(57)【要約】本発明は、免疫系に異なった陰性のHIV-1エピトープを模倣するAb2タイプ抗イディオタイプ抗体及びその断片に関す。抗体又はその抗体断片は、抗HIV-1抗体を強力に中和することに向けられる。さらに本発明は、抗イディオタイプ抗体を発現するハイブリドーマセルライン3H6に関し、及び前記抗体又はその断片を含む医薬調合物に関す。また本発明は、前記Ab2タイプ抗イディオタイプ抗体又はその断片の投与で誘導されたHIV-1中和Ab3タイプ抗体に関す、及びそれらを含む医薬調合物に関す。また本発明は、抗体又はその断片をスクリーニング手段、又は、診断又は治療の作用物質としての使用に関す。
2005517685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIV-l中和抗体2F5(ECACC Accession No.90091704)と反応、及び、抗体2F5のHIV-1中和活性及び／又は抗体2F5のHIV-1のgp41への結合を阻害又は阻止する、抗体又はその断片において、抗体2F5のコアエピトープのアミノ酸配列ELDKWA(SEQ ID NO 1)に依存せず、そしてSEQ ID NO 2〜SEQ ID NO12から成る群から選択される前記コアエピトープのいずれか等価の変異体又は相同体に依存しない抗体又はその断片。
【請求項２】
アミノ酸配列SEQ ID NO.1(ELDKWA)又は等価の変異体又はその相同体、好ましくはSEQ ID NO 2〜SEQ ID NO12から成る群から選択されるタンパク質またはペプチドへの抗体2F5の結合を阻害又は阻止する請求項１記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
哺乳動物への投与で誘導されるAb3タイプ抗体は、HIV-1中和活性を有し及び／又は、アミノ酸配列SEQ ID NO.1(ELDKWA)又は等価の変異体又はその相同体、好ましくはSEQ ID NO 2〜SEQ ID NO 12から成る群から選択したタンパク質又はペプチドへの結合で抗体2F5と競合する請求項１又は２記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
抗体がAb2タイプ抗体で、抗体2F5に抗イディオタイプである請求項１から３のいずれか１項記載の抗体又はその断片。
【請求項５】
抗体がモノクローナルでありハイブリドーマセルライン3H6(ECACC Acc. No. 01100279)によって産生される請求項１から４のいずれか１項記載の抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学及びワクチン開発の領域にあり、HIV-1のgp41上のエピトープを模倣する抗体に関する。本発明は、さらに、哺乳動物宿主にHIV-l中和抗体を誘導するための使用、及び前記抗体又は抗体断片により誘導されたHIV-1中和抗体に使用する抗体およびその断片の応用に関する。本発明は、哺乳類個体のHIV-1感染を阻害又は阻止する能動又は受動免疫の抗体又は抗体断片を含む医薬調合物、特にワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗イディオタイプ抗体（Ab2）は、他の抗体（Ab1）の抗原結合サイトに対して向けられる。種々の病原性抗原のエピトープは、それらAb2によって機能的及び構造的に模倣されうる。したがって、Ab2は、Ab1様で、同様の生物学特性を持つ抗−抗イディオタイプ抗体（Ab3）を誘導し得る[l]。
【０００３】
異なる種類のAb2は、Ab1との免疫化の後に識別される[2,3]。Abアルファ（Abα）はAb1パラトープから遠位の位置でイディオタイプを認識し、Ab1の正常(nominal)エピトープへの結合を干渉しない。Ab2ベータ（Ab2β）はAb1のパラトープに向けられ、抗原の内部像を生ずる。Ab2βは、イディオタイプおよび抗原特異的異種抗体の結合で、正常抗原と競合し得る。Ab2ガンマ（Ab2γ）と名付けられた３番めのカテゴリーは、イディオタイプを物理的に結合サイト近くで認識するが代理抗原として作用しない[4]。
【０００４】
さらに、内部像抗イディオタイプ抗体は、エピトープと同一の三次元構造又はアミノ酸配列相同を示すであろう。これはレオウイルス系で示され、イディオタイプのアミノ酸配列はウィルス赤血球凝集素と同じモチーフを有していた[5]。したがって、感受性セルのウィルス受容体結合を阻止することができる。
【０００５】
一般に、ペプチド抗原あるいは不活化ウィルスを適用する他のワクチン以上の抗イディオタイプ抗体の利点は多種多様である[6]。それらはウイルス・コンポーネントに関与しない、そして安全であるが、単一エピトープの模倣によって特異性を逃がさない。それらは予防接種に容易に大量に生産することができる。Ab2は、天然抗原に免疫原性でない単一中和エピトープに対して、免疫応答を誘導することさえ出来る。新生児ハツカネズミで実証されたように、ある抗原に免疫原性の無応答性を破ることが出来る[7]。Ab2に基づいたワクチンの能動免疫療法は、癌細胞に対して抗原特異的Ab3を癌患者に誘導することに非常に有力であることが立証された[8-11]。
