(57)【要約】シャペロン様活性を有する安定タンパク質（ＳＰ）として言及される、新規な変性剤安定、プロテアーゼ耐性、ホモオリゴマータンパク質。ＳＰの製造及び精製方法。ＳＰをコードする核酸。ＳＰをコードする核酸の単離方法。ＳＰを認識する抗体。タンパク質の如き高分子を安定、リフォールディング、修復するための、及び凝集及び脱凝集を防止するためのＳＰの使用。ＳＰを含む融合タンパク質。融合タンパク質をコードする核酸構築物。様々な方法及び用途におけるそれらの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のものを含む単離された核酸：
（ａ）シャペロン様活性を有する煮沸安定タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチド；および
（ｂ）前記煮沸安定タンパク質の発現を指向するため前記第一ポリヌクレオチドに動作可能に連結されているプロモーター配列を含む第二ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記プロモーター配列は、真核生物のプロモーターである請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記真核生物のプロモーターは、構成的プロモーターである請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記プロモーターは、構成的植物プロモーター、組織特異的植物プロモーター、および誘導性植物プロモーターからなる群から選択される植物プロモーターである請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を有する請求項４に記載の単離された核酸：
（ｉ）前記構成的植物プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓ植物プロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓ植物プロモーター、ＦＭＶ３４Ｓ植物プロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルス植物プロモーター、ＣｓＶＭＶ植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチン植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチンＵＢＱ１植物プロモーター、大麦の葉のチオニンＢＴＨ６植物プロモーター、およびイネアクチン植物プロモーターからなる群から選択される；
（ｉｉ）前記組織特異的植物プロモーターは、豆類ファゼオリン貯蔵タンパク質植物プロモーター、ＤＬＥＣ植物プロモーター、ＰＨＳβ植物プロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質植物プロモーター、大豆からのコングルチンガンマ植物プロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡＣＴ１１アクチン植物プロモーター、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓからのｎａｐＡ植物プロモーター、およびじゃがいもパタチン遺伝子植物プロモーターからなる群から選択される；および
（ｉｉｉ）前記誘導性植物プロモーターは、えんどう豆ｒｂｃＳ遺伝子由来の光誘導性植物プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子からの植物プロモーター、渇水中に活性なＤＲＥ、ＭＹＣ、およびＭＹＢ植物プロモーター、高塩濃度および浸透圧ストレス中に活性なＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａ  ｈｓｐ１７．７Ｇ４、およびＲＤ２１植物プロモーター、および病原性ストレス中に活性なｈｓｒ２０３Ｊおよびｓｔｒ２４６Ｃ植物プロモーターからなる群から選択される。
【請求項６】
前記プロモーター配列は、原核生物のプロモーターである請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記第一ポリヌクレオチドは、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ重み付けが５０、長さ重み付けが３、平均マッチが１０、平均ミスマッチが−９であるスミス・アンド・ウオーターマンアルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０と少なくとも６０％同一な配列を有する請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項８】
前記安定タンパク質は、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２であるスミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と少なくとも６０％相同な配列を有する請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記安定タンパク質は、本来はオリゴマーである請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
前記シャペロン様活性は、タンパク質の熱安定化を含む請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
請求項１の核酸を含む核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１の核酸で形質転換された細胞。
【請求項１３】
請求項１の核酸で形質転換された生物。
【請求項１４】
下記のものをさらに含む請求項１に記載の単離された核酸：
（ｃ）追加のタンパク質をコードする第三ポリヌクレオチドであって、前記第三ポリヌクレオチドは、前記第一ポリヌクレオチドに隣接し、かつインフレームであり、前記第一および第三ポリヌクレオチドは、前記安定タンパク質と前記追加タンパク質との融合タンパク質を組合わせてコードする。
【請求項１５】
生物源からのシャペロン様活性を有する煮沸安定タンパク質をコードする遺伝子の単離方法であって、シャペロン様活性を有する煮沸安定タンパク質をコードするポリヌクレオドで発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法。
【請求項１６】
下記のものを含む単離された核酸：
（ａ）シャペロン様活性を有する界面活性剤安定タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチド；および
（ｂ）前記界面活性剤安定タンパク質の発現を指向するため前記第一ポリヌクレオチドに動作可能に連結されているプロモーター配列を含む第二ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記プロモーター配列は、真核生物のプロモーターである請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
前記真核生物のプロモーターは、構成的プロモーターである請求項１７に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
前記プロモーターは、構成的植物プロモーター、組織特異的植物プロモーター、および誘導性植物プロモーターからなる群から選択される植物プロモーターである請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項２０】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を有する請求項１９に記載の単離された核酸：
（ｉ）前記構成的植物プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓ植物プロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓ植物プロモーター、ＦＭＶ３４Ｓ植物プロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルス植物プロモーター、ＣｓＶＭＶ植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチン植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチンＵＢＱ１植物プロモーター、大麦の葉のチオニンＢＴＨ６植物プロモーター、およびイネアクチン植物プロモーターからなる群から選択される；
（ｉｉ）前記組織特異的植物プロモーターは、豆類ファゼオリン貯蔵タンパク質植物プロモーター、ＤＬＥＣ植物プロモーター、ＰＨＳβ植物プロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質植物プロモーター、大豆からのコングルチンガンマ植物プロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡＣＴ１１アクチン植物プロモーター、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓからのｎａｐＡ植物プロモーター、およびじゃがいもパタチン遺伝子植物プロモーターからなる群から選択される；および
（ｉｉｉ）前記誘導性植物プロモーターは、えんどう豆ｒｂｃＳ遺伝子由来の光誘導性植物プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子からの植物プロモーター、渇水中に活性なＤＲＥ、ＭＹＣ、およびＭＹＢ植物プロモーター、高塩濃度および浸透圧ストレス中に活性なＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａ  ｈｓｐ１７．７Ｇ４、およびＲＤ２１植物プロモーター、および病原性ストレス中に活性なｈｓｒ２０３Ｊおよびｓｔｒ２４６Ｃ植物プロモーターからなる群から選択される。
【請求項２１】
前記プロモーター配列は、原核生物のプロモーターである請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項２２】
前記第一ポリヌクレオチドは、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ重み付けが５０、長さ重み付けが３、平均マッチが１０、平均ミスマッチが−９であるスミス・アンド・ウオーターマンアルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０と少なくとも６０％同一な配列を有する請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項２３】
前記安定タンパク質は、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２であるスミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と少なくとも６０％相同な配列を有する請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項２４】
前記安定タンパク質は、本来はオリゴマーである請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項２５】
前記シャペロン様活性は、タンパク質の熱安定化を含む請求項１６に記載の単離された核酸。
【請求項２６】
請求項１６の単離された核酸を含む核酸構築物。
【請求項２７】
請求項１６の単離された核酸で形質転換された細胞。
【請求項２８】
請求項１６の単離された核酸で形質転換された生物。
【請求項２９】
下記のものをさらに含む請求項１６に記載の単離された核酸：
（ｃ）追加のタンパク質をコードする第三ポリヌクレオチドであって、前記第三ポリヌクレオチドは、前記第一ポリヌクレオチドに隣接し、かつインフレームであり、前記第一および第三ポリヌクレオチドは、前記安定タンパク質と前記追加タンパク質との融合タンパク質を組合わせてコードする。
【請求項３０】
生物源からのシャペロン様活性を有する界面活性剤安定タンパク質をコードする遺伝子の単離方法であって、シャペロン様活性を有する界面活性剤安定タンパク質をコードするポリヌクレオドで発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法。
【請求項３１】
下記のものを含む単離された核酸：
（ａ）シャペロン様活性を有するプロテアーゼ耐性安定タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチド；および
（ｂ）前記プロテアーゼ耐性安定タンパク質の発現を指向するため前記第一ポリヌクレオチドに動作可能に連結されているプロモーター配列を含む第二ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
前記プロモーター配列は、真核生物のプロモーターである請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項３３】
前記真核生物のプロモーターは、構成的プロモーターである請求項３２に記載の単離された核酸。
【請求項３４】
前記プロモーターは、構成的植物プロモーター、組織特異的植物プロモーター、および誘導性植物プロモーターからなる群から選択される植物プロモーターである請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項３５】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を有する請求項３４に記載の単離された核酸：
（ｉ）前記構成的植物プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓ植物プロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓ植物プロモーター、ＦＭＶ３４Ｓ植物プロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルス植物プロモーター、ＣｓＶＭＶ植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチン植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチンＵＢＱ１植物プロモーター、大麦の葉のチオニンＢＴＨ６植物プロモーター、およびイネアクチン植物プロモーターからなる群から選択される；
（ｉｉ）前記組織特異的植物プロモーターは、豆類ファゼオリン貯蔵タンパク質植物プロモーター、ＤＬＥＣ植物プロモーター、ＰＨＳβ植物プロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質植物プロモーター、大豆からのコングルチンガンマ植物プロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡＣＴ１１アクチン植物プロモーター、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓからのｎａｐＡ植物プロモーター、およびじゃがいもパタチン遺伝子植物プロモーターからなる群から選択される；および
（ｉｉｉ）前記誘導性植物プロモーターは、えんどう豆ｒｂｃＳ遺伝子由来の光誘導性植物プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子からの植物プロモーター、渇水中に活性なＤＲＥ、ＭＹＣ、およびＭＹＢ植物プロモーター、高塩濃度および浸透圧ストレス中に活性なＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａ  ｈｓｐ１７．７Ｇ４、およびＲＤ２１植物プロモーター、および病原性ストレス中に活性なｈｓｒ２０３Ｊおよびｓｔｒ２４６Ｃ植物プロモーターからなる群から選択される。
【請求項３６】
前記プロモーター配列は、原核生物のプロモーターである請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項３７】
前記第一ポリヌクレオチドは、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ重み付けが５０、長さ重み付けが３、平均マッチが１０、平均ミスマッチが−９であるスミス・アンド・ウオーターマンアルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０と少なくとも６０％同一な配列を有する請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項３８】
前記プロテアーゼ耐性タンパク質は、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２であるスミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と少なくとも６０％相同な配列を有する請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項３９】
前記プロテアーゼ耐性タンパク質は、本来はオリゴマーである請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項４０】
前記シャペロン様活性は、タンパク質の熱安定化を含む請求項３１に記載の単離された核酸。
【請求項４１】
請求項３１の単離された核酸を含む核酸構築物。
【請求項４２】
請求項３１の単離された核酸で形質転換された細胞。
【請求項４３】
請求項３１の単離された核酸で形質転換された生物。
【請求項４４】
下記のものをさらに含む請求項３１に記載の単離された核酸：
（ｃ）追加のタンパク質をコードする第三ポリヌクレオチドであって、前記第三ポリヌクレオチドは、前記第一ポリヌクレオチドに隣接し、かつインフレームであり、前記第一および第三ポリヌクレオチドは、前記プロテアーゼ耐性タンパク質と前記追加タンパク質との融合タンパク質を組合わせてコードする。
【請求項４５】
生物源からのシャペロン様活性を有するプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする遺伝子の単離方法であって、シャペロン様活性を有するプロテアーゼ耐性タンパク質をコードするポリヌクレオドで発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法。
【請求項４６】
シャペロン様活性を有する単離された煮沸安定ポリペプチド。
【請求項４７】
ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ重み付けが５０、長さ重み付けが３、平均マッチが１０、平均ミスマッチが−９であるスミス・アンド・ウオーターマンアルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０と少なくとも６０％同一な配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２であるスミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と少なくとも６０％相同な配列を有する請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
本来はオリゴマーである請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記シャペロン様活性は、タンパク質の熱安定化を含む請求項４６に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
請求項４６に記載のポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体。
【請求項５２】
請求項５１に記載の抗体で発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む煮沸安定タンパク質をコードする遺伝子の単離方法。
【請求項５３】
凝集性タンパク質が凝集体として凝集することを防止する方法であって、請求項４６に記載のポリペプチドの有効量を、前記凝集性タンパク質と接触させる工程を含む方法。
【請求項５４】
凝集性タンパク質の凝集体を脱凝集する方法であって、請求項４６に記載のポリペプチドの有効量を、前記凝集体と接触させる工程を含む方法。
【請求項５５】
変性条件に対してタンパク質を安定させる方法であって、請求項４６に記載のポリペプチドの有効量を、前記タンパク質と接触させる工程を含む方法。
【請求項５６】
シャペロン様活性を有する単離された界面活性剤安定ポリペプチド。
【請求項５７】
ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ重み付けが５０、長さ重み付けが３、平均マッチが１０、平均ミスマッチが−９であるスミス・アンド・ウオーターマンアルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０と少なくとも６０％同一な配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２であるスミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と少なくとも６０％相同な配列を有する請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
本来はオリゴマーである請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
前記シャペロン様活性は、タンパク質の熱安定化を含む請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
請求項５６に記載のポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体。
【請求項６２】
請求項６１に記載の抗体で発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む界面活性剤安定タンパク質をコードする遺伝子の単離方法。
【請求項６３】
凝集性タンパク質が凝集体として凝集することを防止する方法であって、請求項５６に記載のポリペプチドの有効量を、前記凝集性タンパク質と接触させる工程を含む方法。
【請求項６４】
凝集性タンパク質の凝集体を脱凝集する方法であって、請求項５６に記載のポリペプチドの有効量を、前記凝集体と接触させる工程を含む方法。
【請求項６５】
変性条件に対してタンパク質を安定させる方法であって、請求項５６に記載のポリペプチドの有効量を、タンパク質と接触させる工程を含む方法。
【請求項６６】
シャペロン様活性を有する単離されたプロテアーゼ耐性ポリペプチド。
【請求項６７】
ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ重み付けが５０、長さ重み付けが３、平均マッチが１０、平均ミスマッチが−９であるスミス・アンド・ウオーターマンアルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０と少なくとも６０％同一な配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２であるスミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と少なくとも６０％相同な配列を有する請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
本来はオリゴマーである請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
前記シャペロン様活性は、タンパク質の熱安定化を含む請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
請求項６６に記載のポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体。
【請求項７２】
請求項７１に記載の抗体で発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む煮沸安定タンパク質をコードする遺伝子の単離方法。
【請求項７３】
凝集性タンパク質が凝集体として凝集することを防止する方法であって、請求項６６に記載のポリペプチドの有効量を、前記凝集性タンパク質と接触させる工程を含む方法。
【請求項７４】
凝集性タンパク質の凝集体を脱凝集する方法であって、請求項６６に記載のポリペプチドの有効量を、前記凝集体と接触させる工程を含む方法。
【請求項７５】
変性条件に対してタンパク質を安定させる方法であって、請求項６６に記載のポリペプチドの有効量を、タンパク質と接触させる工程を含む方法。
【請求項７６】
生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を濃縮するかまたは単離する方法であって、
（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；
（ｂ）前記タンパク質抽出物を煮沸する工程；
（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；および所望により
（ｄ）可溶性タンパク質のシャペロン様活性をアッセイし、シャペロン様活性を有する安定タンパク質を濃縮するかまたは単離する工程
を含む方法。
【請求項７７】
前記可溶性タンパク質をサイズ分画する工程をさらに含む請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする遺伝子を単離する方法であって、
（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；
（ｂ）前記タンパク質抽出物を煮沸する工程；
（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；
（ｄ）可溶性タンパク質のシャペロン様活性をアッセイし、シャペロン様活性を有する安定タンパク質を単離する工程；
（ｅ）前記シャペロン様活性を有する安定タンパク質を認識する抗体の産生を刺激する工程；および
（ｆ）前記抗体で発現ライブラリーをスクリーニングする工程
を含む方法。
【請求項７９】
生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする遺伝子を単離する方法であって、
（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；
（ｂ）前記タンパク質抽出物を煮沸する工程；
（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；
（ｄ）可溶性タンパク質のシャペロン様活性をアッセイし、シャペロン様活性を有する安定タンパク質を濃縮するか、または単離する工程；
（ｅ）前記安定タンパク質を微小配列決定して、これの少なくとも１つの部分アミノ酸配列を得る工程；
（ｆ）前記アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを設計する工程；および
（ｇ）前記オリゴヌクレオチドで発現ライブラリーをスクリーニングする工程
を含む方法。
【請求項８０】
シャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の単離方法であって、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０の連続部分と少なくとも６０％同一な少なくとも１７塩基のポリヌクレオチドでｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法。
【請求項８１】
シャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の同定方法であって、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０のいずれかと、または少なくとも１５塩基のこれらのいくつかの部分と、またはこれに対応する部分と、予め決定された程度の同一性または相同性を有する配列について、複数の核酸および／またはアミノ酸配列を含む電子ライブラリーを検索する工程を含む方法。
【請求項８２】
シャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の単離方法であって、
（ａ）各々少なくとも長さが１５塩基である、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドであって、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を増幅するために選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを準備する工程；
（ｂ）前記少なくとも一対のオリゴヌクレオチドと核酸の１つのサンプルとを接触させ、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を増幅する工程；および
（ｃ）配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を用いて変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸を単離する工程
を含む方法。
【請求項８３】
生物源からのシャペロン様活性を有するプロテアーゼ耐性タンパク質の界面活性剤を用いない単離方法であって、
（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；
（ｂ）前記タンパク質抽出物とプロテアーゼとを接触させる工程；
（ｃ）プロテアーゼ耐性タンパク質を単離する工程；および所望により
（ｄ）前記プロテアーゼ耐性タンパク質を、シャペロン様活性についてアッセイする工程
を含む方法。
【請求項８４】
追加ポリペプチドに融合されたシャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性ポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項８５】
前記シャペロン様活性を有する、前記変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性ポリペプチドが、ペプチド結合を介して前記追加のポリペプチドに融合される請求項８４に記載の融合タンパク質。
【請求項８６】
前記シャペロン様活性を有する、前記変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性ポリペプチドが、架橋剤を介して前記追加のポリペプチドに融合される請求項８４に記載の融合タンパク質。
【請求項８７】
オリゴマー形態を有する請求項８４に記載の融合タンパク質。
【請求項８８】
請求項８４に記載の融合タンパク質を哺乳動物の免疫系に供する工程を含む免疫化方法。
【請求項８９】
酵素調製物を酵素活性の低下から保護する方法であって、酵素調製物に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、酵素調製物を酵素活性の低下から保護するのに十分な量で添加する工程を含む方法。
【請求項９０】
酵素調製物の失われた酵素活性の少なくとも一部分を修復する方法であって、酵素調製物に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、酵素調製物の前記失われた酵素活性の少なくとも前記部分を修復するのに十分な量で添加する工程を含む方法。
【請求項９１】
ポリペプチドに対する免疫応答を低下させつつ、免疫系を有する動物へポリペプチドを投与する方法であって、動物へポリペプチドを投与する工程を含み、前記ポリペプチドは、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質に融合されており、これによって、ポリペプチドだけを動物へ投与することによって発生する免疫応答と比較して、前記ポリペプチドに対する前記免疫応答を低下させる方法。
【請求項９２】
シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を発現するトランスジェニック植物。
【請求項９３】
植物を、生物または非生物ストレスに対してより耐性のあるものにする方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に発現するように植物を作り変える工程を含む方法。
【請求項９４】
植物を、生物または非生物ストレスからより回復可能なものにする方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に発現するように植物を作り変える工程を含む方法。
【請求項９５】
細胞移動を増加する方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の細胞移動を増加させるのに十分な量へ前記細胞を暴露する工程を含む方法。
【請求項９６】
傷の治癒の加速方法であって、傷に対して、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の傷の治癒を加速させるのに十分な量を投与する工程を含む方法。
【請求項９７】
傷の治癒の誘発方法であって、傷に対して、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の傷の治癒を誘発するのに十分な量を投与する工程を含む方法。
【請求項９８】
毛髪、つめ、または皮膚の強化方法であって、毛髪、つめ、または皮膚に対して、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、毛髪、つめ、または皮膚の強化のために十分な量を投与する工程を含む方法。
