(57)【要約】本発明は、HBV感染の治療または予防に有用な、HBV抗原を含む組成物に関する。本明細書に説明されるように組成物の内容は様々であるが、組成物はストレス蛋白質、またはその一部（例えば、断片）もしくは誘導体、およびHBV抗原を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレス蛋白質またはその一部、およびB型肝炎ウイルス（HBV）コア抗原を含む単離された融合蛋白質であって、個体に投与されるとHBVコア抗原に対する免疫応答を誘導または増強する融合蛋白質。
【請求項２】
ストレス蛋白質が熱ショック蛋白質である、請求項1記載の融合蛋白質。
【請求項３】
ストレス蛋白質が、Hsp10、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp100-200、Hsp100、Lon、TF55、Hsp40、FKBP、サイクロフィリン、Hsp20-30、ClpP、GrpE、ユビキチン、カルネキシン、または蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ、またはストレス蛋白質の小分子量ファミリーより選択される、請求項1記載の融合蛋白質。
【請求項４】
ストレス蛋白質がウシ結核菌BCG hsp65である、請求項3記載の融合蛋白質。
【請求項５】
HBVコア抗原が、C末端のアルギニンに富むドメインの全体または一部を欠くHBVコア抗原断片を含む、請求項1記載の融合蛋白質。
【請求項６】
HBVコア抗原断片が、HBV adw株のコア抗原のアミノ酸1〜149またはアミノ酸1〜151を含む、請求項5記載の融合蛋白質。
【請求項７】
図6、8、10、または12のいずれか1つに示される配列を含む融合蛋白質。
【請求項８】
請求項1から7のいずれか一項記載の融合蛋白質を含む薬学的組成物。
【請求項９】
薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項8記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項1から7のいずれか一項記載の融合蛋白質をコードする配列を含む単離された核酸。
【請求項１１】
図5、7、9、または11のいずれか1つに示される配列を含む単離された核酸。
【請求項１２】
請求項10または11に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項10または11に記載の核酸を含むレトロウイルスベクター。
【請求項１４】
請求項12記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１５】
請求項1から7のいずれか一項記載の融合蛋白質を生産する方法であって、
(a) 請求項14記載の細胞を提供する段階、および
(b) 核酸の発現を許す条件下で細胞を培養する段階
を含む方法。
【請求項１６】
対象者においてHBVコア抗原に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、対象者に請求項1から7のいずれか一項記載の融合蛋白質を有効量投与する段階を含む方法。
【請求項１７】
対象者においてHBVコア抗原に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、対象者に請求項8記載の薬学的組成物を有効量投与する段階を含む方法。
【請求項１８】
薬学的組成物が薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
HBVコア抗原に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、対象者に請求項12記載の発現ベクターを有効量投与する段階を含む方法。
【請求項２０】
HBVコア抗原に対する免疫応答を誘導または増強する方法であって、対象者に請求項13記載の発現ベクターを有効量投与する段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許出願第60/266,733号（2001年2月5日）の出願日に利益を主張するものである。米国特許出願第60/266,733号の内容は、その全体が参照として本願に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明の技術分野はB型肝炎ウイルスの免疫療法である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
B型肝炎ウイルス（HBV）は、ヒトに感染し、2つの臨床転帰に至る可能性のある、非細胞変性性DNAウイルスである。成人の臨床的感染の大部分（90〜95％）では、数週間または数ヶ月後にウイルスは消失し、患者は再感染に対して生涯にわたる免疫を獲得する。しかし、残りの症例では、組織からウイルスは消失せず、患者は慢性感染する。慢性感染の後遺症は深刻であり：患者は肝臓組織の瘢痕化（肝硬変）を非常に起こしやすく、最終的には肝細胞癌を発症する可能性がある。
【０００４】
HBVに対する予防接種があり、多くの先進国では感染リスク全般を低下させるために小児の予防接種プログラムを実施している。残念ながら、慢性HBV感染による病的状態および死亡は数十年にわたって起こり、予防接種の影響は遠い将来にしか現実化しない。実際、成人におけるHBV感染の年間発生率は、今後8年間に5％未満しか低下しないと推測される。2008年までには、米国のみで毎年150,000件の新たな感染が起こり、ヨーロッパおよび日本ではこれ以上だと予測される。このような患者はウイルスの巨大な保有者群となり、そのうちから、年に20,000から40,000の慢性感染が起きる。明らかに、ワクチンがあっても、慢性HBV感染は、今後何年もの間、健康上の深刻な問題であり続けると考えられる。
【０００５】
慢性HBVの現在の治療法には、αインターフェロン（IFN-α）およびラミブジンが含まれる。これらの治療法は、ウイルス量を低下させ、HBV複製および高力価のウイルス血症のマーカーであるHBe抗原の血清変換または消失をもたらす能力によって評価される。IFN-αはHBeを除去できるが、それはウイルス負荷の低い約3分の1の患者においてのみである。この治療法は高価で、かなりの不快な副作用を伴う。ラミブジンは小分子の抗ウイルス剤で、経口投与での忍容性が非常に高い。この化合物は、患者のウイルス負荷を低下させるのに効果的であるが、HBeの消失の応答が見られる患者は比較的少なく、この治療法を中止すると通常、ウイルス量が上昇する。一方で、治療を続けると、ラミブジン耐性変異体が選択される可能性がある。IFNαとラミブジンを併用しても、有効性の上昇が認められない。明らかに、HBV感染を治療するために有効な免疫療法が、非常に望まれる。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明はストレス蛋白質またはその一部、およびHBV抗原を含む組成物を特徴とする。これらの組成物は、以下に詳しく説明される。その成分は、様々な供給原から入手でき、その長さおよび含量は様々であり得る。例えば、ストレス蛋白質は任意の哺乳類（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類）またはストレス蛋白質を発現する他の任意のクラスの生物体（例えば、細菌またはマイコバクテリウム）によって天然において発現されるものであり得り；ストレス蛋白質および/またはHBV抗原は、全長、切断型、または1つまたは複数のアミノ酸残基の付加によって延長したものであり得り；また、ストレス蛋白質またはHBV抗原の内容は様々であり得る（例えば、ストレス蛋白質またはその一部、およびHBV抗原は、1つまたは複数のアミノ酸置換を含み得る）。しかし、全ての変異は、哺乳類においてHBVに対する免疫応答を誘導または増強しえる組成物を生じるものでなくてはならない。好ましくは、免疫応答は、HBV感染患者の感染の徴候または症状が改善（客観的または主観的に）するほど、強いものである。したがって、抗原は全長および天然に存在する抗原、ならびにその断片および他の変異体を含み、患者に投与されると（例えば、本明細書に記述される方法によって）、断片または変異体の中に存在する1つまたは複数のエピトープに対する免疫応答を誘導するものである。
【０００７】
同様に、全長または天然に存在するストレス蛋白質に加えて、本発明の組成物は免疫刺激性のストレス蛋白質の断片（すなわち、抗原に対する免疫応答を促進する断片）を含み得る。HBV抗原が単独で投与された場合に通常起こる免疫応答よりもその免疫応答が強い、または何らかの意味で勝っていれば、ストレス蛋白質またはその断片は、免疫応答を促進すると言える。
【０００８】
免疫応答は、液性または細胞性の応答のいずれでも良い。例えば、本明細書に記述されるように、抗原断片は、1つまたは複数のHLAクラスIペプチド抗原を含み得る。細胞性免疫応答には、細胞障害性Tリンパ球（CTL）のような免疫系の抗原特異的細胞、ならびにTヘルパーリンパ球（Th）、および単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、およびγδT細胞のような先天性免疫系の細胞であり得る。当業者は、例えば細胞障害性Tリンパ球の誘導（以下の実施例参照）、細胞の増殖反応、サイトカインの誘導、またはこれらの事象の組み合せによって示される免疫応答を十分に検出または評価できる。
【０００９】
特定の態様では、HBV抗原はHBVコア抗原またはその断片もしくは誘導体であり得る。HBV抗原の誘導体には、1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を含むもののようなHBV抗原変異体が含まれる。例えば、HBV抗原の変異体には、1〜2個、2〜5個、5〜10個、10〜25個、またはそれ以上の置換されたアミノ酸残基が含まれ得る。または、置換または欠失もしくは切断のような他の変異は、全長HBV抗原の配列の1〜2％、2〜5％、5〜10％、または10〜25％を構成し得る。組成物の抗原性部分と同様に、ストレス蛋白質の変異体は、1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を含み得る。例えば、ストレス蛋白質の変異体は、1〜2個、2〜5個、5〜10個、10〜25個、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。ここでもまた、置換または欠失もしくは切断のような他の変異は、全長ストレス蛋白質の配列の1〜2％、2〜5％、5〜10％、または10〜25％を構成し得る。
【００１０】
ストレス蛋白質およびHBV抗原の様々な組み合せも、本発明の範囲内である。例えば、本発明の組成物には、全長のHBV抗原が全長のストレス蛋白質と会合したもの；HBV抗原の断片または他の変異体からなる抗原が、全長ストレス蛋白質と会合したもの；全長HBV抗原がストレス蛋白質の断片または他の変異体と会合したもの；およびHBV抗原の断片または他の変異体がストレス蛋白質の断片または他の変異体と会合したものが含まれる。もちろん、本明細書に記述されるように、これらの成分の各々が複数（すなわち、複数のHBV抗原および複数のストレス蛋白質）存在する可能性があり、成分のそれぞれは、全長蛋白質の形、または免疫活性のあるその断片もしくは変異体として存在し得る。
【００１１】
さらに、本明細書に記述される任意の取り合わせにおいて、HBV抗原およびストレス蛋白質は、任意の形で会合してよい。例えば、ストレス蛋白質およびHBV抗原は、融合ポリペプチドの形（ストレス蛋白質とHBV抗原が、融合したオープンリーディングフレームの翻訳の際に共有結合する）で存在し得る。または、ストレス蛋白質およびHBV抗原は、各々が別個に翻訳または合成された後で、化学的に結合され得る。これらの成分は、非共有結合で会合しても良い（例えば、混合物またはより秩序立った組成物中）。「ポリペプチド」および「蛋白質」という用語は、異なる意味を意図していることが文脈上で明らかな場合を除き、アミノ酸残基の鎖を記述するために互換的に使用される。
【００１２】
ストレス蛋白質は以下にさらに説明されるが、ストレス蛋白質は熱ショック蛋白質（Hsp）であり得る。さらに、HspはHsp65（例えば、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)のHsp65）のようなマイコバクテリウムHsp、または任意の種のHspファミリーの任意の蛋白質であり得る。
【００１３】
本発明の組成物は、種々の方法で患者に投与されるように製剤化でき、選択的にアジュバントを含む。本組成物の別の選択的な成分は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、および担体を含む。
