(57)【要約】  本発明は、新奇な単離されたファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓポリメラーゼＪＤＦ−３、及びその変異体組換え型を特徴とする。本発明の変異体ポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失し、及び／または該ポリメラーゼの野生型と比較して、非従来型ヌクレオチドに対する識別の減少を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定するための組成物であって、前記組成物は、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少したファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼと、第１のプライマーとを含み、前記第１のプライマーは前記鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドの３’に隣接してアニールすることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２の配列を有し、さらに、Ｄ１４１，Ｅ１４３，Ａ４８５，Ｌ４０８またはＰ４１０における１つ以上のアミノ酸変異をさらに含むことを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１ＡまたはＤ１４１Ｔ、Ｅ１４３Ａ、Ｌ４０８ＨまたはＬ４０８Ｆ、Ａ４８５Ｔ、及びＰ４１０Ｌからなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸変異を有することを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１Ａ，Ｅ１４３Ａ，Ｐ４１０Ｌ及びＡ４８５Ｔに４つのアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠失していることを特徴とする請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログをさらに含み、前記連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼによって鋳型依存的に前記第１のプライマー中へ取り込まれることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、第１の検出可能なラベルで標識されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
１つより多い連鎖終結用ヌクレオチドアナログが標識されており、各連鎖終結用ヌクレオチドアナログは異なる第１の検出ラベルによって標識されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、ジデオキシヌクレオチドであることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ジデオキシヌクレオチドは、ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰからなる群より選択されることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記第１のプライマーは、第２の検出可能なラベルによって標識されていることを特徴とする請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
第１及び第２の検出可能なラベルは、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドを同定するためのシグナルを発生することを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
第２のプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１のプライマーは第２の検出可能なラベルで標識されており、前記第２のプライマーは第３の検出可能なラベルで標識されており、前記第２及び第３の検出可能なラベルは、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドを同定するためのシグナルを発生することを特徴とする請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第２のプライマーは、前記鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドの５’に隣接してアニールすることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＤＮＡリガーゼをさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼのための反応バッファをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記鋳型ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物またはプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記第１または第２または第３の検出可能なラベルは、蛍光ラベル、放射性同位体、化学発光ラベル、量子ドットラベル、抗原、またはアフィニティ分子からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする請求項８，１２または１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第１の検出可能なラベルは、ローダミンラベルまたはシアニンラベルであることを特徴とする請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定するためのキットであって、前記キットは、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少したファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼと、第１のプライマーとを含み、前記第１のプライマーは前記鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドの３’に隣接してアニールすることを特徴とするキット。
【請求項２３】
前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２の配列を有し、さらに、Ｄ１４１，Ｅ１４３，Ａ４８５，Ｌ４０８またはＰ４１０における１つ以上のアミノ酸変異をさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１ＡまたはＤ１４１Ｔ、Ｅ１４３Ａ、Ｌ４０８ＨまたはＬ４０８Ｆ、Ａ４８５Ｔ、及びＰ４１０Ｌからなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸変異を有することを特徴とする請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１Ａ，Ｅ１４３Ａ，Ｐ４１０Ｌ及びＡ４８５Ｔに４つのアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠失していることを特徴とする請求項２２〜２６に記載のキット。
【請求項２８】
少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログをさらに含み、前記連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼによって鋳型依存的に前記第１のプライマー中へ取り込まれることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項２９】
少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、第１の検出可能なラベルで標識されていることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項３０】
１つより多い連鎖終結用ヌクレオチドアナログが標識されており、各連鎖終結用ヌクレオチドアナログは異なる第１の検出ラベルによって標識されていることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項３１】
前記連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、ジデオキシヌクレオチドであることを特徴とする請求項２８に記載のキット。
【請求項３２】
前記ジデオキシヌクレオチドは、ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰからなる群より選択されることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記第１のプライマーは、第２の検出可能なラベルによって標識されていることを特徴とする請求項２９に記載のキット。
【請求項３４】
第１及び第２の検出可能なラベルは、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドを同定するためのシグナルを発生することを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
第２のプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項３６】
前記第１のプライマーは第２の検出可能なラベルで標識されており、前記第２のプライマーは第３の検出可能なラベルで標識されており、前記第２及び第３の検出可能なラベルは、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドを同定するためのシグナルを発生することを特徴とする請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記第２のプライマーは、前記鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドの５’に隣接してアニールすることを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
ＤＮＡリガーゼをさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼのための反応バッファをさらに含む請求項２２に記載のキット。
【請求項４０】
前記鋳型ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物またはプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項４１】
前記第１または第２または第３の検出可能なラベルは、蛍光ラベル、放射性同位体、化学発光ラベル、量子ドットラベル、抗原、またはアフィニティ分子からなる群から選ばれる１つであることを特徴とする請求項２９，３３または３６に記載のキット。
【請求項４２】
前記第１の検出可能なラベルは、ローダミンラベルまたはシアニンラベルであることを特徴とする請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
対照鋳型及び／または少なくとも１つの対照プライマーをさらに含む請求項２２，２８または３９に記載のキット。
【請求項４４】
対照鋳型及び４つの対照プライマーを含む請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
試料中の鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定する方法であって、前記方法は、
（ａ）第１のプライマーを前記鋳型ＤＮＡに接触させる工程であって、前記接触によって前記第１のプライマーは、前記鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドの３’に隣接してアニールすることができ、これにより前記第１のプライマーと前記鋳型ＤＮＡとの間で二本鎖が形成される工程と、
（ｂ）工程（ａ）からの前記二本鎖を、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログの存在下でインキュベートする工程であって、非従来型ヌクレオチドと前記ターミネータに対する識別が減少した前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは第１の検出可能なラベルで標識されており、前記インキュベーション工程によって、ＤＮＡポリメラーゼによる標識された連鎖終結用ヌクレオチドアナログの前記第１のプライマーへの鋳型依存的取り込みが可能になるインキュベーション工程と、
（ｃ）工程（ｂ）からの前記二本鎖の有無または正体を、前記第１の検出可能なラベルによって発生されるシグナルによって判定する工程とを含む方法。
【請求項４６】
前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２の配列を有し、さらに、Ｄ１４１，Ｅ１４３，Ａ４８５，Ｌ４０８またはＰ４１０における１つ以上のアミノ酸変異をさらに含むことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１ＡまたはＤ１４１Ｔ、Ｅ１４３Ａ、Ｌ４０８ＨまたはＬ４０８Ｆ、Ａ４８５Ｔ、及びＰ４１０Ｌからなる群より選ばれる１つ以上のアミノ酸変異を有することを特徴とする請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１Ａ，Ｅ１４３Ａ，Ｐ４１０Ｌ及びＡ４８５Ｔに４つのアミノ酸変異を含むことを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠失していることを特徴とする請求項４５〜４９に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログが第１の検出可能なラベルによって標識されていることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
１つより多い連鎖終結用ヌクレオチドアナログが標識されており、各連鎖終結用ヌクレオチドアナログは異なる第１の検出ラベルによって標識されていることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、ジデオキシヌクレオチドであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
前記ジデオキシヌクレオチドは、ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰからなる群より選択されることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１のプライマーは、第２の検出可能なラベルによって標識されていることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
第１及び第２の検出可能なラベルは、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドを同定するためのシグナルを発生することを特徴とする請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記鋳型ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物またはプラスミドであることを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
工程（ａ）の前に、ＰＣＲ産物からＰＣＲプライマー及びｄＮＴＰを除去する工程をさらに含む請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
試料中の鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定する方法であって、前記方法は、
（ａ）第１のプライマーと第２のプライマーを、前記鋳型ＤＮＡ分子に接触させる工程であって、前記接触によって前記第１のプライマーは、前記鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドの３’に隣接してアニールすることができ、前記第２のプライマーは、前記鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にある前記ヌクレオチドの５’に隣接してアニールすることができ、これにより前記鋳型ＤＮＡ分子と前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーの間で複合体が形成され、前記第１のプライマーは第２の検出可能なラベルで標識されており、前記第２のプライマーは第３の検出可能なラベルで標識されている工程と、
（ｂ）工程（ａ）からの前記複合体を、ＤＮＡリガーゼ存在下でインキュベートする工程であって、該インキュベーション工程によって、単一の分子を形成するように前記第１及び第２のプライマー間のライゲーションが可能になる工程と、
（ｃ）工程（ｂ）からの単一の分子の有無または正体を、前記第２及び第３の検出可能なラベルによって発生されるシグナルによって判定する工程とを含む方法。
【請求項６０】
前記第１または第２または第３の検出可能なラベルは、放射性ラベル、蛍光ラベル、化学発光ラベル、比色ラベル、及び酵素ラベルからなる群より選択される１つであることを特徴とする請求項４５，５５または５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記第１の検出可能なラベルは、ローダミンラベルまたはシアニンラベルであることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の開示
本発明は、新規の単離されたファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓポリメラーゼＪＤＦ−３、及びその変異組み換え型を特徴とする。本発明の変異ポリメラーゼは、３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠失しているか、及び／または、ポリメラーゼの野生型に比べて非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少している。
【０００２】
技術分野
本発明は、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少したＤＮＡポリメラーゼ酵素を利用する組成物及び方法に関する。本発明の酵素は、検出可能な核酸の標識が求められる多くの用途において有用であり、ＤＮＡシーケンシング用途において特に有用である。
【０００３】
発明の背景
核酸の検出可能な標識は、研究ならびに臨床診断技術用途を含め、分子生物学における多くの用途に対して必要とされている。一般的に用いられている核酸の標識方法では、１つ以上の非従来型ヌクレオチドと、新しく合成される相補鎖への非従来型ヌクレオチドの鋳型依存性取り込みを触媒するポリメラーゼ酵素とを使用する。
【０００４】
ＤＮＡポリメラーゼによる正確なデオキシヌクレオチドの取り込み能力が、インビボにおける高フィデリティＤＮＡ複製のための基礎となっている。ポリメラーゼの活性部位内のアミノ酸は、鋳型ヌクレオチドの対面に正確な相補的ヌクレオチドを配置することを助ける特異的結合ポケットを形成する。もし誤ったヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはヌクレオチドアナログがその位置を満たしてしまうと、入ってくるヌクレオチドに接触するアミノ酸の正確な位置合わせが、ＤＮＡ重合に好ましくない位置に歪曲する可能性がある。そのため、ＤＮＡの標識に用いられていた非従来型なヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、標準のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ：いわゆる「標準的な」ｄＮＴＰには、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）及びチミジン三リン酸（ＴＴＰ））が含まれる）よりも延長した鎖へ低効率でしか取り込まれない傾向にある。
【０００５】
ポリメラーゼによる非従来型ヌクレオチドの取り込みの効率が低下すると、ＤＮＡ標識のためにより多くの非従来型ヌクレオチドが必要となる。特定のヌクレオチドの取り込み効率の減少は、均一のシグナル強度のために非従来型ヌクレオチドの公平な取り込みに依存しているＤＮＡシーケンシングなどの技術またはアッセイの実施に悪影響を及ぼすこともある。
【０００６】
入ってくるヌクレオチド三リン酸と接触するＤＮＡポリメラーゼの正体と正確なアミノ酸配列により、当該ポリメラーゼ酵素によって取り込み可能なヌクレオチドの性質が従来型及び非従来型いずれについても決まる。入ってくるヌクレオチド三リン酸と接触するアミノ酸の正確な位置が変化すると、それが結合または鎖長延長のいずれの段階であっても、ポリメラーゼのもつ、異常なもしくは非従来型ヌクレオチドの利用能力に劇的な変化が起こりうる。ときには遠く離れたアミノ酸の変化が非直接的な空間または構造的影響によってヌクレオチドアナログの取り込みに影響を与えることもある。高いヌクレオチドアナログ取り込み能力を有したポリメラーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を、染料、反応性基、または不安定同位体などのシグナル分子で修飾されたヌクレオチドで標識するのに有用である。
【０００７】
標識されたヌクレオチドに加えて、修飾されたヌクレオチドの極めて重要な仲間として、ジデオキシヌクレオチドがある。いわゆる「サンガー」または「ジデオキシ」ＤＮＡシーケンシング法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ,Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ７４:５４６３、引用により本願に組み込む）は、デオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドを含有する混合物から、ＤＮＡポリメラーゼによって、アニールされたプライマー上へヌクレオチドが鋳型に向けて取り込まれることによるものである。ジデオキシヌクレオチドの取り込みによって連鎖が終結し、酵素はその鎖のそれ以上の延長を触媒できなくなる。反応産物を電気泳動で分離すると、延長産物の「ラダー」が見られ、各延長産物は、鋳型中の対面するヌクレオチドに相補的な特定のジデオキシヌクレオチドにおいて終結している。プライマーからのジデオキシヌクレオチドアナログの距離が、延長産物の長さによって示される。それぞれ４つのジデオキシヌクレオチドアナログｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧ、またはｄｄＴ（ｄｄＮＴＰ）のうちの１つを含む４つの反応を同一のゲル上で分離すると、ラダーパターンから鋳型の配列を直接読みとることができる。延長産物は、例えば、反応中に同位体標識または蛍光標識したプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸またはジデオキシヌクレオチド三リン酸を含めるなどの方法を含むいくつかの方法によって検出することができる。
【０００８】
ゲル泳動中に検出を行えることから蛍光標識はより迅速にデータを収集でき、１つの反応及びゲルからより長い配列を読みとることができるという利点がある。さらに、蛍光配列検出により、４つの異なる標識化蛍光ダイターミネータを含有する１つの反応チューブ（いわゆるダイターミネータ法、Ｌｅｅら、１９９２,Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.２０:２４７１,引用により本願に組み込む）内でのシーケンシングを行えるようになった。
【０００９】
ＤＮＡシーケンシングに有用なポリメラーゼの品質としては、ジデオキシヌクレオチドの取り込みが向上していることが望まれる。ジデオキシヌクレオチドの取り込みの向上により、高額な放射性同位体または蛍光染料で標識したジデオキシヌクレオチドに対する要件を低減することにより、ＤＮＡシーケンシングなどのプロセスのコスト効率を高めることができる。さらに、公平なジデオキシヌクレオチド取り込みにより、シグナルの均一性が高まり、塩基決定の精度が上がる。均等なシグナル出力により、さらに対立遺伝子変化などの要因によって引き起こされる微妙な配列の違いを検出できるようになる。関連地点において２つの異なる半分の強度のシグナルを生み出す対立遺伝子変化は、不均一にｄｄＮＴＰを利用するポリメラーゼに起因する多様なシグナル長によって容易に隠されてしまう。
【００１０】
天然型のＤＮＡポリメラーゼによるリボヌクレオチドの取り込みは希にしか起こらない。リボヌクレオチドを高いレベルで取り込む変異体を、部分リボ置換によりシーケンシングなどの用途のために用いることができる。この系において、リボヌクレオチドと同一の塩基に対応するデオキシヌクレオチドとの混合物が変異ポリメラーゼによって取り込まれる（Ｂａｍｅｓ,１９７８Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.１１９:８３-９９）。リボシーケンシング反応系をアルカリ条件及び熱に暴露すると、延長された鎖の断片化が起こる。全４つの塩基に対する反応系を変性アクリルアミドゲル上で分離すると、シーケンシングラダーが生じる。当該技術分野においては、この代替のシーケンシング方法に対してリボヌクレオチドを高度に利用したポリメラーゼ変異体が求められている。
【００１１】
あるいは、ＤＮＡシャフリングなどのＤＮＡ分子のランダムな切断を必要とする系においては、リボヌクレオチド取り込みに続くアルカリ加水分解を利用することができた（（Ｓｔｅｍｍｅｒ,１９９４,Ｎａｔｕｒｅ,３７０：３８９-３９１）これは分子育種、セクシャルＰＣＲ及び定向進化法とも呼ばれる）。
【００１２】
ＤＮＡ標識酵素における他の望ましい品質は、熱安定性である。熱安定性を示すＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型を増幅するために熱変性、プライマーアニーリング、及び酵素的プライマー延長のサイクルを利用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の開発によって、分子生物学及び臨床診断の多くの局面で変革されてきた。プロトタイプ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼであり、この酵素は元々好熱性真性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離されたものである。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたいわゆる「サイクルシーケンシング」反応は、従来の（すなわち非サイクル）シーケンシング反応に比べて出発鋳型を少量しか必要としないという利点を有する。
【００１３】
ＤＮＡポリメラーゼには、ファミリーＡ，Ｂ及びＣと呼ばれる３つの大きなファミリーがある。ポリメラーゼをこれらの３つのファミリーのうちのどれに分類するかは、大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩ（ファミリーＡ）、ＩＩ（ファミリーＢ）、ＩＩＩ（ファミリーＣ）との当該ポリメラーゼの構造上の類似性に基づいている。例として、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼとしては、限定はされないがＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｔａｑポリメラーゼ）及びバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、以前はα−ファミリーポリメラーゼとして知られていた（Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ  ａｎｄ  Ｉｔｏ,１９９１,Ｎｕｃ.Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.１９:４０４５）ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されないがα、δ及びεＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４、ＲＢ６９及びψ２９バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）が挙げられ、ファミリーＣのＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されないがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩα及びεサブユニット（Ｂｒａｔｈｗａｉｔｅ  ａｎｄ  Ｉｔｏ,１９９３,Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.２１:７８７）によって、それぞれｄｎａＥ及びｄｎａＱ遺伝子の産物として挙げられている）が挙げられる。古細菌、細菌、ウィルス及び真核生物の広範なスペクトルにわたる各ファミリーのＤＮＡポリメラーゼタンパク質配列のアライメントは、引用により本願に組み込むＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅ  ａｎｄ  Ｉｔｏ（前掲、１９９３年）の中に示されている。
【００１４】
ＤＮＡポリメラーゼが、初期のＤＮＡ重合体中へ非天然のヌクレオチドを取り込みを行えない程度を表す用語が「識別」である。ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼにおいて、ジデオキシヌクレオチドアナログの取り込みに対する効果的な識別は、単一のアミノ酸残基に大いに関連している。ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼのうちの大多数の酵素は、フェニルアラニン（ｐｈｅまたはＦ）残基を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片におけるＦ７６２と同等の位置に有し、ジデオキシヌクレオチドに対する強い識別を示す。いくつかのポリメラーゼ（例えばＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）は、対応する位置にチロシン（ｔｙｒまたはＹ）残基を有し、ジデオキシヌクレオチドに対して比較的弱い識別を示す。この位置にチロシンを有するファミリーＡのポリメラーゼは、該ポリメラーゼがデオキシヌクレオチドを取り込むレベルと同等かわずかに異なるレベルで、ジデオキシヌクレオチドを容易に取り込む。この部位において識別に関与するチロシンまたはフェニルアラニンを逆転すると、ファミリーＡ酵素のジデオキシヌクレオチド識別プロファイルが反転する（Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ,１９９５,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ９２:６４４９）。
【００１５】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの中でも、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＦＳ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）として知られるＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼの変異型は、ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼのＦ７６２に相当する位置にＦ６６７Ｙ変異を含み、野生型酵素に比べて高いジデオキシヌクレオチド取り込みを示す（ｄｄＮＴＰに対する識別が低下）。ジデオキシヌクレオチド取り込みの識別が低下することにより、野生型酵素よりも、蛍光及び標識ジデオキシヌクレオチドシーケンシングに対してより有用なものとなる。
【００１６】
しかしながら、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＦ６６７Ｙ変異体は、ローダミンダイターミネータの使用を必要とするフルオレセインで標識されたジデオキシヌクレオチドと共に用いるのには適していない。現在Ｔａｑシーケンシング反応とともに用いられているローダミンダイターミネータは、ＤＮＡ二次構造を安定化して、シグナルの圧縮をもたらす。圧縮の問題を解消するための研究から、大量のヌクレオチドアナログデオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）をデオキシグアノシン三リン酸の代わりに用いる系が得られた。（ｄＩＴＰ）の取り込みがシグナルの圧縮を減少させる一方で、反応系におけるｄＩＴＰの存在が、反応温度の低下及び反応時間の増大を含むさらなる複雑な事態を生み出している。さらに、シーケンシングにおいてローダミン染料を用いると、望ましくない反応後精製を行う必要がでてくる（Ｂｒａｎｄｉｓ,１９９９Ｎｕｃ.Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ.２７:１９１２）。
【００１７】
ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、いわゆるパームドメインにおいて触媒に関与する酸性残基の位置を除いては、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼと実質的に異なる構造を示す（Ｗａｎｇら、１９９７,Ｃｅｌｌ８９:１０８７;Ｈｏｐｆｉｎｅｒら、１９９９,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ９６:３６００）。ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼのユニークな構造により、ヌクレオチドアナログとの完全に異なるスペクトルの相互作用が可能になり、おそらくは、構造的束縛によりファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼとともに使用するには不適切なアナログの利用が可能となっている。熱安定性ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、超好熱性古細菌において同定されている。これらの生物は９０℃を超える温度において成育し、それらの酵素は好熱性真正細菌のファミリーＡＤＮＡポリメラーゼよりも大きい熱安定性を有する（Ｍａｔｈｕｒら、１９９２,Ｓｔｒａｔａｇｉｅｓ５:１１）。超好熱性古細菌に由来するファミリーＢポリメラーゼは、非従来型ヌクレオチドに対する識別を低下させるための修飾によく適した出発基質であるかもしれない。
【００１８】
３つのファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの結晶構造が解析されているが（前掲Ｗａｎｇら、１９９７;Ｈｏｐｆｉｎｅｒ,Ｋ.-Ｐ.ら、１９９９,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.９６:３６００;Ｚｈａｏ,１９９９,Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｏｌｄ  Ｄｅｓ.,７:１１８９）、ＤＮＡポリメラーゼまたはｄＤＮＴＰポリメラーゼ共複合体の構造は報告されていない。現時点において、ヌクレオチドアナログ識別に寄与しているアミノ酸残基の同定は、ファミリＡ−ｄＮＴＰ構造物の外挿または関連するファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼを用いた変異実験からのみ推測することができる（例えば、ヒトｐｏｌα、ファージＴ４、ファージψ２９、Ｔ.ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ）。
【００１９】
ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの配列比較によって、Ｉ〜ＶＩまでの６つの保存領域が示されている（前掲Ｂｒａｉｎｔｈｗａｉｔｅ  ａｎｄ  Ｉｔｏ,１９９３）。Ｗａｎｇら（前掲Ｗａｎｇら、１９９７）によって提案されたバクテリオファージＲＢ６９ＤＮＡポリメラーゼ（ファミリーＢ）の結晶構造は、領域ＩＩ中のＹ４１６（ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種のファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼにおけるＹ４０９に相当）が、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）中のＹ１１５、及びＫｌｅｎｏｗ断片（ファミリーＡポリメラーゼ）中のＥ７１０と同じ位置を有することを示している。逆転写酵素−ＤＮＡ共結晶の分子座標を用いてＲＢ６９におけるｄＮＴＰ及びプライマー鋳型複合体のモデリングを行った。このモデルから、ｄＮＴＰのデオキシリボース部分の下でＲＢ６９のＹ４１６がパックすることが予測される。この位置のチロシンはリボース選択性に関与し、哺乳動物の逆転写酵素（Ｙ１１５）において（Ｇａｏら、１９９７,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ９４:４０７;Ｊｏｙｃｅ,１９９４,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ９４:１６１９）、及び対応する不変のグルタミン酸残基（Ｅ７１０）がリボヌクレオチドに対する識別を減少させているファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼにおいて（Ｇｅｌｆａｎｄら、１９９８,Ｐａｔ.Ｎｏ.ＥＰＯ８２３４７９;Ａｓｔａｔｋｅら、１９９８,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ９６:３４０２）、ポリメラーゼによるリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの間の識別に貢献していると見なされてきた。
【００２０】
ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼにおいて行われた変異実験からも、ｄＮＴＰ取り込み及びリボース選択性において領域ＩＩ中の類似Ｙを含む領域が関与していると見なされた。ヒトＤＮＡポリメラーゼα中の対応するＹ８６５における変異が、ｄＮＴＰヌクレオチド阻害剤に対するポリメラーゼのフィデリティ及び選択性に影響を与える。そのような阻害剤としては、例えば３’−ＯＨ基の代わりに嵩高い３’−アジド基を有したＡＺＴ−ＴＰなどのｄＮＴＰ、ｄＧＴＰのグアニン塩基中のＣ−２位置のアミノ基に結合したブチルフェニル基を含むＢｕＰｄＧＴＰ（嵩高く、疎水性の高いプリン塩基ヌクレオチドになる）など、及びピリミジンデオキシヌクレオチド三リン酸の競争阻害剤であるアフィジコリンが挙げられる。興味深いことに、変異体はｄｄＣＴＰの取り込みには全く違いを見せなかった（Ｄｏｎｇら、１９９３,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８:２６１４３）。さらに、アナロガスＹ（Ｙ４１１）の１つ前のアミノ酸であるＬ４１２がメチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）に変換されたバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼの変異体は、無機ピロリン酸アナログホスホノ酢酸（ＰＡＡ）に対して、それぞれ非常に高い感受性及び中程度の感受性を示す。ＰＡＡ感受性の変化から、ヌクレオチドアナログとポリメラーゼとの相互作用が予想できることがわかっている。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにおけるＬ４１２は、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種のＤＮＡポリメラーゼにおけるＬ４１０に相当する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼＬ４１２Ｍ変異体は、野生型ポリメラーゼの５０分の１の量のｄｄＧＴＰで阻害されたが、ｄＧＴＰに対するＫｍｓは類似していた。筆者が述べているように、この研究において、「Ｌ４１２ＭＤＮＡポリメラーゼのｄｄＧＴＰに対する感受性に拘わらす、野生型とＬ４１２ＭＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれるｄｄＮＴＰに何ら違いは見られなかった」（Ｒｅｈａ-Ｋｒａｎｔｚら、１９９３,Ｊ.Ｖｉｒｏｌ.６７:６０）。バクテリオファージψ２９において、領域ＩＩにおける変異（ＬＹＰ、ＹはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ３種のＤＮＡポリメラーゼと類似しているＹ４０９）は、ＰＡＡで試した場合に入り組んだ結果を与える。すなわち、Ｐ２５５ＳはＰＡＡに対して非常に高感受性を有し、Ｌ２５３Ｖは野生型酵素よりも低い感受性しか示さなかった（Ｂｌａｓｃｏら、１９９３,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８:２４１０６）。これらのデータは、ポリメラーゼ−核酸相互作用におけるＬＹＰ領域（領域ＩＩ）の役割を裏付けるものであるが、ｄｄＮＴＰの取り込みの向上についてはこれらの引例においては達成されていない。
【００２１】
他の研究において、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＬｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ（ＶＥＮＴ（商標）ポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に由来する古細菌のファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼにおける領域ＩＩの広範な変異が行われている。この研究において、ヌクレオチドアナログ識別を調べるという目的のためだけに、２６の異なる部位特異的変異体が作成された（Ｇａｒｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｃｋ,１９９９,Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.２７:２５４５）。ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼの部位特異的変異から、Ｙ４１２（ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼのＹ４０９に相当）における３つの変異体が、核酸の結合を変えることができることが分かった（前掲Ｇａｒｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｃｋ,１９９９）。Ｙ４１２Ｖは、ジデオキシヌクレオチド取り込みが２倍増加し、リボヌクレオチドＡＴＰの取り込みが２００倍増加し、最も顕著であった。Ｙ４１２Ｆ変異体はアナログ取り込みに関して全く変化を示さなかった。
【００２２】
ファミリーＢポリメラーゼの領域ＩＩＩ（モチーフＢとも呼ばれる）も、ヌクレオチド認識において役割を果たすことが証明されている。ＪＤＦ−３ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸４８７〜４９５に対応するこの領域は、コンセンサス配列ＫＸ３ＮＳＸＹＧ（前掲Ｊｕｎｇら、１９９０;上記Ｂｌａｓｃｏら、１９９２;Ｄｏｎｇら、１９９３,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８:２１１６３;Ｚｈｕら、１９９４,Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ１２１９:２６０;Ｄｏｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ,１９９５,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７０:２１５６３）を有し、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼのヘリックスＯ中のＫＸ３（Ｆ／Ｘ）ＧＸ２ＹＧと、構造的にではなく機能的に（前掲Ｗａｎｇら、１９９７）類似している。Ｋｌｅｎｏｗ断片やＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼにおいて、ＯヘリックスはｄＮＴＰ結合において重要な役割を果たすアミノ酸を含んでいる（Ａｓｔａｋｔｅら、１９９８,Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２７８:１４７;Ａｓｔａｔｋｅら、１９９５,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７０:１９４５;Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９２,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ．２６７:８４１７;Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９０,Ｊ.ｂｏｉｌ.Ｃｈｅｍ.２６５:１４５７９;Ｐａｎｄｅｙら、１９９４,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６９:１３２５９;Ｋａｕｓｈｉｋら、１９９６,Ｂｉｏｃｈｅｍ.３５:７２５６）。具体的には、ヘリックスＯは、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼにおいてｄｄＮＴＰ識別に関与しているとみなされるＦ（Ｋｌｅｎｏｗ断片におけるＦ７６３、ＴａｑにおけるＦ６６７）を含んでいる（ＫＸ３（Ｆ／Ｘ）ＧＸ２ＹＧ）（前掲Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ,１９９５）。
【００２３】
ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼの領域ＩＩＩの部位特異的実験では、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種のＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５と類似するアラニンもターゲットにしている（前掲Ｊｕｎｇら、１９９０）。これらの変異体（Ａ→Ｃ、Ａ→Ｓ、Ａ→Ｌ、Ａ→Ｉ、Ａ→Ｆ及びＡ→Ｖ）は、元の酵素のポリメラーゼ活性の０．１２〜１．２倍の範囲の特異的な活性を示した（Ｇａｒｄｎｅｒ  ａｎｄ  Ｊａｃｋ,１９９９,Ｎｕｃｌ.Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.２７:２５４５）。ジデオキシヌクレオチド取り込みは、未変異酵素の４〜１５倍の範囲であった。興味深いことに、最も高いジデオキシヌクレオチド取り込み（１５倍）を示した変異体は、元の酵素の０．１２倍の特異的活性しか有しなかった。
【００２４】
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉｉに由来するファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼに関する部位特異的突然変異誘発の研究では、ＪＤＦ−３のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基４８８〜４９３に相当する配列ＩＬＡＮＳＦにおいて各残基が別個にチロシンに改変された（Ｒｅｉｄｌら、米国特許第５，８８２，９０４号）。この研究から、Ｌ４８９Ｙ変異体が、この部位に野生型のロイシン残基を有する酵素と比較して、約３倍も大きなジデオキシヌクレオチドの取り込みを示すことが判明した。
【００２５】
活発な研究領域の１つとして、核酸またはＤＮＡ「チップ」と呼ばれる核酸アレイを、複数の異なる核酸配列を同時に分析するために用いることがある。米国特許第５，８８２，９０４号（Ｒｅｉｄｌら１９９９年３月１６日発行）に記載されているような、これらの用途の多くは非従来型ヌクレオチド、特に蛍光的に標識された非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少しているＤＮＡポリメラーゼから利益を得ている。チップ形式において取り組まれる用途としては、とりわけＤＮＡシーケンシング及び変異の検出が挙げられる。例えば、「ミニシーケンシング」法（例えば、Ｐｅｓｔｉｎｅｎら、１９９７,Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ.７:６０６;Ｓｙｖａｎｅｎ,１９９９,Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ１３:１-１０）及びアレイドプライマー延長（ＡＰＥＸ）変異検出法（Ｓｈｕｍａｋｅｒら、１９９６,Ｈｕｍ.Ｍｕｔａｔ.７:３４６）のような方法は、蛍光標識されたヌクレオチドまたは他の非従来型ヌクレオチドに対する識別が低下したＤＮＡポリメラーゼから利益を得ている。チップまたはゲルに基づくミニシーケンシング系において用いるための非識別性のＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野では求められている。そのような系は、多重化した一塩基変異多形（ＳＮＰｓ）の検出を有益に可能にするとともに、定量的遺伝子型決定も可能にする。配列の違いを同定することにより、遺伝性疾患、多因子性疾病の素因、及び新しいまたは既存の薬剤製品に対する感受性の診断と治療を行えるようになる。
【００２６】
ヒトゲノム計画の完了とともに、個人間での遺伝的相違、具体的には１０００塩基対ごとに１回発生すると推定されている（Ｈａｌｕｓｈｋａら、１９９９）一塩基変異多形（ＳＮＰ）を分析することに現在大きな注目が集められている。ＳＮＰの重要性は、これらが疾病に関連する座の同地を可能にする遺伝的マーカーとして働くことにある（Ｌａｉら，１９９８）。ＳＮＰは、遺伝的疾病の根底にある原因を調べるためにも用いることができ、最終的に個人向け薬品への道を開くことを助けると考えられる。
【００２７】
ＳＮＰ検出に用いられる現行のアッセイは、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ（Ｓａｉｋｉら、１９８９）、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、１９８８）、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）（Ｓｈｉら、２００１）、ＴａｑＭａｎアッセイ（Ｌｉｖａｋら１９９５）、分子ビーコンアッセイ（Ｔｙａｇｉら、１９９８）、及びプレイマー延長アッセイ（Ｔｙａｇｉら、１９９８;Ｇｉｌｌｅｓら、１９９９;Ｆｕら、１９９８）などが挙げられ、これらはゲル電気泳動（Ｃｈｅｎら、１９９７）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Ｆｕら、１９９８）、固相ミニシーケンシング（Ｓｙｖａｎｅｎら、１９９０）、半導体マイクロチップ（Ｇｉｌｌｅｓら、１９９９）、及びフローサイトメトリー分析（Ｔａｙｌｏｒら、２００１）などを含む様々なプラットフォーム上で行われる。
【００２８】
ミニシーケンシングの原理は、分析しようとするＳＮＰ位置に隣接してプライマーをアニールさせて、ｄｄＮＴＰを容易に取り込むＤＮＡポリメラーゼを用いて、これらのプライマーをＳＮＰに相補的なｄｄＮＴＰで延長するというものである（Ｓｙｖａｎｅｎら、１９９０,引用により本願に組み込む）。ミニシーケンシングは、他のＳＮＰ検出方法の大半に影響を及ぼすマッチ種及びミスマッチ種の熱安定性ではなく、ポリメラーゼによって媒介されるヌクレオチド取り込み反応の高い精度（高い特異性）に基づいているところに独自性がある。したがって、ハイブリダイゼーションに基づく方法に比べて、ミニシーケンシングは反応条件、温度の小さな変化に対して、また傍らにあるＤＮＡ配列に対して鈍感である。さらに、ミニシーケンシングは、ホモ接合遺伝子型とヘテロ接合遺伝子型との間の識別を可能にする（Ｃｈｅｎら、１９９７）。これらの特徴は、多重及び／または高処理能のＳＮＰ検出においては重要である。ゲノム計画の完了と、高処理能のＳＮＰ検出に対する高い関心にともない、ｄｄＮＴＰ及びダイ標識したｄｄＮＴＰを単一の塩基延長アッセイ（ミニシーケンシング）において効率的に取り込む酵素の需要は相当なものである。
【００２９】
ＤＮＡポリメラーゼは、ミニシーケンシングプロトコールの中心成分を構成する。効率的なｄｄＮＴＰ及びｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ取り込み及び高いフィデリティは、ミニシーケンシング酵素にとって必須の特徴である。シーケンシング及びミニシーケンシングに適した市販のＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ（ＴａｑＦ６６７Ｙ変異体、例えばＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅやＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ）またはバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）から得られたものであって、これらはいずれもファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼである。Ｔ７（天然）またはＴａｑ（遺伝子操作によるＦ６６７Ｙ変異体）ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド結合ポケットチロシン（Ｙ）残基は、効率的なｄｄＮＴＰ取り込みに関与していると考えれている（Ｔａｂｏｒら、１９９５）。古細菌（ファミリーＢ）ＤＮＡポリメラーゼを用いた最近の２つの変異研究において、変異によってｄｄＮＴＰ識別が減少することが確認されたが、古細菌のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、ＴａｑＦ６６７Ｙ変異体よりもｄｄＮＴＰ取り込み効率が低かった（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９９９;Ｅｖａｎｓら、２０００）。
【００３０】
非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少したＤＮＡポリメラーゼが当該技術分野において求められている。当該技術分野においては、ジデオキシヌクレオチドに対する識別が減少した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、さらには、蛍光的に標識されたジデオキシヌクレオチドに対する識別が減少したＤＮＡポリメラーゼが特に求められている。
【００３１】
発明の概要
本発明は、非従来型なヌクレオチドに対する識別が減少したＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いる組成物よび方法に関する。この特質をもつ酵素は、核酸の検出可能な標識を必要とする多くの用途において有用であり、ＤＮＡシーケンシング用途において特に有用である。
【００３２】
本発明は、さらに、配列番号：２のＬ４０８、Ｐ４１０、Ｓ３４５、及び／またはＡ４８５に対応する位置に１つ以上の変異を有するファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ、または核酸の鋳型依存性重合を指示する能力を有したその断片に関する。本発明は、配列番号：２のＬ４０８、Ｐ４１０、Ｓ３４５、及び／またはＡ４８５に対応する位置において変異されたファミリーＢポリメラーゼの変異体及び変形物（例えば、化学修飾または抗体複合化によって調製された可逆的に不活性化されたバージョンのファミリーＢポリメラーゼ）も包含する。
【００３３】
１つの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＳ３４５に対応する位置においてセリンからプロリンへの変異と、配列番号：２のＰ４１０に対応する位置においてプロリンからロイシンへの変異とからなる二重変異を有する。
【００３４】
本発明は、配列番号：２において１〜７７６の残基で表されるアミノ酸配列を有する精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００３５】
１つの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種から単離される。
【００３６】
他の実施形態において、熱安定性ポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＪＤＦ−３種ＤＮＡポリメラーゼの発現をコードするベクターによって形質転換された組み換え生物から単離される。
【００３７】
本発明は、配列番号：１中に示されるヌクレオチド配列を含む組み換えベクターも包含する。
【００３８】
本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列またはその機能的断片を含む単離された組換え型ポリペプチドも包含する。
【００３９】
本発明は、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠失したＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種由来の単離された組み換えＤＮＡポリメラーゼをさらに包含する。
【００４０】
１つの実施形態において、単離された組み換えＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＤ１４１に対応するアミノ酸においてアスパラギン酸からスレオニンまたはアラニンへの変異、または配列番号：２のＥ１４３に対応するアミノ酸においてグルタミン酸からアラニンへの変異を有している。
【００４１】
他の実施形態において、単離された組み換えＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＤ１４１に対応するアミノ酸においてアスパラギン酸からスレオニンまたはアラニンへの変異、または配列番号：２のＥ１４３に対応するアミノ酸においてグルタミン酸からアラニンへの変異を有している。
【００４２】
本発明は、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少した単離された組み換えＤＮＡポリメラーゼも包含する。
【００４３】
１つの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼである。
【００４４】
他の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置におけるロイシンからヒスチジンへの変異；配列番号：２のＬ４０８に対応する位置におけるロイシンからフェニルアラニンへの変異；配列番号：２のＰ４１０に対応する位置におけるプロリンからロイシンへの変異；配列番号：２のＡ４８５に対応する位置におけるアラニンからスレオニンへの変異からなる群より選択される変異をさらに含んでいる。
【００４５】
本発明はさらに、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置にアラニンからスレオニンへの変異を有し、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置におけるロイシンからヒスチジンへの変異；配列番号：２のＬ４０８に対応する位置におけるロイシンからフェニルアラニンへの変異；配列番号：２のＰ４１０に対応する位置におけるプロリンからロイシンへの変異からなる群より選択される変異をさらに含んだ単離された組み換えＤＮＡポリメラーゼも包含する。
【００４６】
本発明は、配列番号：２のＰ４１０に対応する位置にプロリンからロイシンへの変異を有し、さらに配列番号：２のＳ３４５に対応する位置におけるセリンからプロリンへの変異を含む単離された組み換えＤＮＡポリメラーゼも包含する。
【００４７】
他の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド及びヌクレオチド複合体からなる群より選択される非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少している。
【００４８】
他の実施形態において、ヌクレオチド複合体は、同位体標識されたヌクレオチド、蛍光標識されたヌクレオチド、ビオチン標識されたヌクレオチド、化学発光的に標識されたヌクレオチド及び量子ドット標識されたヌクレオチドからなる群より選ばれる。
【００４９】
本発明は、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置におけるアラニンからスレオニンへの変異、または配列番号：２のＬ４０８またはＰ４１０に対応する位置における変異を含む単離された組み換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼを包含し、ＤＮＡポリメラーゼは、該ポリメラーゼの野生型に比べて非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少していることを特徴とする。
【００５０】
１つの実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠失している。
【００５１】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＤ１４１またはＥ１４３に対応するアミノ酸において変異を有している。
【００５２】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＤ１４１に対応する位置においてアスパラギン酸からスレオニンまたはアラニンへの変異を有している。
【００５３】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＥ１４３に対応する位置においてグルタミン酸からアラニンへの変異を有している。
【００５４】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＥ１４３に対応する位置においてグルタミン酸からアラニンへの変異と、配列番号：２のＤ１４１に対応する位置においてアスパラギン酸からスレオニンまたはアラニンへの変異を有している。
【００５５】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは熱安定性である。
【００５６】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは古細菌に由来する。
【００５７】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置においてロイシンからヒスチジンへの変異を有する。
【００５８】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置においてロイシンからフェニルアラニンへの変異を有する。
【００５９】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＰ４１０に対応する位置においてプロリンからロイシンへの変異を有する。
【００６０】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を有する。
【００６１】
他の実施形態において、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含むファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置にロイシンからヒスチジンへの変異を含む。
【００６２】
他の実施形態において、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含むファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む。
【００６３】
他の実施形態において、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含むファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＰ４１０に対応する位置にプロリンからロイシンへの変異を含む。
【００６４】
他の実施形態において、配列番号：２のＰ４１０に対応する位置においてプロリンからロイシンへの変異を含むファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＳ３４５に対応する位置にセリンからプロリンへの変異をさらに有する。
【００６５】
他の実施形態において、配列番号：２のＳ３４５に対応する位置においてセリンからプロリンへの変異を含むファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＴ６０４に対応する位置にさらなる変異を含んでいてもよい。
【００６６】
他の実施形態において、配列番号：２のＹ４９７に対応する位置においてチロシンからシステインへの変異を含むファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＩ６３０に対応する位置にイソロイシンからバリンへの変異をさらに含んでいてもよい。
【００６７】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＥ６４５に対応する位置にグルタミン酸からリジンへの変異を含む。
【００６８】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＥ５７８に対応する位置にグルタミン酸からリジンへの変異を含み、配列番号：２のＲ４６５に対応する位置にアルギニンからメチオニンへの変異をさらに含んでいてもよい。
【００６９】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ３９６に対応する位置においてロイシンからグルタミンへの変異を含み、配列番号：２のＶ４０１，Ｎ４２４，Ｐ５６９，Ｅ６１７またはＶ６４０に対応する位置にさらに変異を含んでいてもよい。
【００７０】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＳ６５１に対応する位置においてセリンからアスパラギンへの変異を含む。
【００７１】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ３９６に対応する位置においてロイシンからプロリンへの変異を含み、配列番号：２のＥ４５９に対応する位置にさらに変異を含んでいてもよい。
【００７２】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４５６に対応する位置においてロイシンからプロリンへの変異を含み、配列番号：２のＥ６５８に対応する位置にさらに変異を含んでいてもよい。
【００７３】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置においてロイシンからヒスチジンへの変異を含み、配列番号：２のＶ４３７またはＬ４７８に対応する位置にさらに変異を含んでいてもよい。Ｌ４０８Ｈ変異は、本明細書に記載するジデオキシヌクレオチド及びダイジデオキシヌクレオチドスクリーニングにおいて単離された。
