(57)【要約】本発明は、医薬として活性な化合物としての使用のための新規スルホンアミド誘導体、ならびにそのようなスルホンアミド誘導体を含む医薬製剤に関する。前記スルホンアミド誘導体は、神経障害、自己免疫疾患、癌および心血管疾患の処置において有用である。更に、前記スルホンアミド誘導体はJNK経路の有用なモジュレーターであり、それらはJNK2及び3の特に有効で且つ選択的なインヒビターである。本発明は更に、新規スルホンアミド誘導体ならびにその調製法に関する。式IのAr1は置換または非置換アリーレンまたはヘテロアリーレン基であり；R1とR2は、独立して水素とC1-C6アルキル基から成る群から選択される。
2005504031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのスルホンアミド誘導体
【化１】
2005504031.tif 000046
ならびに、その幾何異性体、エナンチオマーとしての光学活性型、ジアステレオ異性体、およびこれらの混合物、ならびにその塩
［式中
Ar1は、置換または非置換アリールまたはヘテロアリール基である；
XはOまたはSである；
Ar2は、置換または非置換アリーレンまたはヘテロアリーレン基である；
R1とR2は、独立して水素およびC1-C6アルキル基からなる群から選択される；
Ra、Ra'、Rb、Rb'は、独立して水素およびC1-C6アルキルからなる群から選択される；
または、Ra'とRaまたはRb'は、これらが結合した炭素原子とともに、O、N、Sから選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含有する、置換または非置換5〜8員の飽和、部分的に不飽和または芳香族の環を形成する；
R3は、H、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、アリールまたはヘテロアリール、N、O、Sから選択される1〜3個のヘテロ原子を任意に含有する3〜8員のシクロアルキル、アリールC1-C10アルキル、およびヘテロアリールC1-C10アルキルからなる群から選択される；
または、R3とRaまたはRa'は、R3に結合したN原子とともに、さらにO、N、Sから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を任意に含有する5〜8員飽和環を形成する；
R4は、Hおよび-C(H)R5R6からなる群から選択される；
R5とR6は、独立してH、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、アリールまたはヘテロアリール、N、O、Sから選択される1〜3個のヘテロ原子を任意に含有する3〜8員シクロアルキル、アリールC1-C10アルキルおよびヘテロアリールC1-C10アルキルからなる群から選択される；
mは１〜5の整数である；
nは0〜2の整数である；そして
pは１〜10の整数である］、
ただし、式Ｉの化合物は、
N-[[5-[[[3-[[4-[(3-アミノプロピル)アミノ]ブチル]アミノ]プロピル]アミノ]スルホニル]2-チエニル]メチル]ベンズアミド、またはN-[[5-[[[3-[[4-[(3-アミノプロピル)アミノ]ブチル]アミノ]プロピル]アミノ]スルホニル]2-チエニル]メチル]4-クロロ]ベンズアミド、またはN,N'-[1,4-ブタンジイルビス(イミノ-3,1-プロパンジイルイミノスルホニル-5,2-チオフェンジイルメチレン)]ビス[4-クロロ-]ベンズアミドのいずれでもない。
【請求項２】
請求項１のスルホンアミド誘導体であって、Ar1が、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、C1-C6アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホニル、およびC1-C6チオアルコキシから選択される基により任意に置換される、フェニル、チエニル、フラニル、ピリジルからなる群から選択される、上記誘導体。
【請求項３】
Ar1が非置換または置換フェニルである、請求項１または２に記載のスルホンアミド誘導体。
【請求項４】
請求項１のスルホンアミド誘導体であって、Ar2が、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、C1-C6アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホニル、およびC1-C6チオアルコキシから選択される基により任意に置換される、フェニレン、チエニレン、ピリジレンからなる群から選択される、上記誘導体。
【請求項５】
Ar2が非置換または置換チエニレンまたはフェニレン基である、請求項１〜４のいずれか１項のスルホンアミド誘導体。
【請求項６】
Ar1が、ハロゲノフェニル、ニトロフェニル、ヒドロキシフェニル、アルコキシフェニル、3,4-ジヒドロキシフェニルから選択され、XがOであり、R1が水素であり、mが１であり、Ar2がチエニレンまたはフェニレンである、請求項１〜５のいずれか１項のスルホンアミド誘導体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項のスルホンアミド誘導体であって：
Ar1が4-クロロフェニルであり、XがOであり、R1とR2が両方とも水素である；mが１である；nが0、1または2である；Ar2が、チエニレンまたはフェニレン基である；Ra、Ra'、Rb、Rb'が水素であり、R3が水素、C1-C6アルキルまたはアリールである；R4が、H、C1-C10アルキル、アリールC1-C10アルキル、CH2-(C3-C8-シクロアルキル)、CH2-(C3-C8-ヘテロシクロアルキル)、CH2-アリールおよびCH2-ヘテロアリール基からなる群から選択される、上記誘導体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項のスルホンアミド誘導体であって：
Ar1が4-クロロフェニルであり、XがOであり、R1とR2が水素であり、mが１である；nが0、1または2である；Ar2が、チエニレンまたはフェニレン基であり、RaまたはRa'が、R3と5〜6員環を形成する；R3が水素、C1-C6アルキルまたはアリールである；R4が、H、C1-C10アルキル、アリールC1-C10アルキル、CH2-C3-C8-シクロアルキル、CH2-C3-C8-ヘテロシクロアルキル、アリールおよびCH2-ヘテロアリール基からなる群から選択される、上記誘導体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項のスルホンアミド誘導体であって：
Ar1が4-クロロフェニルであり、XがOであり、R1とR2が水素であり、mが１である；nが0、1または2である；Ar2が、チエニレンまたはフェニレン基であり、Raが、Ra'と5〜6員環を形成する；R3が水素、C1-C6アルキルまたはアリールである；R4が、H、C1-C10アルキル、アリールC1-C10アルキル、CH2-C3-C8-シクロアルキル、CH2-C3-C8-ヘテロシクロアルキル、アリールおよびCH2-ヘテロアリール基からなる群から選択される、上記誘導体。
【請求項１０】
以下の群から選択される請求項１〜９のいずれか１項のスルホンアミド誘導体：
4-クロロ-N-{5-[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-3-イルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-{5-[2,2-ジメチル-3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-(5-{3-[メチル-(4-トリフルオロメチルベンジル)アミノ]プロピルスルファモイル}チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-{5-[3-(ヘキシルメチルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-{5-[2-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)シクロヘキシルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-[5-(2-ヘキシルアミノエチルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド；
4-クロロ-N-{5-[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-4-イルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-[5-(3-ヘキシルアミノ-2,2-ジメチルプロピルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド；
4-クロロ-N-{5-[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)ベンジルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-{5-[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-(5-{[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-3-イルメチル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド；
4-クロロ-N-(5-{メチル-[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル)ベンズアミド；
4-クロロ-N-{5-[(3-ヘキシルアミノプロピル)メチルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド；
4-クロロ-N-(5-{[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-2-イルメチル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル)ベンズアミド；および
4-クロロ-N-{5-[2,2-ジメチル-3-(3-トリフルオロメタンスルホニルフェニルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項のスルホンアミド。
【請求項１２】
てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病、網膜疾患、脊髄損傷、多発性硬化症、頭部外傷と虚血、卒中、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心筋再潅流障害、および虚血性症状を含む心血管疾患であって心臓、腎臓、腎臓および脳再潅流障害、腎不全を含むものから選択される神経障害の治療用医薬の調製のための、式Ｉ
【化２】
2005504031.tif 000047
［式中
Ar1は、置換または非置換アリールまたはヘテロアリール基である；
XはOまたはSである；
Ar2は、置換または非置換アリーレンまたはヘテロアリーレン基である；
R1とR2は、独立して水素およびC1-C6アルキルからなる群から選択される；
Ra、Ra'、Rb、Rb'は、独立して水素およびC1-C6アルキルからなる群から選択される；
またはRa'とRaまたはRb'は、これらが結合した炭素原子とともに、O、N、Sから選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含有する、置換または非置換5〜8員の飽和、部分的に不飽和または芳香族の環を形成する；
R3は、H、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、アリールまたはヘテロアリール、N、O、Sから選択される1〜3個のヘテロ原子を任意に含有する3〜8員のシクロアルキル、アリールC1-C10アルキル、およびヘテロアリールC1-C10アルキルからなる群から選択される；
またはR3とRaもまたはRa'は、R3に結合したN原子とともに、さらにO、N、Sから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を任意に含有する5〜8員飽和環を形成する；
R4は、Hおよび-C(H)R5R6からなる群から選択される；
R5とR6は、独立してH、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、アリールまたはヘテロアリール、N、O、Sから選択される1〜3個のヘテロ原子を任意に含有する3〜8員シクロアルキル、アリールC1-C10アルキルおよびヘテロアリールC1-C10アルキルからなる群から選択される；
mは１〜5の整数である；
nは0〜2の整数である；そして
pは１〜10の整数である］
のスルホンアミド誘導体、ならびに、その幾何異性体、エナンチオマーとしての光学活性型、ジアステレオ異性体、およびこれらの混合物、ならびにその塩の使用。
【請求項１３】
てんかん、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、網膜疾患、脊髄損傷、多発性硬化症、頭部外傷と虚血、炎症性腸症候群（IBD）、リウマチ様関節炎、喘息、敗血症ショック、移植拒絶から選択される自己免疫疾患、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、肝臓癌、腎臓癌、肺癌から選択される癌、卒中、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、心筋再潅流障害、および虚血性症状を含む心血管疾患であって、心臓、腎臓、腎臓および脳再潅流障害、腎不全を含むものから選択される神経障害の治療用医薬の調製のための、請求項１〜１０項のいずれか１項のスルホンアミド誘導体の使用。
【請求項１４】
JNK経路の調節のための、但書無しの請求項１〜１０のいずれか１項のスルホンアミド誘導体の使用。
【請求項１５】
JNKの異常発現または活性に関連する障害の治療または予防のための、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
JNK2および／またはJNK3の異常発現または活性に関連する障害の治療または予防のための、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１つのスルホンアミド誘導体、
