(57)【要約】本発明は、Ｃ−末端側の酸性領域（ＡＴＳ）のアミノ酸配列のなかで少なくとも１０固以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチドに関するもので、ペプチドの本質的な性質は保存しながらもそのペプチドに結合する融合の相手方となる蛋白質に環境ストレス耐性を付与することができる。また、本発明は、前記ペプチドを融合の相手方となる蛋白質に結合してなる融合蛋白質、前記融合蛋白質をコード化するヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド配列を含む組換えベクター、及び前記組換えベクターで形質転換又はトランスフェクションされた細胞に係る。また、本発明は、化学合成又は遺伝子組換えにより、前記環境ストレス耐性を付与するペプチド又は環境ストレス耐性融合蛋白質を製造する方法に関するものである。
2005517389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域のアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続アミノする酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含む環境ストレス耐性を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドがシヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域を含有する請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項２において、前記シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域が、α−シヌクレインのアミノ酸残基９６−１４０、β−シヌクレインのアミノ酸残基８５−１３４、γ−シヌクレインのアミノ酸残基９６−１２７、並びにシノレチンのアミノ酸残基９６−１２７から選択される請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
前記シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域が、α−シヌクレインのアミノ酸残基１０３−１１５、アミノ酸残基１１４−１２６、アミノ酸残基１１９−１４０及びアミノ酸残基１３０−１４０からなる群から選択される請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記シヌクレインファミリーが、α−シヌクレイン、β−シヌクレイン、γ−シヌクレイン及びシノレチンからなる群から選択される請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項６】
前記シヌクレインがヒト由来のものである請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
前記環境ストレスが、熱、ｐＨ又は金属である請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドと融合の相手方となる蛋白質の融合蛋白質。
【請求項１０】
前記ペプチドが、前記融合の相手方となる蛋白質の本質的な性質に影響を与えないアミノ酸残基の位置で結合している請求項９に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
前記アミノ酸残基の位置が、前記融合の相手方となる蛋白質のＮ−末端及び／又はＣ−末端である請求項１０に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
前記融合の相手方となる蛋白質が、環境ストレスに不安定な蛋白質である請求項９に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
前記環境ストレスに不安定な蛋白質が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又はジヒドロ葉酸還元酵素であること請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドをコードるヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項９〜１３のいずれかに記載の蛋白質をコードするヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１１及び配列番号１３に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１４及び配列番号１５に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１４及び配列番号１２に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１６及び配列番号１７に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１８及び配列番号１９に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２０及び配列番号２１に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２２及び配列番号２３に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２４及び配列番号２５に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２６及び配列番号２７に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２８及び配列番号２９に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号３０及び配列番号３１に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号３２及び配列番号３３に記載の配列を有するプライマーの対、並びに配列番号３４及び配列番号３５に記載の配列を有するプライマーの対からなる群から選択される、環境ストレス耐性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを検出するための対になったプライマー。
【請求項１７】
請求項１４又は１５に記載のヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組換えベクターにより形質転換又はトランスフェクトされた細胞。
【請求項１９】
環境ストレスに不安定な蛋白質の本質的な性質は保存しながらも環境ストレス耐性を有する実質的に純粋な融合蛋白質の製造方法において、（ａ）請求項１５の環境ストレス耐性を有する融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を、当該ＤＮＡ配列に制御可能に結合され、ＤＮＡ配列の発現を制御する一つ以上の発現制御配列を有するベクターに挿入する段階と、（ｂ）その結果のベクターで宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトさせる段階と、（ｃ）その結果の形質転換体又はトランスフェクタントを、ＤＮＡが発現するように、適切な条件で適切な培地で培養させる段階と、（ｄ）前記培養液から前記ＤＮＡ配列によりコードされた実質的に純粋な蛋白質を取得する段階とを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は標的蛋白質に対する環境ストレス耐性を有する新規のペプチド及びこの蛋白質を含む融合蛋白質に関するものである。より詳しくは、本発明はシヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域（ＡＴＳ）を含む環境ストレス耐性を有するペプチド、又はＡＴＳのアミノ酸配列内に、少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含む、環境ストレス耐性を有するペプチドと、前記ペプチドを融合の相手方となる蛋白質と融合させて形成される、環境ストレス耐性を有する融合蛋白質と、前記ペプチド及び融合蛋白質をコード化するヌクレオチド配列と、前記ヌクレオチド配列を含む組換えベクターと、前記組換えベクターにより形質転換又はトランスフェクションされた細胞とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
“環境ストレス耐性を有する蛋白質”とは、熱、ｐＨ、金属イオン、有機溶媒などの外部環境要因に対する物理的、科学的及び生物学的な安定性を示す蛋白質をいう。通常、このような蛋白質のうちには、水の沸点温度でも安定した熱安定性蛋白質がある。このような蛋白質としては超好熱菌（hyperthermophilic）に由来する蛋白質がある[Jaenicke R. and Bohm G., Curr. Opin. Struct. Bio., 8, 738-748 (1998); Ress D. C. and Adams M. W. W. Structure, 3, 251-254 (1995); and Adams M. W. W., Ann. Rev. Microbiol. 47, 627-658 (1993)]。これらの蛋白質は、好中温菌(mesophilic)に由来する蛋白質（水の沸点付近又は以上）に比べ、極めて高い融点（以下、“Ｔｍ”という）を有する。しかし、温度が前記Ｔｍより上昇すると、殆どの超好熱性の蛋白質も変性されて、不溶性凝集体を形成する[Klump et al., J. Biol. Chem., 267, 22681-22685 (1992); Klump et al., Pure. Appl. Chem., 66, 485-489 (1994); Cavagnero S. et al., Biochemistry, 34, 9865-9873 (1995)]。
【０００３】
最近知られたその他の熱安定性蛋白質は、本質的に非構造性の蛋白質である[Plaxco, K. W. and Groβ M., Nature, 386, 657-658 (1997); Wright P. E. and Dyson H. J., J. Mol. Biol., 293, 321-331 (1999)]。この本質的に非構造性の蛋白質が熱安定性を有する理由は、この非構造性の蛋白質が熱処理によりあまり変化しないからである。熱力学的に言えば、この非構造性の蛋白質は、その形態が室温でほぼアンフォールドされ、高温で少し変化するため、熱安定性蛋白質というよりは耐熱性蛋白質（以下、“ＨＲＰｓ”という）である（Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)）。したがって、耐熱性蛋白質（ＨＲＰｓ）という用語は本質的に非構造性の蛋白質の熱的反応性を説明するのにより適切である。すなわち、ＨＲＰｓは、超好熱性の蛋白質及び非構造性蛋白質などの如く、熱処理によっても凝集しない蛋白質である定義することができる。
【０００４】
蛋白質の熱的反応性は、ジャーカットＴ細胞とヒトの血清から、熱処理により凝集しない一部のＨＲＰｓを精製し、特性表示することにより体系的に調査された（Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)）。ジャーカットＴ細胞溶解物とヒトの血清からの蛋白質の耐熱性に対する研究によると、ＨＲＰｓの熱的反応性の四つの形態が認められた。その反応性の形態はつぎのようである。グループＩのＨＲＰｓは、温度にかかわらず半アンフォールドされた形態を有するα−シヌクレイン及びαｓ−カゼインなどの非構造性の蛋白質で表される。ヒトの血清フェツイン及びアルブミンで表されるグループIIのＨＲＰｓは、熱処理時に非可逆的に形態変化することを特徴とする。トランスチレチン及び牛の血清フェツインで表されるグループIIIのＨＲＰｓは、可逆的に形態変化することを特徴とする。通常の熱安定性蛋白質である、超好熱性の蛋白質などのグループIVのＨＲＰｓは、熱による形態変化がないことを特徴とする。
【０００５】
殆どの蛋白質は、温度の上昇につれアンフォールドして沈殿するが、この過程は通常非可逆的である(Bull H. B. and Breese K., Arch. Biochem. Biophys., 156, 604-612 (1973))。医学又は産業分野で広く使用されるホルモン、サイトカイン及び酵素などの蛋白質において、熱安定性の改善などのストレス耐性の改善は、解決すべき課題の一つである。もちろん、ストレス耐性を改善すると、製品の寿命が延長するので、新たな医学製品とより安定した産業用酵素、飲食物又は化学製品を開発することができる。したがって、新規のストレス耐性を有する蛋白質に関する本発明は非常に有用である。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、熱、ｐＨ、金属イオンなどの環境ストレスに対する蛋白質の特性を研究したところ、シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域（以下、“ＡＴＳ”という）からなるペプチドが、環境ストレス耐性を与えるのに重大な役割をし、ＡＴＳを標的蛋白質（融合の相手方となる蛋白質）と融合させて製造した融合蛋白質が、融合前の蛋白質の本質的な性質を保存しながらも環境ストレス耐性を有することを発見した。この発見に基づき、本発明者らは、化学的合成又は遺伝子組換えにより、環境ストレス耐性を有する融合蛋白質を製造して本発明を完成した。
したがって、本発明は、蛋白質と結合して、その蛋白質の本質的な性質は保存しながらも融合の相手方となる蛋白質に環境ストレス耐性を与える、ＡＴＳからなるペプチドを提供する。
【０００７】
その他の特徴によると、本発明は、ＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含み、融合の相手方となる蛋白質と結合してその本質的な性質は保存しながらも、それに環境ストレス耐性を与えるペプチドを提供する。
【０００８】
さらに他の特徴によると、本発明は、ＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチドを融合の相手方となる蛋白質と結合してなる、環境ストレス耐性の改善された融合蛋白質を提供する。
【０００９】
さらに他の特徴によると、本発明は、ＡＴＳからなるペプチド、又はＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチドの製造方法を提供する。
【００１０】
さらに他の特徴によると、本発明は、ＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチドを、化学的合成又は遺伝的組換えにより融合の相手方となる蛋白質と結合してなる、環境ストレス耐性を有する融合蛋白質の製造方法を提供する。
【００１１】
さらに他の特徴によると、本発明は、ＡＴＳからなるペプチド、又はＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチドをコード化するヌクレオチド配列を提供する。
【００１２】
さらに他の特徴によると、本発明は、ＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチド、又はこのペプチドを融合の相手方となる蛋白質と結合してなる、環境ストレス耐性を有する融合蛋白質をコード化するヌクレオチド配列を提供する。
【００１３】
さらにほかの特徴によると、本発明は、環境ストレス耐性を有する融合蛋白質をコード化するＤＮＡを検出するためのプライマーを提供する。
【００１４】
さらにほかの特徴によると、本発明は、ＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチド、又は環境ストレス耐性が改善された融合蛋白質をコード化するヌクレオチド配列を有する組換えベクターを提供する。
【００１５】
さらに他の特徴によると、本発明は、ＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチド、又は環境ストレス耐性の改善された融合蛋白質をコード化するヌクレオチド配列を有する組換えベクターにより形質転換又はトランスフェクションされた細胞を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、融合の相手方となる蛋白質と結合して、蛋白質の本質的な性質は保存しながらも環境ストレス耐性を付与する、ＡＴＳからなるペプチドを提供する。また、本発明は、ＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチドを提供する。
【００１７】
ここに使用する“環境ストレス”という用語は、天然又は非天然蛋白質の変性を引き起こし得る物理的又は化学的作用を意味する。これと関連して、“蛋白質の変性”とは、加熱、凍結及び乾燥などの物理的作用、又は酸、アルカリ、金属イオン又は有機溶媒などの化学的作用により蛋白質の高次構造が変化することであって、一般に生物学的機能の喪失、溶解度の減少、反応性の増減、酵素による分解容易性、結晶性の喪失、物理化学的特性の変化、修飾ブルーシフトなどの随伴する現象を含む。本発明において、蛋白質を変性させ得る環境ストレスの例としては、温度、水分、ｐＨ、電解質、還元糖、加圧、乾燥、凍結、界面張力、光線などの物理的要因と、酸、アルカリ、中性塩、有機溶媒、金属イオン、酸化／還元剤などの化学的要因とを含む。
