(57)【要約】紙材料、たとえば、紙、ライナボード、段ボール板紙、ティッシュペーパー、ペーパータオル、段ボール製容器および箱、の製造における脂肪酸酸化酵素の使用法。脂肪酸酸化酵素の例は、EC 1.13.11として分類されるオキシゲナーゼであり、その如何なる亜綱、たとえばリポキシゲナーゼ、EC 1.13.11.12、を含む。これらの酵素の効果は、ピッチの沈着を減少することであり、ならびに漂白および脱インキ効果もまた紙パルプおよび結果の紙材料に観察される。脂肪酸酸化酵素は、基質と、プロテアーゼ、リパーゼ、キシリナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ステリルエステラーゼ、および/またはコレステロールエステラーゼと、あるいは界面活性剤および他の補助剤と共同して使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
紙材料の製造における脂肪酸酸化酵素の使用。
【請求項２】
ピッチの沈着を減少させるための請求項１に記載の使用。
【請求項３】
漂白のための請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
回収された印刷済み紙材料からのパルプを含む製紙パルプから紙材料を製造する方法における、脱インキのための請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
化学パルプが、紙材料の製造のために使用されているパルプの部分を構成する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
酵素のための基質と一緒になった、請求項１〜５のいずれか１項に記載の脂肪酸酸化酵素の使用。
【請求項７】
プロテアーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ステリルエステラーゼ、および/またはコレステロールエステラーゼ活性を有する追加の酵素と組み合わせての、脂肪酸酸化酵素の請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
請求項7に記載の使用法であって、前記追加の酵素がラッカーゼおよび/またはペルオキシダーゼ活性を有する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記追加の酵素がリパーゼ活性を有する、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
製紙用パルプおよび/または工程水を脂肪酸酸化酵素で処理する工程を含んで成る、紙材料の製造方法。
【請求項１１】
酵素処理したパルプを形成および乾燥する工程を更に含んで成る、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素処理が、
a)ピッチ沈着の減少、
b)生じる紙材料の漂白
をもたらす、請求項10または11に記載の方法。
【請求項１３】
化学パルプが、紙材料の製造のために使用されるパルプの部分を構成する、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
前記製紙用パルプがリサイクルされた印刷済み紙材料を含み、そして前記酵素処理が、少なくとも部分的に酵素の脱インキ効果により、得られる紙材料の漂白をもたらす、請求項10〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
酵素のための基質が酵素処理工程の前または途中に添加される、請求項10〜14のいずれか１項に記載方法。
【請求項１６】
製紙用パルプおよび/または工程水を、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ステリルエステラーゼ、および/またはコレステロールエステラーゼ活性を有する追加の酵素で処理する事をさらに含む、請求項10〜15のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記追加のオキシドレダクターゼ酵素が、ラッカーゼおよび/またはペルオキシダーゼ活性を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記追加酵素がリパーゼ活性を有する、請求項16〜17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記追加の酵素での該処理が、脂肪酸酸化酵素での処理前、処理と同時、および/または処理後に実施される、請求項16〜18のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紙材料の製造における脂肪酸酸化酵素の使用、並びに紙材料の製造方法に関するものであり、該方法は製紙用パルプおよび/または製紙工程水を脂肪酸酸化酵素で処理する工程を含む。
【背景技術】
【０００２】
紙材料の製造において酵素を使用することは、よく知られている。この目的のために使用された酵素の例は、プロテアーゼ、リパーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、同様にオキシドレダクターゼ（フェノール酸化酵素）のような種々の酸化酵素、たとえばラッカーゼおよびペルオキシダーゼである。
これらの酵素の効果は広範であり、たとえばピッチのような種々の残渣の制御、強度改善、脱インキ、排水改良、組織軟化、漂白、などである。
【０００３】
製紙工程において、溶解したコロイド状物質（DCS）が、パルプおよび紙の製造中に工程水に分散する。DCSは、しばしば木材ピッチまたは木材樹脂と称される。ピッチは、ローラーに付着して製紙機械に問題を生じ、その結果紙材料に斑点または穴を生じる。
木材は、その主要成分、セルロース、ヘミセルロース、およびリグニンに加えて約1〜10%のピッチまたは抽出物を含む。ピッチの主要成分は、脂肪酸、トリグリセライド、ステロール、ステリルエステル、およびいわゆる樹脂酸、たとえばアビエチン酸である。
【０００４】
WO 00/53843は、ある種のステリルエステラーゼ酵素の調製、およびピッチのステリルエステル部分を加水分解するための紙製造時におけるその使用法を開示している。
米国特許6,066,486は、シュードモナス・フラギ（Pseudomonas fragi）に由来するコレステロールエステラーゼを含む酵素の調製およびパルプ樹脂を加水分解するためのその使用法を開示している。
日本特許2000080581は、パルプ化または製紙工程中におけるアビエチン酸の分解のためのある種のペルオキシダーゼの使用法を開示している。
【０００５】
