(57)【要約】個体が抗リン脂質抗体症候群を有しているか、または抗リン脂質抗体症候群を有する可能性が高まっていることを予測するための方法であって：ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして経時的に光散乱または透過率をモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；そして時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで個体が抗リン脂質抗体症候群を有しているかまたは抗リン脂質抗体症候群のリスクが上昇していることを決定すること；を含む方法。リン脂質を凝固試薬の一部として、または凝固が活性化されていない試薬の一部として提供することができる。タンパク質に結合するリン脂質に対する特定の抗体のための確認アッセイを実施することができる。
2005520170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が抗リン脂質抗体症候群を有している可能性の上昇を予測するための方法であって：
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；
ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；そして時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで個体で抗リン脂質抗体症候群の可能性が上昇していることを決定すること；
を含んでなる方法。
【請求項２】
時間依存的測定がサンプルを通る吸光度及び／または透過率の変化の経時的な光学的測定である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが個体の全血または血漿サンプルである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トロンボプラスチンを含んでなる凝固試薬の一部としてリン脂質を加える請求項１に記載の方法。
【請求項５】
凝固試薬がプロトロンビン時間試薬である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
リン脂質が非二重層配列を含む種々の構造のリン脂質の異種性混合物である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リン脂質が天然供給源に由来する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
凝固試薬が組織因子、ハライド塩及びリン脂質の混合物を含んでなる請求項４に記載の方法。
【請求項９】
２価金属カチオンまたは２価金属カチオンの塩をリン脂質と一緒に添加することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗リン脂質抗体の存在を決定するために少なくとも１つの確認アッセイを実施することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの確認アッセイがラテックス・イムノアッセイまたはＥＬＩＳＡである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つのイムノアッセイが少なくとも１つの抗β２糖タンパク質、抗プロトロンビン及び抗カルジオリピン抗体に関するアッセイを含んでなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
個体が経口抗凝固剤を摂取しているヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
抗リン脂質抗体が確認アッセイで認められる場合、経口抗凝固剤治療を開始することをさらに含んでなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
時間依存的測定プロファイルが光学透過率プロファイルである請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
光学透過率プロファイルが写真−光学凝固分析器で作成される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
個体が自然流産または血栓塞栓性事象を経験した者である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＰＴＴが凝固時間の延長を呈するかどうかを決定するために個体からのサンプルでさらにＡＰＴＴアッセイを実施することを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの確認アッセイが基準：ａ）リン脂質依存的スクリーニングアッセイの延長；ｂ）プールされた正常血漿との１：１混合物を用いる延長されたアッセイの修正の欠如；及びｃ）過剰のリン脂質の添加による延長されたアッセイの修正；に従ってＡＰＬＡを同定するための確認アッセイである請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
リン脂質が凝固試薬の一部として添加されない請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＡＰＴＴ試薬で時間依存的測定プロファイルを誘導すること、及び時間依存的測定で負の勾配１があるかどうかを決定することを含んでなる確認アッセイを実行する請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
血小板中和試験である確認アッセイを実行する請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
予め決定された値または閾値を超えたＡＰＴＴ時間依存的測定で勾配１がない場合、次いでイムノアッセイであるさらなる確認アッセイを実施する請求項２１の方法。
【請求項２４】
イムノアッセイが抗β２糖タンパク質、抗プロトロンビン及び抗カルジオリピン抗体に関するＥＬＩＳＡである請求項２３の方法。
【請求項２５】
小胞またはリポソームがラッセルクサリヘビ毒を含んでなるＤＲＶＶＴＤＲＶＶＴ試薬の一部である請求項１の方法。
【請求項２６】
値または勾配が予め決定された閾値を超える場合、次いで被験サンプルがＣ反応性タンパク質またはＬＣ−ＣＲＰを含んでなるかどうかを決定する請求項１の方法。
【請求項２７】
被験サンプルがＣ反応性タンパク質を含んでなるかどうかを決定することが、ホスホリルコリンの存在下及び不在下でＡＰＴＴアッセイを実施することを含んでなる請求項２６の方法。
【請求項２８】
負のＡＰＴＴ勾配があり、そしてこれがホスホリルコリンによりにより阻害されない場合、ＡＰＬＡに関する確認試験を実施する請求項２７の方法。
【請求項２９】
リン脂質がホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び／またはホスファチジルイノシトールである請求項１の方法。
【請求項３０】
勾配または値を決定する前に金属塩の形態の金属カチオンを添加することをさら含んでなる請求項２９の方法。
【請求項３１】
複数のホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールを被験サンプルに添加する請求項２９の方法。
【請求項３２】
被験サンプルが個体から精製されたＩｇＧである請求項１の方法。
【請求項３３】
値または勾配を決定する前にリン脂質結合タンパク質を被験サンプルに添加することをさらに含んでなる請求項３２の方法。
【請求項３４】
リン脂質結合タンパク質がβ２糖タンパク質１、カルジオリピンまたはプロトロンビンである請求項３３の方法。
【請求項３５】
値または勾配を決定する前に凝固試薬を被験サンプルに添加することをさらに含んでなる請求項３３の方法。
【請求項３６】
個体が播種性血管内凝固の患者ではない請求項１の方法。
【請求項３７】
リン脂質が哺乳動物組織に由来する試薬の一部である請求項１の方法。
【請求項３８】
組織が脳または胎盤である請求項３７の方法。
【請求項３９】
金属カチオンの供給源の不在下でリン脂質を添加する請求項１の方法。
【請求項４０】
リン脂質がプロトロンビン時間試薬の一部である請求項１の方法。
【請求項４１】
ＡＰＬＡに対してさらに感受性があるリン脂質で再度請求項１の方法を実施することをさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つのイムノアッセイが抗β２糖タンパク質に関するアッセイを含んでなる請求項の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つのイムノアッセイが抗プロトロンビンに関するアッセイを含んでなる請求項１２の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つのイムノアッセイが抗β２糖タンパク質及び抗プロトロンビンに関するアッセイを含んでなる請求項１２の方法。
【請求項４５】
少なくとも１つのイムノアッセイが抗カルジオリピン抗体に関するアッセイを含んでなる請求項１２の方法。
【請求項４６】
被験サンプルが経口抗凝固剤の投与を受けている個体に由来し、そしてプロトロンビンをリン脂質と一緒に被験サンプルに添加する請求項１の方法。
【請求項４７】
リン脂質結合タンパク質の存在を決定するために確認アッセイを実施することをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
確認アッセイがβ２糖タンパク質、プロトロンビンまたは抗カルジオリピンに関するアッセイである請求項４７の方法。
【請求項４９】
被験サンプルをリン脂質と組み合わせ、そして凝固試薬を被験サンプルに添加しないで時間依存的測定プロファイルが得られる請求項１の方法。
【請求項５０】
抗リン脂質抗体の存在の可能性の上昇を決定した後に、ａ）リン脂質依存的スクリーニングアッセイの延長；ｂ）プールされた正常血漿との１：１混合物を用いる延長されたアッセイの修正の欠如；及びｃ）過剰のリン脂質の添加による延長されたアッセイの修正；を含んでなる確認アッセイを実施する請求項１の方法。
【請求項５１】
予め決定された閾値を越えた勾配１が検出される場合、リン脂質抗体の存在の可能性の上昇を決定した後に、個体からの被験サンプルにリン脂質を少なくとも１つのリン脂質結合タンパク質と一緒に添加すること、サンプルに関して時間依存的測定プロファイルを実施すること、及び検出された最初の勾配１に比較して勾配１の増加があるかまたはないかを決定することを含んでなる確認アッセイを実施する請求項１の方法。
【請求項５２】
添加したリン脂質がＰＴまたはＡＰＴＴ試薬の一部ではない請求項１の方法。
【請求項５３】
勾配１が予め決定された閾値を越えて検出される場合、再度１つのリン脂質結合タンパク質を添加して請求項１の方法を実施し、そして別のリン脂質結合タンパク質を添加してさらに再度請求項１の方法を実施し、そして各々の添加試験に関して勾配１における増加があるかどうかを決定することをさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項５４】
勾配１が予め決定された閾値を越えて検出される場合、確認試験としてＤＲＶＶＴ試験を実施することをさらに含んでなる請求項１の方法。
【請求項５５】
リン脂質がＰＣ及びＰＳを含んでなる請求項１の方法。
【請求項５６】
リン脂質がさらにＰＥを含んでなる請求項５５の方法。
【請求項５７】
ＰＳが全リン脂質の１０％またはそれ以上である請求項５６の方法。
【請求項５８】
ＰＳが全リン脂質の１５％またはそれ以上である請求項５４の方法。
【請求項５９】
ＰＳが全リン脂質の２５％またはそれ以上である請求項５８の方法。
【請求項６０】
ＰＣが全リン脂質の少なくとも４０％である請求項５６の方法。
【請求項６１】
ＰＣが全リン脂質の少なくとも６０％である請求項６０の方法。
【請求項６２】
ＰＣが全リン脂質の４０％から７０％である請求項６１の方法。
【請求項６３】
ＰＥが全リン脂質の少なくとも５％である請求項５６の方法。
【請求項６４】
ＰＥが全リン脂質の少なくとも１５％である請求項６３の方法。
【請求項６５】
ＰＥが全リン脂質の５から５０％である請求項６３の方法。
【請求項６６】
ＰＥが全リン脂質の５から３０％である請求項６５の方法。
【請求項６７】
全リン脂質のＰＳが１０％から３０％、ＰＣが４０％から７０％及びＰＥが５％から５０％である請求項５６の方法。
【請求項６８】
凝固試薬がトロンビン時間試薬である請求項４に記載の方法。
【請求項６９】
凝固試薬が希釈されたラッセルクサリヘビ毒試薬である請求項４に記載の方法。
【請求項７０】
凝固試薬が活性化部分トロンボプラスチン時間試薬である請求項４に記載の方法。
【請求項７１】
凝固試薬がヘビ毒及びリン脂質を含んでなる試薬である請求項４に記載の方法。
【請求項７２】
リン脂質が、抗リン脂質抗体症候群を有する患者の大部分で予め決定された閾値を越えて勾配１を引き起こすのに十分なリン脂質である請求項１の方法。
【請求項７３】
時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えることが決定される場合、次いで試験サンプルが、抗リン脂質抗体症候群を有している可能性が上昇している個体からのサンプルであるとして合図される請求項１の方法。
【請求項７４】
方法を実施する分析器と接続したプリンターで警告を印刷することにより合図を実施する請求項７３の方法。
【請求項７５】
方法を実施する分析器と接続したモニターで警告を表示することにより合図を実施する請求項７３の方法。
【請求項７６】
個体が抗リン脂質抗体症候群を有している可能性が上昇していることを予測するための方法であって：
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルを、リン脂質を含んでなる凝固試薬と組み合わせること；
ｃ）フィブリン重合の形成を経時的にモニター観察して、時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルのデータを十分に定義する１つまたはそれ以上の予測変数のセットを定義すること；
ｅ）抗リン脂質抗体症候群と１つまたはそれ以上の予測変数との関係を示すモデルを誘導すること；及び
ｆ）工程ｅ）のモデルを利用して個体における抗リン脂質抗体症候群の可能性の上昇を予測すること；
を含んでなる方法。
【請求項７７】
凝固試薬がＰＴ試薬である請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
工程ａ）からｅ）をＡＰＴＴ試薬を用いて繰り返すことをさらに含んでなる請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
ＰＴ試薬を使用する場合、１つまたはそれ以上の予測変数が凝血開始前の勾配、凝固後の勾配及び血塊形成の開始時間を含む請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＡＰＴＴ試薬を使用する場合、１つまたはそれ以上の予測変数が１つまたはそれ以上の凝固発現に相当する時間、凝固の中点に相当する時間、凝固の終点に相当する時間、及び凝血開始前の値または勾配を含む請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
予測変数が凝固時間またはＩＮＲ、及び血塊形成の開始前の勾配を含む請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
リン脂質を含んでなる凝固試薬がプロトロンビン時間試薬である請求項７６の方法。
【請求項８３】
１つまたはそれ以上のパラメーターが勾配１、ｔｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１、ｔｍａｘ２、勾配３及び変化量である請求項８２の方法。
【請求項８４】
個体が経口抗凝固治療を受けていない個体である請求項８３の方法。
【請求項８５】
１つまたはそれ以上のパラメーターが勾配１、ｔｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１及びｔｍａｘ２である請求項８２の方法。
【請求項８６】
１つまたはそれ以上のパラメーターが勾配１、ｔｍｉｎ２、ｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１、ｔｍａｘ２、ｍａｘ２、勾配３及び変化量である請求項８２の方法。
【請求項８７】
個体が経口抗凝固治療を受けている個体である請求項８６の方法。
【請求項８８】
時間依存的測定プロファイルが少なくとも１つの光学プロファイルである請求項７６の方法。
【請求項８９】
光学プロファイルが血栓症及び止血試験のための自動分析器により提供される請求項８８の方法。
【請求項９０】
工程ｆの後、予測された抗リン脂質抗体症候群を確認するための１つまたはそれ以上のアッセイを実施する請求項７６の方法。
【請求項９１】
１つまたはそれ以上の確認アッセイが抗リン脂質抗体に関する１つまたはそれ以上のイムノアッセイである請求項９０の方法。