【請求項９９】
毛髪、つめ、または皮膚の手入れ方法であって、毛髪、つめ、または皮膚に対して、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、毛髪、つめ、または皮膚の手入れのために十分な量を投与する工程を含む方法。
【請求項１００】
活性成分として、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質、および製薬的に許容しうるキャリヤーを含む製薬組成物。
【請求項１０１】
前記製薬組成物は、パッケージに包装され、傷治癒用途に使用するために印刷されて識別されている請求項１００に記載の製薬組成物。
【請求項１０２】
前記製薬組成物は、パッケージに包装され、毛髪、つめ、または皮膚の強化および／または手入れに使用するために印刷されて識別されている請求項１００に記載の製薬組成物。
【請求項１０３】
生物源からのシャペロン様活性を有する煮沸安定タンパク質の単離方法であって、
（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；
（ｂ）前記タンパク質抽出物を煮沸する工程；
（ｃ）可溶性タンパク質画分を回収する工程；および所望により
（ｄ）前記プロテアーゼ耐性タンパク質をシャペロン様活性についてアッセイする工程
を含む方法。
【請求項１０４】
前記タンパク質抽出物をプロテアーゼで消化する工程をさらに含む請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
凝集性タンパク質のタンパク質凝集に関連した病気の治療方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、前記凝集性タンパク質の凝集を脱凝集するか、および／または防ぐのに十分な量で、これを必要とする被験者に投与する工程を含む方法。
【請求項１０６】
前記凝集タンパク質は、ベータアミロイドおよびプリオンからなる群から選択される請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
結合分子の結合活性を増加する方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質のオリゴマーの表面上に、結合分子の多重コピーを示す工程を含む方法。
【請求項１０８】
前記結合分子は、受容体、リガンド、酵素、基質、阻害剤、抗体、および抗原からなる群から選択される請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
シャペロン様活性を有する複数の変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を含むオリゴマー、および前記オリゴマーへ融合されている少なくとも２つの異なる分子を含むヘテロ複合物。
【請求項１１０】
前記少なくとも２つの異なる分子は、少なくとも１つの第一酵素および第二酵素を含む請求項１０９に記載のヘテロ複合物。
【請求項１１１】
前記第一酵素および前記第二酵素は、合成または分解経路における一連の反応を触媒する請求項１１０に記載のヘテロ複合物。
【請求項１１２】
前記第一酵素および前記第二酵素は、合成または分解経路における異なる反応を触媒する請求項１１０に記載のヘテロ複合物。
【請求項１１３】
前記少なくとも２つの異なる分子は、少なくとも１つの結合分子および１つのリポーター分子を含む請求項１０９に記載のヘテロ複合物。
【請求項１１４】
ＨＲＰ保護アッセイを用いて決定された場合、少なくとも１０単位／ｍｇタンパク質のＨＲＰ保護活性を有し、シャペロン様活性を有する、単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質であって、前記ＨＲＰ保護アッセイは、異なる最終タンパク質濃度で、予め決定された体積においてシャペロン様活性を有する、単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質と、ｐＨ７．５における４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に存在する５ｎＭ  ＨＲＰ１００μｌとを混合し、このようにして第一反応混合物を形成し、前記反応混合物の２５℃における１６時間のインキュベーション後、前記第一反応混合物５μｌと３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン１００μｌとを混合し、このようにして第二反応混合物を形成し、前記第二反応混合物を１０分間インキュベーションし、前記第二反応混合物の反応を１Ｍ硫酸１００μｌの添加によって停止し、前記第二反応混合物中の比色変化を４３５ｎｍにおいて記録することによってＨＲＰ残存酵素活性を測定する工程を含み、ここで、前記単位は、前記ＨＲＰ保護アッセイにおいてＨＲＰ活性の５０％保護を与える、１ｍｇ／ｍｌの濃度においてシャペロン様活性を有する前記変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の希釈率として規定される単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１１５】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１１６】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも１０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１１７】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも１５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１１８】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも２０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１１９】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも２５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２０】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも３０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２１】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも３５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２２】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも４０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２３】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも４５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２４】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも５０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２５】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも５５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２６】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも６０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２７】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも８０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２８】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも１００００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２９】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも１５０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１１４に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１３０】
タンパク質１ｍｇあたりの保護活性単位として決定された、シャペロン様活性を有する予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の比活性を増加させる方法であって、前記予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をオートクレーブする工程を含む方法。
【請求項１３１】
タンパク質１ｍｇあたりの保護活性単位として決定された、シャペロン様活性を有する予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の比活性を増加させる方法であって、前記予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をプロテアーゼで処理する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変性剤（例えば煮沸、界面活性剤、ほかの変性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性シャペロン様オリゴマータンパク質、これらをコードするポリヌクレオチド、これらの使用、およびこれらの比活性を増加させる方法に関する。より詳しくは本発明は、新規変性安定、プロテアーゼ耐性の、ホモ−モノマーから構成されたホモ−オリゴマータンパク質であって、以下で安定タンパク質（ＳＰ）と呼ばれるタンパク質、ＳＰ、ＳＰをコードする核酸構築物、ＳＰを認識する抗体の産生および精製方法、巨大分子、例えばタンパク質、ＳＰを包含する融合タンパク質、これらの融合タンパク質をコードする核酸構築物を安定化し、リフォールディングし、脱凝集するため、換言すればシャペロニングするためのＳＰの使用、同種または異種複合体構造の免疫化および／または形成におけるこれらの使用、安定タンパク質の比活性を増加させる方法、およびその他の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子シャペロン
分子シャペロンは、不安定な、非ネイティブに（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅｌｙ）組織化された（以後、非ネイティブ）タンパク質を選択的に認識し、結合するこれらの顕著な能力を特徴とする。シャペロンとこのようなタンパク質との相互作用は、種々のシャペロンに特異的な多重（多様な）機能に取り組むが、これらの機能には次のものが含まれる。すなわち、新生タンパク質の最終コンホメーションへの折りたたみの容易化および促進、膜輸送に適した非構造化形態における基質の保持、特異的コンホメーションにおけるタンパク質の維持、折りたたまれていないタンパク質の凝集の予防、および凝集タンパク質の復元の促進である。最後の２つの機能は、高温およびほかのストレスを受けている細胞にとって特に重要である。したがって、多くの分子シャペロンがまず、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）として同定されたことは驚くべきことではない。
【０００３】
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）
Ｈｓｐは、ストレス温度に暴露されたすべての生物に見られるタンパク質群である。多くのＨｓｐが、新生ポリペプチドの適切な折りたたみに関わり、かつ損傷を受けたタンパク質がその生物学的に活性なコンホメーションを取り戻すのを助ける分子シャペロンの活性を有することが、明らかに証明されている（Ｈａｒｔｌ、１９９６年）。小さいＨｓｐ（ｓＨｓｐ）は、様々な生物において１２〜４０ｋＤａの分子サイズを有し、かつ植物中に豊富に見られるＨｓｐである。植物のｓＨｓｐは、ほかのｓＨｓｐおよびアルファクリスタリンのように、これらの機能的形態であると考えられている大きいオリゴマー複合体を形成する傾向がある（Ｃｈｅｎら、１９９４年；Ｌｅｅら、１９９５年；Ｃｏｌｌａｄａら、１９９７年）。Ｓｕｚｕｋｉら（１９９８年）は、えんどう豆からの葉緑体局在性Ｈｓｐ２１が複合体として存在し、熱ストレスおよび回復の間に解離しないという証拠を提供した。植物ｓＨｓｐとは対照的に、哺乳類のサイトゾルｓＨｓｐは、熱ストレスの間ホスホリル化によって、モノマーへの複合体解離を受ける（Ｒｏｇａｌｌａら、１９９９年）。Ｈａｓｌｂｅｃｋら（１９９９年）による最近の論文は、酵母からのＨｓｐ２６複合体の解離は、温度調節されており、効率的なシャペロン活性の必須条件であることを証明した。インビトロ内で、ｓＨｓｐは、非ネイティブタンパク質に結合し（Ｌｅｅら、１９９５年、Ｅｈｒｎｓｐｅｒｇｅｒら、１９９７年、Ｖｅｉｎｇｅｒら、１９９８年）、したがって非ネイティブタンパク質の凝集を防ぎ、シャペロンネットワークによるその後のリフォールディングを可能にすることが証明されている（Ｅｈｒｎｓｐｅｒｇｅｒら、１９９７年、Ｖｅｉｎｇｅｒら、１９９８年；Ｈａｓｌｂｅｃｋら、１９９９年）。
【０００４】
一般にＨｓｐは、中程度の温度で安定であるが、８０℃を超える温度では安定でない。えんどう豆Ｈｓｐ１８．１の蓄積は、３８℃で３８時間の半減期で、依然として安定である。５５℃では、熱変性ＬＤＨの凝集の予防に対するＨｓｐ１８．１の効果は、４５℃におけるものよりも小さかった（Ｌｅｅら、１９９５年）。Ｈｓｐ２５オリゴマーは、４３℃において６０分まで安定であった（Ｅｈｒｎｓｐｅｒｇｅｒら、１９９７年）。７０℃以上の温度へのＨｓｐ２１の暴露は、不可逆性凝集を生じた（Ｈｒｎｄａｈｌら，１９９９年）。高度に熱安定なＨｓｐの唯一の報告は、酵母からのＨＳＰ１２である（ＰｒａｅｋｅｌｔおよびＭｅａｃｏｃｋ、１９９０年）。その物理化学的性質およびアミノ酸組成の類似性に基づいて、Ｍｔｗｉｓｈａら（１９９８年）は、ＨＳＰ１２がＬＥＡ様タンパク質であることを示唆した。ｓＨｓｐのあらゆるオリゴマー複合体が、ＳＤＳ変性下に安定であるとは報告されていない。報告されたｓＨｓｐのすべては、タンパク質が架橋されていなければ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてモノマーとして立証されている。
【０００５】
Ｈｓｐおよびシャペロン様分子の使用：
ストレスタンパク質がタンパク質およびペプチド構造を安定させる独特の能力は、ペプチドの抗原性を修飾するため、酸化ストレスおよび熱ストレスから細胞を保護するため、タンパク質凝集を改変するため、およびインビトロにおけるタンパク質の折りたたみを促進するために用いられてきた。
【０００６】
Ｈｓｐが抗原のコンホメーションを行なう能力は、多くの提案された用途につながった。これらの用途には、非抗原性腫瘍抗原を用いた、ワクチンへのＨｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、およびｇｐ７６の組み込み（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａの米国特許第６１６２４３６号）、伝染病の病原体に対する免疫性の惹起（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａの米国特許第６１３９８４１号）、および組織移植片免疫応答の調節による同種移植片および異種移植片拒絶反応の抑制（Ａｔｔｆｉｅｌｄの米国特許第５８９１６５３号）が含まれる。
【０００７】
Ｈｓｐをコードする、クローン化されたＤＮＡ配列の高レベルの発現は、形質転換細胞中に新規ストレス耐性を与えるために用いられてきた。過剰発現されたヒトＨｓｐ２７は、形質転換された１９２９細胞および１３．Ｓ．１．２４細胞を、酸化ストレスから保護した（Ｒｏｇａｌｌａ，Ｔ．ら、ＪＢＣ（１９９９年）２７４、１８９４７−５６）。植物由来ｓＨｓｐ  Ｃｓ  Ｈｓｐ１７．５（栗の子葉からのもの）は、形質転換大腸菌中に過剰発現された時、低温（４℃）および高温（５０℃）の両極端に対して細菌を保護した（Ｓｏｔｏ−Ａら、「植物生理学（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、（１９９０年）１２０、５２１−５２８）。
【０００８】
アルファ−ベータレンズクリスタリンもまた、ｓＨｓｐタンパク質と考えられる。クリスタリンタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、アミロイド凝集体形成を受けやすい細胞中に発現された時、ｓＨｓｐはインビトロにおけるフィブリル形成を妨げた。しかしながらこの脱凝集は、アミロイドベータタンパク質の毒性を減少するのではなくむしろ増加させた（Ｓｔｅｇｅ，Ｇ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９９年）２６２（１）：１５２−６）。
【０００９】
足場タンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質のインビトロでのアセンブリーにおいて（Ｎｅｗｃｏｍｂ，ＷＷ．ら、ウイルス学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）（１９９９年）、７３、４２３１−５０）；インビトロ、および異種発現系において正確なタンパク質の折りたたみを促進するため（Ｙｏｓｈｉｄａらの米国特許第５５６１２２１号参照）、および同じ粒子上に複数の抗原を示すことによって免疫応答を促進するため（Ｇｏｎｚａｌｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ（２００１年）３０５、２５９−２６７）に、首尾よく用いられてきた。
【００１０】
しかしながら既知のＨｓｐまたはｓＨｓｐのどれも、過酷な変性条件下、例えば煮沸または高ＳＤＳ濃度への暴露下に安定でない、またはタンパク質分解切断に対して耐性がない。
【００１１】
植物由来の煮沸安定タンパク質：
Ｐｅｌａｈら（１９９５年）は、水ストレスを受けたポプラの若枝からの煮沸安定タンパク質の精製計画を教示している。煮沸安定タンパク質抽出物は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、６６ｋＤａ分子質量を有する主要バンドを生じた。微小配列決定の時、この６６ｋＤａタンパク質のＮ−末端配列は、コムギジャーミン（ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍｉｎ）ＧＦ−２．８およびＧＦ−３．８との高度の相同性を示した。ジャーミンおよびジャーミン様タンパク質は、遍在性であり、水溶性で、ホモ−オリゴマー細胞外糖タンパク質であり、両極端の熱−、ｐＨ−、および界面活性剤−安定性、およびプロテアーゼ耐性を示し、オキサレートオキシダーゼ活性を有する。しかしながらこれらは、まったくシャペロン様活性を欠いている。
【発明の開示】
【００１２】
本発明の１つの側面によれば、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質（本明細書において安定タンパク質、ＳＰ）であって、シャペロン様活性を有する安定タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチド；およびこの安定タンパク質の発現を指向するため第一ポリヌクレオチドに動作可能に連結されているプロモーター配列を含む第二ポリヌクレオチドを含む単離された核酸が提供される。
【００１３】
下記の本発明の好ましい実施形態における１つのほかの特徴によれば、このプロモーター配列は、真核生物のプロモーターである。
【００１４】
記載されている好ましい実施形態におけるさらにもう１つの特徴によれば、この真核生物プロモーターは、構成的プロモーターである。
【００１５】
記載されている好ましい実施形態におけるさらにもう１つの特徴によれば、このプロモーターは、植物プロモーター、例えば構成的植物プロモーター、組織特異的植物プロモーター、および誘導性植物プロモーターである。
【００１６】
記載されている好ましい実施形態におけるさらにもう１つの特徴によれば、（ｉ）この構成的植物プロモーターは、ＣａＭＶ３５Ｓ植物プロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓ植物プロモーター、ＦＭＶ３４Ｓ植物プロモーター、サトウキビ桿状バドナウイルス（ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ）植物プロモーター、ＣｓＶＭＶ植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチン植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチンＵＢＱ１植物プロモーター、大麦の葉のチオニンＢＴＨ６植物プロモーター、およびイネアクチン植物プロモーターからなる群から選択され；（ｉｉ）組織特異的植物プロモーターは、豆類ファゼオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）貯蔵タンパク質植物プロモーター、ＤＬＥＣ植物プロモーター、ＰＨＳβ植物プロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質植物プロモーター、大豆からのコングルチンガンマ植物プロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子植物プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡＣＴ１１アクチン植物プロモーター、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓからのｎａｐＡ植物プロモーター、およびじゃがいもパタチン遺伝子植物プロモーターからなる群から選択され；および（ｉｉｉ）誘導性植物プロモーターは、えんどう豆ｒｂｃＳ遺伝子由来の光誘導性植物プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子からの植物プロモーター、渇水中に活性なＤＲＥ、ＭＹＣ、およびＭＹＢ植物プロモーター、高塩濃度および浸透圧ストレス中に活性なＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａ  ｈｓｐ１７．７Ｇ４、およびＲＤ２１植物プロモーター、および病原性ストレス中に活性なｈｓｒ２０３Ｊおよびｓｔｒ２４６Ｃ植物プロモーターからなる群から選択される。
【００１７】
好ましい実施形態におけるさらにもう１つの特徴によれば、このプロモーター配列は、原核生物のプロモーターである。
【００１８】
下記の本発明の好ましい実施態様におけるさらにほかの特徴によれば、第一ポリヌクレオチドは、ウイスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）配列分析パッケージのベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）ソフトウエアを使用し、スミス・アンド・ウオーターマン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０と少なくとも６０％同一な配列を有する。この場合、ギャップ重み付けが５０、長さ重み付けが３、平均マッチが１０、平均ミスマッチが−９である。
【００１９】
記載されている好ましい実施形態におけるさらにほかの特徴によれば、この安定タンパク質は、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、スミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と少なくとも６０％相同な配列を有する。この場合、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２である。
【００２０】
記載されている好ましい実施形態におけるさらにほかの特徴によれば、この安定タンパク質は、本来はオリゴマーである。
【００２１】
記載されている好ましい実施形態におけるさらにほかの特徴によれば、シャペロン様活性は、タンパク質の熱安定化を包含する。
【００２２】
記載されている好ましい実施形態におけるさらにほかの特徴によれば、この単離された核酸はさらに、追加のタンパク質をコードする第三ポリヌクレオチドを含み、この第三ポリヌクレオチドは、５’または３’位のどちらかにおいて、第一ポリヌクレオチドに隣接し、かつインフレームであり、第一および第三ポリヌクレオチドは、安定タンパク質と追加タンパク質との融合タンパク質を組合わせてコードし、この場合、この追加タンパク質は、安定タンパク質に対してＣまたはＮ末端に配置されてもよく、融合タンパク質はまた、安定タンパク質と追加タンパク質との間に約１〜１００アミノ酸のスペーサーペプチドを含んでいてもよい。
【００２３】
本発明のもう１つの側面によれば、本明細書に記載されている核酸を含んでいる核酸構築物が提供される。
【００２４】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、本明細書に記載されている核酸を用いて形質転換された細胞または生物が提供される。
【００２５】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する安定タンパク質をコードする遺伝子の単離方法であって、本明細書に記載されているポリヌクレオチド、または少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも５０、さらに好ましくは少なくとも１００連続塩基のこれの一部分で発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【００２６】
本発明の付加的側面によれば、例えばタンパク質の安定化に有効なシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性ポリペプチドが提供される。
【００２７】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるほかの特徴によれば、このポリペプチドは、本明細書に記載されているようなポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２８】
記載されている好ましい実施態様におけるさらにほかの特徴によれば、このポリペプチドは、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、スミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と少なくとも６０％相同な配列を有する。この場合、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２である。
【００２９】
記載されている好ましい実施態様におけるさらにほかの特徴によれば、このポリペプチドは、本来はオリゴマーであり、好ましくは少なくとも１０サブユニットのホモ−オリゴマーである。
【００３０】
本発明のさらに１つの付加的側面によれば、本明細書に記載されているポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体、すなわちポリクローナルまたはモノクローナル抗体が提供される。
【００３１】
本発明のさらに１つの付加的側面によれば、凝集性タンパク質が凝集体として凝集するのを防ぐ方法であって、本明細書に記載されているポリペプチドの有効量を、この凝集性タンパク質と接触させる工程を含む方法が提供される。
【００３２】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、凝集性タンパク質の凝集体を脱凝集する方法であって、本明細書に記載されているポリペプチドの有効量を、この凝集体と接触させる工程を含む方法が提供される。
【００３３】
したがって本発明は、凝集性タンパク質のタンパク質凝集に関連した病気の治療方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、この凝集性タンパク質の凝集を脱凝集するか、および／または防ぐのに十分な量で、これを必要とする被験者に投与する工程を含む方法を提供する。この凝集性タンパク質は、例えばベータアミロイドまたはプリオンである。
【００３４】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、変性条件に対してタンパク質を安定させる方法であって、本明細書に記載されているポリペプチドの有効量を、タンパク質と接触させる工程を含む方法が提供される。
【００３５】
本発明のなおもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を濃縮するかまたは単離する方法であって、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物を煮沸する工程；（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；および所望により（ｄ）これらの可溶性タンパク質のシャペロン様活性をアッセイし、このシャペロン様活性を有する安定タンパク質を濃縮するかまたは単離する工程を含む方法が提供される。好ましくはこの方法はさらに、これらの可溶性タンパク質をサイズ分画する工程も含む。
【００３６】
本発明のもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする遺伝子を単離する方法であって、本明細書に記載されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【００３７】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする遺伝子を単離する方法であって、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物を煮沸する工程；（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；（ｄ）これらの可溶性タンパク質のシャペロン様活性をアッセイし、シャペロン様活性を有する安定タンパク質を単離する工程；（ｅ）シャペロン様活性を有する安定タンパク質を認識する抗体の産生を刺激する工程；および（ｆ）これらの抗体で発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【００３８】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする遺伝子を単離する方法であって、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物を煮沸する工程；（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；（ｄ）これらの可溶性タンパク質のシャペロン様活性をアッセイするか、シャペロン様活性を有する安定タンパク質を濃縮するか、または単離する工程；（ｅ）安定タンパク質を微小配列決定して、これの少なくとも１つの部分アミノ酸配列を得る工程；（ｆ）このアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを設計する工程；および（ｇ）このオリゴヌクレオチドで発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【００３９】
本発明の１つのほかの側面によれば、シャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の単離方法であって、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０と少なくとも６０％同一な少なくとも１７塩基のポリヌクレオチドを有するｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【００４０】
本発明のさらに１つのほかの側面によれば、シャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の同定方法であって、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０のいずれか、または少なくとも１５塩基のこれらのいくつかの部分、またはこれに対応する部分との、予め決定された程度の同一性または相同性を有する配列について、複数の核酸および／またはアミノ酸配列を含む電子ライブラリーを検索する工程を含む方法が提供される。
【００４１】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、シャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の単離方法であって、（ａ）各々少なくとも長さが１５塩基である、少なくとも一対のオリゴヌクレオチドであって、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を増幅するために選択される少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを供給する工程；（ｂ）この少なくとも一対のオリゴヌクレオチドと核酸の１つのサンプルとを接触させ、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を増幅する工程；および（ｃ）変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸を単離するために、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を用いる工程を含む方法が提供される。
