(57)【要約】センサの電極の上を通過する流体の流量を測定することができるセンサ。これらのセンサでは、流量決定電極と呼ばれる電極が、流体の流量を決定するために、作動電極、基準電極、および対向電極などの従来の電極と共に使用される。一態様では、本発明は、サンプルがセンサの電極の上を連続的に流れるとき、具体的にはサンプルの流量が比較的小さいとき、流体のサンプルにおける検体の濃度を測定するためのセンサを提供する。他の態様では、本発明は、流体のサンプルにおける検体の濃度を測定するための方法を提供し、この場合、サンプルの流量は、センサが適所にある時間期間中に変化する。好ましい実施形態では、センサは、４つの電極、すなわち、作動電極、基準電極、対向電極、および流量決定電極を使用する。代替として、基準電極の機能および対向電極の機能の両方を実施する単一の電極が、基準電極および対向電極と置き換わることができる。さらに、電気化学的活性種からの妨害を補償するために、ダミー電極またはブランク電極を使用することができる。対象の検体に特有の試薬が、作動電極の上に付着されることが必要である。
2005525568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体の流量を決定するための、前記流体が通って流れるチャネルを備えるセンサであって、前記流体が
（ａ）作動電極と、
（ｂ）少なくとも１つの流量決定電極と、
（ｃ）基準電極と、
（ｄ）対向電極とに接触することができるように、前記チャネルが構成される、センサ。
【請求項２】
反応層が、前記作動電極の上に重なり、拡散層が、前記反応層の上に重なる、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記反応層が、酵素を含む、請求項２に記載のセンサ。
【請求項４】
前記酵素が、オキシダーゼである、請求項３に記載のセンサ。
【請求項５】
前記酵素が、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、および乳酸オキシダーゼからなる群から選択される、請求項４に記載のセンサ。
【請求項６】
半浸透性層が、前記作動電極と前記反応層との間に配置される、請求項２に記載のセンサ。
【請求項７】
拡散層が、前記少なくとも１つの流量決定電極の上に重なる、請求項１に記載のセンサ。
【請求項８】
半浸透性層が、前記少なくとも１つの流量決定電極と前記反応層との間に配置される、請求項４に記載のセンサ。
【請求項９】
反応層が、前記作動電極の上に重なり、拡散層が、前記反応層の上に重なり、電気化学的活性材料を無反応材料に変換する材料の層が、前記拡散層の上に重なる、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１０】
半浸透性層が、前記作動電極と前記反応層との間に配置される、請求項９に記載のセンサ。
【請求項１１】
反応層が、前記少なくとも１つの流量決定電極の上に重なり、拡散層が、前記反応層の上に重なる、請求項９に記載のセンサ。
【請求項１２】
半浸透性層が、前記少なくとも１つの流量決定電極と前記反応層との間に配置される、請求項１１に記載のセンサ。
【請求項１３】
２つの流量決定電極が使用され、前記流量決定電極の一方が、前記作動電極の上流側にあり、前記流量決定電極の他方が、前記作動電極の下流側にある、請求項１に記載のセンサ。
【請求項１４】
チャネルを有するセンサにおいて、前記チャネルを流れる流体のサンプルの流量を決定するための方法であって、
（ａ）請求項１に記載のセンサを提供するステップと、
（ｂ）流体の知られている流量において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定された前記応答と、ステップ（ｂ）における流体の前記流量との関係を確立するステップと、
（ｄ）流体の前記サンプルの知られていない流量において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）において確立された前記関係によって、流体の前記サンプルの前記知られていない流量の値を決定するステップとを含む、方法。
【請求項１５】
前記応答が、電気化学的活性材料の調合物の結果である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記電気化学的活性材料が、過酸化水素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記電気化学的活性材料が、酸素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
流体の流量を決定するための、前記流体が通って流れるチャネルを備えるセンサであって、前記流体が、
（ａ）作動電極と、
（ｂ）少なくとも１つの流量決定電極と、
（ｃ）基準電極および対向電極の機能を実施する２重目的の電極とに接触することができるように、前記チャネルが構成されるセンサ。
【請求項１９】
反応層が、前記作動電極の上に重なり、拡散層が、前記反応層の上に重なる、請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２０】
前記反応層が、酵素を含む、請求項１９に記載のセンサ。
【請求項２１】
前記酵素が、オキシダーゼである、請求項２０に記載のセンサ。
【請求項２２】
前記酵素が、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、および乳酸オキシダーゼからなる群から選択される、請求項２１に記載のセンサ。
【請求項２３】
半浸透性層が、前記作動電極と前記反応層との間に配置される、請求項１９に記載のセンサ。
【請求項２４】
拡散層が、前記少なくとも１つの流量決定電極の上に重なる、請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２５】
半浸透性層が、前記少なくとも１つの流量決定電極と前記反応層との間に配置される、請求項２１に記載のセンサ。
【請求項２６】
反応層が、作動電極の上に重なり、拡散層が、前記反応層の上に重なり、電気化学的活性材料を無反応材料に変換する材料の層が、前記拡散層の上に重なる、請求項１８に記載のセンサ。
【請求項２７】
半浸透性層が、前記作動電極と前記反応層との間に配置される、請求項２６に記載のセンサ。
【請求項２８】
反応層が、前記少なくとも１つの流量決定電極の上に重なり、拡散層が、前記反応層の上に重なる、請求項２６に記載のセンサ。
【請求項２９】
半浸透性層が、前記少なくとも１つの流量決定電極と前記反応層との間に配置される、請求項２８に記載のセンサ。
【請求項３０】
２つの流量決定電極が使用され、前記流量決定電極の一方が、前記作動電極の上流側にあり、前記流量決定電極の他方が、前記作動電極の下流側にある、請求項１８に記載のセンサ。
【請求項３１】
チャネルを有するセンサにおいて、前記チャネルを流れる流体のサンプルの流量を決定するための方法であって、
（ａ）請求項１８に記載のセンサを提供するステップと、
（ｂ）流体の知られている流量において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定された前記応答と、ステップ（ｂ）における流体の前記流量との関係を確立するステップと、
（ｄ）流体の前記サンプルの知られていない流量において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）において確立された前記関係によって、流体の前記サンプルの前記知られていない流量の値を決定するステップとを含む、方法。
【請求項３２】
前記応答が、電気化学的活性材料の調合物の結果である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記電気化学的活性材料が、過酸化水素である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記電気化学的活性材料が、酸素である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
チャネルを有するセンサにおける前記チャネルを流れる流体のサンプルの流量、および前記センサにおける前記チャネルを流れる流体の前記サンプルの流れの方向を決定するための方法であって、
（ａ）流体の流量を決定するための、前記流体が通って流れるチャネルを備えるセンサを提供するステップを含み、前記流体が、
（１）作動電極と、
（２）一方が前記作動電極の上流側にあり、他方が前記作動電極の下流側にある、２つの流量決定電極と、
（３）基準電極と、
