(57)【要約】本発明は、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター、変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニット、変異サブユニットをコードしているポリヌクレオチド、変位サブユニットを含む発現ベクター、前記変位サブユニットを発現可能である宿主細胞、薬物スクリーニング方法、および本発明の前記薬物スクリーニング方法によって同定された化学物質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン伝導ヒトＧＡＢＡAレセプター。
【請求項２】
少なくとも１つのＧＡＢＡAレセプターサブユニットを含み、前記サブユニットが、その第一および第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ中に１つまたはそれ以上の変異を持つ、請求項１に記載のレセプター。
【請求項３】
ＴＭ２に従って番号付けした場合に、−６'〜−１'アミノ酸位置にて変異した、請求項２に記載のレセプター。
【請求項４】
少なくとも１つの変異αサブユニット、および／または少なくとも１つの変異βサブユニット、および／または少なくとも１つの変異γサブユニットを含む、請求項３に記載のレセプター。
【請求項５】
少なくとも１つの変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットを含む、請求項４に記載のレセプター。
【請求項６】
第一および第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ中に、１つまたはそれ以上の変異を含む、変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニット。
【請求項７】
ＴＭ２に関して番号付けした場合に、−６'〜−１'アミノ酸位置にて変異した、請求項６に記載のレセプターサブユニット。
【請求項８】
１つの変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットである、請求項６〜７いずれかに記載のレセプターサブユニット。
【請求項９】
配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5を含み、式中
Ｘ1はＤまたはＥを表し、
Ｘ2はＳ、ＣまたはＡを表し、
Ｘ3はＧ、ＡまたはＶを表し、
Ｘ4はＥまたはＤを表し、および
Ｘ5はＫまたはＲを表す、
請求項６〜８のいずれかに記載のレセプターサブユニット。
【請求項１０】
配列ＤＳＧＥＫまたはその代配列（サブシークエンス）を含む、請求項６〜８のいずれかに記載のレセプターサブユニット。
【請求項１１】
配列ＧＥ、ＳＧＥ、ＤＳＧＥ、ＧＥＫ、ＳＧＥＫ、ＤＳＧＥＫ、ＤＳ、ＤＳＧ、ＥＫおよびＧＥＫから選別された配列を含む、請求項１０に記載のレセプターサブユニット。
【請求項１２】
請求項６〜１１に記載の変異サブユニットをコードしている、ポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットをコードしている、請求項１２に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１２〜１３に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１２〜１３に記載のポリヌクレオチド配列、または請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターの活性を阻害するため、活性化するため、または調節するための、化学化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞を、スクリーニングすべき化学化合物の活性に対して適用すること、
（ｉｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞を、ＧＡＢＡまたはに任意に他のＧＡＢＡ活性基質での活性に対して適用すること、および
（ｉｉｉ）直接または間接的に、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを通してイオン流束をモニタし、それによって、前記化学化合物の活性を決定すること、
の段階を含む方法。
【請求項１７】
カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞が、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ−ｋ１細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ７細胞、ＰＣ１２細胞、ＨｉＢ５細胞、ＲＮ３３ｂ細胞、またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞（ＸＬＯ）、または任意のカチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを発現可能な細胞株である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターのイオン流束のモニタリングが、蛍光または放射リガンド方法を用いて実施される、請求項１６〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞を、蛍光インディケーターまたは放射リガンドでロードまたはインキュベートされ、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを通した、イオン流束の変化を決定可能である、請求項１６〜１８の任意に記載の方法。
【請求項２０】
蛍光インディケーターが、ＦＬＵＯ−３、ＦＬＵＯ−４、カルシウム  グリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ）、ＦＵＲＡ−２、ＳＢＦＩ、ＰＢＦＩ、ＣＤ２２２、ＢＣＥＣＦ、ＤＩＢＡＣ4（３）、ＤｉＯＣ５（３）またはＤｉＯＣ２（３）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
