(57)【要約】核酸の解析に使用するための新たな方法をここに開示する。開示される使用は、ポリヌクレオチド発現解析、一塩基多型の検出、病原体の検出、および遺伝子組み換え細胞もしくは生物の検出を含む。該方法は、核酸の精製された調製物もしくは未精製の細胞溶解物を用いて実施されうる。開示された方法を行うための検査方法およびキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
集団中の遺伝子組み換え細胞もしくは生物を検出する方法であって、以下の工程：
前記集団の少なくとも１つのサンプルからポリヌクレオチドを得る工程；
目的の遺伝子組み換え細胞もしくは生物に含まれる少なくとも１つのトランスジーンについて特異的センサープローブのペアを提供する工程であって、前記ペアの各プローブが3'末端および5'末端を有し、前記ペアの第１プローブが前記トランスジーンに相補的な3'部分とプライマー結合部位を含む5'末端を有し、前記ペアの第２プローブが前記トランスジーンに相補的な5'部分とプライマー結合部位を含む3'部分を含み、ここに、前記第１および第２プローブの前記の相補的部分が前記トランスジーン上の隣接領域に相補的である工程；
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記ポリヌクレオチドを前記の特異的なセンサープローブと結合させる工程；
前記センサープローブを、少なくとも１つの前記のトランスジーンとハイブリダイズさせる工程；
ハイブリダイズしたセンサープローブペアのメンバーを連結させ、連結部位を含む連結センサープローブを形成させる工程；
前記連結センサープローブを増幅し、増幅連結センサープローブを提供する工程であって、前記増幅連結センサープローブが検出可能な標識を含む工程；
それぞれの異なる連結センサープローブについて、少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチド(detector oligonucleotide)を提供する工程であって、前記検出オリゴヌクレオチドが、各クラスの検出オリゴヌクレオチドで異なり、前記増幅連結センサープローブの標識と区別可能である検出可能な標識を含み、前記検出オリゴヌクレオチドが、前記トランスジーンと相補的であって前記連結部位を含む前記連結センサープローブの部分にハイブリダイズ可能である工程；
ストリンジェントな条件下で、前記標識増幅連結センサープローブを前記検出オリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記検出オリゴヌクレオチドを前記増幅連結センサープローブとハイブリダイズさせる工程；
前記増幅連結センサープローブの検出可能な標識と結合した前記検出オリゴヌクレオチドの存在を検出することによって、前記増幅連結センサープローブと前記検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定する工程；次いで、
検出オリゴヌクレオチドの同定によって前記トランスジーンを同定する工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが未精製の細胞溶解物に含まれる、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが部分精製された細胞溶解物に含まれる、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリＡ  ＲＮＡ、またはそれらの混合物である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記検出オリゴヌクレオチドがさらにマイクロスフェア（microsphere）を含むものであって、前記マイクロスフェアが前記検出オリゴヌクレオチドのための前記検出可能なラベルを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
前記マイクロスフェアの前記検出可能なラベルが少なくとも２つの異なる蛍光色素を含む、請求項５の方法。
【請求項７】
前記センサープローブペアの前記プライマー結合部位が、前記トランスジーンに相補的でない、請求項１の方法。
【請求項８】
各センサープローブペアの前記第１プローブの前記プライマー結合部位が、共通のプライマー結合部位を含み、各センサープローブペアの前記第２のプローブの前記プライマー結合部位が共通のプライマー結合部位を含む、請求項１の方法。
【請求項９】
前記センサープローブのそれぞれが、前記トランスジーンおよび前記検出オリゴヌクレオチドに相補な第１の部分；前記トランスジーンに相補的であるが前記検出オリゴヌクレオチドには相補的でない第２の部分；ならびに、前記トランスジーンまたは前記検出オリゴヌクレオチドのいずれもと相補的でないプライマー結合部位を含む第３の部分を含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記トランスジーンにハイブリダイズする際に、前記センサープローブペア中の各センサープローブの前記第１の部分が互いに隣接する、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記センサープローブのそれぞれが、前記トランスジーンおよび前記検出オリゴヌクレオチドに相補的な第１の部分；前記トランスジーンに相補的であるが前記検出オリゴヌクレオチドにはそうでない第２の部分；前記共通のプライマー結合部位を含み、前記共通のプライマー結合部位が前記トランスジーンもしくは前記検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的でない第３の部分を含む、前記請求項８の方法。
【請求項１２】
前記トランスジーンにハイブリダイズする際に、前記センサープローブペア中の各センサープローブの前記第１の部分が互いに隣接する、請求項１１の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子組み換え細胞もしくは生物が、植物、動物、細菌、酵母、真菌またはウイルスである、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記検出オリゴヌクレオチドが、約１５ヌクレオチド長ないし約３０ヌクレオチド長である、請求項１の方法。
【請求項１５】
前記プライマー結合部位が、約１２ヌクレオチド長ないし約２４ヌクレオチド長である、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記の検出可能な標識が定量的な標識である、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記の検出可能な標識がフローサイトメトリーによって検出される、請求項１の方法。
【請求項１８】
対象もしくは組成物における病原体を検出するための方法であって、以下の工程；
前記対象もしくは組成物より得られた少なくとも１つのサンプルからポリヌクレオチドを得る工程；
前記病原体に特徴的な少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列について、１ペアの特異的なセンサープローブを提供する工程であって、前記ペアにおける各プローブが、3'末端および5'末端を有し、前記ペアの第１プローブが前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的な3'部分と、プライマー結合部位を含む5'部分を有し、前記ペアの第２プローブが前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的な5'部分と、共通のプライマー結合部位を含む3'部分を有するものであって、ここに、前記第１および第２プローブの相補的な部分が、前記標的ポリヌクレオチド配列の隣接領域に相補的である工程；
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記ポリヌクレオチを前記特異的センサープローブと組み合わせる工程;
前記センサープローブを、前記の少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる工程；
ハイブリダイズしたセンサープローブペアのメンバーを連結して、連結部位を含む連結センサープローブを形成させる工程；
前記連結センサープローブを増幅し、増幅連結センサープローブを提供する工程であって、前記増幅連結センサープローブが検出可能な標識を含む工程；
それぞれの異なる連結センサープローブについて、少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記検出オリゴヌクレオチドが、検出オリゴヌクレオチドのクラスごとに異なる、前記の増幅連結センサープローブの標識と区別できる検出可能な標識を含み、ここに、前記検出オリゴヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的であり、前記連結部位を含む前記連結センサープローブの一部にハイブリダイズすることができるものである工程；
ストリンジェントな条件下で、前記の標識された増幅連結センサープローブを、前記検出オリゴヌクレオチドと組み合わせて、前記検出オリゴヌクレオチドを前記増幅連結センサープローブとハイブリダイズさせる工程；
前記の増幅連結センサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、前記増幅連結センサープローブの検出可能な標識と結合した前記検出オリゴヌクレオチドの前記の検出可能な標識の存在を検出することによって測定する工程；次いで、
検出オリゴヌクレオチドの同定によって前記標的ポリヌクレオチド配列を同定し、前記ポリヌクレオチド配列を用いて前記病原体を同定する工程；
を含む方法。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドが未精製の細胞溶解物に含まれる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチドが部分精製された細胞溶解物に含まれる、請求項１８の方法。
【請求項２１】
前記センサープローブペアの前記プライマー結合部位が、前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的でない、請求項１８の方法。
【請求項２２】
各センサープローブペアの前記第１プローブの前記プライマー結合部位が、共通のプライマー結合部位を含み、センサープローブペアの前記第２プローブの前記プライマー結合部位が、共通のプライマー結合部位を含む、請求項１８の方法。
【請求項２３】
前記センサープローブのそれぞれが、前記トランスジーンおよび前記検出オリゴヌクレオチドに相補な第１の部分；前記トランスジーンに相補的であるが前記検出オリゴヌクレオチドには相補的でない第２の部分；ならびに、前記トランスジーンまたは前記検出オリゴヌクレオチドのいずれもと相補的でないプライマー結合部位を含む第３の部分を含む、請求項１８の方法。
【請求項２４】
前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする際に、前記センサープローブペア中の各センサープローブの前記第１の部分が互いに隣接する、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記センサープローブのそれぞれが、前記トランスジーンおよび前記検出オリゴヌクレオチドに相補的な第１の部分；前記トランスジーンに相補的であるが前記検出オリゴヌクレオチドにはそうでない第２の部分；前記共通のプライマー結合部位を含み、前記共通のプライマー結合部位が前記トランスジーンもしくは前記検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的でない第３の部分を含む、請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記標的ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする際に、前記センサープローブペア中の各センサープローブの前記第１の部分が互いに隣接する、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドが、DNA、cDNA、RNA、mRNA、ポリA RNAもしくはそれらの混合物である、請求項１８の方法。
【請求項２８】
前記検出オリゴヌクレオチドがさらにマイクロスフェアを含むものであり、前記マイクロスフェアが前記検出オリゴヌクレオチドのための検出可能な標識を含む、請求項１８の方法。
【請求項２９】
前記マイクロスフェアの前記の検出可能な標識が、少なくとも２つの異なる蛍光色素を含む、請求項１８の方法。
【請求項３０】
前記検出オリゴヌクレオチドが１５ヌクレオチド長ないし約３０ヌクレオチド長である、請求項１８の方法。
【請求項３１】
前記プライマー結合部位が、約１２ヌクレオチド長ないし約２４ヌクレオチド長である、請求項１８の方法。
【請求項３２】
前記の検出可能な標識が定量的な標識である、請求項１８の方法。
【請求項３３】
前記の検出可能な標識がフローサイトメトリーによって検出される、請求項１８の方法。
【請求項３４】
前記病原体が、細菌、ウイルス、酵母、真菌もしくは寄生体である、請求項１８の方法。
【請求項３５】
前記対象が動物もしくは植物である、請求項１８の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、飼料、食料、生体液、組織、バイオプシー、培養培地、もしくは医薬組成物である、請求項１８の方法。
【請求項３７】
一塩基多型を検出するための方法であって、以下の工程；
対象より細胞の集団を得る工程であって、前記集団が、一塩基多型を含む少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを含む細胞を含む工程；
前記細胞を溶解し、前記標的ポリヌクレオチドを含む細胞溶解物を得る工程であって、前記溶解物がさらに精製されない工程；
各標的ポリヌクレオチドについて、少なくとも１ペアの特異的なセンサープローブを提供する工程であって、前記ペアにおける各プローブが、3'末端および5'末端を有し、前記ペアの第１センサープローブが前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的な3'部分と、プライマー結合部位を含む5'部分を有し、前記ペアの第２センサープローブが前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的な5'部分と、プライマー結合部位を含む3'部分を有するものであって、ここに、前記ペアの前記センサープローブ上の前記相補的な部分が、前記標的ポリヌクレオチドにすぐ隣接し、第１プローブの3'末端もしくは第２プローブの5'末端のいずれかが前記一塩基多型のアリルに相補的である工程；
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも１ペアの特異的センサープローブと、前記の少なくとも１つのポリヌクレオチド標的を組み合わせる工程；
前記センサープローブを、前記の少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程；
存在する一塩基多型アリルが前記センサープローブに相補的でない場合、連結が起こらないような条件下で、１ペアのセンサープローブのハイブリダイズしたメンバーを連結させ、連結部位を含む連結センサープローブを形成させる工程；
前記連結センサープローブを増幅し、増幅連結センサープローブを得る工程であって、前記増幅連結センサープローブが検出可能な標識を含む工程；
それぞれ異なる連結センサープローブについて、少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記オリゴヌクレオチドが、各クラスの検出オリゴヌクレオチドについて異なり、前記増幅連結センサープローブの標識と区別できる検出可能な標識を含み、ここに、前記検出オリゴヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的で、前記連結部位を含む前記連結センサープローブの一部にハイブリダイズすることができるものである工程；
ストリンジェントな条件下で、前記の増幅連結センサープローブを前記検出オリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記検出オリゴヌクレオチドを前記増幅連結センサープローブとハイブリダイズさせる工程；
前記増幅連結センサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、前記増幅連結センサープローブの検出可能な標識と結合した前記検出オリゴヌクレオチドの前記の検出可能な標識の存在を検出することによって、測定する工程；次いで、
前記一塩基多型の前記アリルの存在、不在または頻度を測定する工程であって、前記アリルが検出オリゴヌクレオチドの標識によって同定される工程；
を含む方法。
【請求項３８】
各標的ポリヌクレオチドについて、少なくとも第１および第２の特異的センサープローブのペアであって、前記第１プローブの3'末端もしくは前記第２プローブの5'末端のいずれかが、一塩基多型のアリルに相補的であり、前記第１プローブの3'末端もしくは前記第２プローブの5'末端のいずれかが、前記一塩基多型の別のアリルに相補的であるものを提供することを含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
各センサープローブペアの前記第１プローブの前記プライマー結合部位が、共通のプライマー結合部位を含み、各センサープローブペアの前記第２のプローブの前記プライマー結合部位が共通のプライマー結合部位を含む、請求項３７の方法。
【請求項４０】
前記センサープローブのそれぞれが、前記トランスジーンおよび前記検出オリゴヌクレオチドに相補な第１の部分；前記トランスジーンに相補的であるが前記検出オリゴヌクレオチドには相補的でない第２の部分；ならびに、前記トランスジーンまたは前記検出オリゴヌクレオチドのいずれもと相補的でないプライマー結合部位を含む第３の部分を含む、請求項３７の方法。
【請求項４１】
前記トランスジーンにハイブリダイズする際に、前記センサープローブペア中の各センサープローブの前記第１の部分が互いに隣接する、請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記センサープローブのそれぞれが、前記トランスジーンおよび前記検出オリゴヌクレオチドに相補的な第１の部分；前記トランスジーンに相補的であるが前記検出オリゴヌクレオチドにはそうでない第２の部分；前記共通のプライマー結合部位を含み、前記共通のプライマー結合部位が前記トランスジーンもしくは前記検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的でない第３の部分を含む、請求項３９の方法。
【請求項４３】
前記トランスジーンにハイブリダイズする際に、前記センサープローブペア中の各センサープローブの前記第１の部分が互いに隣接する、請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記検出オリゴヌクレオチドがさらにマイクロスフェアを含むものであり、前記マイクロスフェアが前記検出オリゴヌクレオチドのための検出可能な標識を含む、請求項３７の方法。
【請求項４５】
前記マイクロスフェアが２つの異なる蛍光色素を含む、請求項４４の方法。
【請求項４６】
前記標識がフローサイトメトリーによって検出される、請求項３７の方法。
【請求項４７】
前記増幅連結センサープローブと前記検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの前記測定が定量的である、請求項３７の方法。
【請求項４８】
少なくとも１つの前記標的ポリヌクレオチドが、植物もしくは動物より得られる、請求項３７の方法。
【請求項４９】
少なくとも１つの前記標的ポリヌクレオチドが、DNA、cDNA、RNA、mRNA、ポリA RNAもしくはそれらの混合物である、請求項３７の方法。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドの集団が、少なくとも２０個の異なる標的ポリヌクレオチドを含む、請求項３７の方法。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドの集団が、少なくとも５０個の異なる標的ポリヌクレオチドを含む、請求項３７の方法。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドの集団が、少なくとも１００個の異なる標的ポリヌクレオチドを含む、請求項３７の方法。
