(57)【要約】  血液流体サンプル中の、ＨＤＬに会合したコレステロールの濃度を測定するための、アッセイデバイスおよび方法が開示される。このアッセイ設計は、サンプルからの非ＨＤＬリポタンパク質の除去、およびサンプル中のＨＤＬコレステロールのアッセイが、このアッセイの妨害なしに行われるようなものである。このデバイスはまた、ＨＤＬアッセイのために使用される試薬による、同じサンプルに対して実施される他のアッセイの妨害を防ぐ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含有する、血液流体サンプル中の、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と会合した血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスであって、該デバイスは、以下：
血液流体サンプルを、マトリックス中のサンプル適用領域から、該マトリックス中の１つ以上のサンプル収集領域へと分配するために効果的な、サンプル分配マトリックス、
該サンプル分配マトリックスから間隔を空けた、ＨＤＬアッセイ要素であって、該ＨＤＬアッセイ要素において、ＨＤＬ濃度がアッセイされ得る、ＨＤＬアッセイ要素、
該ＨＤＬアッセイ要素と該サンプル分配マトリックスとの間に配置され、そして該マトリックスから間隔を空けた、試薬パッドであって、該試薬パッドは、該流体サンプルから、非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に除去するために有効な試薬を含む、試薬パッド、ならびに
設置手段であって：
（ａ）該ＨＤＬアッセイ要素および試薬パッドが該マトリックスから間隔を空けている、サンプル分配位置に、該デバイスを維持するため、ならびに
（ｂ）該ＨＤＬアッセイ要素が、該試薬パッドと接触して配置または維持され、そして該試薬パッドが、該接触と同時にかまたは該接触に引き続いて、該マトリックスに接触される、試験位置に、該デバイスを移動させるため、
に効果的な、設置手段、
を備える、アッセイデバイス。
【請求項２】
前記ＨＤＬアッセイ要素の下部表面が、前記試薬パッドの上部表面に取り付けられている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
カセット本体をさらに備え、該カセット本体に、前記サンプル分配マトリックスが取り付けられる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
反応棒をさらに備え、該反応棒に、前記ＨＤＬアッセイ要素が取り付けられている、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記取り付け手段が、前記反応棒を前記カセット本体に取り付けるため、および該反応棒およびカセット本体の相対位置を、前記サンプル分配位置と前記試験位置との間で調節するために効果的である、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
前記カセット本体が、前記血液流体サンプルを収容するための壁、および細胞血液成分を該血液流体サンプルから取り出すためのふるいパッドさらに備え、該ふるいパッドは、前記サンプル適用領域と流体連絡している、請求項３に記載のデバイス。
【請求項７】
前記反応棒に取り付けられた、さらなるアッセイ要素をさらに備え、その結果、前記デバイスが前記試験位置に移動される場合に、前記パッドが前記サンプル収集領域に接触される、請求項４に記載のデバイス。
【請求項８】
前記設置手段が、さらに、
（ｃ）前記試験位置から、前記ＨＤＬアッセイ要素および試薬パッドが前記マトリックスから間隔を空ける位置へと、前記デバイスを移動させるため、
に効果的である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
前記反応棒が、光学的に透明であるか、または窓を備え、それを通して、前記アッセイ要素が見える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記試薬が、スルホン化多糖類を含有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記試薬パッドが、前記流体サンプルに可溶性の形態の前記試薬を含浸されており、そして該試薬は、該試薬パッド内で沈殿した非ＨＤＬリポタンパク質を捕捉するために効果的な物質である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記試薬が、前記試薬パッドに固定されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記ＨＤＬアッセイ要素が、試薬を含み、該試薬は、ＨＤＬに会合したコレステロールの存在下で、光学的に検出され得るアッセイ要素の変化を生じる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記ＨＤＬアッセイ要素が、バイオセンサを備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記バイオセンサが、前記要素におけるＨＤＬ会合コレステロールの濃度に依存する、酸素または過酸化水素の生成を測定するために効果的である、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記試薬パッドが、多孔性ポリマー膜を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記試薬パッドが、非対称ポリマー膜であり、より小さい穿孔の表面、および反対側の、より大きい穿孔の表面を有する、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記膜が、そのより小さい穿孔の表面が前記ＨＤＬアッセイ要素に面するように配向されている、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記ＨＤＬアッセイ要素および前記試薬パッドの各々が、非対称ポリマー膜であり、そして前記膜が、該試薬パッドのより小さい穿孔の表面が該ＨＤＬアッセイ要素のより大きい穿孔の表面と接触するよう積層されている、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２０】
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含有する血液流体サンプル中の、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と会合した血清コレステロールを測定する方法であって、以下の工程：
（ａ）該サンプルを、吸収性サンプル分配マトリックスと接触させる工程であって、該マトリックスを通して、該サンプルが、１つ以上のサンプル収集部位に分配される、工程；
（ｂ）該サンプル収集部位と、試薬パッドの第一の表面とを接触させる工程であって、該表面に、該サンプルが移動され、該表面が、非ＨＤＬリポタンパク質を該流体サンプルから選択的に除去するために効果的な試薬を含有する、工程であって、
該試薬パッドの反対側の表面が、同時に、ＨＤＬアッセイ要素と接触し、該ＨＤＬアッセイ要素は、ＨＤＬコレステロール濃度の指標を生じるために効果的なアッセイ試薬を含み、その結果、連続的なサンプル体積が、該試薬パッドから該ＨＤＬアッセイ要素へと進行する、工程、および
（ｃ）該ＨＤＬアッセイ要素における検出によって、該サンプル中のＨＤＬコレステロールのレベルを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