【００７４】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のＹ４９６に対応する位置においてチロシンからアスパラギンへの変異を含む。
【００７５】
他の実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びヌクレオチド複合体からなる群より選択される非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少している。
【００７６】
他の実施形態において、ヌクレオチド複合体は、同位体標識されたヌクレオチド、蛍光標識されたヌクレオチド、ビオチン標識されたヌクレオチド、化学発光的に標識されたヌクレオチド及び量子ドット標識されたヌクレオチドからなる群より選ばれる。
【００７７】
他の実施形態において、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少した単離された組み換えＤＮＡポリメラーゼ、または配列番号：２のＡ４８５に対応する位置にアラニンからスレオニンへの変異、または配列番号：２のＬ４０８またはＬ４１０に対応する位置に変異を含む単離された組み換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼであって、該ＤＮＡポリメラーゼはポリメラーゼの野生型に比べて非従来型なヌクレオチドに対する識別が減少しており、該ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸４０９におけるＹからＴへの変異；配列番号：２のアミノ酸４８５におけるＡからＣ，Ｓ，Ｌ，Ｉ，ＦまたはＶへの変異；配列番号：２のアミノ酸４９４におけるＹからＳへの変異；配列番号：２のアミノ酸４９６におけるＹからＬへの変異；及び配列番号：２のアミノ酸４９０におけるＡからＹへの変異からなる群より選択される変異に対応するポリメラーゼ中のアミノ酸残基における変異をさらに含む。
【００７８】
他の実施形態において、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少した単離された組換え型ＤＮＡポリメラーゼ、または配列番号：２のＡ４８５に対応する位置にアラニンからスレオニンへの変異、または配列番号：２のＬ４０８またはＰ４１０に対応する位置に変異を含む単離された組み換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼであって、該ＤＮＡポリメラーゼはポリメラーゼの野生型に比べて非従来型なヌクレオチドに対する識別が減少しており、該ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸４８３〜４９６（４８３と４９６含む）の１つに対応するポリメラーゼのアミノ酸における変異をさらに含む。
【００７９】
１つの実施形態において、変異は、配列番号：２のアミノ酸４８５、４９０、４９４，または４９６のうちの１つに対応するポリメラーゼのアミノ酸におけるものである。
【００８０】
本発明は、配列番号：２のＡ４８５に対応するアミノ酸におけるアラニンからスレオニンへの変異と、少なくとも、配列番号：２のそれぞれＬ４０８、Ｙ４０９またはＰ４１０に対応するアミノ酸のポリメラーゼにおける置換とを含む、単離された組換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００８１】
本発明は、配列番号：２のＡ４８５に対応するポリメラーゼのアミノ酸においてＡ以外のアミノ酸と、少なくとも、配列番号：２のそれぞれＬ４０８、Ｙ４０９またはＰ４１０に対応するアミノ酸のポリメラーゼにおける置換とを含む、単離された組換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００８２】
本発明は、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む組み換えベクターをさらに包含する。
【００８３】
本発明は、ＤＮＡの相補鎖を標識する方法をさらに包含し、該方法は、鋳型ＤＮＡ分子と、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種に由来する組換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼとを、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少したＤＮＡポリメラーゼと、非従来型ヌクレオチドとに、ＤＮＡポリメラーゼが相補ＤＮＡ鎖を合成するのに十分な時間及び条件下で接触させて、相補的ＤＮＡ鎖を合成し、非従来型ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取り込む工程を含む。
【００８４】
本発明は、ＤＮＡの相補鎖を標識する方法をさらに包含し、該方法は、鋳型ＤＮＡ分子を、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置におけるアラニンからスレオニンへの変異、または配列番号：２のそれぞれＬ４０８またはＰ４１０に対応する部位における変異を含み、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少した組み換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼと、非従来型ヌクレオチドとに、ＤＮＡポリメラーゼが相補ＤＮＡ鎖を合成するのに十分な時間及び条件下で接触させて、相補的ＤＮＡ鎖を合成し、非従来型ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取り込む工程を含む。
【００８５】
１つの実施形態において、組換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠失している。
【００８６】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する位置においてロイシンからヒスチジンへの変異を有する。
【００８７】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する位置においてロイシンからフェニルアラニンへの変異を有する。
【００８８】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ｐ４１０に対応する位置においてプロリンからロイシンへの変異を有する。
【００８９】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ａ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を有する。
【００９０】
他の実施形態において、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含む組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する位置にロイシンからヒスチジンへの変異を含む。
【００９１】
他の実施形態において、配列番号：２のアミノ酸Ａ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含む組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応するアミノ酸においてロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む。
【００９２】
他の実施形態において、配列番号：２のアミノ酸Ａ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含む組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のＰ４１０に対応するアミノ酸においてプロリンからロイシンへの変異を含む。
【００９３】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びヌクレオチド複合体からなる群より選択される非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少している。
【００９４】
他の実施形態において、ヌクレオチド複合体は、同位体標識されたヌクレオチド、蛍光標識されたヌクレオチド、ビオチン標識されたヌクレオチド、化学発光的に標識されたヌクレオチド及び量子ドット標識されたヌクレオチドからなる群より選ばれる。
【００９５】
本発明はさらに、ＤＮＡのシーケンシング方法も包含し、該方法は、シーケンシングすべきＤＮＡ鎖を、シーケンシングプライマーと、ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種に由来する組換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼであって、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少したＤＮＡポリメラーゼと、連鎖終結用ヌクレオチドアナログとに、ＤＮＡポリメラーゼが相補ＤＮＡ鎖を合成する条件下で接触させて、相補的ＤＮＡ鎖を合成し、ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取り込む工程を含み、連鎖終結用ヌクレオチドアナログの取り込みにより、鋳型ＤＮＡ鎖の核酸配列が決定できるように鎖長延長が終結する。
【００９６】
本発明はさらに、ＤＮＡのシーケンシング方法も包含し、該方法は、シーケンシングすべきＤＮＡ鎖を、シーケンシングプライマーと、配列番号：２のＡ４８５に対応する位置におけるアラニンからスレオニンへの変異、または配列番号：２のＬ４０８またはＰ４１０、Ｓ３４５又はＰ４１０に対応する部位における変異を含み、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少した組み換え型ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼと、連鎖終結用ヌクレオチドアナログとに、ＤＮＡポリメラーゼが相補ＤＮＡ鎖を合成する条件下で接触させて、相補的ＤＮＡ鎖を合成し、ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取り込む工程を含み、連鎖終結用ヌクレオチドアナログの取り込みにより、鋳型ＤＮＡ鎖の核酸配列が決定できるように鎖長延長が終結する。
【００９７】
１つの実施形態において、組換え型ＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼを欠失している。
【００９８】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する位置においてロイシンからヒスチジンへの変異を有する。
【００９９】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する位置においてロイシンからフェニルアラニンへの変異を有する。
【０１００】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ｐ４１０に対応する位置においてプロリンからロイシンへの変異を有する。
【０１０１】
他の実施形態において、配列番号：２のＰ４１０に対応する位置にプロリンからロイシンへの変異を含む組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、さらに配列番号：２のＳ３４５に対応する位置におけるセリンからプロリンへの変異を有する。
【０１０２】
他の実施形態において、組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のアミノ酸Ａ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を有する。
【０１０３】
他の実施形態において、配列番号：２のアミノ酸Ａ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含む組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置にロイシンからヒスチジンへの変異を含む。
【０１０４】
他の実施形態において、配列番号：２のアミノ酸Ａ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含む組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のＬ４０８に対応する位置にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む。
【０１０５】
他の実施形態において、配列番号：２のアミノ酸Ａ４８５に対応する位置においてアラニンからスレオニンへの変異を含む組換え型ファミリーＢポリメラーゼは、配列番号：２のＰ４１０に対応する位置にプロリンからロイシンへの変異を含む。
【０１０６】
他の実施形態において、連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、ジデオキシヌクレオチオチドである。
【０１０７】
他の実施形態において、ジデオキシヌクレオチドは検出可能に標識されている。
【０１０８】
他の実施形態において、ジデオキシヌクレオチドは蛍光的に標識されている。
【０１０９】
他の実施形態において、ジデオキシヌクレオチドは、フルオレセイン及びローダミンからなる群より選択される部分によって標識されている。
【０１１０】
本発明は、本明細書に開示の方法を実施するためのキットも包含する。
【０１１１】
本発明は、本明細書中に開示した組換え型ＤＮＡポリメラーゼの作成方法も包含し、該方法は、前記ポリメラーゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞を、前記ＤＮＡポリメラーゼの生産を可能とする条件下で培養する工程を含む。
【０１１２】
本発明は、本明細書に記載の変異ＤＮＡポリメラーゼと、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの別のＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは変異型、Ｆ６６７Ｙ）との混合物を包含する。このような混合物は、標識されたヌクレオチドから合成ヌクレオチドへの重合によって発生されるシグナルの均一性を高めるのに有用である。
【０１１３】
本発明は、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置におけるヌクレオチドを同定するための組成物を提供し、該組成物は、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少したファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼと、第１のプライマーとを含み、該第１のプライマーは鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドの３’に隣接してアニールする。
【０１１４】
１つの実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１１５】
好ましい実施形態において、ＪＤＦ−３のＤＮＡポリメラーゼは配列番号：２の配列を有し、さらに、Ｄ１４１，Ｅ１４３，Ａ４８５、Ｌ４０８またはＰ４１０の位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸変異をさらに含む。
【０１１６】
好ましい実施形態において、ＪＤＦ−３のＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１ＡまたはＤ１４１Ｔ、Ｅ１４３Ａ、Ｌ４０８ＨまたはＬ４０８Ｆ、Ａ４８５Ｔ、及びＰ４１０Ｌからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸変異を有する。
【０１１７】
好ましい実施形態において、ＪＤＦ−３のＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｐ４１０Ｌ及びＡ４８５Ｔに４つのアミノ酸変異を含む。
【０１１８】
好ましくは、上記実施形態におけるファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。
【０１１９】
本発明の上記実施形態は、少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログをさらに含んでいてもよく、該連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、鋳型依存的にファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼによって第１のプライマーに取り込まれる。
【０１２０】
好ましい実施形態において、少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、第１の検出可能なラベルによって標識されている。
【０１２１】
他の好ましい実施形態において、１つより多い連鎖終結用ヌクレオチドアナログが標識され、各連鎖終結用ヌクレオチドアナログは異なる第１の検出可能なラベルで標識されている。
【０１２２】
好ましくは、上記実施形態における連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、ジデオキシヌクレオチドである。
【０１２３】
より好ましくは、ジデオキシヌクレオチドは、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰからなる群より選ばれる。
【０１２４】
好ましい実施形態において、第１のプライマーは第２の検出可能なラベルによって標識されている。
【０１２５】
他の好ましい実施形態において、第１及び第２の検出可能なラベルは、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定するためのシグナルを発生する。
【０１２６】
ヌクレオチドを同定するための上記組成物は、第２のプライマーをさらに含んでいてもよい。
【０１２７】
１つの実施形態において、第１のプライマーは、第２の検出可能なラベルで標識されており、第２のプライマーは第３の検出可能なラベルで標識されており、第２及び第３の検出可能なラベルは、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定するためのシグナルを発生する。
【０１２８】
好ましい実施形態において、第２のプライマーは鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドの５’に隣接してアニールする。
【０１２９】
１つの実施形態において、上記組成物はＤＮＡリガーゼをさらに含む。
【０１３０】
好ましい実施形態において、上記各組成物は、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼのための反応バッファをさらに含む。
【０１３１】
好ましい実施形態において、鋳型ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物またはプラスミドＤＮＡである。
【０１３２】
他の好ましい実施形態において、第１または第２または第３の検出可能なラベルは、蛍光ラベル、同位体、化学発光ラベル、量子ドットラベル、抗原、またはアフィニティ分子からなる群より選ばれるラベルである。
【０１３３】
他の好ましい実施形態において、第１の検出可能なラベルはローダミンラベルまたはシアニンラベルである。
【０１３４】
本発明は、さらに上記各組成物をキット形式で提供する。
【０１３５】
好ましい実施形態において、上記キットは対照鋳型及び／または少なくとも１つの対照プライマーをさらに含む。
【０１３６】
好ましい実施形態において、キットは対照鋳型と、４つの対照プライマーとをさらに含む。
【０１３７】
本発明は、試料中の鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）第１のプライマーを鋳型ＤＮＡ分子と接触させる工程であって、接触により第１のプライマーを鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドの３’に隣接してアニールして、第１のプライマーと鋳型ＤＮＡ分子との間に二本鎖が形成される工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られる二本鎖を、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ及び少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログの存在下においてインキュベートする工程であって、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少しており、ターミネータは第１の検出可能なラベルで標識されており、インキュベート工程によって、標識された連鎖終結用ヌクレオチドアナログのＤＮＡポリメラーゼによる鋳型依存的第１のプライマーへの取り込みが可能になるインキュベーション工程と、
（ｃ）第１の検出可能なラベルから発生されるシグナルによって工程（ｂ）で得られる二本鎖の存在または正体を判定する工程とを含む。
【０１３８】
好ましい実施形態において、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、ＪＤＦ−３のＤＮＡポリメラーゼである。
【０１３９】
他の実施形態において、ＪＤＦ−３のＤＮＡポリメラーゼは、配列番号：２の配列を有し、Ｄ１４１，Ｅ１４３，Ａ４８５、Ｌ４０８またはＰ４１０の位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸変異をさらに含む。
【０１４０】
好ましい実施形態において、ＪＤＦ−３のＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１ＡまたはＤ１４１Ｔ、Ｅ１４３Ａ、Ｌ４０８ＨまたはＬ４０８Ｆ、Ａ４８５Ｔ、及びＰ４１０Ｌからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸変異を有する。
【０１４１】
さらに好ましい実施形態において、ＪＤＦ−３のＤＮＡポリメラーゼは、Ｄ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、Ｐ４１０Ｌ及びＡ４８５Ｔの４つのアミノ酸変異を含む。
【０１４２】
好ましくは、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。
【０１４３】
１つの実施形態において、少なくとも１つの連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、第１の検出可能なラベルによって標識されている。
【０１４４】
他の好ましい実施形態において、１つより多い連鎖終結用ヌクレオチドアナログが標識され、各連鎖終結用ヌクレオチドアナログは異なる第１の検出可能なラベルで標識されている。
【０１４５】
好ましくは、上記実施形態における連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、ジデオキシヌクレオチドである。
【０１４６】
より好ましくは、ジデオキシヌクレオチドは、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰからなる群より選ばれる。
【０１４７】
好ましい実施形態において、第１のプライマーは第２の検出可能なラベルによって標識されている。
【０１４８】
他の好ましい実施形態において、第１及び第２の検出可能なラベルは、鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定するためのシグナルを発生する。
【０１４９】
好ましい実施形態において、鋳型ＤＮＡ分子はポリメラーゼ連鎖反応の産物またはプラスミドである。
【０１５０】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、工程（ａ）の前にＰＣＲプライマー及びｄＮＴＰをＰＣＲ産物から除去する工程をさらに含む。
【０１５１】
本発明は、試料中の鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドを同定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）第１のプライマーと第２のプライマーとを鋳型ＤＮＡ分子に接触させる工程であって、接触により、第１のプライマーは鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドの３’に隣接してアニールし、第２のプライマーは鋳型ＤＮＡ分子の所定位置にあるヌクレオチドの５’に隣接してアニールして、鋳型ＤＮＡ分子と第１及び第２のプライマーとの間で複合体を形成し、該第１のプライマーは第２の検出可能なラベルで標識されており、第２のプライマーは第３の検出可能なラベルで標識されている接触工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られる複合体を、ＤＮＡリガーゼの存在下でインキュベートする工程であって、インキュベーションにより第１のプライマーと第２のプライマーとが繋がれて単一の分子が形成されるインキュベーション工程と、
（ｃ）第２及び第３の検出可能なラベルから発生されるシグナルによって、工程（ｂ）で得られる単一の分子の存在または正体を判定する工程とを含む。
【０１５２】
好ましい実施形態において、第１または第２または第３の検出可能なラベルは、放射性ラベル、蛍光ラベル、化学発光ラベル、比色ラベル及び酵素ラベルからなる群から選ばれるラベルである。
【０１５３】
別の実施形態において、第１の検出可能なラベルはローダミンラベルまたはシアニンラベルである。
【０１５４】
本明細書中で用いる「識別」とは、ＤＮＡポリメラーゼが、初期のＤＮＡ重合体中へ非従来型のヌクレオチドを取り込みを行えない傾向のことをいう。ＤＮＡポリメラーゼは、限定はされないがヌクレオチド塩基相補性を含むヌクレオチド構造及び糖及び複素環塩基の構造的特徴を感知して、ＤＮＡポリメラーゼが初期のポリマー中への取り込みに非従来型ヌクレオチドよりも従来型ヌクレオチドを優先的に利用できるようにする能力を有している。ＤＮＡポリメラーゼは、従来型デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰをＤＮＡポリマー強力に取り込むことを好み、ポリメラーゼはその結合ポケット内で非従来型ヌクレオチドによっては進みにくい。
【０１５５】
本明細書中で用いる「識別が減少した」とは、ＤＮＡポリメラーゼが非従来型ヌクレオチド型を初期のＤＮＡポリマーから排除する（すなわち、非従来型ヌクレオチドを初期のＤＮＡポリマーへ取り込まない）傾向が、識別の減少を示さない親または野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも５０％減少していることをいう。ＤＮＡポリメラーゼのもつ、ＤＮＡポリマーへ非従来型ヌクレオチドよりも従来型デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びＴＴＰを取り込みやすいという選択性は、ＤＮＡポリメラーゼによって非従来型ヌクレオチドの方がＤＮＡポリマーにより容易に取り込まれるといったように、天然の選択性レベルよりも減少している。本発明に従えば、識別の減少を示すポリメラーゼは、少なくとも１つの非従来型ヌクレオチドに対して識別の減少を示すが、すべての非従来型ヌクレオチドに対して識別の減少を示すわけではない。
【０１５６】
本発明に従えば、識別は、対応する従来型ヌクレオチドの取り込みを５０％阻害するのに必要とされる非従来型ヌクレオチドの濃度を測定することによって定量化される。この濃度は、非従来型ヌクレオチドに対する「Ｉ５０％」と呼ぶことにする。所与の非従来型ヌクレオチドに対する識別は、該非従来型ヌクレオチドに対するＩ５０％が、変異ＤＮＡポリメラーゼの代わりに親ＤＮＡポリメラーゼを含めて同様のアッセイを行った場合に、少なくとも２倍（５０％）減少している場合に、「減少している」という。
【０１５７】
あるいは、識別の減少は、識別の減少を示す変異ポリメラーゼを用いる反応において、野生型または親酵素を用いた場合に得られるシーケンシングラダーと同等のラダーを得るのに必要とされる非従来型ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはコルジセピン）の量を測定することにより定量化してもよい。シーケンシングラダーは、例えば、プライマー末端から１〜４００塩基の範囲で調べることができ、ラダーはシーケンシング反応において生成される延長産物の長さだけでなく、生成される延長産物の数の点でも一致する。このタイプのアッセイに対して、一定量のｄＮＴＰと変化量の非従来型ヌクレオチドを用いて、野生型（または親）酵素及び変異ポリメラーゼの両方によってシーケンシングラダーが生成される（リボヌクレオチドに対して、シーケンシングラダーは重合産物のアルカリ切断によって生成される）。前掲のＧａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ,１９９９を参照のこと。変異体は、野生型または親酵素によって生成されるものと同じシーケンシングラダー（生成される延長産物の数と長さに関して）を生産するのに、野生型または親ポリメラーゼによって用いられる非従来型ヌクレオチドの量の、少なくとも２倍（５０％）未満、５倍（８０％）未満、１０倍（１００％）未満などしか必要とするようであれば識別の減少を示していることになる。
【０１５８】
本明細書中で用いる「親」または「原体」とは、識別の減少を示す変異ポリメラーゼ作成時に出発物質として用いたポリメラーゼのことをいう。「親」という用語には、自然界で発生するいわゆる「野生型」酵素だけでなく、非従来型ヌクレオチドに対する識別が減少した酵素を作成するための出発物質として用いたエキソヌクレアーゼ欠失酵素などの中間型のものも包含する。
【０１５９】
本明細書中で用いる「非従来型ヌクレオチド」は、ａ）ＤＮＡポリメラーゼによって認識または取り込まれる４つの従来型デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰのうちの１つでないヌクレオチド構造物、ｂ）（ａ）の４つの従来型デオキシヌクレオチドのうちの１つでない合成ヌクレオチド、ｃ）修飾された従来型ヌクレオチド、またはｄ）リボヌクレオチド（ＤＮＡポリメラーゼによって正常に認識または取り込まれないからである）及びリボヌクレオチドの修飾型のことをいう。非従来型ヌクレオチドとしては、限定はされないが、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒより市販されている表ＩＩＩに挙げたものが含まれる。上記非従来型ヌクレオチドのいずれも「ヌクレオチド複合体」であってよく、本明細書中でこの用語は、限定はされないが蛍光ラベル、同位体、化学発光ラベル、量子ドットラベル、抗原またはアフィニティラベルを含む検出可能なラベルを保持しているヌクレオチオドのことをいう。
【０１６０】
本明細書中の「細胞」、「細胞系列」及び「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができ、そのようなすべての表記は子孫を包含する。したがって、「形質転換体」または「形質転換細胞」という単語には、転移の数に関係なく、一次対象細胞及びそれから誘導される培養物が含まれる。すべての子孫は、意図的または非意図的変異のために、ＤＮＡ含量が正確には同一でない場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされるように、同一の機能を有する変異子孫も含まれる。
【０１６１】
本明細書中で用いる「ベクターで形質転換された生物」とは、組換え型遺伝子構築物を保持する生物のことをいう。
【０１６２】
本明細書中で用いる「熱安定性」とは、酵素が昇温状態において活性であり、約９３℃〜約９７℃の範囲のＤＮＡ二本鎖変性温度に対して耐性であるような、ＤＮＡポリメラーゼの性質のことをいう。「活性がある」とは、二本鎖核酸の変性を行うのに必要な時間だけ昇温状態または変性温度に供した場合に、酵素がプライマー延長反応を実行する能力を保持していることを意味する。本明細書中で用いる「昇温状態」とは、約７０℃〜約７５℃の範囲のことをいい、本明細書中で用いる「非昇温状態」とは、約３５℃〜約５０℃の範囲のことをいう。
【０１６３】
本明細書中で用いる「古細菌の」という用語は、古細菌（ｋｉｎｇｄｏｍ  Ａｒｃｈｅａ）の生物またはそれに由来するＤＮＡポリメラーゼのことをいう。
【０１６４】
本明細書中で用いる「プライマー」という用語は、天然または合成のいずれであってもよいオリゴヌクレオチドのことをいい、該オリゴヌクレオチドは実質的に相補的（すなわち、１０のうちの少なくとも７、好ましくは１０のうちの少なくとも９、より好ましくは１０塩基のうちの９塩基が完全に相補的）であり、相補的鋳型ＤＮＡにアニールしてプライマーと鋳型ＤＮＡとの間に二重鎖を形成する。プライマーは、シーケンシングするＤＮＡ鎖へのアニーリングに続いて、ポリメラーゼによる核酸合成の開始点として機能することもできる。プライマーは典型的には一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適当な長さは、プライマーの使用目的に依存するが、ＤＮＡシーケンシング用途に対しては典型的には約１５〜約４０ヌクレオチドの長さである。
【０１６５】
本明細書中で用いる「ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ」とは、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼのメンバーとして分類される任意のＤＮＡポリメラーゼのことをいい、ファミリーＢの分類は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩとの構造的類似性に基づいている。以前はα−ファミリーポリメラーゼとして知られていたファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼには、限定されないが表Ｉに挙げたようなものが含まれる。