放射リガンドが、Ｒｂ+、またはＴＰＰ+等の有機カチオンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターのイオン流束のモニタリングが、たとえばＦＬＩＰＲアッセイ（蛍光イメージプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）、モレキュラー  ディバイシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）より入手可能）を用いた、分光学的方法によって実施される、請求項１６〜２１の任意に記載の方法。
【請求項２３】
カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターのイオン流束のモニタリングが、パッチクランプ技術によって実施される、請求項１６〜２１の任意に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１６〜２３に記載の方法にしたがって同定された、化学化合物。
【請求項２５】
疾患、疾病または状態が、ＧＡＢＡAレセプター不全に関連している
ヒトを含む哺乳動物の疾患または疾病または状態の診断、治療、予防または緩和のための、請求項２４にしたがって同定された化学化合物の使用。
【請求項２６】
前記疾患、疾病または状態が、喘息、急性心不全、低血圧、尿閉、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、前立腺癌、パーキンソン病、精神疾患および神経疾患、不安症、統合失調症、躁病、鬱病、ジスキネジー、記憶障害、睡眠障害、痙攣性疾患およびてんかんである、請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター、変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニット、変異サブユニットをコードしているポリヌクレオチド、前記変異サブユニットを含む発現ベクター、前記変異サブユニットを発現可能である宿主細胞、薬物スクリーニング方法、および本発明の前記薬物スクリーニング方法によって同定された化学化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
イオンチャネルの好ましい薬物スクリーニング方法には、ウェルのアレイ内、通常９６または３８４ウェルの標準マイクロタイタープレート内での、細胞内にロードしたインディケー化合物とともに、試験化合物および生物学的試薬の混合物を使用する、標準のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が含まれ、各ウェルからのシグナル、蛍光発色、細胞内ｐＨ、光学密度、放射活性などのいずれか、を測定する。
【０００３】
ＧＡＢＡAレセプターは、新規薬物の開発のための魅力的な対象である。しかしながら、ＧＡＢＡAレセプターは、塩化物チャネルであり、従来のＨＴＳ方法とは、互換性がない。さらに、ＧＡＢＡAレセプターを機能的に発現可能である細胞のほとんどが、その膜を介した適切な塩化物濃度を維持しない。これらの標的を評価するためには、コストと時間がかかる電気生理学的方法が未だに好ましい方法である。
【０００４】
これらのレセプターを、より効率的であり、安価なハイスループット薬物スクリーニング方法の標的にする、非常に強い要求が、本技術分野で存在する。
【０００５】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｗａｎｇ  Ｃｈｉｈ−Ｔｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．：「ショウジョウバエからの変異ＧＡＢＡ−ゲート塩化物チャネルにおける、カチオン浸透性およびカチオン−アニオン相互作用（Ｃａｔｉｏｎ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｃａｔｉｏｎ−Ａｎｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｕｔａｎｔ  ＧＡＢＡ−Ｇａｔｅｄ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）」；Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９９  ７７  ６９１−７００］は、Ｍ２領域に近い部分での変異によって、カチオン浸透可能となった、昆虫ＧＡＢＡレセプターを記述している。しかしながら、このレセプターは、薬物によって影響を受ける調節部位を含まず、ハイスループット薬物スクリーニングには適さない。
【０００６】
Ｂｅｒｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．［Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｄ，Ｇａｌｚｉ  ＪＬ，Ｄｅｖｉｌｌｅｒｓ−Ｔｈｉｒｙ  Ａ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ  Ｓ  ＆  Ｃｈａｎｇｅｕｘ  ＪＰ：「チャネル領域Ｍ２内での２つの異なる部位での変異は、神経性α７ニコチン性レセプターのカルシウム浸透性を変化させる（Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｉｔｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｄｏｍａｉｎ  Ｍ２  ａｌｔｅｒ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  α７  ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  ｒｅｓｅｐｔｏｒ）」；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３  ９０  ６９７１−６９７５］は、そのＴＭ２領域内での２つの異なる部位での変異が、どのようにニコチン性α７レセプターのカルシウム浸透性を変化させるかを記述している。
【０００７】
Ｋｅｒａｍｉｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．［Ｋｅｒａｍｉｄａｓ  Ａ，Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ  ＡＪ，  Ｆｒｅｎｃｈ  ＣＲ，Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ  ＰＲ  ＆  Ｂａｒｒｙ  ＰＨ：「Ｍ２孔変異は、アニオン−からカチオン−感受性に、グリシンレセプターチャネルを変換する（Ｍ２  Ｐｏｒｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｖｅｒｔ  ｔｈｅ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｒｏｍ  Ｂｅｉｎｇ  Ａｎｉｏｎ−  ｔｏ  Ｃａｔｉｏｎ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ）」；Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．  ２０００  ７８  ２４７−２５９］は、塩化物伝導α１相同グリシンレセプター内で実施した３つの変異が、どのように前記レセプターをアニオン−からカチオン−感受性に変えるのかを記述している。
【０００８】
ハイスループット薬物スクリーニングに好適なカチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターは、いままで開示されてきていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ハイスループット薬物スクリーニングに好適である、カチオン伝導ヒトＧＡＢＡAレセプターを提供することである。
【００１０】
したがって、その第一の観点において、本発明は、カチオン伝導ヒトＧＡＢＡAレセプターを提供する。
【００１１】
他の観点において、本発明はその第一および第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ中に、１つまたはそれ以上の変異を含む、変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットを提供する。
【００１２】
また他の観点において、本発明は、本発明の変異サブユニットをコードしているポリヌクレオチド配列に関する。
【００１３】
第四の観点において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを提供する。
【００１４】
第五の観点において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列、または本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１５】
第六の観点において、本発明は、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターの活性を阻害するため、活性化するため、または調節するための、化学化合物をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞を、スクリーニングすべき化学化合物の活性に対して適用すること、
（ｉｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞を、ＧＡＢＡまたは任意に他のＧＡＢＡ活性基質での活性に対して適用すること、および
（ｉｉｉ）直接または間接的に、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを通してイオン流束をモニタし、それによって、前記化学化合物の活性を決定すること、
の段階を含む方法を提供する。
【００１６】
最終観点において、本発明は、本発明の方法によって同定された化学化合物に関し、またＧＡＢＡAレセプター不全に関連した、ヒトを含む哺乳動物の疾患、疾病または状態の、診断、治療、予防または軽減のための、そのような化合物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の他の目的は、以下の詳細な記述および実施例より、当業者より理解されるであろう。
【００１８】
本発明は、カチオン伝導ヒトＧＡＢＡAレセプターに関し、提供する。
【００１９】
ＧＡＢＡAレセプターは、中枢神経系の主要な阻害レセプターであり、会合して塩化物チャネルを形成する、５つのサブユニットからなる。現在まで、６つの主要な型のＧＡＢＡAレセプターサブユニット、すなわちαサブユニット（６つ、すなわちα１〜６が記述されている）、βサブユニット（３つ、すなわちβ１〜３が記述されている）、γサブユニット（３つ、すなわちγ１〜３が記述されている）、δサブユニット、ρサブユニット（ρ１〜３）、εサブユニットおよびθサブユニット、が記述されている。野生型（ｗｔ）ＧＡＢＡAレセプターは、主として、２つのα−、２つのβ−、および１つのγ−サブユニットからなると考えられているが、他の組み合わせも機能的であり、たとえば、αおよびβサブユニットのみからなるレセプターも機能的である。
【００２０】
各ＧＡＢＡAレセプターサブユニットは、大きな細胞外Ｎ−末端領域、４つの膜貫通領域（ＴＭ１〜ＴＭ４）、ＴＭ１とＴＭ２間の小さな細胞内ループ、ＴＭ２およびＴＭ３間の小さな細胞外ループ、ＴＭ３およびＴＭ４間の大きな細胞内ループおよび短いＣ−末端領域からなる。各５つのサブユニットのＴＭ２領域は、レセプター複合体の塩化物伝導孔の境界を定める。
【００２１】
本発明にしたがって、ＴＭ１およびＴＭ２膜貫通領域を橋渡ししている細胞内ループ内、および／またはＴＭ２それ自身内に挿入された一組の変異が、このレセプターが、カチオンではなく、塩化物イオンをもはや伝導せず、これによって、カチオン−伝導ＧＡＢＡAレセプターを構成する様式で、変異レセプターの生理学に影響を与えることが分かってきた。
【００２２】
本発明の記述において、アミノ酸は確立されている一文字表記を用いて表す。
（カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター）
その第一観点において、本発明はカチオン伝導ヒトＧＡＢＡAレセプターを提供する。より特異的には、本発明のカチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターは、野生型ＧＡＢＡAレセプターの機能的誘導体であり、変異により野生型ＧＡＢＡAレセプターより誘導され、したがって、変異ＧＡＢＡAレセプターであると特徴付けされうる。
【００２３】
