(57)【要約】生きた系において複数のタンパク質または有機代謝物の速度論（すなわち、分子フラックス速度、合成および分解または除去の速度）を測定するための方法が、本明細書中に開示される。この方法は、さらなる、生化学調製工程または分析／機器デバイスの必要無しに、既存の質量分光プロファイリング技術および当該分野で周知の静的プロテオミクスおよび静的オルガネオミクスを使用することによって、高処理大スケール自動化様式で達成され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、組織、または生物のプロテオームの全てまたは一部の複数のタンパク質の分子フラックス速度を決定する方法であって、該方法が、以下の工程：
ａ．一種以上の同位体標識タンパク質前駆体を該細胞、組織または生物に、一種以上の同位体標識が、該細胞、組織または生物のプロテオームまたはその一部の複数のタンパク質内に組み込まれるのに十分な期間の間、投与する、工程；
ｂ．該細胞、組織、または生物から該プロテオームまたはその一部を得る、工程；
ｃ．質量分析によって、該プロテオームまたは該プロテオームの一部の個々のタンパク質を表すイオンの複数の質量アイソトポマーエンベロープを同定する、工程；
ｄ．質量分析によって各同定されたタンパク質に対応する質量アイソトポマーエンベロープ内のイオンの相対的および絶対的質量アイソトポマー存在比を定量する、工程；および
ｅ．該複数のタンパク質の分子フラックス速度を決定するために、各同定されたタンパク質の該分子フラックス速度を計算する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記投与工程（ａ）が、連続する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記投与工程（ａ）が、前記一種以上のタンパク質前駆体を、規則的な測定間隔で投与する工程を包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記一種以上のタンパク質前駆体が、経口的に投与される、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記測定工程の前に、前記タンパク質を改変する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記改変工程が、前記タンパク質をペプチドまたは個々のアミノ酸に生化学的に分解する工程を包含する、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記改変工程が、前記タンパク質を化学的に変化させる工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記同定工程（ｃ）が、クロマトグラフィーによって前記プロテオームまたはプロテオームの一部の個々のタンパク質を同定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記複数のタンパク質が、前記細胞、組織、または生物のプロテオームを含む、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記複数のタンパク質の合成および分解の速度を示す工程をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記１つ以上のタンパク質前駆体が、アミノ酸を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記一種以上のタンパク質前駆体が、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３、およびＨＣＯ３からなる群より選択される、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記同位体標識が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓおよび３４Ｓからなる群より選択される、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記同位体が、２Ｈである、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、前記同位体標識タンパク質前駆体が、２Ｈ２Ｏ、Ｈ２１８Ｏ、１３ＣＯ２、Ｃ１８Ｏ１７Ｏ、Ｈ１６ＣＯ３、１５ＮＨ３、２Ｈ標識アミノ酸、１３Ｃ標識アミノ酸、１５Ｎ標識アミノ酸、１８Ｏ標識アミノ酸、３４Ｓ標識アミノ酸、および３３Ｓ標識アミノ酸からなる群より選択される、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記同位体標識タンパク質前駆体が、２Ｈ２Ｏである、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、前記生物が、ヒトである、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、前記投与工程（ａ）を中断するさらなる工程を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、前記投与工程（ａ）の前に、前記細胞、組織、または生物に診断剤または治療剤を投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２０】
細胞、組織、または生物に対する、診断剤または治療剤の効果を決定する方法であって、以下の工程：
ａ．請求項１に記載の方法に従って、該細胞、組織、または生物中の複数のタンパク質の分子フラックス速度を決定する、工程；
ｂ．該薬剤を投与する、工程；
ｃ．該診断剤または治療剤の効果を決定するために、請求項１に記載の方法に従って、該細胞、組織、または生物中の複数のタンパク質の分子フラックス速度を決定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、前記細胞、組織、または生物中の複数のタンパク質の分子フラックス速度に対する、診断剤または治療剤の効果が、薬物または他の治療剤の発見、開発または認可のために使用される、方法。
【請求項２２】
細胞、組織、または生物中の複数のタンパク質の分子フラックス速度に対する、一種以上の遺伝子の効果を決定する方法であって、以下の工程：
ａ．請求項１に記載の方法に従って、一種以上の細胞、組織、または生物の第１の集団中の複数のタンパク質の分子フラックス速度を決定する工程であって、該第１の集団の細胞、組織、または生物が、該一種以上の遺伝子を含む、工程；
ｂ．請求項１に記載の方法に従って、一種以上の細胞、組織、または生物の第２の集団中の複数のタンパク質の分子フラックス速度を決定する工程であって、該第２の集団が、該一種以上の遺伝子を含まない、工程；
ｃ．複数のタンパク質の分子フラックス速度に対する、該一種以上の遺伝子の効果を決定するために、該第１の集団および該第２の集団のおける分子フラックス速度を比較する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞、組織または生物から複数のサンプルを単離する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２４】
細胞、組織または生物のオルガネオームの全てまたは一部における複数の有機代謝物の分子フラックス速度を決定する方法であって、該方法が、以下の工程：
ａ．一種以上の同位体標識有機代謝物または有機代謝物前駆体を、該細胞、組織または生物に、該一種以上の同位体標識有機代謝物由来の一種以上の同位体標識が、該細胞、組織または生物のオルガネオームまたはその一部の複数の有機代謝物内に組み込まれるのに十分な時間の間、投与する工程；
ｂ．該細胞、組織、または生物から、該オルガネオームまたはその一部を得る、工程；
ｃ．質量分析によって、該オルガネオームまたはその一部の個々の有機代謝物を表すイオンの複数の質量アイソトポマーエンベロープを同定する、工程；
ｄ．質量分析によって工程（ｃ）において個々の同定された有機代謝物に対応する質量アイソトポマーエンベロープ内のイオンの相対的および絶対的質量アイソトポマー存在比を定量する、工程；ならびに
ｅ．該複数の有機代謝物の合成または除去の速度を決定するために、各同定された有機代謝物の合成または除去速度を計算する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記一種以上の有機代謝物または有機代謝物前駆体が、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３、ＨＣＯ３、アミノ酸、単糖類、炭水化物、脂質、脂肪酸、核酸、解糖中間体、酢酸、およびトリカルボン酸サイクル中間体からなる群より選択される、方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、前記同位体標識が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓからなる群より選択される、方法。
【請求項２７】
請求項２４に記載の方法であって、前記投与工程（ａ）が、連続する、方法。
【請求項２８】
請求項２４に記載の方法であって、前記投与工程（ａ）が、前記前駆体を、規則的な測定間隔で投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２４に記載の方法であって、前記一種以上の有機代謝物または有機代謝物前駆体が、経口的に投与される、方法。
【請求項３０】
請求項２４に記載の方法であって、前記投与工程（ａ）を中断するさらなる工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項２４に記載の方法であって、前記測定工程の前に、前記有機代謝物を改変する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３２】
請求項２４に記載の方法であって、前記同定工程（ｃ）が、クロマトグラフィーによって前記オルガネオームまたはオルガネオームの一部の個々の有機代謝物を同定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項３３】
請求項２４に記載の方法であって、前記複数の有機代謝物が、前記細胞、組織、または生物のオルガネオームを含む、方法。
【請求項３４】
請求項２４に記載の方法であって、前記複数の有機代謝物の合成および除去の速度を示す工程をさらに包含する、方法。
【請求項３５】
請求項２４に記載の方法であって、前記有機代謝物前駆体が、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３、およびＨＣＯ３からなる群より選択される、方法。
【請求項３６】
請求項２６に記載の方法であって、前記同位体が、２Ｈである、方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の方法であって、前記有機代謝物前駆体が、Ｈ２Ｏである、方法。
【請求項３８】
請求項２４に記載の方法であって、前記同位体標識有機代謝物前駆体が、２Ｈ２Ｏ、３Ｈ２Ｏ、およびＨ２１８Ｏからなる群より選択される、方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、前記同位体標識有機代謝物前駆体が、２Ｈ２Ｏである、方法。
【請求項４０】