【０１６６】
本明細書中で用いる「ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼ」は、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼのメンバーとして分類される任意のＤＮＡポリメラーゼのことをいい、ファミリーＡの分類は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩとの構造的類似性に基づいている。ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼには、限定されないが表Ｉに挙げたようなものが含まれる。
【０１６７】
本明細書中で用いる「３’→５’エキソヌクレアーゼ欠失」または「３’→５’エキソ」とは、ＤＮＡポリマーの３’末端から取り込まれたヌクレオチドを除去する能力を実質的に欠失しいてる酵素のことをいう。ファミリーＢのポリメラーゼのメンバーによって例示される、例えば３’→５’エキソヌクレアーゼ活性のようなＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性は、変異によって欠失させて、エキソヌクレアーゼ欠失ポリメラーゼを得ることができる。本明細書中で用いる、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＤＮＡポリメラーゼは、実質的に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。「実質的に欠失している」という表現のなかには、活性が完全に欠失していること、あるいは活性が「実質的に」欠失していることが包含される。活性の「実質的な」欠失は、親ポリメラーゼに対して、変異ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性が０．０３％であり、また、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％、または２０％であってもよいが、親または野生型ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性の５０％未満であることを意味する。
【０１６８】
本明細書中で用いる、「変異」とは、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を変化させる出発親ＤＮＡ配列に導入される変化のことをいう。変異の結果としては、限定されないが、新しい性質、特性、機能または、親ＤＮＡによってコードされるタンパク質においては見られない特性を生み出すことが含まれる。
【０１６９】
本明細書中で用いる、「野生型」とは、自然界で見られる、生物、菌株、遺伝子、タンパク質または特徴の典型的な状態のことをいう。したがって、野生型は、野生型に変更を導入することにより野生型から誘導された、変異体とは区別される天然の状態である。
【０１７０】
本明細書中で用いる、「対応する」とは、機能的に同等のドメインまたはサブシーケンスが同定されている、２つ以上の核酸またはポリペプチドの比較における配列類似性のことをいい、そのような機能的に同等のドメインまたはサブシーケンスまたはそのようなドメインまたはサブシーケンス内のアミノ酸は、「対応している」と言われる。すなわち、２つ以上の配列を、類似または同一の配列領域に対して全配列を調べる比較アライメント分析によって比較し、他の配列からの領域と機能的に同等でありそうな領域を同定する。
【０１７１】
本明細書中で、アミノ酸、アミノ酸配列またはタンパク質ドメインの比較に関して用いる用語「類似する」は、同一ではないにせよ、「保守的な（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）」相違を示すアミノ酸またはドメインのことをいう。「保守的な」という用語は、異なるアミノ酸は、対応するまたは参照配列においてアミノ酸と同様の特性を有することを意味している。典型的な保守的な置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅのあいだ、ＳｅｒとＴｈｒのあいだ、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕのあいだ、ＡｓｎとＧｌｎのあいだ、及び塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇのあいだ、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒのあいだでの置換である。２つのポリペプチド配列の間での類似度（大半は百分率）を計算する際には、比較している２つの分子の全長に対する、２つのポリペプチド配列のなかの対応するアミノ酸残基間で同一性または類似性が観察される位置の数を考慮する。
【０１７２】
本明細書中で用いる用語「機能的に同等の」は、所与のモチーフ、領域またはモチーフまたは領域中のアミノ酸が、酵素の全体機能に関して、別の酵素においてモチーフ、領域、またはモチーフまたは領域中のアミノ酸が遂行するのと同じ機能を遂行することを意味する。
【０１７３】
本明細書中で用いる「連鎖終結用ヌクレオチドアナログ」とは、一旦取り込まれてしまうと、ＤＮＡポリメラーゼによる配列延長のための基質としては機能できず、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡポリマーの延長を終結させるヌクレオチドアナログのことをいう。このようなヌクレオチドアナログは、典型的には、ＤＮＡポリメラーゼが入ってくるヌクレオチドによってホスホジエステル結合を合成することのできる該ヌクレオチドアナログの糖部分上に水酸基を欠失している。連鎖終結用ヌクレオチドアナログは、非従来型ヌクレオチドのサブセットであり、限定はされないがジデオキシヌクレオチドを含んでいる。
【０１７４】
本明細書中で用いる「検出可能に標識された」という表現は、様々な手段によって容易に検出可能な官能基（ラベル）を取り込んだ構造的修飾のことをいう。検出可能に標識できる化合物としては、非限定的にヌクレオチドアナログが含まれる。検出可能なヌクレオチドアナログラベルとしては、非限定的に蛍光化合物、同位体化合物、化学発光化合物、量子ドットラベル、ビオチン、酵素、電子密度試薬、及び抗血清やモノクローナル抗体が利用できるハプテンまたはタンパク質が含まれる。様々な検出手段としては、非限定的に分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的または化学的手段が含まれる。
【０１７５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して本明細書中で用いる、「単離された」という用語は、天然で発生する配列がその正常な細胞環境から取り除かれているか、あるいは非自然環境において合成されている（例えば、人工的に合成されている）ことを意味する。したがって、配列は、細胞を含まない溶液中または異なる細胞環境中におくことができる。この用語は、配列が存在するヌクレオチドまたはポリヌクレオチド鎖だけであることではなく、それぞれに通常付随する非ヌクレオチドまたは非ポリペプチド材料を本質的に含まない（少なくとも約９０〜９５％の純度）ことを含意している。
【０１７６】
本明細書中で用いる用語「組換え型」は、遺伝子操作によって（すなわち、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする遺伝材料の修飾または操作によって）変えられた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことをいう。
【０１７７】
本発明は、上述のような全長変異ＤＮＡポリメラーゼのみならず、変異ポリメラーゼの機能的断片、すなわち変異ポリメラーゼの全アミノ酸配列よりは小さいものの、少なくとも１組の条件下において、ポリヌクレオチドの重合を触媒する能力を保持しているＤＮＡポリメラーゼの断片を意味する。このような機能的断片は、独立物として存在することもあるし、あるいは融合タンパク質などのより大きなポリペプチドの構成要素であることもある。
【０１７８】
本明細書中で用いる「相補的ＤＮＡ鎖」という用語は、プライマー延長反応においてＤＮＡポリメラーゼによって鋳型ＤＮＡ分子から合成されたＤＮＡ分子のことをいう。
【０１７９】
本明細書中で用いる「鋳型ＤＮＡ分子」という用語は、例えばプライマー延長反応において、ＤＮＡポリメラーゼによって相補的核酸鎖が合成される元になる核酸の鎖のことをいう。「鋳型ＤＮＡ分子」は、配列を同定する必要がある鋳型ＤＮＡ鎖のこともいう。配列は、鋳型ＤＮＡ分子の所定の位置にある１つのヌクレオチドについて同定する必要がある場合と（すなわち、ミニシーケンシングによって）、ＤＮＡ分子の断片または全体について同定する必要がある場合（すなわち、シーケンシングによって）がある。本発明に従う「配列」という用語は、鋳型ＤＮＡ分子の所定の位置もしくは１つより多い位置におけるヌクレオチドの識別のことをいう。
【０１８０】
本発明のさらなる特徴と利点は、以下の実施形態及び図面の説明のなか、及び請求項からより完全に明示されるであろう。
【０１８１】
開示
本発明は、非修飾の野生型に比べて非従来型ヌクレオチドに対する識別の減少をもたらす１つ以上の遺伝子変異を有する、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの発見に基づいている。ここで述べる全ての引例は、そっくりそのまま引用により本願に取り込む。
非従来型ヌクレオチドに対する識別の減少を見せるファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは以下のとおりである。
【０１８２】
Ａ．本発明に従って有用なＤＮＡポリメラーゼ
本発明に従えば、ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼは非従来型ヌクレオチドに対して識別の減少をみせる酵素を生じるように変異させることができる。表Ｉはこのファミリーによって分類した周知のＤＮＡポリメラーゼの非限定的リストを含んでいる。
【表１】
2005512560.tif 000002
2005512560.tif 000003
2005512560.tif 000004
2005512560.tif 000005
【０１８３】
Ｂ．プラスミド
本発明に従うファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの生成のための出発配列は、プラスミドベクターに含有させることができる。クローン化したファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの非限定的なリスト、及びそれらのＧｅｎｅＢａｎｋアクセス番号が表ＩＩに列挙されている。
【表２】
2005512560.tif 000006
2005512560.tif 000007
2005512560.tif 000008
2005512560.tif 000009
2005512560.tif 000010
【０１８４】
ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの修飾型の発現を許容するプラスミドは、既知の多数の中から当業者によって選択可能である。本発明に従う修飾ＤＮＡポリメラーゼの発現のためのプラスミドベクターは、ＤＮＡポリメラーゼの高レベル発現を指示する配列を含むことが好ましく、ＤＮＡポリメラーゼの誘導可能な高レベル発現を指示する配列を含むことがより好ましい。誘導可能な高レベル発現系の一例として、本発明に従う修飾ＤＮＡポリメラーゼをコードする配列をバクテリオファージＴ７プロモータの制御下においたプラスミドを、染色体内に誘導可能なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有した細菌に導入するようにしてもよい。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の誘導によって、Ｔ７プロモータによって駆動される修飾ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の高レベル発現が誘導される（例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ,Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ.２７:２５４５を参照のこと）。
【０１８５】
Ｃ．突然変異誘発
様々な方法により、クローン化した野生型のファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼに変異をかけて、非従来型ヌクレオチドに対して識別の減少を示す型を作成することができる。
【０１８６】
まず最初に、当該技術分野においては、１つ以上のランダムに位置した変異を保持する変異体団を与えるランダム突然変異誘発の方法がある。このような変異体団を次に、野生型のポリメラーゼに比べて識別の減少を示すかどうかをスクリーニングするようにしてもよい（下記の「変異体についての識別減少の評価方法」を参照のこと）。ランダム突然変異誘発のための方法の例として、いわゆる「変異性ＰＣＲ法」がある。この名前が物語っているように、この方法は、ＤＮＡポリメラーゼが高フィデリティ取り込みを支持しない条件の下で、所与の配列を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼが異なれば変異性取り込みを促進する条件が変わるが、当業者であれば所与の酵素に対してそのような条件を決定できるであろう。増幅のフィデリティにおける多くのＤＮＡポリメラーゼに対する基本変数は、例えば、バッファ中の二価金属の種類と濃度である。、ポリメラーゼのエラー率に影響を与えるために、マンガンイオンの使用及び／またはマグネシウムまたはマンガンイオン濃度の変化を適用することができる。
【０１８７】
第２に、当該技術分野においては、特定の部位または領域に直接的に変異をかけることのできる多数の部位特異的突然変異誘発が知られている。従来法及びＰＣＲに基づく方法を含め、部位特異的突然変異誘発を実施するための多数のキットが市販されている。その例としては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより市販されているＥＸＳＩＴＥ（商標）ＰＣＲに基づく部位特異的変異キット（カタログ番号：２００５０２、ＰＣＲに基づく）及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅより市販されているＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位特異的変異キット（カタログ番号：２００５１８、ＰＣＲに基づかない）、ならびにこれもＳｔｒａｔａｇｅｎｅより市販されているＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（登録商標）二本鎖部位特異的変異キット（カタログ番号：２００５０９）が挙げられる。
【０１８８】
当該技術分野において知られている上記よりも古い部位特異的突然変異誘発は、変異すべき配列を、一本鎖ＤＮＡ鋳型の単離を可能にする、Ｍ１３バクテリオファージベクターなどのベクター中にサブクローニングすることによるものであった。これらの方法においては、変異プライマー（すなわち、変異すべき部位にアニールすることのできるプライマーであって、変異部位に１つのミスマッチヌクレオチドを保持するもの）を一本鎖鋳型にアニールして、変異プライマーの３’末端から始まる鋳型の相補鎖の重合を行っていた。その後、得られた二本鎖で宿主細菌を形質転換し、プラークについて所望の変異を有しているかどうかを調べた。
【０１８９】
もっと最近では、部位特異的突然変異誘発に、一本鎖鋳型を必要としないという利点を有するＰＣＲの手順が用いられるようになった。さらに、サブクローニングを必要としない方法も開発されてきた。ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発を実施する際には、いくつかの問題を考慮しなければならない。第１に、これらの方法において、ポリメラーゼによる望ましくない変異の拡大を防ぐためにＰＣＲサイクルの数を減らすことが望ましい。第２に、反応中に居座る未変異の親分子の数を減らすために選択を行わなければならない。第３に、１つのＰＣＲプライマーセットを使用できるように、鎖長の長いＰＣＲ方法が好ましい。第４に、いくつかの熱安定性ポリメラーゼが鋳型非依存性末端延長活性を有しているため、ＰＣＲによって生成した変異体産物の平滑末端ライゲーションの前に末端ポリシング工程を組み込む必要があることが多い。
【０１９０】
以下に記載するプロトコールは、次の工程によって上記の考慮をふまえている。第１に、使用する鋳型濃度を、従来のＰＣＲ反応において用いられるよりも約１０００倍高くすることにより、産物の収率を劇的に低下させることなく、サイクルの数を２５〜３０から５〜１０に減らすことができる。第２に、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３、Ａ残基はメチル化されている）を用いて、親ＤＮＡに対する選択性を与える。これは最も一般的な大腸菌の株ＤａｍがそれらのＤＮＡを配列５−ＧＡＴＣ−３においてメチル化するためである。第３に、長い（すなわち、全プラスミド長）ＰＣＲ産物の割合を増加させるために、ＰＣＲ混合物中にＴａｑＥｘｔｅｎｄｅｒが用いられる。最後に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる分子内ライゲーションの前にＰＣＲ産物の末端を研磨する。
【０１９１】
方法について、以下に詳細に示す。
【０１９２】
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインのＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発
プラスミド鋳型ＤＮＡ（約０．５ｐモル）をＰＣＲカクテルに加える。ＰＣＲカクテルは、１×変異バッファ（２０ｍＭ  トリスＨＣｌ，ｐＨ７．５；８ｍＭ  ＭｇＣｌ２；４０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）；１２〜２０ｐモルの各プライマー（当業者であれば、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング特性に影響を及ぼす、塩基組成、プライマー長及び目的とするバッファ塩濃度などを考慮しながら、必要に応じて変異プライマーを設計するであろう。１つのプライマーには所望の変異が含まれていなければならず、１つ（同一または他の）には、その後のライゲーションを容易にするための５’ホスフェートを含んでいなければならない）、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、及び２．５ＵのＴａｑＥｘｔｅｎｄｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより市販、Ｎｉｅｌｓｏｎら(１９９４)Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ７:２７及び米国特許第５，５５６，７７２号を参照のこと）を含んでいる。ＰＣＲサイクルは以下のようにして行った。９４℃４分間、５０℃２分間及び７２℃２分間の１サイクル行った後、９４℃１分間、５４℃２分間及び７２℃１分間のサイクルを５〜１０サイクル行う。親の鋳型ＤＮＡ、及び線形の変異プライマーを取り込んだＰＣＲで生成されたＤＮＡをＤｐｎＩ（１０Ｕ）及びＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）を用いて処理する。これにより、インビボでメチル化された親鋳型のＤｐｎＩ消化と、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによる、線形ＰＣＲ産物上の鋳型非指向性ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによって延長された塩基の除去が達成される。反応は、３７℃で３０分間インキュベートした後、７２℃にしてさらに３０分間インキュベートする。０．５ｍＭ  ＡＴＰを含有する変異バッファ（１×、１１５μＬ）をＤｐｎ−消化し、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで研磨したＰＣＲ産物に加える。溶液を混合し、そのうちの１０μＬを新しい微量遠心管に取り、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２〜４Ｕ）を加える。ライゲーションは３７℃で６０分以上行う。最後に、処理済溶液を標準的な方法に従ってコンピテント大腸菌に形質転換する。
【０１９３】
Ｄ．本発明に従う有用な非従来型ヌクレオチド
当該技術分野においては広範な非従来型ヌクレオチドが市販されている。それらのどれもが本発明のＤＮＡポリメラーゼとともに使用できるものとする。そのような非従来型ヌクレオチドの非限定的リストが表ＩＩＩに示されている。
【表３】
2005512560.tif 000011
2005512560.tif 000012
2005512560.tif 000013
2005512560.tif 000014
【０１９４】
本発明に従って有用なさらなる非従来型ヌクレオチドとしては、限定されないが、７−デアザ−ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、５’−メチル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸などが挙げられる。さらなる非従来型ヌクレオチドまたは上記リスト以外の変形は、Ｗｒｉｇｈｔ＆Ｂｒｏｗｎ,１９９０,Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.Ｔｈｅｒ.４７:４４７によって検討されている。リボヌクレオチドは一般にＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれないことから、リボヌクレオチドは従来型ヌクレオチドとして適格でないことを特記しておく。ポリメラーゼが標識または未標識のリボヌクレオチドを取り込む能力を与える、もしくはその能力を高めるファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの修飾が、ここでは特に意図されている。
【０１９５】
Ｅ．変異体の識別の減少の評価方法
当該技術分野において知られるようにして、あるいは本明細書に記載したようにして作成され、細菌中で発現されたランダムまたは部位特異的変異体について、いくつかの異なるアッセイによって非従来型ヌクレオチドに対する識別の減少をスクリーニングすることができる。１つの方法において、例えばＬａｍｂｄａ  ＺａｐＩＩ（登録商標）に基づいて発現ベクターによって宿主に感染させることによって生成された溶菌λファージプラーク中で発現させたファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼタンパク質を、メンブレン支持体に転移させる。固定化されたタンパク質について、メンブレンを取り込みについて調べたいＤＮＡ鋳型と非従来型ヌクレオチドを含むバッファ中に浸漬することにより、メンブレン上のポリメラーゼ活性を検定する。
【０１９６】
Ｓａｇｎｅｒら（Ｓａｇｎｅｒ,Ｇ.,Ｒ.,ａｎｄ  Ｋｅｓｓｌｅｒ,Ｃ.(１９９１)Ｇｅｎｅ９７:１１９〜１２３）によって用いられている技術の変形を用いて、変異ポリメラーゼライブラリーのスクリーニングを行うことができる。この手法のために、λファージクローンを１平方センチメートルあたり１０〜２０プラークの密度でプレーティングする。プラーク中に存在するタンパク質をフィルターに移し、ポリメラーゼスクリーニングバッファで濡らした（５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭβ―ＭＥ）。フィルターをプラスチックラップとガラスの層の間に保った状態で、６５℃で３０分間インキュベートすることにより、宿主細胞タンパク質を熱不活性化する。熱処理したフィルターを新鮮なプラスチックラップに移し、約３５μＬのポリメラーゼアッセイカクテルをフィルター１平方センチメートル毎に加える。アッセイカクテルは、１×クローン化Ｐｆｕ（ｃＰｆｕ）マグネシウム非含有バッファ（１×バッファは２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００であり；Ｐｆｕマグネシウム非含有バッファはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号：２００５３４）から入手してもよい）、１２５ｎｇ／ｍＬ活性化させた子牛胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、１．２９μＣｉ／ｍＬα−３３ＰｄｄＮＴＰまたはジデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ：ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ比＝１：１５にて）から構成される。最初のスクリーニングは、ＭｎＣｌ２の存在下で行われたが、好ましい方法は、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファ中でスクリーニングすることである（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）。プラスチックラップとガラス板の間にフィルタを置き、６５℃で１時間インキュベートした後、７０℃で１時間１５分間インキュベートする。フィルターを１回の洗浄につき５分間ずつ、２×ＳＳＣ中で３回洗浄し、その後１００％エタノール中で２回リンスし、真空乾燥させる。次にフィルターをＸ線フィルムに露光し（約１６時間）、フィルタをファージクローンを保有する元のプレートと整合することにより、ラベルを取り込んだプラークを同定する。この方法で同定されたプラークをさらに薄い濃度で再度プレーティングし、同様の条件でアッセイして、精製されたプラークの単離を行えるようにする。
【０１９７】
上述したようなアッセイにおいて、ラベルによって発生されるシグナルは、アッセイに用いられる特定の非従来型ヌクレオチドまたは非従来型ヌクレオチドの組み合わせに関して、ポリメラーゼの活性を測定することを目的としている。全部で４つの従来型ヌクレオチドに対応する非従来型ヌクレオチドを反応系に含めてもよいし、あるいは、１つの非従来型ヌクレオチドのみを含めて、所与の非従来型ヌクレオチドの利用に対する変異体の影響を調べるようにしてもよい。１つの手法としては、１回目のスクリーニングにおいて、全部で４つの従来型ヌクレオチドに対応する従来型ヌクレオチドを用いて、基準となる野生型クローンよりも取り込みが多いクローンを同定し、その後のスクリーニングにおいて個々の非従来型ヌクレオチドの取り込みをモニターすることがある。好ましいスクリーニングの形態において、ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ及びｄｄＴＴＰのジデオキシヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドアナログを用いてもよいが、これは、ｄｄＧＴＰがいくつかのＤＮＡポリメラーゼによって識別されず、どのスクリーニングにおいてもバックグラウンドシグナルが上昇するためである。
【０１９８】
ジデオキシヌクレオチド取り込み能の向上したクローンをスクリーニングするために、ジデオキシヌクレオチドのみを用いた第１のスクリーニングによって同定されたクローンについて、４つすべてのｄＮＴＰ、Ｈ−ＴＴＰトレーサ、及び低レベルの各ｄｄＮＴＰを用いたＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド取り込みアッセイにおいて、低レベルの４つの各ジデオキシヌクレオチドに対する感受性による特徴づけを行ってもよい。ジデオキシヌクレオチドの取り込みによりＤＮＡ鎖長延長が停止するので、ジデオキシヌクレオチドの取り込み能が優れていると、トリチウム標識したデオキシヌクレオチドの取り込みが、野生型ＤＮＡポリメラーゼに比べて減少する。ヌクレオチド取り込みの５０％阻害を与えるｄｄＮＴＰ濃度（Ｉ５０％）の比較を用いて、種々のポリメラーゼまたはポリメラーゼ変異体のｄｄＮＴＰ取り込み効率を比較することができる。ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰに対するＩ５０％値を比較することにより、変異体の特定の塩基に対する感受性の減少を同定することができる。このような変異体は、より均一なＤＮＡシーケンシングラダーを生産することが予想される。
【０１９９】
個々のｄｄＮＴＰの取り込みを測定するために、様々な濃度の関心ｄｄＮＴＰと、全部で２００μＭの各ヌクレオチド三リン酸からなるカクテルを調製する。例えば、野生型ＪＤＦ−３ポリメラーゼによるｄｄＡＴＰの取り込みは、０，４０，８０，１２０及び１６０μＭ  ｄｄＡＴＰで測定することができる。これらの反応系において、ｄＡＴＰの濃度は、それぞれ２００，１６０，１２０，８０及び４０μＭに調節して、アデニンヌクレオチド三リン酸の全量が２００μＭとなるようにする。比較において、変異体は、ｄｄＡＴＰが０，５，１０及び２０μＭとなるｄｄＡＴＰ濃度、それぞれ２００，１９５，１９０及び１８０μＭに調節したｄＡＴＰ濃度（ｄＡＴＰ＋ｄｄＡＴＰ＝２００μＭ）を用いてアッセイすることができる。ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰ取り込みを同様に測定するために、さらに別のカクテルを調製する。
【０２００】
上述の濃度パラメータにおける核酸の取り込みは、例えば、１μＬの適当に希釈した細菌抽出物（すなわち、クローン化ポリメラーゼまたは変異クローン化ポリメラーゼを発現する、熱処理し、清澄化した細菌細胞の抽出物（実施例１、部Ｍ））を、１０μＬの各ヌクレオチドカクテルに添加した後、７２℃で３０分間インキュベートすることによって測定することができる。延長反応は氷上で停止させ、５μＬのアリコートをＤＥ８１イオン交換フィルター（２．３ｃｍ；Ｗｈａｔｍａｎ＃３６５３２３）に迅速にスポットする。未取り込みのラベルは、２×ＳＣＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６回洗浄し、１００％エタノールで簡単に洗浄することによって除去する。取り込まれた放射能をシンチレーションカウントによって測定する。酵素を欠如する反応についても、試料のインキュベーションと平行して行い、「全ｃｐｍｓ」（フィルタ洗浄工程を省略）及び「最小ｃｐｍｓ」（フィルタを上述のように洗浄）を決定する。
【０２０１】
結合したｃｐｍは、細菌抽出物の体積あたりに存在するポリメラーゼ活性の量に比例する。約１０，０００ｃｐｍの取り込みをもたらす細菌抽出物の体積（一般に約０．２５〜１μＬ）を、後続のヌクレオチドアナログ取り込み試験において用いるために決定した。
【０２０２】
ランダム突然変異誘発によって作成した変異ＤＮＡポリメラーゼに対する遺伝子をシーケンシングして、変異の部位と数を同定してもよい。１つより多い変異を含む変異体に対して、所与の変異の効果は、特定の変異体に由来する他の変異から単離する際に、部位特異的突然変異誘発によってエキソ原体遺伝子に当該同定された変異を導入することによって評価することができる。このようにして、得られた１つの変異体のスクリーニングアッセイによって、該変異体単独の効果を決定することができるのである。
【０２０３】
Ｆ．本発明に従う変異をかけたファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの発現
本発明に従うファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼの変異型を発現させて単離するために、当該技術分野において周知の方法を適用することができる。多くの細菌発現ベクターは、外来配列によってコードされるタンパク質を高レベルで誘導可能に発現させることのできる配列要素または配列要素の組み合わせを含んでいる。例えば、上述のように、組み込まれた誘導可能型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現する細菌を、Ｔ７プロモータと連結した変異ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有する発現ベクターで形質転換するようにしてもよい。適当なインデューサ、例えば、ｌａｃ誘導性プロモータに対するイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによる、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導により、Ｔ７プロモータからの変異遺伝子の高レベル発現が誘導される（前掲Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ,１９９９を参照のこと）。
【０２０４】
適当な細菌の宿主株は、当業者によって当該技術によって入手可能なもののなかから選択可能である。非限定的な例としては、大腸菌ＢＬ−２１株が外来性タンパク質の発現に一般的に用いられている。これは、この株が、ＷＪ５６やＥＲ２５６６を含む、誘導可能なＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を保持する大腸菌ＢＬ−２１の他の株に対するプロテアーゼを欠失しているためである。特定のポリメラーゼ遺伝子に対するコドンの利用が、通常に見られる大腸菌遺伝子とは異なるような状況に対して、より珍しいアンチコドンをもつｔＲＮＡをコードするｔＲＮＡ遺伝子を保持するように修飾され（例えば、ａｒｇＵ，ｉｌｅＹ，ｌｅｕＷ，及びｐｒｏＬ  ｔＲＮＡ遺伝子）、これによりクローン化されたタンパク質遺伝子、例えばクローン化された古細菌酵素遺伝子を高効率で発現させることのできるＢＬ−２１株がある（珍しいコドンｔＲＮＡを保有するいくつかのＢＬ２１-ＣＯＤＯＮ  ＰＬＵＳ（商標）細胞株が、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅより市販されている）。