（４）対向電極とに接触することができるように、前記チャネルが構成され、前記方法がさらに、
（ｂ）流体の知られている流量において、かつ流体の流れの第１の所与の方向において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定された応答と、ステップ（ｂ）における流体の流量およびステップ（ｂ）における流体の流れの方向との関係を確立するステップと、
（ｄ）流体の知られている流量において、かつ流体の流れの第２の所与の方向において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において測定された応答と、ステップ（ｄ）における流体の流量およびステップ（ｄ）における流体の流れの方向との関係を確立するステップと、
（ｆ）流体の前記サンプルの知られていない流量において、かつ流体の前記サンプルの流れの知られていない方向において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の一方の応答を決定するステップと、
（ｇ）ステップ（ｃ）およびステップ（ｅ）において確立された前記関係によって、流体の前記サンプルの流れの方向および流体の前記サンプルの前記知られていない流量の前記値を決定するステップとを含む方法。
【請求項３６】
チャネルを有するセンサにおける前記チャネルを流れる流体のサンプルの流量、および前記センサにおける前記チャネルを流れる流体の前記サンプルの流れの方向を決定するための方法であって、
（ａ）流体のサンプルの流量を決定するための、前記流体が通って流れるチャネルを備えるセンサを提供するステップを含み、前記流体が、
（１）作動電極と、
（２）一方が前記作動電極の上流側にあり、他方が前記作動電極の下流側にある、２つの流量決定電極と、
（３）基準電極および対向電極の機能を実施する２重目的の電極とに接触することができるように、前記チャネルが構成され、前記方法がさらに、
（ｂ）流体の知られている流量において、かつ流体の流れの第１の所与の方向において、前記作動電極の応答および流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において測定された応答と、ステップ（ｂ）における流体の流量およびステップ（ｂ）における流体の流れの方向との関係を確立するステップと、
（ｄ）流体の知られている流量において、かつ流体の流れの第２の所与の方向において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において測定された応答と、ステップ（ｄ）における流体の流量およびステップ（ｄ）における流体の流れの方向との関係を確立するステップと、
（ｆ）流体の前記サンプルの知られていない流量において、かつ流体の前記サンプルの流れの知られていない方向において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の一方の応答を決定するステップと、
（ｇ）ステップ（ｃ）およびステップ（ｅ）において確立された前記関係によって、流体の前記サンプルの流れの方向および流体の前記サンプルの前記知られていない流量の値を決定するステップとを含む、方法。
【請求項３７】
流体の流量を決定するための、前記流体が通って流れるチャネルを備えるセンサであって、前記流体が、
（ａ）流量決定電極と、
（ｂ）基準電極と、
（ｃ）対向電極とに接触することができるように、前記チャネルが構成される、センサ。
【請求項３８】
拡散層が、前記流量決定電極の上に重なる、請求項３７に記載のセンサ。
【請求項３９】
反応層が、前記流量決定電極の上に重なり、拡散層が、前記反応層の上に重なる、請求項３７に記載のセンサ。
【請求項４０】
半浸透性層が、前記少なくとも１つの流量決定電極と前記反応層との間に配置される、請求項３９に記載のセンサ。
【請求項４１】
検体を含む流体のサンプルの流量を決定するための方法であって、
（ａ）請求項３７に記載のセンサを提供するステップと、
（ｂ）前記検体の知られている濃度を有する流体のサンプルの知られている流量において、前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｃ）前記流量決定電極の前記応答と、前記検体の知られている濃度を有する流体のサンプルの前記知られている流量との関係を確立するステップと、
（ｄ）流体の流量が知られておらず、かつ前記流体における検体の濃度が知られている場合に、前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記関係から、流体の流量を決定するステップとを含む、方法。
【請求項４２】
流体の流量を決定するための、前記流体が通って流れるチャネルを備えるセンサであって、前記流体が、
（ａ）流量決定電極と、
（ｂ）基準電極および対向電極の機能を実施する２重目的の電極とに接触することができるように、前記チャネルが構成されるセンサ。
【請求項４３】
拡散層が、前記流量決定電極の上に重なる、請求項４２に記載のセンサ。
【請求項４４】
反応層が、前記流量決定電極の上に重なり、拡散層が、前記反応層の上に重なる、請求項４２に記載のセンサ。
【請求項４５】
半浸透性層が、前記少なくとも１つの流量決定電極と前記反応層との間に配置される、請求項４４に記載のセンサ。
【請求項４６】
検体を含む流体のサンプルの流量を決定するための方法であって、
（ａ）請求項４２に記載のセンサを提供するステップと、
（ｂ）前記検体の知られている濃度を有する流体のサンプルの知られている流量において、前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｃ）前記流量決定電極の前記応答と、前記検体の知られている濃度を有する流体のサンプルの前記知られている流量との関係を確立するステップと、
（ｄ）流体の流量が知られておらず、かつ前記流体の検体の濃度が知られている場合に、前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記関係から、流体の流量を決定するステップとを含む方法。
【請求項４７】
知られていない流量において流れる流体のサンプルの検体の濃度を決定するための方法であって、
（ａ）請求項１に記載のセンサを提供するステップと、
（ｂ）前記サンプルの前記流量が知られていない、流体の前記サンプルを前記センサの前記流れチャネルに導入するステップと、
（ｃ）流体の前記サンプルの前記知られていない流量において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｄ）較正関係によって、流体の前記サンプルの前記知られていない流量の値を決定するステップと、
（ｅ）較正関係によって、流体の前記サンプルにおける前記検体の濃度の未補正値を決定するステップと、
（ｆ）前記検体の補正されていない濃度の前記値を、ステップ（ｄ）において決定された前記流量によって補正することによって、流体の前記サンプルにおける前記検体の濃度の補正値を決定するステップとを含む方法。
【請求項４８】
サンプルが知られていない流量において流れる、流体のサンプルにおける検体の濃度を決定するための方法であって、
（ａ）請求項１８に記載のセンサを提供するステップと、
（ｂ）前記サンプルの前記流量が知られていない、流体の前記サンプルを前記センサの前記流れチャネルに導入するステップと、
（ｃ）流体の前記サンプルの前記知られていない流量において、前記作動電極の応答および前記流量決定電極の応答を決定するステップと、
（ｄ）較正関係によって、流体の前記サンプルの前記知られていない流量の値を決定するステップと、
（ｅ）較正関係によって、流体の前記サンプルにおける前記検体の濃度の未補正値を決定するステップと
（ｆ）前記検体の濃度の前記未補正値を、ステップ（ｄ）において決定された前記流量によって補正することによって、流体の前記サンプルにおける前記検体の濃度の補正値を決定するステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体の流量を決定することができるセンサに関する。より具体的には、センサは、流体のサンプルの流量が、決定中に変化することが予期される場合、連続的な方法で流体のサンプルにおける検体の濃度を決定するために使用されることができる。
【背景技術】
【０００２】
流体の流量の決定は、流体のサンプルの化学分析および薬などの化学物質の送達のために構成されたシステムにおいて重要である。流体の流量が知られているとき、流体が緩慢に移動する流体である場合でも、流体における検体の濃度を精確に決定することができ、または、リザーバから送達される調合物の化学物質の濃度を精確に決定することができる。
