(57)【要約】蛍光標識試薬を添加した標的細胞を有する標本との相互作用をモニターすることによって化合物をスクリーニングするための装置が開示されている。１つの実施形態では、光源を備える光学照射ユニットであって前記光源からの光が前記標本を照射するように誘導される光学照射ユニットと、前記標本からの放射光を受容し且つ前記放射光から少なくとも３つの放射波長の光を分離するために連結されている蛍光識別ユニットと、該蛍光識別ユニットに連結されており、前記波長の放射光によって放射されたフォトンをカウントする蛍光検出ユニットと、を備える。薬物の候補をスクリーニングするための装置において使用するための二次元音響光学走査システムを備える別の実施形態も開示されている。該二次元音響光学走査システムでは、各変調器が他の変調器の一次光線の屈折域に入る間隔で配置されている２つの垂直音響光学変調器を利用している。蛍光標識試薬を添加された標的細胞を有する標本と化合物との相互作用をモニターすることによって化合物をスクリーニングする方法も記載されている。本方法は、光源を前記標本に連結させて標本を照射する工程と、前記標本によって放射された少なくとも３つの波長の光を分離する工程と、前記３つの波長の光から得られるフォトンのカウントを検出する工程とを、含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの光源を備え、少なくとも２つの前記光源からの光が標本を照射するように誘導される光学照射ユニットと、
前記標本からの放射光を受容し、前記放射光からの少なくとも３つの放射波長の光を分離するように連結された蛍光分離ユニットと、
前記少なくとも３つの波長の放射光によって放射されたフォトンを計数するために前記蛍光分離ユニットに連結された蛍光検出ユニットと、
を備える、蛍光標識試薬を添加した標的細胞を有する標本と化合物との相互作用をモニターすることによって前記化合物をスクリーニングするための装置。
【請求項２】
前記光学照射ユニットがレーザ光線光源を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記光学照射ユニットが、前記レーザ光線光源に連結された光処理ユニットをさらに備え、前記光処理回路が前記第一のレーザ光線光源からの光線の質を変化させる、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記光処理ユニットがフィルターを備える、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記光処理ユニットが光線拡幅器を備える、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記光学照射ユニットと連結された少なくとも２つの二色性ミラーをさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記第一の光源からの光を通過させ且つ前記第二の光源からの光を屈折させて、前記第一の光源と前記第二の光源からの光が融合するように、前記少なくとも２つの二色性ミラーのうち第一の二色性ミラーが連結されている、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記少なくとも２つの二色性ミラーのうち前記第二の二色性ミラーが、前記第一の二色性ミラーからの光を屈折させ、前記標本からの放射光を通過させる、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記蛍光分離ユニットが少なくとも２つの二色性ミラーを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記蛍光分離ユニットが前記標本から放射された前記光から得られる第一の波長の光を屈折させる第一二色性ミラーを備える、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記蛍光分離ユニットが前記標本から放射された前記光から得られる第二の波長の光を屈折させ、前記標本から放射された第三の波長の光を通過させる第二の二色性ミラーを備える、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記蛍光分離ユニットが少なくとも３つの二色性偏光解析装置と少なくとも３つのバンド制限干渉フィルターとを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記少なくとも３つの波長の放射光を受容するように連結された少なくとも３つの光検出器をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
偏光を発生する少なくとも２つの光源を備える光学照射ユニットと、
標本を同軸性に照射するように前記光学照射ユニットに連結された複数のフィルターと、
前記標本から放射される光から得られる少なくとも３つの放射波長の光を誘導し及び分離し、並びに前記少なくとも３つの放射波長の光の各波長の光を別個の二色性偏光解析装置に連結する、少なくとも２つのフィルターを備える蛍光分離ユニットと、
少なくとも３つの検出器を備え、前記検出器のそれぞれが光検出器を備える蛍光検出ユニットと、
を備える、蛍光標識試薬を添加した標的細胞を有する標本と化合物との相互作用をモニターすることによって前記化合物をスクリーニングするための装置。
【請求項１５】
前記光学照射ユニットがレーザ光線光源を備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記レーザ光線光源に連結された光処理ユニットをさらに備え、前記光処理回路が前記レーザ光線光源からの光線の質を変化させる、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記光処理ユニットがフィルターと光線拡幅器とを備える、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
別個の各二色性偏光解析装置が別個の中継レンズとフィルターに連結されている、請求項１４に記載の装置。
【請求項１９】
前記第一のレーザ光線光源と前記第二の光源からの光を前記標本に誘導するために、前記複数のフィルターが少なくとも２つの二色性ミラーを備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項２０】
前記標本から放射される光を受容するように連結された倒立顕微鏡をさらに備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項２１】
前記蛍光分離ユニットの前記少なくとも２つのフィルターが少なくとも２つの二色性ミラーを備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項２２】
前記蛍光検出ユニットに連結されたコンピュータをさらに備える、請求項１４に記載の装置。
【請求項２３】
前記コンピュータがカウンタを備える、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
第一の光源と、
第二の光源と、
前記第一の光源および前記第二の光源からの光を受容するように連結された第一の二色性ミラーと、
前記第一の二色性ミラーを通過した前記第一の光源からの光を受容するように連結され、および前記第一の二色性ミラーによって屈折された前記第二の光源からの光を受容するように連結され、ならびに前記第一の光源及び前記第二の光源からの前記光を前記標本まで屈折させるように連結され、および前記標本から放射された光を通過するように連結された第二の二色性ミラーと、
前記標本から放射される前記光からの第一の波長の光を屈折させる第三の二色性ミラーと、
前記標本から放射される前記光からの第二の波長の光を屈折させ、前記標本からの第三の波長の光を通過させる第四の二色性ミラーと、
少なくとも３つの二色性偏光解析装置及び少なくとも３つのバンド制限干渉フィルターと、
前記第一、第二、第三の波長の光に付随する出力を受容するように連結されている少なくとも３つの光検出器と、
を備える、蛍光標識試薬を添加した標的細胞を有する標本と化合物との相互作用をモニターすることによって前記化合物をスクリーニングするための装置。
【請求項２５】
前記光学照射ユニットがレーザ光線光源を備える、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
光処理ユニットをさらに備える、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
前記光処理ユニットがフィルターを備える、請求項２６に記載の装置。
【請求項２８】
前記光ユニットが光線拡幅器を備える、請求項２６に記載の装置。
【請求項２９】
前記標本から放射された光を受容するように連結された倒立顕微鏡をさらに備える、請求項２４に記載の装置。
【請求項３０】
前記少なくとも３つの光検出器の出力を受容するように連結されたコンピュータをさらに備える、請求項２４に記載の装置。
【請求項３１】
アルゴンイオンレーザと、
キセノン光源と、
前記アルゴンイオンレーザ及び前記キセノン光源からの光を受容するように連結された第一の二色性ミラーと、
前記第一の二色性ミラーを通過した前記アルゴンイオンレーザからの光を受容するように連結され、および前記第一の二色性ミラーによって屈折された前記キセノン光源からの光を受容するように連結された、ならびに前記アルゴンイオンレーザ及び前記キセノン光源からの前記光を前記標本まで屈折させるように連結され、および前記標本から放射された光を通過するように連結された第二の二色性ミラーと、
前記標本から放射される前記光からの第一の波長の光を屈折させる第三の二色性ミラーと、
前記標本から放射される前記光からの第二の波長の光を屈折させ、前記標本からの第三の波長の光を通過させる第四の二色性ミラーと、
それぞれの放射波長のための少なくとも３つの二色性偏光解析装置及び少なくとも３つのバンド制限干渉フィルターと、
前記第一、第二、第三の波長の光に付随する出力を受容するように連結された少なくとも３つの光検出器と、
前記少なくとも３つの光検出器の出力を受容するように連結されたコンピュータと、
を備える、標本中の標的細胞のプロファイルを発生する蛍光標識試薬を添加した標的細胞を有する標本と化合物との相互作用をモニターすることによって前記化合物をスクリーニングするための装置。
【請求項３２】
標本を照射するために前記標本に第一の光源を連結する工程と、
前記標本を照射するために前記標本に第二の光源を連結する工程と、
前記標本から放射される少なくとも３つの波長の光を分離し、前記３つの放射波長の光から得られるフォトンを検出する工程と、
を含む、蛍光標識試薬を添加した標的細胞を有する標本と化合物との相互作用をモニターすることによって前記化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３３】
前記第一の光源を連結する前記工程が、前記標本にレーザ光線光源を連結することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記レーザ光線光源からの前記光をフィルタリングする工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記レーザ光線光源からの前記光を拡大する工程をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第一の光源及び前記第二の光源からの光を前記標本上に集光させる工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一、第二、第三の波長の光をフィルタリングする工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記第一、第二、第三の波長の光からフォトンのカウントを発生させる工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的細胞の応答プロファイルを作成する工程をさらに含む請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記標本を照射するために前記標本にアルゴンイオンレーザを連結する工程と、
前記標本を同軸性に照射するために前記標本にキセノン光源を連結する工程と、
前記蛍光標識試薬添加標本から発光される少なくとも３つの波長の光を分離し、前記３つの放射波長の光からフォトンを検出する工程と、
前記第一、第二、第三の波長の光からフォトンカウントを発生させる工程と、
前記標的細胞の応答プロファイルを作成する工程と、
を含む、蛍光標識試薬を添加した標的細胞を有する標本と化合物との相互作用をモニターすることによって前記化合物をスクリーニングする方法。
【請求項４１】
目的の化学物質を少なくとも３つ含有する標本と化合物とを相互作用させる工程と、
前記標本から放射される光信号から前記少なくとも３つの化学物質の活性を同時に検出する工程と、
を備える、薬学的に活性な化合物を同定する方法。
【請求項４２】
前記３つの化学物質が陽イオン指示薬と、陰イオン指示薬と、膜電位指示薬とを備える、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記３つの化合物がシグナル伝達経路の活性化とそれらの相互作用を描出する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記陽イオンがＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋を備える、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記陰イオンがＣｌ−、ＨＣＯ３−を備える、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
１又は複数の光源と、
各変調器が他の変調器の一次光線の屈折域に入る間隔で配置されている２つの垂直音響光学変調器と、
光源に反応する収束レンズと、
光源に反応する光ファイバアレイと、
マルチウェルプレートから収集した光を分析するシステムと、
走査システムを操作するためのコンピュータシステムと、
を備える、マルチウェルプレートの二次元ハイスループット動態走査システム。
【請求項４７】
前記光源がレーザを備える、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４８】
