(57)【要約】本発明は、異種Ｔ細胞レセプターを産生することができるトランスジェニック非ヒト動物および失活した内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物に関する。本発明はまた、係るトランスジェニック非ヒト動物を産生するための方法およびベクターおよび導入遺伝子にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種Ｔ細胞レセプターを産生できる非ヒトトランスジェニック動物であって、失活した内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座、およびヒトＴ細胞レセプター遺伝子座から構成され、そのゲノムに含有される導入遺伝子を含む、前記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
失活した内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座が、α鎖およびβ鎖Ｔ細胞レセプター遺伝子座である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
ヒトＴ細胞レセプター遺伝子座が再構成されない、請求項１または２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
ヒトＴ細胞レセプター遺伝子座が、作動可能な連結において、複数個のヒトＴ細胞レセプターＶ遺伝子並びにＤおよび／またはＪおよびＣ遺伝子から構成される、請求項１〜３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
動物が、生産的なＶＤＪＣ再構成および異種Ｔ細胞レセプターの発現が可能である、請求項１〜４のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
導入遺伝子が、非ヒトトランスジェニック動物のリンパ球において、生産的なＶＤＪＣ再構成を受け、かつＴ細胞が、抗原刺激に応じて、検出可能な量のトランスジェニックＴＣＲを発現する、請求項１〜５のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、抗原に反応するＴ細胞の集団を含み、およびＴ細胞レセプターが、ヒトＴ細胞レセプターを含む、請求項１〜６のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
産生されるヒトＴ細胞レセプターが、ヒトαおよびβ鎖から構成される、請求項１〜７のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
ヒトＭＨＣ遺伝子座のヒトＨＬＡ遺伝子から構成され、そのゲノムに含有される導入遺伝子をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡ遺伝子のすべてを含有する、請求項９に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡ遺伝子の一部を含有する、請求項９に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
ヒトＨＬＡ遺伝子が、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩである、請求項９〜１１のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１３】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、ヒトＭＨＣクラスＩレセプターによって提示された抗原に反応する、および／またはヒトＭＨＣクラスＩＩレセプターによって提示された抗原に反応するＴ細胞の集団を含む、請求項９〜１２のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１４】
ヒトＨＬＡ遺伝子が、ＭＨＣクラスＩである、請求項９〜１３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１５】
ヒトＨＬＡ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ２である、請求項９〜１４のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１６】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、ヒトＭＨＣクラスＩレセプターによって提示された抗原に反応するＴ細胞の集団を含む、請求項９〜１５のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
ヒトＨＬＡ遺伝子が、ＭＨＣクラスＩＩである、請求項９〜１３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１８】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、ヒトＭＨＣクラスＩＩレセプターによって提示された抗原に反応するＴ細胞の集団を含む、請求項１７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１９】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、ここで、前記免疫応答は、抗原に反応するＴ細胞の集団を含み、およびＴ細胞レセプターが、ヒトαおよびβ鎖を含む、請求項９〜１８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２０】
ヒトコレセプターから構成され、そのゲノムに含有される遺伝子をさらに含む、請求項９〜１９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２１】
遺伝子が、ＣＤ８コレセプターおよび／またはＣＤ４コレセプターをコードする、請求項２０に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２２】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、抗原に反応するＴ細胞の集団を含み、およびＴ細胞レセプターが、ヒトＴ細胞レセプターおよびコレセプター分子を含む、請求項２０または２１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２３】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、ヒトＭＨＣクラスＩレセプターによって提示された抗原に反応する、および／またはヒトＭＨＣクラスＩＩレセプターによって提示された抗原に反応するＴ細胞の集団を含む、請求項２０〜２２のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２４】
コレセプターが、ＣＤ８コレセプターである、請求項２０〜２３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２５】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、抗原に反応するＴ細胞の集団を含み、およびＴ細胞が、その細胞表面に、ヒトＴ細胞レセプターおよびコレセプターＣＤ８分子を発現する、請求項２０〜２４のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２６】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、ヒトＭＨＣクラスＩレセプターによって提示された抗原に反応するＴ細胞の集団を含む、請求項２０〜２５のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２７】
コレセプターが、ＣＤ４コレセプターである、請求項２０〜２３のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２８】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、前記免疫応答は、抗原に反応するＴ細胞の集団を含み、およびＴ細胞が、その細胞表面に、ヒトＴ細胞レセプターおよびコレセプターＣＤ４分子を発現する、請求項２０〜２３および２７のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２９】
非ヒトトランスジェニック動物が、抗原に対し免疫応答を引き起こし、ここで、前記免疫応答は、ヒトＭＨＣクラスＩＩレセプターによって提示された抗原に反応するＴ細胞の集団を含む、請求項２０〜２３、２７および２８のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３０】
動物が、遺伝子導入により操作できる任意の動物である、請求項１〜２９のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３１】
動物が、マウスである、請求項１〜３０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３２】
動物が、ラットである、請求項１〜３０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３３】
動物が、霊長類である、請求項１〜３０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３４】
動物が、チンパンジーである、請求項１〜３０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３５】
動物が、ヤギである、請求項１〜３０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３６】
動物が、ブタである、請求項１〜３０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３７】
動物が、ゼブラフィッシュである、請求項１〜３０のいずれかに記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３８】
異種Ｔ細胞レセプターを産生することができる非ヒトトランスジェニック動物の産生方法であって、
胚または胚性幹細胞の内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座を失活させる工程、
活性ヒトＴ細胞レセプター遺伝子座を含有する導入遺伝子を前記胚または胚性幹細胞へ導入する工程、
活性ヒト導入遺伝子を含有する前記胚または胚性幹細胞からのヒトＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞を産生することができるトランスジェニック動物を産生する工程、および
適宜、異種Ｔ細胞レセプターを産生することができるトランスジェニック動物およびその子孫を産生するために、トランスジェニック動物をブリーディングする工程、
を含む、前記方法。
【請求項３９】
内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座が、αおよびβ鎖Ｔ細胞レセプター遺伝子座である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
導入遺伝子が、ヒトα鎖およびヒトβ鎖Ｔ細胞遺伝子座を含む、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
異種Ｔ細胞レセプターを産生することができる非ヒトトランスジェニック動物の産生方法であって、
胚または胚性幹細胞の内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座を失活させる工程であって、前記遺伝子座が、Ｔ細胞レセプターαまたはＴ細胞レセプターβ遺伝子座である、前記工程、
失活した遺伝子座を含有する前記胚または胚性幹細胞からのヒトＴ細胞レセプターを発現することができるトランスジェニック動物を産生する工程であって、該動物が、前記内因性遺伝子座を発現することができない、前記工程、
失活した内因性Ｔ細胞α遺伝子座を有する産生トランスジェニック動物と、失活した内因性Ｔ細胞β遺伝子座を有する産生トランスジェニック動物とを交配する工程、
失活した内因性Ｔ細胞αおよびＴ細胞β遺伝子座の両方が失活している子孫を選択する工程、
活性ヒトＴ細胞レセプター遺伝子座を含有する導入遺伝子を胚または胚性幹細胞へ導入する工程であって、前記ヒトＴ細胞レセプター遺伝子座が、ヒトＴ細胞レセプターαまたはβ遺伝子座である、前記工程、
活性ヒト導入遺伝子を含有する前記胚または胚性幹細胞からのトランスジェニック動物を産生する工程、
活性ヒトＴ細胞レセプターα導入遺伝子を有する産生トランスジェニック動物と、活性ヒトＴ細胞レセプターβ導入遺伝子を有する産生トランスジェニック動物とを交配する工程、
ヒトＴ細胞レセプターαおよびＴ細胞レセプターβ導入遺伝子が両方活性である子孫を選択する工程であって、動物が、ヒトＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞を産生できる、前記工程、
内因性Ｔ細胞レセプターαおよびＴ細胞レセプターβ遺伝子座が両方失活した産生トランスジェニック動物と、ヒトＴ細胞レセプターαおよびＴ細胞レセプターβ遺伝子座が両方活性である産生したトランスジェニック動物とを交配する工程、
失活した内因性Ｔ細胞レセプターαおよびＴ細胞レセプターβ遺伝子座を有し、かつ活性ヒトＴ細胞レセプターαおよびＴ細胞レセプターβ導入遺伝子を含有する子孫を選択する工程、および
適宜、異種Ｔ細胞レセプターを産生することができるトランスジェニック動物およびその子孫を産生するために、トランスジェニック動物をブリーディングする工程、
を含む、前記方法。
【請求項４２】
内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座が、前記遺伝子座の機能的な制限によって不活性化される、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座が、前記遺伝子座からＪセグメント遺伝子を欠失させることによって不活性化される、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座が、前記遺伝子座からＤセグメント遺伝子を欠失させることによって不活性化される、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座が、前記遺伝子座からＣセグメント遺伝子を欠失させることによって不活性化される、請求項３８〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
ヒトＴ細胞レセプター遺伝子座が、再構成されない、請求項３８〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
活性ヒトＴ細胞レセプター遺伝子座を含有する導入遺伝子が、作動可能な連結において、複数個のヒトＴ細胞レセプターＶ遺伝子並びにＤおよび／またはＪおよびＣ遺伝子を含む、請求項３８〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
異種Ｔ細胞レセプターおよび異種ＭＨＣ分子を産生することができる非ヒトトランスジェニック動物の産生方法であって、
請求項３８〜４７のいずれかに記載の方法によって産生した、異種Ｔ細胞レセプターを発現するトランスジェニック動物と、ヒトＭＨＣ遺伝子座を含有し、かつヒトＭＨＣ分子を発現するトランスジェニック動物とを交配させる工程、
異種Ｔ細胞レセプターおよび異種ＭＨＣ分子を発現するトランスジェニック動物の子孫を選択する工程、および
適宜、異種Ｔ細胞レセプターおよび異種ＭＨＣ分子を産生することができるトランスジェニック動物およびその子孫を産生するために、トランスジェニック動物をブリーディングする工程、
を含む、前記方法。
【請求項４９】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡ遺伝子のすべてを含有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡ遺伝子の一部を含有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
ヒトＨＬＡ遺伝子が、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩである、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
ヒトＨＬＡ遺伝子が、ＭＨＣクラスＩである、請求項４８〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
ヒトＨＬＡ遺伝子が、ＭＨＣクラスＩＩである、請求項４８〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
異種Ｔ細胞レセプター、異種ＭＨＣ分子および異種コレセプター分子を産生することができる非ヒトトランスジェニック動物の産生方法であって、
請求項４８〜５３のいずれかに記載の方法によって産生した、異種Ｔ細胞レセプターおよび異種ＭＨＣ分子を発現するトランスジェニック動物と、異種コレセプター遺伝子を含有するトランスジェニック動物とを交配する工程、
異種Ｔ細胞レセプター、異種ＭＨＣ分子および異種コレセプター分子を発現するトランスジェニック動物の子孫を選択する工程、
適宜、異種Ｔ細胞レセプター、異種ＭＨＣ分子および異種コレセプター分子を産生することができるトランスジェニック動物およびその子孫を産生するために、トランスジェニック動物をブリーディングする工程、
を含む、前記方法。
【請求項５５】
異種コレセプターが、ＣＤ８コレセプターおよびＣＤ４コレセプターである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
異種コレセプターが、ＣＤ８コレセプターである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
異種コレセプターが、ＣＤ４コレセプターである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
異種Ｔ細胞レセプターを産生することができる、不死化細胞系。
【請求項５９】
Ｔ細胞レセプターが、特定の抗原に特異的である、請求項５８に記載の不死化細胞系。
【請求項６０】
Ｔ細胞レセプターが、対象となる選択されたペプチド／ＭＨＣ複合体と反応することができる、請求項５８または５９に記載の不死化細胞系。
【請求項６１】
請求項５８〜６０のいずれかに記載の細胞系によって産生される単離された核酸配列であって、前記配列が、異種Ｔ細胞レセプターαまたはβ鎖をコードするか、または、異種Ｔ細胞レセプターαまたはβ鎖をコードする配列に相補的である、前記単離された核酸配列。
【請求項６２】
請求項５８〜６０のいずれかに記載の細胞系によって産生される単離された核酸配列であって、前記配列が、異種Ｔ細胞レセプターα鎖をコードするか、または、異種Ｔ細胞レセプターα鎖をコードする配列に相補的である、前記単離された核酸配列。
【請求項６３】
請求項５８〜６０のいずれかに記載の細胞系によって産生される単離された核酸配列であって、前記配列が、異種Ｔ細胞レセプターβ鎖をコードするか、または、異種Ｔ細胞レセプターβ鎖をコードする配列に相補的である、前記単離された核酸配列。
【請求項６４】
核酸が、ＲＮＡである、請求項６１〜６３のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項６５】
核酸が、ＤＮＡである、請求項６１〜６３のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項６６】
請求項５８〜６０のいずれかに記載の細胞系によって産生される、異種Ｔ細胞レセプター。
【請求項６７】
レセプターが、精製されるか、または部分的に精製される、請求項６６に記載の異種Ｔ細胞レセプター。
【請求項６８】
異種Ｔ細胞レセプターを産生することができる不死化細胞系の生成方法であって、
異種Ｔ細胞レセプターを産生することができるトランスジェニック動物を請求項３８〜５７のいずれかに記載の方法によって産生する工程、
前記動物において免疫応答を誘発する工程、
ヒトＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞を単離する工程、および
異種Ｔ細胞レセプターを産生することができる不死化細胞系を生成するために、単離したＴ細胞と不死化細胞系とを融合する工程、
を含む、前記方法。
【請求項６９】
単離したＴ細胞が、対象となる特定の抗原に特異的なＴＣＲを発現する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
単離したＴ細胞が、対象となる選択されたペプチド／ＭＨＣ複合体と反応することができるＴＣＲを発現する、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
不死化細胞系が、骨髄種細胞系である、請求項６８〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