【０２０５】
本発明の修飾ＤＮＡポリメラーゼの精製に適した多くの方法が当業者によって知られている。例えば、Ｌａｗｅｒら（１９９３,ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ.＆Ａｐｐ.２:２７５）の方法は、この方法が元々はＴａｑポリメラーゼの単離のために設計されたことからも、大腸菌において発現される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの単離に非常に適している、あるいは、宿主タンパク質を破壊するための熱変性工程と、非常に活性が高く約８０％の純度をもつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを単離するための２回のカラム精製工程（ＤＥＡＥ−セファロースカラム及びヘパリン−セファロースカラム）とを採用した、Ｋｏｎｇらの方法（１９９３,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８:１９６５、引用により本願に組み込む）を用いてもよい。さらに、以下の実施例１のパートＮに詳細に示されているように、ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、硫酸アンモニウム分画に続くＱセファロースカラム及びＤＮＡセルロースカラムによって単離してもよく、あるいは、ＨｉＴｒａｐＱカラムで汚染物質を吸着した後、ＨｉＴｒａｐヘパリンカラムからの勾配溶出を行って単離してもよい。
【０２０６】
Ｇ．ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種の識別が減少した熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの調製
ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）に対する識別の減少を示す熱安定性ファミリーＢのポリメラーゼを調製するために、超好熱性古細菌ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種に由来する３’→５’エキソヌクレアーゼ欠失（Ｄ１４１Ａ）ファミリーＢポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列に対し、本明細書中に記載した「変異性ＰＣＲ」を用いてランダム突然変異誘発を行い、バクテリオファージλＺａｐ（登録商標）ＩＩ中にクローニングした。ＪＤＦ−３に由来するポリメラーゼを選んだ理由は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）に由来するファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼに比べて、プロセッシビティならびに、重合速度及びｄｄＮＴＰ取り込みが優れているからである（下記の表ＩＶを参照のこと）。変異体のライブラリーを大腸菌宿主上にプレーティングし、溶菌プラークを示したタンパク質を固体支持体上に移し、これをＤＮＡ鋳型ならびに４つすべてのα−３３Ｐ標識されたジデオキシヌクレオチドを含むバッファ中に浸漬した。標識されたジデオキシヌクレオチドを取り込んだ変異体は、それらのα−３３ＰｄｄＮＴＰを取り込む能力に対応するシグナルを発生した。単離されたクローンについて、全部で４つのｄＮＴＰ及びＨ−ＴＴＰトレーサを用いるＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド取り込みアッセイにおいて、低レベルの各４つのジデオキシヌクレオチドに対する感受性の特徴づけを行った。ジデオキシヌクレオチドの取り込みはＤＮＡ鎖長延長を停止するので、ジデオキシヌクレオチドの優れた取り込み能力は、トリチウム標識されたデオキシヌクレオチドの取り込みを減少させる。未変異の原体ＤＮＡポリメラーゼはジデオキシヌクレオチドをめったに取り込まず、高いｄｄＮＴＰレベル（各ｄｄＮＴＰ１００〜１６０マイクロモル）でも５０％しか阻害されない。変異酵素は、５〜４０マイクロモル濃度のｄｄＮＴＰにおいて５０％の阻害しか示さず、４つすべてのｄｄＮＴＰに対して高い取り込みが観察された（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＴＴＰ及びｄｄＧＴＰ、下記実施例１の表Ｖ及びＶＩを参照のこと）。
【０２０７】
非従来型ヌクレオチドの取り込みは、それぞれ０．０２１μＭで存在するα−３３Ｐ標識ｄｄＮＴＰと２．１μＭで存在するｄＮＴＰを用いて、サイクルシーケンシングにおける精製変異ポリメラーゼの使用を介して評価した。変異体は４つすべてのジデオキシヌクレオチドを容易に利用し、Ｆ６６７ＹＴａｑＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）に比べて遜色のないシーケンシングラダーを発生した（ＶａｎｄｅｒＨｏｒｎら、１９９７、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２:７５８）。
【０２０８】
４０の精製変異体のうちの１７について関係するドメインをシーケンシングした。大半のランダム変異したクローンは、シーケンシングした領域中に１つより多い変異を含んでいたが、すべての変異体は３つの部位のうちの１つに変異を含んでいた。ｄｄＮＴＰ取り込みの向上した表現型に関与すると予測される変異を、部位特異的突然変異誘発により、原体エキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼ配列中に導入し、ジデオキシヌクレオチド取り込みが向上した表現型に寄与すると予想されない付属変異体を除外した。
【０２０９】
１７のＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異体のうちの１６が、コンセンサス配列４０４ＤｘｘＳＬＹＰＳＩＩ４１３内のチロシンのいずれかの側の領域ＩＩ（モチーフＡ）中に見つけられた。これらの変異は、ＤＦＲＳＬＹＬＳＩＩ（Ｐ４１０Ｌ）、ＤＦＲＳＨＹＰＳＩＩ（Ｌ４０８Ｈ）及びＤＦＲＳＦＹＰＳＩＩ（Ｌ４０８Ｆ）から構成された。したがって、領域ＩＩのＬＹＰモチーフは、ＪＤＦ−３のファミリーＢポリメラーゼにおけるｄｄＮＴＰ識別に重要であるようにみえる。
【０２１０】
従来技術におけるＪＤＦ３ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼにおけるＹ４０９に相当するチロシンの修飾から、これがヌクレオチド結合ポケットにおける位置合わせのためのものと理解されている。しかしながら、本明細書中で示すように、Ｙ４０９に隣接する残基（Ｌ４０８ＨまたはＬ４０８ＦまたはＰ４１０Ｌ）の修飾では、特にｄｄＮＴＰ取り込みに関するヌクレオチド結合を大いに変化させるという予期せぬ結果が得られた。
【０２１１】
領域ＩＩの外で起こる非従来型ヌクレオチドの取り込みの向上を導く唯一のＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異は、領域ＩＩＩ中の４８５位におけるアラニン（ａｌａまたはＡ）からスレオニン（ｔｈｒまたはＴ）への変換（Ａ４８５Ｔ）である。この部位は、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼのヘリックスＯ中のＫＸ３（Ｆ／Ｙ）ＧＸ２ＹＧと構造的にではなく機能的に類似する、ＫＸ３ＮＳＸＹＧ（前掲Ｊｕｎｇら、１９９０;上記Ｂｌａｓｃｏら、１９９２;Ｄｏｎｇら、１９９３,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８:２１１６３;Ｚｈｕら、１９９４,Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ａｃｔａ１２１９:２６０;Ｄｏｎｇ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ、１９９５,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７０:２１５６３）（領域ＩＩＩまたはモチーフＢと呼ばれる）の２残基上流である。Ｋｌｅｎｏｗ断片やＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼにおいて、ＯヘリックスはｄＮＴＰ結合に主要な役割を果たすアミノ酸を含んでいる（Ａｓｔａｋｔｅら、１９９８、Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２７８:１４７;Ａｓｔａｔｋｅら、１９９５、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２７０:１９４５;Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９２、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ２６７:８４１７;Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９０,Ｊ.ｂｏｉｌ.Ｃｈｅｍ.２６５:１４５７９;Ｐａｎｄｅｙら、１９９４、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６９:１３２５９;Ｋａｕｓｈｉｋら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ.３５:７２５６）。具体的には、ヘリックスＯは、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼにおいてｄｄＮＴＰ識別に関与しているとみなされるＦ（Ｋｌｅｎｏｗ断片におけるＦ７６３、ＴａｑにおけるＦ６６７）を含んでいる（ＫＸ３（Ｆ／Ｘ）ＧＸ２ＹＧ）（前掲Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５）。
【０２１２】
ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼにおけるｄｄＮＴＰ取り込みに対するＡ４８５Ｔ変異の影響は、ＲＢ６９及びＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ結晶構造（前掲Ｈｏｐｆｉｎｅｒら、１９９９）によって、提案されているヌクレオチド結合表面の活性部位から遠ざかるように面していることが示されたため驚くべきものであった。さらに、古細菌ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼにおいてリボース選択性に関与している側鎖のタイプ（Ａ：小さく、非極性）は、ファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼにおいてｄｄＮＴＰ識別を命令している嵩高な芳香族Ｙ及びＦ残基のものとは異なっている（前掲Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５）。さらに、この位置（Ａ４８５）は、ＤＮＡポリメラーゼファミリーのいずれのあいだでもあまり保存されておらず、このドメインに対するコンセンサス配列には含まれていないことから（前掲Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ  ａｎｄ  Ｉｔｏ、１９９３）、ｄＮＴＰ認識においてさほど重要でないことが暗示される。
【０２１３】
Ｐ４１０ＬとＡ４８５Ｔの変異を含むＪＤＦ−３二重変異体を構築した。ジデオキシヌクレオチドサイクルシーケンシングにおいて、二重変異体によって実証されたバンドパターン強度は非常に均一であったことから、対応するｄｄＮＴＰよりもｄＮＴＰを好むという選択性が殆どないことが示唆される（図８及び実施例１Ｑを参照のこと）。このポリメラーゼ特性は、自動化シーケンシングにおける塩基呼び出しの精度を高める。Ｐ４１０ＬとＡ４８５変異との組み合わせ、Ｌ４０８ＨとＡ４８５変異との組み合わせ、及びＬ４０８ＦとＡ４８５変異との組み合わせによって、ｄｄＮＴＰの取り込みの向上を示す酵素が得られると予想している。このような二重変異酵素によるジデオキシヌクレオチド取り込みの効率は、取り込みの相対向上度を決定するために、本明細書に記載したようなＩ５０％を測定することにより、キャラクタライズまたは定量化してもよい。
【０２１４】
実施例
以下の実施例は説明のみを意図して与えられるものであって、請求される本発明の範囲を限定することは一切意図していない。
【０２１５】
実施例１
Ａ．Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＪＤＦ−３種ＤＮＡポリメラーゼからのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種をフアンデフカ海峡より採取した海洋試料から培養した。ゲノムＤＮＡを単離し、標準的な手順を用いてＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にゲノムＤＮＡライブラリーを調製するために用いた。λライブラリーをＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦの大腸菌上にプレーティングし、サンガーら（Ｓａｎｇｅｒ,Ｇ.,Ｒｕｇｅｒ,Ｒ.,ａｎｄ  Ｋｅｓｓｌｅｒ,Ｃ.(１９９１)Ｇｅｎｅ９７:１１９-１２３）によって記載されている方法の変形を用いて、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するクローンをスクリーニングした。活性ポリメラーゼを含むプラークの芯を抜き、ＳＭバッファ中に保存した。陽性の一次プラークを再度プレーティングし、再度アッセイして、単離クローンの精製を可能にした。二次クローンをＺＡＰＩＩシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって提供される説明書に従って切り出し、インサートのＤＮＡ配列を決定した（図１）。
【０２１６】
ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼの翻訳されたアミノ酸配列を図２に示した。アミノ酸配列アライメントから、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢと呼ばれるＤＮＡポリメラーゼのクラスに対して相同性を示すことがわかった。
【０２１７】
組換え型ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼを下記のようにして精製した（「ＪＤＦ−３の精製（方法１）」を参照のこと）。ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼの生化学的特性を、他の市販されている古細菌ＤＮＡポリメラーゼと比較した。表ＩＶ及びＶに示されている結果から、他の酵素に比べて、ＪＤＦ−３は高いプロセシビティと、高い重合速度（Ｋｃａｔ）、及び大きなｄｄＮＴＰ利用傾向を示すことが分かった。このことから、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼをＤＮＡシーケンシング酵素を開発するために選択した。
【表４】
2005512560.tif 000015
【０２１８】
Ｂ．ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子からのインテインの除去
ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼ配列とのアライメントにより、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼクローンは、インテイン配列を含むことが分かった（図３及び図４）。組換え型ＪＤＦ−３ポリメラーゼの発現を向上させるために、インテインを逆ＰＣＲによって除去した。ＰＣＲプライマーは、インテイン末端をコードする配列のすぐ上流または下流から開始するように設計し、プライマーの３’末端がインテインから遠ざかるような向きとした。プライマーにはライゲーションを容易にするために５’−リン酸基の修飾も行った。プラスミド／インサート配列を標準的な方法によってＰＣＲ増幅し環状化した。
【０２１９】
Ｃ．３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の減少したＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異体の構築
３’−５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を欠失するＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチドアナログ取り込みを必要とする用途（例えば、ＤＮＡシーケンシング）に対して、取り込み後のヌクレオチドアナログの除去を防ぐために好ましい。プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼに付随する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、突然変異誘発によって減少または無くすことができる。配列の比較から、ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメイン中に３つの保存されたモチーフ（エキソＩ，ＩＩ，ＩＩＩ）が同定されている（Ｖ.Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ,Ｊ.Ｋ.Ｐｉｎｓｏｎｎｅａｕｌｔ,ａｎｄ  Ｃ.Ｍ.Ｊｏｙｃｅ,Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ.２６２,３６３(１９９５)に概説）。Ｖｅｎｔ（Ｈ.Ｋｏｎｇ,Ｒ.Ｂ.Ｋｕｃｅｒａ,ａｎｄ  Ｗ.Ｅ.Ｊａｃｋ,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８,１９６５(１９９３)）及びＰｆｕ（Ｓｔｒａｗｔａｇｅｎｅ,非公開）などの古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む、多数のＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、保存されたアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のどれをアラニンに置換しても無くすことができることが証明されている。保守的な置換により、古細菌９°Ｎ−７ＤＮＡポリメラーゼの変異体について示されているように、エキソヌクレアーゼ活性の減少が起こる（Ｍ.Ｗ.Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ,Ｈ.Ｋｏｎｇ,Ｒ.Ｂ.Ｋｕｅｒａ,Ｊ.Ｗａｒｅ,Ｈ.Ｊａｎｎａｓｃｈ,ａｎｄ  Ｆ.Ｂ.Ｐｅｒｌｅｒ,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.９３,５２８１(１９９６)）。
【０２２０】
実質的に低下した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、エキソＩドメイン中の保守的な１４１Ｄまたは１４３Ｅ残基にアミノ酸置換を導入することによって調製した。ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（登録商標）二本鎖部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、Ｄ１４１Ａ、Ｄ１４１Ｎ、Ｄ１４１Ｓ，Ｄ１４１Ｔ、Ｄ１４１Ｅ及びＥ１４３Ａの変異体を構築した。
【０２２１】
ＪＤＦ−３変異体タンパク質を分析するために、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を、
【化１】
2005512560.tif 000016
【０２２２】
を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を消化し、精製し、標準的な方法を用いて高発現レベルベクター内にライゲーションした。プラスミドクローンをＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換した。標準的な方法を用いて組み換え型細菌クローンを増殖させ、ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を誘導の非存在下で発現させた。組換え型クローンのエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼ活性を細菌溶解物を用いてアッセイした。典型的には、粗抽出物を７０℃で１５〜３０分間加熱し、その後遠心分離して、清澄な溶解物を得た。
【０２２３】
Ｋｏｎｇら（Ｋｏｎｇら、１９９３,Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６８:１９６５）の方法ならびにＳｏｕｔｈｗｏｒｔｈら（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９６,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.Ｕ.Ｓ.Ａ.９３:５２８１）の方法を含む、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を測定するための多数の方法が当該技術分野において知られている。上記の文献の全内容を引用により本願に組み込む。Ｋｏｎｇらの方法によって測定された、野生型及び活性変異ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は以下の通りである。
【表５】
2005512560.tif 000017
【０２２４】
複合エキソヌクレアーゼ変異体Ｄ１４１Ａ＋Ｅ１４３Ａは、Ｌ項に記載のようにして作成した。
【０２２５】
Ｅ１４３ＡＪＤＦ−３変異体（クローン＃５５０）は３’−５’エキソ活性の有意な減少を示したため、ｄｄＮＴＰならびに他のヌクレオチドアナログの取り込みを高めるためのさらなる突然変異誘発の対象に選んだ。実質的にエキソヌクレアーゼ活性の減少を示した他のＪＤＦ−３変異体、ＪＤＦ−３Ｄ１４１Ｔ変異体もこの目的ために使用することができた。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を完全に除去する必要のある実験または用途に対しては、二重変異体Ｄ１４１Ａ＋Ｅ１４３Ａが好ましかった。
【０２２６】
Ｄ．ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の変異性ＰＣＲ増幅
高フィデリティ複製を支持しないような条件下において全遺伝子（クローン＃５５０）を増幅することにより、ランダム変異をエキソＪＤＦ−３中に導入した。潜在的変異体のスペクトルを広げるために、３つの異なるＰＣＲ酵素を変異性条件下で用いた。
【０２２７】
好ましい形態において、各１００μＬの反応型を各ＰＣＲ酵素を用いて増幅した。
【０２２８】
ｉ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによる増幅
反応混合物
【表６】
2005512560.tif 000018
【０２２９】
サイクルパラメータ
ＰＣＲは、Ｈｏｔ  Ｔｏｐアセンブリを備えたＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（商標）４０温度サイクラを用いて実施した。以下は使用したサイクル条件である。
【０２３０】
１）９５℃で１分間
２）９５℃で１分間
３）５４℃で１分間
４）７２℃で２．５分間
５）２）〜４）の工程を３０回反復
ｉｉ．エキソ−ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼによる増幅
反応混合物
【表７】
2005512560.tif 000019
【０２３１】
サイクルパラメータ
ＰＣＲは、Ｈｏｔ  Ｔｏｐアセンブリを備えたＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（商標）４０温度サイクラを用いて実施した。以下は使用したサイクル条件である。
【０２３２】
１）９５℃で１分間
２）９５℃で１分間
３）５４℃で１分間
４）７２℃で２．５分間
５）２）〜４）の工程を３０回反復
ｉｉｉ．エキソ−ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによる増幅
反応混合物
【表８】
2005512560.tif 000020
【０２３３】
サイクルパラメータ
ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ社の９６００温度サイクラを用いて実施した。以下は使用したサイクル条件である。
【０２３４】
１）９５℃で１分間
２）９５℃で１分間
３）５３℃で１分間
４）７２℃で５分間
５）２）〜４）の工程を３０回反復
順方向プライマー
変異体ライブラリーの初期バージョンを順方向プライマー４６１を用いて作成した。このプライマーは、ＥｃｏＲＩ部位を含んでいる。プライマー４６１及び９２３によって増幅された産物を制限酵素によって切断し、以下のセクションに記載するようにλベクター中にクローニングした場合、ベクターによってコードされるβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）タンパク質の最初の３９のアミノ酸を有する融合タンパク質が合成される。
【表９】
2005512560.tif 000021
【０２３５】
プライマー４６１を用いて単離されたクローンがｐ＃で示されている。
【０２３６】
増幅及びクローニングの好ましい態様は順方向プライマー７２１を用いる。このプライマーもまたＥｃｏＲＩ部位に続いて、３つの連続するインフレーム停止コドンとリボソーム結合部位とを含んでいる。この構成により、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ末端にあるすべてのベクター由来残基を持たないように翻訳されることができる。順方向プライマー７２１を用いて構築したライブラリーから単離されたクローンは、一連のｐ＃クローンと区別するために１＃で示されている。
【表１０】
2005512560.tif 000022
【０２３７】
逆方向プライマー
【表１１】
2005512560.tif 000023
【０２３８】
Ｅ．クローニング用ＰＣＲ産物の調製
ＰＣＲ産物は、ＳＴＲＡＴＡＰＲＥＰ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：４００７７１）を用いて精製し、濃縮した。ＰＣＲ産物を１．５×ユニバーサルバッファ（１０×ユニバーサルバッファの組成は、１Ｍ  ＫＯＡｃ、２５０ｍＭ  トリス−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、５ｍＭβ−メルカプトエタノール及び１００μｇ／ｍＬＢＳＡである）中、３７℃で１時間、５０ユニットのＸｈｏＩと５０ユニットのＥｃｏＲＩにて消化した。消化した試料を１％アガロース、１×ＴＢＥゲルに泳動し、臭化エチジウム染色によって可視化した。２．３ｋｂ増幅産物を、ＳＴＲＡＴＡＰＲＥＰ（商標）ＤＮＡゲル抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：４００７６６）を用いてゲル分離し、精製した。
【０２３９】
Ｆ．ＰＣＲインサートのＵｎｉ−Ｚａｐ（登録商標）ＸＲλベクターへのクローニング
２００ｎｇの精製した増幅産物を、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで予め消化し、アルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２３７２１１）で脱リン酸化しておいた１μｇのＵＮＩ−Ｚａｐ（登録商標）ＸＲλベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２３９２１３）とライゲーションした。ＤＮＡは２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：６０００１１）及び０．５ｍＭのＡＴＰを用いて、１×リガーゼバッファ（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）中、１０〜１５μＬの反応体積でライゲーションした。ライゲーションは１６℃にて最低１６時間実施した。
【０２４０】
Ｇ．λパッケージング及び細菌感染
各ライゲーション反応から２マイクロリットルをＧＩＧＡＰＡＣＫ(登録商標)ＩＩＩゴールドパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２００２０１）を用いて室温で９０分間パッケージングした後、５００μＬのＳＭバッファ（５０ｍＭ  トリスｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び０．０１％ゼラチン）及び２０μＬのクロロホルムで停止した。パッケージングされたλベクターを大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ宿主細胞上にプレーティングした。
【０２４１】
Ｈ．ジデオキシヌクレオチドスクリーニング
変異ポリメラーゼライブラリーを、Ｓａｎｇｅｒら（Ｓａｎｇｅｒ,Ｇ.,Ｒｕｇｅｒ,Ｒ.,ａｎｄ  Ｋｅｓｓｌｅｒ,Ｃ.(１９９１)Ｇｅｎｅ９７:１１９-１２３）によって用いられている技術の変形を用いてスクリーニングした。λファージクローンを１平方センチメートルあたり１０〜２０プラークの密度でプレーティングした。プラーク中に存在するタンパク質をフィルターに移し、ポリメラーゼスクリーニングバッファで濡らした（５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０），７ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３ｍＭβ―ＭＥ）。フィルターをプラスチックラップとガラスの層の間に保った状態で、６５℃で３０分間インキュベートすることにより、宿主細胞タンパク質を熱不活性化した。熱処理したフィルターを新鮮なプラスチックラップに移し、約３５μＬのポリメラーゼアッセイカクテルをフィルター１平方センチメートル毎に加えた。ポリメラーゼアッセイカクテルは、１×クローン化Ｐｆｕマグネシウム非含有バッファ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号：２００５３４）、１２５ｎｇ／ｍＬ  活性化させた子牛胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、１．２９μＣｉ／ｍＬα−３３ＰｄｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２から構成される。最初のスクリーニングは、ＭｎＣｌ２の存在下で行われたが、１×Ｔａｑポリメラーゼバッファ中でスクリーニングすることを好ましい方法とした（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）。再度プラスチックラップとガラス板の間にフィルタを置き、６５℃で１時間インキュベートした後、７０℃で１時間１５分間インキュベートした。フィルターを１回の洗浄につき５分間ずつ、２×ＳＳＣ中で３回洗浄し、その後１００％エタノール中で２回リンスし、真空乾燥器中で乾燥させた。次にフィルターを約１６時間Ｘ線フィルムに露光した。強いシグナルに対応するプラークの芯を抜き、ＳＭバッファ中においた。陽性の一次プラークをさらに薄い濃度で再度プレーティングし、実質的に類似する条件下においてアッセイし、単離されたプラークを精製できるようにした。
【０２４２】
Ｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチドスクリーニング
ｄｙｅ−デオキシヌクレオチド及びｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチドの利用能力が高められた変異ポリメラーゼを検出するために、ＪＤＦ−３変異ＤＮＡポリメラーゼライブラリーを以下のことを除いては前述のようにしてスクリーニングした。
【０２４３】
Ｆｌｕ−１２−ｄＵＴＰスクリーニングのためのポリメラーゼアッセイカクテル：
０．９×Ｔａｑバッファ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２００４３５）、６５μＭ  ｄＡＴＰ、６５μＭ  ｄＣＴＰ、６５μＭ  ｄＧＴＰ、６５μＭ  ｄＴＴＰ、０．３μＭフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社内製品）、０．７５μｇ／μＬ活性化子牛胸腺ＤＮＡ。
【０２４４】
ＲＯＸ  ｄｄＮＴＰのためのポリメラーゼアッセイカクテル
１×Ｔａｑバッファ、０．９μＭ  ｄＡＴＰ，０．９μＭ  ｄＣＴＰ，０．９μＭ  ｄＧＴＰ，０．９μＭ  ｄＴＴＰ，０．６μＭ  ＲＯＸ  ｄｄＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ(ＮＥＮ)ＮＥＮ４７８）、０．０６μＭ  ＲＯＸ  ｄｄＧＴＰ（ＮＥＮ  ＮＥＬ４７９）、０．０６μＭ  ＲＯＸ  ｄｄＣＴＰ（ＮＥＮ  ＮＥＬ４７７）、０．０６μＭ  ＲＯＸ  ｄｄＵＴＰ（ＮＥＮ  ＮＥＬ４７６）、０．８４μｇ／μＬ活性化子牛胸腺ＤＮＡ（注意：ＤＮＡポリメラーゼがｄｄＧＴＰに対する識別をしないことから、ＲＯＸ  ｄｄＧＴＰを含まないスクリーニング系が好ましい方法である）。
【０２４５】
フルオレセインｄｄＵＴＰのためのポリメラーゼアッセイカクテル
１×Ｔａｑバッファ、７０μＭ  ｄＡＴＰ、７０μＭ  ｄＴＴＰ、７０μＭ  ｄＣＴＰ、１５μＭ  ｄＴＴＰ、１μＭ  フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ（ＮＥＮ  ＮＥＬ４０１）、０．８４μｇ／μＬ活性化子牛胸腺ＤＮＡ。
【０２４６】
フルオレセインへの抗体の結合