コンピュータのデジタル／アナログボード及び高周波駆動エレクトロニクスからの周波数及び電圧発生器によって前記音響工学変調器が駆動される、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４９】
音響光学変調器によって放射された前記光が平凸レンズまで通過し、該レンズにおいて前記光線が平行とされる、請求項４６に記載のシステム。
【請求項５０】
前記光線が光ファイバアレイを通してレンズアレイまで通過し、該レンズアレイにおいてマルチウェルプレートのスポット上に前記光線が集光される、請求項４９に記載のシステム。
【請求項５１】
光線が集光する前記マルチウェルプレート上のスポットが前記プレート上の特定のウェル内に予めプログラムされている、請求項５０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記マルチウェルプレートのスポットから発光された光が収束レンズによって収集される、請求項５１に記載のシステム。
【請求項５３】
前記収束レンズアレイから放射された前記光が別の光ファイバによって収集される、請求項５２に記載のシステム。
【請求項５４】
前記放射された光が分析される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５５】
中継レンズと、干渉フィルターと、光電子増倍管と、パルス弁別器及び増幅器とを備える分析装置によって光が分析される、請求項５３に記載のシステム。
【請求項５６】
前記解析装置からの出力をコンピュータに送る、請求項５５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、診断システムに関し、具体的には薬物の候補をスクリーニングするための方法及び装置に関する。
【０００２】
（政府の補助）
本発明は、イリノイ州のテクノロジー・チャレンジ助成金から補助を受けて行われた。米国連邦政府およびイリノイ州は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
製薬産業や国家が持続的に健康を向上させるには、疾患の新しい治療法となる新規リード化合物を絶えず供給しなければならない。これには、副作用が最小限で且つ毒性が低い効果的な治療を与える特異的な生物活性を求めて、候補化合物のライブラリーをスクリーニングすることが必要である。イオンチャネルは、数多くの生理学的過程において中心的な役割を果たしており、例えば嚢胞性線維症や高血圧症等の幾つかの疾患に関与している。ヒトゲノムに関する知識が爆発的に蓄積されていくにつれ、イオンチャネルは、新薬を開発するための重要な標的群として重みを増しつつある。細胞を利用した既存のハイスループットスクリーニングアッセイは、イオンチャネルの機能と連結させることができる測定可能な生理的出力を与えるが、イオンチャネル応答に要求されるミリ秒単位の時間分解能とハイスループットという両立しがたい要求に応えることができない。
【０００４】
さらに重要なことに、一般に、このような既存のハイスループットスクリーニング装置では、「ヒット」と分類された新薬の候補について、機序に関する詳細な情報が得られない。これらの新薬の候補が「リード化合物」とするために、その後、ロースループットのハイコンテントスクリーニングを行う。続いて、リード化合物に追跡調査を行う価値があることを確認するために、特別なアッセイを開発して、シグナル伝達経路の機序を確定する。特に、かかるスクリーニングが行われる化合物の大部分が薬物にならないことを考えると、このような一連の操作は、極めて高価であり、多大な時間を消費するといえる。
【０００５】
このような多大な時間を要する高額な創薬過程の効率を改善するために開発された新技術が、極めて有益なものとなり得ることは明らかである。創薬の工程数を減少させるためのかかるアプローチの一つに、細胞アッセイスクリーニングがある。細胞アッセイ技術には蛍光検出を用いることが多いが、蛍光検出には、その他の研究方法と比較して大きな利点がある。この利点には、感度が高いこと、ダイナミックレンジが広いこと、試料から発せられた信号を遠隔検出できることが挙げられる。蛍光検出技術により、生細胞及び生物組織中に存在する対象物質の濃度の迅速な動的変化をモニターすることができる。蛍光を利用した測定は、薬物及び細胞受容体、イオンチャネル、又は細胞に特異的なその他の相互作用を介して活性化されるシグナル伝達経路を研究するために広く適用されている。
【０００６】
細胞を利用したアッセイ技術には、多重同時測定は使用しているものは存在しない。生物試料中に存在する目的の細胞内成分を検出するために利用できる蛍光検出装置は数多く存在する。これらの装置の多くは、落射型蛍光顕微鏡を使用しており、蛍光標識試薬を一度に一つしか測定できない。このようなシステムでは、試料を照射するために顕微鏡の対物レンズを通して伝達される幅の広い光源をフィルタリングすることによって、励起波長が選択される。試料から発せられた光を同一の顕微鏡の対物レンズによって集光し、電化結合素子（ＣＣＤ）カメラ又は光電子増倍管（ＰＭＴ）によってフィルタリングし、検出を行う。
【０００７】
単一蛍光標識試薬検出というアプローチには、一度に一つの事象しか検出できないという限界がある。例えば、Ｇタンパク質共役受容体が薬物によって活性化されるか否かの指標となるセカンドメッセンジャーとして細胞内のカルシウムイオン濃度を測定するために、Ｆｕｒａ−２蛍光標識試薬検出が広く利用されている。しかし、実際の生理学的状況はさらに複雑である。場合によっては、単一の受容体が異なるＧタンパク質を活性化することにより、二つ又は複数のシグナル伝達経路が誘導され、複数のセカンドメッセンジャーが産生されることがある。また、様々な信号を統合できる単一のＧタンパク質上に複数の受容体が集約する場合もある。異なるシグナル伝達経路が相互作用して、複雑な細胞事象を遂行したり、発生や生理学的過程において必要とされる細胞活性の微調整を可能にしたりすることもある。このように、単一のリガンドが複数のエフェクタータンパク質を誘発して、複雑な信号伝達ネットワークを開始させることがある。単一の蛍光標識試薬系では、イオン及びシグナル伝達経路中のかかる相互作用を検出することはできない。
【０００８】
アッセイの感度及び精度を上昇させる一つの方法として、複数の蛍光標識試薬を使用する方法が認められている。切断される分子の異なる部分に２個の蛍光標識試薬を付着させた分子の酵素的な切断の動態を測定するために、２個の蛍光標識試薬が相互相関法において使用されている。しかし、本発明とは異なり、この技術は単一の現象をアッセイするために使用されており、生細胞に特有な複雑な現象のアッセイには使用できない。
【０００９】
複数の細胞現象を同時検出すれば、各スクリーニングアッセイから得られる情報の量と質が大幅に向上する。このような多重アッセイが必要とされていることは、広く認識されている。従来のアプローチとしては、様々な濃度の薬物候補に応じて産生された細胞成分の濃度測定値を分析するアプローチがあるが、本発明とは異なり、速度論的な情報を得ることはできない。
【００１０】
複数の細胞の速度論的現象を同時に検出するために使用できる多重蛍光標識試薬検出系は、イオン及び信号伝達経路とそれらの相互作用、複数のシグナル伝達経路の活性化、並びに単一のリガンドによって開始された対応する下流カスケードを解明し、理解するために極めて重要である。かかる多重蛍光標識試薬系を利用することができれば、創薬の費用対効果を大幅に向上させ、創薬工程のスケジュールを短縮できる可能性がある。例えば、上皮細胞機能の制御を考えると、上皮細胞の機能は、細胞内のＣａ＋＋、Ｎａ＋、Ｋ＋及びＣｌ−を制御する複数の主要なイオンチャネル及び輸送体が順次活性化されることによって時間的に制御されており、次いで細胞の膜電位がモジュレートされる。細胞内のＮａ＋（［Ｎａ＋］ｉ）、Ｃａ＋＋（［Ｃａ＋＋］ｉ）、Ｃｌ−（［Ｃｌ−］ｉ）濃度及び細胞膜電位を個別に測定することにより、多数の基本的な生理学的及び病態生理学的な機序に、これらが中心的な役割を果たしていることが示唆される。［Ｃａ＋＋］ｉ、［Ｎａ＋］ｉ、［Ｃｌ−］ｉと細胞膜電位の特異性と感受性は、これらの機序の多くに関連している。このため、［Ｃａ＋＋］ｉ、［Ｎａ＋］ｉ、［Ｃｌ−］ｉ及び細胞膜電位を直接測定することは、薬物の候補を治療に使用できるか否かを評価するための適切な終局的指標となる。複数の蛍光標識試薬から発せられる、薬物によって誘発された動的（及び空間的な）蛍光の応答を同時に性質決定することにより、被検化合物の作用部位及び作用機序を高い特異性で同定することができる。これらの各蛍光標識試薬は、薬物によって誘発された分子状態の変化、又は特定のイオンの濃度若しくは脂質膜電位に対して感受性を有する。これらの各パラメータは、特定の細胞機序（共役している場合もあるし、共役していない場合もある）に依存しているので、得られたデータ群を総合することにより、細胞を研究するために使用した薬物候補の性質について特有の情報を得ることができる。単一の蛍光標識試薬を測定したり、あるいは数個の蛍光標識試薬の応答を個別に逐次測定したりしても、このようなデータが確実に得られるとは限らない。
【００１１】
複数の蛍光標識試薬測定に加えて、ハイスループット薬物スクリーニング装置も、候補細胞の相互作用によって生じ得る妨害を可能な限り最小限に抑え、できるだけ短時間で何千もの候補化合物を素早くスクリーニングできるように設計する必要がある。多重蛍光標識試薬の速度論的現象を検出する系の場合、予め色素を添加した細胞を各ウェルに入れた後、薬物候補を追加するために通例９６又は３８４のウェルプレートを使用する既存の単一蛍光標識試薬系に比べて、設計上の制約はさらに深刻なものとなる。８６ｍｍＸ１２８ｍｍの大きさのプレート上に配置された複数のウェル内で５μｍの空間分解能を有するとともに、最大５０μ秒の時間分解能が得られるように、時間及び空間の両面で正確に制御しながらプレート上の各ウェルを走査することが可能で、しかも、蛍光シグナルを少なくとも数分間追跡することができる改良された走査システムが必要とされている。現在の走査システムは、点から点へ走査を移動させる機械装置を用いており、かかる厳密な必要条件を満たすことができず、また、慣用される光学系を用いた音響光学走査装置も使用できない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、多重蛍光標識試薬ハイスループット薬物スクリーニングシステムの要求を満たし得る改良された走査システムなど、薬物候補をスクリーニングするための改良された方法及び装置が必要とされている。
【００１３】
本明細書に組み込まれて、本明細書の一部を成している添付の図面は、本発明の実施形態を図示するものであって、本明細書の記載とともに、本発明の原理を説明する役割を果たしている。これらの図面は、本発明の範囲を記載されている実施形態に限定することを意図するものではない。添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更と修飾を加え得ることは自明であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要約）
本開示は、薬物の候補によって活性化された３以上の蛍光標識試薬から発せられる時間依存的な蛍光の同時測定を用いて、細胞を利用したマルチシグナル薬物スクリーニングを行う方法及び装置に関し、薬物の候補によって活性化された３以上の蛍光標識試薬から発せられる時間依存的蛍光の同時測定を提供する２以上の２次元音響光学変調器を含むハイスループット薬物スクリーニングプラットフォームに関する。
【００１５】
前記方法及び装置は、現行のシステムよりも感度と特異性を向上させることによって、従来技術を改善する。集光の向上とバックグラウンドノイズの減少により、信号対雑音比も大幅に向上する。二色性偏光解析装置を用いると、入射光による干渉が大幅に減少する。高帯域高周波のフォトンカウントを用いることによって、細胞現象の動態が初めてミリ秒単位で測定できるようになる。幾つかの蛍光信号を同時測定することにより、薬物候補に対する複雑な細胞応答を解明できる。このように、標的細胞と薬物の候補に対するその反応とを詳細に特徴付けることにより、ハイスループット薬物スクリーニングを行うことが可能になる。
【００１６】
前記装置は、試料に入射光を誘導する少なくとも２つの二色性ミラー又は等価なフィルターとともに、少なくとも２つの所定の波長の光を放射する光源を含有する光学励起システムと、好ましくは倒立蛍光顕微鏡又は光学スキャナを備えた試料固定／索引システムと、少なくとも３つの放射波長を誘導、分離して光検出器に誘導させるための少なくとも２つのロングパス二色性ミラー又は等価なフィルターを備えた蛍光分離システムと、複数の二色性偏光解析装置と各放射波長のための複数の干渉フィルターと複数のフォトン検出器とそれぞれ１ＭＨｚのバンド幅でリアルタイムに少なくとも３つの蛍光シグナルを処理して表示するマルチチャネルのトランジスタ−トランジスタロジック（ＴＴＬ）カウンタ及びインタフェース化されたコンピュータ制御システムとを備えた蛍光光検波システムと、からなる。蛍光標識試薬の標的は、主な陽イオン、主な陰イオン、及び細胞膜電位である。例えば、主な陽イオンはＮａ＋、 Ｋ＋、又はＣａ＋＋であり得、主な陰イオンはＣｌ−又はＨＣＯ３−であり得る。本発明の３つの検出器は、それぞれ、主な陽イオン、主な陰イオン、及び細胞膜電位を検出するように設計することができる。
【００１７】
本発明は、バックグラウンドノイズに対する信号の比が高く、細胞、組織、臓器及びタンパク質等の生物学的試料から発せられる３つの蛍光発光とそれらの動態を高感度に同時検出することができ、ミリ秒単位で生じる細胞現象を捕捉する高速のリアルタイム検出システムを備えているため、薬物の候補に対する細胞応答の性質を詳しく経時的に決定することを初めて可能にする、蛍光検出システムを提供する。
【００１８】
本明細書に開示されている細胞を用いた蛍光検出に関する発明を使用することによって、分子レベル又は酵素レベルでのスクリーニングを行う場合には不可能である態様で、非特異的な標的の活性化と特異的な生理学的活性及び毒性とをともに細胞レベルで測定することができる。本発明の方法及び装置の別の用法は、かかる分子スクリーニング又は酵素スクリーニングから得られた「ヒット」を確認するための細胞スクリーニングを行うことである。ミリ秒単位の時間間隔で、細胞の蛍光標識試薬を報告できる分子種の蛍光動態の変化を検出することができる。
【００１９】
