(57)【要約】本願発明はＥｇ５タンパク質活性を調節することによる症状の治療方法であって、そのような治療を必要とする哺乳類に対して、少なくともひとつの低分子化合物のＥｇ５タンパク質阻害剤の有効量を投与することよりなる方法を提供する。本願発明は、また、Ｅｇ５タンパク質活性を調節することによる症状の治療方法であって、そのような治療を必要とする哺乳類に対して、少なくともひとつの低分子化合物のＥｇ５タンパク質阻害剤の有効量を、少なくともひとつの他の抗がん剤と併用して投与することよりなる方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類に対し、少なくともひとつの低分子化合物のＥｇ５タンパク質阻害剤の有効量を投与することよりなる、Ｅｇ５タンパク質活性を調節することによる病気の治療方法。
【請求項２】
該低分子化合物が有糸分裂停止およびアポトーシスを誘起する、請求項１の方法。
【請求項３】
該低分子化合物が細胞増殖試験において約10μM以下のＩＣ５０値を有する、請求項１の方法。
【請求項４】
該低分子化合物と併用して、少なくともひとつの他の抗ガン剤を当該哺乳類に投与することよりなる、請求項１の方法。
【請求項５】
その病気がガンである、請求項１の方法。
【請求項６】
該低分子化合物が式Ｉ又はＩＩＡ
【化１】
2005506298.tif 000010
（式中、Ｒ１は水素、アルキルおよびシクロアルキルよりなる群から選択され；
Ｒ２とＲ３はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキルおよびヘテロアリールアルキルよりなる群から選択され；又はＲ２とＲ３は一緒になって炭素環若しくはヘテロ環を形成してもよく；
Ｒ４はアルキル、アリールアルキル、ヘテロシクロアルキル、アミノアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ＣＮ、ＣＯＲ５、ＣＯ２Ｒ５およびＣＯＮＲ５Ｒ６よりなる群から選択され；
Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキルおよびヘテロシクロアルキルアルキルよりなる群から選択され；ＺはＯ、ＳおよびＮＲ８よりなる群から選択され；
Ｒ８はＨ、ＣＮ、スルホンアミド、ＯＲ７、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルよりなる群から選択され；Ｒ７はＨ、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキルおよびヘテロアリールアルキルよりなる群から選択される。）
の化合物又はそのエナンチオマー、ジアステレオマー、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物である請求項１の方法。
【請求項７】
Ｒ４がアルキル、アリールアルキル、ＣＯ２Ｒ５およびＣＯＮＲ５Ｒ６よりなる群から選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
Ｒ４がＣＯ２Ｒ５であってＺがＯである、請求項６の方法。
【請求項９】
Ｒ４がＣＯＮＲ５Ｒ６であってＺがＯである、請求項６の方法。
【請求項１０】
Ｒ４がアルキルおよびアリールアルキルよりなる群から選択され、ＺがＯである、請求項６の方法。
【請求項１１】
Ｒ１がメチル、Ｒ２がアリール、Ｒ４がＣＯ２Ｒ５、Ｒ５がアルキルでＺがＯである、請求項６の方法。
【請求項１２】
Ｒ１がメチル、Ｒ２がアリール、Ｒ４がＣＯＮＲ５Ｒ６、Ｒ５がアルキルでＺがＯである、請求項６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、米国仮出願 No.60/279,956(2001年3月29日出願) および No.60/280,366(2001年3月30日出願)に対する米国特許法119条(e)に基づく利益を主張する。
発明の分野
本願発明はキネシン様Ｅｇ５モータータンパク質阻害剤を用いる、ガンのような増殖性疾患の治療方法、および抗悪性腫瘍薬と併用してＥｇ５阻害剤を用いるガンの治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体における細胞集団の維持は、細胞分割およびプログラム化された細胞死の細胞プロセスにより支配されている。正常細胞においては、それぞれのプロセスの開始と完了に関する細胞現象は高度に制御を受けている。ガンのような増殖性疾患においては、それらのいずれか若しくは両方のプロセスが撹乱されている可能性がある。例えばガン細胞は、恐らくは突然変異により、正の制御因子による過剰発現若しくは負の制御因子による発現低下を通じて細胞分割サイクルが制御（チェックポイント制御）を失っているのかもしれない。
或いは、ガン細胞は負の制御因子の過剰発現によりプログラム化された細胞死を進行させる能力を失っているのかも知れない。ここに、ガン性細胞に対してプログラム化された細胞死およびチェックポイント制御を回復させるような新規な化学療法剤開発の必要性が存在する。
ヒトにおけるガン治療法のひとつのアプローチは細胞周期進行の必須タンパク質を標的とすることである。細胞周期がひとつの相から次の相へ進行するためにはある種の必須現象が完了しなければならない。細胞周期にはそれぞれの相と現象を正しい順に実行させるためのチェックポイントが複数存在する。そのようなチェックポイントのひとつが有糸分裂の分裂中期に生じる紡錘体である。有糸分裂における必須機能を有するタンパク質を標的とする低分子化合物が紡錘体チェックポイントを惹起させて有糸分裂の細胞を停止させる可能性がある。有糸分裂の細胞を停止させる低分子化合物の中で、臨床で抗腫瘍活性を示すものがアポトーシス、即ち、プログラム化された細胞死に関連する形態学的変化、をも誘導し得る。ガン治療における有効な化学療法とはプログラム化された細胞死とチェックポイント制御を誘導するものであるかもしれない。残念ながら、細胞内でこれらのプロセスを制御できる化合物はほとんど存在しない。有糸分裂の停止とアポトーシスを誘導できる化合物の多くはチューブリン結合剤である。これらは、微小管の動的不安定性を変化させ、間接的に紡錘体の機能／構造を変化させて有糸分裂の停止を引き起こす。これら化合物の多くはすべての微小管を構成するチューブリンタンパク質を特異的に標的とするから、微小管が関与する多数の正常細胞プロセスの多くに影響を与える可能性がある。従って、増殖細胞関連タンパク質をより特異的に標的化する低分子化合物の必要性が存在する。
【０００３】
Ｅｇ５は、紡錘体に局在する数種のキネシン様モータータンパク質のひとつであり、双極性紡錘体の形成および／又は機能に必要であることが知られている。最近、紡錘体の双極性を妨害する低分子化合物の報告がなされた（非特許文献１参照）。より詳細には、その低分子化合物は異常な紡錘体の形成を誘起したが、そこでは中央にある一対の中心小体より発する微小管の単一星状配列が、微小管末端に染色体が付着した状態で存在する。その低分子化合物は、単一星状配列に因んで「モナストロール」と呼ばれた。この単一星状配列の表現型は以前Ｅｇ５モータータンパク質が免疫的に枯渇した有糸分裂細胞で観察されたことがあった。この独特な単一星状配列の表現型のために、モナストロールのＥｇ５阻害剤としての可能性が確認された。実際、モナストロールは更にin vitro試験で、Ｅｇ５による微小管の運動性を阻害することが示された。Ｅｇ５阻害剤モナストロールは、関連するキネシンモーター又は細胞内ゴルジ装置の運動を担うモーターに対しては明らかな効果を示さない。単一星状配列の表現型を示す細胞は、Ｅｇ５の免疫的枯渇又はＥｇ５のモナストロールによる阻害を通じて細胞周期のＭ期で停止させる。しかしながら、Ｅｇ５の阻害又は免疫的枯渇によりもたらされる有糸分裂の停止は一過性である（非特許文献２参照）。単一星状配列の表現型も、モナストロールによりもたらされる有糸分裂における細胞周期の停止も可逆的である。細胞は回復して、正常な両極性紡錘体を形成し、有糸分裂を完了し細胞周期と正常な細胞増殖を進行させる。これらのデータから、一過性に有糸分裂を停止させるＥｇ５低分子化合物阻害剤はガン細胞増殖に対して有効でないことが示唆される。にもかかわらず、モナストロールによる有糸分裂停止の発見は興味があり、更に研究を進めてヒトのガン治療に有効な方法でＥｇ５モータータンパク質を調節するのに用い得る化合物を同定する必要がある。また、これら化合物を他の抗腫瘍剤と組み合わせて使用する用途を探索する必要もある。
【０００４】
最近の別の報告によれば、レチノイン酸が細胞周期に影響を与えＥｇ５遺伝子発現を調節することによりＧ２／Ｍ期の進行を遅らせることが提唱されている（非特許文献３参照）。Ｅｇ５タンパク質の免疫的枯渇又はモナストロールによる有糸分裂停止と同じく、レチノイン酸による有糸分裂停止も一過性である。
従って、Ｅｇ５阻害剤を用いて、ガンのような増殖性疾患を治療する方法を提供することが本発明の目的である。加えて、Ｅｇ５阻害剤と他の抗腫瘍剤とを併用してガンを治療する方法を提供することが本発明の目的である。本発明のこれらの目的その他の目的は以下の記述から明らかとなるであろう。
要約
本発明は、哺乳類に対して、少なくともひとつの低分子化合物のＥｇ５タンパク質阻害剤の有効量を投与することよりなる、Ｅｇ５タンパク質活性を調節することによる病気の治療方法を提供する。本発明はまた、哺乳類に対して、少なくともひとつの低分子化合物Ｅｇ５阻害剤および少なくともひとつの他の抗ガン剤を併用してその有効量を投与することよりなる治療方法を提供する。
【非特許文献１】
Mayer, T. U. et. al. 1999. Science 286 (5441) 971-4
【非特許文献２】
Kapoor, T. M., 2000. J Cell Biol 150 (5) 975-80
【非特許文献３】
Kaiser, A., et. al., 1999. J Biol Chem 274 (27), 18925-31
【発明の開示】
【０００５】
以下に掲げるのは本発明の方法に用いられる化合物を記述するため使用される種々の述語の定義である。これらの定義は本願明細書において独立して又はより大きなグループの一部として用いられるいずれの場合にも適用される（特別な例において他に限定されない限り）。
「アルキル」の語は、特に他の定義がない限り、単独で又は別のグループの一部として、炭素数１から１２の一価のアルカン（炭化水素）由来のラジカルをいう。アルキル基は直鎖、分枝鎖又は環状の飽和炭化水素グループで置換されていてもよい。置換される場合、アルキル基は最大４つの置換基を有することができ、Ｒとして定義されるが、いずれの位置で置換されていてもよい。アルキル基で置換されたアルキル基という場合は「分枝状アルキル基」と同義的に用いられる。典型的な非置換アルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、n-ブチル、tert-ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等が例示できる。典型的な置換基としては以下の例が挙げられるがこれらに限定されるものではない；ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等）、ハロアルキル（ＣＣｌ３、ＣＦ３）、アルコキシ、アルキルチオ、ヒドロキシ、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、アルキルオキシカルボニル（−Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アルキルカルボニルオキシ（−ＯＣＯＲ）、アミノ（−ＮＨ２）、カルバモイル（−ＮＨＣＯＯＲ又は−ＯＣＯＮＨＲ）、ウレア（−ＮＨＣＯＮＨＲ）、チオール（−ＳＨ）。定義されるアルキル基はひとつ若しくはそれ以上の炭素炭素二重結合又はひとつ若しくはそれ以上の炭素炭素三重結合を含んでいてもよい。