好ましい実施様態において、本発明のカチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターは、少なくとも１つの変異サブユニットを含み、このサブユニットは、その第一およびその第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ内、および／またはＴＭ２領域それ自身内に、１つまたはそれ以上の変異を持つ。
【００２４】
さらに好ましい実施様態において、本発明のカチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターは、少なくとも１つの変異αサブユニット、および／または少なくとも１つの変異βサブユニット、および／または少なくとも１つの変異γサブユニットを含む。さらに好ましい実施様態において、サブユニットは、変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットである。
（変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニット）
他の観点において、本発明は、その第一および第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ内、および第二膜貫通領域（ＴＭ２）内に、１つまたはそれ以上の変異を含む、変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットを提供する。本発明の変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットは、野生型ＧＡＢＡAレセプターサブユニットの機能的誘導体であり、変異により野生型ＧＡＢＡAレセプターサブユニットより誘導され、したがって、変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットであると特徴付けされうる。
【００２５】
本発明の変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットは、とりわけ、変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２および／またはγ３サブユニットでありうる。
【００２６】
好ましい実施様態において、本発明にしたがって意図される変異は、
−野生型ＧＡＢＡAレセプターαサブユニット中の、「ＥＳＶＰＡＲ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）で表記される部分アミノ酸配列の位置に相当する位置、
−野生型ＧＡＢＡAレセプターβサブユニット中の、「ＤＡＳＡＡＲ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）で表記される部分アミノ酸配列の位置に相当する位置、
−野生型ＧＡＢＡAレセプターγサブユニット中の、「ＤＡＶＰＡＲ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）で表記される部分アミノ酸配列の位置に相当する位置、
すなわち、ＴＭ２にしたがって番号付けした場合に、−６’〜−１’のアミノ酸位置で挿入されるべきである。
【００２７】
より好ましい実施様態において、その第一およびその第二膜貫通領域（ＴＭ１およびＴＭ２）を橋渡ししているループ中で、以上で同定された部分６アミノ酸配列は、部分５アミノ酸配列ＤＳＧＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、または任意のその副配列または任意のその保存的置換物によって置換される。他の方法で表現すると、以上で同定された部分６アミノ酸配列は、以下の部分５アミノ酸配列、
Ｘ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5、
で置換され、式中
Ｘ1はＤまたはＥを表し、
Ｘ2はＳ、ＣまたはＡを表し、
Ｘ3はＧ、ＡまたはＶを表し、
Ｘ4はＥまたはＤを表し、および
Ｘ5はＫまたはＲを表す。
【００２８】
本発明のもっとも好ましい変異体は、以下のリストから選択された部分アミノ酸配列を含む。
【００２９】
【数１】
2005506056.tif 000002
【００３０】
（変異サブユニットをコードしているポリヌクレオチド配列）
他の観点において、本発明は、本発明の変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットをコードしている、精製および単離ポリヌクレオチド配列を提供する。本発明のポリヌクレオチド配列によってコードされている変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットは、とりわけ、変異α１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、γ１、γ２またはγ３サブユニットでありうる。
（組換え体発現ベクター）
さらに他の観点において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む、組換え体発現ベクターを提供する。
【００３１】
本明細書で定義したように、組換え体発現ベクターは、望む細胞内にポリヌクレオチドを導入するために使用する、発現担体または組換え体発現構造物である。発現ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターであり得、そこで本発明のポリヌクレオチドが挿入されうる。好適な発現担体には、限定はしないが、真核生物発現ベクターおよび原核生物発現ベクター、たとえば、細菌直鎖または環状プラスミド、およびウイルスベクターが含まれる。しかしながら、産出宿主内で、複製可能であり、生存可能である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターを使用してよい。
【００３２】
好ましい真核生物発現ベクターには、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）より入手可能）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）より入手可能）、およびｐｃＤＮＡ−３（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）より入手可能）が含まれる。
【００３３】
