(57)【要約】治療用核酸分子を含む組換え型の完全なミニ細胞を含む組成物が開示される。このようなミニ細胞調製物を精製する方法も開示される。さらに、(i)第1の核酸セグメントを含んでなるプラスミドを含む利用可能な組換え型の完全なミニ細胞を作出し、(ii)これらのミニ細胞を包み込み能のある哺乳動物細胞と接触させ、ミニ細胞が哺乳動物細胞に包み込まれるようにし、その後、この哺乳動物細胞が第1の核酸セグメントの発現産物を産生することを含んでなる、遺伝子形質転換法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)治療用核酸分子を含む組換え型の完全なミニ細胞と(ii)その医薬上許容される担体とを含んでなる組成物。
【請求項２】
107個のミニ細胞につき約1個未満の混入親細菌細胞しか含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
108個のミニ細胞につき約1個未満の混入親細菌細胞しか含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
109個のミニ細胞につき約1個の混入親細菌細胞しか含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
治療用核酸分子を含む組換え型の完全なミニ細胞から実質的になる組成物。
【請求項６】
(i)第1の核酸配列からなるプラスミドを含む組換え型の完全なミニ細胞を準備し、(ii)該ミニ細胞を、ファゴサイトーシスまたはエンドサイトーシス能のある哺乳動物細胞と接触させ、その結果、該ミニ細胞が該哺乳動物細胞によって包み込まれ、それにより該哺乳動物細胞が第1の核酸配列の発現産物を産生することを含んでなる遺伝子形質転換法。
【請求項７】
該哺乳動物細胞がin vivoのものであり、該第1の核酸配列が治療用発現産物をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ミニ細胞含有サンプルを(i)一連のクロスフローフィルター、次いで(ii)デッドエンドフィルターに通し、それによりミニ細胞を該サンプル中の混入物から分離して精製ミニ細胞調製物を得ることを含んでなる精製方法。
【請求項９】
該精製ミニ細胞調製物を抗生物質で処理するステップをさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該ミニ細胞含有サンプルを分画遠心分離に供する予備的ステップをさらに含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
該一連のクロスフローフィルターが約0.45μm以上の孔径の少なくとも1つのフィルターと約0.2μm以下の孔径の少なくとも1つのフィルターとを含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
該デッドエンドフィルターが約0.45μmの孔径のものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該一連のクロスフローフィルターが約0.45μmの孔径の少なくとも2つのフィルターと約0.2μmの孔径の少なくとも1つのフィルターとを含んでなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該精製ミニ細胞調製物を抗生物質で処理するステップをさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞、組織または器官に投与することによる、疾患治療方法または形質改変方法に用いるための薬剤の調製における、治療用核酸分子を含有する組換え型の完全なミニ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、他を排除するものではないが、特に遺伝子療法に関して、完全な細菌ミニ細胞の手段によるオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの宿主細胞への送達に関する。本発明はまた、完全な細菌ミニ細胞を精製するための医薬上適合する方法に関する。
【０００２】
Salserらに対する米国特許4,497,796号では、1980年頃に利用可能な、哺乳動物細胞を形質転換するための初期の様々なアプローチに焦点を当てている。特に、Salserらは、リン酸カルシウムとのDNA共沈降の技術による、メトトレキサート耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子の、マウスL1210細胞または骨髄細胞への導入を開示している。
【０００３】
Salserらはまた、「ウイルスベクター」の他、特定細胞の融合技術：核膜に包まれた限定数の染色体の細胞融合；ミニ細胞融合；プラスミドDNAを含む細菌プロトプラストとの融合；およびDNAをパッケージングした赤血球ゴーストとの融合をはじめとする「遺伝材料を細胞へ挿入するための(その他)多くの方法」について述べている(第5段18〜30行目；引用は省略)。これらの技術に共通しているのはDNAを含む細胞構造体(一重膜により仕切られる)を用いて、これをポリエチレングリコール(PEG)などの膜融合促進剤の存在下で標的哺乳動物細胞と接触させることである。哺乳動物細胞と細胞構造体は融合してハイブリッド細胞を形成し、後者に含まれるDNAは前者の細胞質中へ放出され、ハイブリッドの核へ送られ、そしてこれがDNAを発現し得る。
【０００４】
Salserの開示は、細胞質内容物を欠いているが元の形態は維持している赤血球残物である「赤血球ゴースト」、および「細菌プロトプラスト」、すなわち、典型的にはペプチドグリカンの合成を阻害する溶解酵素または抗生物質の作用により外膜(細胞壁)をはぎ取った細菌細胞を記載している。Salserらはまた、第3のタイプの簡素化した細胞構造体、すなわちミニ細胞プロトプラストの使用も示唆している。
【０００５】
ミニ細胞は、DNAの分離により、二分裂の際の細胞分裂の協調を妨げることによって生じさせた無核型の大腸菌(E. coli)またはその他の細菌細胞である。原核生物の染色体複製は正常な二分裂に関連し、細胞中央の隔壁の形成に関与している。大腸菌では、例えば、minCDなどのmin遺伝子の突然変異によって細胞分裂中の細胞極における隔壁の形成の阻害を除去することができ、結果として正常な娘細胞と無核のミニ細胞が生じる(de Boerら, 1992; Raskinおよびde Boer, 1999; HuおよびLutkenhaus, 1999; Harry, 2001)。
【０００６】
minオペロン突然変異の他、無核のミニ細胞はまた、枯草菌(Bacillus subtilis)でのdivIVB1におけるものなど、隔壁形成に作用する一定の範囲のその他の遺伝子再配列または突然変異の後にも生じる(ReeveおよびCornett, 1975; Levinら, 1992)。ミニ細胞はまた、細胞分裂／染色体分離に関与するタンパク質の遺伝子発現レベルにおける摂動の後にも生じ得る。例えば、minEの過剰発現は極性分裂およびミニ細胞の産生をもたらす。同様に、例えば、枯草菌のsmc突然変異(Brittonら, 1998)、枯草菌のspoOJ欠失(Iretonら, 1994)、大腸菌のmukB突然変異(Hiragaら, 1989)、および大腸菌のparC突然変異(StewartおよびD’Ari, 1992)など、染色体分離の欠陥から染色体を欠くミニ細胞が得られる。遺伝子産物はトランス型で提供され得る。コピー数の多いプラスミド、例えばCafAから過剰発現した場合、細胞分裂の速度が速くなり、かつ／または複製後の染色体分配が阻害され(Okadaら, 1994)、その結果、細胞チェーンと無核のミニ細胞が生じる(Wachiら, 1989; Okadaら, 1993)。
【０００７】
ミニ細胞は、特定の条件下で形成され、自発的に放出される他の小胞(ミニ細胞とは対照的に特定の遺伝子再配列またはエピソーム遺伝子発現によるものではない)とは異なる。このようなその他の小胞の例としては、小さな膜性の小胞である細菌の疱状突起がある(Dorwardら, 1989)。疱状突起は例えばアグロバクテリウム菌(Agrobacterium)、バチルス菌(Bacillus)、ボルデテラ菌(Bordetella)、エシェリキア菌(Escherichia)、ナイセリア菌(Neisseria)、シュードモナス菌(Pseudomonas)、サルモネラ菌(Salmonella)および赤痢菌(Shigella)に由来するいくつかの細菌種で見られている。細菌の疱状突起は例えば増殖環境の操作により(Katsuiら, 1982)、また、外的な膜脱安定化剤の使用により(Matsuzakiら, 1997)作り出すことができる。
【０００８】
グラム陰性菌の一種においてphiX174溶菌遺伝子Eが発現する場合に生じる空の細菌エンベロープである細菌ゴースト(Lubitzら, 1999)など、その他の細菌成分も存在する。細菌ゴーストは、トランスメンブラントンネル構造から細菌細胞エンベロープを通じて形成される。細胞内の浸透圧が高いために、細胞質内容物は周囲の媒質へ放出されて空の細菌細胞エンベロープが得られる。
【０００９】
原核細胞内でのプラスミドの複製は染色体の複製には依存しないので、上記の異常な細胞分裂の際にプラスミドは正常な娘細胞とミニ細胞の双方へと分離し得る。従って、組換えmin大腸菌由来のミニ細胞は染色体以外の全ての細菌細胞成分とともに相当数のプラスミドコピーを含み、それ自体、プラスミドにコードされる遺伝子のin vitro発現を研究する際に用いられている。Brahmbhatt (1987)、Harlowら (1995)、およびKiharaら (1996)参照。Brahmbhatt (1987)は、例えば、大腸菌ミニ細胞が20kbといった大きなDNAインサートをともなう組換えプラスミドを含むことができ、いずれの染色体DNAも含まず、かつ、同時に9以上の組換えタンパク質を発現し得ることを示している。
【００１０】
このように複製力はないが代謝的に活性な完全なミニ細胞は、プラスミドが持つ遺伝子によりコードされているタンパク質を分析するために用いられている。しかし、Salserらが述べている「ミニ細胞融合」に関しては、ミニ細胞は、細菌プロトプラスト同様、PEGまたは細胞融合を促進するその他の薬剤とともにインキュベートした場合に標的細胞との融合を受けうる構造を得るためにそれらの外膜が剥がされている。また、細菌プロトプラスト同様、このようなミニ細胞プロトプラストは浸透圧溶解を防ぐために等張条件下で維持しなければならず、極めて酵素作用を受けやすい。従って、これらは遺伝子療法には適さない。さらに、他のもっと便宜な形質転換方法の登場により、Salserらはミニ細胞技術は使用されなくなっていくと言及している。
【００１１】
さらに最近では、遺伝子療法の進展がレシピエント哺乳動物のゲノムに外的な遺伝材料を導入するための種々の方法に焦点を当てている。Romanoら (1998, 1999)、BalickiおよびBeutler (2002)、ならびにWadhwaら (2002)の総説を参照。アデノウイルスまたは組換えレトロウイルスベクターの利用など、これらの技術の臨床応用は重大な安全性への懸念のために立ち後れている。ここで形質転換法が呈する問題を示すと、野生型ウイルスとの組換え、挿入および発癌性、ウイルスにより引き起こされる免疫抑制、治療DNAの大きなセグメントを運ぶウイルスベクターの能力に限りがあること、弱毒化ウイルスの毒性型への逆転、組換えウイルスの製造・流通が困難であること、安定性の低さ、および既存の免疫系によって起こる炎症応答などの有害反応が挙げられる。これらの問題を回避するアプローチは、遺伝子療法をより安全かつより効果的なものとする上で多大な利益をもたらすであろう。
【００１２】
サルモネラ菌(Darjiら, 1997; Pagliaら, 2000; Urashimaら, 2000)、赤痢菌(Sizemoreら, 1995; Grillot-Courvalinら, 2002)、リステリア菌(Dietrichら, 1998)および侵襲性大腸菌(Grillot-Courvalinら, 1998)をはじめとする弱毒化生細菌ベクターもヒト遺伝子療法のための遺伝子送達ベクターとし検討されている。しかし、生細菌は弱毒化したとしても、十分な組換えDNAが哺乳動物細胞の細胞質へ、従ってさらに核へと逃れることができるようファゴリソソーム膜溶解機構を持つように操作しなければならない。このような操作は難しく、多くの細胞内病原菌では不可能であると思われる。さらに、病原菌を弱毒化する突然変異は、例えばサルモネラ菌、大腸菌および赤痢菌の芳香族アミノ酸生合成遺伝子における突然変異など、少数の細菌種でしか知られていない。
【００１３】
弱毒化突然変異は多くの細菌種では知られていないので、細菌遺伝子送達系は幅広い細胞内病原菌を用いることができない。細菌ベクターには、そのDNAの一部が遺伝子療法を受けるヒトまたは動物宿主中の他の微生物相に移入する可能性があることから、染色体DNAの存在に関するさらなる懸念がある。このような細菌種間のDNAの無差別な移入は、新たな毒性菌および／または薬剤耐性菌の出現の可能性があるため望ましくない。
【００１４】
発明の概要
これら、またその他の必要性に取り組むため、本発明は、1つの態様によれば、(i)組換え型の完全なミニ細胞(該ミニ細胞は例えばインターロイキン-2をコードする治療用核酸分子を含む)と(ii)その医薬上許容される担体とを含んでなる組成物を提供する。ある好ましい実施形態では、該組成物は107、108、または109個のミニ細胞につき1個未満の混入親細菌細胞しか含まない。
【００１５】
もう1つの態様によれば、本発明は、細胞、組織または器官に投与することによる、疾患治療方法または形質改変方法に用いるための薬剤の調製における、治療用核酸分子を含有する組換え型の完全なミニ細胞の使用を提供する。これに関して治療される疾患は癌、例えばまたはエイズ、肺炎、気腫などの後天性疾患または嚢胞性繊維症などの先天性代謝障害によって生じる症状であり得る。あるいは、この治療法は生殖能力などの形質、またはアレルゲンもしくは感染性病原体に関する免疫応答に影響を及ぼし得る。
【００１６】
本発明はまた、さらなる態様に従い、(i)核酸配列、好ましくは治療用発現産物をコードするものからなるプラスミドを含む組換え型の完全なミニ細胞を準備し、次いで(ii)該ミニ細胞を、ファゴサイトーシスまたはエンドサイトーシス能のある哺乳動物細胞と接触させ、その結果、該ミニ細胞が該哺乳動物細胞によって包み込まれ、それにより後者の細胞がその核酸配列の発現産物を産生することを含んでなる遺伝子形質転換法を提供する。ミニ細胞と哺乳動物細胞の間の接触はin vitroであってもin vivoであってもよい。上述のプラスミドはまた、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーまたはシグナル配列などの調節エレメントとして機能し、かつ、第1の核酸セグメントに機能し得る形で連結された第2の核酸セグメントを含んでもよい。さらに、このプラスミドは緑色蛍光タンパク質をコードする核酸セグメントなどのリポーターエレメントを含んでもよい。