請求項２４に記載の方法であって、前記生物が、ヒトである、方法。
【請求項４１】
請求項２４に記載の方法であって、前記投与工程（ａ）の前に、診断剤または治療剤を、前記細胞、組織または生物に投与する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４２】
細胞、組織、または生物に対する、診断剤または治療剤の効果を決定する方法であって、以下の工程：
ａ．請求項２４に記載の方法に従って、該細胞、組織、または生物中の複数の有機代謝物の合成または除去の速度を決定する、工程；
ｂ．該薬剤を投与する、工程；および
ｃ．該診断剤または治療剤の効果を決定するために、請求項２４に記載の方法に従って、該細胞、組織、または生物中の複数の有機代謝物の合成または除去の速度を決定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、前記細胞、組織、または生物中の複数の有機代謝物の合成または除去の速度に対する、診断剤または治療剤の効果が、薬物または他の治療剤の発見、開発または認可のために使用される、方法。
【請求項４４】
細胞、組織、または生物中の複数の有機代謝物の分子フラックス速度に対する、一種以上の遺伝子の効果を決定する方法であって、以下の工程：
ａ．請求項２４に記載の方法に従って、一種以上の細胞、組織、または生物の第１の集団中の複数の有機代謝物の分子フラックス速度を決定する工程であって、該第１の集団の細胞、組織、または生物が、該一種以上の遺伝子を含む、工程；
ｂ．請求項２４に記載の方法に従って、一種以上の細胞、組織、または生物の第２の集団中の複数の有機代謝物の合成または除去の速度を決定する工程であって、該第２の集団が、該一種以上の遺伝子を含まない、工程；
ｃ．複数の有機代謝物の合成または除去の速度に対する、該一種以上の遺伝子の効果を決定するために、該第１の集団および該第２の集団のおける合成または除去の速度を比較する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の方法であって、前記細胞、組織または生物から複数のサンプルを単離する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４６】
請求項２１に記載の方法によって発見された、薬物または他の治療剤に対する権利。
【請求項４７】
請求項４３に記載の方法によって発見された、薬物または他の治療剤に対する権利。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第６０／３９９，９５０号（２００２年７月３０日出願）の優先権を主張し、この米国特許出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、プロテオームおよびオルガネオーム（ｏｒｇａｎｅｏｍｅ）（それぞれ動的プロテオミクスおよび動的オルガネオミクス（ｏｒｇａｎｅｏｍｉｃｓ））における、分子フラックス速度（分子のプールからの、合成および分解の速度または取り込みおよび除去の速度）を、質量分析法を用いて測定する方法に関する。開示される方法は、高処理大規模自動化適用を可能にする。本方法は、遺伝学、機能遺伝学、薬物の発見および開発、薬物毒性、臨床診断および患者管理における研究に適用可能である。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノムプロジェクトにおける近年の進歩は、逆説的に、遺伝子配列情報自体は不十分であるという広範な認識をもたらした。配列情報（すなわち、構造ゲノミクス）は、遺伝子の機能的結果に関するよりよい情報なしでは、疾患または正常の生理学への洞察をもたらしにくい。遺伝子配列に関する生物学的組織のより高いレベルとしては、発現されたｍＲＮＡレベル、発現されたタンパク質補体、および代謝経路における有機分子の濃度が挙げられる。細胞組織のこれらのレベルは、それぞれ、遺伝子発現プロファイリング（トランスクリプトミクス）、プロテオミクスおよびオルガネオミクスと呼ばれている。全体で、これらは、細胞または組織内に構造的生化学表現型を含む（すなわち、分子の完全な補体が存在する）と考えられ得る。
【０００４】
ｍＲＮＡの遺伝子発現プロファイリングは、遺伝子発現チップの開発を介して達成された。このようなチップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのような会社から市販される。発現されたゲノム（すなわち、ｍＲＮＡ種の相補体）の列挙は、しかし、その全体においてすら、生物系における生化学機能（表現型）に関する情報を最終的に提供しない。技術として印象的であるが、遺伝子発現チップは、生化学において、タンパク質の複合双方向性ネットワーク（完全に集合した生物系を含む）を介した分子のフラックスに関する、表現型および機能の主要な問題を解決しない。
【０００５】
他の方法は、生物系におけるタンパク質の補体（すなわち、「プロテオーム」）の特徴付けに焦点を当てる。現在までのところ、発現されたタンパク質の、自動化された大規模な特徴付け（プロテオミクス）の最も強力な技術は、質量分析であることが証明されている。質量分析計は、大規模自動化プロテオーム分析を大いに簡略化する。類似の質量分析法は、有機代謝物（オルガネオミクス）の自動化大規模特徴付けのために進歩している。
【０００６】
薬学産業における多くの科学者（ゲノミクス会社の科学者を含む）は、開発中である薬物および標的をもたらしそして標的する潜在的な薬物の対数ジャム（ｌｏｇ−ｊａｍ）を予測する。この対数ジャムは、特定の標的を阻害した表現型結果の試験におけるボトルネック（ｂｏｔｔｌｅ−ｎｅｃｋ）から生じる−すなわち、薬物開発の「後部（ｔａｉｌ−ｅｎｄ）」である。薬物開発の後部（標的評価）は、薬物発見の「前部（ｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ）」として突破技術からの類似の後押し（標的の同定および標的の化学的調節剤の同定）を受けない。
【０００７】
この領域における主要な問題の１つは、生物学および薬学において、慣用的な、高処理の動的な測定が存在しないことである。生化学的表現系としてのみ、複合触媒性ネットワーク内の代謝経路を介した分子の流れを減少し得ることを認識し、これはまた、ほとんどの疾患は、正常なプロセスの変更された速度まで減少することが広範に認識される。例えば、アテローム発生は、血管壁増殖および脂質の摂取を反映する；発癌は、細胞増殖を反映する；感染は、微生物の分裂、増殖および死で特徴付けられる。この公式は、これらの疾患をより静的測定の変化（例えば、コレステロール、発癌物質または細菌の濃度）よりも情報価値がある。医学的診断において測定された生化学的プロセスの比率は、あるとしてもまれである。動的プロセスの静的マーカーは、しばしば有益であり、そしてないよりましであり得るが、これらは、疾患活性または疾患の危険度の真の測定ではない。また、静的測定は、個人的な生化学的モニタリングを可能にもしない。例えば、各個人は、ＨＩＶ感染におけるＣＤ４数とＴリンパ球の真の代謝回転との間、またはＤＮＡ付加物と真の癌の危険度との間、またはＬＤＬコレステロールと真のアテローム発生率との間に、異なった関係を有し得る。最終分析において、動態学的疑問は、直接の動態学的測定によって解明されなければならない。
【０００８】
従って、質量分析的プロテオミクスおよびオルガネオミクスの現行技術は、共通かつ根本的な限定によって特徴付けられる：情報は静的であり、動的ではない。静的プロテオミクスおよび静的オルガネオミクスの両方から欠けているものは、動態学である：系において存在する分子プール内へのフラックスおよび分子プールからのフラックスである。動態学（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）または動力学（ｄｙｎａｍｉｃｓ）は、静力学（ｓｔａｔｉｃｓ）と、基礎的な面（時間の次元を含む）において異なっている。動態学とは、分子における時間に関連する変化の研究をいい、ここで、静的測定において決定されるタンパク質または有機分子の濃度は、時間を越えたその速度の変化に関するいかなる情報をも提供しない。静的プロテオームおよびオルガネオームの特徴付けの現行技術は、存在するものの片鱗を提供し得、これらの技術は、系を通した分子の流れ（動態学）に関する情報を提供し得ない。
【０００９】
従って、複数のタンパク質または有機代謝物の分子フラックス速度の大規模測定（すなわち、「動的プロテオミクス」および「動的オルガネオミクス」）について多大な必要が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
これらの必要を満たすため、本発明は、分子フラックス速度（すなわち、細胞、組織、生物）のプロテオームの全てまたは一部における複数のタンパク質の合成または分解の速度）を決定する方法に関する。１種以上の同位体標識タンパク質前駆体が、１種以上の同位体標識が、細胞、組織または生物のプロテオームまたはその一部における複数のタンパク質に取り込まれるために十分な一定の時間、細胞、組織または生物に投与される。次いで、プロテオームまたはその一部が、細胞、組織または生物から得られる。次いで、プロテーム内の個々のタンパク質を表す複数の質量同位元素性エンベロープが、質量分析法によって同定される。さらに、各同定されたタンパク質に相当する同位元素性エンベロープ内のイオンの相対的および絶対的な質量同位元素存在量が、質量分析法によって定量される。これらの相対的および絶対的な同位元素存在量は、各同定されたタンパク質の分子フラックス速度を計算することを可能にし、それにより複数のタンパク質の分子フラックス速度を決定することを可能にする。
【００１１】
１つの局面において、投与工程は、連続であり得る。タンパク質前駆体はまた、定期的に測定された間隔で投与され得る。タンパク質前駆体はまた、経口的に投与され得る。この方法は、投与工程の中断のさらなる工程を含み得る。
【００１２】
１種以上のタンパク質前駆体は、アミノ酸であり得、またはＨ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３、ＨＣＯ３のような１種以上の前駆体が挙げられ得る。同位体標識としては、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓおよび３４Ｓのような１種以上の同位体が挙げられ得る。特定の実施形態において、同位体標識は、２Ｈであり得る。
【００１３】
別の局面において、タンパク質は、測定工程の前に改変され得る。改変は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、生化学的タンパク質分解、またはタンパク質の化学的改変）によるものであり得る。
【００１４】
さらなる局面において、個々のタンパク質はまた、クロマトグラフィーおよび質量分析法の両方によって同定され得る。さらなる実施形態において、複数のタンパク質はまた、細胞、組織または生物のプロテオーム全体を含み得る。計算されたタンパク質の分子フラックスは、計算後に提示され得る。
【００１５】
生物は、培養における細胞から生きた動物まで当該分野における任意の生物であり得る。１つの局面において、生物は、ヒトである。
【００１６】
