(57)【要約】  本発明は腫瘍細胞のＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ−１自己分泌ループを阻害するアンタゴニストを投与することによる腫瘍細胞の阻害方法に関する。内皮細胞で発現された他のＶＥＧＦＲ、特にＶＥＧＦＲ−２を阻害することにより、内皮傍分泌ループを阻害するために、追加的なアンタゴニストを加えることもできる。アンタゴニストの例として、抗体および小分子がある。治療のために好適な癌は、乳癌である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的ＶＥＧＦ−１レセプターを発現する腫瘍細胞の増殖を防止または低減するための方法であって、自己分泌刺激を阻害するために有効な量のＶＥＧＦ−１レセプターアンタゴニストを哺乳動物に対して投与することを含んでなる方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍細胞が乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、腎臓癌、膀胱癌、腺癌、悪性グリオームおよび白血病からなる群より選択される癌から入手される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
癌が乳癌である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
癌が実質的に血管新生化されていない、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
アンタゴニストが小分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アンタゴニストが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物がヒトであり、抗体がＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３３４４として寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたＭａｂ６．１２である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
内皮細胞で発現されたＶＥＧＦＲに特異的な第２アンタゴニストを投与することによって、内皮により媒介される傍分泌ループを阻害することを更に含み、該ＶＥＧＦＲがＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３およびニューロピリンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第２アンタゴニストが小分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
第２アンタゴニストが抗体である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
第２アンタゴニストがＶＥＧＦＲ−２に対して特異的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物がヒトであり、アンタゴニストがＤＣ１０１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
アンタゴニストとともに化学療法剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
化学療法剤が、アントラサイクリン、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカリシノスタチン、シス−プラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、イリノテカン、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシン、カリケアマイシン、タクソール、ゲムシチビン、フルオロウラシル、パクリタクセル、ドセタキセル、ロイコボリンおよびノベルビンからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
放射線を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターのアンタゴニストによる哺乳動物の腫瘍の治療方法に関する。好ましくは、アンタゴニストは腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに特異的に結合する中和抗体である。特に、本発明はヒトＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインに特異的に結合する中和抗体を腫瘍増殖もしくはサイズを低減するために有効な量で投与することによる癌細胞の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤由来増殖因子（ＰｌＧＦ）、ならびにそれらのレセプターＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ，Ｆｌｋ−１）およびＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）は、脈管形成、血管形成および腫瘍増殖に関与している。ＶＥＧＦは、ＰＤＧＦと構造類似性をもった２つの２３ｋＤのサブユニットからなるホモ二量体型の糖タンパク質である。ｍＲＮＡの選択的スプライシングより生じるＶＥＧＦの４種の異なる単量体型アイソフォームが存在する。これらアイソフォームとしては、２種の膜結合形（ＶＥＧＦ206 およびＶＥＧＦ189 ）と２種の可溶性形（ＶＥＧＦ165 およびＶＥＧＦ121 ）がある。胎盤を除くヒトの全組織において、ＶＥＧＦ165 が最も豊富にあるアイソフォームである。
【０００３】
ＶＥＧＦは血管透過性の強誘導因子であり、内皮細胞移動の刺激因子であり、新生血管の重要な生存因子である。ＶＥＧＦは、胚組織（Breier et al., Development (Camp.) 114: 521 (1992)）、マクロファージ、創傷治癒時の増殖性表皮ケラチノサイト（Brown et al., J. Exp. Med., 176: 1375 (1992)）において発現し、また炎症に伴う組織水腫に関与し得る（Ferrara et al., Endocr. Rev. 13: 18 (1992)）。インサイチュ(in situ）ハイブリダイゼーション研究により、多形グリア芽種、血管芽腫、中枢神経系新生物およびＡＩＤＳ関連カポジ肉腫など多数のヒト腫瘍系において、高ＶＥＧＦ発現が実証されている（Plate, K. et al. (1992) Nature 359: 845-848; Plate, K. et al. (1993) Cancer Res. 53: 5822-5827; Berkman, R. et al. (1993) J. Clin. Invest. 91: 153-159; およびNakamura, S. et al. (1992) AIDS Weekly, 13(1)）。低酸素誘導血管形成においても高レベルのＶＥＧＦが観察されている（Shweiki, D. et al. (1992) Nature 359: 843-845）。
【０００４】
ＶＥＧＦの生物学的応答は、腫瘍形成時に、そして発生時に内皮細胞で選択的に発現されるその高親和性ＶＥＧＦレセプターを介して媒介される（Millauer, B., et al. (1993) Cell 72: 835-846）。ＶＥＧＦレセプターは、一般には、そのアミノ末端側細胞外レセプターリガンド結合ドメインに幾つか、一般に５〜７、の免疫グロブリン様ループを有することによって特徴付けられるクラスIII型 チロシンキナーゼである（Kaipainen et al., J. Exp. Med. 178: 2077-2088 (1993)）。その他の２つの領域として、キナーゼインサートドメインと呼ばれる可変長の親水性内部キナーゼ配列の挿入によって割り込まれる形で膜貫通領域およびカルボキシ末端側細胞内触媒ドメインがある（Terman et al., Oncogene 6: 1677-1683 (1991)）。
