(57)【要約】本発明は、軽鎖を欠き、そして少なくとも１つの重鎖抗体の可変ドメインを含む新規免疫コンジュゲートに関する。本発明の免疫コンジュゲートを用いて腫瘍を処置するための医薬品を調製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖を欠き、そこに付着した抗腫瘍物質を有する、重鎖抗体の少なくとも１つの可変ドメインを含み、腫瘍抗原に特異的に結合し、更に上記腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の成長を阻止し、そして腫瘍塊の縮小を導くことを特徴とする免疫コンジュゲート。
【請求項２】
上記腫瘍塊の縮小が、少なくとも５０％である、請求項１記載の免疫コンジュゲート。
【請求項３】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合する、請求項１または２記載の免疫コンジュゲート。
【請求項４】
上記単一ドメイン重鎖抗体が、ラクダ科動物に由来する、請求項１、２、または３記載の免疫コンジュゲート。
【請求項５】
上記抗腫瘍物質が、プロドラッグを活性化する酵素である、請求項１から４のいずれか１項記載の免疫コンジュゲート。
【請求項６】
上記酵素が、細菌のベータ・ラクタマーゼである、請求項５記載の免疫コンジュゲート。
【請求項７】
配列番号１５に示されるヌクレオチド配列または配列番号１６に示されるポリペプチド配列を有する、請求項３または６記載の免疫コンジュゲート。
【請求項８】
医薬品としての請求項１〜７のいずれか１項記載の免疫コンジュゲートの使用。
【請求項９】
免疫コンジュゲートにより認識される腫瘍マーカーを発現する腫瘍を処置するための医薬品の製造のための請求項１〜７のいずれか１項記載の免疫コンジュゲートの使用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項記載の免疫コンジュゲートを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軽鎖を欠き、重鎖抗体のそして少なくとも１つの可変ドメインを含む新規免疫コンジュゲートに関する。本発明の免疫コンジュゲートを用いて腫瘍を処置するための医薬品を調製することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞毒性物質の全身投与は、多くの場合、体内の正常細胞および排除しようとしている腫瘍細胞を死滅させるので、これらの物質を腫瘍細胞に選択的に送達するのが望ましい。標的化された薬物送達系は、細胞毒性物質を癌性細胞に直接送達するためのメカニズムを提供する。現在使用されている抗腫瘍物質送達系は、典型的には腫瘍特異的抗体にコンジュゲートされた細胞毒性物質を利用して免疫コンジュゲートを形成する。この免疫コンジュゲートは腫瘍細胞に結合し、そしてそれにより細胞毒性物質を腫瘍部位に「送達」する。抗体基盤の腫瘍標的化治療の分野における基本的な研究は、十分に限定的な組織発現パターンを有する表面抗原を同定し、腫瘍組織における抗体の選択的および特異的蓄積を可能にする展望により長年推進されている。これらの標的系において利用される免疫コンジュゲートには、抗体−薬物複合体および抗体−毒素複合体などがある。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方をこれらの免疫コンジュゲートで利用している。これらの免疫コンジュゲートにおいて用いられる薬物には、ダウノマイシン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、およびビンデシンなどがある。抗体−毒素複合体において用いられる毒素には、細菌性毒素、例えばリシンおよびPseudomonas aeruginosaエクソトキンＡなどがある。治療目的のための免疫コンジュゲートの使用を志向する研究の量にかかわらず、これらの送達研究法に関与するいくつかの制限が明らかになっている。例えば、細胞表面での腫瘍関連抗原の数およびいずれかの特定の抗体分子に付着できる薬物分子の数により課せられる制限のために、細胞を死滅させるために必要な多量の薬物を標的腫瘍細胞に送達することが、多くの場合達成されない。この制限のために、これらの複合体における更に強力な細胞毒性物質、例えば植物毒素の使用、および非常に高度な薬物多重率を有する重合体結合抗体−薬物複合体の開発に至っている。しかしながら、たとえ薬物負荷率を大きくするかまたは強い毒素を使用しても、多くの免疫コンジュゲートは、依然最適には及ばない細胞毒性活性を示し、そして利用可能なすべての抗原性部位が飽和している用量でも完全な死滅を起こすことができない。免疫コンジュゲートの細胞毒性活性が、複合体の抗体成分により媒介される免疫コンジュゲートの腫瘍細胞への取り込みに、多くの場合依存することも認識されている。薬物が、細胞内作用部位を有している抗体−薬物複合体を用いる場合か、または抗体−毒素複合体を用いる場合、この内在化が重要である。しかしながら、大部分の腫瘍随伴抗原、およびしたがってこれらの抗原に結合した抗体−薬物複合体または抗体−毒素複合体は内在化されない。内在化されるこれらの複合体は、多くの場合、薬物または毒素が分解される細胞のリソソームに輸送される。