【０００６】
「アルケニル」の語は、単独で又は別のグループの一部として、直鎖、分枝鎖又は環状の炭素数２から１２の炭化水素ラジカルであって、少なくともひとつの炭素炭素二重結を含むものをいう。
「アルキニル」の語は、単独で又は別のグループの一部として、直鎖、分枝鎖又は環状の炭素数２から１２の炭化水素ラジカルであって、少なくともひとつの炭素炭素三重結を含むものをいう。
原稿中、Ｃの後ろの数字は特別の基が包含できる炭素数を定義する。例えば「Ｃ１−６アルキル」は炭素数１から６の直鎖又は分枝鎖状の飽和炭素を示す；例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、sec−ペンチル、イソペンチル、n−ヘキシルを含む。文脈により「Ｃ１−６アルキル」は二つの原子団を架橋するＣ１−６アルキレンをも示すことができる；例えば、プロパン−１，３−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、２−メチルブタン−１，４−ジイル等が含まれる。
「Ｃ２−６アルケニル」は、少なくともひとつの炭素炭素二重結合を含み、炭素数２から６の直鎖又は分枝鎖状の炭素鎖を示す；例えば、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、ペンテニル、ヘキセニルを含む。文脈により、「Ｃ２−６アルケニル」は二つの原子団を橋渡しするＣ２−６アルケンジイルをも示すことができる；例えば、エチレン−１，２−ジイル（ビニレン）、２−メチル−２−ブテン−１，４−ジイル、２−ヘキセン−１，６−ジイル等が含まれる。「Ｃ２−６アルキニル」は少なくともひとつの炭素炭素三重結合を含み、炭素数２から６の直鎖又は分枝鎖状の炭素鎖を示す；例えば、エチニル、プロピニル、ブチニル、ヘキシニル等が含まれる。
「シクロアルキル」の語は、単独で又は別のグループの一部として炭素間の共鳴又は交互性二重結合を有しない、炭素数３から１５のアルキルの種である。１ないし４の環上構造を有していてもよい。非置換体の例としてはシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、アダマンチル等が含まれる。置換基の例としては、以下のグループのひとつ又はそれ以上のものが含まれる；ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アルキルヒドロキシ、アミノ、ニトロ、シアノ、チオールおよび／又はアルキルチオ。
「アルコキシ」又は「アルキルチオ」の語は、単独で又は別のグループの一部として、既述のアルキル基がそれぞれ酸素原子（-Ｏ-）又は硫黄原子（-Ｓ-）を介して結合したものを表示する。
【０００７】
「アルキルオキシカルボニル」の語は、単独で又は別のグループの一部として、カルボニル基を介して結合したアルコキシ基を表示する。アルキルオキシカルボニル・ラジカルは式：-Ｃ(Ｏ)ＯＲで表され、Ｒは直鎖又は分枝鎖状のＣ１−６アルキル基を意味する。
「アルキルカルボニル」の語は、単独で又は別のグループの一部として、カルボニル基を介して結合したアルキル基をいう。
「アルキルカルボニルオキシ」の語は、単独で又は別のグループの一部として、酸素原子を介して結合したアルキルカルボニル基をいう。
「アリールアルキル」の語は、単独で又は別のグループの一部として、既述のアルキル基に結合した芳香族環をいう。
「アリール」の語は、単独で又は別のグループの一部として、単環性または二環性芳香環を示し、例えばフェニル、置換フェニル等および縮合したナフチル環、フェナントレニル環等を示す。従って、アリール基とは、少なくともひとつの６原子よりなる環を有し、最大２２原子よりなる五環性の基を含み、隣接する炭素原子又は適切なヘテロ原子との間に共鳴二重結合が存在する。アリール基はひとつ又はそれ以上の置換基を有していてもよく、限定はされないが、例えばハロゲン、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、アルキルオキシカルボニル、ニトロ、トリフルオロメチル、アミノ、シクロアルキル、シアノ、アルキルＳ（Ｏ）ｍ（ｍ＝０、１、２）又はチオールで置換されていてもよい。
【０００８】
「炭素環」の語は、単独で又は別のグループの一部として、安定な飽和又は一部不飽和の、炭素数３から７の単一環状炭化水素をいい、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等がある。炭素環は置換されていてもよく、即ち、置換可能な位置のひとつ又はそれ以上が下記のものから独立して選択されるひとつ又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい；アルキル（好ましくは低級アルキル）、アルコキシ（好ましくは低級アルコキシ）、ニトロ、モノアルキルアミノ（好ましくは低級アルキルアミノ）、ジアルキルアミノ（好ましくはジ[低級]アルキルアミノ）、シアノ、ハロ、ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）、アルカノイル、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミド（好ましくは低級アルキルアミド）、アルコキシアルキル（好ましくは低級アルコキシ[低級]アルキル）、アルコキシカルボニル（好ましくは低級アルコキシカルボニル）、アルキルカルボニルオキシ（好ましくは低級アルキルカルボニルオキシ）およびアリール（好ましくはフェニル）で、当該アリールは、ハロ、低級アルキル又は低級アルコキシで置換されていてもよい。
「シクロアルキル」の語は、単独で又は別のグループの一部として、炭素数３から９、好ましくは３から７の飽和若しくは一部不飽和の炭化水素を示す。更に、シクロアルキルは置換されていてもよい。置換シクロアルキルとは、１、２又は３個、好ましくは１個の置換基を有する環であり、ハロ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、シアノ、オキソ（＝Ｏ）、ヒドロキシ、アルコキシ、チオアルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｈ、ＣＯ２−アルキル、-Ｃ（＝Ｏ）アルキル、ケト、＝Ｎ−ＯＨ、＝Ｎ−Ｏ−アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロ、五員環又は六員環ケタール（例えば、１，３−ジオキソラン又は１，３−ジオキサン）、−ＮＲ′Ｒ″、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、−ＣＯ２ＮＲ′Ｒ″、−ＮＲ′ＣＯ２Ｒ″、−ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｒ″、−ＳＯ２ＮＲ′Ｒ″、−ＮＲ′ＳＯ２Ｒ″よりなる群から選択される置換基を有していてもよい。ここで、Ｒ′およびＲ″は独立して水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキルより選択され、一緒になってヘテロシクロ環又はヘテロアリール環を形成してもよい。
【０００９】
「ヘテロアリール」の語は、単独で又は別のグループの一部として、置換又は非置換の芳香族単環五員環若しくは六員環、原子の数９又は１０の二環性基又は原子の数１１から１４の三環性基を示し、ここでは少なくともひとつの環に少なくともひとつのヘテロ原子が存在する。それぞれの環のヘテロ原子総数が４以下で少なくともひとつの炭素原子を含むとすれば、ヘテロ原子を含む各ヘテロアリール環は１個又は２個の酸素原子若しくは硫黄原子および／又は１から４の窒素原子を含み得る。二環性基又は三環性基を形成する縮合環は炭素原子のみを有していてもよく、飽和、一部飽和又は不飽和であってもよい。窒素原子又は硫黄原子は、酸化されていてもよく、窒素原子は四級化されていてもよい。二環性又は三環性のヘテロアリール基は少なくともひとつの完全な芳香環を含まなければならないが、他の縮合環は芳香族であっても非芳香族であってもよい。ヘテロアリール環はいずれの環においても置換可能な窒素原子又は炭素原子上で置換することができる。ヘテロアリール環は、ハロ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、チオアルキル、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、ＣＯ２−アルキル、-ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、フェニル、ベンジル、フェニルエチル、フェニルオキシ、フェニルチオ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロ、ヘテロアリール、−ＮＲ′Ｒ″、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ′Ｒ″、−ＣＯ２ＮＲ′Ｒ″、−ＮＲ′ＣＯ２Ｒ″、−ＮＲ′Ｃ（＝Ｏ）Ｒ″、−ＳＯ２ＮＲ′Ｒ″、−ＮＲ′ＳＯ２Ｒ″よりなる群から選択されるゼロ、１、２又は３個の置換基を有してもよく、ここでＲ′およびＲ″は独立して水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキルより選択され、共になってヘテロシクロ環又はヘテロアリール環を形成してもよい。
【００１０】
典型的な単環性ヘテロアリール基としては、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾリニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、オキサジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル等を例示できる。
典型的な二環性ヘテロアリール基としては、インドリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾキサゾリル、ベンゾチエニル、キノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾピラニル、インドリジニル、ベンゾフラニル、クロモニル、クマリニル、ベンゾピラニル、シンノリニル、キノキサリニル、インダゾリル、ピロロピリジル、フロピリジニル、ジヒドロイソインドリル、テトラヒドロキノリニル、等を例示できる。
典型的な三環性ヘテロアリール基としては、カルバゾリル、ベンズインドリル、フェナントロニリル、アクリジニル、フェナントリジニル、キサンテニル等を例示できる。
「ヘテロシクロアルキル」の語は，単独で又は別のグループの一部として、環上の炭素原子のひとつがＯ、Ｓ又はＮより選択されるヘテロ原子で置換され、残りの炭素原子中最大３個までが当該ヘテロ原子で置換されていてもよいシクロアルキル基（非芳香族）をいう。
【００１１】