【０００６】
抗原（Ab2β）の内部像を表示するAb2も、感染性病原体に対し保護免疫を誘導した[12]。HIV-1感染コントロールでの中和抗体の重要性から、HIV-1感染には、Ab2療法が利用可能となる[13]。HIV-1を含む種々の系での中和Ab3の誘導の可能性は記述されている[14]。
【０００７】
HIV-1抗原の種々の正常ヒト抗原との交差反応は、多重エピトープワクチン以上に、単一エピトープAb2ワクチンの潜在的な利点を示唆する[15]。中和体液免疫応答の誘導に対する異なるアプローチは、抗イディオタイプ抗体でなされてきた。最も有望な実験は、抗CD4特異的mAbで行われており、それらはHIV-1中和抗体をin vitroで誘導することが出来る[16,17]。抗CD4  mAb Leu3a及びIOT4Aも臨床試験で検査され、そしてgp120のCD4への結合を阻害するgp120交差反応免疫応答の誘導を示した[18,19]。V3ループペプチドに対してAb2も生成され、異なるin vitro検査で使用された[20-22]。異なる動物モデルにおいて、それらは、gp120同様に自己ペプチドを結合する能力を備えたAb3を誘導したが、しかしin vitro実験ではHIV-1を中和することが出来なかった。唯一つのAb2だけが、HIV-1に対するワクチンとしての可能性を持つことが記載された[23]。
【０００８】
HIV-1を中和する抗体として上げられたAb2β抗体は、原理的には、ワクチン設計に巨大な可能性を有している。HIV-1に対するワクチンは、細胞及び体液免疫応答を共に誘導しなければならない。HIV-1特異的CTL応答は、様々な実験的ワクチン、DNAワクチン[24]又はキメラインフルエンザ生ウイルスを鼻内噴霧で投与そしてHIV-1エピトープの発現で誘導される[25]。中和抗体応答を誘導する適切な実験的ワクチンは、これまで一般的に入手が出来なかった。ヒトモノクローナル抗体2F5（ハイブリドーマセルラインECACC Accession No.90091704によって生成された）は、広くかつ強力にHIV-1一次分離株を中和する[26]。 したがって、mAb2F5は、適切に誘導された体液免疫応答に結びつく抗HIV-1ワクチンの設計に大変に興味深い手段である。それは、ウィルスエンベロープ外部ドメインgp4l上で６つのアミノ酸コアエピトープ配列ELDKWA(SEQ ID NO:1)を認知している[27]。
【０００９】
2F5様の特異的抗体は、HIV-1感染個体の血清で非常に稀に見出される。HNIG（７０人以上のHIV-1陽性献血者のプール血清）は、gp160及び／又はgp41に顕著な2F5様の特異的結合を示さなかった。2F5が結合するgp41上の領域は、自然感染のヒト免疫系に明白に陰性(cryptic)である。その免疫陰性の挙動には、異なるメカニズムが寄与していると考えられる。ひとつの説明として、正常なヒト血清の中に大量にあるヒト補体H因子が、gp41の領域に結合ドメインを有し、免疫認識に対してマスキングするとされる[28]。このmAbは、幅広く及び効力のあるHIV-1ブロッカー（中和剤）であるが、遊離ウィルス及びHIV-1感染細胞に非常に弱い結合をする[30]。gp41上の融合誘導領域は、HIV-1と宿主細胞の融合イベント中のみ露出されることが結論された。一方、自然感染でのこれら中和エピトープの陰性に対して、さらなる説明を与える。一方、この抗体に中和非感受性のHIV-1分離株はこれまでに見出されていない。
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以前の研究において、2F5のコアエピトープモチーフELDKWA (SEQ. ID NO:1)が、異なる抗原性フォーマットに組み込まれた。インフルエンザ生ウィルスの赤血球凝集素上のELDKWAモチーフのプレゼンテーションは、鼻粘膜スプレーの反復免疫で、マウス糞便に2F5様の特異的IgAとして検出される、長く永続する粘膜の免疫応答を誘導することができた[25]。しかしながら、in vitroで中和能力を検証するのに十分な量のIgAを糞便サンプルから抽出することができなかった。イースト中で発現されるB型肝炎の表面抗原への融合のような免疫の2F5コアエピトープを提供する他の形式は、免疫化したBALB/cハツカネズミに、非常に高い2F5様の特異的ELISAタイター（ELISA-titer）を誘導した。しかしながら、これらの動物血清は、顕著なin vitro中和能力を示さなかった[36]。2F5エピトープのペプチドバージョンも貧弱な免疫原性であった。
【００１１】
