(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの希突起神経膠細胞産生促進因子、特に顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン３、またはインターロイキン５を用いて、多能性神経幹細胞から希突起神経膠細胞を産生する方法に関連する。神経幹細胞は、希突起神経膠細胞促進因子に供される前に、必要に応じて増幅させられ得る。本発明は、少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を哺乳動物に投与することにより、インビボで希突起神経膠細胞を産生する方法を、さらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の多能性神経幹細胞から希突起神経膠細胞を産生する方法であって、該方法は、該多能性神経幹細胞から希突起神経膠細胞の産生をもたらす条件下において、多能性神経幹細胞と、有効量の少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子とを接触させる工程を包含し、ここで該希突起神経膠細胞促進因子は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン５（ＩＬ−５）からなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記希突起神経膠細胞促進因子が、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記希突起神経膠細胞促進因子が、ＧＭ−ＣＳＦである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性神経幹細胞をトリヨードチロニンに接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記多能性神経幹細胞が、細胞培養物として提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞培養物が哺乳動物脳組織を用いて調製される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物脳組織が非胚性哺乳動物から得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物脳組織が成体哺乳動物から得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記脳組織が脳室下領域から得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性神経幹細胞が哺乳動物内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性神経幹細胞が哺乳動物の脳室下領域にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多能性神経幹細胞がヒト細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、げっ歯類細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞および非ヒト霊長類細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多能性神経幹細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記多能性神経幹細胞を、有効量の少なくとも１つの、多能性神経幹細胞の数を増加し得る生物学的因子に接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的因子が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エストロゲン、卵巣ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、およびインシュリン様増殖因子１からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的因子がＥＧＦ５１Ｎである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記多能性神経幹細胞が前記希突起神経膠細胞促進因子および前記生物学的因子に同時に接触される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記多能性神経幹細胞が、前記希突起神経膠細胞促進因子に先立って前記生物学的因子に接触される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
請求項４に記載の方法により産生される前記希突起神経膠細胞を含む組成物。
【請求項２０】
薬学的に受容可能な賦形剤および／または薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
哺乳動物に希突起神経膠細胞を提供する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）多能性神経幹細胞を該哺乳動物に導入し、そして、該神経幹細胞からの希突起神経膠細胞形成をもたらす条件下において、有効量の少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を該哺乳動物に投与する工程；または
（ｂ）該哺乳動物に有効量の請求項２０に記載された組成物を導入する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記（ａ）が、前記神経幹細胞を、有効量の少なくとも１つの、神経幹細胞の数を増加し得る生物学的因子に接触させる工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記神経幹細胞が、前記哺乳動物に導入されることに先立って、前記生物学的因子に接触される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物学的因子が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エストロゲン、プロラクチン、成長ホルモン、およびインシュリン様増殖因子１からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記生物学的因子がＥＧＦ５１Ｎである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記（ａ）が、前記多能性神経幹細胞をトリヨードチロニンに接触させる工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物が、脱髄疾患を被る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記脱髄疾患が、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、びまん性脳硬化症、壊死性出血性脳炎、および白質萎縮症からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物における脱髄疾患を処置または回復させる方法であり、該方法は、該哺乳動物に、有効量の少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を投与する工程を包含し、ここで該希突起神経膠細胞促進因子は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン５（ＩＬ−５）からなる群から選択される、方法。
