(57)【要約】本願は、タンパク質の新しいファミリー、即ちエプシン様タンパク質（ELP）を開示するものである。このタンパク質はENTHドメイン（エプシンNH2末端相同性ドメイン）を含み、成長阻害活性を有する。開示したタンパク質は、過剰増殖性疾患の診断に、そして遺伝子治療目的に使用できる。
2005537783.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ENTHドメインを含み成長阻害活性を有する単離されたタンパク質。
【請求項２】
Eps15と相互作用するNPFドメインを欠失し、且つクラスリンアダプターAP2に結合するDPWドメインを欠失している、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号2、4および5に開示するアミノ酸配列の一つと少なくとも40%、好ましくは50%、より好ましくは70%、さらに好ましくは80%、そして最も好ましくは90%同一のアミノ酸配列を有する、請求項1または2に記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号2、配列番号4または配列番号5に記載のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項1ないし3のいずれか1項に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項1ないし4のいずれか1項に記載のタンパク質をコードしている、好ましくは配列番号1または配列番号3に開示する核酸配列の単離された核酸。
【請求項６】
請求項5に定義する核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項6に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
真核生物細胞である、請求項7に記載の宿主細胞。
【請求項９】
過剰増殖性疾患、特に良性および悪性腫瘍、またはその遺伝的素因を同定するための方法であって、対象の体液または組織試料中における、ELPタンパク質をコードしている核酸配列の発現レベルの変化、および/または少なくとも1個の突然変異を検出する事、または、ゲノムelp座における再編成を検出する事、を含む方法。
【請求項１０】
該突然変異が、ENTHドメインをコードしているDNA領域内部、または5'非翻訳領域、または進化の過程で保存されたアミノ酸をコードしているコドン、プロモーターまたはスプライシング部位に位置している、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
該突然変異が、非機能的ELPタンパク質、低下したタンパク質発現、またはタンパク質の欠如、または融合タンパク質を導く、請求項9-10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
該核酸配列が配列番号1に記載の核酸配列である、請求項9-11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
該疾患が肺ガンである、請求項9ないし12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
該疾患が腎臓ガンである、請求項9ないし12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
該疾患が胃ガンである、請求項9ないし12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
適当な宿主細胞を、発現コンストラクト中の請求項1に記載のタンパク質をコードしている核酸で形質転換させる事、および該細胞を該タンパク質の発現をさせる条件下で培養する事、そして生成したタンパク質を単離する事を含む、ELPタンパク質の生成のための方法。
【請求項１７】
請求項1に記載のタンパク質のエピトープに特異結合できる抗体。
【請求項１８】
過剰増殖性疾患またはその遺伝的素因の同定のための方法における、請求項17に記載の抗体の使用。
【請求項１９】
ELPタンパク質に関連する過剰増殖性疾患の遺伝子治療のための、請求項5に記載の核酸の使用。
【請求項２０】
請求項1ないし4のいずれか1項に記載のタンパク質および/または請求項5に記載の核酸を含む、過剰増殖性疾患、特に良性および悪性腫瘍の処置のための医薬組成物。
【請求項２１】
過剰増殖性疾患が肺ガンである、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
過剰増殖性疾患が腎臓ガンである、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
過剰増殖性疾患が胃ガンである、請求項20に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
エプシン様タンパク質をコードしているmRNAの領域に特異的にハイブリダイズする、遺伝子発現をダウンレギュレーションするためのオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
該オリゴヌクレオチドが化学的修飾を含む、請求項24に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
ELPタンパク質をコードしている遺伝子のエキソン領域に相補的であるヌクレオチド配列を有する、遺伝子サイレンシングのための二本鎖RNA（dsRNA）。
【請求項２７】
約200-2000塩基対、好ましくは700-800塩基対の長さを有する、請求項26に記載のdsRNA。
【請求項２８】
約18-25塩基対、好ましくは20-22塩基対の長さを有する、請求項21に記載のdsRNA。
【請求項２９】
該エプシン様タンパク質がヒトELPである、請求項26に記載のdsRNA。
【請求項３０】
過剰増殖性疾患および/または間違った細胞分化を特徴とする疾患の治療のための、請求項24ないし29のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドまたはdsRNAの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
この出願は、米国仮出願第60/368457号の優先権を主張するものであり、その全内容を引用により本明細書の一部とする。
【０００２】
技術分野
本発明は、成長阻害活性を有するタンパク質の新規なファミリーならびにそれらの診断および治療上の使用に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
成長は、正常な発生のみならず、腫瘍形成および癌腫のような異常な状態にも密接に関連している。その重要性にもかかわらず、細胞レベルで、組織および臓器レベルで、または生体全体のレベルで成長がどのように調節されているのかについては、今なお相対的に殆ど知られていない。成長は、通常、細胞増殖に随伴していることから、成長を調節するメカニズムを理解する努力の多くは細胞周期調節のメカニズムに焦点が合わせられてきた。事実、細胞が細胞周期を経て如何にして進歩するかについての我々の知識は実質上増大している（Nurse 2000）。細胞分裂制御への没頭により、成長が、細胞周期を制御する因子によって調節されているという仮説が導かれた。しかしながら、ショウジョウバエの成虫原基での洗練された実験は、成長が細胞周期を調節するのであってその逆ではないという、酵母における昔の発見を思い起こさせた（Nurse 1975）。このショウジョウバエの実験では、細胞のクローンにおいて細胞周期の時間を加速させても、そのクローンが専有する面積によって測定される正味の成長は刺激されず、対照クローンと同面積を占有する、より多くの、但しより小さな細胞が生成する、という事が示された。逆に、RB相同体RBFの過剰発現により細胞周期を減速させると、やはり同一面積を専有する、より少ない、但しより大きな細胞が生成した（Neufeld, de la Cruz et al. 1998）。故に、正常および異常な発生の際の成長調節の理解には、細胞周期の制御を理解する以上の事が必要である。細胞および組織レベルで成長が如何に調節されているかを理解する事は、癌治療のための新規なアプローチと標的をも提供する。事実、ラパマイシンのような細胞成長を遮断するインヒビターが、抗癌薬として現在臨床試験されている（Hidalgo and Rowinsky 2000）。故に、過剰増殖性疾患の診断と治療を可能にする手段への差し迫った要求がある。
【０００４】
発明の開示
よって、ENTHドメインを含み成長阻害活性を有するタンパク質を提供することが、本発明の全般的な目的である。
【０００５】
本明細書で使用するENTH（エプシンNH2末端相同性ドメイン）ドメインとは、エプシンファミリーのタンパク質中で最初に発見された、保存されたタンパク質ドメインを言う。典型的には、このドメインは該タンパク質のN末端に位置し、16の絶対的保存残基：N-x(11-13)-V-x2-A-T-x(34-36)-R-x(7-8)-W-R-x3-K-x12-G-x-E-x15 -L-x11-12-D-x-G-R-x11-D-x7-Rを特徴とする。
【０００６】
好ましい態様では、このタンパク質は、Eps15と相互作用するNPFドメインを欠失し、且つクラスリンアダプターAP2と結合するDPWドメインを欠失する。
【０００７】
さらなる好ましい態様では、このタンパク質は、配列番号2（ヒトELP）または配列番号5（hELP18aa）または配列番号4（ショウジョウバエELP）に開示するアミノ酸配列と、少なくとも40%、好ましくは50%、より好ましくは60%、さらに好ましくは80%、そして最も好ましくは90%一致するアミノ酸配列を有する。
【０００８】
特に好ましい態様では、このタンパク質は、配列番号2（Homo sapiens）、配列番号4（Drosophila melanogaster）または配列番号5（Homo sapiens h-ELP18aa）のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、本発明に係るタンパク質をコードしている核酸配列である。好ましい態様では、この核酸配列は、配列番号1（h-ELP）および配列番号3（dELP）より成る群から選ばれる。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、対象、例えば人間の患者が、望ましくない細胞増殖または分化の異常な制御を特徴とする疾患の危険性があるかどうかを決定する方法である。
【００１１】
本発明の別の態様は、エプシン様タンパク質のエピトープと特異的に反応する抗体および抗体調製物を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、遺伝子治療目的のための本発明に係るタンパク質および/または核酸の使用である。
【００１３】
さらに別の態様では、本発明は、過剰増殖性疾患、例えばガンの処置のための、本発明に係るタンパク質および/または核酸の使用に関するものである。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係るタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むベクターに関するものである。典型的には、ベクターは、宿主細胞での発現を達成するのに必要な調節配列を含み、そして、エピソーム状態で存在するためにプラスミド複製に必要な配列を含むことができ、または染色体中に組み込まれるよう設計することができる。本明細書で使用する調節配列という語は、本発明に係る遺伝子の天然調節配列と異種調節配列の両者を包含する。
【００１５】
さらに、本発明は、本発明に係るタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明に係るタンパク質を発現できる任意の宿主細胞、例えば細菌、脊椎動物および無脊椎動物細胞を使用できる。この細胞を、例えばエプシン様タンパク質の産生に利用できる。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、エプシン様タンパク質の生成方法であって、エプシン様タンパク質をコードしている核酸配列を含むベクターで適当な宿主細胞を形質転換させ、この宿主細胞をタンパク質の発現をさせる条件下で培養し、そして生成したエプシン様タンパク質を単離する方法に関するものである。本発明に係るタンパク質を発現できる任意の宿主細胞、例えば細菌、脊椎動物および無脊椎動物細胞を使用できる。
