(57)【要約】  本発明は、水溶性ポリマーをタンパク質に結合させることによって調製する化学修飾されたプロゲニポイエチン（ＰｒｏＧＰ）を提供する。本発明によるこの化学修飾されたタンパク質は、修飾していないＰｒｏＧＰに比べてはるかに長く持続する好中球増加活性を有し、用量を減らすこと及びスケジューリングの機会を可能にし得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの水溶性ポリマー分子が生物活性のあるプロゲニポイエチンポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基に共有結合している、生物活性のあるプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項２】
前記ポリマーがポリ（エチレンオキシド）分子である、請求項１に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項３】
前記ポリ（エチレンオキシド）分子がポリ（エチレングリコール）分子である、請求項２に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項４】
ポリ（エチレングリコール）が、遊離アミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基（又は複数の基）を有するアミノ酸残基の位置で付着している、請求項３に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項５】
前記ポリ（エチレングリコール）が活性化されたポリ（エチレングリコール）によってコンジュゲートされる、請求項４に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項６】
前記活性ポリ（エチレングリコール）が、パラニトロフェニル、スクシニミジル、カルボニルイミダゾール、アザラクトン、環状イミドチオン、イソシアネート、イソチオシアネート、アルデヒド、第一級アミン、ヒドラジン、アシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバゼート、チオカルバゼート、チオール、マレイミド、スルホン、及びフェニルグリオキサールからなる群から選択される、請求項５に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項７】
前記活性ポリ（エチレングリコール）が、スクシニミジル、カルボニルイミダゾール、アルデヒド、アシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバゼート、及びマレイミドからなる群から選択される、請求項６に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項８】
前記ポリ（エチレングリコール）が分子量約０．５ｋＤａ〜約１００ｋＤａを有する、請求項７に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項９】
前記ポリ（エチレングリコール）が分子量約３．４ｋＤａ〜約４０ｋＤａを有する、請求項８に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ポリ（エチレングリコール）が分枝ポリマーである、請求項４に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項１１】
分枝ポリ（エチレングリコール）ポリマーが分子量約１０ｋＤａ〜約４０ｋＤａを有する、請求項１０に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項１２】
前記ポリ（エチレングリコール）が２官能性ポリマーである、請求項４に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項１３】
プロゲニポイエチンポリペプチドが式
Ｒ１−Ｌ１−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ１−Ｒ１、Ｒ１−Ｒ２、又はＲ２−Ｒ１
を有しており、
式中、Ｒ１は、式
2005512951.tif 000244
の修飾されたｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
式中、直接又はＮ末端をＣ末端に連結させる能力を有するリンカー（Ｌ２）を介してＮ末端がＣ末端に連結されて、
それぞれ
2005512951.tif 000245
のアミノ酸の位置で新しいＣ末端及びＮ末端を有しており、
式中、Ｒ２が、コロニー刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、及び造血成長因子からなる群から選択される因子であり、
式中、Ｌ１はＲ１をＲ２に連結させる能力を有するリンカーであり、
前記プロゲニポイエチンタンパク質のすぐ前に任意選択で（メチオニン−１）、（アラニン−１）又は（メチオニン−２、アラニン−１）が存することができる、
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲート。
【請求項１４】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２に記載のプロゲニポイエチンタンパク質及び少なくとも１つの製薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項１５】
造血疾患を有する患者に請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲートを治療上有効な量で投与することを含む、前記患者を処置する方法。
【請求項１６】
前記造血疾患が好中球減少症、白血球減少症、血小板減少症、又は貧血症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記造血疾患が、化学療法、放射療法、又は骨髄抑制薬物の結果である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
骨髄移植、火傷、創傷、寄生虫、細菌又はウイルス感染から回復中及び／又はこれらを患っている患者に請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲートを治療上有効な量で投与することを含む、前記患者を処置する方法。
【請求項１９】
前記患者に請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２に記載のプロゲニポイエチンコンジュゲートを治療上有効な量で投与することを含む、造血前駆細胞及び造血幹細胞を末梢血中に動員させる方法。
【請求項２０】
ａ）造血前駆細胞又はＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分離するステップと、
ｂ）前記造血前駆細胞又はＣＤ３４＋細胞を請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２に記載の造血タンパク質を含む増殖培地で培養するステップと
を含む、樹状細胞を生産する方法。
【請求項２１】
ｃ）前記培養中の造血前駆細胞又はＣＤ３４＋細胞に抗原を律動的に与えるステップ
をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−３変異体融合タンパク質、及び多官能性受容体アゴニストからなる群から選択される１つ又は複数の因子をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−３変異体融合タンパク質、及び多官能性受容体アゴニストからなる群から選択される１つ又は複数の因子をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍、感染症又は自己免疫疾患を有するヒトに請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２に記載の造血タンパク質を投与するステップを含む、前記ヒトを処置する方法。
【請求項２５】
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−３変異体融合タンパク質、及び多官能性受容体アゴニストからなる群から選択される１つ又は複数の因子を投与することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
無機溶媒の存在下でコンジュゲーションを行う、ポリ（エチレングリコール）を求核試薬にコンジュゲートさせる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、それだけには限定されないがＧ−ＣＳＦを含めた、ｆｌｔ３のリガンド多官能性アゴニスト及び別の造血成長因子受容体である組換えタンパク質のファミリー、プロゲニポイエチン（ＰｒｏＧＰ）の化学修飾に関し、これによりＰｒｏＧＰの化学的及び／又は生理的特徴を変えることができる。ＰＥＧ化されたＰｒｏＧＰは、低下したクリアランス速度、向上した安定性、低下した抗原性、又はこれらの組合せを有し得る。このＰｒｏＧＰタンパク質のファミリーは、本明細書中にその全体として組み込まれている国際公開公報ＷＯ９８／１７８１０号に記載のｆｌｔ３受容体アゴニスト及び第２の造血成長因子又はコロニー刺激因子受容体アゴニストを含む多官能性タンパク質として定義されている。また、本発明は、ＰｒｏＧＰを修飾する方法にも関する。さらに、本発明は、修飾されたＰｒｏＧＰを含む薬剤組成物に関する。さらなる実施形態は、造血疾患を処置するための修飾されたＰｒｏＧＰの使用である。
【背景技術】
【０００２】
プロゲニポイエチンは、化学療法又は放射療法から引き起こされる造血疾患を含めた一般的な造血疾患の処置に有用な場合がある（Ｍａｃ  Ｖｉｔｔｉｅ，Ｔ．Ｊ．他、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ．、１９９９年、２７（１０）、１５５７〜１５６８）。また、ＰｒｏＧＰは、骨髄移植、創傷治癒、火傷処置、及び寄生虫、細菌又はウイルス感染の処置に有用な場合がある。
【０００３】
身体内に投与する生理活性のあるタンパク質は、身体内におけるクリアランス速度が高いため、その薬理活性を短い時間の間しか示すことができない。さらに、これらタンパク質の相対的疎水性によりその安定性が限定され得ることが一般的に観察されている。
【０００４】
このクリアランス速度を下げるため、安定性を向上させるため、又は治療的タンパク質の抗原性を無効にするために、水溶性ポリマーを用いてタンパク質を化学修飾するいくつかの方法が提案されている。この種類の化学修飾では、タンパク質分解酵素がタンパク質主鎖自体と物理的に接触することを有効に遮断し、したがって分解を阻止し得る。化学的付着は、腎クリアランスを有効に低下し得る。さらなる利点には、特定の条件下で、治療的タンパク質の安定性及び循環時間を増大させること、溶解性を高めること、並びに免疫原性を下げることが含まれる。タンパク質の修飾及び融合タンパク質を記載している総説文献は、Ｆｒａｎｃｉｓ、「成長因子についての焦点３（Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３）」：４〜１０、１９９２年５月（Ｍａｄｉｓｃｒｉｐｔ、Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ  Ｃｏｕｒｔ、Ｆｒｉｅｒｎ  Ｂａｒｎｅｔ  Ｌａｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ  Ｎ２０、ＯＬＤ、ＵＫにより出版）である。
【０００５】
ポリ（アルキレンオキシド）、特にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、治療的タンパク質生成物の調製に使用されてきたこのような化学部分（ｍｏｉｅｔｙ）の１つである（動詞「ｐｅｇ化」とは、少なくとも１つのＰＥＧ分子を付着させることを意味する）。ポリ（エチレングリコール）が付着することによりタンパク質分解から保護されることが示され、Ｓａｄａ他、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７１：１３７〜１３９、１９９１年、特定のポリ（エチレングリコール）部分を付着させる方法が利用可能である。米国特許第４，１７９，３３７号、Ｄａｖｉｓ他、「非免疫原性ポリペプチド（Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、１９７９年１２月１８日発行；及び米国特許第４，００２，５３１号、Ｒｏｙｅｒ、「ポリエチレングリコールを用いた酵素の修飾及びそれにより生成された生成物（Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｔｈｅｒｅｂｙ）」、１９７７年１月１１日発行参照。総説にはＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他、「薬物としての酵素（Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ）」、Ｊ．Ｓ．Ｈｏｌｃｅｒｂｅｒｇ及びＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編、３６７〜３８３ページ、１９８１年参照。
【０００６】
エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（−１，３−ジオキソラン）、ポリ（１，３，６−トリオキサン）、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、及びポリ−アミノ酸（ホモポリマー又は無作為コポリマーのどちらか）など、他の水溶性ポリマーが使用されてきた。
【０００７】