所望の量のサンプルが移動された場合に、前記サンプル収集部位と前記試薬パッドの前記第一の表面との間の前記接触を破壊する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試薬パッドが、前記試薬で含浸されており、該試薬が、前記流体サンプル中に可溶性の形態であり、そして前記試薬パッド内で、沈殿した非ＨＤＬリポタンパク質を捕捉するために効果的な物質である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に除去するために効果的な前記試薬が、前記試薬パッドに固定されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記試薬パッドが、非対称ポリマー膜を備え、該ポリマー膜が、より小さい穿孔の表面および反対側のより大きな穿孔の表面を備える、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記膜が、前記より小さい穿孔の表面が前記ＨＤＬアッセイ要素に面するように配向されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＤＬアッセイ要素が、バイオセンサを備える、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記バイオセンサが、前記要素内のＨＤＬ会合コレステロール濃度に依存する酸素または過酸化水素の生成を測定するために効果的である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＨＤＬアッセイ要素および前記試薬パッドの各々が、非対称ポリマー膜であり、そして該膜が、前記試薬パッドの前記より小さい穿孔の表面が、該ＨＤＬアッセイ要素のより大きな穿孔の表面と接触するように積層される、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、血液流体サンプル中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に会合したコレステロールの濃度を決定するための方法、およびこの方法を実施するための診断アッセイデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血液中に存在するコレステロールの量は、冠状動脈疾患の危険性に関連することが公知である。コレステロールは、主として、タンパク質に結合した形態で、血液中を循環する。コレステロールを輸送するタンパク質は、リポタンパク質であり、これらは、それらの密度に基づいて、３つのクラスに細分される。超低密度リポタンパク質（ＬＶＤＬ）は、トリグリセリドリッチなリポタンパク質であり、これらは、肝臓において合成され、そして最終的に、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に転換され、これは、ヒトにおいて、大部分の血漿コレステロールを輸送する。高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、トリグリセリドリッチなリポタンパク質の異化作用、ならびに抹消組織からのコレステロールの除去および肝臓への輸送に関与する、リポタンパク質である。血清ＨＤＬレベルと冠状疾患の危険性との間の逆の関係が、確立されている。具体的には、ＨＤＬと会合した血清コレステロールの割合が低い場合、冠状疾患の危険性が増加する。
【０００３】
アテローム生成疾患の危険の評価および管理における、相対血清コレステロールレベルの重要性の観点から、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ならびに全コレステロールおよびトリグリセリドの血清レベルについて、正常な個体と危険性の高い個体との両方の大きな集団のスクリーニングに、かなりの努力が費やされている。高い危険性の個体の処置の有効性は、種々のリポタンパク質区画におけるコレステロールの血清レベルの規則的な試験によって、モニタリングされている。
【０００４】
特定のＨＤＬコレステロール試験のための１つの方法は、ポリアニオン性化合物（例えば、硫酸デキストラン、ヘパリン、およびリンタングステン酸塩）による、第ＩＩ群カチオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣａ２＋）の存在下での、血清中での非ＨＤＬリポタンパク質の選択的沈殿に基づく。沈殿の特異性および程度は、種々の要因（ポリアニオン／金属試薬の型および濃度が挙げられる）に依存する。一般に、血清コレステロール粒子の沈殿の順番は、ポリアニオンの濃度の増加とともに、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、そしてＨＤＬである。ＨＤＬは、通常、ヘパリンまたは硫酸デキストランが完全に低密度粒子を沈殿させる濃度において、可溶性のままであるが、ＨＤＬの少量のａｐｏＥ種は、低密度粒子と共沈し得る。低密度粒子の選択的沈殿によって、ＨＤＬ血清コレステロールレベルが決定され得る。
【０００５】
代表的な脂質アッセイ手順において、小体積の血液が引き抜かれ、そして遠心分離されて、透明な血漿または血清のサンプル流体を生じる。次いで、このサンプル流体が、以下を決定するために、いくつかのアッセイ管内にアリコートされる：（ａ）全血清コレステロール、（ｂ）トリグリセリド、および（ｃ）ＨＤＬコレステロール。ＨＤＬサンプルは、上記のように沈殿し、そして低密度粒子は、コレステロール検出の前に、濾過または遠心分離によって除去される。次いで、このサンプルは、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ならびにＨ２Ｏ２の存在下で異なって着色され得る生成物に酸化される色素を含有する酵素混合物と反応される。この管は、分光光度法により読み取られ得、そして所望の合計のＨＤＬコレステロール値およびＬＤＬコレステロール値が決定され得る。
【０００６】
記載されたばかりの液相コレステロールアッセイを用いて達成され得る正確さおよび信頼性にもかかわらず、このアッセイは、広範なスクリーニングにおける使用に対して、多数の限定を有する。第一に、この方法は、静脈血サンプルを使用し、このことは、血液サンプルを引き抜き、そして分画し、そして処理された血液を個々のアッセイ管にアリコートするために、熟練した技術者を必要とする。少なくとも１つのサンプル管（ＨＤＬ決定について）は、沈殿剤で処理されなければならず、そして沈殿した物質を除去するために、さらに処理されなければならない。これらの手順のうちのいくつかは自動化され得るが、この目的で設計される分析機械は高価であり、そして大病院以外では広範には利用可能ではない。
【０００７】
共有に係る米国特許第５，２１３，９６４号、同第５，２１３，９６５号、同第５，３１６，１９６号、および同第５，４５１，３７０号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）は、血清コレステロールレベルを測定するための液体アッセイ手順に付随する、上記問題の多くを実質的に克服する、方法およびアッセイデバイスを開示する。１つの実施形態において、このデバイスは、ＬＤＬ粒子およびＶＬＤＬ粒子もまた含有する血液サンプル中の、ＨＤＬ会合コレステロールの濃度を測定するために設計される。このデバイスは、流体サンプルがマトリックスを通過するにつれて、可溶性リポタンパク質と沈殿したリポタンパク質とを分離し得る、ふるい分けマトリックスを備える。このマトリックスに付随するレザバは、流体サンプルがマトリックス中に引き込まれ、そしてこのマトリックスを通過するにつれて、選択的にＬＤＬおよびＶＬＤＬを沈殿させるために、沈殿剤を放出するように設計される。このことは、ふるい分けマトリックスを通してのＨＤＬのより速い移動に基づいて、沈殿したリポタンパク質からのＨＤＬの分離を可能にする。非ＨＤＬリポタンパク質をこのように消耗された流体サンプルは、次いで、試験表面に移動し、ここで、このサンプルは、コレステロールについてアッセイされる。