【請求項３２】
該希突起神経膠細胞促進因子が該哺乳動物の脳室に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
該希突起神経膠細胞促進因子が該哺乳動物の側脳室に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物に、有効量の少なくとも１つの、神経幹細胞の数を増加し得る生物学的因子を投与する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物学的因子が、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エストロゲン、卵巣ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、およびインシュリン様増殖因子１からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記生物学的因子がＥＧＦ５１Ｎである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
トリヨードチロニンを前記哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記脱髄疾患が、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、びまん性脳硬化症、壊死性出血性脳炎、および白質萎縮症からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記脱髄疾患が多発性硬化症である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国仮特許出願第６０／３９９，１９２号の利益を主張し、その全体の開示内容は、本明細書中において参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、希突起神経膠細胞産生促進因子、特に顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、インターロイキン３、あるいはインターロイキン５を用いて、希突起神経膠細胞を産生する方法に関連する。
【０００３】
（参考文献）
【０００４】
【化１−１】
2005534302.tif 000002
【０００５】
【化１−２】
2005534302.tif 000003
【０００６】
【化１−３】
2005534302.tif 000004
本出願において引用される全ての出版物、特許および特許出願は、本明細書中において、個々の出版物、特許出願または特許の開示内容が、その全体が参考として援用されることが具体的および個別に示されたのと同様の範囲で、その全体が参考として援用されている。
【背景技術】
【０００７】
（発明の背景）
多くの脊椎動物ニューロンの軸索はミエリン鞘によって絶縁されており、これは、軸索が活動電位を伝導し得る速度を大きく増加させる。ミエリンは、特殊なグリア細胞、すなわち末梢神経系のシュワン細胞および中枢神経系の希突起神経膠細胞により形成される細胞の鞘である。これらのグリア細胞は軸索の周りに固い螺旋状に、層の上に層を巻きつけており、これによって軸索膜を絶縁している。しかしながら、その鞘は規則正しく間隔を空けたランビエ絞輪において中断され、ここで膜の脱分極が起こり得る。結果として、１つの絞輪における膜の脱分極は、直ちに隣の絞輪に広がる。したがって、能動的興奮は絞輪における軸索の原形質膜の小領域に制限されているため、活動電位は絞輪から絞輪へ跳躍することによりミエリン化された軸索に沿って伝播し、それによって、信号の伝達を加速し、ならびに代謝エネルギーを節約する。
【０００８】
ミエリン形成の重要性は、中枢神経系のいくつかの領域でミエリン鞘が未知の機構によって破壊される、多発性硬化症のような脱髄疾患によって証明される。脱髄化が起こる場合、神経インパルスの伝播は著しく遅くなり、これは破壊的な神経性の結果をもたらす。例えば、多発性硬化症の共通の症状としては、筋肉の衰弱、緩慢な動作、痙攣、重篤な疲労もしくは無力性の疲労、視覚障害、疼痛、知覚麻痺、刺痛、泌尿器機能障害、性的機能障害、および精神障害が挙げられる。
【０００９】
多発性硬化症の現在の処置は、疾患の根本原因である脱髄化を解消することよりはむしろ、病気の進行を遅らせること、ならびに症状もしくは医学的合併症の緩和に関与する。しかしながら、多くの証拠が、脱髄化ニューロンはインサイチュで再ミエリン化し得ることを示している。多発性硬化症においては、脱髄化と再ミエリン化のサイクルが起こるｙようであり、グリア細胞の移植は潜在的な治療として研究されている（例として、Ｓｍｉｔｈら、２００１；Ｂｒｉｅｒｌｅｙら、２００１；Ｋｏｈａｍａら、２００１を参照のこと）。それにもかかわらず、移植のために多数のミエリン形成細胞を得ることには大きな障害が依然として残っている。グリア前駆細胞は移植のために利用可能である；例えば、Ｏ−２Ａ細胞はインビトロで希突起神経膠細胞とＩＩ型星状細胞に成長する。Ｏ−２Ａ細胞は培養液中で増殖（ｇｒｏｗ）し得るが、限られた数の分裂のみ可能である（Ｒａｆｆ、１９８９）。さらに、動物に注入されたＯ−２Ａ細胞は分裂し続けないようであり、そのため多数の細胞が移植される必要がある。したがって、再ミエリン化のための移植片の改良された供給源が望まれる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、希突起神経膠細胞促進因子、特に顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、またはインターロイキン５（ＩＬ−５）を用いて、多能性神経幹細胞から希突起神経膠細胞を産生する方法に関する。本発明者らは本明細書中において、ＧＭ−ＣＳＦのようなこれらの因子が、神経幹細胞から産生される希突起神経膠細胞のパーセンテージを有意に増加させたことを示す。ＧＭ−ＣＳＦが神経幹細胞の増殖培地（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）に存在した場合、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）する神経幹細胞は減少し、一方希突起神経膠細胞は増加した。したがって、ＧＭ−ＣＳＦは神経幹細胞の発生運命決定を、希突起神経膠細胞系統に転向し得る。希突起神経膠細胞産生を最大化するため、まず神経幹細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を促進し、続いて増幅（ｅｘｐａｎｄ）した神経幹細胞を希突起神経膠細胞形成を増加させるための希突起神経膠細胞促進因子に供することが、好ましい。
【００１１】
本発明は、少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を哺乳動物に投与することにより、インビボで希突起神経膠細胞を産生する方法を、さらに提供する。この方法は、ミエリン形成、特に脱髄疾患を有する哺乳動物における再ミエリン化を促進するために使用され得る。したがって、本発明はまた、希突起神経膠細胞促進因子を用いて脱髄疾患を処置または回復させる方法を提供する。
【００１２】
したがって、本発明の１局面は、哺乳動物の多能性神経幹細胞から希突起神経膠細胞を産生する方法を提供し、この方法は、多能性神経幹細胞を、多能性神経幹細胞から希突起神経膠細胞の産生をもたらす条件下で、有効量の少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子に接触させる工程を包含する。希突起神経膠細胞促進因子は、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、およびＩＬ−５からなる群から選択される。希突起神経膠細胞促進因子は、さらに好ましくはＧＭ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦであり、そして最も好ましくはＧＭ−ＣＳＦである。