【００１７】
本発明のさらにもう1つの態様によれば、ミニ細胞含有サンプルを(i)一連のクロスフローフィルター、次いで(ii)デッドエンドフィルターに通し、それによりミニ細胞を該サンプル中の混入物から分離して精製ミニ細胞調製物を得ることを含んでなる精製方法が提供される。この方法は所望により精製ミニ細胞調製物を抗生物質で処理することを含んでもよい。また、ミニ細胞含有サンプルに対して分画遠心分離を行う予備的なステップも任意に行える。ある好ましい実施形態では、この一連のクロスフローフィルターは(A)約0.45μm以上の孔径を用いた少なくとも1つまたは2つのフィルターと(B)約0.2μm以下の孔径を用いた少なくとも1つのフィルターを含んでなる。
【００１８】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明者らは、完全な細胞壁を有するミニ細胞(「完全なミニ細胞」とする)がin vitroおよびin vivoにおいて宿主細胞(好ましくはヒトまたは動物の哺乳動物細胞)にオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド(一概に「核酸分子」とする)を送達するために効果的なベクターであると断定した。従って、本発明者らは、ミニ細胞が得られた細菌細胞(「親細菌細胞」)を包み込む哺乳動物細胞により同様に完全なミニ細胞が包み込まれることを見出した。さらに、驚くことに、完全な組換えミニ細胞の内容物は宿主細胞に包み込まれた場合、ミニ細胞に由来する少なくともいくらかのプラスミドDNAが分解を逃れ、細胞質を経て宿主細胞の核へと輸送されるようにプロセシングされ、これがその後プラスミドDNAを発現することを見出した。
【００１９】
従って、本発明によれば、異種発現が望まれるDNAを有する完全なミニ細胞をin vitroまたはin vivoのいずれかで、細胞内細菌病原体の様式で親細菌細胞を包み込む哺乳動物細胞と接触させる。同じように、ここでは「包み込み能(engulfing-competent)」というが、哺乳動物細胞はミニ細胞を包み込み、目的のDNAを発現する。
【００２０】
宿主細胞のタイプにより完全なミニ細胞の包み込みには種々の機構が関与すると考えられ、この点で本発明はいずれかの特定の機構に依存するものではない。例えば、ファゴサイトーシス(食作用)はマクロファージおよび好中球のようなその他の食細胞が、粒子表面にその粒子全体を覆ってしまうまで仮足を伸ばすことにより粒子を摂取するという十分記載されているプロセスである。「非特異的」ファゴサイトーシスと記載されているが、このプロセスにおいて特異的な受容体の関与も実証されている。WrightおよびJong (1986); Speertら (1988)参照。
【００２１】
このようにファゴサイトーシスの一形態は表面リガンドと仮足の膜に局在するリガンド受容体の間の相互作用を含む(ShawおよびGriffin, 1981)。この付着のステップは特異的な受容体によって媒介され、細菌表面アドヘシンによるものと思われる。非腸毒素原性大腸菌などの毒性の低い細菌に関しては、ファゴサイトーシスは食細胞受容体に対する表面リガンドの不在下でも起こり得る。例えば、Pikaarら (1995)参照。従って、本発明は、限定されるものではないが、それらの親細菌細胞の性質に調和してアドヘシンを有するかまたは欠き、食細胞(すなわち、「ファゴサイトーシス能のある」宿主細胞)(その好中球およびマクロファージは哺乳動物において基本型である)によって包み込まれる完全なミニ細胞の使用を包含する。
【００２２】
もう1つの包み込み(engulfing)プロセスとして、サルモネラ菌、エシェリキア菌、赤痢菌、ヘリコバクター、シュードモナス菌および乳酸菌種により例示される細胞内病原体が哺乳動物上皮細胞に侵入し、そこで複製するエンドサイトーシスがある。これに関する2つの基本的な機構が、クラスリン依存性受容体を媒介とするエンドサイトーシス(「コーティッド・ピット・エンドサイトーシス(coated pit endocytosis)」とも呼ばれる(Riezman, 1993))と、クラスリン非依存性エンドサイトーシス(SandvigおよびDeurs, 1994)である。本発明に従い、エンドサイトーシスによって働く包み込み能のある細胞(すなわち、「エンドサイトーシス能のある」宿主細胞)が完全な組換えミニ細胞を包み込み、そのミニ細胞が持っているDNAを発現する場合にはこの一方または両方が関与し得る。代表的なエンドサイトーシス能のある細胞としては、乳房上皮細胞、消化管の腸細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞、ならびに尿道および膀胱上皮細胞がある。
【００２３】
本発明は、転写および／または翻訳に対して、疾患を改善する、または治療するあるいは被験体の特定の細胞種、組織または器官に関連する形質を改変するために機能する核酸分子を包み込み能のある細胞へ導入するのに特に有用である。本明細書の目的では、これらの分子は「治療用核酸分子」と分類される。
【００２４】
例えば、ある所定の治療用核酸分子の転写または翻訳は癌、またはエイズ、肺炎、気腫などの後天性疾患の治療、または嚢胞性繊維症などの先天性代謝障害の改善に有用であり得る。また、治療用核酸の転写または翻訳は、野生動物の避妊的不妊化をはじめとする避妊的不妊化も果たし得る。アレルゲンを媒介とする炎症性疾患および感染性病原体を媒介とする炎症性疾患にも、本発明により、患者内で発現した場合にそれぞれアレルゲンおよび感染性病原体に関連した免疫応答に影響を及ぼす治療用核酸分子を投与することによって対抗することができる。治療用核酸分子はまた発現産物を有し得るか、あるいは移植に関連する免疫不全を軽減する、または組織増殖および再生を助ける、発現産物の翻訳後修飾の下流産物であり得る。
【００２５】
あるいは、発現産物または関連の翻訳後作用因子は宿主に所望の利益をもたらす、エリスロポイエチンに代表されるタンパク質、TGF-βなどの増殖因子；IL-2、IL-10、IL-12またはその他のインターロイキンなどのサイトカイン；血清ロイコプロテイナーゼ阻害剤；またはCTLA4-Igなどの抗体であり得る。その他のこのようなタンパク質としては、限定されるものではないが、α-、β-およびγ-グロビン、インスリン、GM-CSF、M-CSF、G-CSF、EPO、TNF、MGF、アデノシンデアミナーゼ、ウイルス性、変異型もしくは異常発現抗原などの腫瘍関連抗原(CDK4、β-カテニン、GnT-V、Casp8)、MAGE、BAGE、GAGE、PRAMEおよびNY-ESO-1などの癌特異的抗原、チロシナーゼ、Melan-A/MART-1、gp100およびTRP-1/gp75などの分化抗原、ならびにHer2/neuおよびCEAなどの過剰発現抗原がある。この種の治療用核酸分子のさらなる例としては、嚢胞性繊維症トランスメンブランレギュレーター(CFTR)、因子VIIまたはその他の血液タンパク質、低密度リポタンパク質受容体、β-グルコセレブロシダーゼ、α-およびβ-ガラクトシダーゼ、インスリン、副甲状腺ホルモン、α-1-アンチトリプシン、fasRおよびfasLをそれぞれコードするDNAがある。
【００２６】
本発明によれば、宿主細胞による治療用核酸分子の発現は必要な化合物を供給すること、目的とする免疫応答を媒介すること、または病理プロセスを妨げることができる。例えば、治療用核酸分子はアンチセンスまたはリボザイム療法に関与し得る。本明細書において、アンチセンス療法は本発明に従ってポリヌクレオチド配列のアンチセンスコピーを、該コピーのRNA転写物がそのポリヌクレオチド配列に相当するメッセンジャーRNA(mRNA)転写物とin situでハイブリダイズするように導入することを含む。このハイブリダイゼーションは典型的には、転写物がタンパク質へと翻訳されないようにするか、またはmRNAを破壊する分解経路を誘導する。
【００２７】
治療用核酸はまた哺乳動物細胞内で短い干渉RNA二重らせん(siRNA)をコードしてもよい。すなわち、siRNAは哺乳動物細胞において標的遺伝子を抑制することが示されている。このRNA干渉(RNAi)法は動物、ヒトおよび植物における配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの方法であり、サイレンシングされた遺伝子に相同な二本鎖(ds)RNAによって開始される。特に種々の細胞種において標的遺伝子の発現を低下させるためのウイルスを媒介とするsiRNAの送達が首尾よく実証されている(Haibinら, 2002)。
【００２８】
治療用核酸分子のこれら、またその他多様な使用の全てについて、本明細書は「遺伝子療法」という題目を用い、これはまた、例えば米国特許第5,399,346号に記載されているように、in vivoおよびex vivoの双方において宿主細胞に治療用核酸分子を導入するための方法論または系に関して、「遺伝子導入」、「遺伝子送達」および「遺伝子に基づくワクチン」という句によっても意味される。このように、本発明のミニ細胞含有組成物はin situ治療作用を達成するため、および体外で細胞を形質転換した後にそれらを被験体へ(再)導入するために使用できる。本発明によれば、in vivoおよびex vivo双方のアプローチに適切な細胞は、食細胞および上皮細胞などの包み込み能のあるものであろう。
【００２９】
上記のように、遺伝子療法は遺伝的または後天的疾患または症状を治療または予防するために行い得る。治療用核酸分子は機能的RNA(例えば、アンチセンスまたはsiRNA)などの産物、またはそのin vivo産生が望まれるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする。例えば、目的の遺伝材料は治療的価値のあるホルモン、受容体、酵素または(ポリ)ペプチドをコードし得る。このような方法の結果、非組み込み型導入DNAの一時的発現、染色体外複製、およびエピソームなどの導入レプリコンの発現、または導入遺伝材料の宿主細胞ゲノムDNAへの組み込みが起こり得る。
【００３０】
治療用核酸分子は、例えば嚢胞性繊維症における嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター(Keremら, 1989; Riordanら, 1989; Rommensら, 1989)、鎌形赤血球性貧血におけるβ-グロビン、また、地中海貧血におけるα-グロビン、β-グロビンおよびγ-グロビンの場合のように、機能が異常であるか、または病的状態において異常なレベルで存在するタンパク質を発現する遺伝子の正常な相当物であってもよい。この治療用核酸分子は上述のようにアンチセンスRNA転写物または短い干渉RNAを含み得る。このように、β-地中海貧血の特徴であるβ-グロビンよりもα-グロビンが過剰に産生される状態は、本発明に従い、α-グロビン mRNAの標的配列に対してアンチセンス型のRNA転写物を有する配列を組み込んだプラスミドを含むように操作した完全なミニ細胞を用いる遺伝子療法によって改善することができる。
【００３１】
癌の治療においては、本発明に従って用いるのに好適な治療用核酸分子はp53遺伝子、網膜芽腫遺伝子、および腫瘍壊死因子をコードする遺伝子などの腫瘍抑制に関連する遺伝子に相当するか、または由来する配列を有し得る。広範な固形腫瘍−癌、乳頭腫および疣贅−は本発明に従ってこのアプローチにより治療できるはずである。これに関して代表的な癌としては、大腸癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、肝臓癌、骨癌、卵巣癌、膵臓癌、脳癌、頭頸部癌、およびリンパ腫が挙げられる。例示的な乳頭腫としては、扁平上皮細胞乳頭腫、脈絡叢膜乳頭腫および咽頭乳頭腫がある。疣贅症状の例としては、生殖器疣贅、足底いぼ、疣贅状表皮胃形成、および悪性疣贅がある。
【００３２】
本発明のための治療用核酸分子はまた、1つの不活性なプロドラッグを1以上の細胞傷害性代謝産物へと変換し、そのプロドラッグをin vivo投与した際に実質上標的細胞が、おそらくは同様に隣接細胞とともに自殺に追いやる酵素をコードするDNAセグメントを含み得る。非ヒト起源またはヒト起源のものであり得るこのような「自殺遺伝子」の前臨床および臨床適用はSpencer (2000)、Shangaraら (2000)およびYazawaら (2002)による総説がある。非ヒト起源の自殺遺伝子の例としては、HSV-チミジンキナーゼ(tk)、シトシンデアミナーゼ(CDA)+ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシル-トランスフェラーゼ(GPT)、ニトロレダクターゼ(NTR)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ(PNP, DeoD)、シトクロムP450(CYP4B1)、カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)、およびD-アミノ酸オキシダーゼ(DAAO)をそれぞれコードするものが挙げられる。ヒト起源自殺遺伝子は、カルボキシペプチダーゼA1(CPA)、デオキシシチジンキナーゼ(dCK)、シトクロムP450(CYP2B1,6)、LNGFR/FKBP/Fas、FKBP/キャスパーゼ、およびER/p53をそれぞれコードする遺伝子により例示される。
【００３３】
本発明の自殺遺伝子療法はエイズの治療に適用できよう。この方法論は処置した哺乳動物細胞がHIV-1に感染して間もなく有毒な遺伝子産物を発現する自殺ベクターを用いて試験した。これらのベクターは、HIV-1感染後にα-ジフテリア毒、シトシンデアミナーゼ、または-a2などの有毒遺伝子の発現を誘導するためのHIV-1調節エレメント、Tatおよび／またはRevを用いる(Curielら, 1993; Dingesら, 1995; Harrisonら, 1992a; Harrisonら, 1992b; Raghebら, 1999)。本発明の組換えミニ細胞アプローチを用い、細胞にこれらのベクターを導入でき、HIV感染後、非導入細胞よりも速やかに排除され、細胞死という犠牲をはらってウイルスの複製を防ぐ。
【００３４】
本発明のアプローチによって導入される核酸分子はリポーターエレメントを含み得る。リポーターエレメントはその組換え宿主に、典型的には宿主が産生しないポリペプチドをコードすることで、容易に検出できる表現型または特徴を付与し、発現した際にin vivoイメージング技術などの組織学的またはin situ分析により検出できるものである。例えば、本発明の完全なミニ細胞によって送達されるリポーターエレメントは、包み込んだ宿主細胞において、in situ分析によって検出可能であり、かつ、転写活性化の定量的または半定量的関数となる比色または蛍光変化をもたらすタンパク質をコードし得る。これらのタンパク質の例としては、エステラーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、およびその活性が検出可能な発色団または蛍光団を生じるその他の酵素が挙げられる。
