(57)【要約】【課題】  生物学的溶液から核酸を単離する方法。  【解決手段】  本発明の方法は、生物学的溶液に対してポリカチオン性沈殿剤を添加すること、及び所望の核酸との複合体を形成させることによってこの所望の核酸を選択的に沈殿させる工程を含み、ここで、この沈殿剤は四級アミノ基を含む高度に荷電した直鎖状ポリマーである。このポリカチオン性沈殿剤は好ましくは、ポリカチオン性沈殿剤と核酸との間の電荷比［＋］／［−］が、沈殿の間に０．５以上、好ましくは０．９以上、そして最も好ましくは１以上であるような量に添加されて、塩濃度の存在下で、核酸／ポリカチオン複合体の定量的な特異的な沈殿を確実にする。
2005531329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
他の核酸、タンパク質、他の高分子量化合物、塩及び他の低分子量物質を含み得る生物学的溶液から核酸を単離する方法であって、該方法は、該溶液に対してポリカチオン性沈殿剤を添加すること及び所望の核酸との可溶性複合体を形成させることによって、溶液中に他の種を残したままで、該所望の核酸を選択的に沈殿させる工程を含み、該沈殿剤は四級アミノ基を含む高度に荷電した直鎖状ポリマーであり、該沈殿剤は、塩の存在下で、ポリカチオン性沈殿剤と核酸との間の電荷比［＋］／［−］が、沈殿の間に約０．５以上、好ましくは約１以上であるような量に添加される、方法。
【請求項２】
沈殿剤が、２５以上の正電荷を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
沈殿剤の添加の前に生物学的溶液における負電荷の数を推定する工程を含む、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
所望の核酸がプラスミドである、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
生物学的溶液が細胞溶解物である、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
細胞溶解物がアルカリ性の細胞溶解物である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
細胞溶解物が沈殿剤の添加の前に予め処理される、請求項５又は請求項６記載の方法。
【請求項８】
沈殿剤におけるポリマー分子量（１モル当たりのグラム）／ポリマー電荷（ポリマー１鎖当たりの電荷の数）の比が約１０００未満、好ましくは約４００未満である、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
沈殿剤が約５００以上、好ましくは約１０００以上の正電荷を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
沈殿剤が、ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルジアリルアンモニウムクロライド）、脂肪族イオネンブロミド及びポリ（Ｎ−アルキル−４−ビニルピリジニウムハライド）からなる群から選択される、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
溶液の塩濃度が、核酸／ポリカチオン複合体の定量的選択的な沈殿を可能にするために沈殿剤の添加の間に制御される、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
溶液から沈殿物を分離することによって形成される沈殿物から所望の核酸を回収する工程、及び引き続く複合体の溶解、及び／又は破壊をまた含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
多価電解質複合体が、溶液において所望の核酸を遊離するための塩の添加によって溶解されるか及び／又は破壊される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
複合体の溶解及び／又は破壊が、電荷比［＋］／［−］及び塩の性質に依存して、０．５Ｍを超える、好ましくは３Ｍを超える塩濃度で行なわれる、請求項１２又は請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
沈殿物を分離した後の溶液から所望の核酸を回収する工程をまた含む、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
形成された第一の沈殿物から第一の所望の核酸を単離する工程と、生物学的溶液から該第一の沈殿物を分離する工程と、沈殿剤の連続的な添加によって残りの溶液から第二の所望の核酸を沈殿する工程とを含む、請求項１２乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
修飾反応に供されている核酸を単離するための、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的溶液から核酸、例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを単離する方法に関する。より詳細には、本発明は、沈殿剤を利用し、これによって所望の核酸とこの沈殿剤から、又は所望されない核酸とこの沈殿剤からのいずれかから複合体が形成される。
【背景技術】
【０００２】
１８６０年代に、Ｆ．Ｍｉｅｓｃｈｅｒは、細胞核から酸性構造物を単離し、これを彼はヌクレイン（ｎｕｃｌｅｉｎ）と、そして後には核酸と名づけた。この物質の生物学的機能は、核酸物質及び詳細にはＤＮＡが遺伝情報の運搬を担うということが確立される１世紀近く後まで発見されなかった。ＤＮＡの分子構造の解明が１９５３年に報告されたとき、生化学及び生物学において新しい段階が始まった。
【０００３】
現在では周知のとおり、核酸は鎖の中に高密度の負に荷電したリン酸基を有するポリマーである。あらゆる生きた生物体において２つのクラスの核酸、すなわちリボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が見出されている。一方で、ウイルスは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか１つのタイプのみを含む。核酸の生物学的機能としては、遺伝情報の保存、複製、組換え及び伝達が挙げられる。ＤＮＡは、核ＤＮＡ、細胞質ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ及びウイルスＤＮＡに分類できる。もう一方のＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ及びサブウイルスＲＮＡに分類できる。