【請求項５３】
センサープローブペア中の各センサープローブの前記部分が、標的ポリヌクレオチドに相補的であり、約１５ヌクレオチド長ないし約３０ヌクレオチド長である、請求項３７の方法。
【請求項５４】
前記共通のプライマー結合部位が、約１２ヌクレオチド長ないし約２４ヌクレオチド長である、請求項３７の方法。
【請求項５５】
前記検出オリゴヌクレオチドが、１８ヌクレオチド長ないし約３０ヌクレオチド長である、請求項３７の方法。
【請求項５６】
前記細胞溶解物が部分精製される、請求項３７の方法。
【請求項５７】
ポリヌクレオチドの発現を測定するための方法であって、以下の工程；
対象より細胞の集団を得る工程であって、前記集団が、少なくとも１つの目的の標的ポリヌクレオチドを含む細胞を含む工程；
前記細胞を溶解し、前記標的ポリヌクレオチドを含む細胞溶解物を得る工程であって、前記溶解物がさらに精製されない工程；
各標的ポリヌクレオチドについて、１ペアの特異的なセンサープローブを提供する工程であって、前記ペアにおける各プローブが3'末端および5'末端を有し、前記ペアの第１プローブが前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的な3'部分と、プライマー結合部位を含む5'部分を有し、前記ペアの第２プローブが前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的な5'部分と、プライマー結合部位を含む3'部分を有するものであり、ここに、前記センサープローブ上の前記相補的な部分が標的ポリヌクレオチド上ですぐ隣接するものである工程；
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、１ペアの特異的センサープローブと、前記の少なくとも１つのポリヌクレオチド標的を組み合わせる工程；
前記センサープローブを、前記の少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる工程；
ハイブリダイズしたセンサープローブのペアのメンバーを連結し、連結部位を含む連結センサープローブを形成させる工程；
前記連結センサープローブを増幅し、増幅連結センサープローブを得る工程であって、前記増幅連結センサープローブが検出可能な標識を含む工程；
それぞれ異なる連結センサープローブについて、少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、前記検出オリゴヌクレオチドが、各クラスの検出オリゴヌクレオチドについて異なり、前記増幅連結センサープローブの標識と区別できる検出可能な標識を含み、ここに、前記検出オリゴヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的で、前記連結部位を含む前記連結センサープローブの一部にハイブリダイズすることができるものである工程；
ストリンジェントな条件下で、前記の標識された増幅連結センサープローブを、前記検出オリゴヌクレオチドと組み合わせ、前記検出オリゴヌクレオチドを前記増幅連結センサープローブとハイブリダイズさせる工程；
前記増幅連結センサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、前記増幅連結センサープローブの検出可能な標識と結合した前記検出オリゴヌクレオチドの前記の検出可能な標識の存在を検出することによって、測定する工程；次いで、
検出オリゴヌクレオチドの同定によって、前記標的オリゴヌクレオチドを同定する工程；
を含む方法。
【請求項５８】
各センサープローブペアの前記第１プローブの前記プライマー結合部位が、共通のプライマー結合部位を含み、各センサープローブペアの前記第２プローブの前記プライマー結合部位が、共通のプライマー結合部位を含む、請求項５７の方法。
【請求項５９】
前記センサープローブのそれぞれが、前記トランスジーンおよび前記検出オリゴヌクレオチドに相補な第１の部分；前記トランスジーンに相補的であるが前記検出オリゴヌクレオチドには相補的でない第２の部分；ならびに、前記トランスジーンまたは前記検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的でないプライマー結合部位を含む第３の部分を含む、請求項５７の方法。
【請求項６０】
前記トランスジーンにハイブリダイズする際に、前記センサープローブペア中の各センサープローブの前記第１の部分が互いに隣接する、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記センサープローブのそれぞれが、前記トランスジーンおよび前記検出オリゴヌクレオチドに相補的な第１の部分；前記トランスジーンに相補的であるが前記検出オリゴヌクレオチドにはそうでない第２の部分；前記共通のプライマー結合部位を含み、前記共通のプライマー結合部位が前記トランスジーンもしくは前記検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的でない第３の部分を含む、請求項５８の方法
【請求項６２】
前記トランスジーンにハイブリダイズする際に、前記センサープローブペア中の各センサープローブの前記第１の部分が互いに隣接する、請求項６１の方法。
【請求項６３】
前記検出オリゴヌクレオチドがさらにマイクロスフェアを含むものであり、前記マイクロスフェアが前記検出オリゴヌクレオチドのための検出可能な標識を含む、請求項５７の方法。
【請求項６４】
前記マイクロスフェアが、２つの異なる蛍光色素を含む、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記の検出可能な標識がフローサイトメトリーによって検出される、請求項５７の方法。
【請求項６６】
前記増幅連結センサープローブと前記検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの前記測定が定量的である、請求項５７の方法。
【請求項６７】
少なくとも１つの前記標的ポリヌクレオチドが、植物、動物、細菌、酵母または真菌より得られる、請求項５７の方法。
【請求項６８】
前記ポリヌクレオチドが、DNA、cDNA、RNA、mRNA、ポリA RNAもしくはそれらの混合物である、請求項５７の方法。
【請求項６９】
前記細胞が少なくとも２０の異なる標的ポリヌクレオチドを含む、請求項５７の方法。
【請求項７０】
前記細胞が少なくとも５０の異なる標的ポリヌクレオチドを含む、請求項５７の方法。
【請求項７１】
前記細胞が少なくとも１００の異なる標的ポリヌクレオチドを含む、請求項５７の方法。
【請求項７２】
センサープローブペア中の各センサープローブの前記部分が、標的ポリヌクレオチドに相補的であり、約１５ヌクレオチド長ないし約３０ヌクレオチド長である、請求項５７の方法。
【請求項７３】
前記共通のプライマー結合部位が、約１２ヌクレオチド長ないし約２４ヌクレオチド長である、請求項５７の方法。
【請求項７４】
前記検出オリゴヌクレオチドが、約１８ヌクレオチド長ないし約３０ヌクレオチド長である、請求項５７の方法。
【請求項７５】
前記細胞溶解物が部分精製される、請求項５７の方法。
【請求項７６】
ポリヌクレオチド発現における変化を測定する方法であって、以下の工程：
第１の細胞集団を得る工程であって、前記集団が少なくとも１つの目的の標的ポリヌクレオチドを含む細胞を含む工程；
請求項５７の方法によって、前記第１の集団における前記の少なくとも１つの目的のポリヌクレオチドの発現を測定する工程；
第２の細胞集団を得る工程であって、前記集団が少なくとも１つの目的の標的ポリヌクレオチドを含む細胞を含む工程；
請求項５７の方法によって、前記第２の集団における少なくとも１つの前記の目的のポリヌクレオチドの発現を測定する工程；
前記第１の集団における前記の少なくとも１つの目的のポリヌクレオチドの発現を、前記第２の集団における前記の少なくとも１つの目的のポリヌクレオチドの発現と比較する工程；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００１年７月２９日に出願され、現在放棄されている米国仮出願第60/302,092号、および２００２年２月１９日出願の米国仮出願第60/357,891号の利益を主張する、２００２年７月２８日出願の米国出願第10/187,039号の一部継続出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、分子生物学分野、特に、核酸配列の同定方法に関する。
【０００３】
（背景）
種々の生物の完全ゲノム配列の入手可能性によって、生物学の様々な基本的側面の我々の理解が著しく進歩することを約束されている。ある疾病の遺伝的基礎の理解、治療的介入の新たな標的の提供、新世代の検査テストの開発等のような前例のない応用的利益の提供も約束される。しかし、ゲノム研究のポテンシャルを享受し、完全に実現するには、新しく、発展したツールが必要であろう。
【０００４】
多細胞生物の体の異なる細胞において、ＤＮＡ相補物（complement）もしくは遺伝子相補物は同じものであるが、異なる細胞におけるポリヌクレオチドの発現には、質的、量的に違いがある。ヒトゲノムは、おおよそ30,000〜40,000遺伝子を含むとされているが、これらの遺伝子のうちのわずかしか、所定の細胞において発現していない(International Human Genome Sequence Consortium, Nature, 409: 860-921, 2001; Venter et al., Science, 291: 1304-1351, 2001)。さらに、異なる細胞の種類で発現した遺伝子間の量的な違いがある。すべての細胞はあるハウスキーピング遺伝子を発現しているが、それぞれの異なる細胞型は、ユニークなセットの遺伝子をさらに発現する。細胞型間での表現型の違いは、ユニークに発現されるタンパク質の相補物によっておおまかに決定される。ある細胞型の機能的同一性を構成し、それを他の細胞型と区別するのは、遺伝子のこのユニークなセットとそれにコードされたタンパク質である。さらに発現した遺伝子の相補物、およびそれらの発現レベルは、所定の細胞型の生理的または発生的ステージによってかなり異なる。ある遺伝子は、細胞の分化の間に特異的に活性化もしくは抑制される。発生および分化の間に発現レベルも変化する。ポリヌクレオチドの発現における質的および量的な変化は、細胞分裂の間、例えば、細胞周期の様々な段階においても行われる。生物学的に活性のある分子、例えば、ホルモン、成長因子およびサイトカインによるシグナル伝達は、しばしば、ポリヌクレオチドの発現の調節を伴う。ポリヌクレオチドの発現における全体的な変化は、老化のプロセスにおいても決定的な役割を果たす。
【０００５】
前記の内在性もしくは内部の因子に加えて、ある外部の因子もしくは刺激、例えば、環境因子も、ポリヌクレオチドの発現プロフィールを変化させる。感染性生物、例えば、バクテリア、ウイルス、真菌および寄生体は、細胞と相互作用し、ポリヌクレオチドの発現の質的および量的状況を変化させる。よって、所定の細胞型によって発現された遺伝子のその相補物は、多くの内在性および外来性因子によって影響される。これらの変化の結果は、正常な細胞の生存、成長、発生および環境への応答に重要である。従って、ポリヌクレオチドの発現における変化の同定、特徴づけおよび測定は重要である。かかる解析より得られた知見は、基礎生物学の我々の理解を促進するのみならず、様々な目的、例えば、感染性および非感染性疾病の検査、新たな薬剤の同定と開発のためのスクリーニング等のために、我々がそれを使用することも可能にする。
【０００６】
ノーザン解析、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ、およびリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）のような、従来の１対１のポリヌクレオチドの発現解析法に加えて；ゲノムワイドスケールでポリヌクレオチドの発現を試験するための現在入手可能ないくつかの方法が存在する。これらのアプローチは、ＲＮＡプロフィーリング、ディファレンシャルディスプレイ等としてさまざまな呼び方をされている。これらの方法を、３つのカテゴリー：（１）サブトラクティブなハイブリダイゼーション(Koyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 1609-1613, 1987; Zipfelet al., Mol. Cell. Biol. 9: 1041-1048, 1989)、マイクロアレイ(米国特許第6,150,095号)等のごときハイブリダイゼーションに基づく方法、（２）ｃＤＮＡタグ：ＥＳＴ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）(例えば、米国特許第5,695,937号および第5,866,330号を参照)、（３）ポリアクリルアミドゲルのようなゲル上のＤＮＡ断片の電気泳動分離物上でディファレンシャルディスプレイを行う、断片サイズに基づく方法であって、しばしばゲルベースと呼ばれる方法（米国特許第5,871,697号、第5,459,037号、第5,712,126およびPCT公開番号第WO98/51789号に記載されている）に広く分けることができる。
【０００７】
マイクロアレイに基づく遺伝子解析アプローチによって、一度に１または数個の遺伝子ではなく、同時に数十万個の遺伝子を扱うことが可能となる。マイクロアレイ技術は、ヒトおよび他の生物の完全ゲノムが解読された適当な時期に出現した。ゲノム配列解読、特に、ヒトゲノム配列解読の結果として生じた膨大な配列情報は、ハイスループットおよびスピードを提供する技術への要求を生み出した。マイクロアレイは、このユニークなニッチを埋めた。複雑な生理学的プロセスの多くが、多くの遺伝子の発現における変化を先行するか継続する。マイクロアレイの出現前に入手可能であった技術は、このような遺伝子発現における大規模の変化をモニターするのに不向きである。ＤＮＡマイクロアレイは、同時に数十万の遺伝子の速く、包括的かつ適度に定量的な解析を行う機会を提供する。
【０００８】
ＤＮＡマイクロアレイは、通常、標準的な顕微鏡のスライドグラスの形式にある小さな空間、例えば１ｃｍ２の長方形の中に整列された、既知配列のＤＮＡ分子の規則正しいセットから構成される。例えば、200 x 200のアレイは、既知配列のプローブに対応したそれぞれのスポットである40,000スポットを含むだろう。かかるマイクロアレイを用いて、様々な条件下での所定の細胞型における40,000遺伝子の発現を同時モニターすることができるかもしれない。プローブは、通常、ｃＤＮＡ、ＥＳＴもしくはオリゴヌクレオチドの形態である。もっとも好ましくは、ハイブリダイゼーションの理想的な基質を提供する、30~200塩基長の範囲のＥＳＴおよびオリゴヌクレオチドである。チップ（ス）としても知られているこれらのマイクロアレイを作成するには、２つのアプローチが存在し、その一方はあらかじめ合成されたプローブの共有結合を伴うものであり、もう一方はチップ上に直接プローブを作成もしくは合成することを伴うものである。サンプルもしくはテスト材料は、通常、ＰＣＲによって増幅されたＲＮＡからなる。ＰＣＲには、出発材料を増幅するとともに蛍光タグを導入できるという２つの目的がある。マイクロアレイ技術の詳細な議論は、例えば、Graves, Trends Biotechnol. 17: 127-134, 1999を参照する。
【０００９】
高密度マイクロアレイは、高精度の機械を使用して、アレイ上の正確な位置にごく少量のＤＮＡ溶液を配置することによって作成されるものであり、そのうちいくつかは市販されている。別のアプローチでは、紙上にインクジェットプリンターがスポットするのと同じ方法でＤＮＡを配置することが可能である。高密度ＤＮＡマイクロアレイ解析は、多くの販売元から市販されている。ＤＮＡマイクロアレイ解析のための標識は、一般に、同時に多数の別々のシグナルの解読を可能にする蛍光を伴う。これにより、異なる蛍光色素で標識された２つのサンプルを、同じチップ上で同時にハイブリダイゼーションさせることが可能となる。各スポットでの蛍光比を計算することにより、２つの異なる条件下での各遺伝子発現の相対変化を測定することができる。例えば、該アプローチを用いた正常な組織と対応する腫瘍組織の比較は、発現が著しく変化する遺伝子を同定するのに役立つ。よって、この方法は、同じ細胞の遺伝子発現プロフィールが２つもしくはそれ以上の条件下で比較される際に特に強力なツールを提供する。様々な波長で蛍光をモニターすることができる高解像度スキャナーは市販されている。
【００１０】
種のゲノムに関する情報がより多く得られるにつれ、遺伝的多様性もしくは多型の形式における新たなマーカーが、様々な形質について同定されている。多くの型の多型が存在することが知られている。例えば、ウイルスの挿入によって、ＤＮＡ配列が挿入されるかゲノム中から欠失するかいずれかの場合に、多型が生じうる。配列多様性のもう１つのソースは、短いタンデム反復(STR)、タンデム反復数(VNTR)、短い反復配列(SSR)またはマイクロサテライトと様々に呼ばれる、ゲノム中の反復配列の存在によって引き起こされうる。これらの反復は、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチドもしくはペンタヌクレオチド反復であることができる。多型は、特定の遺伝子座にて見られる反復配列の数の多様性から生じる。
【００１１】
近年、最も一般的なゲノム中の多型ソースである一塩基多型（SNP）が、有用な遺伝的マーカーとして注目を浴びている。ＳＮＰはヒトのＤＮＡ多型のおよそ９０％を占めている(Collins et al., GenomeRes., 8: 1229-1231, 1998)。ＳＮＰは、ゲノムＤＮＡ中の１塩基対の部位であり、そこに集団における異なる配列の選択肢（アリル）が存在する。ＳＮＰという語は、１塩基置換に限定されず、１塩基挿入もしくは欠失も含む。さらに、１０塩基対以下の短い挿入もしくは欠失は、多くの場合、一塩基多型を検出するために使用される方法で検出されることから、それらもしばしばＳＮＰとして分類される。
【００１２】
ヌクレオチド置換ＳＮＰには、２つの型がある。トランジション（transition）は、１つのプリンがもう１つのプリンによって、または１つのピリミジンがもう１つのピリミジンによって置換されることである。トランスバージョン（transversion）は、プリンのピリミジンへの置換、またはその逆のことである。ＳＮＰが観察される典型的な頻度は、１０００塩基対につき約１カ所である(Li and Sadler, Genetics, 129: 513-523, 1991; Wang et al., Science 280: 1077-1082, 1998; Harding et al., Am. J. Human Genet., 60: 772-789, 1997; Taillon-Miller et al., Genome Res., 8: 748-754, 1998)。ＳＮＰの頻度は、問題となる変化の型および位置により様々である。塩基置換において、置換の２／３はC←→T(G←→A)型を伴う。この頻度の変化は、特にＣｐＧジヌクレオチドにおいて頻繁に起こる、５−メチルシトシン脱アミノ反応に関連していると考えられている。位置については、ＳＮＰはコード領域よりも非コード領域において、より高頻度に起こる。
【００１３】
ＳＮＰが表現型に作用しうる方法は様々である。ＳＮＰが細胞調節に影響を及ぼしうるｍＲＮＡの折りたたみ構造において大きな変化を引き起こすことができることが研究により示された(Shen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 7871-7876,1999)。SNPの存在がコード領域に位置する場合、ＳＮＰの存在により、非機能的もしくは機能の減少したタンパク質が生じうる。非コード領域、例えば、プロモーター領域にSNPが存在する場合、ＳＮＰにより遺伝子の発現が変化しうる。
【００１４】