したがって、抗体−薬物複合体または抗体−毒素複合体は、優れた腫瘍結合特性を有し得るが、それにもかかわらず複合体は細胞内のその作用部位に到達することができないために、細胞毒性利用が制限される可能性がある。これらの欠点のために、現在利用される抗腫瘍物質または毒素送達系は、特にインビボ処置で用いられる場合、成功例が限られている。高い免疫性、正常器官への分布��および固形腫瘍の低浸透性に起因するほとんどのマウス抗体の重大な制限もまた臨床試験により実証されている。遺伝子操作技術の最近の進歩と共に、古典的抗体の特異性および親和性を保持しているより小型の結合ユニットを得るため、および／またはマウス分子の免疫原性を低減させる（「ヒト化」）ために抗体を構築するかまたは操作するために大きな努力が為されている（Hudson(1998)）。免疫グロブリン重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）の対からなる可変フラグメント（Ｆｖ）は、従来の抗体から得ることができる最も小さく、無傷の抗原結合フラグメントである。しかしながら、組換え１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であるＦｖ、すなわちＶＨおよびＶＬドメインが可動性オリゴペプチドリンカーにより繋ぎ止められているＦｖを生成するのが更に都合がよい（Birdら(1988)）。免疫治療の可能性を広げるために、例えば腫瘍細胞をＴもしくはＮＫ細胞のいずれかと架橋する２つの異なるｓｃＦｖ（二重特異性抗体）、またはプロドラッグとして作用するために毒素もしくは酵素に付着させたｓｃＦｖを連結させることにより、更に複雑な構築物が設計されている（Hudson(1999)）。しかしながら、いくつかのこれらのｓｃＦｖ基盤の構築物は、発現および精製が困難であることが判明し、そしてその機能においていくつかの深刻な欠点を呈した。共通のハードルは、オリゴペプチドリンカーの存在に因る凝集を形成する傾向、タンパク質分解性切断に対するリンカーの感受性、および続く抗体構築物のアンフォールディングであった（Whitlowら(1993))。
【０００３】
ラクダ科動物で見出された軽鎖およびＣＨ１ドメインを欠く自然発生重鎖抗体（Hamers-Castermanら(1993)）は、この点で有望な代替物を構成する可能性があるが、これらは免疫コンジュゲートとして評価されたことがなかった。ラクダ科動物が、多量の軽鎖を欠く機能的重鎖抗体を有するという観察により、その可変ドメイン（ＶHＨ）から機能的な単一ドメイン抗体フラグメント（ラクダ単一ドメイン抗体のためのｃＡｂと称される）を作製するための基礎が造られた（Ghahroudiら(1997); Lauwereysら(1998)）。これらの小型分子はうまく発現され、そして多くの場合、ｓｃＦｖで遭遇する可溶性、凝集および分解の問題を広い範囲で打破することが示された。更にこれらは、その対応する抗原に対して良好な特異性を示し、そしてｓｃＦｖに匹敵する親和性を伴って得られる（MuyldermansおよびLauwereys(1999); RiechmannおよびMuyldermans(1999)）。しかしながら、関係する多くの複雑なパラメーター（腫瘍標的化の効率、内在化の効率、腫瘍死滅化の効率、免疫原性、発現の問題）のために、特定のクラスの免疫コンジュゲートが成功するかしないかを予測することができない。本発明者らは、ラクダ可変重鎖抗体および酵素の間の融合物である免疫コンジュゲートを構築し、そして驚くべきことにこれらの免疫コンジュゲートは、既存の免疫コンジュゲートと比較した場合、例えば免疫原性の縮小および優れた腫瘍細胞死滅化などの優れたインビボ特性を有することが見出された。
【０００４】
〔本発明の目的および詳細な説明〕
本発明は、少なくとも１つの重鎖抗体の可変ドメインおよび抗腫瘍物質の融合を含む新規免疫コンジュゲートに関する。特定の免疫コンジュゲートが少なくとも１つの腫瘍抗原に関する特異性を有することが解っている。種々の腫瘍抗原または腫瘍マーカーが技術分野で公知であり、そしてこれらのマーカーを発現する腫瘍に対する治療を、特異的免疫コンジュゲートを用いて達成できることが提唱されている。「腫瘍」なる語は、癌腫、肉腫、リンパ腫、および白血病などの腫瘍性細胞成長のすべての形態に言及するものであると理解されている。したがって、本発明の免疫コンジュゲートは、抗腫瘍物質に連結されている重鎖抗体の可変ドメインを含む。「抗腫瘍物質」なる語法では、これは細胞毒性物質（毒素）であるかまたはプロドラッグを活性細胞毒性物質に変換することができる酵素に対する語であると理解されている。本発明では、免疫コンジュゲートは、いずれの軽鎖も欠いているが、少なくとも１つの重鎖抗体を含む。好ましくは、重鎖抗体の可変ドメインはラクダ科動物に由来するが、その他の種（例えばマウス、ヒト）に由来することもできる。上記重鎖抗体の可変ドメインは、それに付着した抗腫瘍物質を有する。抗体は、その腫瘍マーカー（その標的）と良好な親和性を有しているのが望ましい。抗体が、一度その標的に到達すると、望ましい結果、例えば細胞毒性が達成されるのに十分な長時間、その標的に結合したままであるためにこれは必要である。加えて、非標的抗原に対する結合が、何ら有意な程度で生じないように、抗体は、標的抗原に関して良好な特異性を有していなければならない。