【０００４】
種々の核酸は、最近、主に科学的研究においてだけでなく、薬学的分野及び診断の分野においても用いられ程度が増加している。従って核酸は、例えば、タンパク質産物が細胞、例えば組換え細胞の核酸から発現される生物工学的なプロセスにおいて、遺伝子操作のための方法におけるツールとして、そしてさらに最近では医療用及び診断適用のためにも有用である。有用な核酸産物を得るためには、望ましくない成分、例えば、細胞破片、夾雑物、例えば毒性物質、例えば内毒素などを排除するために注意深い精製スキームが必要である。
【０００５】
今まで、核酸を単離するための最も一般的な方法はクロマトグラフィーを用いることであった。従って、現在利用可能な精製方法は、限外濾過、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又はガラスもしくはシリカゲル粒子上への沈殿によるカオトロピック塩の存在下でのアガロースゲルからの核酸フラグメントの抽出に基づく。
【０００６】
しかし、例えば、二本鎖ＤＮＡフラグメント及びさらに小さい短鎖オリゴヌクレオチドを含む核酸混合物の分離のためには、これらの方法は低い効率でしか有用でない。
【０００７】
他のさらに近年示唆されている精製スキームは、核酸の電荷に基づく。核酸は、その鎖の中に負に荷電した高密度のリン酸基を有するポリマーであるので、ポリアニオンとみなすことができる。従って、核酸を沈殿する種々の方法が開示されている。
【０００８】
ＤＮＡの選択的沈殿の具体的な形態は、米国特許出願公開第２００２／００１０１４５号（Ｗｉｌｓｏｎら）に開示されている。さらに詳細には、有機溶媒を用いた沈殿後の細胞溶解物から得た調製物からのＤＮＡ、好ましくはプラスミドＤＮＡの精製であって、その後の凝縮剤の添加による選択的沈殿による、低イオン強度緩衝液中での再可溶化による精製が示唆される。通常ＤＮＡ調製物中の主な夾雑物であるＲＮＡは、溶液中に残され得るが、所望のプラスミドＤＮＡは直接沈殿される。凝縮剤は、スペルミン及びスペルミジンのような低分子である。開示された沈殿は低塩濃度でのみ起こるので、示唆された方法を、細胞溶解物に直接適用することはできない。従って、この分野では、精製されたＤＮＡ産物を得るのに必要な工程の総数が少なく、それによって総費用が減少する簡略な方法が依然として必要である。
【０００９】
核酸の沈殿に基づく別のアプローチは、ポリエチレンイミン及びアニオン性リン酸エステル界面活性剤を用いる核酸の捕獲及び選択的遊離のための方法として米国特許第５６２２８２２号（Ｅｋｅｚｅら）に開示されている。さらに詳細には、核酸は、例えば溶解後に増幅のために、溶解物とポリエチレンイミンとを接触させて沈殿物を形成することによって利用可能にされる。次いで核酸は強力な塩基を用いて沈殿物から遊離されて、この遊離された核酸は、アニオン性リン酸エステル界面活性剤を含む溶液中で保持される。しかし、強力な塩基での処理は、核酸の構造に有害であり、従ってこの方法は、例えば、プラスミドＤＮＡを沈殿するためには用いることができない。さらに、エチレンイミンは全てのｐＨ値において荷電していないので、この方法を制御されたｐＨで行なうことが必須である。
【００１０】
従って、全ての形態の核酸で有用であって、かつ操作がより簡単である別の方法が依然として必要である。
【００１１】
核酸の沈殿の別の方法は、欧州特許第１０３１６２６号（Ｅｒｂａｃｈｅｒら）に開示されており、ここでは、１〜２４個の繰返し単位からなるアンモニア又はホスホニウム塩を用いて、生物学的サンプルにおいて核酸を安定化させ及び／又は単離する方法が示唆される。しかし、この沈殿は非選択性であって、すなわち、この方法では、溶液中に他の核酸を残したままで、例えばゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡといった特定のタイプの核酸の特定の沈殿をさせることはできない。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／００１０１４５号
【特許文献２】米国特許第５６２２８２２号明細書
【特許文献３】欧州特許第１０３１６２６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
さらに、ここ十年間は、核酸とポリカチオンとの複合体は、遺伝子送達のためのビヒクルとして科学者の注目をかなり引き付けそして注目はますます増している。このビヒクルは細胞の負に荷電した膜と相互作用して強力に結合しなければならないので、これは正に荷電されかつ可溶性でなければならない。これらの要件は、特定の比のポリカチオン／核酸でのみ満たされる。従って、簡便性という要因によって複雑な結合剤誘引の特異的過ぎない量を添加することが必要となる生物工学の精製プロセスとは反対に、遺伝子送達法では、特定の量のポリカチオンを添加することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明の目的は、他の核酸、タンパク質、他の高分子量化合物、塩及び他の低分子量物質を含み得る溶液から、この溶液中にこのような他の種を残したままで、核酸を単離する選択的方法を提供することである。これは、添付の特許請求の範囲に記載の方法によって達成される。
【００１４】
本発明の別の目的は、生物学的溶液からの核酸の単離の方法であって、大規模の操作に簡単かつ適切である方法を提供することである。本発明の関連の目的は、このような方法であって、特に大規模の操作において費用効果的でもある方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、核酸の選択的単離の方法であって、溶液のｐＨにかかわらず有用であって、従って酸及び塩基のようなｐＨ調節剤の使用を回避する方法を提供することである。
【００１６】
なお別の目的は、上記のような核酸の単離の選択的方法であって、広いウインドウのｐＨ及び塩濃度内でそのような核酸の沈殿を可能にし、かつ過剰の沈殿剤の添加に対して過敏でない方法を提供することである。
【００１７】
本発明の特定の目的は、プラスミドのスーパーコイル構造に本質的に影響することのない、核酸プラスミドＤＮＡの選択的な単離方法を提供することである。特定の目的は、高濃度の塩及びＲＮＡを含む清澄化されたアルカリ性溶解物において利用可能である、プラスミドについての選択的単離方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態及び利点は、以下の本発明の詳細な説明及び実験のパートから明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