【００１４】
本発明はHBVに感染した患者に本発明の組成物を投与することによって、患者（例えば、ヒトのような哺乳類）のHBV感染を治療する方法、および患者がHBVに感染する前に本発明の組成物を投与することによって患者（例えば、ヒトのような哺乳類）のHBV感染を予防する（または可能性を低下させる）方法にも関する。
【００１５】
組成物の成分は、ポリペプチドとして患者に直接投与される必要はない。代わりに、ストレス蛋白質、HBV抗原、または各々を1つまたは複数含む融合蛋白質をコードする核酸を投与することができ、蛋白質、抗原、または融合蛋白質をインビボで患者の中で発現させる。核酸はウイルスベクター、例えばウイルスベクターゲノムの一部であるか、例えばリポソームに被包されてもよい。または、核酸は真核細胞または哺乳類細胞中で機能できる調節配列に駆動されるプラスミドのような、裸の核酸として送達しても良い。核酸分子の投与方法は、当技術分野で周知である。
【００１６】
さらに本発明は、本明細書に記述される方法にしたがうB型肝炎ウイルスの治療のための薬剤の生産における、本発明の組成物（例えば、HBV含有融合蛋白質、それらをコードする核酸分子、およびそれらを含む薬学的組成物）の使用にも関する。
【００１７】
本発明の他の特徴および利点は、詳細な記述、図面、および請求の範囲から明らかになると考えられる。本明細書に引用されるすべての特許出願、特許、および出版物は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【００１８】
詳細な説明
本発明はHBV感染の治療または予防に有用な、HBV抗原を含む組成物に関する。本明細書に記述されるように、組成物の内容物は様々であり得るが、組成物はストレス蛋白質またはその一部（例えば、断片）もしくはその誘導体、およびHBV抗原を含む。本発明の方法に使用するために適切な種々の材料および手順は、以下に説明される。
【００１９】
ストレス蛋白質およびHBV蛋白質をコードする核酸配列は既知で、使用できるので、これらをコードする核酸コンストラクト（単独または融合コンストラクトとして）は当技術分野で日常的に実施される方法を用いて、容易に調製できる。選択的に抗原に結合されたストレス蛋白質（Hsp）をコードする核酸の例は、国際公開公報第89/12455号、94/29459号、98/23735号、99/07860号、および本明細書の参考文献を参照されたい。融合蛋白質は、組換え技術のみならず、ストレス蛋白質（例えば、Hsp）とHBV抗原の翻訳後の結合によっても、生産できる。結合技術は、例えば、Hermanson (Bioconjugate Techniques、Academic Press、San Diego、CA、1996)、Lussowら（Eur. J. Immun. 21:2297-2302、1991）、およびBarriosら（Eur. J. Immun. 22:1365-1372、1992）に記述されている。そのような結合方法は、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、およびビスジアゾベンジジンのようなカップリング剤の使用；M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなヘテロ2官能性架橋剤の使用；または分子間ジスルフィド結合の形成を促進するためのストレス蛋白質および抗原中のシステイン残基（天然に存在するものおよび/または組換えで挿入したもの）の使用を含む。
【００２０】
任意のHBV抗原は、本発明の融合蛋白質または組成物に含めることに適している。好ましいHBV抗原は、HBVコア抗原またはその断片もしくは誘導体である。試験を容易にするために、HBV抗原は選択的に、例えばマウスH-2Kb拘束性CTLエピトープのような、既知のマウスMHC拘束性CTLエピトープを含むように修飾できる。そのような修飾の例は、実施例に記述されている（例えば、HBVのadw株では、残基97はイソロイシンであり、これをフェニルアラニンに置換するとマウスH-2Kb拘束性CTLエピトープが生成する）。また、抗原は複数のHBVサブタイプ（例えば、adw、ayw、adr、またはayr）から得られるヒトHLAエピトープを含むように修飾できる。例えば、図2に示されるHBVコア抗原の位置91のスレオニンをバリンに1アミノ酸置換すると、adwおよびadr HBVサブタイプの両方に見られる既知のHLA-A11拘束性CTLエピトープの配列を複製する。HBVコア抗原の他の誘導体には、切断型が含まれる。切断には、C末端のアルギニンの豊富な領域（HBcのアミノ酸150から185）の全体または一部が除去された切断型が含まれるが、これらに限定されない。適当な切断型HBc断片には、HBcのN末端の最初の149アミノ酸またはN末端の最初の151アミノ酸のみからなる断片が含まれるが、これらに限定されない。いずれにしても、HBc抗原（または任意の適当なHBV抗原）の適当な断片は、理想的には1つまたは複数のB細胞またはT細胞エピトープ（または1つまたは複数のB細胞エピトープおよび1つまたは複数のT細胞エピトープ）、好ましくは1つまたは複数のCTLエピトープを含む。さらに、HBVコア抗原の末端システインは、除去したり異なるアミノ酸で置換できる。アミノ酸配列に対して他の修飾もできる。別の例は、既知のHLA拘束性CTLエピトープのアンカー残基を置換して、ペプチドのMHCクラスI分子に対する結合親和性を上昇させることである。これらの修飾されたHBVコア抗原は、融合蛋白質に含めることに適しているが、HBVに対する免疫応答を誘導するために、単独で用いることもできる（選択的にアジュバントとともに製剤化して）。
【００２１】
本発明で使用するために適当な別のHBV抗原には、HBVコア抗原、HBVe抗原（HBeAg）、x蛋白質（HBx）、ポリメラーゼポリペプチド、ならびにHBVエンベロープ蛋白質S、M、およびLならびにそれらの断片が含まれる（SeegerおよびMason、Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:51-68、2000; GanemおよびSchneider、Hepadnavirdae: The viruses and their replication. Knipe、DMおよびHowley、PM編Fields Virology、Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins、2001:2923-2969）。
【００２２】
上述のように、HBV抗原、ストレス蛋白質、またはその両方は、1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を含み得る。これらの置換は、1つまたは複数の予測される必須ではないアミノ酸残基で行なうことができるが、必ずしもそうでなくても良い。「保存的アミノ酸置換」は、1つのアミノ酸残基が、同様な側鎖を持つ別のアミノ酸残基で置換されることである。同様な側鎖を持つアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が含まれる。置換が、予測される必須でない部位で起きるように設計されるか、HBV抗原またはストレス蛋白質コード配列の全体または一部で無作為に導入されるか（飽和変異導入などによる）に関わらず、得られた変異体はそれぞれ抗原性および免疫刺激活性についてスクリーニングして、生物活性を保持している変異体を同定する。変異導入後に、コードされた蛋白質を組換え発現し、蛋白質の活性を決定できる。
【００２３】
HBV抗原は、リンカーまたは介在する外因性配列を入れ、または入れないで、ストレス蛋白質のN末端またはC末端のいずれかに融合させることができる。別の態様では、2つのHBV抗原（本明細書に記載されるように天然に存在するものまたは変異体であることができる）をストレス蛋白質に結合できる（1つをストレス蛋白質のN末端および他方をC末端において；両方をN末端において；または両方をC末端において）。さらに、1つまたは複数のHBV抗原（やはり天然に存在するまたは断片または他の変異体；同一または異なるHBV蛋白質から）をストレス蛋白質のN末端またはC末端、または両方に結合できる。複数のストレス蛋白質が含まれる場合には、さらに他の配置も可能であり、当業者には明らかであると思われる。
【００２４】
ストレス蛋白質とHBV抗原（またはその組み合せ；例えば1つのストレス蛋白質および2つまたはそれ以上のHBV抗原）は、各々が別個に翻訳または合成された後で、化学的に結合できる。上述のように、成分はまた非共有結合で会合し得る（例えば、混合物またはさらに秩序立った組成物中）。HPV抗原と非共有結合で会合しているストレス蛋白質またはその免疫刺激性断片を含む組成物は、米国特許第6,048,530号；米国特許第6,017,544号；米国特許第6,017,540号；米国特許第6,007,821号；米国特許第5,985,270号；米国特許第5,948,646号；米国特許第5,935,576号；米国特許第5,837,251号；米国特許第5,830,464号；または米国特許第5,750,199号に記述されるようにして生産できる。また米国特許第5,997,873号；米国特許第5,961,979号；米国特許第6,030,618号；米国特許第6,139,841号；米国特許第6,156,302号；米国特許第6,168,793号；および国際公開公報第97/06821号も参照されたい。
【００２５】
さらに、組成物には複数の種類のウイルス抗原を含めることができる。例えば、HBV抗原に加えて、本発明の組成物は異なる病原体由来の抗原を含む（またはコードし；本明細書に記述される任意の蛋白質は直接または核酸を用いて投与できる）ことができる。したがって、HBV抗原に加えて、本組成物はC型肝炎抗原、単純ヘルペスウイルス（HSV）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原、サイトメガロウイルス（CMV）抗原、エプスタインバーウイルス（EBV）抗原、呼吸合胞体ウイルス（RSV）抗原、ヒトパピローマウイルス（HPV）抗原、ヘルペスウイルス抗原、またはその組み合せを含む（またはコードする）ことができる。組成物がウイルス抗原としてHBVのみを含む態様について記述されたのと同様な変更（例えば、ストレス蛋白質に会合する方法、全長、断片、または変異体蛋白質を含める、成分の数の変更、およびその配列）が、組成物に少なくとも1つのHBV抗原および少なくとも1つの他のウイルス抗原が存在する（またはコードされる）態様にも適用できる。
【００２６】
驚くべきことに、コア抗原からC末端のアルギニンに富む領域を除去すると、コア抗原に対する免疫応答、特に細胞性および/またはCTL免疫応答を誘導する能力のあるポリペプチドが得られることが分かった。コア抗原のアルギニンに富む領域は、コア抗原のアミノ酸150から183に存在する（Nassal、J. Virol. 66:4107-4116、1992）。適当なコア抗原断片には、この領域を全てまたは部分的に欠失する断片が含まれるが、これらに限定されない。例えば、適当なコア抗原断片は、最初の149または151アミノ酸（または149アミノ酸もしくは151アミノ酸より少ない）を含む可能性がある。
【００２７】
本発明の組成物は、選択的にアジュバントを含み得る。効果的なアジュバントの例には：フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、SAF、ムラミルジペプチド（MDP）、リポ多糖類（LPS）、脂質A、モノホスホリル脂質A（MPL）、百日咳毒素（PT）、ステアリルチロシン、γインスリン、RIBI（細菌から抽出した3つの成分を含む）、クイル（Quil）-A、サポニン（QS21）、ミョウバン（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）、リン酸カルシウム、MF-59、免疫刺激性複合体（ISCOMS）、CpGオリゴヌクレオチドおよびサイトカインが含まれるがこれらに限定されない（GuptaおよびSiber、Vaccine 13:1263-1276、1995; SinghおよびO'Hagan、Nature Biotechnology 17:1075-1081、1999）。
【００２８】
HBV抗原の適当な断片または誘導体は、理想的には少なくとも1つのB細胞またはT細胞エピトープ（または両方）を含む。好ましい態様では、断片または誘導体は少なくとも1つのCTLエピトープを含む。
【００２９】
