(57)【要約】本発明は、肝炎ウイルス感染症、特にC型肝炎ウイルス感染症を治療する組成物および方法を提供する。本発明は、多相性薬物動態プロフィールを提供するために、第1型および第2型のIFN-αを投与することを含む、肝炎ウイルス感染症を治療する方法を提供する。得られる多相性抗ウイルス剤血清濃度プロフィールによって、ウイルス力価の初回の急激な減少の後、経時的なウイルス力価のさらなる減少が得られ、持続的なウイルス反応が得られる。本発明はさらに、多相性IFN-αプロフィールを得るために有効である組成物を提供する。本発明の組成物は、少なくとも、第1の薬物動態プロフィールを有する少なくとも第1型のインターフェロンα（IFN-α）と、第2の薬物動態プロフィールを有する第2型のIFN-αとを含み、第2型のIFN-αは、第1型のIFN-αより長い平均残留時間を有する。本発明はさらに、C末端が改変されたIFN-αを含む組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法：
第1型のインターフェロンα（IFN-α）と第2型のIFN-αとを含む組成物を投与する段階であって、第2型のIFN-αがポリエチレングリコール（PEG）部分を含み、その結果として第1型のIFN-αの平均滞留時間より長い平均滞留時間を有し、組成物は、約24〜48時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表す最大認容量（MTD）の少なくとも約80％であるIFN-αの第1の血清濃度が得られ、その後少なくとも7日間の第2の期間維持されるMTDの約50％またはそれ未満であるIFN-αの第2の濃度が得られるように有効な量で投与される段階。
【請求項２】
持続的なウイルス反応が得られる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
IFN-αの投与前約1日〜約14日間、IFN-γを投与することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
第2型のIFN-αが、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基1〜10位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
第2型のIFN-αが、IFN-αポリペプチドのアミノ末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
第2型のIFN-αが、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基150〜166位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
第2型のIFN-αが、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含む、請求項1記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含む、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法：
第1型のインターフェロンα（IFN-α）と第2型のIFN-αとを含む組成物を投与する段階であって、第2型のIFN-αがポリエチレングリコール（PEG）部分を含み、その結果として第1型のIFN-αの平均滞留時間より長い平均滞留時間を有し、組成物は、第1の相と第2の相が得られるように有効な量で投与され、第1の相において、約24時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表す最大認容量（MTD）の少なくとも約80％であるIFN-αの第1の血清濃度が得られるように、第2の相において、第2の相の任意の24時間かけて測定したIFN-αの最高血清濃度に対するIFN-αの最低血清濃度の比が3未満であって、第2の相におけるIFN-αの最高濃度がMTDの約50％またはそれ未満である段階。
【請求項９】
第2の相の任意の24時間かけて測定したIFN-αの最高血清濃度に対するIFN-αの最低血清濃度の比が約1である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
以下の段階を含む、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法：
第1型のコンセンサスインターフェロンα（CIFN）と第2型のCIFNとを含む組成物を投与する段階であって、第2型のCIFNがポリエチレングリコール（PEG）部分を含み、その結果として第1型のCIFNの平均滞留時間より長い平均滞留時間を有し、組成物は、約24時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表す最大認容量（MTD）の少なくとも約80％であるCIFNの第1の血清濃度が得られ、その後少なくとも7日間の第2の期間維持されるMTDの約50％またはそれ未満であるCIFNの第2の濃度が得られるように有効な量で投与される段階。
【請求項１１】
以下の段階を含む、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法：
第1型のコンセンサスインターフェロンα（CIFN）と第2型のCIFNとを含む組成物を投与する段階であって、第2型のCIFNがポリエチレングリコール（PEG）部分を含み、その結果として第1型のCIFNの平均滞留時間より長い平均滞留時間を有し、組成物が、第1の相と第2の相が得られるように有効な量で投与され、第1の相において、約24時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表す最大認容量（MTD）の少なくとも約80％であるCIFNの第1の血清濃度が得られ、第2の相において、第2の相の任意の24時間かけて測定したCIFNの最高血清濃度に対するCIFNの最低血清濃度の比が3未満であって、第2の相におけるCIFNの最高濃度がMTDの約50％またはそれ未満である段階。
【請求項１２】
以下の段階を含む、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法：
第1の相と第2の相とを含む投与計画においてIFN-αを投与する段階であって、第1の相において、約24時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表すIFN-αの第1の血清濃度C1maxが得られ、第2の相において、C1maxの約50％またはそれ未満であるIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表される第2の血清濃度Csusが得られ、第2の相における任意の24時間における時間の関数としてIFN-α血清濃度によって定義される曲線下面積が、図2に示すように2日目から3日目までの曲線下面積より大きくない段階。
【請求項１３】
以下の段階を含む、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法：
第1の相と第2の相とを含む投与計画においてコンセンサスIFN-α（CIFN）を投与する段階であって、第1の相において、約24時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表すCIFNの第1の血清濃度C1maxが得られ、第2の相において、C1maxの約50％またはそれ未満であるIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表すCIFNの第2の濃度Csusが得られ、第2の相における任意の24時間における時間の関数としてIFN-α血清濃度によって定義される曲線下面積が、図2に示すように2日目から3日目の曲線下面積より大きくない段階。
【請求項１４】
第1型のIFN-αの共有結合分子構造に、ポリエチレングリコールを含まない第1のIFN-αポリペプチドを含む、第1型のインターフェロンα（IFN-α）と；第2型のIFN-αの共有結合分子構造に、直接またはリンカーを通してポリエチレングリコール（PFG）部分に共有結合した第2のIFN-αポリペプチドを含む、第2型のIFN-αと；薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
【請求項１５】
第2型のIFN-αにおいて、PEG部分が、第2のIFN-αポリペプチドのアミノ酸残基1〜10位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
第2型のIFN-αにおいて、PEG部分が、第2のIFN-αポリペプチドのアミノ末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項14記載の組成物。
【請求項１７】
PEG部分が、第2のポリペプチドのアミノ末端アミノ酸のαアミノ基に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
PEG部分が、第2のポリペプチドのアミノ末端アミノ酸のαアミノ基に対するアミド結合によって直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
第2型のIFN-αにおいて、PEG部分が、第2のIFN-αポリペプチドのアミノ酸残基150〜166位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項14記載の組成物。
【請求項２０】
第2型のIFN-αにおいて、PEG部分が、第2のIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項14記載の組成物。
【請求項２１】
PEG部分が、第2のIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
PEG部分が、第2のIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に対するアミド結合によって直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
第2型のIFN-αの共有結合分子構造が、第2のIFN-αポリペプチドのアミノ酸残基1〜149位のアミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含まない、請求項19〜22のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２４】
第2型のIFN-αが単一のPEG部分を含む、請求項15〜18のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２５】
第2型のIFN-αが単一のPEG部分を含む、請求項19〜22のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２６】
第2型のIFN-αが単一のPEG部分を含む、請求項23記載の組成物。
【請求項２７】
第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとが、組成物において約1：1のモル比で存在する、請求項26記載の組成物。
【請求項２８】
第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとがそれぞれ、単一のIFN-αポリペプチド分子を含み、IFN-αポリペプチドが、第1型および第2型に関して同じであって、かつIFN-α-2a、IFN-α-2b、およびコンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択される、請求項25記載の組成物。
【請求項２９】
IFN-αポリペプチドがコンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択される、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
第1型のIFN-αおよび第2型のIFN-αがそれぞれ、単一のIFN-αポリペプチド分子を含み、IFN-αポリペプチドが第1型および第2型に関して同じであって、コンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択される、請求項27記載の組成物。
【請求項３１】
第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとが組成物において約1：5のモル比で存在する、請求項15〜18のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３２】
第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとがそれぞれ単一のIFN-αポリペプチド分子を含み、IFN-αポリペプチドが、第1型および第2型に関して同じであって、かつIFN-α-2a、IFN-α-2b、およびコンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択される、請求項15〜18のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３３】
IFN-αポリペプチドがコンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択される、請求項32記載の組成物。
【請求項３４】
第2型のIFN-αが単一のPEG部分を含む、請求項33記載の組成物。
【請求項３５】
第1型のIFN-αと第2型のIFN-αがそれぞれ、単一のIFN-αポリペプチド分子を含み、IFN-αポリペプチドが、第1型および第2型に関して同じであって、かつコンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択され、第2型のIFN-αが単一のPEG部分を含む、請求項31記載の組成物。
【請求項３６】
単一のインターフェロンα（IFN-α）ポリペプチドを含むインターフェロンα（IFN-α）誘導体であって、IFN-αポリペプチドが一つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（PEG）部分に直接またはリンカーを通して共有結合し、IFN-αポリペプチドが、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍の一つまたはそれ以上の部位でそれぞれのPEG部分に結合し、かつIFN-αポリペプチドが、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍の部位以外の任意の部位でPEG部分に直接またはリンカーを通して共有結合しない、誘導体。
【請求項３７】
IFN-αポリペプチドが、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基1〜149位のアミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合しない、請求項36記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項３８】
少なくとも一つのPEG部分が、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基150〜166位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項36または37に記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項３９】
少なくとも一つのPEG部分が、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項36または37に記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４０】
少なくとも一つのPEG部分が、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項39記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４１】
少なくとも一つのPEG部分が、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端のαカルボキシル基に対するアミド結合によって直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項40記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４２】
IFN-αポリペプチドが、（1）IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸もしくはその近傍に存在する単一の共有結合によって、直接もしくはリンカーを通して単一のPEG部分に共有結合するか、または（2）リンカーを通しておよびリンカーとIFN-αポリペプチドとのあいだの単一の共有結合（結合はIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍の部位に存在する）によって複数のPEG部分に共有結合するかのいずれかである、単一のインターフェロンα（IFN-α）ポリペプチドを含むインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４３】
それぞれのPEG部分が、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基150〜166位のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項42記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４４】
それぞれのPEG部分が、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項42記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４５】
それぞれのPEG部分が、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項44記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４６】
それぞれのPEG部分が、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に対するアミド結合によって直接またはリンカーを通して共有結合する、請求項45記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４７】
IFN-αポリペプチドが単一のPEG部分に共有結合する、請求項42〜46のいずれか一項記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４８】
IFN-αポリペプチドがコンセンサスインターフェロンαポリペプチドである、請求項47記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項４９】
IFN-αポリペプチドがインターフェロンα-2aポリペプチドである、請求項47記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項５０】
IFN-αポリペプチドが、インターフェロンα-2bポリペプチドである、請求項47記載のインターフェロンα（IFN-α）誘導体。
【請求項５１】
請求項47記載のインターフェロンαポリペプチド（IFN-α）誘導体および薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項５２】
IFN-αポリペプチドがコンセンサスインターフェロンαポリペプチドである、請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
個体に請求項51記載の組成物の有効量を投与することを含む、個体におけるC型肝炎感染症を治療する方法。
【請求項５４】
個体に請求項52記載の組成物の有効量を投与することを含む、個体におけるC型肝炎感染症を治療する方法。
【請求項５５】
請求項52記載の組成物の投与によって、全量でインターフェロンαの約5,000,000〜10,000,000国際単位が個体に送達される、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
請求項14記載の組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体におけるC型肝炎感染症を治療する方法。
【請求項５７】
請求項30記載の組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体におけるC型肝炎感染症を治療する方法。
【請求項５８】
請求項30記載の組成物の投与によって、全量でインターフェロンαの約5,000,000〜10,000,000国際単位が個体に送達される、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
請求項35記載の組成物の有効量を個体に投与することを含む、個体におけるC型肝炎感染症を治療する方法。
【請求項６０】
請求項30記載の組成物の投与によって、全量でインターフェロンαの約5,000,000〜10,000,000国際単位が個体に送達される、請求項59記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルス感染症、特に肝炎ウイルス感染症の治療分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
C型肝炎ウイルス（HCV）感染症は、米国における最も一般的な慢性血液媒介性感染症である。新たな感染症の数は減少しているが、慢性感染症の負荷は相当なものであり、米国疾病予防センターは、アメリカにおける感染者は390万人（1.8％）であると推定している。慢性肝疾患は、アメリカにおける成人の死因の第10位であり、年間約25,000人が死亡し、死亡全体の約1％を占める。慢性肝疾患の40％がHCV関連であり、毎年推定で8,000〜10,000人が死亡することを示す研究がある。HCV関連末期肝疾患は、成人における肝臓移植の最も多い適応である。