ヒトＴ細胞遺伝子座と作動可能に連結した酵母人工染色体を含む、単離された核酸。
【請求項７３】
ヒトＴ細胞遺伝子座が、α遺伝子座である、請求項７２に記載の単離された核酸。
【請求項７４】
α遺伝子座が、Ｖα遺伝子、Ｊα遺伝子およびＣα遺伝子を含む、請求項７２または７３に記載の単離された核酸。
【請求項７５】
α遺伝子座の調節配列をさらに含む、請求項７２〜７４のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項７６】
α遺伝子座のエンハンサー領域をさらに含む、請求項７２〜７５のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項７７】
α遺伝子座の組換えシグナルをさらに含む、請求項７２〜７６のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項７８】
α遺伝子座のプロモーター領域をさらに含む、請求項７２〜７７のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項７９】
遺伝子が再構成されていない、請求項７２〜７８のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８０】
異種α遺伝子座からの調節配列をさらに含む、請求項７２〜７９のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８１】
異種α遺伝子座のエンハンサー領域をさらに含む、請求項７２〜８０のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８２】
異種α遺伝子座のプロモーター領域をさらに含む、請求項７２〜８１のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８３】
ヒトＴ細胞レセプター遺伝子座が、β遺伝子座である、請求項７２に記載の単離された核酸。
【請求項８４】
β遺伝子座が、Ｖβ遺伝子、Ｄβ遺伝子、Ｊβ遺伝子およびＣβ遺伝子を含む、請求項７２または８３に記載の単離された核酸。
【請求項８５】
β遺伝子座の調節配列をさらに含む、請求項７２、８３または８４のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８６】
β遺伝子座のエンハンサー領域をさらに含む、請求項７２、８３〜８５のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８７】
β遺伝子座の組換えシグナルをさらに含む、請求項７２、８３〜８６のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８８】
β遺伝子座のプロモーター領域をさらに含む、請求項７２、８３〜８７のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項８９】
遺伝子が再構成されていない、請求項７２、８３〜８８のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項９０】
異種ＴＣＲβ遺伝子からの調節配列をさらに含む、請求項７２、８３〜８９のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項９１】
異種β遺伝子座のエンハンサー領域をさらに含む、請求項７２、８３〜９０のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項９２】
異種β遺伝子座のプロモーター領域をさらに含む、請求項７２、８３〜９１のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項９３】
ヒトＭＨＣ遺伝子座と作動可能に連結した酵母人工染色体を含む、単離された核酸。
【請求項９４】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡクラスＩ遺伝子座を含む、請求項９３に記載の単離された核酸。
【請求項９５】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡクラスＩ遺伝子のすべてを含む、請求項９３または９４に記載の単離された核酸。
【請求項９６】
ＭＨＣ遺伝子座が、ＨＬＡクラスＩ遺伝子の一部を含む、請求項９３または９４に記載の単離された核酸。
【請求項９７】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡ−Ａ２遺伝子である、請求項９３〜９６のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項９８】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡクラスＩＩ遺伝子座を含む、請求項９３に記載の単離された核酸。
【請求項９９】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のすべてを含む、請求項９３または９８に記載の単離された核酸。
【請求項１００】
ＭＨＣ遺伝子座が、ヒトＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の一部を含む、請求項９３、９８または９９に記載の単離された核酸。
【請求項１０１】
異種コレセプター遺伝子と作動可能に連結したプロモーターを含む、単離された核酸。
【請求項１０２】
異種コレセプター遺伝子が、ＣＤ４コレセプターである、請求項１０１に記載の単離された核酸。
【請求項１０３】
異種コレセプター遺伝子が、ＣＤ８コレセプターである、請求項１０１に記載の単離された核酸。
【請求項１０４】
ＣＤ８コレセプターが、αおよびβ鎖から構成される、請求項１０１または１０３に記載の単離された核酸。
【請求項１０５】
標的ベクターを含む単離された核酸であって、対象となる内因性遺伝子座の５´および３´配列に相同的な標的配列を有する薬物選択マーカーを含有する、前記単離された核酸。
【請求項１０６】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子カセットをさらに含む、請求項１０５に記載の単離された核酸。
【請求項１０７】
標的配列が、内因性遺伝子座の相同組換えを導くことができる、請求項１０５または１０６に記載の単離された核酸。
【請求項１０８】
内因性遺伝子座における相同組換えが、内因性遺伝子座の機能的な失活をもたらす、請求項１０５〜１０７のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項１０９】
標的配列が、内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座である、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項１１０】
標的配列が、内因性α鎖Ｔ細胞レセプター遺伝子座である、請求項１０５〜１０９のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項１１１】
標的配列が、内因性β鎖Ｔ細胞レセプター遺伝子座である、請求項１０５〜１１０のいずれかに記載の単離された核酸。
【請求項１１２】
失活した内因性Ｔ細胞レセプター遺伝子座を含む、非ヒトトランスジェニック動物であって、前記トランスジェニック動物は、そのゲノムに、作動可能な連結において、複数個のヒトＴ細胞レセプターのＶ遺伝子並びにそれらのＤおよび／またはＪおよびＣ遺伝子を含む導入遺伝子をさらに含有する、前記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１３】
作動可能な連結において複数個のヒトＶ遺伝子およびＣβ遺伝子座の１つまたは両方を含む、ヒトＴ細胞レセプターβ鎖導入遺伝子であって、ここで、前記非ヒトトランスジェニック動物のリンパ球において、導入遺伝子が生産的なＶＤＪ再構成を受け、そして、抗原刺激に応じて、検出可能な量のＴＣＲヒトβ鎖を発現するＴ細胞を産生する、前記ヒトＴ細胞レセプターβ鎖導入遺伝子、
複数個のヒトＶ遺伝子セグメント、ヒトＪ遺伝子セグメント、ヒトＣαコードエクソンおよびヒト３´下流αエンハンサーを有するヒトＴ細胞レセプターα鎖導入遺伝子であって、ここで、前記非ヒトトランスジェニック動物のリンパ球において、導入遺伝子が生産的なＶＤＪ再構成を受け、そして、抗原刺激に応じて、検出可能な量のＴＣＲヒトα鎖を発現するＴ細胞を産生する、前記ヒトＴ細胞レセプターα鎖導入遺伝子、
失活したβ鎖遺伝子を有する内因性ＴＣＲβ鎖遺伝子座、および
失活したα鎖遺伝子を有する内因性ＴＣＲα鎖遺伝子座、
を有する生殖細胞ゲノムを有する、非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その開示の全体が参照によって本明細書に組込まれる2000年12月19日出願の米国仮出願第60/256,591号、題名「ヒト化免疫系を含むトランスジェニック動物」に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、機能的な異種免疫系成分、特に、異種Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、異種主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子およびコレセプター分子を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物（transgenic non-human animals）並びにトランスジェニック動物を産生するための方法および導入遺伝子に関する。産生した該動物および異種タンパク質は、新規な治療薬およびワクチンの開発を含む、種々の用途に有用である。
【０００３】
発明の背景
生物薬剤産業は、例えば、ヒトおよび動物の疾患を治療するための治療薬としてのタンパク質薬剤の開発の成功によって構築された。生物薬剤の開発は、クローンを目的とした組換えＤＮＡ技術または遺伝子操作を利用して、対象となるタンパク質をクローニングおよび発現し、そして、工業的な規模でそれらの生産を行うことによって促進された。該分野は、タンパク質治療薬が、治療患者の抗体応答を誘発する可能性が低くなるように、できる限り多くのヒト配列を含有すべきであるということが認識され、受け入れられる点までに展開した。これは、より完全なヒトタンパク質を産生するための一連の開発を導いた。
【０００４】
ヒト免疫応答系は、侵入生物に対して、非常に複雑かつ効果的な防御系である。近年、病態中の免疫攻撃を調節若しくは誘発するため、または、自己免疫疾患における攻撃を抑制するための治療薬としての、生体自身の免疫系の成分を用いることに対する関心が大幅に上昇している。天然の免疫系成分を模倣する治療用分子は、生体の自然防御機構に組み込まれることによって、係る疾患の効果的な治療方法を提供するであろう。かかる取り組みの結果、近年、多くの抗体産物が開発され、ヒトに使用するための治療薬として承認された。
【０００５】
そもそも、これらの多くは、マウスモノクローナル抗体として開発されたが、マウス抗体は、一般に、患者の免疫系が、治療的な抗体に対して抗体を産生する、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発する。かかる作用に対し、キメラ抗体または「ヒト化」抗体を生成するための方法が開発され、マウス抗体の定常領域またはフレームワーク領域は、ヒト配列によって置換された。トランスジェニック動物を生成するための他のアプローチとしては、マウス抗体遺伝子を欠失または不活性化し、そして、ヒト抗体遺伝子によって置換することであった（Lonberg and Kay, US Pat. 5,877,397）。これらのトランスジェニック動物は、ワクチン接種に応じてヒト抗体を産生することができる。
【０００６】
Ｔ細胞は、細胞性応答に関与する主要なエフェクター細胞である。抗体が、治療薬として開発されたのと同時に、Ｔ細胞の表面のレセプターＴＣＲは、それら自身に特異性を付与し、治療薬の開発の基盤として、特有の利点を有する。抗体は、血液および細胞外空間の病原体の認識または細胞表面の標的タンパク質に制限されるが、ＴＣＲは、細胞表面において、ＭＨＣ分子によって提示された抗原を認識する（細胞内タンパク質に由来する抗原を含む）。提示された抗原を認識し、活性化するＴ細胞のサブタイプに応じて、ＴＣＲおよびＴＣＲを含有するＴ細胞は、種々の免疫応答のコントロールに関与する。例えば、ヘルパーＴ細胞は、抗体分泌細胞へのＢ細胞の分化の誘発によって体液性免疫応答の調節に関与する。さらに、活性化されたヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞によって、細胞媒介性免疫応答を引き起こす。したがって、ＴＣＲは、通常、抗体によって確認されない標的を、特異的に認識し、そしてまた、多種の免疫応答を引き起こすために、それらを生み出すＴ細胞を誘発する。
【０００７】
Ｔ細胞は、その細胞表面に発現したＴＣＲによって、細胞の表面に提示された抗原を認識する。ＴＣＲは、大部分がαおよびβ鎖の糖タンパク質からなる、ジスルフィド結合型ヘテロ二量体である。Ｔ細胞は、それらレセプター分子に多様性を生成するための組換えメカニズムを利用し、これは、Ｂ細胞が操作する抗体の多様性の生成メカニズムに類似する（Janeway and Travers, Immunobiology 1997）。免疫グロブリン遺伝子に類似するＴＣＲ遺伝子は、Ｔ細胞の発達の間に、再構成されるセグメントからなるものである。ＴＣＲポリペプチドは、可変領域、定常領域、細胞膜貫通領域および細胞内領域からなる。該レセプターが占有される場合、細胞膜貫通領域はタンパク質を固定し、細胞内領域はシグナリングに関与し、一方、可変領域は、抗原の特異的な認識を引き起こし、そして、定常領域は、可変領域結合表面をサポートする。ＴＣＲのα鎖は、可変（Ｖ）および連結（Ｊ）セグメントのみでコードされる可変領域を含有し、一方、β鎖は、さらなる多様性セグメント（Ｄ）を含有する。
【０００８】
ＴＣＲ鎖のＶ、ＤおよびＪセグメントは、生殖細胞系ＤＮＡに複数のコピーで存在する。種々の抗原を認識するためのＴ細胞レパトアおよびその能力の多様性は、ランダムな組換えの過程によって各セグメントファミリーの１つのメンバーの結合をもたらし、単一のＴＣＲα鎖またはβ鎖をコードする単一の分子を生成する。この再構成過程は、Ｔ細胞の両対立遺伝子において起こるものであるが、対立遺伝子排除は、Ｔ細胞当たり１つのＴＣＲ細胞のみを発現するという結果をもたらす（Janeway and Travers, Immunobiology, 1997）。
【０００９】
ＴＣＲは、自己（ＭＨＣ）分子中の抗原提示細胞表面に提示されたペプチド抗原を認識する。ＴＣＲによって認識された、２つの異なる種類のＭＨＣ分子、即ち、クラスＩＭＨＣおよびクラスＩＩＭＨＣ分子は、抗原提示に関与する。成熟Ｔ細胞のサブセットは、それらが発現するコレセプター分子によって定義される。これらのコレセプターは、ＴＣＲと連動してＭＨＣ−抗原複合体の認識およびＴ細胞の活性化に作用する。成熟したヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原を認識し、コレセプターＣＤ４を有することによって分類される。細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ決定因子の抗原を認識し、ＣＤ８コレセプターを有することによって識別される。
【００１０】
種々の前兆（threats）を認識し、自然免疫応答を起こすためのＴＣＲの特異性およびそれらの能力から、ＴＣＲは、現在、治療薬の開発ための基盤としての使用について検討されている。一例として、ヒトＴＣＲを、抗癌剤に化学的に接合し、ＴＣＲが認識できる細胞に抗癌剤を送導するという、ＴＣＲの特異性を利用する。別の例としては、ＴＣＲ遺伝子を、生物活性タンパク質（例えば、サイトカイン、ケモカインまたはリンフォカイン）に遺伝子的に融合させ（または、化学的に接合させ）、該活性剤を、ＴＣＲの特異性によって、作用部位に送達または誘導する。第三の例としては、ＴＣＲを、細胞種に特異的な抗体に結合させることによって、抗体が、エフェクター細胞を集め、そして、該エフェクター細胞を、ＴＣＲが認識する標的細胞の付近に標的化または誘導することができる。
【００１１】
医薬として非ヒト抗体を用いる場合に直面する合併症は、ヒトに使用するためのＴＣＲ治療薬の基礎として、ヒトＴＣＲを用いることが希求されていることに十分な正当性を与える。ヒトＴＣＲは、ＴＣＲに基づく治療薬に対する抗体応答の発生の機会を著しく低減し、所望の細胞媒介性免疫応答を効果的に起こすために必要な機能的な相互作用を改善するであろう。したがって、ＴＣＲに基づく治療薬を開発するための取り組みの結果、係る治療薬の開発に使用するための適切なヒトＴＣＲの産生を誘導するための手段を有することが関心事となっている。
【００１２】
所望の抗原を認識し、反応するＴＣＲの単離のための現行の方法は、Ｔ細胞応答を起こすために、宿主に、抗原性のタンパク質またはペプチドを接種すること、または、適切なＴ細胞を発現する自然に免疫されたソースを発見することを頼みとするものである。適切なソースが作製または同定されると、所望の抗原に特異的なＴ細胞は、適切なＴＣＲを同定するために、増殖、不死化および選別を受けることができる。
【００１３】
ヒトＴＣＲの同定および産生のための現在のアプローチは、高い特異性を有するレセプターを必要とするという問題をもたらす。所望のＴＣＲを同定および産生するためのこれらのアプローチは、困難で、高価かつ時間のかかる手段である。また、上述のアプローチは、対象となる特定の抗原を効果的に認識することができるＴＣＲの選択を、必ずしも達成するわけではない。さらに、ヒトＴ細胞応答を引き起こすための経験的なワクチン接種の使用は、明らかに制限される。最後に、自己抗原（しばしば、癌細胞において過剰に発現した自己抗原）を認識するＴＣＲは、寛容作用により、多量には発見されない。
【００１４】
現行のアプローチのさらなる制限は、特異的な、高親和性のＴＣＲの単離である。コレセプター非依存性のヒトＴＣＲ分子の生成は、ヒトＭＨＣ分子に提示される抗原ペプチドを認識し、機能的な相互作用に関与することにより効果的な、高親和性のＴＣＲをもたらすことができる。
【００１５】
上述の観点から、機能的であり、対象となる特定の抗原を認識し、かつ迅速に、多大な量を産生することができるヒトＴＣＲ分子を得るための方法が希求されていることは明らかである。したがって、異種ＴＣＲの効果的な産生を操作するための方法を有することが望まれる。
【００１６】
本明細書中に記載される参考文献は、単に、本出願の出願日以前のそれらの開示のために提供されているに過ぎない。本明細書においては、いかなるものも、本発明者が、先行発明によってかかる開示を予見する権利を有しないことを認めるものとはみなされない。
【００１７】
発明の要約
本発明は、異種ＴＣＲを発現することができるトランスジェニック非ヒト動物およびそれを産生するための方法に関する。かかるトランスジェニック動物は、例えば、ヒトＴＣＲなどの異種ＴＣＲを発現するＴ細胞のレパトアを産生することができる。トランスジェニック動物に、対象となるタンパク質またはペプチドを用いて免疫することによって、その抗原に特異的なＴ細胞の産生を可能にする。さらに、本発明は、効果的に機能的な相互作用に関与することができ、高い親和性の、効果的な、差別的な分子を産生する、コレセプター非依存性のＴＣＲの産生を提供する。
【００１８】
本発明の１つの側面において、トランスジェニック非ヒト動物は、失活した内因性ＴＣＲ遺伝子座を有し、ゲノムに異種ＴＣＲ遺伝子座をコードする導入遺伝子を保有する。失活したＴＣＲ遺伝子座は、Ｖ、Ｄ、ＪまたはＣ領域のいずれか１つの欠失を含み得る機能的な破壊によって、不活性化されることができる内因性ＴＣＲのα鎖およびβ鎖である。代替的に、機能的な破壊は、該遺伝子のプロモーター領域などの調節領域の突然変異または欠失を含み得る。
【００１９】
動物の異種導入遺伝子は、ＴＣＲの非再構成αおよびβ遺伝子座をコードし、これは、Ｔ細胞の成熟に必要な機能的な異種ＴＣＲを産生することができるような遺伝子座のＶ、Ｄ、ＪまたはＣ遺伝子の機能的な再構成を受けることができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物はまた、特定の抗原に特異的かつ高い親和性で結合する異種ＴＣＲのレパトアを産生することもできる。
特に好ましい態様において、非再構成αおよびβＴＣＲ導入遺伝子は、ヒト導入遺伝子である。
【００２０】
一態様において、非ヒトトランスジェニック動物はまた、ゲノム中に、導入遺伝子に含有されるヒトＭＨＣ遺伝子（ＨＬＡ）の配列を有する少なくとも１つの導入遺伝子を保有する。導入遺伝子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２などのＨＬＡ遺伝子の一部を含有し得る。より好ましくは、導入遺伝子は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のヒトＨＬＡ遺伝子のすべてを含有し得る。さらに、最も好ましくは、非ヒトトランスジェニック動物は、すべてのヒトＭＨＣ遺伝子、クラスＩおよびクラスＩＩの配列を含有する導入遺伝子を保有し、これにより、該動物が、Ｔ細胞に対して多様な抗原ペプチドを提示するための、多様なＭＨＣ分子を産生するための能力を有するようになる。導入遺伝子に含有されるＭＨＣをコードする遺伝子は、該遺伝子座の生殖細胞系の配列のものから非再構成、部分的に再構成または完全に再構成され得る。該動物により産生される異種αおよびβ鎖ＴＣＲは、抗原に対し免疫応答を引き起こすために、Ｔ細胞の認識および異種ＭＨＣ分子−抗原提示複合体との相互作用を促進する。
