(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）の化合物に関する：ここで、Ａ、Ｒ１およびＲ２は、本明細書中で定義されている。本発明はまた、式（Ｉ）の化合物を含有する組成物、式（Ｉ）の化合物を使用する方法、および式（Ｉ）の化合物を製造する方法に関する。本発明の染料は、２−（４’−スルファモイルフェニル）−５−（４’−ジメチルアミノフェニル）オキサゾールの誘導体である。  本発明の第一の局面は、式Ｉの化合物に関する。  本発明の第二の局面は、式Ｉの化合物を含有する組成物に関する。  本発明の第三の局面は、式Ｉの化合物を製造する方法に関する。  本発明の第四の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子に対する多数の異なる分子の各々の親和性をランク付けする方法において、式Ｉの化合物を使用することにある。
2005531490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物およびそれらの塩：
【化１】
2005531490.tif 000010
ここで、
Ａは、単結合、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、ここで、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレンのいずれかは、必要に応じて、置換されている；
Ｒ１は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲ３、−ＮＲ３Ｒ４、−ＳＲ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、−Ｐ（Ｏ）ＨＯＲ３、アミジノ、グアニジノ、ビグアニジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノまたはキレーターである；そして
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして
Ｒ３およびＲ４は、別個に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして、ここで、
Ａは、単結合である；
Ｒ１、Ｒ２およびＡは、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、窒素含有シクロヘテロアルキル基またはシクロヘテロアルケニル基であり、それらのいずれかは、必要に応じて、置換されている；
但し、ＡがＣ１〜８非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨまたはメチルであるとき、Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２または−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒではない；
ＡがＣ１〜３非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨであるとき、Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３または−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３ではない；
ＡがＣ１〜３非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨであるとき、Ｒ１は、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ６Ｆ５ではない；
Ａが単結合であり、そしてＲ２がＨまたはＣＨ３であるとき、Ｒ１は、−Ｂ（ＯＨ）２で置換されたフェニルではない；そして
Ａが単結合であるとき、Ｒ１、Ｒ２およびＡは、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、非置換モルホリニルを形成しない、
化合物。
【請求項２】
Ａが、単結合であり、そしてＲ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、窒素含有シクロヘテロアルキル基または窒素含有シクロヘテロアルケニル基を形成し、それらのいずれかが、必要に応じて、置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、必要に応じて置換した５員〜６員の窒素含有シクロヘテロアルキル基を形成し、該窒素含有シクロヘテロアルキル基が、１個または２個のヘテロ原子を含有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、必要に応じて置換した５員〜６員の窒素含有シクロヘテロアルケニル基を形成し、該窒素含有シクロヘテロアルケニル基が、１個または２個のヘテロ原子を含有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
前記シクロヘテロアルキル基が、必要に応じて置換したチアゾリジン環である、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
前記チアゾリジン環が、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシおよびパーフルオロエトキシからなる群から別個に選択される１個〜２個の置換基で置換されている、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ａが、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、それらのいずれかが、必要に応じて、置換されており、そして
Ｒ１が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１が、シクロアルキルまたはシクロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１が、シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ａが、Ｃ１〜８置換アルキレン、Ｃ２〜８置換アルケニレンまたはＣ２〜８置換アルキニレンであり、そして
Ｒ１が、−ＯＲ３または−ＮＲ３Ｒ４である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ａが、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、そしてヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ−またはジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニルおよびカルボキシからなる群から別個に選択される１個またはそれ以上の置換基で置換されている、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ａが、１個〜３個の水酸基で置換されている、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ａが、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノおよびジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノからなる群から選択される１個〜３個の基で置換されている、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ａが、Ｃ３〜８アルキレン、Ｃ４〜８アルケニレンまたはＣ４〜８アルキニレンであり、そして
Ｒ１が、アリールまたはヘテロアリールであり、それらのいずれかが、必要に応じて、置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ａが、単結合であり、そして
Ｒ１が、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１が、シクロアルキルまたはシクロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１が、シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１が、５員〜７員のシクロアルキル基またはシクロアルケニル基であり、それらのいずれかが、必要に応じて、置換されている、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１が、５員〜７員のシクロヘテロアルキル基またはシクロヘテロアルケニル基であり、それらのいずれかが、必要に応じて、置換されている、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
Ａが、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、それらのいずれかが、必要に応じて、置換されており、そして
Ｒ１が、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４または−Ｐ（Ｏ）ＨＯＲ３であり、
ここで、Ｒ３およびＲ４が、別個に、Ｈ、アルキル、アリールアルキルまたはアルケニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３である、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ａが、置換アルキレン、置換アルケニレンまたは置換アルキニレンである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２３】
Ａが、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、それらのいずれかが、必要に応じて、置換されており、そして
Ｒ１が、アミジノ、グアニジノ、ビグアニジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノアミノまたはホルミルイミノアミノである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１が、グアニジノである、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ａが、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、そしてヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ−またはジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニルおよびカルボキシからなる群から別個に選択される１個〜３個の置換基で置換されている、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ１が、キレーターである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２７】
前記キレーターが、ＥＤＴＡ、ニトロロトリ酢酸およびヒスチジンからなる群から選択される部分である、請求項２６に記載の化合物。
【請求項２８】
前記化合物が、ヒドロキシ反応性プローブである、請求項１に記載の化合物。
【請求項２９】
前記化合物が、アミン反応性プローブである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３０】
前記化合物が、ケトン反応性プローブである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３１】
前記化合物が、カルボン酸反応性プローブである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３２】
前記化合物が、チオール反応性プローブである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、約ｐＨ７でイオン化された化学部分を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、−１〜−３の正味電荷を有する化学部分を形成する、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、＋１〜＋３の正味電荷を有する化学部分を形成する、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、０の正味電荷を有する化学部分を形成する、請求項３３に記載の化合物。
【請求項３７】
請求項１に記載の化合物であって、以下：
４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）−Ｎ−（２−ピロリジン−１−イル−エチル）ベンゼンスルホンアミド；
４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）−Ｎ−（３−（４−メチルピペラジン−１−イル）−プロピル）−ベンゼンスルホンアミド；
ジメチル−（４−｛２−（４−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル）オキサゾール−５−イル｝−フェニル）アミン；
ジメチル−（４−｛２−（４−（４−メチルピペラジン−１−スルホニル）フェニル）−オキサゾール−５−イル｝フェニル）アミン；
４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）−Ｎ−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
２−｛４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）−ベンゼンスルホニルアミノ｝コハク酸；
｛４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）ベンゼンスルホニルアミノ｝−酢酸；
（｛４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）ベンゼンスルホニルアミノ｝メチル−アミノ）酢酸；
４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）−Ｎ−（２−グアニジノエチル）−ベンゼンスルホンアミド；
４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス−ヒドロキシメチルエチル）ベンゼンスルホンアミド；
２−アミノ−５−｛４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）−ベンゼンスルホニルアミノ｝ペンタン酸；および
３−（４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル）ベンゼンスルホニルアミノ）−チアゾリン−２，４−ジカルボン酸ジメチルエステルからなる群から選択される、化合物。
【請求項３８】
請求項１に記載の化合物および化学的に適当な溶媒を含有する、組成物。
【請求項３９】
前記溶媒が、ジメチルスルホキシドである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１に記載の化合物を使用して環境をモニターする方法であって、該方法は、以下の工程を包含する：
該化合物を該環境またはその近くに置く工程；
該化合物を光源に晒す工程であって、ここで、該光源は、２００ｎｍと７００ｎｍの間の波長の光を生じる；および
蛍光エネルギーを検出する工程であって、ここで、該蛍光エネルギーは、該化合物により放射される、
方法。
【請求項４１】
前記光源が、３００ｎｍと６００ｎｍの間の波長の光を生じる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
蛍光熱シフトアッセイとして実行される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記環境が、小胞体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物が、ヒドロキシ反応性プローブとして使用される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物が、アミン反応性プローブとして使用される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記化合物が、ケトン反応性プローブとして使用される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４７】
熱変化によりアンフォールドできる標的分子に対する多数の異なる分子の各々の親和性をランク付けする方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、多数の異なる分子の１分子と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）該多数の異なる分子における任意の分子の非存在下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該多数の異なる分子の任意の分子の非存在下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該分子の各々の親和性をランク付けする工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
熱変化によりアンフォールドできる標的分子に対する多数の異なる分子の２個またはそれ以上の組合せの親和性をランク付けする方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、多数の異なる分子の１個またはそれ以上の異なる分子の組合せと接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）該２個またはそれ以上の異なる任意の分子の非存在下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該２個またはそれ以上の異なる任意の分子の非存在下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該２個またはそれ以上の異なる任意の分子の組合せの親和性をランク付けする工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
熱変化によりアンフォールドできる標的分子に結合する分子対する多数の異なる分子の集合をアッセイする方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、多数の異なる分子の少なくとも２個の分子の集合と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）該多数の異なる分子における任意の分子の非存在下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該多数の異なる分子の任意の分子の非存在下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該異なる分子の集合の親和性をランク付けする工程；（ｇ）該標的分子と親和性を有する分子を含む該異なる分子の集合を選択する工程；（ｈ）該選択した集合を、多数の容器の各々で、小集合に分割する工程；そして（ｉ）該多数の異なる分子から単一の分子が同定されるまで、上記工程（ａ）〜（ｈ）を繰り返す工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
熱変化によりアンフォールドし得る標的分子を安定化ことについて、多数の異なる生化学条件の１以上の有効性をランク付けする方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、該多数の異なる生化学条件と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）参照セットの生化学条件下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該参照セットの生化学条件下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該容器の各々の対する該生化学条件の各々の有効性をランク付けする工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
熱変化によりアンフォールドできる標的分子の寿命を最適化する方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、該多数の異なる分子または異なる生化学条件と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）参照セットの生化学条件下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該参照セットの生化学条件下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該容器の各々の対する該生化学条件の各々の有効性をランク付けする工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
変性またはアンフォールドしたタンパク質のサンプルのリフォールディングまたは再生を促進するために、多数の異なる生化学条件の１以上の有効性をランク付けする方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の化合物の存在下にて、該リフォールドしたタンパク質サンプルの１個を、多数の容器の各々に入れる工程であって、ここで、該リフォールドしたタンパク質サンプルの各々は、該多数の条件の１以上に従って、以前にリフォールドまたは再生したものである；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）参照セットの生化学条件下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該参照セットの生化学条件下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該容器の各々の対する該生化学条件の各々の有効性をランク付けする工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
熱変化によるアンフォールドできるタンパク質の結晶化を促進するために、多数の異なる生化学条件の１以上の有効性をランク付けする方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該タンパク質を、該多数の異なる生化学条件と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）参照セットの生化学条件下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該参照セットの生化学条件下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該容器の各々の対する該生化学条件の各々の有効性をランク付けする工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、
該方法は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾールを次式のアミンと反応させる工程：
【化２】
2005531490.tif 000011
ここで、
Ａは、単結合、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、ここで、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレンのいずれかは、必要に応じて、置換されている；
Ｒ１は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲ３、−ＮＲ３Ｒ４、−ＳＲ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、−Ｐ（Ｏ）ＨＯＲ３、アミジノ、グアニジノ、ビグアニジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノまたはキレーターである；そして
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして
Ｒ３およびＲ４は、別個に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして、ここで、
Ａは、単結合である；
Ｒ１、Ｒ２およびＡは、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、窒素含有シクロヘテロアルキル基またはシクロヘテロアルケニル基であり、それらのいずれかは、必要に応じて、置換されている；
但し、ＡがＣ１〜８非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨまたはメチルであるとき、Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２または−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒではない；
ＡがＣ１〜３非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨであるとき、Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３または−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３ではない；
ＡがＣ１〜３非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨであるとき、Ｒ１は、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ６Ｆ５ではない；
Ａが単結合であり、そしてＲ２がＨまたはＣＨ３であるとき、Ｒ１は、−Ｂ（ＯＨ）２で置換されたフェニルではない；そして
Ａが単結合であるとき、Ｒ１、Ｒ２およびＡは、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、非置換モルホリニルを形成しない、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ジフェニルオキサゾール誘導体、それらの合成、および蛍光染料およびプローブとしてのそれらの使用の領域に関する。本発明の染料は、２−（４’−スルファモイルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾールの誘導体である。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
蛍光は、特定分子がエネルギーを吸収するときに起こる３段階プロセスの結果である。この三段階は、以下を包含する：１）励起；２）励起状態の寿命；および３）蛍光発光。第一段階の励起中には、特定エネルギーの光子は、蛍光体により吸収される。蛍光体は、最初は、基底状態（Ｓ０）である。光子の吸収により、その蛍光体は、励起される。吸収された光子のエネルギーは、電子に移動される。電子は、高いエネルギー状態に移動される。蛍光体は、励起した一重項状態（Ｓ１）で存在しており、これはまた、励起状態とも呼ばれている。蛍光体の励起した状態は、有限時間（典型的には、１０−８〜１０−９秒）にわたって、存在している。励起状態の間、蛍光体は、その並進運動状態、振動状態および電子エネルギー状態を変え、その分子環境との相互作用を受ける。励起した蛍光体は、蛍光発光により、エネルギーを放出し、そして基底状態Ｓ０に戻る。他のプロセス（例えば、蛍光エネルギー移動、項間交差および衝突消光）もまた、Ｓ１の数を減らし得る。発光段階中に放射された蛍光光子の数と、励起段階中に吸収された光子の数との比は、量子収率と呼ばれている。量子収率は、他のプロセス（例えば、蛍光エネルギー移動、項間交差および衝突消光）と競争する蛍光効率の尺度である。
【０００３】
第三段階の蛍光発光中にて、エネルギーｈｖの光子（ここで、ｈは、プランク定数であり、そしてｖは、光子の振動数である）が放射され、発光体は、その基底状態Ｓ０に戻る。放射された光子のエネルギーは、励起段階中に吸収された光子のエネルギーよりも低い。このエネルギー差は、励起状態寿命中のプロセスによる散逸に帰因し得、このようなプロセスには、蛍光エネルギー移動、項間交差および衝突消光が挙げられる。吸収された光子と放射され光子との間のエネルギー差は、ストークスシフトと呼ばれている。ストークスシフトは、放射光子が励起光子とは異なる波長にて低いバックグラウンドで検出可能にするので、蛍光技術の感度の基礎となっている。
【０００４】
蛍光特性を有する化合物は、多数の用途がある。蛍光分子は、単分子分光法で使用できる。スペクトルまたは量子収率がそれらの環境に感受性の蛍光分子は、異種媒体、有機化媒体および生物媒体の研究において貴重であり、これらの用途のために、多くの蛍光染料が開発されている。しかしながら、多くの染料は、吸収波長および発光波長が短い（これは、試料の自動蛍光を原因とする高いバックグラウンドを引き起こすおそれがある）か、吸光率が低いか、量子収率が低いか、またはストークスシフトが小さいかいずれかである。