【請求項９２】
モデルが神経ネットワークである請求項７６の方法。
【請求項９３】
リン脂質がホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及び／またはホスファチジルイノシトールである請求項７６の方法。
【請求項９４】
勾配または値を決定する前に金属塩の形態の金属カチオンを添加することをさら含んでなる請求項９３の方法。
【請求項９５】
複数のホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールを被験サンプルに添加する請求項９３の方法。
【請求項９６】
被験サンプルが個体から精製されたＩｇＧである請求項７６の方法。
【請求項９７】
値または勾配を決定する前にリン脂質結合タンパク質を被験サンプルに添加することをさらに含んでなる請求項９６の方法。
【請求項９８】
リン脂質結合タンパク質がβ２糖タンパク質１、カルジオリピンまたはプロトロンビンである請求項９７の方法。
【請求項９９】
値または勾配を決定する前にさらに凝固試薬の一部としてリン脂質を被験サンプルに添加する請求項９７の方法。
【請求項１００】
個体が播種性血管内凝固の患者ではない請求項７６の方法。
【請求項１０１】
リン脂質が哺乳動物組織に由来する試薬の一部である請求項７６の方法。
【請求項１０２】
組織が脳または胎盤である請求項１０１の方法。
【請求項１０３】
金属カチオンの供給源の不在下でリン脂質を添加する請求項７６の方法。
【請求項１０４】
リン脂質がプロトロンビン時間試薬の一部である請求項７６の方法。
【請求項１０５】
１つまたはそれ以上のイムノアッセイが抗β２糖タンパク質、抗プロトロンビン及び／または抗カルジオリピン抗体に関するイムノアッセイである請求項９１の方法。
【請求項１０６】
個体が抗リン脂質抗体症候群を有している可能性が上昇していることを示すこれらの被験サンプルにおいて第２のアッセイを実施することをさらに含んでなり、第２のアッセイの結果は個体が抗リン脂質抗体症候群を有している可能性を上昇させることができる請求項１の方法。
【請求項１０７】
少なくとも１つの時間依存的測定プロファイルから個体の抗リン脂質抗体症候群を予測するための方法であって、
ａ）個体からの被験サンプルをリン脂質と組み合わせ、そして被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｂ）時間依存的測定プロファイルのデータを十分に定義する１つまたはそれ以上の予測変数のセットを定義すること；
ｃ）抗リン脂質抗体症候群と１つまたはそれ以上の予測変数との関係を示すモデルを誘導すること；及び
ｄ）工程ｃ）のモデルを利用して個体における抗リン脂質抗体症候群の存在を予測すること；
を含んでなる方法。
【請求項１０８】
１つまたはそれ以上の予測変数が凝血開始前のプロファイルの値または勾配の低下を含む請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
１つまたはそれ以上の予測変数がさらに１つまたはそれ以上の：プロファイルの第１誘導の最低値、第１誘導の最低値の時間指数、プロファイルの第２誘導の最低値、第２誘導の最低値の時間指数、プロファイルの第２誘導の最大値、第２誘導の最大値の時間指数、未知サンプルの時間依存的測定中の凝固パラメーターにおける全体的な変化、凝固時間、及び血塊形成後のプロファイルの勾配を含む複数の変数である請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
少なくとも１つの該時間依存的測定プロファイルが少なくとも１つの光学プロファイルである請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
少なくとも１つの該光学プロファイルが血栓症及び止血試験のための自動分析器により提供される請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
未知のサンプルにおいて１つまたはそれ以上の波長で複数の光学測定を経時的に行って、少なくとも１つの該光学プロファイルを誘導し、該光学測定は光散乱及び／または光吸光度の変化に対応する請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
複数の光学測定を経時的に行って、少なくとも１つの該光学プロファイルを誘導し、そして複数の該光学測定は各々第１の光学測定値に正規化される請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
工程ａ）で少なくとも１つの該光学プロファイルが該分析器により自動的に提供され、それによりサンプル容器から試験ウェルに自動プローブにより該サンプルが自動的に除去され、１つまたはそれ以上の試薬が該試験ウェルに自動的に添加されて該適当な変化が該サンプル内で開始され、そして該特性の進行が自動的に光学的に経時的にモニター観察されて該光学データプロファイルが誘導される請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
工程ｄ）の後、予測された抗リン脂質抗体症候群が自動的に該自動分析器のメモリーに蓄積され、及び／または該自動分析器で表示される請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
工程ｄ）の後、予測された抗リン脂質抗体症候群を確認するための１つまたはそれ以上のアッセイを実施する請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
１つまたはそれ以上の確認アッセイが抗リン脂質抗体に関する１つまたはそれ以上のイムノアッセイを含んでなる請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
工程ｃ）の該モデルが神経ネットワークである請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１９】
工程ｃ）の該関係が少なくとも１つの自動化アルゴリズムにより決定される請求項１０７に記載の方法。
【請求項１２０】
該モデルが多層パーセプトロンであり、そして少なくとも１つの該アルゴリズムが逆伝搬学習アルゴリズム（ｂａｃｋ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）である請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
工程ａ）で複数の時間依存的測定プロファイルが工程ｂ）での使用のために誘導される請求項１０７に記載の方法。
【請求項１２２】
複数の該時間依存的測定プロファイルがＰＴ試薬、ＡＰＴＴ試薬、フィブリノーゲン試薬及びＴＴ試薬で開始されるアッセイからの少なくとも２つのプロファイルを含む請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
サンプルが医学的患者に由来し、そして工程ｄ）で双方の該モデル及びさらなる患者の医学的データを利用し個体における抗リン脂質抗体症候群を予測する請求項１０７に記載の方法。
【請求項１２４】
１つまたはそれ以上の確認アッセイが基準：ａ）リン脂質依存的スクリーニングアッセイの延長；ｂ）プールされた正常血漿との１：１混合物を用いる延長されたアッセイの修正の欠如；及びｃ）過剰のリン脂質の添加による延長されたアッセイの修正；に従ってＡＰＬＡを同定するための確認アッセイである請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２５】
被験対象における血栓症のリスクが上昇していることを予測するための方法であって、
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；
ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そしてサンプルを通る光の透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；そして時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで被験対象の血栓症のリスクが上昇していることを決定すること；
を含んでなる方法。
【請求項１２６】
光ビームが自動凝固計の単色光光源に由来する請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
サンプルが個体の全血または血漿サンプルである請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
リン脂質がトロンボプラスチンを含んでなる凝固試薬の一部である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２９】
凝固試薬がＰＴ試薬である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
リン脂質が小胞またはリポソームである請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
リン脂質を凝固試薬の一部として被験サンプルに加えない請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３２】
リン脂質がトロンボプラスチン及びハライド塩を含んでなる凝固試薬の一部である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３３】
金属カチオンまたは金属カチオンの塩を添加することをさらに含んでなる請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３４】
抗リン脂質抗体の存在を決定するために少なくとも１つの確認アッセイを実施することをさらに含んでなる請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３５】
少なくとも１つのアッセイがラテックス・イムノアッセイまたはＥＬＩＳＡである請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
少なくとも１つの確認アッセイが抗β２糖タンパク質、抗プロトロンビン及び抗カルジオリピン抗体に関するアッセイである請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
個体が経口抗凝固剤を投与されている請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３８】
抗リン脂質抗体が決定される場合、個体を経口抗凝固剤で処置することをさらに含んでなる請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３９】
時間依存的測定プロファイルが光学透過率プロファイルである請求項１２５に記載の方法。
【請求項１４０】
光学透過率プロファイルが写真−光学凝固分析器で作成される請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
個体が自然流産または血栓塞栓性事象を経験した者である請求項１２５に記載の方法。
【請求項１４２】
ＡＰＴＴが凝固時間の延長を呈するかどうかを決定するために個体からのサンプルでＡＰＴＴアッセイを実施することをさらに含んでなる請求項１２５に記載の方法。
【請求項１４３】
抗リン脂質抗体症候群を有する個体の治療をモニター観察するための方法であって、
ａ）ＡＰＳを有する個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；
ｃ）被験サンプルに光を誘導し、そしてサンプルからの光の反射率またはそれを通る透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルの値または勾配を決定すること；
ｅ）個体に治療を施すこと；
ｆ）工程ａ）からｄ）を繰り返すこと；及び
ｇ）値または勾配を互いに比較して、該治療の効率を決定すること；
を含んでなる方法。
【請求項１４４】
治療が経口抗凝固剤の投与である請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
値が経時的に低下するか、または勾配が経時的に上昇する場合、次いで個体の状態が悪化していることを決定し、そして値が経時的に上昇するか、または勾配が経時的に低下する場合、次いで個体の状態が改善されていることを決定する請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４６】
小胞またはリポソームが凝固試薬と一部として添加される請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４７】
凝固試薬がＤＲＶＶＴまたはＰＴ試薬である請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
サンプルのＩＮＲが決定される請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４９】
値または勾配及びＩＮＲを用いて個体の治療を管理する請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
治療がＡＰＬＰ抗体の低下を志向する請求項１４３の方法。
【請求項１５１】
抗リン脂質抗体症候群を有する個体の治療をモニター観察するための方法であって、
ａ）ＡＰＳを有する個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルを凝固試薬と組み合わせ、そしてリン脂質を添加すること；
ｃ）フィブリン重合の形成を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）血塊形成の開始前に時間依存的測定プロファイルの値または勾配を決定すること；
ｅ）決定した値または勾配に基づいて個体に治療を施すこと；
を含んでなる方法。
【請求項１５２】
値または勾配が閾値をより大きく超えるほど、治療が個体により多くを提供する請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
治療が経口抗凝固剤の投与であり、そしてここで決定された値または勾配に依存して経口抗凝固剤の投与量を増加または低下させる請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
ＡＰＳの個体の集団内の重大なリスクの個体として個体を分類するための方法であって：
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；
ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；及び
時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いでＡＰＳ個体が重大なリスクの個体であることを決定すること；
を含んでなる方法。
【請求項１５５】
重大なリスクが血栓性事象の重大なリスクである請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
重大なリスクが流産、ＳＬＥまたは自己免疫障害の重大なリスクである請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
重大なリスクがＳＬＥの重大なリスクである請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
重大なリスクが血小板減少症の重大なリスクである請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５９】
抗リン脂質抗体症候群を有する被験対象からの被験サンプルにおける抗リン脂質抗体のレベルを間接的に測定する方法であって：
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；
ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点での値または勾配を決定すること；及び
値または勾配を被験サンプル中の抗リン脂質抗体のレベルに相関させること；
を含んでなる方法。
【請求項１６０】
抗リン脂質抗体が抗β２糖タンパク質、抗プロトロンビン及び／または抗カルジオリピン抗体である請求項１５９の方法。
【請求項１６１】
抗β２糖タンパク質または抗カルジオリピンのレベルが決定される請求項１６０の方法。
【請求項１６２】
個体が抗リン脂質抗体症候群を有する可能性が上昇していることを予測するための方法であって：
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをＡＰＴＴ試薬と組み合わせること；
ｃ）フィブリン重合の形成を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルのデータを十分に定義する１つまたはそれ以上の予測変数のセットを定義すること；
