(57)【要約】   本発明は一般に、遺伝子工学及び抗体産生の分野に関する。特に、本発明は、より成熟したリンパ球系統細胞へと分化する潜在能力をもつ遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の生成及びあらゆる異種抗体又は結合タンパク質の産生を目的とするその使用に関する。
2005525800.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意の異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）の産生のために使用可能な脊椎動物リンパ球の生成方法において、
（ａ）少なくとも１つの異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）をコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を導入することによって、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階；及び
（ｂ）インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）を産生する能力をもつリンパ球を生成する段階
を含んで成る方法。
【請求項２】
（ａ）ハイブリッドーマ細胞を生成するために骨髄腫細胞に分化したリンパ球を融合させること、
（ｂ）形質転換ウイルスにそれを感染させること；
（ｃ）少なくとも１つの形質転換する癌遺伝子の発現を確保するベクター構成体でそれをトランスフェクトすること、
によって、分化したリンパ球を不死化させ、かくして、前記異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）を常時産生する能力をもつ脊椎動物リンパ球を生成する段階をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脊椎動物前駆体リンパ球が、リンパＶ（Ｄ）Ｊ組換え機構の少なくとも１つの構成要素を発現することができ、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物に由来する（なおマウスからのマウス前駆体（ｐｒｅ）Ｂリンパ球が好まれる）、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記脊椎動物前駆体リンパ球が、内因性抗体及び／又は抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）を発現する潜在能力を有しておらず、これは内因性免疫グロブリン又はそのフラグメントの発現が欠如している脊椎動物前駆体リンパ球を単離／選択すること及び／又は、
（ａ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部分を含めた、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のコーディング領域、及びその膜貫通エキソンを伴う又は伴わないμ、δ、γ、ε及びα重鎖のための定常領域エキソン用のコーディング領域のうちのいずれか；
（ｂ）Ｖ及びＪ遺伝子セグメントコーディング領域のいずれかを含めた免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖遺伝子座のコーディング領域、ならびに定常領域エキソンのうちのいずれか；
（ｃ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部を含めたＴ細胞レセプタα、β、γ及びδ遺伝子座のコーディング領域、及びα、β、γ及びδ定常領域エキソンのためのコーディング領域のいずれか；
（ｄ）重鎖イントロンエンハンサ及び３’αエンハンサを含む、シス作用性免疫グロブリン重鎖遺伝子エンハンサ要素；
（ｅ）κ重鎖イントロンエンハンサ（κｉＥ）、３’κエンハンサ及びλ２−４及びλ３−１エンハンサを含むシス作用性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座；
（ｆ）ＴＣＲα、β、γ及びδエンハンサを含めた、シス作用性Ｔ細胞レセプタ遺伝子座エンハンサ要素；
（ｇ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含むトランス作用性組換え活性化遺伝子、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２ならびにそのコーディング領域；及び
（ｈ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含む、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の触媒サブユニット、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４及びＡｒｔｅｍｉｓを含む、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに不可欠のトランス作用性ＤＮＡ修復遺伝子、ならびに該遺伝子のコーディング領域、
から成るグループの中から選択されている少なくとも１つの遺伝要素の少なくとも１つの対立遺伝子を機能的に不活性化するように設計された少なくとも１つのベクター構成体を前記脊椎動物前駆体リンパ球内に導入することによって達成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクター構成体が、好ましくは正のトランスフェクタントの選択を可能にする正の選択マーカーにフランキングする、相同的組換えのための機能を付与する前記少なくとも１つの遺伝要素に対するＤＮＡ配列相同性をもつ領域を含む遺伝子ターゲティングベクターを内含している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子ターゲティングベクターが付加的に、正の選択マーカーをフランキングし、同族リコンビナーゼ酵素の少なくとも１つをコードする核酸配列のトランスフェクション及び過渡的発現の時点で前記正の選択マーカーの欠失を可能にする、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素のための一対のＤＮＡ認識配列を含んで成る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子ターゲティングプラスミドベクターが付加的に、内部で前記遺伝子ターゲティングベクターが非相同的組換えによりゲノム内に無作為に組込まれているトランスフェクタントに対する選択を可能にする負の選択マーカーを含んで成る、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）をコードする前記少なくとも１つの外因性遺伝要素が、
（ａ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスＤＮＡ構成体；
（ｂ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのＤＮＡ構成体；
（ｃ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、再配置されていないＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ−免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座；
（ｄ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｅ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントの（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように設計された修飾された配置内の少なくとも１つの異種免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｆ）一次アミノ酸配列（単複）に関して野生型である、少なくとも１つの異種抗体又はＴ細胞レセプタのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にする生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを包含する異種染色体のフラグメントである染色体導入要素、
から成るグループの中から選択された遺伝子構成体上に担持されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの外因性遺伝要素が、未変性又は修飾済みヒト抗体、ヒト結合タンパク質、ヒト抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントをコードする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの外因性遺伝要素が結合領域の親和力成熟を受ける能力をもつ異種又は人工レセプタをコードする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
脊椎動物前駆体リンパ球の分化がインビトロで、
（ａ）前記脊椎動物前駆体リンパ球の増殖を停止させ、あらゆる前駆体リンパ球成長因子の不在下で培養することによって成熟リンパ球系統細胞への分化を誘発すること；及び
（ｂ）（ｉ）インタロイキン−２、インタロイキン−４、インタロイキン−５、インタロイキン−６、インタロイキン−１０、インタロイキン−１３、ＴＧＦ−β及びＩＦＮ−γを含む可溶性Ｔ細胞関連刺激因子；
（ii）ＣＤ４０、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、補体レセプタ１（ＣＤ３５）及び２（ＣＤ２１）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ｌｇα（ＣＤ７９α）、ｌｇβ（ＣＤ７９β）、ＴＡＰＡ−１（ＣＤ８１）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＴＮＦ−レセプタ１（ｐ５５、ＣＤ１２０ａ）、ＴＮＦ−レセプタ２（ｐ７５、ＣＤ１２０ｂ）、Ｏｘ−４０（ＣＤ１３４）、及びリンフォトキシン−βレセプタに特異的な活性組換え型リガンド又はアゴニスト抗体を含む、Ｂ細胞の副刺激レセプタを活性化する因子；及び
（iii）Ｂ細胞マイトジェン因子、１型のＴ細胞依存性抗原及び、リポサッカリド（ＬＰＳ）、グラム陰性菌からのリポタンパク質、ポリアニオン、ポリ−ｄｌｄＣ、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）及び抗免疫グロブリン試薬を含むその他のポリクローナル活性体、
及びそれらの組合せの中から選択された成分のうちの少なくとも１つの存在下で前記細胞をさらに培養することによりリンパ球終末分化を誘発すること
によりもたらされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
インビボでの前記分化が、適切な脊椎動物宿主内への前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の移植の時点でもたらされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンパ球が、ナイーブな又は抗原で初回免疫されたＴヘルパーリンパ球を用いて前記宿主内に同時移植される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インビボでの分化の後には、少なくとも１つの所望の免疫原性化合物又は組成物での前記宿主の免疫化が続いている、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脊椎動物宿主が、内因性Ｂ細胞、Ｔ細胞及び／又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞又はその組合せの生成に関して欠損している適合性のある宿主である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
脊椎動物宿主が、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物の中から選択され、マウスが好ましい宿主種である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
それ自体既知の要領でいずれかの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）を産生することを目的とした、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により得ることのできる、遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法の後には、
（ａ）少なくとも１つの外因性遺伝要素を前記分化されたリンパ球から単離する段階、及び
（ｂ）前記少なくとも１つの異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）の産生を可能にする状況下に前記遺伝要素（単複）を置く段階、
が続く、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、１つのユニークな特異性を示し従ってモノクローナルである、請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が複数のユニークな特異性を示し、従ってポリクローナルである、請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、ヒトの遺伝的レパートリ又はその一部分に基づいて組立てることができるようなヒト抗体、抗原レセプタ又は結合タンパク質に完全に又は部分的に類似している、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
産生させるべき異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、
（ａ）膜結合又は分泌され、天然の抗体の中に見られる化学量論的組成物内の非相同重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方から成り、かつ既知の重（μ、δ、γ、ε）及び／又は軽（κ及びλ）鎖イソタイプのいずれかから成る抗体；
（ｂ）一次アミノ酸配列に関して完全にヒトである重鎖及び軽鎖ポリペプチドの組合せを伴う抗体；
（ｃ）異なる脊椎動物種からの異種重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含有するハイブリッド抗体；
（ｄ）完全に又は部分的に異種である、分泌されたＦａｂ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ’）２抗体フラグメント、
（ｅ）二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを結果としてもたらす、リンカーペプチドを介して共有結合でカップリングされた抗体のフラグメント、
（ｆ）免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質と構造的類似性をもつ、α、β、γ及びδイソタイプ、抗原レセプタ及びその他の結合タンパク質のＴ細胞レセプタ、
及びそれらの機能的フラグメントから成るグループの中から選択される、
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により得ることのできる、遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球及びより成熟したリンパ球系統細胞。
【請求項２４】
請求項２〜１６のいずれか１項に記載のものに従って得ることのできる、異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントを産生する不死化された細胞。
【請求項２５】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法において使用するためのベクター構成体。
【請求項２６】
請求項８に記載の方法において使用するための遺伝的構成体。
【請求項２７】
野生型免疫エフェクタ機能、又は生殖細胞系列でコード化された異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾済み又は人工エフェクタ機能を示す、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法により得られた、少なくとも１つの抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントを含む、薬学又は診断用調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、遺伝子工学及び抗体産生の分野に関する。特に、それは、より成熟したリンパ球系統細胞へと分化する潜在能力をもつ遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の生成及びあらゆる異種抗体又は結合タンパク質の産生を目的としたその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体が、疾病の診断、予防及び治療にとって有効な試薬であることが実証されてきた（グレニー及びジョンソン(Glennie and Johnson),Immunol,Today,21,p.403〜410,2000）。これは、その可変ドメインを介して標的分子（抗原）上の特定のエピトープに非常に特異的に結合すると同時にその定常領域ドメインを介してエフェクタ機能を媒介するそのユニークな能力に起因している（フレイツァ及びカプラ(Frazer and Capra),Fundamental Immunology，Ｗ.Ｅ.ポール(W.E.Paul)（編）、第４版、p37-74,1999）（図１）。こうしたモノクローナル抗体は、高分子の混合物内のユニークな抗原を特異的に同定しこれらの標的に対しエフェクタ機能を向けることができるようになる。
【０００３】
抗体（又は免疫グロブリン）は、ジスルフィド結合を介してリンクされている２つの同一の重（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖糖タンパク質から成る（図１）。各々のＨ及びＬ鎖は、同じ免疫グロブリンイソタイプに属する異なる抗原の中で同一であるＣ末端定常領域と異なる抗体間で変動するＮ末端可変ドメインを含んで成る（図１）。Ｈ及びＬ鎖可変ドメインの組合せは、抗体の抗原結合ポケットを生成し、その特異性（又はイディオタイプ）を決定するが、一方定常領域はそのイソタイプを決定する（フレイツァ及びカプラ(Frazer and Capra)s.a.）。免疫グロブリンの可変性は、ＶＨ及びＶＬドメインが、Ｖ（可変）、Ｄ（多様性；Ｈ鎖遺伝子座内のみに存在する）及びＪ（接合）遺伝子セグメントと呼ばれる多数の遺伝子セグメントによってコードされるという事実の結果としてもたらされる（利根川,Nature,302,p575-581,1983）（図１）。Ｂリンパ球の分化の間、ＶＨ及びＶＬドメインのための新しいコーディング領域が生成されるように遺伝子セグメントを組立てるＶ（Ｄ）Ｊ組合せの部位特異的組合せプロセスのために各細胞内で１つのＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントが無作為に選択される（グラワンダー(Grawunder)ら,Curr.Opin.Immunol.,10,p172-180,1998）。Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの数が多く、しかも遺伝子セグメント接合が不精確であることから、毎日免疫系により産生される何百万ものＢリンパ球により、異なるＶ領域特異性の巨大なレパートリが生成され得る（メルシャー(Melchers)ら,Curr.Opin.Immunol.,7,p.214-227,1995）。
【０００４】
進化中に、免疫グロブリン遺伝子は異なる種の間でわずかに分出し、そのため抗体の定常領域は種の間で異なるようになっている。その結果として、１つの種からの免疫グロブリンは、もう１つの種の血管系内に導入された場合、免疫原性をもつことが最も多い。
【０００５】
従って、異種抗体に対して患者を露呈した結果として不利な効果、さらには急性毒性さえももたらされる可能性があり、そうでなくても適用された抗体の中性化及びクリアランスが単に導かれる可能性があることから、異種モノクローナル抗体の免疫原性は、ヒトの疾病の療法におけるこの抗体の使用を制限している（クラーク(Clark),Immunol,Today,21,p397〜402,2000）。これとは対照的に、完全にヒト由来の抗体を患者に投与しても、通常上述のような合併症のいずれも発症しない。
【０００６】
ヒトの血清又はヒトのポリクローナル抗体は、場合によって、エボラウイルス感染症といったようなまれでかつ通常致死率の高い疾病の治療又は予防のため、又は例えばヘビの毒液に対する露呈後の個体の治療のため、個々の患者の血液から単離されてきた。しかしながら、このアプローチは数多くの理由で、より多くの人口に影響を及ぼす疾病の治療のためには非実用的である。さらに、倫理上の理由で、所望の抗体を産生するヒトの体内のＢ系統細胞が二次リンパ器官内で発達し常駐し容易に得られないことから、モノクローナル抗体産生を目的として一定の与えられた抗原でヒトを免疫化することは不可能である。さらに、特に癌療法のための治療用抗体用の数多くの潜在的標的抗原がヒトタンパク質である（グレニー及びジョンソン(Glennie and Johnson),s.a.）。正常な状況下では、ヒトはこれらの標的に対する抗体を発生させない。従って、最近では、ヒト免疫系を必要とすることなく治療用のヒト又はヒト化された抗体の発生のための手順を開発することに多大な努力が払われてきた。
【０００７】
最も単純なアプローチは、所望の特異性の異種抗体を分泌するハイブリドーマからのＨ及びＬ鎖（ＶＨ及びＶＬドメイン）の可変ドメインをコードするｃＤＮＡのクローニングのための標準的遺伝子工学処理技術を使用する。クローニングされた可変ドメインｃＤＮＡは、その後、ヒト定常領域遺伝子を含有する適切な大腸菌(E.coli)酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞発現ベクターへとクローニングされる。こうして、ヒトＣＨ及びＣＬ定常領域ドメインに融合された異種ＶＨ及びＶＬドメインをもつモノクローナル抗体の産生が可能となり、結果としてヒト化された抗体がもたらされることになる。しかしながら、このアプローチには、ヒトＣＨ及びＣＬ定常領域に対する異種ＶＨ及びＶＬドメインの融合の結果、親和力の低下又は特異性の改変のいずれかがもたらされ得るという欠点がある。さらに、ヒト化抗体の異種ＶＨ及びＶＬは、Ｖドメインの枠組領域が異なる種の間で変動することから、ヒトの体内でなお免疫原性を示す。この問題は、一部のケースにおいて、Ｈ及びＬ鎖の可変ドメインのヒト枠組領域上に、抗原に対する直接的接触を媒介する個々の相補性決定領域(ＣＤＲ)を移植することによって回避することができる（フィオレンティーニ(Fiorentini)ら,Immunotechnology,3,p45〜59,1997）。しかしながら、理由は分かっていないが、ＣＤＲ移植はなおも、免疫遺伝抗体の生成及び／又は親和力及び特異性の減少／損失という結果をもたらすことが多い。
【０００８】
従って、近年になって、完全にヒト由来の免疫グロブリンの生成のための２つの異なるそしてより効果的なアプローチが開発されてきた。
【０００９】
第１の方法は、E.coliの糸状バクテリオファージの表面上に１つのＶＨ及びＶＬドメインから成る１本鎖可変領域（ｓｃＦｖ）の発現（提示）に基づいている（フーゲンブーム及びチェイムズ(Hoogenboom and Chames),Immunol,Today,21,p371〜3818,2000）（同様に欧州特許第０５８５２８７Ｂ１号明細書、欧州特許第０６０５５２２Ｂ１号明細書も参照のこと）。多様なＶＨ及びＶＬ鎖レパートリを含むファージ提示ライブラリを構築することができ、固定化した領域に対する組換え型ファージの結合によりかかるライブラリから個々のｓｃＦｖ特異性を分離することができる（マクカファティ(MaCafferty)ら,Nature,348,p552-554,1990）。
【００１０】
天然のヒトレパートリから誘導されたｓｃＦｖ結合タンパク質のためのファージ提示ライブラリには、そのレパートリ内に含まれた特異性に制限されるという欠点があり、従って多くのヒト抗原に対する特異性は、これらのライブラリ内では表わされていないことが最も多い。この問題を回避するために組合せ又は合成ファージ提示ライブラリを使用することができるものの、この技術の一般的欠陥は、一定の与えられた抗原についての高親和力結合タンパク質が往々にして単離不可能である、ということにある。従って、強引なクローニング又は部位特異的組換え手順のいずれかにより非常に大きな一次ライブラリを構築するのに多大な努力が払われてきた。
【００１１】
最良の組合せ又は合成ライブラリは、１０９〜１０１１の潜在的に異なる結合部位を含有すると推定され、１〜２００ｎＭの範囲内の結合特異性を生み出すことができる（フーゲンブーム及びチェイムズ(Hoogenboom and Chames,s.a.）。しかしながら、インビボで胚中心Ｂ細胞内の免疫グロブリンの親和力成熟の間に到達できるピコモル範囲（１０−１２Ｍ）内のより高い親和力は、Ｖ遺伝子シャッフリング、変異性ＰＣＲ、Ｅ．ｃｏｌｉミューテータ株の使用などを含めた付加的で冗漫な遺伝子工学手順を利用してのみ生成可能である。
【００１２】
ファージ呈示ライブラリ選択プロセスの成果がいかなるものであろうと、場合によって、ｓｃＦｖ結合部位をコードする遺伝子は、ヒト免疫グロブリンのための適切な発現ベクター内に再クローニングされる必要があり、これらはヒト抗体の大規模産生を可能にする細胞発現系の中に安定した形で移入されることが必要である。
【００１３】
完全にヒトのモノクローナル抗体の産生のための第２のアプローチは、ヒト免疫グロブリンＨ及びＬ鎖遺伝子座のための遺伝子導入マウス包含構成体の使用に基づくものである（ジャコボヴィッツ(Jakobovits),Curr,Opin.Biotechnol.6,p561〜566,1995）。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、場合によって、もはや内因性マウス抗原レセプタ遺伝子の組立てを可能にしない遺伝的背景上へと繁殖される。これらのマウスにおいては、Ｂ系統細胞の発達は、ヒト遺伝子導入構成体からの免疫グロブリンＨ及びＬ鎖の発現によって左右され、これらのマウスのＢ系統細胞は、ヒト抗体を産生する能力しかもたない。この技術には３つの変形形態が存在する。その１つにおいては、導入遺伝子としてヒト免疫グロブリンミニ遺伝子座が使用され、これからはヒト抗体の制限されたレパートリしか生成することができない（フィッシュワイルド(Fishwild)ら,14,p845〜851,1996）（同じく欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書も参照のこと）。第２の変形形態では、酵母人工染色体内にクローニングされた可変領域遺伝子セグメントの大部分を包含するヒトＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖遺伝子座の大きな領域が使用される。第３の変形形態では、完全ヒト免疫グロブリンＨ及びＬ鎖遺伝子座を含有するヒト染色体片が、いわゆる染色体導入動物を生成するマウスの生殖細胞系列内に組込まれる。このような複合導入遺伝子をもつマウスは、事実上正常なヒト免疫グロブリンレパートリを発達させる。
【００１４】
これらの遺伝子導入又は染色体導入マウスの免疫化は、完全にヒトの抗体の生成をもたらす体液性免疫反応を結果としてもたらす。ヒト抗体を生成するこのアプローチは、ファージ呈示ライブラリ技術に比べ１つの重要な利点をもつ。すなわち、免疫反応の推移において正常なプロセスである胚中心Ｂ細胞内の親和力成熟をヒト免疫グロブリンが受けることができるため、一定の与えられた抗原に対する高い親和力を生成することが可能である。
【００１５】
しかしながら、この技術には、１つの重大な欠点がある。すなわち、まず第１に、遺伝子導入又は染色体導入マウスの生成は、非常に冗漫で困難、かつ時間のかかるものであり、従って比較的高価である。手順全体には、少なくとも４つの異なるマウス株、つまり内因性ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子座内のターゲティングされた分析を伴う２つの株ならびにヒトＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子座の一部分又は全てについての導入遺伝子又は導入染色体を担持する２つの株の生成が必要とされる。さらに、これら４つのマウス株全てが一緒に繁殖され、内因性ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子座の両方の同型接合時分断を担持すると同時に異種ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖の両方をコードするヒト導入遺伝子を担持する遺伝子型をもつマウスを結果としてもたらすことが必要である。異なるノックアウト及び遺伝子導入マウス株の生成、そのスクリーニング及び場合によっての交雑育種は、各ステップを完全に最適化した場合でさえ少なくとも２年はかかることになる冗長な手順である。従って、異種マウス株の開発に必要とされる時間枠が広大であるため、修飾済み遺伝子導入構成体を含有する異なるマウス株を設計するための融通性はほとんど残されていない。従って、この技術は、この１つの抗体について新規の遺伝子導入マウス株を生成する冗長な手順を必要とすることになるために、既存の抗体の修飾及び改良（例えばその親和力の）に適してはいない。この技術は、従って、基本的に、ヒト抗体のデノボ（新規の）生成に制限される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述の事実に基づいて、ファージ提示システムの利点（すなわちヒト抗体を生成する上での速度及び融通性及び既存の抗体の特性を修飾し改善する能力）及びヒト免疫グロブリン遺伝子導入マウス技術の利点（すなわち免疫系内で発生する親和力成熟に起因する高親和力抗体を得る能力及び生理学的特長及び天然の構造的特長をもつ抗体の産生）の両方を組合わせるような完全にヒトの抗体の産生を可能にする技術に対する必要性が、明らかに存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、あらゆる異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）の産生のために使用可能な脊椎動物前駆体リンパ球を生成するための手段及び方法を提供する。特に本発明は、脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾し、インビトロ又はインビボのいずれかでより成熟したリンパ球系統細胞へのそれらの分化を実施し、かくして提示させたい特異的活性又は特徴に関して考慮され設計され得る異種免疫グロブリン様のポリペプチドの全ての形態を産生する能力をもつリンパ球を生成するための手段及び方法を提供する。さらに、本発明は、遺伝要素及び構成体ならびに本発明を実施するのに適した特殊なリンパ球を提供している。
【００１８】
かくして、本発明の方法は、短かい時限内であらゆるタイプの抗体又は結合タンパク質を単純に発現する潜在能力をもつリンパ球系統細胞の生成のため、多大な融通性を可能にする。同時に、親和力成熟といったような特定的免疫機能に細胞が参与している適合性のある脊椎動物宿主の中にこれらの細胞を移植することが可能であることから、任意の与えられた抗原化合物又は組成物に対する高い結合親和力をもつ抗体及び免疫グロブリン様のさらには人工の結合タンパク質を生成するために免疫系の選択性を活用することが可能となる。
【００１９】
明細書全体を通して用いられている用語の定義
親和力：レセプタ−リガンド相互作用の会合対解離の速度比により決定される、そのコグネイト抗原（又はそのリガンド又は結合パートナ）についての抗原レセプタ（又は任意のレセプタ）の結合の強度。
【００２０】
親和力成熟：胚中心内の抗原刺激されたＢリンパ球により産生された抗体の結合特異性の抗原により駆動される改善の高度に規制された免疫学的プロセス。このプロセスは、より高い親和力の抗体を生成するＢリンパ球の選択的拡張及び存続と結合された抗体の可変ドメインについてのコーディング領域内部での体細胞超変異によってひき起こされる。
【００２１】
抗体：その単量体形態の中に、各々１つの可変ドメインと１つの（Ｌ鎖）又は複数の（Ｈ鎖）定常領域から成る２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖を含む、血漿細胞及びＢリンパ球によって産生されるグリコシル化ポリペプチド。２つのＨ鎖及び２つのＬ鎖は、Ｈ及びＬ鎖の可変領域の組合せによって形成された２つの結合ドメインをもつ対称なＹ字形のジスルフィドリンクした抗体分子の形に組立てられる。
【００２２】
抗原：免疫グロブリン（又は抗体）の可変ドメインによって結合され得るあらゆる生体分子又は化学的実体。
【００２３】
抗原レセプタ：抗原レセプタは、可変ドメインと定常領域で構成され、前者は抗原に結合する能力をもち、後者はエフェクタ機能を媒介するか又は細胞内にシグナルを形質導入する能力をもつ、抗原レセプタは、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む。
【００２４】
人工結合タンパク質：その天然の遺伝子又はフラグメントから誘導可能でない、ポリペプチド配列（例えば合成スペーサ配列）を含有する結合タンパク質。
【００２５】
結合タンパク質：付加的なエフェクタ機能を伴って又は伴わずに抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつあらゆるタイプのポリペプチドのための最も一般的な用語。結合タンパク質は、人工結合タンパク質、例えば１本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）といったような抗体フラグメントと同様に、Ｔ細胞レセプタ及び免疫グロブリンの可変及び定常領域ドメイン（又はその逆）を組合せる融合生成物をも内含している。さらに、結合タンパク質は、可変ドメインとその他のレセプタ分子の機能的部分の融通生成物でもありうる。換言すると、結合タンパク質は、抗原レセプタの定常領域ドメインと非Ｉｇ又はＴＣＲ関連レセプタからの結合部分の融通でありうる。
【００２６】
シス作用性：同じ対立遺伝子の近くの遺伝要素及び遺伝子座又は同じ対立遺伝子自体に対してのみ影響をもつこと。
【００２７】
コーディング領域：１つのポリペプチド内に発現され得る開いた読取り枠を有する遺伝要素。
【００２８】
相補的決定領域（ＣＤＲ）：抗原に対する接触を直接樹立する可変抗原レセプタドメインの３次元構造内の領域。ＣＤＲは通常、抗原レセプタの最も多様な部分である。
【００２９】
ドメイン：（例えば、いわゆるＩｇスーパーファミリーに属する免疫系の数多くの分子の中に発見できるＩｇ様ドメインといったような、構造的に関係する免疫グロブリンの可変又は定常領域ドメインなどの特定の３次元構造により特徴づけされる生体分子の構造的部分。
【００３０】
エフェクタ機能：例えば、定常領域についての特異的レセプタ（Ｆｃレセプタ）に結合することによって或る種の免疫細胞を活性化するか又は補体を活性化する能力といったような、免疫系の状況下での免疫グロブリンの定常領域の機能。
【００３１】
内因性：或る種の細胞又は生体に対し自発的であること。
【００３２】
エンハンサ：配向又は位置としては独立して長距離にわたりプロモータ要素の活性を刺激できる遺伝要素。
【００３３】
エピトープ：抗体の可変結合領域によって認識される抗原の三次元構造実体。
【００３４】
（抗体、抗原レセプタ又は結合タンパク質の）機能的フラグメント：特定の利用分野に関して前記ポリペプチドに固有の所望の特性の少なくとも１つを共有する抗体、抗原レセプタ及び結合タンパク質から成るグループの中から選択された一定の与えられたポリペプチドから誘導可能な機能的フラグメント。例えば、機能的フラグメントは、或る種の抗原及び／又はリガンドに対し結合する前記ポリペプチドの能力を維持するポリペプチド又はオリゴペプチドであり得る。同じことは、前記ポリペプチドに特徴的な特異的エフェクタ機能を媒介するフラグメントにもあてはまる。さらなる一例は、抗体、抗原レセプタ及び正規のレセプタ−リガンド系の特異的免疫原性及び／又は生理学的エフェクタ機能を活性化又は阻害することのできるフラグメントに関するものである。
【００３５】
遺伝要素：単独で又はいずれかの機能的又は非機能的組合せでの、プロモータ、エンハンサ、及びコーディング領域のような、遺伝子、遺伝子座又はそれらのフラグメント。
【００３６】
胚中心：抗原提示細胞と異なるリンパ球集団の間のコグネイト反応が起こり、その結果抗原反応性リンパ球の増殖性拡張ならびに抗原反応性Ｂリンパ球により産生された抗原のクラススイッチ組合せ及び親和力成熟がもたらされている、末梢リンパ器官（例えば、リンパ節又は脾臓）内の識別可能な組織学的構造。
【００３７】
生殖細胞系列立体配置：親から受継がれるとおりの及び生殖細胞系列を通してさらなる世代まで継代されるとおりの、遺伝子及び遺伝子座の未変性立体配置。例えばリンパ球内のＶ（Ｄ）Ｊ組合せのような体細胞内で発生するＤＮＡ組換え事象は、或る種の遺伝子座上の遺伝情報の再シャフリング又は喪失、ひいては生殖細胞系列立体配置からの遺伝子の変化を導く。
【００３８】
異種(heterologous)：内因性とは異なっていること。
【００３９】
ヒト化抗体：ヒト定常領域に対して非ヒト抗体の可変ドメインを融合することにより生成された人工抗体。
【００４０】
ハイブリドーマ：（抗体を分泌できない）不死の骨髄腫細胞系列及び（大量の抗体を分泌しうる）致死の形質細胞の融合によって生成されてきた不死の細胞系列。
【００４１】
イディオタイプ：抗原レセプタの結合特性（特異性）。
【００４２】
イソタイプ：その（エフェクタ）機能を決定する抗原レセプタの定常領域によって付与される構造的特徴。
【００４３】
免疫グロブリン（Ｉｇ）：抗体と同義語。
【００４４】
免疫グロブリンミニ遺伝子座：Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを受け、かくして制限された可変、コーディング領域のオリゴクローナルレパートリを生成する能力をもつわずかな（すなわち１ケタの）Ｖ、Ｄ及び／又はＪ遺伝子セグメントを含む人工遺伝構成体。
【００４５】
ライブラリ：異なる遺伝要素のコレクション。
【００４６】
モノクローナル抗体：抗体の可変抗原結合領域のユニークな構造により決定される１つの明確な特異性をもつ抗体。
【００４７】
骨髄腫細胞：内因性免疫グロブリンタンパク質を発現する能力の無い、形質細胞分化期にある細胞から誘導された不死の細胞。
【００４８】
ポリクローナル抗体：可変抗原結合領域の異なる構造、従って、最も確率の高い形で異なる結合特異性を有する、抗体混合物。
【００４９】
ＰｒｅＢリンパ球：前駆体Ｂリンパ球は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに関与するリンパ特異的因子（例えばＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２）の発現により特徴づけされ、通常は少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖対立遺伝子上でＶ（Ｄ）Ｊ組換えを開始しているものの、なお生殖細胞系列立体配置内に軽鎖遺伝子座を担持し、従って完全な抗体を発現しない。
【００５０】
一次リンパ器官：例えば骨髄、胸腺そして胎児期の間には肝臓といった、内部でマウス及びヒトの体内の造血基幹細胞からリンパ球が発生している器官。
【００５１】
レパートリ：異なる（結合）特異性のコレクション。
【００５２】
体細胞超変異：高い頻度で（１細胞分裂、一塩基対につき１０−４を上回る突然変異）ゲノムの特異的領域内へ点突然変異を導入する結果となる体細胞内のプロセス。
【００５３】
間質細胞：付加的なｐｒｅＢ細胞成長因子（単複）の存在下でｐｒｅＢ細胞の増殖を支援する能力をもつ骨髄から誘導された増殖性接着細胞。
【００５４】
トランス作用性：異なる染色体上にある遺伝要素及び遺伝子座に対する影響を有すること。
【００５５】
トランスフェクション：通常化学的及び物理的方法を使用することと結びつけられる、真核細胞内の核酸配列を導入するプロセス。
【００５６】
形質転換：連続的に増殖する細胞系列の樹立のために細胞を不死化するプロセス。
【００５７】
導入遺伝子：動物の生殖細胞系列内に導入された人工遺伝要素。従って導入遺伝子は、１世代から次世代へと受け継がれる。
【００５８】
形質導入：組換え型ウイルスの産生を介して哺乳動物細胞内にＤＮＡを送達するプロセス。このために、ウイルス粒子についての構造タンパク質を発現するパッケージング細胞系列が、ウイルス構造タンパク質内へのウイルスＤＮＡ構成体のパッケージングのため調節要素を含む組換え型ウイルスＤＮＡ構成体でトランスフェクトされる。これにより、組換え型ウイルスゲノム内にクローニングされた遺伝情報の導入を導く哺乳動物標的細胞の感染のために使用可能な組換え型ウイルスが産生される。
【００５９】
Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え：その間に多数のＶ（可変）、時としてＤ（多様性）及びＪ（接合）遺伝子セグメントのうちの１つが、抗原レセプタの可変ドメインのためのコーディング領域に組立てられる、ＤＮＡ組換えプロセス。
【００６０】
ベクター：異なる生体及び種の間で核酸要素を入替えるのに使用でき、さらにゲノム情報を伝播、増幅及び維持するためにさらに使用可能な人工的に生成された核酸構成体。
【００６１】
異種(xenogeneic)：異なる種から誘導されていること（heterologousと同義的に用いられることが多い）。
【００６２】
該明細書全体を通して引用された全ての参考文献は、本書に内含されるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
第１の態様に従うと、本発明は、任意の異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）の産生のために使用可能な脊椎動物リンパ球の生成方法において、