【００１８】
具体的にいうと、本発明による環境ストレスは、蛋白質を変性させ得る温度、水分、ｐＨ、金属イオン、電解質、及び酸化／還元剤を含む。殆どの蛋白質は６０〜７０℃の温度で変性し始め、温度の上昇につれて変性速度が増加する。例えば、温度が１０℃上昇すると、アルブミン及びヘモグロビンの変性速度はそれぞれ２０倍及び１３倍増加する。しかし、温度が急に上昇すると、凝集温度が上昇し得る。蛋白質が熱により変性するのには水が必要である。水は、ポリペプチド鎖のアンフォールディング又は組換えの際、ポリペプチド鎖の移動を助ける。したがって、水が十分であれば、より低い温度でも熱変性が起こり得る。また、蛋白質の熱変性はｐＨにも関係があるが、一般にｐＩ側の酸性ｐＨで変性が早く起こる。魚を調理するとき、この特性を用いて、生鮮食品を急に固くするために少量の食酢を添加する。また、蛋白質の変性は電解質（塩）の添加によっても起こり得る。電解質の添加の際、塩化合物、硫酸塩などの電解質内の陽イオンが蛋白質の陰電荷を中和させて、ｐＨが等電点となるようにする。蛋白質を加熱するとき、還元糖が存在すると、非酵素的褐変であるメイラード反応が起こって必須アミノ酸を破壊させる。
【００１９】
本発明における環境ストレスは、蛋白質の変性を引き起こし得る加圧及び乾燥環境を含む。一般に、蛋白質は５０００〜１０，０００気圧の高圧により、又は超音波分解により変性される。特に、可溶性蛋白質は乾燥により変性できる。乾燥が進行するに従い、ポリペプチド鎖間に存在する水分が消失し、この際、隣接ペプチド鎖が再結合してより堅い構造を形成することになる。
【００２０】
本発明による環境ストレスには、蛋白質の変性を引き起こし得る凍結環境が含まれる。例えば、肉類食品が凍結すると、まず水の結合力が弱まり、水が氷結晶として結晶化される。したがって、残り液体内の塩濃度が増加して塩析を引き起こし、これにより蛋白質が変性する。ほかの環境ストレスとしては、界面張力が含まれる。蛋白質は界面で単分子層として拡散するときに変性して凝集することになる。また、さらにほかの環境ストレスとしては、蛋白質の変性を引き起こし得る光の照射が含まれる。蛋白質に光が照射されると、蛋白質三次構造の結合が破壊されて変性することになる。酸、アルカリ、中性塩、アルコール又はアセトンなどの有機溶媒、及び金属イオンも本発明の目的のための環境ストレスに含まれる。蛋白質溶液に酸、アルカリを添加すると、（＋）電荷及び（−）電荷が変化するため、高次構造と深く関係するイオン結合を変化させて、蛋白質を変性させる。
【００２１】
“シヌクレインファミリー”は熱処理により凝集しないと知られた耐熱性蛋白質で、α−シヌクレイン、β−シヌクレイン、γ−シヌクレイン並びにシノレチンが含まれる。シヌクレインは魚類以上の高等動物で発見される蛋白質で、ヒト、ネズミ、鳥類、牛などに存在すると報告された（Clayton and Geroge, Trends in Neuroscience 21, 249-254 (1998)）。好ましくは、本発明によるペプチドはヒトに由来するα−シヌクレイン、β−シヌクレイン、及びγ−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域から由来するものである。
【００２２】
“Ｃ−末端側の酸性領域（ＡＴＳ）”は前記シヌクレインファミリーから由来するもので、好ましくは配列番号１（α−シヌクレインに由来）、配列番号２（β−シヌクレインに由来）、配列番号３（γ−シヌクレインに由来）、及び配列番号４（シノレチンに由来）である。“シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域”という用語は、説明の単純及び明瞭のため、“ＡＴＳ”と略称する。より詳しく、“α−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域（アミノ酸残基９６−１４０）”は“ＡＴＳα”又は“Ｓｙｎ９６−１４０”と略称し、“β−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域（アミノ酸残基８５−１３４）”は“ＡＴＳβ”又は“Ｓｙｎ８５−１３４”と略称し、“γ−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域（アミノ酸残基９６−１２７）”は“ＡＴＳγ”又は“Ｓｙｎ９６−１２７”と略称する。
【００２３】
特に、１４０個のアミノ酸からなる酸性シナプス前蛋白質であるα−シヌクレイン(Ueda K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 11282-11286 (1993); Jakes R. et al., FEBS lett., 345, 27-32 (1994))は本質的に非構造性の蛋白質族に属する(Eliezer D. et al., J. Mol. Biol. 307, 1061-1073 (2001); Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Weinreb P. H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996))。
【００２４】
α−シヌクレインは天然の状態では本質的に非構造化されているため、ほかの多くの蛋白質又はリガンドと反応し得る(Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Weinreb P.H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996))。α−シヌクレインは、少ない酸性リン脂質小胞体、界面活性剤、有機溶媒、及び一部の金属イオンと結合すると、二次構造が増加する(Eliezer D. et al., J. Mol. Biol., 307, 1061-1073 (2001); Kim T. D. et al., Protein Science, 9, 2489-2496 (2000); Davidson W. S. et al., J. Biol. Chem., 273-9443-9 (1998); Weinreb P. H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996); Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999))。前述したように、α−シヌクレインは、たいてい異常な一次及び三次構造特性のため、高い耐熱性を有する。
【００２５】
図１に示すように、α−シヌクレインは三つの独立領域、つまりアミノ−末端両親媒性領域（残基１−６０）、疎水性ＮＡＣ領域（残基６１−９５）、及びカルボキシ−末端酸性尾部（残基９６−１４０）からなる[Lucking C. B. and Brice A. Cell. Mol. Life Sci., 57, 1894-1908 (2000); Iwai A. Biochim. Biophys. Acta. 1502, 95-109 (2000); Hashimoto M. and Masliah E., Brain Pathol., 9, 707-720 (1999); Lavedan C. Genome Res., 8, 871-880 (1998)]。Ｎ−末端領域は種間に強く保存される反面、Ｃ−末端側の酸性領域は大きさ及び配列が大いに変化する。シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域（ＡＴＳ）はサイズ及び配列が大いに変化する（Lucking C. B. and Brice A. Cell. Mol. Life Sci., 57, 1894-1908 (2000); Iwai A. Biochim. Biophys. Acta. 1502, 95-109 (2000); Hashimoto M. and Masliah E., Brain Pathol., 9, 707-720 (1999); Lavedan C. Genome Res., 8, 871-880 (1998)）。これにひきかえ、Ｎ−末端側の両親媒性領域は、ヤマトシビレエイからヒトまで、シヌクレインファミリーの一員間で種間に強く保存される。
【００２６】
また、本発明は、ＡＴＳ、又はＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含み、環境ストレス耐性を与えるペプチドを融合の相手方となる蛋白質と結合してなる、環境ストレス耐性が改善された融合蛋白質を含む。
【００２７】
“融合の相手方となる蛋白質”とは環境ストレスに対する耐性を増大させることが好ましい蛋白質、特に環境ストレスに不安定な蛋白質を意味する。“環境ストレスに不安定な蛋白質”という用語は、環境ストレスにより容易に変性する蛋白質を示す。“変性”は前記定義したような意味を有する。環境ストレスに不安定な蛋白質は変性要因によってよく知られている。本発明によるペプチドが結合する融合の相手方となる蛋白質は、Ｎ−末端及びＣ−末端のいずれか一方又は両方と結合することができる。融合の相手方となる蛋白質は１種の蛋白質、又は２種以上の蛋白質から由来し得る。
【００２８】
本発明による環境ストレス耐性融合蛋白質は、ＡＴＳのペプチド、又はＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含み、環境ストレス耐性を有するペプチドを、ペプチドが融合蛋白質の本質的な性質に影響を与えない範囲内で結合部位にかかわらず融合の相手方となる蛋白質と結合させてなる融合蛋白質を含む。
【００２９】
１グループとして、本発明による環境ストレス耐性融合蛋白質は、ＡＴＳのペプチド、又はＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含み、環境ストレス耐性が改善されたペプチドを、融合の相手方となる蛋白質のＮ−末端と融合させてなる融合蛋白質を含む。
【００３０】
ほかのグループとして、本発明による環境ストレス耐性融合蛋白質は、ＡＴＳのペプチド、又はＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含み、環境ストレス耐性が改善されたペプチドを、融合の相手方となる蛋白質のＣ−末端と融合させてなる融合蛋白質を含む。
【００３１】
好ましいグループとして、本発明による環境ストレス耐性融合蛋白質は、好ましくはＮＡＣ領域とＡＴＳα領域、又はＮＡＣ領域とＡＴＳαのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含み、環境ストレス耐性が改善されたペプチドを、環境ストレスに不安定だと知られた蛋白質のＮ−末端と融合させてなる融合蛋白質である。
【００３２】
ほかの好ましいグループとして、本発明による環境ストレス耐性融合蛋白質は、好ましくはα−シヌクレインの全体を、環境ストレスに不安定だと知られた蛋白質のＣ−末端と融合させてなる融合蛋白質である。
【００３３】
さらにほかの好ましいグループとして、本発明による環境ストレス耐性融合蛋白質は、好ましくはα−シヌクレインの全体を、環境ストレスに不安定だと知られた蛋白質のＮ−末端と融合させてなる融合蛋白質である。
【００３４】
さらにほかの好ましいグループとして、本発明による環境ストレス耐性融合蛋白質は、好ましくはＮＡＣ領域とＡＴＳα領域、又はＮＡＣ領域とＡＴＳαのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含み、環境ストレス耐性を有するペプチドを、環境ストレスに不安定だと知られた蛋白質のＣ−末端と融合させてなる融合蛋白質である。
【００３５】
本発明の融合蛋白質は、ＡＴＳ又はＡＴＳの１０個以上かつ５０個以下のアミノ酸配列が結合する結合部位と、融合の相手方となる蛋白質の種類及び数に応じて、多くの形態の蛋白質を形成し得る。
【００３６】
本発明の一実施例において、融合の相手方となる蛋白質としては、環境ストレスに不安定だと知られた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、“ＧＳＴ”という）とジヒドロ葉酸還元酵素（以下、“ＤＨＦＲ”という）を使用することができる。融合の相手方となる蛋白質のほかの例としては、ＡＴＳαを除くα−シヌクレインと、α−シヌクレインのＮＡＣを含む。
【００３７】
本発明で例として使用されたＧＳＴは一般に細菌から哺乳類動物までに存在し、生体内で多様な細胞毒素を無毒化させる機能をするか、又は酸化的損傷から細胞を保護するか又は脂質、ビリルビン、ハム、ステロイド、胆汁酸塩などの多様な疎水性及び両親媒性物質を運搬するのに関与する。また、これは多様な癌細胞又は薬剤耐性細胞に見つかり、化学療法で対象分子又は腫瘍マーカー分子として使用され、診断用に適用される。ＧＳＴ及びＤＨＦＲは熱ストレスにより容易に沈殿する、熱に不安定な蛋白質として知られている。本発明において、熱処理後にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで定性分析した結果、ＧＳＴ及びＤＨＦＲが凝集して沈殿したことを確認し、よってＧＳＴ及びＤＨＦＲが熱に非常に不安定な蛋白質であることを発見した。
【００３８】
また、例として使用されたヒト由来のα−シヌクレインは、熱安定性を調査するための実験で、沸騰水（およそ１００℃）内で沸騰したときにも沈殿しなかったので、耐熱性を有することを発見した。また、α−シヌクレイン蛋白質を酵素分解して獲得した一連の欠失変異体の熱安定性を調査した実験から、シヌクレイン蛋白質に耐熱性を付与するのにＡＴＳα領域（残基９６−１４０、Ｓｙｎ９６−１４０）が重要な役割をすることが明らかになった（実施例４）。
【００３９】
本発明において、前記ＡＴＳαの耐熱性に基づき、ＡＴＳαを含有するペプチドを熱に不安定なＧＳＴと結合して融合蛋白質を製造した。例えば、配列番号５で表されるＧＳＴのＣ−末端にＡＴＳαを結合してなる融合蛋白質と、配列番号６で表されるＧＳＴのＣ−末端に、α−シヌクレインのＮＡＣ領域と酸性尾領域からなるペプチド（アミノ酸残基６１−１４０）を結合してなる融合蛋白質と、配列番号７で表されるＧＳＴのＣ−末端に、α−シヌクレインのペプチド全体（アミノ酸残基１−１４０）を結合してなる融合蛋白質とを製造した。これらの融合蛋白質は１００℃で３０分間熱処理しても凝集しないことを発見した。また、熱に不安定なＧＳＴのＣ−末端に、酸性尾領域が欠けているα−シヌクレインペプチドが結合された融合蛋白質を製造した。例えば、ＧＳＴのＣ−末端にα−シヌクレインのＮＡＣ領域のペプチドを結合してなる融合蛋白質と、ＧＳＴのＣ−末端にα−シヌクレインの両親媒性領域のペプチドを結合してなる融合蛋白質を製造した。これら融合蛋白質は、１００℃で３０分間熱処理すると凝集及び沈殿することを発見した。前記結果は、ＡＴＳα（Ｓｙｎ９６−１４０）がＧＳＴに耐熱性を付与するのに重要な役割をことを示す（実施例５）。また、これは、ＡＴＳαがｐＨ又は金属イオンによるＧＳＴの凝集を効率よく防止し得ることを示す（実施例１０）。したがって、ＡＴＳαは融合の相手方となる蛋白質に環境ストレス耐性を付与する特性を有すると推定される。
【００４０】
本発明において、α−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域（ＡＴＳα）を導入すると、製造されたＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質に耐熱性を付与し得るという事実に基づき、ＧＳＴのほかに、ＡＴＳαがほかの蛋白質に耐熱性を付与することができるかを確認するため、ＤＨＦＲのＣ−末端にＡＴＳαを導入してＤＨＦＲ−ＡＴＳαを製造した。その結果、天然ＤＨＦＲとは異なり、ＤＨＦＲ−ＡＴＳαは１００℃で３０分間熱処理しても沈殿しないことも見つかった。この結果から、ＧＳＴのほかに、ＡＴＳαはＤＨＦＲとそのほかのストレスに不安定な蛋白質のストレス耐性を増加させるのに優れたことが立証される（実施例１１）。
【００４１】
本発明において、ＡＴＳαに由来するペプチド片を有する一連のＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質を製造した。この融合蛋白質も耐熱性を有する。この融合蛋白質のなかで、ＡＴＳαの全領域を含むＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０とＡＴＳαの２２個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０は、濃度にかかわらず熱処理後に全く沈殿しなかった反面、１１−１３個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６及びＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０は、低濃度では全く沈殿しなかったが、濃度が増加するにしたがって段々凝集した。したがって、ＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質の欠失変異体は天然ＧＳＴの欠失変異体より優れた耐熱性を有し、興味深いことにＡＴＳαの長さによって耐熱性が大きく変化することが立証された（実施例１２）。
