(57)【要約】本発明は、ヒトまたは動物において、骨形成の促進および／または骨吸収を阻害するための組成物の製造のためのヘスペルジン化合物またはそれらの誘導体の一つの使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは動物において、骨形成を促進および／または骨吸収を阻害するための組成物を製造するためのヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つの使用。
【請求項２】
前記組成物が、経口投与に適した栄養組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記栄養組成物が、成長期の若い個体において、骨の形成を促進するためのものであることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記栄養組成物が、老化とともに発生する骨喪失を予防するためのものであることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記栄養組成物が、骨形成と骨吸収の間の比の不均衡が関与する障害の予防または治療するためのものであることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記栄養組成物が、骨折の結果生じる骨不足を治療するためのものであることを特徴とする、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記栄養組成物が、骨粗鬆症、パジェット病、プロテーゼの近傍で認められている骨喪失または骨溶解、転移性定骨疾患、ガンによる高カルシウム血症、多発生骨髄腫、歯周病または変形性関節症などの中から選択される疾患の予防または治療するためのものであることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記栄養組成物が、果汁、好適にはジュースなどを含む飲み物、ヨーグルト、アイスクリーム、そしてチーズ、パン、ビスケットおよび焼き菓子などの焼き物、乳製品、デザート、砂糖菓子、シリアルバー、朝食用のシリアル、食品調味料、果物サラダ、果物のコンポートのなどの形を取ることを特徴とする、請求項２から７のいずれか一つに記載の使用。
【請求項９】
前記栄養組成物が、液状、半液状あるいは乾燥状の、動物の食品向けの製品の形を取ることを特徴とする、請求項２から７のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１０】
ヘスペルジン化合物またはそれらの誘導体の一つが、柑橘類の外皮または果肉から得られた抽出製品の形を取ることを特徴とする、請求項２から９のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１１】
前記栄養組成物が、０．０１ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる毎日の経口投与に適した量のヘスペルジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含有することを特徴とする、請求項２から１０のいずれか一つに記載の使用。
【請求項１２】
骨形成を促進および／または骨吸収を阻害するための、有効栄養化合物として、ヘスペルジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含有することを特徴とする、栄養組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、ヒトまたは動物に用いられる医薬品組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬品組成物が、成長期の若い個体において、骨の形成を促進するためのものであることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬品組成物が、老化とともに発生する骨喪失を予防するためのものであることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬品組成物が、骨形成と骨吸収の間の比の不均衡が関与する障害の予防または治療するためのものであることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記医薬品組成物が、骨折の結果生じる骨不足を治療するためのものであることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
前記組成物が、骨粗鬆症、パジェット病、プロテーゼの近傍で認められている骨喪失または骨溶解、転移性定骨疾患、ガンによる高カルシウム血症、多発生骨髄腫、歯周病または変形性関節症などの中から選択される疾患の予防または治療するためのものであることを特徴とする、請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
前記組成物が、経口、非経口または静脈内投与に適した形を取ることを特徴とする、請求項１３から１８のいずれか一つに記載の使用。
【請求項２０】
前記医薬品組成物が、０．０１ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる毎日の経口投与に適した量のヘスペルジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含有することを特徴とする、請求項１３から１８のいずれか一つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨形成促進および／または骨吸収阻害組成物の食物としての供給または治療的投与による、骨代謝の不均衡が関与する障害のとりわけ予防または治療のための、ヒトまたは動物における骨代謝平衡の維持または回復の分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨は不変の組織ではない。骨は、二つの主要なタイプの細胞、つまり新しい骨組織を生産する骨芽細胞と骨を破壊する破骨細胞が関与する、複雑なプロセスにおける骨組織の破壊とデノボ合成によって常に再編されている。
【０００３】
これらの細胞の活動は、多数のサイトカインと成長因子によって制御され、その大半はＭｕｎｄｙの総合誌に記載されているように識別され、クローニングされている（Ｍｕｎｄｙ，Ｇ．Ｒ．，１９９６，Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．，ｖｏｌ．３２４：２４−２８；Ｍｕｎｄｙ，Ｇ．Ｒ．，１９９３，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．８：Ｓ５０５−Ｓ５１０）。
【０００４】
骨形成に関与する細胞である骨芽細胞は、前駆細胞から分化し、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチン、アルカリフォスフォターゼが含まれる、多数の酵素と骨基質を構成する多数のタンパク質を発現し分泌する。（Ｓｔｅｉｎ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ｖｏｌ．２：１０１８−１０２７；Ｈａｒｒｉｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  Ｖｏｌ．９：８５５−８６３）。
【０００５】