いくつかのＳＮＰの検出方法が当技術分野で周知である。これらは、多発性アリル特異的診断アッセイ（multiplexed allele-specific diagnostic assay）(MASDA; 米国特許第5,834,181号)、TaqManアッセイ(米国特許第5,962,233号)、モレキュラービーコン（molecular beacon）(米国特許第5,925,517号)、マイクロタイターアレイダイアゴナルゲル電気泳動（microtiter array diagonal gel electrophoresis） (MADGE, Day and Humphries, Anal. Biochem., 222:389-395, 1994)、特定アリルのPCR増幅（amplification of specific alleles）(PASA, Sommer et al., Mayo Clin. Proc., 64: 1361- 1372, 1989)、アリル特異的増幅(ASA, Nichols, Genomics, 5: 535-540, 1989)、アリル特異的ＰＣＲ(Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2757-2760, 1989)、増幅不応変異システム（amplification refractory mutation system） (ARMS, Newton et al., Nuc. Acids Res., 17: 2503-2516, 1989)、bi- PASA (Liu et al., Genome Res., 7: 389-398, 1997)、リガーゼ連鎖反応(LCR, Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 189-193, 1991)、オリゴヌクレオチド連結アッセイ(OLA, 米国特許第5,830,711号; Landegren et al., Science, 214: 1077-1080, 1988; Samotiaki et al., Genomics, 20: 238- 242, 1994; Day et al., Genomics, 29: 152-162, 1995; Grossman et al., Nuc. Acids Res., 22: 4527- 4534, 1994)、色素標識オリゴヌクレオチド連結(米国特許第5,945,283号; Chen et al., Genome Res., 8: 549-556, 1998)、制限断片長多型(RFLP, 米国特許第5,324,631号および第5,645,995号)、MALDI-TOF (Bray et al., Hufen. Mutat., 17: 296-304, 2001)、インベイダーアッセイ（Invader Assay）(Hsu et al., Clin. Chem., 47: 1373-1377, 2001)、および単独 (米国特許第5,846,710号および第5,888,819号; Syvanen et al., Am. J. Hum. Genet., 52: 46-59, 1993)もしくはマイクロアレイと組み合わせた(Shumaker et al., Human Mut., 7:346-354, 1996)ミニシーケンシング、または蛍光共鳴エネルギー転移(米国特許第5,945,283号; Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10756-10761, 1997)を含む。
【００１５】
ヌクレオチド配列の検出方法を、病原体の検出および同定にも使用できる。より多くの病原性生物についての遺伝情報が入手可能になれば、より正確かつより早い感染過程で、かかる生物の存在を、特異的核酸配列に基づいて検出することが可能となる。これらの核酸に基づく検出法は、それらの感度、速さおよび正確さが高いことから、従来使用されていた免疫学に基づく方法に急速にとって代わりつつある。
【００１６】
病原体の検出のための特定の核酸配列の存在を用いた方法の例は、例えば、PCT出願WO 99/67628、WO 97/29212、WO 96/17956およびWO 92/03576で見いだすことができる。植物の真菌感染を検出するためのPCRの使用は、例えば、米国特許第6,485,907号; 6,358,680号; 6,319,673号; 5,955,274号;および5,800,997号に加えてPCT公報WO 2002077293、WO 01/51653;およびWO 00/52202で見いだすことができる。植物に加えて、動物およびヒトにおける病原性生物の検出(米国特許第5,849,488号およびPCT公報WO 98/11259)、さらに食料品中の病原体混入の検出(米国特許第5,475,098号およびPCT公報WO 98/20148)にも、分子生物学の技術が使用されている。
【００１７】
ヌクレオチド配列検出の分野において将来性のある１つの方法は、マイクロスフェアに基づく液体アレイである。マイクロスフェアに基づく液体アレイは、標的分子を捕獲するために、分子プローブに結合した異なるコードされたマイクロスフェアを使用する。ついで、フローサイトメトリーもしくは他の読み出し方法によって、捕獲された標的分子を同定、選別および定量する(米国特許第6,268,147号; Bruchez et al., Science, 281: 2013-2016, 1998; Steemers, et al., Nature Biotechnology, 18: 91-94; Kettman, et al., Cytometry, 33: 234-243, 1998)。例えば、Luminex液体アレイシステムは、読み出し速度20,000 マイクロスフェア/秒で標的分子を捕らえて選別するために、100の異なる種類の安価で、着色され、コードされたマイクロスフェアを使用する(Kettman, et al., Cytometry, 33: 234-243,1998)。従って、それにより、安価で多重のハイスループット読み出しプラットフォームが提供され(Smith et al., Clinical Chemistry, 44: 2054-2056, 1998)、ハイスループット形式でのタンパク質リガンド(Willman, et al., Am. J. Clin. Pathol., 115: 764-769, 2001)およびＤＮＡ多型の検出に広く使用されている(Ye, et al., Human Mutation, 17: 305-316 2001)。近年、このシステムが、同時に多数の遺伝子発現をモニターすることに応用された(Yang, et al.,Genome Research, 11: 1888-1898, 2001)。配列特異的ハイブリダイゼーションによって、生物サンプル中の蛍光標識された核酸標的分子が、マイクロスフェアに固定されたＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブによって捕らえられ、次いで、選別され、定量される。しかし、該アッセイは、中および多量の転写物のみを検出するため、標的シグナルを増幅するための長く高価なin vitro転写に依存する。低感度かつ高コストの標的標識反応は、アッセイの広範囲の応用、特にハイスループットスクリーニングへの応用を妨げている。
【００１８】
利用可能な遺伝情報の量が増加し続ければ、大規模な遺伝子発現、ＳＮＰ解析、ＧＭＯ検出および病原体検出の迅速で費用効率の高い方法への要求も増加する。利用可能な多くの方法の広範囲への応用は、使用する消耗品、必要な器具、携わる労働者の量、またはこれら３つの要素のいくつかの組み合わせに関連した高いコストによって限定されている。よって、必要なことは、費用効率の高い方法で大規模スクリーニングを可能にする核酸解析方法である。本発明者らは、RNA転写物の存在および濃度情報を、定量的オリゴヌクレオチド連結に置き換え、一塩基多型の存在を検出するELITE(転写物発現の酵素的連結に基づく同定（Enzymatic Ligation-based Identification of Transcript Expression）)と呼ばれる新しい方法を開発した。
【００１９】
（発明の要約）
本発明のいくつかの態様が提供される中で、１つもしくはそれ以上の目的の標的ポリヌクレオチドを含み、少なくとも標的ポリヌクレオチドの一部のヌクレオチド配列が既知であるテストポリヌクレオチドの集団を提供することを含む、ポリヌクレオチドの発現を測定する方法がある。ポリヌクレオチドの精製された集団、さらなる精製をしていない細胞溶解物、または部分精製された細胞溶解物（部分精製されたポリヌクレオチド）を用いて、該方法を実施することができる。ポリヌクレオチドは、cDNA、RNA、mRNA、ポリA RNAまたはそれらの混合物であってもよい。各標的ポリヌクレオチドについて、１ペアの特異的センサープローブが提供され、ペアの第１プローブが標的ポリヌクレオチドに相補的な3'部分およびプライマー結合部位を含む5'部分をを有し；ペアの第２プローブが標的ポリヌクレオチドに相補的な5'部分とプライマー結合部位を含む3'部分を有する。１つの具体例において、第２プローブの5'末端はリン酸化される。もう１つの具体例において、第１のセンサープローブは共通のプライマー結合部位を有し、第２のセンサープローブも共通のプライマー結合部位を有する。共通のプライマー結合部位は、全ての第１および第２センサープローブで同一であってもよく、または第１および第２センサープローブが、第１センサープローブと第２センサープローブで異なる共通のプライマー結合部位を有していてもよい。１つの具体例において、プライマー結合部位は、標的ポリヌクレオチドに相補的ではない。もう１つの具体例において、センサープローブのそれぞれは３つの部分を含む。この具体例において、第１の部分は標的ポリヌクレオチドおよび検出オリゴヌクレオチド（detector oligonucleotide)に相補的であり；第２の部分は標的ポリヌクレオチドに相補的であるが、検出オリゴヌクレオチドにはそうでなく；第３のポリヌクレオチドは、共通のプライマー結合部位であってもよく、標的ポリヌクレオチドもしくは検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的でないプライマー結合部位を含む。
【００２０】
センサープローブは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした際に、第１プローブの3'末端が、第２プローブに、２つのプローブ間でギャップなくすぐ隣接するものである。３つの部分を有するセンサープローブの場合、各プローブの第１の部分は互いに隣接している。必要であれば、標的ポリヌクレオチドを変性させ、次いで、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、または高度にストリンジェントな条件下でセンサープローブのセットと組み合わせ、センサープローブを標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせる。
【００２１】
ハイブリダイゼーション後、連結反応を行い、ハイブリダイズしたセンサープローブのペアを連結させ、センサープローブペアの両方のメンバーおよび連結部位を含む連結センサープローブを形成させる。１つの具体例において、T4リガーゼを使用するが、別の具体例においては、Taqリガーゼを使用する。もう１つの具体例では、第１プローブの3'末端もしくは第２プローブ5'末端における１つまたはそれ以上の不一致によって、連結反応が行われない。連結センサープローブを、あらゆる適当な方法を用いて増幅すると、生じた増幅連結センサープローブは検出可能な標識を含む。１つの具体例において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応およびセンサープローブ上のプライマー結合部位を用いて行われる。もう１つの具体例において、検出可能な標識は、標識されたdNTPを用いて増幅されたセンサープローブに組み込まれるが、さらに別の具体例においては、標識プライマーを使用する。
【００２２】
それぞれの異なるタイプのセンサープローブのペアについて、少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチドが提供される。検出オリゴヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチドのクラスごとにユニークで、センサープローブの検出可能な標識と異なる、すなわち、区別することができる検出可能な標識を含む。検出オリゴヌクレオチドの少なくとも１部分は、連結および増幅されたセンサープローブとハイブリダイズすることができる。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、さらに連結センサープローブにハイブリダイズしないが、検出オリゴヌクレオチドをマイクロ粒子のごとき標識、例えば、蛍光マイクロビーズまたはマイクロスフェアと結合させるリンカーを含む。１つの具体例において、マイクロ粒子は、少なくとも２つの標識、例えば、２つの異なる蛍光色素を含む。さらなる具体例において、蛍光マイクロビーズまたはマイクロスフェアは、Luminex microsphereである。
【００２３】
標識され、増幅され、連結されたセンサープローブは、検出オリゴヌクレオチドと組み合わせられ、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。必要ならば、増幅センサープローブをハイブリダイゼーションの前に変性させる。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、センサープローブペアの連結部位を含む位置にて、連結センサープローブにハイブリダイズする。対応する連結増幅センサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、あらゆる適当な方法を用いて測定される。１つの具体例において、増幅連結センサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、検出オリゴヌクレオチドに結合したセンサープローブの標識の存在を検出することによって測定される。さらなる具体例において、検出は、フローサイトメーターを用いて行われる。必要であれば、ハイブリダイゼーションの測定は、定量的であってもよい。
【００２４】
もう１つの態様は、一塩基多型(SNP)を含むことが既知であるか推測される、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのテスト集団を提供することを含む、目的の一塩基多型の検出を提供する。該方法を、ポリヌクレオチドの精製された集団、さらなる精製を行っていない細胞溶解物、または部分精製された細胞溶解物（部分精製ポリヌクレオチド）を用いて実施することができる。ポリヌクレオチドは、DNA、cDNA、RNA、mRNA、ポリA RNAまたはそれらの混合物であってもよい。
【００２５】
それぞれの標的ポリヌクレオチドについて、少なくとも１ペアの特異的なセンサープローブが提供され、ここに、該ペアの第１のセンサープローブは標的ポリヌクレオチドに相補的な3'末端およびプライマー結合部位を含む5'末端を有し；該ペアの第２のセンサープローブは標的ポリヌクレオチドに相補的な5'末端およびプライマー結合部位を含む3'末端を有する。もう１つの具体例において、第１のセンサープローブは、共通のプライマー結合部位を有し、第２のセンサープローブも、共通のプライマー結合部位を有する。共通のプライマー結合部位は、全ての第１および第２センサープローブについて同じであっても、第１および第２センサープローブが、第１センサープローブと第２センサープローブとで異なる共通のプライマー結合部位を有していてもよい。１つの具体例において、プライマー結合部位は、標的ポリヌクレオチドに相補的ではない。もう１つの具体例において、センサープローブのそれぞれは、３つの部分からなる。この具体例において、第１の部分は標的ポリヌクレオチドおよび検出オリゴヌクレオチドに相補的であり；第２の部分は標的ポリヌクレオチドに相補的であるが検出オリゴヌクレオチドに相補的ではなく；第３の部分は、共通のプライマー結合部位であってもよく、標的ポリヌクレオチドまたは検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的ではないプライマー結合部位を有する。
【００２６】
ペア中のセンサープローブは、第１プローブの3'末端が第２プローブの5'末端にすぐ隣接した標的ポリヌクレオチド上でハイブリダイズし、第１プローブの3'末端のヌクレオチドもしくは第２プローブの5'末端のヌクレオチドのいずれかが目的のSNPのアリルに相補的なものである。センサープローブが３つの部分を有する場合、各プローブの第１の部分は互いに隣接する。１つの具体例において、センサープローブの第２のペアが提供される。このセンサープローブの第２のペアは、第１のペアと同じ特性を有し、同じ位置において標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするが、この第２のペアの第１プローブの3'末端、またはこの第２ペアの第２プローブの5'末端のいずれかは、センサープローブの第１のペアの相補的なアリルとは異なる目的のSNPのアリルに相補的である。
【００２７】
標的ポリヌクレオチドは、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下で、センサープローブペアと組み合わせ、センサープローブは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズできるようになる。必要であれば、ハイブリダイゼーションの前に標的ポリヌクレオチドを変性させる。ハイブリダイズしたセンサープローブを、連結し、目的のSNPの部位で不一致があれば連結が起こらない連結部位を含む連結センサープローブを形成させた。第１のセンサープローブの3'末端のヌクレオチドまたは第２のセンサープローブの5'末端のヌクレオチドのいずれかと相補的なSNPアリルが存在すれば、連結は起こらない。１つの具体例において、T4リガーゼを使用するが、もう１つの具体例においては、Taqリガーゼを使用する。首尾よく連結されたセンサープローブを、あらゆる適当な方法によって増幅し、検出可能な標識を含む増幅センサープローブである増幅連結センサープローブを得る。１つの具体例において、増幅はポリメラーゼ連鎖反応およびセンサープローブ上のプライマー結合部位によって行われる。もう１つの具体例において、検出可能な標識は、標識されたdNTPを使用して増幅連結センサープローブに取り込まれるが、さらにもう１つの具体例においては、標識プライマーを使用する。
【００２８】
それぞれのタイプのセンサープローブペアについて、検出オリゴヌクレオチドの各クラスが、増幅センサープローブの検出可能な標識とは異なるユニークな検出可能な標識を有する少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチドが提供される。検出オリゴヌクレオチドの少なくとも１部分は、連結および増幅されたセンサープローブとハイブリダイズすることができる。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、さらに、連結センサープローブにハイブリダイズしないが、検出オリゴヌクレオチドをマイクロ粒子のごとき標識、例えば、蛍光マイクロビーズまたはマイクロスフェアと結合させるリンカーを含む。１つの具体例において、蛍光マイクロビーズまたはマイクロスフェアは、Luminex microsphereである。
【００２９】
検出オリゴヌクレオチドと、増幅され連結されたセンサープローブは、組み合わせられ、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。必要であれば、増幅連結センサープローブをハイブリダイゼーションの前に変性させる。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、連結センサープローブペアの連結部位を含む位置、つまり、目的のSNPの位置を含む位置にて、連結センサープローブにハイブリダイズする。対応する連結増幅センサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、あらゆる適当な方法を用いて測定される。
【００３０】
検出オリゴヌクレオチドの、対応する連結され増幅されたセンサープローブへのハイブリダイゼーションは、あらゆる適当な方法を用いて測定される。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドの、増幅され連結されたセンサープローブへのハイブリダイゼーションは、検出オリゴヌクレオチド標識と結合したセンサープローブ標識の存在を検出することによって測定される。もう１つの具体例において、検出は、フローサイトメーターを使用することによって検出される。必要ならば、ハイブリダイゼーションの測定は、定量的であってもよい。