（ａ）少なくとも１つの異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）をコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を導入することによって、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階；及び
（ｂ）インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）を産生する能力をもつリンパ球を生成する段階、
を含んで成る方法を提供している。
【００６４】
上述の異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメントの大規模産生を達成するためには、問題のポリペプチドを産生する終末分化されたリンパ球が不死化されているか又は代替的には、異種抗原又は結合タンパク質についてコードする遺伝情報が単離されこれらの細胞から異なる発現系内へと移送され、ここでこの遺伝情報を維持、増幅しかつ／又はそれぞれの免疫グロブリン又は免疫グロブリン様タンパク質又はその機能的フラグメントの産生のために使用できることが好ましい。
【００６５】
前記リンパ球の不死化は、好ましくは、
（ａ）ハイブリッドーマ細胞を生成するために不死の骨髄腫細胞に分化したリンパ球を融合させること、
（ｂ）例えばアペルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）形質転換ウイルスにそれを感染させること、
（ｃ）例えば過剰発現の時点で、安定した形でトランスフェクトされた細胞の不死化を導くｖ−ａｂ１またはＳＶ４０大型Ｔ抗原といったような少なくとも１つの形質転換する癌遺伝子の発現を確保するベクター構成体でそれをトランスフェクトすること、
によって、達成でき、かくして、前記異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）を常時産生する能力をもつ脊椎動物リンパ球が生成さえることになる。
【００６６】
好ましい実施形態においては、脊椎動物前駆体リンパ球は、リンパＶ（Ｄ）Ｊ組換え機構の少なくとも１つの構成要素を発現することができ、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物に由来し、中でもマウスからのマウス前駆体（ｐｒｅ）Ｂリンパ球が好まれる。
【００６７】
ヒトから、進化的には最も原始的である軟骨魚類にまで至る全ての顎口脊椎動物種の中の一次前駆体Ｂリンパ球は、（マウスにおけるＢ２２０及びｃ−キットの組合せのような）特定の細胞表面マーカーセットの発現によって特徴づけされるだけでなく、そのためにＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２及びＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）といったようなＶ（Ｄ）Ｊ組換え機構のリンパ特異的成分の発現対象である抗体の可変ドメインをコードする遺伝子セグメントを組立てるそれらの潜在能力によっても特徴づけされる。鳥類といったような一部の種は、これらのリンパ球が生成される異なる一次リンパ器官（例えばファブリキウス嚢）を有するものの、そしてＶ（Ｄ）Ｊ組換えに加えて、その他の種は体細胞超変異（例えばヒツジ）又は遺伝子変換（例えばウサギ）といったような抗体多様化のための異なるメカニズムをも使用するという事実にも関わらず、全ての脊椎動物種からの前駆体Ｂリンパ球は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えを受ける能力をもち、ＶＤＪ再配置された免疫グロブリン遺伝子座から生成された抗体が発現され得るように、より成熟したＢ系統細胞へと分化する潜在能力を有している。従って、内因性抗体を発現することのできないかかる脊椎動物前駆体Ｂリンパ球が単離されるか又は生成された場合、及び異種免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部をコードする遺伝要素がこれらのリンパ球内に安定した形で導入された場合、それらは、異種抗体を産生する潜在能力を得ることになり、かくして本発明により包含される。
【００６８】
本発明に従った方法は、一次リンパ器官内に存在する脊椎動物前駆体Ｂ（ｐｒｅＢ）リンパ球を使用する。マウスの場合には、これらの細胞は、例えばマウスｐｒｅＢ細胞上のｃ−キット及び細胞表面マーカーＢ２２０に対して結合する適切に標識づけされた抗体を用いた予備的細胞選別によって胎児の肝臓又は成人の骨髄から単離することができ；代替的にはそれらは、骨髄由来の支持（間質）細胞及びインタロイキン−７及びインタロイキン−３といった成長因子の両方に対するそれらの強い増殖性応答に起因して、マウス胎児肝又は骨髄から選択的に外植させることもできる。
【００６９】
Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え機構のリンパ成分の発現、成熟リンパ球系統細胞まで分化する潜在能力及び抗原レセプタタンパク質の多様化についての遺伝的メカニズムに関して言うと、Ｔ系統リンパ球は、Ｂ系統リンパ球ときわめて類似している、従って、異種抗体又は結合タンパク質を産生する目的での前駆体Ｂリンパ球の遺伝的修飾について本書で記述している方法は、同様にして前駆体Ｂリンパ球にも適用可能であるということを理解すべきである。従って主としてマウスｐｒｅＢリンパ球系に関して記述されている本発明は、以上で記したとおりの全ての顎口脊椎動物からの全ての脊椎動物前駆体リンパ球に対しても適用可能である。本発明の原理を実施するためのその他のあらゆる前駆体リンパ球系の使用は、単に内因性抗体の発現を防止すると同時に異種抗体又は結合タンパク質をコードするこれらの細胞内へ異種遺伝要素を導入することの実現可能性によってのみ左右される、と理解すべきである。当業者ならばこれらの原理の広範な応用可能性を認識すると思われることから、本発明の基礎を成す一般的概念は、マウス前駆体Ｂ（ｐｒｅＢ）リンパ球の使用に関して主として記述される。
【００７０】
マウスにおいては、抗体分泌性形質細胞への造血基幹細胞の発達は高度に調節されたプロセスであり、インビボでは、免疫グロブリンレセプタ遺伝子座内の遺伝子セグメントの整然として再配置及び生産的に再配置されたＩｇ遺伝子座からの免疫グロブリンタンパク質の調節された発現によって左右される（図２）。通常、再配置は、まず最初にＩｇＨ鎖遺伝子座の両方の対立遺伝子上で起こり、ＤからＪＨの遺伝子セグメントが最初に再配置し、その後ＶＨからＤＪＨの遺伝子が再配置される（図２）。生産的ＶＨＤＪＨ再配置が１つの対立遺伝子上で起こった場合、μＨ鎖は、代理Ｌ鎖（ｐｒｅＢ細胞特異的遺伝子Ｘ５及びＶｐｒｅＢによりコードされる）と対合するｐｒｅＢ細胞レセプタとして細胞表面上で発現され得る（烏山ら,Adv.Immunol,63,1-41,1996）。ｐｒｅＢ細胞レセプタの発現は、通常まず最初にκＬ鎖対立遺伝子上で起こりその後λＬ鎖対立遺伝子上で起こる、ＶＬからＪＬへの再配置が開始される段階までのｐｒｅＢ細胞の分化を可能にする（メルチャーズ(Melchers)ら,Ann.Rev.Immunol.,12p,209-225,1994）。生産的ＩｇＬ鎖再配置が発生した場合、膜結合ＩｇＭ及び／又はＩｇＤ抗体がいわゆる未成熟Ｂ細胞により発現され得る。適切なシグナルでの末梢ＩｇＭ／ＩｇＤ陽性の成熟Ｂ細胞の刺激は、発現された抗体のイソタイプをＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥサブタイプ（マウスでは；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ヒトでは；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ）のいずれかへと変更するＩｇＨ鎖対立遺伝子上のクラススイッチ組換えを導くことができる（図１）。
【００７１】
すでに以上で概略的に説明したように、本発明を実施するために適したマウスｐｒｅＢ細胞は、Ｂ２２０及びｃ−キット表面マーカーの発現、リンパＶ（Ｄ）Ｊ組換え遺伝子、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２のうちの少なくとも１つの発現及び間質細胞及び／又はＩＬ７又はＩＬ３の応答性に関してより長い時限の間増殖する能力によって特徴づけされる（ローリンク他(Rolink)ら,EMBOJ.,10,p327-336,1991；ウィンクラー(Winkler)ら,Blood,85,p2045-2051,1995）。ｐｒｅＢ細胞系列及びクローンが野生型マウスから樹立される場合、これらは通常、両方のＩｇＨ鎖対立遺伝子上にＤＪＨ再配置を担持する（アルト(Alt)ら、EMBOJ.,3p,1209-1219,1984）か又は、一部のケースでは非生産的ＶＨＤＪＨ再配置を担持する（図２）。しかしながら、ｐｒｅＢ細胞表現型をもつマウスからのＩＬ７又はＩＬ３応答性細胞、間質細胞を樹立するためには、これらの細胞がＶ（Ｄ）Ｊ組換えが欠如した突然変異体マウス株からも同じく樹立され得ることを理由として、それらのＩｇＨ鎖対立遺伝子の再配置は必要とされない（グラワンダー(Grawunder)ら,International Immunology,7,p1915-25,1995）。あらゆる状況下において、Ｉｇ遺伝子再配置に対する潜在能力の如何に関わらず、ｐｒｅＢ細胞は、より成熟したＢ系統細胞へとインビトロで分化する、場合によってはイソタイプスイッチされた形質細胞へと分化する潜在能力を保持している（ローリンク(Rolink)ら,Immunity,5,p319-330,1996）。
【００７２】
胎児肝臓、胎児血液、胎児脾臓及び成体の骨髄を含むマウスのさまざまなリンパ器官のみならず、特に生後まもない（４週未満）間質細胞、ＩＬ７又はＩＬ３応答ｐｒｅＢ細胞を包含するその他の胎児又は成体の器官からも同様に、長期増殖性マウスｐｒｅＢ細胞系列及びクローンを樹立することができる（ローリンク(Rolink)ら,Blood,81,p2290-2300,1993）。
【００７３】
上述のｐｒｅＢ細胞の生成のために使用されるマウスは、野生型マウス、キメラマウス、移植されたマウス又は内因性マウスＩｇ遺伝子座の上のＶ（Ｄ）Ｊ組換えを妨げる突然変異を担持するマウス株でありうる。上述の突然変異は、ＩｇＨ多様性（Ｄ）遺伝子セグメント内又はその欠失を含むシス内、ＩｇＨＪ遺伝子セグメント内（チェン(Chen)ら,Int.Immunol.,5,p647-656,1993）内、μＨ膜内外アンカーのための２つのエキソンを含むμＨ鎖定常領域内（北村及びラジェブスキー(Kitamura and Rajewsky),Nature,356,p154-156,1992）、Ｉｇκ及びＩｇλ  Ｊ遺伝子セグメント，κＬ鎖定常領域（Ｃκ）（チェン(Chen)ら,EMBO J.,12,p821-830,1993）、λＬ鎖定常領域（Ｃλ１−４）及び重鎖イントロンエンハンサ（ＥμＨ）を含むさまざまなＩｇＨ及びＬ鎖エンハンサ、κイントロンエンハンサ（κｉＥ）、３’κエンハンサ（３’κＥ）及び２つのλエンハンサ（Ｅｘ２−４及びＥｘ３−１）内にあり得る。
【００７４】
本発明に従うと、上述のシス作用性突然変異のいずれかを担持するｐｒｅＢ細胞を、再配置されていない、すなわち生殖細胞系列立体配置にある異種で特にヒトの免疫グロブリン遺伝子座の一部又は全てを含む外因性遺伝要素の導入のために使用することができる。このような遺伝的に修飾されたｐｒｅＢ細胞は、新規の特異性が異種遺伝免疫グロブリン遺伝子座上のＶ（Ｄ）Ｊ組換えの時点でのみ生成されることから、抗体特異性の新規の産生のために使用することができる。
【００７５】
代替的には、例えば、リンパ特異的組換え活性化遺伝子ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２内（モンベート(Mombaerts)ら,Cell,68,p.869-877,1992；シンカイ(Shinnkai)ら,Cell,68,p.855-867,1992）又は非相同ＤＮＡ末端接合に関与しかつＶ（Ｄ）Ｊ組換えのためにも必要である、遍在的に発現されるＤＮＡ修復因子Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ、アルテミス又はＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の触媒サブユニット内といったように、トランス作用性突然変異に起因する内因性免疫グロブリン遺伝子座を再配置する能力をもたないマウスから、適切なｐｒｅＢ細胞を生成することもできる。このようなトランス作用性突然変異を担持するｐｒｅＢ細胞内の異種抗体及び結合タンパク質の産生のためには、Ｖ、（Ｄ）及びＪ遺伝子セグメントのＤＮＡ再配置を必要としない発現構成体を使用することになる（以下参照）。
【００７６】
マウス内のシス作用性突然変異の場合、これらには、好ましくは最低限、免疫グロブリン重及び免疫グロブリンκＬ鎖遺伝子座の中に単数又は複数の同型接合性突然変異が含まれている必要がある。トランス作用性突然変異の場合、一定の与えられたｐｒｅＢ細胞系列内の上述の同型接合性突然変異の１つで、本発明に従った方法の根本的必要条件である内因性免疫グロブリンの発現を排除するのに充分である。
【００７７】
内因性免疫グロブリンの発現と干渉するシス又はトランス作用性修飾を担持する前駆体Ｂリンパ球は、天然に（例えばｓｃｉｄマウス）又は人工的に生成されたＭｕＴを担持するマウスから単離することが可能である。代替的には、例えば両方の重鎖対立遺伝子上での末端枠外ＤＪＨ再配置といった内因性抗体の発現を排除するその免疫グロブリン対立遺伝子上の突然変異について、野生型マウス由来のｐｒｅＢリンパ球をスクリーニングすることができる。内因性マウス抗体の発現を除去する突然変異を、造血基幹細胞内又は早期始原細胞内に導入することができ、そこから、インビトロ又はインビボでの分化のいずれかの時点で、適切な長期増殖性ｐｒｅＢ細胞を生成することが可能である。
【００７８】
代替的には、以上で言及した遺伝的効果は、同様に、遺伝的修飾を受けるべき前駆体リンパ球の少なくとも１つの対立遺伝子内に直接導入することもできる。すでにその他の対立遺伝子上に或る種の突然変異（異型接合型突然変異）を担持する突然変異を受けたクローンを単離することができ、かくして本発明に従って使用されるべき前駆体リンパ球細胞内で異型接合型突然変異を受けた遺伝子座が樹立されることになるため、本発明を実施するには、１つの対立遺伝子の不活性化で充分であり得る。
【００７９】
本発明は野生型前駆体リンパ球を用いて実施できることを理解すべきであるものの、本発明に従った方法においては、前記脊椎動物前駆体リンパ球が、内因性抗体及び／又は抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）を発現する潜在能力を有しておらず、これは内因性免疫グロブリン又はそのフラグメントの発現が欠如している脊椎動物前駆体リンパ球を単離／選択すること及び／又は
（ａ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部分を含めた、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のコーディング領域、及びその膜貫通エキソンを伴う又は伴わないμ、δ、γ、ε及びα重鎖のための定常領域エキソン用のコーディング領域のうちのいずれか；
（ｂ）Ｖ及びＪ遺伝子セグメントコーディング領域のいずれかを含めた免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖遺伝子座のコーディング領域、ならびに定常領域エキソンのうちのいずれか；
（ｃ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部を含めたＴ細胞レセプタα、β、γ及びδ遺伝子座のコーディング領域、及びα、β、γ及びδ定常領域エキソンのためのコーディング領域のいずれか；
（ｄ）重鎖イントロンエンハンサ及び３’αエンハンサを含む、シス作用性免疫グロブリン重鎖遺伝子座エンサ要素；
（ｅ）κ重鎖イントロンエンハンサ（κｉＥ）、３’κエンハンサ及びλ２−４及びλ３−１エンハンサを含むシス作用性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座；
（ｆ）ＴＣＲα、β、γ及びδエンハンサを含めた、シス作用性Ｔ細胞レセプタ遺伝子座エンハンサ要素；
（ｇ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含むトランス作用性組換え活性化遺伝子、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２ならびにそのコーディング領域；及び
（ｈ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含む、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の触媒サブユニット、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４及びＡｒｔｅｍｉｓを含む、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに不可欠のトランス作用性ＤＮＡ修復遺伝子、なたびに該遺伝子のコーディング領域
から成るグループの中から選択されている少なくとも１つの遺伝要素の少なくとも１つの対立遺伝子を機能的に不活性化するように設計された少なくとも１つのベクター構成体を前記脊椎動物前駆体リンパ球内に導入することによって達成されるということが好ましい。
【００８０】
好ましくは、上述のベクター構成体は、好ましくは正のトランスフェクタントの選択を可能にする正の選択マーカーにフランキングする、前記少なくとも１つの遺伝要素に対するＤＮＡ配列相同性をもつ領域を含む遺伝子ターゲティングベクターを内含している。例えば、適切なターゲティングベクターは、好ましくは正の選択マーカー（例えば抗生物質耐性マーカー）をフランキングするターゲティングされた遺伝子座に対する配列同一性又は高い配列相同性（＞９９％）をもつ２つの領域を含み、かくして、各々の配列相同性領域内の２重交差事象が正の選択マーカーのターゲティングされた組込みひいては内因性遺伝子のターゲティングされた分断を結果としてもたらすことになる（図４ａ−ｃ）。これらのターゲティングベクター内で利用される正の選択マーカーには、ピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ヒスチジノール、マイコフェノール酸、ゼオシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する発現カセットが含まれる可能性がある。
【００８１】
前記遺伝子ターゲティングベクターが付加的に、正の選択マーカーをフランキングし、同族リコンビナーゼ酵素の少なくとも１つをコードする核酸配列のトランスフェクション及び過渡的発現の時点で前記正の選択マーカーの欠失を可能にする、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素のための一対のＤＮＡ認識配列を含んで成ることが好ましい。例えば、正の選択マーカーは、ｃｒｅ又はｆｌｐ−リコビナーゼ発現ベクターの過渡的トランスフェクションによる遺伝子ターゲティングされたｐｒｅＢ細胞のゲノムからの選択マーカー発現カセットの部位特異的除去を可能にする、それぞれｃｒｅリコンビナーゼ又はＦＬＰリコンビナーゼ酵素によって認識されるｌｏｘＰ又はＦＬＰ配列がフランキングされる可能性がある（クーン及びシュウェンク(Kuehn and Schwenk),Curr,Opin.Immunol.,9,p.183〜188,1997）（図６ａ、ｂ）。この手順は、同じ正の選択マーカーを使用したターゲティングベクターの反復的使用を可能にする。
【００８２】
前記遺伝子ターゲティングプラスミドベクターは、付加的に、内部で前記遺伝子ターゲティングベクターが非相同的組換えによりゲノム内に無作為に組込まれているトランスフェクタントに対する選択を可能にする負の選択マーカーを含んで成る。例えば、ターゲティング構成体の無作為の組込みに対し選択する適切な負の選択マーカーには、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、ジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ）（マクキャリック他(McCarrick)ら,Transgenic Res.,2,p183-190,1993）又はその減衰バージョンＤＴｔｏｘ１７６（マクスウェル(Maxwell)ら,Mol.Cell.Biol.,7,p1576〜1579,1987）のための発現カセットが含まれる可能性がある。これらの負の選択マーカーは、正／負のターゲティング構成体のターゲティングされた組換えの結果として負の選択マーカーが除去されることになるように、ターゲティング構成体の中に位置づけされている（図６ａ、ｂ）。かくして、相同組換えによるターゲティングベクターの組込みのみが細胞の存続ひいては相同組換えによる内因性遺伝子座の一部分のターゲティング及び分断のための選択を可能にすることになる。
【００８３】
内因性抗体及び／又は抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）を発現するその潜在能力をもたない脊椎動物前駆体リンパ球の使用が好ましいということを理解すべきである。しかしながら、抗体及び／又は抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）を発現する潜在能力をもつ脊椎動物前駆体リンパ球も同様に、本発明に従って使用可能である。前駆体リンパ球の実際の遺伝的背景の如何に関わらず、これらの細胞は、異種抗体又は結合タンパク質の産生を可能にするべく遺伝的修飾に付されなくてはならない。前記修飾は好ましくは適切な標的細胞又はクローンが上述のように選択及び／又は生成により同定された後に実施されることになるということを理解すべきである。しかしながら、内因性免疫グロブリン又はその一部分を発現する能力を無くする前に細胞を遺伝的に修飾することも同様に可能である。さらに、両方の段階を同時に実施することさえ適切であるように思われるかもしれない。
【００８４】
従って、さらなる実施形態においては、所望の遺伝的修飾をもたらすために使用される、異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）をコードする前記少なくとも１つの外因性遺伝要素が、
（ａ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を確保するべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスＤＮＡ構成体；
（ｂ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのＤＮＡ構成体；
（ｃ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、再配置されていないＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ−免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座；
（ｄ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｅ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントの（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように設計された修飾された配置内の少なくとも１つの異種免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｆ）一次アミノ酸配列（単複）に関して野生型である、少なくとも１つの異種抗体又はＴ細胞レセプタのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にする生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを包含する異種染色体のフラグメントである染色体導入要素、から成るグループの中から選択された遺伝子構成体上に担持されており、ここで、少なくとも１つの外因性遺伝要素が、最も好ましくは、未変性又は修飾済みヒト抗体、ヒト結合タンパク質、ヒト抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントをコードすることが好ましい。
【００８５】
さらに、少なくとも１つの外因性遺伝要素が結合領域の親和力成熟を受ける能力をもつ異種又は人工レセプタをコードすることが好ましい。
【００８６】
遺伝的修飾段階を実施するためには、以下で例示される複数の異なる手順を本発明に従って利用することができる。
【００８７】
第１のアプローチは、遺伝子導入マウスの状況において以前に達成されてきたものと類似の、再配置されていない生殖細胞系列立体配置内に異種抗原レセプタの一部分をコードする組換え型プラスミドＤＮＡ構成体を安定した形で導入することに基づいている。これらの異種抗原レセプタ遺伝子座は、免疫グロブリンＨ、κＬ及びλＬ鎖遺伝子座のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメント、ならびにＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）のα、β、γ又はδ遺伝子座のいずれかからの遺伝子セグメントを含む可能性がある。
【００８８】
第２のアプローチは、同じく遺伝子導入マウスの状況下で実施されてきた細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）又は脊椎動物人工染色体（ＶＡＣｓ）内へのクローニングを受けているか又は染色体導入フラグメントとして、再配置されていない生殖細胞系列立体配置内に免疫グロブリン及び／又はＴＣＲ遺伝子座の全て又は一部分を含むメガベースサイズの異種抗原レセプタ遺伝子座の安定した組込みに関する（グリーン(Green)ら,Nat.Genet.,7,p13-21,1994；トミズカ(Tomizuka)ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97p.722-727,2000）。
【００８９】
両方のアプローチの遺伝要素は、内因性Ｉｇ遺伝子座の再配置とのみ干渉するもののなお、再配置されていない及び／又は生殖細胞系列異種抗原レセプタ遺伝子座からのさまざまな抗体レパートリの生成を可能にする、その内因性マウスＩｇ遺伝子座内のシス作用性突然変異を担持するｐｒｅＢ細胞内に安定した形で組込まれなくてはならない。ヒトＩｇ遺伝子座をコードするＤＮＡ構成体の構築は、ヒトゲノムプロジェクトの結果として全てのヒトＩｇ遺伝子座の組織及びそれらのほぼ完全に公開されたＤＮＡ配列が分かっているか否かにかかっている。例えば、ヒトＩｇＨ鎖遺伝子座は、１．２５Ｍｂｐの広がりの中の染色体１４ｑ３２、３３上に位置設定される。これらには、定常領域遺伝子クラスタの上流側に、（対立遺伝子の変動に応じて）１２３〜１２９のＶＨ遺伝子セグメント（これらのうち４１〜４７が機能的）、２７Ｄ及び６ＪＨの遺伝子セグメントが含まれる。ヒトＩｇκＬ鎖遺伝子座は、染色体２ｐ１２上に位置設定され、１．８２Ｍｂｐを含み、（対立遺伝子に応じて）４０又は７６のＶκ遺伝子セグメント（そのうちそれぞれ３４又は６４が機能的）及び５Ｊκの遺伝子セグメントを単一のＣκ領域の上流側に含む。ヒトＩｇλＬ鎖遺伝子座は、染色体２２ｑ１１．２上に位置設定され、１．０５Ｍｂｐに跨り、７〜１１個の縦一列に反復されたＪλ−Ｃλ遺伝子セグメントの上流側に７０又は７１Ｖλ（３１又は３２が機能的）遺伝子セグメントを含有する。
【００９０】
染色体導入フラグメント上に存在するか又はＢＡＣ、ＹＡＣ又はＶＡＣベクター構成体内にクローニングされうる生殖細胞系列の異種免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部分（単複）又は全てを担持するＤＮＡ構成体は、電気穿孔、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リポソーム媒介移入、スフェロ又はプロトプラスト融合、弾道移入、マイクロインジェクション、又は特異的タンパク質−アダクツ形成又はそれらの組合せを含む標準的な遺伝子移入手順を用いて、長期増殖性標的ｐｒｅＢ細胞内に安定した形で移入することができる。例えばピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ヒスチジノール、マイコフェノール酸、ゼオシンなどといったものに対する耐性を付与する遺伝子を含む、ＹＡＣ、ＢＡＣ及びＶＡＣベクターバックボーンの中に含まれた適切な（薬物）選択マーカーによって選択可能である。
【００９１】
第３の概念的に異なるアプローチは、異種の、好ましくはヒトの抗体及び結合遺伝子をコードする異種遺伝要素を導入するために使用可能である。この代替的方法に従うと、異種遺伝要素は、レトロウイルス形質導入を用いて、マウスｐｒｅＢ細胞内に安定した形で移入される。レトロウイルス移入ベクターは、外来性ＤＮＡを７〜１０ｋｂしか収容できず、このため、異種の好ましくはヒトの抗体及び結合遺伝子のための発現ベクターのクローニングは著しく容易になる。従って、異種抗体及び結合遺伝子の全ての特性は、レトロウイルス移入ベクターを用いた標準的な分子生物学技術により容易かつ急速に修飾可能である。これとは対照的に、異種抗体発現のため遺伝子導入マウス系の状況下で修飾を導入することは、非常に冗長でかつ時間のかかるプロセスであり、従って実際上不可能である。導入遺伝子でコードされた異種抗体の機能を変更するために遺伝子導入マウスを使用するには、免疫不全遺伝子バックグラウンド上へのその繁殖を含め、複数の新規遺伝子導入マウスの生成が必要となる。
【００９２】
異種抗体又は結合タンパク質をコードする組換え型レトロウイルス移入ベクターは、モノクローナル結合特異性を発現するクローンとして産生するか又は、ポリクローナル結合特異性をコードするライブラリの形で生成することができる。レトロウイルスベクターは、生殖細胞系列抗原レセプタ遺伝子座の有意な領域を取込むのに充分大きくなることから、異種コーディング領域は、異種抗体及び結合タンパク質の定常領域についてのコーディング領域と組合せた形で可変ドメインをコードするすでにＶ（Ｄ）Ｊ再配置された遺伝子セグメントを含む必要がある。従って異種抗体又は結合タンパク質のためのレトロウイルス発現ベクターのライブラリ又はクローンの発現は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えのための機能的細胞機構を必要とせず、従って、以上ですでに概略的に説明されているように、内因性免疫グロブリン遺伝子発現を除去するシス及び／又はトランス作用性突然変異を担持するｐｒｅＢリンパ球との併用が可能である。
【００９３】
マウスｐｒｅＢ細胞に対して異種抗体又は結合タンパク質の発現を付与するためのレトロウイルス発現ベクターは、まず第１に、感染可能性の環境栄養性、両種性又は汎親和力スペクトルのいずれかをもつ組換え型レトロウイルスを産生する能力をもつ、大部分が市販されているレトロウイルスパッケージング細胞系列内に、トランスフェクトされる。かかるパッケージング細胞系列は、レトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子のための発現構成体を用いて安定した形でトランスフェクトされる。このとき、異種抗体又は結合タンパク質をコードする組換え型レトロウイルスプラスミドベクターでのレトロウイルスパッケージング細胞のトランスフェクションは、ｐｒｅＢ細胞を感染させ異種遺伝子情報をｐｒｅＢ細胞系列及びクローン内に安定した形で形質導入できる組換え型レトロウイルスの形成を結果としてもたらすことになる（図８）。これらの方法の中で用いられるレトロウイルス発現ベクターは、５’−ＬＴＲ  Ｐｓｉパッケージングシグナル及び３’−ＬＴＲを含む、最小限必要とされるレトロウイルス要素を含む市販の空のレトロウイルス移入ベクターから構築される（図１１ａ）。
【００９４】
異種抗体又は結合タンパク質発現のための最終的レトロウイルスベクターは、以下のものから選択されるＢ系統細胞内の異種抗体及び結合タンパク質の発現を確保するような要領で操作可能な形でリンクされた以下の遺伝要素のうちのいずれかを含有することができる；
（ａ）例えばＣＭＶ（サイトメガロウイルス）、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）、β−アクチン又はＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモータなどの構成性プロモータ、又は、例えばＣＤ１９プロモータ又はＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子プロモータといったようなＢ系統特異的プロモータを含めたプロモータ要素；
（ｂ）免疫グロブリン及びＴＣＲ遺伝子座を含む、任意の抗原レセプタからの可変（Ｖ）領域エキソン；
（ｃ）例えばＥμＨ又はκｉＥイントロンエンハンサ要素のような、異種抗体又は結合タンパク質の高レベル及びＢ系統特異的発現を可能にするエンハンサ要素；
（ｄ）抗体及び結合タンパク質の分泌された及び膜結合された形態をコードするエキソンを含む定常領域エキソン（図７ａ、ｂ）；及び
（ｃ）異種抗体又は結合タンパク質の可変領域コーディングエキソンの体細胞超変異のために必要とされる、重及び軽鎖遺伝子座の３’免疫グロブリン遺伝子エンハンサ（すなわち３’α、３’κ、又はλ３−１及びλ２−４エンハンサ）のいずれか（図７ａ、ｂ）。
【００９５】
さらに、例えばピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ヒスチジノール、マイコフェノール酸、ゼオシンといった適切な（薬物）選択マーカー用、又はＥＧＦＰ（増強緑色螢光タンパク質）及びその突然変異体ＹＦＰ（黄色螢光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン螢光タンパク質）及びＢＦＰ（青色螢光タンパク質）又はＲＦＰ（赤色螢光タンパク質）といった適切なリポータ遺伝子用の発現カセットは、それぞれに、安定した形で形質導入された細胞の選択又は単離を可能にするレトロウイルスベクターの一部分であり得る（図７ｂ）。これら全てのコーディング領域及び制御要素の配置及び存在は、異種Ｉｇ糖タンパク質の膜又は分泌形態の示差的発現ならびに、インビボでの胚中心内の異種抗体及び結合タンパク質の抗原駆動された親和力成熟を可能にするべく入念に設計される必要がある。望ましい場合、イソタイプの間で定常領域ドメインエキソンを交換すること又は、発現された異種抗体のエフェクタ機能に影響を及ぼす設計された突然変異を導入することが可能である（図７ａ、ｂ）。これらの非制限的な例は、この系がレトロウイルスによりコードされた異種抗体又は結合タンパク質のいずれかの領域だけの迅速な修飾を可能にすることを例示する目的で言及されている。
【００９６】
これらの組換え型レトロウイルスベクター内の可変ドメインをコードするエキソンは、例えば、マウス宿主内への安定した形で形質導入されたｐｒｅＢ細胞の移植及び後続する免疫化の後の親和力成熟による抗原結合特異性の修飾が意図されている既存の抗体の、１つの与えられた特異性の発現のためのモノクローナルであり得る（図９）。さらに、可変ドメインをコードするエキソンは、多様なＶ（Ｄ）Ｊ再配置のライブラリから誘導され得る。これらのＶ領域ライブラリは、多数の異なるＶＨ遺伝子系統群及びＪＨ遺伝子セグメントを増幅する縮重プライマ対を用いたＰＣＲにより異種の、好ましくはヒトＢリンパ球から単離され得る（図９）。免疫化された又はされていない個体から（初回免疫を受けたレパートリ対ナイーブなレパートリ）又は自己免疫疾患を患う患者から（自己免疫レパートリ）誘導され得る。さらには、Ｖ領域ドメインの完全に合成のライブラリは、相補性決定領域に対応する領域内で無作為なヌクレオチド配列を表示するＶドメイン特異的遺伝子フラグメントのインビトロアセンブリを用いて構築可能である（図９）。
【００９７】
レトロウイルス構成体の組合せは、インビトロ又はインビボでのｐｒｅＢ細胞の分化の時点で完全な異種免疫グロブリン及び２量体結合タンパク質の発現及び分泌を可能するｐｒｅＢ細胞へと同時に又は逐次的に形質導入されうる（図８）。
【００９８】
異種抗体又は結合タンパク質を発現する潜在能力を得ることになるように上述の方法のいずれかによって遺伝的に修飾された脊椎動物のｐｒｅＢ細胞は、異種抗体又は結合タンパク質を発現させ場合によって分泌させることができるように、成熟Ｂ系統細胞そして、場合によって形質細胞へと分化される必要がある。これは、インビトロでの組織培養内の分化によって、又はインビボでの適切な脊椎動物宿主内への遺伝的に修飾されたｐｒｅＢ細胞の移植時点で、達成可能である。
【００９９】
従って、脊椎動物前駆体Ｂリンパ球の分化をインビトロで、
（ａ）前記脊椎動物前駆体リンパ球の増殖を停止させ、あらゆる前駆体リンパ球成長因子の不在下で培養することによってその成熟リンパ球系統細胞への分化を誘発すること；及び
（ｂ）（ｉ）インタロイキン−２、インタロイキン−４、インタロイキン−５、インタロイキン−６、インタロイキン−１０、インタロイキン−１３、ＴＧＦ−β及びＩＦＮ−γを含む可溶性Ｔ細胞関連刺激因子；
（ｉｉ）ＣＤ４０、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、補体レセプタ１（ＣＤ３５）及び２（ＣＤ２１）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ｌｇα（ＣＤ７９α）、ｌｇβ（ＣＤ７９β）、ＴＡＰＡ−１（ＣＤ８１）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＴＮＦ−レセプタ１（ｐ５５、ＣＤ１２０ａ）、ＴＮＦ−レセプタ２（ｐ７５、ＣＤ１２０ｂ）、Ｏｘ−４０（ＣＤ１３４）、及びリンフォトキシン−βレセプタに特異的な活性組換え型リガンド又はアゴニスト抗体を含む、Ｂ細胞の副刺激レセプタを活性化する因子；及び
（ｉｉｉ）Ｂ細胞マイトジェン因子、１型のＴ細胞依存性抗原及び、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、グラム陰性菌からのリポタンパク質、ポリアニオン、ポリ−ｄｌｄＣ、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）及び抗免疫グロブリン試薬を含むその他のポリクローナル活性体、及びそれらの組合せの中から選択された成分のうちの少なくとも１つの存在下で前記細胞をさらに培養することによりリンパ球終末分化を誘発すること、
によりもたらすことが好ましい。
【０１００】
組織培養内のインビトロ分化は、（ａ）ｐｒｅＢ細胞の増殖を停止させると同時に成熟Ｂ細胞表現型の細胞内への分化を誘発することになる、組織培地からの例えばＩＬ７又はＩＬ３といったｐｒｅＢ細胞成長因子の除去、及び（ｂ）形質細胞終末分化が誘発されるような形で前記Ｔ細胞関連及び／又はマイトジェンＴ細胞独立型刺激、を含む２段階プロセスによって達成可能である。ＰｒｅＢ細胞成長因子を除去することによるＢ細胞表現型を伴う細胞内へのｐｒｅＢ細胞の初期分化には、アポプトーシスの誘導が付随している。かくして、例えばｂｃｌ−２又はｂｃｌ−ＸＬといったような抗アポプトーシス遺伝子を過剰発現するｐｒｅＢ細胞を使用することが好ましい実施形態である。これらの抗−アポプトーシス遺伝子は、ｂｃｌ−２又はｂｃｌ−ＸＬ遺伝子導入動物から単離されたｐｒｅＢ細胞を用いることによってか又は、抗アポプトーシス遺伝子のいずれかについて過剰発現ベクターでｐｒｅＢ細胞をトランスフェクション又は形質導入することによって、ｐｒｅＢ細胞内に導入することができる。
【０１０１】
遺伝的に修飾された前駆体リンパ球のインビトロ分化に対する１つの代替案として、これらの細胞は、同様に適切な脊椎動物宿主内への移植の時点でインビボで分化され得、その結果、これらの細胞は二次リンパ器官へと移動し、より成熟したリンパ球系統細胞へと分化する。好ましくは、前記リンパ球は、ナイーブな又は抗原初回免疫を受けたＴヘルパーリンパ球と共に前記宿主内に同時移植され、ここで「同時移植される」という語は、正確に同じ時点での同時移植に制限されないものとして理解すべきである。もう１つの好ましい実施形態に従うと、インビボでの分化の後には、少なくとも１つの所望の免疫原性化合物又は組成物での前記宿主の免疫化が続く。
【０１０２】
さらに、前記脊椎動物宿主は、内因性Ｂ細胞、Ｔ細胞及び／又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞又はその組合せの生成に関して欠損している適合性のある宿主である。
【０１０３】
脊椎動物前駆体リンパ球のための適切な供給源の選択に関して以上ですでに記した通り、脊椎動物宿主が、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物の中から選択されることが好ましくク、マウスが好ましい宿主種である。
【０１０４】
遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球の移植のためのレシピエントとして役立つ適切な宿主は、リンパ球の発達に関し野生型であってもよいし、或いは又、好ましくは、さまざまなシス作用性突然変異阻害性内因性マウスＩｇ遺伝子再配置のいずれかを包含していてもよい。これらは、上述のＥμＨ及びκｉＥエンハンサ要素のようなＩｇ遺伝子座のエンハンサ要素内の突然変異、ＤＨ、ＪＨ又はＪＬ遺伝子セグメントといったようなＩｇ遺伝子コーディング領域及びそれらの膜貫通エキソンを含むＩｇＣ領域内の欠失、を内含し得る。さらに、例えばＶ（Ｄ）Ｊ組換えの開始のために必要とされるＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２遺伝子又は系統又はリンパ球特異的転写因子内の突然変異といったＢ（及びＴ）リンパ球の発達を選択的に妨げるトランス作用性突然変異を担持する適当な宿主を使用することができる（モンベーツ(Mombaerts)ら,s.a；シンカイ(Shinkai)ら,s.a.）。
【０１０５】
さらに、免疫不全宿主を導くトランス作用性突然変異には、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の触媒サブユニット、ＸＲＣＣ４、ＤＮＡリガーゼＩＶ及びアルテミスといったような、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えのためにも必要とされる遍在的に発現されたＤＮＡ修復遺伝子内の突然変異が含まれる。Ｂリンパ球集合単独か又はＢ及びＴの両リンパ球のいずれかが欠如している前述の突然変異のいずれかを伴う脊椎動物宿主が次に、遺伝的に修飾されたｐｒｅＢ細胞の移植を受けることができ、Ｂ及びＴ細胞が欠損したマウスの場合には、組織適合性Ｔヘルパー細胞集合での同時移植を受けることができる。Ｔヘルパー細胞集団は好ましくはナイーブＴヘルパー細胞、抗体で初回免疫されたエフェクタＴ細胞集団又はメモリーＴ細胞又はそれらのあらゆる組合せを含む。Ｔヘルパー細胞集団の同時移植は、遺伝的に修飾されたｐｒｅＢ細胞の移植の実際の時点と同時に、その前に又はその後に起こり得る。