（定義）
「生物学的溶液」という用語は、本明細書においては、核酸のような生物学的物質が存在し得る任意の溶液について用いる。従って、この用語は水溶液、例えば、緩衝液、細胞溶解物などを包含する。
【００２０】
「核酸」という用語は、本明細書において用いる場合、本明細書の背景の欄において考察されるような、任意の形態の核酸を包含する。
【００２１】
「ポリカチオン」という用語は、本明細書においては、「ポリカチオン性沈殿剤」という用語と互換的に用いられる。
【００２２】
「一体型のポリカチオン」とは、四級アミン基がポリマー鎖の一部である分子をいうが、「ペンダント型のポリカチオン」という用語は、四級アミン基がこの鎖からぶら下がっている分子を意味する。
【００２３】
「電荷比」とは、［＋］／［−］として規定されるが、ここで［＋］はポリカチオン中の四級アミノ基の濃度であり、［−］は、プラスミドＤＮＡにおけるリン酸基の濃度である。
【００２４】
沈殿物又は複合体を意味するために本明細書において用いられる「不溶性」という用語は、通常の遠心分離によって形成されている、溶液から分離できる、沈殿物又は複合体を意味する。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明の第一の局面は、生物学的溶液から核酸を単離する方法であって、この方法は、この溶液に対してポリカチオン性沈殿剤を添加すること、及びこの所望の核酸との可溶性の複合体を形成させることによって、この所望の核酸を選択的に沈殿させる方法を含み、ここで、この沈殿剤は四級アミノ基を含む高度に荷電した直鎖状ポリマーである。この方法は、所望の核酸が沈殿されるが、この溶液中の他の核酸及び他の分子は沈殿されないという点に関して選択性である。好ましくは、この薬剤は、塩の存在下で、ポリカチオン性沈殿剤と核酸との間の電荷比［＋］／［−］が、沈殿の間に約０．５以上であるような量に添加される。以下にさらに詳細に考察するとおり、塩濃度は好ましくは沈殿の間に制御される。有利な実施形態では、この電荷比は、沈殿の間、約９以上、好ましくは１以上である。
【００２６】
従って、本発明によって形成された沈殿物はまた不溶性の多価電解質複合体としても公知であり、そして本明細書において用いられる沈殿剤は、合成又は天然のポリカチオンである。可溶性の多価電解質複合体は以前に、工業的スケールのバイオプロセスにおける精製のためよりむしろ例えば遺伝子送達の研究において主に利用されているが、そのような研究においては、多価電解質複合体の特性は解釈され予測されている。沈殿のための用いられる条件下で不溶性である多価電解質複合体は、個々の成分を形成するために再溶解されても、又は完全に破壊されてさえよい。これは、以下にさらに詳細に考察するとおり、溶液中の塩濃度及び／又はｐＨの条件を適合させることによって達成される。
【００２７】
本発明の特定の実施形態において、所望の核酸はプラスミドである。しかし、以下から明らかであるように、本発明は、任意の所望の核酸を回収するために、例えば、溶液中において他の成分からＤＮＡもしくはＲＮＡを単離するために、又は溶液中でお互いからＤＮＡ及びＲＮＡを単離するために用いることができる。
【００２８】
所望の核酸が単離される生物学的溶液は、核酸に有害な影響を有さず、かつその核酸の電荷が本質的にインタクトである任意の溶液であってもよい。従って１つの実施形態において、生物学的溶液は細胞溶解物である。この溶解物は、機械的な細胞破壊の結果であってもよい。或いは、この溶解物は、強力にアルカリ性の試薬を含む界面活性剤で細胞を処理することによって、続いて中和及び遠心分離して、高い塩濃度を有する核酸含有溶液を得ることによって調製された清澄化されたアルカリ性溶解物であってもよい。従って、本発明の１つの主な利点は、塩濃度が高い溶液上でもこの方法は適用可能であるということである。
【００２９】
この方法がアルカリ性溶解物を取り扱う能力の例示的な実施例を、実施例９、１０及び１２に示す。これらの実施例においては、塩濃度は核酸沈殿工程の間、極めて高く、すなわちカリウムに関して約０．６Ｍそして酢酸塩に関して１Ｍである。この塩濃度は背景の欄で示された引用文献に記載される濃度よりもかなり高い。  
【００３０】
実施例９及び１０においては、実施例２に従って調製された清澄化された溶解物を最初に、多価電解質の沈殿工程を改善するために、事前処理（実施例２．１）に供した。この事前処理とは単に、４℃で数日間この清澄化溶解物を保管するということ、次いで遠心分離によって、自然に形成された沈殿物を除去するということを意味する。
【００３１】
実施例１２においては、清澄化された溶解物を最初に、多価電解質の沈殿工程を改善するために、別の事前処理（実施例２．２）に供した。この事前処理は、疎水性のゼオライトを添加した。この別の事前処理は、数日間の貯蔵を必要とする上記の処理に比べて極めて迅速であるという利点を有した。
【００３２】
実施例２．２において用いられる疎水性ゼオライトは、アルカリ溶解工程（実験２）において加えられた化合物であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を吸着することが公知である。ＳＤＳ又は他の物質と組み合わせたＳＤＳは、多価電解質沈殿工程を有害に妨害することが想定できる。従って、それらの除去は有利であるはずである。適切な組成物を用いたゼオライトの選択は、Ｅｒｉｋｓｏｎ及びＧｒｅｅｎ（遺伝子操作された細胞からの細胞内に蓄積したタンパク質の精製におけるゼオライトＹの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｏｌｉｔｅ  Ｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｒｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈ．６（１９９２）２３９〜２４４）によって示される指示によって管理した。
【００３３】
別の実施形態では、事前処理工程、例えば、クロマトグラフィー分離が、本発明による沈殿の前に生物学的溶液に適用される。
【００３４】
