト型結核菌）のＨＳＰまたは哺乳動物（例えば、ヒト）のＨＳＰの断片である。
【００１４】
好ましくは、ＨＳＰ断片は、ヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３５９〜６２５または３５９〜６１０に対して、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。より好ましくは、断片は、ヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３５９〜４５９に対して、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも９０％の相同性を有する。ＨＳＰ断片は、ヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３９６〜４２６に対して、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有することが特に好ましい。ヒト型結核菌ＨＳＰ７０の配列は、表１に記載されている。相同性は、アミノ酸置換の％を計算し、相同性を算出する、Ｐｉｌｅｕｐプログラムを用いて測定され得る。好ましくは、相同性のレベルは、ギャップウェイト（gapweight）８、およびギャップレングスウェイト（gaplengthweight）２を有する、Ｐｉｌｅｕｐプログラムを用いて測定される。
【００１５】
ＨＳＰ断片は、ヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３５９〜６２５、３５９〜６１０、３５９〜４５９または３９６〜４２６からなることが特に好ましい。また、ＨＳＰ断片が、断片はヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアミノ酸残基３５９〜６２５、３５９〜６１０、３５９〜４５９または３９６〜４２６に対応するヒトＨＳＰ７０の断片からなることが好ましい。
【００１６】
ヒトＨＳＰ７０および他のＨＳＰ７０とヒト型結核菌ＨＳＰ７０のアラインメントを表１に示す。このアラインメントに基づき、当業者は、ＨＳＰ７０のどの断片が上記ヒト型結核菌ＨＳＰ７０の特異的断片に対応するかを容易に確定することができる。
【００１７】
好ましくは、ＨＳＰ断片はＣＤ４０結合部位を含む。ＣＤ４０結合部位の位置は、当業者が容易に確定することができる。
【００１８】
また、ＨＳＰ断片は、ＡＴＰアーゼ領域を含まないことが好ましい。ＡＴＰアーゼ領域の位置は、当業者には既知である。
【００１９】
また、ＨＳＰ断片は、哺乳動物に送達された場合、抗ＨＳＰ免疫応答を起こさないことが好ましい。これを達成するために、ＨＳＰ断片は、ＨＳＰの主な抗原性エピトープを含むべきではない。
【００２０】
また、好ましくは、本発明のＨＳＰ断片は１つまたは複数の異種ペプチドを含んでもよい。結合または非結合ペプチドあるいは抗体等の他の構成成分と組み合わせて本発明のＨＳＰを用いることができることは、当業者には明らかである。異種ペプチドを付着させる方法は、当業者には既知である。
【００２１】
「異種ペプチド」という用語は、天然状態においてＨＳＰの一部を自然に形成せず、熱ショックタンパク質由来でない、任意のペプチドを指す。ペプチドとは、本明細書においてはアミノ酸のポリマーとして定義され、産物の具体的な長さを指さない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ペプチドという用語に含まれる。また、この用語は、タンパク質の発現後の修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化およびリン酸化、を指さない、すなわち除外する。この定義に含まれるのは、天然および合成の、１つまたは複数の、非天然アミノ酸等のアミノ酸の類似体を含むペプチド、置換された結合ならびに当該技術分野で既知の他の修飾を有するタンパク質を含むペプチドである。ペプチドは、好ましくは１０００アミノ酸残基未満の長さ、より好ましくは１００アミノ酸未満の長さ、最も好ましくは５０アミノ酸未満の長さである。
【００２２】
好ましくは、異種タンパク質は免疫原性ペプチドである。
【００２３】
「免疫原性ペプチド」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）の体内で免疫応答を起こすことができる任意のペプチドを指す。免疫応答は、抗体または細胞性応答を誘導する、あるいはリンパ球、好中球および単球等の白血球によって媒介される動物での一連の免疫反応を刺激する、ペプチドの能力であり得る。
【００２４】
好ましい免疫原性ペプチドとしては、ウィルス、細菌、原生動物および腫瘍由来のものが挙げられる。免疫原性ペプチドは、ＨＩＶまたはＳＩＶ由来であることが特に好ましい。好ましくは、免疫原性ペプチドは、ＨＩＶ由来のｇｐ１２０またはｐ２４である。