【００１３】
神経幹細胞は任意の哺乳動物の神経幹細胞であり得、これらとしては、例えば、ヒト細胞、ネコ科細胞、イヌ科細胞、げっ歯類細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、および非ヒト霊長類細胞が挙げられる。神経幹細胞は、好ましくはヒト細胞である。
【００１４】
本方法は、インビトロまたはインビボで実施され得る。インビトロ法に関しては、神経幹細胞は細胞培養物として供給され得、希突起神経膠細胞促進因子は培養培地に含まれ得る。培養物は、好ましくは、任意の哺乳動物（胚性、新生仔、および成体哺乳動物を含む）から得られた哺乳動物の脳組織を用いて調製される。特に、脳組織は非胚性哺乳動物、好ましくは成体哺乳動物より得られる。脳組織は好ましくは、前脳の脳室下領域（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）である。
【００１５】
インビボ法に関しては、神経幹細胞は哺乳動物内、特に脳室下領域におかれる。哺乳動物は、好ましくは、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、びまん性脳硬化症、壊死性出血性脳炎、および白質萎縮症からなる群から選択される疾患のような脱髄疾患を有する。疾患は、好ましくは、多発性硬化症である。
【００１６】
必要に応じて、神経幹細胞はまた、少なくとも１つの、多能性神経幹細胞の数を増加させ得る生物学的因子に供される。生物学的因子は、好ましくは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、エストロゲン、卵巣ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、およびインシュリン様増殖因子１からなる群から選択される。神経幹細胞は好ましくは、希突起神経膠細胞促進因子に供される前に、神経幹細胞の数を増加させるため、まず生物学的因子に接触される。あるいは、神経幹細胞は生物学的因子および希突起神経膠細胞促進因子に同時に接触され得る。
【００１７】
さらに、希突起神経膠細胞の分化、成長、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、または生存を促進する他の因子がまた、希突起神経膠細胞促進因子と組み合わせて使用され得る。そのような他の因子の好ましい例は、トリヨードチロニンである。
【００１８】
本発明の別の局面は、少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を用いて神経幹細胞から産生される希突起神経膠細胞を含む組成物を提供する。その組成物は、必要に応じて、薬学的組成物を形成するために、薬学的に受容可能な賦形剤および／または薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。
【００１９】
また、希突起神経膠細胞を哺乳動物に供給する方法が提供され、該方法は、
（ａ）多能性神経幹細胞を哺乳動物に導入し、そして、神経幹細胞からの希突起神経膠細胞形成をもたらす条件下において、有効量の少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を哺乳動物に投与する工程；または
（ｂ）哺乳動物に有効量の上記の薬学的組成物を導入する工程、
を包含する。
【００２０】
方法（ａ）が採用される場合、神経幹細胞は、上記導入の前にかまたは導入が生じた後のいずれかに、少なくとも１つの、神経幹細胞の数を増加し得る生物学的因子にさらに接触され得る。また、生物学的因子が移植の前および後の両方に使用され得ることも意図される。その因子は、移植前に培養培地に添加され得、かつ／または移植後に哺乳動物に投与され得る。
【００２１】
本発明の別の局面は、哺乳動物において脱髄疾患を処置または回復させる方法を提供し、該方法は、哺乳動物に、有効量の少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を投与する工程を包含する。哺乳動物は、好ましくは、多発性硬化症、急性播種性脳脊髄炎、びまん性脳硬化症、壊死性出血性脳炎、および白質萎縮症からなる群から選択される疾患のような脱髄疾患を有する。疾患は、好ましくは、多発性硬化症である。哺乳動物はさらに、少なくとも１つの、神経幹細胞の数を増加し得る生物学的因子、および／または少なくとも１つの、希突起神経膠細胞の分化、成長、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、または生存を刺激することが知られている因子を受容する。希突起神経膠細胞促進因子、生物学的因子、および／または他の因子は、全身性（例えば皮下に）またはインサイチュ（例えば、脳、特に側脳室への投与）のような、哺乳動物内において多能性神経幹細胞との因子および／または薬剤の接触をもたらす任意の様式で投与され得る。
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子、特に顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン５（ＩＬ−５）を用いて、多能性神経幹細胞から希突起神経膠細胞を産生する方法に関する。本発明者らは本明細書中において、ＧＭ−ＣＳＦが、神経幹細胞から産生される希突起神経膠細胞のパーセンテージを有意に増加させたことを示した。ＧＭ−ＣＳＦが神経幹細胞の増殖培地（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）に存在した場合、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）する神経幹細胞は減少し、一方希突起神経膠細胞は増加した。したがって、ＧＭ−ＣＳＦは神経幹細胞の発生運命決定を、希突起神経膠細胞系統に転向し得る。希突起神経膠細胞産生を最大化するため、まず神経幹細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）を促進し、続いて増幅（ｅｘｐａｎｄ）した神経幹細胞を希突起神経膠細胞形成を増加させるための希突起神経膠細胞促進因子に供することが、好ましい。
【００２３】
本発明は、少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を哺乳動物に投与することにより、インビボで希突起神経膠細胞を産生する方法を、さらに提供する。この方法は、ミエリン形成、特に脱髄疾患を有する哺乳動物における再ミエリン化を促進するために使用され得る。したがって、本発明はまた、少なくとも１つの希突起神経膠細胞促進因子を用いて脱髄疾患を処置または回復させる方法を提供する。
【００２４】
本発明をさらに詳細に記述するのに先立って、本出願において使用される用語を、他に断りのない限り、以下のように定義する。
【００２５】
（定義）
「多能性神経幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」もしくは「神経幹細胞」は、神経細胞系統の幹細胞である。幹細胞はそれ自身を再生し得る細胞である。いいかえれば、幹細胞が分裂する場合、生じた娘細胞の少なくともいくつかもまた、やはり幹細胞である。神経幹細胞とそれらの子孫は、神経細胞系統における全てのタイプの細胞（ニューロン、星状細胞、希突起神経膠細胞（星状細胞および希突起神経膠細胞はまとめてグリアもしくはグリア細胞と呼ばれる）が挙げられる）に分化し得る。したがって、神経幹細胞は多能性神経幹細胞である。多能性神経幹細胞は、例えば、米国特許第５，７５０，３７６号；同第５，９８０，８８５号；および同第５，８５１，８３２号に記載されている。