【０１０６】
修飾されたｐｒｅＢ細胞の移植及びＴヘルパー細胞集団の任意の同時移植によってその末梢リンパ球集団が部分的又は完全に再構成されたマウス又は脊椎動物の宿主は、次に、その抗原に対する免疫応答を開始し、適切な異種レセプタ特異性を発現するこのようなリンパ球を刺激し、これにより、Ｂ細胞クローンの増殖性拡張、コードされた異種抗体又は結合タンパク質の結合ドメインの親和力成熟及び異種抗体又は結合タンパク質を分泌する形質細胞内への終末分化を導くように、あらゆる所望の抗原での免疫化のために使用され得る。
【０１０７】
以上のことから明らかであるように、本発明のさらなる好ましい実施形態は、それ自体既知の要領でいずれかの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）を産生することを目的とした、上述の方法により得ることのできる、遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球の使用に関する。この状況下で、遺伝的に修飾され、分化された脊椎動物リンパ球の生成のための上述の方法のいずれかの後には、
（ａ）少なくとも１つの外因性遺伝要素を前記分化されたリンパ球から単離する段階、及び
（ｂ）前記少なくとも１つの異種抗体、抗原レセプタ、人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）の産生を可能にする状況下に前記遺伝要素（単複）を置く段階、
が続くことが好ましい。
【０１０８】
所望の免疫グロブリン又は免疫グロブリン様タンパク質又はその機能的フラグメントの大規模産生を達成するために、問題のポリペプチドについてコードする遺伝情報をこれらの細胞から単離し、異なる発現系内に移入することができ、ここで該遺伝情報を維持、増幅しかつ／又は所望のタンパク質又はその一部分の産生のために使用することができる。
【０１０９】
より詳細に言うと、異種抗体又は結合タンパク質のためのコーディング領域を表わす開いた読取り枠は、特異的プライマ対でのＰＣＲ増幅を含む標準的分子生物学方法により単離され、異種抗体又は結合タンパク質の連続的産生を可能にする異なる発現系の状況へと移入され得る。これらの発現系には、インビトロ転写／翻訳系、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核発現系又は、酵母細胞内、バキュロウイルス感染を用いた昆虫細胞内、又は哺乳動物細胞内での発現のような真核発現系が含まれる。
【０１１０】
上述の異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）は、１つのユニークな特異性を示し従ってモノクローナルであることもでき、又は複数のユニークな特異性によってコードされ従ってポリクローナルであることもできる。
【０１１１】
好ましい１実施形態に従うと、前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）は、ヒトの遺伝的レパートリ又はその一部分に基づいて組立てることができるようなヒト抗体、抗原レセプタ又は結合タンパク質に完全に又は部分的に類似している。
【０１１２】
さらに、産生させるべき異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、
（ａ）膜結合又は分泌され、天然の抗体の中に見られる化学量論的組成物内の非相同重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方から成り、かつ既知の重（μ、δ、γ、ε）及び／又は軽（κ及びλ）鎖イソタイプのいずれかから成る抗体；
（ｂ）一次アミノ酸配列に関して完全にヒトである重鎖及び軽鎖ポリペプチドの組合せを伴う抗体；
（ｃ）異なる脊椎動物種からの異種重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含有するハイブリッド抗体；
（ｄ）完全に又は部分的に異種である、分泌されたＦａｂ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ’）２抗体フラグメント、
（ｅ）二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを結果としてもたらす、リンカーペプチドを介して共有結合でカップリングされた抗体のフラグメント、
（ｆ）免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質と構造的類似性をもつ、α、β、γ及びδイソタイプ、抗原レセプタ及びその他の結合タンパク質のＴ細胞レセプタ、
及びそれらの機能的フラグメントから成るグループの中から選択されることが好ましい。
【０１１３】
もう１つの態様に従うと、本発明は、遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球及びそれから誘導されたより成熟したリンパ球系統細胞、ならびに内部で前記細胞を以上で記述された方法のいずれかにより得ることのできる又はすでに得られている、異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントを産生する不死化された細胞を提供する。
【０１１４】
さらに、ここでは、脊椎動物前駆体リンパ球を少なくとも部分的に不活性化して内因性免疫グロブリン又はその一部分を発現させるのに適したベクター構成体、及び以上で定義されているような異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）をコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を担持する遺伝的構成体も提供されている。
【０１１５】
さらなる１態様に従うと、本発明は、野生型免疫エフェクタ機能、又は生殖細胞系列でコード化された異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾済み又は人工エフェクタ機能を示す、上述の方法のいずれかにより得られた、少なくとも１つの抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントを含む、薬学又は診断用調製物を提供している。
【０１１６】
以下でわかるように、完全にヒトの又はヒト化された抗体又はその機能的フラグメント（単複）は、特異的抗原に対するそれらの可変領域ドメインで結合するその能力によって、又さらにはその定常領域ドメインを介して免疫エフェクタ機能を媒介するその能力によって、ヒトの疾病の診断、予防及び治療において使用することができる。ヒトの疾病の診断、予防及び治療のための本発明に従って産生できるヒトモノクローナル抗体の考えられるいくつかの用途が、以下で詳述される。診断目的では、特定の疾病に関連する抗原構造（例えば或る種の病的細胞上で発現されたもの）を検出できる個体の血管系内への標識づけされた抗体の導入により或る種の病的条件を同定し視覚化するために、ヒトモノクローナル抗体を使用することができる。ヒトの疾病の予防における応用には、病的条件下で或る種の細胞表面レセプタ−リガンド系の相互作用を遮断する（アンタゴニスト抗体）か又はリガンドの病的欠如の場合に細胞表面レセプタに結合するリガンドの効果を模倣する（アゴニスト抗体）能力をもつ抗体が含まれる。さらに、例えば中毒、炎症及び感染の間に、毒性物質又は病原体の機能を遮断するために、ヒトモノクローナル抗体を使用することができる。この状況下で、ヒト抗体は生来の免疫系の特殊化された細胞による除去のためのこれらの物質及び抗原のタグ付けを媒介することから、特に有用である。ヒトモノクローナル抗体は同様に、悪性細胞の表面上で発現された改変済みの自己構造に特異的に結合することによって癌細胞に免疫機能をターゲティングするためにも使用可能である。自己免疫条件の場合、ヒトモノクローナル抗体はさらに、自己免疫因子（自己抗体、アレルギー抗体）の病的効果を中和する又は無効にするためにさらに有用であり得る。ヒトモノクローナル抗体は、抗体が人間の血漿及び流体成分（例えば粘液、唾液、リンパ液など）の正規の構成要素であることから不利な効果を全くひき起こすことなく個体の血管系内に導入され得ることから、ヒトの疾病の診断、予防及び治療にとってきわめて有用である。
【０１１７】
生体物質の寄託
本発明に従って使用される遺伝要素を担持するプラスミドが、プタペスト条約に基づき、以下の受入れ番号で２００１年１２月１７日付けでドイツのブラウンシュバイクにあるＳａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）に寄託された。
プラスミド                    受入れ番号
ｐＢＳ−ＤＴ４                ＤＳＭ１４７０３
ｐＰＧＫ−ｈｙｇｒｏ          ＤＳＭ１４７０４
ｐＧＬ２ｎｅｏ（ｍ）＋        ＤＳＭ１４７０５
ｐＢＳ−ＤＴ４−ｔｏｘ１７６  ＤＳＭ１４７０６
【０１１８】
以下の実験手順は、ヒト抗体産生のための潜在能力を付与するべく遺伝的に修飾されているマウスｐｒｅＢ細胞を用いてヒトモノクローナル抗体を生成するための詳細な方法を記述している。内因性抗体がもはや発現され得ず、安定した形で送達された異種レトロウイルス発現構成体からヒト抗体を産生することができるようにマウスｐｒｅＢ細胞の遺伝子修飾を可能にする選択された方法例が、以下で記述されている。さらに、適切なマウス宿主内へのこれらの遺伝的に修飾されたマウスｐｒｅＢ細胞の移植に関する実験の詳細、ならびにこれらの移植を受けたマウスの免疫化、抗体分泌細胞の単離及びハイブリドーマ細胞系列を分泌する不死のモノクローナルヒト抗体としてのその樹立に関する方法が提示されている。提供されている方法は、遺伝的に修飾されたマウスｐｒｅＢ細胞を用いた異種の、特にヒトのモノクローナル抗体の産生にとって完全かつ充分なものであるが、これらの方法は制限的なものとしてではなく例示としてみなすべきである。
【実施例】
【０１１９】
実施例１；成熟Ｂ系統細胞へと分化する潜在能力をもつ長期増殖性マウス前駆体Ｂ細胞の確立。
間質細胞及びＩＬ７応答性マウス前駆体Ｂ細胞が、交尾後１５〜１８日目のマウスの胚の胎児肝臓の中、成体マウスの骨髄内ならびに新生動物（生後３週間未満）の脾臓内に見い出される（ローリンク(Rolink)ら,s.a.）。これらのｐｒｅＢ細胞を単離するため、マウスをＣＯ２窒息により殺処分し、それぞれの器官を滅菌条件下でとり出す。大腿部及び頸骨をとり出し、滅菌したハサミで骨の両端を開き、５ｍｌの使い捨て注射器及び２５又は２６ゲージの針を用いて２〜５ｍｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で骨髄を洗い流すことによって、完全骨髄細胞が得られた。同様に滅菌条件下で調製した単離済みの脾臓又は胎児肝臓を、５〜１０ｍｌのＰＢＳの入ったペトリ皿内の滅菌２００メッシュの鋼製格子上に置く。器官を細片にカットし、５ｍｌ入りのプラスチック製注射器のプランジャを備えた金属格子を通して穏やかに押しつぶす。遠心分離によりひとたび細胞懸濁液を洗浄し（２００ｇ、１０分、４℃）、１０〜２０ｍｌ入りのＰＢＳ内に再懸濁させる。全ての細胞調製は、氷冷溶液で実施され、組織培養内に移送するまで細胞懸濁液を氷上に保つ。
【０１２０】
個々のｐｒｅＢ細胞クローンの確立は、特殊な間質細胞培地（以下参照）の中で成長させられた半コンフルーエントの３０００ラドでγ照射を受けたＳＴ−２（オガワ(Ogawa)ら,EMBOJ.,7,p1337〜1343,1988）又はＰＡ−６（コダマ(Kodamaら,J.Cell,Physiol.,118,p233-240,1984）マウス間質細胞でコーディングされた９６ウェル平板の中での限界希釈法により実施される。限界希釈法平板固定のためには、全器官細胞集団を使用するか又は、代替的には、そのマーカーに特異的な市販の抗体を用いた螢光又は磁気ビート活性化細胞選別（ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳ）によって富化されたＢ２２０＋又はＣＤ１９＋表面マーカー陽性Ｂ系統細胞を用いることができる。
【０１２１】
マウスｐｒｅＢ細胞の長期培養は、組換え型インタロイキン−７（ＩＬ−７）を１００単位含有する特殊な無血清培地内で実施される（以下参照）。個々のｐｒｅＢ細胞コロニーは、１０％ＣＯ２雰囲気下で加湿されたインキュベータ内で３７℃で６〜７日の培養のうちに、限界希釈条件下の間質細胞フィーダ上で発達する。単一のｐｒｅＢコロニーは当初２４ウェルの平板内に移され、その後、２５ｃｍ２そして場合によっては７５ｃｍ２の組織培養フラスコ内へと逐次的に拡張させられる。初期拡張の後、ｐｒｅＢ細胞密度は、組織培地１ｍｌにつき１×１０５〜２×１０６個のｐｒｅＢ細胞に保たれる必要があり、これは２〜３日毎の細胞の二次培養を必要とする。
【０１２２】
長期増殖間質細胞、ＩＬ−７依存型マウスｐｒｅＢ細胞の確立に必要とされる特殊な無血清組織培地（アイスコーヴ及びメルチャーズ(Iscove and Melchers),J.Exp.Med.,147,p923-933,1978）
（１リットルの培地のための処方）：
【０１２３】
【表１】
2005525800.tif 000003
【０１２４】
全ての成分を、最終体積１０００ｍｌの３重精製された超純粋Ｈ２Ｏ中に溶解させ、滅菌状態にろ過し、使用するまで４℃に保つ。
【０１２５】
ＳＴ−２又はＰＡ−６の間質細胞フィーダの細胞は、以下のような特殊な低血清含有培地の中で成長させる必要がある（１リットルについての処方）；
【０１２６】
【表２】
2005525800.tif 000004
【０１２７】
全ての成分を、最終体積１０００ｍｌの３重精製された超純粋Ｈ２Ｏ中に溶解させ、滅菌状態でろ過し、使用するまで４℃に保つ。
【０１２８】
実施例２：インビトロでの抗体分泌形質細胞へのマウス前駆体Ｂ細胞の段階的分化、
長期増殖性間質細胞及びＩＬ７依存性マウスｐｒｅＢ細胞は、インビトロで達成可能な、より成熟したＢ系統細胞へと分化するその潜在能力を保持する。この分化は、成熟Ｂ細胞表現型をもつ細胞への分化をまず誘発し、第２に抗体分泌性形質細胞の表現型をもつ細胞への分化を誘発することによって、２段階で実施され得る。
【０１２９】
第１の分化段階は、間質細胞が連続的に存在している中でｐｒｅＢ細胞からＩＬ７を除去することによって達成される。このために、ｐｒｅＢ細胞を増殖性培養から収獲し、ＩＬ７が欠如した無血清ｐｒｅＢ細胞培地で３回洗浄し、ＩＬ７の不在下で新鮮な３０００ラドでγ−照射された間質細胞上に１ｍｌあたり１−２×１０６個の細胞の割合で平板固定する。３日の期間内で、ｐｒｅＢ細胞は増殖をやめ、未成熟細胞の表現型をもつ細胞へと分化する。表現型の変化には、ｃ−キット、λ５及びＶｐｒｅＢ発現の喪失及びＣＤ２５及びＣＤ４０の発現の増加が含まれる。野生型マウスからのｐｒｅＢ細胞内では、この分化にはさらにＩｇＨ鎖遺伝子座上での連続的ＶＨ〜ＤＪＨ再配置とそれに続くＩｇＬ鎖遺伝子座上のＶＬ〜ＪＬの再配置が伴い、その結果、分化したＢ系統細胞上での表面結合ＩｇＭ抗体の発現がもたらされる可能性がある（ローリンク(Rolink)ら,s.a.）。しかしながら、ＩｇＨ及びＬ遺伝子セグメントの秩序ある間質細胞がインビトロでのこれらのｐｒｅＢ細胞の表現型分化にとって前提条件でない、ということを指摘しておくべきである（グラワンダ(Grawunder)ら,1995,s.a.）。
【０１３０】
第２の分化段階は、例えばＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、又はＴＧＦ−βといったサイトカインと組合せた形でアゴニスト抗ＣＤ４０抗体又はＬＰＳのいずれかでＩＬ７をもたない細胞を刺激することによって達成できる。この処理は、増殖、（利用されるサイトカイン組合せに応じて）さまざまなＩｇ遺伝子イソタイプへのクラススイッチ組換え、及び場合によっては抗体分泌性形質細胞への分化を誘発することになる。例えば抗ＣＤ４０／ＩＬ４刺激の場合、細胞は、ｐｒｅＢ細胞培地中で３回洗浄され、４〜６日間１００Ｕ／ｍｌのＩＬ４及び５μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４０ＭＡＧの存在下において新鮮でサブコンフルーエントな３０００ラドでγ照射された間質細胞上に平板固定される。大きい増殖性の形質細胞段階の細胞を、際立って増大した正方向散乱値を結果としてもたらすそれらの大きなサイズに基づいて、螢光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により同定し分離することができる。
【０１３１】
野生型ｐｒｅＢ細胞のインビトロ分化には、通常、成長因子の撤去により誘発されたアポトーシスに起因する実質的な量の細胞の喪失が伴っている。この問題は、これらの細胞におけるｂｃｌ−２又はｂｃｌ−ｘＬといったような抗アポプトーシス遺伝子の過剰発現により回避できる（ローリンク（Ｒｏｌｉｎｋ）ら，１９９３，ｓ．ａ．）。これは、Ｂ系統特異的に発現されたｂｃｌ−２導入遺伝子を含むマウスからのｐｒｅＢ細胞を単離すること（ストラッサー(Strasser)ら,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,166,p175-181,1990）又は長期増殖性間質細胞及びＩＬ７依存性マウスｐｒｅＢ細胞内に、ｂｃｌ−２コーディング組換え型レトロウイルスベクターを形質導入することによって達成可能である（以下参照）。
【０１３２】
実施例３：マウスＢｃｌ２過剰発現のためのレトロウイルス発現構成体のクローニング長期増殖性間質細胞及びＩＬ７依存性マウスｐｒｅＢ細胞内への遺伝子の安定した形質導入のための前提条件は、問題の遺伝子のための発現カセットを含む組換え型レトロウイルス移入ベクターの構築にある。レトロウイルス移入ベクターは、レトロウイルスパッケージングシグナル、Ｐｓｉ（ｔ）をフランキングする長さ５’及び３’のレトロウイルス末端反復（ＬＴＲ）配列、異種配列を中に挿入できる多重クローニング部位（ＭＣＳ）及びＥ．ｃｏｌｉ内のベクターの複製及び維持に必要とされる細菌プラスミド制御要素で構成されている。空のレトロウイルス移入ベクターのための一例は、市販のプラスミドｐＬＩＢ（クロンテック(Clontech)）である（図１１ａ）。
【０１３３】
抗アポプト−シス遺伝子ｂｃｌ−２を含むレトロウイルス発現ベクターを構築するためには、単一のプロモータからの２つの遺伝子の同時発現を可能にする、内在リボソーム挿入配列（ＩＲＥＳ）を用いてｂｃｌ−２及びハイグロマイシンＢの発現をリンクすることによって、マウスｂｃｌ−２ｃＤＮＡ及びハイグロマイシンＢ薬物選択マーカーの同時発現のための戦略が適用される。この戦略によると、抗生物質ハイグロマイシンＢで選択可能であるベクター構成体の安定した組込みが同時に、抗アポスト−シス遺伝子座ｂｃｌ−２の発現のための細胞を選択することになる、ｂｃｌ−２及びハイグロマイシンＢｃＤＮＡのカップリングされた発現のためのレトロウイルスベクターの生成は、第１にプロモータ−ｂｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ハイグロマイシンＢ発現カセットの組立てそして第２にレトロウイルス移入ベクターｐＬＩＢのＭＣＳ内へのこのカセットのクローニングという２段階で進行する（図１１ａ＋ｂ）。
【０１３４】
（ａ）  プロモータ−ｂｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ハイグロマイシンＢ発現カセットの構築
ハイグロマイシンＢ薬物耐性マーカーのための開いた読取り枠（ＯＲＦ）及びマウスｂｃｌ−２ｃＤＮＡの両方が、市販のＣＭＶ−プロモータ／ＩＲＥＳベクター−ｐＩＲＥＳ（クロンテック(Clontech)）内にクローニングされる。このために、制限エンドヌクレアーセ−Ｘｂａｌ及びＮｏｔｌのための（大文字で示された）付加的な制限酵素認識部位を含む、
【数１】
2005525800.tif 000005
といったプライマ対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりプラスミドｐＰＧＫ−ハイグロ（配列１）からハイグロマイシンＢＯＲＦを増幅させる（認識配列がＰＣＲで増幅されたＤＮＡフラグメントの端部で直接位置づけされている場合、大部分の制限酵素がＤＮＡを効率よく消化しないことから、制限酵素認識配列の２〜４個のランダムヌクレオチド５’も同様に添加される）。これらのフランキングヌクレオチドは、制限酵素認識部位を強調するため小文字で示されている。強調された制限部位の下流側又はそこから３’のところの配列は、増幅されるべきフラグメントのＤＮＡ配列に対応している。このプライマ配列提示方法は、実験例の記述全体を通して維持される。プライマＰ００１及びＰ００２でのＰＣＲは、フラグメントの末端における制限エンドヌクレアーゼＸｂａｌ及びＮｏｔＩのためのユニークな認識部位を含む１０１７塩基対（ｂｐ）のＤＮＡフラグメントを増幅することになる。このときＰＣＲフラグメントはＸｂａｌ及びＮｏｔＩ制限酵素で２重消化され、その後、Ｘｂａｌ／ＮｏｔＩで２重消化され、その後Ｘｂａｌ／ＮｏｔＩで２重消化されたｐＩＲＥＳプラスミド内に一方向クローニングされて、プラスミド構成体ｐＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢを生成する（図１１ａ）。マウスｂｃｌ−２αｃＤＮＡのＯＲＦは、Ｎｈｅｌ及びＭｌｕｌのための制限酵素認識部位（大文字）を含む：
【数２】
2005525800.tif 000006
という、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列Ｍ１６５０６及びＬ３１５３２に基づいて設計されたプライマ（Ｍ１６５０６の位置１８２１−５３に結合するプライマＰ００３及びＬ３１５３２の位置５０６−５３５に結合するプライマＰ００４）を用いて逆転写酵素でカップリングされたポリメラーゼによりマウスの脾臓ｍＲＮＡから単離され増幅される。６９９ｂｐサイズのＮｈｅｌ／Ｎｏｔｌ２重消化ＰＣＲ産物はこのとき、ｐＢｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢを生成するべくＮｈｅｌ／ＭｌｕＩで２重消化されたベクターｐＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢ内に一方向クローニングされる。
【０１３５】
（ｂ）レトロウイルスＢｃｌ−２発現移入ベクターの構築
空のレトロウイルス移入ベクターｐＬＩＢ及びデュアルｂｃｌ−２／ハイグロマイシンＢ発現ベクターｐＢｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢの多重クローニング部位の中には適合性のある制限酵素部位が欠如していることに起因して、構成性ＣＭＶプロモータ及びポリアデニル化部位を含むＢｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ハイグロマイシンＢのための全発現カセットは、充当された制限酵素認識部位でのＰＣＲを用いてｐＬＩＢ内にクローニングされる。このために、ＣＭＶ−ｂｃｌ２−ＩＲＥＳ−ハイグロマイシンＢ発現カセットは、ＳａＩＩ及びＣｌａＩのための制限酵素認識部位を含む
【数３】
2005525800.tif 000007
というプライマを用いてＰＣＲ鋳型としてｐＢｃＩ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢでＰＣＲ増幅される。次に、Ｓａｌ／Ｃｌａｌ２重消化されたｐＬＩＢベクター内に３７１４ｂｐのＳａＩＩ／ＣａＩ２重消化されたＰＣＲ産物が一方向クローニングされ、かくして、カップリングされたｂｃｌ−２及びハイグロマイシンＢの発現を可能にするレトロウイルス移入ベクターｐＬＩＢ−ｂｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢを生成する。
【０１３６】
実施例４：長期増殖、間質細胞及びＩＬ７依存性マウスｐｒｅＢ細胞のレトロウイルス形質導入
マウスｐｒｅＢ細胞内に遺伝要素を安定した形で移入する１つの方法は、レトロウイルス形質導入を使用することである（図８）。この手順のためには、レトロウイルスゲノムのパッケージングに必要なレトロウイルス配列を含む組換え型ＤＮＡ構成体（５’ＬＴＲ、パッケージングシグナルＰｓｉ（＋）、３’ＬＴＲ）ならびに問題の異種配列又は遺伝子が、レトロウイルス粒子の産生のために必要とされる遺伝子を構成的に発現するパッケージング細胞系列内に過渡的に又は安定した形でトランスフェクトされる。
【０１３７】
間質細胞及びＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞の形質導入のためには、エコトロピックレトロウイルスパッケージ細胞系列ＧＰＥ（マルコビッツ(Markowitz)ら,J.Virol.,62,p1120-1124,1988）を使用でき、これは日常的に、５０〜８０％の効率でｐｒｅＢ細胞の安定した形質導入を結果としてもたらす。このエコトロピックパッケージ細胞系列は（組換え型）レトロウイルス移入ベクターと合わさって、マウス細胞を形質導入することのできる複製欠損（組換え型）レトロウイルスを産生するにすぎない。エコトロピックＧＰＥパッケージ細胞系列の過渡的なトランスフェクションのためには、以下で詳述されるように、標準的リン酸カルシウムトランスフェクションが使用される。
【０１３８】
（ａ）エコトロピックレトロウイルスパッケージ細胞系列ＧＰＥの過渡的トランスフェクション：
ＧＰＥ細胞を、ＳＴ−２及びＰＡ−６間質細胞のためにも使用され例１で記述したＩＭＤＭベースの低血清培地の中で成長させる。トランスフェクションの前日に、トリプシン処理により接着ＧＰＥパッケージ細胞を収獲し５０％のコンフルーエントで新鮮なＩＭＤＭ−ベースの低血清培地内に播種し、１０％のＣＯ２中３７℃で培養させる。翌日、標準的なリン酸カルシウム沈殿を用いてＴ７５（７５ｃｍ２入り）組織培養フラスコのＧＰＥ細胞につき２０μｇのレトロウイルスＤＮＡをトランスフェクトする。トランスフェクションから２４時間後に、トランスフェクトされたＧＰＥ細胞を、ｐｒｅＢ細胞内への組換え型レトロウイルスの形質導入のために使用することができる。
【０１３９】
（ｂ）トランスフェクトされたＧＰＥ細胞培養上清又はトランスフェクトされたＧＰＥ細胞との同時培養を用いたｐｒｅＢ細胞のレトロウイルス形質導入
トランスフェクトされたＧＰＥ細胞によって産生された組換え型レトロウイルスの形質導入のために、２つの方法を互換的に使用することができる：  第１の方法は、調整細胞培養上清でのｐｒｅＢ細胞の感染に依存している。このために、トランスフェクトされたＧＰＥ細胞からの細胞培地をトランスフェクションから２４時間後に交換し、さらにもう２４時間の細胞培養後に収穫する。次に細胞培養上清を含有する組換え型レトロウイルスを１：８（体積）〜１：１（体積）の比で８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で増殖性ｐｒｅＢ細胞の培養に対して添加し、インキュベーションを３７℃で３〜６時間続行する。その後、細胞を収獲し、ポリブレン／レトロウイルス含有培地を除去し、１００ＵのｒＩＬ７を含むｐｒｅＢ細胞培地内の新鮮な３０００ラドでγ照射された間質細胞上に１−２×１０５の密度で細胞を平板固定する。レトロウイルス形質導入されたｐｒｅＢ細胞を次に２４時間後に収獲する。
【０１４０】
第２の方法は、トランスフェクトされた組換え型レトロウイルス産生ＧＰＥ細胞とｐｒｅＢ細胞の同時培養に依存している。このために、対数期のｐｒｅＢ細胞を収獲し、２〜４×１０５個の細胞密度で１００ｕのｒＩＬ７及び８μｇ／ｍｌのポリブレンを含有する新鮮なｐｒｅＢ細胞培地内で再懸濁させ、レトロウイルス構成体でのトランスフェクションから２４時間後に、トランスフェクトされたＧＰＥ細胞上に平板固定する。ＰｒｅＢ細胞を３７℃で６時間同時培養し、次にこれらを収獲し、回収のため１００ＵのｒＩＬ７を含むｐｒｅＢ細胞培地内で新鮮な３０００ラドでのγ−照射を受けた間質細胞上に平板固定する。レトロウイルス形質導入を受けたｐｒｅＢ細胞を次に収獲し、２４時間後にこれを利用することができる。
【０１４１】
実施例５：長期増殖性マウス前駆体Ｂ細胞内の内因性免疫グロブリン重及び軽鎖遺伝子座の不活性化。
マウス前駆体Ｂ細胞からの異種の、好ましくはヒトの抗体の生成のための第１の段階は、その他の方法の中でも例えばｐｒｅＢ細胞内の免疫グロブリン遺伝子座内での遺伝子ターゲティングにより達成可能である、内因性マウスＩｇＨ及びＩｇＬの不活性化である。理論的には、３つのマウス免疫グロブリン遺伝子座すなわちＩｇＨ、ＩｇκＬ及びＩｇλＬ鎖遺伝子座の全てを不活性化することが必要となる。しかしながら、マウスλＬ鎖遺伝子座は、各々１つずつ遺伝子セグメントを伴う３つの機能的Ｖ−Ｊ−Ｃクラスタしか含んでいない。その上、マウスＢ細胞の５％未満しか、λＬ鎖遺伝子座を発現しない。従って実際的には、異種ＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖遺伝子又は遺伝子座の移入時点でｐｒｅＢ細胞から産生された大部分のＢ細胞（＞９５％）が異種抗体を確実に発現することになるように、内因性マウスＩｇＨ及びκＬ鎖遺伝子座を不活性化するだけで充分である。
【０１４２】
（ａ）天然に発生する不可逆的に非機能的なＩｇＨ対立遺伝子でのｐｒｅＢ細胞の単離
一般的には、内因性ＩｇＨ及びκＬ鎖遺伝子座の不活性化のための最も制御された方法は、遺伝子ターゲティングを使用することである（以下参照）。しかしながら、ＩｇＨ鎖遺伝子座の場合、もう１つの方法を応用することができる。
【０１４３】
長期増殖性間質細胞ＩＬ７依存性マウスｐｒｅＢ細胞は、その重鎖対立遺伝子の両方の上にＤＪＨ再配置を担持している。ＤからＪＨへの接合プロセスにおける精度の欠如に起因して、これらのＤＪＨ再配置は、ＪＨ  遺伝子セグメントの固定された読取り枠との関係において考えられる３つの読取り枠全ての中で、Ｄ遺伝子セグメントを読取ることができるような形で、起こり得る。これらの読取り枠は、恣意的に読取り枠Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩと呼称されてきた（カーティネン及びマケラ(Kaartinen and Makela),Immunol.Today,6,p324〜330,1985）。ＤＪＨ接合が読取り枠ＩＩＩ（カーティネン及びマケラ(Kaartinen and Makela)内で発生する場合、大部分のＤ遺伝子セグメントは停止コドンを含み、そのため、機能的Ｈ鎖をかかる重鎖対立遺伝子から発現することは決してできない。
【０１４４】
従って、統計学的には、全ての間質細胞ＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞のほぼ１／９（１１.１％）が、そのＩｇＨ鎖対立遺伝子の両方の上に停止コーディングを伴う読取り枠ＩＩＩ内にＤＪＨ再配置を担持している。限界希釈条件下でサブクローニングし所望の非機能的再配置についてスクリーニングすることにより、これらのｐｒｅＢ細胞を単離することができる。安定したクローンの単離を確保するためには、最後のＪＨ遺伝子セグメントが使い果たされたために二次的再配置により復帰され得ない２つの非機能的ＤＪＨ４遺伝子再配置について再配置をスクリーニングする必要がある。
【０１４５】
（ｂ）マウスＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖遺伝子座のためのターゲティング構成体の生成
内因性のＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖遺伝子座の両方の遺伝子ターゲティングされた不活性化を結果としてもたらす方法についての２つの例が、内因性ＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖タンパク質を発現する潜在能力のないｐｒｅＢ細胞を類似の要領で導くことになる数多くのシス作用性突然変異についての一例として提示されている（図５ａ、ｂ）。両方のターゲティング戦略について、まず最初に、標的遺伝子座に相同なＤＮＡ配列の挿入を可能にするユニークなクローニング部位、ｌｏｘＰ部位によりフランキングされているネオマイシン又はピューロマイシンといったような正の薬物選択マーカー、及び細胞のゲノム内への遺伝子ターゲティングベクターの無作為組込みに対して選択することになる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）を含む空の正−負の遺伝子ターゲティングベクターを構築することが必要である。ｌｏｘＰでフランキングされた（ｆｌｏｘされた）正の選択マーカーの存在は、第１の対立遺伝子のターゲティングに成功した後同系のｌｏｘＰ認識部位の間にある任意のヌクレオチド配列を欠失させるｃｒｅリコンビナーゼの過渡的発現の時点で細胞から抗生物質耐性マーカーを欠失させることができるため、同じ抗生物質を用いた同じ細胞クローン内で両方の対立遺伝子の逐次的遺伝子ターゲティングを可能にすることになる。空の正−負のターゲティングベクターは以下のように構築される（図６ａ、ｂ）：
【０１４６】
ステップ１：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）の多重クローニング部位の拡張
【数４】
2005525800.tif 000008
という２つの相補的合成ＤＮＡオリゴマを、５０μｌの５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０の中で各オリゴマ１００ｐｍｏｌを混合させることによってアニールする。次にこの混合物を２分間９５℃で変性させ、２０分以内で６５℃から室温までゆっくりと冷却する。こうして、ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩ適合性オーバーハング（大文字で示されている）を伴う以下の２本鎖ＤＮＡリンカーが生成されることになる：
【数５】
2005525800.tif 000009
【０１４７】
次に、アニールされたＤＮＡリンカーがＸｈｏＩ−ＫｐｎＩで線状化された市販のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン(Stratagene)）内に連結させ、結果として、以下のクローニング段階で必要とされる拡張された多重クローニング部位（ＭＣＳ＋、図６ａ参照）を含むプラスミドｐＢＳＬを得る。
【０１４８】
ステップ２：ターゲティング構成体の無作為組込みに対する負の選択マーカーとしての野生型又は減衰ジフテリア毒素αのための発現カセット挿入
遺伝子ターゲティング構成体の無作為染色体組込みに対する選択を可能にする負の選択マーカーとして、構成性β−アクチンプロモータの制御下でのジフテリア毒素α（マクキャリック(McCarrick)ら,s.a）又はその減衰バージョンであるジフテリア毒素α（ＤＴ−α  ｔｏｘ（７６）（マクスウェル(Maxell)ら,s.a.）についての発現カセットを使用することができる。マウス胚基幹細胞での遺伝子ターゲティング実験では単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ）のようなその他の負の選択マーカーが一般に使用されるものの、ジフテリア毒素α及びその減衰型突然変異体ｔｏｘ１７６は、体細胞内での遺伝子ターゲティングのために有効であることが実証されている（グラワンダ(Grawunder)ら,Mol.Cell,2,p477-484,1998）。ジフテリア毒素発現カセットは、プラスミドｐＢＳ−ＤＴ４（配列番号２）又はｐＢＳ−ＤＴ４ｔｏｘ１７６（配列番号３；図６ａ参照）から２．１ｋｂのＢｇＩＩＩ−Ｘｂａｌフラグメントとして単離され、ＢｇＩＩＩ−ＮｈｅＩで線状化されたｐＢＳＬ内に連結されて、結果としてｐＢＳＬ−ＤＴ４及びｐＢＳＬＤＴ４ｔｏｘ１７６をそれぞれもたらす（図６ａ参照）。
【０１４９】
ステップ３：空の遺伝子ターゲティングベクターの生成のためのｐＢＳＬ−ＤＴ４及びｐＢＳＬＤＴ４ｔｏｘ１７６内へのｌｏｘＰでフランキングされた正の薬物選択マーカーの挿入
正／負の遺伝子ターゲティングベクターの生成のための次の段階は、ジフテリア発現カセットの上流側でのｐＢＳＬ−ＤＴ４又はｐＢＳＬ−ＤＴ４−ｔｏｘ１７６内への正の薬物選択マーカーの挿入である。代表的な例として、ｐＢＳＬ−ＤＴ４内のジフテリア毒素α発現カセットの上流側でのＩｏｘＰ部位でフランキングされたネオマイシン、ピューロマイシン及びハイグロマイシンＢ発現カセットの挿入が提示されている。しかしながら、ジフテリア毒素αの減衰バージョンを含有するｐＢＳＬＤＴ４ｔｏｘ１７６ベクターに対して同一のクローニング戦略を適用することができるということも指摘しておくべきである。さらに、例えばヒスチジノール、マイコフェノール酸、ブレオマイシン又はゼオシンに対する耐性を付与するその他の正の薬物選択マーカーを使用することが可能である。
【０１５０】
各ケースで、正の抗生物質選択マーカーカセットは、ｌｏｘＰ部位でフランキングされることになり、これは、ｃｒｅリコンビナーゼ酵素により認識可能でかつ同じ選択マーカーの逐次的使用のためｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターの過渡的トランスフェクションの時点でｌｏｘＰ部位の間にある薬物選択マーカーを欠失させるために使用できる。
【０１５１】
ｉ）ｆｌｏｘされたネオマイシン耐性カセットの挿入；
ｌｏｘＰ部位でフランキングされたネオマイシン耐性カセットを、１４９７ｂｐのＢｓｐ１２０１−Ｘｂａｌで消化されたＤＮＡフラグメントとしてプラスミドｐＧＬ２ｎｅｏ（ｍ）＋（配列番号４）から単離でき、Ｎｏｔｌ−Ｘｂａｌで線状化されたｐＢＳＬ−ＤＴ４内に連結させて空のターゲティングベクター、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４生成することができる。
【０１５２】
ii）ｆｌｏｘされたピューロマイシン及びハイグロマイシンＢカセットのクローニング（図６ｂ）；
ネオマイシン以外のｆｌｏｘされた抗生物質選択マーカーはほとんど見当らないことから、ｐＢＳＬ−ＤＴ４内へのｌｏｘＰでフランキングされたピューロマイシン又はハイグロマイシンＢマーカーの挿入のための１つの基本的な段階は、２つのｌｏｘＰ部位を挿入する予備的段階である。これは、ｐＢＳＬ−ＤＴ４でアニールされた合成ＤＮＡオリゴマの中に挿入することによって達成できる。合成ｌｏｘＰ部位は、以下の２つの相補的ＤＮＡオリゴの中に含まれている；
【数６】
2005525800.tif 000010
【０１５３】
これら２つのＤＮＡオリゴマは、例５（ｂ）のステップ１に記述されている通りにアニールされ、結果として、ユニークなＭｌｕｌ制限部位により分離された２つのＩｏｘＰ部位を含む２本鎖ＤＮＡフラグメントをもたらす。さらに、アニールされた合成ＤＮＡオリゴマは、２つの５’−ＣＴＡＧ１本鎖オーバーハングを含み、これは適合性のある制限部位オーバーハング（例えばＳｐｅＩ、Ｎｈｅｌ、又はＡｒｒＩＩ制限酵素によって生成される）の中に直接連結され得る。
【０１５４】
ＤＮＡフラグメントを含むアニールされた２重ｌｏｘＰ部位は、このとき、ＳｐｅＩで線状化されたｐＢＳＬ−ＤＴ４内に連結され、結果としてベクターｐＢＳＬ−ＤＴ４−２ｌｏｘＰをもたらす（図６ｂ）。
【０１５５】
ピューロマイシン又はハイグロマイシンＢ耐性についての発現カセットは、それぞれＰＣＲ鋳型としてプラスミドｐＰｕｒ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））又はｐＰＧＫ−ｈｙｇｒｏ（配列番号１）を用いてＰＣＲ増幅され得る。（シミアンウイルス４０早期プロモータの制御下でピューロマイシンＯＲＦを含む）ｐＰｕｒからの１３６６ｂｐのピューロマイシン発現カセットのＰＣＲ増幅のために使用さえるプライマは次の通りである：
【数７】
2005525800.tif 000011
【０１５６】
両方のプライマ共、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩ（大文字で示されている）のための認識部位を含み、かくして結果としてのＰＣＲ産物はこの制限酵素を用いてクローニングされ得るようになっている。
【０１５７】
単離されたＰＣＲ産物のＭｌｕＩ消化の後、ピューロマイシンマーカーフラグメントをＭｌｕＩで線状化されたｐＢＳＬ−ＤＴ４−２ｌｏｘＰ内に連結させ、空のターゲティングベクター、ｐＢＳＬ−ｆｌｐｕｒ−ＤＴ４を生成する（図６ｂ）。
【０１５８】
ρＰＧＫ−ｈｙｇｒｏ（配列番号１：ホスホグリセレートキナーゼプロモータの制御下でハイグロマイシンＢを含む）からの２００７ｂｐのハイグロマイシンＢ発現カセットのＰＣＲ増幅のために使用されるプライマは、次のとおりである：
【数８】
2005525800.tif 000012
【０１５９】
両方のプライマ共、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩ（大文字で示されている）のための認識部位を含み、かくして結果としてのＰＣＲ産物はこの制限酵素を用いて消化され連結され得るようになっている。
【０１６０】
単離されたＰＣＲ産物のＭｌｕＩ消化の後、ハイグロマイシンＢマーカーフラグメントをＭｌｕＩで線状化されたｐＢＳＬ−ＤＴ４−２ｌｏｘＰ内に連結させ、空のターゲティングベクター、ｐＢＳＬ−ｆｌｈｙｇ−ＤＴ４を生成する（図６ｂ）。
【０１６１】
ステップ４：マウスＩｇＨ及びκＬ鎖遺伝子座ならびにＲＡＧ１遺伝子のための最終ターゲティングベクターのクローニング
内因性遺伝子座のためのターゲティングベクターのクローニングの代表例として、内因性ＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖遺伝子座のシス作用性のターゲティングされた突然変異及びマウスｐｒｅＢ細胞内のＲＡＧ遺伝子のトランス作用性突然変異にとって有用なＧＴＶについてのクローニング戦略が記述される。
【０１６２】
ｉ）  ＩｇＨ鎖ターゲティングベクターの構築（図５ａ）
両方のＩｇＨ鎖対立遺伝子上で数多くの異なるシス作用性のターゲティングされた欠失を生成することにより、ｐｒｅＢ細胞内の内因性マウスＩｇＨ鎖遺伝子座の不活性化を達成することができる。ＩｇＨ不活性化欠失の１つは、例えば、ここで内因性ＩｇＨ対立遺伝子を内因性免疫グロブリン産生能力の無いものにする可能性の１つとして記述されている全てのＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントの欠失である。ターゲティングベクターの構成は、ここで１例として「ｆｌｏｘされた」ネオマイシンターゲティング構成体を用いて紹介されている（図５ａ参照）。例えばピューロマイシン又はハイグロマイシンＢといったようなその他の正の抗生物質選択マーカーを含む遺伝子ターゲティングベクターのクローニングのためには、類似の戦略を適用することができる。
【０１６３】
