(57)【要約】本発明は、VEGF受容体のアンタゴニスト並びにに放射線、化学療法及び/又は追加の受容体アンタゴニストの組合わせの有効量で哺乳類を治療することを含む哺乳類の腫瘍の増殖を低下させるか又は阻害する方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニスト及び治療有効量の上皮増殖因子受容体(EGFR)のアンタゴニストをヒトに投与することを含む腫瘍の増殖阻害方法。
【請求項２】
前記腫瘍がVEGFRを過剰発現する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍が結腸の腫瘍である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍が肺の非小細胞癌(NSCLC)である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
前記VEGFRのアンタゴニストを静脈内投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記VEGFRのアンタゴニストを経口投与する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRのそのリガンドへの結合を阻害する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに結合する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記VEGFRのアンタゴニストが、fms様チロシンキナーゼ受容体(flt-1)VEGFR-1のアンタゴニストである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体がヒト抗体の定常領域を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体がマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有する可変領域及びヒト抗体の枠組み構造領域を含むヒト化抗体である、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がヒト抗体の可変領域を含むヒト抗体である、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに特異的な低分子を含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍がEGFRを過剰発現する、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記EGFRのアンタゴニストを静脈内投与する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記EGFRのアンタゴニストを経口投与する、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記EGFRのアンタゴニストが、EGFRのそのリガンドへの結合を阻害する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記EGFRのアンタゴニストがEGFRに結合する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記EGFRのアンタゴニストが、EGFRのATPへの結合を阻害する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記EGFRのアンタゴニストが、EGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体がヒト抗体の定常領域を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体がマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有する可変領域及びヒト抗体の枠組み構造領域を含むヒト化抗体である、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体がヒト抗体の可変領域を含むヒト抗体である、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記EGFRのアンタゴニストがEGFRに特異的な低分子を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
化学療法薬又は放射線をさらに投与することを含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
治療有効量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニスト及び放射線をヒトに投与することを含む腫瘍の増殖阻害方法。
【請求項３０】
前記腫瘍がVEGFRを過剰発現する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍が結腸の腫瘍である、請求項29又は30に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍が肺の非小細胞癌(NSCLC)である、請求項29又は30に記載の方法。
【請求項３３】
前記VEGFRのアンタゴニストを静脈内投与する、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記VEGFRのアンタゴニストを経口投与する、請求項29〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRのそのリガンドへの結合を阻害する、請求項29〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記VEGFのアンタゴニストがVEGFRに結合する、請求項29〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記VEGFRのアンタゴニストが、fms様チロシンキナーゼ受容体(flt-1)VEGFR-1のアンタゴニストである、請求項29〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項29〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体がヒト抗体の定常領域を含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体がマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有する可変領域及びヒト抗体の枠組み構造領域を含むヒト化抗体である、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体がヒト抗体の可変領域を含むヒト抗体である、請求項39に記載の方法。
【請求項４３】
前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに特異的な低分子を含む、請求項29〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
化学療法薬をさらに投与することを含む、請求項29〜43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
治療有効量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニスト及び化学療法薬をヒトに投与することを含む腫瘍の増殖阻害方法。
【請求項４６】
前記腫瘍がVEGFRを過剰発現する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
前記腫瘍が結腸の腫瘍である、請求項45又は46に記載の方法。
【請求項４８】
前記腫瘍が肺の非小細胞癌(NSCLC)である、請求項45又は46に記載の方法。
【請求項４９】
前記VEGFRの アンタゴニストを静脈内投与する、請求項45〜48 のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記VEGFRのアンタゴニストを経口投与する、請求項45〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRのそのリガンドへの結合を阻害する、請求項45〜50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに結合する、請求項45〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記VEGFRのアンタゴニストが、fms様チロシンキナーゼ受容体(flt-1)VEGFR-1のアンタゴニストである、請求項45〜52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項45〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体がヒト抗体の定常領域を含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体がマウス抗体の可変領域を含むキメラ抗体である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を有する可変領域及びヒト抗体の枠組み構造領域を含むヒト化抗体である、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体がヒト抗体の可変領域を含むヒト抗体である、請求項55に記載の方法。
【請求項５９】
前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに特異的な低分子を含む、請求項45〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記化学療法薬がVEGFRのアンタゴニストに結合されていない、請求項44〜59のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記化学療法薬が、シスプラチン、ドキソルビシン、タキソール、及びその組合わせから成る群から選択される、請求項44〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
治療有効量の上皮増殖因子受容体(EGFR)のアンタゴニスト及び治療有効量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニストを含む腫瘍増殖阻害用キット。
【請求項６３】
前記EGFRのアンタゴニストが、EGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項62に記載のキット。
【請求項６４】
前記EGFRのアンタゴニストがEGFRに特異的な低分子を含む、請求項62に記載のキット。
【請求項６５】
前記VEGFRのアンタゴニストが、VEGFRに特異的な抗体又はその機能均等物を含む、請求項62〜64のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６６】
前記VEGFRのアンタゴニストがVEGFRに特異的な低分子を含む、請求項62〜64のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６７】
化学療法薬及び放射線をさらに含む、請求項62〜66のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は米国特許願第10/091,300号の継続出願である。前記特許願第10/091,300号は2001年3月2日付けで出願され現在係属中の米国特許願第09/798,689号の一部継続出願である。前記特許願第09/798,689号は1999年9月22日付けで出願され現在係属中の米国特許願第09/401,163号の一部継続出願である。前記特許願第09/401,163号は1997年11月10日付けで出願され現在係属中の米国特許願第08/967,113号の継続出願である。前記特許願第08/967,113号は1996年9月3日付けで出願されその後米国特許第5,861,499号として発行された出願の一部継続出願である。前記米国特許第5,861,499号として発行された出願は1995年6月7日付けで出願されその後放棄された米国特許願第08/476,533号の一部継続出願である。前記特許願第08/476,533号は1994年10月20日付けで出願されその後米国特許第5,840,301号として発行された出願の継続出願である。前記米国特許第5,840,301号として発行された出願は1994年2月10日付けで出願されその後放棄された米国特許願第08/196,041号の一部継続出願である。上記先行出願の全開示内容は本願に援用するものである。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、血管内皮増殖因子(VEGF)受容体のアンタゴニストを化学療法薬、放射線及び/又は異なる増殖因子受容体のアンタゴニストと併用して腫瘍を治療する方法を目的とするものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
血管新生は、胎児及び成人の生物体の既存の血管から毛細血管が生成することであるが、腫瘍の増殖、生存及び転移の重要な要素であることが分かっている。上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子-α(TGF-α)、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、酸性及び塩基性の繊維芽細胞増殖因子(aFGF及びbFGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)並びに血管内皮増殖因子(VEGF)を含む増殖因子類とそれらの受容体は、腫瘍の血管新生に役割を演じていると考えられている(Klagsbrun ＆ D’Amore, Annual Rev. Physiol., 53:217-239(1991)参照）。これらの増殖因子が、それらの細胞表面受容体に結合するとその受容体の活性化が誘発され、その結果情報伝達経路が開始されそして改変されて細胞が増殖し分化する。VEGFすなわち内皮細胞特異的マイトジェンは、上記因子の中で、内皮細胞の増殖を特異的に促進することによって血管新生誘発因子として作用する点で異なっている。
【０００４】
VEGFは、2個の23kDのサブユニットからなるホモ二量体の糖タンパク質であり、そして血管透過性の強力な誘発因子であり内皮細胞の遊走と増殖の刺激物質でありかつ新たに形成された血管の重要な生存因子である。VEGFには4種の一量体のアイソフォームが存在するが、これはmRNAの選択的スプライシングからもたらされる。これらアイソフォームとしては、2種の膜結合型(VEGF206とVEGF189)及び2種の溶解型(VEGF165とVEGF121)がある。VEGF165が、胎盤を除くヒトの全組織中で、最も豊富なアイソフォームである。
【０００５】
VEGFは、脈管形成すなわち内皮前駆体(血管芽細胞)が原位置で分化することによって起こる新血管の新規発生の主要制御因子であるが、胚組織(Breier et al., Development(Camb.), 114:521(1992))、マクロファージ、創傷治癒中に増殖している上皮角化細胞(Brown  et al., J. Exp. Med.,176:1375(1992))で発現されそして炎症に関連する組織水腫の原因になることがある(Ferrara et al.、Endocr. Rev.,13:18(1992))。原位置でのハイブリッド形成の研究によって、多形性グリア芽細胞腫、血管芽細胞腫、中枢神経系新生物及びAIDS関連カポジー肉腫を含む多種類のヒト腫瘍系でVEGFが高度に発現されていることが立証されている(Plate et al., Nature 359:845-848(1992);Plate et al.,Cancer  Res. 53:5822-5827(1993);Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-159 (1993); Nakamura et al., AIDS Weekly, 13(1)(1992))。低酸素症が誘発する血管新生にも高レベルのVEGFが観察された(Shweiki et al.,Nature 359:843-845(1992))。
【０００６】
VEGFの生物学的応答はその高アフィニティー受容体を通じて伝達され、この受容体は、胚発生中(Millauer, Cell, 72:835-846(1993))及び腫瘍生成中に内皮細胞に選択的に発現される。VEGF受容体類(VEGFR類)は一般に、そのアミノ末端細胞外受容体のリガンド結合ドメインにいくつもの一般に5個又は7個の免疫グロブリン様ループを有することを特徴とするクラスIII 受容体タイプのチロシンキナーゼである(Kaipainen  et al., J. Exp. Med. 178:2077-2088(1993))。他の二つの領域としては、膜貫通領域、及び可変長の親水性インターキナーゼ配列の挿入部分で中断されているカルボキシ末端細胞内触媒ドメインであるいわゆるキナーゼ挿入ドメインがある(Terman et al., Oncogene, 6:1677-1683(1991))。VEGFR類としては、Shibuya et al., Oncogene, 5:519-524(1990)によって配列が決定されたfms-様チロシンキナーゼ受容体(flt-1)すなわちVEGFR-1； 1992年2月20日付けで出願されたPCT特許願公開第WO92/14248号及びTerman et al., Oncogene, 6:1677-1683(1991)に記載されかつMatthews  et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,88:9026-9030(1991)によって配列が決定されたキナーゼ挿入ドメイン含有受容体/胎児肝臓キナーゼ(KDR/flk-1)すなわちVEGFR-2があるが、他の受容体例えばニューロピリン-1及び-2もVEGFに結合する。他のチロシンキナーゼ受容体であるVEGFR-3(flt-4)は、VEGF同族体のVEGF-CとVEGF-Dに結合しリンパ管の発生に一層重要である。
【０００７】
高レベルのFlk-1が、グリオームが浸潤する内皮細胞によって発現される(Plate et al., Nature 359:845-848(1992))。Flk-1のレベルは、ヒトグリア芽細胞腫によって産生されるVEGFによって特異的にアップレギュレートされる(Plate et al., Cancer Res. 53:5822-5827(1993))。グリア芽細胞腫随伴内皮細胞(GAEC)に高レベルのflk-1が発現していることが見られるということは、Flk-1の転写産物は正常な脳内皮細胞には稀にしか検出できないので受容体の活性は恐らく腫瘍形成中に誘発されるということを示している。このアップレギュレーションは前記腫瘍の直近の血管内皮細胞に限られている。VEGFの活性を、中和性抗VEGFモノクローナル抗体(mAb)で遮断すると、ヌードマウス内のヒト腫瘍異種移植片の増殖が阻害されたが(Kim  et al., Nature 362:841-844(1993))、これはVEGFが腫瘍関連の血管新生に直接関わっていることを示している。
【０００８】
VEGFリガンドは腫瘍細胞内でアップレギュレートされそしてその受容体は腫瘍が浸潤した血管内皮細胞内でアップレギュレートされるが、VEGFリガンドとその受容体の発現は、血管新生と関連がない正常細胞内では少ない。それ故、かような正常細胞は、VEGFとその受容体の間の相互作用を遮断して血管新生を阻害しその結果腫瘍の増殖を阻害することによって悪影響を受けない。
【０００９】
本発明の目的はVEGF受容体のアンタゴニストを提供することである。本発明のさらなる目的は、かようなVEGF受容体のアンタゴニストを使用し特に、かようなVEGF受容体のアンタゴニストを放射線、化学療法又は他の受容体アンタゴニストと併用して、哺乳類の血管新生を阻害して腫瘍増殖を阻害するか又は減少させる方法を提供することである。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、VEGF受容体アンタゴニスト及び別の受容体アンタゴニストの組合わせの有効量を投与することによって哺乳類の腫瘍増殖を減少させるか又は阻害する方法を提供するものである。また本発明は、VEGF受容体のアンタゴニスト及び放射線の組合わせの有効量を投与することによって哺乳類の腫瘍増殖を減少させるか又は阻害する方法を提供するものである。さらに本発明は、VEGF受容体のアンタゴニスト及び科学療法薬の組合わせの有効量を投与することによって哺乳類の腫瘍増殖を減少させるか又は阻害する方法を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、VEGF受容体アンタゴニストを放射線、化学療法及び/又は追加の受容体アンタゴニストと併用して哺乳類の腫瘍増殖を減少させるか又は阻害する方法を提供するものである。
【００１２】
好ましい実施態様で、VEGF受容体アンタアゴストを、化学療法薬、放射線もしくは追加の受容体アンタゴニスト又はこれらの組合わせと併用して、ヒトの腫瘍を含む腫瘍を治療すると相乗作用がある。換言すれば、VEGF受容体アンタゴニストによる腫瘍増殖の阻害は、化学療法薬、放射線もしくは追加の受容体アンタゴニスト又はこれらの組合わせを併用すると予想以上に促進される。相乗作用は、例えば、VEGF受容体アンタアゴストと化学療法薬、放射線又は追加の受容体アンタゴニストとによる追加の治療効果から予想以上に大きい腫瘍増殖の阻害によって示すことができる。好ましくは、寛解がVEGF受容体アンタアゴストと化学療法薬、放射線又は追加の受容体アンタゴニストとの組合わせによる治療から予想されない場合に癌が寛解することによって相乗作用が証明される(実施例VIII参照)。
【００１３】
VEGF受容体のアンタゴニストは、化学療法又は放射線療法及びそれらの組合わせを開始する前、開始中又は開始した後に投与され、すなわち化学療法及び/又は放射線療法を開始する前と開始中、開始する前と開始後、開始中と開始後、又は開始する前と開始中と開始後に投与される。例えば、VEGF受容体アンタゴニストが抗体である場合、抗体は一般に、放射線療法及び/又は化学療法を開始する1〜30日前、好ましくは3〜20日前より好ましくは5〜12日前に投与される。
【００１４】
放射線
VEGF受容体のアンタゴニストと併用する放射線源は、治療される患者の外部又は外部にあってもよい。放射線源が患者の外部にある場合、その治療法は外部ビーム放射線療法(EBRT)として知られている。放射線源が患者の内部にある場合、その治療法は近距離照射治療法(BT)と呼称されている。
【００１５】
放射線は、この目的のために製造された標準の装置、例えばAECL Theraton及びVarian Clinacを使用する周知の標準方法にしたがって投与される。放射線の線量は、当該技術分野では周知のことであるが多数の因子によって左右される。このような因子としては、治療される器官、放射線の経路内に位置していて意図的ではなく悪影響を受けることがある健康な器官、放射線治療に対する患者の許容度及び治療を要する身体の領域がある。線量は、一般に1〜100Gyでありより詳しく述べると2〜80Gyである。いくつかの線量が報告されており、脊髄に対しては35Gyであり、腎臓に対しては15Gyであり、肝臓に対しては20Gyでありそして前立腺に対しては65〜80Gyである。しかし本発明はいかなる特定の線量にも限定されないと強調するもである。線量は、与えられた情況における上記因子を含む特定の因子にしたがって、治療医師が決定する。
【００１６】
外部の放射線源と患者への入射点との距離は、標的細胞を死滅させることと副作用を最小限にすることの間の許容できるバランスを示す距離である。一般に、外部放射線源は患者への入射点から70〜100cmの距離を置いた位置にある。
【００１７】
近距離照射治療法は一般に放射線源を患者の内部に配置して行われる。一般に、放射線源は治療される組織から約0〜3cmの距離をとって配置される。既知の方法としては組織内、空洞内及び表面の近距離照射治療法がある。放射性種は永久的に又は一時的に移植できる。永久移植体に使用されているいくつかの典型的な放射性原子としてはヨウ素-125とラドンがある。一時的移植体に使用されているいくつかの典型的な放射性原子としてはラジウム、セシウム-137及びイリジウム-192がある。近距離照射治療法で使用されているいくつかの追加の放射性原子としてはアメリシウム-241と金-198がる。
【００１８】
近距離照射治療法に使用する放射線量は、外部ビーム放射線治療法についてさきにのべたのと同じでもよい。外部ビーム放射線治療法の線量を決定する場合について先に述べた因子に加えて、使用される放射性原子の性質も近距離照射治療法の線量を決定する際に考慮する。
【００１９】
化学療法
化学療法薬には腫瘍の増殖を阻害するのに有効なすべての化学化合物が含まれている。
【００２０】
化学療法薬の投与は、非経口及び経腸の経路によって全身に各種の方法で達成できる。一実施態様では、VEGF受容体アンタゴニストと化学療法薬を別個の分子として投与する。別の実施態様では、VEGF受容体アンタゴニストは、例えば複合によって化学療法薬に結合される。
【００２１】
化学療法薬の例としては、アルキル化剤例えばナイトロジェンマスタード類、エチレンイミン化合物類及びスルホン酸アルキル類；代謝拮抗薬例えば葉酸、プリン又はピリミジンのアンタゴニスト；有糸分裂阻害剤例えばビンカ・アルカロイド及びポドフィロトキシンの誘導体；細胞毒性抗生物質；DNAの発現を損なうか又はDNAの発現を阻害する化合物がある。
【００２２】
さらに化学療法薬としては、本願で述べるような抗体、生体分子及び低（小）分子がある。
【００２３】
化学療法薬又は化学療法の特定例としては下記のものがある。すなわちシスプラチン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、メクロレタミン(ナイトロジェンマスタード)、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ダウノルビシン、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、5-フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテーレ)、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イフォスファミド、インターフェロンα、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プライカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プライカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、タキソール及びこれらの組合わせがある。
【００２４】
増殖因子受容体のアンタゴニスト
本発明に関連して使用できる(VEGF受容体のアンタゴニスト以外の)増殖因子受容体アンタゴニストには、増殖因子受容体リガンドによる増殖因子受容体の刺激作用を阻害するすべての物質が含まれている。かような刺激作用の阻害によって増殖因子受容体を発現する細胞の増殖が阻害される。
【００２５】
腫瘍形成に関与する増殖因子受容体のいくつかの例は、上皮増殖因子の受容体(EGFR)、血小板由来増殖因子の受容体(PDGFR)、インスリン様増殖因子の受容体(IGFR)、神経成長因子の受容体(NGFR)、及び線維芽細胞増殖因子の受容体(FGFR)である。
【００２６】
本発明で使用される増殖因子受容体のアンタゴニストは好ましくはEGFRのアンタゴニストである。本発明に関連するEGFRのアンタゴニストは、EGFRの活性化を阻害して、EGFRのチロシンキナーゼ活性を阻害し受容体の自己リン酸化及び各種のEGFRシグナル伝達経路に関与している他のタンパク質のリン酸化を防止する生体分子、小分子又はその外の物質である。EGFRの活性化を阻害するということは、EGFRの活性化を完全に防止するか又は停止する必要はなく低下させることを意味する。
【００２７】