ｐｅｇ化された治療的タンパク質のいくつかの例が記載されている。アデノシンデアミナーゼがｐｅｇ化された配合物であるＡＤＡＧＥＮ（登録商標）は、重度の複合免疫不全症を処置するのに認可されている。ｐｅｇ化されたＬ−アスパラギナーゼであるＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標）は、過敏性ＡＬＬ患者を処置するのに認可されている。Ｐｅｇ化されたスーパーオキシドジスムターゼは、頭部損傷の処置について臨床治験されている。Ｐｅｇ化されたα−インターフェロン（米国特許第５，７３８，８４６号、第５，３８２，６５７号）は、慢性肝炎Ｃの処置に認可されているＰＥＧ−イントロン（ｐｅｇｉｔｒｏｎ  α−２ｂ）を用いた肝炎の処置について第ＩＩＩ相臨床治験で試験されており、別の分子ＰＥＧＡＳＹＳ（商標）は依然として薬事規制の認可を待っている。ｐｅｇ化されたグルコセレブロシダーゼ及びｐｅｇ化されたヘモグロビンでは、前臨床試験が行われたことが報告されている。別の例は、ｐｅｇ化されたＩＬ−６、ＩＬ−６に付加するポリ（エチレングリコール）を開示するＥＦ０  ４４２  ７２４号、「修飾されたｈＩＬ−６（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈＩＬ−６）」である。
【０００８】
化学修飾された別の具体的な治療的タンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。Ｇ−ＣＳＦは迅速な増殖及び血流中への好中性顆粒球の放出を誘発し、したがって感染症と戦う治療上の効果をもたらす。欧州特許公報ＥＰ  ０  ４０１  ３８４号、１９９０年１２月１２日公開の「化学修飾された顆粒球コロニー刺激因子（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）」は、ポリ（エチレングリコール）分子が付着しているＧ−ＣＳＦを調製する材料及び方法を記載している。修飾されたＧ−ＣＳＦ及びその類似体は、ポリ（エチレングリコール）など水溶性粒子ポリマーに共有的にコンジュゲートされたさまざまなＧ−ＣＳＦ及び誘導体を述べている、欧州特許ＥＰ  ０  ４７３  ２６８号、１９９２年３月４日公開の「水溶性ポリマーに共有結合したポリペプチドを含む連続放出型の薬剤組成物（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｔｏ  Ａ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ）」にも報告されている。ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する修飾されたポリペプチドは、１９８９年１０月４日公開の欧州特許ＥＰ  ０  ３３５  ４２３号に報告されている。米国特許第５，８２４，７８４では、Ｎ末端が化学修飾されたＧ−ＣＳＦ組成物を含めたタンパク質のＮ末端を修飾する方法が提供されている。米国特許第５，８２４，７７８号は、化学修飾されたＧ−ＣＳＦを開示している。
【０００９】
日本特許出願平２−３０５５５号（１９９０年）は、低下した抗原性を有する化学修飾されたヒトＩＬ−３を開示している。
【００１０】
ＰｒｏＧＰタンパク質のファミリーは、国際公開公報ＷＯ  ９８／１７８１０号に開示されている。
【００１１】
ポリ（エチレングリコール）では、ポリ（エチレングリコール）分子をタンパク質に付着させるためにさまざまな手段が使用されてきた。一般的に、タンパク質上に見つかる反応性基によってポリ（エチレングリコール）分子をタンパク質に結合させる。
【００１２】
リジン残基上やＮ末端にあるものなどのアミノ酸基が、このような付着に便利である。たとえば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４，００２，５３１号、上掲）は、ポリ（エチレングリコール）分子を酵素に付着させるために還元アルキル化を使用したことを述べている。欧州特許ＥＰ  ０  ５３９  １６７号、１９９３年４月２８日公開のＷｒｉｇｈｔ、「Ｐｅｇイミデート及びそのタンパク質誘導体（Ｐｅｇ  Ｉｍｉｄａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、ＰＥＧのイミデート誘導体又は水溶性有機ポリマーを用いて遊離アミノ基を有するペプチド及び有機化合物を修飾することを述べている。Ｃｈａｍｏｗ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５：１３３〜１４０、１９９４年は、還元アルキル化による、モノメトキシポリ（エチレングリコール）アルデヒドを用いたＣＤ４イムノアドヘシンの修飾を報告している。この著者らは、ｐｅｇ化の程度を制御できる条件下でＣＤ４−Ｉｇの５０％がＭｅＰＥＧによって修飾されたことを報告している。同書１３７ページ。この著者らはまた、修飾されたＣＤ４−Ｉｇの（タンパク質ｇｐ１２０に対する）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合能力が、ＭｅＰＥＧ化の度合いと相関した割合で低下したことも報告している。同書。米国特許第４，９０４，５８４号、Ｓｈａｗ、１９９０年２月２７日発行は、反応性アミン基によってポリ（エチレングリコール）分子が付着する、タンパク質中のリジン残基数の改変に関する。
【００１３】
ポリマーをタンパク質に付着させる多くの方法には、リンク基として作用する部分の使用が含まれる。しかし、このような部分は抗原性であるかもしれない。リンク基が関与しない塩化トレシル（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）法が利用可能であるが、塩化トレシルの使用により毒性の副産物が生成され得るので、この方法は治療的な生成物を生成するための使用には困難であるかもしれない。Ｆｒａｎｃｉｓ他、「タンパク質薬剤の安定性：分解のｉｎ  ｖｉｖｏ経路及びタンパク質安定化の戦略（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」（Ａｈｅｒｎ．Ｔ．及びＭａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．編）Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年）参照。また、「水相系を使用した分離、細胞生物学及びバイオテクノロジーにおける応用（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｆｉｓｈｅｒ他編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年、２１１〜２１３ページのＤｅｌｇａｄｏ他、「塩化トレシルを用いた活性化によるＰＥＧのタンパク質への結合、免疫親和性細胞調製における応用（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＥＧ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｙ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｔｒｅｓｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」参照。
【００１４】
また、リンカー基カルボヒドラジドがタンパク質基質（インスリン）のＣ末端カルボキシル基に選択的に付着することを報告しているＲｏｓｅ他、バイオコンジュゲート化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２：１５４〜１５９、１９９１年も参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、低下したクリアランス速度、増大した安定性、低下した抗原性、又はこれらの組合せを有する化学修飾されたＰｒｏＧＰ分子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、それだけには限定されないが、低下したクリアランス速度、増大した安定性、及び低下した抗原性から選択される少なくとも１つの改良された化学的又は生理的特長を有する化学修飾されたＰｒｏＧＰに関する。したがって、以下により詳細に記載するように、本発明は、ＰｒｏＧＰを化学修飾すること、並びにさまざまなポリ（エチレングリコール）部分を使用した具体的な修飾に関連するいくつかの態様を有する。
【００１７】
本発明はまた、化学修飾されたＰｒｏＧＰを生成する方法にも関する。
【００１８】
本発明はまた、化学修飾されたＰｒｏＧＰを含む組成物にも関する。
【００１９】
本発明の修飾されたＰｒｏＧＰは、それだけには限定されないが、好中球減少症、血小板減少症、造血前駆細胞及び幹細胞の末梢血中への動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、骨髄抑制又は造血不全症、及び免疫不全症の処置に有用となり得る。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
プロゲニポイエチン（ＰｒｏＧＰ）タンパク質は、ｆｌｔ３リガンドの多官能性アゴニスト及び別の造血成長因子受容体である、組換えタンパク質のファミリーのメンバーである。この組換え生成及び使用方法は国際公開公報ＷＯ  ９８／１７８１０号に詳述されている。
【００２１】
プロゲニポイエチンタンパク質は式
Ｒ１−Ｌ１−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ１−Ｒ１、Ｒ１−Ｒ２、又はＲ２−Ｒ１
を有しており、
式中、Ｒ１は、式
2005512951.tif 000002
の修飾されたｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
式中、直接又はＮ末端をＣ末端に連結させる能力を有するリンカー（Ｌ２）を介してＮ末端がＣ末端に連結されて、
それぞれ
2005512951.tif 000003
のアミノ酸の位置で新しいＣ末端及びＮ末端を有しており、
式中、Ｒ２が、コロニー刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン、及び造血成長因子からなる群から選択され、
式中、Ｌ１はＲ１をＲ２に連結させる能力を有するリンカーである。
【００２２】
プロゲニポイエチンタンパク質のすぐ前には、任意選択で（メチオニン−１）、（アラニン−１）又は（メチオニン−２、アラニン−１）が存することができる。
【００２３】
好ましい実施形態では、プロゲニポイエチンタンパク質は式
Ｒ１−Ｌ１−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ１−Ｒ１、Ｒ１−Ｒ２、又はＲ２−Ｒ１
を有しており、
式中、Ｒ１は、式
2005512951.tif 000004
の修飾されたｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
式中、直接又はＮ末端をＣ末端に連結させる能力を有するリンカー（Ｌ２）を介してＮ末端がＣ末端に連結されて、
それぞれ
2005512951.tif 000005
のアミノ酸の位置で新しいＣ末端及びＮ末端を有しており、
式中、Ｒ２は、式
2005512951.tif 000006
の修飾されたヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
式中、
2005512951.tif 000007
式中、Ｎ末端から１〜１１個のアミノ酸及び／又はＣ末端から１〜５個のアミノ酸が任意選択で前記修飾されたヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列から削除されており、
式中、直接又はＮ末端をＣ末端に連結させる能力を有するリンカー（Ｌ２）を介してＮ末端がＣ末端に連結されて、
それぞれ
2005512951.tif 000008
のアミノ酸の位置で新しいＣ末端及びＮ末端を有しており、
式中、Ｌ１はＲ１をＲ２に連結させる能力を有するリンカーである。
【００２４】
別の実施形態では、プロゲニポイエチンタンパク質のすぐ前には、任意選択で（メチオニン−１）、（アラニン−１）又は（メチオニン−２、アラニン−１）が先行可能である。
【００２５】
好ましい実施形態では、Ｒ１は、
2005512951.tif 000009
から選択される。
【００２６】
好ましい実施形態では、Ｒ２は、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ  Ｓｅｒ１７、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−３変異体、ＩＬ−５、ＩＬ  ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ細胞成長因子、Ｂ細胞分化因子、好酸球分化因子及び幹細胞因子（ＳＣＦ）である。
【００２７】
好ましい実施形態では、このプロゲニポイエチンタンパク質は、
2005512951.tif 000010
2005512951.tif 000011
から選択される。より好ましくは、このプロゲニポイエチンタンパク質は配列番号１６５である。
【００２８】
好ましい実施形態では、Ｒ２は、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ  Ｓｅｒ１７、Ｇ−ＣＳＦ  Ａｌａ１７及びｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）からなる群から選択される。
【００２９】
好ましい実施形態では、Ｒ２は配列番号２６１のＩＬ−３変異体である。好ましい実施形態では、Ｒ２は配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、又は配列番号２５９のＩＬ−３変異体である。
【００３０】
好ましい実施形態では、リンカー（Ｌ２）は、
2005512951.tif 000012
2005512951.tif 000013
からなる群から選択される。
【００３１】
組換え遺伝子技術を使用して形質転換又はトランスフェクトさせたＥ．ｃｏｌｉや動物細胞など宿主細胞によって生成させた、精製かつ単離した任意のＰｒｏＧＰを本発明中で使用してもよい。中でも、形質転換させたＥ．ｃｏｌｉによって生成されるＰｒｏＧＰが特に好ましい。このようなＰｒｏＧＰは、高い純度及び均一性で大量に得ることができる。たとえば、上記のＰｒｏＧＰを国際公開公報ＷＯ  ９８／１７８１０号に開示されている方法に従って調製してもよい。用語「実質的に以下のアミノ酸配列を有する」とは、ＰｒｏＧＰにおいて不利な機能上の非類似性を引き起こさない限り、上記のアミノ酸配列が１つ又は複数のアミノ酸変化（削除、付加、挿入又は置換）を含んでいてもよいことを意味する。リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、又は対合していないシステイン残基のうち少なくとも１つが含まれているアミノ酸配列を実質的に有しているＰｒｏＧＰを使用することがより好ましい。