【０００８】
非ＨＤＬ血液リポタンパク質を選択的に沈殿させる際に使用された試薬を含む血液を処理することは、コーティングされていないガラス繊維への、サンプル中に存在するＨＤＬの一部の結合を生じ、そして濾過または輸送の間のガラス繊維へのＨＤＬのこのような結合は、しばしば、見かけ上低いＨＤＬコレステロール値を生じることが見出された。この問題は、共有にかかる米国特許第５，４５１，３７０号において、濾過されたサンプルを沈殿／ふるい分けおよび輸送するために使用されるマトリックスにおけるガラス繊維を、親水性ポリマーまたはシリル化剤でコーティングすることによって、取り組まれた。
【０００９】
ＨＤＬの損失を最小にするためのこのようなコーティングに対する必要性に加えて、上記デバイスはまた、沈殿剤でのフロー輸送経路の汚染の可能性を提示する。このような試薬は、マルチアッセイデバイスの他の領域で起こる、他のアッセイ化学を妨害し得る。本発明は、これらの問題に取り組み、そして克服する。
【００１０】
血液サンプル中のＨＤＬコレステロールを測定するためのさらなる方法およびデバイスは、ＥＰ  ０４０８２２３およびＥＰ  ０４１５２９８（Ｒｉｔｔｅｒｓｄｏｒｆら）に開示されており、これらは、以下の工程および対応する要素を備える試験ストリップ上で実施される、連続アッセイ方法を記載する。
【００１１】
血液サンプルが、細胞性血液成分を分離するための分離層に適用される。毛管力または重力によって駆動されて、このサンプルは、可溶性沈殿剤を含有するさらなるキャリアを通って流れ、この沈殿剤は、血清サンプル中に溶解した後に、サンプル中に含まれる非ＨＤＬリポタンパク質を沈殿させる。
【００１２】
さらなるキャリアにおいて、上記沈殿した成分は、血清サンプルから濾過されて、後のＨＤＬ定量を妨害することを防止する。同じキャリア内で、サンプルは、ＨＤＬ定量キャリアに隣接する位置に輸送され、そしてＨＤＬ定量工程が開始されるまで貯蔵される。最後に、このサンプルは、ＨＤＬ定量層に輸送され、ここで、血清サンプル中のＨＤＬコレステロールが、酵素反応によって定量される。
【００１３】
ＨＤＬ定量の正確さに影響を与え得る、このアッセイ設計の欠点は、レザバとして機能するキャリアが、サンプル中への沈殿成分の移動を可能にすることであり、これは、ＨＤＬの定量を妨害する。さらに、血清サンプルの貯蔵の間に、ＨＤＬは、接着によって、キャリア繊維にトラップされ得、沈殿剤は、さらなる望まれない反応を起こし得、そしてキャリアは、血清サンプルが乾燥するにつれて、詰まり得る。
【００１４】
米国特許第５，１３５，７１６号（Ｔｈａｋｏｒｅ）は、血液流体サンプル中のＨＤＬの定量のための、さらなるデバイスおよび方法を開示する。これらのデバイスにおいて、流体サンプルは、連続的に、破壊されない経路を通って、入口ウェルから、ＨＤＬ定量のためのキャリアへと流れる。従って、コントロールサンプルの体積がＨＤＬ試験キャリアに入る能力、およびＨＤＬアッセイのための環境条件を制御する能力が、制限される。このデバイスもまた、単一の流体サンプルからの種々の分析物の同時のアッセイを提供しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、本発明の目的は、上記先行技術の欠点を克服する、ＨＤＬアッセイのデバイスおよび方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および／または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含有する血液流体サンプル中の、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に会合した血清コレステロールを測定するためのアッセイデバイスを提供し、このデバイスは、以下を備える：
血液流体サンプルを、マトリックス中のサンプル適用領域から、該マトリックス中の１つ以上のサンプル収集領域へと分配するために効果的な、サンプル分配マトリックス、
サンプル分配マトリックスから間隔を空けた、ＨＤＬアッセイ要素であって、このＨＤＬアッセイ要素において、ＨＤＬ濃度がアッセイされ得る、ＨＤＬアッセイ要素、
ＨＤＬアッセイ要素とサンプル分配マトリックスとの間に配置され、そしてマトリックスから間隔を空けた、試薬パッドであって、この試薬パッドは、流体サンプルから、非ＨＤＬリポタンパク質を選択的に除去するために有効な試薬を含む、試薬パッド、ならびに
設置手段であって：（ａ）ＨＤＬアッセイ要素および試薬パッドがマトリックスから間隔を空けている、サンプル分配位置に、デバイスを維持するため、ならびに（ｂ）ＨＤＬアッセイ要素が、試薬パッドと接触して配置または維持され、そして試薬パッドが、この接触と同時にかまたはこの接触に引き続いて、マトリックスに接触される、試験位置に、デバイスを移動させるために効果的な、設置手段、を備える。好ましい実施形態において、設置手段は、さらに、（ｃ）試験位置から、ＨＤＬアッセイ要素および試薬パッドがマトリックスから間隔を空ける位置へと、デバイスを移動させるために効果的である。
【００１７】
好ましくは、ＨＤＬアッセイ要素の下部表面は、試薬パッドの上部表面に取り付けられ、その結果、これら２つの層は、永久的に接触する。
【００１８】
１つの実施形態において、このデバイスは、カセット本体および反応棒をさらに備え、このカセット本体に、サンプル分配マトリックスが取り付けられ、そしてこの反応棒に、ＨＤＬアッセイ要素が取り付けられる。設置手段は、反応棒をカセット本体に取り付けるために効果的であり、そして上記のように、反応棒とカセット本体との相対位置を、サンプル分配位置と試験位置との間で調節するために効果的である。代表的に、カセット本体は、血液流体サンプルを収容するためのウェル、およびこの血液流体サンプルから細胞性血液成分を除去するためのふるい分けパッドをさらに備え、このふるい分けパッドは、サンプル適用領域と流体連絡しており、その結果、流体が、ウェルからふるい分けパッドを通り、そしてサンプルマトリックスへと通過する。
【００１９】
ＨＤＬアッセイ要素は、代表的に、試薬を備え、この試薬は、ＨＤＬコレステロールの存在下で、光学的に検出され得る、アッセイ要素の変化を生じる。単一のサンプルに対して複数の分析物の同時のアッセイを実施する際に使用するために、このデバイスは、好ましくは、反応棒に取り付けられたさらなるアッセイ要素を備え、その結果、デバイスが試験位置に移動される場合に、これらの要素は、サンプル収集領域に接触される。好ましくは、反応棒は、光学的に透明であるか、または窓を備え、これを通して、アッセイ要素が見える。
【００２０】
別の実施形態において、ＨＤＬアッセイ要素は、バイオセンサを備える。好ましくは、このバイオセンサは、酸素または過酸化水素の生成（これは次に、サンプル流体中のＨＤＬ会合コレステロールの濃度に依存する）を、電気化学的に測定するために効果的である。さらなるアッセイ要素もまた、バイオセンサを構成し得、酸素または過酸化水素の生成を電気化学的に測定するために効果的であり、これは次に、サンプル流体中の分析物濃度に依存する。
【００２１】
