(57)【要約】患者から血液試料を入手すること、及び腫瘍組織内グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の代理マーカーとして血中グルタチオン（ＧＳＨ）のレベルを検出すること、を含む、その必要のある患者の化学療法に対する感受性を予測するための新規の方法が、ここに記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から血液試料を入手すること、及び腫瘍組織内グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の代理マーカーとして血中グルタチオン（ＧＳＨ）の存在を検出することを含む、その必要のある患者の化学療法に対する感受性を予測する方法。
【請求項２】
所定の腫瘍がＧＳＴ過剰発現を伴っているか否かを予測することを可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍が、胃腸腫瘍、子宮癌、卵巣癌、頭頸癌、肺癌、肉腫、肝臓腫瘍、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫及び血液学的腫瘍からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍が、頭部、頸部及び肺の癌より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
患者から血液試料を入手し、腫瘍組織内グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の代理マーカーとして血中グルタチオン（ＧＳＨ）のレベルを検出し、その血中ＧＳＨレベルが、その患者が抗癌化学療法剤に対する抵抗性への新規の又は後の進行を示す可能性を指示する範囲にあるか否かを決定することにより、その患者の化学療法に対する感受性を予測すること、及び上記ＧＳＨレベルに基づき適切かつ有効な化学療法的治療を選択することを含む、その必要のある患者のための適切な化学療法的治療を選択する方法。
【請求項６】
胃腸腫瘍、子宮癌、卵巣癌、頭頸癌、肺癌、肉腫、肝臓腫瘍、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫及び血液学的腫瘍からなる群より選択される腫瘍に罹患している患者のための適切な化学療法的治療を選択するための、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍が、頭部、頸部及び肺の癌より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血中ＧＳＨレベルに基づき、化合物Ｎ−（５−｛［（５−｛［（５−｛［（２−｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝エチル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−ｌＨ−ピロール−３−イル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−４−［（２−ブロモアクリロイル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（内部コードＰＮＵ１６６１９６）もしくはその医薬適合性の塩又は従来の抗腫瘍剤のその必要のある患者への投与を含み得る適切な化学療法的治療を選択することを可能にする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
従来の抗腫瘍剤が、アルキル化剤、アントラサイクリン系及び白金誘導体からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＳＨ／ＧＳＴ系を過剰発現している腫瘍に罹患している患者を治療する方法であって、まず、患者から血液試料を入手し、腫瘍組織内ＧＳＴ活性の代理マーカーとして血中ＧＳＨのレベルを検出し、そのＧＳＨレベルが、その患者が化学療法剤に対する抵抗性への新規の又は後の進行を示す可能性を指示する範囲にあるか否かを決定することにより、その患者の化学療法に対する感受性を予測すること、及び上記ＧＳＨ／ＧＳＴレベルに基づき、有効量のＮ−（５−｛［（５−｛［（５−｛［（２−｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝エチル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−ｌＨ−ピロール−３−イル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−４−［（２−ブロモアクリロイル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（内部コードＰＮＵ１６６１９６）又はその医薬適合性の塩の投与を含み得る適切かつ有効な化学療法的治療を選択すること、を含む前記方法。
【請求項１１】