【００３１】
もう１つの態様は、細胞または組織の生理的もしくは発生的状態を測定するための方法を提供する。この態様は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを含むテスト細胞もしくは組織よりポリヌクレオチドの集団を得ることを含む。１つの具体例において、標的ポリヌクレオチドは、標準的な方法を用いてテスト細胞または組織より単離される。他の具体例において、部分精製または精製されたポリヌクレオチドが使用される。標的ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの発現を、本明細書に記載された方法を用いて測定し、結果を、既知の生理的もしくは発生的状態の参照の細胞または組織より、同じ方法を用いて得られたものと比較する。
【００３２】
さらに別の態様は、目的の疾病、状態、疾患または素因の検査方法を提供する。この態様は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドを含む、テスト患者の細胞または組織よりポリヌクレオチドの集団を得ることを含む。１つの具体例において標的ポリヌクレオチドは、標準的な方法を用いて細胞または組織より単離される。標的ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの発現を、本明細書に記載された方法を用いて測定し、結果を、目的の疾病、状態、疾患または素因を有することが知られている参照の患者の細胞または組織より、同じ方法を用いて得られたものと比較する。
【００３３】
さらに別の態様は、一塩基多型（ＳＮＰ）に関連した疾病、状態、疾患もしくは素因の検査方法を提供する。この態様は、本明細書に記載のいずれかの方法を用いて、テスト患者の細胞または組織よりポリヌクレオチドの集団を得ること、および少なくとも１つの目的のＳＮＰの少なくとも１つのアリルの存在、不在、または頻度を決定することを含む。テスト患者における目的のＳＮＰアリルの存在、不在、または頻度を、前記疾病、状態、疾患または素因を有することが知られている参照の患者より得られた、細胞または組織のポリヌクレオチドの集団におけるアリルの存在、不在、もしくは頻度と比較する。
【００３４】
さらなる態様は、本明細書に開示された方法を実施するためのキットを提供する。該キットは、最小限では、少なくとも１つの目的の標的ポリヌクレオチドについて少なくとも１ペアのセンサープローブ、提供される各ペアのセンサープローブについて、少なくとも１つの検出オリゴヌクレオチド、および本明細書に記載された方法のいずれかを実施するための説明書を含む。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、さらに、マイクロビーズもしくはマイクロスフェアを含む。該キットは、リガーゼ、プライマー、dNTP、ポリメラーゼおよび／またはバッファー溶液を含んでいてもよい。
【００３５】
さらなる具体例は、集団内の遺伝子組み換え細胞または生物の検出方法を提供する。該方法は、１つもしくはそれ以上の遺伝子組み換え細胞または生物を含むとされる集団から、少なくとも１サンプルを得ることを含む。遺伝子組み換え細胞または生物の例は、トランスジーンのごとき異種ヌクレオチド配列を含む植物、動物、細菌、酵母、真菌およびウイルスを含むが、それらに限定されない。ポリヌクレオチドの精製された集団、さらなる精製が行われていない細胞溶解物、または部分精製された細胞溶解物（部分精製されたポリヌクレオチド）を用いて、該方法を実施することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、DNA、cDNA、RNA、mRNA、ポリA RNAまたはそれらの混合物であってもよい。目的の遺伝子組み換え細胞または生物に含まれる少なくとも１つのトランスジーンについて、１ペアの特異的センサープローブが提供され、該ペアの第１プローブはトランスジーンに相補的な3'部分と、プライマー結合部位を有する5'部分を有し；ペアの第２プローブはトランスジーンに相補的な5'部分とプライマー結合部位を含む3'部分を含む。１つの具体例において、第２プローブの5'末端はリン酸化されている。もう１つの具体例において、第１センサープローブは共通のプライマー結合部位を有し、第２のセンサープローブも共通のプライマー結合部位を有する。共通のプライマー結合部位は、第１および第２センサープローブの全てで同じであっても、第１センサープローブと第２センサープローブで異なっていてもよい。１つの具体例において、プライマー結合部位は、トランスジーンに相補的ではない。もう１つの具体例において、センサープローブのそれぞれは、３つの部分を含む。この具体例において、第１の部分はトランスジーンおよび検出オリゴヌクレオチドに相補的であり；第２の部分はトランスジーンに相補的であるが検出オリゴヌクレオチドに相補的ではなく；第３の部分は、共通のプライマー結合部位であってもよいプライマー結合部位を含み、トランスジーンまたは検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的ではないプライマー結合部位を有する。
【００３６】
センサープローブは、トランスジーンにハイブリダイズした際に、第１プローブの3'末端が、第２プローブにすぐ隣接し、２つのプローブ間にギャップがないものである。３つの部分を有するセンサープローブの場合、各プローブの第１の部分は互いに隣接する。必要であれば、集団から得られたポリヌクレオチドを変性させ、次いで、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、または高度にストリンジェントな条件下でセンサープローブのセットと組み合わせ、センサープローブをトランスジーンにハイブリダイズさせる。
【００３７】
ハイブリダイゼーション後、連結反応を行い、ハイブリダイズしたセンサープローブのペアを連結させ、センサープローブペアの両メンバーと連結部位を含む連結センサープローブを形成させる。１つの具体例において、T4リガーゼを使用するが、別の具体例においては、Taqリガーゼを使用する。もう１つの具体例において、第１プローブの3'末端もしくは第２プローブの5'末端における１つもしくはそれ以上の不一致によって、連結反応が行われない。連結センサープローブを、あらゆる適当な方法を使用して増幅することで、生じた増幅連結センサープローブは、検出可能な標識を含む。１つの具体例において、増幅はポリメラーゼ連鎖反応およびセンサープローブ上のプライマー結合部位を用いて達成される。もう１つの具体例において、検出可能な標識は、標識されたdNTPを用いて増幅センサープローブに組み込まれるが、さらに別の具体例においては、標識プライマーが使用される。
【００３８】
それぞれの異なるタイプのセンサープローブのペアについて、少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチドが提供される。検出オリゴヌクレオチドは、そのクラスの検出オリゴヌクレオチドついてユニークで、センサープローブの検出可能な標識と異なる、すなわち、区別することができる検出可能な標識を含む。少なくとも検出オリゴヌクレオチドの一部は、連結および増幅されたセンサープローブにハイブリダイズすることができる。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、さらにリンカーを含み、該リンカーは連結センサープローブとはハイブリダイズしないが、マイクロ粒子のごとき標識、例えば、蛍光マイクロビーズもしくはマイクロスフェアに検出オリゴヌクレオチドを連結させる。１つの具体例において、マイクロ粒子は、少なくとも２つの異なる標識、例えば、２つの異なる蛍光色素を含む。さらなる具体例において、蛍光マイクロビーズもしくはマイクロスフェアは、Luminex microsphereである。
【００３９】
標識された増幅連結センサープローブは、検出オリゴヌクレオチドと組み合わせられ、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる。必要ならば、増幅センサープローブをハイブリダイゼーション前に変性させる。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、連結センサープローブペアの連結部位を含む位置にて、連結センサープローブにハイブリダイズする。対応する、連結され増幅されたセンサープローブへの検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、あらゆる適当な方法を用いて測定される。１つの具体例において、増幅され、連結されたセンサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、検出オリゴヌクレオチドに結合したセンサープローブの標識の存在を検出することによって測定される。さらなる具体例において、検出は、フローサイトメーターを用いて行われる。次いで、ハイブリダイゼーションの測定を用いて、センサープローブペアおよび検出オリゴヌクレオチドに対応するトランスジーンの存在もしくは不在を測定する。必要であれば、ハイブリダイゼーションの測定は、集団内の遺伝子組み換え細胞もしくは生物の量もしくは数を定量できるような、定量なものでもよい。トランスジーンの検出と関連して記載されているが、該方法は、あらゆるポリヌクレオチドの検出に適用可能である。
【００４０】
もう１つの具体例において、該方法を用いて病原体の存在を検出する。この具体例において、ポリヌクレオチドは、対象もしくは組成物より採取された少なくとも１つのサンプルより得られる。サンプル（複数も可）は、植物もしくはヒトを含む動物のごときあらゆる対象に由来してもよい。同様に、あらゆる組成物は、例えば、飼料、食料、生体液、組織、バイオプシー、培養培地、もしくは医薬組成物を使用してもよい。ポリヌクレオチドを含むあらゆる病原体、例えば、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生体を検出できる。
【００４１】
目的の病原体に特徴的な少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列について、１ペアの特異的なセンサープローブが提供され、該ペアの第１プローブは、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な3'部分と、プライマー結合部位を有する5'部分を有し；ペアの第２プローブは、標的ポリヌクレオチド配列に相補的な5'部分とプライマー結合部位を含む3'部分を含む。１つの具体例において、第２プローブの5'末端はリン酸化されている。もう１つの具体例において、第１センサープローブは共通のプライマー結合部位を有し、第２のセンサープローブも共通のプライマー結合部位を有する。共通のプライマー結合部位は、第１および第２センサープローブの全てで同じであっても、第１センサープローブと第２センサープローブで異なっていてもよい。１つの具体例において、プライマー結合部位は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的ではない。もう１つの具体例において、センサープローブのそれぞれは、３つの部分を含む。この具体例において、第１の部分は標的ポリヌクレオチド配列および検出オリゴヌクレオチドに相補的であり；第２の部分は標的ポリヌクレオチド配列に相補的であるが検出オリゴヌクレオチドに相補的ではなく；第３の部分は、共通のプライマー結合部位であってもよいプライマー結合部位を含み、標的ポリヌクレオチド配列または検出オリゴヌクレオチドのいずれとも相補的ではないプライマー結合部位を有する。
【００４２】
センサープローブは、トランスジーンにハイブリダイズしたときに、第１プローブの3'末端が第２プローブに、２つのプローブ間にギャップなくすぐ隣接するものである。３つの部分を有するセンサープローブの場合、各プローブの第１の部分は互いに隣接する。必要であれば、集団から得られたポリヌクレオチドを変性させ、次いで、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、または高度にストリンジェントな条件下でセンサープローブのセットと組み合わせ、センサープローブをトランスジーンにハイブリダイズさせる。
【００４３】
ハイブリダイゼーション後、リガーゼ反応を行い、ハイブリダイズしたセンサープローブのペアを連結し、センサープローブペアの両方のメンバーおよび連結部位を含む連結センサープローブを形成させる。１つの具体例において、T4リガーゼを使用するが、別の具体例においては、Taqリガーゼを使用する。もう１つの具体例では、第１プローブの3'末端もしくは第２プローブ5'末端における１つまたはそれ以上の不一致によって、連結反応が行われない。連結センサープローブを、あらゆる適当な方法を用いて増幅すると、生じた増幅連結センサープローブは検出可能な標識を含む。１つの具体例において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応およびセンサープローブ上のプライマー結合部位を用いて行われる。もう１つの具体例において、検出可能な標識は、標識されたdNTPを用いて増幅されたセンサープローブに組み込まれるが、さらに別の具体例においては、標識プライマーを使用する。
【００４４】
それぞれの異なるタイプのセンサープローブのペアについて、少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチドが提供される。検出オリゴヌクレオチドは、そのクラスの検出オリゴヌクレオチドついてユニークであり、センサープローブの検出可能な標識と異なる、すなわち、区別することができる検出可能な標識を含む。少なくとも検出オリゴヌクレオチドの一部は、連結され増幅されたセンサープローブにハイブリダイズすることができる。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、さらにリンカーを含み、該リンカーは連結センサープローブとはハイブリダイズしないが、マイクロ粒子のごとき標識、例えば、蛍光マイクロビーズもしくはマイクロスフェアに検出オリゴヌクレオチドを連結させる。１つの具体例において、マイクロ粒子は、少なくとも２つの異なる標識、例えば、２つの異なる蛍光色素を含む。さらなる具体例において、蛍光マイクロビーズもしくはマイクロスフェアは、Luminex microsphereである。
【００４５】
標識増幅連結センサープローブは、検出オリゴヌクレオチドと組み合わせられ、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。必要ならば、増幅センサープローブをハイブリダイゼーション前に変性させる。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、連結センサープローブペアの連結部位を含む位置にて、連結センサープローブにハイブリダイズする。対応する、連結増幅センサープローブへの検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、あらゆる適当な方法を用いて測定される。１つの具体例において、増幅連結センサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、検出オリゴヌクレオチドに結合したセンサープローブの標識の存在を検出することによって測定される。さらなる具体例において、検出は、フローサイトメーターを用いて行われる。次いで、ハイブリダイゼーションの測定を、センサープローブペアおよび検出オリゴヌクレオチドに対応する標的ポリヌクレオチド配列の存在もしくは不在を測定し、病原体を同定する。必要であれば、ハイブリダイゼーションの測定は、存在する病原体の量もしくは数を定量できるような、定量的なものでもよい。
【００４６】
これらの、およびその他の本発明の特徴、態様および利点は、以下の記載、添付の請求項および付属の図面に関連してより理解されるだろう。
【００４７】
（詳細な記載）
以下の詳細な記載は、当業者が本発明を実施するのを補助するために提供される。それでも、この詳細な説明は、本発明を不当に限定するために構築されず、本明細書中で議論される具体例における修正および変化は、当業者によって本発明の範囲を逸脱せず行われうる。
【００４８】
本出願に引用された全ての出版物、特許、特許出願、公共データベース、公共データベースの収録物および他の引用文献は、それぞれの個々の出版物、特許、特許出願、公共データベース、公共データベースの収録物および他の引用文献が明確かつ個々に参照により組み込まれると示されるかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４９】
本発明の態様は、核酸の解析における新しい使用方法を提供する。これらの方法は、遺伝子発現解析のごとき発現解析に特に有用である。さらなる態様は、一塩基多型（SNP）の検出方法を提供する。SNPは、植物およびヒトを含む動物において、遺伝疾患および素因を検査することのみならず、役立つ表現型の同定のための使用、ならびにマーカーアシスト選抜における使用を含む多様な用途を有する。さらなる用途は、遺伝子組み換え生物もしくはトランスジーンの検出、および病原体の検出を含むがそれらに限定されない。多重能力（multiplex capabilities）の提供に加えて、該方法は適応性が高く、使いやすく、コスト効率がよい。
【００５０】
本明細書で使用される「SNP」は、一塩基多型を意味する。
【００５１】
本明細書で使用される「MFI」は、平均蛍光強度を意味する。
【００５２】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、リボヌクレオチドかデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、あらゆる長さのヌクレオチドの重合体（２つもしくはそれ以上の単量体からなる）形態を意味する。特に規定されていないが、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、5'末端および3'末端を有するとされる。ヌクレオチドは、通常ホスホジエステル結合によって結合しているが、この語は、アミノエチルグリシンユニットより構成される中性アミド骨格結合を含む重合体ヌクレオチドのごときペプチド核酸も含む(Nielsen et al., Science, 254: 1497,1991)。この語は、分子の１次構造のみを意味する。よって、この語は、二本鎖および一本鎖DNAおよびRNA、さらに、一本鎖であってもよく、より典型的には二本鎖であるDNA/RNAハイブリッドも意味する。さらに、この語は、RNAもしくはDNA、またはRNAとDNA両方を含む三本鎖領域も意味する。かかる領域の鎖は、同じ分子もしくは異なる分子より由来してもよい。該領域は、全てまたは１つもしくはそれ以上の分子を含んでいてもよいが、より典型的には、分子のいくつかの領域のみを含む。この語は、既知の種類の修飾、例えば、標識、メチル化、「キャップ」、１つもしくはそれ以上の元からあるヌクレオチドの類似体との置換、ヌクレオチド間の修飾、例えば、無電荷の結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）での修飾、ペンダント（pendant）部分を含むもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等を含む）、インターカレーターを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレン等）、アルキレーターを含むもの、修飾された結合を有するもの（例えば、αアノマー核酸等）、さらに、ポリヌクレオチドの未修飾型も含む。ポリヌクレオチドは、センスおよびアンチセンスの両方、またはコードおよび鋳型鎖を含む。この語は、天然に存在する、または化学合成された分子を含む。
【００５３】
「検出可能な標識」という語は、結合すると検出手段を提供する標識を意味する。この目的のための利用可能な標識は多様であり、放射性核種のごとき放射性標識、フルオロフォアもしくは蛍光色素、ペプチド、酵素、抗原、抗体、ビタミンまたはステロイドを含むがそれらに限定されない。例えば、32Pもしくは35Sのごとき放射性核種、または蛍光色素は、PCRプライマーの標識に従来使用されている。化学発光色素も、この目的で使用することができる。標識は、目的の分子に直接また結合していても、リンカーを介して結合していてもよい。適当な標識のより特定な具体例は、キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、シアニン３、シアニン５、フィコエリスリンコンジュゲートストレプトアビジン、アレクサ（Alexa）532、テトラメチルローダミン、蛍光ヌクレオチド、ジゴキシゲニン、およびビオチンデオキシウラシル３リン酸を含む。いくつかの具体例と同様に、核酸は、インターカレート色素、例えば、YOYO、TOTO、Picogreen、エチジウムブロマイド、およびそれらの類似物を用いて標識されてもよい。