様々な生物体から、種々のストレス蛋白質が単離、クローニング、および特徴付けされている（Mizzen、Biotherapy 10:173-189、1998）。任意の免疫刺激性Hspまたはその免疫刺激性断片は、融合ポリペプチドおよび組成物に使用するのに適している。例えばHsp70、Hsp60、Hsp20-30（低分子量Hsp）、およびHsp 10（GroES相同体）は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）および癩菌（Mycobacterium leprae）による感染に対する宿主の免疫応答によって認識される主要な抗原決定基に含まれる。さらに、ウシ結核菌（Mycobacterium bovis）の1つの株であるカルメット-ゲラン菌（Bacille Calmette Guerin） (BCG)のHsp65は、以下の実施例に記述されるように、効果的な免疫刺激剤であることが分かった。
【００３０】
本発明で使用するストレス遺伝子および蛋白質のファミリーは、当技術分野で周知であり、例えば、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、Hsp70、Hsp60、TF55、Hsp40、FKBP、サイクロフィリン、Hsp20-30、ClpP、GrpE、Hsp10、ユビキチン、カルネキシン、および蛋白質ジスルフィドイソメラーゼが挙げられる。例えば、Macario、Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70、1995; Parsellら、Rev. Genet. 27:437-496、1993; および米国特許第5,232,833号を参照されたい。
【００３１】
Hsp100-200蛋白質の例には、Grp170（グルコースに調節される蛋白質）が含まれる。Grp170はERの内腔および前駆ゴルジ区画に存在し、免疫グロブリンの折畳みおよび集合に役割を果たす可能性がある。
【００３２】
Hsp100蛋白質の例には、哺乳類Hsp110、酵母Hsp104、および大腸菌ClpA、ClpB、ClpC、ClpXおよびClpYが含まれる。
【００３３】
Hsp90蛋白質の例には、大腸菌のHtpG、酵母のHsp83およびHsc83、ならびにヒトのHsp90α、Hsp90β、およびGrp94（小さいgp96）が含まれる。Hsp90は、ステロイドホルモン受容体（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲステロン、およびテストステロン受容体）、転写因子、およびシグナル伝達機構に関与するプロテインキナーゼのような、通常は細胞調節分子である蛋白質群に結合する。Hsp90蛋白質は、他のストレス蛋白質を含む大きな、豊富な蛋白質複合体の形成にも参加する。
【００３４】
Lonは、大腸菌内で非天然の蛋白質を分解する4量体のATP依存性プロテアーゼである。
【００３５】
Hsp70の例には、哺乳類細胞のHsp72およびHsc73、癩菌、結核菌、ウシ結核菌（カルメット-ゲラン菌など；本明細書ではHsp71と呼ばれる）のようなマイコバクテリウムまたは細菌のDnaK、大腸菌、酵母、および他の原核生物のDnaK、およびBiPおよびGrp78が含まれる。Hsp70はATPおよび折り畳まれていないポリペプチドおよびペプチドに特異的に結合する能力があり、タンパク質の折畳と開き、ならびに蛋白質複合体の会合および解体に関わる。
【００３６】
Hsp60蛋白質の例には、マイコバクテリウムのHsp65が含まれる。細菌のHsp60は、GroELとしても知られている。Hsp60は大きなホモオリゴマーである複合体を形成し、蛋白質の折畳みにおいて鍵となる役割を果たすと考えられる。Hsp60相同体は、真核生物のミトコンドリアおよび葉緑体に存在する。
【００３７】
TF55蛋白質の例には、Tcpl、TriC、およびサーモソームが含まれる。この蛋白質は通常真核細胞および一部の古細菌の細胞質に存在し、多員環を形成して蛋白質の折畳みを促進する。これらはHsp60ともわずかに相同である。
【００３８】
Hsp40の例には、大腸菌およびマイコバクテリウムのような原核生物のDnaJ、およびHSJ1、HDJ1、およびHsp40が含まれる。Hsp40は種々の細胞の活動の中でも、蛋白質の折畳み、熱耐性、DNA複製における分子シャペロンとしての役割を持つ。
【００３９】
FKBPの例には、FKBP12、FKBP13、FKBP25、およびFKBP59、Fpr1およびNep1が含まれる。これらのタンパク質は通常、ペプチジルプロピルイソメラーゼ活性を持ち、FK506およびラパマイシンのような免疫抑制剤と相互作用する。これらのタンパク質は通常、細胞質および小胞体に見られる。
【００４０】
サイクロフィリンの例には、サイクロフィリンA、B、およびCが含まれる。これらの蛋白質は、ペプチジルプロピルイソメラーゼ活性を持ち、免疫抑制剤サイクロスポリンAと相互作用する。
【００４１】
Hsp20-30は、小さなHspとも呼ばれる。Hsp20-30は通常、大きなホモオリゴマー複合体またはおそらくヘテロオリゴマー複合体中に見られる。1つの生物体または細胞タイプは、いくつかの異なるタイプの小さなHspを発現し得る。Hsp20-30は細胞骨格構造と相互作用し、アクチンの重合/脱重合の調節を行なう可能性がある。Hsp20-30はストレスがかかるか、休止細胞が増殖因子に曝露されると、迅速にリン酸化される。Hsp20-30相同体にはαクリスタリンが含まれる。
【００４２】
ClpPは異常な蛋白質の分解に関与する大腸菌のプロテアーゼである。ClpPの相同体は葉緑体に見られる。ClpPはClpAとヘテロオリゴマー複合体を形成する。
【００４３】
GrpEはストレスで障害を受けた蛋白質の救出、および障害を受けた蛋白質の分解に関与する、約20 kDaの大腸菌の蛋白質である。GrpEは大腸菌におけるストレス遺伝子の発現の調節に関与している。
【００４４】
Hsp10の例にはGroESおよびCpn10が含まれる。Hsp10は大腸菌に見られ、真核細胞のミトコンドリアおよび葉緑体にも見られる。Hsp10はHsp60オリゴマーと会合する、7員環を形成する。Hsp10は蛋白質の折畳みにも関与している。
【００４５】
ユビキチンはATP依存性のサイトゾルのプロテアーゼによる蛋白分解性の除去と協調して蛋白質に結合することが分かっている。
【００４６】
本発明では、全長のストレス蛋白質に加え、任意の免疫刺激性断片または誘導体も有用である。免疫刺激性断片または誘導体（例えば、Hspの免疫刺激性断片）とは、抗原に対する免疫応答を促進する断片または誘導体である。断片または誘導体は、いくつかの方法で免疫応答を促進できる。例えば、断片は、それがなければおこらない免疫応答を誘導するか、起こる免疫応答を増強することができる。いくつかの免疫刺激性断片が記述されている。適当な断片には：(a) マイコバクテリウムHsp70の（特に結核菌Hsp70）のアミノ酸161-370（Huangら、J. Exp. Med. 191:403-408; 2000、2001年1月16日出願の米国特許出願第09/761,534号）；(b)マイコバクテリウムHsp70（特に結核菌Hsp70）のATPアーゼドメインまたはペプチド結合ドメイン（Young、1997年11月25日出願の米国特許出願第09/025,178号）；(c) マウスHsc70（Hsp70ファミリーの構成要素）のアミノ酸280-385（Udonoら、Int. Immunol. 13:1233-1242、2001）；(d) 結核菌Hsp70のアミノ酸359-610（Wandら、Immunity 15:971-983、2001）；(e) (a)から(d)に関して、他の種から得られるHsp70相同体の対応する領域、および(f)マイコバクテリウムHsp65（特にウシ結核菌Hsp65）のアミノ酸1-200（Chuら、2000年7月10日出願の米国特許出願第09/613,303号）。
【００４７】
本発明で有用なストレス蛋白質は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、腸内細菌（例えば、大腸菌）、マイコバクテリウム（特に癩菌、結核菌、マイコバクテリウム・バッカエ(M. vaccae)、スメグマ菌(M. smegmatis)、およびウシ結核菌）、酵母、ショウジョウバエ（Drosophila）、および他の脊椎動物（例えば、ニワトリのような鳥類、またはラット、マウス、もしくはヒトを含む霊長類のような哺乳類）を含むが、これらに限定されない任意の生物体から得られうる。
【００４８】
融合ポリペプチドを含む治療用（例えば、免疫療法用）組成物を生産するためには、ポリペプチドは細菌、酵母、植物もしくは植物細胞、または動物もしくは動物細胞で、組換えにより生産できる。例えば、本発明に係る融合ポリペプチドは、適当な発現媒体中で融合ポリペプチドをコードするDNA断片で、宿主細胞を形質転換（トランスフェクション、形質導入、または感染）させることによって、生産できる。適当な発現媒体には、プラスミド、ウイルス粒子、およびファージが含まれる。昆虫細胞では、バキュロウイルス発現ベクターが適当である。発現媒体の全体またはその一部は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。場合によっては、例えばラックスイッチ（LACSWITCH)（登録商標）誘導発現系（Stratagene; La Jolla、CA）のような誘導可能な発現ベクターを採用することが望ましい。
【００４９】
分子生物学の当業者は、組換え融合ポリペプチドを提供するためには、様々な発現系の任意のものが使用できることを理解すると思われる。使用する正確な宿主細胞およびベクターは、本発明には特に重要ではない。
【００５０】
蛋白質およびポリペプチドは、植物細胞中でも生産され得る。植物細胞には、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、およびタバコモザイクウイルス）およびプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）が適当である。そのような細胞およびベクターは、様々な供給源から入手できる（例えば、American Type Culture Collection、Manassa、VA；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、1994も参照されたい）。形質転換またはトランスフェクションの方法、および発現媒体の選択は、選択した宿主系に依存する。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えば、Ausubelら、上記に記述されている。発現媒体は、例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual、1985、Supp. 1987などに提供されているものから選択できる。発現媒体を含む宿主細胞は、通常の栄養培地に、選択した遺伝子の活性化または抑制、形質転換体の選抜、または選択した遺伝子の増幅に必要な改変を施して、培養できる。
【００５１】
適当または有用である場合には、融合ポリペプチドをコードする核酸は、例えば、細胞培養からポリペプチドの単離を容易にするために、融合ポリペプチドの分泌のためのシグナル配列を含み得る。挿入された核酸配列の効率的な翻訳のために、特異的な開始シグナルも、必要な場合がある。これらのシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。場合によっては、おそらくATG開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供する必要がある。さらに、開始コドンは、挿入断片全体が確実に翻訳されるように、所望のコード配列のリーディングフレームと一致している必要がある。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成を含む、種々の起源でよい。発現効率は、適当な転写または翻訳エンハンサー領域（例えば、Bittnerら、Methods in Enzymol. 153:516、1987に開示されるようなもの）を含めることによって増強できる。また、適当な発現系における最適なコドン使用頻度に合わせて遺伝子配列を改変するか、または所望の遺伝子の発現を促進するために特異的なtRNA分子を発現するように発現宿主を改変できる。
【００５２】