【００２１】
本発明の他の態様は、上記トランスジェニック動物のゲノムに含まれる２種類のコレセプターのうち１つをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。好ましくは、トランスジェニック動物は、コレセプターＣＤ４およびＣＤ８遺伝子を保有し、および遺伝子を発現するであろう。発現したコレセプターの存在は、さらに、異種ＭＨＣ分子により提示された抗原によって生じるＴ細胞応答を促進する。異種ＴＣＲ複合体に組み込まれたコレセプターは、ＭＨＣ分子を差別的に認識し（ＣＤ４−ＴＣＲ複合体は、優先的にＭＨＣクラスＩＩ複合体を認識し、一方、ＣＤ８−ＴＣＲ複合体は、優先的にＭＨＣクラスＩ複合体を認識する）、これは、抗原提示ＭＨＣ複合体に対し高感作であり、そして、抗原に対し、単独のＴＣＲ複合体よりも一層効果的な免疫応答を引き起こす。
【００２２】
本発明の好ましい側面において、例えば、ＴＣＲまたはＭＨＣなどの産生した異種分子は、ヒト分子である。しかしながら、他のソースに由来する異種分子が、類似の目的を達成してもよい。例えば、イヌまたはウマなどの特定の動物に由来する異種分子を、例えば、獣医薬の開発に用いることができる。
【００２３】
本発明に好ましい非ヒトトランスジェニック動物宿主は、マウスであるが、遺伝子導入的に操作することができ、かつ本発明の所定の組換えおよび発現イベントを実施できる免疫系を有する任意の動物もまた、非ヒトトランスジェニック動物宿主としての役割を果たし得る。また、好ましい動物は、限定されずに、ラット、チンパンジー、他の霊長類、ヤギ、ブタまたはゼブラフィッシュを含む。
【００２４】
本発明の他の側面は、非ヒトトランスジェニック動物の産生方法を含む。内因性遺伝子座の不活性化および異種遺伝子をコードする導入遺伝子の挿入が、該動物の産生に必要とされる。これは、多くの工程を経て達成することができる。動物は、機能的に破壊された内因性遺伝子座を有し、かつ異種αおよびβＴＣＲ遺伝子座を含有する導入遺伝子を保有する胚または胚性幹細胞から産生することができる。
【００２５】
好ましい態様の破壊された内因性遺伝子座は、内因性ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子座を含み、およびまた、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４および／またはＣＤ８遺伝子座を含み得る。内因性遺伝子は、多くの手段のうちの任意の１つによって破壊され得る。好ましくは、破壊は、該遺伝子座の特定の配列を破壊する、標的配列の相同組換えによって起こり得る。ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子座において、これは、Ｖ、Ｄ、ＪまたはＣ領域などの所望の配列の欠失を目的とすることを含み得る。代替的に、標的とした破壊は、プロモーターまたは調節配列の突然変異または欠失の原因となり得、これは、該遺伝子座の機能的な破壊をもたらす。他の好ましい方法は、該遺伝子座の発現の機能的な破壊を引き起こすために、ｃｒｅ−ｌｏｘ組換え系またはアンチセンス法の利用を含み得る。
【００２６】
好ましい態様において、該動物に保有される導入遺伝子は、異種ＴＣＲαおよびβ遺伝子座並びに異種ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子座、および／またはＣＤ４およびＣＤ８遺伝子を含有する導入遺伝子を含み得る。異種ＴＣＲ遺伝子座を含有する導入遺伝子は、ＴＣＲ遺伝子座のαおよびβ鎖のＶ、Ｄおよび／またはＪおよびＣ領域の生殖細胞系配列を包含する。該配列は、種々のＴＣＲの産生を可能にするために、再構成されない。導入遺伝子はまた、該導入遺伝子の機能を維持するために、該遺伝子座の調節配列を含む。調節配列は、遺伝子配列の同一の異種ソースに由来し得る。代替的に、調節配列は、内因性種に由来し得る。
【００２７】
非ヒトトランスジェニック動物を産生するための他の好ましい方法は、１つの破壊した遺伝子座または挿入した導入遺伝子を有する胚または胚性幹細胞から非ヒトトランスジェニック動物を産生することを含む。次いで、非ヒトトランスジェニック動物の産生は、破壊を有する動物と、同一の破壊を有する別の動物とのブリーディングからなり、これは、該破壊についてホモ接合的な子孫を産生する。ホモ接合体の産生に関し、これらの動物を、所望の別の破壊を有するホモ接合型動物および選択したホモ接合型二重破壊（homozygous double disruption）を有する子孫と交配する。同様に、相同組換えによる２つの導入遺伝子を保有し、それぞれが、各ゲノム中に対象となる導入遺伝子を保有する動物を産生する。内在性破壊および導入遺伝子を有する動物は、ゲノム中に含有される導入遺伝子および選択されたそれらの子孫を有する動物によるホモ接合型破壊を保有する選択された動物との交配によって、ホモ接合型二重突然変異を有し、かつ対象となる内因性遺伝子を保有する動物を産生できる。ブリーディング工程は、上記順序での実施を必要としない。むしろ、動物のブリーディングは、子孫動物において、所望の遺伝子型が得られるまで、選択を任意の順序で実施する。
【００２８】
さらに、本発明は、異種分子をコードする導入遺伝子構築物として機能する核酸分子、並びに該導入遺伝子を産生するための方法を包含する。本発明の導入遺伝子は、異種ＴＣＲおよび／またはＭＨＣ構築物を含む。さらなる導入遺伝子構築物は、コレセプターＣＤ４および／またはＣＤ８を含む。
【００２９】
本発明の導入遺伝子は、少なくとも１つのＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つのＤ遺伝子セグメント、少なくとも１つのＪ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＣ領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含むＴＣＲβ鎖導入遺伝子を含む。本発明はまた、少なくとも１つのＶ遺伝子セグメント、少なくとも１つのＪ遺伝子セグメントおよび少なくとも１つのＣ領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含むＴＣＲα鎖導入遺伝子を含む。αおよびβ鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、トランスジェニック非ヒト動物に異種のものであり、これは、それらが、非ヒト宿主動物からなるものではない種類のＴＣＲαおよびβ遺伝子セグメントの生殖細胞ＤＮＡ配列に由来または相当するからである。
【００３０】
本発明の一態様において、異種αおよびβＴＣＲ導入遺伝子は、相対的に大きな非再構成の異種ＤＮＡのフラグメントを含む（即ち、機能的なＴＣＲαまたはβ鎖をコードするために再構成されない）。好ましくは、αおよびβ遺伝子座の遺伝子のすべてが、該導入遺伝子に含まれる。かかるフラグメントは、典型的には、異種ＴＣＲ遺伝子座によるＣ、Ｊ（および、β鎖の場合には、Ｄ）セグメントの大部分を含む。さらに、かかるフラグメントはまた、Ｖ遺伝子セグメントの大部分を含む。かかる非再構成導入遺伝子は、トランスジェニック非ヒト動物において、前記動物に、抗原を与える場合、該遺伝子セグメントの組換え（機能的な再構成）、および結果として得られる再構成ＴＣＲαおよび／またはβ鎖の発現を可能にするＴＣＲのレパトアを生成する。代替的に、導入遺伝子は、ＴＣＲのサブセットを産生するために、部分的な再構成または完全な再構成ＴＣＲ遺伝子座を含み得る。
【００３１】
かかる導入遺伝子構築物は、異種ＤＮＡ由来の配列に応じて、例えば、プロモーター、エンハンサー、組換えシグナルなどの調節配列をさらに含み得る。代替的に、かかる調節配列は、本発明に用いられる非ヒト動物の同一のまたは関連する種類に由来する導入遺伝子に組み込まれる。例えば、ヒトＴＣＲ遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスに用いるための齧歯類ＴＣＲエンハンサー配列と組合わされる。
【００３２】
本発明の別の態様は、異種ＭＨＣ遺伝子座の導入遺伝子を含む。ＭＨＣ導入遺伝子は、少なくとも１つの、例えば、ＨＬＡ−Ａ２などの異種ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡ配列を含む。より好ましいのは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のいくつか若しくはすべてをコードする導入遺伝子である。該導入遺伝子のいくつかまたはすべてが、生殖細胞ＭＨＣ遺伝子座配列を含み得る。ＭＨＣ導入遺伝子は、導入遺伝子を保有する動物が、コードされた分子を発現できるように、再構成、部分的に再構成されるか、または非再構成であり得る。
【００３３】
さらに、本発明の他の態様は、コレセプター導入遺伝子を含む。コレセプター導入遺伝子は、コレセプター遺伝子の膜貫通および細胞質ドメインに結合したコレセプター遺伝子の細胞外ドメインを有するコレセプター分子をコードするＤＮＡ配列を含み、ここで、該ドメインは、同種または異種のソースによるものである。これらのコレセプター導入遺伝子は、ＣＤ４および／またはＣＤ８をコードし得る。
【００３４】
好ましい態様において、ＭＨＣ遺伝子座（ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ）およびコレセプターＣＤ４および／またはＣＤ８は、同一の異種ソースによるものである。代替的に、ＭＨＣ遺伝子座およびコレセプターは、非常に関連するソースに由来してもよい。さらに、コレセプターＣＤ４および／またはＣＤ８は、キメラ遺伝子であってもよく、ここで、１つの異種ソースによる細胞外ドメインは、異種ソースまたは同種ソースの膜貫通および細胞質ドメインに融合する。
【００３５】
また、非ヒト動物の内因性遺伝子座を破壊するための本発明で用いられるための核酸分子も本発明に含まれる。かかるベクターは、ＤＮＡの同種セグメントを利用し、好ましくは、遺伝子座の機能的な破壊をターゲットとするように再構築される、ポジティブおよびネガティブセレクションマーカーを有するベクターを利用する。標的化した破壊は、本発明で用いられる非ヒト動物のαおよび／またはβ鎖内因性ＴＣＲをコードする遺伝子セグメントのクラスを含む。かかる内因性遺伝子セグメントは、Ｄ、ＪおよびＣ領域の遺伝子セグメントを含むことができる。例えば、プロモーターなどの調節配列などのさらなる配列を標的にしてもよく、ここで、標的破壊は、遺伝子座の機能の損失をもたらすであろう。
【００３６】
さらなる態様は、内因性ＭＨＣ遺伝子座（ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ）、および／またはコレセプターＣＤ４および／またはＣＤ８遺伝子座の標的破壊を含む。
また、本発明を利用方法も含まれる。ポジティブ−ネガティブセレクションベクターは、細胞が選択された後に、少なくとも１つの非ヒト動物の胚または胚性幹細胞に接触され、ここで、該ポジティブ−ネガティブセレクションベクターは、相同組換えによって、非ヒト動物のゲノムに組み込まれる。移植後、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、染色体ＤＮＡへのベクターの相同組み込みの結果として、実質的に、内因性ＴＣＲ媒介性免疫応答を起こすことはできない。したがって、かかる免疫不全非ヒト動物は、免疫不全の研究、受動的なＴ細胞機能の研究、癌の研究モデルおよび癌治療薬、または、異種導入遺伝子のレセプターとして用いることができる。
【００３７】
本発明はまた、係るトランスジェニック動物による異種ＴＣＲを発現することができるＴ細胞を包含し、ここで、係るＴ細胞は、特定抗原に特異的なＴＣＲのソースを提供するために、不死化される。Ｔ細胞は、特定抗原および／またはペプチド−ＭＨＣ複合体と反応するために、特異性の選択がなされ得る。かかるＴ細胞に由来するハイブリドーマ細胞は、係る異種ＴＣＲのソースの１つとして機能することができる。
【００３８】
Ｔ細胞および／またはそれに由来するハイブリドーマ細胞はまた、クローン化することことができる異種ＴＣＲのαまたはβ鎖をコードする遺伝子座に由来するｃＤＮＡライブラリーの調製のためのｍＲＮＡのソースとして機能することもできる。かかるクローンＴＣＲ遺伝子は、ヘテロ二量体のＴＣＲを産生するために、組換え哺乳類細胞に発現されることができる。クローンＴＣＲ遺伝子はまた、一般に、可溶な単鎖ＴＣＲを、組換え哺乳類細胞に発現するために、操作することができる。
【００３９】
本発明はまた、対象となる選択したＴ細胞を、不死化細胞系に融合することによる、不死化細胞系を産生するための方法を含む。好ましい態様において、不死化細胞系は、骨髄腫細胞系であるが、任意の不死化細胞系も含み得る。
さらに、本発明は、異種ＴＣＲおよびＴＣＲ複合体を包含し、これは、キメラＣＤ４またはＣＤ８を、含んでも、含まなくてもよい。異種ＴＣＲおよびＴＣＲ複合体は、精製または部分的に精製されても、されなくてもよい。さらに、好ましい異種ＴＣＲは、特定の抗原−ＭＨＣまたはペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的なものである。
【００４０】
本発明は、さらに、上記トランスジェニック非ヒト動物の免疫応答の誘発方法に関し、種々の特異性の異種ＴＣＲを誘発する。好ましい方法は、対象となるペプチドまたはタンパク質であるか否かを問わず、該動物に効果的な量の抗原を投与することによって、細胞媒介性応答が、非ヒトトランスジェニック動物で起こるものを含む。これらの免疫抗原によって、該動物を誘発することができ、抗原刺激性応答を引き起こし、およびその抗原に特異的な異種ＴＣＲを発現するＴ細胞を産生することができる。かかるＴ細胞は、慣用の方法によって同定され、並びに所望により精製され、および増殖能力のアッセイまたは上記の任意の用途ために分析することができる。
【００４１】
発明の詳細な説明
上記に要約した通り、ヒトＴＣＲなどの異種ＴＣＲを産生することができるトランスジェニック非ヒト動物が提供される。かかるトランスジェニック非ヒト動物が免疫応答を起こすために、該トランスジェニック前Ｔ細胞は、表面上にＴＣＲを発現することを必要とし、Ｔ細胞の発達を促進し、成熟した、機能的なＴ細胞を産生し、および効果的な抗原刺激応答を誘発することが必要である。したがって、本発明は、異種ＴＣＲ導入遺伝子および係る導入遺伝子を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供し、ここで、該トランスジェニック非ヒト動物は、異種ＴＣＲを産生することができる。かかる導入遺伝子およびトランスジェニック非ヒト動物は、Ｔ細胞の成熟に必要なＴＣＲを産生する。したがって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、異種ＴＣＲ遺伝子配列によってコードされるＴＣＲを産生することができ、これは、特定の抗原に結合する。
【００４２】
治療および／または診断用途として、有望な特定のヒト抗体に反応するヒトＴＣＲを産生することが、しばしば希求される。しかしながら、ヒト抗原に特異的に結合するヒトＴＣＲの産生は、問題を有する。Ｔ細胞のソースとして機能する免疫性を付与された動物は、提示された抗原に対して効果的な免疫応答を起こすにちがいない。動物が免疫応答を起こすためには、提示される抗原は外来のものである必要があり、そして、該動物が、該抗原に寛容であってはならない。したがって、例えば、ＨＬＡレセプター中のヒトペプチドに結合するヒトＴＣＲを産生することが望まれる場合、自己免疫寛容は、ヒトタンパク質への十分な免疫応答を引き起こすことを妨げ、これは、免疫性を付与された動物の、唯一の免疫原性エピトープが、ヒト細胞群の配列多型を有するものであるからであろう。トランスジェニック動物は、失活したマウスＴＣＲ遺伝子座、活性ヒトαおよびβ鎖ＴＣＲ遺伝子座およびＭＨＣをコードするヒト遺伝子座を含有し、例えば、ＨＬＡ−Ａ２レセプターを含有する用途のために構築され得る。抗原ペプチドまたはタンパク質を有する係る動物の試みは、ＨＬＡレセプター中の抗原を認識できるヒトＴＣＲを産生するであろう。
【００４３】
さらに、ＭＨＣクラスＩとＴＣＲの相互作用は、ＣＤ８コレセプターの存在によって増強され、およびＭＨＣクラスＩＩに関しては、ＣＤ４コレセプターの存在によって増強されることが知られている。ある用途において、ヒト免疫応答を模倣する系を有するために、ＴＣＲ、ＭＨＣおよびコレセプターの遺伝子座を有することが希求され得る。代替的に、ヒトコレセプターによる影響がない状況下でのヒトＴＣＲとヒトＨＬＡ−ペプチド複合体との相互作用は、より高い親和性を有するＴＣＲに優先して偏る可能性がある。かかる高親和性ＴＣＲは、通常の内因的な状況下で発生することはないが、治療薬として希求されるであろう。したがって、他の適用に関して、ヒトＣＤコレセプター遺伝子を有することなしに、ヒト遺伝子にコードされた発現ＴＣＲおよびＭＨＣ分子のみを有することが希求され得る。
【００４４】
かかるＴＣＲトランスジェニック動物の使用は、抗原による感作に対応した異種ＴＣＲの産生を模倣することから、該産生したＴＣＲが、異種ＨＬＡ／ＭＨＣ分子中の抗原を認識し、反応できるようにする。ＴＣＲトランスジェニック動物の変種が想定される。例としては、第一に、ヒトＨＬＡ分子中の抗原ペプチドを認識する。高親和性を有する完全にヒト的なＴＣＲの産生に用いることができる動物である。さらなるＴＣＲトランスジェニック動物は、いくつかまたはすべてのＴＣＲ、コレセプター分子および/またはＨＬＡ分子が、トランスジェニックである動物を含む。かかるトランスジェニック動物を産生するために、内因性遺伝子座は、不活性化または除去をしてもしなくてもよい。異種導入遺伝子を、該動物に導入する必要がある。内因性遺伝子座を、不活性にすることによる利点は、不活性化が、混合ＴＣＲ応答の可能性を排除し、生じる唯一の応答が、異種ＴＣＲに基づくものになるようにすることである。完全に改変されたＴＣＲトランスジェニック動物を産生するために、内因性ＴＣＲソースの不活性化および同一の異種ソースからのＭＨＣ/ＨＬＡ導入遺伝子、並びにＣＤ４および／またはＣＤ８コレセプターの組み込みもまた希求され得る。
【００４５】
本明細書中で用いられる「導入遺伝子」は、本明細書に記載される方法などの手段によるヒトの介入によって、非ヒト細胞の生殖細胞系列に導入されるＤＮＡ配列である。
用語「内因性遺伝子座」は、トランスジェニック宿主に変換されるための動物内で見られる天然の遺伝子座を含むものを意味する。
本明細書中で用いられる遺伝子座の「破壊」または「不活性化」は、所望の機能を遂行するための遺伝子座の不能をもたらす、内因性遺伝子座の物理的破壊、または、機能的破壊を含み得る。
【００４６】
本明細書中で用いられる用語「異種分子」は、係る分子を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。トランスジェニック非ヒト動物からなるものではない生物で見られるものに対応するアミノ酸配列またはコードＤＮＡ配列を有する分子として定義される。
【００４７】
この好ましい態様において、ヒトＴＣＲのαおよびβ鎖を発現するために、トランスジェニックマウスを操作する。その結果、該マウスは、ＭＨＣ分子に含まれる提示ペプチド抗体を、特異的に認識するＴＣＲを保有するＴ細胞を産生することができる。このトランスジェニックマウスは、新規な治療薬および／またはモニタリング剤の開発のために選択することができる、多数の抗原特異的ヒトＴＣＲを産生することができる。それはまた、免疫系調節の研究のための基礎的なリサーチ・ツールも提供するであろう。
【００４８】
かかるトランスジェニックの他の考えられる用途は、免疫調節治療および／またはワクチンの効果を評価するためのヒト様宿主の開発である。十分なトランスジェニック宿主を達成するためには、ＴＣＲの改変に加え、以下のさらなる変更を必要とするであろう：天然マウスＭＨＣＩおよび／またはＭＨＣＩＩ遺伝子座の欠失または不活性化；ヒトＨＬＡ遺伝子座の部分的または全体の導入；マウスＣＤ４および/またはＣＤ８コレセプターの欠失または不活性化；ヒトＣＤ４および/またはＣＤ８コレセプター或いはそのキメラの導入。
【００４９】
本発明の目的のためには、異種分子は、ヒト起源のものであり、非ヒト動物は、マウスである。しかしながら、本発明は、遺伝子導入により操作する、任意の非ヒト動物における任意の異種ＴＣＲの産生方法を教示する。さらなる好ましい非ヒト動物は、例えば、ラット、霊長類、チンパンジー、ヤギ、ブタまたはゼブラフィッシュを含み得る。産生した異種ＴＣＲは、所望の治療薬、ワクチンまたはＴＣＲの利用のための任意の動物であり得る。例えば、異種分子のさらなるソースは、所望のワクチン接種法の開発のための任意の家畜を含んでもよく、例えば、イヌ、ネコ、ウマなどである。
【００５０】
トランスジェニック動物産生の基本的なアプローチ法としては、マウスＴＣＲの遺伝子座を不活性化するか、または除去し、そして、ヒトＴＣＲのαおよびβ鎖遺伝子座の生殖細胞配列を、該マウスＤＮＡに導入することである。表１に示される工程は、例示を目的として、トランスジェニック宿主がマウスであり、導入遺伝子のための異種ソースがヒトである場合の所望のトランスジェニックの産生経路として考えられるものである。表１に示される工程の順序は、典型的な目的のみに関するものであり、類似の所望の最終生成物を達成するために、代替的な順序を考えることができる。内因性遺伝子座がノックアウトまたは不活性化され、そして異種遺伝子座が導入されることにより（いずれの順序においても）産生されたトランスジェニック動物は、ヒトＴＣＲのみを産生することができるマウスの産生へ進化中の中間物（intermediates）と考えることができる。該中間物のいくつかは、以下に記載されるように、特定の用途に有用であり得ることもまた示されるであろう。最も広範囲なヒト導入遺伝子置換によるトランスジェニック動物は、ヒトが使用することを目的としたワクチン製剤の評価に有用であるであろう。