および医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
R4がHではない請求項１〜１０のいずれか１項のスルホンアミド誘導体の調製法であって、式VII （ここで、R5とR6は上記で定義したものである）のカルボニル基を式VIの化合物（ここで、Ar1、X、R1、Ar2、R2、Ra、Ra'、Rb、Rb'、R3、m、n、およびpは上記で定義したものである）で還元アミノ化する工程を含む、上記方法。
【化３】
2005504031.tif 000048
【請求項１９】
式IVの化合物の脱保護工程を含む、R4がHである請求項１〜１０のいずれか１項に記載のスルホンアミド誘導体の調製法。
【化４】
2005504031.tif 000049
【請求項２０】
式VIの化合物が、上記で定義した式IVの化合物の脱保護工程の結果である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
式IVの化合物が、式IIの化合物を式IIIの化合物と反応させた結果である、請求項１９または２０に記載の方法。
【化５】
2005504031.tif 000050
【請求項２２】
式Xの化合物を式IIIのスルホニルクロリド（ここで、Ar1、X、R1、Ar2、R2、Ra、Ra'、Rb、Rb'、R3、R4、m、n、およびpは上記で定義したものである）でN-スルホニル化する工程を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のスルホンアミド誘導体の調製法。
【化６】
2005504031.tif 000051
【化７】
2005504031.tif 000052
【請求項２３】
式Xの化合物が、式IXの化合物の脱保護工程の結果である、請求項２２に記載の方法
【化８】
2005504031.tif 000053
（ここで、Pは保護基である）。
【請求項２４】
式IXの化合物が、式VII の化合物を式VIIIの化合物で還元アミノ化した結果である、請求項２３に記載の方法
【化９】
2005504031.tif 000054
（ここで、Pは保護基である）。
【請求項２５】
式XIII（ここで、Ar1、X、R1、Ar2、R2、Ra、Ra'、Rb、Rb'、m、n、およびpは上記で定義したものである）のカルボニル基を式XIV（ここでR3とR4は上記で定義したものである）のアミンで還元アミノ化する工程を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の式Ｉの化合物の調製法。
【化１０】
2005504031.tif 000055
【請求項２６】
式XIIIの化合物が式XIIの化合物（ここで、Ar1、X、R1、Ar2、R2、Ra、Ra'、Rb、Rb'、m、n、およびpは上記で定義したものである）の酸化の結果である、請求項２５に記載の方法。
【化１１】
2005504031.tif 000056
【請求項２７】
式XIIの化合物が、式XIの化合物（ここで、R2、Ra、Ra'、Rb、Rb'、n、およびpは上記で定義したものである）を式IIIの化合物でスルホン化した結果である、請求項２６に記載の方法。
【化１２】
2005504031.tif 000057
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規スルホンアミド誘導体ならびにその調製法に関する。本発明はさらに、薬剤活性化合物として使用されるスルホンアミド誘導体、ならびにそのようなスルホンアミド誘導体を含有する医薬製剤に関する。特に本発明は、アポトーシス関連障害および炎症疾患の治療および／または予防に有用なスルホンアミド誘導体に関する。さらに本発明は、それぞれc-Jun-N-末端キナーゼ（JNK）機能または経路の実質的な調節、特に阻害活性を示すスルホンアミド誘導体に関する。
【０００２】
発明の背景
哺乳動物細胞は、種々の分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）により仲介されるシグナル伝達カスケードを活性化することにより、いくつかの細胞外刺激に応答する。上流の刺激に対する応答の差にもかかわらず、MAPキナーゼカスケードは同様の方法で組織化され、MAPキナーゼキナーゼキナーゼ（MAPKKKまたはMEKK）、MAPキナーゼキナーゼ（MAPKKまたはMKK）およびMAPキナーゼ（MAPK）からなる。MAPキナーゼは、c-Jun-N-末端キナーゼ（JNK）（「ストレス活性化タンパク質キナーゼ」（SAPK）としても知られている）、ならびに細胞外シグナル制御キナーゼ（ERK）およびp38 MAPキナーゼを含むキナーゼの広いファミリーである。これらの３つのMAPキナーゼサブファミリーのそれぞれは、外部刺激により開始される情報を伝達する、少なくとも３つの異なるが類似の経路に関与する。JNKシグナル伝達経路は、環境ストレス（例えば、化学トキシン、放射線照射、低酸素症および浸透圧ショック）への細胞の暴露、ならびに増殖因子または炎症促進性サイトカイン（例えば、腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）またはインターロイキン-1ベータ（IL-1β））で細胞を処理することにより、活性化される。
【０００３】
２つのMAPキナーゼキナーゼ（MKKまたはMAPKKとして知られている）、すなわちMKK4（JNKK1として知られている）およびMKK7は、サイトカインとストレスシグナルに応答して、酵素上の活性化ループ上のThr-Pro-Tyrモチーフ内に位置する特異的スレオニンとチロシン残基の２重リン酸化により、JNKを活性化する。シグナル伝達カスケード中のさらに上流で、MKK4は、セリンとスレオニン残基でのリン酸化を介するMAPキナーゼキナーゼキナーゼ（MEKK1）により、それ自体が活性化されることが知られている。
【０００４】
いったん活性化されると、JNKは転写因子標的のＮ末端領域に結合し、転写活性化ドメインをリン酸化して、その結果種々の遺伝子産物の発現をアップレギュレートし、これは、アポトーシス、炎症応答または発癌プロセスを引き起こす（１〜５）。
【０００５】
JNK基質であることが知られているいくつかの転写位因子は、Junタンパク質（c-jun、JunBおよびJunD）、関連する転写因子ATF2とATFa、Ets転写因子（例えば、Elk-1とSap-1）、腫瘍サプレッサーp53、および細胞死滅ドメインタンパク質（DENN）である。
【０００６】
３つの明確なJNK酵素は、遺伝子JNK1、JNK2、およびJNK3の生成物として同定されており、JNKの10個の異なるアイソフォームが同定されている（3、6、7）。JNK1とJNK2はヒト組織で遍在的に発現されているが、JNK3は、脳、心臓および睾丸に選択的に発現されている（7、8、9、10）。各アイソフォームは異なる親和性で基質に結合し、インビボでの異なるJNKアイソフォームによるシグナル伝達経路の基質特異的制御を示唆している。
【０００７】
多くの疾患プロセスでJNK経路の活性化が記録されており、これが、薬剤発見のためにこの経路を標的とする理由となっている。さらに分子遺伝的アプローチは、いくつかの疾患におけるこの経路の病理的役割を証明した。
【０００８】
例えば、自己免疫疾患や炎症性疾患は、免疫系の不適切な活性化から起きる。活性化された免疫細胞は、炎症性分子（サイトカイン、増殖因子、細胞表面受容体、細胞接着分子および分解性酵素を含む）をコードする多くの遺伝子を発現する。これらの遺伝子の多くは、転写因子c-JunおよびATF-2の活性化を介してJNK経路により制御されることが知られている。
【０００９】
細菌リポ多糖に刺激されたマクロファージでのJNK活性化の阻害は、主要なインスリン促進性サイトカイン（TNF-α）の産生を有効に調節する（11）。
【００１０】
JNK活性化の阻害は、マトリックス金属プロテアーゼ（MMP）の誘導性発現の原因である転写因子活性化を低下させ（12）、これは、リウマチ様関節炎における軟骨と骨侵食および他の自己免疫疾患の全身性の組織破壊の促進の原因であることが知られている。
【００１１】
JNKカスケードはまた、Ｔ細胞中で、抗原刺激とCD28受容体同時刺激（13）により活性化され、OL-2プロモーターの産生を制御する（14）。Ｔリンパ球の不適切な活性化は、多くの自己免疫疾患（喘息、炎症性腸症候群および多発性硬化症を含む）を発症させ持続させる。
【００１２】
アルツハイマー病の傷害を受けやすいニューロンや急性低酸素症患者のCA1ニューロン（15）中では、JNK3タンパク質は高度に発現される。JNK3遺伝子はまた、アルツハイマー病の脳の傷害領域でも発現されることがわかった（16）。さらにJNK3 KOマウスからのニューロンは、野生型マウスのニューロンと比較して、カイニン酸に誘導されるニューロンアポトーシスに対して耐性になることがわかった（８）。
【００１３】
これらの知見に基づき、JNKシグナル伝達経路、特にJNK2とJNK3の経路は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかんと発作、ハンチントン病、外傷性脳損傷ならびに虚血性および出血性卒中のようなアポトーシス由来の神経変性疾患に関係していると考えられている。
【００１４】
アテローム性動脈硬化症や再狭窄のような心血管疾患は、血管壁の増殖制御の欠陥により起きる。JNK経路は、アテローム発生性刺激により活性化され、血管細胞（17、18）中での局所的サイトカインおよび増殖因子産生を制御し、アテローム性動脈硬化症促進性遺伝子を誘導する（19）。
【００１５】
単独の、または心臓、肝臓、腎臓、または脳の再潅流と組合わさった虚血は、細胞死滅と瘢痕形成を引き起こし、これは最終的に、うっ血性心不全、肝障害、腎不全または脳機能不全を引き起こす。JNK経路は、心臓で虚血と再潅流により活性化され（20）、JNK応答性遺伝子の活性化と白血球介在組織傷害を引き起こす。JNK活性化はまた、虚血と再潅流後の腎臓（21）または肝臓（22）でも観察される。JNKのダウンレギュレーションは、腎不全と虚血性腎不全中の腎機能と長期的結果を改善することが証明されている（23）。
【００１６】
癌は、細胞の無制限な成長、増殖、および拡散が特徴である。早期肺癌では、c-junの発現が変化し、非小細胞肺癌の増殖因子シグナル伝達を仲介する（24）。c-jun産生と活性を制御する以外に、JNK活性化はp53のリン酸化を制御することができ、こうして細胞サイクルの進行を調節する（25）。さらにHTLV-1（ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型）介在腫瘍発生におけるJNK活性化の役割（26）は、癌治療におけるJNKインヒビターの使用可能性を示唆する（27）。天然に存在するJNK阻害タンパク質［JNK-相互作用タンパク質-1（JIP1）と呼ぶ］によるJNK活性化の選択的阻害は、細胞の形質転換を阻止する（28）。すなわちJNKインヒビターは、形質転換と腫瘍細胞増殖を阻止することができる。
【００１７】
JNK経路の調節物質としていくつかの小分子が提唱されている。
【００１８】
それぞれ一般式(A)（WO00/35909号；WO00/35906号；WO00/35921号）と式(B)（WO00/64872号）のアリールオキシインドール誘導体が、神経変性疾患、炎症および固形腫瘍の治療について式(A)、そして神経変性疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患、心血管疾患および骨疾患を含む広範な疾患について式(B)が開発されている。
【化１】
2005504031.tif 000003
【化２】
2005504031.tif 000004
【００１９】
式(C)のピラゾロアントロン誘導体は、神経変性疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患ならびに心血管病態の治療のために、JNKを阻害すると報告されている（WO01/12609号）。
【化３】
2005504031.tif 000005
【００２０】
式(D)のテトラヒドロピリミジン誘導体は、神経変性疾患、炎症性疾患および自己免疫疾患、心血管疾患および破壊性骨疾患を含む広範な疾患の治療に有用なJNKインヒビターであることが報告された（WO00/75118号）。
【化４】
2005504031.tif 000006
【００２１】
式(E)の他の複素環化合物が、神経変性疾患、炎症および自己免疫疾患、破壊性骨疾患、心血管疾患および感染症を含む「JNK介在症状」を治療するために、プロテインキナーゼおよび特に特にc-Jun-N-末端キナーゼを阻害すると言われている（WO01/12621号）。
【化５】
2005504031.tif 000007
【００２２】
式(F)で示されるようなベンザゾール誘導体（WO01/47920号）が、JNK経路の調節物質として、特に神経障害、自己免疫疾患、癌および心血管疾患の治療のためにJNK2および／またはJNK3の選択的インヒビターとして記載されている。
【化６】
2005504031.tif 000008
【００２３】
式(G)のいくつかのスルホンアミド誘導体（WO01/23378号）、式(H)のスルホニルアミノ酸誘導体（WO01/23379号）、および式(J)のスルホニルヒドラジド誘導体（WO01/23382号）もまた、神経変性疾患、自己免疫疾患、癌および心血管疾患の治療のためにJNK、特にJNK2とJNK3を阻害するように開発された。
【化７】
2005504031.tif 000009
【化８】
2005504031.tif 000010
【００２４】
いくつかの広まっている疾患におけるJNK経路の高い関連性は、JNK3インヒビターを含むJNKのインヒビター（好ましくは選択的インヒビター）を開発するニーズを強調している。
【００２５】
発明の要約
本発明の目的は、種々の疾患、特に神経系または自己免疫系関連の障害、癌、虚血症状および心血管疾患の治療に適した分子を提供することである。
【００２６】
特に本発明の目的は、JNK経路が関与する疾患の治療法で有用なJNK（Junキナーゼ）経路を、調節、好ましくはダウンレギュレートまたは阻害することができる化合物を提供することである。
【００２７】
さらに本発明の目的は、該化合物の調製法を提供することである。さらに本発明の目的は、疾患、特にJNK機能により仲介される疾患の治療のための新しい分類の医薬製剤を提供することである。
【００２８】
