(57)【要約】ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）産生微生物を検出できるプレート用の培地であり、PI-PLCと接触すると、蛍光を発する少なくとも1つの蛍光性の化合物、及び、発色する少なくとも1つの発色性の化合物を含む。蛍光性の化合物は化学式（I）[式中、R1、R2、R3、R4及びR5は水素及び蛍光性置換基からなる群から独立して選択され、Xは水酸基、ORy（式中、Ryは、C1-C4アルキルからなる群から選択される）及びO-Me+（式中、Me+は、有機又は無機塩基に由来するカチオンである）からなる群から選択される]で表され、発色性の化合物は化学式（IV）[R10は水素及びC1-4アルキルからなる群から選択され、R6、R7、R8及びR9は水素及び発色性置換基からなる群から選択される]で表される化合物又は有機又は無機塩基と前記化学式（IV）との塩によって表される。
2005525825.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）を代謝的に産生することができるタイプの微生物の検出のためのプレート用の培地であり、
前記プレート用の培地が、組み合わせで、PI-PLCと接触すると蛍光を発することができる少なくとも1つの蛍光性の化合物、及び、PI-PLCと接触すると発色することができる少なくとも1つの発色性の化合物を含むことを特徴とし、
前記蛍光性の化合物が化学式（I）：
【化１】
2005525825.tif 000006
[式中、R1、R2、R3、R4及びR5は、水素及び蛍光性の置換基からなる群から独立して選択され、Xは、水酸基；ORy（式中、Ryは、C1-C4アルキルからなる群から選択される）；及びO-Me+（式中、Me+は、有機又は無機塩基に由来するカチオンである）からなる群から選択される]
によって表され、
前記発色性の化合物が化学式（IV）：
【化２】
2005525825.tif 000007
[式中、R10は、水素及びC1-4アルキルからなる群から選択され、R6、R7、R8及びR9は、水素及び発色性の置換基からなる群から選択され、Xは、前記で定義したものである]
によって表される、
プレート用の培地。
【請求項２】
前記化学式（I）及び（IV）中のMe+が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化アンモニウム、ジエチルアミン、トリエチルアミン、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウム、シクロヘキシルアミン、ピリジン、ピペリジン、ピロリジン、モルフォリン、N-メチル-モルフォリン、N-エチル-モルフォリン及びp-トルイジンに由来するカチオンである、請求項１に記載のプレート用の培地。
【請求項３】
前記化学式（I）中の蛍光性の各置換基が、任意にアルキル鎖中に酸素原子を含むC1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、ニトロ、カルボキシ、C1-C4カルボキシアルキル、及びシアノからなる群から独立して選択され、任意の前記アルキル基が、置換基として任意に少なくとも1つのハロゲン原子を含む、請求項１又は２に記載のプレート用の培地。
【請求項４】
化学式（I）中のR3が任意に1つ以上のハロゲン原子を含む低級アルキルであり、Xが水酸基であり、R1、R2、R4及びR5が水素原子であり、化学式（I）の前記化合物の塩が、有機又は無機塩基により形成される塩である、請求項１から３のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項５】
前記化学式（I）の化合物が、4-メチルウンベリフェリル myo-イノシトール-1-ホスフェート、及び、その有機又は無機塩基との塩である、請求項１から４のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項６】
前記化学式（IV）中のR6、R7及びR8が、水素、塩素及び臭素から選択され、R9及びR10が水素である、及び/又は、前記化学式（IV）の化合物が有機又は無機塩基との塩の形態である、請求項１から５のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項７】
前記化学式（IV）の化合物が、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェート、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェート、6-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェート及びこれらの塩から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項８】
前記塩が、前記化学式（IV）の化合物のアンモニウム塩である、請求項７に記載のプレート用の培地。
【請求項９】
更に、少なくとも1つのゲル形成成分、及び、前記微生物の増殖を補佐することができる少なくとも1つの栄養素を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項１０】
更に、前記対象とする微生物以外の微生物に対する少なくとも1つの阻害剤を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項１１】
前記栄養素が、ペプトン及びアミノ酸からなる群から選択される、請求項９又は１０に記載のプレート用の培地。
【請求項１２】
前記アミノ酸が、前記培地リットル当り約10から約200ミリグラムの量でのL-システイン及びL-トリプトファンに加えて、前記培地リットル当り約2から約20グラムの量での酸性で加水分解されたカゼインとして使用される、請求項１１に記載のプレート用の培地。
【請求項１３】
前記栄養素が、栄養素分析によって選択され、前記培地のリットル当り約1から約12グラムの量で、酵母抽出物、肉抽出物及び脳-心臓-浸出物からなる群の少なくとも1つの構成員を含む、請求項９から１２のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項１４】
更に、前記培地のリットル当り約0.5から約5グラムの量で、D-グルコース、ピルビン酸ナトリウム及びL-ラムノースからなる群から選択される少なくとも1つの炭化水素を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項１５】
更に、前記微生物の増殖を改善することができる微量元素を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項１６】
更に、クエン酸鉄、クエン酸鉄アンモニウム、及びフェリオキサミンの群から選択される少なくとも1つの鉄化合物を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項１７】
更に、アルブミン、リン脂質及びグリセロリン酸からなる群から選択される、PI-PLCの切断促進剤を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項１８】