X. Zhang; Pulp & Paper Canada,101:3 (2000), page59-62は、溶解したコロイド状物質を除去するために、たとえばラッカーゼの能力の研究を開示している。
Karlssonら：脂肪酸および樹脂酸とのTrametesラッカーゼの反応性；Appl. Microbiol. Biotechnol. (2001) 55;317-320もまた、ラッカーゼをモデルピッチ調製品処理のために使用した実験を開示している。
然しながら、上述した参照文献のいずれも紙資材製造のためにここに定義している如き、脂肪酸酸化酵素の使用を開示していない。
【発明の開示】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、ある種の酸化酵素、すなわち脂肪酸酸化酵素が紙材料の製造に有利である事を発見した。これらの酵素の重要な効果は、ピッチの沈着を減少する事である。さらに、これらの酵素は、紙パルプおよび得られる紙材料に対して漂白効果を有する。そうして最後に、脱インキ効果もまた観察されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
紙およびパルプ
述語「製紙工程」又は「製紙方法」は、パルプを水に懸濁し、種々の添加物と混合し、ついで紙、段ボール、ティッシュペーパー、ペーパータオルなどを形成し、プレスし、乾燥する設備に通す工程を意味する。
述語「紙資材料」は、パルプから製造できる製品、たとえば、紙、ライナボード、段ボール製板紙、ティッシュペーパー、ペーパータオル、段ボール製容器または箱に関する。
【０００８】
述語「製紙用パルプ」または「パルプ」は、紙材料の製造に使用出来る如何なるパルプをも意味する。たとえば、パルプは、バージンパルプとして供給出来るし、またはリサイクル源に由来することも出来る。製紙用パルプは、木材パルプ、非木材パルプ、または古紙から製造されたパルプであろう。木材パルプは、松、セコイア、樅、スプルース、杉および栂のような針葉樹、または楓、榛の木、樺、ヒッコリー、ぶな、箱柳、アカシアおよびユーカリのような広葉樹から製造される。非木材パルプは、たとえばバガス、竹、綿、またはケナフから製造されるであろう。古紙パルプは、新聞紙、混合事務所廃棄物、コンピュータープリントアウト、白紙台帳、雑誌、牛乳カートン、紙コップ等の様な古紙を再パルプ化して製造されるであろう。
【０００９】
特定の具体例においては、処理されるべき製紙用パルプは、広葉樹パルプおよび針葉樹パルプの両方を含む。
処理されるべき木材パルプは、機械パルプ（たとえば砕木パルプ、GP）、化学パルプ（たとえばクラフトパルプまたは亜硫酸パルプ）、セミケミカルパルプ（SCP）、サーモメカニカルパルプ（TMP）、ケミサーモメカニカルパルプ（CTMP）、または漂白ケミサーモメカニカルパルプ（BCTMP）であろう。
【００１０】
機械パルプは、粉砕および精製法により製造される。ここで原料は、周期的な圧力衝撃を受ける。TMPはサーモメカニカルパルプ、GWは砕木パルプ、PGWは加圧砕木パルプ、RMPは精製機械パルプ、PRMPは加圧精製機械パルプおよびCTMPはケミサーモメカニカルパルプである。
【００１１】
化学パルプは、大部分のリグニンおよびヘミセルロース成分が除去されるアルカリ蒸解により製造される。クラフトパルプ化すなわち硫酸塩蒸解においては、硫化ナトリウムまたは苛性ソーダが主たる蒸解薬品として使用される。これらの型のパルプにおいては、アルカリ蒸解の結果として、ピッチのトリグリセライド部分は、脂肪酸およびグリセロールに加水分解されるであろう。表題が示す如く、脂肪酸酸化酵素はトリグリセライドのアルカリ加水分解の結果生じる脂肪酸のさらなる分解を触媒するので、これらの酵素はそのようなパルプの処理に特に有益である。
【００１２】
処理されるべきクラフトパルプは、漂白クラフトパルプであろう。そうしてそれは、針葉樹漂白クラフトパルプ（SWBK、NBKP(Nadel Holz漂白クラフトパルプ)とも呼ばれる）、広葉樹漂白クラフトパルプ（HWBK、LBKP（Laub Holz 漂白クラフトパルプ）とも呼ばれる）、および/またはこれらの混合物からなる。
【００１３】
本発明の方法で使用されるべきパルプは、機械または化学パルプの懸濁液、あるいはその組み合わせである。たとえば、本発明のプロセスで使用されるべきパルプは、0%、10-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、または90-100%の化学パルプを含むであろう。特定の具体例において、化学パルプは紙資材を製造するために使用されるパルプの一部を成している。本発明の文脈で、「一部を成す」という表現は、本発明のプロセスで使用されるべきパルプにおいて、化学パルプの割合は、1-99%の範囲内にあることを意味する。特定の具体例において、化学パルプの割合は、2-98%、3-97%、4-96%、5-95%、6-94%、7-93%、8-92%、9-91%、10-90%、15-85%、20-80%、25-75%、30-70%、40-60%、または45-55％の範囲内にある。
【００１４】
本発明の使用および工程の特定の具体例において、化学パルプは、クラフトパルプ、亜硫酸パルプ、セミケミカルパルプ(SCP)、サーモメカニカルパルプ(TMP)、ケミサーモメカニカルパルプ(CTMP)、漂白ケミサーモメカニカルパルプ（BCTMP）である。特定の具体例において、クラフトパルプは、漂白クラフトパルプ、たとえば針葉樹漂白クラフトパルプ（SWBK、NBKP(Nadel Holz漂白クラフトパルプ)とも呼ばれる）、広葉樹漂白クラフトパルプ（HWBK、LBKP（Laub Holz 漂白クラフトパルプ）とも呼ばれる）、および/またはこれらの混合物からなる。
【００１５】
工程条件
本発明の方法は、パルプ化または製紙工程中に、たとえばピッチによる問題を避けるために、ピッチを構成する化合物の酸化および加水分解に特に適用できる。
本発明の方法は、如何なるピッチ含有パルプにも、特に相当量のリノール酸または他の不飽和脂肪酸を有するパルプに適用されるであろう。
【００１６】
紙およびパルプ加工の場合には、本発明に従うプロセスは、どのパルプ製造段階でも実施できる。酵素は、どの貯蔵タンク、たとえば、パルプ貯蔵容器（貯蔵箱）、貯蔵塔、混合容器または計測容器、にも添加出来る。酵素処理は、パルプ漂白前に、パルプ漂白プロセスとの関連で、または漂白後に、実施出来る。パルプ漂白との関連で実施する時には、酵素調製品は、塩素、二酸化塩素の様な漂白薬剤と一緒に添加されるであろう。酸素ガス、過酸化水素またはオゾン、あるいはそれらの混合物の適用もまた、パルプの漂白を遂行するであろう。
【００１７】