「ヘテロ環」の語は、単独で又は別のグループの一部として、安定で、飽和又は一部不飽和の単環系であって、環を構成する炭素原子および窒素、硫黄および／又は酸素より選択される他の原子の数が５から７であるものをいう。好ましくは、ヘテロシクリルは単環の５又は６員環であって窒素、硫黄および／又は酸素より選択されるヘテロ原子を１、２又は３個含むものがよい。ヘテロ環は置換されていてもよく、即ち、置換可能な位置のひとつ又はそれ以上が下記のものより独立して選択されるひとつ又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい；アルキル（好ましくは低級アルキル）、アルコキシ（好ましくは低級アルコキシ）、ニトロ、モノアルキルアミノ（好ましくは低級アルキルアミノ）、ジアルキルアミノ（好ましくはジ[低級]アルキルアミノ）、シアノ、ハロ、ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）、アルカノイル、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミド（好ましくは低級アルキルアミド）、アルコキシアルキル（好ましくは低級アルコキシ[低級]アルキル）、アルコキシカルボニル（好ましくは低級アルコキシカルボニル）、アルキルカルボニルオキシ（好ましくは低級アルキルカルボニルオキシ）およびアリール（好ましくはフェニル）で、当該アリールは、ハロ、低級アルキル又は低級アルコキシで置換されていてもよい。そのようなヘテロ環の例としては、イソキサゾリル、イミダゾリニル、チアゾリニル、イミダゾリジニル、ピロリル、ピロリニル、ピラニル、ピラジニル、ピペリジル、モルホリニル、トリアゾリル等が挙げられる。ヘテロ環は炭素原子を介して又は安定構造を与えるならいずれのヘテロ原子を介しても、親構造に置換することができる。
【００１２】
「ヘテロシクリル」の語は、単独で又は別のグループの一部として、安定であって、飽和若しくは一部不飽和の、単環、架橋単環、二環性又はスピロ環系で、炭素原子および窒素、硫黄および／又は酸素より選択される他の原子よりなるものをいう。好ましくは、ヘテロシクリルとは単環５員環若しくは６員環又は二環性８-１１員環であって、炭素原子および窒素、硫黄および／又は酸素より選択される１、２又は３個のヘテロ原子よりなるものをいう。ヘテロシクリルにおいて「置換基を有することがある」とは、置換可能な位置のひとつ又はそれ以上が、以下より独立して選択されるひとつ又はそれ以上の置換基で置換され得ることを示す；アルキル（好ましくは低級アルキル）、アルコキシ（好ましくは低級アルコキシ）、ニトロ、モノアルキルアミノ（好ましくは低級アルキルアミノ）、ジアルキルアミノ（好ましくはジ[低級]アルキルアミノ）、シアノ、ハロ、ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）、アルカノイル、アミノカルボニル、モノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルアミド（好ましくは低級アルキルアミド）、アルコキシアルキル（好ましくは低級アルコキシ[低級]アルキル）、アルコキシカルボニル（好ましくは低級アルコキシカルボニル）、アルキルカルボニルオキシ（好ましくは低級アルキルカルボニルオキシ）およびアリール（好ましくはフェニル）で、当該アリールは、ハロ、低級アルキル又は低級アルコキシで置換されていてもよい。そのようなヘテロシクリルとしては、イソキサゾリル、イミダゾリニル、チアゾリニル、イミダゾリジニル、ピロリル、ピロリニル、ピラニル、ピラジニル、ピペリジル、モルホリニル、トリアゾリル等を例示できる。ヘテロシクリルは炭素原子を介して又は安定構造を与えるならいずれのヘテロ原子を介しても、親構造に置換することができる。
【００１３】
「ヘテロ原子」の語は、独立して選択されたＯ、Ｓ又はＮをいう。いずれのヘテロ原子も、その原子価が満たされない場合はそれが満たされるように水素原子が置換していると解すべきである。
「ハロゲン」又は「ハロ」の語は、独立して選択される塩素、臭素、フッ素又はヨウ素をいう。
「アミノ」の語は、単独で又は別のグループの一部として、−ＮＨ２をいう。「アミノ」は１又は２個の置換基を有することがあり、これらは同一又は異なっていてもよく、例えば、アルキル、アリール、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルキルアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオアルキル、カルボニル、カルボキシ等が挙げられる。これら置換基は更にカルボン酸、ここで定義されたアルキル又はアリールのいずれによっても置換され得る。ある具体的態様では、アミノ基はカルボキシル又はカルボニルで置換されＮ−アシル体又はＮ−カルバモイル体を形成する。
官能基が「保護される」という場合は、保護された部位における好ましくない副反応を除くためその基が修飾されていることを意味する。本発明化合物における適切な保護基は、当業者の知識を考慮し標準的な教科書〔例えば、as Greene, T. W. et al., Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley, N. Y. (1991)〕を参照して本出願から認識できるであろう。
ここで用いられているように、「放射線療法」の語句はＸ線又はガンマー線であって、外部光源から例えばビーム照射したり、小さな放射線活性源を埋め込む場合も含まれるがこれらに限定されるものではない。
ここで用いられているように、「抗悪性腫瘍剤」の語句はガン細胞の増殖を防ぐ化合物をいう。本発明における抗悪性腫瘍剤とは、一般的には、（1）細胞のＤＮＡ複製能力に干渉するか、（2）ガン性細胞にアポトーシスを誘導することにより、ガン細胞の増殖を防ぐ。
ここで用いられているように、「患者」の語はすべての哺乳類を包含する。
【００１４】
本発明の方法で用いられる化合物の適切な無機塩又は有機塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、メタンスルホン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、リン酸塩等を例示できる。薬学的用途に適さない塩であっても、例えば遊離化合物Ｉの精製や単離に利用できるもの、およびその薬学的に許容される塩もまた包含される。
本発明化合物のすべての立体異性体も、混合物として、又は純粋な若しくは実質的に純粋なものとして考慮される。特にラセミ体および特異的活性を呈する、単離された光学異性体が包含される。ラセミ体は物理的方法、例えば、分別結晶、ジアステレオマー誘導体の結晶化若しくは分離又はキラルなカラム・クロマトグラフィーによって分割することが可能である。個々の光学活性体は慣用的手法、例えば、光学活性な酸との塩形成と続く結晶化によりラセミ体から得ることができる。
本発明は式Ｉの化合物のプロドラッグを包含すると理解しなければならない。種々のプロドラッグが当業者に知られている。プロドラッグ誘導体の例としては、以下を参照できる：
(a) Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard (Elsevier, 1985); and Methods in Enzymology, Vol. 42, pp. 309-396, edited by K. Widder et al., (Academic Press, 1985);
(b) A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krosgaard-Larsen and H.Bundgaard, Chapter 5,"Design and Application of Prodrugs,"by H. Bundgaard, pp. 113-191 (1991) ;
(c) H. Bundgaard, Advanced Drug Deliver Reviews, 8, pp. 1-38 (1992);
(d) H. Bundgaard et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77,285 (1988); and (e) N. Kayeka et al., Chem. Phar. Bull., 32,692 (1984).
【００１５】
本発明は、Ｅｇ５タンパク質活性を調節することによる症状の治療方法であって、そのような治療を必要とする哺乳類に対して、少なくともひとつの低分子化合物のＥｇ５タンパク質阻害剤の有効量を投与することよりなる方法を提供する。本発明はまた、Ｅｇ５タンパク質活性を調節することによる症状の治療方法であって、そのような治療を必要とする哺乳類に対して少なくともひとつの低分子化合物Ｅｇ５阻害剤および少なくともひとつの他の抗ガン剤を併用して（同時に又は経時的に）その有効量を投与することよりなる方法を提供する。好ましい具体的態様は、治療対象がガンのような増殖性疾患である。抗悪性腫瘍剤として作用する化合物およびＥｇ５タンパク質を調節して有糸分裂を停止させ、アポトーシスを誘起し得る化合物はいずれも本発明で使用できる。モナストロールはアポトーシスを誘起しないので本発明の範囲には含まれない。加えて、本発明は、ＨｓＥｇ５遺伝子配列からデザインされたアンチセンスのオリゴヌクレオチドを含まない。
低分子化合物Ｅｇ５モータータンパク質阻害剤はどのような化合物でもよく、例えば２００２年３月２２日出願、代理人事件整理番号LD0300の米国特許出願で、発明の名称「シアノ置換ジヒドロピリジン化合物およびその疾病治療用途」（シリアル番号未定）に記載された化合物（参考のためその開示をここに組み込んだ）又はその薬学的に許容される塩が使用できる。これらは有糸分裂停止およびアポトーシス誘導によりガン治療に対する有効性又は可能性が示された。本発明の方法で使用される化合物で好ましいものとしては、下式Ｉ、ＩＩＡ又はＩＩＩＡの化合物、
【００１６】
【化１】
2005506298.tif 000002
そのエナンチオマー、ジアステレオマー、薬学的に許容される塩、プロドラッグ、溶媒和物が含まれる。ここで、Ｒ１は、水素、アルキル又はシクロアルキルであり;Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル又はヘテロアリールアルキルであり、又はＲ２とＲ３は共に炭素環若しくはヘテロ環を形成し；Ｒ４はアルキル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ＣＮ、ＣＯＲ５、ＣＯ２Ｒ５又はＣＯＮＲ５Ｒ６であり；Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立してＨ、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル又はヘテロシクロアルキルアルキルであり；ＺはＯ、Ｓ又はＮＲ８であり；Ｒ８はＨ、ＣＮ、スルホンアミド、ＯＲ７、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルであり；
Ｒ７はＨ、アルキル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル又はヘテロアリールアルキルである。より好ましい態様は、本発明の方法に使用される低分子化合物は式Ｉ又はＩＩＡ
【００１７】
【化２】
2005506298.tif 000003
の化合物である。
本発明の好ましい態様のひとつは、式Ｉ又はＩＩＡの化合物において、Ｒ１がアルキル、Ｒ２がアリールおよびヘテロアリールよりなる群から選択され、Ｒ３がＨ、Ｒ４がアルキル、アリールアルキル、ＣＯ２Ｒ５およびＣＯＮＲ５Ｒ６よりなる群から選択され、Ｒ５とＲ６はそれぞれ独立してＨ、アルキルおよびアリールアルキルよりなる群から選択され、ＺはＯ、Ｓ又はＮＲ８よりなる群から選択され、Ｒ８はＨおよびＣＮよりなる群から選択される。
別の好ましい態様は、上記式Ｉ又はＩＩＡの化合物よりなる発明であって、Ｒ４がアルキル、アリールアルキル、ＣＯ２Ｒ５およびＣＯＮＲ５Ｒ６よりなる群から選択されるものである。
更に別の好ましい態様は、上記式Ｉ又はＩＩＡの化合物よりなる発明であって、Ｒ４がＣＯ２Ｒ５又はＣＯＮＲ５Ｒ６であり、ＺがＯであるものである。