【０００３】
慢性C型肝炎の抗ウイルス療法は、この10年間で急激に進化して、治療の有効性には有意な改善が認められる。それにもかかわらず、ポリエチレングリコール化IFN-αプラスリバビリンを用いた併用治療を行っても、患者の40％〜50％が治療に失敗して、すなわち無反応であるか、または再発する。これらの患者は現在、有効な代替治療がない。特に、肝生検において進行した線維症または硬変を認めた患者は、腹水、黄疸、静脈瘤出血、脳症、および進行肝不全を含む進行肝疾患の合併症を発症する有意なリスクを有するのみならず、肝細胞癌のリスクが著しく増加している。
【０００４】
慢性HCV感染症の高い発生率は、アメリカにおける慢性肝疾患の将来的な負荷に関して公衆衛生の点から重要な意味を有する。国立健康栄養試験調査（NHANES III）に由来するデータは、1960年代後半から1980年代初期に新たなHCV感染率の大きい増加が、特に年齢20〜40歳の人に起こったことを示している。20歳またはそれ以上で長期HCV感染症を有する人の数は、1990年から2015年のあいだに750,000人から300万人以上へと4倍以上となりうると推定される。30または40歳代での感染者の比例的な増加はさらに大きい。HCV関連慢性肝疾患のリスクは感染症の期間に関連することから、20年以上の感染者では硬変のリスクは進行的に増加して、これによって1965〜1985年のあいだに感染した患者における硬変関連罹患率および死亡率の実質的な増加が起こる。
【０００５】
慢性C型ウイルス感染症は、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベルの間欠的または持続的な上昇および循環中のHCV RNAの一定レベルを特徴とする。現在のところ、承認された治療は、天然の白血球に由来する、または特異的サブタイプもしくはコンセンサスインターフェロンα（IFN-α）のcDNA配列を用いる組換え法によるαインターフェロンを用いる。承認された投与計画は、用量範囲6〜50μgのIFN-αの皮下投与を週に3回、24〜48週間の期間で行うことである。
【０００６】
IFN-αの定期的投与もまた、ウイルスの消失が得られうることを期待して行われている。反復投与は、IFN-αの急速な排泄およびインビボ分解を考慮すると必要であるように思われる。より良好な効率を得るもう一つの試みにおいて、IFN-αとリバビリンのような併用治療が行われている。インターフェロンα-2b＋リバビリン（Rebetron(商標)）の使用に対してインファジェン＋リバビリンの使用を比較するフェーズIV臨床試験からの最近の中間的な結果から、いくつかのインターフェロンが持続的なウイルス反応（SVR）を得るために他より強力である可能性があることが示されている。例えば、インファジェンとリバビリンの併用によって治療した患者は、レベトロンによって治療した患者におけるSVRが31％であるのに対し、SVR 56％を得た。
【０００７】
治療的方法をさらに改善する試みで、様々な研究者らが、タンパク質の分子量および大きさを増加させるために、ならびに全身循環時間を持続するために、ポリマー鎖を付加することによって、IFN-αの化学的改変を試みている。IFN-αのこれらの操作によって、循環時間が増加し、有効性はさらに改善するが、タンパク質の有意な分画はその活性を失う。このため、より大量のタンパク質を患者に投与しなければならず、そのような投与に伴って好中球減少症のような副作用を生じる。
【０００８】
IFN-αのそのような改変の例は、「PEG化」として知られるプロセスであるIFN-α分子へのポリエチレングリコール（PEG）鎖の付加である。αインターフェロンのPEG化によって、ポリペプチドの抗ウイルス活性の有意な減少が起こり、このようにPEG化は、活性の望ましくない低下が起こる可能性がある残基の改変を回避するために注意深く制御されなければならない。例えば、ABループ（残基29〜35位）、ヘリックスD（123〜140位）、およびサブタイプ識別ドメイン（残基78〜95位）のようなインターフェロン分子における受容体結合ドメインの化学的改変によって、タンパク質の抗ウイルス活性は有意に喪失する。変異誘発、欠失、化学改変および核磁気共鳴試験は、His34のようなこれらのドメインにおけるリジンまたはヒスチジンが活性の重要な決定因子であることを示している。
【０００９】
IFN-αが含まれる治療計画の際のウイルスの動態が調べられている。全般的に、何人かではウイルス力価の初回の急激な減少を認める（初期ウイルス反応；EVR）。EVRによって血清中HCV RNAレベルは、治療開始後24〜48時間のあいだに約0.5〜3対数減少する。初期の強い反応は、持続性のある反応を得るために都合がよい。患者によっては、EVRの後にさらに血中のウイルスのより急激でない減少が起こる（第2の相の減少）。第2の相の減少は、数週間または数ヶ月のあいだのウイルスレベルのより遅い減少である。
【００１０】
上記の承認された治療計画が利用できるにもかかわらず、持続的なウイルス反応を得たのは、治療した患者のごく少数に過ぎない。このように、当技術分野においてHCV感染症を治療する改善された方法が必要である。本発明は、この要求に取り組む。
【００１１】
文献
2005517648.tif 000002
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、肝炎ウイルス感染症、特にC型肝炎ウイルス感染症を治療する組成物および方法を提供する。本発明は、多相性薬物動態プロフィールを提供するために、IFN-αの第1型および第2型を投与することを含む、肝炎ウイルス感染症を治療する方法を提供する。得られる多相性抗ウイルス剤血清濃度プロフィールは、ウイルス力価の初回の急激な減少の後、経時的なウイルス力価のさらなる減少を引き起こし、持続的なウイルス反応を得る。本発明はさらに、多相性IFN-αプロフィールを得るために有効である組成物を提供する。本発明の組成物は、第1の薬物動態プロフィールを有する少なくとも第1型のインターフェロンα（IFN-α）と第2の薬物動態プロフィールを有する第2型のIFN-αとを含み、第2型のIFN-αは、第1型のIFN-αより長い平均滞留時間を有する。本発明はさらに、C末端が改変されたIFN-αを含む組成物を提供する。
【００１３】
発明の特徴
治療方法
本発明は、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を特徴とする。方法は一般的に、第1型のインターフェロンα（IFN-α）と第2型のIFN-αとを含む組成物を投与することを含み、第2型のIFN-αは、ポリエチレングリコール（PEG）部分を含み、その結果として第1型のIFN-αの平均滞留時間より長い平均滞留時間を有し、組成物は、約24〜48時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清で表す最大認容量の少なくとも約80％であるIFN-αの第1の血清濃度が得られるように、その後少なくとも7日間の第2の期間維持されるMTDの約50％またはそれ未満であるIFN-αの第2の濃度が得られるように有効な量で投与される。多くの態様において、持続的なウイルス反応が得られる。
【００１４】
いくつかの態様において、方法は、IFN-αを投与する前約1〜14日間、IFN-γを投与することをさらに含む。
【００１５】
いくつかの態様において、第2型のIFN-αは、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基1〜10位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、第2型のIFN-αは、IFN-αポリペプチドのアミノ末端のアミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含む。いくつかの態様において、第2型のIFN-αは、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基150〜166位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含む。いくつかの態様において、第2型のIFN-αは、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合したPEG部分を含む。
【００１７】
本発明はさらに、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を特徴とする。方法は一般的に、第1型のインターフェロンα（IFN-α）と第2型のIFN-αとを含む組成物を投与することを含み、第2型のIFN-αは、ポリエチレングリコール（PEG）部分を含み、その結果として第1型のIFN-αの平均滞留時間より長い平均滞留時間を有し、組成物は、第1の相と第2の相を得るために有効量で投与され、第1の相において、約24時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表す最大認容量（MTD）の少なくとも約80％であるIFN-αの第1の血清濃度が得られ、第2の相において、第2の相の任意の24時間にわたり測定したIFN-αの最高血清濃度対IFN-αの最低血清濃度の比が3未満であって、第2の相におけるIFN-αの最高濃度がMTDの約50％またはそれ未満である。
【００１８】
いくつかの態様において、第2の相の任意の24時間の期間にわたり測定したIFN-α最高血清濃度対IFN-α最低血清濃度の比は約1である。
【００１９】
本発明はさらに、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を特徴とする。方法は一般的に、第1型のコンセンサスインターフェロンα（CIFN）と第2型のCIFNとを含む組成物を投与する段階を含み、第2型のCIFNは、ポリエチレングリコール（PEG）部分を含み、その結果として第1型のCIFNの平均滞留時間より長い平均滞留時間を有し、組成物は、約24時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清で表す最大認容量（MTD）の少なくとも約80％であるCIFNの第1の血清濃度が得られるように、その後少なくとも7日間の第2の期間維持されるMTDの約50％であるまたはMTD未満であるCIFNの第2の濃度が得られるように有効な量で投与される。
【００２０】
本発明はさらに、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を特徴とする。方法は一般的に、第1型のコンセンサスインターフェロンα（CIFN）と第2型のCIFNとを含む組成物を投与することを含み、第2型のCIFNはポリエチレングリコール（PEG）部分を含み、その結果として第1型のCIFNの平均滞留時間より長い平均滞留時間を有し、組成物は、第1の相と第2の相を得るために有効量で投与され、第1の相において、約24時間の第1の期間内にIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表す最大認容量（MTD）の少なくとも約80％であるCIFNの第1の血清濃度が得られ、第2の相において、第2の相の任意の24時間にかけて測定したCIFNの最高血清濃度対CIFNの最低血清濃度の比が3未満であって、第2の相におけるCIFNの最高濃度がMTDの約50％またはそれ未満である。
【００２１】
本発明はさらに、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を特徴とする。方法は一般的に、第1の相と第2の相とを含む投与計画においてIFN-αを投与することを含み、第1の相において、約24時間の第1の期間内に、IFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表すIFN-αの第1の血清濃度C1maxが得られ、第2の相において、C1maxの約50％またはそれ未満であるIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表す第2の血清濃度Csusが得られ、第2の相における任意の24時間における時間の関数としてIFN-α血清濃度によって定義される曲線下面積は、図2に示すように2日目から3日目までの曲線下面積より大きくない。
【００２２】
本発明はさらに、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を特徴とする。方法は一般的に、第1の相と第2の相とを含む投与計画においてコンセンサスIFN-α（CIFN）を投与することを含み、第1の相において、IFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表すCIFNの第1の血清濃度C1maxが、約24時間の第1の期間内に得られ、第2の相において、C1maxの約50％またはそれ未満であるIFN-αの国際単位/ml血清（IU/ml）で表すCIFNの第2の濃度Csusが得られ、第2の相における任意の24時間における時間の関数としてCIFN血清濃度によって定義される曲線下面積は、図2に示すように2日目から3日目までの曲線下面積より大きくない。
【００２３】
本発明はさらに、個体におけるC型肝炎ウイルス感染症を治療する方法を特徴とする。方法は一般的に、個体に本発明の組成物の有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、本発明の組成物は以下を含む：その共有結合分子構造がポリエチレングリコールを含まない第1のIFN-αポリペプチドを含む、第1型のインターフェロンα（IFN-α）；その共有結合分子構造がポリエチレングリコール（PEG）部分に直接またはリンカーを通して共有結合した第2のIFN-αポリペプチドを含む、第2型のIFN-α；および薬学的に許容される賦形剤。他の態様において、本発明の組成物は、IFN-αポリペプチドが、一つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（PFG）部分に直接またはリンカーを通して共有結合する、IFN-αポリペプチドが、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍の一つまたはそれ以上の部位でそれぞれのPFG部分に結合する、およびIFN-αポリペプチドがIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍の部位以外の任意の部位でPEG部分に直接またはリンカーを通して共有結合しない、単一のインターフェロンα（IFN-α）ポリペプチドを含むインターフェロンα（IFN-α）誘導体を含む。いくつかの態様において、本発明の組成物の投与は、全量で約0.5×106〜10×106 IUのIFN-αを個体に投与する。いくつかの態様において、本発明の組成物の投与は、全量でインターフェロンαの約5,000,000〜10,000,000国際単位を個体に投与する。
【００２４】
第1型および第2型のIFN-αを含む組成物
本発明はさらに、以下を含む組成物を特徴とする：その共有結合分子構造がポリエチレングリコールを含まない第1のIFN-αポリペプチドを含む、第1型のインターフェロンα（IFN-α）；その共有結合分子構造がポリエチレングリコール（PEG）部分に直接またはリンカーを通して共有結合した第2のIFN-αポリペプチドを含む、第2型のIFN-α；および薬学的に許容される賦形剤。
【００２５】
いくつかの態様において、第2型のIFN-αにおいて、PEG部分は、第2のIFN-αポリペプチドのアミノ酸残基1〜10位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合する。いくつかの態様においては、第2型のIFN-αにおいて、PEG部分は、第2のIFN-αポリペプチドのアミノ末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合する。
【００２６】
いくつかの態様において、PEG部分は、第2のポリペプチドのアミノ末端アミノ酸のαアミノ基に直接またはリンカーを通して共有結合する。いくつかの態様において、PEG部分は、第2のポリペプチドのアミノ末端アミノ酸のαアミノ基に対するアミド結合によって直接またはリンカーを通して共有結合する。
【００２７】
いくつかの態様においては、第2型のIFN-αにおいて、PEG部分は、第2のIFN-αポリペプチドのアミノ酸残基150〜166位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合する。
【００２８】
いくつかの態様においては、第2型のIFN-αにおいて、PEG部分は、第2のIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合する。いくつかの態様において、PEG部分は、第2のIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に直接またはリンカーを通して共有結合する。いくつかの態様において、PEG部分は、第2のIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に対するアミド結合によって、直接またはリンカーを通して共有結合する。
【００２９】
いくつかの態様において、第2型のIFN-αの共有結合分子構造は、第2のIFN-αポリペプチドのアミノ酸残基1〜149位のアミノ酸に直接またはリンカーを通して結合したPEG部分を含まない。
【００３０】
いくつかの態様において、第2型のIFN-αは単一のPEG部分を含む。
【００３１】
いくつかの態様において、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとが、組成物において約1：1のモル比で存在する。いくつかの態様において、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとが、組成物において約1：5のモル比で存在する。
【００３２】
いくつかの態様において、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとはそれぞれ、単一のIFN-αポリペプチド分子を含み、IFN-αポリペプチドは第1型および第2型に関して同じであり、IFN-α-2a、IFN-α-2bおよびコンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択される。いくつかの態様において、IFN-αポリペプチドは、コンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択される。
【００３３】
いくつかの態様において、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとは単一のIFN-αポリペプチド分子を含み、IFN-αポリペプチドは、第1型および第2型に関して同じであり、コンセンサスIFN-αポリペプチドからなる群より選択される。
【００３４】
いくつかの態様において、第2型のIFN-αは単一のPEG部分を含む。
【００３５】
IFN-α誘導体
本発明はさらに、単一のインターフェロンα（IFN-α）ポリペプチドを含むインターフェロンα（IFN-α）誘導体を特徴とし、IFN-αポリペプチドは、一つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（PEG）部分に直接またはリンカーを通して共有結合し、IFN-αポリペプチドは、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍の一つまたはそれ以上の部位でそれぞれのPEG部分に結合し、IFN-αポリペプチドは、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍の部位以外の任意の部位でPEG部分に直接またはリンカーを通して共有結合しない。
【００３６】
本発明はさらに、単一のインターフェロンα（IFN-α）ポリペプチドを含むインターフェロンα（IFN-α）誘導体を特徴とし、IFN-αポリペプチドは、（1）IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端もしくはその近傍に存在する単一の共有結合によって、直接もしくはリンカーを通して単一のPEG部分に共有結合するか、または（2）リンカーを通しておよびリンカーとIFN-αポリペプチドとのあいだの単一の共有結合（結合はIFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍の部位に存在する）によって複数のPEG部分に共有結合するかのいずれかである。
【００３７】
いくつかの態様において、IFN-αポリペプチドは、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基1〜149位における如何なるアミノ酸にも直接またはリンカーを通して共有結合しない。
【００３８】
いくつかの態様において、少なくとも一つのPEG部分は、IFN-αポリペプチドのアミノ酸残基150〜166位の一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に直接またはリンカーを通して共有結合する。
【００３９】
いくつかの態様において、少なくとも一つのPEG部分は、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸に直接またはリンカーを通して共有結合する。いくつかの態様において、少なくとも一つのPEG部分は、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に直接またはリンカーを通して共有結合する。いくつかの態様において、少なくとも一つのPEG部分は、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸のαカルボキシル基に対するアミド結合によって直接またはリンカーを通して共有結合する。
【００４０】
いくつかの態様において、IFN-αポリペプチドは、単一のPEG部分に共有結合する。
【００４１】
いくつかの態様において、IFN-αポリペプチドは、コンセンサスインターフェロンαである。いくつかの態様において、IFN-αポリペプチドは、インターフェロンα-2aポリペプチドである。いくつかの態様において、IFN-αポリペプチドは、インターフェロンα-2bポリペプチドである。