さらに本発明で定義されるEGFR活性化の阻害は、EGFRアンタゴニストと受容体の相互作用でもたらされるEGFRの阻害を意味する。その相互作用は、EGFRアンタゴニストと受容体の十分な物理的又は化学的相互作用を意味しその結果チロシンキナーゼ活性が阻害される。かような化学的相互作用の例としては、EGFRアンタゴニストと受容体の間の会合又は結合を含み当該技術分野で知られておりそして共有結合、イオン結合、水素結合などがあることは当業者であれば分かるであろう。このことは、リガンドと相互に作用して活性化を阻害するEGFのアンタゴニストと異なっている。
【００２８】
他の増殖因子の場合、EGFRの活性化は、高レベルのリガンド、EGFR遺伝子の増幅、受容体の転写の増大、又は受容体の無秩序なシグナリングを起こす突然変異によって増大することがある。EGFRをコードする遺伝子が増幅されるとそのEGFRに結合するリガンドの数が増大しその結果細胞の増殖が一層刺激される。EGFRは遺伝子の増幅が無くても恐らくEGFRの転写、mRNAの翻訳又はそのタンパク質の安定性を増大する突然変異によって過剰発現されることもある。EGFRの突然変異体は、構成要素として活性チロシンキナーゼを有するグリオーム、肺の非小細胞癌、卵巣癌及び前立腺癌に確認されており、これは、これらの癌におけるEGFRの過剰発現よりむしろ高レベルのEGFRの活性に対する役割を示唆している(例えば、Pedersen et al., Ann. Oncol., 12(6);745-760(2001)参照)。タイプIII  EGFRの突然変異体はEGFRvIII 、de2-7 EGFR又はAEGFRという種々の名称があるがエキソン2-7がコードする細胞外リガンド結合ドメインの部分を欠いている(Wikstrand et al., Cancer Res., 55:3140-3148(1995)参照)。
【００２９】
本発明の一実施態様では、EGFRアンタゴニストはEGFRがそのリガンドに結合するのを阻害する。リガンドがEGFRの外部細胞外ドメインに結合すると、受容体の二量体化、EGFRの自己リン酸化、受容体内部の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、及びDNAの合成と細胞分裂の調節に関与する多数のシグナル伝達経路の開始を刺激する。EGFRに対するリガンドとしては、例えばEGF、TGF-α、アンフィレグリン、ヘパリン結合性EGF(HB-EGF)及びβレクルリン(betarecullulin)がある。BGFとTGF-αはEGFR仲介刺激をもたらす重要な内因性リガンドと考えられているが、TGF-αはより強力に血管新生を促進することが分かっている。
【００３０】
本発明の他の実施態様では、EGFRのアンタゴニストがEGFRに結合する。EGFRのアンタゴニストは、EGFRの細胞外の部分の外側に結合できる(この結合によってリガンドの結合は阻害できるかもしくは阻害できない)か又はチロシンキナーゼドメインの内部に結合できることは分かるであろう。EGFRに結合するEGFRアンタゴニストの例としては、限定されないが、EGFRに対し特異的な抗体(及びその機能均等物)などの生体分子並びにEGFRの細胞質ドメインに直接作用する例えば小分子の合成キナーゼ阻害剤がある。
【００３１】
本発明のEGFRアンタゴニストは、好ましくは生体分子であり、より好ましくはEGFRに対し特異的な抗体か又はその機能均等物である。本発明に有用な抗体についての説明は、「抗体」という標題の章にみられる。さらに、抗体の結合に続いて、その    EGFR−抗体複合体は、好ましくは細胞内に取り込まれて分解され、細胞による受容体の再使用が防止される。
【００３２】
公知の生体分子のEGFRアンタゴニストは、EGFRに対し特異的なキメラ(ヒト/マウス)モノクローナル抗体であるERBITUX(商標)(IMC-C225)である(例えば、米国特許第4,943,533号(Mendelsohn et al.)及び同第6,217,866号(Schlessinger et al.)；米国特許願第08/973,065号(Goldstein et al.)及び同第09/635,974号(Teufel)；PCT特許願公開第WO99/60023号(Waksal et al.)及び同第WO00/69459号(Waksal)参照)。前記モノクローナル抗体のERBITUX(商標)はEGFRに特異的に結合してリガンド例えばEGFが結合するのを遮断する。この遮断は、EGFR活性化の作用を阻害することによって、腫瘍の浸潤、転移、細胞修復及び血管新生を阻害する。さらに、又は代わりにモノクローナル抗体のERBITUX(商標)は、受容体-抗体の複合体の細胞内取り込みを促進して、そのリガンドによる受容体のさらなる刺激又は他の機構を防止することができる。
【００３３】
生体分子EGFRアンタゴニストの他の例は、EGFRに対し特異的な完全ヒトIgG2モノクローナル抗体のABX-EGFである。ABX-EGFはEGFRに高い特異性で結合してEGFRがそのリガンドのEGFとTGF-αの両方に結合するのを遮断する(例えば、米国カリフォルニア州サンフランシスコで2001年5月12〜15日に開催されたASCOの第37回年次総会に提出されたFiglin et al.のAbstract 1102参照)。クローンE7.63としてすでに知られている ABX-EGFの配列と特性決定は、米国特許第6,235,883号(Abgenix, Inc.)の28欄62行〜29欄36行と図29〜34に開示されている(Yang et al.,Critical Rev. Oncol./Hematol.,  38(1):17-23,2001参照)。
【００３４】
代わりのしかし好まし実施態様では、本発明のEGFRアンタゴニストは小分子のチロシンキナーゼ阻害剤である。小分子については「小分子」という標題の章に説明してある。多種類の小分子が、EGFRを阻害するのに有効であると報告されている。
【００３５】
例えば、Spada et al.の米国特許第5,656,655号はEGFRを阻害するスチリル基で置換されたヘテロアリール化合物を開示している。そのヘテロアリール基は1個又は2個のヘテロ原子を有する単環リングであるか又は1〜約4個のヘテロ原子を有する二環リングであり、その化合物は任意に一置換されているか又は多置換されている。上記米国特許第5,656,655号に開示されている化合物は本願に援用するものである。
【００３６】
Spada et al.の米国特許第5,646,153号は、EGFRを阻害するビス 単環式及び/又は二環式アリール、ヘテロアリール、炭素環式及びヘテロ炭素環式の化合物を開示している。米国特許第5,646,153号が開示している化合物は本願に援用するものである。
【００３７】
Bridges et al.の米国特許第5,679,683号は、EGFRを阻害する三環式ピリミジン化合物を開示している。これらの化合物は縮合複素環ピリミジン誘導体であり、3欄35行〜5欄6行に記載されている。上記3欄35行〜5欄6行のこれら化合物に関する記載事項は本願に援用するものである。
【００３８】
Barkerの米国特許第5,616,582号は、受容体チロシンキナーゼ阻害活性を有するキナゾリン誘導体を開示している。米国特許第5,616,582号に開示されている化合物は本願に援用するものである。
【００３９】
Fly et al., Science, 265:1093-1095(1994)はEGFRを阻害する構造を有する化合物を開示している。その構造は図1に示されている。Fly et al.の論文の図1に示されている化合物は本願に援用するものである。
【００４０】
Osherov et al., J. Biol. Chem.,268(15):11,134-142(1993)は、EGFR/HER1及びHER2を阻害するチルホスチン(tyrphostin)類を開示している。Osherov et al.の論文に開示されている化合物及び特に表Ｉ、II、III 及びIVに示されている化合物は本願に援用するものである。
【００４１】
Levitzki et al.の米国特許第5,196,446号は、EGFRを阻害するヘテロアリールエテンジイル化合物又はヘテロアリールエテンジイルアリール化合物を開示している。米国特許第5,196,446号の2欄42行〜3欄40行に開示されている化合物は本願に援用するものである。
【００４２】
Panek et al., J, Pharma. Exp, Thra.,1433-1444(1997)は、EGFR、PDGFR及びFGFRの受容体ファミリーを阻害するPD166285として確認された化合物を開示している。PD166285は、1436頁の図1に示されている構造を有する6-(2,6-ジクロロフェニル)-2-(4-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニルアミノ)-8-メチル-8H-ピリド(2,3-d)ピリミジン-7-オンと同定されている。Panek et al.の論文の1436頁の図1に記載されている化合物は本願に援用するものである。
【００４３】
小分子のEGFRアンタゴニストの一例はIRESSA(商標)(ZD1939)であり、これは、ATP-ミメティク(ATP-mimetic)として機能しEGFRを阻害するキノザリン誘導体である(米国特許第5,616,582号(Zeneca Limited)；ＰＣＴ特許願公開第WO96/33980号(Zeneca Limited)の4頁；米国カリフォルニア州サンフランシスコで2001年5月12〜15日に開催されたASCOの第37回年次総会に提出されたRowinsky et al.のAbstract 5； 米国カリフォルニア州サンフランシスコで開催されたASCOの第37回年次総会に提出されたAnido et al.のAbstract
1712参照）。
【００４４】
TARCEVA(商標)は小分子EGFRアンタゴニストの別例である。TARCEVA(商標)(OSI-774)は、4-置換フェニルアミノキノザリンの誘導体[6,7-ビス(2-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-4-イル]-(3-エチニル-フェニル)アミン塩酸]のEGFR阻害剤であり、PCT特許願公開第WO96/30347号(Pfizer Inc.)の例えば2頁12行〜4頁34行及び19頁14〜17行に記載されている(Moyer  et al.,Cancer Res.,57:4838-  4848 (1997)；Pollack et al., J. Pharmacol.,291:739-748(1999)も参照)。TARCEVA(商標)は、ｐ27-仲介細胞周期の停止をもたらすEGFR及びEGFRの下流のPI3/Akt及びMAP(マイトジェン活性化タンパク質)キナーゼシグナル伝達経路のリン酸化の阻害を行うことによって機能する(米国カリフォルニア州サンフランシスコで2001年5月12〜15日に開催されたASCOの第37回年次総会に提出されたHidalgo et al.のAbstract 281参照)。
【００４５】
EGFRを阻害する多くの他の小分子が知られている。小分子のEGFRアンタゴニストのいくつかの例が、PCT特許願公開第WO96/116051号、同第WO96/30347号、同第WO96/33980号、同第WO97/27199号(Zeneca Limited)、同第WO97/30034号(Zeneca Limited)、同第WO97/42187号(Zeneca Limited)、同第WO97/49688号(Pfizer Inc.)、同第WO98/33798号(Warner Lambert Company)、同第WO00/18761号(American Cyanamid Company)及び同第WO00/31048号(Warner Lambert Company)に記載されている。小分子のEGFRアンタゴニストの具体例としては、チロシンキナーゼ類特にEGFRの阻害剤のキノザリン(N-[4-(3-クロロ-4-フルオロ-フェニルアミノ)-7-(3-モルホルン-4-イル-プロポキシ)-キナゾリン-6-イル]-アクリルアミド)であるC1-1033(PCT特許願公開第WO00/31048号(Warner Lambert Company)の8頁22〜26行に記載されている)；EGFRの阻害剤のピロロピリミジンであるPKI166(PCT特許願公開第WO97/27199号(Novartis AG)の10〜12頁に記載されている)；EGFRとHER2の阻害剤であるGW2016；及びEkB569がある。
【００４６】
追加のEGFRアンタゴニストは周知の方法を使って容易に確認できる。本発明のEGFRアンタゴニストは、一般にリン酸化の事象を含むEGFRのチロシンキナーゼ活性を阻害する。したがってリン酸化反応検定法が、本発明に関連して有用なアンタゴニストを確認するのに有用である。いくつかのチロシンキナーゼ活性検定法がPanek et al.(1997)及びBatley et al.,Life Sci.,62:143-150(1998)に記載されている。さらにEGFRの発現を検定する特異的な方法を利用できる。これらの方法としては、タンパク質の発現を検出する免疫組織化学法(IHC)、遺伝子の増幅を検定する蛍光in situ ハイブリッド形成法(FISH)、競合放射性リガンド結合検定法、固体マトリックスブロッティング法例えばノーザンブロット法及びサザーンブロット法、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応法(RT-PCR)及びELISA法がある(例えば、Grandis et al., Cancer,78:1284-1292(1996)；Shimizu et al.,Japan J. Cancer Res.,85:567-571 (1994)；Sauter et al., Am. J. Path.,148:1047-1053(1996)；Collins, Glia, 15: 289- 296(1995)；Radinsky et al., Clin. Cancer Res.,1:19-31(1995)；Petrides et al.,Cancer Res.,50:3934-3939(1990)；Hoffmann et al., Anticancer Res.,17: 4419- 4426  (1997)；Wikstrand et al.,Cancer Res.,55:3140-3148(1995)参照)。
【００４７】
VEGF受容体のアンタゴニスト
一実施態様で、VEGF受容体のアンタゴニストが、VEGF受容体の細胞外ドメインのエピトープに特異的に結合する。そのVEGF受容体の細胞外ドメインはリガンド結合ドメインである。そのリガンド結合ドメインは前記受容体の一方の末端に見られるが、通常アミノ末端に見られる。
【００４８】
VEGF受容体のいくつかの例としては、文献ではflt-1(VEGFR-1)、KDR及びflk-1(VEGFR-2)と呼称されているタンパク質チロシンキナーゼ受容体がある。状況によって特に断らない限り又は明確に示唆しない限り、本明細書はVEGF受容体の通例の文献命名法に従っている。KDR(VEGFR-2)は、MWが180kDのヒト型のVEGF受容体と呼称されている(上記Terman et al.の文献)。flk-1(VEGFR-2)はKDRのマウス同族体と呼称されている(上記Matthews et al.の文献)。flt-1(VEGFR-1)は異なる形態のVEGF受容体と呼称されているがKDR/flk-1(VEGFR-2)受容体に関連している(上記Shibuya et al.の文献参照)。
【００４９】
その外のVEGF受容体としては、VEGFで架橋標識化できるもの又はKDRで同時に免疫沈降させることができるもの(VEGFR-2)がある。これらVEGF受容体のいくつかの既知の形態のものは、分子量が約170KD、150KD、130-135KD、120-125KD及び85KDである(例えば、Quinn et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 90:7533-7537(1993)；Scher et al.,J. Biol. Chem.,271:5861-5767(1996)参照)。
【００５０】
VEGF受容体は通常、内皮細胞などの細胞に結合する。VEGF受容体は腫瘍細胞などの非内皮細胞にも結合する。あるいはVEGF受容体は好ましくは可溶性型で細胞から遊離していることもある。
【００５１】
本発明のアンタゴニストはVEGF受容体を中和する。本明細書では、受容体を中和するということは、シグナルを伝達するその受容体固有のキナーゼ活性を不活性化することを意味する。VEGF受容体の中和を検定する信頼性のある検定法は受容体のリン酸化の阻害を検定する方法である。
【００５２】
本発明はVEGF受容体中和の特定の機構に限定されない。本願が出願された時点では、ＶＥＧＦ受容体の抗体による中和の機構は十分に理解されていなかったので、一つのアンタゴニストがたどる機構がもう一つのアンタゴニストのたどる機構と必ずしも同じでない。可能性があるいくつかの機構としては、VEGFリガンドがVEGF受容体の細胞外結合ドメインに結合するのを防止する機構及び受容体が二量体化又はオリゴマー化するのを防止する機構がある。しかし他の機構を除外できない。
【００５３】
本発明に関連するVEGF受容体(すなわちVEGFR)のアンタゴニストは、受容体のVEGFRサブファミリーを阻害する生体分子、小分子又は他の物質である。受容体のVEGFRサブファミリーの活性化の阻害とはVEGFRの活性化が低下することを意味する。すなわちこの活性化を防止するのにVEGFRの活性化を完全に停止する必要はない。さらに、本発明で定義されるVEGFR活性化の阻害は、VEGFRアンタゴニストとVEGFRの相互作用によって行われるVEGFRアンタゴニストの阻害を意味する。会合は、受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害するVEGFRアンタゴニストとVEGFRの間の十分な物理的又は化学的相互作用を意味する。会合又は結合を含むこのような化学的相互作用の例は当該技術分野で知られており、共有結合、イオン結合、水素結合などがあることは、当業者であれば分かっているであろう。したがって、本発明のVEGFRアンタゴニストは受容体のチロシンキナーゼ活性を阻害し、その結果、受容体の自己リン酸化及びVEGFRのシグナリング経路に関与ている他の各種タンパク質のリン酸化が阻害される。脈管形成又は血管新生に関与しているこのような経路としては、下記のホスホリパーゼCγ(PLCγ)経路、又はホスファチジルイノシトール3’キナーゼ(PI3-K)/Aktとマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)の経路がある(例えばLarrivee et al., Int’l  J. Mol. Med.,5:  447-456 (2000)参照)。
【００５４】
受容体のVEGFRサブファミリーは、細胞外ドメイン内の7個の免疫グロブリン様ループ、単一の膜貫通領域及び細胞内領域の分割されたチロシンキナーゼドメイン(クラスIII 受容体チロシンキナーゼ)が存在していることを特徴としている。受容体のVEGFRサブファミリーの既知のメンバーがいくつかあり、その例としてはVEGFR-1、VEGFR-2及びVEGFR-3がある。KDR(VEGFR-2)が内皮細胞の増殖、遊走、分化、管生成、血管の透過性の増大及び血管の完全性の維持をもたらす主なVEGFシグナル伝達トランスデューサーである。VEGFR-1はキナーゼ活性がはるかに弱いのでVEGF-によって刺激されたときマイトジェン応答を発生できないがKDR(VEGFR-2)の約10倍の親和力でVEGFに結合する。VEGFR-1は、VEGFと血小板増殖因子(PIGF)が誘発する単球とマクロファージの遊走及び組織因子の産生にも関与している。
【００５５】
上記EGFRの場合のように、VEGFRの活性化は、高レベルのリガンド、VEGFR遺伝子の増幅、受容体の転写の増大又は無秩序な受容体シグナリングを起こす突然変異によって増大する。
【００５６】
本発明の一実施態様で、VEGFRのアンタゴニストは、VEGFRのそのリガンドに対する結合を阻害する。リガンドがVEGFRの外部の細胞外ドメインに結合すると、受容体の二量体化、VEGFRの自己リン酸化、受容体の内部の細胞質チロシンキナーゼドメインの活性化、及び脈管形成及び血管新生の調節に関与している多数のシグナル伝達経路の開始を刺激する。
【００５７】
VEGFRに対するリガンドとしては、VEGFとその同族体のP1GF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及びVEGF-Eがある。例えばP1GFはVEGFR-1にだけ結合する二量体の分泌される因子であるが、絨毛の栄養膜細胞層、合胞体栄養細胞層及び絨毛外の栄養膜によって大量に産生され、VEGFに近いアミノ酸相同性を有している。ヒトには三つのアイソフォームP1GF-1、P1GF-2及びP1GF-3が存在している。P1GF不全マウスによる研究は、この増殖因子がそれ自体血管新生に関与していないが病的状態ではVEGFの血管形成作用と透過作用を特異的に調節することを立証している。またVEGF-Dは、VEGFファミリーの他のメンバーには見られないN末端とC末端の延長が存在することからVEGF-Cとの類縁性が高い。ヒトの成人の組織において、VEGF-D mRNAは心臓、肺、骨格筋、結腸及び小腸に最も豊富に存在している。VEGF-D受容体の特異性を分析した結果、VEGF-DはVEGFR-2(Flk1)とVEGFR-3(Flt4)の両者のリガンドであるのでこれらの受容体を活性化できるが、VEGF-DはVEGFR-1に結合しないことが明らかになった。さらにVEGF-Dは内皮細胞のマイトジェンである。
【００５８】
本発明の他の実施例で、VEGFRアンタゴニストはVEGFRと結合する。VEGFRアンタゴニストは、リガンドの結合を阻害するかもしくは阻害しないVEGFRの細胞外部分の外側に結合するか又はチロシンキナーゼドメインの内部に結合すると解すべきである。VEGFRに結合するVEGFRアンタゴニストの例としては、限定されないが、生体分子例えば受容体リボザイム及びVEGFRに対して特異的な抗体(又はそれらの機能均等物)並びにVEGFRの細胞質ドメインに直接作用する合成のキナーゼ阻害剤例えば小分子がある。本発明のVEGFRアンタゴニストは、好ましくは生体分子であり、より好ましくはVEGFRに対して特異的な抗体又はその機能均等物であり、これらについては以下により詳細に説明する。あるいは、本発明のVEGFRアンタゴニストは小分子のキナーゼ阻害剤であり、これについては以下に詳細に説明する。
【００５９】
好ましい一実施態様で、VEGF受容体のアンタゴニストはVEGFR-1に特異的に結合する。特に好ましいのは、VEGFR-1の細胞外ドメインに結合してそのリガンドのVEGFとP1GFの一方もしくは両者が結合するのを阻害し及び/又はVEGFが誘発するかもしくはP1GFが誘発するVEGFR-1の活性化を中和する抗原結合性タンパク質である。例えば、mAb 6.12は、可溶性で細胞表面で発現されるVEGFR-1に結合するscFvである。scFv 6.12はマウスのモノクローナル抗体mAb 6.12のVLとVHのドメインを含んでいる。mAb 6.12を産生するハイブリドーマ細胞系はATCC番号PTA-3344として寄託されている。その寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定及び同条約の規則に基づいてなされた。この条約は、生存培養物を寄託日から30年間保管することを保証する。その微生物は、ブダペスト条約の条項に基づき出願人とATCCの合意を条件としてATCCによって入手できるようにされ、関連する米国特許の発行に拘束されること無く入手できるように保証されている。寄託された菌株が入手できることは、政府当局が特許法に基づいて与えた権利を犯して発明を実施する許可証とみなすべきではない。
【００６０】
他の好ましい抗体は、諸実施例に記載されているが、具体的に述べると実施例XII、XIII 及びXIV並びに配列番号：1〜83に記載されている。さらにこれら好ましいくつかのVEGFR抗体のアンタゴニストはLu et al., Int’l J. Cancer, 97: 393-399 (2002)にも記載されている。
【００６１】
また、VEGFR-2抗体を産生する各種のハイブリドーマも存在している。例えば、ラット抗マウスVEGFE-2モノクローナル抗体(DC101)を産生するハイブリドーマ細胞系はATCC HB 11534として寄託し、マウス抗マウスVEGFE-2モノクローナル抗体mAb 25を産生するハイブリドーマ細胞系(M25.18A1)はATCC HB 12152として寄託し、マウス抗マウスVEGFE-2モノクローナル抗体mAb 73を産生すハイブリドーマ細胞系(M73.24)はATCC HB 12153として寄託した。
【００６２】
さらに、抗VEGFR-1抗体を産生する各種のハイブリドーマが存在し、これらハイブリドーマとしては、限定されないが、PCT特許願公開第WO98/22616号、同第WO99/59636号、オーストラリアで受け付けられた特許願第AU 1998 50666B2号及びカナダ特許願第CA 2328893号に開示されているハイブリドーマのKM1730(FERM BP-5697として寄託)、KM1731(FERM BP-5718として寄託)、KM173２(FERM BP-5698として寄託)、KM1748(FERM BP-5699として寄託)、KM1750(FERM BP-5700として寄託)がある。
【００６３】
多くの他のVEGFRアンタゴニストが当該技術分野で知られている。VEGFRアンタゴニストのいくつかの例が、米国特許願第07/813,593号、同第07/906,397号、同第07/946,507号、同第07/977,451号、同第08/055,269号、同第08/252.517号、同第08/601,891号、同第09/021,324号、同第09/208,786号及び同第09/919,408号(すべてLemischka et al.の出願)；米国特許第5,840,301号(Rockwell et al.)；米国特許願第08/706,804号、同第08/866,969号、同第08/967,113号、同第09/047,807号、同第09/401,163号及び同第09/768,689号(すべてRockwellの特許願)；米国特許願第09/540,770号(Witte et al.)；並びにPCT特許願第US01/06966号(Liao et al.)に記載されている。米国特許第5,861,301号(Terman et al.)、Terman et al.,Oncogene 6:1677-1683(1991年9月)、PCT特許願公開第WO94/10202号(Ferrara et al.)及び同第WO95/21865号(Ludwig)はVEGFRのアンタゴニスト、特に抗VEGFR-2抗体を開示している。さらにPCT特許願第US95/01678号(協和発酵)は抗VEGFR-2抗体を開示している。抗VEGFR抗体類は米国特許願第09/976,787号(Zhue et al.)にも記載されている。米国特許第6,177,401号(Ullrich et al.)、同第5,712,395号(App et al.)及び同第6,981.569号(App et al.)は有機分子のVEGFRアンタゴニストを記載している。さらに、KDR(VEGFR-2)とVEGFR-1に対する2種の抗原結合特異性すなわち抗原結合性部位を有する抗体である二重特異性抗体(BsAb)が知られている(例えば米国特許願第09/865,198号(Zhu et al.)、同第60/301,299号(Zhu)参照)。
【００６４】
Henneqin et al.は、J. Med. Chem.42,5369-5389(1999)に、VEGF受容体アンタゴニストとして有用である特定のキナゾリン類、キノリン類及びシンノリン類を開示している(Annie et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human Retrovirology 17,A41(1998)参照)。 Henneqin et al.の論文に開示されているVEGF受容体アンタゴニストは本願に援用するものである。
【００６５】
さらにApp et al.(米国特許第5,849,742号)は、チロシンキナーゼ阻害剤として作用するキナゾリン、キノキシリン、置換アニリン、イソオキサゾール類、アクリロニトリル及びフェニルアクリロニトリル化合物の小分子誘導体を開示している。Henneqin et al.、Annie et al.及びApp et al.が記載いている小分子はVEGF受容体アンタゴニストとして本発明に含まれている。
【００６６】
