(57)【要約】本発明は改良されたヘテロポリマー複合体に関する。改良されたヘテロポリマー複合体は、C3b様受容体(霊長類における補体受容体(CR1)またはCD35、およびその他の非霊長類哺乳類、例えば、イヌ、マウス、ラット、ブタ、ウサギにおけるH因子として知られている)部位に特異的な第1のモノクローナル抗体であって、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された(共有結合した)該抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型は、Fc受容体に対して最も高い親和性を有するイソ型、例えばヒトにおけるIgG1またはIgG3である。本発明はまた、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を哺乳類ヘ投与することを含んでなる、C3b様受容体による哺乳類における抗原の免疫クリアランス方法に関する。本発明はまた、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を哺乳類ヘ投与することを含んでなる、哺乳類におけるウイルス感染もしくは微生物感染を治療または予防する方法に関する。本発明はまた、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を哺乳類ヘ投与することを含んでなる、哺乳類における敗血性ショックを治療または予防する方法に関する。本発明はまた、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を哺乳類ヘ投与することを含んでなる、哺乳類における癌を治療する方法に関する。本発明はさらに、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を含んでなる、ウイルス感染、微生物感染、敗血性ショック、および癌の治療または予防のための医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体であって第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された(共有結合した)該抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である、ヘテロポリマー複合体。
【請求項２】
第1のモノクローナル抗体が霊長類赤血球上の補体受容体に特異的である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
霊長類赤血球がヒト赤血球である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
ヒト赤血球上で発現される補体受容体CR1に特異的な第1のモノクローナル抗体であって第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された該抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型がヒトIgG1またはヒトIgG3である、ヘテロポリマー複合体。
【請求項５】
第2のモノクローナル抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
第1のモノクローナル抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
第1のモノクローナル抗体のイソ型がヒトIgG1またはヒトIgG3である、請求項４に記載の複合体。
【請求項８】
第1のモノクローナル抗体が、7G9、1B4、3D9、E-11、57F、YZ1、およびHB8592からなる群から選択される、請求項４に記載の複合体。
【請求項９】
少なくとも2種のヘテロポリマー複合体を含んでなり、そのうち少なくとも1種の複合体が、哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体であって第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された該抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型が、該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である、ヘテロポリマーカクテル組成物。
【請求項１０】
第2のモノクローナル抗体がウイルス抗原と特異的に結合する、請求項４に記載の複合体。
【請求項１１】
ウイルス抗原が、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アレナウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、トガウイルス、またはラブドウイルスの、抗原である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
ウイルス抗原が、HIV gp120、インフルエンザ・ノイラミニダーゼ、インフルエンザ血球凝集素、およびRSV F糖タンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１３】
第2のモノクローナル抗体が微生物抗原と特異的に結合する、請求項４に記載の複合体。
【請求項１４】
微生物抗原がリポ多糖である、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
微生物抗原が、連鎖球菌種(Streptococcus sp.)、連鎖球菌種(Streptococcus sp.)、ナイセリア種(Neisseria sp.)、コリネバクテリア種(Corynebacterium sp.)、クロストリジウム種(Clostridium sp.)、ヘモフィルス種(Haemophilus sp.)、クレブシエラ種(Klebsiella sp.)、ブドウ球菌種(Staphylococcus sp.)、ビブリオ種(Vibrio sp.)、エシェリキア種(Escherichia sp.)、シュードモナス種(Pseudomonas sp.)、カンピロバクター(ビブリオ)種(Campylobacter (Vibrio) sp.)、アエロモナス種(Aeromonas sp.)、バチルス種(Bacillus sp.)、エドワードシエラ種(Edwardsiella sp.)、エルシニア種(Yersinia sp.)、赤痢菌種(Shigella sp.)、サルモネラ種(Salmonella sp.）、トレポネーマ種(Treponema sp.)、ボレリア種(Borrelia sp.)、レプトスピラ種(Leptospira sp.)、マイコバクテリウム種(Mycobacterium sp.)、トキソプラズマ種(Toxoplasma sp.)、ニューモシスティス種(Pneumocystis sp.)、フランシセラ種(Francisella sp.)、ブルセラ種(Brucella sp.)、マイコプラズマ種(Mycoplasma sp.)、リケッチア種(Rickettsia sp.)、クラミジア種(Chlamydia sp.)、またはヘリコバクター種(Helicobacter sp.)の、抗原である、請求項１３に記載の複合体。
【請求項１６】
第2のモノクローナル抗体が癌細胞特異的抗原と特異的に結合する、請求項４に記載の複合体。
【請求項１７】
癌細胞特異的抗原が、CD20、Her-2およびPSMAからなる群から選択される、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヘテロポリマー複合体を有効量にて哺乳類に投与することを含む、抗原の免疫クリアランス方法。
【請求項１９】
請求項９に記載のヘテロポリマー複合体カクテルを有効量にて哺乳類に投与することを含む、抗原の免疫クリアランス方法。
【請求項２０】
ヘテロポリマー複合体と結合した、C3b様受容体を発現するフランキングされた(franked)細胞を、有効量にて哺乳類に投与することを含み、但し、該複合体が、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体であって第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された該抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型が、該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である、抗原の免疫クリアランス方法。
【請求項２１】
C3b様受容体を発現する細胞を含む哺乳類から得たサンプルと、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヘテロポリマー複合体を接触させること、およびサンプル中の抗原の結合を検出することを含む、哺乳類において抗原の存在を検出する方法。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか1項に記載のヘテロポリマー複合体を有効量にて哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス感染または微生物感染を治療または予防する方法。
【請求項２３】
ウイルス感染が、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アレナウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、ブニヤウイルス、コロナウイルス、フィロウイルス、フラビウイルス、ヘパドナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、またはラブドウイルスによって引き起こされる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
微生物感染が、酵母感染、真菌感染、原虫感染または細菌感染である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
細菌感染が、連鎖球菌種(Streptococcus sp.)、連鎖球菌種(Streptococcus sp.)、ナイセリア種(Neisseria sp.)、コリネバクテリア種(Corynebacterium sp.)、クロストリジウム種(Clostridium sp.)、ヘモフィルス種(Haemophilus sp.)、クレブシエラ種(Klebsiella sp.)、ブドウ球菌種(Staphylococcus sp.)、ビブリオ種(Vibrio sp.)、エシェリキア種(Escherichia sp.)、シュードモナス種(Pseudomonas sp.)、カンピロバクター(ビブリオ)種(Campylobacter (Vibrio) sp.)、アエロモナス種(Aeromonas sp.)、バチルス種(Bacillus sp.)、エドワードシエラ種(Edwardsiella sp.)、エルシニア種(Yersinia sp.)、赤痢菌種(Shigella sp.)、サルモネラ種(Salmonella sp.）、トレポネーマ種(Treponema sp.)、ボレリア種(Borrelia sp.)、レプトスピラ種(Leptospira sp.)、マイコバクテリウム種(Mycobacterium sp.)、トキソプラズマ種(Toxoplasma sp.)、ニューモシスティス種(Pneumocystis sp.)、フランシセラ種(Francisella sp.)、ブルセラ種(Brucella sp.)、マイコプラズマ種(Mycoplasma sp.)、リケッチア種(Rickettsia sp.)、クラミジア種(Chlamydia sp.)、またはヘリコバクター種(Helicobacter sp.)によって引き起こされる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記複合体が静脈内投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記複合体が1〜10mgの量でヒトへ静脈内投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
微生物抗原がリポ多糖である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヘテロポリマー複合体を有効量にて哺乳類に投与することを含む、哺乳類の敗血性ショックを治療または予防する方法。
【請求項３０】
前記複合体が静脈内投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記複合体が1〜10mgの量でヒトへ静脈内投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ヒトが、免疫無防備状態であるか、免疫不全であるか、高齢であるか、火傷を負っているか、または幼児である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のヘテロポリマー複合体を有効量にて哺乳類に投与することを含む、哺乳類の癌を治療する方法。
【請求項３４】
前記複合体が静脈内投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記複合体が1〜10mgの量でヒトへ静脈内投与される、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によりその全開示内容を本明細書に組み入れる、2001年７月17日出願の米国仮出願第60/305,989号に対する優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
1.発明の分野
本発明は改良されたヘテロポリマー複合体に関する。改良されたヘテロポリマー複合体は、哺乳類のC3b様受容体(霊長類における補体受容体(CR1)またはCD35、およびその他の非霊長類哺乳類、例えば、イヌ、マウス、ラット、モルモット、ウサギにおけるH因子として知られている)に特異的な第1のモノクローナル抗体であって、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された(共有結合した)抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型は、該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型（例えばヒトにおけるIgG1またはIgG3）である。本発明はまた、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を哺乳類ヘ投与することを含んでなる、C3b様受容体による哺乳類における抗原の免疫クリアランス方法に関する。本発明はまた、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を哺乳類ヘ投与することを含んでなる、哺乳類におけるウイルス感染または微生物感染を治療または予防する方法に関する。本発明はまた本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を哺乳類ヘ投与することを含んでなる、哺乳類における敗血性ショックを治療または予防する方法に関し、この場合第2のモノクローナル抗体はリポ多糖、エンドトキシンまたはグラム陰性菌の外壁構成要素と特異的に結合する。本発明はまた、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を哺乳類ヘ投与することを含んでなる、哺乳類における癌を治療する方法に関する。本発明はさらに、本発明の改良されたヘテロポリマー複合体を含んでなる、ウイルス感染、微生物感染、癌、および敗血性ショックの治療または予防のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
免疫粘着反応は、1953年にNelson, 1953, Science 118:733-737によって初めて記載され、感染性因子に対する防御における霊長類赤血球(E)の生物学的役割に対して強い裏付けを与えた。Nelsonは、特異的抗体による細菌のオプソニン化に続いて、補体の活性化により霊長類Eに対する細菌の結合および固定化が促進されたことを報告した。ひと度Eに接着すると、免疫複合体化した細菌は、Eに対して何ら目に見える損傷を与えることなく、細菌がEから取り除かれる反応においてアクセプター食細胞へと効率良く移行した。27年後、Fearon, 1980, J. Exp. Med. 152: 20-30は、補体活性化産物C3bに最も特異的な最初の補体受容体CR1を同定および特性決定したが、これは今ではEの免疫粘着反応を促進することが知られている。
【０００４】
微生物に対する防御作用をもたらす上での霊長類E CR1の推定される役割は、細菌および／またはウイルスが感受性のある器官および組織に侵入し、かつ/または脈管構造内の部位に付着してコロニーを形成する前に、血流中に存在する細菌および／またはウイルスをE上に迅速に固定化および捕捉することを含む。さらに、Nelsonは、Eと結合した細菌の食細胞への移行はin vitroで効率的かつ迅速に起こり、この反応の後にインターナライズされた細菌の食作用ならびに分解が起こったことを報告した。この知見は、Eと結合した病原体が、肝臓および脾臓における固定された組織マクロファージなどのアクセプター細胞に移行するin vivoでも、同様の反応が起こるであろうことを示唆する。
【０００５】
2.1 移行反応およびCR1
CR1は、補体カスケードの増幅をダウンレギュレートし、特にI因子により媒介される活性型C3bの分解における補因子として働くその能力に基づいて最初に同定された。Cornacoffら, 1983, J Clin Invest 71: 236-247は、霊長類E CR1が血液循環中で粒子状であるばかりか可溶性の補体オプソニン化免疫複合体(IC)と結合可能であることを報告している。実際に、可溶性のICでの移行反応のin vitroモデルでは、CR1と結合し、かつICと会合したC3bのC3biへの分解、次いでCR1と結合しないリガンドであるC3dgへの分解を触媒する上でのI因子の潜在的役割に主眼が置かれることが多かった。従ってC3bの分解は、補体オプソニン化ICをE CR1から血漿中へ再び放出する。この放出は、可溶性小タンパク質とともに調製したICではin vitroにおいて極めて迅速である(半減期は約5分)ことが示され、in vivoでのIC クリアランスおよび移行反応において役割を果たすものと思われる。しかし、Eと結合したIgG抗体/dsDNA ICの血漿中での広範な動態分析では、in vitroでのこれらの複合体の顕著な安定性が実証され、これは非ヒト霊長類の血液循環からの迅速なクリアランスとは対照的である。さらに、Emlenらの研究からin vitroにおいてEと結合したICのヒト単球への移行がI因子とは無関係であることが証明されている(Emlenら, 1989, J Immunol 142: 4366-4371およびEmlenら, 1992, Clin Exp Immunol 89: 8-17参照)。
【０００６】
2.2 免疫複合体(IC)
全身性紅斑性狼瘡(SLE)IgG抗dsDNA抗体および種々の長さのdsDNAを用いて調製したICは、免疫粘着反応を検討するための特に有用なモデルを提供する。dsDNAの多価性が親和性の高いIgG結合を可能にする。このことが、補体を活性化し、C3bを捕捉し、次いで霊長類Eと迅速に結合する安定な可溶性複合体の生成をもたらす。これらの複合体のdsDNA分子間にはほとんど架橋がないことから、これらの特性および補体系と相互作用する能力は、dsDNA分子あたりのIgG結合の相対数および密度によって原則として定義される。
【０００７】
大きさの異なるdsDNAを用いて調製した種々のICについては1時間後に10%未満しか放出されないことが示すように、in vitroでのIgG抗体/dsDNA ICとチンパンジーE との結合はI因子の供給源の存在下では安定であることが報告されている(Kimberlyら, 1989, J Clin Invest 84:962-970およびEdbergら, 1992, Eur J Immunol 22:1333-1339)。しかし、これらの複合体が125Iで標識され、補体でオプソニン化され、in vitroで51Cr標識したチンパンジーEと結合された後、動物へ再注入される場合、Eと結合したICはわずか5分の半減期で血液循環から排除され、注入物質の2%未満が血漿中に放出され、このプロセス中での51Cr標識Eの損失は実質的にない。従って、E結合補体オプソニン化IgG抗体/dsDNA ICの特異性は矛盾を示し、すなわち、複合体がin vitroにおいてはI因子を含む血漿中で極めて安定であるにもかかわらず、in vivoにおいてはE表面から迅速に取り除かれ、血液循環から排除される。この動態の矛盾は、少なくともIgG抗体/dsDNA ICに関して、またその結果を一般化すればおそらくはその他のICに関しても、I因子により媒介される放出に依存するとは思われないプロセスによりin vivo移行反応が促進されることの、有力な手掛かりとなる。
【０００８】
2.3 ヘテロポリマー
補体の存在下で霊長類Eににより媒介されるIgG抗体/dsDNA ICのin vitroおよびin vivo結合ならびにin vivoクリアランスの動態分析に基づき、霊長類Eの免疫粘着機能を用いて血流中の病原体のターゲティングおよび排除のための治療法を開発した(参照によりその開示内容を本明細書に組み入れる、米国特許第5,487,890号および同5,879,679号参照)。特に、標的病原体に特異的なmAbと化学的に架橋されたCR1に特異的なmAbを含んでなる、二重特異性モノクローナル抗体(mAb)複合体(ヘテロポリマー、HP)を用いて霊長類EのCR1上の病原体を結合および固定化した。
【０００９】
109M-1を超える親和性を有するE CR1に特異的な数種のマウスmAbを作製したことから、高親和性病原体特異的mAbを用いて、補体の不在下で細菌およびウイルスをはじめとするどんな標的病原体と結合させることも事実上可能となる。HPにより媒介される結合も、数種のHPの単一の病原体およびE上のクラスターCR1領域との同時連結によって増強することができる。Kuhnら, 1998, J. Immunol. 160:5088; Hahnら, 2001, J. Immunol. 166:1057; Taylorら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3305; Taylorら, 1997, J. Immunol. 159:4035; Reist ら, 1994, Eur. J. Immunol. 24:2018; Taylorら, 1997, J. Immunol. 158:842; Nardinら, 1999, Mol. Immunol. 36:827;およびCornacoffら, 1983, J. Clin. Invest. 71:236参照。
【００１０】
2.4 CR1およびICクリアランスの協調損失
特定の機構に限定する意図はないが、図１は移行反応に関して提案した機構の模式図を示す。移行反応の最初の工程は食細胞上のFc受容体によるEと結合したICの認識と固定を含む。この工程は、HPを介して、C3bオプソニン化ICに関してもEと結合したICに関しても起こるはずである。この結合の後に、アクセプター細胞上で膜結合プロテアーゼによってCR1が切断され(工程2)、次いでCR1をはじめとする全ICが、肝臓のクッパー細胞などのアクセプター細胞のFc受容体を介してインターナライズされる(工程3)協調反応が起こる。
【００１１】
非ヒト霊長類におけるICのE CR1との補体非依存性の結合を研究するための単純なin vivoモデルは、マウス抗CR1mAbに続いてポリクローナルサル抗マウスIgGを静脈注入することで確立できる。アカゲザルの血液循環中への125I標識抗CR1マウスmAb 7G9の注入はmAbとEの迅速な結合を生じたが、1時間にわたって血液循環からはほとんどクリアランスが起こらなかった(図2Aの黒丸)。ポリクローナルサル抗マウスIgG調製物を注入した場合、注入されたサルIgGは既にCR1に配位結合しているマウスmAb 7G9と直接結合し(図2Bの白四角:マウス抗ヒトIgG、黒い菱形:マウスIgGの捕捉)、Eから迅速に除去され、Eの損失なく(すなわち、ヘマトクリットに変化なく)血液循環から排除された。実際に、Eと結合したICのうち90%を超えるもの(125I標識抗CR1ならびにサル抗マウスIgGの双方とも)がEから除去された。第2の非交差反応性抗CR1 mAb HB 8592を用いたウエスタンブロット分析およびRIAによれば、CR1もICが排除されたのと同じ速度でEから除去されることが証明された(図2Aの白丸)。この協調反応を説明するもっともらしい機構はタンパク質分解切断の後、アクセプターマクロファージによる放出されたICの取りこみによってCR1が失われたというものである。実際に、抗CR1 mAbを131Iで標識し、画像化すると、排除されたカウントは主に肝臓に、そして程度は低いが脾臓に局在した。