【０００３】
連続監視バイオセンサとして知られるあるセンサは、生体内または生体外の条件下にある生物学的サンプルの検体の濃度を連続的に監視するために使用されることができる。たとえば、患者が、血液のグルコースの濃度の変化についてより良好な理解を有して、それにより、自分の治療食または投薬を修正することができるように、体液のグルコースの濃度を連続的に監視することができる。一般に、血液のグルコースの濃度は、食事をとる、運動するなどの通常の活動中に著しく変化することが予期される。この機能について開示されたバイオセンサは、参照によって全て本明細書に組み込まれている、米国特許第４，９５３，５５２号、第４，９６０，４６７号、第５，２４３，９８２号、第５，２９１，８８７号、第５，３６２，３０７号、第５，４６９，８４６号、第５，５０７，２８８号、第５，５２７，２８８号、第５，６３６，６３２号、第６，１３４，４６１号に記載されている。身体から生物学的サンプルを抽出するための方法および装置が、参照によって全て本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５８２，１８４号、第５，８２０，５７０号、第５，９５１，４９３号、第５，８８５，２１１号、第５，６４０，９５４号に記載されている。
【０００４】
連続監視バイオセンサは、流れ注入分析（ＦＩＡ）システムにおいて検体を監視するために、製薬または産業の応用分野においても使用される。これらの応用分野では、自動シリンジポンプなどのポンプが、バイオセンサを通るサンプルの流量を精確に制御することができる。この機能について開示されたバイオセンサが、参照によって本明細書に組み込まれている米国特許第６，２１４，２０６号に記載されている。連続監視を含む応用分野において使用するのに適切なバイオセンサは、過酸化物などの少なくとも１つの反応生成物の検出、または媒介物質の補助による電流の検出に通常応じる。そのようなバイオセンサは、２つまたは３つの電極を通常含む。３つの電極を有するバイオセンサは、作動電極、基準電極、および対向電極を有する。２つの電極を有するバイオセンサは、作動電極と、基準電極ならびに対向電極との両方として機能する２重目的の電極を有する。
【０００５】
生物学的サンプルが、たとえばグルコースなどの検体の濃度を連続的に測定するために、患者の身体から連続的に取り出されるとき、サンプルの流量は、１つまたは複数の理由のために変化する可能性がある。たとえば、生物学的サンプルが間質液であるとき、身体からの間質液の排出レートは、患者の身体からサンプルを除去するのを補助する真空のレベル、または患者の水和状態に応じて変化することがある。真空のレベルは、真空の漏れのために変化することがある。患者が過剰水和しているとき、間質液の流量は、比較的高くなることがある。患者が脱水しているとき、間質液の流量は比較的低くなることがある。さらに、バイオセンサの動作中に間質液が収集される身体の箇所の治癒または炎症により、流量が変化することもある。バイオセンサの作動電極の表面への検体の拡散レートは、身体から出る流体の流量に応じるので、バイオセンサの応答は、流体の流量に応じる。検体の連続測定のために身体から生物学的サンプルを連続的に取り出すことを含む状況は、バイオセンサがサンプルのプールに浸漬されているので、流量が変化しないことが想定される、バイオセンサが患者の身体に埋め込まれる状況とは対照的であることがある。製薬または産業の応用分野では、流量は、通常、蠕動ポンプまたはモータ付きシリンジポンプによって、外部から制御される。
【０００６】
生物学的流体が患者の身体から取り出される際に、生物学的流体の流量を測定するために、サンプルの流量を測定するための追加の装置を使用することができる。この追加の装置は、サンプルの流路に配置されなければならず、それにより、流路の寸法が増大し、したがって、必要なサンプルの容積が増大する。さらに、追加の測定システムが必要であり、それにより、バイオセンサシステムのコストが増大される。
【０００７】
流体の流量を検査するための他の手段は、気泡（すなわち、空気栓）を流路に導入することを含む。気泡の導入により、空気−液体境界面の運動を監視することが可能になる。熱または分光による方法による、空気−液体境界面の検出に利用可能な方法および装置があり、これにより、気泡または空気液体境界面の流量を決定することによって、流体の流量を決定することができる。
【０００８】
たとえばグルコースなどの検体の濃度を連続的に監視するためのバイオセンサは、バイオセンサの作動電極の表面上に、たとえばグルコースオキシダーゼなどの酵素を固定することによって、構築されることができる。生物学的サンプルにおける検体は、作動電極において酸化され、たとえば過酸化水素などの電気化学的活性反応生成物は、作動電極の表面と、生物学的サンプルが通って流れているバイオセンサのチャネル、すなわち流れチャネルとに拡散することができる。この電気化学的活性反応生成物の一部は、流れチャネルから作動電極に戻って拡散することがあり、これにより、バイオセンサの反応に影響を与える。生物学的サンプルの低い流量では、戻り拡散の程度は、高い流量においてより著しく高い。その結果、測定電流など、バイオセンサの反応は、サンプルの流量に応じ、反応は、より低い流量においてより高くなる。生物学的流体を連続的に監視するための生物学的センサでは、具体的にはサンプルが皮膚における人工開口から身体外に取り出されるとき、サンプルの流量は、非常に重要になる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、サンプルの流量を測定するために、あらゆる追加の装置または追加のステップを必要とせずに、生物学的サンプルを連続的に監視するためのバイオセンサを開発することが所望される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様では、本発明は、センサの電極の上を通過する流体の流量を測定することができる様々なタイプのセンサを提供する。これらのセンサのいずれかでは、流量決定電極と呼ばれる電極が、流体の流量を決定するために、作動電極、基準電極、対向電極などの従来の電極と共に使用される。
【００１１】
他の態様では、本発明は、サンプルがセンサの電極の上を連続的に流れるとき、特に生物学的サンプルの流量が比較的低いとき、流体のサンプルにおける検体の濃度を測定するためのセンサを提供する。他の態様では、本発明は、センサが適所にある時間期間中にサンプルの流量が変化する場合の、流体のサンプルにおける検体の濃度を測定するための方法を提供する。検体の濃度など、生物学的サンプルの１つまたは複数のパラメータを測定するために使用されるセンサは、本明細書ではバイオセンサと呼ばれる。
【００１２】
好ましい実施形態では、センサは、４つの電極、すなわち、作動電極、基準電極、対向電極、および流量決定電極を使用する。代替として、基準電極の機能および対向電極の機能の両方を実施する単一の電極が、基準電極および対向電極と置き換わることができる。さらに、電気化学的活性種からの妨害を補償するために、ダミー電極またはブランク電極を使用することができる。対象の検体に特有の試薬が、作動電極の上に付着されることが必要である。
【００１３】
作動電極、基準電極、対向電極など、センサに通常包含されている電極の他に、センサは、センサの流れチャネルを流れる流体の流路に拡散する電気化学的活性種の量を測定する流量決定電極を備える。流体の流量と流量決定電極の応答とを関係付ける、または流体の流量と流量決定電極および作動電極の応答レートとを関係付けるために、較正関係を確立することができる。
【００１４】
一実施形態では、流体のサンプルの流量は、作動電極の応答および流量決定電極の応答から決定することができる。第２の実施形態では、流体のサンプルの流量は、サンプルの流量の変化に対して反応しないように修正された作動電極の応答と、サンプルの流量の変化に対して反応するように構成された流量決定電極の応答とから、決定することができる。第３の実施形態では、流体のサンプルの流量は、サンプルの流れの方向の知識と共に、作動電極の応答および流量決定電極の応答から決定することができる。
【００１５】
