(57)【要約】試料中のタンパク質をはじめとする生体物質および生体異物を分析する方法および装置。標本を調製し、この標本には、エネルギー吸収性マトリックスを含有させることができる。標本にレーザービームを照射して、標本からタンパク質を放出させる。放出されたタンパク質の原子質量を、ある原子質量の範囲について測定する。原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、それらの特定のタンパク質を空間配置の関数として識別する。タンパク質を分析することにより、試料中の疾患をモニタリングし、分類することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタンパク質を分析する方法であって、
（a）エネルギー吸収性マトリックスを含む標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、かつ、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別する
過程を含む方法。
【請求項２】
標本が腫瘍関連組織を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍関連組織が肺組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍関連組織が乳房組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍関連組織が直腸組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項９】
標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
標本を作製する過程が、レーザー捕捉顕微解剖によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
目的とする原子質量窓を分析する過程が、
原子質量窓内のタンパク質の質量を、第一スポットと第二スポットとの直線距離の関数として画像的に描出する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質の質量を画像として描出する過程が、三次元のプロットを描出する過程を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
過程（b）と（c）を、標本上でX、Yプロット内に配置された多数のレーザースポットについて繰り返し、かつ
原子質量窓内のタンパク質の原子質量を、標本上でX、Yプロット内に配置された複数のレーザースポットの関数として画像的に描出する過程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
レーザービームで標本を照射する前に、標本を乾燥させる過程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
第一レーザースポットから得られた目的とする原子質量窓内のタンパク質を、レーザービームで第二レーザースポットを照射している間に分析する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
レーザースポットと、その次のレーザースポットとの間の直線移動距離が、各レーザースポットの幅の2倍未満である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
標本が血液から単離されたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
標本が血漿から単離されたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
標本が乳房生検標本を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
標本が走査検定用チップをさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
標本が組織を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
組織が脳組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
組織が前立腺組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
組織が結腸組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２６】
組織が乳房組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】
組織が肺組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２８】
組織が直腸組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２９】
標本を作製する過程が、細胞分画によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
細胞分画が、細胞選別を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
細胞選別が、フローサイトメトリーを含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
標本を作製する過程が、レーザー捕捉顕微解剖またはその他の細胞単離法によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
疾患を分類する方法であって、
（a）エネルギー吸収性マトリックスを含む罹患標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、かつ
（i）識別された特定のタンパク質を、1種また複数の疾患と相関させて、罹患標本を分類する
過程を含む方法。
【請求項３４】
罹患標本が腫瘍関連組織を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３８】
罹患標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３９】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項４０】
標本の経時変化を経時的にモニタリングする方法であって、
（a）まずエネルギー吸収性マトリックスを含む罹患標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、
（i）（a）から（h）までの過程を2回目として繰り返し、かつ
（j）1回目に識別された特定のタンパク質を、2回目に識別された特定のタンパク質と比較して、標本の経時変化を経時的にモニタリングする過程を含む方法。
【請求項４１】
1回目または2回目に識別された特定のタンパク質を、1種また複数の疾患と相関させる過程をさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
1種また複数の疾患を治療する過程をさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
標本が腫瘍関連組織を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４７】
腫瘍関連組織が肺組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍関連組織が乳房組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍関連組織が直腸組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項５０】
標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項５１】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項５２】
タンパク質含有試料を分析する装置であって、
レーザービームで、標本上の複数のレーザースポットを逐次照射して、各レーザースポットから試料タンパク質を逐次放出させるレーザー源と、
標本を、レーザービームに対して、移動前および移動後のレーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ逐次移動させる移動機構と、
放出された試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定する質量分析器と、
質量分析器から、原子質量についてのデータを受け取るコンピュータと、
目的とする原子質量窓内の原子質量を、標本上の個々のレーザースポットの関数として描出するディスプレーと、
原子質量窓内の原子質量を、1種また複数の特定のタンパク質と相関させる手段と
を備えている装置。
【請求項５３】
標本上のレーザースポットの寸法を選択的に形成して確定するレーザーマスクをさらに備えている、請求項52記載の装置。
【請求項５４】
光学系をさらに備えている、請求項53記載の装置。
【請求項５５】
目的とする原子質量窓内の原子質量を、標本上でX、Yプロット内に配置された複数のレーザースポットの関数として画像的に描出する、請求項52記載の装置。
【請求項５６】
試料を分析する方法であって、
（a）エネルギー吸収性マトリックスを含む標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質を決定し、かつ、
（h）決定された特定のタンパク質を、空間配置の関数としてマッピングする
過程を含む方法。
【請求項５７】
試料を分析する方法であって、
（a）標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第一試料を放出させ、
（c）放出された第一試料の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第二試料を放出させ、
（f）放出された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第二試料の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を決定し、かつ、
（h）決定された特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を、空間配置の関数としてマッピングする
過程を含む方法。
【請求項５８】
罹患標本が、エネルギー吸収性マトリックスを含むものである、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
標本の経時変化を経時的にモニタリングする方法であって
（a）標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第一試料を放出させ、
（c）放出された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第一試料の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第二試料を放出させ、