通常の生理的条件下で融合ポリペプチドが可溶性であると有用である。また、ストレス蛋白質（またはその免疫刺激性断片）およびHBV抗原が、無関係の第3の蛋白質またはポリペプチドに融合して（または会合して）少なくとも3つの部分からなる蛋白質または蛋白質混合物を生成する、融合蛋白質（または共有結合および非共有結合の複合体および混合物を含む、蛋白質の他の配置）の使用方法も、本発明の範囲内である。第3の蛋白質は、融合蛋白質または他の複合体の精製、検出、もしくは可溶化を促進するか、または他の機能を提供する可能性がある。例えば、発現ベクターpUR278（Rutherら、EMBO J. 2:1791、1983）は、lacZ融合蛋白質を生成するために使用できる。pGEXベクターは、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）を含む融合蛋白質として発現するために使用できる。一般に、そのような融合蛋白質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズに吸着し、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、溶解した細胞から容易に精製できる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がGST部分から切り離せるように、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【００５３】
融合蛋白質または共有結合複合体は、融合蛋白質または複合体の一部に特異的に結合する抗体を用いて精製できる。または、含まれる蛋白質の他の性質を精製に使用できる（例えば、金属結合）。例えば、Janknechtら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972、1981）に記述されるシステムは、ヒト細胞株中で発現された非変性融合蛋白質の容易な精製を可能にする。このシステムでは、関心のある遺伝子を、この遺伝子のオープンリーティングフレームが6つのヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳で融合するように、ワクシニア組換えプラスミドにサブクローニングする。組換えワクシニアウイルスで感染した細胞抽出物を、Ni2+ニトリロ酢酸-アガロースカラムにのせ、イミダゾール含有緩衝液でヒスチジンタグ付き蛋白質を選択的に溶出する。細菌培養物でも、同様な手順が使用できる。
【００５４】
または、第3の蛋白質は免疫グロブリンFcドメインであり得る。そのような融合蛋白質は、アフィニティカラム用いて容易に精製できる。
【００５５】
特に、短い抗原性断片を含む融合ポリペプチドは、化学合成でも生産できる（例えば、Solid Phse Peptide Synthesis、第2版、1984 The Pierce Chemical Co.、Rockford、ILに記述される方法）。
【００５６】
単離後、必要に応じて融合ポリペプチドは、ポリペプチドが本発明の方法の実施に十分な免疫応答を誘発（例えば、誘導または増強）する能力をさらなる処理が損なわないかぎり、さらに精製および/または濃縮できる。超遠心分離および/または沈殿（例えば、硫酸アンモニウムによる）、微量濾過（例えば、0.45μm酢酸セルロースフィルター）、限外濾過（例えば、サイジング膜および再循環濾過の使用）、ゲル濾過（例えば、セファロースCL-6B、CL-4B、CL-2B、6B、4B、または2B、セファクリルS-400またはS-300、スパロース6またはウルトラゲルA2、A4、またはA6で充填されたカラム；すべてPharmacia Corp.から市販されている）、タンパク分離用液体クロマトグラフィー(FPLC)、および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を含め、精製および濃縮のための様々な方法が当技術分野で知られている（例えば、Fisher、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology、WorkおよびBurdon編、Elsevier、1980を参照されたい）。
【００５７】
本発明の組成物中のポリペプチドは、複数のストレス蛋白質および/または複数のHBV蛋白質の抗原性または免疫刺激性抗原決定基、または蛋白質全体を含み得る。選択的に、ポリペプチドは、それに対する免疫応答が望まれる他の配列を含み得る。
【００５８】
本発明は本明細書に記述されるように少なくとも1つの融合ポリペプチドを含む免疫療法組成物、および選択的に、希釈剤、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、または重炭酸溶液（例えば、0.24 M NaHCO3）のような薬学的に許容される担体を含む。組成物に使用される担体は、投与方法および経路、および標準的な薬学的習慣に基づいて選択される。適当な薬学的担体および希釈剤、ならびにその使用の薬学的必要性は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに記述されている。アジュバント、例えば、コレラ毒素、大腸菌易熱性エンテロトキシン（LT）、リポソーム、または免疫刺激性複合体（ISCOM）も、免疫療法組成物に含められうる。
【００５９】
組成物は、溶液（筋肉内、皮膚内、または静脈内投与に適する）、懸濁液、座薬、錠剤、細粒、粉末、カプセル、軟膏、またはクリームとして調合できる。これらの組成物を調製する場合には、1つまたは複数の薬学的担体を含められうる。薬学的に許容される担体または他の添加剤の例には、溶媒（例えば、水または生理食塩水）、可溶化剤（例えば、エタノール、ポリソルベート、またはクレモフォア（Cremophor）EL（登録商標））、等張性を与える薬剤、保存剤、抗酸化剤、賦形剤（例えば、乳糖、でんぷん、結晶セルロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、リン酸水素カルシウム、軽無水珪酸、または炭酸カルシウム）、結合剤（例えば、でんぷん、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはアラビアゴム）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、または硬化油）、または安定剤（例えば、乳糖、マンニトール、マルトース、ポリソルベート、マクロゲル、またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油）が含まれる。必要に応じて、グリセリン、ジメチルアセトアミド、乳酸ナトリウム、界面活性剤、水酸化ナトリウム、エチレンジアミン、エタノールアミン、重炭酸ナトリウム、アルギニン、メグルミン、またはトリスアミノメタンを添加する。ポリ-D,L-ラクチド-コ-グリコリドまたはポリグリコリドのような生分解性ポリマーは、組成物の徐放が望ましい場合にはバルクマトリックスとして使用できる（例えば、米国特許第5,417,986号、米国特許第4,675,381号、および米国特許第4,450,150号を参照されたい）。上述のように、溶液、錠剤、細粒、またはカプセルのような薬学的調製物は、これらの成分を用いて調製できる。組成物が経口投与される場合には、風味や色が添加される場合がある。
【００６０】
免疫療法組成物は、任意の適当な経路、例えば、静脈内、動脈内、局所、注射（例えば、腹腔内、胸膜内、皮下、筋肉内）、経口、皮内、舌下、表皮内、鼻腔内（例えば、吸入）、肺内、または直腸内で投与できる。
【００６１】
投与される免疫療法組成物の量は、当業者によって決定できるように、例えば、特定のストレス蛋白質/抗原組成物、アジュバントが組成物と共に投与されるかどうか、共に投与されるアジュバントのタイプ、投与の様式および頻度、および望まれる効果（例えば、保護または治療）に依存する。一般に、免疫療法組成物は成人1用量あたり1μg〜100 mgの範囲の量が投与される。好ましくは融合蛋白質50〜10,000μg（例えば、約100〜5000μg、特に約500μg、1000μg、1500μg、または2000μg）が投与される。免疫療法薬と共にアジュバントが投与される場合には、成人1用量あたり1 ng〜100 mgの範囲の量が一般に使用できる。当業者が決定できるとおり、投与は必要に応じて繰り返す。例えば、初回抗原刺激量の後に、1週ごとまたは1ヶ月ごとに1回または複数回の追加免疫を行なうことができる。同一または異なる製剤を用いて、追加免疫は、初回免疫の3〜12週間後に行い、2回目の追加免疫は、最初の追加免疫の3〜12週間後に行なうことができる。融合蛋白質に含まれるHBV抗原に対する免疫療法薬によって誘発された免疫応答の試験のために、個体から血清、PBL、またはPBMCを採取できる。特定の抗原に対する抗体または細胞障害性T細胞またはサイトカイン分泌細胞のアッセイ法は、当技術分野で周知である。必要に応じてさらなる追加免疫が行なえる。組成物中の融合ポリペプチドの量を変化させることによって、最大の免疫応答を誘発するために免疫プロトコールを最適化できる。
【００６２】
もちろん、ポリペプチド（単独または融合蛋白質の一部として）はウイルスベクター（例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクター）のような核酸を投与することによっても送達できる。
【００６３】
本発明の免疫療法薬は、HBVに対する活性を持つ1つまたは複数の化合物または組成物（抗HBVウイルス剤）と組み合せて投与することもできる。例えば、まず患者を抗HBVウイルス剤で治療して、HBV感染の重症度を低下させることができる（例えば、循環するHBe抗原（HBV複製および高力価ウイルス血症のマーカー）の低下または消失、抗HBe抗体の出現、血清HBV DNAの低下もしくは消失、またはアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)レベルの低下によって測定される）。適切な低下ができたら、本発明の免疫療法薬を患者に投与できる。または、抗HBVウイルス剤および免疫療法薬を、実質的に同時に投与でき（抗ウイルス剤と免疫療法薬は異なる投与経路を持つ可能性があることを留意のこと）、または免疫療法薬を最初に投与した後で、抗ウイルス剤を投与することもできる。免疫療法薬とそのように組み合せて使用するために適当な抗ウイルス化合物または組成物には、インターフェロンα2b（イントロンA（IntronA）、Schering Plough）、ペグインターフェロンα2b、およびラミブジン[(-)-β-L-3’-チア-2’,3’-ジデオキシシチジンまたは3TC]（エピヴィル-HBV（Epivir-HBV）、Glaxo Wellcome）のようなヌクレオシドアナログおよびリバビリン（レベトロン（Rebetron)(商標）、ICN Pharmaceuticals）が含まれるがこれらに限定されない。適当であると考えられる実験的化合物がさらにいくつかあり、これらには、ヘムトリシタビン（2’,3’-ジデオキシ-5’-フルオロ-3’-チアシチジン、FTC、コビラシル、Triangle Pharmaceuticals）、クレブジン（2’-フルオロ-5-メチル-β-L-アラビノフラノシルウラシル、L-FMAU、Triangle）、アデフォビル（9-(2-ホスフォニルメチル)-アデニン、PMEA、Gilead Sciences）、エンテカビル（Bristol-Myers Squibb）、(-)-β-D-2,6-ジアミノプリンジオキソラン(DAPD)、β-L-2’,3’-ジデオキシ-5-フルオロシチジン（β-L-FddC）、β-L-2’,3’-ジデヒドロ-ジデオキシ-5-フルオロシチジン（β-L-Fd4C）、およびファミシクロビルが含まれる。
【００６４】
さらに詳述せずとも、当業者は上述の開示および以下の実施例に基づいて、本発明を完全に使用できると考えられる。以下の実施例は、当業者が融合ポリペプチドをどのように単離および使用できるかを例示するためのものと解釈すべきものであり、本開示の残りの部分を限定するものではない。本開示に引用される全ての出版物は、参照として本明細書に組み入れられる。
【００６５】
実施例
実施例1：HBVコア抗原-Hsp融合蛋白質の作製
融合蛋白質構築の一般的な方法および手順は、参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報94/29459号、国際公開公報98/23735号、国際公開公報99/07860号に記載されている。
【００６６】
HBVサブタイプadwをコードする遺伝子は、プラスミドpBR/HBV（ATCCから購入、ATCC45020）から得た。全長蛋白質のコード配列は、図1に示されており、全長蛋白質のアミノ酸配列は図2に示されている。
【００６７】
全長のウシ結核菌BCG Hsp65蛋白質をコードする遺伝子は、プラスミドpET65から得た（国際公開公報99/07860号を参照されたい）。
【００６８】
これらの開始材料および適当なプライマーを用いて、以下のコンストラクトが調製され、蛋白質生産のためにpET28a（Novagen）にクローニングされ。
【００６９】
1.1 hisHepCorT(149/87S97F)：切断されたHBVコア抗原（アミノ酸1〜149）をコードするDNA