更に別の好ましい態様は、上記式Ｉ又はＩＩＡの化合物よりなる発明であって、Ｒ４がアルキルおよびアリールアルキルよりなる群から選択され、ＺがＯであるものである。
更に別の好ましい態様は、上記式Ｉ又はＩＩＡの化合物よりなる発明であって、Ｒ１がメチル、Ｒ２がアリール、Ｒ４がＣＯ２Ｒ５であり、Ｒ５がアルキル、ＺがＯであるものである。
更に別の好ましい態様は、上記式Ｉ又はＩＩＡの化合物よりなる発明であって、Ｒ１がメチル、Ｒ２がアリール、Ｒ４がＣＯＮＲ５Ｒ６であり、Ｒ５がアルキル、ＺがＯであるものである。
【００１８】
併用療法（同時又は経時的）においては、Ｅｇ５タンパク質の低分子化合物阻害剤は既知の抗ガン治療、例えば放射線療法と共に使用できる。又、細胞分裂停止性若しくは細胞毒性の薬剤、例えば限定はされないが、シスプラチンやドキソルビシンのようなＤＮＡ作用薬、エトポシドのようなトポイソメラーゼＩＩ阻害薬、ＣＰＴ−11やトポテシンのようなトポイソメラーゼＩ阻害薬、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロンのようなチューブリン作用薬、タモキシフェンやカソデックスのようなホルモン性薬剤、５−フルオロウラシルのようなチミジル酸合成阻害薬、BMS-214662のようなファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、フラボピリドールのようなサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、メトトレキサートのような代謝拮抗剤等と併用できる。
更に、併用療法には、他の抗ガン剤と一定用量を製剤化した低分子化合物Ｅｇ５阻害剤も含まれる。一定用量を製剤化する場合、合剤として有効用量範囲内の本発明化合物と、認可された用量範囲内の他の薬剤とを用いる。合剤とするのが適切でない場合、本発明の方法に用いる化合物は既知の抗ガン剤又は細胞毒性薬剤と経時的に投与してもよい。本発明は連続投与に限定されるものではない；Ｅｇ５タンパク質の低分子化合物阻害剤は既知の抗ガン剤又は細胞毒性薬剤の投与前又は投与後に投与することができる。
併用療法の場合、Ｅｇ５タンパク質の低分子化合物阻害剤および抗腫瘍剤はそれらが単独投与される場合よりも少ない用量で本発明の治療効果を達成することができ、それ故に毒性による副作用を回避又は最小に押さえることが期待される。
【００１９】
発明の背景で述べたように、Ｅｇ５はキネシン様モータータンパク質であって細胞周期の有糸分裂における紡錘体両極化を助長する。より詳しくは、Ｅｇ５は有糸分裂において紡錘体の微小管を束ねて選別するために働く。従って、Ｅｇ５はサイクルのＭ期における紡錘体チェックポイントを通じて細胞周期制御に関与する。いずれの理論にも束縛されないことを希望するが、本発明の方法に使用される化合物はＥｇ５阻害剤として作用するものである。本発明の方法に使用される化合物はまた、他のモータータンパク質、例えば限定はされないが、Xklp2、MKLP1、CHO1、クロモキネシン、Nod、Cenp-E、MCAK、BimCファミリー、Kar3ファミリー等に対応するヒトモータータンパク質をも阻害することが考えられる。かくして本発明はまた、Xklp2、MKLP1、CHO1、クロモキネシン、Nod、Cenp-E、MCAK、BimCファミリー、Kar3ファミリー等に対応するモータータンパク質を制御することにより、ガンのような増殖性疾患を含む病気を治療する方法を与える。その方法は、そのような治療を要する哺乳類に当該モータータンパク質の低分子化合物阻害剤を少なくともひとつ、その有効量を投与することからなり、他の抗ガン剤と併用してもよい。更に、本発明の方法に使用される化合物はまた、他のキネシン又はキネシン様タンパク質の阻害剤として作用することが想定されるので、他のキネシン又はキネシン様タンパク質に関連する疾患の治療にも有効である。従って、本発明はキネシン又はキネシン様タンパク質を制御することにより、ガンのような増殖性疾患を含む病気を治療する方法を与える。その方法は、そのような治療を要する哺乳類に当該キネシン又はキネシン様タンパク質の低分子化合物阻害剤を少なくともひとつ、その有効量を投与することからなり、他の抗ガン剤と併用してもよい。
【００２０】
本発明の方法で使用される化合物は、両極性紡錘体を崩壊させ、紡錘体チェックポイントを開始させ、有糸分裂を停止させ、プログラム化された細胞死を誘起してガン細胞の増殖を抑制する。レチノイン酸やモナストロールがそれぞれＥｇ５の発現又は作用を制御することにより有糸分裂を一過性に停止させることに比べて、本発明の方法に使用される低分子化合物はＥｇ５モータータンパク質の作用を阻害して細胞周期を停止させるが、それは一過性のものでなく、むしろプログラム化された細胞死を進行させる。更に本発明の方法に使用される化合物は効力が強くヒト細胞に対してin vitroで有糸分裂を停止させアポトーシスを誘起する。好ましい化合物の場合、約10μMと同濃度若しくはそれ以下でかかる効果を発現する。
レチノイン酸のような薬剤は細胞に対して多指向性の効果を発現するが、これに比して本発明の低分子化合物は多くの制御的遺伝子の発現に直接作用を及ぼさない。
微小管作用薬に比して、本発明は微小管の動的不安定性を損なうことはない。本発明は、Ｅｇ５モータータンパク質の阻害することにより、より特異的に増殖細胞の紡錘体を標的化することができ、既存の抗ガン剤とは異なった毒性を与えることができる。
本発明のある種の化合物は、以下のスキームと当業者の通常の知識に従って一般的に調製可能である。本発明化合物の溶媒和物（例えば水和物）もまた本発明の範囲内にある。溶媒和の方法は当業者に一般に知られている。従って、本発明化合物は遊離体若しくは水和物の形で、以下のスキームで例示される方法により得ることができる。
【００２１】
【化３】
2005506298.tif 000004
ＺがＳである式Ｉの化合物はスキーム１に従って製造される。ケトン又はアルデヒドＩ（例えばベンズアルデヒドではＲ２がフェニル、Ｒ３がＨ）とアセトアセタミドＩＩＩを縮合させるとクネーフェナーゲル(Knoevenagel)生成物ＩＶが異性体混合物として得られる。Ｓ−パラメトキシベンジルチオウレアと反応させると保護されたジヒドロピリジンチオンＶが得られる。例えば、バージェス(Burgess)試薬、（メトキシカルボニルスルファモイル）トリエチルアンモニウムヒドロキシド・分子内塩のような脱水剤を用いて、Ｖの一級アミド基を脱水させることによりＶＩにおけるシアノ置換基に誘導できる。Ｎ３置換基がＲ４Ｘとの反応により導入でき、ここでＲ４はアルキル若しくはアシル、Ｘは脱離基であるか、又はＲ４Ｘはイソシアネート若しくはハロホルムである。保護基は水の存在下酸で処理することにより除去することができ、ＺがＳである式Ｉの化合物を与える。
【化４】
2005506298.tif 000005
クネーフェナーゲル(Knoevenagel)生成物ＩＶをＯ-メチルイソウレアと反応させて得られるＯ-メチルジヒドロピリミジンＶＩＩＩから、ＺがＯ、ＮＨ又はＮＲ８である式Ｉの化合物が製造される。バージェス(Burgess)試薬のような脱水剤を用いて一級アミドをニトリル基に変換する。Ｎ３置換基がＲ４Ｘとの反応により導入でき、ここでＲ４はアルキル若しくはアシル、Ｘは脱離基であるか、又はＲ４Ｘはイソシアネート若しくはハロホルムである。メチルエーテル保護基は水の存在下、酸で処理することによりＺがＯである式Ｉの化合物が製造される。或いは式Ｘの化合物をアンモニウムアセテートの存在下水酸化アンモニウムと反応させて又はメタノール中シアナミドと反応させてＺがＮＨ又はＮＲ８である式Ｉの化合物が製造される。
式Ｉの化合物はビグネリ(Bignelli)反応〔D.J.Brown in The Pyrimidines, Wiley: New York, 1962, 440〕を用いて製造することもできる。
【００２２】
【化５】
2005506298.tif 000006
式Ｉの化合物はスキームＩＩＩに概略を示すように固体支持体上で製造することもできる。出発化合物ＸＩは、固相合成に用いる樹脂に結合したベンジルアルコールを意味し、●で示されるメリフィールド樹脂と、２−メトキシ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドとを反応させＮａＢＨ４のような還元剤でアルデヒドを還元して製造される。ベンジルアルコールは、ＴＨＦ中ヘキサクロロエタンとトリフェニルホスフィンのような試薬によりベンジルクロリドに変換し、式ＸＩＩの樹脂を製造する。クロリドをチオウレアで置換してイソチオウレア樹脂ＸＩＩＩを製造する。得られた樹脂を、式Ｒ２ＣＯＲ３のケトン若しくは式Ｒ２ＣＨＯのアルデヒドの存在下、過剰量のケトアミド、例えばアセタミド（ＩＩＩ、Ｒ１はＣＨ３）、で処理し、式ＸＩＶの樹脂に結合したピリミジンチオンを製造する。Ｎ３置換基がＲ４Ｘとの反応により導入でき、ここでＸは脱離基であり、Ｒ４はアルキル若しくはアシルであるか、又はＲ４Ｘはイソシアネート若しくはハロホルムであって、塩基の存在下式ＸＶの構造を形成させる。バージェス(Burgess)試薬のような試薬を用いて一級アミドを脱水してシアノ基に変換し、式ＸＶＩの化合物を得る。種々の条件下で生成物を樹脂から切断し式Ｉの化合物を得るが、Ｚは用いた切断条件により決定される。水性の酸条件下で切断するとＺがＯである式Ｉの化合物、無水の酸条件下で切断するとＺがＳである式Ｉの化合物がそれぞれ得られる。或いは、構造ＸＶＩの樹脂を酢酸アンモニウムの存在下で水酸化アンモニウムで処理するとＺがＮＨである式Ｉの化合物が得られ、シアナミドで処理するとＺがＮＨＣＮである式Ｉの化合物が得られる。
【００２３】
【化６】
2005506298.tif 000007
式ＸＶＩＩＩの化合物はスキームＩＶに図示した方法により３−アミノ−３−アルキルアクリロニロリルＸＶＩＩから得ることができる。式ＸＶＩＩの化合物を塩酸のような水性の酸で処理しオルトギ酸エチルと反応させると式ＸＶＩＩＩの化合物が得られる。次いで，トリエチルアミンのような塩基の存在下で式ＸＶＩＩＩの化合物をＯ−メチルイソウレアと反応させると式ＸＩＸのピリミジンが得られる。式ＸＩＸのピリミジンを例えばグリニヤール(Grignard)試薬、Ｒ３ＭｇＢｒのような有機金属種とエーテル若しくはＴＨＦのような溶媒中で反応させると、式ＸＸのピリミジン、即ち式ＩＸの化合物でＲ２がＨのものを与える。スキームＩＩと同様にして、式ＸＸの化合物は式ＸＸＩＩの化合物、即ち、式ＩでＲ４がエトキシカルボニル、Ｒ２がＨである化合物に変換できる。
上記すべての図式において、２−アセチルアセトニトリル誘導体、Ｒ１ＣＯＣＨ２ＣＮを式ＩＩＩの化合物に置き換えることが可能である。
式ＩＩＡのジヒドロピリジン類縁体もスキームＶに記載された一般法に従って製造できる。
【化７】
2005506298.tif 000008
かくして、適切な式ＩＩＡのジヒドロピリジン誘導体が、構造ＸＸＩＩＩのアセテートと構造ＸＸＩＶのアルデヒドとを酢酸とピリジンを用いて水を共沸蒸留で除きながら(Chem.Pharm.Bull., 1992,40,2423-31)、又はビスマストリクロリドを用いて反応させ(Chem.Lett., 1992,10,1945-6)、式ＸＸＶの化合物を得る。これら化合物はエタノール中で加熱して３−アミノ−クロトンニトリル（ＸＸＶＩ）と縮合させ、式ＩＩＡの化合物を高収率で得ることができる。
より詳しくは、式ＩＩＡの化合物（ＸＸＶＩＩ）はスキームＶＩにより得られる；
【００２４】
【化８】
2005506298.tif 000009