更に、例えばレシチンのような、酵素産生誘導剤を含み、前記誘導剤の切断が、コロニーの発色を改良すること、並びに、蛍光及び/又は発色コロニーの周囲の白色の沈殿領域を形成することによって、標的微生物をより良好に識別できることに貢献している、請求項１から１７のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項１９】
更に、前記対象とする微生物の着色コロニーの可視での検出性を改善するためのコントラスト剤を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項２０】
前記阻害剤が、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、酵母及び真菌の増殖を阻害することができる化合物からなる群から選択される、請求項１０から１９のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項２１】
前記阻害剤が、ポリミキシン、スルファメタゾール、スルファメトキサゾール、ホスホマイシン、ドキシサイクリン、セフタジジム、クリンダマイシン、ナリジクス酸、シクロヘキシミド、トリメトプリム、及びアンホテリシンから選択される、請求項１０から２０のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項２２】
サンプル中の界面活性成分の影響を弱めるための少なくとも1つの成分を含み、前記対象とする微生物を含む恐れのあるサンプルと直接接触させることによる、直接接触方法で使用するための、請求項１から２１のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項２３】
サンプルの界面活性成分の影響を弱めるための前記成分が、レシチン及びL-ヒスチジンを含む、請求項２２に記載のプレート用の培地。
【請求項２４】
ready-to-useのプレート用の培地を提供するための水溶性の培地を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項２５】
実質的に無水の形態である、請求項１から２３のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項２６】
異なる耐性により増殖する細菌を更に区別するために、前記プレート用の培地の表面に、選択された抗生物質ディスクを置く、請求項１から２５のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項２７】
検出すべき前記微生物が、Listeria monosytogenes、Listeria ivanovii、Bacillus cereus、Bacillus cereusのプロバイオティクス株、Bacillus thuringiensis、Bacillus mycoides、Bacillus anthracis、Staphylococcus aureus、Legionella pneumophila、Clostridium属、Helicobacter pylori、Candida属及びAspergillus属から選択される、請求項１から２６のいずれか一項に記載のプレート用の培地。
【請求項２８】
対象とする微生物の検出方法であり、前記微生物が、ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）を代謝的に産生することができるタイプの微生物であり、
(a)水溶性のゲル、及び、前記微生物の増殖を補佐することができる少なくとも1つの栄養素；並びに、請求項１に記載の化学式（I）の少なくとも1つの化合物、及び、請求項１に記載の化学式（IV）の少なくとも1つの化合物を含むプレート用の培地を提供する工程；
(b)前記プレート用の培地に、前記対象とする微生物を含む恐れがあるサンプル物質を接種する工程；
(c)前記工程(b)の後のプレート用の培地を培養する工程；
(d)任意に、異なる耐性により増殖する細菌を更に区別するために、前記プレート用の培地の表面に、選択された抗生物質ディスクを置く工程；及び
(e) 前記サンプル中に前記対象とする微生物が存在することを示す、前記対象とする微生物の蛍光及び/又は発色したコロニーの形成について、前記工程(c)又は(d)の後のプレート用の培地を観察する工程；
を含む方法。
【請求項２９】
前記化学式（I）の化合物が、4-メチルウンベリフェリル myo-イノシトール-1-ホスフェート又はその塩である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記化学式（IV）の化合物が、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェート又はその塩である、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）を代謝的に産生することができるタイプの微生物の検出に用いるための、請求項１に記載の化学式（I）の少なくとも1つの化合物と、請求項１に記載の化学式（IV）の少なくとも1つの化合物との組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な細菌、酵母又はカビを検出及び同定するためのプレート用の培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光性/発色性を有する可能性のある化合物は、蛍光/発色するようになる化合物であり、それ故、特定の微生物又はそのような微生物によって産生される物質と接触させることで、蛍光的に/可視的に/分光的に検出することができる。そのような化合物が、WO99/48899(=EP949266)及びWO98/38332に、出願人によってそれぞれ開示されている。それぞれの場合、検出のために用いられるのは、蛍光性又は発色性の化合物のどちらかである。
【０００３】
これらの参考文献に開示されているように、「ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼC」（すなわち、1-ホスファチジル-D-myo-イノシトール イノシトールホスホヒドロラーゼ又は略すとPI-PLC；酵素分類EC3.1.4.10）と名付けられた酵素は、Listeria monocytogenes、Listeria ivanoviiのような病原性の細菌、Bacillus cereusグループの細菌、特にBacillus cereus及びBacillus thuringiensis、Staphylococcus aureus及びClostridium novyiを含む様々な細菌の培養上清に見出される（J.G. Songer, Trens in Microbiology 5(1997), 156を参照）。
【０００４】
Listeria monocytogenesの検出用の培養培地はWO99/04032に開示されており、主として、寒天、栄養素とともに望ましくない細菌を抑えるための抗生物質からなり、この場合もまた、発色性の基質のみを利用する。
【０００５】
