(57)【要約】溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体よりなり、該気体微粒子リポソーム複合体が、気体充填微粒子；その微粒子表面に吸着した少なくともひとつの脂質と界面活性剤；およびその脂質又は界面活性剤に結合した液体充填リポソームよりなる製剤を記載する。該製剤の製造方法および超音波画像化のための用途も記載する。本発明はまた、該製剤を、心疾患、炎症、感染症、ガン又は血栓塞栓症の患者の治療のために用いる用途も含む。
2005505532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体よりなり、該気体微粒子リポソーム複合体が、
気体充填微粒子
その気体充填微粒子の表面に吸着した少なくともひとつの脂質と界面活性剤、および
その脂質又は界面活性剤に結合した液体充填リポソーム
よりなる製剤。
【請求項２】
気体充填微粒子の気体の水中（25℃、１気圧）における溶解度が約１．０％（ｖ／ｖ）未満である請求項１の製剤。
【請求項３】
気体充填微粒子の平均直径が約０．１μｍから約１０μｍである請求項１の製剤。
【請求項４】
気体充填微粒子の平均直径が約０．５μｍから約１０μｍである請求項１の製剤。
【請求項５】
気体充填微粒子が少なくとも１種の不活性気体よりなる請求項１の製剤。
【請求項６】
不活性気体が希ガスである請求項５の製剤。
【請求項７】
不活性気体がパーフルオロエーテルである請求項５の製剤。
【請求項８】
不活性気体がパーフルオロカーボンである請求項５の製剤。
【請求項９】
気体充填微粒子がその表面上に脂質を吸着したものである、請求項１の製剤。
【請求項１０】
気体充填微粒子がその表面上に界面活性剤を吸着したものである、請求項１の製剤。
【請求項１１】
脂質又は界面活性剤が気体充填微粒子の表面上において単一分子層を形成した請求項１の製剤。
【請求項１２】
脂質又は界面活性剤が気体充填微粒子の表面上において二分子リポソーム層若しくは多分子リポソーム層を形成した請求項１の製剤。
【請求項１３】
界面活性剤が、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤又はアニオン性界面活性剤である、請求項１の製剤。
【請求項１４】
非イオン性界面活性剤が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン、キサンタンガム、ペクチン又はデキストランよりなる請求項１３の製剤。
【請求項１５】
カチオン性界面活性剤が、テトラアルキルアンモニウムイオン、テトラアルキルホスホニウムイオン、又はその適切な塩よりなる請求項１３の製剤。
【請求項１６】
カチオン性界面活性剤が、テトラヘキシルアンモニウム、テトラオクチルアンモニウム、テトラデシルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラヘキシルホスホニウム、テトラオクチルホスホニウム、テトラブチルホスホニウム、テトラフェニルホスホニウム、又はその適切な塩よりなる、請求項１５の製剤。
【請求項１７】
アニオン性界面活性剤が、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート又はその適切な塩よりなる、請求項１３の製剤。
【請求項１８】
アニオン性界面活性剤が、ドデシルサルフェート、パルミチルサルフェート、ドデシルカルボキシレート、パルミチルカルボキシレート又はその適切な塩よりなる、請求項１７の製剤。
【請求項１９】
脂質がホスホリピド、グリコリピド、トリグリセリド又は脂肪酸よりなる、請求項１の製剤。
【請求項２０】
ホスホリピドが、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリンよりなる、請求項１９の製剤。
【請求項２１】
液体充填リポソームが、吸着した脂質または界面活性剤に対して連続した状態で結合した、請求項１の製剤。
【請求項２２】
液体充填リポソームが、気体充填微粒子の外表面の約５０％より多くを占める、請求項１の製剤。
【請求項２３】
それぞれの液体充填リポソームが、独立して約１０ｎｍから約２００ｎｍの直径を有する、請求項１の製剤。
【請求項２４】
それぞれの液体充填リポソームが、独立して約２０ｎｍから約１００ｎｍの直径を有する、請求項１の製剤。
【請求項２５】
それぞれの液体充填リポソームが、独立して気体充填微粒子の直径の約１０％未満である直径を有する、請求項１の製剤。
【請求項２６】
それぞれの液体充填リポソームが、独立して治療薬又は診断薬を該液体充填リポソームの内部に包含する、請求項１の製剤。
【請求項２７】
治療薬が抗凝血剤、血栓溶解剤、抗新生物剤又は抗炎症剤である、請求項２６の製剤。
【請求項２８】
治療薬が、ドキソルビシン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、ナベルビン、シスプラチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、インテグレリン、ロキシフィバンまたはエンブレルよりなる、請求項２６の製剤。
【請求項２９】
診断薬がＸ線造影剤又はＭＲＩ造影剤よりなる、請求項２６の製剤。
【請求項３０】
それぞれの液体充填リポソームが独立して、高親和性の標的化部位を該液体充填リポソームの表面上に結合させた、請求項１の製剤。
【請求項３１】
気体微粒子リポソーム複合体の表面に結合した高親和性標的化部位が
血管新生においてアップレギュレートされる受容体に結合するリガンド、
炎症においてアップレギュレートされる受容体に結合するリガンド又は
アテローム動脈硬化においてアップレギュレートされる受容体に結合するリガンド
よりなる、請求項３０の製剤。
【請求項３２】
気体微粒子リポソーム複合体の表面に結合した高親和性標的化部位が
インテグロンαＶβ３、αＶβ５またはＧｐIIｂ／IIIａに結合するリガンド、
マトリクスメタロプロテイナーゼに結合するリガンド又は
ＬＴＢ４受容体に結合するリガンド
よりなる、請求項３０の製剤。
【請求項３３】
気体微粒子リポソーム複合体の表面に結合した高親和性標的化部位が
1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン‐シクロ(Arg‐Gly‐Asp‐D‐Phe‐Lys)‐ドデカノエート：
DPPE‐PEG3400‐シクロ(Arg‐Gly‐Asp‐D‐Phe‐Lys)‐ドデカノエート：
1‐(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミノ)‐α,ω‐ジカルボニル PEG3400‐2‐｛[7‐(N‐ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)‐4‐アザ‐6‐(2‐メチルプロピル)‐11‐オキサ‐5‐オキソビシクロ[10.2.2]ヘキサデカ‐1(15),12(16),13‐トリエン‐3‐イル]カルボニルアミノ｝‐N‐(3‐アミノプロピル)アセタミド；または
1‐(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミノ)‐α,ω‐ジカルボニル PEG3400‐[7‐(N‐ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)‐4‐アザ‐6‐(2‐メチルプロピル)‐11‐オキサ‐5‐オキソビシクロ[10.2.2]ヘキサデカ‐1(15),12(16),13‐トリエン‐3‐イル]‐N‐｛[4‐(アミノメチル)フェニル]メチル｝カルボキサミド
よりなる、請求項３０の製剤。
【請求項３４】
それぞれの液体充填リポソームが独立して、懸濁溶媒の液体を包含する、請求項１の製剤。
【請求項３５】
気体微粒子リポソーム複合体の平均直径が約０．１μｍから約１０μｍである、請求項１の製剤。
【請求項３６】
気体微粒子リポソーム複合体の平均直径が約０．２μｍから約４μｍである、請求項１の製剤。
【請求項３７】
気体微粒子リポソーム複合体が二つ又はそれ以上の気体微粒子リポソーム複合体の凝集体として存在する請求項１の製剤。
【請求項３８】
凝集体が約１μｍから約１００μｍの直径を有する、請求項３７の製剤。
【請求項３９】
気体微粒子リポソーム複合体が溶媒密度の約０．９０から約１．１０の密度を有する、請求項１の製剤。
【請求項４０】
脂質又は界面活性剤が高親和性標的化部位を含む、請求項１の製剤。
【請求項４１】
脂質又は界面活性剤が治療薬を含む、請求項１の製剤。
【請求項４２】
治療薬がドキソルビシン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、ナベルビン、シスプラチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、インテグレリン、ロキシフィバンまたはエンブレルよりなる、請求項４１の製剤。
【請求項４３】
溶媒が診断薬を含む、請求項１の製剤。
【請求項４４】
診断薬がＸ線造影剤又はＭＲＩ造影剤である、請求項４３の製剤。
【請求項４５】
高親和性標的化部位が
1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミン‐シクロ(Arg‐Gly‐Asp‐D‐Phe‐Lys)‐ドデカノエート：
DPPE‐PEG3400‐シクロ(Arg‐Gly‐Asp‐D‐Phe‐Lys)‐ドデカノエート：
1‐(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミノ)‐α,ω‐ジカルボニル PEG3400‐2｛[7‐(N‐ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)‐4‐アザ‐6‐(2‐メチルプロピル)‐11‐オキサ‐5‐オキソビシクロ[10.2.2]ヘキサデカ‐1(15),12(16),13‐トリエン‐3‐イル]カルボニルアミノ｝‐N‐(3‐アミノプロピル)アセタミド；または
1‐(1,2‐ジパルミトイル‐sn‐グリセロ‐3‐ホスホエタノールアミノ)‐α,ω‐ジカルボニル PEG3400‐[7‐(N‐ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)‐4‐アザ‐6‐(2‐メチルプロピル)‐11‐オキサ‐5‐オキソビシクロ[10.2.2]ヘキサデカ‐1(15),12(16),13‐トリエン‐3‐イル]‐N‐｛[4‐(アミノメチル)フェニル]メチル｝カルボキサミド