酵素調製品もまた、これらの物質と共に添加されるであろう。好ましくは、酵素調製品は漂白に先立って添加される。酵素はまた、漂白から生じる循環プロセス水（白水）および機械またはケミメカニカルパルプ化プロセスから生じるプロセス水（茶色水）にも添加出来る。クラフトパルプ化プロセスの特定の具体例で、酵素は褐色紙料洗浄中に添加される。
【００１８】
本発明の文脈で、述語「工程水」は、１）製紙工程に原料として添加される水、２）紙材料の製造のための工程のいずれかの工程から生じる中間水製品、同様に３）プロセスの産物または副産物としての廃水を含む。特定の具体例において、プロセス水は、循環(再循環)される、された、されている、または循環を意図される。すなわち、プロセスの他工程で再利用される。術語「水」は、かわるがわる如何なる水媒体、溶液、懸濁液、たとえば、普通の水道水、ならびに製紙プロセスで通常使用される種々の添加物および補助剤と混合した水道水を意味する。特定の具体例において、プロセス水は、低含量の固形(乾燥)物、たとえば、20%、18%、16%、14%、12%、10%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満の乾燥物を含む。
【００１９】
本発明の使用および方法は、廃水でのパルプ工業用漂白染料のための、PCT/DK02/00251の例２に述べられている様なマグナポルセ・サルビニ（Magnaporthe salvinii）に由来するリポキシゲナーゼの使用法を含まない。
本発明の方法は、紙およびパルプ加工の通常の条件下で実施されるであろう。プロセス条件は、適用される酵素、反応時間および与件の関数である。
本発明の酵素は、有効量で添加されるべきである。術語「有効量」により、ピッチ成分を酸化し、望ましい漂白および/または脱インキなどの様な、望ましくかつ期待される効果を達成するのに十分な量を意味する。
【００２０】
特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素および、もしあるならば、追加酵素の量は、１ｔの紙パルプ当たり(各酵素の)約0.1 mg の酵素蛋白質から約100.000 mg の酵素蛋白質である。
さらなる特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素および、もしあるならば、追加の酵素の量は、１ｇ（乾燥重量）のリグノセルロース物質当たり0.00001〜20 mgの酵素（純酵素蛋白質として計算）の範囲であり、あるいは0.0001〜20 mg、たとえば0.0001〜10 mg/g、0.0001〜1 mg/g、0.001〜0.1 または0.01〜0.1 mg/gのリグノセルロース物質当たり酵素である。尚、これらの量は、各酵素の量に関する。
【００２１】
酵素処理は、通常の濃度、たとえば乾燥物の0.5〜10%で実施出来る。特定の具体例において、濃度は、乾燥物の0.5〜45；0.5〜40；0.5〜35；0.5〜30；0.5〜25；0.5〜20；0.5〜15；0.5〜10；0.5〜8；0.5〜6；0.5〜5%の範囲内である。
酵素処理は、約10から約100℃の温度で実施されるであろう。温度範囲のさらなる例（全て「約---から」および「約---へ」）は、下記の通りである：20〜100、30〜100、35〜100、37〜100、40〜100、50〜100、60〜100、70〜100、10〜90、10〜80、10〜70、10〜60、および30〜60℃であり、また同様に、ここに示した上方値および下方値のいずれかの組み合わせである。典型的な温度は、約20から90℃、または20から95℃、好ましくは約40から70℃、または40から75℃である。
【００２２】
酵素処理は、約2から約12のpHで実施されるであろう。さらなるpH領域の例は(全て「約---から」および「約---まで」)、下記の通りである：3〜12、4〜12、5〜12、6〜12、7〜12、8〜12、9〜12、2〜11、2〜10、2〜9、2〜8、4〜10、5〜8、また同様に、ここに示した上方値および下方値のいずれかの組み合わせである。典型的なpH範囲は、約2から12、好ましくは約4.5から9または6から9の範囲内である。
【００２３】
酵素処理の適切な時間は、数秒から数時間の範囲である。たとえば、約30秒から約48時間、または約1分から約24時間、あるいは約1分から約18時間、あるいは約1分から約12時間、あるいは約1分から約5時間、あるいは約1分から約2時間、あるいは約1分から約1時間、あるいは約1分から約30分である。典型的な反応時間は、約10分から3時間、10分から10時間、好ましくは、15分から1時間、または15分から2時間である。
大気からの分子酸素は、もし必要であれば、通常十分な量が存在する。それ故、反応は開放型反応器で、すなわち大気圧下で実施する。
【００２４】
脂肪酸酸化酵素および追加の酵素のほかに種々の添加剤は、もしあるならば、本発明の方法または使用において使用出来る。界面活性剤および/または分散剤は、しばしば製紙パルプに存在しおよび/または添加される。かくて、本発明のプロセスおよび使用法は、製紙パルプに通常使用される陰イオン、非イオン、陽イオン、および/または両性イオン界面活性剤および/または分散剤の存在下で実施されるであろう。陰イオン界面活性剤の例は、アルキル、置換アルキル、またはアリールのカルボン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩、または燐酸塩である。
【００２５】
脂肪酸は、アルキルカルボン酸塩の例である。非イオン界面活性剤の例は、ポリオキシエチレン化合物、たとえばアルコールのエトキシレート、プロポキシレート、またはエトキシレート/プロポキシレート混合物、他のポリグリセロールおよび他のポリオール、また同様にある種のブロック共重合体である。陽イオン界面活性剤の例は、水溶性陽イオン重合体、たとえば、4級硫酸アンモニウムおよびある種のアミン、たとえば、エピクロロヒドリン/ジメチルアミン重合体（EPI-DMA）およびこれらの架橋溶液、ポリジアリルジメチル塩化アンモニウム（DADMAC）、DADMAC/アクリルアミド共重合体、ならびに米国特許No.5,681,862およびNo.5,575,993に開示されている様なイオネン重合体である。双性イオンまたは両性イオン界面活性剤の例は、ベタイン、グリシネート、プロピオン酸アミン、プロピオン酸イミン、および種々のイミダゾリン誘導体である。米国特許No.5,256,252に開示された重合体もまた使用されるであろう。
【００２６】
本発明に従ってもまた、上述の様な界面活性剤は、その如何なる組み合わせも含んで、ここに定義した如き脂肪酸酸化酵素と共に製紙プロセスで使用され、およびその様な酵素と共に組成物に含まれるであろう。その様な組成物中の各界面活性剤の量は、組成物の約8から約40%(重量/重量)の量であろう。特定の具体例において、各界面活性剤の量は、約10から約38、または約12から約36、あるいは約14から約34、あるいは約16から約34、あるいは約18から約34、あるいは約20から約34、あるいは約22から約34、あるいは約24から約34、あるいは約26から約34、あるいは約26から32%(重量/重量)の量である。
