(57)【要約】  巨大分子上のリガンド結合部位、および結合時の該リガンドの立体化学を同定する方法であって、該方法は、マルチスケール・アプローチを使用することを含み、該リガンドを異なるレベルの詳細さを持つ複数のモデルとして表示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨大分子上でのリガンドの結合部位、および結合時の該リガンドの立体化学を同定するための、コンピューターに基づいた方法であって、マルチスケール・アプローチを使用し、該リガンドを、異なるレベルの詳細さを持つ複数のモデルとして表示することを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記マルチスケール・アプローチを使用することが：
前記リガンドを、該リガンド中の原子数よりもより少ない数の特徴点を含むモデルとして表示し；
前記巨大分子に対する該リガンドのモデルの複数の空間位置および／または向きに関して、これらの特徴点により表示されるように、該リガンドのモデルおよび該巨大分子間の相互作用エネルギーを評価し；
該相互作用エネルギーが予め決定されている基準を満足しない空間位置および／または向きを取り除き；
該リガンドのモデルに関して増加した数の特徴点を使用して、以上の段階を連続した各反復にて反復する
ステップを含む方法。
【請求項３】
前記リガンドが、第１回目の前記反復に関しての単一の特徴点として表示される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドを表示するモデル中の特徴点の数が、各反復において１つずつ増加される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
請求項２、３、または４に記載の方法であって、前記の取り除くステップにおける前記の予め決められた基準が、
前記相互作用エネルギーが、０のような閾値を下回っていること；
該相互作用エネルギーが、最低値５のような、その特定の反復に関しての全ての種類のエネルギーの、予め決定された最低の数にランクされること；または
該相互作用エネルギーが、最低値１０％のような、その特定の反復に関しての全ての種類のエネルギーの、予め決定された最低の分画にランクされること
の内の１つである。方法。
【請求項６】
ｋ−法クラスター化アルゴリズムを適用して、前記リガンドをモデルとして表示することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドのモデルが該リガンドの原子のパラメーターの平均を含み、該パラメーターが該原子の空間位置および少なくとも１つの原子力場記述子を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記の少なくとも１つの原子力場記述子が、原子の種類、電荷、および分極可能性からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
予め決められた数の反復；
前記リガンドのモデルの取り除かれない立体化学の数が、予め決められた数よりもより小さいこと；
該リガンドのモデルの取り除かれない立体化学の分布が、予め決められた範囲内にあること
の内の１つの後に、該反復プロセスを終結させることを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
最低エネルギーを有する立体化学のモデルか、予め決められた数の最低ランクの立体化学のモデルの平均の立体化学を選択すること；および
この選択されたモデルから、前記リガンドの立体化学を再構築すること
により、最適の結合部位および該リガンドの立体化学を決定することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
局所エネルギーの最小化を適用して、最適化された結合部位およびリガンドの立体化学を決定することを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記リガンドの代表的な一連のコンホメーションを初期に同定することを更に含む、請求項２にかかる先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リガンドの代表的な一連のコンホメーションが、予め決定される角度間隔により、該リガンドの回転可能な各結合を回転させることにより得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記の予め決定される角度間隔が、１０°より大きく、好ましくは２０°より大きく、最も好ましくは少なくとも３０°である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
コンホメーションの数が予め決定される量を超過する場合、この数のコンホマーが無作為にサンプリングされる、請求項１２、１３、または１４に記載の方法。
【請求項１６】
同定された各コンホメーションの分子エネルギーを評価し；および
エネルギーが予め決定される量を超過する全てのコンホメーションを取り除く
ステップを更に含む、請求項１２、１３、１４、または１５に記載の方法。
【請求項１７】
各反復において、
残っている各リガンドのコンホメーションを、数多くの特徴点を含むモデルとして表示し；および
パージ基準をこのモデルの表示に適用して、巨大分子とのそれらの相互作用エネルギーを評価するためのより少ない数のモデルを得る
ステップを更に含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
パージ基準が、
特定の特徴点間の距離における変動が１．３Å未満であり、前記モデルの特定のアーム間の角度における変動が３０°未満であり（３以上の特徴点を有するモデルに関し）、特定の２面角が３０°未満である（４つ以上の特徴点を有するモデルに関し）ように、該モデルを単一のモデルとして取り扱うこと
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リガンドのモデルに関しての特徴点の数が増える場合に、前記巨大分子との最低相互作用エネルギーを持った先行する反復から、該モデルにより表示される該リガンドのコンホメーションを考慮するだけのステップを更に含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
デジタル形式にて、同定された結合部位および／またはリガンドの立体化学および／または結合時のコンホメーションを表示する情報を出力することを更に含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法により得られた、同定された結合部位、結合時のリガンドの立体化学、および結合時の該リガンドのコンホメーションからなる群から選択される少なくとも１つを表示する情報を使用して、前記巨大分子の突然変異、および／または、該結合部位にて該リガンドを結合させるか結合させないという、該リガンドにおけるバリエーションを設計することを含む方法。
【請求項２２】
同一の巨大分子上に別個にある複数の異なるリガンドについて、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法を繰り返し；
各リガンドについて同定された結合部位を、既知の結合部位と比較し；および
この同定された結合部位がこの既知の結合部位に適合するリガンドを、有用な化合物として同定する
ステップを含む、医薬的に有用な化合物を同定する方法。
【請求項２３】
リガンドおよび巨大分子に関する原子の情報を受け取るためのインターフェイス；
マルチスケール・アプローチを使用して該リガンドを異なるレベルの詳細さを持つ複数のモデルとして表示するための、および相互エネルギー評価を実行して好ましくない結合部位および立体化学を除くためのモジュール；および
この、また各々の予め決定された結合部位、およびリガンドの立体化学に関する情報を出力するためのインターフェイス
を含む、該巨大分子上での該リガンドの結合部位、および結合時の該リガンドの立体化学を決定するためのシステム。
【請求項２４】
結合時の前記リガンドの好ましいコンホメーションの同定を包含させるための更なるモジュールを含む、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法を実行するためにアレンジされた、請求項２３または２４に記載のシステム。
【請求項２６】
コンピューター・プロセッサーにより実行される場合、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法を実行するための、該コンピューター・プロセッサーを起動させることが可能なコンピューター・プログラム。
【請求項２７】
請求項２６に記載のコンピューター・プログラムを既に記録した、コンピューターにより読み取り可能な保管媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子認識方法に関し、より具体的には、巨大分子上でのリガンドの結合部位、および結合時の、該巨大分子に関与する該リガンドの立体化学を同定するためのものである。
【背景技術】
【０００２】
ゲノミクス、プロテオミクス、およびバイオインフォマティクスは、薬剤の発見の努力に関わる新規治療標的を、急速に獲得している。ゲノムプロジェクトは、過多な新たな配列を解明するものである。それらの３Ｄ（３次元）構造は、Ｘ線結晶解析または核磁気共鳴（ＮＭＲ）のような種々の技術により、解決されるであろう。一旦詳細な構造が知られたとしても、これらの標的と相互作用するかも知れない候補薬剤の設計は、困難な仕事である。新規な理論的アプローチは、薬剤発見の努力に関する主要な道筋となり、我々がゲノム後時代（ポスト・ゲノム時代）における潤沢な情報を扱う能力を、改善するであろう。結合（ドッキング）アルゴリズムは、合理的な薬剤設計において必須である。以前から、既知のタンパク質結合部位に結合し得る化合物用の何十億もの小分子の仮想ライブラリーの中で探索することが知られている。このような状況において、球により結合部位をモデル化するＤＯＣＫのような適合化アルゴリズム、またはリガンドを化学的に好ましい相互作用領域へと向けさせるＴＨＩＮＫ、または建設的な構築方法であるＦＬＥＸＸが、この潜在的なリガンドを、速くドッキングさせることが出来る。しかしながら、該結合部位の先行する知識を提供することが必要である。
【０００３】
