(57)【要約】加水分解により放出されるか又は光によって活性化され得るシンナメート部分及び生物学的に活性な分子部分を含むプロドラッグ組成物を開示する。このシンナメート部分は、生物学的に活性な分子部分とケイ皮酸骨格との間のアシル結合の適当な加水分解速度を達成するために、シンナメート部分の電子特性ならびに光反応性を修飾するための様々な電子供与基又は電子求引基の置換基を有していてもよい。生物学的に活性な分子は、任意の生物学的に活性な薬剤又は診断用薬、たとえば、パクリタキセル、カンプトテシン、ドキソルビシン、アメトプテリン、エトポシド、又はフルコナゾール等の化学療法剤であってもよい。本プロドラッグ組成物は、ターゲティングのためにプロドラッグ組成物上に担体部分を加えるように、又は薬剤の取り込みを促進するように、修飾することができる。本プロドラッグ組成物は、エネルギー源で活性化して、所望の部位で薬剤を放出することができる。代表的なエネルギー源は、体外又は体内のいずれかで投与することができる、電気力、超音波、光又は放射性物質の放射線の形態であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2005504006.tif 000016
〔式中、
Ｘ1Ａは、放出可能な生物学的に活性な部分の残基であり；
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニル及び−（ＣＲ15Ｒ16）ｐ−Ｄからなる群より独立して選択され；
ここで、Ｒ15及びＲ16は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；及びＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニルからなる群より独立して選択され；
ｐは、１〜約１２の正の整数であり；
Ｄは、−ＳＨ、−ＯＨ、Ｘ2、−ＣＮ、−ＯＲ19、ＮＨＲ20、
【化２】
2005504006.tif 000017
の中から選択され、
ここで、
Ｒ17は、Ｈ、ＣＨ3又はＸ3であり；
Ｒ18は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル又はベンジルであり；
Ｒ19は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル、Ｘ2又はベンジルであり；
Ｒ20は、Ｈ、Ｃ1〜10アルキル又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ21
（式中、Ｒ21はＨであり、Ｃ1〜4アルキル又はアルコキシ、ｔ−ブトキシ又はベンジルオキシである）であり；
Ｘ2及びＸ3は、独立して選択されるハロゲンであり；
Ｒ3は、Ｈ、ＣＨ3、又は−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ15Ｒ16）ｗ−Ｄであり、
（ここで、ｗは、０又は１〜約１２の整数であり、Ｄは、Ｈであるか又はＲ1及びＲ2に関する記述どおりである）
Ｊは、Ｏ、ＮＨ又はＳであり；
Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル及びハロゲンからなる群より独立して選択され；
Ｚは、Ｈ、ＮＲ7Ｒ8又は
【化３】
2005504006.tif 000018
であり、
式中、
Ｒ7は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、アルケニル又はアルキニル（置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル、又は−（ＣＲ23Ｒ24）ｑ−アリール、又はＲ8の中から選択され、
ここで、Ｒ23及びＲ24は、Ｈ及びＣ1〜Ｃ10アルキルからなる群より独立して選択され；
ｑは、１〜約６の整数であり；
Ｒ8は、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ26及び（ＣＲ9Ｒ10）n−ＣＨ2−Ｅからなる群より選択され；
ここで、Ｒ9及びＲ10は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニル及びハロゲンからなる群より独立して選択され；
Ｒ26は、Ｈ、ＣＨ3、Ｏ−ｔ−ブチル、Ｏ−ベンジルであり；
Ｅは、ＯＨ、ＳＨ又はＯ−Ｃ（Ｏ）Ｒ27
（式中、Ｒ27は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ベンジル又はフェニルである）であり；
Ｒ22は、Ｈ又はＣＨ3であり；
ｎは、１〜約１０の正の整数であり；
Ｒ11は、Ｈ又は−Ｌ−Ｂ
（式中、Ｌはリンカーであり；
Ｂは、活性な部分、反応性基部分又はポリマーである）であり、
Ｒ25は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ28又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ29
（式中、Ｒ28は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル又はベンジルであり；Ｒ29は、ＣＨ3、ｔ−ブチル又はベンジルである）である〕
を含む化合物。
【請求項２】
Ｘ1が、Ｏ、ＮＨ、又はＳである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記生物学的に活性な部分の前記残基が、合成又は天然の有機化合物からなる群より選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記有機化合物が、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、及び診断用薬からなる群より選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記化学療法剤が、タキサン、タキサン誘導体、パクリタキセル、パクリタキセル誘導体、ドセタキセル、ドセタキセル誘導体、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体、ドキソルビシン、ドキソルビシン誘導体、アメトプテリン、エトポシド、イリノテカン及びフルコナゾールからなる群より選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記化学療法剤が、パクリタキセルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記生物学的に活性な部分の前記残基が、タンパク質、多糖、核酸、サイトカイン、成長因子、抗体、ｍＡＢ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ホルモン及び脂質からなる群より選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項８】
Ｚが、ＮＲ7Ｒ8である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ8が、−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＨ2である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ8が、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌ−Ｂが、マレイミジル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ11が、ポリアルキレンオキシド残基を含む、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ポリアルキレンオキシド残基が、ポリエチレングリコールである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ポリエチレングリコールが、約２，０００〜約２００，０００ダルトンの数平均分子量を有する、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ11が、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリ（−アスパラギン酸）、ポリ（−Ｌ−リシン）、ポリ（−乳酸）、ポリ（−乳酸）とポリ（−グリコール酸）とのコポリマー及びポリ−Ｎ−ビニルピロリドンからなる群より選択されるポリマーを含む、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１６】
【化４】
2005504006.tif 000019
〔式中、ｄは、正の整数であり、Ｒ30は、Ｈ、ｔＢｏｃ、ｆＭｏｃ又は保護基である〕
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
【化５】
2005504006.tif 000020
2005504006.tif 000021
〔式中、ｄは、正の整数であり、Ｒ30は、Ｈ、ｔＢｏｃ、ｆＭｏｃ又は保護基である〕
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
【化６】
2005504006.tif 000022
〔式中、Ｘ1Ａは、放出可能な生物学的に活性な部分であり；Ｒ30は、Ｈ、ｔＢｏｃ、ｆＭｏｃ又は保護基である〕
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１９】
【化７】
2005504006.tif 000023
2005504006.tif 000024
〔式中、Ｘ1Ａは、放出可能な生物学的に活性な部分であり；Ｒ30は、Ｈ、ｔＢｏｃ、ｆＭｏｃ又は保護基である〕
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２０】
【化８】
2005504006.tif 000025
〔式中、Ｒ30は、Ｈ、ｔＢｏｃ、ｆＭｏｃ又は保護基である〕
からなる群より選択される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｘ1Ａが、
【化９】
2005504006.tif 000026
〔ここで、＊は結合点を示す〕
からなる群より選択される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
【化１０】
2005504006.tif 000027
2005504006.tif 000028
からなる群より選択される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｊが、Ｏであり、Ｒ2が、Ｈであり、Ｒ7が、ＣＨ3ＣＨ2であり；Ｒ8が、−（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11であり、ｎが、２であり、Ｒ9及びＲ10が、ともにＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6が、Ｈ、ＣＨ3及びＣＨ3ＣＨ2からなる群より独立して選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ7が、ＣＨ3ＣＨ2であり；Ｒ8が、−（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11であり、ｎが、２であり、Ｒ9及びＲ10が、ともにＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２６】
請求項１に記載の化合物の薬学的に許容し得る塩。
【請求項２７】
請求項２０に記載の化合物の薬学的に許容し得る塩。
【請求項２８】
請求項２１に記載の化合物の薬学的に許容し得る塩。
【請求項２９】
Ｘ1Ａが、生物学的に活性な部分の残基である、請求項１に記載の化合物の有効量を、このような処置を必要としている哺乳動物に投与することを含む、処置方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物に投与した後、請求項１に記載の化合物をエネルギー源に曝露することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記エネルギー源が、３４０〜７００nmの範囲の波長を有する白色光である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記エネルギー源が、３５０〜４２０nmの範囲の波長を有する白色光である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記エネルギー源が、マイクロ波、超音波、電波エネルギー、γ放射線、放射能、紫外線及び赤外線からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
式
【化１１】
2005504006.tif 000029
〔式中、
Ｘ4は反応性末端基であり；
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニル及び−（ＣＲ15Ｒ16）ｐ−Ｄからなる群より独立して選択され；