【００３２】
本発明によれば、ポリ（エチレングリコール）はＰｒｏＧＰのアミノ酸残基を介して共有結合されている。このアミノ酸残基は、活性化されたポリ（エチレングリコール）の末端反応性基が結合し得る、たとえば遊離アミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル（チオール）基を有する任意の反応性残基であってよい。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基は、リジン残基及び／又はＮ末端アミノ酸残基を含んでいてもよく、遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基はアスパラギン酸、グルタミン酸及び／又はＣ末端アミノ酸残基を含んでいてもよく、システインなどスルフヒドリル（チオール）基を有している。
【００３３】
別の実施形態では、オキシン化学（Ｌｅｍｉｅｕｘ  ＆  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、Ｔｉｂ  Ｔｅｃｈ、１６：５０６〜５１３、１９９８年）を使用してＮ末端セリン残基を標的にする。
【００３４】
本発明で使用するポリ（エチレングリコール）は、特定の形態又は分子量範囲に限定されない。通常、分子量５００〜６０，０００が使用され、好ましくは分子量１，０００〜４０，０００が使用される。また、ポリ（エチレングリコール）は、米国特許第５，９３２，４６２号、米国特許第５，３４２，９４０号、米国特許第５，６４３，５７５号、米国特許第５，９１９，４５５号、米国特許第６，１１３，９０６号、及び米国特許第５，１８３，６６０号に記載のような分枝ＰＥＧであることもできる。
【００３５】
ポリ（アルキレンオキシド）、特にポリ（エチレングリコール）は末端反応性基によってＰｒｏＧＰに結合しており、ＰＥＧとタンパク質との間にリンク部分（スペーサー）が残っていても残っていなくてもよい。本発明のＰｒｏＧＰコンジュゲートを形成するために、ポリ（アルキレンオキシド）などのポリマーを「活性化された」形に変換する。反応性基は、たとえば、アミノ基、カルボキシル基又はチオール基などタンパク質上の化学部分とポリ（エチレングリコール）との結合を媒介する末端反応性基である。典型的には、一方又は両方の末端ポリマーヒドロキシル末端基（すなわちα及びω末端ヒドロキシル基）が反応性官能基に変換され、共有結合性のコンジュゲーションが可能になる。このプロセスをしばしば「活性化」と呼び、反応性基を有するポリ（エチレングリコール）生成物を、本明細書中で以降「活性化されたポリ（エチレングリコール）」と呼ぶ。α及びωリンク基をどちらも含むポリマーを、「ビス活性化されたポリ（アルキレンオキシド）」と呼び、「２官能性」であるという。αとω末端ヒドロキシルとに同じ反応性基を含むポリマーを、時折、「ホモ２官能性」又は「ホモビス活性化された」という。αとω末端ヒドロキシルとに異なる反応性基を含むポリマーは、時折、「ヘテロ２官能性」又は「ヘテロビス活性化された」という。単一の反応性基を含むポリマーを、「モノ活性化された」ポリアルキレンオキシド又は「１官能性」と呼ぶ。他の実質的に非抗原性のポリマーも同様に「活性化」又は「官能化」される。
【００３６】
したがって、活性化されたポリマーは、α−アミノ基、カルボキシル基又はチオール基などタンパク質上の化学部分と、ポリ（エチレングリコール）との結合を媒介するのに適している。２ヶ所で活性化されたポリマーは、２つのタンパク質分子、又は別の実施形態では１つのタンパク質分子及び反応性の小分子とこの様式で反応し、架橋結合によってタンパク質ポリマー又はタンパク質−小分子コンジュゲートを有効に形成することができる。ＰｒｏＧＰ上に見つかるリジンのアミノ末端α−アミノ基又はε−アミノ基のどちらかと反応する能力を有する官能基には、ｐ−ニトロフェニルなどのカーボネート、又はスクシニミジル；カルボニルイミダゾール；アザラクトン；環状イミドチオン；イソシアネート又はイソチオシアネート並びにアルデヒドが含まれる。ＰｒｏＧｐ上のカルボン酸基、反応性カルボニル基及び酸化炭水化物基と反応する能力を有する官能基には、第一級アミン；並びにアシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバゼート、チオカルバゼートなどのヒドラジン及びヒドラジド官能基などが含まれる。ＰｒｏＧＰ上に利用可能であれば、メルカプト基も、チオール、マレイミド、スルホン、及びフェニルグリオキサールなどの反応性基を有する適切に活性化されたポリマーの付着部位として使用することができる。たとえば、その開示が本明細書中にその全体として組み込まれている米国特許第５，０９３，５３１号参照。求電子性中心と反応する能力を有する他の求核試薬には、それだけには限定されないが、たとえば、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール、活性メチレンなどが含まれる。
【００３７】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰｒｏＧＰのＮ末端アミノ基又はリジンのε−アミノ基と活性化されたＰＥＧとを使用して第二級アミン又はアミド結合が形成される。本発明の別の好ましい態様では、Ｃｈａｍｏｗ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、５：１３３〜１４０、１９９４年や米国特許第５，８２４，７８４号に記載のＮａＣＮＢＨ３、ＮａＢＨ３、ピリジンボランなどの適切な還元剤を用いて還元することによって、ＰｒｏＧＰのＮ末端の第一級アミノ基と単鎖又は分枝鎖ＰＥＧアルデヒドとの間に第二級アミン結合が形成される。
【００３８】
本発明の好ましい一実施形態では、スクシニミジルエステル、環状イミドチオンなどのアミド形成リンカーで活性化されたポリマーを使用して、ＰｒｏＧｐとポリマーとの間の結合をもたらす。本明細書中に参照として組み込まれている米国特許第５，３４９，００１号；米国特許第５，４０５，８７７号；及びＧｒｅｅｎｗａｌｄ他、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１７：１０１〜１６１、２０００年参照。ＰｒｏＧＰの遊離アミノ基に結合していてもよい１つの好ましい活性化されたポリ（エチレングリコール）には単鎖又は分枝鎖のＮ−ヒドロキシスクシニルイミドポリ（エチレングリコール）が含まれ、ポリ（エチレングリコール）のコハク酸エステルをＮ−ヒドロキシスクシニルイミドで活性化させることによって調製することができる。
【００３９】
本発明の他の好ましい実施形態には、他の活性化されたポリマーを使用して、ε−アミノ又は他の基を介したポリマーとＰｒｏＧＰとの共有結合を形成させることが含まれる。たとえば、末端を活性化させたポリマーの形のイソシアネート又はイソチオシアネートを使用してリジンのアミノ基と尿素又はチオ尿素ベースの結合を形成することができる。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様では、本明細書中に参照として組み込まれている米国特許第５，１２２，６１４号、第５，３２４，８４４号、及び第５，６１２，６４０号に記載のように、タンパク質アミノ基でカルバメート（ウレタン）結合が形成される。例には、Ｎ−スクシニミジルカルボネート、パラ−ニトロフェニルカルボネート、及びカルボニルイミダゾールの活性化されたポリマーが含まれる。本発明の別の好ましい実施形態では、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカルボネート誘導体をＰｒｏＧｐ上のアミノ基に連結させる。
【００４１】
本発明の別の態様は、酵素又はｐＨ配向性の加水分解によって予想通り分解して遊離ＰｒｏＧＰ又は他のＰｒｏＧＰ誘導体を放出することができる機能的リンカーによってＰｒｏＧＰ分子に付着している、ポリ（エチレングリコール）などの水溶性ポリマーからなる、プロドラッグの形又は徐放型のＰｒｏＧｐである。また、このプロドラッグは、カスケード潜在化処理（ｃａｓｃａｄｅ  ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の使用を要する「二重プロドラッグ」（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、先進薬物送達の総説（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）、３：３９〜６５、１９８９年）であることができる。このような系では、加水分解反応には、最初の律速（遅い）酵素ステップ又はｐＨ配向性ステップと、第１ステップが起こった後にしか起こらない迅速な非酵素的加水分解を含む第２のステップとが含まれる。このような放出可能なポリマーは、ＰｒｏＧＰを連続的に放出する、永続しない、リザーバとしての役割を果たすことができるタンパク質コンジュゲートを提供する。このような機能的リンカーは、米国特許ＵＳ  ５，６１４，５４９号；米国特許ＵＳ  ５，８４０，９００号；米国特許ＵＳ  ５，８８０，１３１号；米国特許ＵＳ  ５，９６５，１１９号；米国特許ＵＳ  ６，０１１，０４２号；米国特許ＵＳ  ６，１８０，０９５  Ｂ１；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４２；３６５７〜３６６７、１９９９年；Ｌｅｅ，Ｓ．他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ、１２：１６３〜１６９、２００１年；Ｇａｒｍａｎ  Ａ．Ｊ．他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２２３：３６１〜３６５、１９８７年；Ｗｏｇｈｉｒｅｎ  Ｃ．他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、４：３１４〜３１８、１９９３年；Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｍ．Ｊ．他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８７；１４４０〜１４４５、１９９８年；Ｚｈａｏ  Ｘ．、最近の先進薬物送達系、第９会国際シンポジウム（Ｎｉｎｔｈ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔ．）、１９９；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４３：４７５〜４８７、２０００年；及びＧｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．、１７：１０１〜１６１、２０００年に記載されている。
【００４２】
本発明の別の実施形態は、無機溶媒の存在下でコンジュゲーションを行う、ＰＥＧを求核試薬にコンジュゲートさせる方法である。「求核試薬」とは、それだけには限定されないが、抗体や造血成長因子、ペプチド、酵素、医薬品化合物又は有機部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含めたタンパク質として定義される。好ましくは、無機溶媒はアセトニトリル、メタノール、又はエタノールである。より好ましくは、無機溶媒はアセトニトリルである。好ましくは、無機物の濃度は約１％〜約２５％、より好ましくは約３％〜約１３％。より好ましくは約８％である。
【００４３】
ｐｅｇ化反応と呼ばれるコンジュゲーション反応は、従来、タンパク質上のどこにポリマーが付着するかに関係なく、過剰モルのポリマーを用いた溶液中で実施されていた。しかし、このような一般的な技術は、十分な生物活性を保持したままで生物活性のあるタンパク質を非抗原性ポリマーにコンジュゲートさせるには不適当であることが証明された。ＰｒｏＧＰの生物活性を維持する１つの方法は、ポリマーのカップリングプロセス中に、受容体結合部位（又は複数の部位）に関連するこれらＰｒｏＧＰ反応性基のコンジュゲーションを実質的に避けることである。本発明の別の態様は、高レベルの保持された活性を維持しながらポリ（エチレングリコール）をＰｒｏＧＰにコンジュゲートさせる方法を提供することである。
【００４４】
共有結合による化学修飾は、生物活性のある物質を活性化されたポリ（エチレングリコール）との反応で一般的に採用される任意の適切な条件下で行うことができる。このコンジュゲーション反応は、ＰｒｏＧＰの失活を避けるために比較的穏やかな条件下で行う。穏やかな条件には、反応溶液のｐＨを３〜１０の範囲、かつ反応温度を約０〜３７℃の範囲に維持することが含まれる。ＰｒｏＧＰ中の反応性アミノ酸残基が遊離アミノ基を有する場合は、上記の修飾は、好ましくは、リン酸、クエン酸、酢酸、コハク酸又はＨＥＰＥＳを含めた非限定的なリストの適切な緩衝液（ｐＨ３〜１０）中で、１〜４８時間、４〜３７℃で行う。Ｎ末端アミノ基をＰＥＧアルデヒドなどの試薬の標的にする場合は、ｐＨ４〜７を維持することが好ましい。活性化されたポリ（エチレングリコール）は、ＰｒｏＧＰの遊離アミノ基の数の０．０５〜１００倍、好ましくは０．０５〜０．５倍のモル量で使用してもよい。それに対して、ＰｒｏＧＰ中の反応性アミノ酸残基が遊離カルボキシル基を有する場合は、上記の修飾は、好ましくは、ｐＨ約３．５〜約５．５で行われ、たとえば、ポリ（オキシエチレンジアミン）を用いた修飾は、カルボジイミド（ｐＨ４〜５）の存在下で１〜２４時間、４〜３７℃で行われる。活性化されたポリ（エチレングリコール）は、ＰｒｏＧＰの遊離カルボキシル基の数の０．０５〜３００倍のモル量で使用してもよい。
【００４５】
別の実施形態では、コンジュゲーション反応に含められるポリマーの量の上限は、相当量の高分子量種を形成させずに、すなわち約２０％を超えるコンジュゲートがＰｒｏＧＰ１分子あたり約１本より多くのポリマーの鎖を含むことがないように、活性化されたポリマーとＰｒｏＧＰとを反応させることが可能な範囲で、約１：１を超える。たとえば、本発明のこの態様では、後にいずれの高分子量種からも単離することができる所望のコンジュゲートを有意な量で形成させるために、約６：１までの比が使用可能なことが企図される。
【００４６】