該リガンドおよびホスト分子が剛体であると仮定しよう。残念ながら、力ずくの探索では、該リガンド−ホスト相互作用エネルギーが全ての可能なドッキング立体化学において評価されるが、妥当な量の計算時間中では完結され得ず、特に大きなタンパク質またはリガンドを用いる場合はそうである。この計算時間の要求に関する幾つかのアイディアを得るためには、我々は、典型的なタンパク質ホストはおよそ６０Å３の体積を占めるかも知れないということを考えるべきかも知れない。１Åの中庸な焼き写し（translation）の解像度であってさえ、これは、探索に２１６０００個の焼き写しを残す。各軸において２０°という妥当な回転に関する解像度が与えられ、および潜在的なリガンドおよびタンパク質がそれぞれ、３５原子および３５００原子を含有するという条件下では、１．５×１０１４通りの非結合性エネルギー評価値が、完全な範囲の可能なドッキングの立体化学を走査するのに必要とされるであろう。種々の仮定を用いて９９％の特徴点を立ち退かせることが出来るとしても、我々は、１．５×１０１２個の評価値をなお要求することになってしまう。結果として、ＧＲＩＤのような力ずくのアプローチは、小さなプローブ群に限られ、妥当な計算時間中で、詳細なリガンドを取り扱うことは出来ない。リガンド−ホストのドッキングに関わる１つの問題は、最適な結合位置に位置させるために実行されるに必要とするエネルギー評価値の数を減らすことである。
【０００４】
異なるアプローチは、このリガンド・タンパク質相互作用エネルギーを最小化する全体的な最適化アルゴリズムを介する、所与のポテンシャル場におけるドッキング・シミュレーションに基づいている。モンテ・カルロ・シミュレーション化アニーリング、遺伝子アルゴリズム、または複数同時コピー探索（ＭＣＳＳ）法のような方法は、この点では成功している。一般に、もし該リガンドの初期位置が、該ホスト分子の結合部位内、または隣にあれば、これらの方法論は妥当な結果を与える。良い位置にて該シミュレーションを開始することにより、我々は、考慮されることを必要とするドッキングの立体化学の数を制限し、多くの局所的な落とし穴を避けることが出来る。しかしながら、このやり方では、最適化する者を支援することにおいて、結果的に極めて長い計算が失敗となり、これは全体としての最小値（極小値ではなく）を検出するのに失敗することがあるであろうという問題が、なお存在する。
【０００５】
幾つかの仮想スクリーニング方法は、リガンドのフレキシブルさを考慮するものである。タンパク質−リガンド複合体の形状および確立された結合自由エネルギーが、各コンホマー（ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）について計算される。しかしながら、この戦略に伴う１つの問題は、何百万または何十億さえもの分子のハイ・スループット・ドッキング（ＨＴＤ）の間に、それが莫大な計算時間およびディスクの保管場所を浪費するということである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、上記の問題を、少なくとも部分的に軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従って、本発明は、巨大分子上でのリガンドの結合部位および結合時の該リガンドの立体化学を同定する、コンピューターを基盤とした方法を提供し、該方法はマルチスケール・アプローチを使用することを含み、該リガンドを、異なる水準の詳細さを持つ複数のモデルとして表示する。
【０００８】
本発明は、結合部位が、如何なる先行する知識もなしに、コンピューターにとって負担が軽い量の時間中に同定されることを可能にする。
【０００９】
好ましくは、該マルチスケール・アプローチを使用することは、
該リガンドを、該リガンド中の原子数よりもより少ない数の特徴点を含むモデルとして表示し；
該巨大分子に対する該リガンドモデルの複数の空間位置および／または向きに関して、これらの特徴点により表示されるように、該リガンドモデルおよび該巨大分子間の相互
作用エネルギーを評価し；
該相互作用エネルギーが、予め決定されている基準を満足しないそれらの空間位置および／または向きを取り除き；
該リガンドモデルに関しての増加した数の特徴点を使用して、以上の段階を連続した各反復にて反復する
ステップを含む。
【００１０】
力ずくのアプローチでは、多くの立体化学において、該リガンド原子が該タンパク質原子から距離を置き過ぎるか、接近しているであろうから、数多くの操作が冗長となる。本発明は、フィルターを通す操作を用いることにより、早期の段階にてこれらの立体化学を取り除くことが出来るということを実現させて、これ故に計算時間の実質的な量を節約する。この戦略は、信号および画像加工の分野、いわゆる「マルチスケール・アプローチ」（Ｆｏｒｇｙ、Ｅ．Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ、１９６５、２１、７６８〜７６９、およびＭａｃＱｕｅｅｎ、Ｊ．Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｆｔｈ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ．Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ；Ｌｅ  Ｃａｍ，Ｌ．Ｅ．；Ｎｅｙｍａｎ，Ｊ，Ｅｄｓ．；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，１９６７参照）の分野において発展した方法から取り入れられたものである。本発明は該マルチスケールの概念に基づいており、ここでは、この潜在的なリガンドに関するモデルの階層を取り扱う。このことは簡単なアプローチによってなされ、ここで潜在的なリガンドは、特徴点の数を増やすことにより表示される。高まった各レベルの詳細さにて、潜在的な結合部位の剪定が行われる。好ましくは、非結合性エネルギーの関数が使用され、各ステップでの分子間相互作用をスコア化する。このアプローチを適用することは、より簡単な、速い力ずくのスタイルの探索へと立ち返ることを可能にし、手の込んだ最適化プロトコールに対する必要性を取り除く。
【００１１】
好ましくは、該リガンドは考慮すべき向きがないので、この第１の反復のスピードを大いに増加させる利点を持つ、この第１の反復に関しての単一の特徴点として表示される。
【００１２】
好ましくは、該リガンドを表示するモデル中の特徴点の数は、各反復にて１つずつ増加される。このことは、２つの特徴点しか持たない第２の反復に関しても、該リガンドのどの回転が考慮されることを必要としているかについては、２つの特徴点しかないことを意味し、このことは再度計算時間を低減する。
【００１３】
好ましくは、前記の取り除くステップにおける予め決定された基準は：
該相互作用エネルギーが、０のような閾値を下回っていること；
該相互作用エネルギーが、最低値５のような、その特定の反復についての全ての種類のエネルギーの、予め決定された最低の数にランクされること；または
該相互作用エネルギーが、最低値１０のような、その特定の反復についての全ての種類のエネルギーの、予め決定された最低の分画にランクされること
の内の１つである。
【００１４】
有利には、本発明は好ましくは、ｋ−法クラスター化アルゴリズムを適用して、該リガンドをモデルとして表示することを含む。
【００１５】
好ましくは、該リガンドの該モデルは、該リガンドの原子についてのパラメーターの平均を含み、これらのパラメーターは、これらの原子の空間的な位置、および少なくとも１つの原子の力場記述子を含む。このことは、特徴点により表示される各クラスターについての原子パラメーターの平均を計算することはコンピューターにとっては簡単であるという利点を持っている。好ましくは、この少なくとも１つの原子の力場記述子は：
原子の種類、電荷、および分極可能性
からなる群から選択される少なくとも１つを含む。該相互作用エネルギー評価において使用されるより多くの記述子を加えることにより、該モデルの洗練さを増加させることは、率直なことである。
【００１６】
好ましくは、本発明は更に、
予め決められた数の反復；
該リガンドモデルの取り除かれない立体化学の数が、予め決められた数よりもより小さいこと；
該リガンドモデルの取り除かれない立体化学の分布が、予め決められた範囲内にあること
の内の１つの後に、該反復プロセスを終結させることを提供する。
【００１７】
好ましくは、本発明の方法は更に、
最低エネルギーを有するその立体化学のモデルか、予め決められた数の最低ランクの立体化学モデルの平均の立体化学を選択すること；および
この選択されたモデルから、該リガンドの立体化学を再構築すること
により、最適の結合部位およびリガンドの立体化学を決定することを含む。
【００１８】
任意に、本発明の方法は更に、局所エネルギー最小化を適用し、最適化された結合部位およびリガンドの立体化学を決定することを含む。このマルチスケール・アプローチは、恐らくは４回の反復のみで、潜在的な結合部位を速く同定するために使用され得、その後より精密な決定が、他の最適化技術を使用して行われ得る。
【００１９】
好ましくは、本発明の方法は更に、
該リガンドの一連の代表的なコンホメーションを初期に同定する
ステップを含む。
【００２０】
好ましくは、該リガンドの一連の代表的なコンホメーションは、予め決められた角度間隔により該リガンドの各回転可能な結合を回転させることにより得られる。
【００２１】
好ましくは、この予め決められた角度間隔は、１０°よりも大きく、より好ましくは２０°よりも大きく、最も好ましくは、４５°または６０°でさえあるような、少なくとも３０°である。このことは、コンピューターの負担を大いに軽減する。
【００２２】
好ましくは、もしコンホメーションの数が予め決められた量を超過する場合には、その時はコンホマーのその量を、無作為にサンプリング（サンプルとして一部を選択し、抽出すること）する。
【００２３】
好ましくは、本方法は更に、
同定された各コンホメーションの分子エネルギーを評価し；および
エネルギーが予め決められた量、例えば約１２Ｋｃａｌ／ｍｏｌを超過する全てのコンホメーションを取り除く
ステップを含む。
【００２４】
任意に、本方法は更に、各反復において、
残っている各リガンドのコンホメーションを、数多くの特徴点を含むモデルとして表示し；および
パージ（不要なものを取り除くこと）基準をこのモデル表示に適用し、巨大分子とのそれらの相互作用エネルギーを評価するためのより少ない数のモデルを得る
ステップを含む。
【００２５】
パージは、ドッキングされるべき潜在的なモデルの数を抑えることにおいて効率的である。
【００２６】
好ましくは、該パージ基準は、
特定の特徴点間の距離における変動が１．３Å未満であり、該モデルの特定のアーム間の角度における変動が３０°未満であり（３以上の特徴点を有するモデルに関し）、特定の２面角が３０°未満である（４つ以上の特徴点を有するモデルに関し）ためのそれらのモデルを、単一のモデルとして取り扱うこと