（f）放出された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第二試料の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の空間配置を決定し、かつ、
（h）特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を、空間配置の関数として識別し、
（i）（a）から（h）までの過程を繰り返し、かつ
（j）1回目に識別された特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を、その後の回に識別された特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物と比較して、標本の経時変化を経時的にモニタリングする過程を含む方法。
【請求項６０】
識別された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を識別された試料から放出されたタンパク質と相関させる過程をさらに含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
疾患を分類する方法であって、
（a）罹患標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、かつ
（i）識別された特定のタンパク質を、1種また複数の疾患と相関させて、罹患標本を分類する
過程を含む方法。
【請求項６２】
罹患標本が、エネルギー吸収性マトリックスを含むものである、請求項61に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、米国特許仮出願第60/329,719号（2001年10月15日出願）および米国特許出願第10/178,067号（2002年6月21日出願）に対して優先権を主張するものであり、ここに言及することをもって、本明細書にこれらの出願を参照として組み込むものである。米国政府は、NIHからの助成金第GM58008号にもとづいて、本発明に関して権利を有しうる。
【０００２】
1．  発明の分野
本発明は、一般的には、医用画像化、分析、モニタリング、および診断の分野にかかわるものである。より詳細には、本発明は、試料中のタンパク質を分析する装置および方法を提供する。さらに詳細には、本発明は、質量分析による病理組織の直接的なプロファイリングに使用することができ、さらには、疾患の分類、進行、および治療について評価する際に使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
2．  関連技術の説明
毎年、約150万人のアメリカ人が、癌と診断されており、残念なことに、毎年、約500,000人が、この疾患で死亡している。癌は、人々を各種の異なったかたちで罹患させる。癌患者の約11%が結腸直腸癌と診断され、15%が前立腺癌と診断され、20%が肺癌と診断され、15%が乳癌と診断され、2%が脳腫瘍と診断される。したがって、腫瘍が増殖中の領域で、特定の腫瘍マーカーを有効なかたちで識別できれば、こうした腫瘍や、一般的に他の各種の多くの疾患を診断、モニタリング、分析、治療するうえで有益な一歩となる。
【０００４】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI MS）は、感度が高く、使用が簡単で、各種の試料を分析するうえで有用なオフライン法となる適応度の高い分析技術である。MALDI MSを使用した静的サンプリングシステムは、複合生理食塩水中に含まれるペプチドの分析に関してアトモルレベルの感度を示すように、極めて高い感度を示すものである。さらに、100%水溶性の試料の分析に際しては、マトリックスで予めコーティングしたセルロースの標的が使用されており、この場合には、さらに有機溶媒で処理する必要がない。
【０００５】
細胞全体中の特定のペプチドの分析にMALDIを使用することは、幾つかの報告に記載されている。また、軟体類であるリムネア・スタグナリス（Lymnaea stagnalis、モノアラガイ属の種）の単一神経細胞で、いくつかの神経ペプチドの直接分析を記載している報告もある。こうした分析では、単離したニューロンを破砕し、少量のマトリックスと混合することにより、分析を行った。神経ペプチドの前駆体ペプチドからの生成に関与している代謝プロセスのいくつかを解明する際にMALDI MSが使用可能である点についても示されている。また、アプリプシア・カリフォルニカ（Aplypsia californica）の単一神経細胞の幾つかの特定の神経ペプチドについての分析も行われており、この分析では、過剰な塩をマトリックス溶液ですすぐことによって除去する過程を含む手順が使用されている。
【０００６】
生体組織や有機ポリマーをはじめとする試料の表面での元素の空間配置を分析する際に、二次イオン質量分析（SIMS）を使用することについては、相当量の研究報告がある。また、最近では、生体試料中の有機化合物や代謝産物にSIMS法を適用する試みも行われている。ブタ脳組織の標本に塩化コリンおよび塩化アセチルコリンを沈殿させた試料から、二次イオン質量スペクトルを生成させる際の条件が、少なくとも一つの報告に記載されている。この試料には、グリセロールの塊状クラスターの一次イオンビームが照射され、空間配置されたSIMSスペクトルから生成した画像が得られ、この画像は、スパイクを付された分析対象物の種類および位置を反映していた。
【０００７】
米国特許第5,808,300号には、MALDI MSを用いて生体試料を画像化する方法および装置が記載されている。この技術は、試料の画像を1つまたは複数のm/z 図として生成し、もともとの生体試料のXY座標上に特定の分子の濃度をマッピングする際に使用することができる。生体試料の分析は、直接行うことも、試料のインプリントに用いて行うこともできる。分析で得られた画像は、選ばれたイオンについての画像として個々のm/z値として、また、積算したイオンの画像として、また、全体的なイオンの画像として表示することができる。この画像化処理は、物理的トラックまたは、他のX, Y 堆積方法を用いた他の分離技術に使用することもできる。米国特許第5,808,300号は、参照として本明細書に組み入れられるものである。
【０００８】
米国特許第5,272,338号には、液体金属イオン源を使用して試料を質量分析計内でイオン化し、その後、レーザービームを使用して、射出された分子を照射し、共鳴的にイオン化する機器の具体的なセットアップが記載されている。この方法では、一般に、SIMS/クロスビーム型レーザーイオン化と称される技術が用いられている。米国特許第55,272,338号は、参照として本明細書に組み入れられるものである。
【０００９】
米国特許第5,372,719号および第5,453,199号には、試料をその表面に曝露させると、試料の化学画像が表面に堆積されるような化学的に活性な表面の製造技術が開示されている。開示された方法では、吸収剤による分子の分離を行っている。米国特許第5,372,719号および第5,453,199号は、参照として本明細書に組み入れられるものである。
【００１０】
米国特許第5,607,859号には、反対に帯電した分子同士の相互作用によって高度にポリイオン的な分析対象物を質量分析で特定する方法が記載されており、この米国特許第5,607,859号は、参照として本明細書に組み入れられるものである。
【００１１】
米国特許第5,569,915号には、気相で分子を断片化する質量分析装置が開示されており、 米国特許第5,569,915号は、参照として本明細書に組み入れられるものである。
【００１２】
米国特許第5,241,569号には、放射標識した試料から出たγ線とβ電子を検出する中性子活性化分析が記載されている。米国特許第5,241,569号は、参照として本明細書に組み入れられるものである。この技術は、試料中の元素の位置を特定する際に使用することができる。
【００１３】
以上に言及した技術は、ある種の一般的分析を行うにあたって少なくともある程度の有用性を示すものの、さまざまな欠点も存在している。たとえば、現在臨床検査施設で迅速な判定を行う際に使用されている技術では、凍結切片の分析が、光学顕微鏡を使用して行われることが多い。しかし、こうした技術は、往々にして、非特異的で不正確である。さらに重要な点としては、従来技術では、MALDI MSの持つ、特定の原子質量を有していたり、選択したある原子質量窓内であったりするようなある量の目的とする分子を分析したり、ある量の目的とする分子を供試試料上の位置の関数として効果的に描出したりする能力を有効に利用する手法をとりいれていない点が挙げられる。さらに、従来技術では、MALDI MS技術を使用することによって、臨床試料中のタンパク質を効果的に分析するには至っていない。さらにまた、従来技術では、MALDI MS技術を使用することによって、病理組織の直接的なプロファイリングを行い、ひいては、疾患の分類、発症、治療を評価する際に用いることができない。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
組織中のタンパク質をはじめとする生体物質の分子レベルでの分析および画像化は、医療分野での画像化、モニタリング、分析、診断、疾患の分類、各種障害の治療において重要な位置を占めている。本明細書で使用する場合には、「生体物質」は広義に解釈されるものとし、たとえば、核酸、脂質、炭水化物をはじめとする「生化学（Biochemistry）」（Stryerら, 2002）で扱われているような任意の分子を包含しうるものである。すなわち、分子の分析および画像化は、正常組織に比べて腫瘍でより多く発現されるような特定のタンパク質の所在を検出する戦略において、不可欠な構成要素として使用することができる。同様に、こうした分子の分析および画像化は、正常組織に比べて腫瘍での発現が少ないような特定のタンパク質の所在を検出する際にも使用することができる。本発明で開示する技術は数多くの目的のうちの一つは、脳腫瘍、特にヒトグリア芽細胞腫でのペプチドおよびタンパク質の分子レベルでの分析および画像化を行うことである。
【００１５】
一般的には、本発明の開示内容は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（MALDI MS）および熱スプレーイオン化質量分析（ESI MS）といった質量分析技術を用いて、組織中のタンパク質をはじめとする生体物質の画像化および検出を含む。本発明の開示内容の特定の側面では、組織切片中に存在する生体分子の直接的なマッピングおよび画像化を行うにあたって、質量分析（MS）における分子に対する特異性や感度を利用する。こうした技術は、MALDI MSを使用することによって開発されたものであり、組織切片のような試料の表面または表面の近傍に存在するペプチドやタンパク質を分析する際に使用しうるものである。画像化MSは、細胞での分子の複雑な状態を解明し、理解するという難題に取り組むにあたって、新たなツールを提供するものである。画像化MSは、生体組織内の分子の空間配置を研究するにあたって、免疫化学や蛍光顕微鏡技術のような技術を一体化する。
【００１６】