【０００５】
このように最初の実施態様では、本発明は、軽鎖を欠き、腫瘍抗原と特異的に結合し、そこに付着した抗腫瘍物質を有する、重鎖抗体の少なくとも１つの単一ドメイン可変ドメインを含み、更に上記腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の成長を阻止することを特徴とする免疫コンジュゲートを提供し、そして腫瘍塊の縮小を導く。「成長を阻止する」なる語法は腫瘍の縮小、腫瘍における壊死損傷の誘導、腫瘍死の誘導および腫瘍の成長停止を含む。好ましい実施態様では、腫瘍塊の縮小は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、および優先的には９０％以上である。
【０００６】
単一ドメイン可変重鎖抗体および、例えば酵素または毒素を変換するプロドラッグの間のコンジュゲーション（もしくはカップリング）を化学的結合により、または双方のパートナーをコードする核酸配列と一緒にスプライシングすることにより行なうことができる。
【０００７】
特定の実施態様では、免疫コンジュゲートは二価であり、そして２つの重鎖の一価可変ドメインと一緒に化学的結合により、または組換えＤＮＡ技術により形成される。また免疫コンジュゲートは、二重特異性であり、そして各々が異なる腫瘍マーカーに特異的である、重鎖の２つの可変ドメインを一緒に結合することによりそれを形成することができる。
【０００８】
別の実施態様では、本発明は、軽鎖を欠き、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的に結合するが、少なくとも１つの重鎖抗体の可変ドメインを含み、そこに付着した抗腫瘍物質を有し、そして更にＣＥＡを発現する腫瘍細胞の成長を阻止することを特徴とする免疫コンジュゲートを提供する。
【０００９】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、癌画像化および治療のためのマーカー抗原として使用されている。異なる特異性および親和性を有する多くのＣＥＡ抗体が、技術分野で公知である。最適な抗ＣＥＡ抗体は、高比率および高量の抗体がその他の体組織よりも腫瘍に局在する抗体であり、そしてこれは「特異的に結合する」と称される。好ましくは、非特異的抗体局在化は観察されない。抗ＣＥＡ免疫コンジュゲートの特異性は、それがヒト結腸直腸癌に結合するが、以下のいくつかまたはすべての正常組織：肝臓、腎臓、大腸、扁桃腺、肺、脳、睾丸、卵巣、子宮、乳房、血液塗抹標本、胎盤、脾臓、胸腺、食道、胃、膵臓、リンパ節、および骨格筋には結合しないようなものが好ましい。
【００１０】
本発明による免疫コンジュゲートは、抗腫瘍物質に連結された重鎖抗体の少なくとも１つの可変ドメインを含む。これにより抗体が抗腫瘍物質を腫瘍に標的化させることができ、したがって腫瘍の成長の阻止、好ましくは腫瘍の損傷、破壊、および／または死滅という結果に至る。このように、免疫コンジュゲートは人体または動物体の処置の方法において使用するのに適している。特に、ＣＥＡに関して特異性を有する免疫コンジュゲートは、結腸直腸腫瘍を処置するための医薬品の製造における使用に適している。抗体に連結された抗腫瘍物質は、抗体が結合している腫瘍か、または抗体が結合している細胞の環境にある腫瘍を阻止、破壊、損傷、または死滅させるいずれかの作用物質であることができる。例えば、抗腫瘍物質は、毒性物質、例えば化学療法剤、放射性同位元素、プロドラッグ、またはサイトカインを活性化する酵素であることができる。適当な化学療法剤は、当業者に公知であり、そしてアントラサイクリン（例えばダウノマイシンおよびドクソルビシン）、メソトレキセート、ビンデシン、ネオカルジノスタチン、シスプラチナム、クロラムブシル、シトシン・アラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシン、およびカリケアミシンなどがある。技術分野で公知の従来の方法を用いて化学療法剤を抗体にコンジュゲートさせることができる。抗腫瘍物質として使用するのに適した放射性同位元素もまた当業者に公知である。例えば131Ｉまたはアスタチン、例えば211Ａｔを用いることができる。技術分野で公知の従来の方法を用いてこれらの同位元素を抗体に付着させることができる。抗体に付着している抗腫瘍物質は、またプロドラッグを活性化する酵素であることができる。これにより、いわゆる「抗体指向性酵素プロドラッグ治療」（ＡＤＥＰＴ）で行なわれるように、腫瘍部位における不活性プロドラッグのその活性、細胞毒性形態への活性化が可能になる。臨床治療では、抗体−酵素複合体を患者に投与し、そして処置すべき腫瘍の領域に局在させる。次いで局在する酵素の影響下で細胞毒性薬への変換が、処置すべき腫瘍の領域に局在するようにプロドラッグを患者に投与する。１つの酵素は、細菌のカルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）であり、その使用については、例えば国際公開公報第８８／０７３７８号に記載されている。別の細菌の酵素はベータ・ラクタマーゼであり、その使用については米国特許第５７７３４３５号に記載されている。