(57)【要約】本発明は、全般的には、タンパク質間の相互作用を調節するリガンドを同定する方法に関するものである。より具体的には、本発明は、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬又は拮抗薬を、標的分子の安定性を変形する能力に基づいて判定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補助調節因子依存性の標的分子の作用薬又は拮抗薬を同定する方法であって、
前記標的分子の安定性を改変する１組の分子を用意する工程と、
前記組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で前記標的分子の安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングする工程とを含み、
前記組中の１分子と、前記１つ又は複数の補助調節因子中の１補助調節因子との存在下での前記標的分子の安定性の更なる改変は、前記分子が、前記補助調節因子の存在下で、前記標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記標的分子の安定性を改変する前記１組の分子を用意する工程は、前記標的分子の安定性を改変する能力に関して、多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的分子の安定性を更に改変する能力に関して、前記１組の分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子及び前記組中の１つ又は複数の分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記補助調節因子中の１つ又は複数とを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器のそれぞれにおいて前記標的分子を処理して、前記標的分子を変性させる工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の変性曲線を、各前記容器について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記変性曲線のそれぞれと、（１）他の変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）（ｉ）前記組中の前記分子のいずれか、及び／又は、（ｉｉ）前記補助調節因子が存在しないときの、前記標的分子の前記変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記組中の前記分子のいずれかが、前記標的分子の前記安定性を更に改変するか否かを判定する工程であって、安定性の更なる改変は、前記変性曲線の更なる変化によって示される工程と
を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的分子の前記安定性を改変する能力に関して、多数の異なる分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器のそれぞれにおいて前記標的分子を処理して、前記標的分子に変性を起こさせる工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の変性曲線を、各前記容器について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記変性曲線のそれぞれと、（１）他の変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）前記多数の異なる分子のいずれかが存在しないときの前記標的分子の前記変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なる分子中のいずれかが、前記標的分子の前記安定性を改変するか否かを判定する工程であって、安定性の改変は、前記変性曲線の変化によって示される工程と
を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ又は複数の補助調節因子は、活性化補助因子、及び／又は、共リプレッサーを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組中の１つ又は複数の分子は、活性化補助因子の存在下で前記標的分子の安定性を更に改変し、それによって、前記活性化補助因子の存在下で前記標的分子の作用薬を同定することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組中の１つ又は複数の分子は、共リプレッサーの存在下で前記標的分子の安定性を更に改変し、それによって、前記共リプレッサーの存在下で前記標的分子の拮抗薬を同定することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
補助調節因子依存性の標的分子の作用薬又は拮抗薬を同定する方法であって、
前記標的分子の熱変性曲線を移動させる１組の分子を用意する工程と、
前記組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングする工程とを含み、
前記組中の１分子と、前記１つ又は複数の補助調節因子中の１補助調節因子との存在下での前記標的分子の前記熱変性曲線の更なる移動は、前記分子が、前記補助調節因子の存在下で、前記標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示すことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記標的分子の前記熱変性曲線をシフトさせる前記１組の分子を用意する工程は、前記標的分子の前記熱変性曲線をシフトさせる能力に関して、多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させる能力に関して、前記１組の分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子及び前記組中の１つ又は複数の分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記補助調節因子中の１つ又は複数の補助調節因子を接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器を加熱する工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記加熱に起因する前記熱変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の熱変性曲線を各前記容器の温度の関数として作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記熱変性曲線のそれぞれと、（１）他の熱変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）（ｉ）前記組中の前記分子のいずれか、及び／又は、（ｉｉ）前記補助調節因子が存在しないときの前記標的分子の前記熱変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記組中の前記分子中のいずれかが、前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させるか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的分子の前記熱安定性を移動させる能力に関して、多数の異なる分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器を加熱する工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記加熱に起因する前記熱変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の熱変性曲線を各前記容器の温度の関数として作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記熱変性曲線のそれぞれと、（１）他の熱変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）前記多数の異なる分子のいずれかが存在しないときの前記標的分子の前記熱変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なる分子中のいずれかが、前記標的分子の前記熱変性曲線を移動させるか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ又は複数の補助調節因子は、活性化補助因子、及び／又は、共リプレッサーを含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記組中の１つ又は複数の分子は、活性化補助因子の存在下で前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させ、それによって、前記活性化補助因子の存在下で前記標的分子の作用薬を同定することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組中の前記１つ又は複数の分子は、共リプレッサーの存在下で前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させ、それによって、前記共リプレッサーの存在下で前記標的分子の拮抗薬を同定することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
補助調節因子依存性の標的分子の拮抗薬を同定する方法であって、
前記標的分子の安定性を改変する１組の分子を用意する工程と、
前記組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の活性化補助因子の存在下で前記標的分子の前記安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングする工程とを含み、
前記組中の１分子及び前記１つ又は複数の活性化補助因子中の１活性化補助因子の存在下での前記標的分子の前記安定性がそれ以上改変されないことは、前記組中の分子が、前記活性化補助因子の存在下で、前記標的分子の拮抗薬であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記標的分子の前記安定性を改変する前記１組の分子を用意する工程は、前記標的分子の前記安定性を改変する能力に関して、多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的分子の前記安定性を更に改変する能力に関して、前記１組の分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子及び前記組中の１つ又は複数の分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記活性化補助因子中の１つ又は複数の活性化補助因子を接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器のそれぞれにおいて前記標的分子を処理して、前記標的分子に変性を起こさせる工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の変性曲線を、各前記容器について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記変性曲線のそれぞれと、（１）他の変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）（ｉ）前記組中の前記分子のいずれか、及び／又は、（ｉｉ）前記活性化補助因子が存在しないときの前記標的分子の前記変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記組中の前記分子中のいずれかが、前記標的分子の前記安定性を更に改変するか否かを判定する工程であって、安定性の更なる改変は、前記変性曲線の更なる変化によって示される工程と