他の特定の具体例において、上記範囲の夫々は界面活性剤の総量に関する。
【００２７】
酵素
酵素番号(EC No.)は、酵素の分類、たとえば、リパーゼ活性を有する酵素に対するリパーゼの酵素番号、などに使用されるであろう。国際生化学・分子生物学連合命名法委員会の勧告案(1992)、Academic Press Inc., 1992を参照せよ。
術語、酵素は、ここに述べた種々の酵素および酵素の種類と同様、野生種および問題の活性を維持している如何なる変異種も同様に含む。その様な変異種は、組換技術で作られるであろう。野生種酵素もまた、組換技術、または自然発生源からの単離および精製により作られるであろう。
【００２８】
特定の具体例において、問題の酵素はよく定義されている。すなわち、唯一つの主要な酵素成分が存在する。これは、たとえば適切なサイズ排除カラムでの分画により推論される。そのような良く定義された、または精製された、あるいは高度に精製された、酵素は当業界で知られている如く、および/または問題の特定の酵素に関して文献に記載されている如く入手できる。
【００２９】
脂肪酸酸化酵素
術語「一つの」脂肪酸酸化酵素は、その様な酵素の少なくとも一つを意味する。術語「少なくとも一つ」は、その様な酵素が1、2、3、4、5、6、またはそれより多いことを意味する。
【００３０】
本発明の文脈において、一つの脂肪酸酸化酵素は、基質シリンガルダジンよりもっと効率的に基質リノール酸を加水分解する酵素である。「もっと効率的に」は、より高い反応速度を意味する。これは、例2に記述された方法を用い、ならびに(1)基質リノール酸での吸光度の1分間当たりの増加（234 nmの吸光度）、および(2)基質シリンガルダジンでの吸光度の1分間当たりの増加（530 nmの吸光度）の差を計算、すなわち反応速度の差(RRD)＝(d(A234)/dt - d(A530)/dt)を計算することにより試験できる。もしRRDが0より大きければ、問題の酵素は、ここに定義されている様な脂肪酸酸化酵素の資格がある。もしRRDが0または0より小さければ、問題の酵素は、脂肪酸酸化酵素ではない。
特定の具体例において、RRDは1分間当たり少なくとも0.05、0.10、0.15、0.20、または少なくとも0.25吸光度単位である。
【００３１】
例２の方法の特定の具体例において、酵素はよく定義されている。さらにまた、例２の方法に対して酵素用量は、234 nmまたは530 nmでの１分間当たりの吸光度増加が最大になるように調整されている。特定の具体例において、最大の吸光度増加は、1分間当たり0.05〜0.50、0.07〜0.4、0.08〜0.3、0.09〜0.2、または0.10〜0.25吸光度単位の範囲内である。酵素用量は、1 mL当たり0.01〜20、0.05〜15、または0.10〜10 mgの酵素蛋白質である。
あるいは、「脂肪酸酸化酵素」は、シリンガルダジンよりもっと効率的に不飽和脂肪酸を酸化出来る酵素として定義できるであろう。酵素の活性は、基質としてシリンガルダジンまたはリノール酸を含み、pH 6および30℃で、本出願の例1に記述されている様な標準酸素計の設定で比較することが出来る。
【００３２】
特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素は、EC 1.13.1.3またはEC 1.13.11.-と分類されている酵素として定義される。EC 1.13.11.-は、現在49個存在する、それらの亜綱の酵素EC 1.13.11.1-EC 1.13.11.49のいずれか１個を意味する。EC. 1.11.1.3は、指定された脂肪酸ペルオキシダーゼであり、およびEC 1.13.11.-は、2原子の酸素を伴う単一の供与体に働く指定されたオキシゲナーゼである。
【００３３】
さらに特定の具体例において、EC 1.13.11.-酵素は、夫々EC 1.13.11.12、EC 1.13.11.31、EC 1.13.11.33、EC 1.13.11.34、EC 1.13.11.40、EC 1.13.11.44またはEC 1.13.11.45、指定されたリポキシゲナーゼ、アラキドン酸塩12-リポキシゲナーゼ、アラキドン酸塩15-リポキシゲナーゼ、アラキドン酸塩5-リポキシゲナーゼ、アラキドン酸塩8-リポキシゲナーゼ、リノール酸塩ジオール合成酵素、およびリノール酸塩11-リポキシゲナーゼとして分類される。
【００３４】
さらに特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素は、ポリ不飽和脂肪酸、ことにcis,cis-1,4ジエン、たとえば、リノール酸の酸化を触媒し、およびヒドロペルオキシダーゼを作る酵素であるEC 1.13.11.12として分類されるリポキシゲナーゼ（LOX)である。しかし他の基質、たとえばモノ不飽和脂肪酸もまた酸化されるであろう。
【００３５】
微生物のリポキシゲナーゼは、たとえば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サーモアクチノミセス・ブルがリス（Thermoactinomyces vulgaris）、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、フサリウム・プロリフェラツム（Fusarium proliferatum）、サーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）、ピリクラリア・オリゼー（Pyricularia oryzae）、およびゲオトリカム（Geotrichum）の菌株に由来する。ガエウマンノミセス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）に由来するリポキシゲナーゼの調製は、WO 02/20730の例3-4に記述されている。マグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）に由来するリポキシゲナーゼのAspergillus oryzaeでの発現は、特許協力条約PCT/DK02/00251の例2に記述されており、そしての酵素は、たとえばWO 02/20730の例4に記述されている如き標準法を用いて精製できる。
【００３６】
リポキシゲナーゼ（LOX）もまた、植物の種、たとえば、大豆、えんどう豆、ひよこ豆、および隠元豆から抽出される。代わりに、リポキシゲナーゼは、哺乳動物細胞、たとえば、兎の網状赤血球から得られるであろう。