上述のとおり、沈殿剤はカチオン性の高度に荷電した直鎖状ポリマーであって、これは、一体型ポリカチオンとして公知のように、このポリマー鎖の一部として、又はペンダントポリカチオンとして公知のように、この鎖の置換として付加されたかのいずれかである、四級アミノ基を含む。この状況では、「高度に荷電した」という用語は、ポリマー分子量（１モル当たりのグラム）／ポリマー電荷の比が、１０００未満、好ましくは４００未満であることを意味する。特定の実施形態では、この比は約２５０未満、例えば約２１５未満である。１つの実施形態では、ポリカチオン性沈殿剤は、約２５以上の正電荷、すなわち四級アミン基を含む。特定の実施形態では、ポリカチオン性沈殿剤は、約５０以上、より好ましくは約５００以上、そして最も好ましくは約１０００以上の正電荷、すなわち四級アミン基を含む。通常、ポリマーの各々の反復単位は、このようなアミン基の１つを含み、従って上記で示した数はまた、用いられる沈殿剤における反復単位の数にあてはまる。従って１つの実施形態では、沈殿剤は、１０００以上の反復単位からなる。
【００３５】
１つの実施形態では、沈殿剤は、約１４００ＤＰを含み、かつ１６０というポリマー分子量／ポリマー電荷の比を示すポリマー、すなわち、市販の製品（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（米国ペンシルバニア州ウォーリントン））であるポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルジアリルアンモニウムクロライド）（ＤＭＤＡＡＣ）である。この実施形態では、この沈殿物、すなわち、不溶性多価電解質複合体は、塩濃度に依存して、０．５≦［＋］／［−］≦１０の領域において、好ましくは０．７≦［＋］／［−］≦５の領域において形成される。
【００３６】
別の実施形態では、沈殿剤は、約８０ＤＰを含み、かつ１７２というポリマー分子量／ポリマー電荷の比を示す脂肪族イオネンブロミドを含むポリマーである。
【００３７】
さらに別の実施形態では、沈殿剤はポリ（Ｎ−アルキル−４−ビニルピリジニウムハライド）を含むポリマーである。従って、特定の実施形態では、沈殿剤は、ポリ（Ｎ−メチル−４−ビニルピリジニウムクロライド）、ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド）及びポリ（Ｎ−プロピル−４−ビニルピリジニウムブロミド）からなる群から選択される。これらのうち幾つかは市販されている（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（米国ペンシルバニア州ウォーリントン））。従って、好ましい鎖長は、ＤＰ２５を超え、そして最も好ましいのはＤＰ１００を超え、ポリマー分子量／ポリマー電荷比は２１４である。
【００３８】
従って、一般的実施形態において、沈殿剤は、ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルジアリルアンモニウムクロライド、脂肪族イオネンブロミド及びポリ（Ｎ−アルキル−４−ビニルピリジニウムハライドからなる群から選択される。
【００３９】
上記のように、１つの実施形態では、この溶液の塩濃度は、核酸／ポリカチオン複合体の定量的な選択的沈殿を可能にするために、沈殿剤の添加の間、制御される。この状況では、当業者は、特定の複合体を形成するための至適の荷電比が、沈殿の間、生物学的溶液における塩濃度に依存してシフトされることを認識している。従って、本発明の基礎を提供する予期されない知見は、核酸の本発明の沈殿が、先行技術に比べて広いウインドウの塩濃度内で獲得可能であるということである。この利点は、本出願の図５から明らかになる。上記のとおり、核酸の以前の選択的沈殿は、特定の比で得られている。逆に、本発明による沈殿は、核酸に存在する負電荷の数に等しいか又はそれを上回るかのいずれかの多数の正電荷を提供するために、塩の存在下で、ある量のポリカチオン性沈殿剤を添加することによって行なわれ得る。この状況では、種々の電荷比で得られる利点が異なる塩濃度について実証されている、本出願の図６を参照のこと。従って、本発明を用いる利点は、過剰のポリカチオン沈殿剤を添加するいかなる欠点も伴わないということである。なぜなら、この方法では高い電荷比を生じ、これがやはり有効な沈殿を生じるからである。簡便性の理由で、十分な量のポリカチオン性沈殿剤が添加されていることを確認するために、しばしば過剰に添加する。
【００４０】
本発明では、沈殿剤の添加の前に生物学的溶液中の核酸における負電荷の存在数を決定することが有利である。従って、１つの実施形態では、本発明の方法は、沈殿剤の添加の前にサンプル中の負の荷電の数を評価する工程を含む。当業者は、標準的方法に従って、核酸を含むサンプル中の負電荷の数を容易に決定することができる。例えば以下の実施例６を参照のこと。要するに、このような見積もりは、周知の式Ａ＝ε＊ｃ＊１（ここで、Ａは吸光度であり、εは吸光係数であり、１はキュベットを横切って光が移動する長さである）に従って、リン酸基の数を決定するために、例えば、ＤＮＡを含む溶液のサンプルの２６０ｎｍでの吸光度を測定する工程を含む。ＤＮＡについての吸光係数は、６５００Ｍ−１ｃｍ−１である（Ｏｌｉｎｓ，Ｄ．Ｅ．；Ｏｌｉｎｓ，Ａ．Ｌ．；Ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ，Ｐ．Ｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９６７，２４，１５７〜１７６）。ＤＮＡサンプルの負電荷の濃度は、吸光係数で吸光度の値を割ることによって決定される。得られた値は、負電荷の総濃度である。同じ吸光係数を用いてＲＮＡについて、十分な評価を行なうことができる。解析することが所望される溶液が未知の量の核酸（単数又は複数）を、例えば溶解物として含む場合、ＲＮＡからのＤＮＡの分離のために、都合の良いことにわずかなサンプルを解析カラム上にとって泳動する。
【００４１】
１つの実施形態では、本発明の方法はまた、塩のさらなる添加によって形成された沈殿物を溶解することによって、所望の核酸を回収する工程を含む。従って、１つの実施形態では、本発明の方法はまた、溶液から沈殿物を分離すること及びこの沈殿物の引き続く溶解（これによって可溶性の複合体が形成される）によって、そのように形成された沈殿物から所望の核酸を回収する工程を含む。このような可溶性の複合体では、沈殿剤は、核酸に結合されているが、通常の遠心分離によってそれの単離が可能であるほど十分に強固ではない。従って特定の実施形態において、本発明はまた塩の添加によって多価電解質複合体を破壊する工程を含み、これによって所望の核酸が溶液中に遊離状態で存在する。このような破壊された複合体では、反対の荷電のポリマーと、溶液中に分離されて／遊離状態で存在するポリカチオン性沈殿剤及び核酸の両方との間に本質的に相互作用は生じない。このような遊離の核酸は、クロマトグラフィー、電気泳動又は任意の他の周知の方法によって都合よく回収される。当業者は、塩濃度の正確な値が沈殿剤の性質及び量のような他のパラメーターに依存することを理解するが、この種類の複合体は、塩濃度の増大で破壊される。従って特定の実施形態において、この沈殿物の分解及び破壊は、電荷比［＋］／［−］及び塩の性質に依存して、０．５Ｍを超える、好ましくは３Ｍを超える塩濃度で行なわれる。
