(57)【要約】  設計抗体および／または設計抗体断片を作製および選択する方法は、所定の標的に対する最大化された結合親和性、およびこのような抗体が標的種に適用された場合の最小化された免疫原性を提供する。設計抗体の改変体を含むライブラリーもまた、提供される。特定の有用な実施形態においては、種々の癌の処置において有用である、抗ＰＤＧＦ抗体および組成物が生成される。一つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域、および少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域を含む、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法であって、該方法は、以下：
標的に対し特異性を有する抗体のパネルを提供する工程であって、該抗体のパネルは第一種由来の複数の抗体メンバーを含む、工程；
該抗体のパネルの第一メンバーの少なくとも一部の配列を決定する工程；
該パネルの該第一メンバーの配列を、標的種由来の抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーと比較する工程であって、該標的種は該第一種とは異なっている、工程；
該パネルの該第一メンバーの配列と高い相同性を示し、かつＦＲ３領域を含む、少なくとも一つの配列を、該参照ライブラリーの第一メンバーから選択する工程；
該パネルの該第一メンバーからＣＤＲ３領域を得る工程；および
該パネルの該第一メンバー由来の該ＣＤＲ３領域を、該参照ライブラリーの該第一メンバー由来の該少なくとも一つの配列の該ＦＲ３領域に隣接して組み入れることで、設計抗体または設計抗体断片を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法であって、該方法は、以下：
前記パネルの前記第一メンバーの配列を、抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーと比較する工程；
少なくともＦＲ４配列を、該参照ライブラリーの第二メンバーから選択する工程；および
該ＦＲ４配列を、該設計抗体または設計抗体断片に、該パネルの該第一メンバー由来の前記ＣＤＲ３領域に隣接して組み入れる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３】
前記パネルのメンバー由来のＣＤＲ１領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項３に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項５】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項３に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項６】
前記パネルの第二メンバー由来のＣＤＲ１領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項７】
前記パネルの前記メンバーの一つ以上に由来するＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項８】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項７に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項９】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項７に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１０】
前記パネルの第二メンバー由来のＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１１】
前記パネルの前記メンバーの一つ以上に由来するＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のそれぞれがかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１２】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１３】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１４】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１５】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１６】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域、前記ＣＤＲ２領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルのそれぞれ異なったメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１７】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域、前記ＣＤＲ２領域および前記ＣＤＲ１領域のすべてが、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１８】
前記パネルの一つ以上のメンバー由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域を、それぞれ前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含し、組み込まれた該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のうち少なくとも一つが該パネルの第二メンバー由来である、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１９】
前記標的がＰＤＧＦである、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項２０】
前記抗体断片がｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、二重特異性抗体、抗体軽鎖、および抗体重鎖からなる群から選択される、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項２１】
前記標的種がヒトである、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項２２】
前記参照ライブラリーがヒト再編成抗体配列を含む、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法に従って、複数の設計抗体または設計抗体断片を調製する工程を包含する、設計抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項２４】
前記ライブラリーが、設計抗体または設計抗体断片の改変体をさらに含み、該設計抗体または設計抗体断片の改変体が、前記パネルの前記メンバーの前記配列、前記参照ライブラリーの前記第一メンバーの前記配列からなる群より選択される一つ以上の配列に由来する、ＶＨ／ＶＬ境界および／またはベルニエ領域におけるアミノ酸の組み合わせを含む、請求項２３に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項２５】