【００１２】
本願の本節またはその他の節における参照文献の引用は、その参照文献が本発明の先行技術であることを認めるものであると解釈すべきではない。
【発明の開示】
【００１３】
3.  発明の概要
本発明者らは驚くべきことに、ヘテロポリマー複合体のモノクローナル抗体成分に用いるイソ型の選択が、霊長類の赤血球上で発現される補体受容体CR1(CD35)または機能的に類似の分子と結合している病原体または免疫原または抗原を排除する複合体の効果に劇的な影響を及ぼしうることを発見した。より詳しくは、本発明者らは、少なくともその第2のモノクローナル抗体が特定の種におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型、例えばヒトのIgG1またはIgG3であるヘテロポリマー複合体を使用することによって、免疫クリアランス効率が劇的かつ有利に増強されると結論づけるに至った。
【００１４】
本発明は、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された(共有結合した)、哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型が、該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である、ヘテロポリマー複合体に関する。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体がヒト赤血球上の補体受容体(CD1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型がヒトIgG1またはヒトIgG3である。この実施形態の好ましい態様では、第1のモノクローナル抗体がヒトモノクローナル抗体または、ヒト化モノクローナル抗体であり、ヒトIgG1またはヒトIgG3イソ型を有するのが好ましい。第2のモノクローナル抗体がヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である特定の実施形態では、抗体はヒトFc受容体に対してヒトIgG1またはヒトIgG3抗体と少なくとも同等の親和性を有する。第1のモノクローナル抗体が霊長類CR1に特異的なマウスモノクローナル抗体である場合、第2のモノクローナル抗体はイソ型IgG2aを有するマウスモノクローナル抗体ではない。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。第2のモノクローナル抗体が特異的に結合する抗原は、ウイルス、微生物または癌細胞特異的抗原でありうる。
【００１５】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも2種のヘテロポリマー複合体を含んでなり、そのうち少なくとも1種の複合体が第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である、ヘテロポリマーカクテル組成物に向けられる。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。この実施形態の好ましい態様では、各複合体の第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。
【００１６】
もう１つの実施形態では、本発明は、有効量のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することを含んでなる抗原の免疫クリアランス方法に向けられ、該複合体は第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。この方法はさらに、該複合体を少なくとも1つのC3b様受容体部位と、また該抗原と結合させることを含んでもよい。この方法はさらにまた、該結合複合体が該哺乳類の血液循環から排除されるようにすることを含んでもよい。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。
【００１７】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも2種の複合体を含む有効量のヘテロポリマー複合体カクテルを哺乳類へ投与することを含んでなる抗原の免疫クリアランス方法に向けられ、その場合、少なくとも1種の複合体は第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型は該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。この実施形態の好ましい態様では、各複合体の第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。この方法はさらに、前記カクテルを少なくとも1つのC3b様受容体部位と、また該抗原と結合させることを含んでもよい。この方法はさらにまた、該結合カクテルが該哺乳類の血液循環から排除されるようにすることを含んでもよい。
【００１８】
本発明はまた、ヘテロポリマー複合体と結合した、C3b様受容体を発現するフランキングした（franked）細胞の有効量を、哺乳類へ投与することを含んでなり、該複合体が第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である、抗原の免疫クリアランス方法に向けられる。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。この方法はさらにまた、抗原が該哺乳類の血液循環から排除されるようにすることを含んでもよい。
【００１９】
またもう１つの実施形態では、本発明は哺乳類において抗原の存在を検出する方法に向けられ、該方法は、哺乳類から得た、C3b様受容体を発現する細胞を含むサンプルをヘテロポリマー複合体と接触させ(なおこの複合体は、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型は該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である)、サンプル中の抗原の結合を検出することを含んでなる。この実施形態の1つの態様では、検出工程は、細胞を可溶性成分から分離し、その細胞を、抗原に特異的な第2の標識した抗体と接触させることを含む。好ましい実施形態では、この方法は赤血球を含むヒト全血サンプルをヘテロポリマー複合体と接触させ(なおこの複合体は、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、ヒト赤血球上の赤血球補体受容体CR1部位に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である)、抗原の結合を検出することを含んでなる。
【００２０】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、有効量のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することを含んでなる、哺乳類のウイルス感染または微生物感染を治療または予防する方法に向けられ、該複合体は第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型は該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。
【００２１】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、有効量のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することを含んでなる哺乳類の敗血性ショックを治療または予防する方法を提供し、該複合体はリポ多糖、エンドトキシン、またはグラム陰性菌の外壁構成要素に特異的な第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型は該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。
【００２２】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、有効量のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することを含んでなる哺乳類の癌を治療する方法に向けられ、該複合体は癌細胞特異的抗原に特異的な第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型は該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。
【００２３】
前記方法のいずれかに対する別の実施形態では、2種以上のヘテロポリマー複合体が投与され、その複合体中の各々の第1のモノクローナル抗体はC3b様受容体の同一または異なるエピトープに特異的であってよく、各々の第2のモノクローナル抗体は同じ抗原の同じまたは異なるエピトープに特異的であってもよいし、あるいは異なる抗原に特異的であってもよい。
【００２４】
3.1  定義および略語
本明細書において用いられる「ウイルス抗原、微生物抗原、または癌細胞特異的抗原に特異的な抗体」などの表現は、ウイルス抗原、微生物抗原、または癌細胞特異的抗原と免疫特異的に結合し、かつ、その他のポリペプチドとは特異的に結合しない抗体を指す。ウイルス抗原、微生物抗原、または癌細胞特異的抗原と免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原と交差反応性を有する可能性がある。ウイルス抗原、微生物抗原、または癌細胞特異的抗原と免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原と交差反応しないことが好ましい。ウイルス抗原、微生物抗原、または癌細胞特異的抗原と免疫特異的に結合する抗体は、例えば免疫アッセイまたは当業者に公知のその他の技術によって同定することができる。
【００２５】
本明細書において「C3b様受容体」とは、C3b受容体と類似の機能を有する哺乳類の任意の血液循環分子、例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類のCR1(CD35)、または非霊長類哺乳類のH因子を意味するものと理解される(Alexanderら, 2001, J. Biol. Chem. 276:32129)。C3b様受容体の例としては、限定されるものではないが、ヒトまたは非ヒト霊長類のCR1(CD35)、および非霊長類哺乳類のH因子が挙げられる。
【００２６】
本明細書において「断片」とは、ウイルスペプチドもしくはポリペプチド、微生物ペプチドもしくはポリペプチド、あるいはウイルス抗原、微生物抗原、または癌細胞特異的抗原と特異的に結合する抗体のアミノ酸配列の、少なくとも5個連続したアミノ酸残基、少なくとも10個連続したアミノ酸残基、少なくとも15個連続したアミノ酸残基、少なくとも20個連続したアミノ酸残基、少なくとも25個連続したアミノ酸残基、少なくとも40個連続したアミノ酸残基、少なくとも50個連続したアミノ酸残基、少なくとも60個連続したアミノ酸残基、少なくとも70個連続したアミノ酸残基、少なくとも80個連続したアミノ酸残基、少なくとも90個連続したアミノ酸残基、少なくとも100個連続したアミノ酸残基、少なくとも125個連続したアミノ酸残基、少なくとも150個連続したアミノ酸残基、少なくとも175個連続したアミノ酸残基、少なくとも200個連続したアミノ酸残基、または少なくとも250個連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはポリペプチドをさす。
【００２７】
本明細書において「フランキング（franking）」とは、C3b様受容体を発現する細胞、例えば霊長類赤血球と、ヘテロポリマー複合体とのex vivo結合をさす。その後、細胞と結合したヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することができる。細胞はフランキングされた複合体を投与する対象となる個体から得ることができ、または別の好適なドナーから得ることもできる。
【００２８】
本明細書において用いる「融合タンパク質」とは、抗体またはそのフラグメントのアミノ酸配列および異種ポリペプチド(すなわち、非関連ポリペプチド)のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをさす。
【００２９】
本明細書において「宿主細胞」とは、ある核酸分子をトランスフェクトした特定の対象細胞およびこのような細胞の後代または可能性としての後代をさす。このような細胞の後代は、後に続く世代で起こりうる突然変異または環境の影響あるいは核酸分子の宿主ゲノムへの組み込みのために、その核酸分子をトランスフェクトした親細胞と同一でなくなる可能性がある。
【００３０】
本明細書において「免疫クリアランス」とは、抗原と、細胞と結合したヘテロポリマー複合体との結合によって、哺乳類の血液から抗原を取り除き、その結果、本発明のヘテロポリマーまたはヘテロポリマーカクテル組成物を投与した哺乳類の血中の抗原が、血中に同様の濃度の抗原を有するがこの組成物を投与しなかった哺乳類と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%減少することをさす。
【００３１】
本明細書において用いる「単離された」または「精製された」材料とは、実質的に他の混入物を含まない材料のことである。「実質的に含まない」とは、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%純粋(乾燥重量)である調整物を含む。この材料が化学合成によって製造される場合、それは化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、それがその材料の合成に関与する化学前駆体またはその他の化学物質から分離されていることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明のヘテロポリマー複合体は単離または精製されている。
【００３２】
本発明のある実施形態では、「有効量」とは、哺乳類、例えばヒトまたは非ヒト霊長類においてウイルス感染または微生物感染あるいは敗血性ショックに関連する発生率、重篤度、持続時間、および／または症状を軽減する本発明のヘテロポリマーまたはヘテロポリマーカクテル組成物の量である。本発明の特定のその他の実施形態では、「有効量」とは、本発明の組成物を投与した哺乳類においてウイルス力価または微生物力価に、本発明の組成物を投与しない哺乳類または哺乳類群(例えば、2、3、5、10またはそれより多い哺乳類)におけるウイルス力価または微生物力価と比較して、少なくとも2.5%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも25%、少なくとも35%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の減少をもたらす本発明の組成物の量である。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、「有効量」とは、哺乳類、例えばヒトまたは非ヒト霊長類において癌に関連する発生率、重篤度、持続時間、および／または症状を軽減する本発明のヘテロポリマーまたはヘテロポリマーカクテル組成物の量である。特定のその他の実施形態では、「有効量」とは、本発明の組成物を投与した哺乳類において癌の増殖または拡散あるいは血液循環している癌細胞の数を、本発明の組成物を投与しない哺乳類または哺乳類群(例えば、2、3、5、10またはそれより多い哺乳類)における癌の増殖または拡散あるいは血液循環する癌細胞の数と比較して、少なくとも2.5%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも25%、少なくとも35%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%低減させる本発明の組成物の量である。
【００３４】
本明細書で用いられる略語としては、IC、免疫複合体；HCT、ヘマトクリット；NHS、正常ヒト血清；CR1、霊長類E補体受容体；CH50、溶血性補体活性；HP、ヘテロポリマー；CVF、コブラ毒因子；CCS、細胞培養上清；GFP、緑色蛍光タンパク質；C3b、およびC3bi、C3dg、それぞれC3の主要な切断断片およびさらなる分解産物；RT、室温；SATA、N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート；sSMCC、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート、が挙げられる。
【００３５】
4.図面の説明
図１。移行反応に関して提案した機構の模式図。工程１:アクセプター細胞がFc認識を介してE/HP病原体ICと結合する。工程2:アクセプター細胞膜と会合したプロテアーゼがCR1を切断する。工程3：放出されたICおよび結合したCR1がアクセプター細胞にインターナライズされる。Eはこの局部的食作用のプロセスの際、そのまま残る。
【００３６】
図２Ａ〜２Ｂ。in situでE CR1上に形成されたICの血液循環からの排除。125I標識抗CR1 mAb 7G9(0.8mg)を免疫学的にナイーブなアカゲザル(5.3kg)の血液循環中に静注すると、注入した試薬の75%を超える量がEと結合した。61.5分時点(矢印参照)でマウスIgGに対するサル抗体のボーラス注射を行い、血液サンプルを定期的に採取し、さらに80分間処理した。図２Ａ。Eペレットを計数してin vivoで結合したmAb 7G9を測定し、さらにこのペレットを125I標識抗CR1 mAb 7G9およびHB8592でプロービングして(最初はそれぞれEあたり2900および1140エピトープ)、合計のE CR1を求めた。61.5分時点でのサル抗マウスIgG注入後の明らかなCR1エピトープの増加は、Eと結合したサル抗マウスIgGによるマウスmAbプローブの捕捉によるものである。注入した125I標識mAb 7G9と結合した血漿カウント数の90%を超える量が、実験の終了時には血液循環から排除された。図２Ｂ。証明のため、さらにEを数種のその他の試薬でプロービングした:Eと結合したmAb 7G9(ヒツジ抗msIgG)；Eと結合したサル抗マウスIgG(サルIgGと交差反応する、マウス抗huIgG、mAb HB43)；Eと結合したサル抗マウスIgG(マウスIgGは捕捉);Eと結合したC3b(マウス抗C3b mAb 7C12)。
【００３７】
図３Ａ〜３Ｂ。図３Ａ。37℃のインキュベーション培地での、HPまたは血清により媒介される、GFP-PAO1とヒトEとの結合パーセント(平均および標準偏差)の、時間の関数としてのフローサイトメトリー測定。ほとんどの実験において結果は6以上のドナー由来の血清およびEについての独立した測定の平均を表す。E/細菌の比率約50〜1であった。20分 対 60分での、血清により媒介される結合に関する結合%の差(68±13%に対して39±19)は、統計学的に有意であった(P=0.003、両側t検定)。図３Ｂ。HPにより媒介される、PAO1と、EDTA中の抗凝固処理全血中のヒトEまたはサルEいずれかとの結合。E/細菌の比率は500/1以上で、インキュベーションは37℃で15分間実施した。
【００３８】
図４Ａ〜４Ｄ。HPにより媒介される、GFP-PAO1と、CVF処理したカニクイザルのEとの結合。図４Ａ。HPは、24時間前にCVFで処理したカニクイザル(2A、4.2kg)の血液循環中のEとGFP-PAO1との結合を媒介する。このサルのCH50は実験日には0であり、CVF処理前は480であった。GFP-PAO1を4 X 108CFU/kg/hの速度で160分間注入し(総用量:1 X 109CFU/kg)、HP(9H3 X 2H4、140μg/kg)を59分の時点で1分にわたり注入した。初期/最終HCT:23.8/17.3。図４Ｂ。図４Ａと同様であるが、但し、サル(4B、2.7kg)に5 X 108CFU/kg/hのGFP-PAO1を120分にわたり注入した(総用量:1 X 109CFU/kg)。CH50は実験日には17であり、CVF処理前は305であった。60分の時点で、HP(9H3 X 2H4、78μg/kg)を注入した。275分でさらなる9 X 108CFU/kg GFP-PAO1(Bと図示)のボーラス注射を数分にわたり行った。初期/最終HCT:32.5/24.4。図４Ｃ。図４Ａと同様であるが、但し、サル(4C、5.1kg)はHPで処理しなかった。このサルのCH50は実験日には2であり、CVF処理前は232であった。GFP-PAO1を4 X 108CFU/kg/hで120分にわたり連続注入し(総用量:8 X 108CFU/kg)、次いでGFP-PAO1のボーラス(B)注射(8 X 108CFU/kg)を270分の時点で行った。このサルは90 CR1エピトープ/Eを有していた。初期/最終HCT:36.0/24.6。図４Ｄ。図４Ａと同様であるが、但し、細菌注入前のt=0の時点でサル(4D、3.5kg)をHP(9H3 X 2H4、117μg/kg)で処理した。このサルのCH50は実験日には1であり、CVF処理前は394であった。GFP-PAO1を8 X 108CFU/kg/hの速度で1時間注入した(総用量:8 X 108CFU/kg)。初期/最終HCT:43.5/33。サル4A、4B、4C、および4DにおけるIgG抗PAO1の逆数力価はそれぞれ、不検出、>100、14および7であった。全血CFU;SN CFU;およびペレットCFUは、それぞれ全血、血漿上清およびEペレット中で測定されたCFUである。SN粒子およびペレット粒子は、それぞれ血漿上清およびEペレット中で検出された蛍光事象である(後述の「材料および方法」参照)。連続細菌注入時間は図４〜７において水平の両側矢印で示している。
【００３９】
図５Ａ〜５Ｄ。HPにより媒介される、GFP-PAO1と、補体を十分にもつサルのEとの結合。図５Ａ。HPは、GFP-PAO1と、補体を十分にもつカニクイザル(5A、2.3 kg、CH50=136)の血液循環中のEとの結合を媒介する。GFP-PAO1を1 X 109CFU/kg/hの速度で180分間注入し(総用量:3 X 109CFU/kg)、HP(7G9 X 2H4、120μg/kg)を91分の時点で注入した。肝臓の生検を75分の時点で動物から採取したので、ヘマトクリットは報告されない。図５Ｂ。図５Ａと同様であるが、但し、アカゲザル(5B、8.5kg、CH50=420)にGFP-PAO1を1 X 109CFU/kg/hの速度で240分間注入し(総用量:4 X 109CFU/kg)、HP(7G9 X 2H4、127μg/kg)を115分の時点で注入した。最終CH50:364。初期/最終HCT:38/33。図５Ｃ。図５Ａと同様であるが、但し、カニクイザル(5C、3.4kg、CH50=550)にGFP-PAO1を3.5 X 108CFU/kg/hの速度で2時間注入した(総用量:7 X 108CFU/kg)。最終CH50:600。初期/最終HCT:43.4/36.1。図５Ｄ。GFP-PAO1と、カニクイザル(5D、4.8kg、CH50=212)の血液循環中のEとの結合を試験するための抗PAO1 mAb 2H4単独での対照実験。GFP-PAO1を1 X 109CFU/kg/hの速度で210分間注入し(総用量:3.5 X 109CFU/kg)、mAb 2H4(60μg/kg)を91分の時点で注入した後、HP(7G9 X 2H4、120μg/kg)を151分の時点で注入した。最終CH50:177。初期/最終HCT:34/29。4例のサル(5A-5D)におけるIgG抗-PAO1の逆数力価は、それぞれ20、40、33、および20であった。記号の定義については図４参照。
【００４０】
図６Ａ〜６Ｂ。2匹のカニクイザル(6A、3 kg;6B、3.3kg)の血液循環におけるGFP-PAO1の処置(handling)。一方(6B)は細菌を注入する30分前にHP(7G9 X 2H4、125μg/kg)で処理した。サルは双方ともGFP-PAO1を1〜1.2 X 109CFU/kg/hの速度で90分間注入した(総用量:4A、1.5 X 109CFU/kg;4B、1.8 X 109CFU/kg)。HCTおよびCH50に関するデータについては表II参照。2匹のサルにおけるIgG抗PAO1の逆数力価は、それぞれ5および17であった。記号の定義については図４参照。