別の局面において、本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および／または超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）もまた含有する血液流体サンプル中の、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と会合した血清コレステロールを測定する方法を提供する。この方法は、以下の操作を包含する：
（ａ）サンプルを、吸収性サンプル分配マトリックスと接触させる工程であって、このマトリックスを通して、該サンプルが、１つ以上のサンプル収集部位に分配される、工程；
（ｂ）このようなサンプル収集部位と、試薬パッドの第一の表面とを接触させる工程であって、この表面に、サンプル流体が移動され、この表面が、非ＨＤＬリポタンパク質を該流体サンプルから選択的に除去するために効果的な試薬を含有する、工程であって、
試薬パッドの反対側の表面が、同時に、ＨＤＬアッセイ要素と接触し、このＨＤＬアッセイ要素は、ＨＤＬコレステロール濃度の指標を生じるために効果的なアッセイ試薬を含み、その結果、連続的なサンプル体積が、試薬パッドからＨＤＬアッセイ要素へと進行する、工程、および
（ｃ）ＨＤＬアッセイ要素における検出によって、サンプル中のＨＤＬコレステロールのレベルを決定する工程。
【００２２】
血液流体サンプルは、一般に、例えば、サンプル分配マトリックスの上流のふるい分けマトリックスを介して濾過されて、細胞性の血液成分を除去される。上記工程（ｂ）は、上記のように、サンプル分配位置から試験位置へと、デバイスを調節する工程を包含する。好ましくは、この方法はまた、所望の量のサンプル流体が輸送された場合に、サンプル収集部位と、試薬パッドの第一の表面との間の接触を破壊する工程をさらに包含する。従って、流体接触は、サンプルマトリックスと、ＨＤＬアッセイ要素に接続された試薬パッドとの間で、選択的に確立される。上記測定によって、効果的なサンプル分配および体積制御が実現され、そして対応するパッド／試験要素のサンプルの過剰充填が防止される。
【００２３】
非ＨＤＬリポタンパク質を流体サンプルから、結合または沈澱によって選択的に除去するために効果的な試薬としては、例えば、硫酸化多糖類（例えば、硫酸デキストラン）が挙げられ得る。１つの実施形態において、試薬パッドは、流体サンプルに可溶性の形態であり、かつ非ＨＤＬリポタンパク質を試薬パッド内に捕捉するために効果的な物質である、試薬で含浸される。別の実施形態において、この試薬は、試薬パッドに固定され、そして非ＨＤＬリポタンパク質は、固定された試薬への結合によって、サンプルから除去される。
【００２４】
好ましい実施形態において、試薬パッドは、多孔性のポリマー膜を備える。より小さい穿孔の表面および反対側のより大きい穿孔の表面を有する、非対称ポリマー膜であり得る。この場合、好ましくは、この膜は、より小さい穿孔の表面がＨＤＬアッセイ要素に面するように配向される。
【００２５】
ＨＤＬアッセイ要素はまた、多孔性ポリマー膜（例えば、非対称ポリマー膜）であり得、好ましくは、より大きい穿孔の表面が、試薬パッドに面するように配向される。１つの実施形態において、ＨＤＬアッセイ要素および試薬パッドの各々が、非対称ポリマー膜であり、そしてこれらの膜は、試薬パッドのより小さい穿孔の表面が、ＨＤＬアッセイ要素のより大きい穿孔の表面と接触するように、積層される。
【００２６】
別の実施形態において、ＨＤＬアッセイ要素および／または他のアッセイ要素は、上記のように、バイオセンサを備える。
【００２７】
本発明は、上記先行技術より優れた、いくつかの利点を提供する。例えば、沈澱剤または結合試薬を含む試薬パッドがサンプル流体に接触する場合、これは、ＨＤＬアッセイ要素との直接的な接触であり、従って、ＨＤＬアッセイ反応の前の、これらの試薬との血液サンプルの一時的な接触を制限する。
【００２８】
所望であれば、試験方法はまた、必要とされる環境条件に合うように、適合され得る。従って、サンプルの適用および細胞性成分の除去の後であるが結合試薬または沈澱剤との接触の前の所望の時間にわたって、アッセイが停止されて、例えば、周囲の大気を調節し得るか、または試験を支持するための環境温度を適合させ得る。このことは、このデバイスを、サンプル分配位置に維持することによって、達成される。この目的で、サンプル分配マトリックスは、必要であれば、レザバとしてさらに働くように設計される。
【００２９】
本発明の方法において、サンプルの調製およびＨＤＬの評価は、別個の工程で実施される。サンプルの調製は、例えば、細胞性血液成分の濾過、ならびに必要に応じて、血液サンプルの一時的な保存および試験の要件または条件（例えば、温度、圧力および環境の大気）への血液サンプルの適合を包含する。ＨＤＬを評価する工程は、非ＨＤＬ成分の時間効果的な除去、および信頼性のあるＨＤＬ定量を包含する。この測定によって、血液サンプルの、異なる試薬との一時的な接触が減少され、そしてＨＤＬ評価を妨害する任意の化学物質が、防止される。さらに、血液サンプルは、小さい穿孔のキャリア内に広範には貯蔵されない。なぜなら、ＨＤＬ評価工程は、短時間で実施されるからである。
【００３０】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明が、添付の図面と組み合わせて読まれる場合に、より完全に明らかになる。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の用語は、他に示されない限り、以下の意味を有する。
【００３２】
流体が１つの要素から他の要素へと、毛管作用および／または重力を介して移動し得る場合、この要素は、別の要素と「流体連絡」している。これらの要素は、直接接触し得るが、必ずしも直接接触する必要はない；すなわち、この流体が通過し得る他の要素が介在し得る。流体が、１つの要素から他の要素へと、毛管作用および／または重力を介して移動し得ない場合、この要素は、別の要素と「流体連絡していない」。代表的に、これらの要素は、物理的に分離している。すなわち、間隔を空けている。
【００３３】
「パッド」（例えば、反応剤パッドまたはアッセイパッド）とは、本明細書中において使用される場合、含浸されたかまたは固定された試薬を含み得、そして流体が毛管作用および／または重力を介して移動し得る、任意の材料（例えば、多孔性膜または繊維性ストリップ）を包含し得る。
【００３４】
（ＩＩ．アッセイデバイス）
図１および２は、本発明に従って構築された、多分析物アッセイデバイス１４の２つの実施形態を示し、図２は、分解図で示されている。このデバイスは、小体積の血液サンプル（代表的に、１０〜５０μｌの間の血液）を使用して、ＨＤＬと会合した血清コレステロール（ＨＤＬ会合コレステロールとも、単にＨＤＬコレステロールとも称される）を決定するために、特に設計されている。他のアッセイ（例えば、全コレステロールレベルまたトリグリセリドレベル）が、同じサンプルから同時に決定され得る。ＨＤＬ会合コレステロールの決定はまた、単に、ＨＤＬの決定またはＨＤＬアッセイと称され得る。
【００３５】
この装置は、主要本体または支持体１５を備え、これは、ある量の血液サンプル（代表的に、約２５〜５０μｌの間）を受容するような寸法および大きさにされた、ウェル１６を規定する。このウェルは、ふるい分けパッド２２と流体接触しており、このふるい分けパッドは、支持体の上端に形成された切欠き領域２０に備えられ得る。この流体接触は、直接であり得るか、または図１に示されるデバイスにおいてのように、ウェルの基部においてプレート内に形成されたキャピラリー導管１８によって提供され得る。この支持体は、好ましくは、ウェル、切欠き領域、および／またはキャピラリーが標準的な成型方法または機械加工方法によって形成された、プラスチックプレートである。