本発明の別の態様では、２つの官能基が活性化されたＰＥＧ誘導体を使用して、複数のＰｒｏＧＰ分子がＰＥＧによって架橋結合されているポリマーのＰｒｏＧＰ−ＰＥＧ分子を作製することができる。本明細書中に記載する反応条件によって有意な量の修飾されていないＰｒｏＧＰが生じる可能性があるが、この修飾されていないＰｒｏＧＰは、さらなるコンジュゲーション反応のために将来のバッチ中で容易に再利用することができる。本発明の方法では、驚くべきほど僅かな、すなわち約３０％未満、より好ましくは約１０％未満の高分子量種及びＰｒｏＧＰあたり１本より多くのポリマー鎖を含む種しか作製されない。これらの反応条件を、活性化されたポリマーが標的に対して数倍のモル過剰で存在する、ポリマーのコンジュゲーション反応に通常使用されている反応条件と対比すべきである。本発明の他の態様では、ＰｒｏＧＰ  １当量あたり約０．１〜約５０当量でポリマーが存在する。本発明の他の態様では、ＰｒｏＧＰ  １当量あたり約１〜約１０当量でポリマーが存在する。
【００４７】
本発明のコンジュゲーション反応では、最初に、モノ−及びジ−ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰコンジュゲート、未反応のＰｒｏＧＰ、未反応のポリマー並びに通常は約２０％未満の高分子量種を含む反応混合物又はプールが提供される。高分子量種には、１本より多くのポリマー鎖及び／又はポリマー化したＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ種を含むコンジュゲートが含まれる。未反応の種及び高分子量種を取り除いた後、一次モノ及びジ−ポリマー−ＰｒｏＧＰコンジュゲートを含む組成物を回収する。コンジュゲートの大多数は単一のポリマー鎖を含むという事実を考慮すると、このコンジュゲートは実質的に均一である。これらの修飾されたＰｒｏＧＰは、ＡＭＬ、ＴＦ１及びコロニー形成単位アッセイなど標準の細胞増殖アッセイ（本明細書中に参照として組み込まれている米国特許第６，０３０，８１２号）を使用した測定によれば、少なくとも約５％のネイティブ又は未修飾のＰｒｏＧＰに関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有する。本発明の好ましい態様では、修飾されたＰｒｏＧＰは、約２５％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有しており、より好ましくは、修飾されたＰｒｏＧＰは約５０％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有して折り、より好ましくは、修飾されたＰｒｏＧＰは約７５％のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有しており、最も好ましくは、修飾されたＰｒｏＧＰは同じ又は向上されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有している。
【００４８】
本発明の方法は、好ましくは、どちらかといえば制限されたポリマーとＰｒｏＧｐの比を含む。したがって、ＰｒｏＧＰコンジュゲートは、１本のポリマー鎖しか含まない種に主に限定されていることが判明している。さらに、ポリマーのＰｒｏＧＰ反応性基への付着は、使用するポリマーリンカーのモル過剰がより高い場合に比べて、実質的に、より規則的であった。コンジュゲーション反応を停止（ｑｕｅｎｃｈ）した後に反応プール中に存在する未修飾ＰｒｏＧＰは、イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィー又は同様の分離技術を使用して将来の反応で再利用することができる。
【００４９】
ポリ（エチレングリコール）で修飾されたＰｒｏＧＰ、すなわち本発明に従って化学修飾されたタンパク質を、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー及び電気泳動などタンパク質の精製に使用されている従来の方法によって混合反応物から精製してもよい。イオン交換クロマトグラフィーが、未反応のポリ（エチレングリコール）及びＰｒｏＧＰを取り除くのに特に有効である。本発明のさらなる実施形態では、モノ−及びジ−ポリマー−ＰｒｏＧＰ種を反応混合物から単離して高分子量種及び未修飾のＰｒｏＧＰを取り除く。分離は、混合種を約０．５〜１０ｍｇ／ｍＬのＰｒｏＧＰ−ポリマーコンジュゲートを含む緩衝溶液中に置くことによって行う。適切な溶液は約４〜約１０のｐＨを有する。この溶液は、好ましくは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、及びＮａＯＨから選択される１つ又は複数の緩衝塩を含む。
【００５０】
反応緩衝液に応じて、まず最初に未反応ポリマーを取り除くためにＰｒｏＧＰポリマーコンジュゲート溶液で緩衝液の交換／限外濾過を行ってもよい。たとえば、ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰコンジュゲートを低分子量カットオフ（１０，０００〜３０，０００ダルトン）の膜で限外濾過し、未反応のポリマー、存在する場合は界面活性剤など、望ましくない物質をほとんど取り除くことができる。
【００５１】
コンジュゲートの所望の種を含むプールへの分画化は、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー媒体を使用して実施する。このような媒体は、多少は予測可能な様式で変動する電荷の差によってＰＥＧ−ＰｒｏＧＰコンジュゲートと選択的に結合する能力を有している。たとえば、ＰｒｏＧＰの表面電荷はタンパク質表面上の有効な帯電した基の数によって決定される。これら帯電した基は通常、ポリ（アルキレンオキシド）コンジュゲートの潜在的な付着点としての役割を果たす。したがって、ＰｒｏＧＰコンジュゲートは、他の種とは異なる電荷を有することとなり、選択的単離が可能になる。
【００５２】
極性が強い陰イオン又は陽イオン交換樹脂、たとえばそれぞれ第四級アミン又はスルホプロピル樹脂などを、本発明の方法で使用する。陽イオン交換樹脂が特に好ましい。本発明での使用に適した市販されている陽イオン交換樹脂の非限定的なリストに含まれているのは、ＳＰ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）及びＳＰ  Ｓｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファストフロー（ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ）である。他の適切な陽イオン交換樹脂、たとえばＳ樹脂及びＣＭ樹脂を使用することもできる。市販されている陰イオン交換樹脂を含めた、本発明での使用に適した陰イオン交換樹脂の非限定的なリストは、Ｑ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）及びＱ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファストフロー（ｆａｓｔ  ｆｌｏｗ）である。他の適切な陰イオン交換樹脂、たとえばＤＥＡＥ樹脂を使用することもできる。
【００５３】
たとえば、陽イオン交換樹脂は、好ましくはカラムに充填され、従来の手段によって平衡化されている。ポリマーをコンジュゲートさせたＰｒｏＧＰの溶液と同じｐＨと浸透性（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）を有する緩衝液を使用する。溶出緩衝液は、好ましくは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、及び（ＮＨ４）２ＣＯから選択される１つ又は複数の塩を含む。その後、コンジュゲートを含む溶液を未反応のポリマーと共にカラムに吸着させ、一部の高分子量の種は保持されない。カラムに載せ終わった後に、塩濃度が増加する勾配を有する溶出緩衝液をカラムに施用して、所望のポリアルキレンオキシドをコンジュゲートさせたＰｒｏＧＰの分画を溶出させる。溶出されたプールした分画は、好ましくは、陽イオン交換分離ステップの後では均一なポリマーコンジュゲートに限られている。その後、すべてのコンジュゲートされていないＰｒｏＧｐ種を従来の技法によりカラムから逆洗することができる。所望する場合は、追加のイオン交換クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーによって、モノ及びマルチｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰ種をさらに互いから分離することができる。濃度が増大する複数の定組成ステップを使用する技法を使用することもできる。濃度が増大する複数の定組成溶出ステップにより、ジ−ＰｒｏＰＧ−ポリマーコンジュゲート、その後モノ−ＰｒｏＧＰ−ポリマーコンジュゲートが連続的に溶出される。
【００５４】
溶出のための温度範囲は約４℃〜約２５℃である。好ましくは、約６℃〜約２２℃の温度で溶出を行う。たとえば、ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ分画の溶出は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって検出する。単純な溶出時間プロファイルによって分画の回収を成すことができる。
【００５５】
ポリ（エチレングリコール）ポリマーをＰｒｏＧＰ部分（ｍｏｉｅｔｙ）とコンジュゲートさせる方法中で、界面活性剤を使用することができる。適切な界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などイオン性の薬剤が含まれる。ドデシル硫酸リチウム、第四級アンモニウム化合物、タウロコール酸、カプリル酸、デカンスルホン酸など他のイオン性界面活性剤を使用することもできる。非イオン性の界面活性剤を使用することもできる。たとえば、ポリ（オキシエチレン）ソルビタン（Ｔｗｅｅｎ）、ポリ（オキシエチレン）エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ）などの物質を使用することができる。Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ、「生物学及び生化学における界面活性剤の特性及び使用の手引き（Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９２年、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．も参照。本発明の方法中で使用する界面活性剤に対する制限は、ＰｒｏＧＰに実質的に元に戻せない変性が引き起こされず、ポリマーのコンジュゲーションが完全に阻害されない条件下及び濃度でこれらを使用するということだけである。界面活性剤は、約０．０１〜０．５％、好ましくは０．０５〜０．５％、最も好ましくは約０．０７５〜０．２５％の量で反応混合物中に存在する。界面活性剤の混合物も企図される。
【００５６】
界面活性剤が、ポリマーのコンジュゲーションプロセス中に一時的な、可逆的な保護システムを提供すると考えられている。界面活性剤は、リジン又はアミノ末端に基づいたコンジュゲーションの進行を可能にすると同時にポリマーコンジュゲーションを選択的に妨げるのに有効であることが示されている。
【００５７】
本発明のポリ（エチレングリコール）で修飾されたＰｒｏＰＧは、そのｉｎ  ｖｉｖｏでの延長された半減期に起因している可能性のある、より持続する薬理効果を有する。
【００５８】
本発明のＰＥＧ−ＰｒｏＧＰで意図される使用は、免疫化のアジュバントとして使用する、より多い数の樹状細胞を前駆細胞から産生させることである。樹状細胞は、免疫系において重大な役割を果たす。これらは、休止Ｔ細胞の活性化に最も有効な抗原提示細胞（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｇ  ｃｅｌｌ）であり、また未処置のＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性化、したがって一次免疫応答の開始のための主要な抗原提示細胞である。これらは、可溶性の腫瘍に特異的な抗原（Ａｇ）を有効に内部移行、プロセッシング、かつ提示する。樹状細胞は、未処理のＴ細胞のクラスター形成を行うこと、また主要組織適合複合体（ＭＨＣ）及び共刺激分子の発現、サイトカインの産生、並びにリンパ器官に向かう遊走を迅速に上方制御することによってＡｇに遭遇した際に応答する、独特の能力を有している。樹状細胞はＣＤ４依存性免疫応答のための新抗原に対して宿主を感作させるのに非常に重要であるので、これらは、腫瘍免疫の発生及び制御においても重要な役割を果たすかもしれない。
【００５９】
樹状細胞は、顆粒球及びマクロファージに共通の骨髄ＣＤ３４＋前駆体から派生し、純粋な樹状細胞コロニーを生じる別々の樹状細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＤＣ）の存在がヒトで確立されている。さらに、独特のサイトカイン条件下で樹状細胞又はマクロファージ経路に沿って分化する潜在性を有するＣＦＵ後のＣＤ１４＋中間細胞が記載されている。この二分化能を有する前駆細胞は、骨髄、臍帯血、及び末梢血中に存在する。培養した樹状細胞の熟成を描写するために、ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ２０−、ＣＤ４０＋、ＣＤ８０＋、及びＣＤ８３＋などの特異的な細胞表面マーカーに基づいて樹状細胞を単離することができる。
【００６０】
樹状細胞に基づいた戦略によって、腫瘍及び感染性病原体に対する免疫応答を高める方法が提供される。樹状細胞はＨＩＶ−１の複製の促進に主要な役割を果たす可能性があるので、樹状細胞に基づいた療法を使用することができる別の疾病はＡＩＤＳである。免疫療法では、癌患者由来の樹状細胞を産生させること、手術によって取り除いた腫瘍塊由来の腫瘍Ａｇにそれをｉｎ  ｖｉｔｒｏで曝すこと、及びこれらの細胞を腫瘍患者に再注入することを要する。比較的粗い腫瘍細胞の膜調製物は腫瘍抗原源として十分なものであり、腫瘍抗原の分子同定の必要性を避けることが可能である。この腫瘍抗原は、合成ペプチド、炭水化物、又は核酸配列であってもよい。さらに、本発明のＰＥＧ−ＰｒｏＧＰなどのサイトカインの同時投与により、腫瘍免疫の導入がさらに促進され得る。免疫療法が、樹状細胞の数を増加させるために本発明のＰＥＧ−ＰｒｏＧＰを単独で又は他の造血成長因子と共に腫瘍を有する患者に投与し、内在腫瘍抗原が樹状細胞上に提示されるｉｎ  ｖｉｖｏの設定であり得ることが予見される。ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫療法が外来抗原を用いた療法であり得ることも想定されている。また、免疫療法治療には、本発明のＰＥＧ−ＰｒｏＧＰを単独で又は他の造血成長因子と共に患者に投与することによって樹状細胞前駆体又は成熟樹状細胞を動員させること、患者から樹状細胞前駆体又は成熟樹状細胞を取り除くこと、樹状細胞を抗原に曝すこと、及び樹状細胞を患者に戻すことが含まれ得ることも想定されている。さらに、抗原に曝す前に、樹状細胞の数を増加させるために、取り除いた樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで本発明のＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ単独と又は他の造血成長因子と共に培養することができる。また、樹状細胞に基づいた戦略は、自己免疫疾患における免疫応答を軽減させる方法も提供する。