【００３７】
リポキシゲナーゼ活性は、ヒドロペルオキシダーゼの生成を監視することにより、25℃で吸光光度法的に測定されるであろう。標準分析のために、980μLの25  mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0）および10μLの基質溶液（0.2%(v/v)のTween 20で分散した10 mMのリノール酸(長時間保存しないこと)）を含む1 mLの石英セルに10μLの酵素を添加した。酵素は、典型的に最初の1分以内に添加された基質の最大10%のターンオ−バーを保証するに十分な様に希釈した。234 nmの吸収を追跡し、曲線の直線部分から速度を推定した。Cis-trans-共役ヒドロ(ペル)オキシ脂肪酸は、23,000M-1cm-1の分子吸光係数を有すると推測された。
【００３８】
脂肪酸酸化酵素はまた、酵素効果を促進する能力のある酵素に対する基質と共にも適用されるであろう。適切な基質は、大豆油（リノール酸に富む）またはトール油の様な加水分解油である。脂肪酸基質は、脂肪分解酵素により添加油から遊離されるかあるいはクラフトパルプ化または硫酸塩蒸解中に製造されるであろう。
特定の具体例において、基質は1,4-ペンタジエン構造を有する化合物、たとえばcis,cis-1,4-ペンタジエン構造、すなわち構造式にその様な要素を少なくとも1個有する化合物、である。その様な基質の例は、不飽和脂肪酸、たとえば、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびアラキドン酸、また同様に、それらの塩およびエステル、たとえばメチル、およびエチルエステル、である。
【００３９】
さらに特定の具体例において、基質は、リノール酸、リノール酸のメチルまたはエチルエステル、リノレン酸、あるいはリノレン酸のメチルまたはエチルエステル、である。
問題の脂肪酸酸化酵素に対する基質の添加効果を調べるために、以下の方法が使用されるであろう：10 mMのアビエチン酸（0.2%のTween 20に乳化された）のスペクトルを記録する。特徴的なピークが、200 nmおよび250 nm近傍に観察される。最初の実験で、脂肪酸酸化酵素をアビエチン酸乳化液に添加する。第2の実験で、脂肪酸酸化酵素に対する基質もまた添加する。酵素はたとえば上述した如くM. salviniiから誘導したリポキシゲナーゼであり、および基質はたとえばリノール酸である。アビエチン酸の分解を吸光光度法で追跡する。リノール酸をリポキシゲナーゼと共に添加する時には、200 nmおよび250 nm近傍のピークはより早く減少する。
【００４０】
上記方法および本発明のプロセスの特定の具体例において、基質、たとえばリノール酸を、5〜10000 ppm (mg/L)、または10〜9000、10〜8000、25〜7500、30〜7000、50〜6000、50〜5000、50〜4000、75〜3000、80〜2000、90〜1500、100〜1000、150〜800、あるいは200〜700 ppm の量で添加する。例4で、333 ppmのリノール酸もまた脂肪酸酸化酵素と共に使用された。
上記の方法および本発明のプロセスのさらなる特定の具体例において、脂肪酸酸化酵素は、0.005〜50 ppm (mg/L)、または0.01〜40、0.02〜30、0.03〜25、0.04〜20、0.05〜15、0.05〜10、0.05〜5、0.05〜1、0.05〜0.8、0.05〜0.6、あるいは0.1〜0.5 ppmの量で使用される。酵素の量は、良く定義された酵素調製品のmgに関する。
【００４１】
本発明のプロセスにおいて、脂肪酸酸化酵素は、単独でまたは追加の酵素と共に適用されるであろう。術語「追加の酵素」は、少なくとも1個の追加の酵素、たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 個またはそれより多い追加の酵素を意味する。
術語「共に適用される」(または「共に使用される」)は、追加の酵素が本発明のプロセスの同一のまたは他の工程に適用されるであろう事を意味する。他のプロセス工程は、製紙パルプまたはプロセス水が脂肪酸酸化酵素で処理される工程に比較して、製紙プロセスにおける上流または下流であろう。
【００４２】
特定の具体例において、追加の酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、キシナラーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ステリルエステラーゼ、および/またはコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素である。オキシドレダクターゼ酵素の例は、ラッカーゼおよび/またはペルオキシダーゼ活性を有する酵素である。好ましい具体例において、追加の酵素はリパーゼである。
【００４３】
術語「工程」は、少なくとも一つの工程を意味し、1、2、3、4、5またはそれより多いプロセス工程であり得る。換言すれば、本発明の脂肪酸酸化酵素は、少なくとも一つのプロセス工程に適用されるであろうし、そして追加の酵素は、少なくとも一つのプロセス工程にも適用されるであろう。そうしてそれは脂肪酸酸化酵素が使用される工程と比較して、同一または他のプロセス工程であろう。
【００４４】
術語「酵素調製品」は、少なくとも1個の脂肪酸酸化酵素を含む製品を意味する。
酵素調製品はまた、他の酵素活性を有する酵素、好ましくは脂肪分解酵素またはオキシドレダクターゼ活性を有する酵素、最も好ましくは脂肪分解酵素を含むであろう。その酵素活性に加えて、その様な調製品は、好ましくは少なくとも一つの補助剤を含む。紙およびパルプ工業のための酵素調製品に使用される補助剤の例は、緩衝剤、高分子、界面活性剤、および安定剤である。
【００４５】
追加の酵素
プロテアーゼ、リパーゼ、キシナラーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、アミラーゼ、マンナナーゼ、ステリルエステラーゼ、および/またはコレステロールエステラーゼ活性を有する如何なる酵素も、本発明の使用法およびプロセスにおける追加の酵素として使用できる。下記に、その様な追加の酵素の幾つかの非限定的な例を列挙する。大文字で書かれた酵素は、Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkにあるノボザイム（Novozymes A/S）社から商業的に入手できる酵素である。これらのどの追加酵素の活性も、引用参照文献に言及されている方法を含んで、問題の酵素に対して当業界で知られている如何なる方法を用いても分析できる。
【００４６】