別の局面において、本方法は、細胞、組織または生物に、同位体標識した前駆体を投与する前に、診断剤または治療剤を投与する工程をさらに包含し得る。本発明はまた、細胞、組織または生物に対する診断剤または治療剤の効果を、細胞、組織または生物における複数のタンパク質の分子フラックス速度を測定することにより決定する方法、薬剤を投与する方法、および細胞、組織または生物における複数のタンパク質の分子フラックス速度を測定する方法に関する。薬物の発見および開発は、この方法によって達成されるかまたは容易にされ得る。
【００１７】
本方法はまた、細胞、組織および生物における複数のタンパク質の合成の分子フラックス速度に対する１種以上の遺伝子の効果を、１種以上の遺伝子を有する１種以上の細胞、組織および生物の第１の集団における複数のタンパク質の分子フラックス速度を測定することにより決定する工程、１種以上の遺伝子を有さない１種以上の細胞、組織および生物の第２の集団における複数のタンパク質の分子フラックス速度を測定する工程、そして第１および第２の集団における分子フラックス速度を比較し、複数のタンパク質の分子フラックス速度に対する１種以上の遺伝子の効果を決定する工程を包含し得る。
【００１８】
別の局面において、本発明は、細胞、組織または生物のオルガネオームの全てまたは一部における複数の有機代謝物の分子フラックス速度の決定に関する。１種以上の同位体標識有機代謝物または有機代謝物前駆体が、１種以上の同位体標識が、細胞、組織または生物のオルガネオームまたはその一部における複数の有機代謝物に組み込まれるために十分な一定時間、細胞、組織または生物に投与される。オルガネオームまたはその一部は、細胞、組織または生物から得られる。オルガネオームまたはその一部における個々の有機代謝物を表すイオンの複数の質量同位元素性エンベロープは、質量分析法によって同定される。さらに、各同定された有機代謝物に相当する同位元素性エンベロープ内のイオンの、相対的または絶対的な質量同位元素存在量が、質量分析法によって定量される。これらの相対的および絶対的質量同位元素存在量は、各同定された有機代謝物の合成または除去の速度を計算することを可能にし、それにより、複数の有機代謝物の分子フラックス速度の測定を可能にする。
【００１９】
１つの局面において、１種以上の有機代謝物または有機代謝物の前駆体としては、１種以上のＨ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３、ＨＣＯ３、アミノ酸、単糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、核酸、解糖中間体、酢酸およびトリカルボン酸サイクル中間体が挙げられる。別の局面において、同位体標識としては、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓまたは３４Ｓが挙げられる。複数の有機代謝物の前駆体としては、オルガネオーム全体を含み得る。生物は、任意の公知の生物（ヒトを含む）であり得る。特定の実施形態において、同位体標識は、２Ｈであり得る。
【００２０】
別の局面において、前駆体の投与は、連続的であり得る。あるいは、前駆体は、定期的に測定された間隔で投与され得る。１種以上の有機代謝物または有機代謝物の前駆体は、経口投与され得る。さらに、本方法は、標識化前駆体の投与を中断するさらなる工程を包含し得る。
【００２１】
さらなる局面において、本方法は、質量分析計に導入する前に有機代謝物を改変する工程を包含し得る。改変は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、有機代謝物の生化学的な分解または有機代謝物の化学的改変）であり得る。
【００２２】
オルガネオームまたはその一部における個々の有機代謝物は、質量分析計および／またはクロマトグラフィーによって同定され得る。複数の有機代謝物の計算された合成速度または除去速度が、提示され得る。
【００２３】
別の局面において、本発明は、前駆体を投与する前に、細胞、組織または生物に診断剤または治療剤を投与する方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、細胞、組織または生物における複数の有機代謝物の合成速度または除去速度の測定によって、細胞、組織または生物に対する診断剤または治療剤の効果を決定する方法、薬剤を投与する方法、および細胞、組織または生物における複数の有機代謝物の合成速度または除去速度を測定する方法に関する。この方法によって、薬物の発見および開発は、容易にされ得るかまたは達成され得る。
【００２４】
別の局面において、本発明は、１つ以上の遺伝子を有する１つ以上の細胞、組織または生物の第１の集団における複数の有機代謝物の分子フラックス速度の測定、１つ以上の遺伝子を含まない１つ以上の細胞、組織または生物の第２の集団における複数の有機代謝物の分子フラックス速度の測定、ならびに第１および第２の集団における前記複数の有機代謝物の分子フラックス速度の比較によって、細胞、組織または生物における複数の有機代謝物の分子フラックス速度に対する１つ以上の遺伝子の効果を決定する方法に関する。
【００２５】
（本発明の詳細な説明）
本発明者らは、複数のタンパク質または複数の有機代謝物の分子フラックス速度（すなわち、合成速度、分解速度および除去速度）を測定する方法を発見した。第１に、同位体標識化前駆体分子を、細胞、組織または生物に投与する。次いで、複数のタンパク質または複数の有機代謝物の分子フラックス速度を測定する。
【００２６】
（Ｉ．一般的な技術）
本発明の実施は、他に明記しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学（これらは当該分野の範囲内である）の従来の技術を利用する。このような技術は、以下のような文献において完全に説明される：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３−８）Ｊ．ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；  ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，１９９９）；ならびにＭａｓｓ  ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｅｉｇｈｔ  ｙｅａｒｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ，ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｅｓｅ（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．３９）Ｅ１１４６−Ｅ１１６２，１９９９）。さらに、市販のアッセイキットおよび試薬を利用する手順が、他に明記されない限り、代表的に、製造者規定のプロトコルに従って使用される。
【００２７】
（ＩＩ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中に使用される当分野の全ての用語、表示法および他の科学的用語法は、本発明が付随する当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、一般的に理解される意味を有する用語は、明確かつ／または予め参照のために本明細書中で定義され、そしてこのような定義を本明細書中に含めることは、必ずしも当該分野で一般的に理解されている意味と実質的に異なることを表すと解釈されるべきではない。本明細書中に記載されるかまたは参照される技術および手順は、一般的に当業者に十分に理解され、そして以下のような従来の方法論を使用して一般的に利用される：例えば、Ｍａｓｓ  ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｔ  ｅｉｇｈｔ  ｙｅａｒｓ：ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ，ａｎａｌｙｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｅｅｓｅ（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７６（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．３９）Ｅ１１４６−Ｅ１１６２，１９９９）。適切な場合、市販のキットおよび試薬の使用を含む手順は、他に記載されない限り、製造者規定のプロトコルおよび／またはパラメータに従って一般的に実行される。
【００２８】
「分子フラックス速度」とは、タンパク質および／または有機代謝物の合成速度および／または分解速度をいう。「分子フラックス速度」とはまた、分子プールへのタンパク質および／または有機代謝物の投入または分子プールからの除去をいい、従って、前記分子プールへの流れ込みおよび流出と同義である。
【００２９】
「アイソトポログ（ｉｓｏｔｏｐｏｌｏｇｕｅｓ）」とは、同一の元素のかつ化学的な組成を有するが、同位体含量と異なる同位体ホモログまたは分子種（例えば、上記の例において、ＣＨ３ＮＨ２対ＣＨ３ＮＨＤ）をいう。アイソトポログは、それらの同位体組成によって定義され、従って各アイソトポログは独特な正確な分子量を有するが、独特な構造を有さなくてもよい。アイソトポログは、通常分子上の同位体の位置によって異なる同位体アイソマー（例えば、アイソトポマー（ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ））（例えば、ＣＨ３ＮＨＤおよびＣＨ２ＤＮＨ２は、同じアイソトポログであるが、異なるアイソトポマーである）のファミリーを含む。
【００３０】
「同位体標識化水（ｉｓｏｔｏｐｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）」は、水素または酸素のいずれかの１つ以上の特定の重同位体（ｈｅａｖｙ  ｉｓｏｔｏｐｅ）で標識化された水を含む。同位体標識化水の特定の例としては、２Ｈ２Ｏ、３Ｈ２ＯおよびＨ２１８Ｏが挙げられる。
【００３１】
「タンパク質前駆体」とは、任意の有機分子または無機分子もしくはその成分をいい、ここでこれらの１つ以上の原子は、細胞、組織または生物の生科学的プロセスを介して、細胞、組織、生物または他の生物学的系におけるタンパク質分子に取り込まれ得る。タンパク質前駆体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３およびＨＣＯ３。
【００３２】
「同位体標識化タンパク質前駆体」とは、天然に存在するか、細胞、組織または生物に存在する最も豊富な同位体と異なる元素の同位体を含むタンパク質前駆体をいう。同位体標識は、生体分子に存在する元素の特定の重同位体（例えば２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ）を含み得るか、または生体分子に存在する元素の他の同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）を含み得る。同位体標識化タンパク質前駆体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２Ｈ２Ｏ、１５ＮＨ３、１３ＣＯ２、Ｈ１３ＣＯ３、２Ｈ標識化アミノ酸、１３Ｃ標識化アミノ酸、１５Ｎ標識化アミノ酸、１８Ｏ標識化アミノ酸、３４Ｓまたは３３Ｓ標識化アミノ酸、３Ｈ２Ｏ３Ｈ標識化アミノ酸および１４Ｃ標識化アミノ酸。
【００３３】