【００６１】
樹状細胞の研究は、細胞を十分な数で、及び適度に純粋な形で調製することが困難なことによって大いに妨げられてきた。ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞拡大設定では、骨髄、臍帯血、又は末梢血から回収した造血成長因子前駆細胞（ＣＤ３４＋細胞）から樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで産生するために顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）が協力し、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αによって誘発される樹状細胞の産生を亢進するために、ｆｌｋ−２／ｆｌｔ−３リガンド及びｃ−ｋｉｔリガンド（幹細胞因子［ＳＣＦ］）が協同する（Ｓｉｅｎａ，Ｓ他、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２３：１４６３〜１４７１、１９９５年）。免疫療法に十分な量の樹状細胞を提供するために、本発明のＰＥＧ−ＰｒｏＧＰを使用した、樹状細胞前駆体又は成熟樹状細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの拡大方法も、提供されている。
【００６２】
さらに、本発明のポリ（エチレングリコール）で修飾されたＰｒｏＧＰは、好中球減少症からの回復を速めるかもしれないことが観察された。本発明のポリ（エチレングリコール）で修飾されたＰｒｏＧＰは、無処置のＰｒｏＧＰと同じ生物活性を本質的に有し得、したがって、同じ用途に使用し得る。ポリ（エチレングリコール）で修飾されたＰｒｏＧＰは、好中球の数を増加させる活性を有しており、したがって、化学療法又は放射療法から引き起こされるものを含めた一般的な造血疾患の治療に有用である。また、これは、感染症及び骨髄移植の処置にも有用であるかもしれない。また、本発明の修飾されたＰｒｏＧＰは、骨髄系細胞、赤血球系細胞、リンパ系細胞、若しくは造血系の巨核球細胞又はその組合せのいずれかのレベルの減少によって特徴づけられる疾病の処置にも有用であるかもしれない。さらに、成熟骨髄系細胞及び／又はリンパ系細胞を活性化させるのにこれらを使用してもよい。本発明のポリペプチドを用いた処置に感受性のある状態の中には、末梢血中に循環している白血球（白血球）の数の減少である白血球減少症がある。白血球減少症は、特定のウイルスや放射線への曝露によって誘発され得る。これは、さまざまな形の癌療法、たとえば化学療法薬物への曝露、放射線、感染症又は出血、の副作用であることが多い。本発明のこれら修飾されたＰｒｏＧＰを用いた白血球減少症の治療的処置によって、現在利用可能な薬物を用いた処置によって引き起こされる望ましくない副作用が避けられるかもしれない。
【００６３】
本発明の修飾されたＰｒｏＧＰは、好中球減少症の処置又は予防、並びに、たとえば再生不良性貧血症、周期性好中球減少症、特発性好中球減少症、チェディアック東症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、白血病、骨髄形成異常症候群及び骨髄繊維症などの状態の処置に有用であるかもしれない。
【００６４】
本発明の修飾されたＰｒｏＧＰは、血小板減少症の処置又は予防に有用であるかもしれない。現在、血小板減少症の処置方法は、費用が高く感染症（ＨＩＶ、ＨＢＶ）及び同種免疫の重大な危険性を有する血小板輸血、並びに特定の血小板減少症で認可されているＩＬ−１１（Ｎｅｕｍｅｇａ（商標））のみである。修飾されたＰｒｏＧＰは、血小板輸血の必要性を軽減又は減少させるかもしれない。重度の血小板減少症は、ファンコニ貧血症候群、ウィスコット−アルドリッチ症候群、メイ−ヘグリン症候群などの遺伝性欠陥から生じ得る。後天性血小板減少症は、免疫性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、溶血性貧血、又は母児間不適合などにおける自己抗体又は同種抗原から生じ得る。さらに、脾腫大、播種性血管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、感染症、又は人工心臓弁によっても血小板減少症が生じ得る。重度の血小板減少症は、化学療法及び／又は放射療法や癌によっても生じ得る。また、血小板減少症は、癌腫、リンパ腫、白血病、又は繊維症による骨髄浸潤によっても生じ得る。
【００６５】
本発明の修飾されたＰｒｏＧＰは、造血前駆細胞及び幹細胞の末梢血中への動員に有用であるかもしれない。末梢血由来の前駆細胞は、自家骨髄移植の生着（ｓｅｔｔｉｎｇ）において患者の状態を元に戻すのに有効であることが示されている。Ｇ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦを含めた造血成長因子は、末梢血中に循環している前駆細胞及び幹細胞の数を増やすことが示されている。これにより、末梢幹細胞を収集するための手順が単純化され、必要とされる交換療法の回数が減ったことによりの手順の費用が劇的に下がった。修飾されたＰｒｏＧＰは、幹細胞の動員に有用である可能性があり、さらに末梢幹細胞移植の有効性を高め得る。
【００６６】
成長因子の別の計画された臨床使用は、遺伝子療法のための造血前駆細胞及び幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける活性化であった。目的の遺伝子を造血前駆細胞又は幹細胞のゲノム内に取り込ませるためには、細胞分裂及びＤＮＡ複製を刺激する必要がある。造血幹細胞の周期は非常に低い頻度で起こり、これは、成長因子が遺伝子形質導入を高めるのに有用であり、遺伝子療法の臨床的な見通しが高められ得ることを意味する。
【００６７】
多くの薬物が骨髄抑制又は造血不全症を引き起こすかもしれない。このような薬物の例は、ＡＺＴ、ＤＤＩ、化学療法で使用されるアルキル化剤や抗代謝剤、クロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビル、ダウノマイシン、サルファ剤などの抗生物質、フェノチアゾン、メプロバメートなどの精神安定剤、アミノピリンやジピロンなどの鎮痛剤、フェニトインやカルバマゼピンなどの抗うつ剤、プロピルチオウラシルやメチマゾールなどの抗甲状腺薬、及び利尿剤である。本発明の修飾されたＰｒｏＧＰは、これらの薬物で処置した患者で多くの場合引き起こされる骨髄抑制又は造血不全症を予防又は処置するのに有用であるかもしれない。
【００６８】
造血不全症は、ウイルス、微生物、又は寄生虫感染が原因で、あるいは腎疾患や腎不全の処置、たとえば透析の結果として起こる場合もある。本発明の修飾されたＰｒｏＧＰは、このような造血不全症を処置するのに有用であるかもしれない。
【００６９】
造血不全症の処置には、修飾されたＰｒｏＧＰを含む薬剤組成物を患者に投与することが含まれ得る。また、本発明の修飾されたＰｒｏＧＰは、造血前駆細胞を患者に注入する前に、ｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の修飾されたＰｒｏＧＰで細胞を処置することによって、造血前駆細胞の活性化及び増幅に有用となり得る。
【００７０】
さまざまな免疫不全症、たとえばＴリンパ球及び／又はＢリンパ球におけるもの、あるいは免疫疾患、たとえば関節リウマチも、本発明の修飾されたＰｒｏＧＰを用いた処置によって有利に影響され得る。免疫不全症は、ウイルス感染、たとえばＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、放射線への重度の曝露、癌療法の結果、あるいは他の医療処置の結果であり得る。また、本発明の修飾されたＰｒｏＧＰを、単独であるいは他のヘマトポイエチンと組み合わせて、血小板減少症（血小板欠乏症）や貧血を含めた他の血球不全の処置に使用し得る。これら新規のポリペプチドの他の使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏにおける骨髄移植から回復中の患者の処置、並びに診断又は処置で使用する、標準の方法によって賛成したモノクローナル及びポリクローナル抗体の開発である。
【００７１】
本発明のポリ（エチレングリコール）で修飾したＰｒｏＧｐを、患者に投与するために、製薬上許容される希釈剤、等張溶液を調製するための薬剤、ｐＨ調節剤なども含む薬剤中に配合し得る。上記の薬剤は、処置の目的に応じて、皮下、筋肉内、静脈内、又は経口で投与し得る。１用量は、処置する患者の疾患の種類及び状態にも基づく場合があり、通常は成人で、注射で０．１ｍｇ〜５０ｍｇ、経口投与で０．１ｍｇ〜５ｇである。
【００７２】
含められるポリマー物質も、好ましくは室温で水溶性である。このようなポリマーの非限定的なリストには、ポリ（エチレングリコール）やポリ（プロピレングリコール）、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）などポリ（アルキレンオキシド）ホモポリマー、これらのコポリマー、及びブロックコポリマーの水溶性が維持されることを条件としてこれらのブロックコポリマーが含まれる。
【００７３】
ＰＥＧベースのポリマーの代わりとして、デキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルアルコール）、炭水化物ベースのポリマーなどの有効に非抗原性の物質を使用することができる。実際、これらポリマー物質のα−及びω−末端基の活性化は、ポリ（アルキレンオキシド）を変換させるのに使用される方法と類似の方法でもたらすことができ、したがって、当業者には明らかであろう。当分野の技術者は、前記のリストは単なる例示に過ぎず、本明細書中に記載する性質を有するすべてのポリマー物質が企図されることを理解されよう。本発明の目的では、「有効に非抗原性」とは、哺乳動物において無毒であり、認められるほどの免疫原性を誘発させないと当分野で理解されている物質すべてを意味する。
【００７４】
定義
以下は、本明細書中で互換性があるように使用される略記及びその対応する意味のリストである。
ｇ              グラム
ｍｇ            ミリグラム
ｍｌ又はｍＬ    ミリリットル
ＲＴ            室温
ＰＥＧ          ポリ（エチレングリコール）
【００７５】
本開示中に引用されているすべての出版物、特許、及び特許出願は、それぞれ個別の出版物、特許、又は特許出願が具体的に個別に参照として組み込まれていると指示されている場合と同じように、参照として本明細書中に組み込まれている。
【００７６】
明確な理解のために前述の発明を例示及び例によって多少詳しく記載したが、本発明の教示を踏まえて本発明の精神及び範囲から逸脱せずに変化及び改変を行い得ることは、当業者には容易に理解できるであろう。以下の実施例は例証目的でのみ提供し、上で広義に記載した本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００７７】
以下の実施例では、ポリペプチドＰｒｏＧＰは、アミノ酸配列を図１２に示すポリペプチドＰｒｏＧＰ−４である。ポリペプチドＰｒｏＧＰファミリーの他のメンバーも、次の実施例中に例示する方法と同様にｐｅｇ化できることが理解されよう。
実施例
【実施例１】
【００７８】
分子量３０，０００の直鎖ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
【００７９】
【化１】
2005512951.tif 000014
【００８０】
この実施例では、還元的アルキル化によって実質的に均一なＮ末端がモノｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰの調製物を作製する方法を実証する。リジン残基のε−アミノ位の第一級アミンのｐＫａ値に対するＮ末端の第一級アミンのｐＫａ値の比における差を利用して、還元的アミノ化によって分子量約３０，０００のメトキシ−直鎖ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰのＮ末端に選択的にカップリングさせた。１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．０又は１０ｍＭのコハク酸ナトリウム（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）、８％のアセトニトリル（Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｍｕｓｋｅｇｏｎ、ＭＩ）、ｐＨ５．０、に１〜５ｍｇ／ｍＬで溶かしたＰｒｏＧＰタンパク質を、固体のメトキシ−ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド、Ｍ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）を加えることによってこれと反応させ、比ＰＥＧ：ＰｒｏＧＰ（二量体）のモル比２〜１２：１を得た。最終濃度１０ｍＭまでＨ２Ｏに溶かした１ＭのＮａＣＮＢＨ４（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のストックを加えることによって反応を触媒した。暗所、４℃で１８〜２４時間反応を行った。１Ｍのトリス塩基（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を最終トリス濃度５０ｍＭ、最終ｐＨ８．５まで加えることによって、反応を停止した。
【実施例２】
【００８１】