腫瘍が、胃腸腫瘍、子宮癌、卵巣癌、頭頸癌、肺癌、肉腫、肝臓腫瘍、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫及び血液学的腫瘍からなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍が、頭部、頸部及び肺の癌より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍組織内ＧＳＴ活性の代理マーカーとして血中ＧＳＨレベルを決定するためのキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療の領域に関し、より具体的には、化学療法的治療を受けている患者のグルタチオン（ＧＳＨ）又はＧＳＨ関連酵素グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の血中レベルを測定することにより、その患者の化学療法に対する感受性を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高レベルのＧＳＨ又はＧＳＴは、例えば、アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、マスタード系、ＢＣＮＵ）、白金錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン）並びにアントラサイクリン系（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びダウノルビシン）のようないくつかの抗腫瘍薬に対する抵抗性を付与するため、グルタチオン（ＧＳＨ）又は（ＧＳＴ）のレベルは、細胞障害性抗腫瘍治療に対する応答と相関していることが、当技術分野において既知である［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３５：３４０５−３４０９（１９８６）］。
【０００３】
ＧＳＨ及びＧＳＴは、いずれも、例えば、血球、血漿、血清、循環血中芽球及び病理学的（腫瘍）組織のようないくつかのヒト組織に遍在している。
【０００４】
ＧＳＨ及びＧＳＴに関する一般的な参照としては、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：４３１３−４３２０（１９９４）；Ｂｒｉｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７２（２）：３２４−３２６（１９９５）；Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ３：１１３−１２１（１９９８）を参照のこと。
【０００５】
ＧＳＴ、特にＧＳＴ−πは、大半の腫瘍型において高レベルに存在する。正常組織と比較して増加したＧＳＨのレベル及びＧＳＴの活性が、例えば、胃腸腫瘍、子宮癌、卵巣癌、頭頸癌、肺癌、肉腫、肝臓腫瘍及び血液学的腫瘍を含むいくつかの腫瘍型において見出されている［Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：５２２５−５２２９（１９８９）；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２７（４．５）：３３７−３８６（１９９２）］。
【０００６】
ＧＳＨは、多数の毒性傷害により生じた細胞損傷に対する重大な防御的役割を果たしている。前臨床研究及び臨床研究によって、ＧＳＨ／ＧＳＴ過剰発現と、癌又は化学療法に対する癌の応答との間の相関が確立されている。
【０００７】
（ＧＳＨ及びＧＳＨ関連酵素ＧＳＴからなる）ＧＳＨに基づく解毒系の改変も、いくつかの抗新生物剤に対する様々な応答性と関連付けられている。
【０００８】
これまでのところ、ＧＳＨ／ＧＳＴを過剰発現している腫瘍においては、従来の化学療法に対する応答率が低いため、療法に対する感受性を予測する新たなマーカーの特定が、極めて重要となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
化学療法感受性の評価のために容易に分析されることを可能にするため、比較的非侵入性の起源、例えば、血液又は血液成分から、これらの新たな予測マーカーを特定する必要が、さらに重要であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、腫瘍組織内ＧＳＴ活性が血中ＧＳＨレベルと強く相関しており、従って、血中ＧＳＨレベルが腫瘍組織内ＧＳＴ活性の代理マーカーとなり得ることを見出した。
【００１１】
従って、患者から血液試料を入手すること、及び腫瘍組織内グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の代理マーカーとして血中グルタチオン（ＧＳＨ）の存在を検出すること、を含む、その必要のある患者の化学療法に対する感受性を予測する方法が、本発明の第一の目的である。
【００１２】