クチナーゼの例は、フミコラ・インソレンス（Humicola insolens)（米国特許6.827,719）から誘導されたもの；フサリウム（Fusarium）の菌株、たとえば、フサリウム・ロセウム・クルモルム（F. roseum culmorum）、または特にフサリウム・ソラニ・ピシ（F. solani pisi)(WO 90/09446; WO 94/14964; WO 94/03578)、からの誘導品である。クチナーゼはまた、リゾクトニア（Rhizoctonia）菌株、たとえばリゾクトニア・ソラニ（R. solani、またはアルターナリア（Alternaria）菌株、たとえばアルターナリア・ブラッシシコラ（A. brassicicola)(WO 94/03578)、あるいはWO 00/34450に記述されている様なそれらの変異株から,あるいはWO/ 01/92502誘導されるであろう。
【００４７】
プロテアーゼの例は、ALCALASE、ESPERASE、SAVINASE、NEUTRASE、およびDURAZYMプロテアーゼである。他のプロテアーゼは、ノカルヂオプシス（Nocardiopsis）、アスペルギルス（Aspergillus）、リゾプス（Rhizopus）、バシルス・アルカロフィルス（Bacillus alcalophilus）、バシルス・セレウス（B.cereus）、バシルス・ナット（B. natto）、バシルス・ブルガトウス（B. vulgatus）、バシルス・ミコイデス（B. mycoide）、およびバシルス（Bacillus）からのスブチリシン、特にWO 88/03947に開示されている様なノカルディオプシス・スぺシス（Nocardiopsis sp.）種および（ノカルデヂィイオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ならびにそれらの突然変異体、たとえばWO 91/00345およびEP 415296に開示されている様なもの、からのプロテアーゼである。
【００４８】
アミラーゼの例は、BAN、AQUAZYM、TERMAMYL、およびAQUAZYM Ultraアミラーゼである。リパーゼの例は、RESINAZE A2Xリパーゼである。キシナラーゼの例は、PULPZYME HCヘミセルラーゼである。エンドグルカナーゼの例は、NOVOZYM 613,342および476酵素製品である。
マンナナーゼの例は、Stahlbrandら、J. Biotechol. 29 (1993), 229-242に記述されたトリコデルマ・レーセイ（Trichoderma reesei）エンド-β-マンナナーゼである。
【００４９】
ステリルエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、およびコレステロールエステラーゼの例は、本発明の背景技術の項で言及した参照文献に開示されている。オキシドレダクターゼのさらなる例は、EP 730641、WO 01/98469、EP 719337、EP 765394、EP 767836、EP 763115、およびEP 788647に開示されているペルオキシダーゼおよびラッカーゼである。
【００５０】
本発明の文脈において、オキシドレダクターゼ酵素が、受容体（たとえば酸素または過酸化水素）、エンハンサー、メディエイター、および/またはアクチベーターの存在を必要としたりまたは利益を得たりする時にはいつでも、その様な化合物は含まれるべきと考えるべきである。エンハンサーおよびメディエイターの例は、EP 705327、WO 98/56899、EP 677102、EP781328、およびEP 707637に開示されている。もし望ましければ、問題の酵素およびその受容体の組み合わせならびに任意に問題の酵素に対するエンハンサーおよび/またはメディエイターとしてオキシドレダクターゼ酵素系（たとえば、ラッカーゼまたはペルオキシダーゼ酵素系）を定義することにより区別できる。
【００５１】
本発明の特定の具体例を以下に示す：製紙方法におけるピッチの沈着を減少するための脂肪酸酸化酵素の使用法。製紙方法におけるピッチの減少方法であって、パルプおよび/または工程水を脂肪酸酸化酵素を含む酵素調製品にて処理することを含み、好ましくは、この方法はは、パルプが機械パルプまたは化学パルプあるいはそれらの組み合わせ、たとえば化学パルプであることを特徴とする方法。前記酵素が、EC 1.13.11、好ましくは1.13.11.12、好ましくは該酵素は、マグナポルサセア（Magnaporthaceae）属の菌株、好ましくはマグナポルサセア・サルビニー（M. salvinii）、またはガエウマンノミセス（Gaeumannomyces）属、好ましくはガエウマンノミセス・グラミニス（G. graminis）であることを特徴とする方法。
【００５２】
前記の処理が、酵素のための基質、好ましくはリノール酸を添加することにより実施することを特徴とする前記の方法。前記酵素調製品が、脂肪分解酵素および/またはさらにオキシドレダクターゼを含むことを特徴とする前記の方法。前記処理を、20〜90℃、好ましくは40〜70℃の範囲の温度、および/または2〜11、好ましくは4〜9.5、より好ましくは6〜9の範囲のpHで実施し、そして/または処理を10分から3時間、好ましくは15分から1時間で実施し、そして/または該酵素を、0.0001〜20 mg/g、好ましくは0.0001〜10 mg/g、より好ましくは0.001〜1 mg/g、そして最も好ましくは0.01〜0.1 mg/gの範囲の濃度で添加することを特徴とする方法。上記方法の1具体例において、前記酵素調製品は、製紙機の前の貯蔵箱または混合箱に添加される。
【００５３】
ここに記述されおよび請求されている本発明は、ここに開示された特定の具体例により範囲を限定されるものではない。なぜならこれらの具体例は本発明の幾つかの観点の例示を意図しているものであるからである。どの相当する具体例も、本発明の範囲内にあることを意図される。実際ここに示され、および記述されているものに加えて本発明の種々の変更は、前述の記述から当業者にとり明白である。その様な変更もまた、付け加えた請求の範囲内にあることが意図される。紛争の場合には、定義を含む本発明の開示が支配する。
種々の参照文献がここに引用されているが、それらの開示は全体として参照として取り入れられている。
【実施例】
【００５４】
実施例１. リノール酸に対する脂肪酸酸化酵素活性の測定法
TriOxamatic 300 酸素電極付“Oxi 3000 Oximeter”(WTW社製、Wilheim, Germany)および4 mLの標準反応容積を用いた。
10 mg のリノール酸（10 mLの60％リノール酸）を1 mLのエタノールに溶解し、次に2 μLのTween 20を添加した。この原料基質溶液から50μLを、溶液を良く混ぜるように小さな撹拌棒と共に、3.85 mLの緩衝溶液（Britton-Robinson社製; 100 mM 燐酸、酢酸、および硼酸；pHをNaOHで調整）を含む反応ビーカーに添加した。酸素電極を反応ビーカーに挿入した。