【００３５】
好ましい例としては、インジゴ形成基質インドリル-β-D-ガラクトシドの切断によって色の変化が起こる大腸菌β-ガラクトシダーゼ、および発光を伴って、長鎖アルデヒド(細菌ルシフェラーゼ)または複素環式カルボン酸(ルシフェリン)を酸化するルシフェラーゼが挙げられる。これに関してはまた、Prasherら (1995)に記載のように、クラゲAequorea victoriaの緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするリポーターエレメントも有用である。GFP関連技術分野は2つの公開PCT出願WO 095/21191(アミノ酸65〜67からなる発色団を含む238アミノ酸のGFPアポタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を開示)およびWO 095/21191(蛍光タンパク質が変更されたペプチドを提供する、A. victoria GFPのアポタンパク質のcDNAの改変を開示)、および励起倍率において4〜6倍の向上を特徴とする突然変異型GFPに関するHeimら (1994)の報告により例示される。
【００３６】
別のタイプのリポーターエレメントとしては、組換えミニ細胞を毒素耐性とする発現産物に関するものがある。例えば、neo遺伝子は有害なレベルの抗生物質G418から宿主を非保護するが、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする遺伝子はメトトレキサート耐性を付与し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子はクロラムフェニコール耐性を付与する。
【００３７】
リポーターエレメントとして用いるためのその他の遺伝子としては、明瞭な細胞表面抗原、例えばHIV gp120またはヘルペスgDなどのウイルスエンベロープタンパク質(これらは、免疫アッセイにより容易に検出することができる)を発現するように宿主ミニ細胞を形質転換し得るものが挙げられる。
【００３８】
本発明のアプローチによって導入される核酸分子はまた、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーおよび／またはシグナル配列などの調節エレメントに機能し得る形で連結された所望のコードセグメントを有し得る。治療内容を指定する場合、好適なプロモーターは組織特異的または腫瘍特異的とすることもできる。
【００３９】
所定の組織で優先的に活性化させる場合にはプロモーターは「組織特異的」であり、ゆえに標的組織において機能し得る形で連結された構造配列の発現を駆動する上で効果的である。組織特異的プロモーターのカテゴリーとしては、例えば、それぞれアルブミンおよびa1-アンチトリプシンの肝細胞特異的プロモーター；膵臓腺房細胞において活性なエステラーゼI遺伝子制御領域；膵臓β細胞において活性なインスリン制御領域；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞およびマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域；脳の乏突起神経膠細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域；および視床下部の細胞で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域が挙げられる。Frainら (1990)、Cilibertoら (1985)、Pinkertら (1987)、Kelseyら (1987)、Swiftら (1984)、MacDonald (1987)、Hanahan (1985)、Lederら (1986)、Readheadら (1987)、およびMasonら (1986)参照。
【００４０】
特定の腫瘍細胞で、または腫瘍細胞それ自体で優先的に発現するプロモーターおよび本発明に従って種々の癌を治療するのに有用なプロモーターも存在する。癌細胞に特異的なプロモーター種としては、メラノーマをターゲッティングするためのチロシナーゼ；乳癌をターゲッティングするためのMUC1/Df3プロモーター；発現を横紋筋肉腫(RMS)へターゲッティングするハイブリッドmyoDエンハンサー/SV40プロモーター；大腸癌細胞などの癌胎児性抗原(CEA)発現細胞に特異的なCEAプロモーター；および非小細胞肺癌をターゲッティングするためのII型ヘキソキナーゼ遺伝子プロモーターにより例示される。Hart (1996)、MortonおよびPotter (1998)、Kuraneら (1998)、ならびにKatabiら (1999)参照。
【００４１】
発現産物の分泌または発現産物の特定の細胞コンパートメントへの局在を果たすには本発明に従ってシグナル配列を使用することができる。従って、完全なミニ細胞によって送達される治療ポリヌクレオチド分子は、選択された治療パラダイムに応じて目的の発現産物が包み込み細胞またはその後代によって分泌され、それにより周囲の細胞に影響を及ぼすように、適切なリーディングフレームにシグナル配列を含んでもよい。例示的なシグナル配列としては、米国特許第5,143,830号に記載のヘモリシンC末端分泌配列、米国特許第5,037,743号に記載のBAR1分泌配列、および米国特許第6,025,197号に記載のzsig32ポリペプチドのシグナル配列が挙げられる。
【００４２】
本発明の完全な組換えミニ細胞はin vivoで完全性を維持することができるので、上記のように遺伝子療法におけるそれらの使用が可能となる。完全なミニ細胞はまた、例えばフレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、大腸菌(Escherichia coli)またはネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、その他真核生物発現プラスミドを宿主細胞へ導入するために用いられているものなどの組換え細菌細胞に存在する細菌ゲノムDNAを持たない。Sizemoreら (1995); Gentschevら (2000); Caticら (1999); Dietrichら (1998);およびCourvalinら (1995)参照。よって、本発明に従った完全なミニ細胞を用いた遺伝子療法には、組換え細菌の使用に伴う、患者に固有の微生物相に細菌遺伝子または抗生物質耐性マーカー遺伝子の意図しない導入というリスクはない。さらに、組換え細菌は細胞媒介免疫により患者から排除されなければならないので、例えば癌やエイズに罹患している免疫無防備状態の患者の遺伝子療法には適さない。
【００４３】
ミニ細胞はグラム陽性起源またはグラム陰性起源のいずれの細菌細胞からでも調製することができる。本発明はミニ細胞プロトプラストではなく完全なミニ細胞を用いるので、本発明はいずれの抗生物質または化学物質によるミニ細胞の前処理も必要とせず、そのような前処理を含まないことが好ましい。
【００４４】
ミニ細胞産生細菌株は、例えば下記実施例1および2で例示されているように、minCDE遺伝子配列の部分的欠失によるなど、min遺伝子の突然変異により作出することができる。組換え型の完全なミニ細胞を得るには、選択されたミニ細胞産生株の細菌細胞を、限定されるものではないが、エレクトロポレーション(ShigekawaおよびDower, 1988)、化学的方法(Hanahan, 1983)、シャトルベクター(MarcilおよびHiggins, 1992)、およびコンジュゲーション(Firthら, 1996)または形質導入(Davisら, 1980)をはじめとする標準技術によって形質転換する。この形質転換では、任意の真核生物、原核生物または合成源からの治療用核酸分子を好適な、商業的に入手可能な、またはエンドユーザー所有のプラスミドベクターに挿入する。選択されたDNAは遺伝子送達および／またはin vivoで組換えミニ細胞を包み込む細胞内でのDNAの発現に必要な制御エレメントと機能し得る形で連結することができる。
【００４５】
組換えミニ細胞は、組換えプラスミドまたはDNA配列を標的細胞核へ送達できること、また、標的細胞で組換え遺伝子の発現が起こることを確認するためにin vitroで分析するのが好ましい。発現に関するアッセイは異種遺伝子の性質によって異なる。発現は、免疫アッセイ、組織化学アッセイまたは活性アッセイをはじめとする種々の方法によりモニタリングし得る。蛍光マーカー遺伝子の発現は顕微鏡により可視化でき、これが特に便宜なアッセイとなる。例えば、CMVプロモーターなどの真核生物遺伝子発現プロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を、真核細胞をターゲッティングすべく組換えミニ細胞によりプラスミドに導入してもよい(下記参照)。さらに、ノーザンブロット解析または逆転写酵素PCR(RT-PCR)を用い、適当なDNAまたはRNAプローブを用いた転写を評価してもよい。異種遺伝子にコードされているポリペプチドに対する抗体が利用できる場合には、ウエスタンブロット解析、免疫組織化学またはその他の免疫学的技術を用いてポリペプチドの産生を評価することもできる。異種遺伝子が酵素である場合には、適当な生化学アッセイを用いることもできる。例えば、異種遺伝子が抗生物質耐性をコードする場合であれば、抗生物質耐性遺伝子の発現を評価するために、感染細胞の抗生物質に対する耐性の判定を用いることができる。
【００４６】
推定宿主(「標的」)細胞の包み込み能は培養系にてDNA送達の効率を試験することにより評価することができる。例えば、標的腫瘍から生検をとり、得られた組織サンプルを常法に従って用いて、標本培養腫瘍細胞を得、例えば好適なリポーターエレメントを有する本発明の組換えミニ細胞を包み込む能力に関して試験する。このような一次細胞培養を試験することに加えて、またはその代わりに、本発明に従い、それに対して治療プロトコールが調整されている組織種の標本となる細胞系を試験することにより、ミニ細胞を包み込む能力を測定してもよい。細胞培養技術は、例えばFreshner (1992)により十分に記載されている。
【００４７】
本発明によれば、組換えミニ細胞はいくつかの手段により親細胞から精製することができる。1つのアプローチとしては、例えばReeve (1979)により、また、Clark-Curtissら (1983)により記載されているスクロース勾配法の後に、残留している生細菌を殺すためにゲンタマイシン(200μ/ml、2時間)などの抗生物質処理を用いる。
【００４８】
常法を用いる場合、達成される純度は最高で106〜107個のミニ細胞につき混入親細胞1個である。in vivo適用では、本発明によれば、106を超える用量が必要な場合があり、さらに1用量につき1010といった高さの場合もあり、これは上述の混入比であれば、1用量につき10,000個の親の生細菌へと翻訳される。このような混入レベルは特に免疫無防備状態の被験体では致命的であり得る。
【００４９】
さらにまた、従来技術ではスクロース、グリセロールまたはパーコール(登録商標)などの勾配形成剤を含有する媒体を用い、その存在は現在考えられているようにin vivo使用には望ましくない。よって、このパーコール(登録商標)の毒性はこれを「研究目的のみ」に制限し、一方、勾配用のスクロースは高浸透圧を与え、これはミニ細胞において生理学的変化を引き起こし得る。
【００５０】
従って、本発明の遺伝子療法適用では、親細胞の混入を最小限とし、生体適合性がより高い媒体を使うことが好ましい。これらの目標を達成するため、本発明者らは、予期しないことに、クロスフロー濾過(供給流が膜表面に対して平行)とデッドエンド濾過(供給流が膜表面に対して垂直)とを組み合わることが有利であることを見出した。概略はForbes (1987)を参照。所望により、この組合せは、細菌細胞画分をある程度除去し、それによりミニ細胞上清を富化するために、低遠心力での分画遠心分離により行うこともできる。また所望により、この組合せの後に抗生物質処理を行って親細菌細胞を死滅させることもできる。
【００５１】
クロスフロー濾過はフィルター孔径によって親細菌細胞などの大きな混入物から、また、細菌小胞、遊離内毒素、核酸、細胞残渣および過剰な液体などの小さな混入物からミニ細胞を分離することもできる。大きな混入物からミニ細胞を分離するためには、クロスフローフィルターの公称孔径は、ミニ細胞はフィルターを通過するが、大きな細菌細胞は通さないものでなければならない。この目的では、ミニ細胞は直径約0.4μmであるが、細菌細胞はそれより大きいので、0.45μmの孔径が好ましい。ミニ細胞を小さい混入物から分離するためには、クロスフローフィルターの公称孔径は、混入物はフィルターを通過するが、ミニ細胞は通さないものでなければならない。この目的では、細胞残渣は直径約0.05μm〜0.2μmの範囲であり、その他のより小さな混入物は0.2μm未満であるので、0.2μmの孔径が好ましい。
【００５２】
これに関してクロスフロー濾過の効果的な適用には典型的には、大孔径0.45μm前後による少なくとも1つのステップの後、小孔径0.2μm前後による少なくとも1つのステップを必要とする。一連のクロスフロー濾過ステップの間または最中、ミニ細胞の回収を最大限にするためにジアフィルトレーションを行ってもよい。
【００５３】
クロスフロー濾過の使用は細菌培養物など、濃度の高い粒状物質を含む懸濁液にも適合し、培養液1リットル当たり1011〜1013個の細菌およびミニ細胞集団を含んでいてもよい。フィルターへの付着および結果としてのミニ細胞の損失を最小にするため、細菌／ミニ細胞培養物を希釈してもよい(好ましくは、5倍〜10倍)。また、希釈により、適宜、低大気圧および低流速の使用も可能となる。
【００５４】
クロスフロー濾過後に残った残留親細菌細胞を除去するため、デッドエンド濾過を行う。この目的では、孔径約0.45μmのフィルターによる少なくとも1回のデッドエンド濾過の使用が好ましい。
【００５５】
一般に、濾過は遺伝子導入研究に好適なミニ細胞の無菌調製を提供する。in vivo遺伝子導入では、細菌細胞の混入によるリスクをさらに軽減するために抗生物質処理を行うのが好ましい。例えば、親細菌株がそれに対して感受性である抗生物質を含有する増殖培地にミニ細胞を再懸濁させてもよい。この目的で所定の抗生物質の適当量は従来技術により事前に決定することができる。
【００５６】