【０００５】
蛍光分子はまた、米国特許第６，０２０，１４１号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で記述されているように、マイクロプレート熱シフトアッセイで有用である。
【０００６】
蛍光方法を使用する迅速で高処理能力のスクリーニングもまた、１−アニリノナフタレン−８−スルホネートのような蛍光分子よりも長い波長で蛍光を発する蛍光プローブ分子を使用することにより、促進される。それは、化合物およびコンビナトリアルライブラリにおける多くの分子が、現在利用可能な蛍光プローブ分子が蛍光を発するのと同じ波長で蛍光を発するからである。それに加えて、高処理能力スクリーニングアッセイで使用されているプラスチックマイクロプレートもまた、蛍光プローブ分子が蛍光を発するのと同じ波長で蛍光を発する。
【０００７】
それゆえ、励起したときに蛍光を発して、１−アニリノナフタレン−８−スルホネートおよびそれらの誘導体のスペクトルよりも有用なスペクトルで発光を生じる分子が必要とされている。
【０００８】
蛍光分子の１種には、ＤＡＰＯＸＹＬ染料と称する１群の化合物がある。ＤＡＰＯＸＹＬ染料は、４−（４’−（ジメチルアミノ）フェニル）−２−（４’−スルホニルフェニル）オキサゾール部分を含む。多数のＤＡＰＯＸＹＬ染料は、公知であり、これには、Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）スルホニルクロライド；Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）カルボン酸スクシンイミジルエステル；Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）３−スルホンアミドプロピオン酸スクシンイミジルエステル；Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）（２−ブロモアセトアミドエチル）スルホンアミド；Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）２−（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミドエチル）スルホンアミド；Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）３−スルホンアミドフェニルボロン酸；Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）スルホニルヒドラジン；Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）（２−アミノエチル）スルホンアミド；Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）スルホン酸ナトリウム塩；およびＤａｐｏｘｙｌ（登録商標）ブチルスルホンアミドが挙げられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、有機媒体および水性媒体の両方での溶解性を向上した２−（４’−スルファモイルフェニル）−５−（４’−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール誘導体の新しい誘導体が必要とされている。既存のオキサゾール染料よりも極性が高いか低いかいずれかの新しい誘導体が必要とされている。熱シフトアッセイでの有用性を向上した新しいオキサゾール誘導体もまた、必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
蛍光分子として有用な新規種類の化合物が発見された。蛍光分子（これはまた、蛍光体とも呼ばれる）は、高感度検出試薬が望ましい生物用途で、特に適当であることが公知である。蛍光染料は、他の物質に対して、目に見える色および蛍光の両方を与えるのに使用される。本発明の染料は、２−（４’−スルファモイルフェニル）−５−（４’−ジメチルアミノフェニル）オキサゾールの誘導体である。
【００１１】
本発明の第一の局面は、式Ｉの化合物に関する。
【００１２】
本発明の第二の局面は、式Ｉの化合物を含有する組成物に関する。
【００１３】
本発明の第三の局面は、式Ｉの化合物を製造する方法に関する。
【００１４】
本発明の第四の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子に対する多数の異なる分子の各々の親和性をランク付けする方法において、式Ｉの化合物を使用することにある。
【００１５】
本発明の第五の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子に対する多数の異なる分子の２種またはそれ以上の組合せの親和性をランク付けする多変数（ｍｕｌｔｉ−ｖａｒｉａｂｌｅ）方法において、式Ｉの化合物を使用することにある。
【００１６】
本発明の第六の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子に結合する分子に対する多数の異なる分子の集合をアッセイする方法において、式Ｉの化合物を使用することにある。
【００１７】
本発明の第七の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子を安定化するために、多数の異なる生化学条件の１つまたはそれ以上の有効性をランク付けする多変数方法において、式Ｉの化合物を使用することにある。
【００１８】
本発明の第八の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子の寿命を最適化する多変数方法において、式Ｉの化合物を使用することにある。
【００１９】
本発明の第九の局面は、変性またはアンフォールドしたタンパク質の試料のリフォールディングまたは再生を促進するために、多数の異なる生化学条件の１つまたはそれ以上の有効性をランク付けする多変数方法において、式Ｉの化合物を使用することにある。
【００２０】
本発明の第十の局面は、熱変化によるアンフォールドできるタンパク質の結晶化を促進するために、多数の異なる生化学条件の１つまたはそれ以上の有効性をランク付けするマルチ可変方法において、式Ｉの化合物を使用することにある。
【００２１】
本発明のさらに他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、以下で詳細に記述する。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明の第一局面は、式Ｉの化合物およびそれらの化学的に許容できる塩に関する：
【００２３】
【化１】
2005531490.tif 000003
【００２４】
ここで、
Ａは、単結合、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、ここで、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレンのいずれかは、必要に応じて、置換されている；
Ｒ１は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲ３、−ＮＲ３Ｒ４、−ＳＲ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、−Ｐ（Ｏ）ＨＯＲ３、アミジノ、グアニジノ、ビグアニジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノまたはキレーターである；そして
Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルまたはシクロアルキルのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして
Ｒ３およびＲ４は、別個に、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルであり、ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして、ここで、
Ａは、単結合である；
Ｒ１、Ｒ２およびＡは、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、窒素含有シクロヘテロアルキル基またはシクロヘテロアルケニル基であり、それらのいずれかは、必要に応じて、置換されている；
但し、ＡがＣ１〜８非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨまたはメチルであるとき、Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２または−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｂｒではない；
ＡがＣ１〜３非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨであるとき、Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３または−Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３ではない；
ＡがＣ１〜３非置換アルキルであり、そしてＲ２がＨであるとき、Ｒ１は、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ６Ｆ５ではない；
Ａが単結合であり、そしてＲ２がＨまたはＣＨ３であるとき、Ｒ１は、−Ｂ（ＯＨ）２で置換されたフェニルではない；そして
Ａが単結合であるとき、Ｒ１、Ｒ２およびＡは、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、非置換モルホリニルを形成しない。
【００２５】
１サブクラスの化合物は、Ａが、単結合であり、そして
Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、窒素含有シクロヘテロアルキル基または窒素含有シクロヘテロアルケニル基を形成し、それらのいずれかが、必要に応じて、置換されている式Ｉの化合物の群である。
【００２６】
第一サブクラスの化合物のうちでは、好ましい群の化合物は、Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、窒素含有シクロヘテロアルキル基を形成する群の化合物である。適当なシクロヘテロアルキル基には、１−アジリジニル、１−アゼチジニル、１−ピロリジニル、１−ピペリジル、１−パーヒドロアゼピニル、１−パーヒドロアゾシニル、１−パーヒドロアゾニニル、１−パーヒドロアゼシニル、パーヒドロキノリニル、パーヒドロイソキノリニル、１−イミダゾリジニル、１−ピラゾリジニル、２−ピラゾリジニル、３−オキサゾリジニル、２−イソキサゾリジニル、３−チアゾリジニル、２−イソチアゾラジニル、１−ピペラジニル、１−ヘキサヒドロピリダジニル、１−ヘキサヒドロピリミジニル、置換モルホリニル、２−（１，２−ヘキサヒドロチアジニル）、３−（１，３−ヘキサヒドロチアジニル）、４−（１，４−ヘキサヒドロチアジニル）、２−（１，２，５−オキサジアゾリジニル）、２−（１，２，５−チアジアゾリジニル）およびオキサチアゾリジニルが挙げられる。
【００２７】
第一サブクラスの化合物のうちで他の好ましい群の化合物には、Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、１個または２個のヘテロ原子を含有する５員〜６員の窒素含有シクロヘテロアルキル基を形成し、ここで、該シクロヘテロアルキル基は、必要に応じて、置換されている。適当な置換された窒素含有シクロヘテロアルキル基には、以下からなる群から選択される１個またはそれ以上の置換基を含有する、上で列挙したシクロヘテロアルキル基が挙げられる：Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、（Ｃ１〜６）アルコキシ（Ｃ２〜６）アルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、Ｃ６〜１４アル（Ｃ１〜６）アルコキシカルボニル、Ｃ２〜６アルキニルカルボニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、Ｃ２〜６アルケニルスルホニル、Ｃ２〜６アルキニルスルホニル、Ｃ６〜１０アリールスルホニル、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜６アルキルスルホンアミド、Ｃ６〜１０アリールスルホンアミド、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホンアミド、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、Ｃ２〜６カルボキシアルコキシ、Ｃ２〜６カルボキシアルキル、カルボキシアルキルアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシおよびパーフルオロエトキシ。
【００２８】
好ましくは、該置換された窒素含有シクロヘテロアルキル基上の該１個またはそれ以上の置換基は、別個に、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、グアニジンおよびカルボキシからなる群から選択される。
【００２９】
第一サブクラスの化合物のうちで他の好ましい群の化合物には、Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、窒素含有シクロヘテロアルケニル基を形成する化合物の群があり、ここで、該シクロヘテロアルケニル基は、必要に応じて、置換されている。適当な窒素含有シクロヘテロアルケニル基には、２−ピロリン−１−イル、３−ピロリン−１−イル、２−イミダゾリン−１−イル、３−イミダゾリン−１−イル、４−イミダゾリン−１−イル、３−ピラゾリン−２−イルおよび３−ピラゾリン−１−イルが挙げられる。適当な置換された窒素含有シクロヘテロアルケニル基には、以下からなる群から選択される１個またはそれ以上の置換基を含有する、上で列挙したシクロヘテロアルキル基が挙げられる：Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、（Ｃ１〜６）アルコキシ（Ｃ２〜６）アルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、Ｃ６〜１４アル（Ｃ１〜６）アルコキシカルボニル、Ｃ２〜６アルキニルカルボニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、Ｃ２〜６アルケニルスルホニル、Ｃ２〜６アルキニルスルホニル、Ｃ６〜１０アリールスルホニル、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜６アルキルスルホンアミド、Ｃ６〜１０アリールスルホンアミド、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホンアミド、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、Ｃ２〜６カルボキシアルコキシ、Ｃ２〜６カルボキシアルキル、カルボキシアルキルアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシおよびパーフルオロエトキシ。
【００３０】
好ましくは、該置換された窒素含有シクロヘテロアルケニル基上の該１個またはそれ以上の置換基は、Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、グアニジンおよびカルボキシからなる群から選択される。
【００３１】
第二サブクラスの化合物には、以下である式Ｉの化合物の群がある：ここで、Ａは、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、そのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして
Ｒ１は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルであり、そのいずれかは、必要に応じて、置換されている。
【００３２】
該第二サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ａが、Ｃ１〜８アルキレン、Ｃ１〜８アルケニレンまたはＣ１〜８アルキニレン（そのいずれかは、必要に応じて、置換されている）、さらに好ましくは、Ｃ１〜６アルキレン、Ｃ１〜６アルケニレンまたはＣ１〜６アルキニレン（そのいずれかは、必要に応じて、置換されている）である群の化合物がある。
【００３３】
該第二サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ｒ１が、シクロアルキルまたはシクロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている群の化合物がある。好ましくは、Ｒ１は、４員〜８員、さらに好ましくは、５員〜７員の必要に応じて置換したシクロアルキル基または必要に応じて置換したシクロアルケニル基である。Ｒ１が置換シクロアルキル基または置換シクロアルケニル基であるとき、該置換された基上の置換基は、好ましくは、１個または２個のＣ１〜６アルキル、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシまたはパーフルオロエトキシである。
【００３４】
該第二サブクラスの化合物のうちで他の好ましい群の化合物には、Ｒ１が、シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている群の化合物がある。好ましくは、Ｒ１は、４員〜８員、さらに好ましくは、５員〜７員の必要に応じて置換したシクロヘテロアルキル基または必要に応じて置換したシクロヘテロアルケニル基である。Ｒ１が置換シクロヘテロアルキル基または置換シクロヘテロアルケニル基であるとき、該置換された基上の置換基は、好ましくは、１個または２個のＣ１〜６アルキル、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシまたはパーフルオロエトキシである。
【００３５】
第三サブクラスの化合物には、以下である式Ｉの化合物の群がある：ここで、Ａは、置換アルキレン、置換アルケニレンまたは置換アルキニレンである；そしてＲ１は、−ＯＲ３または−ＮＲ３Ｒ４である。
【００３６】
該第三サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、以下である式Ｉの化合物がある：Ａは、置換アルキレン、置換アルケニレンまたは置換アルキニレンである；そしてＲ１は、−ＯＲ３または−ＮＲ３Ｒ４である。該第三サブクラスの化合物のうちで他の好ましい群の化合物には、以下である式Ｉの化合物がある：Ａは、置換アルキレン、置換アルケニレンまたは置換アルキニレンである；そしてＲ１は、−ＯＲ３または−ＮＲ３Ｒ４である。
【００３７】
第三サブクラスの化合物の他の好ましい群の化合物には、Ａが置換アルキレンである化合物がある。該置換アルキレン基は、分枝または直鎖のアルキレン基であり得る。該アルキレン基は、１個またはそれ以上のヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、（Ｃ１〜６）アルコキシ（Ｃ２〜６）アルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、Ｃ６〜１４アル（Ｃ１〜６）アルコキシカルボニル、Ｃ２〜６アルキニルカルボニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、Ｃ２〜６アルケニルスルホニル、Ｃ２〜６アルキニルスルホニル、Ｃ６〜１０アリールスルホニル、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜６アルキルスルホンアミド、Ｃ６〜１０アリールスルホンアミド、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホンアミド、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、Ｃ２〜６カルボキシアルコキシ、Ｃ２〜６カルボキシアルキル、カルボキシアルキルアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシまたはパーフルオロエトキシで置換され得る。
【００３８】
好ましくは、該置換アルキレンは、１個またはそれ以上のヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノおよびカルボキシで置換される。
【００３９】
該第三サブクラスの化合物に適当なＡの値には、２−ヒドロキシプロピレン、２−アミノプロピレン、３−ヒドロキシブチレン、２−ヒドロキシブチレン、２−アミノブチレン、３−アミノブチレン、２，３−ジヒドロキシブチレン、１，２−ジヒドロキシブチレン、１，３−ジヒドロキシブチレン、１，２−ジアミノブチレン、１，３−ジアミノブチレン、２，３−ジアミノブチレン、１−アミノ−２−ヒドロキシブチレン、２−アミノ−１−ヒドロキシブチレン、１−ヒドロキシメチルエチレン、２−ヒドロキシメチルエチレン、１，１−ビス（ヒドロキシフェニル）エチレン、２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）エチレン、２，２−ビス（アミノメチル）エチレン、１，１−ビス（アミノメチル）エチレンおよび１−ヒドロキシメチル−４−メチルアミノペント−２−エチレンが挙げられる。
【００４０】
該第三サブクラスの他の群の好ましい化合物には、Ｒ２がＨまたはＣ１〜６アルキルである化合物がある。
【００４１】
該第三サブクラスの他の好ましい化合物には、該アルキレンが２個またはそれ以上のＯＨで置換されている化合物がある。
【００４２】
第四サブクラスの化合物には、以下である式Ｉの化合物の群がある：
ここで、Ａは、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、そのうちのいずれかは、必要に応じて置換されている；
そしてＲ１は、アリールまたはヘテロアリールであり、それらのいずれかは、必要に応じて、置換されている。
【００４３】
該第四サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ａが、Ｃ１〜８置換アルキレン、Ｃ２〜８置換アルケニレンまたはＣ２〜８置換アルキニレンであり、そのいずれかが、必要に応じて、置換されている化合物がある。該第四サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ａが、Ｃ１〜６置換アルキレン、Ｃ２〜６置換アルケニレンまたはＣ２〜６置換アルキニレンであり、そのいずれかが、必要に応じて、置換されている式Ｉの化合物がある。
【００４４】
好ましくは、Ａは、Ｃ３〜８アルキレン、Ｃ４〜８アルケニレンまたはＣ４〜８アルキニレンである。好ましくは、Ｒ１は、置換アリールまたは置換ヘテロアリールである。Ｒ１が置換アリールまたは置換ヘテロアリールであるとき、該置換された基上の置換基は、好ましくは、１個または２個のＣ１〜６アルキル、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシまたはパーフルオロエトキシである。
【００４５】
第五サブクラスの化合物には、以下である式Ｉの化合物の群がある：Ａは、単結合である；そして
Ｒ１は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルであり、それらのいずれがは、必要に応じて、置換されている。
【００４６】
該第五サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ｒ１が、シクロアルキルまたはシクロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている群の化合物がある。好ましくは、Ｒ１は、４員〜８員、さらに好ましくは、５員〜７員の必要に応じて置換したシクロアルキル基または必要に応じて置換したシクロアルケニル基である。Ｒ１が置換シクロアルキル基または置換シクロアルケニル基であるとき、該置換された基上の置換基は、好ましくは、１個または２個のＣ１〜６アルキル、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシまたはパーフルオロエトキシである。
【００４７】
該第五サブクラスの化合物のうちで他の好ましい群の化合物には、Ｒ１が、シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルであり、それらのいずれがが、必要に応じて、置換されている群の化合物がある。好ましくは、Ｒ１は、４員〜８員、さらに好ましくは、５員〜７員の必要に応じて置換したシクロヘテロアルキル基または必要に応じて置換したシクロヘテロアルケニル基である。Ｒ１が置換シクロヘテロアルキル基または置換シクロヘテロアルケニル基であるとき、該置換された基上の置換基は、好ましくは、１個または２個のＣ１〜６アルキル、ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシまたはパーフルオロエトキシである。
【００４８】
この好ましい群の化合物のうちで、式Ｉのスルファモイル基の窒素は、化学的に実現可能かつ安定であるとき、該シクロヘテロアルキルまたはシクロヘテロアルケニルのヘテロ原子に直接結合され得、そのいずれかは、必要に応じて、置換されている。例えば、もし、Ｒ１が非置換ピペリジン基であるとき、式Ｉのスルファモイル基の窒素は、そのピペリジン基の窒素に直接結合され得る。
【００４９】
第六サブクラスの化合物には、以下である式Ｉの化合物の群がある：ここで、Ａは、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、そのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして
Ｒ１は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨＲ３、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ３、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＲ３または−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＲ３である。
【００５０】
該第六サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ａが、Ｃ１〜８置換アルキレン、Ｃ２〜８置換アルケニレンまたはＣ２〜８置換アルキニレンであり、そのいずれかが、必要に応じて、置換されている式Ｉの化合物がある。該第六サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ａが、Ｃ１〜６置換アルキレン、Ｃ２〜６置換アルケニレンまたはＣ２〜６置換アルキニレンであり、そのいずれかが、必要に応じて、置換されている式Ｉの化合物がある。
【００５１】
好ましくは、Ａは、以下の１個またはそれ以上で置換された置換Ｃ１〜８アルキレン基である：ヒドロキシ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、モノ−およびジ−Ｃ１〜４アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシまたはパーフルオロエトキシ。
【００５２】
第七サブクラスの化合物には、以下である式Ｉの化合物の群がある：
ここで、Ａは、アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレンであり、そのいずれかは、必要に応じて、置換されている；そして
Ｒ１は、アミジノ、グアニジノ、ビグアニジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノアミノまたはホルミルイミノアミノである。
【００５３】
該第七サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ａが、Ｃ１〜８置換アルキレン、Ｃ２〜８置換アルケニレンまたはＣ２〜８置換アルキニレンであり、そのいずれかが、必要に応じて、置換されている式Ｉの化合物がある。該第七サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ａが、Ｃ１〜６置換アルキレン、Ｃ２〜６置換アルケニレンまたはＣ２〜６置換アルキニレンであり、そのいずれかが、必要に応じて、置換されている式Ｉの化合物がある。
【００５４】
第八サブクラスの化合物には、Ｒ１がキレーターである式Ｉの化合物の群がある。Ｒ１がキレーターであるとき、該キレーターはまた、必要に応じて、Ａを該キレーターに連結するリンカー基を含み得る。好ましいキレーターには、ニトロロトリ酢酸、ＥＤＴＡ、ビピリジルおよびヒスチジニルがある。
【００５５】