【００４２】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有するプロテアーゼ耐性タンパク質の界面活性剤を用いない単離方法であって、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物とプロテアーゼとを接触させる工程；（ｃ）プロテアーゼ耐性タンパク質を単離する工程；および所望により（ｄ）このプロテアーゼ耐性タンパク質を、シャペロン様活性についてアッセイする工程を含む方法が提供される。
【００４３】
本発明のもう１つの側面によれば、追加ポリペプチドに融合されたシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性ポリペプチドを含む融合タンパク質が提供され、好ましくはこの融合タンパク質は、オリゴマー形態を獲得する。
【００４４】
１つの実施形態において、シャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性ポリペプチドが、ペプチド結合を介して追加のポリペプチドに融合される。もう１つの実施態様において、シャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性ポリペプチドが、架橋剤を介して追加のポリペプチドに融合される。
【００４５】
本発明のさらに１つの付加的な側面によれば、本明細書に記載されている融合タンパク質を哺乳動物の免疫系に供する工程を含む免疫化方法が提供される。
【００４６】
本発明のもう１つの側面によれば、酵素調製物を酵素活性の低下から保護する方法であって、この酵素調製物に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、酵素調製物を酵素活性の低下から保護するのに十分な量で添加する工程を含む方法が提供される。
【００４７】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、酵素調製物の失われた酵素活性の少なくとも一部分を修復する方法であって、この酵素調製物に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、酵素調製物の失われた酵素活性の少なくともその部分を修復するのに十分な量で添加する工程を含む方法が提供される。
【００４８】
本発明のなおもう１つの側面によれば、ポリペプチドに対する免疫応答を低下させつつ、免疫系を有する動物へポリペプチドを投与する方法であって、動物へポリペプチドを投与する工程を含み、このポリペプチドは、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質に融合されており、これによって、ポリペプチドだけを動物へ投与することによって発生する免疫応答と比較して、このポリペプチドに対する免疫応答を低下させる方法が提供される。
【００４９】
本発明の付加的側面によれば、シャペロン様活性を有する、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を発現するトランスジェニック植物が提供される。
【００５０】
本発明のさらに１つの付加的側面によれば、植物を、生物または非生物ストレスに対してより耐性のあるものにする方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に発現するように植物を作り変える工程を含む方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらにもう１つの付加的側面によれば、植物を、生物または非生物ストレスからより回復可能なものにする方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に発現するように植物を作り変える工程を含む方法が提供される。
【００５２】
本発明の１つのほかの側面によれば、細胞移動（ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を増加する方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、細胞移動を増加させるのに十分な量へこれらの細胞を暴露する工程を含む方法が提供される。
【００５３】
本発明のさらに１つのほかの側面によれば、傷の治癒の加速方法であって、傷に対して、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、傷の治癒を加速させるのに十分な量を投与する工程を含む方法が提供される。
【００５４】
本発明のさらに１つのほかの側面によれば、傷の治癒の誘発方法であって、傷に対して、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、傷の治癒を誘発するのに十分な量を投与する工程を含む方法が提供される。
【００５５】
本発明のもう１つの側面によれば、毛髪、つめ、または皮膚の強化および／または手入れ方法であって、毛髪、つめ、または皮膚に対して、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、毛髪、つめ、または皮膚の強化および／または手入れのために十分な量を投与する工程を含む方法が提供される。
【００５６】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、活性成分としてシャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質、および製薬的に許容しうるキャリヤーを含む製薬組成物が提供される。
【００５７】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるほかの特徴によれば、この製薬組成物は、パッケージに包装され、傷治癒用途に使用するために印刷されて識別されている。
【００５８】
記載されている好ましい実施形態におけるさらにほかの特徴によれば、この製薬組成物は、パッケージに包装され、毛髪、つめ、または皮膚の強化および／または手入れ用途に使用するために印刷されて識別されている。
【００５９】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、生物源からの、シャペロン様活性を有する煮沸安定タンパク質の単離方法であって、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物を煮沸する工程；（ｃ）可溶性タンパク質画分を回収する工程；および所望により（ｄ）このプロテアーゼ耐性タンパク質をシャペロン様活性についてアッセイする工程を含む方法が提供される。
【００６０】
下記の本発明の好ましい実施形態におけるほかの特徴によれば、この方法はさらに、このタンパク質抽出物をプロテアーゼで消化する工程を含む。
【００６１】
本発明のもう１つの側面によれば、結合分子の結合活性を増加する方法であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質のオリゴマーの表面上に、この結合分子の多重コピーを示す工程を含む方法が提供される。この結合分子は例えば、受容体、リガンド、酵素、基質、阻害剤、抗体、および抗原であってもよい。結合分子が結合タンパク質である場合、この結合タンパク質は、遺伝子工学技術、または化学的架橋のどちらかを介して、オリゴマー単位に融合させることができる。結合分子がタンパク質でない場合、この結合分子は、化学的架橋技術を介して、オリゴマー単位に融合させるか、または連結させることができる。
【００６２】
本発明はまた、シャペロン様活性を有する複数の変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を含むオリゴマー、およびこのオリゴマーへ融合されている少なくとも２つの異なる分子を含むヘテロ複合物も提供する。これらの少なくとも２つの異なる分子は、少なくとも１つの第一酵素および第二酵素を含んでいてもよい。第一酵素および第二酵素は、合成または分解経路における一連の反応を触媒しうる。第一酵素および第二酵素は、合成または分解経路における異なる反応を触媒しうる。もう１つの実施形態において、これらの少なくとも２つの異なる分子は、少なくとも１つの結合分子および１つのリポーター分子を含んでいる。
【００６３】
本発明のもう１つの側面によれば、タンパク質１ｍｇあたりの保護活性単位として決定された、シャペロン様活性を有する予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の比活性を増加させる方法であって、１つの方法が、前記予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をオートクレーブする工程を含む一方で、他方の方法が、前記予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をプロテアーゼで処理する工程を含む方法が提供される。
【００６４】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、ＨＲＰ保護アッセイを用いて決定された場合、少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも５００、より好ましくは少なくとも１０００、より好ましくは少なくとも１５００、より好ましくは少なくとも２０００、より好ましくは少なくとも２５００、より好ましくは少なくとも３０００、より好ましくは少なくとも３５００、より好ましくは少なくとも４０００、より好ましくは少なくとも４５００、より好ましくは少なくとも５０００、より好ましくは少なくとも５５００、より好ましくは少なくとも６０００、より好ましくは少なくとも８０００、より好ましくは少なくとも１００００、より好ましくは少なくとも１５０００単位／ｍｇタンパク質のＨＲＰ保護活性を有し、シャペロン様活性を有する、単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質が提供され、前記ＨＲＰ保護アッセイは、異なる最終タンパク質濃度で、予め決定された体積においてシャペロン様活性を有する、単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質と、ｐＨ７．５における４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に存在する５ｎＭ  ＨＲＰ１００μｌとを混合し、このようにして第一反応混合物を形成し、前記反応混合物の２５℃における１６時間のインキュベーション後、前記第一反応混合物５μｌとＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）１００μｌとを混合し、このようにして第二反応混合物を形成し、前記第二反応混合物を１０分間インキュベーションし、前記第二反応混合物の反応を１Ｍ硫酸１００μｌの添加によって停止し、前記第二反応混合物中の比色変化を４３５ｎｍにおいて記録する工程を含み、ここで、前記単位は、前記ＨＲＰ保護アッセイにおいてＨＲＰ活性の５０％保護を与える、１ｍｇ／ｍｌの濃度においてシャペロン様活性を有する前記変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の希釈率として規定される。
【００６５】
本発明は、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を提供し、かつその用途を記載することによって、現在知られている立体配置の欠点に首尾よく対処する。
【００６６】
本発明は、添付図面を参照して、本明細書において例としてのみ記載されている。ここでこれらの図面を特に参照することによって、示されている詳細は、例としてのものであり、本発明の好ましい実施形態の例証的考察のみを目的としており、本発明の原理および概念的側面の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されている。この点に関して、本発明の基本的理解に必要なもの以上に詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされず、これらの図面を用いて行なわれる説明は、この発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具体化されうるかを当業者に明らかにする。
図１は精製された１２．４ｋＤａＳＰ１モノマーおよび１１６ｋＤａオリゴマー画分のＳＤＳ−トリシンＰＡＧＥでの分離を示している。ＳＰ１タンパク質の１２．４および１１６ｋＤａ画分を、煮沸安定ポプラ抽出物の１７％ＳＤＳ−トリシン−ＰＡＧＥ中の対応バンドから切除した。ついでこれらのタンパク質を電気溶出した。これらの電気溶出されたタンパク質のサンプルを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液中で調製し、５分間煮沸し、１７％ポリアクリルアミドＳＤＳ−トリシンゲル上に添加した。レーン１：１２．４ｋＤａＳＰ１画分。レーン２：１１６ｋＤａＳＰ１画分。
図２ａ〜ｃはＳＤＳ−および熱処理へのＳＰ１オリゴマーの安定性を示している。図２ａは、ＳＰ１オリゴマーのＳＤＳ安定性を示す。電気溶出されたＳＰ１（１１６ｋＤａ）を、ＳＤＳサンプル緩衝液中である範囲のモル比で調製し、１７％ポリアクリルアミドＳＤＳ−トリシンゲル上での分離前に煮沸するか（＋）、または煮沸しなかった（−）。図２ｂ〜ｃは、ＳＰ１オリゴマーの熱安定性を示す。電気溶出されたＳＰ１オリゴマー（１１６ｋＤａ）を、ＳＤＳサンプル緩衝液中で、１：９００ＳＤＳ：ＳＰ１モノマーの最終モル比で調製し、１７％ポリアクリルアミドＳＤＳ−トリシンゲル上での分離前に、指示された温度で、５、１０、または２０分間加熱した。ＲＴ：室温。Ｍ：分子サイズマーカー。
図３ａ〜ｃはネイティブまたは組み換えＳＰ１の添加による、熱不活性化からのシトレートシンターゼ（ＣＳ）の保護を示している。４３℃におけるＣＳの酵素活性を、連続した間隔においてアッセイした（次の実施例セクションに記載されているように）。図３ａ：ＣＳを、ＳＰ１の非存在（０）下または存在下に、次のモノマーモル比（ＣＳ：ＳＰ１）：１：５、１：１２．５、１：２５、１：５０で、またはＢＳＡおよびリゾチーム（１：２５ＣＳモノマー：ＢＳＡまたはリゾチームモル比）の存在下にアッセイした。図３ｂ：ＣＳを、組み換えＣＢＤ−ＳＰ１の非存在（０）下または存在下に、次のモノマーモル比（ＣＳモノマー：ＣＢＤ−ＳＰ１モノマー）、すなわち１：５、１：１０、および１：２０で、またはＣＢＤタンパク質の存在下に、モル比（ＣＳモノマー：ＣＢＤ）１：１０または１：２０でアッセイした。図３ｃ：ＣＳを、アルファクリスタリンの不存在（０）下または存在下に、モノマーモル比（ＣＳ：クリスタリン）１：１２．５で、またはグリセロールの存在下に最終濃度１０％または２０％でアッセイした。
図４はＳＰ１の添加による、熱不活性化からのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の保護を示している。５５℃におけるＨＲＰの活性を、（次の実施例セクションに記載されているように）連続的な間隔で、ネイティブＳＰ１の非存在（０）下または存在下に、モノマーモル比（ＨＲＰ：ＳＰ１）１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、または１：３００で、またはＢＳＡの存在下、最終比（ＨＲＰ：ＢＳＡ）１：３００でアッセイした。
図５はＳＰ１ｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号１）およびＳＰ１の推論されたタンパク質配列（配列番号２）を描いている。ＳＰ１ｃＤＮＡを、寄託番号ＡＪ２７６５１７としてＥＭＢＬに提出した。
図６ａ〜ｂは形質転換大腸菌細胞からの組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質（３２．４ｋＤａ）のＰＡＧＥ分析および免疫検出を示している。タンパク質を、１５％トリシン−ＳＤＳ−ポリアクリルアミドミニゲル上で分離した。レーン１：総細菌タンパク質（ｃＤＮＡ挿入断片を含有しない大腸菌）。レーン２：総形質転換細菌タンパク質（ｃｂｄ−ＳＰ１挿入断片を含有する大腸菌）。レーン３：セルロース−精製ＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質。
図６ａは細菌タンパク質のクーマシーブルー染色ゲルを提示している。
図６ｂはニトロセルロース上への細菌タンパク質のウエスタンブロッティング、およびポリクローナル抗−ＳＰ１抗体との反応（１：２，５００）によるＳＰ１タンパク質の免疫検出を示している。
図７はネイティブＳＰ１および組み換えＣＢＤ−ＳＰ１のゲル濾過ＨＰＬＣ分子量分析を示している。精製されたＳＰ１およびＣＢＤ−ＳＰ１は、ＴＳＫ−３０００カラムから、それぞれ９．８（Ｋａｖ＝０．３６０２５）および９．２（Ｋａｖ＝０．２７７５）分の保持時間で単一ピークとして溶離した。校正曲線は、これらの各々の溶離パラメーター（Ｋａｖ）に対する標準的タンパク質の分子量の対数（「材料および方法」参照）をプロットすることによって得られた。Ｒ２容積は、最小２乗法によって計算され、この図面に示されている。挿入：ＳＰ１およびＣＢＤ−ＳＰ１の溶離されたピークのクロマトグラム。
図８はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中に発現された組み換えＳＰ１の煮沸安定特性を示している。対照およびＳＰ１−形質転換Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞の培養培地を、１０分間煮沸するか（Ｂ）、または煮沸せず（ＮＢ）、ついで１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清サンプルを、完全強度（２％）ＳＤＳサンプル緩衝液（レーン２）中、またはネイティブ（０％ＳＤＳ）サンプル緩衝液（レーン０）中のどちらかで調製し、５分間煮沸し、１７％ポリアクリルアミドＳＤＳ−トリシンゲル上で分離した。無ＳＰ１：ＳＰ１配列を含んでいないＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからの培養培地。ＳＰ１含有：組み換えＳＰ１を分泌するＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからの培養培地。
図９は植物からの煮沸安定タンパク質画分によるＣＳの熱不活性化の予防を示している。４３℃におけるＣＳ活性は、（次の実施例セクションに記載されているように）、トマトＭ８２、トマトＶＦ３６、またはポプラ（ＣＳ：タンパク質は、１ミリリットルあたり１：２．５μグラムに等しい）の煮沸安定タンパク質抽出物、またはＢＳＡ（ＨＲＰ：ＢＳＡモル比１：３００）の存在下、連続的な間隔でアッセイした。
図１０はＳＰ１分子構造の走査電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を描いている。この画像は、回転および並進配列によって作られた５１粒子の平均を表わす。
図１１はＣＢＤ−１８０要素の下流であって、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ制限部位との間に挿入されたＳＰ１ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を含む、プラスミド構築物ｐＥＴ−ＣＢＤ１８０−ＳＰ１を描いている。
図１２は様々な関連および非関連植物種からの相同ＥＳＴからの推定ＳＰ１ポリペプチド（配列番号２）と推定ペプチド配列との間の配列相同性の比較を描いている（配列番号７−３２；多数＝１０．００；閾値：４．００；平均重み付け＝１．００；平均マッチ＝２．９１；平均ミスマッチ＝マイナス２．００）。共通配列（配列番号３３）が、各５０残基グループ分けについて示されている。
図１３は推定ＳＰ１ポリペプチド（配列番号２）と、あるｐｏｐ３ｍＲＮＡ（配列番号３４）によってコードされた推定ペプチドとの間の配列相同性の比較を描いている。
図１４ａ−ｄはＳＰ１への抗原性交差反応性を有するマツおよびトマトからのＳＰの免疫検出を描いている。マツ（図１４ａおよび１４ｂ）およびトマト（図１４ｃおよび１４ｄ）からの総煮沸安定タンパク質を、（次の実施例セクションに記載されているように）調製し、ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上へブロッティングし、交差反応性タンパク質を、抗−ＳＰ１または抗−組み換えＳＰ１抗体で免疫検出した。図１４ａは、１２．５％ＳＤＳ−グリシンＰＡＧＥでの分離、ニトロセルロース上へのブロッティング、および抗−組み換えＳＰ１（抗−ＣＢＤ−ＳＰ１）抗体との反応後、雨季（レーンＷ１およびＷ２）または乾季（レーンＳ１およびＳ２）におけるマツ（Ｐｉｎｕｓ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）葉からの煮沸安定タンパク質の免疫交差反応性を描いている。図１４ｂは、１７％ＳＤＳ−トリシンＰＡＧＥでの分離、ニトロセルロース上へのブロッティング、および抗−ネイティブ（オリゴマー）ＳＰ１抗体との反応後、精製ポプラＳＰ１（ＳＰ１）を用いて、３６時間冷間処理された（冷）、３日間塩処理された（塩）、または未処理（Ｃ）のマツの若木の免疫交差反応性を描いている。図１４ｃおよび１４ｄは、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の葉からの煮沸安定タンパク質の免疫交差反応性を描いている。渇水ストレスをともなう（図１４ｃ）（レーンＤ）、渇水ストレスをともなわない（Ｃ）分離、または単独の分離（０）；または塩ストレスをともなう（レーン０、０．１、０．２、０．３、および０．４Ｍ  ＮａＣｌ）またはともなわない（Ｈ２Ｏ）分離（図１４ｄ）に付された葉からの抽出物を、１７％ＳＤＳ−トリシンＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上へブロッティングし、抗−組み換え（抗−ＣＢＤ−ＳＰ１）抗体と反応させた。
図１５はＳＰ１がα−アミラーゼをＣａＣｌ２誘発された不活性化から保護することを示している棒グラフである。α−アミラーゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ａ６３８０、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．０中に溶解されたもの、６ｍＭ  ＮａＣｌを含む、０．２ｍｇ／ｍｌ）を、漸増ＣａＣｌ２濃度の存在下、室温（２５℃）で２時間、ＳＰ１（０．７μＭ、１２−マー複合体のもの）（α−アミラーゼ：ＳＰ１モル比６：１）の非存在下または存在下、インキュベーションした。α−アミラーゼ活性は、「シグマ・ダイアグノスティックス・アミラーゼ（ＳＩＧＭＡ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ  ＡＭＹＬＡＳＥ）」（シグマ、Ｃａｔ番号５７７−３）を用いて測定し、未処理酵素（０−氷）のパーセンテージとして表示された。
図１６はＳＰ１が室温でのインキュベーションの間α−アミラーゼ活性を保護することを示す棒グラフである。α−アミラーゼ（シグマ、Ａ６３８０、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．０中に溶解されたもの、６ｍＭ  ＮａＣｌを含む、０．２ｍｇ／ｍｌ）を、室温（２５℃）で１週間、様々な濃度でＳＰ１の不存在下（０）または存在下にインキュベーションした。α−アミラーゼ活性を、α−アミラーゼによって加水分解された後に残存したデンプンの量を測定することによってテストした。活性は、３７℃で１分あたりのα−アミラーゼ１ミリグラムによって加水分解されたミリグラムデンプンとして規定される。この図面における相対活性は、未処理酵素（０−冷）のパーセンテージとして表示される。
図１７はＳＰ１がα−アミラーゼ活性を修復することを示す棒グラフである。α−アミラーゼ（シグマ、Ａ６３８０、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．０中に溶解されたもの、６ｍＭ  ＮａＣｌを含む、０．２ｍｇ／ｍｌ）を、室温（２５℃）において０．１ｍｇ／ｍｌ（０．７μＭ）ＳＰ１でインキュベーションした。α−アミラーゼ活性を、「シグマ・ダイアグノスティックス・アミラーゼ」（シグマ、Ｃａｔ番号５７７−３）を用いて２時間後にテストした。アミラーゼ：ＳＰ１モノマーモル比は、６：１であった。
図１８はＳＰ１が、損傷ＨＲＰを修復することを示す棒グラフである。希釈ＨＲＰ溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｎＭ、ｐＨ７．５）を、室温（２５℃）で３０分間インキュベーションし、ついでＳＰ１または緩衝液を添加した（１７０ｎＭ、１：１７のＨＲＰ：ＳＰ１の１２−マー複合体モル比に相当する）。ＨＲＰ活性は、示されているように、異なる時点で測定した。相対活性は、未処理酵素（０時間）のパーセンテージとして計算された。
図１９はＳＰ１がＳＯＤ活性を修復することを示すプロットである。化粧品グレードＳＯＤ（「ディスムチン（ｄｉｓｍｕｔｉｎ）」、ペンタファーム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ  Ｌｔｄ．））を、５０ｍＭアセテート／トリス緩衝液、ｐＨ５．５、１．０ｍＭＥＤＴＡ中に１０００倍希釈し（最終ＳＯＤ濃度１０単位／ｍｌ、この場合ＳＯＤ単位は、このアッセイの特定条件下、ピロガロールの減少率中に５０％阻害を引起こす酵素の量として規定される）、３７℃で、指定された濃度でＳＰ１の非存在または存在下にインキュベーションした。ＳＯＤ反応条件は、次のように、２５℃で使い捨てプラスチック１ｍｌキュベットにおいて決定した。すなわち、ＳＯＤ溶液１００μｌ（１０Ｕ／ｍｌ）を、トリス／アセテート緩衝液８００ｍｌ、ｐＨ８．３、１．０ｍＭＥＤＴＡ、および同じ緩衝液中に溶解された（最終濃度０．２ｍＭ）２ｍＭピロガロールの新たに作られた溶液１００μｌと混合した。反応緩衝液中の最終ｐＨは、８．０であった。光学密度は、６０分後、４２０ｎｍで室温において記録された。
図２０ａおよび２０ｂ（ｉ）〜（ｉｖ）はＣＢＤを注射されたマウスのＣＢＤに対する免疫応答が、ＣＢＤ−ＳＰ１融合が注射されたマウスよりもはるかに高いことを示すグラフである。１６匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に、ＣＢＤ｛５μＭ（マウス１〜４）、０．０５μＭ（マウス９〜１２）｝またはＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質｝５μＭ（マウス５〜８）、０．０５μＭ（マウス１２〜１６）｝を注射した（１００μｌ）。２回の注射を、０日目および２１日目に各マウスに行なった。マウスは、第一免疫化前（ＮＩＳ）、第一免疫化の１４日、２１日、および３５日後に採血した。抗原としてＣＢＤを用いたＥＬＩＳＡを使用し、結合抗体の量を検出するためにＨＲＰ共役抗マウス抗体を用いて、血清中の抗体活性をテストした。この目的のために、プレートをＣＢＤでコーティングした（１．０μｇ／ｍｌＰＢＳ、１２０μｇ／ウエル、２時間、３７℃で）。ブロッキングを、３７℃で１時間、ＰＢＳ中１％ＢＳＡを用いて実施した。第一抗体反応は、３７℃で１時間、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中に血清を希釈して実施した。すべての洗浄工程は、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０が補足されたＰＢＳで５回実施した。第二抗体反応を、ＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧ（シグマ、１／１００００希釈された、ｖ／ｖ）で実施した。発色は、ＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＰＩＥＲＣＥ）を用いた５分のインキュベーション後に１Ｍ硫酸によって停止した。
図２１ａ〜ｃは塩ストレスおよびストレスからの回復後のポプラ植物の幹の伸長、葉の保持、および乾燥重量を示す棒グラフである。ポプラ植物を、構成的プロモーターＣａＭＶ３５Ｓの制御下、ｓｐ１遺伝子を内部にもつベクターで形質転換した。異なるレベルのＳＰ１発現を示す、２つの選択されたｓｐ１−トランスジェニックポプラライン、ならびに非形質転換植物（ＮＴ）を、塩耐性についてテストした。インビトロでクローン化されたポプラ植物を、温室で順化し、１：１バーミキュライト：園芸培地溶液が入っている半リットルポットで馴化させた。各ラインおよび各処理に対して６つの植物のグループを用いたブロック実験を、制御された温室（昼は２６℃、夜は２０℃）において設計した。対照植物に、肥料２００ｐｐｍ（７／３／７、ＮＰＫ）を含んでいる水道水（１ポットあたり２５０ｍｌ）を毎日散水した。塩ストレスを受けた植物に、対照として散水したが、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよびＣａＣｌ２（モル比６：１で）を３週間、すなわち「ストレス期間」の間補足した。塩処理の終わりに、すべての植物に、塩をともなわずに追加の３週間、すなわち「回復期間」の間散水した。幹の長さおよび葉の数、ならびに浸透圧を測定するための葉のサンプルを、ストレスおよび回復期間の間、毎週調べた。新鮮な重量および乾燥重量を、実験の最後に調べた。
図２２は傷の治癒に対するＳＰ１の効果を示す棒グラフである。ヒト繊維芽細胞を、増殖培地（１０％ＦＣＳ、２％グルタミンおよび抗生物質を含んでいるＤＥＭＥ培地２ｍｌ）中に２０００００／ペトリ皿（直径４ｃｍ）の密度で播種した。培地は、細胞が密集成長（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達するまで２日ごとに変えた。ミクロピペットチップ（１ｍｌチップ）を用いて引っかききずを作り、ばらばらになった屑を除去するために、この皿をＰＢＳ中で２回洗浄した。この引っかききずに沿う４つの無作為に選択されたスポットを、皿の底部にマーカーペンを用いてマークした。植物由来ＳＰ１タンパク質５μｇ／ｍｌを含むか、または含まない新鮮な培地を、この培地に添加した。これらの細胞を、３７℃で２８時間インキュベーションした。各プレート中の引っかききずは、倒立顕微鏡に連結されたビデオカメラを用いて、この引っかききずに沿う４つのマークされたスポットの写真を撮ることによって、０および２８時間の時点で記録された。すべての画像は、同じ倍率で写された。この引っかききずの距離は、これらの写真上で測定された。これらのデータは、３つのレプリカペトリ皿の１２画像について平均した。この図面において、密集成長は、当初引っかききずのパーセンテージとして計算された。
図２３ａ〜ｂはゲルの写真および表であり、ＣＢＤ−ＳＰ１はＣＢＤタンパク質がセルロースに結合するように結合し、ＳＰ１がＨＲＰを保護するように保護することを示している。等量のＣＢＤおよびＣＢＤ−ＳＰ１（１５ｐモル、ＣＢＤ分子量を基準にして計算された）を、セルロース（シグマセル（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）型２０）３０ｍｇに加えた。これらのタンパク質サンプルは、セルロースに加えられる前（結合前）、セルロースからの溶離前（結合）、およびセルロースからの溶離後（溶離）に収集した。各段階からのタンパク質サンプルを、ＳＤＳ−サンプル緩衝液と混合し、５分間煮沸し、１５％トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に分離した。ＨＲＰ保護アッセイのために、ＨＲＰの１００μｌアリコート（シグマ、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｎＭ、ｐＨ７．５）を、２５℃で、ＳＰ１またはＳＰ１−ＣＢＤ融合タンパク質の存在下、様々な濃度でインキュベーションした。アリコートを１６時間後に除去し、残存酵素活性を決定した。ＨＲＰ反応条件は、次のように決定した。すなわち、５μｌの５ｎＭ  ＨＲＰおよび１００μｌのＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；ＰＩＥＲＣＥ）を２５℃でインキュベーションした。反応は、１Ｍ硫酸の添加によって１０分後に停止し、４３５ｎｍでミクロプレートリーダーによって記録した。ＨＲＰの比色反応ならびにＨＲＰ基質濃度は、直線範囲内にあると決定した。保護単位は、上記条件下にＨＲＰ活性の５０％保護を与える、１ｍｇ／ｍｌの濃度におけるＳＰ１溶液の希釈率である。