【００４２】
本発明はさらに、本発明のインターフェロンα（IFN-α）誘導体と薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を特徴とする。いくつかの態様において、IFN-α誘導体は、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍に直接またはリンカーを通して共有結合した単一のPEG部分および薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの態様において、IFN-αポリペプチドは、コンセンサスインターフェロンα（IFN-α）である。
【００４３】
定義
本明細書において用いられるように、「治療」、「治療する」等の用語は、所望の薬理学的および/または生理学的作用を得ることを意味する。作用は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に予防することに関して予防的であってもよく、および/または疾患および/もしくは疾患に帰因する有害な作用の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であってもよい。本明細書において用いられるように、「治療」とは、哺乳類、特にヒトにおける疾患の如何なる治療も含み、これには以下が含まれる：（a）疾患に対する素因を有する可能性があるがまだ疾患を有すると診断されていない被験者に、疾患または疾患の症状が起こらないようにすること（例えば、原発疾患に関連する、またはそれによって引き起こされる疾患（慢性HCV感染症の状況において起こりうる肝線維症のような）を含む）；（b）疾患を阻害する、すなわちその発生を停止させること；および（c）疾患を軽減する、すなわち疾患の退縮を引き起こすこと。
【００４４】
「個体」、「宿主」、「被験者」および「患者」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、サルおよびヒトを含む霊長類を含むがこれらに限定されない哺乳類を意味する。
【００４５】
「初期ウイルス反応（EVR）」という用語は、「初回ウイルス反応」と互換的に用いられ、「急激なウイルス反応」とは、HCV感染症の治療開始後約24時間、約48時間、約3日、または約1週間以内のウイルス力価の減少を意味する。
【００４６】
本明細書において用いられる「第2の相の減少」という用語は、EVR後数週間から数ヶ月間のウイルスレベルのより遅い減少を指す。
【００４７】
本明細書において用いられるように、「持続的なウイルス反応」（SVR；「持続的反応」または「永続性反応」とも呼ばれる）という用語は、HCV感染症の治療計画に対する血清中HCV力価に関する個体の反応を意味する。一般的に、「持続的ウイルス反応」は、検出可能なHCV RNA（例えば、血清1ミリリットルあたり約500ゲノムコピー未満、約200ゲノムコピー未満、または約100ゲノムコピー未満）が治療中止後少なくとも約1ヶ月、少なくとも約2ヶ月、少なくとも約3ヶ月、少なくとも約4ヶ月、少なくとも約5ヶ月、または少なくとも約6ヶ月患者の血清中に認められないことを意味する。
【００４８】
本明細書において用いられるように、「薬物動態プロフィール」という用語は、経時的なIFN-αの血清濃度プロフィールを意味する。
【００４９】
本明細書において用いられるように「治療失敗患者」とは、一般的に、HCVに関するこれまでの治療に反応しなかったHCV感染患者（「非反応者」と呼ばれる）、またはこれまでの治療に当初反応したが、治療反応が維持されなかった患者（「再発者」と呼ばれる）を意味する。これまでの治療には一般的に、IFN-α単剤療法またはIFN-α併用療法による治療が含まれうるが、併用治療には、IFN-αとリバビリンのような抗ウイルス剤の投与が含まれてもよい。
【００５０】
「肝炎ウイルス感染症」という用語は、一つまたはそれ以上のA、B、C、D、またはE型肝炎ウイルスによる感染症を意味し、血液媒介肝炎ウイルス感染症が特に重要である。
【００５１】
本明細書において用いられるように、「肝（hepatic）線維症」という用語は、本明細書において「肝（liver）線維症」と互換的に用いられ、慢性肝炎感染症の状況において起こりうる肝臓における瘢痕組織の増殖を意味する。
【００５２】
本明細書において用いられるように、「肝機能」という用語は、血清タンパク質（例えば、アルブミン、凝固因子、アルカリホスファターゼ、アミノトランスフェラーゼ（例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ）、5'-ヌクレオシダーゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ等）、のようなタンパク質の合成、ビリルビンの合成、コレステロールの合成、および胆汁酸の合成を含むがこれらに限定されない合成機能；糖質代謝、アミノ酸およびアンモニア代謝、ホルモン代謝、ならびに脂質代謝を含むがこれらに限定されない肝代謝機能；外因性薬剤の解毒化；内臓および門脈血行力学を含む血行力学機能等を含むがこれらに限定されない肝臓の正常な機能を意味する。
【００５３】
本発明の方法において用いるために適した薬物送達装置には、注射装置、埋め込み可能な装置、例えばカテーテルによって接続してもよく接続しなくてもよい浸透圧ポンプのようなポンプ、生分解性のインプラント、リポソーム、デポー剤、およびミクロスフェアが含まれるがこれらに限定されない。
【００５４】
本明細書において用いられる「投与事象（dosing event）」という用語は、その事象が薬物分配装置からの抗ウイルス剤の1回またはそれ以上の放出を含んでもよい、それを必要とする患者に抗ウイルス剤を投与することを意味する。このように、本明細書において用いられる「投与事象」という用語には、抗ウイルス剤を含むデポー剤の設置；連続送達装置（例えば、ポンプまたは他の徐放性注射装置）の設置；および1回皮下注射後の連続送達装置の設置が含まれるがこれらに限定されない。
【００５５】
「デポー剤」という用語は、一般的に容器に入っていないが、薬物の貯蔵所として作用し、そしてそこから薬物が放出される、多くの埋め込み型の生分解性、または非生分解性の徐放性システムの如何なるものも意味する。デポー剤には、ポリマー、非ポリマー生体分解材料が含まれ、固体、半固体、または液体型であってもよい。
【００５６】
「ミクロスフェア」という用語（「微粒子」、「ナノスフェア」または「ナノ粒子」とも呼ばれる）は、一般的にポリマー材料から調製され、通常大きさの範囲が直径約0.01μm〜約0.1 μm、または約0.1 μm〜約10 μmである小さい粒子を意味する。
【００５７】
「治療的有効量」という用語は、所望の治療効果を促進するために有効な治療物質の量、または治療物質の送達速度を意味する。正確な望ましい治療効果は、治療すべき病態、投与すべき製剤、および当業者に認識される他の多様な要因に応じて変化する。
【００５８】
本明細書において「国際単位」および「単位」という用語は、適当な細胞株（例えば、ヒト肺癌細胞株、A549；HEP2/C等）に感染させた後、適したウイルス（例えば、脳心筋炎ウイルス（EMC）、水疱性口内炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス）の細胞変性作用を阻害するインターフェロンの能力を定量するための測定単位を意味するように互換的に用いられる。抗ウイルス活性は、WHOによって供給されるヒトインターフェロンαのような参照標準物質によって示される抗ウイルス活性の「単位」に関して標準化される。そのような方法は、多数の参考文献に詳細に記述されている。国際単位を測定する特定の方法は、Familletti, P.C.、Rubinstein, S.およびPestka, S.（1981）、「A convenient and rapid cytopathic effect inhibition assay for interferon」、Methods in Enzymol. 78巻（S. Pestka編）、アカデミック出版、ニューヨーク、387〜394頁に記述されている。たいていの場合、参照対照物質は、世界保健機構によって提供されるヒトインターフェロンαであり、国際単位を測定する方法は、上記のFamillettiに記載される方法である。
【００５９】
投与されるインターフェロンの量は、化合物の特異的活性およびインビボでのその生物学的作用に依存するであろう。例えば、IFN-α2bは、11.54 μgタンパク質を週に3回投与するが、これは注射1回あたり3×106 IUに対応する（特異的活性、2.68×106 IU/mg）。一方、CIFN-α-con1は、注射1回あたり9 μg用量を投与して、これは投与あたり9×106 IUに対応する（特異的活性、1×109 IU/mg）。しかし、PEG化反応によってしばしば活性の減少が起こるという事実を考慮して、有効性（例えば、ウイルス量の減少、持続的ウイルス反応等）を得るために、より高用量のPEG化材料が投与される。
【００６０】
本発明をさらに説明する前に、記述の特定の態様は当然変化する可能性があるため、本発明はそれらに限定されないと理解すべきである。同様に、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ制限されるため、本明細書において用いた用語は、特定の態様を説明する目的に限られ、制限的に解釈してはならないと理解すべきである。
【００６１】
値の範囲が提供される場合、本文が特に明記していなければ、その範囲の上限と下限のあいだの下限の単位の10分の１までのそれぞれの介在する値、またはその記述の範囲における他の任意の記述のまたは介在する値が、本発明に含まれると理解される。これらのより小さい範囲の上限と下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、同様に、記述の範囲における任意の特に除外された限界に従って本発明に含まれる。記述の範囲に一つまたは双方の限界が含まれる場合、それらの含まれた限界のいずれかまたは双方を除外する範囲も同様に本発明に含まれる。
【００６２】
特に明記していなければ、本明細書において用いる全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の如何なる方法および材料も、本発明の実践または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料を以下に記述する。本明細書において言及した全ての出版物は、出版物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および記述するために参照として本明細書に組み入れられる。
【００６３】
本明細書において、そして添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「1つ（a）」、「1つ（an）」、および「その（the）」には、本文が特に明記していない限り複数形が含まれる。このように、例えば、「1つのインターフェロンαポリペプチド（a interferon-alpha polypeptide）」と言う場合、そのようなポリペプチドの複数形が含まれ、「薬物動態プロフィール（the pharmacokinetic profile）」と言う場合には、当業者に既知の1つまたはそれ以上の薬物動態プロフィールおよびその同等物に対する言及等が含まれる。
【００６４】
本明細書において考察した出版物は、本出願の提出日よりその開示が単になされたために提供される。本明細書の如何なる開示も、先行発明によって、日付をさかのぼって付ける権利が本発明にはないと自認したと解釈されるべきではない。さらに、提供された出版日は実際の出版日とは異なっている可能性があり、それらは個々に確認する必要があるかも知れない。
【００６５】
発明の詳細な説明
本発明は、肝炎ウイルス感染症、特にC型肝炎ウイルス（HCV）感染症を治療する組成物および方法を提供する。方法は、第1の薬物動態プロフィールを有する第1型のインターフェロンα（IFN-α）および第2の薬物動態プロフィールを有する少なくとも第2型のIFN-αを投与することを含む。第2型のIFN-αは、第1型のIFN-αより長い滞留時間（または血清半減期）を有する。このように、第1型と第2型のIFN-αの複合薬物動態プロフィールによって、IFN-αの多相薬物動態プロフィールが得られる。得られる多相IFN-α血清濃度プロフィールは、ウイルス力価の初回の急激な低下を引き起こした後、ウイルス力価の経時的なさらなる減少を引き起こして、持続的なウイルス反応を得る。多相血清濃度プロフィールは、第1型と第2型のIFN-αを実質的に同時にしかし異なる製剤で；同じ製剤で同時に；または異なる製剤で異なる時点で投与することによって得られる。
【００６６】
本明細書に記述の方法および組成物は、如何なる肝炎ウイルス感染症（HBV、HCV、δ等）の治療においても一般的に有用である。HCV感染症の治療は、特に重要である。本明細書におけるHCVという言及は、説明のためであって制限することを意味していない。
【００６７】
HCV感染症を治療するために現在利用可能なIFN-α療法は、一般的に、IFN-αの毎日（QD）、1日おき（QOD）、または1週間に3回（TIW）の皮下注射を必要とする。RNA PCRによって決定した、通常のIFN-α治療に反応した反応者におけるHCV感染症の動態は、数学的モデリングによって分析されている。そのような結果の一般的な解釈を図1に示す。そのような研究から、治療開始後24〜48時間において急速なウイルス減少相が認められ、その結果RNA血清レベルの約0.5対数から約3対数またはそれ以上の減少が起こることが明白に示された。この初期ウイルス反応（EVR）は、ウイルス粒子の産生を減少させるために重要である。初期の強い反応は、一般的により持続性の反応を予測する。この初期反応の後、通常、数日間または数週間にわたってより遅い持続的なウイルスの消失が起こる。一般的に、この第2の相は、患者に関連する特徴に依存する。如何なる理論にも拘束されたくはないが、第2の相のウイルス力価の減少は、例えば、免疫系媒介メカニズムによるウイルス感染細胞の除去に関連する可能性がある。この第2の相の勾配は、患者の持続的なウイルス反応（SVR）を決定し、例えば第2の相の勾配がより急であれば、一般的にSVRおよび陽性治療転帰に関連する。
【００６８】
HCV感染症を治療するための現行の療法は特定の欠点を有する。長期治療期間でのIFN-αの毎日（QD）、1日おき（QOD）、または週に3回（TIW）注射を含む投与計画は、以下の欠点の一つまたはそれ以上を有する：（1）投与計画は、患者にとって不快であり、場合によっては患者のコンプライアンスが低下する；（2）投与計画はしばしば副作用に関連し、患者にさらなる不快を引き起こし、場合によっては患者のコンプライアンスが低下する；（3）投与計画によってIFN-αの血清濃度に「山」（Cmax）と「谷」（Cmin）が起こり、「谷」の期間ではウイルスが複製しうる、および/またはさらなる細胞に感染しうる、および/または変異しうる；（4）多くの場合、初期ウイルス反応の際のウイルス力価の対数的減少は、最終的にウイルスの消失が起こるほど持続的なウイルス反応を行うには不十分である（図2を参照されたい；通常のIFN-αTIW療法後のウイルス動態）。
【００６９】
本発明の方法は、それによって持続的なウイルス反応が起こる多相血清IFN-αを得るために、第1型のIFN-αおよび第2型のIFN-αを投与することを含む。本発明を通して得られる例としての薬物動態プロフィールを図3に示し、ここでCmaxは「誘導相」において得られるIFN-αの濃度であり、Csusは、「維持相」において得られるIFN-αの濃度である。
【００７０】
図3に示される薬物動態プロフィールは、以下を含む多様な方法で得ることができる：（1）その平均滞留時間が第1型のIFN-αより大きくなるように第2型のIFN-αに改変を含む、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとを含む組成物を個体に投与すること；（2）図4に示すように、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとを異なる製剤で実質的に同時に投与すること；（3）図5に示すように、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとを異なる製剤において異なる時間に投与すること。
【００７１】
肝炎ウイルス感染症を治療する方法
本発明は、肝炎ウイルス感染症を治療する方法を提供する。方法は一般的に、第1の薬物動態プロフィールを有する第1型のIFN-αを第2の薬物動態プロフィールを有する少なくとも第2型のIFN-αと共に投与することを含む。第2型のIFN-αは、第1型のIFN-αよりも体内での平均滞留時間がより長い。IFN-α治療を必要とする被験者に投与すると、第1型と第2型のIFN-αの併用によって、IFN-αの多相血清プロフィールが得られる。
【００７２】
本明細書において、IFN-αの型に関する如何なるさらなる特定の言及もなく（例えば、第1型および第2型のIFN-α）「IFN-α」という場合、如何なる型のIFN-αに対する言及も意味する。
【００７３】
本発明の多くの態様において、本発明の方法は、抗ウイルス剤の血清濃度の「山」（Cmax；抗ウイルス剤の最高血清濃度）と「谷」（Cmin：抗ウイルス剤の最低血清濃度）が減少または回避される抗ウイルス剤の血清濃度を得る。多くの態様において、本発明の方法によって、第2の相（例えば、図2〜5に示すように、治療2〜15日間、治療2〜10日間、治療3〜10日間、または治療3〜15日間）においてCmax：Cmin比は、約3.0未満、約2.5未満、約2.0未満、または約1.5未満となる。いくつかの態様において、本発明は、第2の相（例えば、図2〜5に示すように、治療2〜15日間、治療2〜10日間、治療3〜10日間、または治療3〜15日間）のあいだ、Cmax：Cmin比約1.0未満を得る。
【００７４】
一般的に、本発明の方法において、第2の相における抗ウイルス剤の血清濃度対時間の曲線下面積（AUC）は、第2の相の任意の24時間において測定した（すなわち、AUCsusは、第1の相の任意の24時間に測定したAUC（すなわち、AUCmax）より小さい）。言い換えれば、第2の相の任意の24時間において測定したAUCsusは、第1の相の任意の24時間のあいだに測定したAUCmaxより小さい。
【００７５】
第1の相における抗ウイルス剤の血清濃度は、個体の血清中のウイルス力価の1.5対数、2対数、2.5対数、3対数、3.5対数、4対数、4.5対数、または5対数の減少を得るために有効である。
【００７６】
第1の相における抗ウイルス剤の血清濃度は、投与計画の開始後約12時間〜約48時間、約16時間〜約24時間の期間で、個体の血清中のウイルス力価の1.5対数、2対数、2.5対数、3対数、3.5対数、4対数、4.5対数、または5対数の減少を得るために有効である。
【００７７】
抗ウイルス剤の第2の濃度は、約24時間〜約48時間、約2日〜約4日、約4日〜約7日、約1週間〜約2週間、約2週間〜約4週間、約4週間〜約6週間、約6週間〜約8週間、約8週間〜約12週間、約12週間〜約16週間、約16週間〜約24週間、または約24週間〜約48週間の期間維持される。
【００７８】
第2の相において、血清中の抗ウイルス剤の濃度は、ウイルス力価を検出不可能なレベルまで、例えば、約1000〜約5000、約500〜約1000、または約100〜約500ゲノムコピー/mL血清まで減少させるために有効である。いくつかの態様において、抗ウイルス剤の有効量は、100ゲノムコピー/mL血清未満にウイルス量を減少させるために有効な量である。
【００７９】
第2の相における抗ウイルス剤の血清濃度は、持続的なウイルス反応を得るために有効であり、例えば、検出可能なHCV RNA（例えば、約500ゲノムコピー未満、約400ゲノムコピー未満、約200ゲノムコピー未満、または約100ゲノムコピー未満/mL血清）が、治療中止後少なくとも約1ヶ月間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約5ヶ月間、または少なくとも約6ヶ月間患者の血清中に認められない。
【００８０】
いくつかの態様において、第1の相と第2の相の後に少なくとも第3の相が続く。これらの態様のいくつかにおいて、第3の相には、第1の血清濃度と等しいまたはほぼ等しい抗ウイルス剤の血清濃度を得るために有効な用量で抗ウイルス剤を投与することが含まれる。これらの態様のいくつかにおいて、第四の相には、第2の血清濃度と等しいまたはほぼ等しい抗ウイルス剤の血清濃度を得るために有効な用量で抗ウイルス剤を投与することが含まれる。
【００８１】
多相IFN-α血清プロフィールは、第2型のIFN-αが第1型のIFN-αより長い平均滞留時間を有するように、第1型のIFN-αと少なくとも第2型のIFN-αとを投与することによって得られる。
【００８２】
第1型のIFN-αは、患者によって認容されうる最高レベルまたはその近傍であるIFN-αの血清濃度を提供する。第1の相において得られる血清濃度（第1の濃度）は、約10〜約1000、約10〜約500、約20〜約250、約30〜約100、または約50〜約75国際単位（IU）/mlの範囲である。第1の血清濃度は、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、または約24時間〜約48時間のあいだ維持される。
【００８３】
第1の相において、最大認容量（MTD）の約65％〜約70％、約70％〜約75％、約75％〜約80％、約80％〜約85％、約85％〜約90％、約90％〜約95％、または約95％〜約100％であるIFN-αの血清濃度を得るために有効であるIFN-αの量（第1型のIFN-αまたは第1型および第2型両方のIFN-αを含むIFN-αの量）が投与される。このように、投与計画の開始から約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、または約24時間〜約48時間のあいだに、最大認容量（MTD）の約65％〜約70％、約70％〜約75％、約75％〜約80％、約80％〜約85％、約85％〜約90％、約90％〜約95％、または約95％〜約100％であるIFN-αの血清濃度が得られる。
【００８４】