同様に、US 6,284,517に開示されているBacillus cereus及びBacillus thuringiensis用のプレート用の培地は、前記のような発色性の基質のみを利用する。
【０００６】
微生物の分析にPI-PLC基質を用いる主な利点は、PI-PLI酵素はこれらの微生物の毒性因子であり、そのような培地は食品微生物学において有用であるという事実にある。
【０００７】
それにもかかわらず、前記の培地の欠点は、試験を行う時間にある。前記WO99/48899(EP 949266)に開示されたListeria検出系においては、選択的増菌培地(selective enrichment broth)において明確な蛍光を得るのに通常は24時間かかり、微生物を明確な色を示すコロニーにまで増殖させるために、少なくとも更に24時間から48時間のプレート培地での培養が必要である。一方、高い濃度で使用した時、蛍光性の化合物は増菌培地の安定性を減少させる可能性がある。このような基質は、培地の選択性及び蘇生の効率にも影響を与える可能性がある。
【０００８】
一方、発色性のプレート用培地を単独で使用することは、対象とする微生物（ターゲットとする微生物）を迅速にスクリーニングするためのツールを断念することを意味する。加えて、プレート用の培地にストリーキングする前に、微生物を十分な細胞濃度に高めるために、初期サンプルを増やさなければいけないので、この方法では時間を大幅に短縮することはできない。
【０００９】
例えば、食品の試験において、検出するだけでなく、サンプル中に存在する細菌の数をカウントすることが重要な課題であるので、同定しカウントするための迅速で信頼できる方法に対する多大な需要が存在する。
【００１０】
しかしながら、前記プレート用の培地は、望ましくない細菌の増殖を十分に抑えない点で、いつも対象とする微生物に対して十分な選択性を有しているわけではない。更にその上、最小の量の発色性の基質で濃い色のコロニーを得るようには、細菌のPI-PLCに対する発色性の感応性は最適化されていない。
【００１１】
他の細菌種と、PI-PLCを生成する病原性の微生物をより良好に識別することも望まれている。
【特許文献１】WO99/48899
【特許文献２】WO98/38332
【特許文献３】WO99/04032
【特許文献４】US 6,284,517
【非特許文献１】J.G. Songer, Trens in Microbiology 5(1997), 156
【非特許文献２】W. Dunger, H. J. Fiedler; Methoden der Bodenkunde, 2nd edition, 1997, pp 92, Gustav Fischer, Jena-Stuttgart/Germany
【非特許文献３】Biotechnological Bioengineering” Vol. 24, 1982, pp 1519
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
驚くべきことに、発色性の基質及び蛍光性の基質の組み合わせが（例えば、固体の寒天培地に導入することにより）、ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼCを産生する病原性の細菌を検出するだけでなく、同時にスクリーニングにも使用することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
従って、本発明によるプレート用の培地を請求項１において記載した。創作性のあるプレート用の培地の好ましい実施態様を請求項２から２７において特定した。
【００１４】
その上、本発明は、請求項２８において定義される新規の検出方法を提供し、好ましい方法の実施態様を請求項２９から３１において特定した。
【００１５】
一般的に、本発明によるプレート用の培地の本質的な利点は、公知の方法と比較して、時間を節約できることにある（例えば、少なくとも24から48時間）。
【００１６】
本発明によるプレート用の培地により、PI-PLI酵素を産生する細菌、酵母及びカビ（例えば、Listeria spp.及びBacillus spp.のような毒性因子）について、スクリーニングとともに検出、単離及びカウントするための改良した方法が供給される。本出願においては、増殖パラメーターの特徴により（例えば、Biosreen Cを用いた分析により）、栄養素の組み合わせの選択だけでなく、1つの栄養素の選択も改良することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
前記化合物の参照として本出願で用いられている単語「蛍光性を有する可能性のある」及び「発色性を有する可能性のある」とは、これらの化合物の、PI-PLIと接触して、それぞれ「蛍光性」又は「発色性」を有するようになる能力、すなわち、蛍光的に/可視的に活性であり、それぞれ蛍光検出方法及び目視検査又は色素内視鏡により検出できることを指す。
【００１８】
PI-PLCと接触させることにより、化学式（I）の蛍光性を有する可能性のある化合物は、プレート用の培地上で（例えば、一般的な手持ちサイズの蛍光光度計（例えば、366nmのような、実際的な目的において好まれる紫外線の範囲の波長での操作のための蛍光光度計）によって）容易に検出することができる強いフルオロフォアとなる。
【００１９】
新規の同定方法における最初のスクリーニング工程としての本発明により、この単純な検出方法を使用することができる。フルオロフォアの検出は発色団の検出よりもかなり感度が高いので、スクリーニングのための蛍光性の化合物は有利である。従って、本発明による固体のプレート用の培地を利用することによって、PI-PLCを分泌する微生物が存在することを早期に検出することが可能である。
【００２０】
本スクリーニング試験において、最初の工程における「陽性」反応が、色を濃くするために、更なる培養によって確認する必要があるのに対して、培地の更なる培養が必要でないという意味で、蛍光しないことは「陰性」反応として考えることができる。
【００２１】
本発明によるプレート用の培地は、Listeria monocytogenes及びListeria ivanoviiの検出、同定及び列挙と同様に、Bacillus cereusグループの種（例えば、Bacillus cereus、Bacillus thuringiensis及びBacillus anthracis）の検出、同定及び列挙に適している。
【００２２】
本発明による方法は、また、Bacillus cereusグループに由来する種又は株の検出及び同定及びBacillus cereusのプロバイオティクスの種(Paciflor（登録商標）、Toyocerin（登録商標）)の列挙にも適している。プロバイオティクスB. cereusは、非毒性の「弱毒化した」株である。耐性B. cereus野生株と対照的に、これらの細菌はペニシリンG及びセファマンドールに対して感受性である。プロバイオティクス株と野生株との迅速な識別は、B. cereusの試験において非常に有用である。
【００２３】
本発明によるプレート用の培地は、いわゆるプレート培地を接触する（すなわち、対象とするサンプルを接種するための培地上に直接置く）ためだけでなく、如何なる細胞濃度を高める工程も無しにターゲット微生物を直接カウントするためにも使用することができる。如何なる細胞濃度を高める工程も必要ないので、この簡潔で迅速な試験方法は、利点を有する。これは、食品試験及び衛生管理に特に有用である。