【０００５】
ＶＥＧＦレセプターとしては、Shibuya M. et al, Oncogene 5, 519-524 (1990)によって配列決定されたＶＥＧＦレセプター１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼレセプターまたはＦｌｔ−１とも呼ばれる、ＶＥＧＦＲ−１）、およびＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ−２）がある。ヒト形のＶＥＧＦＲ−２は、キナーゼインサートドメイン含有レセプター（ＫＤＲ）とも呼ばれ、１９９２年２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ９２／０１３００およびTerman et al., Oncogene 6: 1677-1683 (1991) に記載されている。ネズミ形のＶＥＧＦＲ−２は、ＦＬＫ−１とも呼ばれ、Matthews W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9026-9030 (1991)によって配列決定されている。
【０００６】
腫瘍体によるＶＥＧＦの放出は、隣接した内皮細胞における血管形成を刺激する。腫瘍体によりＶＥＧＦが発現されると、該ＶＥＧＦ+ 腫瘍細胞はＶＥＧＦレセプター分子すなわちＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２の発現をアップレギュレートすることになる。これらのレセプターは、そのリガンドの結合により、二量体化し、チロシンリン酸化を介して細胞内シグナルを伝達する。ＶＥＧＦは、乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、腎臓癌および膀胱癌、腺癌、悪性グリオームおよび白血病など広範囲にわたる腫瘍の血管新生に対して決定的に重要な役割を果たす。腫瘍は十分な量のＶＥＧＦを産生し、このＶＥＧＦが内皮細胞（ＥＣ）の増殖および移動を刺激し、それにより傍分泌機構によって腫瘍の血管新生を誘導する。
【０００７】
絨毛様細胞栄養芽層、合胞栄養芽層および絨毛外栄養芽層によって多量に産生される、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）に対する他の天然の特異的リガンドである胎盤由来増殖因子（ＰｌＧＦ）は、ＶＥＧＦファミリーの一種である。ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦと近いアミノ酸相同性を共有する二量体型の分泌因子である。ＶＥＧＦとＰｌＧＦの生物学的効果も、内皮細胞移動の刺激を含め一部が類似する。したがって、ＰｌＧＦとＶＥＧＦは、骨髄単球系細胞および内皮系細胞の両方に対し同調して作用し得るように思われる。
【０００８】
中和抗体その他の脈管内皮細胞で発現されるＶＥＧＦレセプターによるシグナル伝達を阻止する分子の投与は、内皮依存性の傍分泌ループを介する血管形成を阻止することによって腫瘍増殖を減少させることが知られている。血管形成を阻害するために、ＶＥＧＦリガンドを阻止するのではなく、ＶＥＧＦレセプターを阻止し、それにより腫瘍増殖のような病理状態を阻害することの１つの利点は、このような阻害を達成するために必要とされる抗体が少なくてすむことである。さらに、レセプターの発現レベルは、環境により誘導されるリガンドの発現レベルよりも定常的となり得る。米国特許第５，８０４，３０１号；同第５，８７４，５４２号；同第５，８６１，４９９号および同第５，９５５，３１１号参照。
【０００９】
ある種の腫瘍細胞はＶＥＧＦを産生するだけでなく、機能的ＶＥＧＦレセプター（ＶＥＧＦＲ）を発現する能力を獲得している場合もあり、この場合には腫瘍増殖を支援する内皮非依存性の自己分泌ループの形成が生じる。本発明者は、最近、ＶＥＧＦ／ヒトＶＥＧＦＲ−２自己分泌ループが生体内(in vivo）での白血球細胞生存および移動を媒介することを最初に実証している。Dias et al., "Autocrine stimulation of VEGFR-2 activates human leukemic cell growth and migration", J. Clin. Invest. 106: 511-521 (2000)。同様に、生体外（in vitro）での幾つかの固形腫瘍細胞系について、ＶＥＧＦ産生およびＶＥＧＦＲ発現も報告されている。（Tohoku, Sato, J. Exp. Med., 185(3):173-84 (1998); 日本, 産科婦人科学会雑誌; 47(2): 133-40 (1995); およびFerrer, FA, Urology, 54(3):567-72 (1999)）。しかしながら、固形腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦＲが機能的であって分裂促進性または他のシグナルを伝達するかどうかは、実証されていない。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、哺乳動物の腫瘍の治療方法であって、該腫瘍を有する哺乳動物を、腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターのアンタゴニストにより処理することを含んでなり、前記ＶＥＧＦレセプターがヒトＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリン（neuropilin）およびこれらの非ヒト相同体（例えばＦＬＫ−１）からなる群より選択され、前記アンタゴニストが腫瘍増殖もしくはサイズを低減するのに有効な量で投与される方法を提供する。好ましくは、該アンタゴニストは、腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに特異的に結合して自己分泌刺激を阻害する中和抗体である。本発明に係る方法および抗体により治療される固形腫瘍の例としては乳癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、グリオームおよびリンパ腫があり、液状腫瘍の例としては白血病がある。
【００１１】
好ましい実施態様において、本発明は、哺乳動物の乳癌の治療方法であって、乳癌を有する哺乳動物を、ヒトＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインに特異的に結合する中和抗体により処理することを含んでなり、前記抗体が腫瘍増殖もしくはサイズを低減するのに有効な量で投与される方法を提供する。
【００１２】
他の実施態様において、第２のＶＥＧＦレセプターアンタゴニストも投与される。この好ましくは、第２アンタゴニストは、腫瘍関連血管内皮細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターに対する抗体であって、内皮依存性の傍分泌ループの阻害を生じさせる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
腫瘍細胞で発現された機能的ＶＥＧＦレセプター、および該ＶＥＧＦレセプターに結合する抗体、ならびに該レセプターの活性を阻害する小分子は、腫瘍細胞の増殖を直接的に阻害することによる腫瘍の治療のために有用である。それ故に、腫瘍細胞増殖の阻害は、血管形成の阻止には依存しない。
【００１４】
本発明は固形腫瘍を治療するための方法および組成物を提供し、ここにおいて腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターのアンタゴニストが該腫瘍を有する哺乳動物に対して投与される。好ましくは、該アンタゴニストは、固形腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターに結合して自己分泌ループを阻害する中和抗体である。また、該アンタゴニストは小分子であってもよい。
【００１５】
本発明は腫瘍を治療するための抗体を提供し、ここにおいて抗体が該腫瘍細胞のＶＥＧＦレセプターに結合してその活性を阻害する。
【００１６】
本発明に係る方法を使用して増殖が低減される腫瘍としては、ＶＥＧＦレセプターを発現する腫瘍がある。腫瘍の例としては、乳癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、グリオーム、リンパ腫および白血病が挙げられる。