【００５１】
失活した内因性遺伝子座を有し、かつ異種ＴＣＲの導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、多数の個々の工程を介して産生され得る。各工程は、個々の破壊および／導入遺伝子を有する動物の交配（または異種交配（crosses））からなる。この方策においては、個々の動物を、対象となる破壊された内因性遺伝子座の１つを有する胚またはＥＳ細胞から産生する。さらに、別の工程においては、ゲノム内に単一の対象導入遺伝子を保有する動物を、胚またはＥＳ細胞から産生する。突然変異体についてホモ接合的な子孫のマウスを生成するために、ヘテロ接合の突然変異体を有する個々のマウスと、同一のヘテロ接合の突然変異体を有するマウスとを交配する。この手順は、任意の所望の突然変異体について行う。
【００５２】
所望のトランスジェニック動物の産生はまた、さらなる方策を介して達成され得る。例えば、トランスジェニック動物は、所望の失活した内因性遺伝子座を有し、かつ対象となる異種分子を含むゲノム導入遺伝子、例えば、ＴＣＲαおよびβ遺伝子座が挿入された胚または胚性幹細胞（ＥＳ）細胞から産生され得る。所望の遺伝子改変を有する胚またはＥＳ細胞が産生され、選択されると、同一の遺伝子改変を有する非ヒトトランスジェニック動物が、選択された胚またはＥＳ細胞を利用することによって産生される。
【００５３】
２つの破壊についてホモ接合的なマウスを産生するために、１つの破壊のホモ接合性突然変異を有する親マウスと別の所望の破壊についてホモ接合的なマウスを交配する。１つより多い対象となる導入遺伝子を保有するマウスを生成するために、自身のゲノムに１つの導入遺伝子を有する親マウスと両方の導入遺伝子を含有する選択された子孫マウスとを交配する。最後に、所望の突然変異についてホモ接合的なマウスを産生し、および所望の導入遺伝子を保有するマウスを産生して、各遺伝子型の親マウスと、すべての突然変異についてホモ接合的であり、かつ所望の導入遺伝子もまた含有する子孫マウスとを交配する。適切な中間トランスジェニック動物をブリーディングすることによって（表１の段階１ｂ、４および５に示される通りに）、より拡大した置換によるトランスジェニック動物を得ることができる。また、本明細書に記載される工程を上記順序で実施する必要はなく種々の中間遺伝子型を有するマウスを産生するために、順序を入れ替えてもよいことに留意されたい。
【００５４】
好ましい態様において、本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、非ヒトの生殖細胞系、胚またはＥＳ細胞に導入遺伝子を組み込むによって産生されるであろう。ＥＳ細胞は、インビトロ（in vitro）で培養された着床前の胚から得ることができる（Evans, M. J., et al. (1981) Nature 292:154-156; Bradley, M. O., et al. (1984) Nature 309: 255-258; Gossler, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 9065-9069; and Robertson, et al. (1986) Nature 322: 445-448）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス媒介性形質導入またはミセル融合（micelle fusion）を含む多くの手段によって、ＥＳ細胞に効果的に導入することができる。次いで、結果として得られる形質転換ＥＳ細胞を胚に導入することによって、生殖細胞系に、トランスジェニックＤＮＡの寄与をもたらすであろう（参考として、Jaenisch, R. (1988) Science 240: 1468-1474を参照）。
【００５５】
【化１】
2005505236.tif 000002
【００５６】
トランスジェニック動物作製の代替的な方法は、直接的に、導入遺伝子を動物に導入するための、レトロウイルス感染の利用を含む（Jaenich, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. 73: 1260-1264）。酵素処理によって、効果的に注入することができる場合、発育中の胚を胚盤胞段階まで育成する。代替的に、ウィルスまたはウィルス産生細胞を後期の段階の胚に注入することができる（Hogan, et al. (1986) in Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。
【００５７】
非ヒト動物への導入遺伝子の移入はまた、接合子へのＤＮＡのマイクロインジェクションを含むことができる。大抵の場合、注入されたＤＮＡは、発生発育が始まる前に、宿主ゲノムに組み込まれるであろう。その結果として、得られる動物は、該動物のすべての体細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡを保有することになるであろう（Brinster, et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 4438-4442）。
【００５８】
好ましい態様において、内因性遺伝子座の不活性化は、胚性幹細胞中の相同組換えを介する、適切な遺伝子座の標的化された破壊によって達成する。得られる生物のゲノムへの遺伝子破壊を含有する改変胚性幹細胞の導入は、生殖細胞系を介して遺伝子改変を伝達することができる動物を生成するから、故に、失活した遺伝子座を有するトランスジェニック動物を生成することとなる。
【００５９】
宿主ＴＣＲ遺伝子座を相同組換えによって不活性化するために、ＤＮＡを、形質転換によって細胞に導入し、該内因性遺伝子座で再び結合して、内因性ＴＣＲサブユニットの生成を阻害する。用語「形質転換」は、ＤＮＡを生存細胞に導入するための技術、例えば、接合、形質転換、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションなどを意味するものである。一般に、相同ＤＮＡを胚または胚性幹細胞に導入することによる相同組換えが、夫々の遺伝子座の機能的な不活性化に用いられ得る。次いで、失活した遺伝子座を有する動物の産生が、宿主胚盤胞に改変細胞を導入することよりなされる。続くブリーディングにより、失活した遺伝子の生殖細胞系伝達が可能となる。次いで、得られるヘテロ接合性の子孫を、ヘテロ接合型の親によるホモ接合型の子を選択し、次のブリーディングを行う。代替的に、所望により、さらなる標的遺伝子座の不活性化を行うために、相同組換えのさらなるラウンドのために形質転換胚性幹細胞を使用してもよい。
【００６０】
本発明の導入遺伝子は、内因性対立遺伝子を破壊することができるＤＮＡ配列を含み、本明細書中の「ノックアウト」は、破壊または失活した構築物若しくは導入遺伝子を意味するものである。さらに、かかる導入遺伝子は、破壊導入遺伝子が、内因性対立遺伝子の発現の欠如をもたらすように、内因性対立遺伝子の物理的または機能的破壊をすることができ、かかる導入遺伝子は、標的化遺伝子座に相同的なＤＮＡ配列を含み、また、破壊されたα鎖ＴＣＲまたはβ鎖ＴＣＲをコードする破壊対立遺伝子を、トランスジェニック非ヒト動物に組み込む。
【００６１】
不活性化に関し、その遺伝子座のＴＣＲサブユニットの発現の抑制をもたらす標的遺伝子の任意の欠損が用いられ得る。したがって、該欠損は、ＴＣＲ遺伝子座のＶ、ＪまたはＣ領域のエンハンサーを含む領域、例えば、５´上流域またはイントロンに存在し得、およびβ鎖を有する場合、Ｄ領域またはそれらの組み合わせに存在する可能性がある。したがって、ＴＣＲ生殖細胞遺伝子の再構成を阻害するか、または、転写障害、メッセージのプロセッシング障害などにより、ＴＣＲサブユニットをコードする機能的なメッセージを生成することができないことが重要な因子となる。
【００６２】
好ましくは、Ｔ細胞の場合は、ＴＣＲβ鎖のＣβ１およびＣβ２対立遺伝子、および最も好ましくは、ＴＣＲα鎖のＣα対立遺伝子が、対立遺伝子の発現を妨害する導入遺伝子の挿入の標的となる。例えば、Ｃα対立遺伝子の場合は、Ｃα発現を妨害する導入遺伝子を含有する遺伝子型を同定した後すぐに、交配−ブリーディングによって、Ｃα陰性の遺伝子型にホモ接合的なトランスジェニック動物を産生することができる。
【００６３】
構造的に、ノックアウト導入遺伝子は、本発明の一側面においては、ＴＣＲを含むＴＣＲポリペプチド変異体をコードし、ここで、定常領域のすべてまたは一部が欠失される。好ましくは、少なくともＣ領域の一部が、欠失される。しかしながら、欠失される配列もまた、ＴＣＲポリペプチドのＶ、Ｄおよび／またはＪセグメントの一部を含み得る。したがって、機能的なＣ領域を欠き、Ｃ領域から上流および／または下流に隣接する配列を欠くか、または、Ｃ領域の不活性挿入を伴なう領域のすべてまたは一部を含み得る構築物を産生する。欠失は、５０ｂｐ以上であってもよく、係る欠失は、機能的なｍＲＮＡの形成の妨害をもたらす。所望により、Ｃ領域の全体または大部分、通常、該遺伝子座の少なくとも約７５％、好ましくは、該遺伝子座の少なくとも約９０％が欠失される。
【００６４】
夫々の導入遺伝子の組込みを表示しやすくするために、マーカー遺伝子が、Ｃ領域の置換に用いられる。種々のマーカー、特に、ポジティブセレクションを可能にするものを用いることができる。特に関心の高いものは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの遺伝子発現から生じるＧ４１８耐性の使用である。
【００６５】
標的遺伝子構築物から上流および／または下流は、二重交叉の発生を識別する遺伝子であり得る。この目的に関して、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-tk）遺伝子が用いられ得、これは、チミジンキナーゼ遺伝子を発現する細胞が、アシクロビルまたはガンシクロビルなどのヌクレオシドアナログの使用によって破壊され得、これは、機能的なＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含有する細胞へのそれらの細胞毒性効果のためである。これらのヌクレオシドアナログに対し、感受性がないということは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の不在を示し、故に、相同組換えが発生し、また、二重交叉が発生した場所を示ことになる。
【００６６】
標的細胞の形質転換またはトランスフェクション後、標的細胞は、ポジティブおよび/またはネガティブマーカー、前記のような、例えば、Ｇ４１８耐性およびアシクロビルまたはガンシクロビル耐性によって選択される。ゲノム中のＧ４１８マーカー遺伝子の存在は、組み込みが発生したことを示すが、さらに、相同的な組み込みが発生したか否かを判断する必要がある。次いで、所望の表現型を示すそれらの細胞は、さらに分析することができ、切断解析、電気泳動、サザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などを含む多数の手段によって達成することができる。標的遺伝子座の遺伝子改変の存在を示すフラグメントの同定によって、標的遺伝子座のコピーを不活性化する相同組換えが発生した細胞を同定することができる。大抵の場合、組み込みの位置を確定するために、ＤＮＡ分析が用いられるであろう。
【００６７】
好ましくは、相同組換えの存在を検出するという利点を有するＰＣＲが用いられ得る。該構築物中の配列に相補的であり、かつ該構築物の外部および標的遺伝子座に相補的であるプローブが用いられ得る。このように、相同組換えが発生した場合、相補鎖に存在するプライマーの両方を有するＤＮＡ鎖のみを得ることができる。予測される大きさの配列に対するプローブの存在を明らかにすることによって、相同組換えの発生をサポートできる。
【００６８】
一般に、ＰＣＲ法で使用するためのＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーは、約１２〜５０ヌクレオチド長、好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチド長である。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、適切に、ＰＣＲ産物に特定の制限酵素切断部位を付加するための制限部位、例えば、連結部位の導入を、適宜含み得る。典型的なプライマーは、以下の例および図で示される。ＰＣＲ産物は、増幅したＴＣＲαおよびβ鎖配列を含み、所望により、標的遺伝子座の最適な分析のためのリボソーム結合配列、イントロン配列、リーダー配列およびプロモーター配列を含むように改変されることができる。
【００６９】
相同組換えのための対象構築物の構築において、原核生物、特に大腸のためのＤＮＡベクターは、各操作後のクローニング、分析、例えば、制限マップまたは配列マップ、所望の配列の拡張および単離に含まれ得る。本明細書中で用いられる用語「ベクター」は、宿主細胞に組み込むことができる対象となる任意の核酸配列、それらのセグメントまたは上記配列など対象となる核酸セグメントの発現をもたらすものを意味する。
【００７０】
ベクターは、例えば、直線核酸セグメントまたは配列、プラスミド、コスミド、ファージミドおよび特別な染色体ＤＮＡを含み得る。特に、ベクターは、組換えＤＮＡであることができる。構築物が大型、一般に、約５０ｋｂｐより大きく、通常、１００ｋｂｐより大きく、かつ通常、約１０００ｋｂｐより大きくない場合、酵母人工染色体（ＹＡＣ）が、構築物のクローニングに用いられ得る。
【００７１】
上記の通り、内因性遺伝子座の不活性化工程は、最初に、次の胚盤胞の再構成およびキメラ動物の生成に用いることができる胚性幹細胞において、α鎖遺伝子座で実施される。これらの動物の連続的な交配−ブリーディングは、胚性幹細胞のソースとして用いることができるホモ接合動物を産生することができる。これらの胚性幹細胞は、β遺伝子座を不活性化するために、単離および改変され、該工程は、すべての所望の遺伝子座が、不活性化されるまで繰り返される。代替的に、β鎖遺伝子座が最初であってもよい。
【００７２】
上記の内因性遺伝子座の不活性化方法に加え、さらなる好ましい不活性化方法が利用でき、例えば、対象となる特定の対象遺伝子の一時的なコントロールを利用するためのｔｅｔ転写系の使用(Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:9302-9306)または組織の特定のコントロールのためのデオキシサイクリック転写調節コントロール（deoxycycline transcriptional regulatory control）の導入を含み得る。
さらに、機能的な不活性化に好ましい方法は、ｃｒｅ−ｌｏｘ欠失、即ち、遺伝子座の標的ノックアウトのための部位特異的組換え系を利用し、ここで、ｌｏｘＰ部位を、対象遺伝子の側面に挿入し、遺伝子を欠失するために活性化ｃｒｅリコンビナーゼを導入する。
【００７３】
代替的に、所望の遺伝子座の転写を阻害するために、アンチセンス法を利用してもよく、故に、遺伝子座の機能的破壊をもたらす。かかる状況下で、指定した対象となる遺伝子座、例えば、ＴＣＲαまたはβ遺伝子座の特定の配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが生成し、有用なアンチセンスターゲティングは、機能的なタンパク質の産生を阻害することになる。
【００７４】
内因性遺伝子座の不活性化はまた、２頭の市販のホモ接合マウス系統を交配することによって達成される（The Jackson Laboratory, Maine）。第一系統B6.129P2-Tcrbtm1Momは、ＴＣＲβ遺伝子座のＤおよびＣ遺伝子セグメントの欠失を含有し、一方、第二系統B6.129S2-Tcratm1Momは、ＴＣＲαのＣ遺伝子セグメントの欠失を含有する（Momberts, et al. (1991) PNAS 88: 3084-3087; Momberts, et al. (1992) Nature 360: 225-231）。両動物系統は、機能的なα／βＴＣＲを産生することができず、共に交配する場合には、不活性化された両内因性ＴＣＲ遺伝子座を有する動物が得られる。
【００７５】
さらに、本発明の好ましい導入遺伝子は、異種分子を含むＤＮＡ配列を含む。本発明の好ましい異種導入遺伝子は、異種ＴＣＲサブユニットを含む。さらに、宿主のゲノム中への係る導入遺伝子の導入によって、該宿主に異種ＴＣＲのレパトアの発現するための能力を与えることができる。本明細書中で用いられる「発現」または「遺伝子発現」は、ＤＮＡの転写およびＲＮＡ転写の翻訳を含む、対象となる核酸配列のタンパク質産物の産生を意味する。
【００７６】
本明細書で用いられ得る種々のセグメントおよび領域をコードする遺伝子は、十分に特徴付けられている。ＴＣＲは、同一の基本構造を有する分子の高いクローン変化率を示す。ＴＣＲは、それぞれジスルフィド架橋によって連結している２つの４５ｋｄの膜貫通型ポリペプチドからなる９０ｋｄのヘテロ二量体である（Samuelson, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 6972; Acuto, et al. (1983) Cell 34: 717; MacIntyre, et al. (1983) Cell 34: 737）。多くのＴ細胞に関し、２つのポリペプチドは、αおよびβ鎖を示す。サブトラクティブハイブリダイゼーション法を用いることによって、ＴＣＲポリペプチド鎖をコードするｃＤＮＡクローンが単離された（Hendrick, et al. (1984) Nature 308: 149; Hendrick, et al. (1984) Nature 308: 153; Yanagi, et al. (1984) Nature 308: 145; Saito, et al. (1987) Nature 325: 125; Chien, et al. (1984) Nature 312: 314）。ＴＣＲポリペプチドの完全な一次配列を明らかにするために、これらのｃＤＮＡクローンの配列分析を実施する。ＴＣＲポリペプチドは、互いに類似し、免疫グロブリンポリペプチドの構造に似ている（Davis and Bjorkman (1988) supra.; and Kronenberg, et al. (1986) Ann. Rev. Immunol. 4:529を参照）。
【００７７】
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖と同様に、αおよびβ鎖は、ＶおよびＣ領域を有する（ Acuto, et al. (1983) supra; Kappler, et al. (1983) Cell 35: 295） 。Ｖ領域は、抗原認識に関与し、Ｃ領域は、膜アンカーおよびシグナル伝達に関与する。ＴＣＲ鎖のＶ領域は、さらに、ＶおよびＪセグメントに分割される。さらに、β鎖の可変領域はまた、ＶおよびＪセグメントの間にＤセグメントを含有する。ＴＣＲ鎖の定常領域は、しばしば、異なるエクソンによってコードされる４つの機能領域から構成される（Davis and Bjorkoran (1988) supra.）。
【００７８】
ＴＣＲのｃＤＮＡの有用性により、マウスおよびヒトＴＣＲ遺伝子のゲノム組織の分析を実施できる。ＴＣＲ遺伝子は、免疫グロブリンに類似する断片組織を示す。β鎖遺伝子座において、２つのほぼ同一なＣβ領域は、それぞれ、１つのＤおよび６つのＪセグメントの前に、直線的に配置する。β遺伝子座はまた、約６５のＶ遺伝子セグメントを含有し、そのうちの４６が機能的であり、そのうちの１つは、逆方向の３´〜Ｃ領域に位置する（Rowen, et al. (1996) Science 272:1755）。Ｔ細胞の体細胞的発達の間、機能的なＴＣＲ遺伝子が、これらのセグメントおよび領域の再構成によって形成する。この過程は、図６に示され、Ｔ細胞レセプターの多様性の基礎となる。
【００７９】
図２および４に図解的に示されるように、ＴＣＲ遺伝子のコードセグメントは、染色体ＤＮＡの大型配列中に分散される。特定のＶ、ＤおよびＪセグメントは、Ｃ領域の隣の完全なＶコード領域を産生するために、共に融合される。ＢおよびＴ細胞は、恐らく、ＩｇおよびＴＣＲの組立てに関して同一の機構を利用し、これは、Ｂ細胞が、トランスフェクションされたＩｇ遺伝子セグメントと同様に、トランスフェクションされたＴＣＲセグメントを再構成し、および該再構成は、融合されるために、セグメントをフランキングする類似の配列を介すからである（Akira (1987) Science 238:1134; Yancopoulos, et al. (1986) supra）。最初に、ＴＣＲβ遺伝子が、再構成され、転写され、次いで、ＴＣＲα遺伝子についてなされる(Chien, et al. (1987) supra; Pardoll, et al. (1987) Nature 326: 79; Raulet, et al. (1985) Nature 312: 36; Samelson, et al. (1985) Nature 315: 765; Snodgrass, et al. (1985) Nature 315: 232)。