【００２４】
培地を直接プレート用に用いる場合は、そのようなサンプルに生じる、例えば殺菌剤による阻害を最終的に克服するための中和剤を加えなければならない。レシチンのような中和剤の更なる利点は、着色を増すことによって、及び、ターゲットする微生物のコロニーの周りの沈殿領域の形成によって、ターゲットとする微生物をより認識しやすくすることに役立つことである。
【００２５】
本発明による化学式（I）の蛍光性基質として使用するための特に好ましい化合物は、4-メチルウンベリフェリル myo-イノシトール-1-ホスフェートのN-メチル-モルホリン塩である。
【００２６】
一般的に、化学式（I）及び/又は（IV）の化合物のラセミ混合物は、本発明によるプレート用の培地の使用に適する。
【００２７】
例えば、4-メチルウンベリフェロン（好ましい4-メチルウンベリフェリル myo-イノシトール-1-ホスフェート又はこれらの塩のPI-PLCによる切断により得られる）は、pHが8を超えると、360nmの最大吸収を示すが、対応する化学式（I）の化合物は、360nmで極わずかな吸収しか示さない。
【００２８】
4-メチルウンベリフェロン（4-メチル-7-ヒドロキシ-クマリン）は、最大蛍光波長が448nmであり（364nmで励起）、大変良好な蛍光発生源である。
【００２９】
本発明による検出方法によれば、本出願で用いられている単語「最初のサンプル」とは、血液、排泄物又はバイ菌が入った食物、飼料、水、飲料又は対象とする細菌を含む可能性がある類似の物質のような、生理学的に又は他に由来する疑わしい源泉から直接得られた物質を指す。食品加工工程から得られたサンプルも対象である。
【００３０】
それぞれ、スクリーニング及び同定の両方の側面において、本発明は、Listeria monosytogenes、Listeria ivanovii、Staphylococcus aureus、Clostridium novyi、Clostridium perfringens、Legionella spp.、Helicobacter pylori、Trypanosoma brucei、Aspergillus fumingatusだけでなく、Bacillus thuringiensis及びBacillus cereusのようなBacillus cereusグループのメンバーを含む、PI-PLC活性を有する微生物の細菌活性を明確に示す手段を供給する。
【００３１】
本発明は、特に、Listeria monosytogenes、Bacillus cereus及びBacillus anthracisのような病原菌のスクリーニング、検出及び単離のための使用に関する。
【００３２】
Bacillus anthracisは、PI-PLCを産生することができず、それ故、特徴的であるが着色していないコロニーによって、B. cereusグループの他のメンバーと区別することができる。
【００３３】
PI-PLCの存在により証明される細菌活性のためのスクリーニング試験及び/又は同定試験において、化学式（I）及び/又は（IV）の化合物を使用する場合、プレーティング前に細菌活性を増すために、最初のサンプルを移す増菌培地を用いることが有用である。本発明の方法の多くの適用にとっては、加えて、対象とする細菌を選択できる増菌培地を使用することが好ましい。選択性を有する（必ずしも選択性は必要でないが）「増菌」という単語は、対象とする細菌に最も適した増菌方法を選択することができる、この業界の当業者により理解される。一般的に、PI-PLC酵素を産生する他の細菌の増殖を阻害することは、抗生物質及び他の阻害剤を含む選択性を有する化合物の様々な組み合わせを用いて達成され、培地は、PI-PLCを含む又は産生する任意の病原菌に特異的に作製されうる。
【００３４】
一般的に、本発明は、化学式（IV）の化合物と組み合わせた場合に、化学式（I）との相乗効果を有すると考えられる。
【００３５】
化学式（IV）の好ましい化合物の群においては、R6、R7及びR8は、それぞれ、好ましくは塩素及び臭素から選択されるハロゲン原子又は水素である；R9及びR10は水素であるのに対して、Xは水酸基である；さらに、このような化合物の有機又は無機塩基との塩を可能性のある発色団として使用することができ（すなわち、PI-PLCによる切断、二量化及びその後の酸化により濃い色の藍色色素を生じる）、特にR10は水素又はメチルである。
【００３６】
発色性の成分の特に好ましい化学式（IV）の化合物は、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェート、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェート及び6-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェートの塩である。これらの中で、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェートのアンモニウム塩が特に好ましい。一般的に、化学式（IV）化合物はラセミ体で使用することができる。
【００３７】
本発明の重要な実施態様を説明するために、Listeria monocytogenesの好ましい試験方法について、より詳細に説明する。この方法は、損傷したEN ISO 11290によるListeria monocytogenes細胞を修復し、蘇生させることができる増菌培地の使用を任意に含む。
【００３８】
そのあと、少量（例えば、増菌培地の少量の液体を移す白金耳）を、蛍光性の基質（好ましくは、前記の化学式（I）の4-メチルウンベリフェリル myo-イノシトール-1-ホスフェート）を含む選択性を有するプレート用の培地上で、ストリーキングする。
【００３９】
好ましくは、このプレート用の培地は選択性であり、Listeria spp.以外の他の細菌の増殖を抑える。この培地は、PI-PLC酵素、及び、Listeria monocytogenes細胞に、単離したコロニーを形成するプレート用の培地上で増殖するのに最適な環境を付与するListeria関連のグラム陽性細菌を含む。
【００４０】
接種に続いて、一般的に16から24時間で、培地をUV蛍光光度計（長波長366nm）に供し、蛍光を測定する。この時点までの生育した小さなコロニーの周りの陽性の蛍光反応は、陽性であると推定され、更なる試験が必要であり、蛍光が無い場合は、Listeria monocytogenesが試験に供したサンプル中に存在していないことを意味する。
【００４１】
更なる時間培養した後、例えば、Listeria monocytogenesが存在している場合、発色性を有する可能性のある化学式（IV）の化合物を含むプレート用の培地には、PI-PLCと接触する時に発色する化合物により生じる色を有する着色コロニーが見られるであろう。例えば、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェートを含む基質を用いると、Listeria monocytogenesのコロニーは青緑色から青色の色になる。このコロニーは、必要であれば、更に試験するために単離することができる。