間質細胞ＩＬ７依存性マウスｐｒｅＢ細胞は通常、両方の対立遺伝子上にＤＪＨ再配置を担持している（以上参照）。この事実はターゲティングベクターの設計の際に考慮される必要がある。ＤＪＨ再配置のタイプの如何に関わらず、可変遺伝子セグメント及びＤ遺伝子セグメントクラスタに介在するＤＮＡ配列ならびにＪＨ遺伝子クラスタとＣμコーディング領域間の介在配列は、全てのｐｒｅＢ細胞内の両方のＩｇＨ対立遺伝子上になおも存在している。従って、ＤＪＨ再配置対立遺伝子のためのターゲティングベクターは、最も５’にあるＤ要素（ＤＦＬ１６．１）の上流側及び最も３’にあるＪＨ遺伝子セグメント（ＪＨ４）の下流側に相同性領域を含んでいなければならない。
【０１６４】
とり囲まれたゲノミックＤＮＡ配列を伴う１つの考えられるＤＦＬ１６．１からＪＨ４の再配置された対立遺伝子のゲノム組織が図５ａに描かれている。遺伝子ターゲティングのための一般的戦略として、欠失すべき領域又は遺伝子の上流側にあるＤＮＡ配列相同性（１−１．５ｋｂ）の短かい領域が、「ｆｌｏｘされた」正の選択マーカー（ここではＮｏｔＩ）の上流側でユニークな制限酵素認識部位内にクローニングされ、欠失すべき領域又は遺伝子の下流側にあるＤＮＡ配列相同性のより長い領域（＞２．５ｋｂ）が「ｆｌｏｘされた」正の選択マーカーとジフテリア毒素α発現カセット（図５ａ）の間のユニークな制限酵素認識部位（ここではＡｓｃＩ）内にクローニングされる。従って、ターゲティングベクターと内因性遺伝子座のＤＮＡ配列相同性の長い領域内で相同組換えが起こる場合に負の選択マーカー（ジフテリア毒素α）の発現が唯一防止され、かくして染色体ＤＮＡ内へのターゲティングベクターのターゲティングされた組込みの時点でＤＴ−α発現カセットは失なわれることになる。相同組換えが短かい相同性アーム内でさらに発生する場合、２重交叉の間にある領域は、正の薬物選択マーカーにより置換されることになる。かくしてターゲティング構成体でのトランスフェクトされたｐｒｅＢ細胞上で抗生物質選択を用いた結果として、内因性遺伝子座の欠失を結果としてもたらす相同組換えによるターゲティングベクターのターゲティングされた組込みに対する強い選択がもたらされる。
【０１６５】
最も５’にあるＤ要素（ＤＦＬ１６．１）の上流側の短かい相同性領域を、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列ＡＦ０１８１４６に基づいて設計された以下のプライマを用いてマウスゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅することが可能である。
【数９】
2005525800.tif 000013
【０１６６】
クローニングを目的として導入された補足されたＮｏｔＩ制限酵素認識部位のヌクレオチドが大文字で示されている。プライマは、ＮｏｔＩ制限酵素で消化されＮｏｔＩで線状化されたｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内に連結されてｐＢＳＬ−５’ＪＨ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４を生成しうる１４６５ｂｐのゲノミックＰＣＲフラグメントＲを増幅することになる（図５ａ）。同じくＥμＨ重鎖イントロンエンハンサを含んでいるＪＨ遺伝子セグメントクラスタの下流側にある長い配列相同性領域は、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列ファイルＪ００４４０に基づいて設計された以下のプライマを用いてマウスゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅され得る（補足されたＡｓｃＩ制限酵素認識部位のヌクレオチドは大文字で示されている）：
【数１０】
2005525800.tif 000014
【０１６７】
プライマは、マウスゲノミックＤＮＡからの３２１５ｂｐのゲノミックＰＣＲフラグメントをＰＣＲ増幅することになり、このフラグメントは、ＡｓｃＩ制限酵素で消化されＡｓｃＩで線状化されたｐＢＳＬ−５’ＪＨ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内に連結されて、ＤＪＨ再配置されたｐｒｅＢ細胞内の全ての残留するＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントを欠失させるのに使用できる最終的なＪＨターゲティングベクターｐＢＳＬ−５’ＪＨ−ｆｌｎｅｏ−３’ＪＨ−ＤＴ４を生成することができる（図５ａ）。
【０１６８】
ii）κＬ鎖ターゲティングベクターの構築（図５ｂ）
ＩｇＨ鎖遺伝子座の場合と同様、κＬ鎖遺伝子座は、Ｊκ遺伝子セグメント、κＬ鎖イントロンエンハンサ（κｉＥ）、定常κＬ鎖領域（Ｃκ）又は３’κエンハンサ（３’κＥ）の全ての欠失を含めた、複数のシス作用性突然変異によって不活性化され得る。一例として、Ｊκ遺伝子セグメントの全てのターゲティングされた欠失のために使用できるターゲティング構成体及び方法が記述されている。さらに、本書で記述されているターゲティング構成体の構築は本書では、「ｆｌｏｘされた」ネオマイシン耐性マーカーを含む構成体をターゲティングする目的でのみ紹介されている。「ｆｌｏｘされた」ピューロマイシン又はハイグロマイシンＢ発現カセットを含有するターゲティング構成体のクローニングは、類似の要領で実施される。Ｊκ遺伝子セグメントクラスタの上流側の短かい相同性領域は、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)エントリＶ００７７７に従って、設計された以下のプライマを用いてマウスゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅され得る（補足されたＮｏｔＩ制限酵素認識部位のヌクレオチドは大文字で印刷されている）：
【数１１】
2005525800.tif 000015
【０１６９】
プライマＰ０１９は、位置１−３０に結合し、プライマＰ０２０はＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)エントリＶ００７７７の位置７１１−７３８に結合する。結果として得られた７３８ｂｐのＰＣＲフラグメントは、ＮｏｔＩ制限酵素で消化され、ＮｏｔＩで線状化された空のターゲティングベクターｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内に連結されてｐＢＳＬ−５’Ｊκ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４を生成する（図５ｂ）。
κｉＥ及び定常κＬ鎖領域（Ｃκ）を含んでいるＪκ遺伝子セグメントクラスタの下流側にある長いＤＮＡ配列相同性領域は、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＶ００７７７に基づいて設計された以下のプライマを用いてマウスゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅され得る（補足されたＡｓｃＩ制限酵素認識部位のヌクレオチドは大文字で印刷されている）：
【数１２】
2005525800.tif 000016
【０１７０】
プライマＰ０２１は、位置２１２９−２１５８に結合し、プライマＰ０２２はＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列Ｖ００７７７の位置５４５６−５４８３に結合する。結果として得られた３３７９ｂｐのＰＣＲフラグメントは、ＡｓｃＩ制限酵素で消化され、ＡｓｃＩで線状化されたベクターｐＢＳＬ５´Ｊκ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内に連結されてｐＢＳＬ−３’Ｊκ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４を生成する（図５ｂ）。
【０１７１】
iii）  ＲＡＧ遺伝子座ターゲティングベクターの生成（図５ｃ）：
ＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖遺伝子座内にシス作用性突然変異を導入することにより内因性免疫グロブリンを発現するｐｒｅＢ細胞の潜在能力を不活性化することに対する代替案として、トランス作用性突然変異を導入することによってその内因性Ｉｇ遺伝子の再配置についてｐｒｅＢ細胞を不能にすることもできる。これは例えば、Ｉｇ遺伝子再配置にとって不可欠である２つの組換え活性化（ＲＡＧ）遺伝子のうちの１つをターゲティングすることによって達成できる。ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２遺伝子のいずれかの中に欠失をもつマウスｐｒｅＢ細胞は、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配置できなくなり、従って内因性免疫グロブリンを発現することができない。
【０１７２】
一例として、ＲＡＧ−１遺伝子のＯＲＦの完全な欠失を可能にするターゲティングベクターの構築について記述する。ＲＡＧ−１コーディング領域の上流側にある約１ｋｂのゲノミック配列のＤＮＡ配列相同性の短アームが、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列ＡＣ０８４７５３に基づいて設計された以下のプライマ対によって増幅される。
【数１３】
2005525800.tif 000017
【０１７３】
各プライマの５’末端に補足されたＮｏｔＩクローニング部位が大文字で強調されており、これは、ＲＡＧ−１に開いた読取り枠の上流側にゲノミック領域を含有する１０９５ｂｐのＰＣＲフラグメントのクローニングのために使用される（図５ｃ）。ＰＣＲ産物は、ＮｏｔＩで消化され、例えばｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４といった正−負ターゲティングベクターのユニークなＮｏｔＩ部位内に連結される。正しい配向でＲＡＧ−１コーディング領域の上流側に短かい相同性アームを含有するプラスミドクローンが単離され、ｐＢＳＬ−５’Ｒ１−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４と呼称される。
【０１７４】
ＲＡＧ−１遺伝子についてのターゲティング構成体の長アームのクローニングのため、ＲＡＧ−１コーディング領域のすぐ下流側の約３ｋｂのゲノミック領域が、ジェンバンク(Genbank)配列ＡＣ０８４７５３に基づいて設計された以下のプライマ対によって増幅される。
【数１４】
2005525800.tif 000018
【０１７５】
ＡｓｃＩ制限酵素のための認識配列が各プライマの５’末端に補足され、ＲＡＧ−１の開いた読取り枠の下流側にＤＮＡ配列相同性長アームを含有する２９５４ｂｐの長さのＰＣＲフラグメントのクローニングのために用いられる。ＡｓｃＩ消化の後、このＰＣＲ産物は、ベクターｐＢＳＬ−５’Ｒ１−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４のユニークなＡｓｃＩ制限部位内にクローニングされる。正しい配向でＲＡＧ−１コーディング領域の下流側に長い相同性アームを含有するプラスミドクローンが単離され、ｐＢＳＬ−５’Ｒ１−ｆｌｎｅｏ−３’Ｒ１−ＤＴ４と呼称され（図５ｃ）、これは、ｐｒｅＢ細胞内の内因性ＲＡＧ−１遺伝子のターゲティングされた欠失のために直接使用可能である。
【０１７６】
ステップ５：長期増殖性間質細胞ＩＬ依存性マウスｐｒｅＢ細胞内の内因性遺伝子座のターゲティング
内因性遺伝子座の両方の対立遺伝子の逐次的なターゲティングされた欠失のためには、２つの異なる戦略を応用することができる。１つの戦略は、２つの異なる対立遺伝子のターゲティングのために２つの異なる正の選択マーカーを伴うターゲティングベクターを利用することである。代替的に、もう１つの戦略は、両方の内因性対立遺伝子の逐次的ターゲティングのため同じターゲティング構成体を２回使用することにある。しかしながら、後者の戦略の場合、第１の対立遺伝子のターゲティングの後に、ｐｒｅＢ細胞内へのｃｒｅ−リコンビナーゼのための発現ベクターの過渡的発現が続いていなくてはならず、これは、もう一方の対立遺伝子の第２のターゲティングのために同じ抗生物質選択を使用できるような形で、ｌｏｘＰ部位がフランキングされた薬物選択マーカーの永久的欠失を導くことになる。
【０１７７】
一例として、第１の戦略に従った、すなわち２つの異なる抗生物質耐性マーカー（ピューロマイシン及びハイグロマイシンＢ）を伴うターゲティングベクターを用いた）内因性遺伝子の両方の対立遺伝子の逐次的ターゲティングのための実験手順について記述する。
【０１７８】
第１の対立遺伝子上の遺伝子座のターゲティングのためには、Ｂｉｏ  Ｒａｄ電気穿孔機及び０.４ｃｍの電気穿孔機槽を用いて９６０μＦのキャパシタンスで３５０Ｖでの電気穿孔により、ＰＢＳ中に再懸濁された１０７個のｐｒｅＢ細胞の中に、ピューロマイシン耐性マーカーを伴う２０μｇの線状化されたターゲティングベクターをトランスフェクションさせる。その後、３０００ラドで照射されたピューロマイシン及びハイグロマイシンＢ２重耐性ＳＴ−２間質細胞のサブコンフルーエント層でコーティングされた９６ウェルの平板培養内に５×１０４細胞／ウェルの密度で、ＩＬ７成長培地内で細胞を平板固定する。トランスフェクションから３０時間後に、ピューロマイシンを２μｇ／ｍｌという最終濃度で添加する。ピューロマイシン耐性コロニーをトランスフェクションから７〜１０日後に単離し、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンでの連続的な選択の下で、新鮮な照射済みのピューロマイシン耐性ＳＴ−２間質細胞上で拡張させる。標準的なＰＣＲ及びゲノミックサザンブロットハイブリダイゼーション分析により、１つの対立遺伝子内へのターゲティングベクターのターゲティングされた組込みについて、個々のピューロマイシン耐性ｐｒｅＢ細胞クローンを分析する。１つの対立遺伝子上のターゲティングベクターのターゲティングされた組込みを伴うｐｒｅＢ細胞クローンを、今度は、上述のものと同じ条件下でハイグロマイシンＢ耐性マーカーを含有する２０μｇの線状化されたターゲティングベクターを用いて、再びトランスフェクトする。トランスフェクトされたｐｒｅＢ細胞を次に、３０００ラドで照射されたピューロマイシン及びハイグロマイシンＢ２重耐性ＳＴ−２間質細胞のサブコンフルーエント層でコーティングされた９６ウェルの平板培養内に５×１０４細胞／ウェルの密度で、ＩＬ７成長培地内で平板固定する。２０μｇ／ｍｌのピューロマイシンと４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを添加することによって、トランスフェクションから３０時間後に、２重耐性ｐｒｅＢ細胞クローンを選択する。ピューロマイシン及びハイグロマイシンＢの２重耐性コロニーを、トランスフェクションから７〜１０日後に単離し、新鮮な照射済みのピューロマイシン／ハイグロマイシンＢ２重耐性ＳＴ−２間質細胞上で、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンと４００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢでの連続的選択下で拡張させる。標準的なゲノミックＰＣＲ及び／又はサザンブロット分析により再び第２の対立遺伝子内へのターゲティングベクターのターゲティングされた組込みについて個々のピューロマイシン／ハイグロマイシンＢ２重耐性ｐｒｅＢ細胞クローンを分析する。
【０１７９】
その後、２つのターゲティングされた対立遺伝子を伴うピューロマイシン／ハイグロマイシンＢ２重耐性ｐｒｅＢ細胞クローンを、その他の遺伝子座及び対立遺伝子上で遺伝子ターゲティング実験を反復させる目的で構成性ｃｒｅ−リコンビナーゼ発現ベクターで過渡的にトランスフェクトすることができる。これは、上述のように電気穿孔法により、多重高次ｃｒｅ−リコンビナーゼ発現ベクター２０μｇでｐｒｅＢ細胞を過渡的にトランスフェクトすることにより行なうことができる。過渡的にトランスフェクトされた細胞はこのとき、３０００ラドで照射されたサブコンフルーエントなＳＴ−２間質細胞上へと複数の９６ウェル平板内に、ＩＬ−７成長培地内の限界希釈条件下で平板固定される。７日間の培養後、４８のクローンセットを、連続的培養のため正常なＳＴ−２間質細胞上に、そしてピューロマイシン耐性か又はハイグロマイシンＢ単一耐性のいずれかのＳＴ−２細胞及びそれぞれの選択物の上にレプリカ平板固定させる。両方の抗生物質に対し感応するものとなった、以前ピューロマイシン／ハイグロマイシンＢの２重耐性であったｐｒｅＢ細胞クローンは、両方のｌｏｘＰフランキングされた耐性マーカーのｃｒｅ−リコンビナーゼ媒介欠失を受けた可能性が高い。サザンブロット分析により２つの耐性マーカーのｃｒｅ−リコンビナーゼ媒介欠失がひとたび確認された時点で、クローンを、その他の内因性遺伝子座及び対立遺伝子のための付加的な遺伝子ターゲティング手順に付すことができる。
【０１８０】
実施例６：ヒト免疫グロブリンポリペプチドのためのレトロウイルス発現構成体の構築
ヒト免疫グロブリンの産生のためにマウス間質細胞、ＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞を再プログラミングする目的で、ヒト抗体ポリペプチドをコードする新規のレトロウイルス発現ベクターを使用することができる。Ｂ細胞分化期に応じて、まずは膜結合免疫グロブリンとして、その後は分泌された免疫グロブリンとして、ヒトＩｇＨ及びＬ鎖タンパク質の調節された発現を可能にする組換え型レトロウイルスベクターの生成方法について記述する。あらゆるタイプの異種結合タンパク質をこれらのレトロウイルスベクター内にクローニングし、あらゆるタイプの異種でかつヒトの結合タンパク質の発現を可能にすることができる、ということに留意すべきである。従って本書で記述されているヒトＩｇＨ及びＩｇＬ鎖の発現のためのレトロウイルス移入ベクターのクローニングについての説明は、除外としてではなく例示としてみなされるべきである。組換え型レトロウイルスベクターは、最高７〜１０ｋｂの異種ＤＮＡ配列を収容することができ、これには、全ての必要とされる細胞型及び分化期特異的プロモータ、エンハンサ及び制御要素ならびに内因性Ｉｇ遺伝子スプライスシグナルを含めたＩｇＨ及びＬ鎖糖タンパク質のための別々の構成体の設計が必要とされる。これらの制御要素は、免疫グロブリンの適正な発現、膜被着及び分泌、さまざまなＢ細胞分化期内のその親和力成熟、ならびに形質細胞内の異種抗体の高レベル分泌を確保するのに必要である。ＩｇＨ及びＬ鎖のための個々のレトロウイルス構成体をｐｒｅＢ細胞内に同時形質導入することができ、この時点で、構成体は感染したｐｒｅＢ細胞のゲノム内に安定した形で組込まれる。潜在性発現内在性免疫グロブリンの無いマウスｐｒｅＢ細胞が使用される場合（以上の記述参照）には、レトロウイルス形質導入を受けたｐｒｅＢ細胞の分化時点で、Ｂ系統細胞内で異種又はヒト抗体又は結合タンパク質のみが発現されることになる。
【０１８１】
（ａ）ＩｇＨ鎖の調節された発現のためのレトロウイルス構成体の生成
さまざまなＩｇＨ及びＬ鎖タンパク質のためのレトロウイルス構成体は場合によってマウス細胞内に形質導入されることになるため、Ｉｇ発現を制御するプロモータ及びエンハンサ要素は、Ｂ系統特異的マウス転写因子での最適な相互作用を確保するべくマウス由来のものとなる。
【０１８２】
レトロウイルス発現構成体の生成源である発現ベクターは、空のレトロウイルスクローニングベクターｐＬＩＢ（クロンテック(Clontech)）である（図１２ａ）。ヒト免疫グロブリン重鎖のための組換え型レトロウイルス発現ベクターの生成は、空のレトロウイルスクローニングベクターｐＬＩＢ内へのヒト抗体のさまざまな可変及び定常領域のためのコーディング領域ならびにプロモータ及びエンハンサ要素の逐次的クローニングが関与する多段階クローニングプロセスである。第１段階においては、マウスＶＨプロモータが、ｐＬＩＢの多重クローニング部位のユニークなＣｌａｌ制限部位の中にＰＣＲクローニングされる。これは、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)データベース受入れ番号Ｘ７１１１９に基づいて設計された以下のプライマを用いたマウスゲノミックＤＮＡからのマウスＶＨプロモータ要素のＰＣＲ増幅により行なわれる。
【数１５】
2005525800.tif 000019
【０１８３】
これらのプライマは、３９４ｂｐのＶＨプロモータフラグメントをＰＣＲ増幅し、このフラグメントは、それらがプライマＰ０２７及びＰ０２８の５’末端において取込まれていることから、その５’及び３’末端にＣｌａｌのための制限酵素認識部位（ＡＴＣＧＡＴ）を含むことになる両方のプライマにおけるＣｌａＩ部位に加えて、逆方向プライマＰ０２８は、さらなるクローニング段階に必要となるもう１つのユニークな制限部位をＰＣＲ産物内に導入する付加的なＢａｍＨＩ制限部位（ＧＧＡＴＣＣ、下線付き）を含んでいる。ＰＣＲフラグメントのＣｌａｌ制限酵素消化の後、新規のＢａｍＨＩ部位を内含する増幅されたＶＨプロモータＰＣＲフラグメントを、Ｃｌａｌ線状化ｐＬＩＢベクター内に連結させる。（５’ＬＴＲプロモータの転写配向とは反対の）所望の配向でＶＨプロモータを含有する連結産物を、診断制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定により同定し、これをｐＡＢ−１と呼称する（図１２ａ）。
【０１８４】
第２段階には、レトロウイルスベクターｐＡＢ−１内へのそのフランキングマトリックス付着領域（ＭＡＲｓ）を伴うマウスイントロン重鎖エンハンサ（ＥμＨ）のクローニングである。そのフランキング（ＭＡＲｓ）を伴うＥμＨエンハンサ要素は、Ｂ系統細胞内での免疫グロブリンタンパク質の効率の良い発現にとって必要であることがわかっている。ＥμＨエンハンサ要素のクローニングは、公開されたＮＣＢＩジェンバンク(Genbank)Ｊ００４４０に従って設計された以下のプライマを用いてマウスゲノミックＤＮＡからの９８３ｂｐのＰＣＲフラグメントを増幅することによって実施される：
【数１６】
2005525800.tif 000020
【０１８５】
５’末端の各プライマに補足されたＴ制限部位（Ｐ０２９についてのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰ０３０についてのＮｏｔｌ）は、大文字で強調されている。このとき、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化させることができ、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで線状化されたレトロウイルスベクターｐＡＢ１内にこれを一方向連結して、ベクターｐＡＢ−２を結果として得る。センスプライマＰ０２９は、付加的ＨｉｎｄＩＩＩ部位のための配列（下線付き）を含有し、これがその後のクローニング段階にとって必要なｐＡＢ−２内のユニークな制限酵素部位を生じさせることになる。
【０１８６】
次に、構成体ｐＡＢ−２に対しマウス３’αエンハンサを含有するＤＮＡフラグメントを添加する。３’αエンハンサは、形質細胞の分化期における抗体の最適でかつ高レベルの発現及び分泌にとって必要であることがわかっている。３’αエンハンサは、晩期Ｂ細胞／形質細胞特異的転写因子のためのさまざまな結合部位を含む、４つのＤＮＡｓｅｌ過敏性部位（ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３及びＨＳ４）を含むことがわかっている。リポータ遺伝子検定においては、０．６ｋｂのゲノミックＤＮＡフラグメント内にあるＨＳ１及び２が、ＤＮＡ配列についてかなり相同性の高いＨＳ３及び４の寄与がほとんどない状態で、３’αエンハンサ活性の少なくとも８０％を付与する、ということが示された。
【０１８７】
４つの３’αエンハンサ成分、ＨＳ１、２、３、及び４は全て、フランキングＤＮＡ配列とは独立して一定の与えられた遺伝子座の転写活性を調節できるいわゆる遺伝子座制限領域（ＬＣＲ）を構成する。従って免疫グロブリン重鎖のための基本的レトロウイルス発現ベクターは少なくとも、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＸ９６６０７に従って設計されたプライマを用いてマウスゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅され得る３’αエンハンサのＨＳ１，２領域を含むべきである（ＰＣＲフラグメントのクローニング又はその後のクローニング段階に必要とされる付加的な制限酵素部位のための認識配列は、大文字で強調されている）：
【数１７】
2005525800.tif 000021
【０１８８】
各々のプライマ内の５’末端ＳａｌＩ部位（ＧＴＣＧＡＣ）に加えてセンスプライマＰ０３１は、付加的なＭｌｕＩ部位（下線付き）を含み、逆方向プライマＰ０２８は、付加的なＸｈｏＩ部位（下線付き）を含む。プライマＰ０３１及びＰ０３２は、ＳａｌＩ制限酵素で消化さベクターｌＩ線状化ベクターｐＡＢ−２内に連結され得る６４４ｂｐのＰＣＲフラグメントを増幅することになる。所望の配向でインサートを伴うクローン（図１２ｂ参照）が、診断制限酵素消化及びＤＮＡ配列により決定され、ｐＡＢ−３と呼称される（図１２ｂ）。
【０１８９】
任意には、ＩｇＨ発現のためのレトロウイルスベクター構成体の中に、さらなる３’αエンハンサ成分ＨＳ３及び４を内含させることができる。このためには、３’αエンハンサＨＳ４領域を含む４６６ｂｐのフラグメントを、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＳ７４１６６に従って設計された以下のプライマを用いて、鋳型としてのマウスゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅することができる：
【数１８】
2005525800.tif 000022
【０１９０】
各プライマの５’末端に補足された制限酵素部位は、大文字で強調されている。両方のプライマ中に存在するＸｈｏＩ制限部位（ＣＴＣＧＡＧ）に加えて、逆方向プライマＰ０３４は、後のクローニングを目的として必要とされる付加的なユニークな制限部位を含む付加的なＳｐｈＩ制限部位（ＧＣＡＴＧＣ、下線付き）を含有している。ゲノミックマウスＤＮＡ上のプライマ対Ｐ０３３及びＰ０３４でのＰＣＲ増幅は、制限酵素ＸｈｏＩで消化され得かつ次にＸｈｏ線状化ベクターｐＡＢ−３内に連結される４６６ｂｐのＰＣＲフラグメントを結果としてもたらすことになる。所望の配向のＨＳ４インサートを伴うクローンが、診断制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定によって決定され、ベクター構成体ｐＡＢ−４と呼称される（図１２ｂ）。最後の３’αエンハンサフラグメント、ＨＳ３は、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＸ９６６０７に従って設計された以下のプライマと共に鋳型としてマウスゲノミックＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅され得る（制限酵素ＳｐｈＩについての認識配列は、ここでも、大文字で強調されている）：
【数１９】
2005525800.tif 000023
【０１９１】
ＰＣＲ増幅を受けたＨＳ３  ３’αエンハンサ領域は、ＳｐｈＩ制限酵素で消化され、ｐＡＢ−５を生成するべく、ＳｐｈＩ線状化ベクターｐＡＢ−４内に連結される。ベクターｐＡＢ−３、４又は５のいずれかを用いて、異種免疫グロブリン重鎖のためのコーディング領域を挿入することができる。
【０１９２】
ヒト免疫グロブリンイソタイプの各々は、ｍＲＮＡ写しからの膜貫通エキソンを維持するか又は欠失させる代替的スプライシング事象により調節される分泌された抗体か、又は膜結合した表面免疫グロブリンとして発現され得る。各々の免疫グロブリンイソタイプは、膜貫通エキソンのためのそれ自体のコーディング領域を有するが、全てのヒトＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ抗体の膜領域は、個々の亜型について事実上同一である。従って、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４抗体を係留する膜のために同じＩｇＧ膜エキソンを利用でき、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方について異なるエキソンセットが使用され、各々の異なるエキソンが各々のＩｇＥ及びＩｇＭ抗体について必要とされる。
【０１９３】
従って、組換え型レトロウイルスＩｇ発現構成体の生成に向かってのクローニング手順における次の段階は、ベクターｐＡＢ−３、４又は５のいずれかの中へのヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体のためのさまざまな膜貫通領域の挿入である。代表例としては、ＶＨプロモータ、ＥμＨエンハンサ及び最小３’αＥエンハンサ（ＨＳ１、２）要素を含有する基本的レトロウイルス構成体ｐＡＢ−３について、さらなるクローニング手順が記述される（図１２ｃ）。
【０１９４】
μＨ鎖膜貫通領域は、ＣμＨ定常領域エキソンＣμＨ１−ＣμＨ４の下流側１．８５ｋｂのところにある２つのエキソンμＭ１及びμＭ２によってコードされる。内因性ポリアデニル化部位を含むμＭ１及びμＭ２エキソンは、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)コンティグ配列ＮＴ０１０１６８に基づいて設計された以下のプライマを用いてＰＣＲによりマウスゲノミックＤＮＡから増幅可能な７７３ｂｐゲノミックフラグメント内に含まれている：
【数２０】
2005525800.tif 000024
【０１９５】
各プライマの５’末端に補足されたＭｌｕＩ制限部位は、大文字で強調されている。結果として得られたＰＣＲ産物は、ＭｌｕＩ制限酵素で消化され得、結果として得られた７７３ｂｐのフラグメントは、ＭｌｕＩ線状ベクターｐＡＢ−３内に連結される。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定によって確認される通りのＤＮＡ配列及び適正な配向でμＭ１及びμＭ２エキソンを含むクローンは、構成体ｐＡＢ−３、１と呼称される（図１２ｃ）。
【０１９６】
ＩｇＧ抗体の膜被着は例えば、ＩｇＧ１遺伝子の膜貫通エキソンによって達成できる。ＩｇＧ１膜スパイニング領域は、１．９ｋｂの領域を貫通するＣｒ１Ｈエキソンの下流側１．２５ｋｂのところにある２つのエキソンによってコードされる。γ／Ｍ１とγ／Ｍ２の間のイントロンを短縮するために、２つのエキソンをより小さなＰＣＲフラグメントに融合させる単一重複拡張（ＳＯＥ）ＰＣＲアプローチが用いられる。一般に、上流側ＰＣＲ産物の逆方向プライマと下流側ＰＣＲ産物のセンスプライマがおよそ３０〜４０ｂｐの相補性を示す場合、２つのＰＣＲ産物の融合を達成することができる。完全な相補性をもつこれらの領域は、それぞれ上流側及び下流側のＰＣＲ産物の増幅のために用いられる逆方向プライマ及び正方向プライマの５’末端に対し１５〜２０個のヌクレオチドとして補足することができる。しかしながら、偶然に、２つのγｌＭ１及びγｌＭ２エキソンの融合の場合には、２８ｂｐの２つの完全に同一の配列がγｌＭ１の下流側７８ｂｐ、γｌＭ２エキソンの上流側２５６ｂｐのところに存在する。これらの配列は、γＨ鎖の＜ｗ＞領域のためのγｌＭ１及びγｌＭ２エキソンの両方を含むＳＯＥ−ＰＣＲにより、さらに短かいＰＣＲフラグメントを生成するために使用可能である。従って、２つのＰＣＲは、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列ＡＬ１２２１２７に基づいて設計された以下のプライマを用いてヒトゲノミックＤＮＡ上で並行して実施される。以下のプライマを用いて、ヒトゲノミックＤＮＡから、γ１膜貫通エキソン１（γｌＭ１）を含む３１５塩基対のＰＣＲフラグメントが増幅され、ここでプライマＰ０３９はＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)エントリＡＬ１２２１２７の位置９７１０−９７４１に結合し、プライマＰ０４０はその位置９４３５−９４６２に結合する：
【数２１】
2005525800.tif 000025
【０１９７】
膜貫通エキソン２（γ１Ｍ２）を含む５５５塩基対のＰＣＲフラグメントは、以下のプライマを用いてヒトゲノミックＤＮＡから増幅され得、ここでプライマＰ０４１はＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)エントリＡＬ１２２１２７の位置８１３７〜８１６４に結合し、プライマＰ０４２は位置７６２４〜７６５４に結合する。
【数２２】
2005525800.tif 000026
２つのＰＣＲ産物は、このとき、γ１Ｍ２エキソンＰＣＲ産物の１／１００とγ１Ｍ１エキソンＰＣＲ産物の１／１００を混合させ、センス及び逆方向プライマＰ０３９及びＰ０４２でＰＣＲを反復することによって８２２ｂｐのＰＣＲ融合産物に融合され得る。ＳＯＥ融合ＰＣＲ産物のクローニングに必要とされるプライマＰ０３９及びＰ０４２（大文字で強調）の両方の中に存在するＭｌｕＩ制限酵素認識部位に加えて、プライマＰ０４２は付加的に、最終的レトロウイルス免疫グロブリン発現ベクター内の免疫グロブリン写しの適正な転写終結を可能にする人工的ポリアデニル化シグナルの相補的配列（下線）を含んでいる。このとき、８３２ｂｐのγ１Ｍ１γ１Ｍ２−ｐｏｌｙＡシグナルＰＣＲフラグメントはＭｌｕＩ制限酵素で消化され、ベクターｐＡＢ−３内に連結される。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により確認されるインサートの適正な配向を伴うクローンは、クローンｐＡＢ−３．２と呼称される（図１２ｃ）。
【０１９８】
α１膜貫通コーディング領域のクローニングは、その内因性ｐｏｌｙＡ部位を含むα１Ｍのための単一のエキソンを含有するフラグメントをヒトゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅することによって達成できる。このＰＣＲ増幅のためには、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＭ６０１９３に従って設計された以下のプライマを使用することができる。
【数２３】
2005525800.tif 000027
【０１９９】
両方のプライマ共、（大文字で強調されている）各プライマの５’末端に補足されているＭｌｕＩクローニング部位を含んでおり、後にＭｌｕＩ線状化ｐＡＢ−３内に連結されるＭｌｕＩ制限酵素で消化可能な７６８塩基対のＰＣＲ産物を増幅することになる。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定によって確認されたインサートの正しい配向をもつクローンをクローンｐＡＢ−３．３と呼称する。
【０２００】
膜結合したＩｇＥ抗体の発現のため、２つのエキソンε１Ｍ１及びε１Ｍ２によってコードされるε１Ｈ鎖のための膜貫通領域はＰＣＲクローニングされる。このために、公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列配列エントリＸ６３６９３に従って設計された以下のプライマを用いてヒトゲノミックＤＮＡから８５８ｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。
【数２４】
2005525800.tif 000028
【０２０１】
両方のプライマ共、ＭｌｕＩ制限酵素で消化可能な８５８ｂｐのＰＣＲ産物を結果としてもたらす（大文字で強調された）各プライマの５’末端に補足されたＭｌｕＩクローニング部位を含んでいる。さらに、逆方向プライマＰ０４６は、最終的発現構成体内のｍＲＮＡ転写の適切な終結を確実にする（下線付きの）人工的ｐｏｌｙＡシグナルの相補的配列を含むように設計されている。ＭｌｕＩ消化されたＰＣＲフラグメントは、ＭｌｕＩ線状化されたｐＡＢ−３内に連結される。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定によって確認されたインサートの正しい配向をもつクローンをクローンｐＡＢ−３．４と呼称する。
【０２０２】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥイソタイプのためのさまざまな膜貫通エキソンのクローニングの後、さまざまなヒト定常領域のためのエキソンをレトロウイルス構成体ｐＡＢ−３．１〜３．４内に挿入しなければならない。このために、定常領域エキソンをコードするＤＮＡフラグメントをｐＡＢ−３．１〜４構成体の各々のユニークなＮｏｔＩ制限酵素認識部位内にクローニングする。
【０２０３】
全ての免疫グロブリンＨ鎖イソタイプγ１、γ２、γ３及びγ４のためのレトロウイルス発現ベクターのクローニングが図１２ｄに描かれている。ヒトゲノミックＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いた４つの異なるＩｇＧ重鎖亜型のＰＣＲ増幅のためには、以下のプライマを使用することができる：
【０２０４】
γ１（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列ＡＬ１２２１２７に従って設計されたプライマ）については：
【数２５】
2005525800.tif 000029
【０２０５】
γ２（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列Ｊ００２３０に従って設計されたプライマ）については：
【数２６】
2005525800.tif 000030
【０２０６】
γ３（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列ＡＬ１２２１２７に従って設計されたプライマ）については：
【数２７】
2005525800.tif 000031
【０２０７】
γ４（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列Ｋ０１３１６に従って設計されたプライマ）については、
【数２８】
2005525800.tif 000032
【０２０８】
各々のケースにおいて、γ１Ｈについては１７８８ｂｐ、γ２Ｈについては１９５９ｂｐ、γ３Ｈについては２３７４ｂｐ及びγ４Ｈについては１８２０ｂｐのＰＣＲ産物をＮｏｔＩ制限酵素で消化させることができ、その時点で、消化されたフラグメントは、ＮｏｔＩ線状化ｐＡＢ−３．２内に連結される（図１２ｄ）。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により決定される通りの、突然変異を全く有しておらず正しい配向でインサートを含む構成体を、それぞれｐＡＢ−３．２−Ｇ１、ｐＡＢ−３．２−Ｇ２、ｐＡＢ−３．２−Ｇ３及びｐＡＢ−３．２−Ｇ４と呼称する。
【０２０９】
μＨ、α１Ｈ、α２Ｈ、及びεＨ鎖をコードする定常領域エキソンのクローニングのためには、同一の方法が利用される（図１２ｅ）。鋳型としてヒトゲノミックＤＮＡを用いた異なるＩｇＨイソタイプのＰＣＲ増幅のために以下のプライマを使用する。
【０２１０】
μＨ（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列ＡＢ０１９４４１に従って設計されたプライマ）については：
【数２９】
2005525800.tif 000033
【０２１１】
α１Ｈ及びα２Ｈ（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列Ｊ００２２０及びＪ００２２１に従って設計されたプライマ）については：
【数３０】
2005525800.tif 000034
【０２１２】
εＨ（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列Ｌ０００２２に従って設計されたプライマ）については、
【数３１】
2005525800.tif 000035
【０２１３】
各々のケースにおいて、μＨについては２２２９ｂｐ  α１Ｈ及びα２Ｈについては１６６７ｂｐ、及びεＨについては１９０８ｂｐのＰＣＲ産物をＮｏｔＩ制限酵素で消化させることができ、それぞれＮｏｔＩ線状化ｐＡＢ−３．１、ｐＡＢ−３．３及びｐＡＢ−３．４内に連結できる（図１２ｅ）。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により決定される通りの、突然変異を全く有しておらず正しい配向でインサートを含む構成体を、それぞれｐＡＢ−３．１−Ｍ、ｐＡＢ−３．３−Ａｌ、ｐＡＢ−３．３−Ａ２及びｐＡＢ−３．４−Ｅと呼称する。
【０２１４】
完全レトロウイルスＩｇＨ及びＩｇＬ鎖発現構成体の両方についてユニークな又は多様な特異性を発現するための類似の戦略が紹介されることになるため、レトロウイルスＩｇＬ鎖発現ベクターのクローニングのための方法の記述の後に紹介されることになる可変ドメインコーディング領域の挿入が、天然のＩｇＨ鎖プロモータにより制御される異なるレトロウイルスＨ鎖発現構成体にはなおも必要である。
【０２１５】
（ｂ）  ＩｇκＬ鎖の調節された発現のためのレトロウイルス構成体の生成
ＩｇＨ鎖発現のために設計された構成体と類似の要領で、ＩｇκＬ鎖の分化期特異的発現のために設計されたレトロウイルス構成体は、明確なκＬ鎖遺伝子座特異的プロモータ及びエンハンサ要素の存在を必要とする。これらには、Ｖκプロモータ、κ軽鎖イントロンエンハンサ（κｉＥ）及びκ３’エンハンサ（κ３’Ｅ）要素が含まれる。これらの要素の逐次的クローニングは以下のように達成することができる（図１３ａ、ｂ）。
【０２１６】
（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＸ５２７６８に従って設計された）以下のプライマを用いてマウスゲノミックＤＮＡからの２９０ｂｐのＰＣＲフラグメントとして、マウスＶκプロモータがＰＣＲ増幅される：
【数３２】
2005525800.tif 000036
【０２１７】
５’未満の各々のプライマに補足された制限部位が大文字で強調されている。両方のプライマの５’末端に存在するＣｌａＩ部位に加えて、逆方向プライマＰ０６２は、後のクローニングを目的として使用されることになるＰＣＲ産物内にもう１つのユニークな制限部位を導入する付加的なＢａｍＨＩ制限部位（ＧＧＡＴＣＣ、下線付き）を含有している。ＰＣＲフラグメントのＣｌａＩ制限酵素消化の後、増幅されたＶκプロモータはＣｌａＩ線状化ｐＬＩＢベクター内に連結される。（５’ＬＴＲプロモータの転写配向とは反対の）所望の配向にＶκプロモータを含有する連結産物は、ＤＮＡ配列決定及び診断制限酵素によって同定され、構成体ｐＡＢ−６を発生させる。
【０２１８】
κｉＥ及びκＬ鎖定常ドメインのためのコーディング領域は、ヒト及びマウスκＬ鎖遺伝子座の両方において近接して位置設定されており、エンハンサは種を横断して機能すると思われる。従って、κＬ鎖をコードする２つの異なるレトロウイルス発現ベクターのための任意のクローニング手順が記述され、そのうちの１つはヒト、もう１つはマウスのκイントロンエンハンサ（κｉＥ）を利用している。両方の構成体を互換可能な形で使用できるという点に留意するべきである。ヒトκｉＥを含む構成体のクローニングは、（公開された体細胞超変異配列エントリＡＦ０１７７３２に基づいて設計された）以下のプライマを用いて５’にあるＭＡＲを含むヒトＣκエキソン及びヒトκｉＥの両方を含有するゲノミックヒトＤＮＡからのＰＣＲフラグメントを増幅することによって達成可能である：