ここで、Ｒ15及びＲ16は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；及びＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニルからなる群より独立して選択され；
ｐは、１〜約１２の正の整数であり；
Ｄは、−ＳＨ、−ＯＨ、Ｘ2、−ＣＮ、−ＯＲ19、ＮＨＲ20、
【化１２】
2005504006.tif 000030
の中から選択され
ここで、
Ｒ17は、Ｈ、ＣＨ3又はＸ3であり；
Ｒ18は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル又はベンジルであり；
Ｒ19は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル、Ｘ2又はベンジルであり；
Ｒ20は、Ｈ、Ｃ1〜10アルキル又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ21
（ここで、Ｒ21は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル又はアルコキシ、ｔ−ブトキシ又はベンジルオキシである）であり；
Ｘ2及びＸ3は、独立して選択されるハロゲンであり；
Ｒ3は、Ｈ、ＣＨ3、又は−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ15Ｒ16）ｗ−Ｄであり、
（ここで、ｗは、０又は１〜約１２の整数であり、Ｄは、Ｈであるか又はＲ1及びＲ2に関する記載どおりである）
Ｊは、Ｏ、ＮＨ又はＳであり；
Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル及びハロゲンからなる群より独立して選択され；
Ｚ1は、Ｈ又は
【化１３】
2005504006.tif 000031
2005504006.tif 000032
であり、
ここで、Ｒ30は、Ｈ、ｔＢｏｃ、ｆＭｏｃ又は保護基である〕
のケイ皮酸誘導体と、生物学的に活性な部分とを、前記ケイ皮酸誘導体への、前記生物学的に活性な部分の共有結合を引き起こすのに十分な条件で反応させることを含む、複合体を調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、一般に、薬剤又は他の分子を含有するエネルギー可逆的組成物に関する。特に、本出願は、ケイ皮酸又は関連分子のコア（本明細書ではＺ−ＣＩＮＮと示す）に結合した、本明細書で−Ｘ1Ａと示される薬剤部分及び他の生物学的に活性な部分に関する。
【０００２】
プロドラッグの場合、薬剤の特性を可逆的様式で変えて、薬剤の放出を制御するために、活性な薬剤を、一般に、別の分子に結合する。プロドラッグの大半は、薬剤部分のヒドロキシル基、アミノ基、又はチオール基と、担体分子のカルボキシレート基との間、又はその逆の間に形成される、エステル又はアミド結合を有する。結合を構成している分子の化学的特性によって、これらのプロドラッグは、数分から数日までの範囲の加水分解速度を有する。プロドラッグが投与される溶液の温度、ｐＨ及び化学組成物も、プロドラッグからの、活性成分の放出速度に影響を及ぼす可能性がある。非常に短い加水分解速度及び非常に長い加水分解速度は、一般に有用ではない。０．５〜４８時間の範囲の加水分解速度が、一般により望ましい。プロドラッグは、１）薬剤の水溶性特性を変えるように、２）薬剤の循環寿命を変えるように、３）より大きい生物膜透過、及び従って疾患部位へのより大きいアクセスを可能にするよう、親化合物より親油性であるように、４）たとえば、プロドラッグを、その不活性形でその作用部位に輸送させ、そこで、不活性なプロドラッグをその標的部位で活性な親化合物に変換させることによって、より低い毒性を有するように、５）プロドラッグ複合体に付いた特異的ターゲティング分子のため、標的部位にて選択的に結合するように、又は他の目的のために、デザインすることができる。
【０００３】
長年にわたって、多数のプロドラッグが開発されてきた。たとえば、様々な治療薬のアミノ酸エステルの調製を提案した者もいた。エステル結合を用いたポリマー複合体の形成を提案した者もいた。いずれの場合にも、活性な化合物は、加水分解によりin vivoで放出される。もう１つのアプローチは、放射線活性化細胞毒素プロドラッグを使用して、新生物疾患を処置する方法を開示している米国特許第６，０７１，９０８号に記載されている。このプロドラッグは、水の放射線分解で発生する還元剤を使用して、殺腫瘍細胞障害性エフェクターを放出する。
【０００４】
またさらなるプロドラッグアプローチは、酵素活性の可逆的調節に光を使用するPorterらの、米国特許第５，１１４，８５１号及び第５，２１８，１３７号参照）。具体的には、Porterらは、不活性な、ｏ−ヒドロキシシンナメート置換エステル又はアシル酵素を形成するために、酵素活性部位アミノ酸残基を、シンナメート（ＣＩＮＮ）誘導体に結合することを開示している。光分解の時に、活性部位アミノ酸残基との結合が切断され、活性部位が露出される。この概念に関連して多数の潜在的な利点がある。理論上、この技術を使用して、技術者は、in vivo又はex vivoで光に曝露することにより、in vivo酵素活性を特異的にかつ速やかに調節することができる。
【０００５】
Porterらの躍進にも関わらず、この分野での研究は続けられてきた。引き続き、当該技術分野において、阻害された酵素以外のシンナメート・コア・プラットホームを拡大する必要性がある。非酵素治療用化合物を体内の当該部位により上手くターゲティングする手段を提供することも望ましいであろう。これまでは、技術者は、治療上望ましい部位で薬剤が生成され得る時及び量を調節することがほとんどできなかった。さらに、投与される薬剤の量及び／又は非標的送達によって引き起こされる末梢器官損傷の量を減少させることは、当業者により歓迎されるであろう。プロドラッグの加水分解を、独立に開始又は調節できる能力を有することも有利であろう。プロドラッグ又は他の複合体を疾患部位に局在化する手段を有することも有利であろう。本発明はこれらの必要性及び他の必要性に取り組む。
【０００６】
発明の概要
本発明の目的は、本明細書でＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａとして示され、その−Ｘ1Ａ部分を、加水分解により、あるいは光又は超音波等のエネルギー入力により、調節された速度で調節可能に放出することができる、改良された組成物を提供することにある。
【０００７】
本発明のもう１つの目的は、疾患部位に結合して、−Ｘ1Ａを放出する前に、この複合体を濃縮することができる、Ｂ−Ｌと示される、Ｚ−ＣＩＮＮに結合したさらなる分子を組み込むことにより、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａを含む組成物が、表面又は疾患部位に、ターゲティング、送達及び結合するのを容易にする手段を提供することにある。
【０００８】
本発明のもう１つの目的は、本明細書で「Ｂ−Ｌ」として示される基を用いることを含む、様々な方法で誘導化することができるさらなる部位をＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ化合物上に提供し、本明細書でＢ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａと示され、安定性、循環時間増加、ターゲティング能、又は適切な支持体への固定等のさらなる特性を備えた、組成物を提供することにある。
【０００９】
従って、本発明の目的は、外因性の刺激を加えることにより、有効な薬剤を調節された速度で放出するプロドラッグ組成物、及びその調製方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、ターゲティング分子を組み込むことにより疾患部位へのプロドラッグ組成物の送達を容易にする手段を提供することにある。
【００１１】
本発明のもう１つの目的は、循環時間、溶解性、又は安定性を増加させるために、分子を組み込むことによりプロドラッグ組成物を変える手段を提供することにある。
【００１２】
本発明のもう１つの目的は、緩徐な放出、さらなる分子の精製等のために、生物表面又は非生物表面、たとえばビーズ、ステント、又は他のマトリックス材料に結合することができる分子を組み込むことにより、プロドラッグ組成物を変える手段を提供することにある。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は、酵素以外の生物学的に活性な分子を、上に明記されている様式で、結合及び放出することにある。
【００１４】
これらの目的及び他の目的は、一実施形態でＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ及び式（Ｉ）：
【００１５】
【化１４】
2005504006.tif 000002
【００１６】
〔式中、Ｘ1Ａは、放出可能な生物学的に活性な部分の残基であり；
【００１７】
Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニル及び−（ＣＲ15Ｒ16）ｐ−Ｄからなる群より独立して選択され；
【００１８】
ここで、Ｒ15及びＲ16は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；及びＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニルからなる群より独立して選択され、
【００１９】
ｐは、１〜約１２の正の整数であり；
【００２０】
Ｄは、−ＳＨ、−ＯＨ、Ｘ2、−ＣＮ、−ＯＲ19、ＮＨＲ20、
【００２１】
【化１５】
2005504006.tif 000003
【００２２】
の中から選択され
【００２３】
ここで、Ｒ17は、Ｈ、ＣＨ3又はＸ3であり；
【００２４】
Ｒ18は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル又はベンジルであり；
【００２５】
Ｒ19は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル、Ｘ2又はベンジルであり；
【００２６】
Ｒ20は、Ｈ、Ｃ1〜10アルキル又は−Ｃ（Ｏ）Ｒ21であり、
【００２７】
ここでＲ21は、Ｈ、Ｃ1〜4アルキル又はアルコキシ、ｔ−ブトキシ又はベンジルオキシであり、
【００２８】
Ｘ2及びＸ3は、独立して選択されるハロゲンであり；
【００２９】
Ｒ3は、Ｈ、ＣＨ3、又は−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲ15Ｒ16）ｗ−Ｄであり、
（ここで、ｗは、０又は１〜約１２の整数であり、Ｄは、Ｈであるか又はＲ1及びＲ2に関する記述どおりである）
Ｊは、Ｏ、ＮＨ又はＳであり；
【００３０】
Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル及びハロゲンからなる群より独立して選択され；
【００３１】
Ｚは、Ｈ、ＮＲ7Ｒ8又は
【００３２】
【化１６】
2005504006.tif 000004
【００３３】
であり、
【００３４】
式中、Ｒ7は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、アルケニル又はアルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル又はヘテロアルキニル、又は−（ＣＲ23Ｒ24）ｑ−アリール、又はＲ8の中から選択され、
【００３５】
ここで、Ｒ23及びＲ24は、Ｈ及びＣ1〜Ｃ10アルキルからなる群より独立して選択され；
【００３６】
ｑは、１〜約６の整数であり；
【００３７】
Ｒ8は、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11、（ＣＲ9Ｒ10）n−ＣＨ2−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ26及び（ＣＲ9Ｒ10）n−ＣＨ2−Ｅからなる群より選択され；
【００３８】
ここで、Ｒ9及びＲ10は、Ｈ、ＣＨ3、Ｃ2〜Ｃ10アルキル、Ｃ2〜Ｃ10アルケニル又はＣ2〜Ｃ10アルキニル（それぞれが置換されていても非置換であってもよく、直鎖であっても分岐鎖であってもよい）；Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルキル、Ｃ2〜Ｃ10ヘテロアルケニル又はＣ2〜Ｃ10ヘテロアルキニル及びハロゲンからなる群より独立して選択され；
【００３９】
Ｒ26は、Ｈ、ＣＨ3、Ｏ−ｔ−ブチル、Ｏ−ベンジルであり；
【００４０】
Ｅは、ＯＨ、ＳＨ又はＯ−Ｃ（Ｏ）Ｒ27であり、
【００４１】
ここで、Ｒ27は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、ベンジル又はフェニルであり；
【００４２】
Ｒ22は、Ｈ又はＣＨ3であり；
【００４３】
ｎは、１〜約１０の正の整数であり；
【００４４】
Ｒ11は、Ｈ又は−Ｌ−Ｂであり、
【００４５】
ここで、Ｌはリンカーであり；
【００４６】
