(57)【要約】分子量61,300±5,000Da；補助因子としてのNADPHおよびNADH；pH7.4における最適温度55〜60℃；最適pH4.5〜8.5；および特に酵母に由来するα,β-不飽和ケトンにおける基質特異性によって特徴付けられるエノン還元酵素、ならびにケトイソホロンからレボジオンを調製する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地中NADHまたはNADPHの存在下でケトイソホロンをNADPH脱水素酵素に接触させる段階、および結果として生じるレボジオンを反応混合物から単離する段階を含む、ケトイソホロンからレボジオンを製造する方法。
【請求項２】
NADPH脱水素酵素が、酵素クラスEC 1.6.99で定義される旧黄色酵素である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
酵素が、NADPH脱水素酵素の製造に適した微生物から得ることができる、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
微生物が、サッカロミセス属、チゴサッカロミセス属、カンジダ属、グルコノバクター属、ベネッケア属、およびビブリオ属からなる群より選択される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
微生物がサッカロミセス・セレビシエである、請求項3または4記載の方法。
【請求項６】
微生物が、サッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 204508)、その機能的等価物、継代培養物、突然変異体、または変種である、請求項3または4記載の方法。
【請求項７】
NADPH脱水素酵素が、サッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 204508)由来のoye2遺伝子またはoye3遺伝子によってコードされる旧黄色酵素である、請求項1または2記載の方法。
【請求項８】
反応が、4.5〜8.5のpH値および20〜40℃の範囲の温度で行われる、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
反応が、5.0〜8.0のpH値および25〜35℃の範囲の温度で行われる、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
液体培地中NADHまたはNADPHの存在下で、NADPH脱水素酵素を発現する形質転換された微生物またはその無細胞抽出物にケトイソホロンを接触させる段階、および得られたレボジオンを反応混合物から単離する段階を含む、ケトイソホロンからレボジオンを製造する方法。
【請求項１１】
組換え微生物が大腸菌である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
NADPH脱水素酵素が、酵素クラスEC 1.6.99で定義される旧黄色酵素である、請求項10または11記載の方法。
【請求項１３】
形質転換された微生物によって発現された酵素が、サッカロミセス属、チゴサッカロミセス属、カンジタ属、グルコノバクター属、ベネッケア属、およびビブリオ属からなる群より選択される微生物に由来することができる、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
形質転換された微生物によって発現される酵素が、サッカロミセス・セレビシエ、好ましくはサッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 20458)に由来する、請求項10〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
形質転換された微生物によって発現されるNADPH脱水素酵素が、サッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 20458)由来のoye2遺伝子またはoye3遺伝子によってコードされる旧黄色酵素である、請求項10〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
反応が、4.5〜8.5のpH値および20〜40℃の範囲の温度で行われる、請求項10〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
反応が、5.0〜8.0のpH値および25〜35℃の範囲の温度で行われる、請求項10〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
本明細書、特に実施例に関して実質的に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(本明細書では以後NADPHと呼ぶ)脱水素酵素により、2,6,6,-トリメチル-2-シクロヘキサン-1,4,-ジオン(本明細書では以後ケトイソホロン(ketoisophorone)と呼ぶ)から(6R)-2,2,6-トリメチルシクロヘキサン-1,4-ジオン(本明細書では以後レボジオン(levodione)と呼ぶ)を製造する方法に関する。レボジオンは、カロテノイド、例えばゼアキサンチンの合成において重要な中間体である。
【背景技術】
【０００２】