【数３３】
2005525800.tif 000037
【０２１９】
各プライマの５’末端に補足された付加的な制限部位が、ここでも大文字で強調されている（プライマＰ０６３内のＢａｍＨＩ及びＰ０６４内のＮｏｔＩ）。プライマＰ０６３は、後のクローニング段階で使用される付加的なＭｌｕＩ制限部位のための配列を含有する。ＰＣＲプライマは、２３５９ｂｐのフラグメントを増幅し、このフラグメントは、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化され得かつ次にＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ線状化ｐＡＢ−６内に一方向クローニングされ得る（図１３ａ）。
【０２２０】
マウスκｉＥを利用する構成体については、マウスκｉＥを含有するＰＣＲ産物は以前に記述したＳＯＥ−ＰＣＲアプローチによってヒトＣκ領域を含むＰＣＲ産物に融合される。このために、マウスκｉＥ及びヒトＣκ領域の第１のＰＣＲ増幅は、３６ｂｐの相補性を示すＣκ領域正方向プライマとκｉＥ逆方向プライマを用いて並行して行なわれる。これら２つのＰＣＲ産物を融合させるのに用いられる第２のＰＣＲにおいては、各々のＰＣＲ反応の１／１００が混合されκｉＥ正方向（Ｐ０６５）及びＣκ領域逆方向プライマ（Ｐ０６４）で増幅され、３６ｂｐの末端相補性領域における２つのＰＣＲ産物の融合を結果としてもたらす。
【０２２１】
鋳型としてマウスゲノミックＤＮＡを用いて、（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＶ００７７７に基づいて設計された）マウスのκｉＥの増幅のために、以下のプライマを使用することができる：
【数３４】
2005525800.tif 000038
【０２２２】
鋳型としてヒトゲノミックＤＮＡを用いて、（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＡＦ０１７７３２に基づいて設計された）ヒトＣκ領域の増幅のために、以下のプライマを使用することができる：
【数３５】
2005525800.tif 000039
【０２２３】
プライマＰ０６６及びＰ０６７内の末端相補性領域には下線が付されており、この領域が、鋳型としての最初の２つのＰＣＲ産物の混合物及びプライマＰ０６５及びＰ０６４を用いて行なわれる第２のＰＣＲにおいて２つのＰＣＲ産物の融合を媒介する。結果として得られた１５２４ｂｐのマウスκｉＥ−ヒトＣκ融合ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化され得、次にＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ線状化ベクターｐＡＢ−６内に一方向クローニングされて、ベクターｐＡＢ−８を生成する（図１３ａ）。
【０２２４】
次に、マウスκ３’Ｅは、ｐＡＢ−７及びｐＡＢ−８の両方の中でヒトＣκ領域の下流側でクローニングされ、それぞれ構成体ｐＡＢ−７．１及びｐＡＢ−８．１を生成する。マウスゲノミックＤＮＡからのκ３’ＥのためのＰＣＲ増幅に使用されるプライマは、（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＸ１５８７８に基づいて設計された）以下のとおりのものである。
【数３６】
2005525800.tif 000040
【０２２５】
両方のプライマ共、ＳａｌＩ制限部位（大文字で強調されている）を含み、そのため結果として得られた８２７ｂｐのＰＣＲ産物をｐＡＢ−７及びｐＡＢ−８の適合性ＳａｌＩ制限部位内にクローニングすることが可能になっている。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定によって決定される通りの、正しいＤＮＡ配列を伴いかつ正しい配向でインサートを担持するベクタークローンが、ｐＡＢ−７．１及びｐＡＢ８．１と呼称される（図１３ａ）。
【０２２６】
次のクローニング段階では、構成性ＳＶ４０プロモータの制御下のピューロマイシン耐性マーカーがレトロウイルスκＬ鎖発現構成体内にクローニングされる。完全異種抗体の発現を可能にするためマウスｐｒｅＢ細胞内に安定した形でＩｇＨ及びＩｇＬ鎖レトロウイルス構成体の両方を同時形質導入する必要があることから、ピューロマイシン耐性のための発現カセットの内含が好ましい。レトロウイルス同時形質導入の効率を増大させるために、レトロウイルスＩｇＬ鎖構成体がまず形質導入され、安定した形で形質導入された細胞が、ピューロマイシン選択を用いたＩｇＬ鎖構成体の組込みのために選択される。ＩｇＨ鎖レトロウイルスベクターの二次的形質導入がこのとき、ＩｇＨ鎖レトロウイルスベクターで形質導入される各細胞内での抗体産生のための潜在能力をもつ細胞を発生させることになる。
【０２２７】
ピューロマイシン発現カセットは、一部の望ましくない内部制限酵素部位をＳＯＥ−ＰＣＲで欠失させ増幅されたＰＣＲフラグメントの端部に対し適切なＣｌａＩクローニング部位を付加することによって、ピューロマイシン耐性ベクターｐＰｕｒ（クローンテック(Clontech)）からクローニングすることができる。
【０２２８】
ＳＯＥ融合ＰＣＲのために使用されるプライマは以下の通りである：
【数３７】
2005525800.tif 000041
【０２２９】
まず最初に、２回のＰＣＲ増幅は、ＰＣＲのために同じｐＰｕｒ鋳型を使用してプライマ対Ｐ０７０／Ｐ０７１及びＰ０７２／Ｐ０７３で並行して行なわれる。逆方向プライマＰ０７１及び正方向プライマＰ０７２は、プライマＰ０７０及びＰ０７３のみを用いた付加的なＰＣＲ増幅の中で以前のＰＣＲフラグメントのアリコートを用いた第２のＰＣＲにより２つのＰＣＲ産物を融合できるようにする３６ｂｐの完全相補性領域（下線付き）を含有するように設計される。プライマＰ０７０及びＰ０７３は、ｐＡＢ−７．１及びｐＡＢ−８．１の適合性のあるＣｌａＩ部位内への結果として得られた１３５１ｂｐのピューロマイシン発現カセットのクローニングを可能にするＣｌａＩ制限部位（大文字）を含んでいる。こうしてそれぞれレトロウイルス構成体ｐＡＢ−７．１Ｐｕｒ及びｐＡＢ−８．１Ｐｕｒが生成され（図１３ｂ）、これらは、その中にそれぞれκＬ鎖のユニークな又は多様な可変ドメインをコードする単一のＶＪκ領域又はＶＪκ領域ライブラリを挿入することのできる構成体である。可変領域エキソンのクローニングのための手順は、異種ヒトλＬ鎖のためのレトロウイルス発現ベクターのクローニングについても記述した後、以下でＨ鎖及びλＬ鎖可変領域のクローニングと共に紹介されることになる。
【０２３０】
（ｃ）ＩｇλＬ鎖の調節された発現のためのレトロウイルス構成体の生成
一部のケースでは、κＬ鎖の代りにλＬ鎖を含む異種抗体を産生することが望まれる。レトロウイルス構成体ｐＡＢ−７．１−Ｐｕｒ及びｐＡＢ−８．１Ｐｕｒ内のヒトＣκコーディング領域をヒトＣκコーディング領域のいずれかと交換するだけで充分であるかもしれないものの、完全な内因性λＬ鎖発現パターンは、λＬ鎖遺伝子座特異的プロモータ及びエンハンサ要素によりλＬ鎖の発現を制御することによってのみ達成されることになる。このことは特に、κＬ鎖遺伝子再配置及び発現がＢ細胞分化中のλＬ鎖の再配置及び発現に先行するマウス系においてあてはまる。
【０２３１】
マウスλＬ鎖遺伝子座特異的エンハンサ要素は、Ｃλ２、Ｃλ４及びＣλ１、Ｃλ３定常領域エキソンの近くに位置設定されそれぞれλ２、λ４及びλ１、λ３軽鎖イソタイプの発現を調節するλ２−４エンハンサ及びλ３−１エンハンサである。
【０２３２】
κＬ鎖レトロウイルス発現構成体の場合と同様（以上参照）、レトロウイルスλＬ鎖発現ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子発現ベクターを含むように設計されている。従って、第１のクローニング段階では、ＳＶ４０プロモータにより制御されるピューロマイシン発現カセットが、マウスゲノミックＤＮＡ及びｐＡＢ−７．１ＰｕｒをそれぞれＰＣＲ増幅用鋳型として用いたＳＯＥ−ＰＣＲによりＶλプロモータに融合される。２つの並行ＳＯＥ−ＰＣＲ反応のためのプライマは、以下の通りである（公開されたＮＣＢＩ−Ｇｅｎｂａｎｋデータベース配列エントリＪ００５９１に基づいて設計されたＶｘプロモータ特異的プライマＰ０７６及びＰ０７７を用いる：
【数３８】
2005525800.tif 000042
【０２３３】
以前に記述したＳＯＥ融合ＰＣＲに関しては、まず最初に２つのＰＣＲ増幅、すなわち鋳型としてのｐＡＢ−７．１Ｐｕｒ上のプライマＰ０７４及びＰ０７５を用いたピューロマイシン発現カセット、及び鋳型としてのマウスゲノミックＤＮＡ上のプライマＰ０７６及びＰ０７７を用いたＶλプロモータ、が並行して実施される。第１の並行したＰＣＲの各１／１００体積のアリコートを次に混合し、プライマＰ０７４及びＰ０７７で再び増幅させる。ピューロマイシン発現カセットはこうして、第１回目の並行ＰＣＲに用いられる逆方向プライマＰ０７５とセンスプライマＰ０７６（下線付き）における３６ｂｐの設計された完全な相補性を理由として、Ｖλプロモータの５’末端に融合される。
【０２３４】
プライマＰ０７４及びＰ０７７は両方共、ＣｌａＩ線状化ｐＬＩＢ内にＰＣＲ融合産物をクローニングするのに使用可能なＣｌａＩ制限部位を含んでいる。付加的なＭｌｕＩ制限部位（下線付き）も同様に、逆方向プライマＰ０７７内に取込まれ、さらなるクローニング段階に必要とされるＶλプロモータの付加的なユニークなＭｌｕＩ部位３’を発生させる。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定によって確認される通りの正しいＤＮＡ配列をもち正しい配向でｐＬＩＢ内に挿入されたピューロマイシン−Ｖλプロモータ融合ＰＣＲフラグメントを伴うベクタークローンをベクターｐＡＢ−９と呼称する（図１４ａ）。
【０２３５】
次に、２つのマウスλ２−４Ｅ及びλ３−１Ｅエンハンサ要素を、マウスゲノミックＤＮＡからＰＣＲ増幅させ、ここでも又この後にＳＯＥ−ＰＣＲによる両方の配列の融合が続く。（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列エントリＸ５４５５０及びＸ５４６０８にそれぞれ基づいて）以下のプライマを使用することができる。
【数３９】
2005525800.tif 000043
【０２３６】
前述のアプローチと同様、まず最初に２つのＰＣＲフラグメントが、鋳型としてマウスゲノミックＤＮＡを用いてプライマ対Ｐ０７８／Ｐ０７９及びＰ０８０／Ｐ０８１で並行して増幅され、２回目のＰＣＲにおいて、これらのＰＣＲ産物のアリコートが鋳型として使用され、プライマＰ０７９及びＰ０８０の３６ｂｐの相補性（下線付き）に起因してプライマＰ０７８及びＰ０８１でのＰＣＲ増幅により融合される。
【０２３７】
結果として得られた１５１３ｂｐのＰＣＲ融合産物は、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩの制限酵素で消化可能であり（それぞれの認識部位はプライマＰ０７８及びＰ０８１内に取込まれている：大文字で強調）、ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ線状化されたｐＡＢ−９内に一方向クローニングされる。制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により確認される通りの正しいＤＮＡ配列を伴うベクタークローンが、ベクターｐＡＢ−１０と呼称される（図１４ａ）。プライマＰ０７９及びＰ０８０内の相補的領域は、望まれる場合エンハンサ要素の各々を別々に除去できるようにするため、付加的なユニークなＸｈｏＩ部位を含むように設計されている（大文字で強調）。
【０２３８】
次の段階では、ヒトＣλ領域のいずれかが、（公開されたＮＣＢＩ−ジェンバンク(Genbank)配列Ｄ８７０２３及びＤ８７０１７に基づいて設計された）以下のプライマを用いてレトロウイルス構成体ｐＡＢ−１０内にクローニングされる：
【数４０】
2005525800.tif 000044
【０２３９】
これらのプライマは、鋳型としてヒトゲノミックＤＮＡが使用される場合、１０９４ｂｐのＰＣＲフラグメントとして機能的ヒトＣλ領域のいずれかを増幅することができる。プライマＰ０８２及びＰ０８３は、それぞれＣｌａＩ及びＮｏｔＩのための制限部位を含有することができ、ＰＣＲ  フラグメントのＣｌａＩ−ＮｏｔＩによる２重消化及びｐＡＢ−１０内へのその一方向連結を可能にして、（増幅されたＣλ領域に応じて）ｐＡＢ−１１−λ１、ｐＡＢ−１１−λ２、ｐＡＢ−１１−λ３又はｐＡＢ−１１−λ７のいずれかを生成することができる（図１４ｂ）。
【０２４０】
完全なＩｇλＬ鎖レトロウイルス発現ベクターの生成のためには、完全ＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖レトロウイルス発現ベクターの生成と共に、以下の節で記述されているさまざまなｐＡＢ−１１構成体のユニークなＭｌｕＩ及びＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位内にＶλＶλ再配置された可変領域エキソンをクローニングしなければならない。
【０２４１】
実施例７：レトロウイルスＩｇＨ及びＬ鎖発現ベクター内へのＶＨＤＪＨＬ又はＶＬＪＬ可変領域エキソンのクローニング
これまで記述した異なるヒトＩｇＨ及びＩｇＬ鎖のためのレトロウイルス発現構成体は、可変ドメインのためのコーディング領域を除いて、ヒト抗体発現のための全てのコーディング領域及び制御要素を含んでいる。例えば、可変領域ドメインをコードするエキソンのさまざまなレパートリ（ライブラリ）を、さまざまなＶＨＤＪＨ及びＶＬＪＬＤＮＡ再配置を伴うＢリンパ球を含むヒト末梢血リンパ球のゲノミックＤＮＡからクローニングすることができる。可変ドメインのためのこれらのコーディング領域は、小胞体、トランスゴルジ網を通り、場合によって細胞表面に至るまでのＩｇＨ及びＩｇＬ鎖の適切な輸送のために必要とされる各々のＶＨＤＪＨＬ及びＶＬＪＬ再配置エキソンから５’のところに位置設定された（図１５）共通のリーダーエキソンを含有している必要がある。ヒトＩｇＨ、ＩｇκＬ及びＩｇλＬ可変領域リーダー配列の大部分のリーダー配列に結合する縮重プライマが記述されてきており、これらは、ＶＨＤＪＨ又はＶＬＪＬ可変コーディング領域のクローニングのためのさまざまなヒトＪＨ及びＪＬ  遺伝子セグメントを増幅する縮重プライマと組合わせて使用される。ＰＣＲ産物の一方向クローニングに用いられる制限酵素のための認識部位（図１５参照）が、縮重プライマの５’末端に補足され、大文字で強調されている。わずか１つ以上のヌクレオチドを含むことのできる縮重プライマ内の位置は、カッコ内に示されている。
【０２４２】
末梢Ｂリンパ球のヒトゲノミックＤＮＡからのリーダー配列を内含するヒトＩｇ重鎖可変ドメインのＰＣＲ増幅のための正方向プライマは以下の通りである：
【数４１】
2005525800.tif 000045
【０２４３】
末梢Ｂリンパ球のヒトゲノミックＤＮＡのリーダー配列を内含するヒトＩｇκ軽鎖可変ドメインの増幅のための正方向プライマは以下の通りである：
【数４２】
2005525800.tif 000046
【０２４４】
末梢Ｂリンパ球のヒトゲノミックＤＮＡのリーダー配列を内含するヒトＩｇλ軽鎖可変ドメインの増幅のための正方向プライマは以下の通りである：
【数４３】
2005525800.tif 000047
【０２４５】
ここで、ＢｇＩＩＩがＢａｍＨＩと同じ適合性オーバーハングを生成することから、クローニング目的のためプライマＰ０８４−Ｐ０８７の５’末端に補足されたＢａｍＨＩ制限酵素認識部位の代りに、ＢｇＩＩＩ制限酵素のための認識部位を使用することができるという点に留意されたい。ＶλＪλ領域のクローニングの場合、フラグメントを受け入れるレトロウイルス構成体がすでに内部ＢａｍＨＩ制限部位を含んでいることから、正方向プライマＰ０８８は、ＭｌｕＩ部位を含む。代替的には、ＭｌｕＩ制限酵素と同じＣＧＣＧオーバーハングを産生するＡｓｃＩ部位を含有するＰ０８８に類似したプライマを用いることも可能である。
【０２４６】
６つのヒトＩｇＨ  Ｊ鎖遺伝子セグメント全ての増幅のための逆方向プライマは、以下の通りである。大文字で強調されているＨｉｎｄＩＩＩ部位が、クローニング目的でいくつかのフランキングヌクレオチドを内含するプライマの５’末端に補足されている。
【０２４７】
ヒトＢリンパ球からのゲノミックＤＮＡを用いたＪＨ１、ＪＨ４、及びＪＨ５遺伝子セグメントを含有する可変領域エキソンのＰＣＲ増幅のための逆方向プライマは、以下の通りである：
【数４４】
2005525800.tif 000048
【０２４８】
ヒトＢリンパ球からのゲノミックＤＮＡを用いたＪＨ２、ＪＨ３及びＪＨ６遺伝子セグメントを含む可変領域エキソンの増幅のための縮重逆方向プライマは、以下の通りである。
【数４５】
2005525800.tif 000049
【０２４９】
ヒトＢリンパ球からのゲノミックＤＮＡを用いたヒトＪκ１−４遺伝子セグメントを含む可変κ領域エキソンの増幅のための逆方向縮重プライマは、以下の通りである。
【数４６】
2005525800.tif 000050
【０２５０】
ヒトＢリンパ球からのゲノミックＤＮＡを用いたＪκ５遺伝子セグメントを含む可変κ領域エキソンの増幅のための逆方向プライマは、以下の通りである。
【数４７】
2005525800.tif 000051
【０２５１】
ヒトＢリンパ球からのゲノミックＤＮＡを用いたＪλ１−３遺伝子セグメントを含む可変領域ＩｇλＬエキソンのＰＣＲ増幅のための逆方向縮重プライマは、以下の通りである。
【数４８】
2005525800.tif 000052
【０２５２】
ヒトＢリンパ球からのゲノミックＤＮＡを用いたＪλ７遺伝子セグメントを含む可変領域ＩｇλＬエキソンのＰＣＲ増幅のための逆方向プライマは、以下の通りである。
【数４９】
2005525800.tif 000053
【０２５３】
上述のプライマＰ０８４〜Ｐ０９４での再配置されたＶＨＤＪ４及びＶＬＪＬ  遺伝子セグメントを含む可変ドメインエキソンのＰＣＲ増幅及びクローニングのためには、複数の正方向又は逆方向プライマが特定の１つの可変領域について指示されている場合、等モル量のプライマが使用される。Ｈ及びκＬ鎖のための可変領域のクローニングの場合には、ＰＣＲフラグメントはＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化され、ＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖発現のためＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化されたベクター内に一方向クローニングされる。λＬ鎖のための可変領域のクローニングの場合、ＰＣＲフラグメントはＭｌｕＩで消化され、ＩｇλＬ鎖発現のためＭｌｕ／ＨｉｎｄＩＩＩで２重消化されたベクター内に一方向クローニングされる。
【０２５４】
実施例８：遺伝的に修飾されたマウスｐｒｅＢ細胞内への異種ＩｇＨ及びＬ鎖のためのレトロウイルス発現ベクターの逐次的形質導入
間質細胞及びＩＬ７依存性マウスｐｒｅＢ細胞のレトロウイルス形質導入については、例３で詳細に記述した。ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖をコードするレトロウイルス発現構成体の逐次的形質導入のためには、エコトロピックパッケージング細胞のトランスフェクション及びｐｒｅＢ細胞内に組換え型レトロウイルスを感染させるための条件について、同一のプロトコルが用いられる。唯一の差異は、２つのレトロウイルス発現構成体が以下で概略的に説明するプロトコルによって逐次的に形質導入されるという点にある。
【０２５５】
間質細胞及びＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞は、まず最初に、異種ＩｇＬ鎖をコードするレトロウイルス構成体で過渡的にトランスフェクションされたＧＰＥパッケージング細胞からの上清による感染を受ける。上述のように、ＩｇＬ鎖発現ベクターは付加的にピューロマイシン耐性マーカーを含んでいる。従って、安定した形で形質導入された細胞を、形質導入から２４時間後に、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを組織培地に添加することによって選択することができる。形質導入を受けた細胞は、さらにピューロマイシン含有培地内で４８時間培養され拡張される。形質導入を受けていないｐｒｅＢ細胞は、ピューロマイシン選択に起因して削除され、ｐｒｅＢ細胞の１００％  ＩｇＬ鎖で形質導入された集団が４８時間の培養後に得られることになる。
【０２５６】
この時点で、異種ＩｇＨ鎖をコードするレトロウイルスベクターでのトランスフェクションを過渡的に受けたエコトロピックパッケージング細胞系列ＧＰＥの上清と共に細胞をインキュベートする。その後これらの細胞をさらに２４時間培養状態に保ち、その時点で、異種免疫グロブリン重鎖の発現に起因してこれらの細胞は増殖を止める。その後細胞を収獲し、免疫障害をもつマウスの移植のためにこれを使用することができ、ここでこれらの細胞はＢ系統区画を再構築でき、又異種抗体分泌細胞を発生させる免疫応答に参与することができる。
【０２５７】
実施例９：異種抗体産生のためのマウス内への長期増殖性マウス前駆体Ｂ細胞の移植
安定した形で形質導入を受けたレトロウイルス発現ベクターからの異種ＩｇＨ及びＬ鎖を発現するＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞及び間質細胞が、Ｂ細胞欠損ＪＨＴマウス内へ、又はＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞と合わせてｃＢ１７ＳＣＩＤ、ＲＡＧ−２又はＲＡＧ−２マウス内に静脈内注射され、かくして、移植を受けた細胞は、移植を受けたマウスの抗原性刺激の時点でＴ細胞依存性又は独立性免疫応答を始めることができるようになる。
【０２５８】
このために、生後１．５〜３ヵ月のマウスに、３００〜６００ラドのγ照射を亜致死状態で行ない、照射から４〜６時間後に、マウスに、ＰＢＳ中に再懸濁させられた５×１０６〜１０７個のｐｒｅＢ細胞を静脈内注射する。ＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー細胞の付加的な移植の場合、ヒツジ抗マウスＩｇ抗体でコーティングしたダイナビーズ（ミランアナリティカＡＧ(Milan Analytika),ラ.ロッシュ,スイス）を用いてＢ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させて、同系マウスのプールされた腋窩、腸間膜及びそ径部リンパ節からＣＤ４＋細胞を単離する。１０６個のこれらの通常は９０％を上回る純度のＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞が、ｐｒｅＢ細胞と同時注射される。細胞集団は、移植後６週間、移植された宿主のＢ及びＴ細胞区画を構築させられる。
【０２５９】
実施例１０：ｐｒｅＢ細胞移植を受けたマウスの免疫化
ＨｕｐｒｅＢ細胞及びＴヘルパー細胞を用いて移植され再構築された免疫障害をもつマウスの免疫化は、基本的に記述された通りに行なわれる（ハーロウ及びレイン(Harlow and Lane),Cold Spring Harbor Laboratory Press,p150〜173）。簡単に言うと、１０〜５０μｇの抗原を２５０μｌのＰＢＳ中に溶解させ、２５０μｌの完全フロイントアジュバントと勢よく混合され、抗原−アジュバント混合物が、腹腔内注射される。２週間後に５〜２０μｇの抗原を腹腔内でマウスに追加投与し、今度は不完全フロインドアジュバンドと混合させる。最初の追加抗原投与の後１０日目に、マウスを血清中の抗原特異的異種抗体について分析する。最高の応答を示すマウスに、その後４週間目で再び、腹腔内及び静脈内の両方で不完全フロインドアジュバント中の５〜２０μｇの抗原を追加投与する。３日後、マウスから脾細胞を単離させ、異種抗原特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の生成のためにこれを使用する。
【０２６０】
実施例１１：抗体分泌形質細胞への分化のためのＨｕｐｒｅＢ細胞のインビトロ刺激
同時に間質細胞及びＩＬ７依存性ＨｕｐｒｅＢ細胞を、インビトロで完全に組織培養内で抗体分泌細胞へと分化させることができる。このために組織培地及び２〜３日間の照射済み間質細胞上での連続的培養からＩＬ７を撤去することによって連続的に増殖するＨｕｐｒｅＢ細胞培養をまず表面免疫グロブリン陽性Ｂ細胞へと分化させる。培地中に成長因子が不在である場合には、増殖は停止し、分化が誘発され、この誘発には、ｂｃｌ−２のような抗アポプトーシス遺伝子が分化細胞内で発現されないかぎりアポプトーシスの誘発が伴う。
【０２６１】
分化された細胞はその後収獲され、例えば１００Ｕ／ｍｌのｒｌＬ４及び２０μｇ／ｍｌのアゴニスト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の存在下で、新鮮な照射済み間質細胞上に再度平板固定される。培養５〜６日以内で、細胞は、異種Ｉｇ遺伝子座から大量の抗体を分泌し異種モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ細胞クローンの生成のために使用可能である形質細胞表現型の大型増殖性細胞へと分化する。
【０２６２】
実施例１２：ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成のためのＨｕｐｒｅＢ細胞から誘導された形質細胞と骨髄腫細胞の融合
インビトロ分化（例１１）の時点又は移植されたマウスの免疫化後（図１０）のいずれかで、ＨｕｐｒｅＢ細胞から誘導された形質細胞を不死化するために、不死の骨髄腫細胞系列と形質細胞を融合させることが必要である。細胞融合に用いられる骨髄腫細胞系列には、ヌクレオチド生合成のサルベージ経路に関与するＨＧＰＲＴ遺伝子の発現が欠如している。これらの細胞は、正規の組織培地内で非決定的に成長するものの、ヌクレオチド合成が組織培地への例えばアミノプテリンといった薬物の添加によって新たに遮断された場合に、死枯することになる。対照的に、ＨＧＰＲＴ遺伝子を発現する細胞は、特に付加的なチミジン及びヒポキサンチンが補充された場合、ＨＧＰＲＴ遺伝子産物がそれぞれピリミジン及びプリンヌクレオチドの合成のためにこれらの物質を利用できることから、アミノプリテンによる新たなヌクレオチド合成の遮断から切り抜けることができる。かくして、（ヒポキサンチン(hypoxanthine)、アミノプテリン(aminopterine)及びチミジン(thymidine)を含有する）ＨＡＴ選択培地内では、致死的であるものＨＧＰＲＴ＋である抗体分泌形質細胞及び不死であるもののＨＧＰＲＴ−であり従ってアミノプテリン感応性骨髄腫細胞の融合の結果得られた細胞のみが生き延び増殖する。これらの細胞は、ハイブリドーマ細胞と呼ばれ、サブクローニングされた場合、形質細胞融合パートナによりコードされる特異性をもつモノクローナル抗体を分泌することになる。
【０２６３】
ハイブリドーマ細胞の生成のためには、ＨｕｐｒｅＢ細胞での移植を受けた免疫化されたマウスの脾臓由来のいずれかの形質細胞又は抗ＣＤ４０及びＩＬ４刺激によってインビトロで生成された形質細胞が使用される。各々のケースにおいて、反復的遠心（５００ｇ５分）及び再懸濁段階によって異種細胞懸濁液が生成され、いかなる補充物もないＩＭＤＭ培地で２回清浄される。
【０２６４】
５×１０６個の骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０クーラー及びミルステイン(Kohler and Milstein),Eur.J.Immunol.,6p.511-519,1976；又はＸ６３Ａｇ８.６５３カーニー(Kaerney)ら,J.Immunol.，123,p1548-1550,1979）及び５×１０７個の脾細胞（又は５×１０７個のインビトロ分化形質細胞）が組合わされ、混合され、再び５分間５００ｇで遠心分離される。１ｍｌのＩＭＤＭ培地中の５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００希釈液を、細胞ペレットにゆっくりと添加し、その間細胞をタッピングにより再懸濁させる。２分のインキュベーション後、補充分無しの１０ｍｌのＤＭＥＭをゆっくりと添加し、場合によって５分間５００ｇで細胞を遠心分離する。上清を除去した後、１００Ｕ／ｍｌの組換え型ＩＬ６及び１倍濃縮ＨＡＴ補充物を含有する１リットルのＩＭＤＭベースの間質細胞成長培地（例１で記述されている）中で細胞ペレットを再懸濁させる。細胞は、５０枚の９６ウェルの組織培養平板内に分配され、個々のハイブリドーマクローンを同定できかつ組織培養中でのさらなる拡張及び特徴づけのため単離できるまで、３７℃でインキュベートされる。
【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１】免疫グロブリン構造及び遺伝的特徴の概略的表示である。抗体又は免疫グロブリン（Ｉｇ）は、その単量体形態で、ジスルフィド結合により共有的にリンクされた２つの同一の軽鎖（ＩｇＬ）及び２つの同一の重鎖（ＩｇＨ）から成る糖タンパク質である。各々のＩｇＨ鎖は、抗体イソタイプに応じて、１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＨ）と３〜４個の定常領域ドメイン（ＣＨ１−３又は４）を含んでいる。さらに、抗体は、第１及び第２のＣＨドメインの間にヒンジ領域を含み、ヘテロテトラマー糖タンパク質の２つの抗原結合アームに対し融通性を与える。軽鎖は、わずか１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＬ）と１つのＣ末端定常ドメイン（ＣＬ）から成る。２つのＩｇＨ及びＩｇＬ鎖の配置は、ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖可変ドメインの会合により形成される、抗原のための２つのきわめて可変的な結合部位を伴うＹ形の単量体抗体を結果としてもたらす。可変ドメインは、異なる抗体間でＶ領域を比較した場合、いわゆる超可変領域で大幅に異なっている。この可変性は、Ｖ領域が単一の遺伝子によりコードされるのではなく、ＶＨ領域の場合、各々１つずつがそこから任意に選択され次に組換えられてＩｇＨ鎖の可変コーディング領域を形成する一定数の異なるＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントによってコードされる（図面の左上部分を参照のこと）。このプロセスは、Ｖ（Ｄ）Ｊ組合せと呼ばれ、Ｂ細胞発達初期の間に起こる。ＩｇＬ鎖遺伝子座は、無作為なＶからＪへの再配置によりそこから、可変ドメインのためのコーディング配列が生成される一定数の異なるＶ及びＪ遺伝子セグメントのみを含んでいる（図面の右上部分を参照のこと）。同じサブクラス（イソタイプ）からの抗体の定常領域ドメインは、抗体のエフェクタ機能を決定し、異なる抗体間でも同一である。しかしながら、免疫応答中、発現される抗体のイソタイプを変更するために、個々のＢリンパ球を誘発することができる。この場合、体細胞ＤＮＡ組換え事象は、異なる定常領域遺伝子から５’のところにある（図面の下部で定常領域遺伝子のグラフ表示中に１つのドットで表わされている）スイッチ領域間で発生する。例えば、μ及びε−スイッチ領域間の組換えは、図面に表わされているように、ＣμからＣγ４までの全ての定常領域遺伝子の欠失を結果としてもたらすことができる。この結果として、ＶＤＪ可変コーディング配列がＣε定常領域の近くまでもって来られ、ＩｇＥイソタイプの抗体の発現を導く。
【図２】マウス内のＢ細胞の発達を例示している。マウス内のＢリンパ球の分化は、表現型及び遺伝型によって細分されうる全く異なる複数の期に細分されうる。野生型マウスの骨髄の中に見い出すことのできる最も早期に分化増殖能を獲得した前駆体Ｂ（ｐｒｅＢ）細胞は、系統特異的マーカー（Ｌｉｎ−と呼称される）を発現しないものの基幹細胞抗原１（Ｓｃａ−１）の表面発現によって特徴づけされる多能性造血基幹細胞（ＨＳＣ、左側）から誘導される。これから、両方のＩｇＨ鎖対立遺伝子の上にＤＪＨ再配置を通常担持しＢ２２０（パン−Ｂ細胞マーカー）及びｃ−キットの表面発現によって特徴づけされるｐｒｅＢ細胞が生成される。この段階で、その他のＩｇ遺伝子座は全て、通常なお生殖細胞系列（ＧＬ）立体配置内にある。ＤＪＨが再配置されたｐｒｅＢ細胞は、ｐｒｅＢ−１細胞と呼称され、特定の条件下で組織培養内で拡張され得る。これらの細胞内の次の再配置事象には、予め存在するＤＪＨ要素まで再配置するＶＨ  遺伝子セグメントの１つが関与する。これがμＨが発現され得るような形であらゆる対立遺伝子上の生産的再配置を導く場合には、これらの細胞は増殖性シグナルを受け取り、拡張し、ｐｒｅＢ−ＩＩ細胞へと分化する。これらの細胞はｃキット表面マーカーの発現を喪失するが、ＣＤ２５の発現を獲得する。ＩｇＬ鎖対立遺伝子のいずれかの上のさらなる生産的再配置が、膜結合されたＩｇＭを発現する未成熟Ｂ細胞への分化を結果としてもたらす。これらの未成熟のナイーブＢ細胞は骨髄を離れ、末梢リンパ器官内に移動し、ここでこれらは場合によって抗原と遭遇する可能性がある。免疫応答中、これらのＢ細胞はこのとき抗体分泌性形質細胞へと分化でき、その間ＩｇＨ定常領域内では、もう１つのＤＮＡ組換えプロセス（クラススイッチ組換え）が起こり、その結果形質細胞によって分泌される抗体イソタイプの変化がもたらされる可能性がある。
【図３】ヒト化された前駆体Ｂリンパ球（ＨｕｐｒｅＢ）の生成のための本発明に従った方法の図式的概覧である。マウスＤＪＨ再配置ｐｒｅＢ−Ｉ細胞は、交尾後１４〜１９日目のマウスの胚の肝臓からか又は成体マウスの骨髄から単離することができる（ステップ１）。これらの細胞の長期培養には、例えばＩＬ−７（インタロイキン７）といったような或る種の成長因子の存在及び／又は間質細胞フィーダ層を含めた特殊な組織培養条件が必要である。これらの条件下では、ｐｒｅＢ−Ｉ細胞は、さらに分化しない（ステップ２）。異種抗体の産生のためにこれらの細胞を用いるには、これらの細胞内でさらなる生産的内因性Ｉｇ遺伝子再配置が実施され得ることを防止しなければならない。これは、例えば、ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子座の両方の対立遺伝子上にシス作用性突然変異（単複）を導入することによって（ステップ３ｂ）か又は代替的に、例えば２つの組換え活性化遺伝子、ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２のうちの１つを削除することなどといったＩｇ遺伝子のさらなるＶ（Ｄ）Ｊ組換えを除去するトランス作用性突然変異（単複）を導入することによって（ステップ３ａ）達成可能である。後者の細胞はこのとき、この場合ヒトである異種のＩｇＨ及びＩｇＬ鎖の発現を媒介する能力をもつ組換え型レトロウイルスを用いて安定した形で形質導入され得る（ステップ４ａ）。これらのレトロウイルスベクターは同様に、内因性Ｉｇ遺伝子座内でシス作用性突然変異を担持する前者の細胞を安定した形で形質導入するためにも同様に使用可能である。さらに、シス作用性突然変異を担持するｐｒｅＢ細胞はなおもＩｇ遺伝子再配置にとって応答能あるものである。従って、Ｖ（Ｄ）Ｊ再配置を受ける可能性があり、かつそこから新規異種抗体を産生できるこれらの細胞を異種生殖細胞系列Ｉｇ遺伝子座でトランスフェクトすることが可能である（ステップ４ｂ）。異種(heterologous又はxenogeneic)ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子がヒト由来のものである場合、ｐｒｅＢ−１  細胞は、完全にヒトの抗体の発現に対する潜在能力しかもたず、従ってＨｕｐｒｅＢ細胞と呼ばれる。
【図４】正−負の遺伝子ターゲティングベクターを用いた内因性遺伝子座のターゲティングを例示する概略的表現である。内因性遺伝子座のターゲティングについては、その遺伝子座からおよそ１ｋｂ上流側のゲノミック領域（短アーム）及びその遺伝子からおよそ３ｋｂ（長アーム）下流側の領域が、空の正−負ターゲティングベクター内にクローニングされる。一例として、ＤＪＨ３再配置されたＩｇＨ鎖遺伝子座のためのターゲティング戦略が描かれている。この構成体は、ｐｒｅＢ−Ｉ細胞内にトランスフェクションされ、相同性組換えによるターゲティングベクターの組込みが選択され場合によってスクリーニングされる。正の選択マーカーは、トランスフェクトされた細胞のゲノム内への構成体の安定した組込みについての選択を可能にする。負の選択マーカーの発現は細胞にとって有毒なものとなり、細胞は、正しい遺伝子座での２回の相同な組換え事象によって発生する安定した組込みの時点での負の選択マーカーの喪失の場合にのみ生き延びることになる。内因性遺伝子座とターゲティング構成体の間の相同組換えのために考えられる２つの部位は、斜線により表わされている。このような相同組換え事象により構成体の組込みが発生した場合、正の薬物選択マーカーが短及び長相同性アーム間にある内因性領域を置換する。正の選択マーカーが、ここで示されているように２つのｌｏｘＰ組換えシグナルによりフランキングされている場合、ｃｒｅリコンビナーゼの過渡的発現が選択マーカーの欠失を媒介することができ、かくして同じ遺伝子座の第２の対立遺伝子のターゲティングのために同じターゲティング構成体を使用することが可能となる。
【図５ａ】ＩｇＨ鎖遺伝子座ターゲティングベクターの構築のためのクローニング戦略を例示する。ここではＤＦＬ１６．１−ＪＨ４再配置遺伝子座の例において、ＤＪＨ再配置されたマウスＩｇＨ鎖遺伝子座のための考えられる１つのターゲティング構成体の構築のための詳細なクローニング戦略が描かれている。同じターゲティングベクターで、その他のＤＪＨ再配置されたＩｇＨ鎖遺伝子座をターゲティングすることができる。内因性遺伝子座内にユニークな制限部位が示され（上部構成体１、ゲノミックＤＮＡから空の正−負ターゲティングベクターｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４にＰＣＲクローニングされている１５２３及び３２１５ｂｐの領域が表わされている（図６ｂ参照、さまざまな異なる空のターゲティングベクターの一例として、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４が選択された）。短及び長アームのためのＰＣＲプライマは、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内のユニークな適合性のある制限部位内へのフラグメントのクローニングのためのＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ制限部位を含むように設計されている。下部には最終ターゲティング構成体の組織が描かれ、選択された制限部位の位置が示されている。
【図５ｂ】ＩｇκＬ鎖遺伝子座ターゲティングベクターの構築のためのクローニング戦略を例示している。全ての生殖細胞系列Ｊκ遺伝子セグメントのターゲティングされた欠失向けに設計されたマウスＩｇκＬ鎖遺伝子座のための考えられる１つのターゲティング構成体を構築するための詳細なクローニング戦略がここに描かれている。内因性遺伝子座内にユニークな制限部位が示されており（上部構成体）、ゲノミックＤＮＡから空の正−負ターゲティングベクターｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内への７３９−３３７９ｂｐの領域が示されている（図６ｂ参照、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４がさまざまな異なる空のターゲティングベクターの一例として選択された）。図５ａにあるように、短及び長アームのためのＰＣＲプライマは、短及び長アームのｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４の適合性制限部位内へのクローニングのためのＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ制限部位を含むように設計されている。最終的ターゲティング構成体の組織は、下部に描かれており、選択された制限部位の位置が示されている。
【図５ｃ】ＲＡＧ遺伝子座ターゲティングベクターの構築のためのクローニング戦略を例示している。ＲＡＧ−１遺伝子のターゲティングされた欠失のために設計されたマウスＲＡＧ遺伝子座用の考えられる１つのターゲティング構成体を構築するための詳細なクローニング戦略が、ここで描かれている。マウス内のＲＡＧ遺伝子座は、染色体２上に位置設定され、各々Ｉｇ遺伝子の再配置にとって不可欠である２つの非常に密にリンクされた遺伝子、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２を含んでいる。両方の遺伝子の開いた読取り枠（ＯＲＦ）は、１つの単一エキソンによってコードされるが、（三角によって示されている）各々のプロモータ要素の下流側の短かい未翻訳エキソンが、全ＲＡＧＯＲＦを含む１つの大型エキソンに対してスプライされている。内因性遺伝子座内にはユニークな制限部位が表わされている（上部構成体）。それぞれＲＡＧ−１ＯＲＦの上流側及び下流側の１０７８及び２９５０ｂｐのゲノミック領域が、指示されている通り、空の正−負ターゲティングベクターｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内にゲノミックＤＮＡからＰＣＲクローニングされている（さまざまな異なる空のターゲティングベクターの一例として選択されたｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内については図６ｂを参照のこと）。図５ａの場合と同様に、短及び長アームのためのＰＣＲプライマは、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４の適合性のある制限部位の中への短及び長アームのクローニングのためのＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ制限部位を含有するように設計されている。最終ターゲティング構成体の組織は、下部に描かれており、選択された制限部位の位置が示されている。