【００４２】
本発明において、それぞれβ−シヌクレインの酸性尾部（ＡＴＳβ）とγ−シヌクレインの酸性尾部（ＡＴＳγ）を含むＧＳＴ−ＡＴＳβ融合蛋白質とＧＳＴ−ＡＴＳγ融合蛋白質を製造したところ、これら融合蛋白質も非常に高い耐熱性を有することを発見した。したがって、ＡＴＳαのほかに、ＡＴＳβとＡＴＳγはほかの蛋白質に耐熱性を提供し得るペプチドであり、これらは環境ストレス耐性を有する融合蛋白質の製造に使用し得ることが立証された（実施例１３）。
【００４３】
本発明において、ＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質も製造し、その耐熱性をＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質と比較した。その結果、ポリグルタミン酸末端は同数のグルタミン酸塩残基を有するＡＴＳペプチドに比べ、耐熱性を付与するのにあまり効果的でないことが分かった。例えば、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０は同数のグルタミン酸残基を有するＧＳＴ−Ｅ５よりはるかに優れ、２倍多いグルタミン酸を有するＧＳＴ−Ｅ１０よりも少し高い耐熱性を表した。したがって、陰電荷の増加による蛋白質の溶解度増加のほかにも、ＡＴＳの特徴的なアミノ酸配列は、ＡＴＳを有する融合蛋白質に高い環境ストレス耐性を付与するメカニズムに重要な役割をすることが提案された。
【００４４】
本発明により製造された融合蛋白質は、１００℃以上の水沸騰点で数分間熱処理しても、凝集及び沈殿しない耐熱性を有する（実施例５）。天然ＧＳＴのＴ５０値と、α−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域（アミノ酸残基９６−１４０）がＧＳＴのＣ−末端と結合された融合蛋白質ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０のＴ５０値はそれぞれ５５．５℃と５７．５℃であることを発見したが、これは酸性尾領域が融合蛋白質の熱安定性を増加させることを示す。ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０から観察されたこのような熱安定性の相当な増加は、酸性尾部が蛋白質を熱による凝集から保護することによるものである。また、図６ｂに示すように、ＧＳＴは融点（７０℃）より低い温度である５２℃で凝集するが、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０融合蛋白質は凝集しない。
【００４５】
本発明によると、ＡＴＳαは、シヌクレイン蛋白質自体にだけでなく、熱に不安定な蛋白質にも耐熱性を付与するのに決定的な役割を果たす。ＡＴＳαは陰電荷で荷電した残基間の反発力により不利な分子間作用を引き起こし得る。このような概念は、切断されたＣ−末端側の酸性領域を有するα−シヌクレイン突然変異とＣ−末端側の酸性領域が欠けているＮＡＣペプチドを有するα−シヌクレイン突然変異が、同一条件下で全長α−シヌクレインより早く凝集するという報告により支持される(Sperpell L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4897-4902 (2000); Crowther R. A. et al., FEBS Letters, 436, 309-312 (1998); Han H. et al., Chem. Biol., 2, 163-169 (1995); Iwai A. et al., Biochemistry, 34, 10139-10145 (1995))。したがって、ＡＴＳαは親水性を増大させ、よってこれを含む蛋白質又は融合蛋白質の溶解度を増大させ、熱により誘導された蛋白質又は融合蛋白質の凝集を抑制する。
【００４６】
本発明により製造された耐熱性融合蛋白質は、熱に不安定な蛋白質に比べ、ヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)及びｐＩが低い特徴がある（実施例６）。蛋白質の溶解度はおよそ蛋白質の総電荷の二乗に比例する（Tanford C., John Wiley and Sons, Inc. New York (1961)）。実際、熱に不安定な蛋白質にＡＴＳαを導入すると、結果の融合蛋白質のｐＩとヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)がかなり減少する（表１）。
【００４７】
本発明により製造された融合蛋白質は熱による酵素活性の減少を抑制する特徴がある。本発明によるＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０融合蛋白質はＧＳＴより高いＴ５０値を示す（実施例８）。
【００４８】
本発明により製造されたＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０融合蛋白質はグループIIのＨＲＰｓに属する（実施例７）。その構造を遠紫外線ＣＤスペクトルを用いて調査した結果、本発明により製造されたＧＳＴ−Ｓｙｎ−９６−１４０は、よく整頓された二次構造要素を含むことを発見した。この遠紫外線ＣＤスペクトルは１００℃でこの要素が減少することを示したが、全体形状は変わらなかった。冷却後、遠紫外線ＣＤスペクトルは初期のスペクトルとは違うままであったが、これはＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０融合蛋白質の形態が非可逆的に変化することを示す。熱処理したＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の室温でのＣＤスペクトルは１００℃で得たスペクトルと似ているが、これは、蛋白質が二つの独立領域、つまり規則的な二次構造要素の領域と、ランダムコイル類似形状の領域とからなることを示す（実施例９）。
【００４９】
α−シヌクレインはＦｅ２＋、Ａｌ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＣａ２＋などの金属イオンと幾つかの２価イオンと結合することができる(Paik S. R. et al., Arch, Biochem. Biophys, 344, 325-334 (1997); Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999); Nielsen M. S. et al., J. Biol. Chem., 276, 22680-22684 (2001))。金属イオン（Ｆｅ２＋、Ａｌ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｕ２＋）はα−シヌクレインと結合して、蛋白質の自己オリゴメリゼーションを引き起こす。Ｃｕ２＋及びＣａ２＋はそれぞれ解離定数が５９μＭ、ＩＣ５０が３００μＭのＡＴＳα領域と特別に結合すると知られている(Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999); Nielsen M. S. et al., J. Biol. Chem., 276, 22680-22684 (2001))。しかし、Ｆｅ２＋、Ａｌ２＋及びＺｎ２＋の結合部位と結合定数は未だ決定されていない。
【００５０】
本発明により製造された耐熱性融合蛋白質は２価陽イオン及び金属イオンにより凝集しない。本発明によるＡＴＳαと融合したＧＳＴ蛋白質はｐＨと金属による凝集に対する耐性を示し、ＡＴＳαは環境ストレスから融合蛋白質を保護して、安定性をかなり増大させる（実施例１０）。本発明によると、２価陽イオンの結合がα−シヌクレインとＧＳＴ−α−シヌクレイン融合蛋白質の熱的反応性に影響を与えないことを示す。
【００５１】
また、本発明は、化学的合成または遺伝子組換えにより、ＡＴＳペプチド、又はＡＴＳのアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基からなる群から選択される一つの配列を有するペプチドの製造方法を提供する。
【００５２】
標的蛋白質と融合する本発明のペプチドは生化学分野の熟練者に広く知られた化学的合成により容易に製造できる（Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY (1983))。代表的な方法としては、液相又は固相合成、断片凝縮、Ｆ−ＭＯＣ又はＴ−ＢＯＣ化学法が含まれる（Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England (1989)）。
【００５３】
本発明によるペプチドは、保護されたアミノ酸間の凝縮反応を、通常の固相法で、Ｃ−末端から始めて第１アミノ酸、第２アミノ酸、第３アミノ酸などに順次進行して行うことにより合成することができる。凝縮反応後、酸分解又はアミノリシスなどの公知方法により保護基とＣ−末端アミノ酸が結合された担体を除去することができる。前述したペプチド合成法は文献に詳細に説明されている（Gross and Meienhofer's, The peptides, vol 2., Academic Press (1980)）。
【００５４】
本発明によるペプチドの合成に使用できる固相担体は、ペプチドと結合し得る官能基を有する置換されたベンジル形態のポリスチレン樹脂、ヒドロキシメチルフェニルアセティックアミド形態のポリスチレン樹脂、置換されたベンズヒドリルポリスチレン樹脂、及びポリアクリルアミド樹脂を含むが、これに限定されるものではない。
【００５５】
最初の保護されたアミノ酸の保護基はペプチド合成に通常使用される保護基であればどんなものであってもよく、酸分解、還元又はアミノリシスなどの通常の方法により容易に除去することができる。このようなアミノ酸保護基の具体的な例としは、ホルミル；トリフルオロアセチル；ベンジルオキシカルボニル；（オルト− パラ−）クロロベンジルオキシカルボニル及び（オルト− パラ−）ブロモベンジルオキシカルボニルなどの置換されたベンジルオキシカルボニル；及びｔ−ブトキシカルボニル及びｔ−アミルオキシカルボニルなどの脂肪族オキシカルボニルを含む。アミノ酸のカルボキシル基はエステル基に転換させることにより保護することができる。エステル基としては、ベンジルエステル、メトキシベンジルエステルなどの置換されたベンジルエステル；シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル又はｔ−ブチルエステルなどのアルキルエステルを含む。グアニジノ残基は、保護基が不要であるが、ニトロ；又はトシル、メトキシベンゼンスルホニル又はメシチレンスルホニルにより保護することができる。トリプトファンのインドール基はホルミルにより保護することができるか、又は保護できない。
【００５６】
保護基の除去及びペプチドから担体の除去は、多様なスカベンジャーの存在下で無水ヒドロフルオライドを使用して行える。スカベンジャーの例としては、ペプチド合成に通常使用されるアニソール、（オルト−、メタ−、パラ−）クレゾール、ジメチルスルファイド、Ｃｏ−クレゾール、エタンジオール、及びメルカプトピリジンを含む。
【００５７】
ほかの手段において、本発明によるペプチドは遺伝子工学により製造することができる。まず、通常の方法によりペプチドをコード化するＤＮＡ配列を作製する。ＤＮＡ配列は適切なプライマーを使用してＰＣＲ増幅により作製する。ほかの方法として、ＤＮＡ配列は公知の標準方法、例えば自動ＤＮＡ合成器（Biosearch, Applied Biosystemsから購入し得るものなど）を使用して合成することができる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはステインなどの方法（Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)）により合成することができる。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御された気孔ポリマー支持体を使用して製造することができる（Sarin et al., 1988, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 85, 7448-7451 (1988)）。
【００５８】
作製されたＤＮＡ配列はこのＤＮＡ配列の発現を制御する一つ以上の発現制御配列を含むベクターに挿入させて組換え発現ベクターを形成する。このベクターにより宿主細胞を形質転換又はトランスフェクションさせ、この形質転換体又はトランスフェクション体はＤＮＡ配列が発現するのに適切な条件で適切な培地で培養する。このように、ＤＮＡ配列によりコード化された実質的に純粋なペプチドは培養物から得ることができる。
【００５９】
ここで使用する“形質転換”という用語は、ＤＮＡがベクターに導入されるとき、染色体以外の形態又は染色体への統合で複製される現象を意味する。ここで使用する“トランスフェクション”という用語は、コーディング配列が実際に発現されるか又は発現されないかにかかわらず、発現ベクターが宿主により収容される現象を意味する。
【００６０】
“形質転換された宿主細胞”及び“トランスフェクションされた宿主細胞”という用語は、ＤＮＡの細胞への導入を意味する。この細胞は“宿主細胞”と呼ばれ、真核細胞又は原核細胞であり得る。典型的な原核細胞としては、多様な大腸菌の多様な菌株を含む。典型的な真核細胞としては、哺乳類から由来する細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣及びヒトから由来する細胞を含む。導入されたＤＮＡ配列は宿主細胞と同一の又は異なる種から得るか、あるいは異種又は同種ＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であり得る。
【００６１】
ここで使用する“ベクター”という用語は、適切な宿主細胞のＤＮＡの発現に影響を与えられる制御配列に制御可能に結合したＤＮＡ配列を含むＤＮＡ作製物を意味する。このような制御配列は、転写を実施するためのプロモータ、この転写を制御し得る任意のオペレータ配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコード化する配列、及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。このベクターは、プラスミド、ウィルス、ファージ粒子、又は単純な潜在的ゲノム挿入物であり得る。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは関係なく複製し機能することができるか、又は場合に応じてはゲノム自体に統合できる。本明細書においては、プラスミドは現在最も一般に使用されるベクター形態であるので、“プラスミド”と“ベクター”は時々交互に使用する。しかし、本発明は、同等な機能をし当業界に知られたほかの形態のベクターも含む。哺乳動物細胞培養物の好ましい発現ベクターはｐＲＫ５（ヨーロッパ特許第３０７，２４７号）、ｐＳＶＩ６Ｂ（ＰＣＴ公報番号ＷＯ９１／０８２９１）及びｐＶＬＩ３９２（Pharmingen）に基づく。
【００６２】
“制御配列”という用語は、特定の宿主生物に制御可能に結合したコーディング配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核生物に適切な制御配列は、プロモータ、オペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物はプロモータ、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを含む。
【００６３】
核酸は、機能的関係で配置されるとき、ほかの核酸に“制御可能に結合される”。これは、適切な分子（例えば、転写活性化剤）が制御配列と結合するとき、遺伝子又は制御配列は遺伝子の発現を制御する方式で結合されることを意味する。例えば、先配列又は分泌物リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参与する前駆体として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに制御可能に結合され、プロモータは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に制御可能に結合されるか、又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に制御可能に結合される。一般に、“制御可能に結合した”という表現は、接触し、そして分泌リーダーの場合には接触しリーディングフレーム内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要がない。この配列の結合は便利な制限酵素部位での結合によりなされる。このような部位が存在しない場合、通常に合成されたオリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーを使用することができる。
【００６４】
ここで使用する“発現ベクター”という用語は、異種ＤＮＡ断片が挿入された組換え担体であって、一般に二重ストランドのＤＮＡ断片を意味する。ここで、異種ＤＮＡは宿主細胞内で天然に発見されない異質ＤＮＡと定義される。発現ベクターは、宿主細胞内にあると、宿主染色体ＤＮＡに関係なく複製されて、ベクターの幾つかのコピー及びこれが挿入された（異種）ＤＮＡを生成することができる。
