(57)【要約】本発明は、約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性マイクロスフェアを含む、吸引と胃食道逆流の両方を検出するための診断用組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性マイクロスフェアを含む、吸引と胃食道逆流の両方を検出するための診断用組成物。
【請求項２】
マイクロスフェアが約１〜４ミクロンの直径を有する、請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項３】
約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性高分子マイクロスフェアを含む、吸引と胃食道逆流の両方を検出するための請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項４】
高分子マイクロスフェアが、ポリエステル、ポリリン酸エステル、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカーボネート、ポリアミドおよびタンパク質からなる群から選ばれる高分子材料から形成されている、請求項３に記載の診断用組成物。
【請求項５】
ポリエステルが、乳酸、グリコール酸、マンデル酸、カプロラクトン、α−ヒドロキシ酸、ラクチドおよびグリコリドの、ホモポリマーならびにコポリマーからなる群から選ばれる、請求項５に記載の診断用組成物。
【請求項６】
ポリ乳酸の生分解性マイクロスフェアを含む、請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項７】
吸引と胃食道逆流の両方を検出するための診断用組成物を含む食品であって、該組成物が約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性マイクロスフェアを含む、食品。
【請求項８】
吸引と胃食道逆流の両方を検出するための診断用組成物の製造のための、約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性マイクロスフェアの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小児および成人における吸引および胃食道逆流の診断用の診断マーカー、そのようなマーカーの製造およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
気道への吸引は、乳幼児における肺疾患の主要因の一つである。不幸にも、吸引の診断は、気付かないことならびに既存の診断試験の低い感度および特異性により、しばしば遅れる。
【０００３】
気管気管支（ｔｒａｃｈｅｏｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｔｒｅｅ）内への食物や胃物質の吸引は、様々な疾患状態（例えば、喘音（ｓｔｒｉｄｏｒ）を引き起こす喉頭および気管・気管支の炎症、咳、喘鳴（ｗｈｅｅｚｉｎｇ）、再発性肺炎、気管支拡張症、肺線維症、ならびに大量の吸引による窒息および死さえも）を引き起こし得る（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ＣＬ．  Ｔｈｅ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃ  ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ．  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９４６；  ５２：  １９１−２０５；  Ｂａｕｅｒ  ＭＬ，  Ｆｉｇｕｅｒｏａ−Ｃｏｌｏｎ，  Ｇｅｏｒｇｅｓｏｎ  Ｋ，  Ｙｏｕｎｇ  ＤＷ．  Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．  Ｓｏｕｔｈ  Ｍｅｄ  Ｊ  １９９３；  ８６：  ７８９−７９５；  Ｍｏｒａｎ  ＴＪ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  １９５５；  ６０：  １２２−１２９）。
【０００４】
乳幼児における吸引の素因となる一般的な状態には、嚥下と呼吸との協調の発達の遅れに起因する未成熟（Ｈａｒｄｉｎｇ  Ｒ，  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐ，  ＭｃＣｌｅａｌａｎｄ  ＭＥ．  Ｌｉｑｕｉｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｓｈｉｐ  ｃａｔ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙ．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｏｎｄ  １９７８；  ２７７：  ４０９−４２２）、喉頭・気管裂（ｌａｒｙｎｇｏ−ｔｒａｃｈｅａｌ  ｃｌｅｆｔ）や気管食道瘻などの気道と食道との異常な連絡、大規模な胃食道逆流、および神経の異常（例えば、脳性麻痺、声帯麻痺、家族性自律神経障害）が挙げられる。
【０００５】