骨芽細胞は、ＢＭＰｓ（「Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」）ペプチドを含む多数の成長を制御するペプチドも合成するが、該ＢＭＰｓは、骨基質の中に貯蔵され、骨の正常な形成に関与すると思われる。
【０００６】
アルカリフォスフォターゼ、オステオカルシン、オステオポンチンと同様に、ＢＭＰｓペプチドは、培養中の骨芽細胞が増殖そして分化するときに、これらの細胞によって発現される。
【０００７】
破骨細胞は、骨吸収と一般的に呼ばれているプロセスにおいて、骨喪失に関与する多核細胞である。
【０００８】
成人のヒトまたは動物の健康な個体において、骨芽細胞と破骨細胞の共同作用は、骨量の経時的な維持を可能にし、そして同時に骨の吸収とデノボ合成による骨組織の再編を保証する。
【０００９】
健康な大人の被験者において、破骨細胞と骨芽細胞の形成速度は、骨形成と骨吸収の間に平衡が成立するような速度である。しかしながら、骨粗鬆症の個体においては、骨の再編プロセスに不均衡が生じ、それにより骨の形成速度よりも速い速度で骨が失われてしまう。大半の個体において、老化に応じてある程度この不均衡は存在するが、骨粗鬆症の個体においてはより深刻であり、より若年で発生する。
【００１０】
したがって、ヒトやその他の哺乳類において、きわめて多様な障害が、骨の代謝または再編の不均衡を招く骨吸収と骨形成の異常な代謝に関係する。
【００１１】
個体によって骨量のピーク値に大きなばらつきがとくに認められるが、このばらつきは、ごく若いときからの骨成長プロセスにおける大きな変動によるものである。このように、成年年齢の初期に、骨量ピークとしても示される最大骨量に達し、該骨量ピークは、個体ごとにばらつきがある。骨量のピーク値が低く、老化によって骨が喪失する個体は、年齢とともに不利になる。したがって、個体を問わず、老化によって非病理的に発生する骨再編の不均衡、とりわけ早期の骨折のリスクをできる限り減らすように、骨喪失の早期予防治療が推奨される。
【００１２】
骨代謝の不均衡が関与する病理的な疾患として、骨粗鬆症、パジェット病、プロテーゼの近傍で認められる骨喪失または骨溶解、転移性骨疾患、ガンによる高カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病などの障害および疾病などがとりわけ挙げられる。
【００１３】
骨代謝の一部の障害と疾病は、例えば、長期入院などの、長期に渡って動かなかった後に、あるいは無重力空間に滞在した後に、引き起こされることがある。
【００１４】
異常な骨吸収が関与する障害の中でもっとも有名なものが骨粗鬆症であり、更年期の始まった後の婦人にもっとも頻繁に現れる。骨粗鬆症は、骨がもろくなり骨折しやすくなることに関連する骨量の減少と骨組織の微小構造の破綻を特徴とする全身性骨疾患である。
【００１５】
骨粗鬆症の原因となる骨喪失を促進する可能性のある要因は他にもあり、喫煙、アルコールの過多、座ることの多い生活様式、カルシウム不足、偏った食餌、あるいはビタミンＤ不足などがある。
【００１６】
骨粗鬆症は慢性傷害にあたるため、骨喪失が関与する他の障害と同様にその予防と治療は長期的に計画しなければならない。
【００１７】
広く認められているように、早くから注意することが好ましいが、それは骨の蓄えにきわめて重要な二つの段階があるからである：
・最大骨量（骨量ピーク）の獲得を可能にする成長期；
・骨量の喪失速度を左右する老化。
【００１８】
したがって、骨粗鬆症の予防は、高齢者に限定されるものではない。
【００１９】
他方で、ヒトまたは動物において、骨形成の増大を必要とすることを特徴とする、数多くの状態が存在する。例えば、骨折の場合、骨の完全な修復を促進するために骨成長を刺激する必要がある。この必要性は歯周病、転移性骨疾患、骨溶解および、例えば軟骨の異常または傷害の、治療または再生のために、結合組織を修復することが求められる状態にも存在する。原発性および二次性の副甲状腺機能亢進症の場合、ならびに糖尿病を伴う骨粗鬆症、グルココルチコイドが関与する骨粗鬆症においても、骨成長の促進が求められる。
【００２０】
今日、骨形成の促進または骨吸の収阻害のための数多くの有効成分が存在し、その中でもポリホスホン酸塩化合物群（欧州特許第２１０７２８号明細書）、オキサゾリジノン・チオアミド（米国特許出願公開第２００２／００１０３４１号明細書）、ビスホスホン酸のアミノ化合物（米国特許出願第２００１／００４６９７７号明細書）あるいはイソフラボン化合物（米国特許出願第２００２／００３５０７４号明細書）を挙げることができる。トマト属植物抽出物の使用も提案されている（米国特許出願第２００２／０００９５１０号明細書）。
【特許文献１】欧州特許第２１０７２８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２／００１０３４１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
今日、骨形成の促進および／または骨吸収の阻害のための数多くの有効成分が存在しているが、とりわけ現在の治療の成功が限定されているために、新しい有効成分に対する要望が常に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
くわえて、骨代謝の不均衡によって引き起こされる特定の状態の慢性的性格を考慮すると、ヒトまたは動物において長期間の使用が可能で、例えば栄養組成物の形のような栄養補給剤の形を取ることができる、新規な有効成分に対する要望が存在する。
【００２３】
意外なことに、発明者により、フラボノイド族の化合物であるヘスペリジンが、骨形成を促進し骨吸収を阻害することにより、骨代謝に作用することが可能であることが分かった。
【００２４】
したがって、本発明によって提供されるのは、有効成分としてヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含む、ヒトまたは動物に用いられる栄養組成物および医薬品組成物である。
【００２５】
本発明はまた、ヒトまたは動物、とくにイヌ、ネコまたはウマに対する、骨形成の促進および／または骨吸収の阻害のための組成物を製造するために、ヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つを使用することに関するものでもある。
【００２６】
第一の態様によれば、上記の使用は、前記組成物が経口投与に適した栄養組成物であることを特徴とするものである。
【００２７】
第二の態様によれば、上記の使用は、前記組成物が経口、非経口または静脈内投与に適した医薬品組成物であることを特徴とするものである。
【００２８】
図１は、それぞれ、正常な動物（ＴＳＨ）、卵巣摘出動物（ＴＯＶＸ）、ヘスペリジンで治療した正常な動物（ＨｐＳＨ）およびヘスペリジンで治療した卵巣摘出動物（ＨｐＯＶＸ）の、異なる動物区間で同等の身体組成（体重に対する脂肪質量の％）が維持されたことを示している。縦軸は、脂肪質量の百分率である。
【００２９】
図２は、標準の食餌のものと比較した、ヘスペリジンメニューを受けた、無傷のラットまたは卵巣摘出ラットの大腿骨骨幹端の密度の増加を示している。縦軸は、ｇ／ｃｍ3で表した骨密度を示す。
【００３０】
図３は、デオキシピリジノリンの尿中排出量の測定によって評価した、卵巣摘出によって誘発された骨吸収の増加のヘスペリジンによる予防を示している。縦軸は、尿中のデオキシピリジノリン／クレアチニンのモル比の測定値を示す。
【００３１】