式ＸＸＩＩＩのアセトアセテートと式ＸＸＩＶのアルデヒドとを酢酸とピリジン中で水を共沸蒸留で除きながら(Chem.Pharm.Bull., 1992,40,2423-31)、又はビスマストリクロリドを用いて反応させ(Chem.Lett., 1992,10,1945-6)、式ＸＸＶのベンジリデン化合物を得る。これらベンジリデン（ＸＸＶ）はエタノール中で加熱して３−アミノ−クロトンニトリル（ＸＸＶＩ）と縮合させ、式ＸＸＶＩＩのジヒドロピリジンを高収率で与える。
本発明の化合物は薬学的性質を有する；特に、本発明の方法に用いられる低分子化合物は有糸分裂を停止させＥｇ５阻害剤と考えられる。本発明の新規化合物は種々の増殖性疾患（Ｅｇ５モータータンパク質の作用制御を介して治療し得る疾患を含むが、これらに限定されない）、例えばガン、自己免疫疾患、ウィルス病、真菌感染病、神経変性疾患、心血管性障害の治療に有用である。
【００２５】
本発明は種々のガンの治療方法を提供する；これらのガンには以下のものが含まれるがこれらに限定されない。
１．膀胱、乳房、直腸、腎臓、肝臓、肺（小細胞癌を含む）、卵巣、前立腺、精巣、すい臓、食道、胃、胆のう、頚部、甲状腺、皮膚（扁平上皮癌を含む）等を含む癌腫
２．急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、バーケッツ（Burketts）リンパ腫等を含むリンパ系列の造血性腫瘍
３．急性および慢性骨髄性白血病、骨髄異形性症候群、前骨髄性白血病等を含む骨髄性系列の造血性腫瘍
４．星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、シュワン腫等を含む中枢および末梢神経系の腫瘍
５．腺維肉腫、横紋筋肉腫、骨肉腫等を含む間葉起源の腫瘍
６．黒色腫、色素性乾皮症、角質棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞ガン、奇形癌腫等を含むその他の腫瘍
【００２６】
本発明のより好ましい具体例では、本発明の方法は癌性腫瘍の治療に用いられる。本発明は、腫瘍発育の減少、腫瘍による負担の軽減又は哺乳類宿主の腫瘍退行に有利である。
本発明の方法又は組成物の用途に適した抗腫瘍剤には、限定はされないが以下のものを含む；微小管の安定化薬剤、例えばパクリタキセル（登録商標：タキソールとして知られる）、ドセタキセル（登録商標：タキソテールとしても知られる）、７−Ｏ−メチルチオメチルパクリタキセル（米国特許5646176号に開示、参考のため併記した）、３′−tert−ブチル−３′−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニル−４−デアセチル−３′−デフェニル−３′−Ｎ−デベンゾイル−４−Ｏ−メトキシカルボニル−パクリタキセル（米国特許同時係属出願、２０００年２月３日出願、60/179,965に開示、参考のため併記した）C-４メチルカーボネートパクリタキセル（WO 94/14787に開示、参考のため併記した）、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、デスオキシエポチロンＡ、デスオキシエポチロンＢ、[1S[lR*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S]]-7-11-ジヒドロキシ-8,8,10,12,16-ペンタメチル-3-[1-メチル-2-(2-メチル-4-チアゾリル)エテニル]-4-アザ-17-オキサビシクロ[14.1.0]ヘプタデカン-5,9-ジオン（WO 99/02514に開示、参考のため併記した）、[1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-3-[2-[2(アミノメチル)-4-チアゾリル]-1-メチルエテニル]-7,11-ジヒドロキシ-8,8,10,12,16-ペンタメチル-4,17-ジオキサビシクロ[14.1.0]-ヘプタデカン-5,9-ジオン（米国特許同時係属出願、２０００年２月１７日出願、09/506,481に開示、参考のため併記した）、その他これらの誘導体；微小管の破壊薬；サイクリン依存性キナーゼの阻害剤（米国特許6040321号に開示済みのものを含む、参考のため併記した）；ファルネシルトランスフェラーゼの阻害剤；アルキル化薬；抗代謝剤；エピドフィロトキシン（epidophyllotoxin）、抗悪性腫瘍酵素；トポイソメラーゼ阻害薬；プロカルバジン；ミトキサントロン；白金配位錯体；生物学的応答調節剤；成長因子阻害剤；ホルモン／抗ホルモン療法剤；造血成長因子等。
【００２７】
本発明の用途に適した抗悪性腫瘍剤の種類としては、限定されないが以下のものが含まれる；アントラサイクリン系薬剤、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオチド、タキサン、エポチロン、ディスコデルモライド（discodermolide）、プテリジン系薬剤、ダイネン（diynenes）、アロマターゼ阻害剤、ポドフィロトキシン等。特に有用なものは、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、７−Ｏ−メチルチオメチルパクリタキセル、３′−tert−ブチル−３′−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニル−４−デアセチル−３′−デフェニル−３′−Ｎ−デベンゾイル−４−Ｏ−メトキシカルボニル−パクリタキセル、C-４メチルカーボネートパクリタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、デスオキシエポチロンＡ、デスオキシエポチロンＢ、[1S[lR*,3R*(E),7R*,1OS*,11R*,12R*,16S]]-7-11-ジヒドロキシ-8,8,10,12,16-ペンタメチル-3-[1-メチル-2-(2-メチル-4-チアゾリル)エテニル]-4-アザ-17-オキサビシクロ[14.1.0]ヘプタデカン-5,9-ジオン、[1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-3-[2-[2(アミノメチル)-4-チアゾリル]-1-メチルエテニル]-7,11-ジヒドロキシ-8,8,10,12,16-ペンタメチル-4,17-ジオキサビシクロ[14.1.0]-ヘプタデカン-5,9-ジオン、ドキソルビシン、カルミノマイシン（carminomycin）、ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン（methopterin）、ジクロロ-メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ポルフィロマイシン（porfiromycin）、５−フルオロウラシル、6-メルカプトプリン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体（エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド等）、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（leurosidine）、ビンデシン、ロイロシン（leurosine）等。
【００２８】
他の有用な抗悪性腫瘍剤としては、エストラムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロフォスファミド、ブレオマイシン、タモキシフェン、イフォスファミド、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、イダトレキサート（idatrexate）、
トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、トポテカン、アラ(ara)−Ｃ、ビカルタミド、フルタミド、リュープロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、インターロイキン、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（例えば限定はされないが米国特許6040321号のものを含む；参考のために併記した）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば限定はされないが米国特許6011029号のものを含む；参考のために併記した）等が含まれる。
好ましい抗悪性腫瘍剤の種類としては、タキサンおよびエポチロンであり、好ましい抗悪性腫瘍剤としては、パクリタキセル、ドセタキセル、７−Ｏ−メチルチオメチルパクリタキセル、３′−tert−ブチル−３′−Ｎ−tert−ブチルオキシカルボニル−４−デアセチル−３′−デフェニル−３′−Ｎ−デベンゾイル−４−Ｏ−メトキシカルボニル−パクリタキセル、C-４メチルカーボネートパクリタキセル、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、デスオキシエポチロンＡ、デスオキシエポチロンＢ、[1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S]]-7-11-ジヒドロキシ-8,8,10,12,16-ペンタメチル-3-[1-メチル-2-(2-メチル-4-チアゾリル)エテニル]-4-アザ-17-オキサビシクロ[14.1.0]ヘプタデカン-5,9-ジオン、[1S-[1R*,3R*(E),7R*,10S*,11R*,12R*,16S*]]-3-[2-[2(アミノメチル)-4-チアゾリル]-1-メチルエテニル]-7,11-ジヒドロキシ-8,8,10,12,16-ペンタメチル-4,17-ジオキサビシクロ[14.1.0]-ヘプタデカン-5,9-ジオン、米国特許6040321号に例示されるサイクリン依存性キナーゼ、(R)-7-シアノ-2,3,4,5-テトラヒドロ-1-(1H-イミダゾール-4-イルメチル)-3-(フェニルメチル)-4-(2-チエニルスルフォニル)-1H-1,4-ベンゾジアゼピン・メシル酸塩の他米国特許6011029号に例示されるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤等がある。
【００２９】
本発明の方法は少なくともひとつの低分子化合物Ｅｇ５タンパク質阻害剤を含む薬学的組成物を使用することができる。好ましい化合物は式Ｉ、ＩＩＡ、ＩＩＩＡ又は米国特許出願（シリアル番号未定、2002年3月22日出願、代理人事件整理番号ＬＤ0300）に開示された式を有し、薬学的に許容される担体と、追加的に他の少なくともひとつの抗腫瘍剤を含んでいてもよい。本発明で使用される組成物はさらに他の薬学的に許容される添加物、例えば、ミョウバン、安定剤、抗菌剤、緩衝剤、着色剤、着香剤等をひとつ又はそれ以上含んでもよい。本発明における抗悪性腫瘍剤、Ｅｇ５タンパク質の低分子化合物阻害剤および組成物は経口的に又は静脈注、筋肉注、腹腔内、経皮、直腸若しくは局所投与を含んで非経口的に投与することができる。
経口投与のためには、本発明の抗悪性腫瘍剤、Ｅｇ５タンパク質の低分子化合物阻害剤および組成物は例えば錠剤、カプセル剤、水溶液又は懸濁液として投与できる。経口投与のための錠剤の場合、通常使用される担体としてはラクトース、コーンスターチが含まれ、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を通常添加する。経口投与のためのカプセル剤の場合、有用な担体としてはラクトース、コーンスターチが含まれる。経口投与のために水性懸濁液を用いる場合は、通常、乳化剤および／又は懸濁化剤を加える。加えて、甘味剤および／又は着香剤を経口用組成物に炭化してもよい。筋肉注、腹腔内、経皮、静脈注投与の場合は、有効成分を通常蒸留水に溶かし、溶液のpHを適切に調節して緩衝化する。静脈注投与の場合は、等張液となるように溶質の総濃度を調節しなければならない。