最後に本発明の目的は、自己免疫系および／または神経系の障害により引き起こされる疾患の治療および／または予防法を提供することである。
【００２９】
第１の態様において本発明は式Ｉの化合物を提供する：
【化９】
2005504031.tif 000011
［式中
・  Ar1は、置換または非置換アリールまたはヘテロアリール基から選択される；
・  Ar2は、置換または非置換アリーレンまたはヘテロアリーレン基から選択される；
・  XはOまたはS、好ましくはOである；
・  R1とR2は、独立して水素およびC1-C6アルキル基からなる群から選択される；
・  Ra、Ra'、Rb、Rb'は、独立して水素およびC1-C6アルキル基からなる群から選択される；または、Ra'とRaまたはRb'は、これらが結合した炭素原子とともに、O、N、Sから選択される１つ以上のヘテロ原子を任意に含有する、置換または非置換5〜8員の飽和、部分的に不飽和または芳香族の環を形成する；
・  R3は、H、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、アリールまたはヘテロアリール、N、O、Sから選択される1〜3個のヘテロ原子を任意に含有する3〜8員のシクロアルキル、アリールC1-C10アルキル、およびヘテロアリールC1-C10アルキルからなる群から選択される；
・  または、R3とRaもまたはRa'は、R3に結合したN原子とともに、さらにO、N、Sから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を任意に含有する5〜8員飽和環を形成する；
・  R4は、Hおよび-C(H)R5R6からなる群から選択される；
・  R5とR6は、独立してH、C1-C10アルキル、C2-C10アルケニル、C2-C10アルキニル、アリールまたはヘテロアリール、N、O、Sから選択される1〜3個のヘテロ原子を任意に含有する3〜8員シクロアルキル、アリールC1-C10アルキルおよびヘテロアリールC1-C10アルキルからなる群から選択される；
・  mは、１〜5の整数、好ましくは１〜3の整数であり、最も好ましくは１である；
・  nは、0〜2の整数、好ましくは0または１である；
・  pは、１〜10の整数、好ましくは１〜6である］。
ただし、式Ｉの化合物は、
ベンズアミド、N-[[5-[[[3-[[4-[(3-アミノプロピル)アミノ]ブチル]アミノ]プロピル]アミノ]スルホニル]2-チエニル]メチル]-；または
ベンズアミド、N-[[5-[[[3-[[4-[(3-アミノプロピル)アミノ]ブチル]アミノ]プロピル]アミノ]スルホニル]2-チエニル]メチル]4-クロロ]；または
ベンズアミド、N,N'-[1,4-ブタンジイルビス(イミノ-3,1-プロパンジイルイミノスルホニル-5,2-チオフェンジイルメチレン)]ビス[4-クロロ]のいずれでもない。
【００３０】
第２の態様において本発明は、疾患の治療のための但書無しの式Ｉの化合物を提供する。
【００３１】
第３の態様において本発明は、医薬組成物の調製のための但書無しの式Ｉの化合物を提供する。
【００３２】
第４の態様において本発明は、JNK経路の調節のための但書無しの式Ｉの化合物を提供する。
【００３３】
第５の態様において本発明は、但書付きの式の化合物の合成法を提供する。
【００３４】
発明の詳細な説明
以下の段落は、化学的残基と用語の定義を与え、他の定義を特に明記しない場合は、本明細書と請求の範囲を通して均等に適用される。
【００３５】
「C1-C6アルキル」は、１〜６個の炭素原子を有する１価の分岐または非分岐のアルキル基を意味する。この用語は、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ヘキシルなどの基により例示される。
【００３６】
「C3-C6シクロアルキル」は、３〜６個の炭素原子を有する飽和または部分的に不飽和の炭素環を意味する。例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニルなどがある。
【００３７】
「C3-C6ヘテロシクロアルキル」は、３〜６個の原子を有し、N、SおよびOから選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有する飽和または部分的に不飽和の環を意味する。例には、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、モルホリニルなどがある。
【００３８】
「アリール」は、単一の環（例えばフェニル）または複数の縮合環（例えばナフチル）を有する６〜14個の炭素原子の不飽和芳香炭素環基を意味する。例には、フェニル、ナフチル、フェナントレニルなどがある。
【００３９】
「アリールC1-C6アルキル」は、アリール置換基（ベンジル、フェネチルなどを含む）を有する上記で定義したC1-C6アルキル基を意味する。
【００４０】
「ヘテロアリール」は、単環式複素環式芳香族、または２環式もしくは３環式縮合複素環式芳香族基を意味する。複素環式芳香族基の具体例には、任意に置換されたピリジル、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、1,2,3-トリアゾリル、1,2,4-トリアゾリル、1,2,3-オキサジアゾリル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,2,5-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、1,3,4-トリアジニル、1,2,3-トリアジニル、ベンゾフリル、[2,3-ジヒドロ]ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、ベンゾトリアゾリル、イソベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、3H-インドリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾ[1,2-a]ピリジル、ベンゾチアゾリル、ベンゾキサゾリル、キノリジニル、キナゾリニル、フタラジニル、キノキサリニル、シノリニル、ナフチリジニル、ピリド[3,4-b]ピリジル、ピリド[3,2-b]ピリジル、ピリド[4,3-b]ピリジル、キノリル、イソキノリル、テトラゾリル、5,6,7,8-テトラヒドロキノリル、5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリル、プリニル、プテリジニル、カルバゾリル、キサンテニルまたはベンゾキノリルがある。
【００４１】
「ヘテロアリールC1-C6アルキル」は、2-フリルメチル、2-チエニルメチル、2-(1H-インドール-3-イル)エチルなどを含むヘテロアリール置換基を有するC1-C6アルキル基を意味する。
【００４２】
「C2-C6アルケニル」は、好ましくは２〜６個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１つまたは２つの部位のアルケニル不飽和を有するアルケニル基を意味する。例には、エテニル（-CH=CH2）、n-2-プロペニル（アリル、-CH2CH=CH2）などがある。
【００４３】
「アルキニル」は、好ましくは２〜６個の炭素原子を有し、かつ少なくとも１つまたは２つの部位のアルキニル不飽和を有するアルキニル基を意味する。例には、エチニル（-C≡CH）、プロパルギル（-CH2C≡CH）などがある。
【００４４】
「アシル」は、基-C(O)Rを意味し、ここでRは「C1-C6アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」を含む。
【００４５】
「アシルオキシ」は、基-OC(O)Rを意味し、ここでRは「C1-C6アルキル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」を含む。
【００４６】
「アルコキシ」は、基-O-Rを意味し、ここでRは「C1-C6アルキル」または「アリール」または「ヘテロアリール」または「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」を含む。好適なアルコキシ基は、例えばメトキシ、エトキシ、フェノキシなどである。
【００４７】
「アルコキシカルボニル」は、基-C(O)ORを意味し、ここでRはH、「C1-C6アルキル」または「アリール」または「ヘテロアリール」または「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」を含む。
【００４８】
「アミノカルボニル」は、基-C(O)NRR'を意味し、ここで各R、R'は、独立して水素または「C1-C6アルキル」または「アリール」または「ヘテロアリール」または「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」を含む。
【００４９】
「アシルアミノ」は、基-NR(CO)R'を意味し、ここで各R、R'は、独立して水素または「C1-C6アルキル」または「アリール」または「ヘテロアリール」または「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」を含む。
【００５０】
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子を意味する。
【００５１】
「スルホニル」は、基「-SO2-R」を意味し、ここでRはH、「アリール」、「C1-C6アルキル」、ハロゲンで置換されてよい「C1-C6アルキル」、例えば-SO2-CF3基、「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」から選択される。
【００５２】
「スルホキシ」は、基「-S(O)-R」を意味し、ここでRはH、「C1-C6アルキル」、ハロゲンで置換されてよい「C1-C6アルキル」、例えば-SO2-CF3基、「アリール」、「ヘテロアリール」、「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」から選択される。
【００５３】
「チオアルコキシ」は、基-S-Rを意味し、ここでRは「C1-C6アルキル」または「アリール」または「ヘテロアリール」または「アリールC1-C6アルキル」または「ヘテロアリールC1-C6アルキル」を含む。例には、チオメトキシ、チオエトキシなどがある。
【００５４】
「置換または非置換」：個々の置換基の定義により制限されない場合は、「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」などの上記基は、「C1-C6アルキル」、「アリールC1-C6アルキル」、「ヘテロアリールC1-C6アルキル」、「C2-C6アルケニル」、「C2-C6アルキニル」、２級または３級アミノ基または4級アンモニウム残基、「アシル」、「アシルオキシ」、「アシルアミノ」、「アミノカルボニル」、「アルコキシカルボニル」、「アリール」、「ヘテロアリール」、カルボキシル、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、メルカプト、ニトロ、スルホキシ、スルホニル、アルコキシ、チオアルコキシ、トリハロメチルなどからなる群から選択される１〜５個の置換基で任意に置換することができる。あるいは該置換はまた、特にビシナル官能性置換基が関与する時、隣接置換基が閉環を受けて、例えば保護基を得るために閉環により形成されるラクタム、ラクトン、環状無水物のみでなく、アセタール、チオアセタール、アミナールを形成する場合を含んでよい。
【００５５】
「医薬として許容される塩」または「錯体」は、所望の生物活性を保持する式Ｉの下記の化合物の塩または錯体を意味する。そのような塩の例には、特に限定されないが、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）と形成される酸付加塩、および有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモイン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、およびポリガラクツロン酸）と形成される塩がある。該化合物はまた、医薬として許容される４級塩として当業者により投与され、これは具体的には、式-NR,R',R"+Z-の４級アンモニウム塩があり、ここでR、R'、R"は、独立して水素、アルキル、またはベンジルであり、Zは対イオンであり、塩化イオン、臭化イオン、ヨウ化イオン、アルコキシド、トルエンスルホネート、メチルスルホネート、スルホネート、ホスホネート、またはカルボキシレート（例えば、安息香酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、桂皮酸塩、マンデル酸塩、およびジフェニル酢酸塩）を含む。
【００５６】
「医薬として活性な誘導体」は、受容者に投与されると、本明細書に開示の活性を直接または間接に与えることができる任意の化合物を意味する。
【００５７】
「エナンチオマー過剰」（ee）は、エナンチオ選択的工程を含む合成により得られる生成物を意味し、ここでは少なくとも約52％のeeの次数のある過剰なエナンチオマーが得られる。エナンチオマー合成が無い場合は通常ラセミ体が得られるが、これはまたJNKインヒビターとしての本発明の活性を有してもよい。
【００５８】
本発明はまた、式Ｉの化合物の幾何異性体、光学活性型、エナンチオマー、ジアステレオ異性体、これらの混合物、ならびにそのラセミ体と医薬として許容される塩を含む。
【００５９】
式Ｉの化合物中の好適なAr1とAr2は、置換または非置換C1-C6アルキル、好ましくはトリハロメチル、置換または非置換C1-C6アルコキシ、置換または非置換C2-C6アルケニル、置換または非置換C2-C6アルキニル、アミノ、アシルアミノ、アミノカルボニル、C1-C6アルコキシカルボニル、アリール、カルボキシル、シアノ、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、スルホニル、スルホキシ、アシルオキシおよびC1-C6チオアルコキシにより任意に置換された、フェニル、チエニル、フラニル、ピリジルからなる群から独立して選択されるものである。最も好ましくはAr1は、置換フェニル、例えばハロゲノフェニル、ヒドロキシフェニル、アルコキシフェニル、そして最も好ましくはAr2は、非置換または置換チエニルまたはフェニル基である。
【００６０】