【００２６】
成体神経幹細胞とは、好ましくは、成体哺乳動物の前脳の脳室下領域（ＳＶＺ）にあるかまたは由来する神経幹細胞を指し、これらは、成体海馬の増殖細胞（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）とは異なる。
【００２７】
本明細書中において記載される神経幹細胞の「子孫」とは、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）または分化の結果として神経幹細胞から由来するあらゆる細胞を指す。
【００２８】
「ニューロスフェア」は、クローン性増幅（ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）の結果として単一の神経幹細胞から由来する細胞群である。初代ニューロスフェアは、神経幹細胞を含む脳組織を初代培養として平板培養することにより生成される。ニューロスフェアを形成するように神経幹細胞を培養する方法は、例として、米国特許第５，７５０，３７６号に記載されている。２代目ニューロスフェアは、初代ニューロスフェアを解離し、個々の解離された細胞に再度ニューロスフェアを形成させることによって生成され得る。
【００２９】
「希突起神経膠細胞促進因子」は、多能性神経幹細胞からの希突起神経膠細胞形成を増加させ得る物質である。希突起神経膠細胞促進因子は、好ましくは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン５（ＩＬ−５）からなる群から選択される。
【００３０】
「顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子」、もしくは「ＧＭ−ＣＳＦ」は、（１）ネイティブヒトＧＭ−ＣＳＦと実質的配列同一性を共有し；かつ、（２）ネイティブヒトＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を保有するタンパク質因子である。
【００３１】
ネイティブ哺乳動物タンパク質と「実質的配列同一性」を共有するタンパク質は、少なくとも１つの、アミノ酸レベルでネイティブ哺乳動物タンパク質と少なくとも約３０％同一なポリペプチドからなる。そのタンパク質は、好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％、そして最も好ましくは、少なくとも約８０％、アミノ酸レベルでネイティブタンパク質と同一である。したがって、そのタンパク質は、ネイティブタンパク質の改変体もしくはアナログである。例えば、ネイティブヒトＧＭ−ＣＳＦと実質的配列同一性を共有するタンパク質は、少なくとも１つの、アミノ酸レベルでネイティブヒトＧＭ−ＣＳＦと少なくとも約３０％同一なポリペプチドからなる。そのタンパク質は、好ましくは、少なくとも約４０％、より好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約７０％、そして最も好ましくは、少なくとも約８０％、アミノ酸レベルでネイティブヒトＧＭ−ＣＳＦと同一である。したがって、「ＧＭ−ＣＳＦ」という用語は、ネイティブＧＭ−ＣＳＦの、欠失性、挿入性、または置換性の変異体であるＧＭ−ＣＳＦのアナログを包含する。さらに、「ＧＭ−ＣＳＦ」という用語は、多種由来のＧＭ−ＣＳＦ、天然に存在する改変体、および、それらの異なる翻訳後修飾形態（例えば、グリコシル化形態およびリン酸化形態）を包含する。
【００３２】
ネイティブタンパク質との「パーセント同一性」もしくは「％同一性」という句は、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列とその改変体もしくはアナログの配列とを最もうまく（ギャップも含めて）アラインメントした場合の、改変体もしくはアナログにも見られるネイティブタンパク質中のアミノ酸配列のパーセンテージを指す。パーセント同一性は、ＬＡＬＩＧＮもしくはＢＬＡＳＴのような、当該分野で確立された任意の方法もしくはアルゴリズムによって決定され得る。好ましくは、パーセント同一性を決定にするのにＢＬＡＳＴが使用される。
【００３３】
因子は、それが既知の任意のＧＭ−ＣＳＦレセプターに結合し得る場合、「ＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性」を保有する。
【００３４】
「初代ニューロスフェア」は、脳組織を培養することによって生成されるニューロスフェアである。代表的には、脳組織は、適切な培地で培養される前に解剖し、そして機械的に解離され、そしてニューロスフェアを形成し得る。例示的方法は、例えば、米国特許第５，７５０，３７６に記載されている。
【００３５】
「２代目ニューロスフェア」は、初代ニューロスフェアを解離し（継代し）、そして解離された細胞を、単一細胞からのニューロスフェアの形成をもたらす条件下で培養することにより生成される、ニューロスフェアである。
【００３６】
「哺乳動物」とは、哺乳動物のファミリーの任意のメンバーである。哺乳動物は、好ましくは、霊長類、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、およびブタ）であり、そして最も好ましくは、ヒトである。
【００３７】
「脱髄疾患」は、脱髄化より引き起こされるか、または脱髄化に関連する、疾患または医学的状態である。これらの疾患もしくは状態の例としては、多発性硬化症（多発性硬化症、急性多発性硬化症、視神経脊髄炎（デビック病）の、再発性および慢性進行形態が挙げられる）、びまん性脳硬化症（シルダーびまん性軸周囲性脳炎およびバロー同心性硬化症が挙げられる）が挙げられる。脱髄疾患はまた、脱髄がウイルス感染、ワクチン、遺伝病によって引き起こされる、種々の疾患を含む。これらの脱髄疾患の例としては、急性播種性脳脊髄炎（麻疹、水痘、風疹、インフルエンザ、もしくは流行性耳下腺炎の後；または、狂犬病もしくは天然痘予防接種の後に発症する）、壊死性出血性脳炎（出血性白質脳炎を含む）、および白質萎縮症（クラッベ球状細胞白質萎縮症（Ｋｒａｂｂｅ’ｓ  ｇｌｏｂｂｏｉｄ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、異染性白質萎縮症、副腎白質萎縮症、副腎脊髄神経障害、副腎脊髄神経障害、ペリツェーウス−メルツバッヒャー（Ｐｅｌｉｚａｅｕｓ−Ｍｅｒｚｂａｃｈｅｒ）白質萎縮症、キャナヴァン病、およびアレグザンダー病が挙げられる）が挙げられる。脱髄疾患は、好ましくは、多発性硬化症もしくはびまん性脳硬化症であり、そして最も好ましくは、多発性硬化症である。
【００３８】
「処置または回復」とは、疾患または医学的状態の症状の軽減または完全な排除を意味する。
【００３９】
「有効量」は、意図された目的を達成するのに十分な治療剤の量である。所定の治療剤の有効量は、その薬剤の性質、投与の経路、その治療剤を受容する動物の大きさや種、および投与の目的のような要因によって変動する。個々の場合における有効量は、当該分野で確立された方法に従って、当業者により経験的に決定され得る。
【００４０】
（方法）
多能性神経幹細胞の単離およびインビトロ培養の方法は、最近開発された（例えば、米国特許第５，７５０，３７６号；同第５，９８０，８８５号；同第５，８５１，８３２号を参照のこと）。インビトロでの多能性神経幹細胞の単離および培養に胎仔の脳が使用され得ることが発見された。さらに、成体脳細胞は脳細胞を複製および再生し得ないと長く信じられていたのとは対照的に、神経幹細胞が成体哺乳動物の脳からも単離され得ることが分かった。これらの幹細胞は、胎生由来および成体由来のいずれも、自己複製し得る。子孫細胞は再び増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）し得るか、もしくは、ニューロン、星状細胞、および希突起神経膠細胞を含む、神経細胞系統のあらゆる細胞に分化し得る。