【００１７】
本発明は所与の腫瘍タイプを治療するために有用な抗体を同定するための方法、ならびに特定の患者の腫瘍を治療するために有用な抗体を同定するための方法に関する。
【００１８】
株化された腫瘍細胞系から、組織生検から、血液から、又は他の適当な源から入手され得る腫瘍細胞は、これをアッセイして、該腫瘍細胞で機能的ＶＥＧＦレセプターが発現されているか、どの機能的ＶＥＧＦレセプターが発現されているかを決定し得る。ＶＥＧＦレセプターの存在は、本願明細書で示される指針と共に、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡアッセイおよび他の公知の方法によって検出し得る。ＶＥＧＦレセプターが存在していることを見出すために、細胞をＶＥＧＦレセプターのアゴニストリガンドに曝露し、そしてレセプターのリン酸化が起こるかどうかを決定することにより、レセプター機能について細胞を試験し得る。レセプターリン酸化の決定方法は当業界でよく知られており、例えば、モノクローナル抗体または放射性標識によるホスホチロシンの測定が挙げられる。例えば関心あるＶＥＧＦレセプターにより活性化されることが知られている細胞シグナル伝達経路の活性化および細胞増殖等、レセプター機能の他のマーカーも試験し得る。機能性のための適当なマーカーは、関心あるＶＥＧＦレセプターによって異なることになる。
【００１９】
本発明は、腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに特異的に結合可能な抗体を提供する。ＶＥＧＦレセプターとしては、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３およびニューロピリン並びにこれらの非ヒト相同体（例えばＦＬＫ−１）がある。本願明細書において規定するＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインとしては、該レセプターの細胞外部分のリガンド結合ドメイン、ならびに二量化および重複エピトープに関与する細胞外部分が含まれる。抗体は、ＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインに結合すると、効果的にレセプター活性化を阻止し及び／又はレセプター二量体化を妨害する。このような結合の結果、抗体はＶＥＧＦレセプターの活性化を中和する。レセプターを中和するとは、該レセプターがシグナルを伝達するための本来の能力を減少および／または不活性化することを意味する。ＶＥＧＦレセプターの中和についての信頼あるアッセイは、レセプターリン酸化の阻害である。レセプターリン酸化の決定方法はよく知られており、例えば、モノクローナル抗体または放射性標識によるホスホチロシンの測定が挙げられる。
【００２０】
好ましい実施態様において、本発明に係る抗体は、ヒトＶＥＧＲＦ−１に結合し、ヒトＶＥＧＲＦ−１に対するＶＥＧＲの結合および／またはＰｌＧＦの結合を阻害する。Ｍａｂ６．１２は、細胞表面で発現された可溶性のＶＥＧＦＲ−１に結合する抗体の例である。Ｍａｂ６．１２を産生するハイブリドーマ細胞系はＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３３４４として寄託されている。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約およびその規則（ブタペスト条約）の規定の下で行われる。この条約は寄託の日から３０年間生存能力のある培養体の保持を保証する。微生物はブタペスト条約の条項の下でＡＴＣＣにより入手可能とされ、米国特許の発行により無制限の入手可能性を保証するＡＴＣＣと出願人との間の取り決めの対象となる。寄託された菌株の入手可能性は、何れかの政府の当局の下でその特許法に従って付与される権利に反して発明の実施の許諾であるとして解釈すべきでない。
【００２１】
上記の抗体のほか、他の抗ＶＥＧＦ中和抗体（例えばＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３およびニューロピリンに対する抗体）も、本願明細書で示される指針と共に当業界で公知の方法を使用して容易に生産し得る。本発明の抗体は天然リガンドの親和性と同等またはより高い親和性をもってＶＥＧＦレセプターに結合し得る。
【００２２】
本発明に有用な抗体としては、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体が含まれる。ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体は両方とも当業界で公知の方法により生産し得る。モノクローナル抗体を生産するための方法としては、Kohler及びMilsteinによってNature 256, 495-497 (1975)において、およびCampbellによって"Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridoma" in Burdon et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elisevier Science Publishers, Amsterdam (1985) において記載されている免疫学的方法；ならびにHuseらによってScience 246, 1275-1281 (1989) において記載されているような組換えＤＮＡ方法が挙げられる。
【００２３】
キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体も本発明に有用である。有用なキメラ抗体としては、ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列と非ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列を含んでなるキメラ抗体が挙げられる。しかしながら、非ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列と非ヒト抗体の可変領域のアミノ酸配列を含んでなるキメラ抗体も有用である。キメラ抗体の非ヒト可変領域はネズミのものであってよい。有用なヒト化抗体としては、ヒト抗体からの定常領域と可変フレームのアミノ酸配列を含んでなるヒト化抗体が挙げられる。ヒト化抗体の超可変領域のアミノ酸配列はネズミのものであってよい。
【００２４】
キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体は、当業界で公知の方法、例えばファージディスプレー等により生産し得る。（例えばJones, P.T. et al., (1996) Nature 321, 522-525; Riechman, L. et al., (1998) Nature 332, 323-327; Queenらへの米国特許第５，５３０，１０１号; Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. National Center for Biotechnology Information, National Institute of Health, Bethesda, MD; Queen, C. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033; McCafferty et al. (1990) Nature 348, 552-554; Aujame et al. (1997) Human Antibodies 8, 155-168; およびGriffiths et al. (1994) EMBO J. 13, 3245-3260 参照）。ヒト抗体はトランスジェニック動物からも生産し得る（Bruggemann and Taussig (1997) Curr. Opin. Biotechno. 8, 455-458 でレビューされており; また例えば Wagner et al. (1994) Eur. J. Immunol. 42, 2672-2681; Green et al. (1994) Nature Genet. 7, 13-21 も参照）。
【００２５】