【００５４】
本明細書で使用される「配列」という語は、単量体が重合体を生じる線形順序、例えば、ポリペプチドにおけるアミノ酸の順序またはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を意味する。
【００５５】
本明細書で使用される「マイクロスフェア」および「マイクロビーズ」という語は、互換的に使用される。
【００５６】
本明細書で使用される「対象」という語は、あらゆる植物または動物を意味する。
【００５７】
本明細書で使用される「動物」という語は、ヒトを含む。
【００５８】
GMOは、遺伝子組み換え生物を意味する。
【００５９】
本明細書で使用される「トランスジーン」とは、分子生物学の技術を用いて細胞もしくは生物に導入された異種のポリヌクレオチド配列を意味する。トランスジーンは、安定に組み込まれてもそうでなくてもよく、生物の生殖細胞系に導入されてもそうでなくてもよい。
【００６０】
本明細書で使用される「異種のDNA配列」、「異種のポリヌクレオチド配列」、「外来性DNA部分」または「異種の核酸」は、特定のホスト細胞に対して外来のソースに由来する配列、または同じソースに由来する場合、元の形態から改変された配列を意味する。従って、ホスト細胞における異種の遺伝子は、特定のホスト細胞について内在性遺伝子であるが、例えば、DNAシャッフリングを用いて改変されたDNA配列を有する遺伝子を含む。この語は、本来存在しない多コピーの、本来存在するDNA配列も含む。よって、この語は、細胞に対して外来もしくは異種の、または細胞に対して同種であるが、ホスト細胞内で通常核酸の存在しない位置にあるDNA部分を意味する。外来性DNA部分を発現させて、外来性ポリペプチドが得られる。
【００６１】
「実質的に純粋な」「実質的に精製された」または「精製された」とは、物質が他の混入したタンパク質、核酸、またはもとのソースの生物に由来する他の生物学的物質を含まないことを意味する。純度は標準的な方法によって分析されてもよく、通常、少なくとも約90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%純粋であろう。「部分精製された」または「部分的に純粋な」とは、物質が、少なくとも5%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、または少なくとも85%純粋であることを意味する。分析は、重量またはモルパーセントによるものであってもよく、また、ゲル染色、分光光度法もしくは末端標識等によって評価されてもよい。未精製とは、精製されていないか、または部分精製されていることを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」または「ＰＣＲプライマー」とは、天然に存在するものを制限酵素消化し精製したものか、人工的に製造されたもののいずれかのオリゴヌクレオチドであって、適当な条件下で鋳型DNAもしくはRNA分子にハイブリダイズして、例えば、DNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ、もしくはRNA依存性DNAポリメラーゼによる重合によってプライマーの伸長を開始し、鋳型分子に相補的なDNAもしくはRNA分子を得ることのできるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、長さが、しばしば約５ないし約５０、典型的には約１０ないし約３０、より典型的には約１８ないし約２５ヌクレオチドであり、普通は、パリンドローム配列またはダイマーの形成を起こす配列を含まない。たいてい、プライマーは１本鎖であるが、プライマー伸長に使用する前に鎖を処理し、分離するならば、２本鎖プライマーを使用してもよい。
【００６３】
本発明のいくつかの態様において、標的ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチド配列もしくはトランスジーンが提供される。本明細書で使用される、標的ポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチド配列を互換的に使用できる。標的ポリヌクレオチドまたは挿入遺伝子は、DNAもしくはRNAであってよい。さまざまタイプのDNAおよびRNA、例えば、mRNA、cRNA、ウイルスRNA、合成RNA、cDNA、ゲノムDNA、ウイルスDNA、プラスミドDNA、合成DNA、増幅DNAまたはそれらのいずれかの組み合わせを使用することができる。標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンを、核酸を含むあらゆるソースより得ることができる。ソースは、典型的には、原核および真核、例えば、細菌、酵母、真菌、植物および動物の細胞および組織を含む。標的ポリヌクレオチドを、ウイルスからも得ることができる。組織とは、本来の状態では、まとまって、１つもしくはそれ以上の特定の機能をする多数の細胞を意味する。組織の非限定的な例は、筋組織、心組織、神経組織、葉組織、茎組織、根組織等を含む。標的ポリヌクレオチドもしくはトランスジーンを得るための細胞は、半数体、２倍体、または倍数体であってよい。
【００６４】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が、塩基対を介して相補鎖と結合するプロセスをいう。ハイブリダイゼーションの技術および条件は、当業者によく知られている。２本鎖の核酸分子をハイブリダイゼーションに使用する場合、ハイブリダイゼーション前に、２本鎖分子を、熱または化学変性によって１本鎖にすることもよく知られている。本明細書で使用される、ハイブリダイゼーションは、必要であれば、かかる変性を特別に言及するかどうかにかかわらず、かかる変性を含む。
【００６５】
一態様は、ポリヌクレオチドの発現、例えば、遺伝子発現を測定するための方法を提供する。測定は、必要であれば、定量的であってもよい。この方法において、試験ポリヌクレオチド、例えば、DNAもしくはRNAの集団が提供される。ポリヌクレオチドの集団を、あらゆるソースより得ることができる。例えば、ポリヌクレオチドを、植物もしくは動物の細胞または組織より単離することができる。１つの具体例において、ポリヌクレオチドは、単離または精製される。もう１つの具体例において、細胞溶解物を、溶解物に含まれるポリヌクレオチドをさらに精製することなく使用する。さらにもう１つの具体例において、本明細書に記載された方法にて使用する前に、ポリヌクレオチドを部分精製する。ポリヌクレオチドの単離および精製方法は当業者によく知られており、標準的なテキスト、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に示されている。
【００６６】
ポリヌクレオチドの集団は、１つもしくはそれ以上の目的の標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンを含み、標的ポリヌクレオチドは既知の核酸配列を含む。１つの具体例において、ポリヌクレオチドの集団は、少なくとも20の異なる標的ポリヌクレオチドを、もう１つの具体例においては少なくとも50の異なる標的ポリヌクレオチドを、さらにもう１つの具体例においては少なくとも100の異なるポリヌクレオチドを含む。当業者に明らかなように、集団の全てのポリヌクレオチドの配列が既知である必要はない。同様に、標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンの完全な配列も既知である必要はないが、標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンの配列の一部だけは既知である必要がある。
【００６７】
各標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンについて、少なくとも１ペアの特異的センサープローブが提供される。特異的センサープローブは、使用される条件下でセンサープローブが集団内の１つの標的分子にのみ優先的にハイブリダイズするように選択される。必要であれば、１ペア以上のセンサープローブを使用できることは明らかであろう。つまり、特定の標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンについて、標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーン上の異なる位置にてハイブリダイズする、または異なる条件下でハイブリダイズする異なるセンサープローブペアを使用することができる。ペアの１つのメンバーの3'部分が標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンに相補的であり、該ペアの他のメンバーが標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンに相補的な5'部分を有するように、センサープローブの各ペアを選択する。各センサープローブは、典型的に、プライマー結合部位（配列）も含む。１つの具体例において、プライマー結合部位は、標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンに相補的ではないか、最低限に相補的である。さらに、プライマー結合部位は、検出オリゴヌクレオチドに相補的であってもなくてもよい。もう１つの具体例において、センサープローブは共通のプライマー結合部位を有する。共通のプライマー結合部位は、全てのセンサープローブについて同じであってもよい。別の具体例において、プライマープローブペアの各タイプの第１のメンバーは、共通のプライマー結合部位を共有するが、プライマープローブペアの各タイプの第２のメンバーも、各ペアの第１メンバーの共通のプライマー結合部位とは異なる、共通のプライマー結合部位を共有する。共通のプライマー結合部位の使用により、使用しなければならないプライマー数が大幅に減少する。もう１つの具体例において、センサープローブのそれぞれは、３つの部分を含む。この具体例において、第１の部分は標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンおよび検出オリゴヌクレオチドに相補的であり；第２の部分は標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンに相補的であるが検出オリゴヌクレオチドには相補的ではなく；第３の部分は、共通のプライマー結合部位であってもよいが、標的ポリヌクレオチド／トランスジーンまたは検出オリゴヌクレオチドのいずれもと相補的ではないプライマー結合部位を含む。
【００６８】
センサープローブは、標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンにハイブリダイズする際に、ペアの１つのメンバーの3'末端がペアの他のメンバーの5'末端にすぐ隣接するようにも選択される。すぐに隣接するとは、ペアの１つのメンバーの3'末端とペアの他のメンバーの5'末端の間にギャップがないことを意味する。各センサープローブが３つの部分を含む１つの具体例において、センサープローブは、標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンにハイブリダイズした際に、センサープローブペアの各メンバーの第１の部分が互いにすぐ隣接するように選択される。
【００６９】
１つの具体例において、標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンに相補的なセンサープローブの部分は、長さ約１５ないし約３０ヌクレオチドであり、もう１つの具体例においては、長さ約１８ないし２４ヌクレオチドであり、さらに別の具体例においては長さ約２０ヌクレオチドである。１つの具体例において、プライマー結合部位は約１５ないし約２０ヌクレオチド長であり、さらにもう１つの具体例においては、約１８ヌクレオチド長である。
【００７０】
次いで、標的ポリヌクレオチドまたは目的のトランスジーンを含むポリヌクレオチドの集団を、標的ポリヌクレオチドとセンサープローブのハイブリダイゼーションを許容する条件下で、特異的センサープローブのペアと組み合わせる。必要であれば、ハイブリダイゼーションの前に、当業者に知られたあらゆる方法、例えば、熱もしくは化学変性を用いて、標的ポリヌクレオチドを変性させる。ハイブリダイゼーション条件は、ややストリンジェント、ストリンジェント、または高度にストリンジェントであってもよい。１つの具体例において、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行われる。
【００７１】
当業者に知られているように、ストリンジェンシーは、ハイブリッド形成のTmと関連する。核酸ハイブリッドのTm（融解温度）は、50%の塩基が塩基対となる温度である。例えば、ハイブリッド中の１つのパートナーが約２０塩基の短いオリゴヌクレオチドであれば、典型的には、２本鎖の50%はそのTmにて分離鎖となる。この場合、Tmはオリゴヌクレオチドの濃度に依存する時間独立的平衡を反映する。それに対して、両鎖がより長い場合、Tmは、両鎖が、別の２本鎖および変性領域含みうる構造にて一緒になっている状況に対応する。この場合、Tmは時間およびポリヌクレオチド濃度に独立した分子内平衡を反映する。
【００７２】
当業者によく知られているように、Tmは、ポリヌクレオチドの組成（例えば、長さ、２本鎖のタイプ、塩基組成、および正しい塩基対の量）および溶媒の組成（例えば、塩濃度およびホルムアミドのごとき変性剤の存在）に依存する。Tmの計算についての式は、Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, 1989)で見られ、以下の式：
Tm = 81.5℃-16. 6(log10[Na+]) + 0.41 (% G + C) -0. 63 (% ホルムアミド)-600/L)
（式中：Lは塩基対におけるハイブリッドの長さであり、Na+の濃度は0.01Mないし0.4Mの範囲であり、G + C含量は30%ないし75%の範囲である。）
である。RNAを含むハイブリッドについての等式は、同じ文献で見られる。別の式は、Davis etal., Basic Methods in Molecular Biology, 2nd ed., Appleton and Lange, 1994, Sec 6-8で見られる。
【００７３】
ハイブリダイゼーションおよび洗浄の方法は、当業者によく知られており、本明細書で引用されている分子生物学の標準的な文献において見られる。一般的に、ハイブリダイゼーションは、通常、高いイオン強度(6X SSC or 6X SSPE)の溶液中で、Tmより20~25℃低い温度にて行われる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の特定の例は、42℃にて5X SSPE、50% ホルムアミドまたは68℃にて5X SSPEを含む。ストリンジェントな洗浄条件は、たいてい、予備試験にて経験的に決定されるが、通常、Tmより約12〜25℃低い温度および塩の組み合わせを含む。高度にストリンジェントな洗浄条件の例は、60℃で、1X SSCである。非常に高度にストリンジェントな洗浄条件は、４２℃で、0.1X SSPE, 0.1% SDSである (Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984)。極度にストリンジェントな洗浄条件の例は、50〜65℃で、0.1X SSPE, 0.1% SDSである。当業者によく認識されているように、様々な要素の組み合わせによって、実質的に等しいストリンジェンシーの条件が生じうる。かかる等しい条件は、本発明の開示の範囲内である。
【００７４】
標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンへのセンサープローブのハイブリダイゼーションに次いで、互いにすぐ隣接した標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンにハイブリダイズしたセンサープローブのペアを、互いに連結し、連結センサープローブを形成させる。使用した連結条件は、好ましくは、センサープローブのペアの隣接した3'と5'末端間の１つの不一致の存在により連結が起こるのを妨げるものである。当業者に知られたあらゆる適当なリガーゼを使用することができる。１つの具体例において、T4リガーゼを使用する。もう１つの具体例において、Taqリガーゼを使用する。T4 DNAリガーゼは、RNAにハイブリダイズしたDNAオリゴヌクレオチドの連結を触媒でき(Kleppe, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 67: 68-73, 1970)、この連結により、標的とプローブ間の１塩基の不一致を区別できる(Nilsson, et al., Nature Biotech. 18: 791-793, 2000)ことが、以前から当業者に認識されていた。TaqDNAリガーゼは、細胞溶解物および部分精製されたポリヌクレオチドに特に有用であることがわかっている。
【００７５】
連結したセンサープローブを増幅して、増幅したセンサープローブを得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR) (米国特許第4,965,188号；4,800,159号；4,683,202号；4,683,195号)、リガーゼ連鎖反応(Wu and Wallace, Genomics, 4: 560-569, 1989 ; Landegren et al., Science, 241: 1077- 1080, 1988)、転写増幅(Kwoh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173-1177, 1989)、自己維持連続複製（self-sustained sequenced replication）(Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874- 1878, 1990)および核酸に基づく連続増幅（nucleic acid based sequence amplification）(NASBA)を含むがそれらに限定されない、あらゆる既知の増幅方法を使用してもよい。１つの具体例において、増幅はPCRによって行われる。
【００７６】
PCRのごときプライマーに基づく増幅を使用する場合、センサープローブ上のプライマー結合部位、例えば、共通のプライマー結合部位を利用することができる。プライマー部位が異なる標的分子に対するセンサープローブ間で共通である場合、単一のプライマーまたはプライマーのセットを使用することができる。これは、同じ結合条件下での異なるプライマーの結合効率の違いのために生じうる増幅における偏りを制限する。この偏りの現象または消失によって、増幅が定量的になる。連結センサープローブ上の２つのプライマー結合部位の存在によって、連結センサープローブの優先的な増幅が可能になる。従って、連結センサープローブは指数関数的に増幅するが、非連結センサープローブは、増幅しないか直線的にしか増幅しない。
【００７７】
１つの具体例において、増幅センサープローブは検出可能な標識またはマーカーを含む。１つの具体例において、検出可能な標識またはマーカーは、増幅中に増幅センサープローブに組み込まれる。この具体例において、１つまたは両方が標識を含むプライマー；標識されたヌクレオシド３リン酸（ＮＴＰｓ）；または標識プライマーおよびＮＴＰの組み合わせの使用によって、標識を組み込むことができる。当業者であれば、過度の実験をせずに、どの標識を特定の実験条件に合わせて使用すべきか決定できるだろう。ある具体例において、標識はビオチン−デオキシウラシル３リン酸およびフィコエリスリンをコンジュゲートしたストレプトアビジンである。
【００７８】