第九サブクラスの化合物には、以下である式Ｉの化合物の群がある：ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＡは、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、約ｐＨ７でイオン化される化学部分を形成する。該第九サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、−１〜−３の正味電荷を有する化学部分を形成する化合物の群がある。該第九サブクラスの化合物のうちで好ましい群の化合物には、Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、−１〜−２の正味電荷を有する化学部分を形成する化合物の群がある。該第九サブクラスの化合物のうちで他の好ましい群の化合物には、Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、＋１〜＋３の正味電荷を有する化学部分を形成する化合物の群がある。該第九サブクラスの化合物のうちで他の好ましい群の化合物には、Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、＋１〜＋２の正味電荷を有する化学部分を形成する化合物の群がある。該第九サブクラスの化合物のうちで他の好ましい群の化合物には、Ｒ１、Ｒ２およびＡが、Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、０の正味電荷を有する化学部分を形成する化合物の群がある。
【００５６】
式Ｉの代表的な化合物には、以下がある：
４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ（２−ピロリジン−１−イル−エチル）ベンゼンスルホンアミド；
４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）−プロピル］−ベンゼンスルホンアミド；
ジメチル−（４−｛２−［４−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］オキサゾール−５−イル｝−フェニル）アミン；
ジメチル−（４−｛２−［４−（４−メチルピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−オキサゾール−５−イル｝フェニル）アミン；
４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）ベンゼンスルホンアミド；
２−｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−ベンゼンスルホニルアミノ｝コハク酸；
｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホニルアミノ｝−酢酸；
（｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホニル｝メチル−アミノ）−酢酸；
４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）−ベンゼンスルホンアミド；
４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス−ヒドロキシメチルエチル）ベンゼンスルホンアミド；
２−アミノ−５−｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−ベンゼンスルホニルアミノ｝ペンタン酸；
３−［４−（５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホニル］−チアゾリジン−２，４−ジカルボン酸ジメチルエステルおよびそれらの塩。
【００５７】
以下の化合物は、本発明から除外されることが分かる：Ｎ−（２−アミノエチル）−４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホンアミド；Ｎ−メチル−Ｎ−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホンアミド；Ｎ−ブチル−４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホンアミド；３−［４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホンアミノ］−フェニルボロン酸；Ｎ−（２−（２−ブロモアセトアミド）エチル）−４−［５−（４−ジメチルアミノ−フェニル）オキサゾール−２−イル］−ベンゼンスルホンアミド；Ｎ−（２−（３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド）エチル）−４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼン−スルホンアミド；３−［４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール２−イル］ベンゼン−スルホンアミノ］プロピオン酸２，５−ジオキソピロリジニルエステル；Ｎ−（２−（２−ペンタフルオロベンズアミド）エチル）−４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホンアミド；Ｎ−（２−アミノエチル）−４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホンアミド；およびジメチル−［４−（２−［４−（モルホリン−４−スルホニル）フェニル］−オキサゾール−５−イル）フェニル］アミン。
【００５８】
本発明はまた、式Ｉの化合物の塩を含む。塩との用語は、式Ｉの化合物の酸付加塩または塩基付加塩を意味する。酸付加塩は、式Ｉの化合物に適当な酸を加えることにより、形成できる。塩基付加塩は、式Ｉの化合物に適当な塩基を加えることにより、形成でき、ここで、該化合物は、該適当な塩基と反応する酸化学基を有する。該酸または塩基は、式Ｉの化合物化合物を実質的に劣化、分解または破壊しない。
【００５９】
本発明は、また、立体異性体だけでなく光学異性体（例えば、個々の鏡像異性体およびジアステレオマーだけでなく鏡像異性体の混合物）も含むと考えられることが理解でき、これらは、本発明の選択した化合物における構造上の非対称性の結果として、生じる。
【００６０】
式Ｉの化合物はまた、溶媒和（特に、水和）され得る。水和は、これらの化合物またはこれらの化合物を含有する組成物の製造中に起こり得るか、または水和は、これらの化合物が吸湿性であるために、時間の経過と共に起こり得る。
【００６１】
任意の構成成分または式Ｉにおいて、任意の変数が１回より多く生じるとき、各出現時のその定義は、各他の出現時のその定義とは無関係である。また、置換基および／または変数の組合せは、このような組合せが安定な化合物を生じる場合に限り、許容できる。
【００６２】
本発明の他の局面は、式Ｉの化合物および１種またはそれ以上の化学的に適当な溶媒を含有する組成物に関する。該化学的に適当な溶媒は、以下からなる群から選択される：１−ブタノール；１−ヘプタノール；１−ヘキサノール；１−メトキシ−２−プロパノール；１−オクタノール；１−ペンタノール；１−プロパノール；１，１，１−トリクロロ−メタン；１，１，２−トリクロロエチレン；１，１，２−トリクロロトリフルオロエタン；１，２−ジクロロテトラフルオロエタン；１，３−ブタンジオール；１，３−ブチレングリコールメチルエーテル；１，３−ジメトキシ−２−プロパノール；１，４−ジオキサン；２−（２−ｎ−ブトキシエトキシ）エタノール；２−ブタノール；２−ブタノン；２−ブトキシエタノール酢酸エステル；２−ジエチルアミノエタノール；２−エトキシエタノール酢酸エステル；２−エトキシエタノール；２−ヘプタノン；２−ヘキサノン；２−ヒドロキシプロパン酸；２−メトキシエタノール；２−メチルアミノエタノール；２−メチルプロパノール；２−オクタノール；２−ペンタノン；２，４−トルエンジイソシアネート；２，５−ヘキサンジオン；３−（３−メチルブトキシ）−１，２−プロパンジオール；３−ブトキシ−１，２−プロパンジオール；３−エトキシ−１−プロパノール；３−メトキシ−１，２−プロパンジオール；３−メチル−２−ブタノン；４−メチル−２−ペンタノール；５−メチル−２−ヘキサノン；５−メチル−３−ヘプタノン；α−テルピネオール；酢酸；酢酸２−メトキシ−１−メチルエチルエステル；アセトン；アクロレイン；酢酸アミル；ベンゼン；酢酸プロピル；ブトキシエタノール；酢酸ブチル；ブチルアミン；酪酸メチル；酪酸ブチル；四塩化炭素；カテコール；クロロジフルオロメタン；クロロメタン；クロロペンタフルオロエタン；クロロトリフルオロメタン；シクロヘキサノール；シクロヘキサノン；ｄ−リモネン；ジアセトンアルコール；ジアミルエーテル；ジブチルエーテル；ジクロロジフルオロメタン；ジクロロフルオロメタン；ジクロロメタン；ジエタノールアミン；シュウ酸ジエチル；ジエチレングリコールジエチルエーテル；ジエチレングリコールモノエチルエーテル酢酸エステル；ジエチレングリコールモノメチルエーテル；ジエチレングリコールモノメチルエーテル酢酸エステル；ジエチレングリコール；ジエチレングリコールジメチルエーテル；ジエチレングリコールモノエチルエーテル；ジイソブチルケトン；ジイソプロピルエーテル；ジイソプロピルアミン；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ジメチルアセトアミド；ジメチルアミン；ジメチルエタノールアミン；ジペンテン；ジフェニルエーテル；ジプロピレングリコールモノメチルエーテル酢酸エステル；ジプロピレングリコールモノメチルエーテル；エタノール；酢酸エチル；プロピオン酸エチル；エチルベンゼン；エチレングリコールモノフェニルエーテル；エチレングリコール；エチレンオキシド；エチレングリコールメチルエーテル酢酸エステル；エチレングリコールジブチルエーテル；エチレングリコールジエチルエーテル；エチレングリコールモノベンジルエーテル；ホルムアルデヒド；ギ酸；フルフラール；フルフリルアルコール；γ−��チロラクトン；ヘプタン；ヘキサメチルジシラザン；ヘキサメチレンジイソシアネート；ヘキサン；ヒドロキノン；イソオクチルアルコール；イソプロピルアルコール；酢酸イソプロピル；乳酸エチルエステル；乳酸メチルエステル；乳酸ブチルエステル；乳酸アミルエステル；ｍ−キシレン；メタンスルホン酸；メタノール；メトキシベンゼン；メチルイソブチルケトン；メチル第三級ブチルエーテル；酢酸メチル；メチルイソブテニルケトン；プロピオン酸メチル；モノエタノールアミン；モノエチルアミン；モノメチルアミン；酢酸ｎ−ヘキシル；ｎ−ヘキシルエーテル；Ｎ−メチルピロリドン；Ｎ−ニトロソジメチルアミン；ｏ−キシレン；ｐ−キシレン；ペンタフルオロプロピルアルコール；ペンタン；ポリグリコールＥ２００；プロピレングリコールモノフェニルエーテル；プロピレンオキシド；プロピレンカーボネート；プロピレングリコールジエチルエーテル；酢酸第二級ブチル；スルホラン；テルピニルエチレングリコールエーテル；テトラクロロエチレン；テトラエチレンペンタミン；テトラエチレングリコール；テトラフルオロメタン；テトラヒドロフラン；テトラヒドロフルフリルアルコール；テトラヒドロピラン−２−メタノール；トルエン；トリクロロフルオロメタン；トリクロロメタン；トリエタノールアミン；トリエチルアミン；トリエチレングリコール；トリエチレングリコールジメチルエーテル；トリフルオロメタン；トリメチレングリコール；トリオキサン；ＶＭ  ＆  Ｐ  Ｎａｐｈｔｈａ；水；キシレン；またはそれらの組み合わせ。代表的な組合せには、ＤＭＳＯと水；メタノールと水；エタノールとメタノール；およびイソプロパノールと水が挙げられる。
【００６３】
（定義）
本明細書中で使用する「アルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、１０個までの炭素（但し、その鎖長が限定されている場合は除く）の直鎖基または分枝鎖基の両方（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、４，４−ジメチルペンチル、オクチル、２，２，４−トリメチルペンチル、ノニルおよびデシル）のいずれかを意味する。
【００６４】
本明細書中で使用する「アルキレン」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、１０個までの炭素（但し、その鎖長が限定されている場合は除く）の直鎖基または分枝鎖基を意味する。典型的な例には、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピレン（−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−）、ｎ−ブチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソブチレン、３−メチルペンチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−）、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレンおよびデシレンが挙げられる。
【００６５】
本明細書中で使用する「アルケニル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、２個〜１０個の炭素原子（但し、その鎖長が限定されている場合は除く）の直鎖または分枝鎖基を意味し、これには、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、このアルケニル鎖は、２個〜８個の炭素原子の長さであり、最も好ましくは、２個〜４個の炭素原子の長さである。
【００６６】
本明細書中で使用する「アルケニレン」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、２個〜１０個の炭素原子（但し、その鎖長が限定されている場合は除く）の直鎖または分枝鎖基を意味し、該直鎖基または分枝基は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む。典型的な例には、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、プロペニレン（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−）、ｎ−ブテニレン（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−）、および３−メチル−２−ペンテニレン（−ＣＨ２ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２−）、ヘキセニレン、ヘプテニレン、オクテニレン、ノネニレンおよびデセニレンが挙げられる。
【００６７】
本明細書中で使用する「アルキニル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、２個〜１０個の炭素原子（但し、その鎖長が限定されている場合は除く）の直鎖または分枝鎖基を意味し、ここで、その鎖中の炭素原子の２個の間では、少なくとも１個の三重結合が存在し、これには、アセチレニル、１−プロピニル、２−プロピニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、このアルキニル鎖は、２個〜８個の炭素原子の長さであり、最も好ましくは、２個〜４個の炭素原子の長さである。
【００６８】
本明細書中で使用する「アルキニレン」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、２個〜１０個の炭素原子（但し、その鎖長が限定されている場合は除く）の直鎖または分枝鎖基を意味し、該直鎖基または分枝基は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む。典型的な例には、エチニレン（−Ｃ≡Ｃ−）、プロピニレン（−Ｃ≡ＣＣＨ２−および−ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−）、ｎ−ブチニレン（−Ｃ≡ＣＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２Ｃ≡ＣＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ≡Ｃ−）、４−メチル−２−ペンチニレン（−ＣＨ２Ｃ≡ＣＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−）、１−ブチニレン、２−ブチニレン、３−ブチニレン、４−ブチニレン、ペンチニレン、ヘキシニレン、ヘプチニレン、オクチニレン、ノニニレンおよびデシニレンが挙げられる。本明細書中で置換基としてアルケニル部分またはアルキニル部分が存在している全ての場合では、その不飽和結合（すなわち、そのビニレン結合またはアセチレン結合）は、好ましくは、窒素部分、酸素部分またはイオウ部分に直接的には結合していない。
【００６９】
本明細書中で使用する「アルコキシ」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、酸素原子に結合した上記アルキル基のいずれかを意味する。典型的な例には、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、第二級ブチルオキシ、ｎ−ブチルオキシ、ｔ−ブチルオキシ、ｎ−ペンチルオキシ、２−メチルブチルオキシ、３−メチルブチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシおよび２−エチルブチルオキシなどがある。
【００７０】
本明細書中で使用する「アリール」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、その環部分に６個〜１４個の炭素、好ましくは、その環部分に６個〜１０個の炭素を含有する単環式、二環式または三環式の芳香族基を意味する。典型的な例には、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラセニルおよびテトラヒドロナフチルが挙げられる。
【００７１】
本明細書中で使用する「アラルキル」および「アリールアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、アリール置換基を有する上述のアルキル基を意味する。このような基には、ベンジル、フェニルエチル、フェニルプロピルまたは２−ナフチルメチルが挙げられる。
【００７２】
本明細書中で使用する「ヘテロアリール」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、５個〜１４個の環原子、環状アレイで共有されている６個、１０個または１４個のπ電子を有し、そして炭素原子および１個、２個、３個または４個の酸素、窒素またはイオウヘテロ原子を含有する基を意味する（この場合、ヘテロアリール基の例には、以下がある：チエニル基、ベンゾ［ｂ］チエニル基、ナフト［２，３−ｂ］チエニル基、チアントレニル基、フリル基、ピラニル基、イソベンゾフラニル基、ベンゾオキサゾリル基、クロメニル基、キサンテニル基、フェノキサチイニル基、２Ｈ−ピロリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、インドリジニル基、イソインドリル基、３Ｈ−インドリル基、インドリル基、インダゾリル基、プリニル基、４Ｈ−キノリジニル基、イソキノリル基、キノリル基、フタラジニル基、ナフチリジニル基、キナゾリニル基、シンノリニル基、プテリジニル基、４αＨ−カルバゾリル基、カルバゾリル基、β−カルボリニル基、フェナントリジニル基、アクリジニル基、ペリミジニル基、フェナントロリニル基、フェナジニル基、イソチアゾリル基、フェノチアジニル基、イソオキサゾリル基、フラザニル基、フェノザジニル基およびテトラゾリル基）。
【００７３】
本明細書中で使用する「ヘテロアリールアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、アルキル基に結合したヘテロアリール基を意味する。典型的な例には、２−（３−ピリジル）エチル、３−（２−フリル）−ｎ−プロピル、３−（３−チエニル）−ｎ−プロピルおよび４−（１−イソキノリニル）−ｎ−ブチルが挙げられる。本明細書中で使用する「ヘテロアリール（Ｃ１〜４）アルキル」との用語は、Ｃ１〜４アルキル基に結合したヘテロアリール基を意味する。
【００７４】
本明細書中で使用する「シクロアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、３個〜１０個の炭素原子を含有するシクロアルキル基を意味する。典型的な例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニルおよびシクロデシルがある。シクロアルキルには、また、二環式シクロアルキル基が挙げられる。典型的な二環式シクロアルキル基には、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［３．１．１］ヘプチルおよびビシクロ［２．２．２］オクチルが挙げられる。
【００７５】
本明細書中で使用する「シクロアルキルアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、アルキル基に結合したシクロアルキル基を意味する。典型的な例には、２−シクロペンチルエチル、シクロヘキシルメチル、シクロペンチルメチル、３−シクロヘキシル−ｎ−プロピルおよび５−シクロブチル−ｎ−ペンチルが挙げられる。本明細書中で使用する「シクロアルキル（Ｃ１〜４）アルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、Ｃ１〜４アルキル基に結合したシクロアルキル基を意味する。
【００７６】
本明細書中で使用する「シクロアルケニル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、３個〜１０個の炭素原子および１個〜３個の炭素−炭素二重結合を含有するシクロアルケニル基を意味する。典型的な例には、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタジエニル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル、シクロオクタトリエニル、シクロノネニル、シクロノナジエニルおよびシクロデセニルが挙げられる。シクロアルケニルには、また、二環式シクロアルケニル基が挙げられる。典型的な二環式シクロアルケニル基には、ビシクロ［２．２．１］ヘプテニル、ビシクロ［３．１．１］ヘプテニルおよびビシクロ［２．２．２］オクテニルが挙げられる。
【００７７】
本明細書中で使用する「シクロアルケニルアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、アルキル基に結合したシクロアルケニル基を意味する。典型的な例には、２−（２−シクロペンテニル）エチル、２−（２−シクロヘキセニル）エチル、３−（２−シクロペンテニル）−ｎ−プロピルおよび４−（３−シクロヘキセニル）−ｎ−ブチルが挙げられる。本明細書中で使用する「シクロアルケニルアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、Ｃ１〜４アルキル基に結合したシクロアルケニル基を意味する。
【００７８】
本明細書中で使用する「シクロヘテロアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、炭素原子および１個〜４個のヘテロ原子を含有する５個〜１４個の環原子を意味する。典型的な例には、ピロリジニル、イミダゾリジニル、ピラゾリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジル、ピペラジニル、キヌクリジニル、モルホリニルおよびジオキサシクロヘキシルが挙げられる。シクロヘテロアルキルには、また、二環式シクロヘテロアルキル基が挙げられる。典型的な二環式シクロヘテロアルキル基には、キヌクリジニル、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル、８−アザビシクロ［３．２．１］オクチルおよび４−チア−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタンが挙げられる。
【００７９】
本明細書中で使用する「シクロヘテロアルキルアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、アルキル基に結合した、炭素原子および１個〜４個のヘテロ原子を含有する５個〜１４個の環原子を意味する。典型的な例には、２−（２−フラニル）エチル、３−（２−モルホリニル）−ｎ−プロピル、４−（１−ピペリジル）−ｎ−ブチルおよび２−（２−イミダゾリジニル）エチルが挙げられる。本明細書中で使用する「シクロヘテロアルキル（Ｃ１〜４）アルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、Ｃ１〜４アルキル基に結合した、炭素原子および１個、２個、３個または４個の酸素ヘテロ原子、窒素ヘテロ原子またはイオウヘテロ原子を含有する５個〜１４個の環原子を意味する。
【００８０】
本明細書中で使用する「シクロヘテロアルケニル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、炭素原子、１個〜４個のヘテロ原子および１個〜３個の二重結合を含有する５個〜１４個の環原子を意味する。典型的な例には、ピロリニル、イミダゾリニル、ピラゾリニル、ジヒドロピリジニル、テトラヒドロピリジニルおよびジヒドロピラニルが挙げられる。シクロヘテロアルケニルには、また、二環式シクロヘテロアルケニル基が挙げられる。典型的な二環式シクロヘテロアルケニル基には、キヌクリジニル、７−アザビシクロ［２．２．１］ヘプテニルおよび８−アザビシクロ［３．２．１］オクテニルが挙げられる。
【００８１】
本明細書中で使用する「シクロヘテロアルケニアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、アルキル基に結合した、炭素原子、１個〜４個のヘテロ原子、１個〜３個の二重結合を含有する５個〜１４個の環原子を意味する。典型的な例には、２−（２−（１，２−ジヒドロピリジニル））エチルおよび３−（２−（１，２，３，６−テトラヒドロピリジニル）−ｎ−プロピルが挙げられる。本明細書中で使用する「シクロヘテロアルケニル（Ｃ１〜４）アルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、Ｃ１〜４アルキル基に結合したシクロヘテロアルケニル基を意味する。
【００８２】
本明細書中で使用する「アルキレンジオキシ」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、環を意味し、特に、Ｃ１〜４アルキレンジオキシである。アルキレンジオキシ基は、必要に応じて、ハロゲン（特に、フッ素）で置換されている。典型的な例には、メチレンジオキシ（ＯＣＨ２Ｏ）またはジフルオロメチレンジオキシ（ＯＣＦ２Ｏ）が挙げられる。
【００８３】
本明細書中で使用する「ハロゲン」または「ハロ」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素を意味する。
【００８４】
本明細書中で使用する「モノアルキルアミン」および「モノアルキルアミノ」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、１個の水素原子を上で定義したアルキル基で置換したＮＨ２基を意味する。
【００８５】
本明細書中で使用する「ジアルキルアミン」および「ジアルキルアミノ」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、両方の水素原子を上で定義したアルキル基で置換したＮＨ２基を意味する。
【００８６】
本明細書中で使用する「ヒドロキシアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、その１個またはそれ以上の水素を１個またはそれ以上のヒドロキシル部分で置換したアルキル基を意味する。
【００８７】
本明細書中で使用する「ハロアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、その１個またはそれ以上の水素を１個またはそれ以上のハロ部分で置換したアルキル基を意味する。典型的な例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、トリクロロエチル、トリフルオロエチル、フルオロプロピルおよびブロモブチルが挙げられる。
【００８８】
本明細書中で使用する「ハロアルケニル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、その１個またはそれ以上の水素を１個またはそれ以上のハロ部分で置換したアルケニル基を意味する。
【００８９】
本明細書中で使用する「ハロアルキニル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、その１個またはそれ以上の水素を１個またはそれ以上のハロ部分で置換したアルキニル基を意味する。
【００９０】
本明細書中で使用する「カルボキシアルキル」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、その１個またはそれ以上の水素を１個またはそれ以上のカルボン酸部分で置換したアルキル基を意味する。