【００１７】
以下の詳細な説明に対して考察を行うならば、本発明をより良く理解でき、上に開示した目的以外の目的も明らかになるであろう。そのような説明は添付した図面について言及している。
【００１８】
発明を実施する態様
細胞、組織および生物レベルにおける成長に特異的に関与している遺伝子を同定するため、本発明者等はショウジョウバエでの遺伝的アプローチを採用した。本発明者等は、細胞分化に影響を及ぼさずに細胞増殖を妨害または促進する劣性突然変異を求めてゲノム全体にわたるスクリーニングを実施した。このスクリーニングは、遺伝的モザイクのハエを産み出す組織特異的組換え系（Newsome, Asling et al. 2000）を利用して実施した。これらのハエは、頭部組織に無作為に誘導された突然変異についてホモ接合であるが、身体および生殖細胞系の同じ突然変異についてはヘテロ接合である。その遺伝子産物が成長を選択的に促進する遺伝子（潜在的オンコジーン）の突然変異は、小さな頭のハエを産むが、遺伝子産物が成長阻害機能を発揮する遺伝子（潜在的腫瘍抑制遺伝子）の突然変異は、正常より大きな頭のハエを生ずる。腫瘍形成に関わる遺伝子を発見するためのこのスクリーニングの妥当性は、小頭表現型を惹起する、ラパマイシンTOR、Myc、Rasの標的としての既知オンコジーンのショウジョウバエ相同体における突然変異、および、大頭表現型を惹起するPTEN、LATSおよびTS1のような既知の腫瘍抑制遺伝子相同体における突然変異を同定することによって例示できる（(Huang, Potter et al. 1999; Oldham, Montagne et al. 2000）。
【００１９】
本発明に記載の遺伝子の突然変異は正常のものより大きな頭を持つハエを産み（図1）、これは、本質的な成長阻害機能を強く示唆するものである。後にこの遺伝子は新規であることが確認され、ショウジョウバエエプシンタンパク質と共通するドメインの故にエプシン様タンパク質（ELP）と命名された。エプシンNH2-末端相同性（Epsin NH2-Terminal Homoloay （ENTH））ドメインとして知られるこのドメイン（Kay, Yamabhai et al. 1999）は、レセプター仲介エンドサイトーシスおよび成長レセプターの調節に関わっている全てのエプシンファミリータンパク質（Rosenthal, Chen et al. 1999）に見出されている（Carbone 1997; Nakashima, Morinaka et al. 1999）。しかしながらELPには、エンドサイトーシスに関与するエプシンの二つの必須ドメイン：Eps15と相互作用するC末端NPFドメイン（Chen, Fre et al. 1998）およびクラスリンアダプターAP2（Robinson PJ, Liu JP, Trends in neuroscience 1994）とクラスリン（Rosenthal, Chen et al. 1999）に結合するDPW中心モチーフ、が欠失している。ENTHドメインの三次元構造はアルマジロ反復の構造に似ていることから、このドメインが核-細胞質間輸送をも仲介しているであろうと仮定された（Hyman, Chen et al. 2000; Vecchi, Polo et al. 2001）。
【００２０】
ENTHドメインは、膜レセプターから下流の要素へのシグナル伝達で中枢的役割を果たしている（Martin 2001）、膜リン脂質PI(3,4,5)P3の脱リン酸化型である、ホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスファート（PIP2）に結合すると記載されている（Itoh, Koshiba et al. 2001）。よって、PIP3に結合しPIP3レベルによって調節されていることが知られているPHドメインを含むタンパク質と同様に、ENTHドメインを含むタンパク質の局在と機能はPIP2レベルによって調節されている可能性がある。
【００２１】
腫瘍抑制遺伝子LATSを欠失する細胞で観察される成長表現型が、本明細書に記載する遺伝子の突然変異についてホモ接合の細胞の成長表現型に極めて類似するという事実は、ELPもまた腫瘍抑制遺伝子を構成していることを示している。
【００２２】
本発明の範囲において、D. melanogaster ELPタンパク質と2種類のヒトELPイソ型および対応遺伝子が同定された。
【００２３】
本発明の第一の態様は、ENTHドメインとそれらの成長阻害活性の存在を特徴とするエプシン様タンパク質（ELP）に関するものである。本発明の範囲において、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）およびヒトのエプシン様タンパク質をクローニングし特性決定した。
【００２４】
dELP過剰発現はハエの翅において細胞死を誘発し、複眼の大きさを著しく縮小する（これもまた成長に及ぼすその否定的効果の現れである）事、そして、トランスヘテロアレレ突然変異体のキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）背景におけるhElpおよびdElpトランスジーンの過剰発現は、幼虫後期から蛹期のホモ接合突然変異体の致死性を部分的に救済するという事が示された。これらの発見は、ショウジョウバエと人間のタンパク質が同じ機能を持っていることを証明している。
【００２５】
これらのタンパク質の成長阻害活性は、エプシン様遺伝子が腫瘍抑制因子として機能することを示すものである。
【００２６】
ELPタンパク質という語は、本明細書前記に定義したタンパク質のいずれかの、機能的フラグメント、変異体または誘導体をも包含する。本発明に係るタンパク質は、キメラタンパク質として、例えば組換え融合タンパク質として提供することができる。
【００２７】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、該ELPポリペプチドの一つをコードしている第一のアミノ酸配列と、ELPタンパク質の一つの任意のドメインに対して外来性であり且つこれと実質上相同的でないドメインを規定する第二のアミノ酸配列との融合である。キメラタンパク質は、第一のタンパク質をも発現する生物に見出される外来ドメイン（たとえ異なるタンパク質であっても）を呈する場合もあれば、異なる種類の生物によって発現されるタンパク質構造の「種間」、「遺伝子間」等の融合である場合もある。一般に、融合タンパク質は一般式X-ELP-Y［式中、ELPはELPタンパク質の一つから誘導されるタンパク質の一部であり、そしてXおよびYは個別に、存在しないか、または或る生物のELP配列の一つ（天然に存在する突然変異体を包含する）に関連しないアミノ酸配列である］で示すことができる。
【００２８】
第二の側面では、本発明は、ELPタンパク質をコードしている核酸配列に関するものである。ELPのアミノ酸配列に変化を導くDNA配列多型もまた本発明に含まれる。当業者は、ELPポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードしている核酸のうち1またはそれ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの約3-5%まで）におけるこれらの変異が、天然のアレレ変異のために、所定の種の個体間に存在し得るという事が理解できるであろう。エプシン様タンパク質の活性部分をコードしている核酸のフラグメントもまた本発明の範囲内にある。本明細書で使用するelp遺伝子フラグメントとは、配列番号2、配列番号4または配列番号5に示すELPのアミノ酸配列全体をコードしているヌクレオチド配列よりも少ないヌクレオチドを有する核酸を指すが、好ましくは完全長タンパク質の生物活性を幾らか保持し、または適当なアゴニスト/アンタゴニストの存在下で幾らかの生物活性を回復するペプチドをコードしている。本発明の範囲内にある核酸フラグメントは、他のelpアレレおよび/または相同体を検出および単離するスクリーニングプロトコルに使用するための、高または中等度ストリンジェントな条件下で他の種由来の核酸とハイブリダイズできる核酸フラグメント、および、ELPタンパク質（これに代わるイソ型、例えば、mRNAスプライス変異体を包含する）をコードしている核酸の存在の検出に使用するための、ヒト検体由来の核酸とハイブリダイズできる核酸フラグメント、を包含する。本発明の範囲内の核酸はさらに、リンカー配列、修飾された制限エンドヌクレアーゼ部位、および、対象が生成したポリペプチドの組換え型の分子クローニング、発現または精製に有用なその他の配列を包含する。
【００２９】
さらなる側面では、本発明は、対象、例えば人間の患者が、望ましくない細胞増殖または分化の異常な制御を特徴とする疾患の危険性があるかどうかを判定するための方法に関するものである。この方法は、エプシン様遺伝子中の少なくとも1個の突然変異、またはエプシン様遺伝子の異所性発現（misexpression）を特徴とする遺伝子損傷の存在または不在を、対象の組織試料中で検出することを包含する。
【００３０】
例を挙げると、ELPコード化転写物の存在（または不在）についての無傷の組織および組織試料の組織学的スクリーニングを容易にするヌクレオチドプローブを、本発明に係る遺伝子から作製することができる。ELPメッセージまたはゲノムELP配列を目的とするプローブを、例えば新生物性または過形成性疾患（例えば望ましくない細胞増殖）に現れ得るアレレ突然変異の予想的および治療的評価の両方に利用することができる。このオリゴヌクレオチドプローブはエプシン様タンパク質の発現（またはその欠失）に随伴する何らかの異常を含み得る発達障害の分子的根拠の決定を容易にする助けとなり得る。例えば、ポリペプチド合成における変異をコード配列中の突然変異から識別できる。
【００３１】
例えば、正常組織に対する腫瘍組織中のELP RNA発現を比較するドットブロット実験により、複数のガン、特に肺ガン試料、腎臓ガン試料および胃ガン試料に関連するELP RNAの著明なダウンレギュレーションを見出すことができる。
【００３２】
好ましい態様では、この診断法は、対象（例えば人間の患者）の組織試料中に、(i) エプシン様タンパク質をコードしている遺伝子の突然変異、または(ii) エプシン様タンパク質の異所性発現、のうち少なくとも一方を特徴とする遺伝子損傷の存在または不在を検出する事を含むと特徴付けることができる。例を挙げると、(i) エプシン様タンパク質をコードしている遺伝子からの1またはそれ以上のヌクレオチドの除去、(ii) エプシン様タンパク質をコードしている遺伝子への1またはそれ以上のヌクレオチドの付加、(iii) エプシン様タンパク質をコードしている遺伝子の1またはそれ以上のヌクレオチドの置換、(iv) エプシン様タンパク質をコードしている遺伝子の大幅な染色体再編成、(v) エプシン様タンパク質をコードしている遺伝子のメッセンジャーRNA転写物レベルの著しい変化、(vi) エプシン様タンパク質をコードしている遺伝子のメッセンジャーRNA転写物の非野生型スプライスパターンの存在、(vii)非野生型レベルのエプシン様タンパク質、および（viii) elp遺伝子の5'非翻訳領域または3'非翻訳領域中の突然変異、のうち少なくとも一つが存在することを確認することにより、係る遺伝子損傷を検出することができる。
【００３３】
本発明の一つの側面では、配列番号1のセンスまたはアンチセンス配列、または天然に存在するその突然変異体、または本発明に係る遺伝子に本来付随する5'もしくは3'フランキング配列またはイントロン配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ/プライマーを提供する。このプローブを組織試料の核酸に暴露し、その試料核酸とプローブのハイブリダイゼーションを検出する。或る態様では、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)(例えば、米国特許第4683195号および4683202号を参照されたい）またはライゲーション連鎖反応（LCR)(Landegren, Kaiser et al. 1988; Nakazawa, English et al. 1994）においてこのプローブ/プライマーを利用する事を含み、後者は遺伝子の点突然変異の検出に特に有用となり得る。別法として、タンパク質レベルの測定にイムノアッセイを使用することもできる。