本発明に係る抗体としては、該抗体を免疫系に対して自己のように認識させるように、表面で発現された残基を置換することによって免疫原性を少なくした抗体も含まれる。（例えばPadlan, E.A. (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 967-973 参照）。
【００２６】
本発明に有用な抗体として、その結合特性がダイレクトミューテーションにより又はアフィニティミューテーションの方法により改善された抗体も含まれる。（例えばYang et al. (1995) J. Mol. Bio. 254, 392-403; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Bio. 226, 889-896; Low et al. (1996) J. Mol. Bio. 250, 359-368参照）。
【００２７】
抗体の機能的断片および等価物も本発明に有用であり、このような断片および等価物はその対応する全抗体の結合特性と同一であるか又は類似する結合特性を有する。このような断片は、一方または両方のＦａｂフラグメントあるいはＦ（ａｂ’）2 フラグメントを含み得る。このような断片は当業界で既知の方法により生産し得る。（例えばLamoyi et al, Journal of Immunological Methods 56, (1983); およびParham, Journal of Immunology 131, 2895-2902 (1983)参照）。
【００２８】
本発明の他の態様において、抗体を抗腫瘍剤または検出可能なシグナル生成剤に化学的に又は生合成により結合させることができる。本発明は更に、標的部分またはレポーター部分が結合された抗体をも企図する。
【００２９】
抗体およびその機能的等価物のほか、使用し得る他の生物学的アンタゴニストとして、例えばレセプター活性化を阻止することによって腫瘍細胞の増殖を阻害する、タンパク質、ペプチド、または核酸分子、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、も含まれる。
【００３０】
他の有用なアンタゴニストとして、例えばレセプター活性化を阻止することによってＶＥＧＦレセプターを発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する、有機または無機の小分子であってもよい。このような小分子は、一般的に５００未満、より一般的には４５０未満の分子量を有する。最も一般的に、このような低分子は、通常、炭素、水素、そして場合により酸素および／または硫黄原子を含んでなる有機分子である。
【００３１】
本発明の他の態様において、内皮依存性の傍分泌ループを阻害するために、腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターに対するアンタゴニストに加えて、第２のＶＥＧＦレセプターアンタゴニストが投与される。ＶＥＧＦＲ−１アンタゴニストが第１アンタゴニストとして使用される場合に、第２アンタゴニストは好ましくは他のＶＥＧＲレセプターを阻害する。このような場合に、ＶＥＧＦＲ−１アンタゴニストはＶＥＧＦＲ−１に関連する自己分泌および傍分泌の両ループを阻害し、それにより他のＶＥＧＦＲ−１アンタゴニストを加えることを不必要にする。第２アンタゴニストは、好ましくは中和抗体であり、好ましくはＶＥＧＦレセプターまたは腫瘍血管系で発現された他の増殖因子レセプターを標的とする。
【００３２】
このような第２アンタゴニストの例は、ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）に結合してＫＤＲに対するＶＥＧＦの結合を阻止する抗体である。マウスｓｃＦｖファージディスプレーライブラリーからｓｃＦｖ  ｐ１Ｃ１１が生産されている。（Zhu ら，１９９８年）。ｐ１Ｃ１１は、ＶＥＧＦ−ＫＤＲ相互作用を阻止し、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦで刺激されるレセプターリン酸化および分裂誘発(mitogenesis）を阻害する。このｓｃＦｖは、ＨＵＶＥＣの細胞表面で発現されたＫＤＲおよび可溶性のＫＤＲの両方に、例えば高い親和性（Ｋd ＝２．１ｎＭ）をもって結合する。ＤＣ１０１は、中和されたマウスＶＥＧＦＲ−２に結合するラットモノクローナル抗体である。ＤＣ１０１を生産するハイブリドーマ細胞系が、１９９４年１月２６日にＡＴＣＣ受付番号ＡＴＣＣ ＨＢ １１５３４として寄託されている。このような抗体の他の例は、マウスにおける内皮依存性の傍分泌および自己分泌の両ループを阻害する、ネズミＶＥＧＦＲ−１のアンタゴニストＭＦ１である。Yan Wu et al., "Inhibition of Tumor Growth and Angiogenesis in animal models by a neutralizing anti-VEGFR 1 monoclonal antibody", ImClone Systems Incorporated, New York。
【００３３】
ヒトに対する抗体６．１２等のような抗体を投与すると、該抗体はそれ自身で自己分泌および傍分泌の両ループを阻害し、該抗体は腫瘍細胞または内皮細胞でのレセプターの位置とは無関係にＶＥＧＦＲ−１を阻害する。実施例２について、そのモデルはマウスにおいてヒト腫瘍を含み、ここで内皮細胞はネズミ由来のものである。抗体６．１２はヒトＶＥＧＦＲ−１に対して特異的であり、したがって該マウスモデルにおいて、マウス内皮細胞ではなく、ヒト癌細胞の自己分泌ループを阻害するだけである。したがって、マウス内皮細胞の傍分泌刺激は、該モデルにおいて抗体６．１２により影響を受けない。ＭＦ１はマウス特異的であり、ヒト腫瘍細胞ではなく、マウス内皮細胞を阻害する。
【００３４】
本発明の更に他の態様において、実質的に血管新生化されていないか又は未だ血管新生化されていない腫瘍を有する患者が、腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦレセプターのアンタゴニストにより処理される。このような患者の例は、転移中の腫瘍を有する患者であり、ここで転移は未だ血管新生化されていない。好ましい実施態様において、患者は転移中の乳癌を有し、該アンタゴニストはＶＥＧＦＲ−１に対する中和抗体である。
【００３５】
本発明に係るアンタゴニストは、併用治療法においても使用し得る。抗体および小分子は、化学療法剤、放射性同位体等の抗腫瘍剤または放射線治療とともに投与することができる。適した化学療法剤は、当業者に知られており、アントラサイクリン（例えばダウノマイシンおよびドクソルビシン）、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカリシノスタチン、シス−プラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、イリノテカン、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシン、カリケアマイシン、タクソール、ゲムシチビン、フルオロウラシル、パクリタクセル、ドセタキセル、ロイコボリンおよびノベルビンが挙げられる。本発明に係るアンタゴニストは、他の治療方式とともに投与してよい。例えば、本発明の抗体および／または小分子を外部治療、例えば外部ビーム照射とともに投与してよい。
【００３６】
本発明の抗体および／または小分子は、診断または治療の目的のために使用される場合には、医薬として許容される担体を更に含む組成物の形態で投与されることが理解されよう。適した医薬として許容される担体としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等の１種以上、およびこれらの混合物が挙げられる。医薬として許容される担体は、結合性タンパク質の有効期間または有効性を向上する少量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤を更に含んでもよい。
【００３７】
ヒトを含む哺乳動物に対する投与方法としては、限定されることなく、経口、静脈、腹膜内、脳脊髄内、皮下、くも膜下、筋肉内または局所投与が挙げられる。
【００３８】