【００４２】
塩は、実質的には、クロマトグラフィーの分野で周知でありそしてイオン交換体の脱離のために通常用いられる任意の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸アンモニウム、酢酸カリウムなどであってもよい。本発明において用いられる塩の唯一の要件は、それらの塩が複合体からポリカチオン性沈殿剤を置き換えることが可能であり、それによってこの核酸を遊離できるということ、そして所望の核酸に対して有害な影響を有さないということである。
必要に応じて、この沈殿物を例えば、水又は適切な緩衝液を用いて、その溶解の前に洗浄してもよい。
【００４３】
別の実施形態では、本発明はまた、沈殿物の分離後にこの溶液から所望の核酸を回収する工程を含む。例えば、ＤＮＡをも含む溶液からＲＮＡを単離することが所望される場合、ＤＮＡは最初に沈殿されてもよく、この沈殿物は除去されてもよく、そして残りの溶液がＲＮＡの供給源として用いられてもよい。次いで、ＲＮＡは、第二の沈殿又はクロマトグラフィーもしくは電気泳動のような標準的な方法に従ってのいずれかでこの溶液から回収され得る。従って、特定の実施形態では、本発明の方法は、形成された第一の沈殿物から第一の所望の核酸を単離する工程と、生物学的溶液からこの第一の沈殿物を分離する工程と、沈殿剤の連続的な添加によって残りの溶液から第二の所望の核酸を沈殿させる工程とを含む。
【００４４】
本発明の別の局面は、修飾反応に供されている核酸を単離するための本発明による方法の使用である。従って、このような核酸は例えば核酸フラグメントであってもよい。
【００４５】
本発明の最終の局面は、本発明による方法、例えば、沈殿を実施するための十分な物質、及び必要に応じて、添加されるべき塩を分離区画に、このような方法を行なう方法に関する書面の指示書とともに備えるキットである。
【００４６】
（図面の詳細な説明）
図１は、異なる電荷比、すなわち異なる［＋］／［−］における、異なるプラスミド又はＲＮＡを用いたポリカチオン性沈殿剤によって形成された複合体の溶解度が１Ｍ酢酸カリウムでどうであるかという研究を示す溶解度クロマトグラムである（実施例７を参照のこと）。プラスミドＤＮＡ又はＲＮＡとポリカチオン性沈殿剤との混合を研究して得られたデータを上清に残留するＤＮＡの部分対［＋］／［−］として示す。
【００４７】
図２は、以下の実施例８に従って、１Ｍ酢酸カリウムにおいて行なったプラスミドＤＮＡ及びＲＮＡでのモデル実験の結果のクロマトグラフィー解析を示す。清澄化アルカリ性溶解物においてと同様の条件（すなわち、ＲＮＡの量＞＞プラスミドＤＮＡの量）を用いた。ポリカチオン性沈殿剤とプラスミドＤＮＡとの間の比は、１．４、すなわち［＋］／［−］＝１．４であった。
【００４８】
図３は、以下の実施例９に従う同じプラスミド含有溶液に対する引き続くポリカチオン性沈殿剤の添加によって得られたアガロースゲル電気泳動の結果を示す。［＋］／［−］＝１に相当して、２倍希釈されたプラスミドＤＮＡ含有清澄化アルカリ性溶解物に、ポリカチオン性沈殿剤溶液を添加した。沈殿後、上清を新しい試験管に移して、同じ量のポリカチオン性沈殿剤を再度加えた。この手順を４回繰り返した。このブランクは２倍希釈溶解物であり、これをまた遠心分離して、プラスミドＤＮＡを含まない少量のペレットを得た。［＋］／［−］＝５とは、ポリカチオン性沈殿剤［＋］／［−］＝１の量が、同じ溶液に引き続き５倍加えられていることを意味する。Ｓは、上清を意味し、Ｐはペレットである。ペレットは２Ｍ酢酸カリウムに溶解した。サンプルは、以下の実施例５に記載されるようにアガロースゲル電気泳動上で解析した。図３から、［＋］／［−］＝５における本発明による方法では、プラスミドＤＮＡの選択的な沈殿が生じることが証明される。当業者によって容易に理解されるとおり、ポリカオン性沈殿剤を添加することによって、当然ながら各々の工程においてある程度の希釈が達成され、これはアガロースゲル上のバンドの強度の減少として図３に示されている。
【００４９】
図４は、［＋］／［−］＝４に相当する、２倍希釈され、ポリカチオン性沈殿剤が添加された清澄化アルカリ溶解物のアガロースゲル電気泳動の結果を図示している。沈殿後、溶解ペレット中では、ＲＮＡもプラスミドＤＮＡも検出されない（レーン２）。５つの同一のサンプルを実施例１０に従って試験管中で調製した。沈殿後、５つの上清を新しい試験管に移した。この５つの上清に、本発明による２ｍＭ（相当する単量体濃度に基づいて）のポリカチオン溶液の種々の濃度（それぞれ［＋］／［−］＝１、２、３、４、５に相当する）を添加した。ブランクとして清澄化アルカリ性溶解物の溶液及び蒸留水を用いた。全てのペレットを１ｍｌ  ２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）に再溶解した。サンプルを実施例５に記載のようにアガロースゲル電気泳動上で解析した。［＋］／［−］＝４＋１での第二の沈殿からの結果をレーン３〜４に示しており、ここでは３が上清であり４が溶解ペレットである。［＋］／［−］＝４＋２での第二の沈殿からの結果をレーン５〜６に示し、４＋３をレーン７〜８に、４＋４をレーン９〜１０に、そして４＋５をレーン１１〜１２に示す。レーン１は、２倍希釈された清澄化されたアルカリ性溶解物を示す。２工程沈殿によって、［＋］／［−］＝４＋１でのプラスミドＤＮＡの部分的沈殿が得られたが、残りの全てでは完全かつ選択的な沈殿であった。
【００５０】
図５は、外部の塩濃度に対する、ＤＮＡ／ＰＤＭＤＡＡＣ（１）、ＤＮＡ／２，５−イオネンブロミド（２）及びＤＮＡ／１０，１０−イオネンブロミド（３）システムの上清に残留するＤＮＡ部分の依存を示す。他の条件は図６においてと同じである。
【００５１】
図６は、外部の塩の非存在（１）における、そして異なるＮａＣｌ濃度Ｍの存在下（０．０４Ｍ（２）、０．０６Ｍ（３）、０．０９Ｍ（４）及び０．１２Ｍ（５））における組成物φ＝［＋］／［−］に対するＤＮＡ／ＰＤＭＤＡＡＣシステムの上清中に残留したＤＮＡ部分の依存を示す（０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０、２５℃）。
【００５２】
（実験のパート）