ｅ）抗リン脂質抗体症候群と１つまたはそれ以上の予測変数との関係を示すモデルを誘導すること；及び
ｆ）工程ｅ）のモデルを利用して個体における抗リン脂質抗体症候群の可能性の上昇を予測すること；
を含んでなる方法。
【請求項１６３】
時間依存的測定プロファイルが少なくとも１つの光学プロファイルである請求項１６２の方法。
【請求項１６４】
光学プロファイルが血栓症及び止血試験のための自動分析器により提供される請求項１６３の方法。
【請求項１６５】
工程ｆの後、予測された抗リン脂質抗体症候群を確認するための１つまたはそれ以上のアッセイを実施する請求項１６２の方法。
【請求項１６６】
１つまたはそれ以上の確認アッセイが抗リン脂質抗体に関する１つまたはそれ以上のイムノアッセイである請求項１６５の方法。
【請求項１６７】
モデルが神経ネットワークである請求項１６２の方法。
【請求項１６８】
１つまたはそれ以上のパラメーターが勾配１、凝固時間、ｔｍｉｎ２、ｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１、ｍｉｎ１、ｔｍａｘ２、ｍａｘ２、勾配３及び変化量である請求項１６２の方法。
【請求項１６９】
複数のパラメーターが用いられ、そして勾配１、凝固時間、ｔｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１、ｔｍａｘ２、ｍａｘ２、勾配３及び変化量から選択される請求項１６８の方法。
【請求項１７０】
個体が経口抗凝固剤治療を受けていない請求項１６９の方法。
【請求項１７１】
複数のパラメーターが用いられ、そしてその少なくとも２つが勾配１及び勾配３である請求項１６８の方法。
【請求項１７２】
１つまたはそれ以上の確認アッセイを実施することをさらに含んでなる請求項１６２の方法。
【請求項１７３】
１つまたはそれ以上の確認アッセイがＣ反応性タンパク質またはＬＣ−ＣＲＰに関して検定することを含む請求項１７２の方法。
【請求項１７４】
１つまたはそれ以上の確認アッセイが少なくとも１つの抗リン脂質抗体に関するイムノアッセイを含んでなる請求項１７３の方法。
【請求項１７５】
抗リン脂質抗体が抗β２糖タンパク質、抗プロトロンビン及び／または抗カルジオリピン抗体である請求項１７４の方法。
【請求項１７６】
個体が経口抗凝固剤治療を受けている請求項１６２の方法。
【請求項１７７】
個体からの被験サンプルに関してＰＴアッセイを実施すること、及び予め決定された閾値を越える勾配１があるかどうかを決定することをさらに含んでなる請求項１６２の方法。
【請求項１７８】
ＡＰＴＴ試薬及びホスホリルコリンで第２のアッセイを実行して勾配１が阻止されているかどうかを決定することをさらに含んでなる請求項１６８の方法。
【請求項１７９】
単一のパラメーターを使用し、そしてモデルが閾値である請求項１６２の方法。
【請求項１８０】
リン脂質抗体症候群のリスクの上昇を決定するための方法であって：
ａ）ＡＰＴＴ試薬を個体の被験サンプルに添加すること；
ｂ）被験サンプルにおける時間依存的測定プロファイルを実施すること；
ｃ）血塊形成の開始前にプロファイルが予め決定された閾値を越えた勾配または値を示すかどうかを決定すること、及びその場合；
ｄ）カルシウムを含まないＡＰＴＴ試薬を用いる以外は（ａ）から（ｃ）を繰り返し、抗リン脂質抗体症候群（または抗リン脂質抗体症候群の可能性の上昇）の決定は、再度予め決定された閾値を越えた値または勾配を示すプロファイルであることを確認すること；
を含んでなる方法。
【請求項１８１】
個体をモニター観察するための方法であって：
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；
ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；
そして時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで個体が抗リン脂質抗体症候群を有しているかまたは抗リン脂質抗体症候群のリスクが上昇していることを決定すること；
を含んでなる方法。
【請求項１８２】
被験サンプル中の抗リン脂質抗体を検出するための方法であって：
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；
ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；及び
時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで個体が抗リン脂質抗体を有していることを決定すること；
を含んでなる方法。
【請求項１８３】
根底にあるＡＰＳが原因で個体が臨床事象を経験する可能性の上昇を決定するための方法であって：
ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；
ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；
ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；
ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；及び
時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで個体が根底にあるＡＰＳが原因で個体が臨床事象を経験する可能性が上昇していることを決定すること；
を含んでなる方法。
【請求項１８４】
臨床事象がＳＬＥ、流産、血栓症または自己免疫障害である請求項１８３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００１年６月２９日出願のＯｒｔｅｌに対する米国仮特許出願第６０／３０２２６１号から、及び２００１年９月１１日出願のＯｒｔｅｌに対する米国仮特許出願第６０／３１８７５５号への優先権を主張し、各々出展明示により本明細書の一部とする。
【０００２】
（背景技術）
本発明は波形分析及び波形に基づく患者の異常の予測の分野である。被験サンプルを通る光透過率を経時的にモニター観察して「波形」の時間依存的測定プロファイルを提供する凝固計（またはその他の分析器）から波形を提供することができる。本発明はまた患者の抗リン脂質抗体を検出し、とりわけ患者サンプルから時間依存的測定プロファイルを入手し、そして時間依存的測定プロファイルに基づいて、患者が抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）または抗リン脂質抗体（ＡＰＬＡ）を有している可能性の上昇を予測する分野でもある。本発明はまた時間依存的測定プロファイル及び／またはＡＰＳの結果としての血栓症のリスクを評価すること、ならびにこれらの患者の治療をモニター観察することをも志向する。
【０００３】
（関連技術の説明）
伝統的に、臨床試験の凝固試験に関して報告された結果は凝固時間として提供される。光透過率の変化を時間の関数としてモニター観察することにより凝固時間を決定する凝固計を利用することができる。かかる凝固計は１９９７年７月８日に発行されたＦｉｓｃｈｅｒらに対する米国特許第５６４６０４６号に開示されており、その対象は出展明示により本明細書の一部とする。これらの分析器から得られた光学データを用いて凝固反応の開始前、反応中及び開始後に生じる特定の事象を定義することができる。この研究法を用いて、ＰＴ（プロトロンビン時間）またはＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）アッセイに関する光学データを３つのセグメント、すなわち「相」に分けることができる：凝固前セグメント、凝固セグメント、及び凝固後セグメント（図２）。これらのセグメントは（１）反応中の個々の事象の時期；（２）これらの事象が生じる速度；及び（３）変化の大きさ；を定義する一連のパラメーターにより特徴づけられる。
【０００４】
透過率波形（ＴＷ）は種々の臨床状況に関する有用な情報を提供することが示されており、例えば２０００年８月８日発行のＧｉｖｅｎｓらに対する米国特許第６１０１４４９号及び２００１年１１月２０日発行のＢｒａｕｎらに対する米国特許第６３２１１６４号に開示されており、その各々の対象は出展明示により本明細書の一部とする。そこで開示されるように波形パラメーターを用いて、神経ネットワークモデルを用いてヘパリンまたは特定の因子の欠損の存在を予測することができる。また波形シグナルの振幅を用いて血漿サンプル中のフィブリノーゲン濃度を推定した。本発明では患者をスクリーニングするか、または患者が抗リン脂質抗体症候群を有している可能性の上昇を予測するのにこれらの波形分析を用いることができる。
【０００５】
別の実例では（２００１年１２月２０日公開のＦｉｓｃｈｅｒらに対する国際公開公報第０１／９６８６４号に開示されており、出展明示により本明細書の一部とする）、ＡＰＴＴ試験の凝固前相に関与する「二相性」変化が播種性血管内凝固（ＤＩＣ）に随伴されている。この「二相性」変化はＡＰＴＴの凝固前相での負の勾配１の出現を特徴とし、そしてＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）と低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）との間の沈殿の形成の結果である。この複合体はリポタンパク質複合Ｃ反応性タンパク質からＬＣ−ＣＲＰと称されている。ＡＰＴＴのこの負の勾配１は、ＤＩＣに関する標準的な臨床検査における異常（例えばＤ二量体レベルの上昇）の進展に先行することが示され、そして波形変化は臨床結果と密接に相関した。以下に示すように、ＰＴに関する（及びＡＰＴＴに関する）二相性波形は、患者がＡＰＬＡを有することを予測し、そしてさらなる試験を促すのに有用である。
【０００６】
抗リン脂質抗体（ＡＰＬＡ）はリン脂質及びリン脂質結合タンパク質、主にβ２ＧＰＩ及びプロトロンビンからなる複合体に特異性を有する抗体の異種性群である。これらの抗体は再発性の動脈及び静脈血栓塞栓症、ならびに再発性の自然流産に随伴される。ＡＰＬＡに関する診断用臨床試験は最も一般的な免疫学的（抗カルジオリピン）または機能的アッセイ（ループス抗凝固因子）である。病理学的抗カルジオリピン抗体は、抗カルジオリピンＥＬＩＳＡの遮断バッファーに用いられるウシ胎仔血漿に存在するタンパク質補助因子、β２ＧＰＩの存在を必要とすると報告している研究者もいる。一方、ループス抗凝固因子はプロトロンビン−リン脂質複合体を認識し、そしてリン脂質依存性凝固アッセイを阻止する。抗β２ＧＰＩ抗体を含むその他の抗体もまたループス抗凝固活性に寄与する。β２ＧＰＩに対する抗体及びプロトロンビンがＡＰＬＡを有する患者における血栓症のリスク上昇に随伴されることを実証している研究もある。
【０００７】
インビトロ反応性プロファイルに基づいて、ＡＰＡを２つのサブクラスに分ける：１）抗カルジオリピン抗体（ＡＣＡ）及び２）ループス抗凝固因子（ＬＡＣ）。これらの反応性プロファイルは１９５０年代初期から知られている。ヒト血漿中のリン脂質反応性抗体の存在は最初、感染の証拠はないが梅毒の血漿学的試験で陽性である患者で報告された。偽陽性梅毒試験に寄与する抗体は最終的に試験試薬中のカルジオリピンを認識していることが解った。１９５２年に、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者におけるリン脂質依存性凝固インヒビターについての最初の報告が公開された。リン脂質依存性凝固インヒビターと血栓症との矛盾した関連性は１９６３年に最初に報告され、ループス抗凝固因子なる用語は９年後にＳＬＥの患者の流行に基づいて提示された。
【０００８】
ＡＣＡは抗体のアニオン性または中性リン脂質への結合に基づいて、免疫学的方法により検出される。近年、実際の抗原標的がリン脂質表面ではなく、むしろこれらのリン脂質に結合するタンパク質、最も注目すべきはβ２−糖タンパク質１及びプロトロンビンであることが解明されてきている。抗β２−糖タンパク質１及び抗プロトロンビン抗体の直接測定のための免疫アッセイもまた利用されている。
【０００９】
ＬＡＣはリン脂質依存性凝固アッセイ、例えばＡＰＴＴ及びＤＲＶＶＴにおける干渉により決定される。ＬＡＣ及びＡＣＡは独立して生じるか、または同時に存在し得る。ＬＡＣ及びＡＣＡ活性は同一抗体の特性であり得るか、または活性を物理学的に分離することができる。
【００１０】
抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）なる用語を用いて、ＡＰＡの存在と動脈及び静脈血栓症、胎児喪失ならびに血小板減少症のような臨床上の特徴との間の関連性について報告されている。疾患関連性の範囲は広い。ＡＰＳはいずれかの基礎障害（原発性ＡＰＳ）の不在下で存在し得るか、または症状はＳＬＥもしくはその他の自己免疫疾患、またはその他の病理学的症状に関連する慢性炎症性疾患のバックグラウンドに対して存在し得る。しかしながら、本明細書で用いるように、「抗リン脂質抗体症候群」または「ＡＰＳ」は、いずれかの臨床上の特徴が存在してもしなくても、単に抗リン脂質抗体を有している個体の症状を意味する。本明細書で用いる「重大なリスク」とは、ＡＰＳに起因する臨床事象、例えば流産、血栓性事象、自己免疫障害、血小板減少症、ＳＬＥ等を有するリスクが上昇している、ＡＰＳを有する個体を意味する。
【００１１】
（発明の要約）
抗リン脂質抗体症候群の検査室診断は臨床医には矛盾を示す。血栓症との関連性にも関わらず、伝統的なスクリーニングアッセイ（ＡＰＴＴ及びＰＴ）では通常凝固時間の延長が示される。光学プロファイルから算出される波形パラメーターは臨床的に有用なさらなる情報を提供することが示されている。本発明で提示する実施例はＰＴ及びＡＰＴＴから得られる光学波形プロファイルがＡＰＳの患者を同定するのに有用であることを示している。
【００１２】
本発明は、個体が抗リン脂質抗体症候群を有しているかまたはその可能性が上昇していることを予測するための方法であって、ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；そして時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで患者が抗リン脂質抗体症候群を有しているかまたは抗リン脂質抗体症候群のリスクが上昇していることを決定すること；を含んでなる方法を志向する。
【００１３】
本発明はまた個体が抗リン脂質抗体症候群を有している可能性が上昇していることを予測するための方法であって、ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルを、リン脂質を含んでなる凝固試薬と組み合わせること；ｃ）フィブリン重合の形成を経時的にモニター観察して、時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルのデータを十分に定義する１つまたはそれ以上の予測変数のセットを定義すること；ｅ）抗リン脂質抗体症候群と１つまたはそれ以上の予測変数との関係を示すモデルを誘導すること；及びｆ）工程ｅ）のモデルを利用して個体における抗リン脂質抗体症候群の可能性の上昇を予測すること；を含んでなる方法を志向する。
【００１４】
本発明はさらに少なくとも１つの時間依存的測定プロファイルからの個体の抗リン脂質抗体症候群を予測するための方法であって、ａ）個体からの被験サンプルをリン脂質と組み合わせ、そして被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｂ）時間依存的測定プロファイルのデータを十分に定義する１つまたはそれ以上の予測変数のセットを定義すること；ｃ）抗リン脂質抗体症候群と１つまたはそれ以上の予測変数との関係を示すモデルを誘導すること；及びｄ）工程ｃ）のモデルを利用して個体における抗リン脂質抗体症候群の存在を予測すること；を含んでなる方法を志向する。
【００１５】
本発明はまた、被験対象における血栓症のリスクが上昇していることを予測するための方法であって、ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そしてサンプルを通る光の透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；そして時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで被験対象の血栓症のリスクが上昇していることを決定すること；を含んでなる方法を志向する。
【００１６】
本発明はさらに、抗リン脂質抗体症候群を有する個体の治療をモニター観察するための方法であって、ａ）抗リン脂質抗体症候群を有する個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そしてサンプルからの光の反射率またはそれを通る透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルの値または勾配を決定すること；ｅ）患者に治療を施すこと；ｆ）工程ａ）からｄ）を繰り返すこと；及びｇ）値または勾配を互いに比較して、該治療の効率を決定すること；を含んでなる方法を志向する。