「同位体標識化有機代謝物の前駆体」とは、天然に存在するかまたは細胞、組織もしくは生物に存在する前記元素の最も豊富な同位体と異なる元素の同位体を含む有機代謝物前駆体をいう。同位体標識は、生体分子に存在する元素の特定の重同位体（例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３５Ｓ、３４Ｓ）を含むか、または生体分子に存在する元素の他の同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）を含み得る。同位体標識化有機代謝物の前駆体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：２Ｈ２Ｏ、１５ＮＨ３、１３ＣＯ２、Ｈ１３ＣＯ３、２Ｈ標識化アミノ酸、１３Ｃ標識化アミノ酸、１５Ｎ標識化アミノ酸、１８Ｏ標識化アミノ酸、３３Ｓ標識化アミノ酸もしくは３４Ｓ標識化アミノ酸、３Ｈ２Ｏ、３Ｈ標識化アミノ酸、１４Ｃ標識化アミノ酸、１４ＣＯ２およびＨ１４ＣＯ２。
【００３４】
「部分的に精製する」とは、他の類似の化合物の混合物の１つ以上の成分を除去する方法をいう。例えば、「タンパク質を部分精製する」とは、１つ以上のタンパク質の混合物から１つ以上のタンパク質を除去することをいう。
【００３５】
「単離する」とは、化合物の混合物から１つの化合物を分離することをいう。例えば、「タンパク質を単離する」とは、１つ以上のタンパク質の混合物中の全ての他のタンパク質から１つの特定のタンパク質を分離することをいう。
【００３６】
「生物学的サンプル」とは、細胞、組織または生物から得られた任意のサンプルを包含する。この定義は、血液および最小の侵襲性適用または非侵襲性適用（例えば、尿収集、採血（ｂｌｏｏｄ  ｄｒａｗｉｎｇ）、針吸引（ｎｅｅｄｌｅ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）および最小の危険性、不快または試みに関する他の手順）によるサンプリングを介して生物からアクセス可能である生物学的起源の他の液体サンプルを含む。定義はまた、試薬での処理、可溶化または特定の成分（例えば、タンパク質または有機代謝物）の富化によるようなそれらの調達の後の任意の方法において操作されたサンプルを含む。用語「生物学的サンプル」とはまた、臨床的サンプル（例えば、血清、血漿、他の生物学的流体または組織サンプル）を包含し、そしてまた、培養液中の細胞、細胞上清液および細胞溶解物を包含する。
【００３７】
「生物学的流体」とは、限定されないが、尿、血液、間質液、水腫流体（ｅｄｅｍａ  ｆｌｕｉｄ）、唾液、涙液、炎症性浸出液、滑液、膿瘍、蓄膿、または他の感染流体、脳脊髄液、汗、肺分泌物（痰）、精液、糞、胆汁、腸分泌物、または他の生物学的流体。
【００３８】
「正確な質量」とは、分子の化学式中の全ての同位元素の正確な質量を合計することによって計算した質量をいう（例えば、ＣＨ３ＮＨＤに対しては、３２．０４８４７）。
【００３９】
「名目上の質量」とは、分子の正確な質量を丸めることによって得られる整数値の質量をいう。
【００４０】
「質量アイソトポマー」とは、同位体組成ではなく、名目上の質量に基づいて分類する同位体異性体のファミリーをいう。質量アイソトポマーは、アイソトポローグ（ｉｓｏｔｏｐｏｌｏｇｕｅ）（例えば、ＣＨ３ＮＨＤ、１３ＣＨ３ＮＨ２、ＣＨ３１５ＮＨ２は、同じ質量のアイソトポマーの一部であるが、異なるアイソトポローグである）とは違って、異なる同位体組成の分子を含み得る。操作上の用語では、質量アイソトポマーは、質量分析計によっては分離されないアイソトポローグのファミリーである。四極子質量分析計に関しては、これは代表的には、質量アイソトポマーが名目上の質量を共有するアイソトポローグのファミリーであることを意味する。従って、アイソトポローグＣＨ３ＮＨ２およびＣＨ３ＮＨＤは、名目上の質量が異なり、異なった質量のアイソトポマーとして区別されるが、アイソトポローグＣＨ３ＮＨＤ、ＣＨ２ＤＮＨ２、１３ＣＨ３ＮＨ２およびＣＨ３１５ＮＨ２は全て、名目上の質量が同じであり、従って、同じ質量のアイソトポマーである。従って、各質量アイソトポマーは、代表的には、１つより多いアイソトポローグからなり、１種より多い、正確な質量を有する。アイソトポローグと質量アイソトポマーとの区別は、実際に有用である。というのは、個々のアイソトポローグの全ては、四極子質量分析計を使用して分離されず、より高い質量分離度を生じる質量分析計を使用しても分離され得ないので、質量分析計データからの計算が、アイソトポローグではなく、質量アイソトポマーの存在量に基づいて行なわなければならないからである。質量が最も小さい質量アイソトポマーは、Ｍ０と表され；ほとんどの有機分子に関しては、これは、全ての１２Ｃ、１Ｈ、１６Ｏ、１４Ｎなどを含む種である。他の質量アイソトポマーは、それらの質量の差によって、Ｍ０から区別される（Ｍ１、Ｍ２など）。所定の質量アイソトポマーに関しては、分子内の同位体の配置または位置は、特定されず、異なり得る（すなわち、「位置アイソトポマー」は区別されない）。
【００４１】
「質量アイソトポマーエンベロープ」とは、分子またはイオンフラグメントに関連した質量アイソトポマーのセットをいう。
【００４２】
「質量アイソトポマーパターン」とは、分子の質量アイソトポマーの存在量のヒストグラムをいう。伝統的に、そのパターンは、相対存在量％として表され、その総存在量は、最も多い質量アイソトポマーの存在量に対して標準化され；最も多いアイソトポマーを１００％であるという。しかし、確立分析（例えば、質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ））に関する適用に対して好ましい形態は、比率または分画存在量であって、各種がその総量に寄与する分画が使用される。用語「同位体パターン」は、用語「質量アイソトポマーパターン」と同意語として使用され得る。
【００４３】
「単一同位体質量」とは、１Ｈ、１２Ｃ、１４Ｎ、１６Ｏ、３２Ｓなど全てを含む分子種の正確な質量をいう。Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩからなるアイソトポローグに関しては、最も小さい質量を有するアイソトポローグの同位体組成は、固有かつ明白である。なぜなら、これらの元素の最も多い同位体はまた、質量が最も小さいからである。単一同位体質量は、ｍ０と略され、他の質量のアイソトポマーの質量は、ｍ０との質量の差によって同定される（ｍ１、ｍ２など）。
【００４４】
「同位体的に、不安定」とは、天然に見出される同位体の分布とは異なる分布（天然には豊富ではない同位体が、過剰に（豊富な）存在するか、または欠損して（枯渇して）存在する）を有する元素または分子の明白な組込みから生じる元素または分子の状態をいう。
【００４５】
「モノマー」とは、ポリマーの合成の間に結合する、ポリマー中で２回以上存在する化学物質単位をいう。
【００４６】
「ポリマー」とは、モノマーの２個以上の繰り返しから合成され、モノマーの２個以上の繰り返しを含む分子をいう。
【００４７】
「タンパク質」とは、アミノ酸のポリマーをいう。本明細書中で使用される場合、タンパク質は、長いアミノ酸ポリマーならびにペプチドのような短いポリマーであり得る。
【００４８】
「プロテオーム」とは、特定の一連の条件の下で、細胞、組織または生物によって発現されたタンパク質の相補体をいう。
【００４９】
「静的プロテオミクス」とは、これらのタンパク質の合成または分解の速度（フラックス）としてではなく、それらの濃度またはレベルによって、細胞、組織または生物中で発現されるタンパク質相補体を特徴づける当該分野で周知の、現在の質量分析技術をいう（動的プロテオミクスと対比される）。
【００５０】
「動的プロテオミクス」とは、プロテオーム中のタンパク質の合成および／または分解の比率（フラックス）を特徴づける質量分析技術をいう。
【００５１】
「有機代謝物」とは、細胞、組織または生物中の代謝に関与する任意の有機分子をいう。有機代謝物としては、アミノ酸、糖、糖アルコール、有機酸、ステロールおよびヌクレオチド塩基が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００５２】
「オルガネオーム（ｏｒｇａｎｅｏｍｅ）」とは、細胞、組織または生物に存在する有機分子の集団をいう。「オルガネオーム」はまた、特定の一連の条件の下で、細胞、組織または生物に存在する有機分子の集団をいう。
【００５３】
「静的オルガネオミクス（ｓｔａｔｉｃ  ｏｒｇａｎｅｏｍｉｃｓ）」とは、細胞、組織または生物に存在する有機分子または代謝物の合成または分解の速度によってではなく、それらの濃度またはレベルによって、これらの有機分子または代謝物の相補体を特徴づける当該分野で周知の現在の質量分析技術をいう。
【００５４】
「動的オルガネオミクス」とは、オルガネオーム中の有機分子または代謝物の合成および／または分解の速度を特徴付ける質量分析技術をいう。
【００５５】
「有機代謝前駆体」とは、直接にかまたはあらかじめ形質転換によって、有機代謝物の細胞のプールに入り得る有機分子または無機分子をいう。
【００５６】
（ＩＩＩ．本発明の方法）
本発明は、細胞、組織または生物のプロテオームの全て、または一部の中の複数のタンパク質の分子のフラックスの速度を決定する方法に関する。第一に、１つ以上の同位体標識したタンパク質前駆体が、細胞、組織または生物に、プロテオームまたはそれらの部分中の複数のタンパク質に組み込まれるのに十分な期間投与される。プロテオームまたはその部分は、細胞、組織または生物から入手され、そして、複数のタンパク質がそれぞれ質量分析により同定される。同定されたタンパク質またはペプチドのそれぞれに対応するアイソトポマーエンベロープ中のイオンの相対的および絶対的な質量アイソトポマー存在量は、質量分析および上記複数のタンパク質の分子フラックス速度を決定するための同定された各タンパク質またはペプチドの分子フラックス速度によって定量される。
【００５７】
全てのオルガネオームまたはオルガネオームの一部中の複数の有機代謝物の分子フラックス速度を決定するために、同一の方法が適用され得る。
【００５８】
複雑な生物学的システムの機構を、図１に示す。機能的ゲノムのレベルを、図２に示す。本発明は、動的プロテオミクス測定および動的オルガネオミクス測定を、測定し、分析し、定量し、定性し、解釈する方法に関する（図３を参照のこと）。
【００５９】
（同位体標識前駆体の投与）
本発明の方法の第一工程として、同位体標識前駆体を投与する。
【００６０】
（Ａ．同位体標識前駆体分子の投与）
（１．標識前駆体分子）
（ａ．同位体標識）
分子フラックスの速度を測定する第一工程は、細胞、組織または生物への同位体標識前駆体分子を投与する工程を包含する。同位体標識前駆体分子は、安定な同位体または放射性同位体であり得る。使用され得る同位体標識としては、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉまたは有機的系に存在する他の元素の同位体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
一実施形態において、同位体標識は、２Ｈである。
【００６２】
（ｂ．前駆体分子）
前駆体分子は、タンパク質または有機代謝物に組み込まれる同位体標識を有する任意の分子であり得る。同位体標識は、同位体標識前駆体分子を形成するために、本明細書中に開示される全ての前駆体分子を改変するために使用され得る。
【００６３】
完全前駆体分子は、１つ以上のタンパク質および／または有機代謝物中に組み込まれ得る。あるいは、前駆体分子の一部は、１つ以上のタンパク質および／または有機代謝物中に組み込まれ得る。