図４は、対照動物に対する、治療したラットにおける（血漿中のオステオカルシンの濃度を測定して評価した）骨芽細胞の活性の促進を示している。縦軸は、ｍｇ／ｌで表した血漿中のオステオカルシン濃度を示す。
【００３２】
図５は、継代３１でのｈＰＯＢ−ｔｅｒｔ細胞の、１０および５０μＭのヘスペレチンによって刺激された骨芽細胞の分化の速度（アルカリフォスフォターゼの活性の増加）を示している。縦軸は、アルカリフォスフォターゼの活性をパラニトロフェノールμＭ／時間／タンパク質ｍｇで表されている。横軸は、日を単位として表した時間である。
【００３３】
図６は、２１日インキュベートした後の、ヘスペリチン（５０μＭ）による、（継代３１での）ｈＰＯＢ−ｔｅｒｔ細胞における石灰質の蓄積の促進を図示している。縦軸は、Ｃａ++μｇ／タンパク質ｍｇの単位で表した、カルシウムＣａ++／タンパク質の割合の測定値である。
【００３４】
図７は、未処理の（ＯＶＸ対照）またはヘスペリジン処理した（ＯＶＸ  Ｈｅｓｐ）卵巣摘出したラットにおける、および対照の（ＳＨ対照）またはヘスペリジンで処理した（ＳＨ  Ｈｅｓｐ）正常なラットにおける、経時的な食餌摂取量の制御を示している。横軸は、２日間隔の時間；縦軸は、摂取した食餌のグラム数。
【００３５】
図８は、各区（ＳＨ）、（ＳＨ  Ｈｅｓｐ）、（ＯＶＸ）および（ＯＶＸ  Ｈｅｓｐ）のラットの体重の変化の概要を図示したものである。横軸は日数；縦軸は、動物の平均体重＋／−標準偏差。
【００３６】
図９は、各区（ＳＨ）、（ＳＨ  Ｈｅｓｐ）、（ＯＶＸ）および（ＯＶＸ  Ｈｅｓｐ）のラットの身体組成を、脂肪質量の百分率で図示している。横軸は動物区；縦軸は、脂肪質量の百分率で表した身体組成。
【００３７】
図１０は、各区（ＳＨ）、（ＳＨ  Ｈｅｓｐ）、（ＯＶＸ）および（ＯＶＸ  Ｈｅｓｐ）のラットの子宮の重量を示している。横軸は動物区；縦軸は、グラムで表した子宮の平均重量。
【００３８】
図１１は、各区（ＳＨ）、（ＳＨ  Ｈｅｓｐ）、（ＯＶＸ）および（ＯＶＸ  Ｈｅｓｐ）のラットの大腿骨全体の密度（Ｔ−ＢＭＤ）を示している。横軸は動物区；縦軸は、ｇ／ｃｍ2で表した大腿骨のミネラル濃度。
【００３９】
図１２は、各区（ＳＨ）、（ＳＨ  Ｈｅｓｐ）、（ＯＶＸ）および（ＯＶＸ  Ｈｅｓｐ）のラットの大腿骨遠位骨幹端のミネラル濃度（Ｍ−ＢＭＤｐ）を示している。横軸は動物区；縦軸は、ｇ／ｃｍ2で表した大腿骨遠位骨幹端のミネラル濃度。
【００４０】
図１３は、各区（ＳＨ）、（ＳＨ  Ｈｅｓｐ）、（ＯＶＸ）および（ＯＶＸ  Ｈｅｓｐ）のラットの大腿骨骨幹のミネラル濃度（Ｄ−ＢＭＤ）を示している。横軸は動物区；縦軸は、ｇ／ｃｍ2で表した大腿骨骨幹のミネラル濃度。
【００４１】
図１４は、各区（ＳＨ）、（ＳＨ  Ｈｅｓｐ）、（ＯＶＸ）および（ＯＶＸ  Ｈｅｓｐ）のラットの大腿骨の最大荷重を示している。横軸は動物区；縦軸は、ニュートン（Ｎ）で表した大腿骨の最大荷重。
【００４２】
本発明によって提供されるのは、ヒトまたは動物における骨形成を促進および／または骨吸収を阻害するために、ヒトまたは動物に使用するための、有効成分としてヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含む、栄養組成物および医薬品組成物である。
【００４３】
ヘスペリジンは、主として柑橘類、すなわちミカン属の果実にある天然のグルコシド化合物である。ヘスペリジンは、オレンジやレモンを含む柑橘類の皮の中に大半が存在するが、果肉の中にも、したがって、果汁の中にも大量に存在する。
【００４４】
ヘスペリジンは、フラバノン核（３’、５’、５−トリヒドロキシ−４’−メトキシフラバノン）を有しており、当該フラバノン核には、ヘスペリチンの７位炭素上に存在するヒドロキシル基において、ルチノースであるＬ−ラムノシル（α１→６）−グルコースのグルコシドの部分が共有結合している。
【００４５】
ヘスペリジン化合物は、とりわけ酸化によるビタミンＣの変質を減らすことでビタミンＣの生物活性を強化するためにビタミンＣと組み合わせて広く用いられる、フラボノイド族の化合物である。この用途において、ヘスペリジンは、心臓血管疾患、とくに高血圧と出血の治療の助剤として提案されている。
【００４６】
ヘスペリジンは、軟骨に由来する軟骨細胞の基質の破壊を阻害するその能力の故に、軟骨保護剤としても記載されている（欧州特許出願公開第６３３０２２号明細書）。
【００４７】
ヘスペリジンは、皮膚の色素沈着防止剤として（独国特許出願公開第１９７４２０２５号明細書）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（米国特許第５７６３４１４号明細書）またはアシルＣｏＡ−コレステロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＰＣＴ出願、国際公開第９９／２１．５４９号パンフレット）または血小板凝集阻害剤（韓国特許出願公開第２７６９７９号明細書）として、先行技術で提案されている。
【００４８】
意外なことに、本発明によれば、ヘスペリジンが骨の形成を促進し、骨吸収を阻害することが示された。
【００４９】
実施例に示すごとく、ヘスペリジンは骨幹端の骨組織（骨梁）の密度と骨幹骨（皮質骨）の密度の増加を誘発し、それによって骨の石灰化の改善を誘導する。
【００５０】
ヘスペリジンは、この化合物を加えた食餌を与えられた動物で認められる、血漿中のオステオカルシン濃度の大幅な増加が証明しているように、骨の成長も促進する。
【００５１】
アルカリフォスファターゼの活性の増加の誘導によって分かるように、ヘスペリジンが骨芽細胞の前駆細胞の増殖の停止ならびにそれらの成熟骨芽細胞への分化を引き起こすことも示された。同様に、ヘスペリジンは、骨芽細胞へのカルシウム蓄積の増加も誘発する。
【００５２】
くわえて、ヘスペリジンは、ヒトの骨粗鬆症を模倣する標準的な動物実験モデルである卵巣摘出したラットにおける骨吸収も阻害する。
【００５３】
とくに、ヘスペリジンが、更年期の生理機能を模倣するモデルである６箇月齢の卵巣摘出したラットで認められるように、成長を終えた個体、とりわけホルモン欠乏の状態にある個体における老化の過程での骨の蓄えの維持を可能にすることが、本発明によって示された。
【００５４】
骨形成と骨吸収阻害のそれぞれにおけるヘスペリジンのこれら二つの協働的な活性は、ヒトまたは動物に対し、骨代謝の平衡の維持または回復のために有効成分として大きな有用性を付与するものであり、すなわち：
・骨芽細胞および破骨細胞の活性を、年齢とともに絶えず一定に維持し、このようにして骨代謝障害を予防する；あるいは
・例えば、骨粗鬆症などの障害における骨代謝の不均衡を修復し、または、例えば骨の亀裂骨折の場合に骨再生を促進する。
【００５５】
したがって、本発明は骨形成を促進しおよび／または骨吸収を阻害することにより、ヒトまたは動物において骨代謝の平衡を維持または回復させるのに適した組成物を製造するために、ヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つを使用することを目的とするものである。
【００５６】
ヘスペリジンは、化合物（Ｓ）−７−［［６−０−（６−デオキシ−α−Ｌ−マンノピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］オキシ］−２、３−ジヒドロ−５−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オンを意味するものとする。
【００５７】
ヘスペリジンの「誘導体」は、本発明においては下記の化合物を意味する：