体内の腫瘍の近傍でない部分からのクリアランスを加速させるために、抗体−酵素複合体を国際公開公報第８９／００４２７号の教示にしたがって修飾することができる。体内の腫瘍の近傍でない部分で酵素を不活性化する別の成分を提供することにより抗体−酵素複合体を国際公開公報第８９／００４２７号にしたがって使用することもできる。抗体にコンジュゲートされる抗腫瘍物質は、サイトカイン、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）でもよい。その他の組織に影響を及ぼすことなく、サイトカインが腫瘍への損傷または破壊を媒介するように抗体は腫瘍を標的化する。従来の組換えＤＮＡ技術を用いてＤＮＡレベルでサイトカインを抗体に融合させることができる。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、軽鎖を欠き、腫瘍抗原に特異的に結合するが、ラクダ科動物に由来する少なくとも１つの重鎖抗体の可変ドメインを含み、そこに付着した抗腫瘍物質を有し、そして更に上記腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の成長を阻止することを特徴とする免疫コンジュゲートを提供する。
【００１２】
本発明では、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体の可変ドメインをＶHＨと称する。
【００１３】
別の実施態様では、本発明は、軽鎖を欠き、ＣＥＡに特異的に結合するが、ラクダ科動物に由来する重鎖抗体の少なくとも１つの可変ドメインを含み、そこに付着した抗腫瘍物質を有し、そして更にＣＥＡを発現する腫瘍細胞の成長を阻止することを特徴とする免疫コンジュゲートを提供する。
【００１４】
「ラクダ科動物」のファミリーでは、軽ポリペプチド鎖を欠く免疫グロブリンが見出されている。「ラクダ科動物」は、旧世界ラクダ科動物（Camelus bactrianusおよびCamelus dromaderius）および新世界ラクダ科動物（例えばLama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna）を含む。欧州特許第０６５６９４６号はラクダ科動物免疫グロブリンの単離および使用について記載し、そして出展明示により本明細書の一部とする。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は、軽鎖を欠き、腫瘍抗原に特異的に結合するが、重鎖抗体の少なくとも１つの可変ドメインを含み、そこに付着したプロドラッグを活性化する酵素を有し、そして更に上記腫瘍マーカーを発現する腫瘍細胞の成長を阻止することを特徴とする免疫コンジュゲートを提供する。
【００１６】
特定の実施態様では、酵素は、細菌のベータ・ラクタマーゼである。
【００１７】
更に特定の実施態様では、免疫コンジュゲートは配列番号１５に示すヌクレオチド配列および配列番号１４に示すアミノ酸配列を有する。
【００１８】
別の実施態様では、本明細書に記載した免疫コンジュゲートを医薬品として使用することができる。
【００１９】
別の実施態様では、本発明により提供される免疫コンジュゲートを免疫コンジュゲートにより認識される腫瘍マーカーを発現する腫瘍を処置するための医薬品の製造のために使用することができる。
【００２０】
更に別の実施態様では、本発明は、本発明の免疫コンジュゲートを含む薬学的組成物を提供する。
【００２１】
「処置するための医薬品」なる用語は、本明細書に記載する疾患を処置または予防するための、先に記載した免疫コンジュゲートおよび薬学的に許容され得る担体または賦形剤（双方の用語を互換的に用いることができる）を含む組成物に関する。先に記載したような免疫コンジュゲートまたはその薬学的に許容されるその塩の投与を、経口、吸入、または非経口投与によることができる。
【００２２】
活性化合物を単独で、または好ましくは薬学的組成物として処方して投与することができる。免疫コンジュゲートにより認識される抗原を発現する腫瘍を処置するのに有効な量は、通常の因子、例えば処置される障害の性質および重篤度ならびに哺乳動物の体重に依存する。
【００２３】
しかしながら、通常、単位投与量は、免疫コンジュゲートまたは薬学的に許容され得るその塩の０．０１から５０mg、例えば０．０１から１０mg、または０．０５から２mgの範囲である。単位投与量を１日１回またはそれ以上、例えば１日２、３、または４回、更に通常は、１日１から３回、１日量が通常０．０００１から１mg/kgであるように、したがって適当な１日量は７０kg成人に関しては、０．０１から５０mg、例えば０．０１から１０mg、更に通常は０．０５から１０mgの範囲であるように投与する。化合物または薬学的に許容され得るその塩を単位投与量組成物、例えば単位投与量経口、非経口、または吸入組成物の形態で投与するのが非常に好ましい。かかる組成物を混合により調製し、そして経口、吸入用、または非経口投与用に、適宜適当に適合させ、そして錠剤、カプセル、経口液体調製物、粉末、顆粒、糖衣錠、再構築用粉末、注射用、および注入用溶液もしくは懸濁液もしくは坐薬、またはエアロゾルの形態にできる。通常、経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位投与量で提示し、そして従来の賦形剤、例えば結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、着香剤、および湿潤剤を含有する。技術分野で公知の方法にしたがって錠剤をコートすることができる。