【００６５】
当業界によく知られたように、宿主細胞内のトランスフェクションされた遺伝子の発現レベルを増大させるため、選択された発現宿主細胞内で機能する転写及び翻訳発現制御配列に遺伝子が制御可能に結合されなければならない。好ましくは、発現制御配列及び該当遺伝子は細菌選択マーカー及び複製基点をさらに含む発現ベクター内に含まれる。発現宿主が真核細胞である場合、発現ベクターは真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００６６】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるためには、多様な発現宿主／ベクター組換えを用いることができる。真核宿主に有用な発現ベクターとしては、例えばＳＶ４０、牛乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウィルス、サイトメガロウイルス及びレトロウィルスから由来する発現制御配列を含むベクターが含まれるが、これに限定されるものではない。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、ｐＥＴ、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣベクター、ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体などの大腸菌由来の細菌性プラスミドと、ＲＰ４などの広い宿主範囲のプラスミドと、例えばλＧＴ１０及びλＧＴ１１、ＮＭ９８９などの多数のファージラムダ誘導体のようなファージＤＮＡと、Ｍ１３及びフィラメント性の単一ストランドのＤＮＡファージのようなほかのＤＮＡファージとが含まれる。酵母細胞に有用なベクターとしては、２μプラスミド及びその誘導体が含まれる。昆虫細胞に有用なベクターとしては、ｐＶＬ９４１が含まれる。
【００６７】
また、本発明のＤＮＡ配列を発現させるためには、これらベクターに多様な発現制御配列を用いることができる。有用な発現制御配列としては、前記発現ベクターの構造遺伝子に関連した発現制御配列が含まれる。有用な発現制御配列の例としては、例えばＳＶ４０又はアデノウィルスの初期及び後期プロモータ、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣ又はＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモータ、ファージラムダの主要オペレータ及びプロモータ領域、ｆｄコート蛋白質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はほかのグリコール酵素のプロモータ、例えばＰｈｏ５などの酸性ホスファターゼのプロモータ、酵母アルファ−交配システムのプロモータ及び原核細胞又は真核細胞又はそのウィルスの遺伝子の発現を制御すると知られた構成及び誘導プロモータ、及びこれらの多様な組合が含まれる。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモータΦ１０は大腸菌内のペプチドの発現に特に有用である。
【００６８】
前記ベクターにより形質転換又はトランスフェクションされた宿主細胞は本発明のほかの面を構成する。本発明のＤＮＡ配列を発現するのには多様な単細胞の宿主細胞が有用である。これら宿主としては、大腸菌、シュードモナス、バシラス、ストレプトミセス、菌類、酵母のような周知の真核及び原核宿主と、スポドプテラフルギペルダ（ＳＦ９）などの昆虫細胞と、ＣＨＯ及びマウス細胞などの動物細胞と、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０及びＢＭＴ１０などのアフリカグリーンモンキー細胞と、ヒト細胞と、組織培養された植物細胞とが含まれる。好ましい宿主生物としては、大腸菌及びバシラススブチリスなどの細菌と、組織培養された哺乳動物細胞とが含まれる。
【００６９】
もちろん、全てのベクターと発現制御配列が本発明のＤＮＡ配列を発現するのに、みんな同等に機能するわけではないことを理解する必要がある。また、全ての宿主が同一発現システムに対して同等によく機能するわけではない。しかし、当業者であれば、過度の実験なしで本発明の範囲から逸脱しないで、これらベクター、発現制御配列及び宿主のなかで適宜選択することができる。例えば、ベクターを選択するのには、ベクターが宿主内で複製しなければならないため、宿主を考慮しなければならない。ベクターの複製数、複製数を制御する能力、及びベクターによりコード化されるほかの蛋白質、例えば抗生剤マーカーの発現も考慮しなければならない。発現制御配列を選択するにあたっても、多様な因子を考慮しなければならない。この因子としては、例えば、配列の相対強度、制御可能性、及び本発明のＤＮＡ配列との相用性が、特に可能な二次構造に関連して含まれる。単細胞宿主は、選定されたベクターとの相用性、本発明のＤＮＡ配列によりコード化される産物の毒性、分泌特性、蛋白質を正確にフォールドし得る能力、培養及び発酵のための要求条件、及び本発明のＤＮＡ配列によりコード化される産物を宿主から精製する容易性を考慮して選択しなければならない。これら変数内で、当業者は本発明のＤＮＡ配列を大規模の培養で発現させる多様なベクター／発源制御配列／宿主の組合を選択することができる。
【００７０】
本発明のＤＮＡ配列によりコード化されるペプチドは、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどを使用する正常又は逆ファージなどの液体クロマトグラフィー；アフィニティークロマトグラフィー（無機リガンド又はモノクローナル抗体など）；サイズ別排除クロマトグラフィー；固定された金属キレートクロマトグラフィー；ゲル電気泳動などの通常の方法により発酵又は細胞培養物から分離して精製することができる。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱しない範囲内で最適の分離及び精製技術を選択することができる。“実質的に純粋なペプチド”という用語は、本発明によるポリペプチドが、細菌に由来するほかの蛋白質が実質的にないことを意味する。
【００７１】
また、本発明は、化学的分析又は遺伝子組換えにより、本発明による環境ストレス耐性を有する融合蛋白質を製造する方法を提供する。好ましくは、本発明による環境ストレス耐性を有する融合蛋白質は遺伝子組換えにより製造される。生化学及び遺伝子工学での当業者であれば、シヌクレインファミリーのＣ末端酸性尾領域のペプチド、又はシヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域のアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個以上かつ５０個以下のアミノ酸のアミノ酸配列とこれに結合された蛋白質などの融合蛋白質を通常の技術を使用して製造することができることが分かる。
【００７２】
本発明は、シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域を含むペプチドをコード化するヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域のアミノ酸配列のなかで、少なくとも１０個以上かつ５０個以下のアミノ酸のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含み、蛋白質と結合して蛋白質の本質的な性質は保存しながらも融合の相手方となる蛋白質に環境ストレス耐性を付与し得るペプチドをコード化するヌクレオチド配列を提供する。また、本発明は、ペプチドが融合の相手方となる蛋白質と結合した融合蛋白質をコード化するヌクレオチド配列を提供する。
【００７３】
特定の具体例において、熱に不安定なＧＳＴ蛋白質のＣ−末端にα−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域のペプチドが結合された融合蛋白質のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を提供する。例えば、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０をコード化するＤＮＡ配列（配列番号８）、ＧＳＴのアミノ酸配列のＣ−末端にα−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域のアミノ酸残基（アミノ酸残基９６−１４０）が結合された融合蛋白質、ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０をコード化するＤＮＡ配列（配列番号９）、ＧＳＴのアミノ酸配列のＣ−末端にα−シヌクレインのＮＡＣ領域とＣ−末端側の酸性領域（アミノ酸残基９６−１４０）を含むアミノ酸配列が結合された融合蛋白質、又はＧＳＴのアミノ酸配列のＣ−末端にα−シヌクレインの全長アミノ酸配列（アミノ酸残基１−１４０）が結合された融合蛋白質であるＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０をコード化するＤＮＡ配列（配列番号１０）がある。
【００７４】
本発明は、環境ストレス耐性を有する蛋白質をコード化するＤＮＡを検出するためのプライマーを提供する。本発明のほかの具体例においては、前記ヌクレオチド配列を含む組換えベクターと、この組換えベクターにより形質転換又はトランスフェクションされた細胞を提供する。
【００７５】
以下、つぎの実施例により本発明を詳細に説明する。しかし、以下の実施例は本発明を例示するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００７６】
ＧＳＴ−シヌクレイン融合作製物及び発現ベクターの製造
α−シヌクレインは、三つの独立領域、つまりＮ−末端側の両親媒性領域（残基１−６０、図１ａ）、疎水性ＮＡＣ領域（残基６１−９５、図１ａ）、及びＣ−末端酸性領域（残基９６−１４０、図１ａ）からなる。α−シヌクレインの全領域とＧＳＴの融合蛋白質であるＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０、両親媒性領域とＧＳＴの融合蛋白質であるＧＳＴ−Ｓｙｎ１−６０、ＮＡＣ領域とＧＳＴの融合蛋白質ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−９５、ＮＡＣ及び酸性尾領域とＧＳＴの融合蛋白質であるＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０、酸性尾領域とＧＳＴの融合蛋白質であるＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０をコード化する五つのＧＳＴ−シヌクレイン融合作成物をそれぞれ合成した（図１ｂ）。
【００７７】
ＧＳＴ−α−シヌクレイン融合作製物は、後述する特定のプライマーでα−シヌクレイン遺伝子をＰＣＲ増幅し、増幅されたＤＮＡをｐＧＥＸ発現ベクター（Amersham Pharmacia Biotech)のＧＳＴ遺伝子後に結合させることにより製造した。全長α−シヌクレインの蛋白質コーディング領域（残基１−１４０）は、下線のＢｇ１II制限部位を有するプライマー１（配列番号１１）と下線のＳａ１Ｉ制限部位を有するプライマー２（配列番号１２）でＰＣＲ増幅を行い、アミノ−末端両親媒性領域（残基１−６０）は、プライマー１（配列番号１１）と下線のＳａ１Ｉ制限部位を有するプライマー３（配列番号１３）でＰＣＲ増幅を行った。ＮＡＣの蛋白質コーディング領域（残基６１−９５）は、下線Ｂｇ１II制限部位を有するプライマー４（配列番号１４）と下線Ｓａ１II制限部位を有するプライマー５（配列番号１５）でＰＣＲ増幅を行い、ＮＡＣ及び酸性尾部（残基６１−１４０）は、プライマー４（配列番号１４）とプライマー２（配列番号１２）でＰＣＲ増幅を行った。Ｃ−末端側の酸性領域の蛋白質コーディング領域（残基９６−１４０）は、下線ＫｐｎＩ制限部位を有するプライマー６（配列番号１６）と下線Ｓａ１Ｉ制限部位を有するプライマー７（配列番号１７）でＰＣＲ増幅を行った。使用したプライマーの配列は表１に示す。
【００７８】
【表１】
2005517389.tif 000003
【００７９】
増幅されたＤＮＡを１％のアガロースゲルを用いて電気泳動により精製し、制限酵素で消化した後、ｐＧＥＸベクター（Pharmacia Biotech, Buckingamshire, UK）の制限酵素部位に結合して、発現ベクターを作製した。全ての作製物はＤＮＡ塩基配列決定法によりその配列を確認した。
【実施例２】
【００８０】
ＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の細菌性発現及び精製
ＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の発現のために実施例１で作製した発現ベクターを、
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株ｐｌｙｓＳ（Inbitrogen）に形質転換させた。形質転換された細菌を、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で、３７℃で吸光度Ａ６００で０．８まで成長させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した後、４時間さらに培養した。培養液は１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を獲得した。この細胞を燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で再懸濁させ、超音波処理で破壊させた。細胞片を除去した後、浮遊物をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。すなわち、前記浮遊物を、ＰＢＳで平衡されたグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（韓国、大田のPeptron）に通過させ、融合蛋白質を１０ｍＭのＧＳＨ（Sigma, St. Louis, MO）で溶出させた。溶出されたＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質はＦＰＬＣゲル濾過カラムでさらに精製し、セントリコン（Centricon）濃縮器（Amicon, Beverly, MA）で濃縮させた。
【実施例３】
【００８１】
α−シヌクレイン及びＧＳＴ蛋白質の熱的反応性
α−シヌクレインは“本質的に非構造性の蛋白質”であって、規則的な二次構造が欠けており、相当部分のランダムコイルを含んでいる(Plaxco K. W. and Groβ M., Nature, 386, 657-658 (1997); Wright P. E. and Dyson H., J., J. Mol. Biol., 293, 321-331 (1999); Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); and Weinreb P. H. et al., Biochemistry, 35, 13709-13715 (1996))。以前の研究によると、α−シヌクレイン及びαｓ−カゼインなどの本質的に非構造性の蛋白質は、温度にかかわらず類似したアンフォールド形態を有し、そのアンフォールドされた形態が室温だけでなく高温でも安定するため、耐熱性を有することを示す（Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)）。したがって、α−シヌクレイン及びＧＳＴ蛋白質の熱的反応性を定性的熱誘発蛋白質凝集アッセーを用いてまず最初に比較した。本実施例で使用されたＧＳＴ及びα−シヌクレイン蛋白質は、それぞれＧＳＴ及びα−シヌクレイン遺伝子を有するｐＧＥＸベクター及びｐＲＫ１７２発現ベクターを大腸菌に形質転換させることにより製造した（Jakes et al., FEBS Letters 345, 27-32 (1994)）。組換えＧＳＴ蛋白質は実施例２で説明した同一の方法で精製し、組換えα−シヌクレインは公知の方法で精製した(Kim J., Molecules and Cells, 7, 78-83 (1997); Paik S. R. et al., Arch. Biochem. Biophys., 344, 325-334 (1997))。
【００８２】
ＧＳＴとα−シヌクレイン蛋白質の、熱により誘導される凝集は、試料の熱処理後にＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより定性分析した。ＰＢＳに懸濁された各蛋白質（０．６ｍｇ／ｍｌ）を沸騰水浴内で１０分間加熱し、空気中で冷却させた。蛋白質試料を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、浮遊物を１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。蛋白質バンドはクマシーブリリアントブルーＲ２５０（Coomassie Brillinant blue R250）で着色した。