さらにVEGFRアンタゴニストを確認する検定法は当該技術分野ではよく知られているので、本発明に使用するのに適切な別のアンタゴニストは容易に識別できる。本発明のVEGFRアンタゴニストは、一般にリン酸化反応を含むVEGFRのチロシンキナーゼ活性を阻害する。したがってリン酸化反応の検定法は、本発明に関連するVEGFRアンタゴニストを確認するのに有用である。いくつかのチロシンキナーゼ活性の検定法が、Panek et al.,J. Pharmacol. Exp. Thera.283:1433-1444(1997)及びBatley et al.,Life Sci.,62:143-150(1998)に記載されている。さらに、VEGFRの発現を検出する特異的な方法を利用できる。
【００６７】
抗体
本発明の抗体は当該技術分野で知られている方法で製造できる。これらの方法としては、Kohler and Milstein, Nature,256:495-497(1975)；Burdon et al.,編集「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」Volume 13(Elsevier Science Publishers,Amusterdam(1985))におけるCampbellの論文「Monoclonal Antibody Technology,The Production and Characteriization of Rodent and Human Hybridomas」及びHuse et al., Science, 246:1275 -1281 (1989)に記載の組換えDNA法に説明されている免疫学的方法がある。
【００６８】
本発明の抗体は、その抗体が全抗体と同じ結合特性を持っているか又は全抗体に匹敵する結合特性を持っていれば、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体又は他の適切な形態の抗体例えば抗体のフラグメントもしくは誘導体、一本鎖抗体(scFv)、又は抗体の合成同族体であればよい。用語の抗体ドメイン、抗体領域及び抗体フラグメントは本願で使用される場合、特に断らない限り又は前後関係から明らかであれば当該技術分野でよく知られている標準の定義が与えられる(例えば、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology,W.B.Saunders Company,Philadelphia,PA(1991)参照)。本発明の抗体はモノクローナル抗体が好ましい。
【００６９】
抗体のフラグメントは全抗体を切断するか又はフラグメントをコードするDNAを発現させることによって製造できる。抗体のフラグメントは、Lamoyi et al.,J.Immunol.Methods,56:235-243(1983)及びParham,J.Immunol,131:2895 -2902 (1983)に記載の方法で製造できる。このようなフラグメントはFabフラグメント又はF(ab’)2フラグメントの一方又は両者を含んでいてもよい。このようなフラグメントは、一本鎖フラグメントの可変領域の抗体すなわちscFv、ジボディー(dibody)又は他の抗体フラグメントを含んでいてもよい。このような機能均等物の製造方法は、PCT特許願公開第WO93/21319号、ヨーロッパ特許願第239,400号、PCT特許願公開第WO89/09622号、ヨーロッパ特許願第338,745号及びヨーロッパ特許願第EP332,424号に開示されている。
【００７０】
一本鎖抗体(scFv)は、相互連結リンカーあり又は無しで軽鎖の可変領域に連結した抗体の重鎖の可変領域からなるポリペプチドである。したがってscFvは全抗体の結合性部位を含んでいる。これらの連鎖は細菌内又は真核細胞内で産生される。一本鎖抗体の一例はp1C11である。P1C11はVEGF―KDR(VEGF―VEGFR-2)相互作用を遮断しかつVEGFが刺激する受容体のリン酸化及びHUVECの有糸分裂誘発を阻害することが分かった(後記実施例IX参照)。このscFvは、可溶性KDR(VEGFR-2)及びHUVECの細胞表面に発現されたKDR(VEGFR-2)の両者に結合する。p1C11の配列は配列番号：21として示してある。上記一本鎖抗体は、当該技術分野で知られている方法でキメラ化又はヒト化された抗体にすることができる(例えば後記実施例IX-3参照)。キメラ化scFvの一例はキメラ化p1C11すなわちc-p1C11である。
【００７１】
好ましくは抗体フラグメントは全抗体のすべての相補性決定領域(CDR)6個を含有しているが、含有している上記領域の数が全数より少ない例えば3個、4個又は5個のCDRを含有するフラグメントも機能できる。その抗体フラグメントが短すぎて免疫原性が得られない場合は、担体分子に複合させることができる。いくつかの適切な担体分子としてはキーホールリンペットヘモシアニン及びうし血清アルブミンがある。複合は当該技術分野で知られている方法で実施できる。
【００７２】
本発明の抗体は、結合特性が、直接突然変異、親和性成熟法、ファージジスプレイ又は連鎖シャフリング(chain shuffling)によって改善された抗体も含んでいる。親和性と特異性は、CDRを変異させ次いで所望の特性を有する抗原結合部位を求めてスクリーニングすることによって修正又は改善できる(例えば、Yang et al.,J. Mol. Bio.,254:392-403(1995)参照)。CDRは各種の方法で変異させることができる。一つの方法は、個々の残留物又は残留物の混合物を無作為化して、別様に同一の抗原結合性部位の集団において20種類のアミノ酸がすべて特定の位置に見られるようにする方法である。あるいは、変異導入型PCR法で、突然変異をCDR残留物の領域に誘発させる(例えばHawkins et al.,J. Mol.Bio.,226:889-896(1992)参照）。重鎖可変領域と軽鎖可変領域の遺伝子を含有するファージ展示ベクターを変異誘発菌株のイー・コリ(E.coli)中に増殖させる(例えばLow et al.,J. Mol. Bio.,250:359-368(1996)参照)。これらの突然変異誘発法は当業者に知られている多くの方法を例証している。
【００７３】
本発明の抗体は、一つの種例えばマウスの抗体の可変領域及び異なる種例えばヒトの抗体の定常領域を有するキメラ抗体でもよい。あるいは本発明の抗体は、一つの種例えばマウス由来の抗体の超可変領域もしくは相補性決定領域(CDR)及びヒト抗体の枠組み構造可変領域と定常領域を有するヒト化抗体でも好い。またあるいは本発明の抗体は、ヒト抗体の定常領域と可変領域の両者を有するヒト抗体でもよい。
【００７４】
抗体、特にモノクローナル抗体は当該技術分野で公知の方法で製造できる。抗体製造法の例としては、限定されないが、ハイブリドーマ細胞内で製造する方法及び哺乳類の細胞を受容体アンタゴニストをコードするDNAで形質転換する方法がある。これらの方法は、Kohler and Milstein, Nature,256:495-497(1975)；Burdon et al.,編集「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology」Volume 13(Elsevier Science Publishers,Amusterdam(1985))におけるCampbellの論文「Monoclonal Antibody Technology,The Production and Characteriization of Rodent and Human Hybridomas」及びHuse et al.,Science,246:1275-1281 (1989)に記載の組換えDNA法に説明されている免疫学的方法を含む各種の刊行物に記載されている。
【００７５】
抗体の均等物も当該技術分野で知られている方法で製造される。例えば、抗体のフラグメントは全抗体から酵素で製造できる。抗体の均等物は、その均等物をコードするDNAから製造することが好ましい。抗体のフラグメントをコードするDNAは、全長の抗体をコードするDNAの所望の部分以外のすべてを欠失させることによって製造できる。キメラ化抗体をコードするDNAは、対応するヒト抗体の領域に実質的にもしくは排他的に由来するヒトの定常領域をコードするDNA及びヒト以外の哺乳類の可変領域の配列に実質的にもしくは排他的に由来する可変領域をコードするDNAを組換えることによって製造できる。ヒト化抗体をコードするDNAは、対応するヒト抗体の領域に実質的にもしくは排他的に由来する相補性決定領域(CDR)以外の定常領域と可変領域をコードするDNA及びヒト以外の哺乳類に実質的にもしくは排他的に由来するCDRをコードするDNAを組換えることによって製造できる。
【００７６】
抗体のフラグメントをコードする適切なDNA分子源としては、全長の抗体を発現するハイブリドーマなどの細胞がある。これらのフラグメントは、それ自体抗体の均等物として使用できるし又は上記のように均等物に組み換えることができる。この章でのべるDNAの欠失と組換えは、標題「抗体の機能均等物」の章で先に列挙した公開特許願に記載の方法及び/又は以下に述べるような他の標準の組換えDNA法などの既知の方法で実施できる。
【００７７】
本発明の、ベクターを形質転換し受容体アンタゴニストを発現させるための好ましい宿主細胞は、COS-7細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞及びリンパ腫、骨髄腫もしくはハイブリドーマの細胞などのリンパ系の細胞系などの哺乳類の細胞である。酵母などの他の真核細胞を代わりに使用できる。例えば、マウス胎仔の肝臓ストローマ細胞系2018は、APtag―flk-1融合タンパク質とAPtag―flk-2融合タンパク質に結合しすなわちVEGFR-2及びflk-2  (ATCC,Manassas,VA,CRL 10907)のリガンドを含有し、ヒト胎児脾臓細胞系のFsp 62891はflk-2のリガンド(ATCC CRL 10907)を含有し、そしてヒト胎児胸腺ストローマ細胞系のFthy 62891はVEGFR-2のリガンド(ATCC CRL 10936)を含有している。
【００７８】
形質転換された宿主細胞は、当該技術分野で既知の方法にて、同化可能な炭素源(グルコース又はラクトースなどの炭水化物)、窒素（アミノ酸、ペプチド、タンパク質又はそれらの分解生成物例えばペプトン、アンモニウム塩など）並びに無機塩源(硫酸塩、リン酸塩及び/又はナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの炭酸塩)を含有する液体培地内で培養する。この培地はさらに例えば鉄、亜鉛、マンガンなどの微量元素のような増殖促進物質を含有している。
【００７９】
酵母の遺伝子構造を発現したい場合、酵母に使用する適切な選択遺伝子は酵母のプラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である(Stinchcomb et al.,Nature,282:39(1979)；Kingsman et al.,Gene,7:141(1979)参照)。このtrp1遺伝子は、トリプトファン内で増殖する性能を欠いている酵母の変異株(例えばATCC No.44076すなわちPEP4-1)に対する選択マーカーを提供する（Jones,Genetics,85:12(1977)参照）。その酵母宿主細胞のゲノム内にtrp1の損傷(lesion)が存在すると、トリプトファン不在下での増殖によって形質転換を検出するのに有効な環境を提供する。同様にLeu2-不全酵母菌株(ATCC 20,622又は38,626)はLeu2遺伝子を有する既知の既知のプラスミドで相補される。
【００８０】
あるいはまた、受容体アンタゴニストをコードするDNAは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス又はレンチウイルスなどのウイルスに由来するベクター中にクローン化することができる。遺伝子の発現は誘発性又は非誘発性の制御配列によって制御される。
【００８１】
要するに、抗体、抗体均等物又はVEGF受容体などの所望のDNAを発現する核酸分子を含有する細胞の適切な資源が選択される。全RNAは適切な資源から標準の手順で製造される。その全RNAを使ってcDNAを合成する。RNAを単離し次いでcDNAを合成する標準の方法は、例えば先に述べたような分子生物学のの標準のマニュアルで提供されている。
【００８２】
そのcDNAは既知の方法で増幅できる。例えばcDNAは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅のための鋳型として使用できる(Saiki et al.,Science,239,487(1988)又はMullis et al.の米国特許第4,683,195号参照)。PCRによって増幅を行うのに使うオリゴヌクレオチドプライマーの配列は増幅すべき既知の配列から誘導される。前記オリゴヌクレオチドは当該技術分野で既知の方法で合成される。適切な方法としては、Caruthers, Sciece,230, 281-285 (1985)に記載されている方法がある。
【００８３】
上流及び下流のオリゴヌクレオチドを使ってPCRによる増幅を行う。その条件は標準の手順によって特定のプライマー対各々に対し最適化される。そのPCR産物は、例えば、プライマー間の配列に対応して正しい大きさのcDNAについて電気泳動法で分析する。あるいはそのコーディング領域を増幅して2以上のオーバーラップしているフラグメントにすることができる。そのオーバーラップしているフラグメントは、そのフラグメントから無傷のcDNAが得られるように制限部位を含むよう設計される。
【００８４】
VEGF受容体に対する全タンパク質コーディング領域を単離するため、例えば上流のPCRオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくはATG出発コドン及びその出発コドンの上流に少なくとも5〜10個のヌクレオチドを包含している5’末端の配列に対して相補的である。下流のPCRオリゴヌクレオチドプライマーは、所望のDNA配列の3’末端の配列に対して相補的である。その所望のDNA配列は、好ましくはVEGF受容体の全細胞外部分をコードしそして膜貫通領域のすべてもしくは一部及び/又はストップコドンを含む細胞内部分のすべてもしくは一部を任意にコードしている。
【００８５】
抗体、抗体の均等物又はVEGF受容体をコードするDNAなどの増幅すべきDNAも、広範囲の宿主細胞の広範囲のクローニングベクター中に複製することができる。その宿主細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。
【００８６】
DNAがスプライスされるベクターは、染色体、非染色体又は合成DNAの配列のセグメントを含んでいてもよい。いくつかの適切な原核クローニングベクターとしては、colE1、pCRI、pBR322、pMB9、pUC、pKSM及びRP4などのイー・コリ(E.coli)由来のプラスミドがある。又原核ベクターとしては、M13などのファージDNAの誘導体及び他の一本鎖DNAの線状ファージがある。VEGF受容体ををコードする核酸をクローン化するのに使う好ましいベクターはバキュロウイルスのベクターである。
【００８７】
発現すべきDNAを含有するベクターは適切な宿主細胞にトランスフェクトされる。その宿主細胞は、適切な培地内に保持し、その細胞とベクターが複製する条件下におく。そのベクターを細胞から回収する。そのベクターから発現すべきDNAを回収する。
【００８８】
抗体、抗体の均等物又は受容体をコードするDNAなどの発現すべきDNAは、適切な発現ベクター中に挿入し次に適切な原核又は真核の宿主細胞内で発現させる。
【００８９】
例えば、宿主細胞中に挿入されたDNAはVEGF受容体の全細胞外部分又はVEGF受容体の細胞外部分の可溶性フラグメントをコードする。DNAがコードするVEGF受容体の細胞外部分は、追加のアミノ酸配列の5’末端もしくは3’末端又は両方に任意に連結させる。その追加のアミノ酸配列は、VEGF受容体のリーダー配列、膜貫通領域及び/又は細胞内領域などのなどのVEGF受容体の細胞外領域に連結されてもよい。またその追加のアミノ酸配列は、天然のVEGF受容体に連結されない配列でもよい。この追加のアミノ酸配列は、特別の目的例えば発現レベル、分泌、可溶性又は免疫原性を改善するのに役立てることが好ましい。
【００９０】
細菌、特にイー・コリ内でタンパク質を発現するベクターは公知である。このようなベクターとしては、Dieckmann and Tzagoloff, J. Biol. Chem., 260, 1513 -1520 (1985)に記載されているPATHベクター類がある。これらのベクターは、アントラニル酸シンターゼ(TrpE)をコードするDNA配列とそのカルボキシ末端に連結するポリリンカーを含有している。その外の発現ベクター系は、βガラクトシダーゼ(pEK)；λPL；マルトース結合性タンパク質(pMAL)；及びグルタチオンS-トランスフェラーゼ(pGTS)に基づいている(Gene 67, 31(1988)及びPeptide Research 3,167(1990)参照)。
【００９１】
酵母内で有効なベクターは入手可能である。適切な例は2μプラスミドである。
【００９２】
また哺乳類細胞内で発現させるのに適切なベクターも知られている。このようなベクターとしては、SV-40、アデノウイルス、レトロウイルス由来のDNA配列及び上記ベクターなどの哺乳類機能ベクターの組合わせ由来のシャトルベクターの周知の誘導体並びに機能プラスミドとファージDNAがある。
【００９３】
当該技術分野ではさらに真核発現ベクターが知られている(例えば、P. J. Southern and P.Berg, J. Mol. Appl. Genet.,1:327-341(1982)；Subramani et al.,Mol. Cell. Biol.,1:854-864(1981)；Kaufmann and Sharp,「Amplifica-tion And Expression of Sequences Cotransfcted with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene」,J. Mol. Biol.,159, 601-621(1982)；Kaufmann and Sharp, J. Mol. Biol.,159, 601-664(1982)；Scahill et al.,「Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune InterferonDNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells」, Proc. Nat’l  Acad. Sci. USA, 80, 4654-4659 (1903)；Urlaub and Chasin, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)参照)。
【００９４】
本発明で有用な発現ベクターは、発現すべきDNAの配列又はフラグメントに作動的に連結されている少なくとも一つの発現制御配列を含んでいる。その制御配列は、クローン化されたDNA配列の発現を制御及び調節するためベクターに挿入される。有用な発現制御配列の例は、lac系；trp系；tac系；trc系；ファージλの主オペレーターとプロモーター領域；fdコートタンパク質の制御領域；酵母の解糖プロモーター例えば3-ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター；酵母の酸性ホスファターゼのプロモーター例えばPho5；酵母のα接合因子のプロモーター；ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス及びシミアンウイルス由来のプロモーター例えばSV-40の初期プロモーターと後期プロモーター；並びに原核細胞もしくは真核細胞及びそれらのウイルスもしくはそれらの組合わせの遺伝子の発現を制御することが知られている他の配列である。
【００９５】
制御シグナル並びに発現すべきDNA例えば抗体、抗体の均等物又はVEGF受容体をコードするDNAを含有するベクターは、発現を行うための宿主細胞に挿入される。いくつかの有用な発現宿主細胞としては周知の原核細胞及び真核細胞がある。いくつかの適切な原核宿主としては例えばイー・コリ(E.coli）のE. coli SG-936、E. coli HB-101、E. coli W3110、E. coli X1776、E. coli X2282、E. coli DHI及びE. coli MRC1など；シュードモナス属の細菌(Pseudomoas)；バシラス属の細菌例えばバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)；及びストレプトマイセス属の細菌(Streptomyces)がある。適切な真核細胞としては、組織培養中の酵母などの真菌の細胞、昆虫の細胞、COS細胞やCHO細胞などの動物の細胞、ヒトの細胞、及び植物の細胞がある。
【００９６】
適切な培地内に保持された宿主細胞内で発現させた後、発現されるポリペプチド又はペプチド例えば抗体、抗体の均等物又はVEGF受容体をコードするポリペプチド又はペプチドを培地から単離し次に当該技術分野で公知の方法で精製する。そのポリペプチド又はペプチドが培地中に分泌されないときは、その宿主細胞を溶解した後に単離と精製を行う。
【００９７】
さらに本発明の抗体は哺乳類を可溶性受容体で免疫化することによって製造できる。その可溶性受容体は、それ自体免疫原として使用することができ又は担体タンパク質もしくはビーズ類すなわちセファロースビーズなどの他の物体に結合させることができる。哺乳類が抗体を産生した後、脾細胞などの抗体産生細胞の混合物を単離する。前記混合物から個々の抗体産生細胞を単離し次にその細胞を例えば骨髄腫細胞などの腫瘍細胞と融合させて不死化させことによってモノクローナル抗体を製造できる。得られたハイブリドーマを培養して保存し、モノクローナル抗体を発現させ、その抗体を培地から収穫する。
【００９８】
抗体は、対象の特異的受容体を発現する細胞の表面に結合された受容体からも製造できる。受容体が結合されている細胞は、VEGFRに対する血管内皮細胞のような受容体を自然に発現する細胞でもよい。あるいは受容体が結合されている細胞は、受容体をコードするDNAをトランスフェクトされた細胞例えばVEGFRをトランスフェクトされた3T3細胞でもよい。
【００９９】
受容体は本発明の抗体をつくらせる免疫原として使用できる。その受容体ペプチドは、天然の資源例えばその受容体を発現する細胞から得ることができる。例えば、VEGF受容体ペプチドは血管内皮細胞から得ることができる。あるいは、合成の受容体ペプチドを市販の機械を使って製造できる。かような実施態様で、そのVEGF受容体のアミノ酸配列は、例えばflt-1(VEGFR-1)についてはShibuya et al.,Oncogene 5,519-524(1990)に、KDR(VEGFR-2)についてはPCT特許願第US92/01300号及びTerman et al.,Oncogene 6:1677-1683(1991)に、並びにflk-1についてはMatthews et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA,88:9026-9030 (1991)によって提供できる。
【０１００】
別の選択肢として、受容体をコードするDNA例えばcDNA又はそのフラグメントをクローン化し次いで発現させて得たポリペプチドを回収し免疫原として使って、本発明の抗体をつくらせることができる。例えば、対応する抗体が形成されるVEGF受容体を製造するため、本発明のVEGF受容体又はその一部分特に細胞外の部分をコードする核酸分子を、下記のような標準の組換えDNA法を使って、宿主細胞内で発現する既知のベクター中に挿入できる。このような核酸分子の適切な資源としては、VEGF受容体を発現する細胞すなわち血管内皮細胞がある。
【０１０１】
本発明の抗体はいずれの哺乳類でも製造できる。ヒト以外の適切な哺乳類としては、例えばウサギ、ラット、馬、ヤギ又は霊長類がある。マウスが好ましい。本発明の抗体は、以下の免疫グロブリンクラス：IgG、IgM、IgA、IgD又はIgE及びそのサブクラスの中のひとつのメンバーでもよく、IgG1抗体が好ましい。本発明の抗体及びその機能均等物はいずれかの免疫グロブリンクラスのメンバーであってもよく又はそのメンバーに結合してもよい。
【０１０２】
非抗体のVEGFRアンタゴニスト
さきに考察した抗体又は抗体の機能均等物に加えて、本発明に有用な受容体アンタゴニストは、特に上記治療法に関連する他の生体分子や小分子でもよい。
【０１０３】
生体分子としては、分子量が450より大きいすべての脂質並びに単糖類、アミノ酸類及びヌクレオチド類の重合体がある。したがって、生体分子としては、例えばオリゴ糖類と多糖類；オリゴペプチド類、ポリペプチド類、ペプチド類及びタンパク質類；並びにオリゴヌクレオチド類とポリヌクレオチド類がある。オリゴヌクレオチド類とポリヌクレオチド類としては、例えばDNAとRNAがある。
【０１０４】
生体分子としてはさらに、上記分子のいずれかの誘導体がある。例えば、生体分子の誘導体としては脂質並びにオリゴペプチド類、ポリペプチド類、ペプチド類及びタンパク質類のグリコシル化誘導体がある。生体分子の誘導体としてはさらにオリゴ糖類と多糖類の脂質誘導体、例えばリポ多糖類がある。
【０１０５】
本明細書では、生体分子でないどの分子も小分子とみなされる。本発明の小分子は炭素原子と水素原子並びに限定されないが窒素、硫黄、酸素、及びリンを含むヘテロ原子を有する物質である。小分子中の原子は共有結合及びイオン結合で連結され、共有結合は有機小化合物例えばIressa(商標)及びTarceva(商標)などの小分子のチロシンキナーゼ阻害剤で一般的であり、そしてイオン結合は無機小化合物で一般的である。有機小分子内の原子の配列は、連鎖例えば炭素-炭素連鎖もしくは炭素-ヘテロ原子連鎖又は炭素原子を含むリング例えばベンゼン又は炭素とヘテロ原子の組合わせすなわち複素環例えばピリミジンもしくはキナゾリンを示す。有機小分子の1又は2以上の連鎖がリング系に連結されると置換リング系が形成され、二つのリングが縮合すると縮合多環系(単に多環系と呼称されることもある)が形成されその例はIressa(商標)の親骨格である。小分子としては、天然に見られる化合物例えばホルモン類、神経伝達物質類、ヌクレオチド類、アミノ酸類、糖類、脂質類及びそれらの誘導体、並びに従来の有機合成法、生体仲介合成法又はその組合わせによって合成されるこれらの化合物がある(例えば、Ganesan,Drug Discov. Today,7(1):  47-55  (Jan.  2002)；Lou, ,Drug Discov. Today,6(24):1288-1294(Dec.2001)参照)。
【０１０６】
小分子のいくつかの例としては、有機化合物、有機金属化合物、有機化合物と有機金属化合物の塩類、糖類、アミノ酸類、ヌクレオシド類及びヌクレオチド類がある。小分子は任意の分子量を有していてもよいことを強調するものである。これらの化合物は分子量が一般に450より小さいので単に小分子と呼称される。小分子には天然に見られる化合物と合成化合物が含まれている。
【０１０７】
小分子及び生物学的薬物のヒト患者への投与は当該技術分野で知られている方法で行われる。小分子の投与法の例は、Spadaの米国特許第5,646,153号の57欄47行〜59欄67行に記載されている。小分子の投与に関するこの説明は本明細書に援用するものである。
【０１０８】
VEGF受容体のVEGFによる活性化の中和
内皮細胞又は腫瘍細胞などの非内皮細胞の試料中のVEGF受容体の活性化の中和は、生体内又は生体外で行うことができる。VEGF受容体を発現する細胞の試料中のVEGF受容体のVEGFによる活性化の中和は、細胞を本発明のアンタゴニスト例えば抗体と接触させることからなっている。生体外では、細胞を、アンタゴニスト例えば抗体と、VEGFを細胞の試料に添加する前、添加と同時に又は添加後に接触させる。
【０１０９】
生体内では、本発明のアンタゴニスト例えば抗体を、哺乳類に投与することによってVEGF受容体と接触させる。哺乳類に投与する方法としては、経口、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内の投与がある。
【０１１０】
この生体内中和法は哺乳類の血管新生を阻害するのに有効である。血管新生の阻害は、例えば腫瘍増殖などの病状に付随する血管新生を防止又は阻害するのに有効な治療法である。したがって本発明のアンタゴニスト例えば抗体は、抗血管新生剤でありかつ抗腫瘍免疫治療剤である。
【０１１１】