【００１７】
本発明はなおさらに、抗リン脂質抗体症候群を有する個体の治療をモニター観察するための方法であって、ａ）抗リン脂質抗体症候群を有する個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルを、リン脂質を含んでなる凝固試薬と組み合わせること；ｃ）フィブリン重合の形成を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）血塊形成の開始前に時間依存的測定プロファイルの値または勾配を決定すること；ｅ）決定した値または勾配に基づいて患者に治療を施すこと；を含んでなる方法を志向する。
【００１８】
本発明はまた、ＡＰＳの患者の集団内の重大なリスクの患者として個体を分類するための方法であって、ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；そして時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いでＡＰＳ患者が重大なリスクの患者であることを決定すること；を含んでなる方法を志向する。
【００１９】
本発明はまた、抗リン脂質抗体症候群を有する被験対象からの被験サンプルにおける抗リン脂質抗体のレベルを間接的に測定する方法であって、ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点での値または勾配を決定すること；及び値または勾配を被験サンプル中の抗リン脂質抗体のレベルに相関させること；を含んでなる方法を志向する。
【００２０】
本発明はなおさらに、個体が抗リン脂質抗体症候群を有する可能性が上昇していることを予測するための方法であって、ａ）個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルをＡＰＴＴ試薬と組み合わせること；ｃ）フィブリン重合の形成を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルのデータを十分に定義する１つまたはそれ以上の予測変数のセットを定義すること；ｅ）抗リン脂質抗体症候群と１つまたはそれ以上の予測変数との関係を示すモデルを誘導すること；及びｆ）工程ｅ）のモデルを利用して個体における抗リン脂質抗体症候群の可能性の上昇を予測すること；を含んでなる方法を志向する。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、リン脂質抗体症候群のリスクの上昇を決定する方法は、ａ）ＡＰＴＴ試薬を患者の被験サンプルに添加すること；ｂ）被験サンプルにおける時間依存的測定プロファイルを実施すること；ｃ）血塊形成の開始前にプロファイルが予め決定された閾値を越えた値または勾配を示すかどうかを決定すること、及びその場合；ｄ）カルシウムを含まないＡＰＴＴ試薬を用いる以外はａ）からｃ）を繰り返し、ＡＰＳ（またはＡＰＳの可能性の上昇）の決定は、再度予め決定された閾値を越えた値または勾配を示すプロファイルであることを確認すること；を含んでなる。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態では、個体をモニター観察する方法はａ）個体からの被験サンプルを提供すること；ｂ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｃ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｄ）時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；そして時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで患者が抗リン脂質抗体症候群を有しているかまたは抗リン脂質抗体症候群のリスクが上昇していることを決定すること；を含んでなる。
【００２３】
（好ましい実施例の説明）
本発明では、被験サンプルにおける凝固開始の前に、複合体の形成に起因する標本における光透過率の変化が（予め決定された閾値を越える）負の勾配として検出される。この変化は被験サンプル中の抗リン脂質抗体の可能性の上昇を示している。さらに本明細書で論じるように、本明細書で勾配１と称する、この最初の勾配を用いて病理学的及び非病理学的抗リン脂質抗体を区別することができる。
【００２４】
本明細書で用いる「モニター観察」または「モニター観察すること」なる用語はＡＰＳに関して患者をスクリーニングすること、ＡＰＬＡを検出すること、個体がＡＰＳを有しているとして診断すること、患者のＡＰＳの状態の重篤度を決定すること、個体のＡＰＳの状態の病理学を決定すること、または個体の状態の進行もしくは後退を追跡することを意味する。本明細書で用いる「抗リン脂質抗体症候群」及び「ＡＰＳ」とは、個体が抗リン脂質抗体を有している状態を意味する。そして本明細書で用いる「抗リン脂質抗体」または「ＡＰＬＡ」なる用語は、１つまたはそれ以上の異なる型の抗リン脂質抗体を含む全ての抗リン脂質抗体の少なくとも１つのサブセットを意味する。また、「サンプル」または「被験サンプル」なる用語は血液、血漿または血漿サンプルを意味する。また、本明細書で（「時間依存的測定プロファイルにおける特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越える場合」のように）「超える」なる用語を用いる場合、測定される勾配またはその他の値の絶対値がその他の値の勾配の閾値の絶対値よりも大きいことを意味する。加えて、本明細書において用いる「時間依存的測定」は、パラメーター変化の「グラフ」またはプロファイルに至るように、一定時間の複数の時点でパラメーター変化が測定される、被験サンプルのパラメーター変化の経時的な測定を意味する。本発明の好ましい時間依存的測定は、サンプルを通る光透過率における変化の経時的な測定である。「個体」及び「患者」なる用語は本明細書において互換的に用いられ、そして医師の介護下にある人に限定することを意味するものではない。本明細書で用いる「リン脂質」は技術分野の技術者に公知の用語である。例えば、小胞またはリポソームの形態であるリン脂質を本明細書に開示する種々の方法に用いることができる。本明細書で用いる「確認アッセイ」とは最初のアッセイ、例えば抗リン脂質抗体の少なくとも一部の結合及びかかる結合の検出に関与するアッセイの予測値を高めるアッセイを意味する。
【００２５】
材料及び方法
血漿サンプル
正常ドナー：２０人の正常ドナーからの血漿サンプルを入手して、種々ＡＰＬＡ抗体レベルのカットオフ値を確立した。さらに、６人の個体を採用して、そしてＩｇＧスパイクアッセイのため、及びＩｇＧ媒介光透過性アッセイにおける正常範囲を確立するための最初のＩｇＧ精製のための血漿サンプルを入手した。これらのドナーのうちの２人は大規模ＩｇＧ精製のための血漿サンプルを提供した。これらの個体のなかで公知のＡＰＬＡを有している者はいなかった。
【００２６】
ＡＰＬＡを有する患者：ＡＰＬＡ及び負のＰＴ勾配１の結果（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌを用いる）を有する９人の患者を採用した。国際血栓止血学会のループス抗凝固因子／抗リン脂質抗体小委員会により推奨される診断基準に従ってＡＰＳの診断を行った。抗カルジオリピン抗体ＩｇＧレベルをＥＬＩＳＡにより決定した。即座に使用しないサンプルは使用時まで−７０℃で保存した。
【００２７】
試薬
プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ、リン酸塩緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）、パケット、アンクロッド、カルジオリピン、アネキシンＶ、ヒト血漿アルブミン及びその他の化学物質はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）から購入した。ヒトプロトロンビン、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子はＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｅｓｓｅｘ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、バーモント州）から入手した。ＩｇＧ調製物を濃縮するためのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３０遠心フィルター装置はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）から購入した。Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｌ（ＰＴ試薬、ＩＳＩ  ２．００）及び凝固試験で用いたその他の試薬はｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ、ノースカロライナ州）から入手した。Ｄａｄｅ  Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）（ＰＴ試薬、ＩＳＩ  １．００）はＤａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ、デラウェア州）から入手した。
【００２８】
β２ＧＰＩ、プロトロンビン及び第Ｖ因子における遺伝的多型性の決定
Ｓａｎｇｈｅｒａらに従って以下のプライマー：
【化１】
2005520170.tif 000003
【００２９】
を用いてポリメラーゼ連鎖反応によりエクソン７（コドン３０６）及びエクソン８（コドン３１６）のβ２ＧＰＩ遺伝的多型性を決定した．プロトロンビンＧ２０２１０Ａ多型性及び第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ多型性を以前に報告されているように実施した。
【００３０】
ヒト血漿β２ＧＰＩの精製
以前に報告されている方法にわずかに修飾を加えた方法に従ってヒト血漿β２ＧＰＩの精製を実施した（Ｉｚｕｍｉら、検討中の原稿）。簡単には、過塩素酸を血漿に加えて最終濃度１．８％にして、室温で３０分間攪拌した。アニオン交換クロマトグラフィー及びヘパリンカラムクロマトグラフィーにより上澄からβ２ＧＰＩを精製した。β２ＧＰＩ調製物をドデシル硫酸１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により試験し、そしてＥＬＩＳＡにより定量した。
【００３１】
４℃で保存を延長した後、リン脂質に結合しなかったβ２ＧＰＩの切断形態を部分精製されたβ２ＧＰＩ分画から単離した。切断部位はＡｌａ３１４及びＰｈｅ３１５残基の間のペプチド結合であり、タンパク質シークエンシングにより確認した。プラスミン切断β２ＧＰＩ（Ｌｙｓ３１７−Ｔｈｒ３１８の間で切断する）と同様に、切断されたβ２ＧＰＩはリン脂質に結合しなかった。
【００３２】
免疫学的アッセイ
抗カルジオリピン抗体ＥＬＩＳＡ：カルジオリピンに対するＩｇＧ抗体は以前に報告されているようにＥＬＩＳＡにより検出され、そしてＬｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＡＰＬ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｏｒａｖｉｌｌｅ、ジョージア州）の抗カルジオリピンＩｇＧキャリブレーターを用いて標準曲線を確立した。１０ＧＰＬ単位の抗カルジオリピンＩｇＧレベルをカットオフ値として確立した（１ＧＰＬ単位は標準血漿からアフィニティ精製された１μｇ／ｍｌ  ＩｇＧ抗カルジオリピン調製物のカルジオリピン結合活性として定義される）。
【００３３】
抗プロトロンビン及び抗β２ＧＰＩ抗体ＥＬＩＳＡ：ヒトプロトロンビンに対するＩｇＧ抗体を以前に報告されているように検出した。ヒトβ２ＧＰＩに対するＩｇＧ抗体を検出した。抗プロトロンビン及び抗β２ＧＰＩに関するカットオフ値を、正常なドナーから得られた平均値プラス３標準偏差として確立した。
【００３４】
プロトロンビン時間及び光学データパラメーター
全てのＰＴアッセイをＭＤＡ−１８０（登録商標）写真−光学凝固計（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｉｎｃ．）で２検体ずつ実施した。ＰＴアッセイでは、クエン酸処理した患者の血漿５０μｌを３７℃まで加温した後、トロンボプラスチン１００μｌと混合した。５８０ｎｍで１５０秒間の光透過率に関して反応を連続的にモニター観察した。その他の波長（または複数の波長）を使用でき、そしてその他の凝固計以外の分析器を使用することができる。具体的に記載したもの以外は、全実験で使用したトロンボプラスチンはＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌであった。
【００３５】
反応中に、コンピューターアルゴリズムが凝固時間及び透過率波形を作り上げるその他の光学パラメーターを記載したように決定した。勾配１パラメーターを、反応の開始で始まり、そして凝固の発現で終わる線の勾配として定義した。凝固時間が２５秒を超える場合、または凝固が検出されなかった場合、勾配１パラメーターを５８０ｎｍ、２５秒間での光学密度を用いて算出した。透過率波形を、ＷＥＴを用いてダウンロードし、そしてＷＩＴ  Ａ．００ソフトウェア（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ、Ｉｎｃ．）を用いてオフラインで見た。
【００３６】
フィブリノーゲンの負の勾配１への寄与を決定するために、脱フィブリン患者及び正常の血漿を報告されたように調製した。簡単には、５０Ｕ／ｍｌアンクロッド５μｌをクエン酸処理した血漿１ｍｌに加え、そして３７℃で５分間インキュベートした。処理した血漿を８０００ｇで遠心して、フィブリン塊をペレット化し、そしてＰＴ分析用にきれいなチューブに移した。トロンビンが負の勾配１に寄与したかどうかを決定するために、ヒルジン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）をＡＰＬＡ患者血漿に最終濃度０．１、０．２５、０．５、１．０、１０及び２０Ｕ／ｍｌで加え、そして次にヒルジン・スパイク血漿サンプルをＰＴアッセイにて使用した。
【００３７】
全ＩｇＧの精製
プロテインＡセファロースＣＬ−４８カラムを製造者の指示書に従って調製した。カラムをＰＢＳ１０カラム容量で平衡にした。血漿を解凍し、そしてＳｏｒｖａｌｌ  ＳＳ３４ローター中１００００ｒｐｍで１０分間遠心し、そして上澄をプロテインＡセファロースカラムに適用した。以下に記載するようにＩｇＧ涸渇血漿を収集し、そして保存した。次いでカラムをＰＢＳで十分洗浄した（〜５０カラム容量またはＯＤ２８０がゼロになるまで）。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）３カラム容量でＩｇＧを溶出し、２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和し、そして次にカラムをＰＢＳ３容量で洗浄した。ＯＤ２８０でモニター観察してＩｇＧが含まれる分画を合わせ、そしてＰＢＳに対して一晩透析した。透析されたＩｇＧをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−３０遠心用フィルター装置で濃縮し、そしてＩｇＧに関するＯＤ２８０吸光係数（Ｅ１％，１ｃｍ＝１４．３）を用いて最終ＩｇＧ濃度を決定した。ＩｇＧの使用濃度をＰＢＳで４０ｍｇ／ｍｌに調整した。
【００３８】
ＩｇＧ涸渇血漿及びＩｇＧスパイクの調製
プロテインＡセファロースカラムＩｇＧを吸収させることにより患者及び対照からのＩｇＧ涸渇血漿サンプルを得た。バッファーでの血漿の希釈を最低限にするために、血漿８ｍｌをプロテインＡセファロースカラム５ｍｌに適用した。最初に流した血漿５から６ｍｌを捨てた。続く血漿２から３ｍｌをＩｇＧ涸渇血漿として収集した。ＩｇＧ涸渇血漿中の抗カルジオリピンＩｇＧ抗体レベルを決定することによりプロテインＡカラムの効率を評価した。ＩｇＧ吸収の後、吸収前には抗カルジオリピンＩｇＧ抗体レベルが最高であった２人の患者からのＩｇＧ涸渇血漿中の抗カルジオリピンＩｇＧ抗体レベルは検出不能になった（Ａ００３及びＡ００４）。
【００３９】
ＩｇＧ涸渇対照血漿を患者Ａ００３及びＡ００４からのＩｇＧで最終濃度８ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧまでスパイクした。反対に、患者Ａ００３及びＡ００４からのＩｇＧ涸渇血漿サンプルを正常ドナーからのＩｇＧで同一最終濃度でスパイクした。ＩｇＧスパイク血漿サンプルを完全（分画化していない）血漿ならびに患者及び対照からのＩｇＧ涸渇血漿サンプルと一緒にＰＴアッセイで試験した。
【００４０】
ＩｇＧ波形アッセイ