ビデオＸ線透視検査中の食道造影や胃食道シンチグラフィーといった吸引の診断のための利用可能な試験は、十分には感度がよくはない（ＭｃＶｅａｇｈ  Ｐ，  Ｈｏｗｍａｎ−Ｇｉｌｅｓ  Ｒ，  Ｋｅｍｐ  Ａ．  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｄ  ｂｙ  ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  ｍｉｌｋ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｂａｒｉｕｍ  ｓｗａｌｌｏｗ  ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｇｒａｐｈｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  １９８７；  １４１：  ９１７−９２１）。１９８５年に、ＣｏｒｗｉｎおよびＩｒｗｉｎ（Ｃｏｒｗｉｎ  ＲＷ，  Ｉｒｗｉｎ  ＲＳ．  Ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄ−ｌａｄｅｎ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｍ  Ｒｅｖ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｄｉｓ  １９８５；  １３２：  ５７６−５８１）は、吸引のマーカーとして、脂質を持った肺胞マクロファージ（ＬＬＡＭ）のＯｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏ染色を発表した。さらに最近では、他者が、この試験が吸引に特異的ではないこと、および他の状態が肺胞マクロファージ内の脂肪胞（ｆａｔ  ｖａｃｕｏｌｅ）の増加も生じ得ることにも気付いた（Ｋａｊｅｔａｎｏｗｉｃｚ  Ａ，  Ｓｔｉｎｓｏｎ  Ｄ，  Ｌａｙｂｏｌｔ  ＫＳ，  Ｒｅｓｃｈ  Ｌ．  Ｌｉｐｉｄ−ｌａｄｅｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｃｈｅａｌ  ａｓｐｉｒａｔｅ  ｏｆ  ｖｅｎｔｉｌａｔｅｄ  ｎｅｏｎａｔｅｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｐｕｌｍｏｎｏｌ  １９９９；  ２８：  １０１−１０８；  Ｋｎａｕｅｒ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓ，  Ｒａｔｊｅｎ  Ｆ．  Ｌｉｐｉｄ−ｌａｄｅｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ  ａｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｐｕｌｍｏｎｏｌ  １９９９；  ２７：  ４１９−４２２；  Ｖｉｃｈｉｎｓｋｙ  Ｅ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ，  Ｄａｓ  Ｍ，  Ｅａｒｌｅｓ  ＡＮ，  Ｌｅｗｉｓ  Ｎ，  Ａｄｌｅｒ  Ａ，  ＭｃＱｕｉｎｔｔｙ  Ｊ．  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆａｔ  ｅｍｂｏｌｉｓｍ：  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｃｈｅｓｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｓｉｃｋｌｅ  ｃｅｌｌ  ａｎｅｍｉａ．  Ｂｌｏｏｄ  １９９４；  １１：  ３１０７−３１２２）。
【０００６】
Ｅｌｉｄｅｍｉｒおよび彼の同僚（Ｅｌｉｄｅｍｉｒ  Ｏ，  Ｆａｎ  ＬＬ，  Ｃｏｌａｓｕｒｄｏ  Ｎ．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２０００；  １６１：  ６２２−６２６）は、近年、マウスにおけるミルクの吸引が、気管支肺胞マクロファージ内の乳タンパク質の特異的免疫細胞化学的染色によって診断できたことを示した。この方法はミルクの検出に特異的であるようだが、他の食物物質の吸引はこの方法では検出できない。さらに、彼らは、免疫細胞化学的方法によって、肺胞マクロファージ内の乳タンパク質（α−ラクトアルブミンおよびβ−ラクトグロブリン）を染色した。彼らは、彼らの方法が、Ｏｉｌ−Ｒｅｄ  Ｏ染色（この染色は誘導した吸引後３〜４日間のみ陽性であったが）に比べて非常に感度がよくかつ非常に特異的であることを見出した。吸引は、神経障害を持つ小児における場合に上述から生じ得るが、胃食道逆流に付随するものであってもよく、大規模な発症の間にのみ発生するものであってもよく、必ずしも毎日起こらないかもしれない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、何日かまたは何週間か前に起こったかもしれない吸引の診断に役立ち得る、感度がよく特異的なマーカーを提供することである。以下に記載し説明するように、本発明のマーカーは、安全で生分解性であり、食物とともに経口で与えることができ、肺胞マクロファージにより容易に「飲み込まれる」ことができ、そして、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）肺胞マクロファージにおいて十分な期間同定できるマーカーである。