を含む。
【００２７】
好ましくは、本方法は更に、該リガンドのモデルに関しての特徴点の数が増える場合に、該巨大分子との最低相互作用エネルギーを持った先行する反復から、該モデルにより表示されるそれらのリガンドコンホメーションを考慮するだけの段階を含む。このことは、構築されるべき効率的な探索ツリー（tree、樹状図）を可能にする。
【００２８】
好ましくは、本発明は更に、デジタル形式にて、この同定された結合部位および／またはリガンド立体化学および／または結合時のコンホメーションを表示する情報を出力することを含む。
【００２９】
本発明の更なる態様は、前記のいずれかの方法によって得られた結合部位および／またはリガンドの立体化学および／またはコンホメーション情報を使用して、該巨大分子の突然変異、および／または、該結合部位にて該リガンドを結合させるか結合させないという、該リガンドにおけるバリエーションを設計することを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明の更なる態様は、
同一の巨大分子上に別個にある複数の異なるリガンドについて、前に概論された本発明のいずれかの方法を繰り返し；
各リガンドについて同定された結合部位を、既知の結合部位と比較し；および
この同定された結合部位が、この既知の結合部位に適合するリガンドを、有用な化合物として同定する
ステップを含む、医薬的に有用な化合物を同定する方法を提供する。
【００３１】
本発明の更なる態様は、巨大分子上でのリガンドの結合部位、および結合時の該リガンドの立体化学を決定するためのシステムを提供し、該システムは、
該リガンドおよび巨大分子に関する原子の情報を受け取るためのインターフェイス；
マルチスケール・アプローチを使用し、該リガンドを異なるレベルの詳細さを持つ複数のモデルとして表示するための、および相互エネルギー評価を実行して好ましくない結合部位および立体化学を除くための、モジュール；および
この、また各々の予め決定された結合部位、およびリガンドの立体化学に関する情報を出力するためのインターフェイス
を含む。
【００３２】
好ましくは、該システムは、前に定義されたような本発明の方法を実行するためにアレンジされる。
【００３３】
本発明はまた、コンピューター・プロセッサーにより実行される場合に、該コンピューター・プロセッサーを起動させ、前に定義されたような本発明による方法を実行可能であるコンピューター・プログラムを提供する。
【００３４】
本発明を具現化する方法は、コンピューター機器またはコードを含むコンピューター・ソフトウェアとして実現され、コンピューターにより読み取り可能な保管媒体上で保管され得る。本発明は、コンピューター・プロセッサーを使用して、このようなソフトウェアを実行するためのシステムとして具現化され得る。該システムは、例えばユーザーのインターフェイスから、または保管媒体から、またはインターネットのようなコミュニケーション・ネットワークに亘る、リガンドおよび巨大分子の情報を受け取るためのインターフェイスを包含してもよい。該システムはまた、本発明を具現化する方法を実行するためのモジュールを含んでもよい。該システムは、例えばそれをスクリーン上にディスプレーすること、それを印刷すること、それを保管媒体に保管すること、またはそれをコミュニケーション・ネットワークに亘り送信することにより、結果得られる結合部位情報および／またはリガンドの立体化学および／またはコンホメーション情報を出力するための、インターフェイスを包含してもよい。
【００３５】
「マルチスケール・アプローチ」は、「スケール−空間解体（scale-space decomposition）」として知られる構築物に依っている。これは、そのオリジナルのデータへの「スケール化操作因子（scaling operator）」の適用を含んでいる。該スケール化操作因子の効果は、我々のデータ中で最高レベルの詳細さに対応する情報を取り除くことである。この些細な詳細さを取り除くことにより、該データ中のより大きなスケールの特徴が強調される。該スケール化操作因子の繰り返しの適用は、その要求されるスケールが達成されるか、または結果得られる、該解体中に残された情報がもうなくなるまで、我々のデータ中で益々大きな構造へと反映される。該スケール化操作因子の選択は、もし「スケール−空間解体」を介するマルチスケール解析が成功裏に完結された場合には、決定的に重要である。本発明のこの実施形態によれば、該リガンドに関する情報の殆どは初期に取り除かれ、その後徐々に、前記の解体への逆の過程中に再度導入される。
【００３６】
我々は、簡単ではあるが強力な方法：ｋ−法クラスター化アルゴリズム（Hartigan, J. Clustering Algorithms; Wiley; New York, 1975, 84-112 および Rollet, R.; Benie, G. B.; Li, W.; Wang, S.; Boucher, J. M. Int. J. Remote Sens. 1998, 19, 3003-3009 参照）を用いることにより、種々のスケールにおいて該リガンドをモデル化した。
【００３７】
ｋ−法により発生された一連のクラスターを使用することにより、我々は一連のリガンドモデルを得、各々が、その以前のモデルよりも１つ多い特徴点を含有している。これらの特徴点はよく分布され、各モデルが、発生される点の数について、該リガンドの可能な最良の記述を与えることを確かなものにする。我々のｋ−法の手順の実現化において、ｎ個の原子ｘ１，ｘ２，．．．，ｘｎはｋ個のクラスターとなり、ｋ＜ｎである。ｍｉを、ｉ番目のクラスターにおける原子座標の平均位置としてみよう。もし該クラスターがよく分離されている場合は、それらを分離するために、我々は最小距離分類因子を使用することが出来る。もしｘとｍｉとの間の距離が全てのｋの距離の最小値である場合、原子ｘはクラスターｉ中にある。これらの平均値を初期化する定義方法はないので、平均値ｍ１，ｍ２，．．．，ｍｋについて、無作為の初期値を使用することは、よくあることである。その次の段階にて、いずれの平均値における変化もなくなるまで、我々はその確立された平均値を使用し、これらの原子をクラスター中へと分類する。全てのクラスターについて、ｍｉを、クラスターｉについての全原子の平均位置により置き換える。図１は、ＨＩＶ−逆転写酵素阻害剤ネビラピン（nevirapine）に関する、増加した数の特徴点（１〜９）についてのｋ−法を描いている。
【００３８】
その初期のクラスターは、該リガンドの平均位置にある。該リガンド中の全原子は、この初期のクラスターに属している（図１ａ）。第２のクラスターについての平均値を初期化するために、我々はその初期のクラスター中心から最も遠く離れている原子を探索する。この原子はその後、その新たなクラスターの一時的な中心になる。それらの現在帰属されているクラスター中心よりもこのクラスター中心により近い全ての原子がアイデンティティーを変更し、その新たなクラスターに属するようにマークされる。該クラスター中心の位置はその後、自己の一貫性を得るまで反復され、これにより各クラスター中心は、該クラスターに属している原子（複数）の平均位置に位置されるようになる（図１ｂ）。このプロセスは、該リガンド中に原子がある限り何回繰り返されてもよく、各反復はその次のモデルを発生させる（図１ｃ〜ｉ）。
【００３９】
グリッドに基づいた速い方法が、リガンド−タンパク質の対の相互作用エネルギーを前もって計算することにより、エネルギー評価について用いられ（例えば、Wade, R. C.; Goodford P. J. J. Med. Chem. 1993, 36, 140-147 および Wade, R. C.; Goodford P. J. J. Med. Chem. 1993, 36, 148-156 参照）、検索表を形成する。エネルギーは、該グリッドから、１次関数的に計算を施される。該エネルギーは、全ての原子のモデルが非結合性の１２−６レナード−ジョーンズである Consistent Valence Force Field（ＣＶＦＦ）（MSI、サンディエゴ、ＣＡ）、および静電項と共に、式１により計算される。Ａｉｊはこれら２原子（ｉ，ｊ）についての斥力パラメーターであり、Ｂｉｊはそれらの引力分極可能性パラメーターであり、ｑｉは部分的な電荷であり、εは誘電率である。原子ｉは特徴点ｋに属しており、ｊはタンパク質のグリッド点である。全てのｋの特徴点中の原子の合計は、該リガンド中の原子数と同一である。
【００４０】
該エネルギーは、特徴点ｋ中の全ての原子ｉと各タンパク質原子（ｊ）との間で計算される。このプロセスは、全てのｋの特徴点について繰り返される。特徴点ｋ中の原子の種類は異なるが、それらのタンパク質原子ｊへの距離は、それらが特徴点ｋから計算されるので同一である。
【００４１】
【数１】
2005515575.tif 000002
【００４２】
一連のリガンドモデルは、前記のようにして発生される。第１のモデルの単一点はその後、そのホスト分子の場で全立体化学においてテストされる。単一点は回転され得ないのだから、該テストは非常に簡単である。エネルギーが所与の閾値よりもより低い全ての立体化学がマークされ、その次の順番の計算用に保たれる。現在の実行において、それらの結合部位に対する如何なる結合力、すなわちそれらの相互作用エネルギーを実証しない立体化学はマイナスなものではなく、引き続いての反復から立ち退かされる。その次の計算から拒否されている位置の中には、ドッキングする立体化学のようなものとして考えられる該ホスト分子から遠く離れ過ぎているか、または近過ぎるものがある。更に、この簡単なテストは、潜在的に良いか（マイナスの相互作用結合エネルギー）、または良くないリガンドの間での区別を行う。より多くの特徴点が加えられるに連れ、この分類は益々より潜在的になる。
【００４３】
第１ラウンド（反復）を生き残った各立体化学において、我々は、第２のモデルをテストした。この第２のモデルは、該リガンドの「主軸」の寸法に関連しているある所定の距離により分離された２点から形成される。該モデルの起源が今や重要であり、引き続き各立体化学は、該モデルの全ての可能な回転を考慮しなくてはならない。しかしながら、該モデルは２点しか含有しないので、該回転は、完全なリガンドを回転させるよう試みるよりも、遙かにより速い。もう１度、非結合性エネルギーがこれらの２つのモデルの所与の閾値よりもより低い全ての立体化学が、その次のラウンド用に保たれる。この第２のモデルが、その潜在的な結合部位が該リガンド程度の大きさの分子を保持するに充分大きくない場合、如何なる立体化学をもフィルターにかけて除外し始めることは、明らかである。
【００４４】