本発明は、細胞中に添加され、薬物候補によって活性化される複数の蛍光標識試薬から発せられる時間依存性蛍光の同時測定を利用する、細胞を用いたマルチシグナル薬物スクリーニングシステム用の二次元走査システムにも関する。前記システムの感度と特異性は、現行のシステムより高く、現行のシステムよりも短時間でより多くの薬物候補を確実にスクリーニングできるため、現在の技術水準に勝っている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
ここで、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明し、その例を添付の図面に図示する。好ましい実施形態と併せて本発明を説明するが、本発明がこれらの実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、代替物、改変物及び均等物をその範囲に含むことを意図するものであり、これらは添付の特許請求の範囲に規定されている本発明の範囲に属し得る。
【００２１】
図１を見ると、図１には、薬物スクリーニングシステム１００のブロック図が示されている。特に、光源ブロック１０２は、第一の光線１０６を発する第一の光源１０４と、第二の光線１１０を発する第二の光源１０８と、を備える。前記光源ブロック１０２は、所定の励起波長を少なくとも２つ備えていることが好ましい。好ましい実施形態では、前記光源ブロック１０２は、キセノン光源を装備した低出力（＜５０ｍＷ）偏光アルゴンレーザーを含有する光源の集合からなる。顕微鏡１１２は、１つまたはそれ以上の蛍光標識試薬を添加した試料１１４を保持し、検定する。試料１１４をプレート１１５（図１０−１２に更に詳述されている）によって保持し、光線１０６及び１１０を受光する顕微鏡１１２と併せて使用する。試料によって発せられた光線１１６は蛍光分離装置１１８に連結される。蛍光分離装置１１８は複数の波長の光１２２、１２４及び１２６を発生する。本明細書では３つの波長の光が示されているが、任意の数の波長を発生させることができる。複数のフォトン検出器を有するフォトン検出器ブロック１２８と前記波長の光１２２、１２４及び１２６を連結する。前記フォトン検出器は、前記波長の光１２２、１２４及び１２６から発せられるフォトンの発光を検出して計数し、カウント１３０、１３２及び１３４をコンピュータ１３６に連結する。標的細胞の反応プロファイルが、フォトン発光のカウントに基づいて生成される。
【００２２】
図２には、薬物スクリーニングシステム１００が更に詳細なブロック図として示されている。特に、光源１０２は、レーザ光線２０２を発生する第一の光源１０４を備えている。レーザ光線２０２はフィルター２０４に連結されている。該フィルターは、例えば、試料がレーザ光線から受けるあらゆる損傷を軽減するために、レーザ光線の強度を低下させるＮＤフィルター（ｎｅｕｔｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ）とすることもできる。特に、レーザ光線の強度が明るすぎる場合には、試料の色素が退色する。フィルター２０４からの出力であるフィルター処理されたレーザ光線２０６は、光線拡幅器２０８と連結されている。光線拡幅器２０８は、レーザ光線を拡幅し、第一の光線１０６を生成する。
【００２３】
一つの実施形態では、前記第一の光源１０４は、励起源として使用される偏光アルゴンイオンレーザを備える。レーザ光線２０２は、フィルター２０４（例えば、ＮＤフィルターとすることができる）を通過し、光線拡幅器２０８（例えば、１０Ｘ光線拡幅器とすることができる）に到達する。図２の実施形態では、光線拡幅器２０８からの出力である光線は、二色性ミラー２１０と連結されている。特に、二色性ミラーは、第一の光線１０６を通過させるだけではなく、第二の光線１１０を屈折させる。二色性ミラー２１０は、例えば、第一の光線１０６の波長を通過させ、その他の波長を反射する４５°ロングパス二色性ミラーとすることができる。図６には、本発明に従って、フルオレセインをベースとする蛍光標識試薬、ジヒドロキノリンをベースとする蛍光標識試薬及びスチリルをベースとする蛍光標識試薬の同時測定に使用することができる二色性ミラーのスペクトル特性が示されている。二色性ミラー２１０及び２１４は顕微鏡１１２の一部として図示されているが、慣用の顕微鏡に取り付けられていない場合もあるし、取り付けられている場合もある。
【００２４】
第二の光線１１０は、キセノンランプから発せられた単色光線とすることができ、二色性ミラー２１０によって誘導、屈折させる励起光源として使用することもできる。あるいは、水銀アーク灯等の光源から発せられる単色光を使用してもよい。第二の二色性ミラー２１４を配置して集合光線２１２を屈折させ、試料１１４に当たる前に対物レンズ２１８に結ばれる入射光線２１６を与える。顕微鏡の対物レンズの下に戴置された４５°バンドパスの二色性ミラーによって９０°垂直に反射された融合光線を対物レンズ２１８によって試料の上に集光する。
【００２５】
二色性ミラー２１４も、試料１１４が発光した光を通過させる。通過した光線２２０は、倒立顕微鏡１１２内に含有されている８０％トムソン式反射プリズム２２２に与えられる。前記プリズムは、光線を屈折し、屈折された光線１１６を発生する。試料１１４から発光された蛍光波長が通過し、好ましくは、顕微鏡内部の８０％トムソン式反射プリズムによって顕微鏡のサイドポートの方向に反射される。倒立顕微鏡を使用すると、観察者は反射光線２２０も観察することができるので、入射光線２１６の焦点を試料に適切に集光させることができる。蛍光波長の数は、試料中の蛍光標識試薬の数による。図２の実施形態は、３つの蛍光波長を検出するように設計されているが、任意の数の波長を検出するように設計することができる。
【００２６】
通例、蛍光検出には、検出システムのバックグラウンドノイズの削減、励起源に関連する光学装置（二色性ミラー、干渉フィルター、集束レンズ等）、分析すべき試料を含有する基質、及び複数の蛍光標識試薬検出システム中の発光フィルターなどの問題がある。複数の光源波長と複数の発光波長が関与する場合には、バックグラウンドシグナルの削減がさらに重要となる。エピ蛍光モードで複数の蛍光標識試薬を検出するために重要な課題は、フォトンの喪失を最小限に抑え、複数波長の入射光源から高いバックグラウンドシグナルを生じさせずに、フォトンを効果的に分離、収集することである。
【００２７】
３つの波長からなる発光された蛍光光線は、最も短い波長を反射し、これより長い残りの２つの波長を有する蛍光シグナルは通過させることができるもう一つのロングパス二色性ミラーに誘導されることが好ましい。ロングパス二色性ミラーによって反射された蛍光波長は、好ましくは二色性偏光解析装置、前記波長に対する干渉フィルターを通過し、リレーレンズによってフォトンカウント型光電子増倍管（ＰＭＴ）上に焦点を合わせる。蛍光分離器１１８は、発光蛍光の各成分波長を各フォトン検出器に誘導し、同時に励起光源から生じる反射ノイズを削減することが好ましい。検出路中に二色性偏光解析装置を使用すると、入射波長からの干渉が大幅に減少し、信号対雑音比が大幅に増加する。特定の用途について好ましい二色性偏光解析装置を選択するためには、偏光された励起源を使用する際に、特定の発光波長に関して信号対雑音比又は信号対バックグラウンドレベルを測定する必要がある。信号対雑音比は、測定された所定量の蛍光材料から発せられる発光の大きさを、同一条件下で空のアドレス可能なウェルを測定することによって得られる雑音と比較することによって測定することができる。「アドレス可能なウェル」とは、顕微鏡の対物レンズの焦点距離内又は同じ目的を果たす他の検出器（例、光学スキャナ）の範囲内に薄い底を有し（〜０．１７ｍｍ＃１カバーグラス）、且つ最上部から自由にアクセスできるマルチウェルチャンバーの１つのウェル上に位置する空間的に区別された位置を意味する。
【００２８】
図２の実施形態を参照すると、反射光１１６は、反射光１１６を通過光線２２６と屈折光線２２８とに分割する第三の二色性ミラー２２４に連結されている。屈折光線２２８は、第一の波長のものであることが好ましい。屈折光線２２８は、二色性偏光解析装置２３０に連結されており、その後に中継レンズ２３２及びフィルター２３４が続いている。同じく、光の一部を通過させて別の波長の通過光線２４２及び屈折光線２４４を発生させる第四の二色性ミラー２４０に通過光２２６を当てる。前記屈折線２４４を、別の二色性偏光解析装置２４６、中継レンズ２４８及びフィルター２５０に当てる。最後に、第三の波長の通過光線２４２が、二色性偏光解析装置２５２、中継レンズ２５４及びフィルター２５６に連結されている。前記中継レンズは前記屈折光線をそれぞれのカウンタに集光させるのに対して、前記フィルター（好ましくはバンドパスフィルター）は前記屈折光線の所望の周波数を通過させる。従って、蛍光分離器１１８は３つの異なる波長を有する試料から光線を発生する。
【００２９】
前記３つの各光線は、二色性偏光解析装置、中継レンズ及びフィルターによりフィルター処理が行われた後に、ＰＭＴ及びパルス増幅器／パルス弁別器（ＰＡＤ）に与えられる。各ＰＭＴ及びＰＡＤの出力は、ＴＴＬカウンタ２７２と付属ソフトウェア２７４を備えるコンピュータ１３６に連結されている。ＰＭＴ２６０、２６４、及び２６８によって発生された電流パルスは、ＰＡＤ２６２、２６６、及び２７０によって、５Ｖトランジスタトランジスタロジック（ＴＴＬ）パルスに変換される。それぞれＰＡＤ２６２、２６６、及び２７２の各々から生じたＴＴＬパルス１３０、１３２、及び１３４は、ＴＴＬカウンタ２７２（例えば、コンピュータに接続された５チャンネルの５ＭＨｚ  ＴＴＬカウンタ）と連結されていることが好ましい。データをソフトウェア２７４で処理し、その結果を、リアルタイムでスクリーン上に表示することも可能である。
【００３０】
蛍光検出システム１１８及び１２８には、好ましくは、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）又はフォトダイオード等の少なくとも３つのフォトン感受性検出器が装備される。好ましい実施形態では、かかるＰＭＴは、少なくとも３つの放射波長を同時にフォトン検出し、定量するために、最大３Ｘ１０７ｃｐｓの最大計数速度（ランダムパルス）を有する。かかるＰＭＴは、一般に最大１０７ｃｐｓまで良好な直線性を示す。前記検出器はエピ蛍光モードで機能することが好ましく、この場合、照射はアドレス可能なウェルの底から行うことが好ましく、放射光シグナルもアドレス可能なウェルの底から収集することが好ましい。
【００３１】
好ましくは、それぞれが少なくとも１ＭＨｚのバンド帯を有する少なくとも３つの蛍光シグナルをリアルタイムに処理して表示するコンピュータ制御システムに接続されたマルチチャネルＴＴＬカウンタを使用すべきである。前記データプロセシング及び制御ユニットは、ＰＭＴから発生した電流パルスを５ＶのＴＴＬパルスに変換することが好ましく、このＴＴＬパルスは、コンピュータに接続されたマルチチャネルＴＴＬカウンタ１３０によってさらに計数される。複数の検出器から得られたフォトン数を断続的に測定する。放射された複数の各波長から得られた数は、リアルタイムでコンピュータ画面に同時に表示することが好ましい。
【００３２】
図３には、本発明によって薬物の候補をスクリーニングする方法がフローチャートで示されている。工程３０２では、蛍光標識試薬を添加した標的細胞の試料に第一の光源を当てる。工程３０４でも、同じく、蛍光標識試薬を添加した標的細胞の試料に第二の光源を当てる。試料によって発せられた少なくとも３つの波長の光を、工程３０６で分離する。少なくとも３つの波長の光から得られたフォトンのカウントを工程３０８で検出する。次いで、工程３１０において、標的細胞の応答プロファイルが得られる。
【００３３】
図４には、本発明によって薬物の候補をスクリーニングする方法がさらに詳細にフローチャートで示されている。特に、工程４０２では、第一の光源からレーザ光線が与えられている。工程４０４では、前記第一の光源からのレーザ光線が適切な光線を発生するように変化される。工程４０６では、第一の光源からの変化された光線を、蛍光標識試薬を添加した標的細胞の試料に誘導する。工程４０８では、第二の光源からの光を前記試料に誘導される。工程４１０では、第一の光源及び第二の光源から誘導された光線の焦点を前記試料に合わせる。試料によって発光された光の第一の波長の光を工程４１２で分離する。試料によって発光された光の第二の波長の光を工程４１４で分離する。最後に、試料によって発光された光の第三の波長の光を工程４１６で分離する。工程４１８では、前記３つの波長の光から得られるフォトンカウントを検出する。工程４２０では、フォトンカウントに基づいて、標的細胞の応答プロファイルが得られる。図３及び４の方法は、図２の薬物候補をスクリーニングするシステム又はその他の適切な装置によって実行可能できることを理解されたい。
【００３４】
図５では、本発明によって薬物の候補をスクリーニングする別の方法をフローチャートで説明する。工程５０２において、第一の光源からレーザ光線を与える。第一の光源から与えられるレーザ光線の強度の範囲は、工程５０４で減少される。前記強度範囲は、例えば、図２のフィルター２０４等のＮＤフィルターによって減じることが可能である。第一の光源から与えられるレーザ光の光線を工程５０６で拡幅する。該光線は、例えば、図２の光線拡幅器２０８等の光線拡幅器によって拡幅することが可能である。工程５０８では、蛍光標識試薬を添加した標的細胞の試料に向けて、前記第一の光源から発生した拡幅された光線を誘導する。工程５１０では、第二の光源から発生した光を前記試料に誘導する。工程５１２では、第一の光源から発生した前記拡幅された光線及び第二の光源から発生した前記拡幅された光線の焦点を、前記試料に合わせる。図２の対物レンズ２１８等のレンズを用いることにより、光線の焦点を試料に合わせる。工程５１４では、前記試料によって放射された光は、目視することが好ましい。図２の倒立顕微鏡１１２等の倒立顕微鏡で目視を行うことが可能である。目視により、薬物スクリーニングの操作者は、試料上に誘導した光線の焦点を適切に試料に合わせることができる。
【００３５】