分子量２０．０００の直鎖ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
実施例１に記載の手順を使用して、分子量２０，０００のメトキシ−直鎖ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰのＮ末端にカップリングさせた。
【実施例３】
【００８２】
分子量５，０００の直鎖ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
実施例１に記載の手順を使用して、分子量５，０００のメトキシ−直鎖ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド試薬（Ｆｌｕｋａ）をＰｒｏＧＰのＮ末端にカップリングさせた。
【実施例４】
【００８３】
分子量４０，０００の分枝鎖ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
【００８４】
【化２】
2005512951.tif 000015
【００８５】
実施例１に記載の手順を使用して、分子量４０，０００のメトキシ−分枝ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド（ＰＥＧ２−ＡＬＤ）試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰのＮ末端にカップリングさせた。
【実施例５】
【００８６】
分子量２０，０００の直鎖ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
【００８７】
【化３】
2005512951.tif 000016
【００８８】
この実施例では、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル（ＮＨＳ）活性エステルを使用して、実質的に均一なモノｐｅｇ化されたプロゲニポイエチン（ＰｒｏＧＰ）の調製物を作製する方法を実証する。ＰｒｏＧＰタンパク質ストック溶液を１〜５ｍｇ／ｍＬで１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．０に溶かし、０．２５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を加えることによってｐＨ７．２まで滴定した。その後、この溶液を、固体のメトキシ−ＰＥＧスクシニミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を加えることによってこれと反応させ、比ＰＥＧ：プロゲニポイエチンのモル比６．５：１を得た。反応は４℃で１時間行った。０．１Ｎの酢酸を用いて、又は５×モル過剰のトリスＨＣｌを加えることによってｐＨを４．０まで下げて、反応を停止した。同様の方法で、分子量５〜２０，０００のＣＭ−ＨＢＡ−ＮＨＳを使用することができた。
【００８９】
【化４】
2005512951.tif 000017
【実施例６】
【００９０】
分子量３，４００の直鎖ビオチン−ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
【００９１】
【化５】
2005512951.tif 000018
【００９２】
実施例５に記載の手順を使用して、分子量３，４００のビオチン−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＮＨＳ試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰにカップリングさせた。
【実施例７】
【００９３】
分子量１０，０００の分枝ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
【００９４】
【化６】
2005512951.tif 000019
【００９５】
実施例５に記載の手順を使用して、分子量１０，０００の分枝ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰにカップリングさせた。
【実施例８】
【００９６】
分子量２０，０００の分枝ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
実施例５に記載の手順を使用して、分子量２０，０００の分枝ＰＥＧ２−ＳＰＡ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰにカップリングさせた。
【実施例９】
【００９７】
分子量４０，０００の分枝ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
実施例５に記載の手順を使用して、分子量４０，０００の分枝ＰＥＧ２−ＳＰＡ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰにカップリングさせた。
【実施例１０】
【００９８】
分子量２０，０００の直鎖ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
【００９９】
【化７】
2005512951.tif 000020
【０１００】
実施例４に記載の手順を使用して、分子量２０，０００のＰＥＧ−ＢＴＣ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰにカップリングさせた。この実施例では、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカーボネート誘導体を使用して、実質的に均一なｐｅｇ化されたプロゲニポイエチン（ＰｒｏＧＰ）の調製物を作製する方法を実証する。
【実施例１１】
【０１０１】
分子量５，０００の直鎖ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
【０１０２】
【化８】
2005512951.tif 000021
【０１０３】
実施例５に記載の手順を使用して、分子量５，０００のスクシニミジルスクシネート−ＰＥＧ（ＳＳ−ＰＥＧ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）をＰｒｏＧＰにカップリングさせた。この実施例では、加水分解可能な結合を使用して、実質的に均一なｐｅｇ化されたプロゲニポイエチン  （ＰｒｏＧＰ）の調製物を作製する方法を実証する。
【実施例１２】
【０１０４】
分子量２０，０００の直鎖ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ
【０１０５】
【化９】
2005512951.tif 000022
【０１０６】
この実施例では、分子量２０，０００のメトキシ−ＰＥＧヒドラジド、ＨＺ−ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、実質的に均一なｐｅｇ化されたプロゲニポイエチン（ＰｒｏＧＰ）の調製物を作製する方法を実証する。ＰｒｏＧＰタンパク質ストック溶液を１〜５ｍｇ／ｍＬで１０ｍＭのコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．０に溶かした。その後、この溶液を、固体を加えることによってＨＺ−ＰＥＧと反応させ、比ＰＥＧ：プロゲニポイエチンのモル比６．５〜２６：１を得た。最終濃度２ｍＭのカルボジイミド（ＥＤＣ、ＥＯＡＣ）で反応を触媒した。反応は４℃で２時間行った。０．１Ｎの酢酸を用いてｐＨを４まで下げることによって、反応を停止した。
【実施例１３】
【０１０７】
マルチｐｅｇ化された種
２つ以上のＰＥＧが付着した（マルチｐｅｇ化された）修飾されたＰｒｏＧＰも実施例１〜４から得、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してモノｐｅｇ化された種から分離した。２つ以上のＰＥＧが付着した（マルチｐｅｇ化された）修飾されたＰｒｏＧＰも、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用してモノＰＥＧ化された種から分離した。
【０１０８】
２つ以上のＰＥＧが付着した（マルチｐｅｇ化された）修飾されたＰｒｏＧＰも実施例５〜１３から得ることができ、実施例１〜４と類似の方法で精製することができる。
【実施例１４】
【０１０９】
Ｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰの精製
単一のイオン交換クロマトグラフィーステップを使用して、反応混合物からｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰを＞９５％（ＳＥＣ分析）まで精製した。
【０１１０】
陰イオン交換クロマトグラフィー
単一の陰イオン交換クロマトグラフィーステップを使用して、反応混合物から、モノｐｅｇ化された３０Ｋ、２０Ｋ及び５Ｋ  ＰＥＧアルデヒドＰｒｏＧＰ種を＞９５％（ＳＥＣ分析）まで精製した。陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してモノｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰを未修飾のＰｒｏＧＰ及びマルチｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰ種から精製した（図１）。上記の代表的な３０ＫのアルデヒドＰｒｏＧＰ反応混合物（５０〜３５０ｍｇのタンパク質）を、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５（緩衝液Ａ）で平衡化したＱ−セファロース高速カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＸＫ  ２６／２０、床容積７０ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で精製した。反応混合物を５０ｍＭのトリス、８％のアセトニトリル、ｐＨ８．５で５×希釈し、流速１０ｍＬ／分でカラムに載せた。カラムの５倍体積の緩衝液Ａ、次いでカラムの５倍体積の３０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａでカラムを洗浄した。その後、カラムの２０倍体積の緩衝液Ａ及び３０〜１３０ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配で、さまざまなＰｒｏＧＰ種をカラムから溶出させた。２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）によって溶出液をモニターし、１２ｍＬずつの分画を回収した。（実施例１５で評価したように）ｐｅｇ化の度合い、たとえばモノ、ジ、トリなどについて分画をプールした。１ＭのＨＣｌを用いてこのプールのｐＨを７．５まで低下させ、その後、１０Ｋのオメガセル攪拌細胞濃縮器（Ｏｍｅｇａｃｅｌｌ  ｓｔｉｒｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）（Ｆｉｌｔｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）でプールを１〜５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。吸光係数０．９７％を使用して、Ａ２８０によってプールのタンパク質濃度を決定した。この方法による精製された３０ＫのモノＰＥＧ−アルデヒドＰｒｏＧＰの全収率は２５〜３０％であった。
【０１１１】
陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィーを、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５（緩衝液Ｃ）で平衡化したＳＰセファロース高速カラム（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｃｏｌｕｍｎ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ  ２６／２０、床容積７０ｍｌ）で実施した。反応混合物を緩衝液Ｃで１０×希釈し、流速５ｍＬ／分でカラムに載せた。次に、カラムの５倍体積の緩衝液Ｃ、次いでカラムの５倍体積の１２％の緩衝液Ｄ（１０ｍＭの酢酸、ｐＨ４．５、１ＭのＮａＣｌ）でカラムを洗浄した。その後、カラムの２０倍体積の１２〜２７％の直線勾配の緩衝液Ｄを用いてＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ種をカラムから溶出させた。溶出液を２８０ｎｍでモニターし、１０ｍＬずつの分画を回収した。ｐｅｇ化の度合い（モノ、ジ、トリなど）に従って分画をプールし、１０ｍＭの酢酸ｐＨ４．５の緩衝液中にイオン交換させ、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜を装着した攪拌セルで１〜５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。吸光係数０．７１を使用して、Ａ２８０ｎｍによってプールのタンパク質濃度を決定した。この方法によるモノｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰの全収率は１０〜５０％である。
【実施例１５】
【０１１２】
生化学的な特徴づけ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）、非変性及び変性サイズ排除クロマトグラフィー（図２、４）、ＲＰ  ＨＰＬＣ（図５）、トリプシン消化によるマッピング（図７）、並びにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ６）によって、精製したｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰのプールを特徴づけた。
【０１１３】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、３０Ｋのメトキシ−ＰＥＧプロピオンアルデヒドとＰｒｏＧＰとの反応、陰イオン交換精製、及び最終的な精製した生成物を評価した（図２ａ、２ｂ）。分析用の非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ＨＲ  １０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して、５０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中、流速０．４ｍＬ／分で行った。