【００４１】
図７Ａ〜７Ｂ。2匹のカニクイザル(7A、3kg;7B、2.3kg)の血液循環中のTNF-αおよびIL-1βレベルに対するGFP-PAO1注入の影響。なお一方(7B)は細菌注入の開始15分前にHP(7G9 X 2H4、115μg/kg)で処理した。対照サル(HPなし、7A)の血圧を制御するため、15分の時点でフェニレフリンの連続注入を開始した。HPで処理したサルには2時間経つまでフェニレフリンを与えなかった。
【００４２】
図８。雄のスタンプテールマカクザル(9kg、4500 CR1/E)の血液循環からの131I標識ΦX 174のHP媒介性のクリアランス。131I標識ΦX174 (100μg)を０の時点で注入し、HP(480μg)を約50分後に注入した(矢印)。肝臓のカウント数(白四角、右側のY軸)は1分でのアンガー（Anger）カメラ・イメージングからの積分強度に基づくもので、任意の因数を掛けてその他のパラメーターと直接比較できるようにする。131I標識ΦX174の注入5分後の肝臓のカウント数は、自然に排除された数を表すと同時に肝臓内の大量の血液循環による定常レベルを表している。HP注入してすぐに、カウント数の90%を超える量がEと結合し、この結合は血漿結合カウント数の急速な減少を伴った。実験の最後に、カウント数の95%を超える量が血液循環から排除され、このクリアランスは肝臓のカウント数の増加を伴った。注入したカウント数の合計(アンガーカメラ・イメージングに基づく)は9900であり、クリアランスが完了した後、注入したカウント数の50%を超える量が肝臓で明確に同定された。
【００４３】
図９。注入されたFab'X Fab'HPは全IgG抗ΦX174 mAbを続いて注入しない限りクリアランスを媒介しない。０の時点で、100μgの131I標識ΦX174を8.7kgの雌のスタンプテールマカクザルの血液循環中に注入し(4500 CR1/E)、Fab'x Fab'HP(360μg)を48分後に注入した(上の軸、左の矢印)。HPの注入に伴って非常に高いレベルのE結合が起こったが、Eと結合したカウント数は血液循環中から排除されず、肝臓のカウント数(右側のy軸、図８の凡例参照)は一定のままであった。40分後(上の軸、右の矢印)全抗ΦX174 mAb 7B7(500μg)を注入し、5分遅れて、クリアランスが始まり、急速に進行した。全身のバックグラウンド(注入前)は2,000のカウントで、肝臓のバックグラウンドは130のカウント、そして合計31,000のカウントが注入された。
【００４４】
図１０。ΦX174に特異的な抗体を血液循環中に有する5.8kg雄カニクイザルの血液循環中に(０の時点で)注入された131I標識ΦX174の肝臓に対する自発的クリアランス。注入後すぐ、合計カウント数(白丸)の90%を超える量がEと結合した(黒丸)。血漿のカウント(黒三角)は低いままであった。131I標識ΦX174の注入前に、肝臓内総数(右側のy軸、図８の凡例参照)は40未満であり、バックグラウンドカウントの合計数は400であった。注入したカウントの合計数(アンガーカメラ・イメージングに基づく)は約14,000であった。クリアランスが完了した後、注入したカウントの50%を超える量が肝臓で明確に同定された。
【００４５】
図１１。カニクイザルにおける、HPにより媒介されるE結合およびDVのクリアランス。DVを約3 x 109 DV粒子/kg/hの速度で注入し、DV注入が終了した1時間後に、HPのボーラス注射(約200μg/kg)を行った。HP注射して90分〜2時間後、2度目のDV注入を同じ用量を用いて1時間実施した。血漿内の粒子およびEと結合した(細胞)DV粒子を、RT-PCRにより一定の時間間隔で測定した。横棒はDV注入時間を表し、矢印はHP注射を示す。時間０はDV注入前の血液サンプルを表し、これは各実験における検出限界を表す。各点は3回の独立したRNA単離からの少なくとも4回の独立したRT-PCR定量反応から得られた平均値およびSDを表す。HPを抗DVIgGI mAb 9D12(パネルA)または抗DV IgG2a mAb lAID-2(パネルBおよびC)かのいずれかを用いて抗CR1 mAb 7G9を架橋することで調製した。パネルCでは、開始から5時間経った時点でDVを用いてこのサルに3回目の抗原チャレンジを行った。
【００４６】
5. 発明の詳細な説明
5.1 ヘテロポリマー複合体
本発明は、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された(共有結合した)、哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である、ヘテロポリマー複合体を提供する。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。この実施形態の好ましい態様では、第1のモノクローナル抗体はヒトまたはヒト化モノクローナル抗体であり、ヒトIgG1またはヒトIgG3イソ型を有するのが好ましい。第2のモノクローナル抗体がヒト、ヒト化またはキメラ抗体である実施形態では、抗体はヒトFc受容体に対して、ヒトIgG1またはヒトIgG3抗体と少なくとも同等の親和性を有する。第1のモノクローナル抗体が霊長類CR1に特異的なマウスモノクローナル抗体である場合、第2のモノクローナル抗体はイソ型IgG2aを有するマウスモノクローナル抗体ではない。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。第2のモノクローナル抗体が特異的に結合する抗原は、ウイルス抗原、微生物抗原または癌細胞特異的抗原でありうる。
【００４７】
もう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも2種のヘテロポリマー複合体を含んでなり、そのうち少なくとも1種の複合体が第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型が、該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である、ヘテロポリマーカクテル組成物を提供する。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG 1またはヒトIgG3である。この実施形態の好ましい態様では、各複合体の第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。
【００４８】
ヘテロポリマー構築物は既に記載されている(米国特許第5,487,890号参照)。本発明者らは驚くべきことに、ヘテロポリマーのモノクローナル抗体成分として用いるイソ型の選択が、前記複合体のもつ、C3b様受容体を介して細胞と結合している（例えば、CR1を介して霊長類赤血球と結合している）病原体または免疫原または抗原を排除する効果に劇的な影響を及ぼしうることを発見した。より詳しくは、本発明者らは、少なくとも第2のモノクローナル抗体が特定の哺乳類種におけるFc受容体に対して最も高い親和性を有するイソ型（例えばヒトにおける、IgG1またはIgG3イソ型）であるヘテロポリマー複合体の使用によって、免疫クリアランス効率が劇的かつ有利に増強されると結論づけるに至った。
【００４９】
本発明のヘテロポリマーは、C3b様受容体、例えば、霊長類赤血球上のCR1または特定の非霊長類哺乳類上のH因子に特異的なモノクローナル抗体から、また、特定の抗原に特異的であり、Fc受容体と結合するモノクローナル抗体から調製される。モノクローナル抗体はC3b様受容体の結合能を保持しつつ互いに、また、同様に第2のモノクローナル抗体のFc受容体に対する結合能を保持しつつ特定の抗原と、架橋(共有結合)しうるものでなければならない。
【００５０】
モノクローナル抗体は特定の抗原(例えば、CR1、ウイルス抗原、微生物抗原、癌細胞特異的抗原等)に対する抗体の均質な集団である。本発明で有用なモノクローナル抗体(mAb)は、培養中の継代細胞株により抗体分子の産生を提供するような当技術分野で公知の任意の技術を用いて調製してもよい。これらには、限定されるものではないが、初めはKohlerおよびMilstein (1975, Nature 256,495-497)により記載されたハイブリドーマ技術、より最近ではヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら, 1983, Immunology Today 4: 72)、およびEBV-ハイブリドーマ技術(Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が挙げられる。本発明で用いるmAbを産生するハイブリドーマはin vitroまたはin vivoで培養しうる。
【００５１】
本発明の組成物および方法に用いうるモノクローナル抗体としては、限定されるものではないが、ヒトモノクローナル抗体またはキメラヒト-マウス(または別の種の)モノクローナル抗体が挙げられる。ヒトモノクローナル抗体は、当技術分野で公知の多数の技術のうちのいずれによって作出してもよい(例えば、Tengら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 7308-7312; Kozborら, 1983, Immunology Today 4, 72-79;および Olssonら, 1982, Meth. Enzymol. 92, 3-16)。
【００５２】
さらに、ヒト部分および非ヒト部分の双方を含んでなるキメラであるヒト化モノクローナル抗体などの組換え抗体(これらは標準的な組換えDNA技術を用いて作出できる)も本発明のヘテロポリマー複合体に用いられる。キメラ抗体とは、マウスモノクローナル由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である(例えば、Cabillyら, 米国特許第4,816,567号;およびBossら, 米国特許第4,816,397号参照、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れる)。ヒト化抗体とは、非ヒト種由来の1以上の相補性決定領域(CDR)とヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種に由来する抗体分子である(例えば、全開示内容を参照により本明細書に組み入れる、Queen、米国特許第5,585,089号参照)。このようなキメラヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えDNA技術によって、例えば、PCT公開公報WO 87/02671;欧州特許出願第184,187号;欧州特許出願第171,496号;欧州特許出願第173,494号;PCT公開公報WO 86/01533;米国特許第4,816,567号;欧州特許出願第125,023号; Betterら, 1988, Science 240:1041-1043; Liuら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liuら, 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sunら, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimuraら, 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Woodら, 1985, Nature 314:446-449;およびShawら, 1988, J. Natl. Cancer Inst 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oiら, 1986, Bio/Techniques 4:214, 米国特許第5,225,539号; Jonesら, 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyanら (1988) Science 239:1534;およびBeidlerら, 1988, J. Immunol. 141:4053-4060、なおこれら各々の全開示内容は参照により本明細書に組み入れる)に記載されている方法を用いて作製することができる。
【００５３】
ヒト患者の治療的処置には完全なヒト抗体が特に望ましい。このような抗体は、内因性の免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を発現できないが、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子は発現できるトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全体または一部を用いて標準的な様式で免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は従来のハイブリドーマ技術を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスが持つヒト免疫グロブリンのトランスジーンは、B細胞の分化中に再配列され、続いてクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。従って、このような技術を用いて、治療上有用なIgG、IgA、IgM、およびIgE抗体を作製することができる。ヒト抗体を作製するためのこのような技術の概要については、LonbergおよびHuszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93)参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのこのような技術、およびこのような抗体を作製するためのプロトコールの詳細な検討については、例えば、米国特許第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,569,825号;同第5,661,016号;および同第5,545,806号を参照されたい(なお、これらの各々の全開示内容は参照により本明細書に組み入れる)。さらに、Abgenix, Inc. (Freemont, CA)およびGenpharm(San Jose, CA)などの企業では、上記のものと類似の技術を用いて選択された抗原に対するヒト抗体を提供することを試みている。
【００５４】
選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は「ガイドセレクション」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて同じエピトープを認識する完全なヒト抗体の選択をガイドする(Jespersら (1994) Bio/technology 12:899-903)。
【００５５】
このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、およびIgDをはじめとするいずれの免疫グロブリンクラスのものであっても、またそのいずれのサブクラスのものであってもよい。抗体のイソ型は、ある種内での重鎖クラスおよびサブクラスの各々、ならびに軽鎖タイプおよびサブタイプの各々を区別する定常領域決定基によって定められる。各イソ型は別個の定常領域遺伝子によってコードされ、種内の全メンバーが同じ定常領域遺伝子を持つ。種内では、正常な各個体はその血清中に全てのイソ型を発現する。異なる種は異なる不変領域遺伝子を受け継ぐので、異なるイソ型を発現する。従って、ある種由来の抗体を別の種に注射する場合、そのイソ型決定基が外来のものとして認識され、外来抗体上のイソ型決定基に対して抗体応答が誘発される。
【００５６】
血清中で最も豊富なイソ型である免疫グロブリンG(IgG)は血清免疫グロブリン全体の約80%を占める。IgG分子は2種類のγ重鎖と2種類のκまたはλ軽鎖からなるモノマーである。ヒトには4種のIgGサブクラスがあり、それらの血清濃度が低くなっていく順に番号が付けられている:IgG1(9mg/ml)、IgG2(3mg/ml)、IgG3(1mg/ml)、およびIgG4(0.5mg/ml)。この4種のサブクラスは、そのDNA配列が95%相同な異なる生殖細胞系CH遺伝子によってコードされている。これらのサブクラスを互いに区別する構造上の特徴は、ヒンジ領域の大きさと重鎖間の分子内ジスルフィド結合の数および位置である。IgGのサブクラス間のアミノ酸の僅かな違いが分子の生物活性を左右する。IgG1、IgG3、およびIgG4は容易に胎盤を通過して、発達中の胎児の保護に重要な役割を果たす。いくつかのIgGサブクラスは補体系のアクチベーターであるが、それらの効力はさまざまである。IgG3サブクラスは最も効率的な補体アクチベーターであり、その次がIgG1である。IgG2は補体活性では比較的効率が悪く、IgG4は補体系を全く活性化することができない。また、IgGは食細胞上のFc受容体と結合することによってオプソニンとしても機能するが、この機能にもサブクラスによる違いがある。ヒトでは、IgG1およびIgG3はFc受容体と高い親和性で結合する。IgG4は中程度の親和性を有し、IgG2は親和性が極めて低い。抗体およびそのサブタイプおよび分類に関する総説としては、一般に、Janis Kuby, Immunology. 1992, W. H. Freeman & Company, New York参照。
【００５７】
さらに、分子生物学技術、例えばReffら, 1994, Blood 83(2):435に記載のものなどを用いて抗体のイソ型を遺伝子工学的に作製することもできる。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態では、第2のモノクローナル抗体のイソ型は、ヒトIgG1およびヒトIgG3である。もう1つの好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体および第2のモノクローナル抗体の両イソ型は、ヒトIgG1およびヒトIgG3である。
【００５９】
本発明はさらに、本発明のヘテロポリマー複合体を調製するため、2種の異なる可変領域を持ち、かつ、2つの異なる標的と結合する抗体である、二重特異性抗体の使用を含む。これら二重特異性抗体は、ヘテロポリマー複合体が2種のモノクローナル抗体から構成され、その抗体が二重特異性抗体でありうるという点で本発明の二重特異性ヘテロポリマー複合体とは区別される。本発明の一実施形態によると、ヘテロポリマー複合体は、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、C3b様受容体上の2つの異なる部位に特異的な第1の二重特異性モノクローナル抗体を含んでなり、その第2のモノクローナル抗体のイソ型はFc受容体に対して最も高い親和性を有するイソ型である。本発明のもう１つの実施形態では、ヘテロポリマー複合体は、特定の抗原上の2つの部位またはエピトープに特異的な、あるいは2つの抗原に特異的な第2の二重特異性モノクローナル抗体と化学的に架橋された、C3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、その第2の二重特異性モノクローナル抗体のイソ型はFc受容体に対して最も高い親和性を有するイソ型、例えば、ヒトではIgG1またはIgG3である。さらにもう１つの実施形態では、ヘテロポリマー複合体は、特定の抗原上の2つの部位またはエピトープに特異的な、あるいは2つの抗原に特異的な第2の二重特異性モノクローナル抗体と化学的に架橋された、C3b様受容体上の2つの異なる部位に特異的な第1の二重特異性モノクローナル抗体を含んでなり、その第2の二重特異性モノクローナル抗体のイソ型は特定の哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い親和性を有するイソ型である。
【００６０】
二重特異性抗体の作製方法は当技術分野で公知である。全長二重特異性抗体の従来の製造は、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現(ここで、この2鎖は異なる特異性を有する)に基づくものである(Milsteinら, 1983, Nature 305:537-539)。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組合せのために、これらのハイブリドーマ(クアッドローマ)は10種の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、そのうち一つだけが正しい二重特異性構造を持つ。この正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー工程でなされるが、やはり煩雑で産物の収量も低い。
【００６１】
類似の手順が1993年5月13日公開のPCT公報WO 93/08829およびTrauneckerら, 1991, EMBO J. 10:3655-3659に開示されている。
【００６２】
また別のより好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。これは、ヒンジ、CH2およびCH3領域の少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合であることが好ましい。少なくとも1つの融合物に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第1の重鎖定常領域(CH1)を有するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および、所望により、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別個の発現ベクターに挿入し、好適な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、この構築物に用いられる3種のポリペプチド鎖の不等比率が最適の収量をもたらす場合の実施形態において、3種のポリペプチド断片の相互比率を調整する点で大きな柔軟性が得られる。しかしながら、少なくとも2種のポリペプチド鎖を等しい比率で発現させると高収量がもたらされる場合、または比率が特に重要でない場合には、1つの発現ベクターに2種または3種全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することができる。
【００６３】
このアプローチの好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方の腕にある第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、もう一方の腕にあるハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第2の結合特異性を与える)から構成される。二重特異性分子の半分だけにある免疫グロブリン軽鎖の存在が容易な分離方法を提供するので、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を、この非対称構造が容易にすることが分かった。このアプローチは、全開示内容を参照により本明細書に組み入れる、1994年3月3日公開のPCT公報WO 94/04690に開示されている。二重特異性抗体の作製に関してさらに詳しくは、例えば、Sureshら, Methods in Enzymology, 1986, 121:210参照。
【００６４】
本発明はまた、その第1のモノクローナル抗体が、C3b様受容体上の部位に特異的な抗体、あるいはその抗体の機能的活性を示すフラグメント、誘導体または類似体である、ヘテロポリマー複合体を提供する。機能的活性とは、断片、誘導体または類似体の由来する抗体が認識するのと同じ抗原を認識する抗-抗イディオタイプ抗体を、その断片、誘導体または類似体が誘起できることを意味する。具体的には、好ましい実施形態では、免疫グロブリン分子のイディオタイプの抗原性は、C末端からC3b様受容体を特異的に認識するCDR配列までのフレームワークおよびCDR配列の欠失によって、増強されうる。どのCDR配列がC3b様受容体と結合するかを決定するには、CDR配列を含む合成ペプチドを、当技術分野で公知のいずれかの結合アッセイ法(例えば、BIAコアアッセイ)によりC3b様受容体との結合アッセイに用いればよい。
【００６５】