【００４２】
色素原の色は細胞内に保持され、コロニーの色は水に不溶でコロニー内に保持されるので、一般的に、発色性の成分は固体表面で最も良好に機能する。
【００４３】
本発明によるプレート用の培地は、良好な安定性を有する傾向にある。例えば、暗所において4℃で4週間保存した後、プレート用の培地の色及び選択性は、新たに調製した培地と本質的には同等であるであろう。Listeria monocytogenesのコロニーの外観は、青緑色から青色の直径1.0-2.5mmの凸状になり、青緑色から青色のハロは存在する場合もあるし、存在しない場合もある。
【００４４】
蛍光性の化学式（I）の化合物（例えば、4-メチルウンベリフェリル myo-イノシトール-1-ホスフェート）は、broth培地だけでなく、寒天のような固体培地にも有効であることは驚きである。
【００４５】
蛍光はコロニーから寒天培地へとにじみ出るという事実にもかかわらず、蛍光は、PI-PLC酵素を分泌する病原性の細菌が存在しているか、又は存在していないかをスクリーニングするための試験として機能する。
【００４６】
結果的に、蛍光性の基質の存在下での陽性の反応（細菌種によるPI-PLC酵素の分泌）によってコロニーは蛍光を示し、このことはPI-PLC分泌細菌種が高い細胞濃度で存在していることを示す。
【００４７】
これは、対象とする細菌種（Listeria monocytogenesのような）のための推定陽性反応であり、前記で説明したPI-PLCの発色性の基質（IV）を用いた、コロニーの形態での細菌種の更なる単離を保障する。
【００４８】
蛍光性の化学式（I）の成分及びその蛍光により、組み合わせの発色性の化学式（IV）の成分の酵素発色反応、又は、本発明によるプレート培地を損なうことは無い。
【００４９】
一般的に、蛍光性の化学式（I）の成分と発色性の化学式（IV）の基質が、1つの培地に存在することにより、通常は24時間以内に、迅速に陽性反応を推定することができ、その後に更なる時間（例えば、24時間）培養し、確認反応として発色効果を用いて、固体培地上のコロニーを同定する。
【００５０】
本発明による好ましいプレート用の培地の更なる利点は、例えば、L. monocytogene/L. ivanovii.の青緑色のコロニーの周りの白い沈殿領域が生じることである。任意に、コロニーは、更なる試験のために単離することができる。
【００５１】
以下に示す実施例で明らかになるように、本発明は、ホスファチジルイノシトール-特異的ホスホリパーゼC（PI-PLC）を代謝的に産生することができる、様々な衛生学的に及び病理学的に重要な微生物についての、スクリーニング用だけでなく、単離、特徴付け、及び定量的評価（微生物のカウント）用の、新規で改良されたプレート用の培地を提供する。
【００５２】
一般的に、4-メチルウンベリフェリル-イノシトール-1-ホスフェートのような、化学式（I）及び（IV）成分及び新規の好ましい化合物は、リットル当り約0.05-0.3グラム(g/l)の濃度で使用することができるが、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェートの一般的な濃度は、約0.1-0.4g/lであろう（本出願で用いられている単語「約」は、与えられた数値の50％までの偏差がある可能性を示す）。
【００５３】
多くの量を用いても、高いコストを埋め合わすことができる利点は通常は得られない。ここで及び以下の実施例で示す濃度の値は、完全にready-to-useの培地に基づいていることを強調しておく。乾燥したプレート用の培地（例えば、保存期間を増す、又は、他の適用の形態のため）を作製するためには、適切な量を状況に応じて計算しなければならない。
【００５４】
化学式（I）及び（IV）の置換基R1からR10は、それぞれ、このような置換基により、PI-PLCと接触させた際に蛍光及び/又は発色をそれぞれ生じる化学式（I）及び/又は（IV）の化合物の特異的な光の吸収を増やす、又は少なくとも著しく消滅させないような、蛍光性又は発色性を有する。
【００５５】
一般的に、プレート用の培地の組成物は、それ自体、この業界で良く知られており(例えば、“Biotechnological Bioengineering” Vol. 24, 1982, pp 1519を参照)、液体、半液体、又は固体の培養培地として入手でき、一般的には：
−寒天又はゼラチンのような、ゲル形成成分；
−対象とする微生物のための炭素源を含む栄養素；
−様々な添加剤；及び（望む形態に依存して）
−ゲル形成成分のゲル形成能によっては必要である任意の水溶性の培地；
を含む。
【００５６】
この業界の当業者に良く知られているように、一般的にはペトリディッシュのような担体又は基材を、液体又は半液体のプレート用の培地のサポートとして使用する。
【００５７】
本発明によるプレート用の培地は、このような液体又は半液体の形態と同様に、乾燥したプレート用の培地を含む。好ましい「乾燥」とは、実質的に無水であり、貯蔵性のために、一般的には重量で5％未満、好ましくは重量で3％未満の水を含む。言い換えれば、本発明による、一般的な乾燥した又は無水のプレート用の培地とは、十分な水溶性の培地の添加により、液体又は半液体のプレート用の培地となるように構成されている。
【００５８】
プレート用の培地の調製は、例えば、一般的な成分の製品に示されているように、よく知られた通例に従う。
【００５９】
単語「ready-to-use」は、一般的に、培養のために用いるプレート用の培地の、最大の水含量から最小の水含量の範囲の様々な濃度のプレート用の培地を含み、「水溶性」又は「液体」と同様に、「半乾燥」又は「半液体」のプレート用の培地も含む。微生物培養の分野において良く知られているように、一般的なプレート用の培地は、ペトリディッシュ又は他のタイプの支持プレートのような担体に適用した後で、比較的硬いゲルを形成する、注ぐことができる組成物、又は「液体」の組成物（時には「ゾル」と言われる）として作製される。それ故、ready-to-useの液体又は半液体の形態においては、本発明によるプレート用の培地は、必ずしも必要でないが、そのような担体又はプレートを含むことができる。
【００６０】
本発明による一般的な無水のプレート用の培地は、意図した使用に必要な全ての基本的成分（すなわち、ゲル形成成分、化学式（I）及び/又は化学式（II）の化合物、及び、−一般的に−微生物に必須の栄養素）を含み、本発明による好ましい無水のプレート用の培地は、水溶性の成分を除き、ready-to-useのプレート用の培地に必須の成分（例えば、フリーズドライした組成物又は凍結乾燥物）を含む。
【００６１】
しかしながら、本発明によるプレート用の培地の必要な性質は、蛍光及び発色の形成によって微生物のPI-PLCの検出するための、化学式（I）及び化学式（IV）の少なくとも1つの化合物を含むことであることに注目すべきである。従って、実際に使用する者が特異的な必要性の観点から使用することを望む場合、栄養素、選択のための特異的な添加剤（阻害剤）又は生育を促進するための活性剤、酵素切断の改良、又は接触プレート方法(contact plate method)に必要な添加剤を、本発明による乾燥、半液体（半固体と同義語）又は液体のプレート用の培地に、必ずしも必要でないが−好ましくは−含むことができる。