よりなる、請求項４０の製剤。
【請求項４６】
超音波画像化が必要な患者において
該患者に請求項１−４５の任意の製剤の有効量を投与し；
該気体微粒子複合体が循環して標的部位に到達するまで十分な時間をおき；そして
患者に対して超音波画像化を実施することよりなる超音波画像化の方法。
【請求項４７】
患者がヒトである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
該製剤の有効量が約１０３から約１０６個の気体微粒子複合体よりなる、請求項４６の方法。
【請求項４９】
十分な時間が約５分から約２時間の間である、請求項４６の方法。
【請求項５０】
十分な時間が約５分から約３０分の間である、請求項４６の方法。
【請求項５１】
そのような治療が必要な患者において
該患者に請求項１−４５の任意の製剤であって、ひとつ又はそれ以上の液体充填リポソームが独立して治療薬を含むものの有効量を投与し；
該気体微粒子複合体が循環して標的部位に到達するまで十分な時間をおき；そして
該患者において、病的部位で該治療薬が微粒子リポソーム複合体から放出されるのに十分な量の超音波エネルギーをその部位に適用することよりなる、心疾患、炎症、感染症、ガン又は血栓塞栓症の治療方法。
【請求項５２】
患者がヒトである請求項５１の方法。
【請求項５３】
それぞれの液体充填リポソームが独立して治療薬を含む、請求項５１の方法。
【請求項５４】
該製剤の有効量が約１０３から約１０１０個の気体微粒子複合体よりなる、請求項５１の方法。
【請求項５５】
リポソーム懸濁液を、少なくともひとつの脂質若しくは界面活性剤を含む水溶液と接触させ；そして
該懸濁液を水中（２５℃、１気圧）の溶解度が約１．０％（Ｖ／Ｖ）未満の気体と十分に混合して、実施例１−４５の任意の製剤を製造する方法。
【請求項５６】
機械的な撹拌により混合を行う、請求項５５の方法。
【請求項５７】
超音波照射により混合を行う、請求項５５の方法。
【請求項５８】
リポソームの水性懸濁液中に高速で気体を注入することにより混合を行う、請求項５５の方法。
【請求項５９】
リポソーム懸濁液を、少なくともひとつの治療薬および界面活性剤を含む水溶液と接触させ；そして
該懸濁液を水中（２５℃、１気圧）の溶解度が約１．０％（Ｖ／Ｖ）未満の気体と十分に混合して、実施例１−４５の任意の製剤を製造する方法。
【請求項６０】
機械的な撹拌により混合を行う、請求項５９の方法。
【請求項６１】
超音波照射により混合を行う、請求項５９の方法。
【請求項６２】
リポソームの水性懸濁液中に高速で気体を注入することにより混合を行う、請求項５９の方法。
【請求項６３】
少なくともひとつの界面活性剤と液体充填リポソームを含む水溶液よりなる容器と；
水中（２５℃、１気圧）の溶解度が約１．０％（Ｖ／Ｖ）未満の気体を該水溶液中に導入する手段よりなる、実施例１−４５の任意の製剤を製造するためのキット。
【請求項６４】
容器がヘッドスペースを含む、請求項６３のキット。
【請求項６５】
ヘッドスペースが少なくともひとつの不活性気体を含み、該気体の水中（２５℃、１気圧）の溶解度が約１．０％（Ｖ／Ｖ）未満のものである、請求項６３のキット。
【請求項６６】
不活性気体がパーフルオロカーボンである、請求項６３のキット。
【請求項６７】
不活性気体がパーフルオロエーテルである、請求項６３のキット。
【請求項６８】
不活性気体が希ガスである、請求項６３のキット。
【請求項６９】
溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体よりなり、該気体微粒子リポソーム複合体が、
気体充填微粒子
その気体充填微粒子の表面に吸着した少なくともひとつの脂質と界面活性剤、および
その脂質又は界面活性剤に結合した液体充填リポソーム
よりなる、治療用又は診断用の製剤。
【請求項７０】
溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体よりなり、該気体微粒子リポソーム複合体が、
気体充填微粒子
その気体充填微粒子の表面に吸着した少なくともひとつの脂質と界面活性剤、および
その脂質又は界面活性剤に結合した液体充填リポソーム
よりなる製剤を、心疾患、炎症、感染症、ガン又は血栓塞栓症の治療のための医薬の製造に用いる用途。
【請求項７１】
溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体よりなり、該気体微粒子リポソーム複合体が、
気体充填微粒子
その気体充填微粒子の表面に吸着した少なくともひとつの脂質と界面活性剤、および
その脂質又は界面活性剤に結合した液体充填リポソーム
よりなる製剤を、必要な患者において診断目的の画像化を行うための医薬の製造に用いる用途。
【請求項７２】
溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体よりなり、該気体微粒子リポソーム複合体が、
気体充填微粒子
その気体充填微粒子の表面に吸着した少なくともひとつの脂質と界面活性剤、および
その脂質又は界面活性剤に結合した液体充填リポソーム
よりなる製剤を、必要な患者において超音波の画像化を行うための医薬の製造に用いる用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体（microsphere liposome composite:MSLC）を包含する製剤を提供するものである。気体微粒子リポソーム複合体には、気体充填微粒子；その気体充填微粒子の表面上に吸着された少なくともひとつの脂質と界面活性剤；およびその脂質又は界面活性剤に結合した、液体で満たされたリポソームが含まれる。その液体で満たされたリポソームの外表面上には、MSLCを指向的に運搬し、受容体、酵素、mRNAその他関連する生物学的標的物の選択的画像化を目的として、標的化のためのリガンド（即ち、診断薬の標的化部分）を組み込むことができる。加えて、その液体で満たされたリポソームにはひとつ又はそれ以上の薬物（例えば、治療薬および／又は診断薬）をそのリポソームの中に含めることができる。かくして、その治療薬又は診断薬は病理学的部位若しくは器官へ選択的に運ばれて局所的な投与が可能となる。そして、標的化MSLCが結合した病理学的部位において音響的エネルギーの適用により薬物放出が促進され、選択的手法により治療薬又は診断薬の高い局所濃度を達成できる。
【背景技術】
【０００２】
超音波画像化は患者（例えば、哺乳類）体内の構造を画像化し診断や治療を補助するための有用な方法である。超音波画像の際には、音波を発生し受信するために超音波スキャナーを用いることができる。その際、該スキャナーを画像化すべき部位を覆う体表面上において、スキャナーから発生した音波を画像化すべき部位の方向に向ける。そして、該スキャナーがその下にある部位から反射された音波を検出し、そのデータを画像化する。体内の各構造の音響的性質（例えば、密度等）は、典型的には、透過速度や構造の密度に依存する。音響的性質の変化は異なる物質の界面（即ち、固体、液体および気体の界面）上で最も顕著である。従って、超音波エネルギーは異なる物質間の界面を含む部位に対して向けられると、物質の異なる音響的性質が異なる反射的特徴を作り出す。得られる超音波画像の質は異なる物質間の界面を有することにより強調されるから、異なる構造間の音響的性質の差異を増加させ、超音波画像化により得られる画像の質を向上させることは有用である。
【０００３】
超音波画像化の質に影響し得る方法のひとつは、体内の血管系に超音波造影剤として機能する造影剤を導入することである。造影剤を注入し微小血管系に灌流させるとより鮮明な画像を得ることができる。この薬剤は音波反射剤として機能し、血管系と他の構造の界面を効果的に強調することができる。
気体を取り込んだ液体又は固体の造影剤は当業者によく知られている。例えば、米国特許4,235,871号、4,265,251号、4,442,843号、4,533,254号、4,572,203号、4,657,756号、4,681,199号、5,088,499号、5,147,631号、5,228,446号、5,271,928号、5,380,519号、5,413,774号、5,527,521号、5,531,980号、5,547,656号、5,558,094号、5,573,751号、5,585,112号、5,620,689号、5,715,824号、5,769,080号、欧州特許公報0122624号、0727225号、国際特許公開公報WO96/40285号、WO99/65467号を参照できる。これら造影剤により提供される微小気泡は、微小気泡の気体とその環境の液体との間の音響的性質の差異により音波反射剤として機能する。
【０００４】
Feinstein（米国特許4,572,203号）は超音波造影剤として、ある種の粘性液体を超音波処理して得られる、直径6-20ミクロンの微小気泡を開示する。Feinsteinはまた、超音波造影剤として、気体ではなく、例えば、ガラス又はグラファイトのような、金属微粒子を含む固体若しくは半固体を開示している。これら粒子は毛細管を通過し得る程度に十分小さく、超音波造影剤として機能する。更には、磁性粒子〔例えば、マグネタイト（Fe3O4）〕を内部に含む、アミノ酸高分子マトリックス（例えばアルブミン）よりなる微小粒子を開示する。
Tickner（米国特許4,265,251号）は超音波増強剤として、ある種の糖組成物であって、中空で内部が気体で満たされた「微小気泡(microbubble)」粒子を開示している。
【０００５】
Rasor et al.,（米国特許）は超音波画像化に使用される、血液に可溶な、固体物質の微小粒子（直径が1-50ミクロン）凝集物を図示している。これらは、粒子間の空間に気体を含むもの、粒子表面に気体が吸着したもの又は粒子の内部構造の全体部分に気体をふくむもの等がある。ここでは、次の固体物質；種々の糖類、NaCl、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、CaCl2、AlCl3が用いられる。