これらの引き続いてのモデルについてこれらのステップを繰り返すことは、不適切な立体化学の内のより多くのものを取り除く。ついに我々は、生き残っている僅かな立体化学と共に終了し、通常は、テストするモデルがなくなる前までであろう。これらの生き残っている立体化学は、該リガンドが上手くドッキングすることが可能な領域、およびこのドッキングしたリガンドの焼き写しを示す。
【００４５】
この文脈において、用語「立体化学」は、該リガンドの空間位置および向き、あるいは前記タンパク質または他の巨大分子に関連したリガンドモデルを取り込むものである。
【実施例】
【００４６】
［実施例の結果］
本方法論をテストするために、リガンドと複合体化された数多くのホスト巨大分子（図２）が、プロテイン・データ・バンク（the Protein Data Bank、ＰＤＢ；Berman, H.M.; Westbrook, J.; Feng, Z.; Gilliland, G.; Bhat, T.N.; Weissig, H.; Shindyalov, I.N.; Bourne, P.E. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 235-242参照）からダウンロードされた。これらのリガンドは消去され、その後これらのリガンドの正しいドッキング部位を見出そうとする試みがなされた。全てのテストケースにおいて、我々は、このホストタンパク質を、該タンパク質の大きさよりも、各次元において３Åより大きな寸法のボックス中に置いた。我々は、０．７Åの解像度、および５°の回転角を有する分子グリッドを用いた。距離に依存する誘電率ε＝４ｒが使用された。
【００４７】
［ストレプタビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）／ビオチン］
我々は、ビオチンとのストレプタビジンとの複合体（ｐｄｂエントリー１ｓｔｐ；解像度２．６Å）を利用した。この探索結果は、表１および図３ａ中に示される。この結晶構造中のビオチンの中心（centroid）とそれの予見される立体化学の中心との間の距離は、１．１５Åである。Ｎ２３、Ｓ４５、Ｎ４９、およびＤ１２８へのこれら複数の水素結合は、該タンパク質（ダッシュにより示されている）へのタイトな結合を可能にする要因の中の１種であり、我々が予見した立体化学において保存されている。結果の「集合体」の質は、最低エネルギーを有する５つの立体化学の中心と該結晶構造中の該リガンドの中心との間の距離（この場合は０．９３Åである）を計算することにより評価された。共役勾配局所最適化がその後、それの予見される位置中にあるビオチンとの該複合体に関して用いられた。該タンパク質の原子は固定されたままにされ、該リガンドが動くようにされた。この計算は、０．０１ｋｃａｌ／Åの収束基準が達成されてしまった場合、３５６回の反復（Ｒ１００００単一プロセッサーに関しては１２秒）後、収束した。この最適化後の、該結晶構造中のビオチンの中心とそれの予見された立体化学の中心との間の距離は、０．３７Åへと減少された。
【００４８】
［ＭｃＰＣ−６０３／ホスホコリン］
免疫グロブリンＭｃＰＣ６０３のＦａｂ−ホスホコリン複合体が、ｐｄｂエントリー２ｍｃｐとして取り出された。この力場は、信頼出来る部分電荷を該ホスホコリンリガンドへと帰属することが出来なかったので、それの部分電荷は、ＳＴＯ−３Ｇ基本セットと共にハートリー−フォック（Hartree-Fock）計算を使用する、ゴーシアンＩｎｃ．、ピッツバーグ、ＰＡからのゴーシアン（Gaussian）９８プログラム（改訂Ａ．７版）を用いて計算された。該結晶構造中のホスホコリンの中心とそれの予見される立体化学の中心との間の距離は、２．０２Åである。ＭｃＰＣ−６０３による該ホスホコリンの認識は、第１義的にArg H52 の影響のために、特徴において優勢に静電的である。図３ｂから分かるように、Arg H52 の、プラスの電荷を帯びた側鎖中のＮη１と、マイナスに荷電したホスホコリン部分中のＰ原子との間の距離は、該結晶構造中では３．１２Åであり、一方、我々の予見した立体化学では、この距離は４．６６Åである。最低エネルギーを有する５つの立体化学の中心と、該結晶構造中の該リガンドの中心との間の距離は、１．７０Åである。ストレプタビジン／ビオチンのテストケース中でのものと同じ最小化プロトコールを用いて、収束は１５９回の反復（Ｒ１００００単一プロセッサーに関しては１７秒）後に達成された。該最小化後の、該結晶構造中のホスホコリンの中心と、それの予見される立体化学の中心との間の距離は、１．９０Åであった。
【００４９】
［β−トリプシン／ベンズアミジン］
ベンズアミジンにより阻害されるβ−トリプシンが、ｐｄｂエントリー３ｐｔｂとしてダウンロードされた。該結晶構造中のビオチンの中心とそれの予見された立体化学の中心との間の距離は、１．６８Åである。図３ｃから分かるように、その芳香環は明らかに、その疎水性結合ポケットを満たしている。最低エネルギーの５つの立体化学の中心と、該結晶構造中の該リガンドの中心との間の距離は、１．５９Åである。再び、該リガンドは最小化され、８９４回の反復（Ｒ１００００単一プロセッサーに関しては２５秒）後に収束された。該最小化後の、該結晶構造中のベンズアミジンの中心とそれの予見される立体化学の中心との間の距離は、０．３８Åへと抑えられた。
【００５０】
［チトクローム（シトクローム）Ｐ−４５０カム（ｃａｍ）／カンファー（樟脳）］
ｐｄｂエントリー２ｃｐｐは、Ｆｅ３＋を伴ったプロトポルフィリン基、およびカンファーを含有する。その力場は、Ｆｅ３＋を伴ったプロトポルフィリン基に関して適切な部分電荷を含有しないので、この部分に関する該部分電荷は、前記のように計算された。該結晶構造中のカンファーの中心とそれの予見される立体化学の中心との間の距離は、０．６２Åである。最低エネルギーの５つのグリッド点の中心と該結晶構造中の該リガンドの中心との間の距離は、０．８５Åである。図３ｄは、該結晶構造中でカンファーへと向かうアルゴリズムにより創出された低エネルギー解を比較するものである。該アルゴリズムは、該カンファーの焼き写しを成功裏に検出し、カンファーの正しい向きは、該低エネルギーの集合体中に包含されたが、最低エネルギーを有するものとしてはランクされなかった。我々は、ストレプタビジン／ビオチンのテストケースでのものと同じ最小化プロトコールを用いた。該最小化は、６７７回の反復（Ｒ１００００単一プロセッサーに関しては５５秒）後に収束した。該最小化後の、該結晶構造中のベンズアミジンの中心とそれの予見される立体化学の中心との間の距離は、０．５４Åへと抑えられた。
【００５１】
［ＨＩＶ−逆転写酵素／非ヌクレオシド性阻害剤（ＮＮＩｓ）］
我々は、このテストケース用のホスト分子として、ＨＩＶ−逆転写酵素のｐｄｂファイル１ｖｒｔ（解像度２．２Å）を利用し、３つの非ヌクレオシド性阻害剤（ＮＮＩｓ）をドッキングさせようと試みた。第１の阻害剤はネビラピンであったが、これはこのｐｄｂエントリー中のタンパク質と複合体化されている。第２の阻害剤は、ＡＺＴ耐性ＨＩＶ−１逆転写酵素複合体（ｐｄｂエントリー１ｒｔ３）から採られた１０５１Ｕ９１であり、これは突然変異Ｄ６７→Ｎ、Ｋ７０→Ｒ、Ｔ２１５→Ｆ、Ｋ２１９→Ｑを包含した。これら２つの構造中の活性部位（Ｐ９５、Ｌ１００、Ｋ１０１、Ｖ１０６、Ｅ１３８、Ｖ１７９、Ｙ１８１、Ｙ１８８、Ｇ１９０、Ｆ２２７、Ｗ２２９、Ｌ２３４、Ｈ２３５、Ｙ３１８、合計数１３０の「重」原子）の平方根平均（ＲＭＳ）偏差は、１．６９Åである。高いＲＭＳ値はＹ１８１によるものであり、これはこれらの構造中に異なるロータマー（回転異性体）を適用するものである。第３の阻害剤は、ｐｄｂエントリー１ｖｒｕ（解像度２．４Å）から採られたα−アニリノフェニルアセトアミド（α−ＡＰＡ）であった。１ｖｒｔの活性部位に対するこの活性部位の残基のＲＭＳは、０．７２Åであった。
【００５２】
ネビラピンについてのドッキング段階が、図４に示される。第１の反復の終わりにおける最低エネルギーの２０，０００の位置が、図４ａに示される。この集合体は、該タンパク質まで遠過ぎない距離の点、または近過ぎない距離の点を示していることが分かる。図４ｂは、第３の反復後に残っている点を示す。これらの残っている点は、該タンパク質中の種々のポケットへと収束することが分かる。図４ｃは、最後の反復において残っている点を示す。明らかに、全ての点が、実際の結合部位において焦点を当てられている。１ｖｒｔ結晶構造中の該リガンドの中心と、最低エネルギーを有するその予見された立体化学の中心との間の距離は、ネビラピン、１０５１Ｕ９１、およびα−ＡＰＡについてはそれぞれ、１．１５Å、１．６２Å、および１．２０Åである。最低エネルギーグリッド点の５つの中心については、この距離は、ネビラピン、１０５１Ｕ９１、およびα−ＡＰＡについてはそれぞれ、０．９５Å、０．９０Å、１．４９Åである。該活性部位の残基と該阻害剤の予見された位置との間の相互作用の解析は、Ｒｅｎらにより刊行された結果（Ren, J.; Esnouf, R.; Garman, E.; Somers, D.; Kirby, C.R.I.; Keeling, J.; Darby, G.; Jones, Y.: Stuart, D.I.; Stammers, D. Nat. Struct. Biol. 1995, 2, 293-302）に一致し、これは、図４ｅ（ネビラピンについては６原子、１０５１Ｕ９１については１０原子、α−ＡＰＡについては８原子）から分かるように、３つの全ての阻害剤が、Ｙ１８１、１８８、およびＹ３１８と、更に接触する（「重原子」間の距離＜４．０Å）ことを示すものである。我々は、ストレプタビジン／ビオチンのテストケースにおけるものと同じ最小化プロトコールを用いた。該最小化は４４８回の反復（Ｒ１００００単一プロセッサーに関しては１５７秒）後に、収束した。該最小化後の、該結晶構造中のネビラピンの中心とそれの予見される立体化学の中心との間の距離は、０．３２Åへと抑えられた。
【００５３】
［ヒト核妊娠Ｘ受容体（レセプター）（ｈＰＸＲ）−ＳＲ１２８１３］