を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的分子の前記安定性を改変する能力に関して、多数の異なる分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器のそれぞれにおいて前記標的分子を処理して、前記標的分子に変性を起こさせる工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の変性曲線を、各前記容器について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記変性曲線のそれぞれと、（１）他の変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）前記多数の異なる分子のいずれかが存在しないときの前記標的分子の前記変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なる分子中のいずれかが、前記標的分子の前記安定性を改変するか否かを判定する工程であって、安定性の改変は、前記変性曲線の変化によって示される工程と
を含むことを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
補助調節因子依存性の標的分子の拮抗薬を同定する方法であって、
前記標的分子の熱変性曲線を移動させる１組の分子を用意する工程と、
前記組中の１つ又は複数の前記分子を、１つ又は複数の活性化補助因子の存在下で前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングする工程とを含み、
前記組中の１分子及び前記１つ又は複数の活性化補助因子中の１活性化補助因子の存在下での前記熱変性曲線がそれ以上移動しないことは、前記組の前記分子が、前記活性化補助因子の存在下で、前記標的分子の拮抗薬であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記標的分子の前記熱変性曲線をシフトさせる前記１組の分子を用意する工程は、前記標的分子の前記熱変性曲線をシフトさせる能力に関して、多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させる能力に関して、前記１組の分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子及び前記組中の１つ又は複数の分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記活性化補助因子中の１つ又は複数の活性化補助因子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器を加熱する工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記加熱に起因する前記熱変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の熱変性曲線を各前記容器の温度の関数として作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記熱変性曲線のそれぞれと、（１）他の熱変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）（ｉ）前記組中の前記分子のいずれか、及び／又は、（ｉｉ）前記活性化補助因子が、存在しないときの前記標的分子の前記熱変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記組中の前記分子中のいずれかが、前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させるか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的分子の前記熱変性曲線を移動させる能力に関して、多数の異なる分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器を加熱する工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記加熱に起因する前記熱変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の熱変性曲線を各前記容器の温度の関数として作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記熱変性曲線のそれぞれと、（１）他の熱変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）前記多数の異なる分子のいずれかが、存在しないときの前記標的分子の前記熱変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なる分子中のいずれかが、前記標的分子の前記熱変性曲線を移動させるか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
補助調節因子依存性の標的分子の作用薬を同定する方法であって、
前記標的分子の安定性を改変する１組の分子を用意する工程と、
前記組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の共リプレッサーの存在下で前記標的分子の前記安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングする工程とを含み、
前記組中の１分子及び前記１つ又は複数の共リプレッサー群の中の１共リプレッサーの存在下での前記標的分子の前記安定性がそれ以上改変されないことは、前記組中の分子が、前記共リプレッサーの存在下で、前記標的分子の作用薬であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記標的分子の前記安定性を改変する前記１組の分子を用意する工程は、前記標的分子の前記安定性を改変する能力に関して、多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的分子の前記安定性を更に改変する能力に関して、前記１組の分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子及び前記組中の１つ又は複数の分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記共リプレッサー群の中の１つ又は複数の共リプレッサーとを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器のそれぞれにおいて前記標的分子を処理して、前記標的分子に変性を起こさせる工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の変性曲線を各前記容器について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記変性曲線のそれぞれと、（１）他の変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）（ｉ）前記組中の前記分子のいずれか、及び／又は、（ｉｉ）前記共リプレッサーが、存在しないときの前記標的分子の前記変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記組中の前記分子中のいずれかが、前記標的分子の前記安定性を更に移動させるか否かを判定する工程であって、安定性の更なる改変は、前記変性曲線の更なる変化によって示される工程と
を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的分子の前記安定性を改変する能力に関して、多数の異なる分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器のそれぞれにおいて前記標的分子を処理して、前記標的分子に変性を起こさせる工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の変性曲線を各前記容器について作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記変性曲線のそれぞれと、（１）他の変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）前記多数の異なる分子のいずれかが、存在しないときの前記標的分子の前記変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なる分子中のいずれかが、前記標的分子の前記安定性を改変するか否かを判定する工程であって、安定性の改変は、前記変性曲線の変化によって示される工程と
を含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
補助調節因子依存性の標的分子の作用薬を同定する方法であって、
前記標的分子の熱変性曲線を移動させる１組の分子を用意する工程と、
前記組中の１つ又は複数の前記分子を、１つ又は複数の共リプレッサーの存在下で前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングする工程とを含み、
前記組中の１分子及び前記１つ又は複数の共リプレッサー群の中の１共リプレッサーの存在下での前記熱変性曲線がそれ以上移動しないことは、前記組の前記分子が、前記共リプレッサーの存在下で、前記標的分子の作用薬であることを示すことを特徴とする方法。
【請求項２８】
前記標的分子の前記熱変性曲線をシフトさせる前記１組の分子を用意する工程は、前記標的分子の前記熱変性曲線をシフトさせる能力に関して、多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させる能力に関して、前記１組の分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子及び前記組中の１つ又は複数の分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記共リプレッサー群の中の１つ又は複数の共リプレッサーとを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器を加熱する工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記加熱が起因する前記熱変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の熱変性曲線を各前記容器の温度の関数として作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記熱変性曲線のそれぞれと、（１）他の熱変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）（ｉ）前記組中の前記分子のいずれか、及び／又は、（ｉｉ）前記共リプレッサーが、存在しないときの前記標的分子の前記熱変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記組中の前記分子中のいずれかが、前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させるか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的分子の前記熱変性曲線を移動させる能力に関して、多数の異なる分子中の前記１つ又は複数の分子をスクリーニングする工程は、