【０１１４】
ＰＥＧ化によってタンパク質の流体力学的な体積が大いに増大し、その結果、保持時間がより早い時間にシフトする。３０ＫのＰＥＧアルデヒドＰｒｏＧＰの反応混合物中で、未修飾のＰｒｏＧＰと共に２つのＰＥＧ化された種を観察した。これらのＰＥＧ化された種及びＰＥＧ化されていない種をＱ−セファロースクロマトグラフィーで分離し（図１）、次いで、生じた精製された３０ＫのモノＰＥＧアルデヒドＰｒｏＧＰ）が非変性ＳＥＣにおける単一ピークとして溶出されることを示した（純度＞９５％、図２ｃ）。このＱ−セファロースクロマトグラフィー工程により、モノＰｅｇ化されたＰｒｏＧＰから遊離ＰＥＧ、ＰＥＧ化されていないＰｒｏＧＰ二量体及びマルチＰＥＧ化された種が効率的に取り除かれた。
【０１１５】
変性ＳＤＳ  ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
共有結合していないＰｒｏＧＰ二量体を解離させる変性ＳＤＳ  ＳＥＣを使用して、３０ＫのモノＰＥＧアルデヒドＰｒｏＧＰがＰｒｏＧＰ二量体の１つのサブユニット（単量体）にしかＰＥＧ化されていないことを実証した（図４）。変性ＳＥＣ  ＨＰＬＣは、ランニング緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中に０．１％のＳＤＳを含めること以外は、非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣについて記載した方法と同じ方法で、実施した。タンパク質の溶出の後、２２０ｎｍにおける吸光度をモニターした。非変性ＳＥＣにおける単一ピークとして溶出される精製された３０ＫのモノＰＥＧアルデヒドＰｒｏＧＰは、変性条件下ではＰＥＧ化されたサブユニットとＰＥＧ化されていないサブユニット（以下で同定する）とに分離される。
【０１１６】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ
共有結合していないＰｒｏＧＰ二量体を解離させるＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、純度、及び３０ＫのモノＰＥＧアルデヒドＰｒｏＧＰがＰｒｏＧＰ二量体の１つのサブユニット（単量体）にしかＰＥＧ化されていないことを実証した（図３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、厚さ１ｍｍの１２％トリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上で還元条件及び非還元条件下で行い、Ｎｏｖｅｘ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）Ｇ−２５０染色キットゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して染色した。非変性ＳＥＣにおける単一ピークとして溶出する精製した３０Ｋのモノ−ＰＥＧアルデヒドＰｒｏＧＰは、ＰＥＧ化されたサブユニットとＰＥＧ化されていないサブユニットとに分離される。
【０１１７】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ  ＨＰＬＣ）
ＲＰ  ＨＰＬＣを、５０℃の温度でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム（４．６×２５０ｍｍ、粒子サイズ５μｍ）で実施した。４０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡで平衡化したカラム上に流速１ｍＬ／分で試料を載せた。５８％のアセトニトリル３ｍＬでカラムを洗浄した。次いで、５８〜６３％の勾配のアセトニトリルで２７分間かけてタンパク質を溶出させた。調製用及び分析用のＲＰ−ＨＰＬＣを、５０℃の温度でＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ１８カラム、４．６×２５０ｍｍ、粒子サイズ５ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で実施した。４０％のアセトニトリル、０．１％のＴＦＡで平衡化したカラム上に流速１ｍＬ／分で試料を載せた。５８％のアセトニトリル３ｍＬでカラムを洗浄した。次いで、５８〜６３％の勾配のアセトニトリルで２７分間かけてタンパク質を溶出させた。２１４ｎｍでの吸光度について溶出液をモニターした。非変性ＳＥＣにおける単一ピークとして溶出する精製されたＰＥＧ−ＰｒｏＧＰは、変性条件下ではＰＥＧ化されたサブユニットとＰＥＧ化されていないサブユニット（以下で同定する）とに分離される（図５）。各々の種が何であるかを確認するために、ＲＰ−ＨＰＬＣによる溶出からのピーク（図５）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ及びＮ末端配列決定実験のために回収した。
【０１１８】
Ｎ末端配列決定及びペプチドマッピング
自動化エドマン分解化学を使用して、ＮＨ２末端タンパク質配列を決定した（ＳＯＰ  ４００．３２４）。分解には、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４９４  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を使用した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  ２．１ｍｍ  ｉ．ｄ．ＰＴＨ−Ｃ１８カラムを装着したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  １４０Ｃ  ＰＴＨ  ａｎａｌｙｚｅｒを使用したオンライン方式のＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって、それぞれのＰＴＨ−ＡＡ誘導体を同定した。ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰの正しい質量に対応しているＲＰ−ＨＰＬＣピーク（図５）のＮ末端配列決定により、２つのシグナルが生じた。大きい方のシグナル（収率約７５％）は、Ｎ末端アミノ酸が存在しないこと以外はＰＥＧ−ＰｒｏＧＰに予想される配列を有していた。Ｎ末端がＰＥＧ化されたタンパク質ではこの結果は予想通りである。第１サイクルのこの残基は、ＰＥＧ部分が付着しているために回収不可能である。小さい方のシグナル（収率約２５％）は、正しいＮ末端アミノ配列を有していた。ＲＰ−ＨＰＬＣから回収したピークが１００％ＰＥＧ化されていることを考慮すると、これらのデータにより、ＰＥＧ修飾の７５％がＮ末端で起こり、残りはおそらく、可能性のあるいくつかのリジン残基の１つに連結されていることが示唆される。
【０１１９】
トリプシン消化
５０：１で、４０％のＡＣＮ（Ｂ＆Ｊ）、０．１％のＴＦＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で再構成した、トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）ダルベッコ改変ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅ）、１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５（Ｓｉｇｍａ）トリプシンで、ＰＥＧ化されたＰｒｏＧＰを１ｍｇ／ｍＬで消化した。終夜、３７℃で消化させた後、トリプシンの第２アリコートを加え、溶液を終夜、３７℃で再度消化させた。５％の１．０ＮのＨＣｌ（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて消化を停止し、必要な場合は、使用するまで消化物を４℃で保存した。３５％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡで平衡化したＴｏｓｏＨａａｓ  ３０００ＰＷカラム上に０．５ｍＬ／分で１７５μｇを注入し、５０分間かけて溶出させた（図７）。分画を手動で０〜２５分間回収した。エドマン化学によってＰＥＧ化された断片を含む分画を配列決定した。結果により、ＰＥＧコンジュゲーションの約７７％がＮ末端アラニン上のαアミノ基で起こり、残りの２３％はＫ２８４に１４％、Ｋ２０１に５％、Ｋ２５２に４％と分布していることが示された。マトリックス支援によるレーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）。
【０１２０】
ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した、ＰｒｏＧＰのＰＥＧ化された単量体、ＰＥＧ化されていない単量体を濃縮し、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸をマトリックスとして、濃縮物の約１μＬをＭＡＬＤＩターゲット上にスポットした。Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、直線モードにおける陽イオンをモニターすることによってスペクトルを得た。１２３回のスキャンを収集し、平均値を計算した。ＢＳＡを標準として使用して質量を計算した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより、３０ＫのモノＰＥＧ化された−ＰｒｏＧＰ−４（ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ）単量体（図６）及びＰＥＧ化されていないＰｒｏＧＰ−４単量体（データ示さず）としての各サブユニットの正しい質量が確認された。早い溶出ピークは、３２，０００ｋＤａのＰＥＧと３９，０００ｋＤａのＰｒｏＧＰ４とを足したものに相当する分子質量７１，０００ｋＤａを有していた。遅い溶出ピークは、ＰｒｏＧＰ−４の正しい分子質量（３９，０００ｋＤａ）を有していた。
【実施例１６】
【０１２１】
ＢＡＦ３／Ｇ−ＣＳＦＲ細胞増殖アッセイ
ヒトＧ−ＣＳＦ受容体をコードしている遺伝子を形質移入させたマウスＢａＦ３細胞系（ｍＢａＦ３／ｈＧ−ＣＳＦＲ）を使用して、ｈＧ−ＣＳＦアゴニスト活性を検査した。ＰｒｏＧＰ及びＰＥＧ化されたＰｒｏＰＧの段階的な希釈液を含む９６ウェルマイクロタイタープレートにｍＢａＦ３／ｈＧ−ＣＳＦＲ細胞を１ウェルあたり２．５×１０４個の細胞で播種した。細胞に、Ｔ５６時間で［メチル−３Ｈ］−チミジンを１ウェルあたり０．５ｍＣｉで１８時間、律動的に与えた。プレートをガラス繊維フィルターマットに回収し、取り込まれた放射活性をシンチレーションスペクトロスコピーによって測定した。細胞系のアッセイ培地は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）５００μｇ／ｍｌを補充したＩＭＤＭ、ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）１００μｇ／ｍｌ、ＢＳＡ  １ｍｌあたりホスファチジルコリン２．５ｍｇからなる脂質代用品、並びに５０ｍＭの２−メルカプトエタノールから構成されていた。ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰのＧ−ＣＳＦ受容体アゴニスト活性は、ＰｒｏＧＰ−４と比較した場合に亢進されていた（表１）。ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ（．００５ｎＭ）のＥＣ５０値は、ＰｒｏＧＰ−４（．０２１ｎＭ）で決定されたものより約４倍低かった（ｐ＜０．０５）。
【実施例１７】
【０１２２】
ＢＡＦ３／Ｆｌｔ３細胞増殖アッセイ
ヒトＦｌｔ３の細胞外及び膜貫通ドメイン、ヒトＩＬ−３リーダー配列、及びヒトＧ−ＣＳＦ受容体の細胞質ドメインを使用してキメラＦｌｔ３／Ｇ−ＣＳＦ受容体分子を構築した。生じた構築体を使用して、マウスリンパ球細胞系Ｂａｆ／３に形質移入させた。記載したプロトコルにより、ヒトＦＬに応答して増殖したが試験した他のヒトサイトカインには応答しなかった、Ｂａｆ／３の安定なクローンが生じた。このクローン系を使用して、ＰｒｏＧＰ及びｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰのＦｌｔ３アゴニスト活性を分析した。各成長因子の段階的な希釈液を含む９６ウェルマイクロタイタープレートに、細胞を、血清を含まないＩＭＤＭ、ヒトトランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、ウシ血清アルブミン１ｍｌあたりホスファチジルコリン２．５ｍｇの脂質代用品（５００μｇ／ｍｌ）、並びに２−メルカプトエタノール（５０μｍ）中で、１ウェルあたり２．５×１０４個の細胞で播種した。５６時間後、細胞にメチル３Ｈチミジンを１ウェルあたり０．５μＣｉで１４〜１８時間、律動的に与え、細胞を回収し、取り込まれた放射活性をシンチレーションスペクトロスコピーによって測定した。ＰＥＧ化された形のＰｒｏＧＰはＰｒｏＧＰ−４の生物活性を維持していた（表１）。
【０１２３】
【表１】
2005512951.tif 000023
【実施例１８】
【０１２４】
ＣＦＵ−ＧＭクローン原性アッセイ
クローン原性前駆細胞が成長因子に応答して半固体培地中で分裂及び分化するコロニー形成単位顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）アッセイ中で、ヒト骨髄由来のＣＤ３４＋細胞を使用して造血前駆細胞の拡大を実証した。セントルイス大学医学大学院（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）との共同により、新鮮な骨髄（ＢＭ）吸引液を得た。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用した密度勾配遠心分離の後、単核の細胞分画を回収した。次いで、Ｉｓｏｌｅｘ  ５０幹細胞試薬キット（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）を使用したポジティブ選択によって、ＣＤ３４＋細胞（幹細胞及び前駆細胞）を単離した。この手順により、細胞の＞９０％がＣＤ３４＋細胞表面抗原を発現する濃縮された細胞生成物が得られる。これらＣＤ３４＋細胞を、Ｉｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中の０．９％のメチルセルロース、３０％のＦＢＳ、１％のＢＳＡ、１ｍＭの２−メルカプトエタノール及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４２３０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）中で、３５ｍｍの組織培養皿に播種した（１皿あたり１０，０００個の細胞）。