【００８０】
異種宿主にヒトＴＣＲの産生をもたらすためには、ＴＣＲのαおよびβ鎖の発現のために有用な内因性遺伝子の欠失と同時に、該宿主が、ＴＣＲの産生に関与する必要な酵素および他の要素を与える能力があるものであることが必要とされる。したがって、生殖細胞系の再構成、スプライシングなどに関連するそれら酵素および他の要素は、異種宿主おいて機能的でなければならない。上記の通り、内因性ＴＣＲ鎖の産生に関連する種々のエクソンを含む機能的な天然領域が欠失されるであろう。
【００８１】
したがって、本発明での使用のための導入遺伝子の産生に関し、生殖細胞配列ＴＣＲ遺伝子座または、ヒトＴＣＲ遺伝子座の機能的に再構成されたβおよびα遺伝子が好ましい。かかる異種配列は、操作によって、ＴＣＲレパトアを示すことができる異種ＴＣＲポリペプチド変異体をコードする構造的なＤＮＡ配列と同様に、調節配列を含む。かかる異種配列の使用の唯一の制限は、機能的なことである。異種調節配列は、ＴＣＲのレパトアを産生することができるように、ＴＣＲポリペプチドの十分な量を効果的に発現するためのトランスジェニック動物に利用されなければならない。さらに、異種ＴＣＲが、トランスジェニック動物に適切に発現される場合には、所望の免疫応答を引き起こすことができる。さらにまた、本発明の実施に用いることができる機能的な導入遺伝子を産生するために、同種および異種ＤＮＡ配列を混合してもよい。（例えば、異種的な構造の遺伝子およびその逆を有する異種レギュレーター）。
【００８２】
本発明の方策は、ＴＣＲαおよびβ鎖遺伝子座の周知機構に基づくものである。導入遺伝子は、例えば、少なくとも１つのＴＣＲのポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列に由来するものである。好ましくは、ＴＣＲのαおよびβ遺伝子座の生殖細胞配列が、導入遺伝子として用いられる。上述のように、ＴＣＲαおよびβ遺伝子座は、十分に特徴づけられている。本発明の導入遺伝子は、係るＤＮＡ配列に由来するものである。
【００８３】
かかるＤＮＡは、体細胞のゲノムから得ることができ、十分に確立された技術によってクローン化され得る。故に、かかるクローンＤＮＡ配列は、本発明の導入遺伝子を構築するための組換え技術によって、さらに操作され得る。
【００８４】
かかる異種導入遺伝子は、好ましくは、トランスジェニック非ヒト動物において発現され得る、作動可能に連結した該遺伝子座の生殖細胞ＤＮＡ配列を含む。代替的に、作動可能に連結した部分的に再構成されたまたは十分に再構成されたＴＣＲαまたはβ鎖の配列が、導入遺伝子の調製に用いられ得る。
【００８５】
用語「作動可能に連結された」は、核酸配列セグメント、または所定のセグメントもしくは配列から上流の配列（５´）または下流の配列（３´）に作動可能に（即ち、機能的に）連結した遺伝子配列を意味するものである。これらの隣接する配列は、所望の細胞種において、核酸セグメントまたは配列のプロセッシングおよび/または発現に影響を与える。
典型的には、本発明の異種タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、好適な宿主細胞中で該ＤＮＡセグメントを複製するために、ベクター、好ましくは、ＤＮＡベクターに挿入される。
【００８６】
ＴＣＲαまたはβ鎖遺伝子座を単離し、クローン化し、移入するために、酵母人工染色体が用いられ得る。遺伝子座全体を、クローン化することができ、１個または２、３個のＹＡＣクローン内に含有させることができる。複数のＹＡＣクローンを用い、相同性が重なる領域を含有する場合、それらは、該遺伝子全体を示す単一の構築物を産生するために、酵母宿主系統内で再結合することができる。ＹＡＣアームはさらに、概要が示された前記方法による該構築物の胚性幹細胞または胚への導入を補助するための改善によって、哺乳類選択カセットを用いて改変することができる。
産生したＴＣＲの幅広いスペクトルを得るために、ＴＣＲ遺伝子座の生殖細胞配列のすべてまたはほとんどを含むことが好ましい。しかしながら、いくつかの例において、Ｖ領域全体のサブセットを含むことが好ましいであろう。種々のＶ領域遺伝子ファミリーは、Ｖ領域クラスター内に分散する。したがって、Ｖ領域の相補鎖全体ではなく、ヒトαおよびβ鎖ＴＣＲ遺伝子の周知のＶ領域遺伝子のサブセットを得ることによって（Berman et al., EMBO J. (1988) 7:727-738）、トランスジェニック宿主を、強い免疫応答を起こすことが可能であり、多様なＴＣＲを提供することができる。
【００８７】
上記のように、本発明の調製されたヒト導入遺伝子は、受胎された卵母細胞または胚性幹細胞の前核に導入され得る。ゲノムの統合は、使用する特定の戦略に応じて、ランダムまたは相同的であり得る。したがって、形質転換を用いて、反復工程を用いまたはブリーディングと組み合わせることによって、宿主ＴＣＲサブユニットを実質的に欠きながら、ヒトＴＣＲを産生することが可能なトランスジェニック動物を得ることができる。
【００８８】
ヒト遺伝子座が、宿主ゲノムに導入され、相同組換えまたはランダムな組込みによって、種々のトランスジェニックまたは変異動物の適切なブリーディングによって不活性化された内因性ＴＣＲ遺伝子座を有する宿主動物が産生されると、内因性ＴＣＲサブユニットを産生するための天然的な能力を欠損するが、実質的なＴＣＲレパトアを有するヒトＴＣＲを産生する能力は有している宿主を産生することができる。
【００８９】
かかる宿主系統は、特定の抗原による免疫付与により、特異的なヒトＴＣＲを産生するマウスＴ細胞の産生によって、反応するであろう。次いで、特定の好ましい特異性を有するＴＣＲを産生する特定のＴ細胞を単離することができるであろう。かかるＴ細胞は、特異的なヒトＴＣＲの継続的な安定産生のために、マウス骨髄腫細胞と融合または任意の他の方法により不死化することができる。
【００９０】
上記の不死化細胞系により産生した抗原特異的ヒトＴＣＲは、単離され、治療薬に用いるための開発に用いられる。
さらに、抗原特異的ＴＣＲサブユニットをコードする核酸の単離は、これらの産生した不死化細胞系から単離され得る。単離された核酸は、ＴＣＲに基づく治療薬の製造および開発に使用することができる。
【００９１】
単離された核酸はまた、可溶性の単鎖ＴＣＲの調製および製造に有用であり得、これは係属特許出願U.S.S.N 09/422,375、U.S.S.N. 08/943,086および U.S.S.N. 08/813,781に記載されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９２】
本発明の対象方法および方策は、異種ＴＣＲを産生するトランスジェニック動物の産生に制限する必要はなく、さらなる異種免疫系成分の産生を提供する機会を与えるものである。例えば、ＴＣＲは主要組織適合遺伝子複合体タンパク質（ＭＨＣ）などの分子、並びにコレセプターＣＤ４/ＣＤ８に関連して、および相互作用によって機能することが知られている。
【００９３】
ＭＨＣ遺伝子座は、十分に特徴付けされている。ＭＨＣ分子をコードする導入遺伝子を、ＴＣＲ遺伝子座について記載した方法と同様に調製することができる。次いで、ＭＨＣ導入遺伝子を、細胞またはトランスジェニック動物に、さらに組み込むことができ、ＭＨＣ分子と連動して異種ＴＣＲを共発現する。好ましい異種ＭＨＣ導入遺伝子は、再構成された、作動可能に連結したＤＮＡ配列を含み、ここで、トランスジェニック宿主への導入により、異種ＭＨＣＩおよび／またはＭＨＣＩＩ分子を発現することができる動物を与える。
【００９４】
また、マウスに機能的であり、かつマウスに発現されたヒトＭＨＣ分子と相互作用を起こす能力を有する、ヒトコレセプター分子ＣＤ４およびＣＤ８が、既に産生されている（Fugger, et al. (1994) PNAS 91:6151-6155; Medsen, et al. (1999) Nature Genetics 23: 343-347; Kieffer, et al. (1997) J. Immunol. 159:4907-4912）。コレセプターの細胞外ドメインがヒトであり、および膜貫通および細胞内ドメインがマウスである場合、キメラマウス−ヒトＣＤ４またはＣＤ８コレセプターはまた、マウス細胞のシグナリングの特別な観点から、係るキメラコレセプターの使用を必要とする場合に用いられるが、ほとんどの使用に関しては、ヒトコレセプター機能で十分である。
【００９５】
したがって、本発明のさらなる態様は、上記の産生したトランスジェニック動物に、コレセプター分子ＣＤ４およびＣＤ８を含む導入遺伝子を組み込むことを包含する。かかる分子は、マウス宿主のヒトＴＣＲとの相互作用について機能的である。コレセプターは、異種ＭＨＣ分子と連動するしないに関わらず、ＴＣＲトランスジェニック宿主に発現することができる。
【００９６】
本明細書に記載されるすべての文献は、参照によって本明細書に完全に組み込まれる。以下の非制限的な例示は、本発明を説明するものである。
以下の非制限的な例示は、本発明を説明するものである。
【００９７】
方法および材料
トランスジェニックマウス、胚（embryos）および胚性幹細胞は、参照によって本明細書中に組み込まれるHogan, et al., 「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratory、「Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach」, E. J. Robertson, ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987、Zjilstra, et al. (1989) Nature 342:435-438およびSchwartzberg et al. (1989) Science 246:799-803に従って得、操作した。
【００９８】
ＤＮＡクローニング手順およびＹＡＣの操作は、参照によって本明細書中に組み込まれるJ. Sambrook, et al. 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed.」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,、および「Genome Analysis: A Laboratory Manual, Volume 3 (1999)」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,に従って実施した。
【００９９】
トランスジェニックまたは野生型マウス系統、ヒトＹＡＣリソースライブラリーおよびオリゴヌクレオチドなどのさらなるリソースは、外部の販売業者から購入した。例えば、リソースは、the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine)、ResGen (Huntsville, Alabama)、HGMP Resource Centre (Cambride, United Kingdom)およびSigma Genosys (The Woodlands, Texas)から得ることができる。
【０１００】
ハイブリドーマ細胞および抗体は、「Antibodies: A Laboratory Manual」, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)に従って操作し、この文献は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１０１】
例１
マウスＴＣＲα鎖遺伝子の相同組換えによる不活性化
この例は、胚性幹（ＥＳ）細胞中の相同組換え、続いて、失活したα対立遺伝子を有するＥＳ細胞の初期のマウス胚（胚盤胞）への注入によって、マウス生殖細胞系に突然変異遺伝子を導入することによるマウスの内因性ＴＣＲα遺伝子座の不活性化について説明する。
この方策は、マウスα遺伝子座に相同なＤＮＡ配列を含有するベクターを用いる相同組換えによって、α鎖定常領域（Ｃα）を欠失させるものであり、ここで、Ｃαをスパニングする該遺伝子座の３．７ｋｂセグメントを欠失させ、ピューロマイシン選択マーカーＰｕｒによって置換する。
【０１０２】
α標的ベクターの構築：
プラスミドｐＰｕｒ（Clonetech; Palo Alto, CA）は、ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐｕｒ）を含有し、トランスフェクションされたＥＳ細胞の薬物選択に用い、ＳＶ４０プロモーターの転写調節下にある。該プラスミドはまた、Ｐｕｒ遺伝子のＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む。このプラスミドは、α−標的ベクターの構築のための出発点として用いる。第一工程は、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする配列を挿入することである。
【０１０３】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子は、本明細書中に参照として組み込まれるMansour, et al. (1988), Nature 336:348-352に記載される通り、相同組換えを有するＥＳクローンを富化するために、該構築に含める。ＨＳＶ−ｔｋカセットを、プラスミドｐＨＳＶ−１０６(GibcoBRL)から得、これは、該ｔｋプロモーターおよびポリアデニル化配列により一括されるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子の構造的な配列を含有する。ｔｋカセットを、ＢａｍＨＩ部位（ＴＫｆ、以下を参照）およびポリアデニル化部位の近隣に位置する部位を包含し、およびＮｏｔＩ部位（ＴＫｒ、以下を参照）をコードするプライマーを用いたＰＣＲによってｐＨＳＶ−１０６から増幅する。結果として得られるフラグメントを、ｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙに連結し、配列を決定し、そしてＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを用いて切除する。ｐＰＵＲベクターが特有のＮｏｔＩ部位を含むように、ＥｃｏＲＩを用いて切除し、オリゴヌクレオチドＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣに連結することによって改変する。結果として得られるプラスミドｐＰＵＲｔｋは、特有のＮｄｅＩ、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位を含有する（図１ａ）。
【０１０４】
【化２】
2005505236.tif 000003
【０１０５】
マウスα鎖配列（図１ｂ）を、Ｃα遺伝子座：
【化３】
2005505236.tif 000004
および
Ｃαエクソン１の５´領域：
【化４】
2005505236.tif 000005
に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、肝臓ＤＮＡに由来するゲノムファージライブラリーから単離する。
【０１０６】
マウスＣαセグメントの３´を拡張する４．１ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーＰＣａ３´ｆおよびＰＣａ３´ｒ（以下に示される配列）を用いるＰＣＲ増幅によって、ポジティブファージクローンから単離し、ＢａｍＨＩによって消化したｐＰＵＲｔｋ中にサブクローン化して、プラスミドｐＰＵＲｔｋ−Ｃａ３´を生成する（図１ｃ）。
【化５】
2005505236.tif 000006
【０１０７】
マウスＣαセグメントの５´を拡張する４．８ｋｂのＮｄｅＩフラグメントもまたオリゴヌクレオチドプライマーＰｃａ５´ｆおよびＰｃａ５´ｒを用いるＰＣＲ増幅によって、ポジティブファージクローンから単離する。結果として得られるフラグメントを、ＮｄｅＩを用いて消化し、ＮｄｅＩによって消化したｐＰＵＲｔｋ−Ｃａ３´に連結し、、ｐｕｒ遺伝子および３´下流Ｃα配列の５´〜３´方向性と同様に、ｐＰＵＲｔｋ−Ｃａ５´３´を生成する（図１ｄ）。
【化６】
2005505236.tif 000007
これは、Ｃαのフランキング領域を有するプラスミドをもたらすが、一体化する際に、遺伝子不活性化を導くＣαの欠失をもたらす。
【０１０８】
Ｃα対立遺伝子の標的不活性化を有するＥＳ細胞の生成および分析：
用いるＥＳ細胞は、本質的に、Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (Oxford: IRL Press), p. 71-112に記載される通りの有糸分裂的に不活性なＳＮＬ７６／７細胞フィーダーレイヤー上で増殖したＡＢ−１系統である（McMahon and Bradley (1990), Cell 62:1073-1085）。
【０１０９】
他の好適なＥＳ系統は、限定されずに、Ｅ１４系統（Hooper, et al. (1987) Nature 326:292-295）、Ｄ３系統（Doetschman, et al. (1985) J. Embryol. Exp. Morph. 87:27-45）およびＣＣＥ系統（Robertson, et al. (1986) Nature 323:445-448）を含む。特定の標的突然変異を保有するＥＳ細胞からのマウス系統の生成の成功は、ＥＳ細胞の多能性（即ち、宿主胚盤胞に注入する際の、胚形成への関与、および、結果として生じる動物の生殖細胞に寄与するためのそれらの能力）に依存する。
【０１１０】
任意に用いるＥＳ細胞系の多能性は、培養の時間および取扱う際の対処によって変えることができる。多能性に対する唯一の確実なアッセイは、ターゲッティングに用いるための特定のＥＳ細胞群が、ＥＳゲノムの形質転換が可能なキメラを生じることができるか否かを決定することである。これは、遺伝子ターゲッティングの前に、ＡＢ−１細胞の母体群の一部を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ胚盤胞に注入し、該細胞が、高いＥＳ細胞寄与を有するキメラマウスを産生することができるか否か、および、これらのキメラの大部分が、ＥＳゲノムを子孫に伝達することができるか否かを確認する。
【０１１１】
α鎖不活性ベクターｐＰＵＲｔｋ−Ｃａ５´３´を、ＮｏｔＩによって消化し、そして、Hasty, et al. (1991), Nature, 350:243-246に記載の方法による、エレクトロポレーションによってＡＢ−１細胞に導入する。エレクトロポレーションによって導入された細胞を、１〜２×１０６ 細胞／ウェルの濃度で、１００ｍｍシャーレに置く。２４時間後、Ｇ４１８（２００m ｇ／ｍｌの活性成分、ネオマイシン耐性細胞の選択のため）およびファイアルウリジン（fialuridine）（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−（β）−ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシルまたはＦＩＡＵ）（０．５ｍＭ、ＨＳＶ−ｔｋ陽性細胞の選択のため）を培地に加え、そして、薬剤耐性クローンを、１０〜１１日間以上増殖させる。クローンを回収し、トリプシン処理し、２つに分割し、さらに、増殖させる。次いで、各クローンに由来する細胞の半分を凍結し、そして残りの半分を、ベクターと標的配列との間の相同組換えの分析に用いる。
【０１１２】
ＤＮＡ分析は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより実施する。ＤＮＡを、Laird, et al. (1991), Nucl. Acids Res. 19:4293に記載のようにクローンから単離し、ＢａｍＨＩによって消化し、そして図１ｄに示されるプローブＡとしての７３０ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントによってプローブ化する。このプローブは、野生型遺伝子座の８．９ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを検出し、および標的ベクターと相同的に組み換えらえれる遺伝子座の特徴的な２．４ｋｂバンドを検出する（図１ｄおよび１ｅを参照）。２．４ｋｂのＢａｍＨＩバンドを示すサザンブロット分析により選別した陽性ピューロマイシンおよびＦＩＡＵ耐性クローンは、制限酵素ＡｆｌＩＩによって消化したＣα遺伝子との相同組換えによって不活性であり、これは、ベクターが、Ｃα遺伝子のものに相同的に結合したことを立証する。該プローブは、野生型遺伝子座の１２．３ｋｂのフラグメントおよび相同的に組み換えられた遺伝子座の９．９ｋｂのフラグメントを検出する。
【０１１３】
不活性化ＴＣＲα鎖を有するマウスの生成：