本発明は、一局面では、試料中のタンパク質を分析する方法である。エネルギー吸収性マトリックスを含む標本を作製し、この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから第一試料タンパク質を放出させる。放出された第一試料タンパク質の原子質量を、ある範囲の原子質量に関して測定する。標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と機能的に相関した所定の直線距離だけ移動させる。標本に再度レーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、第二試料タンパク質を放出させる。放出された第二試料タンパク質の原子質量を、ある範囲の原子質量に関して測定する。その原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質を決定する。決定された特定のタンパク質は、空間配置の関数としてマッピングすることができる。
【００１７】
本発明は、別の局面では、標本は、腫瘍関連組織を含むものとすることができ、腫瘍関連組織は、脳組織を含むものとすることも、前立腺組織を含むものとすることも、結腸組織を含むものとすることもできる。標本を作製する過程は、新鮮な切片または凍結切片を作製する過程を含むものとすることができ、この過程は、レーザー捕捉顕微解剖をはじめとする細胞単離技術によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程も含むものとすることができる。本明細書で使用する場合には「別々の層」は、ある腫瘍の別々の二次元切片のことを称するものである。目的とする原子質量窓を分析する過程は、目的とする原子質量窓内のタンパク質の質量を、第一スポットと第二スポットとの直線距離の関数として画像的に描出する過程を含むものとすることができる。標本は、レーザービームで標本を照射する前に、乾燥させておくことができる。第一レーザースポットから得られた目的とする原子質量窓内のタンパク質は、レーザービームが第二レーザースポットを照射している間に分析することができる。レーザースポットと、その次のレーザースポットとの間の直線移動距離は、各レーザースポットの幅の2倍未満とすることができる。特定のタンパク質を識別する過程は、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含むものとすることができる。
【００１８】
本発明は、別の局面では、疾患を分類する方法に関するものである。この方法では、エネルギー吸収性マトリックスを含む罹患標本を作製し、この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから第一試料タンパク質を放出させる。放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ移動させる。標本にレーザービームを再び照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから第二試料タンパク質を放出させる。放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定する。特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、識別された特定のタンパク質を、1種また複数の疾患と相関させて、罹患標本を分類する。
【００１９】
本発明は、別の局面では、標本の経時変化を経時的にモニタリングする方法である。まずエネルギー吸収性マトリックスを含む罹患標本を作製し、この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから第一試料タンパク質を放出させる。放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ移動させる。この標本にレーザービームを再び照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから第二試料タンパク質を放出させる。放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定する。特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別する。かつ、以上のような過程を繰り返し、1回目に識別された特定のタンパク質、またはより特定すると試料疾患を、2回目に識別された特定のタンパク質と比較して、標本の経時変化の経時的なモニタリングを行う。
【００２０】
この方法は、別の局面では、1回目または2回目に識別された特定のタンパク質をはじめとする生体物質を、1種また複数の疾患と相関させる過程を含むものとすることができる。この方法は、こうした1種また複数の疾患を治療する過程を含むものとすることもできる。
【００２１】
本発明は、別の局面では、タンパク質含有試料を分析する装置に関するものである。この装置は、レーザー源と、移動機構と、質量分析器と、コンピュータと、ディスプレーと、原子質量を相関させる手段とを備えている。レーザー源は、レーザービームで、標本上の複数のレーザースポットを逐次照射して、各レーザースポットから試料タンパク質を逐次放出させる。移動機構は、標本を、レーザービームに対して、移動前および移動後のレーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ逐次移動させるようになっている。質量分析器は、放出された試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定するようになっている。コンピュータは、質量分析器から、原子質量についてのデータを受け取るようになっている。ディスプレーは、目的とする原子質量窓内の原子質量を、標本上の個々のレーザースポットの関数として描出するようになっている。原子質量を相関させる手段は、原子質量を、1種また複数の特定のタンパク質と相関させる相関作業を行う手段を備えている。この機能を実施する手段は、本明細書および、本明細書に組み入れられる参照文献に記載されており、本発明に記載した相関過程を実施するためのデータベースおよびコンピュータ化された方法およびソフトウェアをはじめとする各種の多岐にわたる機構を備えたものとすることができる。
【００２２】
例示的態様の説明
本明細書で開示する技術は、当技術分野に欠けている点を、試料中のタンパク質を効果的に分析する方法を提供することによって克服するものである。こうした技術は、無数の疾患の画像化、モニタリング、診断、治療を行ううえで、広範な応用範囲を有している。態様によっては、診断および／または治療の措置過程で、特定の腫瘍マーカーの分析、画像化、識別、モニタリングを行うことができる。
【００２３】
図7は、本発明に開示したある方法の具体例を示すものである。段階20では、試料を生成する。以下で説明するように、この試料は、エネルギー吸収性マトリックスを含有するものとすることも、しないものとすることもできる。一態様では、標本として、直接プロファイリングが可能な新鮮な凍結切片を使用することができる。こうした標本では、当技術分野で参照される従来の方法の一部で必要とされていたような面倒な試料調製過程を必要とせずに調製を行うことができる。標本は、個々の細胞とすることも細胞群とすることもでき、レーザー捕捉顕微解剖で単離することができる。標本は、脳組織、前立腺組織、結腸組織といった組織を含むものとすることができるが、これらに限定されるものではなく、動物またはヒトの組織とすることがき、腫瘍関連組織とすることができる。標本が腫瘍関連組織である場合には、本明細書に記載する技術を、外科切除した腫瘍の外縁部を術中に評価する際に使用することができる。一態様では、標本は、癌組織を含むものとすることができる。分析を行うことができる癌組織の例としては、睾丸、前立腺、肺、乳房、結腸、および脳の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の態様では、組織は、正常なものとすることができる。組織標本は、外科的手段を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって得ることができる。組織を外科的に得る際には、組織が無傷であり、組織の位置が除去を行う前にわかっていることが有利である。組織は、任意の培養液中で生育させた組織から得ることもでき、また、得られた組織は、その後の分析に備えて、当技術分野で公知の方法により任意の期間にわたって保存することができる。本発明の開示内容に照らして、当業者であれば、他の種類の標本や組織であっても、本明細書に記載した技術に、わずかな変更を加えるだけで分析が可能であることが理解できるはずである。
【００２４】
試料は、エネルギー吸収性マトリックスとして、UVや他の波長のエネルギーを吸収する物質を含有することができる。こうしたマトリックスは、エネルギー吸収に関して比較的高い消衰係数を有する有機化合物または無機化合物を含むことができ、試料に薄層として適用したり、それ以外では試料に含ませたりすることができる。エネルギー吸収性マトリックスの例としては、2,5-ジヒドロキシ安息香酸およびα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。エネルギー吸収性マトリックスは、熱スプレー、空気スプレー、スピンコーティング、浸漬塗布をはじめとする任意の適当な方法を用いて適用することができる。
【００２５】
試料は、エネルギー吸収性マトリックスをさらに含有することなく、組織を含有することもできる。この場合には、エネルギーは、試料によってのみ吸収され、エネルギーは、外来のエネルギー吸収性マトリックスに最初に入射することとはならない。試料の調製は、マトリックスを適用する過程をさらに要することがないので、より簡素である。
【００２６】
段階22では、標本をレーザーで照射する。この段階の前に、標本を乾燥させておくこともできる。段階22で照射するするレーザーは、標本上の所定の第一スポットを照射するよう配置されており、この照射によって、タンパク質が標本から放出される。レーザースポットの寸法と位置は、当技術分野で公知のとおり、変化させることが可能である。レーザーの種類とその出力設定も、当技術分野で公知のとおり、調整が可能である。
【００２７】
段階24では、放出されたタンパク質の原子質量を、原子質量の範囲について測定する。この段階は、当技術分野の一般的な分光法の知識と計測の知識にしたがって実施することができる。
【００２８】
段階26では、標本をレーザービームに対して移動させる。この平行移動は、所定の距離を行うものとすることができ、この距離は、レーザースポットの寸法と機能的に関連したものとして、効果的な走査パターンを達成することができる。当技術分野で公知の通り、平行移動距量を変化させることによって走査分解能に影響を及ぼすことができる。標本を平行移動させる際に使用する機構は、市販されている多数の平行移動ステージの任意のものとすることができる。平行移動移動の種類は、用途に応じて一次元、二次元、または三次元とすることができる。一態様では、あるレーザースポットとその次のレーザースポットの間の移動距離は、それらの各レーザースポットの幅の2倍未満とすることができる。
【００２９】