工程５１６では、試料によって発光された光の第一波長を分離する。第一の波長の光は、例えば、図２の二色性ミラー２２４等の二色性ミラーによって分離することが可能である。同様に、工程５１８では、試料によって発光された第二の波長の光を分離する。該第二の波長の光は、図２の二色性ミラー２４０等の第二の二色性ミラーによって分離することができる。最後に、試料によって発光された第三の波長の光を工程５２０で分離する。第三の波長の光は、例えば、図２の二色性ミラー２２４及び２４０によって通過される光とすることができる。次に、工程５２２で、第一、第二、第三の波長のそれぞれから発せられた励起光のフィルタリング処理を行う。例えば、図２の二色性解析装置２３０、２４６及び２５２等の二色性の解析装置を使用して励起光のフィルタリング処理を行うことができる。工程５２４では、フィルタリングされた第一、第二、第三の波長の光の焦点を検出器に合わせる。例えば、図２の中継レンズ２３２、２４８及び２５４を使用して、光の波長に焦点を合わせることができる。次に、工程５２６では、３つの波長の各光を別々の干渉フィルターに通過させる。例えば、それぞれ３つの波長の光を通過させるように、図２のフィルター２３４、２５０及び２５６を選択することができる。最後に、３つの波長の各光から得られたフォトンカウントを工程５２８で検出し、工程５３０で標的細胞の応答プロファイルを発生する。
【００３６】
以下の実施例では、別段の記載がない限り、下記の実験プロトコルを使用する。これらの実施例は例示にすぎず、本明細書に添付したクレームに記載されている本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００３７】
レチノイン酸（ＢＥＧＭ、ｗ／ＲＡ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を含有する気管支／気管上皮細胞増殖培地を用い、３７°Ｃ、５％  ＣＯ２にて、Ｔ−２５ｃｍ２のフラスコ中で正常なヒト気管支／気管上皮細胞（ＮＨＢＥ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を培養した。Ｔ−２５フラスコ中のＮＨＢＥ細胞が６０％−８０％の集密度に達した時点で、３５００細胞数／ｃｍ２の播種密度を用いて、前記細胞を継代した。Ｔ−２５フラスコ中で前記細胞の一部を再度培養し、残りの細胞は、ＵＶ照射したＶｉｔｒｏｇｅｎ（ｐＨをバランスし、１：１  ＢＥＧＭ：Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした４ウェルのカバーグラスチャンバー（ＬａｂＴｅｋ ＩＩ）上に播種した。ＮＨＢＥ細胞は通常は、２４時間以内にコラーゲンをコートしたカバーグラスチャンバーに付着した。これらの細胞が６０％の集密度に達する前に、後述する全ての実験に使用した。全ての実験で使用した細胞は、レチノイン酸（ＢＥＧＭ、ｗ／ＲＡ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を有する気管支／気管上皮細胞増殖培地で培養された第二又は第三の継代細胞のうち何れかであった。
【００３８】
蛍光標識試薬を細胞に添加するために、以下の操作を採用した。全ての蛍光標識試薬の調製と細胞洗浄用の培地として、特に明記されていない限り、フェノールレッド無しのＢａｌａｎｃｅｄ Ｈａｎｋ‘ｓ（ＢＨ）液を培地として使用した。Ｆｌｕｏ−３（Ｃａ＋＋指示薬）、ｄｉ−ＭＥＱ（Ｃｌ−指示薬）及びＲＨ４２１（細胞膜電位指示薬）を室温で、順次、細胞に添加した。まず、８μＭ  Ｆｌｕｏ−３液とともに、細胞を６０分間インキュベートした後、５０μＭ  ｄｉ−ＭＥＱとともに５分間、次いで、最後に１０μＭ  ＲＨ４２１とともに５分間インキュベートした。各蛍光標識試薬を添加している間に、ＢＨ液を余分な色素を洗浄した。各実験を開始する前に、細胞は室温で最低１５分間、ＢＥＧＭ中で安定化させた。
【００３９】
実験は室温で行った。試験した薬剤は全て、Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｈａｎｋ’ｓ液中に調製した。カバーグラスチャンバーのウェルの一つを倒立顕微鏡のステージ上に置き、細胞から発せられるバイオレット、グリーン及びオレンジの放射光を用いて、蛍光標識試薬を添加した細胞の焦点を概ね同一の焦点面に目視により集光させた。１００Ｈｚの試料化周波数で、以下のフォトンカウント、すなわちＣａ＋＋蛍光の場合、２０−５０／チャンネル（ｃｐｃ）、Ｃｌ−蛍光の場合、７０−２００ｃｐｃ、細胞膜電位蛍光の場合２０−５０ｃｐｃを有する細胞を本研究のために選択した。ベースラインを２分間安定させた後、目的薬物の用量を増加させながら、２分の間隔を置いて、ウェルに局所添加した。細胞をその正常な細胞容積の調節範囲以下に収縮又は膨潤させるために、各実験の終わりに、毒性量の目的薬物を試料に添加した。これによって、各蛍光標識試薬の蛍光シグナルは最大値又は最小値のいずれかに達した。これらの蛍光シグナルのいずれか一つでも最大値又は最小値に達しなかった場合には、その実験は廃棄した。バックグラウンド蛍光は、同一ウェルの無細胞領域を用いて記録した。信号対パックグラウンド比が１０倍を下回っている場合には、その実験も廃棄した。
【実施例１】
【００４０】
グリベンクラミドに対する細胞内Ｃａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応
気道上皮細胞中に存在する塩素イオンチャネルのブロッカーであるグリベンクラミドは、［Ｃｌ−］ｉ（ＭＥＱの蛍光は［Ｃｌ−］ｉに逆比例する）を予想通りに増加させ、［Ｃｌ−］ｉの増加は、次いで細胞膜を過分極させた。この反応を図７に示す。特に、図７は、塩素イオンチャネルブロッカーであるグリベンクラミドの濃度を徐々に増加させた場合における、（２５μＭ〜５００μＭ）正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）のＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例を示す。８００秒を超えて１０ｍｓの間隔で獲得したフォトンカウントとして前記動態反応を測定した。グリベンクラミドの濃度が５００μＭ以下の正常ヒト気管支上皮細胞では、細胞内Ｃａ＋＋及び膜電位にはほとんど影響を及ぼさないが、細胞内Ｃｌ−は減少する点に注意が必要である。しかし、グリベンクラミドの濃度が５００μＭに達すると、細胞内Ｃａ＋＋は急増し、細胞内Ｃｌ−は同時に減少、膜電位は同時に増加する。これらの事象とその動態の相関関係は、本発明によらなければ観察できず、グリベンクラミドが細胞に影響を及ぼす機序を理解する上での唯一の手がかりとなる。
【実施例２】
【００４１】
ウリジン三リン酸に対する細胞内Ｃａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応
図８には、カルシウム依存性塩素イオンチャネル活性剤であるウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の濃度を徐々に増加させる場合における、（．０１ｍＭ〜１ｍＭ）ＮＨＢＥ細胞のＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例が示されている。ＵＴＰは、ｐ２Ｙ受容体と結合するリガンドである。８００秒を超えて１０ｍｓ間隔で獲得したフォトンカウントとして前記動態反応を測定した。
【００４２】
ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）はカルシウム依存性塩素イオンチャネル活性剤である。ＵＴＰの濃度上昇に対する反応を図８に示す。ＵＴＰ濃度が０．１ｍＭ及び１ｍＭの場合、細胞内Ｃａ＋＋は急増し、その後測定可能な速度で減少するが、基本的には、細胞内Ｃｌ−又は膜電位の何れにも変化がない点に気付くであろう。本発明の場合、細胞内Ｃａ＋＋の細胞外への流入の動態を測定することが可能であり、他の細胞現象との関係を調べることができる。
【実施例３】
【００４３】
カルシウム感受性Ｂｋである１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ１６１９）に対する細胞内のＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応
細胞膜の過分極は、細胞内のカリウムの減少等、様々な細胞の機序を介しても誘発され得る。図９には、カルシウム感受性Ｂｋカリウムチャネル活性剤である１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ１６１９）の濃度を徐々に増加させた場合における（０．０１ｍＭ〜１．０ｍＭ）、ＮＨＢＥ細胞のＣａ＋＋、Ｃｌ−、及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応が示されている。前記動態反応は、９００秒を超えて１０ｍｓ間隔で獲得したフォトンカウントとして測定した。経時的反応を誘発するメカニズムの観点から見たこれらの薬物の相対的効力、薬物作用の持続時間、及び細胞膜の過分極の大きさを初めて比較し、モニターできることに注意されたい。１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ１６１９）の濃度増加に対する反応を図９に示す。０．０１ｍＭでは、細胞内のＣａ＋＋及びＣｌ−には基本的に変化はないが、膜電位は若干増加する。０．１ｍＭでは、細胞内Ｃａ＋＋及びＣｌ−ともに、基本的には未変化のままであるが、膜電位には少し増加が見られる。１ｍＭでは、細胞内Ｃａ＋＋は急増、細胞内Ｃｌ−は同時急減し、膜電位では同時急増が見られる。これらの事象の相関関係は、潜在的な活性化の機序を理解する上で手がかりとなる。刺激薬に対するこのような少なくとも３つの同時反応の群は、次いで、特徴的なパラメータを測定するために使用することが可能であり、両者を併用することにより、刺激薬に対する試料中の標的細胞の協同的動態反応プロファイルが一意的に確定される。
【００４４】
ハイスループット薬物スクリーニングを実行するためには、スクリーニングシステムに、本発明の２次元走査システム等の２次元走査装置が含まれていることが好ましい。前記走査システムには、下記のことを実行する機能がなければならない。
【００４５】
１．複数のウェルがあり、各５０μｍ内の空間分解能を有する１６０ｍｍＸ８５ｍｍの標準タイタープレートの面を走査できること。
【００４６】
２．５０μ秒／ピクセルの動的分解能を有する１２Ｘ８ピクセルの面を走査できること。
【００４７】
３．少なくとも２０ＫＨｚのバンド幅のフォトンカウンティング検出装置をサポートできること。
【００４８】
４．プレート上の任意の点、又は事前に設定された若しくはランダムに構成されたプレート上の任意のウェル内の細胞も走査できること。
【００４９】
本発明は、音響光学変調器（ＡＯＭ）を基礎としている。図１０を参照すると、ＡＯＭは極めて高い無線周波数で共鳴し、前記変調器の圧電結晶培地内で音響波面を発生する。前記結晶上で接線方向に入射光線を遮断する際には、ブラッグの法則に基づいて音響光学の波面により光線を偏光する。偏光角度は音響光学波面の波長に左右されるので、電子的に共鳴器の周波数を変更することにより偏光角度を正確に制御することが可能である。標準的な周波数は、ＫＨｚからＭＨｚの範囲内で、立ち上がり時間は約１０ナノ秒、アクセス時間は約１５μ秒である。出力光線には、ゼロ次（ＤＣ）、一次、二次等の光線が含まれ、一次光線には入射光線エネルギーの約６０％が含まれている。
【００５０】
図１１は、上述の条件を満たす二次元走査システムの１つの実施形態のブロック図である。該システムの中心機能は、各一次ビームの偏光の範囲内に、互いに直角に（直角のＸ軸及びＹ軸）距離を保って設置されている２つの音響光学変調器（６０２）である。この変調器は、図１１を参照すると、持続波のアルゴンイオンレーザ（６０１）を含む光源がその二次元音響光学装置に当たる光線を発生し（６０２）、互いに直角に、互いの一次光線の偏光の範囲内に間隔をおいて配置された一対の音響光学変調器で構成される二次元音響光学装置に、この光線が衝突する。
【００５１】
電子機器回路が前記音響光学変調器を駆動し（６１４）、コンピュータシステム（６１１）内でデジタルアナログ（Ｄ／Ａ）ボードの走査周波数及び電圧（６１３）が電子機器回路を駆動する。前記音響光学変調器によって発生した８Ｘ１２の光学レーザ光は平凸レンズ（６０３）を通過し、これによって、前記レーザ光は平行に且つ８Ｘ１２光ファイバアレイ（６０４）の全面に伝わることになる。光ファイバの遠位端を９６レンズアレイ（６０５）と連結し、各レンズは９６ウェルプレート（６０６）の予め定められた点に光線を誘導する。Ｆｌｕｏ−３及びＲＨ４２１から発光された蛍光、９６ウェルプレートの各ウェルから発光された蛍光を２組の検出ファイバで別々に検出する。これらの検出ファイバは２つの８Ｘ１２光学ファイバアレイを形成しており、各々が検出された蛍光信号を形成する。各々が発光した蛍光は、光電子増倍管及びパルス弁別器（６１０）、干渉フィルター、並びに中継レンズを通過する。Ｆｌｕｏ−３放射を表す信号（６０７）及びＲＨ４１２を表す信号（６０９）を分析してリアルタイムで表示する場合には、ブロック（６０８）、次に（６１０）からの信号が、コンピュータシステム（６１１）内のＴＴＬタイマーボード及びリアルタイムディスプレイ（６１２）に移動する。図１１に示されている実施形態には、一つの光源と、３つの９６光ファイバアレイと、９６ウェルプレートと２つの蛍光信号とが示されているが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。特に、複数の光源を使用することができ、凹レンズ等の幾何光学装置を使用して各ウェルの指定の位置にレーザ光を誘導することが可能であり、更に多くのファイバを束ねることが可能であり、更に多くのウェルを走査することができ、３個以上の蛍光シグナルを同時に分析することが可能である。
【００５２】
図１２は、コンピュータシステム６１５内で行う測定の結果をリアルタイムで処理及び表示するコンピュータ論理のフローチャートである。コンピュータ内のＤ／Ａボードの電圧及び走査周波数は、音響光学変調用結晶のｘ軸及びｙ軸座標信号をＲＦドライバ６１８に伝え、次にＡＯＭスキャナ６０２のためにパラメータを設定する。次に、ＴＴＬカウンタタイマーボード６１６へ、９６ウェルプレートからフォトン検出器６１０及び６１２へ戻る蛍光信号を伝えるため、蛍光信号はリアルタイムで表示される。受信した信号の数を、予め設定しておいたカウント合計６１４と比較する。予め設定しておいた最大値に達した時点でカウンタを解除する（６１５）。
【００５３】
好ましい実施形態では、ＰＣＩバスを搭載したマルチチャネルカウンタタイマーコンピュータボードが、システムのために設定される。ＰＣＩバスを搭載した第二の多目的コンピュータボードを使用して、ＡＯＭスキャナのＸ座標及びＹ座標（ＡＯＭｘ及びＡＯＭｙ）をそれぞれ制御するために２つの電圧アナログ出力信号を与え、他のコンピュータボード上で行われる緩衝されたフォトン現象の計数操作のためにゲート信号を与える。リアルタイムシステム統合（ＲＴＳＩ）バスコネクタを用いて、前記２つの装置を接続する。