フィルタをＴＢＳＴ（５０ｍＭ  トリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中に溶解した１％の脱脂粉乳によって４℃で一晩ブロックした。フィルタをＴＢＳＴ中で簡単に洗浄した後、イルミネータキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：３００３６０）からのアルカリホスファターゼ共役抗フルオレセイン抗体を、５０ｍＬのＴＢＳＴ中、１／１０，０００希釈で加えた。１００ｍＭ  トリスｐＨ９．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなるバッファ中にそれぞれ０．３ｍｇ／ｍＬ及び０．１５ｍｇ／ｍＬの濃度のＮＢＴ／ＢＣＩＰで抗体を検出した。
【０２４７】
ローダミンへの抗体の結合
抗ＲＯＸ抗体（Ｚｙｍｅｄカタログ番号７１−３６００ウサギローダミン（５−ＲＯＸポリクローナル、１ｍｇ／ｍＬ）をＴＢＳＴ中に１：１０００希釈した。ブロックしたフィルタを簡単に吸い取って余分な水分を除き、プラスチックラップ上に置いて、２．５ｍＬの希釈抗体溶液で覆った。プラスチックラップをもう１枚フィルター上に置いてから、室温で１時間インキュベートした。フィルタをＴＢＳＴで簡単に３回洗浄し、それぞれ１５分間を３回穏やかに攪拌しながら洗浄した。洗浄したフィルタを、ＴＢＳＴ中に１：５０００希釈したアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体とともにインキュベートした。フィルタを抗体とともに１時間インキュベートしてから、前述のようにＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて検出した。
【０２４８】
Ｉ．ジデオキシヌクレオチド認定
一次ライブラリスクリーニングにおいて３３Ｐ標識ｄｄＮＴＰを取り込んだλファージクローンを再度スクリーニングして、ポリメラーゼ活性を確認し、３３Ｐ−ｄｄＮＴＰ取り込みに対する二価金属イオンの寄与を調べた。この回のスクリーニングのあいだに選択されたクローンをｐ＃として示した。これらのクローンはすべて、「順方向プライマー」のタイトルの項において考察したように、アミノ末端タグを含んでいた。図５は、クローンｐ１，ｐ２，ｐ３，ｐ６，ｐ７，ｐ８，ｐ９，ｐ１０，ｐ１１，ｐ１２，ｐ１４，ｐ１５及びｐ１６が、親＃５５０クローンとのシグナル強度の類似性に基づいて、野生型レベルのＤＮＡポリメラーゼ活性を示すことを表している（図５、パネル３）。最初のスクリーニングは０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２の存在下で行われたにも拘わらず、ｐ９とｐ１０を除くすべてのクローンが、３３Ｐ標識ｄｄＮＴＰを、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（パネル２）の存在下と同等の程度に取り込むことができ、クローンｐ２，ｐ４，ｐ８，ｐ１１，ｐ１２，ｐ１３，ｐ１４，ｐ１５，ｐ１７，及びｐ１８は最も高いシグナルを発生した。
【０２４９】
１８の変異体を評価のために選んだ。各精製プラークから単離した１マイクロリットルのファージを、それぞれ３つの大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ芝上に置いた。エキソ−ＪＤＦ３ＤＮＡ（＃５５０クローン）の親コピーを含むファージをマス目上にスポッティングした。ファージによって形成されたプラークをフィルタに移し、最終バッファの組成を除いては前述のスクリーニングの項に記載したようにして処理した。各フィルタ（フィルタ１〜３）のために用いたバッファは以下のとおりであった。
【表１２】
2005512560.tif 000024
【０２５０】
結果を図５に示す。
【０２５１】
Ｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチド認定
前述のように、一次λクローンを大腸菌芝上にスポッティングし、適当な抗体又は抗原を用いて再スクリーニングした。
【０２５２】
Ｊ．λクローンの切り出し
ラムダＺａｐ（商標）ベクターは、適切な条件下でヘルパーファージとともにインキュベートした場合に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＫ−）及びインサートを含むベクターの一部のファージミドコピーを生産するように設計されている。このプロセスにより、ラムダクローン中に含まれていたものと同一のインサートを保持するプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−）ベクターが得られる。所望の表現型を有するクローンの切り出しは、ＥＸＡＳＳＩＳＴ（商標）システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２００２５３）のなかの説明書に従って実施した。
【０２５３】
Ｋ．変異体の配列解析
変異体のシーケンシングは、以下のプライマーを用いてＳｅｑｕｅｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州、マウンテンビュー）によって行われた。
【０２５４】
プライマー３（またはプライマＧ）
５’ＣＣＡＧＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＴＡＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣ３’
プライマー５（またはＪＤＦ３−１１２８）
５’ＡＡＣＴＣＴＣＧＡＣＣＣＧＣＴＧ３’
Ｌ．ジデオキシヌクレオチド突然変異誘発
ｄｄＮＴＰ識別の減少に寄与するアミノ酸を結論的に同定するために、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２００５１８）を用いて個々の点変異をエキソ−ＪＤＦ−３＃５５０クローン中に導入した。以下の変異体を調製した。Ｌ４０８Ｈ，Ｌ４０８Ｆ，Ｐ４１０Ｌ，Ａ４８５Ｔ，Ｓ３４５Ｐ，Ｄ３７３Ｙ，Ａ６１９Ｖ及びＬ６３１Ｖ。さらに、Ａ４８５Ｔ変異をエキソ−ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ変異クローン中に導入することにより、二重変異（Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ）を構築した。すべての３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を完全に除去するために、変異Ｄ１４１Ａをすべてのクローンに与えた。すでに存在している５’→３’エキソヌクレアーゼ変異（Ｅ１４３Ａ）は、親鋳型ＪＤＦ−３  ５５０中に存在していた。
【０２５５】
Ｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチド突然変異誘発
ダイヌクレオチドの識別の減少に寄与するアミノ酸を結論的に同定するために、変異Ｓ３４５Ｐ単独と、Ｐ４１０Ｌ及びＰ４１０Ｌ＋Ａ４８５Ｔと組み合わせたものとを作成した。
【０２５６】
Ｍ．熱処理された細菌抽出物の調製
切り出したプラスミドを含む大腸菌ＳＯＬＲ細胞を３７℃で一晩増殖させた。５００μＬの培養物に含まれる細胞を微量遠心分離によって回収した。細胞ペレットを５０μＬの５０ｍＭ  トリス（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。リゾチームを最終濃度１μｇ／μＬとなるように加え、細胞を３７℃で１０分間、次に６５℃で１０分間インキュベートする間に溶解した。熱不活性化細胞材料を微量遠心分離によって回収し、上清について以下のようにしてｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰ取り込みを調べた。
【０２５７】
Ｎ．ＪＤＦ−３及びＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体の精製。
【０２５８】
エキソ−ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼを精製するための１つの方法では、硫酸アンモニウム分画の後に、Ｑセファロースカラム及びＤＮＡセルロースカラムを実施する。第２の方法は、ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体の迅速な精製を可能にするために開発されたものであり、ＨｉＴｒａｐＱカラム上に汚染物質を吸着した後、ＨｉＴｒａｐヘパリンカラムから勾配溶出することを伴う（セクションｉｉｉ）。
【０２５９】
ｉ．細菌溶解物の調製
凍結細胞ペースト（３〜１４グラム）を、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１０ｍＭβ−メルカプトエタノールからなる３倍体積の溶解バッファで再懸濁した。リゾチームを０．２ｍｇ／ｍＬで加え、ＰＭＳＦを最終濃度１ｍＭで加えた。細胞を１時間かけて氷上で溶解した。溶解物を２分間超音波処理した（９０％効率、２×２．５、１×３．０レベル）。超音波処理に続いて、溶解物を６５℃で１５分間加熱し、細菌のタンパク質を変性させた。加熱した溶解物を、ＳｏｒｖａｌｌＳＳ−３４ロータを用いたＳｏｒｖａｌｌＲＣ−２Ｂ遠心機中、１４．５Ｋｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を回収した。
【０２６０】
ｉｉ．硫酸アンモニウム分画及びＱセファロース／ＤＮＡセルロースクロマトグラフィ（方法１）
硫酸アンモニウムを細胞溶解物に最終濃度４５％で加えた。硫酸アンモニウムは１５分間かけて加え、混合物はさらに３０分間攪拌した。混合物を上述のように遠心分離し、上清を回収した。追加の硫酸アンモニウムを最終濃度が６５％となるまで加えた。混合物を上述のように遠心分離し、上清を除去した。ペレットを、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、及び１０％（ｖ／ｖ）グリコールから成るバッファＡ１０ｍＬ中に再懸濁した。バッファーＡを２回交換（各３リットル）しながら、上清を一晩透析した。
【０２６１】
透析物を、予めバッファーＡで平衡化しておいた、２．６×９．４ｃｍのＱ−セファロースファストフローカラム（５０ｍｌｓ）上にローディングした。カラムを吸収（ＯＤ２８０）がベースラインに達するまでバッファＡで洗浄した。次にカラムを０〜１ＭのＮａＣｌ／バッファＡの勾配によって溶出した。画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイによって分析した（下記参照）。活性タンパク質は典型的には１３０ｍＭ〜２４０ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した。活性画分をプールし、バッファＢを２回交換しながら（各３リットル）一晩透析した。バッファＢは、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、１０％（ｖ／ｖ）グリコール、及び５０ｍＭ  ＮａＣｌから成る。
【０２６２】
Ｑ−セファロース溶出液を、バッファＢで平衡化しておいた、１．６×４．９ｃｍ（１０ｍｌｓ）ＤＮＡセルロースカラム上にローディングした。カラムを吸収（ＯＤ２８０）がベースラインに達するまでバッファＢで洗浄した。次にカラムを５０〜１０００ｍＭのＮａＣｌ／バッファＡの勾配によって溶出した。画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイによって分析した。活性タンパク質は典型的には２８０ｍＭ〜３６０ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した。活性画分をプールし、ＪＤＦ−３最終バッファに対して一晩透析した。ＪＤＦ−３最終バッファは、２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｖ／ｖ）イゲパール６３０、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロールから成る。
【０２６３】
ｉｉｉ．ＨｉＴｒａｐＱ／ＨｉＴｒａｐヘパリンクロマトグラフィー（方法２）
複数の変異体を迅速に精製するのに好ましい方法は以下のとおりである。熱変性工程の直前にＴｗｅｅ２０とイゲパールＣＡ６３０とを最終濃度が０．０１％（ｖ／ｖ）となるように添加し、熱変性温度として７２℃を用いたことを除いては、細菌細胞溶解物を上記方法１のようにして調製した。
【０２６４】
溶解物を、バッファＣで予め平衡化しておいた、１．６×２．５ｃｍ（５ｍｌｓ）ＨｉＴｒａｐＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製プレパックドカラム）上にローディングした。バッファＣは、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、及び０．１％（ｖ／ｖ）イゲパール６３０からなる。カラムを吸収（ＯＤ２８０）がベースラインに達するまでバッファＣで洗浄した。画分全体を通して流液（ＯＤ２８０吸収がバックグラウンドを超える）を回収し、予めバッファＤで平衡化しておいた、１．６×２．５ｃｍ（５ｍｌｓ）ＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製プレパックドカラム）上にローディングした。バッファＤは、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｖ／ｖ）イゲパール６３０、及び１０％（ｖ／ｖ）グリセロールから成る。カラムを吸収（ＯＤ２８０）がベースラインに達するまでバッファＤで洗浄した。次にカラムを０〜１ＭのＫＣｌ／バッファＤの勾配によって溶出した。画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイによって分析した。活性タンパク質は典型的には３９０ｍＭ〜５６０ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した。活性画分をプールし、ＪＤＦ−３最終バッファに対して一晩透析した（上記参照）。精製ポリメラーゼは−２０℃で保存した。
【０２６５】
ｉｖ．精製タンパク質の分析
ＪＤＦ−３及び変異ＤＮＡポリメラーゼの濃度は、Ｐｉｅｒｃｅのクーマシーブルータンパク質アッセイ試薬を用いて、ＢＳＡ基準（Ｐｉｅｒｃｅ）に対して決定した。さらに、種々のポリメラーゼ調製物の純度と相対タンパク質濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ポリメラーゼ試料を４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動し、標準的な方法を用いてゲルを銀染色した。
【０２６６】
Ｏ．ヌクレオチド取り込みアッセイ
ＤＮＡポリメラーゼ活性は、精製したＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体または様々な変異体クローンから調製した熱処理後の細菌抽出物を用いて測定した。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、活性化された子牛胸腺ＤＮＡへの３Ｈ−ＴＴＰの取り込みによってモニターすることにより測定した。典型的なＤＮＡポリメラーゼ反応カクテルは以下のものを含んでいた。
【表１３】
2005512560.tif 000025
【０２６７】
取り込みは、１μＬのポリメラーゼ試料を１０μＬのポリメラーゼカクテルのアリコートに加えることによって測定した。ＤＮＡポリメラーゼ試料を適当な保存バッファ（例えば、２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｖ／ｖ）イゲパール６３０、１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中に希釈した。重合反応は、７２℃で３０分間行った。延長反応を氷上で停止させ、５μＬのアリコートをＤＥ８１イオン交換フィルター（２．３ｃｍ；Ｗｈａｔｍａｎ＃３６５３２３）に迅速にスポットした。未取り込みの［３Ｈ］ＴＴＰは、２×ＳＣＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６回洗浄し、１００％エタノールで簡単に洗浄することによって除去した。取り込まれた放射能をシンチレーションカウントによって測定した。酵素を欠如する反応についても、試料のインキュベーションと平行して行い、「全ｃｐｍｓ」（フィルタ洗浄工程を省略）及び「最小ｃｐｍｓ」（フィルタを上述のように洗浄）を決定した。
【０２６８】
結合したｃｐｍは、細菌抽出物の体積あたりに存在するポリメラーゼ活性の量に比例した。約１０，０００ｃｐｍの取り込みをもたらす細菌抽出物の体積（０．２５〜１μＬ）を、後続のヌクレオチドアナログ取り込み試験において用いるために決定した。
【０２６９】
Ｐ．ｄｄＮＴＰ取り込み効率の定量化
相対ｄｄＮＴＰ取り込み効率を調べるために、ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体について評価を行った。様々な濃度の各ｄｄＮＴＰターミネータ（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰ）の存在下で、ヌクレオチド取り込みを測定した。ｄｄＮＴＰ取り込みによって延長不能末端が生成されるため、ｄｄＮＴＰを効率的に取り込むポリメラーゼに対して重合は強力に阻害される。ヌクレオチド取り込みの約５０％阻害をもたらすｄｄＮＴＰ濃度（Ｉ５０％）を比較することにより、様々なポリメラーゼまたはポリメラーゼ変異体のｄｄＮＴＰ取り込み効率を比較することができる。ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰのＩ５０％値を比較することにより、特定の塩基に対する感受性が減少した変異体を同定することができる。このような変異体は、より均一なＤＮＡシーケンシングラダーを生むと予想された。
【０２７０】
個々のｄｄＮＴＰの取り込みを測定するために、様々な濃度の関心ｄｄＮＴＰと、全部で２００μＭの各ヌクレオチド三リン酸とからなるカクテルを調製した。例えば、野生型ＪＤＦ−３ポリメラーゼによるｄｄＡＴＰの取り込みは、０，４０，８０，１２０及び１６０μＭ  ｄｄＡＴＰにおいて測定した。これらの反応系において、ｄＡＴＰ濃度は、それぞれ２００，１６０，１２０，８０及び４０μＭに調節して、アデニンヌクレオチド三リン酸の全量が２００μＭとなるようにした。比較において、変異体は、ｄｄＡＴＰが０，５，１０及び２０μＭとなるｄｄＡＴＰ濃度、それぞれ２００，１９５，１９０及び１８０μＭに調節したｄＡＴＰ濃度（ｄＡＴＰ＋ｄｄＡＴＰ＝２００μＭ）を用いてアッセイした。ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、及びｄｄＴＴＰ取り込みを測定するために、さらに別のカクテルが調製した。３つの異なるｄｄＮＴＰ濃度におけるＪＤＦ−３変異体によるｄｄＮＴＰ取り込みを調べるために、以下の成分からなる１２反応カクテルを調製した。
【０２７１】
１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．８
１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ  ＫＣｌ
０．００１％ゼラチン
５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（ＮＥＮ＃ＮＥＴ−２２１Ｈ，２０．５Ｃｉ／ミリモル；エタノールを除去するために部分的に蒸発）
２５０μｇ／ｍＬの活性化子牛胸腺ＤＮＡ（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＃２７−４５７５−０１）
１２の反応カクテルのそれぞれに、以下にまとめたように適当な量のｄＮＴＰ及びｄｄＮＴＰを加えた。
【表１４】
2005512560.tif 000026
【０２７２】
１０μＬの各ポリメラーゼカクテルに、１μＬの適当に希釈した細菌抽出物（１０，０００ｃｐｍ）を加えることにより取り込みを測定した。重合反応は７２℃で３０分間行った。延長反応は上記のようにして計数した。
【０２７３】
「最小ｃｐｍ」（上記洗浄フィルタ）を決定するために、酵素を含まない反応系も試料のインキュベーションと平行して行った。ｄｄＮＴＰ濃度の関数としての％活性を決定するために、まずバックグラウンド（「最小ｃｐｍ」値）を各試料のｃｐｍから減算した。１００％活性と等価である（０ｄｄＮＴＰ）「全ｃｐｍ」は、ｄｄＮＴＰを含まない４つの反応系（Ａ−０，Ｇ−０，Ｃ−０，及びＴ−０）に対して補正したｃｐｍを平均することによって求めた。次に、補正後の試料ｃｐｍ（ｄｄＮＴＰによる）を補正後の全ｃｐｍ（平均０ｄｄＮＴＰ）で割ることにより、残存活性百分率を計算した。
【０２７４】
活性百分率をｄｄＮＴＰ濃度の関数としてプロットした。それぞれの変異体について、各ｄｄＮＴＰに対するＩ５０％値（ヌクレオチド取り込みを５０％阻害するｄｄＮＴＰ濃度）を決定した。比較によって、野生型ＪＤＦ−３に比べてｄｄＮＴＰの取り込みが向上した変異体を同定することができた。
【０２７５】
最初の研究では精製酵素を用い、Ｉ５０％値を４０〜１６０μＭ  ｄｄＮＴＰを利用する阻害プロットから決定した。表Ｖの結果は、変異体ｐ８（Ｐ４１０Ｌ）、ｐ１１（Ｐ４１０Ｌ）、及びｐ１２（Ａ４８５Ｔ）が、親のエキソ−ＪＤＦ−３ポリメラーゼよりも低い濃度のｄｄＮＴＰによって阻害されることを示している。感受性の向上は、変異体が元のＪＤＦ−３ポリメラーゼよりも４つすべてのｄｄＮＴＰをより効率的に取り込むことを示している。
【０２７６】
ｄｄＴＴＰよりもＴＴＰを優先的に取り込む酵素に対しては（エキソ−ＪＤＦ−３，エキソ−Ｐｆｕ）、一定量の［３Ｈ］ＴＴＰ（５μＭ）と組み合わせて、ｄｄＴＴＰ（８０〜１６０μＭ）の濃度を次第に高め、これに対応してＴＴＰ（１１５〜３５μＭ）の濃度を低くすると、ｄｄＮＴＰ濃度の増加に伴って取り込まれるｃｐｍも増加する。したがって、これらの最初の実験（ｄｄＴＴＰ＞１２０μＭ）において、ＴＴＰに対するＩ５０％は人工的に高い。これらは異なるポリメラーゼ変異体間でのｄｄＴＴＰ取り込みを比較するために用いることはできるが、ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰまたはｄｄＡＴＰと比較してのｄｄＴＴＰに対する選択性の減少／増大を評価するために用いることはできない。
【表１５】
2005512560.tif 000027
【０２７７】
より多数の変異クローンのスクリーニングを行えるようにするために、次の実験ではＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を含む細菌抽出物を用いた。さらに、低濃度の各ｄｄＮＴＰ阻害剤（５〜２０μＭ）を用いることにより、感受性を高めた。表ＶＩの結果は、一次フィルタースクリーニングから選択された変異体のすべてがｄｄＮＴＰ取り込みの向上を示したことが示されている。ｄｄＮＴＰ取り込みの向上は２０倍を超えるものであった。アミノ酸４０８（Ｌ４０８Ｈ／Ｆ）、４１０（Ｐ４１０Ｌ）、または４８５（Ａ４８５Ｔ）における変異（「一次変異」と呼ぶ）を含むすべての変異体が、４つすべてのｄｄＮＴＰに対して識別の減少を示した。全部ではないにせよ大半のＬ４０８Ｈ／Ｆ一次変異を有する変異体が、４つすべてのｄｄＮＴＰに対して非常に類似したＩ５０％値（２倍未満の相違）を示し、塩基選択性を持たないか減少していることがわかった。
【表１６】
2005512560.tif 000028
【０２７８】
Ｑ．精製ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を用いたシーケンシング
ｉ．放射性標識したジデオキシヌクレオチドによるシーケンシング
１〜２μＬの精製酵素をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ放射性標識ターミネータサイクルシーケンシングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ-Ｐｈａｒｍａｃｉａ#ＵＳ７９７５０）に代入した。試料は、キットによって提供される対照プライマーと鋳型を用いて、製造業者の指示に従って処理した。各３マイクロリットルの各シーケンシング反応系を、６％アシルアミド−７Ｍ尿素、１×ＴＢＥ  ＣＡＳＴＡＷＡＹ（商標）プレキャストゲル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：４０１０９０及び４０１０９４）上にローディングした。ブロモフェノールブルー指示染料がゲルの端に到達したところで、ゲルを固定し、乾燥させ、２４〜７２時間、フィルムに露光した（図６）。
【０２７９】
図６の結果は、クローンｐ１１（パネルＤ）及びｐ８（パネルＥ）が、親＃５５０クローン（パネルＢ）と比べて４つすべてのｄｄＮＴＰの取り込みの劇的向上を見せたことを示している。変異体ｐ１１とｐ８はいずれも一次Ｐ４１０Ｌ変異とアミノタグとを含むが、付属変異の数と種類に関して異なっている。変異体ｐ１２（パネルＣ）は、ぼんやりとしたシーケンシングラダーを与えたが、これはおそらく酵素の使用量が十分でなかったか、あるいは熱安定性を低下させるような付属変異が存在したからと考えられる。すべてのレーンにおいて終結産物が認められ、親クローンと比べて４つすべてのｄｄＮＴＰの取り込みが高められていることが示唆される。変異体ｐ１２は、付属変異に加えて一次変異Ａ４８５Ｔを含んでいる。ここで同定されたＪＤＦ−３変異体とは対照的に、親クローンは、プライマー延長（図６）とｄｄＮＴＰ阻害アッセイ（表Ｖ及びＶＩ）のいずれからも証明されるように、ｄｄＧＴＰに対する強い選択性を示した。
【０２８０】
ｉｉ．放射性標識されたプライマーと蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いたシーケンシング
様々なＤＮＡポリメラーゼ及びポリメラーゼ変異体は、ジデオキシヌクレオチドアナログ上のダイ部分に対して様々な程度の識別を示すと思われる。ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体によるダイ標識ジデオキシヌクレオチドアナログの利用を評価した。以下の方法を用いた。
【０２８１】
ａ．プライマー標識
シーケンシングプライマーＳＫをＫＩＮＡＣＥ-ＩＴ（商標）キナージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２００３９０）を用いて放射性標識した。インキュベーション反応系（４０μＬ）は、以下の成分を含んでいた。
【０２８２】
１×      キナーゼバッファ＃１
０．７５  μＣｉ／μＬ  γ−３３Ｐ  ＡＴＰ
０．３７５  μ／μＬ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
２．５  ｐｍｏｌ／μＬ  ＳＫプライマー
反応系を３７℃で４５分間インキュベートした。プライマーをサイズ排除マトリックス（ＮＵＣ  ＴＲＡＰ（登録商標）Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：４００７０１）を用いて遊離のヌクレオチドから精製した。
【０２８３】
ｂ．ダイ標識したジデオキシヌクレオチド：ｄＮＴＰ比
蛍光ジデオキシヌクレオチドはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（ＮＥＮ）より購入した。
【０２８４】
Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ  ＮＥＮカタログ番号：ＮＥＬ−４９０
Ｒ１１０−ｄｄＴＰ  ＮＥＮカタログ番号：ＮＥＬ−４９５
ＴＡＭＲＡ−ｄｄＵＴＰ  ＮＥＮカタログ番号：ＮＥＬ−４７２
ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ  ＮＥＮカタログ番号：ＮＥＬ−４７７
３つの異なる濃度のダイ標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）及び一定量のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ：２．１４μＭ）を用いて取り込みを測定した。
【０２８５】
条件３）１：１  （２．１４μＭ各ｄＮＴＰ：２．１４μＭダイ標識ｄｄＮＴＰ）
条件２）１：０．１  （２．１４μＭ各ｄＮＴＰ：０．２１４μＭダイ標識ｄｄＮＴＰ）
条件１）１：０．０１  （２．１４μＭ各ｄＮＴＰ：０．０２１４μＭダイ標識ｄｄＮＴＰ）
ｃ．ＤＮＡシーケンシング反応混合物の調製
４つのポリメラーゼ、エキソ−ＪＤＦ−３（＃５５０クローン）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（４Ｕ／μＬ）、ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ（補助変異を有するクローンｐ８及びアミノ末端タグ）及びＪＤＦ−３Ｌ４０８Ｈ（クローン１−１）について、ダイ標識ｄｄＮＴＰの利用を調べた。以下の試薬を含む混合物を構成した。
【０２８６】
１３．７μＬ  Ｈ２Ｏ
１μＬ  標識ＳＫプライマー（２ｐｍｏｌ／μＬ）
１μＬ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（０．２μｇ／μＬ）
１μＬ  ポリメラーゼ（〜１．５Ｕ／μＬ）
２μＬ  １０×バッファ（１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を利用するＬ４０８Ｈ以外のすべてに対して反応バッファ１、バッファ（下記参照）
１０×反応バッファ１
２６０ｍＭ  トリスｐＨ９．５
６５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０×１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２バッファ
２４ｍＭ  ＭｇＣｌ２
２６０ｍＭ  トリスｐＨ９．５
２．５μＬの各ダイ標識ｄｄＮＴＰターミネータ（ｄｄＧＴＰ，ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ及びｄｄＧＴＰを４本のチューブの１つに別々に分注した。４．５μＬの各ポリメラーゼ反応系を４本のチューブそれぞれに加え、最終反応体積７μＬとした。
【０２８７】
ｄ．サイクルシーケンシング反応
試料は、Ｈｏｔ  Ｔｏｐアセンブリ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：４００８７０及び４００８９４)を備えたＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６温度サイクラにおいて、以下の条件を用いて循環させた。
【０２８８】
１）９５℃で１分間
２）９５℃で１分間
３）５０℃で１分間
４）７２℃で２分間
５）ステップ２）〜４）を３０回反復
４μＬの停止溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）を各増幅反応系に加えてから、９９℃で５分間加熱した。試料を上述のように６％ＣＡＳＴＡＷＡＹ（商標）ゲル上に電気泳動した。ゲルを乾燥させ、フィルムに７２時間露光した（図７）。
【０２８９】
様々なポリメラーゼクローンによるダイ標識ｄｄＮＴＰの利用を調べるために設計された研究の結果が図７に示されている。クローンｐ８（パネルＣ）及び１−１（パネルＤ）は、Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ及びＲ１１０−ｄｄＧＴＰの取り込みが、親クローン（パネルＡ）に比べて著しく向上していた。この向上は、０．１×（１）及び０．１×（２）ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ／ｄｄＮＴＰ比でシーケンシングラダーを合成することによって証明された。ｄｄＴＴＰ及びｄｄＣＴＰの取り込みの向上を実現するために、反応条件及び／またはダイ部分の最適化を行ってもよい。
【０２９０】
ｉｉｉ．二重変異エキソ−ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼによるシーケンシング
残基４０８，４１０及び４８５における変化が、ｄｄＮＴＰ取り込みを向上するのに十分であるかどうかを確認するために、個々の変異を部位特異的突然変異誘発により親５５０（ＪＤＦ−３エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ）クローンに導入した。さらに、点変異を組み合わせて、単一の変異をもつポリメラーゼに比べてジデオキシヌクレオチド取り込みを向上させるかどうかについて調べた。
【０２９１】
１×反応バッファ、０．１５ｐｍｏｌ／μＬロング２０プライマー、及び１０ｎｇ／μｇ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳからなるＤＮＡシーケンシング反応系を以下のようにして調製した。
【０２９２】
８１μＬ  Ｈ２Ｏ
９μＬ  −２０ロングプライマー（２ｐｍｏｌ／μＬ）
６μＬ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（０．２μｇ／μＬ）
＊＊μＬポリメラーゼ
１２μＬ１０×バッファ（２６０ｍＭ  トリスｐＨ９．５，６５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）
上記一覧に示した１８μＬのカクテルを、適当な数のチューブ（ポリメラーゼにつき１本）に等分した。各ポリメラーゼ（２μＬ）をカクテルのアリコートに加え、チューブをよく混合した。得られたそれぞれのポリメラーゼ混合物（４．５μＬ）を、予め０．０６ｍＭの４つの−３３Ｐ−ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＧＴＰまたはｄｄＴＴＰ；１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；４５０μＣｉ／ｍＬ）のうちの１つと、６ｍＭの各デオキシヌクレオチドを２．５μＬの体積中に含む、４本のチューブのそれぞれに加えた。
【０２９３】
シーケンシング反応は、Ｈｏｔ  Ｔｏｐアセンブリを備えたＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６温度サイクラにおいて、以下の条件を用いて循環させた。
【０２９４】
１）９５℃で１分間
２）９５℃で４５秒間
３）６０℃で４５秒間
４）７２℃で１．５分間
５）ステップ２）〜４）を３０回反復