設計抗体または設計抗体断片を提示するファージミドライブラリーまたはファージライブラリーを生成する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項２６】
前記ファージミドライブラリーまたは前記ファージライブラリーを前記標的に対する活性についてパニングし、該標的に優先的に結合するファージ粒子またはファージミド粒子を単離する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項２７】
抗体または抗体断片を選ぶための方法であって、該方法は、以下：
請求項１に記載の方法に従って複数の設計抗体を調製する工程；
標的に対する複数の抗体の結合親和性を決定する工程；および
結合親和性に基づき、前記ライブラリーから抗体を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の抗体または抗体断片を選ぶための方法であって、該方法は、以下：
前記複数抗体の免疫原性を決定する工程；および
結合親和性および免疫原性に基づき、抗体を選択する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２９】
設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法であって、該方法は、以下：
標的に対する特異性を有する抗体のパネルを提供する工程であって、該抗体のパネルは、第一種由来の複数の抗体メンバーを含む、工程；
該標的に関して望ましい結合特性を有する該パネルの第一メンバーを選択する工程；
該抗体のパネルの複数メンバーの少なくとも一部の配列を決定し、該複数メンバーのコンセンサス配列を決定する工程；
該コンセンサス配列を標的種由来の抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーと比較する工程であって、該標的種は、該第一種と異なっている、工程；
該参照ライブラリーの第一メンバーから、該コンセンサス配列と高度の相同性を示し、かつ、ＦＲ３領域を含む、少なくとも一つの配列を選択する工程；
該パネルの該第一メンバーからＣＤＲ３領域を得る工程；および
該パネルの該第一メンバー由来の該ＣＤＲ３領域を、該ライブラリーの該第一メンバー由来の該少なくとも一つの配列の該ＦＲ３領域に隣接して組み入れ、設計抗体または設計抗体断片を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法であって、該方法は、以下：
前記コンセンサス配列を、抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーと比較する工程；
該参照ライブラリーの第二メンバーから、少なくともＦＲ４配列を選択する工程；および
該ＦＲ４配列を、前記設計抗体または設計抗体断片に、前記パネルの前記第一メンバー由来の前記ＣＤＲ３領域に隣接して組み入れる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３１】
前記パネルのメンバー由来のＣＤＲ１領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法。
【請求項３２】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項３１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項３３】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項３１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項３４】
前記パネルの第二メンバー由来のＣＤＲ１領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法。
【請求項３５】
前記パネルの前記メンバーの一つ以上に由来するＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法。
【請求項３６】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項３５に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項３７】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項３５に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項３８】
前記パネルの第二メンバー由来のＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法。
【請求項３９】
前記パネルの前記メンバーの一つ以上由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のそれぞれがかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４０】
前記パネルの一つ以上のメンバー由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のそれぞれがかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含し、組み込まれた該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のうち少なくとも一つが該パネルの第二メンバー由来である、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４１】
前記標的がＰＤＧＦである、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４２】
前記抗体断片がｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、二重特異性抗体、抗体軽鎖、および抗体重鎖からなる群から選択される、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４３】
前記標的種がヒトである、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４４】
前記参照ライブラリーがヒト再編成抗体配列を含む、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４５】
請求項２９に記載の方法に従って、複数の設計抗体または設計抗体断片を調製する工程を包含する、設計抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項４６】
前記ライブラリーが、設計抗体または設計抗体断片の改変体をさらに含み、該設計抗体または設計抗体断片の改変体が、前記パネルの前記メンバーの前記配列、前記参照ライブラリーの前記メンバーの前記配列からなる群より選択された一つ以上の配列に由来する、ＶＨ／ＶＬ境界および／またはベルニエ領域におけるアミノ酸の組み合わせを含む、請求項４５に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項４７】