本発明の目的は、HIV-1に対して中和体液免疫応答を誘導することが可能な抗原結合成分を生成することにある。発明のさらなる目的は、HIV-1中和抗体を誘導し得る斬新な抗体又は抗体断片を提供することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、HIV-1のgp41抗原の抗体を目指したネズミ科の抗体及びその断片を開示する。発明は、HIV-1のgp41の上で陰性(cryptic)中和エピトープとの反応が知られているヒトモノクローナル抗体2F5を意図した、抗イディオタイプマウスAb2βの生成について特に記載する。本発明のAb2の一つ、すなわち3H6と命名される（微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定で保管：PHLS Porton Down, Salisbury, UK; ECACC Acc. No. 01100279）マウスモノクローナルAb2は、ヒトAb1 2F5の結合をgp160に対して同様に、少なくともコアエピトープ配列ELDKWA (SEQ ID NO:1)を含む合成エピトープに対しても阻害する。3H6は、2F5のHIV-1中和能力も減少させる。
【００１３】
また本発明は、3H6抗体から引き出されたFab断片に関係があり、これらは、簡単な免疫の初回／追加処方の適用で、ヒト及び非ヒト哺乳動物の血清に中和免疫応答を誘導することが示されている。したがって、3H6 Fab断片は、自然感染中のnativeHIV-1に明らかに免疫抗原性の欠けたあるいは単に免疫抗原性の乏しいエピトープの模倣に成功する。本発明の文中で、「抗体断片」は、全体の抗体分子の結合特異性を保持する全体の抗体の抗原結合部である。用語は、例えばFab-、F(ab')2-、 Fv-及びscFv断片を包含する。抗体断片は、抗体のタンパク質分解消化として周知の従来技術である、例えばパパイン(papain)消化又は遺伝子工学によって得ることができる。
【００１４】
抗体断片の構造の性質が、結晶研究、シーケンス方法及び／又は周知の他の方法によって一旦分析されたならば、抗体及び抗体断片は、ペプチド合成又は組換えDNA技術のような合成方法でも調製することができる。
【００１５】
別の実施形態に、本発明はヒト化抗体及び抗体断片に関する。「ヒト化」は、非ヒト抗体又は抗体断片が、ヒト抗体の部分と関連していることを意味する。通常、それは非ヒト、例えば、げっ歯類抗体の可変領域からの相補性決定領域(CDR)は、ヒト抗体，例えばヒト免疫グロブリンGの可変領域からのフレームワーク領域と併合することを意味する。そのようにして、非ヒト抗体の抗原結合サイトを含む断片が、適切なヒト抗体に挿入される。抗体を"ヒト化する"方法は最先端技術である。例えば、非ヒト抗体のCDRを含む可変領域をコード化するエクソンは、適切なヒト抗体のフレームワーク配列にスプライスされる。さらに、非ヒト抗体のFab断片は、適切なヒト抗体の適切なFc断片と結び付く。適切なヒトフレームワークは、非ヒト抗体への相同性に基づくデータベースにおいて相同性探索によって見つかるであろう。
【００１６】
本発明による"ヒト化"抗体断片は、2F5抗体を抗原として選択することにより、合成ヒト可変領域の無作為組み合わせを用いる合成ファージライブラリーからも誘導される。ヒト化抗体は、以降、接頭辞"hu"を使用して引用する。例えば、用語"hu3H6"は、ヒト化3H6抗体を引用する。
【００１７】
更なる実施例として、本発明はキメラ抗体に関す。キメラ抗体とは、非ヒト、特にげっ歯動物、の可変領域全体抗体が、抗体のヒト定常領域で発現される抗体である。これは、抗体にヒトエフェクター機能を与える。"キメラ"抗体は、抗原結合サイトを含む可変領域をコード化する非ヒトエキソンを、抗体定常領域をコード化するヒトエキソンと分子レベルで融合することにより作成される。キメラマウス／ヒト抗体は、以降、接頭辞"mo/hu"によって識別する、例えば、用語 "mo/hu3H6"はキメラマウス／ヒト2H6抗体を引用する。
【００１８】
用語"3H6"が識別なく使用される場合、もし別の意味がそれぞれの前後関係から推測可能でなければ、その用語は、マウスのAb2抗体3H6に関係がある、例えば、セルライン3H6(ECACC Acc. No. 01100279)によって生産されたものである。そのような他の意味は、用語3H6をグループ要素；マウス、キメラ及びヒト化3H6抗体、の各々又は全てを包含する総括的な用語としての使用を含む。
【００１９】
また別の実施形態として、本発明は、抗体サイトカイン構造に関する。キメラmo/hu3H6抗体のvH及びvL鎖が、ヒトFc及びCκ鎖と融合して、免疫グロブリンGアイソタイプを有する（図６）組換え発現タンパク質となる。キメラ免疫グロブリンG分子は胎盤を通過することができ、そのために、前述の構造が、HIV-1の母子感染をうまく妨害、阻害又は阻止することが期待される。mo/hu3H6 Fcガンマ抗体と同様に抗イディオタイプ抗体3H6 Fab断片も、体液免疫応答を誘導し、かつ免疫系の中和抗体の誘導の引き金となる。
【００２０】