図２４ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２４ｂは植物および組み換え細菌からのＳＰ１タンパク質産出を示す写真である。大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ＳＰ１遺伝子（ｐＥＴ２９ａ、カナマイシン耐性が与えられている）を有するプラスミドで形質転換し、カナマイシンＡ（シグマＫ４０００；５０μｇ／ｍｌ）を含んでいるＭ９最少培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）中に（Ｏ．Ｄ．（６００ｎｍ））＝０．０５まで増殖させた。この手順を、全部で５連続希釈および再増殖の間反復した。滅菌グリセロールを、最終濃度１５％（ｖ／ｖ）まで添加した。４０μＬのアリコートを、無菌で滅菌管中に分注し、−８０℃に保存した。組み換えＳＰ１遺伝子を有する細菌の増殖：細菌グリセロール保存溶液のアリコート（４０μｌ）を、カナマイシンＡを含んでいるＭ９最少培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）１２ｍｌ中に無菌で２５０倍希釈し、１〜３のＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）まで増殖させた。この培養液を、複合培地中に１２０倍希釈し、０．８のＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）まで増殖させた。この時点で、この培養液は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、０．５ｍＭ）の添加によって誘導され、この培養物をさらに４時間増殖させた。細胞を、遠心分離（１０，０００ｇ、１５分、４℃）によって回収し、細胞ペレットを、−８０℃で冷凍保存した。細菌貯蔵培養物の細菌調製物からの組み換えＳＰ１の抽出および精製：細菌細胞ペレットを、トリスＨＣｌ緩衝液（３０ｍＭ；ｐＨ＝１０．５；１８０ｇ／リットル；Ｏ．Ｄ．（６００ｎｍ）＝１００〜１２０）中に縣濁し、濁度が４倍低下するまで氷上で超音波処理した（１時間、全能力の４０％のパルス）。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００およびリゾチームを添加し（それぞれ０．１％および１０μｇ／ｍＬ）、静かな攪拌をともなってインキュベーションし（３７℃で１時間）、ついで遠心分離した（１５０００ｇ、１５分、４℃）。ペレットを廃棄し、ＮａＣｌおよびＭｇＣｌ２を上清（それぞれ１５０ｍＭおよび２．５ｍＭ）に添加し、ｐＨをＨＣｌで８．３に調節した。核酸を消化するために、ベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（シグマ、Ｃａｔ番号Ｅ１０１４；０．３単位／ｍｌ）とともに、静かな攪拌をともなって（３７℃で１２時間）インキュベーションした。タンパク質を消化するために、ＮＨ４ＨＣＯ３およびサブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）（シグマ、Ｃａｔ番号Ｐ５３８０）を、この抽出物（それぞれ０．１Ｍおよび１μｇ／ｍｌ）に添加し、溶液を、静かな攪拌をともなって（３７℃で１２時間）インキュベーションした。煮沸感受性タンパク質を除去するために、抽出物を煮沸し（１０分）、氷上で冷却し、遠心分離した（１００００ｇ、１５分、４℃）。上清を、濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ番号４２）および膜フィルター（シュライヒャー・ウント・シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｌｌ）ＭＥ−２８、１．２μｍ細孔サイズ、およびＭＥ−２５、０．４５μｍ細孔サイズ）を通して濾過した。濾過物を濃縮し、濾過物が無色になるまで、トリス緩衝塩水またはホスフェート緩衝塩水で洗浄した。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法および標準としてのＳＰ１を用いて、タンパク質濃度を測���し、１０ｍｇ／ｍｌに調節した。チメロサール（Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）（シグマ、Ｃａｔ番号Ｔ８７８４）を添加した（５０ｐｐｍ）。溶液を、１ｍｌアリコートとしてネジ蓋付アンバービンに分注し、４℃で暗室に保存した。図２４ａ（ｉ）（左から右）レーン１−ポプラの葉の粗抽出物。このサンプルをトリシン適用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）緩衝液と混合し、ゲル上への適用前に１０分間煮沸した；レーン２−１０分間の煮沸および遠心分離後のポプラの葉の粗抽出物。サンプルをトリシン適用緩衝液と混合し、ゲル上への適用前に１０分間煮沸した。図２４ａ（ｉｉ）（左から右）レーン１−大腸菌中に発現された組み換えタンパク質の粗抽出物。このサンプルをトリシン適用緩衝液と混合し、ゲル上への適用前に１０分間煮沸した。レーン２−１０分間の煮沸および遠心分離後に大腸菌中に発現された組み換えタンパク質の粗抽出物。このサンプルをトリシン適用緩衝液と混合し、ゲル上への適用前に１０分間煮沸した。図２４ｂ−組み換えＳＰ−１は、煮沸およびタンパク質分解に耐性がある（左から右）：レーン１−粗抽出物：可溶化細菌（上記の文参照）；レーン２−１０分間の煮沸および遠心分離後の粗抽出物の上清。このサンプルをトリシン適用緩衝液と混合し、ゲル上への適用前に１０分間煮沸した。レーン３−１０分間の煮沸および遠心分離後の粗抽出物の上清。このサンプルを、トリシン適用緩衝液と混合したが、ゲル上への適用前に煮沸しなかった。レーン４−プロテイナーゼＫ処理後の粗抽出物。このサンプルをトリシン適用緩衝液と混合し、ゲル上への適用前に１０分間煮沸した。レーン５−プロテイナーゼＫ処理後の粗抽出物。このサンプルをトリシン適用緩衝液と混合したが、ゲル上への適用前に煮沸しなかった。
図２５はヒトの毛髪に対するＳＰ１の効果を示す棒グラフである。長さ約２０ｃｍのヒトの毛髪を、一人の個人から採取した。各毛髪を、各々が長さ約１０ｃｍの２つの断片にカットした。１つの断片を、トリス緩衝液｛（１００ｍＭ；ｐＨ８．０）、対照｝中で室温で１０分間インキュベーションし、他方の断片を、ＳＰ１を含んでいる同じ緩衝液（５０μｇ／ｍｌ；ＳＰ１処理された毛髪）中にインキュベーションした。この毛髪を、１０分間空気乾燥し、各々の個々の断片の強さを、他方の断片の強さと比較した。各々の毛髪断片を、マスキングテープを用いて金属棒へ、および他方の末端をプラスチックカップの取っ手に貼り付けた。このカップを、毛髪を通して金属棒から吊り下げた。毛髪が切れるまで、このカップに水を加えて重さを徐々に増した。強さは、毛髪が切れる以上の重量として規定した。ＳＰ１処理された毛髪の強さが、対照毛髪の強さよりも高い確率は、対スチューデントｔ−テストによって決定された場合、９７％である。
図２６ａ〜ｂはオートクレーブ処理後の組み換えＳＰ１比活性の増加を示す表およびプロットである。
図２７ａ〜ｂはクーマシーブルー染色ゲル電気泳動法結果の写真、および次のようなプロテアーゼ処理後の組み換えＳＰ１比活性の増加を示す棒グラフを示す。レーン１−１０倍希釈でのアルカラーゼ；レーン２−１００倍希釈でのアルカラーゼ；レーン３−１０００倍希釈でのアルカラーゼ；レーン４−１００００倍希釈でのアルカラーゼ；レーン５−無（煮沸のみ）；レーン６−低分子量マーカー＋ＳＰ１；レーン７−１０倍希釈におけるサビナーゼ；レーン８−１００倍希釈でのサビナーゼ；レーン９−１０００倍希釈でのサビナーゼ；レーン１０−１００００倍希釈でのサビナーゼ；レーン１１−無処理。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
本発明は、（ｉ）シャペロン様活性を有する、本明細書において安定タンパク質（ＳＰ）とも呼ばれている、新規の変性剤（例えば、煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性ホモ−オリゴマータンパク質；（ｉｉ）ＳＰの生産、精製、およびその比活性の増加方法；（ｉｉｉ）ＳＰをコードする核酸；（ｉｖ）ＳＰをコードする核酸の単離方法；（ｖ）ＳＰを認識する抗体；（ｖｉ）巨大分子、特にタンパク質の安定化、リフォールディング、活性化、凝集の予防および／または脱凝集のためのＳＰの使用；（ｖｉｉ）ＳＰを含んでいる融合タンパク質；（ｖｉｉｉ）これらの融合タンパク質をコードする核酸構築物；および（ｉｘ）免疫化のためのこれらの使用に関する。本発明の付加的側面および用途は、さらに下で考察される。
【００６８】
本発明の原理および操作は、図面および添付の説明を参照して、よりよく理解することができる。
【００６９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が、次の記載において示されているか、または実施例によって例示されている詳細に限定されないことを理解すべきである。本発明は、ほかの実施態様も可能であるし、または様々な方法で実行または実施することができる。同様に、本明細書において用いられている表現および用語法は、説明を目的としており、限定的なものとみなすべきでないことも理解すべきである。
【００７０】
本発明を実行に移している間、新規の主要な煮沸安定タンパク質は、水ストレスを受けたポプラ植物（本明細書においてＳＰ１と呼ばれる）から精製された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示されているように、ＳＰ１は、ネイティブ状態において、１１６ｋＤａの高分子量オリゴマー複合体として存在し、これは、８０℃を超える温度において、および高濃度（６００：１までのモル比ＳＤＳ：ＳＰ１モノマー）のＳＤＳの存在下に安定である。オリゴマーＳＰ１複合体は、極端な温度（１００℃）と高い（６００：１またはそれ以上のモル比ＳＤＳ：ＳＰ１モノマー）ＳＤＳ濃度との組合わせに付された時のみ、そのモノマー形態（１２．４ｋＤａ）に転換可能である。
【００７１】
さらには、本発明を実行に移している間、水ストレスを受けたポプラの粗タンパク質抽出物からのネイティブＳＰ１が、プロテイナーゼＫでのタンパク質分解消化への耐性を示したことが証明された。液体窒素−均質化ポプラ植物材料から抽出された時、プロテイナーゼＫでの６０分の消化後に残存する主な可溶性タンパク質は、ＳＰ１として同定された。さらにはプロテアーゼ精製ＳＰ１タンパク質は、そのオリゴマー性を維持する。したがってＳＰ１は、タンパク質分解消化への耐性を示し、植物材料から界面活性剤を用いることなく単離および精製されうる。
【００７２】
さらには、本発明を実行に移している間、ゲル精製されたネイティブＳＰ１が、熱不活性化／凝集に対して熱に不安定なタンパク質を安定化し、かつ修復するその能力についてテストされた。シトレートシンターゼ酵素活性は、酵素タンパク質の凝集によって、４３℃で１５分間インキュベーションされた時に低下した。いくつかのｓＨｓｐ（例えばアルファ−クリスタリン）は、ダイマーＣＳタンパク質の凝集を防ぐことができるが、ＣＳ触媒活性の不活性化を逆転させることはできない。ＳＰ１タンパク質の添加（１：５０ＣＳ対ＳＰ１モノマー）は、４３℃で４０分間ＣＳ酵素活性のほぼ完全な熱保護（９３％）を与えた。より低い濃度のＳＰ１は、有意ではあるが、比例してさらに低い熱安定化を与えた。ＢＳＡ、アルファ−クリスタリン、およびグリセロールは、熱不活性化からＣＳを保護することにおいて有効でなかった。同様な濃度のネイティブ精製オリゴマーＳＰ１もまた、５５℃への長時間暴露による触媒活性の熱不活性化から、モノマー酵素であるホースラディッシュペルオキシダーゼ（３００：１のＳＰ１対ＨＲＰモル比）を保護することにおいて有効であった（２時間後５３％残存活性）。さらには、ネイティブ精製オリゴマーＳＰ１は、熱不活性化後のホースラディッシュペルオキシダーゼの活性の修復において有効であった。したがってＳＰ１は、非変性条件下、生物活性の阻害をともなわずに、変性条件への暴露の間、モノマーおよびポリマータンパク質を安定化および修復するシャペロン様能力を示す。
【００７３】
さらには、本発明を実行に移している間、水ストレスを受けたポプラの若枝からのポリアデニル化ＲＮＡが、大腸菌中のラムダ発現ライブラリーのためのｃＤＮＡを調製するために用いられた。ＳＰ１ポリペプチド配列を発現するクローンは、ゲル精製ネイティブＳＰ１に対して産生を刺激されたポリクローナル抗−ＳＰ１抗体との反応性によって同定された。増幅および配列決定された時、５６７ヌクレオチドＳＰ１ｃＤＮＡ挿入断片（配列番号１）は、ＳＰ１ポリペプチドモノマーの全長コーディング配列（配列番号２）を表わすオープンリーディングフレームを含んでいることが発見された。このコーディング配列の分析は、トレオニン、アラニン、ロイシン、グルタミン、およびセリン残基に富み、トリプトファンが低く、システインを欠いた、高度に親水性のタンパク質を示した。ほかの報告されたタンパク質配列との相同性は検出されなかったが、様々な進化的に遠い（系統発生的に遠い）植物種からのＳＰ１との配列相同性を示すタンパク質が、ＥＳＴデータベースを用いて同定された。有意な相同性を有する２５配列が同定された（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおける３配列、トウモロコシにおける２配列、ジャガイモにおける１配列、イネにおける２配列、サトウモロコシにおける１配列、大豆における７配列、トマトにおける２配列、およびコムギにおける７配列、配列番号７−３２）。ＳＰ１とＰｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ  ｘ  Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓ  ｐｏｐ３ｍＲＮＡ配列との間に、９６．６％の相同性が見られる（それぞれ、核酸およびアミノ酸配列についての配列番号３４および３５）。推定ペプチド配列が整列され、ＳＰ１のペプチド配列（配列番号２）と比較されたが、例えば２〜３の保存されたコンセンサス配列：「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（６１−７５、配列番号３６）、「ＶＫＨ」（９−１１、配列番号３７）、および「ＫＳＦ」（４７−４９、配列番号３８）が明らかになり、このことは、ＳＰ１が、単子葉植物および双子葉植物の両方のゲノムにおいて広い発現量を有するタンパク質遺伝子のファミリーの一員であることを示す。しかしながらＳＰ１以外、機能は発見されず、このファミリーにおけるタンパク質のいずれのものともされなかった。
【００７４】
さらには、本発明を実行に移している間、ＳＰ１ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームが、ｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０ＣＢＤ発現ベクターのＣＢＤ要素の下流に適切な配向において挿入された時、ＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が得られた。組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質は、形質転換細菌の封入体中に検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、融合タンパク質は３２．４ｋＤａに移動し、ポリクローナル抗−ＳＰ１抗体でのウエスタンブロット分析によって決定された場合、高度に免疫反応性であった。したがってこの融合タンパク質およびネイティブＳＰ１は、共通のエピトープを有する。この抗原同一性はさらに、ポリクローナル抗−ＣＢＤ−ＳＰ１抗体の生成のときにもさらに証明された。セルロースへのＣＢＤ要素の親和性を利用して、組み換えＣＢＤ−ＳＰ１タンパク質が、セルロースビーズ上で精製された。ポリクローナル抗体は、高度に精製された融合タンパク質に対して産生を刺激された。抗−ＣＢＤ−ＳＰ１抗体および抗−ネイティブＳＰ１抗体のどちらも、ゲル濾過ＨＰＬＣ−精製ネイティブタンパク質（１７２．５±１．２５ｋＤａ）および組み換えタンパク質（２６７．５±２．５ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥで、同じＳＰ１およびＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質を認識した。したがって組み換えＳＰ１配列は、このネイティブタンパク質の抗原性特性およびオリゴマー形成特性を保持する。
【００７５】
さらには、本発明を実行に移している間、非融合組み換えＳＰ１の分泌は、ＳＰ１コーディング配列の一部分をインフレームで、分泌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ中にクローン化し、検証されたインフレーム構築物を用いて宿主植物細胞を形質転換することによって達成された。高レベル発現のスクリーニングおよび誘導は、組み換えＳＰ１が培養培地中に分泌されることを明らかにした。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによって分泌された非融合組み換えＳＰ１は、抗−ネイティブＳＰ１および抗−組み換えＣＢＤ−ＳＰ１ポリクローナル抗体と抗原的に交差反応性であることが発見された。
【００７６】
さらには本発明を実行に移している間、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ培養培地から回収された組み換えＳＰ１は、極端な変性条件に付され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚化された。ネイティブタンパク質と同様に、組み換えＳＰ１は、高界面活性剤濃度（例えば２％ＳＤＳ）または高温（例えば煮沸）への暴露に続いて、依然としてオリゴマー複合体として留まった。これらの２つの両極端、すなわち高ＳＤＳ濃度および煮沸の組合わせのみが、タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでモノマー形態として移動させた。したがって組み換えＳＰ１はまた、ネイティブＳＰ１タンパク質の抗原性および煮沸および界面活性剤安定性オリゴマー特徴を保持する。
【００７７】
組み換えＳＰ１ポリペプチドは、ネイティブＳＰ１と同様なシャペロン様活性を有する。比較的低いモノマーモル比（２０：１ＣＢＤ−ＳＰ１：ＣＳ比）において、精製ＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質は、シトレートシンターゼ（ＣＳ）活性の熱不活性化に対して有意な（７３％）保護を与えた。より低いＣＢＤ−ＳＰ１対ＣＳ比（５：１）は、比例してさらに少ない保護（３３％）を生じる一方、より高い濃度のリゾチームまたはアルファ−クリスタリンでのＣＳのインキュベーションは、ＣＳ酵素活性に対して安定化作用を有した。したがって、クローン化されたＳＰ１配列によってコードされたＳＰ１タンパク質の部分は、ネイティブタンパク質の抗原性特性および熱安定化特性の両方を保持する。
【００７８】
ＳＰ１のオリゴマー性は、走査電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像化を介して調べられた。これらの画像は、約１１ｎｍの外径を有するリング様配列に配列された、１２サブユニットのオリゴマーを明らかにした。
【００７９】
ＣＳの触媒活性を保護することが発見された主要煮沸安定タンパク質が、ほかの系統発生的に遠い植物、すなわちトマトおよびマツにおいて検出された。ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離され、ニトロセルロース上にブロッティングされ、抗−ＳＰ１抗体で免疫検出された時、これらの遠い種からの煮沸安定タンパク質抽出物は、ＳＰ１のモノマーおよびオリゴマー構造の両方に相互関連する交差反応性タンパク質を含んでいることが発見された。さらには、トマトおよびマツからのこれらの交差反応性タンパク質は、渇水、低温および塩ストレス反応性であるように見えた。したがって系統発生的に遠い種からのＳＰであって、ＳＰ１との免疫交差反応性を示すＳＰもまた、シャペロン様活性を有する。
【００８０】
さらには、本発明を実行に移している間、ＳＰは、酵素調製物を酵素活性の低下から保護するため、酵素調製物の失われた酵素活性の少なくとも一部分を修復するために用いることができることが発見された。さらには、ＳＰは、ポリペプチドに対する免疫応答を低下させつつ、免疫系を有する動物へポリペプチドを投与するために用いることができることも発見された。さらには、ＳＰの自然量以上にＳＰを発現するトランスジェニック植物は、非生物ストレスに対してより耐性があり、かつ非生物ストレスからより回復可能であることも発見された。生物ストレスに対する同様な挙動、例えば寄生虫感染が予測される。さらには、ＳＰは細胞移動を増加させるために用いることができ、したがって傷治癒の加速および／または誘発のために用いることができることも発見された。同様にＳＰは、毛髪の強さを増加させるために用いることができることも発見された。ＳＰは、つめおよび皮膚の強さも同様に増加させるために用いることができるであろうと予測される。
【００８１】
したがって、本発明の１つの側面によれば、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチドを含んでいる単離核酸が提供される。本発明のこの側面のポリヌクレオチドによってコードされた、この変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質は、シャペロン様活性を有し、これは本明細書にさらに詳しく記載されているようにアッセイ可能である。
【００８２】
本明細書において用いられているような「変性剤安定」という語句は、水溶液中での変性処理後の大きい（５０％以上）構造オリゴマー安定性のことを言う。変性処理は、煮沸、および化学的変性剤、例えば界面活性剤（例えばＳＤＳ）、尿素、またはグアニジン−ＨＣｌへの暴露を含むことがある。
【００８３】
本明細書および特許請求の範囲のセクションにおいて用いられているような「煮沸安定」という語句は、サイズ分画アッセイによって決定された場合、実質的に１００℃で水溶液中で、少なくとも１０分間の処理後、大きい（５０％以上）構造オリゴマー安定性のことを言う。
【００８４】
本明細書および特許請求の範囲のセクションにおいて用いられているような「界面活性剤安定」という語句は、サイズ分画アッセイによって決定された場合、１／２，０００モル比（モノマー：ＳＤＳ）を含有する水溶液中の処理後のオリゴマータンパク質の大きい（５０％以上）構造オリゴマー安定性のことを言う。
【００８５】
本明細書および特許請求の範囲のセクションにおいて用いられているような「プロテアーゼ耐性」という語句は、３７℃で少なくとも６０分間、５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有する水溶液中での処理後の大きい（５０％以上）安定性のことを言う。
【００８６】
本明細書および特許請求の範囲のセクションにおいて用いられているような「シャペロン様活性」という語句は、タンパク質のネイティブ折りたたみ、およびネイティブオリゴマー化を仲介し、不正確なタンパク質構造の形成を防ぎ、現存の不正確なタンパク質構造をもとの状態に戻し、部分的に変性されたタンパク質またはこれらのドメイン間に発生しうる不正確な相互作用を阻害することによって、ストレス関連損傷を制限する能力のことを言う。１つのこのような不正確な相互作用は、例えばシトレートシンターゼ中のように、酵素タンパク質の不可逆性変性、および熱両極端の結果として生じる触媒活性の有意な損失を生じることがあるであろう。もう１つの不正確な相互作用は、ストレスの結果として、または形質転換細胞中の異種遺伝子発現において、非ネイティブに折りたたまれたタンパク質の凝集を引起こすであろう。このような不正確な相互作用を防ぐことによって、「シャペロン様活性」を有する分子は、生物的に活性な分子へ、熱およびその他のストレス耐性を与え、タンパク質の凝集を防ぐことができるか、またはこれを逆転することさえできるであろう。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチドは、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、スミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０、または少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、または少なくとも２５０の連続塩基のこれらの一部分と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％同一な配列を有し、この場合、ギャップ重み付けが５０であり、長さ重み付けが３であり、平均マッチが１０であり、平均ミスマッチが−９である。
【００８８】
配列番号１は、発現ライブラリー、および熱安定タンパク質画分の主要バンドに対して産生を刺激された抗−ＳＰ１抗体を用いてクローン化されたポプラ（ＳＰ１）からの安定タンパク質（ＳＰ）をコードするｃＤＮＡである。配列番号３４は、相同配列である。これらまたはほかの相同配列、および従来の核酸ハイブリダイゼーション、逆転写ＰＣＲ、またはほかの技術を用いて、あるいはまた抗−ＳＰ１抗体を用いて、当業者は、（ｉ）ＳＰ１をコードするゲノムクローン；および（ｉｉ）ほかの種からの安定タンパク質のｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離することができる。さらにはこの文脈において、ＳＰ１は、水ストレスを受けたポプラからの煮沸安定タンパク質画分中の主要タンパク質であり、これはほかの植物種中に存在し、したがってこれは、特に水ストレス条件下、あらゆる植物の煮沸安定タンパク質画分中の最も豊富なタンパク質であると予想されることも強調すべきである。このことによって、これらの単離およびこれをコードするポリヌクレオチドの単離が、例えば分取ゲル電気泳動法、ペプチド単離、および微小配列決定、ついで合成オリゴヌクレオチドを用いるか、またはＲＴ−ＰＣＲによって、適切なライブラリーまたはゲノムライブラリーのスクリーニングによって、かなり単純にされる。
【００８９】
したがって本発明のもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する安定タンパク質をコードする遺伝子の単離方法であって、本明細書に記載されているポリヌクレオチドまたはこれらの一部分で発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法が提供される。追加の遺伝子単離方法が、以下で考察される。
【００９０】
本明細書で用いられている「相補的ポリヌクレオチド」または「ｃＤＮＡ」という語句は、逆転写酵素またはその他のあらゆるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた、メッセンジャーＲＮＡの逆転写の結果から本来生じる配列を含んでいる。このような配列は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、インビボまたはインビトロでその後増幅されうる。
【００９１】
本明細書において用いられている「ゲノムポリヌクレオチド」という語句は、もともと染色体に由来し、染色体の連続部分を反映する配列を含んでいる。
【００９２】
好ましくは、本発明のこの側面のポリヌクレオチドによってコードされた安定タンパク質は、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、スミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％相同な（同一＋類似のアミノ酸）配列を有する。この場合、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２である。
【００９３】
あるいはまた、またはこれに加えて、本発明のこの側面によるポリヌクレオチドは好ましくは、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０、または少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、または少なくとも２５０の連続塩基のこれらの一部分とハイブリッド形成可能である。
【００９４】
長い核酸（例えば長さ１００ｂｐ以上）についてのハイブリダイゼーションは、本発明の好ましい実施態様にしたがって、ストリンジェントなまたは穏和なハイブリダイゼーションによって実施される。この場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、１０％デキストランスルフェート、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、および５×１０６ｃｐｍ３２ｐ標識プローブを含有するハイブリダイゼーション溶液によって、６５℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液および６５℃での最終洗浄を用いて実施され、一方で、穏和なハイブリダイゼーションは、１０％デキストランスルフェート、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、および５×１０６ｃｐｍ３２ｐ標識プローブを含有するハイブリダイゼーション溶液によって、６５℃で、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳの最終洗浄溶液および５０℃での最終洗浄を用いて実施される。
【００９５】
したがって本発明のこの側面は、（ｉ）配列番号１および３４に示されているポリヌクレオチド；（ｉｉ）これらの断片；（ｉｉｉ）これらとハイブリッド形成可能な配列；（ｉｖ）これと相同な配列；（ｖ）異なるコドン使用を有する、同様なポリペプチドをコードする配列；（ｖｉ）自然発生的に、または人為的に誘導されて、ランダムにまたは標的化された様式で、突然変異、例えば欠失、挿入、または１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換を特徴とする改変された配列を包含する。各々のこのような配列は、発現系を用いて発現させることができ、これによってコードされたタンパク質は、安定性について、および本明細書の次の実施例のセクションでさらに説明され、例示されているようなシャペロン様活性についてテストされる。
【００９６】
本明細書において用いられている「異なるコドン使用を有する配列」とは、これらのアミノ酸を特定するトリプレットコドンの１つまたはそれ以上の塩基組成が異なる、同一なアミノ酸残基配列および数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のことを言う。このような異なるコドン使用は、個々のアミノ酸残基をコードする複数のトリプレットの関数であり、遠い種、例えば哺乳動物および原生動物における相同タンパク質の遺伝子について、および多重コピー遺伝子ファミリーの組織特異的タンパク質について証明されている。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明のこの側面による単離核酸はさらに、センス配向における第一ポリヌクレオチドの発現を調節するためのプロモーター配列を内部にもつ第二ポリヌクレオチドも含んでいる。このようなプロモーターは、これらの下流に存在する配列を転写するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに結合するのに役立つので、転写に必要とされるシス作用配列要素であることが知られている。
【００９８】
本明細書に記載されている第一ポリヌクレオチドは、本発明の本質的な要素であるが、これはモジュラーであり、異なる状況において用いることができる。本発明のポリヌクレオチドと併せて用いられるえり抜きのプロモーターは、それ自体は二次的重要性を有するものであり、あらゆる適切なプロモーターを含むであろう。しかしながら転写開始部位が、確かにオープンリーディングフレームの上流に位置するようにする必要がある。本発明の好ましい実施形態において、選択されるプロモーターは、昆虫および哺乳動物由来細胞を包含する、細菌、酵母、または植物または動物のより高等な細胞であれ、特別な該宿主細胞中で活性な要素を含んでいる。
【００９９】
本明細書において用いられている「真核生物のプロモーター」とは、真核生物細胞において遺伝子発現を指向しうるプロモーターのことを言う。これは、真核生物ゲノム、または真核生物細胞に感染しうるウイルスゲノムに由来しうる。
【０１００】
本明細書において用いられている「原核生物のプロモーター」とは、原核生物において遺伝子発現を指向しうるプロモーターのことを言う。これは、原核生物ゲノムまたはプラスミド、または原核生物細胞に感染しうるウイルスゲノムに由来しうる。
【０１０１】
本明細書および特許請求の範囲のセクションにおいて用いられている「植物プロモーター」という語句は、植物細胞において遺伝子発現を命令しうるプロモーターを包含する。このようなプロモーターは、植物、ウイルス、菌類、または動物起源から由来しうる。このようなプロモーターは、構成的、すなわち、複数の植物組織において高レベルの遺伝子発現を指向しうるか、または組織特異的、すなわち特定の１つまたは複数の植物組織において遺伝子発現を指向しうるか、または誘導性である、すなわち刺激下に遺伝子発現を指向しうるか、またはキメラでありうる。
【０１０２】
亜細胞小器官、例えば葉緑体、クロロプラスチド、またはミトコンドリアにおいて遺伝子発現を指向しうるプロモーターも、本発明の範囲内にある。このようなプロモーターは、原核生物においてもまた作用しうる。
【０１０３】
用いられる植物プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、またはキメラプロモーターであってもよい。
【０１０４】
構成的植物プロモーターの例には、非限定的に、ＣａＭＶ３５ＳおよびＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＦＭＶ３４Ｓプロモーター、サトウモロコシ桿状バドナウイルスプロモーター、ＣｓＶＭＶプロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＣＴ２／ＡＣＴ８アクチンプロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチンＵＢＱ１プロモーター、大麦の葉のチオニンＢＴＨ６プロモーター、およびイネアクチンプロモーターが含まれる。
【０１０５】
組織特異的プロモーターの例には、非限定的に、豆類ファゼオリン貯蔵タンパク質プロモーター、ＤＬＥＣプロモーター、ＰＨＳβプロモーター、ゼイン貯蔵タンパク質プロモーター、大豆からのコングルチンガンマプロモーター、ＡＴ２Ｓ１遺伝子プロモーター、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓからのＡＣＴ１１アクチンプロモーター、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓからのｎａｐＡプロモーター、およびじゃがいもパタチン遺伝子プロモーターが含まれる。