ヒト核妊娠Ｘ受容体（ｈＰＸＲ）は、危険な薬剤−薬剤相互作用を媒介することにおいて、危険な役割を果たしている。Watkins ら（Watkins, R.E.; Wisely, G.B.; Moore, L.B.; Collins, J.L.; Lambert, M.H.; Williams, S. P.; Willson, T.M.; Kliewer, S.A.; Redinbo, M.R. Science 2001, 292, 2329-2333）は最近、それぞれ２．５Å（ｐｄｂファイル１ｉｌｇ）および２．７５Å（１ｉｌｈ）の解像度にて、ｈＰＸＲのリガンド結合ドメインのａｐｏ構造、およびコレステロール低下薬剤ＳＲ１２８１３との複合体を解き明かしている。衝撃的なことに、ＳＲ１２８１３は、３つの区別可能な（異なる）向きで結合することが出来る。これらの向きの中心間の距離は、１．３５〜２．４４Åの間にて変動する。該ａｐｏ中の結合部位（Ｌ２０６、Ｓ２０８、Ｌ２０９、Ｖ２１１、Ｌ２４０、Ｍ２４３、Ｍ２４６、Ｓ２４７、Ｆ２５１、Ｆ２８１、Ｃ２８４、Ｑ２８５、Ｆ２８８、Ｗ２９９、Ｍ３２３、Ｌ３２４、Ｈ４０７、Ｒ４１０、Ｆ４２０、合計数３３８の「重」原子）とリガンドが結合した形態との間の距離は、１．００Åである。前記アルゴリズムがタンパク質の可塑性を取り扱い得るか、または該リガンドがよく適応されていない状況であるかどうかをテストするために、我々は該ａｐｏ構造に関して我々のプログラムを用い、この結合結果を複合体化したものに比較した。該複合体の結晶構造中でのＳＲ１２８１３の３つの向きの中心と、それの予見される立体化学の中心との間の距離はそれぞれ、１．２０Å、２．０５Å、および２．９１Åであった。前記の最小化プロトコール（Ｒ１００００単一プロセッサーに関しては１４７秒）を使用する、引き続いての７０１回の反復は、これらの距離をそれぞれ、０．６５Å、１．１１Å、および１．８２Åへと小さくさせた。
【００５４】
［ヘパリン−塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）］
これは、ヘパリンが生体分子なので（２４．０５Å×１３．６８Å×１３．０８Åの大きさ、１５２原子）、小さなリガンドを含む前記テストケースとは異なり、我々は質的な結果に興味を持った。我々は、ヘパリンの６量体断片−塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）複合体を含有するｐｄｂファイル１ｂｆｃ（２．２Åの解像度）を利用した。標準的な「鍵と鍵穴」のパラダイムに適合する殆どの複合体とは違って、高度の表面相補性を呈するリガンドおよびホストを用いると、ｂＦＧＦ上のヘパリン結合部位は、立体的に悪く定義されてしまう。代わりに、高度にマイナスに荷電したヘパリンとそれの結合部位との間での静電的相互作用により、まるで該リガンドが所定の場所に保持されるかのように見える。この計算は、２１９、３５６の初期の数の焼き写しを用いて始まった。該結合部位が、明確に同定された（図５）。
【００５５】
本発明の実施形態は、特定されたホスト−リガンド対に関しての結合部位を信頼性良く位置付けることが出来るツールを提供する。これらの結果により実証されたように、本発明は、極めて成功している。ＭｃＰＣ−６０３／ホスホコリンを除く全ての定量的なテストケースにおいて、前記結晶構造中の前記リガンドの中心とそれの予見される立体化学の中心との間の距離は、０．６２〜１．６８Åにて変動した。前記ＭｃＰＣ−６０３／ホスホコリン複合体（２ｍｃｐ）の解像度が僅か３．１Åであるということを心に留めれば、このことは、２．０２Åの距離が鋭敏な結果であるというヒントを与えるかも知れない。ｈＰＸＲ／ＳＲ１２８１３の場合では、前記アルゴリズムは、該リガンドの第１の向き（１．２０Å）に関して、最良の結果を示した。加えてそれは、第２（２．０５Å）および第３（２．９１Å）の向きに関しても、妥当な結果を示した。
【００５６】
更に、我々は、最低エネルギー解だけでなく低エネルギー解の「集合体」も、非常に精確であることを示した。全てのテストケースにおいて、該結晶構造中の該リガンドの中心とそれの予見される立体化学の「集合体」の中心との間の距離は、０．８５Å〜１．７０Åにて変動した。平均では、これらの「集合体」の結果は、最低エネルギーの結果よりもより良かった。この事実は、前記アルゴリズムが一貫性を有し、１部位−該結合部位へと収束することを示唆するものである。
【００５７】
前記ＭｃＰＣ−６０３／ホスホコリン実験およびＨＩＶ−逆転写酵素／ＮＮＩｓ実験は、技術面で特にひどいテストを代表するものである。該ホスホコリンリガンドは、該ＭｃＰＣ−６０３（４４２残基、３４０１の「重」原子）の大きさに比べて極めて小さい（１１の「重」原子）。結晶構造データ（ｐｄｂファイル１ｖｒｔ）および図４から分かるように、該ＨＩＶ−逆転写酵素であるホスト分子は、我々がドッキングさせようと試みた３つのＮＮＩｓに比較して、極めて大きな分子である（ネビラピン、１０５１Ｕ９１、およびα−ＡＰＡに関してそれぞれ、２０、２２、および２１の「重」原子）。大きさにおけるこの相違のために、該ホストは、本当の結合部位に加えて、この阻害剤が中へとドッキングし得るであろう多くのポケットを表すであろう。α−ＡＰＡおよび１０５１Ｕ９１は、それらがその活性部位の異なる立体化学から採られるので、難しいテストケースであり、それらの生物活性な立体化学は、それらの相対的な硬直さにも関わらず、複合体（複数）の中である程度変動するかも知れないであろう。更に、ＭｃＰＣ−６０３／ホスホコリンのような他のテストケースとは違って、該ホスト分子および該リガンド間の相互作用は疎水的であり、静電的ではない。我々は３つの異なるリガンドを比較しているが、これらの予見されるものの中心と該結晶構造との間の小さな距離は、該活性部位が成功裏に検出されたことを実証するものである。
【００５８】
この焼き写しに加えて、該結合部位中の該リガンドの向きが、全てのテストケースにおいて見出された。８つの内６つにおいて、それは最低エネルギーを有するものとしてランクされている。第１の例外は、ｆＰＸＲ／ＳＲ１２８１３であったが、迷走したテストケースであり、これは３つの「正しい」向きがあるからである。カンファーにおいて、その正しい回転は低エネルギーの一連の解中に包含されたが、最低エネルギーを有するものとしてはランクされなかった。これらの知見は更なる実施形態を示唆し、これは、自由エネルギーを確立させる経験的な自由エネルギー関数のような、ＣＶＦＦ非結合性エネルギー項以外のより洗練されたコスト関数を用いることが、結合または有限差ポワソン−ボルツマン法により、これらの分子の静電特性を表示するように変更され、より精確なエネルギーを与えるものである。上記の実施例において使用された実施形態において、我々は、１次補間アプローチを用い、前記グリッドからこれらのエネルギーを得る。より洗練された補間戦略を使用すれば、これらの結果を更に改善することが出来るであろう。
【００５９】
このマルチスケール・アプローチの現在の実行は、別々の探索空間において遂行される。結果として、その精確さは、該グリッドの解像度、およびその回転角の大きさにより限定される。我々は、我々の方法が、同じエネルギー関数を使用して、連続した探索空間上で用いられる速い局所最適化について、優れた開始点を産み出すことを示した。これらの結果により実証されたように、ＭｃＰＣ−６０３／ホスホコリンを除く全てのテストケースにおいて、短い最適化後の、該結晶構造中の該リガンドの中心とそれの予見される立体化学の中心との間の距離は、０．３２Å〜０．６５Åにて変動した。再び、ＭｃＰＣ−６０３／ホスホコリン複合体（２ｍｃｐ）の解像度が僅か３．１Åなので、我々は妥当な結果として、１．９０Åの距離を見出す。我々は、該最適化が急速に収束することを示した。このような結果は、我々が用いるこの別々の探索方法が、該リガンドをそれの「本当の」位置に近い隣に位置させ、信頼性があるというヒントを与えるものである。
【００６０】
殆どのドッキング・アルゴリズムはテストケースとして、これらの酵素−リガンド複合体（ｐｄｂファイル）から採られたような酵素および／またはリガンドの、固定された構造を用いる。ここで、この相互作用空間を走査する場合に、その真の酵素−リガンド複合体を位置させようとするバイアスがあるというクレームが沸き起こるかも知れない。我々は２つの異なるテストケースにおいて、該アルゴリズムが、タンパク質の可塑性を取り扱い得ることを示した。前記ＨＩＶ−逆転写酵素／ＮＮＩｓのテストケースにおいて我々は、我々が、異なる生物活性な立体化学中の他の結晶構造から採られたリガンドを、上手くドッキングさせることが出来ることを示した。前記ｈＰＸＲ−ＳＲ１２８１３の系においては、我々はこの複合体化されたタンパク質中の結合部位を同定することに成功し、ここで我々のアルゴリズムに関しての入力は、未結合の立体化学の状態の該タンパク質（だけ）であった。
【００６１】
本発明は、LIGSITEのような、タンパク質表面上のポケットの検出用アルゴリズムを凌駕する幾つかの利点を提供する。我々は、ＨＩＶ−逆転写酵素のような大きなタンパク質中に存在する幾つかの結合ポケットを示唆する代わりに、本発明を具現化するアルゴリズムが、正しいものを検出するに充分鋭敏であることを示した。更に、それは、この正しい結合の向きに該リガンドを位置させるに充分鋭敏である。本方法は、大きなリガンドがあり結合ポケットがないヘパリン−ｂＦＧＦ複合体の場合、良く作動した。
【００６２】
「マルチスケール・アプローチ」の使用は、数多くの小さなステップへと効率的に問題を噛み砕くことが出来るようにする。このような方式により問題を解体することは、計算時間の効率的な配分を可能にし、これにより、最も大切な領域だけが、如何なる詳細さにおいても考慮されるようになる。本発明の実施形態は、構造生物学における研究に発する結果を活用することにおいて本当の価値を持っており、構造ゲノム計画からのデータを解析するに価値あるツールであり得る。
【００６３】
上記の主要な実施形態において、前記酵素および前記基質間の相互作用は、簡単な非結合性エネルギー項を介して評価された。それにもかかわらず、これらの結果は精確であり、これらの計算は速く収束する。この事実は、該「マルチスケール・アプローチ」が信頼出来る方式により該リガンドを表示する能力を、支持するものである。
【００６４】
［本発明の更なる実施形態］
上記の実施形態および実施例の結果は、該リガンドを、特定の内部コンホメーションを持つ剛体の分子として扱い、前記巨大分子に関する該リガンドのエネルギー的に好ましい立体化学を同定したが、それはすなわち、該リガンドの中心を焼き移した位置、および該リガンドの回転の向きである。以下の更なる実施形態および実施例は、本発明の方法を完全にフレキシブルなドッキングにまで拡張し、それはすなわち、結合部位にて結合した場合の該巨大分子に関する該リガンドの立体化学（位置および向き）を同定するだけでなく、結合した場合の該リガンドのコンホメーションを同定することにまで拡張するものであり、それはすなわち、該リガンド分子内の原子のアレンジであり、これは回転可能な結合の周りにおける該リガンドの幾つかの部分の相対回転を包含する。該リガンドのコンホメーションは、単にコンホマーとしても言及される。
【００６５】