Hilmann et al.,（EP0122624）には、種々の有機親油性化合物を含み、気体を封入した固体界面活性剤を含む微小粒子が包含される。また、界面活性物質粒子と非界面活性物質粒子、例えば、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、種々の糖類等との組み合わせも開示されている。
【０００６】
Glajch et al.,（米国特許5,147,631号）は、気体若しくは液体を取り込んだ無機物質よりなる多孔性粒子を開示する。開示された物質としては、それぞれモノマー若しくはポリマーとしてのホウ酸塩、アルミナ、炭酸塩、シリカ、リン酸塩等の他、その薬学的に許容される有機若しくは無機のカチオン塩が含まれる。
Ungerは診断用の画像化目的のため、気体で満たされたパーフルオロカーボンよりなる微小粒子を開示し（米国特許5,547,656号、5,527,521号）、更に一般的な診断用の超音波画像化目的のため気体若しくは気体前駆体を満たしたリポソーム組成物、およびこれら造影剤の製造と使用方法を開示した（米国特許5,228,446号、5,585,112号、5,769,080号、5,715,824号）。
【０００７】
Unger（米国特許5,088,499号）は超音波造影剤として、気体で満たされたリポソームおよびその用途を開示する。ここには、pH、温度、圧等により活性化される気体の前駆体、又は気体を含む物質や、その他固体若しくは液体の造影剤が含まれる。
ここでUngerにより開示された上記物質の場合、気泡を封入したリポソーム膜が、リン脂質のような両親媒性脂質膜による、よく知られた単層若しくは多層のヘッド・ツウ・テイル構造として記述されている。かくしてUngerの組成物は、液体で満たされる内部が気体で置き換えられた古典的なリポソームである。
【０００８】
Quayは超音波造影剤として、低Ｑ因子（低拡散率）の自由気体の微小気泡利用方法を開示した（米国特許5,573,751号、5,558,094号）。但し、Quayはこれらの特許において拡散率の低い種々の気体よりなる自由気体の微小気泡を開示しているが、これら微小気泡の組成や構造については開示していない。
Schneider（米国特許5,271,928号、5,380,519号、5,531,980号）は、細かく分割された気体の中空の球又は小球であって、界面活性剤等により安定化された微小気泡の懸濁液を開示した。
Schneiderの微小気泡の特許（上記5,271,928号、5,380,519号、5,531,980号）には、超音波造影剤が、気体微小気泡周辺の実質的な境界層を欠く微小気泡よりなるものとして開示されている。Schneiderによれば、これら微小気泡は一過性の外膜で結合しているにすぎない（米国特許5,531,980号、1欄）。
【０００９】
Schneiderによる微小気泡の上記（米国特許5,271,928号、5,380,519号、5,531,980号）開示は微小気泡を基本とする超音波造影剤の調製方法を志向するものであるが微小気泡そのものの好ましい組成／構造については言及されていない。
Schneider（米国特許5,413,774号）は微粒子による超音波造影剤として、リポソーム実質境界層を有する微小胞であって、溶解度の低い気体をその中に含むものを開示する。しかしながら、微小風船の構造や組成は記載がなく、むしろ、選択された溶解度の低い気体を用いてこれら微小胞や微小風船による造影剤を調製する方法を記載している。
上記の造影剤は一般的な脈管構造、特に心臓の画像化のために提案されたものである。
【００１０】
特定の器官、系その他の体内部位の画像化は種々の特定病態の診断に有用である。その例としては、腫瘍、血塊、感染部位を指定した方法で特異的に画像化することが含まれる。Quay, et al.,（欧州特許出願EP727225）は、所望の分子に組み込んで複合体を形成させる細胞接着因子（CAM）リガンドを含む組成物の用途を図示する。CAMは界面活性剤又はアルブミン担体に組み込まれ、また、十分に高い蒸気圧を有し体温では気体である化学薬品を構成する
Unger（WO96/40285）は、気体を含む標的化リポソームを記載する。これは、診断用画像化または生物活性薬の輸送のために体内の特定組織を標的化することができる。
【００１１】
気体微粒子の乳化液又は懸濁液（その代わりに、微小気泡という）は次のいずれかである；1)溶液中で界面活性剤により安定化され気体と液体との界面で表面張力の減少を引き起こす自由な微小気泡（即ち、固定した実質的外膜を微小気泡表面に有しない）、または2)実質境界層を有する真の小胞であって、液体溶媒中の懸濁液として気体微粒子を安定化するもの。これら素材の実際上の困難のひとつは、関連する、音響的に活性な、粒子サイズ直径0.5〜10μmのものは懸濁されている水性溶媒とは異なる密度を有するということである。それで、これら微粒子は速やかに分離するという傾向を当然に有する（即ち、微小気泡の懸濁液が不均一となる）。そのため、微粒子の分離が生じる前に造影剤は混合したらすぐに使用する必要がある。
【００１２】
気体微粒子を薬物輸送のプラットフォームとして用いる場合（Unger, WO96/40285およびQuay, EP0727225参照）は、治療的部分は脂質若しくは高分子境界層に化学的若しくは物理的に吸着することにより気体微粒子の表面上に組み込まれる。実際上の困難は、気体微粒子を囲む表面上の物質に対して、治療薬の限られた量しか吸着若しくは結合しないことである。
Allen et al.,（米国特許5,620,689号）は、化学療法薬を封入したリポソームを用いてB細胞又はT細胞の新生物を扱う方法を開示する；該リポソームは、周囲を覆うポリエチレングリコールを介してリポソーム表面に結合した生物的方向付けのための置換基を有している。See et al.,（WO99/65467）は径が200nmに満たないリポソームを薬物で満たす方法を開示する。これらの開示は、文献上に現れた同じリポソーム薬物輸送の開示の大きな分野の典型であり、いずれも液体で満たされたリポソームのみであって、ここで提供するMSLC組成物の形態の気体微粒子の開示はない。
【００１３】
上記の造影剤の使用にもかかわらず、超音波画像、例えば心筋組織の画像は品質が悪く、変わりやすくて定量化ができなかった。最近まで、総体的な診断結果は幾分失望的であった。かくして、体内における血管域と組織のコントラストを改良し、超音波画像の質を向上させる超音波画像化の試薬が依然として求められている。求められているのは希薄な水性懸濁液とした場合に安定で優れた音響的応答をすることのできる試薬である。加えて、そのような試薬は分離して浮遊する微粒子が最小限度に抑えられたものである。
人体の組織と血管域の描写を改良し超音波画像を鮮明化し質を向上させる超音波画像化試薬の要求が存在し、存在し続けている。加えて、正常組織に対する毒性が高く治療係数の低い薬物のために、病変部位への薬物輸送制御の改良が、必要である。
【００１４】
発明の要約
本発明は超音波画像化における解像度増強および超音波刺激（即ち、音響的に）による薬物放出のための製剤を提供する。該製剤により、希釈された水性懸濁液において優れた安定な音響的応答を与えることのできる安定な気体微粒子（細かく分割された気泡）懸濁液が提供される。また、該製剤は既知の製剤に比べて、気体を満たした微粒子につきより高濃度の活性薬物を目的の組織へ輸送することが可能であり、それにより病変部位における薬物又は遺伝子の局所濃度を高め意図した治療上の利点を確保することができる。超音波を散乱させる性質に優れ、血管内で超音波の後方散乱シグナルを選択的に増加させる。そして、その血管内における超音波の後方散乱シグナルの増加が周辺固形組織に対するコントラストを改善する。加えて、該製剤は分離して浮遊する微粒子が最小限度に抑えられている。
【００１５】
本発明は、溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）を包含する製剤を提供する。気体微粒子リポソーム複合体には、気体充填微粒子；その気体充填微粒子の表面上に吸着された少なくともひとつの脂質と界面活性剤；およびその脂質又は界面活性剤に結合した、液体で満たされたリポソームが含まれる。
本発明はまた、そのような画像化を必要とする患者（例えば、哺乳類）における超音波画像化の方法を提供する。その方法には、本発明製剤の有効量を患者（例えば、哺乳類）に投与し；気体で満たされた微粒子複合体が標的部位に到達するのに十分な時間を置き；患者（例えば、哺乳類）の超音波画像化を実施する方法が含まれる。
【００１６】
本発明はまた、そのような治療を必要とする患者（例えば、哺乳類）における心臓疾患、感染症、ガンまたは血栓塞栓性疾患を治療する方法を提供する。その方法には、本発明製剤の有効量を患者（例えば、哺乳類）に投与し、その中にはひとつ若しくはそれ以上の液体充填リポソームが独立して治療薬を含み；気体で満たされた微粒子複合体が標的部位に到達するのに十分な時間を置き；患者（例えば、哺乳類）の標的部位に十分な超音波エネルギーを与えて、病変部位において微粒子リポソーム複合体からの治療薬の放出を引き起こす方法が含まれる。
本発明はまた、該発明の製剤を製造する方法を提供する。その方法には、少なくともひとつの界面活性剤と脂質を含む水溶液中のリポソーム懸濁液と接触させ；１気圧、25℃で水に対する溶解度が約1.0％（v/v）未満の気体を製剤化に十分なだけ該懸濁液と混合する方法が含まれる。
【００１７】
本発明はまた、該発明の製剤を製造する方法を提供する。その方法には、少なくともひとつの治療薬および少なくともひとつの界面活性剤若しくは脂質を含む水溶液中のリポソーム懸濁液と接触させ；１気圧、25℃で水に対する溶解度が約1.0％（v/v）未満の気体を製剤化に十分なだけ該懸濁液と混合する方法が含まれる。
本発明はまた、該発明の製剤を製造するためのキットを提供する。そのキットには、少なくともひとつの界面活性剤と脂質および液体充填リポソームを含む水溶液；該水溶液中に１気圧、25℃で水に対する溶解度が約1.0％（v/v）未満の気体を導入する手段を入れた容器が含まれる。
本発明はまた、そのような治療を必要とする患者（例えば、哺乳類）における心臓疾患、感染症、ガンまたは血栓塞栓性疾患の治療薬の製造のために本発明の製剤の使用を提供する。その製剤には、溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体が含まれ、該複合体には、気体充填微粒子；その気体充填微粒子の表面上に吸着された少なくともひとつの脂質と界面活性剤；およびその脂質又は界面活性剤に結合した、液体で満たされたリポソームが含まれる。
