(57)【要約】本発明は、インビトロおよびインビボの両方での遺伝子移入および遺伝子発現をアッセイするために使用され得る融合タンパク質に関する。この融合タンパク質は、第２タンパク質（これは、タンパク質融合タグであり得る）に融合されたレポータータンパク質（例えば、ソマトスタチンレセプター）を含む。あるいは、融合タンパク質は、リーダー配列に融合され得る。このリーダー配列は、発現されたタンパク質を局在化させ得、例えば、融合タンパク質を細胞膜に局在化させ得る。本発明は、融合タンパク質をコードする核酸および遺伝子発現をアッセイする方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、以下：
ａ）レポーターアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）該レポーターアミノ酸配列に融合された第２のポリペプチド；および
ｃ）該融合タンパク質の末端に融合されたリーダー配列
を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
前記ポリペプチドがソマトスタチンレセプターポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ポリペプチドがソマトスタチン２型レセプターポリペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、細胞質テイルの全体または一部が欠失している変異体ヒトソマトスタチンレセプターである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、前記細胞質テイルのＣ末端〜アミノ酸３１４の部分が欠失している変異体ヒトソマトスタチンレセプターである、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記第２のポリペプチドがタンパク質融合タグである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記第２のポリペプチドが赤血球凝集素Ａである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記リーダー配列がＩｇκリーダー配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記リーダー配列がＩｇκリーダー配列である、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項１１】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１０に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項６に記載の融合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項１４】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１３に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１６】
融合タンパク質の発現についてアッセイする方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項１０に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞に遺伝子を移入させる工程；および
ｂ）該融合タンパク質の化学特性、物理特性または生物学的特性に基づいて発現をアッセイする工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記遺伝子移入がインビボで生じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記ベクターの発現が、ソマトスタチンレセプターまたは変異ソマトスタチンレセプターに対して特異的に結合するリガンドと前記宿主細胞とを接触させることによってアッセイされ、ここで、該リガンドは、検出可能に標識されている、方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、前記ベクターの発現が、ソマトスタチン２型レセプターまたは変異ソマトスタチン２型レセプターに対して特異的に結合するリガンドと前記宿主細胞とを接触させることによってアッセイされ、ここで、該リガンドは、検出可能に標識されている、方法。
【請求項２０】
前記リガンドは、放射性標識されたソマトスタチンアナログである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記リガンドは、放射性標識されたオクトレオチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ベクターの発現が、前記融合タンパク質に対して特異的に結合する抗体と前記宿主細胞とを接触することによってアッセイされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体は、赤血球凝集素Ａに対して特異的に結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターの発現が、前記融合タンパク質の酵素活性に基づいてアッセイされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素活性がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＮＡ構築物であって、該ＤＮＡ構築物は、以下：
ａ）レポータータンパク質；および
ｂ）レセプターに融合された第２のポリペプチドであって、ここで、該第２のポリペプチドは、該融合タンパク質の発現を独立して定量するためのタグを提供する、第２のポリペプチド、
をコードするセグメントを含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項２７】
前記レポータータンパク質がレセプターである、請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２８】
前記レポーターまたは前記第２のポリペプチドのいずれかに融合されたリーダー配列をさらに含む、請求項２６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２９】
前記レセプターが、ソマトスタチン２型レセプターまたは１つ以上の変異が導入されたソマトスタチン２型レセプターである、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３０】
前記第２のポリペプチドがタグである、請求項２８に記載のいずれか１つのＤＮＡ構築物。
【請求項３１】
リガンドに結合した変異レセプターの能力をアッセイする方法であって、該方法は、以下：
ａ）請求項２８に記載のＤＮＡ構築物で細胞をトランスフェクトする工程であって、ここで、該ＤＮＡ構築物は、該変異レセプターまたは他のレポーターをコードする、工程；
ｂ）レポーターまたは該レセプターもしくは他のレポーターに対する検出可能に標識されたリガンドに由来するシグナルをアッセイすることによって、該融合タンパク質の発現を定量する工程；ならびに
ｃ）第２のポリペプチドを用いて該ＤＮＡ構築物によってコードされる融合タンパク質の発現を定量することによって、工程ｂ）において決定された値を正規化する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記変異レセプターは、１つ以上の変異が導入されたソマトスタチン２型レセプターである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＮＡ構築物中の前記第２のポリペプチドがタグである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
インビボでのソマトスタチン融合タンパク質の発現を検出する工程を包含する、画像化方法。
【請求項３５】
前記ソマトスタチン融合タンパク質がカルボキシ末端変異を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記カルボキシ末端変異がアミノ酸３１４を超えたアミノ酸の欠失を含む、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国仮特許出願６０／２６８，６００、発明の名称「Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｕｐｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ」（２００１年２月１５日出願）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、レポーターポリペプチドを含む融合タンパク質に関し、そしてインビトロおよびインビボの両方で遺伝子発現を検出するためにこれらの融合タンパク質を使用する方法に関する。本発明はまた、レポーターがソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）またはその細胞内ドメイン全体もしくは一部を欠失することによって変異されたＳＳＴＲである融合タンパク質を含む。さらに、レセプター変異体を作製およびアッセイする方法が、提供される。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子治療が臨床的に実用的になり得るまで、患者に送達された遺伝子のインビボ発現を正確にアッセイするための方法を開発する必要性がある。理想的には、このような方法は、患者の体内のどこで発現が生じているかだけでなく、その発現が治療的に有効であるのに十分なレベルおよび期間で生じているかどうかも、明らかにすべきである。従って、開発された方法のほとんどは、注射された放射性標識化合物を検出するためにγ−カメラ、ＳＰＥＣＴ、またはＰＥＴ画像化に大いに依存している。例えば、単純疱疹ウイルス１チミジンキナーゼ遺伝子の移入は、放射性標識されたプロドラッグのγ−カメラ画像化および陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）の使用に従ってきた（Ｔｊｕｖａｊｅｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４３３３−４３４１（１９９８）；Ａｌａｕｄｄｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５：１７５−１８０（１９９８）；Ｇａｍｂｈｉｒら、Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．９６：２３３３−２３３８（１９９９））。２型ドーパミンレセプターの移入は、標識したアンタゴニストを用いてＰＥＴによって検出され（Ｇａｍｂｈｉｒら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２６：４８１−４９０（１９９９）；ＭａｃＬａｒｅｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：７８５−７９１（１９９９））、そしてラットナトリウム／ヨウ素共搬の移入は、細胞内トラップされた放射性ヨウ素を検出するためにγ−カメラの使用に従ってきた（Ｍａｎｄｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：６６１−６６８（１９９９））。これらの方法の多くでの１つの問題は、これらがヒトにおける使用についての安全性が未知の放射性医薬を使用するという点か、またはこれらが予測できない有害な結果を有し得る方法で放射性同位体を使用するという点のいずれかである。
【０００４】