ケトイソホロンからレボジオンを製造するための微生物学的方法が知られており、例えば米国特許第4,156,100号を参照されたい。
【０００３】
予期していたことではないが、本発明者らはNADPH脱水素酵素を触媒として使用することにより、レボジオンがケトイソホロンから形成できることを見出した。本発明の方法において触媒として使用するNADPH脱水素酵素は、一般に旧黄色酵素(old yellow enzyme：OYE)として知られており、生物化学および分子生物学国際連合命名委員会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)により提供される酵素命名法に従って、酵素クラスE.C.1.6.99で定義される(Academic Press, 1992)。
【発明の開示】
【０００４】
本発明はケトイソホロンからレボジオンを製造する方法に関し、液体培地中NADHまたはNADPHの存在下でケトイソホロンをNADPH脱水素酵素に接触させる段階、および結果として生じるレボジオンを反応混合物から単離する段階を含む。
【０００５】
本明細書において使用する際、「NADPH脱水素酵素」という用語は、NADHまたはNADPH(例えば、生物化学および分子生物学国際連合命名委員会により提供される酵素命名法に従って、EC 1.6.99として分類される旧黄色酵素(OYE))の存在下でケトイソホロンのレボジオンに対する酵素反応を触媒することができるタンパク質を包含する。
【０００６】
特に、本発明はケトイソホロンからレボジオンを製造する方法に関し、ここで反応を触媒するNADPH脱水素酵素は酵素クラス EC 1.6.99で定義されるOYEである。
【０００７】
本発明の方法において触媒として使用するOYEは、この酵素の製造に適した、サッカロミセス属（Saccharomyces）、チゴサッカロミセス属（Zygosaccharomyces）、カンジタ属（Candida）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、ベネッケア属（Beneckea）、またはビブリオ属（Vibrio）を含むがこれに限定されない任意の適切な微生物から得ることができるまたは単離してもよい。上記の微生物はまた、原核生物命名法の国際コードによって定義される、同一の物理-化学的性質を有するそのような微生物の同義語またはバソニムも含む。
【０００８】
NADPH脱水素酵素を発現する大腸菌のような、形質転換された微生物もまた開始微生物として使用することができる。
【０００９】
本発明の1つの態様において、OYEのようなNADPH脱水素酵素の製造に適した微生物はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、好ましくはアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)、10801 University Boulevard Manassas, VA20100-2209, U.S.A.から公的に入手可能なサッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 204508)である。公知の精製方法を酵素の調製のために使用することができる(Abramovitz, A.S.およびMassey.V.、J. Biol. Chem. 251,5321-5326,1976を参照されたい）。上記微生物の機能的等価物、継代培養物、突然変異体、および変種を本発明において使用することができる。
【００１０】
本発明の1つの態様において、例えばNADPH-FMN Oxidoreductase(登録商標)(Sigma, U.S.A.)のような、市販されているOYEをケトイソホロンのレボジオンへの触媒的開裂のために使用することができる。
【００１１】
好ましくは本発明に使用されるOYEは、それぞれ45.0kDaおよび44.9kDaの分子量を有するOYE2およびOYE3の2つのサブユニットから構成される。驚くべきことに、OYE2およびOYE3はNADPHを利用できるだけでなく、NADHを本発明の反応の触媒のための補助因子として利用できることも見出された。
【００１２】
従って、本発明のさらなる局面は、ケトイソホロンのレボジオンへの触媒反応のために使用されるOYEが、サッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 204508)由来のoye2遺伝子またはoye3遺伝子によってコードされる方法を提供することである。
【００１３】
本発明のOYEは、下記式に従う補助因子の存在下でケトイソホロンのレボジオンへの還元を触媒する：
2005517448.tif 000002
【００１４】
例として、標準的な酵素反応は下記のように実施される：基礎反応混合物(100μlの1M Tris-HCl緩衝液 pH8.0、100μlの80mM NADH、100μlの0.13Mケトイソホロン、および総容量を1mlにするための水)に5μlの酵素溶液を補充し、20〜40℃で5〜300分、好ましくは25℃で30分インキュベートする。反応混合物を1mlの有機溶媒、例えばエチルアセテート、n-ヘキサン、トルエン、またはn-ブチルアセテートによって抽出し、レボジオンを有機溶媒層中に回収する。抽出物を、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、またはペーパークロマトグラフィーなどのような既知の方法によって分析する。ガスクロマトグラフィーの場合、下記の条件を1つの態様として適用することができる：