【００３０】
本発明の併用療法はまた、他のよく知られた療法であって、治療しようとする症状に対する特別の有用性のために選択された療法と併せて使用することができる。一定用量を製剤化する場合、本発明に係る併用組成物の有効成分は有効な用量の範囲内で用いられる。或いは、抗悪性腫瘍剤と低分子化合物は適切な用量範囲内で別個に投与してもよい。本発明の好ましい具体例は、本発明化合物の有効用量内での投与に先立って、抗悪性腫瘍剤の有効用量を投与するものである。
本発明はガンの治療方法を包含する。それは、少なくともひとつの抗悪性腫瘍剤と少なくともひとつの本発明化合物を同時に又は経時的に投与する方法である。ここで、ある併用治療の場合には抗悪性腫瘍剤と本発明の化合物よりなる薬学的な組成物が有利かも知れないし、他の治療においては抗悪性腫瘍剤の前投与が有利かもしれない。また、本発明に係る抗悪性腫瘍剤とＥｇ５蛋白質の低分子化合物阻害剤との併用は、他のガン治療法（好ましくはガン性腫瘍）、例えば限定はされないが放射線療法や外科的方法と組み合わせて使用できることを理解すべきである。
抗悪性腫瘍剤、放射線療法、Ｅｇ５蛋白質の低分子化合物阻害剤のヒトに対する一日用量は通常、処方する医者により決定され、その用量は患者の兆候の重篤度と同様、年齢、体重、個々の患者の応答により変化する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の更なる理解を容易にするため、以下の試験例と実施例を提供するが基本的にはより具体的な詳細を図示するための目的に過ぎない。発明の範囲は実施例により限定されるとみなしてはならず、特許請求の範囲に記載した事項全体を包含する。
【００３２】
試験例
本発明のＥｇ５阻害剤の薬理学的性質は多くの薬理学的試験により確かめられる。以下に例示された薬理学的試験は本発明の化合物およびその塩について実施した。実施例１から同３２の化合物は抗増殖活性を示した。
細胞培養
株化細胞は10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640中で維持した。以下のひとつ又はそれ以上の試験例で用いたヒト株化細胞は、限定されないが次のものを含む；A2780卵巣ガン細胞、HCT116、結腸直腸ガン細胞、HT-29、結腸直腸腺ガン細胞、SK-BR-3、哺乳類腺ガン細胞、Saos-2、骨肉腫細胞、PC-3、前立腺ガン細胞、LX-1、肺ガン細胞等。カンガルーラットの腎臓上皮細胞、PTK2もまた用いた。
７２時間増殖試験
用いた株化細胞により3000から6000個／ウェルの密度で、細胞を９６ウェルプレート上に蒔いた。培養は終夜行った。用量応答曲線を７つの異なる濃度で、それぞれ３回ずつ試験して求めた。ＤＭＳＯの最大濃度は0.5％を超えなかった。細胞を被験化合物に約７２時間さらした。増殖はプロメガ（Promega）のＸＴＴ又はＭＴＳを用いて測定した。式Ｉ又はＩＩＡの化合物は７２時間細胞増殖試験で活性を示し、ＩＣ５０値が約10μＭと同等若しくはそれより小さい値で細胞増殖を阻害した。
クローン原性成長試験
コロニー成長阻害活性を標準的なクローン原性試験を用いて測定した。簡単には、約200個／ウェルの細胞を６ウェル組織培養プレート（ファルコン；Falcon, Franklin Lakes, NJ）上に蒔き、１８時間かけて付着させた。試験培地は10％ウシ胎児血清を含むRPMI-1640を用いた。用量応答曲線を６つの異なる濃度で、それぞれ２回ずつ試験して求めた。ＤＭＳＯの最大濃度は0.25％を超えなかった。細胞を被験化合物に約４から２４時間さらした。その後、被験化合物を除去して、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。それから通常の培養の培地に置き換えた。コロニーには３日毎に新鮮な培地を与えた。オプティマクス（Optimax）イメージステーションを用いて、１０日から１４日後のコロニー数を数えた。コロニー形成を90％又は50％阻害するのに要する被験化合物濃度（それぞれＩＣ９０又はＩＣ５０）を非線形回帰分析により決定した。本発明化合物は細胞に約２４時間さらした場合にクローン原性試験において活性を示した。
【００３３】
併用研究-クローン原性成長試験
他の抗悪性腫瘍剤と併用した場合の本発明に係るＥｇ５阻害剤の用途を試験した。被験化合物の扱い以外は標準的なコロニー成長試験と本質的に同一である。併用の研究においては、細胞を式Ｉの化合物と他の抗悪性腫瘍剤の両方で処理した。被験化合物は同時に又は経時的に投与した；投与の順序および間隔（約１時間から２４時間）は変化させた。データの評価は、薬剤の単独使用の場合と併用した場合との生存率を比較しアイソボログラムを用いて作用の相乗性を分析して行った。
細胞周期分析
本発明化合物で処理した細胞の細胞周期プロファイルをフローサイトメトリーで追跡した。簡単には、約２×１０５個／ウェルの細胞を標準的６ウェル培養プレート上に蒔き、１７時間成長させた。その後細胞を本発明化合物に２から２４時間さらした；被験化合物の濃度は種々変化させた。被験化合物にさらした後、細胞群を収集してＤＮＡ含量決定のためヨウ化プロピジウムで染色し、また有糸分裂およびアポトーシスのタンパク質生物マーカーに対する適切な免疫学的試薬で染色した；例えば限定はされないが、抗リン酸トレオニンプロリン、抗Ｍフェースホスホプロテイン２（ＭＭＰ２）、抗ｐ８５ＰＡＲＰ等。本発明化合物は細胞周期分析において活性を示し、全細胞集団に対するアポトーシスおよび有糸分裂の比率を有意に増加させた。
免疫細胞化学試験
細胞を200から2000個／ウェルの密度で４チェンバーグラススライド上に蒔き、終夜で付着させた。その後細胞を本発明化合物（濃度は100ｎＭから50μＭ）で４時間から３０時間処理し、続く染色のために固定化して透過性にした。染色試薬としては、例えばヨウ化プロピジウム、ＤＡＰＩ、ローダミンファロイジン、抗αチューブリン、抗βチューブリン、抗γチューブリン、その他適切な蛍光標識化された二次抗体等が挙げられる。細胞は蛍光および共焦点蛍光顕微鏡により観察した。本発明化合物は両極性紡錘体形成を阻害し、微小管の単一星状配列を誘起した。
【実施例】
【００３４】
実施例1
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-ニトロフェニル)-2-チオキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
A.ステップ1
アセトアセタミド6.42g、3-ニトロベンズアルデヒド8.0g、酢酸0.61ml、ピペリジン0.21mlおよびトルエン30mlの混合物を加熱還流した。ディーンスタルク（Dean-Stark）トラップを用いて生成する水を共沸させて除去した。２時間還流後、反応混合物を室温まで冷却すると多くの固体が析出した。EtOAc300mlとMeOH25mlで処理して固体を濾別し、EtOAc15mlで２回洗浄して目的物3.1gを収率25％で得た。
B.ステップ2
実施例1・ステップ1の化合物200mg、2-(4-メトキシベンジル)-2-チオシュードウレア塩酸塩198mg、酢酸ナトリウム84mgおよびDMF3.6mlの混合物を85℃で15時間加熱し、それから室温まで冷却した。得られた反応混合物を調製用HPLC(YMC S5 ODS 20 x 100 mm)カラムを用いて生成し、目的の分画を濃縮乾固した。飽和NaHCO3(50ml)を加えてEtOAc(3 x 50ml)で抽出した。合一したEtOAc抽出液を飽和食塩水30mlで洗浄しMgSO4上で乾燥した。濾過して減圧下に濃縮し所望の生成物126.1mgを36％収率で得た。
C.ステップ3
実施例1・ステップ2の化合物(86.5 mg)とBurgess試薬(150mg)および無水THF7.0mlの混合物を室温で１時間撹拌し、減圧下で濃縮し、YMC S5 (ODS 20 x 100 mm)を用いた調製用HPLCで生成して所望の生成物80.8mgを収率87％で得た。
D.ステップ4
実施例1・ステップ3の化合物(60mg)、ピリジン(0.1ml)をCH2Cl20.6 mlに溶解し、クロロギ酸エチル17μlを加えて2.5時間撹拌し、更にクロロギ酸エチル22μlを加えて反応混合物を2時間撹拌した。トリフルオロ酢酸0.3mlを加えてから混合物を更に1時間撹拌し、減圧下で濃縮してDMF、MeOHおよび少量のCH2Cl2を加えて濾過し、(YMC S5 ODS 20 x 100 mm)カラムを用いる調製用HPLCで精製して生成物22.5mgを収率42.7％で得た。
MS(M-H)+ = 345.
HPLC RT = 2.85 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90% 水性メタノール、グラディエント 4分間；0.2%リン酸含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
【００３５】
実施例2
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-ニトロフェニル)-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸1-エチルエステル
A.ステップ1
実施例1・ステップ1の化合物7.83ｇおよびＯ-メチルイソウレア硫酸水素酸塩7.48gをDMF(100ml)に溶解し、NaHCO310.92gを少しずつ加えたら、気体が発生した。反応混合物を2時間撹拌し、その後65℃で終夜撹拌した。室温にまで冷却し、EtOAc800mlで希釈して水(2 x 100ml)、飽和食塩水 (1 x 100ml)でそれぞれ洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥し濾過し減圧下で濃縮して得られた残渣をEtOAc-CH2Cl2-ヘキサン中で粉砕して所望の生成物5.48gを固体として得た(56%)。
B.ステップ2
実施例2・ステップ1の化合物(209mg)とBurgess試薬(274.5mg)の混合物をCH2Cl2(5ml)およびTHF(10ml)中で終夜撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、EtOAc150mlで希釈してNaHCO3(2 x 30ml)および飽和食塩水 (1 x 30ml)でそれぞれ洗浄しMgSO4上で乾燥した。減圧下で濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製して所望の生成物136mg(69.4%)を得た。
C.ステップ3
実施例2・ステップ2の化合物2.075ｇをCH2Cl2(30ml)に溶解し、アルゴンガス雰囲気下0℃でピリジン1.23mlを加え、次いでクロロギ酸エチル0.87mlをゆっくり加えた。反応混合物を室温にまで戻し、3時間撹拌してから飽和NaHCO3(50ml)と飽和食塩水(50ml)を加えてEtOAcで3回抽出した。有機層を合一してで洗浄し、MgSO4上で乾燥して濾過し、減圧下に濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィーで精製して所望の生成物2.57g(98%)を得た。
D.ステップ4
実施例2・ステップ3の化合物1.44gをCH3CN(25ml)およびH2O(2.5ml)に溶解し、TFA2.5mlを加えて反応混合物を2時間撹拌すると多くの白色固体が析出した。固体を濾別してCH3CN (3 x 20ml) およびヘキサン(2 x20ml)で洗浄し空気中で乾燥して所望の生成物860mg(62.2%)を得た。濾液を減圧下に濃縮し、得られた個体をCH3CNから再結晶して更に目的物320mg(23.2%)を得た。
MS(M-H)+ = 329.