ソマトスタチンレセプターは、細胞外ループおよび細胞内ループによって架橋された７回膜貫通ドメインからなる類似の推定３次元構造を有するＧタンパク質関連レセプターのクラスに属する。このソマトスタチンレセプターファミリーは、５つの異なる遺伝子（これらのうちの１つが、２つのスプライス改変体ｍＲＮＡを生成する）によってコードされる少なくとも６つの異なるレセプターサブタイプを含む。ヒト、ラット、およびいくつかの場合マウスのソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）サブタイプ１、２、２ｂ、３、４、および５をコードする遺伝子配列が、文献中で公開されている（Ｂｒｕｎｓら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７３３：１３８−１４６，１９９４およびその中に引用される参考文献）。これらのレセプターをコードする例示的なｍＲＮＡについての登録番号は、以下に見出され得る。
【０００５】
ソマトスタチン２型レセプターは、細胞外ドメイン、７回膜貫通ドメイン、およびおそらくレセプターのインターナリゼーションを担う細胞内ドメインの存在によって特徴付けられる。２型レセプターは、２つの異なるサブ形態（２および２ｂ）に分けられ、これらは、２型がより長いＣ末端細胞質（すなわち、細胞内）ドメインを有する以外は同一である。インビボにおいて、２型レセプターは、１１１Ｉｎ標識したオクトレオチド（Ｊｏｈｎら、Ｇｕｔ  ３８：３３−３９（１９９５））、および９９ｍＴｃもしくは１８８Ｒｅのいずれかで標識されたソマトスタチンアナログ（Ｚｉｎｎら、ＪＰ  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４１：８８７−８９５（２０００））を用いて検出されている。現在、１８８Ｒｅアナログは、治療用途についてＦＤＡによって承認されていない。そして、９９ｍＴｃアナログは、肺を画像化するためにのみ承認されている。対照的に、１１１Ｉｎオクトレオチドは、全身の画像化に対して承認されている。ソマトスタチンレセプターの画像化に依存する以下の遺伝子移入の系は、遺伝子治療を評価およびモニタリングするための新規なツールを提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明の実施形態は、インビトロおよびインビボの両方において遺伝子移入を定量するために使用され得る融合タンパク質を含む。例示的なタンパク質の構造特徴を、図１に示す。融合タンパク質のＣ末端またはＮ末端に、レポーターポリペプチドが存在し得る。本明細書中に使用される場合、レポーターポリペプチド（「レポーター」）は、インビトロおよび／またはインビボにおいて遺伝子移入を検出するために使用されるシグナルを提供するために使用される。レポーターは、種々の方法（光学的な方法、そして特に、通常の放射線学的な方法（例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））、コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）、超音波、単純写真、そして特に、核医学の当業者に公知の他の技術（例えば、γカメラ画像化、単光子射出断層撮影（ＳＰＥＣＴ）および陽子射出断層撮影法（ＰＥＴ））が挙げられるが、これらに限定されない）によって検出され得る。シグナルの生成は、レポーターおよび／もしくは標識されたリガンドの結合の生物物理学的特徴、前標識（ｐｒｏｌａｂｅｌ）の変換、および／または目的の融合タンパク質をコードする核酸構築物を発現する細胞中での標識の隔離もしくは局在の結果であり得る。特定の実施形態において、融合タンパク質は、リガンド結合ポリペプチドをコードするアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、レポーターポリペプチドは、ＳＳＴＲポリペプチド（例えば、サブタイプ１、２、２ｂ、３、４、および５）である。他の実施形態において、レポーターポリペプチドは、ＳＳＴＲ２型レセプターである。ＳＳＴＲに対する言及は、他に示されない限り、全てのサブタイプを含む。本発明は、任意の種由来のＳＳＴＲを用いて研究し、そして現時点で当該分野で記載されているこのような全てのレセプターを用い得る。特定の実施形態において、Ｙａｍａｄａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５１−２５５（１９９２））およびＰａｔｅｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：２８８−２９４（１９９３））によって開示されるようなヒト形態のレセプターを使用する。種々の実施形態において、ネイティブなソマトスタチンレセプターにおける変更は、その基本的な生物学的特徴（例えば、リガンド結合、抗体認識など）を実質的に変更させる変化を含み得る。他の実施形態において、ＳＳＴＲの改変体（例えば、レセプターの細胞質テイルの全体または一部が欠失したＳＳＴＲ融合タンパク質）が使用され得る。特定の実施形態において、Ｃ末端から残基３１４にわたるアミノ酸配列の全てまたは一部が欠失され得る。
【０００７】
融合タンパク質はまた、レポーターポリペプチド（例えば、ＳＳＴＲ）のＮ末端またはＣ末端に融合された第２のポリペプチドを含み得る。任意のタンパク質またはペプチド（治療能力について評価されているものを含む）が、この位置に使用され得る。他の実施形態において、タンパク質融合タグ（「タグ」）が使用され得る。免疫学的手段、生物学的手段、化学手段、または物理手段によって容易に検出されるタグが、選択され得る。第２のポリペプチドとしては、赤血球凝集素Ａ（ＨＡ）、β−ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、トランスフェリン、ｍｙｃ−タグ、ＶＰ１６、（Ｈｉｓ）６−タグクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、および当該分野で公知の他のタンパク質融合タグが挙げられ得るが、これらに限定されない。タグは、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫局在、ＦＡＣＳ分析、および他の公知の免疫学的方法によって検出され得る。
【０００８】
細胞中の種々の輸送経路を介したタンパク質の輸送が、ペプチド標的化シグナル配列（本明細書中においてリーダー配列と称される）によって一部調節される。リーダー配列は、タンパク質を特定の細胞小器官に指向させる。例えば、細胞から分泌されるタンパク質は、シグナル配列と呼ばれるリーダー配列によって小胞体（ＥＲ）に指向される。シグナル配列は、完全（すなわち、ＥＲの管腔）または部分的（すなわち、膜貫通ドメインによってＥＲ膜に結合されたままにする）のいずれかで、ＥＲ膜を横切ってタンパク質を転位させ得る。種々の非限定的な実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質の末端に融合されたリーダー配列を含む。特定の実施形態において、融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端に融合されるリーダー配列を含む。リーダーの機能は、代表的に、融合タンパク質を特定の亜細胞（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）位置に導くことである。特定の実施形態において、リーダーは、融合タンパク質を細胞膜に導く。特定の実施形態において、リーダー配列としては、Ｉｇκリーダー配列が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態において、融合タンパク質の細胞膜への局在化は、その融合タンパク質に結合する標識リガンドを用いてその融合タンパク質が検出されることを可能にする。従って、発現は、細胞を破壊することを必要とせずにアッセイされ得る。
【０００９】
特定の実施形態は、上記の融合タンパク質をコードする核酸を含む。これらの核酸は、発現ベクター（この中で、これらの核酸は、プロモーターに作動可能に連結される）に組込まれ得る。用語「作動可能に連結される」は、それらの正常な機能を実行することができるような様式で連結された遺伝子エレメントをいう。例えば、遺伝子は、その転写がプロモーターの制御下であり、そしてそのような転写が最終的にその遺伝子によって通常コードされるポリペプチドを産生する場合、プロモーターに作動可能に連結されている。本発明はまた、記載される融合タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含む。
【００１０】
代替の実施形態は、例えば、上記のように発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、次いでコードされる融合タンパク質の化学特性、物理特性または生物学的特性に基づいて発現を検出することによって、遺伝子発現をアッセイする方法を含み得る。この方法は特に、インビボで使用される場合に効果的であり、そしてａ）発現が生じる患者の体内の部位を同定するため；ｂ）発現を定量するため；そしてｃ）発現の期間を決定するために使用され得る。例えば、患者または動物に投与される１１１Ｉｎ標識したオクトレオチドは、融合タンパク質のソマトスタチン２型レセプター部分に結合し、そしてγ−カメラを用いて検出され得る。このレセプターの細胞質テイルは、ノイズに対して特定のシグナルを変更するように操作され得る。タグがその融合タンパク質中で第２のポリペプチドとして使用されている場合、このタグは、レセプターへのリガンドの結合によって得られる結果を確認するために使用され得る。第２のポリペプチドとしてタンパク質融合タグを使用することもまた、変異体間の発現レベルを正規化し、そして分析される変異体についてリガンド結合親和性もしくは抗体親和性を比較することによって、インビトロでの発現をインビボでの発現と比較するために使用され得る。従って、変異体は、インビトロおよびインビボにおいて遺伝子移入を伝達するための改善された特性を持って作製され得る。例えば、赤血球凝集素Ａ（ＨＡ）は、ＨＡタグに特異的に結合する抗体を用いて検出され得る。他の実施形態において、第２のポリペプチドもまた、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性のような特有の酵素活性によって検出され得る。タグは、変更されたレポータータンパク質特性（例えば、リガンド結合または抗体認識）と独立して、発現がアッセイされることを可能にする。この系の特定の実施形態において、本明細書中に記載される融合タンパク質は、レポータータンパク質の変異体およびソマトスタチンレセプター以外のレセプターを開発するために使用され得る。
【００１１】
（発明の説明）
本発明の実施形態は、インビトロおよびインビボの両方での遺伝子移入および発現を追跡するために使用され得る融合タンパク質に関する。適切に構成された融合タンパク質エレメントをコードするＤＮＡ分子を構築するための手順は、当該分野で周知であり、この目的のために使用され得るプラスミドは、分子生物学における標準的な技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照のこと）を使用して作製され得る。ソマトスタチンレセプターをコードするＤＮＡは、合成により作成され得るか、あるいは以下の実施例の節において記載される技術のようなＰＣＲ技術を使用してクローニングされ得る。本発明は、任意の第２のポリペプチド配列および細胞膜にタンパク質を方向付け得るリーダー配列と適合性である。同様に、哺乳動物細胞において活性な任意の型のプロモーターが本発明とともに使用され得、これらのプロモーターとしては、誘導性プロモーター、応答性プロモーターまたは構成性プロモーターが挙げられる。好ましい哺乳動物プロモーターとしては、以下が挙げられる：マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８（１９８２））；ヘルペスウイルスの前初期プロモーターおよびＴＫプロモーター（Ｙａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６２４９−６２５８（１９９５））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０（１９８１））；ならびにヒトＣＭＶプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ  ４１：５２１−５３０（１９８５））。全長プロモーターまたは最小プロモーターが使用され得、他の調節エレメントが含まれ得る。一般に、遺伝子がレポーターと融合する場合を除いては、融合タンパク質の最終的なＣ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドの直後に終止コドンを配置して、外来アミノ酸を含むことを避けることは適切である。