【００６２】
本発明による好ましいプレート用の培地の適用には、前記した、いわゆる接触プレート方法のための使用がある。この方法においては、対象とするサンプル（例えば、チーズのような食品製品又は食品加工において試用される道具又は装置の部品（衛生のためのモニター））を、接種及び衛生のコントロールのためのプレート上の培地に直接置く。この方法のためのプレート用の培地は、好ましくは、一般的なサンプルに含まれているであろう、界面活性剤の影響を弱めることができる成分を含む。レシチンのようなリン脂質、及びL-ヒスチジンは、これに適した添加剤であり、より詳細に以下に説明するように他の目的においても適した添加剤である。一般的に販売されている接触プレートは長方形（20×80mm）であり、良好な接触特性のために、外側へ出っ張った緩やかな凸状を形成するように満たされている。
【００６３】
半液体培地に接種することができ、その後、非特異的な栄養素の層にのせ、又は、その移動性及び/又は電場の影響のために対象とする微生物の移動に用いることができる。蛍光及び/又は発色の形成は、プレート用の培地の半固体部分において見られる。
【００６４】
プレート用の培地とともに使用するためのゲル化剤（ゲル形成剤とも言われる）は、この業界で良く知られており、購入することができる。本発明によるプレート用の培地を含む微生物培養に使用するための様々なタイプの寒天又はゼラチンのような、適した試薬により、水溶性のゲルを形成することができる。
【００６５】
本発明によるプレート用の培地の全てのタイプの好ましい栄養素は、明白に微生物の増殖の停止期間を短くする狙いで、カゼイン、大豆、肉に由来するペプチド性、パンクレアチン消化、トリプシン消化及びパパイン消化ペプトン及びアミノ酸（例えば、カザミノ酸）の混合物を含む。ペプトン混合物を、Columbia agarのような高品質の栄養寒天により置き換えることができる。
【００６６】
好ましいアミノ酸の混合物は、L-システイン及びL-トリプトファンを含むものであり、一般的に、最終的な又はready-to-useのプレート用の培地で計算して、リットル当り10-200ミリグラム(mg/l)の量で使用される。
【００６７】
本発明によるプレート用の培地に適していると考えられる添加剤は、一般に、約1から12g/lの量の、ビタミンを含む、対象とする微生物に必須の増殖剤（例えば、酵母抽出物又は肉抽出物（単語「肉」には、とりわけ、肝臓のような器官、血液を含む）、及び、脳-心臓‐浸出物）である。
【００６８】
本発明によるプレート用の培地に適していると考えられる炭素源は、とりわけ、一般に、約0.5から5g/lの濃度での、炭化水素又はその代謝前駆体（例えば、D-グルコース、ピルビン酸ナトリウム、及びL-ラムノース）を含む。ピルビン酸ナトリウムは、また、細胞の増殖を阻害する酸素ラジカルの量を減少させる。
【００６９】
増殖及びPI-PLC切断を改良するために、マグネシウム塩のような微量成分（例えば、MgSO4）を添加することができ、約0.2-1.0g/lからの一般的な濃度で、標準的な微量元素溶液「Schlosser」（W. Dunger, H. J. Fiedler; Methoden der Bodenkunde, 2nd edition, 1997, pp 92, Gustav Fischer, Jena-Stuttgart/Germanyを参照）を添加することができる。このような微量元素溶液はPI-PLC産生を増し、その結果、化学式（I）及び/又は（IV）の化合物の切断を増し、予想できないかなりの程度の蛍光及び/又は発色を生じることとなると考えられている。
【００７０】
他の好ましい添加剤は、鉄源又は鉄イオン（例えば、クエン酸鉄アンモニウムのようなクエン酸鉄（例えば、約0.1-1.0g/lの濃度で）、又はフェリオキサミンBのようなフェリオキサミン（例えば、リットル当り約50-2000マイクログラム(ug/l)、好ましくは100-500ug/l））である。
【００７１】
PI-PLCの切断を促進するために、一般的に、約20-100ml/lの濃度で血清（例えば、ウマ又はウシ血清）を、又は、一般的に、約2-5g/lの濃度でウシ血清由来のアルブミンを加えることができる。このようなアルブミンの使用は、乾燥したプレート用の培地を調製する場合に、特に有利である。
【００７２】
PI-PLCに対する他の活性化剤又は促進剤は、一般的に約1-5g/lの濃度でのリン脂質（例えば、大豆、他の精液又は卵黄由来のレシチン）、及び、約0.5-2.0g/lの濃度でのグリセロリン酸の塩（例えば、グリセロリン酸マグネシウム又はグリセロリン酸ナトリウム）である。このような成分の使用は、簡単に前記した接触プレート方法で使用するためのプレート用の培地において非常に重要である。例えば、一般的に約0.5から2g/lの濃度で使用されるL-ヒスチジンは、直接接触させるためのプレート用の培地の使用のための他の添加剤である。
【００７３】
着色したコロニーを認識しやすくするために、一般的に約1-5g/lの量で、二酸化チタンのような不活性な乳白剤を加えることができる。
【００７４】
コロニーの大きさを小さくするため、及び、本発明によるプレート用の培地に用いられる蛍光及び/又は発色の効率を改良するために、例えば、約1-5g/lの濃度の、天然のデンプンを加えることができる。
【００７５】
対象とする特異的な微生物を選択できるプレート用の培地を調製することは有用である。例えば、Listeria monocytogeneに対する選択性を付与するためには、他のグラム陰性又はグラム陽性細菌（例えば、酵母及びカビのみならずBacillus cereusも）のような、PI-PLCを産生する他の微生物が増殖することは不都合であり、プレートの読み取りが混乱することを防ぐためにも阻止すべきである。
【００７６】
一方、プレート用の培地がListeria以外の微生物を選択するように調製されている場合、それに応じた適した阻害剤を選択しなければならないであろう。以下に示す阻害剤は、Listeriaを選択するプレート用の培地の説明に役立つ例である。この業界における経験を有する者は、一般的な微生物の知識に基づいて、及び/又は、1回か2回の単純な増殖試験により、適した阻害剤を容易に選択できるであろう。
【００７７】
Listeriaに特異的なプレート用の培地のための適した阻害剤は、相乗効果を有する抗生物質の組み合わせ（例えば、グラム陰性細菌を阻害するためのホスホマイシン（例えば、約20-50mg/lで）又はセフタジジム（例えば、約20-50mg/lで）、ドキシサイクリン（例えば、約2-20mg/lで）だけでなく、スルファメトキサゾール（例えば、約50-1000mg/lで）と任意に組み合わせた、ポリミキシンBのような抗生物質（例えば、リットル当り約10から20ミリグラム(mg/l)の濃度で）との組み合わせ）を含む。
【００７８】
更に、塩化リチウムの添加（約2-20mg/lで）により（好ましくは、ナリジクス酸（例えば、約20-50mg/lで）又はクリンダマイシン（例えば、1-10mg/lで）と組み合わせて）、望ましくないグラム陽性細菌を抑えるのに役立つ。
【００７９】
酵母及びカビの阻害は、シクロヘキサミド（例えば、約50-300mg/lで）又はアンホテリシンB（例えば、約1-5mg/lで）の添加により、適切に達成することができる。