本発明に係る組成物は、多様な形態をとってよい。これらの形態としては、例えば、固形、半固形および液状の剤形、例えば、錠剤、丸剤、粉剤、液剤、分散剤または懸濁剤、リポソーム剤、坐剤、注射可能および不溶解性の液剤が挙げられる。好適な形態かは意図される投与態様および治療用途に依存する。好適な組成物は注射可能または不溶解性の液剤の形態である。
【００３９】
本発明による抗体の有効用量および投与計画は、臨床試験および動物研究等のような当業界で公知の方法を使用して当業者が決定することができる。投与される物質の濃度は、治療または予防の目的によって異なるであろう。
【００４０】
２種のアンタゴニストを同時投与する場合またはアンタゴニストを他の治療方法と組み合わせる場合の実施態様において、望ましければ、各治療が他の治療とは独立して投与される場合の用量よりも少ない用量または少ない頻度で、各治療が投与されてよい。
【００４１】
本願明細書を通じて記載される全ての引用および本願明細書で引用される全ての文献はここで参照により明示的に取り込まれる。
【００４２】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載されるものであり、何ら本発明の範囲を限定することを意図するものでなく、また本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでもない。実施例には、従来の方法、例えば、ベクターおよびプラスミドの構成、該ベクターおよびプラスミドへのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、または宿主細胞へのプラスミドの導入などに用いられるものの詳細な説明は記載されない。このような方法は当業者によく知られており、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F, and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressなど多数の刊行物に記載されている。
【実施例】
【００４３】
例１：乳癌細胞が機能的ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）を発現する
本実験は、乳癌細胞が機能的ＶＥＧＦＲ−１を発現することを示す。２種のヒト細胞系ＤＵ−４４７５（ＥＲ陰性）およびＭＣＦ−７（ＥＲ陽性）を広く研究した。両細胞系ともＶＥＧＦＲ−１陽性である。これらの乳癌細胞により発現されたＶＥＧＦＲ−１は、ＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋｌ／２）経路のＰｌＧＦで誘導されるレセプターチロシンリン酸化および活性化によって決定される通り、機能的である。ＰｌＧＦまたはＶＥＧＦによるＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、結局は生体外（in vitro）における増大した細胞増殖を招く。さらに、ＤＵ−４４７５およびＭＣＦ−７はＶＥＧＦＲ−２を発現せず、それ故にＶＥＧＦＲ−１に対する中和ｍＡｂ（６．１２−ヒトＶＥＧＦＲ−１のみを阻止する）によるのみでは増殖阻害されない。
【００４４】
ヒト乳癌の免疫組織化学分析
１６のヒト乳管癌生検のホルマリン固定パラフィン埋込み組織を、従来のプロトコルに従って、ＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦおよびフォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）の免疫反応性について評価した。使用した抗体は、ヒトＶＥＧＦＲ−１に対するｍＡｂ（ＦＢ５）；ヒトＶＥＧＦＲ−２に対するｍＡｂ（６．６４）；ＶＥＧＦポリクローナル抗体；およびｖＷＦポリクローナル抗体(Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, California, USA）である。第２のペルオキシダーゼ標識抗体を１：６０００の希釈度で使用した。ペルオキシダーゼ反応は、ジアミノベンジジン減法で発色し、スライドをヘマトキシリン・エオジンで対比染色した。全ての切断面を光学顕微鏡の下で観察した。
【００４５】
細胞培養
ヒト乳癌細胞系ＤＵ−４４７５、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＡＴＣＣ(Manassas, VA, USA）より入手した。ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１は１０％致死性ウシ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ファンギゾン（０．２５μｇ／ｍｌ）およびＬ−グルタミン（０．５８４ｍｇ／ｍｌ）(Gibco BRL, Rockville, MD, USA）で補充されたＲＰＭＩ １６４０（Bio Whittaker Inc., Walkersville, Maryland, USA）中で部分集蜜的（subconfluent）単層培養体として増殖したのに対し、ＤＵ−４４７５細胞は懸濁して増殖した。ＨＵＶＥＣは前に述べたように入手し培養した（J Clin Invest. 1973, 52(11): 2745-56）。細胞は３７℃で５％ＣＯ2 の下で加湿したインキュベータ内に保持した。
【００４６】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびＲＴ−ＰＣＲ
製造業者の指示に従い、トリゾール(Gibco BRL, Rockville, MD, USA）を用いて、全ＲＮＡを分離した。次に、製造業者のプロトコル（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersy, USA）に従い、スーパースクリプトII逆転写酵素を用いて、第１鎖（first-strand）ｃＤＮＡを合成した。アドバンテージ２ポリメラーゼ・ミックス（Advantage 2 polymerase mix）（Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, California, USA）を用いて、ＰＣＲを行った。増幅条件は次の通りである：９４℃で５分間、６３℃で４５秒間および７２℃で４５秒間のプレサイクル；そして次に以下：９４℃で１分間、６３℃で４５秒間、７２℃で２分間および７２℃で７分間を３５サイクル。ＰＣＲに用いたプライマーは次の通りである：ＶＥＧＦＲ−１（順方向：ＡＴＴＴＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＣＣＴＴＧＣ；逆方向：ＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＡＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣ）；ヒトＶＥＧＦＲ−２（順方向：ＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＧＴＣＧＴＧ；逆方向：ＣＣＡＧＡＧＡＴＴＣＣＡＴＧＣＣＡＣＴＴ）；ＶＥＧＦ（順方向：ＣＧＡＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＡＴＧ；逆方向：ＴＴＣＴＧＴＡＴＣＡＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＧＴＧＡＧ）；ＰｌＧＦ（順方向：ＣＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＧＧ；逆方向：ＧＡＡＣＧＧＡＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＣＴＧ）およびβ−アクチン（順方向：ＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡ；逆方向：ＧＴＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＧＴＣＣＡＣＧ）。
設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、３のＶＥＧＦスプライシングバリアント（バリアント１２１，１６５，１８９）を増幅した。
【００４７】
フローサイトメトリー分析
ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１+ およびＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ+ 細胞の同定のために、ＤＵ４４７５、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、Ｆｌｔ−１に対する２μｌのＦＩＴＣ標識高親和性ｍＡｂ（クローンＦＢ５）と共に、又はＫＤＲに対する非結合ｍＡｂ（クローン６．６４）と共に、２０分間インキュベートした。次に、後者に対し、第２のＰＥ標識Ａｂ（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA）を２０分間加えた。ＶＥＧＦＲ−１またはヒトＶＥＧＦＲ−２に対する陽性細胞の数を、Coulter Elite フローサイトメータ（COULTER, Hialeah, Florida, USA）を用いて決定し、免疫グロブリンＧアイソタイプ対照（ＦＩＴＣ； Immunotech, Marceille, France）と比較した。生育不能の細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により同定した。
【００４８】
細胞培養上清中のＶＥＧＦおよびＰｌＧＦレベルの定量
ヒトＶＥＧＦ165 またはＰｌＧＦに対して特異的なＥＬＩＳＡキット（R&D Systems Inc., Minneapolis, USA）を用いて、ヒト乳癌細胞におけるＶＥＧＦおよびＰｌＧＦの産生を定量した。ＤＵ４４７５、ＭＣＦ−７、Ｔ−４７ＤおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系を６穴プレート内に１０6 細胞／穴の密度で播種した。細胞を血清条件で培養し、４８時間後に上清を集めた。更に希釈することなく、これらを使用した。各試料を２回測定した。
【００４９】
細胞増殖アッセイ
ＤＵ４４７５細胞の増殖を、トリパンブルー排除試験を用いて、及びＢｒｄＵ取り込みアッセイを用いることによって、生存可能な細胞の数を計数することにより決定した。
トリパンブルー排除試験のために、細胞を１２穴プレート内の無血清ＲＰＭＩ中に２．５×１０5 ／穴の密度で播種した。培養体を２４時間毎に、３７℃で４８時間、以下：５０ｎｇ／ｍｌ ＰｌＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ(R&D Systems Inc., Minneapolis, USA）、１μｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦＲ−１に対するｍＡｂ（クローン６．１２）で処理するか、又は未処理のままにした。血球計を使用して、生存可能な細胞を３回計数した。核実験を３回行った。
ＢｒｄＵ取り込みアッセイのために、５×１０3 細胞を、以下の条件：無血清、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＰｌＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ−１に対するｍＡｂクローン６．１２（１μｇ／ｍｌ）、および６．１２とＰｌＧＦによる同時インキュベーションで、９６穴プレート内に４８時間置いた。最後の２４時間で培養体にＢｒｄＵを加えた。取り込まれたＢｒｄＵを、製造業者のプロトコルに従い、ＥＬＩＳＡキット（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）を用いて定量した。
【００５０】
ＶＥＧＦＲ−１リン酸化アッセイ
レセプターリン酸化アッセイのために、ＤＵ４４７５細胞を１２穴プレート内に播種して（５×１０5 細胞／穴）ＲＰＭＩ無血清培地中で１８時間保った。培地を取り換えた後に、その細胞を、３７℃で、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰｌＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）により１０分間処理するか、又はヒトＶＥＧＦＲ−１およびヒトＶＥＧＦＲ−２に対するｍＡｂ（それぞれクローン６．１２およびＩＭＣ−１Ｃ１１）で１時間、そしてＰｌＧＦで１０分間、同時インキュベートした。刺激の後に、冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、０．４％カコジル酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中で、プロテアーゼインヒビター（１ｍｌ／ｍＬアプロチニン、１０ｍｇ／ｍＬロイペプチン、１ｍＭグリセロリン酸、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムおよび １ｍＭ ＰＭＳＦ）の存在下、４℃で３０分間、細胞を溶解させることによって全タンパク質抽出物を得た。タンパク質抽出物からの上清を、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０）およびプロテインＧアガロースビーズ（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, USA）の存在下、４℃で終夜、免疫沈降して、リン酸化されたタンパク質を沈殿させた。この免疫沈降物を添加液に再懸濁させ、そして還元性条件下（β−メルカプトエタノールの存在下）、７．５％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画した。次に、タンパク質をニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。ブロットを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ − １％ ＴＷＥＥＮ-２０中で室温において１時間ブロックし、次に第１抗体および第２抗体とともにインキュベートした。マウスモノクローナル抗体である抗ＶＥＧＦＲ−１（R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA)を１μｇ／ｍＬの濃度で使用し、第２の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, USA）を１：６０００で使用した。ＥＣＬ化学ルミネッセンス検出システムおよびＥＣＬフィルム(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey, USA）を用いて、該ニトロセルロースブロット上のタンパク質の検出を行った。
【００５１】
Ｆｌｔ−１を介するＭＡＰキナーゼ経路の活性化
ＭＡＰＫリン酸化を評価するために、ＤＵ４４７５細胞を１２穴プレート内に播種して（５×１０5 細胞／穴）無血清ＲＰＭＩ培地中で１８時間保った。次に、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、そして増殖因子（ＶＥＧＦ，５０ｎｇ／ｍＬ；ＰｌＧＦ，１００ｎｇ／ｍＬ）を用いて又は用いないで１０分間処理するか、又はクローン６．１２と共に１時間プレインキュベートした後にＰｌＧＦで１０分間刺激した。細胞を更にｐ４２／ｐ４４およびｐ３８インヒビターそれぞれＰＤ９８０５９（３０μＭ）およびＳＢ２０３５８０（２０μＭ）により１時間刺激し、そしてＰｌＧＦで１０分間刺激した。細胞溶解およびタンパク質分離を上に述べたように行った。タンパク質を７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ にかけ、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。移し取った後に、その膜を、１μｇ／ｍＬの濃度の、ｐ４２／ｐ４４ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, USA）およびｐ３８ＭＡＰキナーゼ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）に対する抗体によりイムノブロットした後に、第２の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）と共にインキュベーションを行った。試料の等しい添加(loading）を確保するために、膜のストリップ化(strip）および抗ｐ４２／ｐ４４抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, USA）または抗ｐ３８抗体による再プローブ化(reprobe）を行った。