用語［哺乳類］はどんな哺乳類も意味する。哺乳類のいくつかの例としては、犬やネコなどのペット動物；豚、ウシ、羊、及びヤギなどの家畜；マウスやラットなどの実験動物；サル類、類人猿及びチンパンジー類などの霊長類；並びにヒトがある。
【０１１２】
VEGF受容体は、腫瘍細胞などの細胞内にオートクリン及び/又はパラクリンのループが予想外に存在していることを示すいくつかの非内皮細胞に見られる。本発明のアンタゴニスト例えば抗体は、これら細胞のVEGF受容体の活性を中和するのに有効なので、オートクリン及び/又はパラクリンのループを遮断して腫瘍の増殖を阻害する。
【０１１３】
哺乳類の血管新生を阻害しかつ腫瘍の増殖などの病状を阻害する方法は、その機能均等物を含む本発明のアンタゴニスト例えば抗体のいずれか一つの有効量を、哺乳類に全身的に又は哺乳類中の腫瘍に直接投与することで構成されている。その哺乳類はヒトが好ましい。この方法は、充実性腫瘍好ましくは重症の血管腫瘍及び非充実性腫瘍の両者を有する被験者を治療するのに有効である。
【０１１４】
腫瘍増殖の阻害又は減少には、癌性腫瘍と非癌性腫瘍を含む腫瘍の進行の防止又は阻害が含まれている。腫瘍の進行には、腫瘍の侵襲、転移、再発及び大きさの増大が含まれている。また腫瘍増殖の阻害と減少には腫瘍の破壊も含まれている。
【０１１５】
すべてのタイプの腫瘍が本発明の治療方法で治療できる。腫瘍は充実性でも非充実性でもよい。
【０１１６】
本発明のアンタゴニストで治療できる充実性腫瘍のいくつかの例としては、癌腫、肉腫、芽細胞腫又はグリオームである。このような腫瘍のいくつかの例としては、類表皮腫瘍、扁平腫瘍、例えば頭部と頸部の腫瘍、直腸結腸の腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、小細胞と非小細胞の腫瘍を含む肺腫瘍、膵臓腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍及び肝臓腫瘍がある。その外の例としては、カポジー肉腫、CNS新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫と脳転移、黒色腫、胃腸と腎臓の癌腫と肉腫、横紋筋肉腫、グリア芽細胞腫好ましくは多形性グリア芽細胞腫及び平滑筋肉腫がある。本発明のアンタゴニストが有効な血管新生皮膚癌の例としては、ヒトの悪性ケラチノサイトのような悪性ケラチノサイトの増殖を抑制することによって治療できる扁平細胞癌、基底細胞癌及び皮膚癌がある。
【０１１７】
非充実性腫瘍のいくつかの例としては、白血病、多発性骨髄腫及びリンパ腫がある。白血病のいくつかの例としては、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CLL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、赤血球白血病又は単球性白血病がある。リンパ腫のいくつかの例としては、ホジキン病及び非ホジキン病を伴うリンパ腫がある。
【０１１８】
後記実験結果は、本発明の抗体が、トランスフェクトされた3T3細胞内で発現されるマウスの細胞外flk-1(VEGFR-2) (VEGFR-2)/細胞内fmsキメラ受容体のVEGFが誘発するリン酸化を特異的に遮断することを示している。本発明の抗体は、CSF-1で十分に刺激されたキメラ細胞外fms/細胞内FLK-2受容体に全く作用しなかった。また下記生体内の試験は、本発明の抗体がヌードマウスの腫瘍の増殖を有意に阻害できたことを示している。
【０１１９】
VEGF受容体のアンタゴニスト例えばモノクローナル抗体のカクテルは、腫瘍細胞の増殖を阻害する特に有効な治療法を提供する。そのカクテルは、少ない場合は2、3又は4種類の抗体を含有し多い場合は6、8又は10種類の抗体を含有している。
【０１２０】
血管新生を予防又は阻害することは、過剰な血管新生を特徴とする非新生物性病状、例えば血管新生緑内障、増殖性糖尿病網膜炎を含む増殖性網膜炎、関節炎、黄斑変性、血管腫、血管線維腫及び乾癬を治療するのにも有効である。
【０１２１】
VEGF受容体の単離と精製を目的とする本発明のアンタゴニストの使用
本発明のアンタゴニストを使用し、アフィニティークロマトグラフィー(Dean et al.,Affinity Chromatography:A Practical Approach,IRL Press,  Arlington,VA(1985))などの従来の方法を利用してVEGF受容体を単離し精製することができる。当該技術分野でよく知られている他の方法としては、抗体でコートされた磁気ビーズによる磁気分離法、固体マトリックスに結合された抗体による「パニング法」及びフローサイトメトリーがある。
【０１２２】
VEGF受容体の資源は一般に血管細胞であり、特にVEGF受容体を発現する血管内皮細胞である。血管内皮細胞の適切な資源は、臍帯血細胞特にヒトの臍帯血管内皮細胞(HUVEC)などの血管である。
【０１２３】
VEGF受容体は、VEGF発現細胞の表面上のVEGF受容体又は他の抗原を認識して結合する追加のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体をつくるための抗原などの他の物質を産生する出発物質として使用できる。
【０１２４】
flk-1(VEGFR-2)陽性腫瘍細胞の単離と精製を目的とする本発明のアンタゴニストの使用
本発明のアンタゴニストを使用し、アフィニティークロマトグラフィー(Dean,P.D.G. et al.,Affinity Chromatography:A Practical Approach,IRL Press,  Arlington,VA(1985))などの従来の方法を利用してflk-1  (VEGFR-2)  (VEGFR-2)陽性腫瘍細胞すなわちflk-1(VEGFR-2)受容体を発現する腫瘍細胞を単離し精製することができる。当該技術分野でよく知られている他の方法としては、抗体でコートされた磁気ビーズによる磁気分離法、抗体に複合された補体などの細胞傷害剤、固体マトリックスに結合された抗体による「パニング法」及びフローサイトメトリーがある。
【０１２５】
生体外又は生体内でのVEGF及びVEGF受容体のレベルの監視
本発明のアンタゴニスト例えば抗体を使用し、当該技術分野で知られている標準検定法と方法を利用して生物試料中のVEGF又はVEGF受容体の生体外又は生体内でのレベルを監視することができる。生物試料のいくつかの例としては血液などの体液がある。標準検定法では、例えば抗体に標識をつけ次いで当該技術分野で周知の放射線免疫検定法などの標準免疫検定法を実施する。
【０１２６】
本発明を実施するのに有用な標準の組換えDNA法は、Sambrook et al.,「Molecular Cloning」 Second Edition,Cold Spring Harber Laboratory Press(1987)及びAusubel et al.,(Eds)「Current Protocols in Molecular Biology」, Green Publishing Associates/Wiley-Interscience, New York(1990)に説明されている。
【０１２７】
投与
本発明の受容体アンタゴニストは、腫瘍の進行例えば腫瘍の増殖、侵襲、転移及び/又は再発を予防し、阻害し又は減少させるのに十分な量で腫瘍に冒されている患者に投与して治療することができる。これを達成するのに十分な量は治療上有効な投与量とし定義されている。この用途に有効な量は、疾患の重篤度及び患者自身の免疫系の一般状態に左右される。投与計画も疾患の状態と患者の状態によって変わり一般に単一大型丸薬の投与又は連続注入から一日当たり複数回(例えば4〜6時間毎）の投与までの範囲内であり、又は治療医及び患者の症状によって指示される。しかし本発明は特定の投与法に限定されないことに留意すべきである。
【０１２８】
本発明は、例えば乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部と頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部又は肝臓の腫瘍を含む適切な腫瘍を治療するのに利用できる。本発明の方法は、好ましくは、腫瘍が結腸の腫瘍であるとき又は腫瘍が肺の非小細胞癌(NSCLC)であるときに使用する。
【０１２９】
さらに本発明の対象とする腫瘍はEGFRを過剰発現する方が好ましい。EGFRの発現の増大は多種類のヒトの腫瘍に有意な比率で検出されている。例えば、頭部と頸部(80-100%)、結腸直腸(25-77%)、膵臓(30-50%)、肺(40-80%)、食道(43-89%)、腎細胞(50-90%)、前立腺(65%)、膀胱(31-48%)、子宮頸/子宮(90%)、卵巣(35-70%)及び乳房(14-91%)である。またEGFRの発現は、特定の腫瘍のタイプの不良予後、生存低下及び転移の増加の指標であることも立証されている。
【０１３０】
さらに本発明の対象とする腫瘍は、VEGFRの異常な発現又はシグナル伝達を行う方が好ましい。VEGFRによって増大したシグナル伝達は多種類のヒトの癌に観察されている。高レベルのVEGFR-2が、グリオームの浸潤する内皮細胞によって発現される(Plate et al.,Nature 359:845-848(1992))。VEGFR-2のレベルは、ヒトのグリア芽細胞腫が産生するVEGFによって特異的にアップレギュレートされる(Plate et al.,Cancer Res.53:5822-5827(1993))。グリア芽細胞腫随伴内皮細胞(GACE）にVEGFR-2が高レベルで発現されているのが見られるということは、受容体の活性が恐らく腫瘍形成中に誘発されることを示している。というのは、VEGFR-2の転写産物は正常な脳の内皮細胞には稀にしか検出できないからである。このアップレギュレーションは腫瘍に直近の血管内皮細胞に限られている。
【０１３１】
本発明は腫瘍の増殖を阻害又は減少させるのに有用である。腫瘍の増殖を阻害又は減少させることは、腫瘍の進行例えば腫瘍の増殖、侵襲、転移及び/又は再発を予防し阻害し又は減少させることを意味する。さらに本発明は、アテローム性血管硬化症、関節炎、黄斑変性及び乾癬などの血管形成症状を治療するのに有用である。本発明が有用である症状を有する患者は、当業者の能力と知識によって十分に確認することができる。
【０１３２】
本発明では、適切な方法又は経路例えば経口、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内の投与を利用して、EGFRのアンタゴニスト及び/又はVEGFRのアンタゴニストを投与できる。アンタゴニストの投与量は、例えばアンタゴニストのタイプ、治療される腫瘍のタイプと重篤度及びアンタゴニストの投与経路を含む多数の因子によって決まる。しかし本発明は特定の投与法又は投与経路に限定されないことを強調するものである。
【０１３３】
別の一実施態様で、EGFRのアンタゴニスト及びVEGFRのアンタゴニストは、一又は二種以上の抗新生物剤と組み合わせて投与できる(例えば、米国特許第6.217,866号(Schlessinger et al.)(Anti-EGFR antibodies in combination with antineoplastic agents)；米国特許願第09/312,286号(Waksal et al.)(Anti-EGFR antibodies in combination with radiation)参照)。化学療法薬又は放射線などの適切な抗新生物剤を使用できる。化学療法薬の例としては、限定されないがシスプラチン、ドキソルビシン、パクリタキセル、イリノテカン(CPT-11)、トポテカン又はそれらの組合わせがある。抗新生物剤が放射線である場合、放射線源は治療される患者の外部(外部ビーム放射線療法-EBRT)又は内部(近接照射療法-BT）に位置していてもよい。投与される抗新生物剤の投与量は、例えば抗新生物剤のタイプ、治療される腫瘍のタイプと重篤度及び抗新生物剤の投与経路を含む多数の因子によって決まる。しかし本発明は特定の投与量に限定されないことを強調するものである。
【０１３４】
さらに別の実施態様で、EGFRのアンタゴニスト及びVEGFRのアンタゴニストは一又は二種以上の適切なアジュバント例えばサイトカイン類(例えばIL-10及びIL-3)又は他の免疫刺激剤と組み合わせて投与できる(例えばLarrivee et al.の前掲文献参照)。しかし、腫瘍の進行を、治療上有効な方式で予防し阻害し又は減少させるのにEGFRのアンタゴニストとVEGFRのアンタゴニストだけの投与で十分であることは分かるであろう。
【０１３５】
さらに、本発明のEGFRのアンタゴニスト及び/又はVEGFRのアンタゴニストは、受容体に特異的に結合してリガンド-毒素のインターナリゼーション(internalization)を行った後に有毒で致命的なペイロードを送達するリガンド複合体として投与できる。毒素と受容体の複合体は、非特異的毒性を最小限にしながら、EGFR又はVEGFRを過剰発現する腫瘍細胞に対し特異的な毒性剤を開発すために設計した。例えばEGFとシュードモナス属の細菌(Pseudomonas)の内毒素(PE)からなる複合体は、EGFRを発現するHeLa細胞に対し毒性であることを生体外で示した。チオリダジン及びアデノウイルスを含む各種の作用剤が、複合体の細胞毒性を増大するのみならず細胞の複合体取り込みを促進することができる。
【０１３６】
本発明のEGFRのアンタゴニスト及び/又はVEGFRのアンタゴニストは、哺乳類に予防と治療を目的として使用する場合、医薬として許容できる担体を追加して含有する組成物の形態で投与する。適切な医薬として許容できる担体としては、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどの一又は二種以上及びこれらの組合わせがある。医薬として許容できる担体はさらに、結合タンパク質の貯蔵寿命又は有効性を高める湿潤剤、乳化剤、保存剤又は緩衝剤などの補助物質を少量含有していてもよい。注射用の組成物は、当該技術分野で周知のように、有効成分を哺乳類に投与した後に迅速に徐々に又は遅らせて放出するように配合できる。
【０１３７】
本発明のEGFRのアンタゴニスト及び/又はVEGFRのアンタゴニストは、各種の形態にすることができる。その形態としては、固体、半固体及び液体の剤形があり、例えば錠剤、丸剤、散剤、液剤、分散剤もしくは懸濁剤、リポソーム剤、坐剤、注射液剤及び注入液剤がある。好ましい形態は、意図する投与モードと治療用途によって決まる。
【０１３８】
本発明のアンタゴニストは、医薬の技術分野で周知の方式で製造できる。組成物を製造する場合、有効成分は通常、担体と混合するか担体で希釈し及び/又は例えばカプセル、サッシェ、紙などの容器の形態である担体の中に封入される。担体が希釈剤として働く場合、担体は有効成分の賦形剤、添加剤又は媒質としてはたらく固体、半固体又は液体の物質である。したがって本発明の組成物は、錠剤、トローチ剤、サッシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エーロゾル剤(固体として又は液体媒体内)、有効化合物を例えば10重量％まで含有する軟膏、軟質と硬質のゼラチンカプセル剤、坐剤、注射液剤、懸濁剤、滅菌包装散剤及び局所パッチの形態である。
【０１３９】
腫瘍増殖阻害用のキット
本発明は、治療するのに有効な量のEGFRアンタゴニスト及び治療するのに有効な量のVEGFRアンタゴニストを含有する腫瘍増殖阻害用のキットも含んでいる。本発明のキットのEGFR又はVEGFRのアンタゴニストは適切なアンタゴニストであればよく、その例は先に述べてある。本発明のキットのEGFRアンタゴニストは、好ましくはEGFRに対し特異的な抗体又はその機能均等物で構成されている。あるいは及び好ましくは本発明のキットのEGFRアンタゴニストはEGFRに対し特異的な小分子で構成されている。本発明のキットのVEGFRアンタゴニストは、好ましくはVEGFRに対し特異的な抗体又はその機能均等物で構成されている。あるいは及び好ましくは本発明のキットのVEGFRアンタゴニストはVEGFRに対し特異的な小分子で構成されている。その上、本発明のキットはさらに抗新生物剤を備えていてもよい。本発明に関連する適切な抗新生物剤の例は本願に記載されている。本発明のキットはさらにアジュバントを備えていてもよくその例は本願に記載されている。
【０１４０】
したがって、本発明の受容体のアンタゴニストは、当該技術分野で周知の試験法、診断法、予防法又は治療法に生体内及び生体外で使用できる。勿論、本願に開示された発明の原理の変形は当業者であれば実施できるものでありかつこのような変形は本発明の範囲内に含まれるものである。
【０１４１】
本願で挙げた文献はすべて本願に援用するものである。
【実施例】
【０１４２】
下記の実施例は、本発明の理解を助けるために記載されているが、決して本発明の範囲を限定しようとするものではなくかつ限定するとみなすべきではない。これら実施例には、例えばベクターやプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子の前記ベクターやプラスミドへの挿入又はプラスミドの宿主細胞への導入に採用される従来の方法の詳細な説明は含まれていない。このような方法は当業者には周知の方法であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F. and  Maniatis,T.「Molecular Cloning : A Laboratory Manual」(1989),2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Pressを含む多数の刊行物に記載されている。
【０１４３】
実施例I  細胞系と培地
NIH3T3細胞を、the American Type Culture Collection(米国メリーランド州ロックビル)から入手した。3T3細胞に、キメラ受容体のマウスflk-1  (VEGFR-2)/ヒトfmsをトランスフェクトすることによって、C441細胞系を構築した。10A2は、キメラ受容体のヒトfms/マウスFLK-2を含有する3T3トランスフェクタントであり、その単離と特性決定はDosil et al.,Mol. Cell. Biol.,13:6572-6585(1993)に記載されている。細胞は、例によって10%の仔ウシ血清(CS)、1mMのL-グルタミン、抗体、及び600μg/mlのG418(米国ミズーリ州セントルイス所在のSigmaのGeneticin)を補充されたダルベッコ変法イーグル培地(DME)内に保持した。
【０１４４】
グリア芽細胞腫の細胞系GBM-18を5%の仔ウシ血清、1mMのL-グルタミン及び抗体を補充したDME内に保持した。
【０１４５】
可溶性キメラタンパク質であるマウスflk-1(VEGFR-2):SEAPs(分泌性アルカリ性ホスファターゼ)を分泌する安定な3T3細胞系を製造し、10%の仔ウシ血清含有DMEM中に保持した。ならし培地を収集した。そのならし培地から可溶性のflk-1(VEGFR-2):SEAPを単離した。
【０１４６】
実施例 II  モノクローナル抗体の単離
実施例 II-1. ラット抗マウスflk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体DC-101(IgG1)。
Lewisラット(Charles River Labs)を、マウスflk-1:SEAP可溶性受容体、ウサギ抗アルカリホスファターゼポリクローナル抗体及びプロテインGセファローズビーズからなる免疫複合体で高度免疫化をおこなった。これら動物にこの複合体を3ヶ月間にわたって7回(０、14、21、28、49、63、77日目に)腹腔内に注射した。いくつもの時点で、これら動物の尾静脈から採血し次いでmflk-1(VEGFR-2):SEAPsに高力価で結合する免疫血清をELISAでスクリーニングした。最後の注射をしてから5日後にラットを殺し脾臓を無菌状態で取り出した。脾細胞を洗浄しカウントし次にマウス骨髄腫細胞系NS1と2:1の比率で融合させた。ハイブリドーマをHAT培地内で選択し次にmflk-1(VEGFR-2):SEAPsと特異的に結合するがSEAPタンパク質と結合しないコロニーをELISA法でスクリーニングした。陽性ハイブリドーマの数を限界希釈法で3回エキスパンドさせてクローン化した。さらにDC-101と命名した一つのサブクローンの特性決定を行った。
【０１４７】
実施例 II-2. マウス抗マウスflk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体Mab 25及びMab 73
マウス抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体(Mab)は、DC-101に採用したのと類似のプロトコルを利用して製造した。簡単に述べると、抗-SEAP-プロテイン/Aセファロース複合体又はトランスフェクトされたNIH3T3細胞のならし培地由来の小麦胚芽凝集素セファロースに結合されたflk-1(VEGFR-2)/SEAP可溶性受容体の複合体をマウスに注射した。マウスは、6ヶ月にわたって定期的に間隔を置いて高度免疫を行った。免疫脾臓細胞をプールしてマウス骨髄腫細胞系NSIに融合させた。ハイブリドーマをHAT培地内で選択しインキュベートした後、マウスMabを産生するコロニーをスクリーニングした。DC-101に採用したプロトコルと異なり、fmsのC末端領域に相当するペプチドに生成したポリクローナル抗体をコートしたELISAプレート上のC441細胞の溶解液から捕獲したflk-1(VEGFR-2)/fms受容体に結合する陽性上澄み液を最初にスクリーニングした。次に、無傷のC441細胞及び精製されたflk-1(VEGFR-2)/SEAPとSEAPだけに結合する反応性MabをELISA法で検定した。C441に対する結合性を示しそしてflk-1(VEGFR-2)/SEAPとの反応性を示すがSEAPとの反応性を示さないハイブリドーマ由来の上澄み液を、腹水中でエキスパンドさせ増殖させ次いで精製した(EZ-PREP, Pharmacia)。精製したMabについて、C441細胞上でFACSによって検定してそれらMabが細胞表面に結合することを確認し、かつVEGFが誘発するflk-1(VEGFR-2)/fmsの活性化を阻害するそれらMabの性能をリン酸化反応検定法で確認した。これらの試験結果から、Mab 25とMab 73(アイソタイプのIgG1)の、DC-101に観察されたレベルに匹敵するレベルでflk-1(VEGFR-2)に特異的に結合しかつ受容体の活性化を遮断する性能に基づいてさらに特性決定を行うためこれらMabのクローン化を行った。
【０１４８】
実施例 III   検定法
実施例 III -1  ELISA法
各種mAbsのflk-1(VEGFR-2):SEAP及びSEAPタンパク質に対する結合特性を比較する固相ELISA法で抗体類をスクリーニングした。マイクロタイタープレートに50-100ng/ウエルのflk-1:SEAP又はAP(pH9.6 炭酸緩衝液中)を4℃にて一夜かけてコートした。10%の新生仔ウシ血清(NB10)を補充したリン酸緩衝食塩水で、プレートを37℃で1時間遮断した。ハイブリドーマ上澄み液又は精製した抗体をプレートに添加して37℃で2時間放置し、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに複合させたヤギ抗ラットIgG(Tago)を添加して37℃でさらに1時間放置した。十分に洗浄した後、TMB(Kirkegaard and Perry,Gaithersburg MD)プラス過酸化水素を色素原として添加し次いでそのプレートをELISAリーダーにて450nmの吸光度を読み取った。
【０１４９】
実施例 III -2  アイソタイピング
各種モノクローナル抗体のアイソタイピングを、すでに報告されているようにして(Songsakphisarn,R. and Golstein,N.I.Hybridoma,12:343-348,1993)ラットのアイソタイプ特異試薬(Zymed Labs,SOUTH San Francisco CA)を使って実施した。
【０１５０】
実施例 III -3  リン酸化検定法、免疫沈降検定法及び免疫ブロット検定法
C441細胞及び10A2細胞によるリン酸化検定とウェスタンブロット分析をすでに報告されている方法(Tessler et al.,1994)をいくらか修正し利用して実施した。簡単に述べると、細胞をDME-10%CS内で90%集密度まで増殖させ次に実験を行う前に血清をDME-0.5%CS内で24時間飢餓状態にした。HUVEC細胞をEGM基礎培地内でサブコンフリューエンス(subconfluence)まで増殖させた。中和検定の場合、mAb DC-101の存在下及び不在下、血清なしの条件下(DME-0.1%BSA)で、細胞を各種濃度の適当なリガンドで室温にて15分間刺激した。リガンド、VEGF及びCSF-1をそれぞれ、10-80ng/ml及び20-40ng/mlの濃度で検定した。モノクローナル抗体は、0.5μg/ml〜10μg/mlの範囲内の濃度で検定した。VEGFが誘発するflk-1(VEGFR-2)-fms受容体の活性化に対するmAb DC-101の作用を評価するため、抗体を、同時に添加するか(競合阻害)又はリガンドを添加する前に室温で15分間かけて細胞に予め結合させておいた。DC-101の不在下と存在下血清なしの培地内でインキュベートされた細胞はそれぞれ、リガンドの不在下及び抗体の存在下での受容体の自己リン酸化の対照として役立つ。Fms/FLK-2キメラ受容体(10A2)を発現する対照細胞系を飢餓状態にし次に20及び40ng/ml のCSF-1で刺激し5μg/mlのDC-101の存在下と不在下で検定した。
【０１５１】
刺激を行った後、単分子層を、1mMのオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷PBSで洗浄した。次に細胞を、溶解緩衝液(20mMのトリス-HCl、pH 7.4、1%のTritonX-100、137mMのNaCl、10%のグリセリン、10mMのEDTA, ２mMのオルトバナジン酸ナトリウム、100mMのNaF、100mMのピロリン酸ナトリウム、5mMのPefabloc(Boehringer Mannheim Biochmicals, Indianapolis IN)、100μgのアプロチニン及び100μg/mlのロイペプチン)内で溶解し次いで14000xgで10分間遠心分離した。プロテインAセファロースビーズに結合させたヒトfms受容体のC末端領域(Tessler et al.,J. Biol. Chem.,269:12456-12461,1994)又はマウスFLK-2 インターキナーゼドメイン(Small et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA,91,459-463,1994) に相当するペプチドに生成したポリクローナル抗体を使って、トランスフェクトされた細胞の透明溶解液からタンパク質を免疫沈降させた。DC-101又は無関係のラットIgGによる免疫沈降は、プロテインＧビーズに結合させた抗体10μgで実施した。次にこれらビーズを、0.2% ToritonX-100、10mM Tris-HCl, pH8.0、150mM NaCl、2mM EDTA (緩衝液A)で一回洗浄し、500mM NaClを含有する緩衝液Aで二回洗浄し次いでTris-HCl,pH8.0で二回洗浄した。液体をきったビーズを、2xSDSローディング緩衝液内の30μlと混合し、4〜12%勾配ゲルのSDS PAGE(Novex,San Diego CA)に付した。電気泳動を行った後、タンパク質を分析用のニトロセルロース製フィルターにブロットした。フィルターを、遮断緩衝液(50mM Tris-HCl,pH7.4、5%ウシ血清アルブミンを含有する150mM NaCl(TBS)及び10%脱脂乾燥ミルク(Biorad,CA))内で一夜遮断した。リン酸化された受容体を検出するため、ブロットを、遮断緩衝液内で室温にて1時間、ホスホチロシン(UBI,Lake Placid,NY)に対するモノクローナル抗体でプローブした。次にブロットを0.1% Tween-20を含有する0.5xTBS(TBS-T)で十分に洗浄し次いで西洋ワサビペルオキシダーゼに複合させたヤギ抗マウスIg(Amersham)とともにインキュベートした。ブロットをTBSで洗浄し次いで化学発光剤(ECL,Amersham)とともに1分間インキュベートした。リン酸化されたタンパク質と反応する抗ホスホチロシンを、高性能発光検出フィルム(Hyperfilm-ECL,Amersham)に0.5〜10分間暴露することによって検出した。
【０１５２】