【００３６】
領域２０に備えられるふるい分けパッド２２は、サンプルが、図に示されるように下から上への方向でパッドマトリックスを通って移動するにつれて、大きい粒子物質（血液細胞を含む）を部分的に除去するように機能する。パッド２２は、好ましくは、表面のぬれによって水性流体を引くように、そして血液サンプルがマトリックスを通して引かれるにつれて血液細胞の移動を遅れさせるように設計された材料の、ガラス繊維マトリックスから形成される。すなわち、このパッドは、細胞の大きさの粒子を、媒体を通る異なる移動速度に基づいて、可溶性血清成分から分離するための、クロマトグラフィー媒体として働く。１つの例示的なパッドは、約０．１６ｇ／ｃｍ３の充填密度を有するガラス繊維フィルタ（例えば、Ｗｈａｔｍａｎによって供給されるＧＦ／ＤまたはＰＤ００８フィルタ）である。このパッドは、辺の寸法約３×８ｍｍおよび約１ｍｍの厚さの寸法に切断される。このパッドは、規定された体積のサンプル流体（好ましくは、約１５〜２５μｌの間）を吸収するような寸法にされる。ふるい分けパッド２２は、赤血球捕捉試薬（例えば、レクチン、赤血球表面膜タンパク質に特異的な抗体、トロンビン、またはイオン交換薬剤）をさらに含み得る。
【００３７】
ふるい分けパッド２２は、次に、プレート１５の上端に沿って延びる、細長ストリップまたはサンプル分配マトリックス２６に接触する。このストリップはまた、図２に示されるように、発泡体クッション２７または他の支持体によって支持され得る。マトリックス２６は、ストリップの中心サンプル適用領域２８（これは、パッド２２と流体接触している）から反対側のサンプル収集領域３０、３２（マトリックスの端部に隣接する）へとサンプル流体を分配するように働く。このマトリックスは、好ましくは、ガラス繊維から形成される。このマトリックスの充填密度および厚さは、ストリップのサンプル適用領域へ、ストリップのサンプル収集領域へと供給される体積のサンプル流体（例えば、１０〜２５μｌ）を吸収し、そして分配するようなものである。マトリックスは、約０．１６ｇ／ｃｍ３と４．０ｇ／ｃｍ３との間の、好ましい充填密度を有する。１つの例示的なストリップ材料は、Ｗｈａｔｍａｎから入手可能なＦ−１６５−２５Ａガラス繊維フィルタであり、これは、約０．２ｇ／ｃｍ３の充填密度および約０．１２ｍｍの厚さを有する。
【００３８】
サンプルは、沈澱剤または結合試薬の存在下で、ふるい分けパッドおよびサンプル分配マトリックスのために使用されるガラス繊維と接触しないので、ＨＤＬの接着を防止するための、米国特許第５，４５１，３７０号に記載されるようなコーティングは必要とされない。しかし、所望であれば、ガラス繊維は、例えば、５重量％ポリビニルアルコールでコーティングされ得る。
【００３９】
デバイス１４はまた、細長支持体６２から構成される反応棒６０、ならびにこの支持体の下部表面に、示される位置で備えられる複数の湿潤可能アッセイ要素６４、６６、６８および７０を備える。支持体６２は、好ましくは、透明であるか、または窓（例えば、窓７６（図２））を有し、これは、支持体における単なる開口部であり得、これは、支持体を通してパッドが見えることを可能にする。反応棒におけるアッセイ要素は、透明または半透明な接着材料によって、あるいは超音波溶接または他の適切な結合方法によって、支持体に取り付けられ得る。特定のアッセイにおいて使用される各パッドは、以下にさらに記載されるように、パッドにおいて、光学的に（目視によりまたは検出器により、あるいはバイオセンサを介して）検出され得る分析物依存性の変化を生じるために効果的な、分析物依存性試薬を含む。パッドの全てまたは任意の一体的なサブセットが、特定のアッセイにおいて使用され得る。
【００４０】
望ましくは、アッセイ要素は、多孔性ポリマー膜であり、好ましくは、約１００〜１５０μｍの厚さおよび約３ｍｍの辺の寸法を有する。各要素の吸収体積は、好ましくは、約０．５〜１．０μｌである。１つの実施形態において、アッセイ要素、および特に、ＨＤＬアッセイにおいて使用されるアッセイ要素は、非対称膜である；すなっわち、以下にさらに記載されるように、膜の厚さにわたって空隙率勾配を有する膜である。このアッセイ要素はまた、以下に記載されるように、バイオセンサを含み得る。
【００４１】
反応棒は、設置手段によって、支持体１５上に設置される。この設置手段は、（ａ）このデバイスを、サンプル分配位置（ここで、アッセイ要素および試薬パッドは、マトリックスから間隔を空けている）に維持するため、および（ｂ）このデバイスを、試験位置（ここで、ＨＤＬアッセイ要素が、試薬パッドと接触して配置され（るか、またはこれらの２つのパッドが一緒に付着される場合は、維持され）、そして試薬パッドは、同時にかまたは引き続いて、サンプル収集部位においてマトリックス２６と接触される）に輸送するために、効果的である。設置手段はまた、所望の量のサンプルがアッセイ要素に入った後に、および／または接触時間を決定した後に、デバイスを試験位置から、アッセイ要素および試薬パッドがマトリックスから間隔を空ける位置（これは、「サンプル分配位置」と同じである）へと移動させることによって、このような接触を破壊するために使用され得る。このような移動は、共有に係る米国特許第５，１１４，３５０号に記載されるように、アッセイ要素の頂部表面における反射率（これは、ぬれの程度を反映する）をモニタリングすることによって制御され得る。あるいは、湿潤可能材料の吸収能力およびサンプル取り込みの速度が既知である場合、サンプルの量は、予め決定された接触時間を単に使用することによって、十分な正確さで制御され得る。
【００４２】
設置手段は、例えば、一対の弾性部材（例えば、エラストマーブロック７１、７２）を備え得、これらは、非移動位置またはサンプル分配一の方へとパッドを偏倚するように働き、ここで、これらのパッドは、サンプル分配マトリックスから間隔を空け、この間隔は、代表的に、約０．５〜１．０ｍｍの間である。弾性部材の圧縮または解放によって、サンプル分配マトリックス２６と試薬パッド７４とＨＤＬアッセイ要素６４との間の接触が、選択的に確立および分離され得る。支持ブロックは、ばねまたはピストン様の作用によって、圧縮され得る。あるいは、外部機械的デバイスが、主要本体１５および／または支持体６２を係合し得、そして互いの方へと移動させ得る。このようなデバイスとしては、従来の構成要素（例えば、クランプ、ピストン、ステッパモータ、ウォームギアなど）が挙げられる。例示的なシステムは、Ｃｈｏｌｅｓｔｅｃｈ  ＬＤＸ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒであり、これは、本明細書中に記載されるようなアッセイデバイスと共に使用するために有利な、独立式の自動分析器である。
【００４３】
好ましい実施形態において、ＨＤＬをアッセイするために使用されるアッセイ要素の少なくとも１つには、図に示されるように、試薬パッド７４が取り付けられている。あるいは、このような試薬パッド７４は、ＨＤＬアッセイ要素（これとは接触しても接触しなくてもよい）とマトリックス２６のサンプル収集領域との間で実質的に同一平面の位置に支持され得る。例えば、圧縮可能な支持要素は、試薬パッドをマトリックスの上で支持し得、その結果、反応棒の主要本体の方への移動（またはその逆）が、まずアッセイ要素６４を試薬パッド７４の上表面と接触させ、次いで、試薬パッドの下表面をサンプル分配マトリックスと接触させる。試薬パッドは、好ましくは、約１００〜１５０μｍの厚さ、約３ｍｍの変寸法、および約０．５〜１．０μｌの吸収体積を有する。
【００４４】