【００４１】
神経幹細胞から分化する細胞のほとんどは星状細胞である。したがって、神経幹細胞は全種類の成熟もしくは未成熟な神経細胞の良い供給源を提供するにもかかわらず、脱髄疾患のために希突起神経膠細胞を産生するのに神経幹細胞を使用することは、通常効果的な方法ではない。本発明では、しかしながら、神経幹細胞からの希突起神経膠細胞産生の効率を有意に増加させる方法を提供する。実施例１に示すように、神経幹細胞を顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で分化させた場合、希突起神経膠細胞のパーセンテージは数倍に増加した。したがって、ＧＭ−ＣＳＦは、神経幹細胞からの希突起神経膠細胞産生を促進するのに使用され得る。特に、ＧＭ−ＣＳＦは希突起神経膠細胞もしくはそれらの前駆体のための生存因子として使用され得る（実施例２）。
【００４２】
ＧＭ−ＣＳＦは神経幹細胞を増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）するように刺激しない。事実、神経幹細胞の増殖培地（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）へのＧＭ−ＣＳＦの含有は、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）した神経幹細胞の自己増幅（ｓｅｌｆ−ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を阻害した（実施例３）、これはおそらく、神経幹細胞の早熟性の分化が誘導されたことによる。実際、増殖シグナル（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）（この場合、上皮増殖因子）の存在下でＧＭ−ＣＳＦにさらされた神経幹細胞は、分化培地に移されたすぐ後に、希突起神経膠細胞前駆細胞のマーカーを発現した。このことは、これらの細胞が増殖培地（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａ）中で希突起神経膠細胞系統にコミットされていたことを示唆している。これらの結果と合わせて、ＧＭ−ＣＳＦはニューロン系統へのコミットを阻害した（実施例４）。
【００４３】
本発明は、したがって、ＧＭ−ＣＳＦのような希突起神経膠細胞促進因子を用いて、神経幹細胞からの希突起神経膠細胞産生を増大させる方法を提供する。好ましくは、神経幹細胞は、最初に希突起神経膠細胞促進因子のない状態で増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）または増幅（ｅｘｐａｎｄ）させられ、そして神経幹細胞の増幅（ｅｘｐａｎｄ）した集団はその後、希突起神経膠細胞形成を誘導するため、希突起神経膠細胞促進因子とともにインキュベートされる。神経幹細胞を増幅（ｅｘｐａｎｄ）し得る任意の薬剤がこの実施例において使用され得る。これらの薬剤は、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）を刺激し得るか、分化を阻害し得るか、もしくは神経幹細胞の細胞死を防ぎ得る。例示的な薬剤としては、これらに制限されないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、エストロゲン、卵巣ホルモン、プロラクチン、成長ホルモン、インシュリン様増殖因子１、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が挙げられる。さらなる薬剤は、例えば神経幹細胞の培養物への候補薬剤の添加、およびその薬剤の存在下で形成されたニューロスフェア数の評価のような、当該分野で公知の方法により同定され得る（例として、米国特許第５，７５０，３７６号；同第５，９８０，８８５号；同第５，８５１，８３２号を参照のこと）。
【００４４】
上述のネイティブ哺乳動物薬剤と実質的配列同一性を共有し、かつ神経幹細胞数を増加させ得る、これらの薬剤の改変体もしくはアナログが本出願で使用され得ることを、述べておくべきである。例えば、ネイティブ哺乳動物ＰＡＣＡＰの２形態、ＰＡＣＡＰ３８およびＰＡＣＡＰ２７がある。神経幹細胞数を増加させ得、かつＰＡＣＡＰ３８もしくはＰＡＣＡＰ２７のいずれかと、実質的配列同一性を共有する任意の改変体もしくはアナログは、本発明における使用に適している。特に有用なのは、例えば、米国特許第５，１２８，２４２号；同第５，１９８，５４２号；同第５，２０８，３２０号；同第５，３２６，８６０号；同第５，６２３，０５０号；同第５，８０１，１４７号および同第６，２４２，５６３号に開示されているアナログおよび改変体である。
【００４５】
同様に、神経幹細胞数を増加し得るネイティブ哺乳動物ＥＧＦと実質的配列同一性を共有するＥＧＦ改変体もしくはアナログは、本出願で使用され得る。これらのＥＧＦ改変体およびアナログとしては、これらに制限されないが、２つのＣ末端アミノ酸の欠失、および５１位での、アスパラギン、グルタミン、セリン、もしくはアラニンのような中性アミノ酸置換を有する、組み換え改変ＥＧＦ（特に、５１位にアスパラギンもしくはグルタミンをそれぞれ有する、ＥＧＦ５１ＮもしくはＥＧＦ５１Ｑ；ＷＯ０３／０４０３１０）、１６位でＨｉｓ残基が中性もしくは酸性アミノ酸に置き換わっているＥＧＦムテイン（ＥＧＦ−Ｘ１６）（米国特許第６，１９１，１０６号）、ネイティブＥＧＦのアミノ酸残基が欠失している、ＥＧＦの５２位アミノ酸欠失改変体（ＥＧＦ−Ｄ）、Ｎ末端残基および２つのＣ末端残基（Ａｒｇ−Ｌｅｕ）が欠失している、ＥＧＦ欠失変異体（ＥＧＦ−Ｂ）、２１位でＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｄ（ＥＧＦ−Ｃ）、２１位でＭｅｔ残基が酸化されているＥＧＦ−Ｂ（ＥＧＦ−Ａ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ニューレグリン、または上記のいずれかを含む融合タンパク質が挙げられる。他の有用なＥＧＦアナログもしくは改変体は、ＷＯ０３／０４０３１０、ならびに米国特許第６，１９１，１０６号および同第５，５４７，９３５号に記載されている。
【００４６】
特に、プロラクチンとして挙げられるのは、天然に存在するプロラクチン改変体、プロラクチン関連タンパク質、胎盤性ラクトゲン、Ｓ１７９Ｄ−ヒトプロラクチン（Ｂｅｒｎｉｃｈｔｅｉｎら、２００１）、ヒト、他の霊長類、ラット、マウス、ヒツジ、ブタ、およびウシを含む種々の哺乳動物種（ただし、これらに制限されない）由来プロラクチン、および、米国特許第６，４２９，１８６号および同第５，９５５，３４６号に記載されたプロラクチン改変体である。
【００４７】
あるいは、神経幹細胞は、分化させられる前に、コミットされた希突起神経膠細胞前駆細胞の数を増加させるため、希突起神経膠細胞促進因子の存在下で増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）させられ得る。
【００４８】
神経幹細胞培養物から産生された希突起神経膠細胞は、特に、失われたかもしくは機能していない希突起神経膠細胞を補償するために、哺乳動物に（例えば、移植によって）導入され得る。哺乳動物は、好ましくは、ヒト、イヌ科、ネコ科、げっ歯類、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、または非ヒト霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。神経幹細胞は、成体を含む任意の年齢の哺乳動物由来の脳組織から培養され得ることから、自家移植のために、哺乳動物の自身の組織を用いて神経幹細胞を増殖（ｇｒｏｗ）させることが好ましい。特に、移植部位が、脳血管関門のために免疫性拒絶反応がより重篤でない脳である場合、同種および異種移植もまた可能である。