【００８３】
期待のとおり、α−シヌクレインは熱処理時に沈殿しなかったが、ＧＳＴ蛋白質は沈殿した（図２）。α−シヌクレインは、熱処理された場合と熱処理されていない場合に共に、蛋白質バンドが観察された。しかし、ＧＳＴ蛋白質は、熱処理されていない場合、蛋白質バンドが観察されたが、熱処理後には観察されなかった。したがって、α−シヌクレインは耐熱性蛋白質である反面、ＧＳＴは熱に不安定な蛋白質であることが分かる。このような実験結果はｐＨ及び緩衝溶液の塩濃度と蛋白質濃度に関係なく再現できる（データは示さない）。
【実施例４】
【００８４】
α−シヌクレイン欠失変異体の熱的反応性
つぎに、α−シヌクレインの耐熱性を誘導する領域を決定するため、一連の欠失変異体を使用した。実施例２で製造したＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質を蛋白質１ｍｇ当たり１ユニットのトロンビンで室温で２時間処理して、ＧＳＴ融合蛋白質からα−シヌクレイン断片を切断した。その結果のα−シヌクレイン欠失変異体の熱安定性を調査した。
【００８５】
実施例３と同一方法により、トロンビンでの消化により得られた、切断された産物の熱安定性を調査した。得られたα−シヌクレイン欠失変異体は、それぞれＡＴＳα（残基９６−１４０）を有する二つの欠失変異体（Ｓｙｎ６１−１４０、Ｓｙｎ９６−１４０）と、α−シヌクレインＮ末端（Ｓｙｎ１−６０）を有する欠失変異体と、疎水性ＮＡＣ領域（Ｓｙｎ６１−９５）を有する欠失変異体とを含む。
【００８６】
天然型（Ｓｙｎ１−１４０）とＡＴＳα（Ｓｙｎ６１−１４０、Ｓｙｎ９６−１４０）を有する二つの欠失変異体は沈殿しなくて、熱処理後にＳＤＳポリアクリルアミドゲルによる分析で蛋白質バンドが観察された。これは、二つの蛋白質が耐熱性を有することを示す。これにひきかえ、α−シヌクレインのＮ−末端部（Ｓｙｎ１−６０）とＮＡＣペプチド（Ｓｙｎ６１−９５）は熱処理により沈殿したので、蛋白質バンドが観察されなかった（図３）。この結果から、ＡＴＳαを有する欠失変異体のみが耐熱性を有することを発見した。したがって、ＡＴＳαが耐熱性の原因であることが分かった。本発明者らのデータと一致して、以前の研究ではＣ−末端が切断されたα−シヌクレイン蛋白質とＮＡＣペプチドが天然型蛋白質より容易にフィラメント内に集まることを示した(Serpell L. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 4897-4902 (2000); Crowther R. A. et al., FEBS Letters, 436, 309-312 (1998); Han H. et al., Chem. Biol., 2, 163-169 (1995); and Iwai A. et al., Biochemistry, 34, 10139-10145 (1995))。全体的に見て、Ｃ−末端が切断されたα−シヌクレイン欠失変異体は天然型とＣ−末端側の酸性領域を有する欠失変異体より室温及び高温での安定性が低いと思われる。したがって、ＡＴＳαはα−シヌクレインの熱溶解性に非常に重要な役割を果たすことが分かる。
【実施例５】
【００８７】
ＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の熱反応性
実施例２で製造したＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の熱安定性を調査した。実施例３で説明した方法を使用して、ＧＳＴ−α−シヌクレイン融合蛋白質を沸騰水浴内で１０分間沸騰した。この蛋白質溶液を遠心分離し、浮遊物はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。また、ＧＳＴ−α−シヌクレイン融合蛋白質の熱反応性を時間の経過にしたがい３６０ｎｍで吸光度をモニタすることにより定量的に分析した(Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10449-53 (1992))。実験において、図４ａに示すように、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０、ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０、及びＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０は熱処理の前後に蛋白質バンドを示したが、これは、これら蛋白質が熱処理により沈殿しなかったことを示す。したがって、これら蛋白質は耐熱性を有することが分かる。反面、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−６０及びＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−９５は、熱処理前に蛋白質バンドが観察されたが、熱処理後には観察されなかった。したがって、これら蛋白質は熱に不安定で、熱処理により完全に沈殿したことが分かる。
【００８８】
また、ＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の、熱による凝集を、時間の経過にしたがって６５℃での濁度を測定することにより定量的に分析した。図４ｂに示すように、ＧＳＴ蛋白質のＯＤ３６０は熱処理２分後に激しく増加し、殆どの蛋白質は３分後に凝集した。ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−９５はＧＳＴ蛋白質と類似して反応し、完全に凝集した。ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−６０も、凝集が比較的遅延したが、熱処理後に完全に凝集した。図４ａの結果と一致して、３０分間の熱処理後にもＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０、ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０及びＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の蛋白質凝集の証拠はなかった。面白いことには、これら三つの耐熱性ＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質はみんなＡＴＳαを有する。この結果から、熱に不安定な蛋白質はＡＴＳαの導入により耐熱性蛋白質に転換できることが分かる。
【実施例６】
【００８９】
α−シヌクレイン欠失変異体、ＧＳＴ及びＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質のｐＩ及びヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)
以前に、ジャーカットＴ細胞溶解物とヒトの血清からの多くの耐熱性蛋白質が高酸性蛋白質であると報告された。これは、ｐＩ値が蛋白質の耐熱性に関係することを示す（Kim T. D., et al., Molecules and Cells, 7, 78-83 (2000)）。高く荷電した蛋白質は高温でも溶解できるため、蛋白質の溶解度は耐熱性を決定するのに重要な役割を果たす。このような仮説を確認するため、α−シヌクレイン欠失変異体のｐＩ及びヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)をＧＳＴ及びＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質と比較した（表２）。ｐＩ及びヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)はプロットパラム（ProtParam）を使用して計算した。
【００９０】
この結果から、表２に示すように、α−シヌクレイン、Ｓｙｎ６１−１４０、Ｓｙｎ９６−１４０、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０、ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０、及びＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０などの耐熱性蛋白質は異常に低いｐＩとヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)の値を示す。一方、Ｓｙｎ６１−９５を除く、熱に不安定な蛋白質はより高い値を示す。面白いことには、熱に不安定な蛋白質であるＳｙｎ６１−９５は非常に低いｐＩ値を示すが、極めて高いヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)を有する。したがって、低いヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)を有し高く荷電した蛋白質は熱による蛋白質凝集に耐性を有する利点がある。
【００９１】
【表２】
2005517389.tif 000004
【００９２】
ａｐＩ値はProtParamプログラムを使用して計算した（www.expasy.ch）。
ｂヒドロパシーバリュー(hydropathyl value)はProtParamプログラムを使用して計算した（www.expasy.ch）。
ｃＨＲ、耐熱性
ｄＨＬ、熱に不安定
【実施例７】
【００９３】
２価陽イオン結合の影響
Ｃｕ２＋及びＣａ２＋などの幾つかの２価陽イオンはマイクロモル範囲の解離定数でＡＴＳαと特異的に結合すると知られている(Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999); and Nielsen M. S. et al., J. Biol. Chem., 276, 22680-22684 )。Ｚｎ２＋も、未だ結合部位が確認されていないが、α−シヌクレインと特異的に結合すると知られている(Paik S. R. et al., Biochem. J., 340, 821-8 (1999); and Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000))。ＡＴＳαは蛋白質の耐熱性に重要であるため、ＡＴＳαを有するＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の熱による凝集に対する２価陽イオン結合の影響を調査した。２価陽イオンとしては、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２及びＺｎＣｌ２を使用した。ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０、ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０及びＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０融合蛋白質を、それぞれの２価陽イオン０〜１．０ｍＭを有する２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝溶液で最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。この蛋白質溶液を６５℃で３０分間反応させ、３６０ｎｍで見かけの吸光度を測定した。
【００９４】
図５ａ及び図５ｂに示す実験結果から、低濃度の２価陽イオンは融合蛋白質の熱による凝集に影響を与えないことが見つかった。しかし、高濃度では、融合蛋白質が全く沈殿しなかったが、蛋白質の凝集をかなり増大させた。特に、Ｚｎ２＋は熱による蛋白質凝集を増加させるのに最も効果的であると思われた。α−シヌクレインと２価陽イオン間の解離定数はかなり低く、殆どの蛋白質は高濃度の金属イオンにより影響される。したがって、この結果は、ＡＴＳαに２価陽イオンが特異的に結合することは融合蛋白質の熱反応性に影響を与えないことを暗示する。しかし、高濃度の金属イオンの非特異的結合は熱処理中に蛋白質の凝集をさらに誘導することが分かった。
【実施例８】
【００９５】
熱処理後のＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質のＧＳＴ活性
前記実施例で説明した天然型ＧＳＴ蛋白質とは異なり、ＡＴＳαを有するＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質は耐熱性を有することが見つかった。これは、熱に不安定な蛋白質が単にＡＴＳαを導入することにより耐熱性蛋白質に転換できることを示す。続いて、耐熱性ＧＳＴ−融合蛋白質が熱処理後に酵素活性を維持するかを調査した。ＧＳＴ及びＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質を水浴内で１０分間沸騰し、室温で冷却させた。その後、熱処理された蛋白質の酵素活性を比較した。この酵素活性は発色基質である１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＴＮＢ）を使用して分析した（Habig W. H. et al., J. Biol. Chem., 249, 7130-7139 (1974)）。精製されたＧＳＴ及びＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質を、最終濃度が２０μｇ／ｍｌとなるように基質溶液（ｐＨが７．４である０．１Ｍの燐酸緩衝溶液に１ｍＭのＧＳＨ及び２ｍＭのＤＴＮＢを溶解）で希釈し３７℃で１０分間培養した。培養の完了時、３５０ｎｍでの吸光度を測定して酵素活性を分析した。吸光度はスペクトラマクス２５０（Spectromax 250）マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, CA, USA）で測定した。
【００９６】
この結果から、図６ａに示すように、ＧＳＴとＧＳＴ−融合蛋白質はみなこのような厳しい条件で酵素活性を全く喪失した。続いて、熱処理後に初期酵素活性の５０％を失う温度であるＴ５０値を決定するのに使用される熱不活性曲線（図６ｂ）によりＧＳＴ及びＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の熱安定性を定量的に測定した。図６ｂに示すように、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０のＴ５０はＧＳＴよりおよそ２℃高い。面白いことには、ＧＳＴの熱不活性化が蛋白質の熱凝集との良い相関関係を有する。導入されたＡＴＳαは、融合蛋白質の熱凝集を防止して、熱不活性化から酵素を保護することができることが分かる。
【実施例９】
【００９７】
熱により誘導されたＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の構造的変化
以前に、ＣＤ分析で分析した、α−シヌクレインの熱により誘導された二次構造変化が報告された（Kim T. D. et al., Biochemistry, 39, 14839-14846 (2000)）。α−シヌクレインのＣＤスペクトルは、蛋白質に二次構造要素がほぼ全く欠けていることを示した。また、１００℃でのα−シヌクレインのＣＤスペクトルは２５℃でのＣＤスペクトルと少し異なるが、不規則なコイル状のポリペプチドの特性を示した。この結果と一致して、ペプチドのアンフォールドでよく見られる、ＣＤシグナルの直線的温度依存性が観察された。
【００９８】
本発明者らは、ＧＳＴ及びＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質のＣＤスペクトルを測定して、熱変性によるＧＳＴの二次構造変化を分析した。このＣＤスペクトルは温度制御システムが装着されたＪａｓｃｏ−Ｊ７１５分光偏光計（Jasco, Japan）で連続モードで記録した。遠紫外線ＣＤの測定は、２５及び１００℃で、０．５ｎｍのバンド幅を有する１９０−２５０ｎｍの波長範囲、１秒反応時間および１０ｎｍ／分のスキャン速度で行った。示したスペクトルは緩衝溶液信号を差し引いて矯正した５回のスキャンの平均値である。ＣＤデータは平均残余楕円率［θ］（度・ｃｍ２ｄｍｏｌ−１）で表現した。ＣＤ測定のための蛋白質試料は、特に指定がない限り、１０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝溶液で製造し、全てのスペクトルはパス長さが０．１ｃｍであるキュベットで測定した。
【００９９】
熱変性実験は、１℃／分の加熱速度及び１秒の反応速度で行った。温度スキャンデータは２５℃から１００℃まで収集した。ＧＳＴとＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の濃度はそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌと０．３ｍｇ／ｍｌであった。ＣＤスペクトルは、特に指定がない限り、２２２ｎｍの波長で０．５℃ごとに測定した。熱転移の可逆性は、温度減少により記録された新たなスキャンと熱によりアンフォールドされた蛋白質試料の冷却により記録されたほかのスキャンを比較して、検査した。
【０１００】