IFN-αの第1の血清濃度を得るために投与される用量は、約10 μg〜約100 μg、約20 μg〜約70 μg、約25 μg〜約60 μg、約30 μg〜約50 μgの範囲である。これらの様々な用量は、遊離のインターフェロンを指し、これを得るために投与するデポー剤の量は、下記のように薬物負荷効率に依存する。
【００８５】
慢性C型肝炎患者は、一般的に循環中のウイルスを105〜107ゲノムコピー/mlのレベルで有する。この第1の相において、IFN-αの血清濃度は、HCV力価を約5×104〜約105、約104〜約5×104、または約5×103〜約104ゲノムコピー/ml血清まで減少させるために有効である。
【００８６】
いくつかの態様において、第1の相におけるIFN-αの血清濃度は、投与計画の開始後約12時間〜約48時間、または約16時間〜約24時間の期間内でHCV力価を約5×104〜約105、約104〜約5×104、または約5×103〜約104ゲノムコピー/ml血清まで減少させるために有効である。
【００８７】
いくつかの態様において、第1の相におけるIFN-αの血清濃度は、個体の血清中のウイルス力価の1.5対数、2対数、2.5対数、3対数、3.5対数、4対数、4.5対数、または5対数の減少を得るために有効である。
【００８８】
第1の相におけるIFN-αの血清濃度は、投与計画の開始後約12時間〜約48時間、または約16時間〜約24時間の期間で、個体の血清中のウイルス力価の1.5対数、2対数、2.5対数、3対数、3.5対数、4対数、4.5対数、または5対数の減少を得るために有効である。
【００８９】
第1の相において、感染者によって認容されうるインターフェロンの用量によって治療可能なレベルまでウイルス力価を減少させるために有効なIFN-αの血清濃度が得られる。
【００９０】
第2の相において、少なくとも第2型のIFN-αは、患者によって認容できる最大レベルより十分に低い、そしてウイルス力価をさらに一層減少させるために有効なIFN-αの血清濃度を得るために有効であるレベルで投与される。第2の相において、IFN-αは、約5 IU/ml〜約50 IU/mlのIFN-αの血清濃度を得るために有効な用量で投与される。いくつかの態様において、IFN-αは、約5 IU/ml〜約100 IU/mlまたはそれ以上のIFN-αの血清濃度を得るために有効である用量で投与される。第2の相において、IFN-αの投与量は、約0.5×106 IU〜約50×106 IUの範囲である。
【００９１】
第2の相において、少なくとも第2型のIFN-αは、MTDの約10％〜約15％、約15％〜約20％、約20％〜約25％、約25％〜約30％、約30％〜約35％、約35％〜約40％、約40％〜約45％、または約45％〜約50％であるIFN-αの血清濃度を得て維持するために有効なレベルで投与される。第2の相におけるIFN-αの血清濃度は、MTDより十分下であるが、なおも抗ウイルス作用を発揮するために有効である。このように、投与計画の開始後約48時間〜約4日間、約48時間〜約7日間、約48時間〜約10日間、または約48時間〜約15日間にわたって、MTDの約10％〜約15％、約15％〜約20％、約20％〜約25％、約25％〜約30％、約30％〜約35％、約35％〜約40％、約40％〜約45％、または約45％〜約50％であるIFN-αの血清濃度が得られる（そして一般的に維持される）。
【００９２】
IFN-αの第2の濃度は、約24時間〜約48時間、約2日〜約4日、約4日〜約7日、約1週間〜約2週間、約2週間〜約4週間、約4週間〜約6週間、約6週間〜約8週間、約8週間〜約12週間、約12週間〜約16週間、約16週間〜約24週間、または約24週間〜約48週間のあいだ維持される。
【００９３】
第2の相において、IFN-αの第2の血清濃度は、ウイルス力価を、約1000〜約5000、約500〜約1000、または約100〜約500ゲノムコピー/mL血清まで減少させるために有効である。いくつかの態様において、IFN-αの有効量は、100ゲノムコピー/mL血清未満にウイルス量を減少させるために有効な量である。
【００９４】
IFN-αの第2の血清濃度は、持続的なウイルス反応を得るために有効であり、例えば、検出可能なHCV RNA（例えば、約500ゲノムコピー未満、約200ゲノムコピー未満、または約100ゲノムコピー未満/mL血清）が、治療中止後少なくとも約1ヶ月間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約5ヶ月間、または少なくとも約6ヶ月間患者の血清中に認められない。
【００９５】
いくつかの態様において、第1の相と第2の相の後に少なくとも第3の相が続く。これらの態様のいくつかにおいて、第3の相には、第1の血清濃度と等しいまたはほぼ等しいIFN-αの血清濃度を得るために有効な用量でIFN-αを投与することが含まれる。これらの態様のいくつかにおいて、第四の相には、第2の血清濃度と等しいまたはほぼ等しいIFN-αの血清濃度を得るために有効な用量でIFN-αを投与することが含まれる。
【００９６】
いくつかの態様において、本発明の組成物は、第1型のIFN-αがその平均滞留時間を増加するように改変されていない、および第2型のIFN-αがその平均滞留時間を増加するように改変されている、第1型のIFN-αと少なくとも第2型のIFN-αとを含む。
【００９７】
体内でのその平均滞留時間を増加するIFN-αの改変には、IFN-αポリペプチドに対する一つまたはそれ以上の部分の結合が含まれるがこれらに限定されず、その部分にはタンパク質、オリゴ糖、多糖類、およびポリエチレングリコール（PEG）が含まれるがこれらに限定されない。下記の態様において、PEG改変IFN-αは、第2型のIFN-αによって例示される。しかし、当業者は、それらの改変を有しないIFN-αと比較して滞留時間を増加させる他の改変も同様に用いることができることを認識するであろう。
【００９８】
投与される第1型のIFN-αと第2型のIFN-αの量は、上記のようにマイクログラムで表記される。または、用量は活性の単位または国際単位（IU）としても表記される。単位またはIUは、適当な細胞株（例えば、ヒト肺癌細胞株、A549；HEP2/C等）に感染させた後、適したウイルス（例えば、脳心筋炎ウイルス（EMC）、水疱性口内炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス）の細胞変性作用を阻害するインターフェロンの能力としてインビトロで測定される。抗ウイルス活性は、WHOによって供給されるヒトインターフェロンαのような参照標準物質に対して測定される。そのような方法は、以下を含む多数の参考文献において詳細に記述されている：Familletti, P.C.、Rubinstein, S.およびPestka, S.（1981）、「A convenient and rapid cytopathic effect inhibition assay for interferon」、Methods in Enzymol. 78巻（S. Pestka編）、アカデミック出版、ニューヨーク、387〜394頁。
【００９９】
投与されるインターフェロンの量は、化合物の特異的活性およびインビボでのその生物学的作用に依存するであろう。例えば、IFN-α2bは、11.54 μgタンパク質を週に3回投与するが、これは3×106 IU/注射（特異的活性、2.68×106 IU/mg）に対応する。一方、CIFNα-con1は、9 μg用量/注射で投与され、これは9×106 IU/投与に対応する（特異的活性、1×109 IU/mg）。しかし、PEG化反応によってしばしば活性の減少が起こるという事実を考慮して、有効性（例えば、ウイルス量の減少、持続的なウイルス反応等）を得るために、より大量のPEG化材料が投与される。
【０１００】
第1型のIFN-α
第1型のIFN-αは、天然に存在するIFN-αと比較して体内の平均滞留時間を増加させる改変を含まない任意の型のIFN-αである。既知の如何なるIFN-αも第1型として用いることができる。本明細書において用いられる「インターフェロンα」という用語は、ウイルス複製および細胞増殖を阻害して免疫反応を調節する関連ポリペプチドファミリーを意味する。「IFN-α」という用語には、天然に存在するIFN-α；合成IFN-α；および天然または合成IFN-αの類似体；天然に存在するIFN-αに関して記述される抗ウイルス特性を有する本質的に任意のIFN-αが含まれる。
【０１０１】
適したαインターフェロンには、天然に存在するIFN-α（天然に存在するIFN-α2a、IFN-α2bを含むがこれらに限定されない）；シェリングコーポレーション（Schering Corporation、ケニルワース、ニュージャージー州）から販売されるIntron(登録商標)Aインターフェロンのような組換え型インターフェロンα2b；ホフマン・ラ-ロシュ（Hoffman-La Roche、ナトリー、ニュージャージー州）から販売されているRoferon(登録商標)インターフェロンのような組換え型α-2a；ベーリンガーインゲルハイムファーマシューティカルズインク（Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc、リッジフィールド、コネチカット州）から販売されているBerofor(登録商標)α2インターフェロンのような組換え型インターフェロンα-2C；日本のスミトモ（Sumitomo）から販売されているスミフェロンまたはグラクソ-ウェルカム（Glaxo-Wellcome Ltd.、ロンドン、イギリス）から販売されているWellferon(登録商標)インターフェロンα-n1（INS）のような天然のαインターフェロンの純粋な混合物であるインターフェロンα-n1；およびインターフェロンサイエンシズ（Interferon Sciences）が製造して、パーデュー・フレデリック（Purdue Frederick Co.、ノーウォーク、コネチカット州）からAlferon(登録商標)の商品名で販売されている天然のαインターフェロン混合物であるインターフェロンα-n3が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０２】
「IFN-α」という用語はまた、コンセンサスIFN-αを含む。コンセンサスIFN-α（「CIFN」および「IFN-con」とも呼ばれる）は、米国特許第4,695,623号および第4,897,471号に開示されるIFN-con1（「CIFN-α con1」、「IFN-α con1」、または「IFN-con1」とも呼ばれる）、IFN-con2、およびIFN-con3と命名されるアミノ酸配列；ならびにInfergen(登録商標)（アムジェン（Amgen）、サウザンドオークス、カリフォルニア州）を含むがこれらに限定されない。コンセンサスインターフェロンは、天然に存在するインターフェロンαのコンセンサス配列の決定によって定義される。IFN-conをコードするDNA配列は、上記の特許または他の標準的な方法に記述されるように合成してもよい。CIFNの使用、とりわけインファジェンの使用は特に重要である。
【０１０３】
いくつかの態様において、第1型のIFN-αは、N末端アミノ酸が、ホルミル基、アセチル基、マロニル基等のようなアシル基によってアシル化されている、N-ブロック種である。
【０１０４】
PEG化IFN-α
上記のIFN-αポリペプチドの如何なるものも、一つまたはそれ以上のポリエチレングリコール部分によって改変することができる、すなわちPEG化することができる。PEG化IFN-αポリペプチドのPEG分子は、IFN-αポリペプチドの一つまたはそれ以上のアミノ酸側鎖に結合している。いくつかの態様において、PEG化IFN-αは、唯一のアミノ酸上にPEG部分を含む。他の態様において、PEG化IFN-αは、二つまたはそれ以上のアミノ酸上にPEG部分を含む、すなわちIFN-αは、異なるアミノ酸残基2、3、4、5、6、7、8、9、または10個に結合したPEG部分を含む。
【０１０５】
IFN-αは、アミノ基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を通してPEGに直接（すなわち、連結基を使用せずに）カップリングさせてもよい。
【０１０６】
いくつかの態様において、PEG化IFN-αは、IFN-αポリペプチドのアミノ末端またはその近傍（N末端）でPEG化される、すなわちPEG部分は、アミノ酸1位〜アミノ酸4位、またはアミノ酸5〜約10位の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基でIFN-αポリペプチドに結合する。
【０１０７】
他の態様において、PEG化IFN-αは、約10〜約28位の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基でPEG化される。
【０１０８】
他の態様において、PEG化IFN-αは、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端またはその近傍（C末端）で、例えばアミノ酸156〜アミノ酸166、またはアミノ酸150〜約155位の一つまたはそれ以上の残基でPEG化される。
【０１０９】
他の態様において、PEG化IFN-αは、アミノ酸100〜114位の一つまたはそれ以上の残基の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基でPEG化される。
【０１１０】
IFN-α上でのポリエチレングリコールの結合部位の選択は、当業者に既知であるように、タンパク質の受容体結合および／または活性部位ドメイン内の部位のそれぞれの役割によって決定される。一般的に、PEG化を回避すべきアミノ酸には、アミノ酸30またはアミノ酸40位からのアミノ酸残基およびアミノ酸113位〜アミノ酸149位までのアミノ酸残基が含まれる。
【０１１１】
いくつかの態様において、PEGは、連結基によってIFN-αに結合する。連結基は任意の生体適合性の連結基であり、この場合「生体適合性」とは、化合物または基が非毒性で、損傷、病気、疾患、または死亡を引き起こすことなく、インビトロまたはインビボで利用される可能性があることを意味する。PEGは、例えば、エーテル結合、エステル結合、チオール結合、またはアミド結合を通して連結基に結合することができる。適した生体適合性の連結基には、エステル基、アミド基、イミド基、カルバメート基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、糖質、スクシニミド基（例えば、スクシニミジルスクシネート（SS）、スクシニミジルプロピオネート（SPA）、スクシニミジルカルボキシメチレート（SCM）、スクシニミジルスクシンアミド（SSA）、またはN-ヒドロキシスクシニミド（NHS））、エポキシド基、オキシカルボニルイミダゾール基（例えば、カルボニルイミダゾール（CDI）を含む）、ニトロフェニル基（例えば、ニトロフェニルカーボネート（NPC）、またはトリクロロフェニルカーボネート（TPC）を含む）、トリシレート基、アルデヒド基、イソシアネート基、ビニルスルホン基、チロシン基、システイン基、ヒスチジン基、または一級アミンが含まれるがこれらに限定されない。PEGをIFN-αポリペプチドに結合させる方法は当技術分野で既知であり、既知の如何なる方法も用いることができる。例えば、Parkら、Anticancer Res. 1：373〜376（1981）；Zaplipsky and Lee、「Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications」、J.M. Harris編、プレナム出版、ニューヨーク、第21章（1992）、および米国特許第5,985,265号を参照されたい。
【０１１２】
PEG化IFN-αおよびこれを作製する方法は、米国特許第5,382,657号、第5,981,709号、第5,985,265号、および第5,951,974号に記載されている。PEG化IFN-αは、PEG化ロフェロンがペガシス（ホフマンラロシュ（Hoffman LaRoche））として知られるインターフェロンα2a（ロフェロン、ホフマンラロシュ、ナトレー、ニュージャージー州）；PEG化イントロンがPEG-イントロン（シェリングプラウ（Schering-Plough））として知られるインターフェロンα2b（イントロン、シェリングプラウ、マディソン、ニュージャージー州）、インターフェロンα-2c（ベロフォーアルファ、ベーリンガーインゲルハイム（Boehringer Ingelheim）、インゲルハイム、ドイツ）、およびPEG化インファジェンがPEG-インファジェンと呼ばれる天然に存在するインターフェロンαのコンセンサス配列の決定によって決定されるコンセンサスインターフェロン（CIFN）（インファジェン、アムジェン（Amgen）、サウザンドオークス、カリフォルニア州）に結合したPEGが含まれるがこれらに限定されない、PEGと上記の任意のIFN-α分子との結合物を含む。
【０１１３】
いくつかの態様において、第1型のIFN-αは、N-ブロック（および非PEG化）IFN-αであり、第2型のIFN-αは、N末端PEG化IFN-αである。細菌が産生するIFN-α集団の約30％が、アシル基によってN末端がブロックされており、N末端でPEG化することができない。細菌が産生するIFN-αのN末端PEG化によって集団の約30％〜40％がN-ブロック（非PEG化）され、約60％〜70％においてN末端PEG化IFN-αが得られる。これらの態様のいくつかにおいて、IFN-αは、CIFNαcon-1である。いくつかの態様において、N末端PEG化細菌産生IFN-αを非PEG化（およびN-ブロック）IFN-αから分離するために、N末端PEG化細菌産生IFN-αに一つまたはそれ以上の分離段階を行う。分離は、サイズ排除クロマトグラフィー、HPLC等を含むがこれらに限定されない如何なる既知の方法も用いて行われる。二つの亜集団、すなわち第1のN-ブロック非PEG化IFN-α亜集団と第2のN末端PEG化IFN-α亜集団を互いに分離して、二つの亜集団を既定の比（本明細書に記述するように）で再度混合して、共にまたは個別に投与する。
【０１１４】
他の態様において、第1型のIFN-αは、N-ブロック（および非PEG化）IFN-αであり、第2型のIFN-αは、C末端PEG化IFN-αである。例えば、PEG化IFN-αから分離されたN-ブロック非PEG化IFN-αを、C末端PEG化IFN-αと混合する。
【０１１５】
ポリエチレングリコール
IFN-αポリペプチドとの結合に適したポリエチレングリコールは、室温で水溶性であり、一般式R(O-CH2-CH2)nO-Rを有し、式中、Rは水素またはアルキルもしくはアルカノール基のような保護基であり、nは1〜1000までの整数である。Rが保護基である場合、これは一般的に炭素1〜8個を有する。
【０１１６】
多くの態様において、PEGは、少なくとも一つのヒドロキシル基を有し、例えばアミノ基、例えば、リジン残基のεアミノ基、ポリペプチドのN末端の遊離のアミノ基、またはアスパラギン、グルタミン、アルギニン、もしくはヒスチジンのアミノ基のような他の任意のアミノ基と反応する官能基を生成するように改変された末端のヒドロキシル基を有する。
【０１１７】
他の態様において、PEGは、IFN-αポリペプチドにおける遊離のカルボキシル基、例えば、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端における遊離のカルボキシル基と反応するように誘導体化される。IFN-αのカルボキシル末端で遊離のカルボキシル基と反応するPEGの適した誘導体には、PEG-アミンおよびPEGのヒドラジン誘導体（例えば、PEG-NH-NH2）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１８】
他の態様において、PEGは、アミノ基と選択的に反応してアミド誘導体を生成する末端のチオカルボン酸基、-COSHを含むように誘導体化される。チオ酸の反応性の特性のために、他のアミノ基に対して特定のアミノ基の選択性が得られる。例えば、-SHは、リジン残基におけるεアミノ基がプロトン化されて、非求核性のままであるような適当なpH条件で、N末端のアミノ基との反応において十分な脱離基能を示す。一方、適したpH条件での反応は、近づくことができるリジン残基のいくつかを選択的に反応させる可能性がある。
【０１１９】
他の態様において、PEGは、PEG鎖の末端でN-ヒドロキシスクシニミデートのような反応性エステルを含む。そのようなN-ヒドロキシスクシニミデート含有PEG分子は、中性の6.5〜7.5のような特定のpH条件で選択されたアミノ基と反応する。例えば、N末端アミノ基は、中性pH条件で選択的に改変されてもよい。しかし、試薬の反応性が極端である場合には、近づくことができるリジンのNH2基も同様に反応する可能性がある。
【０１２０】
PEGは、IFN-αポリペプチドに直接またはリンカーを通して結合させることができる。いくつかの態様において、リンカーは、IFN-αポリペプチドに付加されて、リンカー改変IFN-αポリペプチドを形成する。そのようなリンカーは、様々な官能基、例えばリンカー改変IFN-αポリペプチドにPEG試薬をカップリングさせるための、スルフヒドリル、アミノ、またはカルボキシル基のような反応性基を提供する。
【０１２１】
いくつかの態様において、IFN-αポリペプチドに結合したPEGは直線状である。他の態様において、IFN-αポリペプチドに結合したPEGは分岐状である。米国特許第5,643,575号に記載されるような分岐PEG誘導体、「Star-PEG's」およびシェアウォーターポリマーズインク（Shearwater Polymers, Inc.）、カタログ「Polyethylene Glycol Derivatives 1997〜1998」に記載されるマルチアームPEG's。米国特許第6,046,305号に記載のものを含むStar-PEGが、当技術分野において記述される。
【０１２２】
分子量約2 kDa〜約100 kDaの範囲のPEGが一般的に用いられ、この場合、PEGに関して「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製物において、いくつかの分子が、記述の分子量より大きいまたは幾分小さいことを示している。例えば、IFN-αとの結合に適したPEGは、約2 kDa〜約5 kDa、約5 kDa〜約10 kDa、約10 kDa〜約15 kDa、約15 kDa〜約20 kDa、約20 kDa〜約25 kDa、約25 kDa〜約30 kDa、約30 kDa〜約40 kDa、約40 kDa〜約50 kDa、約50 kDa〜約60 kDa、約60 kDa〜約70 kDa、約70 kDa〜約80 kDa、約80 kDa〜約90 kDa、または約90 kDa〜約100 kDaの範囲の分子量を有する。