【００５２】
Ａｋｔリン酸化アッセイ
ＤＵ４４７５細胞を１２穴プレート内に播種して（５×１０5 細胞／穴）無血清ＲＰＭＩ培地中で１８時間保った。次に、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、上記のように増殖因子または抗ヒトＶＥＧＦＲ−１ｍＡｂを用いて又は用いないで処理し、更にＰＩ３キナーゼインヒビター  ワートマニン（３０ｎＭ）で１時間そしてＰｌＧＦで１０分間同時インキュベートした。細胞溶解、タンパク質分離、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびニトロセルロース膜へのエレクトロブロットを前述したように行った。１μｇ／ｍｌの濃度の第１のマウスポリクローナル抗ホスホ−Ａｋｔ抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, USA）を使用した後に、第２の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）と共にインキュベーションを行って、Ａｋｔリン酸化（Ｓｅｒ４７３）のレベルを決定した。。等価なタンパク質の添加を確保するために、膜のストリップ化および抗Ａｋｔ抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, California, USA）による再プローブ化を行った。
【００５３】
乳癌細胞系におけるアポトーシスの分析
ＤＵ４４７５細胞を１２穴プレート内に播種し（５×１０5 細胞／穴）、以下の条件：無血清ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ、クローン６．１２（２μｇ／ｍＬ）、クローン６．１２（１０μｇ／ｍＬ）、および４％パラホルムアレデヒド（陽性対照）で、４８時間保った。細胞を収穫し、そして製造業者の指示(Immunotech, Maeceille, France）に従い、フルオレセインイソチオシアネート結合アネキシンＶにより、そしてＰＩにより染色した。
Coulter Elite フローサイトメータ(COULTER, Hialeah, Fl, USA）を用いて、結果を分析した。ＦＩＴＣ標識アネキシンＶおよびＰＩについて二重陽性であった細胞をアポトーシスと判断した。
【００５４】
株化ＤＵ４４７５乳癌の増殖におけるＶＥＧＦＲ−１ ｍＡｂの生体内（in vivo）効果
完全に株化された腫瘍に対するＶＥＧＦＲ−１ Ａｂ の効果を評価するために、ＤＵ４４７５ヒト乳癌細胞（１×１０6 ）を無胸腺ヌードマウス(Jackson Labs, Bar Harbor, ME, USA）に皮下注射した。これらマウスを各１６匹の群に分け、腫瘍をおよそ２０，１２０および４００ｍｍ3 の大きさまで成長させた。処理される動物は１０００μｇの以下：抗マウスＶＥＧＦＲ−１ ｍＡｂ （ｍＦ１）、抗ヒトＶＥＧＦＲ−１ ｍＡｂ （６．１２）、または両方の組合せを、３日毎に腹腔内注射を受けた。対照群はＰＢＳで注射された。腫瘍を４２日間にわたり週に２回測定した。抗体による処理の後の１４日目、３０日目および実験の最後に、腫瘍組織について組織学的検査を行った。
【００５５】
例２：ＶＥＧＦＲ−１に対するｍＡｂが生体内(in vivo）で乳癌増殖を阻止する
ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへのＤＵ−４４７５ヒト乳癌細胞の皮下接種により、４〜５日後に検出および測定し得る、大きな固形の高度に血管新生化された腫瘍が生体内(in vivo）で生じた。
【００５６】
ＤＵ−４４７５腫瘍をもったマウスを、ネズミＶＥＧＦＲ−１に対する中和ｍＡｂ（クローンＭＦ１）またはネズミＶＥＧＦＲ−２に対する中和ｍＡｂ（ＤＣ１０１）により、３日毎に４００μｇで処理して宿主由来の血管形成を阻止することによって、この乳癌の増殖が遅延し、接種後１４日〜２１日で効果が特に明確であった。しかしながら、この処理は単独では腫瘍増殖を完全に阻止するために十分でなく、接種後２１日ではＭＦ１処理またはＤＣ１０１処理したマウスにおける腫瘍が対照（未処理）マウスと同じ大きさに成長した。
【００５７】
腫瘍をもったマウスをヒトＶＥＧＦＲ−１に対する中和ｍＡｂ（６．１２）（３日毎に４００μｇ）で処理することによって、腫瘍増殖に劇的な遅延を生じ、この遅延は接種後２８日まで持続した。注目すべきことに、ＤＵ−４４７５をもったマウスはＩＭＣ−ＩＣ１１（抗ヒトＶＥＧＦＲ−２）処理に対する応答がなく、これらの乳癌細胞が機能的ヒトＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）のみを発現することが確認された。しかしながら、腫瘍増殖の著しい遅延にもかかわらず、ｍＡｂ６．１２により処理されたマウスからの腫瘍は２１日後に生存能力のある腫瘍領域を依然として有していた。これらの腫瘍は、結局は３６日後に１ｃｍ3 に成長し、周囲の皮膚を侵し始め、その時点でマウスを犠牲にした。
【００５８】
ＤＵ−４４７５をもったマウスに対し、（内皮依存性の傍分泌ループを標的とする）ＭＦ１またはＤＣ１０１と共に（ＶＥＧＦ／ヒトＶＥＧＦＲ−１自己分泌ループを標的とする）６．１２を同時に投与することによって、腫瘍増殖に相乗的な阻害を生じた。６．１２＋ＤＣ１０１（３日毎に４００μｇ）または６．１２＋ＭＦ１（３日毎に４００μｇ）で同時処理したマウスは、腫瘍増殖の著しい持続した遅延を示し、２１〜２８日後に完全に壊死し後退した腫瘍を生じ、６．１２／ＤＣ１０１（ヒトＶＥＧＦＲ−１に対するｍＡｂ／ネズミＶＥＧＦＲ−２に対するｍＡｂ）の組合せの場合には３６日後にはもはや測定できなかった。それ故に、腫瘍増殖の持続した遅延は、傍分泌および自己分泌の両方のＶＥＧＦ／ＮＶＥＧＦレセプターシグナル伝達経路に対するｍＡｂで処理されたマウスにおいてのみ生じた。
【００５９】
ＤＵ４４７５乳癌細胞系を用いた生体内(in vivo）実験
非肥満性糖尿病の免疫無防備状態（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ）マウス(Jackson Labs, Bar Harbor, ME, USA）を全ての実験に用いた。２１匹のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにＤＵ４４７５細胞（１×１０6 ／マウス）を皮下注射し、注射後４日目にマウスを各３匹の７つの群に分けた。細胞接種後４日目に腹腔内処理を開始した。６つ群は週３回、以下の中和ｍＡｂ：４００μｇの抗ヒトＦｌｔ−１（クローン６．１２）、４００μｇの抗ネズミＶＥＧＦＲ−１（ｍＦ１）、４００μｇの抗ヒトＶＥＧＦＲ−２（ＩＭＣ１−Ｃ１１）、８００μｇの抗ネズミＶＥＧＦＲ−２（ＤＣ１０１）で処理した。対照群は未処理であった。
【００６０】
腫瘍を３５日間にわたって３〜４日毎に測定した。腫瘍がおよそ１０００ｍｍ3 に達した時に、マウスを犠牲にした。従来のプロトコル（上を参照）に従って、腫瘍を摘出し、２％パラホルムアルデヒド中で固定し、７０％エタノール中に保存し、免疫組織化学分析のために処理した。パラフィンブロックを５μｍ断面に切断し、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、形態学的評価を行った。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】例１で詳述される増殖因子により処理されたＤＵ４４７５ヒト乳癌細胞におけるｐＥｒｋ１／２発現についてのイムノブロットを示す図である。
【図２】図１のブロットのデンシトメトリー分析を示すチャートである。
【図３】例２で詳述される抗体の組合せによる、ＤＵ４４７５ヒト乳癌細胞を接種されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの処理の結果を示すチャートである。