C441細胞受容体レベルでflk-1(VEGFR-2)/fmsを検出するため、ブロットを、製造メーカーのプロトコル(Amersham)にしたがってはがしとり、抗fmsウサギポリクローナル抗体で再びプローブした。
【０１５３】
実施例 III -4  フローサイトメーター結合検定法
C441細胞を、10cm プレート内でほぼ密集状態まで増殖させた。細胞を非酵素的解離緩衝液(Sigma)で取り出し、血清無しの冷培地内で洗浄し次いで1%BSA(HBSS-BSA)で補充したハンクス均衡塩類溶液に、1試験管当たり100万個の組織濃度で再懸濁させた。モノクローナルAbのDC-101又はアイソタイプの適合した無関係抗体の抗FLK-2 23H7を1試験管当たり10μg添加し氷上で60分間放置した。洗浄した後、FITCに複合させたヤギ抗マウスIgG
(TAGO) 5μlを添加し氷上でさらに30分間放置した。細胞を三回洗浄し、HBSS-BSA 1ml中に再び懸濁させ次にCoulter Epios Elite Cytometerで分析した。蛍光第二抗体の非特異的結合を、第一抗体を欠いている試料から確認した。
【０１５４】
実施例 III -5  無傷の細胞に対する結合検定法
C441細胞による検定を、24ウエルディッシュ内で密集状態まで増殖させた細胞で実施した。HUVEC細胞は6ウエルディッシュ内で密集状態まで増殖させた。単分子層を、結合緩衝液(DMEM,50 mM HEPES pH 7.0,0.5% ウシ血清アルブミン)内で各種の量のmAb DC-101とともに4℃で2時間インキュベートした。次に細胞を、冷リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し次いでビオチンと複合させた第二抗ラットIgG抗体(最終濃度 2.5μg/ml)とともにインキュベートした。4℃で１時間後、細胞を洗浄し、ストレプタビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とともに4℃で30分間インキュベートした。洗浄した後、細胞結合抗体を、比色検出システム(TMB,Kirkegaard and Perry）で得られる540nmの吸光度を測定することで測定した。第二抗体だけのOD 540nmは非特異的結合の対照として役立つ。
【０１５５】
実施例 III -6  細胞増殖の検定法
マイトジェン検定を、Cell Titer 96 Non Radioactive Cell proliferation Assay Kit(Promega Corp.,Madison,WI)を使って実施した。この検定法では、生細胞によるテトラゾリウム塩のホルマザン産物への還元反応から得られる値として色を計量測定して、増殖を測定した。簡単に述べると、HUVEC細胞を、ゼラチンをコートした24ウエルのゼラチンコートプレートを使いEGM基礎培地内で1000細胞/ウエルにて増殖させた。48時間インキュベートした後、各種成分をウエルに添加した。1μg/mlのmAb DC-101の存在下及び不在下で、1ng/mlのVEGFを培地に添加した。指定された場合ヘパリン(Sigma)を最終濃度1μg/ml まで添加した。次に細胞をさらに3日間インキュベートした。細胞の増殖を測定するため、テトラゾリウム色素を20μlずつ各ウエルに添加し細胞を37℃で3時間インキュベートした。細胞を可溶化し次に生成物ホルマザンの吸光度(OD570)を増殖の定量値として測定した。
【０１５６】
実施例 IV  生体外活性の検定法
実施例 IV-1 マウスの抗flk-1(VEGFR-2)Mab 25と73は、VEGFが誘発するflk-1(VEGFR-2)/fms受容体の活性化を特異的に中和する。
等濃度のflk-1(VEGFR-2)/fmsをトランスフェクトされた3T3細胞系のC441から免疫沈降させたFLK/fmsとPDGF受容体で検定を行い、一方ヒトEGFRは腫瘍細胞系のKBから免疫沈降させた。10μｇ/mlのマウスの抗flk-1(VEGFR-2)Mab25と73の存在下及び不在下、20ng/ml VEGF(flk-1/fms)、DMEM-10%仔ウシ血清(PDGFR)又は10ng/ml EGF(EGFR)を含有するRPMI-0.5%BSAで、細胞を刺激した。刺激を行った後、細胞をPBS-1mMオルトバナジン酸ナトリウムで洗浄し次に溶解させた。Flk-1/fmsとPDGFRを、溶解液から、c-fms(IM 133)のC末端領域及びPDGF(UBI)受容体それぞれに相当するペプチドに対して生成したポリクローナル抗体で免疫沈降させた。EGFRはヒト受容体のN末端領域に対するMab(C225)で免疫沈降させた。免疫沈降された溶解液をSDSポリアクリルアミド電気泳動法に付し続いてウエスタンブロット法に付した。ブロットを抗PTyrMab(UBI)でプローブして受容体の活性化を検出した。刺激された細胞の受容体の中和は、無関係のMabと未刺激の対照に対して評価した。
【０１５７】
実施例 IV-2  プローブとしてMab25とMab27を使うウエスタンブロット法による flk-1(VEGFR-2)/fms受容体の検出
c-fms受容体のC末端領域に相当するペプチドに対して生成したポリクローナル抗体によって、等濃度のトランスフェクトされた3T3細胞系C441で製造した溶解液から免疫沈降させたflk-1(VEGFR-2)/fms受容体のウエスタンブロット上のマウス抗flk-1(VEGFR-2)Mabによって、受容体を検出した。SDSゲル電気泳動法とウエスタンブロット法で分析した後、そのブロットを四つの部分に分割し、各セクションを、50μg/mlの抗flk-1(VEGFR-2)Mab 25と73でプローブした。次にブロットをはがしとり前記抗fmsポリクローナル抗体で再度プローブした結果、各Mabが検出したバンドはflk-1(VEGFR-2)/fms受容体を示すことが証明された。
【０１５８】
実施例 IV-3  抗flk-1(VEGFR-2)Mabによる免疫沈降で行う、VEGFで刺激されたHUVECとOVCAR-3細胞からの活性化KDR(VEGFR-2)の検出
新たに単離したHUVECの溶解液から、タンパク質を、異なる抗体で免疫沈降させた。溶解を行う前に、細胞を、RPMI-0.5%BSA中で室温にて10分間、20ng/mlのVEGFで刺激し、次に1mM オルトバナジン酸ナトリウムを含有するPBSで洗浄した。個々の免疫沈降は等容積の溶解液で実施し次にSDSポリアクリルアミド電気泳動法を行い続いてウエスタンブロット法を行った。そのブロットを最初、抗PTyrMab(UBI)でプローブし続いてはがしとり次いでflk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2,IM142)のインターキナーゼに相当するペプチドに対し生成したポリクローナル抗体で続いてflk-1(VEGFR-1)のC末端領域に対するポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)で再度プローブした。これらの免疫沈降は、無関係のラットMabの23H7、無関係のマウスMabのDAB8で、抗flk-1(VEGFR-2)Mab,DC-101,73,25及び抗flk-1/KDR  (VEGFR-1/  VEGFR-2)ポリクローナル抗体のIM 142に対して行った。場合によっては、ブロットをはがしとり次に抗flk-1 Mab 73と25で再度プローブして交差反応のバンドを検出した。
【０１５９】
類似のプロトコルを採用して、卵巣癌細胞系のOVCAR-3の1又は2種以上のKDR(VEGFR-2)受容体型を検出した。
【０１６０】
実施例 V  抗体の活性
実施例 V-1  DC-101によるERISA法と免疫沈降法
ラットIgG1モノクローナル抗体のDC-101がマウスチロシンキナーゼ受容体flk-1(VEGFR-2)に対して特異的であることが分かった。この抗体が、精製されたflk-1(VEGFR-2):SEAPには結合するがアルカリホスファターゼ又は他の受容体チロシンキナーゼ例えばFLK-2には結合しないことをELISA法のデータが示した。図1に見られるように、DC-101はマウスflk-1(VEGFR-2):SEAPSを免疫沈降させるがSEAPだけは免疫沈降させない。
【０１６１】
実施例 V-2   flk-1(VEGFR-2)受容体のリン酸化のDC-101による阻害
DC-101が、C441細胞内のflk-1(VEGFR-2)のそのコグネイトリガンドのVEGF165によるリン酸化を中和できるかどうかを確認する実験を実施した。これらの試験では、モノクローナル抗体とVEGFを同時に単分子層に加えて室温で15分間放置した。これらの条件は、受容体/リガンドの結合に対する抗体の競合効果(競合阻害)を確認するように設計した。図2aに示されているこれら検定の結果は、VEGF165が誘発するflk-1(VEGFR-2)/fms受容体のリン酸化が、細胞をDC-101の存在下で検定したとき著しく低下したことを示している。さらにこれらのデータは、MabがVEGF165と競合して、受容体のリガンドによる完全活性化を防止することを示唆している。VEGF- flk-1(VEGFR-2)受容体の相互作用のDC-101による阻害に対する感度を測定するため、各種レベルの抗体と組み合わせて最大刺激濃度のVEGF165(40ng/ml)でC441細胞を検定した。これらMabの滴定試験結果は図2bに示してある。DC-101が0.5μg/mlを超える濃度で含有されている場合、flk-1(VEGFR-2)のVEGF165によるリン酸化が著しく低下することが観察された。これらのデータは、リガンドによる受容体の活性化を阻害するのに比較的低い濃度の抗体(<1μg/ml)で十分であることを示している。前記抗体は、5μg/mlで、過剰リガンドの存在下(80ng/ml) flk-1(VEGFR-2)のVEGF165による刺激を中和できる(図3aと3b)。対照として、DC-101の作用を、CSF-1を使って十分に刺激されたfms/FLK-2受容体(10A2細胞系)について試験した。これらの条件下でDC-101は受容体の活性化に対する作用を全く示さなかった。
【０１６２】
実施例 V-3  DC-101による阻害試験
抗体と受容体の相互作用を最大にするためリガンドを添加する前に、DC-101を細胞とともにプレインキュベートした試験で、Mabの阻害作用の程度と特異性をさらに評価した。これらの実験では、単分子層を、5μg/mlのDC-101、従来法で製造したラット抗FLK-2 Mab(2A13)（ImClone,NY）及び対照のラットIgG1(Zymed Labs)とともに室温で15分間インキュベートした後、40ng/mlのVEGF165を添加しさらに15分間インキュベートした。比較するために、DC-101とVEGF165を同時に添加する検定を実施した(競合阻害)。これら試験の結果(図4)は、抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体をflk-1(VEGFR-2)/fmsでトランスフェクトされた細胞とともにプレインキュベートするとVEGF165による受容体の活性化が完全に阻害されることを示している。刺激するためVEGF121を使用したとき、類似の結果が観察された。VEGFによるflk-1(VEGFR-2)のリン酸化は無関係のアイソタイプ適合ラット抗体を添加することによって全く影響されないが、抗fmsポリクローナル抗体でプローブされた同じブロットの反応性は、1レーン当たり等レベルの受容体タンパク質を示している。これらデータは、DC-101によって観察されたリン酸化反応の阻害が試験試料中の受容体タンパク質の不足よりむしろ受容体活性化の遮断が原因であったことを示している。
【０１６３】
実施例 V-4  FACS分析法によるDC-101のC441細胞との結合の検定
flk-1(VEGFR-2)/fms受容体でトランスフェクトされた3T3細胞(C441細胞)に対する結合性について、上記MabをFACS分析法で検定した。図6に示す試験結果は、C441細胞の表面で発現されたキメラflk-1(VEGFR-2)/fmsがmAb DC-101によって特異的にに認識され、そして類縁のチロシンキナーゼ受容体FLK-2に対する同じアイソタイプの抗体によって認識されないことを証明している。細胞表面におけるmAb-受容体の相互作用の効力を、無傷のC441細胞に結合する各種レベルのmAbを測定する検定法で確認した。図7に示すこれら試験の結果は、mAbがflk-1(VEGFR-2)/fms受容体と、約500ng/mlという相対的見掛けアフィニティーで結合することを示している。これらの試験結果は、mAbが細胞表面に発現したflk-1(VEGFR-2)に対し強力なアフィニティーを持っていることを示している。
【０１６４】
実施例 V-5  免疫沈降によるDC-101の反応性
DC-101のflk-1(VEGFR-2)/fms受容体との反応性の程度を、この抗体がVEGFによる活性化の後に上記受容体を免疫沈降させる性能を測定することによってさらに評価した。図8は、mAb DC-101によって、リン酸化されたflk-1(VEGFR-2)/fms受容体がVEGFで刺激されたC441細胞から免疫沈降されることを示す。これらの結果は、DV-101モノクローナル抗体と抗fmsポリクローナル抗体は類似のレベルの受容体相互作用を示すが、ラット抗FLK-2抗体の2H37(IgG1)と2A13(IgG2a)は反応性を全く示さないことを示している。次にmAb DC-101が、VEGFの誘発するflk-1(VEGFR-2)/fmsのリン酸化を、リガンドの最大刺激濃度(40ng/ml)下で中和できるかどうか確認する実験を行った。これらの試験では、モノクローナル抗体を、リガンドと同時に又はリガンドで刺激する前に単分子層に添加し室温で15分後に検定した。これらの条件は、受容体/リガンドの結合に対する抗体の競合効果(競合阻害)及び予め結合された抗体が受容体の活性化を防止する効力の両者を測定するように検討した。図4に示すこれら検定の結果は、flk-1(VEGFR-2)/fmsのリン酸化が、mAbとVEGFの同時添加によって低下しそして抗体を受容体に予め結合させることによって著しく阻害されることを示している。これらデータのデンシトメトリースキャンを行ったところ、mAb DC-101がflk-1(VEGFR-2)/fmsと相互に作用してリン酸化を、対照の完全に刺激された受容体(レーン4)の6%(レーン5,P)及び40%(レーン6,C)のレベルまで阻害することが明らかになった。これらデータから本発明の発明者らは、mAb DC-101がリガンド-受容体の相互作用と強く競合してflk-1受容体の活性化を中和すると推定している。mAb DC-101による阻害に対するVEGF- flk-1(VEGFR-2)相互作用の感度を確認するため、抗体の濃度を増やしながら最大のVEGFのレベルでC441細胞を検定した。検定は、競合させ予め結合させる条件下、上記mAbで実施した。このmAbの滴定試験の結果は図9に示してある。mAb DC-101が0.5μg/mlを超える濃度でVEGF抗体と競合すると、flk-1(VEGFR-2)のリン酸化が著しく低下することが観察される。これらのデータも、リガンドによる受容体の活性化を完全に阻害するのに、比較的低い濃度の予め結合された抗体(<1μg/ml)で十分であることを示している。
【０１６５】
実施例 V-6  リン酸化検定法によるDC-101の活性
受容体の活性化に対するmAb DC-101のアンタゴニスト的挙動をさらに評価するため、固定量の抗体(5μg/ml)を、量を増やしたリガンドで刺激されたC441細胞に添加するリン酸化の検定を実施した(図3a)。mAb DC-101の存在下又は不在下、各リガンド濃度によって誘発されるリン酸化のレベルもデンシトメトリーの読取り値で定量した。図3bに示すこれらデータのグラフは、前記抗体が過剰量のVEGFの存在下でも受容体のリン酸化を一部分中和できたことを示している。受容体活性化に対するmAb DC-101の特異性を評価するため、この抗体を、3T3でトランスフェクトされた細胞系10A2内でCSF-1が誘発するfms/FLK-2受容体の活性化を競合して阻害する性能について試験した。これらの実験では、5μg/mlのmAb DC-101を、受容体を完全に活性化することが分かっているCSF-1の濃度(20-40ng/ml)で試験した。これらの試験結果は、図10に示してあるが、mAb DC-101はfms/FLK-2受容体のCSF-1仲介リン酸化に全く作用しないことを示している。
【０１６６】
実施例 V-7  プレインキュベーション試験によるDC-101の阻害特性
DC101又は無関係抗体を細胞とともにプレインキュベートした後にリガンドを添加して抗体と受容体の最大の相互作用を保障する試験で、抗体の阻害特性の程度と特異性をさらに評価した。これらの実験では、単分子層を5μg/mlのDC-101、ラット抗FLK-2 mAb(2A13)又は対照のラットIgG1(Zyme Labs)とともにプレインキュベートした後、40ng/mlのVEGFを添加した。比較するため、抗体とVEGFを同時に添加する競合検定を実施した。これら試験の結果は、抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体及びflk-1(VEGFR-2)/fmsでトランスフェクトされた細胞のプレインキュベーションだけがVEGFによる受容体の活性化を完全に阻害するが、VEGFによるflk-1(VEGFR-2)のリン酸化は、無関係のアイソタイプ対応ラット抗体の添加によって全く影響されないことを示している。抗fmsポリクローナルでプローブされた同じブロットの反応性(図11)は、1レーン当たり等レベルの受容体タンパク質を示している。これらのデータは、mAb DC-101で処理された細胞に観察されたリン酸化の欠如が、等量の発現された受容体のVEGF誘発リン酸化の遮断が原因であったことを示している。
【０１６７】
実施例 V-8  抗体と相同受容体型との相互作用
次に抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体が、ヒト内皮細胞上の相同受容体型と相互に作用するかどうかを確認する実験を実施した。クローン化HUVEC細胞(ATCC)にDC-101を濃度をあげながら添加して滴定するとこの抗体は複雑な結合挙動を示すことを示した。このデータは、内皮細胞に起こると報告されている抗体とVEGF受容体の特異的な相互作用(Vaisman et al.,J. Biol. Chem. 265: 19461-19466,1990)を示している。次に、DC-101の、VEGFで刺激されたHUVEC細胞との相互作用の特異性を、図8の場合に報告したのと類似の条件下でリン酸化検定法を利用して評価した。これらの試験では、DC-101が、リガンド成分を除いた場合の架橋VEGF-受容体のバンドについて報告されたのと類似の分子量を有するタンパク質のバンドをHUVEC細胞から免疫沈降させた(図 １2)。これらのバンドは、細胞がVEGFで刺激されるとリン酸化が増大することを示している(図12のレーン1と2を比較せよ)。さらにVEGFが誘発する、受容体バンドのリン酸化は、検定時に1μg/mlのヘパリンを添加することによって強化される(図12のレーン3)。この発見は、低濃度のヘパリンの存在下でVEGFの内皮細胞への結合が増大するという以前の報告(Gitay-Goren et al.,J. Biol. Chem.,267,6093-6098,1992)と一致している。
【０１６８】
各種受容体型がHUVEC上のVEGFと結合しそして両者が刺激によって結合できることが分かっている場合、免疫沈降されたどのタンパク質がDC-101と相互に作用して図12に見られるリン酸化バンドの複合体を生成するのか確かめることは困難である。分子量が約180(KDR(VEGFR-2))、155、130-135、120-125及び85の細胞表面が発現する受容体型はHUVEC上のVEGFに結合することが報告されている。このような知見は、幾種類もの受容体型がリガンドに刺激されるとKDR-flk-1(VEGFR-2/VEGFR-1)について報告されているのと類似の方式でヘテロ二量体を形成する可能性があることを示している。しかし、KDR(VEFR-2)以外のこれら受容体型の正確な性質と役割はやはり定義する必要がある。したがって、抗体の反応性は、KDR(VEGFR-2）とは独立した幾種類ものVEGF受容体のうちの1種との単一又は複数の相互作用から生ずる。
【０１６９】
DC-101は、ELISA法のフォーマットではヒトKDR(VEGFR-2)と反応せずまたFACS分析法で新たに単離されたHUVECにも結合しない。これらの試験結果は、DC-101とヒトKDR(VEGFR-2)が直接相互に作用する可能性は非常に低いことを示唆している。
【０１７０】
DC-101と異なり、Mab 25とMab 73の両者はELISA法のフォーマットでヒトKDR(VEGFR-2)と反応しかつFACS分析法で新たに単離されたHUVECと結合する。
【０１７１】
実施例 V-9  HUVECのマイトジェン検定法
抗体の存在下及び不在下、VEGFで刺激されたHUVEC細胞(ATCC)のマイトジェン検定法で抗体を検定したとき、内皮細胞に対するDC-101の阻害作用が観察された(図12)。これらの試験結果は、VEGFによる細胞増殖の著しい増加がDC-101によって約35%減少することを示している。ヘパリンは、これらの検定法で採用した増殖条件下では細胞の増殖に対して特異的な作用を全く示さない。
【０１７２】
DC-101は、VEGFが誘発するHUVECの増殖と受容体リン酸化に作用できるので、これらの結果は、Mabが、細胞表面での接触性は劣っているがHUVECの増殖に小さいながら何らかの役割を演じているまだ明らかになっていない受容体と相互に作用しているためであると考えられる。また適切な分子量のリン酸化バンドがVEGFで刺激されたHUVECからDC-101によって免疫沈降されることは、DC-101が、活性化された受容体複合体と結合するまだ明らかになっていないflk-1(VEGFR-2)様タンパク質と相互に作用するという概念を裏付けている。
【０１７３】
実施例 V-10  Mab 25とMab 73のC441細胞とHUVECに対する結合
Mab 25とMab 73はFACS分析法でC441細胞とHUVECに結合して両細胞系でインターナライゼーションを示す。ウエスタンブロットから得た結果は、両方の抗flk-1 Mabが、抗fmsポリクローナル抗体によるC441細胞からの免疫沈降体内のFLK/fms受容体の単一又は複数のバンドを検出できることを示している(プロトコルについては上記実施例 IV-2参照)。これらの抗体は、flk-1(VEGFR-2)/fms受容体のVEGF誘発活性化を特異的に中和するのでPDGFによるマウスPDGF受容体のリン酸化又はEGFによるヒトEGF受容体のリン酸化に全く影響しない(プロトコルについては上記実施例 IV-1参照)。これらの抗体は増殖検定法にてVEGFが刺激したHUVECを50%まで阻害できるが、DC-101は増殖に対する作用がはるかに小さい。
【０１７４】
実施例 V-11   Mab 25とMab 73によるKDR(VEGFR-2)の免疫沈降
KDR(VEGFR-2)は、活性化されたHUVECからMab 25とMab 73によって免疫沈降されるリンタンパク質の一種である。KDR(VEGFR-2)は、VEGFで刺激された初期継代HUVEC由来の抗flk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2)ポリクローナル抗体(IM142)を使ってウエスタンブロット法と免疫沈降分析法で検出された。逆に、これらの抗体によって、VEGF刺激HUVECから免疫沈降されたバンドは、IMI42と交差反応性であるが抗flt-1(抗VEGFR-1)ポリクローナル抗体とは交差反応性ではない。これらの発見によって、KDR(VEGFR-2)が、活性化された内皮細胞の増殖応答の原因であるVEGFR受容体として関係があるという実験的証拠に基づいて、MabがHUVECのKDR(VEGFR-2)の活性に影響すると推定できる(プロトコルについては上記実施例IV-3参照)。
【０１７５】
実施例 VI  非内皮(腫瘍)細胞上のVEGF受容体型の存在
抗ホスホチロシンによる免疫沈降と検出によって、いくつもの腫瘍系をDC-101とのタンパク質反応性でスクリーニングした。細胞系の8161(黒色腫)及びA431(類表皮腫)由来の免疫ブロットから分子量が約170ｋDと120kDのリン酸化バンドがえられた。これらの結果は、ヒトVEGF受容体型が腫瘍細胞などの非表皮細胞に発現されることを示している。
【０１７６】
類似の実験でKDR(VEGFR-2)様受容体が卵巣癌細胞系OVCAR-3に発現されることが分かった。これらの細胞もVEGFを分泌するようである。リン酸化バンドは、ウエスタンブロット法によって抗flk-1(VEGF-2)Mabと反応性であるVEGF刺激OVCAR-3細胞由来の抗KDR(VEGFR-2)ポリクローナル抗体で免疫沈降される。またこれら細胞からマウスMabによって免疫沈降されたバンドは、同じポリクローナル抗体と交差反応性を示す。さらに特定のマウス抗flk-1(VEGF-2)Mabは、増殖検定においてこれら細胞に対する阻害作用を誘発する。これらの試験結果は、ヒトVEGF受容体型の非表皮発現(すなわち腫瘍細胞での発現)を証明している。リン酸化及び増殖の検定からのデータも、VEGFが腫瘍形成中オートクリン及びパラクリンの方式で受容体の活性を調節できることを示唆している(プロトコルについては上記実施例VI-3参照)。
【０１７７】
実施例 VII   DC-101を使用する生体内の試験
実施例 VII -1   DC-101による血管新生の生体内での阻害
抗flk-1(VEGF-2)モノクローナル抗体が、VEGFを発現する腫瘍細胞の増殖を遮断するかどうかを確認するために生体内の試験を設計した。これらの実験では、高レベルのVEGFメッセージを有しかつ無血清培地で24時間調整したのち約5ng/mlのVEGF増殖因子を分泌するヒトグリア芽細胞腫の多形細胞系を使用した(図5)。
【０１７８】
ゼロ日目に、100万〜200万個のグリア芽細胞腫の細胞を無胸腺ヌードマウス(nu/nu;Charles River Labs)の側腹部に注射した。同じ日から開始して、これら動物にDC-101と対照の抗体(100μg/動物)を腹腔内注射した。これらマウスは続いて3、５、7、10、12、14、17、19及び21目に抗体処置を受けた。これら動物には、0、3、5、7、10、12、14、17、19及び21日目にDC-101又は対照のマウスFLK-2(2A13)受容体に対するマウス抗体を100μgずつ全接種量1mg/動物で注射した。腫瘍は5日目までには出現し始め、50日間追跡した。腫瘍の大きさを毎日パスで測定しそして腫瘍の容積は式：p/6 x大直径x(小直径)2(Baselga,J. Nat’l Cancer Inst. 85;1327-1333)で計算した。測定は一週間当たり少なくとも3回行い腫瘍の容積を上記のようにして計算した。DC-101グループで腫瘍を持っていた1匹の動物は、試験の初期に死んだのでグループ間の統計的有意性を決定するのに利用しなかった。
【０１７９】
図14aと14bは、個々の動物の38日間にわたる腫瘍増殖の低下についてDC101グループと対照の2A13グループを比較した結果を示す。すべての動物が試験の過程で大きさと数の異なる腫瘍を発生したが、DC-101で処置したマウスは腫瘍の進行が全般的に遅くなった。DC-101グループの一匹のマウスは、小さい腫瘍が観察された49日目まで腫瘍無しのままであった。その後も腫瘍の増殖は著しく抑制された。上記データの統計的分析を行ってこれら2グループ間の腫瘍の大きさの差を評価した。データは、腫瘍の大きさがコバリエート(covariate)として処置によって時間の経過とともに小さくなったとき標準共分散分析に付した。その分析結果は、DC-101グループの時間の経過とともに腫瘍の大きさが小さくなる状態は2A13を注射されたマウスに見られる前記状態とは有意差がある(p<0.0001)ことを示した。
【０１８０】
図15は、VEGFを分泌するヒトグリア芽細胞腫細胞系のGBM-18を移殖された無胸腺ヌードマウスにおけるDC-101の治療効能を示す。ヌードマウスにGBM-18細胞を皮下に注射し、三つの治療群すなわちPBSの対照、無関係ラットIgG1の対照及びDC-101の治療群に分割した。治療剤は、腫瘍の異種移植片と同時に投与され4週間続けた。その試験結果は、DC-101で治療したヌードマウスのGBM-18腫瘍の増殖が対照と比べて有意に少ないことを示した。この実験は、DC-101が腫瘍随伴血管内皮細胞上でのflk-1(VEGFR-2)のVEGFによる活性化を遮断することによって腫瘍の増殖を抑制しかつDC-101がVEGFを分泌する血管新生腫瘍に対する抗血管新生剤として治療上の価値があることを示している。
【０１８１】