【０１０６】
誘導性プロモーターは、特異的刺激、例えば光、温度、化学物質、渇水、高塩濃度、浸透圧ショック、酸化条件を含むストレス条件によって、または病原菌に冒された場合に誘導されるプロモーターであり、これには、非限定的に、えんどう豆ｒｂｃＳ遺伝子由来の光誘導性プロモーター、アルファルファｒｂｃＳ遺伝子からのプロモーター、渇水中に活性なＤＲＥ、ＭＹＣ、およびＭＹＢプロモーター、高塩濃度および浸透圧ストレス中に活性なＩＮＴ、ＩＮＰＳ、ｐｒｘＥａ、Ｈａｈｓｐ１７．７Ｇ４、およびＲＤ２１プロモーター、および病原性ストレス中に活性なｈｓｒ２０３Ｊおよびｓｔｒ２４６Ｃプロモーターが含まれる。
【０１０７】
本明細書に記載されている第一（コーディング領域）および第二（プロモーター配列）ポリヌクレオチドは好ましくは、以下にさらに詳細に記載されるような追加の遺伝要素を好ましくは有する核酸構築物の一部を形成する。
【０１０８】
したがって、本発明による構築物は好ましくはさらに、適切な選択可能なマーカーを含んでいる。本発明によるより好ましい実施形態において、この構築物はさらに、複製起点も含んでいる。本発明によるもう１つの最も好ましい実施形態において、この構築物は、シャトルベクターであり、これは大腸菌（ここで、この構築物は適切な選択可能なマーカーおよび複製起点を含んでいる）中に増殖可能であり、同時に、えり抜きの生物の細胞中の増殖、またはそのゲノム中への組み込みに対しても適合性がありうる。本発明のこの側面による構築物は、例えばプラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルス、または人工染色体であってもよい。
【０１０９】
本発明の構築物は、細菌、例えば大腸菌、酵母細胞、またはより高等な細胞、例えば植物の細胞からの様々な範囲の種において、これによってコードされたポリペプチドを発現するために用いることができる。発現は、以下により詳細に記載されるように、安定または一過性であるように選択することができる。本発明のシャペロン様活性を有する安定タンパク質を過剰発現する植物は、ストレス適応性または耐性になると予想され、その理由は、植物中のＳＰ１およびＳＰ１様タンパク質の内因性発現が、ストレス誘導と相互関連しているからである（図１４および実施例セクション参照）。
【０１１０】
いくつかの核酸形質転換方法は、本発明によるストレス耐性植物の生成方法を実施するために用いることができる。
【０１１１】
したがって、単子葉植物および双子葉植物の両方の中への核酸構築物の多様な導入方法が存在する（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１年）４２：２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９年）３３８：２７４−２７６）。このような方法は、核酸構築物またはこれらの一部分の、植物のゲノム中への安定な組み込みか、または核酸構築物の一過性発現（この場合、これらの配列は、植物の子孫によって受け継がれない）に依存する。
【０１１２】
外因性配列、例えば本発明の核酸構築物中に含まれるものの、植物ゲノム中への安定なゲノム組み込みを実施する２つの原則的方法がある。
（ｉ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−媒介遺伝子移動：Ｋｌｅｅら、（１９８７年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７−４８６；ＫｌｅｅおよびＲｏｇｅｒｓ、「細胞培養および植物の体細胞遺伝学（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ）」、第６巻、「植物核遺伝子の分子生物学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ）」、編集、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，カリフォルニア州サンディエゴ（１９８９年）ｐ．２−２５において；Ｇａｔｅｎｂｙ、「植物生物技術（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、編集、Ｋｕｎｇ，Ｓ．およびＡｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、マサチューセッツ州ボストン（１９８９年）ｐ．９３−１１２において。
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、「細胞培養および植物の体細胞遺伝学」、第６巻、「植物核遺伝子の分子生物学」編集、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，カリフォルニア州サンディエゴ（１９８９年）ｐ．５２−６８において；これには、プロトプラスト中へのＤＮＡの直接取り込み方法も含まれる：Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら、（１９８８年）バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」６：１０７２−１０７４。植物細胞の短い電気ショックによって誘発されたＤＮＡ取り込み、Ｚｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．（１９８８年）７：３７９−３８４。Ｆｒｏｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６年）３１９：７９１−７９３。粒子照射による植物細胞または組織中へのＤＮＡ注入、Ｋｌｅｉｎら、バイオ／テクノロジー（１９８８年）６：５５９−５６３。ＭｃＣａｂｅら、バイオ／テクノロジー（１９８８年）６：９２３−９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０年）７９：２０６−２０９；ミクロピペット系の使用による：Ｎｅｕｈａｕｓら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７年）７５：３０−３６；ＮｅｕｈａｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０年）７９：２１３−２１７；または発芽花粉を用いたＤＮＡの直接インキュベーション、ＤｅＷｅｔら、「卵細胞組織の実験的操作（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ）」、編集．Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｎｔｅｌｌ，Ｓ．Ｈ．およびＤａｎｉｅｌｓ，Ｗ．Ｌｏｎｇｍａｎ，ロンドン、（１９８５年）ｐ．１９７−２０９；およびＯｈｔａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国（１９８６年）８３：７１５−７１９。
【０１１３】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ系は、植物ゲノムＤＮＡ中に組み込まれる、規定されたＤＮＡセグメントを含んでいるプラスミドベクターの使用を含んでいる。植物組織の接種方法は、植物種およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ送達系に応じて様々である。広く用いられている方法は、全植物分化の開始のための良好な源を提供するあらゆる組織外植片を用いて実施することができるリーフディスク手順である。Ｈｏｒｓｃｈら、「植物分子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ）Ａ５」、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８年）ｐ．１−９において。補足的方法は、減圧浸潤と組合わせてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ送達系を用いる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ系は、トランスジェニック双子葉植物の作製において特に実行可能である。
【０１１４】
植物細胞中への直接ＤＮＡを移入する様々な方法がある。エレクトロポレーションにおいて、プロトプラストが、強い電界に短く暴露される。マイクロインジェクション法において、ＤＮＡは、非常に小さいミクロピペットを用いて、これらの細胞中に直接、機械的に注入される。微粒子照射において、ＤＮＡは、マイクロプロジェクタイル、例えばマグネシウムスルフェート結晶、タングステン粒子、または金粒子上に吸着され、これらのマイクロプロジェクタイルは、物理的に加速されて細胞または植物組織中に入る。
【０１１５】
形質転換後、植物繁殖が行なわれる。植物繁殖の最も普通の方法は、種子による方法である。しかしながら種子繁殖による再生は、農作物において均一性の欠如があるという欠陥を有する。その理由は、種子は、メンデルの法則によって支配された遺伝的分散にしたがって、植物によって生産されるからである。基本的には各種子は、遺伝的に異なり、各々がそれ自体の特異的素質をともなって成長する。したがって形質転換植物は、再生植物が親トランスジェニック植物と同一の素質および特徴を有するように生産されるのが好ましい。したがってこの形質転換植物は、これらの形質転換植物の急速な一貫性のある再生を与える微小繁殖によって再生されることが好ましい。
【０１１６】
本発明の核酸構築物の中に含まれている単離核酸を一過性に発現するために利用することができる一過性発現方法は、非限定的に、上記のようなマイクロインジェクション法および照射を包含するが、一過性発現、およびウイルス媒介発現を有利にする条件下においてであり、この場合、核酸構築物を含むパッケージまたは非パッケージ組み換えウイルスベクターが、植物組織または細胞を感染させるために利用され、したがってその中に確立された繁殖組み換えウイルスが、非ウイルス核酸配列を発現する。
【０１１７】
植物宿主の形質転換に有用であることが証明されているウイルスには、ＣａＭＶ、ＴＭＶ、およびＢＶが含まれる。植物ウイルスを用いた植物の形質転換は、米国特許第４８５５２３７号（ＢＧＶ）、欧州特許公開第６７５５３号（ＴＭＶ）、日本公開特許公報第６３−１４６９３号（ＴＭＶ）、欧州特許公開第１９４８０９号（ＢＶ）、欧州特許公開第２７８６６７号（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ら、「分子生物学におけるコミュニケーション：ウイルスベクター（Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク、ｐｐ．１７２−１８９（１９８８年）に記載されている。植物を含む多くの宿主中の異種ＤＮＡの発現への使用のためのシュードウイルス粒子が、ＷＯ８７／０６２６１号に記載されている。
【０１１８】
植物中への非ウイルス外因性核酸配列の導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築、上記引例によって、ならびにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ら、「ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）」（１９８９年）１７２：２８５−２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７年）６：３０７−３１１；Ｆｒｅｎｃｈら、サイエンス（１９８６年）２３１：１２９４−１２９７；およびＴａｋａｍａｔｓｕら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０年）２６９：７３−７６によって示されている。
【０１１９】
このウイルスがＤＮＡウイルスである時、そのウイルスそれ自体のためにこれらの構築物を作ることができる。あるいはまた、このウイルスをまず、異種ＤＮＡを用いた所望のウイルスベクターの構築を容易にするために、細菌プラスミド中にクローン化することができる。ついでこのウイルスは、プラスミドから切除することができる。このウイルスがＤＮＡウイルスであるならば、細菌複製起点を、ウイルスＤＮＡに付着させることができ、これはついで、細菌によって複製される。このＤＮＡの転写および翻訳は、ウイルスＤＮＡを包膜するコートタンパク質を産生するであろう。このウイルスがＲＮＡウイルスであるならば、このウイルスは一般に、ｃＤＮＡとしてクローン化され、プラスミド中に挿入される。このプラスミドはついで、これらの構築物のすべてを作るために用いられる。ついでＲＮＡウイルスが、プラスミドのウイルス配列の転写、およびウイルス遺伝子の翻訳によって産生され、ウイルスＲＮＡを包膜するコートタンパク質を産生する。
【０１２０】
非ウイルス外因性核酸配列、例えば本発明の構築物中に含まれるものの、植物中への導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記引例によって、ならびに米国特許第５３１６９３１号において示されている。
【０１２１】
１つの実施形態において、次のような植物ウイルス核酸が提供される。すなわち、ネイティブコートタンパク質コーティング配列が、ウイルス核酸、非ネイティブ植物ウイルスコートタンパク質コーディング配列、および非ネイティブプロモーターから欠失されており、好ましくは植物宿主中の発現、組み換え植物ウイルス核酸のパッケージング、および組み換え植物ウイルス核酸による宿主の全身感染を確保することが可能である、非ネイティブコートタンパク質コーディング配列のサブゲノムプロモーターが挿入されているものである。あるいはまたコートタンパク質遺伝子を、非ネイティブ核酸配列の挿入によって不活性化することができ、したがってタンパク質が産生される。組み換え植物ウイルス核酸は、１つまたはそれ以上の追加の非ネイティブサブゲノムプロモーターを含んでいてもよい。各々の非ネイティブサブゲノムプロモーターは、植物宿主中の隣接遺伝子または核酸配列を転写または発現することが可能であり、互いとの、およびネイティブサブゲノムプロモーターとの組み換えが不可能である。非ネイティブ（異種）核酸配列は、ネイティブ植物ウイルスサブゲノムプロモーター、または１つ以上の核酸配列が含まれているならば、非ネイティブ植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入されてもよい。非ネイティブ核酸配列は、サブゲノムプロモーターの制御下、宿主植物中に転写または発現され、所望の産物を産生する。
【０１２２】
第二実施形態において、第一実施形態と同様に、組み換え植物ウイルス核酸が提供されるが、ただし、ネイティブコートタンパク質コーディング配列が、非ネイティブコートタンパク質コーディング配列の代わりに、非ネイティブコートタンパク質サブゲノムプロモーターの１つに隣接して配置されている。
【０１２３】
第三実施形態において、次のような組み換え植物ウイルス核酸が提供される。すなわち、ネイティブコートタンパク質遺伝子が、そのサブゲノムプロモーターに隣接しており、１つまたはそれ以上の非ネイティブサブゲノムプロモーターが、ウイルス核酸中に挿入されているものである。この挿入された非ネイティブサブゲノムプロモーターは、植物宿主中で隣接遺伝子を転写または発現させることができ、互いとの、およびネイティブサブゲノムプロモーターとの組み換えができない。非ネイティブ核酸配列は、非ネイティブサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入することができ、したがってこれらの配列は、サブゲノムプロモーターの制御下、宿主植物中に転写または発現され、所望の産物を産生する。
【０１２４】
第四実施形態において、第三実施形態と同様に、組み換え植物ウイルス核酸が提供されるが、ただし、ネイティブコートタンパク質コーディング配列は、非ネイティブコートタンパク質コーディング配列によって置換されている。
【０１２５】
ウイルスベクターは、組み換え植物ウイルス核酸によってコードされたコートタンパク質によって包膜され、組み換え植物ウイルスを産生する。組み換え植物ウイルス核酸または組み換え植物ウイルスが、適切な宿主植物に感染するために用いられる。組み換え植物ウイルス核酸は、宿主中への複製、宿主中への全身的広がり、および宿主中の異種遺伝子（単離核酸）の転写または発現が可能であり、所望のタンパク質を産生する。
【０１２６】
あるいはまた本発明のこの側面による核酸構成はさらに、正および負の選択マーカーも含み、したがってノックインおよびノックアウト手順に用いられる相同組み換えを含むが、これらに限定されるわけではない相同組み換え事象について選択するために用いることができる。当業者は、この構築物を用いて相同組み換え事象を受けた、トランスフェクションされた胚幹細胞を効率的に選択するための正および負の両方の選択遺伝子を含むノックアウトまたはノックイン構築物を、容易に設計することができる。ノックアウトおよびノックイン構築物の構築および使用に関するそれ以上の詳細は、次の文献に記載されている。例えばＦｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．およびＩｋｅｄａ、Ｊ．Ｅ．：「クレロックス（Ｃｒｅ−ｌｏｘ）部位特異的組み換えによる哺乳動物プロモーターのトラッピング（Ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｒｅ−Ｌｏｘ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」。ＤＮＡ  Ｒｅｓ  ３（１９９６年）７３−８０；Ｂｅｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．，Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｎ．Ａ．およびＣｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｇ．：「ヒトの病気のマウスモデル。第Ｉ部：マウスにおける遺伝子分析のための技術および資源（Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ）」。「遺伝子および発達（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」１１（１９９７年）１−１１；Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．，Ａｒｒｏｙｏ，Ｅ．，Ｋａｌｌａ，Ｋ．Ａ．，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｆ．Ｌ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．：「Ｔｓｔ−１／Ｏｃｔ−６／ＳＣＩＰは、末梢髄鞘形成における単一工程を調節し、正常な呼吸に必要とされる（Ｔｓｔ−１／Ｏｃｔ−６／ＳＣＩＰ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａ  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｓｔｅｐ  ｉｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｎｏｒｍａｌ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ）」。Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １０（１９９６年）１７５１−６２である。これらは、参照して本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
本発明のもう１つの側面によれば、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に発現するトランスジェニック植物が提供される。
【０１２８】
植物中の高いネイティブＳＰ発現は、ストレス条件と、明確に相互関連している。植物中のＳＰ１の過剰発現は、結果として（ｉ）植物を、生物ストレスに対してより耐性に、かつ生物ストレス後、より回復可能にした。
【０１２９】
これにより、本発明のもう１つの側面によれば、植物を生物または非生物ストレスに対してより耐性のあるものにする方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に発現させるために植物を作り変えることによって実施される。
【０１３０】
本発明のもう１つの側面によれば、生物または非生物ストレスから植物をより回復可能にする方法が提供される。この発明のこの側面による方法は、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、植物中に、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の自然量以上に発現させるために植物を作り変えることによって実施される。
【０１３１】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、安定タンパク質をコードする、本明細書に記載されているポリヌクレオチドのいずれとも特異的にハイブリッド形成可能な、塩基が少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０、または少なくとも４０個のオリゴヌクレオチドが提供される。
【０１３２】
より短い核酸（長さ１００塩基以下、例えば長さが１７〜４０塩基）のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな、穏和、またはマイルドなハイブリダイゼーションによって実施される。この場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、または３ＭＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および０．１％脱脂ドライミルクのハイブリダイゼーション溶液、Ｔｍの１−１．５℃以下のハイブリダイゼーション温度、３ＭＴＭＡＣＩの最終洗浄溶液によって、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、Ｔｍの１−１．５℃以下で０．５％ＳＤＳによって実施され；穏和なハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、または３ＭＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および０．１％脱脂ドライミルクのハイブリダイゼーション溶液、Ｔｍの２−２．５℃以下のハイブリダイゼーション温度、３ＭＴＭＡＣＩの最終洗浄溶液、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、Ｔｍの１−１．５℃以下で０．５％、６×ＳＳＣの最終洗浄溶液、および２２℃の最終洗浄によって実施され；一方、マイルドなハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、または３ＭＴＭＡＣＩ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．６）、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、および０．１％脱脂ドライミルクのハイブリダイゼーション溶液、３７℃のハイブリダイゼーション温度、６×ＳＳＣの最終洗浄溶液、および２２℃の最終洗浄によって実施される。
【０１３３】
本発明の付加的側面によれば、各々独立して、核酸増殖反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、その一部分の指数関数的増幅を指向するように、本明細書に記載されている単離核酸と反対配向において特異的にハイブリッド形成可能な、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２２、少なくとも２５、少なくとも３０、または少なくとも４０塩基のオリゴヌクレオチドのペアが提供される。このポリメラーゼ連鎖結反応およびほかの核酸増幅反応は、当業界においてよく知られており、本明細書においてそれ以上の説明を必要としない。本発明のこの側面によるオリゴヌクレオチドのペアは好ましくは、適合性融解温度（Ｔｍ）、例えば７℃未満、好ましくは５℃未満、より好ましくは４℃未満、最も好ましくは３℃未満、理想的には３℃〜０℃だけ異なる融解温度を有するように選択される。適切なオリゴヌクレオチドペアは、オリゴ（ＯＬＩＧＯ）ソフトウエアを用いて、選択することができる。
【０１３４】
その結果、本発明のさらに１つの付加的側面によれば、本明細書に記載されているプライマーのペアを用いて得られた核酸増幅産物が提供される。このような核酸増幅産物は、ゲル電気泳動法またはあらゆるほかのサイズベースの分離技術によって単離することができる。あるいはまたこのような核酸増幅産物は、親和性分離、すなわちストランド親和性または配列親和性のどちらかによって単離することができる。さらには、このような産物はひとたび単離されたら、制限、連結反応などによってさらに遺伝的に操作することができる。またはこれは、将来の使用のために必要に応じて標識することができる。
【０１３５】
本発明の現在好ましい実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドによってコードされた変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質は本来、例えば同心配列に配列された、例えば少なくとも１０個のサブユニット、場合により１２または１４個のサブユニットのホモ−オリゴマーである。このホモ−オリゴマーは、これらの用語が本明細書において規定されているような変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性である。しかしながら、安定タンパク質のホモ−オリゴマー形成のプロセスの結果、少なくとも短時間、２つまたはそれ以上のサブユニットの部分的に組立てられたホモ−オリゴマーが予想されるので、より少ないサブユニットのホモ−オリゴマーを生じることがあることが分かるであろう。
【０１３６】
本発明のもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする遺伝子の単離方法であって、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物を煮沸する工程；（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；（ｄ）シャペロン様活性を有する精製煮沸安定タンパク質を得る工程；（ｅ）シャペロン様活性を有する煮沸安定タンパク質を認識する抗体を産生刺激する工程；および（ｆ）これらの抗体で発現ライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【０１３７】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をコードする遺伝子の単離方法であって、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物を煮沸する工程；および（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；（ｄ）例えば、シャペロン様活性についてこれらの可溶性タンパク質をアッセイし、シャペロン様活性を有する安定タンパク質を濃縮するかまたは単離することによって、このシャペロン様活性を有する精製煮沸安定タンパク質を得る工程；（ｅ）シャペロン様活性を有する安定タンパク質を微小配列決定して、これの少なくとも１つの部分アミノ酸配列を得る工程；（ｆ）このアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドを設計する工程；および（ｇ）このオリゴヌクレオチドでライブラリーをスクリーニングする工程を含む方法が提供される。
【０１３８】
所定のアミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドの設計および合成、およびライブラリーをスクリーニングするためのこれらの使用は、当業界においてよく知られている。例えば、実施例セクションにおいて下記の一般的な引例を参照されたい。このようなオリゴヌクレオチドはあるいはまた、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ、および同様な手順において、ｃＤＮＡ増幅によって遺伝子を単離するために用いることができる。
【０１３９】
同様に、本発明によれば、シャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の単離方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、配列番号１、５、６、３４、３９、または４０の連続部分と少なくとも６０％同一な、少なくとも１７塩基のポリヌクレオチドでｃＤＭＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって実施される。このようなポリヌクレオチドは、上にさらに詳しく記載されており、好ましくは適切な標識を用いて標識される合成オリゴヌクレオチドであってもよい。
【０１４０】
本発明はさらに、シャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の同定方法にも関する。この方法は、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０のいずれか、または少なくとも１５、少なくとも１７、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０またはそれ以上の塩基のこれらの一部分、またはこれに対応する部分のいずれかとの、予め決定された程度の同一性または相同性を有する配列について、複数の核酸および／またはアミノ酸配列を含む電子ライブラリーを調査することによって実施される。
【０１４１】
本発明のもう１つの側面は、シャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸の単離方法を提供する。この方法は、（ａ）各々独立して、長さが少なくとも１５、少なくとも１７、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０またはそれ以上の塩基である、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのペアであって、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とのある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を増幅するために選択される、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのペアを供給する工程；（ｂ）オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのペアと核酸のサンプルとを接触させ、配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を増幅する工程；および（ｃ）配列番号１、２、５−３５、または３９−４０とのある程度の同一性を有するか、またはこれと相同なタンパク質をコードする核酸を用いて変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を潜在的にコードする核酸を単離する工程を含む。
【０１４２】
本発明のもう１つの側面によれば、例えばタンパク質の安定化に有効な、シャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定および／またはプロテアーゼ耐性ポリペプチドが提供される。好ましくはこのポリペプチドは、本明細書に記載されているポリヌクレオチドによってコードされる。最も好ましくはこのポリペプチドは、ウイスコンシン配列分析パッケージのベストフィットソフトウエアを使用し、スミス・アンド・ウオーターマン・アルゴリズムを利用して決定された場合、配列番号２または３５と、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同な（同一＋類似のアミノ酸）配列を有する。この場合、ギャップ作製ペナルティーが８であり、ギャップ延長ペナルティーが２である。本発明のこの側面のポリペプチドは好ましくは本来、ホモ−オリゴマー、好ましくは上でさらに詳しく説明されている１４サブユニットのホモ−オリゴマーである。以下にさらに詳細に記載されるように、本発明のポリペプチドは、植物の煮沸安定／プロテアーゼ耐性画分から精製することができる。あるいはまたこれは、本明細書においてさらに詳しく記載され、例示されるように、組み換えＤＮＡ技術を用いて製造することができる。これは次の実施例セクションにおいて示されており、本発明の組み換えポリペプチドおよびその対応ネイティブタンパク質が、同様なオリゴマー化、エピトープ、およびシャペロン様活性特性を共有するということが、さらに上で考察されている。
【０１４３】
本発明のポリペプチドは、当業界において知られている手段のいずれかによって精製することができる。タンパク質精製の様々な方法が、例えば「タンパク質精製へのガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、編集、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ、１９９０年；およびＳｃｏｐｅｓ、「タンパク質精製：原理および実行（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８２年に記載されている。
【０１４４】