HPLC RT = 2.53 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90% 水性メタノール、グラディエント 4分間；0.2%リン酸含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
【００３６】
実施例3
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-ニトロフェニル)-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルアミド
A.ステップ1
実施例2・ステップ2の化合物(100mg; 0.37mmol)とピリジン(0.74mmol;18μl)をジクロロメタン(40ml)に溶解し、クロロギ酸エチル(81mg;0.40mmol)を加えて得られた溶液を室温で1.5時間撹拌した。反応混合物を飽和NaHCO3(30ml)で希釈し酢酸エチル(3 x 50ml)で抽出しMgSO4上で乾燥した。減圧下で濃縮して白色の泡状物質を得た。クロマトグラフィー (SiO2 : 20％EtOAc／ヘキサン）に付して所望の生成物(99mg; 62%)を無色の泡状物質として得た。
B.ステップ2
実施例3・ステップ1の化合物(12mg; 27nmol)をTHF(0.1ml)に溶解して2ＭエチルアミンTHF溶液(15μl;30mmol）を室温で一度に加え、得られた黄色溶液を30分間撹拌した。反応混合物をメタノール(1.8ml)で希釈して得られる黄色個体を吸引濾過し調製用HPLCにて精製して標記化合物を白色固体(20mg; 22%)として得た。
上記実施例2の場合と比較して、この場合2-メトキシ基が単離精製中に加水分解されTFAで処理することなくジヒドロピリミジノン環を与えた。
【００３７】
実施例4
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-ニトロフェニル)-2-オキソ-1-(1-オキソブチル)-(2H)-ピリミジン
A.ステップ1
実施例2・ステップ2の化合物52mgとピリジン0.15mlを無水のCH2Cl20.6mlに溶解し、ブチリルクロリド23.7μlを加えて、反応混合物を1時間撹拌し、ブチリルクロリド24μlを加えて、反応混合物を更に1.5時間撹拌した。YMC S5 (ODS 20 x 100 mm)カラムを用いる調製用HPLCにより精製して所望の目的物30mgを得た。
B.ステップ2
実施例4・ステップ1の化合物30mg、H2O2mlおよびTFA0.2mlをCH3CN1.2mlに溶解して1.5時間撹拌し、更にTFA0.1mlを加えて2.5時間撹拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、YMC S5 (ODS 20 x 100 mm) カラムを用いる調製用HPLCで精製して所望の目的物11.8mgを得た。
MS(M-H)+ = 327.
HPLC RT = 3.06 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90% 水性メタノール、グラディエント4分間；0.2%リン酸含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
実施例5
エナンチオ 5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-ニトロフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル(エナンチオマーＡ)
実施例2・ステップ4の化合物53mgを無水EtOHに溶解し、調製用カラム〔Chiralcel OD-H S5 (4.6 x 250 mm)〕を用いて不斉分離を行い、エナンチオマーＡ20mgとエナンチオマーＢ27mgを得た。
MS(M-H)+ = 329.
HPLC キラルRT= 10.44 min (Chiralcel OD-H, S5, カラム 4.6 x 250 mm；溶出液 10%MeOH/10%EtOH/ヘプタン；流速 1.0ml/min；検出 220nm；94.7% ee)
【００３８】
実施例6
エナンチオ 5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-ニトロフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル(エナンチオマーＢ)
MS(M-H)+ = 329.
HPLC キラルRT= 10.44 min (Chiralcel OD-H, S5, カラム 4.6 x 250 mm；溶出液 10%MeOH/10%EtOH/ヘプタン；流速 1.0ml/min；検出 220nm；99.64% ee)
実施例7
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-アミノフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
実施例1・ステップ4の化合物12mgをエタノールに溶解し、塩化第二スズ(II)100mgで処理してアルゴン下90分間加熱還流した。反応液を室温まで冷却し飽和NaHCO3溶液でクエンチしEtOAc(3 x 50 ml)で抽出した。有機層を合わせて水洗し、Na2SO4上で乾燥し減圧下に濃縮した。ヘキサンとエーテル中で粉砕して粗生成物8mgを得た。調製用HPLCにより更に生成して所望の生成物3mgをTFA塩として得た。
MS(M+H)+ = 301.
HPLC RT = 1.685 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90% 水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
【００３９】
実施例8
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-(N,N-ジメチル) アミノフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
実施例7の化合物12mgをCH3CN(1ml)に溶解し、パラホルムアルデヒド(40mg)、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(30mg)を加えて酢酸２滴を加えた。反応混合物を室温で2時間撹拌し飽和NaHCO3溶液でクエンチしNa2SO4上で乾燥して減圧下に濃縮した。得られた残渣を調製用HPLCで精製して所望の生成物3.2mgをTFA塩として得た。
MS(M+H)+ = 329.
HPLC RT = 1.76 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90% 水性メタノール、グラディエント4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
実施例9から実施例15は、実施例2の方法に従ってステップ1で適切なベンズアルデヒドを置換させることにより調製した。
実施例9
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-トリフルオロメチルフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
HPLC-HI 100% at 2.84 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm).
MS:(M+H)+ = 354.
実施例10
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(2,3-ジクロロフェニル)-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
HPLC-HI 100% at 3.2 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm).
MS:(M-H)- =352.
実施例11
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-メトキシフェニル)-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
HPLC-HI 100% at 2.42 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速ml/min；検出 220nm).
MS:(M+H)+ = 316.
【００４０】
実施例12
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3,5-ジクロロフェニル)-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
HPLC-HI 87% at 3.26 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm).
MS:(M-H)- = 352.
実施例13
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3,4-ジクロロフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
HPLC-HI  100% at 3.197 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm).
MS:(M-H)- = 352.
実施例14
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-シアノフェニル)-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸 l-エチルエステル
HPLC-HI 93% at 2.32 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm).
MS:(M+H)+ = 311.
実施例15
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(4-メトキシフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
HPLC-HI 100% at 2.55 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm, 10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出220nm).
MS:(M+H)+ = 316.
【００４１】
実施例16
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(4-メチルフェニル)-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
A.ステップ1
15%塩酸(115ml)に対して3-アミノクロトンニトリル(41g,0.5mol)のEt2O(500ml)混濁溶液を0℃で激しく撹拌しながら30分間かけて滴下し、更に反応混合物を０℃で15分間撹拌した。水溶液を分液し、Et2O(2 x 125ml)で抽出し、有機層を合わせてNa2SO4上で乾燥した。オルトギ酸エチル(83ml)を滴下ロートと蒸留セットを装備した500mlの三ツ口フラスコに入れ、60-65℃のオイルバス上で撹拌しながら上記のエーテル溶液を滴下した。滴下速度はエーテルの蒸留速度と等しくなるように調節した。エーテル溶液の滴下が半分完了した時点で、更にオルトギ酸エチル83mlを追加し、オイルバス温度を徐々に100℃まで加熱して反応混合物を5時間撹拌した。蒸留（150-155℃/2mmHg）により、所望の化合物26.6g(38%)を赤色固体として得た。
B.ステップ2
Ｏ-メチルイソウレア硫酸塩(9.9g, 80mmol)、実施例16・ステップ1の化合物(7.4g, 53mmol)およびエタノール(90ml)の混合物にトリエチルアミン(11ml, 80mmol)を加えた。混合物を室温で15分撹拌し、次いで66℃で3時間撹拌してからEtOHを除去して濃縮した。EtOAc(80ml)とH2O(80ml)を加え、水層を分液してEtOAc(2 x 80ml)で抽出し有機層を合わせてNa2SO4上で乾燥した。濃縮して得られた褐色個体をEtOAcに溶解しシリカゲルパッドで濾過し、EtOAc／ヘプタン（１／１）で洗浄して暗色を除き濾液を濃縮した。得られた個体をヘプタン／EtOAcより再結晶して黄色結晶5.18gを収率65%で得た。
C.ステップ3
実施例16・ステップ2の化合物(75mg, 0.5mmol)をTHF(2ml)に溶解し、アルゴン下ｐ-トリルマグネシウムブロミドのエーテル溶液(1M, 1ml, 1mmol)を0℃で滴下した。反応混合物をその温度で1.5時間撹拌し、グリニヤール(Grignard)試薬3mlを-78℃で追加した。反応溶液をゆっくりと室温まで戻し2分間撹拌してから飽和NH4Cl(5ml)とH2O(5ml)を加え、混合物をEtOAc(2 x 15ml)で抽出した。有機層を合わせて乾燥し濃縮してシリカゲルのクロマトグラフに付し所望の生成物45.6gを91％収率で得た。
D.ステップ4
実施例16・ステップ3の化合物(109mg, 0.45mmol)にピリジン(0.2ml, 2.5mmol)と乾燥CH2Cl2を加え、次いでクロロギ酸エチル(0.1ml, 1.05mmol)を加えて得られた混合物を室温で終夜撹拌した。MeOHを加え、得られた混合物を15分間撹拌し、濃縮してシリカゲルのクロマトグラフに付し所望の生成物100mgを無色のオイルとして得た（71%）。
E.ステップ5
実施例 15・ステップ4の化合物(100mg, 0.32mmol)、H2O(0.7ml)、CH3CN(0.5ml)およびTFA(7ml)の混合物を室温で2時間撹拌した。その後CH3CNを除去して濃縮しNaHCO3を加えて混合物を塩基性とし、析出した固体を濾取して水洗し乾燥して所望の生成物64mgを得た。粗生成物を乾燥しEtOH／H2Oより再結晶して所望の生成物を更に20mg得た。
MS(M+H)+ = 300.
HPLC RT = 3.40 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.2%リン酸含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
【００４２】
実施例17
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-シクロヘキシル-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
実施例16・ステップ2の化合物(30mg, 0.2mmol)をTHF(1.2ml)に溶解し、シクロヘキシルマグネシウムクロリドのエーテル溶液(2M溶液, 1.0ml, 2mmol)をアルゴン下-44℃で加え、反応液を徐々に室温まで戻して10分間撹拌した。飽和NH4Clを加え得られた混合物をEtOAcで数回抽出し、有機層を合わせて乾燥しシリカゲルパッドで濾過して濃縮し黄色オイルを得た。そのオイルをCH2Cl2（2ml）に溶解し、ピリジン（80μl, 0.9mmol）とクロロギ酸エチル(50μl, 0.5mmol)を加えて室温で30分間撹拌した。その後更に10分間撹拌してから、H2O(25μl)とEtOAcを加え、混合物をNa2SO4上で乾燥し、シリカゲルパッドで濾過して濃縮し黄色オイルを得た。そのオイルをCH3CN(2ml)に溶解して、H2O(0.3ml)およびTFA(0.2ml)を加え、混合物を室温で2時間撹拌した。飽和NaHCO3溶液とEtOAcを加え、水層を分液してEtOAcで抽出し有機層を合わせてNa2SO4上で乾燥し濃縮してシリカゲルクロマトグラフに付し、所望の生成物35mgを黄色の泡状物質として得た(60%)。
MS(M+H)+ = 392.