本発明はまた、センサープローブのそれぞれの異なるペアについて、特定の標的ポリヌクレオチドまたはトランスジーンのためのセンサープローブを識別することができる、少なくとも１つのクラスの検出オリゴヌクレオチドを提供する。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドがセンサープローブの特定のグループを識別する能力は、特定の検出オリゴヌクレオチドのクラスに結合した検出可能な標識またはマーカーの存在による。検出可能な標識は、直接検出オリゴヌクレオチドに結合していても、リンカー分子を介していてもよい。この具体例において、検出可能な標識は様々であり、使用される検出オリゴヌクレオチドのクラスごとにユニークである。よって、例えば、20の標的ポリヌクレオチドが検出される実験において、少なくとも、20のクラスの検出オリゴヌクレオチドであって、各クラスが異なる標識を含むものが使用される。検出オリゴヌクレオチドとともに使用される検出可能な標識またはマーカーは、増幅センサープローブとともに使用される検出可能な標識またはマーカーと異なるものでなければならない。異なるとは、標識が、例えば、発光スペクトルに基づいて、互いに区別できることを意味する。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、長さ約18ないし30ヌクレオチドである。もう１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、約24ヌクレオチド長である。
【００７９】
１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、さらにマイクロビーズもしくはマイクロスフェアを含む。１つの具体例において、マイクロビーズは、リンカー、例えば、5'amino-unilinker (Oligo Etc. , Wilsonville, OR)によってオリゴヌクレオチドに結合している。マイクロビーズもしくはマイクロスフェアを使用する場合、検出オリゴヌクレオチドの同定は、異なる大きさ、形および／または色（標識）のマイクロビーズもしくはマイクロスフェアを用いて達成されてもよい。マイクロビーズは、大きさ約0.1μMないし約1000μM、通常は約1ないし約100μM、典型的には、約2ないし約50μM、より典型的には、約3ないし約25μM、普通は、約6ないし約12μMの範囲であってよい。マイクロビーズは、臭素化ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、ポリブタジエン、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリジメチルシロキサン、ポリイソプレン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリ塩化ビニリデン、ポリジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート、ポリラクチド、ポリグリコリド、ラクチド−グリコリド共重合体(poly (lactide- co-glycolide))、ポリ無水物、ポリオルソエステル、ポリホスファゼン、ポリホスファゼ、ポリスルホン、またはそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されないあらゆる適当な材料から作られてよい。他のポリマー材料、例えば、炭水化物、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アガー、ゲル、タンパク質のポリマー、ポリペプチド、真核および原核細胞、ウイルス、脂質、金属、樹脂、ラテックス、ゴム、シリコン、例えば、ポリジメチルジフェニルシロキサン、ガラス、セラミック、炭、 カオリナイト、ベントナイト、およびそれらの類似物も使用できる。１つの具体例において、市販のLuminex microsphere (Luminex Corp., Austin, TX)を使用する。
【００８０】
Luminex microsphereは、米国特許第6,268,222号およびPCT出願WO 99/37814およびWO 01/13120において、広く議論されている。簡単に説明すると、マイクロスフェアは、１つもしくはそれ以上の蛍光色素で染色されたナノ粒子重合体を組み込んだマイクロ粒子である。所定の集団における全てのナノ粒子は、同じ濃度の色素で染色され、既知量のこれらのナノ粒子を、異なる色素で染色された既知量の他のナノ粒子とともにマイクロスフェアへ組み込むことによって、多重蛍光マイクロスフェアが生じる。異なるナノ粒子の集団の量および比を変化させることによって、ユニークな発光スペクトルの多数の別々のマイクロスフェアの集団を確立し、区別することができる。使用した蛍光色素は、発光波長が550 nmと900 nmの間であるシアニン色素として知られる通常のクラスのものである。これらの色素はメチン基を含んでいてもよい；多くのメチン基は、色素の発光特性に影響を及ぼす。モノメチン色素であるピリジンは、典型的に、青から青緑の蛍光発光をするが、キノリンは緑から黄緑の蛍光発光をする。トリメチン色素類似体は、実質的には、赤い波長方向にシフトし、ペンタメチン色素はさらにシフトし、しばしば赤外蛍光発光を示す。しかしながら、ビーズの組成と相性のよいあらゆる色素を使用できる。
【００８１】
本明細書に記載される方法の実施において、多くの異なるマイクロビーズもしくはマイクロスフェアを使用する場合、色素が、同じか部分的に一致する励起スペクトルを有しながら異なる発光スペクトルを有することが好ましいが、必須ではない。多くのクラスまたは集団の粒子が２つの色素から生じうる。例えば、赤／オレンジの色素を有するナノ粒子の集団の割合は、割合の十分な増分によって変化することから、得られた割合は、前の割合と視覚的に重複することはない。このようにして、多数の異なる蛍光マイクロビーズのクラスが生じる。
【００８２】
検出オリゴヌクレオチドは、当業者に知られたあらゆる適当な方法によってマイクロビーズに連結していてもよい。厳密な連結方法は、マイクロビーズの組成、およびリンカーが存在すればそのタイプによって多様であろう。１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドは、よく知られたカルボジイミドカップリング手順によりマイクロビーズに結合する。多数の検出オリゴヌクレオチドが、１つのマイクロビーズに連結していてもよい。同じ標識もしくは蛍光サインを有する同じクラスもしくはグループのマイクロビーズは、同じセンサープローブペアに特異的な検出オリゴヌクレオチドを有することから、それらに同じ標的ポリヌクレオチドもしくはトランスジーンは結合するだろう。標的ポリヌクレオチドもしくはトランスジーンへの、検出オリゴヌクレオチドの結合は、センサープローブを用いて達成される。いくつかの具体例において、１グループ以上のセンサープローブペアを、１つの標的ポリヌクレオチドに導入してもよい。その場合、１つのクラスのマイクロビーズに結合した検出オリゴヌクレオチドの配列は異なるものでもよいが、全ての配列は同じ標的ポリヌクレオチドもしくはトランスジーンに結合するだろう。
【００８３】
増幅連結センサープローブに検出オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせるために、検出オリゴヌクレオチドは、検出オリゴヌクレオチドの少なくとも１部分が増幅センサープローブの１部分に相補的であり、同様に、標的ポリヌクレオチドもしくはトランスジーンに相補的なものである。増幅センサープローブの変性の後、必要であれば、ハイブリダイゼーションを、典型的には、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、または高度にストリンジェントな条件下で行う。１つの具体例において、増幅センサープローブへの検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で行われる。もう１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする増幅センサープローブの部分は、センサープローブペアのメンバーが増幅前に連結された連結部位を含む。この方法では、うまく連結したセンサープローブペアへの検出オリゴヌクレオチドの好ましいハイブリダイゼーションにあわせて、条件を修正することができる。当業者によく知られているように、使用される正確な条件は、使用されるセンサープローブペアおよび検出オリゴヌクレオチドの組成によって変化する。ハイブリダイゼーションの条件の最適化は、当該分野においてルーチンであり、当業者であれば、本明細書で提供される指示および分子生物学の標準的な参照テキストを使用して、必要以上の実験をせずに達成することができる。
【００８４】
連結および増幅センサープローブにハイブリダイズした検出オリゴヌクレオチドの同定、および必要であれば定量は、検出可能な標識を用いて達成される。ハイブリダイゼーションの成功により、増幅センサープローブに連結した標識、および検出オリゴヌクレオチドに連結した標識の両方を含む分子が生じる。１つの具体例において、元のポリヌクレオチドの集団における、それぞれの標的ポリヌクレオチドもしくはトランスジーンの存在が、検出オリゴヌクレオチドに連結した標識をもとに測定され、それぞれの標的の量は、核クラスの検出オリゴヌクレオチドに連結したセンサープローブの量を計ることによって測定されることができる。標識の存在、および必要であればその量の測定は、単一の測定装置を用いて、本質的には同時に行われるか、または、異なる測定装置を用いて順次に行われる。例えば、検出オリゴヌクレオチドは、ユニークな標識に基づいて同定され、分類されることができる。分類の後、各クラスの検出オリゴヌクレオチドに連結したセンサープローブ標識の量を測定し、そのことにより、もとのポリヌクレオチドの集団に存在する各標的ポリヌクレオチドの同定および定量が可能になる。もう１つの具体例において、フローサイトメーターのごとき装置を用いて、各検出オリゴヌクレオチドを別々に解析し、そのユニークなマーカーに基づいて同定することができる。次いで、検出オリゴヌクレオチドを解析し、増幅センサープローブの存在を測定する。センサープローブ標識が存在すれば、検出分子に連結した標的ポリヌクレオチドについてのイベントが記録される。
【００８５】
１つの具体例において、検出オリゴヌクレオチドおよびセンサープローブ標識は、発光スペクトルの違いに基づいて区別される。この具体例において、固体検出器、光電子増倍管、写真フィルム、または目を含む、２つの標識のスペクトルの特徴における違いを検出するあらゆる検出システムを使用することができ、それらはいずれも、さらなる計測装置、例えば、分光器、ルミノメーター顕微鏡、プレートリーダー、蛍光スキャナー、フローサイトメーターもしくはそれらのいずれかの組み合わせとともに使用してもよい。 
【００８６】
標識間の区別が視覚検査によって行われる場合、好ましくは、標識は、視覚識別をしやすくするために、認知できる位異なる色の発光波長を有する。機器を用いて標識を区別することが望ましい場合、様々なフィルターおよび回折格子によって、それぞれの最大発光が独立して検出できる。
【００８７】
検出オリゴヌクレオチドが蛍光マイクロビーズを含む１つの具体例において、フローサイトメーター、例えば、混合物中の異なるクラスのビーズを、蛍光色素の同一性、各クラスのビーズのサイズおよび／または形に基づいて、互いに物理的に分離することができ；標的ポリヌクレオチドの存在を、特定のクラスのビーズを含むそれぞれの分離されたプールについて、検出可能な標識の存在に基づき、質的もしくは量的に測定することのできる蛍光活性化セルソーターを用いて、検出オリゴヌクレオチドを区別することができる。検出オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたセンサープローブに含まれる分子および標識の両方を検出できるあらゆるフローサイトメーターを使用できる。多数の励起レーザーおよび検出器を有するフローサイトメーターが好ましい。１つの具体例において、Luminex 100システムが使用される。当業者によく知られている様に、最適な検出に必要な厳密な設定は、使用する機器、使用する標識、および使用する粒子のごとき要素によって多様である。当業者であれば、不必要な実験を行わずに、本明細書に開示された方法を実施するためのフローサイトメーターの使用のための設定および条件の最適化を行うことができる。フローサイトメーターの使用についての一般的な手引きを、Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd ed., Wiley-Liss, 1995 および Jaroszeski et al., Flow Cytometry Protocols, Humana Press, 1998のごときテキストに記載されている。蛍光マイクロビーズおよびフローサイトメトリーの使用例は、Smith et al., Clin. Chem., 44: 2054-2056, 1998に記載されている。フローサイトメトリーの使用は、特に、２以上のクラスの検出オリゴヌクレオチドを使用して、同時に複数の標的ポリヌクレオチドの存在を測定する場合に有用である（複合解析）。
【００８８】
本明細書に記載された方法を、核酸の精製された分離物、部分精製された分離物、またはほとんどもしくは全く精製工程を行っていない粗製の細胞溶解物を用いて行うことができる。粗製の細胞溶解物は、細胞膜および／または細胞壁を破壊し、ポリヌクレオチドを放出させることのできる、当該分野で知られたあらゆる方法もしくはそれらの組み合わせを用いて得られる。例えば、それだけに限定しないが、細胞膜および／または壁を破壊する界面活性剤もしくは変性剤のごとき化学的な方法、浸透圧ショック、凍結および融解、粉砕、ホモジェナイゼーション、超音波処理、またはこれらと他の方法のあらゆる組み合わせを用いて溶解物を得てもよい。必要であれば、溶解物は、粒子状物質および細胞の残骸を除去するための遠心分離のごとき最小限の精製を受けることができる。より高い純度を望む場合、溶解物中のポリヌクレオチドを、当該分野で知られたあらゆる方法、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed, Wiley and Sons, 1992; および Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載の方法を用いて、部分精製もしくは精製することができる。典型的には、ポリヌクレオチドの部分精製された調製物は、約５％ないし約８５％の純度を有し、精製された調製物は、典型的には、約８６％ないし約９９％の純度を有するであろう。
【００８９】
本明細書に記載の方法を、一塩基多型（SNP）を検出するために使用することもできる。SNPの検出は、前記の方法にごくわずかな修正をすることで達成されうる。SNPの検出のために、ポリヌクレオチドの集団を得て、該集団は、少なくとも１つのSNPを有する１つもしくはそれ以上の標的ポリヌクレオチドを含む、もしくは含むとされる。ポリヌクレオチドは、さらなる精製を行っていない細胞溶解物中に含まれるか、あるいは、ポリヌクレオチドは、精製もしくは部分精製されうる。SNPの検出のために、センサープローブのペアが提供され、各ペアの第１プローブは標的ポリヌクレオチドに相補的な3'末端を有し、第２プローブは標的ポリヌクレオチドに相補的な5'末端を有する。各ペアのセンサープローブは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした際に、第１プローブの3'末端が第２プローブの5'末端にすぐ隣接するように設計される。さらに、SNPの検出のために、第１プローブの3'末端もしくは第２プローブの5'末端のいずれかの末端ヌクレオチドは、目的のSNPのアリルの１つに相補的である。１つの具体例において、異なるセンサープローブペアを使用して、同じSNPの別のアリルの存在を検出することができる。この具体例において、１セットのセンサープローブは、目的のSNPの１つのアリルに相補的な末端ヌクレオチドを有し、さらなるセットのセンサープローブは、目的のSNPの別のアリル（単数もしくは複数）に相補的な末端ヌクレオチドを有する。
【００９０】
ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下での、標的ポリヌクレオチドへのセンサープローブペアのハイブリダイゼーションに次いで、第１プローブの3'末端もしくは第２プローブの5'末端のいずれかに１つの不一致があれば連結が起こらないような条件下で、センサープローブを互いに連結させ、連結センサープローブを形成させる。次いで、本明細書に記載のように、連結センサープローブを増幅し、増幅センサープローブが検出可能な標識を含むようにする。用いたセンサープローブの各ペアについて、前記の特徴を有する検出オリゴヌクレオチドを提供する。必要であれば、増幅連結センサープローブを変性して、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。次いで、増幅連結センサープローブへの検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、本明細書に記載の方法のいずれかを用いて行う。次いで、目的のSNPのアリルの存在、不在もしくは頻度を、検出オリゴヌクレオチドの同一性に基づいて測定する。
【００９１】
本発明の方法によって、対象が目的のSNPの特定のアリルについてホモ接合であるかヘテロ接合であるかを決定することができる。例えば、センサープローブが２つの可能なアリルのうちの１つだけに提供される場合、アリルが存在しなければ、バックグラウンドを超えるシグナルは得られないだろう。対象がアリルについてホモ接合である場合には、最大のシグナルが得られ、対象がヘテロ接合である場合には、ホモ接合の個体で見られたものの約半分のシグナルが得られるであろう。２つの別個のアリルのそれぞれにプローブが提供されるもう１つの例において、ヘテロ接合の対象は、両方のアリルについてほぼ同じ大きさのシグナルを示すとされるが、ホモ接合の個体は、２つのアリルのうち１つのみについて、バックグラウンド以上のシグナルを示す。
【００９２】
SNPは、病理状態との関連が深まりつつあるために、本明細書に記載の方法を、SNP（単数もしくは複数）と関連した疾病、状態、疾患もしくは素因の診断のために使用することができる。この具体例において、ポリヌクレオチドの集団は、テスト対象の細胞または組織より得られる。前記ポリヌクレオチドの集団における少なくとも１つの目的のSNPのアリルの存在もしくは不在を、本明細書で議論される方法を用いて測定する。テスト対象のポリヌクレオチドにおける目的のSNPアリル（単数もしくは複数）の存在、不在もしくは頻度を、前記疾病、状態、疾患もしくは素因を有することが既知である対照の対象より得られたポリヌクレオチドにおける目的のアリル（単数もしくは複数）の存在、不在もしくは頻度と比較する。
【００９３】
複数の標的ポリヌクレオチドの存在および／または量を同時に測定できる可能性によって、本発明の方法は、発現プロファイリングに最適となる。発現プロファイリングは、異なる条件もしくは生理的状態の下での、ポリヌクレオチド、例えば、遺伝子の発現における変化を測定することを伴う。ポリヌクレオチドの発現における変化は、病理的状態と相関しうるため、本明細書に記載の方法は、発現パターンの変化に関連した疾病、状態、疾患もしくは素因の診断に有用である。この態様において、１つもしくはそれ以上の標的ポリヌクレオチドに関する情報は、テスト対象より本明細書に記載の方法を用いて得られ、疾病、状態、疾患もしくは素因を有することが既知である対象の発現パターンと比較される。１つの具体例において、既知の疾病、状態、疾患もしくは素因の対象の発現パターンを示すデータは、コンピュータが解読可能な媒体に記憶され、テスト対象の発現パターンを、記憶された発現パターンと比較することができる。
【００９４】
本明細書で使用される「素因」とは、個々の対象が特定の疾病、状態もしくは疾患を患う見込みを意味する。例えば、大きな素因を有する対象は、平均より、疾病、状態もしくは疾患を患う可能性が高く、小さな素因を有する対象は、平均より、疾病、状態もしくは疾患を患う可能性が低い。これらの疾病、状態もしくは疾患は、遺伝的なものであっても、微生物によるものであってもよい。
【００９５】
本明細書に開示される方法を、細胞または組織の、発生的もしくは生理的状態の測定のために使用することもできる。この態様において、テスト細胞もしくは組織のポリヌクレオチドの発現は、既知の生理的もしくは発生的状態の細胞より得られた発現パターンと比較される。２つの発現パターンを比較することによって、テスト細胞もしくは組織の発生的もしくは生理的状態の測定が可能である。１つの具体例において、既知の発生的もしくは生理的状態の細胞または組織の発現パターンを示すデータは、コンピュータが解読可能な媒体に記憶され、テスト細胞もしくは組織の発現パターンを、記憶された発現パターンと比較することができる。