【００５４】
マルチウェルプレートの走査設定、すなわち利用者が選択したウェル数及びウェルあたりの走査数に応じて、ＡＯＭスキャナの操作電圧範囲は、前記プレートを空間的にカバーするのに必要とされる必要な工程の数に分割される。次に、コンピュータソフトウェアは、ＡＯＭｘ及びＡＯＭｙの電圧対について数値を計算して、コンピュータハードウェアにこれらの電圧を出力させた、次いで、光線の方向とマルチウェルプレート上におけるその走査が制御される。前記コンピュータソフトウェアには、マルチウェルプレートのウェルを走査するラスター走査又はランダム走査モードを動作させる機能がある。コンピュータボードは、ゲートパルスの立ち上がりを引き金として利用し、ＤＡ変換を用いて、ＡＯＭスキャナを制御する電圧対をアナログ出力とし発信する。各蛍光標識試薬から発光された蛍光が産生したフォトンカウントを別個に長期間モニターして、マルチチャネルカウンタタイマーコンピュータボードを用いて計数する。区間測定法を用いて、フォトン現象を計数する。フォトンカウント用装置は同時に、ＡＯＭスキャナのフォトン検出器から５Ｖのトランジスタトランジスタロジック（ＴＴＬ）電圧シグナルをサンプリングする。
【００５５】
フォトンカウントデータ収集ソフトウェアプログラムは、以下の機能からなる。Ｓｅｔ＿Ｇａｔｅ＿Ｄｅｖｉｃｅ機能はゲート装置をプログラムし、ＲＴＳＩバスにゲートパルスを発生させる。その走査周波数値は、所定の範囲（０Ｈｚ以上５ＫＨｚ未満）から選択することが可能である。Ｓｅｔ＿Ｔｈｅ＿Ｃｏｕｎｔｅｒｓ機能は、緩衝化された期間の測定用に、フォトンカウンティングボード上にカウンタを設定する。上記２つの機能は、カウンタ上でのセットアップオペレーションを完了し、まず主制御プログラム中に呼び出される。セットアップを完了させ、フォトンカウンティングボード上のカウンタのソースピンにフォトン現象シグナルを接続させた後に、電圧対の生成とフォトンカウンティングを同時に開始するためにＡｒｍ＿Ｃｏｕｎｔｅｒｓ機能を呼び出すことが可能である。電圧対の出力により決定される走査位置で、複数の各フォトン検出装置に発生するフォトン現象の数を収集して個別に計数するために、前記ソフトウェアは、連続する２つの期のゲートパルス信号を使用する。次にコンピュータプログラムは、スキャンシーケンスによって規定されたところに従って、ＡＯＭスキャナの次の位置に対応する次の電圧対出力を選択し、電圧生成とフォトンカウンティング操作を繰り返し、前記ソフトウェアがそのデータ収集セッションを終了するように命令されるまで、この処理を繰り返す。最後の機能であるＤｉｓａｒｍ−Ｃｏｕｎｔｅｒｓ（６１５）は、カウンティング操作を停止し、全ての電圧出力及びフォトンカウンティング操作をリセットする。リアルタイムベースでホストＰＣが収集したデータを各セッションの最後にデータベースに転送する。
【００５６】
図１３を参照すると、前記ソフトウェアには、利用者がアプリケーションを管理してデータ収集セッションの進行状況をモニターするグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）も実装されている。コンピュータスクリーンの左には、当該実験に関連するパラメータのリストがある。中央には、信号を検出するウェルのアレイが示されている。このアレイでは、検討中のウェルが強調表示される。ウェルの表示の下には、時間の関数として検討している当該ウェルから検出された３つの蛍光シグナルの振幅がプロットされている。
【００５７】
このソフトウェアモジュールにより、コンピュータハードウェア（ＰＣベース、カスタムハードウェア又はＡＳＩＣの何れか）を用いて、ＡＯＭハードウェアの制御とデータ収集をリアルタイムに行うことができる。前記ソフトウェアパッケージを用いると、ホストコンピュータ（ＰＣベース、カスタムハードウェア又はＡＳＩＣの何れか）は、測定地点に位置する最大８つのデータ収集端末から入力の収集と処理を同時に行うことができ、リアルタイムで出力を介して対処し、将来のオフライン処理のためにデータベースに情報を保管することが可能となる。前記ソフトウェアには、走査操作と測定処理を管理し、モニターするためにアナログ信号を発信することができる。前記ソフトウェアパッケージはコンピュータネットワーク構成要素を実装している。このコンピュータネットワーク構成要素によって、２人以上の同時利用ユーザーが同時にネットワーク上で遠く離れた所から閲覧、実行、操作することができる。前記ソフトウェアは、利用者が結果を閲覧してアプリケーションを実行できるＧＵＩを実装する。前記ソフトウェアは、高レベル言語であるＣ言語及びＣ＋＋言語で書かれているが、アセンブリレベルの言語を含むモジュールを実装することも可能である。データ収集とハードウェア通信用のミドルウェア／アプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩｓ）を前記ソフトウェアアプリケーション内から呼び出す。
【００５８】
このシステムでは、５ミリ秒未満で９６ピクセルの走査を完了する。各ピクセルの走査には、５０μ秒かかる。この内訳はアクセス時間１５μ秒とドゥエル時間３５μ秒である。必要な処理帯域は２０ＫＨｚよりも大きく、直接機能呼び出しを用いてボードレベルで実行される。現在の音響光学走査装置と同様に、高水準のアイコンプログラミングを用いて実行することはできない。このように現行の実質的に一次元の音響光学走査装置は、光源、光線拡幅器、単一の音響光学デフレクター及び適切なレンズ、ドライバ及びフィルターからなる励起源を用いているため、厳密に言えば、上記の必要条件を満たすことができない。すなわち、
１．８Ｘ１２の長方形の格子上に少なくとも９６のウェルがあり、５０μｍの各ウェルの中に空間分解能を有する１６０ｍｍＸ８５ｍｍの標準タイタープレートの面を走査できること。
２．５０μ秒／ピクセルの動的分解能を有する４００Ｘ４００ピクセルの面を走査する機能を有し、これによって複数の蛍光標識試薬から得られる信号の反応速度を同時に測定できること。
３．少なくとも２０ＫＨｚの帯域幅のフォトンカウンティング検出装置をサポートできること。
４．プレート上の任意の点、又は事前にプログラムされた若しくはランダムに構成されたプレート上の任意のウェル内の細胞も走査できること。
【００５９】
本発明の方法及び装置は、とりわけ、細胞のシグナル伝達経路の正確な描写やこれらの経路を活性化又はモジュレートする生物活性剤の同定に使用される。本技術は、薬物候補をスクリーニングする効率を改善させるために使用できる。前記方法と装置を使用すれば、薬物候補のハイスループットスクリーニングに豊富な情報量がもたらされる。現在の技術では、まず、最初のスクリーニングとして情報量の低い最初の工程を迅速に行った後に、第一の工程を突破した薬物の候補に対して高い情報量のスクリーニングを行う、という２つの別個の工程を使用している。１回の処理だけで、同時に少なくとも３つの細胞間情報をリアルタイムに追跡する機能によって、現在の技術で可能なものよりもさらに多くの複雑な細胞現象の相互作用を学べる可能性が開かれる。本発明の方法及び装置は、そのような理解を発展させるための新しいツールを提供する。また、ミリ秒のタイムスケールの分解能を用いて、体液中のイオン及び／又はその他の種の濃度をリアルタイムで同時に検出及び追跡するために、前記方法及び装置を適合させることができるであろう。最後に、この方法及び装置のために開発された管理及び分析ソフトウェアは、ミリ秒又は更に大きな時間尺度の分解能を有する少なくとも３つ以上の信号をリアルタイムで同時に追跡するその他の技術に適用できることを理解されたい。
【００６０】
従って、薬物をスクリーニングするための新しい新規な方法及び装置が記載されていることが、理解できるであろう。本明細書の教示に基づけば、数多くの代替物及び均等物が得られることは自明であり、それらは開示されている本発明に包含されることを当業者であれば理解できるであろう。結果として、本発明は前述の実施形態に限定されるものではなく、以下のクレームのみによって限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、本発明に従って薬物の候補のスクリーニングシステムを示すブロック図である。
【図２】図２は、本発明の代替実施例に従った薬物の候補スクリーニングシステムの更に詳細なブロック図である。
【図３】図３は、本発明に従った薬物の候補スクリーニング方法のフローチャートである。
【図４】図４は、本発明特有の代替実施例に従った薬物の候補スクリーニング方法の更に詳細なフローチャートである。
【図５】図５は、本発明の代替実施例に従った薬物の候補スクリーニング方法のフローチャートである。
【図６】図６は、本発明に従ってフルオレセイン系蛍光標識試薬、ジヒドキノリン系蛍光標識試薬及びスチリル系蛍光標識試薬を同時測定するための二色性ミラーのスペクトラル特性を示す。
【図７】図７は、本発明に従った、正常ヒト気管支上皮細胞において付加的に増加するグリベンクラミド濃度へのＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例である。
【図８】図８は、本発明に従った、ＮＨＢＥ細胞において付加的に増加するウリジン三燐酸（ＵＴＰ）濃度（．０１μＭ〜１ｍＭ）に対するＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例である。
【図９】図９は、本発明に従った、ＮＨＢＥ細胞において付加的に増加する１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−ｏｎｅ（ＮＳ１６１９）濃度（０．０１ｍＭ〜１．０ｍＭ）に対するＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例である。
【図１０】図１０は、正確に定義されたポイントへ一次元で入射するレーザ光線を移動させることができる音響光学変調器の図である。
【図１１】図１１は、本発明の２次元走査システムのブロック図である。
【図１２】図１２は、本発明に従った、測定値の分析及び表示する方法に関するコンピュータ論理を説明するフローチャートである。
【図１３】図１３は、２次元走査システムのグラフィカルユーザインタフェースである。
【図１】
2005530136.tif 000002
【図２】
2005530136.tif 000003
【図３】
2005530136.tif 000004
【図４】
2005530136.tif 000005
【図５】
2005530136.tif 000006
【図６】
2005530136.tif 000007
【図７】
2005530136.tif 000008
【図８】
2005530136.tif 000009
【図９】
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【図１０】
2005530136.tif 000011
【図１１】
2005530136.tif 000012
【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年2月14日(2005.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の光源を備え、所望の波長が誘導されて標本を照射するように前記光源からの光が分割される光学照射ユニットと、
前記標本からの放射光を受容し、前記放射光からの少なくとも３つの放射波長の光を分離するように連結された蛍光分離ユニットと、
前記少なくとも３つの波長の放射光によって放射されたフォトンを計数するように前記蛍光分離ユニットに連結された蛍光検出ユニットと、
を備える、蛍光標識試薬を添加した標的細胞を有する標本と化合物との相互作用をモニターすることによって前記化合物をスクリーニングするための装置。
【請求項２】
少なくとも３つの所定の蛍光標識試薬を含有する標本に化合物を接触させる工程と、
前記標本から放射された光学シグナルから前記少なくとも３つの蛍光標識試薬の活性を同時に検出する工程と、
を含む、薬学的に活性な化合物を同定する方法。
【請求項３】
前記３つの蛍光標識試薬がシグナル伝達経路の活性化及びそれらの相互作用を描出する陽イオン指示薬、陰イオン指示薬、及び膜電位指示薬を備える、請求項２の方法。
【請求項４】
２以上の光源と、
各変調器が他の変調器の一次光線の屈折域に入る間隔で配置されている２つの垂直音響光学変調器と、
前記光源に応答する収束レンズと、
前記光源に応答する光ファイバアレイと、
マルチウェルプレートから収集した光を分析するシステムと、
走査システムを操作するためのコンピュータシステムと、
を備える、マルチウェルプレートの二次元ハイスループット動態走査を行うためのシステム。
【請求項５】
音響光学変調器によって放射された前記光が平凸レンズまで通過し、該レンズにおいて前記光線が平行とされ、マルチウェルプレートのスポット上に集光される、請求項４のシステム。
【請求項６】
前記マルチウェルプレートのスポットから放射された前記光が収束レンズによって収集される、請求項５のシステム。
【請求項７】
前記収束レンズアレイから放射された前記光が、中継レンズと、干渉フィルターと、光電子増倍管と、パルス弁別器と、増幅器とを備える分析装置によって収集され、分析され、前記分析装置からの出力がコンピュータに送付される、請求項５のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、診断システムに関し、具体的には薬物の候補をスクリーニングするための方法及び装置に関する。
【０００２】
（政府の補助）
本発明は、イリノイ州のテクノロジー・チャレンジ助成金から補助を受けて行われた。米国連邦政府およびイリノイ州は、本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
製薬産業が継続的に発展するためには、通例、細胞を利用したハイスループットスクリーニングアッセイを用いて、薬物候補のライブラリーに対して特異的な生物活性のスクリーニングを行う必要がある。薬物の候補と標的細胞との相互作用の機序に関する詳細な情報を取得するには、薬物候補と細胞の相互作用から生じる複数のシグナルを、このような相互作用が生じる時間分解能で取得しなければならない。このような細胞アッセイのための方法としては、蛍光検出が選択されるのが通例である。しかし、蛍光を利用した既存のアッセイ技術には、必要とされる時間分解能でこのような複数のシグナルをモニターできるものがない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、細胞を利用したハイスループット薬物スクリーニングシステムというニーズに合致し得る、改良された薬物候補のスクリーニング法及び装置が必要とされている。