【０００８】
近年の研究（Ａｖｉｔａｌ  Ａ，  Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｙ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｃ．  Ｃｈａｒｃｏａｌ  ｉｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈａｍｓｔｅｒｓ．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  ５１：  １−５，  ２００２）では、本発明者らは、ミルクまたは正常生理食塩水と混合した活性炭粒子を使用し、ハムスターにおいて気管滴注を行った。炭粒子は、単回の滴注後３ヶ月間ＢＡＬにおいて容易に同定されたが、３ヵ月後のＢＡＬにおいてはｈｙｐｅｒｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙが見られた。これは、粒子には大きなものもあり気道の炎症を引き起こしたかもしれないという事実に起因した。
【０００９】
理解されるように、炭粒子は、安定ではなく、肺への炭粒子の導入に固有の危険により、ヒトの診断ツールとしては容認できないであろう。
【００１０】
上記技術状態を念頭に置くと、幼い小児や老人の集団といった危険にさらされている集団ならびに嚥下障害を生じる神経障害に罹患した集団用の、吸引と胃食道逆流の両方を検出するための安全な診断マーカーの必要性があることは明らかである。理解されるように、これらの群は、肺に食物を吸引する傾向があり、これは、深刻な肺の損傷および死さえ生じ得る。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
従って、本発明によれば、約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性マイクロスフェアを含む、吸引と胃食道逆流の両方を検出するための診断用組成物がここに提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の好ましい実施態様では、上記マイクロスフェアは、約１〜４ミクロンの直径を有する。
【００１３】
本発明の特に好ましい実施態様では、約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性高分子マイクロスフェアを含む、吸引と胃食道逆流の両方を検出するための診断用組成物が提供される。
【００１４】
加水分解メカニズムおよび／または酵素メカニズムを介して分解し得る任意のポリマーが適当であり得る。これらの条件下で分解されるポリマーは、就中、ポリエステル、ポリリン酸エステル、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカーボネート、ポリアミドおよびタンパク質（ポリペプチド）である。典型的なポリエステルは、例えば、乳酸（またはラクチド）、グリコール酸（またはグリコリド）、マンデル酸、カプロラクトン、α−ヒドロキシ酸（例えば、ヒドロキシ酪酸）のホモポリマーまたは異なるコポリマーである。光学活性なモノマーを含むポリマーは、ｄ−またはｌ−モノマーのみ、あるいはこれら２つの任意の組み合わせからなり得る。ポリマーの化学組成および／または分子量を変えることによって、その分解速度を制御することが可能である。
【００１５】
いずれの具体的ポリマーまたはコポリマーにも、異なる溶媒、非溶媒、および界面活性剤が、その調製プロセスにおいて適当であり得る。
【００１６】
本発明の別の局面では、吸引と胃食道逆流の両方を検出するための診断用組成物（該組成物は約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性マイクロスフェアを含む）を含む食品を提供する。
【００１７】
本発明での使用に特に好ましいのは、ポリ乳酸のマイクロスフェアである。
【００１８】
以下に記載されるように、本発明に従い、生理食塩溶液に懸濁した小さく（２．１μ）均一なポリ乳酸マイクロスフェアの気管滴注をハムスターにて行い、それを正常生理食塩水のみの気管滴注と比較し、ＢＡＬ細胞学、マクロスフェアインデックスおよび肺組織学をその後３ヶ月間追跡した。
【００１９】
ここで、本発明の側面がより完全に理解され評価され得るように、特定の好ましい実施態様に関連して、以下の実施例に本発明を記載するが、これらの特定の実施態様に本発明を限定することを意図しない。それとは逆に、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲内に含まれ得る全ての代替物、改変物、等価物を包含することを意図する。従って、好ましい実施態様を含む以下の実施例は本発明の実施の例示の役目をし、示される詳細は、例に過ぎず、本発明の好ましい実施態様の例示的考察のみを目的とするものであり、処方手順の、ならびに本発明の原理および概念的側面の、最も有益で容易に理解される説明と考えられるものを提供するために提示されることが理解される。
【実施例】
【００２０】
実施例１．非溶媒を用いた沈殿によるＰＬＡマイクロスフェア調製の手順：