前記セクションで記載した標的ＥＳクローンの５つを解凍し、Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (Oxford: IRL Press), p. 113-151に記載の通りに、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ胚盤胞に注入し、そして、偽妊娠のメスの子宮に移して、インプットＥＳ細胞に由来する細胞と宿主胚盤胞の混合の結果、キメラマウスを生成する。該キメラに対するＥＳ細胞の寄与の程度は、ＥＳ細胞系に由来の、黒いＣ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンド上のアグーチの毛色の量によって視覚的に評価できる。標的クローンの胚盤胞注入から得られる子孫の約半分が、キメラ体（即ち、アグーチおよび黒色の色素沈着を示す）であると推測され、およびこれらのほとんどが、毛の色素沈着に関し、拡大した（７０％以上の）ＥＳ細胞の寄与を示す。ＡＢ１ ＥＳ細胞は、ＸＹ細胞系であり、オスＥＳ細胞によって移植されたメスの胚の性転換のため、これら高いパーセンテージキメラのほとんどがオスである。５つの標的クローンのうち４つに由来するオスキメラを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのメスと交配し、そして、生殖細胞形質転換を示す主要なアグーチの毛色が存在する子孫を観察する。これらのクローンのいくらかによるキメラは、常にアグーチの子孫を生成する。注入されたＥＳクローンにおいて、Ｃα遺伝子座の１つのみが標的となるため、各アグーチ群が、突然変異遺伝子座を受け継ぐ確率は、５０％であった。標的遺伝子のスクリニーングを、標的ＥＳクローンの同定に利用するプローブを用いて（プローブＡ、図１ｄ）、尾部断片バイオプシーからの、ＢａｍＨＩによって消化したＤＮＡのサザンブロット分析によって実施する。
【０１１４】
アグーチの子孫の約５０％が、８．９ｋｂの野生型バンドに加え、２．４ｋｂのハイブリダイズＢａｍＨＩバンドを示し、これは、標的Ｃα遺伝子座の生殖細胞形質転換を立証する。突然変異体にホモ接合的なマウスを生成するために、ヘテロ接合体を共に交配し、そして、上記のように子孫のＣα遺伝子型を決定する。
【０１１５】
３種の遺伝子型が、ホモ接合体の交配に由来することができる：（ｉ）通常のＣα遺伝子座のコピーを２つ有する野生型マウス、（ｉｉ）Ｃα遺伝子の標的コピーの１つおよび通常のマウスＣα遺伝子の１つを保有するヘテロ接合体および（ｉｉｉ）Ｃα突然変異にホモ接合的なマウス。この後者のマウスによるＣα配列の欠失を、Ｃαエクソン２に特異的なプローブを用いて、サザンブロットのハイブリダイゼーションによって確認する。一方、Ｃαエクソン２プローブのハイブリダイゼーションが、ヘテロ接合のおよび野生型の同腹の個体（sibling）によるＤＮＡ試料で観察されたが、ホモ接合体においては、ハイブリダイズシグナルが存在しないことから、これは、Ｃα遺伝子座の両コピーが、標的突然変異による欠失よって不活性化された新規なマウス株の生成を証明する。
【化７】
2005505236.tif 000008
【０１１６】
例２
相同組換えによるマウスＴＣＲβ遺伝子の不活性化
この例は、ＥＳ細胞中の相同組換えによる内因性マウスＴＣＲβ鎖遺伝子座の不活性化について説明する。方策は、Ｃβ鎖配列を含有するベクターを用いる相同組換えによって内因性β鎖定常領域（Ｃβ）セグメントを欠失させるものであり、ここで、該Ｃβ領域を欠失させ、そして、ネオマイシン選択可能マーカー ｎｅｏの遺伝子によって置換する。
【０１１７】
Ｃβ鎖標的ベクターの構築
プラスミドｐＧＴ−Ｎ２８およびｐＧＴ−Ｎ３９(New England Biolabs)は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）を含有し、トランスフェクションされたＥＳ細胞の薬物選択に用いられ、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）遺伝子プロモーターの転写調節下にある。ｎｅｏ遺伝子の後ろには、ｐｇｋポリアデニル化部位がある。Ｃβ鎖構築物のためのクローニングベクターを構築するために、ＰＮｅｏ、ｐＧＴ−Ｎ２８およびｐＧＴ−Ｎ３９を、ＳｐｅＩおよびＡｆｌＩＩによって切断し、そして、ｐＧＴ−Ｎ２８から２．８ｋｂのフラグメントを単離し、精製して、ｐＧＴ−Ｎ３９の消化物から単離および精製した１．６ｋｂのフラグメントに連結する。結果として得られるプラスミドｐＮｅｏは、ユニークな制限酵素認識部位ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに隣接するｎｅｏ遺伝子を含有する。
【０１１８】
Ｃβ１の５´領域およびＣβ２の３´領域を含有するマウスＣβ鎖配列（図２ａ）を、肝臓ＤＮＡに由来するマウスゲノムファージライブラリーから以下のＣβ鎖定常領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離する。
【化８】
2005505236.tif 000009
【０１１９】
Ｃβ１の５´領域に位置する３．０ｋｂのゲノムＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ファージから単離し、これは、Ｃβ１プローブを用いて同定する。Ｃβノックアウトベクター中にクローン化したフラグメントを、以下の方法によって生成する：先ず、ファージＤＮＡを、ＢａｍＨＩを用いて消化し、そして、ＥｃｏＲＩで消化する前に、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩリンカー（以下のＢ／Ｎ＃１および＃２を参照）をアニールし、連結する。次いで、このフラグメントを、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＮｅｏ中にクローン化し、ｐＮｅｏＣｂ５´と称するプラスミドをもたらす。
【化９】
2005505236.tif 000010
【０１２０】
構築の次の工程は、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩフラグメントとしてのＨＳＶチミジンキナーゼカセットのｐＰＵＲｔｋからの切除およびそれをＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩによって切断したｐＮｅｏＣｂ５´に連結することを含む。結果として得られるプラスミドは、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子、Ｃβ１の５´領域の３ｋｂの配列およびｎｅｏ選択可能マーカーを保有し、これは、指定のｐＮＥＯｔｋＣｂ５´である。
【０１２１】
該構築のＣβノックアウトベクターの形成過程の最終工程は、プローブＣβ２を用いたハイブリダイゼーションに陽性のファージから、３．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを単離することによって達成する。このフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩによって切断したｐＮＥＯｔｋ−Ｃ５´中にクローン化する。結果として得られる構築物ｐＮＥＯｔｋＣｂ５´３´（図２ａおよび２ｄ）は、６．４ｋｂのＣβ１および２遺伝子座のフランキングゲノム配列、およびｎｅｏ遺伝子が挿入されたことによるＣβ１および２領域をスパニングする１１．３ｋｂの欠失を含有する。
【０１２２】
Ｃβ対立遺伝子の標的不活性化を伴なうＥＳ細胞の生成および分析：
ＡＢ−１ＥＳ細胞（McMahon and Bradley (1990), Cell 62:1073-1085）を、本質的にRobertson, E. J. (1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (Oxford: IRL Press), pp. 71-112で記載されるような有糸分裂的に不活性なＳＮＬ７６／７細胞フィーダーレイヤー上で増殖させる。前例に記載したように、標的構築物ｐＮＥＯｔｋ−Ｃｂ５´３´とのＥＳ細胞のエレクトロポレーションの前に、ＥＳゲノムの生殖細胞伝達が可能であるキメラ由来のＡＢ−１の生成によってＥＳ細胞の多分化能を決定する。
【０１２３】
Ｃβ鎖不活性ベクターｐＮＥＯｔｋ−Ｃｂ５´３´を、ＮｏｔＩによって消化し、そして、Hasty et al. (1991) Nature 350:243-246に記載の方法によって、ＡＢ−１細胞にエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションされた細胞を、１〜２×１０６細胞／ウェルの濃度で、１００ｍｍシャーレにプレーティングする。２４時間後、Ｇ４１８（２００m ｇ／ｍｌの活性成分、ネオマイシン耐性細胞の選択のため）およびＦＩＡＵ（０．５ｍＭ）を培地に加え、および薬剤耐性クローンを、８〜１０日間以上増殖させる。クローンを、回収し、トリプシン処理し、２つに分割し、さらに、増殖させる。次いで、各クローンに由来する細胞の半分を凍結し、そして残りの半分を、ベクターおよび標的配列の間の相同組換えの分析に用いる。
【０１２４】
ＤＮＡ分析を、サザンブロットハイブリダイゼーションにより実施する。ＤＮＡを、Laird, et al. (1991), Nucl. Acids Res. 19:4293に記載のようにクローンから単離し、ＢａｍＨＩによって消化し、そして８００ｂｐによってプローブする。図２ａに示されるプローブＡおよびＢとしてのプライマーＰＲＩＭｂ５´ｆおよびＰＲＩＭｂ５´ｒを用いて、ｐＮＥＯｔｋ−Ｃｂ５´３´からＰＣＲフラグメントを生成する。このプローブは、野生型遺伝子座の１０．４ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを検出し、一方、７．４ｋｂのバンドは、標的ベクターと内因性配列との相同組換えの診断に用いる。サザンブロットハイブリダイゼーションによってスクリーニングしたＧ４１８およびＦＩＡＵの二重耐性クローンは、７．４ｋｂのフラグメントを含有し、さらに、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶおよびＴｔｈ１１１Ｉによる消化によってＣβ遺伝子座において所望の標的が発生（ｅｖｅｎｔ）したことを確認する。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＶおよびＴｔｈ１１１Ｉによって消化したＤＮＡのサザンブロットとプローブＡおよびＢのハイブリダイゼーションによって、野生型遺伝子座の、それぞれ、８．７ｋｂ、３．６ｋｂおよび３．４＋３．９ｋｂのバンドを産生し、一方、標的重鎖遺伝子座においては、それぞれ、８．３ｋｂ、２．８ｋｂおよび０．９＋３．４ｋｂのバンドが期待できる。
【０１２５】
【化１０】
2005505236.tif 000011
【０１２６】
Ｃβ欠失を保有するマウスの産生
前セクションで記載した３つの標的ＥＳクローンを解凍し、Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., Oxford: IRL Press, p.113-151に記載のように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞へ注入し、そして、偽妊娠のメスの子宮に移す。該キメラに対するＥＳ細胞の寄与の程度は、ＥＳ細胞系に由来し、黒いＣ５７Ｂｌ／６Ｊバックグラウンド上のアグーチの毛色の量によって視覚的に評価できる。標的クローンの２つの胚盤胞注入から得られる子孫の約半分が、キメラ体（即ち、アグーチおよび黒の色素沈着を示す）である。このキメラのほとんどが、毛の色素沈着に、明らかな（約５０％以上の）ＥＳ細胞の寄与を示す。ＡＢ１−ＥＳ細胞は、ＸＹ細胞系であり、オスＥＳ細胞によって移植されたメスの胚の性転換のため、これら高いパーセンテージキメラのほとんどがオスである。オスキメラを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのメスと交配し、そして、ＥＳゲノムの生殖細胞形質転換を示す主要なアグーチの毛色が存在する子孫を観察する。両クローンによるキメラは、一貫して、アグーチの子孫を生成する。注入されたＥＳクローンにおいては、変異遺伝子座の１つのみが標的となるため、各アグーチ群が、変異遺伝子座を継続する確率は、５０％であった。標的遺伝子のスクリニーングを、標的ＥＳクローン（プローブＡ、図２ａ）の同定に利用されたプローブを用い、ＢａｍＨＩによって消化した尾部のバイオプシーによるＤＮＡのサザンブロット分析によって実施する。アグーチの子孫の約５０％が、１０．４ｋｂの野生型バンドに加え、約７．４ｋｂのハイブリダイズＢａｍＨＩバンドを示し、これは、標的Ｃβ遺伝子（ＣβＫＯ）セグメントの生殖細胞形質転換を立証する。
【０１２７】
ＣβＫＯについてホモ接合的なマウスを生成するために、ヘテロ接合体を共に交配し、上記のように子孫のβ鎖遺伝子型を決定する。３つの遺伝子型が、ヘテロ接合体の交配に由来する：通常のＣβ遺伝子座のコピーを有する野生型マウス、該遺伝子の標的コピーの１つおよび通常のコピーの１つを有するヘテロ接合体、およびＣβＫＯ突然変異にホモ接合的なマウスである。この後者のマウスのＣβ配列の欠損を、プローブとしてＣβ１またはＣβ２を用いて、陽性クローンのＢａｍＨＩ消化物のサザンブロット分析によって判断する。これらのプローブは、ＣβＫＯ遺伝子座を有するマウスからはシグナルを発生しないが、生成した１０．４および６．２ｋｂの野生型遺伝子座フラグメントは、夫々、重鎖遺伝子の両コピーが、Ｃβ配列の欠失によって突然変異した新規なマウス系統の生成を証明する。
【０１２８】
例３
ヒトＴＣＲ遺伝子座のためのベクター構築および改変
ｐＹＡＣ４−ｎｅｏベクター：
酵母は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）の外因性ＤＮＡの大型フラグメントをクローン化するために有益な宿主である。インビトロにおいて、長さ１．２メガ塩基（Ｍｂｐ）までの直線ＤＮＡ分子を構築し、宿主酵母細胞に形質転換し、およびソースのゲノムＤＮＡの正確な複製として増殖させる（Burke, D.T., Carle, G.F. and Olson, M.V. (1987) Science 236: 806; Bruggemann, M, and Neuberger, M.S. (1996) Immunol. Today 7:391）。最も広く用いられるＹＡＣベクターの１つは、ｐＹＡＣ４である。(Burke, D.T., et al.; 図３ａ)。このベクターは、大腸菌または酵母に形質転換することができ、いずれの宿主においても環状分子として複製される。しかしながら、ｐＹＡＣ４は、優先的に、直線的な酵母染色体の大型挿入物のクローン化に用いられる。第一世代のｐＹＡＣ４ベクターは、ｐＹＡＣトランスフェクタントの選択を容易にするように、Ｇ４１８耐性のネオマイシン遺伝子を含有するように改変された(Cooke, H. and Cross, S. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 11817)。我々は、さらに、ｐＹＡＣ４−ｎｅｏベクターを、制限部位ＥｃｏＲＩ、ＦｓｅＩ、ＫｓｐＩ、ＡｓｃＩおよびＥｃｏＲＩを含有するポリリンカー領域を加えることによって改変する。ポリリンカーを、ｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子のオーカー抑制(ochre-suppressing)対立遺伝子のＳＵＰ４−ｏ遺伝子のＥｃｏＲＩ部位にクローン化する。これらの制限エンドヌクレアーゼによる低頻度の切断から、それらによるヒトＤＮＡの消化は、ＴＣＲαおよびβ遺伝子座のほとんどを含む、ＤＮＡの大型フラグメントを生成する。
【０１２９】
ｐＹＡＣ４−ｎｅｏベクターにポリリンカー配列を加えるために、ＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩによって消化し、次いで、アニールした該ポリリンカーをコードするオリゴヌクレオチドの存在下で連結し、ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏを得る。オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである：
【化１１】
2005505236.tif 000012
次いで、ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏベクターを、大腸菌の形質転換に用いて、長さが５００Ｋｂｐより大きい、大型ヒトＤＮＡフラグメントのクローニングおよび操作のための大量のベクターＤＮＡを生成する。
【０１３０】
例４
ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏベクター中へのヒトＴＣＲα遺伝子座ののクローニング：
高分子量を有するＤＮＡを、ルツァット法（Luzzatto）の改変によって、全血から得られる循環白血球から調製する（Luzzatto, L. (1960) Biochem. Biophys. Res. Commun.2:402）。該ＤＮＡを、元々は、無傷の染色体ＤＮＡ分子を酵母スフェロプラストから単離するために開発されたスクロース ステップ グラディエント手順（sucrose step-gradient procedure）によって精製する。このプロトコルは、粗溶菌液の一段階の精製のみを含むものであるが、不純ヌクレアーゼのない、直ちに、大抵の制限エンドヌクレアーゼによって切断されるＤＮＡ試料を産生する。高分子量を有するヒトＤＮＡを単離するための具体的なプロトコルは、Methods in Enzymology (1991) 194:251-270で確認することができる。ヒトＴＣＲα遺伝子座は、染色体１４ｑ１１．２に位置し、その全体の配列が決定されており、そして全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ヌクレオチドデータベースに寄託されている（図４ａ）。我々の主な目的は、ヒトＴＣＲを発現するトランスジェニック動物を産生することであり、これは、広範囲のＴＣＲ多様性を示す。したがって、我々は、大型であるが、扱いやすいＴＣＲ可変エクソンのほとんどすべておよび連結セグメントのすべてを含有するＤＮＡフラグメントを生成するために、低頻度に切断する、制限エンドヌクレアーゼを使用することが最も適していると考える。ヌクレオチド配列情報、特に、ヒトα／βＴＣＲ遺伝子座の情報へのアクセスは、ＹＡＣベクター中にクローニングするための対象遺伝子座をコードするフラグメントに、ヒトＤＮＡを消化するための制限エンドヌクレアーゼ酵素の特有の切断を同定するための能力を増大させる。ＮＣＢＩデータベースおよびベクターＮＴＩソフトウェアを用いて、我々は、ＴＣＲα遺伝子座の制限マップを生成することができる（図４Ｂ〜Ｆを参照）。
【０１３１】
該分析は、ある酵素ＫｓｐＩが、ｂｐ７２４２６のまたは第一可変エクソンの５´（ＴＣＲＡＶ１）のヒトＴＣＲα遺伝子座を消化することを明らかにした。それはまた、２回目に１，０６０，９４６ｂｐの３´エンハンサーの下流のＤＮＡを切断する。ＫｓｐＩフラグメント産物は、長さが、９８８，５２０ｂｐまたはおよそ１メガ塩基（Ｍｂｐ）である。この情報を有することによって、我々は、ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４ベクター中へのクローニングのために、該ＤＮＡを大きさによって分別し、およそ１メガ塩基のＤＮＡフラグメントを単離する。簡潔には、消化した試料は、パルス・フィールド・ゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を用いて、大きさで分画し、精製する。このプロトコルを用いて、我々は、長さが１Ｍｂｐより小さい、ＫｓｐＩによって消化した不純フラグメントを除去する。これは、ＹＡＣベクター中へのクローニングの効率を増大し、並びにヒトＴＣＲα遺伝子を含有するＤＮＡフラグメントの単離を容易にする。ＰＦＧＥの実施後、該ゲルを、エチジウムブロマイドによって着色し、１Ｍｂｐバンドを切り出し、該ＤＮＡを、ＧＥＬａｓｅおよびエタノール沈殿（EpiCenter, Madison, WI）によって単離する。高純度の無傷のＤＮＡを回収し、次いで、ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏベクター中にクローン化する。
【０１３２】
Ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏ（α）：
ＨｕＴＣＲαＹＡＣベクターの生成を、ＢａｍＨＩおよびＫｓｐＩによってクローニングベクターを消化することによって達成し、後に、脱リン酸化されるレフトおよびライトアーム産物を得る。ホスファターゼ処理の効果は、後に、所望のライゲーション産物を大きさの分画によって分離することが困難である連鎖した（concatenated）ベクターフラグメントの形成を抑制することにある。具体的には、挿入ＤＮＡ４０〜１００μｇと、等量の調製ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏベクターを混合する。New England Biolabs (NEB)ライゲーション反応バッファーによって容量を２５０μｌおよびバッファー組成物を調整し、１０００ユニットのＮＥＢＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、ライゲーション反応を行い、１５℃で１０時間インキュベートする。
【０１３３】
形質転換：
次いで、連結した材料を、酵母スフェロプラストを形質転換するのに用いる（Burgers, P.M.J. and Percival, K.J. (1987) Anal. Biochem. 163: 391-397）。形質転換宿主のために、我々は、他の宿主として幅広く用いられていることから、酵母株ＡＢ１３８０を選択したが、他の酵母宿主株、例えば、ＹＰＨ９２５も好適であり得る。形質転換株は、ウラシルを欠く合成培地上で選択され、これらのプレートを、以下の標準的な方法で調製する。これらの形質転換体を、ＨｕＴＣＲαＹＡＣベクター並びに消化ｍｏｄ−ｐＹＡＣ−ｎｅｏ（α）を保有する陽性体を同定するために選別する。