したがって本発明のもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定およびプロテアーゼ耐性タンパク質の濃縮または単離方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出して、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物を煮沸する工程；（ｃ）可溶性タンパク質を収集する工程；および所望により（ｄ）可溶性タンパク質のシャペロン様活性についてアッセイする工程によって実施される。好ましくはこの方法はさらに、これらの可溶性タンパク質をサイズ分画する工程、および本明細書においてさらに詳しく記載されるように、シャペロン様活性について分画されたタンパク質をアッセイする工程も含む。
【０１４５】
本明細書において用いられている、「タンパク質を単離する」という語句は、タンパク質を、その自然環境の成分から同定、および分離および／または回収することを意味する。その自然環境の汚染成分は、このタンパク質についての診断、治療、または商業的使用を妨害する材料であり、これには、酵素およびほかのタンパク質または非タンパク質溶質を含めることができる。本明細書において用いられている「タンパク質を濃縮する」という用語は、タンパク質を、上記のように、その自然環境の汚染成分の少なくとも１０％、好ましくは５０％から分離することを意味する。
【０１４６】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有するプロテアーゼ耐性タンパク質の界面活性剤を用いない単離方法が提供される。この方法は、（ａ）好ましくは冷抽出手順（例えば少なくとも−５０℃、好ましくは−８０℃）を用いて、可溶性タンパク質を抽出し、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物とプロテアーゼとを接触させる工程；（ｃ）プロテアーゼ耐性タンパク質を単離する工程；および所望により（ｄ）シャペロン様活性についてプロテアーゼ耐性タンパク質をアッセイする工程によって実施される。
【０１４７】
本発明のもう１つの側面によれば、生物源からのシャペロン様活性を有する煮沸安定タンパク質の、さらにもう１つの単離方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、（ａ）生物源から総タンパク質を抽出し、タンパク質抽出物を得る工程；（ｂ）タンパク質抽出物を煮沸する工程；（ｃ）可溶性タンパク質画分を回収する工程；および所望により（ｄ）プロテアーゼ耐性タンパク質をシャペロン様活性についてアッセイする工程によって実施される。プロテアーゼはまた、この手順においても用いることができる。
【０１４８】
本発明のさらに１つの追加の側面によれば、凝集性タンパク質が、凝集体中に凝集するのを防ぐ方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、本明細書に記載されているポリペプチドの有効量と、この凝集性タンパク質とを接触させることによって実施される。
【０１４９】
本明細書の目的のための「有効量」は、当業者に知られている考察事項によって決定される。この量は、物理化学的または機能的測定によって評価された場合、接触タンパク質中に、さもなければ凝集を生じる条件下、溶解性の有意な増加、例えば遠心分離の時の沈殿への耐性、屈折特性の減少、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ，濾過、透析でのサイズ分画、またはその他のあらゆるサイズ分画での分子量の減少；および／または生物特性、例えば触媒活性、分子結合活性、および抗原特性の保持を誘導するのに有効なものでなければならない。
【０１５０】
本発明のもう１つの側面によれば、凝集性タンパク質の凝集体の脱凝集方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、本明細書に記載されているポリペプチドの有効量と凝集体とを接触させることによって実施される。
【０１５１】
それ故、本発明は、凝集性タンパク質凝集に関連した病気の治療方法であって、変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質であって、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、凝集性タンパク質の凝集を脱凝集するか、および／または防ぐのに十分な量で、これを必要とする被験者に投与する工程を含む方法を提供する。この凝集性タンパク質は例えば、アルツハイマー病、およびプリオン関連病、例えば脳海綿症（ｅｎｃｅｐｈａｌｕｓ  ｓｐｏｎｇｙｆｏｒｍ）の場合のように、ベータアミロイドまたはプリオンである。
【０１５２】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、変性条件に対してタンパク質を安定させる方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、本明細書に記載されているポリペプチドの有効量をタンパク質と接触させることによって実施される。
【０１５３】
この状況において本発明は、シトレートシンターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼに関して実行に移された。これらは、次の実施例セクションにおいてさらに詳しく記載され、例示されているように、タンパク質抗−凝集、安定化、およびシャペロン活性を評価するための受入れられたモデル系である。
【０１５４】
本発明のさらになお１つの側面によれば、酵素調製物を酵素活性の低下から保護する方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、酵素調製物を酵素活性の低下から保護するのに十分な量で、酵素調製物に添加することによって実施される。
【０１５５】
本発明のもう１つのほかの側面によれば、酵素調製物の失われた酵素活性の少なくとも一部分を修復する方法が提供される。本発明のこの側面による方法はシャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を、酵素調製物の失われた酵素活性の少なくとも一部分を修復するのに十分な量で、酵素調製物に添加することによって実施される。
【０１５６】
本発明のさらに１つの付加的側面によれば、本明細書に記載されているポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体、すなわちポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が提供される。本発明は、血清免疫グロブリン、ポリクローナル抗体またはこれらの断片、（すなわち抗体の免疫反応性誘導体）、またはモノクローナル抗体またはこれらの断片を利用することができる。例えばＦｖ、Ｆ（ａｂｌ）２、Ｆａｂ断片（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、「抗体」、コールド・スプリング・ハーバー、単鎖抗体（米国特許第４９４６７７８号）、キメラまたはヒト化抗体、および相補的決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗原結合領域の少なくとも一部分を有するモノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の精製断片は、従来の手順によって調製することができる。これらの血清免疫グロブリン、抗体、または断片の精製は、当業者に知られている多様な方法、アンモニウムスルフェートまたはナトリウムスルフェートによる沈殿、ついで塩水に対する透析、イオン交換クロマトグラフィー、親和性または免疫親和性クロマトグラフィー、ならびにゲル濾過、ゾーン電気泳動法などによって達成することができる（Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理および実行（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、第２版、ｐｐ．１０４−１２６、１９８６年、フロリダ州オーランド、アカデミック・プレス参照）。標準生理条件下、抗体は、血漿およびほかの体液、およびあるいくつかの細胞の膜中に見出され、Ｂ細胞と称される型またはこれらの機能的同等物のリンパ球によって産生される。ＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合によって互いに連結された４つのポリペプチド鎖から構成されている。無傷のＩｇＧ分子のこれらの４つの鎖は、Ｈ−鎖と呼ばれる２つの同一な重鎖、およびＬ−鎖と呼ばれる２つの同一な軽鎖である。追加のクラスには、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、および関連タンパク質が包含される。
【０１５７】
単鎖抗体を包含する、モノクローナル抗体の生成および選択方法は、例えばＴｒａｍｏｎｔａｎｏおよびＳｈｌｏｅｄｅｒ、「酵素学（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１７８、５５１−５６８、１９８９年などの評論に概要が示されているように、当業界においてよく知られている。本発明の精製ネイティブＳＰ、組み換えＳＰ、または組み換えＳＰ−融合タンパク質（下記参照）、または少なくとも１つの免疫原性エピトープを含んでいるこれらの免疫原性部分が、本発明の抗体を生成するために用いられてもよい。
【０１５８】
好ましくは抗体の惹起は、インビボまたはインビトロ技術を通して行なわれ、この抗体は、次の工程を含む方法によって調製された。すなわち、まず抗体を産生しうる細胞（インビボまたはインビトロ）を、本発明のＳＰタンパク質またはこれの免疫原性部分に暴露する工程、これによって抗体産生細胞を生成する工程である。第二に、これらの抗体産生細胞を、例えばこれらと骨髄腫細胞とを融合するか、またはこれらに形質転換ウイルスを感染させ、これによって、各々モノクローナル抗体を産生する複数の不死化細胞を生成させることによって、抗体産生細胞を不死化する工程、および第三に、複数のモノクローナル抗体をスクリーニングして、特異的にＳＰと結合するモノクローナル抗体を同定する工程である。これらの方法は、当業界において知られており、したがって本明細書においてさらに詳しく述べない。
【０１５９】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、追加のポリペプチドに融合された、シャペロン様活性を有する、変性剤（例えば煮沸および／または界面活性剤）安定プロテアーゼ耐性ポリペプチドを含む融合タンパク質が提供される。好ましくはこの融合タンパク質は、オリゴマー形態を獲得し、これの出現により、ホモ−またはヘテロ−オリゴマー形態を組立てることができる。同じＳＰオリゴマー上の多様なタンパク質の同時表示は、本明細書に記載されているような異なる融合タンパク質の混合物の可逆性変性および再組み立てによって、あるいはまた同じ細胞／生物（インビボアセンブリー）におけるいくつかの融合タンパク質の共発現によって達成しうる。このような融合タンパク質は、融合配列の各々に由来する生物特性（例えば基質またはリガンド結合、酵素活性、抗原活性など）を表わしうる。あらゆる従来の融合パートナーを用いることができる。これには、例えばベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼなどが含まれる。融合ポリペプチドは好ましくは、標準的技術によって産生された組み換え核酸の発現によって作製される。
【０１６０】
次のものは、本発明の安定タンパク質に融合させることができる既知の遺伝子を有するタンパク質の非網羅的リストを示す。すなわち、医薬特性を有するタンパク質；凝集性タンパク質、例えばベータアミロイド、メッセンジャータンパク質、例えばサイトカインＩＬ−１およびＩＬ−７、およびこれらの受容体タンパク質、感染病の作用物質のタンパク質、例えばｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、およびほかの病原性菌株からの細菌放出された（ｅｘｐｏｒｔｅｄ）タンパク質、病原性ウイルス、例えばＢ型肝炎、および伝染性胃腸炎から、および寄生虫感染における原生動物および寄生虫からのタンパク質；非感染病、例えばあまり抗原性でない自己腫瘍細胞タンパク質、またはこれらのエピトープのいずれか、自己免疫病の場合のインターフェロンおよびこれらの受容体タンパク質、研究に有用なタンパク質であって、イムノアッセイ用のタンパク質またはポリペプチド試薬を包含するもの、例えばインシュリン、ガストリン、オピオイド（ｏｐｉｏｄ）、成長因子、カルシトニン、マラリアおよびその他の原生動物血液段階抗原、酵素、例えばペルオキシダーゼ、および熱または界面活性剤不安定な生物活性タンパク質であって、商業的用途において有用な酵素およびタンパク質を包含するもの、例えばプロテアーゼ、グリコシル−ヒドロラーゼおよびリパーゼ、形質転換された細胞またはこれらの培養培地中で凝集する異種タンパク質、例えば成長因子、グリコシル−ヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、核酸修飾酵素（リガーゼ、制限酵素、逆転写酵素、核酸ポリメラーゼ）である。
【０１６１】
本発明による融合タンパク質は、２つのオープンリーディングフレームが、単一核酸中に融合され、連続リーディングフレームを作製し、発現系におけるこれらの翻訳が、融合タンパク質を生じる遺伝子工学技術によって、またはタンパク質を連結または接合するための、当業界において知られている複数の連結試薬のいずれかを用いて、予め存在するタンパク質の化学的融合または連結を介してのどちらかによって、入手しうる。
【０１６２】
したがって、タンパク質またはポリペプチドを包含する異なる型の分子を共役または融合（結合）するための多くの方法が知られている。これらの方法は、安定タンパク質をあらゆるほかのタンパク質と結合させるために、本発明にしたがって用いることができる。２つの単離ペプチドは、当業者に知られているあらゆる共役方法を用いて、共役または融合することができる。１つのペプチドは、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（同様にＮ−スクシンイミジル３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート）（「ＳＤＰＤ」）（シグマ、Ｃａｔ番号Ｐ−３４１５）、グルタルアルデヒド共役手順、またはカルボジイミド共役手順を用いて、もう１つのペプチドと共役させることができる。
【０１６３】
ＳＰＤＰ共役  −  当業者に知られているあらゆるＳＰＤＰ共役方法を用いることができる。例えば１つの例証的実施形態において、下に記載されているＣｕｍｂｅｒらの方法（１９８５年、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」１１２：２０７−２２４）の修正例が用いられる。第一ペプチド（１．７ｍｇ／ｍｌ）が、ＳＰＤＰの１０倍過剰（エタノール中５０ｍＭ）と混合され、第二（ｓｅｃｏｎｆ）ペプチドが、２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１０ＭＮａＣｌｐＨ７．２中のＳＰＤＰの２５倍過剰と混合され、これらの反応物の各々が、例えば３時間室温でインキュベーションされる。ついでこれらの反応物は、ＰＢＳに対して透析される。第一ペプチドは、例えば５０ｍＭＤＴＴを用いて１時間室温で還元される。この還元されたペプチドは、Ｇ−２５カラム（５％までのサンプル／カラム容量）上の平衡によって、５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ６．５を用いて脱塩される。この還元ペプチドは、１：１０第二ペプチド：第一ペプチドのモル比においてＳＰＤＰ−第二（ｓｅｃｏｎｇ）ペプチドと組み合わされ、４℃で一晩インキュベーションされ、ペプチド−ペプチド共役体が形成される。
【０１６４】
グルタルアルデヒド共役  −  １つのペプチドともう１つのペプチドとの共役は、グルタルアルデヒドを用いて、当業者に知られている方法によって達成することができる。例えば１つの例証的実施形態において、下記のＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによる共役方法（１９９６年、「生物共役体技術における抗体修飾および共役（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ、  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、アカデミック・プレス、サンディエゴ）が用いられる。これらのペプチド（１．１ｍｇ／ｍｌ）は、０．１Ｍホスフェート、０．１５ＭＮａＣｌ  ｐＨ６．８中の０．０５％グルタルアルデヒドと１０倍過剰で混合され、室温で２時間反応させられる。過剰部位を遮断するために、０．０１Ｍリシンを添加することができる。この反応後、過剰グルタルアルデヒドは、ＰＢＳ（１０％ｖ／ｖサンプル／カラム容積）で平衡されたＧ−２５カラムを用いて除去される。
【０１６５】
カルボジイミド共役  −  １つのペプチドともう１つのペプチドとの共役は、脱水剤、例えばカルボジイミドを用いて、当業者に知られている方法によって達成することができる。最も好ましくはカルボジイミドは、４−ジメチルアミノピリジンの存在下に用いられる。当業者によく知られているように、カルボジイミド共役は、ペプチドのカルボキシル基と、１つのペプチドのヒドロキシル基（結果としてエステル結合の形成を生じる）、またはこの１つのペプチドのアミノ基（結果としてアミド結合の形成を生じる）、またはこの１つのペプチドのスルフヒドリル基（結果としてチオエステル結合の形成を生じる）との間に共有結合を形成するために用いることができる。同様に、１つのペプチドの炭素基と、他方のペプチドのヒドロキシル、アミノ、またはスルフヒドリル基との間に類似の共有結合を形成するために、カルボジイミド結合を用いることができる。一般に、Ｊ．Ｍａｒｃｈ、「上級有機化学：反応のメカニズム、および構造（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎ’ｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、ｐｐ．３４９−５０  ＆  ３７２−７４（第３版）、１９８５年参照。例証のためであって、限定的ではなく、ペプチドが、カルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて、共有結合を介してもう１つのペプチドに共役される。一般に、Ｎｅｉｓｅｓらによる共役方法（１９７８年、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１７：５２２；Ａ．Ｈａｓｓｎｅｒら（１９７８年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４４７５）；Ｅ．Ｐ．Ｂｏｄｅｎら（１９８６年、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：２３９４）およびＬ．Ｊ．Ｍａｔｈｉａｓ（１９７９年、「合成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」５６１）参照。
【０１６６】
本発明の安定タンパク質がオリゴマー化されることが、本明細書に示されている。さらに本明細書において、本発明の安定タンパク質および追加のタンパク質を含んでいる融合タンパク質が同様にオリゴマー化されることも示されている。この特徴は、結合分子の結合活性を増加させること、および異なる機能に役立ちうるヘテロ複合体を生成させることを含むいくつかの目的に役立ちうる。
【０１６７】
したがって本発明のもう１つの側面によれば、結合分子の結合活性を増加させる方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質のオリゴマーの表面上に結合分子の多重コピーを表示することを含む。この結合分子は、例えば受容体、リガンド、酵素、基質、阻害剤、抗体、および抗原であってもよい。結合分子が結合タンパク質である場合、結合タンパク質は、遺伝子工学技術または化学的架橋のどちらかを介して、オリゴマー単位に融合されうる。結合分子がタンパク質でない場合、結合分子は、化学的架橋技術を介してオリゴマー単位に融合または連結されうる。
【０１６８】
本明細書において、オートクレーブおよび／またはプロテアーゼでの処理によって、本発明のタンパク質の比活性を増加させうることが示されている。
【０１６９】
したがって本発明のもう１つの側面によれば、１ｍｇタンパク質あたりの保護活性単位において決定された場合、シャペロン様活性を有する、予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の比活性の増加方法が提供される。１つの方法は、前記の予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をオートクレーブする工程を含む一方で、他方の方法は、前記の予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をプロテアーゼで処理する工程を含む。
【０１７０】
したがって本発明は、次のようなシャペロン様活性を有する、単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質を提供する。すなわち、ＨＲＰ保護アッセイを用いて決定された場合、少なくとも１０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００、より好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも５００、より好ましくは少なくとも１０００、より好ましくは少なくとも１５００、より好ましくは少なくとも２０００、より好ましくは少なくとも２５００、より好ましくは少なくとも３０００、より好ましくは少なくとも３５００、より好ましくは少なくとも４０００、より好ましくは少なくとも４５００、より好ましくは少なくとも５０００、より好ましくは少なくとも５５００、より好ましくは少なくとも６０００、より好ましくは少なくとも８０００、より好ましくは少なくとも１００００、より好ましくは少なくとも１５０００単位／ｍｇタンパク質のＨＲＰ保護活性を有するものであり、前記ＨＲＰ保護アッセイは、シャペロン様活性を有する単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質と、異なる最終タンパク質濃度で、予め決定された体積において、ｐＨ７．５における４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に存在する５ｎＭ  ＨＲＰ１００μｌとを混合し、このようにして第一反応混合物を形成し、前記反応混合物の２５℃における１６時間のインキュベーション後、前記第一反応混合物５μｌとＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）１００μｌとを混合し、このようにして第二反応混合物を形成し、前記第二反応混合物を１０分間インキュベーションし、前記第二反応混合物の反応を、１Ｍ硫酸１００μｌの添加によって停止し、前記第二反応混合物中の色彩変化を４３５ｎｍにおいて記録することによって、ＨＲＰ残存酵素活性を決定することを含み、ここで、前記単位は、前記ＨＲＰ保護アッセイにおけるＨＲＰ活性の５０％保護を与える１ｍｇ／ｍｌの濃度で、シャペロン様活性を有する、前記変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の希釈率として規定される。
【０１７１】
本発明はまた、シャペロン様活性を有する複数の変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質と、オリゴマーに融合されている少なくとも２つの異なる分子とを含んでいるオリゴマーを含むヘテロ複合体も提供される。これらの少なくとも２つの異なる分子は、少なくとも１つの第一酵素と第二酵素とを含んでいてもよい。第一酵素および第二酵素は、合成または分解経路において一連の反応を触媒しうる。第一酵素および第二酵素は、合成または分解経路において異なる反応を触媒しうる。もう１つの実施形態において、これらの少なくとも２つの異なる分子は、少なくとも１つの結合分子とレポーター分子、例えばＧＦＰまたはＨＲＰを含んでいる。
【０１７２】
これらの分子がタンパク質である場合、これらのタンパク質は、遺伝子工学技術または化学的架橋を介して、オリゴマー単位に融合させることができる。これらの分子がタンパク質でない場合、これらの分子は、化学的架橋技術を介して、オリゴマー単位に融合または連結させることができる。
【０１７３】
このような融合タンパク質の使用法の１つは、本発明の安定タンパク質がこれらの活性を保持し、また融合タンパク質の状況にある時、オリゴマー化性も保持するという事実から生じる。興味深いことに、このような条件下、本発明の安定タンパク質に融合された相対物もまた、次の実施例セクションにおいて証明されているように、融合ＣＢＤ−ＳＰ１によってその活性を保持する。したがって、本発明のオリゴマー化融合タンパク質は、免疫化または表面反応のために本発明の安定タンパク質に融合された相対物をよりよく提示するのに役立ちうる。
【０１７４】
したがって本発明のさらに１つの付加的側面によれば、哺乳動物の免疫系に、本明細書に記載されている融合タンパク質を供する工程を含む免疫化方法が提供される。
【０１７５】
ＳＰ１−ポリペプチド融合タンパク質での免疫化が、ポリペプチドへの免疫応答を低下させることが明らかにされた。したがって本発明のさらに別の側面によれば、ポリペプチドに対する免疫応答を低下させつつ、免疫系を有する動物にポリペプチドを投与する方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質に融合されたポリペプチドを動物に投与し、これによって、単独のポリペプチドを動物に投与することによって生じる免疫応答と比較して、前記ポリペプチドに対する免疫応答を低下させることによって実施される。
【０１７６】
インビトロアッセイにおいて、ＳＰ１が、ペトリ皿における繊維芽細胞の削られた部位のさらに迅速な被覆を誘発することが証明された。
【０１７７】
したがって本発明のもう１つの側面によれば、細胞移動の増加方法が提供される。本発明のこの側面による方法は、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、細胞移動を増加させるのに十分な量へこれらの細胞を暴露することによって実施される。
【０１７８】
細胞移動は、傷治癒にとって不可欠であるので、本発明によれば、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、傷治癒を加速させるのに十分な量を傷に投与することによって実施される傷治癒の加速方法もまた提供される。さらにまた、本発明によれば、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、傷治癒を誘発するのに十分な量を傷に投与して実施された傷治癒の誘発方法も提供される。
【０１７９】
下記の実施例セクションにおいて、毛髪がＳＰ１の投与を介して強化されることが証明される。
【０１８０】
したがって、本発明のもう１つの側面によれば、毛髪、つめ、または皮膚の強化および／または手入れ方法が提供される。この方法は、シャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の、毛髪、つめ、または皮膚の強化および／または手入れのために十分な量を、毛髪、つめ、または皮膚に投与することによって実施される。
【０１８１】
本発明のポリペプチドは、製薬（化粧品および化粧品医薬（ｃｏｓｍｏｃｅｕｔｉｃａｌ））組成物中に配合することができ、これらの組成物は、活性成分としてのシャペロン様活性を有する変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質、および適切な規制当局、例えば米国の食品医薬品局によって、ヒトへの使用または獣医による使用に対して承認された、製薬的に許容しうるキャリヤーを含んでいる。傷治癒への使用のために、この製薬組成物はパッケージに包装され、傷治癒用途に使用するために印刷して識別される。毛髪、つめ、または皮膚の強化／手入れに使用するために、この製薬組成物はパッケージに包装され、毛髪、つめ、または皮膚の強化および／または手入れに使用するために印刷して識別される。このような組成物において、追加成分を用いることができる。例えば本発明の安定タンパク質は、毛髪、皮膚、またはつめ手入れ用組成物、例えば石鹸、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ジェル、スプレー、ラック染料などに添加することができる。これらのほかの成分は、当業界においてよく知られており、一般的にはこのような製品の容器に記載されている。
【０１８２】
本発明のさらなる目的、利点、および新規特徴は、次の実施例を調べた時に、当業者には明らかになるであろう。これらの実施例は、限定的であることが意図されていない。さらには、上に記載され、かつ特許請求の範囲のセクションにおいてクレームされている本発明の様々な実施形態および側面の各々は、次の実施例において、実験的裏付けが見出される。
【実施例】
【０１８３】
ここで次の実施例を参照する。これらの実施例は、上記説明とともに、本発明を非限定的に例証する。
【０１８４】
一般に、本明細書に用いられている専門用語、および本発明において用いられている実験室手順は、分子、生化学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術を包含する。このような技術は、文献において完全に説明されている。例えば次の文献参照。「分子クローニング：研究所マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９年）；「分子生物学における昨今のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第Ｉ−ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編集（１９９４年）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「分子生物学における昨今のプロトコル」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、メリーランド州ボルチモア（１９８９年）；Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニングへの実用ガイド（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８年）；Ｗａｔｓｏｎら、「組み換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら、（編集）「ゲノム分析：研究所マニュアルシリーズ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ）」、第１−４巻、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク（１９９８年）；米国特許第４６６６８２８号；第４６８３２０２号；第４８０１５３１号；第５１９２６５９号、および第５２７２０５７号に開示されている方法；「細胞生物学：研究所ハンドブック（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、第Ｉ−ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編集（１９９４年）；「動物細胞の培養−基本技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、ニューヨーク（１９９４年）、第三版；「免疫学における昨今のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第Ｉ−ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編集（１９９４年）；Ｓｔｉｔｅｓら（編集）、「基本および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、コネチカット州ノーウオーク（１９９４年）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編集）、「細胞免疫学において選択された（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク（１９８０年）；入手可能なイムノアッセイは、特許および化学文献に幅広く記載されている。例えば次の文献参照。米国特許第３７９１９３２号；第３８３９１５３号；第３８５０７５２号；第３８５０５７８号；第３８５３９８７号；第３８６７５１７号；第３８７９２６２号；第３９０１６５４号；第３９３５０７４号；第３９８４５３３号；第３９９６３４５号；第４０３４０７４号；第４０９８８７６号；第４８７９２１９号；第５０１１７７１号；お���び第５２８１５２１号；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編集（１９８４年）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編集（１９８５年）；「転写および翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編集（１９８４年）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編集（１９８６年）；「固定化細胞および酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６年）；「分子クローニングへの実用ガイド」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４年）、および「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」第１−３１７号、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲプロトコル：方法および応用へのガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）；Ｍａｒｓｈａｋら、「タンパク質精製および特徴決定のための戦略−研究所コースマニュアル（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ）」ＣＳＨＬプレス（１９９６年）；これらのすべては、本明細書において完全に開示されているかのように参照して組み込まれる。ほかの一般的な参考文献は、この書類全体において示されている。これらの文献中の手順は、当業者によく知られていると考えられ、読者の便利さのために示されている。これらの中に含まれているすべての情報は、参照して本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