ＩｇＧ波形アッセイをＭＤＡ−１８０（登録商標）凝固計でのＰＴ基盤アッセイにおける、クエン酸処理した血漿に関するＰＢＳ中８ｍｇ／ｍｌ  精製ＩｇＧ（またはＩｇＧ及び血漿タンパク質混合物）で代用した。８ｍｇ／ｍｌ  ＩｇＧ（またはＩｇＧ及び血漿タンパク質混合物）５０μｌを３７℃まで加温し、トロンボプラスチン１００μｌと混合し、そして次に５８０ｎｍでモニター観察した。血塊形成はなかったので、最初の２５秒間の波形プロファイルから勾配１の結果が得られた。異常波形を６人の正常ドナーから精製された全ＩｇＧサンプルで得られた平均以下の２以上の標準偏差として定義した。
【００４１】
ＩｇＧ波形アッセイにおいて試験するために以下の血漿タンパク質を選択した：プロトロンビン、β２ＧＰＩ、第ＩＸ因子、第Ｘ因子及びアネキシンＶ。ヒト血漿アルブミンは陰性対照として含まれた。個々の血漿タンパク質をその生理学的濃度で、及び生理学的濃度の４倍の濃度でＩｇＧと混合した（プロトロンビン、１００及び４００μｇ／ｍｌ；β２ＧＰＩ、２００及び８００μｇ／ｍｌ；第ＩＸ因子、５及び２０μｇ／ｍｌ；第Ｘ因子、１０及び４０μｇ／ｍｌ；アネキシンＶ、４及び１６ｎｇ／ｍｌ；及びヒト血漿アルブミン、４０及び１６０ｍｇ／ｍｌ）。異常波形の作成に寄与する血漿タンパク質に関しては、濃度依存性を調べるためにさらなる濃度を含めた。タンパク質のリン脂質結合への依存性を試験するために、切断されたβ２ＧＰＩを元来のβ２ＧＰＩと同一濃度で使用した。
【００４２】
Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ及びＤａｄｅ  Ｉｎｎｏｖｉｎで得られた結果を比較することにより、ＩｇＧ波形アッセイのトロンボプラスチン特異性を決定した。精製された正常及び患者ＩｇＧサンプルを個々のトロンボプラスチンと共に、β２ＧＰＩまたはプロトロンビンの存在下または不在下でインキュベートした。
【００４３】
統計分析
分析のために１次データをエクセル  スプレッドシート・ファイルにダウンロードした（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ワシントン州）。Ｐｒｉｓｍ，ｖ．３．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を用いて統計分析を実施した。データを平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。対応のあるｔ検定（両側検定）を用いて、ＡＰＬＡ患者からの全ＩｇＧのＩｇＧ涸渇正常血漿及び経口抗凝固因子を投与された非ＡＰＬＡ患者からのＩｇＧ涸渇血漿への添加の前後で、ならびに生理学的濃度の血漿タンパク質の患者の全ＩｇＧへの添加の前後での凝固時間及び勾配１の値における変化を比較した。統計学的な有意性をｐ＜０．０５として定義した。
【００４４】
図１及び図４Ｂに示すように、この勾配１の変化はＡＰＬＡを有する患者４１人中２６人（６３％）で同定され、そしてこれは正常及びワルファリン投与されている非ＡＰＬＡ患者の双方からＡＰＬＡ患者をそのままで区別する唯一のパラメーターであった。
【００４５】
本発明の１つの実施形態では、リン脂質を含有するプロトロンビン時間試薬を個々の被験サンプルに混合する。これは多くの方法、例えば、サンプル容器からサンプルのアリコートを吸引するプローブを伴った自動プローブが突き刺されている被験サンプル容器（例えばバキュテイナー型容器）から被験サンプルアリコートを提供することにより達成することができる。自動プローブをキュベット上の位置まで移動させ、そしてそこに降ろす。別の自動プローブは試薬容器から試薬を吸引し、そしてキュベット上の位置まで移動してそこに試薬を入れる。光ビームはキュベットを通って透過し、そして透過光は経時的に検出され、従って時間依存的な測定プロファイル、この場合は光透過率プロファイルが提供される。凝固試薬（例えばＰＴ試薬、ＡＰＴＴ試薬、ＴＴ試薬、ＤＲＶＶＴ試薬、組織因子、ヘビ毒＋リン脂質等）を被験サンプルに添加する場合、次いで図２で示されるような凝固波形が得られる。
【００４６】
プロトロンビン時間試薬またはトロンボプラスチンを用いる本発明の実施形態では、試薬はＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｌでよく、これはＡＰＬＡに対して最高の感受性、及び評価されるプロトロンビン時間試薬の最良の識別能力を示す。ＨＴＦ（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｒ  ＨＴＦ）及びＤａｄｅ  Ｃ  プラスなどのその他の試薬もまたＡＰＬＡに対して（図２２で示されるように）感受性を示す。図９で説明するように、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加によりＡＰＬＡ個体のサンプルに公知である勾配１応答がなくなるので、脂質構造はこの複合体の形成に重要である。本発明の別の実施形態では、プロトロンビン時間を用いないで、むしろ金属カチオンを伴うかまたは伴わないリン脂質を被験サンプルと組み合わせ、そして前記したように勾配１の変化を決定する。
【００４７】
図２は光学透過率対正常標本のプロトロンビン時間アッセイの時間を示し、透過率の第１及び第２誘導を含む。凝固中の事象を識別記号Ａ（シグナルの始点）、Ｂ（凝固の発現）、Ｃ（凝固の中点）、Ｄ（凝固の終点）及びＤ（シグナルの終点）により示す。図２の反応の３つのセグメントは凝固前セグメント（Ａ−Ｂ）、凝固セグメント（Ｂ−Ｄ）、及び凝固後セグメント（Ｄ−Ｅ）を含む。パラメーターｔＢ、ｔＣ及びｔＤは各々ｔｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１及びｔｍａｘ２を意味し、これは凝固発現、中点、及び終点に対応する。ＭＤＡ（登録商標）に関して報告された凝固時間をｔｍｉｎ２から誘導する。勾配１はＡ点及びＢ点（凝固前相）を結ぶ線の勾配であり、勾配３はＤ点及びＥ点（凝固後相）を結ぶ線の勾配である。
【００４８】
凝固はキュベットを通る透過率の低下を引き起こす唯一の事象ではない。凝固開始前の最初の勾配である勾配１（点Ａから点Ｂへの線の勾配として定義される）は、凝固の発現前の光透過率の異常な低下の結果である。この最初の負の勾配は、以下の実施例で示すように、抗リン脂質抗体症候群の可能性の上昇を示している。
【００４９】
負のＰＴ勾配１がＡＰＬＡを有する患者で観察される
正常なドナー血漿、経口抗凝固剤を投与されている患者、ＡＰＬＡ患者及び経口抗凝固剤を投与されているＡＰＬＡ患者のＭＤＡ（登録商標）からのＰＴ及びＡＰＴＴ光学データから波形パラメーターを算出した。これらの患者群からのＰＴパラメーターに関する結果の平均（表１）は波形パラメーターの診断上の有用性を示し、とりわけ経口抗凝固剤による影響を受けていないＡＰＬＡ集団の識別における勾配１及び勾配３が有用であり、これはまた経口抗凝固剤の影響を受けなかった。異常な勾配１の結果（正常ドナーの平均以下でＳＤを超える）はＡＰＬＡ患者の６３％（４１人中２６人）で観察され、一方異常な勾配３の結果はＡＰＬＡ患者の２４％（４１人中１０人）で観察された（図４、そしてデータは示していない）。
【００５０】
凝固試薬を本発明で用いる場合、ＰＴ試薬はＡＰＴＴ試薬を超えるのが好ましいが、好ましくは１つ以上の凝血プロファイルパラメーター（例えば凝固時間、勾配１及び／または勾配３）を用いる場合、ＡＰＴＴ凝血プロファイルを用いることができる。これらの患者群からのＡＰＴＴパラメーターの結果の平均（表２）は、勾配１及び勾配３がＡＰＬＡ集団に関する診断有用性を示すことを示した。これらのパラメーターはまた経口抗凝固剤の影響を受けなかった。経口抗凝固剤投与を受けているＡＰＬＡ患者の１５．４％（２６人中４人）及び経口抗凝固剤投与を受けていないＡＰＬＡ患者の３０．８％（１３人中４人）のみでＡＰＴＴ勾配１値が正常ドナーの平均以下で２ＳＤを超えて異常に低下した（図３）。しばしばＡＰＬＡに関する試験の一部として用いられるＡＰＴＴ凝固時間はＡＰＬＡ患者の７５．６％（４１人中３１人）で延長したが、経口抗凝固剤投与を受けている非ＡＰＬＡ患者の８２．４％（１７人中１４人）でも延長した。これらの結果により、ＡＰＬＡ患者の高いパーセンテージでＰＴ勾配１及びＡＰＴＴ勾配１が異常であり、そしてこれらのパラメーターが抗凝固剤投与を受けているＡＰＬＡ患者にも有用であることが示された。
【００５１】
図３に関連してより具体的には、この図は経口抗凝固剤治療を伴う及び伴わない患者及び対照からのＡＰＴＴ凝固時間及び勾配１の結果の分布を説明している。ＭＤＡ（登録商標）写真−光学凝固計のＰｌａｔｅｌｉｎ（登録商標）Ｌで全てのサンプルを測定し、そして透過率波形プロファイルを分析のためにダウンロードした。ＡＰＴＴ凝固時間をパネルＡで示し、そして破線は正常ドナーの平均を超えて標準偏差２である値を特定する。ＡＰＴＴ勾配１の結果をパネルＢに示し、破線は平均以下で標準偏差２である値を特定する。水平の実線は個体の各サブセットに関する平均値を特定する。略語には：ＮＤ、正常ドナー；ＯＡＣ、経口抗凝固剤投与されている患者；ＡＰＬＡ、経口抗凝固剤治療を受けていない抗リン脂質抗体患者；ＡＰＬＡ＋ＯＡＣ、経口抗凝固剤治療を受けている抗リン脂質抗体患者などがある。
【００５２】
図４で示されるように、経口抗凝固剤治療を伴う及び伴わない患者及び対照からのＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）ＬでのＰＴ凝固時間及び勾配１の結果の分布が示されている。全てのサンプルをＭＤＡ（登録商標）写真−光学凝固計で測定し、そして透過率波形プロファイルを分析のためにダウンロードした。パネルＡで示されるＰＴ凝固時間及び破線は正常ドナーの平均を超えて標準偏差２である値を特定する。ＰＴ勾配１の結果をパネルＢに示し、破線は平均以下で標準偏差２である値を特定する。水平の実線は個体の各サブセットに関する平均値を特定する。略語は図３と同一である。
【００５３】
次に図５で示されるように、正常及びＡＰＬＡ患者血漿サンプルからのＰＴアッセイの透過率波形プロファイルを示す。（Ａ）正常ドナー及び（Ｂ）ワルファリン治療を受けていないＡＰＬＡ患者からの血漿サンプルでプロトロンビン時間をＭＤＡ（登録商標）写真−光学凝固計でＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｌを用いて測定した。
【００５４】
図６はＰＴ及びＰＴ勾配１値に及ぼすヘパリンの効果を説明している。プールされた正常血漿を０．１、０．４、０．６、０．８、１．０及び１０Ｕ／ｍｌの濃度のブタ由来ヘパリンでスパイクした。同一のＭＤＡ（登録商標）写真−光学凝固計でＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｌを用いてスパイクした血漿でＰＴを測定し、そして透過率波形プロファイルを分析のためにダウンロードした（へパリンは１０Ｕ／ｍｌで凝血に至らなかった）。パネルＡでは、破線が平均を超えて標準偏差２である値を特定し；パネルＢでは破線が平均以下で標準偏差２である値を特定する。図７はトロンビンインヒビターであるヒルジンの添加の、ＡＰＬＡ患者血漿のＰＴ勾配１に及ぼす効果を示しており、これは変化がトロンビン生成とは独立していることを実証している。
【００５５】
図８ａで示されるように、正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１はＰＴ試薬（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ）を患者の血漿に添加した場合に示され、そして図８ｂはリン脂質混合物を血漿に添加した場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１を示す。図９はデタージェント（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の添加の、ＡＰＬＡ患者血漿のＰＴ勾配１に及ぼす効果を説明している。これらのデータはリン脂質表面に関する要件を示している。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は用量依存的な様式で勾配１の変化を減じた。
【表１】
2005520170.tif 000004
【表２】
2005520170.tif 000005
【００５６】
ＡＰＬＡ患者からの血漿における負のＰＴ勾配１はＩｇＧに起因する
患者ＩｇＧがＰＴ勾配１で観察された異常に寄与するかどうかを決定するために、正常血漿サンプルからのＰＴ光学プロファイル（図１０Ａ）を、全ＩｇＧの除去前（図１０Ｂ）及び除去後（図１０Ｃ）のＡＰＬＡ患者血漿からのＰＴプロファイルと比較した。プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーを用いてＡＰＬＡが上昇した２人の患者に関して血漿からＩｇＧ抗体を除去した。ＡＰＬＡ患者からの全ＩｇＧの除去により、ＩｇＧ涸渇前の同一血漿と比較して、ＰＴ勾配１のほとんど完全な正規化（絶対値で１２倍低下）及び凝固時間の大幅な短縮に至った（図１０Ｂ及びＣ）。この患者は試験時に経口抗凝固剤治療を受けておらず、そして後天性低プロトロンビン血症ではなかった。
【００５７】
ＩｇＧ涸渇正常血漿へのＡＰＬＡ患者からのＩｇＧの添加
２人のＡＰＬＡ患者から精製した全ＩｇＧを６人の正常ドナーからのＩｇＧ涸渇血漿サンプルに添加し、最終濃度８ｍｇ／ｍｌを得た。６人の正常血漿に関する平均ＰＴ勾配１の結果はベースラインで０．３０６×１０−３±０．１０９×１０−３であり、そして平均ＰＴ凝固時間は１２．８８±０．２３秒であった。ＡＰＬＡ  ＩｇＧの添加後、平均ＰＴ勾配１は−０．５２１×１０−３±０．０６３×１０−３（ｐ＜０．０００１）であり、そして平均ＰＴ凝固時間は１３．７１±０．２４秒（ｐ＜０．０００１）であった。１つの正常血漿での個体の実験に関する光学プロファイルをＰＴに関しては図１１Ａ及び１１Ｂに、そしてＡＰＴＴアッセイに関しては１１Ｃ及び１１Ｄに示す。これらの同一のＩｇＧ調製物もまたＡＰＴＴ凝固時間の延長を引き起こしたが、６つのＩｇＧ涸渇正常血漿に関するＡＰＴＴ勾配１の結果には影響しなかった（パネルＣ及びＤ）。対照的に、正常血漿からの全ＩｇＧの、ＩｇＧ涸渇ＡＰＬＡ患者血漿への添加は凝固時間または勾配１の結果を変化させなかった（データは示していない）。
【００５８】
ワルファリン投与を受けている患者からのＩｇＧ涸渇血漿へのＡＰＬＡ患者からのＩｇＧの添加
ＡＰＬＡ患者からの全ＩｇＧをワルファリンの投与を受けている非ＡＰＬＡ患者６人からのＩｇＧ涸渇血漿サンプルに添加し、最終濃度８ｍｇ／ｍｌを得た。ワルファリン治療を受けている非ＡＰＬＡ患者からの血漿サンプルの平均ＰＴ勾配１は０．２３１×１０−３±０．０７×１０−３であり、そして平均ＰＴ凝固時間は２０．６３±２．６８秒であった。ＡＰＬＡ  ＩｇＧの添加前のＩｇＧ涸渇血漿サンプルの平均ＰＴ勾配１は０．２５１×１０−３±０．１０５×１０−３であり、そして平均ＰＴ凝固時間は２０．５９±２．８２９秒であった（ｐ＝有意でない）。しかしながらＡＰＬＡ  ＩｇＧの添加後、平均ＰＴ勾配１は−０．２３２×１０−３±０．０７２４×１０−３（ｐ＜０．０００１、ＩｇＧ涸渇血漿と比較）であり、そして平均ＰＴ凝固時間は２２０４１±２．８２９秒（ｐ＜０．０００１）であった。経口抗凝固剤治療を受けている１人の患者での個体の実験に関する光学プロファイルをＰＴに関しては図１２Ａ及び１２Ｂに、そしてＡＰＴＴアッセイに関しては１２Ｃ及び１２Ｄに示す。正常ドナーから精製した全ＩｇＧの、ＩｇＧ涸渇ＡＰＬＡ患者血漿への添加は凝固時間または勾配１の結果を変化させなかった（データは示していない）。
【００５９】
ＡＰＬＡを有する患者からの全ＩｇＧの、ワルファリンを投与されている非ＡＰＬＡ患者からのからのＩｇＧ涸渇血漿サンプルへの添加は、統計的に有意なＩＮＲの増加に至った（図１３）。ＩＮＲ結果で観察されたシフトは２つのＩｇＧ調製物に関してわずかに異なり、これはこれらの抗体の異種性特性と合致した（図１３）。２つのＩｇＧ涸渇血漿サンプルに関して、ＡＰＬＡ患者からの全ＩｇＧの添加により、治療用ＩＮＲから治療を超えた結果へのシフトに至った（図１３）。この結果は、数人の患者における経口抗凝固剤治療中の抗リン脂質抗体がＰＴ結果を延長させる公知の能力と合致する。これはしばしば抗凝固の実際のレベルを反映しないＩＮＲ結果に至る。
【００６０】
Ｃ反応性タンパク質のレベルは負のＰＴ勾配１の存在に随伴されない
ＤＩＣを有する患者からの負のＡＰＴＴ勾配１がＶＬＤＬとＣＲＰとの間の複合体形成に起因したという知見は、Ｆｉｓｃｈｅｒらに記載されるように、ＡＰＬＡを有する患者におけるＣＲＰのレベルに注目することを我々に促した。異常なＰＴ勾配１値を有する３８人の患者からの血漿サンプルを試験した。ＣＲＰレベルと異常ＰＴ勾配１の結果の振幅との間に相関性はなかった（ｒ＝０．１７１２；ｐ＝０．２９０８）。さらに、これらの患者のうち２２人（５８％）は正常なＣＲＰレベルを有していた。従って、ＡＰＬＡ血漿における負のＰＴ勾配１値の存在はＣＲＰレベル上昇とは関連しなかった。
【００６１】
負のＰＴ勾配１はフィブリノーゲンまたはトロンビン活性を必要としない。
【００６２】