（ａ）前記標的分子と、多数の容器のそれぞれにおいて前記多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子とを接触させる工程と、
（ｂ）前記多数の容器を加熱する工程と、
（ｃ）各前記容器の中で、前記標的分子の前記加熱が起因する前記熱変性に関連した物理的変化を測定する工程と、
（ｄ）前記標的分子の熱変性曲線を各前記容器の温度の関数として作成する工程と、
（ｅ）工程（ｄ）の前記熱変性曲線のそれぞれと、（１）他の熱変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）前記多数の異なる分子のいずれかが、存在しないときの前記標的分子の前記熱変性曲線とを比較する工程と、
（ｆ）前記多数の異なる分子中のいずれかが、前記標的分子の前記熱変性曲線を更に移動させるか否かを判定する工程と
を含むことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
未知の機能を有する標的分子の作用薬なのか又は拮抗薬なのかを判定するための方法であって、
未知の機能を有する標的分子の安定性を改変する１組の分子を用意する工程であって、前記１組の分子は、生物学的機能を共有する受容体群の安定性を改変する工程と、
前記組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で前記標的分子の前記安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングする工程であって、前記組中の１分子及び前記１つ又は複数の補助調節因子中の１補助調節因子の存在下での前記標的分子の前記安定性の更なる改変は、前記分子が、前記補助調節因子の存在下で、前記標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示す工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３２】
前記標的分子の前記安定性を改変する前記分子の組を提供する工程は、前記標的分子の前記安定性を改変する能力に関して、生物学的機能を共有する受容体の前記安定性を改変する分子の一団又は複数団をスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
未知の機能を有する標的分子の作用薬なのか又は拮抗薬なのかを判定するための方法であって、
未知の機能を有する標的分子の熱変性曲線をシフトさせる１組の分子を用意する工程であって、前記１組の分子は、生物学的機能を共有する受容体群の熱変性曲線をシフトさせる工程と、
前記組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で前記標的分子の前記熱変性曲線を更にシフトさせる能力に関してスクリーニングする工程であって、前記組中の１分子及び前記１つ又は複数の補助調節因子中の１補助調節因子の存在下での前記標的分子の前記熱変性曲線の更なるシフトは、前記分子が、前記補助調節因子の存在下で、前記標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示す工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記標的分子の前記熱変性曲線を移動させる前記分子の組を提供する工程は、前記標的分子の前記熱変性曲線を移動させる能力に関して、生物学的機能を共有する受容体の前記熱変性曲線を移動させる分子の一団又は複数団をスクリーニングする工程を含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的分子は、核内受容体であることを特徴とする請求項１乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記標的分子は、Ｇタンパク質結合受容体であることを特徴とする請求項１乃至３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記標的分子は、ＥＲ−αであることを特徴とする請求項１乃至３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記標的分子は、ＥＲ−βであることを特徴とする請求項１乃至３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記標的分子は、チロシンキナーゼであることを特徴とする請求項１乃至３０のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記標的分子は、ＮＦ−κＢであることを特徴とする請求項１乃至３０のいずれかに記載の方法。
ｙ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、親和性がリガンド又はアロステリック調節因子（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）によって調整される、タンパク質間の相互作用に係わるリガンドを同定する方法に関するものである。より具体的には、本発明は、受容体の作用薬リガンド（ａｇｏｎｉｓｔ  ｌｉｇａｎｄ）又は拮抗薬リガンド（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｌｉｇａｎｄ）を、補助調節因子（ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）の存在下で受容体の安定性を変形する能力に基づいて判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、参照として本明細書にそのまま組み込まれた、２００２年７月２４日に出願した米国仮出願第６０／３９８，０２３号の優先権利益を主張するものである。
【０００３】
シグナル伝達及び遺伝子発現における中心テーマは、タンパク質間モジュラー領域の構成的又は誘発的な相互作用である。これらの相互作用を増強するリガンドの知識は、生物学的事象の根底にある分子メカニズムの本質に関する情報及び疾患治療用の療法の開発に関する情報を提供する。リガンド同定用の既存の方法は、取り扱いが厄介であり、未知の機能を有するタンパク質の場合に限定される。
【０００４】
核内受容体（ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は、再生、細胞分化、脂質及び糖質のホメオスタシスを含む細胞機能を制御する転写因子のスーパーファミリーの構成体である。それらの機能は、多様なリガンド（生体異物、ホルモン、脂質、及び他の既知及び未発見のリガンド）の組によって調整される。今日までに４８の核内受容体が同定されており、そのうちの２８の核内受容体は、既知のリガンドを持ち、残りの核内受容体は、オーファン受容体に分類されている。受容体の生態は、複雑で組織特異性（非特許文献１参照）であり、分子の作用メカニズムは、これらの受容体をリガンドに依存して又は依存しないで調整する、補助調節因子と称される補助タンパク質の優先的動員機能のように見える。適切な補助調節因子の動員は、遺伝子転写又は抑制をもたらす。
【０００５】
Ｐａｎｖｅｒａ社は、エストロゲン受容体サブタイプβに対する拮抗薬リガンドと作用薬リガンドの識別用試薬を販売しており、活性化補助因子タンパク質の優先的動員に関するデータを公開した（非特許文献２及び３参照）。それらの試薬は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ））に基づくアッセイで使用される。
【０００６】
同じくＦＲＥＴに基づく他の核内受容体（ＥＲ−α、ＥＲＲ及びＰＰＡＲファミリー）用の同様なアッセイに関する出版物がある（非特許文献４及び５参照）。同様な実験は、ビアコア技術（Ｂｉａｃｏｒｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して実施されている（非特許文献６及び７参照）。
【０００７】
読み取りが遺伝子発現である細胞アッセイが、存在する（非特許文献８及び９参照）。例えば、Ｋａｒｏ−Ｂｉｏ社は、核内ホルモン受容体に対する作用薬リガンドと拮抗薬リガンドとを識別するための立体配座感応性ペプチドプローブを含めた遺伝子発現読み取りアッセイ（ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒｅａｄｏｕｔ  ａｓｓａｙ）を開発した（非特許文献１０及び１１参照）。
【０００８】
非特許文献１２は、エストラジオール存在下でのＥＲ−α受容体の熱安定性について報告している。しかし、該文献は、ＥＲ−α受容体の作用薬又は拮抗薬としての分子の同定法について説明していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記に説明した技術は、幾つかの欠点を持っている。例えば、核内受容体の分析、遺伝子発現読み取りアッセイ、及び細胞に基づいたアッセイにおいて、同定されたリガンド又は補助調節因子が対象とする受容体と直接相互作用を行い、シグナル伝達又は遺伝子活性化／抑制アッセイの読み取りを作成することができる他のタンパク質を介して相互作用を行わないことを確証するために逆スクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｃｒｅｅｎ）が必要である。また、細胞読み取り技術は、弱リガンド（典型的に、１μＭを超える親和性を有する化合物は、めったに同定されない）を同定する感度が弱く、良好な細胞透過特性を有する化合物に適用できるのみである。他の商業的な管内アッセイは、競合置換アッセイを確立するため、又はＦＲＥＴに基づいた補助調節因子アッセイを確証するためのツールとして商業的な管内アッセイを使用するための、リガンドについての知識を必要とする。
【００１０】
したがって、補助調節因子に依存する受容体に対するリガンドの高速かつ高処理な同定、及び補助調節因子の存在下で受容体に及ぼす該リガンドの効果の更なる同定を容易にする、正確で信頼性のある技術が必要とされている。
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００１／０００３６４８号
【特許文献２】米国特許第６，０２０，１４１号
【特許文献３】米国特許第６，０３６，９２０号
【特許文献４】米国特許第６，２９１，１９１号
【特許文献５】米国特許第６，２６８，２１８号
【特許文献６】米国特許第６，２３２，０８５号
【特許文献７】米国特許第６，２６８，１５８号
【特許文献８】米国特許第６，２１４，２９３号
【特許文献９】米国特許第６，２９１，１９２号
【特許文献１０】米国特許第６，３０３，３２２号
【特許文献１１】米国特許第５，５８５，２７７号
【特許文献１２】米国特許第５，６７９，５８２号
【非特許文献１】Shang&Brown,Science 295:2465-2468,2002
【非特許文献２】Bolger et al.,Environmental Health Perspectives 106:1-7(1998）