【０１３４】
コロニースクリーニング：
コロニースクリーニングプロトコルは、ナイロン膜の表面でのコロニーの成長、酵母のスフェロプラスティング、該スフェロプラストの界面活性剤による溶解および塩基によるＤＮＡ変性を含む。我々は、ブラウンスティン等による記載されるプロトコルを利用する（Brownstein, B.H., Silverman, R.D., Little, R.D., Burke, D.T., Korsmeyer, S.J., Schlessinger, D., and Olson, M.V. (1989) Science 244: 1348）。簡潔には、このプロトコルは、複製フィルターを作製するために、コロニーリフト（colony lift）レプリカ培養を利用し、これは、プローブのためのコロニーおよび陽性クローンの増殖のための可変細胞を与える複製（duplicate）を提供する。酵母コロニーを、ナイロンフィルター上でコロニーをスクリーニングするために適切な大きさに成長させる。３０℃で、約２日間成長させることを必要とする。コロニーを含有する複製フィルターの１つを、１．０Ｍソルビトール、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、５０ｍＭＥＤＴＡおよび１５ｍＭジチオトレイトール（酵素バッファーのｐＨは７に調整）中で酵母溶菌酵素［ＩＣＮ＃１５２２７０、＞７０，０００ユニット（Ｕ）／ｇ］２ｍｇ／ｍｌを浸透させた厚手のペーパーフィルターに移し、３０℃で一晩インキュベートする。この膜を、１０％ドデシル硫酸ナトリウムによって室温下で５分間浸透させたペーパーフィルターに移す。次いで、膜を、０．５ＭＮａＯＨで１０分間浸透させたペーパーフィルターに移し、それを、０．３ＭＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．２ＭＴｒｉｓＨＣｌにそれぞれｐＨ７．５で５分間浸透させた３つの連続的なペーパーフィルターに移すことによって中和する。該フィルターを風乾し、プロ−ビングを、ラベル化したオリゴヌクレオチド並びに標準的なハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラフィー技術によって実施する。ヒトＴＣＲα遺伝子座陽性コロニーを同定するために、我々は、該ＤＮＡ挿入物の５´および３´末端に特異的な２つのオリゴヌクレオチドプローブを用いて、コロニーを選別する。これらオリゴヌクレオチドは、それぞれ、５´末端ＫｓｐＩ部位のおよそ１００ｂｐ下流および３´末端ＫｓｐＩサイトの１００ｂｐ上流をアニ−ルし、これらの配列は以下の通りである：
【０１３５】
【化１２】
2005505236.tif 000013
【０１３６】
トランスジェニックヒトＴＣＲα遺伝子座：
ヒトＴＣＲα導入遺伝子座を、ｍｏｄ−ｐＹＡＣ−ｎｅｏ（α）中に組み立てた後（これは、ＶαおよびＪαエクソンの全体、単一のＣαエクソンおよび３´エンハンサーを含有し得る）、我々は、酵母宿主株を用いるスフェロプラスト融合によって、該ＨｕＴＣＲαＹＡＣベクターを胚性幹細胞（ＥＳ）に導入する（Pachnis, V., Pevny, L., Rothstein, R., and Constantini, F. (1990) PNAS 87: 5109-5113; Huxley, C. and Gnirke, A., (1991) Bioessays, 13: 545-550; Davies, N.P and Huxley, C. (1996) in Methods in Molecular Biology, Vol.54: YAC Protocols. Eds. D. Markie. Humana Press Inc., Tolowa, NJ.）。
【０１３７】
Ｇ４１８耐性を、ＨｕＴＣＲαＹＡＣを含有する酵母に成功裏に融合したＥＳ細胞のモニターに用いる。ネオマイシン耐性のＨｕＴＣＲαＹＡＣ陽性ＥＳ細胞の選択を、スフェロプラスト融合の２〜３週間後に実施する。適切に改変したＥＳ細胞のＰＣＲおよびサザンブロット分析同定に続き、５つのクローンを増殖させ、胚盤胞に導入して（Hogan, B.R., Beddington, F., Costantini, F. and Lacy, E. (1994) Manipulating the Mouse embryo: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. pp. 477）、そして、偽妊娠メス宿主株に移植する。キメラマウスとＭｕＴＣＲα陰性／ＭｕＴＣＲ（β）陰性のマウスとのブリーディングは、ヒトＴＣＲαのみを産生するマウスをもたらす（例１０を参照）。
【０１３８】
例５ａ
ｍｏｄ−ｐＹＡＣ−ｎｅｏベクター中へのヒトＴＣＲβ遺伝子座のクローニング
上記例に記載の通り、消化およびクローニングのためのヒトＤＮＡを調製する。ヒトＴＣＲβ遺伝子座は、染色体７ｑ３５に位置し、およびその全配列が決定されており、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースに寄託されている。ＮＣＢＩデータベースおよびベクターＮＴＩソフトウェアを用いて、我々は、ヒトＴＣＲβ遺伝子座を組立て、ヌクレオチドマッピングを実施した（図５ｂ〜ｈを参照）。該マッピング実行の分析は、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼを用いるヒトゲノムＤＮＡの消化によって、３０の可変エクソンのうちの、いずれも連結および多様性セグメントに属する２１エクソン、両定常エクソンおよび３´エンハンサーを含有する大型ＤＮＡフラグメントを生成することを証明した。ＴＣＲβＤＮＡフラグメントの長さは、５９８，０５４ｂｐであることが決定された（図５ｂ〜ｈを参照）。この利用可能な情報を有することによって、我々は、ｐＹＡＣ−ｎｅｏベクター中へのクローンニングのために、該ＤＮＡを大きさで分画し、長さが５００〜６００ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを単離することができる。
【０１３９】
該ＤＮＡの単離後、我々は、２つの特定の制限エンドヌクレアーゼを用いて１００μｇを消化し、ヒトＴＣＲβ遺伝子座の大部分を含有するフラグメントを生成する。例４に記載したように、消化ＤＮＡ試料を、ＰＦＧＥを用いて、サイズによって分画し、精製する。これは、クローニングの効率およびヒトＴＣＲβ遺伝子座の大部分を含有するＤＮＡフラグメント単離の可能性を増大させる。ＰＦＧＥの実行を完了した後、６００ｋｂバンドをゲルから切り出し、そして、該ＤＮＡをＧＥＬａｓｅ（EpiCenter, Madison, WI）、エタノール沈殿によって単離する。高純度および無傷のＤＮＡを回収し、次いで、ｍｏｄ−ｐＹＡＣ−ｎｅｏベクター中にクローン化する。
【０１４０】
Ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏ（β）：
Ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏ（β）ベクターの調製は、ベクターＤＮＡを、最初に、ＢａｍＨＩ、次いで、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩで消化することを除いて、ヒトＴＣＲα遺伝子座のクローニングで用いた手順と同様である。導入ＤＮＡのｐＹＡＣベクター中への連結は、例４で記載したヒトＴＣＲα遺伝子座に関して記載したものと同様である。ヒトＴＣＲβ遺伝子座を含有するｐＹＡＣベクターを有する酵母の形質転換後、我々は、前記のように、コロニーのスクリーニングを実施する。
【０１４１】
トランスジェニックヒトＴＣＲβ遺伝子座：
ヒトＴＣＲβの導入遺伝子座をｍｏｄ−ｐＹＡＣ−ｎｅｏ（β）に組立てた後（構築物である ヒトＴＣＲβＹＡＣは、Ｖβの大部分およびＪβおよびＤβセグメントの全体、２つのＣβエクソンおよび３´エンハンサーを含有することができる）、我々は、該ＨｕＴＣＲβＹＡＣを、スフェロプラスト融合によって胚性幹細胞（ＥＳ）に導入し（Pachnis, V., Pevny, L., Rothstein, R., and Constantini, F. (1990) PNAS 87: 5109-5113; Huxley, C. and Gnirke, A., (1991) Bioessays, 13: 545-550; Davies, N.P and Huxley, C. (1996) in Methods in Molecular Biology, Vol.54: YAC Protocols. Eds. D. Markie. Humana Press Inc., Tolowa, NJ.）、そして、キメラマウスを胚盤胞注入によって産生する（Hogan, B.R., Beddington, F., Costantini, F. and Lacy, E. (1994) Manipulating the Mouse embryo: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. pp. 477）。
【０１４２】
Ｇ４１８耐性を、酵母を含有するＹＡＣに融合したＨＭ−１胚性幹細胞のモニターに用いる。次いで、ネオマイシン耐性のＨｕＴＣＲβＹＡＣ陽性ＨＭ−１ＥＳ細胞の選択を、融合の２〜３週間後に実施する。完全なＨｕＴＣＲβＹＡＣのコピーを含有するＥＳ細胞を、サザンハイブリダイゼーションによって確認し、そして、ＨｕＴＣＲβＹＡＣ陽性クローンを、胚盤胞の再構成に用い、キメラ動物を産生する。キメラ動物とＭｕＴＣＲα陰性／ＭｕＴＣＲβ陰性であるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスとのブリーディング（例１０を参照）は、生殖細胞伝達、そして、ゲノムに融合されたＨｕＴＣＲβ遺伝子座を有するマウスをもたらす。遺伝子伝達は、尾のＤＮＡのサザンブロット分析によって確認できる。
【０１４３】
例５ｂ
ヒトＴＣＲβまたはＴＣＲα遺伝子を発現するマウスをまた、代替的な方法によって構築する。例えば、ＮＣＢＩおよび米国立ヒトゲノム研究所データベースから得られる情報を用いて、いくつかのヒトＹＡＣクローンによって、ＴＣＲβ鎖遺伝子座を再構築することができる。同定したこれらのヒトＹＡＣは、ＲｅｓＧｅｎから利用でき、ＴＣＲβ鎖配列および重なり合う相同性を含有する。第一のＹＡＣクローンＤ４９Ｈ４は、ＴＣＲβ遺伝子座の５´末端からトリプシノーゲン遺伝子の反複までを含有し、一方、第二のＹＡＣ９４０ａ１２は、ＴＣＲβ遺伝子座の３´末端を含有する（図５ｉ）。２つのクローンは、かなりの領域の相同的な重なりを有するため、それらを相同組換えによって、単一のヒトＴＣＲβＹＡＣ（ＨｕＴＣＲβＹＡＣ）の組立てに用いることができる。組換えイベント並びにランダムな欠失またはキメラ現象の欠如は、２つの遺伝子間の配列相同性の領域に隣接するプライマーのセットを用いるＰＣＲ、ＰＦＧＥおよび／またはサザンブロット分析によって確認できる。
【０１４４】
ＨｕＴＣＲβＹＡＣを哺乳類細胞または胚に導入する前に、ＹＡＣ構築物のアームを改変することができる。ＨｕＴＣＲβＹＡＣのアームは、マウス調節配列および/または哺乳類選択カセットを含むために、「レトロフィット（retrofitting）」と呼ばれる技術によって、改変する（図５ｊ）。ＹＡＣアームは、ｐＲＡＮ４(Markie, D. et al., (1993) Somatic Cell and Molecular Genetics, 19: 161-169)などのベクターと、Eric D. Green in Genome Analysis: A Laboratory Manual, Volume 3 (1999), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記載の種々の形質転換法によってレトロフィットする。アームの改変は、酵母宿主株およびＥＳ細胞間の成功的な融合発生の選択に関与し、さらに、それが、該宿主ゲノムに統合される際のＨｕＴＣＲβ導入遺伝子の発現を急増させる。
【０１４５】
Ｖβセグメントの大部分、ＪβおよびＤβセグメント全体および２つのＣβエクソンを含有するＨｕＴＣＲβＹＡＣ構築物の組立ておよび改変後、該ＨｕＴＣＲβＹＡＣを、スフェロプラスト融合によってＥＳ細胞に導入する。成功的に融合したＥＳ細胞は、マウス胚盤胞およびキメラの生成に用いることができる。代替的に、該構築物を、該酵母宿主株から単離し、ＨｕＴＣＲβＹＡＣ構築物の剪断を抑制するためのわずかな改変を用いる（Montolui, L. (1996) in Methods in Molecular Biology, Vol.54: YAC Protocols. Eds. D. Markie. Humana Press Inc., Tolowa, NJ.）、Hogan, et al., 「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Laboratoryで概説されるようなマイクロインジェクションによって、単細胞期（one-cell stage）の胚に導入する。結果として得られる子孫を、尾のバイオプシーのサザン分析によって、マウスゲノム中へのＨｕＴＣＲβＹＡＣ構築物の組込みをテストすることができる。陽性動物を、同型接合性にすることができ、他のマウス系統に存在する他のものと交配することができる。
【０１４６】
例６
ヒトＴＣＲα／βマウスの生成:
Ａ）ＨｕＴＣＲαマウスおよびＨｕＴＣＲβマウスの遺伝子的交配によるヒトＴＣＲα／βマウスの生成：
ＨｕＴＣＲαおよびＨｕＴＣＲβ含有マウスの両方を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドにおいて交配する。これらのマウスは、さらに、機能的なマウスＴＣＲα／β遺伝子座を有し、それらＴ細胞上にマウスＴＣＲを提示する。これらのマウスの成功的なブリーディングは、機能的なマウスおよびヒトＴＣＲを含有するＣ５７Ｂｌ／６Ｊトランス遺伝子座マウスの生成をもたらす。該マウスが、ヒトＴＣＲα／β遺伝子座の両方を有しているか否かを判断するために、我々は、尾部ＤＮＡを用いるサザンブロットハイブリダイゼーションおよびαまたはβに特異的なオリゴヌクレオチドを用いて膜のプロービングを実施するであろう。
【０１４７】
Ｂ）マウスＴＣＲα/βノックアウトバックグラウンドにおけるヒトＴＣＲα/β陽性マウスの生成：
次いで、Ａ（マウスおよびヒトＴＣＲ遺伝子座の両方に陽性である）で生成したマウスを、ブリーディングの次のラウンドに用い、欠失または不活性化された内因性マウスＴＣＲ遺伝子座を有するＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに加える。これは、マウスＴＣＲα／βノックアウトマウスとマウスＴＣＲα／β遺伝子座およびヒトＴＣＲα／β遺伝子座の両方に陽性のマウスとを交配することによって実施する。陽性マウスのスクリーニングを、エンドヌクレアーゼで処理した、尾断片からのＤＮＡおよびサザンブロットハイブリダイゼーション技術によって再び実施する。ゲルに流出し、ナイロン膜に移したＤＮＡフラグメントを、それぞれ、ＴＣＲαまたはβ鎖に特定のプライマーを用いてプローブする。ヒトＴＣＲα／βに陽性であり、かつマウスＴＣＲα／βに陰性であるマウスを８週齢まで成長させ、脾臓Ｔ細胞の染色のために、いくつかの脾臓を単離する。ヒトＴＣＲα／βを発現するＴ細胞の同定を、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーによって実施する。該アプローチは、フィコエリトリンと接合した抗ＴＣＲ特異的ｍＡｂ(TCR Pan α／β, clone BMA031 (IgG2b mouse) Coulter Immunotech, ME)によるものである。
【０１４８】
Ｃ）ヒトＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２を含有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配したマウスＴＣＲα／βバックグラウンドにおけるヒトＴＣＲα／β陽性マウスの生成：
これは、ヒトＭＨＣクラスＩ分子によって拘束されるヒトＴＣＲα／βを産生するという我々の必用性を増殖するために作出される１種のマウスの一例である。この例において、我々は、ＨＬＡ−Ａ２．１として知られているヒトクラスＩ分子の使用を選択した。生成するＴ細胞は、このＭＨＣ分子によって制限されたペプチドと反応し、一般に、ＣＤ８＋表現型であり、および本質的に細胞溶解性である。ＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子を、該細胞群の５０％近くに発現し、発現ＭＨＣの最も一般的な形態を形成する。具体的には、我々は、ヒトＴＣＲα／βトランスジェニックマウスとドクター・リンダ シェルマン（Dr. Linda Sherman）によって、以前に生成されたＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウス(Sherman and Lustgarten, US Pat. App. 08/812,393 and WO97/32603)とを交配した。我々は、ＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子およびヒトＴＣＲα／β遺伝子座を有するであろう新規なマウスを産生するために、両マウスを交配する。このマウスはまた、これらの遺伝子座の任意のさらなる改変を実施しなかったことから、内因性マウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩ遺伝子座を含有する。将来的には、マウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩ遺伝子座のノックアウトを生成することが望まれる。本明細書において、我々は、マウスＴＣＲα／β、また、ヒトＴＣＲαおよびＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックのノックアウトを生成についての記載を制限している。我々は、サザンブロットハイブリダイゼーションおよびフローサイトメトリーによって陽性マウスを選別する。さらに、我々は、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示された所望のペプチド抗原と反応するＴ細胞クローンを生成し、次いで、それらのＶＪａおよびＶＤＪ再構成のＰＣＲ分析を実施する。これはまた、ＶαおよびＶβファミリー特異的ｍＡｂを用いる免疫蛍光染色による、Ｔ細胞のＴＣＲ発現のさらなる特性評価へと続く（Immunotech カタログを参照）。
【０１４９】
例７
機能的なヒトＴＣＲに関するヒトＴＣＲトランスジェニックマウスの試験：
ヒトＴＣＲ導入遺伝子の機能性を評価するために、これらのマウスから単離したＴ細胞を、ヒトＴＣＲαおよびβ可変領域に特異的な抗体のパネルを用いて着色し、フローサイトメトリーによって分析する。さらに、ｍＲＮＡを、これらの細胞から単離し、ＴＣＲのｃＤＮＡクローンの構造を調査する。
【０１５０】
内因性マウスＴＣＲαおよびβ鎖遺伝子座の定常領域の欠失および非再構成ヒトＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖導入遺伝子座の単一コピーを含有するマウスから、脾臓Ｔ細胞を単離する。これらの細胞を、ヒトＴＣＲαおよびβ可変領域に特異的な抗体のパネル（Coulter Immunotech）を用いて着色し、フローサイトメトリーによって分析する。これは、機能的に再構成されたαおよびβ鎖によるＴ細胞の総数および多様性の分析を可能にする。ヒトＴ細胞中のそれらの発現に関連する種々の可変領域の比例的な分布の評価もまた実施する。
【０１５１】
ポリアデニル化ＲＮＡをまた、１１週齢のオスの第二世代ヒトＴＣＲα／βトランスジェニックマウスから単離する。このＲＮＡを、オリゴ−ｄＴ／ＳＭＡＲＴＩＩオリゴヌクレオチド（Clonetech）によって開始する単鎖ｃＤＮＡの合成に用いる。次いで、結果として得られるｃＤＮＡを、ヒトαまたはβ定常領域に特異的な合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびClonetechによるユニバーサルプライマーミックス（Universal primer mix）を用いて、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ＰＣＲ増幅の鋳型として用いる。適切なサイズに増幅したフラグメントを、アガロースゲルから単離し、ｐＧＥＭ Ｔ−Ｅａｓｙ中でクローン化し、配列を決定する。
【０１５２】
ＤおよびＪセグメントの使用、さらに、Ｎ領域の付加、ＣＤＲ３の長さの分布（length distribution）に注目し、導入遺伝子にコードされた鎖の全体的な多様性を調査し、および機能的なｍＲＮＡ分子をもたらす結合頻度を調査する。
【０１５３】
例８
トランスジェニックＴＣＲ／ＨＬＡ−Ａ２マウスの免疫および免疫応答：
この例は、本発明のトランスジェニックマウスの成功的な免疫および免疫応答を例証する。
【０１５４】
トランスジェニックマウス（ＨｕＴＣＲα／β ／ｍｕＴＣＲα−／β −−−ＨＬＡ−Ａ２．１）のペプチドプライミングおよびＣＴＬ系統の増殖：