本コンストラクトはヒスチジンタグを含むN末端の20アミノ酸配列も含む。本コンストラクトは、野生型蛋白質由来の2つのアミノ酸の変異を持ち：アミノ酸87はアスパラギンからセリンに、アミノ酸97はイソロイシンからフェニルアラニンに変化していた。これらの2つの変異は、既知のマウスのCTLエピトープを再現するように行われた。また切断蛋白質のC末端には外因性のアスパラギン残基が付加される。DNA配列は図3に示されており、コードされるアミノ酸配列は図4に示されている。
【００７０】
1.2 hisHepCor(97F)Hsp65：ウシ結核菌BCG Hsp65のN末端に融合した全長HBVコア蛋白質のアミノ酸を含む融合蛋白質をコードするDNA
本コンストラクトは、ヒスチジンタグを含むN末端の20アミノ酸配列も含み、イソロイシンからフェニルアラニンへのアミノ酸97の変更を持つ。HBVコア蛋白質とHsp65蛋白質の間には2つのさらなる残基が挿入されており：アスパラギンおよびバリンである。DNA配列は図5に示されており、コードされるアミノ酸配列は図6に示されている。
【００７１】
1.3 hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65：ウシ結核菌BCG Hsp65のN末端に融合したHBVコア蛋白質の1〜149アミノ酸を含む融合蛋白質をコードするDNA
本コンストラクトは、ヒスチジンタグを含むN末端の20アミノ酸配列も含み、HBVコア蛋白質とHsp65蛋白質の間には付加的なアスパラギン残基が挿入されている。DNA配列は図7に示されており、コードされるアミノ酸配列は図8に示されている。
【００７２】
1.4 HepCorT(151/97F)Hsp65：ウシ結核菌BCG Hsp65のN末端に融合したHBVコア蛋白質の1〜151アミノ酸（2つの配列の間にはアミノ酸の挿入はない）を含む融合蛋白質をコードするDNA
HBVコア配列は、野生型配列から以下のように改変され：イソロイシン97はフェニルアラニンに変化している。DNA配列は図9に示されており、コードされるアミノ酸配列は図10に示されている。
【００７３】
1.5 HepCor(97F)Hsp65：ウシ結核菌BCG Hsp65のN末端に融合した全長HBVコア蛋白質（2つの配列の間にはアミノ酸の挿入はない）を含む融合蛋白質をコードするDNA
すぐ上のコンストラクトと同様に、HBVコアのアミノ酸97はイソロイシンからフェニルアラニンに変化していた。DNA配列は図11に示されており、コードされるアミノ酸配列は図12に示されている。
【００７４】
1.6 HepCorT(151/97F)：切断されたHBVコア抗原（アミノ酸1〜151）をコードするDNA
このコンストラクトは、アミノ酸151で切断されていることに加えて、図2に示される野生型adw蛋白質から1つのアミノ酸変異を持ち：既知のマウスCTLエピトープを再生成するために、アミノ酸97はイソロイシンからフェニルアラニンに変化していた。
【００７５】
1.7 HepCor(97F)：全長HBVコア抗原をコードするDNA
このコンストラクトは、図2に示される野生型adw蛋白質から1つのアミノ酸変異を持つ：既知のマウスCTLエピトープを再現するために、アミノ酸97はイソロイシンからフェニルアラニンに変化している。
【００７６】
結核菌から得られるHsp70のような他のストレス蛋白質を用いてさらなるコンストラクトも作製できる。
【００７７】
場合によってはHBc分子は、既知のマウス特異的CTLエピトープを再現するために、HBc遺伝子産物に1つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって、改変されていた。置換の1つはアミノ酸位置87で導入され、アスパラギンがセリンに置換されていた。この置換は、H-2Kd (HBc.Kd)拘束性マウスCTLエピトープ（87SYVNTNMGL95）を作製した（Kuhroberら、Int. Immunol. 9:1203-1212、1997）。第2の置換は、アミノ酸位置97に導入され、イソロイシンがフェニルアラニンに置換された。この置換はH-2Kb (HBc.Kb)拘束性マウスCTLエピトープ（93MGLKFRQL100）を作製した（Kuhoberら、J. Immunol. 156:3687-3695、1996）。6つのヒスチジン残基（Hisタグ）を含む20のアミノ酸をコードするDNA断片は、精製を容易にするためにいくつかのコンストラクトのN末端に付加された。融合蛋白質は、これらの修飾なしで、容易に作製できる。
【００７８】
実施例2：蛋白質精製
以下の略号が使用される。BCGはウシ結核菌変種カルメット-ゲラン菌；CVはカラム容積；ETはエンドトキシン；EUはエンドトキシン単位；IBは封入体；MTは結核菌；およびPBSはリン酸緩衝生理食塩水である。
【００７９】
全てのコンストラクトは15 Lの発酵槽（Braun ED）で培養された。細菌細胞ペーストは蛋白質精製に使用するまで、-70℃で保管された。
【００８０】
2.1 hisHepCorT(149/87S97F)の精製
細胞溶解：
凍結した細胞ペースト約277 gを800 mLの溶解緩衝液（30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、2 mM EDTA、0.2 mM PMSF、pH 8.5）と混合した。その後、200μg/mLになるようにリゾチーム、および50μLのベンゾナーゼ（Benzonase)(商標）を添加した。細胞は-70℃で一晩凍結し、1時間融解し、50 mL遠心チューブに分注し、氷上に保管し、0.5インチのチップを取り付けたブランソンソニフィアII（BRANSON Sonifier II）を用いて9の設定で45秒間6回超音波処理した。
【００８１】
細胞の破片とIBは、4℃で17,000 RPM（Beckman、Avanti J-30、JA30.50ローター）で20分間遠心分離することにより、上清から分離した。1チューブあたり25 mLの洗浄緩衝液（30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、2% (v/v) トライトン（Triton）X-100、pH 8.5）を用いて沈殿を再懸濁した。4℃で22,000 RPMで20分間遠心分離した後、上清を破棄し、20 mLの8 M尿素、30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、0.2 mM PMSF、pH 8.5を添加し、4℃で一晩インキュベートした。溶解したIBを含む上清を、22,000 RPMで30分の遠心分離によって採取し、2つの部分に分けて-70℃で凍結した。
【００８２】
Niキレーティングクロマトグラフィー：
キレーティングセファロースファーストフロー（Amersham-Pharmacia）250 mLをXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）に充填した。樹脂は3 CVずつの50 mM EDTA、ミリQ（Milli-Q)(商標）品質の水、0.5 M NaOH、2 M NaCl、ミリQ(商標）品質の水、70% (v/v)エタノール、およびQミリQ(商標）品質の水で洗浄した。その後、樹脂に200 mM NiSO4を添加し、ミリQ(商標）品質の水で洗浄し、5 CVの開始緩衝液（6 M塩酸グアニジン、30 mM トリス、2 mM 2-メルカプトエタノール、20 mMイミダゾール、pH 8.5）で平衡化した。
【００８３】
試料の一部を5 mL/minでカラムに添加し、280 nmでモニターした吸光度がベースラインに下がるまで、10 mL/minで開始緩衝液で洗浄した。ETを除去するために、5 CVの6 M塩酸グアニジン、30 mM トリス、2 mM 2-メルカプトエタノール、20 mMイミダゾール、2% (v/v) トライトン X-100、pH 8.5でカラムを洗浄した。その後、カラムを6 M尿素、30 mM トリス、2 mM 2-メルカプトエタノール、20 mMイミダゾール、pH 8.5で洗浄した。その後、6 M尿素、30 mM トリス、2 mM 2-メルカプトエタノール、20 mMイミダゾール、pH 8.5中の0〜500 mMイミダゾールの5 CVの勾配で5 mL/minで蛋白質を溶出した。
【００８４】
クロマトグラフィーの段階は、試料の第2の部分について繰り返し、比較的純粋な蛋白質を含む画分をプールした。
【００８５】
ソース15Q陰イオン交換クロマトグラフィー：
60 mLのソース15Q樹脂（Amersham-Pharmacia）をXK26/40カラム（Amersham-Pharmacia）に充填した。樹脂は5 mL/minで2 CVのミリQ(商標）品質の水、3 CVの1 M NaOH、3 CVのミリQ(商標）品質の水、2 CV NaCl、2 CVのミリQ(商標）品質の水、2 CVの10% (v/v)酢酸と40% (v/v)イソプロパノールの混合液、2 CVのミリQ(商標）品質の水で洗浄し、その後、3 CVの開始緩衝液（6 M尿素、30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、pH 8.5）で平衡化した。
【００８６】
前段階でプールした試料を、0.5 mL/minでカラムに添加し、280 nmでモニターした吸光度がベースラインに下がるまで、開始緩衝液で6 mL/minで洗浄した。その後カラムを11 CVの開始緩衝液中の2% (v/v) トライトン X-100で洗浄した。蛋白質は11 CVの開始緩衝液中の0〜600 mM NaClで溶出した。
【００８７】
このクロマトグラフィーの段階を繰り返し、比較的純粋な蛋白質を含む画分をプールした。
【００８８】
ソース15S陽イオン交換クロマトグラフィー：
50 mLのソース15S樹脂（Amersham-Pharmacia）をXK26/40カラム（Amersham-Pharmacia）に充填した。樹脂は5 mL/minで2 CVの1 M NaOH、3 CVのミリQ(商標）品質の水、2 CVのNaCl、2 CVのミリQ(商標）品質の水、2 CVの10% (v/v)酢酸と40% (v/v)イソプロパノールの混合液、2 CVのミリQ(商標）品質の水で洗浄し、その後、3 CVの開始緩衝液（6 M尿素、23 mM 酢酸ナトリウム、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、pH 4.8）で平衡化した。
【００８９】
前段階でプールした試料を、3 mL/minでカラムに添加し、280 nmでモニターした吸光度がベースラインに下がるまで、開始緩衝液で3 mL/minで洗浄した。蛋白質は15 CVの開始緩衝液中の0〜1,000 mM NaClで6 mL/minで部分的に溶出し、残りは6 M塩酸グアニジン、30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、pH 8.5で溶出した。
【００９０】
透析および試料の調合：
その後、プールした試料を以下の溶液に対してこの順序で透析した：
1. 4 Lの6 M尿素、30 mM トリス HCl pH 8.5、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、0.8 Mアルギニンで4℃で一晩。
2. 4 Lの3M尿素、30 mM トリス HCl pH 8.5、2 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、25% (w/v)ショ糖で4℃で一晩。
3. 2 Lの30 mM トリス HCl pH 8.5、4.5 mM 還元グルタチオン、0.5 mM 酸化グルタチオン、0.8 M アルギニン、25% (w/v)ショ糖で4℃で一晩。
4. 2 Lの10 mM PBS pH 7.4、4.5 mM 還元グルタチオン、0.5 mM 酸化グルタチオン、25% (w/v)ショ糖で4℃で一晩。
5. 段階4の繰り返し。
【００９１】
各透析段階が平衡に達するまで行われたと考えると、最終的な成分の濃度は、PBS 10 mM、還元グルタチオン4.5 mM、酸化グルタチオン0.5 mM、アルギニン≦1.48 mM、尿素≦0.25 mM、ショ糖730 mMまたは25% (w/v)である。
【００９２】
2.2 hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65の精製
細胞溶解：