【非特許文献３】Panvera corporate presentation presented at the Orphan Receptor Meeting San Diego,June 2002
【非特許文献４】Zhou et al.,Molecular Endocrinology 12:1594-1604(1998)
【非特許文献５】Coward et al.,98:8880-8884,(2001)
【非特許文献６】Cheskis et al.,J.Biological Chemistry 11384-11391(1997)
【非特許文献７】Wong et al.;Biochemistry 40:6756-6765(2001)
【非特許文献８】Camp et al.,Diabetes 49:539-547(2001)
【非特許文献９】Kraichely et al.,Endocrinology,141:3534-3545,(2000)
【非特許文献１０】Paige et al.,PNAS 96:3999-4004(1999)
【非特許文献１１】presentation by Karo-Bio at the Orphan Receptor Meeting,San Diego June 2002
【非特許文献１２】Greenfield et al.,Biochemistry 40:6446-6652(2001)
【非特許文献１３】Aranda and Pascual,Physiological Reviews 81:1269-1304(2001)
【非特許文献１４】Collingwood et al.,Journal of Molecular Endocrinology 23:255-275(1999)
【非特許文献１５】Robyr et al.,Molecular Endocrinology 23:329-347(2000)
【非特許文献１６】Lee et al.,Cellular and Molecular Life Sciences 58:289-297(2001)
【非特許文献１７】Laudet,J.Molecular Endocrinology 19:207-226(1997)
【非特許文献１８】Maglich et al.,Genome Biology 2:1-7(2001)
【非特許文献１９】Eftink,M.R.,Biophysical J.66:482-501(1994)
【非特許文献２０】Weber,P.C.et al.,J.Am.Chem.Soc.116:2717-2724(1994)
【非特許文献２１】Clegg,R.M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:2994-2998(1993)
【非特許文献２２】Giguere,Endocrine Reviews 20:689-725(1999)
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、斯かる要求を満たす。本発明は、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬又は拮抗薬を同定する方法を提供する。該方法は、標的分子の安定性を改変する１組の分子を用意する工程と、該組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で、標的分子の安定性を更に改変する能力に関してスクリーニング（ｓｃｒｅｅｎ）する工程とを含む。その組中の１分子と補助調節因子の存在下での標的分子の安定性の更なる改変は、該分子が、補助調節因子の存在下で、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示す。
【００１３】
本発明は、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬又は拮抗薬を同定する別の方法を提供する。該方法は、標的分子の熱変性曲線を移動させる１組の分子を用意する工程と、該組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で、標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングする工程とを含む。その組中の１分子と補助調節因子の存在下での標的分子の熱変性曲線の更なる移動は、該分子が、補助調節因子の存在下で、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示す。
【００１４】
本発明はまた、補助調節因子依存性の標的分子の拮抗薬を同定する方法を提供する。該方法は、標的分子の安定性を改変する１組の分子を用意する工程と、該組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の活性化補助因子の存在下で、標的分子の安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングする工程とを含む。もし、標的分子の安定性が、その組中の１分子と活性化補助因子の存在下で、更に変化しなければ、このことは、その組中の該分子は、活性化補助因子の存在下での該標的分子の拮抗薬であることを示す。
【００１５】
本発明はまた、補助調節因子依存性の標的分子の拮抗薬を同定する別の方法を提供する。該方法は、標的分子の熱変性曲線を移動させる１組の分子を用意する工程と、該組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の活性化補助因子の存在下で、標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングする工程とを含む。もし、その組中の１分子と活性化補助因子の存在下で、標的分子の熱変性曲線の更なる移動がなければ、このことは、その組中の斯かる分子は、活性化補助因子の存在下での該標的分子の拮抗薬であることを示す。
【００１６】
本発明はまた、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬を同定する方法を提供する。該方法は、標的分子の安定性を改変する１組の分子を用意する工程と、該組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の共リプレッサー（ｃｏ−ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）の存在下で、標的分子の安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングする工程とを含む。もし、その組中の１分子と共リプレッサーの存在下で、標的分子の安定性の更なる改変がなければ、このことは、その組中の斯かる分子は、共リプレッサーの存在下での該標的分子の作用薬であることを示す。
【００１７】
本発明は、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬を同定する別の方法を提供する。該方法は、標的分子の熱変性曲線を移動させる１組の分子を用意する工程と、該組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の共リプレッサーの存在下で、標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングする工程とを含む。もし、その組中の１分子と共リプレッサーの存在下で、熱変性曲線が更に移動しなければ、このことは、その組中の斯かる分子は、共リプレッサーの存在下での該標的分子の作用薬であることを示す。
【００１８】
本発明はまた、未知の機能を有する標的分子の作用薬又は拮抗薬を判定するための方法を提供する。未知の機能を有する標的分子の安定性を改変する１組の分子を用意する工程であって、該組の分子は、生物学的機能を共有する受容体群の安定性を改変する工程と、該その組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で該標的分子の安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングする工程とを含む。その組中の１分子と補助調節因子の存在下での標的分子の安定性の更なる改変は、該分子が、補助調節因子の存在下で、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示す。
【００１９】
本発明は、未知の機能を有する標的分子の作用薬又は拮抗薬を判定するための別の方法を提供する。未知の機能を有する標的分子の熱変性曲線を移動させる１組の分子を用意する工程であって、該組の分子は、生物学的機能を共有する受容体群の熱変性曲線を移動させる工程と、該その組中の１つ又は複数の分子を、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で該標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングする工程とを含む。その組中の１分子と補助調節因子の存在下での標的分子の熱変性曲線の更なる移動は、該分子が、補助調節因子の存在下で、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示す。
【００２０】
本発明の方法の利点は、遺伝子発現読み取りアッセイ及び細胞に基づくアッセイも、アッセイを確立するための既知のリガンドの使用も必要とされないことである。斯かる直接的な方法で情報を作成する能力によって、療法仮説（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ）の試験を行い、オーファン受容体の解読をするための、所望の特性を有する薬剤の発見が可能になる。
【００２１】
単一の一体化アッセイで、隔離され、及び／又は、精製されたタンパク質及びペプチドを使用することによって、タンパク質間相互作用の調節に関わるリガンドを同定し、生物学的応答を予想することができる。リガンドを同定できるだけでなく、標的タンパク質に対する固有の親和性を計算することもでき、その親和性を生物活性と関連付けるために使用することができる。作成された情報は、オーファン受容体のリガンドを同定するためにも使用することができ、その結果、該リガンドは、これらのタンパク質の生物学的性質を解析するツールとして使用し、治療仮説を検定することができる。
【００２２】
タンパク質などの標的分子の融解温度の変化は、対象とする当該タンパク質に対する巨大分子及びリガンドの結合エネルギーの熱力学的関連の直接的結果であるので、本発明の方法によって作成されたデータは、逆スクリーニングを必要としない。更に、リガンドの標的分子に対する親和性は、より高感度である（ピコモルからｍＭの親和性が判定される）。また、本発明は、低い細胞透過性を有する化合物に限定されない。また、上記のように、本発明は、アッセイ確立用の既知のリガンドを必要としないので、オーファン受容体の解明のために、非常に強力である。
【００２３】
また、本発明の特徴及び利点を、添付図面を参照にして、以下に、より詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下の説明において、生化学技術及び薬理学技術の当業者に周知の様々な用語及び方法論を参照する。斯かる周知の用語及び方法論を説明する出版物及び試料は、完全な形で説明されているかのごとく、参照として本明細書にそのまま組み込まれている。
【００２５】