【００９６】
さらにもう１つの態様は、本明細書に開示される新たな方法を実施するためのキットを提供する。１つの具体例は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドもしくはトランスジーンについて少なくとも１ペアのセンサープローブ、センサープローブの各ペアについて少なくとも１つの検出オリゴヌクレオチド、および本明細書に記載のポリヌクレオチドの発現を測定するため新たな方法を実施するための説明書を含むキットを提供する。もう１つの具体例は、少なくとも１つの標的ポリヌクレオチドについて少なくとも１ペアのセンサープローブ、各ペアのセンサープローブについて少なくとも１つの検出オリゴヌクレオチド、および本明細書に記載の一塩基多型を検出するための新たな方法を実施するための説明書を含むキットを提供する。前記のいずれのキットにおいても、検出オリゴヌクレオチドは、さらにマイクロビーズもしくはマイクロスフェアを含むことができる。さらに、前記のいずれのキットは、リガーゼ、プライマー、dNTP、ポリメラーゼおよび／またはバッファー溶液も含むことができる。
【００９７】
本明細書に記載の方法を、細胞もしくは生物の集団内の遺伝子組み換え細胞もしくは生物の存在を検出するために使用することもできる。あらゆる生物、例えば、植物もしくは動物より、細胞を得ることができる。同様に、トランスジーンもしくは異種のヌクレオチド配列を含みうるあらゆる生物を、記載された方法の実施に使用することができる。非限定的な例は、植物、動物、酵母、真菌およびウイルスを含む。該方法を、生物もしくは細胞内のトランスジーンまたは異種のポリヌクレオチドを検出するために使用することができる。集団内の細胞もしくは生物より得られた、さらなる精製を行っていない細胞溶解物、部分精製された、または精製されたポリヌクレオチドを用いて、該方法を実施することができる。本明細書に記載されたようなあらゆる形態のポリヌクレオチド、例えば、DNAもしくはRNAを使用することができる。この態様において、センサープローブは、集団もしくは生物中に存在することが既知であるか、存在するとされる、トランスジーンもしくは異種のヌクレオチド配列にハイブリダイズするように設計される。本明細書に記載のように、センサープローブは、各センサープローブペアのメンバーが、トランスジーン上の隣接部位に結合するように設計される。必要であれば、センサープローブは、共通のプライマー結合部位を含むことができる。ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしたセンサープローブペアを、T4リガーゼもしくはTaqリガーゼのごときリガーゼを用いて互いに連結する。
【００９８】
連結の後、連結センサープローブペアを、本明細書に記載のいずれかの方法を用いて増幅し標識する。次いで、増幅され、連結されたセンサープローブを、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下で、標識された検出オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。検出オリゴヌクレオチドの設計は本明細書に記載されている。ハイブリダイゼーション後、検出オリゴヌクレオチドと連結した連結センサープローブペアの存在を、本明細書に記載した方法のようなあらゆる適当な方法を用いて測定する。次いで、トランスジーンもしくは異種のヌクレオチド配列の存在もしくは不在を、検出オリゴヌクレオチドに結合したセンサープローブの同一性に基づいて測定する。この測定は、定量的であってもよいため、集団、細胞もしくは生物内の遺伝子組み換え物質の量を測定することができる。
【００９９】
本明細書に開示された方法を、対象または組成物における１つもしくはそれ以上の病原体の存在もしくは不在を検出するためにも使用することができる。対象は、あらゆる生物、例えば、植物もしくはヒトを含む動物であってもよい。適当な組成物は、飼料、食料、生体液、組織、バイオプシー、培養培地、および医薬組成物を含むが、それらに限定されない。食料とは、あらゆる物質、特に、栄養価のあるものであって、ヒトの食物として使用されるか調製されうるものを意味する。飼料とは、ヒト以外の動物の食料における構成物質、特に栄養価のあるもののいずれかを意味する。この態様において、目的の病原体（単数もしくは複数）に特有の少なくとも１つの標的ポリヌクレオチド配列に特異的なセンサープローブが提供される。病原体に特有の配列は、特定の病原体にユニークである必要はなく、その同定において有用なものでなければならない。従って、かかる配列を、他の標的ポリヌクレオチドと組み合わせて用いて、病原体を同定してもよい。本発明の方法の多重能力は、それらの同一性を決定するための、病原体の核酸フィンガープリンティングに特に有用にする。 
【０１００】
センサープローブの適当なセット（単数もしくは複数）が同定されれば、プローブは、病原体の存在についてテストされる対象もしくは組成物より得られたポリヌクレオチドを含むサンプル（単数もしくは複数）と組み合わせられる。未精製のポリヌクレオチド、例えば、細胞溶解物より得られるものを、精製された、および部分精製されたポリヌクレオチドと同様に使用することができる。センサープローブは、共通のプライマー結合部位を有するものを含む、本明細書に記載のあらゆるタイプのものであってよい。センサープローブペアは、ポリヌクレオチドと組み合わせて、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。次いで、ハイブリダイズしたセンサープローブペアを、本明細書に記載のように、連結、増幅および標識する。次いで、増幅され、標識されたセンサープローブを、標識検出プローブと組み合わせて、ややストリンジェントな、ストリンジェントな、もしくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせる。連結され増幅されたセンサープローブへの検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、本明細書に記載されたようなあらゆる適当な方法を用いて測定される。次いで、この情報を用いて、１つもしくはそれ以上の標的ポリヌクレオチドの存在に基づいて、目的の病原体の存在もしくは不在を測定する。ここに開示される方法は、定量的であるため、サンプル中の病原体（単数もしくは複数）の量を測定することができる。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は、本発明の応用の実例を提供する。以下の実施例は、本発明の範囲を完全に定義するものでも、限定するものでもない。
【０１０２】
実施例１
ポリヌクレオチド発現の測定
1.1  植物材料の処理およびRNAの調整
本明細書に記載された方法の実施を示すために、アラビドプシス（Arabidopsis）の推定（putative）プラストシアニン遺伝子を解析した。この遺伝子は、暗所では低レベルで発現し、光によってフィトクロムAシグナル経路を介して誘導されうる。phyAヌル変異体において、光誘導はブロックされる(Tepperman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 9437-9442, 2001)。
【０１０３】
アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）生態型RLDの野生型およびphyAヌル変異体の実生を、前記のTepperman et al., 2001に記載のように暗所にてアガープレート上で生育させた。発芽後５日に、実生を連続遠赤外光（FRc）にさらし、実生全体のサンプルを以下の時点：光処理の０、１、３、６、１２、１８および２４時間後にて７回採取した。８番目のサンプルも、さらに２４時間暗所に維持した実生から採取した（６日暗所対照）。RNAサンプルを、前記のTepperman et al., 2001に記載のように調製した。あるいは、細胞溶解物を実施例４に説明するように使用することもできる。
【０１０４】
1. 2  オリゴヌクレオチドおよびプローブの設計と合成
全てのオリゴヌクレオチドは、２次構造およびダイマーの形成が最小となるように設計した。
【０１０５】
1. 2.1  検出オリゴヌクレオチド
24マーの検出オリゴヌクレオチド配列を、標的mRNA配列について選択した。この方法において、cDNAの合成は必要ではないため、検出オリゴヌクレオチド配列を、mRNAのあらゆる領域から選択することができる。検出オリゴヌクレオチドのTmは、65℃から75℃にわたった。それぞれの半分の12塩基のTmは、32℃から40℃にわたった。検出オリゴヌクレオチドは、RNA鋳型のセンス方向にあり、カルボキシル化マイクロスフェアと結合させるために5'末端のamino-Unlinkerで修飾された。オリゴヌクレオチドを、Operon Technologies (Alameda, CA)によって合成し、HPLC精製した。
【０１０６】
1. 2.2  センサープローブ
センサープローブは、長さ38ヌクレオチドであった。センサープローブの各ペアは、第１プローブの3'末端の20塩基の配列および第２プローブの5'末端の20塩基の配列を含み、それらは順番通りに連続し、標的mRNA中の連続した40ヌクレオチドの伸長に相補的である。センサープローブは、連結後、中央の24塩基が検出オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするように設計した。第１プローブの5'末端の最後の18塩基および第２のプローブの3'末端の最後の18塩基はセンサープローブと共通であり、PCRプライマーのための共通の結合部位をもたらした。各ペアの第１プローブをカートリッジ精製し、第２プローブを5'リン酸化およびPAGE精製した。
【０１０７】
1. 2. 3  プライマー
プライマー１の配列は、第１プローブの5'末端部分と同一であり、プライマー２の配列は、第２センサープライマーの3'末端に相補的であった。プライマーを、使用前にカートリッジ精製した。
【０１０８】
1. 3  マイクロビーズへの検出オリゴヌクレオチドのコンジュゲーション
カルボキシル化蛍光色素マイクロビーズ（Luminex, Austin TX）を、製造業者の説明書に従って、one-sepカルボジイミド結合処理によって、5'amino-unilinker修飾検出オリゴヌクレオチドと結合させた。簡単に説明すると、24マーのオリゴヌクレオチド(Am-Unilinker; Oligo Etc., Wilsonville, OR)を、ヌクレアーゼフリーの水に溶解し、濃度を1mMとした。Luminexビーズ(1.25 x 107/ml, Luminex 番号L100-C1XX)を室温に戻し、13,000 rpmにて１分間遠心し、少なくとも20秒間ボルテックスして、凝集したビーズを分離した後、1.5mlチューブに0.4ml (5 x 106)を移した。次いで、このチューブを13,000 rpmにて１分間遠心し、注意深く上清を除いた。50μlの0.1 M ２−（Ｎ-モルフォリノ）エタンスルホン酸 (MES, pH 4.5, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO)を加えて、混合物を穏やかにボルテックスした。次に、50μl のMES中のビーズに1μlのAm-Linkerを加えた。
【０１０９】
室温の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩粉末(EDC, Pierce カタログ番号22980)を、ヌクレアーゼフリー水に溶解し、濃度を10mg/mlとした。2.5μl の新鮮な10mg/ml EDC をAm-Unilinkとビーズの混合物に加え、すぐにボルテックスした。次いで、この混合物を室温、暗所にて30分間インキュベートした。EDC添加とインキュベーションを、さらに２回繰り返した。３回目のインキュベーションの後、1mlの0.1% SDSを加えて、チューブをボルテックスして、13,000 rpmで１分間遠心して、上清を注意深く除いた。コンジュゲートしたマイクロスフェアを、100μlのTEバッファー(10mM Tris-Cl; 1mM EDTA)に再溶解し、濃度5x104ビーズ/μlにて暗所で保管した。
【０１１０】
1. 4  センサープローブの連結
連結反応物は、最終量4μl中に、5-500ngの全RNA、および1μlの0.1μM センサープローブのペアの各メンバーの混合物を含んでいた。多重反応のために、全てのセンサープローブをあらかじめ混合し、それぞれのセンサープローブについて0.1μMの濃度となるようにした。次いで、0.1μM プレミックス1μlを500ngのRNAと混合し、最終量を4μlとした。混合物を65℃で10分間加熱し、次いで、室温までゆっくり冷却した後、2μlのDNAリガーゼ反応混合物(1.2μl 5xバッファー、0.3μl ヌクレアーゼフリー、および0.5μl のT4 DNAリガーゼ, 1U/μl, Invitrogen, Carlsbad, CA)を加えた。反応物を37℃で４時間インキュベートした後、70℃で10分間加熱した。連結生成物を4℃にて保存した。
【０１１１】
1. 5  連結したセンサープローブのPCR増幅
連結されたセンサープローブを、２つのユニバーサルプライマーを用いて増幅した。プライマー１は、各プローブペアの第１センサープローブに位置する5'共通プライマー結合領域と同じ配列を有し、5'末端がビオチン化されている。プライマー１の配列は、5'ビオチン- gctgctagtgtccgatgt 3' (配列番号1)である。プライマー２は、各セットの第２のセンサープローブの3'共通プライマー結合部分に相補的であり、5' gatctcctagagtcgtga 3' (配列番号2)の配列を有する。20μlの反応物は、6μlの連結生成物、1.5mMmgCl2、200μM の各dNTP、0.5μMの各PCRプライマー、1 U Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen) およびlx PCRバッファー(Invitrogen)を含んでいた。PCR反応を、94℃で３分間保持した後、サーモサイクラーにて、94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で30秒間を２５サイクルした後、72℃で5分間保持した。
【０１１２】
1. 6  検出
蛍光マイクロビーズにコンジュゲートした検出オリゴヌクレオチドを、1.5X TMACバッファー(3M テトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC)、0.1% SDS、50mM Tris-HCl, pH 8.0、4mM EDTA, pH 8.0)で、1: 330 v/vの比にて希釈し、あらかじめ55℃に加熱した。多重反応において、それぞれに異なる検出オリゴヌクレオチドを有した異なる色をコードした（異なる発光スペクトルの）マイクロビーズを、1.5X TMACバッファーに1: 330 (v/v)の比にて、等量混合して、55℃にあらかじめ加熱した。
【０１１３】
5μlのPCR産物を12μlのヌクレアーゼフリー水と混合し、95℃で10分間処理して変性させた。次に、33μlの1.5X TMACバッファーで希釈したマイクロビーズコンジュゲート検出オリゴヌクレオチドを、変性PCR産物に加えて混合した。反応物は、およそ5000の各クラスの検出オリゴヌクレオチドを含んでいた。次いで、PCR産物を、55℃で１時間、検出オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、混合物を遠心し、上清を除去した。ペレットを、80μlのストレプトアビジンコンジュゲートR-フィコエリスリン溶液(PE, Molecular Probes, Eugene OR)に55℃にて溶解し、暗所で10分間インキュベートした。ペレットに加える前に、ストレプトアビジンコンジュゲートR-フィコエリスリンを1X TMACバッファーで2μg/ulにあらかじめ希釈しておいた。各反応より得られた50μlのPE染色マイクロビーズコンジュゲート検出オリゴヌクレオチドを、Luminex 100 system (Luminex, Austin TX)を用いて解析し、検出オリゴヌクレオチドの各クラスについて100イベントを測定した。マイクロビーズの各クラスに関連した蛍光強度を記録した。100ビーズより得られた平均蛍光強度(MFI)を、サンプル中の標的RNAの相対量として算出した。
【０１１４】
1. 7  特異性
異なるRNA鋳型、および異なるオリゴヌクレオチドペアの、野生型アラビドプシス（Arabidopsis）の実生の全RNAサンプルにおける相対mRNA鋳型に及ぼす影響を調査することにより、連結の特異性を検討した。この目的のために、３つのphyA調節遺伝子を用いた（表１A）。これらの遺伝子の発現は、野生型のアラビドプシスにおいて誘導されるはずである(前記のTepperman et al. , 2001)。４つの実験を行い、それらの結果を表１Bに示す。
【０１１５】
第１の実験は、標的RNAと代表的なセンサープローブとの相互作用の特異性を扱った。センサープローブペアを用いて、表1Aに示される様々な条件における、アラビドプシスのプラストシアニン遺伝子の発現を検出した。予想通り、プラストシアニン遺伝子の転写物は、光誘導アラビドプシス野生型の実生の全RNAからのみ検出された。RNA鋳型を除いた場合、もしくは標的RNAがRNAサンプル中に存在しない場合、酵母tRNAサンプルもしくはマウス肺全RNAサンプル、発現シグナルは、水対照のバックグラウンドと同様であった。バックグラウンドより若干高いシグナルが、暗所で生育させたアラビドプシスの実生の全RNAより検出されたが、これは暗所で生育させた実生におけるプラストシアニン遺伝子の基底レベルの発現を示した。
【０１１６】
第２の実験は、連結の特異性を検討するために計画された。推定（putative）プラストシアニン、グリコール酸オキシダーゼ、および機能未知のタンパク質の３つのアラビドプシス遺伝子を、光生育アラビドプシスの実生の全RNAサンプルにて、様々な代表的なセンサープローブを用いて検出した。それぞれの遺伝子は、完全に一致した；連結部位で１塩基の不一致を有する；あるいは、誤ってペアになったセンサープローブを有する、すなわち、センサープローブペアの１メンバーが標的ではない異なる遺伝子と相同である、；センサープローブペアによって示される。完全に一致したセンサープローブでの反応を用いた場合、調査された３つの全ての遺伝子の発現シグナルは、光生育アラビドプシスの実生の全RNAサンプルから検出された。連結部位におけるセンサープローブ中の１塩基の不一致は、シグナルをバックグラウンドレベルまで低下させた。誤ってペアになったセンサープローブを用いた場合にも、同様の結果が得られた。
【０１１７】
第３の実験は、連結反応におけるT4 DNAリガーゼの重要性を調査した。T4 DNAリガーゼを使用して、もしくは使用せずに反応を行った。正の対照の実験とは対照的に、T4 DNAリガーゼを使用しない反応ではシグナルが検出されなかったことから、該リガーゼが反応に必要なことが明らかに示された。
【０１１８】
第４の実験は、PCR増幅された連結センサープローブと検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特異性を示すために行われた。３つの遺伝子の発現をモニターしたアッセイにおいて、３つの異なる検出オリゴヌクレオチドをコンジュゲートしたマイクロスフェアを混合した後、ハイブリダイゼーションおよび検出を行った。相補的なセンサープローブのみが、対応する検出オリゴヌクレオチドによって捉えられたが、不一致のセンサープローブのハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドと同等であった。
【０１１９】
標的mRNAに対する完全に一致したセンサープローブの適当な結合は、RNAを鋳型としたT4 DNAリガーゼ介在センサープローブ連結に重要である。T4 DNAリガーゼは標的と特異的にハイブリダイズするよう設計されたセンサープローブの連結を特異的に触媒できることが、前記の実験により示される。アラビドプシスおよびマウス肺サンプルによって示されるように、反応において非標的RNAの複雑さは連結の特異性に影響を与えなかった。非特異的センサープローブ、例えば、１塩基不一致のセンサープローブおよび誤ったペアのセンサープローブが、標的RNAと非特異的に結合することにより隣接していても、連結反応はそれらに寛容ではなかった。連結は、反応物中に特異的な標的ポリヌクレオチドが存在することも必要とした。RNAがない、もしくは標的mRNAがない場合、オリゴヌクレオチドペアはT4 DNAリガーゼによって連結されなかった。