従って、本発明の方法によれば、所定の腫瘍が、ＧＳＨ／ＧＳＴ過剰発現を伴っているか否かを特定することが可能であり、従って最も適切な抗腫瘍療法の選択が可能である。
【００１３】
従って、まず、患者から血液試料を入手し、腫瘍組織内グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）活性の代理マーカーとして血中グルタチオン（ＧＳＨ）のレベルを検出し、その血中ＧＳＨレベルが、その患者が化学療法剤に対する抵抗性への新規の又は後の進行を示す可能性を指示する範囲にあるか否かを決定することにより、その患者の化学療法に対する感受性を予測すること、及び適切かつ有効な化学療法的治療を選択すること、を含む、その必要のある患者のための適切な化学療法的治療を選択する方法が、本発明のさらなる目的である。
【００１４】
換言すると、このようにして検出されたＧＳＨの血中レベルが、患者が、従来の化学療法剤、例えば、アルキル化剤、アントラサイクリン系又は白金錯体に対する抵抗性を示す可能性を示す程に高かった場合には、上記のＧＳＨレベルに基づき、適切かつ有効な化学療法的治療は、ＧＳＨ／ＧＳＴを過剰発現している腫瘍の治療において有効な抗腫瘍剤の投与を含み得る。
【００１５】
これに関して、化合物Ｎ−（５−｛［（５−｛［（５−｛［（２−｛［アミノ（イミノ）メチル］アミノ｝エチル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−ｌＨ−ピロール−３−イル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）アミノ］カルボニル｝−１−メチル−１Ｈ−ピロール−３−イル）−４−［（２−ブロモアクリロイル）アミノ］−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド（内部コードＰＮＵ１６６１９６）及びその医薬適合性の塩は、従来の抗腫瘍療法に対して不充分に応答性であるか又は抵抗性であることが既知の、ＧＳＨ／ＧＳＴを過剰発現している可能性があると文献に記載されている腫瘍の治療において有効であることが最近明らかとなった。
【００１６】
【化１】
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の上記化合物、及びＧＳＨ／ＧＳＴ系を過剰発現している腫瘍に対するその有効性に関する一般的な参照としては、国際特許出願ＷＯ９８／０４５２４及びＷＯ０１／８５１４４（２００１年４月１９日出願、２０００年５月８日出願の英国特許出願第００１１０５９．３号に基づく優先権を主張）（いずれも、本出願人の出願であり、参照してここに組み込まれる）を参照のこと。
【００１７】
従って、好ましくは、適当な療法は、例えば、国際特許出願ＷＯ０２／２８３８９（２００１年１０月２日出願の米国特許第０９／６７６７７０号に基づく優先権を主張）（本出願人の出願であり、参照してここに組み込まれる）に報告された投与スケジュールによる、適切な量の化合物ＰＮＵ１６６１９６の、その必要のある患者への投与を含み得る。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態によると、化学療法に対する感受性を予測する上記の方法は、例えば、胃腸腫瘍、子宮癌、卵巣癌、頭頸癌、肺癌、肉腫、肝臓腫瘍、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫及び血液学的腫瘍を含む、いくつかの腫瘍型において有利に使用され得る。
【００１９】
さらに好ましくは、該腫瘍は、肺、頭部及び頸部の癌より選択される。
【００２０】
さらに、上記の方法は、例えば、従来の化学療法剤、例えば、アルキル化剤、白金誘導体又はアントラサイクリン系による一次化学療法治療が、とりわけ前述の抵抗性効果の発生のため、期待された結果を与えることができなかった場合に、二次療法として適切な抗腫瘍療法を選択するためにも適用され得る。
【００２１】
ＧＳＨのアッセイのためのいくつかの方法が技術分野において既知であり、関連するキットは商業的に入手可能である。
【００２２】
従って、本発明によれば、血液試料中のＧＳＨレベルを検出するための任意の商業的に入手可能なキットが、便利に利用され得る。
【００２３】
この点で、腫瘍組織内ＧＳＴ活性の代理マーカーとして血中ＧＳＨレベルを決定するためのキットの使用が、本発明のさらなる目的である。
【００２４】
本発明を制限するのではなく例示するため、以下に実施例を与える。
【００２５】
（実施例）
以下の実施例は、血液中のＧＳＨ検出が、腫瘍組織内ＧＳＴレベルの代理マーカーとなることを示すため、血液中のＧＳＨレベルと腫瘍組織内ＧＳＴ活性との間に存在する強い相関を証明するために使用された。
【００２６】
前述の通り、図１及び２は、肺癌患者及び頭頸癌患者の血液中のＧＳＨレベルと、該患者の腫瘍組織内ＧＳＴ活性との間の上記の相関を明白に示している。
【００２７】
以下の表Ｉに関しては、肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者２９人及び頭頸癌（ＳＣＣ）を有する患者２３人に由来する組織試料及び血液試料を対象とした。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