【００５５】
100μLの精製酵素溶液を添加した。すなわち、(a)マグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）由来のリポキシゲナーゼを約0.4 mg/mL濃度で、または(b)ガエウマンノミセス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）由来のリポキシゲナーゼを約0.76 mg/mL濃度で(最終反応で、約0.02 mg/mLを意味する)添加した。これらのリポキシゲナーゼは、前述の如く調製した。温度は、25℃であった。溶解酸素濃度（mg/L）を測定し、時間(分)の関数としてプロットした。酵素活性を、酵素添加後の曲線の直線部分の勾配（mg/L/分）として計算した。基線を、あてはまる時には、減算により修正した。すなわち、もし時間の関数としての酸素濃度を示す曲線が脂肪酸酸化酵素の添加前に約0.05 mg酸素/mL/分以上の勾配を示すならば(すなわち対照)、この値を試料勾配の値から減算した。
【００５６】
【表１】
2005506472.tif 000002
【００５７】
実施例２. 脂肪酸酸化酵素
4種類の酵素、すなわち２種類のラッカーゼおよび２種類リボキシゲナーゼを下記の如く試験した。ポリポルス・ピンシツス（Polyporus pinsitus）由来のラッカーゼは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-Page）による分子量が65 kDa、等電的電気泳動（IEF）によるplが3.5、およびpH 5.5での最適温度が60℃であった。コプリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）由来のラッカーゼは、SDS-Pageによる分子量が67〜68 kDa、IEFによるplが3.5〜3.8、およびpH 7.5での最適温度が65℃であった。酵素を、WO 96/00290および米国特許No. 6,008,029に記述されている如く調製および精製した。２種類のリポキシゲナーゼは、マグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）およびガエウマンノミセス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）に由来し、そして前述した様に調製した。
【００５８】
酵素の用量を、234 nm/530 nmでの1分間当たりの吸光度増加が最大、すなわち1分間当たり0.1〜0.25吸光度単位の範囲になる様に調整した。
基質溶液：11.65 mgのリノール酸（60%、 Sigma社製）、同様に12.5 mLの0.56 mM シリンガルダジン (Sigma社製)エタノール溶液を、全容積を25 mLとなる様に脱イオン水と混合した。
【００５９】
50μLの試験用酵素調製品を、900μLのリン酸塩緩衝液（50μM、pH 7.0）および50μLの基質溶液を入れた石英セルに移した。セルを、温度を23℃に調整した吸光度計に置き、そうして234 nmおよび530 nmでの吸光度を時間の関数として測定した。530 nmでの吸光度は、シリンガルダジンの分解を示し、一方234 nmでの吸光度は、リノール酸の分解を示す。時間の関数としての吸光度の増加を、2から4分までの反応時間を基に、すなわち、d(A234)/dtと、また同様にd(A530)/dtを計算した。
結果を下表2に示す。これら4酵素のうち2つのリポキシゲナーゼのみが、ここに定義した脂肪酸酸化酵素としての資格がある。何故なら、RRD ＝ 反応速度の差 ＝ (dA234/dt-dA530/dt)がこれら2酵素に対してのみ0より大きいからである。
【００６０】
【表２】
2005506472.tif 000003
【００６１】
実施例３. 脂肪酸酸化酵素によるピッチの減少
ピッチモデルを以下の様に調製する：
50%リノール酸60% (Sigma L-1626)
20%アビエチン酸 (Sigma A9424)
20%オレイン酸 (Merck 471)
5%コレステロールリノール酸塩 (Sigma C-0289)
5%オリーブ油 (Sigma O-1500)
65℃で30分間混合した。保存は冷蔵庫内で30日未満とした。
【００６２】
0.1%ピッチ懸濁液の調製
50 mgピッチモデル
1 mLエタノール
1 mL 0.1 M NaOH
48 mL緩衝液（50 mMホウ酸塩、pH 9.0）
室温で10分間混合した。
【００６３】
円形紙片（直径＝5.5-6 mm、マルチコピー用紙  80 g/m2）を、AおよびBと名付けた2個の96孔の微量定量プレート（NUNC社製ID 269620）に移す。2個の別の同様の微量定量プレートCおよびDも、紙片無しで使用する。100μLの0.1%ピッチ懸濁液を、これら4個の各微量定量プレートの各孔に添加する。前述のマグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）由来のリポキシゲナーゼを脂肪酸酸化酵素として使用し、そしてそれを孔内濃度10ppmを得るように微量定量プレートAおよびCの孔に添加する。同様な量の緩衝液（50 mMホウ酸塩、pH9.0）を、微量定量プレートBおよびDの孔に添加する。次に微量定量プレートを振盪（600 rpm）しながら30分間培養する。
【００６４】
30分後、20μLの酵素処理をしたピッチ懸濁液を、各孔に200μLのエタノール（ピッチ成分を溶解する）を入れた微量定量プレートA-Dに対応する、2組目の微量定量プレートに移す（Corning Inc. Costar UV plate 96 well No. 3635）。ピッチの主要成分であるアビエチン酸は、約255nmで強く吸収する。従って、A255は、懸濁液に残留するピッチの量を示す。A255は、8回の同一実験の平均値として測定され、そうして紙に吸着したピッチの量は、（エタノールで11xに希釈後）紙の存在および不存在での培養後に得られたピッチ懸濁液で測定されたA255の変化に基づいて推測される。
【００６５】
結果は、下表３の様に示される。脂肪酸酸化酵素の不在下で紙へのピッチの基本的な（ブラインド）吸着は、D/B比として計算されるであろう。紙に対するピッチの吸着に関して酵素（サンプル）の効果は、C/A比として計算される。酵素がピッチの沈着を減少させたことを示す1方法は、(C/A - D/B)が0より小さいかどうかである。代わりに、酵素効果は((C-A)-(D-B))として計算されるであろう、そうしてもしこの値が0より小さければ、これがピッチの分解に対する酵素効果を示す他の方法であろう。紙以外の他の固体、たとえば金属および線維(Style 4000綿)もまた試験されるであろう。ピッチ沈着の減少を示す上述の方法は、他の固体物質への沈着に関して類推により同様に適用される。