流量決定電極をセンサに含むことにより、サンプルの流量に関係なく、検体の濃度を精確に決定することが可能になる。流量決定電極は、他の電極と同時に製造されることが好ましい。追加の製造ステップは、必要ではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書において使用される際に、「流量決定電極」という表現は、サンプルの流量に応じる応答を決定するために使用される電極を意味する。流量決定電極は、任意の電気化学的活性種を生成する必要がない。「センサ」という用語は、信号または刺激を検出し、かつそれに反応する装置を意味する。「バイオセンサ」という用語は、生物学的サンプルの１つまたは複数のパラメータ、より具体的には生物学的サンプルにおける生物学的活性物質の痕跡および低レベルを決定するために使用することができるセンサを意味する。「流れチャネル」という表現は、対象のサンプルがバイオセンサにおいて通って流れるチャネルを意味する。「拡散」という用語は、粒子または分子が、粒子または分子の濃度がより高い領域から、粒子または分子の濃度がより低い領域へ移動する、粒子または分子が分散するプロセスを意味する。「戻り拡散」という表現は、サンプルの流れの方向とは反対の方向に、粒子または分子が拡散することを意味する。「反応」という用語は、センサによって測定された信号を意味する。通常の状況では、信号は、酸化還元などの化学反応によって生成される、電流などの電気信号である。「反応する」という用語は、たとえば流体の流量など、パラメータの変化の結果として、応答が変化することを意味する。「反応しない」という用語は、たとえば流体の流量など、パラメータの変化の結果として、応答が変化しないことを意味する。「反応層」という表現は、酸化させるなど、対象の検体と反応する試薬を含む層を意味する。グルコースの場合、反応層は、酵素グルコースオキシダーゼを含むことができる。「ブランク」という用語は、たとえば酵素など、活性成分が欠如していることを意味する。「濃度プロファイル」という表現は、任意の所与の時間における過酸化水素の分布を指す。図４、図５、および図６では、各線は、過酸化水素の所与の濃度を表す。濃度は、線ごとに異なる。過酸化水素の濃度は、過酸化水素を生成した電極からの距離が増大するにつれて減少する。
【００１７】
ここで図１、図２、および図３を参照すると、センサ１０が、基板１２、作動電極１４、流量決定電極１６、基準電極１８、絶縁層２０、対向電極２２、上部層２４、流れチャネル２６、サンプル入口２８、およびサンプル出口３０を備える。追加の特徴３２、３４、および３６は、作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８をそれぞれ暴露させ、かつ追加の層のための十分な容積を形成するのを可能にするために、絶縁層２０に形成されたマイクロウエルである。センサ１０は、基準電極の上に付着された材料を備える層３８、反応層４０、反応層４０の上に重なる拡散層４２、流量決定電極１６の上に重なる拡散層４２ａ、およびスペーサ層４４をさらに含む。マイクロウエル３２、３４、および３６のすぐ下にはない作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８の部分は、それぞれ、作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８のトラックおよび接点を構成する。
【００１８】
本発明に適切なセンサの通常の寸法は、以下の通りである。
【００１９】
各電極の主寸法  ４００μｍ
流れチャネルの幅  １ｍｍ
流れチャネルの深度  ５０μｍ
流れチャネルの長さ  ５ｍｍ
支持体  ５０〜２００μｍの厚さ×１０ｍｍの長さ×６ｍｍの幅
絶縁層  ４０μｍの厚さ、支持体と同一面（しかし、マイクロウエルおよび電気接点を覆わない）
マイクロウエル  ３０〜４０μｍの深度×０．４〜０．８ｍｍの長さ×０．４〜０．８ｍｍの幅
スペーサ層  ５０から２００μｍの厚さ（面積は、絶縁層の面積と同程度とすることができる、電気接点および流れチャネルが暴露される）
上部層  ５０から２００μｍの厚さ（面積は、サポートの面積と同程度とすることができる、電気接点が暴露される）
サンプル入口  １ｍｍの直径
サンプル出口  １ｍｍの直径
さらに、センサを製造するためのプロセスは、電極間の距離を指示する。本発明では、任意の２つの電極間において、１００マイクロメートルの間隔を達成することができる。
【００２０】
基板１２を準備するのに適切な材料は、たとえばガラスおよび高分子材料など、あらゆる非導電性材料を含むが、これに限定されるものではない。基板１２に好ましい高分子材料は、ポリイミドである。ポリイミドは、柔軟で、バイオセンサの製造中に遭遇する極端な温度に耐えることができる。基板を準備するのに適切な他の高分子材料は、ポリカーボネートおよびポリエステル（たとえば、「ＭＹＬＡＲ」）を含む。
【００２１】
センサは、４つの電極、すなわち、作動電極１４、流量決定電極１６、基準電極１８、および対向電極２２を使用することが好ましい。代替として、基準電極の機能および対向電極の機能の両方を実施する単一の電極が、基準電極および対向電極と置き換わることができる。さらに、電気化学的活性種からの妨害を補償するために、ダミー電極およびブランク電極を使用することができる。対象の検体に特有の試薬が、作動電極１４の上に付着されることが必要である。
【００２２】
作動電極１４および流量決定電極１６を形成するのに好ましい材料は、たとえば導電性金属、好ましくは貴金属など、導電性材料を含むが、これに限定されるものではない。作動電極１４および流量決定電極１６を準備するのに好ましい金属は、白金、金、およびパラジウムを含み、白金が好ましい。白金は、他の金属より、過酸化水素を測定するのに良好な表面を提供する。たとえば、白金は、過酸化水素の測定に必要な電圧の特性、および作動電極の表面上における酸化の効率に関して、金より優れている。
【００２３】
真空蒸着によって、作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８を形成するための金属を付着させることが好ましい。真空蒸着は、金属の非常に薄いが一様な層を基板の上に付着させるために使用することができる技術である。金属は気化され、気化された金属は、基板の上に付着される。金属は高い沸点を有するので、真空は、沸点を下げるようにも作用する。真空蒸着は、スクリーン印刷による付着と比較して、清浄で一様な表面を提供する。純粋な金属が、真空蒸着に使用される。したがって、樹脂または他の被覆剤による表面の汚染はない。基板１２は、粗い表面を有する（たとえば、１０マイクロメートル未満の平均的な表面の粗さを有する）、または基板１２の上に付着された電極は、電極の表面積が、増大された面積を有して感度の増大を提供するように、付着後に電気化学的にエッチングされることが好ましい。
【００２４】
基準電極１８は、銀と塩化銀との混合物を備える層を含む。この層は、たとえば白金などの導電性材料で作成された電極の上に電気化学付着によって銀を付着させ、次いで、塩化銀の層を得るように、塩化カリウムが存在する状態で付着された銀を電気化学的に（ガルバニ電気により）処置することによって製造することができる。
【００２５】
対向電極２２は、炭素、金、パラジウム、白金、またはステンレス鋼など、あらゆる導電性材料から形成することができる。基準電極および対向電極を使用する代替として、２重目的の電極を使用することができ、この場合、基準電極および対向電極の機能を実施するために、塩化銀を有するまたは全く有していない、銀層を使用することができる。２重目的の電極は、好ましくないが、生成される電流が小さく、かつ監視の期間が短いとき、使用することができる。監視の期間が、１時間を超えるなど長過ぎる場合、基準電圧は、時間の経過と共にドリフトする傾向がある。
【００２６】
流量決定電極１６は、過酸化水素を酸化させることができる金属電極を備える。流量決定電極に適切な金属は、白金、パラジウム、および金を含むが、これに限定されるものではない。流量決定電極１６は、反応層を含まない。しかし、流量決定電極１６は、たんぱく質の分子が流量決定電極の表面を汚染することを阻止するために、拡散層を有することができる。
【００２７】
絶縁層２０は、フォトレジスト材料など、任意の光重合可能材料から形成することができる。本発明において絶縁層としての使用に適切なフォトレジスト材料は、商標「ＶＡＣＲＥＬ」を有する。絶縁層２０を形成するのに適切な他のフォトレジスト材料は、「ＴＥＮＴＭＡＳＴＥＲ」および「ＰＹＲＡＬＡＵＸ」を含む。光重合可能材料の使用の代替として、絶縁層２０は、作動電極１４、流量決定電極１６、基準電極１８、および接点を暴露させることを可能にするために、開口を内部に有するテープを備えることができる。
【００２８】