凍結した細胞ペースト79 gを1,000 mLの溶解緩衝液（30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、pH 7.5）と混合した。溶解物は-70℃で一晩凍結した。その後、融解し、200μg/mLになるようにリゾチームを添加し、細胞を1時間インキュベートした。いくつかのプロテイナーゼ阻害剤の混合物（アプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチンを各々40 mg/mLずつ）および15μLのベンゾナーゼ(商標）を添加した。溶解物は、250 mL ロゼットクーリングセル（Rosette Cooling Cell) (Fisher)中で、0.5インチのチップを取り付けたブランソンソニフィアIIを用いて7の設定で60秒間6回超音波処理した。
【００９３】
細胞の破片とIBは、4℃で23,000 RPM（Beckman、Avanti J-30、JA30.50ローター）で20分間遠心分離することにより、上清から分離した。塩酸グアニジンを6 Mの濃度になるように上清に添加し、1,400 mLとなった。試料は400 mL画分1本と500 mL画分2本に分割した。
【００９４】
Niキレーティングクロマトグラフィー：
キレーティングセファロースファーストフロー（Amersham-Pharmacia）187 mLをXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）に充填した。あらかじめ製造元の指示にしたがって再生しておいた樹脂は、5 CVの開始緩衝液（6 M塩酸グアニジン、50 mMイミダゾール、30 mM トリス、1 mM 2-メルカプトエタノール、pH 7.5）で平衡化した。
【００９５】
400 mLの試料を10 mL/minでカラムに添加し、280 nmでモニターした吸光度がベースラインに下がるまで、開始緩衝液で洗浄した。ETを除去するために、5 CVの6 M塩酸グアニジン、30 mM トリス、1 mM 2-メルカプトエタノール、2% (v/v) トライトン X-100、pH 7.5でカラムを洗浄した。その後、カラムを8 M尿素、30 mM トリス、pH 8.5で洗浄した。その後、8 M尿素、30 mM トリス、1 mM 2-メルカプトエタノール、pH 7.5中の0〜500 mMイミダゾールの勾配で蛋白質を溶出した。
【００９６】
クロマトグラフィーの段階は、前段階で得られた2つの500 mL画分を用いて繰り返し、これらの3回で得られた画分をプールした。
【００９７】
ソース30Q陰イオン交換クロマトグラフィー：
167 mLのソース15Q樹脂（Amersham-Pharmacia）をXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）に充填した。樹脂は5 CVの2 M NaCl、1 M NaOH、ミリQ(商標）品質の水、40% (v/v)イソプロパノール、10% (v/v)酢酸、ミリQ(商標）品質の水で再生した。その後、3 CVの開始緩衝液（6 M尿素、30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、pH 7.5）でカラムを平衡化した。
【００９８】
前段階でプールした試料を、10 mL/minでカラムに添加し、214 nm、254 nm、および280 nmでモニターした吸光度がベースラインに下がるまで、開始緩衝液で洗浄した。蛋白質は開始緩衝液中の0〜500 mM NaCl勾配で、6 mL/minで溶出した。所望の蛋白質を含む画分をプールした。
【００９９】
セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；
53 mLのセラミックヒドロキシアパタイトを、3 CV 1 M NaOH および0.5 Mリン酸ナトリウム、pH 6.8で再生したXK26/40カラム（Amersham-Pharmacia）に充填した。その後カラムを6 M尿素、20 mMリン酸ナトリウム、pH 6.8で平衡化した。
【０１００】
前段階でプールした試料を、5 mL/minでカラムに添加し、214 nm、254 nm、および280 nmでモニターした吸光度がベースラインで安定するまで、6 M尿素、20 mMリン酸ナトリウム、pH 6.8で洗浄した。不純物はカラムに結合し、hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65は素通り画分に存在した。
【０１０１】
透析および試料の調合：
前クロマトグラフィーの素通り画分をプールし（250 mL）、以下の溶液に対してこの順序で透析した：
1. 4 Lの3 M塩酸グアニジン、10 mMリン酸ナトリウム、0.8 Mアルギニン、4.5 mM還元グルタチオン、0.5 mM酸化グルタチオン、25% (w/v)ショ糖で4℃で一晩。
2. 4 Lの10 mMリン酸ナトリウム、4.5 mM 還元グルタチオン、0.5 mM 酸化グルタチオン、25% (w/v)ショ糖で4℃で一晩。
3. 段階2の繰り返し。
【０１０２】
各透析段階が平衡に達するまで行われたと考えると、最終的な成分の濃度は、リン酸ナトリウム10 mM、尿素1.85 mM、還元グルタチオン4.5 mM、酸化グルタチオン0.5 mM、ショ糖730 mMまたは25% (w/v)である。
【０１０３】
ゲル濾過クロマトグラフィー：
製造元によって充填済のハイロード26/60スーパーデックス200（HiLoad 26/60 Superdex 200)(Amersham-Pharmacia）ゲル濾過カラムを1 M NaOHで再生し、10 mMリン酸ナトリウム、4.5 mM 還元グルタチオン、0.5 mM 酸化グルタチオン、25% (w/v)ショ糖、pH 7.4で平衡化した。
【０１０４】
透析済試料を3つの部分（30 mL、20 mL、20 mL）に分け、1.5 mL/minまたは2 mL/minで平衡緩衝液中で個別にカラムに流し、蛋白質を含む画分をプールした。
【０１０５】
2.3 HepCorT(151/97F)Hsp65の精製
細胞溶解：
凍結した細胞ペースト500 gを2500 mLの溶解緩衝液（30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、2 mM EDTA、0.1 mM PMSF、10 mg/mlアプロチニン、10 mg/mLロイペプチン、5 mM p-アミノ-ベンザミジン、0.2 mg/mLリゾチーム、pH 7.5）と混合し、-70℃で最低2時間凍結した。
【０１０６】
凍結した細胞懸濁液を37℃で融解し、氷上に保管し、1分間4回超音波処理した（Branson Sonifier 450、3/4”チップ）。溶解物を15,000gで遠心分離し、可溶性画分を64,000gで清澄化し、可溶性の試料を保管した。可溶性画分に6 M尿素を添加した後、3つの等しいサイズの部分に分割した。
【０１０７】
ソース30Qクロマトグラフィー：
190 mLのソース30Q樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、3 CVの開始緩衝液（6 M尿素、30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、pH 7.5）で平衡化した。
【０１０８】
試料の1つの部分をカラムに添加した。樹脂は、280nm、254 nm、および214 nmの吸光度がベースラインに下がるまで、開始緩衝液で洗浄し、蛋白質は5 CVの開始緩衝液中の0〜500 mM NaCl直線勾配で溶出した。HepCor65T(151/97F)を含む画分をプールした。
【０１０９】
クロマトグラフィー段階は、試料の他の2つの部分についても繰り返した。3つの部分の全てのプールを合わせて、6M尿素、25 mM酢酸ナトリウム、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、pH 5.5に対して透析した。その後試料を2つの部分に分割した。
【０１１０】
ソース15QクロマトグラフィーpH 5.5：
50 mLのソース15S樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK26/40カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、開始緩衝液S1（6 M尿素、25 mM酢酸ナトリウム、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、pH 5.5）で平衡化した。
【０１１１】
ソース30Q試料の1つの部分をカラムに添加し、a) 280 nmのベースラインが安定するまで開始緩衝液S1、b) 10 CVの開始緩衝液S1中 2%(v/v) トライトン X-100、およびc) 280 nmベースラインが安定化するまで開始緩衝液S1で洗浄した。最後に、蛋白質を18 CVの0〜230 mM NaClの直線勾配で溶出した。残りの蛋白質は1M NaCl洗浄段階で、カラムから除去した。
【０１１２】
このクロマトグラフィー段階は、ソース30Qの第2の部分を用いて繰り返した。HepCor65T(151/97F)を含む画分をプールし、濃酢酸でpH 4.8に調節し、2つの部分に分割した。
【０１１３】
ソース15SクロマトグラフィーpH 4.8：
ソース15Sカラムを再生し、開始緩衝液S2（6 M尿素、25 mM酢酸ナトリウム、10 mM 2-メルカプトエタノール、1 mM EDTA、pH 4.8）で平衡化した。
【０１１４】
ソース15S試料の1つの部分をカラムに添加し、a) 280 nmのベースラインが安定するまで開始緩衝液S2、b) 10 CVの開始緩衝液S2中 2%(v/v) トライトン X-100、およびc) 280 nmベースラインが安定化するまで開始緩衝液S2で洗浄した。
【０１１５】
蛋白質は10 CVの開始緩衝液S2中の0〜500 mM NaClの直線勾配で溶出した。残りの蛋白質は2 CVの1M NaCl洗浄段階、および最終的な3 CV 6M塩酸グアニジンストリップで、カラムから除去した。HepCorT(151/97F)Hsp65を含む画分をプールした。
【０１１６】
ソース15SクロマトグラフィーpH 4.8−エンドトキシン除去：
前段階で得られたプールした画分を開始緩衝液S2で透析した後、ソース15Sカラムに再度添加した。
【０１１７】
ソース15Sカラムを再生し、開始緩衝液S2で平衡化した。ソース15S試料の半分をカラムに添加し、280 nmのベースラインが安定化するまで開始緩衝液S2で、その後10 CVの開始緩衝液S2中2%(v/v) トライトン X-100で、再度280 nmのベースラインが安定化するまで開始緩衝液S2で洗浄した。
【０１１８】
該蛋白質を4 CVの1 M NaCl洗浄段階、および最終的な3 CV 6M塩酸グアニジンストリップで、カラムから溶出した。HepCor65T(151/97F)を含む画分をプールし、3段階でDPBS、10%(w/v)ショ糖に透析した。
【０１１９】
2.4 HepCor(97F)Hsp65の精製
細胞溶解：
凍結した細胞ペースト200 gを600 mLの溶解緩衝液（30 mM トリス、20 mM 2-メルカプトエタノール、5 mM EDTA、0.1 mM PMSF、0.2 mg/mLリゾチーム、pH 7.5）と混合し、4℃で約30分間撹拌した。
【０１２０】
細胞懸濁液を1分間4回超音波処理した（Branson Sonifier 450、3/4”チップ、設定9）。溶解物を18,500gで遠心分離し、可溶性画分を保管した。蛋白質溶液は、108,850gで4℃で20分間遠心分離して清澄化した。
【０１２１】
硫酸アンモニウム沈殿：
清澄化した蛋白質溶液に、硫酸アンモニウム溶液を25％飽和になるまで添加し、10,000gで蛋白質を沈殿させた。沈殿は、溶解緩衝液に再懸濁した。
【０１２２】
酢酸沈殿：
蛋白質溶液は1 M酢酸を用いて注意深くpH 4.5に調整し、その後4℃で20分間撹拌した。その後、蛋白質を4℃で10,000gで10分間沈殿させた。蛋白質沈殿は、Q緩衝液A（6M尿素、30 mM トリス、10 mM 2-メルカプトエタノール、5 mM EDTA、0.1 mM PMSF、pH 8.5）に再懸濁した。
【０１２３】
Qセファロース高速クロマトグラフィー：
150 mL Qセファロース高速樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、3〜5 CVのQ緩衝液Aで平衡化した。試料をカラムに添加し、素通り画分を採取した。2-メルカプトエタノールを150 mMになるように加え、蛋白質のプールを4℃で1時間インキュベートした。
【０１２４】
第2のQセファロース高速クロマトグラフィー：
Qセファロース高速樹脂カラムを再生し、Q緩衝液Aで平衡化した。
【０１２５】
第1のQセファロース高速カラムの素通り画分をカラムに添加し、再度素通り画分を採取した。2-メルカプトエタノールを300 mMになるように加えた。塩酸グアニジンを6Mになるように加えた。蛋白質試料を室温で72時間インキュベートし、0.22μMフィルターで濾過した。