段階28および30では、標本の移動後に、追加のデータを取得する。このデータ取得については、段階22および24に関して上述したとおりである。図示するように、段階26〜30は、試料の効果的な走査を行うために、必要に応じて繰り返すことができる。一態様では、試料の移動とデータの取得を数回繰り返して、X、Y二次元パターンを生成することができる。試料の連続切片を分析することによって、三次元のデータセットを得ることができる。当業者であれば理解できるように、データ分析段階、たとえば、段階30、32、および34は、追加の走査を行っている間に行うことができる。すなわち、データの処理は、試料の走査を行うのと同時に実施することができる。
【００３０】
段階32では、目的とする区間は、放出されたタンパク質（レーザービームによって試料から放出されたタンパク質）の質量が分布する範囲内で設定する。この目的とする区間は、放出されたタンパク質の質量が分布する範囲の全体を含むものとすることも、その任意の一部とすることもできる。目的とする区間内で、放出されたタンパク質の質量を分析して、放出されたタンパク質の空間配置を決定することができる。すなわち、放出されたタンパク質の位置は、目的とする区間内での測定質量にかんがみて、それらの位置（たとえば、1個または複数のレーザースポットの位置）と相関させることができる。一態様では、この段階において、目的とする原子質量窓内のタンパク質の質量を、第一レーザースポットと第二レーザースポットの間の（および／または、あるレーザースポットとその次のレーザースポットの間の）直線距離の関数として画像として描出する。当業者であれば、このデータ分析過程に、当技術分野で公知の他のマッピング技術も適用しうることが理解できるはずである。
【００３１】
段階34では、段階32で分析したタンパク質を、たとえば、質量数をはじめとする区別される特徴に照らして識別することができる。この特定の段階では、当技術分野で公知の1つまたは複数の技術を用いることができる。一態様では、段階34を、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびデータベースの検索によって行うことができる。
【００３２】
段階37では、正常組織または試料のデータとの比較を行ったり、および／または別の種類のデータとの比較を行ったりすることができる。たとえば、正常組織との比較を行ったり、正常組織に関連するデータとの比較を行ったりすることができる。このようにして、たとえば、段階39に示す通り、疾患の進行および治療の状態を評価することができる。
【００３３】
図7のような枠組みを機能させることにより、疾患の診断、モニタリング、治療をはじめとする数多くの医療実践に関与することが可能となる。なお、医療実践は、これらに限定されるものではない。図8に示すように、特定のタンパク質が識別されると、識別されたタンパク質を1種また複数疾患と関連づけて、標本の疾患を分類（または識別）することができる。たとえば、マーカータンパク質が識別された場合には（段階34）、これらのタンパク質を、対応する疾患と関連づけることができる。タンパク質の検定は、図7の段階37および39と類似した段階36で行っているように、疾患の進行と治療の状態を決定するために行うこともできる。当技術分野では公知のように、1種また複数のマーカーが、1種また複数の疾患を示す場合もある。さらには、標本または患者の疾患および一般的状態を、特定のタンパク質および／または疾患を長期間に渡って識別することによってモニタリングすることも可能である。たとえば、図7の各段階を、まず1回目に実施した後、2回目を実施することもできる。この場合、分析結果を比較することによって、疾患の進行と位置を追跡できる。たとえば、2回目には、特定のマーカーの存在が特定の領域で減少している可能性もあり、その場合には、対応する疾患の治療が効果的に進んでいることが示唆される可能性がある。1回目と2回目のデータ分析の間隔は、当業者であればわかるように、必要に応じて変化させることができる。こうした例として、本明細書で開示する一態様では、図7の技術を使用して、化学療法をモニタリング、および治療スキームの見直しが行われることが含まれる。患者の組織のそのときどきの状態を経時的にモニタリングして、治療の期間を通じて治療計画の有効性を評価することができ、それによって医師は、治療計画を調整して、良好な結果がえられるよう最適化することができる。
【００３４】
図9は、図7〜8に示し、以上に記載したようなステップを実施するための装置の図である。図示するように、この装置は、レーザー源52、平行移動ステージ54、質量分析装置56、コンピュータ58を備えている。レーザー源52は、標本を、複数のレーザースポットで順次制御されたかたちで照射して、標本からタンパク質を順次放出させることができるように構成されている。平行移動ステージ54は、一般に、標本を移動させる任意の移動機構とすることができ、この平行移動ステージは、標本をレーザービームに対して所定の距離だけ移動する。この距離を、レーザースポットの寸法と機能的に相関させて、解像度を制御することができる。質量分析装置56は、標本から放出されたタンパク質の原子質量を、ある範囲の原子質量について測定する。コンピュータ58は、質量分析装置56から原子質量についてのデータを受取り、目的とする原子質量窓内の原子質量を、標本上の個々のレーザースポットの関数として描出するディスプレーを備えることができる。または、原子質量を描出するディスプレーは、コンピュータ56とは別に設置することもできる。態様によっては、コンピュータ56は、原子質量窓内の原子質量と、1種また複数の特定のタンパク質とを、当技術分野で公知のソフトウェアを使用して関連づける際にも使用することができる。または、この関連づけの作業は、上記とは別のコンピュータ、データベース、ネットワーク、またはマニュアル方法を使用して実施することもできる。
【００３５】
本明細書に記載した技術は、癌をはじめとする疾患をモニタリングし、分類する際にも使用することができ、たとえば、癌の診断および予後の予測、ならびに癌の治療方法についての分析を行う際に使用することができる。評価を行う癌としては、脳、前立腺、結腸、乳房、肺、卵巣、脾臓、直腸、および腎臓の癌を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
一態様では、本発明の方法によって乳癌をモニタリングし、分類することができる。現在、乳房の生検標本は、LORADとして公知のチップ技術を使用して、調べることが行われているが（D. Klemら、1999）、LORADを使用して分析を行う生検試料を、本明細書に開示した技術と組み合わせて分析したり、別途分析したりすることもできる。
【００３７】
本明細書で使用する場合には、「タンパク質」という用語は広義の意味で使用するものであり、ペプチドとポリペプチドを包含するものとして定義する。
【００３８】
本明細書に記載した方法は、タンパク質だけでなく、治療薬を分析する際にも使用することができる。また、この方法は、タンパク質の変化を、治療の過程で使用した治療薬と相関させることによって、試料の経時変化をモニタリングする際にも使用することができる。すなわち、治療薬を標本中で調べて、疾患および治療をモニタリングし、分類することができる。こうした治療薬の1種また複数の例としては、DNA、化学療法剤、抗癌剤を挙げることができるが、治療薬は、これらに限定されるものではない。治療薬は、「Physician's Desk Reference」（たとえば、2002年版）、または当技術分野で公知の任意の他のソースに収載された任意の薬剤から選択することもできる。治療薬は、また、パクリタキセル、カンポテシン、エポチロン、ドセタキセル、エトプシド、ドキソルビシン、ダウノマイシン、ゲルダナマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキセート、シクロスポリン、エモジン、アンフォテリシンBなどを含有する1種また複数の薬剤とすることもできる。態様によっては、薬剤を、化学療法剤、抗生物質、抗ウイルス剤、抗炎症剤、および放射線増感剤からなる群より選択することもできる。
【００３９】
本明細書に記載した方法を使用して、治療薬の代謝産物を分析することもできる。こうした代謝産物は、たとえば、組織、血液、血漿、または尿から検出することができる。本明細書で使用する場合には、「代謝産物」という用語は、治療薬またや薬剤が体内で化学変化を生じることによって生成した化合物のことを称するものである。こうした薬剤の一例としては、モルヒネが挙げられ、モルヒネの場合、その効果は、主に、そのグルクロン酸抱合代謝産物の1種によって生じている。
【００４０】
本明細書で使用する場合には、「腫瘍関連組織」という表現は、異常であるか罹患しているかのいずれかであるような細胞を1種また複数含有する組織について称するものである。当技術分野では周知のように、腫瘍によっては、たとえば乳癌、卵巣癌、脾臓癌の場合のように、罹患組織中の全細胞が必ずしも異常なわけではないものもある。したがって、腫瘍関連組織は、細胞の一部のみが異常であるような組織を包含するものである。
【００４１】
態様によっては、標本には、非組織系の供試生体試料含むこともでき、たとえば、血液や尿といった試料を使用することも可能である。血液は、患者から採取して調製すればよい。全血を使用しても、試料が赤血球、白血球または血漿を含んでもよい。細胞は、生理食塩水で1回以上または複数回洗浄することができ、分析の前に細胞を溶解しておくこともできる。尿試料も、分析の前に調製することができる。非組織生体試料については、細胞は、エネルギー吸収性マトリックスを含むものとして調製することも、含まないものとして調製することもできる。
【００４２】
本明細書で使用する場合には、経時的に標本の「経時変化をモニタリングする（monitoring the development）」という表現は、標本を、経時的に、疾患の進行にともなうすべての変化についてモニタリングすることを称するものである。こうしたモニタリングには、疾患の進行および退行のモニタリングを含むことができる。また、罹患している可能性の高い標本について、疾患の発症についてモニタリングすること、病理組織の除去後に、疾患が再発するかどうかについて標本をモニタリングすること、高リスク患者から得た標本を、疾患の発症以前にモニタリングすることも含まれるものである。
【００４３】
本明細書で使用する場合には、「電気ブロッティング」という用語は、タンパク質または他の生体試料をゲルから膜へと移す際に使用する当技術分野で公知の技術について称するものである。標本を転写にあたっては、エレクトロブロッティングでの代わりに、類似した技術ではあるものの電流は使用しない接触ブロッティングを使用することもできる。同様に、キャピラリー転写を使用することもできる。
【００４４】
本明細書で使用する場合には、「細胞分画」という用語は、細胞を分離または単離する幅広い一連の技術を称するものである。これらの技術は、通常、均質化（組織を破砕して、細胞成分を放出させる過程）、および遠心分離（密度、寸法、形状に応じて個々の成分を分離する過程）を含む2段階である。細胞分画は、個々の細胞または細胞群を単離することによって標本を精製する際に使用することができる。細胞分画は、フローサイトメトリーなど、当技術分野で公知の方法を使用することによって行うことができる。適当な技術の一つとしては、細胞選別が挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用する場合には、「光学系」という表現は、一般に放射線、たとえば光をレーザーから案内する際に使用される1つまたは複数のレンズまたは他の光学機器のことを称するものである。たとえば、光学系は、レーザービームの中心線を所望の位置に合わせしたり、レーザービームの焦点を所望の位置に合わせたりして、特定の直径および出力を得るために、および／または、好適なビーム特性を得るために使用することができる。レーザーマスクを用いて、供試標本上でのレーザースポットのサイズを選択的に形成したり画定したりすることもできる。こうしたマスクは、標本入射時にレーザービームが形状面でも寸法面でも十分に画定されたものとなるよう、ビームのうちの使用を意図していないビーム部分を遮断することができる。