【００６４】
前駆体分子としては、ＣＯ２、ＮＨ３、グルコース、乳酸塩、Ｈ２Ｏ、酢酸塩および脂肪酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６５】
（ｉ．タンパク質前駆体）
タンパク質前駆体分子は、当該分野で公知の任意のタンパク質前駆体分子であり得る。これらの前駆体分子は、ＣＯ２、ＮＨ３、グルコース、乳酸塩、Ｈ２Ｏ、酢酸塩および脂肪酸であり得る。
【００６６】
タンパク質の前駆体分子はまた、１つ以上のアミノ酸を含み得る。前駆体は、任意のアミノ酸であり得る。前駆体分子は、１つが重水素で置換されたかまたは複数が重水素で置換されたアミノ酸であり得る。例えば、前駆体分子は、１つ以上の、１３Ｃ−リジン、１５Ｎ−ヒスチジン、１３Ｃ−セリン、１３Ｃ−グリシン、２Ｈ−ロイシン、１５Ｎ−グリシン、１３Ｃ−ロイシン、２Ｈ５−ヒスチジンおよび任意の重水素で置換されたアミノ酸であり得る。標識されたアミノ酸は例えば、非標識のアミノ酸で希釈してか、または希釈せずに投与され得る。同位体で標識された前駆体は全て、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入され得る。
【００６７】
タンパク質前駆体分子はまた、翻訳後または翻訳前に修飾されたアミノ酸に対する任意の前駆体を含み得る。これらの前駆体としては、メチル化の前駆体（例えば、グリシン、セリン、Ｈ２Ｏ）；ヒドロキシル化の前駆体（例えば、Ｈ２ＯまたはＯ２）；リン酸化の前駆体（例えば、リン酸塩、Ｈ２ＯまたはＯ２）；プレニル化の前駆体（例えば、脂肪酸、酢酸塩、Ｈ２Ｏ、エタノール、ケトン体、グルコースまたはフルクトース）；カルボキシル化の前駆体（例えば、ＣＯ２、Ｏ２、Ｈ２Ｏまたはグルコース）；アセチル化の前駆体（例えば、酢酸塩、エタノール、グルコース、フルクトース、乳酸塩、アラニン、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２またはＯ２）；および当該分野で公知の他の翻訳後修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
遊離アミノ酸に存在する標識化の程度は、実験的に決定され得るか、または、アミノ酸の標識化部位の数に基づいて、想定され得る。例えば、水素同位体を標識として使用する場合、遊離アミノ酸、または、より詳細には、ｔＲＮＡアミノ酸のＣ−Ｈ結合に存在する標識は、体内水分中の２Ｈ２Ｏに曝露されている間に、同定され得る。非必須のアミノ酸のそれぞれのＣ−Ｈ結合の総数は、例えば、アラニンでは４で、グリシンでは２などであることが知られている。
【００６９】
タンパク質についての前駆体分子は、水であり得る。Ｃ−Ｈ結合における水素原子は、タンパク質のＯ−Ｈ結合およびＮ−Ｈ結合が水溶液中で不安定であるため、２Ｈ２Ｏからのタンパク質合成を測定するために有用なアミノ酸における水素原子である。従って、２Ｈ２ＯからＯ−Ｈ結合もしくはＮ−Ｈ結合への２Ｈ標識の交換は、上記のような遊離アミノ酸からのタンパク質の合成を伴わずに生じる。Ｃ−Ｈ結合は、特定の酵素触媒中間代謝反応の間に、Ｈ２Ｏから遊離のアミノ酸への取り込みを行う（図４）。従って、２Ｈ２Ｏ投与後のタンパク質に結合したアミノ酸のＣ−Ｈ結合における２Ｈ標識の存在は、タンパク質が、２Ｈ２Ｏ曝露の期間中に遊離形態であったアミノ酸から集められた（すなわち、タンパク質が新規に合成された）ことを意味する。分析的には、使用されるアミノ酸誘導体は、すべてのＣ−Ｈ結合を含まなければならないが、すべての潜在的に混在するＮ−Ｈ結合およびＯ−Ｈ結合を除去しなければならない。
【００７０】
体内水分由来の水素原子は、遊離アミノ酸に取り込まれ得る。標識した水由来の２Ｈまたは３Ｈは、中間の代謝反応を介して、細胞中の遊離アミノ酸に入り得るが、２Ｈまたは３Ｈは、ペプチド結合中に存在するかまたは転移ＲＮＡに結合されるアミノ酸には入り得ない。遊離の必須アミノ酸は、急速に可逆的なアミノ基転移反応を介して、体内水分からα−炭素Ｃ−Ｈ結合へ、単一の水素原子を取り込み得る（図４）。遊離の非必須アミノ酸は、多数の代謝的に交換可能なＣ−Ｈ結合を有し、従って、当然のことながら、新規に合成されたタンパク質において、２Ｈ２Ｏ由来の１分子当たり、より高い同位体濃縮値を示すことが期待される（図４Ａ〜Ｂ）。
【００７１】
当業者は、体内水分由来の標識した水素原子が、他の生化学経路を介して他のアミノ酸に取り込まれ得ることを理解する。例えば、水由来の水素原子が、クエン酸回路において前駆体であるα−ケトグルタル酸の合成を介してグルタミン酸に取り込まれ得ることが、当該分野で公知である。次に、グルタミン酸は、グルタミン、プロリン、およびアルギニンについての生化学的前駆体であることが公知である。別の例として、体内水分由来の水素原子は、翻訳後修飾されたアミノ酸（例えば、３−メチル−ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｎｅ）中のメチル基、ヒドロキシプロリンもしくはヒドロキシリジン中のヒドロキシル基など）に取り込まれ得る。他のアミノ酸合成経路が、当業者に公知である。
【００７２】
酸素原子（Ｈ２１８Ｏ）もまた、酵素触媒反応を介して、アミノ酸に取り込まれ得る。例えば、アミノ酸のカルボン酸部分への酸素交換が、酵素触媒反応中に生じ得る。アミノ酸への標識した酸素の取り込みが、図４Ｃに示されるように当業者に公知である。酸素原子はまた、酵素触媒反応を介して、１８Ｏ２からアミノ酸（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンまたは他の翻訳後修飾されたアミノ酸が挙げられる）に取り込まれ得る。
【００７３】
標識した水由来の水素標識および酸素標識はまた、翻訳後修飾を介して、アミノ酸に取り込まれ得る。１つの実施形態において、翻訳後修飾は、翻訳後修飾の前に、生合成経路を介して、標識した水素または標識した酸素を既に含み得る。別の実施形態において、翻訳後修飾は、翻訳後修飾工程（例えば、メチル化、ヒドロキシル化、リン酸化、プレニル化、硫酸化、カルボキシル化、アセチル化、または他の公知の翻訳後修飾）の前あるいは後のいずれかに、体内水分由来の遊離の交換標識した水素に関する代謝誘導体から、標識した水素、酸素、炭素、または窒素を取り込み得る。
【００７４】
被験体への投与に適切であるためのタンパク質前駆体としては、タンパク質中に見出される標準的なアミノ酸に加えて、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３およびＨＣＯ３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
（ｉｉ．有機代謝産物の前駆体）
有機代謝産物の前駆体は、有機代謝経路に入り得る任意の前駆体分子であり得る。有機代謝産物および有機代謝産物前駆体としては、Ｈ２Ｏ、ＣＯ２、ＮＨ３、ＨＣＯ３、アミノ酸、単糖類、炭水化物、脂質、脂肪酸、核酸、解糖中間体、酢酸、およびトリカルボン酸回路中間体が挙げられる。
【００７６】
有機代謝産物前駆体はまた、直接的に投与され得る。質量同位体は、タンパク質または有機代謝産物前駆体の質量同位体標識（２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、３３Ｓおよび３４Ｓが挙げられるが、これらに限定されない）において有用であり得る。多くの場合、同位体標識の代謝損失を回避するために、同位体標識した原子が、比較的不安定でないか、または少なくとも被験体内で予測可能な様式で振舞うことが望ましい。同位体標識した前駆体を生合成プールに投与することによって、同位体標識した前駆体は、プール中で形成された有機代謝産物に直接取り込まれ得る。
【００７７】
（ｉｉｉ．前駆体分子としての水）
水は、タンパク質および多くの有機代謝産物の前駆体である。従って、標識した水は、本明細書中で教示される方法において前駆体として役立ち得る。
【００７８】
標識した水は、商業的に容易に入手され得る。例えば、２Ｈ２Ｏは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｓ（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入され得、そして３Ｈ２Ｏは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｉｎｃから購入され得る。一般的には、２Ｈ２Ｏは非放射活性であり、従って、放射活性な３Ｈ２Ｏよりも毒性の懸念をほとんど示さない。２Ｈ２Ｏは、例えば、総体内水分のパーセント（例えば、摂取される総体内水分の１％（例えば、１日当たり摂取される３リットルの水について、３０マイクロリットルの２Ｈ２Ｏが摂取される））として投与され得る。３Ｈ２Ｏが使用される場合、次いで、当業者によって容易に決定される非毒性量が投与される。
【００７９】
比較的高い体内水分濃縮度の２Ｈ２Ｏ（例えば、総体内水分の１〜１０％が標識される）は、本発明の技術を使用して、比較的安価に達成され得る。この水分濃縮度は、いかなる毒性の徴候もなく、ヒトおよび実験動物において数週間もしくは数ヶ月間維持されるこれらのレベルで、比較的定常かつ安定である。多数のヒト被験体（＞１００人）におけるこの知見は、大容量の２Ｈ２Ｏでの前庭毒性についての以前の懸念と正反対である。本出願人は、体内水分濃縮度における急速な変化が（例えば、少量の分けられた用量で最初に投与することによって）妨げられる限り、比較的高い体内水分濃縮度の２Ｈ２Ｏが、毒性を伴わずに維持され得ることを発見している。例えば、市販の２Ｈ２Ｏの少ない費用は、比較的少ない費用で１〜５％の範囲における濃縮度の長期維持を可能にする（例えば、計算によって、１０％の遊離のロイシン濃縮度、従って、この期間についてロイシン前駆体プールにおける７〜８％の濃縮度での２Ｈ−ロイシンの１２時間の標識よりも、２％の２Ｈ２Ｏ濃縮度、従って、アラニン前駆体プールにおける７〜８％の濃縮度での２ヶ月間の標識（図４Ａ〜Ｂ）が、より低い費用であることが明らかである）。
【００８０】
１８Ｏ同位体が非毒性であり、かつ結果として有意な健康上のリスクを示さないので、Ｈ２１８Ｏの投与について比較的高くかつ比較的定常な体内水分濃縮度もまた、達成され得る（図４Ｃ）。
【００８１】
（ｉｖ．タンパク質および有機代謝産物の前駆体の投与様式）
１以上の同位体標識した前駆体の投与様式は、同位体標識した前駆体の吸収特性、および各々の化合物が標的にされる特定の生合成プールに依存して変化し得る。前駆体は、インビボ分析のために、生物、植物および動物（ヒトを含む）に、直接投与され得る。さらに、前駆体は、インビトロで生細胞に投与され得る。生細胞の特定の型としては、肝細胞、脂肪細胞、筋細胞、線維芽細胞、ニューロン、膵臓のβ細胞、腸管上皮細胞、白血球、リンパ球、赤血球、微生物細胞、およびインビトロで生存および機能性が維持され得る任意の他の細胞型が挙げられる。
【００８２】
一般的には、投与の適切な様式は、少なくとも一過性の期間の間、生合成プール内および／またはこのようなプールを供給するレザバ中で定常状態レベルの前駆体を生成する様式である。投与の静脈内経路または経口経路は、一般に、このような前駆体をヒトを含む生物に投与するために使用される。必要に応じて前駆体組成物のゆっくりとした放出に関連して使用される場合には、他の投与経路(例えば、皮下投与または筋肉内投与)もまた、適切である。注射用の組成物は、一般的に、滅菌した薬学的賦形剤中で調製される。