【００９１】
本明細書中で使用する「ヘテロ原子」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、炭素原子（「Ｏ」）、イオウ原子（「Ｓ」）または窒素原子（「Ｎ」）を意味する。そのヘテロ原子は、窒素であるとき、ＮＲａＲｂ部分を形成し得、ここで、ＲａおよびＲｂは、互いに別個に、水素またはＣ１〜Ｃ８アルキルであるか、またはそれらが結合する窒素と一緒になって、飽和または不飽和の５員環、６員環または７員環を形成することが認識される。
【００９２】
本明細書中で使用する「ｔ−Ａｍ」との略語は、単独でまたは他の基の一部として、ＣＨ３ＣＨ２（ＣＨ３）２Ｃ−の構造を有する活性アミル部分を意味する。
【００９３】
本明細書中で使用する「窒素含有」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、化学部分内に少なくとも１個の窒素原子を含有する該部分を意味する。具体的には、「窒素含有」は、シクロヘテロアルキルおよびシクロヘテロアルケニルのような部分を修飾するのに使用される。例えば、窒素含有シクロヘテロアルキル基は、該基が環の一部として少なくとも１個の窒素原子を有する上で定義したシクロヘテロアルキル基である。窒素含有シクロヘテロアルキル基の例には、ピロリジン、ピペリジン、モルホリンおよび３−チアピロリジンが挙げられる。窒素含有シクロヘテロアルキル基の群に含まれないシクロヘテロアルキル基の例には、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェンおよびチアペンがある。
【００９４】
本明細書中で使用する「キレーター」との用語は、単独でまたは他の基の一部として、１個またはそれ以上のイオンに非共有結合的に結合するか錯化する化学部分を意味する。キレーターは、リチウム、カルシウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムおよび／または他の生物学的に重要な金属イオンに結合できる。イオンへのキレーターの結合は、キレーターとイオンとの間の解離定数を測定することにより、決定できる。本発明によれば、キレーターとイオンとの間の解離定数ＫＤは、約１０−３〜約１０−１５Ｍ−１である。好ましくは、キレーターとイオンとの間の解離定数ＫＤは、約１０−６〜約１０−１５Ｍ−１である。Ｒ１がキレーターであるとき、Ｒ１をＡに連結する化学結合は、Ｒ１の炭素原子またはＲ１のヘテロ原子上にあり得る。好ましくは、該キレーターをＡに連結する化学結合は、該キレーターの炭素原子上にある。
【００９５】
キレーターには、任意のカチオンまたはアニオンに結合するか錯化する化学部分が挙げられる。キレーターの例は、当該技術分野で周知である。好ましくは、このキレーターは、金属カチオンに結合する。適当なキレーターには、ビピリジル（ｂｉｐｙ）；ターピリジル（ｔｅｒｐｙ）；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；クラウンエーテル；アザ−クラウンエーテル；コハク酸；クエン酸；サリチル酸；ヒスチジン；イミダゾール；エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）；ニトロロ酢酸；アセチルアセトネート（ａｃａｃ）；硫酸エステル；ジチオカルバミン酸エステル；カルボン酸エステル；アルキルジアミン；エチレンジアミン（ｅｎ）；ジエチレントリアミン（ｄｉｅｎ）；硝酸エステル；ニトロ；ニトロソ；（Ｃ６Ｈ５）２ＰＣＨ２ＣＨ２Ｐ（Ｃ６Ｈ５）２（ｄｉｐｈｏｓ）；グリム；ジグリム；ビス（アセチルアセトネート）エチレンジアミン（ａｃａｃｅｎ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンテトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−トリ酢酸（ＤＯ３Ａ）、１−オキサ−４，７，１０−トリアザシクロドデカン−トリ酢酸（ＯＴＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナントリ酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンテトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、ＤＯＴＡ−Ｎ（２−アミノエチル）アミド；ＤＯＴＡ−Ｎ−（２−アミノフェネチル）アミド；および１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカンがある。
【００９６】
本明細書中で使用する「イオン化された」との用語は、化合物または化学部分の正電荷および負電荷が均衡していない該化合物または化学部分の状態、または隣接原子または非隣接原子上に正電荷および負電荷が存在している化合物または化学部分の状態を意味し、該化合物または化学部分は、無電荷正準表示を有しない。イオン化された化合物または化学部分は、正味負電荷または正電荷を有し得る。好ましくは、正電荷および負電荷の不均衡は、それぞれ、１個またはそれ以上の陽子の獲得または喪失が原因である。１個またはそれ以上の陽子の獲得または喪失は、該化合物または化学部分内の官能基間で起こり得る。双性イオン性の化合物または化学部分は、それぞれ、イオン化された化合物または化学部分に含まれる。本発明によれば、化合物は、該化合物または化学部分のサンプルの少なくとも約８９％がｐＨ７で水溶液中にてイオン化されるなら、好ましくは、該化合物または化学部分のサンプルの少なくとも約９８％がｐＨ７で水溶液中にてイオン化されるなら、イオン化されている。
【００９７】
化合物は、当該技術分野で周知の方法（例えば、分光学的または電位差測定的）で、イオン化されていると決定できる。一例として、式Ｉの化合物（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＡは、該Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２を形成する）がある。水溶液中にて、約ｐＨ７で、該化合物の少なくとも９８％の分子がプロトン化形状で該−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２を含有していることが決定される。それゆえ、本発明によれば、式Ｉの化合物（ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＡは、該Ｒ１、Ｒ２およびＡが結合するＮと一緒になって、−Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２を形成する）は、化合物の該第九サブクラスに分類されると考えられる。
【００９８】
本明細書中で使用する「置換した」との用語は、以下からなる群から別個に選択される１個またはそれ以上の置換基で置換した基を意味する：ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、トリフルオロメチル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルコキシ、Ｃ１〜６アルキレンジオキシ、Ｃ１〜６アミノアルキル、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、（Ｃ１〜６）アルコキシ（Ｃ２〜６）アルコキシ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、Ｃ６〜１４アル（Ｃ１〜６）アルコキシカルボニル、Ｃ２〜６アルキニルカルボニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、Ｃ２〜６アルケニルスルホニル、Ｃ２〜６アルキニルスルホニル、Ｃ６〜１０アリールスルホニル、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜６アルキルスルホンアミド、Ｃ６〜１０アリールスルホンアミド、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホンアミド、Ｃ２〜６カルボキシアルコキシ、Ｃ２〜６カルボキシアルキル、カルボキシアルキルアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシ、パーフルオロエトキシ、グアニジン、アミジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノ、ホルミルイミノ、アシルニトリル、アシルアジド、アセチルアジド、ジクロロトリアゼン、イソチオシアネート、ハロゲン化スルホニル、スルホスクシンイミジルエステル、イソシアネート、ハロゲン化アシル、アルデヒド、ハロアセトアミド、マレイミド、アジリジニル、アルキルチオ（ジスルフィド）、アクリロ、α−ハロアルキルカルボニル、ボロネート、ヒドラジン、セミカルバジド、カルボヒドラジン、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルケニルアルキル、シクロヘテロアルキルアルキルおよびシクロヘテロアルケニルアルキル。「必要に応じて置換した」との用語は、置換されていても置換されていなくてもよい基を意味する。
【００９９】
「置換した」との用語が、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロヘテロアルキル基、シクロヘテロアルケニル基、アリール基またはヘテロアリール基と併用されるとき、本明細書中の「置換した」との用語は、以下からなる群から別個に選択される１個またはそれ以上の置換基で置換した基を意味する：ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、トリフルオロメチル、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ６〜１０アリール、５員〜１０員ヘテロアリール、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルコキシ、Ｃ１〜６アルキレンジオキシ、Ｃ１〜６アミノアルキル、Ｃ１〜６アミノアルコキシ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ、Ｃ２〜６アルキルカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ２〜６アルコキシカルボニル、カルボキシ、Ｃ１〜６ヒドロキシアルキル、Ｃ２〜６ヒドロキシアルコキシ、（Ｃ１〜６）アルコキシ（Ｃ２〜６）アルコキシ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、ジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ（Ｃ２〜６）アルコキシ、Ｃ２〜１０モノ（カルボキシアルキル）アミノ、ビス（Ｃ２〜１０カルボキシアルキル）アミノ、Ｃ６〜１４アル（Ｃ１〜６）アルコキシカルボニル、Ｃ２〜６アルキニルカルボニル、Ｃ１〜６アルキルスルホニル、Ｃ２〜６アルケニルスルホニル、Ｃ２〜６アルキニルスルホニル、Ｃ６〜１０アリールスルホニル、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホニル、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル、Ｃ１〜６アルキルスルホンアミド、Ｃ６〜１０アリールスルホンアミド、Ｃ６〜１０アル（Ｃ１〜６）アルキルスルホンアミド、アミジノ、グアニジノ、Ｃ１〜６アルキルイミノアミノ、ホルミルアミノアミノ、Ｃ２〜６カルボキシアルコキシ、Ｃ２〜６カルボキシアルキル、カルボキシアルキルアミノ、シアノ、トリフルオロメトキシまたはパーフルオロエトキシ。
【０１００】
好ましくは、「置換した」との用語は、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロヘテロアルキル基、シクロヘテロアルケニル基、アリール基またはヘテロアリール基と併用されるとき、以下からなる群から別個に選択される１個またはそれ以上の置換基で置換した基を意味する：Ｃ１〜４アルキル、Ｃ２〜４アルケニル、Ｃ２〜４アルキニル、Ｃ６〜１０アリール、５員〜１０員ヘテロアリール、ヒドロキシ、Ｃ１〜４アルコキシ、Ｃ１〜４アルキレンジオキシ、ハロ、Ｃ１〜４ハロアルキル、Ｃ１〜４アルキルチオ、チオ、アミノ、モノ（Ｃ１〜４）アルキルアミノおよびジ（Ｃ１〜４）アルキルアミノ。
【０１０１】
「蛍光プローブ分子」との用語は、式Ｉの化合物をいう。この式Ｉの化合物は、規定の波長または規定の範囲の波長の光によって励起された後に、蛍光エネルギーを放出し得る。この蛍光分子または化合物は、アンフォールディングしたレセプターまたは変性したレセプターに結合し得る。
【０１０２】
「コンビナトリアルライブラリー」との用語は、構造に関連してもしなくともよい化学的または生化学的なビルディングブロックのセットを、所定の化合物の長さに対する可能な手段ごとにおいて、結合することにより形成される複数の分子または化合物をいう。あるいは、この用語は、化学的ビルデイングブロックの特定のセットを選択的な組合せによって形成される複数の化学的または生化学的な化合物を呼称し得る。コンビナトリアルライブラリーは、当業者にとってなじみの深い方法に従って構築され得る。例えば、以下を参照のこと：
【０１０３】
【数１】
2005531490.tif 000004
【０１０４】
。好ましくは、「コンビナトリアルライブラリー」との用語は、米国特許第５，４６３，５６４号に示されるような、指向された多様性化学ライブラリーをいう。コンビナトリアルライブラリーが構築される様式に関わらず、このライブラリー中の各分子または化合物は、さらなる参照のために目録に記載される。
【０１０５】
用語「化合物ライブラリー」とは、化学的または生化学的ビルディングブロックを組み合わせるコンビナトリアルアプローチを使用して形成されなかった複数の分子または化合物である。
複数の分子または化合物をいう。代わりに、化合物ライブラリーは、リガンド−レセプター結合アッセイおいて将来使用されるために集積および貯蔵される複数の分子または化合物である。その化合物ライブラリー中の分子または化合物の各々は、さらなる参照のために目録に記載される。
【０１０６】
「複数（多数）の分子」、「複数（多数）の化合物」、および「複数（多数）の容器」とは、少なくとも２つの分子、化合物、または容器をいう。
【０１０７】
「スクリーニング」との用語は、変性および／またはアンフォールディングし得る標的分子に結合する能力に関する、複数の分子または化合物の試験をいう。スクリーニングは、熱シフトアッセイにおいて標的分子（例えば、タンパク質レセプター）に対する結合について分子が試験される、反復または非反復のプロセスである。例えば、複数の分子（たとえば、コンビナトリアルライブラリー）からの分子のどのサブセットも、その標的分子に結合しない場合、様々なサブセットが、熱シフトアッセイにおける結合について試験される。
【０１０８】
「ランク付け」との用語は、複数の分子または化合物が、あらゆる分子または化合物の非存在下での標的分子の熱アンフォールディング情報と比較したときの、標的分子に対して取得される熱アンフォールディング情報（例えば、熱アンフォールディングＴｍ）をシフトする能力に従って、標的分子に対する複数の分子または化合物の親和性の順位付けをいう。
【０１０９】
「ハイスループット」との用語は、人による介入が最小限のものとなり、かつ自動化が最大限のものとなるスクリーニング活性を含む。例えば、ハイスループットスクリーニングは、自動化した、ピペットティング、混合および加熱、熱アンフォールディング情報のソフトウェア制御生成、ならびに熱アンフォールディング情報のソフトウェア制御比較を含む。あるいは、ハイスループット法は、単一の適切な装置を操作する一人の人間による２４時間毎にスクリーニングされ得る方法である。
【０１１０】
「自動的に実施される」との用語は、スクリーニングプロセスの少なくとも数個の局面が機械によって実行され、必要に応じて、コンピュータ制御されることを意味する。
【０１１１】
「ランク付け」との用語はまた、タンパク質の安定化、タンパク質フォールディング、タンパク質結晶化、またはタンパク質の寿命を最適化する際の複数の生化学的条件の効力の順位付けをいう。タンパク質安定化の最適化、タンパク質フォールディングの最適化、タンパク質結晶化の最適化、タンパク質寿命の最適化の状況において、用語「ランク付け」とは、条件の参照セット下に標的分子の熱アンフォールディング情報と比較して、標的分子に対して取得される熱アンフォールディング情報（例えば、熱アンフォールディングＴｍ）をシフトさせる生化学的条件の１以上の組み合わせの効力の順位付けをいう。
【０１１２】
上記のように、Ｔｍの変化に従った、分子、化合物、または生化学的条件が、好ましい。あるいは、分子、化合物、または生化学的条件が、温度アンフォールディング曲線全体の変化に従って標的分子を安定化させるそれらの能力について順位付けされ得る。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」との用語は、同異義語である。タンパク質またはペプチドについて、「アンフォールディング」との用語は、加熱に起因する構造の任意の変化を包含する。例えば、「アンフォールディング」との用語は、液体結晶性状態からモルテングロビュール状態への遷移をいう。このモルテングロビュール状態において、３次構造および４次構造が、タンパク質のネイティブ状態と比較して、変更されており、そして、少なくとも幾つかの２次構造はインタクトなままである。この用語「アンフォールディング」はまた、結晶性の喪失、アミノ酸側鎖の順序、２次構造、３次構造、または４次構造を含む。「アンフォールディング」との用語はまた、ランダムコイル形成を包含する。
【０１１４】
「フォールディング」、「リフォールディング」および「再び天然状態にする（再生する）」との用語は、生体分子の完全な化学的機能および生物化学的機能を与える、タンパク質の、正しいアミノ酸側鎖の順序、二次構造、三次構造、または四次構造、または核酸の二次構造、三次構造、または四次構造の獲得をいう。
【０１１５】
「変性タンパク質」との用語は、ネイティブのアミノ酸の、アミノ酸側鎖の順序、二次構造、三次構造、または四次構造を除去するための処理をしたタンパク質をいう。「ネイティブタンパク質」とは、完全な化学的機能または生物学的機能を有するタンパク質を提供する、アミノ酸側鎖の順序、二次構造、三次構造、または四次構造の程度を保持するタンパク質をいう。ネイティブタンパク質は、加熱されておらず、かつ化学的アンフォールディング剤（例えば、尿素）で処理していないタンパク質である。
【０１１６】
核酸に関して、「アンフォールディング」との用語は、アンフォールディング、脱コイル構造、脱ねじれ構造による、二次構造、三次構造、および／または四次構造の喪失、またはヘリックス構造の喪失をいう。塩基対合の中断による本発明ヘリックス構造および三本ヘリックス構造の消失が、核酸のアンフォールディングの例である。
【０１１７】
「アンフォールディングした核酸」および「変性した核酸」との用語は、フォールド、コイル状、ヘリックス状、またはねじれ状の構造を取り除くための処理がなされた核酸をいう。三本鎖の核酸複合体のアンフォールディングは、その三本鎖が２つの相補鎖から取り除かれたときに、完了する。二本鎖ＤＮＡのアンフォールディングは、２つの相補鎖の間の塩基対がさえぎられ、そしてランダム形態が想定される１本鎖ＤＮＡ分子を生じる、１本鎖ＲＮＡのアンフォールディングは、分子間水素結合がさえぎられるときに、完了し、そのＲＮＡは、ランダムで、水素結合を有さない形態を想定する。
【０１１８】
「アンフォールディング曲線」とは、温度の関数、変性剤濃度の関数、圧力の関数、ならびに他の生化学的パラメーターおよび物理化学的パラメーターの関数のようなタンパク質のアンフォールディングと関連した物理学的変化のプロットである。アンフォールディング曲線は、デジタル的に生成されるか、または紙もしくはコンピュータースクリーン上にプロットされることによって生成される。「温度アンフォールディング曲線」は、温度の関数としてタンパク質または核酸のアンフォールディングと関連する物理学的変化のプロットである。例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：８５９（１９９５）；およびＣｌｅｇｇ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２９９４〜２９９８（１９９３）を参照のこと。温度アンフォールディング曲線は、デジタル的に生成されるか、または紙もしくはコンピュータースクリーン上にプロットされることによって生成される。好ましくは、温度アンフォールディング曲線は、デジタル的に生成される。
【０１１９】
「中点温度、Ｔｍ」とは、温度アンフォールディング曲線の温度中点である、この温度中点において、Ｔｍは、サンプル中の標的分子の２分の１がアンフォールディングしており、そして、そのサンプル中の標的分子の２分の１が、フォールドしたままである。このＴｍは、当業者によって周知の方法を使用して容易に決定される。例えば、Ｗｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．らＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２７１７〜２７２４（１９９４）；Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２９９４〜２９９８（１９９３）を参照のこと。好ましくは、このＴｍは、デジタル温度アンフォールディング曲線からデジタル的に抽出される。
【０１２０】
「温度アンフォールディング情報」との語句とは、加熱に応答する標的分子アンフォールディングに関連する情報である。例えば、温度アンフォールディング曲線は、１種の温度アンフォールディング情報である。温度アンフォールディング曲線は、コンピュータスクリーン、または紙の上にプロットされ得る。好ましくは、熱アンフォールディング曲線は、コンピュータソフトウェアを使用して、デジタル的に生成され、次いで、コンピュータスクリーン上に可視化され得る。より好ましくは、温度アンフォールディング情報は、温度アンフォールディングＴｍである。デジタル的に生成された温度アンフォールディング曲線は、温度アンフォールディングＴｍがデジタル生成された曲線から抽出されるために、プリントまたは表示される必要はない。最も好ましくは、温度アンフォールディングＴｍは、デジタル的に生成された温度アンフォールディング曲線からデジタル的に抽出される。
【０１２１】
温度アンフォールディング情報がデジタル的に生成される数値的に求められる場合、以下の５つのフィッティングパラメーターが評価される：（１）ｙｆ，ネイティブタンパク質に対する遷移前の蛍光；（２）ｙｕ，アンフォールディングしたタンパク質の対する遷移後の蛍光；（３）Ｔｍ、アンフォールディング遷移に関する中点での温度；（４）ΔＨｕ，ｖｏｎ’ｔ  Ｈｏｆｆアンフォールディングエンタルピー変化；ならびに（５）ΔＣｐｕ，タンパク質アンフォールディングしたときの熱容量変化。非線形最小自乗法曲線フィッティングが、適切なソフトウェア（例えば、ＫＡＬＥＩＤＡＧＲＡＰＨＴＭ  ３．０ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｒｅａｄｉｎｇ  ＰＡ））を使用して実施される得、上記の５つのフィッティングパラメーターが、自乗された残差の和を最小化するためのＭａｒｑｕａｒｄｔ法を利用しつつ、揺らぐことを可能にする。温度中点Ｔｍが、デジタル的に生成された温度アンフォールディング情報から抽出される。
【０１２２】
本明細書中で使用される場合、「温度プロファイル」との用語は、経時的な温度変化をいう。「温度プロファイル」との用語は、温度における連続的な上がり下がりの変化を含み、線形的変化および非線形的変化の両方を含み得る。この用語はまた、任意の逐次的な温度変化プロトコル（温度の漸進的な上昇または下降によって特徴付けられるプロトコルも含む）（この間に、温度の上昇または下降は、温度が一定に維持される期間によって隔てられている）を含む。
【０１２３】
「リード分子」との用語は、標的分子に対する相対的に高い親和性を表示する、コンビナトリアルライブラリーに由来する、分子または化合物である。「リード化合物」および「リード分子」との用語は、同意義語である。「相対的に高い親和性」との用語は、１０−４〜１０−1５Ｍの範囲のＫｄにおける親和性に関する。
【０１２４】
「標的分子」との用語は、ペプチド、タンパク質、核酸および他のレセプターを含む。この用語は、酵素および酵素でないタンパク質の両方を包含する。この用語は、単量体のタンパク質および多量体のタンパク質を含む。多量体タンパク質は、ホモマーまたはヘテロマーであり得る。この用語は、少なくとも２つのヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む核酸を包含する。核酸は、１本鎖、二本鎖、または三本鎖であり得る。この用語は、合成オリゴヌクレオチド、組換えＤＮＡ分子の部分、または染色体ＤＮＡの一部分である核酸を含む。この標的分子との用語はまた、フォールディング、コイル形成、またはらせん形成を通して、二次構造、三次構造、または四次構造を得ることができる、ペプチド、タンパク質、および他のレセプターの部分を包含する。この標的分子としては、補因子、補酵素、補欠分子基、脂質、オリゴサッカリド、またはリン酸基が挙げられるが、これらに限定されない置換基で置換され得る。
【０１２５】
「標的分子」および「レセプター」との用語は、同義である。
【０１２６】
標的分子の例は、以下に開示されるものに含まれるが、これらの限定されない：
【０１２７】
【数２−１】
2005531490.tif 000005
【０１２８】
【数２−２】
2005531490.tif 000006
【０１２９】
。
【０１３０】
「分子」との用語は、その標的分子に対する結合親和性について試験される化合物をいう。この用語は、核酸およびペプチドを含むがそれらに限定されない任意の構造の化合物を包含する。より具体的には、「分子」との用語は、化合物ライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリー中の化合物を包含する。
【０１３１】
「蛍光」との用語は、蛍光エネルギーの放出を包含する。より狭くは、「蛍光」との用語は、蛍光放出、経時間的な蛍光の変化率（すなわち、蛍光寿命）、蛍光極性、蛍光異方性、および蛍光共鳴エネルギー移動をいう。Ｅｆｔｉｎｋ，Ｍ．Ｒ，，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．６６：４８２〜５０１（１９９４）を参照こと。
【０１３２】
「標的分子を接触させる」との用語は、広義には、溶液中のその標的分子を、結合について試験される分子とともに置くこと、または標的分子を安定化させることについて試験される条件下に、溶液中のその標的分子を置くことをいう。狭義には、接触は、標的分子の溶液および結合に関してスクリーニングされる分子との回転、旋回、振とう、または振動をいう。より具体的には、接触は、標的分子と結合に関して試験される分子との混合をいう。混合は、例えば、手動または自動ピペッティング装置を使用して、ピペットの先端を通す取り込みおよび放出の反復を行うことによって達成され得る。好ましくは、接触は、標的分子、結合について試験される分子との間の結合の平衡をいう。接触は、以下のように容器中で生じる得るか、または、その標的分子およびスクリーニングされる分子が、その容器中に置かれる。
【０１３３】
その標的分子は、結合についてスクリーニングされる分子と接触される前に核酸と接触され得る。この標的分子は、結合についてスクリーニングされる分子と接触される前にペプチドと複合体化され得る。標的分子は、結合についてスクリーニングされる分子と接触される前に、リン酸化され得るかまたは脱リン酸化され得る。
【０１３４】
炭化水素部分は、標的分子が結合についてスクリーニングされる分子と接触される前に、その標的分子に添加され得る。あるいは、炭化水素部分は、標的分子が結合についてスクリーニングされる分子と接触される前に、その標的分子から取り除から得る。
【０１３５】
「容器」との用語は、レセプターおよび結合について試験される分子が置かれ得る、任意の容器またはチャンバをいう。この「容器」は、反応試験管（例えば、試験管、マイクロチューブ、バイアルなど）を包含する。本発明の方法において、「容器」との用語は、好ましくは、マルチウェルマイクロプレートまたはマルチウェルマイクロタイタープレート中のウェルをいう。
【０１３６】
「サンプル」との用語は、容器の内容物をいう。
【０１３７】
「スペクトル放出」、「温度変化」および「物理学的変化」は、光または熱の形態でのエネルギーの放出、光または熱の形態でのエネルギーの吸収、濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ）の変化、および光の極性特性の変化を包含する。具体的には、これらの用語は、蛍光放出、蛍光エネルギー移動、紫外線または可視光の吸収、光の偏光極性、蛍光放出の偏光特性の変化、経時的な蛍光の変化率の変化（すなわち、蛍光寿命）、蛍光異方性の変化、蛍光共鳴エネルギー移動の変化、濁度の変化、ならびに酵素活性の変化をいう。好ましくは、これらの用語は、