カラム：ULBON HR-20M(Shinwa, Japan) 0.25mmφ×30m
カラム温度：160℃(一定)
インジェクター温度：250℃
キャリアガス：(約1ml/分)
【００１５】
反応は、Tris-HCl緩衝液、リン酸緩衝液等の溶媒中、NADHまたはNADPHの存在下において約4.5〜約8.5のpH値で行うことができる。好ましくは、pHは5.0〜8.0である。
【００１６】
本発明は、OYEの助けによりケトイソホロンからレボジオンを製造するための方法に関し、この方法において、反応は4.5〜8.5のpH値および20〜40℃の範囲の温度で行われる。好ましくは、反応は5.0〜8.0のpH値および25〜35℃の範囲の温度で行われる。
【００１７】
本発明のOYE2タンパク質およびOYE3タンパク質をコードする遺伝子は、起源となる微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエの遺伝子配列情報に基づいてクローニングすることができ、大腸菌のような適切な宿主生物において過剰発現させることができる。NADPH脱水素酵素を発現する大腸菌のような組換え微生物は、周知の技術(「Molecular cloning: a Laboratory Manual」, 第2版/ Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 を参照)によって調製することができる。
【００１８】
従って、本発明はケトイソホロンからレボジオンを製造するための方法に関し、この方法は、液体培地中NADHまたはNADPHの存在下でNADPH脱水素酵素を発現する組換え微生物またはその無細胞抽出物にケトイソホロンを接触させる段階、および得られたレボジオンを反応混合物から単離する段階を含む。好ましくは、組換え微生物は大腸菌である。
【００１９】
組換え微生物によって発現されるNADPH脱水素酵素は、本発明の他の局面と同様酵素クラスEC 1.6.99で定義されるOYEである。
【００２０】
特に、組換え微生物における発現のために使用されるOYEは、サッカロミセス属、チゴサッカロミセス属、カンジダ属、グルコノバクター属、ベネッケア属、およびビブリオ属、またはそれらの機能的等価物、継代培養物、突然変異体、および変種からなる群より選択される微生物に由来する。好ましくはOYEはサッカロミセス・セレビシエに由来し、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエS288C (ATCC 204508)に由来する。最も好ましいものは、サッカロミセス・セレビシエS288C (ATCC 204508)由来のoye2遺伝子またはoye3遺伝子によってコードされるOYEである。
【００２１】
NADPH脱水素酵素を発現する例えば大腸菌のような組換え微生物は、炭素供給源として、グルコースもしくはスクロースのような糖類、エタノールもしくはグリセロールのようなアルコール、オレイン酸、ステアリン酸、もしくはそれらのエステルのような脂肪酸、または菜種油もしくは大豆油のような油分；窒素供給源として、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、アミノ酸、コーンスティープリカー、糠、酵母抽出物等；無機塩供給源として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム等；および他の栄養供給源として、麦芽抽出物、肉抽出物等を含む、栄養培地中で培養しても良い。培養は好気的に行うことができ、通常、pH 3.0.〜9.0の培地における10〜40℃の範囲の温度での、1〜7日の培養期間で行われる。好ましくは、培養はpH5.0〜8.0の培地、かつ25〜35℃の培養温度で2〜4日間行われる。
【００２２】
OYEは、ケトイソホロンからレボジオンを製造するための触媒として有用である。1つの態様において、組換え微生物を使用する、ケトイソホロンからレボジオンを製造する反応は、Tris-HCl緩衝液、リン酸緩衝液等のような溶媒中、NADHまたはNADPHの存在下において約4.5から約8.5のpH値で行うことができる。好ましい態様において、反応は5.0〜8.0のpHで行われる。
【００２３】
反応を行わせるための好ましい温度範囲は20〜40℃である。pHおよび温度をそれぞれ5.0〜8.0および25〜35℃に設定した場合、この反応から通常最良の結果が得られる。
【００２４】
さらなる態様において、組換え微生物を使用する、レボジオンを製造するための反応は4.5〜8.5のpH値および20〜40℃の範囲の温度で行われる。好ましくは、反応は5.0〜8.0のpH値および25〜35℃の温度範囲で行われる。
【００２５】
溶液中のケトイソホロンの濃度は他の反応条件によって変化しうるが、一般に1mM〜2M、好ましくは10mM〜100mMである。
【００２６】
反応において、OYEは適切な担体に固定化した形態で使用されてもよい。当技術分野において一般に知られている、酵素を固定化する任意の方法を使用してもよい。例えば、酵素を1つもしくは複数の官能基を有する樹脂の膜、顆粒等に直接結合させてもよく、または酵素を1つもしくは複数の官能基を有する架橋化合物、例えばグルタルアルデヒドを通して樹脂に結合させてもよい。