Ｂは、第２の活性な部分、反応性基部分又はポリマーであり、
【００４７】
Ｒ25は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ28又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ29であり、
【００４８】
ここで、Ｒ28は、Ｃ1〜Ｃ6アルキル又はベンジルであり；Ｒ29は、ＣＨ3、ｔ−ブチル又はベンジルである〕
に対応する化合物が提供される本発明により実現される。
【００４９】
Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＨＳＯ4−等を含む、薬学的に許容し得る塩も提供する。
【００５０】
幾つかの好ましい態様では、Ｘ1Ａは、プロドラッグとしてＺ−ＣＩＮＮに結合するパクリタキセル又は別の化学療法剤（薬剤）等の、生物学的に活性な分子の残基である。
発明のまたさらなる態様では、式Ｉの反応性Ｚ部位を使用して、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ組成物が誘導体化される。特に、Ｒ8が（ＣＲ9Ｒ10）−ＮＲ22−Ｒ11であり、Ｒ11がＬ−Ｂであるとき、当業者は、中でも、ターゲティング抗体又はポリマー、たとえばＰＥＧ又は他のポリマーに連結される光活性化可能なプロドラッグを得ることができる。部分「Ｂ」は、−Ｈであってもよく、ＤＮＡ等の天然ポリマー、ＰＥＧ等の合成ポリマー、合成若しくは天然の有機分子、又は天然若しくは合成のターゲティングペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質、たとえばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であってもよい。
【００５１】
本発明の他の態様では、Ｈ−Ｘ1Ａは、生物学的に活性な分子又は部分、たとえば、Ｚ−ＣＩＮＮのＣ（＝Ｏ）に結合している式（Ｉ）のＸ1に対応する側鎖−Ｏ、−Ｓ又は−ＮＨを有するタンパク質である。従って、Ｈ−Ｘ1Ａは、Ｚ−ＣＩＮＮへの結合により不活性化され、かつ好ましくはin vivoでターゲティングを続行させた後、加水分解、光又は他のエネルギー源への曝露の１つ以上によって回復される生物学的活性を有することができる薬剤等である。
【００５２】
本発明の結果として、幾つかの利点が提供される。たとえば、これらのＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ不活化組成物は、ターゲティング能の向上、溶解性上昇、循環中の半減期増加、又は他の特徴等の、様々な有益な特性を有することができる。加えて、Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ不活化組成物は、リンカーＬを介して支持体材料に架橋することにより、固定することができる。支持体材料は、産業上又は薬学的に好適な任意の材料、たとえば、有機ポリマー、無機ポリマー、天然ポリマー、バイオポリマー又はゼオライトであってもよく、またフィルム、膜、フィルター、ビーズ、粒子、樹脂、微粒子、又はカラムの形態であってもよい。あるいは、Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａは、親和力等のメカニズム又は活性化支持体材料とのさらなるカップリング反応によって、支持体に結合させることができる。
【００５３】
式Ｉの組成物、Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａは、患者に投与するために、薬学的に許容し得る担体とともに使用することができる。一実施形態では、この担体は、リポソーム、マイクロカプセル、腸溶コーティング製剤、肺（吸入）投与用製剤の１つである。
【００５４】
Ｚ−ＣＩＮＮと−Ｘ1Ａを連結するアシル結合は、加水分解及び／又はエネルギー活性化を受けやすい。エネルギー活性化がなければ、アシル結合は、ほぼ中性のｐＨにて暗所で比較的安定でありうる。エネルギー活性化したとき、アシル結合は急速に加水分解されて、生物学的に活性なＨＸ1Ａを放出する。一実施形態では、可視光線、赤外線、紫外線、超音波、マイクロ波、及び放射線等の照射源への曝露後に、ＨＸ1Ａが放出される。別の実施形態では、エネルギー源は、Ｕ＊、Ｃｏ＊、Ｆｅ＊、Ｉ＊、Ｃｓ＊又はＴｃ＊（Ｍ＊は放射性物質を示す）等の放射性物質によって生じる放射線である。好ましい実施形態では、エネルギー源は、３００〜８５０nmの範囲の波長を有する光である。特に好ましい一実施形態では、この光は、３００nm〜４５０nmの範囲の波長を有する。最も好ましい光は、３５０nm〜４２０nmの範囲の波長を有する。
【００５５】
発明のさらなる態様では、本発明の組成物の調製方法及び使用方法も提供する。
【００５６】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される用語「再活性化」は、たとえばエネルギー源による、共有的アシル結合の切断によって、プロドラッグを変換し、親化合物Ｈ−Ｘ1Ａを再生する過程を指す。
【００５７】
用語「ケイ皮酸」は、３−フェニル−２−プロペン酸の通称又は慣用名である。Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1−Ａ分子は、ケイ皮酸の誘導体を含む。
【００５８】
ＩＵＰＡＣ名は、合成された化合物に与えられる。
【００５９】
本発明の目的上、用語「アルキル」、「アルケニル」及び「アルキニル」は、アルコキシ又は置換シクロアルキル等を含む、たとえば、これらの直鎖誘導体、分岐鎖誘導体、置換誘導体、シクロ誘導体を含むと理解されるものとする。「置換された」は、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−等を含むと理解されるものとする。
【００６０】
本発明の目的上、「分子」及び「生物学的に活性な分子」は、有機分子又は小分子のみならず、タンパク質、ペプチド等を包含すると理解されるものとする。
【００６１】
本発明の目的上、「ハロゲン」は、塩素、フッ素、臭素等を含むと理解されるものとする。
【００６２】
本発明の目的上、「−Ｘ1Ａ部分」（「−Ｘ1Ａ」）は、Ｚ−ＣＩＮＮのアシル結合が加水分解されるとき、本来の化合物すなわち親化合物Ｈ−Ｘ1Ａを再生する、Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ化合物の残基又は成分を意味すると理解されるものとする。
【００６３】
本発明の目的上、「Ｂ−Ｌ部分」（「Ｂ−Ｌ」）は、Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａの安定性、送達、又は局在化、たとえば、疾患部位又は身体の個々の器官又は領域への送達を促進する分子から誘導される、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ組成物上の置換基を意味すると理解されるものとする。
【００６４】
本発明の目的上、特に、可変要素Ｂを説明するために使用される「反応性基」は、マレイミジル残基の非共有電子対（二重結合）を含むがこれに限定されない、Ｌと１つ以上の生物学的に活性な部分又はポリマーとの接合を促進することができる部分を含むと理解されるものとする。
【００６５】
本発明の目的上、「エネルギー源」は、エネルギーの形態を意味すると理解されるものとする。エネルギー源は、患者の体外に当てられるか、又は、たとえば光ファイバーカテーテル、先端に超音波機能が付いたカテーテル又は放射線インプラント等を使用して患者体内に投与される。
【００６６】
ＩＩ．ケイ皮酸骨格を有するプロドラッグ
アシル結合（エステル又はアミド）結合の加水分解は、分子全体の安定性の関数である。ケイ皮酸骨格（Ｚ−ＣＩＮＮ）は、組成的又は構造的修飾を受ける。ケイ皮酸骨格の化学的特性を修飾する１つ以上の置換基を導入して、Ｚ−ＣＩＮＮと−Ｘ1Ａ部分との間に形成されるアシル結合の加水分解速度、ならびにＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａの感光性を、効果的に修飾することができる。
【００６７】
Ｚ−ＣＩＮＮ化合物は、アシル結合の所望の加水分解速度及びＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａの所望の感光性に基づいて選択される。アシル結合の加水分解速度は、この組成物の立体特性及び電子特性によって異なる。概して、電子求引基は、Ｚ−ＣＩＮＮの電子密度を低下させ、従って、水分子がカルボニル基を攻撃する傾向を増強し、従ってアシル結合の加水分解速度を高める。これにひきかえ、電子供与基は、Ｚ−ＣＩＮＮの電子密度を上昇させ、従って、水分子がカルボニル基を攻撃する傾向を低減させ、従って、アシル結合の加水分解速度を低下させる。同様に、立体障害基又は置換基は、アシル結合のカルボニル基に対する水分子の攻撃を妨害する傾向があり、従って、アシル結合の加水分解速度を低下させる。
【００６８】
プロドラッグの感光性は、主としてＺ−ＣＩＮＮの電子特性に左右される。概して、π−スタッキングシステムの電子密度の上昇によって、高波長を有する光による活性化を受けやすくなり、一方、π−スタッキングシステムの電子密度の低下によって、低波長を有する光による活性化を受けやすくなる。加えて、π−スタッキングシステムの増加は、活性化エネルギーを、より長い波長を有する光に移動させる傾向があり、一方、π−スタッキングシステムの減少は、活性化エネルギーを、より短い波長を有する光に移動させる傾向がある。様々な電子特性を有する置換基を使用して、ケイ皮酸骨格の感光性を修飾することができる。置換基は、式Ｉに記載のもの等の、任意の電子求引基又は電子供与基であってもよい。当業者は、所望の光又はエネルギー源及び所望の加水分解速度範囲に基づいて、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ組成物を生成するために必要なＺ−ＣＩＮＮ骨格を決定し、選択することができるであろう。
【００６９】
ＩＩＩ．Ｚ−ＣＩＮＮ誘導体
Ａ．Ｚ−ＣＩＮＮ
Ｚ−ＣＩＮＮをコア分子として使用して、様々な組成物を形成することができる。様々な官能基をＺ−ＣＩＮＮに導入して、その化学的性質ならびに物理的性質を修飾することができる。これらの組成物は、求核試薬又は光に対して、異なる反応性を有することもできる。幾つかの好ましい化合物を以下で詳細に論じる。
【００７０】
Ｚ−ＣＩＮＮコア分子は、式（ＩＩ）
【００７１】
【化１７】
2005504006.tif 000005
【００７２】
〔式中、全ての可変要素は、上述の式（Ｉ）に記載のとおりである〕
である。
【００７３】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）に関する１つの好ましい実施形態では、Ｚは、ＮＲ7Ｒ8である。さらに、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、及びＲ6は、Ｈであるか、ＣＨ3又はＣＨ2ＣＨ3等の低級アルキル基である。式（Ｉ）及び（ＩＩ）に関する、別の好ましい実施形態では、Ｒ7は、ＣＨ3ＣＨ2であり、Ｒ8は、−（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11であり、Ｒ9及びＲ10は、Ｈであり；式中、ｎは、２であり；Ｘ1は、Ｏ、Ｓ又はＮＨである。Ｊが、Ｏであり、Ｚが、ＮＲ7Ｒ8である、本発明のこれらの態様において、幾つかの好ましいＲ8基は、以下を含む：
【００７４】
１．（ＣＨ2）n−ＮＨ2及びその塩、たとえば−ＮＨ3＋：Ｃｌ−若しくはＢｒ−又はＨＳＯ4−等。
２．（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ
３．（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ3
４．（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ｔ−ブチル
５．（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−ベンジル
６．（ＣＨ2）n−ＯＨ
７．（ＣＨ2）n−ＳＨ
８．（ＣＨ2）n−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ21；〔式中、Ｒ21は、ＣＨ3、Ｃ1〜6アルキル又はフェニルであり；上記ｎはそれぞれ、２〜約１０、好ましくは２〜４の整数である〕。
【００７５】
本発明のまたさらなる態様では、Ｚは、置換されたピペラジンであり、それによって式（Ｉａ）：
【００７６】
【化１８】
2005504006.tif 000006
【００７７】
〔式中、全ての可変要素は、式（Ｉ）に関して、先に定義したとおりである〕
の組成物を提供する。
【００７８】
一般に、ケイ皮酸骨格は、標準技術及び当業者により入手できる試薬を使用して、合成することができる。このとき、ケイ皮酸骨格は、プロドラッグを形成するための、本明細書でＨ−Ｘ1Ａとして記載の親化合物との一次反応物の役割を果たす。
【００７９】