本発明の特に好適な実施態様は、Ar1が、ハロゲノフェニル、ヒドロキシフェニル、アルコキシフェニルであり、XがOであり、R1が水素であり、mが１であり、nが0または１であり、pが１または2であり、Ar2がチエニレンまたはフェニレン基、好ましくはチエニレン基であり、Ra、Ra'、Rb、Rb'が水素であり、R3がH、低級アルキルまたはアリールである式Ｉのスルホンアミド誘導体である。
【００６１】
本発明の他の好適な群は、Ar1が、ハロゲノフェニル、ヒドロキシフェニル、アルコキシフェニルであり、XがOであり、R1が水素であり、mが１であり、nが0、1または2であり、Ar2がチエニレンまたはフェニレン基、好ましくはチエニレン基であり、かつRaまたはRa'のいずれかが、R3と5〜6員環を形成するか、またはRaがRa'と5〜6員環を形成し、R3がH、低級アルキルまたはアリールである式Ｉの化合物である。
【００６２】
式Ｉの化合物のさらに好適な群において、Ar1は4-クロロフェニルであり、XはOであり、R1は水素であり、mは１であり、nは0、1または2であり、Ar2はチエニレンまたはフェニレン基、好ましくはチエニレン基であり、かつRa、Ra'、Rb、Rb'は水素であり、R3はH、低級アルキルまたはアリールであり、R4はHまたはC1-C10アルキルまたはアリールC1-C10アルキル、好ましくはヘキシルまたはベンジル基である。
【００６３】
該アリールまたはヘテロアリール基は、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、スルホニル（例えば、トリフルオロメチルスルホニル基）、C1-C6アルキルまたはC1-C6フルオロアルキルにより任意に置換される。
【００６４】
但書付きの式Ｉの化合物は新規であると考えられ、本発明の観点を構成する。
【００６５】
但書無しの式Ｉの化合物は、疾患の治療に使用される。
【００６６】
具体的には式Ｉの化合物は、哺乳動物、特にヒトの免疫系および神経系の障害の治療に使用するのに適している。そのような神経系障害には、例えば神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、網膜疾患、脊髄損傷、多発性硬化症、頭部外傷、てんかんと発作、虚血性および溶血性脳卒中がある。免疫系障害には、例えば喘息、移植拒絶、炎症性プロセス、例えば炎症性腸疾患（IBD）、軟骨および骨侵食障害、リウマチ様関節炎、敗血症ショックがある。
【００６７】
式Ｉの化合物はまた、癌（乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、睾丸癌、卵巣癌、肺癌、肝臓癌、および腎臓癌）の治療に使用するのに適している。
【００６８】
別の実施態様において式Ｉの化合物は、心血管疾患（アテローム性動脈硬化症、再狭窄、卒中、虚血、例えば脳虚血、心筋梗塞を含む）の治療に使用するのに適している。
【００６９】
別の実施態様において式Ｉの化合物は、心不全および腎不全、肝障害、および脳再潅流傷害を含む種々の虚血性症状を治療するのに使用される。
【００７０】
好ましくは式Ｉの化合物は、単独でまたは医薬組成物の形で、JNK経路の調節、さらに詳しくは、JNK特にJNK2とJNK3の発現または活性に関連する疾患の治療または予防に有用である。通常該調節は、好ましくはJNK経路の阻害、特にJNK2および／またはJNK3の阻害を含む。JNKのそのような異常発現または活性は、多くの刺激（例えば、ストレス、敗血症ショック、酸化的ストレス、サイトカイン）により開始され、例えば無制限のアポトーシス、炎症性応答または発癌プロセスに至るプロセスのカスケードを引き起こす。これらの現象は、しばしば上記障害および病状を含む種々の障害に関与している。従って本発明の化合物は、JNK機能またはシグナル伝達経路を調節することにより、障害の治療に使用される。JNK機能または経路の調節はその活性化を含むが、好ましくはJNK経路、特にJNK1および／またはJNK2および／またはJNK3の阻害までのダウンレギュレーションを含む。本発明の化合物は、単独でまたは別の薬剤とともに、例えば別のJNK調節物質とともに使用してもよい。
【００７１】
薬剤として使用される時、本発明のスルホンアミド誘導体は典型的には医薬組成物の形で投与される。式Ｉの化合物および医薬として許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物はまた、本発明の範囲内である。当業者は、医薬組成物を調製するのに適した多様なそのような担体、希釈剤または賦形剤を承知している。
【００７２】
式Ｉの化合物は、通常使用されるアジュバント、担体、希釈剤または賦形剤とともに、医薬組成物および単位剤形として調製され、固体（例えば、錠剤または充填カプセル）、または液体（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル、またはこれらが充填されたカプセル）のような形で調製され、すべて経口使用で、また非経口（皮下を含む）使用のための無菌注射用溶液の形で調製される。そのような医薬組成物およびその単位剤形は、通常の比で成分を含み、追加の活性化合物または成分を含むかまたは含まず、そのような単位剤形は、使用される１日の投与量範囲に適した有効量の活性成分を含有してもよい。
【００７３】
薬剤として使用される時、本発明のスルホンアミド誘導体は、典型的には医薬組成物の形で投与される。そのような組成物は、薬剤分野で公知の方法により調製することができ、少なくとも１つの活性化合物を含有する。一般に本発明の化合物は医薬として有効な量で投与される。実際に投与される化合物の量は、関連する状況（治療すべき症状、選択される投与経路、投与される実際の化合物、各患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重症度などを含む）を考慮して、典型的には医師により決定される。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、種々の経路（経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、および鼻内を含む）により投与することができる。目的の送達経路に依存して、この化合物は好ましくは注射用または経口組成物として調製される。経口投与用組成物は、バルク液剤または懸濁剤、またはバルク粉末の形でもよい。しかしより一般的には、組成物は正確な投与を促進するために単位剤形で提供される。用語「単位剤形」は、ヒト被験体および他の哺乳動物のための単位用量として適した物理的に分かれた単位を意味し、各単位は、所望の治療効果を示すように計算されたあらかじめ決められた量の活性物質を、適当な医薬賦形剤とともに含有する。典型的な単位剤形は、あらかじめ充填された、あらかじめ測定されたアンプルまたはシリンジの液体組成物、または丸剤、錠剤、カプセルなどを固体組成物の形で含む。そのような組成物では、スルホンアミド化合物は通常少量成分（約0.1〜約50重量％、または好ましくは約１〜約40重量％）であり、残りは種々のビヒクルまたは担体、および所望の投与型を形成するのに有用な加工補助物である。
【００７５】
経口投与に適した液体型は、適当な水性もしくは非水性ビヒクルを、緩衝剤、懸濁剤、および分配剤、着色剤、香味剤などとともに含む。固体型は、例えば以下の成分の任意のもの、または類似の性質の化合物を含む：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたは乳糖、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；直打用滑沢剤、例えばコロイド二酸化ケイ素；甘味剤、例えばショ糖またはサッカリン；または香味剤、例えばハッカ、サリチル酸メチル、またはオレンジ風味。
【００７６】
注射用組成物は典型的には、注射用無菌食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水、または当該分野で公知の他の注射用担体に基づく。上記したように、そのような組成物中の式Ｉのスルホンアミド化合物は典型的には少量成分であり、しばしば0.05〜10重量％の範囲であり、残りは注射用担体などである。
【００７７】
経口投与または注射用組成物の上記成分は、単に代表的なものである。さらなる物質ならびに加工法などは、(29)のパート８に記載されている。
【００７８】
本発明の化合物はまた、持続放出性型または持続放出薬剤送達系で投与することができる。代表的な持続放出物質の説明もまた、(29)に取り込まれている物質に記載されている。
【００７９】
本発明のさらなる目的は、式Ｉのスルホンアミド誘導体の調製法である。本発明のスルホンアミドは、容易に利用できる出発物質から、以下の一般的方法と操作を使用して調製される。典型的または好適な実験条件（すなわち、反応温度、時間、試薬のモル数、溶媒など）が示される時は、特に明記しない場合は他の実験条件も使用可能であることを理解されたい。最適な反応条件は、使用される特定の反応物または溶媒により変化するが、そのような条件は、当業者がルーチンの最適化法により決定することができる。
【００８０】
本発明の化合物の合成：
新規スルホンアミド誘導体は、容易に利用できる出発物質から調製することができる。式Ｉのスルホンアミドの合成経路の３つの例を記載する。
【００８１】
以下の略語はそれぞれ下記の意味を有する：
AMEBA：(4-ホルミル-3-メトキシフェノキシメチル)ポリスチレン
Boc：tert-ブチルオキシカルボニル
DCE：ジクロロエタン
DCM：ジクロロメタン
DMA：ジメチルアセトアミド
DMF：ジメチルホルムアミド
DMSO：ジメチルスルホキシド
EDTA：エチレンジアミン四酢酸
Fmoc：フルオレニルメチルオキシカルボニル
NMP：N-メチルピロリドン
TFA：トリフルオロ酢酸
THF：テトラヒドロフラン
TLC：薄層クロマトグラフィー
TMOF：トリメチルオルト蟻酸
【００８２】
プロトコールＩ：
好適な経路は、式IIの化合物（ここで、Ra、Ra'、Rb、Rb'、R2、R3、nおよびpは式Ｉで定義したものであり、Pはアミン保護基である）から出発する。
【化１０】
2005504031.tif 000012
【００８３】
式IIのモノ保護ジアミンは公知の化合物であるか市販されており、あるいはこれらは公知の化合物から従来法により調製することができる。式IIの化合物の典型的な例は、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、（n-またはt-）ブチレンジアミン、1-アミノピペリジン、アミノメチルピペリジンがある。
【００８４】
式IIでは、典型的なアミン保護基Pは以下の残渣である：カルボベンゾキシ（Cbz）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（fmoc）、アリルオキシカルボニル、(2S)-2-([[1-(3,5-ジメトキシフェニル)-1-メチルエトキシ]カルボニル]、ベンジル、1,1,1-トリフェニルメチル、最も好ましくはtert-ブチルオキシカルボニル（Boc）。他のアミン保護基は、合成化学者には公知である(30)。
【００８５】
一般にそのようなモノ保護ジアミンは、式IIIのスルホニルクロリドと、スカベンジャーとしての塩基の存在下でスキームIに従って反応して、式IVで示される構造を有するスルホンアミドに到る。
【００８６】
スキームＩ：
【化１１】
2005504031.tif 000013
【００８７】
上記反応は、非求核性塩基（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、炭酸カリウムなど）の存在下で、非プロトン性溶媒（例えば、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、N-メチルピロリジン、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロエタンまたはジクロロメタン）中で、約０℃〜約100℃、好ましくは20〜60℃の温度で行われる。
【００８８】
式IVのスルホンアミドの調製に使用される式IIIのスルホニルクロリドは、通常のスルホニル化法を使用して、好ましくはスルホニル化試薬としてクロロスルホン酸を使用して調製される。典型的にはスルホニル化反応は、式Vのカルボキサミドを約５〜約10モル当量のスルホニル化試薬で不活性溶媒（例えば、ジクロロメタン）中で、約-70℃〜約50℃の温度で処理することにより行われる。
【化１２】
2005504031.tif 000014
【００８９】
好ましくはクロロスルホン酸の添加は-70℃で行われ、中間体であるスルホン酸が生成する。温度を20℃に上げると、式IIIのスルホニルクロリドの生成が可能になる。スルホン化化合物の混合物が得られる場合、式IIIのスルホニルクロリドは、フラッシュクロマトグラフィーまたは結晶化のような適切な方法により単離することができる。
【００９０】
式V（X＝O）のカルボキサミドは、当業者に公知の方法により調製され、例えばアミン（例えばチエ-2-ニルメチルアミン、チエ-2-ニルエチルアミン、フラ-2-ニルメチルアミン、またはピリジル-2-イルメチルアミン）をハロゲン化アロイル（例えば、4-クロロベンゾイルクロリド、ピリジニルベンゾイルクロリド）と反応させることにより調製される。式V（X＝S）のチオカルボキサミドは、当業者に公知の方法により調製され、例えば式VのカルボキサミドをLawesson試薬(31)で処理することにより調製される。
【００９１】
式IVのスルホンアミド化合物はまた、式IIのモノ保護ジアミンから出発して、固相法を使用して、例えばポリマー結合試薬（例えば、ポリマー結合トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピペリジン）を使用して得ることができる。典型的には式IIIのスルホニルクロリドは、式IIの対応するモノ保護ジアミンの１〜5当量過剰で使用される。最終的に残存する過剰のスルホニルクロリドは、ポリマー結合１級アミン（例えば、アミノメチルポリスチレンまたはトリスアミン）を使用して捕捉される。樹脂をろ過することにより、純粋なスルホンアミドが得られる。
【００９２】
当業者に公知の脱保護法（30）を使用する式IV中の保護基Pの以後の除去により、適用される脱保護プロトコールにより、式VIの１級または２級アミン、またはその対応するアンモニウム塩が得られる。
【化１３】
2005504031.tif 000015
【００９３】