flk-1(VEGFR-2)受容体チロシンキナーゼに対するモノクローナル抗体は、血管新生を排除することによって腫瘍の侵襲を阻害する。侵襲増殖と血管新生は悪性腫瘍の本質的な特性である。両現象は、表面移植検定法で良性角化細胞を悪性角化細胞から区別するのに適していることが証明された。コラーゲンゲルに結合された細胞単層をヌードマウスの背部筋肉に移植した後、全腫瘍細胞は最初、器質化した扁平上皮を形成したが悪性角化細胞だけが2-3週間以内に侵襲増殖した。良性細胞及び悪性細胞ともに血管新生を誘発した。悪性細胞に対する血管新生の応答は早期に起こるが非常に強力であり、毛細血管の増殖は悪性上皮の方に向かう。その上に、良性腫瘍細胞の移植体の毛細血管は2-3週間後に減少したが、悪性の角化細胞は進行中の血管新生のレベルを保持する。血管内皮増殖因子(VEGF)とそのコグネイト受容体は腫瘍の血管新生に重要な役割を演じている。DC-101を投与すると、進行中の血管新生を中断させて腫瘍の侵襲を阻害する。この抗体は、新たにできた血管の網目構造の成熟とそれ以上の拡大を防止したが、初期の血管新生の導入を有意には妨害しなかった。これらの試験結果は、腫瘍が侵襲するには血管新生が先行する必要がありそしてVEGF受容体がこのモデル系では血管新生を維持するのに決定的であるという証拠を提供している。
【０１８２】
実施例 VII -2  樹立グリア芽細胞腫(gbm-18)の腫瘍に対する各種濃度のDC-101の作用
無胸腺マウス(nu/nu)の皮下にGMB-18(ヒトの多形グリア芽細胞腫)を接種した。腫瘍が平均容積100-200ｍｍ3に達したときに抗体療法を開始した。治療は、(ｉ)DG-101：200、400もしくは800μg/注射；(ii)無関係のアイソタイプ適合ラットIgG(400μg/注射)；又は(III )PBSの6回の注射(３週間にわたって週2回ずつ)で構成されている。腫瘍の容積はパスで測定した。DC-101グループの腫瘍の阻害は、PBSグループおよび無関係モノクローナル抗体グループに対して有意差(＊)があることが分かった。
【０１８３】
別の実験は、ラット抗flk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体DC-101の、ヌードマウスのGBM-18腫瘍の増殖に対する作用を証明している。動物(nu/nu；Charles River Labs;10動物/グループ)へ、ゼロ日に、GBM-18細胞(ヒトグリア芽細胞腫[100];100万/動物）を皮下に注射した。PBＳ又はDC-101による治療(200μg/注射)は7日目に始まり3週間にわたり1週間に2回ずつ(6x)続けた。グラフは、腫瘍の平均容積及び各グループそれぞれの腫瘍増殖速度の時間の経過とともに低下するデータのプロット(λとして示す勾配；実線)並びに99%の信頼限界(点線)を示す。DC-101によって治療された動物の線の勾配はPBSで治療された動物のそれと有意差があった(p<0.01)。無関係のラットIgG1モノクローナル抗体(抗マウスIgA；Pharmigen)がGBM-18の異種移植片の増殖に対し全く影響せずPBSの場合に観察された結果と類似の結果を示したことに注目することが大切である(データは示していない)。
【０１８４】
実施例 VIII  抗flk-1(VEGFR-2)抗体はヌードマウス内のヒト腫瘍移植片の放射線もたらす治癒速度を選択的に増大する
この実施例は、マウスの腫瘍血管の内皮細胞に対し決定的なVEF受容体-2のflk-1(VEGFR-2)を遮断するモノクローナル抗体DC-101が分割放射線療法(RT)による腫瘍異種移植片の治療可能性を増大するかどうか、及びこの抗体が同時に正常組織(マウスの皮膚)の放射線反応を調節するかどうかを評価した。
【０１８５】
材料と方法：ヒトの肺の小細胞癌54Aと多形グリア芽細胞腫U87を、ヌードマウスの後足の皮下に移植した。治療は、腫瘍が直径8mmに達したとき(ゼロ日)に開始した。DC-101は、3日毎に20又は40mg/1kg体重の投与量で合計6回腹腔内に注射した。放射線の合計線量を、分割して段階的に毎日等しい分割線量で5日連続して照射した。ゼロ日に、マウスに抗体の第一注射を行うか又はRTを開始した。併用治療の場合は、DC-101の投与をゼロ日に開始しそしてRTを1日目に開始した。腫瘍の大きさは治療後1週間に2-3回測定した。局所に制御された腫瘍を有するマウスは、いずれかのグループに最後の腫瘍再発が観察された後90日間追跡した。腫瘍に照射した領域の皮膚の急性反応をRTを開始してから最初の30日間、採点スケールを使って評価した。
【０１８６】
試験結果：抗体を単独で使用した場合、投与量依存方式で両者の腫瘍の増殖阻害を誘発した(しかし後退は示さなかった)。その効果は、U87異種移植片より54A異種移植片の方が顕著であった。DC-101は、最低線量の放射線(合計25〜30 Gy)と併用すると、いずれのモデルでも、RT単独と比べて追加の腫瘍増殖が遅延した。抗体はまた、投与量依存方式でRTの治療効果を増大した。例えば、DC-101は、そのより高い投与量で、腫瘍の50%を局所的に抑制するのに必要な放射線の線量を減少させた。すなわち54A異種移植片の場合、RT単独のときの67.6Gyから併用療法のときの39.1Gyまで１／1.7に減少しそしてU87の場合、97.8Gyから74.8Gyまで1／1.3に減少した。また、DC-101のこのような作用は腫瘍に対し選択的であることが特に重要である。すなわち、この抗体による皮膚の放射線反応の平行変化は全く検出されなかった。追加の実験で評価したところ、DC-101が誘発した腫瘍の放射線応答の増大は、腫瘍の放射線増感又は酸素化の変化と関連は無かったが、抗体による腫瘍間質液の圧力の有意な減少と関連があった。
【０１８７】
結論：上記試験結果は、VEGF分子に対する主要受容体に対して、抗体がVEGFシグナル伝達経路を遮断すると、腫瘍の分割RTに対する治療応答を選択的に高めることができるので治療利益を提供できることを総合的に示唆している。
【０１８８】
実施例 IX  一本鎖抗体の製造
実施例 IX-1  材料
実施例 IX-1 (a). 細胞系とタンパク質
初代培養HUVECをEBM-2培地中に5%CO2下37℃で保持した。すべての検定に2〜5継代の細胞を使用した。VEGF165タンパク質をバキュロウイルス中に発現させ次いで精製した。KDR(VEGFR-2)の細胞外ドメインをコードする相補的DNAを、ヒト胎児腎臓mRNAからPT-PCRで単離し次いでベクターAP-TagのBglII部位及びBspE部位中にサブクローン化した。このプラスミドの中には、KDR(VEGFR-2)の細胞外ドメインのcDNAが、ヒト胎盤APのcDNAと同じ読み枠内に融合されている。このプラスミドを、ネオマイシン発現ベクターpSV-NeoとともにNIH 313細胞中にエレクトロポレートし次いで安定な細胞クローンをG418で選択した。その可溶性融合タンパク質KDR-APを、APに固定化したモノクローナル抗体を使ってアフィニティークロマトグラフィーで細胞培養液の上澄み液から精製した。
【０１８９】
実施例 IX-1 (b)  マウスの免疫化及び一本鎖抗体ファージ展示ライブラリーの構築
雌のBALB/Cマウスに、2ヶ月間に、KDR-AP 10μg含有のRIBI Adjuvant System 200μlを2回腹腔内(i.p.)注射し続いてRIBI adjuvant無しでi.p.注射を1回行った。またこのマウスにはKDR-AP 10μg含有のRIBI 200μlを第一免疫化の時点で皮下(s.c.)注射した。このマウスにKDR-AP 20μg の追加免疫注射を腹腔内に行い3日後に安楽死させた。ドナーマウスから脾臓を取り出しその細胞を分離した。RNAを抽出し次にmRNAを脾細胞の全RNAから精製した。scFvファージ展示ライブラリーを、線状ファージM13の表面に展示されたmRNAを使って構築した。
【０１９０】
scFvを線状ファージの表面に展示するときには、抗体のVHドメインとVLドメインを15個アミノ酸長のリンカー(GGGGS)3で連結し次にファージタンパク質III のN末端にに融合させる。アンバーコドン(TAG)が続く15個アミノ酸長のEタグ(TAG)を、検出と他の分析目的のためVLのC末端とタンパク質III の間に挿入した。Eタグとタンパク質III の間に配置されたアンバーコドンは、これによって、サプッレサー宿主(例えばTGI細胞）が形質転換されると、表面展示フォーマットのscFvを構築することができ、そして非サプレッサー宿主(例えばHB2151細胞)が形質転換されると可溶型のscFvを構築できる。
【０１９１】
アセンブルされたscFvDNAをpCANTAB 5Eベクターに連結した。形質転換されたTG1細胞を2YTAKプレートにプレートし次いでインキュベートした。そのコロニーをはがしとり10mlの2YT培地にいれ50%グリセリン液と混合してライブラリーストックとして-70℃で保管した。
【０１９２】
実施例 IX-1 (c)  バイオパニング
上記ライブラリーストックを対数期まで増殖させM13K07 ヘルパーファージでレスキューし次いで2YTAK培地(100μg/mlのアンピシリンと50μg/mlのカナマイシンを含有する2YT)内で30℃にて一夜増幅させた。このファージ製剤を4% PEG/0.5M NaCl中に沈殿させ、500μg/mlのAPタンパク質を含有する3%脱脂ミルク/PBS中に再懸濁させ次に37℃で1時間インキュベートして抗AP scFvを展示するファージを捕獲し他の非特異的結合を遮断した。
【０１９３】
KDR-AP(10μg/ml)をコートされたMaxisorp Star試験管(Nunc,Denmark)を、まず3%ミルク/PBSで37℃にて1時間遮断し次に前記ファージ製剤とともに室温で1時間インキュベートした。これら試験管を、PBSTで10回洗浄し次にPBS(0.1%のTween 20を含有するPBS)で10回洗浄した。結合したファージを、新しく調製した100mMトリエチルアミン溶液1mlを使って室温にて10分間溶離させた。その溶離したファージを、中間対数期のTG1細胞10mlとともに37℃で、30分間静置してインキュベートし次に30分間攪拌しながらインキュベートした。この感染されたTG1細胞を次に2YTAGプレートにプレートし30℃にて一夜インキュベートした。
【０１９４】
パニングを3ラウンド行った後にスクリーニングしたクローンの99%(185/186)が特異的なKDR(VEGFR-2)バインダーであることが分かった。しかしこれらバインダーのうち15個(8%)のみ、KDR(VEGFR-2)が固定化VEGFに結合するのを遮断できた。これら15個のクローンのDNA BstNIフィンガープリンティングを行うと、2種類の消化パターンが存在することを示したが、21個の無作為に採取したVEGF非ブロッカーは4種類のパターンを示した。またすべての消化パターンが第二ラウンドのパニングの後に確認されたクローンにも見られた。各消化パターンの代表的なクローンを第二ラウンドのパニングの後に発見されたクローンから採取してDNAの配列を決定した。配列を決定された15個のクローンから2個のユニークVEGFブロッカーと3個の非ブロッカーが同定された。KDR(VEGFR-2)に結合しないか又はVEGFがKDR(VEGFR-2)に結合するのを遮断しないscFvの1種であるp2A7を、すべての試験に対する負の対照として選択した。
【０１９５】
実施例 IX-1 (d)  ファージELISA法
個々のTG1クローンを96ウエルプレートに37℃で増殖させ次いで先に述べたようにしてM13K07ヘルパーファージでレスキューした。前記増幅したファージ製剤を、1/6容積の18%ミルク/PBSを使って室温で1時間遮断し、次にKDR-AP又はAPでコートしたMaxi-sorp 96ウエルマイクロタイタープレート(Nunc)に加えた(1μg/ml x 100μl)。室温で1時間インキュベートした後、これらプレートをPBSTで3回洗浄し次いでウサギ抗M13ファージAb-HRP複合体とともにインキュベートした。これらプレートを5回洗浄し、TMB ペルオキシダーゼの基質を添加し、マイクロプレートリーダーを使って450nmのODを読み取りscFv抗体を同定し配列を決定した。
【０１９６】
実施例 IX-1 (e)  可溶性scFvの製造
個々のクローンのファージを使って、非サプレッサーのイー・コリ宿主HB2151に感染させ次いでその被感染体を2YTAG-Nプレート上で選択した。HB2 151細胞内のscFvを、1mMのイソプロピル-1-チオ-B-D-ガラクトピラノシドを含有する2YTA培地内で前記細胞を30℃で培養することによって発現させた。20%(w/v) スクロース、200mM NaCl、1mM EDTA及び0.1mM PMSFを含有する25mM Tris(pH 7.5)に前記細胞のペレットを再懸濁させ続いて4℃で1時間ゆるやかに攪拌しながらインキュベートすることによってこれら細胞のペリプラズム抽出物を調製した。15,000 rpmで15分間遠心分離した後、上澄み液から、可溶性scFvを、RPAS Purification Module(Pharmacia Biotech)を使いアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１９７】
実施例 IX-2  検定法
実施例 IX-2(a)  定量KDR(VEGFR-2)結合検定法
精製された可溶性scFvのKDR(VEGFR-2)に対する結合性を定量試験するため二つの検定法を採用した。
【０１９８】
二種類のVEGFブロッカーのp1C11とp1F12、一種類の非ブロッカー、優性クローンのp2A6及び非バインダーのp2A7を含む四種類のクローンを、非サプレッサー宿主のイー・コリHB2151細胞を使って振とうフラスコ内で発現させた。抗Eタグアフィニティークロマトグラフィーによって、イー・コリのペリプラズム抽出物から、可溶性scFvを精製した。これらクローンの精製されたscFvの収量は100-400μg/l培養液の範囲内であった。
【０１９９】
直接結合検定法では、各種の量の可溶性scFvを、KDR(VEGFR-2)をコートした96ウエルMaxi-sorp マイクロタイタープレートに添加し次いで室温で1時間インキュベートした後、そのプレートをPBSTで3回洗浄した。次にこれらプレートを、100μlのマウス抗Eタグ抗体とともに室温で1時間インキュベートし続いて100plのウサギ抗マウス抗体-HRP複合体とともにインキュベートした。これらのプレートを洗浄し次にファージERISAについて先に述べた手順にしたがって増殖させた。
【０２００】
別の検定法すなわち競合VEGF遮断検定法では、各種の量の可溶性scFvを固定量のKDR-AP(50ng)と混合し次いで室温で1時間インキュベートした。次にその混合物を、VEGF165(200ng/ウエル)をコートした96ウエルマイクロタイタープレートに移し次に室温でさらに2時間インキュベートし、その後これらプレートを5回洗浄し次にApに対する基質を添加して、結合されたKDR-AP分子を定量した。次いでIC50すなわちVEGFに結合するKDR(VEGFR-2)の50%を阻害するのに必要なscFvの濃度を計算した。
【０２０１】
図16は、直接結合ELISA法で検定した、scFvの固定化KDR(VEFR-2)に対する投与量依存性結合を示す。図17に示すように、固定化VEGFに対するKDR(VEGFR-2)の結合を、クローンp1C11とp1F12は遮断するがp2A6は遮断しない。図17に示すデータは3回測定の平均値±SDである。負の対照のクローンp2A7は、KDR(VEGFR-2)に結合しないしKDR(VEGFR-2)のVEGFへの結合も遮断しない(図16と17)。クローンp1C11すなわちこの優性クローンは、パニングの各ラウンドの後、最高のKDR(VEGFR-2)との結合性能及びVEGFのKDR(VEGFR-2)への結合に対する最高の遮断性能を示した(表1)。KDR(VEGFR-2)に対する最大結合の50%を達成するのに必要なクローンp1C11の抗体濃度及びKDR(VEGFR-2)のVEGFへの結合を50%阻害するのに必要なクローンp1C11の抗体濃度はそれぞれ0.3nMと3nMであった(表1参照)。FACS分析の結果は、p1C11、p1F12及びp2A6が、HUVECの細胞表面にに発現された受容体にも結合できることを証明した。
【０２０２】
実施例 IX-2(b)  可溶性scFvのBLAcore 分析
可溶性scFvのKDR(VEGFR-2)との結合の機構は、BLAcore バイオセンサー(Pharmacia Biosensor)を使用して測定した。KDR-AP融合タンパク質をセンサーチップに固定化し次に可溶性scFvを62.5nM〜1000nMの範囲の濃度で注射した。センサグラム(sensorgram)を各濃度について得てプログラムBIA Evaluation 2.0を使って評価し、速度定数のkonとkoffを決定した。Kdを速度定数の比率koff/konから計算した。
【０２０３】
表1は、BIAcore装置の表面プラズモン共鳴の試験結果を示す。VEGF遮断性scFvのp1C11とp1F12はそれぞれ、固定化KDR(VEGFR-2)に2.1nMと5.9nM  のKdで結合した。非遮断性scFvのp2A6は、主として非常に高い解離速度が原因で最良のバインダーのp1C11より約6倍弱いアフィニティーでKDR(VEGFR-2)に結合した(Kd,11.2nM)。予想どおりにp2A7は、BIA core上の固定化KDR(VEGFR-2)に結合しなかった。
【０２０４】
実施例 IX-2(c)  リン酸化の検定
リン酸化の検定を、先に述べたプロトコルにしたがって早期継代HUVECで実施した。簡単に述べると、HUVECを、0.5%のウシ血清アルブミンを補充した無血清EBM-2基礎培地内で5μg/mlのscFvの存在下又は不在下室温にて10分間インキュベートし続いて20 ng/mlのVEGF165で室温にてさらに15分間刺激した。その細胞を溶解し、その細胞溶解液からKDR(VEGFR-2)受容体を、ウサギ抗KDR(抗VEGFR-2)ポリクローナル抗体(ImClone Systems Incorporated)に結合させたプロテインAセファロースビーズで免疫沈降させた。そのビーズを洗浄しSDSローディング緩衝液と混合し次いで上澄み液をウエスタンブロット分析に付した。KDR(VEGFR-2)のリン酸化を検出するため、ブロットを抗ホスホチロシンMabの4G10でプローブした。MAPキナーゼの活性を検定する場合は、細胞溶解液をSDS-PAGEによって分離し次いでホスホ特異的MAPキナーゼ抗体を使ってウエスタンブロット分析を行った。シグナルはすべてECLを使用して検出した。
【０２０５】
試験結果は、VEGFで刺激されたKDR(VEGFR-2)受容体のリン酸化を、VEGF遮断性scFvのp1C11は阻害できたがVEGF非遮断性scFvのp2A6は阻害できなかった。さらにp1C11は、MAPキナーゼp44/p42のVEGFの刺激による活性化も効果的に阻害した。対照的にp1C11とp2A6はどちらもMAPキナーゼp44/p42のFGFの刺激による活性化を阻害しなかった。
【０２０６】
実施例 IX-2(d)  抗マイトジェン検定
96ウエル組織培養プレート(Wallach,Inc.,Gaithersburg,MD)中のVEGF、bFGF又はEGF無しのEBM-2培地200μl内に、HUVEC(5x103細胞/ウエル)をプレートし次いで37℃にて72時間インキュベートした。各種の量の抗体をそれぞれ二つのウエルに添加し37℃で1時間プレインキュベートした後、VEGF165を最終濃度16ng/mlまで添加した。18時間インキュベートした後、0.25μCiの[3H]-TdR(Amersham)を各ウエルに添加しさらに4時間インキュベートした。その細胞を、氷上に置き血清含有培地で2回洗浄し続いて10%TCAとともに4℃で10分間インキュベートした。次にその細胞を水で1回洗浄し次いで25μlの2%SDS中で可溶化させた。シンチレーション液(150μl/ウエル)を添加しDNAが取り込んだ放射能をシンチレーションカウンター(Wallach ,Model 1450 Microbeta Scintillation Counter)で測定した。
【０２０７】
HUVEC上のVEGFで刺激されたマイトジェン活性を遮断するscFv抗体の性能は図18に示してある。VEGF遮断性scFvのp1C11は、HUVEC中でVEGFが誘発するDNA合成を、EC50すなわちVEGFが刺激するHUVECのマイトジェン誘発の50%を阻害する抗体の濃度、約5nMで強く阻害した。非遮断性scFvのp2A6はVEGFのマイトジェン活性に対する阻害作用を全く示さなかった。p1C11とp2A6はどちらもHUVECにおけるbFGFが誘発するDNA合成を阻害しなかった(図示せず)。図18に示したデータは少なくとも三つの別個の実験を表わしている。(!)VEGFのみ；(逆Ａ)VEGFなし。
【０２０８】
実施例 IX-3  p1C11からのキメラ抗体の製造
実施例 IX-3(a)  細胞系とタンパク質
初代培養のヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を、37℃で5%CO2雰囲気下EBM-2培地中に保持した。2〜5継代の細胞をすべての検定に使用した。VEGF165及びKDR(VEGFR-2)-アルカリホスファターゼ融合タンパク質(KDR-AP)をそれぞれバキュロウイルス及びNIH 3T3細胞で発現させ次いで上記手順にしたがって精製した。抗-KDR(抗-VEGFR-2)scFv p1C11及びscFv p2A6、すなわちKDR(VEGFR-2)に結合するがKDR(VEGFR-2)-VEGF相互作用を遮断しない抗体を、上記のようにKDR(VEGFR-2)で免疫化したマウスから構築したファージ展示ライブラリーから分離した。C225は、上皮増殖因子(EGF)受容体に対するキメラIgG1抗体である(上記事項参照)
【０２０９】
実施例 IX-3(b)  scFvp1C11の可変ドメインのクローン化
p1C11の軽鎖の可変ドメイン(VL)(配列番号：8と配列番号：16)及び重鎖の可変ドメイン(VH)(配列番号：7と配列番号：15)それぞれを、プライマー1と2及びプライマー3と4を使ってPCRによってscFv発現ベクターからクローン化した。次に哺乳類の細胞内でタンパク質を分泌するリーダーペプチドの配列を、プライマー5と2及びプライマー5と4を使ってPCRによってVLとVHそれぞれの5’末端に付加した。
【０２１０】
プライマー1： 5’ CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAG CTC3’[配列番号：37]
【０２１１】
プライマー2：5’ TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG3’ 
BamHI[配列番号：38]
【０２１２】
プライマー3：5’ CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC
AAG CTG3’[配列番号：39]
【０２１３】
プライマー4：5’ TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT3’ BamHI
[配列番号：40]
【０２１４】
プライマー5：5’ GGT CAA AAG CCT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT
TTT HindIII CTA GTA GCA ACT3’[配列番号：41]
【０２１５】
実施例 IX-3(c)  キメラp1C11 IgGの発現ベクターの構築
キメラIgGの軽鎖と重鎖を発現させる別個のベクターを構築した。クローン化したVL遺伝子をHindIII とBamHＩで消化しヒトκ軽鎖の定常領域(CL)を含むベクターpKN100に連結して、キメラp1C11軽鎖すなわちc-p1C11-Lの発現ベクターをつくった。クローン化したVH遺伝子をHindIII とBamHＩで消化しヒトIgG1(γ)重鎖の定常領域(CH)を含むベクターpGID105に連結して、キメラp1C11重鎖すなわちc-p1C11-Hの発現ベクターをつくった。両構造体は、制限酵素による消化で試験しジデオキシヌクレオチドの配列決定法によって確認した。
【０２１６】
図19に示したように、上記VHドメインとVLドメインの両者は、マークしてあるように、その5’末端がリーダーペプチド配列をコードする遺伝子セグメント(配列番号：23と配列番号：24)に正確に融合されている。上記VHドメインとVLドメインはそれぞれ、HindIII / BamHＩ部位を介して、ヒトγ1定常領域遺伝子のcDNAバージョンを含む発現ベクターpG1D105及びヒトκ鎖定常領域遺伝子のcDNAバージョンを含む発現ベクターpKN100に連結されている。各場合、発現はHCMViプロモーターの制御下にあり人工の終結配列で終わる。Kabatらの超可変配列の定義にしたがって定義される軽鎖と重鎖の相補的決定領域(CDR)の残基には下線を引いてあり、CDR-H1〜H3とCDR-L1〜L3それぞれに標識を付けてある。CDR-H1(配列番号：１と配列番号：9)；CDR-H2(配列番号：2と配列番号：10)；CDR-H3(配列番号：3と配列番号：11)；CDR-L1(配列番号：4と配列番号：12)；CDR-L2(配列番号：5と配列番号：13)；CDR-L3(配列番号：6と配列番号：14)。
【０２１７】
実施例 IX-3(d)  IgGの発現と精製
COS細胞に、IgGの一過性発現を行うため、等量のc-p1C11-Lプラスミドとc-p1C11-Hプラスミドを同時にトランスフェクトした。150mmの培養皿中のDMEM/10%FCS内で増殖させたサブコンフリュウエントCOS細胞を、40mM Tris(pH 7.4)を含有するDMEM 20mlで一回すすぎ、続いて4mlのDMEM/DEAE-Dextran/DNA混合物（40mMの Tris、0.4mg/mlのDEAE- Dextran(Sigma)及び各々20μgづつのc-p1C11-Ｌプラスミドとc-p1C11-Hプラスミドを含有するDMEM）とともに37℃で4.5時間インキュベートした。その細胞を、100nMのクロロキン(Sigma)を含有するDMEM/2%FCS 4mlとともに37℃で1時間インキュベートし続いて1.5mlの20%グリセリン/PBSとともに室温で1分間インキュベートした。その細胞を、DMEM/5%FCSで二回洗浄し次いで同じ培地20ml中で37℃にて一夜インキュベートした。その細胞をプレーンDMEMで二回洗浄した後、細胞培養培地を無血清DMEM/HEPESに変更した。その細胞培養上澄み液を、トランスフェクトしてから48時間後と120時間後の時点で収集した。製造メーカー(Pharmacia Biotech)が説明するプロトコルにしたがって、プロテインGカラムを使いアフィニティークロマトグラフィーによって、プールした上澄み液からキメラIgGを精製した。IgGを含有する画分をプールし緩衝液をPBSに変更し次いでCentricon 10 濃縮器(Amicon Corp.,Beverly,MA)を利用して濃縮した。そのIgGの純度をSDS-PAGEで分析した。精製した抗体の濃度は、ヤギ抗ヒトｙ鎖特異的抗体を捕獲剤として使いそしてHRP-複合ヤギ抗ヒトk鎖抗体を検出剤として使ってELISA法で測定した。標準曲線は臨床グレードの抗体C225を使用して校正した。
【０２１８】
プロテインGによってアフィニティー精製を行った後、約150 kDの単一のタンパク質バンドがSDS-PAGEに見られた。HRP-複合抗ヒトIgG1 Fc特異的抗体を使用してウエスタンブロット分析を行った結果、精製されたタンパク質中にヒトIgG Fcタンパク質の存在することが確認された(図示せず)。
【０２１９】
ELISA試験の結果は、c-p1C11が親のscFvより一層効率的に固定化KDR(VEGFR-2)に結合することを示している(図20)。
【０２２０】
実施例 IX-4  検定法と分析法
実施例 IX-4(a)  FACS分析法
早期継代HUVEC細胞を増殖因子欠除EBM-2培地中で一夜増殖させてKDR(VEGFR-2)の発現を誘発させた。その細胞を収穫しPBSで3回洗浄しc-p1C11 IgG(5μg/ml)とともに4℃で1時間インキュベートし続いてFITC標識化ウサギ抗ヒトFc抗体(Capper,Organon Teknika Corp.,West Chester,PA)とともにさらに60分間インキュベートした。その細胞を洗浄し次いでフローサイトメーター(Model EPICS(登録商標),Coulter Corp.,Edison,NJ)で分析した。
【０２２１】
図21は、KDR(VEGFR-2)を発現するHUVECに結合するc-p1C11のFACS分析の結果を示すグラフである。親のscFv p-1C11で先に見られたように、c-p1C11は早期継代HUVECに発現されたKDR(VEGFR-2)に特異的に結合する。