【０１２５】
１０〜１２日間、３７℃、５％のＣＯ２を含む加湿空気中で、培養物を成長因子と共にインキュベートした。同時添加実験におけるそれぞれの受容体アゴニストの濃度は、示したそれぞれの濃度値で等モルである。倒立顕微鏡を用いて造血細胞のコロニー（＞５０個の細胞）を数えた。Ｐｅｇ  ＰｒｏＧＰによって誘発された、造血前駆細胞のコロニー形成単位顆粒球／マクロファージ細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）への拡大及び分化は、ＰｒｏＧＰ−４又はヒトｆｌｔ３リガンドとｈＧ−ＣＳＦとを共に投与することで誘発される応答と等しかった（図８）。
【実施例１９】
【０１２６】
薬物動態学（Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）（ＰＫ）における成長因子の投与
メスのＣ５７ＢＬ／６（８〜１２週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）マウスをＰｈａｒｍａｃｉａの動物施設に収容した。ＰｒｏＧＰ及びＰｅｇ化されたＰｒｏＧＰをＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で希釈し、１回の注射あたり１００μｇの用量でマウスに投与した。マウスには、単一の皮下（ＳＣ）用量を注射した。
【０１２７】
ＰｒｏＧＰ  ＥＬＩＳＡ
サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してマウス血漿中のＰｒｏＧＰ及びｐｅｇ化されたＰｒｏＧＰタンパク質の濃度を決定した。親和性によって精製した、１００ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．２で１μｇ／ｍｌまで希釈したヤギ−抗−Ｆｌｔ３リガンドポリクローナル抗体で、９６ウェルのマイクロタイタープレートを１５０ｍｌ／ウェルでコーティングした。プレートを終夜、室温で、加湿チャンバ内でインキュベートし、３ＢＳＡ及び０．０５％のポリオキシエチレン−ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４で１時間、３７℃で遮断した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭのＮａＣｌ（洗浄緩衝液）でプレートを４回洗浄した。血漿ＰＫ試料をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）、ｐＨ７．４で希釈し、マウスのプールした血漿のアッセイマトリックスで力価を１：２にした。マトリックスと試料の血漿濃度の割合を一致させた。プレートを２．５時間、３７℃で加湿チャンバ内でインキュベートし、その後、洗浄緩衝液で４回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートされた、親和性によって精製したヤギ−抗ヒトＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストポリクローナル抗体をアッセイ緩衝液で１：１００００（０．２５〜．０５μｇ／ｍＬ）に希釈し、各ウェルに１５０μｌずつ加えた。プレートを１．５時間、３７℃で加湿チャンバ内でインキュベートした。ウェルの中身を出した後、洗浄緩衝液で各ウェルを再び４回洗浄した。その後、各ウェルに１５０ｍＬのＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液を入れた。プレートを室温で約１０分間インキュベートし、マイクロタイタープレート読取り装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）上で６５０ｎｍの試験波長を読み取った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓから供給された４パラメータ曲線適合プログラム（ｆｏｕｒ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して、未知のＰＫ試料中の免疫反応性ＰｒｏＧＰの濃度をＰｒｏＧＰ−４又はＰＥＧ−ＰｒｏＧＰのいずれかの標準曲線から計算した。
【０１２８】
薬物動態学のデータ分析
表２に報告するＰＫパラメータは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（バージョン３．０、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、ＮＣ）を使用したノンコンパートメント解析によって決定したものである。血漿濃度のデータ（ｎ＝３）の平均値を計算し、その平均値で単一のＰＫ分析を行った。血漿濃度と時間との対数線形プロットを目で調べることによって、ノンコンパートメント解析の間に見掛けの終末半減期（ｔ１／２）を手動で選択した。ＰｒｏＧＰ−４とＰＥＧ−ＰｒｏＧＰとの薬物動態学の比較を図９及び表２に示す。このデータは、マウスに皮下投与したＰＥＧ−ＰｒｏＧＰの単一の１００μｇ用量では、ＰｒｏＧＰ−４に比べて血漿存在時間が引き延ばされたことを示している。４８時間では、血漿中のＰＥＧ−ＰｒｏＧＰの濃度はＰｒｏＧＰ−４より約７０倍高かった。投与後９６時間でＰＥＧ−ＰｒｏＧＰでは検出可能なレベルが観察されたが、ＰｒｏＧＰ−４は７２時間で検出不可能であった。終末半減期（ｔ１／２）、クリアランス（Ｃｌ）、最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、及び最大濃度（Ｃｍａｘ）などのＰＫ値は、ＰＥＧ−ＰｒｏＧＰとＰｒｏＧＰ−４で有意な差がなかった。要約すると、ＰＥＧ化により、このタンパク質がマウスの血液中を循環する時間が延長される。
【０１２９】
【表２】
2005512951.tif 000024
【０１３０】
薬物動力学（Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）（ＰＤ）における成長因子の投与
メスのＣ５７ＢＬ／６（８〜１２週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）マウスをＰｈａｒｍａｃｉａの動物施設に収容した。ＰｒｏＧＰ−４及びＰｅｇ化されたＰｒｏＧＰをＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）で希釈し、１回の注射あたり１００〜５００μｇの範囲の用量でマウスに投与した。マウスには、以下のように単一の皮下（ＳＣ）用量を注射した。第０〜６日目又は第０〜９日目のいずれかで毎日ＰｒｏＧＰ−４を投薬（１回の注射あたり０．１ｍｇ）；第０、３及び６日目又は第０、３、６及び９日目にＰＥＧ−ＰｒｏＧＰを投薬（１回の注射あたり０．３ｍｇ）；第０日目又は第０及び５日目にＰＥＧ−ＰｒｏＧＰを投薬（１回の注射あたり０．５ｍｇ）。ベヒクル対照は第０〜９日目に毎日ＰＢＳを投薬した（１回の注射あたり０．１ｍｌ）。
【０１３１】
末梢血及び脾臓の処理
心室穿刺によって、ＣＯ２で麻酔したマウスから末梢血を採取し、ヘパリンでコーティングした管に入れた。血液採取の直後に安楽死させた動物から脾臓を採取した。細胞計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＺＭ、Ｍｉａｍｉ  Ｌａｋｅｓ、ＦＬ）を使用して全血液の総白血球（ＷＢＣ）総数を数えた。０．１５Ｍの低張性塩化アンモニウム溶液（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）を使用して赤血球を溶解した。遠心分離（３００×ｇ、１０分間）によって細胞を回収し、２％のＦＢＳ（Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む冷ＩＭＤＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）（ＩＭＤＭ−ＦＢＳ）で洗浄した。脾臓を採取して冷ＩＭＤＭ−ＦＢＳ中で処理し、細胞懸濁液にホモジナイズし、７０ｕｍのナイロンメッシュで濾過した。低張性塩化アンモニウム溶液を使用して赤血球を溶解し、脾臓細胞を冷ＩＭＤＭ−ＦＢＳで洗浄し、７０ｕｍのメッシュで濾過した。脾臓細胞を２％のＢＳＡを含むＩＭＤＭ緩衝液２５ｍｌに再懸濁させ、脾臓あたりの総脾細胞数を決定するために計数した。
【０１３２】
フローサイトメトリー試薬
蛍光色素又はビオチンにコンジュゲートされたモノクローナル抗体をＰｈａｒｍｉｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃ  ＩＩ／ＩＩＩ受容体抗体、Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ）、ＦＩＴＣにコンジュゲートされた抗体ＣＤ１１ｃ／ＨＬ３及びＰＥにコンジュゲートされた抗体ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ／／ＡＦ６−１２０．１）を１〜５μｇ／ｍｌで使用した。さまざまな抗体の組合せでアイソタイプが一致した対照を使用した。
【０１３３】
脾臓中の全白血球（ＷＢＣ）及び樹状細胞（ＤＣ）の応答は、毎日投与したＰｒｏＧＰ−４と３日毎に投薬したＰＥＧ−ＰｒｏＧＰとで類似していた（図１０）。第１０日目における末梢血中の比較ＤＣ応答は、毎日投薬したＰｒｏＧＰ−４より３日毎に投薬したＰＥＧ−ＰｒｏＧＰの方が大きかった。ＤＣの動員の動態学（図１１）は、脾臓ではＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ−４とＰｒｏＧＰ−４とで類似していたが（実施例１）、末梢血では、ＤＣの動員の動態学は、毎日投薬したＰｒｏＧＰ−４と比較した場合に３日毎に投薬したＰＥＧ−ＰｒｏＧＰ−４（実施例１）で改変されていた。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４反応のイオン交換クロマトグラフィーの溶出プロファイルの複製である。
【図２ａ】組替えＰｒｏＧＰ−４のＳＥＣ  ＨＰＬＣプロファイルである。
【図２ｂ】分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４反応混合物のＳＥＣ  ＨＰＬＣプロファイルである。
【図２ｃ】イオン交換で精製した、Ｎ末端がモノｐｅｇ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４のＳＥＣ  ＨＰＬＣプロファイルである。
【図３】分子量３００００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１はタンパク質標準、レーン２はブランク、レーン３はＰｒｏＧＰ−４、レーン４は分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４である。
【図４】イオン交換で精製した、Ｎ末端がモノｐｅｇ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４のＳＤＳ−ＳＥＣ  ＨＰＬＣプロファイルである。
【図５】Ｎ末端がモノＰＥＧ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４の逆相ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図６】逆相精製した、単量体のモノＰＥＧ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４単量体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す図である。
【図７】モノＰＥＧ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４トリプシン消化物のＳＥＣ  ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。
【図８】ヒト骨髄由来のＣＤ３４＋細胞の拡大及び分化を測定するコロニー形成単位顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）アッセイにおける、ｆｌｔ３受容体アゴニスト、Ｇ−ＣＳＦ受容体アゴニスト、ｆｌｔ３受容体アゴニストとＧ−ＣＳＦ受容体アゴニストとを共に加えること、ＰＥＧ化されていないＰｒｏＧＰ−４及びモノＰＥＧ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４の応答曲線の比較を例示する図である。
【図９】ＰｒｏＧＰ−４及びモノＰＥＧ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４におけるネズミ血漿濃度曲線の比較を例示する図である。
【図１０】投薬の２４時間後に得た末梢血及び脾臓中の全白血球（ＷＢＣ）及び樹状細胞（ＤＣ）数を例示することにより、マウスに毎日投薬したＰＥＧ化されていないＰｒｏＧＰ−４のｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性を、３日毎に投薬したＮ末端がモノＰＥＧ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４と比較した図である。
【図１１】投薬の２４、４８及び７２時間後に得た末梢血及び脾臓中の全白血球（ＷＢＣ）及び樹状細胞（ＤＣ）数を例示することにより、マウスに毎日投薬したＰＥＧ化されていないＰｒｏＧＰ−４のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＤＣ応答の動態学を、３日毎に投薬したＮ末端がモノＰＥＧ化された分子量３０，０００のＰＥＧ−ＡＬＤ  ＰｒｏＧＰ−４と比較した図である。
【図１２】ＰｒｏＧＰ−４のアミノ酸配列を示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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