HPLC RT = 3.60 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.2%リン酸含有；流速 4ml/min；検出220nm)
実施例18
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-フェニル-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
実施例16・ステップ2の化合物(55mg, 0.37mmol)を乾燥THF(2ml)に溶解し、フェニルマグネシウムブロミドのTHF溶液(2M, 2ml, 4mmol)をアルゴン下-78℃で滴下した。滴下後、反応液を徐々に室温まで戻し、出発物質が消滅するまで約10分間撹拌した。飽和NH4Cl溶液とH2Oを加え混合物をEtOAcで二度抽出し、有機層を合わせてNa2SO4上で乾燥し、濃縮してシリカゲルクロマトグラフに付し、固体の中間体を得た。その固体をCH2Cl2(5ml)に溶解し、ピリジン(0.15ml, 1.8mmol)とクロロギ酸エチル(0.1ml, 1mmol)を加えて反応混合物を室温で0.5時間撹拌した。反応を50μlのH2Oでクエンチし、EtOAcで希釈して得られた混合物をNa2SO4上で乾燥しシリカゲルパッドで濾過して中間体をオイルとして得た。そのオイルをCH3CN(5ml)に溶解して、H2O(0.5ml)とTFA(0.4ml)を加え、反応混合物を1.5時間撹拌して減圧下に濃縮した。飽和NaHCO3溶液を加えて混合物を中和し、沈殿物を濾取して空気中で乾燥しEtOAc／ヘプタンから再結晶して生成物70mgを固体として得た（収率66％）。
MS(M+H)+ = 286.
HPLC RT = 1.28 min. (Phenom-Prime S5 C18 4.6 x 30 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 2分間；0.1%TFA含有；流速 5ml/min；検出 220nm)
実施例19から実施例24は実施例18の方法で適切なアリールマグネシウムハライドと反応させることにより調製した。
【００４３】
実施例19
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(2-メチルフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
MS(M+H)+= 300.
HPLC RT = 1.41 min. (Phenom-Prime S5 C18 4.6 x 30 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 2分間；0.1%TFA含有；流速 5ml/min；検出 220nm)
実施例20
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-クロロフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
MS(M+H)+= 320.
HPLC RT = 1.43 min. (Phenom-Prime S5 C18 4.6 x 30 mm;10-90%水性メタノール、グラディエント 2分間；0.1%TFA含有；流速 5ml/min；検出 220nm)．
実施例21
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(3-フルオロフェニル)-2-オキソ-l-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
MS(M+H)+= 304.
HPLC RT = 1.29 min. (Phenom-Prime S5 C18 4.6 x 30 mm;10-90%水性メタノール、グラディエント 2分間；0.1%TFA含有；流速 5ml/min；検出 220nm)．
実施例22
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(4-クロロフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
MS(M+H)+ = 320.
HPLC RT = 1.44 min. (Phenom-Prime S5 C18 4.6 x 30 mm;10-90%水性メタノール、グラディエント 2分間；0.1%TFA含有；流速 5ml/min；検出 220nm)．
実施例23
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(4-フルオロフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸 1-エチルエステル
MS(M+H)+ = 304.
HPLC RT = 3.21 min. (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm;10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.2%リン酸含有；流速 4ml/min；検出 220nm)．
実施例24
5-シアノ-3,6-ジヒドロ-4-メチル-6-(2-フルオロフェニル)-2-オキソ-1-(2H)-ピリミジンカルボン酸1-エチルエステル
MS(M+H)+ = 304.
HPLC RT= 3.05 min. (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm;10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.2%リン酸含有；流速 4ml/min；検出 220nm)．
【００４４】
実施例25
5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(3-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
A.2-アセチル-3-(3-ニトロフェニル)-アクリル酸エチルエステル
アセト酢酸エチル(8.6g, 66mmol)、3-ニトロベンズアルデヒド(10g, 66mmol)、酢酸(0.8g)、ピリジン(0.26mL)およびトルエン(30ml)の混合物をディーンスタルク（Dean-Stark）トラップを備えたフラスコ中で加熱還流した。2時間後に水1.1mlが回収されたので混合物を冷却し酢酸エチルで希釈して水(100ml)、飽和炭酸水素ナトリウム溶液(100ml)および飽和食塩水(100ml)で洗浄した。有機層を集めて硫酸ナトリウム上で乾燥し濾過して濃縮した。残渣をエーテル-ヘキサンより再結晶して白色個体を得た(6g, 35%)。
B.5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(3-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
ステップAのベンジリデン(2.63g, 10mmol)、3-アミノクロトンニトリル(0.86g, 11mmol)およびエタノール(50ml)の混合物を24時間加熱還流した。混合物を減圧下に濃縮し残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ヘキサン／酢酸エチル (1: 1)で溶出して固体の生成物を得た(2.0g, 61%)。
HPLC-HI 100% at 2.84 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm).
MS: Found (M+H)+ = 328.
元素分析  Calculated for C17H17N3O4 : C 62.37; H 5.23; N 12.83. Found: C 62.08, H 5.18, N 12.67.
実施例26
5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(4-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(4-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3-カルボン酸エチルエステルを、ステップAにおいて4-ニトロベンズアルデヒドを用いること以外は実施例25と同様にして調製した。
HPLC-HI 93% at 2.89 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm).
MS: Found (M+H)+ = 328.
【００４５】
実施例27
5-シアノ-4-(3-シアノフェニル)-2,6-ジメチル-1,4-ジヒドロピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
5-シアノ-4-(3-シアノフェニル)-2,6-ジメチル-1,4-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸エチルエステルを、ステップAにおいて3-シアノベンズアルデヒドを用いること以外は実施例25と同様にして調製した。
HPLC-HI 83% at 2.71 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
MS: Found (M+H)+ = 308.
実施例28
5-シアノ-2,6-ジメチル-4- (3-トリフルオロメチルフェニル)-1,4-ジヒドロピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(3-トリフルオロメチルフェニル)-1,4-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸エチルエステルを、ステップAにおいて3-トリフルオロメチルベンズアルデヒドを用いること以外は実施例25と同様にして調製した。
HPLC-HI 95% at 3.21min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
MS: Found (M+H)+ = 351.
実施例29
5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(3-メトキシフェニル)-1,4-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(3-メトキシフェニル)-1,4-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸エチルエステルを、ステップAにおいて3-メトキシベンズアルデヒドを用いること以外は実施例25と同様にして調製した。
HPLC-HI 97% at 2.81min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
MS: Found (M+H)+ = 313.
実施例30
5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(3-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸イソプロピルエステル
5-シアノ-2,6-ジメチル-4-(3-ニトロフェニル)-1,4-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸イソプロピルエステルを、ステップAにおいてアセト酢酸イソプロピルを用いること以外は実施例25と同様にして調製した。
HPLC-HI 82% at 3.04 min(YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
MS: Found (M+H)+ = 342.
【００４６】
実施例31
5-シアノ-4-(3,4-ジクロロフェニル)-2,6-ジメチル-1,4-ジヒドロピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
A.2-アセチル-3-(3,4-ジクロロフェニル)-アクリル酸エチルエステル
アセト酢酸エチル(1.3g, 10mmol)、3,4-ジクロロベンズアルデヒド(1.8g, 10mmol)およびBiCl3(315mg)の混合物を80℃で3時間加熱した。混合物を冷却後、酢酸エチル(100ml)で希釈し、10％炭酸水素ナトリウム溶液、10％硫酸水素ナトリウム溶液および飽和食塩水で洗浄した。有機層を集めて硫酸ナトリウム上で乾燥し濃縮した。得られたベンジリデン生成物は精製せずステップBで用いた。
B.5-シアノ-4-(3,4-ジクロロフェニル)-2,6-ジメチル-1,4-ジヒドロ-ピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
ステップAのベンジリデン(0.13g, 0.4mmol)、3-アミノクロトンニトリル(44mg, 0.5mmol)およびエタノール(1ml)の混合物を24時間加熱還流した。混合物を減圧下に濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ヘキサン／酢酸エチル(7:3)で溶出して生成物を固体として得た(15mg, 11%)。
HPLC-HI 95% at 3.64 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
MS: Found (M+H)+ = 352.
実施例32
5-シアノ-4-(3,5-ジクロロフェニル)-2,6-ジメチル-1,4-ジヒドロピリジン-3-カルボン酸エチルエステル
5-シアノ-4-(3,5-ジクロロフェニル)-2,6-ジメチル-1,4-ジヒドロピリジン-3-カルボン酸エチルエステルを、ステップAにおいて3,5-ジクロロベンズアルデヒドを用いること以外は実施例31と同様にして調製した。
HPLC-HI 90% at 3.50 min (YMC S5 ODS カラム 4.6 x 50 mm；10-90%水性メタノール、グラディエント 4分間；0.1%TFA含有；流速 4ml/min；検出 220nm)
MS: Found (M+H)+ = 352.
【国際公開パンフレット】
2005506298.tif 000011
2005506298.tif 000012
2005506298.tif 000013
2005506298.tif 000014
2005506298.tif 000015
2005506298.tif 000016
2005506298.tif 000017
2005506298.tif 000018
2005506298.tif 000019
2005506298.tif 000020
2005506298.tif 000021
2005506298.tif 000022
2005506298.tif 000023
2005506298.tif 000024
2005506298.tif 000025
2005506298.tif 000026
2005506298.tif 000027
2005506298.tif 000028
2005506298.tif 000029
2005506298.tif 000030
2005506298.tif 000031
2005506298.tif 000032
2005506298.tif 000033
2005506298.tif 000034
2005506298.tif 000035
2005506298.tif 000036
2005506298.tif 000037
2005506298.tif 000038
2005506298.tif 000039
2005506298.tif 000040
2005506298.tif 000041
2005506298.tif 000042
2005506298.tif 000043
2005506298.tif 000044
2005506298.tif 000045
2005506298.tif 000046
2005506298.tif 000047
2005506298.tif 000048
2005506298.tif 000049
2005506298.tif 000050
2005506298.tif 000051
2005506298.tif 000052
2005506298.tif 000053
2005506298.tif 000054
2005506298.tif 000055
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506298.tif 000056
【国際調査報告】
2005506298.tif 000057