本発明の実施形態において、補助調節因子依存性の標的分子用の作用薬及び拮抗薬の同定方法が提供されており、標的分子の安定性を改変する分子に基づいて、変性（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）を行うことができる方法である。標的分子の安定性を改変する分子は、標的分子及び１つ又は複数の補助調節因子の存在下で、標的分子の安定性を更に改変する能力に関して、スクリーニングすることができる。標的分子の安定性が更に改変されるか否かで、該分子が、補助調節因子が存在するとき、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを示す。
【００２６】
本発明の他の実施形態において、補助調節因子依存性の標的分子用の作用薬及び拮抗薬の同定方法が提供されており、この方法は、温度変化が起因する、標的分子の変性に係わる。標的分子の熱変性曲線を移動する分子は、標的分子及び１つ又は複数の補助調節因子の存在下で標的分子の熱変性曲線を更に移動する能力に関して、スクリーニングすることができる。標的分子の熱変性曲線が更に移動するか否かは、該分子は、補助調節因子存在下における標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかに関する指標となる。
【００２７】
用語「標的分子」は、ペプチド、タンパク質、核酸、及び他の受容体を包含する。該用語は、酵素と酵素ではないタンパク質の両方を包含する。該用語は、単量体タンパク質及び多量体タンパク質を包含する。多量体タンパク質は、ホモマー（ｈｏｍｏｍｅｒｉｃ）でもよいし、ヘテロマー（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）でもよい。該用語は、オリゴヌクレオチドなどの少なくとも２個のヌクレオチドを含む核酸を包含する。核酸は、一本鎖でも、二重鎖でも、又は三重鎖でもよい。該用語は、合成オリゴヌクレオチド、組換えＤＮＡ分子の一部分又は染色体ＤＮＡの一部分である核酸を包含する。
【００２８】
用語「標的分子」は、折り畳み、コイル化、又はねじれによって二次、三次、又は四次構造をとることのできる、ペプチド、タンパク質、及び他の受容体の部分も包含する。
【００２９】
標的分子は、補助因子、補酵素、補欠分子族、脂質、オリゴ糖、又はリン酸基を非限定的に含む置換基で代用することができる。用語「標的分子」及び「受容体」は、同義である。
【００３０】
より具体的には、本発明において使用される標的分子は、補助調節因子に依存する。「補助調節因子に依存する」とは、標的分子は、少なくとも１つのリガンドを結合することができ、少なくとも１つの補助調節因子を結合することができることを指す。更に、標的分子の活性は、リガンドに依存しようが、独立した機能であろうが、少なくとも部分的に、補助調節因子に基づく。補助調節因子依存性の標的分子は、非限定的に核内受容体を含む。
【００３１】
核内受容体及びそれに関連した補助調節因子の役割は、参照によりそのまま本明細書に組み込まれた、非特許文献（非特許文献１３〜１６参照）に記載されている。
【００３２】
また、補助調節因子依存性の標的分子は、ヒトを非限定的に含む脊椎動物種のみならず昆虫を非限定的に含む無脊椎動物種をも包含する。
【００３３】
例示的には、昆虫は、数百の核内受容体を含み、該核内受容体に対して、リガンドは、作用薬又は拮抗薬として同定することができる。参照によりそのまま本明細書に組み込まれた、脊椎動物、線虫動物、及び節足動物に存在する核内受容体の説明のための非特許文献（非特許文献１７及び１８参照）を参照されたい。
【００３４】
用語「タンパク質」は、ポリペプチド断片群の全長又はポリペプチド断片群を包含する。用語「ペプチド」は、合成又はペプチドライブラリーから派生したタンパク質断片群を指す。本明細書で使用される用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、同義である。
【００３５】
用語「補助調節因子」は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに標的分子をリガンドに依存して、又は独立に調整するペプチドなどの核酸を非限定的に含む任意の構造の化学物質を指す。該用語は、自然分子、合成分子、及び仮想分子を指す。より具体的には、該用語は、ペプチド或いは標的分子をリガンドに依存して、又は独立に調整する、自然又は合成のポリペプチド／タンパク質を指す。該用語は、自然配列又はファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）ライブラリーから派生したペプチドを包含する。該ペプチドは、自然タンパク質の断片であってもよい。より具体的には、該用語は、活性化補助因子及び共リプレッサーを指す。
【００３６】
用語「活性化補助因子」は、標的分子に結合して、該標的分子の活性化、又は活性増加を起こす分子を指す。本発明の実施形態において、該用語は、標的分子に結合して、遺伝子転写の誘発又はシグナル機能（例えば、シグナル伝達）の誘発をする分子を指す。
【００３７】
用語「共リプレッサー」は、標的分子に結合して、該標的分子の不活性化、又は活性減少を起こす分子を指す。本発明の実施形態において、該用語は、標的分子に結合して、遺伝子転写の抑制又はシグナル機能（例えば、シグナル伝達）の抑制をする分子を指す。
【００３８】
用語「作用薬」は、標的分子に結合し、該標的分子と結合するために活性化補助因子を誘発又は動員する分子を指す。
【００３９】
本発明の実施形態において、用語「作用薬」は、核内受容体に結合して、活性化補助因子を動員する分子を指す。これらの実施形態において、該用語は、より具体的には、活性化補助因子との直接相互作用を促進する核内受容体の立体配座の変化を誘発することによって遺伝子発現を改変する分子を指す。
【００４０】
用語「拮抗薬」は、標的分子に結合し、該標的分子と結合するために共リプレッサーを誘発又は動員する分子を指す。
【００４１】
本発明の実施形態において、用語「拮抗薬」は、核内受容体に結合し、共リプレッサーを動員する分子を指す。これらの実施形態において、該用語は、より具体的には、共リプレッサーとの直接相互作用を促進する核内受容体の立体配座の変化を誘発することによって、遺伝子発現を改変する分子を指す。
【００４２】
用語「分子」は、補助調節因子などの追加の化合物の存在下又は不在下で、標的分子への結合性に関して試験される化合物を指す。該用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸、並びにペプチドを非限定的に含む任意の構造の化学物質を指す。該用語は、自然分子、合成分子、及び仮想分子を指す。該用語は、化合物ライブラリー又はコンビナトリアルライブラリー中の化合物を含む。該用語「分子」及び「リガンド」は、同義である。
【００４３】
用語「分子多重度」「化合物多重度」又は「容器多重度」は、少なくとも２つの分子、化合物、又は容器を指す。
【００４４】
用語「機能」は、例えば、タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドなどの標的分子の生物学的機能を指す。
【００４５】
「熱変性曲線」は、温度の関数としてのタンパク質又は核酸の変性に関連した物理的変化のプロットである。
【００４６】
用語「結合する」及び「結合」は、２つ以上の分子間の相互作用を指す。より具体的には、該用語は、非共有結合などの、リガンドと標的分子との間、補助調節因子と標的分子との間、又はリガンド、標的分子と補助調節因子との間の相互作用を指す。
【００４７】
用語「安定性の改変」は、１つ又は複数のリガンドが結合する標的タンパク質において所与の程度の物理的変化を引き起こすために必要な圧力量、熱量、界面活性剤の濃度、又は変性剤の濃度の、リガンドなしにおける標的タンパク質の同程度の物理的変化を引き起こすために必要な圧力量、熱量、界面活性剤の濃度、又は変性剤の濃度に対する、相対的な変化を指す。安定性の改変は、安定性の増大又は減少として示すことができる。リガンドによる標的分子の安定性の改変は、リガンドが標的分子に結合することを示す。
【００４８】
用語「安定性の更なる改変」は、標的分子の安定性を改変することが知られている分子及び１つ又は複数の付加的分子の存在下で、標的分子に起こる安定性の一層の改変を指す。より具体的には、該１つ又は複数の付加的分子は、補助調節因子であってもよい。
【００４９】
用語「変性」は、アミノ酸側鎖、タンパク質の二次、三次、又は四次構造の結晶配列などの構造の喪失を指す。タンパク質などの標的分子は、変性剤（尿素、グアニジニウム塩酸塩、又はグアニジニウムチオコハク酸塩など）及び界面活性剤を用いた処理、圧力を用いた標的分子の処理、標的分子の加熱、又は任意の適切な変化によって、変性を起こすことができる。
【００５０】
用語「物理的変化」は、光又は熱の形でのエネルギーの放出、光又は熱の形でのエネルギーの吸収、濁度の変化、及び光の極性の変化を包含する。具体的には、該用語は、蛍光放出、蛍光エネルギー移動、紫外線又は可視光の吸収、光の偏光特性の変化、蛍光放出の偏光特性の変化、蛍光の経時変化率の変化（即ち、蛍光寿命）、蛍光異方性の変化、蛍光共鳴エネルギー移動の変化、濁度の変化、及び酵素活性の変化を指す。好ましくは、該用語は、蛍光を意味し、より好ましくは、蛍光放出を指す。蛍光放出は、タンパク質に固有なものでもよいし、蛍光レポーター分子によるものであってもよい。タンパク質の変性を監視するために蛍光技術を使用することは、当業者に周知のことである（例えば、非特許文献１９参照）。
【００５１】
「熱変性曲線」は、温度、変性剤濃度、及び圧力などのパラメータの関数としてのタンパク質の変性に関連した物理的変化のプロットである。
【００５２】
用語「熱安定性の改変」は、１つ又は複数のリガンドが結合する標的タンパク質の所与の程度の物理的変化を引き起こすために必要な熱エネルギーの、リガンドなしに標的タンパク質の同程度の物理的変化を引き起こすために必要な熱エネルギーに対する、相対的な変化を指す。熱安定性の改変は、熱安定性の増大又は減少として示すことができる。リガンドによる標的分子の熱安定性の改変は、リガンドがタンパク質に結合することを示している。
【００５３】
用語「熱変性曲線の移動」は、リガンドに結合された標的分子の熱変性曲線の、リガンドの不在下における該タンパク質の熱変性曲線に対する、相対的な移動を指す。
【００５４】
用語「熱変性曲線の更なる移動」は、標的分子の熱変性曲線を移動することが知られている分子及び１つ又は複数の付加的分子の存在下で、標的分子の熱変性曲線に起こる一層の移動を指す。より具体的には、該１つ又は複数の付加的分子は、補助調節因子であってもよい。
【００５５】
用語「標的分子との接触」は、結合性に関してスクリーニングされる分子を含む溶液中に標的タンパク質を入れることを広義に指す。より狭義に言えば、接触とは、標的分子と結合性に関してスクリーニングされる分子との溶液を回転、旋回、揺動又は振動させることを指す。より具体的には、接触とは、標的分子と結合性に関して試験される分子との混合を指す。該混合は、例えば、ピペットの先端からの吸い込み、放出を繰り返すことによって達成することができる。好ましくは、接触は、標的タンパク質と結合性に関して試験される分子との間の平衡を指す。接触は、容器内で行うか、又は標的分子及びスクリーニングされる分子を容器内に入れる前に行う。
【００５６】
用語「容器」は、受容体及び結合性に関して試験される分子を入れる任意の器又はチャンバを指す。用語「容器」は、反応管（例えば、試験管、マイクロチューブ、バイアル、キュベットなど）を包含する。本発明の実施形態において、用語「容器」は、マルチウェルマイクロプレート又はマイクロタイタープレート中の穴を指す。
【００５７】