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供しており、添付の特許請求の範囲によって規定されるように本発明を制限すると解釈されるべきではない。本出願において以下に又は他のいずれかに示される全ての引用文献は本明細書に参考として援用される。
【００５３】
（材料）
発酵培地：
３０ｇ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｓｏｙａ  ｂｒｏｔｈ／Ｌ（ＯＸＯＩＤ）
１０ｇ  酵母エキス／Ｌ（Ｇｉｓｔｅｘ）
１０ｇ  デキストロース／Ｌ
１００ｍｇ  アンピシリン）／Ｌ（Ｓｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス））
発現プラスミド及び細菌株：
総プラスミドサイズ５．９ｋｂｐを与えるＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ（３ｋｂｐ）由来のキシラナーゼ遺伝子インサートを有するプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋／−）２．９ｋｂｐを有するＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ（Ｅｖａ  Ｎｏｒｄｂｅｒｇ  Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｘｙｌａｎ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｘｙｌａｎａｓｅ．Ｄｏｃｔｏｒａｌ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｗｅｄｅｎ，１９９９，ＩＳＢＮ  ９１−６２８−３５９８−Ｘ）。
【実施例１】
【００５４】
（細胞増殖）
１００ｍｌの発酵培地を含有する５００ｍｌの振盪スラスコ（３７℃、１６０ｒｐｍ、９ｈ）中で、プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を２（ＯＤ６００ｎｍ）の光学密度まで増殖させた。この一晩培養物の各々１０ｍｌを用いて、各々が１００ｍｌの発酵培地を含む４個の５００ｍｌの振盪フラスコに接種して、細胞をさらに９時間（３７℃、１６０ｒｐｍ）、６．５の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで増殖させた。この培養物の全て（４００ｍｌ）を用いて、１０Ｌの発酵培地を含む１５Ｌの発酵槽（Ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｘ）に接種した。この細胞を８．５時間（３７℃、６００ｒｐｍ）、１２．５の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで増殖させた。発酵の間、１Ｍ  ＮａＯＨの添加によってこの培地のｐＨを７に保ち、そしてときおりアデカノール（旭電化工業株式会社）を添加することによって、発泡を阻害した。１０Ｌ  の細胞培養物を無菌の配管を通して、４００Ｌの発酵培地を含む７８４Ｌの発酵槽（Ｂｅｌａｃｈ  ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ  ＡＢ（スウェーデン、ストックホルム））中にポンピングした。この細胞を１０時間（３７℃）、１３の光学密度（ＯＤ６００ｎｍ）まで増殖させた。発酵の間、５Ｍ  ＮａＯＨの添加によってこの培地のｐＨを７に保ち、そしてアデカノールの添加によって、発泡を阻害した（コントロールユニット）。３．５ｋｇのデキストロースを含有する８Ｌの水をまた、培養の間発酵槽中にポンピングした（供給バッチ、コントロールユニット）。酸素要求によって撹拌速度をコントロールした。１．２Ｌ／分の供給速度に操作したシャープレス遠心分離において１５０００ｒｐｍでの遠心分離によって細胞を収集した。得られた細胞ペーストを５ｇ、２５ｇ、及び３００ｇのアリコートとして−８０℃で貯蔵した。
【実施例２】
【００５５】
（細胞溶解）
以下のようなアルカリ溶解方法によって細胞溶解を行なった：
実施例１からの５ｇの細胞ペーストを解凍して、穏やかなボルテックスによって、３６ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）６１ｍＭグルコース、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に完全に再懸濁した。磁気撹拌装置を備えたプラスチックビーカーに細胞懸濁液を移して、７８ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ含有１％ＳＤＳを添加して、穏やかな撹拌を室温で７分間継続した。このインキュベーション期間後に、５９ｍｌの冷（５℃）３Ｍ  ＫＡｃ（ｐＨ５．５）を添加して、その溶液を氷浴中で２０分間、磁気撹拌によって穏やかに混合した。形成された白色沈殿物をＳｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローター中での４℃で１００００ｒｐｍの３０分間の遠心分離によって除去した。この上清を最後にナイロンネット（Ｆａｌｃｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒａｉｎｅｒ、孔径３５μｍ）を通して濾過した。
【００５６】
（実施例２．１  ４℃での保管による清澄化溶解物の事前処理）
実施例２からの清澄化溶解物を４℃で６日間保管した。形成された沈殿物をＳｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローター中での４℃で１００００ｒｐｍの３０分間の遠心分離によって除去した。
【００５７】
（実施例２．２  ゼオライトによる清澄化溶解物の事前処理）
固体ゼオライトＹ（モル比４３０のＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３を有するゼオライトＹは、東ソー株式会社から入手した）と２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）及びＮａＣｌとを混合することによって、ゼオライト上清（１６０ｍｇ／ｍｌ）を調製した。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの最終濃度は２ｍＭであって、ＮａＣｌ濃度は０．２Ｍであった。２０分間の穏やかな混合の間に上清を室温でインキュベートした。次いで、５２．５ｍｌのゼオライト上清を、実施例２に記載されるとおり調製した１０５ｍｌの清澄化溶解物に添加して、６０秒間混合し、次いで１３０００×ｇで４℃で１０分間遠心分離した。この上清を収集して、使用するまで冷蔵庫に保管した。