本発明のその他の実施形態としては、ヘテロポリマー複合体であって、それに含まれるC3b様受容体（例えばCR1）に特異的な抗体の断片として、限定されるものではないが、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のCH1ドメインを含み抗体分子のペプシン消化によって生成されうるF(ab')2フラグメント、およびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されうるFabフラグメントが挙げられるような前記複合体が包含される。本発明はまた、C3b様受容体に特異的な抗体の重鎖および軽鎖二量体、またはFvsもしくは1本鎖抗体(SCA)などのその最小フラグメントも提供する(例えば、米国特許第4,946,778号; Bird, 1988, Science 242:423-42; Hustonら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;およびWardら, 1989, Nature 334:544-54に記載の通り)。
【００６６】
他の実施形態では、本発明のヘテロポリマー複合体は抗体の融合タンパク質(またはその機能的活性を示す断片)を用いて調製する。例えば、第1の、第2の、または双方のモノクローナル抗体を共有結合(例えばペプチド結合)を介して、N末端またはC末端のいずれかで、抗体でない別のタンパク質のアミノ酸配列(またはその一部、好ましくはそのタンパク質の少なくとも10、20、または50のアミノ酸部分)と、Fc受容体の結合親和性に影響しないように融合させる。抗体またはその断片は不変ドメインのN末端で他方のタンパク質と共有結合させるのが好ましい。
【００６７】
ヘテロポリマー複合体抗体としては、任意の種類の分子の共有結合(ただし、このような共有結合は、抗体がそれと特異的なエピトープと免疫特異的に結合するのを妨げるものではない)によって、さらに改変された類似体および誘導体が挙げられる。例えば、限定するものではないが、抗体の誘導体および類似体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、PEG化、リン酸化、アミド化、公知の保護基/封鎖基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との結合などにより、さらに改変されたものが挙げられる。限定されるものではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などをはじめとする公知の技術によって、多数の化学修飾のうちいずれを行ってもよい。さらに、類似体または誘導体は1以上の非古典的アミノ酸を含んでもよい。
【００６８】
本発明のヘテロポリマー複合体抗体としては、Fc受容体と相互作用するアミノ酸残基に修飾(例えば、置換、欠失または付加)を有する抗体が挙げられる。特に、本発明の抗体としては、FcドメインとFc受容体との間の相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基に修飾を有する抗体が挙げられる(例えば、全開示内容を参照により本明細書に組み入れる、PCT公報WO 97/34631参照)。
【００６９】
抗体の作製において、所望の抗体のスクリーニングは当技術分野で公知の技術(例えば、酵素結合免疫吸着検定法、すなわちELISA)によって行うことができる。例えば、病原体タンパク質の特異的ドメインを認識する抗体を選択するため、このようなドメインを含む断片と結合する産物に対して作製されたハイブリドーマをアッセイしてもよい。
【００７０】
第1の病原体と特異的に結合するが異なる病原体とは特異的に結合しない抗体を選択するには、第1の病原体と明確に結合し、かつ第2の病原体と結合しないことに基づいて選択すればよい。
【００７１】
5.2  抗原
本発明のヘテロポリマー複合体を調製するための第2のモノクローナル抗体を得るためには、任意のウイルス抗原、微生物抗原または癌細胞特異的抗原を用いればよい。ヒトに投与するウイルス抗原または微生物抗原に免疫特異的な抗体はヒト化またはヒトモノクローナル抗体であることが好ましい。第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3であるのがより好ましい。本明細書において、「ウイルス抗原」には、限定されるものではないが、免疫応答を誘起できる任意のウイルスペプチド、ポリペプチド、タンパク質を含む。ウイルス抗原の例示としては、レトロウイルス(例えば、I型およびII型ヒトTリンパ増殖性ウイルス(HTLV)ならびにヒト免疫不全ウイルス(HIV))、I型およびII型ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、エプスタイン-バーウイルスおよびサイトメガロウイルス)、アレナウイルス(例えば、ラッサ熱ウイルス)、パルボウイルス、パラミクソウイルス(例えば、麻疹ウイルス、ヒトRS(呼吸器合胞体)ウイルスおよびニューモウイルス)、アルボウイルス、アデノウイルス、ブニヤウイルス(例えば、ハンタウイルス)、コロナウイルス、フィロウイルス(例えば、エボラウイルス)、フラビウイルス(例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)、黄熱病ウイルス、および日本脳炎ウイルス)、ヘパドナウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス(HBV))、オルトミクソウイルス(例えば、センダイウイルス、インフルエンザウイルスA、BおよびC)、パポバウイルス(例えば、パピローマウイルス)、ピコルナウイルス(例えば、ライノウイルス、エンテロウイルス、およびA型肝炎ウイルス)、ポックスウイルス、レオウイルス(例えば、ロタウイルス)、トガウイルス(例えば、風疹ウイルス)、およびラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス)の抗原である。具体的なウイルス抗原としては、HIV gp120、HIV nef、RSV F糖タンパク質、インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼ、インフルエンザウイルス血球凝集素、HTLV tax、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質(例えば、gB、gC、gDおよびgE)およびB型肝炎表面抗原が挙げられる。
【００７２】
本明細書において、「微生物抗原」としては、限定されるものではないが、免疫応答を誘起できる任意の微生物ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖類、多糖類、または脂質分子(例えば、LPSおよび莢膜多糖5/8をはじめとする、微生物、真菌、病原性原生動物、または酵母のポリペプチド)が挙げられる。さらなる例となる微生物抗原としては、連鎖球菌種(Streptococcus sp.)、ナイセリア種(Neisseria sp.)、コリネバクテリア種(Corynebacterium sp.)、クロストリジウム種(Clostridium sp.)、ヘモフィルス種(Haemophilus sp.)、クレブシエラ種(Klebsiella sp.)、ブドウ球菌種(Staphylococcus sp.)、ビブリオ種(Vibrio sp.)、エシェリキア種(Escherichia sp.)、シュードモナス種(Pseudomonas sp.)、カンピロバクター(ビブリオ)種(Campylobacter (Vibrio) sp.)、アエロモナス種(Aeromonas sp.)、バチルス種(Bacillus sp.)、エドワードシエラ種(Edwardsiella sp.)、エルシニア種(Yersinia sp.)、赤痢菌種(Shigella sp.)、サルモネラ種(Salmonella sp.）、トレポネーマ種(Treponema sp.)、ボレリア種(Borrelia sp.)、レプトスピラ種(Leptospira sp.)、マイコバクテリウム種(Mycobacterium sp.)、トキソプラズマ種(Toxoplasma sp.)、ニューモシスティス種(Pneumocystis sp.)、フランシセラ種(Francisella sp.)、ブルセラ種(Brucella sp.)、マイコプラズマ種(Mycoplasma sp.)、リケッチア種(Rickettsia sp.)、クラミジア種(Chlamydia sp.)、またはヘリコバクター種(Helicobacter sp.)の抗原である。微生物種の例としては、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、淋菌(Neisseria gonorrhoea)、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、破傷風菌(Clostridium tetani)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、臭鼻菌(Klebsiella ozaenae)、鼻硬腫菌(Klebsiella rhinoscleromotis)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、大腸菌(Escherichia coli)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、カンピロバクター(ビブリオ)ジェジュニ(Campylobacter (Vibrio) jejuni)、カンピロバクター(ビブリオ)フィタス(Campylobacter (Vibrio) fetus)、アエロモナス・ヒドロフィラ(Aeromonas hydrophila)、セレウス菌(Bacillus cereus)、エドワードシエラ・タルダ(Edwardsiella tarda)、エンテロコリチカ菌(Yersinia enterocolitica)、ペスト菌(Yersinia pestis)、偽結核菌(Yersinia pseudotuberculosis)、志賀菌(Shigella dysenteriae)、フレクスナー菌(Shigella flexneri)、ソンネ菌(Shigella sonnei)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、フランベジアトレポメーマ(Treponema pertenue)、ピンタフランベジア(Treponema carateneum)、バンサンボレリア(Borrelia vincentii)、ボレリア・ブルグドルフェリー(Borrelia burgdorferi)、ワイル病菌（Leptospira icterohemorrhagiae）、ヒト型結核菌(Mycobacterium tuberoculosis)、トキソプラズマ(Toxoplasma gondii)、ニューモシスティス・カリニ(pneumocystis carinii)、野兎病菌(Francisella、tularensis)、ウシ流産菌(Brucella adortus)、ブタ流産菌(Brucella suis)、マルタ熱菌(Brucella melitensis)、マイコプラズマ種（Mycoplasma spp.）、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazeki)、恙虫病リケッチア(Rickettsia tsutsugumushi)、クラミジア種（Chlamydia spp.）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ブラストミセス・デルマ���チジス(Blastomyces dermatitidis)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformanas)、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatus)、赤痢アメーバ(Entomoeba histolytica)、口腔トリコモナス(Trichomonas tenas)、腸トリコモナス(Trichomonas hominis)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)、ガンビアトリパノソーマ(Trypanosoma gambiense)、ローデシアトリパノソーマ(Trypanosoma rhodesiense)、クルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)、ドノバン・リーシュマニア(Leishmania donovani)、熱帯リーシュマニア(Leishmania tropica)、ブラジルリーシュマニア(Leishmania braziliensis)、ニューモシスティス・ニューモニア(Pneumocystis pneumonia)、三日熱マラリア病原虫(Plasmodium vivax)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、四日熱マラリア病原虫(Plasmodium malaria)、蟯虫(Enterobius vermicularis)、鞭虫(Trichuris trichiura)、ヒト回虫(Ascaris lumbricoides)、旋毛虫(Trichinella spiralis)、糞線虫(Strongyloides stercoralis)、日本住血吸虫(Schistosoma japonicum)、マンソン住血吸虫(Schistosoma mansoni)、ビルハルツ住血吸虫(Schistosoma haematobium)、および鉤虫の抗原である。
【００７３】
本明細書において、「癌細胞特異的抗原」とは、非癌細胞、好ましくは正常細胞と比較して癌細胞で選択的または示差的に発現する抗原(例えば、タンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または糖脂質)をさす。癌細胞特異的抗原の例としては、限定されるものではないが、不適切にグリコシル化されたタンパク質または脂質、CD20、Her-2、およびPSMAが挙げられる。また、癌細胞特異的抗原には、癌細胞と結合したヒト補体成分、例えば癌細胞と結合したC3bまたはC3bi(C3dまたはC3gは異なる)が挙げられる。
【００７４】
本発明に有用なCR1特異的モノクローナル抗体の例示としては、限定されるものではないが、1B4、HB8592、および7G9が挙げられる。HB8592および1B4は、Taylorら, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88:3305-3309およびReistら, 1993, Eur. J. Immunol. 23:3021-3027に開示されている。モノクローナル抗体7G9は本発明者らの研究室で開発されたmAbであり、Reinagel and Taylor, 2000, J. Immunol. 164:1977にも開示されている。CR1に対するその他の入手可能かつ有用なmAbとしては、3D9、E-11、57F、およびYZ1が挙げられる(Hoggら, 1984, Eur. J. Immunol. 14:236; O'Sheaら, 1985, J. Immunol. 134:2580; Nussenzweig, 1982, J. Exp. Med. 151:1427-1438;およびFearon, 1985, J. Immunol. 134:185参照)。CR1に特異的ないずれのモノクローナル抗体も本発明のヘテロポリマーに使用することができる。抗C3b様受容体抗体の作製に関する方法例については、国際特許出願公開公報WO 01/80883も参照。
【００７５】
本発明において有用な抗原に特異的なモノクローナル抗体の例示としては、限定されるものではないが、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染患者の治療用のヒト化抗RSVモノクローナル抗体であるシナジス(Synagis(登録商標))(MedImmune, Inc., MD);HIV感染の治療用のCD4融合抗体であるPRO542(Progenics);B型肝炎ウイルスの治療用のヒト抗体であるOstavir(Protein Design Labs, Inc., CA);サイトメガロウイルス(CMV)の治療用のヒト化IgG1抗体であるProtovir(Protein Design Labs, Inc., CA);および抗LPS抗体が挙げられる。
【００７６】
癌の治療のために利用可能な癌細胞特異的抗体の例示としては、限定されるものではないが、転移性乳癌患者の治療用のヒト化抗HER2モノクローナル抗体であるHerceptin(登録商標)(トラツヅマブ(Trastuzumab); Genetech, CA);非ホジキンリンパ腫患者の治療用のキメラ抗CD20モノクローナル抗体であるRetuxan(登録商標)(リツキシマブ(rituximab); Genetech);頭頸部癌の治療用のキメラIgG抗体であるIMC-C225(Imclone Systems Inc., NY);肉腫の治療用のヒト化抗体であるVitaxin(MedImmune. Inc., MD);慢性リンパ球性白血病(CLL)の治療用のヒト化IgG1抗体であるCampath I/H(Leukosite, MA);急性骨髄性白血病(AML)の治療用のヒト化IgG抗体のSmart M195(Protein Design Labs, Inc., CA);非ホジキンリンパ腫の治療用のヒト化IgG抗体であるLymphoCide(Immunomedics, Inc., NJ);および非ホジキンリンパ腫の治療用のヒト化抗体であるSmart ID10(Protein Design Labs, Inc., CA)が挙げられる。
【００７７】
5.3  架橋
ひとたびモノクローナル抗体が作製されれば、それらを架橋してヘテロポリマー複合体が形成される。架橋の化学およびこのような目的に有効な試薬は当技術分野で周知である。モノクローナル抗体をコンジュゲートさせるのに用いる架橋試薬の性質は本発明では限定されない。a)抗体の活性(結合親和性)が保持され、かつ、b)Fc受容体による、少なくとも第2のモノクローナル抗体のFc部分の結合に悪影響を与えない限り、いずれの架橋試薬を用いてもよい。
【００７８】
モノクローナル抗体の有効な架橋の例は、室温で30分間リン酸ナトリウムバッファー中にて過ヨウ素酸ナトリウムでFcを酸化した後、第2の抗体とともに4℃で一晩インキュベートするものである。このコンジュゲート化はまた、一方または双方のモノクローナル抗体をスルホスクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミドヘキサノエート(suffosuccinimidyl 6-[3-(2-pyridyldithio)propionamidel hexanoate)(スルホ-LC-SPDP、Pierce)を用いて室温で18時間誘導体化することによって行ってもよい。この手順に関する詳細については、例えば、Karpovskyら, 1984, J. Exp. Med. 160:1686-1701; Perezら, 1985, Nature 316:354-356またはTitusら, 1987, Journal of Immunology 139:3153-3158参照。その他の手順は当業者に公知であり、Segalら, 1995, Curr. Prot. Immunol. 2:131に示されている手順が挙げられる。コンジュゲートはまた、次いで共有結合を形成するような種々の架橋試薬を用いてFc断片を誘導化することにより調製してもよい。この反応の例は、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC、Pierce)を用いるFc断片の誘導体化であり、第2のモノクローナル抗体がN-スクシンイミジル S-アセチルチオアセテート(SATA)でチオール化される。誘導体化した成分を架橋剤から分離精製し、室温で一緒にして1時間にわたって架橋させる。アルデヒド、イミド、シアノ、ハロゲン、カルボキシル、活性化カルボキシル、無水物およびマレイミド官能基を含んでなるその他の架橋試薬は当業者に公知であり、モノクローナル抗体のコンジュゲート化に用いうる。架橋試薬の選択は、当然、モノクローナル抗体の性質に応じて異なる。上記の架橋試薬はタンパク質-タンパク質のコンジュゲート化に有効である。もしコンジュゲート化させる化合物が炭水化物であるかまたは炭水化物部分を有していれば、ABH、M2C2H、MPBHおよびPDPHなどの異種二価性架橋試薬がモノクローナル抗体とのコンジュゲート化に有用である(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)。タンパク質および炭水化物をコンジュゲート化させる別法がBrumeanuらにより開示されている(Genetic Engineering News October 1, 1995, p 16)。
【００７９】
上記の架橋試薬のいずれにおいても、誘導体化された化合物の架橋試薬からの分離精製が重要である。実質的に非コンジュゲート化反応物を含まない最終コンジュゲートの精製もまた重要である。精製は、コンジュゲートのどちらかの成分の特性に基づくアフィニティー、ゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーにより行える。最初のアフィニティー精製工程でFcおよびFc-化合物コンジュゲートを保持するためタンパク質Aセファロースを用い、その後Fcコンジュゲートの質量、大きさまたは電荷に基づくゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーを行う方法が特に好ましい。この精製スキームの初期工程により、コンジュゲートが本発明の必須要件であるFc受容体と確実に結合するようになる。
【００８０】
5.4  ヘテロポリマー複合体の治療および予防用途
もう１つの実施形態では、本発明は、有効量のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することを含んでなる、抗原の免疫クリアランス方法に向けられ、この場合、該複合体は、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型は、該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。この方法はさらに、該複合体を少なくとも1つのC3b様受容体部位と、また前記抗原と結合させることを含んでもよい。この方法はさらにまた、該結合複合体が該哺乳類の血液循環から排除されるようにすることを含んでもよい。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。
【００８１】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、少なくとも2種の複合体を含む有効量のヘテロポリマー複合体カクテルを哺乳類へ投与することを含んでなる、抗原の免疫クリアランス方法に向けられ、この場合、少なくとも1種の複合体は第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型が、該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。この実施形態の好ましい態様では、各複合体における第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。この方法はさらに、該カクテルを少なくとも1つのC3b様受容体部位と、また前記抗原と結合させることを含んでもよい。この方法はさらにまた、該結合カクテルが該哺乳類の血液循環から排除されるようにすることを含んでもよい。
【００８２】
本発明はまた、ヘテロポリマー複合体と結合したC3b様受容体を発現する、有効量のフランキングされた(franked)細胞を哺乳類へ投与することを含んでなる、抗原の免疫クリアランス方法に向けられ、この場合、該複合体は第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型が、該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、 第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG 1またはヒトIgG3である。この方法はさらにまた、抗原が該哺乳類の血液循環から排除されるようにすることを含んでもよい。
【００８３】