【００４６】
本明細書で使用する場合には、冠詞「1つの（a）」または「1つの（an）」は、1つまたは複数であることを意味しうるものである。特許請求の範囲で「含む（comprising）」という語とともに使用した場合には、「1つの（a）」または「1つの（an）」という語は、1つまたは複数であることを意味するものである。
【００４７】
実施例
以下の実施例は、開示内容についての具体的な態様を示すために挙げられるものであり、本発明は、これらの実施例に限定されるわけではない。当業者であれば、以下の実施例に開示された技術が、本発明の発明者によって、本発明を実施するうえでうまく機能することが見いだされた技術であり、したがって、本発明を実施する際の特定のモードであると考えうることを理解できるはずである。しかし、当業者であれば、本発明の開示内容にかんがみ、開示された具体的な態様には、多くの変更を加えることができ、その場合にも、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたはほぼ類似の結果を得ることができることを理解しうるはずである。そうした変更は、いずれも、本開示内容の範囲内に含まれるものである。
【００４８】
実施例1
一般的な方法
図1は、本明細書に開示した態様に適した方法を図示したものである。図1に示した方法は、MALDI質量分析によって組織の空間的な分析を行うために設計したものである。この態様では、凍結切片を金属プレート上にマウントし、紫外線吸収性マトリックスでコーティングし、質量分析計に入れる。パルス変調したUVレーザーによって、分析対象物が組織から脱着され、イオン化されるので、そのm/z値を、飛行時間分析装置などの機器を用いて測定する。組織をカバーするラスターと、いくつかのスポット（何千カ所単位のスポットである場合もある）でのピーク強度から、特定の分子量の値での質量分析画像を生成することができる。
【００４９】
分子の画像分析を行う際には、組織試料をいくつかのプロトコールを用いて調製することができ、すなわち、（a）新鮮な凍結切片、レーザー捕捉顕微解剖または他の細胞単離方法によって単離された個々の細胞または細胞群の直接的な分析、または（b）組織の膜ターゲット上での接触ブロッティングを用いて調製することができる。代表的な調製方法では、本発明者とその助手らは、組織の凍結切片をステンレス鋼製のターゲットプレートにマウントし、マトリックス （たとえば、シナピン酸）の溶液でコーティングし、乾燥し、質量分析計（ボイジャーエリート（Voyager Elite）DE, アプライド・バイオシステムス（Applied Biosystems）、マサチューセッツ州フラミンガム（Framingham）を使用）に真空入り口から挿入した。装置の制御は、本発明者の研究室で作成した質量分析画像化ソフトウェアを使用して行ったが、本明細書で説明するような結果を得るうえでは、任意の市販ソフトウェアの多くが、本発明者が使用したソフトウェア同様、適当である。本発明者とその助手らは、一連のレーザースポット（直径25μm）を用いて、試料表面上のラスターから分子画像を作製した。レーザーの位置は固定し、試料プレートの方を、連続したスポットが形成されるよう再配置させた。各スポットとも、照射領域内に存在する分子に由来する質量スペクトルを生成した。代表例では、各質量スペクトルは、ファスト・トランジェント・レコーダPCボード（DP211、アクアイリス（Acqiris）、スイス、ジュネーブ）を使用することによって得られたレーザーショット50回の平均であった。レーザー周波数を20 Hzとしとしたところ、取得、コンピュータへのデータのダウンロード、データの処理、および試料ステージの再配置を含む1サイクルあたりの時間は、各データポイントあたり約2.5秒であった。代表的なデータアレイは、所望の画像解像度に応じて1,000〜30,000スポットのものであり、このデータアレイには、分子量の範囲が500 D〜80 kD超の各スポットで放出されたイオンの強度が含まれている。大半の組織切片では、200を超えるタンパク質およびペプチドのピークが、レーザーによってアブレーションされた各スポットについて得られた質量スペクトルに記録されていた。任意の所望の分子量の値について、試料の質量分析画像または分子量特異的なマップを作製することができた。一般的に、マップを個別に作製して、タンパク質の存在、分子量、位置を確認することが可能である。組織片上の単一のラスターから、それぞれ分子量の異なる何百もの画像マップを、画像化質量分析によって作製することが可能であった。
【００５０】
実施例2
哺乳動物の組織への適用
本発明者とその助手らは、画像化質量分析を使用して、マウスの脳から得た正常組織の切片とヒト脳腫瘍異種移植片の切片を調べた。これらの試料は、明確に定義された領域を含んでおり、その多くが、タンパク質とペプチドのサブセットを、独特の分布またはアレイで有していた。脳は線対称なので、タンパク質の局在化した分布と、調製組織切片の均質性とを、内部を確認することができた。金属プレート上に固定し、マトリックスでコーティングした正常なマウスの脳切片の光学画像を図2Aに示す。本発明者とその助手らは、スポット中心間の各方向での距離を100μmとして170 x 90個のスポットを得て、切片の走査を行った。82の異なる質量範囲で生じるイオンを記録し、ピーク面積を積分して、カラースケールを使用して相対的な値をプロットすることにより、画像を作製した。具体的な分子の画像については、分子ピークのいずれかの側の2つの質量電荷比（m/z）の単位によって区切られる区間について、データを取得した。タンパク質の信号の多くは、脳の全領域に共通であったが、シグナルの一部は、脳の所定の領域について高度に特異的であることが見出された。たとえば、m/zが8258 ± 1で検出されるタンパク質（図2B）は、大脳皮質と海馬の領域に存在しており、m/zが6716 ± 1で検出されるタンパク質（図2C）は、黒質と内側膝状核の領域に局在化しており、m/zが2564 ± 1で検出されるペプチドは、中脳に存在していた（図2D）。これらのイオンは、[M+H]+の種であり、化合物の分子量は、陽子の重量、通常は、測定されたm/z値から、1 m/z単位を差し引くことによって得ることができた。タンパク質の識別は、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびデータベースの検索によって実施することができる。
【００５１】
実施例3
分子画像化のための腫瘍関連組織の調製
腫瘍関連組織は、ヒトグリア芽細胞腫の細胞（D54）をヌードマウスの後肢に皮下移植することによって生成した。腫瘍が、直径約1 cmまで成長したところで、腫瘍をマウスから外科的に切除し、液体窒素を使用してただちに凍結させた。画像分析に際し、本発明者は、ミクロトームを使用して、腫瘍組織を、正常組織への付着点に対して直交する方向の厚さ12μmの切片に切断した。凍結切片は、質量分析による画像分析に先立って、上述のプロトコールにしたがって処理を行った。
【００５２】
質量分析による画像化の直後に作製した凍結ヒトグリア芽細胞腫切片の光学画像を、図3Aに示す。図3Aの向きは、腫瘍の活発に成長している領域が図の上側に、腫瘍の健康な組織への付着点が図の下側に来るような向きである。光学画像上の細線（網掛け）パターンは、走査中に、レーザーによる表面のアブレーションによって生成したものである。
【００５３】
実施例4
腫瘍切片の分子画像化
面積が8.5 mm x 8 mmの（中心間の距離が100μmの画像スポットを含む）ラスターから質量スペクトル像を作製した。走査の間に、本発明者とその助手らは、45の質量範囲の画像を記録し、さらなる分析に備えて質量スペクトルを保存した。腫瘍のそれぞれ異なった領域に存在する分子の3つの質量スペクトル画像を、図3B〜3Dに示す。この図では、白黒の対照を使用して、異なったイオンを示し、黒の飽和度が、相対強度の関数となっている。全体では、150種の異なるタンパク質が検出され、その多くが、組織のどの部分にも存在していた。選択された個々のタンパク質は、以下に記載するようにして識別した。3種の異なる質量スペクトルを、走査の間に、グリア芽細胞腫の異なる領域から取り出した（図4）。これらのスペクトルから、腫瘍の様々な部分において、タンパク質発現に差違があることが示される。
【００５４】
腫瘍の増殖しつつある領域は特に重要で、この領域では多くのタンパク質が、正常組織より高いレベルで発現していた。たとえば、分子量が4,964のタンパク質（図3D）は、腫瘍の外側の領域にのみ局在していた。他のタンパク質、たとえば、分子量が41,662のタンパク質（図3B）は、壊死した領域に局在していた。さらに、他のタンパク質は、分子量が11,639のタンパク質について示すように、壊死した中央部と増殖しつつある周縁部との間の虚血領域に局在化していた。
【００５５】
実施例5
マッピングしたタンパク質の識別
マッピングしたタンパク質を識別するために、ヒトグリア芽細胞腫の組織の適当な部分の抽出物を作製し、HPLCによって、タンパク質を分画した。この抽出物のUVクロマトグラムを図5に示す。
【００５６】
実施例6
目的とするタンパク質を含有している画分のオンライン質量分析
熱スプレーイオン化（ESI）質量分析（イオントラップ（Ion Trap）、フィニガン（Finnigan Company）、カリフォルニア州サンジョゼ（San Jose））を使用して、オンライン質量分析を行ったところ、目的とするタンパク質を含有する画分を局在化することができた。たとえば、分子量が4,964 のタンパク質の1種は、クロマトグラムで28.35分に溶出した。本発明者とその助手らは、この分画の試料をMALDIのターゲット・プレートにスポッティングして、トリプシンによるオン・ターゲット消化を行った。消化生成物を、MALDI MSによって分析し、その後、データベース検索を、スイスプロット（SwissProt）で、ソフトウェアとして「MoverZ」（プロテオメトリクス（ProteoMetrics）、ニューヨーク州ニューヨーク）を使用することにより実施した。ソフトしウェアとしては、別のものを使用しても、同等の結果を得ることができた。その結果、チモシン.4 （Tβ.4）が、消化生成物のデータとぴったり一致することが見いだされた。タンデム質量分析によって、アミノ末端ペプチドの配列を分析したところ、ヒトグリア芽細胞腫の異種移植片中のタンパク質がTβ.4であるという識別結果を確認した。
【００５７】
Tβ.4の発現が増加することは、各種の腫瘍で報告されている。腫瘍の増殖中の領域でのTβ.4の局在化は、Tβ.4のレベルが正常/良性組織より胚性/新生物組織で高いという以前の知見と一致する。この免疫調節性ペプチドについて公知の活性の一つは、細胞質のモノマーアクチンを隔絶する能力である。また、アクチンフィラメントは、抗癌剤によって誘導されたアポトーシスで、クランプ構造に変化することが示されており、このプロセスは、Tβ.4 濃度が低下した結果であると考えられている。