【図６ａ】遺伝子ターゲティング用のＤＴ−α及びＤＴ−α（ｆｏｘ１７６）ベースの正負ベクターのための詳細なクローニング戦略を示す（準備段階）。空のターゲティングベクターの生成のための前提条件は、相同組換えによる内因性遺伝子座のターゲティングのために必要とされるゲノミック領域のためならびに正及び負の選択マーカーのための発現カセットの挿入用にその後使用できる付加的な有用な制限部位がポリリンカーに対し添加されるような形で、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような規則的クローニングプラスミドの多重クローニング部位（ＭＣＳ）を拡張することにある。ここで描かれているのは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＭＣＳ内に付加的な制限部位を伴う付加的なオリゴマを挿入し、かくして拡張されたポリリンカーを伴うプラスミドｐＢＳＬを生成することである。この構成体は、ＤＴα（ｔｏｘ１７６）と記された野生型ジフテリア毒素α又はその減衰したバージョンのいずれかのためのβ−アクチンプロモータで駆動された発現カセットを挿入するために用いられる（例５ｂ、ステップ２を参照のこと）。拡張された多重クローニング部位を伴うこれら２つの構成体は、それぞれｐＢＳＬ−ＤＴ４（左下）及びｐＢＳＬ−ＤＴ４ｔｏｘ１７６（右下）と呼称される。ジフテリア毒素発現カセットは、指示されているように、Ｘｂａｌ及びＢｇｌＩＩ制限部位を用いてｐＢＳＬ内にクローニングされる。減衰されたＤＴｔｏｘ１７６発現カセットにユニークな診断ＮｈｅＩ制限部位も同様に示されている。
【図６ｂ】遺伝子ターゲティングのためのＤＴ−α及びＤＴ−α（ｔｏｘ１７６）ベースの正−負ベクター向けの詳細なクローニング戦略を例示している（最終クローニング段階）。正の選択マーカーとしてのネオマイシン、ハイグロマイシンＢ又はピューロマイシンのいずれか及び野生型ジフテリア毒素α発現カセットを含有する空の正−負ターゲティングベクターのクローニングが描かれている。代りにＤＴ−α（ｔｏｘ１７６）のための発現カセットを含むベクターにも、同じくクローニング戦略を使用することができる。フラグメントのクローニング及び構成体の線状化に用いられる制限酵素も示されている。全ての正の選択マーカーは、ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得るｌｏｘＰ部位によってフランキング（ｆｌｏｘ）されるように設計されている。既存のベクターｐＧＬ２−ｎｅｏ（ｍ）＋（ＤＳＭ１４７０５）から、ｆｌｏｘされたネオマイシンカセットを再クローニングすることが可能であるものの、ｆｌｏｘされたハイグロマイシンＢ及びｆｌｏｘされたピューロマイシン発現カセットは、２段階で挿入する必要があった。このため、表示されているようにｐＢＳＬ−ＤＴ４−２ｌｏｘＰを生成する目的でＭｌｕＩ部位により分離された２つのｌｏｘＰ部位を含有する合成ＤＮＡオリゴマがｐＢＳＬ−ＤＴ４内に挿入された。最終段階では、ハイグロマイシンＢ及びピューロマイシン耐性のための発現カセットがｐＢＳＬ−ＤＴ４−２ｌｏｘＰのユニークなＭｌｕＩ部位内にＰＣＲクローニングされた。
【図７ａ】ヒトＩｇＨ鎖のためのレトロウイルス発現ベクターの概略的組織を示す。ヒトＩｇＨ鎖タンパク質の発現を可能にする組換え型レトロウイルスベクターは、Ｉｇ遺伝子座プロモータ及びエンハンサ要素ならびにＩｇＨ鎖の可変及び定常領域ドメイン用のコーディング配列を含むモジュール式設計を示している。ＩｇＨ発現カセットの転写配向は、Ｉｇ特異的プロモータ及びエンハンサ要素に基づいてＢ細胞特異的発現パターンを付与するため、レトロウイルス５’ＬＴＲプロモータ要素とは反対である。発現カセットは、マウスＶＨプロモータ、ＩｇＨ可変ドメインをコードするＶＤＪエキソンを伴うリーダー（Ｌ）配列、マウスイントロン重鎖エンハンサ（ＥμＨ）、異種ＩｇＨ鎖の定常領域をコードするエキソン、免疫グロブリンの膜貫通領域のためのエキソン及びマウスＩｇＨ３’αエンハンサからの要素を含む。異なるＬ−ＶＤＪ領域そしてＬ−ＶＤＪ領域でさえも、適合性オーバーハングを生成する制限酵素を用いてＩｇＨ発現ベクターのユニークなＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の中にクローニングすることができる。モジュール式設計に起因して、（指示されているような）、単純な分子生物学の技術を用いて、定常領域エキソン又はエンハンサ要素を置換することができる。
【図７ｂ】ヒトＩｇκＬ鎖のためのレトロウイルス発現ベクターの概略的組織を示す。図７ａに描かれたベクターと同様に、ヒトＩｇκＬ鎖タンパク質の発現を可能にする組換え型レトロウイルスベクターは、ＩｇＬ鎖特異的遺伝子座プロモータ及びエンハンサ要素ならびにＩｇκＬ鎖の可変及び定常領域ドメイン用のコーディング配列を含むモジュール式設計を示している。ＩｇκＬ発現カセットの転写配向は、Ｉｇ特異的プロモータ及びエンハンサ要素に基づいてＢ細胞特異的発現パターンを付与するため、レトロウイルス５’ＬＴＲプロモータ要素とは反対である。発現カセットは、マウスＶκプロモータ、ＩｇκＬ可変ドメインをコードするＶＪエキソンを伴うリーダー（Ｌ）配列、マウスκイントロンエンハンサ（κｉＥ）、異種ＩｇＨ鎖の定常領域をコードするエキソン及びマウスＩｇκ３’エンハンサ（カッパ３´Ｅ）からの要素を含む。さらに、レトロウイルスＩｇκＬ鎖発現ベクターは、完全ピューロマイシン発現カセットを含み、安定した形で形質導入されるｐｒｅＢ細胞の選択を可能にする。異なるＬ−ＶＪ領域そしてＬ−ＶＪ領域でさえも、適合性オーバーハングを生成する制限酵素を用いてＩｇＨ発現ベクターのユニークなＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の中にクローニングすることができる。モジュール式設計に起因して、（指示されているような）、単純な分子生物学の技術を用いて、修飾された定常領域エキソン又はエンハンサ要素を置換することができる。
【図８】異種ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖をコードするレトロウイルスベクターを用いたマウス間質細胞／ＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞のレトロウイルス形質導入のための手順を例示している。内因性Ｉｇ遺伝子再配置（図３参照）と干渉する突然変異を伴うＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞系列と長期増殖性間質細胞を、指示されている通り、ＩｇＬ鎖及びＩｇＨ鎖をコードするレトロウイルス発現ベクターを用いて、逐次的に形質導入することができる。まずは異種ＩｇＬそして次にＩｇＨ鎖を発現するレトロウイルス構成体を用いた連続的形質導入の後、細胞は、インビトロ又はインビボのいずれかでの細胞の分化の時点で異種抗体を発現する潜在能力を有する（図１０参照）。
【図９】可変ドメインコーディング領域をそこから単離できる供給源の図式的概監である。可変ドメインコーディング配列は、この図に示されているように、数多くの異なる供給源から単離することができる。レトロウイルスベクターのモジュール式設計のため、例えば既存の有用なモノクローナル抗体からの例えば単一特異性のみをコードするレトロウイルスベクターをクローニングすることができる。これらのベクター形質導入及びインビボでのマウス内への形質導入済み細胞の移植（図１０参照）の時点で、単一特異性を次に親和力成熟に付すことができる。代替的には、健康な、病気の又は免疫された患者のいずれかからの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から完全ＶＤＪ及びＶＪライブラリを単離し、その後ＩｇＨ鎖レトロウイルス発現ベクター内にクローニングすることが可能である。事実、その後安定した形で形質導入されインビボで機能的に選択され得る、レトロウイルスＩｇ発現ベクター内にクローニングされ得る完全に合成のＶＨ及びＶＬ領域レパートリを生成することさえも可能である（図１０参照）。
【図１０】完全にヒトのモノクローナル抗体の産生のための免疫不全マウス内へのＨｕｐｒｅＢの移植を例示している。ＨｕｐｒｅＢ細胞は、正常なマウスｐｒｅＢ細胞と同様、マウス宿主内に移植され得、そこで、これらは、宿主の免疫応答に参加することができる。ＨｕｐｒｅＢ細胞が、内因性Ｂ細胞が欠如した免疫不全宿主内に移植される場合、そのとき産生可能な唯一の抗体は、移植されたＨｕｐｒｅＢ細胞からの異種（ヒト）抗体である。ＨｕｐｒｅＢ細胞の移植のために使用可能な数多くの異なる宿主株が存在する。Ｂ及びＴリンパ球の両方が欠如している株は例えば、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２−欠損及びｓｃｉｄマウス株である。移植されたＨｕｐｒｅＢ細胞から誘導されたＢリンパ球が関与するＴ細胞依存性免疫応答を惹起できるためには、Ｔヘルパーリンパ球集団を単離しこれらのマウス（左側）の中に同時移植することができる。代替的には、例えばＪＨ欠損マウスのように、Ｂリンパ球だけが欠如しているマウス株を、ＨｕｐｒｅＢ細胞単独での移植により再構成することが可能である（右側）。末梢Ｂ及びＴリンパ球区画がひとたび移植後再構成されたならば、これらのマウスを、所望のいずれかの抗原に対する適当な免疫化プロトコルを用いて、免疫化することができる。これらのマウスが誘導された形質細胞は、その後、注射された免疫原性化合物又は組成物に特異的な異種（ヒト）モノクローナル抗体を常時分泌する能力をもつ（ハイブリドーマ）細胞を産生するために、例えば骨髄腫細胞との融合により不死化され得る。
【図１１ａ】抗アポプトーシス遺伝子ｂｃｌ−２の構成性発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階）。インビトロでの連続的に増殖するｐｒｅＢ細胞培養からのＩＬ−７の除去は、結果としてｐｒｅＢ細胞の分化をもたらすが、それと同時にアポプトーシスの誘発をも導く。このアポプトーシスは、例えばｂｃｌ−２のような抗アポプトーシス遺伝子の構成性発現によって防止可能である。ｂｃｌ−２のための選択可能な発現ベクターの生成のために、マウスｂｃｌ−２ｃＤＮＡは、２重遺伝子発現ベクターｐＩＲＥＳ内へのハイグロマイシンＢ読取り枠で逐次的にクローニングされる。このベクターは、中に２つの異なる遺伝子をクローニングできる２つの多重クローニング部位によってフランキングされた内在リボソーム挿入配列を含む。こうして、１つの単一プロモータからの哺乳動物内の２つの遺伝子の同時発現が可能となる。ｐＢｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢベクターの生成のためのｐＩＲＥＳ内へのｂｃｌ−２ＯＲＦ及びハイグロマイシンＢ選択マーカー遺伝子の挿入の戦略が示されている。
【図１１ｂ】抗アポプトーシス遺伝子ｂｃｌ−２の構成性発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示する（最終クローニング段階）。ＣＭＶプロモータで駆動されたｂｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ハイグロマイシンＢカセットの組立ての後、ｐＢｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢベクターからの全２重発現カセットは、ＳａｌＩ−ＣｌａＩフラグメントとして、描かれている通りにレトロウイルス移入ベクターｐＬＩＢ内に再クローニングされる。これは、ｐｒｅＢ細胞を安定した形で形質導入し、ｂｃｌ−２の同時発現及びハイグロマイシンＢ耐性を付与するのに用いられる組換え型レトロウイルス構成体ｐＬＩＢ−Ｂｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢを生成する。
【図１２ａ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階Ｉ）。さまざまなＩｇＨプロモータ及びエンハンサ要素ならびに異なる可変及び定常領域ドメインのためのコーディング配列が、例えばプラスミドｐＬＩＢといったようなレトロウイルス移入ベクター内に逐次的にクローニングされる。このプラスミドは、レトロウイルスパッケージング及びプロウイルス組込みに必要な全ての要素、すなわち５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル、及び（指示された通り）ＣｏｌＥ１複製起点を伴う細菌のアンピシリン選択可能プラスミドバックボーン内にクローニングされた３’ＬＴＲを含有する。ここで描かれているのは、ＶＨプロモータ、フランキングマトリクス付着領域（ＭＡＲ）を含むマウス重鎖イントロンエンハンサ（ＥμＨ）及びＩｇＨ鎖３’αエンハンサ（３’αＥ）である。ＰＣＲ増幅されたフラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階で使用可能なプラスミドバックボーン内のユニークな適合性制限酵素が強調されている。
【図１２ｂ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階ＩＩ）。ＩｇＨ３’αエンハンサは、４つの機能的領域を含み、これらは、末端Ｂ細胞分化の間のエンハンサの活性化時点で、ＤＮａｓｅｌ消化に対し感応性の高いものとなり、従って超感応性領域と呼ばれる。これらのＨＳ領域の各々は、３’αＥのエンハンサ活性に寄与するが、エンハンサ活性の大部分は、ＨＳ１，２領域によって付与される。単独で３’αＥのＨＳ１，２領域は、全３’αＥ領域とほぼ同じレベルまでレポータ遺伝子発現を駆動できるが、いくつかのレトロウイルスＩｇＨ発現構成体にとっては３’αＥのその他の機能的領域を内含することが望ましいかもしれない。従って、３’αＥのＨＳ３及びＨＳ４領域のクローニングがここで描かれている。ゲノミックＰＣＲ  フラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階で使用可能なプラスミドバックボーン内の適合性のある制限酵素が強調されている。
【図１２ｃ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を示している（準備段階ＩＩＩ）。ＩｇＨプロモータ及びエンハンサ要素のレトロウイルス移入ベクター内へのクローニングに続いて、ＩｇＨ鎖のためのコーディング配列を挿入する必要がある。膜結合された、ならびに分泌された形態の免疫グロブリンを発現できるようにするために、ＩｇＨ鎖の膜貫通領域のためのエキソンをレトロウイルス発現ベクター内に内含させることが必要である。膜貫通領域は、異なるイソタイプ間で長さ、一次配列及びエキソン／イントロン構造が著しく異なる。従って、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ重鎖のための異なる膜貫通領域をクローニングすることが必要である。一例として、プラスミドｐＡＢ−３内への４つのそれぞれの異なる膜貫通領域のＰＣＲクローニングと挿入が描かれている。同じクローニング手順は、ＩｇＨ３’αＥの拡張されたバージョンを含むベクターＰＡＢ−４及びＰＡＢ５で実施することができる。ゲノミックＰＣＲフラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびに、さまざまなクローニングで使用可能なプラスミドバックボーン内の適合性のある制限酵素が強調されている。
【図１２ｄ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階ＩＶ）。ヒトＢリンパ球は、配列がわずかに異なりかつ異なる生理学的エフェクタ機能を示す４つの異なるＩｇＧイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を産生することができる。すでにＩｇＧ膜貫通エキソンを含む中間ベクターｐＡＢ−３．２内への定常領域遺伝子のクローニングがここに描かれている。さまざまなＩｇＧイソタイプのためのヒンジ（Ｈ）領域をコードするエキソンを内含する内因性エキソン／イントロンの組織が示されている。ゲノミックＰＣＲフラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階で使用可能なプラスミドバックボーン内のユニークな適合性のある制限酵素部位が示されている。ＶＤＪ再配置された可変ドメインエキソンのクローニングの時点で、これらの構成体は、完全なＩｇＧ鎖を発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１２ｅ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階Ｖ）。残りのヒトＩｇイソタイプＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＥのための定常領域遺伝子のクローニングについてここで描かれている。図１２ｄで描かれたＩｇＧ定常領域遺伝子についてのクローニング手順と同様に、これらのイソタイプのためのゲノミック領域は、これらのイソタイプのためのそれぞれの膜貫通エキソンの下流側のユニークなＮｏｔＩ制限部位の中にＮｏｔＩ消化されたＰＣＲフラグメントとして挿入されている。さまざまなＩｇＧイソタイプのためのヒンジ（Ｈ）領域をコードするエキソンを内含する内因性エキソン／イントロンの組織が示されている。ゲノミックＰＣＲフラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階で使用可能なプラスミドバックボーン内のユニークな適合性制限酵素部位が示されている。ＶＤＪ再配置された可変ドメインエキソンのクローニングの時点で、これらの構成体は、それぞれのイソタイプの完全なＩｇＨ鎖を発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１３ａ】ヒトＩｇκＬ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階Ｉ）。ＩｇＨ鎖についてのレトロウイルス発現ベクターの構築と類似して、ＩｇκＬ鎖のための発現ベクターは、レトロウイルス移入ベクター内に逐次的にＣＬＮされる必要のあるκＬ鎖遺伝子座特異的プロモータ及びエンハンサ要素をκＬ領域タンパク質のためのコーディング配列に加えて必要とする。基本的レトロウイルスベクターｐＬＩＢから出発して、まず、指示されている通りＶκプロモータがｐＬＩＢ内にクローニングされる。この後には、ヒトκＬ鎖定常領域遺伝子（図面の左側）及びヒトκイントロンエンハンサ（その上流側マトリクス関連領域ＭＡＲを伴うκｉＥ）を含むＰＣＲ産物の挿入、又代替的には、単一重複拡張（ＳＯＥ）ＰＣＲにより生成されるヒトκＬ鎖定常領域遺伝子（図面の右側）を伴うマウスκｉＥの融合ＰＣＲフラグメントの挿入が続いている。両方の構成体の中に、マウスκ３’エンハンサ（κ３’Ｅ）を含むＰＣＲ産物が挿入される。さまざまなゲノミックＰＣＲフラグメントの末端に取込まれている制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階内で使用可能なプラスミドバックボーン内のユニークな適合性制限酵素部位が示されている。
【図１３ｂ】ヒトＩｇκＬ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示する（準備段階ＩＩ）。ヒトＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖のためのレトロウイルス発現構成体は、ｐｒｅＢ細胞内に逐次的に形質導入されることになり、従ってＩｇκＬ鎖発現ベクターでの第１回目の形質導入の後、安定した形で形質導入された細胞について逐次可能であることが望ましい。このような理由からＳＶ４０プロモータで駆動されたピューロマイシン発現カセットが、指示されているように、２つの考えられるＩｇκＬ鎖レトロウイルス移入ベクター中間体ｐＡＢ−７．１及びｐＡＢ−８．１内に挿入される。これらのベクター内へのＶκＪκ再配置された可変ドメインエキソンのクローニング時点で、これらのレトロウイルス構成体は、ヒトＩｇκＬ鎖を発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１４ａ】ヒトＩｇκＬ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を示す（準備段階Ｉ）。ヒトＩｇλＬ鎖のためのレトロウイルス発現構成体は、まずｐＬＩＢ内にＶλプロモータ及びピューロマイシンカセットの融合ＰＣＲ産物を挿入することによってクローニングされる（ＰＣＲ融合は、例の節で記述されているように、単一重複拡張（ＳＯＥ）ＰＣＲによって行なわれる）。次の段階では、λＬ鎖エンハンサ要素、λ２−４及びλ３−１エンハンサのＳＯＥ−ＰＣＲ融合構成体が、指示された通りに構成体の中に挿入される。最終的に、ヒトＣλ１領域のコーディング配列が、指示された制限酵素を用いてこのレトロウイルスクローニングベクター内にＰＣＲクローニングにより挿入される。これらのベクター内へのＶλＪλ再配置された可変ドメインエキソンのクローニング時点で、これらのレトロウイルス構成体は、ヒトＩｇλＬ鎖を発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１４ｂ】ヒトＩｇλＬ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示する（準備段階ＩＩ）。指示された通りユニークなＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ制限酵素を用いた単純なクローニングによりＣλ１コーディング配列を置換するために、その他のヒトＩｇλＬ鎖定常領域遺伝子を使用することができる。ＶλＪλ再配置されたベクターＤエキソンをこれらのベクター内にクローニングした時点で、指示された通り、これらのレトロウイルス構成体は、異なるヒトＩｇλＬ鎖イソタイプを発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１５ａ】レトロウイルスヒトＩｇＨ、ＩｇκＬ及びＩｇλＬ鎖発現ベクター内へのＶ領域遺伝子の挿入を示す。これまで記述されてきたヒトＩｇＨ及びＬ鎖のための全てのレトロウイルス発現構成体は、可変ドメインのためのコーディング配列を含んでいなかった。これらは、さまざまな供給源からのＰＣＲクローニングによって単離され得（例えば図９を参照のこと）、単一特異性をコードするＶ領域エキソンとして又は（縮重プライマ対でＰＣＲ増幅される必要のある）異なる特異性をコードするライブラリとして、レトロウイルスベクター内に挿入され得る。Ｖ領域は、指示されているように、その特徴的リーダー（Ｌ）配列と合わせてＰＣＲ増幅される。可変領域エキソンのクローニングのためには使用可能な制限酵素が示されている。この図面は、いくつかの選択された最終的レトロウイルスＩｇＨ及びＩｇＬ鎖発現ベクターを描いている。これらのベクターがモジュール式設計であるため、異なるコーディング領域及びプロモータ及びエンハンサ要素を使用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2005525800.tif 000067
【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
2005525800.tif 000074
【図１３ａ】
2005525800.tif 000075
【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【配列表】
2005525800000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年4月16日(2004.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつあらゆる結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生のために使用可能な脊椎動物リンパ球の生成方法において、
ヒトにおけるインビボ産生が除外されることを条件として、
（ａ）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を導入することによって、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階；及び
（ｂ）インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力をもつリンパ球を生成する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
（ａ）ハイブリッドーマ細胞を生成するために骨髄腫細胞に分化したリンパ球を融合させること、
（ｂ）形質転換ウイルスにそれを感染させること、または
（ｃ）少なくとも１つの形質転換する癌遺伝子の発現を確保するベクター構成体でそれをトランスフェクトすること、
によって、分化したリンパ球を不死化させ、かくして、前記人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメントを常時産生する能力をもつ脊椎動物リンパ球を生成する段階をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脊椎動物前駆体リンパ球が、リンパＶ(Ｄ)Ｊ組換え機構の少なくとも１つの構成要素を発現することができ、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物に由来する（なおマウスからのマウス前駆体（ｐｒｅ）Ｂリンパ球が好まれる）、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記脊椎動物前駆体リンパ球が、内因性抗体及び／又は抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）を発現する潜在能力を有しておらず、これは内因性免疫グロブリン又はそのフラグメントの発現が欠如している脊椎動物前駆体リンパ球を単離／選択すること及び／又は、
（ａ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部分を含めた、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のコーディング領域、及びその膜貫通エキソンを伴う又は伴わないμ、δ、γ、ε及びα重鎖のための定常領域エキソン用のコーディング領域のうちのいずれか；
（ｂ）Ｖ及びＪ遺伝子セグメントコーディング領域のいずれかを含めた免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖遺伝子座のコーディング領域、ならびに定常領域エキソンのうちのいずれか；
（ｃ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部を含めたＴ細胞レセプタα、β、γ及びδ遺伝子座のコーディング領域、及びα、β、γ及びδ定常領域エキソンのためのコーディング領域のいずれか；
（ｄ）重鎖イントロンエンハンサ及び３’αエンハンサを含む、シス作用性免疫グロブリン重鎖遺伝子エンハンサ要素；
（ｅ）κ重鎖イントロンエンハンサ（κｉＥ）、３’κエンハンサ及びλ２−４及びλ３−１エンハンサを含むシス作用性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座；
（ｆ）ＴＣＲα、β、γ及びδエンハンサを含めた、シス作用性Ｔ細胞レセプタ遺伝子座エンハンサ要素；
（ｇ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含むトランス作用性組換え活性化遺伝子、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２ならびにそのコーディング領域；及び
（ｈ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含む、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の触媒サブユニット、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４及びＡｒｔｅｍｉｓを含む、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えに不可欠のトランス作用性ＤＮＡ修復遺伝子、ならびに該遺伝子のコーディング領域、
から成るグループの中から選択されている少なくとも１つの遺伝要素の少なくとも１つの対立遺伝子を機能的に不活性化するように設計された少なくとも１つのベクター構成体を前記脊椎動物前駆体リンパ球内に導入することによって達成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクター構成体が、好ましくは正のトランスフェクタントの選択を可能にする正の選択マーカーにフランキングする、相同的組換えのための機能を付与する前記少なくとも１つの遺伝要素に対するＤＮＡ配列相同性をもつ領域を含む遺伝子ターゲティングベクターを内含している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子ターゲティングベクターが付加的に、正の選択マーカーをフランキングし、同族リコンビナーゼ酵素の少なくとも１つをコードする核酸配列のトランスフェクション及び過渡的発現の時点で前記正の選択マーカーの欠失を可能にする、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素のための一対のＤＮＡ認識配列を含んで成る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子ターゲティングプラスミドベクターが付加的に、内部で前記遺伝子ターゲティングベクターが非相同的組換えによりゲノム内に無作為に組込まれているトランスフェクタントに対する選択を可能にする負の選択マーカーを含んで成る、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）をコードする前記少なくとも１つの外因性遺伝要素が、
（ａ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスＤＮＡ構成体；
（ｂ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのＤＮＡ構成体；
（ｃ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ(Ｄ)Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、再配置されていないＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ−免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座；
（ｄ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ(Ｄ)Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｅ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントの（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように設計された修飾された配置内の少なくとも１つの異種免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｆ）一次アミノ酸配列（単複）に関して野生型である、少なくとも１つの異種抗体又はＴ細胞レセプタのＶ(Ｄ)Ｊ組換え及びその後の発現を可能にする生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを包含する異種染色体のフラグメントである染色体導入要素、
から成るグループの中から選択された遺伝子構成体上に担持されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの外因性遺伝要素が、未変性又は修飾済みヒト抗体、ヒト結合タンパク質、ヒト抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントをコードする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの外因性遺伝要素が結合領域の親和力成熟を受ける能力をもつ異種又は人工レセプタをコードする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
脊椎動物前駆体リンパ球の分化がインビトロで、
（ａ）前記脊椎動物前駆体リンパ球の増殖を停止させ、あらゆる前駆体リンパ球成長因子の不在下で培養することによって成熟リンパ球系統細胞への分化を誘発すること；及び
（ｂ）（ｉ）インタロイキン−２、インタロイキン−４、インタロイキン−５、インタロイキン−６、インタロイキン−１０、インタロイキン−１３、ＴＧＦ−β及びＩＦＮ−γを含む可溶性Ｔ細胞関連刺激因子；
（ii）ＣＤ４０、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、補体レセプタ１（ＣＤ３５）及び２（ＣＤ２１）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ｌｇα（ＣＤ７９α）、ｌｇβ（ＣＤ７９β）、ＴＡＰＡ−１（ＣＤ８１）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＴＮＦ−レセプタ１（ｐ５５、ＣＤ１２０ａ）、ＴＮＦ−レセプタ２（ｐ７５、ＣＤ１２０ｂ）、Ｏｘ−４０（ＣＤ１３４）、及びリンフォトキシン−βレセプタに特異的な活性組換え型リガンド又はアゴニスト抗体を含む、Ｂ細胞の副刺激レセプタを活性化する因子；及び
（iii）Ｂ細胞マイトジェン因子、１型のＴ細胞依存性抗原及び、リポサッカリド（ＬＰＳ）、グラム陰性菌からのリポタンパク質、ポリアニオン、ポリ−ｄｌｄＣ、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）及び抗免疫グロブリン試薬を含むその他のポリクローナル活性体、
及びそれらの組合せの中から選択された成分のうちの少なくとも１つの存在下で前記細胞をさらに培養することによりリンパ球終末分化を誘発すること
によりもたらされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
インビボでの前記分化が、適切な脊椎動物宿主内への前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の移植の時点でもたらされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンパ球が、ナイーブな又は抗原で初回免疫されたＴヘルパーリンパ球を用いて前記宿主内に同時移植される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インビボでの分化の後には、少なくとも１つの所望の免疫原性化合物又は組成物での前記宿主の免疫化が続いている、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脊椎動物宿主が、内因性Ｂ細胞、Ｔ細胞及び／又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞又はその組合せの生成に関して欠損している適合性のある宿主である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
脊椎動物宿主が、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物の中から選択され、マウスが好ましい宿主種である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
それ自体周知の要領で、あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつあらゆる結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生方法において、
ヒトにおけるインビボ産生が除外されることを条件として、
（ａ）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を導入することによって、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階；又は、代替的には、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有し、かつ
（iii）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を担持する、
遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球を使用する段階；
（ｂ）インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力をもつ遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球を生成する段階；
又、代替的には、
前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力を持つ前記遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球を使用する段階；
（ｃ）結合タンパク質又はその機能的フラグメントの発現をもたらす段階、
を含む方法。
【請求項１８】
段階（ｂ）の後に、
（ａ）少なくとも１つの外因性遺伝要素を前記分化されたリンパ球から単離する段階；及び
（ｂ）前記少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生を可能にする状況下に前記遺伝要素を置く段階、
が続いている、請求項１又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、１つのユニークな特異性を示し従ってモノクローナルである、請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が複数のユニークな特異性を示し、従ってポリクローナルである、請求項１７又は１８に記載の使用。
【請求項２１】
前記異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、ヒトの遺伝的レパートリ又はその一部分に基づいて組立てることができるようなヒト抗体、抗原レセプタ又は結合タンパク質に完全に又は部分的に類似している、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
産生させるべき異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、
（ａ）膜結合又は分泌され、天然の抗体の中に見られる化学量論的組成物内の非相同重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方から成り、かつ既知の重（μ、δ、γ、ε）及び／又は軽（κ及びλ）鎖イソタイプのいずれかから成る抗体；
（ｂ）一次アミノ酸配列に関して完全にヒトである重鎖及び軽鎖ポリペプチドの組合せを伴う抗体；
（ｃ）異なる脊椎動物種からの異種重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含有するハイブリッド抗体；
（ｄ）完全に又は部分的に異種である、分泌されたＦａｂ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ’）２抗体フラグメント、
（ｅ）二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを結果としてもたらす、リンカーペプチドを介して共有結合でカップリングされた抗体のフラグメント、
（ｆ）免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質と構造的類似性をもつ、α、β、γ及びδイソタイプ、抗原レセプタ及びその他の結合タンパク質のＴ細胞レセプタ、
及びそれらの機能的フラグメントから成るグループの中から選択される、
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により得ることのできる、遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球及びより成熟したリンパ球系統細胞。
【請求項２４】
請求項２〜１６のいずれか１項に記載のものに従って得ることのできる、異種抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントを産生する不死化された細胞。
【請求項２５】
請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法において使用するためのベクター構成体。
【請求項２６】
請求項８に記載の方法において使用するための遺伝的構成体。
【請求項２７】
野生型免疫エフェクタ機能、又は生殖細胞系列でコード化された異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾済み又は人工エフェクタ機能を示す、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法により得られた、少なくとも１つの抗体、人工結合タンパク質、抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントを含む、薬学又は診断用調製物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
完全にヒトのモノクローナル抗体の産生のための第２のアプローチは、ヒト免疫グロブリンＨ及びＬ鎖遺伝子座のための遺伝子導入マウス包含構成体の使用に基づくものである（ジャコボヴィッツ(Jakobovits),Curr.Opin.Biotechnol.6,p561〜566,1995）。ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、場合によって、もはや内因性マウス抗原レセプタ遺伝子の組立てを可能にしない遺伝的背景上へと繁殖される。これらのマウスにおいては、Ｂ系統細胞の発達は、ヒト遺伝子導入構成体からの免疫グロブリンＨ及びＬ鎖の発現によって左右され、これらのマウスのＢ系統細胞は、ヒト抗体を産生する能力しかもたない。この技術には３つの変形形態が存在する。その１つにおいては、導入遺伝子としてヒト免疫グロブリンミニ遺伝子座が使用され、これからはヒト抗体の制限されたレパートリしか生成することができない（フィッシュワイルド(Fishwild)ら,14,p845〜851,1996）（同じく欧州特許第 ０ ５４６ ０７３ Ｂ１号明細書、米国特許第５，８７４，２９９号明細書、および国際公開第９２／０３９１８号パンフレットも参照のこと）。第２の変形形態では、酵母人工染色体内にクローニングされた可変領域遺伝子セグメントの大部分を包含するヒトＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖遺伝子座の大きな領域が使用される。第３の変形形態では、完全ヒト免疫グロブリンＨ及びＬ鎖遺伝子座を含有するヒト染色体片が、いわゆる染色体導入動物を生成するマウスの生殖細胞系列内に組込まれる。このような複合導入遺伝子をもつマウスは、事実上正常なヒト免疫グロブリンレパートリを発達させる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