【００２４】
使用に適した充填剤にはセルロース、マンニトール、ラクトース、およびその他の類似の作用物質などがある。適当な崩壊剤にはデンプン、ポリビニルピロリドン、およびデンプン誘導体、例えばデンプングリコレートナトリウムなどがある。適当な滑剤には、例えばステアリン酸マグネシウムなどがある。適当な薬学的に許容され得る湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムなどがある。混和、充填、錠剤化等の従来の方法によりこれらの固体経口組成物を調製することができる。多量の充填剤を用いて混和操作を繰り返し行い、活性物質をこれらの組成物全体に送達することができる。かかる操作はもちろん技術分野で慣用されている。経口液体調製物を例えば水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳液、シロップ、またはエリキシルの形態にできるか、または使用前に水もしくはその他の適当なベヒクルで再構成するための乾燥製品として提示することができる。かかる液体調製物は従来の添加剤、例えば懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、または硬化食用脂、乳化剤、例えばレシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアカシア；非水性ベヒクル（食用油を含んでよい）例えば扁桃油、ヤシ油、油状エステル、例えばグリセリンのエステル、プロピレングリコール、またはエチルアルコール；保存剤、例えばメチルもしくはプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸、および望む場合、従来の着香剤、または着色剤を含有することができる。経口処方は従来の徐放処方、例えば腸溶コーティングを有する錠剤または顆粒をも含む。好ましくは、吸入用の組成物は吹入剤のような気道への投与用、またはネブライザー用のエアロゾルもしくは溶液、または吸入用微細粉末として、単独でまたは不活性担体、例えばラクトースと組み合わせて提示される。このような場合、活性化合物の粒子の直径は５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、例えば１および５ミクロンの間、例えば２および５ミクロンの間であるのが適当である。好ましい吸入用量は０．０５から２mg、例えば０．０５から０．５mg、０．１から１mgまたは０．５から２mgの範囲である。非経口投与用には、本発明の化合物および滅菌ベヒクルを含有する液体単位投与形態を調製する。ベヒクルおよび濃度に依存して、活性化合物を懸濁または溶解のいずれかにすることができる。通常、化合物をベヒクル中に溶解し、そして滅菌濾過した後、適当なバイアルまたはアンプルに充填し、そして密閉することにより非経口用溶液を調製する。有利には、補助剤例えば、局所麻酔剤、保存剤、および緩衝剤をもベヒクルに溶解する。安定性を強化するために、バイアルに充填した後、組成物を凍結させ、そして真空下で水を除去することができる。化合物をベヒクルに溶解する代わりに懸濁し、そして滅菌ベヒクルに懸濁する前にエチレンオキシドに暴露することにより滅菌する以外は、実質的に同一の様式で非経口用懸濁液を調製する。
【００２５】
有利には、界面活性剤または湿潤剤を組成物に含めて、活性化合物の均一な分布を促す。適当な場合、少量の気管支拡張薬、例えば交感神経様作用アミン、例えばイソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリン、およびエフェドリン；キサンチン誘導体、例えばテオフィリンおよびアミノフィリン、ならびにコルチコステロイド、例えばプレドニゾロンおよび副腎刺激剤、例えばＡＣＴＨを含めることができる。一般に行なわれているように、通常、組成物には、医薬的処置に関する使用のために書かれた、すなわち印刷された指示書が添付される。
【００２６】
本発明は、更に薬学的に許容され得るその塩、または薬学的に許容され得るその溶媒和物、および必要な場合、薬学的に許容され得るその担体を含む、本明細書に記載された障害の処置および／または予防に用いるための薬学的組成物を提供する。
【００２７】
腫瘍に対する本発明の治療方法を技術分野で公知のいずれかその他の治療、例えば照射、化学療法、または外科手術と組み合わせて用いることもできることは明白である。
【００２８】
以下の実施例は、本発明の好ましい特徴を更に十分に説明するが、本発明をいかなるようにも限定することを意図するものではない。以下に開示するすべての出発物質および試薬は、当業者に公知であり、市販のものを入手するか、または周知の技術を用いて調製することができる。
【実施例１】
【００２９】
ラクダ単一ドメイン：：β−ラクタマーゼ複合体の構築および精製