【００１８】
本発明はまた、そのような画像化を必要とする患者（例えば、哺乳類）で用いられる超音波画像化のための薬品の製造における本発明の製剤の使用を提供する。その製剤には、溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体が含まれ、該複合体には、気体充填微粒子；その気体充填微粒子の表面上に吸着された少なくともひとつの脂質と界面活性剤；およびその脂質又は界面活性剤に結合した、液体で満たされたリポソームが含まれる。
本発明はまた、そのような画像化を必要とする患者（例えば、哺乳類）で用いられる診断用の画像化のための薬品の製造における本発明の製剤の使用を提供する。その製剤には、溶媒中に懸濁された気体微粒子リポソーム複合体が含まれ、該複合体には、気体充填微粒子；その気体充填微粒子の表面上に吸着された少なくともひとつの脂質と界面活性剤；およびその脂質又は界面活性剤に結合した、液体で満たされたリポソームが含まれる。
【発明の開示】
【００１９】
図２および図３において、本発明は水性溶媒(2)中に分散された気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）(1)を提供する。該気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）(1)には適切な不活性気体(4)よりなる気体充填微粒子(3)が含まれる。脂質(5)および／又は界面活性剤(6)はその気体充填微粒子(3)の表面(12)に吸着されている。液体充填リポソーム（LFL）(7)は脂質(5)および／又は界面活性剤(6)に結合している。LFL(7)は治療薬(8)または診断薬(9)をLFL(7)の内部液体(10)中に含むことができる。加えて、標的化部分(11)をLFL(7)の表面(13)に結合させることができる。
本明細書では、「気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）」(1)とは、該微粒子の外側表面(12)上に吸着された、少なくともひとつの脂質(5)および界面活性剤(6)を有し、また該脂質(5)または界面活性剤(6)に結合した液体充填リポソーム(7)を有する気体充填微粒子(3)をいう。
【００２０】
本明細書において、「界面活性剤」(6)とは、液体中で界面張力を減少させる、イオン性若しくは非イオン性のあらゆる物質をいう。界面活性剤(6)の語には、分子量1,000に満たない両親和性分子および気体充填微粒子(3)と周辺の水性溶媒(2)との間の界面張力を減少させ得る高分子をいう。
本明細書において、「液体充填リポソーム（LFL）」(7)とは、内部に液体(10)（即ち、内部分の液体）を含むリポソームをいう。液体充填リポソーム(7)は単一層、二重層または多重層構造をとり得る。液体充填リポソーム(7)は、吸収された液体又は界面活性剤(6)に連続的に結合する。
本明細書において、気体充填微粒子(3)表面を覆う脂質(5)又は界面活性剤(6)に結合した液体充填リポソームに関し「連続的な」又は「切れ目のない」の語は、気体充填微粒子(3)の外部表面(12)の有意な部分（例えば、少なくとも約50%）が液体充填リポソーム(7)で覆われることをいう。
【００２１】
本明細書において、「標的化部分」の語は、生体適合性のある有機分子、生体適合性のある無機分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド類縁体、ポリサッカライドその他の分子であって受容体、酵素、mRNA又はDNAに対して高い親和性を有するものをいう。ここで生体適合性のある有機分子、生体適合性のある無機分子、タンパク質、ペプチド、ペプチド類縁体、ポリサッカライドその他の分子はin vivoの病変部位で周辺の正常組織との関連においてその表現を改められる。加えて、原則的にはこの標的化部分は液体充填リポソーム(7)の表面に結合している。
本明細書において、「高親和性」の語は、単一の標的化部位と生物学的標的（受容体、酵素、mRNA又はDNA）との相互作用に関する解離定数、Kd、で表現した場合約１μmに満たない結合親和性をいう。
【００２２】
本明細書において、「患者」とは所定の疾患又は異常を有しており、特定の疾患又は異常の治療を受ける必要がある対象をいう。適切な患者としては例えば動物が含まれる。適切な動物としては、例えば哺乳類が含まれる。そして、適切な哺乳類としては、例えばヒトが含まれる。
本明細書において、「処理」または「治療」の語は、患者における疾患または異常の治療をいい；(i)患者、特にそのような疾患や異常になりやすいが未だ発症とは診断されていない患者において、該疾患又は異常の発生を防ぐこと；(ii)そのような疾患や異常を阻止する、即ち、その進行を止めること；および／又は(iii)そのような疾患や異常を緩和、即ち、退行させることが含まれる。
【００２３】
気体充填微粒子
本明細書において、「気体充填微粒子(gas-filled microsphere)」とは溶媒中に懸濁された微小気泡(microbubble)であって、溶媒の凝固点より上で沸点より下、約0気圧を超えて約5気圧以下（例えば、標準温度、標準圧）において名目ばかりの球状を有する。
図２および図３に図解されたように気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）(1)は気体充填微粒子(3)を含む。気体充填微粒子(3)は通常、音響的に活性である。気体充填微粒子(3)は通常、25℃、１気圧において水に対し1.0％（v/v）に満たない溶解度である。加えて、気体充填微粒子(3)は通常、平均径が約0.1〜10μmである。好ましくは、気体充填微粒子(3)の平均径は約0.5〜10μmである。
【００２４】
気体充填微粒子(3)は通常、一種又はそれ以上の適切な不活性気体(4)を含む。本発明における適切な不活性気体は超音波造影剤の分野でよく知られている。本発明に有用な不活性気体(4)は、例えばUnger, et al.（米国特許5,547,656、5,527,521、5,228,446、5,585,112、5,769,080、5,715,824）、Quay et al.,（米国特許5,573,751、5,558,094）、Schneider（米国特許5,271,928、5,380,519、5,531,980）に開示されている。これらは、気体および気体の前駆体（即ち、減圧又は温度上昇により気相へ移行する液体）を含み得る。好ましい不活性気体とは血中での溶解度が低く、非活性、非代謝性、および／または患者（例えば、哺乳類）で非毒性のものである。本発明で有用な不活性気体として適切なものには、例えばパーフルオロカーボンガス（例えば、C2-C6のパーフルオロカーボン）、パーフルオロエーテルガス、窒素および希ガス（ヘリウム、アルゴンおよびネオン）が含まれる。
【００２５】
気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）
気体微粒子リポソーム複合体(1)には、気体充填微粒子(3)；気体充填微粒子(3)の外表面に吸着した、少なくともひとつの脂質(5)と界面活性剤(6)；および該脂質(5)又は界面活性剤(6)に結合した液体充填リポソーム(7)が含まれる。気体微粒子リポソーム複合体(1)（MSLC）は通常、平均直径が約0.1〜約10μmである。好ましくは、気体微粒子リポソーム複合体(1)は平均直径が約0.2〜約4μmである。気体微粒子リポソーム複合体(1)は通常、溶媒密度に対して約0.90から約1.10の密度を有する。気体微粒子リポソーム複合体(1)（MSLC）は二つ又はそれ以上の気体微粒子リポソーム複合体の会合体として存在し得る。会合体は通常、直径が約1〜100μmである。
【００２６】
脂質および界面活性剤
図２又は図３に図解したように、気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）(1)は気体充填微粒子(3)の外表面に吸着した少なくともひとつの脂質(5)と界面活性剤(6)を含む。脂質(5)および界面活性剤(6)は、気体充填微粒子(3)の外表面(12)上において単一分子層、二分子層または多分子層として存在し得る。界面活性剤(6)は気体充填微粒子(3)の外表面(12)上に速やかに吸着し、低溶解度不活性気体(4)又は他の気体の表面張力を減少させる。加えて、界面活性剤(6)はLFLが接着する接触面として働く。
【００２７】
界面活性剤(6)は、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤またはアニオン性界面活性剤のいずれも可能である。適切な非イオン性界面活性剤としては、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン、キサンチン、ガム、ペクチンデキストラン等が含まれる。適切なカチオン性界面活性剤としては、例えばテトラヘキシルアンモニウム、テトラデシルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、テトラヘキシルホスホニウム、テトラデシルホスホニウム、テトラブチルホスホニウム、テトラフェニルホスホニウムおよびその適切な塩が含まれる。適切なアニオン性界面活性剤としては、アルキルスルホネート、アルキルカルボキシレート、およびその適切な塩が含まれる。更に適切なアニオン性界面活性剤としては、ドデシルサルフェート、パルミチルサルフェート、ドデシルカルボキシレート、パルミチルカルボキシレート、およびその適切な塩が含まれる。
適切な脂質(5)としては、例えばホスホリピド、グリコリピド、トリグリセリドおよび脂肪酸が含まれる。適切なホスホリピドとしては、ジパルミトイルホスファチジルコリンクロリド、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、およびジオレオイルホスファチジルコリンが含まれる。
【００２８】
液体充填リポソーム（LFL）