次に、例として図１を参照しながら、ケイ皮酸骨格の合成を説明する。具体的には、２−エチルアミノエチルアミン（１）等のアミンを、無水物（２）と反応させて、アミド（３）を生成することができる。３を、１，３−シクロヘキサンジオン（４）と縮合し、続いて脱水して、３−アミノ−２−シクロヘキセン−１−オン（５）を生成する。触媒の存在下で５を脱水素し、３−ヒドロキシフェニルアミン（６）を生成する。加水分解で保護基を除去して７を得て、続いてＮ−アシル化して８を得る。ＰＯＣｌ3/ＤＭＦと８との反応で、アルデヒド（９）を生成する。適切なウィティッヒ（Wittig）試薬、カルベトキシエチリデントリフェニルホスホラン（１０）と９との反応で１１を生成し、ここでアルデヒド基が２−プロペン酸エチルエステルに変換される。Ｎ−アシル基を交換して１２を得て、これをＬｉＯＨ中で加水分解して１３（ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ）を得る。式（Ｉａ）の化合物は、アミン（１）の代わりにピペラジンを使用して、同様に調製することができる。当業者は理解するであろうが、アルコールの代わりに他の基を使用して、ケイ皮酸骨格を、任意の数の代替官能基に連結することができる。このような代替は、式（ＩＩＩ）
【００８０】
【化１９】
2005504006.tif 000007
【００８１】
〔式中、全ての可変要素は、式（Ｉ）で前述したとおりであり、Ｘ4は、ＯＨ、ＮＨ、ＳＨ、ハロゲン、たとえば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等の反応性末端基であるか、又は、アルデヒド、ヒドラジン、カルバザート、トシル、メシル、パラニトロフェニル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、マレイミジル等を制限なく含む、当該技術分野で周知の他の反応性基であり、場合によって、Ｚ−ＣＩＮＮと末端反応性基との間の二官能性スペーサーを含む〕
で示される。本発明のこの態様の中で、幾つかの特に好ましい化合物に、以下のものが含まれる：
【００８２】
【化２０】
2005504006.tif 000008
2005504006.tif 000009
【００８３】
〔ここで、Ｒ30は、−Ｈ、−ｔＢＯＣ、ｆＭｏｃ、又は保護基である〕。
【００８４】
上の式（ＩＩＩ）の化合物を出発材料として使用し、親化合物上の利用可能なアミン、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール等を使用して、様々な生物学的に活性な部分のプロドラッグが作られる。図２を参照されたい。さらなる例として、ＤＣＩ/ＤＭＡＰ等の標準カップリング剤を使用してＮ−ＣＩＮＮ骨格（１３）にカップリングされる、アミノ酸誘導体又はペプチド誘導体などが挙げられる。反応前に、ペプチド又はアミノ酸上のカルボキシル基を、許容し得る保護基で保護する。次いで、アミノ基を１３、ＤＣＩ、及びＤＭＡＰと反応させてアミド結合を生じ、保護基を除去する。アルコール又はチオールの場合にも、同様の手順に従う。
【００８５】
上述のとおり、関心のある親化合物、たとえば、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａを形成するために使用されるＨ−Ｘ1Ａは、利用できる反応性基、たとえば、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、又はアミン基等を有しなければならない。適当な化合物としては、制限なく、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、又は診断用薬、又はこれらの組合せ、あるいは他の既知の機能を有する任意の他の分子、たとえば、Ｚ−ＣＩＮＮに連結することができる核酸又はそのフラグメント、糖、タンパク質、ホルモン、又はペプチドなどがある。当業者は、他の分子をこのリストに加えることができるであろう。プロドラッグを形成するために使用される親分子は、タンパク質、多糖、核酸分子、又は合成若しくは天然の有機化合物であってもよい。タンパク質には、サイトカイン、成長因子、抗体、ｍＡＢ、一本鎖（ｓｃＦｖ）抗体、又はホルモン、又はこれらの組合せ、あるいは他の既知の機能を有する任意の他のタンパク質分子が含まれる。主として疾患の処置に関して言及してきたが、ある場合には、診断又は予後の理由で、送達が、罹患しているか又は潜在的に罹患している部位への診断用薬の送達である場合もあることを理解すべきである。
【００８６】
Ｚ−ＣＩＮＮと−Ｘ1Ａを接続するアシル結合は、加水分解及びエネルギー活性化を受けやすい。エネルギー活性化がなければ、アシル結合は、ほぼ中性のｐＨで、最高数日間、安定している。この特性のため、本発明のシンナメート系化合物は治療用途に有用であり、必要に応じて、光活性化を用いて又は用いずに、in vivoで酵素を放出するプロドラッグ担体の役割を果たすことができる。プロドラッグは、患者に投与するために、薬学的に許容し得る担体とともに使用することができる。
【００８７】
Ｂ．好ましいＺ基
幾つかの特に好ましい実施形態では、Ｚは、ＮＲ7Ｒ8であて、Ｒ7は、ＣＨ3ＣＨ2であり、Ｒ8は、−（ＣＲ9Ｒ10）n−ＮＲ22−Ｒ11であり、ｎは２であり、Ｒ9及びＲ10は、ともにＨである。プロドラッグが、ターゲティングｍＡｂ、ポリマー又はその両者を含むことができるように、Ｒ11は、好ましくはＬ−Ｂである。２００２年１月３１日出願の、同一出願人による米国特許出願番号第１０/０６６，３２３号（その内容を参照により本明細書に援用する）も参考にされたい。
【００８８】
Ｃ．好ましいＬ−Ｂ基
ｉ．ターゲティング分子。
プロドラッグをある特定の部位に向ける方法を使用することも可能である。たとえば、Bredehorstら、米国特許第５，４３３，９５５号は、ターゲティング部分に結合したアクティベーターを先ず対象に投与し、次いで第２工程でプロドラッグが循環中に放出され、アクティベーターが結合するところでのみ活性化される、２段階方法について記述している。モノクローナル抗体は、特定の細胞又は罹患組織への選択的ターゲティングに広く使用される。たとえば、臨床使用された抗癌薬の多くに、腫瘍関連細胞表面抗原を認識する様々なモノクローナル抗体がターゲティング分子として使用されてきた。抗体に結合した表面活性酵素を使用して、薬剤送達工程を達成することもできる。この抗体−酵素複合体は、インターナリゼーションを必要としない。抗体複合体として使用されてきた表面活性酵素の一例は、ホスホリパーゼ−Ｃであり、これは、インターナリゼーションを必要とせずに、全ての細胞膜のリン脂質を直接攻撃する。抗体複合体として使用されるもう１つの表面活性酵素は、補体活性化因子であるコブラ毒因子（ＣＶＦ）であり、細胞によるインターナリゼーションを必要としないことに加えて、本質的に細胞障害性ではない。
【００８９】
抗体指定酵素プロドラッグ療法（Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy：ＡＤＥＰＴ）は、抗体が酵素を腫瘍部位に導く療法である。酵素を腫瘍に位置させた後、比較的非毒性のプロドラッグを与え、これが適切な酵素の作用によって親薬剤に変換される。たとえば、米国特許第５，７６０，０７２号は、切断後に抗腫瘍作用を有する、切断可能なＮ−（脂肪族又は芳香族）−Ｏ−グリコシルカルバメートスペーサー基に結合したパクリタキセル部分を有するパクリタキセルプロドラッグについて記述している。このプロドラッグは、内因性酵素又は外因性酵素である、加水分解酵素で活性化することができる。米国特許第５，４３３，９５５号は、アクティベーターを所定の使用部位に局在化するためにアクティベーター−ターゲティング部分複合体を使用する、動物におけるプロドラッグの部位特異的in vivo活性化方法、及びアクティベーターの存在下で活性な薬剤に変換されるプロドラッグ化合物について記述している。もう１つの代表的なＢ部分は、プロドラッグが送達されるべき細胞上の特異的受容体に結合する、ターゲティングペプチド又はターゲティングタンパク質、たとえば、抗体又はｍＡＢ、ホルモン、レクチン、サイトカイン、又は成長因子の１つである。
【００９０】
ｉｉ．ポリマー
プロドラッグ送達過程をさらに促進するために、Ｒ11は、溶解性又は循環半減期を増大するために付けることができる天然ポリマー、合成ポリマー、合成又は天然の有機分子を含んでもよい。たとえば、活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）をＺ−ＣＩＮＮコア分子に付けることができる。特に、ポリ（エチレングリコール）−Ｎ−スクシンイミジルカーボネート及びこれらの誘導体について記述している米国特許第４，１７９，３３７号全般及び米国特許第５，６１２，４６０号を参照されたい。前記のそれぞれの内容を参照により本明細書に援用する。しかし、一般に、活性化ｍＰＥＧ（たとえば、ＳＳ−ｍＰＥＧ5000，Shearwater Polymers, Inc.）を、〜ｐＨ７．０で６０分間、アミノ−Ｚ−ＣＩＮＮと反応させる。余分のＳＳ−ｍＰＥＧをグルシルグリシンで失活させ、適切な条件で、ｍＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＡＰを親化合物、たとえばＨ−Ｘ1Ａと反応させて、プロドラッグを作る。
【００９１】
さらに詳細には、本発明のポリマー複合体を作るためには、Ｒ11は、ポリマーを含んでもよい。たとえば、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）等のポリマー、又は似した生物学的に許容し得るポリマーを、当業者に知られている条件に従い、活性化形に変換する。従って、末端ポリマーヒドロキシル末端基（すなわちα及びω末端ヒドロキシル基）の一方又は両方を、Ｒ11、及び必要に応じて、別の活性な基又はターゲティング基の一部として、Ｚ−ＣＩＮＮに共有的に結合することが可能な同一（ホモ−）又は異なる（ヘテロ−）反応性官能基に変換する。ポリマーの利点のみならず、ｍＡｂによってもたらされるターゲティングも利用できるように、Shearwater Polymersから市販されているもの等の、ホモ官能性及びヘテロ官能性ポリマーを使用することもできる。他の実質的に非抗原性のポリマーは、同様に「活性化される」か又は官能化される。ＰＡＯ系ポリマーの代わりとして、他の実質的に非抗原性又は事実上非抗原性の材料、たとえば、コラーゲン、グリコサミノグリカン、ポリアスパラギン酸、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマーを含む前述のコポリマー、ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、親水性ポリマーに架橋したコラーゲン又は任意の他の好適な非反応性ポリマー、たとえば、ポリエチレンアルコールを使用することができる。特に好ましいポリマー基は、一官能性又は二官能性活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系ポリマーである。使用される活性化ＰＥＧ又は他のポリマーの具体的なタイプは、技術者の個々のニーズ及び所望の最終生成物によって異なることを、当業者は十分理解するであろう。ほとんどの市販されている活性化ポリマーは、必要以上の実験をせずにここで使用できると考えられる。
【００９２】
あらゆる分子量範囲のポリマー基が許容し得る。好ましいポリマー分子量は、２，０００〜２００，０００ダルトンであってもよい。より好ましい分子量範囲は、５，０００〜５０，０００ダルトンである。最も好ましいポリマー分子量範囲は、１２，０００〜４０，０００ダルトンである（数平均）。
【００９３】
Ｄ．好ましいＸ1Ａ基
代表的な一実施形態では、−Ｘ1Ａは、合成又は天然の有機化合物、たとえば、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス薬、抗真菌薬、及び診断用薬の１つである。好ましい一実施形態では、プロドラッグ組成物は化学療法剤である。別の好ましい実施形態では、プロドラッグ組成物は、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）薬等の抗ウイルス薬である。−Ｘ1Ａは、サイトカイン、ペプチド、成長因子、抗体、ｍＡＢ、ホルモン、多糖、核酸分子又は脂質等の、非酵素タンパク質であってもよい。
【００９４】
最も好ましい実施形態は、−Ｘ1Ａがパクリタキセル部分又はドセタキセル等のタキサンであり、プロドラッグが式Ｉ（式中、Ｒ1は、ＣＨ3であり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、Ｈ基であり、Ｒ7は、ＣＨ2ＣＨ3であり、Ｒ8は、ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2である）の構造を有する場合である。
【００９５】