しかしながら、この技術には、１つの重大な欠点がある。すなわち、まず第１に、遺伝子導入又は染色体導入マウスの生成は、非常に冗漫で困難、かつ時間のかかるものであり、従って比較的高価である。例えば、国際公開第９２／０３９１８号パンフレットは、ヒトモノクローナル抗体を発現する遺伝子導入マウスのＢ細胞を開示している。この遺伝子導入マウスを達成するためには、原核注入により異種ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖導入遺伝子を導入することによって外因性要素を受精卵にトランスフェクトする。手順全体には、少なくとも４つの異なるマウス株、つまり内因性ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子座内のターゲティングされた分析を伴う２つの株ならびにヒトＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子座の一部分又は全てについての導入遺伝子又は導入染色体を担持する２つの株の生成が必要とされる。さらに、これら４つのマウス株全てが一緒に繁殖され、内因性ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子座の両方の同型接合時分断を担持すると同時に異種ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖の両方をコードするヒト導入遺伝子を担持する遺伝子型をもつマウスを結果としてもたらすことが必要である。異なるノックアウト及び遺伝子導入マウス株の生成、そのスクリーニング及び場合によっての交雑育種は、各ステップを完全に最適化した場合でさえ少なくとも２年はかかることになる冗長な手順である。従って、異種マウス株の開発に必要とされる時間枠が広大であるため、修飾済み遺伝子導入構成体を含有する、異なるマウス株を設計するための融通性はほとんど残されていない。従って、この技術は、この１つの抗体について新規の遺伝子導入マウス株を生成する冗長な手順を必要とすることになるために、既存の抗体の修飾及び改良（例えばその親和力の）に適してはいない。この技術は、従って、基本的に、ヒト抗体のデノボ（新規の）生成に制限される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明は、あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつあらゆる結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生のために使用可能な脊椎動物前駆体リンパ球の生成手段及び方法を提供している。特に本発明は、脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾し、インビトロ又はインビボのいずれかでより成熟したリンパ球系統細胞へのそれらの分化を実施し、かくして前記結合タンパク質またはその機能的フラグメントを産生する能力をもつリンパ球を生成する手段及び方法、ならびに前記結合タンパク質またはその機能的フラグメントの産生方法を提供する。さらに本発明は、本発明に従った方法を実施するのに適した一般に遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球及び成熟リンパ球系統細胞ならびにそれらから誘導された不死化細胞を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
第１の態様に従うと、本発明は、あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつあらゆる結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生のために使用可能な脊椎動物リンパ球の生成方法において、
ヒトにおけるインビボ産生が除外されることを条件として、
（ａ）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を導入することによって、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ｉｉ）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階；及び
（ｂ）インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力をもつリンパ球を生成する段階、
を含んで成る方法を提供している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
上述の結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメントの大規模産生を達成するためには、問題のポリペプチドを産生する終末分化されたリンパ球が不死化されているか又は代替的には、異種抗原又は結合タンパク質についてコードする遺伝情報が単離されこれらの細胞から異なる発現系内へと移送され、ここでこの遺伝情報を維持、増幅しかつ／又はそれぞれの免疫グロブリン又は免疫グロブリン様タンパク質又はその機能的フラグメントの産生のために使用できることが好ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
前記リンパ球の不死化は、好ましくは、
（ａ）ハイブリッドーマ細胞を生成するために不死の骨髄腫細胞に分化したリンパ球を融合させること、
（ｂ）例えばアベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）形質転換ウイルスにそれを感染させること、または
（ｃ）例えば過剰発現の時点で、安定した形でトランスフェクトされた細胞の不死化を導くｖ−ａｂ１またはＳＶ４０大型Ｔ抗原といったような少なくとも１つの形質転換する癌遺伝子の発現を確保する適切なベクター構成体でそれをトランスフェクトすること、
によって、達成でき、かくして、前記結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメントを常時産生する能力をもつ脊椎動物リンパ球が生成されることになる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
ヒトから、進化的には最も原始的である軟骨魚類にまで至る全ての顎口脊椎動物種の中の一次前駆体Ｂリンパ球は、（マウスにおけるＢ２２０及びｃ−キットの組合せのような）特定の細胞表面マーカーセットの発現によって特徴づけられるだけでなく、そのためにＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２及びＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）といったようなＶ(Ｄ)Ｊ組換え機構のリンパ特異的成分の発現対象である抗体の可変ドメインをコードする遺伝子セグメントを組立てるそれらの潜在能力によっても特徴づけられる。鳥類といったような一部の種は、これらの前駆体Ｂリンパ球が生成される、異なる一次リンパ器官（例えばファブリキウス嚢）を有するものの、そしてＶ(Ｄ)Ｊ組換えに加えて、その他の種は体細胞超変異（例えばヒツジ）又は遺伝子変換（例えばウサギ）といったような抗体多様化のための異なるメカニズムをも使用するという事実にも関わらず、全ての脊椎動物種からの前駆体Ｂリンパ球は、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えを受ける能力をもち、ＶＤＪ再配置された免疫グロブリン遺伝子座から生成された抗体が発現され得るように、より成熟したＢ系統細胞へと分化する潜在能力を有している。従って、内因性抗体を発現することのできない、かかる脊椎動物前駆体Ｂリンパ球が単離されるか又は生成された場合、及び異種免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部をコードする遺伝要素がこれらのリンパ球内に安定した形で導入された場合、それらは、異種抗体を産生する潜在能力を得ることになり、かくして本発明により包含される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
従って、さらなる実施形態においては、所望の遺伝的修飾をもたらすために使用される、結合タンパク質、又はその機能的フラグメントをコードする前記少なくとも１つの外因性遺伝要素が、
（ａ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの結合タンパク質、又はその機能的フラグメントの発現を確保するべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスＤＮＡ構成体；
（ｂ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの結合タンパク質、又はその機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのＤＮＡ構成体；
（ｃ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ(Ｄ)Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、再配置されていないＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ−免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座；
（ｄ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ(Ｄ)Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｅ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列内に指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗原又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ(Ｄ)Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように設計された修飾された配置内の少なくとも１つの異種免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体； 
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
染色体導入フラグメント上に存在するか又はＢＡＣ、ＹＡＣ又はＶＡＣベクター構成体内にクローニングされうる生殖細胞系列の異種免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部分又は全てを担持するＤＮＡ構成体は、電気穿孔、リン酸カルシウム又はＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、リポソーム媒介移入、スフェロ又はプロトプラスト融合、弾道移入、マイクロインジェクション、又は特異的タンパク質−アダクツ形成又はそれらの組合せを含む標準的な遺伝子移入手順を用いて、長期増殖性標的ｐｒｅＢ細胞内に安定した形で移入することができる。例えばピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ヒスチジノール、マイコフェノール酸、ゼオシンなどといったものに対する耐性を付与する遺伝子を含む、ＹＡＣ、ＢＡＣ及びＶＡＣベクターバックボーンの中に含まれた適切な（薬物）選択マーカーによって選択可能である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
第３の概念的に異なるアプローチは、異種の、好ましくはヒトの抗体及び結合タンパク質をコードする異種遺伝要素を導入するために使用可能である。この代替的方法に従うと、異種遺伝要素は、標的細胞として多能性造血基幹細胞を用いる遺伝病向けの遺伝子療法との関連で記載されてきたレトロウイルス形質導入を用いてマウスｐｒｅＢ細胞内に安定した形で移入される（アンドンスン(An Dong Sung)ら,J.Virol,75(8),p.3547-3555(2001年)を参照のこと）。レトロウイルス移入ベクターは、外来性ＤＮＡを７〜１０ｋｂしか収容できず、このため、異種の好ましくはヒトの抗体及び結合遺伝子のための発現ベクターのクローニングは著しく容易になる。従って、異種抗体及び結合遺伝子の全ての特性は、レトロウイルス移入ベクターを用いた標準的な分子生物学技術により容易かつ急速に修飾可能である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
異種抗体又は結合タンパク質を発現する潜在能力を得ることになるように上述の方法のいずれかによって遺伝的に修飾された脊椎動物のｐｒｅＢ細胞は、異種抗体又は結合タンパク質を発現させ場合によって分泌させることができるように、成熟Ｂ系統細胞そして、場合によって形質細胞へと分化される必要がある。これは、インビトロでの組織培養内で又は、インビボでの適切な脊椎動物宿主内への遺伝的に修飾したｐｒｅＢ細胞の移植の時点で分化により達成できるが、ここで、ヒトにおけるインビボ産生は除外することが条件となる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
遺伝的に修飾された前駆体リンパ球のインビトロ分化に対する１つの代替案として、これらの細胞は、同様に適切な脊椎動物非ヒト宿主内への移植の時点でインビボで分化され得、その結果、これらの細胞は二次リンパ器官へと移動し、より成熟したリンパ球系統細胞へと分化する。好ましくは、前記リンパ球は、ナイーブな又は抗原初回免疫を受けたＴヘルパーリンパ球と共に前記宿主内に同時移植され、ここで「同時移植される」という語は、正確に同じ時点での同時移植に制限されないものとして理解すべきである。もう１つの好ましい実施形態に従うと、インビボでの分化の後には、少なくとも１つの所望の免疫原性化合物又は組成物での前記宿主の免疫化が続く。本書で記載されている方法とは対照的に、ＳＣＩＤマウス内への遺伝的に修飾されていないヒトＣＤ３４＋造血基幹細胞の移植（国際公開第０１／８７０５８号パンフレット）は、（適合ヒトＴ細胞の欠如のため）高親和力抗体の生成も、これらのＢ細胞により産生された抗体のタイプ及び特性の融通性も、全く可能にするものではない。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
以上のことから明らかになるように、本発明のさらなる態様は、それ自体周知の要領で、あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつあらゆる結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生方法において、
ヒトにおけるインビボ産生が除外されることを条件として、
（ａ）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を導入することによって、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階；又は、代替的には、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有し、かつ
（iii）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を担持する、
遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球を使用する段階；
（ｂ）インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力をもつ遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球を生成する段階；
又、代替的には、
前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力を持つ前記遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球を使用する段階；
（ｃ）結合タンパク質又はその機能的フラグメントの発現をもたらす段階、
を含む方法を提供している。
この状況下で、遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球の生成を含む以上の方法のいずれにも以下の段階、
（ａ）少なくとも１つの外因性遺伝要素を前記分化されたリンパ球から単離する段階、及び
（ｂ）前記少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生を可能にする状況下に前記遺伝要素を置く段階、
が続くことが好ましい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
上述の結合タンパク質、又はその機能的フラグメントは、１つのユニークな特異性を示し従ってモノクローナルであることもでき、又は複数のユニークな特異性によってコードされ従ってポリクローナルであることもできる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
好ましい実施形態に従うと、前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントは、ヒトの遺伝的レパートリ又はその一部分に基づいて組立てることができるような、ヒト抗体、抗原レセプタ又は結合タンパク質の構造的及び／又は機能的特長を完全に又は部分的に共有する。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
さらに、産生させるべき結合タンパク質、又はその機能的フラグメントが、
（ａ）膜結合又は分泌され、天然の抗体の中に見られる化学量論的組成物内の非相同重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方から成り、かつ既知の重（μ、δ、γ、α、ε）及び／又は軽（κ及びλ）鎖イソタイプのいずれかからなる抗体；
（ｂ）一次アミノ酸配列に関して完全にヒトである重鎖及び軽鎖ポリペプチドの組合せを伴う抗体；
（ｃ）異なる脊椎動物種からの異種重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含有するハイブリッド抗体；
（ｄ）完全に又は部分的に異種である、分泌されたＦａｂ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ'）２抗体フラグメント、
（ｅ）二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを結果としてもたらす、リンカーペプチドを介して共有結合でカップリングされた抗体のフラグメント、
（ｆ）免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質と構造的類似性をもつ、α、β、γ及びδイソタイプ、抗原レセプタ及びその他の結合タンパク質のＴ細胞レセプタ、
及びそれらの機能的フラグメントからなる群の中から選択されることが好ましい。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
もう１つの態様に従うと、本発明は、
（ａ）一次リンパ器官から誘導され、成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力をもち、
（ｂ）あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる異種抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる異種人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも１つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を担持し、かつ
（ｃ）前記少なくとも1つの外因性遺伝要素に操作可能な形でリンクされた少なくとも１つの選択マーカーを担持する、
遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球を提供している。
更にもう１つの態様に従うと、本発明は、
（ａ）あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる異種抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる異種人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも1つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を担持し、かつ
（ｂ）前記少なくとも1つの外因性遺伝要素に操作可能な形でリンクされた少なくとも１つの選択マーカーを担持する、
成熟リンパ球系統細胞を提供している。
さらなる態様に従うと、本発明は、
（ａ）あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる異種抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる異種人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも１つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を担持し、
（ｂ）前記少なくとも１つの外因性遺伝要素に操作可能な形でリンクされた少なくとも１つの選択マーカーを担持し、かつ
（ｃ）前記少なくとも１つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する、成熟リンパ球系統細胞から誘導された不死化された細胞を提供する。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
実施例１：成熟Ｂ系統細胞へと分化する潜在能力をもつ長期増殖性マウス前駆体Ｂ細胞の確立
間質細胞及びＩＬ７応答性マウス前駆体Ｂ細胞が、交尾後１５〜１８日目のマウス胎児の胚の胎児肝臓の中、成体マウスの骨髄内ならびに新生動物（生後３週間未満）の脾臓内に見い出される（ローリンク(Rolink)ら,Blood, 81,p.2290-2300,1993）。これらのｐｒｅＢ細胞を単離するため、マウスをＣＯ２窒息により殺処分し、それぞれの器官を滅菌条件下でとり出す。大腿部及び頸骨をとり出し、滅菌したハサミで骨の両端を開き、５ｍｌの使い捨て注射器及び２５又は２６ゲージの針を用いて２〜５ｍｌのリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で骨髄を洗い流すことによって、完全骨髄細胞が得られた。同様に滅菌条件下で調製した単離済みの脾臓又は胎児肝臓を、５〜１０ｍｌのＰＢＳの入ったペトリ皿内の滅菌２００メッシュの鋼製格子上に置く。器官を細片にカットし、５ｍｌ入りのプラスチック製注射器のプランジャを備えた金属格子を通して穏やかに押しつぶす。遠心分離によりひとたび細胞懸濁液を洗浄し（２００ｇ、１０分、４℃）、１０〜２０ｍｌ入りのＰＢＳ内に再懸濁させる。全ての細胞調製は、氷冷溶液で実施され、組織培養内に移送するまで細胞懸濁液を氷上に保つ。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
【図１】免疫グロブリン構造及び遺伝的特徴の概略的表示である。抗体又は免疫グロブリン（Ｉｇ）は、その単量体形態で、ジスルフィド結合により共有的にリンクされた２つの同一の軽鎖（ＩｇＬ）及び２つの同一の重鎖（ＩｇＨ）からなる糖タンパク質である。各々のＩｇＨ鎖は、抗体イソタイプに応じて、１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＨ）と３〜４個の定常領域ドメイン（ＣＨ１−３又は４）を含んでいる。さらに、抗体は、第１及び第２のＣＨドメインの間にヒンジ領域を含み、ヘテロテトラマー糖タンパク質の２つの抗原結合アームに対し融通性を与える。軽鎖は、わずか１つのＮ末端可変ドメイン（ＶＬ）と１つのＣ末端定常ドメイン（ＣＬ）からなる。２つのＩｇＨ及びＩｇＬ鎖の配置は、ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖可変ドメインの会合により形成される、抗原のための２つのきわめて可変的な結合部位を伴うＹ形の単量体抗体を結果としてもたらす。可変ドメインは、異なる抗体間でＶ領域を比較した場合、いわゆる超可変領域で大幅に異なっている。この可変性は、Ｖ領域が単一の遺伝子によりコードされるのではなく、ＶＨ領域の場合、各々１つずつがそこから任意に選択され次に組換えられてＩｇＨ鎖の可変コーディング領域を形成する一定数の異なるＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントによってコードされる（図面の左上部分を参照のこと）。
【図２】マウス内のＢ細胞の発達を例示している。マウス内のＢリンパ球の分化は、表現型及び遺伝型によって細分されうる全く異なる複数の期に細分されうる。野生型マウスの骨髄の中に見い出すことのできる最も早期に分化増殖能を獲得した前駆体Ｂ（ｐｒｅＢ）細胞は、系統特異的マーカー（Ｌｉｎ−と呼称される）を発現しないものの基幹細胞抗原１（Ｓｃａ−１）の表面発現によって特徴づけされる多能性造血基幹細胞（ＨＳＣ、左側）から誘導される。これから、両方のＩｇＨ鎖対立遺伝子の上にＤＪＨ再配置を通常担持しＢ２２０（パン−Ｂ細胞マーカー）及びｃ−キットの表面発現によって特徴づけされるｐｒｅＢ細胞が生成される。この段階で、その他のＩｇ遺伝子座は全て、通常なお生殖細胞系列（ＧＬ）立体配置内にある。ＤＪＨが再配置されたｐｒｅＢ細胞は、ｐｒｅＢ−１細胞と呼称され、特定の条件下で組織培養内で拡張され得る。これらの細胞内の次の再配置事象には、予め存在するＤＪＨ要素まで再配置するＶＨ  遺伝子セグメントの１つが関与する。これがμＨが発現され得るような形であらゆる対立遺伝子上の生産的再配置を導く場合には、これらの細胞は増殖性シグナルを受け取り、拡張し、ｐｒｅＢ−ＩＩ細胞へと分化する。これらの細胞はｃキット表面マーカーの発現を喪失するが、ＣＤ２５の発現を獲得する。ＩｇＬ鎖対立遺伝子のいずれかの上のさらなる生産的再配置が、膜結合されたＩｇＭを発現する未成熟Ｂ細胞への分化を結果としてもたらす。これらの未成熟のナイーブＢ細胞は骨髄を離れ、末梢リンパ器官内に移動し、ここでこれらは場合によって抗原と遭遇する可能性がある。免疫応答中、これらのＢ細胞はこのとき抗体分泌性形質細胞へと分化でき、その間ＩｇＨ定常領域内では、もう１つのＤＮＡ組換えプロセス（クラススイッチ組換え）が起こり、その結果形質細胞によって分泌される抗体イソタイプの変化がもたらされる可能性がある。
【図３】ヒト化された前駆体Ｂリンパ球（ＨｕｐｒｅＢ）の生成のための本発明に従った方法の図式的概覧である。マウスＤＪＨ再配置ｐｒｅＢ−Ｉ細胞は、交尾後１４〜１９日目のマウスの胚の肝臓からか又は成体マウスの骨髄から単離することができる（ステップ１）。これらの細胞の長期培養には、例えばＩＬ−７（インタロイキン７）といったような或る種の成長因子の存在及び／又は間質細胞フィーダ層を含めた特殊な組織培養条件が必要である。これらの条件下では、ｐｒｅＢ−Ｉ細胞は、さらに分化しない（ステップ２）。異種抗体の産生のためにこれらの細胞を用いるには、これらの細胞内でさらなる生産的内因性Ｉｇ遺伝子再配置が実施され得ることを防止しなければならない。これは、例えば、ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子座の両方の対立遺伝子上にシス作用性突然変異（単複）を導入することによって（ステップ３ｂ）か又は代替的に、例えば２つの組換え活性化遺伝子、ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２のうちの１つを削除することなどといったＩｇ遺伝子のさらなるＶ(Ｄ)Ｊ組換えを除去するトランス作用性突然変異（単複）を導入することによって（ステップ３ａ）達成可能である。後者の細胞はこのとき、この場合ヒトである異種のＩｇＨ及びＩｇＬ鎖の発現を媒介する能力をもつ組換え型レトロウイルスを用いて安定した形で形質導入され得る（ステップ４ａ）。これらのレトロウイルスベクターは同様に、内因性Ｉｇ遺伝子座内でシス作用性突然変異を担持する前者の細胞を安定した形で形質導入するためにも同様に使用可能である。さらに、シス作用性突然変異を担持するｐｒｅＢ細胞はなおもＩｇ遺伝子再配置にとって応答能あるものである。従って、Ｖ(Ｄ)Ｊ再配置を受ける可能性があり、かつそこから新規異種抗体を産生できるこれらの細胞を異種生殖細胞系列Ｉｇ遺伝子座でトランスフェクトすることが可能である（ステップ４ｂ）。異種(heterologous又はxenogeneic)ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖遺伝子がヒト由来のものである場合、ｐｒｅＢ−１  細胞は、完全にヒトの抗体の発現に対する潜在能力しかもたず、従ってＨｕｐｒｅＢ細胞と呼ばれる。
【図４】正−負の遺伝子ターゲティングベクターを用いた内因性遺伝子座のターゲティングを例示する概略的表現である。内因性遺伝子座のターゲティングについては、その遺伝子座からおよそ１ｋｂ上流側のゲノミック領域（短アーム）及びその遺伝子からおよそ３ｋｂ（長アーム）下流側の領域が、空の正−負ターゲティングベクター内にクローニングされる。一例として、ＤＪＨ３再配置されたＩｇＨ鎖遺伝子座のためのターゲティング戦略が描かれている。この構成体は、ｐｒｅＢ−Ｉ細胞内にトランスフェクションされ、相同性組換えによるターゲティングベクターの組込みが選択され場合によってスクリーニングされる。正の選択マーカーは、トランスフェクトされた細胞のゲノム内への構成体の安定した組込みについての選択を可能にする。負の選択マーカーの発現は細胞にとって有毒なものとなり、細胞は、正しい遺伝子座での２回の相同な組換え事象によって発生する安定した組込みの時点での負の選択マーカーの喪失の場合にのみ生き延びることになる。内因性遺伝子座とターゲティング構成体の間の相同組換えのために考えられる２つの部位は、斜線により表わされている。このような相同組換え事象により構成体の組込みが発生した場合、正の薬物選択マーカーが短及び長相同性アーム間にある内因性領域を置換する。正の選択マーカーが、ここで示されているように２つのｌｏｘＰ組換えシグナルによりフランキングされている場合、ｃｒｅリコンビナーゼの過渡的発現が選択マーカーの欠失を媒介することができ、かくして同じ遺伝子座の第２の対立遺伝子のターゲティングのために同じターゲティング構成体を使用することが可能となる。
【図５ａ】ＩｇＨ鎖遺伝子座ターゲティングベクターの構築のためのクローニング戦略を例示する。ここではＤＦＬ１６．１−ＪＨ４再配置遺伝子座の例において、ＤＪＨ再配置されたマウスＩｇＨ鎖遺伝子座のための考えられる１つのターゲティング構成体の構築のための詳細なクローニング戦略が描かれている。同じターゲティングベクターで、その他のＤＪＨ再配置されたＩｇＨ鎖遺伝子座をターゲティングすることができる。内因性遺伝子座内にユニークな制限部位が示され（上部構成体１、ゲノミックＤＮＡから空の正−負ターゲティングベクターｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４にＰＣＲクローニングされている１５２３及び３２１５ｂｐの領域が表わされている（図６ｂ参照、さまざまな異なる空のターゲティングベクターの一例として、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４が選択された）。短及び長アームのためのＰＣＲプライマは、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内のユニークな適合性のある制限部位内へのフラグメントのクローニングのためのＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ制限部位を含むように設計されている。下部には最終ターゲティング構成体の組織が描かれ、選択された制限部位の位置が示されている。
【図５ｂ】ＩｇκＬ鎖遺伝子座ターゲティングベクターの構築のためのクローニング戦略を例示している。全ての生殖細胞系列Ｊκ遺伝子セグメントのターゲティングされた欠失向けに設計されたマウスＩｇκＬ鎖遺伝子座のための考えられる１つのターゲティング構成体を構築するための詳細なクローニング戦略がここに描かれている。内因性遺伝子座内にユニークな制限部位が示されており（上部構成体）、ゲノミックＤＮＡから空の正−負ターゲティングベクターｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内への７３９−３３７９ｂｐの領域が示されている（図６ｂ参照、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４がさまざまな異なる空のターゲティングベクターの一例として選択された）。図５ａにあるように、短及び長アームのためのＰＣＲプライマは、短及び長アームのｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４の適合性制限部位内へのクローニングのためのＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ制限部位を含むように設計されている。最終的ターゲティング構成体の組織は、下部に描かれており、選択された制限部位の位置が示されている。
【図５ｃ】ＲＡＧ遺伝子座ターゲティングベクターの構築のためのクローニング戦略を例示している。ＲＡＧ−１遺伝子のターゲティングされた欠失のために設計されたマウスＲＡＧ遺伝子座用の考えられる１つのターゲティング構成体を構築するための詳細なクローニング戦略が、ここで描かれている。マウス内のＲＡＧ遺伝子座は、染色体２上に位置設定され、各々Ｉｇ遺伝子の再配置にとって不可欠である２つの非常に密にリンクされた遺伝子、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２を含んでいる。両方の遺伝子の開いた読取り枠（ＯＲＦ）は、１つの単一エキソンによってコードされるが、（三角によって示されている）各々のプロモータ要素の下流側の短かい未翻訳エキソンが、全ＲＡＧＯＲＦを含む１つの大型エキソンに対してスプライされている。内因性遺伝子座内にはユニークな制限部位が表わされている（上部構成体）。それぞれＲＡＧ−１ＯＲＦの上流側及び下流側の１０７８及び２９５０ｂｐのゲノミック領域が、指示されている通り、空の正−負ターゲティングベクターｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内にゲノミックＤＮＡからＰＣＲクローニングされている（さまざまな異なる空のターゲティングベクターの一例として選択されたｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４内については図６ｂを参照のこと）。図５ａの場合と同様に、短及び長アームのためのＰＣＲプライマは、ｐＢＳＬ−ｆｌｎｅｏ−ＤＴ４の適合性のある制限部位の中への短及び長アームのクローニングのためのＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ制限部位を含有するように設計されている。最終ターゲティング構成体の組織は、下部に描かれており、選択された制限部位の位置が示されている。
【図６ａ】遺伝子ターゲティング用のＤＴ−α及びＤＴ−α（ｆｏｘ１７６）ベースの正負ベクターのための詳細なクローニング戦略を示す（準備段階）。空のターゲティングベクターの生成のための前提条件は、相同組換えによる内因性遺伝子座のターゲティングのために必要とされるゲノミック領域のためならびに正及び負の選択マーカーのための発現カセットの挿入用にその後使用できる付加的な有用な制限部位がポリリンカーに対し添加されるような形で、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような規則的クローニングプラスミドの多重クローニング部位（ＭＣＳ）を拡張することにある。ここで描かれているのは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＭＣＳ内に付加的な制限部位を伴う付加的なオリゴマを挿入し、かくして拡張されたポリリンカーを伴うプラスミドｐＢＳＬを生成することである。この構成体は、ＤＴα（ｔｏｘ１７６）と記された野生型ジフテリア毒素α又はその減衰したバージョンのいずれかのためのβ−アクチンプロモータで駆動された発現カセットを挿入するために用いられる（例５ｂ、ステップ２を参照のこと）。拡張された多重クローニング部位を伴うこれら２つの構成体は、それぞれｐＢＳＬ−ＤＴ４（左下）及びｐＢＳＬ−ＤＴ４ｔｏｘ１７６（右下）と呼称される。ジフテリア毒素発現カセットは、指示されているように、Ｘｂａｌ及びＢｇｌＩＩ制限部位を用いてｐＢＳＬ内にクローニングされる。減衰されたＤＴｔｏｘ１７６発現カセットにユニークな診断ＮｈｅＩ制限部位も同様に示されている。
【図６ｂ】遺伝子ターゲティングのためのＤＴ−α及びＤＴ−α（ｔｏｘ１７６）ベースの正−負ベクター向けの詳細なクローニング戦略を例示している（最終クローニング段階）。正の選択マーカーとしてのネオマイシン、ハイグロマイシンＢ又はピューロマイシンのいずれか及び野生型ジフテリア毒素α発現カセットを含有する空の正−負ターゲティングベクターのクローニングが描かれている。代りにＤＴ−α（ｔｏｘ１７６）のための発現カセットを含むベクターにも、同じくクローニング戦略を使用することができる。フラグメントのクローニング及び構成体の線状化に用いられる制限酵素も示されている。全ての正の選択マーカーは、ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得るｌｏｘＰ部位によってフランキング（ｆｌｏｘ）されるように設計されている。既存のベクターｐＧＬ２−ｎｅｏ（ｍ）＋（ＤＳＭ１４７０５）から、ｆｌｏｘされたネオマイシンカセットを再クローニングすることが可能であるものの、ｆｌｏｘされたハイグロマイシンＢ及びｆｌｏｘされたピューロマイシン発現カセットは、２段階で挿入する必要があった。このため、表示されているようにｐＢＳＬ−ＤＴ４−２ｌｏｘＰを生成する目的でＭｌｕＩ部位により分離された２つのｌｏｘＰ部位を含有する合成ＤＮＡオリゴマがｐＢＳＬ−ＤＴ４内に挿入された。最終段階では、ハイグロマイシンＢ及びピューロマイシン耐性のための発現カセットがｐＢＳＬ−ＤＴ４−２ｌｏｘＰのユニークなＭｌｕＩ部位内にＰＣＲクローニングされた。
【図７ａ】ヒトＩｇＨ鎖のためのレトロウイルス発現ベクターの概略的組織を示す。ヒトＩｇＨ鎖タンパク質の発現を可能にする組換え型レトロウイルスベクターは、Ｉｇ遺伝子座プロモータ及びエンハンサ要素ならびにＩｇＨ鎖の可変及び定常領域ドメイン用のコーディング配列を含むモジュール式設計を示している。ＩｇＨ発現カセットの転写配向は、Ｉｇ特異的プロモータ及びエンハンサ要素に基づいてＢ細胞特異的発現パターンを付与するため、レトロウイルス５’ＬＴＲプロモータ要素とは反対である。発現カセットは、マウスＶＨプロモータ、ＩｇＨ可変ドメインをコードするＶＤＪエキソンを伴うリーダー（Ｌ）配列、マウスイントロン重鎖エンハンサ（ＥμＨ）、異種ＩｇＨ鎖の定常領域をコードするエキソン、免疫グロブリンの膜貫通領域のためのエキソン及びマウスＩｇＨ３’αエンハンサからの要素を含む。異なるＬ−ＶＤＪ領域そしてＬ−ＶＤＪ領域でさえも、適合性オーバーハングを生成する制限酵素を用いてＩｇＨ発現ベクターのユニークなＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の中にクローニングすることができる。モジュール式設計に起因して、（指示されているような）、単純な分子生物学の技術を用いて、定常領域エキソン又はエンハンサ要素を置換することができる。
【図７ｂ】ヒトＩｇκＬ鎖のためのレトロウイルス発現ベクターの概略的組織を示す。図７ａに描かれたベクターと同様に、ヒトＩｇκＬ鎖タンパク質の発現を可能にする組換え型レトロウイルスベクターは、ＩｇＬ鎖特異的遺伝子座プロモータ及びエンハンサ要素ならびにＩｇκＬ鎖の可変及び定常領域ドメイン用のコーディング配列を含むモジュール式設計を示している。ＩｇκＬ発現カセットの転写配向は、Ｉｇ特異的プロモータ及びエンハンサ要素に基づいてＢ細胞特異的発現パターンを付与するため、レトロウイルス５’ＬＴＲプロモータ要素とは反対である。発現カセットは、マウスＶκプロモータ、ＩｇκＬ可変ドメインをコードするＶＪエキソンを伴うリーダー（Ｌ）配列、マウスκイントロンエンハンサ（κｉＥ）、異種ＩｇＨ鎖の定常領域をコードするエキソン及びマウスＩｇκ３’エンハンサ（カッパ３´Ｅ）からの要素を含む。さらに、レトロウイルスＩｇκＬ鎖発現ベクターは、完全ピューロマイシン発現カセットを含み、安定した形で形質導入されるｐｒｅＢ細胞の選択を可能にする。異なるＬ−ＶＪ領域そしてＬ−ＶＪ領域でさえも、適合性オーバーハングを生成する制限酵素を用いてＩｇＨ発現ベクターのユニークなＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の中にクローニングすることができる。モジュール式設計に起因して、（指示されているような）、単純な分子生物学の技術を用いて、修飾された定常領域エキソン又はエンハンサ要素を置換することができる。
【図８】異種ＩｇＨ及びＩｇＬ鎖をコードするレトロウイルスベクターを用いたマウス間質細胞／ＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞のレトロウイルス形質導入のための手順を例示している。内因性Ｉｇ遺伝子再配置（図３参照）と干渉する突然変異を伴うＩＬ７依存性ｐｒｅＢ細胞系列と長期増殖性間質細胞を、指示されている通り、ＩｇＬ鎖及びＩｇＨ鎖をコードするレトロウイルス発現ベクターを用いて、逐次的に形質導入することができる。まずは異種ＩｇＬそして次にＩｇＨ鎖を発現するレトロウイルス構成体を用いた連続的形質導入の後、細胞は、インビトロ又はインビボのいずれかでの細胞の分化の時点で異種抗体を発現する潜在能力を有する（図１０参照）。