図２又は図３に図解したように、気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）(1)は脂質(5)または界面活性剤(6)に結合した液体充填リポソーム(7)（LFL）を含む。液体充填リポソーム(7)の存在により、界面活性剤、又は脂質で封入された気体充填微粒子(3)が安定化される。一つ又はそれ以上の液体充填リポソーム(7)は、通常、懸濁液(2)（即ち、溶媒(2)）の液体を含む。好ましくは、各液体充填リポソーム(7)は、通常、懸濁溶媒(2)の液体を含む。懸濁溶媒(2)の液体が液体充填リポソーム(7)の内部（例えば、内部空間）液中に存在することによって、微粒子組成物の密度が懸濁溶媒の密度と近い（約２０％以内）ものとなりそのため微粒子の浮遊および／または分離が最小化される。
LFL(7)は内部の液体充填空間にひとつまたはそれ以上の薬物（治療薬(8)および／または診断薬(9)）を含むことができる。LFL(7)は界面活性剤又は脂質で覆われた気体充填微粒子(3)に結合しているので、内部気体の超音波刺激によって破裂しひとつ又はそれ以上の薬物（治療薬(8)および／または診断薬(9)）を病的な器官または組織において放出することができる。しかしながら、液体充填リポソーム(7)はそれ自身限られた音響的活性しか持ち合わせていない。
【００２９】
LFL(7)は界面活性剤、又は脂質で封入された気体充填微粒子(3)に結合してこれを安定化する。このことは、MSLC(1)の密度を懸濁溶媒のそれと近いものとし、それにより気体微粒子の浮遊および／または分離を最小化する。また、調製後の合理的な一定時間内（例えば最大約30分）は、気体微粒子懸濁液を大きさの分布において均一なもの（例えば、約1から5μm）とする。
液体充填リポソーム(7)は通常、微粒子表面上の50%より大きな範囲を占有する。液体充填リポソーム(7)はまた、吸着した脂質(5)や界面活性剤(6)に対して原則的に連続した状態で結合する。この方向付けがMSLC(1)に対して傑出した浮力を与え、希釈した水性懸濁液において、音響的再現性のある応答力をもつ優れた懸濁液であって、比較的安定なものを提供する。
【００３０】
LFL(7)の大きさも重要である。液体充填リポソーム(7)は、気体充填微粒子(3)の約10%未満の直径を有するものが好ましい。in vivo超音波画像化や薬物輸送剤として最大の関心がある範囲は、ほとんどの場合、直径約1〜5μmのMSLC(1)であって、直径が100nmより小さい液体充填リポソーム(7)よりなるものである。より大きな液体充填リポソーム(7)（例えば、直径約0.2μmより大きいもの）は、体内毛細血管の直径を超える直径を有するMSLC(1)を造る。これは毛細管閉塞、およびこれに続く血液微小循環阻害に関連した組織に対する生物学的毒性という危険な状況を作り出す。従って、直径が約100nm未満のLFL(7)を利用して、生存している患者（例えば、哺乳類）にとって安全な次元にある正しいMSLC(1)を造ることが当然に好ましい。各液体充填リポソーム(7)の直径は通常、約10〜200nmである。好ましくは、各液体充填リポソーム(7)の直径は通常、約20〜100nmである。加えて、各液体充填リポソーム(7)は気体充填微粒子(3)の直径の約10%未満の直径を有するものが好ましい。
【００３１】
図２又は図３に図解したように、ひとつ又はそれ以上のLFL(7)はひとつ又はそれ以上の薬物（例えば、治療薬(8)および／または診断薬(9)）を内部の液体充填空間に含むことができる。各液体充填リポソーム(7)は独立して、その内部液中に（例えば、治療薬(8)および／または診断薬(9)）を含むことができる。LFL(7)は、界面活性剤又は脂質で覆われた気体充填微粒子(3)に結合しているので、超音波刺激によって破裂しひとつ又はそれ以上の薬物（治療薬(8)および／または診断薬(9)）を病的な器官または組織において局在した高濃度の状態で放出することができる。高エネルギー超音波は通常、気体充填微粒子(3)を急速に膨張させ収縮させて気泡を破壊することができる。気体充填微粒子(3)により捕捉された超音波エネルギーはMSLC(1)を断片化し破壊し、次には、MSLC(1)の表面に結合したLFL(7)の内部に含まれるひとつ又はそれ以上の薬物（例えば、治療薬(8)）を放出する。
【００３２】
治療薬(8)の適切な類としては、例えば、抗凝血剤、血栓溶解剤、抗新生物薬、抗炎症薬等がある。特定の適切な治療薬(8)は例えば（PCT/US99/13682）に開示され、例えば、ドキソルビシン、シクロホスファミド、アドリアマイシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、ナベルビン、シスプラチン、組織プラスミノーゲンアクチベータ、インテグレリン、ロキシフィバン、エンブレル等がある。本発明の超音波刺激による薬物放出の好ましい具体的態様においては、MSLC(1)が高親和性標的化部分(11)とLFL(7)の溶液中の治療薬（例えば、治療剤(8)）の両方を含み、気泡により輸送される薬物量と治療係数を最大化する。
診断薬(9)の適切な類としては、例えばＸ線造影剤、ＭＲＩ造影剤が含まれる。特定の適切な診断薬としては、例えば、非イオン性ヨード化Ｘ線造影剤、イオン性ヨード化Ｘ線造影剤、含ガドリニウムＭＲＩ造影剤、含鉄ＭＲＩ造影剤、含マンガンＭＲＩ造影剤等が含まれる。
【００３３】
LFLにおける診断薬(9)の使用は、超音波画像の増強（例えば、後方散乱）およびＸ線若しくはＭＲＩ画像の増強をひとつのMSLC組成物で可能にした。ひとつ又はそれ以上の薬物（例えば、治療薬(8)および／または診断薬(9)）を選択された病的状態へ標的化輸送するためには、本発明のLFL(7)は、液体充填リポソーム(7)の表面(13)に共有結合で結合又は吸着した高親和性の標的化部分(11)で修飾することができる。かくして、液体充填リポソーム(7)は、通常、該液体充填リポソーム(7)の表面に結合したひとつ又はそれ以上の高親和性の標的化部分(11)を有することができる。これにより、病的部位に対してin vivoで超音波による対照増強を与え得るLFL(7)を提供できる。これは、病的部位の機能不全細胞中に存在し、過剰に発現しまたは変化した受容体、酵素、mRNAもしくはDNAに対して高親和性を有するリガンドをLFL(7)に対し提供することにより達成される。あるいは、正常組織の選択的画像化を目的として、これらLFL(7)に結合した標的化部位を正常組織の受容体に結合させることができ、隣接する病的組織はLFL(7)の標的とされる受容体を欠くので音響的増強が存在せず対照的となる。ひとつまたはそれ以上のLFL(7)は内部の液体溶媒中に、懸濁溶媒(2)中からひとつまたはそれ以上の適切な診断薬を含んでいてもよい。
【００３４】
MSLC(1)を特定の病的部位に向けるため、LFL(7)の表面(13)に組み込むことのできる適切な高親和性標的化部分(11)が以前に開示されている。例えば、Unger et al.,（PCT/US96/09938）、Allen（米国特許5620689号）、Quay（EP0727225）には指向的超音波造影剤又は薬物輸送組成物の成分である界面活性剤(6)若しくは脂質(5)に組み込むことのできる生物学的標的化部分の例が多く提供されている。この中には、腫瘍特異的抗体、接着分子のような受容体特異的ペプチドやペプチド類縁体等がある。
【００３５】
適切な特異的標的化部分(11)としては、例えば1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-ドデカノエート；DPPE-PEG3400-シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)-ドデカノエート；1-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミノ)-α,ω-ジカルボニル PEG3400-2｛[7-(N-ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)-4-アザ-6-(2-メチルプロピル)-11-オキサ-5-オキソビシクロ[10.2.2]ヘキサデカ-1(15),12(16),13-トリエン-3-イル]カルボニルアミノ｝-N-(3-アミノプロピル)アセタミド；1-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミノ)-α,ω-ジカルボニル PEG3400-[7-(N-ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)-4-アザ-6-(2-メチルプロピル)-11-オキサ-5-オキソビシクロ[10.2.2]ヘキサデカ-1(15),12(16),13-トリエン-3-イル]-N-｛[4-(アミノメチル)フェニル]メチル｝カルボキサミドが含まれる。
【００３６】
本発明で用いられる液体充填リポソーム(7)は当業者によく知られている。本発明で用いられるリポソーム調製のために好ましい物質中にはホスホリピドがあり、本質的にカチオン性、アニオン性又は両性イオン性であって、混合物として用いることもできる。リポソーム調製又はその組成物のための多くの材料が存在する。例えば、New（R.R.C.New 編、「リポソーム、その実践的アプローチ」, Oxford Univ. Press, Oxford, UK,1990）, Tyrrell（「リポソームの新しい観点」、D.A.Tyrrell, T.D.Heath, C.M.Colley & B.E.Ryman, Biochimica & Biophysica Acta, 457(1976),259-302）、Schneider（米国特許4,224,179)、Woodle（MC Woodle and D.Papahadjopoulos、Methods in Enzymology 171,193,1989）を参照できる。特に、Papahajopoulos（米国特許4,235,871）は治療薬を含むLFLsの調製法を記載している。
【００３７】
MSLCの平均粒度分布および安定性の制御
MSLCの粒度と安定性は種々のパラメータ、例えば、溶液中の脂質濃度；組成物中に含まれるLFLの直径、高分子界面活性剤（例えば、ポリエチレングリコール、PEG）の分子量；用いられる高分子の濃度等を通じて制御できる。
１．溶液中のホスホリピドの濃度
脂質濃度を変えることにより、液体充填リポソームの安定性および粒度分布を制御することができ、次には、懸濁液中で形成され安定化されるMSLCの粒度を調節することになる。懸濁液中の安定化MSLCの平均粒度は、最初のLFLの粒度および濃度に直接比例する。LFLの粒度と数は利用できる脂質（例えば、ホスホリピド）の量に依存するから、最初の脂質濃度が懸濁液中で安定化されるMSLCの粒度分布と数に直接影響することとなる。