蛍光、より好ましくは蛍光放出をいう。蛍光放出は、タンパク質にとって内因性のものであるか、または、蛍光レポーター分子に起因し得るものである。タンパク質アンフォールディングをモニターするため蛍光技術の使用は、当業者にとって周知である。例えば、Ｅｆｔｉｎｋ，Ｍ．Ｒ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．６６：４８２〜５０１（１９９４）を参照のこと。
【０１３８】
蛍光マイクロタイタープレート温度シフトアッセイは、米国特許第６，０２０，１４１号（２０００年２月１日発行）に開示される。
【０１３９】
「キャリア」との用語は、任意の形態にある、プラットフォームまたは他の対象を包含し、キャリアはそれ自体で、少なくとも２つの容器を支持することができる。このキャリアは、任意の材料（ガラス、プラスチックまたは金属が挙げられるがこれらに限定されない）から製作され得る。好ましくは、このキャリアは、マルチウェルマイクロプレートである。マイクロプレートおよびマイクロタイタープレートとの用語は、同意義である。このキャリアは、加熱エレメントから取り除かれる。本発明において、複数のキャリアが使用される。キャリアの各々は、複数のウェルを保持している。
【０１４０】
「生物化学的条件」との用語は、物理学的反応、化学的反応、または生物化学的反応の任意の構成要素を包含する。具体的には、この用語は、温度、圧力、タンパク質濃度、ｐＨイオン強度、塩濃度、時間、電流、電位差、補因子の濃度、補酵素、酸化剤、還元剤、界面活性剤、金属イオン、リガンド、またはグリセロールの条件をいう。
【０１４１】
「有効性（効力）」との用語は、アンフォールディングしたタンパク質または変性したタンパク質のリフォールディングまたは天然状態に戻すことを促進する際の生化学的条件の特定のセットの効力をいう。
【０１４２】
「条件の参照セット」との用語は、標的分子についての温度アンフォールディング情報が取得されるような生物化学的条件のセットをいう。参照条件とは異なる条件下で取得される温度アンフォールディング情報は、参照条件下の標的分子に関して得られる温度アンフォールディング情報と比較される。
【０１４３】
「偏光測定」との用語は、蛍光の偏光における変化の測定をいう。
【０１４４】
「集合」との用語は、単一の容器の中で標的分子または標的レセプターに結合することについて試験される少なくとも２つの分子のプールまたは群をいう。
【０１４５】
「ホスト（宿主）」とは、タンパク質を発現する目的のための組換えＤＮＡで形質転換された細菌細胞あって、このタンパク質は、その宿主細菌細胞にとって異種である。
【０１４６】
蛍光温度シフトアッセイは、標的レセプター（例えば、タンパク質または核酸）の温度アンフォールディング情報（例えば、Ｔｍ）のリガンド依存的な変化に基づく。ある温度範囲わたって加熱された場合、レセプターはアンフォールディングする。温度の関数としてアンフォールディングの程度をプロットすることのよって、そのレセプターに対して温度アンフォールディング曲線を取得し得る。通常は、温度アンフォールディング曲線は、コンピュータソフトウェアを使用して、デジタル的に生成され得る。温度中点Ｔｍは、レセプターの半分がアンフォールディングしており、かつその分子の半分がフォールドしているままである温度である。
【０１４７】
リガンド結合は、そのレセプターを安定させる（Ｓｃｈｅｌｌｍａｎ，Ｊ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １４：９９９〜１０１８（１９７５））。結合の程度および相互作用の自由エネルギーは、リガンド濃度の関数として類似した結果を得る（Ｓｃｈｅｌｌｍａｎ，Ｊ．，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：２７３〜２７９（１９９３）；Ｂａｒｃｅｌｏ，Ｆ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ７４：３１５〜３２４（１９９０））。リガンドによる安定化の結果として、より多くのエネルギー（熱）が、レセプターのアンフォールディングを行うために必要とされる。従って、リガンド結合によって、温度アンフォールディング情報（例えば、Ｔｍ）はシフトされる。この特性は、リガンドがレセプターに結合するか否か（温度アンフォールディング情報における変化または「シフト」）を決定するために使用され得、従って、そのリガンドがそのレセプターに結合することを意味する。
【０１４８】
（化合物の用途）
本発明の化合物は、蛍光プローブが有用であることが知られている用途において、蛍光プローブ分子として有用である。式Ｉの化合物を蛍光プローブ分子として使用する際に、式Ｉの化合物は、探査するサンプルに加えられる。式Ｉの化合物を含有するサンプルは、次いで、光源に暴露される。該光源は、一定波長範囲に限定された光を生じる。この波長範囲はも、約２００ナノメーター（ｎｍ）と約６００ナノメーターの間、好ましくは、約２５０ｎｍと約５００ｎｍの間、最も好ましくは、約３００ｎｍと約４００ｎｍの間である。その光源に暴露すると、式Ｉの化合物は、蛍光を起こし、蛍光エネルギーを放射する。好ましくは、蛍光エネルギーは、蛍光光エネルギーである。該放射された蛍光エネルギーは、当該技術分野で周知の方法を使用して、検出される。該放射された蛍光エネルギーの強度および波長により、そのサンプルについての情報が得られる。該放射された蛍光エネルギーは、約３００ｎｍと約８００ｎｍの間、好ましくは、約４００ｎｍと約７００ｎｍの間、好ましくは、約４５０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長範囲を有する。特に、式Ｉの化合物は、蛍光熱シフトアッセイにおける蛍光プローブ分子として有用である。蛍光熱シフトアッセイは、米国特許第６，０２０，１４１号で詳細に記述されており、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０１４９】
本発明の他の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子に対する多数の異なる分子の各々の親和性をランク付けする方法における式Ｉの化合物の使用を提供し、該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）式Ｉの化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、多数の異なる分子の１分子と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）該多数の異なる分子における任意の分子の非存在下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該多数の異なる分子の任意の分子の非存在下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該分子の各々の親和性をランク付けする工程。
【０１５０】
本発明の他の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子に対する多数の異なる分子の２個またはそれ以上の組合せの親和性をランク付けするマルチ可変方法における式Ｉの化合物の使用を提供し、該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）式Ｉの化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、多数の異なる分子の１個またはそれ以上の異なる分子の組合せと接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）該２個またはそれ以上の異なる任意の分子の非存在下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該２個またはそれ以上の異なる任意の分子の非存在下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該２個またはそれ以上の異なる任意の分子の組合せの親和性をランク付けする工程。
【０１５１】
本発明の他の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子に結合する分子対する多数の異なる分子の集合をアッセイする方法における式Ｉの化合物の使用を提供し、該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）式Ｉの化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、多数の異なる分子の少なくとも２個の分子の集合と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）該多数の異なる分子における任意の分子の非存在下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該多数の異なる分子の任意の分子の非存在下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該異なる分子の集合の親和性をランク付けする工程；（ｇ）該標的分子と親和性を有する分子を含む該異なる分子の集合を選択する工程；（ｈ）該選択した集合を、多数の容器の各々で、小集合に分割する工程；そして（ｉ）該多数の異なる分子から単一の分子が同定されるまで、上記工程（ａ）〜（ｈ）を繰り返す工程。
【０１５２】
本発明の他の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子を安定化するために、多数の異なる生化学条件の１以上の有効性をランク付けするマルチ可変方法における式Ｉの化合物の使用を提供し、該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）式Ｉに記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、該多数の異なる生化学条件と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）参照セットの生化学条件下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該参照セットの生化学条件下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該容器の各々の対する該生化学条件の各々の有効性をランク付けする工程。
【０１５３】
本発明の他の局面は、熱変化によりアンフォールドできる標的分子の寿命を最適化するマルチ可変方法における式Ｉの化合物の使用を提供し、該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）式Ｉに記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該標的分子を、該多数の異なる分子または異なる生化学条件と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）参照セットの生化学条件下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該参照セットの生化学条件下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該容器の各々の対する該生化学条件の各々の有効性をランク付けする工程。
【０１５４】
本発明の他の局面は、変性またはアンフォールドしたタンパク質のサンプルのリフォールディングまたは再生を促進するために、多数の異なる生化学条件の１以上の有効性をランク付けするマルチ可変方法における式Ｉの化合物の使用を提供し、該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）式Ｉに記載の化合物の存在下にて、該リフォールドしたタンパク質サンプルの１個を、多数の容器の各々に入れる工程であって、ここで、該リフォールドしたタンパク質サンプルの各々は、該多数の条件の１以上に従って、以前にリフォールドまたは再生したものである；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）参照セットの生化学条件下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該参照セットの生化学条件下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該容器の各々の対する該生化学条件の各々の有効性をランク付けする工程。
【０１５５】
本発明の他の局面は、熱変化によるアンフォールドできるタンパク質の結晶化を促進するために、多数の異なる生化学条件の１以上の有効性をランク付けするマルチ可変方法における式Ｉの化合物の使用を提供し、該方法は、以下の工程を包含する：（ａ）式Ｉに記載の化合物の存在下にて、多数の容器の各々で、該タンパク質を、該多数の異なる生化学条件と接触させる工程；（ｂ）該多数の容器を同時に加熱する工程；（ｃ）該容器の各々における蛍光を測定する工程；（ｄ）該容器の各々の温度の関数として、該標的分子についての温度アンフォールディング情報を作製する工程；（ｅ）該容器の各々について得られた該温度アンフォールディング情報と以下の（ｉ）および（ｉｉ）とを比較する工程：（ｉ）他の容器の各々について得られた温度アンフォールディング情報、および（ｉｉ）参照セットの生化学条件下での該標的分子について得られた温度アンフォールディング情報；そして（ｆ）該容器の各々にある該標的分子と該参照セットの生化学条件下での該標的分子との間の該温度アンフォールディング情報の差に従って、該容器の各々の対する該生化学条件の各々の有効性をランク付けする工程。
【０１５６】
本発明の化合物はまた、リード化合物を生成するための改善された方法において使用され得る。化合物または化合物のコンビナトリアルライブラリーが温度シフトアッセイを使用してスクリーニングされた後に、その標的レセプターにに結合する化合物は、化学的に改変されて、化合物の第２のライブラリーを生成する。この第２のライブラリーは、次いで、温度シフトアッセイを使用してスクリーニングされ得る。新規ラブラリーをスクリーニングしそして生成するプロセスは、１０−４〜１０−１５ＭのＫｄの幅で親和性を有する標的レセプターに結合する化合物が得られるまで続けられる。
【０１５７】
蛍光画像システムを使用して、標的分子またはレセプターの温度アンフォールディングを観察し得る。蛍光画像化システムは、当業者にとって、周知である。例えば、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＴＭ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）は、７６８ピクセル×４９４ピクセルの解像度を有する高性能電荷結合素子カメラを使用する。この電荷結合素子カメラは、コンピュータと接続され、画像が、Ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅＴＭを用いて解析される。ＣＨＥＭＩＩＭＡＧＥＲＴＭ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）は、ＡＬＰＨＡＩＭＡＧＥＲＴＭの全ての機能を実施して、そして、さらに、化学発光サンプルおよび他の低強度サンプルの画像を取り込む冷電荷結合素子である。このＣＨＥＭＩＩＭＡＧＥＲＴＭ電荷結合素子は、Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）プロセッサ（１．２Ｇｂハードドライブ、１６Ｍｂ  ＲＡＭ）、ＡｌｐｈａＥａｓｅＴＭ解析ソフトウェア、ライトタイトキャビネット（ｌｉｇｈｔ  ｔｉｇｈｔ  ｃａｂｉｎｅｔ）、ならびにＵＶおよび白色光トランスイルミネータを備える。例えば、ＭＲＣ−１０２４  ＵＶ／可視光レーザー共焦画像化システム（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）は、広範囲照明の波長（３５０〜７００ｎｍ）に及ぶ１以上の発蛍光団の同時画像化を容易にする。このＧｅｌ  Ｄｏｃ  １０００  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｉｔｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）は、２０ｃｍ×２０ｃｍまたは５ｃｍ×４ｃｍ程の大きさのサンプル領域を明確に表示し得る。少なくとも２つの９６ウェルのマイクロプレートは、２０ｃｍ×２０ｃｍの領域に適合し得る。このＧｅｌ  Ｄｏｃ  １０００システムはまた、時間依存的実験の効率を促進する。
【０１５８】
蛍光熱画像化システムは、マイクロプレート温度シフトアッセイにおけるレセプターのアンフォーリングをモニターするために使用され得る。この実験において、複数のサンプルが、２５℃〜１１０℃の間の温度で同時に加熱される。蛍光の読み取りが、複数のサンプルの各々について同時に実施される。例えば、９６ウェルマイクロプレートまたは３８４のマイクロプレートの各ウェルにおける蛍光は、同時にモニタされ得る。あるいは、蛍光の読み取りは、各々サンプルについて連続的かつ同時に実施され得る。より低い温度で、全てのサンプルは、低いレベルの蛍光を表示する。温度が上昇するにつれて、各々サンプルにおける蛍光が増大する。高い親和性でその標的分子に結合するリガンドを含むウェルは、温度アンフォールドＴｍを高温度側にシフトさせる。結果として、高い親和性で標的分子に結合するリガンドを含むウェルは、いずれのリガンドの非存在下でのその標的分子のＴｍを超える所定温度において、高い親和性のリガンドを含まないウェルに比べて、より蛍光発光は少なくなる。そのサンプルが漸増的に加熱された場合に、複数のサンプルの全ての蛍光は、加熱段階の各々において同時に画像化される。そのサンプルが連続的に加熱された場合に、複数のサンプルの全ての蛍光を、加熱の間に同時に加熱する。
【０１５９】
蛍光熱シフトアッセイは、１００μＬの容積で実施される。しかし、以下の理由により、１〜１０μＬの体積で、熱シフトアッセイを実施することが好ましい。第１に、約１０分の１〜１００分の１のタンパク質が、小型化されたアッセイにとって必要である。従って、約４〜４０ｐｍｏｌのタンパク質（２５ｋＤａのタンパク質に関しては、０．１μｇ〜１．０μｇ）が、このアッセイに対して必要とされる（すなわち、約１μＭ〜約４μＭの標的分子濃度の１〜１０μＬの使用体積）。従って、１ｍｇ程の少なさのタンパク質を使用して、小型化されたフォーマットにおいて、１，０００〜１０，０００アッセイを実施される。これは特に、標的分子が微量で使用可能であるときに、有益である。
【０１６０】
第２に、約１０分の１〜１００分の１程のリガンドが、この小型アッセイに対して使用される。ライブラリー化合物が微量にて合成される貴重なコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするときに、研究者にとって上記の利点は重要である。ヒトαトロンビンの場合、この理想的なリガンド濃度は、約５０μＭであり、これは、その小型化された形式のアッセイおける、２５〜２５０ｐｍｏｌのリガンド、または１０〜１００ｎｇ（５００ＤａのＭＷと仮定する）のリガンドとして解釈される。
【０１６１】
第３に、より小さい使用体積によって、より大きいアレイのアッセイの使用能力が可能となる。なぜならば、この小型化したアッセイは、より小さい面積へと適合され得るからである。例えば、３８４ウェル（１６×２４アレイ）または８６４ウェル（２４×３６アレイ）のプレートは、９６ウェルのプレートと同じ寸法（８．５ｃｍ×１２．５ｃｍ）を有している。この３８４ウェルプレートおよび８６４ウェルプレートによって、そのユーザが、９６ウェルプレートを使用して実施され得るのと比べて、それぞれ、４倍のアッセイおよび９倍のアッセイを実施することが可能になる。
【０１６２】
あるいは、１５３６ウェルプレート（３２×４８アレイ；Ｍａｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）が、使用され得る。１５３６ウェルプレートは、９６ウェルプレートによって可能とされ得るループットの１６倍が可能となる。従って、１５３６ウェルプレート配置を使用して、このアッセイ速度は、９６ウェル形式を使用して実施され得るアッセイの速度と比較して、約１６倍だけ増加され得る。８×１２のアッセイアレイの（９６ウェルプレート中の）配置によって、９６アッセイ／時間、すなわち、約２３００アッセイ／２４時間の効率が可能となる。３２×４８のアレイアッセイ配置によって、約１５３６アッセイ／時間の実行を容易にし、すなわち、約３７，０００アッセイ／２４時間が、３２×４８アッセイアレイ配置を使用して実施され得る。
【０１６３】
あるいは、１５３６を超えるウェル／プレートを含むマイクロプレートアレイは、本発明の方法において使用され得る。
【０１６４】
このアッセイ体積は、１〜１００μＬであり得る。好ましくは、このアッセイ体積は、１〜５０μＬである。より好ましくは、このアッセイ体積は、１〜２５μＬである。なおより好ましくは、このアッセイ体積は、１〜１０μＬである。なおより好ましくは、このアッセイ体積は、１〜５μＬである。なおより好ましくは、このアッセイ体積は、５μＬである。最も好ましくは、このアッセイ体積は、１μＬまたは２μＬである。
【０１６５】
好ましくは、このアッセイは、Ｖ底ポリカーボネートプレートまたはポリカーボネートくぼみ型プレート中で実施される。このくぼみ型プレートは、１５μＬの全体積を保持する複数の丸底ウェルを備えるプレートである。
【０１６６】
本発明の方法において、温度アンフォールディング情報の生成は、温度アンフォールディングＴｍを決定することをさらに包含し、そして、その比較工程は、（ｉ）他の容器の各々における標的分子に対するＴｍおよび（ｉｉ）異なる分子のいずれかの存在下で標的分子について得られたか、または、生化学的条件の参照設定下で得られたＴｍと、各々の容器中の分子についてのＴｍを比較することを包含し、そして、ここで、そのランク付け工程は、単数の様々な分子またはＴｍの差異に従う多数の様々な生化学的条件の効率（効力）を順位付けることを包含する。
【０１６７】
本発明の方法において、その測定工程は、多数の容器の各々に存在する式Ｉの分子の存在下で、１以上の様々な分子または様々な生化学的条件とそのタンパク質を接触させること包含し、ここで、その測定工程は、多数の容器の各々の中で、式Ｉの分子を光で励起して、そして多数の容器の各々からの蛍光を測定することを包含する。
【０１６８】
本発明の方法において、標的分子が二本鎖オリゴヌクレオチドであるとき、一方の鎖は、ドナー発蛍光団を含み、オリゴヌクレオチドの他方の鎖は、アクセプター発蛍光団を含む。この接触工程は、多数の容器の各々の中で、そのオリゴヌクレオチドを、多数の様々な分子または多数の様々な生化学的条件を接触させることを包含し、そして、ここで、その測定工程は、多数の容器の各々の中で、式Ｉのドナー発蛍光団を光で励起して、そして、多数の容器内の各々の中で、アクセプター発蛍光団からの蛍光を測定することを包含する。
【０１６９】
本発明の方法において、蛍光は、全ての容器で、同時に測定され得る。あるいは、蛍光が、同時に、その容器のサブセットの中で、測定され得る。あるいは、蛍光が、同時に１つの容器内で測定され得る。
【０１７０】
Ｔｍのシフトを同定するために、治療標的のＴｍの周辺の温度範囲にわたって、蛍光の読み取りを実施し、リガンド／標的複合体についての完全な温度アンフォールディング曲線を取得することの１つの代替物は、標的分子のＴｍの近傍での単一温度でのアッセイを実施することである。この実施形態において、（標的分子を含むが、候補リガンドを含まない）コントロールサンプルと比較してより少なく蛍光発光するサンプルが、その候補リガンドがその標的分子に結合することを示す。
【０１７１】
本実施形態において、加熱工程から得られた、標的分子の温度アンフォールディングに関連する、蛍光は、１以上の別個の、または、固定された、温度範囲にわたって温度の関数としての標的分子に関する温度アンフォールディング情報を生成することによって決定される。温度アンフォールディングに関する蛍光が、測定される。いずれのリガンドの非存在下における標的分子に関する、別個のまたは固定された温度が、注目される、複数の様々な分子、例えば、コンビナトリアル化合物の各々の存在下での蛍光が、測定される。複数の分子の各々の存在下での標的分子温度アンフォールディングに関連する蛍光は、複数の様々な分子の任意のものの非存在下での別個または固定された温度での標的分子に対して得られた蛍光と比較される。複数の様々な分子の親和性は、蛍光の変化に従って順位付けされる。
【０１７２】
蛍光が測定される別個または固定された温度は、熱安定性におけるシフトを識別するために有用である任意の温度であり得る。好ましくは、この別個または固定された温度は、標的分子に対する結合について試験される複数の様々な分子のいずれかの非存在下での標的分子についての中点の温度Ｔｍである。
【０１７３】
本発明の方法は、リガンド−タンパク質相互作用をアッセイすることに限定されない。本発明の方法は、タンパク質の安定化に関する任意の多変量系を迅速にアッセイするために使用され得る。例えば、本発明の方法は、標的分子に対する１以上の化合物またはリガンドの結合を同時にアッセイするのに使用され得る。このアプローチを使用する際に、複数リガンド結合の相加的効果が評価され得る。正の協同性および負の協同性が決定され得る。この方法を達成するために、蛍光熱シフトアッセイが、任意のリガンドの非存在下、単一のリガンドの存在下、および２以上のリガンドの存在下において、標的分子（例えば、タンパク質）に関して実施される。温度アンフォールディング情報が、タンパク質単独、ならびに、タンパク質およびリガンドの各々の組合せに関して生成される。次いで、中点の温度、Ｔｍが、タンパク質単独、および各々の組合せについて決定される。次いで、各々のＴｍは、他の組合せについての他のＴｍの各々と比較され得る。あるいは、アンフォールディング曲線が、タンパク質単独、ならびに各々の組合せについて生成され、そして温度アンフォールディング曲線の各々が、他の温度アンフォールディング曲線の各々と比較される。これらの様式のいずれかにおいても、結合相互作用またはタンパク質安定性に対する１以上のリガンドの相加的寄与が決定され得る。
【０１７４】
類似の様式において、タンパク質の安定性に対する１以上の生化学的条件の相加的寄与が決定され得る。従って、本発明は、タンパク質の安定性、従って、タンパク質の貯蔵寿命を最適化する生化学的条件を迅速に同定するために使用され得る。さらに、本発明の方法は、アンフォールディングしたかまたは変性したタンパク質をリフォールディングするかまたは天然状態に戻すための種々の生化学的条件の効力をランク付けるために使用され得る。この実施形態は、効率的なリフォールディング条件または天然状態に戻す条件に関してスクリーニングする信頼性の高い方法に対する当該分野における必要性に取り組むものである。
【０１７５】
例えば、細菌細胞中の組換えＤＮＡの発現は、通常、組換えタンパク質の細菌性封入体をもたらす（Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ．Ａ．Ｏ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４０：１〜１２（１９８６））。他の発現系が、細菌系の代わりに使用され得るが、細菌細胞内の発現は、組換えタンパク質の高レベルの産生のために選択された方法のままである（Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ，２８３頁〜２９８頁，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９９５））。多くの場合において、組換えタンパク質の回収には、タンパク質が封入体から単離されることが必要である。封入体からのタンパク質精製は、組換えタンパク質の変性を必要とする。結果として、組換えタンパク質は、そのネイティブの、完全な機能形態であるタンパク質を生成するのに適切な条件下で、天然状態に戻されるかまたはリフォールディングされなければならない。
【０１７６】
これらのような場合において、変性タンパク質は、さらなる研究または使用のために有用であるために、天然状態に戻されるかまたはリフォールディングされなければならない。不運なことに、所定のタンパク質またはこのタンパク質のフラグメントが天然状態に戻るべき正確な条件を容易に予測することはできない。各々のタンパク質は、異なっている。どの条件のセットが最適であるかを知り得る前に、天然に戻る条件の多くの異なる組み合わせを試験することが常に行われなければない。従って、種々の天然状態にもどる条件の効力をランク付けするための、信頼性が高くそして迅速な方法を有することが所望される。
【０１７７】
組換えＤＮＡ技術によって、細菌タンパク質発現装置の取り込みを通しての比較的多量の多種多様な目的の異種ポリペプチドの生合成が可能となった。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ．で発現する、治療目的で価値のある正しくフォールディングした稀少なヒトタンパク質の安価でかつ多量の供給の見込みは、不溶性タンパク質封入体への、アンフォールディングしたかまた部分的にアンフォールディングしたタンパク質の極度の支配的な凝集に起因してだめになる。最近の概説については、Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｒ．，＆  Ｌｉｌｉｅ，Ｈ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：４９−５６（１９９５）；Ｓａｄａｎａ，Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４８：４８１−４８９（１９９５）；Ｊａｅｎｉｃｋｅ，Ｒ．，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  Ｓｅｒ．Ｂ−Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３４８：９７−１０５（１９９５）を参照のこと。Ｅ．Ｃｏｌｉ中の自己凝集反応を首尾よく行うことの理由は、部分的にアンフォールディングした状態において様々な程度で見出される異種タンパク質の比較的高い濃度（細胞