２５℃でのＧＳＴのＣＤスペクトルから、図７ａに示すように、蛋白質は良く整頓された二次構造要素を有することを発見した。しかし、１００℃では蛋白質沈殿により遠紫外線ＣＤスペクトルは殆ど消えた（データは示さない）。２２２ｎｍでのＧＳＴの楕円率の熱による変化により、ＧＳＴのＴｍがおよそ７０℃であることが見つかった。ＧＳＴは１００℃で完全に沈殿し、ＣＤシグナルは２２２ｎｍで観察されなかったが、これは、ＧＳＴが非可逆的に沈殿したことを示す（データは示さない）。このような結果により、ＧＳＴ蛋白質は温度の増加によりアンフォールドし沈殿する典型的な熱に不安定な蛋白質であることを確認した。
【０１０１】
ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の遠紫外線ＣＤスペクトルを図７ｂに示した。室温でのＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の遠紫外線ＣＤスペクトル（実線）は、この蛋白質がよく整頓された二次構造要素を有することを示す。ＣＤスペクトルは１００℃でこれら要素が減少したが全体的な形態は変わらなかったことを示した（点線）。この結果は、加熱により全くアンフォールドされないことを意味する。面白いことには、１９５ｎｍで新たな吸収バンドが現われたが、これはランダムコイル状のポリペプチドの特性である。蛋白質溶液を冷却した後、遠紫外線ＣＤスペクトルは初期のスペクトル（鎖線）とは区別できるが、これは、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の形態が非可逆的に変化することを示す。熱処理したＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の室温でのＣＤスペクトルは１００℃で得たものと類似しているが、これは、この蛋白質が二つの独立領域、つまり通常の二次構造要素を有する領域とランダムコイル状形態を有する領域からなることを示す。加熱により誘導された形態変化を確認するため、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の融点曲線を温度によって測定した。２２２ｎｍで熱により誘導された楕円率の変化を図７ｂに示す。面白いことには、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の熱によるアンフォールディングは２段階に起こると思われる。第１変化は６２℃で起こり、第２変化は９５℃で起こった。期待の通り、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の温度曲線は非可逆的であると思われる（点線）。
【０１０２】
ＧＳＴは熱不安定な蛋白質である反面、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０は耐熱性蛋白質である。二つの蛋白質の安定性を比較するためには、両蛋白質のＴｍを決定することが有用である。しかし、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０とＧＳＴはペプチドのドメインの数が相違するため、そのＴｍ値を直接比較することは難しい。面白いことには、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０のＴｍ値（第１変化で６２℃）がＧＳＴのＴｍ値（第２変化で７０℃）よりやや低いと思われる。与えられた蛋白質の融点（Ｔｍ）は天然蛋白質と熱により変性された蛋白質間の自由エネルギーの変化に関連するため、融点は蛋白質の形態安定性の熱力学パラメーターとして使用された。したがって、ＧＳＴのＣ−末端にＡＴＳαを導入すると、温度増加などの環境ストレスに対する蛋白質安定性と耐熱性に有利であるが、蛋白質本来の熱安定性には不利であることが分かる。
【実施例１０】
【０１０３】
ｐＨ及び金属により誘導された蛋白質の凝集
ｐＨにより誘導されたＧＳＴ及びＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の凝集を、時間による６５℃での濁度を測定することにより調査した。濁度の測定は、時間による３６０ｎｍでの見かけの吸光度をモニタして行った。各蛋白質を相違したｐＨ値を有する緩衝溶液で、最終濃度が０．２ｍｌ／ｍｌとなるように、希釈させた。緩衝溶液としては０．１Ｍの酢酸塩（ｐＨ４．０及び５．０）、０．１Ｍのクエン酸塩（ｐＨ６．０）、及び０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を使用した。この緩衝溶液で希釈された蛋白質溶液を室温で１時間培養させ、その見かけの吸光度をベックマン（Beckman）分光光度計（DU650, Beckman）で測定した。ＧＳＴとＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の金属による凝集を同様に分析した。各蛋白質を０〜１．０ｍＭのＺｎ２＋又はＣｕ２＋を有する２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝溶液で、最終濃度が０．２ｍｇ／ｍｌとなるように、希釈させた。この蛋白質溶液を室温で３０分間培養させ、３６０ｎｍでの見かけの吸光度を測定した。
【０１０４】
ｐＨによる蛋白質の凝集の結果を図８ａに示す。ＧＳＴ蛋白質のＯＤ３６０はｐＨ７．４からｐＨ５．０まで着実に増加し、ｐＨ４．０で最高値に到達した。一方、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０のＯＤ３６０はｐＨ５．０まで変化しなかったが、おそらくは酸性尾部の中和によりｐＨ４．０で激しく増加した。この結果から、ＡＴＳαは高酸性条件で充分な保護効果を表していないが、ｐＨ４．５以上のｐＨにより誘導される凝集からＧＳＴを完全に保護することができることが分かる。金属により誘導される蛋白質の凝集の結果は図８ｂに示す。また、ＡＴＳαは金属により誘導される凝集からＧＳＴを保護すると思われる。ＧＳＴ蛋白質のＯＤ３６０は０．２〜１．０ｍＭのＺｎ２＋で処理したときに着実に増加するが、ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０のＯＤ３６０はＧＳＴより常に低かった。特に、Ｃｕ２＋により誘導される蛋白質凝集は、ＡＴＳαを導入することにより完全に遮断された。この結果から、ＡＴＳαは金属により誘導される凝集からＧＳＴを保護することができることが分かる。
【実施例１１】
【０１０５】
ストレスにより誘導されるＤＨＦＲの凝集に対するＡＴＳαの影響
ＧＳＴ−ＡＴＳα以外のＡＴＳαを有する融合蛋白質が環境ストレスに対する耐性を示すかを検査するため、本発明者らは、Ｃ−末端にＡＴＳαを有するＤＨＦＲ−シヌクレイン融合蛋白質であるＤＨＦＲ−ＡＴＳαを作製した。
【０１０６】
ＤＨＦＲの蛋白質コーディング領域を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII制限部位を使用して、大腸菌発現ベクターのｐＲＳＥＴＡにサブクローンさせた（ｐＤＨＦＲ）。ＡＴＳαの蛋白質コーディング領域（残基９６−１４０）を下線ＫｐｎＩ制限部位を有する５′−オリゴヌクレオチドプライマー（表３、配列番号１８）と下線ＳａｌＩ制限部位を有する３−オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号１９）を用いてＰＣＲで増幅させた。増幅されたＤＮＡをゲル精製させ、適切な酵素で消化させ、適切な制限酵素で消化されたｐＤＨＦＲに結合させ、ゲル精製させた。その結果の発現ベクター（ｐＤＨＦＲ−ＡＴＳα）をＤＮＡ塩基配列決定法で確認した。
【０１０７】
【表３】
2005517389.tif 000005
【０１０８】
蛋白質の発現のため、発現ベクター（ｐＤＨＦＲ−ＡＳＴα）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換させた。形質転換された細菌を、３７℃で０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地内で吸光度Ａ６００で０．８まで成長させた。この培地に０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加し、さらに４時間培養した。この培養溶液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞を獲得した。この細胞を燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で再懸濁させ、超音波処理で破壊させた。大腸菌株を除去した後、浮遊物を負荷緩衝溶液（０．３ＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾールを有する５０ｍＭの燐酸緩衝溶液（ＰＨ８．０））で平衡されたＮｉ−ＮＴＡカラムにロードした。負荷緩衝溶液で洗浄した後、蛋白質を同一緩衝溶液内に２５０ｍＭのイミダゾールで溶出させた。ＤＨＦＲ−ＡＴＳαをＦＰＬＣゲル−濾過カラムでさらに精製させた。精製された蛋白質を濃縮させセントリコン（Amicon, Beverly, MA）でバッファーチェンジさせた。ＤＨＦＲ−ＡＴＳα融合蛋白質の耐熱性をＤＨＦＲの耐熱性と比較した。ＰＢＳに懸濁された各蛋白質（０．２ｍｇ／ｍｌ）を６５℃及び１００℃の沸騰水浴内で１０分間加熱し、空気中で冷却させた。蛋白質試料を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、浮遊物を１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。ＳＤＳポリアクリルアミド上の蛋白質バンドは、目で見られるように、クマシーブリリアントブルーＲ２５０（Coomassie Brillinant blue R250）で着色した。
【０１０９】
図９に示すように、ＤＨＦＲ−ＡＴＳαは６５℃と１００℃での熱処理前後に蛋白質バンドが観察されたが、これは、熱処理による沈殿が発生しなかったことを示す。一方、ＤＨＦＲは、熱処理前に蛋白質バンドが観察されたが、熱処理後には観察されなかった。これは、蛋白質が熱処理により完全に沈殿し、熱に不安定であることを示す。したがって、天然型ＤＨＦＲは熱ストレスにより容易に沈殿する、熱に不安定な蛋白質である反面、本発明によるＤＨＦＲ−ＡＴＳαは高い耐熱性を有することが分かる。すなわち、ＡＴＳαはＧＳＴだけでなくＤＨＦＲとそのほかの蛋白質に耐熱性を提供し得るペプチドであることが立証された。
【実施例１２】
【０１１０】
ＡＴＳαから由来するペプチド断片を有するＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の耐熱性
α−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域（ＡＴＳα）は４５個のアミノ酸（残基９６−１４０）でなり、１５個のＧｌｕ／Ａｓｐ残基がＡＴＳα領域を介して散在する。本発明者らは、ＡＴＳαから由来するペプチド断片を有するＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の欠失変異体が耐熱性を有するかを検査した。このため、α−シヌクレインのＡＴＳαの遺伝子部をｐＧＥＸベクターに結合させることにより、一連のＧＳＴ−ＡＴＳα欠失変異体を作製した。ＡＴＳαの遺伝子部をコード化するＤＮＡを、自動ＤＮＡ合成機を用いて、表４に示すオリゴヌクレオチドで合成した（配列番号２０−２７）。
【０１１１】
【表４】
2005517389.tif 000006
【０１１２】
センスとして配列番号２０のオリゴヌクレオチドとアンチセンスとして配列番号２１のオリゴヌクレオチドを用いてＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５を作製した。配列番号２２と配列番号２３で表されるオリゴヌクレオチドを用いてＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６を作製した。配列番号２４と配列番号２５で表されるオリゴヌクレオチドを用いてＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０を作製した。配列番号２６と配列番号２７で表されるオリゴヌクレオチドを用いてＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０を作製した。合成されたセンス及びアンチセンスＤＮＡ対をアニーリングし、ｐＧＥＸベクターのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位に結合させることにより、ＡＴＳαの１３個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５（残基１０３−１１５）と、ＡＴＳαの１３個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６（残基１１４−１２６）と、ＡＴＳαの２２個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０（残基１１９−１４０）と、ＡＴＳαの１１個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０（残基１３０−１４０）などのＧＳＴ−ＡＴＳα欠失変異体の一連の発現ベクターを作製した（図１０ａ）。全ての発現ベクター（ｐＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５、ｐＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６、ｐＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０、及びｐＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０）の配列をＤＮＡ塩基配列決定法で確認した。発現ベクターｐＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５、ｐＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６、ｐＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０、及びｐＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、その結果の組換え蛋白質を、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。そのＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質をＦＰＬＣゲル−濾過カラムでさらに精製した。
【０１１３】
そのＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質の耐熱性を検査した。ＰＢＳに懸濁された各蛋白質（０．２ｍｇ／ｍｌ）を沸騰水浴内で１０分間加熱し、空気中で冷却させた。この蛋白質試料を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、浮遊物を１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの蛋白質バンドを、目で見られるように、クマシーブリリアントブルーＲ２５０で着色させた。
【０１１４】
図１０ｂに示すように、ＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質の欠失変異体を高濃度（０．６ｍｇ／ｍｌ）で熱処理したとき、ＡＴＳαの全領域を含むＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０と、ＡＴＳαの２２個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０は全く沈殿しないが、１１個−１３個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６及びＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０は部分的に沈殿した。一方、ＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質の欠失変異体を低濃度（０．２ｍｇ／ｍｌ）で熱処理したとき、全ての蛋白質は全く凝集しなかった（データは示さない）。
【０１１５】