図１、図２、および図３に示す実施形態では、上部層２４は、基板１２を準備するのに適切な材料から形成することができる。以前に記述したように、これらの材料は、たとえばガラスおよび高分子材料など、任意の非導電性材料を含むが、これに限定されるものではない。上部層２４に好ましい高分子材料は、ポリイミドである。ポリイミドは、柔軟で、かつバイオセンサの製造中に遭遇する極端な温度に耐えることができる。上部層２４を形成するために使用することができる他のポリマーは、ポリ塩化ビニルおよびポリエステルを含む。代替実施形態では、対向電極２２を延長して、上部層として使用することができる。この代替実施形態では、サンプル入口およびサンプル出口は、対向電極において形成されなければならない。他の代替実施形態では、対向電極２２の材料は、真空蒸着によって上部層２４の上に付着させることができる。以前に記述したように、真空蒸着は、金属の非常に薄いが一様な層を基板の上に付着させるために使用することができる技術である。金属は気化され、気化された金属は、基板の上に付着される。金属は高い沸点を有するので、真空は、沸点を下げるようにも作用する。
【００２９】
サンプル入口２８は、サンプルがセンサ１０内に導入される位置である。サンプル入口２８は、作動電極１４と位置合わせされて配置されることが好ましい。サンプル出口３０は、サンプルがセンサ１０から除去される位置である。サンプル出口は、基準電極１８の下流側に配置されることが好ましい。サンプルは、サンプル入口２８において始まり、サンプル出口３０において終わる流れチャネル２６を通って流れる。
【００３０】
以前に記述したように、マイクロウエル３２、３４、および３６は、作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８をそれぞれ暴露させるように、絶縁層２０に形成される。さらに、反応層４０および拡散層４２を形成する材料は、マイクロウエル３２に挿入される。拡散層４２ａを形成する材料は、マイクロウエル３４に挿入される。層３８を形成する材料は、マイクロウエル３６に挿入される。層３８を形成する材料は、層４２および４２ａを形成する材料とほぼ同様である。
【００３１】
反応層４０は、高分子基質において固定された酵素を備え、したがって、酵素は、バイオセンサが使用されている際に、反応層から拡散しない。反応層４０は、適切な反応媒体に酵素が存在する状態で、たとえばメタクリレートまたはその派生物など、モノマー材料を重合させることによって形成することができる。酵素は、高分子基質において物理的にトラップされ、したがって、固定される。過酸化水素など、電気化学的活性反応生成物を生成することができるあらゆる酵素を、本発明のバイオセンサにおいて使用することができる。そのような酵素の代表的な例は、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、および乳酸オキシダーゼを含むが、これに限定されるものではない。酵素は、作動電極１４の表面の上に固定される。反応層４０の深度は、約１０から１５マイクロメートルの範囲にあることが好ましい。
【００３２】
流量決定電極１６は、流れチャネル２６の深度が、作動電極１４から流量決定電極１６まで著しく変化しないように、反応層４０にほぼ等しい深度を有する任意のブランク層（図示せず）を含むことが可能である。
【００３３】
拡散層４２は、層の１つの主要表面から層の他の主要表面までの分子フラックスを制御する。拡散層４２は、材料の自由な流れに対する障壁を提供する。拡散層４２は、拡散層４２の孔よりサイズの大きい分子が、拡散層４２を流れるのを防止するが、拡散層４２の孔よりサイズの小さい粒子が、拡散層４２を流れることを可能にする。拡散層４２は、検体が流れチャネル２６から反応層４０まで通って拡散する蛇行路を提供する、無反応性高分子基質を備える。この蛇行路により、サンプルの検体の一部のみが反応層４０に拡散することが可能になる。拡散層４２は、たんぱく質などのすべての巨大分子を拡散層４２の表面上に保持する。拡散層４２は、反応層４０に到達することができる検体の分子の数を限定し、したがって、検体の酸化レートを限定する。作動電極１４における検体のこの部分的な変換は、センサ１０のダイナミックレンジを増大させるように作用する。無媒介バイオセンサ、すなわち媒介物質を使用しないバイオセンサでは、反応レートは、サンプルに溶解した酸素のレベルに応じる。検体の一部のみが反応層４０に到達し、かつ酸素が、検体が拡散することができるより迅速に拡散することができるので、拡散層４２により、拡散層４２を有していないバイオセンサで使用することができるより広範な濃度にわたって、バイオセンサを使用することが可能になる。拡散層４２は、適切な反応媒体において、たとえばメタクリレートまたはその派生物など、モノマー材料を重合させることによって形成することができる。
【００３４】
拡散層４２ａは、拡散層４２と同一、またはほぼ同一である。拡散層４２ａは、たんぱく質などのすべての巨大分子を拡散層４２ａの表面上に保持し、それにより、これらの巨大分子が、流量決定電極１６の表面を汚染することを防止する。任意の拡散層３８は、拡散層４２と同一、またはほぼ同一である。任意の拡散層３８は、たんぱく質などのすべての巨大分子を拡散層３８の表面上に保持し、それにより、これらの巨大分子が基準電極１８の表面を汚染するのを防止する。
【００３５】
スペーサ層４４は、サンプルが検定中に通って流れる流れチャネル２６を創出するために、上部層２４と絶縁層２０との間に挿入される。スペーサ層４４を形成するのに適切な材料は、その主要表面の両方に接着層を有する感圧接着テープを含むが、これに限定されるものではない。
【００３６】
流量決定電極１６は、流体のサンプルの流量を決定する機能を実施する。この機能は、様々な方式で実施することができる。一実施形態では、作動電極は、反応層および拡散層を備える。流量決定電極は、拡散層、および任意にブランク層を備える。この実施形態では、作動電極および流量決定電極からの応答は、流体の選択され知られている流量において測定され、較正曲線が、上述した応答を流体の知られている流量で相関するために確立される。この実施形態では、知られていない流量について、作動電極の応答および流量決定電極の応答が測定され、流量は、上述した較正データから決定される。
【００３７】
他の実施形態では、作動電極は、反応層と、拡散層と、カタラーゼ、ペルオキシダーゼなど、電気化学的活性材料（たとえば、過酸化水素）を無反応材料（たとえば、酸素および水）に変換する材料の層とを備える。ペルオキシダーゼは、酸化酵素を還元するために、たとえばフェノールまたはアニリンなどの還元剤を必要とするので、追加の還元剤を使用することができない場合、カタラーゼがぺルオキシダーゼより好ましい。電気化学的活性材料を無反応材料に変換する材料の層は、約５マイクロメートルの厚さを通常有する。流量決定電極は、反応層および拡散層を備える。過酸化水素を酸素および水に変換する材料の層は、流れチャネルに拡散する過酸化水素分子を酸化し、それにより、過酸化水素が作動電極に戻り拡散するのを排除する。この実施形態では、作動電極および流量決定電極からの応答は、流体の選択され知られている流量において測定され、較正曲線が、上述した応答を流体の知られている流量で相関するために確立される。この実施形態では、知られていない流量について、作動電極の応答および流量決定電極の応答が測定され、流量は、上述した較正データから決定される。
【００３８】
他の実施形態では、２つの流量決定電極および１つの作動電極が使用される。作動電極は、反応層および拡散層を備える。流量決定電極のそれぞれは、拡散層、および任意にブランク層を備える。作動電極は、２つの流量決定電極の間に配置される。この実施形態では、作動電極からの応答および各流量決定電極からの応答は、流体の選択され知られている流量において測定され、較正曲線が、上述した応答を流体の知られている流量で相関するために、各流量決定電極および作動電極について確立される。この実施形態では、知られていない流量について、作動電極の応答および流量決定電極の応答が測定され、流量は、上述した較正データから決定される。この実施形態では、流体の流量を決定することができることに加えて、流体の流れの方向も決定することができる。流体の流れの方向に応じて、流量決定電極の一方のみが、測定可能な応答を生成する。どちらの流量決定電極が測定可能な応答を生成するかを知ることによって、流体の流れの方向を決定することができる。第３の実施形態のバイオセンサは、流れの方向が重要である微細機械加工されたミクロ流体装置と共に使用することができる。そのような装置では、たとえばバルブまたは電気浸透構成要素などの様々な手段が、流体の流れの方向を制御するために使用される。流体が適切な方向に流れていない場合、所望の効果は起きない。たとえば、チップについて微細機械加工実験室においてある反応を実施させることを試行している場合、反応物質は、適切なシーケンスに従って適切な位置に送達されない。流体の流れの方向の知識は、プロセスステップの適切なシーケンスを保証する。