【００８０】
一般的に、このようなメカニズムは、PI-PLCを産生する他の微生物、特にBacillus cereus及びBacillus thuringiensisの検出及びカウントのための培地に適用され、選択性は、Listeriaのために前記で説明した類似の方法で達成することができる。
【００８１】
Bacillus cereusグループに特異的なプレート用の培地のための阻害は、好ましい実施例に従い、相乗効果を生じる抗生物質の組み合わせ、例えば、ポリミキシンB（10-20mg/l）、スルファメトキサゾール（10-200mg/l）及びトリメトプリム（1-20mg/l）の組み合わせを用いることによって達成される。
【００８２】
本発明によって開示されているBacillus cereusグループに特異的なプレート用の培地は、また、動物の飼料から単離された、いわゆる「プロバイオティクス」Bacillus cereusの特徴付け及び区別するために使用することもできる。非毒性の「弱毒化した」Bacillus cereus株Paciflor（登録商標）及びToyocerin（登録商標）は、成長促進剤として働く食品添加物として用いられる。
【００８３】
毒性のBacillus cereusの野生株から、これらのプロバイオティクスに寄与する胞子形成菌を区別することは、単純に（例えば、生化学試験により）行うことができない。これは、これらの株が、溶血素の産生、デンプン加水分解、ゼラチナーゼ及びレシチナーゼ反応だけでなくカタラーゼ反応も等しく、炭化水素の発酵においても如何なる有意な差異を示さないからである。
【００８４】
しかしながら、予想できなかったことに、前記の非毒性のプロバイオティクスBacillus cereus株は、実質的により薄く着色化（例えば、薄い青緑色のコロニー）し、本発明による新規のBacillus cereusグループのプレート用の培地上で検出することができるPI-PLCが遅れた産生を示した。
【００８５】
不十分にPI-PLCを産生するBacillus cereusの野生型株から明確に区別するために、培地の表面に抗生物質のディスクを用いることができる。B. cereusの野生株は、ペニシリンG(10ug/disc)及びセファマンドール(30ug/disc)に耐性であるが、全ての試験したプロバイオティクスB. cereus株は感受性であった。
【００８６】
本発明によるプレート用の培地を用いることによる、微生物の検出及びカウントの非制限の実施例には、Listeria monosytogenes、Listeria ivanovii、Staphylococcus aureus、Legionella pneumophila、Clostridium属、Helicobacter pyloriだけでなく、Bacillus cereusグループ、特にBacillus cereus、Bacillus thuringiensis、Bacillus mycoides、Bacillus weihenstephanensis及びBacillus anthracisのメンバーを含む。更に対象とする微生物には、酵母（例えば、Candida属）及びカビ（例えば、Aspergillus属）がある。
【００８７】
Listeria monocytogenesを同定するための好ましい試験方法は、損傷したListeria monocytogenes細胞を修復し、蘇生させることができる、前記の増菌培地の使用（例えば、EN ISO 11290-1及びEN ISO 11290-2に記載されている、前増菌のための、いわゆるFraser 1/2-brothでの培養後に、通常のFraser-brothでの選択的増菌を行うという組み合わせ）を含む。
【００８８】
そのあと、少なくとも、少量の増菌培地（例えば、増菌培地の少量の液体を移す白金耳）によって接種する。プレート用の培地は、蛍光性及び/又は発色性の化合物を含むことから、すなわち、対象とする微生物によって産生されるPI-PLCと接触させて蛍光又は発色を呈して、対象とする微生物の存在を示せることから（そして、プレート用の培地の組成によりもたらされ選択性を有する増殖条件のために）、プレート用の培地を培養することにより、対象とする微生物が増殖し、対応する蛍光及び/又は発色を呈する微生物のコロニーが形成される。望むならば、微生物の細胞は、確認のために、蛍光及び/又は発色したコロニーから単離することができる。
【００８９】
プレート用の培地は、また、サンプル（例えば、病原菌を直接カウントするための様々な食品サンプルで）で直接接種することができる。
【００９０】
前記した接触プレート方法、及び、前記で開示した、選択性を有する、本発明による直接用いるプレート用の培地は、特に、食品加工業界での制御及びモニターする目的において興味深い。以下に記す非制限の実施例は、更に発明を説明するために記載する。
【００９１】
一般的に、本発明は、食品、飲料及び動物の飼料のような生理学上のサンプル又は消耗品を含む汚染している可能性のある物質中の、Listeria monosytogenes、Listeria ivanovii、プロバイオティクスB. cereus株（Paciflor（登録商標）及びToyocerin（登録商標））、Bacillus thuringiensis及びBacillus anthracisを含むBacillus cereusのような微生物の病原性になる可能性のある細菌活性の、安全で、感度が良く、商業的に発展できる検出、同定及びカウントを提供する。
【００９２】
本発明は、非制限の実施例により、より詳細に説明する。
【実施例】
【００９３】
実施例１−３：Listeria monocytogenesのための改良した選択性を有するプレート用の培地
【００９４】
（実施例１）
本実施例では、本発明による化学式（I）の蛍光性を有する化合物を用いた、Listeria monocytogenesのための、改良したready-to-useの選択性を有するプレート用の培地の調製、接種及び効果を説明する。
【００９５】
プレート用の寒天を、以下に示す基本的な成分から調製した：
寒天                                    15.0g/l
特製ペプトン(special peptone)           18.0g/l
酵母抽出物                              8.0g/l
カザミノ酸                              5.0g/l
肉抽出物                                5.0g/l
グリセロリン酸ナトリウム                 1.0g/l
ピルビン酸ナトリウム                     1.0g/l
硫酸マグネシウム七水和物                 1.5g/l
塩化リチウム                             5.0g/l
クエン酸鉄アンモニウム                   0.2g/l
第二リン酸カリウム(KH2PO4)                1.5g/l
第二リン酸ナトリウム(NaH2PO4・2H2O)         3.1g/l