一連のクロスフロー濾過／デッドエンド濾過配置は、記載のように、勾配形成剤の使用を不要とするだけでなく、10-7を超える(すなわち、107 個のミニ細胞につき親細胞1個未満)の純度を提供する。好ましくはこの純度は10-8を超え、より好ましくは約10-9のオーダーである。一連のクロスフロー濾過／デッドエンド濾過配置はまた、より良好な品質管理も提供する。さらにまた、Clarke-CurtissおよびCurtiss (1983)の技術が必要とするようなアンピシリン、シクロセリン、またはその他の抗生物質耐性遺伝子の必要もない。また、Sancarら (1979)が記載している方法とは対照的に、この一連の精製アプローチはDNAを損傷する放射線を用いないので、一連のクロスフロー濾過／デッドエンド濾過配置によって調製されたミニ細胞に由来する治療用核酸分子は放射線により誘発される非特異的な突然変異を含まない。
【００５７】
本発明の組換えミニ細胞から本質的になる組成物(すなわち、このようなミニ細胞を、組成物のDNA送達の質を過度に妨害しないその他の構成成分とともに含む組成物)は、1以上の生理学上許容される担体または賦形剤を用いて常法にて調剤することができる。注射用製剤は単位投与形、例えばアンプルまたはバイアルで提供してもよいし、保存料を加えて、また加えずに多用量容器で提供してもよい。製剤は油性または水性ビヒクル中の液剤、懸濁剤または乳剤であってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤などの配合剤を含んでもよい。好適な溶液としてはレシピエントの血液と等張であり、生理食塩水、リゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。あるいは、ミニ細胞は好適なビヒクル、例えば無菌パイロジェンフリー水または生理食塩水で再構成する凍結乾燥粉末状としてもよい。ミニ細胞はまた、デポー製剤として調剤してもよい。このような長時間作用製剤は埋植(例えば皮下または筋肉内)または筋肉内注射により投与し得る。
【００５８】
本発明のミニ細胞含有組成物は種々の経路により、哺乳動物身体の種々の部位へ投与して、局部的または全身的いずれかの所望の治療効果を達成することができる。送達は例えば、経口投与、体腔への製剤の塗布、吸入もしくは通気、または非経口、筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔、皮下、腫瘍内もしくは皮内投与により達成し得る。
【００５９】
同様に、意図される適用の性質は治療用核酸分子の送達に用いる組換えミニ細胞の細菌源の選択に影響を及ぼす(または、それにより影響を受ける)。例えば、サルモネラ菌、大腸菌、および赤痢菌種は、消化管の腸細胞上のエンドサイトーシス媒介受容体により認識されるアドヘシンを含み、大腸癌細胞に効果的な治療用核酸分子を送達することを目的とした経口投与に好適であり得る。同様に、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)由来のミニ細胞は胃上皮細胞に特異的なアドヘシンを含み、胃癌細胞に向けた経口送達に好適であり得る。吸入または通気は肺上皮細胞上の受容体により認識されるアドヘシンを含むシュードモナス種に由来する完全なミニ細胞の投与に理想的であり得、例えば、CFTRタンパク質をコードする治療用核酸分子を嚢胞性繊維症患者の肺へ送達する。乳酸菌由来のミニ細胞は尿道または膀胱上皮細胞に特異的なアドヘシンを含み、尿道または膀胱癌に対する治療用核酸分子の尿道内送達によく適している。
【００６０】
本発明はある範囲の核酸分子(cDNAならびにゲノムDNAまたはRNAであってもよく、また、センスまたはアンチセンス配向のものであってもよい)を送達するために使用できる。本発明によれば、完全なミニ細胞に存在する核酸分子は、そのミニ細胞が生じた細菌細胞由来のゲノムDNAでない限り、プラスミド、発現ベクターまたはその他の遺伝子構築物の形態をとってもよい。本発明で用いるのに好適なものは、真核生物遺伝子発現プロモーターの翻訳または転写制御下に置き得るか、あるいは宿主細胞由来のトランス作用因子を用いて哺乳動物細胞で発現させ得る、真核生物、原核生物または合成源に由来する所望のDNAまたはRNA配列のいずれかである。
【実施例】
【００６１】
実施例１  グラム陰性菌であるネズミチフス菌、大腸菌およびフレクスナー赤痢菌からの細菌ミニ細胞の作出
本明細書に記載し(A、BおよびC)、また図2および3に示したように、グラム陰性菌由来のミニ細胞産生細菌株を作出した。
【００６２】
一般的な材料および方法
以下の例において使用した細菌株を表1に記載し、その参照も示した。細菌はすべて、-80℃で保存したグリセロールストックから増殖させた。サルモネラ菌、大腸菌、赤痢菌およびリステリア菌株はトリプチケースソイブロス(Trypticase Soy Broth (TSB) (BBL 商標、Bacto Labs, Liverpool, NSW, Australiaから購入))中で増殖させた。使用説明書に従って30gm/lに調製し、121℃で15分間オートクレーブ処理した。液体培養物は37℃で振盪培養器にて増殖させた。赤痢菌と大腸菌は、XLD寒天(キシロース-リシン-デオキシコール酸塩寒天)にプレーティングし、それぞれ赤および黄色のコロニーを形成することにより区別した。XLDはOxoid(Melbourne, Australia)から購入し、使用説明書に従って53gm/lに調製し、次に2分間煮沸した。以下に示す液体培地および固体培地中の濃度で抗生物質を使用した：アンピシリン100μg/ml、クロラムフェニコール30μg/ml、カナマイシン30μg/ml。
【表１】
2005505296.tif 000002
【００６３】
必要に応じて1%グルコースを添加したM9最小培地中で菌株を増殖させた。菌株によってはさらに栄養補助剤を加えた。大腸菌株ENIh003には1mMのチアミンを加えた。フレクスナー赤痢菌株ENSf001には、M9に0.4mMセリン、0.2mMプロリン、0.001%フェニルアラニン、0.001％トリプトファン、0.001％チロシン、0.001%ヒスチジン、0.002mg/mlバリン、0.0125mg/mlニコチン酸、0.001%チアミンおよび0.0225mg/mlのメチオニンを添加した。
【００６４】
プラスミドDNAは、Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Inc., Victoria, Australia)を用いて精製した。サルモネラ菌、赤痢菌および大腸菌株のゲノムDNAは、Current Protocols in Molecular Biology (Chapter 2, Section I, Unit 2.4; John Wiley & Sons, Inc.)の基本プロトコールを用いて調製した。使用した制限酵素および修飾酵素はすべて、Promega(Madison, WI, USA)またはRoche(Castle Hill, NSW, Australia)から購入したが、Deep Vent DNAポリメラーゼはNew England Biolabs (Beverly, MA, USA)から購入した。
【００６５】
リステリア菌(ENLM001)のゲノムDNAは常法(Ausubel ら, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc.)に、記載のような変更を加えたものにより精製した。一晩培養物の1.5mlサンプルを13,200rpmで3分間遠心分離し、その上清を排気した。この細菌細胞ペレットを2.5mg/mlのリゾチームを加えた1mlのTEバッファー(10mM Tris pH 8.0; 1 mM EDTA pH 8.0)中に再懸濁させ、37℃で1時間インキュベートした。次にRNアーゼAを最終濃度15mg/mlとなるように加えて、その溶液を室温で1時間インキュベートした。次に、100μg/mlのプロテイナーゼKと0.5% SDSを加え、その混合物をさらに37℃で1時間インキュベートした。その後、200μlの5M NaClを溶液に加えて十分に混合し、次いで160μlのCTAB/NaCl溶液(0.7M NaCl中10% CTAB)を混合した。この混合物を次に65℃で10分間インキュベートした。このサンプルを等容量のクロロホルム/イソアミルアルコールで抽出した後、等容量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールで抽出した。0.6容量のイソプロパノールおよび1/10容量の5M酢酸ナトリウムを用いて溶液からゲノムDNAを沈殿させた。このDNAペレットをエタノールで洗浄して風乾させた後、TEバッファーに再懸濁させた。
【００６６】
PCRプライマーは合成されたものをSigma-Genosys (Castle Hill, NSW, Australia)から購入した。基本PCRプロトコールを以下に示す。50μlのPCRのすべての反応成分は、1Xバッファー、200μMのdNTPs、50pmolの各プライマー、1ユニットのDeep Vent DNAポリメラーゼ、50pmolのゲノムDNA鋳型(プラスミドでは25pmol)を含み、ヌクレアーゼフリー水で50μlとし、PCRは0.2mlの試験管でThermo Hybaid (Ashford, Middlesex, UK)製のGradient PCR Express Thermalcyclerにて行った。minCDE遺伝子クラスターを得るためのPCR条件を以下に示す：94℃で4分間；次に94℃で35秒間、60℃で30秒間、72℃で2.5分間を30サイクル；その後、最終サイクルとして94℃で35秒間、60℃で35秒間、72℃で5分間。ΔminCDEカセットを得るためのPCR条件を以下に示す：94℃で4分間；次に94℃で35秒間、60℃で30秒間、72℃で2分間を30サイクル；その後、最終サイクルとして94℃で35秒間、60℃で35秒間、72℃で4分間。ΔminCDE::Cmlカセットを得るためのPCR条件を以下に示す：94℃で4分間；次に94℃で35秒間、60℃で30秒間、72℃で3分間を30サイクル；その後、最終サイクルとして94℃で35秒間、60℃で35秒間、72℃で6分間。
【００６７】
用いた標準的な分子生物学プロトコールはSambrook ら(1989)およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley & Sons, Inc., NJ, USA)に記載されている。
【００６８】
得られたミニ細胞はLeica Model DMLB光学顕微鏡を用い、Leica DCカメラおよびLeica IM画像マネージメントソフトウエアによる画像解析で顕微鏡学的定量を行った。サンプルは暗視野顕微鏡を用いて40倍、または油浸では100倍で観察した。スライドグラス上のカバースリップは1.5%アガロースで封止した。容積の10%をトリプチケースダイズ寒天プレート上にプレーティングし、37℃で一晩インキュベートして各バッチのミニ細胞の純度を測定した。この方法により通常109個のミニ細胞につき1個の混入細胞という非常に高い純度が得られた。このミニ細胞懸濁液を、その親細菌が感受性であることが判定された適当な抗生物質とともにTSB中に再懸濁させ、培養物を37℃で4時間振盪しながらインキュベートし、残存している親細菌をすべて死滅させた。例えば、ネズミチフス菌minCDE株はアンピシリンに対し感受性であると判定されているので、このミニ細胞懸濁液を50μg/mlのアンピシリンを含有するTSB中で4時間インキュベートして、残存している細菌があればそれを確実に死滅させた。次にこのミニ細胞を10,000gで30分間遠心分離して回収し、1XBSGバッファー中で4回洗浄し(増殖培地を除去するため)、以降の実験のために所望の容量で再懸濁した。
【００６９】
[A]ネズミチフス菌の2つの異なる菌株からのミニ細胞産生菌株の作出
プラスミド構成の概略図を図2に示す。使用した細菌株、プラスミドおよびPCRプライマーをそれぞれ表1、2および3に示す。
【００７０】
FASTA解析法(Pearson and Lipman, 1988)により、大腸菌のminCDE遺伝子配列(Mori(1996)参照)を使用し、相同なDNA配列についてGenbankデータベースを検索した。ネズミチフス菌ゲノム(CT18)のTYPN3コンティグ101 DNA配列が大腸菌のminCDE配列と相同であることがわかった。これらのデータをもとにオリゴヌクレオチドプライマーENOL001およびENOL002を設計し、これらを用いてネズミチフス菌株ENIh008からEcoRI-minCDE-HindIII断片として完全なminCDE遺伝子の合成を開始させた。
【００７１】
この断片をpNEB193のEcoRI/HindIII部位へクローニングし、pEN001として表されるプラスミドを作製し、それを大腸菌株JM109中で増殖させてENE001株を得た。プライマーENOL003およびENOL004はpEN001中のminCDEカセットから全部で1081bpの配列を欠失させ、さらに同時に、今後1以上のマーカー遺伝子を挿入するための場所として固有のKpnI、SmaIおよびXbaI制限部位を含む16塩基対(bp)を挿入するよう設計した。
【００７２】
この欠失配列には、minC遺伝子の3'末端からの386塩基対、minD遺伝子の上流の23塩基対の介在配列およびminD遺伝子の5'末端からの672塩基対が含まれていた。この結果、プラスミドpEN002中のΔminCDE欠失カセット(755塩基対)がENE003株に含まれることとなった。pHSG415由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子(表2、図2)、1330塩基対HaeII断片/平滑末端)をpEN002のSmaI部位にクローニングして、右回りの方向にクローニングされたCmlR遺伝子とともにΔminCDE::CmlR欠失カセットを持つプラスミドpEN003を得た。これをENE006株とした。
【表２】
2005505296.tif 000003
【００７３】
2005505296.tif 000004
【００７４】
このΔminCDE::CmlR欠失カセットをプライマーENOL001およびENOL002を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりプラスミドpEN003から増幅し、平滑末端とし、自殺プラスミドpGP704(図2、表2)のSmaI部位にクローニングした。このpEN005と表されるプラスミドをENIh001株(SM10λpir；表1)へ形質転換し、菌株番号ENE007を得た。コンジュゲーション(フィルター接合)実験において、菌株ENE007をドナー株とし、ネズミチフス菌株ENIh007およびENSm083(表1)をレシピエント株として使用した。ドナー株およびレシピエント株の静置培養物をTSB中、37℃で一番増殖させた。フィルター接合コンジュゲーションではTSAプレート上のHybond N+メンブラン上でドナー：レシピエント比1:3で培養物を混合し、37℃で8時間インキュベートした。この細胞を回収して滅菌生理食塩水で2回洗浄した。細胞ペレットを生理食塩水に再懸濁させ、150mmのペトリ皿にプレーティングした。このプレートを37℃で72時間までインキュベートした。