【００３８】
２．LFLの直径
脂質（例えば、ホスホリピド）濃度とは無関係に、懸濁液中のMSLC粒度はLFL粒度を物理的手段により変更することによって変えることができる。LFL粒度は、押し出し又は超音波処理等の手段により変えることができ、これらはリポソーム科学の分野でよく知られている（R.R.C.New 編、「リポソーム、その実践的アプローチ」, Oxford Univ. Press, Oxford, UK,1990参照）。既に述べたようにLFL粒度の変化がMSLCの粒度分布を変えることになる（即ち、約100nmより小さな粒度領域の小さなLFLが約10μmより小さい領域の小さなMSLCを作り出す）。
【００３９】
３．組成物に用いられる界面活性剤の分子量
組成物中の界面活性剤高分子（イオン性又は非イオン性）の分子量は生成するMSLCの平均直径に影響するものとして利用できる。例えば、高分子量ポリエチレングリコール（PEG）は、組成物中の他の成分／脂質に共有結合により結合した場合、および遊離のPEGとして溶液中に加えた場合のいずれも、一度気体が系中に導入されるとより大きな粒度の気体性気泡含有MSLCの安定化に用いることができる。例えば、PEG分子量を500から10,000の範囲で変化させるとMSLCの直径を調節することができる。
４．高分子濃度
リポソーム懸濁液中の高分子界面活性剤の濃度を変化させることによりMSLCの粒度を制御することができる。組成物中の高分子濃度の上昇は、通常、懸濁液中のMSLCの平均粒度および／または濃度を増大させる
【００４０】
気体微粒子リポソーム複合体の調製
本願の気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）は、界面活性剤および液体充填リポソームを含む水性懸濁液に、水に対する溶解度の低い気体を混合することにより調製できる。これは、機械的撹拌や、超音波処理または界面活性剤とLFLを含む液体中に気体を高速注入することにより達成できる。
最初のLFLを形成するためには、それらが経口的に許容される（即ち、非毒性）であることを条件として、表面活性物質と、例えばグリセロール、プロピレングリコールのような非水性成分、又は、例えばポリサッカライド、タンパク質、合成高分子のような懸濁補助剤を含む大量の水溶液中にホスホリピドを懸濁することができる。本発明のMSLCを製造するために使用されるLFLを調製する方法は、以前に、Woodle（M.C.Woodle, D.Papahadjopoulos, Method in Enzymology, 171,193, 1989）に記載されている。
【００４１】
MSLCの生物学的標的化が望ましい場合は、LFLの表面に共有結合で結合させた、又は吸着させた高親和性の標的化部分を持たせることができる。その標的化部分はMSLCの表面に吸着され、又は、好ましくはリン酸エステルとして共有結合によりLFLに結合させ、又はMSLCの成分であるPEGに結合させる（Allen、米国特許5,620,689参照）ことができる。超音波刺激による薬物放出のためのMSLCの場合は、界面活性剤と薬物を含む溶媒中での調製により、その内部溶液中に治療薬を含むLFLを調製し、続いて適切な不活性ガスを含む溶媒を混ぜるか音波処理を行うことができる。
約100nmより小さい粒度のLFLの直径を調整することは、超音波画像化および薬物放出のため必要な粒度範囲（例えば、直径約0.5μmより大で約10μmより小）のMSLCを形成し安定化させるために重要である。LFLの粒度を制御する方法は文献（R.R.C.New 編、「リポソーム、その実践的アプローチ」, Oxford Univ. Press, Oxford, UK,1990, pp.36-85参照）に記載がある。所望の粒度のLFLを作るための微小流動化技術はCook, et al.,（米国特許4,533,254）に記載されている通り極めて有効的である。
【００４２】
構造の証拠
この新規な構造〔気体微粒子リポソーム複合体（MSLC）という〕の証拠を示すため、実施例１のリポソーム系を調製して四つの技術、即ち、光学顕微鏡、透過電子顕微鏡、蛍光プローブおよび軟Ｘ線顕微鏡を用いて分析した。これら技術によりマクロ構造（約１μmより大きな粒度）、微細構造（10nm〜1000nm）および化学構造（分子レベルで）の微小環境についての情報が提供される。
【００４３】
光学顕微鏡検査
光学顕微鏡検査により物体の形状と大きさがミクロンの範囲で決定できる。従って、直径が約1〜10μmの範囲のMSLC組成物は、1000X顕微鏡を用いて見ることができ、直径約1から10mmまで拡大できる。光学顕微鏡検査は、MSLCが球状の形状であり直径が約1〜10μmの粒度範囲に存在することを示すことができた。
MSLC懸濁液を調製（例えば、実施例１のように）後、シリンジ（B-D5ccシリンジで正確なガイド22 1/2G針；0.70mmｘ40mm）を用いてバイアルから0.5mLをゆっくりと引き出す。試料をHanging Dropスライド（直径18mm；深さ0.5mm）上においてカバースライドで覆った。それから、顕微鏡オイルを一滴カバースライド上に落とした。試料は10倍の接眼レンズと油浸系アクロマート（Oil Immersion Achromatic）対物レンズ（100倍）を備え、全体として1000倍の倍率を与え得るオリンパス社BHA-P顕微鏡を用いて検査した。結果の写真は、粒度が1μmから10μmまでの範囲で球状の物体を示した。直径が約2μmより大きい、気体で充填されたMSLCはより小さな粒度の一次的なMSLC単位の集まりと思われる。
【００４４】
電子顕微鏡検査
MSLCの表面上におけるLFLの存在は透過電子顕微鏡検査（TEM）により示された。透過電子顕微鏡検査は標本に照射するのに電子ビームを利用する。電子ビームは高真空状態で作用して1,000,000倍まで拡大することができる。高真空も電子ビームも研究系に損害を与える。従って、多くの試料を検査するためには試料は薄く、乾燥していて、通常、対照のための染色を含む。
リポソーム構造を検査するためのひとつの技術は、逆染色法である。逆染色法によれば電子的密度の高い物質で標本を囲み又は包埋することにより、構造の像が強調される。TEMの場合、リンタングステン酸（PTA）を染色剤として用い、界面活性剤−リポソーム混合物を含む含水系に気体を混入する前と混入してMSLCを形成した後に試料を検査する。
【００４５】
気体を混入する前の界面活性剤−LFLの系（非活性化試料）については、前活性化試料の６滴を0.3%PTA染色液1mlに加えて静かに振盪する。混合物を5分間そのままにしておき、その後混合物の１滴をグリッド板に付した。該グリッドを濾紙片の上で30分間空気乾燥し、その後TEMのためのグリッド格納ケースに移した。
MSLCの試料（気体を混入後）については、その１滴を0.3%PTA染色液1mlに加えて静かに混合した。それから、１滴をグリッドに付した。過剰の溶液はwickingと空気乾燥で除いた。
TEMの写真によればパーフルオロカーボンガスを混入する前の組成物は約50nmから100nmのリポソームを含むことを示す。混入後のMSLC懸濁液（パーフルオロカーボンガスを混入の後）のTEMの写真によれば、約300nmから1000nmのMSLCを示し、これらは脂質や界面活性剤の殻のない気体充填微粒子で約50nmから100nmのリポソーム単位が表面に沿って並んでいる。
【００４６】
蛍光分析
リポソーム系の一般的な化学的性質を研究するために蛍光プローブ実験が用いられた。蛍光プローブはフルオロフォア、典型的なものはピレンであって、リポソームの特定領域に局在し蛍光を発することによりエネルギー光量子に応答する。この蛍光発光を微小環境（微小極性）および系中におけるフルオロフォアの局在化濃度の決定に用いることができる。
この実験においては、ピレンの蛍光スペクトルを比較するために、対照の溶媒（界面活性剤および液体充填リポソームを含まない溶液）のバイアル、界面活性剤および液体充填リポソーム（パーフルオロカーボンガスを混入する前）のバイアルおよびMSLCを含む懸濁液（組成物にパーフルオロカーボンガスを高速で混入した後）のバイアルにピレンを注入した。対照の溶媒としては、80%塩化ナトリウム溶液（9%NaCl）、10%プロピレングリコールおよび10%グリセロールの混合物を用いた。MSLC懸濁液は実施例１の記載の通りに調製した。
研究結果によると、対照溶媒中のピレンの微小環境下における極性は純粋な水性環境下において溶解させた場合と一致した。界面活性剤／液体充填リポソーム系（ガス混入前）の微小環境下におけるピレンの極性はLFLの脂質膜に溶解したピレンと一致した。パーフルオロカーボンガスを界面活性剤／液体充填リポソーム系に高速で機械混入した後のピレンの局在濃度の上昇が認められ、その様子はTEM実験において観察されたMSLC構造と同様のリポソーム凝集物の存在と一致した。
【００４７】
軟Ｘ線顕微鏡検査
軟Ｘ線とは約100から1000eVのエネルギーのＸ線である。これらエネルギーは炭素や酸素のような小さな原子番号のＫ殻吸収端によく適合する。これらのＸ線の波長は1から10nmの範囲であり、可視光線のそれは350から700nmである。これにより分解能の高い画像化が可能となる。軟Ｘ線顕微鏡検査は試料を破壊することなく高い分解能を提供する；Ｘ線は試料に殆ど影響しない。
MSLC懸濁液をこの軟Ｘ線顕微鏡の技術でもって研究した。試料を二枚の窒化ケイ素膜の間に調製した。この膜は厚さ100nm、大きさが3mmｘ3mmで厚さ200ミクロン、9mmｘ9mmのサイズのシリコンフレーム中にある。一方の膜をウェットセルの各サイドに装てんした後、MSLCの物質のごく小さな一滴（約5μLより少ないが、量は明確でない）をシリンジで一方の膜に載せた。これら実験では試料の希釈や前処理は行っていない。次に、ウェットセルの二つの部分を一緒においてスクリューで固定した。二つの膜の試料の層の厚さを可視光の顕微鏡でチェックした。層の厚さが適当でなければ、正しい厚さとなるようスクリューで調節した。水の小さな一滴をウェットセルの貯蔵スロットにおいて試料の乾固を防いだ。貯蔵スロットをテープ小片でシールしてウェットセルを顕微鏡に装てんした。
【００４８】