【００２５】
「サイトカイン」という用語は、任意のサイトカイン、特に、インターロイキンやモノカイン等のリンフォカインを含む。特に好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αが挙げられる。
【００２６】
好ましくは、本発明のＨＳＰ断片は、１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／または１つまたは複数のサイトカインおよび／またはＮＯの産生を増加させる。
【００２７】
好ましいＣＣケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βが挙げられる。
【００２８】
「産生の増加」という用語は、ＨＳＰ断片と接触させた場合の、１つまたは複数のサイトカイン、１つまたは複数のＣＣケモカインまたはＮＯの、細胞による産生の増加を指す。１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインの産生の増加は、１つまたは複数のサイトカインおよび１つまたは複数のＣＣケモカインをコードする遺伝子発現の増加の結果、あるいはサイトカインまたはＣＣケモカインの細胞からの放出の結果であり得る。１つまたは複数のサイトカイン、１つまたは複数のＣＣケモカインまたはＮＯの産生は、対応する全長ＨＳＰと接触する細胞によって産生されたレベルよりも、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも８０％上回るレベルだけ増加することが好ましい。
【００２９】
細胞は、ＨＳＰ断片と２回以上接触させ得る。細胞をＨＳＰ断片と２回以上接触させることによって、より高いレベルの１つまたは複数のサイトカイン、１つまたは複数のＣＣケモカインおよびＮＯを得ることが可能であることが見出された。したがって、本発明は、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの細胞による産生を増加させるために、細胞をＨＳＰ断片と１回あるいは複数回接触させることを包含する。「複数回」という用語は、細胞をＨＳＰ断片と２回以上、好ましくは３〜５０回、より好ましくは３〜６回接触させ得ることを意味する。繰り返される接触の間隔は、どれだけ免疫記憶が存続するかによって、１日〜長年であり得る。好ましくは、繰り返される接触の間隔は１ヶ月である。
【００３０】
また、本発明は、本発明のＨＳＰ断片をコードする単離された核酸分子を提供する。また、この核酸分子に相補的な核酸も提供される。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であっても、ＤＮＡであってもＲＮＡであっても、天然であっても非天然であってもよい。また、本発明による単離された核酸を含むベクターも提供される。ベクターとは、目的の核酸を細胞へ転移させる働きをする分子である。
【００３１】
適切なベクターとしては、プラスミドやコスミド等の細菌ベクターまたは真核生物ベクター、λファージ等のファージベクター、アデノウィルスベクターやバキュロウィルスベクター等のウィルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。これらのベクター
は、当該技術分野で既知である。
【００３２】
好ましくは、ベクターは、適切な宿主細胞で発現される本発明の核酸分子が核酸分子によってコードされるタンパク質を産生するのを可能にする、適切な調節配列を含む。ベクターは通常、核酸分子に動作可能に結合する適切なプロモーター配列および終止配列、またはポリＡ配列等の他の配列を含む。この調節配列は、当該技術分野で既知である。また、ベクターを含む宿主細胞が提供される。細胞は、細菌、酵母または真核生物であり得る。
【００３３】
さらに、本発明は、本発明によるＨＳＰ断片またはＨＳＰ断片をコードする核酸を、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、アジュバントまたは媒体と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【００３４】
また、本発明は、療法における使用のための本発明によるＨＳＰ断片を提供する。
【００３５】
また、本発明は、疾患の治療または予防用医薬の製造における、本発明によるＨＳＰ断片の使用を提供する。疾患は、微生物感染、特に、ウィルス感染、免疫系疾患、癌であり得る。
【００３６】
さらに、必要とする患者に有効用量のＨＳＰ断片を投与することを含む、疾患の治療または予防方法を提供する。この方法により治療されることが可能な疾患は、上に定義された通りである。
【００３７】
また、本発明は、本発明によるＨＳＰ断片と細胞を接触させることを含み、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの産生を、対応する全長ＨＳＰによってもたらされる産生レベルよりも増加させる方法を提供する。