式VIのアミンのアンモニウム塩は、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、またはN-メチルモルホリンのような塩基の存在下で中和される。式VIのアミン残基の式Ｉのアミンへのアルキル化は、アルデヒドまたはケトンの還元アミノ化により行われ、式VIのアミンが、式VII（ここでR5とR6は式Ｉについて定義されたものである）の所望のアルデヒドまたはケトンと反応させられる。
【化１４】
2005504031.tif 000016
【００９４】
式VIIのケトンとアルデヒドの典型的な例は、C1-C10アルデヒド／ケトン、およびPh-C(O)-(C1-C6)アルキル型のケトンである。
【００９５】
式VIのアミンが１級アミンかまたは２級アミンかにより、対応するイミンまたはイミニウムイオンがあらかじめ形成され、これは単離されるか、またはin situで還元される。出発物質が１級アミンの場合は、中間体イミンは、さらにアルキル化されるのを避けるため単離される。イミン中間体は、適当な還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素）を用いてPdの存在下で還元される。好適な還元剤は、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムである。イミンがプロトン化されている時は、還元中に例えば酢酸の添加によりpHが調整できるように、イミンの還元が好ましい。還元アミノ化は(32)で考察されている。
【００９６】
式Ｉのスルホンアミドはまた、式VIのアミンまたはそのアンモニウム塩から、ポリマー結合試薬を使用して得ることができる。ポリマー結合塩基（例えば、ポリマー結合トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピペリジン）を使用して、アミンVIのアンモニウム塩を中和してもよい。還元アミノ化のために、式VII の適切なアルデヒドまたはケトンは0.9当量で使用される。ポリマー結合還元剤（例えばポリマー結合水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）を使用して、中間体イミンを式Ｉのアミンに還元する。式VIの過剰のアミンは、AMEBAアルデヒド樹脂を使用して捕捉することができる。次に、樹脂をろ過して式Ｉのスルホンアミドが得られる。
【００９７】
プロトコールII：
他の好適な経路は、式VIIIの化合物（ここで、Ra、Ra'、Rb、Rb'、R2、R3、nおよびpは式Ｉで定義したものであり、Pはアミン保護基である）から出発する。式VIIIのモノ保護ジアミンは、公知の化合物であるか市販されており、あるいはこれらは、公知の化合物から従来法により調製することができる。
【化１５】
2005504031.tif 000017
【００９８】
式VIIIでは、典型的なアミン保護基Pは以下の残基から選択される：カルボベンゾキシ（Cbz）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（fmoc）、アリルオキシカルボニル、(2S)-2-([[1-(3,5-ジメトキシフェニル)-1-メチルエトキシ]カルボニル]、ベンジル、1,1,1-トリフェニルメチル、最も好ましくはtert-ブチルオキシカルボニル（Boc）である。他のアミン保護基は、合成化学者には公知であろう(30)。
【００９９】
式VIIIのアミンのアルキル化は、還元アミノ化を介する式VII のアルデヒドまたはケトンとの反応により行われ、以下のように式IXのアミンが得られる：
【０１００】
スキームII：
【化１６】
2005504031.tif 000018
【０１０１】
式VIIIのアミンは、必要であれば、アミンの一部が脱プロトン化されることを確実にするために非求核性塩基（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、またはN-メチルモルホリン）の存在下で、極性溶媒（例えば、DCE、THF、TMOF、DMF、DMA、DCM、メタノール、NMP）中で、式VII の適切なアルデヒドまたはケトンと反応させられる。中間体のイミン誘導体はin situで還元されるかまたは溶媒を留去して単離され、別の反応で還元される。出発物質が１級アミンの場合は、中間体イミンは、さらにアルキル化されるのを避けるため単離される。イミンがプロトン化されている時は、還元中に例えば酢酸の添加によりpHが調整できるように、イミンの還元が好ましい。イミン誘導体の還元は、適当な還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素）を用いてPdの存在下で行われ、最も好ましくはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムである。好適な溶媒は、DCE、THF、TMOF、DMF、DMA、DCM、メタノール、NMPである。
【０１０２】
式IXのアミンはまた、固相合成を介して、ポリマー結合試薬を使用して得ることができる。ポリマー結合還元剤（例えばポリマー結合した水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム）を使用して、イミンを式IXの対応するアミンに還元する。式VIIIの過剰のアミンは、AMEBAアルデヒド樹脂を使用して除去することができる。次に、樹脂をろ過して式VIIIのアミンが得られる。
【０１０３】
当業者に公知の脱保護法を使用して、式IX中の保護基Pの以後の除去により、対応するアミンXが得られる。
【化１７】
2005504031.tif 000019
【０１０４】
アミンXは、適用される脱保護法により、対応するアンモニウム塩として得られる。
【０１０５】
最終的に、そのようなアミンまたはアンモニウム塩は、式IIIのスルホニルクロリドと、スカベンジャーとしての塩基の存在下で反応されて、式Ｉで示されるスルホンアミドが得られる。
【０１０６】
反応は一般に、非求核性塩基（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、炭酸カリウムなど）の存在下で、非プロトン性溶媒（例えば、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、N-メチルピロリドン、アセトニトリル、クロロホルム、ジクロロエタンまたはジクロロメタン）中で、約０℃〜約100℃、好ましくは20〜60℃の温度で行われる。式Xのアンモニウム塩の場合、反応は過剰のスカベンジャー塩基中で行うべきである。
【０１０７】
スルホンアミドＩはまた、固相合成経路を介して、ポリマー結合試薬（例えば、ポリマー結合トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピペリジン、カーボネート）を使用して合成することができる。典型的にはスルホニルクロリドIIIは、対応するアミンVIIIの１〜1.5当量過剰で使用される。最終的に残存する過剰のスルホニルクロリドは、ポリマー結合１級アミン（例えば、アミノメチルポリスチレンまたはトリスアミン）を使用して捕捉される。樹脂をろ過することにより、純粋なスルホンアミドＩが得られる。
【０１０８】
R4がHである式Ｉの化合物の場合、合成モードはプロトコールＩに従い、いったん化合物VIが生成されるとこのプロセスは止まる。式VIの化合物は、式Ｉの化合物のサブセットである。
【０１０９】
R3が芳香族残基である式Ｉの化合物の生成については、プロトコールIIIを使用すべきである。
【０１１０】
プロトコールIII：
式IIIのスルホニルクロリドを式XIのアミノアルコールと反応させて、式XIIのアルコールを得る。反応は、DMFまたはTHFのような極性溶媒中で行う。過剰のアミンは酸性の水相に抽出される。
【０１１１】
溶媒を留去後、式XIIのアルコールを酸化剤（例えば、ピリジン-N-オキシド）を用いて酸化して式XIIIのアルデヒドを得る。
【０１１２】
式XIIIのアルデヒドを、すでにプロトコールＩまたはIIに記載のように還元アミノ化に付す。この場合、式XIIIのアルデヒドは、式XIVの芳香族アミンと極性溶媒（例えば、DCE、THF、TMOF、DMF、DMA、DCM、メタノール、NMP）中で反応させて式Ｉのアミンを得る。中間体のイミンはin situで還元されるかまたは溶媒を留去して単離され、別の反応で還元される。例えば酢酸、または必要であれば少量の塩基の添加により、pHを弱酸性から中性に調整することにより、イミンの生成が促進される。イミン誘導体の還元は、適当な還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素）を用いてPdの存在下で行われ、最も好ましくはトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムである。好適な溶媒は、DCE、THF、TMOF、DMF、DMA、DCM、メタノール、NMPである。
【０１１３】
スキームIII：
【化１８】
2005504031.tif 000020
【０１１４】
式Ｉのある化合物を得るのに、上記の一般的合成法が適用できないなら、当業者に公知の適当な調製法を使用すべきである。
【実施例】
【０１１５】
実施例：
本発明を以下の実施例により例示するが、これらは決して本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１６】
本発明の化合物は、上記の異なる合成経路に従って合成される。以下の例は、式Ｉの化合物の好適な合成法とその活性の好適な測定法を例示する。
【０１１７】
実施例Ｉ：5-({[1-(4-クロロフェニル)メタノイル]アミノ}メチル)チオフェン-2-スルホニルクロリド（1b）（式IIIの化合物）：
a) 4-クロロ-N-チオフェン-2-イルメチルベンズアミド（1a）
【化１９】
2005504031.tif 000021
50mlの無水CH2Cl2中の塩化4-クロロベンゾイル（0.114mol）を30分かけて、０℃でCH2Cl2（200ml）中の2-アミノメチルチオフェン（0.137mol）とiPr2NEt（0.25mol）の攪拌溶液に加えた。白色の固体が生成し、反応物を１時間かけて室温まで暖めた。混合物を200mlのCH2Cl2で希釈し、塩酸（0.1N）で２回洗浄し、MgSO4で乾燥した。溶媒を留去すると、28ｇ（98％）の標題のベンズアミド（1a）が白色の固体として得られた：融点 153〜54℃、1H NMR（CDCl3） δ 7.9 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.58 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.44 (dd, J=3.77, 1.13 Hz, 1H), 7.22 (d, J=5.27 Hz, 1H), 7.16 (dd, J=3.39, 5.27 Hz, 1H), 6.62 (br d, 1H), 4.98 (d, J=5.65 Hz, 2H)。
【０１１８】
b) 5-({[1-(4-クロロフェニル)メタノイル]アミノ}メチル)チオフェン-2-スルホニルクロリド（1b）
【化２０】
2005504031.tif 000022
CH2Cl2（80ml）中のクロロスルホン酸（20.1ml, 198mmol）を、−80℃のCH2Cl2（500ml）中の上記化合物（1a）（10ｇ、40mmol）の溶液に滴下して加えた。混合物を５時間で室温にした。反応混合物を氷上に注ぎ、CH2Cl2で迅速に抽出した。有機層をMgSO4で乾燥し、溶媒を蒸発乾固して、8.8ｇ（63％）の所望のスルホニルクロリド（1b）を得た；融点 133〜35℃、1H NMR（DMSO-d6） δ 9.21 (t, J=6.4 Hz, 1H), 7.87 (d, J=8.67 Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.67, 2H), 6.91 (d, J=3.39 Hz, 1H), 6.77 (d, J=3.39 Hz, 1H), 4.53 (d, J=3.77 Hz, 2H)。
【０１１９】
実施例II：4-クロロ-N-{5-[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-3-イルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド(2)
上記化合物（２）の合成は３工程合成である（スキームＩを参照）。
【化２１】
2005504031.tif 000023
【０１２０】
プロトコールＩ：
工程１  −  N-スルホニル化（式IVの化合物）
モノ保護ジアミン（+/-）-3-アミノ-1-N-Boc-ピペリジン（式IIの化合物）（0.4ｇ、２mmol、１当量）、5-(4-クロロベンズアミドメチル）チオフェン-2-スルホニルクロリド（1b）（式IIIの化合物）（0.99ｇ、2.4mmol、1.2当量）、およびピペリジン樹脂（２ｇ、1.5当量、1.5mmol/gをのせる）を、オービタルシェーカー上のTHF（50ml）中で一晩回転する。アミノメチルポリスチレン（1.82ｇ，１当量、1.1mmol/g）をフラスコに加え、内容物をオービタルシェーカー上で一晩回転する。
【０１２１】
樹脂をろ過し、さらに50mlのTFFで洗浄する。ろ液を合わせ、減圧下で溶媒を留去して、対応するスルホンアミド（式IV）を定量的に得る。この段階でさらなる精製は必要無い。
【０１２２】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
工程１から得られるスルホンアミドを丸底フラスコに入れ、50％ TFA/DCM（50ml）に溶解する。反応の完了がTLCにより確認されるまで、フラスコをオービタルシェーカー上で回転する。
【０１２３】
減圧下で溶媒を留去して、TFAアンモニウム塩を得る。メタノール（50ml）に溶解した塩、炭酸塩樹脂（2.67ｇ、２当量、1.5mmol/gをのせる）を加え、内容物をオービタルシェーカー上で一晩回転する。樹脂をろ過し、さらに50mlのメタノールで洗浄する。ろ液を合わせ、減圧下で溶媒を留去して遊離アミンを定量的に得る。この段階でさらなる精製は必要無い。
【０１２４】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
丸底フラスコに、工程２からの遊離アミン（0.41ｇ、１mmol、１当量）、アルデヒド 4-(トリフルオロメチル)-ベンズアルデヒド（0.16ｇ、0.9mmol、0.9当量）、および氷酢酸（60μl、１mmol、１当量）を充填する。メタノール（30ml）を加え、フラスコをオービタルシェーカー上で一晩回転する。水素化ホウ素樹脂（0.67ｇ，２当量、2.5mmol/gをのせる）をフラスコに加え、内容物をオービタルシェーカー上で一晩回転する。AMEBA（アルデヒド）樹脂（0.46ｇ，0.5当量、0.9mmol/gをのせる）をフラスコに加え、内容物をオービタルシェーカー上で一晩回転する。