【００３９】
センサ１０は、任意に、電気化学的活性種からの妨害を補償するために、ダミー電極を有することができる。ダミー電極が使用される場合、ダミー電極は、作動電極１４の上流側に配置されることが好ましい。
【００４０】
センサ１０は、任意に、作動電極１４の表面と反応材料の層４０との間に配置された、たとえばポリジアミノベンゼン層など、半浸透性で好ましくはポリマーの好ましい層（図示せず）を含むこともできる。この層は、電気化学付着によって作動電極１４の表面上に形成されることが好ましい。電気化学付着では、ポリジアミノベンゼンは、電極の表面における１，３−ジアミノベンゼンの電気化学重合によって、電極の上に付着される。そのように形成される高分子膜は、絶縁性である。この層の目的は、妨害剤が作動電極１４の表面に移動および拡散するのを限定することである。妨害剤の例は、アスコルビン酸、尿酸、ゲンチシン酸、およびアセトアミノフェンを含む。この層は、印加電圧のレベルが高いとき、好ましい。異なる妨害剤は、異なる酸化電位を有する。たとえば約３００ｍＶなどのより低い電位では、ゲンチシン酸のみが、得られる信号に寄与する。電圧が増大するにつれ、他の妨害剤が、得られる信号に寄与し始める。半浸透性層の厚さは、約１００オングストロームであることが好ましい。
【００４１】
センサ１０は、任意に、流量決定電極１６の表面と拡散層４２との間に配置された、たとえばポリジアミノベンゼン層など、半浸透性で好ましくは高分子の層（図示せず）を含むこともできる。この任意の半浸透性層は、作動電極１４に印加される任意の半浸透性層と同一、またはほぼ同一とすることができる。
【００４２】
電極は、任意の順序で構成することができるが、ある順序は、他よりも好ましい。好ましい実施形態では、作動電極１４は、流量決定電極１６の上流側に配置されるべきである。基準電極１８は、サンプルが排出される時間と、サンプルが作動電極１４と接触する時間との間において、最小限の時間が経過するように、流量決定電極１６の下流側で、かつ流れチャネル２６において配置されるべきである。
【００４３】
センサ１０の４つの電極が、２つの基板の上に配置されることが好ましい。図２および図３に示すように、一方の基板は、作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８を支持することが好ましい。他の基板は、対向電極２２を支持することが好ましい。
【００４４】
少なくとも２つの作動電極（すなわち、１つの作動電極および少なくとも１つの流量決定電極）を有し、かつ１つの基準電極および２つの対向電極をするセンサから、データを連続的に収集することができるあらゆる電気化学装置を、本発明において使用することができる。そのような装置は、バイポテンシオスタットまたはトリポテンシオスタットなど、マルチポテンシオスタットとして知られている。バイポテンシオスタットは、単一の電気化学的セルにおいて、単一の基準電極に関して、同じまたは異なる電圧を２つの作動電極に同時に印加することができる。バイポテンシオスタットを使用するシステムでは、１つの対向電極のみが、２つの作動電極において生成された電流の測定に使用される。バイポテンシオスタットは、市販されている。エコケミー（Ｅｃｈｏｃｈｅｍｉｅ）（オランダ）およびパインチェムインストルメントカンパニー（ＰｉｎｅＣｈｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（米国）が、本発明において使用するのに適切なポテンシオスタットを製造している。装置は、
（１）単一の基準電極に関して、作動電極および流量決定電極において、一定の電圧を印加する能力と、
（２）反応生成物の酸化によって、単一の対向電極によって作動電極および流量決定電極において生成される電流を測定する能力とを有するべきである。
【００４５】
電気化学的活性反応生成物（たとえば、グルコースオキシダーゼの場合は過酸化水素）を酸化するのに十分な大きさの電圧が、作動電極１４および流量決定電極１６に印加される。作動電極１４および流量決定電極１６からの応答（電流）が測定される。流量決定電極１６は、作動電極１４によって測定されない電流を測定すると想定される。流体の流量と作動電極１４および流量決定電極１６の応答との間に確立された較正関係から、流体の流量が計算され、センサ１０の応答は、測定によって決定される値から補正される。
【００４６】
バイポテンシオスタットの代わりに、携帯可能機器を使用することが所望される可能性がある。バイポテンシオスタットと同じ機能を実施することに加えて、携帯機器は、測定時に、圧力（真空）などのパラメータを制御し、かつ温度などのパラメータを監視するように構成することができる。
【００４７】
センサは、半導体の調整に使用される手順を適合させることによって、製造することができる。製造の好ましい方法は、以下の方法を含む。
【００４８】
１．フォトレジスト層が、第１の非導電性基板１２（ガラス、ポリイミドなど）の上に付着される。
【００４９】
２．フォトレジスト層は、金属の層の構成を得るために、マスクによって現像される。この構成は、電極、ならびにトラックおよび電気接点を構成する。
【００５０】
３．金属（たとえば、白金、金、パラジウム、またはある他の貴金属）の層が、蒸着またはスパッタリングなどの付着技術によって、現像されたマスクを担持する基板１２の上に付着される。
【００５１】
４．次いで、フォトレジスト層は、剥離され、マイクロウエル３２、３４、および３６の下に位置する作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８の接点、トラック、および領域を形成する付着された金属が残る。
【００５２】
５．作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８を構成する付着金属の領域を暴露させるために、第２のフォトレジスト層が、以前に記述した方法で、すなわちマスクによって、前に付着された金属を含む基板１２の上に付着される。残っている現像されたフォトレジストは、絶縁層２０を形成する。マイクロウエル３２、３４、および３６が、作動電極１４、流量決定電極１６、および基準電極１８の領域と位置合わせされるように形成され、該領域に、材料の追加の層が付着される。第２のフォトレジスト層は、マイクロウエル３２を画定し、マイクロウエル３２は、反応層４０および拡散層４２を含む作動電極１４の領域を画定する。第２のフォトレジスト層は、マイクロウエル３４を画定し、マイクロウエル３４は、拡散層４２ａおよび任意にブランク層を含む流量決定電極１６の領域を画定する。第２のフォトレジスト層は、マイクロウエル３６を画定し、マイクロウエル３６は、銀／塩化銀の層および任意に拡散層を含む基準電極１８の領域を画定する。
【００５３】
６．銀が、基準電極１８の上に重なるマイクロウエル３６においてガルバニ電気により付着され、次いで、塩化カリウムの存在する状態で、付着された銀をガルバニ電気により処置することによって、塩化銀に部分的に変換される。
【００５４】
７．酵素（たとえば、グルコースオキシダーゼ）は、親水性溶媒において、メタクリレートまたはその派生物などの光重合可能モノマーと混合されて、作動電極１４の上に重なるマイクロウエル３２に分与される。化学調合物は、酵素を高分子（たとえば、ポリメタクリレート）反応層４０において固定するために、紫外線に暴露される。
【００５５】
８．高分子（たとえば、ポリメタクリレート）拡散層４２が、作動電極１４の上に重なるマイクロウエル３２に分与される。この層４２も、反応層４０を形成するために使用される方法と同様の方法で形成される。この層は、酵素を包含する反応層４０と同様であるが、酵素を含まない。この拡散層４２は、より広いダイナミックレンジを可能にし、また、サンプルに存在する可能性があるたんぱく質を分離する。
【００５６】
９．高分子拡散層４２ａが、流量決定電極１６の上に重なるマイクロウエル３４の上に分与される。この層４２ａも、反応層４０を形成するのに使用される方法と同様の方法で形成される。この層は、酵素包含反応層４０と同様であるが、酵素を含まない。この拡散層４２ａは、より広いダイナミックレンジを可能にし、また、サンプルに存在する可能性があるたんぱく質を分離する。ブランク層（図示せず）が、任意に、拡散層４２ａが分与される前に、マイクロウエル３４に分与されることができる。
【００５７】
１０．次いで、スペーサ層４４が、図１に示すように、アセンブリの上に配置される。本発明のバイオセンサにおいて使用するのに適切なスペーサ層４４は、両面感圧接着テープ（５０μｍの厚さ）の層である。