【００１２】
レポータータンパク質融合物（例えば、ＳＳＴＲ融合タンパク質）をコードするＤＮＡが発現ベクターに組み込まれた後、このベクターは、当該分野で公知の任意の手段により細胞に導入され得る。これらの手段としては、リン酸カルシウム沈澱、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム移入、ウイルス移入、非ウイルス移入または裸のＤＮＡの注射。次いで、発現は、ＳＳＴＲについての標識リガンドを使用して検出され得る。特定の実施形態において、発現は、ソマトスタチン２型レセプターについての標識リガンド（例えば、標識オクトレオチド）を使用して、検出され得る。
【００１３】
代表的には、発現ベクターは、患者または実験動物に注射により投与される。特定の実施形態において、発現ベクターは、トランスジェニック動物またはキメラ動物を作出するために使用され得る。次いで、遺伝子移入および発現の部位は、検出可能に標識されたリガンドのＳＳＴＲへの結合に基づいて同定され得る。特定の実施形態において、細胞質ドメインに欠失を有するレセプターが使用され得る。検出可能な標識としては、磁気共鳴薬剤、光学的画像化薬剤、同位体、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、当該分野で公知の他の標識薬剤、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。種々の実施形態において、１１１Ｉｎ標識オクトレオチドが被験体に投与され得る。次いで、これは、γカメラを使用してリガンドが追跡され得る（実施例の節を参照のこと）。
【００１４】
発現を定量するための代替的方法もまた、使用され得る。例えば、標準的なレセプター結合アッセイが、細胞調製物に対して行われ得る。この方法の本質的な特徴は、ＳＳＴＲ融合タンパク質を発現するＤＮＡで形質転換した細胞を、ＳＳＴＲレセプター部分に特異的に結合する検出可能に標識したリガンドとともにインキュベートすることである。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）、フルオレスカミンがある。有用な化学発光化合物としては、ルミノール、イソルミノール、サロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが挙げられる。有用な酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、１１１Ｉｎ−オクトレオチドがリガンドとして使用されうる。
【００１５】
非特異的結合は、大過剰の非標識リガンドの存在下で結合反応を行うことにより決定され得る。例えば、同位体により標識したオクトレオチドを、大過剰の非標識オクトレオチドの存在下でレセプターとともにインキュベートし得る。非特異的結合は、結合全体（すなわち、試験した各サンプルについての非標識リガンドの非存在下での結合）から差し引かれるべきである。洗浄、拡販、振盪、濾過などのような他の工程は、必要であればアッセイに含まれ得る。アッセイは、スキャッチャード分析を行うに十分な範囲にある、いくつかの濃度のリガンドで行われ得る。この型の分析は、当該分野で周知であり、存在するレセプターの数を決定するために使用され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１．２．１−１１．２．１９（１９９３）を参照のこと）。
【００１６】
融合タンパク質発現はまた、別の検出手段により確認され得る。例えば、融合タンパク質のレポーター部分または第２のポリペプチド部分のいずれかに対する抗体が使用されて、免疫蛍光により発現が位置決めされ得る。あるいは、または例えば、ＳＳＴＲ検出と組み合わせて、タンパク質融合タグが、免疫学的方法により検出され得る。これらの方法としては、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学などが挙げられるが、これらに限定されない。免疫学的方法は、本明細書中に記載の融合タンパク質をコードするベクターによりトランスフェクトされた細胞を選別、単離、および／または同定するために使用され得る。あるいは、β−ガラクトシダーゼのような標準的なタグが融合成分として含まれ得、定量のために使用され得る。種々の融合タンパク質タグが、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）のような業者から入手可能である。従って、インビトロアッセイは、最初に細胞における発現の部位、量および持続時間を決定するために使用され得、続いて、動物における発現の部位、持続時間および量のインビボ画像化のために使用され得る。組織調製を引き続いて使用して、動物が屠殺された後の結果を確認および定量し得る。ヒトにおいては、画像化が、発現の位置、持続時間および量に対する情報を提供し得る。
【００１７】
（核酸ベクター）
特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の核酸分子のいずれかを含むベクター、または組換え発現ベクターに関する。ベクターは、融合タンパク質をコードするＤＮＡもしくはＲＮＡを増幅し、そして／またはＳＳＴＲ融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現するかのいずれかのために本明細書中で使用され得る。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス性粒子またはウイルス、および組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えにより宿主ゲノムに組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス性粒子としては、アデノウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、微粒子および裸のＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。種々の実施形態において、発現は、標的化リガンドにより、特定の細胞型または細胞集団に標的化され得る。発現ベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の発現ベクターとしては、ｐＳＰＯＲＴＴＭベクター、ｐＧＥＭＴＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＰＲＯＥＸベクターＴＭ（ＬＴＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＱＥＴＭベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＳＥ４２ＯＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＹＥＳ２ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。発現構築物は、内因性または外因性の発現制御ＤＮＡ配列および転写終結因子に作動可能に連結された融合タンパク質コードポリヌクレオチドを含み得る。多くのベクターにおいて、核酸挿入のための空間は制限されているので、より小さなレポーターまたはレポーター融合構築物を挿入することが望ましくあり得る。例えば、ソマトスタチンレセプターのカルボキシ末端の全てまたは一部の欠失が用いられ得る。発現制御ＤＮＡ配列としては、一般に、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および調節エレメント結合部位が挙げられ、代表的には、発現構築物が利用される発現系に基づいて選択される。プロモーターおよびエンハンサー配列は、一般に、遺伝子発現を増大させる能力について選択される一方、オペレーター配列は、一般に、遺伝子発現を調節する能力について選択される。本発明の発現構築物はまた、構築物を有する宿主細胞の同定を可能にする１以上の選択マーカーをコードする配列を含み得る。発現構築物はまた、宿主細胞において相同組換えを容易にする配列を含み得る。種々の実施形態において、構築物はまた、宿主細胞における複製に必要な配列を含み得る。
【００１８】
種々の例示的組織特異的プロモーターは、本明細書中に列挙される（ＰｅａｒｓｅおよびＴａｋｏｒ，１９７９；ＮｙｌｅｎおよびＢｅｃｋｅｒ，１９９５）。完全な列挙ではないが、これらのプロモーターは、本発明の特定の実施形態において使用され得るプロモーターおよびエンハンサーの型の例示である。本発明において有用なさらなるプロモーターは、当業者に容易に知られる。エンハンサーとしては、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、Ｔ細胞レセプター、ＨＬＡ  ＤＱαおよびＤＱβ、β−インターフェロン、インターロイキン−２、インターロイキン−２レセプター、ＭＨＣクラスＩＩ  ５、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲα、β−アクチン、筋クレアチンキナーゼ、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼＩ、メタロチオネイン、コラゲナーゼ、アルブミン遺伝子、α−フェトプロテイン、τ−グロビン、β−グロビン、ｅ−ｆｏｓ、ｃ−ＨＡ−ｒａｓ、インスリン、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、α１−アンチトリプシン、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン、マウスコラーゲンまたはＩ型コラーゲン、グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ９４およびＧＲＰ７８）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）、血小板由来増殖因子、デュシェーヌ筋ジストロフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
誘導性プロモーターとしては、ＭＴ  ＩＩ、ＭＭＴＶ（マウス乳腺腫瘍ウイルス）、ｃ−ｊｕｎ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マウスＭＸ遺伝子、ＧＲＰ７８遺伝子、α−２−マクログロブリン、ビメンチン、ＭＨＣクラスＩ遺伝子Ｈ−２κＢ、ＨＳＰ７０、プロリフェリン（Ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）、腫瘍壊死因子、甲状腺刺激ホルモンα、およびインスリンＥボックスが挙げられるが、これらに限定されない。細胞特異的発現また組織特異的発現は、細胞特異的エンハンサーおよび／またはプロモーターを使用することにより達成され得る。一般には、Ｈｕｂｅｒら  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７：２７９−２９２，１９９５を参照のこと。
【００２０】
発現構築物は、コードされるタンパク質の生成のために利用され得るが、単に、ＳＳＴＲ融合タンパク質コードポリヌクレオチド配列を増幅するためにも利用され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、ポリヌクレオチドが発現制御配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結される発現ベクターである。特定の実施形態において、自律的に複製する組換え発現構築異物（例えば、ポリヌクレオチドを組み込む、プラスミドベクターおよびウイルスＤＮＡベクター）であり得る。発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物であり得、この構築物において、ＳＳＴＲ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主においてＳＳＴＲ融合タンパク質の発現をもたらし得る適切な制御配列に作動可能に連結されるかまたは接続される。ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連すると、作動可能に連結されるかまたは接続される。例えば、プロモーターは、配列の転写を制御する場合に、コード配列に作動可能に連結されるかまたは接続される。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としないが、むしろ、宿主において複製する能力（通常は、複製起点により付与される）および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子のみが必要である。発現ベクターにおける制御配列の必要性は、選択される宿主および選択される形質転換法に依存して変化する。一般に、制御配列としては、転写プロモーター、転写を制御するための必要に応じたオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列が挙げられる。