試薬パッド７４（好ましくは、ＨＤＬ測定のために使用される選択されたアッセイ要素（例えば、図におけるアッセイ要素６４）と接触する）は、液体サンプルからＬＤＬ粒子またはＶＬＤＬ粒子を選択的の除去するために使用される試薬を含む。このような試薬は、沈澱剤として当該分野において公知である；例えば、ＰＳ  Ｂａｃｈｏｒｉｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７８−１００（１９８６）による概説を参照のこと。これらは、第ＩＩ群カチオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣａ２＋）の存在下で、ポリアニオン性化合物（例えば、スルホン化多糖類、ヘパリン、またはリンタングステン酸塩）を含む。好ましい試薬は、酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムと組み合わせられ、中性ｐＨを維持するように緩衝された、スルホン化多糖類（例えば、５０，０００〜５００，０００ダルトンの代表的な分子量を有する硫酸デキストラン）である。
【００４５】
試薬パッドは、結合したかまたは沈澱した非ＨＤＬリポタンパク質を、試薬パッド内に捕捉し、そしてこれらがＨＤＬアッセイ要素６４に入ることを防止するために、効果的である。ガラス繊維フィルタが、このような目的で使用され得るが、このようなガラス繊維は、上記で引用された米国特許第５，４５１，３７０号に記載されるように、試薬の存在下でＨＤＬの結合を防止するために、コーティングされるべきである。好ましい実施形態において、試薬パッド７４は、以下にさらに記載されるように、多孔性ポリマー膜から構成される。
【００４６】
試薬パッドは、上記のように、非ＨＤＬリポタンパク質の選択的除去のための試薬を含む。１つの実施形態において、膜は、このような試薬を含浸される。例えば、以下に記載されるようなポリスルホン非対称膜が、硫酸デキストランおよびマグネシウム塩（例えば、酢酸マグネシウム）を含有する水溶液で含浸され、そして乾燥される。デバイスに組み込むためのこのような膜を調製するための例示的な手順は、実施例１に記載されている。この場合、可溶性沈澱剤が、サンプルが膜を通過するにつれて、サンプル溶液中に放出される。
【００４７】
別の実施形態において、試薬は、膜に固定される。好ましくは、負に荷電した試薬（例えば、硫酸デキストラン）が、静電力によって、および／または共有結合的に、正に荷電した表面基を有する膜に固定される。この目的のための例示的な材料は、表面四級アンモニウム基を有するナイロン膜（例えば、Ｃｕｎｏ  Ｃｏｒｐ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ，ＣＴ）によって提供される、ＡＭ０８０膜）である。
【００４８】
この場合、膜は、親和性分離媒体として働き、その結果、非ＨＤＬリポタンパク質は、沈澱するよりむしろ、膜に固定された薬剤に結合し、これによって、サンプル流体から分離される。
【００４９】
カチオン性表面を有する他の市販のポリマー膜としては、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎｙ＋ＴＭ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、Ｚｅｔａｂｉｎｄ（登録商標）（これもまた、Ｃｕｎｏ  Ｃｏｒｐ．製）、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ（登録商標）（ＮＥＮ／ＤｕＰｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＰｏｓｉｄｙｎｅ（登録商標）（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｇｌｅｎ  Ｃｏｖｅ，ＮＹ）が挙げられる。米国特許第５，５４３，０５４号（Ｃｈａｒｋｏｕｄｉａｎら）は、負に荷電した炭水化物をその表面の正に荷電した部分の近くに反応性部分を有する膜への共有結合のための方法を記載する。この膜は、例えば、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｒ−４３０８ＴＭでコーティングされた（ポリアミド−ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂）で多孔性ポリマー（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオリド、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリスルホン、またはポリスチレン）である。
【００５０】
１つの実施形態において、試薬パッド７４は、非対称膜から構成される；すなわち、この膜は、その厚さにわたって空隙サイズ勾配を有する。非対称膜は、沈澱物の最適な補足のために、可溶性形態で膜に組み込まれる、沈澱剤とともに使用するのが特に好ましい。非対称膜の調製は、例えば、米国特許第４，６２９，５６３号、同第５，１７１，４４５号、同第５，８８６，０５９号、同第５，５３６，４０８号、同第５，５６２，８２６号、および同第４，７７４，１９２号；Ｄ．Ｒ．Ｌｌｏｙｄ，「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ２６９：１−２１（１９８５）に記載されている。これらは、種々の細孔サイズおよび細孔サイズ比で、市販されている。製造材料としては、ポリスルホン、ポリエーテルスルホネート、ポリアミド、ポリエーテルアミド、ポリウレタン、酢酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンおよび修飾ポリスチレン、ならびにブレンド、コポリマーおよび積層複合材料が挙げられる。例示的な非対称膜は、ポリスルホンまたはポリエチレンスルホンの膜であり、例えば、ＵＳＦ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって提供される、ＦＩＬＴＥＲＩＴＥＴＭ膜である。最小の細孔サイズは、代表的に、０．０１〜１．０μｍの範囲であり、最大／最小細孔サイズ比は、１００以上である。厚さは、代表的に、１００〜１５０μｍである。
【００５１】
非対称膜は、好ましくは、そのより大きい穿孔の表面がサンプル適用領域に面した（すなわち、図１および２において、下向きに面した）状態で配向され；そしてそのより小さい穿孔の表面は、以下にさらに記載されるように、ＨＤＬレベルをアッセイするための試薬を含むアッセイ要素（例えば、アッセイ要素６４）に面し、そして好ましくは、接触する。この配向は、大きい方の細孔を通して、パッド内へのサンプルの自由なアクセスを可能にし、そして小さい方の細孔（これは一般に、直径が１μｍ以下である）を通しての、沈澱物質（溶液が可溶性沈澱剤に接触する際に形成される）の通過を防止する。この細孔サイズはまた、非対称膜のために好ましい。
【００５２】
１つの実施形態において、試薬パッド７４は、単一の膜から構成される。本発明はまた、複数の積層された膜（すなわち、約６層まで）の使用を意図し、ここで、少なくとも１つ、そして好ましくは各膜が、試薬パッド７４に対する非ＨＤＬリポタンパク質の結合または沈澱のための試薬を含む。これらは、上記のような固定された試薬を含み得るか、またはこれらは、可溶性試薬で含浸され得る。後者の場合、非対称膜が好ましく、そして好ましくは、最上膜のより小さい穿孔の表面がアッセイ要素６４に面し、そして最下膜のより大きい穿孔の表面が、サンプル適用領域に面するように配向される。
【００５３】
１つの実施形態において、アッセイ要素６４はまた、ＨＤＬレベルをアッセイするための試薬を含むポリマー膜であり、そして上記のように、非対称膜であり得る。光学走査およびアッセイ結果の定量のために、より均一な表面を提供する目的で、アッセイ要素６４のために使用される非対称膜は、その小さい方の穿孔の表面を上に向け、そしてその大きい方の穿孔の表面を試薬パッド７４に向けて配向される。