【００５８】
１１．導電性金属（たとえば、金、ステンレス鋼、白金、パラジウム）のプレートが、スペーサ層４４の上に配置され、これにより、対向電極２２を形成する。対向電極２２およびスペーサ層４４は、流れチャネル２６を形成する。代替実施形態では、図１に示すように、絶縁サポートを対向電極２２の上に配置することができる。絶縁サポートは、上部層２４である。他の代替実施形態では、対向電極２２を、ポリエステル（「ＭＹＬＡＲ」）などの絶縁サポートの上に付着させることができ、付着された対向電極２２を担持する絶縁サポートを、スペーサ層４４の上に配置することができる。絶縁サポートが使用されない場合、サンプル入口およびサンプル出口は、対向電極を形成する導電性金属のプレートに形成されなければならない。図１に示すように、絶縁サポートが使用される場合、サンプル入口およびサンプル出口は、絶縁サポートにおいて形成されなければならない。対向電極２２が絶縁サポートの上に付着される場合、このステップの第３の実施形態において記述したように、サンプル入口およびサンプル出口は、サンプルが流れチャネルへのアクセスを得ることを対向電極が妨害する場合、絶縁支持体および付着された対向電極に形成されなければならない。
【００５９】
実施形態が、マイクロウエル３２について、カタラーゼなど、過酸化水素を酸素および水に変換する材料の層を必要とする場合、拡散層４２と同じ方法で、この層を形成するための材料をマイクロウエルに分与することによって、この層を加えることができる。材料は、拡散層４２を形成するための材料が分与された直後に、分与することができる。
【００６０】
バイオセンサなど、生物学的サンプルの分析に本発明のセンサを使用するために、人工開口が、生物学的サンプルを構成する体液を抽出するために、身体の一部（たとえば、腕または腹部）の皮膚において作成される。皮膚に開口を形成する手段は、当業者にはよく知られている。これらの手段の例は、レーザポレーション、微小針による穿刺を含むが、これに限定されるものではない。
【００６１】
センサ１０は、２つの開口を有する絶縁取付け部品（図示せず）に配置することができる。サンプル入口２８およびサンプル出口３０は、取付け部品のこれらの開口と位置合わせされ、センサ１０は、位置合わせリングの補助で装置に固定されることができる。取付け部品の開口の一方は、入口として作用する。取付け部品の他の開口は、出口として作用する。この出口は、使用済みサンプルが格納されるリザーバにも接続される。出口は、身体の一部の皮膚にある人工開口からサンプルを流出させるために必要な圧力差を作る、真空生成装置にも接続される。取付け部品は、たとえば両面接着テープなどの感圧接着によって、身体の一部に固定されることができる。
【００６２】
身体の一部から抽出されたサンプルは、取付け部品の入口およびセンサ１０の入口２８を通って流れチャネル２６に入り、電極の構成の上を流れ、センサの出口３０および取付け部品の出口から出る。使用済みサンプルは、廃棄されるまで、リザーバに格納される。
【００６３】
本発明のセンサおよび方法は、検体が電気化学的にも活性である状況について使用することができる。たとえば、酸素電極（すなわち、酸素の還元を測定する電極）を上記の状況において使用する場合、酸素の濃度プロファイルを、流量のモニタとして使用することができる。酸素電極は、サンプルの酸素の電気化学決定に使用することができることが好都合である。酸素は、グルコースの酸化がグルコースオキシダーゼによって触媒作用される反応において消費される。グルコースの酸化の結果である酸素テンションの低下（すなわち、流体の表面における酸素のレベルに応じる酸素の濃度）は、グルコースの濃度に正比例する。酸素の測定に使用される原理は、過酸化水素の測定に使用される原理と同様である。過酸化水素の測定は、反応生成物（過酸化水素）の生成に関係し、酸素の測定は、反応物質（酸素）の消費に関係する。過酸化水素の濃度は、グルコースの濃度が増大するにつれて増大し、酸素の濃度は、グルコースの濃度が増大するにつれて減少する。酸素電極が使用される状況では、通常の条件は、白金カソード（Ｏ２＋４Ｈ＋＋４ｅ−→２Ｈ２Ｏに従って、酸素が還元される）、および−０．６Ｖの電位が白金カソードに印加されるＡｇ／ＡｇＣｌの２重目的の電極を含み、酸素の濃度に比例する電流が生成される。
【００６４】
本発明のセンサおよび方法は、具体的には、生物学的サンプルにおける検体の濃度を決定するための手段として、反応生成物または反応物質の測定を含む、連続監視バイオセンサに適用可能である。たとえば、本発明のセンサおよび方法は、流体のサンプルにおける検体の濃度を決定するための方法を提供し、この場合、前記サンプルは、知られていない流量において流れる。方法は、白金で作成された作動電極、白金で作成された流量決定電極、基準電極、および対向電極を有するセンサを提供するステップを含む。代替として、基準電極および対向電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌで作成された２重目的の電極（すなわち、対向／基準電極）によって置き換えることができる。次いで、流体のサンプルが、センサの流れチャネルに導入される。次いで、作動電極の応答および流量決定電極の応答が、サンプルの知られていない流量において決定される。サンプルの知られていない流量の値は、較正関係によって決定される。そのような較正関係は、以前に記述されている。サンプルにおける検体の濃度の未補正値が、較正関係によって決定される。検体の濃度を電気応答で補正するための較正関係を展開する方法は、当業者にはよく知られている。たとえば、作動電極の応答は、一連の較正実行を実行することによって、検体の濃度で補正することができる。この較正実行では、検体の様々な濃度を含んでいる流体のサンプルが、サンプルの平均流量であることが予期されるサンプルの流量において、センサに導入される。サンプルにおける検体の濃度の補正値は、検体の濃度の値を調整することによって以前に決定された流体の流量と、較正実行の他のセットによって決定されたファクタとを相関させる較正関係により、検体の補正されていない濃度の値を補正することによって決定される。たとえば、流体の流量が平均流量より大きい場合、較正関係は、おそらくは、検体の濃度の値を上方調整することになる。流体の流量が平均流量より小さい場合、較正関係は、おそらくは、検体の濃度の値を下方調整することになる。
【００６５】
バイオセンサは、人間の患者について使用されるように構成される。生物学的サンプルは、皮膚の上に人工開口を形成して、患者の身体から間質流体を取り出すのを補助するために真空を適用することによって、患者の身体から取り出すことができ、それにより、間質流体は、バイオセンサの電極に接触することができる。したがって、間質流体のグルコースなどの検体の濃度を決定することができる。
【００６６】
以下の非限定的な例は、本発明をさらに示す。
【００６７】
例
例１
この例は、生物学的サンプルの流量を測定する追加の能力を有する、生物学的サンプルにおけるグルコースの濃度を監視するのに適切なセンサを示す。この例では、作動電極は、流量決定電極の上流側に配置される。サンプルは、作動電極の上を通過し、その後、流量決定電極に接触する。
【００６８】
センサは、白金で作成された作動電極、白金で作成された流量決定電極、基準電極、および対向電極を備える。代替として、基準電極および対向電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌで作成された２重目的の電極（すなわち、対向／基準電極）によって置き換えられることができる。作動電極および流量決定電極は、生物学的サンプルの電気化学的活性妨害材料からの妨害を抑制するために、半浸透性材料が上に付着されている。作動電極の上に、最高で３つの別個の層を含むことができるヒドロゲル膜が重なる。作動電極の表面に最も近いヒドロゲル膜の層は、反応層であり、この層は、グルコースオキシダーゼを含む。グルコースオキシダーゼを含む反応層の上に、拡散層が重なる。流量決定電極の上に、最高で３つの別個の層を含むことができるヒドロゲル膜が重なる。流量決定電極の表面に最も近いヒドロゲル膜の層は、ブランク層であり、これは、作動電極の上に重なる反応層と同一、またはほぼ同一であるが、グルコースオキシダーゼが存在しない点が異なる。ブランク層の上に、拡散層が重なる。
【００６９】
この例において記述される実施形態では、カタラーゼ層は、作動電極にも流量決定電極の上にも付着されない。
【００７０】