【０１２３】
PEG-IFN-α結合体の調製
上記のように、PEG部分は、IFN-αポリペプチドのN末端もしくはその近傍、配列内部、またはC末端もしくはその近傍のアミノ酸残基に、直接またはリンカーを通して結合することができる。結合は溶液中または固相において行うことができる。
【０１２４】
N末端結合
PEG部分をIFN-αポリペプチドのN末端またはその近傍のアミノ酸残基に結合させる方法は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第5,985,265号を参照されたい。
【０１２５】
いくつかの態様においては、N末端化学改変IFN-αを選択的に得る既知の方法を用いる。例えば、特定のタンパク質における誘導体化に利用することができる異なるタイプの一級アミノ基（リジン対N末端）の異なる反応性を利用した還元的アルキル化によるタンパク質改変法を、用いることができる。適当な反応条件では、ポリマーを含むカルボニル基によるN末端でのタンパク質の実質的に選択的な誘導体化が得られる。反応は、リジン残基のεアミノ基とタンパク質のN末端残基のαアミノ基のpKaの差を利用することができるpHで行われる。そのような選択的誘導体化によって、PEG部分のIFN-αに対する結合が制御される：ポリマーとの結合は、IFN-αのN末端で主として起こり、リジン側鎖アミノ基のような他の反応基の有意な改変は起こらない。
【０１２６】
C末端結合
米国特許第5,985,265号に記載されるようなN末端特異的カップリング技法は、主としてモノPEG化産物を提供する。しかし、過剰量の試薬および微量の多重PEG化産物を除去することをねらいとした精製技法によって、N末端ブロックポリペプチドが除去される。治療の場合、そのようなプロセスによって製造コストは有意に増加する。例えば、十分に特徴が調べられたインファジェン配列の構造を調べると、クリッピングがカルボキシル末端で約5％であることが判明し、このように主要なC末端配列が唯一存在することを示している。このように、いくつかの態様において、N末端PEG化IFN-αは用いない；代わりにIFN-αポリペプチドがC末端でPEG化される。
【０１２７】
したがって、モノPEG化インファジェン産物を得る治療的アプローチと共に有効な合成アプローチは以下のように想像される。
【０１２８】
C末端に関して選択的なPEG試薬は、スペーサーを用いてまたはスペーサーを用いずに調製することができる。例えば、一端でメチルエーテルとして改変され、他の端部でアミノ機能を有するポリエチレングリコールを、開始材料として用いてもよい。
【０１２９】
縮合剤として水溶性カルボジイミドを調製または取得する段階を実施してもよい。IFN-α（例えば、インファジェンまたはコンセンサスインターフェロン）を縮合試薬として水溶性のカルボジイミドにカップリングさせることは、一般的にアミド結合を形成させるために最適なpHで適した緩衝液系を用いる水性培地において行われる。分子量を増加させるために、タンパク質に高分子量PEGを共有結合によって付加してもよい。
【０１３０】
選択した試薬は最適化試験のプロセスに依存するであろう。適した試薬の非制限的な例は、EDACまたは1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである。EDACは水溶性であることから、予め有機溶媒に溶解する必要なく、反応に直接加えることができる。過剰量の試薬およびクロスリンク反応の副産物として形成されたイソウレアは、いずれも水溶性であり、透析またはゲル濾過によって容易に除去される可能性がある。少量のモルを反応に加えやすくするために、EDCの濃縮水溶液を調製する。保存溶液を調製して、試薬の水不安定性を考慮して直ちに使用する。文献における合成プロトコールのほとんどは、最適な反応培地のpHが4.7〜6.0の範囲であることを示唆している。しかし、縮合反応は、pH 7.5までは収率の有意な喪失なく進行する。水を溶媒として用いてもよい。インファジェンの意図される使用を考慮すると、好ましくは培地は、pHを4.7〜6.0の範囲に予め滴定した2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸緩衝液であろう。しかし、産物が同じ緩衝液に存在するという事実を考慮すると、pH 7〜7.5の0.1 Mホスホネートも同様に用いてもよい。PEGアミン対IFN-α分子の比は、C末端カルボキシル残基が選択的にPEG化されて、モノPEG化誘導体を生成するように最適にする。
【０１３１】
PEGアミンを用いることをその名称または構造によって上記のように言及したが、そのような誘導体は例示に限られることを意味し、同様にIFN-αタンパク質のカルボキシル基と縮合するPEG-NH-NH2の場合のように、ヒドラジン誘導体のような他の基も同様に用いることができる。水相の他に、反応はまた、固相で行うことができる。ポリエチレングリコールは、分子量300〜40000の化合物のリストから選択することができる。様々なポリエチレングリコールの選択はまた、インビトロおよびインビボで精製誘導体のカップリング効率および生物学的効果、すなわち循環時間、およびウイルス活性等によって左右されるであろう。
【０１３２】
さらに、適したスペーサーをタンパク質のC末端に加えることができる。スペーサーは、適当なPEG試薬とカップリングさせて、高分子量IFN-α誘導体を提供するために、SH、NH2、またはCOOHのような反応基を有していてもよい。C末端PEG化インターフェロンを調製するために、複合固相／液相方法論を工夫することができる。例えば、Gly-Gly-Cys-NH2スペーサーを用いて、IFN-αのC末端を固相上に伸長させ、適当な分子量の活性化ジチオピリジル-PEG試薬を用いて溶液中でモノPEG化する。C末端でのカップリングは、N末端でのブロッキングとは無関係であるため、想像されるプロセスおよび産物は、コストに関して有益であり（第三のタンパク質は、N末端PEG化法の場合と同様に浪費されない）、慢性C型肝炎感染症、肝線維症等を治療する場合の治療の経済性に貢献するであろう。
【０１３３】
分子のどこかに、PEG試薬と反応してその部位でのモノPEG化が起こる、またはIFN-αのC末端での-COOH基の他に多数のPEG化が起こる、より反応性の高いカルボキシル基がアミノ酸残基に存在する可能性がある。これらの反応は、分子のC末端の立体的自由度のために、そして分岐鎖分子の場合のようにカルボジイミドとPEG試薬とによって課された立体妨害のために、あったとしても最小であろうと想像される。したがって、これは、天然または宿主系において発現される、インファジェンおよび類似のそのようなタンパク質のPEG改変の好ましい様式であり、有効性を改善してより高いインビボ生物活性を維持するためにN末端を様々な程度にブロックしてもよい。
【０１３４】
C末端PEG化を得るもう一つの方法は以下の通りである。C末端PEG化の選択性は、ヘリックスに埋もれた、またはIFN-αの内部に埋もれたカルボキシル残基での反応を妨害する立体妨害試薬によって得られる。例えば、そのような試薬の一つは、分子量〜40 kDaの分岐鎖PEGであり、この試薬は以下のように合成できる。
【０１３５】
OH3C-(CH2CH2O)n-CH2CH2NH2＋グルタミン酸、すなわちHOCO-CH2CH2CH(NH2)-COOHは、適した物質、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドまたは水溶性のEDCによって縮合され、分岐鎖PEG物質OH3C-(CH2CH2O)n-CH2CH2NHCOCH(NH2)CH2OCH3-(CH2CH2O)n-CH2CH2NHCOCH2を提供する。
2005517648.tif 000003
【０１３６】
この試薬は、アミノ基を、IFN-αの遊離で柔軟なカルボキシル基とカップリングさせて、ペプチド結合を形成するために過剰量で用いることができる。
【０１３７】
望ましければ、PEG化IFN-αは、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびその組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の既知の方法を用いて、非PEG化IFN-αから分離される。例えば、PEG-IFN-α結合体がモノPEG化IFN-αである場合、モノPEG化材料の荷電特徴を有する材料（同じ見かけの荷電を有する他の多PEG化材料が存在する可能性がある）を得るために、産物をまずイオン交換クロマトグラフィーによって分離して、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてモノPEG化材料を分離する。
【０１３８】
大腸菌において発現され、精製されるコンセンサスインターフェロンαcon-1（IFN-α con-1）は、少なくとも3つのN末端を有する：細菌産生CIFNの約3分の1がN末端メチオニンを有し；細菌産生CIFNの約3分の1がN末端システインを有し；および細菌産生CIFNの約3分の1が、ホルミル、アセチル、およびマロニル基を含む多くのアシル基によってアシル化されたN末端メチオニンまたはN末端システインのいずれかを有する。N末端アシル化種は、集合的にN-ブロック種と呼ばれる。N末端がブロックされたタンパク質は、モルまたは質量に基づいて分子の約3分の1を占める。したがって、PEG化は、N-ブロックされた種のN末端では起こらないことから、細菌産生IFN-α集団のN末端でのPEG化は、収率が約60〜70％に限定される。
【０１３９】
一般的なPEG化法では、タンパク質におけるアミノ基が多数PEG化され、タンパク質の活性が失われる。外部リジン残基の改変によって、特定のタンパク質の生物活性が失われる。さらに、大きいPEGの結合または多数のPEG化部位によっても同様に、受容体結合ドメインで起こるPEG結合の機会が増加することから、インビトロ生物活性の減少が起こりうる。
【０１４０】
さらに、PEGイントロンおよびペガシスの合成に関して採用される最近のPEG化プロトコールは、ヒスチジンまたはリジンの内部残基改変法によって、これらの産物のコストの増加に寄与する改変タンパク質のインビトロ抗ウイルス活性の有意な減少が起こることを示唆している。
【０１４１】
PEG化における選択性は、試薬対基質のモル比のみならず、適当な構造のポリエチレングリコールの選択によっても得ることができる。例えば、分岐鎖PEGは、単一の部位または直鎖状PEGより少ない部位に結合することは周知であり、したがって、いくつかの態様において分岐鎖PEGが好ましい場合がある。同様に、分岐鎖PEGは、多数の小さい直鎖PEGの結合の場合より天然の分子の生物活性を妨害する可能性が低くなりうる。分子のカルボキシル末端における相対的自由度は、十分に高分子量の直鎖状PEGを用いた場合でもカルボキシル基の選択的PEG化にとって十分な可撓性を提供する。分岐鎖PEGの場合、立体妨害のためにさらなる選択性を獲得する可能性がある。このように、タンパク質内部の分子のどこかに存在する側鎖に存在するアスパラギン酸またはグルタミン酸におけるカルボキシル残基は、カップリング化学および試薬によって立体的に妨害される。選択性、分解からの保護、および改変産物の活性の喪失のあいだの微細なバランスのために、PEG化分子の薬物動態は注意深く調べられ、最適化される。
【０１４２】
ヒトインターフェロンαコンセンサス配列に関して提唱される三次元モデルは、C末端領域に中等度の量の可撓性が存在することを示唆する。Kornら（1994）J. Interferon Res. 14：19。天然に存在するIFN-αでは、156〜166位の配列が存在しなくとも活性は消失しない。Fish（1992）J. Interferon Res. 12：257〜66；Levyら（1981）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：6186〜90。カルボキシ末端残基13個を欠損する人工的に切断された類似体は、活性を保持した。Wetzelら（1982）UCLA Symp Mol. Cell Biol. 25。モデルにおいて、これらの配列は受容体認識ループとは離れたアミノ末端に隣接する分子の底に存在するヘリックスEのカルボキシ末端端部の約3分の1を含む。
【０１４３】
IFN-con1は、IFN-α2bとのアミノ酸19個の差を含む。これらの変化の半分以上が分子のC末端に集合している。変異誘発および抗体結合試験から、分子のこの領域における残基が受容体結合または生物活性にとって重要でないことが示唆される。Welter（1997）、Seminar Oncol.24（3補則9）：52〜62。このように、ポリペプチド構造のこのセグメントでの残基の変異に関してかなりの量の可撓性が存在し、モノPEG化分子は完全な活性を保持する可能性がある。本発明のC末端のモノPEG化分子は、対応する親（非誘導体化）IFN-α分子の完全または実質的に完全な受容体結合活性および他の生物活性を保持すると考えられている。
【０１４４】
第1型および第2型のIFN-αを異なる製剤で実質的に同時に投与する
いくつかの態様において、多相薬物動態プロフィールは、第1型および第2型のIFN-αを異なる製剤で実質的に同時に投与することによって得られる。このように、いくつかの態様において、第1型と第2型は、異なる製剤において投与され、互いに約5秒〜約15秒、約15秒〜約30秒、約30秒〜約60秒、約1分〜約5分、約5分〜約15分、約15分〜約30分、約30分〜約60分以内に投与される。
【０１４５】
いくつかの態様において、PEG化IFN-αおよび非PEG化IFN-αは、異なる製剤において実質的に同時に投与される。いくつかの態様において、N末端PEG化IFN-αおよび非PEG化IFN-αは、異なる製剤において実質的に同時に投与される。いくつかの態様において、C末端PEG化IFN-αおよび非PEG化IFN-αは、異なる製剤において実質的に同時に投与される。
【０１４６】
第1型および第2型のIFN-αを異なる製剤で異なる時間で投与する
いくつかの態様において、多相薬物動態プロフィールは、第1型および第2型のIFN-αを異なる製剤で異なる時間に投与することによって得られる。このように、いくつかの態様において、第1型と第2型は、異なる製剤において投与され、第1型はt0で投与され、第2型は第2の時間t1で投与され、t1−t0は約12時間〜約16時間、約16時間〜約20時間、約20時間〜約24時間、約24時間〜約36時間、または約36時間〜約48時間である。
【０１４７】
第1型および第2型のIFN-αを含む組成物を投与する
いくつかの態様において、多相薬物動態プロフィールは、第1型と第2型のIFN-αを同じ製剤において投与することによって得られる。そのような製剤には、下記により詳細に説明するように、第1型と第2型のIFN-αを含む組成物が含まれる。
【０１４８】
組成物
本発明は、PEG化IFN-αを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明の組成物には、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとが含まれ、第2型のIFN-αは、第1型のIFN-αと比較してその平均滞留時間を増加させるPEG改変を含むが、第1型はそのような改変を含まない。他の態様において、本発明の組成物には、カルボキシル末端またはその近傍で一つまたはそれ以上のPEG部分を含むIFN-α（「C末端PEG化IFN-α」）が含まれる。
【０１４９】
本発明の組成物において、第1型対第2型の比は、1：100〜約1：50、約1：50〜約1：25、約1：25〜約1：10、約1：10〜約1：5、約1：5〜約1：1、約1：1〜約1：0.5、約1：0.5〜約1：0.1、約1：0.1〜約1：0.05、約1：0.05〜約1：0.04、約1：0.04〜約1：0.02、または約1：0.02〜約1：0.01である。
【０１５０】
本発明の他の態様において、組成物は、組成物におけるPEG化IFN-αおよび非PEG化IFN-αの総モル数の百分率として、非PEG化IFN-αを約10％〜約15％、約15％〜約20％、約20％〜約25％、約25％〜約30％、約30％〜約35％、約35％〜約40％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約55％、約55％〜約60％、約60％〜約65％、約65％〜約70％、約70％〜約75％、約75％〜約80％、約80％〜約85％、または約85％〜約90％含む。
【０１５１】
本発明のさらなる態様において、組成物は、組成物におけるPEG化IFN-αおよび非PEG化IFN-αの総モル数の百分率として、PEG化IFN-αを約90％〜約85％、約85％〜約80％、約80％〜約75％、約75％〜約70％、約70％〜約65％、約65％〜約60％、約60％〜約55％、約55％〜約50％、約50％〜約45％、約45％〜約40％、約40％〜約35％、約35％〜約30％、約30％〜約25％、約25％〜約20％、約20％〜約15％、または約15％〜約10％含む。
【０１５２】
いくつかの態様において、本発明の組成物には、PEG化IFN-αと非PEG化IFN-αとが含まれ、PEG化IFN-αは、PEG部分に直接または間接的に結合したN末端またはその近傍に一つまたはそれ以上の残基を含む。例えば、N末端PEG化インファジェンは、非PEG化インファジェンの活性の約20％を保有している。N末端PEG化IFN-αの活性の減少は、非PEG化IFN-αが消失した後のより低いがより長く作用する薬物動態作用を提供するために用いられる。特定の態様において、N末端PEG化IFN-αは、N末端PEG化インファジェンである。
【０１５３】
いくつかの態様において、PEG化の開始材料は細菌産生IFN-αである。細菌産生IFN-αの約30〜40％が、N末端アミノ基がアシル化された誘導体であり、アシル化によってアミノ基でのPEG化が防止される。いくつかの態様において、第1型のIFN-αは、細菌産生IFN-αのアシル化型である。開始材料の約60〜70％がN末端アミノ基でアシル化されず、したがって、N末端アミノ基でPEG化を受ける。したがって、細菌産生IFN-αのPEG化によって、IFN-α集団の約60〜70％のPEG化が起こる。
【０１５４】
いくつかの態様において、第1型のIFN-αは、N-ブロックされ（および非PEG化）IFN-αであり、第2型のIFN-αは、N末端PEG化IFN-αである。IFN-αの細菌産生集団の約30％が、アシル基によってN末端をブロックされており、N末端でPEG化することができない。細菌産生IFN-αのN末端PEG化によって、集団の約30％〜40％がN-ブロックされ（および非PEG化）、約60％〜70％がN末端PEG可IFN-αとなる。これらの態様のいくつかにおいて、IFN-αは、CIFN-αcon-1である。いくつかの態様において、PEG化IFN-αを非PEG化（およびN-ブロック）IFN-αから分離するために、N末端PEG化細菌産生IFN-αに一つまたはそれ以上の分離段階を行う。分離は、サイズ排除クロマトグラフィー、HPLC等が含まれるがこれらに限定されない、任意の既知の方法を用いて行われる。二つの亜集団、すなわちN-ブロック非PEG化IFN-αの第1の亜集団と、N末端PEG化IFN-αの第2の亜集団を互いに分離して、二つの亜集団を既定の比率で再度混合する（本明細書において記述するように）。
【０１５５】
いくつかの態様において、本発明の組成物には、非PEG化IFN-αおよびN末端でブロックされてもされなくてもよいC末端PEG化IFN-αが含まれる。これらの態様のいくつかにおいて、C末端PEG化IFN-αは、モノPEG化であり、例えばIFN-αはC末端またはその近傍に唯一のPEG部分を含む。
【０１５６】
C末端PEG化IFN-α
なお他の態様において、本発明の組成物には、C末端PEG化IFN-αが含まれる。いくつかの態様において、C末端PEG化IFN-αは、モノPEG化であり、すなわちIFN-αは、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端に結合した単一のPEG部分を含む。いくつかの態様において、PEGは直鎖状である。他の態様において、PEG部分は分岐である。
【０１５７】
多くの態様において、本発明のC末端PEG化モノPEG化IFN-αポリペプチドは、親（非PEG化）分子の少なくとも一つの生物活性の少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約98％を保持している。いくつかの態様において、本発明のC末端PEG化モノPEG化IFN-αポリペプチドは、親（非PEG化）分子の少なくとも一つの生物活性の95％〜100％を保持する。IFN-αの生物活性には、IFN-α受容体との結合；EMCウイルスの細胞変性作用のインビトロ阻害；DAUDIヒトリンパ芽球B細胞株のインビトロ増殖阻害；インビトロまたはインビボでの2',5'オリゴアデニレートシンテターゼ活性の活性化；RNアーゼL合成の活性化等が含まれるがこれらに限定されない。
【０１５８】
如何なる既知のIFN-αポリペプチドもPEG部分によって改変することができ、この場合PEG部分は、IFN-αポリペプチドのカルボキシル末端に共有結合する。特定の態様において、IFN-αはCIFN、例えばCIFNαcon-1である。
【０１５９】
本発明のC末端PEG化IFN-αは、非PEG化IFN-αと比較してインビボ滞留時間の増加を示す（非PEG化IFN-αも同様に、そのインビボ滞留時間を増加させる如何なる他の改変も含まない）。C末端PEG化IFN-αは、親分子、例えば如何なる改変も有しない同じIFN-αと比較した場合に、約10％〜約15％、約15％〜約20％、約20％〜約25％、約25％〜約30％、約30％〜約35％、約35％〜約40％、約40％〜約45％、約45％〜約50％、約50％〜約100％（または2倍）、約2倍〜約3倍、約3倍〜約5倍、約5倍〜約7倍、約7倍〜約10倍、約10倍〜約15倍、約15倍〜約20倍、約20倍〜約25倍、または約25倍〜約30倍増加したインビボ滞留時間を示す。
【０１６０】
製剤