【００４９】
神経幹細胞が哺乳動物に移植され得、そしてインビボで希突起神経膠細胞を形成するように誘導され得ることも、また意図される。したがって、神経幹細胞は、確立された方法を用いて培養で増幅（ｅｘｐａｎｄ）させられ得、哺乳動物に移植され得、そして希突起神経膠細胞を産生する希突起神経膠細胞促進因子とインビボで接触され得る。必要に応じて、移植された神経幹細胞は、上に開示されたような、神経幹細胞の数を増加させることが知られている生物学的因子をその哺乳動物に投与する工程によって、インビボで再度増幅（ｅｘｐａｎｄ）させられ得る。
【００５０】
細胞は、好ましくは、哺乳動物の脳または脊髄中、特に、例えば脱髄化した軸索の周囲のような希突起神経膠細胞が十分でない部位に、導入される。ヒトにおいては、脱髄化の領域は、一般的にプラーク様構造を伴っており、これは磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）で可視化され得る。グリア細胞はその標的ニューロンに移動し得ることが知られているため、細胞はまた、中枢神経系の他の領域にも移植され得る。細胞は、脳梁を通って対向する半球の対応する位置に効率的に移動することが知られているため（Ｌｅａｒｉｓｈら、１９９９）、特に有用なアプローチは、他の半球における、標的障害の「鏡像」位置に移植することである。
【００５１】
希突起神経膠細胞促進因子もしくは生物学的因子は、当該分野で確立された任意の適切な経路、例えば、くも膜下腔内、血管内、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、皮内、皮下、経口、局所、直腸、膣、経鼻、または吸入を含む経路によって、投与され得る。投与経路は主に、薬剤の性質に依存する。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは脳血管関門を通過し得る（ＭｃＬａｙら、１９９７）、ゆえに、これは全身性に、および脳内に投与され得る。好ましい投与方法は、注入（例えば、針やカテーテルによって行われる）もしくは輸液である。
【００５２】
本発明は、希突起神経膠細胞形成をもたらす条件下で哺乳動物に希突起神経膠細胞促進因子を投与することによって、インビボでの希突起神経膠細胞産生を促進する方法を、さらに提供する。結果として生じた希突起神経膠細胞は、哺乳動物中の脱髄化ニューロンを再ミエリン化し得、これによって、哺乳動物の脱髄疾患は処置されるかまたは回復させられ得る。これまでの研究者はＧＭ−ＣＳＦがミエリンの炎症および変性を促進し得ることを示唆したが（Ｂｅ’ｅｒｉら、１９９８；Ｏｕｓｍａｎら、２００１）、本発明者らの結果は、予期せぬことに、ＧＭ−ＣＳＦが希突起神経膠細胞促進因子として有用であることを示す。
【００５３】
本発明がまた、脱髄疾患を防ぐために、このような疾患の危険のある哺乳動物において、使用され得ることが意図される。多発性硬化症の原因は完全には明らかではないが、いくつかの危険因子が同定されている。例えば、多発性硬化症（ＭＳ）は、ＭＳ患者の血族１親等の１〜２％で発症し、そしてある種の組織適合性抗原を有する人々も同様にＭＳと相関がある。したがって、本発明は、高危険群においてＭＳを防ぐために使用され得る。
【００５４】
本発明で有用なＧＭ−ＣＳＦとしては、神経幹細胞からの希突起神経膠細胞産生を増加させ得る、任意のＧＭ−ＣＳＦアナログもしくは改変体が挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦアナログもしくは改変体は、ネイティブヒトＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の少なくとも約３０％を含み、かつＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性を保有するポリペプチドである。好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦの生物学的活性は、ＧＭ−ＣＳＦレセプターに結合する能力である。特にＧＭ−ＣＳＦとして挙げられるのは、天然に存在するＧＭ−ＣＳＦタンパク質、および、ヒト、イヌ科、ネコ科、げっ歯類、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、もしくは非ヒト霊長類を含む（ただしこれらに制限されない）、種々の種由来のＧＭ−ＣＳＦである。
【００５５】
ＧＭ−ＣＳＦの他に、同様の生物学的機能を有する他のサイトカインもまた、ＧＭ−ＣＳＦの代わりに、またはそれに加えて、本発明において、希突起神経膠細胞促進因子として使用され得る。これらのサイトカインとしては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン５（ＩＬ−５）が挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦと同様に、Ｇ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５のアナログおよび改変体もまた、採用され得る。これらのＧ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５のアナログおよび改変体は、それぞれネイティブヒトＧ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５と実質的配列同一性を共有すべきであり、また、それぞれネイティブヒトＧ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５のレセプターに結合すべきである。各アナログおよび改変体が希突起神経膠細胞の産生を刺激する能力は、本明細書に開示された方法にしたがって決定され得る。本開示にしたがって、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５を誘導もしくは活性化することが知られている因子が、希突起神経膠細胞形成および再ミエリン化を促進するために採用され得ることが、さらに意図される。
【００５６】
上述の希突起神経膠細胞促進因子に加えて、希突起神経膠細胞分化を促進することが知られている他の因子（例として、Ｍｉｌｌｅｒ、２００２を参照のこと）は、希突起神経膠細胞促進因子に組み合わせて使用され得る。これらの他の因子としては、これらに制限されないが、ソニック・ヘッジホッグ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、ｃＡＭＰ、およびレチノイン酸が挙げられる。さらに、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、増殖関連癌遺伝子α（ＧＲＯ−α）、ニューレグリン、および／またはＥＧＦのような、希突起神経膠細胞に対する分裂促進、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）、生存効果を有する因子も添加され得る。本発明における他の全ての因子および薬剤と同様に、実質的配列同一性と所望の活性とを共有するこれらの因子のアナログおよび改変体も、また使用され得る。
【００５７】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供される、しかし、いかなる方法においても本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例において、次の略語は次の意味を有する。定義されていない略語は、それらの一般的に認められた意味を有する。