【００５４】
あるいは、アッセイ要素６４のために使用される非対称膜は、その大きい方の穿孔の表面を上に向け、そしてその小さい方の穿孔の表面を試薬パッド７４に向けて配向され得る。この配向は、可視的な定量的読取が、上表面からなされるアッセイに、より適している。
【００５５】
所望であれば、ＨＤＬアッセイ試薬（例えば、ペルオキシダーゼ）は、酵素固定のための周知の方法に従って、アッセイ要素膜に固定され得る（例えば、米国特許第４，９９９，２８７号；米国特許第５，４１９，９０２号；Ｂｌｕｍ，Ｌ．Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｌｅｔｔ．２０（２）：３１７−２６（１９８７）；Ｋｉａｎｇ，Ｓ．Ｗ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２２（８）：１３７８−８２（１９７６）；Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ，Ｇ．Ｇ．編、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２巻：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（１９８４）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｐ．、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１１巻：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９１）を参照のこと）。別の実施形態において、アッセイ要素６４から下流に拡散し得る任意の生成した過酸化水素を分解するために効果的な試薬（例えば、カタラーゼ）は、試薬パッド７４に含まれ得る。
【００５６】
２つの付着したポリマー膜がアッセイ要素６４および試薬パッド７４のためにそれぞれ使用される、好ましい実施形態において、適切な試薬は、含浸または固定され、そしてこれらの膜は、製造の間、アッセイデバイスに組み込むために、２膜層として処理される。２つの非対称膜を備える例示的な２膜層が、図３に断面で示されており、好ましい配向が示され、大きい方の細孔が７８であり、そして小さい方の細孔が８０である。
【００５７】
さらなる実施形態において、ＨＤＬアッセイ要素は、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９５８９６６（Ｄｏｂｓｏｎら）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるような、バイオセンサを備える。この文献は、微小規模のバイオセンサデバイスを開示し、このデバイスは、導電性表面、導電性表面の上に重なる誘電材料の層、および誘電層を通って延びる複数の細孔を備える。これらの細孔の各々が、微小電極として働き得、この細孔内で導電性表面に接触する生体高分子によって、化学的応答を電気信号に変換する。使用の際に、アッセイされるべき分析物を含有する流体が、生体高分子と接触するように、これらの細孔に適用される。本発明のＨＤＬアッセイデバイスにおいて、このことは、試薬パッド７４（すなわち、バイオセンサの細孔を含む表面）をＨＤＬアッセイ要素と流体接触させて配置することによって、達成され得る。
【００５８】
サンプル流体を介して導電性表面と電気的に接触する、対電極が提供される。電圧が、対電極と導電性表面との間に印加され、そしてこれらの間を流れる電流が測定される。測定された電流は、アッセイされる流体中の選択された分析物の量を示す。
【００５９】
微小電極は、好ましくは、電流滴定バイオセンサとして機能する。簡単にいえば、電流滴定バイオセンサは、電位が２つの電極間に印加される場合の電流の発生によって、機能する。例は、Ｃｌａｒｋ酸素電極であり、これは、酸素の還元または過酸化水素の酸化によって発生する電流を測定する。
【００６０】
このようなバイオセンサの、溶解した酸素濃度に対する依存性は、「媒介物」の使用によって克服され得る。この媒介物は、電子を直接電極に運び、酸素補基質の還元を回避する。フェロセンは、通常使用される媒介物のファミリーの代表である。
【００６１】
微小電極の細孔内の生体高分子は、代表的に、酵素（例えば、ＨＤＬ会合コレステロールの測定については、コレステロールオキシダーゼ）である。コレステロールは、コレステロールオキシダーゼによって、対応するケトンに酸化され、過酸化水素を遊離し、これが次いで、酵素ペルオキシダーゼによって、水および酸素に転換され得る。次いで、酸素または水素のいずれかのペルオキシダーゼが、電気化学的に、バイオセンサにおいて測定される。
【００６２】
（ＩＩＩ．アッセイ方法）
操作の際に、血液サンプルがウェル１６に入れられ、そして毛管作用によって、ふるい分けマトリックス２２内に吸収され、ここで、大きい粒子（赤血球を含む）が除去され、その後、サンプル分配マトリックス２６に入る。これらの工程は、デバイスが「サンプル分配」位置にある間に行われ、その結果、サンプル分配マトリックスは、試薬にもアッセイ要素にも接触しない。血清サンプルがサンプル収集部位（例えば、マトリックス２６の端部に隣接する部位３０および３２）に達すると、このデバイスは、好ましくは、反応棒６０をアッセイ要素６６、６８および７０の位置に移動させ、そして試薬パッド／アッセイ要素７４／６４（図に示される実施形態において）をマトリックスと接触させることによって、試験位置に調節される。この位置において、マトリックス中のサンプル流体は、毛管流れによって各接触したパッド内に引き込まれ、流体の移動は、パッド表面に対して垂直な方向に起こる。このプレートは、所望の程度のパッドのぬれが達成されるまで、この位置に保持される。次いで、このプレートは、所望であれば、所望の量のサンプル流体がアッセイ要素に入り、そして／または適切な接触時間（例えば、以下の実施例２に記載されるような）の後に、サンプル分配マトリックスとアッセイ要素と試薬パッドとの間の接触を破壊するために移動される。
【００６３】
試薬パッド７４がアッセイ要素６４に固定されていないデバイスの実施形態において、反応棒および主要本体の、互いの方へのそれぞれの移動は、代表的に、反応棒を下向きに移動させ、まずアッセイ要素６４を試薬パッド７４と接触させて配置し、これらの要素の図に示されるような配置に近づけ、そしてさらに移動させて、試薬パッドをサンプル分配マトリックスと接触させることによる。接触は、上記のように、所望の程度のぬれが達成されるまで維持される。
【００６４】
試薬パッド７４に入るサンプル血清は、膜に含まれる沈澱剤または結合試薬と接触し、その結果、非ＨＤＬリポタンパク質が選択的に沈澱され、そして可溶性試薬の場合は、濾過によって保持されるか、または固定された試薬の場合は、膜に結合される。従って、この膜は、非ＨＤＬリポタンパク質を捕捉するために効果的であり、一方で、血清含有液相ＨＤＬの、ＨＤＬアッセイ要素６４への通過を可能にする。ＨＤＬアッセイ要素は、ＨＤＬ会合コレステロールの定量のための試薬を含有する。好ましくは、これらとしては、ＨＤＬから遊離コレステロールを解放するためのコレステロールエステラーゼ；遊離コレステロールとの反応によるＨ２Ｏ２の生成のためのコレステロールオキシダーゼ；Ｈ２Ｏ２を酸素および水に転換するペルオキシダーゼ；ならびにペルオキシダーゼおよびＨ２Ｏ２の存在下で、区別可能に着色されるシグナル反応生成物に転換される、結合色素系が挙げられる。あるいは、生成する酸素またはＨ２Ｏ２は、上記のように、バイオセンサの使用によって測定され得る。