【００５８】
本発明者とその助手らは、他の腫瘍でもTβ.4の発現が増えることを観察した。たとえば、マウスの前立腺癌モデルの一部では、画像化質量分析を使用することによって、このタンパク質が高レベルで検出されている。
【００５９】
実施例7
熱スプレー四重極飛行時間型質量分析計（ESI QTOFMS）によるマウス前立腺腫瘍由来のTβ.4タンパク質の確認
Tβ.4であるとの識別結果を確認するために、本発明者とその助手らは、熱スプレー四重極飛行時間型質量分析計（ESI QTOFMS）（Q-Star、アプライドバイオシステムス（Applied Biosystems）/サイエックス（SCIEX）、カリフォルニア州フォスターシティ（Foster City））を使用して、トリプシン断片の一つから、断片イオンのスペクトル（MS/MS analysis）を生成した。前立腺癌を有するマウスから精製したTβ.4の同様の消化生成物から得たN末端トリプシンペプチドのMS/MSスペクトルを、図6に示す。断片イオンは、ペプチドの全配列をカバーするyおよびbイオンシリーズの部分を識別することによって符合させた。このスペクトルによって、前立腺癌のマウスモデルにTβ.4が存在していることが確認された。さらに、MS/MSスペクトルから、Tβ.4ペプチドのN末端にアセチル基が存在していることも確認された。分子量が11,639 ± 2のタンパク質（図3C）も、同様に、S100カルシウム結合性タンパク質A4（S100A4）であると同定され、分子量の測定値が41,659 ± 4のタンパク質は、細胞質のアクチンであることが同定された。
【００６０】
実施例8
組織の調製
凍結マウス脳から、12μmの切片を、ライカ（Leica）CM 3000クライオスタット上で-15℃にて数片切り出し、金でコーティングしたステンレス鋼のプレート上に直接載置した。この切片を、ただちに低温室（4℃）に移し、10μlのマトリックス（アセトニトリル/0.05% トリフルオロ酢酸（50:50）へのシナピン酸10 mg/ml溶液）を、ピペットで、組織に隣接した一直線上に滴下し、プラスチック製の小型へらを使用して、組織上に機械的に塗り拡げた。切片は、45分間の風乾の後、デシケータで2時間乾燥し、その後質量分析を行った。この適用技術を行った結果、組織表面上に有機マトリックスの結晶が形成され、しかも、試料分子の拡散が低減する。
【００６１】
実施例9
HPLCによる、グリア芽細胞腫の抽出とタンパク質の分画
グリア芽細胞腫の一部（82 mg）を、500μlの抽出用バッファー（0.25 Mショ糖、0.01 M Tris-HCl、および阻害剤の混合物（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルス（Roche Molecular Biochemicals）、スイス）に浸漬し、デュアル（Duall）ホモジナイザー使用して均質化し、3回遠心分離し（680 gで10分、10,000 gで10分、および55,000 gで1時間）、各回とも、可溶分画を新規なチューブに移した。最終画分（50μl）を、C4マイクロボアカラム（ヴァイダック（Vydac）、カリフォルニア州ヘスペリア（Hesperia））で分離し、試料を回収し、分離過程を、214 nmに設定したUV検出装置で記録した。溶媒Aを0.1%トリフルオロ酢酸とし、溶媒Bを95%アセトニトリル、4.9%の水、および0.1%のトリフルオロ酢酸とした。流量を200μl/分とし、5%Bで5分、その後60%Bまでは55分、その後100%Bまでは10分、最後に100%Bで5分の勾配を使用した。
【００６２】
実施例10
トリプシンによるターゲット上での消化
この過程では、試料（2μl）をターゲット上に載置し、乾燥してから、消化溶液（2μlの20nMウシトリプシン、配列決定用グレード（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルス（Roche Molecular Biochemicals））および50mM炭酸水素アンモニウムを加えた。プレートを37℃に30分間保ち、その間は、水を加えて容積を一定に保った。試料の乾燥後、α-シアノ-4-ヒドロキシ珪酸（シグマ（Sigma））のアセトニトリルと0.1%トリフルオロ酢酸（2μl）の50:50溶液への飽和溶液2μlを、MALDIマトリックスとして加えた。
【００６３】
本明細書で開示し、請求の範囲に記載した装置および方法は、いずれも、本発明の開示内容にかんがみて、過度の実験を行わなくても製造および実施することができる。以上では、本発明の技術を、特定の態様について記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神、範囲から逸脱することなく、改変を加えることが可能であることが明らかであると思われる。たとえば、当業者であれば理解できるように、本開示内容は、任意の波長で駆動される任意の種類のレーザーとともに使用することができる。たとえば、使用波長としては、約10〜約106オングストロームが想定されているものの、本開示内容は、それらに限定されるものではない。また、本明細書に記載した技術は、各種の試料、たとえば、凍結された試料、ポリマーもしくはワックス（もしくは他の材料）の基材上に載置された試料、またはポリマーもしくはワックス（もしくは他の材料）に包埋された試料に適用することができる（試料はこれらに限定されるものではない）。当業者が理解しうる改変例は、いずれも、添付した特許請求の範囲に定義した本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられるものである。
【００６４】
参照文献
以下の参照文献は、参照として本明細書に詳細に組み入れられる。
2005539199.tif 000002
2005539199.tif 000003
2005539199.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６５】
以下の図面は、本発明の明細書の一部をなすものであり、本発明の幾つかの特定の側面をさらに詳細に示すために本発明に包含させたものである。本発明は、本明細書に示す具体的態様についての詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の1枚または複数を参照することによって、より理解されることができる。
【図１】本発明に開示された態様にしたがって試料を分析する際の方法の模式図である。
【図２】本発明に開示した態様でのマウスの脳切片の質量分析画像を示す。図2Aは、金でコーティングしたプレートにマウントした凍結切片の光学画像を示す。図2Bは、大脳皮質領域と海馬のm/z 8,258での結果を示す。. 図2Cは、黒質および内側膝状核領域のm/z 6,716での結果を示す。図2Dは、中脳のm/z 2,564での結果を示す。
【図３】発明に開示した態様でのタンパク質の画像を示す。これらの図は、特に、グリア芽細胞腫の切片に由来する選ばれたタンパク質の画像を示す。図3Aは、金属プレートにマウントし、マトリックスでコーティングしたヒトグリア芽細胞腫の切片を示す（図中の線は、レーザーによるマトリックスのアブレーションによるもの）ものである。図3B〜3Dは、タンパク質の質量分析画像を示すものであり、腫瘍が増殖している領域で高濃度であること（図3D）、ならびに虚血および壊死領域で他のタンパク質が特異的に存在していること（図3Bおよび3C）が示されている。
【図４】グリア芽細胞腫の切片（図3）のさまざまな位置で測定したMALDI質量分析スペクトルを示す。150を超える数の異なったピークが検出され、そのうちの一部は、組織中で際だった空間分布を有していた。上側の線は、腫瘍の先端かつ増殖がもっとも活発な領域のもの、中央の線は、虚血領域、下側の線は、腫瘍の壊死領域である。挿入図は、チモシンβ.4.領域のスペクトルの拡大図を示す。
【図５】本発明に開示された態様でのグリア芽細胞腫の異種移植抽出物をLCで分離した際のUVクロマトグラムを示す。分子量が4,964の分析対象物が、オンラインの熱スプレー質量分析（ESI MS）で、保持時間28.3分の時点で検出された（挿入図は、質量スペクトルを示す）。
【図６】本発明に開示された態様でのN末端トリプシン断片Tβ.4の熱スプレーMS/MSによる質量分析結果を示す。質量スペクトルのデータから、この断片の完全な配列を確認した。
【図７】本発明に開示された態様の方法の各過程を示すフローチャートである。
【図８】本発明に開示された態様の方法の各過程を示す別のフローチャートである。
【図９】本発明に開示された態様の各過程を実施するのに適した装置の模式図である。
【図１】
2005539199.tif 000005
【図２】
2005539199.tif 000006
【図３】
2005539199.tif 000007
【図４】
2005539199.tif 000008
【図５】
2005539199.tif 000009
【図６】
2005539199.tif 000010
【図７】
2005539199.tif 000011
【図８】
2005539199.tif 000012
【図９】
2005539199.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月17日(2004.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタンパク質を分析する方法であって、
（a）標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本から第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本から第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、かつ、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、
（j）空間配置の関数として特定のタンパク質を正常試料を表す同様のデータと比較し、かつ、
（i）比較の過程によって試料の疾患状態を評価する過程を含む方法。
する
【請求項２】
標本が腫瘍関連組織を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍関連組織が肺組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍関連組織が乳房組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍関連組織が直腸組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項９】
標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
標本を作製する過程が、レーザー捕捉顕微解剖またはその他の細胞単離法によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
目的とする原子質量窓を分析する過程が、
原子質量窓内のタンパク質の質量を、直線距離の関数として画像的に描出する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質の質量を画像として描出する過程が、三次元のプロットを描出する過程を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