【００３４】
好ましい態様では、elp遺伝子の突然変異は、ENTHドメインコード化領域内部、elp遺伝子の5'非翻訳領域、またはENTHドメインに直接隣接する遺伝子領域に位置している。
【００３５】
本発明の別の側面は、エプシン様タンパク質のエピトープと特異的に反応する抗体および抗体調製物を提供する。
【００３６】
例えば、cDNA配列に基づくELPタンパク質から誘導した免疫原を使用することにより、抗タンパク質/抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を標準プロトコルで作製できる（例えば、(Harlow and Lane 1988)を参照されたい)。マウス、ハムスターまたはウサギといった哺乳動物を、免疫原性形態の該ペプチド（例えば、抗体反応を引き起こすことのできる脊椎動物由来ポリペプチドまたは抗原性フラグメント）で免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術は、担体とのコンジュゲーションまたはその他の当分野で周知の技術を包含する。ELPタンパク質の免疫原性部分をアジュバントの存在下で投与することができる。血漿または血清中の抗体価を検出することにより、免疫の進行を監視できる。抗原としてのこの免疫原と共に標準ELISAまたはその他のイムノアッセイを利用して、抗体レベルを評価できる。
【００３７】
好ましい態様では、この抗体は、脊椎動物、例えば哺乳動物のELPタンパク質の抗原決定基に免疫特異的である。ELPタンパク質の抗原性調製物で動物を免疫した後、抗ELP抗血清が取得でき、そして所望によりポリクローナル抗ELP抗体をこの血清から単離できる。モノクローナル抗体を作製するために、免疫した動物から抗体産生細胞（リンパ球）を収穫し、不死化した細胞、例えば骨髄腫細胞と、標準的体細胞融合法により融合させてハイブリドーマ細胞を得る。このような技術は当分野で周知であり、例えばハイブリドーマ技術（(Kohler and Milstein 1975)によって最初に開発された）、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbar 1983）、およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのEBV-ハイブリドーマ技術（Cole 1985）を包含する。ELPタンパク質と特異的に反応する抗体の産生についてハイブリドーマ細胞を免疫化学的にスクリーニングし、係るハイブリドーマ細胞を含む培養からモノクローナル抗体が単離できる。
【００３８】
本明細書で使用する抗体という語は、ELPポリペプチドの一つと特異的に反応するそのフラグメントの包含をも意図している。抗体は常套技術を用いて断片化でき、そのフラグメントを、抗体全体について上に記載した方法と同じ方法で、その有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、F(ab)2フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって生成できる。得られたF(ab)2フラグメントを、ジスルフィド橋を還元するよう処理して、Fabフラグメントを作製できる。本発明に係る抗体はさらに、その抗体の少なくとも1個のCDR領域が付与したELPタンパク質に対する親和性を有する二重特異性およびキメラ分子の包含を意図している。
【００３９】
ELPポリペプチド、またはELP変異体、およびFabおよびF(ab)2のような抗体フラグメントに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体（Ab）を用いて1またはそれ以上のELPタンパク質の作用を遮断し、例えば胚形成および/または特異な組織の維持におけるこれらのタンパク質の役割を研究することができる。同様のアプローチにおいて、抗ELPモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、または抗ELP抗体を懸濁させた生分解性ゲルを、ELP作用を遮断しようとする領域内またはその近傍部位に移植することができる。この種の実験は、成長調節に関わり得る様々な因子の役割を解読する助けとなり得る。例えばElpタンパク質発現の低下または増強を検出することにより、またはELPタンパク質の細胞内誤局在を検出する事により、または個体の組織もしくは体液試料、例えば血液中に異常なELPタンパク質を検出する事により、この抗体は、ELPタンパク質に関連する疾患またはその素因を同定するための診断検定に使用するための手段としても好適である。この、ELPタンパク質の異常型は、例えば不完全なまたは異なるスプライシングの所産であるかも知れず、野生型ELPタンパク質に比して増強したまたは低下したまたは異なる活性を有する、より短いまたはより長いELPタンパク質を導くかも知れない。さらに、この異常型ELPタンパク質は、完全長ELPタンパク質またはそのフラグメントが別のタンパク質またはそのフラグメントと融合しているキメラタンパク質であってもよい。このキメラタンパク質は、例えば二つの遺伝子間の除去から生じることがあり、またはゲノム再編成の所産であることもある。当業者は、組織および/または体液試料中の抗体を用いたタンパク質検出の適切な方法を知悉している。そのような方法は、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（「ELISA」）、細胞型ELISA、免疫沈降、スロットまたはドットブロット、ラジオイムノアッセイ、および蛍光イムノアッセイを包含するがこれらに限定される訳ではない。
【００４０】
別の態様では、本発明は、  ELPに関連する過剰増殖性疾患の遺伝子治療のための、本発明に係るタンパク質および/または核酸（完全長であるか所望のフラグメントであるかに拘わらず）の用途に関するものである。デリバリーのための適切なベクターは、当業者が容易に選択できる。遺伝子治療ベクターは種々の供給源から容易に取得でき、例えばアデノ随伴ウイルス［国際特許出願第PCT/US91/03440号］、アデノウイルスベクター（Ishibashi, Brown et al. 1993; Kay, Landen et al. 1994）、またはその他のウイルス性ベクター、例えば種々のポックスウイルス、ワクシニア等を包含する。所望の遺伝子、例えばBAP-1の挿入およびコードされたタンパク質のインビボ発現を獲得する方法は、当業者に周知である。
【００４１】
本発明に係るタンパク質および/または核酸は、例えば薬用製剤の形態でも過剰増殖性疾患の処置に好適である。この薬用製剤を、所望により、活性化合物と有害な反応をしない補助物質、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝剤、着色料、香料および/または芳香性物質等と混合することができる。
【００４２】
このタンパク質は、注射（即ち、皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、好ましくは筋肉内）、経口投与、吸入、経皮適用、局所投与または直腸内投与、好ましくは注射、経皮または局所投与によって投与できる。投与経路に応じて、薬用組成物中の該ペプチドを何らかの物質で被覆して、或る種の酵素の作用からこれらを保護することができる。当業者はペプチドを特定部位にデリバリーするのに適した被覆について熟知しているであろう。該ペプチドの薬理作用を延長させるため、この組成物に有機物質を含有させることもできる。係る有機物質の例は、非抗原性ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸のスルホン酸または燐酸エステル、デキストラン、ポリエチレングリコールおよびその他のグリコール類、フィチン酸、ポリグルタミン酸、およびプロタミンを包含する。
【００４３】
治療目的のため、活性ELPペプチドまたはそのフラグメントを適当な担体分子とのコンジュゲートの形態で投与することもできる。その担体分子は細胞中へのELPペプチドの取り込みを亢進させ、そして/または特定の標的細胞、例えば腫瘍細胞へのELPペプチドのデリバリーをさせる。好適な担体分子は例えばトランスフェリンまたはウイルス細胞侵入タンパク質である。
【００４４】
本発明はさらに、細胞中でのELP分子の発現をダウンレギュレートするのに利用できるアンチセンス分子に関するものである。このアンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）、特に天然核酸からの化学的修飾を有する合成ODN、または係るアンチセンス分子をRNAとして発現する核酸コンストラクトであってよい。このアンチセンス配列は標的遺伝子のmRNAに相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、様々なメカニズム、例えば翻訳に利用できるmRNAの量を低下させることにより、またはRNアーゼHの活性化により、または立体障害によって遺伝子発現を阻害する。1種類のまたは組み合わせたアンチセンス分子（組み合わせは複数の異なる配列を含むことができる）を投与できる。
【００４５】
アンチセンス分子は、適当なベクター中の全部のまたは一部の標的遺伝子配列を発現させることにより作製でき、ここで、転写の開始は、アンチセンス鎖がRNA分子として作製されるような向きである。或いは、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般に少なくとも約7、通常は少なくとも約12、より普通には少なくとも約20ヌクレオチド長であり、約500以上ではなく、通常約50以上ではなく、より普通には約35ヌクレオチド長以上ではない。この長さは、阻害効率、特異性（交差反応性が無いことを包含する）等によって決まる。7ないし8塩基長の短いオリゴヌクレオチドは遺伝子発現の強力且つ選択的なインヒビターとなり得ることが見出されている（(Wagner, Matteucci et al. 1996)を参照されたい）。
【００４６】
本発明の別の態様は、RNA干渉（RNAi）によるelp遺伝子の転写後サイレンシングに関するものである。RNAiは、植物、線虫、無脊椎動物および哺乳動物細胞培養において記載されている、短い二本鎖RNA（dsRNA）により仲介される転写後遺伝子サイレンシングの一形態である（(Ngo, Tschudi et al. 1998)(Vaucheret and Fagard 2001)(Kinnerdell and Carthew 1998; Caplen, Fleenor et al. 2000; Elbashir, Harborth et al. 2001; Timmons, Court et al. 2001）。二本鎖RNA（dsRNA）が、この短いdsRNAに相補的な一本鎖RNAを迅速に分解する分解反応を誘発することが示された（Montgomery and Fire 1998; Montgomery, Xu et al. 1998）。このようにRNAiを用いて例えば生物全体または無脊椎動物および脊椎動物細胞系における遺伝子発現を低下させることができる（Kennerdell and Carthew 1998; Caplen, Fleenor et al. 2000; Clemens, Worby et al. 2000; Elbashir, Harborth et al. 2001）。ELP dsRNAは、そのdsRNAの殆どがエキソン領域に対応している限り、cDNAまたはゲノムDNA鋳型から作製できる。通常、700ないし800塩基対を有する標的領域が最も活性である。しかしながら、200塩基対しかないdsRNAや2000塩基対もあるdsRNAでも強力な干渉活性を有することが判明している。両方のRNA鎖を、例えばT7、SP6またはT3プロモーターを各々の末端に含むPCRフラグメントから同時に合成できる。このPCRフラグメントは、例えばT7-ポリメラーゼ結合部位を含む2つのプライマーを用いてELP cDNAまたはゲノムDNAの増幅によって作製できる。次いで、ELP配列を含む適当な鋳型を用いてPCR反応を実施できる。Taqポリメラーゼが最良の収量を与えるが、Pfuのような他のポリメラーゼを使用することもできる。最初の10サイクルは40℃のアニーリング工程を含み、次いで55℃のアニーリング工程を含む35サイクルを実施する。必要ならばDMSOを最終濃度5%となるまで添加してよい。フェノール-クロロホルム抽出とNH4OAc中でのエタノール沈殿化を利用して反応混合物からPCR鋳型を単離できるが、他の商業的に入手可能なPCR精製キットも同様に使用できる。RNA合成反応は、適当なRNAポリメラーゼを使用し、PCR DNA鋳型1μgを加えた50μl体積で実施できる。Ambion製MEGAscript(登録商標）キットが極めて良好に働く。この合成反応中にRNAが二本鎖となる。RNアーゼを含まないDNアーゼによってDNA鋳型を除去し、dsRNAをフェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿によって精製できる。DNA鋳型 1μgからの典型的なRNA収量は80ないし120μgの範囲である。dsRNAは、使用直前までNaOAc/エタノール沈殿として-80℃で保存できる。