更なる実施例として、本発明は、哺乳類の個体への投与で抗体又は抗体断片によって誘導された抗体の免疫原性を改善する免疫活性分子との関連、例えば融合又は結合する抗体又は抗体断片に関する。例えば、抗体断片は、IL-4のようなサイトカイン構造に結合し得る。それは前記哺乳動物の免疫反応性を増強し、好ましくは増加したBセル応答を引き起こす。それはHIVの処置に特に重要である。本発明は、全体のAb2抗体、特に、マウス3H6、キメラmo/hu3H6及びhu3H6を含む抗体3H6にも関し、抗体は、少なくとも一つの抗体及び／又はその抗HIV作用断片、そして少なくとも一つのサイトカインに関与、特にIL-4関与した抗体及び／又はその抗HIV作用断片との組み合わせから成る混合物に対しても同様に、いかなる非免疫刺激分子と関与（例えば、結合、融合またはリンク）する。ここで使用される用語"抗HIV作用断片"は、HIV-1中和抗体2F5(ECACC  Accession No.90091704)と反応する抗体断片に関し、それは、抗体2F5のHIV-1中和活性及び／又は抗体2F5のHIV-1のgp41への結合を阻害又は阻止する、そして、それらは哺乳動物への適切な投与で、2F5タイプ抗HIV-1抗体の誘導に好ましい。
【００２１】
癌およびウィルス感染の処置にインターロイキンの治療使用が、数年来適用されてきた。さらに、IL-2 のようないくつかのサイトカインは、感染初期段階で縮小される。特に、HIV-l治療では、多数の指摘及び個別の研究は、IL-15が多大な有益性が有ると指摘する。
【００２２】
IL-2同様に、IL-15は活性化T細胞及びNK細胞の増殖の原因で、IFN-γの分布を支援、そしてB細胞に免疫グロブリンの生成を刺激する。IL-15 mRNAは、異なる組織で検知され、堅く制御されている。IL-15は、CD8+記憶(memory)細胞の増殖を誘発し、一方IL-2は、CD8+記憶細胞の増殖を阻害する。したがって本発明により、IL-15は、改良されたHIVワクチンを開発する概念において可能な候補に選ばれ、特に少なくとも、それが、a)患者のBリンパ細胞中に中和抗体の生成を促進する、及びb) 患者のCD8(メモリー細胞の数を増加することにより細胞免疫を刺激することの理由による。さらに、AIDS患者へのIL-2の注入が、高い供与量で激しい副作用を示したが、一方IL-15は、はるかに有害でなく、新生児においても認められている。
【００２３】
従って、さらに本発明の実施形態として、抗体2F5と反応する抗イディオタイプAb2抗体又は抗体断片、好ましくは免疫活性分子としてIL-15と関連、例えば融合又は結合で関連したAb2 3H6又はその断片に関する。好ましい実施形態として、本発明は、キメラmo/hu3H6又はヒト化抗体hu3H6及びヒトIL15から成る融合タンパク質に関する、いわゆる組換えタンパク質に関するもので、mo/hu3H6又はhu3H6及び抗体重鎖C末端(図6)のヒトIL-15から成る融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、哺乳類のレシピエントに中和、2F5様の抗体を誘導する、一方同時に、CD8+記憶細胞の増殖が、IL-15テール(tail)作用を通じて刺激される。
【００２４】
さらにメモリT細胞活動を誘導する本発明のサイトカイン関連Ab2抗体の前記の作用とは別に、Ab2抗体又はその抗HIV有効断片と、サイトカイン関連Ab2抗体又はその抗HIV有効断片の組み合わせは、相互に成分比率を、特に抗HIV-1ワクチンにおいて調整することにより、最適な治療結果の開発を可能にする。好ましい実施形態として、本発明は、混合物又は組成に関し、典型的にはHIV-1ワクチンに関し、3H6、3H6の断片、mo/hu3H6、mo/hu3H6の断片、hu3H6及びhu3H6の断片から成る群から選ばれた少なくとも1つの抗体又はその有効断片で、少なくとも一つのサイトカインに関連した、好ましくはIL4又はIL-15関連の抗体又はその有効断片とを組み合わせ、ここで抗体又は断片は、3H6、3H6の断片、mo/hu3H6、mo/hu3H6の断片、hu3H6及びhu3H6の断片から成る同じ群から選択されたものから成る。
【００２５】
適切な比率は、投与に先立ち各受取人レシピエントにin vitroモデルを使用して決定することができる。通常、この決定はAb2関連IL-15濃度を最小レベルまで減少させ、少なくとも好ましくは、体液免疫応答の最良に可能な誘導を保証する濃度までhu3H6抗体を追加する。
【００２６】
免疫応答を誘導した3H6の血清は、重要なin vitroの中和能と同様に抗原上の2F5の特異結合阻害パターンを示す。更に抗2F5-Ab2β 3H6は、同族のAb1と強く反応する一方、無関係Igに交差反応性のないイディオタイプの高い特異性を示すアイソタイプマッチ(matched)コントロール抗体を認識しない。
【００２７】
したがって、抗イディオタイプ抗体3H6は、直接に防御及び中和免疫応答を誘導するワクチンとして、または防御及び中和Bセル応答も成功裡に誘導するHIV-1ワクチンの設計に寄与する道具として使用してもよい。Ab2は、免疫系が他の抗原を備えた刺激に耐性かもしれないHIV-1感染新生児の予防接種にふさわしい[37、38]。
【００２８】