【００２１】
種々の実施形態において、ベクターは、宿主生物により認識されるプロモーターを含み得る。このプロモーター配列は、原核生物、真核生物、合成またはウイルスのプロモーター配列であり得る。適切な原核生物配列の例としては、バクテリオファージλのＰＲプロモーターおよびＰＬプロモーター（Ｔｈｅ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌａｍｂｄａ，Ｈｅｒｓｈｅｙ，Ａ．Ｄ．，編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９７３）；Ｌａｍｄａ  ＩＩ（Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．Ｗ．，編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））；Ｅ．ｃｏｌｉのｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、熱ショックプロモーターおよびｌａｃＺプロモーター、ならびにＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら．Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０，１９８１）が挙げられる。さらなるプロモーターとしては、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの長末端反復、マロネイウイルス、サイトメガロウイルス前初期プロモーター、エプスタインバーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、およびヒトメタロチオネインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
さらなる調節配列がまた、ベクターに含まれ得る。適切な調節配列の例は、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子およびバクテリオファージλの遺伝子ｃＩＩのシャイン−ダルガーノ配列により示される。シャイン−ダルガーノ配列の後ろに、ＳＳＴＲ融合タンパク質をコードするＤＮＡが続き、成熟ＳＳＴＲ融合タンパク質の発現を生じ得る。
【００２３】
さらに、適切な発現ベクターは、形質転換された宿主細胞のスクリーニングを可能にする適切なマーカーを含み得る。選択された宿主の形質転換は、当該分野の専門家には周知である種々の技術のいずれか１つを使用して行われ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。
【００２４】
複製起点もまた、外来起源を含むベクターの構築物によるか、または宿主細胞染色体複製機構によるかのいずれかにより提供され得る。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルスの複製起点を含むベクターを使用するのではなく、当業者は、選択マーカーとＳＳＴＲ融合タンパク質をコードするＤＮＡとの同時形質転換の方法により、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＢＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照のこと）。
【００２５】
レポータータンパク質融合物（例えばＳＳＴＲ２融合タンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、従来の技術にしたがってベクターＤＮＡと組換えられ得る。これらの技術としては、連結のための平滑末端化または付着末端化した末端、適切な末端を与えるための制限酵素消化、適切な場合には、付着末端のフィルイン、所望でない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼとの連結が挙げられる。このような操作についての技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）により開示され、当該分野で周知である。哺乳動物発現ベクターを構築するための方法は、例えば、Ｏｋａｙａｍａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：２８０，１９８３；Ｃｏｓｍａｎら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：９３５，１９８６；Ｃｏｓｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７６８，１９８４；ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、およびＷＯ９１／１８９８２に開示される。
【００２６】
（核酸送達）
（リポソーム処方物）
特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドおよび／または発現ベクターは、リポソーム中に捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部水性媒体により特徴付けられる小胞構造物である。多層リポソームは、水性媒体により分離される複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が、過剰な水溶液中で懸濁されると自律的に形成する。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再配置を受け、脂質二重層の間に水および溶解した溶質を捕捉する。（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ，Ｉｎ：Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ、Ｗｕら（編），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ８７−１０４，１９９１）。カチオン性脂質−核酸複合体（例えば、リポフェクタミン−核酸複合体）もまた意図される。
【００２７】
本発明の特定の実施形態において、リポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成し得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞進入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９）。他の実施形態において、リポソームは、複合体化され得るか、または核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とともに使用され得る（Ｋａｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，１９９１）。なおさらなる実施形態において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１両方と複合体化され得るかまたはこれらともに使用され得る。このような発現ベクターが、インビトロおよびインビボにおけるポリヌクレオチドの移入および発現において首尾よく使用されているので、これらの発現ベクターは、本発明に適用可能である。細菌プロモーターがＤＮＡ構築物において使用される場合、適切な細菌ポリメラーゼをリポソーム内に含み得ることも望ましい。
【００２８】
「リポソーム」は、取り囲まれた脂質二重層の生成により形成される種々の単層脂質小胞および多層脂質小胞を含む包括的用語である。リン脂質は、本発明に従うリポソームを調製するために使用され、正味の正電荷を有し得るか、正味の負電荷を有し得るか、または中性であり得る。リン酸ジセチルは、リポソームに負電荷を付与するために使用され得、そしてステアリルアミンは、リポソームに正電荷を付与するために使用され得る。
【００２９】
本発明に従う使用に適切な脂質は、市販の供給源から入手され得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手され得、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から入手され得；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手され；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）などの脂質は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から入手され得る。クロロホルム、クロロホルム／メタノール、またはｔ−ブタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃にて保存され得る。特定の実施形態において、クロロホルムは、メタノールより容易にエバポレートされるので、唯一の溶媒として使用される。
【００３０】
本発明に従って使用されるリポソームは、異なる方法により作製され得る。リポソームのサイズは、合成方法に依存して変化する。水溶液中に懸濁されたリポソームは、一般に、脂質二重層分子の１以上の同心の層を有する、球状の小胞の形態にあり得る。各層は、式ＸＹにより示される分子の平行なアレイからなる。ここでＸは親水性部分であり、Ｙは疎水性部分である。水性懸濁液において、同心層は、親水性部分が、水相と接触し続ける傾向があり、疎水性領域は自己会合する傾向があるように構成される。例えば、水相がリポソーム内にもリポソーム外にも存在する場合、脂質分子は、構成ＸＹ−ＹＸの二重層（ラメラとして公知）を形成する。
【００３１】
本発明の範囲内のリポソームは、公知の実験技術に従って調製され得る。１つの実施形態において、リポソームは、リポソーム脂質を容器（例えば、ガラス製の洋ナシ型フラスコ）内の溶媒中で混合することにより調製され得る。この容器は、リポソームの予測される懸濁液の容積より１０倍大きな容積を有するべきである。ロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を、減圧下で約４０℃にて除去する。溶媒は、通常、リポソームの所望の容積に依存して、約５分〜２時間内に除去される。組成物は、真空下でデシケーター中でさらに乾燥され得る。乾燥した脂質は、一般に、時間とともに劣化する傾向があるので、約１週間後には廃棄される。
【００３２】
乾燥した脂質を、全ての脂質フィルムが再懸濁されるまで振盪することにより、滅菌した発熱物質を含まない水中で約２５〜５０ｍＭのリン脂質にて水和し得る。次いで、水性リポソームは、アリコートに分離され得、各々、ウイルスが入れられ、減圧下で凍結乾燥および密封される。
【００３３】