【０００５】
本明細書に組み込まれて、本明細書の一部を成している添付の図面は、本発明の実施形態を図示するものであって、本明細書の記載とともに、本発明の原理を説明する役割を果たしている。これらの図面は、本発明の範囲を記載されている実施形態に限定することを意図するものではない。添付の特許請求の範囲に記載されている本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更と修飾を加え得ることは自明であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要約）
本開示は、薬物の候補によって活性化された３以上の蛍光標識試薬から発せられる時間依存的蛍光の同時測定を用いて、細胞を利用したマルチシグナル薬物スクリーニングを行う方法及び装置に関し、前記時間依存的蛍光の同時測定を提供する２以上の２次元音響光学変調器を含むハイスループット薬物スクリーニングプラットフォームに関する。
【０００７】
前記方法及び装置は、現行のシステムよりも感度と特異性を向上させることによって、従来技術を改善する。集光の向上とバックグラウンドノイズの減少により、信号対雑音比も大幅に向上する。二色性偏光解析装置を用いると、入射光による干渉が大幅に減少する。高バンド幅高周波のフォトンカウントを用いることによって、細胞現象の動態が初めてミリ秒単位で測定できるようになる。複数の蛍光信号を同時測定することにより、薬物候補に対する複雑な細胞応答を解明できる。このように、標的細胞と薬物の候補に対するそれらの反応とを詳細に特徴付けることにより、ハイスループット薬物スクリーニングを行うことが可能になる。
【０００８】
前記装置は、試料に入射光を誘導する少なくとも２つの二色性ミラー又は等価なフィルターとともに、少なくとも２つの所定の波長の光を放射する光源を含有する光学励起システムと、好ましくは倒立蛍光顕微鏡又は光学スキャナを備えた試料固定／索引システムと、少なくとも３つの放射波長を誘導、分離して光検出器に誘導させるための少なくとも２つのロングパス二色性ミラー又は等価なフィルターを備えた蛍光分離システムと、複数の二色性偏光解析装置と各放射波長のための複数の干渉フィルターと複数のフォトン検出器とそれぞれ１ＭＨｚのバンド幅でリアルタイムに少なくとも３つの蛍光シグナルを処理して表示するマルチチャネルのトランジスタ−トランジスタロジック（ＴＴＬ）カウンタ及びインタフェース化されたコンピュータ制御システムとを備えた蛍光光検波システムと、からなる。本発明の蛍光標識試薬と３つの検出器は、主な陽イオン、主な陰イオン、及び細胞膜電位を標的とする。例えば、主な陽イオンはＮａ＋、 Ｋ＋、又はＣａ＋＋であり得、主な陰イオンはＣｌ−又はＨＣＯ３−であり得る。
【０００９】
本発明は、バックグラウンドノイズに対する信号の比が高く、細胞、組織、臓器及びタンパク質等の生物学的試料から発せられる３つの蛍光発光とそれらの動態を高感度に同時検出することができ、ミリ秒単位で生じる細胞現象を捕捉する高速のリアルタイム検出システムを備えているため、薬物の候補に対する細胞応答の性質を詳しく経時的に決定することを初めて可能にする、蛍光検出システムを提供する。
【００１０】
本明細書に開示されている細胞を用いた蛍光検出に関する発明を使用することによって、分子レベル又は酵素レベルでのスクリーニングを行う場合には不可能である態様で、非特異的な標的の活性化と特異的な生理学的活性及び毒性とをともに細胞レベルで測定することができる。本発明の方法及び装置の別の用法は、かかる分子スクリーニング又は酵素スクリーニングから得られた「ヒット」を確認するための細胞スクリーニングを行うことである。ミリ秒単位の時間間隔で、細胞の蛍光標識試薬を報告できる分子種の蛍光動態の変化を検出することができる。
【００１１】
本発明は、細胞中に添加され、薬物候補によって活性化される複数の蛍光標識試薬から発せられる時間依存性蛍光の同時測定を利用する、細胞を用いたマルチシグナル薬物スクリーニングシステム用の二次元走査システムにも関する。前記システムの感度と特異性は、現行のシステムより高く、現行のシステムよりも短時間でより多くの薬物候補を確実にスクリーニングできるため、現在の技術水準に勝っている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ここで、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明し、その例を添付の図面に図示する。好ましい実施形態と併せて本発明を説明するが、本発明がこれらの実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。本発明は、代替物、改変物及び均等物をその範囲に含むことを意図するものであり、これらは添付の特許請求の範囲に規定されている本発明の範囲に属し得る。
【００１３】
図１を見ると、図１には、薬物スクリーニングシステム１００のブロック図が示されている。特に、光源ブロック１０２は、第一の光線１０６を発する第一の光源１０４と、第二の光線１１０を発する第二の光源１０８と、を備える。前記光源ブロック１０２は、所定の励起波長の偏光を少なくとも２つ備えていることが好ましい。好ましい実施形態では、前記光源ブロック１０２は、キセノン光源を装備した低出力（＜５０ｍＷ）偏光アルゴンレーザーを含有する光源の集合からなる。顕微鏡１１２は、１つまたはそれ以上の蛍光標識試薬を添加した試料１１４を保持し、検定する。試料１１４をプレート１１５（図１０−１２に更に詳述されている）によって保持し、光線１０６及び１１０を受光する顕微鏡１１２と併せて使用する。試料によって発せられた光線１１６は蛍光分離装置１１８に連結される。蛍光分離装置１１８は複数の波長の光１２２、１２４及び１２６を発生する。本明細書では３つの波長の光が示されているが、任意の数の波長を発生させることができる。複数のフォトン検出器を有するフォトン検出器ブロック１２８と前記波長の光１２２、１２４及び１２６を連結する。前記フォトン検出器は、前記波長の光１２２、１２４及び１２６から発せられるフォトンの発光を検出して計数し、カウント１３０、１３２及び１３４をコンピュータ１３６に連結する。標的細胞の反応プロファイルが、フォトン発光のカウントに基づいて生成される。
【００１４】
図２には、薬物スクリーニングシステム１００が更に詳細なブロック図として示されている。特に、光源１０２は、レーザ光線２０２を発生する第一の光源１０４を備えている。レーザ光線２０２はフィルター２０４に連結されている。該フィルターは、例えば、試料がレーザ光線から受けるあらゆる損傷を軽減するために、レーザ光線の強度を低下させ得るＮＤフィルター（ｎｅｕｔｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒ）とすることもできる。特に、レーザ光線の強度が明るすぎる場合には、試料の色素が退色する。フィルター２０４からの出力であるフィルター処理されたレーザ光線２０６は、光線拡幅器２０８と連結されている。光線拡幅器２０８は、レーザ光線を拡幅し、第一の光線１０６を生成する。
【００１５】
一つの実施形態では、前記第一の光源１０４は、励起源として使用される偏光アルゴンイオンレーザを備える。レーザ光線２０２は、フィルター２０４（例えば、ＮＤフィルターとすることができる）を通過し、光線拡幅器２０８（例えば、１０Ｘ光線拡幅器とすることができる）に到達する。図２の実施形態では、光線拡幅器２０８からの出力である光線は、二色性ミラー２１０と連結されている。特に、二色性ミラーは、第一の光線１０６を通過させるだけではなく、第二の光線１１０を屈折させる。二色性ミラー２１０は、例えば、第一の光線１０６の波長を通過させ、その他の波長を反射する４５°ロングパス二色性ミラーとすることができる。図６には、本発明に従って、フルオレセインをベースとする蛍光標識試薬、ジヒドロキノリンをベースとする蛍光標識試薬及びスチリルをベースとする蛍光標識試薬の同時測定に使用することができる二色性ミラーのスペクトル特性が示されている。二色性ミラー２１０及び２１４は顕微鏡１１２の一部として図示されているが、慣用の顕微鏡に取り付けられていない場合もあるし、取り付けられている場合もある。
【００１６】
第二の光線１１０は、キセノンランプから発せられた単色光線とすることができ、二色性ミラー２１０によって誘導、屈折させる励起光源として使用することもできる。あるいは、水銀アーク灯等の光源から発せられる単色光を使用してもよい。第二の二色性ミラー２１４を配置して集合光線２１２を屈折させ、試料１１４に当たる前に対物レンズ２１８に結ばれる入射光線２１６を与える。顕微鏡の対物レンズの下に戴置された４５°バンドパスの二色性ミラーによって９０°垂直に反射された融合光線を対物レンズ２１８によって試料の上に集光する。
【００１７】
二色性ミラー２１４も、試料１１４が発光した光を通過させる。通過した光線２２０は、倒立顕微鏡１１２内に含有されている８０％トムソン式反射プリズム２２２に与えられる。前記プリズムは、光線を屈折し、屈折された光線１１６を発生する。試料１１４から発光された蛍光波長が通過し、好ましくは、顕微鏡内部の８０％トムソン式反射プリズムによって顕微鏡のサイドポートの方向に反射される。倒立顕微鏡を使用すると、観察者は反射光線２２０も観察することができるので、入射光線２１６の焦点を試料に適切に集光させることができる。蛍光波長の数は、試料中の蛍光標識試薬の数による。図２の実施形態は、３つの蛍光波長を検出するように設計されているが、任意の数の波長を検出するように設計することができる。
【００１８】
通例、蛍光検出には、検出システムのバックグラウンドノイズの削減、励起源に関連する光学装置（二色性ミラー、干渉フィルター、集束レンズ等）、分析すべき試料を含有する基質、及び複数の蛍光標識試薬検出システム中の発光フィルターなどの問題がある。複数の光源波長と複数の発光波長が関与する場合には、バックグラウンドシグナルの削減がさらに重要となる。エピ蛍光モードで複数の蛍光標識試薬を検出するために重要な課題は、フォトンの喪失を最小限に抑え、複数波長の入射光源から高いバックグラウンドシグナルを生じさせずに、複数の発光波長からのフォトンを効果的に分離、収集することである。
【００１９】
３つの波長からなる発光された蛍光光線は、最も短い波長を反射し、これより長い残りの２つの波長を有する蛍光シグナルは通過させることができるもう一つのロングパス二色性ミラーに誘導されることが好ましい。ロングパス二色性ミラーによって反射された蛍光波長は、好ましくは二色性偏光解析装置、前記波長に対する干渉フィルターを通過し、リレーレンズによってフォトンカウント型光電子増倍管（ＰＭＴ）上に焦点を合わせる。蛍光分離器１１８は、発光蛍光の各成分波長を各フォトン検出器に誘導し、同時に励起光源から生じる反射ノイズを削減することが好ましい。検出路中に二色性偏光解析装置を使用すると、入射波長からの干渉が大幅に減少し、信号対雑音比が大幅に増加する。特定の用途について好ましい二色性偏光解析装置を選択するためには、偏光された励起源を使用する際に、特定の発光波長に関して信号対雑音比又は信号対バックグラウンドレベルを測定する必要がある。信号対雑音比は、測定された所定量の蛍光材料から発せられる発光の大きさを、同一条件下で空のアドレス可能なウェルを測定することによって得られる雑音と比較することによって測定することができる。「アドレス可能なウェル」とは、顕微鏡の対物レンズの焦点距離内又は同じ目的を果たす他の検出器（例、光学スキャナ）の範囲内に薄い底を有し（〜０．１７ｍｍ＃１カバーグラス）、且つ最上部から自由にアクセスできるマルチウェルチャンバーの１つのウェル上に位置する空間的に区別された位置を意味する。
【００２０】
図２の実施形態を参照すると、反射光１１６は、反射光１１６を通過光線２２６と屈折光線２２８とに分割する第三の二色性ミラー２２４に連結されている。屈折光線２２８は、第一の波長のものであることが好ましい。屈折光線２２８は、二色性偏光解析装置２３０に連結されており、その後に中継レンズ２３２及びフィルター２３４が続いている。同じく、光の一部を通過させて別の波長の通過光線２４２及び屈折光線２４４を発生させる第四の二色性ミラー２４０に通過光２２６を当てる。前記屈折線２４４を、別の二色性偏光解析装置２４６、中継レンズ２４８及びフィルター２５０に当てる。最後に、第三の波長の通過光線２４２が、二色性偏光解析装置２５２、中継レンズ２５４及びフィルター２５６に連結されている。前記中継レンズは前記屈折光線をそれぞれのカウンタに集光させるのに対して、前記フィルター（好ましくはバンドパスフィルター）は前記屈折光線の所望の周波数を通過させる。従って、蛍光分離器１１８は３つの異なる波長を有する試料から光線を発生する。
【００２１】
前記３つの各光線は、二色性偏光解析装置、中継レンズ及びフィルターによりフィルター処理が行われた後に、ＰＭＴ及びパルス増幅器／パルス弁別器（ＰＡＤ）に与えられる。各ＰＭＴ及びＰＡＤの出力は、ＴＴＬカウンタ２７２と付属ソフトウェア２７４を備えるコンピュータ１３６に連結されている。ＰＭＴ２６０、２６４、及び２６８によって発生された電流パルスは、ＰＡＤ２６２、２６６、及び２７０によって、５Ｖトランジスタトランジスタロジック（ＴＴＬ）パルスに変換される。それぞれＰＡＤ２６２、２６６、及び２７０の各々から生じたＴＴＬパルス１３０、１３２、及び１３４は、ＴＴＬカウンタ２７２（例えば、コンピュータに接続された５チャンネルの５ＭＨｚ  ＴＴＬカウンタ）と連結されていることが好ましい。データをソフトウェア２７４で処理し、その結果を、リアルタイムでスクリーン上に表示することも可能である。
【００２２】
蛍光検出システム１１８及び１２８には、好ましくは、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）又はフォトダイオード等の少なくとも３つのフォトン感受性検出器が装備される。好ましい実施形態では、かかるＰＭＴは、少なくとも３つの放射波長を同時にフォトン検出し、定量するために、最大３Ｘ１０７ｃｐｓの最大計数速度（ランダムパルス）を有する。かかるＰＭＴは、一般に最大１０７ｃｐｓまで良好な直線性を示す。前記検出器はエピ蛍光モードで機能することが好ましく、この場合、照射はアドレス可能なウェルの底から行うことが好ましく、放射光シグナルもアドレス可能なウェルの底から収集することが好ましい。