上記の組成物は、周知の試薬および方法を用いて調製することができる。組成物は、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤として提供される。広く多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で既知であり、本明細書において詳細に記述する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro（2000）、「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、リッピンコット、ウィリアムス＆ウィルキンス；「Phamaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems」（1999）、H.C.Anselら編、第7版、リッピンコット、ウィリアムス＆ウィルキンス；および「Handbook of Pharmaceutical Excipients」（2000）、A.H. Kibbeら編、第3版、アメリカ製薬工業会を含む、多様な出版物において詳細に記述されている。
【０１６１】
媒体、アジュバント、担体、または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、一般的に容易に入手可能である。その上、pH調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤等のような薬学的に許容される補助剤も、一般的に容易に入手可能である。
【０１６２】
いくつかの態様において、PEG化インターフェロンは、水性緩衝液において調製される。適した水性緩衝液には、5 mM〜100 mMまでの様々な強度の酢酸、コハク酸、クエン酸、およびリン酸緩衝液が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、水性緩衝剤には、等張溶液を提供する試薬が含まれる。そのような試薬には、塩化ナトリウム、および糖、例えばマンニトール、デキストロース、蔗糖等が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの態様において、水性緩衝剤にはさらに、ポリソルベート20または80のような非イオン性界面活性剤が含まれる。選択的に、製剤にはさらに保存剤が含まれてもよい。適した保存剤には、ベンジルアルコール、フェノール、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム等が含まれるがこれらに限定されない。多くの場合、製剤は、約4℃で保存される。製剤はまた凍結乾燥してもよく、この場合それらには、一般的に蔗糖、トレハロース、乳糖、マルトース、マンニトール等のような凍結保護剤が含まれる。凍結乾燥製剤は、室温であっても長期間にわたって保存することができる。
【０１６３】
C末端PEG化IFN-αによる肝炎の治療
いくつかの態様において、本発明は、ウイルス量を減少させるために有効な量のC末端PEG化IFN-αを投与することを含む、肝炎ウイルス感染症を治療する方法を提供する。
【０１６４】
C末端PEG化IFN-αの「有効量」は、投与計画の開始後約12時間〜約48時間、約48時間〜約3日、約3日〜約7日、約7日〜約2週間、約2週間〜約4週間、または約4週間〜約8週間、約8週間〜約12週間、約12週間〜約16週間、約16週間〜約24週間、または約24週間〜約48週間にわたって個体の血清中のウイルス量の1.5対数、2対数、2.5対数、3対数、3.5対数、4対数、4.5対数、または5対数減少を得るために有効な量である。
【０１６５】
C末端PEG化IFN-αは、毎日、週に2回、週に1回、2週間に1回、または週に3回、約24時間〜約48時間、約2日〜約4日、約4日〜約7日、約1週間〜約2週間、約2週間〜約4週間、約4週間〜約6週間、約6週間〜約8週間、約8週間〜約12週間、約12週間〜約16週間、約16週間〜約24週間、または約24週間〜約48週間の期間投与される。
【０１６６】
いくつかの態様において、C末端PEG化IFN-αは、ウイルス量を検出不能レベルまで、例えば約1000〜約5000、約500〜約1000、または約100〜約500ゲノムコピー/ml血清まで減少させるために有効な量および期間で投与される。いくつかの態様において、抗ウイルス剤の有効量は、100ゲノムコピー/ml血清より低いレベルまでウイルス量を減少させるために有効な量である。
【０１６７】
いくつかの態様において、C末端PEG化IFN-αは、約30 μg〜約300 μgの用量で投与される。いくつかの態様において、C末端PEG化IFN-αは、32.5μg、65 μg、130 μg、または162.5 μgの用量で投与される。
【０１６８】
いくつかの態様において、C末端PEG化IFN-αは、併用療法において投与され、例えばもう一つの抗ウイルス剤または他の治療物質は：（1）異なる製剤で実質的に同時に；（2）実質的に同時に同じ製剤で；または（3）異なる製剤で、異なる時間に、投与される。併用治療については先に詳述している。
【０１６９】
治療方法
本発明は、肝炎ウイルス感染症を治療する方法を提供する。方法は一般的に、抗ウイルス剤の多相血清濃度を得るために有効なレベルおよび方法で本発明の組成物を投与することを含む。
【０１７０】
本発明の多くの態様において、本発明の方法の投与計画は、抗ウイルス剤の血清濃度の「山」（Cmax；抗ウイルス剤の最高血清濃度）と「谷」（Cmin：抗ウイルス剤の最低血清濃度）が減少または回避される抗ウイルス剤の血清濃度を得る。多くの態様において、本発明の方法によって、Cmax：Cmin比は、第2の相（例えば、図2〜5に示すように、治療2〜15日間、治療2〜10日間、治療3〜10日間、または治療3〜15日間）のあいだ、約3.0未満、約2.5未満、約2.0未満、または約1.5未満となる。いくつかの態様において、投与計画は、第2の相（例えば、図2〜5に示すように、治療2〜15日間、治療2〜10日間、治療3〜10日間、または治療3〜15日間）のあいだ、Cmax：Cmin比約1.0未満を得る。
【０１７１】
一般的に、本発明の方法の投与計画において、第2の相の任意の24時間のあいだ測定した第2の相における抗ウイルス剤の血清濃度対時間の曲線下面積（AUC）（すなわち、AUCsus）は、第1の相の任意の24時間に測定したAUC（すなわち、AUCmax）より小さい。言い換えれば、第2の相の任意の24時間のあいだ測定したAUCsusは、第1の相の任意の24時間のあいだに測定したAUCmaxより小さい。
【０１７２】
第1の相における抗ウイルス剤の血清濃度は、個体の血清中のウイルス量の1.5対数、2対数、2.5対数、3対数、3.5対数、4対数、4.5対数、または5対数減少を得るために有効である。
【０１７３】
本発明の組成物および／または投与計画は、約24時間〜約48時間、約2日〜約4日、約4日〜約7日、約1週間〜約2週間、または約2週間〜約4週間のあいだ比較的一定のままであるIFN-α血清濃度プロフィールを第2の相において得るように設計された非PEG化IFN-αとPEG化IFN-αとの混合物を患者に投与する。一つの態様において、本発明の組成物および／または投与計画は、t1−t0が約12時間〜約16時間、約16時間〜約20時間、約20時間〜約24時間、約24時間〜約36時間、約36時間〜約48時間であって、t2−t1が約24時間〜約48時間、約2日〜約4日、約4日〜約7日、約1週間〜約2週間、または約2週間〜約4週間である、図3、4または5に示したIFN-α血清濃度（IFN-α国際単位/ml血清（IU/ml））プロフィールを得るように設計される。
【０１７４】
図3に示す多相薬物動態プロフィールは、非PEG化IFN-αとPEG化IFN-αとの混合物を含む薬学的製剤を患者に投与することによって得ることができる。非PEG化IFN-α対PEG化IFN-αのモル比は、薬物の投与後16〜24時間でIFN-αの総血清濃度（IU/ml）の初回ピークを得るように予め選択する。図3に示す薬物動態プロフィールを示す本発明の態様において、第1の相（t1−t0）の任意の24時間における時間の関数としてのIFN-αの総血清濃度（IU/ml）の曲線下面積（AUCmax）は、第2の相（t2−t1）における任意の24時間のAUC（AUCsus）より約2倍大きい。これらの態様において、AUCmax：AUCsusの所望の比2：1は、非PEG化IFN-αとPEG化IFN-αとが本質的に同じ特異的活性（IU/mgタンパク質）を有すると仮定して、非PEG化IFN-α対PEG化IFN-αのモル比1：1を特徴とする組成物によって得ることができる。そのような態様において、アミノ酸重量で非PEG化IFN-α50％とPEG化IFN-α50％とを含む組成物を患者に投与すると、図3の薬物動態プロフィールを得ることができる。
【０１７５】
他の態様において、本発明は、PEG化IFN-αが非誘導体化の親IFN-αより低い特異的活性（IU/mgタンパク質）を有する、PEG化IFN-αと非PEG化IFN-αとの混合物を提供する。一つの例において、ペガシス産物のPEG化インターフェロンα2a活性成分は、ロフェロン産物の非PEG化IFN-α-2a活性成分の特異的活性（IU/mgタンパク質）の約10％を示す。もう一つの例において、PEG-イントロン産物のPEG化インターフェロンα-2b活性成分は、イントロン-A産物の非PEG化インターフェロンα-2b活性成分の特異的活性（IU/mgタンパク質）の約10％を示す。さらにもう一つの例において、米国特許第5,985,265号に記載のN末端モノPEG化CIFNは、Infergen(登録商標)αcon-1産物の非PEG化CIFN活性成分の特異的活性（IU/mgタンパク質）の約20％を示す。
【０１７６】
PEG化IFN-α成分が非PEG化IFN-α成分と比較して減少した特異的活性（IU/mgタンパク質）を有する混合物を用いる態様において、非PEG化IFN-α対PEG化IFN-αのモル比は約1：1／（混合物におけるPEG化IFN-αによって示される非PEG化IFN-α特異的活性の割合/100）である。例えば、上記のPEG化IFN-αおよび非PEG化IFN-αの3つの組成物は、図3に示す薬物動態プロフィールに影響を及ぼすように、下記の表1に示されるモル比を用いて調製される。
【０１７７】
【表１】
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【０１７８】
第1の相における抗ウイルス剤の血清濃度は、投与計画の開始後約12時間〜約48時間、または約16時間〜約24時間以内に個体の血清におけるウイルス力価の1.5対数、2対数、2.5対数、3対数、3.5対数、4対数、4.5対数、または5対数減少を得るために有効である。
【０１７９】
抗ウイルス剤の第2の濃度は、約24時間〜約48時間、約2日〜約4日、約4日〜約7日、約1週間〜約2週間、約2週間〜約4週間、約4週間〜約6週間、約6週間〜約8週間、約8週間〜約12週間、約12週間〜約16週間、約16週間〜約24週間、または約24週間〜約48週間のあいだ維持される。
【０１８０】
第2の相において、血清中の抗ウイルス剤の濃度は、ウイルス量を検出不能レベルまで、例えば約1000〜約5000、約500〜約1000、または約100〜約500ゲノムコピー/ml血清まで減少させるために有効である。いくつかの態様において、抗ウイルス剤の有効量は、100ゲノムコピー/ml血清より低いレベルまでウイルス量を減少させるために有効な量である。
【０１８１】
第2の相における抗ウイルス剤の血清濃度は、持続的なウイルス反応を得るために有効であり、例えば検出可能なHCV RNA（例えば、約500ゲノムコピー/ml血清未満、約200ゲノムコピー/ml血清未満、または約100ゲノムコピー/ml血清未満）を、治療中止後少なくとも約1ヶ月間、少なくとも約2ヶ月間、少なくとも約3ヶ月間、少なくとも約4ヶ月間、少なくとも約5ヶ月間、または少なくとも約6ヶ月間患者の血清中に認めない。
【０１８２】
いくつかの態様において、少なくとも第三の相が第1および第2の相の後に続く。これらの態様のいくつかにおいて、第三の相には、第1の血清濃度と等しいまたはほぼ等しい抗ウイルス剤の血清濃度を得るために有効な用量で抗ウイルス剤を投与することが含まれる。これらの態様のいくつかにおいて、第四の相には、第2の血清濃度に等しいまたはほぼ等しい抗ウイルス剤の血清濃度を得るために有効な用量で抗ウイルス剤を投与することが含まれる。
【０１８３】
併用治療
いくつかの態様において、方法は、本発明の組成物と、IFN-γおよび／またはリバビリンのようなさらなる治療物質とを含む組成物を投与することを含む併用治療を提供する。投与計画がIFN-αとIFN-γおよび／またはリバビリンのようなさらなる物質との投与を含む多くの態様において、IFN-αは、先に記述したようにIFN-αの多相血清濃度が得られるように投与される。
【０１８４】
いくつかの態様において、さらなる治療物質をIFN-αの治療の全過程において投与し、治療期間の開始時および終了時は一致する。他の態様において、さらなる治療物質を、IFN-αの治療期間と重なり合う期間投与する、例えばさらなる治療物質による治療はIFN-α治療が始まる前に開始して、IFN-α治療が終わる前に終了する；さらなる治療物質による治療はIFN-α治療が始まった後に開始して、IFN-γ治療が終わった後に終了する；さらなる治療物質による治療はIFN-α治療が始まった後に開始して、IFN-α治療が終わる前に終了する；さらなる治療物質による治療はIFN-α治療が始まる前に開始して、IFN-α治療が終わった後に終了する。
【０１８５】
なお他の態様において、さらなる治療物質は、IFN-α治療が始まる前に投与され、IFN-α治療が始まると終了し、例えば、さらなる治療物質は、「プライミング」投与計画において用いられる。
【０１８６】
インターフェロンγ
IFN-γポリペプチドをコードする核酸配列は、公共のデータベース、例えばジェンバンク、雑誌刊行物等からアクセスしてもよい。ヒト疾患の治療に関して様々な哺乳類IFN-γポリペプチドが重要であるが、一般的にヒトタンパク質が用いられる。ヒトIFN-γコード配列は、ジェンバンクアクセッション番号X13274；V00543；およびNM_000619に認められる。対応するゲノム配列は、ジェンバンクアクセッション番号J00219；M37265；およびV00536に認められる。例えば、Grayら（1982）Nature 295：501（ジェンバンクX13274）；およびRinderknechtら（1984）J.B.C. 259：6790を参照されたい。
【０１８７】
対象のIFN-γ型の例としては、N末端メチオニンを有するアミノ酸140個の一本鎖ポリペプチドであるActimmune(登録商標)（ヒトインターフェロン）がある。これは、大腸菌における組換えによって産生され、グリコシル化されない。Rinderknechtら（1984）、J. Biol. Chem. 259：6790〜6797。
【０１８８】
本発明の方法において用いられるIFN-γは、それらがIFN-γ活性、特にヒトIFN-γ活性を有する限り、天然のIFN-γs、組換え型IFN-γsおよびその誘導体の如何なるものであってもよい。ヒトIFN-γは、インターフェロンに特徴的な抗ウイルスおよび抗増殖特性を示すと共に、当技術分野で既知であるように他の多くの免疫調節活性を示す。IFN-γは、先に提供した配列に基づくが、タンパク質の産生およびタンパク質溶解プロセシングによって、そのプロセシング変種が起こりうる。Grayら、上記によって提供された非プロセシング配列は、アミノ酸（aa）166個からなる。大腸菌において産生された組換え型IFN-γは、当初アミノ酸146個であると考えられた（アミノ酸20位で始まる）が、無処置のヒトIFN-γは、残基23位の後で切断されて、アミノ酸143個のタンパク質、または細菌において発現に必要な末端のメチオニンが存在する場合にはアミノ酸144個のタンパク質を生じることが後に判明した。N末端メチオニンは、大腸菌発現の特定の場合において、プロセシングによって除去されない、mRNA翻訳「開始」シグナルAUGによってコードされるアーチファクトである。他の微生物システムまたは真核細胞発現系では、メチオニンは除去される可能性がある。
【０１８９】
本発明の方法において用いるために、無処置のIFN-γペプチド、その改変および変種、または一つもしくはそれ以上のペプチドの組み合わせの如何なるものを用いてもよい。対象となるIFN-γペプチドには断片が含まれ、完全な配列と比較してカルボキシ末端で多様に切断されうる。そのような断片は、アミノ酸24〜149個（プロセシングされていないポリペプチドの残基からの番号付け）が存在する限り、ヒトγインターフェロンの特徴的な特性を示し続ける。外来の配列は、活性を失うことなく、アミノ酸155位後のアミノ酸配列を置換することができる。例えば、米国特許第5,690,925号を参照されたい。無処置のIFN-γ部分には、アミノ酸残基24〜150、24〜151、24〜152、24〜153、24〜155、および24〜157から多様に伸長した分子が含まれる。これらの変種および当技術分野で既知のIFN-γ活性を有する他の変種の如何なるものも、本発明の方法において用ることができる。
【０１９０】
IFN-γポリペプチドの配列は、配列における標的変化を生成するために当技術分野において既知の様々な方法で変化させてもよい。変種ポリペプチドは、通常、本明細書に定義される配列と実質的に類似である、すなわちアミノ酸の少なくとも1個が異なる、および少なくとも2個しかし約10個を超えないアミノ酸が異なる。配列の変化は置換、挿入、または欠失であってもよい。アラニンまたは他の残基を系統的に導入する変異の走査を用いて、重要なアミノ酸を決定してもよい。対象となる特定のアミノ酸置換には、保存的および非保存的変化が含まれる。保存的アミノ酸置換には典型的に、以下の群内の置換が含まれる：（グリシン、アラニン）；（バリン、イソロイシン、ロイシン）；（アスパラギン酸、グルタミン酸）；（アスパラギン、グルタミン）；（セリン、トレオニン）；（リジン、アルギニン）；または（フェニルアラニン、チロシン）。
【０１９１】
一次アミノ酸配列を変化させる、または変化させない可能性がある対象となる改変には、ポリペプチドの誘導体化、例えばアセチル化またはカルボキシル化；グリコシル化部位を導入または除去するアミノ酸配列の変化；タンパク質をポリエチレングリコール化に対して感受性にするアミノ酸配列の変化等が含まれる。同様に、グリコシル化の改変、例えば、その合成およびプロセシング、またはさらなるプロセシング段階において、ポリペプチドのグリコシル化パターンを改変することによって得られた改変、例えば、哺乳類のグリコシル化または脱グリコシル化酵素のようなグリコシル化に影響を及ぼす酵素にポリペプチドを曝露することによって得られた改変が含まれる。同様に、リン酸化アミノ酸残基、例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンを有する配列も含まれる。
【０１９２】
タンパク質溶解分解に対するその抵抗性を改善するために、溶解度特性を最適にするために、または治療物質としてそれらをより適するようにするために、通常の化学技術を用いて改変されているポリペプチドが本発明に含まれる。例えば、ペプチド骨格を環状化して安定性を増強してもよい（Friedlerら（2000）、J. Biol. Chem. 275：23783〜23789）。天然に存在するL-アミノ酸以外の残基、例えばD-アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含む類似体を用いてもよい。タンパク質は、安定性を増強するためにポリエチレングリコール化してもよい。
【０１９３】
ポリペプチドは、当技術分野で既知の通常の方法を用いたインビトロ合成によって調製しても、組換え法によって調製してもよく、または誘導されてもしくは本来タンパク質を産生する細胞から単離してもよい。特定の配列および調製法は、簡便さ、経済性、必要な純度等によって決定される。望ましければ、合成または発現の際に他の分子または表面との結合を可能にする様々な基をポリペプチドに導入してもよい。このように、チオエーテルを作製するためにはシステイン、金属イオン錯体に結合させるためにはヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためにはカルボキシ基、アミドを形成するためにはアミノ基等を用いることができる。
【０１９４】
ポリペプチドはまた、組換え合成の通常の方法に従って単離および精製してもよい。発現宿主の溶解物を調製して、溶解物をHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、または他の精製技術によって精製してもよい。ほとんどの場合、用いられる組成物は、産物の調製およびその精製法に関連した混入物に対して、所望の産物を重量で少なくとも20％、より通常、重量で少なくとも約75％、好ましくは重量で少なくとも約95％含み、治療目的の場合には、通常少なくとも約99.5％を含む。通常、割合は、総タンパク質に基づく。
【０１９５】
リバビリンおよび抗ウイルス剤
ICNファーマシューティカルズインク（ICN Pharmaceuticals Inc、コスタメサ、カリフォルニア州）から販売されているリバビリン、1-β-D-リボフラノシル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミドは、メルクインデックス第11版において化合物番号8199として記述されている。その製造および処方は米国特許第4,211,771号に記述されている。本発明はまた、リバビリンの誘導体を用いることも企図する（例えば、米国特許第6,277,830号を参照されたい）。リバビリンは一日約400、約800、または約1200mgの用量で投与される。
【０１９６】
他の抗ウイルス剤を、本発明の治療方法において投与することができる。例えば、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（IMPDH）を阻害する化合物は、直接の抗ウイルス活性を発揮する能力を有する可能性があり、そのような化合物を、本明細書に記述するようにIFN-α組成物と共に投与することができる。肝炎C NS3プロテアーゼの有効な阻害剤である薬物を、本明細書に記述するようにIFN-α組成物と併用して投与してもよい。肝炎C NS3プロテアーゼ阻害剤は、ウイルス複製を阻害する。HCV NS3ヘリカーゼの阻害剤のような他の物質も同様に、併用治療にとって魅力的な薬物であり、本明細書に記載される併用治療において用いることが企図される。HCVタンパク質配列と相補的であってウイルスコアタンパク質の発現を阻害する、Heptazyme(商標)のようなリボザイムおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドも同様に、本明細書に記載の併用治療において用いるために適している。
【０１９７】
肝臓ターゲティングシステム