【００２７】
反応後、エチルアセテート、n-ヘキサン、トルエン、まはたn-ブチルアセテートのような水に非混和性かつレボジオンを容易に可溶化する有機溶媒を用いた抽出によって、レボジオンを反応混合物から回収してもよい。レボジオンのさらなる精製は、抽出物を濃縮してレボジオンを直接結晶化することによって、または様々な種類のクロマトグラフィー(例えば薄層クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、または高速液体クロマトグラフィー)を組み合わせることによって実行することができる。
【００２８】
下記の実施例は本発明をさらに説明する。
【００２９】
実施例1．サッカロミセス・セレビシエゲノムDNAからの、oye2遺伝子およびoye3遺伝子のクローニング
サッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 204508)のゲノムDNAを、酢酸カリウム法を用いて調製した。調製したゲノムDNAを鋳型として使用し、oye2およびoye3の遺伝子断片をサーマルサイクラー(Perkin Elmer 2400, U.S.A.)を使用する2段階PCR法により得た。PCR混合物(0.02ml)は、各プライマー5pmol、0.312mMの各dNTP、および2.5UのPyrobest DNAポリメラーゼ(Takara Shuzo Co. LTD/ Kyoto, Japan)を含んだ。サッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 204508)の100ngゲノムDNAを、第1のPCR反応の鋳型として使用した。反応後の混合物を1:20で水に希釈し、第2のPCR反応の鋳型として使用した。第1のPCTRに関して、98℃で10秒、55℃で30秒、および72℃で90秒のサイクルを25回繰り返した。第2のPCRに関しては、98℃で10秒、51℃で30秒、および72℃で90秒のサイクルを25回繰り返した。
【００３０】
oye2遺伝子をクローニングするために、第1のPCR反応は下記のプライマー
2005517448.tif 000003
を用いて実施した。この反応により、oye2遺伝子(1250bp)を含むDNA断片が増幅された。第2のPCRは下記のプライマー
2005517448.tif 000004
を用いて実施した。
【００３１】
この反応により、oye2遺伝子(1200bp)のちょうどORFを含むDNA断片が増幅された。この増幅oye2遺伝子をEcoRIおよびPstIで処理し、前もってEcoRIおよびPstIで消化したベクターであるpKK223-3(Amersham Bioscience/ Buckinghamshire、England)にライゲーションしてプラスミドpKK223-3/OYE2を構築した。大腸菌DH5αをライゲーション混合物により形質転換させ、いくつかのクローンを配列分析のために選択した。各候補クローンのクローニングされたoye2遺伝子の配列は「サーモシークエンスIIダイターミネーターサイクルシークエンシングキット(Thermo Sequence II dye terminator cycle sequencing kit)」(Amersham Bioscience/ Buckinghamshire、England)および自動配列分析機(ABI prism 377)を使用することにより決定した。配列分析のために使用したプライマーは下記のとおりである：
2005517448.tif 000005
【００３２】
サッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 204508)の既知のoye2配列と完全に等しい配列を示すクローンの内の1つをさらなる実験のために選択した。oye3遺伝子に対し、第1のPCR反応を下記のプライマーを用いて実施した：
2005517448.tif 000006
【００３３】
この反応により、oye3遺伝子(1250bp)を含むDNA断片を増幅した。第2のPCR反応は下記のプライマーを用いて実施した：
2005517448.tif 000007
【００３４】
この反応により、ちょうどoye3遺伝子のORF(1200bp)を含むDNA断片を増幅した。この増幅oye3遺伝子をMfeIおよびPstIで処理し、前もってEcoRIおよびPstIで消化したベクターであるpKK223-3(Amercham Bioscience/ Buckinghamshire、England)にライゲーションしてプラスミドpKK223-3/OYE2を構築した。大腸菌DH5αをライゲーション混合物により形質転換させ、いくつかのクローンを配列分析のために選択した。各候補クローンのクローニングされたoye3遺伝子の配列は「サーモシークエンスIIダイターミネーターサイクルシークエンシングキット」(Amersham Bioscience/ Buckinghamshire、England)および自動配列分析機(ABI prism 377)を使用することにより決定した。配列分析のために使用したプライマーは下記である：
2005517448.tif 000008
【００３５】
サッカロミセス・セレビシエS288C(ATCC 204508)の既知のoye3配列と完全に等しい配列を示すクローンの内の1つをさらなる実験のために選択した。