【００２３】
好ましくは、それぞれが少なくとも１ＭＨｚのバンド幅を有する少なくとも３つの蛍光シグナルをリアルタイムに処理して表示するコンピュータ制御システムに接続されたマルチチャネルＴＴＬカウンタを使用すべきである。前記データプロセシング及び制御ユニットは、ＰＭＴから発生した電流パルスを５ＶのＴＴＬパルスに変換することが好ましく、このＴＴＬパルスは、コンピュータに接続されたマルチチャネルＴＴＬカウンタ１３０によってさらに計数される。複数の検出器から得られたフォトン数を断続的に測定する。放射された複数の各波長から得られた数は、リアルタイムでコンピュータ画面に同時に表示することが好ましい。
【００２４】
図３には、本発明によって薬物の候補をスクリーニングする方法がフローチャートで示されている。工程３０２では、蛍光標識試薬を添加した標的細胞の試料に第一の光源を当てる。工程３０４でも、同じく、蛍光標識試薬を添加した標的細胞の試料に第二の光源を当てる。試料によって発せられた少なくとも３つの波長の光を、工程３０６で分離する。少なくとも３つの波長の光から得られたフォトンのカウントを工程３０８で検出する。次いで、工程３１０において、標的細胞の応答プロファイルが得られる。
【００２５】
図４には、本発明によって薬物の候補をスクリーニングする方法がさらに詳細にフローチャートで示されている。特に、工程４０２では、第一の光源からレーザ光線が与えられている。工程４０４では、前記第一の光源からのレーザ光線を変化させて適切な光線を発生させる。工程４０６では、第一の光源からの変化された光線を、蛍光標識試薬を添加した標的細胞の試料に誘導する。工程４０８では、第二の光源からの光が前記試料に誘導される。工程４１０では、第一の光源及び第二の光源から誘導された光線の焦点を前記試料に合わせる。試料によって発光された光の第一の波長の光を工程４１２で分離する。試料によって発光された光の第二の波長の光を工程４１４で分離する。最後に、試料によって発光された光の第三の波長の光を工程４１６で分離する。工程４１８では、前記３つの波長の光から得られるフォトンカウントを検出する。工程４２０では、フォトンカウントに基づいて、標的細胞の応答プロファイルが作成される。図３及び４の方法は、図２の薬物候補をスクリーニングするシステム又はその他の適切な装置によって実行可能できることを理解されたい。
【００２６】
図５では、本発明によって薬物の候補をスクリーニングする別の方法をフローチャートで説明する。工程５０２において、第一の光源からレーザ光線を与える。第一の光源から与えられるレーザ光線の強度の範囲は、工程５０４で減少される。前記強度範囲は、例えば、図２のフィルター２０４等のＮＤフィルターによって減じることが可能である。第一の光源から与えられるレーザ光の光線を工程５０６で拡幅する。該光線は、例えば、図２の光線拡幅器２０８等の光線拡幅器によって拡幅することが可能である。工程５０８では、蛍光標識試薬を添加した標的細胞の試料に向けて、前記第一の光源から発生した拡幅された光線を誘導する。工程５１０では、第二の光源から発生した光を前記試料に誘導する。工程５１２では、第一の光源から発生した前記拡幅された光線及び第二の光源から発生した前記拡幅された光線の焦点を、前記試料に合わせる。図２の対物レンズ２１８等のレンズを用いることにより、光線の焦点を試料に合わせる。工程５１４では、前記試料によって放射された光は、目視することが好ましい。図２の倒立顕微鏡１１２等の倒立顕微鏡で目視を行うことが可能である。目視により、薬物スクリーニングの操作者は、試料上に誘導した光線の焦点を適切に試料に合わせることができる。
【００２７】
工程５１６では、試料によって発光された光の第一波長を分離する。第一の波長の光は、例えば、図２の二色性ミラー２２４等の二色性ミラーによって分離することが可能である。同様に、工程５１８では、試料によって発光された第二の波長の光を分離する。該第二の波長の光は、図２の二色性ミラー２４０等の第二の二色性ミラーによって分離することができる。最後に、試料によって発光された第三の波長の光を工程５２０で分離する。第三の波長の光は、例えば、図２の二色性ミラー２２４及び２４０によって通過される光とすることができる。次に、工程５２２で、第一、第二、第三の波長のそれぞれから発せられた励起光のフィルタリング処理を行う。例えば、図２の二色性解析装置２３０、２４６及び２５２等の二色性の解析装置を使用して励起光のフィルタリング処理を行うことができる。工程５２４では、フィルタリングされた第一、第二、第三の波長の光の焦点を検出器に合わせる。例えば、図２の中継レンズ２３２、２４８及び２５４を使用して、光の波長に焦点を合わせることができる。次に、工程５２６では、３つの波長の各光を別々の干渉フィルターに通過させる。例えば、それぞれ３つの波長の光を通過させるように、図２のフィルター２３４、２５０及び２５６を選択することができる。最後に、３つの波長の各光から得られたフォトンカウントを工程５２８で検出し、工程５３０で標的細胞の応答プロファイルを作成する
以下の実施例では、別段の記載がない限り、下記の実験プロトコルを使用する。これらの実施例は例示にすぎず、本明細書に添付したクレームに記載されている本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００２８】
レチノイン酸（ＢＥＧＭ、ｗ／ＲＡ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を含有する気管支／気管上皮細胞増殖培地を用い、３７°Ｃ、５％  ＣＯ２にて、Ｔ−２５ｃｍ２のフラスコ中で正常なヒト気管支／気管上皮細胞（ＮＨＢＥ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を培養した。Ｔ−２５フラスコ中のＮＨＢＥ細胞が６０％−８０％の集密度に達した時点で、３５００細胞数／ｃｍ２の播種密度を用いて、前記細胞を継代した。Ｔ−２５フラスコ中で前記細胞の一部を再度培養し、残りの細胞は、ＵＶ照射したＶｉｔｒｏｇｅｎ（ｐＨをバランスし、１：１  ＢＥＧＭ：Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした４ウェルのカバーグラスチャンバー（ＬａｂＴｅｋ ＩＩ）上に播種した。ＮＨＢＥ細胞は通常は、２４時間以内にコラーゲンをコートしたカバーグラスチャンバーに付着した。これらの細胞が６０％の集密度に達する前に、後述する全ての実験に使用した。全ての実験で使用した細胞は、レチノイン酸（ＢＥＧＭ、ｗ／ＲＡ、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を有する気管支／気管上皮細胞増殖培地で培養された第二又は第三の継代細胞のうち何れかであった。
【００２９】
蛍光標識試薬を細胞に添加するために、以下の操作を採用した。全ての蛍光標識試薬の調製と細胞洗浄用の培地として、特に明記されていない限り、フェノールレッド無しのＢａｌａｎｃｅｄ Ｈａｎｋ‘ｓ（ＢＨ）液を培地として使用した。Ｆｌｕｏ−３（Ｃａ＋＋指示薬）、ｄｉ−ＭＥＱ（Ｃｌ−指示薬）及びＲＨ４２１（細胞膜電位指示薬）を室温で、順次、細胞に添加した。まず、８μＭ  Ｆｌｕｏ−３液とともに、細胞を６０分間インキュベートした後、５０μＭ  ｄｉ−ＭＥＱとともに５分間、次いで、最後に１０μＭ  ＲＨ４２１とともに５分間インキュベートした。各蛍光標識試薬を添加している間に、ＢＨ液で余分な色素を洗浄した。各実験を開始する前に、細胞は室温で最低１５分間、ＢＥＧＭ中で安定化させた。
【００３０】
実験は室温で行った。試験した薬剤は全て、Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｈａｎｋ’ｓ液中に調製した。カバーグラスチャンバーのウェルの一つを倒立顕微鏡のステージ上に置き、細胞から発せられるバイオレット、グリーン及びオレンジの放射光を用いて、蛍光標識試薬を添加した細胞の焦点を概ね同一の焦点面に目視により集光させた。１００Ｈｚの試料化周波数で、以下のフォトンカウント、すなわちＣａ＋＋蛍光の場合、２０−５０／チャンネル（ｃｐｃ）、Ｃｌ−蛍光の場合、７０−２００ｃｐｃ、細胞膜電位蛍光の場合２０−５０ｃｐｃを有する細胞を本研究のために選択した。ベースラインを２分間安定させた後、目的薬物の用量を増加させながら、２分の間隔を置いて、ウェルに局所添加した。細胞をその正常な細胞容積の調節範囲以下に収縮又は膨潤させるために、各実験の終わりに、毒性量の目的薬物を試料に添加した。これによって、各蛍光標識試薬の蛍光シグナルは最大値又は最小値のいずれかに達した。これらの蛍光シグナルのいずれか一つでも最大値又は最小値に達しなかった場合には、その実験は廃棄した。バックグラウンド蛍光は、同一ウェルの無細胞領域を用いて記録した。信号対パックグラウンド比が１０倍を下回っている場合には、その実験も廃棄した。
【実施例１】
【００３１】
グリベンクラミドに対する細胞内Ｃａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応
気道上皮細胞中に存在する塩素イオンチャネルのブロッカーであるグリベンクラミドは、［Ｃｌ−］ｉ（ＭＥＱの蛍光は［Ｃｌ−］ｉに逆比例する）を予想通りに増加させ、［Ｃｌ−］ｉの増加は、次いで細胞膜を過分極させた。この反応を図７に示す。特に、図７は、塩素イオンチャネルブロッカーであるグリベンクラミドの濃度を徐々に増加させた場合における、（２５μＭ〜５００μＭ）正常ヒト気管支上皮細胞（ＮＨＢＥ）のＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例を示す。８００秒超にわたって１０ｍｓの間隔で獲得したフォトンカウントとして前記動態反応を測定した。グリベンクラミドの濃度が５００μＭ以下の正常ヒト気管支上皮細胞では、細胞内Ｃａ＋＋及び膜電位にはほとんど影響を及ぼさないが、細胞内Ｃｌ−は減少する点に注意が必要である。しかし、グリベンクラミドの濃度が５００μＭに達すると、細胞内Ｃａ＋＋は急増し、細胞内Ｃｌ−は同時に減少、膜電位は同時に増加する。これらの事象とその動態の相関関係は、本発明によらなければ観察できず、グリベンクラミドが細胞に影響を及ぼす機序を理解する上での唯一の手がかりとなる。
【実施例２】
【００３２】
ウリジン三リン酸に対する細胞内Ｃａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応
図８には、カルシウム依存性塩素イオンチャネル活性剤であるウリジン三リン酸（ＵＴＰ）の濃度を徐々に増加させる場合における、（．０１ｍＭ〜１ｍＭ）ＮＨＢＥ細胞のＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例が示されている。ＵＴＰは、ｐ２Ｙ受容体と結合するリガンドである。８００秒超にわたって１０ｍｓ間隔で獲得したフォトンカウントとして前記動態反応を測定した。
【００３３】
ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）はカルシウム依存性塩素イオンチャネル活性剤である。ＵＴＰの濃度上昇に対する反応を図８に示す。ＵＴＰ濃度が０．１ｍＭ及び１ｍＭの場合、細胞内Ｃａ＋＋は急増し、その後測定可能な速度で減少するが、基本的には、細胞内Ｃｌ−又は膜電位の何れにも変化がない点に気付くであろう。本発明の場合、細胞内Ｃａ＋＋の細胞外への流入の動態を測定することが可能であり、他の細胞現象との関係を調べることができる。
【実施例３】
【００３４】
カルシウム感受性Ｂｋカリウムチャンネル活性剤である１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ１６１９）に対する細胞内のＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応
細胞膜の過分極は、細胞内のカリウムの減少等、様々な細胞の機序を介しても誘発され得る。図９には、カルシウム感受性Ｂｋカリウムチャネル活性剤である１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ１６１９）の濃度を徐々に増加させた場合における（０．０１ｍＭ〜１．０ｍＭ）、ＮＨＢＥ細胞のＣａ＋＋、Ｃｌ−、及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応が示されている。前記動態反応は、９００秒超にわたって１０ｍｓ間隔で獲得したフォトンカウントとして測定した。経時的反応を誘発するメカニズムの観点から見たこれらの薬物の相対的効力、薬物作用の持続時間、及び細胞膜の過分極の大きさを初めて比較し、モニターできることに注意されたい。１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン（ＮＳ１６１９）の濃度増加に対する反応を図９に示す。０．０１ｍＭでは、細胞内のＣａ＋＋及びＣｌ−には基本的に変化はないが、膜電位は若干増加する。０．１ｍＭでは、細胞内Ｃａ＋＋及びＣｌ−ともに、基本的には未変化のままであるが、膜電位には少し増加が見られる。１ｍＭでは、細胞内Ｃａ＋＋は急増、細胞内Ｃｌ−は同時急減し、膜電位では同時急増が見られる。これらの事象の相関関係は、潜在的な活性化の機序を理解する上で手がかりとなる。刺激薬に対するこのような少なくとも３つの同時反応の群は、次いで、特徴的なパラメータを測定するために使用することが可能であり、両者を併用することにより、刺激薬に対する試料中の標的細胞の協同的動態反応プロファイルが一意的に確定される。
【００３５】
ハイスループット薬物スクリーニングを実行するためには、スクリーニングシステムに、本発明の２次元走査システム等の２次元走査装置が含まれていることが好ましい。前記走査システムには、下記のことを実行する機能がなければならない。
【００３６】
１．複数のウェルがあり、各５０μｍ内の空間分解能を有する１６０ｍｍＸ８５ｍｍの標準タイタープレートの面を走査できること。
【００３７】
２．５０μ秒／ピクセルの動的分解能を有する１２Ｘ８ピクセルの面を走査できること。
【００３８】
３．少なくとも２０ＫＨｚのバンド幅のフォトンカウンティング検出装置をサポートできること。
【００３９】
４．プレート上の任意の点、又は事前に設定された若しくはランダムに構成されたプレート上の任意のウェル内の細胞も走査できること。
【００４０】