流れチャネルにおける過酸化水素の濃度プロファイルを図４に示す。図４では、作動電極は参照符号１００によって示され、流量決定電極は参照符号１０２によって示され、流れチャネルは参照符号１０４によって示される。濃度プロファイルは、点線によって示される。得られた結果は、図７に示すように、流量決定電極の応答（ＳＦ）と、作動電極の応答（ＳＷ）と流量決定電極の応答（ＳＦ）との差との比が、流量に逆に関係することを示す。流量の変化に対する最大感度は、約２μｌ／ｈｒから約１０μｌ／ｈｒの範囲にある。
【００７１】
作動電極の反応層の調合物は、以下のように準備される。グルコースオキシダーゼが、脱イオン水（２５ｗｔ％）に溶解されて、Ｎ−メチルイミノジエタノール（１ｗｔ％）およびベンゾキノン（０．２ｗｔ％）を含む、ポリエチレングリコール４００の等しい量と混合される。フォトイニシエータ（２，２’ジメトキシフェニルアセトフェノン、１ｗｔ％）、架橋剤（テトラエチレングリコールジメタクリレート、３ｗｔ％）、反応性モノマー（２−ヒドロキシエチルメタクリレート、１２ｗｔ％）、充填剤（ポリ（２−ヒドロキシメタクリレート）、２４ｗｔ％）、可塑剤（ポリエチレングリコール４００、３６ｗｔ％）、および脱イオン水（２４ｗｔ％）を含む先駆物質溶液が準備された。次いで、酵素溶液の１つの（１）パートが、先駆溶液の３つの（３）パートと混合される。
【００７２】
以上の溶液は、作動電極と位置合わせされたマイクロウエルに分与され、混合物は、作動電極の反応層を形成するように紫外線に暴露されることによって、光重合する。拡散層が、同様の方法で形成されるが、酵素溶液は省略される。拡散層は、反応層の上に重なる。
【００７３】
例２
この例は、生物学的サンプルの流量を測定する追加の能力を有する、生物学的サンプルのグルコースの濃度を監視するのに適切なセンサを示す。この例では、作動電極は、流量決定電極の上流側に配置される。サンプルは、作動電極の上を通過し、その後、流量決定電極に接触する。
【００７４】
センサは、白金で作成された作動電極、白金で作成された流量決定電極、基準電極、および対向電極を備える。代替として、基準電極および対向電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌで作成された２重目的の電極（すなわち、対向／基準電極）によって置き換えられることができる。作動電極および流量決定電極は、生物学的サンプルの電気化学的活性妨害材料からの妨害を抑制するために、半浸透性膜が上に付着されている。作動電極の上に、最高で３つの別個の層を含むことができるヒドロゲル膜が重なる。作動電極の表面に最も近いヒドロゲル膜の層は、反応層であり、この層は、グルコースオキシダーゼを含む。グルコースオキシダーゼを含む層の上に、拡散層が重なる。流量決定電極の上に、最高で３つの別個の層を含むことができるヒドロゲル膜が重なる。流量決定電極の表面に最も近いヒドロゲル膜の層は、作動電極の上に重なる反応層と同一、またはほぼ同一である。ブランク層の上に、拡散層が重なる。
【００７５】
作動電極の表面から最も遠いヒドロゲル膜の層は、過酸化水素が流れチャネルに漏れるのを防止するために、過酸化水素を酸素に変換するカタラーゼを含む。カタラーゼ層は、作動電極の上にのみ付着される。
【００７６】
流れチャネルにおける過酸化水素の濃度プロファイルを図５に示す。図５では、作動電極は参照符号２００によって示され、流量決定電極は参照符号２０２によって示され、流れチャネルは参照符号２０４によって示される。濃度プロファイルは、点線によって示される。得られた結果は、図８に示すように、カタラーゼ層を有していない流量決定電極の応答（ＳＦ）とカタラーゼ層を有している作動電極の応答（ＳＷ）との差と、作動電極の応答（ＳＷ）との比が、流量に逆に関係することを示す。流量の変化に対する最大感度は、約２μｌ／ｈｒから１０μｌ／ｈｒである。
【００７７】
例３
この例は、２つの流量決定電極が使用されるバイオセンサを示す。サンプルが、作動電極に接触する前に、第１の流量決定電極の上を通過するように、作動電極を位置決めすることができる。作動電極に接触した後、サンプルは、第２の流量決定電極の上を通過する。
【００７８】
作動電極は、例１の作動電極と同じ材料を備え、かつほぼ同様の上に重なる層を有する。流量決定電極は、例１の流量決定電極と同じ材料を備え、かつ、ほぼ同様の上に重なる層を有する。対向電極および基準電極は、例１の対向電極および基準電極と同じ材料を備え、かつほぼ同様の上に重なる層を有する。
【００７９】
この例の実施形態では、サンプルの流量および流れの方向の両方を決定することができる。電極からの応答の測定を実施するために、トリポテンシオスタットが使用される。流量決定電極の一方から測定可能な信号を得ることができない場合、電極は、作動電極の上流側にあり、流体は、他の流量決定電極に向かって流れていると想定することができる。
【００８０】
流れチャネルにおける過酸化水素の濃度プロファイルを図６に示す。図６では、作動電極は参照符号３００によって示され、流量決定電極は参照符号３０２および３０３によって示され、流れチャネルは参照符号３０４によって示される。濃度プロファイルは、点線で示される。
【００８１】
例４
この例は、知られている濃度において存在する検体を含む流体の流量を決定するために、本発明の原理を使用することができる方法を示す。この例は、薬剤、栄養素（たとえば、グルコース）などの生物学的サンプルが、患者の体内に注入される状況に適合させることができる。検体の濃度はすでに知られているので、濃度を測定する必要はない。しかし、流体の流量は、注入される検体の量を決定するために、所望される可能性がある。したがって、作動電極は必要ではない。過酸化水素は、依然として生成されなければならないので、流量決定電極は、反応層を必要とする。
【００８２】
この例では、センサは、白金で作成された流量決定電極、基準電極、および対向電極を備える。代替として、基準電極および対向電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌで作成された２重目的の電極によって置き換えることができる。流量決定電極は、生物学的サンプルの電気化学的活性妨害材料からの妨害を抑制するために、半浸透性膜が上に付着されている。流量決定電極の上に、最高で３つの別個の層を含むことができるヒドロゲル膜が重なる。作動電極の表面に最も近いヒドロゲル膜の層は、反応層であり、この層は、グルコースオキシダーゼを含む。グルコースオキシダーゼの上に、拡散層が重なる。
【００８３】
検体の濃度は、センサを含まない方法によって測定される。流体がセンサに導入され、流量決定電極からの応答が測定される。センサの応答、検体の濃度、および流体の流量を補正するために以前に確立された関係を使用して、流体のサンプルの知られていない流量を決定することができる。
【００８４】
本発明の範囲および精神から逸脱しない本発明の様々な修正および変更が、当業者には明らかになるであろう。本発明は、本明細書において記述された例示的な実施形態に過度に限定されるものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本明細書において記述されるセンサの分解斜視図である。
【図２】センサが、分解図ではなく組み立てられて示され、いくつかの層の一部が、他の層の一部をより明確に示すために切断されて示されている、図１に示したセンサの斜視図である。
【図３】図１に示したセンサの拡大側面図である。
【図４】この概略図に示す実施形態では、作動電極が、流体の流量の変化に反応し、流量決定電極も流体の流量の変化に反応する、サンプルが、流量決定電極と接触する前に作動電極と接触する、本発明のセンサの流れチャネルにおける作動電極および流量決定電極の配置を示す概略図である。
【図５】この概略図に示す実施形態では、作動電極が流体の流量の変化に反応せず、流体流量電極が流体の流量の変化に反応する、サンプルが、流量決定電極と接触する前に作動電極と接触する、本発明のセンサの流れチャネルにおける作動電極および流量決定電極を示す概略図である。
【図６】この概略図に示す実施形態では、流体の流量および流体の流れの方向の両方を決定することができ、この概略図に示す実施形態では、作動電極が流体の流量の変化に反応し、流量決定電極も流体の流量の変化に反応する、サンプルが、流量決定電極と接触する前に作動電極と接触する、本発明のセンサの流れチャネルにおける作動電極および２つの流量決定電極の配置を示す概略図である。
【図７】図４に示したタイプのセンサの較正関係を示すグラフである。
【図８】図５に示したタイプのセンサの較正関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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