抗癌薬として以下のものが挙げられるが、この限りではない：タキサン類、たとえばパクリタキセル又はタキソテレ；カンプトテシン類、たとえばカンプトテシン、ＣＰＴ１１、イリノテカン、又はトポテカンＨＣｌ；ポドフィロトキシン類、たとえばテニポシド；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；酒石酸ビノレルビン；プロカルバジンＨＣｌ；クラドリビン、ロイスタチン；ヒドロキシ尿素；ゲムシタビンＨＣｌ；酢酸リュープロリド；チオグアニン；プリネトール（purinethol）；フルオロウラシル；アントラサイクリン類、たとえばダウノルビシン又はドキソルビシン（アドリアマイシン）；メトトレキセート類；ｐ−アミノアニリン・マスタード；シタラビン（ara−Ｃ又はシトシンアラビノシド）；エトポシド；硫酸ブレオマイシン；アクチノマイシンＤ；イダルビシンＨＣｌ；マイトマイシン；プリカマイシン；ミトキサントロンＨＣｌ；ペントスタチン；ストレプトゾシン；Ｌ−フェニルアラニン・マスタード；カルボプラチン誘導体；プラチノール；ブスルファン；フルコナゾール；アミフォスチン；ロイコボリンカルシウム及び酢酸オクトレオチド。
【００９６】
抗感染薬として以下のものが挙げられるが、この限りではない：ニスタチン；アンホテリシンＢ；フルコナゾール；メトロニダゾール；アミノグリコシド抗生物質、たとえばアミカシン、ガラマイシン、ネトロマイシン又はストレプトマイシン；セファロスポリン抗生物質、たとえばセフプロジル、セファレキシンＨＣｌ又はセフェピム；天然、合成及び半合成のマクロライド抗生物、たとえばクラリスロマイシン又はエリスロマイシン塩；クロロマイシン塩及びビブラマイシン塩。
【００９７】
他の薬剤として以下のものが挙げられるが、この限りではない：アスパラギナーゼ；アルギニンデアミナーゼ；メチオニナーゼ；インターロイキン；インターフェロン及びインターフェロン作用物；リパーゼ；エステラーゼ；ＤＮＡ及びＲＮＡ配列/オリゴヌクレオチド（センス又はアンチセンス）及びマトリックスメタロプロテアーゼインヒビター。
【００９８】
上述の生物学的に活性な部分は、Ｘ1を介してＺ−ＣＩＮＮに付けられ、従って、Ｚ−ＣＩＮＮと、放出可能な連結、たとえばエステル、尿素、アミドを形成することができる。従って、−Ｘ1Ａの親分子である、ＨＸ1Ａは、Ｚ−ＣＩＮＮ中間体と反応し、結果としてＸ1Ａ残基がＺ−ＣＩＮＮに共有結合することができる、遊離のヒドロキシル基、スルフヒドリル基、カルボキシル基、アミノ基等を有する。好適な−Ｘ1Ａ基の非限定的サンプルには以下のものが含まれる：
【００９９】
【化２１】
2005504006.tif 000010
2005504006.tif 000011
【０１００】
〔式中、＊は結合点を示す。〕。
【０１０１】
さらなる具体例を以下に記載する：
ターゲティング剤（以下を含むがこの限りではない）：
・多少の能力で、細胞又は腫瘍細胞をターゲットする、マウスを含む、抗体；
・マウス、ラット、ヒト、サル、キメラ構築物等を含む哺乳動物起源のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、たとえばハーセプチン（Herceptin）（登録商標）（トラスツズマブ）；
・一本鎖抗体；
これらの抗体は、細菌、植物、酵母、動物、哺乳動物の乳（マウス、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ等）、及びマウス、ラット、ヒト、ハムスター、等を含む動物細胞培養で発現され得る；
・天然及び組み換えの両成長因子、及び細胞表面上の受容体に結合する成長因子のペプチド分画（ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＬＧＦ−Ｉ、ＩＬＧＦ−ＩＩ、ＴＧＦ）；
・天然又は組み換えの両インターフェロン、及び細胞表面上の受容体に結合するインターフェロンのペプチド分画（ＩＦＮ−α、β、及びγ）及びインターフェロン作用物；
・天然又は組み換えのいずれかの、サイトカイン、及び細胞表面受容体に結合するサイトカインのペプチド分画（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ、等）；
・細胞表面受容体に結合する、天然、組み換え、又は合成のいずれかのペプチド；
・細胞表面受容体に結合する、天然又は合成のいずれかのホルモン（エストロゲン、プロエストロゲン）；
・細胞表面受容体に結合する、天然又は合成のいずれかの代謝産物（アミノ酸、糖、ビタミン、ヌクレオチド、ヌクレオシド）；
・腫瘍細胞表面に結合する、天然又は組み換えのいずれかのレクチン；
・リン酸化又は非リン酸化糖ペプチド（ＭＤＰ、ＭＴＰ、ＤＤＰ、ＤＴＰ）又は糖−ペプチド−脂質ターゲティング剤（モノホスホリル−リピドＡ、ジホスホリル−リピドＡ、ＤＰＧ−ＤＤＰ、ＤＰＧ−ＤＴＰ、等）；
・ポリエチレングリコールポリマー及び誘導体（２，０００〜＞２００，０００ダルトン）；
・ポリ−アスパラギン酸、グルタミン酸又はポリ−リシンアミノ酸ポリマー、又はこれらの若しくは他のアミノ酸の混合物；
・細胞表面酵素のインヒビター（ペプチド又は化学物質；共有結合又は非共有結合）（マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビター、チロシンキナーゼインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、カゼインキナーゼインヒビター、プラスミノーゲンアクティベーターインヒビター）；及び
・グルコサミノグリカン及びデキストラン。
【０１０２】
当業者に明白になるであろうが、具体的に記載されていないが、上記カテゴリーに含まれるターゲティング剤も、本発明の範囲内である。
【０１０３】
従って、本発明の一態様において、好ましいＲ11置換基は、生体物質に対する抗体等のタンパク質であり、光又は他のエネルギー源によって放出する前に、これを使用して潜在的酵素活性の局在化を助けることができる。
【０１０４】
Ｅ．担体
薬剤の送達方法は周知である。全身的、局所的（local）又は部分的（regional）送達に適した多くの担体は、当業者に入手可能であり、また薬剤担体又は送達に関するテキストを参照することにより、確認することが可能である。しかし、ある種の担体が好適なこともあり、たとえば、脂質膜（たとえばリポソーム）を通過する取り込み又は輸送を増強する担体が好ましい場合もあるが、一方、緩徐な放出には他の担体、たとえばポリ（乳酸−グリコール酸）コポリマーが好ましいこともある。製剤たとえば、肺送達用の微粒子状製剤、又は消化管下部に送達するための腸溶コーティング内に封入された製剤を必要とする場合もある。たとえば、米国特許第６，０９９，８６４号、及びその中のマイクロカプセル又はリポソーム内への封入に関する参考文献を参照されたい。本明細書に開示されているプロドラッグ組成物は、個々の疾患及び生物学的に活性な薬剤に望ましい任意の送達形態で投与することができる。もう１つの実施形態では、本プロドラッグは、送達するためにマイクロカプセル又はリポソームに調製される。
【０１０５】
一実施形態では、担体は、静脈内用製剤、リポソーム、マイクロカプセル、腸溶コーティング製剤、及び肺投与用製剤の中から選択される。
【０１０６】
ＩＶ．使用／処置の方法
本明細書に開示のプロドラッグ化合物は、多くの用途を有する。薬学的に重要な１つの一般的用途は、ターゲティングのみならず、プロドラッグがエネルギー源に曝露されるまで、治療効果のある親化合物の実質的に遅延した放出を達成するために、シンナメート骨格の二官能性態様を使用する。Ｚ−ＣＩＮＮ部分は、様々な活性成分を送達するというプラットホームの役割を果たすため、本発明は、哺乳動物における様々な病状を処置する方法も提供する。この方法は、本明細書に記載のとおり、本発明の組成物の有効量を、このような処置を必要としている哺乳動物に、たとえば、ドキソルビシンのプロドラッグ等を、このような処置を必要としている哺乳動物に、投与することを含む。
【０１０７】
本プロドラッグ組成物は、中でも、哺乳動物における、親化合物で処置されるものと同様の疾患、たとえば新生物疾患の処置、腫瘍組織量の減少、新生物転移の予防及び腫瘍の再発/新生物成長の予防に有用である。投与されるプロドラッグの量は、そこに含まれる親分子の量によって異なる。一般に、この処置方法で使用されるプロドラッグの量は、哺乳動物で所望の治療成果を効果的に達成する量である。当然、様々なプロドラッグ化合物の投与量は、親化合物、in vivo加水分解速度、光又はエネルギーの強度及び持続時間、ポリマーの有無等によって幾分異なる。当業者は、臨床経験及び治療適応症に基づいて選択されるプロドラッグの最適投与方式を決定するであろう。必要以上の実験をしなくても、技術者には実際の投薬量が明らかになるであろう。従って、本発明の化合物は、薬学的に許容し得る製剤の一部として、たとえば、非経口用剤形、すなわち当業者に周知の静脈内用又は経口用剤形の一部として投与される。
【０１０８】
本化合物は、標的酵素の溶液をインヒビターと平衡化し、次いで溶液を洗い落としてから、エネルギー入力後遊離の酵素を放出することにより、精製、特に、所与の条件で、固定され、標的分子と選択的に結合するものに使用することができる。たとえば、「Ａ」位に４−アミノイミノフェノールを含む化合物は、固定され、溶液からトロンビンを単離するために使用することができるであろう。
【０１０９】
本化合物は、診断用アッセイで使用することができる。診断用アッセイは手作業であっても自動化されていてもよく、研究室でもキットの形態でも有用である。
【０１１０】
Ｖ．合成方法
本発明の別の態様では、本明細書に記載の複合体を調製する方法を提供する。幾つかの好ましい方法は、式（ＩＶ）：
【０１１１】
【化２２】
2005504006.tif 000012
【０１１２】
〔式中、全ての可変要素は式（１）で前述したとおりであり、
【０１１３】
Ｘ4は、反応性末端基、たとえばＯＨ、ＮＨ、ＳＨ、ハロゲン、たとえば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、又はアルデヒド、ヒドラジン、カルバザート、トシル、メシル、パラニトロフェニル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、マレイミジル等を制限なく含む、当該技術分野で周知の他の反応性基であり、
【０１１４】
Ｚ1は、Ｈ又は
【０１１５】
【化２３】
2005504006.tif 000013
2005504006.tif 000014
【０１１６】
である〕
のケイ皮酸誘導体を、生物学的に活性な部分（ＨＸ1Ａ）と（当該生物学的に活性な部分を当該ケイ皮酸誘導体に共有結合させるのに十分な条件で）、反応させることを含む。
【０１１７】
開示されているＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ組成物の合成は、図２に示されるように、薬剤等の生物学的に活性な分子（ＨＸ1Ａ）と、Ｚ−ＣＩＮＮとのアシル化反応によって達成することができる。一実施形態において、２つの部分、Ｚ−ＣＩＮＮ及びＨＸ1Ａの組合せは、４，４−ジメチルアミノピリジンの存在下、ジシクロヘキシルカルボジイミドでＺ−ＣＩＮＮを活性化し、続いてＨＸ1Ａを攻撃してエステル又はアミド結合を形成することにより達成することができる。別の実施形態では、２つの部分、Ｚ−ＣＩＮＮ及びＨＸ1Ａの組合せは、塩基又は塩基の混合物等の脱水剤の存在下で、ケイ皮酸ハロゲン化物、無水ケイ皮酸、又はケイ皮酸のいずれかと、生物学的に活性な分子（ＨＸ1Ａ）、たとえばヒドロキシル基を有する薬剤とをカップリングすることにより達成され、プロドラッグ組成物を生成する。別の実施形態では、塩基又は塩基の混合物、たとえばトリエチルアミン又はこれを含む塩基の混合物の存在下で、ケイ皮酸と、ＨＸ1Ａのハロゲン化物、トシレート形又はメシレート形とをカップリングすることにより、Ｚ−ＣＩＮＮとＨＸ1Ａを組み合せることができ、プロドラッグ組成物を生成する。また別の実施形態では、塩基又は塩基の混合物、たとえばトリエチルアミン又はこれを含む塩基の混合物の存在下で、Ｚ−ＣＩＮＮと、遊離のヒドロキシル基を有するＨＸ1Ａとを直接カップリングすることによりシンナメート部分とＨＸ1Ａを組み合せることができ、プロドラッグ組成物を生成する。一例として、図３に、Ｚ−ＣＩＮＮ（１３）を使用したパクリタキセルプロドラッグ（１５）の合成を図示する。ジイソプロピルカルボジイミド及びジメチルアミノピリジンの存在下、ＣＨ2Ｃｌ2中で、１３をパクリタキセル（１４）と反応させて、１５を得る。１５を加水分解して、１６を生成する。
【０１１８】
図４に示すとおり、Ｂ又はＢ−Ｌ部分をＺ−ＣＩＮＮに付けることができる。Ｚ−ＣＩＮＮへの、Ｂ又はＢ−Ｌ部分の結合は、一般に、中性のｐＨで、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ（１５）とＢ又はＢ−Ｌ（ＳＭＰＨ；１７）をカップリングし、Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ（１８）を生成することを含む。図５に示すとおり、１８を１９とさらに反応させて、２０を得ることができる。一般に、Ｂ又はＢ−Ｌとの反応前に、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａを形成しなければならない。Ｂ又はＢ−Ｌは、遊離のアミノ基を修飾することができる反応性基（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド等）又は遊離のスルフヒドリル基を修飾することができる反応性基（マレイミド等）を担持し、原形で使用することができる。適当な反応化学の確認は、当該技術の範囲内であり、当該技術分野で入手可能な知見に基づいて容易に達成することができる。