・下記の化学式の、ヘスペリジンのグリコシル化していないフラバノン核で構成されるヘスペレチン化合物；（Ｓ）−２，３−ジヒドロ−５，７−ジヒドロキシ−２−（３−ヒドロシキ−４−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン；３’、５、７−トリヒドロキシ−４’−メトキシフラバノン；
・１．４結合で相互に結合した１から２０のグルコース残基の鎖を含むα−グルコシル−ヘスペリジンに関しては、グルコース残基の鎖は、ヘスペリジンのグルコース残基の４位においてそれ自体が１．４型の結合によって結合している；これらのヘスペリジンの誘導体とその調製法は、とくに欧州特許出願公開第０８２５１９６号明細書および米国特許第６０４８７１２号明細書に記載されている；
・メチル−ヘスペリジン、とりわけ化合物３1−メチル−７−（ラムノシル−２−メチル−グルコシル）ヘスペリジンと化合物３1−メチルヘスペリジンに関しては、これらの化合物ならびに調製法は、とくに米国特許第８５８７８４号明細書に記載されている）；
・ヘスペレチンと硫酸塩またはグルクロニドの共役化合物に関しては、それらはヘスペレチンとともに、ヘスペリジンの代謝生成物として血液循環の中に見られる。
【００５８】
「骨形成の促進」とは、本発明において、骨芽細胞の活性を促進して、骨のタンパク質の網状構造の合成とこのタンパク質の網状構造へのミネラルとくにカルシウムの蓄積を助長、すなわち骨の成長とも呼ばれる石灰化を促進する、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つの能力を意味する。
【００５９】
ヒトまたは動物、とくに哺乳類へのヘスペリジン投与が骨形成を促進するか否かを確認するために、当業者はとくに、通常の密度測定を利用し、所与の用量でのヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つの投与が骨密度の増大を誘導するか否かを確認することができるだろう。
【００６０】
当業者は、骨の破断強度の測定あるいはアルカリフォスファターゼの活性の測定および骨芽細胞におけるカルシウム蓄積の測定などの、実施例に記載されたその他の試験のいずれか一つを利用することもできる。
【００６１】
「骨吸収の阻害」とは、本発明において、破骨細胞による骨組織破壊の活性の阻害を意味する。ヒトまたは動物において、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つの投与が骨吸収を阻害するか否かを確認するために、当業者は、実施例に記載のごとく、デオキシピリジノリンの尿中排出を測定することができるが、それはデオキシピリジノリンの発現の減少は骨吸収阻害を反映しているからである。
【００６２】
動物の生体へのヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つの投与は、骨形成の促進、骨吸収の阻害を同時に誘発し、骨の石灰化、つまり骨密度の全体的な増大は、これら二つの機構の誘導の結果である。
【００６３】
被験者の骨量が減少した状態にあり、結果としてヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを投与することが必要であるか否かを判定するために、当業者は、１９９４年の世界保険機関（ＷＨＯ）の報告をとくに参照することができる；“Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｒａｃｔｕｒｅ  ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ”（ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ−８４３）。
【００６４】
有効成分としてヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを含有する栄養組成物または治療組成物は、まず第一に、ヒトまたは動物において、とくにヒト以外の哺乳類、とりわけイヌ、ネコなどの家畜哺乳類、あるいはウマ、とくに純血種において、骨組織の再編における不均衡による骨の喪失を予防するためのものである。
【００６５】
先に定義したような組成物は、高い骨密度を得るために、そして可能ならば、同時に高い骨量ピークを有する個体を得るための、若い個体において骨の成長を促進するものでもある。とくに、本発明による組成物は、ヒトおよびその他の哺乳類、とりわけ大型種または血統種のイヌ、あるいは競走馬の、成長期の間に有用である。
【００６６】
ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを含有する組成物は、骨不足の症候のある、あるいは骨不足になる可能性のある、すなわち、継続すると骨量の減少を招く骨形成と骨吸収の率の不均衡を生じるおそれのある個体も対象とする。本発明による組成物は、骨折、外科手術、あるいは歯の疾病により骨不足の症候を有する個体も対象とする。
【００６７】
とくに、本発明によるヒトまたは動物のための栄養組成物または医薬品組成物は、骨粗鬆症、パジェット病、プロテーゼの近傍で認められる骨喪失または骨溶解、転移性骨疾患、ガンによる高カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病または変形性関節症などの疾病の治療に有益である。
【００６８】
本発明による組成物は、後述のごとく、栄養組成物または医薬品組成物の形を取ることができる。
【００６９】
本発明によれば、ヘスペリジンは、先行技術文献に記載された多数の抗骨粗鬆症化合物とは反対に、ビタミンＤ３およびデキサメタゾンなどの骨芽細胞分化因子のような助剤の存在を必要とせずに、骨芽細胞の増殖の停止を誘導し、そして分化を引き起こす。この実験結果により、骨形成の促進と骨吸収の阻害に対する、ヘスペリジンとそれらの誘導体の重要性が明らかに示されたが、それは、これらの化合物が単独で使用された時に生物学的に有効であり、結果として、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つをビタミンなどの他の化合物と組み合わせた形で生体に投与する必要がないためである。
【００７０】
くわえて、ヘスペリジンが骨梁の密度だけでなく皮質骨の密度の増加も誘発することは、この分子の高い生物活性レベルを実証している。実際、骨の頭部を形成し、きわめて血管が発達した骨梁は、骨と血流の間のカルシウム交換に最適の場である一方で、骨のまっすぐな本体を形成し、血管が極めて少ない皮質骨は、その石灰化において変化の影響を早期に受ける可能性があるためである。
【００７１】
ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを含む栄養組成物
【００７２】
上述のごとく、骨粗鬆症などのような骨の代謝の不均衡が関与する数多くの障害は、長期的に徐々に進行し、長期にわたる治療を必要とする。それらの予防またはそれらの治療は、したがって、好適には栄養組成物の形で、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを定期的に投与することにより実現が可能である。
【００７３】
同様に、ヒトまたは動物の成長中の若い個体にヘスペリジンを定期的に栄養として投与することは、これらの個体が成人に達したときに、骨形成の促進によって、高い骨密度と高い骨量ピークを得ることを可能にする性格のものである。
【００７４】
同様に、ヘスペリジンを定期的に栄養として投与することは、老化とともに発生する骨喪失の予防にも有効である。