【００４７】
dsRNAの品質は、TBE中の未変性アガロースゲル電気泳動により監視できる。殆どのRNAの電気泳動移動度が、適当な長さのdsRNAで予想される移動度（二本鎖DNAの移動度に極めて近接している）にシフトするような調製物のみを使用すべきである。哺乳動物細胞におけるELP発現を低下させるため、短い20-23量体dsRNAを優先的に使用すべきである（Elbashir, Harborth et al. 2001; Elbashir, Lendeckel et al. 2001）。このような短いdsRNAは、(Elbashir, Harborth et al. 2001）に記載のように3'-オーバーハングを持っており、標準法によってインビトロ合成できる。
【００４８】
細胞にdsRNAを導入する幾つかの方法を文献中に見出すことができ、このような方法は当業者に周知である。
【００４９】
ここに本発明を実施例によってさらに説明する。
【００５０】
これらの実施例は本発明の様々な態様の例示として提供するに過ぎず、いかなる態様によっても本発明を限定するものと解してはならない。
【００５１】
実験の部
細胞、組織および生体レベルでの成長に特異的に関与する遺伝子を同定するため、本発明者等は、ショウジョウバエにおける遺伝的アプローチを採用した。本発明者等は、細胞分化に影響を及ぼさずに細胞増殖を妨害または促進する劣性突然変異についてゲノム全域にわたるスクリーニングを行った。このスクリーニングは、遺伝的モザイクのハエを産む組織特異的組換え系（Newsome, Asling et al. 2000）を利用して実施した。これらのハエは頭部組織に無作為に導入した突然変異についてホモ接合であるが、身体および生殖細胞系の同突然変異についてはヘテロ接合である。その生成物が増殖を選択的に促進する遺伝子（オンコジーン）の突然変異は小さな頭のハエを産み、一方、生成物が増殖阻害機能を発揮する遺伝子（腫瘍抑制遺伝子）の突然変異は、正常より大きな頭のハエを生ずる。このスクリーニングの妥当性は、ラパマイシン標的（TOR）をコードしている遺伝子の突然変異が小頭表現型を惹起し、腫瘍抑制遺伝子PTENをコードしている遺伝子の突然変異が大頭表現型を惹起すると証明できたことで例証できる（Huang, Potter et al. 1999; Oldham, Montagne et al. 2000）。
【実施例】
【００５２】
実施例I：小頭スクリーニング
インスリンレセプターシグナル伝達経路の構成要素の突然変異は、細胞増殖を細胞自律的に損傷する（Bohni, Riesgo-Escovar et al. 1999; Verdu, Buratovich et al. 1999; Weinkove, Neufeld et al. 1999; Brogiolo, Stocker et al. 2001）。突然変異体細胞のクローンは増殖に甚だしい不利益を負い、野生型姉妹クローンに比して小さなクローンとなる。しかしながら、flpリコンビナーゼの持続的供給により有糸分裂組換えを強制的に起こして細胞致死的突然変異によってその姉妹クローンを排除する場合、これらのクローンは臓器全体の実質的割合を占める。無眼調節配列の制御下でflpリコンビナーゼの発現をさせると、眼の成虫原基のみに組織特異的クローンが形成される。相同染色体上の細胞致死的突然変異と組合わさって、この系は、目的遺伝子について同型接合の突然変異体である細胞でほぼ構成される眼球および頭部を生成させる（Newsome, Asling et al. 2000）。特に眼の成虫原基の発達物においてIRS相同体Chicoまたはインスリンレセプター（Inr）の機能を欠失するこのようなモザイクハエは、極めて特徴的な表現型を呈する。身体は正常サイズであるのに対し、眼球と頭部は劇的に縮小している（Bohni, Riesgo-Escovar et al. 1999; Brogiolo, Stocker et al. 2001）。同様の表現型に基づく成長調節遺伝子の突然変異を同定するため、第3染色体の右腕基部付近にflpリコンビナーゼの標的部位を有する（82FRT）雄を、EMS突然変異誘発に付し、4つの要素：リコンビナーゼの供給源（ey-flp）、対応位置にあるFRT部位、優性眼球マーカー（w+）および細胞致死突然変異（c13R3）、をもたらす雌と交配した。F1世代のモザイクハエでは、3R上に新たに誘導した突然変異についてホモ接合であることの効果が頭部および眼球に観察できる。ホモ接合突然変異体組織の存在は、白色眼球組織を生成する色素マーカーw+の喪失によって容易に視覚化できる。
【００５３】
モザイクハエのスクリーニング
第3染色体の右腕にFRT部位を有する雄（FRT82；(Xu and Rubin 1993)）を標準プロトコルに従い33mM EMSで飼育し、遺伝子型y w ey-flp；FRT82 w+ c13R3/TM6B y+の雌と交配した。c13R3は、FRT82 w+染色体上で生成した劣性細胞致死突然変異である（Newsome, Asling et al. 2000）。F1子孫の半数は遺伝子型y w ey-flp/+またはY; FRT82 */FRT82 w+ c13R3を有し、これらを異常サイズの眼球および頭部について採点した。陽性個体をy w ey-flp; FRT82 w+ c13R3/TM6B y+と再交配し、生殖細胞系の伝搬について調べた。約50000のモザイクハエを飽和に達するまでスクリーニングし、大頭表現型を惹起した69の突然変異体を樹立した。
【００５４】
相補グループ分析
大頭表現型を惹起した69の突然変異のうち52が9個の相補グループに分かれた。相補グループとは、いかなる対の組み合わせも各アレレのホモ接合性に伴う致死性を補完できない、幾つかの、少なくとも2個のアレレと定義する。これらの相補グループのうち4個に属する突然変異が過剰増殖表現型をもたらした：過剰の個眼が、眼に腫瘍状外観を与えるひだの形成を惹起した（図1、右図）。
【００５５】
減数分裂的およびSNPマッピング
過剰増殖表現型を示す4個の相補グループのうちの1個は、4個のアレレで構成されていた。一つの代表的アレレを以下の遺伝的マーカー：細胞学的位置87Eにある、mini-w+を持つP-エレメント、90Eにある、w+を持つP-エレメント、および96Eにある、y+を持つP-エレメント、を用いて減数分裂的にマッピングした（(Xu and Rubin 1993))。同じ領域内の欠損を用いる相補性分析により、大まかなマップ位置を確認し、洗練した。アレレ間の組換え頻度および近傍に記されたP-エレメント挿入を評価することによって、より限定的なマッピングを行った。このマッピングに使用したP-エレメントは、EP(3)0738（94A1-2）、1(3)j5B5（94A1-2）および1(3)L3560（94A5-7）であった。このようにして突然変異の遺伝的位置を、P-エレメント挿入1(3)L3560のごく近傍にある染色体位置94Aに絞り込むことができる。
【００５６】
遺伝子分析は、突然変異の部位を、スカホールドAE003738内部のおよそ120kbの300kbp間隔に位置決定した（ヌクレオチド344000 - 464000）。突然変異の分子位置を明確に決定するため、その特定領域内の分子マーカーとしてSNPを使用して、組換え体をマッピングした。SNPは、WAVE系を使用する変性HPLC分析によって解析した（(Underhill, Jin et al. 1996))。突然変異の位置を30kbpの間隔に絞り込んだ。突然変異の正確な位置を、WAVE系とこれに続く配列決定を用いる候補遺伝子の分析によって同定した。
【００５７】
実施例II：Drosophila melanogasterにおけるELPの発現
生涯または特定の発生段階だけに、そして異なるレベルで、ショウジョウバエの生体全体、または特定臓器で、または特定の細胞型で、特定のトランスジーンを発現させることができる。ショウジョウバエの遺伝学に使用する標準法の概要は、[Brand, 1993; Perrimon, 1998; Perrimon, 1998］に見出すことができる。推定腫瘍抑制遺伝子として、野生型または突然変異体ELPタンパク質の過剰発現が成長を妨害すると予想される。この仮説を立証するため、野生型ショウジョウバエELPタンパク質をコードしているUASトランスジーンを持つトランスジェニックハエを、異なる組織特異的プロモーターの制御下で発現されるGa14を有するハエと交配した（図6および表2）。GAL4駆動コンストラクトは、無眼-Gal4、痕跡-Gal4、MS1096-Gal4を包含するがこれらに限定されない（Capdevila and Guerrero 1994）。同様にして、アミノ酸置換または内部除去を持つ突然変異体タンパク質の機能を試験することができる。
【００５８】
【表１】
2005537783.tif 000003
【００５９】
表2. 異なる組織でのDELPの過剰発現。
独立した二つのdelpの挿入を持つトランスジェニック動物を、第一列に示したそれぞれのGAL4供給源と交配して、様々な組織でdELPを過剰発現させた。略語：vs eye omm #↓：非常に小さな眼、個眼数減少；+/- veins：翅内の静脈増加または喪失；ru. wings：痕跡翅、非常に小さなサイズ；no vis. ph.：視認し得る表現型無し。
【００６０】
過剰発現野生型（例えば図6）または予想突然変異体ELPで得られた視認し得る表現型と共にこの系を用いて、ELPタンパク質の構造/機能分析が実施できる。このような表現型は、表現型の抑制をもたらす他の遺伝子における優性または劣性の機能喪失突然変異を求めるスクリーニングにも利用できる。これに代わり、エンハンサー-プロモーター（EP）エレメント（Rorth 1996）を使用して、過剰発現した場合に表現型を抑制する遺伝子を求めるスクリーニングを実施することができる。この場合、EPエレメントがこの遺伝子の5'末端に組み込まれることにより、ランダム遺伝子の過剰発現が引き起こされる。
【００６１】
実施例III：ヒト相同体のクローニング
プログラムBlastp（http://www.ch.embnet.ort/software/aBLAST.html）を使用し、予想コード配列およびdELP配列との相同性を持つ発現配列標識（EST）について公的配列データベースを検索することにより、ヒトELP（hELP)(配列番号1、2、5）を同定した。dELPは、染色体V上の予想遺伝子および幾つかのESTに対し、統計上有意な類似性を示した。hELP完全長cDNAを、Resgen由来の完全長ヒトcDNAクローンコレクションから取得した（受理番号AL529948クローンID CS0DD005YJ09 Library LTI_NFL001_NBC4）。このcDNAのコレクションは、オリゴdTプライマーおよびSuperscript II逆転写酵素を用いて組み立てたライブラリーから誘導した。組み立てプロセスの後、ゲノムDNA配列および一般に入手可能なデータを用いてこの配列をクロスチェックすることにより確認した。
【００６２】