【００７５】
この接合体を、1.5%グルコースおよび30μg/mlのクロラムフェニコールを含むM9最小培地上で選択した。ドナー株はこれらの条件下では特別な栄養要求性のために対比選択されるが、レシピエント株はそのクロラムフェニコール感受性のために増殖できない。従って本実験では、プラスミドによりコードされるクロラムフェニコール耐性を持つネズミチフス菌接合体が選択された。このコロニーをアンピシリン(Amp）またはクロラムフェニコール(Cml)を含有するM9最小培地上に単離株を移植することによりCmlRおよびAmpSといった所望の表現型についてスクリーニングした。CmlRを示したENE007xENIh007コンジュゲーション由来の79個の単離株のうち合計18の単離株がAmpSであることがわかった。同様に、ENE007xENSm083コンジュゲーション由来の56の単離株のうち19個がAmpSでることがわかった。
【００７６】
この単離株の染色体からminCD遺伝子が欠失しているかどうかを判定するために、一晩培養物を暗視野顕微鏡を用いて40倍で可視化した。27の単離株すべてにおいて混合培養物中にミニ細胞が可視化された。すべての単離株にミニ細胞の存在が認められたが、親対照株にはミニ細胞は存在しなかった。精製したミニ細胞を4-0サルモネラ菌体凝集血清(ウサギ)ZC13(Murex Diagnostics, Norcross, Georgia USA)を用いて凝集に関して試験した。
【００７７】
この組換え細菌株を組換えミニ細胞の産生に最適な実験室条件下で増殖させた。Sambrookら (1989)が記載したような標準細菌学的培地を用い、常法により容易に決定できる最適な増殖条件下で細菌を増殖させた。
【００７８】
[B]フレクスナー赤痢菌からのミニ細胞産生株の作出
図3はフレクスナー赤痢菌血清型2b由来のミニ細胞産生株の遺伝学的構築に関連するステップを表す。このクローニングプロトコールは上記のミニ細胞産生ネズミチフス菌株の構築に用いたものと同様であった。
【００７９】
フレクスナー赤痢菌血清型2b(表1)からminCDE遺伝子クラスターをクローニングするために、完全なフレクスナー赤痢菌、血清型2aゲノム配列に関して、進行中の配列決定プロジェクトのデータベース検索に基づいてPCRクローニングプライマーを設計した。フレクスナー赤痢菌血清型2bから精製したゲノムDNA由来の1808bp minCDE遺伝子クラスターを増幅するために、それぞれEcoRIおよびHindIIIテールを持つPCRプライマーENOL059およびENOL060(表3)を用いた。増幅された断片はプラスミドpNEB193(表2)のEcoRIおよびHindIII部位にクローニングし、プラスミドpEN055を得た。インサートDNAを配列決定し、親赤痢菌由来のminCDE DNAであることを確認した。
【表３】
2005505296.tif 000005
【００８０】
2005505296.tif 000006
【００８１】
minCDE遺伝子クラスターにおける欠失は、逆PCR反応においてPCRプライマーENOL062およびENOL063(表3)ならびにプラスミドpEN055を鋳型DNAとして用いて得られた。これにより、271bp(minCの3'末端領域)、23bp(minCおよびminDの遺伝子間配列)および608bp(minDの5'末端領域)の欠失が得られた。同時に、KpnI-SmaI-XbaI制限部位を持つPCRプライマー配列を複数のクローニング部位に挿入した。このPCR産物をSmaIで消化して再連結し、プラスミドpEN056を作製した。
【００８２】
CmlRマーカーはプラスミドpHSG415(表2)から1330bpのHaeII断片としてゲル精製し、T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑末端とし、プラスミドpEN056のSmaI部位へクローニングした。この新しいΔminCDE::CmlRプラスミドをpEN057と表した。
【００８３】
ΔminCDE::CmlRカセットはプライマーENOL059およびENOL060(表3)を用いて、またプラスミドpEN057を鋳型として用いてPCRにより得た。2,272bp断片を平滑末端処理し、自殺プラスミドpGP704(表2)のEcoRV部位へクローニングした。この新しい自殺プラスミドはpEN060と表し、これを持つSM10λpir株をENE105と表した。
【００８４】
ENE105由来のプラスミドpEN060をフレクスナー赤痢菌株ENSf001(表1)に導入するためにレシピエント:ドナー比5:1でフィルター接合コンジュゲーションを用い、レシピエントおよびドナーの一晩培養物(静置増殖)を計算された比率でTSAプレート上のHybond N+メンブラン上で混合し、37℃で一晩インキュベートした。この細胞を回収して2回洗浄した後、栄養補助剤および30μg/mlのクロラムフェニコールを含有する最小選択培地にプレーティングした。ドナーおよびレシピエントは栄養要求性(ドナー)または抗生物質感受性(レシピエント)いずれかのためにこの培地上では増殖できず、従って見出されるコロニーは接合体であるはずである。32の単離株を選び取り、栄養補助剤および30μg/mlのクロラムフェニコールを含有する新しい最小培地プレート上に移植した。
【００８５】
この32の接合体を37℃で一晩インキュベートした後、栄養補助剤および100μg/mlのアンピシリンを含有する新しい最小培地プレート上に移植し、次いで37℃で24〜48時間インキュベートした。32の単離株はすべて、アンピシリン上で増殖可能であり、完全なプラスミドが組み込まれたことを示した。各単離株を暗視野顕微鏡下(40倍)または油浸下(100倍)で検査した。これらの単離株のうち3株にミニ細胞の存在が認められた。この単離株が赤痢菌であって大腸菌ドナーではないことを確認するために、単離株を30μg/mlのクロラムフェニコールを含有するXLDプレート上に線条接種した。またこの単離株は、フレクスナー赤痢菌凝集血清(BIODESIGN International, Saco, Maine, USA)を用いて検査したところ、強い陽性凝集反応を示した。プラスミド精製およびゲル電気泳動分析により、ドナープラスミドは接合体にはエピソームとして存在しないことが確認された。
【００８６】
[C]大腸菌からのミニ細胞産生菌株の作出
大腸菌と赤痢菌ゲノムの間に98%の遺伝子相同性があるとすれば、この試験の目的は、特にゲノム配列が近縁である場合、ミニ細胞産生菌株を作出するために異種ΔminCDE遺伝子配列を使用できるかどうかを決定することである。このため、フィルター接合コンジュゲーションを用いてENE105(表1)由来のプラスミドpEN060(フレクスナー赤痢菌2a由来のΔminCDE::CmlRを持つ；図3)を大腸菌株ENIh003(JM109;表1)に、レシピエント:ドナー比3:1で導入した。レシピエントおよびドナーの一晩培養物(静置増殖)を計算された比率でTSAプレート上のHybond N+メンブラン上で混合し、37℃で一晩インキュベートした。この細胞を回収して2回洗浄した後、栄養補助剤および30μg/mlのクロラムフェニコールを含有する最小選択培地にプレーティングした。ドナーおよびレシピエントは栄養要求性(ドナー)または抗生物質感受性(レシピエント)いずれかのためにこの培地上では増殖できない。106の単離株を選び取り、栄養補助剤および30μg/mlのクロラムフェニコールを含有する新しい最小培地プレート上に移植した。37℃で一晩インキュベートした後、この単離株を栄養補助剤および100μg/mlのアンピシリンを含有する新しい最小培地プレート上に移植し、37℃で24〜48時間インキュベートした。106の単離株はすべて、アンピシリン上で増殖可能であり、完全なプラスミドが組み込まれたことを示した。24の単離株を暗視野顕微鏡下(40倍)または油浸下(100倍)で観察した。6個の単離株に多数のミニ細胞の存在が認められた。過去においてミニ細胞産生細菌株を作出するために多数のさまざまな全般的突然変異および部位特異的突然変異誘発プロトコールが用いられてきたが、本発明は初めて、本試験で用いた独特のクローニング/部位特異的突然変異誘発プロトコールの用途が広く、一定の範囲のグラム陰性菌およびグラム陽性菌からのミニ細胞産生菌株の作出に確実に使用できることを実証した(下記の実施例2)。
【００８７】
実施例２  リステリア菌からのミニ細胞の作出
グラム陽性菌由来のミニ細胞産生細菌株は、本実施例に記載するようにして作出できる。プラスミド構成の概略図を図4に示す。細菌株、プラスミドおよびPCRプライマーはそれぞれ表1、表2および表3に記載する。
【００８８】
リステリア菌のゲノム由来のminCD遺伝子をクローニングするために、プライマーENOL038およびENOL048(表3)を用いてPCRを行い、リステリア菌のゲノムDNAを鋳型として精製した。PCR反応は50μlの容量中でPlatinum(登録商標) Pfx DNAポリメラーゼキット(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)を用いて行った。反応物には、1X Pfxバッファー、2 mM MgSO4、0.2 mM dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP、50 pmol の各プライマーおよび1UのPfxポリメラーゼを含めた。サイクル条件は、94℃の変性ステップを2分間；次に94℃で30秒間、55℃で30秒間および68℃で2分間を35サイクル；次に68℃の最終伸長ステップを5分間であった。各PCR反応混合物の2〜5μlサンプルを1%アガロースゲル上で臭化エチジウムにより染色して可視化した。増幅されたminCD断片はアガロースゲルから切り出した後、モデル422エレクトロエルーター(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を製造者の仕様書に従って用いて電気溶出することにより精製した。
【００８９】
minCD断片(1,556bp)をSacIおよびHindIIIで消化してプラスミドpNEB193(表2；図4)のそれぞれの部位に定方向にクローニングした。ENIh003株(表1)中に形質転換された組換えクローンは、制限消化およびゲル電気泳動により同定した。正確なクローン(pEN045と表されるプラスミド)を配列決定し、minCD遺伝子との同一性を確認した。
【００９０】
プラスミドpEN045中のクローニングされたminCD断片を、プライマーENOL039および ENOL040(表3)を用いてPCRにより欠失させた。これらのプライマーはそれぞれ制限部位XbaIおよびKpnIを持ち、これはΔminCおよびΔminD間の選択マーカーのための挿入部位として働く。minCDの欠失のための反応条件および断片の可視化は上記のとおりとしたが、68℃の伸長ステップは4分間であった。次いでΔminCD断片をXbaIおよびKpnIで消化し、モデル422エレクトロエルーターを用いる電気溶出により精製し、選択マーカー連結のための調製物とした。
【００９１】
グラム陽性菌由来の2つの異なる抗生物質選択マーカーを、pEN045中のΔminCおよびΔminD遺伝子の間のKpnIおよびXbaI部位に挿入した。プラスミドpEN062およびpEN063をそれぞれ構築するために、枯草菌プラスミドpMK4(表2)由来のクロラムフェニコール耐性マーカー(CmlR)、およびストレプトミセス・サンギス(Streptomyces sanguis)プラスミドpVA838(表2)由来のエリスロマイシン耐性マーカー(EmR)を使用した(図4)。表2に記載し、図4に示したXbaIおよびKpnI部位を含むオリゴヌクレオチドを用い、各マーカーをPCRにより増幅した。CmRおよび EmRのPCRは上記と同じ反応容量および試薬濃度を用いて行った。サイクル条件は、94℃の変性ステップを2分間；次に94℃で30秒間、55℃で1分間および68℃で2分間を35サイクル；次に68℃の伸長ステップを5分間であった。使用説明書に従いMinEluteキット(Qiagen Inc, Victoria, Australia)を用いてPCR断片をゲル精製した。次にCmRおよび EmRをKpnIおよびXbaIで消化し、MinEluteカラムで精製し、pEN045中のΔminCおよびΔminD遺伝子間のそれぞれの部位へ連結した。JM109組換え体は、酵素EcoRIおよびDdeI(CmR)、ならびにEcoRIおよびAvaI(EmR)で制限消化することにより同定し、それぞれ単離株ENE110およびENE112を得た。
【００９２】
リステリア菌および大腸菌SM10λpir (ENIh001)間のコンジュゲーション実験のために、接合性プラスミドpGP704を用いて4つの新しいプラスミドを構築した。このプラスミドpGP704はneo遺伝子によりコードされるカナマイシン耐性マーカー(KmR)、またはKmRならびにグラム陽性菌でのプラスミド複製のためのoriのいずれかを含むように改変した。前者はグラム陽性複製起点がない場合に自殺プラスミドとして作用し、neo遺伝子(KmR)はプラスミドの存在を示すマーカーとして働く。これに対し後者はコンジュゲーション実験の陽性対照としての役割を果たす。
【００９３】
neo遺伝子を含むDNAセグメントおよびグラム陽性oriを含むneo遺伝子は、表3に記載したオリゴヌクレオチドのセットを用いてpRB373からPCRにより増幅した。PCR反応容量および試薬濃度は上記の通りとした。サイクル条件は、94℃の変性ステップを2分間；次に94℃で30秒間、56℃で1分間および68℃で2分間を35サイクル；次に68℃の長い伸長ステップを5分間とした。MinEluteカラムを用いてアガロースゲルから産物を精製した。neo遺伝子およびneo遺伝子+グラム陽性oriを含む断片はEcoRIで切断し、pGP704(図4)のEcoRI部位に連結させた。このようにしてpEN064およびpEN066と表されるプラスミドを得た。
【００９４】
次に、それぞれpEN062およびpEN063からSacI-HindIII断片としてΔminCD::CmlRまたはΔminCD::EmRを切り取り、平滑末端とし、プラスミドpEN064およびpEN066のEcoRV部位に連結し、図4に示したように4つの異なるプラスミドpEN069、pEN071、pEN073およびpEN075を得た。この4つのプラスミドをENIh001(大腸菌SM10λ pir)へ形質転換して、それぞれENE124、ENE126、ENE128およびENE130株を得た。従ってENE124はΔminCD::CmlRとneo遺伝子(KmR)を持つプラスミドを含み、ENE126はこれに加えてグラム陽性oriを有する。同様に、ENE128はΔminCD::EmRとneo遺伝子(KmR)を持つプラスミドを含み、ENE130はこれに加えてグラム陽性oriを含んでいた。
【００９５】