【実施例３】
【００５８】
（プラスミドＤＮＡの調製）
実施例１からの細胞ペーストを解凍して、プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａキット（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ（ドイツ、ヒルデン））によって、製造業者の指示に従って精製した。
【００５９】
総プラスミドサイズ６．１ｋｂｐを与える、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ由来の３．４ｋｂｐのインサート（ＪＶ４−ｄｍｇＡ−ｄｅｍＡ遺伝子）を有するｐＵＣ  １９（２．７ｋｂｐ）からなる純粋なプラスミド調製物（ｐＪＶ４，５０μｇ／ｍｌ）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）から入手した。
【実施例４】
【００６０】
（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００カラムにおける群分離による解析）
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−５００ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））をＸＫ  １６／２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））に充填して、ＡＫＴＡ（商標）ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））に取り入れた。このカラムを２Ｍ  ＫＡｃ（ｐＨ５．５）で平衡化して、１ｍｌのサンプルを注入して、１ｍｌ／分の流速で泳動した（３０ｃｍ／ｈ）。この溶出したピークを２６０ｎｍ及び２８０ｎｍで検出した。
【実施例５】
【００６１】
（ゲル電気泳動による解析）
ＴＢＥ緩衝液（０．０８９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中において０．７％アガロースゲル上でゲル電気泳動を行なった。１５μｌのサンプルを各々のウェルにロードして、電気泳動用電源（ＥＰＳ  ３０１，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））によって電力を供給したＨｏｅｆｅｒ（商標）ＨＥ３３  Ｍｉｎｉ水平サブマリンユニット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ））上で６０Ｖで６０分間、このサンプルを泳動した。泳動後、１ｍｌ当たり１．５μｇ臭化エチジウムを含有する１００ｍｌのＴＢＥ緩衝液にゲルを浸漬することによって、このアガロースゲルを臭化エチジウムで染色した。Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国カリフォルニア州サンレアンドロ）のゲルドキュメンテーションソフトウェアＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ  ２２００  ｖ５．５を用いて、このアガロースゲルを解析して写真撮影した。
【実施例６】
【００６２】
（核酸上の負電荷の量の決定）
２６０ｎｍで吸光度を測定すること、及び１リン酸基について計算されるようにモル吸光係数６５００Ｍ−１ｃｍ−１を仮定することによって核酸の濃度を決定した。核酸の濃度は、リン酸基の濃度、すなわち負電荷の濃度として示される。
【実施例７】
【００６３】
（ポリカチオン性沈殿剤ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルジアリルアンモニウム）クロライドとプラスミドＤＮＡ又はＲＮＡとによって形成される複合体の溶解度）
実施例３に記載されるように調製した０．１ｍｌのプラスミドＤＮＡ溶液（ｐＪＶ４又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ，６ｋｂｐ）又は０．１ｍｌのＲＮＡ溶液（Ｓｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス）のパン酵母より）を０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で３Ｍ酢酸カリウム溶液（ｐＨ５．５）及びポリカチオン溶液（２ｍＭの濃度で２〜５０μｌ（対応するモノマー濃度に基づく））と混合した。最終容積は１．０ｍｌであって、最終酢酸カリウム濃度は１Ｍであった。少なくとも１分間の激しい振盪及び１４１００ｇで１０分間の遠心分離後、上清中の残留する核酸の量（２６０ｎｍでの吸光度）を測定することによって、多価電解質複合体の形成をモニターした。この結果を溶液中に残留する核酸対電荷の比［＋］／［−］として図１に示す。
【実施例８】
【００６４】
（ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルジアリルアンモニウム）クロライドによる「人為的（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）」清澄化アルカリ溶解物からのプラスミドＤＮＡの分離）
０．７５ｍｌのプラスミドＤＮＡ溶液（ｐＪＶ４，実施例３に記載のとおり調製）を０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度で、０．０７５ｍｌ  ＲＮＡ溶液（Ｓｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス）、パン酵母から）を１０ｍｇ／ｍｌで、０．５ｍｌ  ３Ｍ酢酸カリウム溶液（ｐＨ５．５）及び０．１７５ｍｌ蒸留水を、０．０８ｍｌ  ２ｍＭ（対応する単量体濃度に基づく）のポリカチオン性沈殿剤（［＋］／［−］＝１．４に相当）と激しく混合した。１４１００ｇで１０分間の遠心分離後、上清を取り出して、ペレットを１．５ｍｌ  ２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）に溶解した。この解析を、実施例４に記載の方法に従って、出発溶液（プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ及び緩衝液（ポリカチオン性沈殿剤の添加なし））、上清及び溶解したペレットで行なった。結果を図２に示す。