一見して、Ab2 3H6が、中和免疫応答を誘導することが出来るワクチン抗原を表わしている。Ab2 3H6の免疫は、HIV-1陽性個体のポリクローナル血清の中で観察された感染応答(ADE)の抗体依存増強の誘導を回避する[39-42]。Abl 2F5を、ボランティアにグラム量で受動的に投与した。ADEの徴候は、捕体活性が検知されたにもかかわらず、これらのヒトボランティアの中では観察されなかった[29]。Ab2 3H6が、免疫動物の血清中に2F5様の特異性を誘導するので、HIV陽性の個人のポリクローナル血清で観察されたADE現象が、Ab2 3H6を備えた予防接種で回避し得ることが期待される[43]。
【００２９】
調合薬としての使用に、本発明の抗体及び抗体断片は、薬学的に認知し得るキャリアーと一緒に組成物の一部になりうる。したがって、さらなる実施例において、本発明は、医薬組成物、特にワクチンに関し、適切な任意の免疫原性のキャリアー及び／又は補助剤と本発明のAb2抗体又は抗体断片から成る。
【００３０】
また別の実施例で、本発明は3H6タイプの現在のAb2抗体又は抗体断片により誘発されたAb3抗体（抗−抗イディオタイプ抗体）に関し、同様にAb2 3H6に向けられた、好ましくはAb2 3H6の結合エピトープに向けられたAb3抗体又は抗体断片から成るワクチンを含む医薬組成物にも関する。最も好ましい実施例では、これらAb3抗体又は抗体断片が、HIV-1を中和する性質である。このようなAb3抗体又はその断片を含む医薬組成物は、HIV-1の受動免疫に役立つ。
【００３１】
本発明の抗体又は抗体断片は、1kg体重に約0.5〜約10μgの投薬の投与を行い、好ましくは一回又はそれ以上の間隔で定期的に追加しても良い。Ab2 3H6抗体又はその断片、又は、抗3H6 Ab3抗体又はその断片のいずれかを含む本発明の医薬組成物は、個体のHIV-1感染を予防的に防ぐため、同様にHIV-1感染した個体の疾病進行を阻止又は停止するために投与しても良い。
【実施例１】
【００３２】
例1：3H6抗体の生成
動物：8-10週経過の雌のBALB/cハツカネズミをチャールズ・リバー（Charles River  ドイツ  ザルツフェルトSulzfeld）から入手した。
抗体：免疫グロブリンサブクラス標準及びアイソタイプ特異的抗マウス抗血清を、シグマ(Sigmaセントルイス、MA)から購入した。モノクローナル抗HIV-1抗体2F5を精製し、免疫の抗原結合断片(Fab')として使用した。抗体を、マーキュリパパイン(Mercuripapainシグマ)で消化させ、消化物をタンパク質A-Sepharose 4 FFカラムで精製した。
動物の免疫：50μgの 2F5 Fab'を腹腔内に完全フロイントアジュバント(CFA)で注入し、3及び6週後に再度、不完全フロイントアジュバント(IFA)を注入した。脾臓-ectomization前の4日間、動物は最後に追加免疫された。脾細胞が、最初の免疫後、日46に準備された。
【００３３】
マウス免疫グロブリンGを分泌するハイブリドーマの生成:
ハツカネズミの血清タイターを、免疫適格脾細胞の展開の基準として使用した。少なくとも1:100,000の抗2F5タイターを備えたハツカネズミのみ融合に使用した。標準プロトコルにより、脾臓セルをX63-Ag-8.653セルで融合し、96ウェルプレートに平板培養した。融合の後日、HAT選択を開始し、成長ウェルの上清を、標準のタンパク質としてマウスmAbを使用し、マウス免疫グロブリンG生産に対して最初に検査を行った。ポリクローナルヤギ抗マウスガンマ鎖抗体(シグマSigma)を被覆緩衝液(0.l N Na2CO3/NaHCO3   pH 9.6) で1:500に希釈し、そして100μLをマイクロタイタープレート(ELISA、等級I、
Nunc、デンマーク)上でプレコートした。各インキュベーション処置後に、プレートをpH 7.2に調節した0.1%トゥイーン20を含むPBSで3回洗浄した。標準マウスmAbを、200 ng/mLで開始し(稀釈緩衝液は、洗浄緩衝液1%のBSAを含む)連続的に希釈した。50μLの標準又は連続希釈した検体ウェルを、プレコートしたウェルで1h結合させ、プレート洗浄後、50μLの1:5,000希釈ヤギ抗マウス免疫グロブリンG+免疫グロブリンM poly HRP80(RDI社)を第2の抗体として使用した。1hのインキュベーション後に、プレートをOPDで染色し、492nm(参照波長620nm)で測定した。
【００３４】
2F5イディオタイプに対する抗体スクリーニングについては、2170 HAT耐性ハイブリドーマの上清が、免疫グロブリンG産生に関してテストされた。65の陽性クローンが見つかった。免疫グロブリンGの陽性クローンの上清の約10%が、抗体2F5とも反応していた。
【実施例２】
【００３５】
例2: 中和抗体の識別
イディオタイプ結合アッセイ:
イディオタイプ結合抗体の初期スクリーニングに対して、96ウェルのマイクロタイタープレートを、終夜4oCで、2F5-IgG1、2F5-IgG3又は2G12、ヒト抗HIV-1抗体を認識する別のgp120でコートした[3l]。検体を200ng/mLで始まる稀釈バッファで28に希釈した。マウス免疫グロブリンG のELISAで記述されたように、Ab2が視覚化された。抗体3H6、4F6及び6F8を安定させれば、異なるプレコーティングのELISAで結合能力に関して検査することが出来た。抗イディオタイプ抗体lG1は、異なる中和抗HIV-1抗体、すなわち2Gl2(ECACC Acc.93091517;詳細はWO 96/33219を参照)に向けられたもので、コントロールとして役立った。