本発明の実施形態において、標的分子に結合する分子は、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で、標的分子への結合能をスクリーニングすることができる。用語「スクリーニング」は、変性即ちアンフォールドすることができる標的分子への、分子又は化合物の結合能を試験することを一般に指す。スクリーニング工程は、アンフォールディングアッセイで分子のタンパク質への結合性を試験する繰り返し又は反復工程でもよい。
【００５８】
上記のように、本発明の実施形態に従って、標的分子の作用薬又は拮抗薬は、標的分子の安定性の改変に基づいて同定することができる。標的分子の安定性を改変する分子は、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で、標的分子の安定性を更に改変する能力をスクリーニングすることができる。
【００５９】
一実施形態において、スクリーニングを実施するために、標的分子の安定性を改変する１つ又は複数の分子（例えば、１組の）は、多数の容器のそれぞれにおいて標的分子及び１つ又は複数の補助調節因子と接触させることができる。各容器中の標的分子は、次に、標的タンパク質の変性を引き起こすように処理できる。標的分子の変性に関連した物理的変化は、測定可能である。次に、各容器における標的分子の変性曲線を作成することができる。各変性曲線は、（１）他の変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）（ｉ）その組の該分子、及び／又は、（ｉｉ）補助調節因子が、存在しないときの標的分子の変性曲線と比較することができる。
【００６０】
作成されたデータに基づいて、スクリーニングされた分子が、補助調節因子の存在下で、標的分子の安定性を更に改変するか否かを判定でき、したがって、補助調節因子の存在下で、該分子は、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを同定することができる。標的分子の安定性の更なる改変は、標的分子の変性曲線の更なる改変によって示される。
【００６１】
本発明の他の実施形態において、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬であるか拮抗薬であるかは、熱安定性を改変する分子、より具体的には、標的分子の熱変性曲線を移動させる分子の分析によって同定することができる。標的分子の熱変性曲線を移動させる分子は、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で、標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングすることができる。
【００６２】
本発明の一実施形態において、スクリーニングは、標的分子と、多数の容器のそれぞれにおいて１つ又は複数の補助調節因子を有する標的分子の熱変性曲線を移動する、１つ又は複数の分子（例えば、１組の）との接触によって達成することができる。該多数の容器は、加熱することができ、温度の関数としての、標的分子の熱変性曲線に関連した物理的変化は、各容器について測定することができる。次に、温度の関数としての、標的分子の熱変性曲線を作成することができる。作成された熱変性曲線は、（１）他の熱変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）（ｉ）その組の該分子、及び／又は、（ｉｉ）補助調節因子が、存在しないときの標的分子の熱変性曲線と比較することができる。
【００６３】
スクリーニング法の実施形態において、容器は、間歇的に、ある温度範囲に亘って加熱することができる。該多数の容器は、同時に加熱することができる。標的分子の熱変性に関連した物理的変化は、各加熱期間後に測定することができる。この方法の代替的実施形態において、容器は、連続的に加熱することができる。
【００６４】
本発明の実施形態において、標的分子の変性曲線を作成する際、熱変性曲線は、各容器中の標的分子の温度の関数としてプロットすることができる。
【００６５】
本発明の一実施形態において、熱変性曲線の比較は、各変性曲線の中点温度Ｔｍを比較することによって達成することができる。「中点温度Ｔｍ」は、熱変性曲線の温度中点である。Ｔｍは、当業者に周知の方法を使用して決定できる（例えば、非特許文献２０及び２１参照）。
【００６６】
例えば、各熱変性曲線のＴｍは、識別可能であり、（１）他の熱変性曲線、及び／又は、（２）（ｉ）その組の該分子、及び／又は、（ｉｉ）容器中に補助調節因子が、存在しないときの標的分子の熱変性曲線について得られたＴｍと比較することができる。
【００６７】
代替的又は付加的に、全熱変性曲線は、コンピュータ分析手段を使用することによって、他の全熱変性曲線と比較することができる。例えば、各全熱変性曲線は、（１）他の熱変性曲線、及び／又は、（２）（ｉ）その組の該分子、及び／又は、（ｉｉ）容器中に補助調節因子が、存在しないときの標的分子の熱変性曲線と比較することができる。
【００６８】
作成されたデータに基づいて、スクリーニングされた任意の分子が補助調節因子の存在下で、標的分子の熱変性曲線を更に移動するか否かを判定でき、したがって、補助調節因子の存在下で、該分子は、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるかを同定することができる。
【００６９】
分子が標的分子の熱変性曲線を移動、及び／又は、更に移動するか否かを判定する必要のある本発明の方法は、タンパク質分解に対する感受性アッセイ、タンパク質による表面結合アッセイ、タンパク質による抗体結合アッセイ、タンパク質の分子シャペロン結合アッセイ、固定化リガンドへの差動結合アッセイ、及びタンパク質の凝集アッセイなどの、分子が標的分子の熱変性曲線を移動、及び／又は、更に移動するか否かを判定する必要のない方法とは、明白に異なる。斯かるアッセイは、当業者によく知られている（例えば、特許文献１１及び１２参照）。開示されている（特許文献１１及び１２参照）これらの手法は、結合性に関して試験される分子の存在下又は不在下でのタンパク質の折り畳み、及び／又は、変性の程度を比較する必要がある。これらの手法は、標的分子に結合する任意の分子が、該標的分子の熱変性曲線を移動するか否かの判定を必要としない。
【００７０】
上記のように、標的分子の安定性を改変する分子は、補助調節因子の存在下で、標的分子の安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングすることができる。例えば、標的分子の安定性を改変することが知られている分子は、活性化補助因子及び／又は共リプレッサーを含む、該標的分子に対する確認された一団の補助調節因子に対して、スクリーニングすることができる。便宜上、標的分子の安定性を改変することが知られている分子を、分子の「組」と称する。
【００７１】
もし、標的分子の安定性が、組由来の分子と該標的分子の活性化補助因子の存在下で、該標的分子及び組由来の分子だけと比較して、更に改変されるならば、このことは、該組由来のその分子は、活性化補助因子の存在下で該標的分子の作用薬であることを示す。
【００７２】
もし、標的分子の安定性が、組由来の分子と該標的分子の共リプレッサーの存在下で、該標的分子及び組由来の分子だけと比較して、更に改変されるならば、このことは、該組由来のその分子は、共リプレッサーの存在下で該標的分子の拮抗薬であることを示す。
【００７３】
同様に、標的分子の熱変性曲線を移動する分子は、補助調節因子の存在下で、標的分子の熱変性曲線を更に移動する能力に関してスクリーニングすることができる。例えば、標的分子の熱変性曲線を移動することが知られている分子は、活性化補助因子及び／又は共リプレッサーを含む、該標的分子に対する確認された一団の補助調節因子に対して、スクリーニングすることができる。便宜上、標的分子の熱変性曲線を移動することが知られている分子を、分子の「組」と称する。
【００７４】
もし、標的分子の熱変性曲線が、組由来の分子と該標的分子の活性化補助因子の存在下で、該標的分子及び組由来の分子だけと比較して、更に移動するならば、このことは、該組由来のその分子は、活性化補助因子の存在下での該標的分子の作用薬であることを示す。
【００７５】
もし、標的分子の熱変性曲線が、組由来の分子と該標的分子の共リプレッサーの存在下で、該標的分子及び組由来の分子だけと比較して、更に移動するならば、このことは、該組由来のその分子は、共リプレッサーの存在下で該標的分子の拮抗薬であることを示す。
【００７６】
本発明はまた、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬であるか拮抗薬であるかを、安定性が更に改変されないこと、及び／又は、標的分子の変性曲線が更に移動しないことに基づいて同定する方法を提供する。
【００７７】
「標的分子の安定性が更に改変されないこと」又は「標的分子の安定性がそれ以上改変されないこと」は、該組由来のその分子及び補助調節因子の両方の存在下で（標的分子及び該組由来のその分子に比較して）、標的分子の安定性に有意な更なる変化がないこと、又はそれ以上の変化がないことを指す。
【００７８】
「標的分子の熱変性曲線が更に移動しないこと」又は「標的分子の熱変性曲線がそれ以上移動しないこと」は、該組由来のその分子及び補助調節因子の両方の存在下で（標的分子及び該組由来のその分子に比較して）、標的分子の熱変性曲線に有意な更なる移動がないこと、又はそれ以上の移動がないことを指す。
【００７９】
本発明の実施形態において、補助調節因子依存性の標的分子の拮抗薬は、活性化補助因子の存在下での、安定性が更に改変されないこと、及び／又は、標的分子の熱変性曲線が更に移動しないことに基づいて同定することができる。本発明の実施形態において、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬は、共リプレッサーの存在下での、安定性が更に改変されないこと、及び／又は、標的分子の熱変性曲線が更に移動しないことに基づいて同定することができる。
【００８０】
補助調節因子依存性の標的分子の拮抗薬は、１つ又は複数の活性化補助因子の存在下で標的分子の安定性を更に改変する能力に関して、標的分子の安定性を改変する分子の組の１つ又は複数をスクリーニングすることによって同定することができる。標的分子の安定性の更なる改変に対する効果に関して、組由来の分子をスクリーニングする方法は、上記に記載されている。もし、標的分子の安定性が、その組中の１分子と活性化補助因子の存在下で、更に変化しなければ、このことは、その組中の斯かる分子は、活性化補助因子の存在下での該標的分子の拮抗薬であることを示す。
【００８１】
拮抗薬はまた、１つ又は複数の活性化補助因子の存在下で標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関して、標的分子の熱変性曲線を移動させる分子の組の１つ又は複数をスクリーニングすることによって同定することができる。標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関して、その組中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする方法は、上記に記載されている。もし、標的分子の熱変性曲線が、その組中の１分子と活性化補助因子の存在下で、更に移動しなければ、このことは、その組中の斯かる分子は、活性化補助因子の存在下での該標的分子の拮抗薬であることを示す。
【００８２】
補助調節因子依存性の標的分子の作用薬は、１つ又は複数の共リプレッサーの存在下で標的分子の安定性を更に改変する能力に関して、標的分子の安定性を改変する分子の組の１つ又は複数をスクリーニングすることによって同定することができる。標的分子の安定性の更なる改変に対する効果に関して、組由来の分子をスクリーニングする方法は、上記に記載されている。もし、標的分子の安定性が、その組中の１分子と共リプレッサーの存在下で、更に変化しなければ、このことは、その組中の斯かる分子は、共リプレッサーの存在下での該標的分子の作用薬であることを示す。