【００７５】
本発明は、有効な栄養化合物としてヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを含有することを特徴とする、骨形成の促進および／または骨吸収を阻害する栄養組成物も対象とする。
【００７６】
「栄養組成物」とは、本発明において、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを含有し、医薬品の性格を持たない食品組成物または補助食品を構成する組成物を意味する。
【００７７】
栄養組成物の製造のためのヘスペルジン化合物またはそれらの誘導体の一つのさまざまな使用を、前記栄養組成物の技術的特性との関連において、以下に定義する。
【００７８】
本発明による栄養組成物は、有利には経口投与に適している。
【００７９】
第一の態様によれば、本発明による栄養組成物は、それを摂取するヒトまたは動物の優れた健康を維持するために用いられる特別食の一部として、あるいは「補助食品」として摂取されるためのものであるが、そのヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つの含有は、基本栄養所要量が提供する以上の生理学的役割をもたらしている。
【００８０】
第一の様態によれば、前記栄養組成物は、成長期の若い個体において骨形成を促進するためのものである。
【００８１】
第二の様態によれば、前記栄養組成物は、老化とともに生じる骨喪失を予防するためのものである。
【００８２】
第三の態様によれば、前記栄養組成物は、骨形成と骨吸収の率の不均衡が関与する障害を予防または治療するためのものである。
【００８３】
第四の態様によれば、前記栄養組成物は、骨折の結果生じる骨不足を治療するためのものである。
【００８４】
さらに他の態様によれば、前記栄養組成物は、骨粗鬆症、パジェット病、プロテーゼの近傍で認められる骨喪失または骨溶解、転移性骨疾患、ガンによる高カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病または変形性関節症などの疾患の予防または治療を目的とする。
【００８５】
有効成分としてヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含有することを特徴とする本発明による栄養組成物は、果汁、好適にはジュースなどの飲み物、ヨーグルト、アイスクリーム、チーズ、そしてパン、ビスケットおよび焼き菓子などの焼き物、乳製品、デザート、砂糖菓子、シリアルバー、朝食用のシリアル、調味料（とくに香辛料とソース）、果物サラダ、果物のコンポートなどを含む食品組成物の多種多様な形を取ることができる。
【００８６】
有効成分としてヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含有することを特徴とする本発明による栄養組成物は、動物、とくに犬猫の食品向けの多種多様な製品の形を取ることもでき、液状、半液状あるいは乾燥状、とくにコロッケ状であってよい。
【００８７】
先に述べたごとく、ヘスペリジンは、ミカン属の柑橘類、とくにオレンジおよびレモンの中に天然に存在する化合物であり、この化合物は果物の皮の中に大半が含まれるが、とりわけＭＡＮＳＥＬＬら（ＭＡＮＳＥＬＬ  Ｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３１：１５６−１６２）、ＲＯＵＳＥＦＦら（ＲＯＵＳＥＦＦ  Ｒ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，ｖｏｌ．３５：１０２７−１０３０）またはＧＩＬ−ＩＺＱＵＩＥＲＤＯら（ＧＩＬ−ＩＺＱＵＩＥＲＤＯ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４９：１０３５−１０４１）に記載のごとく、果肉の中にもかなりの量が含まれる。
【００８８】
第一の様態によれば、本発明による栄養組成物は、柑橘類の果汁の形、とくにオレンジ果汁またはレモン果汁、場合によっては柑橘類の果汁の濃縮物の形を取ることができる。
【００８９】
第二の態様によれば、本発明による栄養組成物は、とりわけオレンジまたはレモンなどの柑橘類または柑橘類の抽出物に富んだ食品組成物で構成することができる。
【００９０】
第三の態様によれば、本発明による栄養組成物は、あらゆる製品形態、とくに、オレンジまたはレモンを含む、柑橘類の外皮、柑橘類の果汁、柑橘類の果肉あるいは柑橘類のあらゆる抽出物で芳香を付けた、あらゆる飲料の形を取る。
【００９１】
したがって、液体の形または個体の形、とりわけ粉末の形を取ることができる本発明による栄養組成物は、柑橘類の皮または果肉から得られた抽出物で構成すること、あるいは柑橘類の皮または果肉から得られた抽出物を含むことができる。
【００９２】
とりわけ、本発明による栄養組成物は、オレンジまたはレモンを含む柑橘類の皮または果肉の抽出物を添加した、例えばミネラルウオーターなどの飲料の形を取る。
【００９３】
さらに他の態様によれば、ミカン属の果実の圧搾物をｐＨ１１．５−１２．５に調整し、ついで圧搾とｐＨ調節によって得られた液体が遠心分離し、ｐＨ５−５．５に二回目のｐＨ調整を行った後加熱し、そしてヘスペリジン濃縮物の回収に先立つ遠心分離の最後のステップに付す、特開平８−１８８５９３号明細書に記載の方法のような、かかる目的を達成するためにとくに適した抽出方法を実施するならば、抽出生成物は、最初にヘスペリジンを濃縮することができる。ヘスペリジンに富んだ抽出物を得るために使用することができるもう一つの抽出法は、英国特許出願公開第４８６．８９８号明細書に記載のものである。
【００９４】
柑橘類から、より具体的にはオレンジまたはレモンから、ヘスペリジンに富んだ抽出物を得るために、当業者は、米国特許発明第２４００６９３号明細書および米国特許発明第２４４２１１０号明細書にそれぞれ記載の方法を有利に参照することができるだろう。
【００９５】
他の態様によれば、本発明による栄養組成物において、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つは化学合成によって生成される。
【００９６】
好適には、本発明による栄養組成物は、０．０１ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる毎日の経口投与に適した量のヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含有する。
【００９７】
ヒトによる摂取のために、本発明による栄養組成物は、０．０１ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる、好適には０．１ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる、そしてきわめて望ましくは１ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる、前記組成物によって提供されるヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つの毎日の補給に適した量の有効成分を含んでいる。
【００９８】
動物、より詳細にはイヌ、ネコまたはウマを含む、ヒト以外の哺乳類による摂取のために、本発明による栄養組成物は、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つが１ｍｇと５００ｍｇの間に、好適には１０ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる、前記組成物によって提供される有効成分の毎日の投与に適している。