【図９】可変ドメインコーディング領域をそこから単離できる供給源の図式的概監である。可変ドメインコーディング配列は、この図に示されているように、数多くの異なる供給源から単離することができる。レトロウイルスベクターのモジュール式設計のため、例えば既存の有用なモノクローナル抗体からの例えば単一特異性のみをコードするレトロウイルスベクターをクローニングすることができる。これらのベクター形質導入及びインビボでのマウス内への形質導入済み細胞の移植（図１０参照）の時点で、単一特異性を次に親和力成熟に付すことができる。代替的には、健康な、病気の又は免疫された患者のいずれかからの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から完全ＶＤＪ及びＶＪライブラリを単離し、その後ＩｇＨ鎖レトロウイルス発現ベクター内にクローニングすることが可能である。事実、その後安定した形で形質導入されインビボで機能的に選択され得る、レトロウイルスＩｇ発現ベクター内にクローニングされ得る完全に合成のＶＨ及びＶＬ領域レパートリを生成することさえも可能である（図１０参照）。
【図１０】完全にヒトのモノクローナル抗体の産生のための免疫不全マウス内へのＨｕｐｒｅＢの移植を例示している。ＨｕｐｒｅＢ細胞は、正常なマウスｐｒｅＢ細胞と同様、マウス宿主内に移植され得、そこで、これらは、宿主の免疫応答に参加することができる。ＨｕｐｒｅＢ細胞が、内因性Ｂ細胞が欠如した免疫不全宿主内に移植される場合、そのとき産生可能な唯一の抗体は、移植されたＨｕｐｒｅＢ細胞からの異種（ヒト）抗体である。ＨｕｐｒｅＢ細胞の移植のために使用可能な数多くの異なる宿主株が存在する。Ｂ及びＴリンパ球の両方が欠如している株は例えば、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２−欠損及びｓｃｉｄマウス株である。移植されたＨｕｐｒｅＢ細胞から誘導されたＢリンパ球が関与するＴ細胞依存性免疫応答を惹起できるためには、Ｔヘルパーリンパ球集団を単離しこれらのマウス（左側）の中に同時移植することができる。代替的には、例えばＪＨ欠損マウスのように、Ｂリンパ球だけが欠如しているマウス株を、ＨｕｐｒｅＢ細胞単独での移植により再構成することが可能である（右側）。末梢Ｂ及びＴリンパ球区画がひとたび移植後再構成されたならば、これらのマウスを、所望のいずれかの抗原に対する適当な免疫化プロトコルを用いて、免疫化することができる。これらのマウスが誘導された形質細胞は、その後、注射された免疫原性化合物又は組成物に特異的な異種（ヒト）モノクローナル抗体を常時分泌する能力をもつ（ハイブリドーマ）細胞を産生するために、例えば骨髄腫細胞との融合により不死化され得る。
【図１１ａ】抗アポプトーシス遺伝子ｂｃｌ−２の構成性発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階）。インビトロでの連続的に増殖するｐｒｅＢ細胞培養からのＩＬ−７の除去は、結果としてｐｒｅＢ細胞の分化をもたらすが、それと同時にアポプトーシスの誘発をも導く。このアポプトーシスは、例えばｂｃｌ−２のような抗アポプトーシス遺伝子の構成性発現によって防止可能である。ｂｃｌ−２のための選択可能な発現ベクターの生成のために、マウスｂｃｌ−２ｃＤＮＡは、２重遺伝子発現ベクターｐＩＲＥＳ内へのハイグロマイシンＢ読取り枠で逐次的にクローニングされる。このベクターは、中に２つの異なる遺伝子をクローニングできる２つの多重クローニング部位によってフランキングされた内在リボソーム挿入配列を含む。こうして、１つの単一プロモータからの哺乳動物内の２つの遺伝子の同時発現が可能となる。ｐＢｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢベクターの生成のためのｐＩＲＥＳ内へのｂｃｌ−２ＯＲＦ及びハイグロマイシンＢ選択マーカー遺伝子の挿入の戦略が示されている。
【図１１ｂ】抗アポプトーシス遺伝子ｂｃｌ−２の構成性発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示する（最終クローニング段階）。ＣＭＶプロモータで駆動されたｂｃｌ−２−ＩＲＥＳ−ハイグロマイシンＢカセットの組立ての後、ｐＢｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢベクターからの全２重発現カセットは、ＳａｌＩ−ＣｌａＩフラグメントとして、描かれている通りにレトロウイルス移入ベクターｐＬＩＢ内に再クローニングされる。これは、ｐｒｅＢ細胞を安定した形で形質導入し、ｂｃｌ−２の同時発現及びハイグロマイシンＢ耐性を付与するのに用いられる組換え型レトロウイルス構成体ｐＬＩＢ−Ｂｃｌ２−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏＢを生成する。
【図１２ａ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階Ｉ）。さまざまなＩｇＨプロモータ及びエンハンサ要素ならびに異なる可変及び定常領域ドメインのためのコーディング配列が、例えばプラスミドｐＬＩＢといったようなレトロウイルス移入ベクター内に逐次的にクローニングされる。このプラスミドは、レトロウイルスパッケージング及びプロウイルス組込みに必要な全ての要素、すなわち５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル、及び（指示された通り）ＣｏｌＥ１複製起点を伴う細菌のアンピシリン選択可能プラスミドバックボーン内にクローニングされた３’ＬＴＲを含有する。ここで描かれているのは、ＶＨプロモータ、フランキングマトリクス付着領域（ＭＡＲ）を含むマウス重鎖イントロンエンハンサ（ＥμＨ）及びＩｇＨ鎖３’αエンハンサ（３’αＥ）である。ＰＣＲ増幅されたフラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階で使用可能なプラスミドバックボーン内のユニークな適合性制限酵素が強調されている。
【図１２ｂ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階ＩＩ）。ＩｇＨ３’αエンハンサは、４つの機能的領域を含み、これらは、末端Ｂ細胞分化の間のエンハンサの活性化時点で、ＤＮａｓｅｌ消化に対し感応性の高いものとなり、従って超感応性領域と呼ばれる。これらのＨＳ領域の各々は、３’αＥのエンハンサ活性に寄与するが、エンハンサ活性の大部分は、ＨＳ１，２領域によって付与される。単独で３’αＥのＨＳ１，２領域は、全３’αＥ領域とほぼ同じレベルまでレポータ遺伝子発現を駆動できるが、いくつかのレトロウイルスＩｇＨ発現構成体にとっては３’αＥのその他の機能的領域を内含することが望ましいかもしれない。従って、３’αＥのＨＳ３及びＨＳ４領域のクローニングがここで描かれている。ゲノミックＰＣＲ  フラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階で使用可能なプラスミドバックボーン内の適合性のある制限酵素が強調されている。
【図１２ｃ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を示している（準備段階ＩＩＩ）。ＩｇＨプロモータ及びエンハンサ要素のレトロウイルス移入ベクター内へのクローニングに続いて、ＩｇＨ鎖のためのコーディング配列を挿入する必要がある。膜結合された、ならびに分泌された形態の免疫グロブリンを発現できるようにするために、ＩｇＨ鎖の膜貫通領域のためのエキソンをレトロウイルス発現ベクター内に内含させることが必要である。膜貫通領域は、異なるイソタイプ間で長さ、一次配列及びエキソン／イントロン構造が著しく異なる。従って、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥ重鎖のための異なる膜貫通領域をクローニングすることが必要である。一例として、プラスミドｐＡＢ−３内への４つのそれぞれの異なる膜貫通領域のＰＣＲクローニングと挿入が描かれている。同じクローニング手順は、ＩｇＨ３’αＥの拡張されたバージョンを含むベクターＰＡＢ−４及びＰＡＢ５で実施することができる。ゲノミックＰＣＲフラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびに、さまざまなクローニングで使用可能なプラスミドバックボーン内の適合性のある制限酵素が強調されている。
【図１２ｄ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階ＩＶ）。ヒトＢリンパ球は、配列がわずかに異なりかつ異なる生理学的エフェクタ機能を示す４つの異なるＩｇＧイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を産生することができる。すでにＩｇＧ膜貫通エキソンを含む中間ベクターｐＡＢ−３．２内への定常領域遺伝子のクローニングがここに描かれている。さまざまなＩｇＧイソタイプのためのヒンジ（Ｈ）領域をコードするエキソンを内含する内因性エキソン／イントロンの組織が示されている。ゲノミックＰＣＲフラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階で使用可能なプラスミドバックボーン内のユニークな適合性のある制限酵素部位が示されている。ＶＤＪ再配置された可変ドメインエキソンのクローニングの時点で、これらの構成体は、完全なＩｇＧ鎖を発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１２ｅ】ヒトＩｇＨ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階Ｖ）。残りのヒトＩｇイソタイプＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、及びＩｇＥのための定常領域遺伝子のクローニングについてここで描かれている。図１２ｄで描かれたＩｇＧ定常領域遺伝子についてのクローニング手順と同様に、これらのイソタイプのためのゲノミック領域は、これらのイソタイプのためのそれぞれの膜貫通エキソンの下流側のユニークなＮｏｔＩ制限部位の中にＮｏｔＩ消化されたＰＣＲフラグメントとして挿入されている。さまざまなＩｇＧイソタイプのためのヒンジ（Ｈ）領域をコードするエキソンを内含する内因性エキソン／イントロンの組織が示されている。ゲノミックＰＣＲフラグメントの末端に取込まれた制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階で使用可能なプラスミドバックボーン内のユニークな適合性制限酵素部位が示されている。ＶＤＪ再配置された可変ドメインエキソンのクローニングの時点で、これらの構成体は、それぞれのイソタイプの完全なＩｇＨ鎖を発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１３ａ】ヒトＩｇκＬ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示している（準備段階Ｉ）。ＩｇＨ鎖についてのレトロウイルス発現ベクターの構築と類似して、ＩｇκＬ鎖のための発現ベクターは、レトロウイルス移入ベクター内に逐次的にＣＬＮされる必要のあるκＬ鎖遺伝子座特異的プロモータ及びエンハンサ要素をκＬ領域タンパク質のためのコーディング配列に加えて必要とする。基本的レトロウイルスベクターｐＬＩＢから出発して、まず、指示されている通りＶκプロモータがｐＬＩＢ内にクローニングされる。この後には、ヒトκＬ鎖定常領域遺伝子（図面の左側）及びヒトκイントロンエンハンサ（その上流側マトリクス関連領域ＭＡＲを伴うκｉＥ）を含むＰＣＲ産物の挿入、又代替的には、単一重複拡張（ＳＯＥ）ＰＣＲにより生成されるヒトκＬ鎖定常領域遺伝子（図面の右側）を伴うマウスκｉＥの融合ＰＣＲフラグメントの挿入が続いている。両方の構成体の中に、マウスκ３’エンハンサ（κ３’Ｅ）を含むＰＣＲ産物が挿入される。さまざまなゲノミックＰＣＲフラグメントの末端に取込まれている制限酵素ならびにさまざまなクローニング段階内で使用可能なプラスミドバックボーン内のユニークな適合性制限酵素部位が示されている。
【図１３ｂ】ヒトＩｇκＬ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示する（準備段階ＩＩ）。ヒトＩｇＨ及びＩｇκＬ鎖のためのレトロウイルス発現構成体は、ｐｒｅＢ細胞内に逐次的に形質導入されることになり、従ってＩｇκＬ鎖発現ベクターでの第１回目の形質導入の後、安定した形で形質導入された細胞について逐次可能であることが望ましい。このような理由からＳＶ４０プロモータで駆動されたピューロマイシン発現カセットが、指示されているように、２つの考えられるＩｇκＬ鎖レトロウイルス移入ベクター中間体ｐＡＢ−７．１及びｐＡＢ−８．１内に挿入される。これらのベクター内へのＶκＪκ再配置された可変ドメインエキソンのクローニング時点で、これらのレトロウイルス構成体は、ヒトＩｇκＬ鎖を発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１４ａ】ヒトＩｇκＬ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を示す（準備段階Ｉ）。ヒトＩｇλＬ鎖のためのレトロウイルス発現構成体は、まずｐＬＩＢ内にＶλプロモータ及びピューロマイシンカセットの融合ＰＣＲ産物を挿入することによってクローニングされる（ＰＣＲ融合は、例の節で記述されているように、単一重複拡張（ＳＯＥ）ＰＣＲによって行なわれる）。次の段階では、λＬ鎖エンハンサ要素、λ２−４及びλ３−１エンハンサのＳＯＥ−ＰＣＲ融合構成体が、指示された通りに構成体の中に挿入される。最終的に、ヒトＣλ１領域のコーディング配列が、指示された制限酵素を用いてこのレトロウイルスクローニングベクター内にＰＣＲクローニングにより挿入される。これらのベクター内へのＶλＪλ再配置された可変ドメインエキソンのクローニング時点で、これらのレトロウイルス構成体は、ヒトＩｇλＬ鎖を発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１４ｂ】ヒトＩｇλＬ鎖の発現のためのレトロウイルス発現ベクターの構築を例示する（準備段階ＩＩ）。指示された通りユニークなＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ制限酵素を用いた単純なクローニングによりＣλ１コーディング配列を置換するために、その他のヒトＩｇλＬ鎖定常領域遺伝子を使用することができる。ＶλＪλ再配置されたベクターＤエキソンをこれらのベクター内にクローニングした時点で、指示された通り、これらのレトロウイルス構成体は、異なるヒトＩｇλＬ鎖イソタイプを発現する能力をもつ（図１５参照）。
【図１５ａ】レトロウイルスヒトＩｇＨ、ＩｇκＬ及びＩｇλＬ鎖発現ベクター内へのＶ領域遺伝子の挿入を示す。これまで記述されてきたヒトＩｇＨ及びＬ鎖のための全てのレトロウイルス発現構成体は、可変ドメインのためのコーディング配列を含んでいなかった。これらは、さまざまな供給源からのＰＣＲクローニングによって単離され得（例えば図９を参照のこと）、単一特異性をコードするＶ領域エキソンとして又は（縮重プライマ対でＰＣＲ増幅される必要のある）異なる特異性をコードするライブラリとして、レトロウイルスベクター内に挿入され得る。Ｖ領域は、指示されているように、その特徴的リーダー（Ｌ）配列と合わせてＰＣＲ増幅される。可変領域エキソンのクローニングのためには使用可能な制限酵素が示されている。この図面は、いくつかの選択された最終的レトロウイルスＩｇＨ及びＩｇＬ鎖発現ベクターを描いている。これらのベクターがモジュール式設計であるため、異なるコーディング領域及びプロモータ及びエンハンサ要素を使用することが可能である。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2005525800.tif 000080
【誤訳訂正書】
【提出日】平成16年10月21日(2004.10.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつあらゆる結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生のために使用可能な脊椎動物リンパ球の生成方法において、
ヒトにおけるインビボ産生が除外されることを条件として、
（ａ）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を導入することによって、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階；及び
（ｂ）インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力をもつリンパ球を生成する段階、
を含んで成る方法。
【請求項２】
（ａ）ハイブリッドーマ細胞を生成するために骨髄腫細胞に分化したリンパ球を融合させること、
（ｂ）形質転換ウイルスにそれを感染させること、または
（ｃ）少なくとも１つの形質転換する癌遺伝子の発現を確保するベクター構成体でそれをトランスフェクトすること、
によって、分化したリンパ球を不死化させ、かくして、前記人工結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメントを常時産生する能力をもつ脊椎動物リンパ球を生成する段階をさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脊椎動物前駆体リンパ球が、リンパＶ(Ｄ)Ｊ組換え機構の少なくとも１つの構成要素を発現することができ、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物に由来する（なおマウスからのマウス前駆体（ｐｒｅ）Ｂリンパ球が好まれる）、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記脊椎動物前駆体リンパ球が、内因性抗体及び／又は抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメント（単複）を発現する潜在能力を有しておらず、これは内因性免疫グロブリン又はそのフラグメントの発現が欠如している脊椎動物前駆体リンパ球を単離／選択すること及び／又は、
（ａ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部分を含めた、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のコーディング領域、及びその膜貫通エキソンを伴う又は伴わないμ、δ、γ、ε及びα重鎖のための定常領域エキソン用のコーディング領域のうちのいずれか；
（ｂ）Ｖ及びＪ遺伝子セグメントコーディング領域のいずれかを含めた免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖遺伝子座のコーディング領域、ならびに定常領域エキソンのうちのいずれか；
（ｃ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部を含めたＴ細胞レセプタα、β、γ及びδ遺伝子座のコーディング領域、及びα、β、γ及びδ定常領域エキソンのためのコーディング領域のいずれか；
（ｄ）重鎖イントロンエンハンサ及び３’αエンハンサを含む、シス作用性免疫グロブリン重鎖遺伝子エンハンサ要素；
（ｅ）κ重鎖イントロンエンハンサ（κｉＥ）、３’κエンハンサ及びλ２−４及びλ３−１エンハンサを含むシス作用性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座エンハンサ要素；
（ｆ）ＴＣＲα、β、γ及びδエンハンサを含めた、シス作用性Ｔ細胞レセプタ遺伝子座エンハンサ要素；
（ｇ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含むトランス作用性組換え活性化遺伝子、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２ならびにそのコーディング領域；及び
（ｈ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含む、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼの触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４及びＡｒｔｅｍｉｓを含む、Ｖ(Ｄ)Ｊ組換えに不可欠のトランス作用性ＤＮＡ修復遺伝子、ならびに該遺伝子のコーディング領域、
から成るグループの中から選択されている少なくとも１つの遺伝要素の少なくとも１つの対立遺伝子を機能的に不活性化するように設計された少なくとも１つのベクター構成体を前記脊椎動物前駆体リンパ球内に導入することによって達成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ベクター構成体が、好ましくは正のトランスフェクタントの選択を可能にする正の選択マーカーにフランキングする、相同的組換えのための機能を付与する前記少なくとも１つの遺伝要素に対するＤＮＡ配列相同性をもつ領域を含む遺伝子ターゲティングベクターを内含している、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子ターゲティングベクターが付加的に、正の選択マーカーをフランキングし、同族リコンビナーゼ酵素の少なくとも１つをコードする核酸配列のトランスフェクション及び過渡的発現の時点で前記正の選択マーカーの欠失を可能にする、部位特異的ＤＮＡ組換え酵素のための一対のＤＮＡ認識配列を含んで成る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子ターゲティングプラスミドベクターが付加的に、内部で前記遺伝子ターゲティングベクターが非相同的組換えによりゲノム内に無作為に組込まれているトランスフェクタントに対する選択を可能にする負の選択マーカーを含んで成る、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）をコードする前記少なくとも１つの外因性遺伝要素が、
（ａ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスＤＮＡ構成体；
（ｂ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有するか又は人工的なものである、少なくとも１つの結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのＤＮＡ構成体；
（ｃ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗体又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、再配置されていないＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ−免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座；
（ｄ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗体又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントのＶ(Ｄ)Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｅ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の指定された突然変異を有する、少なくとも１つの異種抗体又はＴ細胞レセプタ又はその機能的フラグメントの（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするように設計された修飾された配置内の少なくとも１つの異種免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｆ）一次アミノ酸配列（単複）に関して野生型である、少なくとも１つの異種抗体又はＴ細胞レセプタのＶ(Ｄ)Ｊ組換え及びその後の発現を可能にする生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを包含する異種染色体のフラグメントである染色体導入要素、
から成るグループの中から選択された遺伝子構成体上に担持されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの外因性遺伝要素が、未変性又は修飾済みヒト抗体、ヒト結合タンパク質、ヒト抗原レセプタ又はそれらの機能的フラグメントをコードする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの外因性遺伝要素が結合領域の親和力成熟を受ける能力をもつ異種又は人工レセプタをコードする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
脊椎動物前駆体リンパ球の分化がインビトロで、
（ａ）前記脊椎動物前駆体リンパ球の増殖を停止させ、あらゆる前駆体リンパ球成長因子の不在下で培養することによって成熟リンパ球系統細胞への分化を誘発すること；及び
（ｂ）（ｉ）インタロイキン−２、インタロイキン−４、インタロイキン−５、インタロイキン−６、インタロイキン−１０、インタロイキン−１３、ＴＧＦ−β及びＩＦＮ−γを含む可溶性Ｔ細胞関連刺激因子；
（ii）ＣＤ４０、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、補体レセプタ１（ＣＤ３５）及び２（ＣＤ２１）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ）、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ｌｇα（ＣＤ７９α）、ｌｇβ（ＣＤ７９β）、ＴＡＰＡ−１（ＣＤ８１）、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、ＴＮＦ−レセプタ１（ｐ５５、ＣＤ１２０ａ）、ＴＮＦ−レセプタ２（ｐ７５、ＣＤ１２０ｂ）、Ｏｘ−４０（ＣＤ１３４）、及びリンフォトキシン−βレセプタに特異的な活性組換え型リガンド又はアゴニスト抗体を含む、Ｂ細胞の副刺激レセプタを活性化する因子；及び
（iii）Ｂ細胞マイトジェン因子、１型のＴ細胞依存性抗原及び、リポサッカリド（ＬＰＳ）、グラム陰性菌からのリポタンパク質、ポリアニオン、ポリ−ｄｌｄＣ、ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）及び抗免疫グロブリン試薬を含むその他のポリクローナル活性体、
及びそれらの組合せの中から選択された成分のうちの少なくとも１つの存在下で前記細胞をさらに培養することによりリンパ球終末分化を誘発すること
によりもたらされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
インビボでの前記分化が、適切な脊椎動物宿主内への前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の移植の時点でもたらされる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンパ球が、ナイーブな又は抗原で初回免疫されたＴヘルパーリンパ球を用いて前記宿主内に同時移植される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インビボでの分化の後には、少なくとも１つの所望の免疫原性化合物又は組成物での前記宿主の免疫化が続いている、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記脊椎動物宿主が、内因性Ｂ細胞、Ｔ細胞及び／又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞又はその組合せの生成に関して欠損している適合性のある宿主である、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
脊椎動物宿主が、軟骨魚類、硬骨魚、両生類、は虫類、鳥類、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマを含む哺乳動物、及びマウス、ラット、ウサギ及びモルモットを含むゲッ歯類を含む顎口脊椎動物の中から選択され、マウスが好ましい宿主種である、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
それ自体周知の要領で、あらゆる異種抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成るあらゆる抗原レセプタ、生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な野生型免疫エフェクタ機能又は修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを表示するあらゆる人工結合タンパク質、及びそれらのあらゆる機能的フラグメントを内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつあらゆる結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生方法において、
ヒトにおけるインビボ産生が除外されることを条件として、
（ａ）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を導入することによって、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有する、
脊椎動物前駆体リンパ球を遺伝的に修飾する段階；又は、代替的には、
（ｉ）一次リンパ器官から誘導され、かつ
（ii）成熟リンパ球系統細胞へと分化する潜在能力を有し、かつ
（iii）少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも1つの外因性遺伝要素を担持する、
遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球を使用する段階；
（ｂ）インビトロ又はインビボのいずれかでの前記遺伝的に修飾された前駆体リンパ球の成熟リンパ球系統細胞への分化をもたらし、かくして前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力をもつ遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球を生成する段階；
又、代替的には、
前記結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する能力を持つ前記遺伝的に修飾され分化された脊椎動物リンパ球を使用する段階；
（ｃ）結合タンパク質又はその機能的フラグメントの発現をもたらす段階、
を含む方法。
【請求項１８】
段階（ｂ）の後に、
（ａ）少なくとも１つの外因性遺伝要素を前記分化されたリンパ球から単離する段階；及び
（ｂ）前記少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメントの産生を可能にする状況下に前記遺伝要素を置く段階、
が続いている、請求項１又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、１つのユニークな特異性を示し従ってモノクローナルである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）が複数のユニークな特異性を示し、従ってポリクローナルである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、ヒトの遺伝的レパートリ又はその一部分に基づいて組立てることができるようなヒト抗体、抗原レセプタ又は結合タンパク質の構造的及び／又は機能的特徴を完全に又は部分的に共有している、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
産生させるべき結合タンパク質又はそれらの機能的フラグメント（単複）が、
（ａ）膜結合又は分泌され、天然の抗体の中に見られる化学量論的組成物内の非相同重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方から成り、かつ既知の重（μ、δ、γ、α、ε）及び／又は軽（κ及びλ）鎖イソタイプのいずれかから成る抗体；
（ｂ）一次アミノ酸配列に関して完全にヒトである重鎖及び軽鎖ポリペプチドの組合せを伴う抗体；
（ｃ）異なる脊椎動物種からの異種重鎖又は軽鎖ポリペプチドを含有するハイブリッド抗体；
（ｄ）完全に又は部分的に異種である、分泌されたＦａｂ、ｓｃＦｖ及びＦ（ａｂ'）２抗体フラグメント、
（ｅ）二重特異性又は多重特異性抗体フラグメントを結果としてもたらす、リンカーペプチドを介して共有結合でカップリングされた抗体のフラグメント、
（ｆ）免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質と構造的類似性をもつ、α、β、γ及びδイソタイプ、抗原レセプタ及びその他の結合タンパク質のＴ細胞レセプタ、
及びそれらの機能的フラグメントから成るグループの中から選択される、
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
（ａ）一次リンパ器官から誘導され成熟リンパ系統細胞へと分化する潜在能力を有し、
（ｂ）任意の異種抗体；Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成る任意の異種抗原レセプタ；野生型免疫エフェクタ機能、あるいは生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを示す任意の異種人工結合タンパク質；及びその任意の機能的フラグメント（単複）を内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも１つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を担持し、かつ
（ｃ）前記少なくとも１つの外因性遺伝要素に対し操作可能な形でリンクされている少なくとも１つの選択マーカーを担持する、遺伝的に修飾された脊椎動物前駆体リンパ球。
【請求項２４】
（ａ）任意の異種抗体；Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成る任意の異種抗原レセプタ；野生型免疫エフェクタ機能、あるいは生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを示す任意の異種人工結合タンパク質；及びその任意の機能的フラグメント（単複）を内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも１つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を担持し、かつ
（ｂ）前記少なくとも１つの外因性遺伝要素に対し操作可能な形でリンクされている少なくとも１つの選択マーカーを担持する、
成熟リンパ球系列細胞。
【請求項２５】
（ａ）任意の異種抗体；Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成る任意の異種抗原レセプタ；野生型免疫エフェクタ機能、あるいは生殖細胞系列でコードされた異種免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを示す任意の異種人工結合タンパク質；及びその任意の機能的フラグメント（単複）を内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ少なくとも１つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの外因性遺伝要素を担持し、
（ｂ）前記少なくとも１つの外因性遺伝要素に対し操作可能な形でリンクされている少なくとも１つの選択マーカーを担持し、かつ
（ｃ）前記少なくとも１つの異種結合タンパク質又はその機能的フラグメントを産生する、
成熟リンパ球系列細胞から誘導された、不死化細胞。
【請求項２６】
（ａ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部分を含めた、免疫グロブリン重鎖遺伝子座のコーディング領域、及びその膜貫通エキソンを伴う又は伴わないμ、δ、γ、ε及びα重鎖のための定常領域エキソン用のコーディング領域のうちのいずれか；
（ｂ）Ｖ及びＪ遺伝子セグメントコーディング領域のいずれかを含めた免疫グロブリンκ及び／又はλ軽鎖遺伝子座のコーディング領域、ならびに定常領域エキソンのうちのいずれか；
（ｃ）Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントの全て又は一部を含めたＴ細胞レセプタα、β、γ及びδ遺伝子座のコーディング領域、及びα、β、γ及びδ定常領域エキソンのためのコーディング領域のいずれか；
（ｄ）重鎖イントロンエンハンサ及び３'αエンハンサを含む、シス作用性免疫グロブリン重鎖遺伝子座エンハンサ要素；
（ｅ）κ軽鎖イントロンエンハンサ（κｉＥ）、３'κエンハンサ及びλ２−４及びλ３−１エンハンサを含むシス作用性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座エンハンサ要素；
（ｆ）ＴＣＲα、β、γ及びδエンハンサを含めた、シス作用性Ｔ細胞レセプタ遺伝子座エンハンサ要素；
（ｇ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含むトランス作用性組換え活性化遺伝子、ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２ならびにそのコーディング領域；及び
（ｈ）そのプロモータ及びエンハンサ要素を含む、Ｋｕ７０、Ｋｕ８６、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼの触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＲＣＣ４及びＡｒｔｅｍｉｓを含む、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えに不可欠のトランス作用性ＤＮＡ修復遺伝子、ならびに該遺伝子のコーディング領域、
から成るグループの中から選択される少なくとも１つの遺伝要素の少なくとも１つの対立遺伝子を機能的に不活性化するように設計されたベクター構成体。
【請求項２７】
（ａ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の設計された突然変異を有するか又は人工的なものである、前記結合タンパク質の少なくとも１つ、又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型レトロウイルスＤＮＡ構成体；
（ｂ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の設計された突然変異を有するか又は人工的なものである、前記結合タンパク質の少なくとも１つ又はそれらの機能的フラグメントの発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされている、プロモータ、エンハンサ及びコーディング核酸配列を含んで成る組換え型プラスミドベースのＤＮＡ構成体；
（ｃ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の設計された突然変異を有する、前記抗体又はＴ細胞レセプタのうちの少なくとも１つ又はその機能的フラグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされた、再配置されていないＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントを伴う組換え型プラスミドベースのミニ免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座；
（ｄ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の設計された突然変異を有する、前記抗体又はＴ細胞レセプタのうちの少なくとも１つ又はその機能的フラグメントのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするべく操作可能な形でリンクされた、生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｅ）野生型であるか又は一次アミノ酸配列（単複）内に単数又は複数の設計された突然変異を有する、前記抗体又はＴ細胞レセプタのうちの少なくとも１つ又はその機能的フラグメントの（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にするべく設計された修飾された配置内の少なくとも１つの免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを含む、細菌、酵母又は脊椎動物人工染色体；
（ｆ）一次アミノ酸配列（単複）に関して野生型である、前記抗体又はＴ細胞レセプタのうちの少なくとも１つのＶ（Ｄ）Ｊ組換え及びその後の発現を可能にする生殖細胞系列立体配置内の免疫グロブリン又はＴ細胞レセプタ遺伝子座の一部又は全てを包含する染色体のフラグメントである染色体導入要素、
から成るグループの中から選択された任意の抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成る任意の抗原レセプタ；野生型免疫エフェクタ機能、あるいは生殖細胞系列でコードされた免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを示す任意の人工結合タンパク質；及びその任意の機能的フラグメント（単複）を内含する、抗原又はリガンドに対し選択的に結合する能力をもつ結合タンパク質又はその機能的フラグメントをコードする少なくとも１つの遺伝要素を担持する遺伝子構成体において、前記少なくとも１つの遺伝要素が少なくとも１つの選択マーカーに対し操作可能な形でリンクされている遺伝子構成体。
【請求項２８】
任意の抗体、Ｔ細胞レセプタ及び膜結合免疫グロブリンを含む可変ドメイン及び定常領域から成る任意の抗原レセプタ、野生型免疫エフェクタ機能、あるいは生殖細胞系列でコード化された免疫グロブリン又は抗原レセプタから誘導不可能な修飾された又は人工的なエフェクタ機能のいずれかを示す任意の人工結合タンパク質を含めた抗原又はリガンドに対して選択的に結合する能力をもつ、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法により得られた、少なくとも１つの結合タンパク質又はその機能的フラグメント（単複）を含む、薬学又は診断用調製物。
【国際調査報告】
2005525800.tif 000081
2005525800.tif 000082
2005525800.tif 000083
2005525800.tif 000084
2005525800.tif 000085