リステリア菌(ENLM001)を用いるコンジュゲーション実験に、この4つの株ENE124、ENE126、ENE128およびENE130をドナー株として使用した。コンジュゲーションは、基本的にはTrieu-Cuotら(1991)により記載されているようにして行った。株はすべて中央対数期まで増殖させて、2:1 (レシピエント:ドナー) の比率で混合し、容量1mlとした。コンジュゲーション混合物をBHI中で2回洗浄し、1mlのBHIに再懸濁させた。200μlの容量を、BHIプレート上の0.45μMニトロセルロースメンブランフィルター(Millipore)上にプレーティングして37℃で18時間インキュベートした。インキュベーションの後に、このニトロセルロースメンブランを細長く切り、3mlのBHI中に入れた。フィルターメンブランから細菌細胞を遊離させるために激しく攪拌した。300μlの容量のサンプルをBHI、ナリジクス酸(Nal;50μg/ml)、コリスチン(Col;ポリミキシンE)(10μg/ml)、およびクロラムフェニコール(10μg/ml)またはエリスロマイシン(10μg/ml)のいずれかを含有するより大きなプレートにプレーティングした。このプレートを37℃で48時間インキュベートした後、コロニーを採取した。
【００９６】
抗生物質感受性試験を目的に、このコロニーをカナマイシン(15μg/ml)を含有するBHI/Nal/Colプレート、ならびにBHI/Nal/Colおよびクロラムフェニコール(10μg/ml)またはエリスロマイシン(10μg/ml)のいずれかを含有するプレートに移植した。接合体はすべて、プラスミドの組み込みなしにminCDを欠失した染色体の組み込みを示唆する抗生物質プロフィールを示した。つまり、接合体はすべて内部マーカーであるエリスロマイシンまたはクロラムフェニコールを含有する抗生物質プレートで増殖し、カナマイシン含有プレート上で増殖した接合体はなかった(KmRはドナープラスミド上のneo遺伝子によりコードされる)。
【００９７】
暗視野顕微鏡(40倍)および油浸(100倍)を用いてミニ細胞表現型に関して100を超える接合体を検査した。単離株はすべて、顕微鏡下で親細胞と比較した場合にリステリア菌親桿菌の集団中でさまざまな数のミニ細胞構造体を示した(ENIh001およびENLm001)。また、この結果はminCD欠失の組み込み、および正常な中心周辺分裂の阻害と一致している。
【００９８】
30個の接合体を選択および継代培養し、ミニ細胞表現型の維持に関して試験を行った。表現型が維持されることが確認されたため、これらの単離株をグリセロールストックとして今後の試験のために保存した。
【００９９】
実施例３  細菌種からのミニ細胞の精製
ミニ細胞を以下の発明による方法により精製した。この実施例ではネズミチフス菌minCDE-に由来するミニ細胞について詳述する。同様の手順は、ネズミチフス菌の2つの突然変異株、ならびに大腸菌、フレクスナー赤痢菌およびリステリア菌それぞれの1つの突然変異株を含む、さらなるmin突然変異株からミニ細胞を精製するためにも用いた。この工程を至適化し、50回を超えて繰り返して精製ミニ細胞を作出した。この方法は確実であり、通常、細菌培養液10リットルから108〜109個の精製ミニ細胞を産生した。
【０１００】
抗生物質クロラムフェニコールおよびカナマイシン(最終濃度50μg/ml)を含有する50mlのTSB中のグリセロールストックからネズミチフス菌minCDE-/pEGFP-C1培養液を調製した。この培養液を振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。この一晩培養物の2.5mlアリコートを上記の抗生物質を含有する1LのTSB(2Lのバッフルコニカルフラスコ中)に接種し、5個のフラスコを振盪しながら37℃で一晩インキュベートした。
【０１０１】
(A)前準備(ステージ1)
0.2μmのフィルターを介した滅菌ホースを用いてタイプIの水(MQ)を100Lのバイオプロセスバッグに入れた。あらかじめオートクレーブ処理し、2Lの10XBSGを入れた2個の20Lカーボイ中に18Lの滅菌処理水を蠕動ポンプを用いて移した。一方のカーボイはミニ細胞懸濁液の希釈用で、もう一方はジアフィルトレーションで使用した。
【０１０２】
(B)分画遠心分離および前準備(ステージ2)
細菌培養液を2000gで10分間遠心分離した(Sorvall Legend T/RT; TTH 750ローター)。その上清を、0.2μmのブリーザフィルターおよびクイック・ディスコネクト・フィッティングを取り付けた滅菌済の5Lカーボイ中にデカントした。デカンテーション手順はクラスIIバイオハザードキャビネット内で行った。このカーボイを密封し、滅菌チューブをこの5Lカーボイに接続し、そのチューブの他端を上記のようにあらかじめ20Lの1XBSGで満たした20Lカーボイに接続した。ミニ細胞を含む懸濁液を5Lカーボイから20Lカーボイに注入し、1:5の希釈を行った。
【０１０３】
(C)連続ミニ細胞精製システム
Sartorius社製の 3つのクロスフローシステムを直列に接続した。二反復で、0.45μmのSartoconスライスカセットフィルターを最初の2つのスライスホルダーにはめ込み、0.2μmのSartoconスライスフィルターカセットを最後のホルダーにはめ込んだ。各フィルターユニットのねじれをトーションレンチを用いて20Nm(ニュートンメーター)まで締めた。各ユニットをサニタリーエレメントを介してポンプに取り付けた。供給流ライン、保持流ラインおよび透過流ラインを接続した。カーボイを取り付ける前に、システム全体の内部を6Lの1N NaOHを用い、圧力2バールで15分間洗浄した。このステップで種々のホースおよびフィルターの内部を殺菌した。液体を逆に流すことによりシステムからNaOHを排出させ、適切なフィルタークリーニングを確保するため水流量テストを行った。このテストは使用説明書(Sartoriusのマニュアル)に従って行った。ミニ細胞の濾過を行う前に、保持流については3,000〜3,600ml/分、透過流については600〜800ml/分の許容流量を確保した。このシステムのpHが依然として高かったため、PBSプールの測定pHが7.0〜8.0の範囲になるまで滅菌1XPBS(pH7.4)で各システムを洗い流し、再循環させて中和した。次にカーボイ(20L)を接続した。ホースを通して第1の0.45μmのフィルターカセットに接続されている第1のカーボイにミニ細胞懸濁液(25L)を入れた。フィルターの汚染を防ぐために、濾過ステップが進行するにつれてミニ細胞懸濁液を希釈した(すなわち、ジアフィルトレーション)。この希釈液(20Lの1XBSG)を第2のカーボイに入れた。よって、第1のクロスフロー濾過ステップにおいて、ミニ細胞懸濁液は45Lの量で濾過された。透過バルブは最初閉じてあり、ミニ細胞懸濁液が0.45μmのフィルター表面を通して圧力2バールで5分間注入された。これがミニ細胞懸濁液培地に対するフィルターのコンディショニングとなった。次に透過バルブを開いてミニ細胞懸濁液を0.45μmのフィルターを透過させ(圧力2バール、600ml/分)、透過流は第3のカーボイに回収した。第1のカーボイ中の容積が減少するにつれて、濾過されなかった固形物量が増加し、第1のカーボイ中の容積が15Lにまで減った時にジアフィルトレーションのスイッチを入れた。これにより第1のカーボイ中の固形物が希釈されて、フィルターが汚れるのを防ぎ、第3のカーボイにおけるミニ細胞の回収を最大限にする。ひと度、第3のカーボイ中の透過液の容積が約12.5Lに達すると、第2の0.45μmクロスフローフィルターが第3のカーボイ中に見られるミニ細胞懸濁液に対してコンディショニングされた。第3のカーボイ中の容積が15Lのマークに達した時、透過バルブが開いてミニ細胞懸濁液を第4のカーボイへと透過させる。
【０１０４】
この段階で、ミニ細胞懸濁液中の、より大きな親細菌細胞混入物が除去された。次の段階では細菌小胞、遊離内毒素、核酸、細胞残渣のような懸濁液中のより小さい混入物および過剰な液体を取り除いた。これは、0.2μmのクロスフローフィルター通す濾過により行った。ミニ細胞は直径約0.4μmであり、従って0.2μmの孔径は通過しない。一方、細菌小胞の大きさ(直径)は0.05μm〜0.2μmの範囲であるので、濾去される。他の混入物も0.2μm未満であるので、この濾過ステップで保持される唯一の成分はミニ細胞および残留親細菌細胞であった。
【０１０５】
第4のカーボイ中の容積が約15Lに達した時に、0.2μmクロスフローフィルターが第4のカーボイ中に存在するミニ細胞懸濁液に対してコンディショニングされた。次いで透過バルブが開いて廃液を第5のカーボイへと透過し、ミニ細胞は第4のカーボイ中に残り、濃縮された。ジアフィルトレーションシステムを取り入れたことにより、ミニ細胞は絶えず希釈および濾過され、この工程の最後には混入物が確実に完全に除去された。従ってこの濃縮ステップによりミニ細胞懸濁液の容積は開始時の容積45Lから約4Lに減少した。
【０１０６】
(D)ミニ細胞懸濁液のバッファー交換
ミニ細胞懸濁液中の残留塩、培地成分および低分子量廃棄物は1XBSGを用いるジアフィルトレーションにより除去された。この装置は上記のように取り付けて平衡化した。ミニ細胞懸濁液を第1の4Lカーボイに入れ、第2のカーボイには20Lの滅菌1XBSG(ジアフィルトレーション媒体)を入れた。クロスフローユニットを2つの0.1μmフィルターカセットとともに取り付けて、ミニ細胞は通過できないが0.1μm未満の混入物は確実に除去されるようにした。ポンプのスイッチを入れ、0.5バールの圧力がかかるようにスピードを調節した。透過バルブを開いてミニ細胞懸濁液を供給流ラインに流し、0.1μmのフィルターに通した。ミニ細胞は保持流ラインを通って第1のカーボイに戻した。廃液は透過流ラインを通して流し、第3のカーボイに回収した。これによりミニ細胞懸濁液の容積は減少し、そのためジアフィルトレーションシステムのスイッチが入って1XBSGが第1のカーボイに注入された。このステップではミニ細胞懸濁液の容積が4Lに保たれるよう、継続的に補充した。この手順は第2のカーボイが空になるまで続けられ、その結果ミニ細胞懸濁液バッファーは5回交換された。
【０１０７】
(E)ミニ細胞懸濁液の滅菌濾過
0.45μmクロスフローフィルターは滅菌フィルターではないため、この段階ではミニ細胞懸濁液にはまだ若干の親細菌混入物がある。よってin vitroおよびin vivoの使用に最適なミニ細胞懸濁液を得るためには残留親細菌を除去することが重要であった。従前のステップにより得られた4Lのミニ細胞懸濁液をまず滅菌1XBSFGで20Lに希釈し、第1のカーボイ中に保持した。表面積の大きい(500 cm2)0.45μmのフィルターを有するデッドエンドフィルターユニットを、2Lの滅菌1XBSGによりあらかじめ湿らせておき、使用説明書に従って完全性をテストした。ミニ細胞懸濁液を流速700ml/分(すなわち、親細菌細胞が0.45μmのフィルターを押し通らない低流速)で、デッドエンドフィルターを通して注入した。細菌細胞はフィルターにより保持されたが、ミニ細胞は濾過ラインを通って第2のカーボイに流れ込んだ。
【０１０８】
(F)精製されたミニ細胞の濃縮
20L懸濁液中の精製されたミニ細胞をさらに小さい容積へと濃縮した。しかし、このステップは、容積が大きいため標準的な遠心分離とペレットの再懸濁技術により簡単に行えるものではなく、実際には遠心分離技術は用いなかった。
【０１０９】
濃縮ステップは下記の4段階に従って行った。
【０１１０】
ステージ1：ミニ細胞懸濁液を圧力0.5バールで第1のカーボイからサニタリーエレメントを通じて100kDaのクロスフローフィルターを通過させる。ミニ細胞は保持流ラインを通って第1のカーボイへ戻り、透過液は透過液液排出ラインを通って第2のカーボイへ回収された。
【０１１１】
ステージ2：ミニ細胞懸濁液の容積が4Lに減少したところで、工程を止めて懸濁液を第3の滅菌4Lカーボイへ移した。後者には、上記のようなより大きな容積を扱うのに用いられる12.5mmのホースに比べて小さい直径6.4mmのホースを取り付けた。これによりチューブ中のボイド容量が減少した。供給流ラインおよび保持流ラインは直径12.5mmのチューブであるため、アダプターはリッド・クロージャ中でホースに合わせるよう設計されていた。同様に、アダプターは供給流ラインおよび保持流ラインのより大きな口径のチューブに合うように設計されていた。この第2の濃縮段階は前段階と同様にミニ細胞の容積がさらに約200mlに減るまで行った。
【０１１２】
ステージ3：供給流および保持流のための滅菌内面ガラスチューブを含む改変ショットボトルに200mlのミニ細胞懸濁液を移した。ガラスチューブはショットボトルのキャップを貫通し、Marpreneチューブおよびシリコンで密閉されていた。また、ボトルのキャップの上にはブリーザフィルター(0.2μm)が付いていた。さらにボイド容量を減らすために、従前に使用した供給、サニタリーエレメントおよび保持流チューブを滅菌6.4mm Maepreneチューブに替え、従前に使用したポンプはより小さいものに替えた。前回と同様に(100kDAクロスフローフィルター)、ミニ細胞の容積が50mlに減るまで濃縮プロセスを行った。
【０１１３】
ステージ4：高度に精製されたミニ細胞懸濁液を無菌条件下で50mlのFalcon試験管中に移した。
【０１１４】
実施例４  グラム陰性およびグラム陽性minCD-株由来ミニ細胞の走査型電子顕微鏡による同定
ネズミチフス菌、大腸菌、フレクスナー赤痢菌、リステリア菌および相当する親細胞由来のミニ細胞の走査型(SEM)および透過型(TEM)電子顕微鏡写真を撮影し、種々のミニ細胞の形態および大きさを測定した。要するに、ミニ細胞を含む細菌培養液を13,200rpmで20分間遠心分離し、2.5%グルタルアルデヒドを含有するPBSに再懸濁させ、室温で40分間固定した。サンプルを遠心分離して蒸留水中で3回洗浄した。TEMのためには、下記の手順を行った。溶液を交換するために細胞を10,000rpmで1分間遠心分離し、その上清をピペットで取り除いた後、細胞をボルテックスミキサーを用いて新しい試薬中に再懸濁させた。試薬の順序は：(a)0.1Mのカコジル酸バッファー(pH7.2)中、酸化オスミウム−10分間、(b)蒸留水中4%酢酸ナトリウム−1分間、(c)蒸留水中4%酢酸ウラシル−5分間、(d)70%エタノール−5分間、(e)100%エタノール−5分間、(f)100%アセトン−5分間、(g)1:1アセトンおよびSpurrのエポキシ樹脂単量体−30分間、(h)純粋なSpurrのエポキシ樹脂−60℃で48時間硬化、であった。硬化した樹脂ブロックをReichert Ultracut E ultramicrotomeを用いてダイヤモンドナイフで切片を切り出した。切片を酢酸ウラニルで10分間、次いでクエン酸鉛で2分間染色した。Hitachi H-7000透過型電子顕微鏡をビームエネルギー75キロボルトで操作して切片を検査した(University of New South Wales, NSW, Australia)。デジタル画像はAnalySis MegaView II広視野CCDカメラを用いて記録した。