ショウジョウバエとヒトのELPの機能的相同性を確認するため、ヒトとショウジョウバエの完全長ELP cDNAを、pUAS形質転換ベクターのようなショウジョウバエ発現ベクター中にクローニングした（Phelps and Brand 1998）。（Basler and Hafen 1988）に記載の方法に従い、トランスジェニックハエを作製できる。このトランスジーンを、2個のelp突然変異体アレレのいずれかについてトランスヘテロ接合であり、さらにGal-4トランスジーンを有するハエと組み合わせ、UAS-トランスジーンを遍在的にまたは組織および/または段階特異的に発現させた。Gal4トランスジーンは、アクチン-Gal4、チューブリン-Gal4、および熱ショック-Gal4を包含するがこれらに限定される訳ではない。表1に示すように、ショウジョウバエまたはヒトのトランスジーンの遍在的発現は、elp突然変異体アレレのトランスヘテロ接合に関連する幼虫後期から蛹期までの致死性を少なくとも部分的に救済した。この事は、help遺伝子がショウジョウバエelp遺伝子の機能的相同体であることを証明している（図6を参照されたい）。
【００６３】
【表２】
2005537783.tif 000004
【００６４】
表1. 遍在的ELP過剰発現によるdelp-アレレの救済分析。トランスヘテロアレレホモ接合突然変異体の状況でElpを過剰発現させるため、UASElp-トランスジーンを使用した。使用したUAS-Elp-トランスジーン：2.4a: UAS-hElp18aa；5.20d: UAS-DElp-ENTH。使用したElp-アレレ：Delp1G1: V266F-突然変異；Delp4K2: E27G-突然変異；Delp1U1: 5'UTRにおけるトランジション；Delp2W2: 5'UTRにおけるトランジション。使用したGAL4-供給源：armGal4: アルマジロ-Gal4；hsGal4: 熱ショック-Gal4；Act5CGal4: アクチン5C-Gal4。UAS-トランスジーンとGal4-系統にw+を付した。
【００６５】
別法として、ショウジョウバエおよびヒト完全長cDNAを、チューブリンプロモーターを含む形質転換ベクターに、以下の順序で挿入することができる：チューブリンプロモーター - FRT - cDNA STOP - FRT - Gal4（略称：tub：>cDNA>Gal4）。このようにして、チューブリンプロモーターによって救済トランスジーンが直接制御され、その結果、Gal4系によるよりも低い、そしてことによるとより高い生理的レベルのELP発現がもたらされる。さらに、ELP突然変異体のバックグラウンドでは、elp cDNAは、熱ショック誘発プロモーターまたは組織特異的プロモーターのいずれかの下で、FLPリコンビナーゼを発現させることにより、細胞のクローン中に切り取ることができる。このようにして作製した突然変異体細胞は、これらの細胞中でGAL4がチューブリンプロモーターによって駆動することから、UAS-GFPリポーターによって認識できる。この方法はKramps et al.により最近記載された（Cell 109:47-60, 2002）。
【００６６】
実施例IV：ハイブリダイゼーションプローブとしてのELP DNAの用途
以下の方法は、ハイブリダイゼーションプローブとしてのelpの非反復ヌクレオチド配列の用途を記載するものである。この方法は、ELP相同体についてのスクリーニングにも同様に適用できる。相同体DNAについてスクリーニングするため、elp配列（配列番号1および3に示す）を含むDNAをプローブとして利用する（例えばcDNAまたはゲノムライブラリーに含まれるもの）。
【００６７】
ハイブリダイゼーションおよびいずれかのライブラリーDNAを含むフィルターの洗浄を標準的な高ストリンジェント条件下で実施する（Sambrook, Fritsch et al. 1989）。陽性クローンを用いて、より大きなcDNAライブラリーの平板培養をさらにスクリーニングできる。その後、代表的cDNA-クローンをpBluescript（pBS、Stratagene）または類似のクローニングベクター中にクローニングし、配列決定する。
【００６８】
実施例V：in situハイブリダイゼーションのためのハイブリダイゼーションプローブとしてのelpの用途。
ショウジョウバエelp mRNAのin situハイブリダイゼーションは、（Tautz and Pfeifle 1989）に記載のようにして胚で実施できる。しかしながら、少しの改変を加えることで、これはショウジョウバエまたは脊椎動物組織切片中のmRNA転写物の検出にも利用することができる。標識したRNAプローブは、製造者の推奨に従い、例えばDIG RNA標識化キット（SP6/T7)(Boehringer Mannheim）または32P-標識化を用いて、線状化elp cDNAまたはそのフラグメントから製造できる。ハイブリダイゼーションプローブとしてのhelpと共に同様の方法を用いて、ヒト組織をスクリーニングすることができる（図4および5を参照されたい）。
【００６９】
実施例VI：E.coliにおけるELPタンパク質の発現
以下の方法は、細菌細胞におけるELPの組換え発現を記載している。別法として、組換えタンパク質を昆虫および哺乳動物細胞から作製し単離することもできる（Sambrook, Fritsch et al. 1989）。完全長または末端切除型ELPをコードしているDNAを、エピトープ標識またはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）cDNAおよび誘導可能な細菌発現ベクター内部にあるトロンビン開裂部位の下流に融合させる。このようなエピトープ標識はポリ-his、S-タンパク質、チオレドキシン、および免疫グロブリン標識を包含する。商業的に入手可能なpGEX-4T（Pharmacia）のようなプラスミドを包含する様々なプラスミドが利用できる。
【００７０】
簡潔に述べると、例えばGST配列と融合させたELP配列を含む細菌発現プラスミドを、常法によってBL21（例えばStratagene）のようなプロテアーゼ欠失E.coli中に導入することができる。次いでこのプラスミドを含む細菌コロニーを、選択培地中で飽和に達するまで一夜拡張する。翌朝、この培養を1:100に希釈し、最適密度（OD600）0.6となるまで細菌を増殖させる。GST-ELP融合タンパク質が発現されるプロモーターのインデューサーを添加してタンパク質産生を開始させる。使用する発現ベクターに応じて、IPTGを包含する種々のインデューサーが利用できる。
【００７１】
次に、発現されたGST標識を有するELPを、例えばアフィニティビーズまたはアフィニティクロマトグラフィー、例えばグルタチオンビーズ（例えばPharmaciaから市販されている）を用いて精製できる。Lgs-発現細菌を超音波処理用緩衝液（10mM Tris HCl pH8.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1.5%サルコシル、2% Trison-X-100、1mM DTTおよびプロテアーゼインヒビター）中で溶解し、続いて氷上で短時間超音波処理し（例えば中等度出力で20秒間3回）、遠心分離することによって、抽出物を調製する。次いで、透明化した上清を例えばグルタチオンビーズと共に4℃で1時間、穏やかに回転させつつインキュベートする。次にビーズを洗浄緩衝液（20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、0.5% NP40）中で数回洗浄し、最後に、保存緩衝液（20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、10%グリセロール、0.5% NP40、およびプロテイナーゼインヒビター）中で保存する。別法として、His-標識またはIgG標識を有するELPは、それぞれNi2+-キレートアフィニティクロマトグラフィーまたはプロテインAまたはプロテインGカラムクロマトグラフィーを用いて精製できる。
【００７２】
調製物の品質は、例えばSDS-ゲル電気泳動および銀染色またはウェスタンブロットによって確認できる。
【００７３】
標識したエピトープを開裂させねばならない場合、この標識したエピトープとELPタンパク質の間の開裂部位の存在に応じて幾つかの方法が利用できる。例えば、第一のELPアミノ酸の直前にトロンビン開裂部位を含むGST-ELP融合タンパク質を作成することが可能である。簡潔に述べると、グルタチオン-アフィニティビーズ上のGST-ELP調製物を開裂緩衝液（50mM Tris HCl pH7.0、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT）で数回洗浄する。次いでトロンビンを加え、この試料を室温で16時間以上インキュベートする。次に上清を集め、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色またはウェスタンブロットにより、ELPがビーズからうまく開裂したかどうかを分析する。精製したタンパク質を（Harlow and Lane 1988）に記載のように使用して、例えば抗ELP抗体を作製する。
【００７４】
実施例VII：ELPの関与するタンパク質-タンパク質相互作用
インビトロ同時免疫沈降検定を実施して、ELP相互作用の相手を発見または確認することができる。例えば、50%密集状態のHEK293細胞をリポフェクション法によってトランスフェクトする。この目的のため、標識したELPおよび潜在的相互作用相手をコードしているcDNAを含む哺乳動物発現ベクターを、製造者の推奨に従ってリポフェクタミントランスフェクション試薬（Life Technologies, Inc.）と合し、細胞の単層上に積層する。co-IP緩衝液（20mM Tris HCl pH 7.5、140mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM DTT、1% Triton-X100、10%グリセロール、1mMバナジウム酸ナトリウム、50mM NaF、およびプロテアーゼインヒビター）中でのトランスフェクションの25時間後に細胞を溶解する。プロテインG-アガロース（Boehringer Mannheim）にコンジュゲートさせた抗標識抗体（例えば、抗HA、クローン3F10、Boehringer Mannheim）を用いてco-IP緩衝液中で免疫沈降を実施する。対照の免疫沈降はラットまたはマウスIgG（Sigma-Aldrich）を用いて実施する。4℃で3時間インキュベートした後、ビーズを洗浄緩衝液（20mM Tris HCl pH 7.5、140mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM DTT、1% Triton-X100、1mMバナジウム酸ナトリウム、50mM NaF）で4回洗浄し、Laemmli緩衝液25μlに再懸濁する。本発明が提供する抗ELPポリクローナル抗体または抗標識抗体、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（Amersham Pharmacia Biotech）を用いてSDS-PAGE/免疫ブロット検定により免疫複合体を分析する。増強化学ルミネセンス検出法（例えばECL、Amersham Pharmacia Biotech）を用いて検出ができる。
【００７５】
GST-融合タンパク質インビトロ結合検定を行って、例えば、結合ドメインをマッピングし、または相互作用相手を確認し、またはさらなる相互作用タンパク質を見出すことができる。この目的のためには、製造者の提供する説明書に従って、[35S]メチオニンを含有する網状赤血球溶解産物（TNT-溶解産物、Promega Corporation）を用いてタンパク質をインビトロ翻訳（IVT）する。実施例VIの説明のようにして作製したグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質をグルタチオン-セファロース上に固定化し、結合緩衝液（20mM Tris pH 8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、10%グリセロール、0.5% NP40、0.05% BSA、およびプロテイナーゼインヒビター）中で45分間ブロックする。次に、固定化GSTタンパク質2μgを、結合緩衝液中でIVTタンパク質0.5-4μlと共に1.5時間インキュベートする。このビーズを洗浄緩衝液（20mM Tris pH 8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、1mM DTT、1mM MgCl2、0.5% NP40）で4回洗浄しLaemmli SDS試料緩衝液中で煮沸する。無傷のGST融合タンパク質が当量使用された事、そしてcDNAのIVTが成功した事を、クマシー染色またはオートラジオグラフィーを各々用いるSDS-PAGE分析によって確認せねばならない。
【００７６】