【０１２５】
樹脂をろ過し、さらに30mlのメタノールで洗浄し、ろ液を合わせ減圧下で溶媒を留去して粗生成物を得る。粗生成物を分取HPLCによりアセトニトリルと水を溶出液として使用して精製して、純粋な4-クロロ-N-{5-[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-3-イルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（２）を得る。
【０１２６】
実施例III：4-クロロ-N-{5-[2,2-ジメチル-3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（３）：
上記化合物（３）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールＩ）に従う：
【化２２】
2005504031.tif 000024
【０１２７】
工程１  −  N-スルホニル化（式IVの化合物）
この場合使用されるモノ保護ジアミンは、1-N-Boc-アミノ-2,2-ジメチル-1,3-プロパンジアミンである。
【０１２８】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
上記工程１から得られるスルホンアミドをN-Boc脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１２９】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
上記工程２から得られる遊離アミンを、この場合は4-(トリフルオロメチル)-ベンズアルデヒドと反応させる。精製後の最終生成物は、4-クロロ-N-{5-[2,2-ジメチル-3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（３）である。
【０１３０】
実施例IV：4-クロロ-N-(5-{3-[メチル-(4-トリフルオロメチルベンジル)アミノ]プロピルスルファモイル}チオフェン-2-イルメチル)ベンズアミド（４）：
上記化合物（４）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールＩ）に従う：
【化２３】
2005504031.tif 000025
【０１３１】
工程１  −  N-スルホニル化（式IVの化合物）
この場合使用されるモノ保護ジアミンは、N-(3-アミノプロピル)-N-メチルカルバミン酸tert-ブチルエステルである。
【０１３２】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
上記工程１から得られるスルホンアミドをN-Boc脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１３３】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
上記工程２から得られる遊離アミンを、この場合は4-(トリフルオロメチル)-ベンズアルデヒドと反応させる。精製後の最終生成物は、4-クロロ-N-(5-{3-メチル-(4-トリフルオロメチルベンジル)アミノ]プロピルスルファモイル}チオフェン-2-イルメチル)ベンズアミド（４）である。
【０１３４】
実施例V：4-クロロ-N-{5-{3-(ヘキシルメチルアミノ)プロピルスルファモイル}チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（５）：
上記化合物（５）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールＩ）に従う：
【化２４】
2005504031.tif 000026
【０１３５】
工程１  −  N-スルホニル化（式IVの化合物）
この場合使用されるモノBocジアミンは、N-(3-アミノプロピル)-N-メチルカルバミン酸tert-ブチルエステルである。
【０１３６】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
上記工程１から得られるスルホンアミドをN-Boc脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１３７】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
上記工程２から得られる遊離アミンを、この場合は1-ヘキサナールと反応させる。精製後の最終生成物は、4-クロロ-N-{5-{3-(ヘキシルメチルアミノ)プロピルスルファモイル}チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（５）である。
【０１３８】
実施例VI：4-クロロ-N-{5-[2-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)シクロヘキシルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（６）：
上記化合物（６）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールＩ）に従う：
【化２５】
2005504031.tif 000027
【０１３９】
工程１  −  N-スルホニル化（式IVの化合物）
この場合使用されるモノ保護ジアミンは、1-Boc-アミノ-2-アミノシクロヘキサンである。
【０１４０】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
上記工程１から得られるスルホンアミドをN-Boc脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１４１】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
上記工程２から得られる遊離アミンを、この場合は4-(トリフルオロメチル)-ベンズアルデヒドと反応させる。精製後の最終生成物は、4-クロロ-N-{5-[2-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)シクロヘキシルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（６）である。
【０１４２】
実施例VII：4-クロロ-N-[5-(2-ヘキシルアミノエチルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド（７）：
上記化合物（７）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールＩ）に従う：
【化２６】
2005504031.tif 000028
【０１４３】
工程１  −  スルホニル化（式IVの化合物）
この場合使用されるモノ保護ジアミンは、1-Boc-アミノ-エチレンジアミンである。
【０１４４】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
上記工程１から得られるスルホンアミドをN-Boc脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１４５】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
上記工程２から得られる遊離アミンを、この場合は1-ヘキサナールと反応させる。精製後の最終生成物は、4-クロロ-N-[5-(2-ヘキシルアミノエチルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド（７）である。
【０１４６】
実施例VIII：4-クロロ-N-{5-[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-4-イルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（８）：
上記化合物（８）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールＩ）に従う：
【化２７】
2005504031.tif 000029
【０１４７】
工程１  −  スルホンアミド生成（式IVの化合物）
この場合使用されるモノ保護ジアミンは、4-アミノ-1-Boc-ピペリジンである。
【０１４８】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
上記工程１から得られるスルホンアミドをN-Boc脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１４９】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
上記工程２から得られる遊離アミンを、この場合は4-(トリフルオロメチル)-ベンズアルデヒドと反応させる。精製後の最終生成物は、4-クロロ-N-{5-[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-4-イルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（８）である。
【０１５０】
実施例IX：4-クロロ-N-[5-(3-ヘキシルアミノ-2,2-ジメチルプロピルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド（９）：
上記化合物（９）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールＩ）に従う：
【化２８】
2005504031.tif 000030
【０１５１】
工程１  −  スルホニル化（式IVの化合物）
この場合使用されるモノ保護ジアミンは、1-Boc-アミノ-2,2-ジメチル-1,3-プロパンジアミンである。
【０１５２】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
上記工程１から得られるスルホンアミドをN-Boc脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１５３】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
上記工程２から得られる遊離アミンを、この場合は1-ヘキサナールと反応させる。精製後の最終生成物は、4-クロロ-N-[5-(3-ヘキシルアミノ-2,2-ジメチルプロピルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド（９）である。
実施例X：4-クロロ-N-{5-[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)ベンジルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（10）：
【０１５４】
上記化合物（10）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールＩ）に従う：
【化２９】
2005504031.tif 000031
【０１５５】
工程１  −  スルホニル化（式IVの化合物）
この場合使用されるモノ保護ジアミンは、3-(アミノメチル)-1-N-Boc-アニリンである。
【０１５６】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式VIの化合物）：
上記工程１から得られるスルホンアミドをN-Boc脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１５７】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
上記工程２から得られる遊離アミンを、この場合は4-(トリフルオロメチル)-ベンズアルデヒドと反応させる。精製後の最終生成物は、4-クロロ-N-{5-[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)ベンジルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（10）である。
【０１５８】
平行して上記の一般的方法（プロトコールＩ）に従って、以下の化合物を調製した。
以下の表は、記載した例のHPLCデータと質量スペクトルデータである1,2。
【表１】
2005504031.tif 000032
【０１５９】
実施例XI：4-クロロ-N-{5-[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（11）
上記化合物（11）の合成は３工程合成であり、下記の詳細なプロトコール（プロトコールII）に従う：
【化３０】
2005504031.tif 000033
【０１６０】
プロトコールII：
工程１  −  還元アミノ化（式IXの化合物）
丸底フラスコに、モノ保護ジアミン（式VIIIの化合物）、N-(3-アミノプロピル)-N-メチルカルバミン酸tert-ブチルエステル（１mmol、１当量）、式VII のアルデヒド、4-(トリフルオロメチル）ベンズアルデヒド（0.9mmol、0.9当量）、および氷酢酸（60μl、１mmol、１当量）を充填する。
【０１６１】
メタノール（30ml）を加え、フラスコをオービタルシェーカー上で一晩回転する。水素化ホウ素樹脂（0.67ｇ，２当量、2.5mmol/gをのせる）をフラスコに加え、内容物をオービタルシェーカー上で一晩回転する。AMEBA（アルデヒド）樹脂（0.46ｇ，0.5当量、0.9mmol/gをのせる）をフラスコに加え、内容物をオービタルシェーカー上で一晩回転する。
【０１６２】
すべての樹脂をろ過し、さらに30mlのメタノールで洗浄し、ろ液を合わせ、減圧下で溶媒を留去して生成物を得る。得られる3-Boc-アミノメチルピペリジンアルキル化アミン（式IXの化合物）を、精製することなく以後の反応に使用する。
【０１６３】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式Xの化合物）：