サンプリング形式
原発腫瘍又は再発腫瘍に由来する組織。組織学的検査に供された試料に隣接している腫瘍組織の試料（≦２００ｍｇ）が、各患者から収集された。組織試料は、直ちに砕かれた氷に入れられた。試料は、切除から３０分（最大１時間）以内に液体窒素中で凍結させられた。
【００３０】
血液（原発腫瘍の治療前又は失敗の時点）。血液（１５ｍｌ）が、予め冷却されたシリンジに収集され、以下のように処理された。
【００３１】
３ｍｌが、Ｋ３ＥＤＴＡ（又は、ＡＣＤ−Ａ液）チューブに分配され、−２０℃で保管された（全血）。
【００３２】
分析法
ＧＳＨ量。細胞質ゾル中及び全血試料中のＧＳＨレベルが、商業的に入手可能なＧＳＨアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）により測定された。このキットは、黄色の化合物（ＴＮＢ）を生成させるＧＳＨとＤＴＮＢとの間の反応に基づく酵素リサイクリング法を利用する。ＴＮＢ生成の速度は、試料中のＧＳＨの濃度に直接比例する。４０５ｎｍにおけるＴＮＢの吸光度の測定は、試料中のＧＳＨの正確な推定を提供する。
【００３３】
アッセイ中のタンパク質上のスルフヒドリル基による干渉を回避するため、アッセイする前に、試料は１０％メタリン酸（ＭＰＡ）による除タンパクに供された。脱タンパク試料５０μｌ（そのまま、又はキットの洗浄バッファー（Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ）による１：３希釈）が、製造業者の指示に従い、デュプリケートでアッセイされた。ＧＳＨ濃度は、２５分目の吸光度をＧＳＨ濃度（ｎｍｏｌ／ｍｌ）に対してプロットすることにより入手された標準曲線との比較により測定された。細胞質ゾルＧＳＨレベルは、タンパク質含有量に対して標準化された（ｎｍｏｌ／ｍｇ）。
【００３４】
ＧＳＴ活性。細胞質ゾル１０μｌが、商業的に入手可能なアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、製造業者の指示に従い分析された。そのキットは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の比色定量酵素アッセイを実施するために設計されている。試料が、供給された反応緩衝液中の１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）基質と合わせられ、反応物の吸光度が、λ＝３４０ｎｍにおいてモニタリングされる。Ａ３４０の変化の速度は、試料中のＧＳＴ活性の量に比例する。細胞質ゾル試料について、３４０ｎｍにおける吸光度が、５分間、３０秒毎にモニタリングされた。
【００３５】
細胞質ゾル試料について、全ての試料のＧＳＴ活性が、標準（ヒト胎盤の細胞質ゾル）と比較され、タンパク質１ｍｇ当たりのＵ＊として測定された。
【００３６】
＊Ｕ＝胎盤のタンパク質１ｍｇ当たりの（胎盤１０μｌのｄＡ／分）
アッセイバリデーション
方法のバリデーションは、感受性、特異性、精密度（アッセイ内、アッセイ間、バッチ間）、較正範囲、異なる貯蔵条件における試薬の安定性及び分析物の安定性を考慮して計画された。
【００３７】
ＧＳＨ
（ゼロ標準のレプリケート８個の平均＋３ＳＤとして評価された）分析感度は、０．３３ｎｍｏｌ／ｍｌであった。
【００３８】
機能的感度は、方法の非精密プロファイルをプロットすることにより評価された。１０％未満の変動係数（Ｃ．Ｖ．）を有する最小濃度は、０．４ｎｍｏｌ／ｍｌであった。
【００３９】
アッセイキットは、ＧＳＴ−レダクターゼと、試料中に含まれる全ての基−ＳＨと反応するＤＴＮＢとの間の反応に基づく。全てのチオールタンパク質基が除タンパクにより除去されているため、ＧＳＴ−レダクターゼはＧＳＨ基質の特異的な酵素であるため、反応はＧＳＨに特異的なλ＝４０５においてモニタリングされるため、高い特異性が予想される。従って、それ以上の確認実験は実施されなかった。
【００４０】
精密度は、５回の連続的なランについて、全血のデュプリケートを分析することより評価された。
【００４１】
１２％未満のアッセイ間Ｃ．Ｖ．が入手されたが、アッセイ内Ｃ．Ｖ．は５％未満のばらつきであった（表５及び６）。
【００４２】
校正曲線は、０．６ｎｍｏｌ／ｍｌから４０ｎｍｏｌ／ｍｌの範囲である。
【００４３】
全ての試薬は、製造業者により示された期限まで、＋４℃で保管されなければならない。
【００４４】
開封後、試薬は＋４℃で２週間、安定である。
【００４５】
試料及び脱タンパク試料は、それぞれ−８０℃及び−２０℃で保管された場合、最長６ヶ月間安定である。
【００４６】
ＧＳＴ活性
分析感度は、ゼロ標準のレプリケート８個により評価され、０．００５５Ｕ／ｍｌであった。
【００４７】
機能的感度は、低活性試料のレプリケート８個で評価された。レプリケートのＣ．Ｖ．が１０％未満（９．２％）であったため、対応する平均活性レベル（０．００８Ｕの活性）が、機能的感度と見なされた。