【００５９】
℃  ＝  セルシウス度
ｈｒ  ＝  時間
ｍｉｎ  ＝  分
μＭ  ＝  マイクロモル濃度
ｍＭ  ＝  ミリモル濃度
Ｍ  ＝  モル濃度
ｍｌ  ＝  ミリリットル
μｌ  ＝  マイクロリットル
ｍｇ  ＝  ミリグラム
μｇ  ＝  マイクログラム
ＦＢＳ  ＝  ウシ胎仔血清
ＰＢＳ  ＝  リン酸緩衝化生理食塩水
ＤＭＥＭ  ＝  ダルベッコ改変イーグル培地
α−ＭＥＭ  ＝  α−改変イーグル培地
ＭＨＭ  ＝  培地ホルモン混合物
ＧＭ−ＣＳＦ  ＝  顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子
Ｇ−ＣＳＦ  ＝  顆粒球コロニー刺激因子
ＩＬ−３  ＝  インターロイキン３
ＩＬ−５  ＝  インターロイキン５
ＥＧＦ  ＝  上皮増殖因子
ＰＤＧＦ  ＝  血小板由来増殖因子
ＧａｌＣ  ＝  ガラクトセレブロシド
ＭＢＰ  ＝  ミエリン塩基性タンパク質
Ｔ３  ＝  トリヨードチロニン
ＣＮＴＦ  ＝  毛様体神経栄養因子
ＤＩＶ  ＝  インビトロでの日数（ｄａｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
（実施例１）
（ＧＭ−ＣＳＦは神経幹細胞からの希突起神経膠細胞産生を促進する）
神経幹細胞分化に対するＧＭ−ＣＳＦの効果を決定するため、神経幹細胞の培養物をマウス胎仔から調製し、迅速分化プロトコールに供した。初代ニューロスフェアを生成するため、胎生１４日（Ｅ１４）マウス神経節隆起（ｇａｎｇｌｉｏｎｉｃ  ｅｍｉｎｅｎｃｅ）を解離し、培地ホルモン混合物（ＭＨＭ）＋２０ｎｇ／ｍｌ上皮増殖因子（ＥＧＦ）内で、１週間増殖（ｇｒｏｗ）させた。ＭＨＭの組成は以下：
ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）
グルコース（０．６％）
グルタミン（２ｍＭ）
炭酸水素ナトリウム（３ｍＭ）
ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）
インシュリン（２５μｇ／ｍｌ）
トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）
プロゲステロン（２０ｎＭ）
プロレシン（６０μＭ）
塩化セリン（３０ｎＭ）
である。
【００６０】
その後初代ニューロスフェアを解離し、２４ウェルプレート内のポリ−Ｌ−オルニチンコートしたカバーグラス上で、１ウェルあたり１ｍｌのＭＨＭ中で密度２００，０００細胞／ｍｌとして、平板培養した。ＭＨＭ中に２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（マウス組み換えＧＭ−ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の、またはＭＨＭ中に２０ｎｇ／ｍｌのトリヨードチロニン（Ｔ３、Ｓｉｇｍａ）の、またはＧＭ−ＣＳＦおよびＴ３の両方の組み合わせの、存在下または非存在下において、細胞を分化させた。Ｔ３は希突起神経膠細胞分化因子として知られており、本実験ではＧＭ−ＣＳＦと比較するために使用した。
【００６１】
１日後、３日後、または５日後に、これらの細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。１日後、３日後、および５日後に固定した細胞を、未成熟希突起神経膠細胞マーカーＯ４、成熟途上希突起神経膠細胞マーカーガラクトセレブロシド（ＧａｌＣ）、および成熟希突起神経膠細胞マーカーミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を用いて、それぞれ免疫染色した。染色後、Ｏ４陽性細胞、ＧａｌＣ陽性細胞およびＭＢＰ陽性細胞の数を計数した。細胞の全数は、ヘキスト染色および生存核形態を用いて、倍率４０倍下で決定した。この実験を４回実施し、各回では、１カバーグラスにつき１０箇所の、重複しない視野を計数した。Ｔｕｋｅｙ−Ｈｏｎｅｓｔ事後解析による分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、結果の統計学的解析を行った。結果を表１に示す。
【００６２】
（表１  神経幹細胞分化に対するＧＭ−ＣＳＦの効果）
【００６３】
【表１】
2005534302.tif 000005
（＊コントロールと比較してｐ＜０．０５、†ＧＭ−ＣＳＦおよびＴ３と比較してｐ＜０．０５）
したがって、ＧＭ−ＣＳＦは、希突起神経膠細胞の発生の全ての段階において、希突起神経膠細胞のパーセンテージを有意に増加させた。このことは、ＧＭ−ＣＳＦが希突起神経膠細胞をより効率的に産生するのに使用され得ることを示す。Ｔ３のような他の希突起神経膠細胞促進因子は、必要に応じてＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて採用され得る。
【００６４】
ＧＭ−ＣＳＦの効果は、ＧＭ−ＣＳＦに結合する可溶性因子であるＧＭ−ＣＳＦレセプターα（ｓＧＭＲα）によって、特異的に阻害される。迅速分化プロトコールを上記の通り、ＧＭ−ＣＳＦの非存在下または存在下で、１００倍過剰ｓＧＭＲαの存在下または非存在下で、実施した。インビトロでの５日後、これらの細胞を固定し、成熟希突起神経膠細胞マーカーＭＢＰを用いて免疫染色し、そして先に記載したように計数した。結果を図１に示す。これは、ＧＭ−ＣＳＦの効果が特異的であることを示している。
【００６５】
（実施例２）
（希突起神経膠細胞生存に対するＧＭ−ＣＳＦの効果）
希突起神経膠細胞に対するＧＭ−ＣＳＦの生存効果を２系統の実験によって調べた。第１の系統の実験では、神経幹細胞を実施例１に記載したように、ＧＭ−ＣＳＦまたはＴ３の存在下または非存在下で培養し、分化培地中での培養の１日後、３日後、または５日後に固定した。固定した細胞を、成熟途上希突起神経膠細胞マーカーＧａｌＣおよび死に行く細胞のマーカーであるＴＵＮＥＬで免疫染色した。その後、死に行く成熟途上の希突起神経膠細胞（ＧａｌＣ＋、ＴＵＮＥＬ＋細胞）の数を計数した。そして、全ＧａｌＣ＋細胞中のパーセンテージを図２に示す。
【００６６】
図２に示されるように、ＧＭ−ＣＳＦは死に行くＧａｌＣ＋細胞の数を有意に減少させ、他方Ｔ３は、あるとしても、ごくわずかな生存効果しか有さなかった。ＧＭ−ＣＳＦのこの生存効果は、細胞が分化培養物にわずか１日間おかれた後には明らかであり、そして時間と共により顕著になった。したがって、これらの結果はＧＭ−ＣＳＦが希突起神経膠細胞のための生存因子として作用し得ることを示す。
【００６７】
第２の系統の実験では、ＧＭ−ＣＳＦを、分化途上の神経幹細胞に対して、異なる時間に与えた。したがって、神経幹細胞培養物を実施例１に記載したような分化培地に置き、ＧＭ−ＣＳＦを、２４時間後または４８時間後に添加したか、または最初に添加して２４時間後または４８時間後に除去した。同様に、並行する実験においてＴ３を同じ様式で添加または除去した。これらの細胞はインビトロでの５日後固定し、そして成熟希突起神経膠細胞マーカーＭＢＰを用いて免疫染色した。この実験を４回実施し、その結果を表２に示す（＊ｐ＜０．０５）。
【００６８】
（表２  生存試験）
【００６９】
【表２】
2005534302.tif 000006
したがって、希突起神経膠細胞数に対する効果をもたらすための増殖期間（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｐｅｒｉｏｄ  ｏｆ  ｔｉｍｅ）にはＧＭ−ＣＳＦの存在が必要とされる。このことは、ＧＭ−ＣＳＦが希突起神経膠細胞もしくはその前駆体の生存を促進することを示す。対照的に、この結果は、Ｔ３が分化因子として作用したことを示す。なぜなら、希突起神経膠細胞の数が、Ｔ３が培養物中に存在した時間の長さに関わらず変化しなかったからである。