【図４】例２で詳述される抗体の組合せにより処理された後の、ＤＵ４４７５ヒト乳癌細胞を接種されたＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスからの組織の写真である。該組織は形態学的評価のために染色されている。
【図１】
2005515967.tif 000002
【図２】
2005515967.tif 000003
【図３】
2005515967.tif 000004
【図４】
2005515967.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成16年12月21日(2004.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の腫瘍細胞、好ましくはヒト腫瘍細胞で発現されたＶＥＧＦ−１レセプター（ＶＥＧＦＲ−１）のアンタゴニスト。
【請求項２】
下記：
・小分子、
・ＶＥＧＦＲ−１、好ましくは細胞外ＶＥＧＦＲ−１ドメインに結合する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、好ましくは中和抗体、
・好ましくはＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの一方または両方を含む、抗体の機能的断片および機能的等価物、
・抗腫瘍剤または検出可能なシグナル生成剤に化学的に又は生合成により結合された抗体、
・標的またはレポーター部分が結合された抗体、
・好ましくはＶＥＧＦＲ−１活性化を阻止する、タンパク質、ペプチド、核酸分子（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）のような生物学的アンタゴニスト、
・免疫系に対して抗体を自己のように認識させるように、表面で発現された残基を置換することによって免疫原性を少なくした抗体、
から成る群より選択される、請求項１に記載のＶＥＧＦＲ−１のアンタゴニスト。
【請求項３】
ＶＥＧＦＲ−１の活性を阻害する低分子である、請求項１または２に記載のＶＥＧＦＲ−１のアンタゴニスト。
【請求項４】
受託番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３３４４としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたヒトモノクローナル抗体Ｍａｂ６．１２である、請求項１または２に記載のＶＥＧＦＲ−１のアンタゴニスト。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＶＥＧＦＲ−１のアンタゴニストと、内皮細胞で発現されたＶＥＧＦレセプター（ＶＥＧＦＲ）または腫瘍血管系、好ましくはヒト内皮細胞で発現された他の増殖因子レセプターに対する第２アンタゴニストとの組合せ。
【請求項６】
前記第２アンタゴニストが、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリンおよびＦＬＫ−１のようなそれらの非ヒト相同体より選択されるＶＥＧＦＲに対するものである、請求項５に記載の組合せ。
【請求項７】
前記第２アンタゴニストが、下記：
・小分子、
・ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリンまたはそれらの非ヒト相同体、好ましくはそれらの細胞外ドメインに結合する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、好ましくは中和抗体、
・好ましくはＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの一方または両方を含む、抗体の機能的断片および機能的等価物、
・抗腫瘍剤または検出可能なシグナル生成剤に化学的に又は生合成により結合された抗体、
・標的またはレポーター部分が結合された抗体、
・好ましくはＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリンまたはそれらの非ヒト相同体の活性化を阻止する、タンパク質、ペプチド、核酸分子（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）のような生物学的アンタゴニスト、
から成る群より選択される、請求項５または６に記載の組合せ。
【請求項８】
前記第２アンタゴニストが、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ニューロピリンまたはそれらの非ヒト相同体の活性を阻害する小分子である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項９】
前記第２アンタゴニストが血管新生化を阻害する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１０】
前記第２アンタゴニストがＶＥＧＦＲ−２に対するものである、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１１】
前記第２アンタゴニストがＤＣ１０１、好ましくは受託番号ＡＴＣＣ  ＨＢ  １１５３４としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系により産生されたＤＣ１０１である、請求項５〜７，９および１０のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１２】
前記ＶＥＧＦＲ−１のアンタゴニストが抗体ＭＦ−１である、請求項５〜７および９のいずれか一項に記載の組合せ。
【請求項１３】
・請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンタゴニストと、
・請求項５〜１２のいずれか一項に記載の組合せと、
抗腫瘍剤または放射性同位体との組合せ。
【請求項１４】
前記抗腫瘍剤が、アントラサイクリン、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シス−プラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、イリノテカン、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシン、カリケアマイシン、タクソール、ゲムシチビン、フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ロイコボリンおよびノベルビンからなる群より選択される化学療法剤である、請求項１３に記載の組合せ。
【請求項１５】
有効成分として請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンタゴニストまたは請求項５〜１４のいずれか一項に記載のアンタゴニストの組合せと、医薬として許容される担体とを含んで成る医薬組成物。
【請求項１６】
経口、静脈内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、くも膜下、筋肉内または局所投与のために製剤化された、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
注射可能または不溶解性の液剤の形態で存在する、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
哺乳動物、特にヒトの乳癌、卵巣癌、脳腫瘍、腎臓癌、膀胱癌、腺癌、悪性グリオームおよび白血病の治療用の医薬品の製造のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアンタゴニストまたは請求項５〜１４のいずれか一項に記載の組合せの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
上記の抗体のほか、他の抗ＶＥＧＦＲ中和抗体（例えばＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３およびニューロピリンに対する抗体）も、本願明細書で示される指針と共に当業界で公知の方法を使用して容易に生産し得る。本発明の抗体は天然リガンドの親和性と同等またはより高い親和性をもってＶＥＧＦレセプターに結合し得る。
【国際調査報告】
2005515967.tif 000006
2005515967.tif 000007