【００８３】
作用薬はまた、１つ又は複数の共リプレッサーの存在下で標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関して、標的分子の熱変性曲線を移動させる分子の組の１つ又は複数をスクリーニングによって同定することができる。標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関して、その組中の１つ又は複数の分子をスクリーニングする方法は、上記に記載されている。もし、標的分子の熱変性曲線が、その組中の１分子と共リプレッサーの存在下で、更に移動しなければ、このことは、その組中の斯かる分子は、共リプレッサーの存在下での該標的分子の作用薬であることを示す。
【００８４】
標的分子の安定性を改変すること、及び／又は、標的分子の熱変性曲線を移動させることが知られている分子を供給し、標的分子の安定性を更に改変する能力、及び／又は、標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関して斯かる分子をスクリーニングすることに基づく、補助調節因子依存性の標的分子の作用薬又は拮抗薬の同定について上記に説明した。本発明はまた、補助調節因子存在下で、斯かる分子の、標的分子の作用薬又は拮抗薬としての同定法と共に斯かる分子の供給法を包含する。斯かる方法は、受容体に結合するリガンドが知られていないオーファン受容体のリガンドを同定する際に特に有用である。
【００８５】
標的分子の安定性を改変する、及び／又は、標的分子の熱変性曲線を移動させる分子は（便宜上、上記のように「組」と称する）、多数の異なる分子のスクリーニングによって得ることができる。例えば、標的分子の安定性を改変する分子は、標的分子の安定性を改変する能力に関して、多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングすることによって得ることができる。同様に、標的分子の熱変性曲線を移動させる分子は、標的分子の熱変性曲線を移動させる能力に関して、多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子をスクリーニングすることによって得ることができる。本発明の実施形態において、スクリーニングすることができる分子数は、約一千から百万に亘る。
【００８６】
作用薬又は拮抗薬を同定するために上記したスクリーニング法と同様な方法で、標的分子の安定性を改変する能力に関して、分子をスクリーニングすることができる。例えば、標的分子は、多数の容器のそれぞれの中で多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子と接触させることができる。多数の容器それぞれの中の標的分子は、変性を引き起こすように処理される。標的分子の変性に関連した物理的変化は、測定可能である。各容器における標的分子の変性曲線を作成することができる。これらの変性曲線のそれぞれは、（１）他の変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）多数の異なる分子中のいずれも存在しないときの標的分子の変性曲線と比較することができる。
【００８７】
作成されたデータに基づいて、スクリーニングされた分子のいずれかが、標的分子の安定性を改変するか否かを判定することができる。標的分子の安定性の改変は、標的分子の変性曲線の変化によって示される。もしある分子が標的分子の安定性を改変するならば、上記の方法によって、補助調節因子存在下のときに標的分子の作用薬か、又は拮抗薬であるかを同定するために、該分子をスクリーニングすることができる。
【００８８】
同様に、分子は、作用薬又は拮抗薬を同定するためのスクリーニング法と同様な方法で、標的分子の熱変性曲線を移動させる能力に関してスクリーニングすることができる。例えば、標的分子は、多数の容器のそれぞれの中で多数の異なる分子中の１つ又は複数の分子と接触することができる。容器は、加熱することができ、標的分子の熱変性曲線に関連した物理的変化は、各容器内で測定することができる。標的分子の熱変性曲線は、各容器の温度の関数として作成することができる。
【００８９】
熱変性曲線は、（１）他の熱変性曲線のそれぞれ、及び／又は、（２）多数の異なる分子がいずれも存在しないときの標的分子の熱変性曲線と比較することができる。本発明の実施形態において、各熱変性曲線のＴｍは、識別可能であり、（１）他の熱変性曲線、及び／又は、（２）多数の異なる分子がいずれも存在しないときの標的分子の熱変性曲線から得られたＴｍと比較することができる。或いは、各熱変性曲線全体は、（１）他の熱変性曲線、及び／又は、（２）多数の異なる分子がいずれも存在しないときの標的分子の熱変性曲線と比較することができる。
【００９０】
作成されたデータに基づいて、スクリーニングされた分子のいずれが、標的分子の熱変性曲線を移動させるか否かを判定することができる。もしある分子が標的分子の熱変性曲線を移動させるならば、上記の方法によって、補助調節因子存在下における標的分子の作用薬か、又は拮抗薬であるかを同定するために、該分子をスクリーニングすることができる。
【００９１】
上記のように、本発明の方法は、結合するリガンドが知られていないオーファン受容体のリガンドを同定する際に特に有用である。同様に、本発明は、未知の機能を有する標的分子の作用薬又は拮抗薬を同定する方法を提供する。
【００９２】
本発明の一実施形態において、未知の機能を有する標的分子の安定性を改変する１組の分子が提供される。この分子の組は、生物学的機能を共有する各受容体の安定性を改変する。標的分子の安定性を改変する分子の組は、標的分子の安定性を改変する能力に関して、生物学的機能を共有する各受容体の安定性を改変する分子の一団又は複数団をスクリーニングすることによって提供できる。斯かる１組の分子を用意する方法は、参照によりそのまま本明細書に組み込まれた米国特許出願公開（特許文献１参照）に、より詳細に開示されている。
【００９３】
該組中の１つ又は複数の分子は、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で、標的分子の安定性を更に改変する能力に関してスクリーニングすることができる。上記のように、その組中の１分子と補助調節因子の存在下での標的分子の安定性の更なる改変は、該分子が、補助調節因子の存在下で、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるか否かを示す。本発明の実施形態は、標的分子の安定性がそれ以上改変されないことに基づく作用薬及び拮抗薬の同定を含む。
【００９４】
本発明の別の実施形態において、未知の機能を有する標的分子の熱変性曲線を移動させる１組の分子が提供される。この分子の組は、生物学的機能を共有する受容体の熱変性曲線を移動させる。標的分子の熱変性曲線を移動させる分子の組は、標的分子の安定性を改変する能力に関して、生物学的機能を共有する受容体の熱変性曲線を移動させる分子の一団又は複数団をスクリーニングすることによって提供できる。斯かる１組の分子を用意する方法は、同じく米国特許出願公開（特許文献１参照）に、より詳細に開示されている。
【００９５】
該組中の１つ又は複数の分子は、１つ又は複数の補助調節因子の存在下で、標的分子の熱変性曲線を更に移動させる能力に関してスクリーニングすることができる。上記に詳細説明したように、その組中の１分子と補助調節因子の存在下での標的分子の熱変性曲線の更なる移動は、該分子が、補助調節因子の存在下で、標的分子の作用薬であるか、又は拮抗薬であるか否かを示す。本発明の実施形態はまた、標的分子の熱変性曲線がそれ以上移動しないことに基づく作用薬及び拮抗薬の同定を含む。
【００９６】
本発明の実施形態において、マイクロプレート温度移動アッセイは、リガンドを同定し、斯かるリガンドを補助調節因子依存性の標的分子の作用薬又は拮抗薬として同定するための特に有用な手段である。マイクロプレート温度移動アッセイは、１つ又は複数の分子の、標的受容体の温度安定性に対する効果を試験するための直接的かつ定量的な技法である。
【００９７】
マイクロプレート温度移動アッセイの理論、概念、及び応用、並びにマイクロプレート温度移動アッセイを実行するために有効な装置は、参照によりそのまま本明細書に組み込まれた米国特許（特許文献２〜１０参照）に記載されている。これらの引用文献に説明されているマイクロプレート温度移動アッセイは、上記のスクリーニング法を実行するために使用することができる。
【００９８】
マイクロプレート温度移動アッセイは、リガンド結合親和性の熱力学的読み取りを提供する。該アッセイは、機能的に活性な各標的分子が、各標的分子に特徴的で安定化エネルギーを表わすある温度で、協調的に融解する高度に組織的な構造体であることに依存している。分子が標的分子に結合すると、標的分子は、リガンド結合親和性に比例した量だけ安定化され、中点温度が高温側に移動する。
【００９９】
結合の監視を補助するために、放射性標識化合物（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｌｙ  ｌａｂｅｄｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）も、蛍光性又は他の色素嫌性標識も必要としないので、温度移動アッセイには多くの利点がある。該アッセイは、全てではないにしても、多くの薬剤標的生体分子に固有の一般的物理化学的過程である、生体分子の熱変性を利用している。広範な適用性は、新しい治療用受容体タンパク質が入手可能になる度に新しいアッセイを考案する必要性が回避されるので、このアッセイの重要な特徴である。
【０１００】
更に、温度移動アッセイを使用することによって、Ｔｍ及びリガンド結合親和性の比例性のおかげで、１０μＭ濃度超から１ｎＭ濃度未満に亘るリガンド結合親和性を１穴実験（ｓｉｎｇｌｅ  ｗｅｌｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）で測定することができる。したがって、温度移動アッセイは、標的分子単独に対するリガンド結合親和性、及び／又は、補助調節因子の存在下でのリガンド結合親和性を定量的に検出するために使用することができる。
【０１０１】
また、温度移動アッセイは、リガンド及び標的分子と、リガンド、標的分子、及び補助調節因子との間のＴｍの変化に基づいて、作用薬及び拮抗薬を定量的に同定する際に使用することができる。マイクロプレート温度移動アッセイは、単一標的分子上でのリガンド多重結合事象を、標的分子の融解温度の段階的な増加又は付加的な増加として測定するために使用することができる。
【０１０２】
本発明は、リガンドの同定及び斯かるリガンドを核内受容体中の作用薬又は拮抗薬として同定する際に特に有用である。例えば、本発明は、核内受容体リガンドの結合親和性を判定して生体内での有効性を予測したり、リガンドを作用薬又は拮抗薬として識別して生物学的応答を予測したり、オーファン受容体群のリガンドを同定してそれらの生物学的機能を発見したりするために使用することができる。
【０１０３】
例えば、本発明を、エストロゲン受容体ファミリーの２種の亜型である、ＥＲ−α及びＥＲ−βのリガンド結合領域と相互作用をするリガンドを同定するために使用することができる。これらの領域は、２つの既知の結合部位を含み、１つは、エストロゲン状の化合物用であり、もう１つは、補助調節因子タンパク質用である。本発明を、エストロゲン受容体と相互作用をするリガンドを同定するために使用することができる。これらのリガンドは、該リガンドの固有の親和性に比例する、受容体の安定性の認められた増加を起こす。