分子量が２０００または３００００いずれかのｄ，ｌ−ＰＬＡ（ポリ乳酸−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）０．５ｇを、アセトン（Ｆｒｕｔａｒｏｍ）４２ｍｌに溶解した。蒸留水１００ｍｌを、穏やかな磁気撹拌下、６０分間かけて滴下した。ＰＬＡの球形粒子（直径１〜２ミクロン）が沈殿によるプロセスの初期段階で形成される。次いで、アセトンおよび蒸留水の部分を、４０℃でロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ）を用いることによって、蒸発させた。この段階で、沈殿後の粒子の凝集および固化を防止するために、１．５％の濃度で、界面活性剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８）を懸濁液に添加する。異なる界面活性剤および界面活性剤濃度がこの目的に適当であり得ることを述べておく価値がある。また、本方法は、アセトンおよび蒸留水の両方の量における比較的大きな変化にも耐える。
マイクロスフェアは、偏向器を備えているおよび備えていないどちらの光学顕微鏡によっても容易に見ることができるが、マイクロスフェアを着色する可能性を調査した。アセトン溶液に添加する着色剤は、沈殿プロセスの間、粒子に内包されるために、アセトンに溶解し、比較的疎水性であるべきである。あるいは、蛍光物質などの別の標識を添加してもよい。
方法：
動物：所定数の（ｇｉｖｅ  ｎｕｍｂｅｒ）体重１００〜１４０ｇ、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＵＳＡ）から入手した雌性Ｓｙｒｉａｎハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）９〜１２週齢を本実験に用いた。この研究は、本地域の動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により認可された。
所定数のハムスターを（気管滴注なしの）未処置コントロールとして用いた。
所定数のハムスターは、滅菌正常生理食塩水（ｎ＝１８）または均一なサイズ（２．１μ）の白色ポリ乳酸マイクロスフェア（ｎ＝２４）のいずれかを０．１ｍｌ気管滴注した。
滴注後１、３、１０、３２、６０および９０日目に、動物を供死し（生理食塩水、ｎ＝３；マイクロスフェア、ｎ＝４）、ＢＡＬを行った。
光学顕微鏡により示されるように、超音波処理によって、全てのマイクロスフェアを滅菌正常生理食塩水中で効率よく懸濁した（１０ｍｇ／ｍｌ）。
麻酔：ケタミンＨＣｌ（５０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｌ）とデヒドロベンズペリドール（２．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｌ）との混合物を、気管滴注の前に０．２５ｍｌ、放血とＢＡＬの前に０．４ｍｌ、腹腔内注射により投与した。
気管滴注：直接挿管を、金属鈍針を用いて行った。小さなアンビューバッグを用いて数回換気を行い、胸部の動きを確認することによって針の気管内の位置を確かめた。正常生理食塩水またはマイクロスフェア懸濁液（０．１ｍｌ）を気管内にゆっくりと滴注し、次いで、アンビューバッグを用いて数回換気を行い、液体を分散させ、無呼吸を防止した。
気管支肺胞洗浄：ＢＡＬ予定日に、麻酔下、腹大動脈の切除により、放血を行った。気管を露出させ、ポリエチレンカニューレで被覆した鈍針を気管内に挿入した。５ｍｌ滅菌０．９％生理食塩水の３アリコートを注入し、総回収率８５．３±０．８％で回収した。この液体を全細胞数について調べ、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｕｎｔ用のスライドを、ＢＡＬ液約１００μＬを使用して、Ｓｈａｎｄｏｎ  Ｃｙｔｏｓｐｉｎ  ３（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）上に作製した。
マクロスフェアインデックス：観察された最初の１００の連続したインタクトなマクロファージを評価し、その１００マクロファージ内の白色マイクロスフェアの総数を各ＢＡＬの日におけるマイクロスフェアインデックスと定義した。
組織学：全ての動物由来の肺をさらなる評価のためにホルムアルデヒド中に保存し、両肺から４つのスライドを作製した。気管滴注９０日後の８匹のハムスター（白色マイクロスフェア滴注後５匹、生理食塩水注入後３匹）由来の他の内臓（腎臓、肝臓、脾臓、副腎、膵臓、心臓および脳）は、さらなる評価のためにホルムアルデヒド中に保存した。黒色マイクロスフェアを滴注した動物は、肺門周辺のリンパ腺を含む全ての肺外器官を、組織学的評価のためにホルムアルデヒドに保存した。各肺外器官から２つのスライドを作製した。ヘマトキシリン−エオジンを染色に使用した。スライドを２人の上位病理学者（Ｖ．ＤおよびＹ．Ｓ．）によって十分に評価した。
統計学：群データを平均±平均の標準誤差（ＳＥ）として表す。群間の差をＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いるＡＮＯＶＡを使用して比較した。ｐ＜０．０５の場合に、差を有意とみなした。
結果：
この実験の結果を本明細書に添付した図１および２に示す。ここで、図１は、ハムスターの気管内に直接滴注され、全肺洗浄後に得られた肺胞マクロファージ内に検出されたポリ乳酸を示し、図２は、生理食塩水を滴注した動物の肺胞マクロファージを示す。