【０２２２】
実施例 IX-4(b)  定量的KDR(VEGFR-2)結合の検定法
各種の量の抗体を、KDR(VEGFR-2)をコートした96ウエルMaxi-sorp マイクロタイタープレート(Nunc,Denmark)に添加して室温で1時間インキュベートした後、そのプレートを0.1%のTween-20を含有するPBSで3回洗浄した。次にそのプレートを、scFvの場合は100μlのマウス抗Eタグ抗体-HRP複合体(Pharmacia Biotech)又はキメラIgGの場合は100μlのウサギ抗ヒトIgG Fc特異的抗体-HRP複合体(Cappel,Organon Teknika Corp.)とともに室温で1時間インキュベートした。そのプレートを5回洗浄し、TMBペルオキシダーゼの基質（KPL,Gaithersburg,MD）を添加し次に450nmのODをマイクロプレートリーダー(Molecular Device,Sunnyvale,CA)を使って読み取った。
【０２２３】
図20は抗体と固定化KDR(VEGFR-2)の直接結合を示すグラフである。c-p1C11が、固定化KDR(VEGFR-2)受容体に、親のscFvより一層効率的に結合することが示されている。
【０２２４】
実施例 IX-4(c)  BIA core 分析法
抗体がKDR(VEGFR-2)に結合する機構をBIAcore バイオセンサー(Pharmacia Biosennsor）を使って測定した。KDR(VEGFR-2)-AP融合タンパク質をセンサーチップに固定化し次いで抗体又はVEGFを25nM〜200nMの範囲内の濃度で注射した。センサーグラムを各濃度で得て、プログラムBIA Evaluation 2.0を使用して評価し速度定数konとkoffをもとめた。Kdを速度定数の比率koff/konとして計算した。
【０２２５】
BIA coreによる分析結果は、c-p1C11が親のscFvより高いアフィニティーでKDR(VEGFR-2)と結合することを明示した(表2)。c-p1C11のKdは、scFvのKdが2.1であるのに比べて0.82nMである。c-p1C11のアフィニティーが高くなっているのは、2価のキメラIgGの分解速度の低いことが主な原因である。c-p1C11がKDR(VEGFR-2)に結合するアフィニティー(Kd)が、天然リガンドVEGFがKDR(VEGFR-2)に結合するアフィニティー(Kd)に類似していて我々のBIA core 分析法で測定したところ0.93nMであること(表2)に注目することが大切である。
【０２２６】
実施例 IX-4(d)  競合VEGF結合検定法
第一検定法では、各種の量の抗体を固定量のKDR(VEGFR-2)-AP(50ng)と混合し室温で1時間インキュベートした。次にその混合物を、VEGF165(200ng/ウエル)をコートした96ウエルマイクロタイタープレートに移して室温でさらに2時間インキュベートした後プレートを5回洗浄し次いでAPに対する基質(リン酸p-ニトロフェニル、Sigma)を加えて結合KDR(VEGFR-2)-AP分子を定量した。次にEC50すなわちKDR(VEGFR-2)のVEGFに対する結合を50%阻害するのに必要な抗体の濃度を計算した。
【０２２７】
図22は、c-p1C11が投与量依存方式で、KDR(VEGFR-2)受容体が固定化VEGFと結合するのをを遮断することを示しているこのキメラ抗体はVEGF-KDR相互作用をより強力に遮断し、そのIC50(すなわちKDR(VEGFR-2)のVEGFとの結合を50%阻害するのに必要な抗体の濃度)は、scFvのIC50が2.0 nMであるのに比べて0.8 nMである。また対照のscFvのp2A6はKDR(VEGFR-2)に結合するが(図20)、VEGF-KDR(VEGFR-2)相互作用を遮断しない(図22)。
【０２２８】
第二検定法では、各種の量のc-p1C11抗体又は非放射能VEGF165タンパク質を固定量の125Ｉ標識化VEGF165と混合し次いでKDR(VEGFR-2)受容体をコートした96ウエルマイクロタイタープレートに添加した。これらプレートを室温で2時間インキュベートし5回洗浄し次に固定化KDR(VEGFR-2)受容体に結合した放射能標識化VEGF165の量を計数した。放射能標識化VEGFの固定化KDR(VEGFR-2)受容体との結合を50%阻害するのに必要なc-p1C11及び非放射能VEGF165の濃度を求めた。
【０２２９】
放射能標識化VEGF165の結合の阻害の試験結果は図23に示してある。示したデータは3回測定値の平均値である。C-p1C11は、固定化KDR(VEGFR-2)受容体と結合するとき投与量依存方式で125I標識化VEGFと効率的に競合することが示されている。予想通りに、EGF受容体に対するキメラ抗体C225はKDR(VEGFR-2)受容体に結合せずすなわちVEGF-KDR(VEGFR-2)相互作用を阻害しない(図示せず)。
【０２３０】
実施例 IX-4(e)  リン酸化検定法
サブコンフルーエントHUVEC細胞を、増殖因子欠乏EBM-2培地中で24〜48時間増殖させた後に実験した。50nMのオルトバナジン酸ナトリウムで30分間前処理した後、その細胞を抗体の存在下又は不在下15分間インキュベートし続いて20ng/mlのVEGF165又は10ng/mlのFGFで室温にてさらに15分間刺激した。次にその細胞を、溶解緩衝液(50nM Tris、150mM NaCl、1% NP-40、2mM EDTA、0.25% デオキシコール酸ナトリウム、1mM PMSF、1μg/ml ロイペプチン1μg/ml ペプスタチン、10μg/ml アプロチニン,pH 7.5)に溶解しそしてその細胞溶解液をKDR(VEGFR-2)とMAPキナーゼ両者のリン酸化の検定に使用した。抗KDR(VEGFR-2)抗体のMab 4.13(ImClone Systems)に結合させたプロテインAセファロースビーズ(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,CA)によって、前記細胞溶解液からKDR(VEGFR-2)受容体を免疫沈降させた。タンパク質類をSDS-PAGEで分離してウエスタンブロット分析に付した。KDR(VEGFR-2)のリン酸化を検出するため、ブロットを抗ホスホチロシンMabのPY20(ICN Biomedicals,Inc. Aurora,OH)でプローブした。MAPキナーゼの活性を検定する場合は、細胞溶解液をSDS-PAGEで分離し続いてホスホスペシフィックMAPキナーゼ抗体(New England Biolabs,Beverly,MA)を使ってウエスタンブロット分析に付した。シグナルはすべてECL(Amersham,Arlington Heights,IL)を使用して検出した。両検定法において、ブロットはポリクローナル抗KDR(VEGFR-2)抗体(ImClone Systems)で再度プローブして等量のタンパク質がSDS-PAGEゲルの各レーンに負荷されたことを確認した。
【０２３１】
c-p1C11は、VEGFで刺激されるKDR(VEGFR-2)受容体のリン酸化及びp44/p42MAPキナーゼの活性化を効率的に阻害する。対照的に、C225は、VEGFで刺激されるKDR(VEGFR-2)受容体及びMAPキナーゼのの活性化の阻害を全く示さない。c-p1C11とC225はいずれも単独ではKDR(VEGFR-2)とp44/p42MAPキナーゼの活性に対して全く作用しない。scFv p1C11について先に示したように、c-p1C11はp44/p42MAPキナーゼのFGFで刺激される活性化を阻害しない(図示せず)。さらにscFv p2A6又はキメラIgG型p2A6(c-p2A6)はいずれもKDR(VEGFR-2)受容体及びMAPキナーゼのVEGFで刺激される活性化を阻害しない(図示せず)。
【０２３２】
実施例 IX-4(f)  抗マイトジェン検定法
ヒト内皮細胞のVEGFで刺激されるマイトジェン誘発に対する抗KDR(VEGFR-2)抗体の作用を、HUVECを使って［3H］-TdR DNA取り込み検定法で確認した。96ウエル組織培養プレートの、VEGF、bFGF又はEGF無しのEBM-2培地200μl中に、HUVEC(5x103細胞/ウエル)をプレートし、37℃で72時間インキュベートした。各種の量の抗体ををそれぞれ二つのウエルに添加し37℃で1時間プレインキュベートした後、VEGF165を最終濃度16 ng/mlまで添加した。18時間インキュベートした後、0.25μCiの[3H]-TdRを各ウエルに添加してさらに4時間インキュベートした。DNAが取り込んだ放射能をシンチレーションカウンターで測定した。図24に示すデータは少なくとも三つの別個の実験を示している。
【０２３３】
c-p1C11とscFv p1C11の両者は、VEGFによって刺激されるHUVECのマイトジェン誘発を効果的に阻害する(図24)。c-p1C11は、HUVECのVEGF誘発されるマイトジェン誘発に対する、親のscFvより強力な阻害剤である。HUVECのVEGFで誘発されるマイトジェン誘発の50%を阻害するのに必要な抗体の濃度は、c-p1C11の場合は0/8nMでありそしてscFvの場合は6nMである。予想通りに、scFv p2A6はVEGFが刺激する内皮細胞の増殖に対する阻害作用を全く示さない。
【０２３４】
特許を請求する本発明は、上記の明細書と容易に入手できる文献類と出発材料によって実施することができる。しかし出願人は、米国 20852 メリーランド州 ロックビル パークローン・ドライブ 12301 所在のthe American Type Culture Collection(ATCC)に、先に列挙したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を寄託した。
【０２３５】
ラット抗マウスflk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系DC-101は1994年1月26日に寄託した(ATCC受託番号 HB11534)。
【０２３６】
マウス抗マウスflk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体Mab 25を産生するハイブリドーマ細胞系M25.18A1は1996年7月19日に寄託した(ATCC受託番号HB12152)。
【０２３７】
マウス抗マウスflk-1(VEGFR-2)モノクローナル抗体Mab 73を産生するハイブリドーマ細胞系 M73.24は1996年7月19日に寄託した(ATCC受託番号HB12153)。
【０２３８】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定及びその条約(ブダペスト条約)に基づく規則に基づいて実施した。この条約によって、生きている培養物が寄託の日から30年間保管することが保証される。その微生物はブダペスト条約の条項に基づき出願人とATCCの同意を条件としてATCCで入手することができ、関連する米国特許を発行するのに制限無しに入手できるように保証される。この寄託された菌株が入手できることは、米国特許法にしたがって米国政府当局が認可した権利を犯して本発明を実施する許可証とみなしてはならない。
【０２３９】
【表１】
2005525370.tif 000002
【０２４０】
【表２】
2005525370.tif 000003
【０２４１】
実施例 Ｘ
この実施例は、VEGFRのアンタゴニストすなわち抗flt-1(抗VEGFR-1)モノクローナル抗体であるMF-1の産生を証明する。
【０２４２】
標準のハイブリドーマ技術を使ってラット抗VEGFR-1モノクローナル抗体を発生させた。8週齢のラットに、完全フロイントアジュバントを混合したVEGFR-1 Fc(定常領域）組換えタンパク質(R&D Systems,Minneapolis, MN)  100μgを腹腔内(i.p.)に注射して活性化した。次にそのラットを3回追加免疫化した後、不完全フロイントアジュバントと混合した同じタンパク質と融合させた。
【０２４３】
骨髄腫細胞 P3x63Ag8.653を免疫化ラット由来の脾細胞及び骨髄細胞と融合させることによってハイブリドーマ細胞を生成させた。抗VEGFR-1特異的クローンを、ELISA法ベースの結合・遮断検定法で、VEGFR-1アルカリホスファターゼ(AP)組換えタンパク質を使用して選択した。陽性のクローンを限界希釈法でサブクローン化した。
【０２４４】
ハイブリドーマ由来の抗VEGFR-1モノクローナル抗体(mAbs)を、無血清培地内で連続フィード醗酵させることによって得た。このmAbを、γ結合プロテインG セファロースを使いアフィニティークロマトグラフィーによって無血清ならし培地から精製した。生体内試験に使用したこれらmAbは、Pyrogent Plus (登録商標)Limulus Amebocyte Lysate kit(BioWhittaker,Walkersville,MD)を使用してエンドトキシンについて試験した。動物実験に使った抗体製剤はすべて1.25 EU/ml以下のエンドトキシンを含有していた。抗VEGFR-1ポリクローナル抗体を、組換えVEFR-1 APタンパク質で免疫化したウサギから発生させて、γ結合プロテインGカラム(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)によって精製した。
【０２４５】
抗VEGFR-1 mAbの免疫化学的特性を、アフィニティーについてのBIAcore分析のみならずELISA法ベースの結合・遮断検定法によって決定した。結合検定法は、96ウエルマイクロタイタープレート(Falcon Flexibie plate,Becton Dickinson,Bedford, MA)を50ng/ウエルのVEGFR-1 AP又はVEGFR-2 APのタンパク質で4℃にて一夜コートすることによって実施した。ウエルに、5%ウシ血清と0.05% Tween 20を含有するリン酸緩衝食塩水(遮断緩衝液)200μlを添加して遮断し室温(RT)にて2時間インキュベートした。次にウエルを5回洗浄し次いで遮断緩衝液で希釈して50μlにした各種濃度のmAbとともに室温で1時間インキュベートした。ウエルを再び5回洗浄し、50μlのヤギ抗ラットIgG-HRP(BioSource Internationl,Camarillo,CA)とともにRTで1時間インキュベートした。最後に、ウエルを5回洗浄し、次いでの50μl の3,3’,5,5’-テトラ-メチルベンジジン(TMB)基質(Kirkegaard and Perry Lab Inc.,Gaithersburg,MD)とともにRTにて15分間インキュベートした。1M リン酸(H3PO4) 50μlを添加して反応を停止させ次いでマイクロタイタープレートリーダーによって450nmでウエルの読み取りを行った。
【０２４６】
VEGFR-1/VEGF又はP1GFの遮断検定法の場合、ウエルに100ngのVEGF又はP1GF(R&D Systems,Minneapolis,MN)を4℃で一夜かけてコートした。ウエルを上記のようにして遮断し、次に各種濃度のmAbとともに1時間プレプレインキュベートした100ngのVEGFR-1 APとともにRTにて1時間インキュベートした。ウエルを洗浄し次いでリン酸p-ニトロフェニル(PNPP,Sigma,St.Louis MO)とともにインキュベートした。RTで30分間放置して発色させ、次にマイクロタイタープレートリーダーによって405nmで読み取りを行った。
【０２４７】
抗VEGFR-1 mAbのVEGFR-1への結合の機構をBIAcore biosensor  (Pharmacia Bosensor)を使用して確認した。VEGFR-1 Fc融合タンパク質をセンサーチップ上に固定化し、mAbを3.125nM〜50nMの範囲内の濃度で注射した。各濃度でのセンサーグラムを得て、プログラム BIA Evaluation 2.0を使って評価しKd値に対する速度定数の比率kon/koffを求めた。
【０２４８】
実施例 XI
この実施例は、上皮増殖因子受容体(EGFR)のアンタゴニストであるモノクローナル抗体 ERBITUX(商標)(IMC-C225又はC225としても知られている)及び治療上有効な量の血管内皮増殖因子受容体(VEGFR)のアンタゴニストである抗VEGFR-1モノクローナル抗体 DC101を投与した後に腫瘍の増殖が阻害されることを証明する。
【０２４９】
免疫組織化学分析及び抗血管新生治療に使う抗体は以下のように入手した。すなわちラット抗マウスCD31/PECAM-1抗体はPharmingen(San Diego,CA)から、マウス抗増殖性細胞核抗原(PCNA)クローンPC10DAKO A/SはDAKO Corp.(Carpinteria,CA)から、ペルオキシダーゼ複合ヤギ抗ラット免疫グロブリン(IgG)(H+L)とTexas Red複合ヤギ抗ラットIgGはJackson Research Laboratories(West Grove,PA)から、ペルオキシダーゼ複合ラット抗マウスIgG2aはSrotec Harlan Bioproducts for Science,Inc.(Indianapolis,IN)から、及びラット抗マウスVEGF受容体-2モノクローナル抗体(Prewett et al.,1999；Witte et al.,1995)とキメラ抗ヒトEGF受容体モノクローナル抗体(Goldstein et al.,1995)はImClone Systems,Inc.(New York,NY) (Prewett et al.,1999；Witte et al.,1998)からそれぞれ入手した。
【０２５０】
8週齢の雄の無胸腺ヌードマウス(National Cancer Insitute,Animal Production Area,Frederick,MD)に、500μlのHBSS中1.0 x106個のKM12L4結腸癌細胞を、1mlのシリンジに取り付けた30ゲージの針で腹腔内注射した。マウスを無作為に選んで、四つの治療群(1群当たり10匹のマウス)：対照、DC101、C225又はDC101とC225の群の中の1群に入れた。動物実験はすべてthe Animal Care and Use Committee of MD Anderson Cancer Center and UKCCCR,1998によって認可された指針に基づいて行った。
【０２５１】
腫瘍細胞を注射して3日後から始めて、3日毎に、対照の媒体［リン酸緩衝食塩水(PBS)］、DC101(0.8mg)、C225(1.0mg)又はDC101(0.8mg)とC225(1.0mg)を1ml シリンジに取り付けられた27ゲージの針で腹腔内に注射した。なお各注射は全容積700μlで実施した。マウスは毎週、体重測定を行った。対照群が瀕死の状態になったとき(治療を開始してから約30日後)、マウスを殺し、完全剖検を実施し、腫瘍の負荷を定量し、そして腫瘍を収穫し下記のように分析した。
【０２５２】
各マウスについて剖検を実施し、腹膜の腫瘍の大きさをパスで測定し腫瘍の大きさの平均値を求め次に代表的な病変部を切り取った。腹水の程度を、治療群の割り振りを知らない研究者が以下のように評価した。すなわちグレード0：腹水無し、グレード1：少量の腹水、グレード2：中程度の量の腹水、グレード3：多量の腹水、グレード4：腹部が緊張している非常に多量の腹水のグレードで評価した(Aparicio et al.,1999)。腫瘍の切片はOCTコンパウンドで埋包して-70℃で冷凍するか又はホルマリンで固定してパラフィンで埋包した。
【０２５３】
組織の切片は、標準の脱パラフィン処理を行うか(ホルマリンで固定してパラフィンで埋包した組織の場合)又はアセトンとクロロホルム内で固定し(OCＴコンパウンド中で冷凍された組織の場合)、次いで先に述べたようにして(Shaheen et al.,1999)免疫組織化学分析を実施した。簡単に述べると、内因性ペルオキシダーゼをメタノール中3%H2O2で遮断し次にスライド(slide)をPBSで洗浄しタンパク質遮断溶液(１％の正常ヤギの血清と5%の正常ウマの血清を補充したPBS)内で20分間インキュベートし次いでCD31又はPCNAに対する第一抗体とともに4℃にて一夜インキユベートした。次にそのスライドを洗浄しタンパク質遮断溶液とともにインキュベートし、ペルオキシダーゼ複合第二抗体とともに室温で1時間インキュベートし、洗浄しDASとともにインキュベートし、洗浄しヘマトキシリンで対比染色を行い洗浄し、次いでUniversal Mountの上に乗せ次にホットプレート上で56℃で乾燥した。CD31の場合の染色される冷凍切片は、ペルオキシダーゼ複合抗体の代わりにTexas Red(赤色蛍光)と複合された第二抗体とともにインキュベートした。第一抗体を省くと負の対照として役立つ。
【０２５４】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)仲介dUTPニックエンド標識化(TUNEL)染色を、製造メーカーのプロトコルにしたがって実施した。簡単に述べると、切片を4%のメタノール無しパラホルムアルデヒドで固定し洗浄し、0.2% Triton X-100で透過性にし、洗浄し、キットの平衡緩衝液とともにインキュべートし、平衡緩衝液とヌクレオチド混合物とTdT酵素を含有する反応混合物とともに37℃で1時間インキュベートし、2x標準クエン酸塩食塩水とともに室温で15分間インキュベートしてTdT反応を停止させ、洗浄し、DAPIマウントで染色し(核が見えるようにするため)次いでガラスカバースリップをあてがった。
【０２５５】
腫瘍血管とPCNA陽性細胞の数を光学顕微鏡法(無作為に選んだ5箇所の0.159mm2のフィールドを100倍の倍率で計数した)で測定し、ディジタル画像をつくり次いでOptimas Image Analisis software(Biscan,Edmond,WA)で処理した。アポトーシス細胞を以下のようにして免疫蛍光で目視可能にした。切片のディジタル画像をつくりAdobe Phtoshop software(Abode Systems, Mountain View,CA)で処理した。CD311陽性内皮細胞(BC)は、ローダミンフィルターを使って局在赤色蛍光で検出した。アポトーシスは、蛍光フィルターを使って、腫瘍細胞(TC)の場合は局在緑色蛍光で又はECの場合は赤緑色蛍光で確認した。核は、フィルターを使ってDAPIの青色蛍光で検出した。細胞は、1スライド当たり5箇所の連続してオーバーラップしていない0.011mm2のフィールド内の細胞を計数した。なお第一フィールドは腫瘍の非壊死部分から無作為に選んだ。次に1フィールド当たりのアポトーシスECとアポトーシスTCの比率を［アポトーシス細胞の%=(アポトーシス細胞の数/細胞の全数)x100］として計算した。
【０２５６】
治療を開始して30日後に腹膜の病巣の直径を測定して肉眼的腫瘍の負荷を評価した。その腹膜の腫瘍の平均の大きさは、DC101群が対照群より50.3%小さくそしてDC101+C225併用群が対照群より66.7%小さかった。試験終了時には、対照群のマウスとC225群のマウスの100%に腹膜の疾患があったが、DC101群のマウスの10%と併用治療群のマウスの30%は疾患の証拠を全く示さなかった。最終的に腹水のグレードの平均は、DC101群が対照群より66.7%低くそして併用治療群が対照群より100%低かった。さらに,DC101+C225群は腹水の量がDC101群より有意に低く、併用群には事実上腹水が見られなかった。
【０２５７】
腫瘍細胞は、PCNAを免疫組織化学分析によって染色して腫瘍細胞の増殖を評価した。腹膜の腫瘍は、DC101群が対照群より50.3%小さくそしてDC101+C225群が対照群より66.7%小さかった。
【０２５８】
マウスの腹膜の病巣の切片はCD31を免疫蛍光染色して、ECの数を血管新生の尺度として検出した。DC101群とDC101+C225群は、ECの数が対照群より有意に少なかった。
【０２５９】
CD31の同時染色あり及び無しで免疫蛍光TUNEL染色を腹膜転移の切片に実施してTCとECのアポトーシスを定量した。DC101群とDC101+C225群には対照群より多くのアポトーシスTCとECが観察され、DC101群はTCが対照群の14.3倍でECが対照群の226倍であり、DC101+C225群はTCが対照群の23.6倍でECが対照群の331倍であった。そしてDC101+C225群にはDC101単独群より多くのアポトーシスTCとECが観察され、DC101+C225群はTCがDC101群の1.7倍であり、ECがDC101群の1.46倍であった。
【０２６０】
実施例 XII  ヒトFabの製造
実施例 XII(a)  タンパク質と細胞系
初代培養HUVECを、Cornell Medical Center,New YorkのDr.S. Rafiiから入手し、EBM-2培地(Clonetics,Walkersille,MD)中に37℃にて5%CO2雰囲気下で保持した。可溶性融合タンパク質KDR(VEGFR-2)-AP、その免疫グロブリン(Ig)ドメイン欠失変異体及びFlk-1-APを安定にトランスフェクトされたNIH3T3に発現させ、APに対する固定化モノクローナル抗体を使ってアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養液の上澄み液から精製した。なおこの方法はLu et al.,J. Biol. Chem.275:14321-14330(2000)に記載されている。VEGF165タンパク質は、バキュロウイルスに発現させ、Zhu et al.,Cancer Res.58:3209-3214(1998)に記載の手順にしたがって精製した。白血病細胞系のHL60とHELは10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI中に保持した。
【０２６１】
実施例 XII(b)  ファージELISA法
個々のTG1クローンを採取し96ウエルプレート内で37℃にて増殖させ次に前記のようにしてM13K07ヘルパーファージでレスキュー(rescue)した。その増幅されたファージ製剤を1/6容積の18%ミルク/PBSでRTにて1時間遮断し次にKDR(VEGFR-2)-AP又はAP(1μg/mlx100μl)でコートしたMaxi-sorp 96ウエルマイクロタイタープレート(Nunc)に添加した。RTで1時間インキュベートした後、そのプレートをPBSTで3回洗浄し次いでウサギ抗M13ファージ-HRP複合体(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ）とともにインキュベートした。これらプレートを5回洗浄しTMBペルオキシダーゼの基質(KPL,Gaithersburg,MD)を添加し次にマイクロプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を使用して450nmの吸光度を読み取った。
【０２６２】
実施例 XII(c)  DNA BstN I パターンの分析及びヌクレオチドの配列決定
各選択ラウンドの後の抗KDR(VEGFR-2)Fabクローンの多様性を、制限酵素の消化パターン(すなわちDNA指紋)で分析した。個々のクローンのFab遺伝子挿入体を、プライマー：PUC19リバースの5’AGCGGATAACAAT TTCACACA GG3’；及びfdtet seqの5’GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT3’を使用してPCR増幅を行った。その増幅された生成物を高頻度切断酵素BstN Iで消化し3%アガロースゲルで分析した。各消化パターンの代表的なクローンのDNA配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定法で求めた。
【０２６３】
実施例 XII(d)  可溶性Fabフラグメントの発現と精製
個々のクローンのプラスミドを使って非サプレッサーのイー・コリ宿主HB2151を形質転換した。これらの細胞を、1mMのイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラノシド(IPTG,Sigma)を含有する2YTA培地内で30℃にて培養することによって、HB2151内のFabフラグメントの発現を誘発させた。これら細胞のペレットを、20%(w/v)スクロース、200mM NaCl、1mM EDTA及び0.1mM PMSFを含有する25mM Tris(pH 7.5)中に再懸濁させ続いて緩やかに攪拌しながら4℃で1時間インキュベートすることによって細胞のペリプラズム抽出物を製造した。15,000 rpmで15分間遠心分離した後、製造メーカーのプロトコルにしたがって(Amersham Pharmacia Biotech)、プロテインGのカラムを使いアフィニティークロマトグラフィーで、上澄み液から、可溶性Fabタンパク質を精製した。
【０２６４】
実施例 XII(e)  ファージ展示ライブラリーからのヒト抗KDR (VEGFR-2)Fabの選択