【００３６】
実施例2．サッカロミセス・セレビシエのoye2遺伝子またはoye3遺伝子を有する大腸菌株の無細胞抽出物を用いたレボジオンの産生
実施例1において構築し、それぞれoye2またはoye3の完全なDNA配列を含むプラスミドpKK223-3/OYE2およびpKK223-3/OYE3を大腸菌JM109に導入し、組換え菌株JM109[pKK223-3/OYE2]およびJM109[pKK223-3/OYE3]を得た。
【００３７】
菌株JM109[pKK223-3]もまた対照として調製した。これらの菌株それぞれを、0.05mg/mlのアンピシリンおよび2%(w/v)のカザミノ酸(Difco Laboratories, U.S.A.)を含むM9最小培地(2Lのサカグチフラスコ中、2×500ml)中に接種し、37℃で培養した。610nmでの吸光度が0.4に達した時にIPTG(イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド)を培地に加えて濃度を0.01mMにし、培養をさらに8〜10時間続けた。細菌細胞を遠心分離により収集した。約10gの湿細胞(wet cell)が1リットルのブロスから得られた。細胞の画分(0.7g)を、40mMのTris-HCl(pH8.0)、10mMのMgCl2、10mMのジチオスレイトール(DTT)、200mMのKCl、および1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド(PMSF)からなる1.4mlの緩衝液中に再懸濁し、細胞を15分間超音波発振器にかけて破壊した。遠心分離後、得られた上清を、下記のようにレボジオン産生のための無細胞抽出物として使用した。2mgのタンパク質を含む、JM109[pKK223-3/OYE2]、JM109[pKK223-3/OYE3]、またはJM109[pKK223-3]の細胞から得られた各無細胞抽出物を、25mMのTris-HCl(pH8.0)、66mMのNADHまたは55mMのNADPH、および13mMのケトイソホロンからなる1mlの反応混合物において使用した。反応は25℃で30分間行った。反応混合物を1mlのエチルアセテートにより抽出し、レボジオンをエチルアセテート層中に回収した。抽出物はガスクロマトグラフィー[カラム：ULBON HR-20M(Shinwa、Japan) 0.25mmφ×30m、カラム温度：160℃(一定)、インジェクター温度：250℃、キャリアガス：He(約1ml/分)]により分析した。結果は表1に示す。
【００３８】
【表１】
2005517448.tif 000009
【００３９】
JM109[pKK223-3/OYE2]の無細胞抽出物とNADH再利用システムとの組み合わせを使用するもう1つの実験において、レボジオンの収率は95%に達した。この場合、30mgのタンパク質を含むJM109[pKK223-3/OYE2]の無細胞抽出物を、250mMのTris-HCl(pH8.0)、0.31mMのNAD+、220mMのD-グルコース、12.5ユニット/mlのグルコース脱水素酵素、および65mMのケトイソホロンからなる25mlの反応混合物中において使用した。反応は室温で90分間行った。反応混合物のpHは、7%のアンモニウム溶液を用いて7.0よりも高くなるよう制御した。結果として、9.5g/lのレボジオン(使用したケトイソホロンの95%を変換)が産生された。産物の光学純度は、キラルキャピラリーカラムBGB-176(BGB Analytik AG、Switzerland)を使用するガスクロマトグラフィーにより、94.6%(鏡像体過剰率(enantiomeric excess)；e.e.)と解析された。
【００４０】
実施例3．サッカロミセス・セレビシエのoye遺伝子を有する大腸菌株細胞を用いたレボジオンの産生
実施例2で得られたJM109[pKK223-3/OYE2]およびJM109[pKK223-3]の各菌株を、0.05mg/mlのアンピシリンおよび2%(w/v)のカザミノ酸(Difco Laboratories、U.S.A.)を含むM9最小培地(チューブ中5ml)へ接種して37℃で培養した。610nmでの吸光度が0.4に達した時にIPTGを培地に加えて濃度を0.01mMにし、培養をさらに8〜10時間続けた。細菌細胞を遠心分離により収集し、100mMのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)2ml中に再懸濁した。この懸濁液を2つに分け(各1ml)、反応を、33mM(最終濃度。本明細書では以降f.c.と略記する)のケトイソホロンおよび280mM(f.c.)のD-グルコース(0.37mM(f.c.)のNAD+を含むかまたは含まない)、15ユニット/ml(f.c.)のグルコース脱水素酵素を加えることにより開始させた。反応は30℃で終夜行った。反応混合物をエチルアセテートで抽出し、レボジオンをエチルアセテート層中に回収した。抽出物は、実施例1記載のようにガスクロマトグラフィーによって分析した。結果は表2に示す。
【００４１】
【表２】
2005517448.tif 000010
【配列表】
2005517448000001.app
【国際調査報告】
2005517448.tif 000011
2005517448.tif 000012
2005517448.tif 000013
2005517448.tif 000014