【００６５】
操作の間、サンプル流体がＨＤＬアッセイ経路（パッド７４および６４を含む）を通過するにつれて、その前端は、上向きの方向で、パッド７４を通過し、ここで、非ＨＤＬリポタンパク質が反応し、そして捕捉され、そして隣接するアッセイ要素６４に直接入り、ここで、ＨＤＬが、ＨＤＬ会合コレステロールの測定のために、その中のアッセイ試薬と反応する。この間に、サンプルのさらなる部分がパッド７４と接触し続け、そして吸収能力に達するまで、パッド７４からパッド６４に類似の様式で進行する。従って、アッセイ要素６４におけるＨＤＬ会合コレステロールの定量は、試薬パッド７４において起こる沈澱反応または結合反応と同時に起こる。好ましくは、サンプル分配マトリックスからＨＤＬアッセイ経路（要素７４および６４を含む）に移動されるサンプル流体の体積は、アッセイ要素６４の吸収能力以上であり、かつアッセイ要素６４と反応パッド７４との組み合わせた吸収能力以下である。
【００６６】
現在のデバイスおよび方法の１つの利点は、サンプル分配経路が、非ＨＤＬの沈澱剤または結合試薬を含まないことである；このような試薬は、反応パッド７４内にのみ存在する。従って、これらの試薬からの妨害の可能性は、ＨＤＬ以外の分析物のアッセイにおいて、排除される。
【００６７】
好ましくは、アッセイ要素の各々は、酵素との分析物の反応を介してＨ２Ｏ２を産生するための試薬成分を含む；Ｈ２Ｏ２は、引き続いて、基質試薬を、着色されたシグナル反応生成物に転換するか、または上記のように電気化学的に測定される。このような成分としては、例えば、ペルオキシダーゼ、およびこのペルオキシダーゼによって、Ｈ２Ｏ２の存在下で、区別可能に着色されたシグナル反応生成物に転換される結合色素系が挙げられる。Ｈ２Ｏ２の酵素的生成、および引き続き染料を酸化して着色された反応生成物を形成するための、種々の基質特異的オキシダーゼを使用する酵素呈色反応は、周知である。
【００６８】
４つ以上の反応パッドを有するデバイスは、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ）、グルコース、全コレステロール（ＴＣｈ）、およびトリグリセリド脂質（ＴＧ）を同時に測定するために使用され得る。各パッドは、上記共通の経路成分（ペルオキシダーゼおよび結合色素系）を含み、その結果、発生したＨ２Ｏ２は、測定され得るか、または区別可能に着色されたシグナル反応生成物を生成し得る。全コレステロールアッセイ要素（これは、沈澱剤にも結合薬剤にも曝露されない）およびＨＤＬアッセイ要素は、各々、共通の経路成分に加えて、エステル化コレステロールを遊離コレステロール形態で血清リポペプチドから放出するための、コレステロールエステラーゼ（ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびＣＬＤＬ粒子が挙げられる）、ならびに上記のように、サンプル流体中の遊離コレステロールとの反応によってＨ２Ｏ２を生成するための、コレステロールオキシダーゼを含む。グルコースアッセイパッドは、共通の経路成分に加えて、グルコースオキシダーゼを含む。トリグリセリドパッドは、共通の経路成分に加えて、トリグリセリドから中間体Ｌ−グリセロール−３−ホスフェートを経てＨ２Ｏ２を生成するための、リパーゼ、Ｌ−グリセロールキナーゼ、およびＬ−グリセロール−３−ホスフェートオキシダーゼを含む。ＴＧパッドに引き込まれる血清サンプルは、沈澱剤にも結合試薬にも曝露されず、従って、血清リポタンパク質の全てを含有し、従って、ＴＧ信号は、全血清トリグリセリドを表す。
【００６９】
参照標準パッドもまた使用され得る：例えば、共有に係る米国特許第５，１１４，３５０号（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載されるシステムを参照のこと。
【００７０】
上記のように、現在のデバイスおよび方法の１つの利点は、サンプル分配マトリクスが、非ＨＤＬ沈澱剤も非ＨＤＬ結合薬剤も含まないことである；このような試薬は、反応パッド７４にのみ存在する。従って、これらの試薬による妨害の可能性は、全血清コレステロールおよびトリグリセリドのような分析物のアッセイにおいて、排除される。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、説明のために提供され、本発明を限定しない。
【００７２】
（実施例１：可溶性沈澱剤およびＨＤＬ試験膜を用いる、試薬膜の調製）
可溶性沈澱剤を用いて試薬膜を調製するために、１ｍｇ／ｍｌの硫酸デキストラン（５００，０００ＭＷ）および１２．５ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２を含有する水溶液を、ポリスルホン非対称膜（０．２２インチ幅）に分配した。この膜の厚さは１２７±５μｍであり、泡立ち点は８５±５ｐｓｉである。この試薬を、１６．６μｌ／インチの速度で分配し、そしてこの膜を、連続的なロールプロセスで５０℃で２０分間乾燥させる。約１００フィートの長さをこの様式で調製し、そしてアッセイデバイスに合うように切断する。
【００７３】
ＨＤＬ反応膜を調製するために、類似の非対称ポリスルホン膜を、以下の水性処方物で含浸する：コレステロールオキシダーゼ３６．５単位／ｍｌ、コレステロールエステラーゼ２１５単位／ｍｌ、ペルオキシダーゼ２００単位／ｍｌ、４−アミノアンチプリン１．８８μｍ／ｍｌ、およびＴＯＯＳ（３−［エチル（３−メチルフェニル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（１２．０５μｍ／ｍｌ）。分配速度および乾燥時間は、上記試薬膜についてと同じである。
【００７４】
これらの２つの膜を、超音波溶接によって反応棒に別個に（連続的に）付着させ得るか、またはこれらを、単一の超音波溶接工程で同時に付着させ得る。
【００７５】
（実施例２．アッセイ手順）
以下のアッセイを、ＬＤＸ（登録商標）分析器で、本質的に実施例１に記載されるように調製した試薬膜およびＨＤＬアッセイ要素を使用して実施した。サンプル（３５μｌの血清または全血）をサンプルウェルに適用し、そしてサンプル分配マトリックスを通して２分間分散させた。次いで、反応棒をこのマトリックスと３秒間（十分な血清を試薬パッドアッセイ要素に移動させるために十分な時間）接触させ（組み合わせた能力約１．５μｌ）、その後、この棒をその元の位置に戻した。反射率の読取を、ＨＤＬアッセイ要素の上表面から３秒ごとに１５０秒間行い、ＨＤＬアッセイ反応の進行をモニタリングした。次いで、達成された最小反射率値を、先に確立した較正曲線に従って、ＨＤＬコレステロールのｍｇ／ｄＬに変換した。
【００７６】
以下の濃度値（ｍｇ／ｄＬ）は、Ｂｅｃｋｍａｎ参照分析器で上記のように分析した５つの血清サンプルからのものであり、良好な相関を示す。
【００７７】
【表１】
2005515453.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、本発明の１つの実施形態に従って構築された、多分析物アッセイデバイスの側面図である。
【図２】図２は、本発明の１つの実施形態によって構築された、多分析物アッセイデバイスの分解形態での斜視図である。
【図３】図３は、好ましい配置において、本発明の１つの実施形態における試薬パッドおよびＨＤＬアッセイ要素として使用するための、２つの接触非対称膜の断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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