過程（b）と（c）を、標本上でX、Yプロット内に配置された多数のレーザースポットについて繰り返し、かつ
原子質量窓内のタンパク質の原子質量を、標本上でX、Yプロット内に配置された複数のレーザースポットの関数として画像的に描出する過程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
レーザービームで標本を照射する前に、標本を乾燥させる過程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
第一レーザースポットから得られた目的とする原子質量窓内のタンパク質を、レーザービームで第二レーザースポットを照射している間に分析する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
直線移動距離が、各レーザースポットの幅の2倍未満である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
標本が血液から単離されたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
標本が血漿から単離されたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
標本が乳房生検標本を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
標本が走査検定用チップをさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
標本が組織を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
組織が脳組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
組織が前立腺組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
組織が結腸組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２６】
組織が乳房組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】
組織が肺組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２８】
組織が直腸組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２９】
標本を作製する過程が、細胞分画によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
細胞分画が、細胞選別を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
細胞選別が、フローサイトメトリーを含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
標本を作製する過程が、レーザー捕捉顕微解剖によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
疾患を分類する方法であって、
（a）罹患標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本から第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本から第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、
（i）識別された特定のタンパク質を、1種また複数の疾患と相関させて、罹患標本を分類し、
（j）空間配置の関数として特定のタンパク質を標準試料を表す同様のデータと比較し、かつ、
（j）比較過程によって罹患試料の疾患状態を評価する
過程を含む方法。
【請求項３４】
罹患標本が腫瘍関連組織を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３８】
罹患標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３９】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項４０】
標本の疾患の進行を経時的にモニタリングする方法であって、
（a）まず標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本から第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本から、第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、
（i）（a）から（h）までの過程を2回目として繰り返し、かつ
（j）1回目に識別された特定のタンパク質を、2回目に識別された特定のタンパク質と比較して、標本の疾患の進行を経時的にモニタリングする過程を含む方法。
【請求項４１】
1回目または2回目に識別された特定のタンパク質を、1種また複数の疾患と相関させる過程をさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
1種また複数の疾患を治療する過程をさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
標本が腫瘍関連組織を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４７】
腫瘍関連組織が肺組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍関連組織が乳房組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍関連組織が直腸組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項５０】
標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項５１】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項５２】
タンパク質含有試料を分析する装置であって、
レーザービームで、標本上の複数のレーザースポットを逐次照射して、各レーザースポットから試料タンパク質を逐次放出させるレーザー源と、
標本を、レーザービームに対して、移動前および移動後のレーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ逐次移動させる移動機構と、
放出された試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定する質量分析手段と、
質量分析手段から、原子質量についてのデータを受け取るコンピュータと、
目的とする原子質量窓内の原子質量を、標本上の個々のレーザースポットの関数として描出するディスプレーと、
原子質量窓内の原子質量を、1種また複数の特定のタンパク質と相関させ、空間配置の関数として特定のタンパク質を標準試料を表す同様のデータと比較し、試料の疾患状態を評価するよう配置されたコンピュータと
を備えている装置。
【請求項５３】
標本上のレーザースポットの寸法を選択的に形成して確定するレーザーマスクをさらに備えている、請求項52記載の装置。
【請求項５４】
光学系をさらに備えている、請求項53記載の装置。
【請求項５５】
目的とする原子質量窓内の原子質量を、標本上でX、Yプロット内に配置された複数のレーザースポットの関数として画像的に描出する、請求項52記載の装置。
【請求項５６】
標本の経時変化を経時的にモニタリングする方法であって
（a）標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第一試料を放出させ、
（c）放出された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第一試料の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第二試料を放出させ、
（f）放出された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第二試料の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の空間配置を決定し、かつ、
（h）特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を、空間配置の関数として識別し、
（i）（a）から（h）までの過程を繰り返し、かつ
（j）1回目に識別された特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を、その後の回に識別された特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物と比較して、標本の経時変化を経時的にモニタリングする過程を含む方法。
【請求項５７】
識別された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を識別された試料から放出されたタンパク質と相関させる過程をさらに含む、請求項59に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月1日(2005.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のタンパク質を分析する方法であって、
（a）標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本から第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本から第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、かつ、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、
（j）空間配置の関数として特定のタンパク質を正常試料を表す同様のデータと比較し、かつ、
（i）比較の過程によって試料の疾患状態を評価する過程を含む方法。
【請求項２】
標本が腫瘍関連組織を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍関連組織が肺組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
腫瘍関連組織が乳房組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍関連組織が直腸組織を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項９】
標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
標本を作製する過程が、レーザー捕捉顕微解剖またはその他の細胞単離法によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