【０１２６】
スーパーデックス200ゲル濾過クロマトグラフィー：
1800 mLスーパーデックス200樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/90カラム（Amersham-Pharmacia）を、2 CVのGF緩衝液（6M尿素、30 mM トリス、20 mM 2-メルカプトエタノール、2 mM EDTA、pH 7.5）で平衡化した。
【０１２７】
試料は70 mLずつ10個の部分に分割した。個々の部分をこのカラムで処理し、HepCor(97F)Hsp65を含む画分をプールした。
【０１２８】
セファデックス25脱塩ゲル濾過クロマトグラフィー：
300 mLセファデックス25樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、GF25緩衝液（6M尿素、50mM酢酸、5 mM NaOH、1 mM EDTA、10 mM 2-メルカプトエタノール、pH 4.7）で平衡化した。
【０１２９】
試料を75 mLずつの部分に分けて順次処理した。画分を含む部分をプールした。
【０１３０】
SPセファロース高速クロマトグラフィー：
275 mL SPセファロース高速樹脂（Amersham-Pharmacia）を再生し、SP緩衝液A（6M尿素、50mM酢酸、5 mM NaOH、1 mM EDTA、10 mM 2-メルカプトエタノール、pH 4.7）で平衡化した。
【０１３１】
前段階で得られたプールした試料を樹脂と混合し、室温で水平の振とう器上で30分間インキュベートした。その後、スラリーをXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）に充填し、2 CVのSP緩衝液Aで洗浄した。その後カラムを15 CVのSP緩衝液A中の2%(v/v) トライトン X-100で洗浄した。界面活性剤は5 CV SP緩衝液Aおよび2 CVのSP緩衝液A中1M NaClで洗って除去した。その後、蛋白質は6M尿素、10 mM トリス、pH 7.5中でアイソクラティック溶出を行った。
【０１３２】
銅キレーティングセファロースファーストフロークロマトグラフィー：
180 mLのキレーティングセファロースファーストフロー樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、硫酸銅を添加し、2 CVのCu緩衝液A（6M塩酸グアニジン、30 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0）で平衡化した。
【０１３３】
試料をカラムに添加し、3 CVのCu緩衝液Aで洗浄し、その後、5 CVのCu緩衝液A中2%(v/v) トライトン X-100、最後に3 CVのCu緩衝液Aで洗って、界面活性剤を除去した。蛋白質はCu緩衝液A中の300 mMイミダゾールで溶出した。蛋白質はその後DPBSに対して5段階で透析した。
【０１３４】
2.5 HepCorT(151/97F)の精製
細胞溶解：
凍結した細胞ペースト425 gを2.5 Lの氷冷10 mM EDTA、100 mM NaCl、1 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0と混合した。細胞懸濁液を撹拌後、細胞は10,500gで10分間遠心分離して沈殿させた。細胞は、50 mM NaCl、10mM EDTA、1 mM 2-メルカプトエタノール、0.2 mg/mLリゾチーム、pH 8.0に再懸濁し、混合して氷上で1時間インキュベートした。
【０１３５】
細胞懸濁液を2分間2回超音波処理した（Branson Sonifier 450、3/4”チップ、設定8）。溶解物を18,500gで遠心分離し、可溶性画分を保管した。
【０１３６】
硫酸アンモニウム沈殿：
可溶性画分に、硫酸アンモニウムを25％飽和になるまで添加し、10,000gで不純物を40分間沈殿させた。上清にさらに硫酸アンモニウムを35%飽和になるまで添加した。30分間撹拌後、蛋白質を10,000gで30分間遠心分離して沈殿させる。沈殿は、1mM EDTA、1 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0に再懸濁し、76,500gで20分間清澄化させた。
【０１３７】
第2の硫酸アンモニウム沈殿：
1回目の沈殿の試料を、1 mM EDTA、1 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0に溶解し、上述と同じ手順で再度処理した。
【０１３８】
フェニルセファロースファーストフロークロマトグラフィー：
200 mLのフェニルセファロースファーストフロー樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、0.85M硫酸アンモニウム、20 mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA、1mM 2-メルカプトエタノール、pH 6.8で平衡化した。
【０１３９】
試料に、10 mMリン酸ナトリウムになるまで1Mリン酸ナトリウム、1 mM EDTA、1 mM BME、pH 6.8を添加し、硫酸アンモニウムを20%飽和になるまで添加した。試料の半分をカラムに添加し、280 nmの吸光度がベースラインになるまで平衡緩衝液で洗浄した。蛋白質は20 mMリン酸ナトリウム、1 mM EDTA、1mM 2-メルカプトエタノール、pH 6.8までの負の直線勾配300 mLを用いて溶出した。HepCorT(151/97F)を含む画分をプールした。
【０１４０】
第2のフェニルセファロースファーストフロークロマトグラフィー：
カラムを再生し、0.85M硫酸アンモニウム、20 mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA、1mM 2-メルカプトエタノール、pH 6.8で平衡化した。
【０１４１】
最初のフェニルセファロースFFカラムからの試料プールを、平衡緩衝液で2.5 mg/mL蛋白質に希釈した。次に希釈した試料をカラムに添加し、280 nmの吸光度がベースラインで安定するまで平衡緩衝液で洗浄し、20 mMリン酸ナトリウム、1 mM EDTA、1mM 2-メルカプトエタノール、pH 6.8までの直線勾配300 mLを用いて溶出した。
【０１４２】
HepCorT(151/97F)を含む画分をプールし、硫酸アンモニウムを35％飽和まで添加し、その後12,000gで50分間遠心分離して蛋白質を沈殿させた。沈殿を700 mLの8M尿素、10 mM酢酸ナトリウム、30 mM酢酸、25 mM NaCl、0.5 mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール,pH 8.0に再溶解した。
【０１４３】
SPセファロースファーストフロークロマトグラフィー：
SPセファロースファーストフロー樹脂（Amersham-Pharmacia）180mLを含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、その後5 CVの8M尿素、10mM酢酸ナトリウム、30mM酢酸、25mM NaCl、0.5 mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0で平衡化した。
【０１４４】
試料の半分をカラムに添加し、280 nmの吸光度がベースラインになるまで平衡緩衝液で洗浄した。蛋白質は平衡緩衝液から10 mM酢酸ナトリウム、30mM酢酸、1M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、0.5 mM EDTAまでの600 mL直線勾配を用いて溶出した。最後に、カラムを6Mの塩酸グアニジン、50mM Tris、pH 8.5でストリップした。
【０１４５】
試料のもう半分を用いてこの手順を繰り返し、HepCorTを含む画分をプールし、6M尿素、20mM トリス、pH 8.5、0.5 mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.5、最後に6M尿素、20mM トリス、5mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.5,に対して透析した。
【０１４６】
ソース30Qクロマトグラフィー：
150 mLのソース30Q樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、4 CVの平衡緩衝液（6 M尿素、20mM トリス、5 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.5）で平衡化した。
【０１４７】
試料の3分の1をカラムに添加し、95％平衡緩衝液および5％溶出緩衝液（6 M尿素、1mM NaCl、20mM トリス、5 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.5）で洗浄し、100％溶出緩衝液までの1L直線勾配で蛋白質を溶出した。
【０１４８】
試料の第2および第3の部分も、同様に処理した。HepCorTを含む画分をプールし、6 M尿素、20mM酢酸ナトリウム、20mM酢酸、0.5mM EDTA、1mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0に対して透析した。
【０１４９】
SPセファロース高速クロマトグラフィー：
180 mL SPセファロース高速樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、5 CVの6 M尿素、20mM酢酸ナトリウム、20mM酢酸、0.5mM EDTA、1mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0で平衡化した。
【０１５０】
試料の半分をカラムに添加し、280 nmの吸光度がベースラインになるまで平衡緩衝液で洗浄した。
【０１５１】
不純物は2つの直線勾配で溶出した。すなわち、平衡緩衝液中の0〜1M NaCl、その後、溶出緩衝液2（6 M尿素、40mM酢酸ナトリウム、10mM酢酸、0.5mM EDTA、1mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0）ヘの直線勾配である。カラムを溶出緩衝液2中の2%(v/v)トライトン X-100、その後10 CVの溶出緩衝液で洗浄し、界面緩衝剤を除去した。蛋白質は6 M尿素、50mM トリス、0.5mM EDTA、5mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0への勾配で溶出した。
【０１５２】
試料の残りの半分を用いてこの手順を繰り返した後、HepCorT(141/9F)を含む画分を合わせて、蛋白質を2段階で5mMリン酸ナトリウム、50mM NaCl、3.1 mM尿素、20%(w/v)ショ糖、pH 8.5に対して透析した。
【０１５３】
2.6 HepCor(97F)の精製
細胞溶解：
凍結した細胞ペースト100 gを400m Lの氷冷5 mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0と混合した。細胞懸濁液を撹拌後、リゾチームを0.2 mg/mLになるように添加し、懸濁液を混合し、氷上で1時間インキュベートした。
【０１５４】
細胞懸濁液を2分間2回超音波処理し（Branson Sonifier 450、3/4”チップ、設定8）、200mLの氷冷20 mM酢酸ナトリウム、5mM酢酸、3M硫酸アンモニウムを添加し、十分混合した。懸濁液を3分間、超音波処理（Branson Sonifier 450、3/4”チップ、設定8）した。最後に、溶解物を18,500gで遠心分離し、可溶性試料を回収した。
【０１５５】
硫酸アンモニウム沈殿：
可溶性画分を1Lの0.85M硫酸アンモニウムで希釈した。固体の硫酸アンモニウム70g/Lを撹拌しながらゆっくりと添加した。さらに30分混合した後、懸濁液を18,500gで60分間遠心分離した。その後、沈殿を500mLの1mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノールに再懸濁した。113.4g/Lの硫酸アンモニウムを撹拌しながらゆっくりと添加し；溶液をさらに30分混合した。蛋白質は76,500gで20分間沈殿させた。
【０１５６】
沈殿は1Mリン酸ナトリウム、1mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール、20%飽和硫酸アンモニウムを添加して最終濃度5mMリン酸ナトリウムとなるように再溶解した。