マウスの尾の基部に、２６４ペプチド（ヒトｐ５３腫瘍抑制タンパク質によるアミノ酸２６４−２７２）１００μｇ、および不完全フロイントアジュバント１００μｌに乳化した、Ｂ型肝炎ウィルスコアタンパク質（Sette, A., Vitiello, A., et al. (1994) J. Immunol. 153:5586）の合成Ｔ−ヘルパーペプチド提示残基１２８〜１４０に結合するＩ−Ａｂ１２０μｇを皮下注射する。１０日後、次いで、プライミングを受けたマウス脾臓細胞を、提示されるプライミングペプチド５μｇ／ｍｌおよびヒトβ２−ミクログロブリン１０μｇ／ｍｌでパルスされる、照射Ａ２．１−トランスジェニックの、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）活性化脾臓細胞刺激因子とともに培養する。６日後、得られたエフェクター細胞を、提示されるプライミングペプチド、非関連型Ａ２．１結合ペプチドまたはペプチドなしでパルスされるＴ２細胞に対する溶解活性について、種々のＥ／Ｔ比で、４−ｈｒ５１Ｃｒ−リリースアッセイで評価した。２６４ペプチドに特異的なポリクローナルＣＴＬ系統（ＣＴＬ Ａ２ ２６４）を、２６４ペプチド５μｇによってパルスされる照射ＪＡ２細胞、照射Ｃ５７ＢＬ／６脾臓フィラー細胞(filler cell)および２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ラットＣｏｎＡ上清液を用いて、エフェクターＣＴＬの毎週の再刺激によって確立する。このプロトコルは、Theobald, M., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:11993に記載されている。
【０１５５】
ヒトＴＣＲ反応性およびクローン多様性の分析
ＴＣＲの反応性および特異性を、インビトロにおいて、細胞障害性死滅アッセイおよび免疫蛍光染色法を用いて、抗Ｖαおよび抗Ｖβ特異的ｍＡｂｓおよび２６４／ＨＬＡ−Ａ２四量体によって試験する（Altman, J., et al. (1996) Science 274:94-96）。ＣＴＬ系統を増殖させ、次いで、標準的な限界希釈技術を用いてクローン化する。個々のクローンの特異性の試験を、２６４ペプチドを含有するＡ２四量体および２６４特異的Ｔ細胞クローンによって認識されない無関係なペプチドを含有するＡ２四量体による染色によって、および細胞障害性死滅アッセイを行う。これらのアッセイの結果は、２６４ペプチド／ＴＨＬＡ−Ａ２．１複合体についてのＴＣＲの特異性を例証するのに有用である。
【０１５６】
これらのトランスジェニックマウスのヒトＴＣＲレパトアの多様性を評価するために、我々は、抗体染色によって、さらに、αおよびβ可変ファミリー使用の特性を評価する。いくつかのＶαおよびＶβ特異的ｍＡｂｓは、市販されており、ヒトＴＣＲの全体的な可変ファミリーの使用を決定することができる。さらに、ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ＰＣＲ分析（例７および以下を参照）を、Ｔ細胞クローンで実施し、これは、２６４ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２．１複合体についての特異性を例証する。我々は、例７で記載した特性について配列を分析し、対立遺伝子排除への導入遺伝子の発現の効果を評価する。
【０１５７】
組換えＴＣＲ分子を産生する細胞系の生成
Ａ．再構成され、発現したＴＣＲαおよびβ鎖のコピーに対応するゲノムクローンの単離
対象となるペプチド抗原／ＭＨＣ複合体に反応する個々のハイブリドーマクローンからの細胞を、ゲノムＤＮＡの調製に用いる。かかる細胞は、特定のＴＣＲ遺伝子の複対立遺伝子を含有する。例えば、ハイブリドーマは、ＴＣＲ遺伝子の４つのコピーを含有することができる（融合パートナー細胞系による２つのＴＣＲコピーおよび対象となるＴＣＲを発現する元のＴ細胞）。これらの４つのコピーのうち、それらのいくつかは再構成されるが、１つのみが対象となるＴＣＲをコードする。この例に記載される手順は、ＴＣＲαおよびβ鎖の発現コピーの選択的なクローニングを可能にする。
【０１５８】
二本鎖ｃＤＮＡ：
ヒトハイブリドーマ若しくはリンパ腫またはＴＣＲを合成する他の細胞系からの細胞は、全ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ＋ ＲＮＡの単離に用いる。次いで、該ＲＮＡを、逆転写酵素およびＳＭＡＲＴ ＩＩ オリゴ(Clonetech Laboratories, User Manual PT3269-1, March 1999)を用いて、５’−ＲＡＣＥ−ＲｅａｄｙｃＤＮＡの合成に用いる。次いで、単鎖ｃＤＮＡを、プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いて、２次的な鎖合成の鋳型として用いる。
【０１５９】
【化１３】
2005505236.tif 000014
【０１６０】
二本鎖ｃＤＮＡを単離し、クローン化し、そして、発現ＴＣＲ分子のαおよびβ鎖をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列の決定に用いる。次いで、これらの発現した遺伝子のゲノムクローンを単離する。発現α鎖遺伝子のクローニングの手順を、以下に概説する。
【０１６１】
α鎖：
次いで、Ｖ−Ｎ−Ｊ結合を補う配列の２０〜４０のヌクレオチドを用いて、ＴＣＲメッセージを転写する遺伝子を単離するための、ユニークなプローブを合成する。ＤＮＡのこの合成ヌクレオチドセグメントは、ｏ−アルファとして以下に示される。
【０１６２】
次いで、ＴＣＲ発現細胞系から単離し、並びに個々におよびいくつかの異なる制限エンドヌクレアーゼを組み合わせて消化したＤＮＡのサザンブロットを、３２Ｐでラベル化したユニークなオリゴヌクレオチドｏ−アルファによって、プローブする。ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位は、再構成Ｖセグメントの上流であることが判る。
【０１６３】
ＴＣＲ発現細胞系によるＤＮＡを、適切な制限酵素によって切断する。該ＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動法によって、大きさで分画する。発現Ｖセグメントを包含するＤＮＡフラグメントを含むフラクションを、ｌａｍｂｄａＧｅｍ−１２またはＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７(Promega, Madison, WI or Clonetech, Palo Alto, CA)中にクローン化するか、またはフラグメントが十分に小さい場合は、直接ｐＧＥＭシリーズのベクターにクローン化する。特有のプローブｏ−アルファを用いて、Ｖセグメント含有クローンを単離する。大型フラグメントＤＮＡを、陽性クローンから単離し、ｐＧＥＭのポリリンカーまたはその相当物にサブクローン化する。結果として得られるクローンを、ｐｇＴＲＡｒと命名する。
【０１６４】
β鎖：
次いで、Ｖ−Ｎ−Ｄ−Ｎ−Ｊ結合を補う配列の２０〜４０のヌクレオチドを用いて、ＴＣＲメッセージを転写する遺伝子を単離するための、ユニークなプローブを合成する。このＤＮＡの合成ヌクレオチドセグメントは、ｏ−ベータとして以下に示される。
【０１６５】
ＴＣＲ発現細胞系から単離し、並びに個々におよびいくつかの異なる制限エンドヌクレアーゼを組み合わせて消化したＤＮＡのサザンブロットを、３２Ｐでラベルされたユニークなオリゴヌクレオチドｏ−ベータによって、プローブする。ユニークな制限エンドヌクレアーゼ部位は、再構成Ｖセグメントの上流であることが判る。
【０１６６】
ＴＣＲ発現細胞系によるＤＮＡを、適切な制限酵素によって切断する。該ＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動法によって、大きさで分画する。発現Ｖセグメントを包含するＤＮＡフラグメントを含むフラクションを、ｌａｍｂｄａＧｅｍ−１２またはＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７(Promega, Madison, WI or Clonetech, Palo Alto, CA)中にクローン化するか、または該フラグメントが十分に小さい場合は、直接ｐＧＥＭシリーズのベクターにクローン化する。ユニークなプローブｏ−ベータを用いて、Ｖセグメント含有クローンを単離する。大型フラグメントＤＮＡを、陽性クローンから単離し、ｐＧＥＭのポリリンカー(Promega)またはその相当物にサブクローン化する。結果として得られるクローンを、ｐｇＴＲＢｒと命名する。
【０１６７】
３つのドメインのＴＣＲ発現ベクターの構築および哺乳類細胞における発現：
次いで、ｐｇＴＲＡｒおよびｐｇＴＲＢｒ中のにクローン挿入物を、適切なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅し、ｐＧｅｍベクター中の３つのドメイン単鎖Ｖα−Ｖβ／Ｃβ構築物にサブクローン化する。
【０１６８】
次いで、３つのドメインの単鎖ＴＣＲを、単鎖ＴＣＲカッパ定常鎖融合タンパク質の発現のために、ベクターｐＳＵＮ２７中にクローン化する。結果として得られるベクターを、エレクトロポレーションによって、チャイニーズハムスター細胞にトランスフェクションし、可溶なｓｃＴＣＲ−k 融合タンパク質を産生する細胞系を生成し、故に、ペプチド抗原／ＨＬＡ−Ａ２分子への結合親和性を評価することができる。
【０１６９】
代替的に、上記のクローンハイブリドーマ細胞から単離したαおよびβ鎖をコードするＤＮＡを、ｐＧＥＭ中でクローン化した３つのドメインのＴＣＲに必要とされるＶα、Ｖβ−Ｃβフラグメントの構築に用いる。次いで、この構築物を、ｐＳＵＮ２７に移し、上記のように該タンパク質を産生し、評価する。
【０１７０】
例９
ＨＬＡ−Ａ２小型遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）の調製：
ＬＣＬ７２１によるＨＬＡ−Ａ２．１のクローニング
ゲノムＤＮＡを、ヒトＬＣＬ７２１細胞系から単離し、そして、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって消化する。ＨｉｎｄＩＩＩによって消化したゲノムＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で大きさによって分画し、該分画されたＤＮＡを精製する。次いで、精製したゲノムＤＮＡを、ｐＢＲ３２２２のＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結する。連結したＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉＬＥ３９２に形質転換する。ＨＬＡ−Ａ２遺伝子を含有する組換えバクテリアを、プローブとして、合成オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＣＣＡＡＴ−３’を用いて、コロニーハイブリダイゼーションによって、検出する（Hanahan, D, and M. Meselson (1980) Gene 10:63-67）。続いて、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子を含有する５．１ｋｂのクローンフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位のｐｃＤＮＡ３．１（＋）(InVitrogen, Carlsbad, CA)中にサブクローン化する。
【０１７１】
ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスの産生および検出
次いで、トランスジェニックマウスを、標準的なプロトコル(Hogan, G. et al. (1986) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を用い、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子を保有する直線ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を、Ｆ１マウスの交配（Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＤＢＡ／２）によって得られる受精卵に注入することによって産生する。トランスジェニック系統を、尾部ＤＮＡドットブロット分析によって検出した該導入遺伝子を保有するマウスから確立する。２つのトランスジェニック系統を、該導入遺伝子産物の細胞表面発現に基づき選択する。ＨＬＡ−Ａ２の細胞表面発現を検出するため、試験マウスの脾臓細胞または試験マウスの尾静脈から回収した末梢血（０．５ｍＬ）を、トリス緩衝塩化アンモニウム（５ｍｌ）によって処理し、赤血球を溶解する。細胞を洗浄し、２．５m ｇ／ｍＬＣｏｎＡ、２５０ｎｇ／ｍＬイオノマイシン、３ｎｇ／ｍＬＰＭＡおよびＣｏｎＡ活性化ラット脾細胞の５％培養上清液を添加したＲＰＭＩ１０％に再懸濁する。試料を、容量が２ｍｌ、３ｘ１０６細胞／ウェルとして、湿潤な５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃、３日間インキュベートする。ＨＬＡ−Ａ２．１細胞表面発現を、ビオチン化ＨＬＡ−Ａ２．１特異的ｍＡｂＢＢ７．２(Parham, P. et al. (1981) Hum. Immunol. 3:277)およびＰＥ結合ストレプトアビジン(Biomeda, Foster City, CA)を用いて、フローサイトメトリー（FACS; Becton Dickinson & Co, Mountain View, CA）によって、評価する。細胞を、フローサイトメーターを用いて分析する。１つのトランスジェニック系統を、Ｂ１０．Ｄ２２への戻し交配によって維持し、別のトランスジェニック系統を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊへの戻し交配によって維持する。ヘテロ接合的な子孫を、Ｃ５７ＢＬ／６ＪまたはＢ１０．Ｄ２２動物に戻し交配し、次いで、独立したホモ接合株を生じるために、Ｎ２世代で交配する。
【０１７２】
例１０
マウスＴＣＲαおよびβ遺伝子座について陰性である（ＭｕＴＣＲα−／?−またはＭｕＴＣＲαＫＯ／?ＫＯ）マウスの生成：
この例は、ＴＣＲのαおよびβ遺伝座について陰性のマウス系統の作製について説明するものである。これは、ＴＣＲα鎖ノックアウトにホモ接合的なマウスとＴＣＲβ鎖ノックアウトにホモ接合的なマウスとのブリーディングによって達成する。
【０１７３】
ＴＣＲα鎖ノックアウト（例１を参照）およびＴＣＲβ鎖ノックアウト（例２）の両方にホモ接合的なマウスを生成するために、それぞれのノックアウトにホモ接合的なマウスを共に交配し、各遺伝子座にヘテロ接合的な子孫を生成する。これらのヘテロ接合体を交配し、結果として得られる子孫をサザンブロット分析によってスクリーニングする。β鎖ノックアウトの存在のスクリーニングは、ＢａｍＨＩによって消化した尾部バイオプシーＤＮＡの、例２で記載されたプローブＢを用いるサザンブロット分析によって実施する。これらの子孫は、β鎖ノックアウトを示す７．４ｋｂのバンドおよび１０．４ｋｂ野生型バンドの欠損を示し、さらに、失活したα鎖の存在のスクリーニングをする。例１によるプローブＡ（α鎖プローブ、図１ｄを参照）を、ＢａｍＨＩによって消化したＤＮＡのサザンブロット分析のスクリーニングに用いた。このプローブは、野生型の８．９ｋｂフラグメントおよび特徴的なα鎖ノックアウトを判断する２．４ｋｂのバンド検出する。野生型ＤＮＡ配列の欠如を、ＢａｍＨＩによって消化されたＤＮＡを、Ｃαエクソン２プローブおよびＣβ１および／またはＣβ２プローブによってプローブ化し、ハイブリダイズバンドが発見されないことによって確認する。この診断的な試験の組み合わせは、マウスＴＣＲαおよびβ遺伝子座のコピーの両方が標的突然変異によって失活した、新規なマウスの生成を示す。このマウスは、ＭｕＴＣＲα−／β−またはＭｕＴＣＲαＫＯ／βＫＯマウスと呼ばれるものである。
【外１】
【０１７４】
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【外２】
【０１７５】
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【外３】
【０１７６】
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【外４】
【０１７７】
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【０１７８】
すべての参考文献は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
本発明は、その好ましい態様を参照して説明されている。しかしながら、当業者であれば、本開示を考察することにより、本発明の精神と範囲内で変更及び改善を加えることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
【図１】マウスＴ細胞α遺伝子座ノックアウト構築物に用いる主要な工程手順の概要を示す概略図である。
【図１Ａ】特有のＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を含む、構築されたプラスミドｐＰＲｔｋを示す概略図である。
【図１Ｂ】Ｃα遺伝子座の３´末端に特異的な、４．１ｋｂのＢａｍＨＩマウスα鎖配列の単離、増幅および挿入の一般的な工程を示す概略図である。
【０１８０】
【図１Ｃ】Ｃα遺伝子座の３´末端の挿入した４．１ｋｂを含む、プラスミドｐＰＵＲｔｋ−Ｃα３´を示す概略図である。
【図１Ｄ−１】ｐＰＵＲｔｋ−Ｃα３´プラスミドに挿入されたＣαの５´末端の４．８ＫｂのＮｄｅＩフラグメント遺伝子座を含む、プラスミドｐＰＵＲｔｋ−Ｃα５´３´の構築における工程手順を示す概略図である。
【図１Ｅ】α標的ベクターの構築に用いられるｐＰＵＲプラスミドｐＰＵＲｔｋ−Ｃα５´３´を示す概略図である。
【図１Ｆ】エンドヌクレアーゼ制限部位に関連し、Ｃαエクソン１〜４の位置を示すＴＣＲαのｄ遺伝子座（ＭＵＳＴＣＲＡ）の概略図である。
【図１Ｇ】プラスミドに存在する制限部位に関連し、ＴＣＲαのＣα３´のクローニング部位を示す、ｐＰＵＲｔｋ−Ｃα３´の概略図である。
【０１８１】
【図１Ｈ】プラスミドに存在する制限部位に関連し、ＴＣＲαのＣα５´およびＣα３´のクローニング部位を示す、ｐＰＵＲｔｋ−Ｃα３´の概略図である。
【図１Ｉ】プローブＡの切除によるエンドヌクレアーゼ制限位置を示す、ＴＣＲαのｄ遺伝子座（ＭＵＳＴＣＲＡ）の概略図である。
【図２】マウスＴ細胞レセプターβ遺伝子座ノックアウト構築物の構築に用いる主要な工程手順の概要を示す概略図である。得られるベクターは、ｐＮＥＯｔｋＣβ５´３´である。概要の詳細は、他の図から理解でき、これは、各手順の工程を示すために組み込まれる。図に対応する関連工程は、ボックス中、例えば、図２ａおよび２ｂに示される。
【０１８２】
【図２Ａ】ＴＣＲβ遺伝子座３´領域を示す概略図であり、プローブＡおよびＢを生成する。
【図２Ａ】ＴＣＲβ遺伝子座の５´〜Ｃβ１から構成される領域を示す概略図である。
【図２Ｃ】ＴＣＲβ遺伝子座の５´〜Ｃβ２から構成される領域を示す概略図である。
【図２Ｄ】プラスミドｐＮＥＯｔｋＣβ５´３´の生成に用いる制限部位を示すベクターの概略図である。
【図３】酵母人工染色体４（ｐＹＡＣ４−Ｎｅｏ）を示す概略図である。
【０１８３】
【図４】ヒトＴ細胞レセプターα遺伝子座導入遺伝子を、改変したｐＹＡＣ４−ｎｅｏベクター ｍｏｄ−ｐＹＡＣ４−ｎｅｏ中にクローニングする工程の概要を示す概略図である。
【図４Ａ】ヒトＴＣＲα遺伝子座の染色体上の位置の概略図である。
【図４Ｂ】ヒトＴＣＲα遺伝子座の制限マップを示す概略図である。
【図４Ｃ】ヒトＴＣＲα遺伝子座の制限マップを示す概略図である。
【図４Ｄ】ヒトＴＣＲα遺伝子座の制限マップを示す概略図である。
【図４Ｅ】ヒトＴＣＲα遺伝子座の制限マップを示す概略図である。
【図４Ｆ】ヒトＴＣＲα遺伝子座の制限マップを示す概略図である。
【図５】ヒトＴＣＲβ導入遺伝子の構築に用いる、一般的な工程の概要を示す概略図である。
【図５Ａ】ヒトＴＣＲβ遺伝子座の染色体上の位置の概略図である。
【０１８４】
【図５Ｂ】ヒトＴＣＲβ遺伝子座のヌクレオチドマッピングにより得られる結果を示す概略図である。
【図５Ｃ】ヒトＴＣＲβ遺伝子座のヌクレオチドマッピングにより得られる結果を示す概略図である。
【図５Ｄ】ヒトＴＣＲβ遺伝子座のヌクレオチドマッピングにより得られる結果を示す概略図である。
【図５Ｅ】ヒトＴＣＲβ遺伝子座のヌクレオチドマッピングにより得られる結果を示す概略図である。果を示す概略図である。
【図５Ｆ】ＹＡＣ配列に重なるＴＣＲβ鎖遺伝子を示す概略図である。
【図５Ｇ】ヒトＴＣＲβＹＡＣベクターを示す概略図であり、調節配列および／または哺乳類選択カセットを挿入することができる一般的な領域を説明するものである。
【図６】ＴＣＲのＶＤＪ再構成工程を示す概略図であり、非再構成生殖細胞Ｖ遺伝子から再構成ｃＤＮＡまでを示す。
【図１】
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【図１−１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ−１】
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【図１Ｄ−２】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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