Ｂ又はＢ−Ｌ部分とＺ−ＣＩＮＮとの組合せは、Ｒ8のアミノ基の窒素原子を介して達成することができ、これは（ＣＲ9Ｒ10）2−ＮＨＲ11である。図６が示すとおり、一実施形態では、中性ｐＨの緩衝液中で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルポリエチレングリコール（「ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ」）（２１）を、Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ（１６）と反応させて、ＰＥＧ修飾Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ［Ｂ−Ｌ−Ｚ−ＣＩＮＮ−Ｘ−Ａ；（２２）］を生成する。２２を１９とさらに反応さて、２３を生成させることができる。
【０１１９】
ＶＩ．エネルギー活性化
生物学的に活性なプロドラッグを放出するためのエネルギー源は、患者の体外に当てるか、又は体内に投与することができる。エネルギー源は、放射線、磁気波、又は放射性元素からの放射線の形態であってもよい。１つの代表的なエネルギー源は、３００nm〜４５０nmの範囲の波長を有する光の形態である。別の代表的なエネルギー源は、Ｉ＊、Ｔｃ＊、Ｆｅ＊及びＣｓ＊[＊は放射性元素を示す］等の放射性元素からの放射線である。
【０１２０】
エネルギー源を使用して、薬剤又は他のＨＸ1Ａの加水分解及び放出の速度を制御することができる。光は、高度に調節でき、かつクリーンであるため、この課題のエネルギーの形態として、光が理想的である。光は、疾患部位に容易に当てることができる。３００nm未満の短い波長を有する光は、ほとんど組織透過能力を有さない。活性化すべき複合体の吸光スペクトルに応じて、ある特定のプロドラッグ又は他のＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａを活性化するために、ある特定の波長を有する光を使用することができる。当てる光の強度及び持続時間を使用して、発生するＨＸ1Ａの量を調節することができる。たとえば、Ｚ−ＣＩＮＮを修飾するために電子求引性置換基又は電子供与性置換基のいずれかを使用することにより、式Ｉのプロドラッグ組成物の感光性を修飾することができる。たとえば、アミノ基又はアルコキシ基等の電子供与基でＺ−ＣＩＮＮを修飾することにより、活性化エネルギーを、より長い波長を有する放射線に効果的に移動することができる。これと対照的に、電子求引基でＺ−ＣＩＮＮを修飾することにより、活性化エネルギーをより短い波長を有する放射線に効果的に移動することができる。プロドラッグから薬学的に有効な薬剤を放出するためには、又はＺ−ＣＩＮＮＸ1Ａから他のＨＸ1Ａを放出するためには、どのタイプの光を使用し、どの強度及び持続時間が必要であるかを、当業者は決定することができるであろう。
【０１２１】
可視光線以外のエネルギー源、たとえば紫外線、赤外線（たとえばＴｉ−サファイアレーザー）、超音波、マイクロ波、電気力、又はＣｏ＊、Ｕ＊、Ｉ＊、Ｃ＊、Ｆｅ＊及びＣｓ＊及びＴｃ＊等の放射線源により発生される放射線を使用することができる。
【０１２２】
好ましい一実施形態では、エネルギー源はＦｅ＊である。別の好ましい実施形態では、エネルギー源はＣｏ＊である。また別の実施形態では、エネルギー源はＩ＊である。活性化エネルギーを、体外の位置から標的領域に向けることができる。代替実施形態では、活性化エネルギーを体内に投与して、患部でＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａを活性化することができる。一実施形態では、ヒト体内等の哺乳動物体内にプロドラッグ組成物を先ず投与する。次いで、所望の量の放射性物質を含有する別の組成物をヒト体内に投与する。次に、放射性物質からの放射線はプロドラッグ組成物のケイ皮酸骨格を活性化し、プロドラッグを加水分解して生物学的に活性な分子を形成する。
【０１２３】
ＶＩＩ．実施例
実施例に列挙されている数字は、図３〜６に表示のものに対応する。図７〜１０は、実施例６に対応するin vivoデータを提供する。
【０１２４】
実施例１  ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１５）の調製
図３を参照されたい。３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）−アミノ］フェニル−２−メチル−２−プロペン酸（１３；ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ；０．０３２５mmol）を、真空下で１２〜１６時間乾燥させた。乾燥ジクロロメタン（５ml）を１３に加え、この溶液をアルゴン下、４℃で撹拌した。パクリタキセル（１４  KLT Labs, Inc.；０．０３２５mmol）を、乾燥ジクロロメタンに溶解して１３に加えた。１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０３６mmol）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；０．００３２５mmol）を加え、フラスコをアルゴンでフラッシュし、周囲温度まで温め、１６８時間撹拌した。反応混合物を濾過した。この混合物を真空下で乾燥させ、クロロホルム中に再懸濁し、シリカゲル６０を用いたフラッシュクロマトグラフィ（クロロホルム、１％メタノール、２％メタノール及び３％メタノール（全てクロロホルム中）段階勾配を使用）で精製し、生成物、ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１５）を溶離した。
【０１２５】
実施例２  Ｍａｌ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１７）の調製
図４を参照されたい。ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１５；０．００２４mmol）を、３Ｎ  ＨＣｌ  １ml中に再懸濁し、周囲温度で３時間撹拌して、ｔＢＯＣ基を加水分解し、Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１６）を生成した。この反応混合物を３Ｎ  ＮａＯＨで中和して、ｐＨ７．２±０．２とした。１６（０．００２４mmol、２ml）を、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１ml及びＤＭＳＯ  １mlに溶解したスクシンイミジル−［β−マレイミドプロピオンアミド］ヘキサノエート（ＳＭＰＨ；Pierce；１７）０．００２７mmolと混合した。この反応混合物を、周囲温度で２時間揺り動かした。１００ｍＭグリシルグリシン０．１mlを加えて、反応を停止させた。Ｍａｌ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１８）は、２時間以内に使用した。
【０１２６】
実施例３  トラスツズマブ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１９）の調製
図５を参照されたい。５０ｍＭリン酸−０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中５mg/mlで、モノクローナル抗体、ハーセプチン（Herceptin）（登録商標）（トラスツズマブ、Genentech）を調製した。ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート；Pierce）を、ＤＭＳＯに溶解し、２０倍モル過剰をこの抗体に加え、１時間反応させた。ヒドロキシルアミンＨＣｌ（Sigma；リン酸−ＮａＣｌ緩衝液中０．５Ｍ、ｐＨ７．０に中和）を６０〜９０分間加え、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液中で平衡化したＤ−ＳＡＬＴポリアクリルアミド脱塩カラム（Pierce）を用いたクロマトグラフィで、抗体（トラスツズマブ−ＳＨ  １９）を、低分子量物質と分離させた。エルマン（Ellman）の試薬（Pierce）を使用して、抗体へのチオール組み込み（抗体−ＳＨ）を決定した。組み込まれた−ＳＨ基より２倍モル過剰のＭａｌ−Ｌ1−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１８）を、ｐＨ７．４にて周囲温度で２時間、トラスツズマブ−ＳＨ（１９）に加え、トラスツズマブ−Ｌ1−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（２０）を得た。５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化されたＤ−ＳＡＬＴカラム（Pierce）で、抗体含有分画（２０）を、過剰の１８と分離させた。セントリコン（Centricon）ＹＭ−３０膜（Millipore）を使用して、２０を５mg/mlタンパク質に濃縮し、０．２２μmフィルター（German Sciences、Supor Acrodisc２５）を通過させて濾過し、使用するまで、４℃で黄褐色のガラスバイアル中に保存した。実施例６では、２０は、Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ３１０と示されている。
【０１２７】
実施例４  Ｍａｌ−Ｌ2−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（２２）の調製
図６を参照されたい。ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１５；０．００２４mmol）を、３Ｎ  ＨＣｌ  １ml中に再懸濁し、周囲温度で３時間撹拌してｔＢＯＣ基を加水分解し、Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１６）を得た。この反応混合物を３Ｎ  ＮａＯＨで中和してｐＨ７．２±０．２とした。１６（０．００２４mmol、２ml）を、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１ml、及びＤＭＳＯ  １mlに溶解したＮＨＳ−ＰＥＧ3400−ＭＡＬ（Shearwater Polymers, Inc、ＮＨＳ−Ｍａｌ−３４００）０．００２７mmolと混合した。この反応混合物を周囲温度で２時間揺り動かした。１００ｍＭグリシルグリシン０．１mlを加えて、反応を停止させた。Ｍａｌ−Ｌ2−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（２２）は、２時間以内に使用した。
【０１２８】
実施例５  トラスツズマブ−Ｌ2−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（２３）の調製
図６を参照されたい。トラスツズマブ−ＳＨ（１９）は、実施例３に記載のとおりに調製した。組み込まれた−ＳＨ基より２倍モル過剰のＭａｌ−Ｌ2−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（２２）を、ｐＨ７．０及び周囲温度で２時間、トラスツズマブ−ＳＨ（１９）に加え、トラスツズマブ−Ｌ2−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（２３）を得た。５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５で平衡化させたＤ−ＳＡＬＴカラム（Pierce）で、抗体含有分画（２３）を余分の２２と分離させた。セントリコン（Centricon）ＹＭ−３０膜（Millipore）を使用して、２３を５mg／mlタンパク質に濃縮し、０．２２μmフィルター（German Sciences、Supor Acrodisc２５）を通過させて濾過し、使用するまで、４℃で黄褐色のガラスバイアル中に保存した。この実施例におけるＰＥＧ3400は、詳細な説明のセクションに記載の範囲内の任意の分子量のＰＥＧの実例である。ＰＥＧの分子量は、最終化合物の形成に影響を及ぼさなかった。
【０１２９】
実施例６  担癌マウスの標的薬剤送達における、トラスツズマブ−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセルの効果
この実施例では、ＢＴ−４７４ヒト乳癌細胞（Ｈｅｒ２＋；American Type Culture Collection, Rockville, MD）を、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを加えたＰＲＭＩ−１６４０培地で増殖させた。若い、成体のメスｓｃｉｄマウスをFrederick Cancer Research and Development Center（Frederick, MD）から入手した。このマウスを、滅菌した硬木ベッドを備えたプラスチック製マイクロアイソレーター・ケージ内で飼育し、標準的な実験用飼料と濾過した水道水を自由に与え、調節された温度、湿度、照明周期で維持した。このマウスは、使用前２週間、隔離した。