いくつかの抗ＣＥＡラクダ単一ドメインＶＨおよびＶHＨ抗体を免疫ファージ・ディスプレイ・ライブラリーから回収した。ＦＡＣＳ分析を実施して、これらの抗体の、ＬＳ１７４Ｔ細胞で発現されたＣＥＡを認識する能力を分析した（ヒトＬＳ１７４Ｔ腺癌細胞系はＡＴＣＣ（Manassas、バージニア州）から入手した）。ＬＳ１７４ＴはＬＳ  １８０結腸・腺癌細胞系のトリプシン処理した変種であり、そして多量の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を生成する。ＦＡＣＳプロファイルに基づいて、複合体の構築のためにＶHＨｓ  ｃＡｂ−ＣＥＡ３（アミノ酸配列に関して配列番号１、およびヌクレオチド配列に関して配列番号２）、ｃＡｂ−ＣＥＡ５（アミノ酸配列に関して配列番号３、およびヌクレオチド配列に関して配列番号４）、ｃＡｂ−ＣＥＡ６１（アミノ酸配列に関して配列番号５、およびヌクレオチド配列に関して配列番号６）およびＶＨ  ｃＡｂＣＥＡ７２（アミノ酸配列に関して配列番号７、およびヌクレオチド配列に関して配列番号８）を選択した。段階的様式でｃＡｂ−ＣＥＡ配列、ｌｌａｍａ  γ２ｃヒンジ（ＡＨＨＳＥＤＰＳＳＫＡＰＫＡＰ）領域配列（配列番号９）およびβ−ラクタマーゼ（ｂＬ）遺伝子を挿入し、続いて６×ｈｉｓタグをｐＨＥＮ６発現ベクターに挿入することによりｃＡｂ−ＣＥＡ−βラクタマーゼ複合体を構築した。ＰＣＲ増幅によりE.cloacae P99株から特定のｂＬをクローン化した。ｃＡｂ−ＣＥＡ／γ２ｃヒンジの増幅およびＮｃｏＩクローニングのために使用したプライマー配列は、
【００３０】
【表１】
2005517674.tif 000002
【００３１】
（順行プライマー）（配列番号１０）および
【００３２】
【表２】
2005517674.tif 000003
【００３３】
（逆行プライマー：γ２ｃヒンジを含む）（配列番号１１）である。
【００３４】
βラクタマーゼの増幅および位置指定ＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩクローニングのためには
【００３５】
【表３】
2005517674.tif 000004
【００３６】
（順行プライマー）（配列番号１２）および
【００３７】
【表４】
2005517674.tif 000005
【００３８】
（逆行プライマー：６×ｈｉｓタグコード化配列を含む）（配列番号１３）である。得られたｃＡｂ−ＣＥＡ−βＬ  ｈｉｓタグ化複合体を大腸菌（E. coli）で発現させ、そしてＩＭＡＣカラム（Ni-NTA Superflow、QIAGEN）で精製し、続いてSuperdex 75 HR 10/30カラム（Pharmacia）でゲル濾過した。βラクタマーゼにコンジュゲートされた抗リゾチームラクダ単一ドメイン抗体ｃＡｂ−Ｌｙｓ３をも設計し、そして更なる実験において非結合性対照として使用した。ｃＡｂ−Ｌｙｓ３抗体フラグメントの単離は依然に報告された（Ghahroudiら(1997)）。ｌａｃプロモーターの調節下、遺伝子を発現ベクターにＰｅｌ  Ｂリーダーシグナルおよびカルボキシ末端ヘキサヒスチジンテイルの間で再クローン化した（Lauwereysら、EMBO J 17: 3512-3520(1998)）。基質としてニトロセフィンを用いて複合体のｂＬ部分の酵素活性アッセイを行なった。ミカエリス−メンテン反応速度分析により、融合タンパク質はそれが誘導された酵素に由来する全酵素活性を保持することが確認された。
【実施例２】
【００３９】
ｃＡｂ−ＣＥＡ５−βＬ複合体を用いるインビトロ細胞毒性アッセイ
ウェルあたり全部で１０4個のＬＳ１７４Ｔヒト腺癌セル（１０％  ウシ胎仔血清含有ＥＭＥＭ  ０．１ml、１００単位／ml  ペニシリン、０．１mg/ml  ストレプトマイシン、１mM  ピルビン酸ナトリウム、および０．１mM  非必須アミノ酸）を９６ウェルマイクロタイタープレートに載せ、そして一晩付着させた。遮断実験用に、ｃＡｂ−ＣＥＡ−βＬ複合体と反応させる前に、細胞に非コンジュゲートｃＡｂ−ＣＥＡ５と共に０．１mg/mlで３０分間インキュベートした。次いで細胞を１、５および１０nMで複合体に暴露した。４℃で３０分の後、プレートを抗生物質不含、ウシ胎仔血清１０％含有ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、そして次に異なる量のプロドラッグＣＣＭ（７−（４−カルボキシ−ブタンアミド）セファロスポリン・マスタード）またはＰＤＭ（親薬物、フェニレンジアミン・マスタード）を加えた（構造に関しては図１参照）。複合体と反応させなかった細胞にＣＣＭおよびＰＤＭもまた加えた。本発明者らはDr. Peter Senter（Seattle Genetics, Inc.（Washington、米国）の化学部長）からインビトロ細胞毒性研究のためのプロドラッグＣＣＭおよび親薬物ＰＤＭを受け取った。３７℃で１時間の後、細胞をＥＭＥＭで洗浄し、そして２４時間インキュベートした。次いで細胞に［3Ｈ］チミジン（１μCi／ウェル）と共に３７℃で１８時間パルスを与え、凍結および解凍により剥がし、そして９６ウェル細胞ハーベスターを用いてグラスファイバーフィルターマット上に収集した。βプレートカウンターを用いて放射活性を計測した。