【実施例９】
【００６５】
（ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルジアリルアンモニウム）クロライドによって清澄化アルカリ溶解物からプラスミドＤＮＡを分離するときの最適の電荷比の決定）
実施例２．１に従って調製された０．５ｍｌの溶解物に０．５ｍｌの蒸留水を添加した。この溶液に４．７μｌ  ２ｍＭ（相当する単量体濃度に基づく）のポリカチオン性沈殿剤（［＋］／［−］＝１に相当）を添加した。激しい振盪及び１４１００ｇで１０分間の遠心分離後、上清を新しい試験管に移して、同じ量のポリカチオン性沈殿剤を再度添加した。この手順を４回繰り返した。ブランクとしてプラスミドＤＮＡの溶液及び蒸留水を用いた。全てのペレットを１ｍｌ  ２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）に溶解した。このサンプルを実施例５に記載のとおり、アガロースゲル電気泳動で解析した。
【実施例１０】
【００６６】
（ポリ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルジアリルアンモニウム）クロライドを用いる清澄化アルカリ溶解物からのプラスミドＤＮＡの分離）
０．５ｍｌの清澄化アルカリ溶解物（実施例２．１によって調製された）に、０．４８０ｍｌの蒸留水を添加した。５つの同一のサンプルを、試験管中で、各々に１８．９μｌ  ２ｍＭ（相当する単量体濃度に基づく）のポリカチオン溶液（［＋］／［−］＝４に相当）を添加することによって調製した。激しい混合及び１４１００ｇで１０分間の遠心分離後、５つの上清を新しい試験管に移した。この上清に、４．７、９．７、１４．２、１８．９及び２３．６μｌ（［＋］／［−］＝１、２、３、４、５に相当）のポリカチオン溶液をそれぞれ２ｍＭの濃度で添加した。ブランクとして清澄化アルカリ性溶解物の溶液及び蒸留水を用いた。全てのペレットを１ｍｌ  ２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）に溶解した。このサンプルを実施例５に記載のとおり、アガロースゲル電気泳動で解析した。
【実施例１１】
【００６７】
（ＭｉｎｉＱカラムでの陰イオン交換クロマトグラフィーによる解析）
ＡＫＴＡ（商標）エクスプローラーシステムに組み込み、そして０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で平衡化したＭｉｎｉＱカラム（４．６×５０ｍｍ）（全てＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（スウェーデン、ウプサラ）から入手）上での解析的イオン交換クロマトグラフィーによって、スーパーコイルプラスミドの回収を決定した。清澄化アルカリ性溶解物サンプルにおけるプラスミドの定量におけるＲＮＡの干渉を回避するために、これらをＲＮａｓｅ（１００μｇ／ｍｌ）とともに解析の前に１５分間インキュベートした。１００μｌのサンプルをカラムに注射し、次いで１８カラム容積の０．５〜０．８Ｍ  ＮａＣｌ勾配を適用することによって、吸着された核酸を溶出させた。カラムからの溶出物を２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおいてＵＶ吸光度によってモニターした。この解析は０．４ｍｌ／分の流速で行なった。
【実施例１２】
【００６８】
（ゼオライト処理した清澄化アルカリ溶解物からのプラスミドＤＮＡの選択的沈殿）
ゼオライト処理溶解物（実施例２．２）に、１１．１ｍｌ  ２ｍＭ  ＰＤＭＤＡＡＣ（相当する単量体濃度に基づく）を添加した。水の添加によって最終容積を２１０ｍｌに設定した。このサンプルを約６０秒間混合して、１４１００ｇで１０分間（１５〜２０℃）遠心分離した。上清をデカントした後、このペレットを２Ｍ  ＮａＣｌを含有する５ｍｌ  ２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中に再溶解した。クロマトグラフィー解析（実施例４及び１１）を行なって、プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡの含量を決定したが、タンパク質についてはＢＣＡ法を用いた（Ｓｉｇｍａ手順番号ＴＰＲＯ−５６２）。清澄化した溶解物、ゼオライト処理した溶解物及び再溶解したペレットをこれらの方法によって解析した。この解析の結果を表１に提示する。
【００６９】
【表１】
2005531329.tif 000003
サイズ排除クロマトグラフィー（実施例４）によって、又は陰イオン交換クロマトグラフィー（実施例１１）によって、プラスミドＤＮＡ及びＲＮＡを解析した。ＢＣＡ法（Ｓｉｇｍａ手順番号ＴＰＲＯ−５６２）によってタンパク質を解析した。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】異なるプラスミド又はＲＮＡを用いたポリカチオン性沈殿剤による、本発明に従って形成された複合体の溶解度対異なる電荷比［＋］／［−］を示す溶解度の図である。
【図２】１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）において行なったプラスミドＤＮＡ及びＲＮＡでのモデル実験の結果のクロマトグラフィー解析を示す。
【図３】清澄化されたアルカリ性溶解物を含む同じプラスミドＤＮＡに対する引き続くポリカチオン性沈殿剤の添加によって得られたアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図４】プラスミドＤＮＡが２倍希釈された清澄化アルカリ性溶解物から選択的に沈殿され得る方法を実証するアガロースゲル電気泳動の結果を示す。
【図５】溶液中の核酸の割合（Ｙ軸）対塩濃度（Ｘ軸）のプロットであって、外部の塩濃度に対する、ＤＮＡ／ＰＤＭＤＡＡＣ（１）、ＤＮＡ／２，５−イオネンブロミド（２）及びＤＮＡ／１０，１０−イオネンブロミド（３）システムの上清に残留するＤＮＡ部分の依存を示す。
【図６】異なる塩濃度における可溶性核酸対荷電の比を示す。
【図１】
2005531329.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2005531329.tif 000009
【国際調査報告】
2005531329.tif 000010
2005531329.tif 000011
2005531329.tif 000012
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