本明細書に記載の抗ウイルス剤は、任意の既知のターゲティング手段を用いて肝臓にターゲティングすることができる。当業者は、肝細胞に化合物をターゲティングすることが証明されている広く多様な化合物を承知している。そのような肝臓ターゲティング化合物には、アシアロ糖ペプチド；ガラクトースまたはラクトース残基に結合した塩基性ポリアミノ酸；ガラクトシル化アルブミン；アシアロ糖タンパク質-ポリ-L-リジン結合体；ラクトサミン化アルブミン；ラクトシル化アルブミン-ポリ-L-リジン結合体；ガラクトシル化ポリ-L-リジン；ガラクトース-PEG-ポリ-L-リジン結合体；ラクトース-PEG-ポリ-L-リジン結合体；アシアロフェツイン；およびラクトシル化アルブミンが含まれるがこれらに限定されない。
【０１９８】
いくつかの態様において、肝臓ターゲティング化合物は、抗ウイルス剤に直接結合させる。他の態様において、肝臓ターゲティング化合物は、抗ウイルス剤に間接的に、例えばリンカーによって結合させる。なお他の態様において、肝臓ターゲティング化合物を、例えばリポソームまたはミクロスフェアに会合させ、肝細胞ターゲティング送達媒体を形成して、肝細胞ターゲティング送達媒体を用いて抗ウイルス剤を送達する。
【０１９９】
「肝臓にターゲティングする」および「肝細胞ターゲティング」という用語は、被験者に投与された抗ウイルス剤の少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、または少なくとも約90％またはそれ以上が、肝門脈を通して肝臓に入り、肝細胞に関連するようになる（例えば、取り込まれる）ように、肝細胞に抗ウイルス剤をターゲティングすることを指す。
【０２００】
製剤
上記の抗ウイルス剤は、周知の試薬および方法を用いて調製することができる。抗ウイルス剤は、薬学的に許容される賦形剤との製剤において提供される。広く多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で既知であり、本明細書において詳細に記述する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A. Gennaro（2000）、「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、リッピンコット、ウィリアムス＆ウィルキンス；「Phamaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems」（1999）、H.C.Anselら編、第7版、リッピンコット、ウィリアムス＆ウィルキンス；および「Handbook of Pharmaceutical Excipients」（2000）、A.H. Kibbeら編、第3版、アメリカ製薬工業会を含む、多様な出版物において詳細に記述されている。
【０２０１】
媒体、アジュバント、担体、または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、一般的に容易に入手可能である。その上、pH調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤等のような薬学的に許容される補助剤も、一般的に容易に入手可能である。
【０２０２】
本発明の方法において、活性物質は、所望の治療効果を得ることができる如何なる簡便な手段も用いて宿主に投与してもよい。このように、物質は治療的投与のために多様な製剤に組み入れることができる。より詳しく述べると、本発明の物質は、適当な薬学的に許容される担体または希釈剤と共に薬学的組成物に調製することができ、固体、半固体、液体、またはガス状、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾルの調製物に調製してもよい。
【０２０３】
そのため、物質の投与は、経口、口腔内、直腸内、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内等を含む多様な方法で得ることができる。
【０２０４】
薬学的投与剤形において、物質は、他の薬学的に許容される塩の形で投与してもよく、またはそれらは単独もしくは他の薬学的に活性な化合物と適当に会合させると共に配合して用いてもよい。以下の方法および賦形剤は単なる例であって、制限的ではない。
【０２０５】
経口調製物の場合、物質は単独または錠剤、粉剤、顆粒またはカプセル剤を作製するために適当な添加剤、例えば乳糖、マンニトール、コーンスターチ、またはジャガイモデンプンのような従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤；タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ならびに望ましければ、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、および着香料と配合して用いることができる。
【０２０６】
物質は、植物油または他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高等脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールのような水性または非水性溶媒にそれらを溶解、懸濁、または乳化させることによって、ならびに望ましければ、溶解剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および保存剤のような従来の添加剤と共に注射用調製物に調製することができる。
【０２０７】
さらに、物質は、乳化基剤または水溶性基剤のような多様な基剤と混合することによって坐剤に調製することができる。本発明の化合物は、坐剤によって直腸内投与することができる。坐剤には、体内で融解するが、室温では固化するカカオバター、カルボワックスおよびポリエチレングリコールのような媒体が含まれうる。
【０２０８】
それぞれの用量単位、例えば小さじ1杯、大さじ1杯、錠剤、または坐剤が一つまたはそれ以上の阻害剤を含む組成物の規定量を含む、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤のような経口または直腸投与のための単位投与剤形を提供してもよい。同様に、注射または静脈内投与用の単位投与剤形は、滅菌水、通常生理食塩液または他の薬学的に許容される担体における溶液として組成物中に阻害剤を含んでもよい。
【０２０９】
本明細書において用いられるように「単位投与剤形」とは、それぞれの単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体または溶媒と会合して所望の作用を生じるために十分な量で計算された本発明の化合物の既定量を含む、ヒトおよび動物被験者にとって単位用量として適した物理的に個別の単位を意味する。本発明の新規単位用量剤形の明細は、用いる特定の化合物、得られる作用、および宿主におけるそれぞれの化合物に関連した薬物動態に依存する。
【０２１０】
PEG化IFN-α2aの有効量は、90〜180 μg/用量の範囲である。PEG化IFN-α2bの有効量は、用量あたり0.5μg/kg体重〜1.5 μg/kg体重の範囲である。
【０２１１】
活性物質の単位用量、例えば経口または注射用用量を有するキットが提供される。そのようなキットにおいて、単位用量を含む容器の他に、肝炎を治療するための薬物の用途および付随する利益を説明する添付文書が含まれるであろう。好ましい物質および単位用量は上記の本発明において記述した通りである。
【０２１２】
薬物送達システム
如何なる既知の薬物送達系も本発明において用いることができる。さらに、如何なる既知の送達系の併用も用いることができる。
【０２１３】
薬物送達系は、装置が、例えば機械的注入ポンプ、電気機械的注入ポンプ、デポー剤、ミクロスフェアに基づくことができる埋め込み型装置を含む任意の装置となりうる。本質的に、先に記述したような制御された放出（少なくとも二相性の放出）を提供する薬物送達系が、本発明において用いるために適している。いくつかの態様において、薬物送達系はデポー剤である。他の態様において、薬物送達系は、連続送達装置（例えば、注射システム、ポンプ等）である。なお他の態様において、薬物送達系は、注射装置（例えば、シリンジおよび針）と連続送達システムとの併用である。「連続送達システム」という用語は、本明細書において「制御送達システム」と互換的に用いられ、その多様ものが当技術分野において既知であるカテーテル、注射装置等と組み合わせた連続的（例えば、制御された）送達装置（例えば、ポンプ）を含む。
【０２１４】
いくつかの態様において、送達システムはデポーシステムである。デポーシステムは、IFN-αまたは他の抗ウイルス剤が抱埋されるマトリクスを含む。マトリクスはポリマーまたは非ポリマー物質である。
【０２１５】
特定の態様において、薬物送達システムはデポー剤を含む。デポー剤は、第1型のIFN-αと第2型のIFN-αとの均一な混合物を含みうる。または、デポー剤は、例えば第1型のIFN-αが放出され、次いで第2型のIFN-αが放出されるように構成された「層状」とすることもできる。
【０２１６】
いくつかの態様において、デポー剤はポリマーマトリクスを含む。例えば、加水分解可能なエステル結合を有するコポリマーおよびホモポリマーポリエステルに由来するポリマーマトリクスを用いてもよい。これらの多くが当技術分野において生分解性で、毒性を有しないまたは毒性が低い分解産物に至ることが知られている。そのようなポリマーの非制限的な例は、ポリグリコール酸（PGA）およびポリ乳酸（PLA）ポリ(DL-乳酸-コ-グリコール酸)（DL PLGA）、ポリ(D-乳酸-コグリコール酸)（D PLGA）、およびポリ(L-乳酸-コ-グリコール酸)（L PLGA）である。ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)における乳酸およびグリコール酸ポリマーの例としての比は、100：0（すなわち、純粋なポリラクチド）〜50：50の範囲である。他の有用な生分解性または生体腐食性ポリマーには、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリ(ε-カプロラクトン-コ-乳酸)、ポリ(ε-カプロラクトン-コ-グリコール酸)、ポリ(β-ヒドロキシ酪酸)、ポリ(アルキル-2-シアノアクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート）のようなハイドロゲル、ポリアミド、ポリ(アミノ酸)（すなわち、L-ロイシン、グルタミン酸、L-アスパラギン酸等）、ポリ(エステルウレア)、ポリ(2-ヒドロキシエチルDL-アスパルトアミド)、ポリアセタールポリマー、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレアミド、多糖類およびそのコポリマーが含まれるがこれらに限定されない。
【０２１７】
いくつかの態様において、薬物送達システムは、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)システムである。そのようなシステムは文献、例えば米国特許第6,183,781号および第5,654,008号に記載されている。
【０２１８】
これらの態様のいくつかにおいて、デポー剤は、非ポリマーの非水溶性液体担体材料、例えば、ショ糖アセテートイソブチレート（SAIB）、または米国特許第5,968,542号および第5,747,058号に記述の化合物のようなもう一つの化合物等の高粘度液体である。例えばSABER(商標)システム（サザンバイオシステムズインク（Southern Biosystems, Inc））を用いる。
【０２１９】
放出改変薬および/または添加剤をデポーマトリクスに含めることができる。本明細書において用いられる「放出改変剤」は、ポリマー/薬物マトリクスに組み入れられると、マトリクスの薬物放出特性を改変する材料を指す。放出改変剤は、例えば、マトリクスからの薬物放出速度を減少または増加させることができる。放出改変剤の一つの群には金属含有塩が含まれる。
【０２２０】
一つのカテゴリーの添加剤には、生分解性のポリマーおよびオリゴマーが含まれる。ポリマーは、送達される物質の放出プロフィールを変化させるために、組成物に完全性を加えるために、またはそうでなければ組成物の特性を改変するために用いることができる。適した生分解性のポリマーおよびオリゴマーの非制限的な例には、ポリ(ラクチド)、ポリ(ラクチド-コグリコリド)、ポリ(グリコリド)、ポリ(カプロラクトン)、ポリアミド、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリ(フォスファジン)、ポリ(ホスホエステル)、ポリエステルアミド、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、分解性ポリウレタン、ポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバレレート、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ(リンゴ酸)、キチン、キトサン、およびコポリマー、ターポリマー、酸化セルロース、または上記の材料の組み合わせもしくは混合物が含まれる。
【０２２１】
ポリ(α-ヒドロキシ酸)の例には、ポリ(グリコール酸)、ポリ(DL-乳酸)およびポリ(L-乳酸)、ならびにそのコポリマーが含まれる。ポリラクトンの例には、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリ(δ-バレロラクトン)およびポリ(γ-ブチルラクトン)が含まれる。
【０２２２】
他の添加剤には、非生分解性のポリマーが含まれる。添加剤として用いることができる非腐食性ポリマーの非制限的な例には、ポリアクリレート、エチレン-酢酸ビニルポリマー、セルロースおよびセルロース誘導体、アシル置換セルロースアセテートおよびその誘導体、非腐食性ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ(ビニルイミダゾール)、クロロスルホン化ポリオレフィンおよびポリエチレンオキサイドが含まれる。
【０２２３】
本発明の組成物において用いることができるさらなるクラスの添加剤は、天然および合成油ならびに脂肪である。動物またはナッツ植物種子に由来する油には、典型的に、脂肪酸、主にオレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノレン酸のグリセリドが含まれる。
【０２２４】
他の添加剤には、被膜特性改変剤および放出制御剤が含まれる。被膜特性改変剤の例には、可塑剤、例えばクエン酸トリエチル、トリアセチン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキサイド等が含まれる。放出制御剤の例には、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等）、有機塩基（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、リドカイン、テトラカイン等）、無機酸（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム）、有機酸（例えば、クエン酸、乳酸、グリコール酸、アスコルビン酸等）、および放出の際にコーティングに孔を形成する固体可溶性物質（例えば、塩化ナトリウム結晶、グルコース、マンニトール、ショ糖等）が含まれる。
【０２２５】
いくつかの態様において、薬物送達システムは、米国特許第6,201,071号；第6,117,949号；および第6,004,573号に記述されるように、ポリエチレングリコール-ポリ(乳酸コグリコール)酸（PEG-PLGA）に基づく水溶性注射用熱感受性ゲルである。例えば、デポー剤は、水溶性の生分解性のABA型またはBAB型のトリブロックポリマーを含むことができ、これは生分解性のポリエステルで構成される疎水性のAポリマーブロックの主要な量と、親水性のPEG Bポリマーブロックの少量とで構成され、全体的な平均分子量は約2000〜4999であり、逆熱ゲル化特性を有する。そのような材料は、体内でゲルデポー剤を形成して、そこから薬剤が一定速度で放出される。
【０２２６】
いくつかの態様において、薬物送達システムは、例えば米国特許第6,071,538号；第6,245,359号；第6,221,367号；および第6,099,856号に記述されるように、ポリアミノ酸に基づくシステムである。
【０２２７】
他の態様において、薬物送達システムはミクロスフェアである。ミクロスフェアは文献に十分に記述されている。
【０２２８】
もう一つの態様において、薬物送達システムはポンプ、例えば埋め込み型ポンプ、特に調節可能な埋め込み型ポンプである。調節型ポンプ、特に送達位置に存在しながら調節可能なポンプ（例えば、患者の体外から外部調節可能な）が特に重要である。そのようなポンプには、治療的に有効となるAUC IFN-α血清濃度を得るために、IFN-αまたは他の抗ウイルス剤の高濃度を長時間、例えば24〜72時間にわたって提供することができるプログラム可能なポンプが含まれる。
【０２２９】
いくつかの態様において、送達装置はMedipad(登録商標)装置（エランファームインターナショナル（Elan Pharm Int'l., Ltd））である、
【０２３０】
機械的または電気機械的注入ポンプも同様に、本発明によって用いるために適格となりうる。そのような装置の例には、例えば、米国特許第4,692,147号；第4,360,019号；第4,487,603号；第4,360,019号；第4,725,852号等に記述される装置が含まれる。一般的に、本発明の薬物送達法は、多様な任意の再充填可能なポンプシステムを用いて行うことができる。ポンプは経時的に一定で制御された放出を提供する。
【０２３１】
一つの態様において、薬物送達システムは、少なくとも部分的に埋め込み可能な装置である。埋め込み可能な装置は、当技術分野で周知の方法および装置を用いて任意の適した埋め込み部位に埋め込むことができる。埋め込み部位は、薬物送達装置が導入されて配置される被験者の体内の部位である。埋め込み部位には、皮下、皮下、筋肉内、または被験者の体内の他の適した部位が含まれるが必ずしもそれらに限定されない。薬物送達装置の埋め込みおよび除去の簡便さから、皮下埋め込み部位が一般的に好ましい。
【０２３２】
先に述べたように、送達システムの併用を用いることができる。一つの非制限的な例として、初回薬物放出または大量放出特徴を有するPLGAに基づくシステムを、大量に薬物を放出しないショ糖アセテートイソブチレートに基づくシステムと組み合わせてもよい。もう一つの非制限的な例として、ボーラス投与後にゼロ次数スループットを行うような負荷量が装置システムによって実現または得られる。送達分子は、これら全ての送達システムについて、αインターフェロンまたはPEG誘導体化αインターフェロンであってもよい。
【０２３３】
薬物送達システムに応じて、IFN-αは、経口、皮下、筋肉内、非経口、または経皮、皮膚等のような他の経路で投与することができる。例えば薬物が経口送達として門脈循環に入り、所望の臓器に薬物をターゲティングするために有用である場合を例外として、そのような経路、例えば経口によって投与する場合には、薬物の大量放出が起こりうる。
【０２３４】
多くの態様において、IFN-αは皮下送達される。
【０２３５】
IFN-αは、薬学的に許容される賦形剤との製剤として個体に投与される。広く多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で既知であり、本明細書において詳細に説明する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A.Gennaro（2000）、「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、リッピンコット、ウィリアムス＆ウィルキンス；「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems」（1999）H.C.Anselら編、第7版、リッピンコット、ウィリアムス＆ウィルキンス；および「Handbook of Pharmaceutical Excipients」（2000）、A.H. Kibbeら編、第3版、全米製薬協会を含む、多様な出版物において十分に記述されている。
【０２３６】
IFN-αは、一つまたはそれ以上のさらなる治療物質と共に（すなわち、異なる剤形で同時に；同じ剤形で同時に；異なる剤形で約48時間以内、約36時間以内、約24時間以内、約16時間以内、約12時間以内、約8時間以内、約4時間以内、約2時間以内、約1時間以内、約30分以内、または約15分以内もしくはそれ未満で投与する）投与することができる。
【０２３７】
他の態様において、患者は、IFN-αとリバビリンとの併用によって治療される。ICNファーマシューティカルズインク（コスタメサ、カリフォルニア州）から販売されているリバビリン、1-β-D-リボフラノシル-1H-1,2,4-トリアゾール-3-カルボキサミドは、メルクインデックス第11版において化合物番号8199として記述されている。その製造および処方は米国特許第4,211,771号に記述されている。リバビリンは、IFN-αの投与に関連してカプセルまたは錠剤型で経口投与してもよい。当然のこととして、双方の薬剤に関して、鼻腔スプレー、経皮、静脈内、坐剤、徐放性投与剤形のような他のタイプの投与が利用できればそれらも企図される。活性成分を破壊することなく適当な用量が送達される限り、如何なる投与剤形も有効である。投与する場合、リバビリンは、約400 mg〜約1200 mg、約600 mg〜約1000 mg、または約700 mg〜約900 mg/日の範囲の量で投与される。
【０２３８】
いくつかの態様において、併用治療はIFN-αとIFN-γとを含む。これらの態様のいくつかにおいて、IFN-αおよびIFN-γは、同じ製剤で投与され、同時に投与される。他の態様において、IFN-αおよびIFN-γは、個別に、例えば異なる製剤で投与される。これらの態様のいくつかにおいて、IFN-αおよびIFN-γは、個々に同時投与される。他の態様において、IFN-αおよびIFN-γは、個々に、そして互いに約5秒〜約15秒以内、約15秒〜約30秒以内、約30秒〜約60秒以内、約1分〜約5分以内、約5分〜約15分以内、約15分〜約30分以内、約30分〜約60分以内、約1時間〜約2時間以内、約2時間〜約6時間以内、約6時間〜約12時間以内、約12時間〜約24時間以内、または約24時間〜約48時間以内に投与される。