第１に、我々は、該リガンドに関する全てのコンホマーを、系統立てて創出する。妥当な計算時間中での該コンホメーションの空間の適切な網羅に関する問題も、内在している。ねじれ角のみが修飾され、結合長または結合角は、修飾されない。その後、これらのコンホマーは、エネルギー的にランクされる。これに関しては、the Consistent Valence Force Field（ＣＶＦＦ）および全原子モデルが用いられる。これらのコンホマーのエネルギーは、結合性の１２−６レナード−ジョーンズおよび静電エネルギー項を有する式２により計算され、式中Ａｉｊはこれら２つの（ｉ，ｊ）原子に関する斥力パラメーターであり、Ｂｉｊはそれらの引き合う分極可能性パラメーターであり、ｑｉはその部分電荷であり、ｒｉｊは原子間距離であり、およびεはその誘電率である。Ｖｎはねじれ角Φに関するねじれの潜在障壁の高さであり、ｎはそれの個数、およびγはその相因子である。もし該エネルギー項が所与の閾値を超える場合は、該コンホマーは無視され、クラスター化またはドッキングはされないであろう。この段階の終わりに、我々は、最低エネルギーのコンホマーの集合体を保持することになる。
【００６６】
【数２】
2005515575.tif 000003
【００６７】
該結合部位を位置付けるために、我々は「マルチスケール」の概念を使用し、ここでは我々は、前に記載したような、この潜在的なリガンドについて発生されたモデルのヒエラルキー（階層）を取り扱う。我々の探索方法は、図６および７に例示される。我々は、剛体のリガンドについて、前に示されたようなｋ−法クラスター化アルゴリズムを用いることにより、種々のスケールにて各コンホマーをモデル化する。各々の一連のコンホマーは、単一のリガンドであると仮定される。図６は、ＨＩＶ−逆転写酵素阻害剤であるネビラピン上の増加した数の特徴点（１〜３）に関するｋ−法を描くものである。ネビラピンは、図８ｇに示されるような１つの回転可能な結合（我々は、そのメチル基のねじれは無視する）を持っている。もし我々が系統立ってこれら全てのコンホマーを５°間隔にて創出し、これら全てのコンホマーがエネルギー的に許容し得るものと仮定する場合、我々はｎ＝７２のコンホマーをもって終了する。単一点である第１のモデルでは、図１に示されるように、我々はｎ個の点（Ｏ１，Ｏ２．．．Ｏｎ）をもって終了する。明らかに、これら全ての点は同一であり、ｎ回の代わりに１回で表示され得る。第２のモデルは、該コンホマーの「主軸」の寸法に関連する所定の距離（ａ１，ａ２．．．ａｎ）により分け隔てられる２つの点である。ネビラピンの場合では、２つの特徴点によるこの表示は、４．６Åの平均距離、ならびにそれぞれ４．３Åおよび４．９Åの最小値および最大値を持っている。この低いレベルの詳細さにおけるこれら７２個の全てのクラスターをドッキングさせることは、冗長である。代わりに、これらｎ＝７２個のクラスターは、ｋ個のクラスターに対する「パージ基準」によりパージされ、ここでｋ≦ｎであり、殆どの場合（結果参照）ではｋ≪ｎである。ｎ個のクラスターをドッキングさせる代わりに、我々はｋ個のクラスターをドッキングさせることが出来る。Δａ≦０．６Åという遙かに厳しい「パージ基準」は、このネビラピンの場合において、単一の表示を与えるであろう。すなわちｎ＝７２個のクラスターから、我々はｋ＝１個のクラスターへと、その問題を単純化した。実際、このレベルの表示および「パージ基準」では、該リガンドは１つの剛体クラスターとして「扱われる」が、それはフレキシブルである。第３のモデルは、１つの角（α１，α２．．．αｎ）により分け隔てられる２つの距離（ｂ１，ｂ２．．．ｂｎ）および（ｃ１，ｃ２．．．ｃｎ）により定義される。それはｐ個の表示へとパージされ、ここでこの「パージ基準」は２つの距離および１つの角を含む。３点によりパージされるクラスターの数は、前記の２点による表示についてのそれらの数に等しいか、それらの数よりも大きく、すなわちｋ≦ｐである。４つの特徴点による表示については、そのパージ基準は、３つの距離、２つの角、および１つの２面（角）を含む。以上のプロセスが、増えた数の特徴点について繰り返され得る。
【００６８】
本発明のこの実施形態の方法は、図７に示されるようなパージされたクラスターのヒエラルキーのツリー（樹状図）を作り上げる。この図は、フレキシブルなリガンドについての典型的な探索ツリーを記載するものである。各ノード（ツリーの枝分かれ地点）は、１つのこのようなパージされたクラスター、およびこのクラスターが表すコンホマーの組み合わせ（アンサンブル）の表を含有する。この例では、２つの特徴点について、これらのパージされたクラスターの２つのノードが、単一点のパージされた表示から始まる。本方法はそれらの両方とドッキングし、より低いエネルギーのノードを用いて進行し、これ故にこのドッキング手順は、このツリー全体についてというよりもむしろ最低エネルギーのツリーの１つの枝に沿ってのみ行われる。このプロセスは、第３の点などについて繰り返される。この探索では、パージされた少数の表示だけがドッキングされるであろう。もし我々が、前記４点表示がドッキングされるべき最後の１つであると仮定する場合は、この例での最悪のケースは、１つの１点、２つの２点、３つの３点、５つの４点の、１つの剛体のドッキングである。図７に例示される場合では、２つの特徴点のより低いエネルギーノードにより表示されるコンホマー由来の３つのクラスターモデルのノードの３つの特徴点のノードに、最悪のシナリオでは、例示された真ん中の１つが、ドッキングされるように要求される４つの特徴点の５つのノードに至るであろう、最低エネルギーを持つことになるであろう。これら５つのノードは、
３つの特徴点のその真ん中のノードにより表示されるコンホマーを考慮すること；
このような各コンホマーを、４つの特徴点のクラスターとして表示すること；
それらのクラスターをパージして、ドッキング用に使用されるべき５つを得ること
により得られる。
【００６９】
その焼き写しの空間は、前に記載のものと同じ方式により探索される。唯一の違いは、各焼き写しに関する速いツリー探索である。該探索は、前記単一点表示から始まる。この段階の終わりには、本方法は、その枝上前記２点へ向かって移動し、この単一点から進化した、パージされた表示をドッキングさせる。このプロセスは、その次のパージされた表示について繰り返され、ここでこの表示を産み出した親は、該結合部位との最も好ましい相互エネルギーを有するものである。最後の段階において我々は、速い局所最適化を用い、固定されたままの該結合部位を有する完全なコンホマーを使用して、その構造を洗練させる。
【００７０】
グリッドに基づいた方法は、このパージされた表示と該結合部位との間のエネルギー評価に用いられ、これは対になったリガンド−タンパク質相互作用エネルギーを前もって計算することによるものであり、式１に関連して前に記載されたような一覧表を形成するものである。
【００７１】
纏めると、最適な結合部位を見出すことにおいて支援することと同様、リガンドのフレキシビリティーを考慮して、結合時の該リガンドのエネルギー的に好ましいコンホメーションを見出すための本発明による方法は、以下の通りである。
予め決められた角度間隔で各々の回転可能な結合を回転させることによるなどして、該リガンドの代表的な一連のコンホメーションを発生させ；
各コンホメーションの分子エネルギーを評価し；
予め決められたエネルギー閾値を上回る全てのコンホメーションを取り除き；
各々の残ったコンホマーを、数多くの特徴点を有するモデル（またはクラスター）として表示させ；
パージ基準を使用して、これらのコンホメーションを表すモデルをパージして、少なくされた数の代表モデルを得、ここで各モデルはコンホメーションの組み合わせ（アンサンブル）を代表するものであり；
例えば本発明の第１の態様に関して説明された方法論を使用して、各々の代表モデルをドッキングさせ；
最もエネルギー的に好ましいドッキングを伴うモデルによってのみ表示されるコンホメーションのこれらの組み合わせ（アンサンブル）を考慮し、その他のコンホメーションを取り除き、および各々の残ったコンホメーションを、その前の反復からの増加した数の特徴点を有するモデルとして表示し；
前記のパージのステップへと戻ることにより反復し、および予め設定された数の反復後、またはドッキング基準が叶えられた時に終結させる。
【００７２】
［更なる実施例結果］
本方法論をテストするために、数多くのタンパク質リガンド複合体が、プロテイン・データ・バンク（ＰＤＢ）からダウンロードされた。選ばれたこれらのタンパク質は、表２および図９に示されるような、大きさ（８０〜９２６残基）、解像度（１．６Å〜３．１Å）、および折り畳みに関してのファミリー（膜を何回貫通するか）の範囲をカバーするものである。これらのタンパク質は、加水分解酵素（セリンプロテアーゼ）（ＰＤＢエントリー２ｐｋ４、図９ａ）、ストレプタビジン（１ｓｔｐ、９ｂ）、加水分解酵素（エンドリボヌクレアーゼ）（１ｒｏｂ、９ｃ）、異性化酵素（１ｘｉｄ、９ｄ）、ＭｃＰＣ−６０３（２ｍｃｐ、９ｅ）、ヒスチジン結合タンパク質（１ｈｓｌ、９ｆ）、およびＨＩＶ逆転写酵素（１ｖｒｔ、９ｇ）であった。全てのリガンドは、表２および図８に示されるように、フレキシブルな場合、１〜５の範囲の数多くの回転可能な結合、および２４〜３４にて変動する数多くの原子を有する。
【００７３】
我々は、該リガンドの結合部位および生物活性なコンホメーションの両方が未知の場合、最もひどい状況を想定した。これらのリガンドが検出され、その後、１シミュレーションにおいて、これらのリガンドの正しいドッキング部位および生物活性コンホメーションを見出そうと試みられた。全てのテストケースにおいて我々は、このホストタンパク質を、該タンパク質の大きさよりも各次元において３Åより大きい寸法のボックス中に置いた。我々は、０．７Åの解像度を有する分子グリッド、および５°の回転角を用いた。距離依存性誘電率ε＝４ｒを使用した。我々は、これらのリガンドの最大表示を、４つの特徴点に制限した。全てのコンホマーは、３０°間隔で系統的に発生された。３０°間隔にてこれらのコンホマーを創出するという仮定が正当化されるかどうかという疑問は、以下に記述される。もしコンホマーの数が１，０００，０００個の閾値を超えたならば、その時は１，０００，０００個のコンホマーから無作為にサンプリングされた。コンホマーの最低エネルギー（最大１２Ｋｃａｌ／ｍｏｌの閾値まで）の集合体が、クラスター化された。これらのクラスターは、以下の閾値を使用してパージされた：距離＜１．３Å、角＜３０°、および２面（角）＜３０°。共役した勾配局所最適化がその後、それの予見された位置における該リガンドの開始位置からの該複合体上で用いられた。該タンパク質原子は固定されたままで、該リガンドは、０．０１ｋｃａｌ／Åの収束基準が達成されてしまうまで、動くようにされた。
【００７４】
これらの探索結果は、表２ならびに図９および図１０に示される。焼き写しの初期の数は、最小のものである加水分解酵素（セリンプロテアーゼ）（図９ａ）に関しての１５１個、１５６個から、ＨＩＶ逆転写酵素（図９ｇ）についての２，６６６，６６４個の焼き写しまで、該タンパク質の大きさにより変動した。平方根平均偏差（ＲＭＳＤ）値は、我々の結果を前記結晶構造に比較した場合、０．２９Å（ＨＩＶ−逆転写酵素／ネビラピン、図５ｇ）〜２．４３Å（加水分解酵素／ε−アミノカプロン酸、図５ａ）の範囲であり、平均値１．６０Åであった。