停止溶液（μＬ；９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）を各反応系に加えてから、９９℃で５分間加熱した。各試料（４μＬ）を６％アクリルアミド変性ＣＡＳＴＡＷＡＹゲル上にローディングした。ゲルを泳動し、前述のように処理した。
【０２９５】
図８は、Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ二重変異体が、並外れて均等なシグナルを示すことを示している。バンドの均一性は、変異体ｐ８（Ｐ４１０Ｌ変異＋Ａ４８５Ｔを含まない付属変異）及び変異体Ａ４８５Ｔ（データ示さず）に比べて向上していた。変異体ｐ８は、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＣＴＰを配列依存的に選択的に取り込む傾向を示した。酵素の最適量は、本実験において試験した量よりも高くしてもよい。市販のファミリーＡのＤＮＡポリメラーゼ変異体、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅによって生じる配列をパネルＥに示した。
【０２９６】
ｉｖ．ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体によるリボヌクレオチド取り込み
一本鎖ＤＮＡ鋳型にアニールしたプライマーを、変異体及び原体ポリメラーゼを用いて、すべてのリボヌクレオチドまたはすべてのデオキシヌクレオチドを含有する混合物中で延長した。
【０２９７】
混合物を９５℃に加熱し、室温でゆっくりと冷却することにより、Ｍ１３ｍｐ１８＋一本鎖ＤＮＡを９５×モル過剰の３８マープライマーにアニールした。
【０２９８】
３８マープライマー：
５’ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’
非最大レベルでの取り込み活性を調べるために酵素のどの程度の希釈が必要であるかを決定するために、予備アッセイを行った。最終アッセイ溶液は、以下の組成とした。
【０２９９】
リボヌクレオチド混合物
２０ｎｇ／μＬ  アニールされるプライマー／鋳型
１×  クローン化Ｐｆｕバッファ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２００５３２）
２００μＭ  各ＧＴＰ，ＵＴＰ，ＡＴＰ
５０μＭ  ＣＴＰ
１μＭ  ５−３Ｈ  ＣＴＰ２０．２Ｃｉ／ミリモル
０．０５〜０．３ユニット  ＪＤＦ−３ポリメラーゼ＊
デオキシリボヌクレオチド混合物
２０ｎｇ／μＬ  アニールされるプライマー鋳型
１×  クローン化Ｐｆｕバッファ
２００μＭ  各ｄＧＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ
５０μＭ  ＴＴＰ（デオキシリボヌクレオチド）
１μＭ  チミジン５’−三リン酸、［メチル−３Ｈ］２０．５Ｃｉ／ミリモル
０．０５〜０．３ユニット  ＪＤＦ−３ポリメラーゼ＊
＊別々に添加
９マイクロリットルのポリメラーゼを含まない混合物を０．２ｍＬのチューブに入れてから、ポリメラーゼを加えた。試料は、Ｈｏｔ  Ｔｏｐアセンブリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：４００８７０及び４００８９４）を備えたＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）９６温度サイクラー中７２℃でインキュベートした。２分後にデオキシリボヌクレオチド混合物を取り出し、約２℃においた。リボヌクレオチド混合物は３０分間インキュベートした。７マイクロリットルのアッセイ混合物を円形のＤＥ８１フィルタ（Ｗｈａｔｍａｎｎ）にスポッティングし、乾燥させてから、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ，０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）中で各回５分間ずつ３回洗浄した。フィルタをエタノール中で２回リンスし、乾燥させてからシンチレーションカウンタで定量化した。
【０３００】
デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド反応系に対するバックグラウンドの１分あたりのカウント数（ＣＰＭ）を、各酵素に対する同一の二重試料のそれぞれの平均ＣＰＭ値から引いた。バックグラウンドで補正したリボヌクレオチドＣＰＭ値を、バックグラウンドで補正したデオキシリボヌクレオチドＣＰＭ値で割った（図９）。
【０３０１】
ポリメラーゼ            ＮＴＰ／ｄＮＴＰ比        ＪＤＦ−３に対する
５５０
ＪＤＦ-３  ５５０        ０．０００１６５１６２          １
ＪＤＦ-３  Ｌ４０８Ｈ    ０．０４１０８７２５８      ２４９
ＪＤＦ-３  Ｌ４０８Ｆ    ０．０５１７０３９２４      ３１３
ＪＤＦ-３  ＡＬ４８５Ｔ  ０．００７６２８５８３        ４６
ｖ．ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を用いてリボヌクレオチドシーケンシング
デオキシリボヌクレオチドポリマーに取り込まれたリボヌクレオチドは、ポリマー長のサブ集団を与えうるアルカリ加水分解を受けやすい。標識したプライマーを特定のリボヌクレオチド塩基（例えばＡＴＰ）及び４つのデオキシリボヌクレオチド塩基の存在下で延長すると、アルカリ加水分解によって得られる断片が、ＡＴＰが取り込まれた可能性のある位置のすべてに対応する、異なる長さの集団を形成する。これらの断片を大きさによって分けると、他のリボヌクレオチド塩基（ＣＴＰ，ＵＴＰ及びＧＴＰ）加水分解産物に関する、それらの移動パターンによって、鋳型配列の読みとりを行うことができる。前述したように、殆どのＤＮＡポリメラーゼは非従来型デオキシヌクレオチドに対する区別を行う。非従来型ジデオキシヌクレオチドの取り込みが向上したＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異体のサブセットもまた、リボヌクレオチド取り込みに対して耐性が高められている。
【０３０２】
１００ｎｇの３８マープライマーを、ＫＩＮＡＣＥ-ＩＴ（商標）キナージングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：３００３９０）中の指示に従って、γ−３３Ｐを用いてキナーゼ処理した。
【０３０３】
３８マープライマー：
５’ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’
１０Ｔ．１Ｅ（１０ｍＭ  トリスｐＨ８．０，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、ＮＵＣＴＲＡＰ（登録商標）プローブ精製カラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：４００７０１）を用いて、混入している遊離のヌクレオチドから標識オリゴヌクレオチドを精製した。０．３２ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下で９５℃に加熱してから室温に冷却することにより、標識したオリゴヌクレオチド（〜７ピコモル）を０．０９ピコモルのＭ１３ｍｐ１８＋にアニールした。
【０３０４】
延長成分
０．０５４  ｐＭ  アニールされるプライマー／鋳型
２００μＭ  各ｄＮＴＰ
１×ｃＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼバッファ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：２００５３２）
４〜２００  ＡＴＰ＊
０．１〜５ユニット  ＪＤＦ−３ポリメラーゼ＊
＊別個に添加
上記最初の３つの成分を含む８マイクロリットルのカクテルを、０．２ｍＬチューブに等分した。１μＬのポリメラーゼと１μＬの２ｍＭ、０．２ｍＭ、または０．４ｍＭ  ＡＴＰを加え、反応系を７２℃で１５分間インキュベートした。１×ｃＰｆｕポリメラーゼバッファを用いて反応体積を１００μＬにし、１．５ｍＬチューブに移した。反応系を７０ｍＭ  ＮａＯＨの存在下、１００℃で１５分間加熱した後、反応系は７０ｍＭ  ＨＣｌで中和し、１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム及び３２７．５μＬのエタノールを加えることにより沈殿させた。試料を１４ｋｒｐｍで３０分間微量遠心分離してから、上清を除去し、ペレットを８０％エタノールで洗浄した。真空乾燥後、試料を５μＬのシーケンシング停止溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）中に再懸濁し、２．５μＬを６％アシルアミド−７Ｍ尿素、１×ＴＢＥ  ＣＡＳＴＡＷＡＹ（商標）プレキャストゲル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号：４０１０９０及び４０１０９４）上にローディングした。ゲルはブロモフェノールブルー染料がゲルの底部を通過するまで５０ワットで泳動し、その後ゲルを固定し、乾燥し、７２時間フィルムに露光した。
【０３０５】
ＪＤＦ−３  ５５０（野生型ヌクレオチド取り込み）及び試験したすべての変異体に対するシーケンシングラダーは、２００μＭ及び２０μＭのＡＴＰレベルにおいて視認できた。４μＭのレベルにおいて、Ｌ４０８Ｈ及びＬ４０８Ｆ変異体のみが、ラダーを生み出した（データ示さず）。
【０３０６】
ｖｉ．ｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチドターミネータによるシーケンシング
プライマーはＦＡＭｄｄＣＴＰ（ＮＥＮＮＥＬ４８１）の存在下で延長させた。シーケンス反応系を精製し、ＡＢＩ３７０上で泳動した。
【０３０７】
サイクルシーケンシングのための反応条件は以下の通りである。
【０３０８】
１×ｃＰＦＵバッファ、２００ｎｇ  ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳプラスミド、３ピコモルＴ７プライマー、０．２３ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．２３ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２３ｍＭ  ｄＴＴＰ、０．２３ｍＭ  ｄＧＴＰ、ならびに０．０４６ｍＭ  ＦＡＭ  ｄｄＣＴＰ。試料に対して、１０μＬ体積中、Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒサイクラーにおいて、下記の温度と時間のサイクルを２５回行った。
【０３０９】
９５℃  ３０秒間
５５℃  ３０秒間
７２℃  ２分間
試料は製造業者の指示に従って、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐを用いて精製した。乾燥後、試料を６６．７％脱イオンホルムアミド、１６．７ｍｇ／ｍＬブルーデキストラン、及び８．３ｍＭＥＤＴＡからなる３μＬのローディング染料中に再懸濁した。試料を９５℃で３分間加熱し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシーケンサー中、５％ＬｏｎｇＲａｎｇｅｎゲル上にローディングした。
【０３１０】
データはＧｅｎｅ  Ｓｃａｎ２．１において処理した。
【０３１１】
実施例２
ＤＮＡの標識
本発明の修飾ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡのラベリングにも応用することができる。当業者には、放射性標識ヌクレオチドの取り込みを含めて、ＤＮＡを標識するためのいくつかの手段があることが知られている。そのような一般的な手段の１つとして、典型的には約５０〜１０００塩基長の標識されたＤＮＡ断片を生成することを可能にするランダムプライミングがある。本明細書中に記載する手順は、Ｆ.Ａｕｓｕｂｅｌら、Ａｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ,Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ,Ｉｎｃ.,１９９５に準じたものである。
【０３１２】
ＤＮＡランダムプライミングに向けての第１の工程として、２．５マイクロリットルの０．５ｍＭ  ３ｄＮＴＰ（ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ＴＴＰ、それぞれ０．５ｍＭ）、５０μＣｉ［−３２Ｐ］ｄＡＴＰ、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中１マイクロリットルの３〜８ユニット／マイクロリットルＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、０．０５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含む反応混合物を全体積が１１マイクロリットルとなるように調製し、氷上でインキュベートした。次に、約３０〜１００ｇのＤＮＡを約１〜５μｇのランダムヘキサヌクレオチドと１４ミリリットル中で混合し、２〜３分煮沸し、氷上に置いた。１１マイクロリットルの反応混合液をＤＮＡ／ランダムヘキサマー混合液中に加え、ランダムプライミング反応系を１０分間から最長でも４時間かけて室温でインキュベートした。反応を停止するために、１マイクロリットルの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、３マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ、及び１００ミリリットルの１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加し、混合液をフェノールで抽出した。その後、標識されたＤＮＡをクロマトグラフィーにより、未取り込みの放射性前駆物質より分離した。
【０３１３】
Ｒ．Ｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチド取り込みに対するゲルアッセイ
標識したオリゴヌクレオチド二本鎖を、ジデオキシヌクレオチドとｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチドの混合物によって延長した。二本鎖を変性２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上で分離すると、ジデオキシヌクレオチドによって終結された標識オリゴヌクレオチドを、ｄｙｅ−デオキシヌクレオチドで終結されたオリゴヌクレオチドから分解することができる。
【０３１４】
オリゴヌクレオチド：
２５９Ｃ  ３２Ｐ−ＴＡＡＣＧＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＡ→
２５８Ｃ  ＴＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＡＴ
２５９Ｃの５’末端は、３２Ｐγ−ＡＴＰを用いたことを除いては、Ｑ．ｉｉ．の項で記載したように標識し、精製した。標識したオリゴヌクレオチオド２５９Ｃは約０．７ｎｇ／μＬの濃度であった。相補的オリゴヌクレオチド（２５８Ｃ）を同濃度で加え、９５℃で３分間、５０℃で５分間、室温で２０分間加熱した。関連する変異体の熱殺傷溶解物は、実施例のＣ．項に記載のようにして調製した。反応系を、３０ｍＭ  トリスｐＨ８．０及び３ｍＭ  ＭｇＣｌ２からなる５μＬ体積中、全体で０．１ｍＭのヌクレオチド混合物とともにインキュベートした。ＦＬＵｄｄＵＴＰまたはＲＯＸｄｄＵＴＰに対するｄｄＴＴＰの比は、１０：１であった。２量体は、１．２ピコモルの濃度で存在しており、０．５μＬの酵素または粗溶解物または精製酵素を反応系に加えてから、Ｈｏｔ  Ｔｏｐを備えたＲｏｂｅＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ９６温度サイクラー中、５０℃でインキュベートした。試料を２０秒間インキュベートしてから、３μＬのホルムアミドをベースとするローディング染料を加え、試料を９５℃で３分間熱変性させた後、２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上にローディングし、一定の６０ワットにて電気泳動した。ゲルをＸ線フィルムに露光し、フィルムをＥａｇｌｅＥｙｅ（登録商標）Ｅｅａｇｌｅ  Ｓｉｇｈｔソフトウェアパッケージにおいて分析した。
【０３１５】
実施例３
本発明の修飾ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡ分子の所定の位置にあるヌクレオチドを、例えばミニシーケンシングによって、同定するためにも応用することができる。例えば、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼＰ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ変異体（ＪＤＦ−３  Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ／Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ）は、低ｄｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ比（１／１００）を用いて最長かつ最も均一な放射性ＤＮＡシーケンシングラダーを発生し、このことは、効率的なｄｄＮＴＰ取り込み、最小の塩基選択性、及び高いポリメラーゼ活性を示している。本例では、このＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼＰ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ変異体の特性、及び変異ポリメラーゼを用いたミニシーケンシングに対する条件を最適化する手順について記載する。
【０３１６】
Ａ．実験プロトコール
ｉ．材料
ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＰＣＲカラム、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＤＮＡゲル抽出カラム、冷ｄｄＮＴＰ、子牛アルカリホスファターゼ及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製のものを用いた。ローダミン標識ｄｄＮＴＰは、ＮＥＮより購入した。ＥＤＴＡ／ブルーデキストラン、ローダミン染料−マトリックス標準、及びＳＮａＰｓｈｏｔ  ｄｄＮＴＰプライマー延長キットは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより購入した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＴａｑＦ６６７Ｙ変異体）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のものを用いた。Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒポリアクリルアミドゲル（６％）はＢＭＡより購入した。エビアルカリホスファターゼ及びエキソヌクレアーゼＩは、ＵＳＢ社製のものを用いた。ＣＥＮＴＲＩ-ＳＥＰスピンカラムは、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓより購入した。脱イオン化ホルムアミドは、Ｓｉｇｍａ社製のものを用いた。表ＶＩＩに配列が挙げられているオリゴヌクレオチド（ＰＡＧＥ精製済）は、Ｇｅｎｓｅｔ  ｏｌｉｇｏｓより購入した。他のすべての試薬は分子生物学グレードのものを用いた。
【０３１７】
ｉｉ．プライマー：鋳型形成
二本鎖のプライマー鋳型対は、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶液中で、９５℃５分間、室温までゆっくり冷却という温度レジメを用いて鋳型を１０倍過剰の適当なプライマーとアニーリングすることによって形成した。プライマー：鋳型の濃度は、一本鎖鋳型のモルとして表される。
【０３１８】
ｉｉｉ．産物の分析
ダイ標識した産物を６％ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で分解し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７７ＤＮＡシーケンサ上で、３．１．２ＧｅｎｅＳｃａｎ断片分析ソフトウェアを用いて、ピーク同定及び蛍光測定のために可視化した。ローダミン染料マトリックスを製造業者のプロトコールに従ってＡＢＩ３７７シーケンサ上にインストールした。
【表１７】
2005512560.tif 000029
【０３１９】
ｉｖ．ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５ＴＤＮＡポリメラーゼの精製と最適な反応バッファ
ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５ＴをＸＬ−１０  Ｇｏｌｄ中で発現させ、上記Ｂｒａｄ  Ｓｃｏｔｔによる「ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ変異体の精製」Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔにおいて記載したようにして精製した。１ユニットの酵素とは、７２℃、３０分間以内に全１０ナノモルのヌクレオチドを酸不溶状態に取り込むことを触媒する量として定義される。ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔに対する１０×反応バッファは、２００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する。
【０３２０】
ｖ．酵素アッセイ
ａ．ローダミン標識−ｄｄＮＴＰ取り込み及び誤取り込みの速度論的分析
ローダミン標識−ｄｄＮＴＰ取り込みに対するＫｍ及びＶｍａｘ値は、５０ｍＭのプライマー：鋳型を、限界量のポリメラーゼ（０．１ユニットまたは５ｎＭ）とともにインキュベートし、ローダミン標識−ｄｄＮＴＰの濃度を０．１ｎＭから５００ｎＭの範囲で変化させることによって測定した。試料は６０℃で１０分間インキュベートした。その後、反応を氷冷０．２ＭＥＤＴＡ（最終濃度）を用いて停止した。ＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰスピンカラム上で延長されたプライマー：鋳型を精製することにより、取り込まれなかったローダミン標識ｄｄＮＴＰを除去した。次に反応系を乾燥させ、ペレットを３：１ホルムアミド：ＥＤＴＡ／ブルーデキストラン中に溶解し、ＡＢＩ３７７シーケンサ上で６％変性ＰＡＧＥにより解析した。３．１．２ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアを用いてすべてのピーク領域の定量化を実施し、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ-Ｂｕｒｋプロットを用いてＫｍ及びＶｍａｘ値を算出した。
【０３２１】
プライマー：鋳型に対するＫｍ及びＶｍａｘ値は、１００ｎＭのＲ１１０−ｄｄＧＴＰと０．５〜１００ｎＭの範囲の様々な濃度のプライマー：鋳型（ｐＢＬ３１Ｇ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）の存在下で、限界量の酵素（０．１ユニットまたは５ｎＭ）を用いて測定した。試料は６０℃で１０分間インキュベートした。その後、反応を停止し、取り込まれなかったローダミン標識−ｄｄＮＴＰから精製し、上述のように解析した。
【０３２２】
誤挿入の速度論を判定するために、限界量の酵素（０．１ユニットまたは５ｎＭ）を、５０ｎＭのプライマー：鋳型と様々な濃度の非相補的ローダミン標識ｄｄＮＴＰ（１ｎＭ〜１０，０００ｎＭ）の存在下、６０℃で１０分間インキュベートすることにより、定常状態Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ-ＭｅｎｔｅｎＫｍ及びＶｍａｘパラメータを算出した。
【０３２３】
ｂ．  フィデリティのスクリーニング
反応（１０μＬ）は１×反応バッファ中に１ユニットの酵素、１５ｎＭプライマー鋳型、２５ｎＭの非標識相補的ｄｄＮＴＰ、及び２５，１００，５００または１０００ｎＭのローダミン標識非相補的ｄｄＮＴＰとを４つの異なる反応系に含むものとした。反応系をＰｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ９６００中で、９６℃１０秒→５０℃５秒→６０℃３０秒を１サイクルとして２５サイクルにわたってインキュベートした。次に氷冷０．２ＭＥＤＴＡ（最終濃度）で反応を停止し、取り込まれなかったローダミン標識ｄｄＮＴＰから産物を精製し、上述のように解析した。
【０３２４】
ｃ．ローダミン標識ｄｄＮＴＰ取り込みについてのアッセイ
これらの実験は、１ユニットの酵素と、１５ｍＭプライマー：鋳型と（４つの別個の反応系中にｐＢＬ２５Ｃ及びＴｅｍｐ−Ａ、Ｔｅｍｐ−Ｔ、Ｔｅｍｐ−Ｃ、またはＴｅｍｐ−Ｇ）、５０ｎＭｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ（ＴＡＭＲＡ−またはＲ１１０−標識）とを用いて実施した。反応系を６０℃で１０分間インキュベートした後、氷冷０．２ＭＥＤＴＡ（最終濃度）で反応を停止し、取り込まれなかったローダミン標識ｄｄＮＴＰから産物を精製し、上述のように解析した。
【０３２５】
Ｂ．最適化手順：
ｉ．ミニシーケンシング用ＤＮＡ鋳型の調製
インサートのＳＮＰを含む断片を標準的なＰＣＲ条件を用いてゲノムＤＮＡから増幅する。この研究では、ＰＣＲ反応を、２．５ユニットのＴａｑＰｌｕｓ  ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼブレンドを用いて実施した。ヒトα−１−抗トリプシン遺伝子の４ｋｂ断片を、１０ｐｍｏｌのｐＰＣ２６Ｇ及びｐＰＣ２９Ｃプライマー（表ＶＩＩ）を用いて、１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡから増幅した。Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒにおいて以下のプログラムを用いた。９５℃２分間を１サイクル、９５℃１分間、５８℃１分間、及び７２℃４分間を３０サイクル、続いて７２℃７分間を１サイクル。
【０３２６】
得られた４ｋｂ断片をＰＣＲプライマー及び未取り込みのｄＮＴＰから精製するために、断片を（１）ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ  ＤＮＡゲル抽出キットを用いて精製するか、（２）ｅｘｏＩ／ＳＡＰで処理するか、あるいは（３）ＳｔｒａｔａＰｒｅｐカラム上でＳＡＰまたはＣＩＡＰとともにインキュベートすることができる。ＰＣＲ断片をｅｘｏＩ／ＳＡＰで処理するためには、２ユニットの各酵素を４μＬのＰＣＲ産物に加え、混合物を３７℃で１時間インキュベートし、その後７２℃で１５分間インキュベートして酵素を不活性化した。ＰＣＲ増幅された断片をＳｔｒａｔａＰｒｅｐカラムを用いて精製するために、５０μＬのＰＣＲ反応物をＳｔｒａｔａＰｒｅｐカラムにローディングし、溶出前に５０μＬの１×対応する反応バッファ中の１ユニットのＣＩＡＰをカラムに添加したことを除いてはＳｔｒａｔａＰｒｅｐカラムマニュアルに記載のようにして処理した。カラムを室温で５分間インキュベートし、ＰＣＲ断片をマニュアルに記載されているようにして溶出した。溶出液を７２℃で１５分間インキュベートして、残存するすべてのＣＩＡＰを不活性化した。これらの全クリーンアップ方法によって、続くミニシーケンシング用として十分な純度のＤＮＡ鋳型が製造された。
【０３２７】
ｉｉ．プラスミドまたはＰＣＲ増幅された断片を用いたミニシーケンシングプロトコール
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（０．２５ｐｍｏｌ）のミニシーケンシングは、０．１５ｐｍｏｌの各プライマー（例えば、ｐＢＬ２５Ｃ）、１ユニットの酵素、０．０４μＭのＲ６Ｇ−ｄｄＡ、Ｒ１１０−ｄｄＧ、及びＲＯＸ−ｄｄＣ、及び０．２μＭのＴＡＭＲＡ−ｄｄＵを用いて行った。ＰＣＲ増幅された断片を用いる場合には、０．０２ｐｍｏｌ／ｒｘｎと低い鋳型濃度を用いた。すべての反応は１０μＬの体積中で実施した。熱サイクルプログラムは以下のように構成した。Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ９６００において９６℃１０秒間、５０℃５秒間、及び６０℃３０秒間のサイクルを２５サイクル、またはＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒにおいて９６℃５０秒間、５０℃５０秒間、及び６０℃５０秒間のサイクルを２５サイクル。
【０３２８】
標識されたプライマーを未取り込みのｄｙｅ−ｄｄＮＴＰから精製するために、試料をＳＡＰまたはＣＩＡＰのいずれかによって処理するか、あるいはＣＥＮＴＲＩ-ＳＥＰカラムを用いて業者の推奨に従って精製した。１ユニットのＣＩＡＰまたは０．５ユニットのＳＡＰを各１０μＬの反応系に添加し、３７℃で６０分間インキュベートした後、７２℃で１５分間インキュベートしてアルカリホスファターゼを不活性化した。反応系を乾燥させ、ペレットを１０μＬの３：１ホルムアミド：ＥＤＴＡ／ブルーデキストリン中に溶解した。１μＬの各反応系をＡＢＩ３７７シーケンサー上にて６％変性ＰＡＧＥによって分解し、ＧｅｎｅＳｃａｎ３．１．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。
【０３２９】
Ｃ．結果
ｉ．バッファ及び反応温度の最適化
ＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓＪＤＦ−３種のＤＮＡポリメラーゼが、古細菌Ｐ.ｆｕｒｉｏｓｕｓのＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）と密接に関係しているため、クローン化Ｐｆｕバッファ（１０×バッファ：２００ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、及び１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）をバッファ最適化の出発点として用いた。バッファ及び反応温度変化による酵素活性の変化は、ｐＢＬ３４Ａ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプライマー：鋳型の系を用いてＲ６Ｇ−ｄｄＡＴＰを測定することによって決定した。このバッファ中にＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＢＳＡが存在すると、シーケンシングゲル中に人工産物（二重バンド効果）を生み出すことが判明した（データ示さず）。酵素活性は、それぞれ様々な濃度のＫＣｌ（２０，４０または８０ｍＭ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５または２０ｍＭ）、及びＭｇＳＯ４（４または８ｍＭ）の存在下、ｐＨ８．４及び９．５にて測定した。これらの変化のいずれもＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔの活性に顕著な影響を与えなかった。したがって、ＢＳＡ及びＴｒｉｔｏｎを含まないクローン化Ｐｆｕバッファが、ミニシーケンシングにとって最適の反応バッファであると同定された。さらに、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔの活性対温度プロファイルから、ヌクレオチド組み込みは６０℃〜７２℃において有意に増大しないことが分かった（データ示さず）。延長温度をミニシーケンシングプライマーの融点未満に保つために、後続のすべての実験は６０℃で実施した。
【０３３０】
ｉｉ．ローダミン−ジデオキシリボヌクレオチドの取り込み
ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ及びＴａｑＦ６６７Ｙ変異体によるローダミン標識−ｄｄＮＴＰの相対取り込みを決定した。我々はＴＡＭＲＡ−及びＲ１１０−標識ｄｄＮＴＰの両方を用い、取り込まれたｄｙｅ−ｄｄＮＴＰの量をフルオレセインユニットとして測定した。これらの実験は、プライマーとしてｐＢＬ２５Ｃ、相補的鋳型としてＴｅｍｐ−Ａ，Ｔｅｍｐ−Ｔ，Ｔｅｍｐ−ＣまたはＴｅｍｐ−Ｇを４つの別個の反応系中で用いて実施した。これらの４つのプライマー：鋳型系の間での唯一の違いは、ＳＮＰ部位であり、これにより当該プライマー：鋳型配列がｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ取り込みに効果をもつ可能性を評価することができる。図１６のパネルＢは、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５ＴがＴＡＭＲＡ−ｄｄＧＴＰ及びＴＡＭＲＡ−ｄｄＣＴＰを、ＴＡＭＲＡ−ｄｄＡＴＰ及びＴＡＭＲＡ−ｄｄＵＴＰに比べてわずかに効率良く取り込むことを示している。Ｒ１１０標識したｄｄＮＴＰを用いた場合、ｄｄＣＴＰ及びｄｄＧＴＰもまた、ｄｄＡＴＰとｄｄＵＴＰよりも効率よく取り込まれる（図１６パネルＡ）。ＧａｒｄｎｅｒとＪａｃｋは、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓに由来）１５のＡ４８８Ｌ変異体（ＪＤＦ−３Ａ４８５と等価）によるリボヌクレオチドの取り込みにおける変化も観察している。実際に、ＶｅｎｔＡ４８８Ｌ変異体は、ＵＭＰをＣＭＰ，ＧＭＰ及びＡＭＰよりも１０倍も低い効率でしか取り込まず、野生型ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼは、ｄＵＭＰ取り込みい対して同等の偏りを示した。
【０３３１】