また、ＧＳＴ−ＡＴＳα欠失変異体の熱反応性を、各蛋白質の濃度を６５℃で０．２ｍｇ／ｍｌに設定し、時間による３６０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、定量的に分析した(Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); and Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10449-53 (1992))。本実験において、図１０ｃに示すように、ＧＳＴのＯＤ３６０は熱処理２分後に激しく増大し、殆どの蛋白質は３分後に凝集した。これにひきかえ、ＧＳＴ−ＡＴＳα欠失変異体は熱処理１０分後にも全く沈殿しなかった。つぎに、８０℃で１０分間熱処理した後、濃度を０．２ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌに変化させながら３６０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、ＧＳＴ−ＡＴＳα欠失変異体を定性的に分析した。図１２ｄに示すように、ＡＴＳαの全領域を含むＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０とＡＴＳαの２２個のアミノ酸を含むＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０は濃度に関係なく熱処理後に全く沈殿しない反面、１１個−１３個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６及びＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０は低濃度で全く沈殿しなかったが濃度の増加により段々凝集した。蛋白質の凝集は濃度に比例することが分かる。したがって、ＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質の欠失変異体は天然型ＧＳＴより優れた耐熱性を有し、耐熱性はＡＴＳαの長さによって段々変化することが立証された。したがって、標的蛋白質のサイズ及び特性によってＡＴＳαの長さを適宜選択することにより、最適の効果を得ることができる。
【実施例１３】
【０１１６】
β−シヌクレイン又はγ−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域を有するＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の耐熱性
α−シヌクレインのほかにも、ヒトで発見されるβ−シヌクレイン及びγ−シヌクレインはシヌクレインファミリーをなす蛋白質であって、そのアミノ酸配列の高い相同性を互いに共有する。特に、シヌクレインのＮ−末端側の両親媒性領域はヤマトシビレエイからヒトまで、シヌクレインファミリー間で強く保存された。しかし、シヌクレインファミリー一員のＣ−末端側の酸性領域は配列だけでなくサイズにおいても非常に様々である(Lavedan C., Genome Research, 8, 871-880 (1998); Lucking C. B. and Brice A. Cell Mol Life Sci, 57, 1894-1908 (2000); Iwai A., Biochem. Biophys. Acta, 1502, 95-109 (2000); and Hashimoto M. and Masliah E. Brain Pathol. 9, 707-720 (1999))。本発明者らは、それぞれβ−シヌクレインの酸性尾部（ＡＴＳβ）及びγ−シヌクレインの酸性尾部（ＡＴＳγ）を有するＧＳＴ−ＡＴＳβ及びＧＳＴ−ＡＴＳγ融合蛋白質が耐熱性を有するかを検査した。
【０１１７】
ＡＴＳβ（残基８５−１３４）とＡＴＳγ（残基９６−１２７）をそれぞれｐＧＥＸベクターにサブクローンさせて、ＧＳＴ−ＡＴＳβ及びＧＳＴ−ＡＴＳγ融合蛋白質を製造した。ＡＴＳβの蛋白質コーディング領域は、下線ＢａｍＨＩ制限部位を有する５′オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２８）と下線ＸｈｏＩ制限部位を有する３′−オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号２９）を用いてＰＣＲで増幅させた。ＡＴＳγの蛋白質コーディング領域は、下線ＢａｍＨＩ制限部位を有する５′オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３０）と下線ＥｃｏＲＩ制限部位を有する３′−オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号３１）を用いてＰＣＲで増幅させた。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
増幅されたＤＮＡをゲル精製し、適切な酵素で消化させた後、適切な制限酵素で消化されたｐＧＥＸベクターに結合させ、ゲル精製した。全ての発現ベクター（ｐＧＳＴ−ＡＴＳβ及びｐＧＳＴ−ＡＴＳγ）の配列をＤＮＡ塩基配列決定法で確認した。この発現ベクターを大腸菌ストレインであるＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、組換えＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質（ＧＳＴ−ＡＴＳβ及びＧＳＴ−ＡＴＳγ）を、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。このＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質をＦＰＬＣゲル−濾過カラムでさらに精製した。実施例６と同様に、ＧＳＴ−ＡＴＳβ及びＧＳＴ−ＡＴＳγ融合蛋白質の耐熱性を検査した。ＰＢＳに懸濁された各蛋白質（０．６ｍｇ／ｍｌ）を沸騰水浴内で１０分間加熱し、空気中で冷却させた。蛋白質試料を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、浮遊物を１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の蛋白質バンドはクマシーブリリアントブルーＲ２５０で着色させた。
【０１２０】
図１１ｂに示すように、ＧＳＴ−ＡＴＳαだけでなくＧＳＴ−ＡＴＳβ及びＧＳＴ−ＡＴＳγは熱処理後の蛋白質バンドを示すが、これは沈殿しなかったことを示す。したがって、ＧＳＴ−ＡＴＳβ及びＧＳＴ−ＡＴＳγ融合蛋白質が高い耐熱性を有することが立証された。
【０１２１】
また、前記ＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質の熱反応性を、各蛋白質の濃度を６５℃で０．２ｍｇ／ｍｌに設定し、時間による３６０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、定量的に分析した（Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); and Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10449-53 (1992))。本実験において、図１１ｃに示すように、ＧＳＴ蛋白質は２〜３分後に殆ど凝集した。これにひきかえ、前記ＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質は熱処理１０分後にも全く凝集しなかった。つぎに、前記ＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質を、８０℃で１０分間熱処理した後、濃度を０．２ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌまで変化させながら３６０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、定性的に分析した。図１１ｄに示すように、前記ＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質は濃度に関係なく熱処理後に全く沈殿しなかったが、ＧＳＴ蛋白質は低濃度で完全に沈殿した。したがって、ＡＴＳαのほかにも、ＡＴＳβ及びＡＴＳγもほかの蛋白質に耐熱性を提供し得るペプチドであり、これらは環境ストレスに耐性を有する融合蛋白質の製造に使用することができることが立証された。また、シノレチンのアミノ酸配列がγ−シヌクレインと非常に似ているため、シノレチンの酸性尾部も同様に使用できると推定される。
【実施例１４】
【０１２２】
ポリグルタミン酸からなる酸性尾部を有するＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質の耐熱性
シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域において、Ｇｌｕ／Ａｓｐ残基などの陰電荷で荷電した多数のアミノ酸残基を特徴的に分散させた。本発明者らは、ポリグルタミン酸などの純粋に陰電荷で荷電したペプチド断片を有するＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質が耐熱性を有するかを最終に検査した。このため、ポリグルタミン酸をコードする遺伝子の部分をｐＧＥＸベクターに結合させることにより、一連のＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質を構築した（図１２ａ）。ポリグルタミン酸ペプチドの遺伝子の部分をコード化するＤＮＡは自動ＤＮＡ合成器で合成した（表６、配列番号３２−３５）。配列番号３２及び３３のオリゴヌクレオチドはそれぞれＧＳＴ−Ｅ５（５個のグルタミン酸塩残基を有する）を合成するためのセンス及びアンチセンスＤＮＡであり、配列番号３４及び３５のオリゴヌクレオチドはＧＳＴ−Ｅ１０（１０個のグルタミン酸塩残基を有する）を合成するためのセンス及びアンチセンスＤＮＡであった。合成されたセンス及びアンチセンスＤＮＡ対をアニーリングし、ポリグルタミン酸の遺伝子部をｐＧＥＸベクターのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位に結合させることで、ＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質を発現させるための一連の発現ベクターを構築した。全ての発現ベクター（ｐＧＳＴ−Ｅ５及びｐＧＳＴ−Ｅ１０）の配列をＤＮＡ塩基配列決定法で確認した。
【０１２３】
【表６】
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【０１２４】
発現ベクターのｐＧＳＴ−Ｅ５及びｐＧＳＴ−Ｅ１０を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。その結果の組換え蛋白質をグルタチオン−セファロース４Ｂビーズを用いてアフィニティークロマトグラフィーで精製した。このＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質をＦＰＬＣゲル−濾過カラムでさらに精製した（図１２ｂ）。実施例７で説明した方法に従い、ＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質を製造し精製した後、その耐熱性を検査した。ＰＢＳに懸濁された各蛋白質（０．６ｍｌ／ｍｌ）を沸騰水浴内で１０分間加熱し、空気中で冷却させた。この蛋白質試料を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、浮遊物を１２％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析した。ＧＳＴ−Ｅ５及びＧＳＴ−Ｅ１０は共に熱処理後に蛋白質バンドを示していないが、これは熱処理により完全に沈殿したことを示すものである。したがって、ＧＳＴ−Ｅ５及びＧＳＴ−Ｅ１０はこのような厳しい条件で耐熱性を有しないことが立証された。
【０１２５】
また、前記ＧＳＴ−Ｅ５及びＧＳＴ−Ｅ１０融合蛋白質の熱反応性を、各蛋白質の濃度を６５℃で０．２ｍｇ／ｍｌに設定し、時間による３６０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、定量的に分析した(Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); and Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10449-53 (1992))。本実験において、図１２ｃに示すように、ＧＳＴ蛋白質は２〜３分後に殆ど凝集し、ＧＳＴ−Ｅ５融合蛋白質は同一条件で相当量が凝集した反面、ＧＳＴ−Ｅ１０融合蛋白質は６５℃で１０分間の熱処理後にも全く凝集しなかった。つぎに、ＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質を、８０℃で１０分間熱処理を行った後、濃度を０．２ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌまで変化させながら３６０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、定量的に分析した。図１２ｄに示すように、ＧＳＴ蛋白質は低濃度で完全に沈殿し、ＧＳＴ−Ｅ５蛋白質は高濃度でほとんど沈殿した。これにひきかえ、ＧＳＴ−Ｅ１０蛋白質は同一条件での熱処理後に部分的に沈殿し、濃度の増加によって段々と凝集した。したがって、ポリグルタミン酸の長さが増加するに従い、陰電荷がかなり増加して凝集が減少することが分かる。しかし、面白いことには、同数のグルタミン酸塩残基を有するＡＴＳペプチドに比べ、ポリグルタミン酸末端は耐熱性を提供するのにあまり効果的でないことが分かる。実際に、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０は同数のグルタミン酸塩残基を有するＧＳＴ−Ｅ５よりはるかに優れた耐熱性を示し、２倍多いグルタミン酸塩残基を有するＧＳＴ−Ｅ１０よりもやや高い耐熱性を表した（図１０ｄと図１２ｄを比較）。したがって、陰電荷の増加による蛋白質の溶解度の増加のほかにも、ＡＴＳの特徴的なアミノ酸配列は、ＡＴＳを有する融合蛋白質が環境ストレスに対する高い耐性を表し得るようにするメカニズムに重要な役割を果たすことが示唆された。また、本発明者らは、面白いことに、ポリアルギニンなどの陽電荷で荷電したペプチドを有する融合蛋白質は全く耐熱性を示さないが（データは示さない）、これはＡＴＳの特徴的アミノ酸配列が環境ストレスに耐性を提供するのに非常に重要な役割を果たすことに気付いた。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
以上説明したように、本発明によると、シヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域（ＡＴＳ）のペプチド、又はシヌクレインファミリーのＣ−末端側の酸性領域（ＡＴＳ）のアミノ酸配列のなかで少なくとも１０個かつ５０個以下の連続するアミノ酸残基のオリゴペプチド配列からなる群から選択される一つの配列を含むペプチド、又は前記ペプチドを融合の相手方となる蛋白質に融合して形成された、環境ストレス耐性を有する融合蛋白質は融合の相手方となる蛋白質の本質的な性質は保存しながらも多様な環境ストレスに対する耐性を示し、よって医学、生体工学、飲食物などの多様な産業分野に有効に適用し得ると期待される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
本発明の前記及びそのほかの目的、特徴及び利点は添付図面を参照する以降の詳細な説明からより明らかに理解できるであろう。
【図１】図１ａはＮ−末端側の両親媒性領域（残基１−６０）、疎水性ＮＡＣ領域（残基６１−９５）及びＣ−末端側の酸性領域（残基９６−１４０）からなるα−シヌクレインの概略図である。  図１ｂは熱に不安定な蛋白質であるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ−末端に、全長α−シヌクレイン、両親媒性領域、ＮＡＣ領域、ＮＡＣ領域及び酸性尾領域、及び酸性尾領域のペプチドをそれぞれ結合してなる融合蛋白質ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−６０、ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−９５、ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０及びＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の概略図である。
【図２】図２はα−シヌクレインとＧＳＴ蛋白質の熱反応性を示すＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果である（レーン１：熱処理されていないα−シヌクレイン、レーン２：熱処理されていないＧＳＴ、レーン３：熱処理されたα−シヌクレイン、レーン４：熱処理されたＧＳＴ）。
【図３】図３はＧＳＴ−α−シヌクレイン融合蛋白質をトロンビンで処理して製造したα−シヌクレイン欠失変異体の熱反応性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図４】図４ａはＧＳＴ−α−シヌクレイン融合蛋白質の沸騰前（左側パネル）及び沸騰後（右側パネル）の熱反応性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である（レーン１：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０、レーン２：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１−６０、レーン３：ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−９５、レーン４：ＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０、レーン５：ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０）。  図４ｂはＧＳＴ−α−シヌクレイン融合蛋白質の熱による凝集を示す吸光度グラフである。