見られ得るように、ポリ乳酸（ｐｏｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）の白色マイクロスフェアは、肺胞マクロファージ内で明確に同定されるので、吸引の診断のための特異的で感度がよく安定なマーカーとして使用され得る。
理解されるように、ポリ乳酸に加え、他のポリマーおよびコポリマー、ならびに異なる溶媒、非溶媒および界面活性剤が、本発明で使用するためのマイクロスフェアの調製プロセスにおいて適当である。
この目的で使用され得るタンパク質の例は、ヒトアルブミン、ヘモグロビン、ゼラチンおよび大豆タンパク質である。
【００２１】
実施例２．非溶媒を用いた沈殿：
溶媒が水または水溶液のいずれかであり、非溶媒がアセトンなどの水溶性揮発性溶媒であること以外は、ＰＬＡについて記載した実施例１の手順を繰り返す。
【００２２】
実施例３．界面架橋プロセス：
磁気撹拌下、タンパク質２．５ｇを０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液（水相）３５ｍｌに溶解した。３５０ｒｐｍで機械撹拌下、このタンパク質溶液を、０．５％ホスファチジルコリン（界面活性剤−Ｓｉｇｍａ）を含むシクロヘキサン（有機相−Ｂａｋｅｒ）７５ｍｌ中で乳化した。この乳濁液にスクシニルクロライド（ＳＣ）（Ｓｉｇｍａ）１６８．２ｍｇのシクロヘキサン３８ｍｌ溶液を４５分間滴下した。ＳＣは、室温で、縮合反応のメカニズムを介して、タンパク質のアミン基と主に反応する。次いで、マイクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｒｅ）をデカンテーションにより分離し、アセトン（Ｆｒｕｔａｒｏｍ）で３回洗浄し、風乾した。
架橋剤は、任意のジアシルクロライド、またはタンパク質の化学的に活性な基と反応し得る任意の二官能性もしくは多官能性分子であり得る。この方法を用いて、マイクロスフェアまたはマイクロカプセルのいずれかが得られ得る。マイクロスフェアの硬さは、架橋剤の種類と濃度、および有機相と洗浄溶媒の種類を変えることによって制御され得る。
【００２３】
実施例４．加熱による変性：
タンパク質を、実施例２のようにして沈殿するかまたは実施例３のようにして乳化し、その後、その懸濁液を十分に加熱してタンパク質の変性を誘導し、そのようにして、粒子を安定化する。
【００２４】
本発明が上述した例示的な実施例の詳細に限定されないこと、および、本発明がその必須の特性から逸脱することなく他の具体的な形態で実施され得ることは当業者に明らかであり、従って、上述した説明よりも添付の特許請求の範囲を参照して、本実施態様および実施例は、全ての点で、例示的で非制限的であると考えられることが望ましく、従って、特許請求の範囲の均等の意義および範囲内で生じるすべての改変は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ハムスターの気管内に直接滴注され、全肺洗浄後に得られた肺胞マクロファージ内に検出されたポリ乳酸を示す。
【図２】図２は、生理食塩水を滴注した動物の肺胞マクロファージを示す。
【図１】
2005537283.tif 000002
【図２】
2005537283.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月10日(2004.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性高分子マイクロスフェアを含む、肺吸引を検出するための診断用組成物であって、該高分子マクロスフェアが、ポリエステル、ポリリン酸エステル、ポリホスファゼン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカーボネートおよびポリアミドからなる群から選ばれる高分子材料から形成されている、診断用組成物。
【請求項２】
生分解性高分子マイクロスフェアが約１〜４ミクロンの直径を有する、請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項３】
ポリエステルが、乳酸、グリコール酸、マンデル酸、カプロラクトン、α−ヒドロキシ酸、ラクチドおよびグリコリドの、ホモポリマーならびにコポリマーからなる群から選ばれる、請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項４】
ポリ乳酸の生分解性マイクロスフェアを含む、請求項１に記載の診断用組成物。
【請求項５】
肺吸引を検出するための診断用組成物と組み合わせた食品であって、該組成物が約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性高分子マイクロスフェアを含む、食品。
【請求項６】
肺吸引を検出するための診断用組成物の製造のための、約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性高分子マイクロスフェアの使用。
【請求項７】
食物と組み合わせて経口投与するための約０．１〜１０ミクロンの直径を有する生分解性高分子マイクロスフェアを含む診断用組成物を提供することを含む、肺吸引を検出するための診断方法であって、該マイクロスフェアが、気管支肺胞洗浄によって得られる肺胞マクロファージ内で同定され得る、診断方法。
【国際調査報告】
2005537283.tif 000004
2005537283.tif 000005
2005537283.tif 000006
2005537283.tif 000007
2005537283.tif 000008