【０１０４】
核内受容体のリガンド結合領域及び補助調節因子タンパク質は、大腸菌内での標準組み換え法を使用することによって発現させることができる。補助調節因子ペプチドは、標準的な方法を使用して合成することができる。対象とする精製タンパク質の融解温度を、小分子リガンドの不在下及び存在下でのマイクロプレート温度移動アッセイによって判定することができる。
【０１０５】
対象とする標的分子を安定化させる分子が供給される。斯かる小分子を、上述したように、マイクロプレート温度移動アッセイでのスクリーニングによって得ることができる。スクリーン中の小分子の数は、約一千から百万に亘ることができる。小分子は、自然のものでも、合成したものでもよい。
【０１０６】
一旦、１組の小分子が、対象とするタンパク質を安定化すると同定されると、これらの分子は、タンパク質又はペプチド断片などの一団の補助調節因子に対してスクリーニングして、タンパク質の熱安定性に対するその効果を測定することができる。もし相乗効果が観察されると、該化合物は、作用薬又は拮抗薬として分類される。平衡定数は、リガンド及び補助調節因子の両方について計算され、生物学的反応と関連付けられる。
【０１０７】
生物学的機能のオーファン受容体への割り当てに対して、律速段階はツール化合物（ｔｏｏｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の生成である。一団の化合物に対して、対象とする受容体をスクリーニングし、対象とする受容体を安定化するリガンドを、上記の方法によって同定することができる。一旦、リガンドが同定されると、補助調節因子に対してスクリーニングし、同定されたリガンドが、作用薬であるか、それとも拮抗薬であるかを、上記の方法によって判定することができる。
【０１０８】
例えば、ウエスタンブロット分析によって決定した、対象とする受容体を含む細胞系は、同定されたリガンドを用いて処理することができる。リガンド処理細胞系は、次にＤＮＡチップを用いて遺伝子発現のプロファイルを作成され、未処理の細胞系と比較される。もし同定されたリガンドが作用薬であるならば、未処理の細胞系と比較して、幾つかの遺伝子は下方制御（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）されると予想されよう。一旦、この情報が作成されると、受容体の生物学的機能を確定できる。この情報は、ケモインフォマティックス及びバイオインフォマティックスの組み合わせによって、療法仮説の開発及び疾患治療のためのそれらの試験を支援することができる（例えば、参照により本明細書にそのまま組み込まれた非特許文献２２参照）。
【０１０９】
核内受容体のリガンド結合領域、並びにこの領域と相互作用を行うリガンド及び補助調節因子が説明されているが、本発明は、付加的な調節因子の存在下及び最終的にはＤＮＡの存在下で、完全長タンパク質へ変性することが可能である。
【０１１０】
データ分析用の方法及び熱力学的原理を、親和性がリガンド又はアロステリック調節因子によって調整される、任意のタンパク質間の相互作用に対して使用することができることを強調しておかなければならない。実施例としては、作用リガンドを拮抗リガンドから識別するための、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のＧタンパク質との相互作用、ＳＨ２領域の連合に拮抗してリン酸化形態のタンパク質チロシンキナーゼにする化合物の識別、オリゴマー状態のＰＫＡホロ酵素に影響を及ぼすことによって該酵素に作用又は拮抗する化合物の同定、ＮＦ−κからＩκＢの連合を促進又は抑制する化合物の識別、或いは転写因子のオリゴマー形成を促進又は抑制する化合物の識別を非限定的に挙げることができる。
【０１１１】
また、これらの研究を、タンパク質間の相互作用に限定するものではなく、対象とするタンパク質と優先的に相互作用を行うタンパク質領域を示す短い直線配列をペプチドが表現する、タンパク質とペプチドの相互作用のためにも使用することができる。
【０１１２】
これまで本発明について一般的に説明したので、例示目的のためにのみ本明細書に組み込まれ、また、他に規定のない限り、限定を意図したものではない、以下の具体的な実施例を参照にすることによって、本発明をより容易に理解することができるであろう。
【０１１３】
核内受容体に関する実験結果  
活性化補助因子存在下での作用薬応答対拮抗薬応答に関して予期される実験結果を、図１及び図２に示す。作用薬リガンドの場合で、かつ、活性化補助因子タンパク質／ペプチドの存在下では、受容体の安定性の増加が予想される（図１）が、一方、拮抗薬に対しては、付加的な安定化は観察されないであろう（図２）。
（実施例１）  
表１は、活性化補助因子タンパク質ＳＲＣ−３の存在下と、活性化補助因子ＳＲＣ−１及びＳＲＣ−３の配列から派生した２つの活性化補助因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２及びＳＲＣ３−ＮＲ２の存在下と、並びに共リプレッサーＮＣｏＲ−１から派生した共リプレッサーペプチドＮＣｏＲ−１の存在下とで、４つの既知の作用薬及び３つの既知の拮抗薬からなる一団の物質を検討するためのＥＲ−α及びＥＲ−βについて得られたデータの要約である。
【０１１４】
全実験におけるＥＲ−α及びＥＲ−βの濃度は８μＭ、リガンド濃度は２０μＭ、ＳＲＣ−３は１１μＭ、並びに補助調節因子ペプチドＳＲＣ１−ＮＲ２、ＳＲＣ３−ＮＲ２、及びＮＣｏＲ−１は１００μＭであった。実験は、ｐＨ８．０、２５ｍＭのリン酸塩、２００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン中で、かつ、２５μＭのダポキシルスルホンアミド染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手可能）の存在下で実施した。
【０１１５】
最終濃度の２倍の濃度に相当する２μＬのリガンド溶液を、３８４ウェル黒壁グライナープレート中にマイクロピペットを用いて分注した。次に、２μＬのタンパク質染料溶液を３８４ウェルプレート中のリガンド溶液の上に分注した。該プレートは、タンパク質染料及びリガンド溶液をしっかり混合させるために回転させ、その後、試料の加熱中の蒸発を阻止するためにシリコンオイル１μＬを積層した。データをＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ装置（米国特許文献２〜１０参照）上で集め、非線形最小二乗適合ソフト（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ  ｌｅａｓｔ  ｓｑｕａｒｅｓ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析した。以下に記載された結果は、４つの実験の平均である。補助調節因子に関する値は、受容体リガンドのΔＴｍ値からのＴｍ安定化の変化を表す。
【０１１６】
【表１】
2005534005.tif 000002
【０１１７】
上記結果から、かつ、エストロゲン様化合物の存在下における、活性化補助因子タンパク質／ペプチド存在下での逆スクリーニングから、両方の受容体の付加的な安定化が観察された。したがって、これらの化合物は、文献と一致して、作用薬の如く作用する。タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）及びＩＣＩ化合物は、既知の拮抗薬であり、活性化補助因子を動員する能力を持っていない。このことも、文献と一致している。
【０１１８】
また、活性化補助因子ＳＲＣ−３は、ＥＲ−βに比較してＥＲ−αによって優先的に動員される。したがって、これらのエストロゲン様化合物は、ＳＲＣ−３の存在下でＥＲ−βに比較してＥＲ−αを含む細胞系中で高い生物学的応答を有すると予想される。
【０１１９】
更に、エストロゲン受容体は、共リプレッサーペプチドを動員する能力を持っていないので、生物学的見地から、遺伝子抑制がリガンドに依存した形で発生することが予想される。
【０１２０】
（実施例２）  
もしオーファン受容体であると判定されたとき、ＥＲ−αのリガンド及び機能（特許文献１参照）を判定するための本発明の方法の能力を証明するために、ＥＲ−αをステロイド状リガンドに対してスクリーニングした。ＥＲ−αと相互作用することが知られているリガンドは、受容体（下線の引かれていない化合物に対して下線の引かれた化合物）の安定性の増加を発生させるものとして同定される。
【０１２１】
全実験におけるＥＲ−αの濃度は、８μＭで、リガンドの濃度は、２０μＭであった。実験は、ｐＨ８．０で２５ｍＭのリン酸塩、２００ｎＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン中で、かつ、２５μＭのダポキシルスルホンアミド染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲより入手可能）の存在下で実施した。
【０１２２】
最終濃度の２倍の濃度に相当する２μＬのリガンド溶液を、３８４ウェル黒壁グライナープレート中にマイクロピペットを用いて分注した。次に、２μＬのタンパク質色素溶液を３８４ウェルプレート中のリガンド溶液の上に分注した。該プレートは、タンパク質染料及びリガンド溶液をしっかり混合させるために回転させ、その後、試料の加熱中の蒸発を阻止するために１μＬを積層した。データをＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ装置（米国特許文献２〜１０参照）上で集め、非線形最小二乗適合ソフトを使用して分析した。以下に記載された結果は、４つの実験の平均である。
【０１２３】
【表２】
2005534005.tif 000003
【０１２４】
もしＥＲ−αがオーファン受容体であるならば、この受容体は、エストロゲン受容体ファミリーの一構成体であると、データは解釈されたであろう。もし同定された、受容体に結合するリガンドが、実施例１に示したように、一団の補助調節因子に対してスクリーニングされたならば、β−エストラジオール、エストロン、１７−α−エチレンエストラジオール、及び２−メトキシエストラジオールは、この受容体の作用薬であり、一方、４−ヒドロキシタモキシフェンは、拮抗薬である。このデータの組は、オーファン受容体のリガンドを同定するためのマイクロプレート温度移動アッセイの有用性を実証する。
【０１２５】
（実施例３）  
本発明を使用して分析することができる、他のタンパク質間の相互作用の実施例を表３に示す。
【０１２６】
【表３】
2005534005.tif 000004
【０１２７】
本発明の異なる実施形態は、非限定的に上記実施例を含む。実施例の一般的な種類として、対象とするタンパク質、相互作用をするタンパク質又はペプチドパートナー（補助調節因子、例えば、活性化補助因子又は共リプレッサー）、及び相互作用を亢進する（作用薬）又は抑制する（拮抗薬）リガンドが挙げられる。
【０１２８】
上記の発明は、明確さ及び理解し易さのために少し詳しく説明したが、当業者は、この開示を読むことによって、本発明及び添付の特許請求の範囲の真の範疇から逸脱することなしに、形態及び詳細における様々な改変が実施可能であることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】活性化補助因子存在下での作用薬リガンドの同定のために予期される実験結果を示す図である。
【図２】活性化補助因子存在下での拮抗薬リガンドの同定のために予期される実験結果を示す図である。
【図１】
2005534005.tif 000005
【図２】
2005534005.tif 000006
【国際調査報告】
2005534005.tif 000007