目的とする原子質量窓を分析する過程が、
原子質量窓内のタンパク質の質量を、直線距離の関数として画像的に描出する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質の質量を画像として描出する過程が、三次元のプロットを描出する過程を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
過程（b）と（c）を、標本上でX、Yプロット内に配置された多数のレーザースポットについて繰り返し、かつ
原子質量窓内のタンパク質の原子質量を、標本上でX、Yプロット内に配置された複数のレーザースポットの関数として画像的に描出する過程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
レーザービームで標本を照射する前に、標本を乾燥させる過程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
第一レーザースポットから得られた目的とする原子質量窓内のタンパク質を、レーザービームで第二レーザースポットを照射している間に分析する、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
直線移動距離が、各レーザースポットの幅の2倍未満である、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
標本が血液から単離されたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
標本が血漿から単離されたものである、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
標本が乳房生検標本を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
標本が走査検定用チップをさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
標本が組織を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
組織が脳組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
組織が前立腺組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
組織が結腸組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２６】
組織が乳房組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２７】
組織が肺組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２８】
組織が直腸組織を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２９】
標本を作製する過程が、細胞分画によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
細胞分画が、細胞選別を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
細胞選別が、フローサイトメトリーを含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
標本を作製する過程が、レーザー捕捉顕微解剖によって単離された個別の細胞または細胞群を作製する過程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
疾患を分類する方法であって、
（a）罹患標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本から第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本から第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、
（i）識別された特定のタンパク質を、1種また複数の疾患と相関させて、罹患標本を分類し、
（j）空間配置の関数として特定のタンパク質を標準試料を表す同様のデータと比較し、かつ、
（j）比較過程によって罹患試料の疾患状態を評価する
過程を含む方法。
【請求項３４】
罹患標本が腫瘍関連組織を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３８】
罹患標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３９】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項４０】
標本の疾患の進行を経時的にモニタリングする方法であって、
（a）まず標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本から第一試料タンパク質を放出させ、
（c）放出された第一試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本から、第二試料タンパク質を放出させ、
（f）放出された第二試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定のタンパク質の空間配置を決定し、
（h）特定のタンパク質を、空間配置の関数として識別し、
（i）（a）から（h）までの過程を2回目として繰り返し、かつ
（j）1回目に識別された特定のタンパク質を、2回目に識別された特定のタンパク質と比較して、標本の疾患の進行を経時的にモニタリングする過程を含む方法。
【請求項４１】
1回目または2回目に識別された特定のタンパク質を、1種また複数の疾患と相関させる過程をさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
1種また複数の疾患を治療する過程をさらに含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
標本が腫瘍関連組織を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍関連組織が脳組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍関連組織が前立腺組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍関連組織が結腸組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４７】
腫瘍関連組織が肺組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍関連組織が乳房組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍関連組織が直腸組織を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項５０】
標本を作製する過程が、新鮮な凍結切片を作製する過程を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項５１】
特定のタンパク質を識別する過程が、抽出、HPLCによる分画、タンパク質の分解、1つまたは複数の断片の質量分析による配列決定、およびタンパク質データベースの検索の過程を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項５２】
タンパク質含有試料を分析する装置であって、
レーザービームで、標本上の複数のレーザースポットを逐次照射して、各レーザースポットから試料タンパク質を逐次放出させるレーザー源と、
標本を、レーザービームに対して、移動前および移動後のレーザースポットの寸法と機能的に相関する所定の直線距離だけ逐次移動させる移動機構と、
放出された試料タンパク質の原子質量を、原子質量範囲について測定する質量分析手段と、
質量分析手段から、原子質量についてのデータを受け取るコンピュータと、
目的とする原子質量窓内の原子質量を、標本上の個々のレーザースポットの関数として描出するディスプレーと、
原子質量窓内の原子質量を、1種また複数の特定のタンパク質と相関させ、空間配置の関数として特定のタンパク質を標準試料を表す同様のデータと比較し、試料の疾患状態を評価するよう配置されたコンピュータと
を備えている装置。
【請求項５３】
標本上のレーザースポットの寸法を選択的に形成して確定するレーザーマスクをさらに備えている、請求項52記載の装置。
【請求項５４】
光学系をさらに備えている、請求項53記載の装置。
【請求項５５】
目的とする原子質量窓内の原子質量を、標本上でX、Yプロット内に配置された複数のレーザースポットの関数として画像的に描出する、請求項52記載の装置。
【請求項５６】
標本の経時変化を経時的にモニタリングする方法であって
（a）標本を作製し、
（b）この標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第一レーザースポットから、治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第一試料を放出させ、
（c）放出された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第一試料の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（d）標本を、レーザービームに対して、所定の第一レーザースポットの寸法と相関する所定の直線距離だけ移動させ、
（e）標本にレーザービームを照射して、標本上の所定の第二レーザースポットから、治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第二試料を放出させ、
（f）放出された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の第二試料の原子質量を、原子質量範囲について測定し、
（g）原子質量範囲内の目的とする原子質量窓を分析して、試料中の特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物の空間配置を決定し、かつ、
（h）特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を、空間配置の関数として識別し、
（i）（a）から（h）までの過程を繰り返し、かつ
（j）1回目に識別された特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を、その後の回に識別された特定の治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物と比較して、標本の経時変化を経時的にモニタリングする過程を含む方法。
【請求項５７】
識別された治療薬、診断薬、製剤、または代謝産物を識別された試料から放出されたタンパク質と相関させる過程をさらに含む、請求項56に記載の方法。
【国際調査報告】
2005539199.tif 000014