さらに、酵母2ハイブリッド検定を実施して、上記のインビトロ結合検定結果を確認し、または新たな相互作用相手についてcDNAライブラリーをスクリーニングすることができる（Fields and Sternglanz 1994）。ELPと相互作用相手の特異結合を確認し、または両者の結合領域をマッピングするために、所望のcDNAを、それらをLex DNA結合ドメイン（例えばpLexA、Clontech）または酸性活性化ドメイン（例えばpGJ4-5、Clontech）のいずれかに結合させる適当な酵母発現ベクター中にサブクローニングする。次に、酢酸リチウム-ポリエチレングリコール法によって適当なプラスミドの対をリポータープラスミド（例えばpSH18-34、Clontech）と共に適当な酵母菌株（例えばEGY48）中に導入し、選択培地上で増殖させる（Sambrook, Fritsch et al. 1989）。使用したベクター-リポータープラスミドの製造者が記載するようにして、形質転換体をリポーター遺伝子活性について分析する。再現性を確立するため、この相互作用は両方向で試験する。
【００７７】
新規なELP結合タンパク質を単離するため（Bartel, Fields "The Yeast two-Hybrid System"  Oxford UP, 1997）、適当な酵母菌株を、LexA DNA結合ドメイン配列と融合させた、ELP cDNAを含む酵母発現ベクターであるβ-ガラクトシダーゼリポータープラスミドまたはその一部（「ベイトベクター」）、および、cDNA配列のコレクションと融合させた、転写活性化ドメインを含む第二の酵母発現ベクター（「プレイベクター」ライブラリー、例えばRFLY1 0-12 h胚ライブラリー（PNAS 93, 3011ffに記載されている））で形質転換する。次いで、リポータープラスミド、ならびにベイトおよびプレイベクターを含む三重形質転換体を選択培地上で増殖させ、栄養要求性およびβ-ガラクトシダーゼリポーターの相互作用依存的活性化について選択する。選択したクローンから各々のプレイコンストラクトを再単離し、関連性の無いベイト-コンストラクトとの相互作用の不在を調べることにより、ベイト/プレイ相互作用の特異性を評価する。最後に、確認した相互作用物質を配列決定し、完全長cDNAを組み立て、ベイトとの特異的相互作用について再度試験する。
【００７８】
実施例VIII：免疫組織化学
本発明が提供する抗ELP抗体を用いて、ショウジョウバエの胚、成虫原基、成体組織切片、脊椎動物腫瘍細胞系、または脊椎動物組織上でELPタンパク質の位置決定を行うことができる。例えば、HEK293細胞（ATCC）のような形質転換されたセルラインを使用する場合、細胞をポリリジン被覆8ウェルチェンバー（Nalge-Nunc Internat.）中に蒔き、37℃で一夜増殖させる。翌日、細胞をPBS中の3.7%ホルムアルデヒドで10分間固定し、0.5% Triton-X-100中でさらに10分間透過性とし、2% BSA-PBS中の前免疫血清の1:1000希釈で室温下に1時間ブロックする。次に、本発明が提供する抗ELPポリクローナルウサギ免疫血清の1:2000希釈と共に、細胞を室温で2時間インキュベートする。このスライドをPBS中で5分間3回洗浄し、TRITC-コンジュゲート化ブタ抗ウサギ免疫グロブリン（Dako, Inc.）の1:200希釈（v/v）と共にインキュベートする。洗浄工程を反復した後、Vectashield(登録商標）封入剤（Vector Laboratories, Inc.）を用いてカバーグラスを適用する。特異的染色についての正の対照として、細胞の一部を、例えばELP発現プラスミド、例えばpcDNA3.1（Invitrogen）を用いるリポフェクション法によってトランスフェクトできる。トランスフェクションの2日後、対照細胞を抗ELP抗体を用いて上記のように染色する。
【００７９】
実施例IX：RNA干渉実験
RNA干渉（RNAi）とは、短い二本鎖RNA（dsRNA）によって仲介される転写後遺伝子サイレンシングの一形態であって、植物、線虫、無脊椎動物および哺乳動物細胞培養で記載されている（(Ngo, Tschudi et al. 1998 ；Vaucheret and Fagard 2001)(Kennerdell and Carthew 1998；Caplen, Fleenor et al. 2000；Elbashir, Harborth et al. 2001；Timmons, Court et al. 2001）。dsRNAは、この短いdsRNAに相補的な一本鎖RNAが速やかに分解される分解反応を誘起することが示されている（Montgomery and Fire 1998；Montgomery, Xu et al. 1998）。RNAiはこのように、例えば生体または無脊椎動物および脊椎動物セルラインにおける遺伝子発現を低下させるのに利用できる（Kennerdell and Carthew 1998；Caplen, Fleenor et al. 2000；Clemens, Worby et al. 2000；Elbashir, Harborth et al. 2001）。dsRNAを細胞内に導入する幾つかの方法を文献に見出すことができる。例として、ここに、delp dsRNAによるショウジョウバエ細胞の処置を記載する。
【００８０】
ELP dsRNAの製造
そのdsRNAの殆どがエキソン領域に対応している限り、ELP dsRNAをcDNAまたはゲノムDNA鋳型から作製することができる。通常、700ないし800塩基対の標的領域が最も活性である。しかしながら、200塩基対という短いdsRNAおよび2000塩基対という長いdsRNAが強力な干渉活性を有することが知られている。両方のRNA鎖を、例えばT7、SP6またはT3プロモーターを各々の末端に含むPCRフラグメントから同時に合成できる。このPCRフラグメントは、例えばT7-ポリメラーゼ結合部位を含む2個のプライマーを用いてELP cDNAまたはゲノムDNAの増幅によって作製できる。プライマー相補配列は、20ないし24ヌクレオチド長であるべきであり、22ヌクレオチド長が最適であり、そして60℃が最適Tmである。各プライマーの5'末端は、例えば27ヌクレオチドT7プロモーター配列に対応すべきである。次いで、ELP配列を含む適当な鋳型を用いてPCR反応を実施する。Taqポリメラーゼが最良の収率を与えるが、Pfuのような他のポリメラーゼを用いることもできる。最初の10サイクルには40℃のアニーリング工程があり、続いて55℃のアニーリング工程が35サイクルあるべきである。必要ならばDMSOを最終濃度5%まで添加できる。フェノール-クロロホルム抽出およびNH4OAc中のエタノール沈殿化を利用して反応混合物からPCR鋳型を単離できるが、商業的に入手可能な他のPCR精製キットも同様に使用できる。PCR DNA鋳型1μgを含む50μl容積で、適当なRNAポリメラーゼを用いてこのRNA合成反応を実施できる。Ambion由来のMEGAscriptTMキットが非常にうまく働く。RNAはこの合成反応の間に二本鎖となる。RNアーゼを含まないDNアーゼを用いてDNA鋳型を除去することができ、dsRNAをフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿化によって精製できる。DNA鋳型1μgからの典型的なRNAの収量は80ないし120μgの範囲である。dsRNAは使用直前までNaOAc/エタノール沈殿として-80℃で保存する。
【００８１】
dsRNAの品質はTBE中の未変性アガロースゲル電気泳動によって監視できる。このRNAの殆どの電気泳動移動度が、適当な長さのdsRNAについて予想される移動度（二本鎖DNAの移動度に極めて近い）にシフトする調製物のみを使用すべきである。
【００８２】
ショウジョウバエS2細胞中へのELP dsRNAのトランスフェクション
10%FCSを添加したSchneider S2ショウジョウバエ培地（GIBCO）でS2細胞を増殖させる。トランスフェクションの1日前に100万の細胞を6ウェルプレートに蒔き、25℃で一夜増殖させる。次に、製造者のプロトコルに適合させてカチオン性脂質CellFectine（GIBCO）で細胞をトランスフェクトする。簡潔に述べると、合計5μgのDNAおよびdsRNAを、無血清増殖培地1.2ml中のCellFectine脂質ミックス（例えばInvitrogen, Carlsbad, USA由来のDES発現培地）20μlと複合体形成させる。この複合体を室温で15分間インキュベートし、次いで細胞に添加し、ここから通常の増殖培地を1mlの無血清培地に交換した。4時間後、30%FCSを添加した1.2mlの増殖培地を細胞に加える。トランスフェクションの1日後、培地を10%FCSを含有する新鮮な培地に交換する。トランスフェクションの2日後から細胞を検定することができる（例えば、ELPタンパク質レベルまたはTcf転写活性について）。
【００８３】
同様に、（Elbashir, Harborth et al. 2001）に記載の方法を用いて哺乳動物ELP発現を低下させることができる。
【００８４】
実施例X：代替的helpスプライシング変異体およびキメラestの同定とクローニング
ELPの二つのヒトestイソ型：短型および長型、が、公的estデータベースに見出された。短型は、恐らくは異なるまたは不完全なスプライシングのため、c末端近くの54塩基を欠失している（図3）。両イソ型を、遺伝子特異的プライマーおよびest/cDNAクローンを用いて標準分子生物技術によってクローニングした（短：BE615647、BE61693、BG528377；長：cDNAクローンAL529948）。
【００８５】
hElpは、或る種のガンにおいて頻繁に除去されている染色体領域である5qに存在する（Genomics 2000 May 15; 66(1):26-34）。特定の症候群に関連する、この染色体領域からの遺伝物質の喪失が、腫瘍発生の劣性メカニズムを示唆しているという事、そして除去された染色体のバンドが腫瘍抑制因子を有しているという事が仮定できる。ELPの増殖阻害活性は、ELPがこの領域の腫瘍抑制因子であり得ることを示している。
【００８６】
この仮説を裏書きするため、本発明者等は、公的データベースから注文したhELP estの一つを完全に配列決定することによって、5q染色体領域のマッピングによって発見された遺伝子、AF156165と融合したh-ELPのC末端で構成されるキメラestを発見した（Genomics 2000 May 15;66(1):26-34）。h-ELPとAF156165は、各々領域5q23と5q33の間および5q31と5q32の間に位置する。キメラestはこの二つの遺伝子間の除去から発生したものであるのかも知れず、ENTHドメインを欠失する不完全なELPタンパク質を産生する。
【００８７】
実施例XI：正常組織対腫瘍組織におけるELP RNA発現
癌プロファイリングアレー（BD Biosciences cat. 7841-1）の膜を5'標識化hELPプローブ（ヌクレオチド751ないし1951）を用いてハイブリダイズした。製造者の推奨に従ってハイブリダイゼーションを68℃で実施し、0.2 x SCCおよび0.5% SDSを用いる最終洗浄を68℃で15分間行った。試料の照会については、BD bioscienceのカタログを参照されたい。一組の正常組織対腫瘍組織におけるELP RNA発現を示すドットブロットを図5に示すが、これはhELP転写物の発現を示しており、そして、増大したおよび低下したELP発現を有する腫瘍のパーセンテージを下の表3に要約する。
【００８８】
【表３】
2005537783.tif 000005
【００８９】
表3. 図5のデータの要約
各々の正常組織と比較したhELP mRNA発現の低下が、肺、腎臓および胃のガン試料の大半に観察された。ELP RNAのダウンレギュレーションは、全肺癌の3/4前後に、そして腎臓および胃ガン試料の1/2以上に見出された（潜在的腫瘍抑制機能の表示：「腫瘍はそれを排除する事を求める」）。
【００９０】
本発明の現在好ましい態様を示し記載しているが、本発明はこれらに限定される訳ではなく、以下の請求項の範囲内で別途様々に具体化および実施できるという事を明確に理解すべきである。
【００９１】
本明細書全編に引用した全ての文献/刊行物の内容は、引用によりその全体を本明細書の一部とする。
【００９２】
参考文献