【０１３０】
腫瘍移植の１日前に、各動物の皮下に（ｓｃ）エストラジオールペレット（０．７２mg、６０日放出）を埋め込んだ。ＢＴ−４７４細胞（１×１０7細胞）をマトリゲル（Matrigel）（登録商標）と混合し、マウスの皮下に０．２ml移植した。９日に、腫瘍体積は〜２００mm3であった。マウスを６群に分けた。全群が、０．２mlの単回ボーラスとして、薬剤をｉ．ｖ．尾静脈注射で受けた。第１群（マウス４匹）は、生理食塩水対照であった。第２群（マウス４匹）は、ハーセプチン１．０mg及びパクリタキセル０．０２３mg（非連結；全身処置）を受けた。第３群（マウス４匹）は、パクリタキセル０．００２３mgに連結されたハーセプチン０．１mg（Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３１０．１）を受けた。第５群（マウス６匹）は、パクリタキセル０．０１２mgに連結されたハーセプチン０．５mg（Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３１０．５）を受けた。第６群（マウス６匹）は、パクリタキセル０．０２３mgに連結されたハーセプチン１．０mg（Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３１０）を受けた。投与量は、５mg／ml  Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３１０ストック溶液から、リン酸緩衝生理食塩水中への希釈を介して、導いた。１〜３群は、対照群であり、光活性化を受けなかった。４〜６群は、６時間のターゲティング期間後に、以下のとおりに、６５分の光曝露／マウスを受けた。注射の６時間後、光処置を受けるマウスをケタミン／ロムパン（Rompun）混合物で麻酔した。１６Ｇの針で腫瘍付近の皮膚に穴を作り、光ファイバー・プローブを腫瘍の縁まで挿入した。腫瘍を、１５０Ｗハロゲン電球からの〜０．５ｍＷ／cm2の白色光に５分間曝露した。これは薬剤の能動的放出を示す。注射後７２時間、全てのマウスを赤色光下に置き、次いで通常の１２時間明／暗周期に戻した。
【０１３１】
マウスの生存を毎日観察した。毎週２回、カリパスで、腫瘍を二次元で測定し、測定値を腫瘍体積に換算した。処置後３３日に、マウスを安楽死させて腫瘍を切除し、中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン中に包埋し、薄切し、組織学的評価のために、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。様々な用量のハーセプチン−Ｌ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（５）、及び最高用量の連結していないハーセプチン＋パクリタキセルを処置した。上述のとおり、マウスは、光を受けたか、又は受けなかった。生理食塩水を対照として使用した。全ての処置群が腫瘍体積及び腫瘍細胞数の減少を示し、光曝露を受けたサンプルでは、この減少がより速やかにかつ大幅にみられた。図７〜１０及び以下のデータについて述べる。
【０１３２】
【表１】
2005504006.tif 000015
【０１３３】
図７は、非処置対照腫瘍に対する標的Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ３１０（２０）の用量依存的光放出の作用を示す。Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ組成物が使用された全ての場合に、腫瘍塊は２８日までに用量依存的様式で４５〜６０％縮小し、薬剤を活発に放出した。７日までに積極的な縮小がみられ、腫瘍の再増殖は認められなかった。
【０１３４】
図８で、能動的放出を、全身処置と比較する。本発明の化合物を含む、この利点は、明白である。投与されたトラスツズマブ及びパクリタキセルの量が同じであったのにも関わらず、Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ３１０に続く光放出で腫瘍塊が４５％縮小したのに対して、全身処置では２２％であった。
【０１３５】
図９では、加水分解によるパクリタキセルの放出と能動的放出の比較を示す。腫瘍塊収縮の量はほぼ同じであることが、２８日までに分かった。しかし、能動的な光放出の利点は、処置後約７日に最も明白であった。
【０１３６】
最後に、図１０で、加水分解によるＡ−Ｚ−ＣＩＮＮからの薬剤放出を全身処置、すなわち、新規なプロドラッグ担体システムを使用しない、同剤の投与と比較した。全身処置と比較したとき、Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ担体の使用は、腫瘍体積の縮小において即座の一定した利点を提供した。この実験で、Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３１０中のハーセプチン及びパクリタキセルの量は、連結されていない、全身処置におけるハーセプチン及びパクリタキセルの量の１０％であり、標的薬剤送達による増幅された利益を示した。
【０１３７】
実施例７  肺癌
Ａ．抗体−リンカー−ＣＩＮＮ−薬剤の調製及びその使用
ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ酸（１３、０．０３２５mmol）を真空下で一晩乾燥させた。乾燥ジクロロメタン（５ml）を１３に加え、この溶液をアルゴン下、４℃で撹拌した。パクリタキセル（１４  KLT Labs, Inc.、０．０３２５mmol）を、乾燥ジクロロメタン５mlに溶解し、１３に加えた。ＤＭＡＰ（４−ジメチルアミノピリジン、０．００３２５mmol）及び１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０３６mmol）を加え、フラスコをアルゴンでフラッシュし、周囲温度まで温め、１６８時間撹拌した。この反応混合物を濾過し、真空下で乾燥させ、クロロホルム中に再懸濁し、シリカゲル６０を用いたフラッシュクロマトグラフィ（クロロホルム、１％メタノール、２％メタノール及び３％メタノール段階勾配を使用）で精製し、生成物、ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１５）を溶離した。
【０１３８】
ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（１５；０．００２４mmol）を、３Ｎ  ＨＣｌ（１ml）中に再懸濁し、周囲温度で３時間撹拌した。この反応混合物を３Ｎ  ＮａＯＨで中和して、ｐＨ７．４の溶液を得た。Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（２ml）を、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４（１ml）、及びＤＭＳＯに溶解した０．００２７mmolのＮＨＳ−ＰＥＧ3400−ＭＡＬ（２１；Shearwater Polymers, Inc、ＮＨＳ−Ｍａｌ−３４００）（１ml）と混合した。この反応混合物を、周囲温度で２時間揺り動かした。１００ｍＭグリシルグリシン１００μmを加えて、反応を停止させた。Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル（２２）は、２時間以内に使用した。
【０１３９】
Ｂ．抗体〜Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセルの調製
マウスモノクローナル抗体、ＢＲ１１０（Hellstromら、米国特許第５，８４０，８５４号）を、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７）で５mg／mlに希釈した。ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル  Ｓ−アセチルチオアセテート；Pierce）を、ＤＭＳＯに溶解し、２０倍モル過剰をこのタンパク質に加え、１時間反応させた。ヒドロキシルアミンＨＣ１（Sigma；０．５Ｍ、ｐＨ７．０に中和）を６０〜９０分間加え、リン酸−ＮａＣｌ緩衝液で平衡化させたＤ−ＳＡＬＴポリアクリルアミド脱塩カラム（Pierce）を用いたクロマトグラフィで、抗体を低分子量物質と分離した。エルマン（Ellman）の試薬（Pierce）を使用して、マウス抗体へのチオールの組み込み（抗体−ＳＨ；２０）を決定した。組み込まれたＳＨ基より２倍モル過剰のＭａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル２２を、ｐＨ７．４及び周囲温度で２時間、ＢＲ１１０−ｍＡｂ−ＳＨに加え、ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル２３を得た。５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌで緩衝化させたＤ−ＳＡＬＴカラム（Pierce）を用いて、抗体含有分画２３（ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル）を、余分のＭａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル２２と分離した。セントリコン（Centricon）ＹＭ−３０膜を使用して、抗体−薬剤２３（ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル）を、５mg／mlタンパク質に濃縮し、滅菌濾過し（０．２２μmフィルター； Gelman Sciences、Supor Acrodisc２５）、マウス中で増殖しているヒト腫瘍の処置に使用するまで、４℃で黄褐色のガラスバイアル中に保存した。
【０１４０】
Ｃ．Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ４１１（ＢＲ１１０−ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル）によるヒト肺癌の処置
ＭＡｂ  ＢＲ１００は、ヒト肺、結腸及び乳房の腫瘍細胞の細胞表面上に存在する６６−ｋＤａの糖タンパク質に対するマウスｍＡｂである。ヒト肺癌細胞系Ｈ２９８７を、記述（米国特許第５，８４０，８５４号）どおりに細胞培養で増殖させた。１×１０７細胞／マウスを、ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１５０〜２００mm3のサイズに達したとき、Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ４１１を使用して、以下のとおりに腫瘍を処置した；Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ４１１  ０．１〜１．０mg（〜２５μgのパクリタキセルが共有結合しているｍＡｂタンパク質１mg）を、尾静脈から腫瘍担持マウスに静脈内注射した。６時間後、０．１、０．５又は１．０mgのＡ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ４１１を投与されたマウスを、ケタミン／ロムパン混合物で麻酔した。１６Ｇの針を使用して、皮膚に穴を作り、１mmの光ファイバー・プローブを腫瘍まで挿入した。この腫瘍を、約０．５ｍＷ／cm2のエネルギーを有する白色光に５分間曝露した。他の処置群は、光処置を受けなかった。薬剤の光活性化を防止するために、注射後７２時間、全てのマウスを「赤色光」下に置き、次いで通常の明／暗周期に戻した。光処置を受けた群の腫瘍は直ちに縮小し（７日で＞５０％）、２８日までに検出不可能になった。Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ４１１で処置したが、光刺激を受けなかった腫瘍は、遅いペースで収縮し、２８日に、５０mm3より小さかった。抗体及び遊離の薬剤（連結していない）を受けた群は、腫瘍増殖を示し、２８日までに、マウスは死亡するか又は＞８００mm3の腫瘍を有するかのいずれかであった。
【０１４１】
実施例８  結腸癌
Ａ．抗体−リンカー−ＣＩＮＮ−薬剤の調製
実施例５Ａで上述したとおりに、Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセルを調製した。
【０１４２】
Ｂ．抗体〜リンカー−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセルの調製
Ａ７−ｍＡＢ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル２３を作るために、ｍＡｂ  ＢＲ１１０の代わりにｍＡＢ  Ａ７を使用したこと以外は、実施例５Ｂに記載のとおりに抗体〜Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセルを調製した。
【０１４３】