発現ベクターはさらに、本発明のポリヌクレオチド配列と、動作可能に組み合わせた、定常配列を含んでよい。本明細書で定義したように、語句「動作可能な組み合わせ（ｉｎ  ｏｐｅｒａｂｌｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、動作可能要素、すなわち遺伝子（群）および定常配列が、望む発現に影響を与えるように、動作可能に連結されることを意味する。
（宿主細胞）
またさらなる観点において、本発明は、本発明の単離ポリヌクレオチド配列、および／または本発明の組換え体発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３４】
本発明の産出細胞は、好ましくは、任意の内因性ＧＡＢＡAサブユニット活性を発現しないか、または避ける。
【００３５】
本発明の産出細胞は、好ましくは真核細胞、とりわけヒト細胞、または酵母細胞またはフィラメンタス真菌細胞等の、真菌細胞であり得る。好ましい細胞には、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ−ｋ１、ＢＨＫ、ＣＯＳ７、ＰＣ１２、ＨｉＢ５、ＲＮ３３ｂ細胞、およびアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞（ＸＬＯ）、または本発明のカチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを発現可能な、任意の他の細胞株が含まれる。
（薬物スクリーニングの方法）
本発明のカチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターは、はじめて、薬物スクリーニング工程を、従来のハイスループットスクリーニング技術を用いて実施することを可能にする。
【００３６】
したがって、他の観点にて、本発明は、ＧＡＢＡAレセプター活性に関して、化学化合物をスクリーニングするための方法を提供し、それによって、ＧＡＢＡAレセプター活性を持つ化学化合物が、その、ＧＡＢＡAレセプターを介したイオンの流束を阻害、活性化または調節する、細胞内ｐＨを変化させる、または、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞の膜電位を変化させる能力によって同定される。
【００３７】
好ましい実施様態において、本発明の方法には、以下の、
（ｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞を、スクリーニングすべき化学化合物の活性に対して適用すること、
（ｉｉ）カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞を、ＧＡＢＡまたは任意に他のＧＡＢＡ活性基質での活性に対して適用すること、および
（ｉｉｉ）直接または間接的に、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを通してイオン流束をモニタし、それによって、前記化学化合物の活性を決定すること、
の段階が含まれる。
（カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞）
本発明の方法にて使用される、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞は、好ましくは以上で記述したように、本発明の宿主細胞である。
（イオン流束のモニタリング）
本発明の方法にしたがって、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを介したイオン流束を、前記化学化合物によって引き起こされるイオン流束の阻害、活性化、または調節を決定するためにモニタする。イオン流束は、確立された方法を用いて、直接または間接的にモニタしてよい。
【００３８】
好ましい実施様態において、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを介した流束のモニタリングは、蛍光または放射リガンド方法を用いて実施される。
【００３９】
より好ましい実施様態において、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞は、化学試験基質およびＧＡＢＡまたはＧＡＢＡ活性化合物の添加によって引き起こる、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを介したイオン流束の変化を決定可能である、蛍光色素または放射リガンドとともにロード、またはインキュベートする。
【００４０】
好ましい蛍光インディケーターには、限定はしないが、ＦＬＵＯ−３、ＦＬＵＯ−４、カルシウムグリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ）、ＦＵＲＡ−２、ＳＢＦＩ、ＰＢＦＩ、ＣＤ２２２、およびＢＣＥＣＦ、ＤＩＢＡＣ4（３）、ＤｉＯＣ５（３）、およびＤｉＯＣ２（３）が含まれる。
【００４１】
好ましい放射リガンドには、限定はしないが、Ｒｂ+、およびＴＰＰ+等のような有機カチオンが含まれる。
【００４２】
また他の好ましい実施様態において、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを介したイオン流束のモニタリングは、たとえば、ＦＬＩＰＲアッセイ（蛍光イメージプレートリーダー（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）、モレキュラー  デバイセス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）より入手可能）を用いる分光学的方法によって、または、米国特許第５，６７０，１１３号で記述された自動化解析器具を用いて実施してよい。
【００４３】
また他の好ましい実施様態において、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプターを介したイオン流束のモニタリングは、たとえば、Ｈａｍｉｌｌ，Ｏ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．１９８１  ３５１  ８５−１００にて記述されたパッチクランプ技術によって実施する。より好ましい実施様態において、カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター含有細胞の膜電位のモニタリングは、国際特許第ＷＯ９８／５０７９１号で記述された自動化パッチクランプによって実施する。