Basler, K. and E. Hafen (1988).  "Control of photoreceptor cell fate by the sevenless protein requires a functional tyrosine kinase domain."  Cell 54(3): 299-311。
Bohni, R., J. Riesgo-Escovar, et al. (1999).  "Autonomous control of cell and organ size by CHICO, a Drosophila homolog of vertebrate IRS1-4."  Cell 97(7): 865-75。
Brogiolo, W., H. Stocker, et al. (2001).  "An evolutionarily conserved function of the Drosophila insulin receptor and insulin-like peptides in growth control."  Curr Biol 11(4): 213-21。
Caplen, N. J., J. Fleenor, et al. (2000).  "dsRNA-mediated gene silencing in cultured Drosophila cells: a tissue culture model for the analysis of RNA interference."  Gene 252(1-2): 95-105。
Carbone, R., Fre, S., Iannolo, G., Belleudi, F., Mancini, P., Pelicci, P.G., Torrisi, M.R., Di Fiore, P.P. (1997).  "Eps15 and eps15R are essential components of the endocytotic pathway."  Cancer Res. 57: 5498-5504。
Chen, H., S. Fre, et al. (1998).  "Epsin is an EH-domain-binding protein implicated in clathrin-mediated endocytosis."  Nature 394(6695): 793-7。
Clemens, J.C., C.A. Worby, et al. (2000).  "Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways."  Proc Natl Acad Sci U S A 97(12): 6499-503。
Cole (1985).  Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy。
Elbashir, S.M., J. Harborth, et al. (2001).  "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells."  Nature 411(6836): 494-498。
Elbashir, S.M., W. Lendeckel, et al. (2001).  "RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs."  Genes Dev 15(2): 188-200。
Fields, S. and R. Sternglanz (1994).  "The two-hybrid system: and assay for protein-protein interactions."  Trends Genet 10(8): 286-92。
Harlow, E. and D. Lane (1988).  Antibodies, A laboratory manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory。
Hidalgo, M. and E. K. Rowinsky (2000).  "The rapamycin-sensitive signal transduction pathway as a target for cancer therapy."  Oncogene 19(56): 6680-6。
Huang, H., C. J. Potter, et al. (1999).  "PTEN affects cell size, cell proliferation and apoptosis during Drosophila eye development."  Development 126(23): 5365-72。
Hyman, J., H. Chen, et al. (2000).  "Epsin 1 undergoes nucleocytosolic shuttling and its eps15 interactor NH(2)-terminal homology (ENTH) domain, structurally similar to Armadillo and HEAT repeats, interacts with the transcription factor promyelocytic leukemia Zn(2)+ finger protein (PLZF)."  J Cell Biol 149(3): 537-46。
Ishibashi, S., M. S. Brown, et al. (1993).  "Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery."  J Clin Invest 92(2): 883-93。
Itoh, T., S. Koshiba, et al. (2001).  "Role of the ENTH domain in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate binding and endocytosis."  Science 291(5506): 1047-51。
Kay, B. K., M. Yamabhai, et al. (1999).  "Identification of a novel domain shared by putative components of the endocytic and cytoskeletal machinery."  Protein Sci 8(2): 435-8。
Kay, M. A., C. N. Landen, et al. (1994).  "In vivo hepatic gene therapy: complete albeit transient correction of factor IX deficiency in hemophilia B dogs."  Proc Natl Acad Sci U S A 91(6): 2353-7。
Kennerdell, J. R. and R. W. Carthew (1998).  "Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway."  Cell 95(7): 1017-26。
Kohler, G. and C. Milstein (1975).  "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity."  Nature 256(5517): 495-7。
Kozbar (1983).  Immunology Today 4:72。
Landegren, U., R. Kaiser, et al. (1988).  "A ligase-mediated gene detection technique."  Science 241(4869): 1077-80。
Martin, T. F. (2001).  "PI(4,5)P2 regulation of surface membrane traffic."  Current Opinion in Cell Biology 13: 493-499。
Montgomery, M. K. and A. Fire (1998).  "Double-stranded RNA as a mediator in sequence-specific genetic silencing and co-suppression."  Trends Genet 14(7): 255-8。
Montgomery, M. K., S. Xu, et al. (1998).  "RNA as a target of double-stranded RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans."  Proc Natl Acad Sci U S A 95(26): 15502-7。
Nakashima, S., K. Morinaka, et al. (1999).  "Small G protein Ral and its downstream molecules regulate endocytosis of EGF and insulin receptors."  Embo J 18(13): 3629-42。
Nakazawa, H., D. English, et al. (1994).  "UV and skin cancer: specific p53 gene mutation in normal skin as a biologically relevant exposure measurement."  Proc Natl Acad Sci U S A 91(1): 360-4。
Neufeld, T. P., A. F. de la Cruz, et al. (1998).  "Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing."  Cell 93(7): 1183-93。
Newsome, T. P., B. Asling, et al. (2000).  "Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics."  Development 127(4): 851-60。
Ngo, H., C. Tschudi, et al. (1998).  "Double-stranded RNA induces mRNA degradation in Trypanosoma brucei."  Proc Natl Acad Sci U S A 95(25): 14687-92。
Nurse, P. (1975).  "Genetic control of cell size at cell division in yeast."  Nature 256(5518): 547-51。
Nurse, P. (2000).  "A long twentieth century of the cell cycle and beyond."  Cell 100(1): 71-8。
Oldham, S., J. Montagne, et al. (2000).  "Genetic and biochemical characterization of dTOR, the Drosophila homolog of the target of rapamycin."  Genes Dev 14(21): 2689-94。
Phelps, C. B. and A. H. Brand (1998).  "Ectopic gene expression in Drosophila using GAL4 system."  Methods 14(4): 367-79。
Rosenthal, J. A., H. Chen, et al. (1999).  "The epsins define a family of proteins that interact with components of the clathrin coat and contain a new protein module."  J Biol Chem 274(48): 33959-65。
Sambrook, J., E. F. Fritsch, et al. (1989).  Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press。