負のＰＴ勾配１は血塊形成の発現の前に生じる凝固前事象である。フィブリノーゲンが負のＰＴ勾配１の作成に必要かどうかを試験するために、ＡＰＬＡを有する患者及び正常ドナーからの脱フィブリン血漿を入手した。正常ドナーからの脱フィブリン血漿サンプルは凝血せず、そして負のＰＴ勾配１を有さなかった（図３Ａ）。対照的に、脱フィブリン患者血漿サンプルもまた凝血しなかったが、これらのサンプルは依然負のＰＴ勾配１を有していた（図３Ｂ）。負のＰＴ勾配１のトロンビン活性への依存性を考慮から外して、ＡＰＬＡ患者血漿サンプル（Ａ００３及びＡ００４）をヒルジンの漸増濃度でスパイクした。ＰＴ凝固時間は徐々に延長されたが、負のＰＴ勾配１は未変化のままであった（データは示していない）。
【００６３】
精製された患者ＩｇＧはたいていの患者で異常ＩｇＧ波形アッセイを引き起こさなかった
負のＰＴ勾配１の作成にはトロンビンもフィブリノーゲンも必要としなかったので、ＩｇＧ単独で異常な凝固前相を誘起し得るかどうかを試験した。図１５に示すように、全ＩｇＧをＰＴ基盤のアッセイにおいて血漿の代わりに使用した場合、２つのＩｇＧサンプル（Ａ０２５及びＡ４４５）のみが正常なドナーサンプルと比較して異常な凝固前相を表示し、これはさらなる血漿成分が異常な波形プロファイルに寄与していたこと示唆している。
【００６４】
異常ＩｇＧ波形アッセイの生成におけるリン脂質結合血漿タンパク質の役割
患者Ａ００３及びＡ００４からの精製されたＩｇＧを用いるＩｇＧ波形アッセイにおいて異常な凝固前相反応に寄与するための５つのリン脂質結合タンパク質を試験した。試験した血漿タンパク質の中でプロトロンビン及びβ２ＧＰＩのみがＩｇＧ波形アッセイにおける異常プロファイルの作成に寄与した（図１６）。双方のタンパク質がその生理学的濃度で異常ＩｇＧ波形結果を、そしてその生理学的濃度の４倍の濃度でわずかにさらに異常な結果引き起こした（図５）。第ＩＸ因子、第Ｘ因子及びアニキシンＶは異常なＩｇＧ波形アッセイを引き起こさず、ヒト血漿アルブミンも引き起こさなかった。
【００６５】
ＩｇＧ調製物はその反応性においてプロトロンビン及びβ２ＧＰＩと異なる
負のＰＴ勾配１のプロトロンビン及びβ２ＧＰＩへの依存性をさらに定義するために、漸増濃度のプロトロンビン及びβ２ＧＰＩの存在下で９人の患者及び２人の正常ドナーに関するＩｇＧ波形アッセイの結果を特徴づけした。リン脂質結合タンパク質の不在下で異常ＩｇＧ波形を伴う２つのＩｇＧ調製物（Ａ０２５及びＡ４４５）に関して、β２ＧＰＩの漸増濃度で患者Ａ４４５に関する異常ＩｇＧ波形の結果が増強された（図１７Ａ）。しかしながら、どの患者でもプロトロンビンの添加では影響はなかった（図１７Ｂ）。３つのＩｇＧサンプル（患者Ａ００３、Ａ００４及びＡ０２８）はβ２ＧＰＩ（図６Ａ）またはプロトロンビン（図６Ｂ）の存在下で用量依存的な様式で異常ＩｇＧ波形を進展させた。３人全ての患者でβ２ＧＰＩ及びプロトロンビンに対するＩｇＧ抗体レベルが上昇した（図１）。別の３人の患者のＩｇＧサンプル（患者Ａ００５、Ａ００６及びＡ５３２）はプロトロンビンヘの依存性を示したが、β２ＧＰＩには示さなかった（図６）。３人全ての患者でＩｇＧ抗プロトロンビンレベルが上昇したが、Ａ００６のみで抗β２ＧＰＩ  ＩｇＧレベルが上昇した（図１）。最後に、１人の患者のＩｇＧ（患者Ａ１２５）はプロトロンビンでもβ２ＧＰＩでも異常ＩｇＧ波形を誘起しなかった。この患者はＡＰＳを有していたが、プロトロンビンまたはβ２ＧＰＩに対する抗体レベルは上昇していなかった（図１）。２人の正常ドナーからのＩｇＧサンプルはリン脂質結合タンパク質の存在下でも不在下でも異常なＩｇＧ波形を誘起しなかった（１人の正常ドナーを図６に示す）。プロトロンビン及びβ２ＧＰＩ単独では異常なＩｇＧ波形アッセイを誘起しなかった（データは示していない）。
【００６６】
異常ＩｇＧ波形はβ２ＧＰＩのリン脂質への結合を必要とした
次にタンパク質補助因子がＩｇＧ波形アッセイにおいて切断されたβ２ＧＰＩを元来のβ２ＧＰＩと置換することによりリン脂質膜表面に結合できなければならないかを試験した。非リン脂質結合β２ＧＰＩはその野生型の対応物と同一の濃度でＡ００３ＩｇＧの存在下で試験した場合、この患者からの抗体はＥＬＩＳＡにおいて切断されたβ２ＧＰＩに結合したにもかかわらず、異常なＩｇＧ波形を誘起しなかった（図１８）。
【００６７】
異常ＩｇＧ波形は試薬特異的であった
２００μｇ／ｍｌ  β２ＧＰＩの存在下、９人の患者のＩｇＧサンプル中５人のサンプルでＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌを用いて異常ＩｇＧ波形アッセイが観察された（図１９Ａ）。対照的に、９人の患者ＩｇＧサンプル中２人のサンプルのみがトロンボプラスチン  Ｉｎｎｏｖｉｎを用いて異常ＩｇＧ波形アッセイを有した（図１９Ｂ）。注目すべきは、これらの２人の患者はＡ０２５及びＡ４４５であり、双方共にＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌで補助因子非依存性ＩｇＧ波形アッセイを実証した（図４）。これらの２人の患者のＩｇＧサンプルはまたβ２ＧＰＩ不在下でＩｎｎｏｖｉｎを用いて異常なＩｇＧ波形アッセイを有した（データは示していない）。
【００６８】
臨床結果との相関性
４人の患者は再発性静脈性及び／または動脈性血栓性事象を有した（Ａ００３、Ａ００４、Ａ００６及びＡ０２８）。これらの４人の患者のうち３人はβ２ＧＰＩ及びプロトロンビンの双方で異常なＩｇＧ波形アッセイを有した。４番目の患者（Ａ００６）はプロトロンビンのみで異常なＩｇＧ波形アッセイを有したが、ＥＬＩＳＡにより検出される抗β２ＧＰＩ抗体を有した（図１）。これらの患者のうち３人はまた第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎに関してヘテロ接合性であった（図１）。４人の患者は単一の血栓塞栓性事象を有し、そして：［１］さらなるタンパク質補助因子の不在下で異常ＩｇＧ波形アッセイ（Ａ０２５、Ａ４４５）；［２］プロトロンビンのみで異常アッセイ（Ａ５３２）；または［３］正常ＩｇＧ波形アッセイ（Ａ１２５）を有した。注目すべきは、これらの患者のうち１人はまた第２のプロトロンビン多型性を有した（プロトロンビンＧ２０２１０Ａ多型；患者Ａ５３２）。我々の研究で１人の患者のみが無症候性であった（Ａ００５）。この患者はプロトロンビンの存在下で異常ＩｇＧ波形プロファイルを有したが、β２ＧＰＩでは有さなかった。患者の中でＣｙｓ３０６またはＴｒｐ３１６での非リン脂質結合性β２ＧＰＩ多型性に関してホモ接合性であるものはなかった（図１）が、患者Ａ００５はＴｒｐ３１６→Ｓｅｒに関してヘテロ接合性であり、そして患者Ａ４４５はＣｙｓ３０６→Ｇｌｙに関してヘテロ接合性であった。
【００６９】
前記のデータは前記したような通常の凝固臨床試験、プロトロンビン時間、またはその他の凝固試薬（ＡＰＴＴ、ＴＴ、ＤＲＶＶＴ等）もしくはフィブリン重合を活性化させない類似の試薬に基づいた単純な方法を用いてＡＰＬＡ  ＩｇＧ抗体の存在を検出する能力を説明している。これらの実例はワルファリン経口抗凝固剤治療中に用いることができ、そしてヘパリンの影響を受けない方法を実証している。経口抗凝固剤治療はしばしばＰＴアッセイを用いてモニター観察される。種々のトロンボプラスチンは第ＩＩ、第ＶＩＩ及び第Ｘ因子の血漿レベルに対して感受性が異なるので、国際標準比率（ＩＮＲ）を導入して異なる試薬で得られたＰＴ時間の比較を可能にした。ＰＴ凝固時間はしばしば抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）を有する患者において延長され、これはこれらの患者における抗凝固剤治療の管理を複雑にし得る。さらに、ワルファリン投与を受けているＡＰＳの患者がしばしば、これらの患者の抗凝固の真のレベルを正確に反映しない非常に異なったＩＮＲを有していることを示している。従って、血漿中に存在し得る高レベルの抗リン脂質抗体が血塊形成に干渉し得るので、標準化ＰＴに対するＩＮＲの使用はＡＰＳの患者にとって妥当ではない。臨床抗凝固治療では、患者がＡＰＳを有しているかいないかを、一連の経費のかかる試験を行わずに決定することはしばしば困難である。従って、抗凝固治療をモニター観察するのに用いられる通常のＰＴ試験からのＰＴ勾配１値は、そうでなければ気付かれないか、またはそうでなければ不適切な治療を受けているかもしれない、ＡＰＬＡを有している可能性が上昇している患者を同定するのに非常に有用である。経口抗凝固剤は凝固の発現を遅延させることができるが、勾配１に影響しない。ＡＰＬＡ患者からの精製された全ＩｇＧ調製物は負の勾配１を作成するのみならず、凝固時間を有意に延長し、そしてＩｇＧ涸渇経口抗凝固剤投与されていた非ＡＰＬＡ血漿においてＩＮＲを増加させ、これはＩＮＲ値の増加とＡＰＬＡの存在との関係を示唆している。もちろん、凝固試薬以外の試薬、及び凝固分析器以外の分析器を本発明で用いることができる。
【００７０】
さらに詳細には、前記のデータは生物学的に重要な抗体サブセットを同定する能力を示している。精製された患者のＩｇＧ、精製されたタンパク質補助因子及び前記したような負のＰＴ勾配１を作成する特異的トロンボプラスチンを使用するアッセイを用いて、異常なＰＴ波形パラメーターに寄与する成分をよりよく定義すること、及び再発性血栓性事象のリスクを有した患者を同定するためのアッセイを適用する可能性を認識することが可能になっている。
【００７１】
これらの患者で検出される異常な凝固前相はＩｇＧ抗体媒介であり、そしてプロトロンビン及び／またはβ２ＧＰＩの存在により増幅される。ＡＰＬＡはβ２ＧＰＩ及びプロトロンビンに結合することが示されており、そしてＡＰＬＡ−プロトロンビン複合体は脂質膜に結合することが示されている。いく人かの患者でその他のリン脂質結合タンパク質がこの効果を媒介することが可能であり（例えばプロテインＳ、高分子量キニノゲン）、この研究の患者Ａ１２５の場合である。これらの結果はまた、追加のプロトロンビンを反応混合物に加えた場合、抗プロトロンビン抗体を有している、ワルファリン治療を受けている特定の患者がこのアッセイによりさらに良好に検出され得ることを示唆している。
【００７２】
本明細書では記載していない別の実験で、異常なＩｇＧ波形結果が組織因子の存在に依存しないことが示された。Ｄａｄｅ  Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）は、精製されたホスファチジルセリン及びホスファチジルコリンの混合物で再脂質化された精製された組換えヒト組織因子からなり、これはウサギ脳組織から抽出され、そしてホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン及びその他の脂質などのリン脂質の複合混合物を含有するＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌと同様には作用しなかった。勾配１決定に基づくＡＰＳ個体の検出を可能にするその他の試薬はＤａｄｅ  Ｃプラス及びＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｒ  ＨＴＦであった。図１４Ａ及び１４Ｂは種々試薬と異なるリン脂質結合タンパク質との相関を示す。
【００７３】
データはまたＩｇＧ波形アッセイが病理学的ＡＰＬＡと非病理学的ＡＰＬＡとを区別できることを示している。例えば異常ＩｇＧ波形プロファイルを作成するためにβ２ＧＰＩを必要としたＩｇＧを有するこれらの個体は再発性の血栓症問題を有した（Ａ００３、Ａ００４及びＡ０２８）。対照的に、３人の患者の中の１人はプロトロンビンで異常波形を実証したが、β２ＧＰＩでは実証しなかったＩｇＧサンプルを有し、無症候性であり（Ａ００５）、そしてもう１人は単一の静脈性血栓性事象を維持していた（Ａ５３２）。さらなるプロトロンビンのリスク因子の存在（例えば第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ）もまたこれらの患者における血栓症のリスクを変化させることが示されており、再発性の事象を有する４人の患者の中の３人はまた第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎに関してヘテロ接合性であった。
【００７４】
前記の実例では、ＰＴ試薬を各患者サンプルに添加した。しかしながら、ＰＴ試薬の代わりにリン脂質小胞を個体の被験サンプルに添加することも可能である。小胞またはリポソームを例えば天然供給源、合成リン脂質、または被験サンプルに加えた血小板から精製することができる。リン脂質が天然供給源に由来する場合、供給源は哺乳動物組織（例えば哺乳動物、一般的にはウサギの脳組織または胎盤）でよい。リン脂質を金属カチオン（一般的にはカルシウムまたはカルシウム塩）を伴ってまたは伴わずに被験サンプルに添加することができる。標準的なＰＴ試薬を使用しない場合、小胞またはリポソームを血小板、細胞残屑、リン脂質または血小板マイクロ粒子の形態で添加することができる。本発明の１つの実施形態では、１つまたはそれ以上のＰＣ、ＰＳ、ＰＥまたはＰＩを個体の被験サンプルに（金属カチオンを伴ってまたは伴わずに）添加し、続いて被験サンプル中の濁度を光学的にモニター観察する。
【００７５】
前記したように、実際のフィブリン重合は最初の勾配を検出するのに必要ではないので、凝固の活性化は必要ではない。図８で説明するように、フィブリン重合がトロンビンインヒビターの添加により開始された場合でさえも勾配１の変化は明白である。この型の波形は、凝固を活性化しない試薬（例えばフィブリン重合を引き起こさないで凝血に至る）を被験サンプルと単純に混合することによっても達成できる。血塊形成の発現なしで、勾配１は、血塊形成を含み、そして凝固を生じることができる期間を含み得る特定の期間にわたって波形の勾配として決定される。このもしかするとより長い期間より多くのデータの点を可能にすることができ、いくつかの状況で試験の精度を増す可能性がある。
【００７６】
リン脂質に加えて金属カチオンをサンプルに加えることができるが、勾配１を得るかまたはＡＰＳ状態を予測する必要はない。金属カチオンは２価金属カチオンであるのが好ましく、そして塩の形態で添加することができる。好ましい実施形態では、塩は塩化カルシウムであるが、その他の塩（例えばマグネシウムまたはマンガン）を用いることもできる。所望によりバッファー及び安定剤を添加することもできる。前記の成分のいずれかを別個に、または非凝固試薬の一部として一緒に添加することができる。また別に、前記した凝固試薬を用いる場合、トロンビンのインヒビターを添加することができる。凝固が試験で活性化されない場合、光透過率の全体的な低下（変化量）を複数のパラメーター評価において用いることができる（少なくとも勾配１及び変化量）。
【００７７】
凝固試薬を用いる場合、次いで本明細書で前記した勾配１のモニター観察に加えて、凝血波形からさらなるパラメーターを利用することができる。プロファイルのパラメーターは血塊形成の開始時間の１つまたはそれ以上の時間、プロファイルの全体的な変化（例えば光透過率の全体変化）、血塊形成の開始後のプロファイルの勾配、凝血開始の時間での促進、血塊形成の終点後の勾配等でよい。好ましいさらなるパラメーターは血塊形成の開始及び血塊形成終点後の勾配である。ＡＰＬＡ患者を正常の患者と区別する最大の能力を有しているパラメーターを表１に示す（ＰＴ波形）。
【００７８】
本発明のアッセイを実施するための試薬またはキットは凝固活性剤、とりわけＰＴ試薬に見出されるような組織因子を含むことができる。しかしながら好ましいキットは、前記したようなリン脂質小胞またはリポソームの形態のリン脂質を金属塩または金属イオンを伴ってまたは伴わずに含んでなる。キットはまたアッセイを実施するための、及びアッセイの結果がサンプル中の抗リン脂質抗体の上昇の可能性を示すかどうかを決定するための指示書をも提供する。指示書はまた確認を求める（例えばイムノアッセイによる）ための提言、または抗リン脂質症候群を確認するための１つまたはそれ以上の確認アッセイを実施するための実際の指示書をも含むことができる。リン脂質を含んでなる凝固試薬を用いる場合、血塊形成の開始の前に勾配１を決定する指示を示すべきである。より長時間にわたる勾配１の決定を可能にするために、凝血インヒビターを含むこともできる。また、アッセイの感度を増強するためにさらなるリン脂質結合タンパク質、例えばＡＰＬＡが特異的であるタンパク質（例えばβ２糖タンパク質、カルジオリピン、プロトロンビン）、及び１つまたはそれ以上のタンパク質の添加のための指示書を加えることもできる。リン脂質結合タンパク質をＰＴ試薬に、またはリン脂質小胞を含んでなる試薬に加え、続いて凝血プロファイルをモニター観察することができる。勾配１が最初に検出された後、リン脂質結合タンパク質を１つまたはそれ以上の確認アッセイに用いることもできる。確認試験では、特定のリン脂質結合タンパク質を最初の試験からと同一の（複数の）試薬と一緒に被験サンプルに加える。勾配１がさらに険しくなる場合、次いで特定のＡＰＬＡ抗体の存在が解る。例えば、被験サンプルが試験され、そして勾配１の結果に至る場合、例えばβ２糖タンパク質及び／またはプロトロンビンの添加を伴って第２の試験を行うことができる。第２試験が第１試験よりも大きな勾配になる場合、次いでリン脂質結合タンパク質に対する抗体（例えば抗β２糖タンパク質）の存在を決定することができる。ＡＰＳを伴う多くの患者に関して勾配１を引き起こすことができるリン脂質のみならず、さらに確認試験でリン脂質に加えることができる１つまたはそれ以上のリン脂質結合タンパク質（プロトロンビン、β２糖タンパク質、抗カルジオリピン）をも有しているキットを提供することができる。キットの指示書により使用者がキットリン脂質を患者の被験サンプル（例えば血漿）に添加することにより時間依存的測定プロファイルを実行するのを指示する。勾配１の（例えば特定の値を超えた）結果がでると、次いでリン脂質を１つまたはそれ以上のリン脂質結合タンパク質と一緒に添加する第２のアッセイで勾配１が増加し得るかどうかを調べるために、第２のアッセイを実施するようにキットの使用者に指示する。患者の被験サンプルでの勾配１の検出後、勾配１の値が増加し得るかどうかを決定するために、リン脂質の量を次のアッセイで増加させるべきであることを指示書が指示するキットを有することも可能である。そしてもちろん複数のさらなるアッセイ（リン脂質結合タンパク質を添加する１つまたはそれ以上のアッセイ、及び１つまたはそれ以上のリン脂質を次のアッセイで増加���せる１つまたはそれ以上のアッセイ）。