【０２３９】
治療の有効性の決定
本発明の方法が肝炎ウイルス感染症、特にHCV感染症を治療するために有効であるか否かは、ウイルス量を測定することによって、肝線維症を含むがこれらに限定されないHCV感染症に関連したパラメータを測定することによって、決定することができる。
【０２４０】
ウイルス量は、血清中のウイルス力価またはレベルを測定することによって測定することができる。これらの方法には、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および分岐DNA（bDNA）試験が含まれるがこれらに限定されない。例えば、HCV RNAのウイルス量（力価）を測定するための定量的アッセイ法が開発されている。定量的逆転写PCR（RT-PCR）（Amplicor HCV Monitor(商標)、ロシュモレキュラーシステムズ（Roche Molecular Systems）、ニュージャージー州）；および分岐DNA（デオキシリボ核酸）シグナル増幅アッセイ法（Quantiplex(商標)HCV RNAアッセイ法（bDNA）、カイロンコーポレーション（Chiron Corp.）、エメリービル、カリフォルニア州）を含む、多くのそのようなアッセイ法が市販されている。例えば、Gretchら（1995）、Ann. Intern. Med. 123：321〜329を参照されたい。
【０２４１】
先に述べたように、本発明の方法が肝炎ウイルス感染症、例えばHCV感染症を治療するために有効であるか否かは、肝線維症のような肝炎ウイルス感染症に関連したパラメータを測定することによって決定することができる。肝線維症の減少は、肝生検試料を分析することによって決定される。肝生検の分析は、二つの主要な成分、すなわち重症度および現行の疾患活動度の測定としての「等級」によって評価した壊死炎症と線維症病変、ならびに長期疾患進行の反映としての「進行期（stage）」によって評価した肝実質または血管再形成の評価を含む。例えば、Brunt（2000）Hepatol. 31：241〜246；およびMETAVIR（1994）Hepatology 20：15〜20を参照されたい。肝生検の分析に基づき、スコアを割付する。線維症の程度および重症度の定量的評価を提供する多くの標準化採点システムが存在する。これらには、METAVIR、ノデル（Knodell）、シャウア（Scheuer）、ルドウィグ（Ludwig）、およびイシャク（Ishak）採点システムが含まれる。
【０２４２】
肝線維症の血清マーカーも同様に、本発明の治療法の有効性の指標として測定することができる。肝線維症の血清マーカーには、ヒアルロネート、N末端プロコラーゲンIIIペプチド、IV型コラーゲンの7Sドメイン、C末端プロコラーゲンIペプチド、およびラミニンが含まれるがこれらに限定されない。肝線維症のさらなる生化学マーカーには、α-2-マクログロブリン、ハプトグロビン、γグロブリン、アポリポタンパク質A、およびγグルタミルトランスペプチダーゼが含まれる。
【０２４３】
一つの非制限的な例として、標準的なアッセイ法を用いて血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベルを測定する。一般的に、約45国際単位/ml血清未満のALTレベルが、正常であると見なされる。いくつかの態様において、IFN-αの有効量は、ALTレベルを約45 IU/ml血清未満に減少させるために有効な量である。
【０２４４】
肝線維症を治療する方法
本発明は、肝線維症を治療する方法を提供する。方法は、ウイルス量が個体において減少し、肝線維症が治療される、上記のように抗ウイルス剤を投与することを含む。肝線維症の治療には、肝線維症が起こるリスクを減少させること、肝線維症に関連した症状を減少させること、および肝機能を増加することが含まれる。
【０２４５】
本明細書に記述の抗ウイルス剤による治療が肝線維症の減少に有効であるか否かは、肝線維症および肝機能を測定するために十分に確立された多数の任意の技術によって決定される。肝線維症の減少は、肝生検試料を分析することによって決定される。肝生検の分析は、二つの主要な成分、すなわち重症度および現行の疾患活動度の測定としての「等級」によって評価した壊死炎症と線維症病変、ならびに長期疾患進行の反映としての「進行期」によって評価した肝実質または血管再形成の評価を含む。例えば、Brunt（2000）Hepatol. 31：241〜246；およびMETAVIR（1994）Hepatology 20：15〜20を参照されたい。肝生検の分析に基づき、スコアを割付する。線維症の程度および重症度の定量的評価を提供する多くの標準化採点システムが存在する。これらには、METAVIR、ノデル、シャウア、ルドウィグ、およびイシャク採点システムが含まれる。
【０２４６】
METAVIR採点システムは、線維症（門脈線維症、中心葉線維症、および硬変）；壊死（断片および葉の壊死、好酸性陥没、および風船状変性）；炎症（門脈炎症、門脈リンパ様凝集物、および門脈炎症の散布）；胆管の変化；およびノデル指数（門脈周囲壊死、葉壊死、門脈炎症、線維症、および全体的な疾患活動度のスコア）を含む、肝生検の様々な特徴の分析に基づく。METAVIRシステムにおけるそれぞれの進行期の定義は、以下の通りである：スコア0、線維症なし；スコア1、隔膜形成を伴わない門脈の放射状肥大；スコア2、まれに隔膜形成を伴う門脈の肥大；スコア3、硬変を伴わない多数の隔膜；およびスコア4、硬変。
【０２４７】
ノデル採点システムは、肝炎活動度指数とも呼ばれ、四つの組織学的特徴のスコアに基づいて標本を分類する：I、門脈周囲および/またはまたがる壊死；II、葉内変性および巣状壊死；III、門脈炎症；およびIV、線維症。ノデル進行期分類システムでは、スコアは以下の通りである：スコア0、線維症なし；スコア1、軽度の線維症（線維様門脈膨張）；スコア2、中等度の線維症；スコア3、重度の線維症（またがる線維症）；およびスコア4、硬変。スコアが高くなれば、肝組織の損傷はより重度となる。Knodell（1981）Hepatol. 1：431。
【０２４８】
シャウア採点システムのスコアは以下の通りである：スコア0、線維症なし；スコア1、肥大した線維症門脈；スコア2、構築は無傷である門脈周囲または門脈-門脈隔膜；スコア3、明白な硬変を認めないが構築が歪んでいる線維症；スコア4、可能性があるまたは明白な硬変。Scheuer（1991）J. Hepatol. 13：372。
【０２４９】
イシャク採点システムは、Ishak（1995）J. Hepatol. 22：696〜699に記載される。ステージ0、線維症なし；ステージ1、短い線維様隔膜を伴うまたは伴わないいくつかの門脈領域の線維様膨張；ステージ2、短い線維様隔膜を伴うまたは伴わないほとんどの門脈領域の線維様膨張；ステージ3、時に門脈-門脈（P-P）架橋を伴うほとんどの門脈領域の線維様膨張；ステージ4、顕著な架橋（P-P）と共に門脈-中心（P-C）を伴う門脈領域の線維様膨張；ステージ5、時に結節（不完全な硬変）を伴う顕著な架橋（P-Pおよび/またはP-C）；ステージ6、可能性があるまたは明白な硬変。抗線維症治療の利益も同様に、ビリルビン血清レベル、アルブミン血清レベル、プロトロンビン時間の異常、腹水の有無および重症度、ならびに脳症の存在および重症度に基づく多成分ポイントシステムを含むチャイルド・プー（Child-Pugh）採点システムを用いて測定および評価することができる。これらのパラメータの異常の有無および重症度に基づいて、患者を臨床疾患の重症度が増加する順に三つのカテゴリーの一つに分類してもよい：A、BまたはC。
【０２５０】
いくつかの態様において、抗ウイルス剤の治療的有効量は、治療前および治療後の肝生検に基づく線維症進行期において1単位またはそれ以上の変化を引き起こす抗ウイルス剤の量である。特定の態様において、IFN-αとIFN-γの治療的有効量は、METAVIR、ノデル、シャウア、ルドウィグ、またはイシャク採点システムにおいて肝線維症を少なくとも1単位減少させる。
【０２５１】
次に、または間接的に、肝機能指数も同様に用いて、治療の有効性を評価することができる。コラーゲンの特異的染色および/または肝線維症の血清マーカーに基づく肝線維症の定量的程度の形態測定コンピューター化半自動測定も同様に、本発明の治療法の有効性の指標として測定することができる。肝機能の二次指数には、トランスアミナーゼ血清レベル、プロトロンビン時間、ビリルビン、血小板数、門脈血圧、アルブミンレベル、およびチャイルド・プースコアの評価が含まれるがこれらに限定されない。抗ウイルス剤の有効量は、無処置の個体またはプラセボ処置個体における肝機能の指数と比較して、肝機能指数を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、または少なくとも約80％またはそれ以上増加させるために有効な量である。当業者は、その多くが市販されており、臨床の状況で日常的に用いられる標準的なアッセイ法を用いて、肝機能のそのような指標を容易に測定することができる。
【０２５２】
肝線維症の血清マーカーも同様に、本発明の治療法の有効性の指標として測定することができる。肝線維症の血清マーカーには、ヒアルロネート、N末端プロコラーゲンIIIペプチド、IV型コラーゲンの7Sドメイン、C末端プロコラーゲンIペプチド、およびラミニンが含まれるがこれらに限定されない。肝線維症のさらなる生化学マーカーには、α-2-マクログロブリン、ハプトグロビン、γグロブリン、アポリポタンパク質A、およびγグルタミルトランスペプチダーゼが含まれる。
【０２５３】
抗ウイルス剤の治療的有効量は、無処置の個体またはプラセボ処置個体におけるマーカーレベルと比較して、肝線維症の血清マーカーレベルを少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、または少なくとも約80％またはそれ以上低下させるために有効な量である。当業者は、その多くが市販されており、臨床の状況で日常的に用いられる標準的なアッセイ法を用いて、肝線維症のそのような血清マーカーを容易に測定することができる。血清マーカーを測定する方法には、免疫学に基づく方法、例えば、所定の血清マーカーに対して特異的な抗体を用いる酵素結合イムノソルベントアッセイ法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ法等が含まれる。
【０２５４】
機能的肝貯蔵の定量的試験も同様に用いて、抗ウイルス剤による治療の有効性を評価することができる。これらには、インドシアニングリーンクリアランス（ICG）、ガラクトース排泄能（GEC）、アミノピリン呼吸試験（ABT）、アンチピリンクリアランス、モノエチルグリシン-キシリジド（MEG-X）クリアランス、およびカフェインクリアランスが含まれる。
【０２５５】
本明細書において用いられるように、「肝臓の硬変に関連した合併症」とは、非代償性肝疾患の続発症である、すなわち肝線維症の発症の後におよびその結果として起こる障害を指し、これには、腹水の発生、静脈瘤出血、門脈高血圧症、黄疸、進行性肝不全、脳症、肝細胞癌、肝臓移植を必要とする肝不全、および肝臓関連死が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５６】
抗ウイルス剤の治療的有効量は、無処置の個体またはプラセボ処置個体と比較して、肝硬変に関連した障害の発生率（例えば、個体が発症する確率）を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、または少なくとも約80％またはそれ以上減少させるために有効な量である。
【０２５７】
抗ウイルス剤による治療が、肝硬変に関連した障害の発生を減少させるために有効であるか否かは、当業者によって容易に決定することができる。
【０２５８】
肝線維症が減少すれば肝機能は増加する。このように、本発明は、一般的に、抗ウイルス剤の治療的有効量を投与することを含む、肝機能を増加させる方法を提供する。肝機能には、血清タンパク質（例えば、アルブミン、凝固因子、アルカリホスファターゼ、アミノトランスフェラーゼ（例えば、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ）、5'-ヌクレオシダーゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ等）のようなタンパク質の合成、ビリルビンの合成、コレステロールの合成、および胆汁酸の合成；糖質代謝、アミノ酸およびアンモニア代謝、ホルモン代謝、ならびに脂質代謝を含むがこれらに限定されない肝代謝機能；外因性薬剤の解毒化；内臓および門脈血行力学を含む血行力学機能等が含まれるがこれらに限定されない。
【０２５９】
肝機能が増加したか否かは、十分に確立された肝機能試験を用いて、当業者によって容易に確認することができる。このように、アルブミン、アルカリホスファターゼ、アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、ビリルビン等のような肝機能マーカーの合成は、標準的な免疫学および酵素アッセイ法を用いて、血清中のこれらのマーカーのレベルを測定することによって評価することができる。内臓および門脈血行力学は、標準的な方法を用いて門脈楔入圧および/または抵抗によって測定することができる。代謝機能は血清中のアンモニアレベルを測定することによって測定することができる。
【０２６０】
肝臓によって通常分泌される血清タンパク質が正常範囲であるか否かは、標準的な免疫および酵素アッセイ法を用いて、そのようなタンパク質レベルを測定することによって決定することができる。当業者はそのような血清タンパク質の正常範囲を知っている。以下は非制限的な例である。アラニントランスアミナーゼの正常範囲は、約7〜約56単位/L血清である。アスパラギン酸トランスアミナーゼの正常範囲は、約5〜約40単位/ml血清である。ビリルビンは標準的なアッセイ法を用いて測定する。正常なビリルビンレベルは通常、約1.2 mg/dL未満である。アルブミン血清レベルは標準的なアッセイ法を用いて測定する。血清アルブミンの正常レベルは約35〜約55 g/Lの範囲である。プロトロンビン時間の延長は標準的なアッセイ法を用いて測定する。正常なプロトロンビン時間は対照より約4秒未満長い。
【０２６１】
抗ウイルス剤の治療的有効量は、肝機能を少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％またはそれ以上増加させるために有効な量である。例えば、抗ウイルス剤の治療的有効量は、上昇した肝機能の血清マーカーレベルを少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％もしくはそれ以上低下させるために、または肝機能の血清マーカーレベルを正常範囲内まで減少させるために有効な量である。IFN-γの治療的有効量も同様に、低下した肝機能の血清マーカーレベルを少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％もしくはそれ以上増加させるために、または肝機能の血清マーカーレベルを正常範囲内まで増加させるために有効な量である。
【０２６２】
肝臓癌のリスクを低下させる方法
本発明は、個人が肝臓癌を発症するリスクを低下させる方法を提供する。方法は、ウイルス量が個体において減少し、個体が肝臓癌を発症するリスクを低下させる、上記のように抗ウイルス剤を投与することを含む。抗ウイルス剤の有効量は、肝臓癌のリスクを少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％またはそれ以上低下させる量である。肝臓癌のリスクが低下するか否かは、例えば試験群において決定することができ、本発明の方法に従って治療される個体は肝臓癌の発生率が低下する。
【０２６３】
治療に適した被験者
肝炎ウイルス（例えば、HAV、HBV、HCV、δ等）、特にHCVに感染したと臨床診断された個体は、本発明の方法による治療に適している。HCVに感染した個体は、その血液中にHSV RNAを有する、および/または血清中に抗HCV抗体を有すると同定される。そのような個体には、無処置の個体（例えば、これまでHCVによって治療されていない個体、特にこれまでIFN-αに基づくまたはリバビリンに基づく療法を受けていない個体）およびHCVのこれまでの治療が失敗した個体（「治療失敗」患者）が含まれる。治療失敗患者には、非反応者（例えば、HCV力価がHCVのこれまでの治療、特に単一型のIFN-αを用いたこれまでのIFN-α単一療法、によって有意にまたは十分に減少しなかった個体）および再発者（例えば、HCVに関してこれまで治療して（特に単一型のIFN-αを用いたこれまでのIFN-α単一療法で）、HCV力価が有意に減少したがその後増加した個体）が含まれる。対象となる特定の態様において、個体はHCV力価が少なくとも約105、少なくとも約5×105、または少なくとも約106 HCVゲノムコピー/ml血清を有する。患者はいかなるHCV遺伝子型（1aおよび1bを含む遺伝子型1、2、3、4、6等、ならびにサブタイプ（2a、2b、3a等））に感染していてもよく、特に治療の困難な、HCV遺伝子型1、とりわけHCVのサブタイプおよび疑似種のような遺伝子型に感染していてもよい。
【０２６４】
実施例
以下の実施例は、本発明を作製して用いる方法に関する完全な開示および記述を当業者に提供するために述べるのであって、本発明者らが本発明であると見なした範囲を制限すると解釈されず、下記の実験が、実施される全てまたは唯一の実験であると表すことを意図していない。用いた数字（例えば、量、温度等）に関しては正確さを保証するように努力したが、何らかの実験誤差および偏差は容赦されたい。特に明記していなければ、容積は重量での容積であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、気圧は大気圧またはほぼ大気圧である。
【０２６５】
実施例1：コンセンサスインターフェロンαcon-1のC末端PEG化
CIFNαcon-1を、適した緩衝液系、pH 4.7〜6.0の100 mMモルフォリノエタンスルホン酸（MES）、またはpH 6.0〜7.4の100 mM塩化ナトリウムを含む10 mMリン酸ナトリウムのいずれかにおいて1〜10 mg/mlの濃度で溶解する。カップリング分子、すなわちPEG-NH2（直鎖または分岐；分子量20〜40 kDa）をCIFNと同じ緩衝液に溶解して、PEG-NH2の濃度がタンパク質のモル濃度の10倍のままとなるようにタンパク質溶液に加える。この比は、産物の分析後変更することができる（モノPEG化対多PEG化）。同じ緩衝液または水におけるカルボジイミド試薬（EDAC）の高濃度保存液を最終濃度0.5〜1.0 Mとなるように調製する。この保存液の十分量を、PEG試薬対EDACの比がモル比で1：1となるように反応容器に加える。反応混合物を磁石攪拌子によって攪拌して、反応を室温（約17℃）で1〜6時間進行させる。反応はサイズ排除HPLCおよびモル化学量論によってモニターしてもよく、反応温度は、モノPEG化誘導体の形成を最適にするように調節してもよい。
【０２６６】
次に、反応混合物をゲル濾過またはディアフィルトレーション（diafiltration）によって精製して、過剰量の試薬およびそれらに由来する産物を除去する。反応混合物に何らかの混濁が認められれば、産物をさらに濾過してから精製を行い、内容物を分析する。濾液をまず、ディアフィルトレーションまたはゲル濾過によって精製する。HPLC法を用いると正確な結果が得られる。産物は、最後に質量分析、タンパク質配列、ペプチドマッピングおよび他の技術を用いて特徴を調べる。材料の生物活性は、細胞変性保護作用阻害アッセイ法によって確認する。
【０２６７】
精製モノPEG化産物は、100 mM塩化ナトリウムおよび0.01〜0.1％（w/v）ポリソルベート20または80を含む10 mMリン酸ナトリウム中にPEG化インターフェロンα40〜400 μg/mlを含むように調製される。
【０２６８】
検出可能なHCV RNAレベルおよび血清中アラニンアミノトランスフェラーゼレベルの上昇および疾患と一致した肝組織病理によって示される慢性C型肝炎感染症の成人（〜70 kg体重）に、適当な水性緩衝液（注射容量0.5〜1.0 ml）において供給されたPEG化インターフェロン製剤32.5μg、65μg、97.5μg、および130 μgを週に1回48週間のあいだ皮下投与する。血清試料を患者から1ヶ月に1回採取して、RNA PCR定量に基づいて治療の有効性を分析する。アッセイのモニタリングは、治療中止後24週間継続する。72週目での持続的なウイルス反応は、血液中にHCV RNAレベルが検出されないことおよび血清ALTレベルが正常であることに基づいて評価する。
【０２６９】
本発明は、その特定の態様を参照して説明してきたが、様々な変更を行ってもよく、同等物を置換してもよく、それらも本発明の真の趣旨および範囲に含まれることは当業者に理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、対象組成物、プロセス、プロセスの段階または複数の段階を本発明の目的、趣旨および範囲に適合させるために、多くの改変を行ってもよい。そのような改変は全て、添付の請求の範囲内であると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】ポリメラーゼ連鎖反応のような感度のよい測定を用いて、血清中のウイルスRNAレベルによってモニターした血液中のHCVウイルスのクリアランスとして、本明細書に示したインターフェロンα療法のあいだのウイルス動態を示すグラフである。
【図２】徐放性注射（CRI）システムまたはゼロ次数スループットシステムおよびボーラスの投与のあいだのIFN-α血清濃度のプロフィールを示すグラフである。通常のTIW投与計画後のウイルス動態が含まれる。
【図３】本発明による第1型のIFN-αおよび第2型のIFN-αを投与後の、IFN-α血清濃度の薬物動態プロフィールを例示するグラフである。
【図４】本発明による第1型のIFN-αおよび第2型のIFN-αを投与後の、IFN-α血清濃度の薬物動態プロフィールを例示するグラフである。
【図５】本発明による第1型のIFN-αおよび第2型のIFN-αを投与後の、IFN-α血清濃度の薬物動態プロフィールを例示するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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