別の方法において、リポソームは、他の公知の実験手順に従って調製され得る：Ｂａｎｇｈａｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２３８−２５２，１９６５の方法；Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｉｎ  ＢｉｏｌｏｇｙおよびＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編（１９７９）ｐｐ．２８７−３４１に記載される、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓの方法；ＤｅａｍｅｒおよびＵｓｔｅｒ  Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓの方法；Ｍ．Ｏｓｔｒｏ，編，１９８３；ならびにＳｚｏｋａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：４１９４−４１９８，１９７８により記載される逆相エバポレーション法。前述の方法は、水性物質を捕捉するそれぞれの能力およびそれぞれの水性空間  対  脂質比が異なる。
【００３４】
上記のように調製される乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、核酸の溶液中で再構成され得、適切な溶媒（例えば、ＤＰＢＳ）で適切な濃度に希釈され得る。次いで、この混合物は、ボルテックスミキサーで激しく振盪される。カプセル化されない核酸は、２９，０００×ｇでの遠心分離により除去され、リポソームペレットが洗浄される。洗浄されたリポソームペレットは、適切な総リン脂質濃度（例えば、約５０〜２００ｍＭ）に再懸濁される。カプセル化された核酸の量は、標準的な方法に従って決定され得る。リポソーム調製物にカプセル化された核酸の量を決定した後に、リポソームを、適切な濃度に希釈し得、使用時まで４℃にて保存し得る。
【００３５】
（代替的送達系）
（ウイルス法）
ヒトアデノウイルスは、ゲノムサイズが約３６ｋＢである、二本鎖ＤＮＡ腫瘍ウイルスである（Ｔｏｏｚｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｉｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）。真核生物遺伝子発現のためのモデル系として、アデノウイルスは広く研究されてかつ十分に特徴付けられており、このことにより、アデノウイルスは、遺伝子移入系としてのアデノウイルスの開発のための魅力的な系となっている。この群のウイルスは、増殖および操作が容易であり、そしてこれらのウイルスは、インビトロおよびインビボで広範な宿主範囲を示す。溶菌感染した細胞において、アデノウイルスは、宿主タンパク質の合成を遮断し、細胞機構が大量のウイルスタンパク質を合成するように指向させ、そして大量のウイルスを生成することができる。
【００３６】
そのゲノムのＥ１領域は、そのウイルスゲノムの転写調節を担うタンパク質をコードするＥ１ＡおよびＥ１Ｂと、２〜３個の細胞遺伝子を含む。Ｅ２発現（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂを含む）により、ウイルス複製機能（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、および複製を開始させる末端タンパク質）の合成が可能になる。Ｅ３遺伝子産物は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を妨げる。Ｅ３遺伝子産物は、ウイルス増殖に重要であるようである。Ｅ４タンパク質と関連する機能としては、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞遮断が挙げられる。この後期遺伝子産物は、ビリオンキャプシドタンパク質のほとんどを含み、そしてこれらは、主要後期プロモーターからの単一の一次転写物のプロセシングのほとんどが生じた後にのみ、発現される。主要後期プロモーター（ＭＬＰ）は、その感染の後期の間に高い効率を示す（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ：Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ  Ｅｕｒｏｔｅｘｔ版、Ｆｒａｎｃｅ，ｐｐ．５１−６１，１９９１）。
【００３７】
そのウイルスゲノムの小さい部分のみが、シスで必要とされるようである（Ｔｏｏｚｅ，１９８１）ので、アデノウイルス由来ベクターは、２９３細胞のような細胞株と組み合わせて使用された場合、大きなＤＮＡフラグメントの置換についての優れた能力を提供する。Ａｄ５で形質転換したヒト胚性腎細胞株（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２，１９７７）は、トランスで必須ウイルスタンパク質を提供するように開発された。
【００３８】
外来タンパク質を細胞に送達するためのアデノウイルス系の特定の利点としては、以下の（ｉ）〜（Ｖｉ）が挙げられる：（ｉ）外来ＤＮＡにより比較的大きなウイルスＤＮＡ片を置換する能力；（ｉｉ）組換えアデノウイルスの構造的安定性；（ｉｉｉ）ヒトへのアデノウイルス投与の安全性；および（ｉｖ）癌または悪性腫瘍とアデノウイルス感染とのいかなる既知の関連性もないこと；（ｖ）高力価の組換えウイルスを得る能力；および（ｖｉ）アデノウイルスの高い感染性。
【００３９】
レトロウイルスを越えるアデノウイルスベクターのさらなる利点としては、レトロウイルスよりも高いレベルの遺伝子発現が挙げられる。さらに、アデノウイルス複製は、レトロウイルス配列とは異なり、宿主遺伝子複製とは独立している。Ｅ１領域中のアデノウイルス形質転換遺伝子は、容易に欠失され得、かつなお効率の良い発現ベクターを提供するので、アデノウイルスベクターからの腫瘍発生リスクは、無視できると考えられる（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，Ｓｅｍｉｎａｒ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３：２３７−２５２，１９９２）。
【００４０】
一般に、アデノウイルス遺伝子移入系は、アデノウイルスゲノムの一部（例えば、Ｅ１）の欠失により複製不能にされているがなおその感染能力を保持する、操作された組換えアデノウイルスに基づく。比較的大きな外来タンパク質をコードする配列が、そのアデノウイルスゲノム中にさらなる欠失が生じた場合に、発現され得る。例えば、Ｅ１領域およびＥ３領域の両方が欠失したアデノウイルスは、１０ｋＢまでの外来ＤＮＡを保有することができ、そして２９３細胞中で高力価に増殖され得る（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１）。アデノウイルス感染後の導入遺伝子の驚くほど持続する発現もまた、報告されている。
【００４１】
他のウイルスベクターが、本発明における発現構築物として使用され得る。例えば、ワクシニアウイルス由来のベクター（Ｒｉｄｇｅｗａｙ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＲＬ，Ｄｅｎｈａｒｄｔ  ＤＴ編、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４６７−４９２，１９９８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ編、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１１７−１４８，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、Ｇｅｎｅ，６８：１−１０，１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のベクター（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０，１９８４）、ならびにヘルペスウイルス由来のベクターが、使用され得る。これらは、種々の哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８：ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：６４２−６５０，１９９０）。
【００４２】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスの最近の認識によると、異なるウイルス配列の構造−機能の関連性に関する新規な知見が得られた。そのウイルスは、そのゲノムの８０％までの欠失にも関わらず、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写の能力を保持し得たことが、インビトロ研究によって示された（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。このことは、そのゲノムの大部分が、外来遺伝物質で置換され得ることを示唆した。肝臓指向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および持続性（組込み）は、肝臓指向性遺伝子移入のために特に魅力的な特性である。Ｃｈａｎｇらは、最近、アヒルＢ型肝炎ウイルスゲノム中に、そのポリメラーゼコード配列、表面コード配列およびプレ表面コード配列に代わって、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入した。それは、野生型ウイルスとともに、トリ肝細胞癌細胞株中に同時トランスフェクトされた。高力価のその組換えウイルスを含む培養培地が、初代アヒル肝細胞癌に感染させるために使用された。安定なＣＡＴ遺伝子発現が、トランスフェクション後少なくとも２４日間検出された（Ｃｈａｎｇら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １４：１２４Ａ，１９９１）。
【００４３】
（非ウイルス法）
培養哺乳動物細胞中に発現ベクターを移入するためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明により企図される。これらの方法としては、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６−４６７，１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２７４５−２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６８９−６９５，１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１１８８−１１９０，１９８５）、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、およびレセプター媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２，１９８７；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７：８８７−８９２，１９８８）。これらの技術のいくつかは、インビボ使用またはエキソビボ使用に首尾良く適合され得る。
【００４４】
本発明の１つの実施形態において、その発現構築物は、単純に、裸の組換えベクターからなり得る。その構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上記の方法のいずれかによって、実施され得る。例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、ＣａＰＯ４沈殿物の形態のポリオーマウイルスＤＮＡを、成体マウスおよび新生児マウスの、肝臓および脾臓に首尾良く注入し、活性なウイルス複製および急性感染を示した（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７５２９−７５３３，１９８４）。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１９８６）もまた、ＣａＰＯ４沈殿プラスミドの腹腔内直接注入により、トランスフェクトした遺伝子の発現が生じることを示した（ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：９５５１−９５５５，１９８６）。別の実施形態において、細胞が、送達ベクターとして使用され得る。細胞は、インビトロでトランスフェクトされ得、採取され得、そして宿主動物またはヒト中に適切な位置に注入され得る。送達ビヒクルとして使用され得る細胞としては、幹細胞、脾細胞、および動物またはヒトの組織もしくは器官を標的化し得るか、それらに組込み得るか、またはそれらに治療を提供し得る、他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。幹細胞もまた、トランスジェニック動物またはキメラ動物を作製するために使用され得る。