【００３６】
表1は、Ab2の異なるイディオタイプとの相対的な結合特性を示す。4F6及び6F8は、すべての抗体と反応し、定常域でエピトープを認識するように見えた。抗体1G1は、特に2Gl2に結合する。一方、3H6は、2F5の両方のアイソタイプを認識し、2G12には否定であった。
【００３７】
【表１】
2005517685.tif 000003
【００３８】
Ab2 3H6のイディオタイプ阻害アッセイ：
競合結合アッセイを以前記述した様に実行した[32]。Ab2の異なる濃度(50、500ng/mL)を、100ng/mLで開始する2F5の1:2稀釈液でプレインキュベートした。1時間後に、抗体をプレート上で抗原と反応させた。固相は、2μg/mLの濃度で、合成2F5エピトープGGGLELDKWASL(SEQ. ID NO.l3)でコートし、2F5の最終結合は、記述された様に測定された[33]。
【００３９】
ELISA競合アッセイは、Ab2のプレインキュベーション後のELDKWAエピトープへの2F5の残存結合能力を記述するように意図した。Ab2 3H6は、加えた濃度に依存して2F5のエピトープへの結合を阻害又は阻止する。図1は、3H6の濃度増加で、2F5のGGGLELDKWASL(SEQ. ID NO.13)プレコートしたプレートへの結合の減少を記述する。50ng/mLの3H6でさえも、31ng/mL2F5の結合特性を3分の1以上(ODの37%の減少)減少させ、500ng/mLは83%のOD減少となり、一方Ab2 6F8は、2F5のエピトープへの結合を縮小しなかった。GST(グルタチオン-S-転移酵素) ELDKWA融合タンパク質への2F5結合親和性は、1.7x 107M-1で[33]、Ab2 3H6の阻害パターンは、さらなる検査が必要である。
【００４０】
GGGLELDKWASLをELDKWAエピトープを含む他の合成ペプチド又はわずかに変更した特に機能的に等価な物、機能的に等価な相同体を含むそのバリアント又は機能的に等価なバリアントで取り替えた時、類似の結果が得られた。これらは遺伝子コードの縮退及び／又はHIV-1ウィルスの変異性より生ずる。バリアントは、好ましくは、ELDNWA (SEQ ID NO.2), ELNKWA (SEQ ID NO.3), LELDKWA (SEQ ID NO.4), LELDNWA(SEQ ID NO.5), LELNKWA (SEQ. ID NO.6), ELDKWAS (SEQ ID NO.7), ELDNWAS (SEQ ID NO.8), ELNKWAS (SEQ ID NO.9), LELDKWAS (SEQ ID NO.10), LELDNWAS (SEQ ID NO.11), LELNKWAS (SEQ ID NO.12)から成る群から選択される。
【００４１】
3H6を備えたウィルス中和アッセイ:
異なるAb2と2F5の相互作用を、前記したような中和アッセイでさらに研究した[26]。アッセイを、HIV-1株(strain)NL4-3感染AA-2細胞(国立アレルギー疾患・感染症研究所NIAID、ベテスダBethesda、MD)を標識細胞とし、ウィルス応答マーカーとしてp24抗原を使用して実行した。Ab2抗体(開始濃度250μg/mL)の連続稀釈液を、一定量の2F5又は2G12と、陰性コントロール(10μg/mLの各中和抗体)及びウィルスとのプレインキュベーションとして、AA-2細胞の添加前に混合し、そして5日間さらにインキュベートした。ウイルス複製は、アッセイの終了時点でp24-ELISAの中で測定された[34]。Ab含有培養(Vn)のp24抗原生産の、コントロール培養(Vo)のp24抗原生産  に対する比率を、インプットp24を考慮して計算しそしてX%中和を引き起こすAb濃度(μg/mL)をプロットした。各テストは、実際の組織培養感染量50(TCID50)を決定するためにウィルス滴定を含み、ウイルスタイターを直線回帰分析で決定した。ウィルスタイターが102-103 TCID50の範囲でテストは有効であると見なされた。
【００４２】
図2は、Ab2 3H6のプレインキュベーション後の2F5及び2Gl2とのHIV-1 NL4-3のin vitro中和を示す。2F5及び2G12のみ、3μg/mLの濃度でウィルスの90%を中和、12μg/mLおよびllμg/mLでそれぞれウィルスの99% (データ表示無し)を中和する。2F5及び2G12の濃度は10μg/mLで一定した。2F5又は2G12の50μLをAb2、3H6、4F6、6F8の連続稀釈でインキュベートした。3H6のみが2F5中和を除去することができた(4F6及び6F8はプロット無し)。
【００４３】