軟Ｘ線顕微鏡検査の結果、パーフルオロカーボンガスを高速で混入した後の系は約300nmから500nmのMSLCを含み、約50nmから100nmの液体充填リポソーム単位を本質的に境界面全体に沿って有することが示された。
MSLCは、診断超音波用途のため、一般的な目的としては超音波造影剤として使用することができる。また、体内でMSLCの選択的局在化を提供するため、MSLCの表面上にある液体充填リポソームに結合または吸着した生物学的標的化部分を含むように修飾することができる。生物学的標的化MSLCは特定の病気の過程の標的化対照超音波画像化に有用である。加えて、これら生物学的標的化MSLCは薬物の局在化輸送にも用いることができ、この場合薬物は、液体充填リポソーム内に封入されin vivoでMSLCが超音波に晒されたときに放出される。
この製剤は注入や注射により静脈内にまた腹腔内に投与することができる。製剤の溶液は水中で、時には非毒性の界面活性剤を混合して調製できる。また分散液も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、又は適切な他の経口用希釈剤を含む水溶液中で調製できる。
【００４９】
注射や注入に適した薬学的投与形態には、無菌の水溶液、分散液、無菌の注射用若しくは注入用溶液、分散液、時にはリポソーム中に封入したもの等を用時調製するために用いられる製剤よりなる無菌の粉末等が含まれる。すべての場合において、最終の投与形態は無菌の液体で製造および貯蔵の条件で安定でなければならない。液体の担体又は基材は薬学的に許容される希釈剤、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）等である。例えばリポソームの生成や、分散剤の場合に求められる粒度の維持、又は界面活性剤の使用により、適切な流動性も維持されなければならない。多くの場合、例えば糖、緩衝液又は塩化ナトリウムのような等張剤を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な懸濁は、ゼラチン、セルロース、ポロビニルピロリドン、又は同様の懸濁補助剤を使用することにより可能となる。
上記に列挙した必要な成分を組み込んで無菌的濾過をすることにより無菌の注射溶液が調製される。無菌の注射溶液調製のため無菌の粉末を利用する場合は、好ましい調製方法は真空乾燥と凍結乾燥の技術であり、有効成分および前もって無菌濾過した溶液に含まれる所望のいずれの成分をも含む粉末が得られる。
【００５０】
微粒子リポソーム混合物（MSLC）は、約１０３から１０９の微粒子リポソームを含む懸濁液として患者又はヒトに投与される。MSLCが体内を循環する十分な時間の経過後に、超音波画像化の機械（臨床現場で普段から使用されているようなもの）を用いて画像化し、またはMSLCを崩壊（高エネルギー又は超音波の繰り返し照射でもって）させて関心のある器官又は病的部位、例えば心臓、腫瘍上又は炎症部位等で治療薬を放出する。
本発明の製剤が造影剤として機能する能力は当該分野でよく知られた薬理学的モデルにより決定できる。例えば、Villanueva et al.,（Villanueva,F.S., Glasheen,W.P., Sklenar,J., Kaul,S., Circulation, 88,596-604(1993)）を参照できる。
本発明の製剤が治療薬として機能する能力は当該分野でよく知られた薬理学的モデルにより決定できる。例えば、Unger（PCT/US961/09938）（WO96/40285）を参照できる。
【実施例】
【００５１】
本発明は以下の非限定的な実施例によって図解される。
一般的な診断目的のMSLC造影剤の製造方法
実施例１
グリセロール（10ml）とNaCl（680±2mg）を水（最終体積100ml）に含ませ、グリセロール生理食塩水（100mL）を調製した。100mlの容量フラスコ中、DPPC（ジパルミトイルホスファチジルコリン）（40.0mg）、MPEG500DPPE（ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン）（30.0mg）およびDPPA（4.5mg）をプロピレングリコール（10ml）と混合し熱水浴上（70℃）において15分間超音波処理し透明な溶液とした。それからグリセロール生理食塩水を加えて最終体積を100mLとし懸濁液をよく混合した。懸濁液（1.6mL）を2mLのホウケイ酸塩ガラスバイアルに移した。上部空間にパーフルオロプロパンガスを満たしストッパーでバイアルを密栓した。ストッパーはWest Gray V50 lyo 13mm,4416/50エラストマー系のものを用いた。シールは反転型アルミナシールを用いた。液体懸濁液を含むバイアルをIONOS Ionomix（登録商標）を用いて45秒間振盪した。振盪後、懸濁液は乳状白色となった。
生物学的に標的化した診断用MSLC剤の調製
実施例２および実施例３は、新生血管系腫瘍に対する標的化部分（αvβ3拮抗剤）を包含する本発明の超音波造影剤の合成について述べる。
【００５２】
実施例２
A部分．1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-シクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys）-ドデカノエートコンジュゲート
【化１】
2005505532.tif 000003
ジスクシニミジルドデカノエート（0.424g、1mmol）；1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DPPE）（1.489g、1mmol）およびシクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys）TFA塩（0.831g、1mmol）（この環状ペプチド標的化部分の合成については、米国出願09/281474参照、該方法を参考にしてここに取り込んだ）をクロロホルム（25ml）に溶解して撹拌する（5分間）。炭酸ナトリウム（1mmol）および硫酸ナトリウム（1mmol）を加えて溶液を窒素下、室温にて撹拌する（18時間）。クロロホルムを減圧下に除去し、調製用HPLC又は再結晶により粗生成物から題記化合物を精製する。
【００５３】
B部分．造影剤組成物の調製
1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-シクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys）-ドデカノエートコンジュゲートを他の三つの脂質、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホチド酸；1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンおよびN-（メトキシポリエチレングリコール5000カルバモイル）-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンと相対重量比で2:4:54:40で混合する。該脂質混合物（1mg/mL）、塩化ナトリウム（7mg/mL）、グリセリン（0.1mL/mL）およびプロピレングリコール（0.1mL/mL）を含む水懸濁液、pH6-7を2ccのグラスバイアル中に調製した。バイアルを脱気してパーフルオロプロパンで置換し、密封をした。懸濁液を密封バイアル中、歯科用アマルガメータで30-45秒間振盪すると乳状白色液が生じるが、これは新生血管画像化のための超音波造影剤として適切に用いられる。
【００５４】
実施例３
A部分．ωアミノ-PEG3400-シクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys）；
【化２】
2005505532.tif 000004
トリエチルアミン（3mmol）をN-Boc-PEG3400-スクシンイミジルエステル（1mmol）およびシクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys）（1mmol）のジメチルホルムアミド（DMF）溶液（25mL）に加える。反応混合物を窒素下室温で終夜撹拌し、減圧下で溶媒を除去する。粗生成物をトリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（１：１体積比）に溶解し、4時間撹拌する。揮発性のものを除去しジエチルエーテル中で粉砕して題記化合物をTFA塩として単離する。
【００５５】
B部分．DPPE-PEG3400-シクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys）-ドデカノエートコンジュゲートの調製
【化３】
2005505532.tif 000005
ジスクシニミジルドデカノエート（1mmol）、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DPPE）（1mmol）およびωアミノ-PEG3400-シクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys）TFA塩（1mmol）をクロロホルム（25mL）中に溶解し5分間撹拌した。炭酸ナトリウム（1mmol）および硫酸ナトリウム（1mmol）を加えて溶液を窒素下、室温にて撹拌する（18時間）。DMFを減圧下に除去して調製用HPLC又は再結晶により粗生成物から題記化合物を精製した。
【００５６】
C部分．造影剤組成物の調製
DPPE-PEG3400-シクロ（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys）-ドデカノエートコンジュゲートを他の三つの脂質、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホチド酸；1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンおよびN-（メトキシポリエチレングリコール5000カルバモイル）-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンと相対重量比で1:6:54:41で混合する。該脂質混合物（1mg/mL）、塩化ナトリウム（7mg/mL）、グリセリン（0.1mL/mL）およびプロピレングリコール（0.1mL/mL）を含む水懸濁液、pH6-7を2ccのグラスバイアル中に調製する。バイアルを脱気してパーフルオロプロパンで置換し、密封をする。懸濁液を密封バイアル中、歯科用アマルガメータで30-45秒間振盪すると乳状白色液を生じるが、これは超音波造影剤として適切に用いられる。