シクロヘキシミド                         0.2g/l
【００９６】
全ての成分を960mlの水（蒸留水又は脱イオン水）に溶かし、121℃で15分間、オートクレーブを行った。pHは、7.1-7.2の範囲に保持した。
【００９７】
以下の補給剤を、特定の量で追加した：
D-グルコース                            2.0g/l
ウシ血清アルブミン                      3.5g/l
大豆レシチン                            1.5g/l
標準微量元素溶液Schlosser                 5ml/l
4-メチルウンベリフェリル 
myo-イノシトール-1-ホスフェート、
N-メチルモルホリン塩                     0.1g/l
【００９８】
前記で説明したListeraの選択性の観点から、望ましくない微生物の阻害剤として、以下に示す抗生物質を加えた：
ポリミキシンB                           0.01g/l
ナリジクス酸                            0.03g/l
セフタジジム                            0.03g/l
【００９９】
ウシアルブミンを、別に10mlの水（蒸留水又は脱イオン水）に溶かした。レシチンは10mlの20vol.%のエタノールに懸濁させた。グルコース、微量元素溶液及び基質とともに両方の溶液を、無菌状態で、攪拌しながら、50-55℃に冷却した前記の寒天培地に加えた。最後に、抗生物質を無菌状態で加えた。
【０１００】
10分間攪拌後、pHを調整して、培地をペトリディッシュに注ぎ込み、凝固させる。
【０１０１】
標準微量元素溶液「Schlosser」は以下からなる：
硫酸亜鉛七水和物                         1mg/l
硫酸マグネシウム四水和物                 2mg/l
ホウ酸                                  10mg/l
硝酸コバルト(II)六水和物                 1mg/l
モリブデン酸ナトリウム二水和物           1mg/l
硫酸銅（II）五水和物                     0.005mg/l
硫酸鉄七水和物                           0.7g/l
EDTA                                    0.8g/l
再蒸留水                         全体の容量が1リットルになるように加えた
【０１０２】
この標準Schlosser溶液は、十倍の濃度のストック溶液として調製し、121℃で15分間オートクレーブを行った。この濃縮溶液を5ml、前記1リットルのプレート用の培地に加えた。
【０１０３】
白金耳を用いて、前増菌培養した液体培地をプレート用の培地にストリーキングして接種し、36±1℃で24時間培養した。
【０１０４】
結果を、培養後における選択的/区別化プレート用の培地上での様々な細菌のコロニーの性質を示した表１にまとめる。
【０１０５】
（実施例２）
本発明による蛍光性指示薬（化学式I）及び発色性指示薬（化学式IV）の両方の組み合わせを供給するために、0.2g/lの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェートのアンモニウム塩を加えたことを除いて、実施例１を繰り返した。
【０１０６】
再度、結果を表１にまとめる。
【０１０７】
（実施例３）
0.1g/lの4-メチルウンベリフェリル myo-イノシトール-1-ホスフェートのN-メチルモルホリン塩（化学式Iの化合物）を、0.2g/lの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェートのアンモニウム塩（化学式IVの化合物）によって置き換えたことを除いて、実施例１を繰り返した。                
【０１０８】
濃い色を有する、コロニー内に保持され、培地内へと拡散しない5,5’-ジブロモ-4,4’-ジクロロ-インジゴ水不溶性色素が形成される、Listeria monocytogeneコロニーが青色から青緑色の色になったことにより、PI-PLC酵素の存在が示された。
【０１０９】
再度、結果を表１にまとめる。
【０１１０】
【表１】
2005525825.tif 000003
【０１１１】
実施例４−６：Bacillus種のための改良した選択性を有するプレート用の培地
【０１１２】
様々なBacillus種のための選択性を有する蛍光及び/又は発色を呈するプレート用の培地は、以下に記す表２で特徴付けられることを除いて、本質的には、実施例１に記載したとおりに調製した。実施例４のプレート用の培地（比較）は、蛍光性の指示薬（A）を含んでいた。実施例５のプレート用の培地は、蛍光性及び発色性の指示薬（A+B）を含むが、実施例６のプレート用の培地（比較）は発色性の指示薬（B）しか含まなかった。蛍光性/発色性の基質の量が減ってしまうので、コロニーが大きくならないように、栄養素の組成物を選択した。
【０１１３】
【表２】
2005525825.tif 000004
【０１１４】
基本培地を121℃で15分間オートクレーブ行い、pHを7.1-7.3に調整した。
【０１１５】
補給剤を、無菌状態で蒸留水又は脱イオン水に溶かし、約50℃に冷却したプレート用の培地に加えた。完全培地をペトリディッシュに注ぎ込み、凝固させた。
【０１１６】
プレート用の培地について、前増菌培養した液体培地を白金耳を用いて寒天の上にストリーキングして接種し、又は直接サンプルによって接種した。36±1℃で24時間培養した。表３に、培養後におけるBacillus種のための改良した選択的/区別化プレート用の培地上での様々な細菌のコロニーの性質をまとめる。
【０１１７】
本培地の更に有用な形態は、表２で示した培地の表面に抗生物質ディスクをのせることによって、プロビオティクスBacillus cereus種（Paciflor（登録商標）及びToyocerin（登録商標））を検出できることである。本方法は、寒天-拡散試験のように行われる。B. cereusの野生株は、ペニシリンG(10ug/disc)及びセファマンドール(30ug/disc)に耐性であるが、全ての試験したプロバイオティクスB. cereus株はこれらの抗生物質に対して感受性であった。
【０１１８】
【表３】
2005525825.tif 000005
【０１１９】
前記実施例は、好ましい成分である、4-メチルウンベリフェリル myo-イノシトール-1-ホスフェートのN-メチルモルホリン塩、及び、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル myo-イノシトール-1-ホスフェートのアンモニウム塩にそれぞれ関係しているものであるが、それぞれ、化学式（I）及び（IV）の他の基質でも、非常に類似した結果が得られるであろうことは注目すべきである。それ故、前記実施例の様々な修飾は理解できるであろう。
【国際調査報告】
2005525825.tif 000008
2005525825.tif 000009
2005525825.tif 000010