ｉ）に集約される。従って、過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株の上昇したタンパク質の濃度において、アンフォールディングしたタンパク質の露出した疎水性残基が、本来のそれらよりも、同様に露出した基を有する他の分子と出会う可能性（分子内相互作用）がより高くなり、自己崩壊したポリペプチドコンフォメーション（ここで、これらの疎水性残基が、適切な配向（分子内相互作用状態）で充填され、そして、完全にフォールディングしたネイティブ状態に進む）をサンプリングするようになる（図２６を参照のこと）。この観点から、その不溶性のタンパク質封入体は、好ましいタンパク質のフォールディングプロセスに不利益を与える、速度論的にトラップされる反応副産物として見受けられる。
【０１７８】
封入体を単離するための技術、封入体から組換えタンパク質を精製する技術およびタンパク質をリフォールディングさせるかまたは天然状態に戻すための方法は、当業者にとって周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），ｐｐ．１７．３７−１７．４１；Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ：１０  ：４９−５６（１９９５）を参照のこと。
【０１７９】
Ｅ．ｃｏｌｉで大量の正確にフォールディングしたタンパク質を生じることに対する別の障害は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質ゾルの還元性の酸化還元能がインビボでのジスルフィド結合の形成を妨害するということである。ジスルフィド結合の形成は、タンパク質フォールディングに頻繁に結合する多くの細胞外タンパク質の合成において、重要な同時の事象および転写後の事象である。さらに、シス−トランスプロリン異性化反応が、特定のタンパク質の正確なフォールディングのための速度決定工程であることが実証された（Ｌｉｎ，Ｌ．−Ｎ．，＆Ｂｒａｎｄｔｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２  ：５６４−５７３（１９８３））。結果として、部分的にフォールディングした中間体が、それらが凝集および沈降してタンパク質の塊状態となるのに十分な量でインビボにおいて蓄積する。
【０１８０】
細胞は、分子シャペロンと呼ばれるホストタンパク質の１群を利用する。この分子シャペロンは、封入体形成に関する上述のような多くの非生産的副反応（すなわち、凝集および不適切なジスルフィド形成）を明確に防ぐことによってインビボでのタンパク質フォールディングを助ける。しかし、このＥ．ｃｏｌｉシャペロン機構（これは、部分的にはタンパク質（ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ）によって形成される）は、大規模な過剰発現によっておそらくは損なわれる。目的のタンパク質との分子シャペロンの共発現によってこのシャペロンの欠点をただすための多くの試みに関わらず（Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｒ．，＆  Ｌｉｌｉｅ，Ｈ．，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０  ：４９−５６（１９９５））、たった１つの例おいてのみ陽性の結果が報告されている（Ｇｏｌｏｕｂｉｎｏｆｆ，Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２  ：８８４−８８９（１９８９））。
【０１８１】
いかにしてＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳが、インビボのタンパク質フォールディングを支援するかということを説明するための２つの仮説が、提出された。第１の仮説である、アンフィンセンのかご仮説（Ａｎｆｉｎｓｅｎ  ｃａｇｅ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）においては、分子シャペロンの機能は、ネイティブ状態へのタンパク質のフォールディングが、その細胞内での前凝集状態によって妨害されることなしに進むことができる保護された環境を提供することである（Ｍａｒｔｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２  ：３６−４２（１９９１）；Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：６３３−６３５（１９９４））。第２の仮説である「反復アニーリング（ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ）」仮説のもとでは、このシャペロンの機能は、ＡＴＰ加水分解のエネルギーのいくらかが基質であるポリペプチドのコンフォメーションエネルギーに向けられてより高いエネルギー状態へとそのペプチドをもっていくことによって、ミスフォールドしたタンパク質（すなわち、速度論的にトラップされた中間体）を、部分的にアンフォールディングさせ、そのより高いエネルギー状態からそのポリペプチドが再度、溶液中に放出された後に正しくリフォールドしようとすることである（Ｔｏｄｄ，Ｍ．Ｊ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：６５９−６６６（１９９４）；Ｊａｃｋｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：２５５４−２５６３（１９９３）；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓら，Ｃｅｌｌ  ７８  ：６９３−７０２（１９９４）；Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｊ．Ｓ．，＆Ｋｉｍ，Ｐ．Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１３８６−１３９３（１９９１））。
【０１８２】
上記で議論したインビボでの結果は、多くの場合において、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現する組換え異種タンパク質のインビトロのリフォールディングを伴うそのより最近の実験と矛盾を生じることはない。すなわち、タンパク質の一次アミノ酸配列がその天然フォールディングのコンフォメーションを決定付けるのに十分な情報を含み得（Ａｎｆｉｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８１：２２３−２３０（１９７３））、他方、フォールディング反応が生じる生化学的条件が、アンフォールディングした形態、凝集した形態、および正しくフォールディングした形態の間の分配に強く影響を与え得る。
【０１８３】
例えば、ｐＨは、式（４）の第４項に集約される長距離の静電相互作用に対して影響を与えることによってフォールディング反応に影響を与えると理解され得る。
【０１８４】
ΔＧｆｏｌｄ＝ΔＧｃｏｎｆ＋ΣΔｇｉ，ｉｎｔ＋ΣΔｇｉ，ｓ＋ΔＷｅｌ＋（ΔＧｂｉｎｄ）(式４）
ここで、
ΔＧｃｏｎｆ＝（コンフォメーション自由エネルギー）（秩序／無秩序の項）；
Δｇｉ，ｉｎｔ＝（短距離相互作用）（水素結合、ファンデルワールス相互作用、塩橋、補因子結合、など）；
Δｇｉ，ｓ＝（溶媒との短距離相互作用）（疎水性効果、イオン水和、など）；
ΔＷｅｌ＝（長距離静電相互作用）；および
ΔＧｂｉｎｄ＝リガンド結合自由エネルギー。
【０１８５】
タンパク質溶液のｐＨがそのタンパク質のｐＩよりも低い場合、そのポリペプチド上の官能基は、プロトン付加される程度が強くなり、ここで、プロトン付加した官能基の間の静電的斥力は、自由エネルギーの式（式４）の他の項を完全にうちけし，このタンパク質は、そのネイティブコンフォメーションをもはや採用し得ない。
【０１８６】
タンパク質フォールディングに対する別の重要な生化学的パラメーターは、溶媒である、水であり、この水は、脂肪族側鎖および芳香族側鎖（あるいは、ある程度までその主鎖）を排除して、その露出表面積を最小化させる。フォールディング反応に関する溶媒の影響は、自由エネルギー式（式（４））の第３項に集約される。特定の塩が、水溶液中のタンパク質の側鎖間の疎水性相互作用を増大されることが知られている。この効果は、以下のＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列に従うイオンの特性に依存する：カチオン：Ｍｇ２＋＞Ｌｉ＋＞Ｎａ＋＞Ｋ＋＞ＮＨ４＋；アニオン：ＳＯ４２−＞ＨＰＯ４２−＞酢酸＞クエン酸＞酒石酸＞Ｃｌ−＞ＮＯ３−＞Ｃ１Ｏ３−＞Ｉ−＞ＣｌＯ４−＞ＳＣＮ−。０．４Ｍにて、ＳＯ４２−およびＨＰＯ４２−のようなＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒアニオンを安定化させることが、正確にフォールディングしたタンパク質の収率を増大させることが見出されている（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８４））。このタンパク質のネイティブコンフォメーションに対する好ましい結果は、そのカチオンおよびアニオンの「塩析」効果に寄与し、そのタンパク質の選択的な水和に至る（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８４））。
【０１８７】
グリセロールは、水の溶媒和特性を変更し、タンパク質のネイティブコンフォメーションを好む傾向にある。この好む傾向が生じる機構は、共存する溶媒の排除およびタンパク質の優先的な水和であり、これは、Ｈｏｆｍｅｒｉｓｔｅｒ系列の塩の塩効果とは異なる（Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ  ＆  Ａｒａｋａｗａ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９８９），ｐｐ．３３１−３５４）。
【０１８８】
その環境がタンパク質フォールディングにどのように影響を与えるかということの別の例は、既知のリガンドおよび補因子のフォールディングしたタンパク質の収量に対する影響である。リガンド結合は、そのフォールディング反応の自由エネルギーと結合自由エネルギーをカップリングすることによって、アンフォールディング状態からネイティブリガンド複合体へと平衡をシフトさせる効果を有する。ウシ炭酸脱水素酵素ＩＩのリフォールディングにおける金属イオンの役割が記載されている（Ｂｅｒｇｅｎｈｅｍ  ＆  Ｃａｒｌｓｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ９９８：２７７−２８５（１９８９））。タンパク質のフォールディングに影響をあたえることが示されている他の生物学的パラメーターは、以下である：タンパク質濃度、温度、グルタチオン酸化還元緩衝液（ＧＳＨ，ＧＳＳＧ）、界面活性剤の存在および他の添加物（例えば、グリセロール、アルギニン−ＨＣｌ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および有機溶媒）の存在。
【０１８９】
リフォールディング条件下でインキュベーションする間、組換えタンパク質は、固体支持体に固定化され得る。この形態は、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳの機能に関する「アンフィンゼンのかご」仮説に類似し、ここで、アンフォールドタンパク質が、保護された環境下で一時的に固定化され、この環境において、天然状態へのフォールディングが、競合する凝集反応からの干渉なく進行する。ここで、固体支持体上でのタンパク質フォールディングのコンホメーションは、文献における２つの最近の報告からくる。ポリ−ヒスチジンタグ化ＴＩＭＰ−２タンパク質は、透析によってリフォールドされ得、他方、なお金属キレートカラムに結合される（Ｎｅｇｒｏ，Ａ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６０：５２−５６（１９９５））。α−グルコシダーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に結合されるポリイオン性融合ペプチドは、フォールディングを可能にする、他方、約５ｍｇ／ｍＬでヘパリン−セファロース樹脂に結合される（Ｒｕｄｏｌｐｈ＆Ｌｉｌｉｅ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：４９−５６（１９９５））。α−グルコシダーゼの固定化およびリフォールディングのためのポリイオン性アルギニンタグ方法論は、Ｓｔｅｍｐｆｅｒ，Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３２９−３３４（１９９６）に開示される。
【０１９０】
本発明において、温度シフトアッセイは、種々のリフォールディング条件または天然状態に戻す条件の効力をランク付けるために使用される。目的のタンパク質の多数のアリコート（種々の異なる生化学的フォールディング条件下でインキュベートされる）の各々が、マルチコンテナキャリア中の容器に配置される。公知の濃度の天然の完全に機能的なタンパク質のアリコートは、コントロール容器中に配置される。これらのサンプルは、マルチコンテナキャリアのいずれかの中に配置され得る。好ましくは、各サンプルは、マルチウェルマイクロプレートのウェルに配置され得る。
【０１９１】
タンパク質フォールディング反応の結果に影響し得る多くの生化学的変数を考慮することにおいて、タンパク質フォールディングの最適化は、多変量最適化問題であり、薬物発見におけるタンパク質結晶化および定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）とは異なる。多変量最適化問題は、好ましい応答に影響するために、可能な限り多くのデータを回収するための膨大な数の並列実験を必要とする。この点において、タンパク質結晶化およびＱＳＡＲ分析の両方は、生化学的組成物または化学的組成物の漸増的変化のマトリクスアレイを使用する大規模スクリーニングプロトコルから大きな利益を得た。
【０１９２】
本発明は、リフォールディング条件または天然状態に戻す条件の効力をランク付けるために使用され得る。このような条件としては、グリセロールの濃度、タンパク質の濃度、ジスルフィド結合の形成の形成を触媒する薬剤の使用、温度、ｐＨ、イオン強度、溶媒の型、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）および酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）のようなチオール、カオトロープ（例えば、尿素、塩酸グアニジン、アルキル尿素）、有機溶媒（例えば、カルボン酸アミド）、Ｌ−アルギニンＨＣｌ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、混合ミセル、およびシクロデキストリンと組み合わせた界面活性剤が挙げられるがこれらに限定されない。変性剤が、透析、カラムクロマトグラフィー技術、または吸引濾過を使用してタンパク質から除去されるかどうかに関わらず、本発明は、使用され得る。
【０１９３】
蛍光温度シフトアッセイを使用して、最適なタンパク質リフォールディングを容易にする条件は迅速に決定され得る。この実施形態において、天然状態に戻されたタンパク質およびコントロールタンパク質サンプル（すなわち、その完全機能形態における天然タンパク質のサンプル）は、一定の温度範囲にわたって加熱される。離散的な温度間隔で、蛍光読み取りが行われる。あるいは、蛍光読み取りは、連続的な前もって決定された温度プロフィールの間取られ得る。温度アンフォールディング情報（例えば、温度アンフォールディングＴｍ）は、各サンプルについて生成される。天然の完全な機能性参照タンパク質に対するＴｍが、決定される。リフォールディング条件の相対的効力は、Ｔｍでの生化学的条件において公知の量のサンプルタンパク質の蛍光の大きさに比べての、天然の完全機能性参照タンパク質のそのＴｍでのアンフォールディングに関連する蛍光の大きさに従ってランク付けされる。蛍光強度変化の大きさは、タンパク質アンフォールディング（温度アンフォールディング曲線の座標（またはｙ軸）において反映される）をモニターするために使用され、これは、正確にフォールドされたタンパク質の量に比例する。
【０１９４】
本発明は、タンパク質フォールディングを容易にし最適化する生化学的条件をスクリーニングするための方法を提供する。所定のタンパク質に対する条件をスクリーニングするために、目的のタンパク質に対する温度アンフォールディングプロフィールを決定することがまず必要である。これは、マイクロプレート温度シフトアッセイを使用して温度アンフォールディング情報を生成することによって達成される。種々の条件が、最適化され、これらの条件としては、最適ｐＨ、イオン強度依存性、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列の塩の濃度、グリセロール濃度、スクロース濃度、アルギニン濃度、ジチオトレイトール濃度、金属イオン濃度などが挙げられる。
【０１９５】
マイクロプレート温度シフトアッセイを使用して、タンパク質安定性に対するさらなる効果を有する１つ以上の生化学的条件を決定し得る。一旦、温度シフトアッセイを使用して、タンパク質安定性の増大を容易にする１セットの生化学的条件が同定された場合、同じセットの条件は、組換えタンパク質を用いるタンパク質フォールディング実験において使用され得る。図２７を参照のこと。温度シフトアッセイにおいてタンパク質の安定性を増大させる条件が、組換えタンパク質のフォールディングを促進する条件と相関する場合、条件は、タンパク質安定性をさらに増大させる安定化条件の組み合わせが同定されるまで、さらなる温度シフトアッセイを実施することによって、さらに最適化され得る。次いで、組換えタンパク質は、これらの条件下でフォールドされる。このプロセスは、最適なフォールディング条件が、同定されるまで、繰り返される。タンパク質の安定性は、タンパク質フォールディングの収率の改善と相関することが期待される。正確にフォールドされるタンパク質の収率は、任意の適切な技術を使用することによって決定され得る。例えば、正確にフォールドされたタンパク質の収率は、親和性カラム（例えば、タンパク質のリガンドが結合されるカラム）をリフォールドされたタンパク質を通過させることによって、そしてサンプル中に存在するタンパク質の量を定量することによって計算され得る。この方法において、フォールディング条件は、正確なフォールディングに対するこれらのさらなる寄与に対して評価される。タンパク質フォールディング反応に対する遷移状態は、変性形態よりタンパク質の天然形態に類似する。このことは、多くの（ｍａｙ）タンパク質について真実であることが示された（Ｆｅｒｓｈｔ，Ａ．Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３−９（１９９７））。
【０１９６】
本発明の方法は、式Ｉの化合物を使用して、タンパク質フォールディングに好都合である生化学的条件の組み合わせに対するスクリーニングへの、迅速なハイスループットアプローチを提供する。本方法は、タンパク質フォールディングに対する従来のアプローチが必要とする厄介で時間のかかる工程を必要としない。例えば、本発明の方法を使用して、タンパク質を大容量かつ低タンパク質濃度（〜１０μｇ／ｍＬ）に希釈し、組換えタンパク質リフォールディングの従来の方法と関連する凝集問題を回避する。タンパク質凝集の抑制は、（タンパク質のアンフォールド形態とタンパク質のフォールド形態との間）タンパク質フォールディング平衡を正確な天然のコンホメーションに移動させる生化学的パラメーターのスクリーニングを可能にする。
【０１９７】
タンパク質の安定化、タンパク質フォールディング、リガンド選択、および薬物設計のように、タンパク質結晶化を促進する条件の選択は、本発明の方法および器具を使用して解決される別の多変量最適化問題である。
【０１９８】
本発明の方法はまた、タンパク質結晶化を容易にする条件を決定するために有用である。溶液からの分子の結晶化は、可逆的平衡プロセスであり、反応動力学的パラメータおよび熱力学的パラメータは、目的の溶媒系および溶質の化学的特性および物理的特性の関数である（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）；Ｗｅｂｅｒ，Ｐ．Ｃ．，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．４１：１−３６（１９９１））１９９１）。過飽和条件下で、アンフォールドした状態と天然状態との代わりに、その溶質の可溶相と固相との間で分配される平衡へとその系は、駆動される。結晶相の分子は、タンパク質のフォールディングに重要な同じ型の凝集力（すなわち、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、水素結合、および共有結合）の多くによってエネルギー的に支配される秩序だった周期的な三次元アレイに詰め込まれる（Ｍｏｏｒｅ，Ｗ．Ｊ．，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，（１９７２），第８６５頁−第８９８頁）。
【０１９９】
従って、多くの方法において、タンパク質結晶化が、タンパク質フォールディングのより高いレベルのバリエーションとして考えられ得、このタンパク質結晶化において、全分子が、個々のアミノ酸残基の代わりに凝集エネルギーを最大にするように詰め込まれる。さらに、タンパク質結晶化およびタンパク質フォールディングの両方について、溶媒の組成物は、可溶性形態（アンフォールドされた形態）と結晶形態（天然の形態）との間で分配される程度まで、非常に重要な寄与をし得る。凝集エネルギーは、タンパク質高分子に存在し、タンパク質フォールディングおよびタンパク質結晶化の両方に対するこれらの相互作用を調節することにおける溶媒によって果たされる役割は、複雑であり、現在完全には理解されていない。この点について、タンパク質の安定性を増大し、そしてタンパク質フォールディングを推進する生化学的条件は、タンパク質結晶化もまた促進する。
【０２００】
例えば、Ｄ（ＩＩ）ＦＧＦレセプター１の安定性を増大することが見出された生化学的条件は、Ｘ線結晶構造解析クオリティーのタンパク質結晶の結晶化を容易にする条件と相関する。Ｄ（ＩＩ）ＦＧＦＲ１タンパク質の結晶を得るために使用された条件は、表１に示される。
【０２０１】
タンパク質結晶を、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ塩Ｌｉ２ＳＯ４（６５〜７２％）の存在下で、ｐＨ範囲７．４〜９．２において得た。これらの結晶化条件は、約８．０の最適ｐＨと関係した。Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列の他の塩（例えば、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４およびＭｇ２ＳＯ４）はまた、沈殿剤として必要とされるＬｉ２ＳＯ４の量を低下させるための添加剤として有用であると見出された。明らかに、首尾よいＤ（ＩＩ）ＦＧＦＲ１結晶化のためのこれらの条件は、マイクロプレート温度シフトアッセイを使用して同定された安定化条件と密接に関係した。
【０２０２】
ヒトα−トロンビンの安定化を容易にするとして同定された条件は、ヒトα−トロンビンタンパク質結晶化も容易にする。３人の異なる研究者によって同定された、Ｘ線回折品質のヒトα−トロンビン結晶の結晶化を容易にする条件は、以下の参考文献において見出され得る：１）Ｂｏｄｅ，Ｗ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１：４２６−４７１（１９９２）；２）Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：２２５４−２２２７１（１９９４）；および３）Ｚｄａｎｏｖ，Ａ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２５２−２６５（１９９３））。
【０２０３】
表２に要約される条件は、ヒトα−トロンビン安定化を容易にするとして、マイクロプレート温度シフトアッセイにおいて同定された条件と密接に関係する。結晶は、最適ｐＨである約７．０の近傍で形成した。さらに、０．１〜０．５Ｍ  ＮａＣｌ（条件の５０％）または０．１〜０．２Ｍ  ＮａＨＰＯ４の存在に対する明確な傾向が存在する。これは最近発見されたＮａ＋結合部位と一致し（Ｄａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：１４６−１４９（１９９７））、マイクロプレート温度シフトアッセイによって、図１７Ａ〜Ｄおよび図１８が得られた。良好な結晶を産生する表２に記載されるヒトα−トロンビンサンプルは、全てリガンドと複合体を形成しており、それによって、生化学的条件から得られる構造以外のネイティブな構造をさらに安定化する。
【０２０４】
（表１．Ｄ（ＩＩ）ＦＧＦＲ１結晶化条件）
【０２０５】
【表１】
2005531490.tif 000007
【０２０６】
タンパク質結晶化は、遅く、単調で退屈なプロセスであり、歴史的に、タンパク質構造および核酸構造のＸ線回折決定についての律速工程であった。本発明の方法および装置は、所定のタンパク質の安定性、従ってＸ線品質のタンパク質結晶の形成を促進する条件の迅速なハイスループット解析を容易にする。
【０２０７】
タンパク質がより安定である場合、タンパク質が有する結晶格子へのパッキングを阻害する熱力学的動きが、より小さい。より小さな動きを有して、タンパク質は、結晶格子により良好に適合する。従来の結晶化法を使用して、結晶化実験を、数週間にわたって同時に室温に設定する。経時的に、タンパク質のアンフォールディングが生じる。本発明の方法を使用して、タンパク質を安定化する条件は、一定の温度範囲にわたって試験される。
【０２０８】
タンパク質安定化、リガンド結合、タンパク質フォールディング、およびタンパク質結晶化の最適化は、多変量事象である。多変量最適化問題は、どの変数が好都合な応答に影響するかを決定するために、可能な限り多くのデータを回収するために、膨大な数の平行実験を必要とする。例えば、多変量最適化問題は、どの変数がタンパク質の安定化に影響するかを決定するために、可能な限り多くのデータを回収するために、膨大な数の並列実験を必要とする。この点において、タンパク質結晶化および定量的構造活性相関分析の両方は、生化学的組成物または化学的組成物の漸増的変化のマトリクスアレイを使用する大規模スクリーニングプロトコルから大いに利益を得た。従って、リガンド上の化学官能基のバリエーションを、所定の治療レセプターに対する結合親和性に対するこれらの効果と関係づけるために、定量的構造活性相関を実施するほとんど同じ方法において、本発明の方法および装置は、種々の生化学的条件を、実験的に測定されたタンパク質安定性、リガンド特異性、フォールドされたタンパク質の収率、および結晶化されたタンパク質の収率と関係付ける定量的モデルの構築を容易にする。
【０２０９】
蛍光マイクロプレート温度シフトアッセイを使用して、タンパク質安定性に対してさらなる効果を有する１つ以上の生化学的条件を決定し得る。一旦、タンパク質安定性の増大を容易にする生化学的条件のセットが、温度シフトアッセイを使用して同定されると、同じ条件のセットは、組換えタンパク質を用いるタンパク質フォールディング実験において使用され得る。温度シフトアッセイにおいてタンパク質安定性を増大する条件が、組換えタンパク質のフォールディングを促進する条件と関係する場合、条件は、タンパク質安定性をさらに増大する安定化条件の組み合わせが同定されるまで、さらなる温度シフトアッセイを実施することによって、さらに最適化され得る。次いで、組換えタンパク質は、これらの条件下でフォールドされる。このプロセスは、最適フォールディング条件が同定されるまで繰り返される。
【０２１０】
本発明は、多変量事象（例えば、タンパク質安定化、リガンド結合、タンパク質フォールディング、およびタンパク質結晶化）を最適化するために使用される先行技術にまさる多くの利点を提供する。これらの利点の中で主要な利点は、本発明が、ハイスループットスクリーニングを容易にすることである。式Ｉの化合物を使用してマイクロプレート温度シフトアッセイを実施することは、アッセイ感度の増加およびアッセイスループットの増加を提供する。なぜなら、これらの色素は、長波長放出、高い吸光係数、高い量子収率、および高いストークスシフトを有するからである。
【０２１１】