（カチオン伝導ＧＡＢＡAレセプター活性化合物）
他の観点において、本発明は、本発明の方法によって同定され、ＧＡＢＡAレセプターを阻害する、活性化するまたは調節することが可能な、化学化合物に関する。
【００４４】
本発明の化学化合物は、ヒトを含む哺乳動物の疾患または疾病または状態の、診断、治療、予防または軽減のために有用であり、前記疾患、疾病または状態は、ＧＡＢＡAレセプター不全に関する。好ましい実施様態において、前記疾患、疾病または状態は、喘息、急性心不全、低血圧、尿閉、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、前立腺癌、パーキンソン病、精神疾患および神経疾患、不安症、統合失調症、躁病、鬱病、ジスキネジー、記憶障害、睡眠障害、痙攣性疾患およびてんかんである。
【００４５】
本発明は、さらに、以下の実施例に従って例示されているが、これは、請求した本発明の範囲を何ら限定する意図はない。
【実施例１】
【００４６】
変異挿入と、変異レセプターの発現
レセプターのイオン選択性の定義における、ＧＡＢＡAレセプターサブユニットの影響を調査するために、変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットβ3を、部位特異的変異導入によって設計した。
【００４７】
ＧＡＢＡAレセプターサブユニットを、ヒト脳ｍＲＮＡ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＲＴ−ＰＣＲによってクローン化した。ＧＡＢＡAレセプターαサブユニットを、ｐＮＳ１ｚベクター内にサブクローン化し、ＧＡＢＡAレセプターβサブユニットをｐＮＳ１ｎベクター内にサブクローン化し、ＧＡＢＡAレセプターγサブユニットを、ｐＺｅｏＳＶベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にサブクローン化した。ｐＮＳ１ｎおよびｐＮＳ１ｚは、それぞれｐｃＤＮＡ３−Ｎｅｏ（インビトロジェン）またはｐｃＤＮＡ３−Ｚｅｏ（インビトロジェン）より由来した。
【００４８】
ｈｉｎｄＩＩＩ部位を、Ｍ１およびＭ２領域間のループ内に導入し、ｂｓｕ３６Ｉ部位を、すべてのレセプターサブユニット内のＭ２およびＭ３領域間のループ内に導入した。ベクターまたはｃＤＮＡ内の他の部位のｈｉｎｄＩＩＩおよびｂｓｕ３６Ｉ部位を削除した。
【００４９】
キメラＧＡＢＡAＲサブユニットの組を、Ｍ２領域を１つのサブユニットから他のサブユニットに、単純制限消化およびライゲーションによって移して構築した。ＧＡＢＡAＲをコードするプラスミドを、制限酵素ｈｉｎｄＩＩＩおよびｂｓｕ３６Ｉによって消化し、ついで断片をゲル電気泳動を用いて分離し、ゲル抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。キメラＧＡＢＡAＲサブユニットを、急速ライゲーションキット（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））を用いて、断片のライゲーションにより得た。
【００５０】
非ＧＡＢＡ  Ｍ２領域を持つキメラＧＡＢＡAＲを作製するために、全Ｍ２領域をコードしている重複オリゴヌクレオチドを、アニールし、Ｅｘｐａｎｄ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させた。
【００５１】
伸長条件は、以下のように、９４℃２分間、続いて、９４℃１分間、５９℃１分間および７２℃１分間の２０サイクル、および最後の７２℃１０分間のインキュベーションであった。合成Ｍ２領域を、ｈｉｎｄＩＩＩおよびｂｓｕ３６Ｉで消化し、ＧＡＢＡAＲサブユニットのｃＤＮＡとライゲーションした。
【００５２】
変異を、ＱＵＡＮＴ−ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ＳＤＭキット（クオンタム  バイオテクノロジーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＧＡＢＡAレセプターβ3サブユニットのｃＤＮＡ内に導入した。β3サブユニットのＴＭ２ボーダーにおける、６アミノ酸の骨格（ＤＡＳＡＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５））を、ＡＣｈＲα7の相当するアミノ酸（ＤＳＧＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７））によって置換した。
【００５３】
変異導入は、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施した。
【００５４】
【数２】
2005506056.tif 000003
【００５５】
さらに変異ＧＡＢＡAＲβ3サブユニットを作製するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
【００５６】
【数３】
2005506056.tif 000004
【００５７】
ｈＧＡＢＡAＲβ3サブユニット内へのｂｓｕ３６Ｉ部位の導入によって、Ｉ３００Ｖ変異が導かれ、これは、レセプター機能に影響することが明らかになった。このことは、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて逆転する。
【００５８】
【数４】
2005506056.tif 000005
【００５９】
正確な変異導入は、制限酵素解析、およびＤＮＡ配列決定によって確認した。ＣＨＯ−ｋ１細胞（ＡＴＣＣ）を、上述したプラスミドおよび増強グリーンフルオレセンスタンパク質（ＧＦＰ、クロンテック）をコードしているプラスミドで、リポフェクタミンＰＬＵＳキット（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてコトランスフェクトした。
【実施例２】
【００６０】
変異レセプターの発現
すべての構造物を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）内に発現させた。
【００６１】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭ  Ｌ−プロリンを含む、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび２ｍＭグルタマックス含有ＤＭＥＭ（ライフ  テクノロジーズ）内で維持した。細胞を、５％ＣＯ2、９５％空気の湿大気中で、３７℃にて培養し、１週間に二回継代した。