【０１２０】
1. 8  感受性および直線レンジ 
スパイクイン（spike-in）実験を行い、本方法の感受性を測定した。500ngのマウス肺全RNAのバックグラウンドにおいて、40塩基ヌクレオチドの推定プラストシアニン遺伝子配列を、5、0.5、0.05、0.005、0.0005、0.00005および0fモルの希釈系列にて加えた。センサープローブ（プローブ１および２）、PCRプライマーおよび検出オリゴヌクレオチドは、前記のプラストシアニンの実験と同一であり、表1Aに記載されている。鋳型オリゴヌクレオチドを加えずにマウス肺全RNAより検出されたシグナルは、バックグラウンドと同等であったが、500ngのマウス肺全RNAのバックグラウンドにおいて、0.00005 fモルのスパイクされたオリゴヌクレオチドと同程度に少量のものについて、シグナルを明確に検出することができた（図２）。5μlの反応量で、0.00005 fモルの標的は、濃度約1x10-l4 Mである。RNA分子の平均の長さが1000塩基として、ヌクレオチドの分子量が330であるならば、5μlの反応量の500ngの全RNAは、3x10-7 Mと等しい。よって、該方法は、モル比1:3x107を有する複雑なRNAの集団より特異的な標的を検出した。各細胞が105個のmRNA分子を含み、１細胞につき合計107個のRNA分子が存在するならば（mRNAは全RNAの１％であり、様々なRNA種の分子量が同じであるとする）、1／3x107は１コピーのmRNA標的／細胞より少ないことと同じである。重さによって計算した場合、0.00005 fモルは、1 kb長のRNA分子の16.5 pgに相当する。従って、該方法は、500ngの全RNAサンプル中で、16.5 pgと同じくらい少量のmRNA標的を検出することができる。標的RNAが細胞中で多コピー存在する場合、必要な全RNA量は減少するだろう。例えば、前のデータは、暗所で生育させた野生型アラビドプシスの実生の推定プラストシアニン遺伝子の発現レベルがバックグラウンドより少し高いことを示したが、この方法は500ngの全RNAにおける発現を検出したものであり、光生育アラビドプシスにおいては、5ngのRNAは検出に十分であった。
【０１２１】
1. 9  ダイナミックレンジ
ダイナミックレンジは、DNAオリゴヌクレオチドセンサーのPCR増幅、および増幅された連結センサープローブと結合した標識のダイナミックレンジの両方によって導かれる。直線増幅を達成するために、PCR反応は通常25〜30サイクルに限られる。観察される検出のダイナミックレンジは、主に、センサープローブの読み出しのダイナミックレンジによって決定される。前記の感受性の調査に基づいて、本明細書中に開示される方法のシグナル強度は、0.0005 fモルから0.05 fモルの範囲のスパイクイン鋳型量に対して直線応答を示した。アラビドプシスの明所で生育させた野生型の実生の全RNAを、鋳型として5ng-2μgの連続濃度にて使用することにより、様々なRNA濃度に応じたダイナミックレンジを決定した。推定プラストシアニン遺伝子の転写物を標的として選択した。30サイクルのPCR反応で、プラストシアニン遺伝子の転写物は、5ngの全RNAと同程度に低く検出でき、シグナル強度は開始時の全RNAが増加するにつれて質的に増加した（図３）。シグナル強度の直線増加は、5ng〜1μgの全RNAの範囲内で認められた。シグナル強度の変化は、絶対RNA濃度と相関していたが、全RNA量が1μgを超えるとシグナル強度の変化比は低下した。シグナル強度の飽和は、主に液体アレイのダイナミックレンジの検出によって制限される。500ng程度の対照マウス肺全RNAサンプルからは、シグナルが検出されなかった。PCR増幅はしばしば35サイクルでプラトーに達することから、35サイクル以上PCRサイクルを増加させても、シグナルはほとんど増加しなかった（データ示さず）。シグナル強度の増加は、PCR増幅されたＤＮＡセンサープローブの量の増加に由来した。
【０１２２】
1. 10  再現性
同じRNAサンプルを連続希釈で用いて、３回の反復実験を行うことによって、再現性の特性を明らかにした。この実験において、連結反応によるセンサーの生成、PCRによるセンサーの増幅、ならびにセンサーハイブリダイゼーションおよび検出は、各アッセイにおいて5〜500ngの全RNAを用いて、独立して実施された。全てのサンプル間で、平均して、１４％の変動係数（CV）が認められた。異なる希釈濃度の３つの複製間のＣＶは、２％から２１％にわたり（図４）、センサー調製の変動およびハイブリダイゼーションビーズ調製の変動が原因であった。実際には、１つの実験における全ての反応で、同じ薬剤およびマイクロスフェアのマスターミックスを使用するとされるため、サンプル間での全て変動はこの再現性アッセイに比べて減少するだろう。複製間の変動は、通常20%より小さいため、サンプル間で２倍以上の差を有するシグナル強度は、発現の差として解釈してもよい。
【０１２３】
1. 11  多重検出 
多重検出を示すために、11個のphyA調節アラビドプシス遺伝子および対照のハウスキーピング遺伝子であるポリユビキチンの発現を同時に測定した。前記の調査で、光処理の時間経過における発現の変化の概略をつかむために使用された野生型およびphyAヌル変異体の16個のRNAサンプルを、この調査において直接比較のために使用した。合計12ペアのセンサープローブを、12の標的mRNA転写物を示すそれぞれの全RNAサンプルと混合した。これに対応して、それぞれの検出オリゴヌクレオチドを有する１２種類の色をコードしたマイクロスフェアを、同時検出のために、ハイブリダイゼーション物中で混合した。
【０１２４】
予想通り、ポリユビキチン遺伝子は、野生型、変異型いずれにおいての、時間が経過しても一定の発現を示したことから、phyA調節性でも光感受性でもないことが示唆された。推定プラストシアニン、マグネシウムキレターゼサブユニット、クロロプラストFtsHプロテアーゼ、および光化学系II I型クロロフィルa/b結合タンパク質の２つの代表的な配列を含む５個の光合成関連遺伝子は、野生型の実生において、FRcに移動させて初めの時間で迅速に誘導され、24時間を過ぎても高い発現レベルを維持していたが、phyAヌル変異体では、完全に抑制された。PhyAサプレッサーのSpa1の転写レベルは、初期に急増したが、その後基底レベルまで減少した。細胞の代謝およびストレスおよび防御応答に関連した２つの遺伝子（グリコール酸オキシダーゼ、および真菌サーコスポラ・ニコチアネ（Cercospora nicotianae）由来のSOR1に類似した遺伝子）、ならびに未知のタンパク質は、野生型において後期（露光後３時間）に誘導された。調査された２つの遺伝子は、野生型において光処理によって抑制されたが、その低下はphyAヌル変異によって解除されることができた。それらの１つは、有枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼに高度に類似したタンパク質をコードし、もう１つは、C28からC30脂肪酸伸長に関与するタンパク質をコードする。
【０１２５】
GeneChipマイクロアレイより得られた前の結果と比較して、調査した12個のうち１個の遺伝子が、ほぼ同一の発現パターンであり、非常に高い相関を示した。残りは、時間経過の間、同様の発現パターンを示した；しかし、変化の幅は小さかった。２セットのデータ間での平均相関係数は、0.86であり、標準偏差は0.18であった。これらの結果に基づき、本明細書に記載の新しい方法およびGeneChipマイクロアレイを用いた結果は、２つの方法が全く異なる戦略および原理であるにも関わらず、一致していると見ることができる。これらの結果は、検出された変化を他の確立された方法によって確認できることから、本発明の方法は異なる遺伝子発現の定量に有効であることも示す。
【表１】
2005518819.tif 000002
【表２】
2005518819.tif 000003
【０１２６】
実施例２
コムギにおけるセプトリア・トリティシ（Septoria tritici）の検出
セプトリア・トリティシ（マイコスフェレラ・グラミニコラ(Mycosphaerella graminicola)）ゲノムDNA、コムギゲノムDNA、およびエス・トリティシ（S. tritici）を接種して１、４および２１日後のコムギの葉由来のDNAを、Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, およびMaliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されたような標準的な方法を用いて単離した。エス・トリティシ シトクロームB DNA（指定されたMg-cytbおよびSt-cytbおよびエス・トリティシ ITS領域DNA(St-ITSl)）を用いて、多重アプローチを行った。内在性対照配列は、コムギシトクロームB DNA(W-cytb559)およびコムギルビスコ(rubisco)遺伝子(W-Rubisco)であった。
【０１２７】
それぞれの反応について、2μlの0.05μMセンサープローブ混合物を、2μlのDNAに加えて、よく混ぜた。次いで、反応混合物を、室温もしくは４℃のいずれかで、短時間遠心し、反応容器の底に内容物を沈降させた。用いたセンサープローブを表２に示す。反応容器をサーマルサイクラーに入れ、99℃で5分間加熱し、核酸を変性させた。変性後、反応物をゆっくり（約30分以内に）50℃まで冷却し、センサープローブを標的DNAにアニールさせた。
【表３】
2005518819.tif 000004
【０１２８】
それぞれの連結反応について、氷上で、0.7μlヌクレアーゼフリー水を0.8μlの10X Taq DNAリガーゼバッファー(New England Biolabs, Beverly, MA)および0.5μlのTaq DNAリガーゼ(40 ユニット/μl)と混合し、マスターリガーゼミックスを作製した。対照反応物は、1.2μlヌクレアーゼフリー水および0.8μlの10X Taq DNAリガーゼバッファー(New England Biolabs)を含んでいた。次いで、アニールしたセンサープローブを含んだ反応容器を、50℃から室温に冷まし、それぞれの反応物に2μlのリガーゼマスターミックスを加え、反応容器を室温にて短時間遠心して内容物を容器の底に沈降させた。50℃で４時間以上連結を行った後、反応物を４℃に冷却し、氷上に置いた。
【０１２９】
連結の後、連結されたセンサープローブをPCRによって増幅した。それぞれのPCR反応物は、以下のものを含む：
【表４】
2005518819.tif 000005
【０１３０】
PCR増幅を以下のプログラムを用いて行った。
94℃で3分間を１サイクル；次いで、94℃で30秒間、56℃で30秒間、および72℃で30秒間を30サイクル；次いで、72℃で5分間および4℃保持を１サイクル。増幅産物をすぐに使用するか、または-20℃にて保存した。
【０１３１】
標的の検出のために、12μlのヌクレアーゼフリー水を、室温にて、5μlのPCR増幅産物に加えた。ブランク反応のために、17μlヌクレアーゼフリー水を使用した。実施例１のとおりに調製したLuminexにコンジュゲートした検出オリゴヌクレオチドを、55℃、1.5X TMACで330倍に希釈した。検出オリゴヌクレオチドの配列を、表３に示す。希釈後、コンジュゲートした検出オリゴヌクレオチドを短時間ボルテックスして混合し、それぞれの反応物に35μlずつ加えて、95℃で５分間加熱して増幅産物を変性させた。変性後、温度を55℃に下げ、反応物を55℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、室温で５分間の短い遠心をすることによりビーズを沈降させ、上清を除去した。ストレプトアビジン-PE（ストレプトアビジン, R-フィコエリスリンコンジュゲート 1mg/ml, Molecular Probes, Eugene OR, カタログ番号S-866）を55℃の1.5X TMACで500倍に希釈した。80μlの希釈したストレプトアビジン-PEをそれぞれの反応物に加え、55℃で10分間インキュベートした。インキュベーション後、平均蛍光強度（MFI）を、Luminex 100システム(Luminex, Austin, TX)を用いて測定した。
【表５】
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【０１３２】
初めの比較の結果を表４に示す。表４において、F DNAは真菌DNAであり、W DNAは、コムギDNAであり、FW DNAは、エス・トリティシ接種後21日のコムギ由来のDNAである。DNAを含む反応については、それぞれの反応に1μgを使用した。表４の結果は、平均蛍光強度（MFI）のユニットで示される。
【表６】
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【０１３３】
この特定の実験において、コムギと真菌シトクロームB遺伝子の相同性のために、W-Rubiscoは内在性の対照として優れていることが明らかになった。よって、適当な対照遺伝子の選択は、選択される標的遺伝子によるだろう。
【０１３４】
さらなる実験において、生成されたコムギDNA（W DNA）の希釈物を、エス・トリティシ（F DNA）でスパイクし、St-ITS1およびMg-cytb遺伝子を用いて病原体を検出するアッセイの感受性を試験した。結果を表５に示す。
【表７】
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【０１３５】
正の対照としてのRubisco遺伝子の妥当性を試験するために、接種後21日のコムギ植物体から得られたDNAの希釈物を試験し、RubiscoおよびMg-cytbのMFI比を比較した。結果を表６に示す。試験した希釈範囲では、コムギおよび真菌のMFI比に有意な変化がなかったことから、内在性の対照としてRubiscoを使用できることが確認された。
【表８】
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【０１３６】
さらなる実験において、接種後の様々な時期における真菌DNAの検出能力を試験した。DNAを未接種のコムギまたは106個のエス・トリティシ胞子で感染後１、４もしくは２１日のコムギより単離した。得られたDNAを、アガロースゲルから見積もった値に基づいて約25ng/μlに希釈し、各試験に50ngのDNAを使用した。PCR増幅を25または30サイクル行った。結果は表７に示され、該方法が初期の感染を検出できることが示された。感染後１日のMFIが４日のものより大きかったことは、接種時に残った胞子の存在のためであると考えられる。
【表９】
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【０１３７】
実施例３
遺伝子組み換え生物の検出
DNAの集団におけるトランスジーンの存在を検出するための本発明の可能性を示すために、野生型およびトランスジェニックコメの葉より、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 およびMaliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されているような標準的な方法を用いてゲノムDNAを単離した。トランスジェニックおよび野生型植物のDNAを、トランスジェニックDNAを野生型DNAに対して1:100,000; 1:10,000; 1:1000および1:100ngの比で混合した。検出されたトランスジーンは、ホスホマンノースイソメラーゼ（PMI）である。使用した手順は、実施例２で説明したもの同じである。センサープローブペアは、配列5'gctgctagtgtccgatgttgtgtttgtttggatgaacc 3' (配列番号29)および5'p-tgaatggagagtggctgtgctcacgactctaggagatc 3' (配列番号30)を有するプローブを含み、検出オリゴヌクレオチドは、配列5'actctccattcaggttcatccaaa 3' (配列番号31)を有していた。
【０１３８】
結果を表８に示す。表に示すように、トランスジェニック生物のDNAが1/100,000の濃度で存在した場合、該方法はそのDNAの存在を検出することができる。従って、本発明は、遺伝子組み換え生物の存在について、集団をモニターするために使用できる。
【表１０】
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【０１３９】
実施例４
細胞溶解物におけるポリヌクレオチドの検出
精製もしくは部分精製核酸ではなく細胞溶解物を用いて標的配列を検出するための、該方法の能力を、シー・エレガンス（C. elegans）もしくはヒト培養細胞の溶解物を用いて試験した。破砕バッファーをAmbion (Austin, TX, カタログ番号1712)より購入した。培養細胞については、破砕バッファー１μlにつき100~200の細胞を使用した。シー・エレガンスについては、破砕バッファー１μlにつき1.5~6匹を超音波処理して使用した。破砕後、標的配列の検出を、実施例２に記載の方法を基本的に用いて行った。
【０１４０】
培養細胞については、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）およびβアクチン（b-アクチン）遺伝子に対応する配列を検出した。GAPDHおよびb-アクチンのセンサープローブおよび検出オリゴヌクレオチドの配列を表９に示す。サンプルのサイズは、50から400細胞にわたった。対照は、水のみ、オリゴヌクレオチドのみ、溶解物のみ、およびリガーゼを欠く反応混合物からなる。結果を表１０に示す。これらの結果は、該方法は、核酸の精製を必要とせずに、わずか50個の細胞の溶解物に由来する複数の配列を検出できることが示す。
【表１１】
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【０１４１】
シー・エレガンスの溶解物に関しては、検出した遺伝子はunc-104およびunc-25である。センサープローブおよび検出オリゴヌクレオチドの配列を表１１に示す。破砕バッファーを加えて、虫を除いた細胞溶解物を超音波処理してから、遺伝子検出を行った。さらに、未希釈（1X）と、1X連結バッファーで2Xおよび4Xに希釈した溶解物の、３つの濃度の溶解物を試験した。結果は表１２に示され、該方法が細胞溶解物および希釈した細胞溶解物においてポリヌクレオチドを検出できることを示した。
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【０１４２】
結論
前記の発明の詳細な記載および実施例をふまえて、本発明のいくつかの態様が達成されることが理解されうる。
【０１４３】
本発明は、本発明、その本質、およびその実用化について当業者に説明するために、図示および例示によって詳細に記載されることが理解されるべきである。本発明の特定する処方およびプロセスは、特定の実施形態の記載に限定されないが、記載および実施例は以下の請求項およびその等価物を考慮されるべきである。前記のいくつかの実施例および記載は、本発明が機能的である状態についてのいくつかの結論を含むが、本発明者らは、それらの結論および機能によって拘束されるのではなく、可能な例示としてのみ提示するつもりである。
【０１４４】
前記の本発明の特定の具体例は、本発明を網羅するまたは限定するのではなく、また、前記の実施例および詳細な記載に照らして、多くの代替物、修正および変化は、当業者にとって明らかであろうことはさらに理解されるべきである。従って、本発明は、以下の請求の範囲内にある全てのかかる代替物、修正および変化を包含することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、本発明の１つの具体例を図示する。
【図２】図２は、ポリヌクレオチド発現解析について開示された方法の感度を示す。
【図３】図３は、ポリヌクレオチド発現解析について開示された方法のダイナミックレンジを示す。
【図４】図４は、ポリヌクレオチド発現解析について開示された方法の再現性を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年11月16日(2004.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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