さらに、本発明の方法は、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするために使用される先行技術にまさる多くの利点を提供する。これらの利点の中で主要な利点は、本発明が、鉛化合物についてのコンビナトリアルライブラリーのハイスループットスクリーニングハイスループットスクリーニングを容易にすることである。現在の多くのライブラリースクリーニング技術は、リガンドがレセプターに結合するかどうかを示すのみである。この場合において、定量的情報は提供されない。リガンドの系列の相対的結合親和性についての情報は、提供されない。対照的に、本発明は、標的レセプターに対するこれらの相対的親和性について、化合物の系列のランキングを容易にする。この情報を考慮して、構造活性相関は、化合物のセットについて開発され得る。相対的結合親和性をランク付けするために、アンフォールディング中点（Ｔｍ）におけるリガンド依存性変化を使用することの容易さ、再現性、およびスピードによって、本発明は、薬物発見プロセスにおいて強力なツールになる。
【０２１２】
代表的には、従来の動力学的スクリーニングアプローチは、Ｋｉを決定するために、６つの異なるインヒビターの濃度での少なくとも６つのさらなる良好なアッセイを必要とする。本発明を使用して、スループットは、式Ｉの化合物を使用して酵素ベースのアッセイより約６倍に増大する。なぜなら、１つの完全な結合実験は、マルチウェルマイクロプレートの各ウェルにおいて実施され得るからである。速度論的スクリーニングアプローチは、希釈と、これは、通常の信号検出、との間の通常の兼ね合いによって、さらにいっそう制限され、通常約１ｎＭのタンパク質濃度で見出される。この点において、熱量計アプローチ（示差走査熱量計または等温滴定熱量計のいずれか）は、さらにより悪い欠点にある。なぜなら、熱量計アプローチは、孤立した結合実験（通常、１時間当たり１回）に限定されるからである。対照的に、本発明は、１つのウェルにおいて、広いダイナミックレンジの測定可能な結合親和性（約１０−４〜１０−１５Ｍ）を提供する。
【０２１３】
本発明の非常に重要な利点は、薬剤標的である任意のレセプタに普遍的に適用できることにある。それゆえ、新しいレセプタが試験に利用できるようになるたびに新しいアッセイを発明する必要はない。研究中のレセプタが酵素であるとき、研究者は、一連の化合物の親和性の順位を、従来の動力学的方法を使用するときよりも迅速かつ容易に決定できる。それに加えて、研究者は、活性部位、アロステリックコファクター結合部位またはレセプタサブユニット界面のいずれで結合が起こるかに関係なく、酵素を結合する配位子を検出できる。本発明は、タンパク質および拡散のような非酵素レセプタに等しく適用可能である。
【０２１４】
本発明の他の実施形態では、式Ｉの特定の化合物は、反応性プローブとして使用できる。該反応性プローブには、アミン反応性プローブ、チオール反応性プローブ、ヒドロキシ反応性プローブ、アルデヒド反応性プローブ、ケトン反応性プローブおよびカルボン酸反応性プローブが挙げられる。
【０２１５】
式Ｉの特定の化合物は、アミン反応性プローブとして有用である。アミン反応性プローブは、遊離アミン部分を含む対象基質と反応する式Ｉの化合物である。このアミン反応性プローブは、１個またはそれ以上のアミン反応性部分を含む。遊離アミン部分は、−ＮＨ２、−ＮＨＲａ、−ＮＲａＲｂまたはＮＲａＲｂＲｃであり、ここで、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、互いに別個に、水素、アルキル、またはそれらが結合する窒素と一緒になって、飽和環または不飽和環を形成する。このアミン反応性プローブは、対象基質上の遊離アミン基と反応して、共有結合性またはイオン性の共役物を形成し得る。好ましくは、このアミン反応性プローブは、対象基質上の遊離アミン基と反応して、共有結合性共役物を形成する。アミン反応性部分は、カルボン酸、カルボン酸エステル、アセチルアジド、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アリール、ジクロロトリアゼン、イソチオシアネート、ハロゲン化スルホニル、スルホスクシンイミジルエステル、ハロゲン化アシルまたはアルデヒドである。アミン反応性プローブは、多数の用途があり、これには、基質上でのアミンの存在の判定；免疫組織化学；インサイツハイブリッド形成法；神経細胞追跡；オリゴヌクレオチド標識化；および自動化ＤＮＡ配列決定への応用が挙げられる。
【０２１６】
式Ｉの特定の化合物は、チオール反応性プローブとして有用である。チオール反応性プローブは、遊離チオール基を含む対象基質と反応する式Ｉの化合物である。このチオール反応性プローブは、１個またはそれ以上のチオール反応性部分を含む。遊離チオール基部分は、ＳＨである。このチオール反応性プローブは、対象基質上の遊離チオール部分と反応して、共有結合性またはイオン性共役物を形成し得る。好ましくは、このチオール反応性プローブは、遊離チオール部分と反応して、共有結合性共役物を形成する。チオール反応性部分は、イソチオシアネート、スクシンイミジルエステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、アジリジン、ジスルフィド、ハロゲン化アルキル、アクリレートまたはα−ハロケトンである。チオール反応性プローブは、タンパク質共役物を産生して、分析アッセイで使用する低分子量チオール化合物を誘導体化するのに有用である。例えば、Ｓｈｉｍａｄａら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．６５９：２２７〜２４１（１９９４）を参照。
【０２１７】
式Ｉの特定の化合物は、ヒドロキシ反応性プローブとして有用である。ヒドロキシ反応性プローブは、遊離ヒドロキシ部分を含む対象基質と反応する式Ｉの化合物である。このヒドロキシ反応性プローブは、１個またはそれ以上のヒドロキシ反応性部分を含む。遊離ヒドロキシ基部分は、−ＯＨである。このヒドロキシ反応性プローブは、対象基質上の遊離ヒドロキシ部分と反応して、共有結合性またはイオン性共役物を形成し得る。好ましくは、このヒドロキシ反応性プローブは、対象基質上の遊離ヒドロキシ基と反応して、共有結合性共役物を形成する。ヒドロキシ反応性部分は、カルボン酸、カルボン酸エステル、ハロゲン化スルホニル、塩化スルホニル、ハロアセトアミド、イソシアネート、イソチオシアネート、ボロン酸、アシルニトリル、酸ハロゲン化物、酸塩化物、アシルアジド、トリアリールアルキルハライドである。ヒドロキシ反応性プローブは、多数の用途があり、これには、基質上でのヒドロキシルの存在の判定；免疫組織化学；インサイツハイブリッド形成法；神経細胞追跡；基質上でのヒドロキシ基の数の判定が挙げられる（例えば、Ｙａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：４５６４（１９９９））。
【０２１８】
式Ｉの特定の化合物は、アルデヒド反応性プローブとして有用である。アルデヒド反応性プローブは、遊離アルデヒド部分を含む対象基質と反応する式Ｉの化合物である。このアルデヒド反応性プローブは、１個またはそれ以上のアルデヒド反応性部分を含む。遊離アルデヒド部分は、−Ｃ（Ｏ）Ｈである。このアルデヒド反応性プローブは、対象基質上の遊離アルデヒド部分と反応して、共有結合性またはイオン性共役物を形成し得る。好ましくは、このアルデヒド反応性プローブは、対象基質上の遊離アルデヒド基と反応して、共有結合性共役物を形成する。アルデヒド反応性部分は、第一級または第二級アミン（これは、脂肪族または芳香族であり得る）、ヒドラジド、セミカルバジドまたはカルボヒドラジドである。アルデヒド反応性プローブは、多数の用途があり、これには、基質上でのアルデヒド基の存在の判定；免疫組織化学；インサイツハイブリッド形成法；神経細胞追跡；キャピラリー電気泳動法による化合物の分析；炭水化物重合体の配列決定；およびリポ多糖類の染色が挙げられる。
【０２１９】
式Ｉの特定の化合物は、ケトン反応性プローブとして有用である。ケトン反応性プローブは、遊離ケトン部分を含む対象基質と反応する式Ｉの化合物である。このケトン反応性プローブは、１個またはそれ以上のケトン反応性部分を含む。遊離ケトン部分は、−Ｃ（Ｏ）−である。このケトン反応性プローブは、対象基質上の遊離ケトン基と反応して、共有結合性またはイオン性共役物を形成し得る。好ましくは、このケトン反応性プローブは、対象基質上の遊離ケトン基と反応して、共有結合性共役物を形成する。ケトン反応性部分は、第一級または第二級アミン（これは、脂肪族または芳香族であり得る）、ヒドラジド、セミカルバジドまたはカルボヒドラジドである。ケトン反応性プローブは、多数の用途があり、これには、基質上でのケトン基の存在の判定；免疫組織化学；インサイツハイブリッド形成法；神経細胞追跡；キャピラリー電気泳動法による化合物の分析；炭水化物重合体の配列決定；およびリポ多糖類の染色が挙げられる。
【０２２０】
式Ｉの特定の化合物は、カルボン酸反応性プローブとして有用である。カルボン酸反応性プローブは、遊離カルボン酸部分を含む基質と反応する蛍光プローブである。このカルボン酸反応性プローブは、１個またはそれ以上のカルボン酸反応性部分を含む。遊離カルボン酸基部分は、−ＣＯ２Ｈである。このカルボン酸反応性プローブは、対象基質上のカルボン酸基と反応して、共有結合性またはイオン性共役物を形成し得る。好ましくは、このカルボン酸反応性プローブは、対象基質上のカルボン酸基と反応して、共有結合性共役物を形成する。カルボン酸反応性部分は、アミン、ヒドロキシ、カルボン酸、ハロゲン化スルホニル、ハロアセトアミド、イソシアネート、イソチオシアネート、アシルニトリル、酸ハロゲン化物、酸塩化物、アシルアジド、トリアリールアルキルハライド、アミン、ヒドラジンである。このカルボン酸反応性部分がアミンであるとき、好ましくは、アミド共役物が形成される。このカルボン酸反応性部分がヒドロキシであるとき、好ましくは、エステル共役物が形成される。カルボン酸反応性プローブは、多数の用途があり、これには、基質上でのカルボン酸基の存在の判定；免疫組織化学；インサイツハイブリッド形成法；神経細胞追跡；オリゴヌクレオチド標識化；および自動化ＤＮＡ配列決定への応用が挙げられる。
【０２２１】
式Ｉの化合物を、アミン反応性プローブ、チオール反応性プローブ、ヒドロキシ反応性プローブ、アルデヒド反応性プローブ、ケトン反応性プローブまたはカルボン酸反応性プローブとして使用するとき、そのプローブ化合物と対象基質との間の反応を促進するために、１種またはそれ以上の追加化学試薬を使用することが有利であり得る。このような化合物には、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＥＤＡＣが挙げられる。
【０２２２】
もし、研究する標的分子またはレセプタが核酸であるなら、蛍光分光測定は、蛍光共鳴放射移動を使用して、実行できる。オリゴヌクレオチドの１本の鎖上のドナー蛍光体から他の鎖上のアクセプター蛍光体への蛍光エネルギーの移動は、アクセプター蛍光体の蛍光を測定することにより、モニターされる。アンフォールディングまたは変性により、蛍光エネルギーの移動が阻止される。蛍光共鳴放射移動方法は、当業者に周知である。例えば、Ｏｚａｋｉ，Ｈ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：５２０５〜５２１４（１９９２）；Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２９９４〜２９９８（１９９３）；Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：４８４６〜４８５６（１９９３）を参照。
【０２２３】
二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖は、ドナー蛍光体を含む。このオリゴヌクレオチドの他の鎖は、アクセプター蛍光体を含む。ドナーまたはアクセプター蛍光体を「含む」核酸について、その蛍光体は、このオリゴヌクレオチドの配列に直接取り込むことができる。あるいは、この蛍光体は、このオリゴヌクレオチドの５’−末端または３’−末端のいずれかに結合できる。
【０２２４】
式Ｉの化合物は、核酸（オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含めて）の蛍光共鳴エネルギー移動研究で有用である。特に、本発明の化合物は、核酸の構造および立体配置の転位を決定するのに使用できる。例えば、Ｃｌｅｇｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２９９４〜２９９８（１９９３）を参照。
【０２２５】
ドナー蛍光体は、光で励起したときに蛍光エネルギーを放射するものである。ドナー蛍光体によって放射されたエネルギーは、アクセプター蛍光体に吸収される。「ドナー蛍光体」との用語は、カルボキシフルオレセイン、ヨードアセトアミドフルオレセインおよびフルオレセインイソチオシアネートを含めた（それらに限定されないが）全ての蛍光体を包含する。「アクセプター蛍光体」との用語は、ヨードアセトアミドエオシンおほびテトラメチルローダミンを含めた（それらに限定されないが）全ての蛍光体を包含する。
【０２２６】
式Ｉの化合物は、米国特許第６，０３７，１３０号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で記述されているように、分子ビーコンとして有用である。
【０２２７】
式Ｉの化合物は、種々の細胞プロセスおよびシグナル経路の作用の順序および機構をモニターする際に、有用である。異なる細胞プロセスの時間経過、性質および順序は、式Ｉの化合物を使用して、インサイツの観察により、解明できる。式Ｉの化合物に加えて、必要に応じて、研究する細胞プロセスおよびシグナル経路の特定の阻害剤および／または活性化剤が使用され得る。例えば、アクロソーム反応の開始および進行は、式Ｉの化合物を使用して、モニターできる。（例えば、Ｒｏｃｋｗｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．５５（３）：３３５〜３３９（２０００）を参照）。アクロソーム反応をモニターするために式Ｉの化合物を使用するとき、その試験条件には、他の試薬および化合物が投与され得る。このようにして、アクロソーム反応を阻害する化合物および試薬をスクリーニングすることが可能となる。
【０２２８】
式Ｉの化合物はまた、細胞中の小胞体（ＥＲ）をモニターして描出するのに有用である。本発明の化合物は、このＥＲが視覚化できるように、細胞に投与され得る。例えば、Ｓｋｅｐｐｅｒ，ら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２７Ｐ：７２Ｐ（２０００）を参照。また、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １−３（１９９６）も参照。式Ｉの化合物に加えて、他の試薬が使用され得る。このようにして、ＥＲに対する他の試薬および化合物の効果が視覚化され得る。使用できる追加化合物には、ノコダゾール、コルヒチンおよびＴＡＸＯＬが挙げられる。他の試薬および化合物を投与した後の細胞内での染料の分布の変化により、該試薬および化合物の作用に関する情報が得られる。
【０２２９】
式Ｉの特定の化合物は、酸性環境を含むオルガネラをモニターし描出する際に有用である。本発明の化合物は、典型的には、酸性の内部を有するオルガネラ内で集中する。典型的には、酸性オルガネラとは、その内部のｐＨが７未満、好ましくは、６未満のオルガネラである。このようなオルガネラとしては、リソソームが挙げられる。
【０２３０】
式Ｉの化合物はまた、亜鉛イオンの濃度を検出するのに有用である。特に、本発明の化合物は、ピコモル程度に低いレベルの濃度まで遊離Ｚｎ２＋を定量するのに有用である。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．５（１）：１７−２２（２０００）を参照。式Ｉの化合物は、アポカルボニックアンヒドラーゼ酵素と併用するとき、高い選択性で遊離亜鉛のレベルを測定するのに使用できる。
【０２３１】
式Ｉの化合物を使用する全ての方法では、該化合物の濃度は、約０．１ｎＭ〜約１０，０００μＭである。他の好ましい濃度としては、約１ｎＭ〜約１，０００μＭ、約０．１μＭ〜約５００μＭ、約１μＭ〜約５００μＭ、および約１μＭ〜約１００μＭが挙げられる。
【０２３２】
（化合物の調製）
本発明はまた、式Ｉの化合物の多段合成（本明細書中で記述するような中間体および中間体反応工程を含めて）に関する。
【０２３３】
図式Ｉ：式Ｉの化合物は、図式Ｉで示す反応に従って調製でき、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＡは、上で定義したとおりである。適当な溶媒中にて、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）を適当なアミン（３）と攪拌して、式Ｉの化合物（１）を形成する。化合物２は、Ｄｉｗｕら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６６（４）：４２４〜４３１（１９９７）で詳述されているように、図式ＩＩに従って調製できる。
【０２３４】
【化２】
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【０２３５】
図式ＩＩ：溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルムまたはトルエン）中にて、２−アミノ−４’−ジメチルアミノアセトフェノン（４）を４−フルオロスルホニルベンゾイルクロライド（５）と反応させることにより、（６）を反応させて、２−（４’−フルオロスルホニルベンゾイルアミノ）−４”−ジメチル−アミノアセトフェノンを調製する。例えば、濃硫酸を使用することにより、化合物６を脱水して、２−（４’−フルオロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（７、ＤＡＰＯＸＹＬフッ化スルホニル）を得る。次いで、化合物７を塩基（例えば、１０％ＮａＯＨ）と反応させて、２−（４’−スルホフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール、ナトリウム塩（８、ＤＡＰＯＸＹＬスルホン酸、ナトリウム塩）を得る。化合物８を適当な塩素化試薬（例えば、ＰＯＣｌ３、ＰＣｌ５またはＳＯＣｌ２）と反応させて、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）を得る。
【０２３６】
【化３】
2005531490.tif 000009
【０２３７】
図式Ｉで使用されるアミン（３）は、式Ｉの化合物を生成する任意の適当なアミンであり得る。図式Iで使用されるアミンは、当該技術分野で周知の方法に従って、調製され得る。式Ｉの別の化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：（シクロプロピルメチル）アミン；２−（シクロプロピル）エチルアミン；３−（シクロブチル）−１−プロピルアミン；Ｎ−メチル−３−シクロペンチル−１−ペンチルアミン；４−シクロヘキシル−１−ペンチルアミン；４−シクロヘキシル−２−ペンチルアミン；シクロプロピルアミン；シクロブチルアミン；シクロペンチルアミン；Ｎ−メチルシクロペンチルアミン；シクロヘキシルアミン；Ｎ−ヘキシルシクロヘキシルアミン；シクロヘプチルアミン；シクロオクチルアミン；シクロノニルアミン；シクロデシルアミン；２−メチルシクロプロピルアミン；２−メトキシシクロペンチルアミン；３−ヒドロキシシクロペンチルアミン；３−（メトキシカルボニル）シクロペンチルアミン；２−（ヒドロキシフェニル）シクロペンチルアミン；１，４−シクロヘキシルジアミン；Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−シクロヘキシルジアミン；４−オキソ−２−シクロヘキシルアミン；１，２−ジアミノシクロヘキサン；１−アミノ−シス−シクロペンタン−１，３−ジカルボン酸；シス−１−アミノ−２−インダノール；［２−（ベンジルアミノ）シクロヘキシル］メタノール；１−アミノ−２−フェニルシクロプロパンカルボン酸；シクロプロペニルアミン；シクロブテニルアミン；シクロペンテニルアミン；Ｎ−エチルシクロペンテニルアミン；シクロヘキセニルアミン；Ｎ−ベンジルシクロヘキセニルアミン；シクロヘプテニルアミン；シクロオクテニルアミン；シクロノネニルアミン；シクロデセニルアミン；２−メチル−３−シクロプロペニルアミン；４−メトキシ−２−シクロペンテニルアミン；３−ヒドロキシ−２−シクロペンテニルアミン；５−（メトキシカルボニル）−２−シクロペンチルアミン；４−（ヒドロキシフェニル）−３−シクロペンチルアミン；４−オキソ−２−シクロヘキセニルアミン；４−アミノ−２−シクロペンタン−１−カルボン酸；Ｎ−エチル−２−（２−ヒドロキシシクロプロピル）エチルアミン；３−（３−カルボキシシクロブチル）−１−プロピルアミン；Ｎ−メチル−３−（３−（ジメチルアミノ）シクロペンチル）−１−ペンチルアミン；４−（２−クロロシクロヘキシル）−１−ペンチルアミン；４−（３−エトキシシクロヘキシル）−２−ペンチルアミン；イソピノカムフェニルアミン（ｉｓｏｐｉｎｏｃａｍｐｈｅｙｌａｍｉｎｅ）；３−ピナネメチルアミン；およびミルタニルアミン。
【０２３８】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：トロメタミン；２，３−ジヒドロキシ−１−プロピルアミン；１，２−ジヒドロキシ−２−プロピルアミン；２，４−ジヒドロキシ−１−ブチルアミン；３−ヒドロキシ−２−ヘキシルアミン；３−ヒドロキシフェニル−２−ヘキシルアミン；６−ヒドロキシ−１−ヘキシルアミン；２−アミノ−１，２−ジフェニルエタノール；Ｎ−エチル−６−ヒドロキシ−２−（メトキシカルボニル）メチルヘキシルアミン；４−ヒドロキシ−２−ブテニル−１−アミン；Ｎ−メチル−４−ヒドロキシ−２−ブテニル−１−アミン；５−ヒドロキシ−３−ペンテニル−２−アミン；４−ヒドロキシ−２−ブチニル−１−アミン；Ｎ−メチル−４−ヒドロキシ−２−ブチニル−１−アミン；５−ヒドロキシ−３−ペンチニル−２−アミン；２−アミノ−２−デオキシ−グルコース。
【０２３９】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：２−アミノ酢酸；４−アミノ酪酸；６−アミノヘキサン酸；７−アミノヘプタン酸；Ｎ−ベンジル−４−アミノ酪酸；Ｎ−プロピル−６−アミノヘキサン酸；Ｎ−イソブチル−７−アミノヘプタン酸；４−アミノ−２−ヒドロキシ−酪酸；６−アミノ−３−メトキシ−ヘキサン酸；７−アミノ−２−（４−アミノフェニル）ヘプタン酸；Ｎ−ベンジル−４−アミノ酪酸；Ｎ−プロピル−６−アミノ−４−イソプロピルヘキサン酸；Ｎ−イソブチル−７−アミノ−３−クロロヘプタン酸；４−アミノブテン酸；６−アミノヘキセン酸；７−アミノヘプテン酸；Ｎ−ベンジル−４−アミノブテン酸；Ｎ−プロピル−６−アミノヘキセン酸；Ｎ−イソブチル−７−アミノヘプテン酸；４−アミノ−２−ヒドロキシ−ブテン酸；６−アミノ−３−メトキシヘキセン酸；７−アミノ−２−（４−アミノフェニル）ヘプテン酸；Ｎ−ベンジル−４−アミノブテン酸；Ｎ−プロピル−６−アミノ−４−イソプロピルヘキセン酸；Ｎ−イソブチル−７−アミノ−３−クロロヘプテン酸；４−アミノブチン酸；６−アミノヘキシン酸；７−アミノヘプチン酸；Ｎ−ベンジル−４−アミノブチン酸；Ｎ−プロピル−６−アミノヘキシン酸；Ｎ−イソブチル−７−アミノヘプチン酸；４−アミノ−２−ヒドロキシ−ブチン酸；６−アミノ−３−メトキシヘキシン酸；７−アミノ−２−（４−アミノフェニル）ヘプチン酸；Ｎ−ベンジル−４−アミノブチン酸；Ｎ−プロピル−６−アミノ−４−イソプロピルヘキシン酸；Ｎ−イソブチル−７−アミノ−３−クロロヘプチン酸；およびそれらのエステル。
【０２４０】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：２−フェニルエチルアミン；３−フェニル−１−プロピルアミン；４−フェニル−１−ブチルアミン；３−フェニル−１−ブチルアミン；５−フェニル−１−ペンチルアミン；４−フェニル−１−ペンチルアミン；４−フェニル−２−ペンチルアミン；６−フェニル−１−ヘキシルアミン；５−フェニル−１−ヘキシルアミン；５−フェニル−２−ヘキシルアミン；７−フェニルヘプチルアミン；８−フェニルオクチルアミン；Ｎ−ベンジル−２−フェニルエチルアミン；Ｎ−プロペニル−３−フェニル−１−プロピルアミン；Ｎ−ベンジル−４−フェニル−１−ブチルアミン；Ｎ−エチル−３−フェニル−１−ブチルアミン；Ｎ−メチル−５−フェニル−１−ペンチルアミン；Ｎ−シクロプロピル−４−フェニル−１−ペンチルアミン；Ｎ−ブチル−４−フェニル−２−ペンチルアミン；Ｎ−ベンジル−６−フェニル−１−ヘキシルアミン；Ｎ−ヘキセニル−５−フェニル−１−ヘキシルアミン；Ｎ−ｎ−ブチル−５−フェニル−２−ヘキシルアミン；Ｎ−プロピニル−７−フェニルヘプチルアミン；Ｎ−ベンジル−８−フェニルオクチルアミン；３−フェニル−１−プロペニルアミン；４−フェニル−１−ブテニルアミン；３−フェニル−１−ブテニルアミン；５−フェニル−１−ペンテニルアミン；４−フェニル−１−ペンテニルアミン；４−フェニル−２−ペンテニルアミン；６−フェニル−１−ヘキセニルアミン；５−フェニル−１−ヘキセニルアミン；５−フェニル−２−ヘキセニルアミン；７−フェニルヘプテニルアミン；８−フェニルオクテニルアミン；Ｎ−プロペニル−３−フェニル−１−プロペニルアミン；Ｎ−ベンジル−４−フェニル−１−ブテニルアミン；Ｎ−エチル−３−フェニル−１−ブテニルアミン；Ｎ−メチル−５−フェニル−１−ペンテニルアミン；Ｎ−シクロプロピル−４−フェニル−１−ペンテニルアミン；Ｎ−ブチル−４−フェニル−２−ペンテニルアミン；Ｎ−ベンジル−６−フェニル−１−ヘキセニルアミン；Ｎ−ヘキセニル−５−フェニル−１−ヘキセニルアミン；Ｎ−ｎ−ブチル−５−フェニル−２−ヘキセニルアミン；Ｎ−プロピニル−７−フェニルヘプテニルアミン；Ｎ−ベンジル−８−フェニルオクテニルアミン；３−フェニル−１−プロピニルアミン；４−フェニル−１−ブチニルアミン；３−フェニル−１−ブチニルアミン；５−フェニル−１−ペンチニルアミン；４−フェニル−１−ペンチニルアミン；４−フェニル−２−ペンチニルアミン；６−フェニル−１−ヘキシニルアミン；５−フェニル−１−ヘキシニルアミン；５−フェニル−２−ヘキシニルアミン；７−フェニルへプチニルアミン；８−フェニルオクチニルアミン；Ｎ−プロペニル−３−フェニル−１−プロピニルアミン；Ｎ−ベンジル−４−フェニル−１−ブチニルアミン；Ｎ−エチル−３−フェニル−１−ブチニルアミン；Ｎ−メチル−５−フェニル−１−ペンチニルアミン；Ｎ−シクロプロピル−４−フェニル−１−ペンチニルアミン；Ｎ−ブチル−４−フェニル−２−ペンチニルアミン；Ｎ−ベンジル−６−フェニル−１−ヘキシニルアミン；Ｎ−ヘキセニル−５−フェニル−１−ヘキシニルアミン；Ｎ−ｎ−ブチル−５−フェニル−２−ヘキシニルアミン；Ｎ−プロピニル−７−フェニルへプチニルアミン；Ｎ−ベンジル−８−フェニルオクチニルアミン；２−ヒドロキシメチル−２−フェニルエチルアミン；２−メトキシメチル−３−フェニル−１−プロピルアミン；３−ニトロ−４−フェニル−１−ブチルアミン；２−ジメチルアミノ−３−フェニル−１−ブチルアミン；５−（４−アミノフェニル）−１−ペンチルアミン；４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−１−ペンチルアミン；４−（３−カルボキシフェニル）−２−ペンチルアミン；６−フェニル−３−オキソ−１−ヘキシルアミン；５−（４−フェノキシフェニル）−１−ヘキシルアミン；５−フェニル−４−２−ヘキシルアミン；７−（３−グアニジノフェニル）−１−ヘプチルアミン；および８−フェニル−３−（メチルスルホニル）オクチルアミン。
【０２４１】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：Ｎ−ベンジル−２−メチルチオ−２−フェニルエチルアミン；Ｎ−プロペニル−３−（４−（フェニルエチル）フェニル）−１−プロピルアミン；Ｎ−ベンジル−３−アミノ−エチル−４−フェニル−１−ブチルアミン；Ｎ−エチル−２−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）３−フェニル−１−ブチルアミン；Ｎ−メチル−３−ベンゼンスルホニル−５−フェニル−１−ペンチルアミン；Ｎ−シクロプロピル−３−ブトキシアルボニルアミノ−４−フェニル−１−ペンチルアミン；Ｎ−ブチル−４−（４−（アミノメチル）フェニル−２−ペンチルアミン；Ｎ−ベンジル−６−フェニル−１−ヘキシルアミン；Ｎ−ヘキセニル−５−フェニル−１−ヘキシルアミン；Ｎ−ｎ−ブチル−３，４−ジヒドロキシ−５−フェニル−２−ヘキシルアミン；Ｎ−プロピニル−３，４，５−トリヒドロキシ−７−フェニルヘプチルアミン；Ｎ−ベンジル−８−（２，４，６−トリヒドロキシフェニル）オクチルアミン；２−（４−ブロモ−２，５−ジメトキシフェニル）−１−エチルアミン；２，３−ジクロロ−α−メチルベンジルアミン；２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール；２−アミノ−１−フェニル−１，３−プロパンジオール；２−アミノ−３−メトキシ−１−フェニル−１−プロパノール；ビス（α−メチルベンジル）アミン；Ｎ−（１−フェニルエチル）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−アミン；１，２−ジフェニルエチレンジアミン；１−フェニルエチレンジアミン；１，３−ジフェニルプロピレンジアミン；６−メチルアミノ−４，４−ジフェニルヘプタン−３−オン；１−（１−ナフチル）エチルアミン；２−（１−ナフチル）エチルアミン；３−（１−ナフチル）プロピル−１−アミン；４−（１−ナフチル）ブチル−１−アミン；３−（１−ナフチル）ブチル−１−アミン；および４−（１−ナフチル）ブチル−１−アミン。