【００９９】
例として、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを添加したミネラルウオーターは、人間の毎日のミネラルウオーター平均摂取量が約１リットルであると推定して、１リットルあたり０．０１ｍｇから５００ｍｇの有効成分を含むだろう。
【０１００】
さらに他の態様によれば、上述の栄養組成物は、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つと組み合わせて、他の栄養化合物を含むことができる。
【０１０１】
したがって、本発明による栄養組成物は、例えば無機カルシウム塩（塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムまたは炭酸カルシウム）などの生理的に許容できる有機化合物または無機化合物の形でカルシウム源を、あるいは脱脂粉乳、カゼイン酸カルシウムあるいはさらにカルシウムの有機塩（クエン酸カルシウム、マレイン酸カルシウムまたはそれらの混合物）などのカルシウムを含む有機成分を、含有することもできる。
【０１０２】
本発明による栄養組成物に含まれるカルシウムの量は、１００ｍｇと１０００ｍｇの間に含まれる、好適には２００ｍｇと７００ｍｇの間に含まれる、そしてきわめて好適には３００ｍｇと６００ｍｇの間に含まれるカルシウムを含む、前記組成物によって提供される毎日の投与に適合される。
【０１０３】
本発明による栄養組成物は、ビタミン類、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＣ、葉酸、チアミン、リボフラビン、ビタミンＢ6、ビタミンＢ12、ナイアシン、ビオチンあるいはまたパントテン酸を含むこともできる。
【０１０４】
本発明による栄養組成物は、ナトリウム、カリウム、リン、マグネシウム、銅、亜鉛、鉄、セレン、クロムおよびモリブデンなどの無機元素および微量元素を含むこともできる。
【０１０５】
それはまた寒天、アルギン酸塩、イナゴマメ、カラギーナン、アラビアゴム、グアーゴム、カラヤゴム、ペクチンまたはキサンタンガムなどの可溶性繊維を含むことがあり、これらの可溶性繊維は、加水分解したあるいは加水分解していない形である。
【０１０６】
それはまたエネルギー源の化合物、とりわけマルトデキストリン、澱粉、ラクトース、グルコース、スクロース、フルクトース、キシリトール、およびソルビトールの中から選択された一つまたは複数の炭化水素源も含むことができる。
【０１０７】
くわえて、本発明による栄養組成物は、天然または人工の香料、例えば、バナナ、オレンジ、モモ、パイナップル、キイチゴなどの果実の香料、あるいはバニラ、カカオ、コーヒーなどのその他の植物性香料も含むこともできる。
【０１０８】
先に述べたごとく、本発明による骨形成の促進または骨吸収の阻害のための組成物は、後述のごとく、医薬品組成物の形を取ることもできる。
【０１０９】
本発明によるヒトまたは動物の医薬品組成物
【０１１０】
本発明は、有効成分としてヘスペリジン化合物またはそれらの誘導体の一つを含むことを特徴とする、骨形成の促進および／または骨吸収の阻害のためのヒトまたは動物の医薬品組成物も対象とする。
【０１１１】
とくに、本発明は、骨代謝の不均衡が関与する疾病の予防または治療のための、ヒトまたは動物に用いる医薬品組成物の製造、つまりは、骨形成の促進および／または骨吸収の阻害に適した医薬品組成物のための、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つの使用に関するものである。
【０１１２】
医薬品組成物の製造のためのヘスペリジンの使用を、前記医薬品組成物の技術的特徴との関連において、以下に説明する。
【０１１３】
本発明による医薬品組成物は、有効成分としてヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを、かかる治療を必要とする個体における骨形成の促進または骨吸収の阻害に適した量だけ含有している。
【０１１４】
第一の態様によれば、本発明による医薬品組成物は、成年年齢の最初に達した骨密度を増加させ、成年年齢の最初に最大骨量（骨量ピーク）を増加させるために、成長期のヒトまたは動物の若い個体において、骨形成を促進するのに有益である。
【０１１５】
第二の態様によれば、本発明によるヒトまたは動物の医薬品組成物は、老化の過程で年齢とともに発生する骨喪失を予防するのに有益である。
【０１１６】
第三の態様によれば、本発明によるヒトまたは動物の医薬品組成物は、骨形成と骨吸収の率の不均衡が関与する障害または病理の予防または治療に有益である。
【０１１７】
第四の態様によれば、本発明によるヒトまたは動物の医薬品組成物は、骨折の結果生じる骨不足の治療に有益である。
【０１１８】
第五の態様によれば、本発明によるヒトまたは動物の医薬品組成物は、骨再編の不均衡が関与する疾患、例えば、骨粗鬆症、パジェット病、プロテーゼの近傍で認められる骨喪失または骨溶解、転移性骨疾患、ガンによる高カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病あるいは変形性関節炎の治療において有益である。
【０１１９】
それはヒトまたは動物、とくにイヌまたはネコ、あるいはさらにウマ、とりわけ純血種のものの医薬品組成物も対象になり得る。
【０１２０】
本発明による医薬品組成物は、経口、非経口または静脈内投与のための形を取ることができる。
【０１２１】
ヒトに投与するための形状において、本発明による医薬品組成物は、０．０１ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる、前記組成物の形で提供された、有効成分の毎日の投与に適した量のヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを有利には含有している。
【０１２２】
動物、とくにイヌまたはネコなどの家畜哺乳類への投与のための形において、本発明による医薬品組成物は、１ｍｇと５００ｍｇの間に含まれる、前記組成物の形で提供された、有効成分の毎日の投与に適した量のヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを含有している。
【０１２３】
本発明による医薬品組成物は、医薬品として許容される添加剤で構成される群の中から選択された少なくとも一つの添加剤と組み合わされたヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを含んでいる。
【０１２４】
本発明による医薬品組成物の調製技術は、当業者が、刊行物、例えばＲｅｍｍｉｎｇｓｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｄ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，  Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡに容易に見いだすことができるものである。
【０１２５】
生理的に許容できる佐薬、賦形剤、添加剤も、刊行物“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９４に記載されている。
【０１２６】