【００４８】
活性アッセイキットは、ＧＳＴと酵素の特異的基質であるＣＤＮＢとの間の酵素反応に基づいている。従って、使用された方法の特異性は、文献（Ｈａｂｉｇ  Ｗ．Ｈ．，１９７４；Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｂ．，１９８８）において充分に証明されている。従って、さらなる確認実験は実施されなかった。
【００４９】
正確度は、細胞質ゾル試料の希釈試験により評価された。回収率は、１１２％から１３３％であった。
【００５０】
精密度は、２つの異なる活性レベルを有する２個の細胞質ゾル試料で評価された。試料のレプリケート４個が、５回の異なるランにおいてアッセイされた。アッセイ間及びアッセイ内のＣ．Ｖ．は、それぞれ、高活性レベル試料においては９％未満、低活性レベル試料においては１４％未満のばらつきであった。
【００５１】
校正曲線は、０．０１ｄＡ／分から０．４ｄＡ／分の範囲である。
【００５２】
全ての試薬が、製造業者により示された期限まで、−２０℃で保管されなければならない。
【００５３】
試料は、−８０℃で保管された場合、最長６ヶ月間安定である。
【００５４】
結果
肺癌を有する患者２９人及び頭頸癌を有する患者２３人に由来する全血において、ＧＳＨレベルが測定された。血液中の平均レベルは、肺癌で５１６ｎｍｏｌ／ｍｌ（Ｓ．Ｄ．＝１１７）、頭頸癌で４２８ｎｍｏｌ／ｍｌ（Ｓ．Ｄ．＝９７）である。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
ＧＳＴ活性
血漿中のＧＳＴ酵素のレベルは低かったため、総ＧＳＴ活性は、細胞質ゾルにおいては測定したが、血漿試料では測定しなかった。実際、本発明者らは、利用可能であった肺癌患者２９人のうち２１人の血漿試料、及び利用可能であった頭頸癌患者２３人のうち１５人の血漿試料を試験した。ＧＳＴ活性は、方法の感度閾値に近く、肺試料２１個中１１個及び頭頸試料１５個中３個において検出可能でなかった。
【００５７】
ＧＳＴ活性は、肺癌の組織試料２９個及び頭頸癌２２個において測定された。平均活性は、肺癌組織においては１．７２Ｕ／Ｍｇ（Ｓ．Ｄ．＝０．８９）である。頭頸において、平均活性は２．６１Ｕ／ｍｇ（Ｓ．Ｄ．＝１．７４）である。
【００５８】
【表３】
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【００５９】
結論
評価された方法は、組織抽出物（ＧＳＴ活性）及び全血（ＧＳＨレベル）におけるルーチンな使用のための信頼性及び頑健性を有している。
【００６０】
全血ＧＳＨと組織ＧＳＴ活性との間には、高度に有意な正の相関が見出された。
【００６１】
特に、癌組織内ＧＳＴ活性と全血中ＧＳＨレベルとは、肺癌（ｒ＝０．５３、ｐ＝０．００３、図１）及び頭頸癌（ｒ＝０．８９、ｐ＜０．０００１；図２）において相関していた。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
上記の結果は、癌患者の血液試料中のＧＳＨレベルが、腫瘍組織内ＧＳＴ活性の代理マーカーとして使用され得、従って、化学療法に対する患者の応答性がＧＳＨ／ＧＳＴ系過剰発現に関連しているか否かを予測することを可能にする、という証拠を明白に提供している。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】肺癌患者の、腫瘍組織内ＧＳＴ活性と、対応する全血標本中のＧＳＨレベルとの間の相関。
【図２】頭頸癌患者の、腫瘍組織内ＧＳＴ活性と、対応する全血標本中のＧＳＨレベルとの間の相関。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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2005504322.tif 000011
2005504322.tif 000012
2005504322.tif 000013
2005504322.tif 000014
2005504322.tif 000015
2005504322.tif 000016
2005504322.tif 000017
2005504322.tif 000018
2005504322.tif 000019
2005504322.tif 000020
2005504322.tif 000021
2005504322.tif 000022
2005504322.tif 000023
2005504322.tif 000024
2005504322.tif 000025
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504322.tif 000026
2005504322.tif 000027
【国際調査報告】
2005504322.tif 000028
2005504322.tif 000029
2005504322.tif 000030
2005504322.tif 000031
2005504322.tif 000032