材料および実験方法
植物由来の煮沸安定タンパク質の精製：ポプラ、トマトＭ８２、ＶＦ３６、およびマツの煮沸安定タンパク質画分を、次のように調製した：粗植物抽出物を、１００００ｇで１０分間遠心分離し、上清を新鮮な管へ移し替えた。上清を、１０分間煮沸セッションに付し、ついで５分間氷上に保持し、１００００ｇで１０分間遠心分離した。その結果として生じた上清を、４倍体積の冷アセトンを添加して沈殿させ、１００００ｇで１０分間遠心分離した。ついで煮沸安定タンパク質を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中にペレットを溶解することによって回収した。総タンパク質濃度を、ＳＰ１調製物として決定した（下記参照）。
【０１８６】
総煮沸安定タンパク質を１７％ＳＤＳ−トリシンＰＡＧＥで分離した時のみ、Ｐｅｌａｈ（１９９５年）によって記載されている電気泳動法条件を用いて出現する６６ｋＤａバンドは、６６および１１６ｋＤａの２つのバンドとして分離した。６６ｋＤａバンドは、ジェルミン様タンパク質を表わすことが分かった。
【０１８７】
植物ＳＰ１タンパク質の精製：上に記載されているように調製されたポプラ植物のアセトン沈殿煮沸安定タンパク質を、１×トリシン−ＳＤＳサンプル緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２０％グリセロール、１％ＳＤＳ、０．０２５％クーマシーブルーＧ−２５０）中に溶解し、ついで分取１７％ポリアクリルアミドトリシン−ＳＤＳゲル上で分離した。ＳＰ１に対応する主要バンド（１１６ｋＤａオリゴマーおよび１２．４ｋＤａモノマー）タンパク質を、ゲルから切除した。ＳＰ１オリゴマーおよびモノマーを、透析バッグで別々に電気溶出した。この溶離液を、５００倍体積の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して４℃で一晩さらに透析し、ついでアセトン沈殿および遠心分離を行なった。精製ＳＰ１は、ペレットを１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に溶解して得られた。タンパク質濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを用いて、ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイキット（米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して決定した。
【０１８８】
ポリクローナル抗体の生成：ゲル精製ネイティブＳＰ１または組み換えＣＢＤ−ＳＰ１（１注射あたり５０μｇ）を、フロイント（Ｆｒｅｕｉｄ’ｓ）完全アジュバントとともにウサギに注射した。２つの追加ブースト（１４日の間隔で）を注射し、１４日後に抗血清を収集した。
【０１８９】
ｃＤＮＡクローニング：ポリアデニル化（ポリＡ＋）ＲＮＡ抽出を、ＢａｒｔｅｌｓおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（１９８３年）にしたがって、水ストレスを受けたポプラの若枝から実施し、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成用の鋳型として用いた。ラムダＺＡＰＩＩ（米国カリフォルニア州のラホラ、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））ｃＤＮＡライブラリーを、供給業者の指示にしたがって構築し、上に記載されている天然タンパク質に対して産生刺激されたＳＰ１ポリクローナル抗体を用いて免疫スクリーニングした（希釈１：５００、ｖ／ｖ）。インビボ切除を、供給業者の指示にしたがって実施し、配列を決定した（イスラエル国レホボットのザ・ワイズマン・インスティチュート・オブ・サイエンスのシークエンシング・ラブ（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｌａｂ，Ｔｈｅ  Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ））。
【０１９０】
大腸菌におけるＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質の生成：ＳＰ１ｃＤＮＡを次のようにして、ｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０（Ｓｈｐｉｇｅｌら、１９９９年）発現ベクター中にクローン化した。すなわち、ＮｃｏＩ部位（前進プライマー）５’−ＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号３）およびＳＰ１ｃＤＮＡの対応ＯＲＦの増幅のためのＢａｍＨＩ部位（逆プライマー）５’−ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＡＴＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＡＧＣＣ−３’（配列番号４）を有する２つの増幅プライマーを用いて生成されたＰＣＲ産物を、その中にサブクローニングすることによってである。その結果生じたプラスミド（ｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０−ＳＰ１）を用いて、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質合成は、細菌培養物のミッドログ（ｍｉｄ−ｌｏｇ）段階への１ｍＭの最終濃度までのＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド）の添加、ついで３７℃での追加の５時間の誘導によって、ＢＬ２１（ＤＥ３）中に誘導した。組み換えＣＢＤ−ＳＰ１タンパク質を、Ｓｈｐｉｇｅｌら（１９９９年）にしたがってセルロース上で精製した。組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて検出した。
【０１９１】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓによる組み換えＳＰ１の生成および分泌：
ＳＰ１タンパク質コーディング領域のＤＮＡ断片を、分泌Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターｐＰＩＣ９Ｋ（オランダ国グロニンゲン（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）のインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（登録商標））のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位においてインフレームクローン化し、ｐＰＩＣ９Ｋ−ＳＰ１を生成した。この構築配列は、配列決定によって確認した（イスラエル国レホボット、ワイズマン・インスティチュートのシークエンス・ラブ）。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を形質転換するために、ｐＰＩＣ９Ｋ−ＳＰ１を、ＳａｌＩまたはＢｇｌＩＩ制限酵素によって線状化した。これらの線状化された構築物は、各々独立して、供給業者（オランダ国グロニンゲンのインビトロゲン（登録商標））の指示にしたがって、エレクトロポレーションによってＰｉｃｈｉａコンピテント細胞を形質転換するために用いた。この目的のために、５〜１０μｇのＳａｌＩまたはＢｇｌＩＩ線状化ｐＰＩＣ９Ｋ−ＳＰ１ＤＮＡを用いて、ＰｉｃｈｉａＳＭＤ１１６８、プロテアーゼ欠失突然変異体、Ｈｉｓ＋、Ｍｕｔ＋（メタノール資化プラス）表現型菌株を形質転換した。形質転換コンピテント細胞を、ＲＤＢプレート上で培養し、３０℃でインキュベーションした。５日後、ＳａｌＩ（Ｍｕｔ＋）からの２４０コロニー、およびＢｇｌＩＩ（ＭｕｔＳ：緩慢なメタノール資化）からの１８０コロニー形質転換細胞を、まず、０．２５ｍｇ／ｍｌＧ４１８抗体を含んでいるＹＰＤプレートに移し替えた。Ｍｕｔ＋およびＭｕｔＳの７３％および１６％が生存した。Ｍｕｔ＋形質転換細胞の場合、生存コロニーを、より高い濃度のＧ４１８を含んでいるＹＰＤプレートにさらに移し替えた。ＭｕｔＳ形質転換細胞を、ＭＭプレートに移し替えた。高発現レベル形質転換細胞を選択するために、それぞれ４ｍｇ／ｍｌおよび１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８コロニー由来の２つのＭｕｔ＋形質転換細胞、ならびに４つのＭｕｔＳコロニーを、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（インビトロゲン（登録商標））中の組み換えタンパク質の発現のためにマニュアルにしたがって、小容量発現系において用いた。高−コピー数形質転換細胞のスクリーニング、および組み換えＳＰ１の発現を、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（インビトロゲン（登録商標））のマニュアルの指示にしたがって実施した。分泌された組み換えＳＰ１を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって培養培地から検出した。これらのゲルを、総タンパク質視覚化のためにクーマシーブルーを用いて染色するか、またはポリクローナル抗−ＳＰ１でのＳＰ１の免疫検出のためにニトロセルロース（ウエスタンブロット）上へブロッティングした。
【０１９２】
ゲル濾過、ＨＰＬＣ、およびネイティブＳＰ１検出：ＴＳＫＳＷＸ３０００（３０ｃｍ×７．８ｍｍ）カラム（イスラエル国シグマのスペルコ（ＳＵＰＥＬＣＯ））を備えたＨＰＬＣ装置（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、日立）を使用して、そのネイティブ状態においてＳＰ１のサイズを調べた。水ストレスを受けたポプラ植物からの総可溶性タンパク質抽出物１００μＬアリコート、または同じ抽出物の総煮沸安定画分を、ｐＨ６．６でＰＢＳ緩衝液を用いて分離した。流量は、１分あたり０．８ｍｌに調節し、ＵＶモニターを２８０ｎｍで用いて、カラムからのタンパク質の溶離液を検出した。画分を毎分収集した。さらに各画分を、４倍体積の冷アセトンを添加して濃縮し、１０，０００ｇで１０分間の遠心分離を行なった。その結果として生じたペレットを、１×ＳＤＳ−サンプル緩衝液中に溶解した。アリコートを、１７％トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その結果生じたタンパク質プロフィールを、クーマシー染色またはウエスタンブロット分析によって、抗−組み換えＳＰ１抗体を用いて視覚化した（上記参照）。１ミリリットルあたり１ミリグラム、および１ミリリットルあたり０．５ミリグラムの濃度における精製ネイティブＳＰ１および組み換えＣＢＤ−ＳＰ１（５０μｌアリコート）も分析した。タンパク質のサイズを決定するために、チトクロムＣ（１２．４ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、ベータ−アミロース（２００ｋＤａ）、およびアポフェリチン（４４３ｋＤａ）（シグマ−オルドリッチ・イスラエル社）を、分子標準として用いた。ブルーデキストラン（２０００ｋＤａ）を用いて、カラムの空隙容積を評価した。これらの各々の溶離パラメーター（Ｋａｖ）に対して、標準的タンパク質の分子量の対数をプロットすることによって直線相関が得られた。Ｋａｖ値は、方程式：Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／（Ｖｔ−Ｖｏ）（式中、Ｖｅ＝タンパク質の溶離容積、Ｖｏ＝カラムの空隙容積、Ｖｔ＝総充填床容積である）を用いて計算した。
【０１９３】
ＳＤＳおよび加熱への暴露後のＳＰ１安定性：界面活性剤へのＳＰ１複合体の安定性を評価するために、等量の精製ＳＰ１タンパク質を、０％（ネイティブサンプル緩衝液）〜２％（従来のレムリーのサンプル緩衝液）の最終濃度でＳＤＳを含有し、かつ最終モル比１：０、１：２００、１：４００、１：５００、１：６００、または１：４３３４（ＳＰ１モノマー：  ＳＤＳ）に相当するサンプル緩衝液中に調製した。これらのサンプルを、１７％トリシン−ＳＤＳ−ゲル上での分離の前に５分間煮沸した（または煮沸しなかった）。加熱へのＳＰ１オリゴマーの安定性を調べるために、ＳＤＳサンプル緩衝液中で、最終モル比１：９００（ＳＰ１モノマー：ＳＤＳ）でＳＰ１を調製し、ＳＤＳ−トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分離前に、室温〜１００℃の温度範囲において、５、１０、または２０分間加熱した。
【０１９４】
ＳＰ１による熱安定化のインビトロアッセイ：ＳＰ１の熱保護活性は、シトレートシンターゼ（ＣＳ）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素活性の熱安定性に対するＳＰ１の効果を測定することによってインビボで調べた。
【０１９５】
タンパク質調製：ＣＳ（ドイツ国マンハイムのロッシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を、Ｂｕｃｈｎｅｒら（１９９８年）の方法にしたがって調製した。ＨＲＰ、ＢＳＡ、リゾチーム（イスラエル国シグマ）およびＣＢＤ（イスラエル国レホボットのＣＢＤ−テクノロジーズ社）を、約１０ｍｇ／ｍｌに水中に溶解し、ついで４℃で４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）の２００倍体積に対して一晩透析した。透析後、タンパク質を、１３０００ｒｐｍで１５分間２℃で遠心分離し、あらゆる不溶性粒子を除去した。２０μＭ  ＨＲＰ、６０μＭのＢＳＡ、およびリゾチーム保存溶液を、濾過ＨＥＰＥＳ緩衝液中で調製し、アリコートした。アリコートを、−２０℃で保存した。タンパク質の解凍済みのアリコートを、使用後に廃棄した。タンパク質濃度をＳＰ１についてと同様の方法で決定した。凍結乾燥されたアルファ−クリスタリン（カナダ国ストレスジェン社（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  Ｉｎｃ．））を、供給業者の指示にしたがって水中に再縣濁した。
【０１９６】
ＣＳおよびＨＲＰ活性アッセイ：酵素活性アッセイを、２５℃でＥＬＩＳＡプレートにおいて実施した。比色反応を、マイクロプレートリーダー（バイオラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ））によって、ＣＳについては４１２ｎｍで、ＨＲＰについては６５０ｎｎｍで記録した。
【０１９７】
ＣＳ活性アッセイは、少しの修正をともなって、Ｂｕｃｈｎｅｒら（１９９８年）の方法にしたがった。すなわち、反応成分の体積は、ＥＬＩＳＡプレート容積に対して比例して減少させた。簡単に言えば、４μｌの０．１５μＭ  ＣＳを、ＴＥ緩衝液（５０ｍＭトリス、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、１００μＭオキサロ酢酸（５０ｍＭトリス中、ｐＨは調節されていない）、１００μＭ  ＤＴＮＢ（ＴＥ緩衝液中）、および１５０μＭアセチル−ＣｏＡ（ＴＥ緩衝液中）からなる反応混合物２００μｌと混合した。吸光度の変化は、２０秒間隔で１分間記録した。このプロットの線形部分を用いて、ＣＳの比活性を計算した。ＣＳ活性は、１ｃｍあたり１．３６×１０−４ＭのＤＴＮＢのモル吸光係数を用いて、１ｍｇにつき１分あたりのμモルとして表示した（本明細書において活性単位として規定した）。
【０１９８】
感受性１ステップＴＭスローＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ：ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；米国ロックフォード・ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を、これらの実験におけるＨＲＰ活性アッセイ用基質として用いた。ＨＲＰの最適比色分析反応を、実験によって決定した。吸光度対時間を表わすグラフの線形部分を用いて、６５０ｎｍにおける吸光度の変化速度を計算した。最適反応条件は、２５℃でＴＭＢ基質１００μｌ中の４μｌの２．５ｎＭ  ＨＲＰであると決定した。この反応を、３０秒間隔で５分間記録した。ＨＲＰ活性は、１ｃｍあたり３．９×１０−４Ｍのブルー装荷物（ｃｈａｒｇｅ）−複合体についてのモル吸光係数を用いることによって、１ｍｇにつき１分あたりのμモルとして表示した（Ｊｏｓｅｐｈｙら、１９８２年）（本明細書において酵素活性単位として規定した）。
【０１９９】
ＣＳおよびＨＲＰの熱不活性化：予め冷却された４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５中で調製された、０．１５μＭ  ＣＳまたは２．５ｎＭのＨＲＰの１００μｌアリコートを、プログラミングＴ−勾配サーモサイクラー（ドイツ国ゲッティンゲンのビオメトラ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ））を用いて、所望の温度および時間の長さで、タンパク質（ＳＰ１、ＣＢＤ−ＳＰ１、ＢＳＡ、リゾチーム、およびほかの植物煮沸安定タンパク質（上記参照））の非存在または存在下に加熱した。熱チャレンジの間に、酵素活性アッセイのためにアリコートを除去した。
【０２００】
各時点において特異的タンパク質によって与えられた保護の程度は、完全な酵素活性の％残存活性として表示した。各時点は、少なくとも４つの複製を表わす。データは、ＪＭＰ（バージョン３．１１）プログラムによって分析した。
【０２０１】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓからの組み換えＳＰ１の安定性：分泌された組み換えＳＰ１を含有する培養培地を、１０分間煮沸し、ついで１００００ｇで１０分間遠心分離した。上清サンプルを、完全強度ＳＤＳ（２％）サンプル緩衝液またはネイティブサンプル緩衝液（０％ＳＤＳ）中で調製した。サンプルを、１７％トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分離前に、５分間サンプル緩衝液中で煮沸した。
【０２０２】
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）調査：１ｍｌあたり０．４５ｍｇの濃度における精製ネイティブＳＰ１を、カーボングリッドに加え、ウラニルアセテートで染色した。これらの画像を、フィリプス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＣＭ１２ＥＭ中で視覚化し、ティーツ（Ｔｉｅｔｚ）ＣＣＤカメラ（Ｄｒ．Ｓｈａｒｏｎ  Ｗｏｌｆ、イスラエル国レホヴォトのワイズマン・インスティテュート・オブ・サイエンス、エレクトロン・マイクロスコープ・センター（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｃｅｎｔｅｒ））で記録した。
【０２０３】
追加の実験手順：追加の方法および手順は、特別な図面の状況において図面の簡単な説明のところで詳細に記載される。
【０２０４】
実験結果
熱−および界面活性剤変性に対するネイティブＳＰ１オリゴマーの安定性：ポプラ植物からのＳＰ１を、まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで大きいサイズのタンパク質として同定するが、これは、総可溶性タンパク質抽出物中の複合体として出現する。一部変性された時、このタンパク質の大きい（１１６ｋＤａ）および小さい分子サイズ（１２．４ｋＤａ）形態が検出される（図１）。これら２つの形態は、極端な変性条件下（図１）、これら２つの形態のゲル精製サンプルの相互交換によって示されるように、ＳＰ１タンパク質のモノマー（１２．４ｋＤａ）およびネイティブホモ−オリゴマー（１１６ｋＤａ）状態を表わす。
【０２０５】
界面活性剤による変性へのネイティブＳＰ１オリゴマーの顕著な耐性を、ＳＤＳ濃度範囲全体にわたって調べた。ゲルおよびランニング緩衝液中のＳＤＳの存在（０．１％）にもかかわらず、ＳＰ１がネイティブ（０％）サンプル緩衝液中で調製された時、少量のモノマーのみを観察することができることが分かった（図２ａ）。ＳＰ１複合体は、６００：１（ＳＤＳ：ＳＰ１モノマー）までのモル比のＳＤＳ濃度において煮沸された時、および煮沸をともなわないはるかに高いＳＤＳ濃度においてでさえ安定のままであった（図２ａ）。
【０２０６】
したがってＳＰ１オリゴマーもまた、並外れた熱安定性を示す。これはさらに、インキュベーションの長さとは無関係に（図２ｃ）、８０℃までの温度、および９００：１のＳＤＳ：ＳＰ１モノマー濃度において（図２ｂ）、ＳＰ１のオリゴマー形態の一貫した安定性によって証明された。
【０２０７】
ＳＰ１のプロテアーゼ耐性および界面活性剤を用いない精製：ポプラ植物からのＳＰ１の界面活性剤を用いない精製およびプロテアーゼ耐性を、極低温抽出（−５０℃）、ついでポプラの若枝または葉からの可溶性タンパク質画分の３７℃における６０分プロテアーゼＫ処理によって証明した。タンパク質分解性消化の終了の時、残存可溶性画分中の主なタンパク質はＳＰ１であった。分子濾過によるサイズ分画は、プロテアーゼ耐性ＳＰ１が、５０ｋＤａ分子質量よりも大きいことを証明し、これは、この耐性タンパク質がオリゴマー構造を維持したことを示している。
【０２０８】
ＳＰ１は、シトレートシンターゼ（ＣＳ）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素活性の熱安定性を増加させる：ＳＰ１のシャペロン様活性を、ＳＰ１の存在下、熱変性に対するＣＳおよびＨＲＰ酵素活性の耐性を測定することによって、インビトロで評価した。ＣＳは、あらゆる保護剤の非存在下、４３℃での１５分後に不活性化を受ける、商品として入手しうる熱不安定なダイマー酵素である（図３ａ）。高濃度のＳＰ１の存在下（ＣＳ：ＳＰ１比１：５０）、ＣＳ活性は１５分間ほぼ１００％に留まり、アッセイ期間の間（４０分）、その活性の少なくとも９３％を保持した。ＳＰ１のより低い濃度は、熱不活性化に対して、比例してより低い保護を与えた（ＣＳ：ＳＰ１比１：５において、２２％の保護が４０分で達成された）。ＳＰ１によって与えられた劇的保護とは対照的に、ＢＳＡもリゾチームも、ＣＳ活性の熱不活性化に影響を与えなかった（図３ａ）。別のアッセイにおいて、タンパク質安定剤であるグリセロール（１０および２０％）およびＨｓｐアルファ−クリスタリンは、熱不活性化からのＣＳ酵素活性の保護において等しく有効でなかった（図３ｃ）。
【０２０９】
ＨＲＰは、分子質量４４ｋＤａを有する、商品として入手しうるモノマータンパク質である。標準的アッセイ条件下（「材料および方法（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」参照）、５５℃でインキュベーションした時、酵素活性の６０％が１０分後に失われ、９０％超が６０分後に失われた。もとのＨＲＰ活性の３％のみを、５５℃で２時間後測定することができた（図４）。２５℃での熱不活性化酵素の完全（１６時間）インキュベーション後に、活性の回復は観察されなかった。したがってＨＲＰ活性は、５５℃で熱不安定である。ネイティブ精製ＳＰ１が添加された時、熱不活性化からのＨＲＰ活性の保護は、１：５０以上のＨＲＰ：ＳＰ１モル比において有意であった。１：３００のＨＲＰ：ＳＰ１モル比において、６０％超の保護が６０分の時点で達成され、５３％活性が、５５℃で２時間のインキュベーション後に残存した。ＨＲＰの熱不活性化からのＳＰ１媒介保護は有意であったが、２００：１、１００：１、および５０：１の比において比例してさらに弱かった（図４）。１：２５のＨＲＰ：ＳＰ１モル比において、保護はほとんど観察されなかった。ＢＳＡ添加（１：３００のＨＲＰ：ＳＰ１比）もまた、ある程度の保護を与えたが、ＳＰ１は約３倍もさらに効果的であった（図４）。
【０２１０】
ＳＰ１ｃＤＮＡのクローニングおよび配列分析：ラムダ発現ライブラリーを、上記の「材料および実験方法」に記載されているように、水ストレスを受けたポプラの若枝のポリアデニル化ＲＮＡから調製した。ポリクローナル抗−ＳＰ１抗体を用いて、７×１０５組み換えファージ血小板をスクリーニングした後、ＳＰ１ポリペプチド（ＳＰ１ｃＤＮＡ）をコードする５６７ヌクレオチドｃＤＮＡ配列を単離した（図５、およびそれぞれヌクレオチドおよびＳＰ１のアミノ酸配列についての配列番号１および配列番号２）。ｃＤＮＡのヌクレオチド配列分析（ウイスコンシン・パッケージ・バージョン９．１、ウイスコンシン州マジソンのジェネティックス・コンピューター・グループ−ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ−ＧＣＧ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ．））は、ＳＰ１ｃＤＮＡが、４．８７の計算されたｐＩで１２．３６８ｋＤａポリペプチドをコードすることを示した。オープンリーディングフレームの分析は、このポリペプチドがシステイン残基を欠き、トリプトファン残基が低く（０．９％）、ロイシン（１３．８％）、トレオニン（９．２％）、アラニン（８．３％）、グルタミン酸（７．４％）、およびセリン（７．４％）残基に富むことを明らかにした。スイス−プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質バンクにおけるあらゆる既知のタンパク質配列との相同性は、検出されなかった。様々な進化的に遠い植物種からのＳＰ１との配列相同性を示すコーディング配列は、ＥＳＴデータベースを用いて同定された（複数＝１０．０；閾値＝４；平均重み付け＝１．００；平均マッチ＝２．９１；平均ミスマッチ＝−２．００）。有意な相同性を有する２５配列（０．５以下のＥ値）が同定された（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ中に３配列、トウモロコシ中に３配列、ジャガイモ中に１配列、イネ中に２配列、サトウモロコシ中に１配列、大豆中に７配列、トマト中に２配列、およびコムギ中に７配列、図１２、および配列番号７−３２、コンセンサス配列−配列番号３３参照）。推定ペプチド配列を整列し、ＳＰ１のペプチド配列（配列番号２）と比較すると、いくつかの保存コンセンサス配列が明らかになった。すなわち、例えば「ＨＡＦＥＳＴＦＥＳ」（６１−７５、配列番号３６）、「ＶＫＨ」（９−１１、配列番号３７）、および「ＫＳＦ」（４７−４９、配列番号３８）であり、これは、ＳＰ１が双子葉植物および単子葉植物ゲノムの両方の中に幅広い発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を有するタンパク質遺伝子のファミリーの一員であることを示す。しかしながらこれまでのところ、本明細書に報告されている以外、このファミリーにおけるタンパク質のどれについても機能は発見されていないし、それに帰するともされていない。
【０２１１】
上記の配列に加えて、ＳＰ１ｃＤＮＡ（配列番号１）との高いＤＮＡ相同性が、Ｐｏｐｕｌｕｓからの多数のＥＳＴについて注目された：ＥＳＴＡＩ１６１９１２（配列番号５）およびＡＩ１６３０６３（配列番号６）との９７％相同性、ＡＩ１６１６４３（配列番号３９）との９０％相同性、およびハイブリッドポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ×Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）のＡＩ１６３３２９（配列番号４０）との９２％相同性、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ×Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓのｐｏｐ３  ｍＲＮＡ配列（それぞれ、核酸およびアミノ酸配列についての配列番号３４および３５、同様にｐｏｐ３ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質−配列番号３５、およびＳＰ１タンパク質−配列番号２の相同性整列については、図１３参照）との９６．６％相同性、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ×Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｄｅｌｔｏｉｄｅｓの傷応答性ｍＲＮＡ（それぞれＥＭＢＬ受入れ番号Ｍ１８５３８およびＸ５５４４０）との６１．６％相同性である。ＳＰ１タンパク質は、調査されたＰｏｐｕｌｕｓ種のすべてにおいて同定された。ＳＰ１ｃＤＮＡヌクレオチド配列を、ＥＭＢＬに提出した（受入れ番号ＡＪ２７６５１７として）。ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８４年）およびＧｏｌｄｍａｎら（１９８６年）の親水性プロットを用いた、ＳＰ１によってコードされたポリペプチドの分析は、その疎水性Ｃ−末端以外、ＳＰ１が高度に親水性タンパク質であることを示した。
【０２１２】
大腸菌におけるＳＰ１発現、組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質の精製、および組み換えＣＢＤ−ＳＰ１タンパク質の抗原性：ｐＥＴ−ＣＢＤ−１８０ＣＢＤ発現ベクター中へのクローン化されたＳＰ１ｃＤＮＡ配列の導入（図１１、「材料および実験方法」に記載されている）の結果、ＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質をコードしたヌクレオチド配列を生じた。組み換えＣＢＤ−ＳＰ１は、細菌によって高いレベルで（１リットル培養培地あたり約３００ミリグラム）発現され、封入体として蓄積された。総大腸菌抽出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離された時、３２．４ｋＤａバンドは、クーマシーブルー染色によって検出され、見たところ、非形質転換細菌タンパク質画分には存在しなかった（図６ａ）。ＳＰ１を用いた融合タンパク質の抗原性同一性は、ポリクローナル抗−ＳＰ１抗体を用いて、同じゲルのウエスタンブロット上の３２．４ｋＤａ融合モノマータンパク質バンドの免疫検出の時に、強い反応によって証明された（図６ｂ参照）。免疫反応性６５ｋＤａバンドもまた、総形質転換細菌タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出され、これはおそらく、３２．４ｋＤａ融合タンパク質のダイマーを表わす（図６ｂ）。組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質を、セルロースビーズへのＣＢＤの親和性を利用して、４．５Ｍ尿素−可溶化封入体から、セルロースビーズ上で精製した。得られた高度に精製されたＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質を用いて、ウサギ中のポリクローナル抗−ＣＢＤ−ＳＰ１抗体を調製した。これらのポリクローナル抗−ＣＢＤ−ＳＰ１抗体はまた、形質転換細胞抽出物のウエスタンブロット上で、３２．４ｋＤａおよび６５ｋＤａのＣＢＤ−ＳＰ１タンパク質バンドも認識し、さらには組み換えＣＢＤ−ＳＰ１およびネイティブＳＰ１ポリペプチドの抗原性同一性も確認された。非変性条件（ＰＢＳ緩衝液）下、精製ネイティブＳＰ１タンパク質および組み換えＣＢＤ−ＳＰ１タンパク質の分子量は、ゲル濾過ＨＰＬＣ、および抗−ＳＰ１および抗−ＣＢＤ−ＳＰ１抗体を用いたウエスタンブロットでの、溶離されたタンパク質画分の免疫検出によって評価された。ネイティブＳＰ１および組み換えＣＢＤ−ＳＰ１タンパク質の両方は、それぞれ約９．８分および９．２分において単一ピークとして溶離した（図７）。これらのピークは、１７２．５±１．２５ｋＤａおよび２６７．５±２．５ｋＤａの分子量に相当し、これらはそれぞれ、ＳＰ１モノマー（１２．３６９ｋＤａ）１４単位（１３．９）とＣＢＤ−ＳＰ１モノマー（３２．４ｋＤａ）８．４単位との複合体を表わしている。当然ながらサブユニットの数は評価することができるだけであるが、その理由は、これらの結果がこの複合体の形状によって影響されるからである。
【０２１３】
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中のＳＰ１ＤＮＡのクローニングおよび組み換えＳＰ１タンパク質の分泌：組み換え非融合ＳＰ１分泌タンパク質を、「材料および方法」に記載されているように、ＳａｌＩ−またはＢｇｌＩＩ線状化ｐＰＩＣ９ＫプラスミドからのＳＰ１ＤＮＡを用いたＰｉｃｈｉａＳＭＤ１１６８（プロテアーゼ欠失突然変異体、Ｈｉｓ＋、Ｍｕｔ＋）細胞の形質転換によって生成した。高レベルのＳＰ１発現を誘導し、培養物へのメタノールの添加によって、形質転換細胞中に９６時間維持した。１つのＭｕｔ＋および１つのＭｕｔｓ形質転換細胞は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図８）および抗−ＳＰ１抗体を用いたウエスタンブロットでの免疫検出によって立証されているように、対照細胞培養培地には存在しない、比較的高レベルの組み換えＳＰ１を発現および分泌することが分かった。