【００７５】
図９は、第３回目の反復の終わりへと向かうところをスナップ的に撮った写真である。この低いレベルの詳細さにおいてさえ、この計算は明らかに該結合部位へと収束する。加水分解酵素（セリンプロテアーゼ）（図９ａ）、ストレプタビジン（９ｂ）、加水分解酵素（エンドリボヌクレアーゼ）（９ｃ）、およびＨＩＶ逆転写酵素（９ｇ）では、全ての残った焼き写しが、まだ立ち退かされていない低エネルギースコアを有するものでさえ、該結合部位中へ当てはまる。異性化酵素（９ｄ）およびＭｃＰＣ−６０３（９ｅ）では、最高スコアを有するもの（データは示されていない）を包含する焼き写しの大多数が、該結合部位中へ当てはまる。該ヒスチジン結合タンパク質／Ｌ−ヒスチジン複合体（９ｆ）は、Ｌ−ヒスチジンがこれらのモノマー（単量体）の各々に結合するダイマー（２量体）として、プロテイン・データ・バンクに寄託された。我々は本方法論に取り組み、１つの入力としてモノマーではなく該ダイマーを提供した。両方の結合部位が同定され、最低で同一のエネルギーを有する結合点としてランクされた。この傾向は図９ｆにおいて示唆され、ここでは第３回目の反復の終わりにおいて、これらの特徴点の大部分が既にこれら２つの結合部位へと収束している。
【００７６】
１〜最大４までの特徴点が該リガンドの粗い表示であるという事実は、本方法が１０°よりもより大きな２面角の間隔で創出されるコンホマーを使用し、全てのコンホメーション空間の妥当なカバーリングをまだ保持し得るかどうかという問題を喚起する。表３は、１０°および３０°の間隔でコンホマーを創出するのに必要とされる計算時間の比を比較している。ビオチンは、もし我々が１０°の間隔で回転させた場合、（３６０°／１０°）５＝６０，４６６，１７６個のコンホマーを持っている。もし我々が１０°から３０°へと変更すると、コンホマーのこの数は、（３６０°／３０°）５＝２４８，８３２個であろう。換言すれば、我々は６０，４６６，１７６／２４８，８３２＝２４３倍のスピードアップを得る。我々がテストした第７のリガンドでは、このスピードアップは、ネビラピンに関しての３倍〜ビオチンおよびε−アミノカプロン酸に関しての最大２４３倍までにて変動する。我々は、第７のリガンドについて、１０°および３０°にてこれらのコンホマーを系統立てて創出し、これら全てのコンホマーをクラスター化させ、距離＜１．３Å、角度＜３０°、および２面角＜３０°の同一の基準を使用して、これらのクラスターをパージし、最低の１２Ｋｃａｌ／ｍｏｌの集合体を比較した。表３は、これら７つのリガンドの全コンホマーを表示するのに必要とされるパージされたクラスター数を示す。１つの特徴点では、該リガンドが如何にフレキシブルであるか、またはどんな増加分で我々がこれらの２面角を回転させるのかは、問題でない。２つの特徴点の場合では、全リガンドのコンホメーションが、２つにより表示されたビオチンを除き、パージされた１つのクラスターにより尚表示された。換言すれば、このレベルの表示においては、これらのリガンドの全てのコンホメーション空間が、２つのファミリーへと分岐したビオチンを除き、１つの剛体の線へと圧縮された。我々が詳細さのレベルを３つおよび４つの特徴点へと増加させると、より多くのパージされたクラスターが、使用可能なコンホメーション空間を表示するために必要とされる。この４点表示では、これらのパージされたクラスター数は、ネビラピンに関しての１個から、ビオチンに関しての２２個までの範囲である。この数は、コンホマーの実際の本当の数に比較して極めて小さく、それぞれ３６個および６０，４６６，１７６個である（１０°間隔にてこれらのコンホマーを創出する場合）。１０°および３０°間隔にて作動させる場合のパージされたクラスターの数を比較すると、１および２つの特徴点の場合では、我々は同一の個数を得た。この傾向は、７つのリガンドの内の６つにおいて、３つの特徴点へと移動する場合には保存される。唯一の例外Ｌ−ヒスチジンは、１０°の場合の２つ、３つに比較して、３０°の間隔中に２つのパージされたクラスターがある。我々が４つの特徴点による表示へと移行する場合、１０°および３０°の増加分の使用に比較すると、７つのリガンドの内の６つが、２／３以上の数のパージされたクラスターを示す。
【００７７】
３０°の角度間隔が、これらのコンホマーを発生させるために前記実施例にて使用されたが、本発明は、その値に限定されず、４５°または６０°さえであるようなより大きな角度を使用しても、成功した結果が得られるであろう。
【００７８】
本発明のこの更なる態様は、未知の結合部位または機能を有するタンパク質に対する、強固でありかつ柔軟なドッキング方法論を提供する。このアプローチは、３つの仮定を確かめるものである。第１には、前記リガンドの焼き写し、回転、およびコンホメーションのフレキシビリティの両方に関して、この探索空間を分けることが可能であるということ。第２には、我々は、マルチスケール・アプローチを使用して、種々のレベルの詳細さにて、この空間を探索出来るということ。第３には、この探索から始まる結果は、最適な位置に充分近く、速い局所最適化を用いることによって、我々は、信頼出来る予見を得ることが出来るということ。本方法は、２つの基本的な仮定のみを使用して、７つのフレキシブルなリガンドの結合部位および形状を見出すに充分強固である。第１に、タンパク質の３Ｄ構造が既知である。第２に、我々は、分子のメカニクスが１つを基盤とした場合にも、妥当な「コスト関数」を持っている。
【００７９】
本方法の利点は、ヒスチジン結合タンパク質／Ｌ−ヒスチジン複合体の場合におけるように、１つ以上の結合部位がある場合でさえ、尚１つのシミュレーションを必要とするだけであるということである。両方の結合部位が同定され、同一のエネルギー（データは示されていない）によってランクされたことを見ることは、印象深い。更に、該リガンド自体が、妥当な程度の精確さをもってドッキングされた。
【００８０】
該タンパク質の大きさ（焼き写しの初期の数により反映される）とその予見の精確さとの間の相関はなかった。衝撃的なことには、最大の複合体（ＨＩＶ逆転写酵素／ネビラピン）では、我々は最良の予見を得、一方最小のもの（加水分解酵素／ε−アミノカプロン酸）では、我々は最高のＲＭＳＤ値を持っていた。それで、この予見の質は（この問題の複雑さではなく）、初期の焼き写しの数に関して相関しない。該リガンドの大きさとこの予見の質との間の相関もなかった。実際、３０以上の原子を有するこれらのリガンドは、３０未満の原子を持つリガンドよりもより低いＲＭＳＤ値を呈した。該結晶構造の解像度は、この予見の質には相関しなかった。
【００８１】
該リガンドのフレキシビリティとこれらの予見の質との間には、弱い相関がある。ネビラピンはフレキシブルな最小のリガンドだったが、最低のＲＭＳＤ値を示し、一方、ε−アミノカプロン酸は回転可能な５つの結合を持っているが、最高のＲＭＳＤ値を示した。一方、回転可能な４つの結合を有するシチジル酸のようなリガンドは、回転可能な２つの結合を有するＬ−アスコルビン酸のようなリガンドよりもより低いＲＭＳＤを示した。このことは、この予見の精確さに影響を及ぼす他の要因があることを指し示すものである。それらの内の３つが、以下に議論される。
【００８２】
第１に、該探索空間を分ける場合の詳細さのレベル。例えば、該リガンドをより小さな増加分で回転させるか、または０．７Åより高いグリッド解像度を使用することによりこのレベルを上昇させれば、これらの結果を改善するであろう。
【００８３】
第２に、マルチスケール・アプローチを使用する場合のこの詳細さのレベルは、これらの結果に効果を与え得る。４つの特徴点の最大数は、良いテストケースの結果を提供した例としてのみ使用されて来た。特徴点の最適な数は、必要に応じて決定され得る。大きなリガンドは、より多くの特徴点を必要とすることがある。一方、特徴点の追加は、該リガンドの詳細さのレベルを上昇させ、それで該リガンドが回転されるべき角度間隔はより小さくされるはずであり、さもなくば、潜在的に良い位置に近い多くの焼き写しは、該タンパク質との衝突のために見出されないであろう。このパージ基準の鋭敏さは、本方法の成功に対しても決定的である。緩い基準を用いることは、少数のパージされたクラスター（およびその探索ツリーのノード）に至り、この計算時間を有意に抑えるであろう。しかしながら、このような表示は粗過ぎ、引き続いてこれらの結果をねじ曲げてしまうことがあるであろう。一方、厳しいパージ基準を用いることは、多数のクラスターに至るであろう。過多なコンホマーの詳細な表示は、実際により精確ではある。しかしながら、それは、このコンピューターの負担を増加させるであろう。最初に見たところでは、コンホマーを創出する場合にそのねじれが回転される角度間隔と、該パージ基準との間に明確な関係はないように思われる。しかしながら、もし我々が緩いパージ基準を用いる場合、膨大な数のコンホマーを発生させるものの、非常に小さな間隔でこれらのねじれを回転させることにおいて問題点はなく、これはそれらの全てまたは大多数がパージされるであろうからである。
【００８４】
第３に、単純な分子メカニクスの非結合性項およびねじれ項よりもより精確なエネルギー関数が用いられてもよい。このようなエネルギー関数は、該結合によるコンホメーションのエントロピーの損失のような、他のパラメーターを斟酌し得る。明らかに、一旦その活性部位の位置が既知となれば、コンピューターにとってはより高くつくが精確な計算を繰り返すことが出来る。ＣＶＦＦのような簡単かつ一般的なエネルギー関数を用いることにより、マルチスケールに基づいたフレキシブルなドッキング方法論が有効であることを端的に実証する実施例が、与えられる。
【００８５】
本発明の方法論は、幾つかの方式により、計算時間の実質的な量を節約する。第１に、それは無視可能な計算時間を伴う好ましくない全ての焼き写しを、非常に早期の段階にて立ち退かせる。第２に、これら７つのリガンドをドッキングさせるために、それは非常に少数の特徴点を使用する。実際、この仕事において我々は、２４〜３４の範囲の原子数を有するリガンドを、４つの特徴点へとクラスター化した。更に、これらの焼き写しの殆どは、より高くつかない計算時間内で、１〜３の特徴点において、既に立ち退かされている。
【００８６】
本方法論は、これらのリガンドを「硬直化」させる。我々はこれら全てのコンホメーションを、より少数の硬直した特徴点へと圧縮することが出来る。このことは、我々がこのフレキシビリティーの問題を大いに単純化することを可能にしてくれる。最も極めつけの実施例はネビラピンであり、これはフレキシブルだけれども、そのドッキングの間中硬直したものとして扱うことが出来た。７つのリガンドの内６つにおいて、我々は、２点表示において、このフレキシビリティーの問題が無視され得ることを示した。