【０１１５】
高分解能走査型電子顕微鏡に関しては、下記の方法に従った。溶液を交換するために細胞を13,000rpmで20分間遠心分離し、その上清をピペットで取り除き、細胞をボルテックスミキサーを用いて新しい試薬中に再懸濁させた。この目的は、細胞からイオンおよび生体物質をすべて洗い流し、少量の蒸留水に細胞を懸濁させることであった。試薬の順序は(a)蒸留水1ml−再沈殿、(b)蒸留水1ml−再懸濁、(c)250μlを無菌真鍮製試料プレートにのせる、(d)30℃で一晩乾燥させる、(e)顕微鏡検査の直前にXenosput無菌真空スパッターコーター中で2nmの金属クロムを蒸着させてコーティングする、であった。Hitachi S-900電界放射走査型電子顕微鏡をビームエネルギー3キロボルトで用いてメッキされた試料を検査した(University of New South Wales, NSW, Australia)。ImageSlaveデジタイザーを用いてさまざまな倍率のデジタル画像を記録した。
【０１１６】
その結果、グラム陰性菌およびグラム陽性菌双方由来のミニ細胞は直径約400nmであり、リステリア菌以外は、SEMにより観察されたように、おそらくリポ多糖体細胞表面構造のために波立った表面を呈していた。すべての種に関して、ミニ細胞と親細菌の表面の超微細構造に明らかな違いはなかった。TEMの結果は、リステリア菌のミニ細胞はグラム陽性菌細胞膜について予測される堅い細胞壁構造を有していることを示した。サルモネラ菌、フレクスナー赤痢菌、および大腸菌膜は顕微鏡電子ビーム下でより簡単に崩壊した。ミニ細胞の形成、すなわち非対称性細胞分裂はすべてのサンプルにおいて認められた。
【０１１７】
実施例５  マクロファージのような哺乳動物細胞によるミニ細胞の取り込み
マクロファージによる組換えミニ細胞の取り込みを証明するためには、まず、組換えミニ細胞が観察でき、哺乳動物細胞と区別できるGFPのようなトレーサーを組み込むことが必要であった。従って、ミニ細胞が安定してEGFPおよび緑色蛍光を有するかどうか判定するために、プラスミドpEGFPをネズミチフス菌、大腸菌およびフレクスナー赤痢菌のminCDE-ミニ細胞産生株に形質転換した。
【０１１８】
プラスミドpEGFP(表2)は、lacプロモーター由来の、野生型緑色蛍光タンパク質（EGFP;励起極大:488nm；発光極大:507nm)の赤色側にシフトした変異株を発現する細菌発現プラスミドである。プラスミドの骨格はpUC19誘導体であるpPD16.43(Fireら、1990)であり、これは細菌細胞内の増殖および選択のため、高コピー数の複製起点とアンピシリン耐性遺伝子を提供する。このプラスミドをネズミチフス菌、大腸菌およびフレクスナー赤痢菌minCDE-株へ形質転換し、組換え細菌を脳心臓滲出物ブロス(BHI; Difco Laboratories, Detroit, Michigan USA)中で、OD600が0.6に達するまで増殖させた。このミニ細胞を混合培養物から単離して精製し、蛍光顕微鏡検査で可視化した(蛍光顕微鏡 DMLM, Leica Microsystems)。その結果、ミニ細胞はすべて明るい緑色の蛍光を発したが、非組換えネズミチフス菌、大腸菌およびフレクスナー赤痢菌minCDE-株(対照)から精製したミニ細胞は緑色蛍光を示さなかったことが明らかとなった。保存されたミニ細胞(4℃および室温)を30分間、1時間、6時間、12時間、18時間、24時間、2日間、1週間および2週間の時間間隔で蛍光顕微鏡により観察した。その結果、ミニ細胞は完全であり、試験期間を通じて明緑色の蛍光を発し続けることが示された。よって、プラスミドpEGFPは、マクロファージのような哺乳動物細胞、および癌細胞のような他の細胞による組換えミニ細胞の取り込みを追跡するためのトレーサー(緑色蛍光を発するミニ細胞)を提供した。これらの結果から、ひと度発現され、またはミニ細胞中に隔離された組換えタンパク質は、染色体によりコードされるプロテアーゼがないためにかなりの期間(おそらくミニ細胞の完全性が損なわれるまで)安定であることを示唆している。
【０１１９】
American Type Culture Collection (ATCC)から入手したマウスマクロファージ細胞系RAW264.7 (Ralph & Nakoinz, 1977)をin vitroで細胞密度105 個/ウェルで培養し、ネズミチフス菌、大腸菌およびフレクスナー赤痢菌由来のプラスミドpEGFPを有する精製組換えミニ細胞を、ミニ細胞:マクロファージ比50:1および100:1で感染させた。
【０１２０】
マクロファージ感染に先立ち、精製ミニ細胞を蛍光顕微鏡で可視化して大部分のミニ細胞がEGFPを有しており、明緑色蛍光を発していることを確認した。陽性対照として、同じプラスミドを有するネズミチフス菌aroA-SL3261株(表1)を、マクロファージ細胞をトランスフェクトするために同様の細菌:マクロファージ比で用いた。陰性対照(非感染マクロファージ)も、実験的感染細胞と同じ方法で処理した。この培養プレートを37℃にて1000gで10分間遠心分離した。ミニ細胞トランスフェクション試験については、残留する親の生細菌細胞を死滅させるために抗生物質ゲンタマイシン(100μg/ml)およびアンピシリン(200μg/ml)を加えた。陽性対照のサルモネラ菌も同様の抗生物質処理により死滅させた。プレートを5% CO2下 37℃で30分間インキュベートし、次いでPBS中で3回洗浄した。ネズミチフス菌由来ミニ細胞/マクロファージ実験については、スライドを4%ホルムアルデヒドで40分間固定し、次に0.2% Triton X-100を用いて透過処理した。5%BSAを含有するリン酸バッファー中の5%正常ヤギ血清(NGS)で非特異的染色をブロックした後、このカバースリップを抗リポ多糖(LPS)抗体(ウサギ4-Oサルモネラ菌体凝集血清;1:200希釈; Murex Biotech, Dartford, England)とともに室温で4時間インキュベートした。この細胞をPBS中で3回洗浄し、二次抗体(1:1000), Alexa Fluor 594(Molecular Probes, Eugene, OR, USA;ヤギ抗マウスIgG コンジュゲート、励起:590nm、発光:617nm)とともにPBS-BSA中でインキュベートした。プレートは二次抗体とともに暗所で1時間インキュベートし、PBSを用いて5分間ずつ3回洗浄した。カバースリップをグリセロールでマウントし、共焦点顕微鏡で観察した。
【０１２１】
その結果から、ネズミチフス菌、大腸菌およびフレクスナー赤痢菌由来ミニ細胞はすべて、培養物中の約20%〜30%のマクロファージ細胞により包み込まれた。ミニ細胞は明緑色の蛍光を発し、それはマクロファージと関連していた。対照の非組換えネズミチフス菌、大腸菌およびフレクスナー赤痢菌由来ミニ細胞では、弱い非特異的なバックグラウンド蛍光以外、マクロファージに関連する緑色蛍光点は認められなかった。対照の組換えネズミチフス菌aroA株も、組換えミニ細胞双方で見られたものと同様の結果であった。
【０１２２】
緑色蛍光点がマクロファージ細胞内に存在する、すなわちマクロファージがミニ細胞を包み込んでおり、細胞表面に付着しているだけではないことを確認するために、ネズミチフス菌由来ミニ細胞-マクロファージの相互作用に関して三次元画像(矢状および冠状切片を用いる)を撮影した。冠状および矢状切片双方において、ミニ細胞はマクロファージ内に局在しており、このミニ細胞がマクロファージに包み込まれていることを示した。さらに、緑色蛍光点の抗04LPS標識(二次抗体Alexa Fluor 594による黄色蛍光)により、この緑色蛍光点は、実はEGFP発現ミニ細胞であり、人為的なバックグラウンド蛍光ではなかったことが示された。同様の結果が陽性対照サルモネラ菌でも観察され、これによりマクロファージによる受容体に媒介される細胞の取り込みに必要な細菌表面構造がミニ細胞表面に保存されていることが示された。
【０１２３】
実施例６  マクロファージのファゴリソソームにおけるミニ細胞の取り込みおよび分解
マクロファージ内でのミニ細胞の細胞内運命を明らかにするために、ネズミチフス菌由来ミニ細胞を感染させたマウスマクロファージに対してTEM試験を行った。
【０１２４】
要するに、マウスマクロファージ細胞系RAW246.7を、T25フラスコにて標準培養液中で集密度が50%になるまで増殖させた。100μｌ中の107個オーダーのミニ細胞を直接フラスコ中の培地に加え、マクロファージ感染の処理を実施例5に記載のように行った。ミニ細胞:マクロファージのおおよその比は10:1とした。感染後30分、60分および2時間に相当する時点で細胞を回収した。ミニ細胞を含まないさらなるフラスコも陰性対照として含めた。細胞をトリプシン処理し、ペレットを回収し、4%グルタルアルデヒド(500μl)中で固定した。サンプルを処理し、TEMにより分析した(University of New South Wales, Sydney, Australia)。
【０１２５】
この結果、早ければ感染後30分にほぼミニ細胞のサイズ(400nm)の高電子密度粒子がマクロファージの空胞中に認められた(図5、パネルA〜F)。時間の経過とともに(60分および2時間)高電子密度粒子は表面が不規則になり、電子密度が低下し、完全ではなくなってくるように見えた。
【０１２６】
空胞内の高電子密度粒子が包み込まれたミニ細胞であることを確かめるために、上記の実験を下記のように変更して繰り返した。感染後、種々の時間間隔の後に細胞を室温で30分間固定し(4%パラホルムアルデヒド、0.1%グルタルアルデヒド)、PBSで洗浄して細胞をそっとこすり取り、1.5mlのPBS中に回収した。サンプルを免疫金-TEM(EM Unit, ICPMR, Westmead Hospital, Sydney, Australia)のために処理した。サンプルを穏やかに沈殿させ、凍結-置換法により処理した。要するに、このサンプルを一次抗体(抗ネズミチフス菌リポ多糖[因子4、グループB特異性]; Abbott Murex, USA)1:200希釈、次いで金(10nm)コンジュゲート二次抗体で標識した。そのサンプルをPhilips CM-120 BioTWIN電子顕微鏡を用いて80ｋVで観察した。画像は4489型Kodak EMエマルションフィルム上に取り込んだ。
【０１２７】
その結果、ミニ細胞は金標識抗04-LPS抗体によりはっきりと識別され、マクロファージ空胞中に観察された高電子密度粒子はネズミチフス菌由来ミニ細胞であることが示された。ミニ細胞を感染させていない対照マクロファージでは、金標識は認められなかった。またこのデータから、より後の時点においてミニ細胞と会合していない金粒子が空胞内に認められたことも明らかになった。後の時点においてミニ細胞から遊離した金粒子が著しく増加し、また細胞壁の完全性を失い、細胞の電子密度が減少したミニ細胞数の増加も伴っていた。これらのデータは、初期エンドソーム中への異種粒子の摂食に続くエンドソーム−リソソーム融合および酸性ファゴリソソーム中での抗原の分解を含む、マクロファージによって呈される抗原取り込みおよび処理の従来の経路をミニ細胞がたどることを示す。感染後期においてミニ細胞から遊離した金粒子は、処理または消化されたミニ細胞から放出されたLPSを示す可能性がある。
【０１２８】
これらの結果は、組換えミニ細胞がマクロファージのような哺乳動物細胞により包み込まれるだけではなく、細胞内空胞、おそらくファゴリソソーム中で分解されることを示す。
【０１２９】
実施例７  ミニ細胞でトランスフェクトされたマクロファージによる異種タンパク質の発現
EGFPをコードする哺乳動物遺伝子発現プラスミド（細菌細胞またはミニ細胞では発現されない)を有している組換えミニ細胞が哺乳動物細胞の核にプラスミドを送達し、哺乳動物細胞中でEGFPの発現を達成できるかどうかを判定するため、下記の実験を行った。
【０１３０】
実施例5に記載のように、マウスマクロファージ細胞株RAW-264.7をin vitroで培養し、プラスミドpEGFP-C1(表2)を有する、精製組換えネズミチフス菌、大腸菌およびフレクスナー赤痢菌由来のミニ細胞を感染させた。トランスフェクション後48時間に、三次元共焦点顕微鏡により感染細胞を可視化した。
【０１３１】
その結果、約20%のマクロファージが緑色蛍光を発し、組換えミニ細胞はマクロファージ、おそらくファゴリソソーム中で分解され、少なくとも放出されたプラスミドDNAのうちいくらかは緑色蛍光タンパク質を発現する前に細胞核に取り込まれたことが示唆された。対照マクロファージ、すなわち非組換えミニ細胞でトランスフェクトされたマクロファージには緑色蛍光は認められなかった。実験細胞でEGFPが発現するには少なくとも48時間かかる。この結果は、BioRad Genepulserを用いるエレクトロポレーションによりプラスミドpEGFP-C1でトランスフェクトされた陽性対照マクロファージでみられたものと同様であった。
【０１３２】
ミニ細胞でトランスフェクトされたマクロファージ中でのEGFP発現がバックグラウンド蛍光ではなかったことをさらに確認するために、ネズミチフス菌由来のミニ細胞に関して本実験を繰り返した。この場合、ホルムアルデヒドによる固定の後にカバースリップを抗GFPモノクローナル抗体(Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA; 1:300 希釈)とともにインキュベートし、4℃で一晩インキュベートした。このカバースリップをPBSで3回洗浄し(洗浄1回あたり5分間)、PBS/BSA中2%正常ヤギ血清とともに20分間インキュベートした。このカバースリップをPBSで2回洗浄し、PBS中の二次抗体アレクサフルオル(Alexa Fluor)594-抗マウスIgGコンジュゲート(1:1000希釈)で処理した。この反応物を暗所で1時間インキュベートし、PBS中で2回洗浄した。このカバースリップを、赤色(570nm)および緑色(488nm)蛍光可視化フィルターを用いて共焦点顕微鏡により可視化した。その結果から、マクロファージ中に認められる緑色蛍光の点(488nmにおけるレーザー励起)は赤色蛍光の点(570nmにおけるレーザー励起)と同一であることが明らかとなった。両方のレーザーを用いた場合には、緑色および赤色蛍光シグナルが一緒に局在し、黄色蛍光が出現した。さらに、Leica 3D画像ソフトウエアを用いて3D画像を構成した場合には、この蛍光はマクロファージ内に認められた。これらの結果から、抗GFPモノクローナル抗体(赤色蛍光)により同じ点が識別されたため、観察された緑色蛍光点はEGFPタンパク質のマクロファージ発現によるものであったことがわかった。
【０１３３】
この結果から、組換えミニ細胞がマクロファージのような、プラスミドDNAを放出する哺乳動物宿主細胞中で分解し、このDNAが該哺乳動物細胞中で異種タンパク質を発現し得ることが確認された。これは、組換え型の完全なミニ細胞によるin vitro遺伝子療法の実現可能性を示す。