【００３８】
また、本発明は、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの産生を、対応する全長ＨＳＰよってもたらされるレベルよりも増加させるための、本発明によるＨＳＰ断片の使用を提供する。
【００３９】
また、疾患の治療のために、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの産生を、対応する全長ＨＳＰによってもたらされるレベルよりも増加させる薬剤の調製における本発明によるＨＳＰ断片の使用を提供する。疾患は上に定義された通りである。
【００４０】
また、本発明は、免疫応答をＴｈ１応答に分極させるための、本発明によるＨＳＰ質断片の使用を提供する。
【００４１】
また、ワクチンと組み合わせた本発明によるＨＳＰ断片を提供する。
【００４２】
ワクチンは、当業者には既知であり、哺乳動物に送達された場合に防御免疫応答を提供する任意の薬剤を含む。
【００４３】
さらに、本発明は、免疫応答をＴｈ１応答に分極させるための薬剤の調製における、本発明によるＨＳＰ質断片の使用を提供する。
【００４４】
細胞は、免疫応答の間に活性化される。活性化後、Ｔｈ細胞は分裂してエフェクター細胞のクローンを産生することにより、サイトカインを分泌する。サイトカインは、Ｂ細胞
、Ｔｃ細胞および他の免疫細胞の活性化において中心的役割を有する。Ｔｈ細胞によって産生されるサイトカインのパターンにより、産生される免疫応答型が決定される。Ｔｈ１応答は、主にＴ細胞毒性細胞およびマクロファージを活性化するサイトカインプロフィールを有する。Ｔｈ２応答は、主にＢ細胞を活性化する。
【００４５】
したがって、ＨＳＰ断片は、Ｔｈ１アジュバントとして作用し、Ｔｈ１応答を促進するワクチンと共に用いられることが可能である。
【００４６】
通常、先行技術のアジュバントはＴｈ２分極アジュバントである。Ｔｈ１分極アジュバントが必要である。Ｔｈ１応答は、ある微生物による感染および免疫系の疾患により適している。特に、ウィルス感染を処理する場合、Ｔｈ１応答が好ましい。
【００４７】
本発明において定義されるＨＳＰ断片の使用は、１つまたは複数のサイトカインまたはケモカインの細胞による産生を増加させることができる。１つまたは複数のサイトカインの産生は、様々なＴ細胞およびマクロファージ、ならびにウィルス等の病原菌や腫瘍から細胞を保護することができるＴ細胞サプレッサー因子を誘引することができる。
【００４８】
また、本発明のＨＳＰ断片は、樹状細胞（特に、ヒト樹状細胞）の成熟レベルを増加させる。樹状細胞の成熟は、ＣＤ８３、ＣＣＲ７、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６等の細胞表面分子のアップレギュレーションによって実証される。樹状細胞は、抗原提示において非常に有効であるため、免疫応答において重要である。
【００４９】
本発明によると、ＨＳＰ断片は、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの細胞による産生を増加させるために細胞に送達される。細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも存在し得る。好ましくは、細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで存在し、ＨＳＰ断片（異種ペプチドを含んでもよい）は個体に送達されて、１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの産生の増加をもたらす。１つまたは複数のサイトカインおよび／または１つまたは複数のＣＣケモカインおよび／またはＮＯの産生の増加は、微生物感染およびウィルス感染、ならびに腫瘍発生を防止することができる免疫応答をもたらす。ＨＳＰ断片は、ワクチンと同時に、ワクチンの後に、または別々に投与され得る。
【００５０】
本発明のＨＳＰ断片は、任意の薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは媒体と組み合わせて個体に送達されることが可能である。用いられ得る薬学的に許容可能な担体、アジュバントまたは媒体としては、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、バッファー物質（リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩等の電解質等）、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレンブロックポリマー、ポリオキシエチレンブロックポリマー、および羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明のＨＳＰ断片は、経口、非経口、吸入、スプレー、局所、直腸、鼻、頬、膣、または埋め込みリザーバによって投与され得る。好ましくは、本発明のＨＳＰ断片は注射によって投与される。本明細書において用いられる場合、「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、外皮内、病変内および頭蓋内注射、または輸液技法を含む。