我々は同じユニット数のＴａｑＦ６６７Ｙを用いて、同様のローダミン標識−ｄｄＮＴＰ取り込み実験を行った。図１６のパネルＡ及びＢに示したように、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ及びＴａｑＦ６６７Ｙ変異体は、類似したＴＡＭＲＡ−及びＲ１１０−ｄｄＮＴＰ取り込み効率と限られた（３倍未満）の塩基選択性（選択性の順序はＧ＞Ｃ＞Ａ＞Ｔ）を示した。
【０３３２】
ｉｉｉ．重合反応に対する速度論的パラメータ
プライマー：鋳型及びローダミン−ｄｄＮＴＰに対するＫｍ及びＶｍａｘ値は、実験プロトコールに記載のようにして決定した。これらの値は表ＶＩＩＩに報告する。この表ではＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５ＴとＴａｑＦ６６７Ｙの速度論的特性を比較している。この比較により、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５ＴとＴａｑＦ６６７変異体とが類似した定常状態速度論的パラメータを示し、したがって、プライマー：鋳型及びローダミン−ｄｄＮＴＰ基質の両方に対して類似のアフィニティを有することが確立された。
【０３３３】
さらに、表ＶＩＩＩ中の速度論的パラメータを用いて、ＴＡＭＲＡ−ｄｄＡＴＰ（Ｖｍａｘ／Ｋｍ＝１．９／０．９＝２．１）と比較してのＴＡＭＲＡ−ｄｄＣＴＰ（Ｖｍａｘ／Ｋｍ＝３．３／１＝３．３）の取り込み効率を求めた。ＴＡＭＲＡ−ｄｄＣＴＰの取り込み効率がＴＡＭＲＡ−ｄｄＡＴＰの１．５倍であることは、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ変異体が異なるｄｄＮＴＰをわずかに異なる速度で取り込むことを示唆し、図１６で得られた結果の確証となる。
【表１８】
2005512560.tif 000030
【０３３４】
ｉｉｉ．フィデリティ
フィデリティは、増加量の非相補的ヌクレオチドの存在下において、ＤＮＡポリメラーゼが正確なヌクレオチドを取り込む傾向として決定した。これらのアッセイでは、実験プロトコールのなかで記載したように、一定量のプライマー：鋳型、非標識相補的ｄｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼ、及び様々な濃度のローダミン標識非相補的ｄｄＮＴＰを用いた。誤延長されたプライマーの量を、ローダミン標識された誤ったｄｄＮＴＰ／非標識の正しいｄｄＮＴＰの比に対してプロットする（図１８パネルＡ及びＢ）。我々は、すべての可能性のあるミスペアに対して同様のアッセイを行った（表ＩＸ）。
【表１９】
2005512560.tif 000031
【０３３５】
太字で示した２つのミスペアは、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ変異体と比較して、ＴａｑＦ６６７ＹＤＮＡポリメラーゼによってより効率よく形成された。
【０３３６】
ｄｄＴ：ｄＣ及びｄｄＧ：ｄＴの２つのミスペアは、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔと比べて、ＴａｑＦ６６７Ｙ変異体（ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ及びＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ）によって有意に高い頻度で（３〜２０倍）形成された（図１８パネルＡ及びＢ）。他のミスペアは、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ及びＴａｑＦ６６７Ｙに対して、より低い頻度かつ、同等の速度で形成された。
【０３３７】
同様のｄｄＧ：ｄＴミスペア形成速度が、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ（ＴａｑＦ６６７Ｙ変異体：ＡＢＩ）を用いて得られた。ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳは、ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ及び反応バッファ（ＳＮａＰｓｈｏｔキット；ＡＢＩ）を含む混合物の形でしか入手できない。ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳを試験するために、５μＬのＳＮａＰｓｈｏｔキット混合物に０．５ユニットのＳＡＰを加え、３７℃で３０分間及び７２℃で１５分間インキュベートすることにより、ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰを除去した。こうして得られた、ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰを含まない混合物をフィデリティアッセイに用いた。
【０３３８】
このフィデリティの違いが配列特異的でないことを確立するために、我々は２つの他のプライマー：鋳型系（ｐＢＬ２５Ｃ：Ｔｅｍｐ−Ｔ及びｐＰＣ３４Ａ：４ｋｂＰＣＲ増幅断片）を用いて同様の実験を行い、両酵素に対して同様の誤取り込み速度を得た（データ示さず）。我々は、ＴＡＭＲＡ−標識ｄｄＮＴＰを誤ったｄｄＮＴＰとして用いて、同様に誤取り込み速度を得た（データ示さず）。したがって、ＴａｑＦ６６７ＹＤＮＡポリメラーゼによって示されたより低いフィデリティは、配列特異的でもなく、Ｒ１１０ダイの誤取り込みの増加によるものでない。
【０３３９】
フィデリティ低下の機構についての見識を深めるために、我々はミスペアｄｄＧ：ｄＴに対する誤挿入の頻度を決定した。これは誤対正ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰに対する相対Ｋｍ及びＶｍａｘ値に関して評価された。ヌクレオチド誤挿入の効率は、３４−ヌクレオチドオリゴマー（ｐＢＬ３４Ａ）でプライムしたＤＮＡ鋳型ｄＴに対して決定した。見かけのミカエリス定数（Ｋｍ）及び最大速度（Ｖｍａｘ）及び相対挿入頻度をｄｄＡＴＰ及びｄｄＧＴＰについて測定した（表Ｘ）。
【表２０】
2005512560.tif 000032
【０３４０】
表Ｘに示されるように、ｄｄＧ：ｄＴに対するＴａｑＦ６６７Ｙの誤挿入頻度は、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔによって示されるものよりも有意に高い（〜１７倍）。この相違の殆どは、誤ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ：プライマー：鋳型の三重複合体に対するＫｍの違いによるものである。ＴａｑＦ６６７Ｙ変異体は、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ変異体と比べて、ｄＴに対する誤ったヌクレオチド（ｄｄＧＴＰ）に対して７倍低いＫｍ（高い結合アフィニティ）を示した。
【０３４１】
ｉｖ．ミニシーケンシングキットの開発：
ミニシーケンシングとゲル電気泳動とによるＳＮＰ検出には次の５つの主たる工程が含まれている。（ｉ）血液または組織試料からのＤＮＡの抽出；（ｉｉ）ＤＮＰを含むゲノムＤＮＡの特異的断片のＰＣＲ増幅；（ｉｉｉ）未反応のＰＣＲプライマーとｄＮＴＰを除去するためのミニシーケンシング前のＰＣＲ産物の処理；（ｉｖ）ＰＣＲ産物のミニシーケンシングと延長されたプライマーの精製；（ｖ）ゲル電気泳動とＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェア（ＡＢＩ）を用いた蛍光標識プライマーの分析。ここで、我々は工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を最適化し、酵素、反応バッファ、ローダミン標識ｄｄＮＴＰ及び対照プライマー：鋳型系とを含んだミニシーケンシングキットを開発した。
【０３４２】
工程（ｉｉｉ）を最適化するために、我々は、上記実験プロトコールに記載したようにミニシーケンシング前にＰＣＲ産物を未反応のＰＣＲプライマー及びｄＮＴＰから精製するために３つの異なる手法を用いた。ＣＩＡＰ処理を行わずにＳｔｒａｔａＰｒｅｐカラムを用いたＤＮＡ鋳型を精製すると、残留ｄＮＴＰの混入が多くて続くミニシーケンシングを妨害することが分かった。ｄＮＴＰ混入量が微量である場合には、１本の延長されたプライマーの代わりにシーケンシングラダーが生成された（図１８、レーン２）。同様の問題がＱｉａｇｅｎ社のＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製カラムを用いた場合にも観察された（データ示さず）。しかしながら、ＤＩＡＰをＳｔｒａｔａＰｒｅｐカラムに結合したＰＣＲ産物に直接加えることにより、残留ｄＮＴＰが効率的に除去され、熱処理（７２℃で１５分間）後の溶出ＤＮＡが、ミニシーケンシングに適用するのに適したものとなった（図１８、レーン１）。
【０３４３】
ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔミニシーケンシングキットを最適化するために、次の３つの異なるプライマー：鋳型系を用いた。ミニシーケンシングキットは、キット対照として用いられる、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと、プライマーｐＢＬ３４Ａ，ｐＢＬ３１Ｇ，ｐＢＬ２８Ｔ及びｐＢＬ２５Ｃ（表ＶＩＩ）（図２２）；４ｋｂＰＣＲ断片と、プライマーｐＰＣ３７Ａ，ｐＰＣ４１Ｔ，ｐＰＣ２６Ｇ及びｐＰＣ２９Ｃ；及びｐＧＥＭと、４つの対照プライマー（ＡＢＩ＃４３１２１６６）（図１９）を含んでいる。我々のキットプロトコールは、１つの反応系中で４つのローダミン標識ｄｄＮＴＰを利用しているが（実験プロトコールの部を参照のこと）、将来的には、それぞれ異なるローダミン標識−ｄｄＮＴＰ（＋３つの未標識ｄｄＮＴＰ）を用いた４つの別々の反応を実施するという顧客の関心に合わせるようにすることもできる。
【０３４４】
ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ、ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ、プライマー、及び鋳型の濃度は、ＡＢＩ３７７シーケンサによるミニシーケンシング及び蛍光検出に対して最適化した（最適化された条件については実験プロトコールを参照）。酵素、ｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ、及びプライマー：鋳型の濃度を高くすると、蛍光シグナルが増大する。しかしながら、そのようなシグナルの増大はＡＢＩ３７７検出器を飽和し、ダイのブリードスルー（滲み出し：ｂｌｅｅｄ-ｔｈｒｏｕｇｈ）を引き起こすことになる（１つより多い色が１つのスポットを示す）。
【０３４５】
異なるローダミン染料／ｄｄＮＴＰ組み合わせを、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔとともに用いることができる（図２０；Ｒ１１０−ｄｄＧ及びＴＡＭ−ｄｄＵＴＰの代わりにＴＡＭ−ｄｄＧ及びＲ１１０−ｄｄＵ）。しかしながら、実験プロトコール中で提案したようなダイ／塩基組み合わせ（Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ，Ｒ１１０−ｄｄＧＴＰ，ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ，及びＴＡＭＲＡ−ｄｄＵＴＰ）は、３つの異なるプライマー：鋳型セットとともに最大のシグナル均一性を示した。ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔは、ｄｄＵＴＰの取り込みに対して僅かな識別しかしないので（図１６、パネルＡ及びＢ）、ｄｄＵＴＰは他のｄｄＮＴＰの濃度の５倍の濃度で使用する。さらに、以前のデータは、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔが、ローダミン以外の染料（例えば、シアニン染料）を取り込むことができることを示している。プライマー：鋳型配列がｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ取り込みの効率、したがってシグナル均一性にも影響を及ぼすことができると指摘することが絶対に必要である。
【０３４６】
スタンフォードゲノムテクノロジーセンターにおけるＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔのβ−テスティングを、Ｃｙ３−ｄｄＡＴＰ及びＣｙ５−ｄｄＣＴＰ、及びＺｙｏｍｙｓアルデヒドスライド上に固定したプライマーを用いて実施した。
【０３４７】
ミニシーケンシングのためのプライマーの設計時に以下のプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるべきである。（１）ミニシーケンシングによるＳＮＰ変化はプライマーの位置に関して柔軟性がないため、ポジティブ鎖（＋）のアッセイが難しいようであれば、ＤＮＡのネガティブ鎖（−）をプライマー設計のために用いてもよい。（２）４５℃以上の融点を有する１８より長いヌクレオチド長のプライマーを設計する。（３）プライマーに対して、延長可能なヘアピン構造及びプライマー２量体形成について調べる。（４）プライマーはＰＡＧＥ精製すべきである。（５）新しいプライマーを評価する場合には負の対照（ＤＮＡ鋳型を欠失）も泳動すべきである。
【０３４８】
我々は、シグナル強度に影響を及ぼさずに多重化を行うために（１つの反応において、いくつかのプライマーと１つの鋳型）ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５を用いることができるかどうかを調べた。図２０は、同一の鋳型ＤＮＡ中４つのＳＮＰを検出するために４つのプライマーを用いた際に、変化せずに残ったシグナル強度を示したものである。我々はキットを多重化のために最適化してはおらず、この用途が将来のキットの製造においてさらに開発されうることを指摘おかねばならない。
【０３４９】
次に我々は、取り込まれなかったローダミン標識−ｄｄＮＴＰからミニシーケンシング産物を精製するために用いることのできるＳＡＰまたはＣＩＡＰの量を決定した。１０μＬのミニシーケンシング反応系において、０．５ユニットのＳＡＰまたは１ユニットのＣＩＡＰによりすべての未取り込みｄｙｅ−ｄｄＮＴＰが分解された。最適状態の及ばないユニット数のアルカリホスファターゼを用いることにより、未取り込みのｄｙｅ−ｄｄＮＴＰから蛍光シグナルを得ることができ、これによりＳＮＰシグナルのマスキングができた。
【０３５０】
キットサイクル条件の最適化する際に、我々は熱サイクルが産物の収率を高めるかどうかを評価した。図２１に示すように、６０℃または７２℃の延長温度を用いたサイクルでは、酵素活性は有意に変化しなかった。しかしながら、熱サイクルは、６０℃で１０分間の１回のインキュベーションと比較して、ミニシーケンシングのシグナルを高めた。このシグナルの向上は、ＤＮＡ鋳型の濃度がミニシーケンシングプライマーよりもはるかに低い場合に起こると予想される。しかしながら、図２１に示すように、ミニシーケンシングプライマーがＤＮＡ鋳型によって飽和された場合でも、おそらくはミニシーケンシングプライマーがＤＮＡ鋳型にアニーリングする際に２本鎖ＤＮＡの相補鎖と競争するために、熱サイクルはシグナルを高めると思われる。
【０３５１】
図２２は、我々のミニシーケンシングキットの性能を、ＡＢＩ社製ＳＮａＰｓｈｏｔキットと比較して示したものである。我々のミニシーケンシングキットは、ローダミン標識ｄｄＮＴＰを用いているので、産物のバンドを解析するためにはローダミン染料マトリックスをＡＢＩ３７７シーケンサにインストールしなければならない。これに対し、ＳＮａＰｓｈｏｔキットは、ジクロロローダミン標識ｄｄＮＴＰを用いるので、ＳＮａＰｓｈｏｔキットによって生産された産物を解析するためには、ジクロロローダミンマトリックスをインストールした。上で議論したように、我々のキットはＴＡＭＲＡ−ｄｄＣ及びＲＯＸ−ｄｄＵ（ＳＮａＰｓｈｏｔｄｙｅ−ｄｄＮＴＰ）の代わりにＲＯＸ−ｄｄＣ及びＴＡＭＲＡ−ｄｄＵを用いて、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５ＴによるｄｄＵ取り込みを高めている。ＡＢＩは、ＳＮａＰｓｈｏｔ反応において用いられるＡｍｐｌｉＴａｑＦＳまたはジクロロローダミン標識ｄｄＮＴＰの濃度を開示していないため、比較は、同一のプライマー：鋳型量及びそれぞれのキットの推奨プロトコールを用いて簡単に行った。図２２に示すように、我々のキットは、ｄｄＡ及びｄｄＵに比べてｄｄＣ及びｄｄＧに対して相当に低いシグナルを発生したＳＮａＰｓｈｏｔキットと比べて、より均一なシグナルを与える。
【表２１】
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【０３５２】
他の実施形態
他の実施形態は同業者には明らかであろう。上記詳細な説明は明確化のためだけに提供されるものであって、説明的なものにすぎない。本発明の精神及び範囲は、上記実施例には限定されるのではなく、請求項によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０３５３】
【図１】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＪＤＦ−３種のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列（インテイン除去）（配列番号：１）。
【図２】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＪＤＦ−３種のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（インテイン除去）（配列番号：２）。
【図３】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＪＤＦ−３種のＤＮＡポリメラーゼをコードするゲノムクローンのアミノ酸配列（配列番号：３）。翻訳後プロセシングによって取り除かれたインテインの位置が示されている。
【図４】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ＪＤＦ−３種のＤＮＡポリメラーゼをコードするゲノムクローンのＤＮＡ配列（配列番号：４）。５’及び３’の非翻訳領域、ポリメラーゼをコードする領域（エクステイン）、及びインテインをコードする領域に対応するＤＮＡ配列が示されている。
【図５】ＪＤＦ−３変異体によるヌクレオチド取り込みを示す。一次ライブラリースクリーニングにおいて３３Ｐで標識したｄｄＮＴＰを取り込んだλファージクローンを再度スクリーニングして、（パネル１）０．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２または（パネル２）１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２の存在下における３３Ｐ−ｄｄＮＴＰの取り込みを評定した。ポリメラーゼ活性は、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（パネル３）の存在下における３３Ｐ−ｄｄＮＴＰを用いて測定した。ヌクレオチドの利用は、クローン１〜１８及び親＃５５０クローンに対して示した。
【図６】ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を用いて実施した３３Ｐ−ｄｄＮＴＰサイクルシーケンシング反応を示す。精製したＪＤＦ−３をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ放射性標識ターミネータサイクルシーケンシングキットに代入した。ＤＮＡシーケンシングラダーは、以下のポリメラーゼを用いてキットの説明書のとおりに作成した。（Ａ）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｂ）ＪＤＦ−３＃５５０クローン（親）（Ｃ）ＪＤＦ−３Ａ４８５Ｔ変異体（クローンｐ１２）（Ｄ）ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ変異体（クローンｐ１１）（Ｅ）ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ変異体（クローンｐ８）。オリジナルシーケンシングゲルの先頭が側方に示されている。レーンは、下から上へ、ｄｄＧＴＰ，ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰである。クローンｐ８、ｐ１１及びｐ１２は、付属変異とアミノ末端タグとを含んでいる。
【図７】ダイ標識したｄｄＮＴＰ及びＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を用いて実施したサイクルシーケンシング反応を示している。ＤＮＡシーケンシングラダーは、（１）２．１４μＭ  ｄＮＴＰ：０．０２１４μＭ  ｄｄＮＴＰ；（２）２．１４μＭ  ｄＮＴＰ：０．２１４μＭ  ｄｄＮＴＰ；または（３）２．１４μＭ  ｄＮＴＰ：２．１４μＭ  ｄｄＮＴＰを用いて作成した。以下の精製ＤＮＡポリメラーゼを用いた。（Ａ）ＪＤＦ−３＃５５０クローン（親）（Ｂ）Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｃ）ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ変異体（クローンｐ８、付属変異とアミノ末端タグとを含む）（Ｅ）ＪＤＦ−３Ｌ４０８Ｈ変異体（クローン１−１）。オリジナルシーケンシングゲルの先頭が右手側に示されている。
【図８】ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ二重変異体及びα−３３Ｐジデオキシヌクレオチドを用いて行ったサイクルシーケンシング反応を示す。ＤＮＡシーケンシングラダーは、ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ二重変異体を（Ａ）２μＬ（Ｂ）１μＬ（Ｃ）０．５μＬ、ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ変異体（クローンｐ８、付属変異とアミノ末端タグとを含む）（Ｄ）、またはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｅ）を用いて作成した。オリジナルシーケンシングゲルの先頭が左側に示されている。レーンは下から上へ、ｄｄＧＴＰ，ｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰである。
【図９】エキソＪＤＦ−３（５５０）及びこの原体クローンの変異体を用いたリボヌクレオチド取り込みアッセイの結果を示している。デオキシヌクレオチドに対するリボヌクレオチドの取り込み比を、ＪＤＦ−３  ５５０、ＪＤＦ−３  Ｌ４０８Ｈ、ＪＤＦ−３  Ｌ４０８Ｆ及びＪＤＦ−３  Ａ４８５Ｔについてプロットしている。
【図１０】ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼの４つの型及びＦＡＭ  ｄｄＣＴＰによって生成された配列の痕跡を示したものである。パネルＡは、原体ポリメラーゼＪＤＦ−３  ５５０によって生産された微量痕跡を示し、パネルＢは、ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌによって生成された僅かに向上した痕跡を示し、パネルＣは、二重変異体Ｓ３４５Ｐ及びＰ４１０Ｌによって生成された配列を示し、パネルＤはＪＤＦ−３  Ｓ３４５Ｐによって生成された痕跡を示している。
【図１１】パネルＡ中のＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅと、パネルＢ中の二重変異体ＪＤＦ−３  Ｓ３４５Ｐ＋Ｐ４１０Ｌとによって証明されたピーク均一性の相違を示している。
【図１２】ＲＯＸ−ｄｄＵＴＰのジデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ（ＮＥＮ）  ＮＥＬ４７６）またはフルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ（ＮＥＮ  ＮＥＬ４０１）によって標識されたオリゴヌクレオチドの分離３’延長産物を示す。変異体４はＪＤＦ−３  Ｓ３４５Ｐであり、変異体２はＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌであり、変異体３はＪＤＦ−３  Ａ４８５Ｔであり、変異体５はＹ４９６Ｎである。ＦはＦＬＵ  ｄｄＵＴＰを示し、ＲはＲＯＸ  ｄｄＵＴＰを示す。
【図１３】図１２からの相対バンド強度をグラフに示したものである。数値は、ｄｄＴＴＰバンドの強度値を、フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰバンドに対する強度値で割ることによって得られる。
【図１４】ｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチドによって選択されたＪＤＦ−３変異体の配列アライメント（アミノ酸３０１〜４８０）を示したものである。白四角によって強調されている核酸残基が変異の位置を示す。Ｓ３４５Ｐ変異は、変異体２８中に存在する２つの変異のうちの１つである。
【図１５】ｄｙｅ−ジデオキシヌクレオチドによって選択されたＪＤＦ−３変異体の配列アライメント（アミノ酸４８１〜６６０）を示したものである。白四角によって強調されている核酸残基が変異の位置を示す。
【図１６】ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ及びＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔａｑ  Ｆ６６７Ｙ）によるローダミン標識ｄｄＮＴＰの取り込みを示す。ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ及びＴａｑ  Ｆ６６７Ｙ変異体は、それぞれのローダミン標識ｄｄＮＴＰに対して僅かに異なる取り込みを示す。パネルＡ及びＢの反応系は、０．０５ＭのＴＡＭＲＡ標識またはＲ１１０標識ｄｄＮＴＰと、１５ｎＭプライマー：鋳型と、１ユニットの酵素を含むものとした。反応系は実験プロトコールに記載したようにインキュベートした。
【図１７】ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ及びＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔａｑ  Ｆ６６７Ｙ）によるローダミン標識ｄｄＮＴＰの誤挿入。ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔは、特定のｄｄＮＴＰの取り込み時にＴａｑ  Ｆ６６７Ｙに比べて高いフィデリティを示す。パネルＡ及びＢの反応系は、１ユニットのＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５ＴまたはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅのいずれかと、１５ｎＭプライマー：鋳型（パネルＡ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：ｐＢＬ３４Ａ；パネルＢ：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：ｐＢＬ３１Ｇ）と、２５ｎＭの非標識相補的ｄｄＮＴＰ（パネルＡ：ｄｄＡＴＰ；パネルＢ：ｄｄＧＴＰ）及び２５，１００，５００または１０００ｎＭのいずれかのダイ標識非相補的ｄｄＮＴＰ（パネルＡ：Ｒ１１０−ｄｄＧＴＰ；パネルＢ：Ｒ１１０−ｄｄＵＴＰ）を４つの別々の反応中に含むものとした。反応系は実験プロトコールに記載のようにインキュベートし、分析した。パネルＣは、パネルＡのデータを導出したシーケンシングゲルを示す。
【図１８】ミニシーケンシングを実施する前に、ＣＩＡＰ（子牛腸管粘膜由来アルカリホスファターゼ）を補助的に用いたＳｔｒａｔａＰｒｅｐカラム上でＰＣＲ増幅断片をインキュベートして、断片を精製した。１ユニットのＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔを０．０５Ｍ  Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ、０．１５ｐｍｏｌ  ｐＰＣ３７Ａ、及び０．０２ｐｍｏｌのヒトゲノムＤＮＡから増幅された４ｋｂ  ＰＣＲフラグメントの存在下でインキュベートした。ＰＣＲ産物は、実験プロトコールに記載したように、ＣＩＡＰ処理を実施するか（１）実施せず（２）に、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐカラム上で精製した。
【図１９】ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ、及び２つの異なるプライマー：鋳型系を用いたミニシーケンシング。すべての反応系は、１ユニットのＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔと、０．０４ＭのＲ６Ｇ−ｄｄＡ、Ｒ１１０−ｄｄＧ、ＲＯＸ−ｄｄＣ、及び０．２Ｍ  ＴＡＭ−ｄｄＵを１×反応バッファー中に含むのとした。反応系１〜４は、０．４ｐｍｏｌ  ｐＧＥＭ及び１Ｌのｐ２９Ａ，ｐ３８Ｇ，ｐ３４Ｔ，及びｐ４５Ｃ（ＡＢＩ＃４３１２１６６）をそれぞれ含んでいる。反応系５〜８は、０．０２ｐｍｏｌの４ｋｂＰＣＲ産物及び０．１５ｐｍｏｌのｐＰＣ３７Ａ、ｐＰＣ２６Ｇ、ｐＰＣ４１Ｔ、及びｐＰＣ２９Ｃをそれぞれ含んでいる。反応系は実験プロトコールに記載のようにしてインキュベートした。
【図２０】多重化は、ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔによって発生されるシグナル強度に影響を与えない。すべての反応系は、１ユニットのＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔと、０．２５ｐｍｏｌのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと、０．０４ＭのＲ６Ｇ−ｄｄＡ、ＴＡＭ−ｄｄＧ、ＲＯＸ−ｄｄＣ、及び０．２ＭのＲ１１０−ｄｄＵを１×反応バッファ中に含むものとした。反応系１，２，３，４は、それぞれ０．１５ｐｍｏｌのｐＢＬ２５Ｃ、ｐＢＬ２８Ｔ、ｐＢＬ３１Ｇ、及びｐＢＬ３４Ａを含むものとした。反応系５は、０．１５ｐｍｏｌの全部で４つのプライマーを含むものとした。反応系は実験プロトコールに記載のようにしてインキュベートした。
【図２１】熱サイクルによって、ミニシーケンシングのシグナルは著しく高められる。５つの別個の反応系において、１ユニットのＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔを１５ｎＭ  ｐＢＬ２５Ｃ，１００ｎＭ  ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ、及び０．１，１，５，１０または５０ｎＭのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの存在下でインキュベートした。インキュベーションは、Ｐａｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ９６００を用いて、９６℃２分間、５０℃１分間、及び６０℃１０分間の１サイクル、もしくは、９６℃１０秒間、５０℃５秒間、６０℃または７２℃３０秒間のサイクルを２５サイクル繰り返して行った。反応系は、ＳＡＰ処理を用いて未取り込みのＲＯＸ−ｄｄＣＴＰから精製し、産物を実験プロトコールに記載のようにして分析、定量化した。
【図２２】ＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔを含む我々のミニシーケンシングキットと、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＮａＰｓｈｏｔキットとの性能の比較をしたものである。（Ａ）ミニシーケンシング反応は、１ユニットのＪＤＦ−３  Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔと、０．２５ｐｍｏｌのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔと、０．０４ＭのＲ６Ｇ−ｄｄＡ、Ｒ１１０−ｄｄＧ、及びＲＯＸ−ｄｄＣ、０．２Ｍ  ＴＡＭＲＡ−ｄｄＵ、及び０．１５ｐｍｏｌ  ｐＢＬ３４Ａ、ｐＢＬ３１Ｇ、ｐＢＬ２５Ｃ、またはｐＢＬ２８Ｔをそれぞれ４つの別個の反応系に含むものとした。実験プロトコールに記載したようにして、反応系をインキュベートし、精製し、分析した（ローダミンマトリックスを用いて）。（Ｂ）ＳＮａＰｓｈｏｔキットを上記と同一量のプライマー：鋳型とともに用いた。このキットは、ジクロロ−ローダミン標識されたｄｄＮＴＰを用いるので、対応するバンドの分析のためにジクロロ−ローダミンマトリックスをインストールした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
2005512560.tif 000042
【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005512560.tif 000049
【図１０】
2005512560.tif 000050
【図１１】
2005512560.tif 000051
【図１２】
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【図１３】
2005512560.tif 000053
【図１４】
2005512560.tif 000054
【図１４−１】
2005512560.tif 000055
【図１５】
2005512560.tif 000056
【図１５−１】
2005512560.tif 000057
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2005512560.tif 000060
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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