【０１５７】
フェニルセファロースファーストフロークロマトグラフィー：
200 mLのフェニルセファロースファーストフロー樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、0.85M硫酸アンモニウム、5 mMリン酸ナトリウム、1mM EDTA、5mM 2-メルカプトエタノール、pH 6.8で平衡化した。
【０１５８】
試料をカラムに添加し、280 nmの吸光度がベースラインになるまで平衡緩衝液で洗浄した。蛋白質は6M尿素までの段階的勾配を用いて溶出した。HepCorTを含む画分をプールし、硫酸アンモニウムを32%飽和になるまで添加して蛋白質を沈殿させた。12,100gで50分間遠心分離して蛋白質を沈殿させた後、500mLの8M尿素、5mM トリス、5mM 2-メルカプトエタノール、pH 7.5に再溶解した。
【０１５９】
ソース30Qクロマトグラフィー：
150 mLのソース30Q樹脂（Amersham-Pharmacia）を含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、4CVの平衡緩衝液（6 M尿素、5 mM トリス、5 mM 2-メルカプトエタノール、pH 7.5）で平衡化した。
【０１６０】
試料をカラムに添加し、平衡緩衝液で洗浄した。蛋白質は平衡緩衝液から6M尿素、1M NaCl、5mM トリス、5mM 2-メルカプトエタノール、pH 7.5までの直線勾配用いて溶出した。HepCor(97F)を含む画分をプールし、3つの部分に分けた。
【０１６１】
SPセファロース高速クロマトグラフィー：
SPセファロース高速樹脂（Amersham-Pharmacia）190mLを含むXK50/30カラム（Amersham-Pharmacia）を再生し、5 CVの6M尿素、30mM酢酸ナトリウム、10mM酢酸、1 mM EDTA、5 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0で平衡化した。
【０１６２】
試料の1つの部分をカラムに添加し、20 CVの6M尿素、40mM酢酸ナトリウム、10mM酢酸、0.5 mM EDTA、1 mM 2-メルカプトエタノール、2％(v/v) トライトン X-100、pH 8.0で洗浄した。その後、トライトン X-100を除去するために、カラムを10 CVの6M尿素、40mM酢酸ナトリウム、10mM酢酸、0.5 mM EDTA、1 mM 2-メルカプトエタノール、pH 8.0で洗浄した。
【０１６３】
蛋白質は6M尿素、20mM トリス、1M NaCl、1 mM 2-メルカプトエタノール、0.5 mM EDTA、pH 8.5への600 mLの直線勾配を用いて溶出した。
【０１６４】
試料の他の2つの部分についてのこの手順を繰り返し、HepCor(97F)を含む画分をプールした。その後、蛋白質は5段階で40mM酢酸ナトリウム、0.05mM DTT、pH 6.5に対して透析した。
【０１６５】
実施例3：CTL活性のマウスの初回抗原刺激
マウス：
C57BL/6 (H-2b)マウスは、Charles River Laboratories (St. Constant、PQ)から購入した。
【０１６６】
細胞株：
EL4胸腺腫細胞株(H-2b)は、ATCCから入手し、10% FBSおよび2 mM L-グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM-10）で培養した。HBc抗原を発現するEL4.HBc.1D7細胞は、EL4細胞に全長HBc遺伝子およびネオマイシン耐性マーカーをコードするプラスミドをトランスフェクトすることによって、ストレスゲン（Stressgen）で得られた。全長HBc抗原の遺伝子は、HBVのadwサブタイプからクローニングされ、既知のマウスH-2Kb拘束性CTLエピトープ配列およびH-2Kd拘束性CTLエピトープ配列をコードするように改変された（野生型蛋白質adwから2つのアミノ酸が変更され：アミノ酸87はアスパラギンからセリンに、アミノ酸97はイソロイシンからフェニルアラニンに変更された。これらの2つの変異は、既知のマウスCTLエピトープを再現するように作製された）。トランスフェクトされた細胞は、1500μg/mL G418を含むDMEM-10中で選択され、限界希釈によってクローニングしてEL4.HBc.1D7クローンが得られた。この細胞株におけるHBc蛋白質の発現は、HBc特異的抗体を用いてウェスタン免疫ブロット解析で検証された。H-2Kb-拘束性CTLエピトープのMHCクラスIの提示は、このエピトープに特異的なCTL株を用いた溶解によって確認された。FACS解析によって、親細胞株と同様な、高レベルのMHCクラスI発現が形質転換細胞でも見られた。
【０１６７】
CTL活性のためのマウスの初回抗原刺激：
マウスを、緩衝液または2.9 nmolの以下のうちの1つで免疫した（首筋または肩甲骨間領域のいずれかに、皮下注射）：HepCorT(151/97F)Hsp65、HepCor(97F)Hsp65、hisHepCorT(149/87S97F)Hsp65、HepCorT(151/97F)、またはHepCor(97F)。免疫の7日後に、マウスをCO2吸入または頚部脱臼によって安楽死させ、脾臓を取り出した。脾臓細胞の単一細胞懸濁液をCTL培地（RPMI-1640、10% FBS、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、50μM 2-MEおよび45μg/mLゲンタマイシン）で調製した。30 x 106の生存力のあるリンパ球細胞を、1μM HBc CTLエピトープペプチドHBc.93-100.Kb、MGLKFRQLの存在下で、37℃/5% CO2でインキュベートすることにより、再刺激した（Kuhoberら、J. Immunol. 156:3687-95、1996）。再刺激に使用したこの合成ペプチド（Research Genetics、Huntsville、ALによって合成された）は、H-2Kb拘束性のマウスCTLエピトープを含む。
【０１６８】
エフェクター細胞は7日後に採集し、U底の96ウェルマイクロプレート中で、51Cr標識標的細胞と培養した。対照EL4標的は、無関係のH-2Kb拘束性（MUT-1.52-59.Kb）ペプチドで予めパルスした細胞だった（図13を参照されたい）。標的細胞は、HBc.93-100.Kbペプチド（図14を参照されたい）またはEL4.HBc.1D7細胞で予めパルスされたEL4細胞だった（図15を参照されたい）。CTL (100μl)は様々なエフェクター：標的細胞比（100:1、33:1または11:1）で5 x 103個または1 x 104個の標的細胞（100μl）と培養した。標識の自然放出を決定するために、同数の標的細胞を、合計200μlのCTL培地中でエフェクター細胞なしで培養した。標識の放出合計は、同数の標的細胞に100μlのトライトン X-100 (2% v/v水溶液)を添加して、決定した。4時間のインキュベーション後に、マイクロプレートを200 x gで5分間遠心分離し、培養上清100μlを採集した。放出された放射活性は、シンチレーション計数で決定した。補正溶解％は、%補正溶解(CL) = 100 x (CPM試験 − CPM自然) / (CPM合計 − CPM自然)の公式にしたがって、計算した。
【０１６９】
サイトカイン解析：
再刺激したCTLからのγインターフェロン(IFN-γ)および腫瘍壊死因子α(TNF-α)の放出を定量するために、エフェクター細胞をU底の96ウェルマイクロプレートに播き、1μM HBc.93-100.Kbペプチドおよび標的細胞とともに、エフェクター：標的比＝100:1、33:1または11:1で培養した。上清は4時間または24時間のインキュベーション後に採集し、IFN-γ（図16）またはTNF-α（図17）レベルをサンドイッチELISAで解析した。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】HBV（サブタイプadw）コア抗原（HBc）をコードするDNA配列である（配列番号：1）。
【図２】HBV（サブタイプadw）コア抗原（HBc）のアミノ酸配列である（配列番号：2）。
【図３】ヒスチジンタグ付きの切断型HBVコア抗原をコードするコンストラクトhisHepCorT(149/87S97F)のDNA配列である（アミノ酸1〜149；配列番号：3）。
【図４】図3のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列である（配列番号：4）。
【図５】全長のHBVコア抗原およびHsp65蛋白質を含むヒスチジンタグ付き融合蛋白質をコードするコンストラクトhisHepCor(97F)Hsp65のDNA配列である（配列番号：5）。
【図６】図5のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列である（配列番号：6）。
【図７】Hsp65蛋白質に融合した切断型（アミノ酸1〜149）HBVコア抗原を含むヒスチジンタグ付き融合蛋白質をコードするコンストラクトhisHepCorT(149/87S97F)Hsp65のDNA配列である（配列番号：7）。
【図８】図7のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列である（配列番号：8）。
【図９】Hsp65蛋白質に融合した切断型（アミノ酸1〜151）HBVコア抗原を含む融合蛋白質をコードするコンストラクトHepCorT(151/97F)Hsp65のDNA配列である（配列番号：9）。
【図１０】図9のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列である（配列番号：10）。
【図１１】Hsp65蛋白質に融合した全長HBVコア抗原を含む融合蛋白質をコードするコンストラクトHepCor(97F)Hsp65のDNA配列である（配列番号：11）。
【図１２】図11のDNA配列によってコードされるアミノ酸配列である（配列番号：12）。
【図１３】種々の免疫原（HepCorT(151/97F)Hsp65; HepCor(97F)Hsp65； HepCorT(151/97F); HepCor(97F);およびhisHepCorT(149/87S97F)Hsp65）で免疫されたC57BL/6マウスにおけるCTL初回刺激活性（％補正溶解対エフェクター：標的比）を表すグラフである。得られたCTL溶解活性は、対照ペプチドMUT-1.52-59.Kbで予めパルスしたEL4細胞に対して測定した。対照マウスには偽薬（緩衝液）を注射した。
【図１４】種々の免疫原（図13と同様）で免疫されたC57BL/6マウスにおけるCTL初回刺激活性（％補正溶解対エフェクター：標的比）を表すグラフである。得られたCTL溶解活性は、HBc抗原特異的ペプチドHBc.93-100.Kbで予めパルスしたEL4細胞に対して測定した。対照マウスには偽薬（緩衝液）を注射した。
【図１５】種々の免疫原（図13と同様）で免疫されたC57BL/6マウスにおけるCTL初回刺激活性（％補正溶解対エフェクター：標的比）を表すグラフである。得られたCTL溶解活性は、B型肝炎ウイルスコア抗原を発現するEL4.HBc.1D7細胞に対して測定した。対照マウスには偽薬（緩衝液）を注射した。
【図１６】種々の免疫原（図13と同様）で免疫されたC57BL/6マウスにおけるCTL初回刺激活性（IFN-γ(pg/ml)対エフェクター：標的比）を表すグラフである。得られたCTLがγインターフェロン（IFN-γ）を分泌する活性は、HBc抗原特異的ペプチドHBc.93-100.Kbと共培養したEL4細胞に対して測定した。対照マウスには偽薬（緩衝液）を注射した。
【図１７】種々の免疫原（図13と同様）で免疫されたC57BL/6マウスにおけるCTL初回刺激活性（TNF-α(OD410)）を表すグラフである。得られたCTLが腫瘍壊死因子α（TNF-α）を分泌する活性は、HBc抗原特異的ペプチドHBc.93-100.KbとコカルチャーしたEL4細胞に対して測定した。対照マウスには偽薬（緩衝液）を注射した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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2005505238.tif 000079
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505238.tif 000080
【国際調査報告】
2005505238.tif 000081
2005505238.tif 000082
2005505238.tif 000083