【００５２】
ＨＳＰ断片は、無菌注射用調製物の形態で、例えば、無菌注射用水性または油性の懸濁
液として送達され得る。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０等）および懸濁剤を用いて、当該技術分野で既知の技法によって製剤化され得る。また、無菌注射用調製物は、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中で無菌注射用溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）であり得る。使用され得る許容可能な媒体および溶媒には、マンニトール、水、リンガー溶液および生理食塩液がある。さらに、溶媒または懸濁媒体として、無菌固定油が従来使用されている。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリド等の任意の無菌固定油が用いられ得る。オレイン酸等の脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブ油やヒマシ油等の天然の薬学的に許容可能な油であるため、特に、そのポリオキシエチレン化型で注射剤の調製において有用である。また、これらの油溶液または懸濁液は、Ｐｈ．Ｈｅｌｖや類似のアルコール等の長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含み得る。
【００５３】
また、本発明のＨＳＰ断片は、流体としてまたは直腸投与用座剤の形態で投与され得る。座剤は、室温では固体であるが直腸温度では液体であるために直腸で溶解してＨＳＰまたはペプチドを放出する適切な非刺激性賦形剤と、本発明のＨＳＰ断片またはペプチドを混合することによって調製され得る。この物質としては、カカオバター、蜜ろうおよびポリエチレングリコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
ＨＳＰ断片の局所投与は、所望の治療が局所塗布で容易に到達可能な領域または器官を含む場合に望ましい。皮膚への局所塗布に対しては、ＨＳＰ断片は、局所投与用の担体、これらに限定されないが、鉱物油、液体石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水等と共に製剤化されるべきである。あるいは、ＨＳＰ断片は、適切なローションまたはクリームと共に製剤化され、あるいは担体に溶解されることが可能である。適切な担体としては、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステル、ワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。ＨＳＰ断片は、直腸座薬製剤によってまたは適切な浣腸製剤として、下部腸管に局所的に使用されることが可能である。
【００５５】
本発明のＨＳＰ断片は、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。この投与に適した組成物は、薬学的製剤の技術分野の当業者に既知の技法により調製でき、ベンジルアルコールや他の防腐剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該技術分野で既知の可溶化剤や分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製できる。
【００５６】
以下の実施例は、図面を参照して例証として提供され、いかなる方法によっても本発明を限定することを意図しない。
〈実施例〉
【００５７】
組み換えＤＮＡ技法による機能性断片の製造を以下に記載する。
【実施例１】
【００５８】
ヒト型結核菌由来ＨＳＰ７０３５９−６１０に対する発現プラスミドおよび産生株の構築
ＨＳＰ７０３５９−６１０をコードするＤＮＡ断片の増幅
ポリメラーゼ連鎖反応によってヒト型結核菌ＨＳＰ７０遺伝子の領域を増幅するために、プライマー（各２０ｐｍｏｌ）５’−ＧＣＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＴＧＧ ＡＧＧ ＴＧＡ ＡＡＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＴＧＣ−３’および５’−ＧＣＧ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＧＡ ＧＣＣ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＧＣ−３’を、テンプレートとしてのプラスミドｐＫＡＳＭ２１０１と共に用いた。これは、ヒト型結核菌ＨＳＰ７０遺伝子を含むプラスミドであり、Gesellschaft fur Biotechno