【００６２】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、上述したプラスミドおよび増強グリーンフルオレセンスタンパク質をコードしているプラスミドで、取扱説明書にしたがって、リポフェクタミンＰＬＵＳキット（ライフ  テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、を用いてコトランスフェクトした。
【００６３】
結合実験および電気生理学的測定を、トランスフェクション後２４〜４８時間後実施した。
【実施例３】
【００６４】
結合アッセイ
結合研究を、標準の方法を用いて実施した。膜を、組換えＧＡＢＡAＲサブユニットを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞より調製した。この細胞を、ＰＢＳ（ライフ  テクノロジーズ）中で洗浄し、トリプシン処理し、クエン酸トリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．１）中で２回洗浄し、５，０００ｇにて１０分間遠心分離した。
（［3Ｈ］−ムシモール結合）
膜を膜洗浄緩衝液［２０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０２５％（ｗ／ｖ）ＮａＮ3、および種々のプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ塩化ベンズアミジン、０．１ｍＭ塩化ベンズエトチニウム、５０Ｕ／ｍｌバシトラシン、０．３ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍｇ／ｌオボムコイドトリプシン阻害剤、１０ｍｇ／ｌダイズトリプシン阻害剤）］中に再懸濁させ、１７７，０００ｇ、４℃にて３０分間遠心分離した。ペレットを、結合アッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4／Ｋ2ＨＰＯ4、ｐＨ７．５、および１００ｍＭ  ＫＣｌ）中に、１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで再懸濁させ、使用の直前に均質化させた。結合を、２００μｇのタンパク質を含む、最終容量２５０μｌにて、３重で、１、３、１０、３０、１００または３００ｎＭの［3Ｈ］−ムシモール（２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ドゥポント−ニュー  イングランド  ヌクレアー（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）で実施し、非特異的結合を、１ｍＭ  ＧＡＢＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））の存在下で測定した。試料を４℃にて３０分間インキュベートし、標識膜を、ＧＦ／Ｂフィルター（ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ））を用いて、ブランデル（Ｂｒａｎｄｅｌ）細胞回収機上で回収した。フィルターを、３×４ｍｌ結合アッセイ緩衝液で洗浄し、放射活性量を、液体シンチレーション計数機にて測定した。
（［3Ｈ］−フルマゼニル結合）
膜をクエン酸トリス緩衝液中に再懸濁させ、２２，０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。ペレットをタンパク質濃度１００〜２００μｇ／ｍｌまで、クエン酸トリス緩衝液中で懸濁させた。結合を、５０〜１００μｇタンパク質を含む最終容量５５０μｌにて、３重に、０．５、１、２、３または６ｎＭ  ［3Ｈ］−フルマゼニル（８７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ドゥポント−ニュー  イングランド  ヌクレアー）にて実施し、非特異的結合を、１μクロナゼパム（ロッシュ）の存在下で測定した。試料を、４℃にて４０分間インキュベートし、標識膜を、ＧＦ／Ｃフィルター（ワットマン）上での急速濾過によって回収した。フィルターを、２×５ｍｌのクエン酸トリス緩衝液にて洗浄し、放射活性量を、液体シンチレーション計数機にて測定した。
（［35Ｓ］−ＴＢＰＳ結合）
膜をクエン酸トリス緩衝液中に再懸濁させ、２２，０００ｇ、４℃にて１０分間遠心分離した。ペレットを、２００〜４００μｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで、２００ｍＭ  ＫＣｌを含む２０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．４）中に再懸濁させた。結合を、１００〜２００μｇのタンパク質を含む、５５０μｌの最終容量で、５ｎＭ  ［35Ｓ］−ＴＢＰＳ（８９Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ドゥポント−ニュー  イングランド  ヌクレアー）および０．６μＭ  ＧＡＢＡにて、３重に実施し、非特異的結合を２００μＭのピクロトキシン（シグマ）の存在下で測定した。試料を、２０〜２２℃にて１５０分間インキュベートし、結合を、ワットマンＧＦ／Ｃフィルター上での急速濾過によって終了させた。フィルターを２００ｍＭ  ＫＣｌを含む、２×５ｍｌの２０ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（ｐＨ  ７．４）にて洗浄し、放射活性を、液体シンチレーション計数管によって測定した。
【００６５】
（＋）は、野生型レセプターの結合の２．５％以上をしめし、（÷）は２．５％以下を示している。
（データ解析）
ＫdおよびＢmaxを、一部位結合式を用いて推定した。
【００６６】
本実験の結果を、以下の表１に示している。
【実施例４】
【００６７】
特性化
実施例１〜２に従って得た、変異ＧＡＢＡAレセプターサブユニットβ3を、逆電位に関して、電気生理学的に特性化した。
【００６８】