【００８７】
１０°〜１５°間隔にて該リガンドを正常に回転させる他のドッキング研究とは違って、ここで我々は、遙かにより大きな３０°の増加分を用いる。我々は、マルチスケール・アプローチを使用する場合、このような増加分が正当化されることを示した。加えて、我々は３〜２４３倍の範囲のスピードアップを示した。ドッキングにおいて、およびＨＴＤにおいてこれらのコンホマーを発生させ、それらを保存し、その後それらを評価することが、律速段階の１つである。徹底的には評価され得ない、禁じられる程多数のコンホマーを有する高度にフレキシブルな化合物に関する問題は、ケモインフォマティクスにおいて主要な問題である。アンカー−ファースト（anchor-first）の手順（Leach, A.R.; Kuntz, I.D. Conformational Analysis of Flexible Ligands in Macromolecular Receptor Sites. J. Comput. Chem. 1992, 13, 730-748 参照）では、硬直したコアがドッキングされ、そのフレキシブルな部分が増加するように再付加される。該結合部位中の該コンホマーの形状は該アンカーの設置に依存するので、このような方法においては、ある程度のバイアスがある。このことは、もしリガンドの位置がアンモニウムまたはカルボキシレートのような小さな官能基により記述される場合、あるいはもし該リガンドが脂肪族である場合には、限定要因となる。Statistical Classification of Activities of Molecules for Pharmacophore Identification（ＳＣＡＭＰＩ）（Chen, X.; Rusinko, A. ３世; Tropsha, A.; Young, S.S. Automated pharmacophore identification for large chemical data sets. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1999, 39, 887-896）のような他のケモインフォマティクスのアルゴリズムは、コンホメーションを無作為にサンプリングする。本発明は、有利な第３のオプション：より大きな間隔にてこれらのコンホマーを創出し、それらをクラスター化すること、を提供する。本方法の利点は、多くの場合において、全コンホメーション空間を、一様に、無作為にではなく、バイアスのかからないように、網羅することである。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
【表２】
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【００９０】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００９１】
本発明の実施形態が今、添付の図面に関連して記載されるが、これは例示のみのためのものである。
【図１】図１は、ＨＩＶ−逆転写酵素阻害剤ネビラピンについて発生されたモデルの例を描いたものである。
【図２】図２は、第１のセットの例の結果における、テストケースとして選択された９つのリガンドについての化学式を例示している。
【図３ａ】ストレプタビジン／ビオチン。Ｈ−結合は、ダッシュにより示されている。図３ａは、予見されるようなリガンドの立体化学（暗く示されている）および既知の結晶構造（酸素、窒素、硫黄、およびリン原子がそれぞれ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＰとラベルされている；他のラベルされていない原子は炭素であり、水素原子は明確にするために省かれている）の間の比較を与えるものである。このタンパク質は、リボンとして示されている。
【図３ｂ】ＭｃＰＣ−６０３／ホスホコリンの結果。図３ｂは、予見されるようなリガンドの立体化学（暗く示されている）および既知の結晶構造（酸素、窒素、硫黄、およびリン原子がそれぞれ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＰとラベルされている；他のラベルされていない原子は炭素であり、水素原子は明確にするために省かれている）の間の比較を与えるものである。このタンパク質は、リボンとして示されている。
【図３ｃ】β−トリプシン／ベンズアミジン。図３ｃは、予見されるようなリガンドの立体化学（暗く示されている）および既知の結晶構造（酸素、窒素、硫黄、およびリン原子がそれぞれ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＰとラベルされている；他のラベルされていない原子は炭素であり、水素原子は明確にするために省かれている）の間の比較を与えるものである。このタンパク質は、リボンとして示されている。
【図３ｄ】シトクロームＰ−４５０ｃａｍ／カンファー。図３ｄは、予見されるようなリガンドの立体化学（暗く示されている）および既知の結晶構造（酸素、窒素、硫黄、およびリン原子がそれぞれ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＰとラベルされている；他のラベルされていない原子は炭素であり、水素原子は明確にするために省かれている）の間の比較を与えるものである。このタンパク質は、リボンとして示されている。
【図４ａ】ネビラピンについての第１の反復。図４ａは、ＨＩＶ−逆転写酵素についての探索結果を例示している。最低エネルギーのグリッドの点は、明るい灰色のドットとして示されている（２０，０００点まで）。このタンパク質は、暗い灰色のリボンとして示されている。
【図４ｂ】ネビラピンについての第３の反復。図４ｂは、ＨＩＶ−逆転写酵素についての探索結果を例示している。最低エネルギーのグリッドの点は、明るい灰色のドットとして示されている（２０，０００点まで）。このタンパク質は、暗い灰色のリボンとして示されている。
【図４ｃ】ネビラピンについての最終の反復（結晶構造の立体化学が左側に棒モデルとして示され、最低エネルギーの予見される位置が灰色の球として示されている）。図４ｃは、ＨＩＶ−逆転写酵素についての探索結果を例示している。最低エネルギーのグリッドの点は、明るい灰色のドットとして示されている（２０，０００点まで）。このタンパク質は、暗い灰色のリボンとして示されている。
【図４ｄ】ネビラピンのこの予見される立体化学が明るい灰色の棒モデルとして示され、この結晶構造中のリガンドの立体化学が暗い棒モデルとして示されている（最低エネルギーのグリッドの点が、球として示されている）。図４ｄは、ＨＩＶ−逆転写酵素についての探索結果を例示している。最低エネルギーのグリッドの点は、明るい灰色のドットとして示されている（２０，０００点まで）。このタンパク質は、暗い灰色のリボンとして示されている。
【図４ｅ】それらの予見される位置中の種々のＨＩＶ−逆転写酵素阻害剤とその活性部位残基との間の相互作用。ネビラピンは暗い灰色により示され；１０５１Ｕ９１は明るい灰色により示され；α−ＡＰＡは中庸の灰色により示され；該活性部位残基は該リガンドの周りに示されている。水素は示されていない。図４ｅは、ＨＩＶ−逆転写酵素についての探索結果を例示している。最低エネルギーのグリッドの点は、明るい灰色のドットとして示されている（２０，０００点まで）。このタンパク質は、暗い灰色のリボンとして示されている。
【図５】図５は、ヘパリン（棒モデルにより示されている）−塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）に関する探索結果を例示している。ｂＦＧＦの表面は、静電ポテンシャルを指し示すよう影を施されている（ストリッピングはマイナスの静電ポテンシャルを指し示し、暗く影を施された領域はプラスの静電ポテンシャルを持っている）。左側の交差ハッチの球は、結晶構造中のリガンドの中心を指し示し、左側のその他の球は、５つの低エネルギーの立体化学である。
【図６】図６は、ｎ個のコンホマーについての特徴点（１〜３）の増加する数についての「ｋ−法」によるクラスター化の結果を描いたものである。単一点表示では、全てのコンホマーの表示（Ｏ１、Ｏ２．．．Ｏｎ）が同一であり、単一点へとパージされ得る。この２点クラスターは線（ａ１、ａ２．．．ａｎ）として定義され、３点クラスターは２本の線および１つの角（ｂ１、ｂ２．．．ｂｎ）、（ｃ１、ｃ２．．．ｃｎ）、（α１、α２．．．αｎ）として定義される。これら全てのクラスターはｎより遙かに小さな数、該２点についてはｋ、または該３点についてはｐへと尚パージされ得る。
【図７】図７は、このパージされたクラスターが如何に種別されて探索ツリーを形成するかを例示している。該探索は、単一点のパージされたクラスターから始まる。その後それはより低エネルギーの２点のパージされたクラスター、３点のもの、および４点のものへと移動する。該探索は、その関連した分岐に関してのみ行われる。
【図８】図８は、更なる例の結果におけるテストケースとして使用される７つのリガンドについての化学式を例示している。    （ａ）ε−アミノカプロン酸。    （ｂ）ビオチン。    （ｃ）シチジル酸。    （ｄ）Ｌ−アスコルビン酸。    （ｅ）ホスホコリン。    （ｆ）Ｌ−ヒスチジン。    （ｇ）ネビラピン。  その回転は矢印により示されている。メチル部分は回転されていない。
【図９】図９は、図８の７つのリガンドに対応するテストケースとして選ばれた７つのタンパク質を例示している。    （ａ）加水分解酵素（セリン・プロテアーゼ）。    （ｂ）ストレプタビジン。    （ｃ）加水分解酵素（エンドリボヌクレアーゼ）。    （ｄ）異性化酵素。    （ｅ）ＭｃＰＣ−６０３。    （ｆ）ヒスチジン結合タンパク質。    （ｇ）ＨＩＶ逆転写酵素。  これらのタンパク質は、リボンとして示されている。該結晶構造中のリガンドは、暗い棒モデルとして示されている。該第３反復の終わりにおける該リガンドの残っている可能な焼き写しは、明るい灰色の球として示されている。
【図１０】図１０は、７つのリガンドについての、更なるテスト結果（明るい灰色の棒モデルとして示されている）と該結晶構造中の該リガンドのコンホメーション（暗い灰色の棒モデルとして示されている）との間の比較を示している。    （ａ）ε−アミノカプロン酸。    （ｂ）ビオチン。    （ｃ）シチジル酸。    （ｄ）Ｌ−アスコルビン酸。    （ｅ）ホスホコリン。    （ｆ）Ｌ−ヒスチジン。    （ｇ）ネビラピン。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2005515575.tif 000025