【００７０】
まとめると、両系統の実験は、ＧＭ−ＣＳＦが希突起神経膠細胞もしくはその前駆体の生存を促進する能力を有すことを示す。
【００７１】
（実施例３）
（幹細胞増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）中のＧＭ−ＣＳＦの効果）
神経幹細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に対するＧＭ−ＣＳＦの効果を評価するため、実施例１にしたがって調製したニューロスフェア培養物中で生成した細胞の数を、種々の培養培地で１週間増殖（ｇｒｏｗ）させた場合に、計数した。したがって、Ｅ１４神経節隆起細胞を、４０ｍｌの培地中において、２００，０００細胞／ｍｌの密度で１週間増殖（ｇｒｏｗ）させた。培地はＭＨＭ＋ＥＧＦ、ＭＨＭ＋ＥＧＦおよびＧＭ−ＣＳＦ、またはＭＨＭ＋ＥＧＦおよびＴ３であった。その後スフェアを集め、解離し、そして細胞を血球計を用いて計数した。細胞数はコントロール（ＭＨＭ＋ＥＧＦ）のパーセンテージとして計算した。
【００７２】
図３に示すように、これらの結果はＧＭ−ＣＳＦが神経幹細胞培養物中の全細胞数をわずかに増加させ、他方、Ｔ３はその数を減少させたことを示す。
【００７３】
初代ニューロスフェアの数に対するＧＭ−ＣＳＦの効果もまた、ＭＨＭ＋ＥＧＦ、ＭＨＭ＋ＥＧＦ＋ＧＭ−ＣＳＦ、またはＭＨＭ＋ＥＧＦ＋Ｔ３（全て濃度２０ｎｇ／ｍｌ）中でＥ１４マウス神経節隆起由来の細胞を増殖（ｇｒｏｗ）させることによって調べた。したがって、Ｅ１４マウス神経節隆起細胞を解離し、９６ウェルプレート内において、ウェルあたり２００μｌの培地中で、１０，０００細胞／ｍｌの密度で平板培養し、１週間に渡り初代ニューロスフェアを形成させた。次いで、各ウェル中の初代スフェアの数を計数し、前述の統計学的解析を行ったことを示唆する。
【００７４】
図４に示されるこの結果は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴ３のいずれも、神経幹細胞の、初代ニューロスフェアを形成する能力に対する有意な効果を有さなかった。
【００７５】
さらに、初代ニューロスフェア由来２代目ニューロスフェアの自己増幅（ｓｅｌｆ−ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に対するＧＭ−ＣＳＦの効果もまた評価した。初代スフェアの調製には３種類の培地：ＭＨＭ＋ＥＧＦ、ＭＨＭ＋ＥＧＦ＋ＧＭ−ＣＳＦ、またはＭＨＭ＋ＥＧＦ＋Ｔ３、を使用した。初代スフェアを解離させ、９６ウェルプレート内において、１ウェルあたり２００μｌの培地中で、１０００細胞／ウェルの濃度で平板培養し、１週間に渡り初代ニューロスフェアを形成させた。２代目培養物の培地は、ＭＨＭ＋ＥＧＦのみ、ＭＨＭ＋ＧＭ−ＣＳＦもしくはＴ３のみ、またはＧＭ−ＣＳＦもしくはＴ３を補充したＭＨＭ＋ＥＧＦからなった。次いで、各ウェルの２代目スフェアの数を計数し、コントロール（ＥＧＦ→ＥＧＦ（ＥＧＦ  ｔｏ  ＥＧＦ））のパーセンテージとして計算した。
【００７６】
図５は、ＧＭ−ＣＳＦが、ＥＧＦ応答性神経幹細胞由来２代目ニューロスフェアの数に有意に影響を及ぼさないことを示す。加えて、Ｔ３はこの実験において、おそらく分化を促進することによって、２代目ニューロスフェアの数を減少させた。この結果はまた、初代ニューロスフェアの培地にＧＭ−ＣＳＦもしくはＴ３を入れることは、２代目スフェアの形成に有害であったことを示す。
【００７７】
まとめると、これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦが神経幹細胞の自己増幅（ｓｅｌｆ−ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）も増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）も促進しないことを示す。ＧＭ−ＣＳＦによる初代培養物における全細胞数の増加は、ＧＭ−ＣＳＦの生存効果に起因し得る。
【００７８】
（実施例４）
（神経幹細胞発生運命決定に対するＧＭ−ＣＳＦの効果）
初代ニューロスフェア形成中におけるＧＭ−ＣＳＦの存在が神経幹細胞の発生運命決定に影響を与えるかどうかを決定するため、初代ニューロスフェアを、ＥＧＦのみ、ＥＧＦ＋ＧＭ−ＣＳＦ、またはＥＧＦ＋Ｔ３のいずれかの中で、実施例３での記載にしたがって、生成した。次いで、初代スフェアを解離し、２４ウェルプレート内のポリ−Ｌ−オルニチンコートしたカバーグラス上で、１ウェルあたり１ｍｌのＭＨＭ中で密度２００，０００細胞／ウェルとして、平板培養し、５日間に渡り分化させた。分化期間の終わりに、細胞は４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、成熟希突起神経膠細胞マーカーＭＢＰ、ニューロンマーカーβ−チューブリン、およびヘキストを用いて免疫染色した。ヘキスト染色によって明らかにされた生細胞の全数、および免疫染色された細胞を計数した。結果を図６に示す。
【００７９】
図６に示すように、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴ３は、成熟希突起神経膠細胞の数を増加させ、そしてニューロンの数を減少させた。先の実施例と合わせて、これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦが神経幹細胞からの希突起神経膠細胞の分化を促進し、そしてニューロンの数を減らすことによって、ニューロン前駆細胞の数を減少させることを示す。したがって、ＧＭ−ＣＳＦは、神経幹細胞の発生運命を希突起神経膠細胞系統に転向させることによって、希突起神経膠細胞を産生するのに使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】可溶性ＧＭ−ＣＳＦレセプター（ｓＧＭＲα）はＧＭ−ＣＳＦの効果を阻害する。ＤＩＶ：インビトロでの日数（ｄａｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）。＊ｐ＜０．００１。本実験は４回繰り返した（Ｎ＝４）。
【図２】死滅した成熟希突起神経膠細胞のパーセンテージ。Ｃ：コントロール；ＧＭ：ＧＭ−ＣＳＦ；Ｔ３：トリヨードチロニン；ＤＩＶ：インビトロでの日数。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。本実験は４回繰り返した（Ｎ＝４）。
【図３】初代神経幹細胞培養物の全細胞数に対するＧＭ−ＣＳＦ（Ｇ）およびＴ３（Ｔ）の効果。Ｅ＋Ｇ：ＥＧＦ＋ＧＭ−ＣＳＦ；Ｅ＋Ｔ：ＥＧＦ＋Ｔ３。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。本実験は４回実施した（Ｎ＝４）。
【図４】種々の培地で培養された場合の初代ニューロスフェア数。Ｅ＋Ｇ：ＥＧＦ＋ＧＭ−ＣＳＦ；Ｅ＋Ｔ：ＥＧＦ＋Ｔ３。
【図５】種々の培地で培養された場合の２代目ニューロスフェア数。１ｏ：初代ニューロスフェア培地；Ｐ１：２代目ニューロスフェア培地；Ｅ：ＥＧＦ；Ｅ＋Ｇ：ＥＧＦ＋ＧＭ−ＣＳＦ；Ｅ＋Ｔ：ＥＧＦ＋Ｔ３。＊ｐ＜０．００１。本実験は５回実施した（Ｎ＝５）。
【図６】発生運命決定分析。神経幹細胞が種々の培地で培養された後、成熟希突起神経膠細胞（ＭＢＰ＋細胞）またはニューロン（β−チューブリン＋細胞）が計数した。Ｅ：ＥＧＦ；Ｅ＋Ｇ：ＥＧＦ＋ＧＭ−ＣＳＦ；Ｅ＋Ｔ：ＥＧＦ＋Ｔ３。＊ｐ＜０．０５。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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