工程１で得られるモノ保護モノアルキルジアミンを100mlの丸底フラスコに入れ、50％ TFA/DCM（50ml）に溶解する。反応の完了がTLCにより確認されるまで、フラスコをオービタルシェーカー上で回転する。
【０１６４】
減圧下で溶媒を留去して、TFAアンモニウム塩を得る。この塩をメタノール（50ml）に溶解し、炭酸塩樹脂（2.67ｇ、２当量、1.5mmol/gをのせる）をフラスコに加え、内容物をオービタルシェーカー上で一晩回転する。
【０１６５】
樹脂をろ過し、さらに50mlのメタノールで洗浄する。合わせたろ液を減圧下で溶媒を留去して、遊離のモノアルキルジアミン（式X）を得る。この段階で精製は必要無い。
【０１６６】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
丸底フラスコに、THF（50ml）中の工程２から得られたモノアルキルジアミン（0.25ｇ、mmol、１当量）、5-（4-クロロベンズアミドメチル)チオフェン-2-スルホニルクロリド（1b）（0.42ｇ、1.2mmol、1.2当量）、およびピペリジン樹脂（１ｇ、1.5当量、1.5mmol/g）を充填する。フラスコをオービタルシェーカー上で一晩回転する。
【０１６７】
アミノメチルポリスチレン（0.91ｇ、１当量、1.1mmol/gをのせる）をフラスコに加え、内容物をオービタルシェーカー上で一晩回転する。
【０１６８】
樹脂をろ過し、さらに50mlのTHFで洗浄する。ろ液を合わせ、減圧下で溶媒を留去して粗生成物を得る。粗生成物を分取HPLCによりアセトニトリルと水を溶出液として使用して精製して、化合物(11)、4-クロロ-N-{5-[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミドを得る。
【０１６９】
実施例XII：4-クロロ-N-(5-{[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-3-イルメチル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（12）：
【０１７０】
上記化合物（12）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（スキーム２参照）に記載されている：
【化３１】
2005504031.tif 000034
【０１７１】
工程１  −  還元アミノ化（式IXの化合物）
使用されるモノ保護ジアミンは、3-Boc-アミノメチル-ピペリジンであり、アルデヒドは4-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒドである。
【０１７２】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式Xの化合物）：
工程１で得られるモノ保護モノアルキルジアミンを脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１７３】
工程３  −  N-スルホニル化（式Ｉの化合物）
工程２から得られる遊離アミンを、化合物（1b）と反応させて、化合物（12）、4-クロロ-N-(5-{[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピペリジン-3-イルメチル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミドを得る。
【０１７４】
実施例XIII：4-クロロ-N-(5-{メチル[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（13）：
上記化合物（12）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールII）に従う：
【化３２】
2005504031.tif 000035
【０１７５】
工程１  −  還元アミノ化（式IXの化合物）
使用されるモノ保護ジアミンは、1-Boc-アミノ-1,3-プロパンジアミンであり、アルデヒドは4-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒドである。
【０１７６】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式Xの化合物）：
工程１で得られるモノ保護モノアルキルジアミンを脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１７７】
工程３  −  N-スルホニル化（式Ｉの化合物）
工程２からの遊離アミンを化合物（1b）と反応させて、4-クロロ-N-(5-{メチル[3-(4-トリフルオロメチルベンジルアミノ)プロピル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（13）を得る。
【０１７８】
実施例XIV：4-クロロ-N-{5-[(3-ヘキシルアミノプロピル)メチルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（14）：
上記化合物（14）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールII）に従う：
【化３３】
2005504031.tif 000036
【０１７９】
工程１  −  還元アミノ化（式IXの化合物）
使用されるモノ保護ジアミンは、N-(3-アミノプロピル)-N-メチルカルバミン酸tert-ブチルエステルであり、アルデヒドは1-ヘキサナールである。
【０１８０】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式Xの化合物）：
工程１で得られるモノ保護モノアルキルジアミンを脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１８１】
工程３  −  N-スルホニル化（式Ｉの化合物）
工程２から得られる遊離アミンを化合物（1b）と反応させて、4-クロロ-N-{5-[(3-ヘキシルアミノプロピル)メチルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（14）を得る。
【０１８２】
実施例XV：4-クロロ-N-(5-{[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピロリジン-2-イルメチル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル)ベンズアミド（15）：
上記化合物（15）の合成は３工程合成であり、上記の詳細なプロトコール（プロトコールII）に従う：
【化３４】
2005504031.tif 000037
【０１８３】
工程１  −  還元アミノ化（式IXの化合物）
使用されるモノ保護ジアミンは、2-(N-tert-ブトキシカルボニルアミノメチル)ピロリジンであり、アルデヒドは4-(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒドである。
【０１８４】
工程２  −  N-Boc-保護の除去（式Xの化合物）：
工程１で得られるモノ保護モノアルキルジアミンを脱保護して、対応する遊離アミンを得る。
【０１８５】
工程３  −  N-スルホニル化（式Ｉの化合物）
工程２から得られる遊離アミンを化合物（1b）と反応させて、4-クロロ-N-(5-{[1-(4-トリフルオロメチルベンジル)ピロリジン-2-イルメチル]スルファモイル}チオフェン-2-イルメチル)ベンズアミド（15）を得る。
【０１８６】
上記の一般的方法（プロトコールII）に従って、以下の化合物を調製した。
以下の表は、記載した例のHPLCデータと質量スペクトルデータである1,2。
【表２】
2005504031.tif 000038
【表３】
2005504031.tif 000039
【０１８７】
実施例XVI：4-クロロ-N-{5-[2,2-ジメチル-3-(3-トリフルオロメタンスルホニルフェニルアミノ)プロピルスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミド（16）
上記化合物（16）の合成は３工程合成であり、以下のプロトコールからなる（スキームIII参照）：
【化３５】
2005504031.tif 000040
【０１８８】
工程１  −  アミノアルコールのスルホニル化（式XIIの化合物）
２当量のDIEA（1.7ml、10mmol）の存在下でDMF中の２当量の3-アミノ-2,2-ジメチルプロパン-1-オール（1.0ｇ、10mmol）の攪拌溶液に、DMF中のスルホニルクロリド（1b）（1.75ｇ、５mmol、１当量）の溶液を加える。反応混合物を室温で12時間攪拌する。DCMを加え、過剰のアミンを0.1N HCl溶液中に抽出する。有機相を食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥する。溶媒を留去して4-クロロ-N-[5-(3-ヒドロキシ-2,2-ジメチルプロピルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド（式XIIの化合物）を得る。LC-MS分析とNMR分析は、この化合物は次の工程に進むのに充分な純度を有することを示した。
【０１８９】
工程２  −  アルコール酸化（式XIIIの化合物）
工程１で得られた式XIIの化合物（954mg、2.3mmol、1.0当量）を５mlのDMSOに溶解し、混合物にEt3N（3.0当量）を加えた。次に、10mlのDMSOに溶解した３酸化イオウピリジン錯体（3.0当量）をさらに反応混合物に加え、これを室温で2.5時間攪拌した（TLCによりアルコールが完全に消失するまで）。HCl（１M）を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機相をHCl（１M）、次に食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。次に溶媒を留去した。アルデヒド 4-クロロ-N-[5-(2,2-ジメチル-3-オキソプロピルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド（式XIIIの化合物）を、酢酸エチル／DCM（1/1）を使用してカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１９０】
工程３  −  還元アミノ化（式Ｉの化合物）
テトラクロロエチレン中の工程２から得られた4-クロロ-N-[5-(2,2-ジメチル-3-オキソプロピルスルファモイル)チオフェン-2-イルメチル]ベンズアミド（式XIII）（0.41ｇ、１mmol、１当量）と3-((トリフルオロメチル)スルホニル)アニリン（0.22ｇ、１mmol、１当量）（式XIV）を、110℃でモレキュラーシーブ４Åの存在下で36時間加熱する。反応混合物を室温まで冷却させ、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（0.12ｇ、２mmol、２当量）を加える。反応物を室温でさらに12時間攪拌する。有機層を食塩水で洗浄し、MgSO4で乾燥する。溶媒を蒸発乾固する。粗生成物を分取HPLCによりアセトニトリル／水勾配を使用して精製して、純粋な化合物（16）4-クロロ-N-{5-[2,2-ジメチル-3-(3-トリフルオロメタンスルホニルフェニルアミノ)プロパンスルファモイル]チオフェン-2-イルメチル}ベンズアミドを得る。
【０１９１】
以下の表は、記載した例のHPLCデータと質量スペクトルデータである1,2。
【表４】
2005504031.tif 000041
【０１９２】
実施例XVII：医薬製剤の調製
以下の調製例は、本発明の代表的医薬組成物を例示するが、これらは本発明を限定するものではない。
【０１９３】
調製１−錠剤
式Ｉのスルホンアミド化合物を、乾燥粉末として乾燥ゼラチン結合剤と約１：２の重量比で混合する。少量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として加える。錠剤成形機で混合物を240〜270錠剤（１錠剤当たり80〜90mgの活性スルホンアミド化合物）に成形する。
【０１９４】
調製２−カプセル
式Ｉのスルホンアミド化合物を、乾燥粉末としてデンプン希釈剤と約１：１重量比で混合する。混合物を250mgのカプセル中に充填する（１カプセル当たり125mgの活性スルホンアミド化合物）。
【０１９５】
調製３−液剤
式Ｉのスルホンアミド化合物（1250mg）、ショ糖（1.75ｇ）およびキサンタンガム（４mg）を混合し、No.10 メッシュU.S.シーブに通し、次にあらかじめ調製した微結晶セルロースとカルボキシメチルセルロースナトリウム（11：89、50mg）の水溶液と混合する。安息香酸ナトリウム（10mg）、香味剤、着色剤を水で希釈し、攪拌しながら加える。次に充分な水を加えて総量５mlとする。
【０１９６】
調製４−錠剤
式Ｉのスルホンアミド化合物を、乾燥粉末として乾燥ゼラチン結合剤と約１：２の重量比で混合する。少量のステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として加える。錠剤成形機で混合物を450〜900mg錠剤（150〜300mgの活性スルホンアミド化合物）に成形する。
【０１９７】
調製５−注射
式Ｉのスルホンアミド化合物を、緩衝化無菌食塩水注射用水性媒体に溶解して、約５mg/mlの濃度とする。
【０１９８】
実施例XVIII：生物学的アッセイ
生物学的結果
式Ｉの化合物の活性は、インビトロとインビボの生物学的アッセイを使用して評価される。
【０１９９】
JNK2およびJNK3インビトロアッセイ：
JNK2またはJNK3によるc-junのリン酸化を、下記のプロトコールに従ってc-jun中への33Pの取り込みを追跡することにより調べることができる。JNKを介するc-junリン酸化への式Ｉの化合物の阻害活性は、式Ｉの化合物の存在下または非存在下でのリン酸化活性を算出することにより測定される。
【０２００】