本発明は、音響光学変調器（ＡＯＭ）を基礎としている。図１０を参照すると、ＡＯＭは極めて高い無線周波数で共鳴し、前記変調器の圧電結晶培地内で音響波面を発生する。前記結晶上で接線方向に入射光線を遮断する際には、ブラッグの法則に基づいて音響光学の波面により光線を偏光する。偏光角度は音響光学波面の波長に左右されるので、電子的に共鳴器の周波数を変更することにより偏光角度を正確に制御することが可能である。標準的な周波数は、ＫＨｚからＭＨｚの範囲内で、立ち上がり時間は約１０ナノ秒、アクセス時間は約１５μ秒である。出力光線には、ゼロ次（ＤＣ）、一次、二次等の光線が含まれ、一次光線には入射光線エネルギーの約６０％が含まれている。
【００４１】
図１１は、上述の条件を満たす二次元走査システムの１つの実施形態のブロック図である。該システムの中心機能は、各変調器の一次ビームの偏光の範囲内に、互いに直角に（直角のＸ軸及びＹ軸）距離を保って設置されている２つの音響光学変調器（６０２）である。この変調器は、図１１を参照すると、持続波のアルゴンイオンレーザ（６０１）を含む光源がその二次元音響光学装置に当たる光線を発生し（６０２）、互いに直角に、互いの一次光線の偏光の範囲内に間隔をおいて配置された一対の音響光学変調器で構成される二次元音響光学装置に、この光線が衝突する。電子機器回路（６１４）が前記音響光学変調器を駆動し、コンピュータシステム（６１１）内でデジタルアナログ（Ｄ／Ａ）ボード（６１３）の走査周波数及び電圧が電子機器回路を駆動する。前記音響光学変調器によって発生した８Ｘ１２の光学レーザ光は平凸レンズ（６０３）を通過し、これによって、前記レーザ光は平行に且つ８Ｘ１２光ファイバアレイ（６０４）の全面に伝わることになる。光ファイバの遠位端を９６レンズアレイ（６０５）と連結し、各レンズは９６ウェルプレート（６０６）の予め定められた点に光線を誘導する。Ｆｌｕｏ−３及びＲＨ４２１から発光された蛍光、９６ウェルプレートの各ウェルから発光された蛍光を２組の検出ファイバで別々に検出する。これらの検出ファイバは２つの８Ｘ１２光学ファイバアレイを形成しており、各々が検出された蛍光信号を形成する。各々が発光した蛍光は、光電子増倍管及びパルス弁別器（６１０）、干渉フィルター、並びに中継レンズを通過する。Ｆｌｕｏ−３放射を表す信号（６０７）及びＲＨ４１２を表す信号（６０９）を分析してリアルタイムで表示する場合には、ブロック（６０８）、次に（６１０）からの信号が、コンピュータシステム（６１１）内のＴＴＬタイマーボード及びリアルタイムディスプレイ（６１２）に移動する。図１１に示されている実施形態には、一つの光源と、３つの９６光ファイバアレイと、９６ウェルプレートと２つの蛍光信号とが示されているが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。特に、複数の光源を使用することができ、凹レンズ等の幾何光学装置を使用して各ウェルの指定の位置にレーザ光を誘導することが可能であり、更に多くのファイバを束ねることが可能であり、更に多くのウェルを走査することができ、３個以上の蛍光シグナルを同時に分析することが可能である。
【００４２】
図１２は、コンピュータシステム６１５内で行う測定の結果をリアルタイムで処理及び表示するコンピュータ論理のフローチャートである。コンピュータ内のＤ／Ａボードの電圧及び走査周波数は、音響光学変調用結晶のｘ軸及びｙ軸座標信号をＲＦドライバ６１８に伝え、次にＡＯＭスキャナ６０２のためにパラメータを設定する。次に、ＴＴＬカウンタタイマーボード６１６へ、９６ウェルプレートからフォトン検出器６１０及び６１２へ戻る蛍光信号を伝えるため、蛍光信号はリアルタイムで表示される。受信した信号の数を、予め設定しておいたカウント合計６１４と比較する。予め設定しておいた最大値に達した時点でカウンタを解除する（６１５）。
【００４３】
好ましい実施形態では、ＰＣＩバスを搭載したマルチチャネルカウンタタイマーコンピュータボードが、システムのために設定される。ＰＣＩバスを搭載した第二の多目的コンピュータボードを使用して、ＡＯＭスキャナのＸ座標及びＹ座標（ＡＯＭｘ及びＡＯＭｙ）をそれぞれ制御するために２つの電圧アナログ出力信号を与え、他のコンピュータボード上で行われる緩衝されたフォトン現象の計数操作のためにゲート信号を与える。リアルタイムシステム統合（ＲＴＳＩ）バスコネクタを用いて、前記２つの装置を接続する。
【００４４】
マルチウェルプレートの走査設定、すなわち利用者が選択したウェル数及びウェルあたりの走査数に応じて、ＡＯＭスキャナの操作電圧範囲は、前記プレートを空間的にカバーするのに必要とされる必要な工程の数に分割される。次に、コンピュータソフトウェアは、ＡＯＭｘ及びＡＯＭｙの電圧対について数値を計算して、コンピュータハードウェアにこれらの電圧を出力させた、次いで、これらの電圧によって、光線の方向とマルチウェルプレート上におけるその走査位置が制御される。前記コンピュータソフトウェアには、マルチウェルプレートのウェルを走査するラスター走査又はランダム走査モードを動作させる機能がある。コンピュータボードは、ゲートパルスの立ち上がりを引き金として利用し、ＤＡ変換を用いて、ＡＯＭスキャナを制御する電圧対をアナログ出力として発信する。各蛍光標識試薬から発光された蛍光が産生したフォトンカウントを別個に長期間モニターして、マルチチャネルカウンタタイマーコンピュータボードを用いて計数する。区間測定法を用いて、フォトン現象を計数する。フォトンカウント用装置は同時に、ＡＯＭスキャナのフォトン検出器から５Ｖのトランジスタトランジスタロジック（ＴＴＬ）電圧シグナルをサンプリングする。
【００４５】
フォトンカウントデータ収集ソフトウェアプログラムは、以下の機能からなる。Ｓｅｔ ＧａｔｅＤｅｖｉｃｅ機能はゲート装置をプログラムし、ＲＴＳＩバスにゲートパルスを発生させる。その走査周波数値は、所定の範囲（０Ｈｚ以上５ＫＨｚ未満）から選択することが可能である。Ｓｅｔ Ｔｈｅ Ｃｏｕｎｔｅｒｓ機能は、緩衝化された期間の測定用に、フォトンカウンティングボード上にカウンタを設定する。上記２つの機能は、カウンタ上でのセットアップオペレーションを完了し、まず主制御プログラム中に呼び出される。セットアップを完了させ、フォトンカウンティングボード上のカウンタのソースピンにフォトン現象シグナルを接続させた後に、電圧対の生成とフォトンカウンティングを同時に開始するためにＡｒｍ Ｃｏｕｎｔｅｒｓ機能を呼び出すことが可能である。電圧対の出力により決定される走査位置で、複数の各フォトン検出装置に発生するフォトン現象の数を収集して個別に計数するために、前記ソフトウェアは、連続する２つの期のゲートパルス信号を使用する。次にコンピュータプログラムは、スキャンシーケンスによって規定されたところに従って、ＡＯＭスキャナの次の位置に対応する次の電圧対出力を選択し、電圧生成とフォトンカウンティング操作を繰り返し、前記ソフトウェアがそのデータ収集セッションを終了するように命令されるまで、この処理を繰り返す。最後の機能であるＤｉｓａｒｍ−Ｃｏｕｎｔｅｒｓ（６１５）は、カウンティング操作を停止し、全ての電圧出力及びフォトンカウンティング操作をリセットする。リアルタイムベースでホストＰＣが収集したデータを各セッションの最後にデータベースに転送する。
【００４６】
図１３を参照すると、前記ソフトウェアには、利用者がアプリケーションを管理してデータ収集セッションの進行状況をモニターするグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）も実装されている。コンピュータスクリーンの左には、当該実験に関連するパラメータのリストがある。中央には、信号を検出するウェルのアレイが示されている。このアレイでは、検討中のウェルが強調表示される。ウェルの表示の下には、時間の関数として検討している当該ウェルから検出された３つの蛍光シグナルの振幅がプロットされている。
【００４７】
このソフトウェアモジュールにより、コンピュータハードウェア（ＰＣベース、カスタムハードウェア又はＡＳＩＣの何れか）を用いて、ＡＯＭハードウェアの制御とデータ収集をリアルタイムに行うことができる。前記ソフトウェアパッケージを用いると、ホストコンピュータ（ＰＣベース、カスタムハードウェア又はＡＳＩＣの何れか）は、測定地点に位置する最大８つのデータ収集端末から入力の収集と処理を同時に行うことができ、リアルタイムで出力を介して対処し、将来のオフライン処理のためにデータベースに情報を保管することが可能となる。前記ソフトウェアには、走査操作と測定処理を管理し、モニターするためにアナログ信号を発信することができる。前記ソフトウェアパッケージはコンピュータネットワーク構成要素を実装している。このコンピュータネットワーク構成要素によって、２人以上の同時利用ユーザーが同時にネットワーク上で遠く離れた所から閲覧、実行、操作することができる。前記ソフトウェアは、利用者が結果を閲覧してアプリケーションを実行できるＧＵＩを実装する。前記ソフトウェアは、高レベル言語であるＣ言語及びＣ＋＋言語で書かれているが、アセンブリレベルの言語を含むモジュールを実装することも可能である。データ収集とハードウェア通信用のミドルウェア／アプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩｓ）を前記ソフトウェアアプリケーション内から呼び出す。
【００４８】
このシステムでは、５ミリ秒未満で９６ピクセルの走査を完了する。各ピクセルの走査には、５０μ秒かかる。この内訳はアクセス時間１５μ秒とドゥエル時間３５μ秒である。必要な処理バンド幅は２０ＫＨｚよりも大きく、直接機能呼び出しを用いてボードレベルで実行される。現在の音響光学走査装置と同様に、高水準のアイコンプログラミングを用いて実行することはできない。このように現行の実質的に一次元の音響光学走査装置は、光源、光線拡幅器、単一の音響光学デフレクター及び適切なレンズ、ドライバ及びフィルターからなる励起源を用いているため、厳密に言えば、上記の必要条件を満たすことができない。すなわち、
１．８Ｘ１２の長方形の格子上に少なくとも９６のウェルがあり、各ウェル中の空間分解能が５０μｍである１６０ｍｍＸ８５ｍｍの標準タイタープレートの面を走査できること。
２．５０μ秒／ピクセルの動的分解能を有する４００Ｘ４００ピクセルの面を走査する機能を有し、これによって複数の蛍光標識試薬から得られる信号の反応速度を同時に測定できること。
３．少なくとも２０ＫＨｚの帯域幅のフォトンカウンティング検出装置をサポートできること。
４．プレート上の任意の点、又は事前にプログラムされた若しくはランダムに構成されたプレート上の任意のウェル内の細胞も走査できること。
【００５３】
本発明の方法及び装置は、とりわけ、細胞のシグナル伝達経路の正確な描写やこれらの経路を活性化又はモジュレートする生物活性剤の同定に使用される。本技術は、薬物候補をスクリーニングする効率を改善させるために使用できる。前記方法と装置を使用すれば、薬物候補のハイスループットスクリーニングに豊富な情報量がもたらされる。現在の技術では、まず、最初のスクリーニングとして情報量の低い最初の工程を迅速に行った後に、第一の工程を突破した薬物の候補に対して高い情報量のスクリーニングを行う、という２つの別個の工程を使用している。１回の処理だけで、同時に少なくとも３つの細胞間情報をリアルタイムに追跡する機能によって、現在の技術で可能なものよりもさらに多くの複雑な細胞現象の相互作用を学べる可能性が開かれる。本発明の方法及び装置は、そのような理解を発展させるための新しいツールを提供する。また、ミリ秒のタイムスケールの分解能を用いて、体液中のイオン及び／又はその他の種の濃度をリアルタイムで同時に検出及び追跡するために、前記方法及び装置を適合させることができるであろう。最後に、この方法及び装置のために開発された管理及び分析ソフトウェアは、ミリ秒又は更に大きな時間尺度の分解能を有する少なくとも３つ以上の信号をリアルタイムで同時に追跡するその他の技術に適用できることを理解されたい。
【００５４】
従って、薬物をスクリーニングするための新しい新規な方法及び装置が記載されていることが、理解できるであろう。本明細書の教示に基づけば、数多くの代替物及び均等物が得られることは自明であり、それらは開示されている本発明に包含されることを当業者であれば理解できるであろう。結果として、本発明は前述の実施形態に限定されるものではなく、以下のクレームのみによって限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、本発明に従って薬物の候補のスクリーニングシステムを示すブロック図である。
【図２】図２は、本発明の代替実施例に従った薬物の候補スクリーニングシステムの更に詳細なブロック図である。
【図３】図３は、本発明に従った薬物の候補スクリーニング方法のフローチャートである。
【図４】図４は、本発明特有の代替実施例に従って薬物の候補スクリーニング方法の更に詳細なフローチャートである。
【図５】図５は、本発明の代替実施例に従った薬物の候補スクリーニング方法のフローチャートである。
【図６】図６は、本発明に従ってフルオレセイン系蛍光標識試薬、ジヒドキノリン系蛍光標識試薬及びスチリル系蛍光標識試薬を同時測定するための二色性ミラーのスペクトラル特性を示す。
【図７】図７は、本発明に従った、正常ヒト気管支上皮細胞において付加的に増加するグリベンクラミド濃度へのＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例である。
【図８】図８は、本発明に従った、ＮＨＢＥ細胞において付加的に増加するウリジン三燐酸（ＵＴＰ）濃度（．０１μＭ〜１ｍＭ）に対するＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例である。
【図９】図９は、本発明に従った、ＮＨＢＥ細胞において付加的に増加する１，３−ジヒドロ−１−［２−ヒドロキシ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−５−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−ｏｎｅ（ＮＳ１６１９）濃度（０．０１ｍＭ〜１．０ｍＭ）に対するＣａ＋＋、Ｃｌ−及び細胞膜電位の累積的な用量動態反応の例である。
【図１０】図１０は、正確に定義されたポイントへ一次元で入射するレーザ光線を移動させることができる音響光学変調器の図である。
【図１１】図１１は、本発明の２次元走査システムのブロック図である。
【図１２】図１２は、本発明に従った、測定値の分析及び表示する方法に関するコンピュータ論理を説明するフローチャートである。
【図１３】図１３は、２次元走査システムのグラフィカルユーザインタフェースである。
【国際調査報告】
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