【００７９】
別の確認アッセイ（及び同一物を含むキット）は、希釈されたラッセルクサリヘビ毒を患者被験サンプルに加えて、凝固時間が延長されるかどうか、及び／または勾配１の結果がでるかどうかを調べるＤＲＶＶＴ試験である。リン脂質の量を第２の試験のために増加させる２つのＤＲＶＶＴ試験（１つはスクリーニング用、そして１つは確認用）を実行することも可能である。望む場合、ＡＰＴＴをスクリーニングアッセイとして実行する場合、及び勾配１が特定の閾値を越える結果になる場合、次いでＤＲＶＶＴ確認アッセイを実施する。実際に、凝固試薬（ＴＴ、ＰＴ、ＡＰＴＴ、ＤＲＶＶＴ等）またはリン脂質を第１のスクリーニングアッセイに使用し、つづいてリン脂質がより高濃度である同一または異なる試薬を使用することができる。または、血小板中和アッセイを確認アッセイとして実施することができる。
【００８０】
ＡＰＴＴスクリーニングアッセイを実施することも可能であり、勾配１が存在する場合、第２の修飾ＡＰＴＴアッセイ（カルシウムを用いない以外は標準的なＡＰＴＴアッセイと同一）を実施して、ＬＣＣＲＰにより引き起こされる勾配１の可能性を除外する。さらに、第１にＡＰＴＴアッセイを実施することも可能であり、（カルシウムを用いる）ＡＰＴＴアッセイが続く。本発明では第２のアッセイを行わないで、修飾されたＡＰＴＴアッセイをそのままでスクリーニングアッセイとして実行することもできる。
【００８１】
スクリーニングアッセイとして用いることができるリン脂質は好ましくは少なくともホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルセリン（ＰＳ）であり、場合によってはホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）もまた感度を上げるためのリン脂質混合物の一部にしてもよい。リン脂質混合物は１０％またはそれ以上、好ましくは１５％またはそれ以上のＰＳを含んでなることができる。２０％もしくはそれ以上、または２５％もしくはそれ以上の量もまた可能である（１０％から３０％が好ましい）。リン脂質混合物中のＰＣの量は好ましくは少なくとも４０％（好ましくは４０％から７０％の範囲）であり、一方ＰＳ、ＰＣ及びＰＥの混合物中残りはＰＥ、少なくとも５％、または少なくとも１５％である（例えば５から５０％、好ましくは５から３０％の量）。好ましくは、リン脂質は天然の供給源に由来するが、合成的に誘導されたリン脂質を使用することもできる。図２０で示されるように、ＰＣ：ＰＳ＝７５：２５の混合物によりいく人かのＡＰＬＡ患者の検出が可能になる。しかしながら、図２１で示されるように、ＰＥ／ＰＣ／ＰＳの混合物は正常とＡＰＬＡ被験サンプルとをより良好に識別する。
【００８２】
１つ以上のアッセイを患者の被験サンプルで実行する場合、第１のリン脂質混合物を、第２の試験のリン脂質混合物よりも低濃度／量になるように選択することができる。患者サンプルに関する第１の試験のためのリン脂質混合物を、第１の試験を高感度にするためにでき、一方第２の試験のためのリン脂質混合物を、第２の試験をさらに特異的にするためにできる。好ましくは、第１の（スクリーニング）試験には感受性のあるリン脂質混合物または天然供給源に由来するプロトロンビン試薬を用いる。
【００８３】
前記の実例では、患者がＡＰＬＡを有している可能性の上昇を予測するために閾値（勾配１の値）を用いる。２０００年８月８日発行のＧｉｖｅｎｓらに対する米国特許第６１０１４４９号、及び２００１年１１月２０日発行のＢｒａｕｎらに対する米国特許第６３２１１６４号に開示される複数のパラメーター及びモデリング、ならびに１９９９年６月３０日に出願されたＧｉｖｅｎｓらに対する米国特許出願第０９／３４５０８０号に示される自己組織化特徴マップを用いて本発明を容易に実行することもできる（各々は出展明示により本明細書の一部とする）。１つの実施形態では、モデルのパラメーターの１つはＰＴ（またはＡＰＴＴまたはその他の凝固試薬）プロファイルにおける凝血開始前の勾配（勾配１）である。またＰＴ凝血プロファイルからのその他の部分またはパラメーターを用いてＡＰＳの可能性の上昇を予測することもできる。再度表１を参照して、経口抗凝固剤（ワルファリン）を投与されていないＡＰＬＡ患者は正常ドナー（ワルファリンを投与されているＡＰＬＡ患者も同様）とは有意に異なる勾配１を有するのみならず、ワルファリンを投与されている非ＡＰＬＡ患者と比較して、凝固時間、ｔｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１、ｔｍａｘ２、勾配３及び変化量もまた有意に異なった。これらのＡＰＬＡ患者はまたワルファリンを投与されている非ＡＰＬＡ患者と比較して、有意に異なる勾配１、ｔｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１及びｔｍａｘ２を有した。ワルファリンを投与されているＡＰＬＡ患者は正常ドナーと比較して有意に異なる勾配１を有したが、正常と比較して、凝固時間、ｔｍｉｎ２、ｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１、ｔｍａｘ２、ｍａｘ２、勾配３及び変化量もまた有意に異なった。勾配１に加えて、そのようなその他のパラメーター、または米国特許第６１０１４４９号に示される複数のパラメーター及びモデリングを用いて患者が有しているＡＰＳの可能性の上昇の存在を予測することができる。
【００８４】
単一のパラメーターの閾値を用いても、または複数のパラメーターモデルを用いても、患者サンプル中のＡＰＬＡの可能性の指標がある場合、ＡＰＬＡに関する確認アッセイ（例えばイムノアッセイ）及び／またはＬＣ−ＣＲＰの可能性から区別するためのアッセイを実行するのが望ましい（しかしながら複数のパラメーターモデルではこれは不必要になる）。実施することができるかかる区別アッセイの１つはホスホリルコリンの添加を伴うＡＰＴＴアッセイである−勾配１は、元来ＬＣ−ＣＲＰに起因する勾配１を有したＡＰＴＴアッセイでは形成されない。または望む場合、定量的ＬＣ−ＣＲＰアッセイを実行して、このメカニズムにより引き起こされる勾配１の可能性を除外することができる（例えばＡＰＴＴアッセイにおいて）。これはリン脂質を伴わないで金属カチオン（例えばカルシウム）を添加するか、または凝固試薬を用いる場合、その型を変えることにより達成することができる（前記したように、リン脂質及び金属カチオンを含んでなる試薬を、リン脂質及び金属カチオンを有する凝固試薬の代わりに用いることができる）。いずれかの事象では、予め決定した閾値（または勾配１を含み得る１つまたはそれ以上のパラメーターを利用するモデル予測）を越える勾配１の存在はＡＰＬＡの可能性の指標であり、そして好ましくは、さらなる試験で追跡して、患者がＡＰＳを有しているかどうかを確認すべきである。
【００８５】
ＡＰＬＡに関する確認アッセイは、いずれかの（異種性）抗リン脂質抗体に関する１つまたはそれ以上のイムノアッセイでよい。好ましくは、確認アッセイは抗β２糖タンパク質、抗プロトロンビンまたは抗カルジオリピン抗体に関するイムノアッセイである。いずれかの公知のアッセイ方法、例えば金属ゾル・イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ラテックス・イムノアッセイ等によりかかるイムノアッセイを実施することができる。確認アッセイは基準：［１］リン脂質依存的スクリーニングアッセイの延長；［２］プールされた正常血漿との１：１混合物を用いる延長されたアッセイの修正の欠如；及び［３］過剰のリン脂質の添加により延長されたアッセイの修正；に従ってＡＰＬＡを同定するためのアッセイでもよい。
【００８６】
本発明のアッセイは定量的または反応定量的アッセイでもよい。図１４ａ及び１４ｂに示されるように、勾配１の程度をリン脂質抗体（この場合抗β２糖タンパク質抗体及び抗カルジオリピン抗体）の量、ＡＰＳの程度及び／または血栓性事象の可能性に相関させることができる。しばしば抗リン脂質抗体を伴う患者で上昇する抗体レベルとの相関性研究により、６６人のＡＰＬＡ患者のこの集団において、負の勾配１の値と抗カルジオリピンＩｇＧ（ｒ＝０．７）のレベル及びβ２糖タンパク質に対する抗体のレベル（ｒ＝０．６）との相関性を示した。このように、ＡＰＬＡを定量でき、及び／または患者の進行もしくは退行を勾配１に関して繰り返し行った試験に基づいて（または前記したような複数のパラメーターの繰り返し行った分析に基づいて）モニター観察することができる。
【００８７】
前記したＰＴ試薬またはリン脂質の代わりに、試薬はＡＰＴＴ試薬でよい。図３に示されるように、ＡＰＴＴ凝血プロファイルにおける勾配１はまた抗リン脂質抗体症候群を有する患者の可能性の上昇を示し得る。そして、表２に示されるように、ＡＰＴＴ凝血プロファイルから、経口抗凝固剤（ワルファリン）投与を受けていないＡＰＬＡ患者は（正常と比較して）有意に異なるＡＰＴＴ勾配１、ならびに凝固時間、ｔｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１、ｔｍａｘ２、ｍａｘ２、勾配３及び変化量を有した。経口抗凝固剤投与を受けていないこれらのＡＰＬＡ患者はまた経口抗凝固剤投与を受けている非ＡＰＬＡ患者と比較して有意に異なる勾配１及び勾配３を有した。経口抗凝固剤投与を受けているＡＰＬＡ患者は経口抗凝固剤投与を受けている非ＡＰＬＡ患者と比較して有意に異なる勾配１及び勾配３を有し、そして正常と比較してＡＰＴＴ凝固時間、ｔｍｉｎ２、ｍｉｎ２、ｔｍｉｎ１、ｔｍａｘ２、ｍａｘ２及び変化量が有意に異なった。これらのパラメーターは単独でまたは複数パラメーターモデル（例えば、前記した神経ネットワークモデル）で一緒に、ＡＰＳの可能性の上昇を予測するために用いることができた。
【００８８】
本発明はまた患者が重大なリスクのある患者、例えば血栓性事象のリスクが上昇している患者であることを決定することをも志向する。血栓症は最も一般的に抗リン脂質抗体の存在に随伴される臨床事象である。血栓性事象は抗リン脂質抗体を有する患者の３０％までに報告されており、全体的な発生率は年間患者１００人あたり２．５人である。静脈性血栓塞栓症（ＶＴＥ）は血栓性事象の約３分の２に相当する。脳梗塞は最もよくある動脈閉塞性事象であり、しばしば若年層でも発生する。血栓症の再発率もまたとりわけ高く、ＡＰＡの存在はさらに器官損傷及び心臓血管性疾患のリスクの上昇などの機能予後の悪さに関連している。抗リン脂質抗体を有する個体における血栓症の発生率が高いために、本発明はリン脂質を被験サンプルに添加し、時間依存的測定を行い、そして勾配１を決定し、そして勾配１が特定の値を超える場合、次いで個体で血栓性事象を呈するリスクが上昇していることを決定する試験でもよい。
【００８９】
前記の変法では、個体で血栓性事象のリスクが上昇していることを決定し、ここでリン脂質を患者の被験サンプルに加え、そして特定の閾値を越える勾配１を検出する第１の試験を実施する。次いでリン脂質及びベータ２糖タンパク質１またはプロトロンビンのいずれかを患者の被験サンプルに加える第２の試験を実施する。さらなるベータ２糖タンパク質１を添加したときに勾配１の上昇が観察される場合（またはプロトロンビンを添加したときに勾配１の上昇が観察されない場合）、次いで患者のＡＰＳがベータ２糖タンパク質１のレベル上昇の存在に起因する可能性が上昇しており、これは抗トロンビン抗体に随伴されるＡＰＳに比較して、血栓症の合併症のリスクの上昇に随伴されることが示されている。この方法を用いてＡＰＳの患者が、凝血プロファイルにおける勾配１の存在（及び／またはその程度）に基づいてＡＰＳ（例えば流産、血栓性事象、ＳＬＥ、自己免疫障害等）の臨床発現を経験するリスクが高いことを決定することもできる。
【００９０】
また個体が流産を経験するリスクが上昇している個体の決定、及び／または既に経験した流産の原因がＡＰＳによるものであることを決定に本発明を適用することもできる。かかる方法では、個体からの被験サンプルを提供し；被験サンプルをリン脂質と組み合わせ；光ビームを被験サンプルに導いてそして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供し；時間依存的測定プロファイルの特定の時間で、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越える値または勾配を検出し；そして、時間依存的測定プロファイルの値または勾配が予め決定された閾値を越える場合、次いで個体で流産を経験するリスクが上昇していること（または既に経験した流産がＡＰＳに起因した可能性があること）を決定する。
【００９１】
また数週もしくは数ヶ月毎にまたはその他の間隔で試験を複数回実施する本発明を用いて、ＡＰＳのリスクが上昇していると決定されている（またはＡＰＳ患者として確認されている）個体の状態をモニター観察することもできる。抗ベータ２糖タンパク質１を標的とする薬物、例えばＬＪＰ  １０８２（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ．より入手）またはこれもしくはリン脂質結合タンパク質に対するその他の抗体を標的とする別の薬物でＡＰＳ患者を処置する場合、次いで例えば本明細書で前記したアッセイからの勾配１の存在（及び程度）を決定することにより、かかる治療を経時的にモニター観察することができる。
【００９２】
本発明はまた全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の可能性の上昇を決定することをも志向する。ＳＬＥは抗リン脂質抗体を有する患者の３５％で報告されている最も頻発する症状の１つである。ＳＬＥは米国で毎年１０００００人以上の入院の原因となり、ＳＬＥは出産適齢期の女性の腎臓疾患及び脳梗塞の主要な原因である。
【００９３】
本発明の方法を凝固分析器で実施する必要はないが、経時的にサンプルの濁度（または粘度）の変化を決定することができる、好ましくはサンプルを通る光透過率をモニター観察することができる臨床化学分析器またはその他の機器で実施することもできる。特定の値を超える勾配１が前記に従って決定される場合、サンプルをＡＰＳの可能性のあるサンプルとして合図することができる。かかる合図は分析器／装置と接続したプリンターで、またはモニター／スクリーンでの警告、音声警告等によることができる。
【００９４】
本発明を好ましい実施形態を参照して示し、そして記載してきたが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において種々の修飾及び変更を施すことができることは技術分野の技術者には理解されよう。例えば、前記では本発明の理解をより完全なものにするために具体的な詳細を示しているが、本発明がこれらの具体的な詳細を用いることなく本発明を実施することができることは技術分野の技術者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】この図は勾配１の変化がＡＰＬＡを有する患者４１人中２６人（６３％）で同定されたことを示している。
【図２】この図は透過率の第１及び第２誘導を含む、正常な標本のＰＴまたはＡＰＴＴアッセイに関する光学透過率対時間を示す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、経口抗凝固剤治療を伴う及び伴わない患者及び対照のＡＰＴＴ凝固時間及び勾配１の結果を説明している。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、経口抗凝固剤治療を伴う及び伴わない患者及び対照に由来するＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）ＬでのＰＴ凝固時間及び勾配１の結果の分布を説明している。
【図５】この図は正常及びＡＰＬＡ患者の血漿サンプルのＰＴアッセイの透過率波形プロファイルを説明する。
【図６】この図はＰＴ及びＰＴ勾配１の値に及ぼすヘパリンの影響を示す。プールされた正常血漿に０．１、０．４、０．６、０．８、１．０及び１０Ｕ／ｍｌの濃度のブタ由来ヘパリンをスパイクした。