すべての実験を、従来の全細胞パッチクランプ法を用いて、電位クランプにて実施した。増幅器は、ＩＴＣ−１６インターフェースを介して、マッキントッシュＧ３コンピュータによって実行される、ＥＰＣ−９（ＨＥＫＡ−エレクトロニクス、ランブレクト（Ｌａｍｂｒｅｃｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ））であった。実験条件は、増幅器に付随するパルス−ソフトウェアにて設定した。データを、低パスフィルターに通し、３回カットオフ頻度の速度で、ハードディスクに直接サンプリングした。
【００６９】
ピペットを、水平電極引き抜き器具（ツァイト−インストゥルメント（Ｚｅｉｔｚ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ）を用いて、ホウケイ酸ガラス（モジュローム（Ｍｏｄｕｌｏｈｍ））より引き抜いた。ピペット抵抗は、１．６〜２．６ｍΩであり、ピペットを、ｐＨ＝７．２に調整した、１２０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ、および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む溶液で満たした。ピペット電極を、シルバーワイヤで塩化し、参照電極は、実験チャンバーに固定した塩化銀ペレット電極（イン  ビボ  メトリック（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｅｔｒｉｃ））であった。電極を密封直前に、バス中で、オープンピペットによってゼロとした。培養細胞を含むカバースリップを、Ｎｏｍａｒｓｋｉ光学およびマーキュリーランプ（オリンパス（Ｐｌｙｍｐｕｓ））を付属した、倒立顕微鏡（ＩＭＴ−２、オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ））の試料台上に取り付けした、１５μｌ実験チャンバーに移した。実験のために選んだ細胞は、マーキュリーランプからＵＶ光を曝露したときに、明緑色蛍光を発光した。ギガ−シール形成の後、全細胞構造を吸引によって得た。
【００７０】
細胞を、ｐＨ＝７．４に調整した、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液にて、２．５ｍｌ／分の速度にて、連続的に超溶解した。ｐＨ＝７．４に調整した、５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１３５ｍＭ  グルコン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む低塩化物細胞外溶液（グルコン酸−Ｒ）を使用して、塩化物浸透性を取り扱い、ｐＨ＝７．４に調整した、１４ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１２６ｍＭ  ＮＭＤＧおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含む低ナトリウム細胞外溶液（ＮＭＤＧ−Ｒ）を用いて、カチオン浸透性を取り扱った。
【００７１】
細胞を、各実験の開始時点で、−６０ｍＶの保持電位に置き、電流を、３０秒間、連続的に測定し、安定ベースラインを確認した。Ｉ−Ｖ実験を、細胞を−６０、−５０、−４０、−３０、−２０、−１０、０、１０、２０、３０、４０、５０、６０ｍＶの電位に保持し、各膜電位におけるＧＡＢＡ活性化電流を記録することで実施した。
【００７２】
ＧＡＢＡ含有溶液を、その先端を、細胞よりおよそ５０μｍに配置した、カスタムメイド重力依存フローパイプを通して、チャンバーに電送した。パルスソフトウェアによって制御したバルブを伴うフローパイプに連結した、チュービングの圧縮によって、適用を始動させた。一般的に、ＧＡＢＡを、各３０〜４０秒ごとに、０．５〜１秒間適用した。適用の間のサンプリング間隔は１ｍ秒であった。パッチクランプ実験は、室温（２０〜２２℃）にて実施した。電流を、応答のピークの時点で測定し、逆電圧（Ｖｒｅｖ）を、各細胞に関して、Ｉ−Ｖプロットより直接読んだ。
【００７３】
野生型および変異ＧＡＢＡAレセプターを、異なる細胞外溶液中の逆電位に関連して特性化し、カチオンまたはアニオン伝導性を同定した。
【００７４】
本実験の結果は、以下の表１に示している。
【００７５】
【表１】
2005506056.tif 000006
【００７６】
＊（＋）は、野生型レセプターの結合の２５％以上を示し、（÷）は２５％以下を示す。ＮＤ＝測定していない
表１で示したように、Ｎａ−Ｒからグルコン酸−Ｒへの逆電位の移行は、野生型レセプターの塩化物伝導性を示しているが、変異レセプターは伝導性を示さず、一方で、Ｎａ−ＲからＮＭＤＧ−Ｒへの逆電位の移行は、野生型レセプターに関してではなく、変異レセプターに関するカチオン伝導性を示唆している。
【００７７】
［3Ｈ］−ムシモール−および［3Ｈ］−フルマゼニル結合に関して何の変化も観察されず、このことは、レセプターがまだ、機能的なＧＡＢＡAであり、一方でＧＡＢＡAチャネルブロッカー［35Ｓ］−ＴＢＰＳの結合は、変異によってなくなり、このことは、チャネルの改変を示唆している。
【国際公開パンフレット】
2005506056.tif 000007
2005506056.tif 000008
2005506056.tif 000009
2005506056.tif 000010
2005506056.tif 000011
2005506056.tif 000012
2005506056.tif 000013
2005506056.tif 000014
2005506056.tif 000015
2005506056.tif 000016
2005506056.tif 000017
2005506056.tif 000018
2005506056.tif 000019
2005506056.tif 000020
2005506056.tif 000021
2005506056.tif 000022
2005506056.tif 000023
2005506056.tif 000024
2005506056.tif 000025
2005506056.tif 000026
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506056.tif 000027
【国際調査報告】
2005506056.tif 000028
2005506056.tif 000029
2005506056.tif 000030
2005506056.tif 000031
2005506056.tif 000032
2005506056.tif 000033