logische Forschung (GBF), Braunschweig, GermanyのM. Singh教授が保持する、ＷＨＯ抗原バンクから入手可能である。Ｔａｑポリメラーゼ（Qiagen）を用いて反応を行い、条件は製造業者の使用説明書に従った。
【００５９】
発現ベクターｐＬＥＸＷＯ２７−２の構築
ＰＣＲ産物を、ＱＩＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Qiagen）を用いて精製し、ＢａｍＨＩで２時間消化した。制限エンドヌクレアーゼの失活のためにフェノールで抽出後、消化ＤＮＡをエタノール沈殿で回収した。その後、標準的条件を用いて、消化ＤＮＡをでさらに切断し、その後熱処理によってＮｄｅＩを失活させた。同様の手順を用いてベクターｐＪＬＡ６０３を調製した。消化ＰＣＲ産物は、Ｔ４リガーゼ（Roche）を用いて製造業者の使用説明書に従って、ｐＪＬＡ６０３に結合させた（Schauder B. et al 1987 Gene, vol 52 p279-283参照）。
【００６０】
ライゲーション混合物を、ＣａＣｌ２コンピテント大腸菌ＤＨ５α細胞に直接形質転換し、選択培地上に播種した。プラスミドは、クローンから再単離され、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩでの制限により解析した。ペプチド結合ドメインのコード領域を含む２つのプラスミドを、エレクトロポレーションにより発現株大腸菌ＣＡＧ６２９に導入した。このＣＡＧ株は、Singh. Mらによって記載されている（ヒト型結核菌３８ｋＤＡ抗原：大腸菌における過剰産生、精製およびキャラクタリゼーション（The Mycobacterium tuberculosis
38-kDA antigen: overproduction in Escherischia coli, purification and characterisation）、Gene 117:53-60, 1992）。他の株（例えば、大腸菌ＢＬ２１）は、代替物として使用できる。
【００６１】
形質転換体を、再単離プラスミドの制限によって再び解析した。ＨＳＰ７０３５９−６１０の発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって熱誘導後に解析した。
【００６２】
ｐＬＥＸＷＯ２７−２の複製した挿入物は、ＤＮＡ配列解析によって確認された。配列を図１に示す。用いたクローニング手順の結果として、Ｃ末端における追加の１０残基（ＩＴＴＩＴＴＫＤＰＫ、図１に示さず）および追加の単一残基（Ｍ、これも図１に示さず）を有する構築ＨＳＰ７０３５９−６１０を発現させた。これらの残基は、ヒト型結核菌ＨＳＰ７０の配列の一部ではなく、特定の断片の活性に影響を与えない。
【実施例２】
【００６３】
組み換えＨＳＰ７０３５９−６１０の調製
細菌培養
ＨＳＰ７０３５９−６１０の産生のために、大腸菌株ＣＡＧ６２９／ｐＷＯ２７−２（すなわち、ｐＬＥＸＷＯ２７−２で形質転換された大腸菌株ＣＡＧ６２９）を、１ｍＬ当たり１００μｇのアンピシリンを含むＬＢ培地１Ｌ中で生育させた。培養は、約０．１５のＯＤ６００で接種して、３０℃、１８０ｒｐｍでインキュベートした。ＯＤ６００＝０．３に到達した後、温度を４２℃にシフトさせることによってタンパク質発現を誘導した。３．５時間後、ＯＤ６００＝１．２で細胞を回収した。細胞ペレットを−２０℃で保存、またはＨＳＰ７０３５９−６１０の精製のために直接使用した。
【００６４】
ＨＳＰ７０３５９−６１０の精製
ＨｉｓＢｉｎｄ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎ（Novagen）を、ＨＳＰ７０３５９−６１０の精製のために製造業者の使用説明書に従って用いた。上記のように回収された細胞ペレット（２ｇ）を、１０ｍＬのイミダゾール非含有結合バッファーに再懸濁し、超音波処理によって破壊した。粗抽出物を１０分間４０００×ｇで遠心分離した。その後、上清をＨｉｓＢｉｎｄ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｌｕｍｎにかけた。３０ｍＬのイミダゾール非含有結合バッファーでカラムを洗浄後、イミダゾール１５０ｍＭ含有バッファー１５ｍＬでＨＳ
Ｐ７０３５９−６１０を溶出した。精製ポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。
【実施例３】
【００６５】
ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよび一酸化窒素の刺激
ＴＨＰ１細胞（２×１０５個／ｍｌ）を２４ウェルプレートで培養し、様々な濃度のＨＳＰ７０、ＨＳＰ７０３５９−６１０またはＨＳＰ７０１−３５８（Ｎ末端ドメイン）と共にインキュベートした。ＨＳＰ７０調製物中のＬＰＳによるいかなる残存汚染効果も除外するために、５０μｇ／ｍｌのポリミキシンＢを、ＨＳＰ７０またはＬＰＳのいずれかで刺激された単球の培養物に添加した。３〜５日後、上清を用いてＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよび一酸化窒素をアッセイした。インタクトＨＳＰ７０またはＨＳＰ７０１−３５８とは対照的に、ＨＳＰ７０３５９−６１０はＩＬ−１２産生を刺激した（図２）。また、ＨＳＰ７０３５９−６１０は、インタクトＨＳＰ７０と比較して、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳおよびＮＯの増産を刺激した（図２および図３）。
【００６６】
ＨＳＰ３５９−６１０の性質
ＨＳＰ３５９−６１０の性質をインタクトＨＳＰ７０の性質と比較するために、ＨＳＰ３５９−６１０またはインタクトＨＳＰ７０に非共有結合したサイトカインレセプターＣＣＲ５の細胞外領域に対応する合成ペプチドで、マウスを免疫した。４匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス群を腹腔内免疫して４週間後に追加免疫し、血清の抗体応答をＥＬＩＳＡで確定した。Ｎ末端の配列、ＣＣＲ５の第１ループ配列およびＣＣＲ５の第２ループ配列に対応する合成ペプチドの混合物と非共有結合するＨＳＰ７０での免疫後、血清の抗体応答は、主として第１ループ（１／２，０００）、ならびにＨＳＰ７０（１／３２，０００）およびＨＳＰ７０３５９−６１０（１／１６，０００）に対して誘導された（図１）。Ｎ末端およびループ２ペプチドに対する血清の抗体価は、免疫前血清よりも有意に大きくなかった（図１）。ＨＳＰ３５９−６１０と非共有結合するペプチドでマウスを免疫した場合、この場合はインタクトＨＳＰ７０（１／５００未満）またはＨＳＰ７０３５９−６１０（１／１，０００）に対する応答は非常に低いものの、類似の応答が誘導された。また、最も免疫原性のある第１ループペプチドのみと非共有結合するＨＳＰ７０またはＨＳＰ７０３５９−６１０で、マウスを免疫した。前述と同様に、ＨＳＰ７０と複合したペプチドでの免疫は、第１ループペプチド（１／８，０００）、ＨＳＰ７０（１／３２，０００）およびＨＳＰ７０３５９−６１０（１／８，０００）に対する応答を誘導した。ＨＳＰ７０３５９−６１０での免疫は、第１ループペプチド（１／３２，０００）に対する血清の抗体応答の増加をもたらしたが、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ７０３５９−６１０双方に対する応答は、著しく低減した。
【００６７】
要約すると、ＨＳＰ断片は、以下の長所を有する。
ａ）ＨＳＰ断片は、全身投与および粘膜投与双方で有効である。
ｂ）ＨＳＰ断片は、免疫応答のＴｈ−１分極を誘導するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞および抗体応答を導く。
ｃ）ＨＳＰ断片は、ペプチドに対する所望のコンホメーションを付与し得るシャペロン機能を有する。
ｄ）ＨＳＰ断片は、ＣＣＲ５レセプターを遮断およびダウンレギュレートするＣＣケモカインの産生を刺激するため、特異的抗ＨＩＶ効果を有する。
ｅ）断片は樹状細胞の成熟を誘導し、これがＴ細胞に対する抗原提示を促進する。
【００６８】
上で引用された全ての文献は、参照により本明細書に援用される。
【００６９】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ＨＳＰ７０またはＨＳＰ７０３５９−６１０と非共有結合的に複合した合成ペプチドでの免疫後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血清の抗体応答を示す。
【図２】図２は、ＴＨＰ１細胞によるＩＬ−１２およびＴＨＦ−αの産生における、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７０１−３５８、およびＨＳＰ７０３５９−６１０の効果を示す。
【図３】図３は、単球性ＴＨＰ１細胞によるＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１２およびＴＨＦ−αの産生における、ＨＳＰ７０３５９−６１０の効果を示す。
【図４】図４は、ヒト型結核菌ＨＳＰ７０の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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