【００８３】
（Ｂ．複数のタンパク質または有機代謝産物の入手）
本発明の方法を実施することにおいて、１つの局面において、タンパク質および有機代謝産物は、当該分野で公知の方法に従って、細胞、組織、または生物から得られる。この方法は、目的のタンパク質または有機代謝産物に対して特異的であり得る。目的のタンパク質および有機代謝産物は、生物学的サンプルから単離され得る。
【００８４】
複数のタンパク質または複数の有機代謝産物は、細胞、組織、または生物から取得され得る。１以上の生物学的サンプルは、例えば、血液採取、尿収集、生検、または当該分野で公知の他の方法によって得られ得る。１以上の生物学的サンプルは、１以上の生物学的流体であり得る。タンパク質または有機代謝産物はまた、特定の器官または組織（例えば、筋肉、肝臓、副腎組織、前立腺組織、子宮内膜組織、血液、皮膚、および胸部組織）から得られ得る。タンパク質または有機代謝産物は、特定の細胞群（例えば、腫瘍細胞または線維芽細胞）から得られ得る。タンパク質または有機代謝産物はまた、当該分野で公知の標準的な生化学的方法を使用して、生物学的サンプルから得られ得、かつ必要に応じて、部分的に精製され得るかまたは単離され得る。
【００８５】
生物学的サンプリングの頻度は、異なる因子に依存して変化し得る。このような因子としては、タンパク質または有機代謝産物の性質、サンプリングの容易さおよび安全性、タンパク質または有機代謝産物が誘導された合成速度および分解／除去速度、ならびに治療剤もしくは生物製剤の半減期が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
タンパク質または有機代謝産物はまた、従来の精製方法（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、化学抽出、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および／または当業者に公知の他の分離方法が挙げられる）によって部分的に精製され得るか、または必要に応じて、単離され得る。
【００８７】
別の実施形態において、タンパク質または有機代謝産物は、低分子を形成するために加水分解され得るか、またはそれ以外の方法では、分解され得る。加水分解方法は、当該分野で公知の任意の方法を含み、化学的加水分解（例えば、酸加水分解）および生化学的加水分解（例えば、ペプチダーゼ分解）が挙げられるが、これらに限定されない。加水分解または分解は、タンパク質もしくは有機代謝産物の精製および／または単離の前あるいは後のいずれかに、行われ得る。タンパク質または有機代謝産物はまた、従来の精製方法（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）ガスクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ならびに／または当業者に公知の化学的化合物および／もしくは生化学的化合物を分離する任意の他の方法が挙げられる）によって、部分的に精製され得るか、または必要に応じて、単離され得る。
【００８８】
（Ｃ．分析）
発現されたタンパク質における差をプロファイルするために使用される、現在利用可能な技術（静的プロテオミック）は、細胞内のタンパク質レベル（濃度）のみを測定し、そして１つの時点でのみ、この測定を行う。アプローチとしては、グローバルプロテオームマッピング（２Ｄ技術および質量分析を使用する）、差次的発現分析（２Ｄ／ＤＩＧＥ技術および質量分析を使用する）、および発現分析（２Ｄ／ＤＩＧＥ、質量分析およびＬＣベースもしくは他の新規な技術を使用する）が挙げられる。ＲＮＡおよびタンパク質の発現「チップ」は、種々の疾患状態における治療剤に対する生物学的に媒介される抵抗を迅速に検出するために使用され得るが、これらは、遺伝子発現またはタンパク質代謝回転の変化の速度を決定しない。本発明の方法は、遺伝子発現の速度および複数のタンパク質の分子フラックス速度、ならびに複数の有機代謝産物の分子フラックス速度およびこれらの経時的な変化の決定を可能にする。
【００８９】
（質量分析）
タンパク質および有機代謝産物における同位体濃縮は、質量分析（ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、同位体比質量分析、ＧＣ−同位体比−燃焼−ＭＳ、ＧＣ−同位体比−熱分解−ＭＳ、液体クロマトグラフィー−ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化−ＭＳ、マトリックス補助レーザー脱離飛行時間ＭＳ、フーリエ変換−イオンサイクロトロン共鳴ＭＳ、およびサイクロイドＭＳが挙げられるが、これらに限定されない）のような種々の方法によって決定され得る。
【００９０】
質量分析計は、タンパク質および有機代謝産物のような分子を、速く移動する気体イオンに転換し、そしてこれらを、質量対電荷比に基づいて分離する。従って、イオンまたはイオンフラグメントの同位体またはイソトポローグ（ｉｓｏｔｏｐｏｌｏｇｕｅ）の分布は、複数のタンパク質または有機代謝産物における同位体濃縮を測定するために使用され得る。
【００９１】
一般に、質量分析器は、イオン化手段および質量分析計を備える。多数の異なる型の質量分析計が、当該分野において公知である。これらとしては、磁気セクター分析計、エレクトロスプレーイオン化、四重極、イオントラップ、時間飛行型質量分析計、およびフーリエ変換分析計が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
質量分析器はまた、多数の異なるイオン化方法を含み得る。これらとしては、気相イオン化源（例えば、電子衝突、化学的イオン化、および電場イオン化）、ならびに脱離源（例えば、電場脱離、高速原子衝突、マトリックス補助レーザー脱離／イオン化、および表面増強レーザー脱離／イオン化）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
さらに、２つ以上の質量分析計が最初に組み合わせられ（ＭＳ／ＭＳ）、最初に、前駆体イオンを分離し、次いで、気相フラグメントイオンを分離し、そして測定し得る。これらの器具は、タンパク質の最初の一連のイオンフラグメントを生成し、次いで、最初のイオンの二次フラグメントを生成する。得られるオーバーラップする配列は、１回の質量分光分析に基づいて数分（＋コンピュータ分析時間）以内で、重なる「パズル片」をつなぎ合わせることによって、このタンパク質の完全な配列決定を可能にする。
【００９４】
タンパク質の質量分析によって作製される、ＭＳ／ＭＳペプチド断片化パターンおよびペプチドの正確な分子量決定は、タンパク質のアミノ酸配列に関する独特の情報を提供し、そして本発明において用途を見出す。未知のタンパク質が、数分で、１回の質量分光分析の実行によって、配列決定および同定され得る。現在利用可能なペプチド配列およびタンパク質断片化パターンのライブラリーは、複雑なプロテオーム混合物の成分をほぼ確実に同定する機会を与える。
【００９５】
異なるイオン化方法もまた、当該分野において公知である。１つの主要な進歩は、大きい不揮発性の高分子（タンパク質およびポリヌクレオチドが挙げられる）のイオン化のための技術の開発であった。この型の技術としては、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）およびマトリックス補助レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）が挙げられる。これらは、ＭＳが、強力なサンプル分離導入技術（例えば、液体クロマトグラフィーおよびキャピラリーゾーン電気泳動）と組み合わせて適用されることを可能にした。
【００９６】
さらに、質量分析器は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような分離手段と組み合わせられ得る。ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ／ＭＳ）において、ガスクロマトグラフからのキャピラリーカラムが、必要に応じてジェットセパレータを使用して、質量分析器に直接結合される。このような適用において、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）カラムは、サンプル気体混合物からサンプル成分を分離し、そしてこの分離された成分は、質量分析器においてイオン化され、そして化学的に分析される。
【００９７】
ＧＣ／ＭＳ（または小さい無機気体ではなくタンパク質および有機代謝産物のイオンを分析する、他の質量分析手段）が、有機分子の質量アイソトポマーの存在量を測定するために使用される場合、同位体標識された水からの水素標識された同位体の組み込みは、同位体標識された水から有機分子へとインビボで組み込まれる水素原子の数に依存して、３〜７倍に増幅される。
【００９８】
一般に、タンパク質についてのベースラインの質量アイソトポマー頻度分布を決定する目的で、このようなサンプルは、同位体標識された前駆体の注入の前に採取される。このような測定は、細胞、組織または生物において、タンパク質の質量アイソトポマーの天然に存在する頻度を確立する１つの手段である。細胞、組織または生物が、類似の環境履歴を有する被験体の集団の一部である場合、集団のアイソトポマー頻度分布は、このようなバックグラウンド測定のために使用され得る。さらに、このようなベースラインのアイソトポマー頻度分布は、同位体の既知の平均天然存在量を使用して、推定され得る。例えば、本質的に、有機炭素における１３Ｃの天然の存在量は、１．１１％である。このようなアイソトポマーの頻度分布を決定する方法が、以下に議論される。代表的に、タンパク質のサンプルは、被験体への同位体標識された前駆体の投与の前後に採取され、そして以下に記載されるように、アイソトポマー頻度について分析される。類似の考慮が、動的オルガネオミックのための有機分子の単離に適用される。
【００９９】
従って、タンパク質の非常に複雑な混合物（タンパク質分解切断に供されたかまたは直接分析された）でさえの１回の分析が、何千もの発現されたタンパク質を表すペプチドを独特に同定し得る。
【０１００】
タンパク質はまた、タンパク質チップを使用して検出され得る。質量分析を使用するいくつかの市販の「タンパク質チップ」等価物が、現在市場に出ている（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。強力なイオン断片化技術（ＭＳ／ＭＳ器具）および／またはペプチドを生成する生化学的方法（例えば、タンパク質分解）、サンプル導入方法の改善（ＨＰＬＣ、表面脱着など）、最も大きい高分子でさえのイオン化の改善された能力（ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ／ＳＥＬＤＩ）および大きいデータセットの迅速なコンピュータ化取り扱いおよびペプチド／タンパク質参照ライブラリーとの比較と組み合わせた質量分析によるペプチド配列決定の効率は、質量分析を、自動化された大規模なハイスループットの静的プロテオミクスのための、一般的な強力なツールにしている。
【０１０１】
（複数のタンパク質または有機分子の同定）