本発明による医薬品組成物を配合するために、当業者は有利には、欧州薬局方または米国薬局方（ＵＳＰ）の最新版を参照することができる。
【０１２７】
当業者は、とくに有利には、欧州薬局方の第四版、“２００２”あるいはさらに米国薬局方ＵＳＰ  ２５−ＮＦ  ２０版（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）を参照することができる。
【０１２８】
有利には、上述のように規定された医薬品組成物は、経口、非経口、または静脈内投与に適している。
【０１２９】
本発明による医薬品組成物が薬学的または生理的に許容できる少なくとも一つの添加剤を含む場合、該添加剤は、とくに経口による組成物の投与に適した添加剤、または非経口による組成物の投与に適したものである。
【０１３０】
本発明は、骨代謝の不均衡が関与する障害、とくに骨量の喪失に関連する障害の予防または治療のための方法であって、治療に有効な量のヘスペリジンもしくはそれらの誘導体の一つ、またはヘスペリジンもしくはそれらの誘導体の一つを含む医薬品組成物を患者に投与する過程を含む方法にも関するものである。
【０１３１】
本発明によるヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つを含む医薬品組成物は、無差別に固体形状または液体形状を有する。
【０１３２】
経口投与の場合、錠剤、カプセルまたはゼラチンカプセルの形の固体の医薬品組成物が望ましい。
【０１３３】
液状の場合、水性懸濁液、水性でない懸濁液の形、あるいは油中水、または水中油のエマルジョンの形の医薬品組成物が望ましい。
【０１３４】
固体の医薬品の形状は、賦形剤、佐薬または添加剤として、少なくとも一つの希釈剤、芳香剤、可溶化剤、滑剤、懸濁剤、結合剤、崩壊剤およびカプセル化剤を含むことができる。
【０１３５】
かかる化合物は、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、セルロース物質、カカオバター等である。
【０１３６】
液状の組成物には水も含まれ、場合によってはプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールと混合され、また場合によって着色剤、香料、安定剤および濃縮剤と混合される。
【０１３７】
本発明による医薬品組成物の製造のために、ヘスペリジンまたはそれらの誘導体の一つは、明細書において先に引用したさまざまな特許文献の教示にかなうように調製することができる。
【０１３８】
好適には、ヘスペリジンの供給源として、ヘスペリジンを純粋な形で、あるいはほぼ純粋な形で含む医薬品グレードの製品、例えば、酢酸エチル内に９５重量％のヘスペリジンを含有するＳＡＮＪＩＵ  ＥＮＴＥＲＰＲＩＳＥ  ＧＲＯＵＰグループに属するＮＩＮＧＢＯ  ＬＩＷＡＨ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ社によって市販されているヘスペリジンを用いることができる。
【０１３９】
本発明を、非限定的な例として、下記の実施例によってさらに詳しく説明する。
【実施例１】
【０１４０】
卵巣切除したラットにおける骨代謝に対するヘスペリジンの影響
【０１４１】
この実験の目的は、偽手術した対照のラット（ＳＨ）と比較して、卵巣切除したラット（ＯＶＸ）の骨代謝に対するヘスペレチンの影響を試験することであった。ヘスペレチンはそのグリコシル化した形（ヘスペリジン）が柑橘類、より詳細にはオレンジに固有であるフラバノンである。このフラボノイドは、他の植物による製品には存在しない。ヘスペリジンの形の実験メニューを追加した。
【０１４２】
Ａ．材料と方法
【０１４３】
骨組織に対するこの分子の予想される影響を評価するために、３箇月齢の４０匹のＷｉｓｔａｒラット（２６６±２ｇ）を使用した。これらの動物は、実験期間開始前の７日間調整したものを半分含む基本的メニューに馴致させた。０日目、２０匹のラットを偽手術し、他の２０匹の卵巣を摘出した。１０匹ずつの区に分け、３箇月間、各種の食餌療法を施し、終了後に屠殺した。屠殺する前の最後の週、８５日から９０日目、ラットを検査し、尿を採取した（２４時間にわたって）。同様に、ラットの身体組成を測定した。屠殺の際に、各種の分析のために血漿と大腿骨を採取した［大腿骨：破断強度、密度測定；血漿：血中オステオカルシン濃度（骨芽細胞活性のマーカー）、ヘスペレチン濃度；尿：デオキシピリジノリン（骨吸収のマーカー）］。実験の間中、週に一度ラットの体重を測定した。それぞれの動物に与えられた一日の食餌量は２０ｇである。
【０１４４】
区の配分
１０Ｔ  ＳＨおよび１０Ｔ  ＯＶＸ：３箇月間標準対照メニューを与えられる、偽手術した、または卵巣切除したラット
１０Ｈｐ  ＳＨおよび１０Ｈｐ  ＯＶＸ：３箇月間ヘスペリジン（０．５％）が追加された標準対照メニューを与えられる、偽手術した、または卵巣切除したラット
【０１４５】
Ｂ．結果
【０１４６】
Ｂ．１  体重変化と身体組成
結果は、図１に示された。値は平均±ＳＥＭで示した。ラットは典型的な体重変化を示した。実験期間の終わりに、ＯＶＸ動物の体重（ｇ）は偽手術群よりはるかに大きかったが［Ｔ  ＳＨ：３２６．６±９．４；Ｔ  ＯＶＸ：３６３．３±７；Ｈｐ  ＳＨ：３３５．４±１５．４；Ｈｐ  ＯＶＸ：４０６．３±１２．７］、身体組成（全体重％に対する脂肪量％）に関する区間での有意差は認められなかった。
【０１４７】
Ｂ．２  子宮重量
去勢を確認するために、子宮重量を評価した。卵巣摘出はＳＨと比較してこの器官に萎縮（ｍｇ）を効果的に引き起こした（ｐ＜０．０１）。このパラメータはヘスペリジンの摂取によって変化しなかったため、この分子には子宮栄養効果はないと思われる。
【０１４８】
【表１】
2005537241.tif 000002
【０１４９】
Ｂ．３  大腿骨のバイオメカニクス
大腿骨の直径と長さ（ｍｍ）は、治療による有意の変化はなかった。
【０１５０】
【表２】
2005537241.tif 000003
【０１５１】
卵巣摘出は大腿骨の破断強度（Ｎ）を大幅に低下させなかったが、卵巣摘出とヘスペリジンを加えたメニューを与えられたラットは、このパラメータが向上する傾向がある。
【０１５２】
Ｂ．３  密度測定
密度はｇ／ｃｍ2で表した。
【０１５３】
【表３】
2005537241.tif 000004
【０１５４】
偽手術と比較して、卵巣摘出は、対照メニューを与えられたラットの全大腿骨密度の有意の低下を招いた。反対に、ヘスペリジンの摂取はこの低石灰化を予防し、くわえて、ＳＨにおいてこのパラメータを有意に向上させる。
【０１５５】
大腿骨骨幹端の密度（Ｍ−ＢＭＤ）（図２）
主に骨梁で構成された骨幹端の区域において、大腿骨全体に関する結果を検証した。分子を摂取した去勢していない動物における石灰化の向上も実証された（Ｔ  ＳＨとの比較による）。
【０１５６】
大腿骨骨幹部の密度（Ｄ−ＢＭＤ）：
骨幹部の区域は、主に皮質骨で構成される。
【０１５７】
【表４】
2005537241.tif 000005
【０１５８】
ＯＶＸラットにおいてもＳＨにおいても、標準のメニューを与えられた他の区と比較して、ヘスペリジンの摂取は、このパラメータを有意に（ｐ＜０．０５）向上させた。
【０１５９】
Ｂ．４  骨のバイオマーカー
【０１６０】
デオキシピリジノリンの尿中排出（図３）
卵巣摘出は、骨吸収の有意の増加を招く（Ｔ  ＳＨに対してｐ＜０．０１）。この現象は、ＯＶＸラットにおいて、ヘスペリジンの摂取によって回避された。同様にＨｐ  ＳＨラットにおいて、ＤＰＤの尿中排出はＴ  ＳＨと比較して有意に減少した。
【０１６１】