Ｃ．Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ５１１（Ａ７−ｍＡＢ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル）によるヒト結腸癌の処置
ヒト結腸癌細胞系ＬＳ−１８０を、記述（Kinuyaら、J. Nucl. Med. 42:596-600(2001年)）どおりに、細胞培養で増殖させた。１×１０７細胞／マウスを、ヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１５０〜２００mm3のサイズに達したとき、Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ５１１を使用して、以下のとおりに腫瘍を処置した；Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ５１１  ０．１〜１．０mg（〜２５μgのパクリタキセルが共有結合しているｍＡｂタンパク質１mg）を、尾静脈から腫瘍担持マウスに静脈内注射した。６時間後、０．１、０．５又は１．０mgのＡ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ４１１を投与されたマウスを、ケタミン／ロムパン混合物で麻酔した。１６Ｇの針を使用して、皮膚に穴を作り、１mmの光ファイバー・プローブを腫瘍まで挿入した。この腫瘍を、約０．５ｍＷ／cm２のエネルギーを有する白色光に５分間曝露した。他の処置群は、光処置を受けなかった。不必要な光曝露及びＡ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ５１１の活性化を防止するために、注射後７２時間、全てのマウスを「赤色光」下に置き、次いで通常の明／暗周期に戻した。光処置を受けた群の腫瘍は直ちに縮小し（７日で＞５０％）、２８日までに５０mm３より小さかった。Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ５１１で処置したが、光刺激を受けなかった腫瘍は、はるかに遅いペースで収縮し、２８日に１００mm3より小さかった、抗体及び遊離の薬剤（連結していない）を受けた群は、腫瘍増殖を示し、２８日までに、マウスは死亡するか又は＞８００mm3の腫瘍を有するかのいずれかであった。
【０１４４】
実施例９  乳癌
Ａ．抗体−リンカー−ＣＩＮＮ−薬剤の調製
実施例５Ａに記載のとおりに、Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセルを調製した。
【０１４５】
Ｂ．抗体−リンカー−Ｎ−ＣＩＮＮ−薬剤の調製
ＮＲ−ＬＵ−１０ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル２３を作るために、ＢＲ１１０の代わりにｍＡＢ  ＮＲ−ＬＵ  １０を使用したこと以外は、実施例５Ｂに記載のとおりに抗体〜Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセルを調製した。
【０１４６】
Ｃ．Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３６１（ＮＲ−ＬＵ−１０ｍＡｂ−Ｓ−Ｍａｌ−ＰＥＧ3400−Ｎ−ＣＩＮＮ−パクリタキセル）によるヒト乳癌の処置
記述（Burakら、Nucl. Med. Biol. 25:633-637(1998年)）どおりに、ヒト乳癌異種移植片を調製した。異種移植片をヌードマウスに皮下移植した。腫瘍が１５０〜２００mm3のサイズに達したとき、Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３６１を使用して、以下のとおりに腫瘍を処置した；Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３６１  ０．１〜１．０mg（〜２５μgのパクリタキセルが共有結合しているｍＡｂタンパク質１mg）を、尾静脈から腫瘍担持マウスに静脈内注射した。６時間後、０．１、０．５又は１．０mgのＡ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３６１を投与されたマウスを、ケタミン／ロムパン混合物で麻酔した。１６Ｇの針を使用して、皮膚に穴を作り、１mmの光ファイバー・プローブを腫瘍まで挿入した。この腫瘍を、約０．５ｍＷ／cm2のエネルギーを有する白色光に５分間曝露した。他の処置群は、光処置を受けなかった。不必要な光曝露及びＡ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３６１の活性化を防止するために、注射後７２時間、全てのマウスを「赤色光」下に置き、次いで通常の明／暗周期に戻した。光処置を受けた群の腫瘍は直ちに縮小し（７日で＞５０％）、２８日までに５０mm３より小さかった。Ａ−Ｚ−ＣＩＮＮ  ３６１で処置したが、光刺激を受けなかった腫瘍は、はるかに遅いペースで収縮し、２８日に１００mm3より小さかった、抗体及び遊離の薬剤（連結していない）を受けた群は、腫瘍増殖を示し、２８日までに、マウスは死亡するか又は＞８００mm3の腫瘍を有するかのいずれかであった。
【０１４７】
実施例１０  ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−カンプトテシン（２４）の調製
（１３；ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ；０．０３２５mmol）を真空下で１２〜１６時間乾燥させた。乾燥ピリジン（５ml）を１に加え、この溶液をアルゴン下、４℃で撹拌した。カンプトテシン（Aldrich、３６，５６３−７；０．０３２５mmol）を、乾燥ピリジン１０mlに溶解して１３に加えた。１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０３６mmol）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；０．００３２５mmol）を加え、フラスコをアルゴンでフラッシュし、周囲温度まで温め、１６８時間撹拌した。反応混合物を濾過し、この混合物を真空下で乾燥させ、クロロホルム中に再懸濁し、シリカゲル６０を用いたフラッシュクロマトグラフィ（クロロホルム、１％メタノール、２％メタノール及び３％メタノール（全てクロロホルム中）段階勾配を使用）で精製し、生成物、ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−カンプトテシン（２４）を溶離した。
【０１４８】
実施例１１  ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用したｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ドキソルビシンン（２５）の調製
１３（ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ；０．０１７mmol）を真空下で１２〜１６時間乾燥させた。乾燥ピリジン（１５ml）を１３に加え、この溶液をアルゴン下、４℃で撹拌した。ドキソルビシンン塩酸塩（Aldrich、８６−０３６−０；０．０１７mmol）を、乾燥ピリジン１５mlに溶解して１３に加えた。１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０２２mmol）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ；０．００１７mmol）を加え、フラスコをアルゴンでフラッシュし、周囲温度まで温め、１６８時間撹拌した。反応混合物を濾過し、この混合物を真空下で乾燥させ、クロロホルム中に再懸濁し、シリカゲル６０を用いたフラッシュクロマトグラフィ（クロロホルム、１％メタノール、２％メタノール及び３％メタノール（全てクロロホルム中）段階勾配を使用）で精製し、生成物、ヒドロキシル基を介して付いたｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ドキソルビシンン（２５）を溶離した。
【０１４９】
実施例１２  ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用したｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ドキソルビシンン（２６）の調製
１３（ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ；０．０１７mmol）を真空下で１２〜１６時間乾燥させた。乾燥ピリジン（５ml）を１３に加え、この溶液をアルゴン下、４℃で撹拌した。ドキソルビシンン塩酸塩（Aldrich）、８６−０３６−０；０．０１７mmol）を、乾燥ピリジン１５mlに溶解して１３に加えた。１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０．０２２mmol）及びＭｅｓ  緩衝剤（４−モルホリノエタンスルホン酸、ｐＨ４．５）を加え、フラスコをアルゴンでフラッシュし、周囲温度まで温め、１６８時間撹拌した。反応混合物を濾過し、この混合物を真空下で乾燥させ、クロロホルム中に再懸濁し、シリカゲル６０を用いたフラッシュクロマトグラフィ（クロロホルム、１％メタノール、２％メタノール及び３％メタノール（全てクロロホルム中）段階勾配を使用）で精製し、生成物、糖上のアミノ基を介して付いたｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ドキソルビシンン（２６）を溶離した。
【０１５０】
実施例１３  ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−サイトカイン（２７）の調製
１３（ｔＢＯＣ−Ｎ−ＣＩＮＮ；０．０２０mmol）を真空下で１２〜１６時間乾燥させた。１３を３Ｎ  ＨＣｌ  １ml中に再懸濁し、２０℃で３時間混合した。この反応混合物を３Ｎ  ＮａＯＨで中和して、ｐＨ７．２±０．２とした。１３（０．０２０mmol、２ml）を、２００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１ml、及びＤＭＳＯ  １mlに溶解したＮＨＳ−ＰＥＧ3400（Shearwater Polymers, Inc.、ＮＨＳ−３４００）０．０２７mmolと混合した。この反応混合物を周囲温度で２時間揺り動かした。１００ｍＭグリシルグリシン０．１mlを加えて、反応を停止させた。ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮは、２時間以内に使用した。サイトカイン（ＩＬ−２）を入手し、５０ｍＭリン酸−０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７）中に１mg/mlで再懸濁した。ＩＬ−２（１mg）８３nmolに、緩衝液中のＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ８３nmol＋ＤＭＳＯ中のＥＤＣ（Pierce、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩）１２４nmolを加えた。この反応混合物を一晩撹拌した。リン酸−ＮａＣｌ緩衝液中で平衡化したＤ−ＳＡＬＴポリアクリルアミド脱塩カラム（Pierce）を用いたクロマトグラフィで、ＰＥＧ−Ｎ−ＣＩＮＮ−ＩＬ−２を、低分子量と分離させた。
【０１５１】
本発明の多くの修飾及び変更は、当業者に明白になるであろうが、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。ここに記載の具体的な実施形態は、例として提供されているに過ぎず、本発明は添付の請求の範囲の語句、ならびにこのようなクレームに与えられる均等物の全範囲のみによって制限される。本出願に記載の様々な出版物及び特許は、参照により本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】（３−［２−ヒドロキシ−４−（エチル）（２−tert−ブチルオキシカルバミドエチル）アミノ］フェニル−２−メチル−２−プロペン酸エチルエステル）の合成を示す図である。
【図２】本発明の様々なＺ−ＣＩＮＮ−Ｘ1Ａ化合物を合成するための一般的合成スキームを示す図である。
【図３】実施例１〜５に対応する反応スキームを示す図である。
【図４】実施例１〜５に対応する反応スキームを示す図である。
【図５】実施例１〜５に対応する反応スキームを示す図である。
【図６】実施例１〜５に対応する反応スキームを示す図である。
【図７】実施例６に対応するin vivoデータを示す図である。
【図８】実施例６に対応するin vivoデータを示す図である。
【図９】実施例６に対応するin vivoデータを示す図である。
【図１０】実施例６に対応するin vivoデータを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2005504006.tif 000159
2005504006.tif 000160