【００４５】
標的化リガンドは、選択された細胞または組織に送達ベクターを標的化させることができる広範な種類の部分から選択され得る。適切なリガンドの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリアミノポリマー（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：４６２−４６６，１９９７）（例えば、ポリリジン（Ｋｏｌｌｅｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．７：１５７７−１５８６，１９９６）；葉酸塩；水溶性ビタミン；ピリドキシルホスフェート；アポリポタンパク質；インスリン；トランスフェリン；ガラクトース；シアル酸；Ｍａｃ−１；ＶＥＧＦ；塩基性ＦＧＦ；ＥＧＦ；ＶＣＡＭ−１；ＩＣＡＭ−１；ＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１；フィブロネクチン；オステオポンチン；ＲＧＤペプチド；ペプチド模倣物；ＨＩＶ  ＧＰ  １２０／４１またはＧＰ１２０；抗細胞表面レセプター抗体（またはそのフラグメント）（例えば、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗セレクチン）、抗細胞表面レセプター抗体（そのフラグメント）（例えば、ＣＤ３４に対する抗体、ＣＤ１９に対する抗体、ＣＤ４に対する抗体、ＣＤ７に対する抗体、ＣＤＢに対する抗体、ＣＤ２０に対する抗体、ＣＤ２２に対する抗体）。
【００４６】
種々の実施形態において、リガンドは、抗体であってもまたは抗体フラグメントであってもよい。その抗体または抗体フラグメントは、マウス起源であり得、そしてマウス表面認識特徴を除去するようにヒト化され得ることが、認識される。
【００４７】
別の実施形態において、その標的化リガンドは、増殖因子レセプターの細胞外ドメインに結合する。例示的レセプターとしては、ＨＥＲ２／ｎｅｕオンコジーンのｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質産物、表皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター、塩基性線維芽細胞増殖因子（塩基性ＦＧＦ）レセプター、および血管内皮増殖因子レセプター、Ｅ−セレクチンレセプター、Ｌ−セレクチンレセプター、およびＰ−セレクチンレセプター、葉酸塩レセプター、ＣＤ４レセプター、ＣＤ１９レセプター、αβインテグリンレセプター、ならびにケモカインレセプターが挙げられる。
【００４８】
標的化リガンドは、ウイルス性核酸送達ベクターまたは非ウイルス性核酸送達ベクターに共有結合され得る。選択された標的化リガンドを付着するための種々の技術が存在する。例えば、疎水性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、広範に研究されている（Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｉａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １２３７：９９−１０８（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４（４）：２９６−２９９（１９９３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５３：７１−７４（１９９４）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７０５−７０８（１９９５）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．、ＳＴＥＡＬＴＨ  ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（Ｄ．ＬａｓｉｃおよびＦ．Ｍａｒｔｉｎ編）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９５））。
【００４９】
一般的に、送達ベクターは、広範な種類のリガンド中に存在する、例えば、スルフヒドリル、アミノ基、およびアルデヒドまたはケトンとカップリングするために適切な反応基を含むように官能基化され得る。ＰＥＧ末端反応性基の例としては、マレイミド（スルフヒドリル基との反応のため）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）もしくはＮＨＳ−カルボネートエステル（一級アミンとの反応のため）、ヒドラジドもしくはヒドラジン（アルデヒドもしくはケトンとの反応のため）、ヨードアセチル（スルフヒドリル基と優先的に反応性）およびジチオピリジン（チオール反応性）が挙げられる。このような基によりＰＥＧを活性化するための合成反応スキームは、米国特許第５，６３１，０１８号、同第５，５２７，５２８号、同第５，３９５，６１９号に示される。ペプチドのような他のリガンドが、ウイルスベクターまたは他の送達ベクターの構造成分（例えば、コートタンパク質）をコードする遺伝子中にコードされ得る。特許出願ＷＯ９８／３９４６４、ＷＯ９８／３９４６５、およびＷＯ９８／３９４６７は、目的のタンパク質を発現するために特定の細胞集団を標的化する方法を考察する。
【００５０】
（薬学的組成物および投与経路）
ＳＳＴＲ融合タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物の臨床適用が企図される場合、意図される適用のために適切な薬学的組成物としてその複合体を調製することが必要である。一般的に、このことは、発熱物質を本質的に含まず、かつヒトまたは動物に対して有害であり得るいかなる他の不純物をも本質的に含まない、薬学的組成物を調製することを包含する。一般的に、その複合体を安定し、かつ標的細胞による複合体の取込みを可能にするために、適切な塩および緩衝液を使用することもまた、望まれる。
【００５１】
本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に溶解または分散された、有効量のその発現構築物を含む。このような組成物はまた、接種物とも呼ばれ得る。句「薬学的に受容可能なまたは薬理学的に受容可能な」とは、適切な場合、動物またはヒトに投与された場合に、有害な反応、アレルギー反応または他の望まれない反応を生じない、分子実体および組成物をさす。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、任意かつすべての、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。従来の任意の媒体または薬剤が活性成分と不適合性でない限り、この薬学的組成物中でのその媒体または薬剤の使用が、企図される。補助活性成分もまた、この組成物中に組込まれ得る。
【００５２】
遊離塩基としての活性化合物または薬理学的に受容可能な塩の溶液が、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。通常の貯蔵および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるために防腐剤を含む。
【００５３】
本発明の発現構築物および送達ビヒクルは、古典的な薬学的調製物を含み得る。本発明に従う組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能な限り、任意の共通経路を介し得る。この投与としては、経口投与、経鼻投与、経頬投与、直腸投与、膣投与、または局所投与が挙げられる。あるいは、投与は、正常位法、皮内法、皮下法、筋肉内法、腹腔内法、経皮法、または血管内法により得る。このような組成物は、薬理学的に受容可能なキャリア、緩衝液、または他の賦形剤を含む、薬学的に受容可能な祖生物として通常は投与され得る。
【００５４】
本発明の組成物は、液体溶液または液体懸濁物のいずれかとして、注射可能な組成物の形態で、有利に投与され得；液体中溶液もしくは液体中懸濁物に適切な固体形態が、注射前に調製され得る。これらの調製物はまた、乳化され得る。このような目的のための代表的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含む。例えば、この組成物は、１ミリリットルのリン酸緩衝化生理食塩水あたり、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、または約１００ｍｇまでのヒト血清アルブミンを含み得る。他の薬学的に受容可能なキャリアとしては、水性溶液、非毒性賦形剤（塩を含む）、防腐剤、緩衝剤などが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、アルコール性溶液／水性溶液、生理食塩水溶液、非経口ビヒクル（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲルデキストロースなどが挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体補充剤および栄養補充剤が挙げられる。防腐剤としては、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスが挙げられる。この薬学的組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、既知パラメーターに従って調整される。
【００５５】
さらなる処方物が、経口投与のために適切である。経口処方物は、例えば、薬学グレードの、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、代表的賦形剤を含む。この組成物は、溶液形態、懸濁物形態、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、徐放処方物形態、または散剤形態を採る。その経路が局所経路である場合、その形態は、クリーム、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、またはスプレーであり得る。
【００５６】
有効量のこの組成物は、意図される目的（例えば、（ｉ）インビトロでの遺伝子発現をアッセイすること、または（ｉｉ）インビボでの遺伝子発現をアッセイすること）に基づいて、決定される。用語「単位用量」とは、被検体における使用のために適切な物理的に個別の単位を指し、この単位各々は、その投与（すなわち、適切な経路および投与レジメン）に関連して、所望の応答（上記で考察される）を生じるように計算された所定量のこの組成物を含む。投与されるべき量（投与回数および単位用量の両方に従う）は、被検体およびその被検体の状態に依存する。その組成物の正確な量もまた、開業医の判断に依存し、そして各個体に特有である。
【実施例】
【００５７】
（方法および材料）
（クローニング）
ＰＣＲを、Ｓａｃ  ＩＩ制限酵素認識部位を含む順方向プライマー（ＴＣＣ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＧＡ（配列番号１））およびＰｓｔ  Ｉ制限酵素認識部位および終止コドンを含む逆方向プライマー（ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＧＡＧ（配列番号２））を使用して、ソマトスタチン２Ａ型レセプター（ＳＳＴＲ２Ａ）インサートを含むファージ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からＳＳＴＲ２Ａを得るために使用した。フェニルアラニン３１４以外のこのＳＳＴＲ２Ａ細胞内ドメインのほぼすべてを除外する第２オリゴヌクレオチドＴＭ７ＩＢもまた、使用した。このオリゴヌクレオチドはまた、Ｐｓｔ  Ｉ制限部位および終止コドンを含む。「細胞内テールマイナス」ＳＳＴＲ２Ａインサートの全長を、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。このインサートを、膜局在化配列（Ｉｇκリーダー）の下流かつ血球凝集素Ａ（ＨＡ）エピトープタグの下流に配置する。次いで、Ｔｏｐ  １０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ベクター単独でかまたはＳＳＴＲ２インサート含有ベクターのいずれかを使用して、塩化カルシウムを使用して形質転換し、その後、アンピシリン耐性について選択した。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐキットを使用して、Ｍｉｄｉｐｒｅｐを実施した。