Tautz, D. and C. Pfeifle (1989).  "A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback."  Chromosoma 98(2): 81-5。
Timmons, L., D. L. Court, et al. (2001).  "Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans."  Gene 263(1-2): 103-12。
Underhill, P. A., L. Jin, et al. (1996).  "A pre-Columbian Y chromosome-specific transition and its implications for human evolutionary histry."  Proc Natl Acad Sci U S A 93(1): 196-200。
Vaucheret, H. and M. Fagard (2001).  "Transcriptional gene silencing in plants: targets, inducers and regulators."  Trends Genet 17(1): 29-35。
Vecchi, M., S. Polo, et al. (2001).  "Nucleocytoplasmic shuttling of endocytic proteins."  J Cell Biol 153(7): 1511-7。
Verdu, J., M. A. Buratovich, et al. (1999).  "Cell-autonomous regulation of cell and organ growth in Drosophila by Akt/PKB."  Nat Cell Biol 1(8): 500-6。
Wagner, R. W., M. D. Matteucci, et al. (1996).  "Potent and selective inhibition of gene expression by an antisense heptanucleotide."  Nat Biotechnol 14(7): 840-4。
Weinkove, D., T. P. Neufeld, et al. (1999).  "Regulation of imaginal disc cell size, cell number and organ size by Drosophila class I(A) phosphoinositide 3-kinase and its adaptor."  Curr Biol 9(18): 1019-29。
Xu, T. and G. M. Rubin (1993).  "Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues."  Development 117(4): 1223-37。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１Ａ】図1Aは、対照としての野生型キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）の眼の電子走査顕微鏡写真を示している。
【図１Ｂ】図1Bは、ホモ接合のdELP突然変異体組織でほぼ構成される複眼の電子走査顕微鏡写真を示している。この眼は大きさの劇的な拡大を示している。この写真は、遺伝子型y w ey-flp/y w；FRT82 dELP4K2/FRT82 w + c13R3の雌で撮影した。
【図２】図2は、dELP（配列番号4）とhELP（配列番号2）の配列アラインメントを示している。暗色の囲み：同一残基。灰色の囲み：保存残基。
【図３】図3は、2つのh-ELPイソ型：h-ELP（配列番号2)(データベース由来の配列）およびh-ELP18aa（配列番号5)(EST由来の配列）のClustal Wアラインメントを示している。同一アミノ酸をアラインメント下部の星印で示す。
【図４Ａ】図4Aは、ヒト組織におけるh-ELP転写物の発現を示す。
【図４Ｂ】図4Bは、複数の細胞系におけるh-ELP転写物の発現を示している。ノーザンブロット（Clonetech）を、32P標識したh-ELPプローブ（ヌクレオチド751ないし1951）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションはExpressHyb（Clonetech）により68℃で行い、0.1 x SSCおよび0.1% SDS、68℃で10分間の最終洗浄を行った。
【図５】図5は、hELP転写物の発現を示している。癌プロファイリングアレー（BD Biosciences cat. 7841-1）メンブレンを、5'標識したhELPプローブ（ヌクレオチド751ないし1951）とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは68℃で実施し、製造者の推奨に従い0.2 x SSCおよび0.5% SDS、68℃で15分間の最終洗浄を行った。試料の照会にはBD bioscienceのカタログを参照されたい。
【図６】図6は、ハエ成虫の眼および翅においてdelpの過剰発現により惹起された成長表現型を示している。A) 発生しつつある眼におけるdELPの過剰発現は、成虫の眼において成長阻害表現型を誘起し、一方翅における過剰発現は翅の大きさの著しい縮小を導き、これは同時にアポトーシス効果をも含んでいるかも知れない。B) およびD) 対照としてのdelp UAS-系統。遺伝子型：A) y w UAS-delp 3.15；eyGal4/+  B) y w UAS-delp 3.15；+/+  C) y w MS 1096/UAS-delp 3.15  D) y w 3.15 UAS-delp；+/+；MKRS/TM3。
【配列表】
2005537783.tif 000006
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2005537783.tif 000014
2005537783.tif 000015
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2005537783.tif 000018
2005537783.tif 000019
【図３】
2005537783.tif 000020
【図６】
2005537783.tif 000021
2005537783.tif 000022
2005537783.tif 000023
2005537783.tif 000024
【図１Ａ】
2005537783.tif 000025
【図１Ｂ】
2005537783.tif 000026
【図２】
2005537783.tif 000027
【図４Ａ】
2005537783.tif 000028
【図４Ｂ】
2005537783.tif 000029
【図５】
2005537783.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月2日(2004.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ENTHドメインを含み、且つ成長阻害活性を有する単離されたタンパク質であって、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードしている、単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に定義する核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
真核生物細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
過剰増殖性疾患、特に良性および悪性腫瘍、またはその遺伝的素因を同定するための方法であって、対象の体液または組織試料中における、ＥＬＰタンパク質の発現レベルの変化、および/またはＥＬＰタンパク質をコードしている核酸配列内の少なくとも1個の突然変異を検出すること、または、ゲノムelp座における再編成を検出すること、を含む方法。
【請求項７】
該突然変異が、ENTHドメインをコードしているDNA領域内部、または5'非翻訳領域、または進化の過程で保存されたアミノ酸をコードしているコドン、プロモーターまたはスプライシング部位に位置している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該突然変異が、非機能的ＥＬＰタンパク質、低下したタンパク質発現、またはタンパク質の欠如、または融合タンパク質を導く、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
ＥＬＰタンパク質をコードしている該核酸配列が配列番号1又は請求項２で定義する核酸配列から選択される、請求項６〜８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
該疾患が肺ガンである、請求項６〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
該疾患が腎臓ガンである、請求項６〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
該疾患が胃ガンである、請求項６〜９のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
適当な宿主細胞を、発現コンストラクト中の請求項２に記載の核酸で形質転換させること、該細胞を該タンパク質の発現をさせる条件下で培養すること、および生成したタンパク質を単離することを含む、ＥＬＰタンパク質の生成のための方法。
【請求項１４】
過剰増殖性疾患またはその遺伝的素因の同定のための方法における、ＥＬＰタンパク質のエピトープに特異結合できる抗体の使用。
【請求項１５】
ＥＬＰタンパク質に関連する過剰増殖性疾患の遺伝子治療のための、ＥＬＰタンパク質をコードしている核酸、特に配列番号１に記載の核酸配列又は請求項２で定義する核酸配列、の使用。
【請求項１６】
ＥＬＰタンパク質および/またはＥＬＰタンパク質をコードしている核酸配列、配列番号２または配列番号５に記載のタンパク質および配列番号に記載の核酸配列または請求項３で定義する核酸配列を含む、過剰増殖性疾患、特に良性および悪性腫瘍の処置のための医薬組成物。
【請求項１７】
過剰増殖性疾患が肺ガンである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
過剰増殖性疾患が腎臓ガンである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
過剰増殖性疾患が胃ガンである、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
過剰増殖性疾患および/または間違った細胞分化を特徴とする疾患の治療のための、ＥＬＰタンパク質をコードしているｍＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２１】
該オリゴヌクレオチドが化学的修飾を含む、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
該ＲＮＡがＥＬＰタンパク質をコードしている遺伝子のエキソン領域と相補的なヌクレオチド配列を有する、遺伝子サイレンシングのための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の使用。
【請求項２３】
該ＲＮＡが約２００〜２０００塩基対、好ましくは７００〜８００塩基対の長さを有する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
該ＲＮＡが約１８〜２５塩基対、好ましくは２０〜２２塩基対の長さを有する、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
該ＥＬＰタンパク質がヒトＥＬＰである、請求項２２に記載の使用。
【国際調査報告】
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