【図７】この図はＡＰＬＡ患者の血漿のＰＴ勾配１に及ぼすトロンビンインヒビター・ヒルジンの添加の影響を示し、これは変化がトロンビン生成とは独立していることを実証している。
【図８】図８ａは、ＰＴ試薬（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ）を患者の血漿に加えた場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１を説明し、そして図８ｂはリン脂質混合物を患者の血漿サンプルに加えた場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１値を示している。
【図９】この図はＡＰＬＡ患者血漿のＰＴ勾配１に及ぼすデタージェント（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の添加の影響を説明している。
【図１０】ａ）正常なＴＷ；ｂ）ＡＰＬＡ患者血漿からの負の勾配１を伴うＴＷ；及びｃ）全ＩｇＧを除去した後の同一のＡＰＬＡ患者からのＴＷからのＰＴアッセイ（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｌ）に関する透過率波形プロファイルを示す。
【図１１】この図は、ａ）ＩｇＧを添加する前の正常なＰＴ  ＴＷ；ｂ）負の勾配１を示す、８ｍｇ／ｍｌで添加したＡＰＬＡ患者ＩｇＧを伴う同一のドナー血漿からの異常ＰＴ  ＴＷ；ｃ）ＩｇＧを添加する前の正常なＡＰＴＴ  ＴＷ；及びｄ）正常な勾配１を示す添加したＡＰＬＡ患者  ＩｇＧ（８ｍｇ／ｍｌ）を伴う同一のドナー血漿からの延長されたＡＰＴＴ  ＴＷ；を伴うＡＰＬＡ患者からの全ＩｇＧでスパイクしたＩｇＧ涸渇正常血漿からのＰＴ及びＡＰＴＴアッセイの透過率波形プロファイルを示す。
【図１２】図は、ａ）ＩｇＧを添加する前のＰＴ凝固時間の延長を示すＰＴ  ＴＷ；ｂ）負の勾配１を示す、添加したＡＰＬＡ患者ＩｇＧを伴う同一ドナー血漿からの異常ＰＴ  ＴＷ；ｃ）ＩｇＧを添加する前のＡＰＴＴ  ＴＷ；及びｄ）添加したＡＰＬＡ患者ＩｇＧを伴う同一ドナー血漿からの正常勾配１を伴うＡＰＴＴ凝固時間の延長；を伴うＡＰＬＡ患者からの全ＩｇＧでスパイクしたＩｇＧ−涸渇した経口抗凝固剤投与した血漿からのＰＴ及びＡＰＴＴアッセイの透過率波形プロファイルを示す。
【図１３】ワルファリンの投与を受けていた６人の対照からのＩｇＧ涸渇血漿における国際標準比率（ＩＮＲ）に及ぼすＡＰＬＡ  ＩｇＧの影響を示す。
【図１４】図１４ａは抗β２糖タンパク質抗体とプロトロンビン時間勾配１との間の相関性を説明し、そして図１４ｂは抗カルジオリピン抗体のレベルとプロトロンビン時間勾配１との間の相関性を説明する。
【図１５】図１５は、全ＩｇＧをＰＴ基盤のアッセイにおける血漿の代わりに用いた場合、正常ドナーサンプルと比較して２つのＩｇＧサンプルのみが異常な凝固前相を表示したことを示すチャートである。
【図１６】図１６は列挙した血漿タンパク質のうち、プロトロンビン及びβ２ＧＰＩのみがＩｇＧ波形アッセイにおいて異常プロファイルの作成に寄与したことを説明している。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、プロトロンビン及びβ２ＧＰＩの濃度上昇の存在下での９人のＡＰＳ患者及び２人の正常ドナーに関するＩｇＧ波形アッセイの結果を示している。
【図１８】図１８は１つの被験サンプルに関して、非リン脂質結合β２ＧＰＩは、特定の被験サンプルからのＩｇＧの存在下で、その野生型の対応物と同一の濃度で試験する場合、この個体からの抗体がＥＬＩＳＡにおいて切断されたβ２ＧＰＩに結合したが、異常ＩｇＧ波形を誘導しなかったことを示している。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、β２ＧＰＩの存在下、ＡＰＬＡ被験サンプルと正常との間の識別の程度を、用いたＰＴ試薬に依存して変化させることができることを示している。
【図２０】図２０は単純なＰＣ：ＰＳ（７５：２５）リン脂質混合物の識別能力を説明している。
【図２１】図２１はＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ及び種々ＰＥ：ＰＣ：ＰＳリン脂質混合物の識別能力の改善を説明している；ならびに
【図２２】図２２は種々トロンボプラスチンの勾配１に対する感受性を説明している。
【図１】
2005520170.tif 000006
【図２】
2005520170.tif 000007
【図３】
2005520170.tif 000008
【図４】
2005520170.tif 000009
【図５】
2005520170.tif 000010
【図６】
2005520170.tif 000011
【図７】
2005520170.tif 000012
【図８】
2005520170.tif 000013
【図９】
2005520170.tif 000014
【図１０】
2005520170.tif 000015
【図１１】
2005520170.tif 000016
【図１２】
2005520170.tif 000017
【図１３】
2005520170.tif 000018
【図１４−１】
2005520170.tif 000019
【図１４−２】
2005520170.tif 000020
【図１４−３】
2005520170.tif 000021
【図１４−４】
2005520170.tif 000022
【図１５】
2005520170.tif 000023
【図１６】
2005520170.tif 000024
【図１７】
2005520170.tif 000025
【図１８】
2005520170.tif 000026
【図１９】
2005520170.tif 000027
【図２０】
2005520170.tif 000028
【図２１】
2005520170.tif 000029
【図２２】
2005520170.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月19日(2004.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験サンプルをリン脂質及びトロンボプラスチンを含んでなる凝固試薬と組み合わせること；被験サンプルに光ビームを誘導し、そして光散乱または透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；時間依存的測定プロファイルの特定の時点または時間での値または勾配が、対応する予め決定された値または勾配の閾値を越えるかどうかを決定すること；を含んでなる被験サンプルの分析方法。
【請求項２】
少なくとも１つの確認アッセイを利用することを含んでなり、ここで該確認アッセイが基準：ａ）リン脂質依存的スクリーニングアッセイの延長；ｂ）プールされた正常血漿との１：１混合物を用いる延長されたアッセイの修正の欠如；及びｃ）過剰のリン脂質の添加による延長されたアッセイの修正；に従ってＡＰＬＡを同定するためのアッセイである請求項１の方法。
【請求項３】
ａ）被験サンプルをリン脂質と組み合わせること；ｂ）被験サンプルに光ビームを誘導し、そして被験サンプルからの光の反射率またはそれを通る透過率を経時的にモニター観察して時間依存的測定プロファイルを提供すること；ｃ）時間依存的測定プロファイルの値または勾配を決定すること；ｄ）工程ａ）からｃ）を繰り返すこと；及びｅ）値または勾配を互いに比較すること；を含んでなる被験サンプルの分析方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
図８Ａで示されるように、正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１はＰＴ試薬（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ）を患者の血漿に添加した場合に示され、そして図８Ｂはリン脂質混合物を血漿に添加した場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１を示す。図９はデタージェント（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の添加の、ＡＰＬＡ患者血漿のＰＴ勾配１に及ぼす効果を説明している。これらのデータはリン脂質表面に関する要件を示している。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は用量依存的な様式で勾配１の変化を減じた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
本発明のアッセイは定量的または反応定量的アッセイでもよい。図１４Ａ及び１４Ｂに示されるように、勾配１の程度をリン脂質抗体（この場合抗β２糖タンパク質抗体及び抗カルジオリピン抗体）の量、ＡＰＳの程度及び／または血栓性事象の可能性に相関させることができる。しばしば抗リン脂質抗体を伴う患者で上昇する抗体レベルとの相関性研究により、６６人のＡＰＬＡ患者のこの集団において、負の勾配１の値と抗カルジオリピンＩｇＧ（ｒ＝０．７）のレベル及びβ２糖タンパク質に対する抗体のレベル（ｒ＝０．６）との相関性を示した。このように、ＡＰＬＡを定量でき、及び／または患者の進行もしくは退行を勾配１に関して繰り返し行った試験に基づいて（または前記したような複数のパラメーターの繰り返し行った分析に基づいて）モニター観察することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
【図１】この図は勾配１の変化がＡＰＬＡを有する患者４１人中２６人（６３％）で同定されたことを示している。
【図２】この図は透過率の第１及び第２誘導を含む、正常な標本のＰＴまたはＡＰＴＴアッセイに関する光学透過率対時間を示す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、経口抗凝固剤治療を伴う及び伴わない患者及び対照のＡＰＴＴ凝固時間（図３Ａ）及び勾配１の結果（図３Ｂ）の分布を示している。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、経口抗凝固剤治療を伴う及び伴わない患者及び対照に由来するＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）ＬでのＰＴ凝固時間（図４Ａ）及び勾配１の結果（図４Ｂ）の分布を示している。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、正常（図５Ａ）及びＡＰＬＡ患者（図５Ｂ）の血漿サンプルのＰＴアッセイの透過率波形プロファイルを示している。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、異なるヘパリン量がＰＴ及びＰＴ勾配１の値に及ぼす影響を示している。
【図７】この図はＡＰＬＡ患者の血漿のＰＴ勾配１に及ぼすトロンビンインヒビター・ヒルジンの添加の影響を示し、これは変化がトロンビン生成とは独立していることを実証している。
【図８】図８Ａは、ＰＴ試薬（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ）を患者の血漿に加えた場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１を示し、そして図８Ｂはリン脂質混合物を患者の血漿サンプルに加えた場合の正常及びＡＰＬＡ患者に関する勾配１値を示している。
【図９】この図はＡＰＬＡ患者血漿のＰＴ勾配１に及ぼすデタージェント（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）の添加の影響を説明している。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、ＰＴアッセイ（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）Ｌ）に関する透過率波形プロファイルを示し、正常血漿サンプル（図１０Ａ）；全ＩｇＧ除去前のＡＰＬＡ患者血漿サンプル（図１０Ｂ）；全ＩｇＧ除去後のＡＰＬＡ患者血漿サンプル（図１０Ｃ）である。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｄは、全ＩｇＧでスパイクされたＩｇＧ涸渇正常血漿に関するＰＴとＡＰＴＴアッセイの透過率波形プロファイルを示し、ＩｇＧを添加する前の正常なＰＴ透過率波形を示すＡＰＬＡ患者（図１１Ａ）；負の勾配１を示すＡＰＬＡ患者のＩｇＧを８ｍｇ／ｍｌを添加した同一のドナー血漿に関する異常ＰＴ  ＴＷ（図１１Ｂ）；ＩｇＧを添加する前の正常ＡＰＴＴ  ＴＷ（図１１Ｃ）；及び正常な勾配１を示すＡＰＬＡ患者のＩｇＧ（８ｍｇ／ｍｌ）を添加した同一のドナー血漿に関する延長されたＡＰＴＴ  ＴＷ。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、全ＩｇＧでスパイクされたＩｇＧ−涸渇の経口抗凝血薬を投与した血漿に関するＰＴ及びＡＰＴＴアッセイのＴＷプロファイルを示し、延長されたＰＴ凝固時間を示すＩｇＧを添加する前のＰＴ  ＴＷを示すＡＰＬＡ患者（図１２Ａ）；負の勾配１を示す、ＡＰＬＡ患者のＩｇＧを添加した同一のドナー血漿に関する異常ＰＴ  ＴＷ（図１２Ｂ）；ＩｇＧを添加する前のＡＰＴＴ  ＴＷ（図１２Ｃ）；及びＡＰＬＡ患者のＩｇＧを添加した同一のドナー血漿に関する正常な勾配１を伴う延長されたＡＰＴＴ凝固時間。
【図１３】ワルファリンの投与を受けていた６人の対照からのＩｇＧ涸渇血漿における国際標準比率（ＩＮＲ）に及ぼすＡＰＬＡ  ＩｇＧの影響を示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｌは、種々の試薬（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ；Ｄａｄｅ  Ｃ  Ｐｌｕｓ；ＨＴＦ；Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ：Ｉｎｎｏｖｉｎ；及びＲｅｃｏｍｂｉｐｌａｓｔｉｎ）と２つの異なるリン脂質結合タンパク質（抗−β２糖タンパク質”抗β２ＧＰＩ”及び抗カルジオリピン抗体”ＡＣＬ”）を用いた場合のＰＴ勾配１を示す。
【図１５】図１５は、全ＩｇＧをＰＴ基盤のアッセイにおける血漿の代わりに用いた場合、正常ドナーサンプルと比較して２つのＩｇＧサンプルのみが異常な凝固前相を表示したことを示すチャートである。
【図１６】図１６は列挙した血漿タンパク質のうち、プロトロンビン及びβ２ＧＰＩのみがＩｇＧ波形アッセイにおいて異常プロファイルの作成に寄与したことを説明している。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、負のＰＴ勾配１のβ２ＧＰＩへの依存性（図１７Ａ）、及びプロトロンビン濃度を利用した９人のＡＰＳ患者と２人の正常なドナーのＩｇＧ波形結果（図１７Ｂ）の定義を示している。
【図１８】図１８は１つの被験サンプルに関して、非リン脂質結合β２ＧＰＩは、特定の被験サンプルからのＩｇＧの存在下で、その野生型の対応物と同一の濃度で試験する場合、この個体からの抗体がＥＬＩＳＡにおいて切断されたβ２ＧＰＩに結合したが、異常ＩｇＧ波形を誘導しなかったことを示している。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、β２ＧＰＩの存在下、ＡＰＬＡ被験サンプルと正常との間の識別の程度を、用いたＰＴ試薬に依存して変化させることができることを示しており、図１９ＡはＳｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌでの異常ＩｇＧ波形アッセイを示し、図１９Ｂはトロンボプラスチン  Ｉｎｎｏｖｉｎでの異常ＩｇＧ波形アッセイを示している。
【図２０】図２０は単純なＰＣ：ＰＳ（７５：２５）リン脂質混合物の識別能力を説明している。
【図２１】試薬Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ（図２１Ａ）、及び種々ＰＥ：ＰＣ：ＰＳリン脂質混合物（図２１Ｂ〜２１Ｅ）の識別能力の改善を示している。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｆは、ＮＡで表される正常ドナー及びＡＰＬＡで表される抗リン脂質抗体ドナーにおける種々トロンボプラスチン（Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  Ｌ；Ｄａｄｅ  Ｃ  Ｐｌｕｓ；Ｓｉｍｐｌａｓｔｉｎ  ＨＴＦ；Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ  Ｓ：Ｉｎｎｏｖｉｎ；ＲｅｃｏｍｂｉＰｌａｓｔｉｎ）の勾配１の感受性を示している。
【国際調査報告】
2005520170.tif 000031
2005520170.tif 000032
2005520170.tif 000033
2005520170.tif 000034
2005520170.tif 000035
2005520170.tif 000036