【００６６】
勿論、分析pH(すなわち、緩衝液)、および分析温度は、問題の脂肪酸酸化酵素の特徴を顧慮して選択される。たとえば、4、5、6、7、8、9、10、または11位の分析pH、および10、15、20、25、30、37、40、50、60、70、80、90、または95℃位の分析温度である。
【００６７】
【表３】
2005506472.tif 000004
【００６８】
実施例４. 脂肪酸酸化酵素による紙の漂白
ユウカリ（Eucalyptus grandis）から得た未漂白クラフトパルプを使用した。パルプを、Loretzen and Wettre社製パルプ製造機で、4%濃度で再パルプ化した。再パルプ化は、pH=9.0で緩衝液（Britton-Robinson）中で行った。
【００６９】
Britton-Robinson緩衝液
100 mM燐酸（85%）                 6.28 mL
100 mM酢酸（100%）                5.72 mL
100 mM硼酸                        6.18 g
脱塩水で                          1000 mLにする
pHを水酸化ナトリウムの添加により9.0に調整した。
再パルプ化後、パルプスラリーに緩衝液を添加して1%に希釈し、pHをpH = 9.0に再調整した。
【００７０】
脂肪酸酸化酵素による処理を、3 gの乾燥パルプ、すなわち300 mLパルプスラリーを含むビーカーで実施した。処理を、磁石撹拌棒で500 rpmで撹拌しながら、水浴中で25℃にて実施した。333 ppmのリノール酸を全てのビーカーに添加した。使用した脂肪酸酸化酵素は、前述した如く調製したガウエマンノミセス・グラミニス（Gaeumannomyces graminis）由来の精製リポキシゲナーゼであった。使用した酵素量は、下記の表４および表５に示す。酵素処理を2時間実施した。2個のビーカーを、夫々の条件下で実験した。
2時間後、酵素実験を5 mL（固定量）のNaOH（27.65%溶液）の添加により中止した。この添加により、pHは12より高くなり、酵素は失活する。
【００７１】
ビーカーの内容物を、700 mLの脱イオン水を用いて、1000 mLのビーカーに定量的に移した。このパルプ懸濁液を、濾紙を付けたブーフナー漏斗(直径15 cm)上に注いだ。水を吸引して、紙のシートを形成した。紙シートを漏斗から取り出し、濾紙と分けた。シートを、Lorentzen and Wettre社製のシートプレス機で、圧搾した。シートを、金属板、2枚の吸取紙、2枚の濾紙、シート、2枚の濾紙、2枚の吸取紙、金属板のサンドイッチにして、0.4 MPaで、5.5分間圧搾した。濡れた紙を乾いた紙で交換して、0．4 MPaで2分間圧搾を繰り返した。シートを一晩風乾した。
【００７２】
シートの明るさを、Macbeth Color-Eye 7000反射率計を用いて測定した。明るさを、600 nmで記録した。各シートにつき4回測定した。得られた結果を下記の表４に示す。
パルプの脱リグニン度を示す、Kappa数もまた、Tappi 試験法T236(Tappi Press)に記載された方法で各シートについて測定した。各測定に使用した量は、標準法に記載された量の1/4であった。シートの乾燥物含量を、Kappa数を計算するために測定した。得られた結果を、下記の表5に示す。
【００７３】
【表４】
2005506472.tif 000005
【００７４】
【表５】
2005506472.tif 000006
【００７５】
実施例５. 脂肪酸酸化酵素を用いた古新聞紙の脱インキ
200 g の細断した古新聞を1500 mLの水と共にHobartミキサーに入れた。水浴の温度を45℃に設定した。約0.5-1分間低速で撹拌した。次に、3.6 kg/ton (7 lb/ton)の界面活性剤、および前述の如く調製したマグナポルセ・サルビニー（Magnaporthe salvinii）由来の2 mg (10 mg/tonパルプ)のリポキシゲナーゼをミキサーに添加し、さらに500 mLの水をHobartに追加し、よく混合した。ミキサーを30分間低速で運転した。パルプ機温度を45℃に、pHを7に設定した。
【００７６】
パルプの半量をミキサーから容器に移し、10 Lに希釈した。2分間撹拌した。
原料パッド：30 mLのパルプをミキサーから計量し、水で300 mLに希釈し、良く混合した。パルプを真空下でWattman #40濾紙を通して濾過した。パッドを10分間、90℃（195°F）で乾燥した。
【００７７】
パッドの通常洗浄：900 mLのパルプスラリーを容器から計量し、80メッシュの篩上にゆっくりと注ぎ、全ての遊離水が排出するまでゆっくりと振動した。全てのパルプを取り除いて、1000 mLのビーカーに入れる。ビーカーを900 mL線まで水で満たした。パルプをゆっくりと撹拌した。300 mLのパルプスラリーを計量し、真空下でWattman #40濾紙で濾過した。パッドを10分間、90℃（195°F）で乾燥した。
パッドの明るさは、Tappi標準法（T452）を用いて、Macbeth color eyeにより測定した。
【００７８】
パッドの超洗浄：900 mLのパルプスラリーを容器から計量し、80メッシュの篩上にゆっくりと注ぎ、全ての遊離水が排出するまでゆっくりと振動した。パルプを水道水で3分間洗浄し、取り除いて、1000 mLのビーカーに入れる。ビーカーを900 mL線まで水で満たした。パルプをゆっくりと撹拌した。濾過パッドを作るために、300 mLのパルプスラリーを計量し、Wattman #40濾紙で濾過した。パッドを10分間、90℃（195°F）で、迅速乾燥機で乾燥した。
【００７９】
パッドの明るさは、Tappi標準法（T452）を用いて、Macbeth color eyeにより測定した。
２種類の市販酵素、すなわち、両者共Novozymes A/S社、Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから商業的に入手できる、リパーゼRESINASE A 2X、およびセルラーゼDENIMAX L、を用いた比較実験を上述の如く実施した。これらの酵素調製品を、パルプ1トン当たり0.51 kg(1 lb/t)の量で使用した。
結果を下記の表６に示す。
【００８０】
【表６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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