種々の濃度の抗ＣＥＡ−βＬ複合体または非結合性対照としてｃＡｂ−Ｌｙｓ３−βＬを用いて別のセットの実験を実施した。複合体の暴露の後、細胞を固定量のＣＣＭと反応させた。２４時間のインキュベーションの後、細胞に１８時間パルスを与え、収集し、そしてβカウンターで放射活性を計測した。ＣＣＭプロドラッグと組み合わせた、コンジュゲートされたＶHＨ、ｃＡｂ−ＣＥＡ５−βＬ（アミノ酸配列に関しては配列番号１４、およびヌクレオチド配列に関しては配列番号１５）の細胞毒性効果（図２）を、ＣＥＡ抗原を発現するＬＳ１７４Ｔヒト腺癌細胞で決定した。細胞を複合体に暴露し、洗浄して非結合性材料を除去し、そして種々の量の２つの異なるバッチのＣＣＭ（ＣＣＭ１、ＣＣＭ２）と反応させた。未処置細胞に相対して［3Ｈ］チミジンのＤＮＡへの組み込みを測定することにより細胞毒性活性を決定した。プロドラッグＣＣＭはＬＳ１７４Ｔ細胞に対して親薬物ＰＤＭよりもおよそ４０倍毒性が少なかった。ｃＡｂ−ＣＥＡ５−βＬは用量依存的な様式でプロドラッグを効率よく活性化し、ＰＤＭに対する活性において同等の細胞毒性に至った。ｃＡｂ−ＣＥＡ５−βＬは融合タンパク質への暴露の前の非コンジュゲートｃＡｂ−ＣＥＡ５で飽和した細胞上で、限界レベルでＣＣＭを活性化するので、プロドラッグ活性化は免疫学的に特異的である。加えて、プロドラッグ活性化に関してｃＡｂ−ＣＥＡ−βＬ複合体の相対能力を比較するために、ＬＳ１７４Ｔ細胞を種々の量の複合体に暴露した。非結合性材料を洗い流し、そしてＣＣＭを固定濃度３μMで加えたが、これはβラクタマーゼ不在下で細胞毒性活性が低い。ｃＡｂ−ＣＥＡ５−βＬは用量依存的様式でプロド���ッグを効率よく誘導し、そして免疫学的に特異的であることが示された（図３、パネルＡおよびＢ）。コンジュゲートされていないｃＡｂ−ＣＥＡで飽和させることにより、またはＣＣＭの前に細胞を非結合性対照複合体、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３−βＬと反応させることによりプロドラッグ活性化の免疫学的特異性を実証した。予測されたように、ｃＡｂ−Ｌｙｓ３−βＬはプロドラッグＣＣＭを活性化しなかった。
【実施例３】
【００４０】
免疫原性研究
ｃＡｂ−酵素複合体に対する免疫応答を研究するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに細菌性酵素βラクタマーゼにコンジュゲートされたｃＡｂ−ＣＥＡ５抗体フラグメントで単一または複数のコースの静脈内処置を行なう（体重kgあたり免疫コンジュゲート１mg）。最後の処置コース後の７、１４、および６０日にＥＬＩＳＡによりマウス抗ラクダ抗体および抗βラクタマーゼ抗体の発達を分析する。マウスの血清に存在する抗βラクタマーゼ抗体をインビトロβラクタマーゼ活性を阻止するその能力に関して試験する。
【実施例４】
【００４１】
ＬＳ１７４Ｔ腺癌腫瘍異種移植片を担持するヌードマウスにおけるインビボ治療実験
４．１複合体局在
ＬＳ１７４Ｔ腫瘍異種移植片におけるｃＡｂ−ＣＥＡ５：：βラクタマーゼ複合体の局在の程度を明らかにするためにヌードマウスで研究を行なった。直径約０．５から１cmの皮下ＬＳ１７４Ｔ腺癌腫瘍を有するマウス（群あたり動物３匹）に、125Ｉ標識ｃＡｂ−ＣＥＡ５：：βラクタマーゼ（複合体μgあたり４．７２８．４８１cpm）またはｃＡｂ−Ｌｙｓ３：：βラクタマーゼ複合体（複合体μgあたり２．６９１．６２１cpm）を静脈内注射（１mg/kg）した。腫瘍、血液、およびいくつかのその他の組織における放射活性の量を６時間、２４時間、および４８時間後に決定した（図４）。腫瘍におけるｃＡｂ−ＣＥＡ５：：βＬの濃度が測定したいずれかその他の組織における濃度よりも非常に高い（＞１０倍）ことが見出された。関連性のないｃＡｂ−Ｌｙｓ３：：βＬの腫瘍内での優先的な蓄積が認められないので、これは腫瘍細胞におけるＣＥＡ抗原に対する結合に起因する可能性が最も高い。本発明者らはｃＡｂ−ＣＥＡ５：：βＬおよびｃＡｂ−Ｌｙｓ３：：βＬ複合体の双方の蓄積が腎臓においてかなり高いことにも気づいた（組織ｇあたり０．４１から０．５３％ＩＤ）。測定した放射活性が無傷の複合体分子から生じたものか、または分解した材料から生じたものかを調べるために、ニトロセフィンを用いて標的腫瘍、肝臓、および腎臓組織におけるβラクタマーゼの酵素活性を評価した。その結果により、酵素活性は切除された腫瘍組織では変化がなかったが、一方肝臓組織でも腎臓組織でも活性を測定することができず、これは腎臓および肝臓組織において測定された放射活性が無傷の抗体−酵素複合体分子に由来するものではなかったことが示された（これらの組織懸濁液を類似の濃度の冷ｃＡｂ−ＣＥＡ５：：βＬでスパイキングした結果、酵素活性は陽性であり、これは組織懸濁液が酵素活性において阻止効果を呈さなかったことを示している）。ｃＡｂ−ＣＥＡ：：βＬ複合体の投与後６時間に腫瘍ｇあたり注射用量のおよそ３％の、腫瘍の最大取り込みが認められ、一方非結合性対照ｃＡｂ−Ｌｙｓ３：：βＬ複合体に関しては標的化が認められなかった。血液および正常組織レベルこの時点で依然高く、そしてしたがって腫瘍／正常組織比率は低かった。２４時間後、腫瘍におけるｃＡｂ−ＣＥＡ：：βＬ複合体の量は腫瘍ｇあたり注射用量のおよそ１％まで縮小したが、血液および正常組織レベル更に急速に縮小し、そして結果的に、依然高量の放射活性を測定できた腎臓以外は、腫瘍／正常組織比率は１０から５０倍の範囲になった。４８時間後、同様の体内分布が示された。これらのテータに基づいて、抗腫瘍研究に関して複合体およびプロドラッグ投与の間を２４時間間隔に選択した。