またもう１つの実施形態では、本発明は哺乳類における抗原の存在を検出する方法に向けられ、この場合、該方法は、哺乳類から得た、C3b様受容体を発現する細胞を含むサンプルをヘテロポリマー複合体と接触させ(なおこの複合体は、第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である）、サンプル中の抗原の結合を検出することを含んでなる。この実施形態の一態様では、検出工程は細胞を可溶性成分から分離し、細胞と、抗原に特異的な標識した第2の抗体とを接触させることを含んでなる。好ましい実施形態では、この方法は、赤血球を含むヒト全血サンプルをヘテロポリマー複合体と接触させ(なおこの複合体は第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、ヒト赤血球上の赤血球補体受容体CR1部位に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型がヒトIgG1またはヒトIgG3である)、抗原の結合を検出することを含んでなる。
【００８４】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、有効量のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することを含んでなる、哺乳類におけるウイルス感染または微生物感染を治療または予防する方法に向けられ、この場合、該複合体は第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナルのイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。
【００８５】
本発明に従って治療または予防できるウイルス感染の例示としては、限定されるものではないが、レトロウイルス(例えば、I型およびII型ヒトTリンパ球向性ウイルス(HTLV)ならびにヒト免疫不全ウイルス(HIV))、I型およびII型ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、エプスタイン-バーウイルスおよびサイトメガロウイルス)、アレナウイルス(例えば、ラッサ熱ウイルス)、パルボウイルス、パラミクソウイルス(例えば、麻疹ウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルスおよびニューモウイルス)、アルボウイルス、アデノウイルス、ブニヤウイルス(例えば、ハンタウイルス)、コロナウイルス、フィロウイルス(例えば、エボラウイルス)、フラビウイルス(例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)、黄熱病ウイルス、および日本脳炎ウイルス)、ヘパドナウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス(HBV))、オルトミクソウイルス(例えば、センダイウイルス、インフルエンザウイルスA、B、およびC)、パポバウイルス(例えば、パピローマウイルス)、ピコルナウイルス(例えば、ライノウイルス、エンテロウイルス、およびA型肝炎ウイルス)、ポックスウイルス、レオウイルス(例えば、ロタウイルス)、トガウイルス(例えば、風疹ウイルス)、およびラブドウイルス(例えば、狂犬病ウイルス)によって引き起こされるウイルス感染が挙げられる。ウイルス感染の治療および／または予防としては、限定されるものではないが、該感染に関連する1以上の症状の緩和、ウイルス複製の阻害、低下または抑制、および／または免疫応答の増強が挙げられる。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明のヘテロポリマー複合体またはヘテロポリマーカクテル組成物を哺乳類へ投与して、ウイルス感染に関連する1以上の症状、あるいはウイルス感染から直接または間接的に生じる疾病または障害を改善させる。具体的な実施形態では、本発明の組成物はAIDSに関連する1以上の症状を改善させるためにヒトへ投与される。特定のその他の実施形態では、本発明の組成物はヒトまたは非ヒト霊長類でのウイルスの力価を減少させるために投与される。
【００８７】
本発明のヘテロポリマー複合体またはヘテロポリマーカクテルは単独で投与してもよいし、別の種類の抗ウイルス薬と組み合わせて投与してもよい。抗ウイルス薬の例としては、限定されるものではないが、サイトカイン(例えば、IFN-α、IFN-β、およびIFN-γ);逆転写酵素阻害剤(例えば、AZT、3TC、D4T、ddC、ddI、d4T、3TC、アデフォビル、エファビィレンツ、デラビルジン、ネビラピン、アバカビル、およびその他のジデオキシヌクレオシドまたはジデオキシフルオロヌクレオシド);リバビリンなどのウイルスmRNAキャッピング阻害剤;HIVプロテアーゼ阻害剤などのプロテアーゼ阻害剤(例えば、アンプレナビル、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビル、およびサキナビル);アムホテリシンB;糖タンパク質プロセシング阻害剤としてのカスタノスペルミン;インフルエンザウイルス・ノイラミニダーゼ阻害剤などのノイラミニダーゼ阻害剤(例えば、ザナミビルおよびオセルタミビル);トポイソメラーゼI 阻害剤(例えば、カンプトテシンおよびその類似体);アマンタジン;およびリマンタジンが挙げられる。このような抗ウイルス薬は、本発明のヘテロポリマーまたはヘテロポリマーカクテル組成物を投与する前(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間前)、または投与した後(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間後)、または投与と同時に、ウイルス感染の予防または治療のために、哺乳類、好ましくは非ヒト霊長類、より好ましくはヒトへ投与しうる。
【００８８】
本発明に従って治療または予防できる微生物感染の例示としては、限定されるものではないが、酵母感染、真菌感染、原虫感染および細菌感染が挙げられる。微生物感染を引き起こす生物の例としては、限定されるものではないが、化膿連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、淋菌、髄膜炎菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、インフルエンザ菌、肺炎桿菌、臭鼻菌、鼻硬腫菌、黄色ブドウ球菌、コレラ菌、大腸菌、緑膿菌、カンピロバクター(ビブリオ)ジェジュニ、アエロモナス・ヒドロフィラ、セレウス菌、エドワードシエラ・タルダ、エルシニア・エンテロコリチカ、ペスト菌、偽結核菌、志賀菌、フレクスナー菌、ソンネ菌、ネズミチフス菌、梅毒トレポネーマ、フランベジアトレポメーマ、ピンタフランベジア、バンサンボレリア、ボレリア・ブルグドルフェリー、ワイル病菌、ヒト型結核菌、トキソプラズマ・ゴンディ、ニューモシスティス・カリニ、野兎病菌、ウシ流産菌、ブタ流産菌、マルタ熱菌、マイコプラズマ種、発疹チフス・リケッチア、恙虫病・リケッチア、クラミジア種、ヘリコバクター・ピロリ、コクシジオイデス・イミティス、アスペルギルス・フミガーツス、カンジダ・アルビカンス、ブラストミセス・デルマチチジス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、赤痢アメーバ、口腔トリコモナス、腸トリコモナス、膣トリコモナス、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、ドノバン・リーシュマニア、熱帯リーシュマニア、ブラジルリーシュマニア、ニューモシスティス・ニューモニア、三日熱マラリア病原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア病原虫、蟯虫、鞭虫、ヒト回虫、旋毛虫、糞線虫、日本住血吸虫、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、および鉤虫が挙げられる。微生物感染の治療および／または予防としては、限定されるものではないが、該感染に関連する1以上の症状の緩和、微生物複製の阻害、低下または抑制、および／または免疫応答の増強が挙げられる。
【００８９】
特定の実施形態では、本発明のヘテロポリマー複合体組成物を哺乳類、好ましくは非ヒト霊長類、より好ましくはヒトへ投与して、微生物感染に関連する1以上の症状、あるいは微生物感染から直接または間接的に生じる疾病または障害を改善させる。特定のその他の実施形態では、本発明の組成物は哺乳類にいて微生物の数を減少させるために投与される。
【００９０】
本発明のヘテロポリマー複合体またはヘテロポリマーカクテルは単独で投与してもよいし、別の種類の抗微生物薬と組み合わせて投与してもよい。抗微生物薬の例示としては、限定されるものではないが、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、セファロスポリン(cepalospolin)、バンコマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アンフォテリシンB、ナイスタチン、メトロニダゾール、ケトコナゾール、およびペンタミジンなどの抗生物質が挙げられる。このような抗微生物薬は、ヘテロポリマー複合体を投与する前(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間前)、または投与した後(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間後)、または投与と同時に、微生物感染の予防または治療のために、ヒトまたは非ヒト霊長類、好ましくはヒトへ投与してよい。特定の実施形態では、ウイルスまたは細菌感染のリスクの高い霊長類へ本発明の組成物を投与する。患者集団の例としては、限定されるものではないが、ヒト火傷患者、幼児(18ヵ月以下)、免疫無防備状態または免疫不全のヒト、および高齢者(60歳を超える)などが挙げられる。
【００９１】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、有効量のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することを含んでなる、哺乳類の敗血性ショックを治療または予防する方法を提供し、この場合、該複合体はリポ多糖、エンドトキシン、またはグラム陰性菌の外壁の構成要素に特異的である第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。特定の実施形態では、敗血性ショックのリスクのリスクの高い哺乳類へ本発明の組成物を投与する。このような哺乳類の例としては、限定されるものではないが、ヒト火傷患者、幼児(18ヵ月以下)、免疫無防備状態または免疫不全のヒト、および高齢者(60歳を超える)などが挙げられる。
【００９２】
もう１つの実施形態では、敗血性ショックに関連する1以上の症状を改善するために有効量の本発明のヘテロポリマー複合体を動物へ投与する。
【００９３】
本発明のヘテロポリマー複合体またはヘテロポリマーカクテルは単独で投与しても、該哺乳類の敗血性ショックを治療または予防するための他の既知技術と組み合わせて投与してもよい。敗血性ショックを治療または予防するための既知技術の例としては、限定されるものではないが、アンチトロンビン、静脈内免疫グロブリン、サイトカインアンタゴニスト(例えば、抗腫瘍壊死因子(TNF)抗体、可溶性TNF受容体、抗インターロイキン-1(IL-1)抗体、および可溶性IL-1受容体)、抗生物質および抗炎症薬が挙げられる。敗血性ショックの治療および／または予防としては、限定されるものではないが、敗血性ショックを示す1以上の症状と関連する1以上の症状の緩和、および免疫応答の増強が挙げられる。このような追加の既知技術は、ヘテロポリマー複合体を投与する前(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間前)、または投与した後(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間後)、または投与と同時に、敗血性ショックの予防または治療のために、哺乳類、好ましくはヒトへ投与してよい。
【００９４】
さらにもう１つの実施形態では、本発明は、有効量のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与することを含んでなる哺乳類の癌を治療する方法に向けられ、この場合、該複合体は癌細胞特異的抗原に特異的な第2のモノクローナル抗体と化学的に架橋された、該哺乳類のC3b様受容体に特異的な第1のモノクローナル抗体を含んでなり、少なくともその第2のモノクローナル抗体のイソ型が該哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を有するイソ型である。好ましい実施形態では、第1のモノクローナル抗体はヒト赤血球上の補体受容体(CR1またはCD35)に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型はヒトIgG1またはヒトIgG3である。もう１つの実施形態では、第1のモノクローナル抗体は非霊長類哺乳類の血小板上のH因子に特異的であり、第2のモノクローナル抗体のイソ型は該非霊長類哺乳類におけるFc受容体に対して最も高い既知の親和性を持つイソ型である。
【００９５】
本発明の方法に従って治療できる癌の例示としては、限定されるものではないが、新生物、腫瘍、転移または制御されていない細胞増殖を特徴とするいずれかの疾病または障害が挙げられる。癌および増殖性疾患の種類の例としては、限定されるものではないが、白血病(例えば、筋芽細胞性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄性(顆粒球)白血病、および慢性リンパ性白血病)、リンパ腫(例えば、ホジキン病および非ホジキン病)、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫、大腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、肝臓癌、ビルムス腫、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、形成不全症、および過形成が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の治療化合物を前立腺癌(例えば、前立腺炎、良性前立腺肥大症、良性前立腺過形成(BPH)、前立腺傍神経節腫、前立腺癌、前立腺上皮内腫瘍、前立腺-直腸フィステル、および異型前立腺間質病変）の男性に投与する。癌の治療および／または予防としては、限定されるものではないが、癌に関連する1以上の症状の緩和、癌の進行の阻害または低減、癌の退縮の促進、および／または免疫応答の増強が挙げられる。癌の治療および／または予防には、血液またはリンパ系を血液循環する転移細胞のクリアランスまたは低減も含まれる。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与して癌に関連する1以上の症状を改善させる。ある特定のその他の実施形態では、本発明のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与して癌の進行を阻害または低減する。ある特定のその他の実施形態では、本発明のヘテロポリマー複合体を哺乳類へ投与して癌の退縮を促進させる。
【００９７】
本発明のヘテロポリマー複合体またはヘテロポリマーカクテルは単独で投与しても、その他の種類の癌治療(例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、および抗腫瘍薬)と組み合わせて投与してもよい。抗腫瘍薬の例としては、限定されるものではないが、シスプラチン、イホスファミド、パクリタキセル、タキサン、トポイソメラーゼI阻害剤(例えば、CPT-11、トポテカン、9-AC、およびGG-211)、ゲムシタビン、ビノレルビン、オキサリプラチン、5-フルオロウラシル(5-FU)、ロイコボリン、ビノレルビン、テモダール、およびタキソールが挙げられる。このようなその他の種類の癌治療は、ヘテロポリマー複合体を投与する前(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間前)、または投与した後(例えば、1分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、24時間、2日、または1週間後)、または投与と同時に、癌の予防または治療のために、哺乳類、好ましくはヒトへ行ってよい。
【００９８】
5.5  治療または予防上の有用性の実証
予防または治療に用いる本発明の組成物は、ヒトでの試験に先立って、限定されるものではないがチンパンジー、サルなどをはじめとする好適な動物モデル系で試験することができる。in vivo試験には、ヒトへの投与に先立って、当技術分野で公知の適当な任意の動物モデル系を用いることができる。試験モデル例については、Reinagel and Taylor, 2000, J. Immunol. 164:1977参照。
【００９９】
5.6  治療／予防的投与および組成物
本発明は、哺乳類(例えばブタ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトなど）へ有効量の本発明のヘテロポリマー複合体またはヘテロポリマー複合体カクテル組成物を投与することによる、免疫複合体のクリアランス方法、ウイルス感染または微生物感染の予防および治療方法、敗血性ショックの予防および治療方法、ならびに癌の治療方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の組成物をヒト火傷患者、幼児(18ヵ月以下)、免疫無防備状態または免疫不全のヒト、および高齢者(60歳を超える)へ投与する。好ましい態様では、本発明の組成物は実質的に精製されている(例えば、その作用を制限する物質または望ましくない副作用をもたらす物質を実質的に含まない)。
【０１００】
種々の送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる(例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなどへの封入)。導入方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、または経口経路が挙げられる。組成物は都合の良い任意の経路により、例えば注入またはボーラス注射、上皮内層または粘膜内層(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)からの吸収により、投与してもよく、またその他の生物活性薬剤とともに投与してもよい。投与は全身投与または局所投与が可能である。さらに、脳室内およびくも膜下注入をはじめとする好適な任意の経路によって本発明の組成物を中枢神経系に導入することが望ましい場合があり、脳室内注射は例えば、オマヤリザーバー(Ommaya reservoir)などのリザーバに接続した脳室内カテーテルによって補助してもよい。例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアゾール化剤を含む製剤を使用して、肺投与も用いることができる。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明の組成物を治療の必要のある領域へ局所的に投与することが望ましい場合があり、これは例えば、限定されるものではないが、外科手術中の局所注入、例えば外科手術後の創傷包帯と併せた局所塗布、注射により、カテーテルにより、坐薬により、またはインプラント(このインプラントはシラスティック膜などの膜をはじめとする多孔性、無孔性、またはゲル状の物質、あるいは繊維である)により、達成しうる。
【０１０２】
もう１つの実施形態では、この組成物を小胞、特にリポソームに入れて送達できる(Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treatら, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler編, Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein, 同書, pp. 317-327;全般的に同書を参照)。
【０１０３】
さらにもう１つの実施形態では、この組成物は制御放出系または徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いうる(Langer,上記; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507; Saudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照)。もう１つの実施形態では、高分子材料を制御放出系に使用することができる(Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise編, CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball編, Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61参照;また、Levyら, 1985, Science 228:190; Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardら, 1989, J. Neurosurg. 71:105参照)。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療標的(例えば、脳、腎臓、胃、膵臓および肺)の近傍に配置して、それにより全身用量の一部のみが必要となるようにすることができる(例えば、Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 上記, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照)。
【０１０４】
その他の制御放出系はLangerの総説(1990 Science 249:1527-1533)に論じられている。
【０１０５】
本発明はまた医薬組成物も提供する。このような組成物は予防上または治療上有効量の1種以上の本発明のヘテロポリマー複合体および製薬上許容される担体を含んでなる。特定の実施形態では、「製薬上許容される」とは、合衆国または州政府の規制当局に承認された、あるいは、動物、特にヒトでの使用を目的として米国薬局方またはその他の一般に認められている薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」とは、治療薬と共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをさす。このような製薬担体は水、および、石油、動物、植物または合成起源のものを含む油（例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油など）などの無菌の液体でありうる。医薬組成物が静脈投与される場合では、水が好ましい担体となる。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体、特に注射液として用いることができる。好適な製薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、石灰、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。また所望であれば、この組成物に微量の湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤を含めてもよい。これらの組成物は液剤、懸濁剤、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。この組成物は従来の結合剤、およびトリグリセリドなどの担体とともに、坐薬として製剤化することもできる。経口製剤には医薬品級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含めることができる。好適な製薬担体の例は、E. W. Martin著「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。このような組成物に治療上有効量の本発明の化合物を、好ましくは精製した形態で、好適な量の担体とともに含めて患者への投与に適した形態とする。製剤は投与様式に適していなければならない。
【０１０６】