【図５】図５ａはＧＳＴ−Ｓｙｎ１−１４０の熱による凝集に対する２価陽イオンの影響を示す吸光度グラフである。  図５ｂはＧＳＴ−Ｓｙｎ６１−１４０及びＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の熱による凝集に対する２価陽イオンの影響を示す吸光度グラフである。
【図６】図６ａはＧＳＴとＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の熱処理前後のＧＳＴ活性を比較するための吸光度グラフである（■：熱処理前、□：熱処理後）。  図６ｂはＧＳＴとＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の温度による酵素活性（左側）と凝集プロファイル（右側）を示す吸光度グラフである（−●−：ＧＳＴ、−○−：ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０、バーは標準偏差を示す）。
【図７】図７ａはＧＳＴの遠紫外線ＣＤスペクトルと融点曲線を示すグラフである（挿入されたグラフは２２２ｎｍでのＧＳＴ蛋白質の温度による残基当たり平均モル楕円率を示す）。  図７ｂはＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の遠紫外線ＣＤスペクトルと融点曲線（挿入されたグラフ）を示すグラフである（実線：２５℃で測定、点線：１００℃で測定、鎖線：１００℃から２５℃まで冷却した後測定）。
【図８】図８ａはｐＨによるＧＳＴとＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の凝集を示すグラフである。  図８ｂは金属によるＧＳＴとＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０の凝集を示すグラフである。
【図９】図９はそれぞれ６５℃と１００℃で１０分間熱処理する前後のＤＨＦＲ−Ｓｙｎ９６−１４０融合蛋白質の熱反応性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である（最後レーンはサイズマーカー蛋白質である）。
【図１０】図１０ａはα−シヌクレインのＣ−末端側の酸性領域（ＡＴＳα；Ｓｙｎ９６−１４０）のアミノ酸からなるペプチドを含むＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の概略図である。  図１０ｂはＡＴＳαから由来するペプチドを有するＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質欠失変異体の沸騰前（上側パネル）及び沸騰後（下側パネル）の濃度０．６ｍｇ／ｍｌでの熱反応性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。  図１０ｃは濃度０．２ｍｇ／ｍｌで６５℃での熱処理により誘導されるＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質欠失変異体の凝集を示す吸光度のグラフである（１：ＧＳＴ、２：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５、３：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６、４：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０、５：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０）。  図１０ｄは０．２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で８０℃で１０分間の熱処理により誘導されるＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質欠失変異体の凝集を示す吸光度グラフである（１：ＧＳＴ、２：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５、３：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６、４：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０、５：ＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０、６：ＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０）。
【図１１】図１１ａはα−シヌクレイン（ＡＴＳα）、β−シヌクレイン（ＡＴＳβ）及びγ―シヌクレイン（ＡＴＳγ）のＣ−末端側の酸性領域を有するＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の概略図である。  図１１ｂは濃度０．６ｍｇ／ｍｌで１０分間沸騰後のＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質（ＧＳＴ−ＡＴＳα、ＧＳＴ−ＡＴＳβ及びＧＳＴ−ＡＴＳγ）の熱反応性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。  図１１ｃは濃度０．２ｍｇ／ｍｌで６５℃での熱処理により誘導されるＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質の凝集を示す吸光度グラフである（１：ＧＳＴ、２：ＧＳＴ−ＡＳＴα、３：ＧＳＴ−ＡＴＳβ、４：ＧＳＴ−ＡＴＳγ）。  図１１ｄは０．２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で８０℃で１０分間の熱処理により誘導されるＧＳＴ−ＡＴＳ融合蛋白質の凝集を示す吸光度グラフである（１：ＧＳＴ、２：ＧＳＴ−ＡＳＴα、３：ＧＳＴ−ＡＴＳβ、４：ＧＳＴ−ＡＴＳγ）。
【図１２】図１２ａはポリグルタミン酸末端部を有するＧＳＴ−ポリグルタミン酸融合蛋白質（ＧＳＴ−Ｅ５及びＧＳＴ−Ｅ１０）の概略図である。  図１２ｂは精製されたＧＳＴ−Ｅ５及びＧＳＴ−Ｅ１０融合蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。  図１２ｃは時間の関数として濃度０．２ｍｇ／ｍｌで６５℃での熱処理により誘導されるＧＳＴ−Ｅ５及びＧＳＴ−Ｅ１０融合蛋白質の凝集を示す吸光度グラフである（１：ＧＳＴ、２：ＧＳＴ−Ｅ５、３：ＧＳＴ−Ｅ１０）。  図１２ｄは０．２ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で８０℃で１０分間の熱処理により誘導されるＧＳＴ−Ｅ５及びＧＳＴ−Ｅ１０融合蛋白質の凝集を示す吸光度グラフである（１：ＧＳＴ、２：ＧＳＴ−Ｅ５、３：ＧＳＴ−Ｅ１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年2月9日(2004.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
α−シヌクレインのＣ−末端の酸性領域のアミノ酸残基１０３−１１５、アミノ酸残基１１４−１２６、アミノ酸残基１１９−１４０及びアミノ酸残基１３０−１４０、β−シヌクレインのＣ−末端の酸性領域のアミノ酸残基８５−１３４、γ−シヌクレインのＣ−末端酸性尾部のアミノ酸残基９６−１２７、並びにシノレチンのＣ−末端の酸性領域のアミノ酸残基９６−１２７からなる群から選択される、環境ストレス耐性を有するペプチド。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記シヌクレインがヒト由来のものである請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
前記環境ストレスが、熱、ｐＨ又は金属である請求項４に記載のペプチド。
【請求項８】
請求項４に記載のペプチドの製造方法。
【請求項９】
請求項４に記載のペプチドと融合の相手方となる蛋白質との融合蛋白質。
【請求項１０】
前記ペプチドが、前記融合の相手方となる蛋白質の本質的な性質に影響を与えないアミノ酸残基の位置で結合している請求項９に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
前記アミノ酸残基の位置が、前記融合の相手方となる蛋白質のＮ−末端及び／又はＣ−末端である請求項１０に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
前記融合の相手方となる蛋白質が、環境ストレスに不安定な蛋白質である請求項９に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
前記環境ストレスに不安定な蛋白質が、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又はジヒドロ葉酸還元酵素である請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
請求項４に記載のペプチドをコードするヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項９に記載の蛋白質をコードするヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１１及び配列番号１２に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１１及び配列番号１３に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１４及び配列番号１５に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１４及び配列番号１２に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１６及び配列番号１７に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号１８及び配列番号１９に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２０及び配列番号２１に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２２及び配列番号２３に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２４及び配列番号２５に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２６及び配列番号２７に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号２８及び配列番号２９に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号３０及び配列番号３１に記載の配列を有するプライマーの対、配列番号３２及び配列番号３３に記載の配列を有するプライマーの対、並びに配列番号３４及び配列番号３５に記載の配列を有するプライマーの対からなる群から選択される、環境ストレス耐性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを検出するための対になったプライマー。
【請求項１７】
請求項１４又は１５に記載のヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の組換えベクターにより形質転換又はトランスフェクトされた細胞。
【請求項１９】
環境ストレスに不安定な蛋白質の本質的な性質は保存しながらも環境ストレス耐性を有する実質的に純粋な融合蛋白質の製造方法において、（ａ）請求項１５の環境ストレス耐性を有する融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を、当該ＤＮＡ配列に制御可能に結合され、ＤＮＡ配列の発現を制御する一つ以上の発現制御配列を有するベクターに挿入する段階と、（ｂ）その結果のベクターで宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトさせる段階と、（ｃ）その結果の形質転換体又はトランスフェクタントを、ＤＮＡが発現するように、適切な条件で適切な培地で培養させる段階と、（ｄ）前記培養液から前記ＤＮＡ配列によりコードされた実質的に純粋な蛋白質を取得する段階とを含んでなる方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
ＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の細菌性発現及び精製
ＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質の発現のために実施例１で作製した発現ベクターを、
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株ｐｌｙｓＳ（Inbitrogen）に形質転換させた。形質転換された細菌を、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で、３７℃で吸光度Ａ６００で０．８まで成長させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した後、４時間さらに培養した。培養液は１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞を獲得した。この細胞を燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で再懸濁させ、超音波処理で破壊させた。細胞片を除去した後、浮遊物をアフィニティークロマトグラフィーで精製した。すなわち、前記浮遊物を、ＰＢＳで平衡されたグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（韓国、大田のPeptron）に通過させ、融合蛋白質を１０ｍＭのＧＳＨ（Sigma, St. Louis, MO）で溶出させた。溶出されたＧＳＴ−シヌクレイン融合蛋白質はＦＰＬＣゲル濾過カラムでさらに精製し、セントリコン（Centricon）濃縮器（Amicon, Beverly, MA）で濃縮させた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
また、ＧＳＴ−ＡＴＳα欠失変異体の熱反応性を、各蛋白質の濃度を６５℃で０．２ｍｇ／ｍｌに設定し、時間による３６０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、定量的に分析した(Lee G.J. and Vierling E., Method Enzymol., 290, 360-65 (1998); and Horwitz J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10449-53 (1992))。本実験において、図１０ｃに示すように、ＧＳＴのＯＤ３６０は熱処理２分後に激しく増大し、殆どの蛋白質は３分後に凝集した。これにひきかえ、ＧＳＴ−ＡＴＳα欠失変異体は熱処理１０分後にも全く沈殿しなかった。つぎに、８０℃で１０分間熱処理した後、濃度を０．２ｍｇ／ｍｌから１．０ｍｇ／ｍｌに変化させながら３６０ｎｍでの吸光度をモニタリングすることにより、ＧＳＴ−ＡＴＳα欠失変異体を定性的に分析した。図１０ｄに示すように、ＡＴＳαの全領域を含むＧＳＴ−Ｓｙｎ９６−１４０とＡＴＳαの２２個のアミノ酸を含むＧＳＴ−Ｓｙｎ１１９−１４０は濃度に関係なく熱処理後に全く沈殿しない反面、１１個−１３個のアミノ酸を有するＧＳＴ−Ｓｙｎ１０３−１１５、ＧＳＴ−Ｓｙｎ１１４−１２６及びＧＳＴ−Ｓｙｎ１３０−１４０は低濃度で全く沈殿しなかったが濃度の増加により段々凝集した。蛋白質の凝集は濃度に比例することが分かる。したがって、ＧＳＴ−ＡＴＳα融合蛋白質の欠失変異体は天然型ＧＳＴより優れた耐熱性を有し、耐熱性はＡＴＳαの長さによって段々変化することが立証された。したがって、標的蛋白質のサイズ及び特性によってＡＴＳαの長さを適宜選択することにより、最適の効果を得ることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
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【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
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【国際調査報告】
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