複数のタンパク質または有機分子は、質量分析によって、当該分野において周知の標準的な方法を使用して、分析される。以下の参考文献は、タンパク質の同定に対する静的質量分析技術の適用を、特にプロテオーム分析に関して記載する：Ｉｄｅｋｅｒ，Ｔ，Ｔｈｏｒｓｓｏｎ  Ｖ，Ｒａｎｉｓｈ  ＪＡ，Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ  Ｒ，Ｂｕｈｌｅｒ  Ｊ，Ｅｎｇ  ＪＫ，Ｂｕｍｇａｒｎｅｒ  Ｒ，Ｇｏｏｄｌｅｔｔ  ＤＲ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ，Ｈｏｏｄ  Ｌ「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ａ  ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ  ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｎｅｔｗｏｒｋ」Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１年５月４日；２９２（５５１８）９２９−３４；Ｇｙｇｉ  ＳＰ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ．「Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０００年１０月；４（５）：４８９−９４；Ｇｙｇｉ  ＳＰ，Ｒｉｓｔ  Ｂ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ「Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００年８月；１１（４）３９６−４０１；Ｇｏｏｄｌｅｔｔ  ＤＲ，Ｂｒｕｃｅ  ＪＥ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＧＡ，Ｒｉｓｔ  Ｂ，Ｐａｓａｔｏｌｉｃ  Ｌ，Ｆｉｅｈｎ，Ｏ，Ｓｍｉｔｈ  ＲＤ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｃｃｕｒａｃｅ  ｍａｓｓ  ｏｆ  ａ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ」Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２０００年３月１５日；７２（６）１１１２−８；およびＧｏｏｄｌｅｔｔ  ＤＲ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ  Ｒ，Ｗａｔｔｓ  ＪＤ「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｐｈｏｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０００；１４（５）３４４−８；Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら（２００１年４月）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：３７５−３７８。
【０１０２】
タンパク質バイオチップ（タンパク質アレイまたは抗体アレイとしてもまた公知）は、タンパク質を同定するために使用される。これらのバイオチップは、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−低分子相互作用、および酵素−基質反応を測定するための可能性を維持する。これらはまた、疾患細胞由来のタンパク質から、健常な細胞のタンパク質を区別し得る。ＤＮＡチップ技術を利用するタンパク質バイオチップは、ゲノム学を発達させ、そしてまた、何千ものサンプルを同時に分析し得る。ヒトゲノムは、１００，０００個の遺伝子を含み得るが、翻訳後修飾およびＲＮＡスプライシング事象は、１００，０００よりはるかに多くのタンパク質を生じる。
【０１０３】
いくつかのバイオチップは、表面増強レーザー脱着／イオン化［ＳＥＬＤＩ］と称される型の質量分析、およびバイオチップ技術を、単一の一体化されたプラットフォームに組み込み、タンパク質がこのチップ上で直接、捕捉され、分離され、そして定量的に分析されることを可能にする。このチップは、ＳＥＬＤＩプロセスによって、放射性または蛍光性の標識なしで、または遺伝子操作されたタグなしで、直接読み取られる。
【０１０４】
これらの技術は有用であるが、これらは単に、プロテオームの静的評価を提供し、プロテオームの動的評価を提供しない。本明細書中の方法は、このような動的評価を提供する。
【０１０５】
（複数の有機代謝産物の同定）
有機代謝産物を含有するサンプルは、質量分析によって、当該分野において周知の標準的な方法を使用して分析される。以下の参考文献は、代謝産物の同定に対する静的質量分析技術の適用を、有機代謝産物の同定に関して記載する：Ｗｏｌｆｅ，Ｒ．Ｒ．Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｔｒａｃｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；（１９９２年３月）。
【０１０６】
生物系における中間体代謝産物のパターンおよびこれらの濃度は、かなり高レベルの生化学的表現型を表す。無数の有機分子が生物系に存在し、そして機能的な生物学的経路を介して流れを制御する酵素に対する基質として働く。複数の有機代謝産物が、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳアプローチまたはＧＣ／ＭＳアプローチの使用によって、最も効果的に達成され得る。
【０１０７】
血液または尿のスポットが、ＭＳデバイスに導入され、そしてクロマトグラフィー挙動および質量分析によって特徴付けられる。
【０１０８】
このアプローチは、広範な種々の有機代謝産物について、尿サンプルの診断的スクリーニングのために使用され、小児における先天性代謝異常を検出する。植物生化学者もまた、植物の機能的生化学に関する働きに関するいくつかの代謝プロファイリング作用を報告した。
【０１０９】
技術的に、従来の質量分析器（例えば、ＧＣ／ＭＳ機器）を使用すると、タンパク質を単離するより有機代謝産物を単離する方が容易である。なぜなら、有機代謝産物は、一般に、タンパク質よりサイズが小さく、そして揮発性が高いからである。オルガネオミクスの他の特徴は、質量分析の潜在的な適用性（例えば、同時に測定される必要がある非常に多数の分析物；濃度を測定するという要件；自動化および複雑なデータ取り扱いに対する必要性；ならびにインフォマティクスライブラリーとの比較に対する必要性）を強く支持する。
【０１１０】
（相対的質量アイソトポマー存在量および絶対的質量アイソトポマー存在量の測定）
測定される質量スペクトルのピーク高さ、あるいは、ピーク下の面積は、親（０質量同位体）アイソトポマーに対する比として表され得る。サンプル中のアイソトポマーの存在量についての相対値および絶対値を提供する、任意の計算手段が、本発明の目的で、このようなデータを説明する際に使用され得ることが理解される。
【０１１１】
（タンパク質および有機代謝産物の標識部分：非標識部分の計算）
次いで、標識されたタンパク質または有機代謝産物と、標識されていないタンパク質または有機代謝産物との割合が計算される。実施者は、最初に、分子の単離されたアイソトポマー種について測定された過剰モル比を決定する。次いで、実施者は、過剰の比の測定された内部パターンを、理論的パターンと比較する。このような理論的パターンは、米国特許第５，３３８，６８６号；同第５，９１０，４０３号；および同第６，０１０，８４６号（これらは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、二項分布関係または多項分布関係を使用して計算され得る。これらの計算は、質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）を包含し得る。質量アイソトポマー分布分析（ＭＩＤＡ）コンビナトリアルアルゴリズムのバリエーションは、当業者に公知の多くの様々な情報源において議論されている。この方法はさらに、ＨｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎおよびＮｅｅｓｅ（１９９９）、ならびにＣｈｉｎｋｅｓら（１９９６）、ならびにＫｅｌｌｅｈｅｒおよびＭａｓｔｅｒｓｏｎ（１９９２）、ならびに米国特許出願番号１０／２７９，３９９によって議論されており、これらの全ては、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１１２】
上に引用される参考文献に加えて、この方法を実行する計算ソフトウェアは、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｍａｒｃ  Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙから公に利用可能である。
【０１１３】
過剰モル比の、理論的パターンとの比較は、目的のタンパク質について作成された表を使用して、または図式的には、決定された関係を使用して、実施され得る。これらの比較から、前駆体サブユニットプールにおけるサブユニットの質量同位体濃縮の可能性を説明する値（例えば、ｐ値）が決定される。次いで、この濃縮は、各質量アイソトポマーについて新たに合成されたタンパク質の濃縮を説明する値（例えば、値ＡＸ＊）を決定するために使用され、全てのアイソトポマーが新たに合成された場合に存在すると予測されるアイソトポマー過剰比を明らかにする。
【０１１４】
次いで、部分存在量が計算される。個々の同位体（元素について）または質量アイソトポマー（分子について）の部分存在量は、その特定の同位体または質量アイソトポマーによって占められる全存在量の割合である。これは、最も多い存在量の種が値１００を与えられ、そして他の全ての種が１００に対して標準化され、そして相対存在量の百分率として表される、相対存在量から区別される。質量アイソトポマーＭＸについて、
【０１１５】
【数１】
2005534906.tif 000002
であり、ここで、０〜ｎは、存在量が起こる最も低い質量（Ｍ０）の質量アイソトポマーに対する見かけの質量の範囲である。
【０１１６】
【数２】
2005534906.tif 000003
であり、ここで、下付き添え字ｅは、濃縮されたことを表し、そしてｂは、ベースラインまたは自然の存在量を表す。
【０１１７】
前駆体投与の期間の間に実際に新たに合成されたポリマーの割合を決定するために、測定された過剰モル比（ＥＭＸ）が、計算された濃縮値ＡＸ＊（これは、各質量アイソトポマーについて新たに合成された生体高分子の濃縮を説明する）と比較され、全てのアイソトポマーが新たに合成された場合に存在すると予測されるアイソトポマー過剰比を明らかにする。
【０１１８】
（分子フラックス速度の計算）
合成の速度を決定する方法は、タンパク質前駆体プールに存在する、質量同位体で標識されたサブユニットの割合を計算する工程、およびこの割合を使用して、少なくとも１つの質量同位体で標識されたサブユニットを含有するタンパク質の予測頻度を計算する工程を包含する。次いで、この予測頻度が、実際の実験的に決定されるタンパク質アイソトポマー頻度と比較される。これらの値から、選択された組み込み期間の間に、添加された同位体標識された前駆体から合成されるタンパク質の割合が決定され得る。従って、このような期間の間の合成の速度もまた、決定される。
【０１１９】