好ましい実施形態では、組成物をヒトへの静脈投与に適合した医薬組成物として常法を用いて製剤化する。一般に、静脈投与用の医薬組成物は等張の滅菌水性バッファー中の溶液とする。必要であれば、本発明の医薬組成物に、可溶化剤、および注入部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局部麻酔薬を含めてもよい。一般に、成分は個別に、または一緒に混合して、単位剤形として、例えば、有効成分の量を表示したアンプルまたは小袋などの気密容器に入れた凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給する。本発明の組成物を注入によって投与する場合には、滅菌された製薬等級の水または生理食塩水を含む注入瓶に分注すればよい。本発明の組成物を注射により投与する場合には、投与前に成分を混合するように滅菌注射水または生理食塩水のアンプルを提供してもよい。
【０１０７】
本発明の医薬組成物は中和または塩形態で製剤化することができる。製薬上許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンとともに形成されるもの、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第2鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンとともに形成されるものが挙げられる。
【０１０８】
ウイルス感染または微生物感染の治療または予防に有効な本発明の組成物の量は標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、場合によりin vitroアッセイを用いて、至適用量範囲を決定してもよい。製剤中に用いる正確な用量は、投与経路、および疾病または障害の重篤度に応じて変わるため、担当医の判断および各患者の状況に応じて決定すべきである。しかしながら、静脈投与に好適な用量範囲は、一般に体重kgあたりの有効化合物が約20〜500μgである。鼻腔内投与に好適な用量範囲は、一般に約0.01pg/体重kg〜1mg/体重kgである。有効量はin vivoまたは動物モデル試験系から得られた用量応答曲線から推定すればよい
ヘテロポリマー複合体に関しては、好ましい用量は0.1mg/体重kg〜100mg/体重kg(一般に10mg/kg〜20mg/kg)である。もし抗体が脳で作用すべきであるならば、50mg/kg〜100mg/kgの用量が通常適当である。一般に、部分ヒト抗体および完全ヒト抗体はその他の抗体よりもヒト体内での半減期が長い。従って、用量を少なくし、かつ、投与頻度を減らすことができる場合が多い。脂質化などの修飾を利用して抗体を安定化させ、取り込みおよび組織への浸透(例えば、脳へ)を増強させることができる。抗体を脂質化する方法はCruikshankら, 1997, J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193に記載されている。
【０１０９】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の1種以上の成分を充填した1以上の容器を含んでなる薬剤パックまたはキットも提供する。場合によりこれらの容器には、医薬品または生物製品の製造、使用または販売を規制する行政機関の所定の書式での、ヒト投与のための製造、使用または販売についての当局の認可を示した注意書を添付してもよい。
【実施例】
【０１１０】
6. 実施例１
以下の実施例は、抗細菌モノクローナル抗体(mAb)と架橋した霊長類赤血球補体受容体に特異的なmAbからなる二重特異性ヘテロポリマー複合体が、急性注入モデルにおいてサルの血流中の細菌を標的とすることを実証するものである。in vitro研究では、補体により媒介される、緑膿菌（P. aeruginosa）(PAO1株)と血清中の霊長類赤血球との、様々なレベルでの結合(免疫粘着)が証明された。補体の涸渇した動物におけるin vivo実験では、細菌と赤血球との結合が二重特異性試薬の投与前は1%未満であったが、注入から5分以内に99%を超える細菌が赤血球と結合したことが明らかとなった。補体を十分にもつサルでは、注入された細菌の様々な画分が赤血球と結合した。この知見は、動物モデルの解釈において、またヒトにおける菌血症の理解において大きな意味を持ちうる。これら補体を十分にもつサルを二重特異性試薬で処理すると、99%を超える細菌が赤血球と結合した。24時間の生存研究を行ったところ、肺の損傷程度、サイトカインレベルおよび血液循環中の肝臓酵素をはじめとするいくつかの臨床パラメーターが、二重特異性mAb試薬が細菌の抗原チャレンジに対し一定の防御をもたらすことを示す。
【０１１１】
6.1 緒言
ヒトおよびその他の哺乳類は、血流に侵入する細菌およびウイルスに対していくつかの防御線を持つ(Brownら, 1982, J. Clin. Invest. 69:85; Crossら, 1993, Infect. Immun. 61:2741)。先天性免疫により与えられる防御作用のおかげで、大部分の細菌について小用量から中用量で用いて静脈投与により抗原チャレンジされた免疫学的にナイーブな動物は、パターン認識受容体、天然IgM抗体、およびその補体系を利用する種々の機構によって細菌を排除および破壊することができる(Muller-Eberhard, 1989, Curr. Opin. Immunol. 2:3; Ulevitchら, 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:19; Ochsenbeinら, 1999, Science 286:2156)。免疫化動物で抗体と抗原が結合すると免疫複合体(IC)が生じ、これは補体を固定し、補体活性化産物C3bを捕捉し、血液循環している細胞上の免疫粘着受容体と結合する(Nelson, 1953, Science 118:733; Cornacoffら, 1983, J. Clin. Invest. 71:236; Taylorら, 1997, J. Immunol. 159:4035; Fearon, 1980, J. Exp. Med. 152:20)。これら霊長類の受容体(CR1)の90%を超えるものが、血液循環中の赤血球(E)上に見られる。Nelsonははじめて、in vitroとex vivoの双方で、特異的抗体による細菌のオプソニン化が、補体により媒介される、細菌と霊長類Eとの結合をもたらすことを証明した(Nelson, 1953, Science 118:733)。この研究とRobineauxの研究は、霊長類Eにおける細菌の免疫粘着および固定化が食細胞による摂取および破壊を促進することを示唆する。従ってこの反応は病原体に対する宿主の防御において重要でありうる(Robineaux and Pinet, 1960, Ciba Found. Symp. Cell. Aspects Immun.: 5)。
【０１１２】
以下の実験の目的はHP-E系が血流中の細菌を標的とする可能性を評価することである。
【０１１３】
大用量の細菌を数時間にわたり連続静注することによる抗原チャレンジに基づく、急性細菌感染モデルを利用する(Brockmannら, 1986, Am. Rev. Respir. Dis. 134:885; Creaseyら, 1991, Circ. Shock 33:84; Redlら, 1996, Am. J. Physiol. 271:1193; Taylorら, 2000, Blood 95:1680)。このモデルでの免疫粘着の役割は我々の知識の範囲ではまだ評価されていないとはいえ、これらの条件下で生存する細菌を血液循環中で証明でき、種々のエフェクター機構を分析することができる。補体の涸渇した動物および補体を十分にもつ動物の血流中の緑膿菌(PAO1株)についてのHP処理による処置、またはHP処理を用いない処置を研究した。補体を十分にもつサルの血液循環中に注入された細菌の様々な画分がHPの不在下でEと結合するが、HPを注入すると99%を超える細菌がEと結合することが分かった。さらに、HPとともに、またはそれを伴わずに抗原チャレンジした対のサルで行った実験の結果は、細菌抗原チャレンジに対する耐性に関連するいくつかのパラメーターがHP処理によって向上したことを証明するものであった。
【０１１４】
6.2 材料および方法
モノクローナル抗体(mAb)    ヒトおよびサルE CR1に特異的な抗CR1 mAb 7G9および9H3は既に記載されている(Craigら, 1999, Clin. Immunol. 92: 170; Fergusonら, 1995, Arthritis Rheum. 38 : 190)。緑膿菌PAO1に特異的なmAb (Hollowayら, 1994, Microbiol. 140: 2907)および大腸菌に特異的なmAb (O株2型、UVA病院臨床微生物学研究室から単離された1型細胞傷害性壊死因子)を、加熱殺菌した細菌でA/Jマウスを免疫化した後のハイブリドーマから作製した。ハイブリドーマにより産生された細胞培養上清(CCS)を、細菌で被覆したマイクロタイタープレートとの結合を測定することにより、特異的mAbに関してスクリーニングした。親和性の高いmAbの選択(Taylorら, 1997, J. Immunol. 158: 842)にはフローサイトメトリー、RIAおよび磁気分離を用いた。細菌をCCSとともにインキュベートし、洗浄し、FITC標識抗マウスIgGまたは125I標識抗マウスIgGでプロービングした。洗浄したサンプルは、それぞれ、フローサイトメトリーにより解析するか、または結合した125Iをモニタリングした。あるいは、鉄粒子で被覆したBioMag抗マウスIgG(Polysciences Inc., Warrington, PA)をCCS中でインキュベートした細菌に加えた。Polysciences Magnetic Separationユニットにて、粒子と結合した細菌から遊離細菌を分離し、Coulter Multi-Sizer II(Coulter Co., Luton, England)で計数した。これらのアッセイで細菌と結合したmAbを高親和性mAbとして選択した。抗PAO1 mAb 2H4イソ型IgG2aはウエスタンブロット法でPAO1のLPSを認識し(示されていない)、抗大腸菌mAb 3E1はイソ型IgG1である。
【０１１５】
ヘテロポリマーの製造    mAbをアフィニティークロマトグラフィーによって腹水またはCCSから精製し(Changら, 1995, Meth. Enzymol. 254:430)、ホウ酸生理食塩水(0.15M NaCl、0.03Mホウ酸、pH7.8)に対して十分に透析した。架橋手順はSegalおよびBastの方法に基づいて行った(Segalら, 1995, Curr. Prot. Immunol. 2:13.1)。抗CR1 mAbを室温で2時間、N-スクシンイミジルS-アセチルチオアセテート(SATA, Pierce, Rockford, IL)と、14μg SATA/mg mAbの割合で反応させた。混合物をHPバッファー(50mMリン酸ナトリウム、5mM EDTA、pH7.5)で1回交換して透析した後、アルゴン下、室温で2時間、0.5Mヒドロキシルアミン、50mMリン酸ナトリウム、25mM EDTA、pH7.5で処理することによってSATA-mAbを脱保護してSH-mAbを作製した。この間、抗病原体mAbを室温で2時間、スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sSMCC, Pierce)と、14μg sSMCC/mg mAbの割合で反応させた。これらのインキュベーションの終わりに、SH-mAbおよびsSMCC-mAbの双方を個別に、重力流10DGカラム(BioRad, Hercules, CA)でのHPバッファー中へのゲル濾過に付した。SH-mAbのゲル濾過はアルゴン流下で行い、画分を含むSH-mAbをカップリングまでの最短期間、アルゴン下で保存した。SH-mAbを10〜20重量%過剰としてSH-mAbおよびsSMCC-mAbを一緒にし、反転によって穏やかに混合し、アルゴンでフラッシュし、穏やかに振盪しながら室温で16時間反応させた。このカップリング反応は、1mgヨードアセトアミド/10mg mAbとともに室温で1時間インキュベートすることにより停止させ、その後、4℃で保存した。カップリング反応混合物をモノマーIgG mAbおよびヒトIgMで較正したSuperose 6(Pharmacia)上でホウ酸生理食塩水バッファー中でゲル濾過に付した。これら2つのマーカー間に溶出する架橋産物をプールし(ただしこれら2つのマーカーの位置は十分に排除する)、実験に用いた。プールした産物は4℃で保存した。
【０１１６】
GFP-PAO1およびGFP-大腸菌(E.coli)の構築    緑色蛍光タンパク質(Bloembergら, 1997, App. Env. Micro. 63:4543)およびβ-ラクタム耐性をコードするプラスミドpSMC2はニューハンプシャー州ハノーバー、ダートマス医科大学(Dartmouth Medical School,Hanover, NH)George O'Toole博士から厚意により提供されたものである。このプラスミドを標準的な手順を用いるエレクトロポレーションにより、緑膿菌PAO1、および大腸菌の臨床単離株ヘ導入した(Smith and Iglewski, 1989, Nuc. Acids Res. 17: 10509; Provence and Curtiss, 1994, Gene transfer in Gram-netagive bacteria In Methods for general and molecular bacteriology. Gerhardtら, Eds., ASM Press, p. 317.)。350μg/mlカルベニシリンおよび100μg/mlアンピシリンをそれぞれ添加した標準的な寒天で培養物を維持した。
【０１１７】
サル抗細菌抗体    GFP-PAO1を希釈率を変えたサル血漿とともに37℃で15分間インキュベートすることで力価を測定した。オプソニン化した細菌を3回洗浄し、PE標識抗サルIgG、またはサルIgMと交差反応するヒトIgMに特異的なPE標識mAbでプロービングした。IgGの力価は、フローサイトメトリー分析で50%の細菌をFL2陽性として記録させる血漿の希釈率の逆数として報告される。IgM力価(示されていない)も類似の傾向を示した。
【０１１８】
GFP-PAO1およびGFP-大腸菌と、霊長類 Eとのin vitro結合    HPおよび／または血清により媒介される細菌のEとの結合の測定は、Kuhnら, 1998, J. Immunol. 160:5088に報告された方法に従った。要するに、10μl(70ng)の特異的または無関係なHPをPBS中1% BSA(BSA-PBS)または血液型が一致する血清のいずれかの50% E分散液50μlに加えた。37℃で5分の後、5 X 106 GFP形質転換細菌を加えたところ、E/細菌の比が約50対1となった(図3A)。混合物を37℃で5〜60分間インキュベートし、アリコートを氷冷したBSA-PBS中に希釈した。FLl陽性事象をゲート通過させる(gating)ことにより、サンプルを、フローサイトメトリー(Becton Dickinson FacsCalibur)で分析した。Eと結合している細菌または遊離している細菌のパーセントを、この2つの集団に関してFL1結果の前方散乱プロフィールおよび側方散乱プロフィールを調べることにより求めた。あるアッセイでは、細菌に比べてEの比率がずっと高い(>500対1)全血と細菌の混合物にHPを加え、インキュベーションおよび遠心分離(100 X g、5分)の後、上清中に遊離している細菌の数をフローサイトメトリーで測定し、無関係なHPを加えたかまたはHPを加えなかった同等のサンプルと比較した(図3B)。いずれの場合にも等量のサンプルを調べた。CFUアッセイに基づき、37℃で1時間のインキュベート時間の間に血清により媒介されるGFP-PAO1の死滅の証拠は見られなかった(示されていない)。
【０１１９】
in vivoプロトコール    全ての動物実験は、バージニア大学動物管理使用委員会(the University of Virginia Animal Care and Use Committee)および施設内バイオセーフティ委員会(Institutional Biosafety Committee)に認可されたプロトコールに従って適格な獣医によって監督された。カニクイザルおよびアカゲザルの体重は2.3〜8.5kgの間であった。抗CR1 mAbを用いて行ったRIA(Craigら, 1999, Clin. Immunol. 92:170; Fergusonら, 1995, Arthritis Rheum. 38:190)は、1種のサルを除いてEあたり1000〜3000のCR1エピトープを示した(図4C参照)。一部のサルには、GFP-PAO1を注入する24時間前にコブラ毒因子(CVF、70単位/kg、Quidel, San Diego, CA)の静注により前処理して、補体を消費させた(Taniguchiら., 1996, Transplant 62:678)。溶血性補体活性(CH50)を測定したところ、24時間後に補体活性がほとんどまたは全く残っていないことが示された。細菌注入に先立ってサルを麻酔し(ケタミン10mg/kg筋肉注射、アトロピン0.04mg/kg皮下注射)、挿管し、イソフルレンおよび100%酸素による麻酔下で維持した。カテーテルを挿入した大腿動脈を介して血圧をモニタリングした(MicroMed Inc., Louisville, KY)。
【０１２０】
実験の最初の１時間にわたり10ml/kg/hの速度での乳酸加リンゲル溶液の静注を設定した。低血圧は、マカクザルのイソフルレン麻酔に関連する一般的な血行動態的作用であり(Popilskis and Kohn, 1997, Anesthesia and analgesia in nonhuman primates, In Anesthesia and analgesia in laboratory animals, Kohnら編 Academic Press, New York, p. 233)、またそれは細菌注入に対する直接的な応答としても見られた。示されている場合には、平均血圧を50mm Hgを上回るように維持する目的で、フェニレフリンをボーラス注入でまたは0.5〜3μg/kg/分の計算された用量で注入した。
【０１２１】
GFP-PAO1の一晩寒天培養物をPBSに懸濁し、3回洗浄し、無菌生理食塩水中に懸濁し(約1 X 109CFU/ml)、橈側皮静脈へ約109CFU/kg/hに相当する注入速度で1〜4時間にわたり注入した(図4〜6参照)。血液サンプルを動脈カテーテルから抜き取り、HP調製物またはmAbを反対側の橈側皮静脈から60秒にわたり3〜5 mlのボーラス注入を行った。実験の終わりに全ての動物を麻酔下で人道的に安楽死させた。肝臓、肺および脾臓のサンプルを10%ホルマリン中で固定し、病理学者による試験のため盲険的に提出した。さらに、選択された実験では器官のサンプルを無菌濾過した0.1% Triton PBS溶液中の20%分散液としてホモジナイズし、これらの分散液の希釈アリコートをCFUに関して分析した。
【０１２２】
血液サンプルの処理    血液サンプルをEDTAで抗凝固処理し、氷上に保持し、15分以内に処理した。遠心分離(100 X g、5分)の後に血漿上清を除去した。このペレットを200 X gで1回、1800 X gで2回洗浄し、洗浄中に軟膜を取り除いた。この洗浄したEペレットの10μlアリコートを0.5mlの蒸留水に希釈し、激しく振盪して溶解させた後、0.5mlの2 X PBSを加えた。血漿と溶解したEペレットとの双方を、一連のin vitro較正に基づくフローサイトメトリーによりGFP-PAO1に関して分析した。Eペレットの分析法は、同一量(1mlのうちの500μl)の各サンプルを一定流量で制御採取することに基づく。FL1の閾値は蛍光結果を記録するよう設定し、次いでE膜断片に結合している可能性のあるものも含め、細胞溶解物中の全ての細菌が含まれるように十分な大きさの前方／側方散乱ウインドウを選択した。全ての実験で、Eは細菌に対して大過剰であり、そのため同一のEへの同時結合のために細菌を実際よりも少なく数える可能性が最小限に抑えられた。 溶解調製物中のEの数は、残りの未計測サンプルの541nmでの吸光度を測定することにより求めた。ヘマトクリット(HCT)0.4%は溶解後の吸光度0.81に相当する。これらの測定およびHCTに基づき、発明者らはEと結合したGFP-PAO1の濃度(図4〜6では、粒子, ペレットと表示)、および血漿中に遊離している GFP-PAO1の濃度(粒子, SNと表示)の濃度を算出した。血漿上清を無菌濾過したBSA-PBSに希釈し、同一のFL1カットオフおよび類似の光散乱ゲートを用いて、0.5mlの測定量で蛍光細菌を計数した。全血、血漿上清およびペレット状のEの複製サンプルをCFUについて分析した(図4〜6中、それぞれ、CFU, 全血、CFU, SN、CFU, ペレットと表示)。レベルが低いため細菌が最も濃縮されたサンプル中でCFUアッセイによって検出できなかった場合は、図4〜6では、値は100 CFU/mlと報告されている。
【０１２３】
別個の血液アリコートを3回洗浄し、軟膜を取り除き、単離されたEをBSA-PBS中で再構成し、125I標識抗CR1 mAb(HPの調製に用いたものと同じもの)または125I標識ヤギ抗マウスIgGのいずれかでプロービングした。約108 Eを0.2〜1μgの125I標識プローブとともに37℃で30分間インキュベートし、3回の洗浄またはオイルを通した遠心分離の後(Craigら, 1999, Clin. Immunol. 92:170; Fergusonら, 1995, Arthritis Rheum. 38:190)、Eと結合した125Iの量を測定した。これらのサンプルのE濃度は上記のようにして求めた。さらなる血液アリコートを3000 X gで遠心分離して血漿上清を生成し、これをサイトカイン測定のため-80℃で保存した。動物の血液量の合計10〜15%を採取し、150 mlもの多量の乳酸加リンゲル溶液を注入したところ、対照およびHP処理されたサルの双方のHCTが同程度の減少を示した。
【０１２４】
サイトカインアッセイ    ELISAサンドイッチアッセイを用いてサル血漿中のサイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-6)を測定した。プレートを適当な抗サイトカイン捕捉mAb(Pharmigen, San Diego, CA)で被覆し、希釈した血漿とともにインキュベートした後、捕捉mAbと競合しないビオチニル化mAbとともにインキュベートした。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(Southern Biotechnology, Birmingham, AL)と結合したニュートラライト・アビジンを添加して顕色させた。標準として組換えアカゲザルTNF-α(Biosource International, Camarillo, CA)、ヒトIL-1βおよびヒトIL-6(Pharmigen, San Diego, CA)を含めた。
【０１２５】
6.3 結果
In vitroアッセイ    サルモデルでのin vivo研究に備え、GFP-PAO1と霊長類E上のCR1との結合に特異的なHPをin vitroでヒトEおよびサルEで試験した。図3Aは、種々の条件下で、約50E/細菌の比率での、ヒトEに対するGFP-PAO1の結合の程度を示す。BSA-PBSでは15%未満のGFP-PAO1細菌しかがEと結合しない。特異的HPを添加すると、BSA-PBS中でのGFP-PAO1のEとの結合は90%を超えるほど促進され、さらにこの結合は迅速に達成され、かつ60分以上安定である。血清の存在下(HPは加えない)、補体の活性化がGFP-PAO1上にC3bの付着を引き起こす場合、Eの結合は20分で68%に達するが、その後、おそらくC3bがC3biおよびC3dgへと分解されるために、結合は減少する。結合は、代替経路の活性化のみを可能にするMg-EGTAを含む血清中では最初の20分間は低レベルであり、血清がEDTAで処理されている場合は結合が阻止されるため、Eの結合が補体の古典的経路の活性化により媒介されるものと思われる(図3A)。予め氷上で細菌に血清を吸着させると、GFP-PAO1−E結合を促進する血清の能力が著しく低下するが、このことは血清が細菌に特異的な補体固定性抗体を含むことを示唆している。ヒトE上のC3b結合部位を遮断するmAb 1B4(O'Sheaら, 1985, J. Immunol. 134:2580; Edbergら, 1987, J. Immunol. 139:3739)は、血清の熱不活化の場合と同様に結合を阻害する(示されていない)。補体により媒介される免疫粘着の天然のプロセスはHPの不在下で高レベルの結合を引き起こすことから、発明者らは、血清全体ではHPにより媒介される結合を証明することが困難であることを見出した(図3A)。しかしながら、上記の通り、血清により媒介されるE結合は60分経つまで減少し、この時点で血清中のHP処理サンプルおよび対照サンプル間の差は中程度の統計的に有意となり、すなわち61±11% 対 39±19%、p=0.042、片側t検定(図3)である。細菌をBSA-PBS中、血清EDTA中、または吸着した血清中に懸濁すれば、HPにより媒介される結合が明白に示され得る(図3A)。しかし、BSA-PBS中の結合レベル(90%超)は、補体が阻害されている場合でさえも、血漿を含んだサンプルよりも常に高かった。