【０２１４】
組み換えＳＰ１タンパク質のＳＤＳ−および熱−安定特性：形質転換細胞の培養培地からの組み換えＳＰ１タンパク質を、組み換えおよびネイティブポリペプチドの機能的類似性を決定するために、熱およびＳＤＳ濃度の両極端に暴露した（図８）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの熱−およびＳＤＳ−処理培養培地の分離は、ネイティブＳＰ１の場合と同様に、組み換えＳＰ１オリゴマーが煮沸耐性であり、ＳＤＳの高濃度（２％）の存在下においてのみ、モノマー形態に解離することを示している。
【０２１５】
組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質は、ＣＳの熱安定性を増す：組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質がシトレートシンターゼ酵素活性を熱不活性化に対して保護する能力を、ＣＳ比色アッセイ（「材料および方法」に記載されている）を用いて証明した。ネイティブＳＰ１タンパク質と同様に、精製組み換えＣＢＤ−ＳＰ１は、４３℃でＣＳ酵素活性の熱不活性化に対して、有意な濃度依存性保護を与えた（図３ｂ）。４０分後、７３％活性が、ＣＳ：ＣＢＤ−ＳＰ１モノマーモル比１：２０に残存していた。１：５の比において、酵素活性の３３％が、対照と比較して保持された。これとは対照的に、高濃度の非融合ＣＢＤタンパク質（図３ｂ）、ＢＳＡ、またはリゾチームタンパク質（図３ａ）を用いたインキュベーションは、ＣＳの不活性化に対して保護的効果を有していなかった。ほかのタンパク質安定剤、例えばグリセロール（１０または２０％）、またはＨｓｐアルファ−クリスタリン（１：１２．５ＣＳ：アルファ−クリスタリン比）を用いたインキュベーションもまた、ＣＳ不活性化に対して効果がなかった（図３ｃ）。したがってクローン化された配列によってコードされたＳＰ１の部分は、ネイティブタンパク質の熱保護特性を保持する。
【０２１６】
植物からの煮沸安定タンパク質は、ＣＳ酵素活性の熱不活性化に対して保護する：ほかの植物種におけるＳＰ１様タンパク質の存在を、ＣＳ酵素活性の熱−不活性化に対する、トマトおよびマツ（これらは進化的に遠い植物である）からの煮沸安定タンパク質画分の効果をアッセイすることによって調査した。トマトＭ８２、トマトＶＦ３６、およびマツ植物からの総煮沸安定タンパク質を調製し（「材料および方法」に記載されている）、粗ポプラ煮沸安定タンパク質画分と、４３℃におけるＣＳ酵素活性へのこれらの熱安定化効果について比較した。熱不活性化に対する有意な保護（４０分後に残存する６０％超の活性）が、トマトおよびマツ煮沸安定画分によって証明された（図９）。
【０２１７】
マツおよびトマトからのＳＰの免疫交差反応性、ストレス応答性、およびオリゴマー構造：系統発生的に遠い種からの安定タンパク質の抗原性交差反応性を、ウエスタンブロッティングおよび抗−ＳＰ１抗体での免疫検出によって調査した。塩−および渇水ストレスを受けたトマトの葉、および温度−および渇水ストレスを受けたマツ材料からの総煮沸安定タンパク質を調製し（上記の「材料および実験方法」として記載されている）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上へブロッティングし、抗−ネイティブオリゴマーＳＰ１抗体、または抗−組み換えＳＰ１抗体（抗−ＣＢＤ−ＳＰ１）と免疫反応させた。４５−５０ｋＤａにおいて主なストレス応答バンドをともなう交差反応性タンパク質を、トマト（図１４ｃおよび１４ｄ）およびマツ抽出物（図１４ａおよび１４ｂ）の両方のブロットにおいて検出した。同様な交差反応性もまた、イネおよびトウモロコシ煮沸安定タンパク質抽出物について観察された。
【０２１８】
電子顕微鏡法によるネイティブＳＰ１分子構造の特徴決定：ネイティブＳＰ１の分子構造を、走査電子顕微鏡を用いて調べた（「材料および方法」）。精製ＳＰ１タンパク質のこれらのＴＥＭ研究は、中央空洞部を有するリング様タンパク質を示した。構造直径全体は、約１１ナノメートルである（図１０）。
【０２１９】
ＳＰ１によるα−アミラーゼの保護：ＳＰ１によるＨＲＰおよびＣＳ保護に加えて、ＳＰ１は、高いＣａＣｌ２濃度（塩変性として知られている）、および室温における長時間のインキュベーションの両方によって誘発された不活性化から、α−アミラーゼを保護するために用いることができることが本明細書において証明される。図１５に示されているように、高濃度におけるＣａＣｌ２は、α−アミラーゼを不活性化し、１Ｍおよび２Ｍ  ＣａＣｌ２における２時間のインキュベーション後、α−アミラーゼ活性は、それぞれ６０％未満および１０％未満に低下した。ＳＰ１処理された酵素は、１Ｍ  ＣａＣｌ２の存在下、完全に保護され、２Ｍ  ＣａＣｌ２の存在下に５０％保護された。室温における希釈α−アミラーゼ溶液の長いインキュベーションもまた、酵素活性の劇的損失を引起こした。図１６に示されているように、約２５％の活性のみが、室温で１週間のインキュベーション後に残存した。しかしながらＳＰ１の存在下、４０％超の活性が、室温で１週間のインキュベーション後に残存した。したがってＳＰ１は、高いＣａＣｌ２、および室温での希釈酵素溶液の長時間インキュベーションの両方によって誘発される不活性化から、α−アミラーゼを保護する。
【０２２０】
ＳＰ１による酵素活性の修復：酵素活性を修復するＳＰ１の能力を、酵素α−アミラーゼ、ＳＯＤ、およびＨＲＰに関して評価した。
【０２２１】
ＳＰ１によるα−アミラーゼ活性の修復：図１７に示されているように、α−アミラーゼへのＳＰ１の添加の結果、ＳＰ１を含まない酵素と比較して、α−アミラーゼ活性の６０％増加を生じた。この結果は、ＳＰ１が、貯蔵または活性アッセイの間、一部活性を失ったα−アミラーゼを修復することを明らかに示している。
【０２２２】
ＳＰ１によるホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性の修復：希釈されたＨＲＰは、室温に暴露した時に容易に不活性化される。図１８に示されているように、ＨＲＰ活性の３５％以上が、室温への３０分暴露の時に失われた。図１８にさらに示されているように、ＳＰ１は、室温誘発不活性化からＨＲＰを保護するのみならず、損傷を受けたＨＲＰを修復もするが、それは、ＨＲＰ活性の約１０％が、ＳＰ１添加の時に救済され、その後少なくとも６時間維持されたからである。これは、実験の間中活性を失い続けるＳＰ１未処理ＨＲＰとはっきり区別される。
【０２２３】
ＳＰ１によるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の修復：ＳＰ１の修復活性を、ＳＯＤに対しても評価した。図１９に示されているように、化粧品グレードＳＯＤ（ペンタファーム（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ））へのＳＰ１の添加の結果、ＳＰ１未処理ＳＯＤと比較して、６０％高い活性を生じた。この修復活性は、濃度依存性であり、貯蔵またはアッセイの間一部活性を失ったＳＯＤを修復しうることを証明している。
【０２２４】
ＳＰ１を有するポリペプチドの融合の結果としての低下した免疫応答：１６匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に、ＣＢＤ｛５μＭ（マウス１〜４）、０．０５μＭ（マウス９〜１２）｝、またはＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質｛５μＭ（マウス５〜８）、０．０５μＭ（マウス１２〜１６）｝を腹膜内（１００μｌ）注射した。図２０ａに示されているように、免疫化の３５日後、ＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質が注射されたマウスにおける抗−ＣＢＤ抗体の血液力価は、単独のＣＢＤが注射されたマウスにおける抗−ＣＢＤ抗体の血液力価よりもはるかに低かった。ＣＢＤが注射されたマウスの抗体力価と、ＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質が注射されたマウスとの差は、マウスが、より少ない量の抗原で免疫化された時、および注射後の時間がより短い時の方が一層大きい（図２０ｂ（ｉ）〜（ｉｖ））。
【０２２５】
ＳＰ１は、植物に塩耐性を与える：植物への非生物ストレス耐性遺伝子の挿入を用いて、ストレス耐性作物を開発する。塩耐性に対するＳＰ１タンパク質発現レベルの効果を、ＳＰ１トランスジェニックポプラ（Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ）ラインにおいてテストした。ＮＴ（非形質転換植物）植物、ならびにＭ４およびＬ３トランスジェニック植物は、ＳＰ１−タンパク質の正常なレベルを発現し、一方、Ｈ３トラスジェニック植物は、ＳＰ１−タンパク質のかなり高い方のレベルを発現する。幹の長さ、葉の保持、および植物器官の最終乾燥重量を、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ植物（ＮＴ）において、および３つのＳＰ１−形質転換Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａラインにおいて、正常な灌漑方式（ｒｅｇｉｍｅｎ）に対して、ポット実験における塩ストレスおよび塩ストレスからの回復後に測定した（図２１ａ−ｃ）。塩ストレスの結果としてひどい成長抑制が観察された。しかしながら、かなり高い方のレベルのＳＰ１タンパク質を発現するＨ３植物は、普通〜低いＳＰ１レベルを発現する植物よりも、塩ストレスに対してはるかに良好な耐性を示す。回復期間の間の高いＳＰ１レベルの有利な効果は、さらに一層明確であった。すなわち、Ｈ３植物は、その他のラインよりもはるかに良好に塩ストレスから回復した。異なるライン間の有意差は、正常な灌漑方式下には観察されなかったことに注目することが重要である。
【０２２６】
ＳＰ１は傷治癒を誘発する：図２２に示されているように、ＳＰ１は、密集成長単層において引っかかれて裸にされた区域の移動を刺激したが、このことは、傷治癒プロセスにおけるＳＰ１の正の効果を示している。
【０２２７】
毛髪の強さに対するＳＰ１の効果：毛髪は、タンパク質、例えば大部分がケラチンから構成され、したがってＳＰ１は、毛髪を安定および強化させうる。毛髪の強さは、重量に耐えるその能力の測定によってテストされ、それ以上では毛髪がちぎれる重量として規定された。毛髪の強さは、同じドナー間でさえ様々であるので、各々の毛髪を、２つの断片に切断し、１つの断片をトリス緩衝液で処理し、他方はＳＰ１を含有する同じ緩衝液で処理した。各々の個別断片の強さを、他方の強さと比較した。図２５に示されているように、ＳＰ１処理された毛髪の平均の強さは、１６％であり、対照未処理毛髪のものよりも有意に高かった。したがってＳＰ１処理は、ヒトの毛髪を強化する。
【０２２８】
分子の足場として役立つＳＰ１：ＳＰ１とセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）との間の融合を用いて、ＳＰ１のポリペプチドとの融合が、両方の成分の特徴を維持することを証明した。組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合が、ＳＰ１と同様に１２マーオリゴマー中に自発的に組み立てられる能力を維持し、これがＣＢＤと同様にセルロース結合能力を維持し、ＳＰ１と同様にＨＲＰを安定させうることが証明された。図７は、ＳＰ１およびＣＢＤ−ＳＰ１の両方のサイズ排除ＨＰＬＣプロフィールを示している。どちらも、１２マーオリゴマー中に自発的に組み立てられる（図１０）。図２３ａは、セルロースへのＣＢＤ−ＳＰ１の結合能力と、ＣＢＤの結合能力とを比較している。等モル量のＣＢＤおよびＣＢＤ−ＳＰ１タンパク質（左から最初の２つのレーン；ＣＢＤ分子量を基準にして計算された場合１５ｐモル）を、セルロース（シグマセル（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）型２０）３０ｍｇに加えた。同じ結合および溶離手順を、これらの２つのタンパク質に対して実施した。ＣＢＤと同様に、ＣＢＤ−ＳＰ１はセルロースに結合し、同じ条件下に溶離された。ＣＢＤ−ＳＰ１およびＳＰ１の両方のＨＲＰ保護活性を、図２３ｂに示す。ＣＢＤ−ＳＰ１がＳＰ１と同様にＨＲＰを安定させることは明らかである（ＣＢＤ−ＳＰ１の分子量がＳＰ１のものよりも約２倍高いことに注目のこと）。したがってこれらの結果は、ＳＰ１のＣＢＤとの融合が、ＳＰ１およびＣＢＤの両方の特徴を維持することを証明している。
【０２２９】
ＳＰ産生：植物部分およびｓｐｌ−形質転換細菌からのＳＰ抽出および精製は、煮沸およびプロテアーゼへのタンパク質耐性を利用する。例えば図２４ａ（ｉ）〜（ｉｉ）および２４ｂに示されているように、新鮮なポプラの葉およびｓｐｌ−形質転換細菌の両方の粗抽出物中に存在する大部分のタンパク質は、煮沸またはスブチリシンによるタンパク質分解によって除去されるが、ＳＰはそうではない。このような処理後に見られた主なタンパク質は、ＳＰである。
【０２３０】
下記の表Ｉは、ＳＰが上記の方法を用いて精製された源を要約している。表Ｉによれば、各事例において用いられた正確な手順、および使用された活性アッセイの詳細の記載がある。
【表Ｉ】
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【０２３１】
新鮮な植物材料からのＳＰ精製：新鮮な材料（２００グラム、８０％水分）を、３５０ｍｌ  Ｎａアセテート（１００または１５０ｍＭ）と混合し、家庭用フードプロセッサー（マジミックス（Ｍａｇｉｍｉｘ））で５分間、均質ペーストになるまで潰した。固体をガーゼによって分離し、液体を収集し、１０分間煮沸した。熱処理によって形成された固体を、０．２ｍｍステンレススチル（ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｉｌｌ）メッシュを通す濾過によって除去し、ｐＨをＮａＯＨで８．４＋／−０．１に設定した。アルカラーゼ（ノボ・ノルディスク社（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｌｔｄ））を添加し（１：１０００ｖ／ｖ）、シェーカーまたは攪拌機で３７℃で２時間インキュベーションし、プロテアーゼ感受性タンパク質を消化した。プロテアーゼ処理の後に、１０分間の煮沸を行なった。沈殿粒子を遠心分離によって除去した（１００００〜１３０００ｇ）。濾過物を、３０ｋＤａカットオフ膜（サルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＬＴＤ））での限外濾過によって濃縮し、リン酸塩緩衝化生理食塩水によって洗浄した。フェノール化合物酸化が、得られた濾過物を黒くする場合（出発原料が、ポプラ、トマト、トウモロコシ、およびサトウモロコシであるような手順の場合に典型的である）、もう１つの洗浄工程を、遠心分離および限外濾過の前に実施した。これは、１００ｐｐｍアスコルビン酸、４００ｐｐｍＮａメタ−亜硫酸水素塩（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  ＬＴＤ）、および２．５％ポリビニルポリ−ピロリドンの添加、ついで４℃で一晩混合物を攪拌する工程を包含した。
【０２３２】
粒および乾燥葉からのＳＰ精製：異なる穀物（大麦またはアベナ）の粒および予め乾燥された葉（ポプラ、トウモロコシ、またはサトウモロコシ）、および追加の物質、例えばパン酵母を、コーヒーグラインダー（ブラウン社（Ｂｒａｕｎ  ＬＴＤ））を用いて粉末になるまで磨砕した。酵母細胞を、ガラスビーズを用いた渦巻き攪拌（ｖｏｒｔｅｘ）によって抽出した。処理された材料によって示された水分吸着にしたがって、９〜１１ｖ／ｗのＮａアセテート（０．１５Ｍ）でのタンパク質抽出のための出発原料として、４〜５グラムの粉末を用いた。この溶液を攪拌し（室温で１．０時間）、これらの液体を遠心分離（２７００ｇ、２０分）によって分離し、同じ条件下、もとの１粉末重量あたり９倍体積の緩衝液を用いて、これらの固体の抽出を繰返した。ついで両方の抽出物から収集された液体を、「新鮮な植物材料からのＳＰ精製」について上に記載されている基本的プロトコルにしたがってともに処理した。
【０２３３】
ＳＰ活性を決定するために、次のアッセイを用いた：
ＨＲＰ保護アッセイ：ＨＲＰの１００μｌアリコート（シグマ、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中５ｎＭ、ｐＨ７．５）を、２５℃において、異なるタンパク質濃度で抽出物の存在下にインキュベーションした。アリコートを１６時間後に除去し、残存酵素活性を決定した。ＨＲＰ反応条件を次のように決定した。すなわち５μｌの５ｎＭ  ＨＲＰおよび１００μｌのＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；ピアス）を、２５℃でインキュベーションした。反応を、１０分後１Ｍ硫酸の添加によって停止し、４３５ｎｍでマイクロプレートリーダーによって記録した。ＨＲＰの比色反応、ならびにＨＲＰ基質濃度は、線形範囲内にあると決定された。保護単位は、上記条件下、ＨＲＰ活性の５０％保護を与える、１ｍｇ／ｍｌの濃度における抽出物溶液の希釈率として規定された。
【０２３４】
ＳＰ１の比活性の増加：
図２６ａ〜ｂは、オートクレーブ処理後の組み換えＳＰ１比活性の増加を示すプロットおよび表を示す。純粋な組み換えＳＰ１を、ＰＢＳに対して透析し、ＰＢＳ中に１０または１００倍希釈した。非希釈ならびに希釈ＳＰ１をオートクレーブし、沈殿物を遠心分離によって除去した。上記のＨＲＰ保護アッセイを用いて残存タンパク質濃度および保護活性を測定した。オートクレーブされたＳＰ１は、非オートクレーブＳＰ１と比較して、ＨＲＰ活性をよりよく保護することに注目されたい。これは、オートクレーブ後、ＳＰ１比活性が増加されることを示している。
【０２３５】
図２７ａ〜ｂは、タンパク質ゲル電気泳動法結果（クーマシーブルー）を示しており、棒グラフは、プロテアーゼ処理後の組み換えＳＰ１比活性の増加を表わしている。ＳＰ１遺伝子（ｐＥＴ２９ａ、カナマイシン耐性）を有するプラスミドを内部に持つ大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、５×ＬＢ培地中に増殖させ、ＳＰ１タンパク質を発現させるためにＩＰＴＧによって誘導した。細菌細胞ペレットを、トリスＨＣｌ緩衝液（３０ｍＭ；ｐＨ８．４；１グラム／６ｍｌ）中に縣濁し、氷上で超音波処理した。トリトン−Ｘ−１００およびリゾチームを添加し（それぞれ０．１％および１０ｍｇ／ｍｌ）、静かな攪拌をしつつインキュベーションし（３７℃で１時間）、ついで遠心分離をし（１５０００ｇ、１５分、４℃）、およびペレットを廃棄した。タンパク質を消化するために、アルカラーゼまたはサビナーゼ（ノボ・ノルディスク社）を、示されている希釈において抽出物に添加し、この溶液を、静かな攪拌をしつつインキュベーションした（３７℃で３時間）。煮沸感受性タンパク質を除去するために、抽出物を煮沸し（１０分間）、氷上で冷却し、遠心分離した（１００００ｇ、１５分、４℃）。上記のＨＲＰ保護アッセイを用いて測定した場合、特にプロテアーゼアルカラーゼを用いた時の、比活性の顕著な増加に注目されたい。
【０２３６】
特にどのような理論にも結びつけることなく、上記オートクレーブおよびプロテアーゼ処理実験において観察された比活性の増加は、単離物中に依然として存在する非ＳＰタンパク質の凝集またはタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｉｔｉｃ）消化、および／または除去を介した、または単離物中に存在する非活性、変性、または一部変性ＳＰタンパク質の凝集またはタンパク質分解消化、および／またはＳＰ活性化を介した、またはＳＰ阻害剤の排除、または不活性形態から活性形態へのＳＰコンホメーションのシフトを介した排除によって達成されると考えられる。もう１つの仮説は、標的タンパク質に対する直接的効果、例えばさもなければこれを分解するようなプロテアーゼの排除である。すべての場合、タンパク質の１つの量あたりの保護活性の単位において決定された単離ＳＰタンパク質の比活性は、増加すると予想される。
【０２３７】
本発明のいくつかの特徴は、明確化のために、別個の実施形態に関連して記載されているが、これらはまた、１つの実施形態において組合せで提供されている場合があることが理解される。逆に、本発明の様々な特徴が、簡潔化のために、１つの実施形態に関連して記載されているが、これらはまた、別個に、または任意の好適な部分的組合せで提供されている場合がある。
【０２３８】
本発明を特定の実施形態と共に記載しているが、多数の変更形態、修正形態、および変形形態が当業者に明らかであることが明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれるこのような全ての変更形態、修正形態、および変形形態が含まれることが意図される。全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が、それぞれの刊行物、特許、および特許出願があたかも特別または個別に本明細書中で参考として援用されるように示されるような範囲に本明細書中で参考として援用される。さらに、本出願における任意の引例の引用または識別により、このような引例が先行技術として本発明で利用可能であることを承認すべきではない。
【０２３９】
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【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】精製された１２．４ｋＤａＳＰ１モノマーおよび１１６ｋＤａオリゴマー画分のＳＤＳ−トリシンＰＡＧＥでの分離を示している。
【図２ａ】ＳＤＳ−および熱処理へのＳＰ１オリゴマーの安定性を示している。図２ａは、ＳＰ１オリゴマーのＳＤＳ安定性を示す。
【図２ｂ−ｃ】ＳＤＳ−および熱処理へのＳＰ１オリゴマーの安定性を示している。図２ｂ〜ｃは、ＳＰ１オリゴマーの熱安定性を示す。
【図３】ネイティブまたは組み換えＳＰ１の添加による、熱不活性化からのシトレートシンターゼ（ＣＳ）の保護を示している。
【図４】ＳＰ１の添加による、熱不活性化からのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の保護を示している。
【図５】ＳＰ１ｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号１）およびＳＰ１の推論されたタンパク質配列（配列番号２）を描いている。
【図６】形質転換大腸菌細胞からの組み換えＣＢＤ−ＳＰ１融合タンパク質（３２．４ｋＤａ）のＰＡＧＥ分析および免疫検出を示している。
【図７】ネイティブＳＰ１および組み換えＣＢＤ−ＳＰ１のゲル濾過ＨＰＬＣ分子量分析を示している。
【図８】Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中に発現された組み換えＳＰ１の煮沸安定特性を示している。
【図９】植物からの煮沸安定タンパク質画分によるＣＳの熱不活性化の予防を示している。
【図１０】ＳＰ１分子構造の走査電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を描いている。
【図１１】ＣＢＤ−１８０要素の下流であって、ＮｃｏＩとＢａｍＨＩ制限部位との間に挿入されたＳＰ１ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を含む、プラスミド構築物ｐＥＴ−ＣＢＤ１８０−ＳＰ１を描いている。
【図１２】様々な関連および非関連植物種からの相同ＥＳＴからの推定ＳＰ１ポリペプチド（配列番号２）と推定ペプチド配列との間の配列相同性の比較を描いている。
【図１２（Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ）】様々な関連および非関連植物種からの相同ＥＳＴからの推定ＳＰ１ポリペプチド（配列番号２）と推定ペプチド配列との間の配列相同性の比較を描いている。
【図１３】推定ＳＰ１ポリペプチド（配列番号２）と、あるｐｏｐ３ｍＲＮＡ（配列番号３４）によってコードされた推定ペプチドとの間の配列相同性の比較を描いている。
【図１４】ＳＰ１への抗原性交差反応性を有するマツおよびトマトからのＳＰの免疫検出を描いている。
【図１５】ＳＰ１がα−アミラーゼをＣａＣｌ２誘発された不活性化から保護することを示している棒グラフである。
【図１６】ＳＰ１が室温でのインキュベーションの間α−アミラーゼ活性を保護することを示す棒グラフである。
【図１７】ＳＰ１がα−アミラーゼ活性を修復することを示す棒グラフである。
【図１８】ＳＰ１が、損傷ＨＲＰを修復することを示す棒グラフである。
【図１９】ＳＰ１がＳＯＤ活性を修復することを示すプロットである。
【図２０ａ】ＣＢＤを注射されたマウスのＣＢＤに対する免疫応答が、ＣＢＤ−ＳＰ１融合が注射されたマウスよりもはるかに高いことを示すグラフである。
【図２０ｂ】ＣＢＤを注射されたマウスのＣＢＤに対する免疫応答が、ＣＢＤ−ＳＰ１融合が注射されたマウスよりもはるかに高いことを示すグラフである。
【図２１】塩ストレスおよびストレスからの回復後のポプラ植物の幹の伸長、葉の保持、および乾燥重量を示す棒グラフである。
【図２２】傷の治癒に対するＳＰ１の効果を示す棒グラフである。
【図２３】ゲルの写真および表である。
【図２４】植物および組み換え細菌からのＳＰ１タンパク質産出を示す写真である。
【図２５】ヒトの毛髪に対するＳＰ１の効果を示す棒グラフである。
【図２６】オートクレーブ処理後の組み換えＳＰ１比活性の増加を示す表およびプロットである。
【図２７ａ】クーマシーブルー染色ゲル電気泳動法結果の写真を示す。
【図２７ｂ】プロテアーゼ処理後の組み換えＳＰ１比活性の増加を示す棒グラフを示す。
【配列表フリーテキスト】
【０２４１】
配列番号３は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号４は合成オリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号３３はコンセンサス配列である。
配列番号３７は保存されたコンセンサス配列である。
配列番号３８は保存されたコンセンサス配列である。
【配列表】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２（Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ）】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７ｂ】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ−ｃ】
2005537796.tif 000074
【図６】
2005537796.tif 000075
【図８】
2005537796.tif 000076
【図１０】
2005537796.tif 000077
【図１４】
2005537796.tif 000078
【図２３】
2005537796.tif 000079
【図２４】
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【図２７ａ】
2005537796.tif 000081
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月9日(2005.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＲＰ保護アッセイを用いて決定された場合、少なくとも１０単位／ｍｇタンパク質のＨＲＰ保護活性を有し、シャペロン様活性を有する、単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質であって、前記ＨＲＰ保護アッセイは、異なる最終タンパク質濃度で、予め決定された体積においてシャペロン様活性を有する、単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質と、ｐＨ７．５における４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に存在する５ｎＭ  ＨＲＰ１００μｌとを混合し、このようにして第一反応混合物を形成し、前記反応混合物の２５℃における１６時間のインキュベーション後、前記第一反応混合物５μｌと３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン１００μｌとを混合し、このようにして第二反応混合物を形成し、前記第二反応混合物を１０分間インキュベーションし、前記第二反応混合物の反応を１Ｍ硫酸１００μｌの添加によって停止し、前記第二反応混合物中の比色変化を４３５ｎｍにおいて記録することによってＨＲＰ残存酵素活性を測定する工程を含み、ここで、前記単位は、前記ＨＲＰ保護アッセイにおいてＨＲＰ活性の５０％保護を与える、１ｍｇ／ｍｌの濃度においてシャペロン様活性を有する前記変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の希釈率として規定される単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項２】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項３】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも１０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項４】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも１５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項５】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも２０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項６】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも２５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項７】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも３０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項８】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも３５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項９】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも４０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１０】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも４５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１１】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも５０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１２】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも５５００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１３】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも６０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１４】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも８０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１５】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも１００００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１６】
前記ＨＲＰ保護活性は、少なくとも１５０００単位／ｍｇタンパク質である請求項１に記載の単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質。
【請求項１７】
タンパク質１ｍｇあたりの保護活性単位として決定された、シャペロン様活性を有する予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の比活性を増加させる方法であって、前記予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をオートクレーブする工程を含む方法。
【請求項１８】
タンパク質１ｍｇあたりの保護活性単位として決定された、シャペロン様活性を有する予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質の比活性を増加させる方法であって、前記予め単離された変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性タンパク質をプロテアーゼで処理する工程を含む方法。
【国際調査報告】
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