次いで、前駆体−生成物の関係が適用される。連続的標識方法について、同位体濃縮は、漸近（すなわち、最大に可能な）濃縮と比較され、そして動力学的パラメータ（例えば、合成速度）が、前駆体−生成物方程式から計算される。部分合成速度（ｋｓ）が、連続的標識の前駆体−生成物式：
ｋｓ＝［−ｌｎ（１−ｆ）］／ｔ
を適用することによって、決定され得、ここで、ｆ＝部分合成＝生成物濃縮／漸近前駆体／濃縮であり、そして
ｔ＝研究される系における接触の標識の投与時間である。
【０１２０】
不連続標識方法について、同位体濃縮の減少の速度が計算され、そしてタンパク質の動力学的パラメータが、指数関数的減衰方程式から計算される。この方法を実施する際に、生体高分子が、質量アイソトポマー（好ましくは、複数の質量同位体標識された前駆体を含むもの）を濃縮される。タンパク質の、これらのより高い質量のアイソトポマー（例えば、３〜４個の質量同位体標識された前駆体を含むタンパク質）が、比較的低い存在量の天然の質量同位体標識された前駆体に起因して、外因性前駆体の非存在下で無視できる量で形成されるが、タンパク質前駆体の組み込みの期間の間に、有意な量で形成される。細胞、組織、または生物から、引き続く時点で採取されるタンパク質は、質量分析によって分析され、高い質量のタンパク質アイソトポマーの相対頻度を決定する。高い質量のアイソトポマーは、ほぼ排他的に、最初の時点より前に合成されるので、２つの時点の間でのその崩壊は、タンパク質の崩壊の速度の直接的な尺度を提供する。
【０１２１】
好ましくは、第１の時点は、投与の様式に依存して、前駆体の投与を止めた後少なくとも２〜３時間であり、質量同位体で標識されたサブユニットの割合が、前駆体投与後の最も高いレベルから実質的に減衰したことを保証する。１つの実施形態において、続く時点は、代表的に第１の時点後１〜４時間であるが、このタイミングは、バイオポリマープールの置換速度に依存する。
【０１２２】
タンパク質の崩壊の速度は、３つの同位体タンパク質についての崩壊曲線から決定される。本発明の場合において、崩壊曲線がいくつかの時点により規定される場合、崩壊動力学は、この曲線を指数崩壊曲線に適合させることにより決定され得、これから、崩壊定数を決定する。
【０１２３】
分解速度定数（ｋｄ）は、指数崩壊曲線または他の動力学崩壊曲線に基づいて計算され得る：
ｋｄ＝［−ｌｎ  ｆ］／ｔ
本発明が、特定の質量同位体およびタンパク質に関して記載される一方、いかに本方法が、サブユニットプール組成物、ならびに質量同位体で標識され得る２つ以上の同一のサブユニットから形成される実質的に任意のバイオポリマーについての合成速度および崩壊速度を決定するために使用され得るかが、理解される。同様の考察を、有機代謝物について適用する。
【０１２４】
（本発明の技術の使用）
本発明の方法を使用して、行い得る医学的に関連する代謝決定の例としては、以下が挙げられる：ｉ）細胞、組織、または生物中の脂肪合成またはコレステロール合成に関し、栄養効果、および／または薬物処置の効果を決定する、タンパク質の分子フラックス速度；ｉｉ）種々の薬物での処置の前、その間、およびその後の特定の疾患状態において生じ得るような血漿タンパクの分子フラックス速度；ｉｉｉ）筋タンパク質の合成および分解における運動、ホルモン、薬物処置、年齢および疾患のような決定因子の効果を決定する、筋タンパク質ダイナミクス；ｉｖ）インビボでのウイルス複製速度を含む、インビボでのこのような速度における抗ウイルス薬物の評価のための、タンパク質合成速度、ならびに化学療法の効力を決定する、腫瘍中のタンパク質合成速度およびタンパク質分解速度；ｖ）疾患（例えば、糖尿病、癌および低血糖症）により作用され得るような糖新生における変化の研究。正常組織および疾患組織は、しばしば、活性遺伝子の型およびその発現レベルにより識別され得；さらに、疾患の進行は、タンパク質合成またはタンパク質分解の変化の速度を知ることにより、決定され得る。このような試験は、ヒト被験体においてインビボで直接実施されてもよいし、または細胞培養物を使用してエキソビボで実施されてもよい。細胞培養物としては、ヒト細胞、植物細胞、微生物細胞（真菌、酵母および細菌が挙げられる）のような動物細胞が挙げられ得る。
【０１２５】
例えば、癌遺伝子および腫瘍抑圧遺伝子の変化した発現パターンは、これら遺伝子がコードするタンパク質の合成速度および／または分解速度における変化に反映され、そして多数の他の遺伝子の発現プロフィールにおける劇的な変化を引き起こし得る。異なるタンパク質ターンオーバーまたは有機代謝フラックスが、形質転換した状態のマーカーとして働き得、そして従って、腫瘍の診断および分類において潜在的な価値がある。形質転換の原因ではなくむしろ効果である、遺伝子発現における違いは、腫瘍の病期においてマーカーとして使用され得る。従って、公知の腫瘍関連遺伝子のタンパク質動力学的結果の評価は、腫瘍型および腫瘍の病期、処置方法および予後に関して、意味のある情報を提供する可能性を有する。さらに、新しい腫瘍関連遺伝子は、タンパク質または有機代謝フラックスを腫瘍検体およびコントロール組織における遺伝子発現のレベルと体系的に相関させることにより、同定され得る。その発現が正常細胞と比べて腫瘍において増加または減少される、タンパク質または有機代謝物の変化したフラックスと関連する、遺伝子は、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子またはアポトーシス誘導生成物をコードする遺伝子としての分類のための候補である。一般に、基本的な前提は、力学的タンパク質フラックスまたは有機代謝物フラックスのプロフィールは、より未精製の、より生化学的でなく、そしてより体系的でない表現型のマーカーが提供し得るよりも、より特異的な、直接かつ正確な遺伝子機能のマーカーを提供し得る。この手段により、生物における遺伝子産物の生理学的機能または機能不全が、確立され得る−すなわち、真の「機能的遺伝学」が、可能になる。
【０１２６】
これらの実際的適用は、内科医が、健康管理費用を減少させ、迅速な治療的利益を達成し、効果がなくその上毒性の薬物の投与を制限し、そして病原性抵抗における変化（例えば、減少）をモニタリングするのに役立ち得る。
【０１２７】
（キット）
本発明は、インビボで分子フラックス速度を測定し、かつ比較するためのキットを提供する。これらのキットは、同位体標識された前駆体分子を含み得、より好ましい実施形態において、タンパク質を分離、精製、もしくは単離するための当該分野で公知の化合物ならびに／または組織サンプルを得るために必要な化学物質、コンビナトリアル分析のための自動化計算ソフトウェア、およびキットの使用のための指示書を含み得る。
【０１２８】
水の投与のための道具（例えば、測定カップ、針、シリンジ、ピペット、ＩＶチュービング）のような、他のキット構成要素は、キット中で必要に応じて提供され得る。同様に、細胞、組織または生物（例えば、検体カップ、針、シリンジ、および組織サンプリングデバイス）からサンプルを得るための器具がまた、必要に応じて提供され得る。
【０１２９】
（本発明の利点）
本発明の分野は、動的プロテオミクスおよび動的オルガネオミクスの測定−生体システムにおけるそれぞれ発現されたタンパク質および有機代謝物の動力学（すなわち、分子フラックス速度−合成速度および分解速度；生成および除去）に関する。質量分析技術または２次元ゲル電気泳動プロファイリング技術の使用による、同時での非常に多くの数のタンパク質および有機代謝物の静的レベルを測定する能力は、静的プロテオミクスおよび静的オルガネオミクスの分野を大いに進歩させた。しかし、全ての現在のプロテオミクス測定およびオルガネオミクス測定からの以下の欠失は、非常に重要な要素である：動力学またはダイナミックフラックス（すなわち、時間の次元をもたらす分子の流入速度および流出速度）。
【０１３０】
１）現在の質量分析プロテオームプロファイリングからの相違点は、以下である：
ａ）現在の静的質量分析プロファイリング技術は、フラックス（経路を通る分子の動力学または流れ）を測定しない。
【０１３１】
ｂ）生物学的サンプルの収集の前の、安定な同位体標識がインビボまたはエキソビボで投与される、前の工程の操作手順が、プロテオミクスおよびオルガネオミクスについてのプロファイリングの分野で使用されておらず、公知でもない。
【０１３２】
ｃ）特定の質量同位体（ｉｓｏｔｏｐｏｍｅｒ）をモニタリングし、その量的存在量を測定し、分子式、加えられる安定な同位体標識および質量同位体組合わせ計算に基づく各々の分子についての個々の合成速度およびターンオーバー速度を計算する分析手段は、プロテオミクスおよびオルガネオミクスの分野で用いられていなかった。
【０１３３】
ｄ）動力学を追加することにより、焦点は、個々の分子の濃度から分子のプール中へのおよびプールの外への経路フラックスのコントロールへと（すなわち、機能的生化学的出力における個々の分子の真の生化学的結果へと）根本的に変化される。
【０１３４】
ｅ）動力学的測定は、プロテオームおよびオルガネオームの恒常性を制御する調節工程の直接的推論を可能にする。
【０１３５】
２）現れた、または予期され得る根本的な利点および／または驚くべき結果：
ａ）細胞または生物の翻訳（タンパク質合成）プログラムが、タンパク質濃度の変化に対する遅滞期なしに、即座に観察され得る。
【０１３６】
ｂ）他の方法ではデータが利用可能でない、細胞または生物のタンパク質異化作用プログラムが、直接観察され得る。
【０１３７】
ｃ）プロテオームの標識が、処置結果を検出するための静的測定よりも最高２桁大きな感度を有する（すなわち、２０，０００中２００未満のタンパク質が、最も有力な介入の後でさえ定常状態での静的濃度における大きな変化を示す一方、４０〜５０％のタンパク質が、有力な介入後の定常状態での合成速度または異化作用速度における大きな変化を示す）という顕著な結果が、明らかになった。
【０１３８】
前述の発明が、理解を明瞭化する目的に対する例示および例として詳細に記載されるが、特定の変化および改変が、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく本発明になされ得ることが、本発明の教示の下で当業者に容易に明らかである。
【０１３９】
出願人は、任意の特許請求されていない事柄を、放棄せず、公衆に捧げていない。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】図１は、複合生物学的系の組織化を説明する説明図を示す。
【図２】図２は、機能的ゲノミクスのレベルを示す。
【図３】図３は、動的プロテオミクスを測定するための技術を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、標識化水から選択された遊離アミノ酸に交換される標識化水素の経路を示す。例えば、２つの非必須アミノ酸（アラニン、グリシン）および必須アミノ酸（ロイシン）を示す。アラニンおよびグリシンを、図４Ａに示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ロイシンの存在を示す。略語：ＴＡ、トランスアミナーゼ；ＰＥＰ−ＣＫ、ホスホフェノール−ピルビン酸カルボキシナーゼ；ＴＣＡＣ、トリカルボン酸サイクル；ＳＴＨＭ、セリンテトラヒドロ葉酸メチルトランスフェラーゼ。
【図４Ｃ】図４Ｃは、タンパク質合成のための遊離アミノ酸のＨ２１８Ｏ標識を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【国際調査報告】
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