【０１２６】
HPにより媒介されるGFP-PAO1のEとの結合を、次にEDTAで抗凝固処理した全血において試験し、血流中で予測される生理条件により近似させるため、Eが細菌に対し大過剰になる場合には(Shenepら, 1988, J. Infect. Dis. 157:565; Kregerら, 1980, Amer. J. Med. 68:332)、500E/細菌の比率を用いた。結果(図3B)はHPにより媒介されるGFP-PAO1とサルEおよびヒトE双方との結合実証しているが、これらの実験では少なくとも2 log単位の細菌がEと結合している。最後に、類似の実験条件下では、血清および特異的HPの双方が別のグラム陰性菌、大腸菌と霊長類Eとの十分な結合を媒介する。3〜6回の独立した測定に基づき、BSA-PBS中では、HPにより媒介されるGFP-大腸菌とヒトEおよびサルEとの結合は平均すると90%を超え、血清中の結合(HPは加えていない)は、ヒトEおよびサルEのそれぞれについて平均で80%および95%であった。
【０１２７】
補体の涸渇したサル：in vivoでの HPにより媒介されるGFP-PAO1とEとの結合
霊長類系における細菌とEとの結合を促進する上での、補体の天然の生理学的作用を考慮して、CVFで前処理して補体を消費させたサルモデルのHPを試験した。CVF処理から24時間後、この時までに大部分の補体活性化産物が血流から排除され、補体受容体、特にE CR1が連結に利用できることを期待して、細菌を注入した。図4Aに示すように、GFP-PAO1の連続注入は、実験の最初の１時間にわたり細菌とEとのごく僅かな結合をもたらした。HPのボーラス注入を行うと血漿中を自由に循環するGFP-PAO1の数が約100倍減少し、Eと結合した細菌の数は約500倍増加し、血流中の細菌の総数は増加した。HPの初期効果を、注入して数分間だけ観察し、残りの実験を続行した。細菌注入を160分で止めた後、Eと結合している細菌、および遊離している細菌のレベルは双方とも減少した。Eと結合しているGFP-PAO1、および血漿中で遊離しているGFP-PAO1を、フローサイトメトリーにより、またCFU測定により分析した(上記「物質および方法」参照)。この実験および下記(図5、6、表I)の記載では、一般に、Eと結合しているもの、または血漿中に遊離しているものとして測定された細菌の数に関して、フローサイトメトリー測定(粒子)とCFUアッセイとの間に良好な一致があった。
【０１２８】
次の実験では(図4B)、 同用量の細菌を短期間にわたり注入した。HPの投与前にCVF処理した動物ではGFP-PAO1とEとの結合は見られず、HP注入後、99%を超える細菌がEと結合し、血液循環中の細菌の総数は増加した。GFP-PAO1注入を120分で終了させた後、GFP-PAO1のレベルは実質的に低下した。2度目のGFP-PAO1のボーラス注入を260分時点で行うと、70%を超えるGFP-PAO1が直ちにEと結合し、90%を超えるGFP-PAO1が60分後には血液循環から除去された。図4Cに示した対照実験の結果(CVF処理、HPは含まない)は、GFP-PAO1注入を120分で停止した後に細菌が血液循環からより迅速に失われることを示す。HPの不在下では、この対照サルに関する実験を通してGFP-PAO1とEとの結合はほとんどなかった。血液循環中の細菌の定常状態レベルはHP注入後の図4Bに見られたものよりも低く、このことは血流中で遊離している(Eと結合していない)細菌のほうがより迅速に血液循環から除かれることを示唆している。
【０１２９】
最後に、細菌注入前に補体の涸渇したサルをHPで前処理すると、細菌注入時に極めて高レベルのEに関連する結合をもたらすことがわかった(図4D)。蛍光顕微鏡検査によりHPの存在下で細菌はEと結合することが確認されたが、約107細菌/ml 対 4 X 109 E/mlについて予想した通り、Eの大多数は細菌と結合しなかった(示されていない)。
【０１３０】
補体を十分にもつサル：in vivoでHPにより媒介されるGFP-PAO1とEとの結合
次に、補体を十分にもつサル（これは、生理的により適切な条件を表す）においてHPを用いて明白にGFP-PAO1と結合することができるかどうかを検討した(図5A、5B)。カニクイザルまたはアカゲザルへの細菌の連続注入は、血液循環中の細菌の様々な画分がEと結合している定常状態をもたらすことが分かった。この知見は、CVF処理した動物における免疫粘着の不在と併せて、補体の活性化がGFP-PAO1とEとの結合に役割を果たすに違いないことを示す。HP注入時の、CVF処理したサルに認められた、Eと結合している細菌と遊離している細菌の分布における実質的な変化がこの場合にも明白であった(図5A、5B)。血液循環中に遊離している細菌の数は急激に減少したが、Eと結合した数は増加し、血流中の細菌の総数は2〜4倍増加した。HP注入後、血流中の細菌の99.9%を超えるものがEと結合した。Eと結合している細菌と遊離している細菌の分布におけるこうした急速な変化はHPを注入しなかった対照サルには見られなかった(図5C)。
【０１３１】
in vitroおよびin vivo双方での結果(図3、5)は、HPの不在下での細菌と霊長類Eとの結合が、補体の活性化を促進する抗PAO1抗体によって著しく助長されることを示す(Muller-Eberhard, 1989, Curr. Opin. Immunol. 2:3; Ochsenbeinら, 1999, Science 286:2156; Nardinら, 1999, Mol. Immunol. 36:827)。抗PAO1マウスmAb 2H4のイソ型は補体を固定化できるIg2aであり、従って、サルの血流中でのHPにより媒介されるGFP-PAO1とEとの結合の増加は、mAb 2H4が細菌と結合した後の補体の活性化によるものであろうことが示されうる。この可能性を調べるため、GFP-PAO1の連続注入の間にmAb 2H4をカニクイザルの血液循環中に注入した(図5D)。mAb処理の前は、E結合は約50%であった。mAbのみの注入は、Eと結合しているPAO1の増加、および血漿中のPAO1の減少をもたらし、これは免疫粘着の増強に一致する(図5D、表I)。しかしながら、等モル量のHPを後に注入した場合、血漿中で遊離している細菌の数は実質的に減少し、血流中の細菌の総数は2倍に増加し、血流中の99%を超える細菌がEと結合した(図5D、表I)。この結果は、mAb単独は、同じ用量では、HP中へ製剤化された場合の同じmAbと比較して、標的病原体と霊長類Eとのin vivo結合の促進に同程度の効果はないとの発明者らの先の知見に一致する(Taylorら, 1997, J. Immunol. 158:842)。
【０１３２】
HP注入がEの破壊を引き起こしたという証拠はない。全てのサルに対するHP注入前後で総ビリルビンレベルは低いままである(0.3mg/dL未満、示されていない)。いくつかの実験の終了時の低いHCTは(図面の説明を参照)、総血液量の10〜15%の抜き取りおよび体液の注入後には予測されることである。発明者らはこれまでに、51Cr標識EがHPを介して125I標識基質(タンパク質および大腸菌の双方)でオプソニン化され、サルヘ注入される場合の自家Eのごく僅かな損失を証明している(Nardinら, 1999, Mol. Immunol. 36:827)。
【０１３３】
補体を十分にもつサル：細菌の注入前のHPでの処理    次にサルのHPでの前処理が細菌の抗原チャレンジに対する動物の短期応答にいかに影響するかを調べた。実験は、HPの存在下であるが抗生物質の不在下で、GFP-PAO1注入後24時間にわたり、いくつかの臨床パラメーター、特に肺の損傷を調べるように計画した。3通りの異なる細菌注入用量についてナイーブな(naive)動物をHPで処理したサルと比較した。結果は各GFP-PAO1用量について、HPで処理した動物と比較してナイーブな動物の血漿中ではより多くの細菌が遊離していたことを示す(表IIA、図6)。しかし、PAO1とEとの結合は、処理しなかったサルでは全く明らかであった。免疫粘着のレベルはPAO1に対するサルIgG 抗体の力価とほぼ相関する。例えば、サル6A(図6)は中程度の結合しか示さず(32%、表IIA)、逆数力価は5であった。注入細菌の60%を超えるものがサル5B(HP注入前)、7A、および7C(図5、表IIA)のEと結合し、これらのサルのPAO1に対するIgGの逆数力価はそれぞれ40、50、および>100であった。
【０１３４】
主観的基準および臨床分析に基づくと、HPで処理したサルの臨床状態はナイーブな動物よりも良好であった。例えば、HPで処理した動物の肝臓酵素の上昇は未処理の動物よりも低かった(表IIA)。CFUについて臓器を分析したところ(表IIA)、このような少数の動物からは統計学的に有意な結論を導くことはできないが、HPで処理した動物の臓器中の生菌のレベルは低い傾向にある。表IIBに剖検/病理報告からの所見をまとめている。特に目立ったのは、より高い細菌用量における、HPで処理した動物の肺損傷からの防御レベルであった。3 X 109 CFU/kgで処理した対照サル(7A)の肺での細菌増殖の形跡はなかったが(表IIA)、肺の剖検で鬱血、気道中の体液および総合所見の組織病理学的確認が明らかとなった。最高用量の6 X 109 CFU/kgで、24時間時点でのナイーブサルとHPで処理したサル(それぞれ7Cおよび7D)との間に非常に大きな差が認められた。HPで処理したサルの肺にはごく小さい感染病巣が2つだけ検出されたが(7D、表IIB)、重篤な病状は対照動物(7C)の肺において明白であり、対照動物は肺、心臓および腎臓の感染も示した(表IIA)。
【０１３５】
HPによる炎症性サイトカインレベルの低下    グラム陰性菌による感染のうちで最も重大な結果の1つである敗血性ショックはLPSにより媒介される(Warren, 1997, N. Engl. J. Med. 336:952; Deitch, 1998, Shock 9: 1; Morrisonら, 1999, Infect. Dis. Clin. No. Amer. 13:313)。HPにより媒介されるGFP-PAO1とEとの結合は血流中で遊離している細菌のレベルを実質的に低下させることから、E結合を含むクリアランス経路へ向け直すことが細菌のLPSの炎症性効力にも影響を与えることは筋の通ったことであると思われる。LPSが血漿タンパク質および細胞表面受容体と相互作用して炎症を引き起こす機構は複雑である。しかし、炎症経路の最も初期の事象の一つがTNF-α、IL-1β、およびIL-6などの炎症性サイトカインが血流中に現れることであるのは十分認められている(Redlら, 1996, Am. J. Physiol. 271:1193; Morrisonら, 1999, Infect. Dis. Clin. No. Amer. 13:313; Hesseら, 1988, Surg. Gynecol. Obstet. 166:147; Jansenら, 1996, J. Immunol. 156:4401)。いくつかのグループが霊長類モデルを用いて大腸菌を抗原チャレンジした際の血液循環中のサイトカイン出現動態プロフィールを示している(Creaseyら, 1991, Shock 33:84; Redlら1996, Am. J. Physiol. 271:1193; Hesseet ら, 1988, Surg. Gynecol. Obstet. 166:147; Jansenら, 1996, J. Immunol. 156:4401)。本明細書中の観察結果は、GFP-PAO1の抗原チャレンジの後のサイトカイン放出パターンは極めて類似していることを示している(表III、図7)。血液循環中のTNF-αレベルは、細菌注入開始から約1時間後に上昇が始まり、90〜120分後にピークとなり、その後低下する。TNF-αの上昇の後で、IL-1βおよびIL-6のレベルが上昇する。これらの結果はHPの使用が、細菌注入によって促進されるサイトカインの増加を著しく鈍らせることを示す。この知見は、炎症を実質的に軽減する経路によって、HPが細菌の方向の向け直しおよびクリアランスを促進することを強く示唆する(下記「考察」参照)。
【０１３６】
HPおよび対照動物の中には血圧を調節するためにフェニレフリンで処理したものもあった(表III、図7)。フェニレフリンはα-アドレナリン作動性アゴニストであり、TNF-α産生を遮断しないため、HPで処理された動物ではこの処理がサイトカインレベルの低下を引き起こすとは考えにくい(Severnら, 1992, J. Immunol. 148:3441; Van Der Pollら, 1996, J. Clin. Invest. 97:713; Van Der Pollら, 1997, J. Exp. Med. 185:1143)。さらに、フェニレフリンで処理しなかった動物においても同じ傾向が明白である。
【０１３７】
E-HPおよびE CR1レベル    単離され洗浄されたEの結合したHPおよび相対CR1レベルについてRIAにより調べた。その結果は、HPの注入がE結合125I標識抗マウスIgG量の実質的な増加をもたらしたことから、HPが迅速にEと結合することを示す(表IV)。実験が進むにつれてEと結合し得るこのプローブの量が減少したが、これは発明者らが類似の系で既に証明したように、HPがEから取り除かれたことを示唆する(Reistら, 1994, Eur. J. Immunol. 24:2018; Craigら, 1999, Clin. Immunol. 92:170)。HPの調製に用いた抗CR1 mAb 7G9でプロービングしたEは、HP注入直後のmAb結合には僅かな減少しか示さなかったが、これはサルに注入されたHPが全CR1の約30%を占めるのに十分であったため予期されたことであり、遊離のmAbと、Eと結合したHPとの間の何らかの再平衡化が、in vitroでのインキュベーション中に生じた可能性がある。しかし注目すべきは、後の時点になると、Eと結合した抗CR1プローブの量がさらに減少することであり、これらの結果は発明者らが既に報告した、Eと結合したHPのクリアランスはE CR1の損失と同時に生じるという同じパターンに従う(Reist ら, 1994, Eur. J. Immunol. 24:2018; Nardinら, 1999, Mol. Immunol. 36:827; Craigら, 1999, Clin. Immunol. 92:170)。
【０１３８】
6.4  考察
HPにより媒介される結合のin vivoにおける証拠    本研究の目的は、HP系が血流中でGFP-PAO1を標的とする能力、および静脈抗原チャレンジの際に細菌とEとを結合させる能力を測定することであった。HPは、BSA-PBS中(図3A)、およびより高いE/PAO1比率を示す抗凝固処理した全血中(図3B)での、GFP-PAO1と、ヒトEおよびサルEとの結合を、非常に高いレベルで促進することができた。E/PAO1比率が低い場合(図3A)、NHSの存在下で、様々なレベルの免疫粘着が存在し、HPにより媒介されるEとの結合は天然の補体媒介性結合とは容易に区別できなかった。補体の活性化が阻止された場合、HPは明らかにE結合を促進したが、血漿タンパク質の存在がin vitroでのHPにより媒介される結合を減少させた可能性もある。しかし、補体の涸渇したサルおよび補体を十分にもつサルの双方での実験(図4〜6)は、HPがin vivoでの細菌とEとの結合を促進する効率が非常に高レベルであることを明確に示している。
【０１３９】
抗PAO1 mAb 2H4を単独で用いた場合、補体により媒介される細菌とEとの免疫粘着の増加が認められた(図5Dの91分、表I)。しかし、このmAbを等濃度で含むHPを次に用いるとE結合の促進にさらに一層効果があった(図5Dの151分、表II)。C3bの代わりとして働く(Nardinら, 1999, Mol. Immunol. 36:827)HP中の抗CR1 mAbはC3bよりも高い親和性でCR1と結合するため、HPにより媒介されるそのE結合の増加を生じるものと考えられ、その結果、実質的にCR1との連結が増大する。抗CR1 mAb 7G9の濃度0.13μg/mlは、109M-1を超える結合定数に対応する、E CR1の50%飽和を達成するのに十分である(Lindorferら, 2001, J. Immunol. Methods 248:125)のに対して、モノマーC3bのCR1に対する親和性は100分の１よりも低いことが分かっている(Arnaoutら, 1981, J. Immunol. 127:1348; Ahearnら, 1989, Adv. Immunol. 46:183)。従って、免疫粘着の成功のためには、複数のC3b分子が基質に沈着し、E上のCR1クラスターと結合して確実に多価結合するようにする必要がある(Edbergら., 1987, J. Immunol. 139:3739)。CVFで処理したサルおよび補体を十分にもつサルの双方における知見をはじめとする本研究は、HP構築物が基質とE CR1とのin vivo結合の促進において極めて効果的に働くことを示す初期の研究を確認する(Hahnら, 2001, J. Immunol. 166:1057; Reistら, 1994, Eur. J. Immunol. 24:2018; Taylorら, 1997, J. Immunol. 158:842)。
【０１４０】
HP自体は種々の基質と結合した際に補体を活性化させないので、無関係なHP(すなわち、2H4 X IgG)ではなくmAb 2H4をin vivo 免疫粘着試験に単独で用いた(図5D)。例えば、本研究に関連するフローサイトメトリー実験は、溶液中で7G9 X 2H4 HPをEおよびNHSとともにインキュベートするか、または予め形成させたE-HP複合体をNHSとともにインキュベートすると、E上にごく僅かなC3bの沈着が起こることを示した(示されていない)。これらの観察結果はMeriらの研究に合致する(Jokiranta and Meri, 1993, J. Immunol. 151:2124; Hakulinen and Meri, 1998, Am. J. Pathol. 153:845)。HPの合成はN-ヒドロキシスクシンイミド化学を利用してmAb上のリシンを誘導体化するが(「材料および方法」参照)、JokirantaおよびMeriはmAbのこのような化学修飾がC1qの結合を遮断することによって古典的な補体活性を阻害すると報告している(Jokiranta and Meri, 1993, J. Immunol. 151:2124）。
【０１４１】
免疫粘着    大部分の動物は一般的な細菌に対して抗体を生じると思われ(Ochsenbeinら, 1999, Science 286:2156; Carroll, 1998, Ann. Rev. Immunol. 16:545; Parkerら, 1994, J. Immunol. 153:3791)、従って本発明者らのin vitroおよびin vivo実験が補体を活性化させる条件下でGFP-PAO1および大腸菌と、サルEおよびヒトEの双方との結合を実証しているのも驚くことではない(図3、5、6、表I)。急性細菌注入モデルは幅広く試験され、種々の非ヒト霊長類について記載されているものの(Brockmannら, 1986, Am. Rev. Respir. Dis. 134:885; Creaseyら, 1991, Circ. Shock 33:84; Redlら, 1996, Am. J. Physiol. 271:1193; Taylorら, 2000, Blood 95:1680; Hesseら, 1988, Surg. Gynecol. Obstet. 166:147; Jansenら, 1996, J. Immunol. 156:4401)、本発明者らの知る限りでは細菌が血漿中でEと結合しているのか遊離しているのかを判定する試みはなされていない。さらに、細菌に関連するヒト臨床状態を記載する文献は幅広くあるが、これらの報告では血流中の細菌が血漿中で遊離しているのかEと結合しているのかは明らかにされていない(Shenepら, 1988, J. Infect. Dis. 157:565; Kregerら, 1980, Amer. J. Med. 68:332; Weinsteinら, 1997, Clin. Infect. Dis. 24:584)。本発明者らの結果は非ヒト霊長類注入モデルにおける細菌とEとの免疫粘着を証明する。血液循環中での細菌とEとの免疫粘着の程度は、補体および抗菌抗体のレベルをはじめとするいくつかの要素に明らかに関連しているため、免疫粘着の定量的測定が菌血症の患者に重要な予後情報をもたらす可能性がある。同様に、マウスまたはウサギの血流中に注入された細菌が、非霊長類免疫粘着受容体を含む血小板と結合するかどうかを判定することが重要であると思われる(Taylorら, 1985, J. Immunol. 134:2550; Edbergら, 1989, Clin. Immunol. Immunopath, 51:118)。
【０１４２】
細菌のクリアランスに対するHPの効果    HPで処理したサルとナイーブなサルを比較した実験では、HPにより媒介されるGFP-PAO1とEとの結合が細菌を血液循環中で長期間維持する傾向を示す(図4の4Bと4Cを比較、図6の6Bと6Aを比較)。つまり、双方とも血液循環中の細菌の定常状態レベルが低いため、GFP-PAO1が脈管構造から除去される速度は未処理のサルのほうが速く、細菌の注入が停止した後、細菌はより迅速に血流から除かれた。対照的に、サルをHPで処理した後、血液循環中の細菌の新たな定常状態レベルが上昇し、注入が終わるとEと結合した細菌はより遅い速度で血液循環から除去された。非処理のサルとHPで処理したサルの血流から出ていった後の細菌の運命および器官分布には重要な問題が集中する。HPを介してEと結合したGFP-PAO1のクリアランス速度がより遅いことは、肝臓および脾臓中の固定された組織マクロファージと結合したプロテアーゼによるCR1の切断と、その後のこれらの器官での細菌の取り込みとを必要とする速度決定ステップ(Reistら, 1994, Eur. J. Immunol 24:2018; Nardinら, 1999, Mol. Immunol. 36:827; Reinagelら, 2000, J. Immunol. 164:1977)に起因する、様々なクリアランス機構を反映している可能性がある。この機構によるクリアランスは、そうしなければ遊離している(Eと結合していない)細菌が、PAO1に特に感受性のある肺をはじめとする他の器官および組織に侵入できる割合を低減させるはずである(Kurahashiら, 1999, J. Clin. Invest. 104:743: Engelら, 1998, J. Biol. Chem. 273:16792)。HP処理したサルの肺に関連する病状の低減は(上記参照)、この仮説に一致する。従って、HP処理により、細菌のより大きな細胞画分が、該細菌が食作用を受けて壊滅される場である肝臓および脾臓に向け直されると予想することは理に適っている。本発明者らはこれらの器官に関連する生細菌を測定した(表IIA)。もし細菌が実際に死滅していれば、CFUアッセイでは記録されないはずである。HP処理の結果として肝臓の病状が増大した形跡はなく、また、実際に血液循環中の肝臓酵素のレベルはHP処理した動物では低い傾向にあった(表IIA)。最後に、図6Aと6Bとの比較から、対照サルにおいて免疫粘着によりEと結合した細菌は、処理したサルにおけるHPを介してEと結合した細菌よりも速く排除されることが示唆される。PAO1とEとの結合に関しては、より多くのHPが(C3bと比較して)より多数のCR1を、より高い親和性で結合するものと思われる。従って、おそらくHP-細菌複合体をアクセプターマクロファージへ移行させるためにはより多くのCR1分子が切断されなければないために、HPと結合した細菌のクリアランスはより遅くなると考えるのが理にかなっている。
【０１４３】