【０２４２】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：２−（２−ピリジル）エチルアミン；３−（２−ピリジル）−１−プロピルアミン；４−（２−ピリジル）−１−ブチルアミン；２−（２−キノリニル）エチルアミン；３−（２−イミダゾリル）−１−プロピルアミン；４−（３−イソキサゾリル）−１−ブチルアミン；５−（３−ピリジル）−１−ペンチルアミン；２−（６−アミノ−２−ピリジル）エチルアミン；３−（６−クロロ−２−ピリジル）−１−プロピルアミン；４−（６−メトキシ−３−ピリジル）−１−ブチルアミン；３−ヒドロキシ−５−（３−ピリジル）−１−ペンチルアミン；およびα−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸。
【０２４３】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：アゼチジン；アゼリジン；ピロリジン；ピペリジン；ピペラジン；アゼピン；２−メトキシカルボニルアゼチジン；アゼリジン；３−（ヒドロキシフェニル）ピロリジン；４−（グアニジノ）ピペリジン；２−カルボキシメチルピペリジン；および３−エチルアゼピン。
【０２４４】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：リン酸モノアミノエチルエステル；リン酸モノ−（３−アミノプロピル）エステル；リン酸モノアミノエチルエステルジエチルエステル；リン酸モノ−（３−アミノプロピル）エステルジエチルエステル；（１−アミノプロピル）ホスホン酸；（１−アミノ−２−メチルプロピル）ホスホン酸；（１−アミノブチル）ホスホン酸；（１−アミノヘキシル）ホスホン酸；（１−アミノエチル）ホスホン酸；（１−アミノエチル）ホスホン酸ジイソプロピルエステル；（２−ベンジルアミノエチル）ホスフィン酸モノエチルエステル；（１−アミノプロピル）ホスフィン酸；（１−アミノ−２−メチルプロピル）ホスフィン酸；（１−アミノブチル）ホスフィン酸；（１−アミノヘキシル）ホスフィン酸；（１−アミノエチル）ホスフィン酸；（１−アミノエチル）ホスフィン酸ジイソプロピルエステル；および（２−ベンジルアミノエチル）ホスフィン酸モノエチルエステル。
【０２４５】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：アスパラギン酸；グリシン；アラニン；リジン；トリプトファン；チロシン；プロリン；フェニルアラニン；ホモフェニルアラニン；ホモチロシン；バリン；ロイシン；イソロイシン；セリン；システイン；シスチン；ホモセリン；メチオニン；アスパラギン；グルタミン；アルギニン；ヒスチジン；スレオニン；チロキシン；リオチロニン（Ｏ−（４−ヒドロキシ−３−ヨードフェニル）−３，５−ジヨード−Ｌ−チロキシン）；ヒドロキシプロリン；２−アミノ−４−シクロヘキシル酪酸エチル；３−ヒドロキシフェニルグリシン；およびα−メチル−４−カルボキシフェニルグリシン。
【０２４６】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：セロトニン；エピネフリン；ノルエピネフリン；ノルニコチン；Ｌ−ドーパ；メチルドパ；カルビドパ；メチロシン；Ｌ−ジヒドロキシフェニルセリン；ｐ−チラミン；ドーパミン；γ−アミノ酪酸；エフェドリン；アンフェタミン；メタンフェタミン；メスカリン；１−（２，５−ジメトキシ−４−メチルフェニル）−２−アミノプロパン；ｐ−メトキシアンフェタミン；３，４−メチレンジオキシアンフェタミン；２，５−ジメトキシ−４−ブロモアンフェタミン；３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−エチルアンフェタミン；６−ヒドロキシ−３，４−メチレンジオキシメタアンフェタミン；１−（２，５−ジメトキシ−４−ヨードフェニル）−２−アミノプロパン；３−（４−クロロフェニル）−γ−アミノ酪酸；イソプロテレノール；Ｎ−第三級ブチルノルエピネフリン；テルブタリン；アルブテロール；イソエタリン；エピネフリルホウ酸；ジピベフリン；メタプロテレノール；ビトルテロール；コルテロール；フェニルプロパノールアミン；メフェンテルミン；メタラミノール（α−（１−アミノエチル）−ｍ−ヒドロキシベンジルアルコール）；ヒドロキシアンフェタミン（１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アミノプロパン）；レボノルデフリン（α−（１−アミノエチル）−３，４−ジヒドロキシベンジルアルコール）；エチルノルエピネフリン；メトキシフェナミン（２−（２−メトキシフェニル）イソプロピルメチルアミン）；メトキサミン（２−アミノ−１−（２，５−ジメトキシフェニル）プロパノール）；プロパノロール；ジクロロイソプロテレノール；４−ヒドロキシプロパノロール；プロアクトロール；メトプロロール；ナドロール；チモロール；ブトキサミン；アテノロール；アセブトロール；ジアセトロール；ピンドロール；エスモロール；およびベタキソロール。
【０２４７】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：フェンテラミン；ジエチルプロピオン；フェンフルラミン；クロロフェンテルミン；クロルテルミン；フェンメトラジン；メチルフェニデート；フェネルジン（２−（フェニルエチル）ヒドラジン）；トラニルシプロミン（２−フェニルシクロプロピルアミン）；デシプラミン（１０，１１−ジヒドロ−Ｎ−メチル−５Ｈ−ジベンズ［ｂ，ｆ］アゼピン−５−プロパンアミン）；ノルトリプチリン（３−（１０，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−５−イリデン）−Ｎ−メチル−１−プロパンアミン）；プロトリプチリン（Ｎ−メチル−５Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｄ］シクロヘプテン−５−プロピルアミン；マプロチリン（Ｎ−メチル−９，１０−エタノアントラセン−９（１０Ｈ）−プロパンアミン）；フルオキセチン；ヒスタミン；３−（２−アミノエチル）ピラゾール；２−（ジフェニルメトキシ）−Ｎ−メチルエチルアミン；２−［α−［２−メチルアミノ）エトキシ］−α−メチルベンジル］ピリジン；および６−アミノペニシラン酸。
【０２４８】
式Ｉのさらなる化合物は、２−（４’−クロロスルホニルフェニル）−５−（４”−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール（２、ＤＡＰＯＸＹＬ塩化スルホニル）と以下のアミンのいずれか１種とを反応させることにより、製造される：硫酸モノアミノエチルエステル；硫酸モノ−（３−アミノプロピル）エステル；硫酸モノアミノエチルエステルエチルエステル；硫酸モノ−（３−アミノプロピル）エステルエチルエステル；（１−アミノプロピル）スルホン酸；（１−アミノ−２−メチルプロピル）スルホン酸；（１−アミノブチル）スルホン酸；（１−アミノヘキシル）スルホン酸；（１−アミノエチル）スルホン酸（１−アミノエチル）スルホン酸ジイソプロピルエステル；（２−ベンジルアミノエチル）スルホン酸モノエチルエステル；（１−アミノプロピル）スルフィン酸；（１−アミノ−２−メチルプロピル）スルフィン酸；（１−アミノブチル）スルフィン酸；（１−アミノヘキシル）スルフィン酸；（１−アミノエチル）スルフィン酸；（１−アミノエチル）スルフィン酸ジイソプロピルエステル；および（２−ベンジルアミノエチル）スルフィン酸モノエチルエステル。
【０２４９】
式Ｉのさらなる化合物は、図式Ｉに従って製造した化合物をさらに変性することにより、製造される。化合物Iにて、Ｒ１がＮＨＲ３であるとき、該Ｒ１は、以下の官能基に変換されて、式Ｉのさらなる化合物が生成され得る：−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、アミジノ、グアニジノ、ビグアニジノ、アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノおよびキレーター。ＮＨＲ３を−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、アミジノ、グアニジノ、ビグアニジノ、アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノおよびキレーターの１種に変換することは、当該技術分野で周知の化学反応を使用して、実行される。例えば、その末端アミンのグアニジル化は、アミノイミノスルホン酸（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ  Ｂｉｓｃｈｏｆｆ、Ｊ．Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ７７７（１９８６））または１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸塩（Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：２４９７（１９９２））のような標準試薬を使用して、または置換グアニジル化試薬（例えば、Ｎ，Ｎ’−ビス（第三級ブトキシカルボニル）−Ｓ−メチルイソチオ尿素（Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｒ．Ｊ，ａｎｄ  ＭｃＭａｎｉｓ，Ｊ．Ｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：１７００（１９８７））またはＮＲａ、ＮＲｂ、Ｎｃ−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン；ここで、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、式Ｉについて、上で定義されている）を使用して、達成される。有用な１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンには、Ｎ，Ｎ’−ビス（第三級ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンおよびＮ，Ｎ’−ビス（ベンジルオキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンが挙げられる（これらの全ては、Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：３３８９（１９９３）に従って、調製され得る）。
【０２５０】
さらに、化合物１にて、Ｒ１がＯＨであるとき、式Ｉのさらなる化合物は、該ＯＨを以下の基の１種に変換することにより、製造される：シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロヘテロアルキル、シクロヘテロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、−ＯＲ３、−ＮＲ３Ｒ４、−ＳＲ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）Ｒ４、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ３、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３Ｒ４、−ＮＲ３Ｃ（Ｏ）ＯＲ４、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ３、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、もしくは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４、アミジノ、グアニジノ、ビグアニジノ、オキシグアニジノ、アルキルイミノアミノ、ホルミルイミノアミノまたはキレーター。例えば、式Ｉの化合物にて、Ｒ１がＯＨであるとき、式Ｉのさらなる化合物は、化合物１をＣｌ−Ｃ（Ｏ）Ｒ３と反応させて、Ｒ１が−ＯＣ（Ｏ）Ｒ３である式Ｉの化合物を生成することにより、製造される。
【０２５１】
式Ｉのさらなる化合物を生成するために、他の多くの化学反応および変換が使用される。該化学反応および変換は、例えば、化合物１のＲ１を変えるのに使用される。あるいは、該化学反応および変換は、ＡまたはＲ２のいずれかを変性して式Ｉのなおさらなる化合物を生成するために、使用される。該化学反応および変換は、当業者に周知である。例えば、Ｍａｒｃｈ，Ｊ．，「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、４版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，１９９２；Ｌａｒｏｃｋ，Ｒ．Ｃ．，「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、２版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９；およびＧｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ，１９８１を参照。
【実施例】
【０２５２】
（実施例１）
（式Ｉの化合物）
以下の化合物は、式Ｉの化合物の例である。化合物９〜２１は、図式１で示した手順に従って製造するか、または製造した。
【０２５３】
（４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−ピロリジン−１−イルエチル）ベンゼンスルホンアミド（９））
化合物２を２−（１−ピロリジニル）エチルアミンと反応させることにより、化合物９を製造した。化合物９は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４４０．５６６；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４４１．４。
【０２５４】
（４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−［３−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）プロピル］ベンゼンスルホンアミド（１０））
化合物２を３−（４−メチルピペラジニル）−１−プロピルアミンと反応させることにより、化合物１０を製造した。化合物１０は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４８３．６３５；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４８４．４。
【０２５５】
（ジメチル−（４−｛２−［４−（ピペラジン−１−スルホニル）フェニル］オキサゾール−５−イル｝フェニル｝アミン（１１））
化合物２をピペラジンと反応させることにより、化合物１１を調製した。化合物１１は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４１２．５１３；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４１３．５；質量スペクトル（２Ｍ＋Ｎａ）：８４７．１。
【０２５６】
（ジメチル−（４−｛２−［４−（４−メチルピペラジン−１−スルホニル）フェニル］−オキサゾール−５−イル｝フェニル）アミン（１２））
化合物２を４−メチルピペラジンと反応させることにより、化合物１２を調製した。化合物１２は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４２６．５３９；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４２７．５。
【０２５７】
（４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（４−メチルピペラジン−１−イル）−ベンゼンスルホンアミド（１３））
化合物２を１−アミノ−４−メチルピペラジンと反応させることにより、化合物１３を調製した。化合物１３は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４４１．５５４；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４４２．６。
【０２５８】
（２−｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−ベンゼンスルホニルアミノ｝コハク酸（１４））
化合物２をアスパラギン酸と反応させることにより、化合物１４を調製した。化合物１４は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４５９．４８；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４６０．３。
【０２５９】
（｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−ベンゼンスルホニルアミノ｝酢酸（１５））
化合物２をグリシンと反応させることにより、化合物１５を調製した。化合物１５は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４０１．４４３；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４０２．６。
【０２６０】
（（｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル］オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホニル｝−メチルアミノ）酢酸（１６））
化合物１を３−アミノプロパン酸と反応させることにより、化合物１６を調製した。化合物１６は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４１５．４７；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４１６．３。
【０２６１】
（４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミド（１７））
４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−アミノエチル）ベンゼン−スルホンアミドをＮ，Ｎ’−ビス（第三級ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンと反応させることにより、化合物１７を調製した。次いで、得られたビス−Ｂｏｃ保護グアニジノ化合物を、標準的な脱保護化学作用を使用して、脱保護して、化合物１７を得た。化合物１７は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４２８．５５１；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４２９．５。
【０２６２】
（４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−ヒドロキシ−１，１−ビス−ヒドロキシメチルエチル）ベンゼンスルホンアミド（１８））
化合物２をトロメタミンと反応させることにより、化合物１８を調製した。化合物１８は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４４７．５１２；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：４４８．４；質量スペクトル：（２Ｍ＋Ｎａ）：９１６．９。
【０２６３】
（３−｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］ベンゼンスルホニル｝チアゾリジン−２，４−ジカルボン酸メチルエステル（１９））
化合物２を２，４−（ジメトキシスルボニル）チアゾリジンと反応させることにより、化合物１９を調製した。化合物１９は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：５３１．６１；質量スペクトル（Ｍ＋Ｈ）：５３２．６。
【０２６４】
（２−アミノ−５−｛４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−ベンゼンスルホニルアミノ｝ペンタン酸（２０））
化合物２を２，５−ジアミノペンタン酸と反応させることにより、化合物２０を調製する。化合物２０は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：４５８．５３２。
【０２６５】
（３−｛４−［５−（４−ジメチルアミノ−フェニル）−オキサゾール−２−イル］−ベンゼンスルホニル｝−チアゾリジン−２，４−ジカルボン酸（２１））
化合物１９をＬｉＯＨと反応させてそのジエステルをケン化することにより、化合物２１を調製する。化合物２１は、以下の特性を有する：分子量（ＭＷ）：５０３．５５０。
【０２６６】
（実施例２）
（異なる環境におけるジフェニルオキサゾール誘導体染料の蛍光発光スペクトルの比較）
４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミドを異なる溶媒と混合して、１０μＭの最終染料濃度を得た。メタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水性緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）中でのこの染料のスペクトルを、図１に示す。この図は、水性環境から非水性環境へとシフトされる場合、この染料について、著しい発光強度の向上（２００〜５００倍）が観察されたことを図示している。この４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミドを、緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）中トロンビン（タンパク質）の０．１ｍｇ／ｍＬ溶液と混合して、１０μＭの最終染料濃度を得た。この溶液の蛍光発光スペクトルを、混合直後、また、その溶液を５分間にわたって８０℃まで加熱したのに続いて、記録した。本来のトロンビン／染料のスペクトルは、加熱前の蛍光発光を示し、また、アンフォールドしたトロンビン／染料のスペクトルは、加熱後の蛍光発光を示す。これらの２つのスペクトルは、アンフォールドタンパク質に４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミドを結合したとき、蛍光発光の著しい向上が起こることを示しており、アンフォールドタンパク質に結合した染料からの発光は、５−（４”−ジメチルアミノフェニル）−２−（４’−フェニル）オキサゾールスルホネートおよび１，８−アニリノナフチレンスルホネートに対する約４６０ｎｍでの発光極大と比較して、５２０ｎｍで好ましい赤色シフト極大を有する。
【０２６７】
（実施例３）
（他の染料とはデータを生じないタンパク質に対してアンフォールディング遷移を測定するためのジフェニルオキサゾール誘導体染料の使用）
ポリプロピレン３８４ウェルプレートの別々のウェルの各々にて、４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミド、５−（４”−ジメチルアミノフェニル）−２−（４’−フェニル）オキサゾールスルホネートおよび１，８−アニリノナフチレンスルホネートをタンパク質であるＰＰＡＲ−ガンマと混合した。各溶液は、１００μＭの各染料からなり、この染料は、緩衝液（これは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭジチオトレイトールおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる）中にて、０．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質と混合した。Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（登録商標）器具で異なる温度まで加熱することにより生じた個々の蛍光曲線を、図３に示す。この図は、ＰＰＡＲ−γのような特定のタンパク質が、これらの２種のスルホネート染料の存在下では、測定可能な遷移を生じないのに対して、このタンパク質のアンフォールディングは、アンフォールド形状のタンパク質に結合する際の４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミドの高い蛍光を測定することにより、容易にモニタリングし得ることを示している。
【０２６８】
（実施例４）
（小胞体のモニタリング）
マウスの膵臓腺房細胞を、ＣＬＳＰＡコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ．）中にて、６分間単離する。細胞を全細胞パッチクランプし、Ｋｉｄｄ，ら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５２０：１８７〜２０１（１９９９）に記述された条件下にて、そのＣａＣｌ２の流れを記録する。そのパッチピペットを通って１０ｍＭイノシトール−２，４，５−トリホスフェートを注入することにより、局所分泌極Ｃａ２＋スパイクを誘発する。２つの別々の実験にて、式Ｉの化合物を使用して、エイド−フィールド蛍光顕微鏡または２光子励起顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ−ＭＰ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のいずれかを使って、そのＥＲの分布を描出する。これらの細胞を、３０分間にわたって、式Ｉの１００〜２００ｎＭ化合物と共にインキュベートし、そして４００ｎｍの励起光（キセノン光源、広視野；または８００ｎｍに調整したポンプ上げチタン／サファイアレーザーによる、２光子）で眺める。４５０〜７００ｎｍで、放射光を集める。細胞オルガネラの初期視覚化後、さらなる化合物または試薬を投与する。１つの実験では、式Ｉの化合物に加えて、１００μＭのノコダゾールを細胞に投与する。第二の実験では、式Ｉの化合物に加えて、１０ｍＭのＴＡＸＯＬを細胞に投与する。
【０２６９】
本明細書中で引用した全ての特許、出版物および他の参考文献の内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０２７０】
具体的な実施形態の前述の記述は、本発明の一般的な性質を非常に詳細に明らかにしているので、他者は、当業者の範囲内の知見（本明細書中で引用した参考文献の内容を含めて）を適用することにより、過度の実験なしで、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、種々の用途に対して、このような具体的な実施形態を容易に改良および／または改造できる。従って、このような改造および改良は、本明細書中で提示した教示および指針に基づいて、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内に入ると解釈される。本明細書中の表現および用語は、限定ではなく説明する目的であり、本明細書の用語または表現は、当業者の知見と組み合わせて、本明細書中で提示された教示および指針に照らして、当業者により解釈されることが理解できるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０２７１】
【図１】図１Ａは、メタノールおよびジメチルスルホキシド中での４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミドの蛍光発光スペクトルを提供する。また、その緩衝液の蛍光発光スペクトルも提供されている。図１Ｂは、図１Ａのスペクトルの一部を提供し、これは、０〜１０，０００  ｃｐｓの範囲を示している。
【図２】図２は、緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中でトロンビンと混合した４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミドの蛍光発光スペクトルを提供する。四角で表示した発光スペクトルは、この溶液を調製した直後、本来の（フォールド）トロンビンで獲得した。三角で表示した発光スペクトルは、この溶液を５分間にわたって８０℃まで加熱してトロンビンタンパク質をアンフォールドした後に、得た。加熱後に得られたスペクトルは、蛍光発光スペクトルおよび赤色シフト発光極大の増大を示している。
【図３】図３は、３種の染料である４−［５−（４−ジメチルアミノフェニル）オキサゾール−２−イル］−Ｎ−（２−グアニジノエチル）ベンゼンスルホンアミド、５−（４”−ジメチルアミノフェニル）−２−（４’−フェニル）オキサゾールスルホネートおよび１，８−アニリノナフチレンスルホネートについて、実施例３で記述したように、タンパク質ＰＰＡＲ−ガンマを使用して、Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ（登録商標）器具で分析したときの個々の蛍光曲線を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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