JNK3および／またはJNK2アッセイは、96ウェルMTTプレート中で行われる：0.5μgの組換えのあらかじめ活性化したGST-JNK3またはGST-JNK2を、１μgの組換えのビオチン化GST-c-Junおよび２μM 33γ-ATP（２nCi/μl）と、式Ｉの化合物の存在下または非存在下で、50μlの反応容量（50mMトリス塩酸、pH8.0；10mM MgCl2；１mM ジチオスレイトール、および100μM Na3VO4を含有する）中でインキュベーション。インキュベーションは室温で120分行われ、リン酸食塩水緩衝液中に250μgのストレプトアビジン被覆SPAビーズ（アマシャム社（Amersham Inc.）*、５mM EDTA、0.1％ トリトンX-100および50μM ATPを含有する溶液200μlを添加して停止させる。室温で60分インキュベーション後、ビーズを1500×ｇで５分間遠心分離して沈殿させ、５mM EDTA、0.1％ トリトンX-100および50μM ATPを含有する200μlのPBSに再懸濁し、上記のようにビーズを沈殿後、放射能をシンチレーションβカウンターで測定する。ビオチン化GST-c-Junをビオチン化GST-1ATF2またはビオチン化ミエリン塩基性タンパク質と交換して、このアッセイを使用して、それぞれあらかじめ活性化したp38とERK MAP キナーゼの阻害を測定する。
【０２０１】
式Ｉの試験化合物は、JNK3について10μM未満の阻害（IC50）、好ましくは１μM未満、さらに好ましくは0.25μM未満の阻害を示す。例えば化合物（13）と（14）は、JNK3についてそれぞれ188nMと184nMの阻害（IC50）を示す。
【０２０２】
IL-2放出アッセイ：
JNK経路活性化は、IL-2のような炎症性サイトカインの産生を開始させる。JNKは、PMAやイオノマイシン（Ionomycine）のような外部刺激により活性化され、IL-2産生は、IL-2 ELISA試験により測定することができる。以下のプロトコールに従って本発明の化合物有りまたは無しで比較測定すると、化合物がストレス介在IL-2放出を妨害する能力が測定される。
【０２０３】
Jurkat細胞、ヒトＴ細胞白血病細胞株（アメリカンタイプカルチャーコレクション#TIB152）を、10％の熱活性化胎児牛血清（FCS）、グルタミンおよびペンストレプ（Penstrep）を補足したRPMI1640培地（ギブコビーアールエル（Gibco BRL））で培養した。培地中の細胞懸濁物を2.10×106細胞／mlを与えるように希釈する。異なる濃度の式Ｉの化合物（化合物の最終濃度、10、３、１、0.3、0.1μM）を含有する96ウェルプレートに、細胞を蒔く（2.105細胞／ウェル）。この混合物を37℃で加湿CO2雰囲気中で30分インキュベートする。次に細胞を、陰性対照を除くすべてのウェルで、10μlのPMA（ホルボールミリステート-13 アセテート-12）＋イオノマイシン（0.1μMと１μM最終濃度）で処理した。化合物の無いウェルに、10μlのRPMI ２％ DMSO（＝0.1％最終）を加える。細胞を37℃で24時間インキュベートし、次に上清を採取（同じ日に使用しないなら−20℃で凍結）した後、上清についてIL-2 ELISA試験を行う。
【０２０４】
IL-2 ELISAアッセイ：
試験化合物の存在下または非存在下での（PMA＋イオノノマイシン）刺激Jurkat細胞による培地へのIL-2放出は、ELISAにより測定される。以下の方法に従う。
【０２０５】
アールアンドディーシステムズ（R & D Systems）からのモノクローナル抗ヒトIL-2抗体（MAB602）（捕捉）、ビオチン化抗ヒトIL-2抗体（BAF202）（検出）および組換えヒトIL-2（202-IL-010）（標準物質）を使用する。
【０２０６】
プレート調製
PBS（PBS-ツイーン0.05％）で５μg/mlに希釈した100μlの捕捉抗体を96ウェルELISAプレートに移し、室温で一晩インキュベートする。各ウェルを吸引し、洗浄緩衝液（PBS-ツイーン0.05％）で３回洗浄する。最後の洗浄後、プレートをダンプ（damp）する。
【０２０７】
アッセイ手順
1.  100μlの試料または標準物質を加え（2000、1000、500、250、125、62.5、31.25pg/ml）、室温で２時間インキュベートする。
2.  ３回洗浄。
3.  100μlの12.5ng/mlのビオチン化抗ヒトIL-2を加え、室温で２時間インキュベートする。
4.  ３回洗浄。
5.  1:10,000の100μlのストレプトアビジン−HRP（ザイメド（Zymed）＃43-4323）を加え、室温で30分インキュベートする。
6.  ３回洗浄。
7.  100μlの基質溶液（クエン酸／Na2HPO4（１：１）＋H2O2 １：2000＋OPD）を加え、室温で20〜30分インキュベートする。
8.  50μlの停止溶液（H2SO4 20％）を各ウェルに加える。
9.  570nmで補正を加え450nmに設定したマイクロタイタープレートリーダーを使用して、光学密度を測定する。
【０２０８】
c-Junレポーターアッセイ
MAPキナーゼシグナル伝達経路中のJNKによる転写因子、c-junのリン酸化は、市販のPathDetect（登録商標）（33）のようなトランスレポーティングシステムにより追跡することができる。次に式Ｉの化合物によるリン酸化の阻害を測定することができる。
【０２０９】
トランスレポーティングシステムは、ルシフェラーゼ活性を介して、融合トランスアクチベータータンパク質の活性化状態を追跡することを可能にする。トランスアクチベータータンパク質は、酵母の転写アクチベーター、GAL4 DNA結合ドメイン（dbd）に融合した目的の転写因子（c-jun）の活性化ドメインからなる。GAL4 dbdは、ここに結合することが知られている哺乳動物転写因子は無く、従ってアッセイのバックグランドが非常に低いという利点を有する。この場合は、GAL4-cJunを構成性に発現するHelaルシフェラーゼレポーター-c-Jun（HLR-c-Jun）細胞株を使用した。
【０２１０】
MEKK-1遺伝子を挿入した。MEKK-1は、JNKの活性化を開始させるMAPKKKである。野生型MEKK-1の発現は、JNK活性化には充分である（34）。いったんJNKが活性化されると、これは、ダイマーを形成する融合トランスアクチベータータンパク質のc-Junドメイン（GAL4dbd-cJun）のリン酸化を誘導する。次にダイマーは、ルシフェラーゼ発現を活性化するレポーターのGAL4上流活性化配列（GAL4 UAS）に結合することができる。
【０２１１】
ルシフェラーゼ発現は、２重ルシフェラーゼ測定系（Dual-Luciferase（登録商標）Assay System）（35）（ここで、ウミシイタケ（Renilla）は「対照レポーター」として使用される）のような簡便なアッセイを使用して発光により検出される。JNKの阻害はルシフェラーゼ発現の低下として観察され、発光の低下により検出される。
【０２１２】
細胞培養
HLR-c-Jun細胞を、10％ FCS（シグマ（Sigma））、２mMグルタミン（ギブコ（Gibco））、P/S、ヒグロマイシンｂ 100μg/ml、およびG418 250μg/mlを補足したDMEM High Glcで培養する。
【０２１３】
細胞培養物の調製
細胞バンク
細胞を液体窒素下でクリオチューブ中で、10％ジメチルスルホキシドを含有する培地中の1.8ml容量の細胞懸濁物として凍結保存する。
【０２１４】
細胞培養物融解
必要であれば、細胞の凍結バイアルを、37℃の水浴中で半分融解するまで回転させて急速に融解する。次に細胞懸濁液を10mlの培地に加え、次に1200rpmで５分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを培地で復元する。フラスコを37℃で５％CO2雰囲気下でインキュベートする。
【０２１５】
細胞継代
80％のコンフルエントな単層が得られたら、細胞を連続的に継代する。
【０２１６】
各フラスコの培地を除去し、単層を10〜15mlのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で洗浄する。
【０２１７】
トリプシン-EDTA溶液を細胞単層に加え、37℃でインキュベートし、時間を置いて静かにたたいて細胞をはがす。顕微鏡観察で細胞の単層が完全にはがれてばらばらになっていることを確認する。次に細胞を10mlの完全培地に再懸濁し、1200rpmで５分間遠心分離する。上清を捨て細胞を培地に再懸濁し、175cm2のフラスコで1/5希釈する。
【０２１８】
０日目の朝
トランスフェクションのために細胞を調製する
ほとんどコンフルエントな培養物の細胞を、上記したようにトリプシンで処理してはがしてばらばらにする。
【０２１９】
細胞を培地に再懸濁して計数する。
細胞懸濁液を培地で希釈して、3.5×106細胞/mlとし、１mlの細胞懸濁液を、９mlの培地を含有する２つの10cmの培養プレートに入れる。
【０２２０】
プレートを37℃で空気中５％CO2の加湿雰囲気でインキュベートする。
【０２２１】
０日目の夕方
トランスフェクション
対照：  0.2μgのpTK ウミシイタケ、5.8μgのpBluescript KS、500μlのOTPIMEM（ギブコ（Gibco））、18μlのフゲン（Fugene）６。
誘導：  0.1μgのpMEKK1、0.2μgのpTK ウミシイタケ、5.7μgのpBluescript KS、500μlのOTPIMEM（ギブコ（Gibco））、18μlのフゲン（Fugene）６ 30' 室温
【０２２２】
蒔いた細胞にトランスフェクション混合物を加える。プレートを37℃で空気中５％CO2の加湿雰囲気で一晩インキュベートする。
【０２２３】
１日目
96ウェルプレート（ウェル当たり100μlの培地）を準備する。
陰性対照（ビヒクル）：２μlのDMSOを100μlに加える（三重測定）。
【０２２４】
式Ｉの化合物のストック希釈物（100％のDMSO中３、１および0.1mM）２μlを100μlに加える（三重測定）。
【０２２５】
トランスフェクトした細胞をトリプシン処理し、12mlの培地に再懸濁する。
【０２２６】
100μlの希釈物を96ウェルプレートのそれぞれに加える。
【０２２７】
プレートを37℃で空気中５％CO2の加湿雰囲気で一晩インキュベートする。
【０２２８】
２日目
試験操作：２重ルシフェラーゼレポーター測定系（Dual-Luciferase（登録商標）Reporter Assay System）（35）
【０２２９】
プレートから培地を除去し、細胞を100μlのPBSで２回洗浄する。溶解試薬を適用する（受動溶解緩衝液、PLB）。各培養ウェルに５μlの１×PLBを分注する。培養プレートを振盪台またはオービタルシェーカー上に置いて、静かに振盪して１×PLBが細胞単層を確実に完全に覆うようにする。培養プレートを室温で15分間振盪する。20μlの溶解物を白濁した96ウェルプレートに移す。ルミノメータの読み値を記録する。
【０２３０】
−  50μlのルシフェラーゼアッセイ試薬IIを注入し、５分と10分の読み値を記録する。
【０２３１】
50μlのStop % Glo（登録商標）試薬を注入し、５分と10分の読み値を記録する。
【０２３２】
次に相対的発光を測定する：RLU ルシフェラーゼ／RLU ウミシイタケ。
【０２３３】
マウスのLPS誘導性エンドトキシンショック
エンドトキシンはグラム陰性菌の外膜のリポ多糖（LPS）成分である。LPSに対する応答は、異なる細胞集団の活性化が関与し、腫瘍壊死因子アルファ（TNFα）およびIFNガンマ（IFN-γ）を含む種々の炎症性サイトカインを発現させることが証明されている。
【０２３４】
LPSは、JNK（36）を含む種々のMAPキナーゼ経路の活性化を刺激することが知られているため、JNKインヒビターの能力は、LPS抗原刺激によりJNKシグナル伝達経路のスイッチを入れた後に試験することができる。
【０２３５】
式の化合物のJNKインヒビターとしての活性は、以下のプロトコールを使用してLPS抗原刺激した後に評価される。
【０２３６】
LPS（S. abortus-Galanos Lab-）をオスのC57BL/6マウスに注射（200μg/kg、静脈内）してエンドトキシンショックを誘導する。LPS抗原刺激の15分前に、式Ｉの化合物（0.1、１、10mg/kg）またはNaCl（200μM）を静脈内注射（10ml/kg）する。LPS抗原刺激の異なる時点で後頭静脈洞からヘパリン化血液を得て、血液を9000rpmで４℃で10分遠心分離して上清を採取した。マウスによるTNFαやIFNγのようなサイトカイン産生の測定は、TNFαについてDuoset（登録商標）DY410、そしてIFNγについてはDY485のようなELISAキットを用いて測定する。（37）に記載のような他のキットを使用することもできる。
【０２３７】
アレチネズミ（Gerbil）における全体的な虚血
アレチネズミの両側性頚動脈閉塞は、急性の虚血性卒中のよく研究された動物モデルであり、手術が比較的容易である。
【０２３８】
数日で海馬の神経変性が発生し、しばしば「遅延神経死滅」と呼ばれる。さらに組織学的に観察される神経変性が明らかであり、容易に定量される（37）。さらにアレチネズミで見られる組織病理は、心臓発作後のヒト脳の海馬CA1領域で観察されるものに似ている。アレチネズミでは行動観察（例えば、記憶試験）も行うことができる。回復の程度を評価するためのこの種の試験は、ラット（その学習能力ははるかに低い）のような他のモデルでは管理が困難である（39）。
【０２３９】
防御するための式Ｉの神経保護作用は、アレチネズミの全体的な虚血モデルとそのようなプロトコールを使用して評価される：
【０２４０】
-1-  方法
* 手術
−  イソフルラン（0.5〜４％）で麻酔する。
−  総頚動脈（左と右）を組織から離す。
−  Bulldogマイクロクランプを使用して５分間動脈を閉塞する。
−  クランプをはずす（再潅流）。
−  目覚めるまで加熱ランプで動物を収容する。
−  個々のケージで動物を収容する。
【０２４１】
* 動物の屠殺
−  虚血の７日後（断頭またはペントバルビタールの過剰投与）。
−  脳のサンプリング。
【０２４２】
* 組織学的パラメータ
−  イソペンタン中で脳を凍結（−20℃）。
−  低温ミクロトームを使用して海馬の切片作成（20μm）。
−  クレジルバイオレット法で染色。
−  改変Gerhard & Boastスコア（40）による病変の評価（海馬のCA1/CA2サブフィールド）。
【０２４３】
-2-  処理
−  式Ｉの化合物またはビヒクルの投与：再潅流（麻酔の回復後５〜10分）後15分、24時間、および48時間。
−  標準的プロトコール
50匹の動物：８匹ずつ５群（A群：対照、B〜D群：３用量の試験物質、およびE群：参照化合物（オロチン酸 ３×300mg/kg、腹腔内）。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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