サイトカイン放出に対するHPの効果    血漿タンパク質およびCD14/Tlr4などの細胞受容体による、LPSなどの細菌関連構造の認識は、細菌の侵入に対する防御において重要な要素となる。しかし、CD14経路を介してプロセシングされる高レベルのLPSは、一般に血液循環中のサイトカインの増加によってシグナル伝達される炎症応答亢進を誘発させうるが、これが最終的に宿主に損傷を与える(Warren, 1997, N. Engl. J. Med. 336:952; Deitch, 1998, Shock 9:1; Crossら, 1995, J. Clin. Invest. 96:676; Poltorakら, 1998, Science 282:2085)。HPで処理したサルでは、血流中の細菌の99%を超えるものがEと結合し、これらの動物のサイトカインレベルの減少は、これらの動物での細菌のプロセシングが未処理の動物での細菌のプロセシングとは異なっていた可能性があることを示唆する。HPを通じてEと結合した細菌は、固定された組織マクロファージによっておそらくそのマクロファージ上のFC受容体を利用する経路を介してより効果的に食作用を受け、破壊される(Reinagel and Taylor, 2000, J. Immunol. 164:1977; Heumannら, 1992, J. Immunol. 148:3505; Pollackら, 1997, J. Immunol. 159:3519; Aderem and Underhill, 1999, Ann. Rev. Immunol. 17:593)。従って、これらの条件下で細菌およびLPSは特に、CD14受容体を結合した経路から向け直される可能性があるが、そうでなければTNF-αなどのサイトカインにより媒介される炎症応答を誘起する可能性がある。本発明者らは本研究に用いたサルの数が限られているため、このような小さいサンプル規模を基にしては統計学上有意な比較ができないことを認める。
【０１４４】
要約すれば、本発明者らはHPを用いた処理がサルの血流中でのGFP-PAO1の処置にどのように影響を及ぼすのか調べた。注入された細菌の画分は、補体により媒介される反応である免疫粘着によってEと結合する。しかし、GFP-PAO1およびE CR1に特異的なHPを注入すると、細菌とEとのはるかに高レベルの結合(99%超)が引き起こされ、実質的に血漿中で遊離している細菌のレベルの低下を引き起こす。示されている結果に基づくと、Eと結合した細菌は、感受性のある器官にてコロニー形成をする機会が少なく、さらにCD14/LPS炎症性経路を大部分迂回する機構によって血液循環から排除されると結論付けられる。肺の損傷程度、血液循環中のサイトカインレベルおよび肝臓酵素をはじめとするいくつかの臨床パラメーターは、HPが強固でかつ迅速な細菌とEとの結合を促進する他に、細菌チャレンジに対し一定の防御をもたらしうることを示す。
【表１】
2005504741.tif 000002
【０１４５】
a実験の詳細については図5Dの凡例も参照
bフローサイトメトリーにより測定した粒子/全血ml。上記の材料および方法参照
cCFU/全血ml
d各時点での平均値±標準偏差、mAb前についてはn=3、mAb後についてはn=4、HP後についてはn=4
e結合%(粒子)=100 X (ペレット, 粒子) / (ペレット, 粒子 + SN, 粒子)。結合%(CFU)=100 X (ペレット, CFU) / (ペレット, CFU + SN, CFU)。結合%は個々の各時点について算出した後、その平均をとっている。
【表２】
2005504741.tif 000003
【０１４６】
aカニクイザル、図6参照。サル6Aは嗜眠状態、鬱状態および禁断状態であり、12時間経った際に安楽死させた。他の動物も全て24時間の時点で安楽死させた。IgG抗PAO1の逆数力価：6Aは5、6Bは17。
bカニクイザル  IgG抗PAO1の逆数力価：7Aは50、7Bは>100。
cアカゲザル  7Cおよび7DのIgG抗PAO1の逆数力価はいずれも>100であった。サル7Cは24時間時点で弱っており、紅潮していた。6Aと7Cを除き、他のサルには安楽死時に観察できる徴候はなかった。
d細菌注入を開始して60分後の全血およびペレット状EについてのCFU測定値に基づく。
eAST(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ)標準値32±8U/L。ALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)標準値35±7U/L。
f処置後の動脈アクセス部位からの漏出。圧迫帯(pressure wrap)の使用によりそれ以上の血液損失を最小にした。
gCFUアッセイは、PBS中0.1%のTritonにて、5gm 組織/20ml PBSでホモジナイズした組織サンプルに対して行った。
h検出されず
【０１４７】
【表３】
2005504741.tif 000004
【０１４８】
【表４】
2005504741.tif 000005
【０１４９】
aサル4C、4D、6B、7Aおよび5Bは実験の最初の15分間にわたりフェニレフリンで処理した。他のサルは処理をしないか、TNF-αピーク後に処理した。
b7Aおよび7BのTNF-αの値は図7に示したものとは若干異なり、これらは異なるアッセイバッチで経時的に測定したものである。
cHPは115分の時点で投与した。TNF-αは100分の時点で24.5ng/mlであった。
【表５】
2005504741.tif 000006
【０１５０】
a結果は全て、結合cpm/106 E(平均値±SD)にノーマライズした。
bヒツジE(CR1を欠く)に対する125I抗CR1 mAbの結合は、サルEに対して観測された値の10%未満であった。特異的活性が異なる数種の異なる125I標識プローブを用いた。
【０１５１】
7.実施例２
以下の例は、ヘテロポリマーが霊長類の血液循環からプロトタイプのウイルス病原体を除去する能力を持つことを証明する。
【０１５２】
HPの、血液循環からプロトタイプのウイルス病原体を除去する能力を調べた。131I標識バクテリオファージΦX174をアカゲザル、カニクイザルおよびスタンプテールマカクザルの血液循環中に注入した。図8に示した代表的な実験は、ある程度の初期クリアランスはあるものの、最初の48分には、注入したバクテリオファージの大部分が血漿中を自由に循環することを示す。HP注入後、Eとの結合が急速に生じる。HPの注入後間もなく、少量の131IΦX174がEと結合した血液循環に戻る。本発明者らは、HP注入前に放射性標識されたバクテリオファージの画分が脈管構造中で結合し、E-HP複合体がこの粘着したウイルスを結合し、それを血流中に戻す働きをしているということを示す。HPがこの逆戻りを促進できることのさらなる証拠を以下に示す(デング熱ウイルスモデル参照)。
【０１５３】
131I標識バクテリオファージΦX174がHPを介してEと結合した後、それは血液循環から排除され、アンガーカメラのイメージングで示されるように、主に肝臓に局在する(図8の右側の軸)。実際に、カウントが血流から排除される際の速度は、カウントが肝臓によって取り込まれる際の速度と同等であると思われ、このクリアランス過程で血漿へ放出されるカウントは、あるとしてもわずかである(図8)。これらの結果は、肝臓中のアクセプター細胞が基質を取り除き、さらにその基質と、それを血漿へ戻すことなく結合するという協調的過程にも一致する。これらの実験でE CR1の損失は検出されなかったが、おそらくこれはこの研究がE CR1レベルの高いサルで実施され、比較的少量のHPを注入したからであろう。その翌日の動物へのさらなる試験は、ごく少量の131Iが肝臓に残存したこと、膀胱および甲状腺にてカウント数が明示されたことを示した。この知見の最も妥当な説明は、肝臓へ排除されたものは次に食作用を受けて分解され、その結果として遊離した131I-が膀胱および甲状腺へ蓄積することとなった、というものである。最後に、100μg の131IΦX174を9kgの動物へ注入すると、ΦX174粒子/Eの比は約3対1となる。この比較的高いチャレンジ用量でさえも、HPはΦX174とEとの定量的結合を密接に促進することが可能であった(図8)。
【０１５４】
HPの抗CR1 mAb成分は病原体クリアランスに不可欠である。抗ΦX174 mAb 7B7(HPで使用)単独をサルへ注入しても、ΦX174の免疫粘着またはクリアランスは起こらない。しかし、等モル量のHP(同量のmAb 7B7を含む)をその後に動物に注入すると、ΦX 174 はEと結合し、排除された。この結果はC3bの代わりとしての抗CRl mAbの有用性を強調するものである。それは高い親和性でE CR1と結合し、また、HP中に製剤化されているので、抗病原体mAbそれ単独では補体により媒介される免疫粘着を促進するのに十分でない低濃度の条件下でも、mAbにより媒介される標的病原体とEとの結合を促進することができる。
【０１５５】
8. 実施例３
以下の実施例はマクロファージ上のFc受容体が免疫複合体(IC)のクリアランスに重要な役割を果たすことを証明する。
【０１５６】
固定化組織マクロファージはヒトIgGのFc領域に特異的な受容体を有しており、本出願者らは、これらの受容体はHPまたは補体のオプソニン化によりE CR1に結合したICのクリアランスに重要な役割を果たすと考えた。従って、Fab'フラグメントを生じるように消化したIgG抗体を用いることで、Fc領域を欠くHPを調製した。次に、どのような改変がサルの血液循環中の131I標識バクテリオファージΦX174の処置に影響を及ぼすかを判定するためにこれらの改変HPを調べた（図9)。注入したHP(7G9 x 7B7、Fab'フラグメント、図9、上の軸の左側の矢印、48分)はΦX174とEを強固に結合させることができたが、このΦX174はEから除去されず、すなわちこれは、まさにFc認識が移行反応に重要であることの証拠をもたらすものであった。さらに、Eと結合した基質のクリアランスが遅く、かつ安定性が高いことは、血液循環へと戻るEと結合したカウント数の多さによって明らかにされているように、血管からのバクテリオファージの回収を明らかに促進した。ΦX174は多価粒子であり、従って、Fab'含有HPによる結合を受けないΦX174上のさらなるエピトープと結合すると考えられる全体IgG mAb 7B7を用いてクリアランスを促進することができるはずである。実際、88分時点でmAb 7B7を注入したところ(図 9、上の軸の右側の矢印)、Eと結合した物質の除去が促進され、該物質はFc含有HPに関して見られたものと同程度の速度で排除され、肝臓に局在した(図8)。
【０１５７】
Eと結合したICについての、HPにより媒介されるクリアランスと天然C3bにより媒介されるクリアランスの間での推定される類似性を評価するため、ΦX174で免疫化したサルで別の実験を行った。この動物はサルΦX174に特異的な血液循環中のIgG抗体を有しており、in vitroにおける予備実験でこの動物の血清がΦX174とサルEとの免疫粘着をサポートすることが確認された。131I標識バクテリオファージΦX174をこの免疫化サルに注入したところ、該バクテリオファージはすぐにEと結合し、その後はHPにより媒介されるクリアランスのものと同様の動態プロフィールにより、血液循環から急速に排除され、かつ肝臓に局在した(図10)。また、HP処理した動物で見られたのと同様(図8)、Eと結合したICが遊離して血漿中へ戻ることはほとんどなかったことに着目することも重要である。おそらく、移行反応が起こる場合には、Eとアクセプターマクロファージの間の結合は弱く(図1)、従ってCR1が切断された後、遊離した物質はアクセプターマクロファージによって直接取り込まれる。
【０１５８】
この実験は、免疫動物において、特定の病原体などの多価抗原が免疫粘着反応によって迅速にEと結合し、その後、食細胞により血液循環から除去される。図8および9はEと結合しているΦX174のクリアランスのよく似たパターンを示しているが、結合は、HPの作用により、または補体のオプソニン化により、達成されたものである。本発明者らは、実際上、両ケースにおいて同じクリアランス機構が用いられたことを示唆する。Nelsonによって予見されたように、「白血球」(この場合は肝臓マクロファージ)は「赤血球表面を調べ」、E上の特異的部位、すなわちFcを含むICと結合した後、CR1を切断し、ICをインターナライズしたことから、それによって「正常に見える赤血球をそのままに残す」ことが可能になった。この機構をさらに支持するものとして、全てのin vivoクリアランス実験で、Eの平均血球体積はHPにより媒介されるクリアランスの前後で変わらないということが着目される。このように、移行反応は、Eをそのままに残して結合基質を除去する局部的食作用と考えるのが最もよい。
【０１５９】
HPそれ自体は、2つのIgG分子から構成されるという点で極めて単純なICを形成している。E CR1はクラスター状に構成されるので、多量のHPがEと結合した際に、CR1のクラスター領域が局部的に高密度のHPを有するようになることがあり、これはICとして認識される。実際、フローサイトメトリーでは、E CR1の90%超を占めるに十分な量のHPをサルに注入した場合(2200 CR1/E)、半分を超える量のHPが24時間内にEから排除され、これに伴うこのクリアランスはCR1の約50%の喪失であった。ここでもこれらの結果は、HPがCR1のタンパク質分解を受けて排除されるという協調反応と最も一致している。
【０１６０】
9. 実施例4
以下の実施例はヘテロポリマー複合体が霊長類の血液循環からウイルス病原体を除去する能力を有することを証明するものである。
【０１６１】
デング熱ウイルスの表面E糖タンパク質に特異的な高親和性IgG1マウスmAb 9D12を用いて適切なHPを調製した(the Walter Reed InstituteのDr. Alan KingがモノクローナルAbを提供)。このmAbを用いて構築したHPはデング熱ウイルス(DV)血清型2の弱毒化株とヒトEおよびサルEとの結合を85〜90%促進した。これらの結合およびクリアランス実験(下記参照)の全てで、DV粒子はRT-PCRアッセイで定量した。カニクイザルにおける急性ウイルス血チャレンジ研究では、HPは、DVをサルの血液循環中に注入した際にDVを捕捉し、それと結合することができることが示された。注入されたDVのEとの結合およびクリアランスの動態からは、本発明者らが観測した全般的な傾向を示す実験で見られたような、非常に興味深いストーリーが明らかになった(図11A)。HPの不在下でDVを連続注入したところ、血流中のDVはかなり低い定常レベルに至り、注入を止めた後にはウイルスは急速に排除されたが、この実験では排除されたウイルスの局在部位は明らかにされていない(図11A。最初の12分間)。注入の際、注入ウイルスの約50%が細胞と結合しており、本発明者らはこのレベルの非特異的結合の変動が大きいことを見出した。すなわち、in vitro実験では、ヒトEに対してもサルEに対してもDVの非特異的結合は10〜15%であることが示されている。
【０１６２】
DV注入を中断してから1時間後、HPを注入した。Eと結合したDVの量は最初の数分内に劇的に増加し、続いてゆっくり低下した(図11Aの120〜210分)。この回復は、血管内皮細胞に接着しており、従ってEと結合したHPによる連結に利用することができたDVを表しているものと思われる。Eと結合したHPのDVを捕捉する能力は、HP処理したサルに2回目の連続DV注入により抗原チャレンジを行った際に特によく例証される(図11A、210分で開始された)。血液循環中で実証され得る定常レベルのDVは、ほとんど100倍増加し、このDVはこのときには全てEと結合している。ウイルス注入を終了した後、Eと結合した物質は比較的遅い速度ではあるが、排除される。
【０１６３】
これらの実験は、Eと結合したHPがDVと結合し、血液循環からこれを排除することができることを示しているが、取り組むべき問題は多く残っている。2回目のDV感染の重篤な症例では、デング出血熱(DHF)またはデングショック症候群（DSS)が起こる可能性があり、血中のウイルスレベルは108粒子/mlを超えることがありうる。従って、このE-HP系は多量のDVと結合できなければならない。さらに、Eと結合したDVは固定化組織マクロファージに移行した後に食作用を受けて破壊されるということが決定的に重要である。移行したDVの運命はアクセプターマクロファージにより取り込まれる際のプロセスの詳細によって異なると思われ、そのため、この反応におけるFc受容体の役割は特に重要なはずである。in vitroおよびin vivo研究では、この移行反応がFc受容体によるIC認識に依存することが示されており、移行反応を阻害する際の特異的mAbの作用に基づいて、特にFcγRIの結合が最も効率的かつ迅速な移行を確保しうることが予測される。IgG2aマウスmAbはFcγRIと高い親和性で結合し、従って、マウスIgG2a抗DV mAbを用いて調製した特異的HPを伴ってEと結合したDVは、マウスIgG1イソ型を用いて調製したHPよりも迅速に血液循環から排除されるであろう。
【０１６４】
CDCのDr. John Roehrigから厚意により提供されたDVのE-糖タンパク質に特異的なIgG2a mAb(Virology 1998; 246: 317-328)、およびこれらのmAbを用いる（上記第6節に記載の方法に従って調製した）HPは、多量のDVとヒトE(示されていない)およびサルE(表V)の双方とを結合させることができたことから、これはこの系の量的能力という第一の重要な問題に取り組むものである。このデータに基づけば、このHPはin vivoにおいて109を超える粒子/mlとEとを結合させることができるはずである。これについて、mAb 1A1D-2を用いて調製したHPに着目したが、これはこのIgG2a mAbがDVのE糖タンパク質上の、mAb 9D1と同じエピトープと結合するためである。さらに、非常に重要なことであるが、in vitroにおける較正実験でもまた、IgG2a mAb 1A1D-2を用いて調製したHPが、同等の投入量で、mAb 9D12を用いて調製したHPよりも多くのDVとEとを結合させることが示された(表V参照)。
【０１６５】
mAb 1A1D-2を用いて調製した新しいHPの、血中でDVとEとを結合させ、そのクリアランスを促進する能力を調べるために、サルにおいてさらに2つの抗原チャレンジ実験を行った。図11B、11Cに示される実験条件(図11Cの3回目のDV注入以外)は、HPの使用量、ならびにDV注入のレベルおよびタイミング以外は図11Aのものと全く同じであった。
【０１６６】
2005504741.tif 000007
a5 x 107サルEを、過剰なHPでフランキングさせ(franked)、洗浄し、2.5 x 107DV粒子とともに全量15μlでインキュベートした。
b平均値±SD、n=4
cmAb 7G9はIgG2aであり(Fergusonら, 1995, Arthritis Rheum 38:190)、mAb 9D12はIgG1である(Gentryら, 1982, Am. J. Trop. Med. Hyg 31:548)。
dIgG2a(Roehrigら, 1998, Virology 246:317)、mAb 9D12と同じ特異性。
eIgG2a(Roehrigら, 1998, Virology 246:317)
【０１６７】
図11Aと、図11Bおよび11Cを比較すると、HP注入前には、３匹のサル全てで、血流中のDV提示パターンは全く同じであったことが示されている。しかし、サル11Bおよび11Cを、1A1D-2 IgG2a mAbを用いて調製したHPで処理した後には、いくつかの新しい傾向が明らかである。第１に、HP注入後に血流中にわずかながらDVが逆戻りすることがあったが、この逆戻りしたDVは再びEと結合したことである。第２に、HP処理後、DVを再び抗原チャレンジした際に到達した定常状態プラトーが、サル11Bおよび11Cでは著しく低かったことである。最後に、DV注入を終了した後、血液循環中のDVレベルが極めて急速に低下し、検出限界に達したことである。HP処理後に2回抗原チャレンジしたサル11Cでさえ、同じ傾向が現れている。
【０１６８】
これらの知見に対して1つのありうる説明としては、mAb 1A1D-2を用いて調製したHPは確かではないがおそらく、mAb 9D12を用いて調製したHPとは異なるエピトープでDVと結合するということである。しかし、in vitro較正(表V)では、この新規なHPが少なくとも9D12 HPと同様にDVと結合することを示し、そして同じエピトープが認識されるというその事実は、この新規なHPの、DVを認識し、それと結合し、それを脈管構造から回収する能力が9D12 HPのそれに確実に匹敵するはずであることを示す。図11Bおよび11Cに示された結果は、IgG2a抗DV mAbを用いて調製されたHPがより迅速なクリアランスを促進するという推測と一致する。すなわち、HPの注入後、DVはEとの結合を回復した一方で、Eと結合したDVの定常レベルはかなり低かったのだが、これはおそらくそれが急速に排除されたためである。HP処理後に動物にDVを用いて抗原チャレンジを行ったところ、ウイルスの連続注入中、Eと結合したDVの定常レベルは、ここでもまたEからの急速な除去のため、より低いものであった。最後に、DV注入を終了した後は、予測されたように、Eと結合した残存ウイルスが急速に排除された。
【０１６９】
異なる血清型のDVによる2回目の感染の結果はよく知られており、特に抗体レベルが低い場合に宿主抗体とDVとの結合が単球／マクロファージの感染を増加させ、DHFおよびDSSをはじめとする最も有害な病態を促進すると確信させるに十分な理由がある。1つの重要な問題はこの反応におけるFc受容体の役割に関するものである。ΦX174を用いたin vivoおよびin vitroにおける研究に基づき、本発明者らは、血流中のウイルスが十分な数のHPを用いてオプソニン化され、E CR1と結合すれば、上述のように、移行反応の際のプロセシングがその食作用および破壊をもたらすことを示唆する。すなわち、Eと結合したHP-ウイルス複合体のプロセシングおよび分解は、最初にNelsonが記載したEと結合したオプソニン化多価病原体のプロセシングの天然経路に従うはずである。
【０１７０】
本発明は挙げられた実施形態によりその範囲を限定されるものではなく、これらの実施形態は本発明の一態様を例示するものである。実際、当業者ならば、以上の説明および付属の図面から、本明細書に示され、記載されたものの他に本発明の種々の改変が明らかであろう。このような改変も付属のクレームの範囲内に含まれるものとする。
【０１７１】
本明細書に挙げられた全ての特許および刊行物は参照によりその全開示内容を本明細書に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】移行反応に関して提案した機構の模式図である。
【図２】in situでE CR1上に形成されたICの血液循環からの排除を示すグラフである。
【図３】HPまたは血清により媒介される、PAO1とヒトE又はサルEとの結合パーセントのフローサイトメトリー測定の結果を示す図である。
【図４−１】HPにより媒介される、GFP-PAO1と、CVF処理したカニクイザルのEとの結合を示すグラフである。
【図４−２】HPにより媒介される、GFP-PAO1と、CVF処理したカニクイザルのEとの結合を示すグラフである。
【図５−１】HPにより媒介される、GFP-PAO1と、補体を十分にもつサルのEとの結合を示すグラフである。
【図５−２】HPにより媒介される、GFP-PAO1と、補体を十分にもつサルのEとの結合を示すグラフである。
【図６】2匹のカニクイザルの血液循環におけるGFP-PAO1の処置を示すグラフである。
【図７】2匹のカニクイザルの血液循環中のTNF-αおよびIL-1βレベルに対するGFP-PAO1注入の影響を示すグラフである。
【図８】雄のスタンプテールマカクザルの血液循環からの131I標識ΦX 174のHP媒介性のクリアランスを示すグラフである。
【図９】注入されたFab'X Fab'HPは全IgG抗ΦX174 mAbを続いて注入しない限りクリアランスを媒介しないとの結果を示すグラフである。
【図１０】ΦX174に特異的な抗体を血液循環中に有する雄カニクイザルの血液循環中に注入された131I標識ΦX174の、肝臓に対する自発的クリアランスを示すグラフである。
【図１１】カニクイザルにおける、HPにより媒介されるE結合およびDVのクリアランス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
2005504741.tif 000011
【図４−２】
2005504741.tif 000012
【図５−１】
2005504741.tif 000013
【図５−２】
2005504741.tif 000014
【図６】
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【図７】
2005504741.tif 000016
【図８】
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【図９】
2005504741.tif 000018
【図１０】
2005504741.tif 000019
【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504741.tif 000099
2005504741.tif 000100
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【国際調査報告】
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