【００５８】
（細胞株）
ＨＴ  １０８０細胞（ヒト線維芽細胞細胞株）を、１×グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン（ＧＰＳ）および１０％ウシ胎仔血清を含む、ＤＭＥＭ中で増殖させた。トランスフェクションのために、１μｇのＤＮＡを、製造業者の指示に従ってリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とともに添加した。５時間後、そのリポフェクチン−ＤＮＡ溶液を洗浄し、そしてその細胞を、ＤＭＥＭ、１×ＧＰＳ、および１０％  ＦＢＳ中でさらに２日間インキュベートした。その後、この細胞を１：２０および１：５に分割し、そしてＧ４１８選択後に単一コロニーを採取した。
【００５９】
（酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））
コロニーを、ＥＬＩＳＡによって発現について試験した。コンフルエントな９６ウェルプレートを、ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＰＢＳ中２％ホルムアルデヒドまたは１０％ホルマリンとともに３０分間固定した。これらを、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、５％乳汁で３０分間ブロックした。ＰＢＳ中で１回洗浄した後、これらの細胞を、５０ｍＵ／ｍｌ  ＨＲＰ−ラット抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅから得たクローン３Ｆ１０）に、４℃で一晩かまたは室温で１時間曝露した。その後、ＰＢＳで各々５分間の洗浄を３回行った。陽性細胞は、ＨＲＰ  ＥＬＩＳＡ基質に曝露した後、緑色産物を示した。この方法を、ＨＡドメインの存在について定量的にアッセイするために改変した。９６ウェルプレートの１ウェルあたり３０，０００細胞を、上記のように処理した。呈色反応を発色させた後、４０５ｎｍでの光学密度を、ＨＲＰ−ラット抗ＨＡ抗体希釈物を使用して構築した標準曲線と比較した。この曲線の直線部分は、０．９５より大きいＲ２値を生じた。
【００６０】
（ドットブロットおよびウェスタンブロット）
コンフルエントな６つのウェルディッシュをＰＢＳで洗浄し、次いで、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００／ＳＤＳ溶解溶液（０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、１％  Ｔｒｉｔｏｎ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．０２５％アジ化ナトリウム、０．１８％完全プロテアーゼインヒビター、１Ｍ  ヨードアセトアミド）に、４℃にて１時間曝した。３０分後、１４，０００ｇの遠心分離し、上清を収集し、そしてタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定した。７％ＳＤＳゲルにおいて、１レーンあたり２０μｇのタンパク質をロードした。その後、タンパク質を、セミドライ転写装置およびＴｏｗｂｉｎ緩衝液を用いてニトロセルロースに転写した。このブロットを乾燥し、そして転写物をＰｏｎｃｅａｕ−Ｓ染色を用いて確認した。ドットブロットについて、細胞溶解物由来の１５μｇのタンパク質を、ニトロセルロース上にピペットで移し、そして風乾した。次いで、ドットブロットまたはウェスタンブロットのための膜を、ＰＢＳで洗浄し、そして室温にて１時間、５％ミルクでブロックした。０．１％  Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ中での一回の洗浄の後、細胞を、５０ｍＵ／ｍｌ  ＨＲＰ−ラット抗ＨＡ抗体（クローン３  Ｆ１０  Ｒｏｃｈｅ）に、４℃にて一晩または室温にて１時間曝露した。インキュベーションの後、洗浄を、ＰＢＳで各々５分間行い、そして膜を、撮影のために化学発光ＨＰＲ基質で覆った。
【００６１】
（免疫蛍光法）
一晩、８ウェルのシリコンチャンバスライドシステム中で、１ウェルあたり、１０，０００個の細胞を、プレートした。細胞を、１０％ホルマリンで３０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、そして５％ミルクで３０分間ブロットした。次いで、細胞を、室温にて１時間、１：２５０に希釈したマウス抗ＨＡ抗体に曝露した。次いで、５回の洗浄を、各々５分間行った。次いで、１：１５０に希釈したＦＩＴＣ−ヤギ抗マウス抗体を細胞に置いた。次いで、再び、５回の洗浄を、各々５分間行った。次いで、スライドを、免疫蛍光の評価に備えて、カバーガラスと共に取付けた。
【００６２】
（レセプター結合研究）
一晩、９６ウェルプレートの１ウェルあたり３０，０００個の細胞をプレートした。ＰＢＳ洗浄の後、これらを結合緩衝液（２０ｍＭ  ヘペス（ｐＨ７．４）、０．１％バシトラシン、０．２％  ＢＳＡ）中の、１×１０−７Ｍ  １１１Ｉｎ−オクトレオチド、または１×１０−６Ｍのソマトスタチン−２８を含む１１１Ｉｎ−オクトレオチドに、室温にて曝露した。１時間後、細胞をＰＢＳで５回洗浄し、そして次いで、０．１Ｎ  ＮａＯＨで溶解した。γカウンターを用いて放射性崩壊を測定した。コントロールは、放射能を有さない結合緩衝液に曝露された細胞、および放射能を有する結合緩衝液に曝露された細胞を有さないウェルを含んだ。プレートを、各々の洗浄後に観察して、細胞損失をモニターした。
【００６３】
（体内分布およびイメージング）
ヌードマウスにおいて、５×１０６細胞の皮下注射は、１週間後に明瞭な腫瘍を生じた。１匹のマウスあたり、３５０μＣｉまたは１０μＣｉの１１１Ｉｎ−オクトレオチドを、尾静脈を介して、注射した。２４時間後、マウスを屠殺し、そして解剖した。各々の器官および腫瘍を、計量し、そして放射性崩壊を、γカウンターを用いて決定した。片側ｔ検定を使用して、発現における所定の既知の差異について、体内分布における有意な差異を比較した。１１１Ｉｎ−オクトレオチド注射の４時間後および２４時間後に、沈静させたマウスを、中間エネルギーピンホールコリメーター（ｍｅｄｉｕｍ  ｅｎｅｒｇｙ  ｐｉｎｈｏｌｅ  ｃｏｌｌｉｍａｔｏｒ）を取付けたγカメラ（ＧＥ  Ｓｔａｒｃａｍ  ３２００）を使用して１０分間、イメージ化した。
【００６４】
（結果）
（クローニング）
全長または細胞内テールマイナス（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｉｌ  ｍｉｎｕｓ）ＳＳＴＲＡ２レセプターを、発現したタンパク質の膜局在化に関する５’Ｉｇκリーダー配列を含む、ｐＤｉｓｐｌａｙベクターにクローン化した。このリーダー配列を、抗体ベースの検出のための血球凝集素Ａ配列の後に続ける。オクトレオチドに対する結合ドメインは、膜貫通ドメイン３〜７の間のレセプターのカルボキシ部分を含むことが予想される。従って、このレセプターのアミノ末端融合は、結合にあまり干渉しそうになく；さらに、レセプターインターナリゼーションにもあまり干渉しそうにない。このレセプターインターナリゼーションは、カルボキシ末端の細胞内ドメインに依存する（Ｋｏｅｎｉｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３６：２９１−２９８；Ｒｏｔｈら、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：１１１−１１９（１９９７））。ＳＳＴＲ２ＡのＣ末端を超えた発現を防ぐために、停止コドンを、ＰＣＲバックプライマーに導入した。ＳＳＴＲ２をｐＤｉｓｐｌａｙへとクローニングした後、ベクター、またはベクターおよび挿入物を、リポフェクチンおよびＧ４１８選択を用いてＨＴ１０８０細胞に導入した。融合タンパク質産物は、５’Ｉｇκリーダー配列、ＨＡドメイン、および細胞質内Ｃ末端テールを有するまたは有さないＳＳＴＲ２Ａからなる。
【００６５】
（発現）
発現を、ＥＬＩＳＡにより総細胞において、ならびにドットブロットおよびウェスタンブロットによって細胞溶解物において確認した。得られたデータは、全長ＳＳＴＲ２Ａ融合タンパク質を発現する細胞クローンのうち、「クローン２１」が、最も高いレベルの発現を有し、次いで「クローン３」、次いで「クローン１１」が高かったことを示した。例えば、ＨＡドメインに対する抗体を用いる定量的ＥＬＩＳＡにおいて、クローン２１は、クローン３（これはクローン１１よりも反応した）よりも反応した。ベクターのみでトランスフェクトした細胞において、反応は見られなかった。測定を、０．９８のＲ２値を有するＨＲＰ結合体化抗体の希釈曲線と比較した。
【００６６】
ドットブロットによりクローン２１は、クローン３（これはクローン１１よりも大きなシグナルを有していた）よりも、大きなシグナルを有することを見出した。このレセプターの細胞質テールが欠失を受けているクローン（クローン「テール−４」およびクローン「テール−１」）もまた、ドットブロットにおいて有意なシグナルを与えることを見出した。クローンテール−４は、クローンテール−１よりも大きなシグナルを有していた。全長ＳＳＴＲ２Ａ融合タンパク質に対する比較において、クローンテール−４は、クローン２１よりも小さなシグナルを有し、そしてクローンテール１は、クローン１１よりも小さなシグナルを有する。ベクターのみでトランスフェクトした細胞において、シグナルは見られなかった。発現のこのパターンを、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットにおいてもまた見出した。さらに、ウェスタンブロットにおいて、全長またはテールマイナスＳＳＴＲ２キメラ遺伝子でトランスフェクトした細胞を表す全てのレーンにおいて、別個のバンドが観察されたが、ベクターのみでトランスフェクトした細胞由来の物質を含むレーンにおいては観察されなかった。発現した融合タンパク質の予想したよりも大きい分子量（全長ＳＳＴＲ２Ａ融合タンパク質について７２ｋＤａおよびテールＳＳＴＲ２融合タンパク質について７０ｋＤ）は、アミノ末端融合の次の異常なグリコシル化に起因するようである。しかし、上記で実証したように、このことは、リガンド結合を妨げない。
【００６７】
（免疫蛍光）
発現したタンパク質の細胞局在を決定するために、ＨＡタグを免疫蛍光により標的化した。このタグは、全長ＳＳＴＲ２Ａまたはテールマイナス遺伝子キメラでトランスフェクトした細胞において検出されたが、ベクターのみ、または全くトランスフェクションを受けていない細胞でトランスフェクトした細胞においては検出されなかった。免疫蛍光は、最も明確に、細胞の縁で見られたが、核または細胞質においては見られなかった。このことは、発現した融合タンパク質が、細胞膜に局在されることを示唆する。結果をまとめると、Ｉｇκリーダー配列およびＨＡドメインの両方は、融合タンパク質においてそれらの正常な機能を維持していたことを示す。
【００６８】
（レセプター結合）