この選択を行うために、3.7x1010個のクローンを含有する大きなヒトFabファージ展示ライブラリー(DeHaard et al.,J. Biol. Chem.,274: 18218- 18230 (1999))を使用した。このライブラリーは、それぞれ、ヒト定常軽鎖遺伝子(κとλ)及びIgG1重鎖CH1ドメインをコードするDNAそれぞれにに融合されたPCR増幅抗体の可変軽鎖遺伝子及び可変重鎖遺伝子からなっている。軽鎖構造体と重鎖構造体の両者は、軽鎖の場合シグナル配列のpelBが先行しそして重鎖の場合遺伝子III シグナル配列が先行している。重鎖構造体はさらに、ファージ展示のための遺伝子III タンパク質の一部分、ヘキサヒスチジンタグ及びアンバーコドン(TAG)が続く11個のアミノ酸長のc-mycタグをコードしている。このヘキサヒスチジンタグとc-mycタグは精製又は検出に使用できる。このアンバーコドンは、このコドンで非サプレッサー宿主(例えばHB2151細胞)が形質転換されると、サプレッサー宿主(例えばTG1細胞)を使ってファージを展示するか又は可溶型のFabフラグメントを産生することができる。
【０２６５】
ライブラリーストックは、対数期まで増殖させ、M13-K07ヘルパーファージでレスキューされ次いで2YTAK培地(100μg/mlのアンピシリンと50μg/mlのカナマイシンを含有する2YT)中で一夜30℃にて増幅させた。ファージ製剤を4%PEG/0.5M NaCl中に沈降させ、500μg/ml のAPタンパク質を含有する3%無脂ミルク/PBSに再懸濁させ次に37℃で1時間インキュベートして、ファージが展示する抗AP Fabフラグメントを捕獲し他の非特異的結合を遮断する。
【０２６６】
KDR(VEGFR-2)-AP(PBS中10μg/ml)えおコートしたMaxisorp Star 試験管(Nunc,Rosklide,Denmark)をまず3%ミルク/PBSdで37℃にて1時間遮断し次に前記ファージ製剤とともにRTにて1時間インキュベートした。その試験管をPBST(0.1%Tween-20を含有するPBS)で10回洗浄し次にPBSで10回洗浄した。結合したファージを、新しく調製した100mM トリメチルアミン溶液(Sigma,St.Louis,MO)1mlでRTにて10分間溶離させた。その溶離されたファージを10mlの中期対数期TG1細胞とともに37℃にて、30分間静置し次に30分間攪拌した。その感染されたTG1細胞をペレット化しいくつもの大きい2YTAGプレート上にプレートして30℃にて一夜インキュベートした。そのプレート上に増殖したすべてのコロニーをはがしとって3〜5mlの2YTA培地中にいれ、グリセリン(最終濃度10%)と混合し等分して−70℃で貯蔵した。次のラウンドの選択のために、ファージのストック100μlを2YTAG培地25mlに添加して中期対数期まで増殖させた。その培養物を、M13K07ヘルパーファージでレスキューし、増幅させ、沈降させ、そして免疫試験管に固定化されたKDR(VEGFR-2)-APの濃度を低下させかつ結合工程後の洗浄回数を増やして上記手順に続いて選択するのに使用した。
【０２６７】
タンパク質の濃度及び最初の結合工程後の洗浄回数を変えながら合計3ラウンドの選択を実施した。各ラウンドの選択後に、93個のクローンを無作為に採取しKDR(VEGFR-2)に対する結合性についてファージELISA法で試験した。第二選択後に採取した93個のクローンの内70個(75%)及び第三選択後に回収したクローンの90%以上はKDR(VEGFR-2)に対する結合性が陽性であった。これはこの選択法の効率が高いことを示唆している。第二選択で確認された70個のすべてのバインダーからのFabをコードするDNAセグメントを増幅しBstN Iで消化し次に指紋パターンを比較した。合計42種類のパターンが観察されたが、これは単離された抗KDR(VEGFR-2)Fabの優れた多様性を示している。交差反応性の試験によって、42個の抗体の内19個が特異的なFlk-1(VEGFR-１)バインダーであるが残りの23個の抗体はKDR(VEGFR-2)とそのマウス同族体Flk-1に結合すること が証明された。その後の選択は、抗KDR(VEGFR-2)Fabフラグメントの存在下又は不在下での可溶性KDR(VEGFR-2)の固定化VEGFに対する結合性を測定する競合VEGF結合検定法で達成した。この検定法で、VEGFとKDR(VEGFR-2)の間の結合を遮断できる4種のクローンが同定された。これらクローンの内3種はKDR(VEGFR-2)特異的バインダーであり1種はFlk-1と交差反応をした。DNAの指紋分析及び配列決定分析で、4種のKDR(VEGFR-2)/VEGF遮断抗体はすべて非反復DNA及びアミノ酸配列が異なっていることが確認された。
【０２６８】
上記4種のクローンのVHとVLのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列を表3に示す。
【０２６９】
【表３】
2005525370.tif 000004
【０２７０】
VHとVLの連鎖の完全配列は配列の一覧表に示してある。D1F7における、VHのクレオチド配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：19と20に示してあり、VLのクレオチド配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：21と22に示してある。
【０２７１】
D2C6における、VHのクレオチド配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：23と24に示してあり、VLのクレオチド配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：25と26に示してある。
【０２７２】
D2H2における、VHのクレオチド配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：30と31に示してあり、VLのクレオチド配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列番号32と33に示してある。
【０２７３】
D1H4における、VHのクレオチド配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列番号：27と24に示してあり、VLのクレオチド配列とアミノ酸配列はそれぞれ配列番号28と29に示してある。
【０２７４】
第二ライブラリーを、D2C6の単一重鎖と元のライブラリー由来の軽鎖の異なる集団を組み合わせて作成した。10種類の追加のFabを同定して、SA1、SA3、SB10、SB5、SC7、SD2、SD5、SF2、SF7及び1121と命名した。これら10種のFabのVLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は下記のように表わされる。SA1における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：34と35で表わされる。SA3における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：36と37で表わされる。SB10におけるVLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：38と39で表わされる。SB5における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：40と41で表わされる。SC7における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：42と43で表わされる。SD2における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：44と45で表わされる。SD5における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：46と47で表わされる。SF2における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：48と49で表わされる。SF7における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：50と51で表わされる。1121における、VLのヌクレオチドとアミノ酸の配列は配列番号：52と53で表わされる。
【０２７５】
VLCDRの配列を表4に示す。
【０２７６】
【表４】
2005525370.tif 000005
【０２７７】
実施例 XIII   検定法
実施例 XIII (a)  KDR(VEGFR-2)/VEGF相互作用に対するKDR(VEGFR-2)の定量的結合性と遮断性
直接の結合性を検定する場合、各種の量の可溶性Fabタンパク質を、KDR(VEGFR-2)をコートした96ウエルMaxi-sorpマイクロタイタープレートに添加しRTで１時間インキュベートした後、そのプレートをPBSTで3回洗浄した。次にそのプレートを、100μlのウサギ抗ヒトFab抗体-HRP複合体(Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.,West Grove,PA)とともにＲＴにて1時間インキュベートした。そのプレートを洗浄し、ファージELISA法用に上記手順にしたがって展開させた。競合KDR(VEGFR-2)/VEGF遮断検定法では、各種の量のFabタンパク質を固定量のKDR(VEGFR-2)-AP(100ng)と混合しRTで1時間インキュベートした。次いでその混合物を、予めVEGF165(200ng/ウエル)をコートした96ウエルマイクロタイタープレートに移しRTにてさらに2時間インキュベートした後、そのプレートを5回洗浄してAPに対する基質(リン酸p-ニトロフェニル、Sigma)を添加した。450nmの吸光度を測定して、結合したKDR(VEGFR-2)-AP分子(8)を定量した。次に、IC50すなわちKDR(VEGFR-2)のVEGFに対する結合を50%阻害するのに必要なFabタンパク質の濃度を計算した。
【０２７８】
VEGFを遮断する4種類のクローン(DC26、D2H2、D1H4、D1F7)を可溶性Fabとして発現させ次にプロテインGアフィニティークロマトグラフィーでイー・コリのペリプラズム抽出物から精製した。これらクローンの精製されたFabタンパク質の収量は培養液1l当たり60〜400μgの範囲内であった。精製された各Fab製剤をSDS-PAGEで分析したところ、予想通りの分子サイズを有する単一タンパク質のバンドが得られた。
【０２７９】
クローンD2C6とD2H2がより有効なバインダーであり、これらにクローンD1H4とD1F7が続いている。またこれら4種のFabはすべてKDR(VEGFR-2)の固定化VEGFに対する結合を遮断する。KDR(VEGFR-2)の固定化VEGFに対する結合を50%阻害するのに必要な抗体の濃度は、クローンD2C6、D2H2及びD1H4の場合約2nMでありそしてクローンD1F7の場合20nMである。クローンD1F7だけがVEGFのFlk-1に対する結合を遮断し、そのIC50は約15nMである。
【０２８０】
実施例 XIII (b)  可溶性scFvのBIAcoreによる分析
可溶性Fabタンパク質のKDR(VEGFR-2)に対する結合の機構を、BIAcore biosensor(Pharmacia Biosensor)を使って表面プラズモン共鳴によって測定した。KDR(VEGFR-2)-AP融合タンパク質をセンサーチップに固定化し次いで可溶性Fabタンパク質を1.5nM〜100nMの範囲の濃度で注射した。各濃度でセンサーグラムを得て、プログラムBIA Evaluation 2.0を使って評価し速度定数konとkoffを求めた。Kdは速度定数の比率koff/konから計算した。
【０２８１】
３種のKDR(VEGFR-2)特異的Fabフラグメントはすべて固定化受容体に2〜4nmのKdで結合している(表5)。交差反応性のクローンD1F7はKdが45nMであり、そのKdはKDR(VEGFR-2)特異的クローンのKdより約10倍〜15倍弱い。上記3種のKDR(VEGFR-2)特異的FabフラグメントのKdはすべて類似しているが、個々の結合機構すなわちこれら抗体のkonとkoffは全く異なっており、例えばD2C6は最も速いオンレート(on-rate)を有し一方D1H4は最も遅い
オフレート(off-rate)を有していることは注目すべきである。
【０２８２】
【表５】
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【０２８３】
数値はすべてBIAcore 分析法で求め、少なくとも3個の別個の測定値から得た平均値±SEを示してある。
【０２８４】
実施例 XIII (c)  結合エピトープのマッピング
KDR(VEGFR-2)の細胞外Ig様ドメイン欠失変異体の製造については先に述べた(Lu et al.,(2000))。エピトープマッピング検定法では、全長のKDR(VEGFR-2)-AP、二つのKDR(VEGFR-2)Ig-ドメイン欠如変異体のAP融合体及びFlk-1-APが第一に、ウサギ抗AP抗体(DAKO-immunoglobulins, Glostrup，Denmark)を捕獲剤として使用して96ウエルプレート(Nunc)上に固定化される。次にそのプレートを、各種の抗KDR(VEGFR-2)Fabタンパク質とともにRTで1時間インキュベートし続いてウサギ抗ヒトFab抗体-HRP複合体とともにインキュベートした。そのプレートを洗浄し上記のように展開した。
【０２８５】
抗KDR(VEGFR-2)Fabフラグメントの結合エピトープを、全長のKDR (VEGFR-2)及び二つのKDR(VEGFR-2)Igドメイン欠如変異体を使ってマップした。KDR(VEGFR-2)(1-3)は、N末端の最初の三つのIgドメインを含有するKDR(VEGFR-2)変異体である。KDR(VEGFR-2)(3)は3番目のIgドメインだけを含有する変異体である。クローンのD2C6とD1H4はKDR(VEGFR-2)、KDR(VEGFR-2)(1-3)及びKDR(VEGFR-2)(3)に等しく良好に結合するのでそれらの結合エピトープをIgのドメイン3内に配置している。クローンのD2H2とD1F7は全長のKDR(VEGFR-2)及びKDR(VEGFR-2)(1-3)にはるかに効率的に結合するが、これはKDR(VEGFR-2)Igのドメイン(1-3)内により広く結合するエピトープが存在することを示している。クローンD1F7だけがFlk-1と交差反応を行う。
【０２８６】
実施例 XIII (d)  抗マイトジェン検定
HUVEC(5x103細胞/ウエル)を、96ウエル組織培養プレート(Wallach,Inc.,Gaithersburg,MD)上の、VEGF、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)又は上皮増殖因子無し(EGF)のEBM-2培地200μlにプレートして37℃にて72時間インキュベートした。各種量のFabタンパク質をそれぞれ二つのウエルに添加し37℃で1時間プレインキュベートした後、VEGF165を最終濃度16ng/mlまで添加した。18時間インキュベートした後、0.25μCiの[3H]TdR(Amersham)を各ウエルに添加してさらに4時間インキュベートした。これら細胞をPBSで1回洗浄しトリプシン処理を行い次いで細胞ハーベスター(Harvester96,MACHIII ,TOMTEC,Orange,CT)でガラスフィルター(Printed Fitermat A,Walach)に収穫した。その膜をH2Oで3回洗浄し風乾した。シンチレーション液を添加し、DNAが取り込んだ放射能をシンチレーションカウンター(Wallach,Model 1450 Microbeta Scintillation Counter)で測定した。
【０２８７】
HUVEC上のVEGFが刺激するマイトジェン活性を遮断するヒト抗KDR(VEGFR-2)Fabの性能。4種のヒトFabフラグメントはすべて、HUVEC内でVEGFが誘発するDNA合成を、投与量依存方式で阻害した。VEGFが刺激する[3H]-TdRのHUVEC内への取り込みを50%阻害したFabの濃度(EC50)は、クローンD2C6とD1H4では約0.5nMであり、クローンD2H2では0.8nMでありそしてクローンD1F7では15nMである。対照はVEGFだけ(1500cpm)及び単純培地(60cpm)を含有していた。ウエルは二つづつ検定した。示したデータは少なくとも三つの別個の実験を示す。
【０２８８】
実施例 XIII (e)  白血病移動の検定
HL60細胞とHEL細胞を、無血清単純RPMI 1640 培地で3回洗浄し次いでその培地中に1x106/mlで懸濁させた。細胞懸濁液100μlずつを、HL60細胞の場合は3μm孔トランスウエルインサートに添加し又はHEL細胞の場合は8μm孔トランスウエルインサート(Costar(登録商標),Corning Incorporated,Corning,NY)に添加して抗KDR(VEGFR-2)Fabタンパク質(5μg/
ml)とともに37℃にて30分間インキュベートした。次に前記インサートを、VEGF165あり又は無しの無血清RPMI1640 0.5mlが入っている24ウエルプレートのウエルに入れた。37℃、5%CO2での移動を、HL60細胞の場合16〜18  時間実施し又は HEL細胞の場合4時間実施した。移動した細胞を下部コンパートメントから集めてCoulter counter(Model Z1,Coulter Electronics Ltd.,Luton,England)で計数した。
【０２８９】
VEGFは、200ng/で達成された最大刺激によって投与量依存方式でHL60細胞とHEL細胞の移動を誘発した。すべての抗KDR(VEGFR-2)Fabフラグメントが、HL60細胞とHEL細胞のVEGFが刺激する移動を有意に阻害した。対照として、C225のFabフラグメントすなわちEGF受容体に対する抗体は、この検定で有意な阻害作用を示さなかった。
【０２９０】
実施例 XIV  IgGの製造
実施例 XIV(a)  IgG発現用ベクターの構築
IgGの軽鎖と重鎖の発現に使うベクターを別個に構築した。クローン化VL遺伝子を消化してベクターpKN100に連結した。クローン化VH遺伝子を消化して、ヒトIgGI(γ)重鎖定常ドメインを含むベクターpGID105に連結した。構築物を、制限酵素による消化によって検査し次いでジデオキシヌクレオチド配列決定法によって確認した。両方の場合、発現はHCMVプロモーターの制御下で行われ、人工の停止配列で停止させた。
【０２９１】
アセンブルした軽鎖と重鎖の遺伝子を次にLonza GS 発現ベクターpEE6.1及びpEE12.1中にクローン化した。CHO細胞及びNSO細胞の安定なトランスフェクションを行うため単一ベクター中に組み換えた。トランスフェクトされた細胞をグルタミンマイナス培地で培養し、1g/Lほどのレベルで抗体を発現させた。
【図面の簡単な説明】
【０２９２】
【図１】モノクローナル抗体DC-101がマウスflk-1:SEAPSを免疫沈降させるが単独のSEAPSは免疫沈降させないことを証明するモノクローナル抗体DC-101によるflk-1(VEGFR-2)/SEAPSの免疫沈降のウエスタンブロットをしめす。
【図２Ａ】トランスフェクトされた3T3細胞のflk-1(VEGFR-2)/fms 受容体のVEGF165が誘発するリン酸化に対する抗flk-1(VEGFR-2) モノクローナル抗体DC-101の作用を示す競合阻害検定の結果を示す。
【図２Ｂ】モノクローナル抗体DC-101による阻害に対するflk-1(VEGFR-2)/fms 受容体のVEGFが誘発するリン酸化の感度を示す。前記抗体のレベルを変えながら組み合わせた最大の刺激濃度のVEGF165(40ng/ml)でC441細胞を検定した。
【図３Ａ】mAb DC-101の存在下でのflk-1(VEGFR-2)/fms 受容体のVEGF誘発リン酸化の滴定結果を示す。C441細胞を、5μg/mlのmAbDC-101の存在下(レーン1〜4）又は不在下(レーン5〜8)に示したVEGFの濃度で刺激した。抗体の存在下で検定された刺激されていない細胞(レーン9)は対照として有用である。
【図３Ｂ】図3aの各レーンのリン酸化された受容体のレベルのデンシトメトリースキャンが、各VEGF濃度に対してプロットされて、過剰のリガンド濃度におけるmAbの阻害する程度を示す。本明細書の実施例で述べるように抗ホスホチロシンで検出するため細胞溶解液を調製した。
【図４】予め結合されたmAb DC-101による、VEGF- flk-1(VEGFR-2)/fmsの活性化の阻害を示す。C441細胞は、DC-101の不在下(レーン3と4)及び存在下(5と6)に示されたVEGFの濃度で刺激した。刺激されていない細胞(レーン1と2)は対照として役立つ。mAbを2組の条件を使って検定した。Pの場合は、細胞をmAbと予め結合させ続いて室温で15分間VEGFで刺激した。Cの場合は、mAbとリガンドを同時に加えて上記のように検定した。
【図５】モクローナル抗体DC-101の濃度を変える処置及びグリア芽細胞腫細胞からのならし培地(GB CM)による、flk-1(VEGFR-2)/fms受容体のVEGF誘発リン酸化を示す。
【図６】flk-1(VEGFR-2)/fmsをトランスフェクトされた3T3細胞(C441)に結合する抗flk-1(VEGFR-2)mAbのFACS分析結果を示す。トランスフェクトされたflk-1(VEGFR-2)/fms3T3細胞を、10μg/mlの抗flk-1(VEGFR-2)mAb DC-101又はアイソタイプで適合した無関係抗flk-1mAb 23H7 とともに氷上で60分間インキュベートした。細胞を洗浄し、FITCに複合させたヤギ抗マウスIgG 5μgとともに再度インキュベートし、洗浄し次いでフローサイトメトリーで分析して抗体の結合を測定した。データは、無関係mAb 23H7で検出した蛍光に対するDC-101細胞〜C441細胞の蛍光のレベルを示す。
【図７】トランスフェクトされた3T3細胞系 C441上のflk-1(VEGFR-2)/fms受容体に対するmAb DC-101の飽和結合を示す。密集C441細胞を、24ウエルプレート中でmAb DC-101とともにこのmAbの濃度を増大しながら(50ng/mlから2μg/mlまで)4℃で2時間インキュベートした。細胞を洗浄し次いで5μgの抗ラットIgG-ビオチン複合体ともにインキュベートした。結合を検出するため、細胞を洗浄し、ストレプタビジン-HRPの1:1000希釈液とともにインキュベートし、洗浄し、比色検出装置(TMB)中でインキュベートした。データは、mAb DC-101の増大する濃度に対する540 nmの吸光度を示す。細胞のみに対する第二抗体の結合は、比特異的結合について調節するため各測定値から差し引いた。データは三つの独立した実験の平均値を示す。
【図８】VEGFで刺激されたflk-1(VEGFR-2)/fmsをトランスフェクトされた3T3細胞からのリン酸化flk-1(VEGFR-2)/fmsの免疫沈降を示す。細胞を実験手順の章でのべたようにしてVEGFで刺激し、次に溶解液を下記のような無関連の又は関連する抗体で免疫沈降させた。すなわち1.ラット抗FLK2 IgG2a(mAb 2A13)；2.ラット抗flk-1(VEGFR-2)IgG1(mAb DC-101)；3.ラット抗FLK2 IgG1(mAb 23H7)；4.ウサギ抗fmsポリクローナル抗体で免疫沈降させた。免疫沈降させたタンパク質をSDS-PAGEに付し続いてウエスタンブロットに付した。VEGFで活性化された受容体の免疫沈降は、そのブロットを抗ホスホチロシン抗体でプローブすることによって検出した。
【図９】mAb DC-101による阻害に対するflk-1(VEGFR-2)/fms受容体のVEGFが誘発するリン酸化の感度を示す。予め結合させて行う検定と競合検定を、指定の抗体濃度にて40ng/mlのVEGFで実施した。本明細書の実施例に記載したように抗ホスホチロシンで受容体を検出するため、細胞溶解液を調製した。
【図１０】fms受容体のCSF-1が誘発するリン酸化に対するmAb DC-101の作用を示す。(B)では、fms/FLK-2でトランスフェクトされた3T3細胞系10A2を、5μg/mlのmAb DC-101の不在下(レーン3と4)及び存在下(レーン5と6)最適刺激レベルのCSF-1で刺激した。抗体の不在下(レーン1)又は存在下(レーン2)に検定される刺激されていない細胞は対照として役立つ。本明細書の実施例に記載したように抗ホスホチロシンで検出するため、細胞溶解液を調製した。
【図１１】活性化されたflk-1(VEGFR-2)/fms受容体のmAb DC-101による中和の特異性を示す。DC-101(IgG1)又は無関連の抗FLK-2 ラットモノクローナル抗体2A13(IgG2a)もしくは23H7(IgG1)の存在下、C441細胞を20もしくは40ng/mlのVEGFで刺激した。検定は、VEGFの不在下(レーン1〜3)及びVEGFの存在下[競合条件下(レーン4〜8)又は予め結合させた条件下(レーン9〜11)]、各抗体で実施した。本明細書の実施例で述べたように抗ホスソチロシンで検出するため細胞溶解液を調製した。ブロットをはがしとり再度プローブし、前記fms受容体のC末端領域に対するウサギポリクローナル抗体を使ってflk-1(VEGFR-2)/fms受容体を検出した。
【図１２】VEGFで刺激されたHUVEC細胞からのリン酸化受容体バンドの免疫沈降を示す。HUVEC細胞を、内皮増殖培地(EGM）内で3日間培地を変更せずにサブコンフリューエンシーまで増殖させた。受容体型は、刺激されていない細胞(レーン1)、VEGFで刺激された細胞(レーン2)及び1μg/mlのヘパリンの存在下VEGFで刺激された細胞(レーン3)それぞれの溶解液から、mAb DC-101によって免疫沈降させた。リン酸化の検定、免疫沈降及びリン酸化された受容体型の検出は、実験手順の章で述べたようにして実施した。
【図１３】HUVEC細胞がVEGFに応答して行う増殖に対するmAb DC-101の作用を示す。図6の説明文に述べたようにして細胞を48時間増殖させた。細胞を、以下の検定条件下すなわち、培地に入れない(未処置)；新鮮な内皮増殖培地(完全培地）の変更；1μg/mlのヘパリンの不在下又は存在下での10ng/mlのVEGFの添加；及びVEGF及びVEGF-ヘパリンで処置した細胞の条件下にて、1μg/mlのDC-101の存在下で検定した。細胞は、細胞増殖検定キット(promega)を使用して550nmでの比色検出によって増殖について検定した。
【図１４Ａ】DC-101(ラット抗flk-1モノクローナル抗体)による、個々の動物の腫瘍増殖の低下を示す。
【図１４Ｂ】対照の2A13群(ラット抗flk-2モノクローナル抗体)による、個々の動物の腫瘍増殖の低下を示す。
【図１５】無胸腺ヌードマウスに、ヒトグリア芽細胞腫細胞系GBM-18を皮下注射して、3群：PBSの対照、無関連ラットIgG1の対照23H7、及びDC-101に分割した。これらの処置は、腫瘍の異種移植と同時に行い4週間続けた。
【図１６】各種scFv抗体(p1C11、p1F12、p2A6及びp2A7)の固定化KDR(VEGFR-2)に対する直接結合を示すグラフである。
【図１７】各種scFv抗体(p1C11、p1F12、p2A6及びp2A7)による、KDR(VEGFR-2)の固定化VEGF165に対する結合の阻害を示すグラフである。
【図１８】scFv抗体(p2A6及びp1C11)による、VEGFが誘発するHUVECの増殖の阻害を示すグラフである。
【図１９】c-p1C11のVH鎖とVL鎖のヌクレオチド及び演繹アミノ酸配列である。
【図２０】抗体(c-p1C11、p1C11、p2A6)の固定化KDR(VEGFR-2)に対する直接結合を示すグラフである。
【図２１】KDR(VEGFR-2)を発現するHUVECに対するc-p1C11の結合のFACS分析結果を示すグラフである。
【図２２】各種scFv抗体(c-p1C11、p1C11及びp2A6)による、KDR(VEGFR-2)受容体の固定化VEGF165に対する結合の阻害を示すグラフである。
【図２３】c-p1C11及び非放射能VEGF165による、放射能標識化VEGF165の固定化KDR(VEGFR-2)に対する結合の阻害を示すグラフである。
【図２４】抗KDR(VEGFR-2)抗体(c-p1C11、p1C11)による、VEGFが誘発するHUVECの増殖の阻害を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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