図1bは、パーセント中和を記述し、10μg/mLの2F5及び2G12の3H6の増量に対する残存中和能を表わす。3.9μg/mLの3H6は、2F5の中和特性を消滅させ、および1.9μg/mLは、2F5の中和能を5%減少することが出来る。これは、2つの対応する抗体の分子量が、オリゴマー形成または開裂により変わり得るので、3H6及び2F5が、ほとんど等モルの比率で反応することを意味している。3H6は、250μg/mLの高い濃度でも2G12の中和を低減することができない。Ab2 3H6は、3.9μg/mLで95%の2F5中和を低減することが出来た。
【００４４】
抗体3H6の重鎖及び軽鎖の可変域の配列:
a) 抗イディオタイプ抗体3H6(SEQ ID NO. 13)の重鎖可変域(vH)のアミノ酸配列:
GVQLQQSGPELVKTGASVKISCKASGYSFTDYFMHWVKQSHGKSLDWIGYINCYTGATNYSQKFKGKATFTVDTSSNTAYMQFNSLTSEDSAVYYCARTSIGYGSSPPFPYWGQGTLVTVSA
b)抗イディオタイプ抗体3H6(SEQ ID NO. 14)の軽鎖可変域(vL)のアミノ酸配列:
ETTVTQSPASLSMSIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPRLLISDGNTLRPG
VPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPYTFGGGTNLEIK
【実施例３】
【００４５】
例3:抗抗イディオタイプ抗体(Ab3)の誘導
BALD/cハツカネズミのAb3の誘導:
アフィニティークロマトグラフィーによるAb2(3H6)精製後に、 マーキュリパパインシグマ(Mercuripapain Sigma)で消化させ、そして消化物をタンパク質A-Sepharose 4 FFカラムで精製した。3匹のBALB/cハツカネズミに5μgの3H6 Fab'を腹腔内に注入し、3週後に再び注入した。共にフロイントの不完全アジュバントである。さらに1週間後、ハツカネズミを犠牲にし血液と腹水の検体を集めた。検体は、上記の免疫グロブリンGタイターのELISAによって分析された。
【００４６】
3匹のBALB/cハツカネズミを5μg/mL 3H6のFab'断片FIA溶液で免疫化した。不運にも、第2の免疫後に、動物は腹水症を発生し、免疫スキームを終了せずに犠牲になった。血清及び腹水は、2mg/mlまで全免疫グロブリンGタイターを有することが示された。免疫グロブリンGタイター、結合能及び競合アッセイの結果は表2で要約される。ELISAのGGGLELDKWASL(SEQ. ID NO.13)及びgp160への結合は、ポリクローナル血清および腹水のカットオフ稀釈のプロットで図2に説明した。エンドポイントタイター(カットオフ)は、対応する免疫前の免疫グロブリンGで得られたODより少なくとも2倍大きなODになる最も高い稀釈の逆数として計算した。
【００４７】
【表２】
2005517685.tif 000004
【００４８】
Ab3の特性
Ab3の特異性：3H6で免疫にしたハツカネズミの血清と腹水の検体を、合成エピトープGGGLELDKWASL(SEQ. ID NO.13)(1μg/mLの吸着バッファー)及び組換えgpl60(1μg/mLの吸着バッファー)に対する結合のためにアッセイした。上述されるように、マウス抗体が検知された。別の特異性テストでは、Ab3検体の連続稀釈液を、gp160のプレコート上の一定量の2F5と共にインキュベートした。1:10から始めて、Ab3の稀釈液を増加させ2F5の結合能を検査した。
【００４９】
2F5抗体を25ng/mLで利用し、1:10で開始するAb3検体の連続稀釈液をコンペティターとして使用した。2F5の抗原結合と最も強力に競合したAb3血清は、in vitro中和能も示した。図3は、Ab3検体のコンペティションによるプレコートしたgp160に結合する2F5の減少を示す。
【００５０】
融合細胞阻害アッセイ：Ab3血清および腹水の中和能は、HIV-1株RFNTの細胞融合形成の阻害によって評価された。AA-2細胞の追加前に、血清、腹水又はコントロール抗体(2F5)の連続稀釈液を、37oCで1h、ウィルス(102-103のTCID50/ml)とプレインキュベートを行なった。血清および腹水の稀釈液は1:5の培地で始めた。融合細胞形成の評価の前に、細胞を5日間インキュベートした。実験は、稀釈ステップにつき4つのレプリカで実行した。１ウェルに少なくとも1 つの融合細胞の存在は、HIV-1感染の徴候と見なされた。50%の阻害濃度(IC50)は、リード及びミュンヒ（Reed and Muench）の方法によって計算された[35]。実験は、感染タイターを確認するために接種原のウィルス滴定を含んだ。
【００５１】
血清と腹水の中和特性は、HIV-1ラボラトリ(laboratory)株RFNTでテストされた。検体を最初に1:5に薄め、0.2μのろ過で滅菌し、そして4通りのAA-2融合細胞阻害アッセイの中で1:10の開始濃度で使用した。ウィルスタイター(TCID50/ml)は、102.75であることがわかった。腹水サンプル及び血清1は、抗ウイルス性効力を示さなかった。血清2及び3は、稀釈液1:14.1および1:ll.9でIC50にそれぞれ達した。血清1は、腹水検体と同様に中和を示さなかった。
【実施例４】
【００５２】