【０１３４】
組換えミニ細胞が患者に投与された後、患者の、例えば発現が赤血球系細胞に特異的である場合は患者の末梢赤血球細胞中の遺伝子産物の適切なアッセイを行うことにより、異種遺伝子産物の存在をモニタリングまたは評価することができる。上記のようにアッセイの選択はある程度異種遺伝子産物と相関関係にあり、容易に測定し得る。
【０１３５】
実施例８  ヒト乳癌細胞における、ミニ細胞媒介遺伝子送達および遺伝子発現
組換えネズミチフス菌minCDE-株から精製され、プラスミドpEGFP-C1(真核細胞における遺伝子発現のみ;表2)を有するミニ細胞をヒト乳癌細胞(SK-BR-3)に感染させた。トランスフェクション後48時間および96時間に、共焦点顕微鏡でこれらの細胞を可視化した。陰性対照として、非組換えミニ細胞を用いてSK-BR-3細胞をトランスフェクトし、実験細胞と同様に可視化した。
【０１３６】
SK-BR-3乳癌細胞(供給元ATCC、参照番号HTB-30)を6ウェルプレート中のカバースリップ上で培養し、集密度が約50%となるまで増殖させた。真核細胞GFP発現プラスミドpEGFP-C1を有するミニ細胞を細胞に加え、1000ｇで10分間遠心分離し、ミニ細胞とSK-BR-3細胞を接触させた。G-418(400mg/ml)を加えた後に(いくつかのウェルにはG-418を加えなかった)細胞を48時間培養した。さらに48時間インキュベートした後、カバースリップをすべて4%ホルムアルデヒドで1時間固定した。このカバースリップをPBS-BSA(PBS中2%BSA）とともに20分間インキュベートし、PBSで1回洗浄した。カバースリップを抗Her-2抗体(Serotec、モノクローナルマウス抗ヒトIgG;1:100希釈)とともに4℃で一晩インキュベートした。この細胞を、PBSで各5分間3回洗浄し、アレクサフルオル（Alexa Fluor)594コンジュゲート二次抗体(Molecular Probe、ヤギ抗マウスIgG コンジュゲート、励起:590nm、発光:617nm; PBS-BSA中1:1000希釈)とともに暗所で1時間インキュベートした。この細胞をPBSで各5分間3回洗浄し、カバースリップを褪色防止剤(Molecular Probe)で処理した。カバースリップはすべて三次元共焦点顕微鏡(赤色フィルターの励起波長:568nmおよび緑色フィルターの励起波長:488nm)で可視化した。
【０１３７】
これらの結果から、約10%の乳癌細胞が明らかに緑色蛍光タンパク質を発現し、これが細胞質に局在していたことが明らかとなった(図6、パネルA〜C参照)。これは、対照細胞により示された通常のバックグラウンド自己蛍光に対し明確に観察できた。細胞は抗Her-2抗体(赤色蛍光)を用いて明確に識別された。
【０１３８】
この結果は、組換えミニ細胞が哺乳動物遺伝子発現プラスミドDNAを、細胞内で異種発現をもたらすような様式で、例えば上皮乳癌細胞のような食細胞ではない細胞へ送達し得ることを示す。
【０１３９】
実施例９  Balb/cマウスにおけるin vivoミニ細胞媒介遺伝子送達および遺伝子発現
組換えミニ細胞がin vivoにおいて免疫系の細胞に外来遺伝子を送達し得るかどうかを判定するために、プラスミドpEGFP-C1(真核細胞における遺伝子発現のみ;表2)を有する組換えネズミチフス菌minCDE-由来ミニ細胞をマウス腹腔内に接種し、同じプラスミドを有するネズミチフス菌ΔaroA株を接種したマウスと比較した。
【０１４０】
実施例3に記載のように組換えミニ細胞を精製した。ネズミチフス菌(SL3261ΔaroA株、表1)を下記のように調製した。5mlのトリプチケースソイブロス(TSB, Becton Dickinson, Palo Alto, CA, USA)にTSB中ネズミチフス菌の一晩培養物の1:100接種材料を接種し、600nmで測定される光学密度(O.D.)が0.5に達するまで振盪しながら37℃で増殖させた。次いでこの細菌を150μl/mlのゲンタマイシン(Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia)および150μl/mlのアンピシリン(Roche)とともに振盪しながら37℃でさらに2時間インキュベートした。
【０１４１】
死菌およびミニ細胞を8000rpmの遠心分離でペレットとし、BSG(リン酸緩衝生理食塩水[PBS;1リットル蒸留水中1.44gmリン酸水素ナトリウム、0.24gmリン酸二水素カリウム、0.2gm 塩化カリウム、8.0g塩化ナトリウム、pH7.4]、2%ゼラチン含有)に再懸濁し、さらに3回洗浄した。
【０１４２】
表4のスケジュールに従って6週齢のBalb/cマウス8匹の各群に100μlの組換えミニ細胞または組換え死滅ネズミチフス菌を腹腔内接種した。マウス8匹の1つの群は陰性対照とし、接種は行わなかった。接種前および初回ワクチン接種14日後にマウスの眼窩採血により採血した。23日目に全動物に12mgのフェノバルビトンナトリウムの腹腔内注射により麻酔し、屠殺前に心臓穿刺により1mlの血液を採取した。この血液を微量遠心管 (Eppendorf, Hamburg, Germany)中で3000rpm、10分間遠心分離し、ELISAアッセイ用に血清を集めた。実験期間を通して1週間に1回動物の体重を測定し、毎日毒性の徴候を観察した。
【表４】
2005505296.tif 000007
【０１４３】
抗体がGFPに対して産生されたかどうか、すなわち組換えミニ細胞が哺乳動物発現プラスミドpEGFP-C1をin vivoで送達できたかどうかを判定するためにELISAアッセイを行った。また、全群のネズミチフス菌リポ多糖(LPS)抗体レベルも測定した。間接的ELISA法を以下のように行った。
【０１４４】
96ウェルマイクロタイタープレート(Greiner GMBH, NYrtingen, Germany)を50μl/ウェルの0.5μg/ml rEGFP(Clontech, Palo Alto, CA, USA)またはLPS抗原(Sigma)で被覆した。陰性対照としてプレートを1%BSA(Sigma)で被覆した。そのプレートを密封して4℃で一晩インキュベートした。抗原溶液を除去するためにプレートを裏返し、200μlのブロッキングバッファー(PBS中0.05%Tween-20[Sigma]、1%BSA)を各ウェルに加えた後、室温で2時間インキュベートした。ブロッキングバッファーを除去し、プレートを洗浄バッファー(0.05% Tween-20, PBS)で5分間、2回洗浄した。ブロッキングバッファー中でそれぞれEFGPに関しては1:80、LPSに関しては1:300で血清サンプルを希釈した。次いで、100μlのサンプルを各ウェルに加え、振盪しながら室温で1時間インキュベートした。次にプレートを洗浄バッファーで5分間、3回洗浄した。二次抗体、すなわちアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート抗マウス免疫グロブリン(γおよびL鎖; Chemicon, Temicula, CA, USA)またはAPコンジュゲート抗LPSモノクローナル抗体(IgG1イソ型、Biodesign International, Saco, Maine, USA)をブロッキングバッファー中で希釈し、ウェルあたり100μlを加え、次いで振盪しながら室温で1時間インキュベートした。ウェルを洗浄バッファーで3回洗浄し、100μlのPNPP(p-リン酸ニトロフェニル基質;Zymed, San Francisco, CA, USA)を加えた。室温で30分間インキュベートした後に405nmにおける吸光度を測定した。この反応は30μlの0.5M NaOHを加えることにより終了させた。ELISAデータの有意性はスチューデントのt検定(p)により判定した。
【０１４５】
結果を図7に示す。接種14日後に、108個の組換えミニ細胞を腹腔内投与されたマウスに、EGFPに対する強く有意な抗体応答(対照との比較でp<0.02)が観察され、この観察された抗体応答は死滅ネズミチフス菌の最高用量を用いて得られたものよりも強かった。EGFPタンパク質に対する抗体は、哺乳動物発現ベクターpEGFP-C1を有する組換えミニ細胞が末梢マクロファージに包み込まれるばかりでなく、細胞内空胞(おそらく、ファゴリソソーム)中で分解され、少なくともいくらかのプラスミドDNAコピーがファゴリソソームを逃れて哺乳動物細胞の核に入った場合にのみに観察された。核からはEFGPmRNAが産生され、EGFPは細胞質で発現される。このEGFPはマクロファージ内では外来タンパク質であり、それゆえに処理されてMHCを介してペプチドが提示されものと予想される。このプロセスの結果、EGFPペプチドに対する抗体応答が起こる。対照の死滅ネズミチフス菌に比べ、抗EGFP抗体応答は組換えミニ細胞のほうが強かった。
【０１４６】
また、遺伝子療法の送達ベクターである組換えミニ細胞に対する免疫応答を判定するために抗LPS応答も測定した。これらの結果から、抗LPS抗体応答は有意であり、組換えミニ細胞(p=0.0004)および死滅ネズミチフス菌(p=0.001)に関しては類似していることが示された。図8参照。この結果はミニ細胞が少なくとも親細菌細胞表面にみられるLPS構造を保持していることを示している。23日まで、抗EGFP抗体応答は非免疫対照群と差はなかった(組換えミニ細胞および死滅ネズミチフス菌両方に関して)。抗体応答を持続させるための追加免疫を行わなかったので、これは驚くことではない。23日の抗LPS応答は14日に見られたものと類似していた。LPSは高く持続的な抗体力価を誘導する強力な免疫原であることが知られているため、これは予想に反していた。
【０１４７】
実施例１０  種々の投与計画による、Balb/cマウスにおけるin vivoミニ細胞媒介遺伝子送達および遺伝子発現
組換えミニ細胞を実施例3に従って調製した。表5で示されるスケジュールに従って6週齢のBalb/cマウス8匹の各群に100μlの組換えミニ細胞(プラスミドpEGFP-C1を含む;表2)を腹腔内接種した。マウス8匹の1つの群は陰性対照として接種は行わなかった。接種前および初回ワクチン接種14日後にマウスの眼窩採血により採血し、血清は実施例9に従って採集した。
【表５】
2005505296.tif 000008
【０１４８】
GFPに対する抗体が産生されたかどうか、また高用量の組換えミニ細胞または2回投与よりも3回投与のほうが、動物により強い抗体応答を起こさせるかどうかを判定するため従前に記載したようにELISAアッセイを行った。また、全群のネズミチフス菌のリポ多糖(LPS)抗体レベルも測定した。
【０１４９】
結果を図9に示した。108個の組換えミニ細胞を腹腔内投与したマウスにおいて、接種14日後にEGFPに対する非常に強い抗体応答が認められた(対照との比較でp<0.001)。109個のミニ細胞を接種したマウスはEGFPに対しさらに強い抗体応答を示し(対照との比較でp=0.0006)、この用量の抗体レベルは低用量(108個)の場合よりも有意に高かった(p=0.004)。組換えミニ細胞をマウスに2回投与または3回投与した場合、EGFPタンパク質に対する抗体応答に有意な差は認められなかったことより、本例において遺伝子療法を行うには2回投与で十分であることが示唆された。
【０１５０】
組換えミニ細胞に対する免疫応答を測定するために抗LPS応答も測定した。その結果から、抗LPS抗体応答は有意である(p=0.0004)ことが示された。図10参照。
【０１５１】
参考文献
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2005505296.tif 000010
2005505296.tif 000011
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【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】1個の細菌の正常な細胞分裂の概略図およびmin遺伝子の突然変異の結果、どのようにしてミニ細胞が形成されるかを示す。
【図２】ミニ細胞産生細菌株を作出するのに有用なプラスミド調製物の概略図を示す。特にこの図面はネズミチフス菌(S. typhimurium)由来ミニ細胞産生株を作出するためのプラスミド構成を示す。クローニングされたインサートDNAおよび環状プラスミドベクター部分の線図を示す。プラスミドの名称はインサートDNAの左側、環状のベクター地図の内側に太字で示している。クローンを作出する際にPCRプライマーを用いる場合には、点線の矢印の隣にプライマー番号を示している。
【図３】ミニ細胞産生細菌株の作出に有用なプラスミド調製物の概略図を示す。特にこの図面はフレクスナー赤痢菌(Shigella flexneri)2a由来ミニ細胞産生株を作出するためのプラスミド構成を示す。
【図４】ミニ細胞産生細菌株の作出に有用なプラスミド調製物の概略図を示す。特にこの図面はリステリア菌(Listeria monocytogenes)由来ミニ細胞産生株を作出するためのプラスミド構成を示す。
【図５】ネズミチフス菌由来ミニ細胞でトランスフェクトしたマウスマクロファージ細胞のTEM画像を示す。各パネルに感染後の時間と倍率を示している。これらの画像はマクロファージ空胞内のミニ細胞様の高電子密度粒子(矢印)を示している。
【図６】ミニ細胞を媒介とする、ヒト乳癌細胞への遺伝子送達および異種遺伝子発現を示す。パネルAは、非組換え型ミニ細胞でのトランスフェクション後96時間の対照乳癌細胞系SK-BR-3を抗HER-2抗体で標識し、アレクサフルオル(Alexafluor)コンジュゲート二次抗体で検出したものを示す。パネルBは、プラスミドpEGFP-C1を有する組換えミニ細胞でのトランスフェクション後96時間のSK-BR-3細胞におけるGFP発現(真核細胞のGFP発現)を示す。パネルCは、ミニ細胞/pEGFP-C1でトランスフェクトしたSK-BR-3細胞を抗HER-2抗体で標識し、アレクサフルオルコンジュゲート二次抗体で検出したものを示す。これらの画像は共焦点顕微鏡で可視化した。
【図７】組換えミニ細胞およびプラスミドpEGFP-C1を有する死滅ネズミチフス菌親細胞の腹腔内投与14日後のマウス血清抗GFP応答を示す。この凡例および図面8〜10の凡例では、10*8および10*9はそれぞれ108および109を示す。
【図８】組換えミニ細胞およびプラスミドpEGFP-C1を有する死滅ネズミチフス菌親細胞の腹腔内投与14日後のマウス血清抗LPS応答を示す。
【図９】プラスミドpEGFP-C1を有する組換えミニ細胞の腹腔内投与14日後のマウス血清抗GFP応答を示す。
【図１０】プラスミドpEGFP-C1を有する組換えミニ細胞の腹腔内投与14日後のマウス血清抗LPS応答を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2005505296.tif 000106
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