以下の実施例４および５はマトリックスプロテイナーゼ阻害剤に対する標的化部分を包含する本発明の超音波造影剤の合成について述べる。これら造影剤は腫瘍、アテローム斑、CHF（うっ血性心不全）における心組織変性等で認められる細胞外マトリックスの分解している部位に対してMSLCを標的化するのに有用である。この組成物は音響的に活性なMSLCを病的部位に局在化させ、これら病変の選択的な超音波画像化を行うのに有用である。或いは、実施例８又は９で記載されるように、MSLCに結合したLFLの内部に治療薬を含むものを調製することができ、これらは病気の特定部位で超音波刺激により薬物を放出するのに有用である。
【００５７】
実施例４
1-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミノ)-α,ω-ジカルボニルPEG3400-2-｛[7-(N-ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)-4-アザ-6-(2-メチルプロピル)-11-オキサ-5-オキソビシクロ[10,2,2]ヘキサデカ-1(15),12(16),13-トリエン-3-イル]カルボニルアミノ｝-N-(3-アミノプロピル)アセタミドコンジュゲートの合成
【化４】
2005505532.tif 000006
スクシンイミジルエステルDSPA-PEG-NHSエステル（Shearwater Polymers, Huntsville,Alabama）(1mmol)をクロロホルム（25ml）に溶解し、2-｛[7-(N-ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)-4-アザ-6-(2-メチルプロピル)-11-オキサ-5-オキソビシクロ[10,2,2]ヘキサデカ-1(15),12(16),13-トリエン-3-イル]カルボニルアミノ｝-N-(3-アミノプロピル)アセタミド・TFA塩（1mmol）（この標的化部分の合成は米国特許出願60/182,627参照）を加える。炭酸ナトリウム（1mmol）および硫酸ナトリウム（1mmol）を加えて溶液を窒素下、室温にて撹拌する（18時間）。DMFを減圧下に除去して調製用HPLCにより粗生成物から題記化合物を精製する。
【００５８】
造影剤組成物の調製
1-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミノ)-α,ω-ジカルボニルPEG3400-2-｛[7-(N-ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)-4-アザ-6-(2-メチルプロピル)-11-オキサ-5-オキソビシクロ[10,2,2]ヘキサデカ-1(15),12(16),13-トリエン-3-イル]カルボニルアミノ｝-N-(3-アミノプロピル)アセタミドコンジュゲートを他の三つのホスホリピド、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホチド酸；1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンおよびN-（メトキシポリエチレングリコール5000カルバモイル）-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンと重量比で1:6:54:41で混合する。該脂質混合物（1mg/mL）、塩化ナトリウム（7mg/mL）、グリセリン（0.1mL/mL）およびプロピレングリコール（0.1mL/mL）を含む水懸濁液、pH6-7を2ccのグラスバイアル中に調製する。バイアルを脱気してパーフルオロブタンで置換し、密封をする。懸濁液を密封バイアル中、歯科用アマルガメータで30-45秒間振盪するとマトリックスメタロプロテイナーゼを標的としたMSLCの乳状白色液を生じるが、これは超音波造影剤として適切に用いられる。
【００５９】
実施例５
1-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミノ)-α,ω-ジカルボニルPEG3400-[7-(N-ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)-4-アザ-6-(2-メチルプロピル)-11-オキサ-5-オキソビシクロ[10,2,2]ヘキサデカ-1(15),12(16),13-トリエン-3-イル]-N-｛[4-(アミノメチル)フェニル]メチル｝カルボキサミドコンジュゲートの合成
【化５】
2005505532.tif 000007
スクシンイミジルエステルDSPA-PEG-NHSエステル（Shearwater Polymers, Huntsville,Alabama）(1mmol)をクロロホルム（25ml）に溶解し、[7-(N-ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)-4-アザ-6-(2-メチルプロピル)-11-オキサ-5-オキソビシクロ[10,2,2]ヘキサデカ-1(15),12(16),13-トリエン-3-イル]-N-｛[4-(アミノメチル)フェニル]メチル｝カルボキサミド・TFA塩（1mmol）（この標的化部分の合成は米国特許出願60/182,627参照）を加える。炭酸ナトリウム（1mmol）および硫酸ナトリウム（1mmol）を加えて溶液を窒素下、室温にて撹拌する（18時間）。DMFを減圧下に除去して調製用HPLCにより粗生成物から題記化合物を精製する。
【００６０】
造影剤組成物の調製
1-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミノ)-α,ω-ジカルボニルPEG3400-[7-(N-ヒドロキシカルバモイル)(3S,6R,7S)-4-アザ-6-(2-メチルプロピル)-11-オキサ-5-オキソビシクロ[10,2,2]ヘキサデカ-1(15),12(16),13-トリエン-3-イル]-N-｛[4-(アミノメチル)フェニル]メチル｝カルボキサミドコンジュゲートを、他の三つのホスホリピド、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホチド酸；1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリンおよびN-（メトキシポリエチレングリコール5000カルバモイル）-1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルエタノールアミンと相対重量比で1:6:54:41で混合する。該脂質混合物（1mg/mL）、塩化ナトリウム（7mg/mL）、グリセリン（0.1mL/mL）およびプロピレングリコール（0.1mL/mL）を含む水懸濁液（1.6mL）、pH6-7、を2ccのグラスバイアル中に調製する。バイアルを脱気してパーフルオロブタンで置換し、密封をする。懸濁液を密封バイアル中、歯科用アマルガメータで30-45秒間振盪するとマトリックスメタロプロテイナーゼを標的としたMSLCの乳状白色液を生じる。この懸濁液は超音波造影剤として適切に用いられる。
【００６１】
生物学的に標的化した治療用MSLC剤の調製
実施例６
実施例３のホスホリピド造影剤組成物にドキソルビシン（100-200mg/ml）を加える。その1から2ミリリットルをバイアルに移す。バイアルを脱気してパーフルオロブタンで置換し、密封をする。懸濁液を密封バイアル中、歯科用アマルガメータで30-45秒間振盪すると治療用の乳状白色MSLC懸濁液を生じる。
実施例７
実施例４のホスホリピド造影剤組成物にシクロホスファミド（100-200mg/ml）を加える。その1から2ミリリットルをバイアルに移す。バイアルを脱気してパーフルオロブタンで置換し、密封をする。懸濁液を密封バイアル中、歯科用アマルガメータで30-45秒間振盪すると治療用の乳状白色MSLC懸濁液を生じる。
【００６２】
実施例８
実施例５のホスホリピド造影剤組成物にシクロホスファミド（100-200mg/ml）を加える。その1から2ミリリットルをバイアルに移す。バイアルを脱気してパーフルオロブタンで置換し、密封をする。懸濁液を密封バイアル中、歯科用アマルガメータで30-45秒間振盪すると超音波活性治療用途の乳状白色MSLC懸濁液を生じる。
実施例９
実施例５のホスホリピド造影剤組成物に組織プラスミノーゲンアクチベータ（10-100mg/ml）を加える。その1から2ミリリットルをバイアルに移す。バイアルを脱気してパーフルオロブタンで置換し、密封をする。懸濁液を密封バイアル中、歯科用アマルガメータで30-45秒間振盪すると治療用途の乳状白色MSLC懸濁液を生じる。
【００６３】
実施例１０
標的化MSLCを生きている患者（例えば、哺乳類）に注射し、病的部位若しくはその近傍に局在化するまで十分な時間をおいてから、診断用の超音波を走査し、又は治療薬輸送の場合はMSLCを崩壊させて標的化部位において該薬物を放出させるのに十分なエネルギーの超音波を、脈動的に繰り返すか、非常に強力な超音波エネルギーを有する波動を一度に与えることにより、照射する。
すべての刊行物、特許および特許文書は、個別に引用した場合のように、本願に引用して援用する。本発明は、具体的な好ましい態様および技術に関連して記載した。しかしながら、本発明の射程および思想の範囲内にとどまりながら、多くの変更、修正がなされ得ることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は気体充填リポソームを図解する。
【図２】図２は本発明の単一層気体微粒子リポソーム複合体を図解する。
【図３】図３は本発明の多重層気体微粒子リポソーム複合体を図解する。
【図１】
2005505532.tif 000008
【図２】
2005505532.tif 000009
【図３】
2005505532.tif 000010
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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