例4:サイトカイン関連抗体
3H6 vL及びvHのコード配列を、培養ハイブリドーマセルラインからのRT-PCRを経て、マウスmAb Ab2/3H6から分離した(例1を参照)。その後、ヒトCK及び免疫グロブリンG Fc領域を、SOE-PCR(重複拡張によるスプライシング)によって、3H6の可変断片に融合させ、続いて真核細胞発現ベクターpIRESにクローンとした。このクローニングステップは、CMV-プロモータ-キメラ 3H6 重鎖 -インターナルリボゾームエントリーサイト(IRES) - キメラ3H6 軽鎖 - SV4O polyAを備えたbicistronic発現カセットとなる。最終のプラスミドはp3H6mhHC/LCと呼ばれる。
【００５３】
ヒトIL-15 cDNAをPCRにより増幅し、SOE-PCRにより抗体重鎖領域へ融合させ、Fig.6に示される融合タンパク質mo/hu3H6/IL-15とする。mo/hu3H6/IL-15重鎖は、発現プラスミドp3H6mhHC/LCで3H6キメラ重鎖を置換して、第2発現プラスミドp3H6mhHC-IL-15/LCとなる。
【００５４】
２つの組換えCHOセルラインは、コトランスフェクションにより生成される:マウス/ヒトを発現する一つのセルライン、そして3H6重鎖(mo/hu3H6/IL-15)のC末端でヒトIL-15と同じ抗体を発現する第２セルライン。
【００５５】
上述の標的プラスミドは、LipofectinRによってマウスジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)に対してプラスミドpdhfrコードと一緒にコトランスフェクトされた。次のトランスフェクション細胞の選択は、遺伝アミカシン(G418) を使用して実行した。メトトレキサート(MTX)は増幅マーカーとして使用される。サブクローンの拡張の後に、最良の産生クローンのスクリーニングを、商用抗ヒトIL-l5 mAb及びmAb2F5をELISAとフローサイトメトリーで行った。望ましいタンパク質の最も高い分泌率のサブクローンが拡張する前に、選別プロセスを繰り返す。その後、mo/hu3H6又はmo/hu3H6/IL-15融合タンパク質の分泌され、細胞内に残存したタンパク質の量の数量化と比較を行う。
【００５６】
タンパク質の精製は、アフィティー・クロマトグラフィーそして任意にはイオン交換クロマトグラフィーを続けてもよい。分離・精製された融合タンパク質mo/hu3H6/IL-15を、次の生化学特性の分析測定にかける:
−Biacoreシステム又は等温マイクロ熱量計を使用したIL-2/IL-15-Rのアフィニティー；
−ゲルろ過カラム及びnativeゲル電気泳動を使用した分子サイズ；
−ヒト血清中のインキュベーションによる免疫サイトカインのin vitro安定性；
−結合能を比較するmo/hu3H6抗体分子とのmo/hu3H6/IL-15融合タンパク質の競合アッセイ；
−mo/hu3H6及びmo/hu3H6/IL-15の融合タンパク質の阻害特性について記述するin vitro中和実験；
−生体膜による拡散、免疫組織アッセイを使用した選択組織の対応する受容体、IL-2/IL-15-Rへの結合。
【００５７】
mo/hu3H6/IL-4融合タンパク質の構築および発現は、同様にして行われる。in vitro実験からの結果は、本発明の上述の融合タンパク質の活動を刺激するB細胞応答と同様にHIV-1中和活動の両方を確認している(データは示さず)。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】2F5のAb2 3H6のプレインキュベーション後の、プレコートしたエピトープに対する2F5の結合能力の減少を示す。100 ng/mLで開始する2F5の連続希釈は、50 ng/mL又は500 ng/mLの3H6又は非特異的Ab2 6H8でプレインキュベーションを行った。１時間後に、稀釈液をマイクロタイタープレートでGGGLELDKWASL (SEQ ID NO:13)と反応させ、2F5が検知された。
【図２】3H6及び無関連マウス免疫グロブリンGの増加に伴う10 μg/mLの2F5及び2Gl2の中和アッセイを示す。
【図３】3H6免疫のハツカネズミの腹水及び血清サンプルのgpl60の結合を示す。
【図４】3H6免疫のハツカネズミの腹水及び血清サンプルのGGGLELDKWASL (SEQ ID NO:13)への結合を示す。
【図５】プレコートしたGGGLELDKWASL (SEQ ID NO:13)のELISA結合検査で、3H6免疫のハツカネズミ血清の2F5との競合アッセイの結果を示す。
【図６】融合タンパク質mo/hu3H6/IL-15の概略図である。
【図１】
2005517685.tif 000005
【図２】
2005517685.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005517685.tif 000012
2005517685.tif 000013
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