【００４２】
４．２プロドラッグ治療の抗腫瘍効果
ＣＣＭの用量を段階的に増加させた（１００、１５０、２００mg/kg）、２４時間後の規定のｃＡｂ−ＣＥＡ：：βＬ複合体（１mg/kg体重）の抗腫瘍効果を図５に示す。未処置腫瘍担持マウスまたは非結合性ｃＡｂ−Ｌｙｓ３：：βＬ複合体と組み合わせてプロドラッグを投与されたマウスと比較して、プロドラッグ治療の組み合わせにより有意な抗腫瘍効果が得られた。治療効率は用量依存的であった。２００mg  ＣＣＭ／kg／注射の投与を受けた動物において、腫瘍の部分的退化などの有意な抗腫瘍効果が得られた。ＣＣＭ治療を受けているいずれの群においても明白な毒性はなかった。対照的に、４mg／kg／注射のＰＤＭ薬で全身処置したマウスでは、処置の中止後腫瘍が成長したので、腫瘍成長に関して有利な効果はなかった。更に、ＰＤＭ用量はほぼ最大耐量（４．５mg／kg／注射）で与えられたが、前身投与により毒性に至り、そして＞１０％の体重減少を招いた。
【００４３】
材料および方法
腫瘍局在研究
ＩＯＤＯＧＥＮ試薬を用いて、製造者（Pierce, Rockford、イリノイ州、米国）の推奨する方法にしたがって、ｃＡｂ−ＣＥＡ：：βＬ複合体を無担体12５Ｉで放射性ヨー素化した。インビトロでの放射性ヨー素化後の免疫反応性の保持をＬＳ１７４Ｔ細胞への結合により確認した。体重kgあたり酵素およそ１mgを、腫瘍異種移植片が定着している胸腺欠損ヌードマウスに静脈内注射した（１０日前に２×１０6  ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞を注射し、そして腫瘍を測定し、直径およそ５から６mmであった）。複合体の注射の後、３群のマウスを６、２４および４８時間後に屠殺した。腫瘍、血液サンプル、および一連のその他の組織を除去し、重量測定し、そしてガンマカウンターで計測した。
【００４４】
抗腫瘍研究
５群の雌胸腺欠損ヌードマウスに２×１０6  ＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞を皮下注射した。１０日後、腫瘍が約１００mm3の大きさに達したときに、体重kgあたりβＬ複合体１mgを静脈内注射し、続いて２４時間後にプロドラッグＣＣＭを注射した。ｃＡｂ−βＬ＋ＣＣＭでの処置を毎週のスケジュールで全部で３ラウンド実施した。一般健康状態、体重、および腫瘍成長に関して週２回動物をモニター観察し、そして処置を受けていない対照群と比較した。式：（最大長×垂直方向幅2）／２を用いて腫瘍体積を算出した。
【００４５】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】セラフォスポリン・マスタード・プロドラッグであるＣＣＭおよび親薬物である、フェニレン・ジアミン・マスタード、ＰＤＭの構造。
【図２】［3Ｈ］チミジンのＤＮＡへの組み込みにより決定されるＬＳ１７４Ｔ腺癌細胞に及ぼすｃＡｂ−ＣＥＡ５−βＬ＋ＣＣＭの組み合わせの細胞毒性効果。ＬＳ１７４Ｔ細胞をｃＡｂ−ＣＥＡ５−βＬ複合体と共にインキュベートし、洗浄し、そしてＣＣＭと１時間反応させる。効果を、予め複合体に暴露しないでＣＣＭまたはＰＤＭと１時間反応させた細胞と、および複合体と反応させる前にコンジュゲートされていない飽和量のｃＡｂ−ＣＥＡ５と反応させた細胞と比較した。
【図３】ＬＳ１７４Ｔ腺癌細胞に及ぼすＣＣＭ（３μM）のインビトロ細胞毒性。細胞を種々濃度の複合体と反応させ、洗浄し、そして次にＣＣＭに１時間暴露した。２４時間のインキュベーションおよび１８時間のパルシングの後、細胞毒性を未処置対照細胞に相対した［3Ｈ］チミジンの組み込みを測定することにより定量化した。ＣＣＭ暴露の前に細胞を非結合対照複合体ｃＡｂ−Ｌｙｓ３−βＬと反応させることにより、または複合体と反応させる前にコンジュゲートされていないｃＡｂ−ＣＥＡ５（０．１mg/ml）で飽和させることによりプロドラッグ活性化の免疫学的特異性の実証を行なった。
【図４】ヌードマウス（１群あたり動物３匹）におけるｃＡｂ−ＣＥＡ５：：βＬおよび非結合対照ｃＡｂ−Ｌｙｓ３：：βＬの薬物動態。投与後６時間、２４時間、および４８時間の皮下ＬＳ１７４Ｔ腺癌腫瘍における、および正常組織におけるβＬ複合体レベルを示す。ｃＡｂ−Ｌｙｓ３：：βＬを非結合性対照とした。
【図５】ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するヌードマウスにおけるｃＡｂ：：βＬ／ＣＣＭの組み合わせの治療効果。複合体（１mg/kg）を矢印で指示した日に静脈内注射し、そして２４時間後にＣＣＭを投与した。治療効果をＭＴＤでのＰＤＭの効果と比較した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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