血漿中のオステオカルシン濃度（図４）
オステオカルシンが骨芽細胞活性の指標であるがゆえ、ヘスペリジンの摂取は、骨の成長を促進する（Ｈｐ  ＳＨ  ｖｓ  Ｔ  ＳＨ；Ｈｐ  ＯＶＸ  ｖｓ  Ｔ  ＯＶＸ；ｐ＜０．０５）。
【０１６２】
ヘスペリジンの血中濃度
ヘスペリジンは、実際には、ヘスペレチンのグリコシドである（ヘスペレチン−７−ラムノグルコシド）。ヘスペリジンを追加したメニューを与えられたＯＶＸラットの血漿中のアグリコンの平均濃度は、ＳＨと同様、１２．５３±２．４８μＭであった。反対に、対照のメニューを与えられたラットでは、ヘスペレチンの痕跡はいっさい検出されなかった。
【０１６３】
実施例１の結論
この一連の実験結果は、ヘスペリジンが卵巣切除したラットにおけるエストロゲン欠乏による骨喪失を予防できることを示している。この効果は、骨芽細胞の活性の促進と連動する、骨吸収の減少によってなされている可能性がある。このフラボノンの有益な効果は、無傷の（偽手術の）、すなわち正常なホルモン状態と骨代謝とを有するラットにおいても観察された。
【実施例２】
【０１６４】
ｈＰＯＢ−ｔｅｒｔ細胞（ヒト骨膜の不死化骨芽細胞株、Ｄａｒｉｍｏｎｔら、２００２）に対するヘスペレチンの影響
【０１６５】
ｈＰＯＢがコンフルエントな状態の培地において三つのヘスペレチン濃度を試験した：１．１０および５０μＭ。これらの培地には、骨芽細胞分化因子（ビタミンＤ３とデキサメタゾン）は存在しない。対照は、（ヘスペリチンがＤＭＳＯに溶解している）ＤＭＳＯを０．１％含んでいた。細胞は、これらの培地において３５日間インキュベートされた。骨芽細胞分化のマーカーであるアルカリフォスファターゼの活性は、市販のキット（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．２４７）を用いて細胞溶解物で測定した。細胞は、インキュベートの０、４、８、１２日目に採取された。石灰化の証拠となる細胞のカルシウム濃度を、市販のキット（Ｓｉｇｍａ  Ｎｏ．５８７）を用いて、異なる培地で、インキュベートの２１日後に細胞溶解物で定量した。
【０１６６】
結果
ＡＬＰの活性
アルカリフォスファターゼの活性、すなわち骨芽細胞の分化は、用量に依存することにより、ヘスペリチンの存在の下で刺激される。１０および５０μＭの用量は、実験の４日目からこのプロセスを増加させ、インキュベートの８日目に頭打ちになる。５０μＭのヘスペレチンはもっとも効果的であるが、反対に１μＭの濃度は、未処理細胞と比較して、効果がなかった。
【０１６７】
細胞内のカルシウムの蓄積
培養の２１日目以降、ヘスペレチンの５０μＭの用量だけが、対照区の細胞（０．１％  ＤＭＳＯ）内のカルシウム量と比較して、カルシウムの蓄積を促進すると思われる。
【実施例３】
【０１６８】
六箇月齢の卵巣切除したラットにおける骨代謝に対するヘスペリジンの影響。
【０１６９】
Ａ．材料と方法
実験は６箇月齢のＷｉｓｔａｒラット４８匹について行った：２４匹は卵巣摘出（ＯＶＸ）、２４匹は偽手術（ＳＨ）
【０１７０】
動物を、１２ｈ−１２ｈの昼夜サイクルで温度が２１±１℃に制御された個他のケージに入れた。
【０１７１】
０日目に外科手術をした後、動物を７日間馴致した。この馴致期間の終了後、ラットを重量パラメータに基づいて均質な４つの区に分け、７２日間、２２ｇの下記のメニューを毎日与えた：
・ＳＨ区：対照メニューを与えられた１２匹の偽手術したラット
・ＯＶＸ区：対照メニューを与えられた１２匹の卵巣切除したラット
・ＳＨ  Ｈｐ区：ヘスペリジンメニューを与えられた１２匹の偽手術ラット
・ＯＶＸ  Ｈｐ区：ヘスペリジンメニューを与えられた１２匹の卵巣切除したラット。
【０１７２】
屠殺するときに（９０日）、ラットはクロラールを腹腔内に注射して麻酔した（Ｆｌｕｋａ；８％溶液；生体重１００ｇに対して０．４ｍｌ）。血液採取は腹部大動脈の部位で実施した。子宮を秤量した。
【０１７３】
大腿骨を採取し、隣接する軟組織を取り除き、骨密度測定のために８０％エタノール内に保存した。
【０１７４】
Ｂ．結果
【０１７５】
１．食餌の摂取
与えられた食餌量は、試験の前週の最も低い平均消費レベルを元に計算した（ＳＨロット）。
結果は図７に示されている。
図７の結果は、異なる区の動物の食餌レベルに有意差が認められなかったことを示している。
【０１７６】
２．体重変化
体重変化の結果は図８に示されている。
全ての区の動物の体重の特徴は、類似した変化を示しており、すなわち対象とするグループを問わず、実験の開始と終了の間に増加している。
【０１７７】
３．身体組成
身体組成の測定結果は図９に示されている。
異なるグループの動物の身体組成は、個体が受けた治療を問わず、有意の変化はなかった。
【０１７８】
４．子宮重量
結果は図１０に示されている。
子宮切除による子宮萎縮は、ヘスペリジンの摂取によって回避されなかった。
図１０に示した結果は、ヘスペリジンには子宮肥大効果がないことを示している。
【０１７９】
５．骨のミネラル濃度
骨のミネラル濃度の測定結果は図１１、１２、１３に示されている。全大腿骨のミネラル濃度の測定結果は、図１１に示されている。大腿骨近位骨幹端のミネラル濃度の測定結果は、図１２に示されている。大腿骨骨幹部のミネラル濃度の測定結果は図１３に示されている。
去勢は、大腿骨の低石灰化により、全骨のミネラル濃度（ｇ／ｃｍ2）の減少を示した。このプロセスは、ヘスペリジンの摂取によって（少なくとも部分的に）回避される。
同様の特徴が、骨梁の部位（図１２）、ならびに皮質骨内（図１３）において実証された。
【０１８０】
６．バイオメカニクス特性
動物の異なる区の個体の大腿骨のバイオメカニクス特性を分析した。結果は図１４に示された。
大腿骨のバイオメカニクス特性は、エストロゲンの欠如によって低下した。ヘスペリジンの摂取（ＯＶＸ  Ｈｐ）は、それらを維持すること、さらには無傷の動物においてそれらを向上させることを可能にした。
【０１８１】
結論として、実施例３の一連の結果は、老化が関与する骨損失の実験モデルにおいて、ヘスペリジンが骨保護の活性を有することを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】各動物区の身体組成（体重に対する脂肪質量の％）を示したグラフ。
【図２】各区のラットの大腿骨骨幹端の密度を示したグラフ。
【図３】各動物区の尿中のデオキシピリジノリン／クレアチニンのモル比の測定値を示したグラフ。
【図４】各動物区の血漿中のオステオカルシンの濃度を示したグラフ。
【図５】継代３１でのｈＰＯＢ−ｔｅｒｔ細胞の、ヘスペレチンによって刺激された骨芽細胞の分化の速度（アルカリフォスフォターゼの活性の増加）を示したグラフ。
【図６】２１日インキュベートした後の、（継代３１での）ｈＰＯＢ−ｔｅｒｔ細胞における石灰質の蓄積を示したグラフ。
【図７】各動物区の、摂取した食餌のグラム数を示したグラフ。
【図８】各区のラットの体重の変化を示したグラフ。
【図９】各動物区の脂肪質量の百分率を示したグラフ。
【図１０】各動物区の子宮の重量を示したグラフ。
【図１１】各動物区の大腿骨全体の密度（Ｔ−ＢＭＤ）を示したグラフ。
【図１２】各動物区の大腿骨遠位骨幹端のミネラル濃度（Ｍ−ＢＭＤｐ）を示したグラフ。
【図１３】各動物区の大腿骨骨幹のミネラル濃度（Ｄ−ＢＭＤ）を示したグラフ。
【図１４】各動物区の大腿骨の最大荷重を示したグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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