融合タンパク質のＳＳＴＲ２部分の適切な機能を確認するために、レセプター結合アッセイを、クローンおよび標識化オクトレオチドを用いて行った。レセプター飽和は、１×１０−７Ｍのオクトレオチドで生じることが報告されている（Ｒｅｉｓｉｎｅら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４４：１００８−１０１５（１９９３）；Ｒａｙｎｏｒら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４３：８３８−８４４（１９９３））。１０−７Ｍ  １１１Ｉｎ−オクトレオチドに対する異なるクローンの結合を、１０−６Ｍソマストチン（ｓｏｍａｓｔｏｔｉｎ）−２８の存在下および非存在下で比較した。用いたリガンドの飽和レベルにより、レセプター結合の差異は、タンパク質発現に起因するはずである。全長ＳＳＴＲ２Ａキメラ遺伝子を含むクローン（クローン２１、クローン１１、およびクローン３）およびＣ末端細胞内ドメイン欠失を含むクローン（クローンテール−１およびクローンテール−４）は、冷ソマストチン−２８の添加ありよりも、冷ソマストチン（ｓｏｍａｓｔｏｔｉｎ）−２８の添加なしで、１分間あたりより多くのカウントを示したことを見出した。１１１Ｉｎ−オクトレオチドに対する特異的な結合は、クローン１１よりもクローン３、クローン３よりもクローン２１についてより大きく、そしてクローンテール−１とクローン１１との間、およびクローン−４とクローン２１との間で類似している。類似の低いカウントが、ソマトスタチン−２８の存在下において、全てのクローンで見られた。予想されるように、同じ低いカウントが、ソマトスタチン−２８の添加のありまたはなしで、ベクターでトランスフェクトした細胞、またはトランスフェクトしていない細胞で見出された。この知見は、融合タンパク質のＳＳＴＲ２Ａドメインが機能的であり、そしてレセプターの細胞内テールが、オクトレオチドまたはソマストチン（ｓｏｍａｓｔｏｔｉｎ）−２８の結合のために必要ではないことを実証する。さらに、レセプター結合データは、ウェスタンブロットを用いて得られたデータと相関する。従って、ＨＡタグを用いて得られた結果は、ＳＳＴＲ２Ａに基づくレセプター−リガンド結合データを確認する。
【００６９】
（イメージングおよび体内分布）
クローン２１、クローン３、クローン１１、またはベクターでトランスフェクトした細胞を注射したマウスを、尾静脈を介する１１１Ｉｎ−オクトレオチドの投与の４時間または２４時間後にイメージ化した。腫瘍なしでは、バックグラウンド活性のみが、注射の４時間後に明白であった。２４時間後、ベクターでトランスフェクトした細胞由来の腫瘍は目に見えず、そしてクローン１１由来の腫瘍は、見ることが困難だった。対照的に、クローン２１由来の腫瘍は、明らかに目に見え、そして、より低い程度で、クローン３由来の腫瘍もまた明確であった。
【００７０】
マウスを屠殺して、体内分布を評価した。これは、１ｇあたり最も大きな放射能は、クローン２１由来の腫瘍であり、次いでクローン３、クローン１１、そして、最後に、ベクターのみでトランスフェクトした細胞の順であったのことを示した。このデータは、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、ウェスタンブロット、レセプター結合アッセイ、およびイメージングにより得られたデータと十分に相関する。
【００７１】
マウスの第２の群に、ベクターのみでトランスフェクトした細胞、あるいはクローンテール−４、クローンテール−１、またはクローン１１でトランスフェクトした細胞を注射した。これらのマウスを、上記と同じ様式でイメージ化した。４時間後、バックグラウンド活性のみが明白であった。２４時間後、ベクターでトランスフェクトした細胞由来の腫瘍は、まだ目に見えず、そしてクローン１１由来の腫瘍は、見ることが困難であった。比較において、クローンテール−４由来の腫瘍およびクローンテール−１由来の腫瘍は、明らかに目に見え、クローンテール−４由来の腫瘍は、クローンテール−１由来の腫瘍よりもより明白であった。従って、インビボでは、ＳＳＴＲ２Ａの部分を含む融合タンパク質を発現する細胞を非侵襲的にイメージ化することが可能である。
【００７２】
これらのマウスをまた屠殺し、そして体内分布について評価し、これによりイメージングの知見を確認した。群１（全長ＳＳＴＲ２Ａ融合タンパク質）のマウスと、群２（全長ＳＳＴＲ２Ａ融合タンパク質および欠失したＣ末端細胞質ドメイン）のマウスとの間の取り込みの比較において、より大きな放射性トレーサー取り込みが、クローン１１由来の腫瘍よりもクローンテール−１由来の腫瘍において見られたが；これらは、類似のレベルのレセプター発現およびリガンド結合を示す。実際、テール−１由来の腫瘍は、体内分布がクローン２１由来の腫瘍（これはより大きな発現を有する）に類似していた。さらに、より大きな体内分布は、クローン２１由来の腫瘍よりもテール−４由来の腫瘍において見られたが、これらは、類似の発現レベルおよびレセプター結合を示す。器官内の取り込みは、２つの実験で類似する。従って、細胞内Ｃ末端欠失は、特異的な１１１Ｉｎ−オクトレオチド局在を増大させると考えられる。これは、次いで、リガンドインターナリゼーションおよび／または保持の増加の可能性がある。従って、この方法は、遺伝子発現の正規化の間に、変異の比較を可能にする。さらに、データは、ＳＳＴＲ２全体が、インビボでの可視化に必要ではないことを実証する。多くの遺伝子移入ベクターにおいて目的の遺伝子の挿入のための空間が限定されるので、より小さなＳＳＴＲ変異体が所望される。
【００７３】
体内分布実験をまた、人に用いた放射性トレーサーの用量と類似の用量を用いて行った。この方法の強固さをさらに試験するために、最小の融合タンパク質発現を有する細胞を用いた。放射性トレーサーのより大きな用量を用いる場合、マウスにおける器官放射性トレーサー取り込みは、ヒトにおける臨床知見を模倣する。１ｇあたりの放射能は、腎臓で最も高く、次いで、肝臓、胃腸管、肺、そして脾臓が高かった。比較において、血液および筋肉の、１ｇあたりの取り込みは、極めて低かった。クローン１１由来の腫瘍は、ベクターのみで形質転換した細胞由来の腫瘍よりも、より多くの１ｇあたりの放射性トレーサーの取り込みを有していた。このデータは、融合タンパク質を用いる遺伝子移入が、ヒトにおいて現在用いられる１１１Ｉｎオクトレオチドの用量に従い得ることを意味する。
【００７４】
（考察）
得られたデータは、ＳＳＴＲ２遺伝子キメラの移入が、インビボまたはインビトロで検出され得ることを実証する。さらに、発現された融合タンパク質の異なるドメインが、それらの機能を保持することを見出した。発現したタンパク質は、そのアミノ末端に、膜局在のための５’Ｉｇκリーダー配列および抗ＨＡ抗体による検出のための血球凝集素Ａタグを含む。融合タンパク質のＳＳＴＲ２Ａ部分は、オクトレオチドを結合し続けることが見出された。
【００７５】
ソマトスタチンレセプターＣ末端融合タンパク質は、インビトロで研究されている（Ｒｏｔｈら、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：１１１−１１９（１９９７））。しかし、アミノ末端融合が、本発明のために選択された。なぜならば、オクトレオチドに対する結合ドメインは遠位にあり、膜貫通ドメイン３〜７の間のＳＳＴＲ２アミノ酸を主に含むことが予想されるからである（Ｌｉａｐａｋｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０３３１−２０３３９（１９９６）；Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２４６２１−２４６２６（１９９４）；Ｋａｕｐｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  １４：７２７−７３５（１９９５））。ＳＳＴＲ２Ａアミノ末端での膜局在シグナルは、融合により破壊されるが、新しい膜局在シグナルが、Ｉｇκリーダー配列により作成される。さらに、アミノ末端融合は、レセプターインターナリゼーションにあまり干渉しないようである。レセプターインターナリゼーションは、カルボキシ末端細胞内ドメインに関係する（Ｋｏｅｎｉｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３６：２９１−２９８）。カルボキシ末端に融合したベクター配列の発現を防ぐために、停止コドンを、ＳＳＴＲ２Ａの最後のコドンの後のＰＣＲリバースプライマーに導入した。
【００７６】
異種タンパク質の第２の部分（ＨＡドメイン）を、発現を確認する目的のために利用した。これに関して、ＥＬＩＳＡアッセイは、少数の細胞の迅速なスクリーニングを可能にし、それにより、多数の耐性クローンを増殖させるために通常必要とされる時間を節約する。さらに、初期スクリーニングを、放射能を利用しないで行った。再度、ＨＡドメインの利用の際に、免疫蛍光は、融合タンパク質を細胞膜に局在させた。このことは、機能的リーダー配列の存在を確認する。タンパク質およびタンパク質セグメントは、タグとして用いられ得る。タグ（例えば、ＨＡ、ｍｙｃ、（Ｈｉｓ）６および当該分野で公知の他のもの）を用いて、ＳＳＴＲレセプター融合タンパク質のアッセイを増強し得る。このタグを用いて、タンパク質発現を正規化し得、そして種々のＳＳＴＲ融合改変体の特徴付けを、個別にまたはまとめて可能にする。
【００７７】
タンパク質発現はまた、ウェスタンブロットにより検出され得る。発現したタンパク質は、全長ＳＳＴＲ２Ａ挿入物について７２，０００Ｄａおよび細胞内テールマイナス挿入物について７０，０００Ｄａの見かけの分子量を有する。これらの値は、ＳＳＴＲ２Ａについて以前に報告された分子量よりも小さく、そしてタンパク質成分のみについて予想した分子量よりも大きい。以前の研究は、野生型ＳＳＴＲ２がグリコシル化されることを示した。従って、分子量における矛盾は、レセプターの通常のグリコシル化が変化している、Ｉｇκ配列およびＨＡドメインに起因する可能性がある。ソマトスタチン−２８が、融合タンパク質を発現する細胞に対する１１１Ｉｎ−オクトレオチドの結合を阻害するので、このデータは、グリコシル化において推定した修飾が、リガンド結合に干渉しないことを意味する。
【００７８】
本明細書中で議論される実施例は、発現した融合タンパク質の３つの部分が、機能的であり、そしてインビトロ発現データが、インビボイメージングおよび体内分布データと相関することを実証する。細胞内カルボキシ末端は、ＳＳＴＲ２Ａをイメージングするために、またはインビトロもしくはインビボでの融合タンパク質を検出するために必要ではない。実際、インビボで、カルボキシ末端細胞内ドメインの欠失は、放射性トレーサー局在を増大させると考えられる。従って、データは、増加した特異的放射性薬品局在のために、レセプター変異体またはキメラレセプター変異体を作製することが可能であることを示唆する。この方法は、遺伝子発現のための正規化の間に、変異の比較を可能にする。インビボでのカルボキシ末端の欠失したレセプターの可視化は、この方法が、望ましい特性（例えば、減少したサイズの挿入物）を有する変異体の作製を可能にすることを実証する。さらに、動物におけるイメージングが、ヒトで用いた１１１Ｉｎ−オクトレオチドの用量に対して、１ｇあたりの基準で、類似する１１１Ｉｎ−オクトレオチドの用量で、有効に達成され得ることを見出した。従って、遺伝子移入（キメラ遺伝子移入を含む）の非侵襲的検出は、臨床的に実行可能であり得る。
【００７９】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、全体が本明細書中で参考として援用される。ここまで本発明を十分に記載してきてたが、本発明は、本発明の精神もしくは範囲、またはその任意の実施形態に影響することなく、広範かつ等価な範囲内の条件、パラメーターなどで実施され得ることが当業者に容易に理解される。
【００８０】
ソマトスタチンレセプターに関するヒトｍＲＮＡおよびラットｍＲＮＡについての登録番号は、以下のとおりである：ヒト：ＳＳＴＲ１＝ＮＭ＿００１０４９；ＳＳＴＲ２＝ＮＭ＿００１０５０；ＳＳＴＲ３＝ＮＭ＿００１０５１；ＳＳＴＲ４＝ＮＭ＿００１０５２；ＳＳＴＲ５＝ＮＭ＿００１０５３。ラット：ＳＳＴＲ１＝ＮＭ＿０１２７１９；ＳＳＴＲ２＝ＮＭ＿０１９３４８；ＳＳＴＲ４＝ＮＭ＿０１３０３６；ＳＳＴＲ５＝ＮＭ＿０１２８８２。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、本発明の例示的な融合タンパク質を作製する基本的な構造特徴を示す。示される特定の実施形態において、Ｉｇκドメインの後ろに赤血球凝集素Ａ（ＨＡ）第２のポリペプチドがあり、次いで、ソマトスタチン２型レセプター（その細胞質テイルあり、または細胞質テイルなしのいずれか）がある。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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