前記設計抗体または設計抗体断片を提示するファージミドライブラリーまたはファージライブラリーを生成する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項４８】
前記ファージミドライブラリーまたは前記ファージライブラリーを前記標的に対する活性についてパニングし、該標的に優先的に結合するファージ粒子またはファージミド粒子を単離する工程を包含する、請求項４５に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項４９】
抗体または抗体断片を選ぶための方法であって、該方法は、以下：
請求項２９に記載の方法に従って複数の設計抗体を調製する工程；
複数の抗体の結合親和性を決定する工程；および
結合親和性に基づき、抗体を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の抗体または抗体断片を選ぶための方法であって、該方法は、以下：
前記複数抗体の免疫原性を決定する工程；および
結合親和性および免疫原性に基づき、抗体を選択する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５１】
抗体または抗体断片を選択するための設計抗体または設計抗体断片の参照ライブラリーであって、該ライブラリーは、設計抗体または設計抗体断片の改変体を含み、該改変体は、標的種に対してネイティブな抗体由来のフレームワーク領域であって、該フレームワーク領域が所定の標的に対する特異性を有する第一抗体のフレームワーク領域と高度の相同性を示す、フレームワーク領域、所定の標的に対する特異性を有する該第一抗体由来のＣＤＲ３領域、該第一抗体または該標的種に対してネイティブな抗体のいずれかに由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域の組み合わせ、ならびにＶＨ／ＶＬ境界および／またはベルニエ領域におけるアミノ酸の組み合わせであって、該アミノ酸の組み合わせが該標的種にネイティブな抗体に存在するアミノ酸かつ該第一抗体に存在するアミノ酸に相当する、アミノ酸の組み合わせを有する、ライブラリー。
【請求項５２】
一つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域、および少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域を含む、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片。
【請求項５３】
生殖細胞系ヒト抗体配列および再編成ヒト抗体配列の双方の由来であるフレームワーク領域、および少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域を含む、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片。
【請求項５４】
一つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域、非ヒトＣＤＲ３、ならびに非ヒト抗体配列のコンセンサス由来であるＣＤＲ１またはＣＤＲ２のうち少なくとも一つを含む、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片。
【請求項５５】
ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片を提供する方法であって、一つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域を、少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域と合わせる工程を包含し、該フレームワーク領域が、以下：
（ｉ）標的に結合する非ヒト抗体のパネルからの複数メンバーについて、抗体コンセンサス配列を確立する工程；
（ｉｉ）該非ヒト抗体のパネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３を、該コンセンサス配列のＣＤＲ３の代わりに置き換え、複合配列を形成する工程；および
（ｉｉｉ）該複合配列をヒト抗体配列データベースと比較し、そして、該複合配列との相同性に基づき、少なくとも一つのヒト抗体配列を選択する工程、
によって選択されるヒト抗体配列由来である、方法。
【請求項５６】
ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片を提供する方法であって、一つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域を少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域と合わせる工程を包含し、該フレームワーク領域が、以下：
（ｉ）標的に結合する非ヒト抗体パネルからの複数メンバーについて、抗体コンセンサス配列を確立する工程；
（ｉｉ）該非ヒト抗体パネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３を、該コンセンサス配列のＣＤＲ３の代わりに置き換え、複合配列を形成する工程；
（ｉｉｉ）該複合配列の第一部分をヒト生殖細胞系抗体配列データベースと比較し、そして、該複合配列の該第一部分との相同性に基づき、少なくとも一つのヒト抗体配列を選択する工程；および
（ｉｖ）該複合配列の第二部分をヒト再編成抗体配列データベースと比較し、そして、該複合配列の該第二部分との相同性に基づき、少なくとも一つのヒト抗体配列を選択する工程、
によって選択される２つのヒト抗体配列由来である、方法。
【請求項５７】
標的配列に結合する非ヒト抗体のパネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３を含む設計複合抗体配列であって、該設計抗体配列の残余が、該非ヒト抗体パネルからの複数メンバーの抗体コンセンサス配列由来である、設計複合抗体配列。
【請求項５８】
非ヒトドナー抗体由来のＣＤＲ領域をヒトアクセプタ抗体由来のフレームワーク領域に組み入れる工程を包含する、ヒト化抗体を作製する方法における改良点であって、該改良点は、該ヒトアクセプタ抗体配列を、以下：
（ｉ）標的に結合する非ヒト抗体のパネルからの複数メンバーについて、抗体コンセンサス配列を確立する工程；
（ｉｉ）該ヒト抗体パネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３を、該コンセンサス配列のＣＤＲ３の代わりに置き換え、複合配列を形成する工程；および、
（ｉｉｉ）該複合配列をヒト抗体配列データベースと比較し、そして、該複合配列との相同性に基づき、少なくとも一つのヒトアクセプタ抗体配列を選択する工程、
によって選択する工程を包含する、改良点。
【請求項５９】
抗体Ｃ１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲ由来の少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体軽鎖。
【請求項６０】
抗体Ｃ１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲ由来の少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体重鎖。
【請求項６１】
腫瘍の処置方法であって、その必要のある被験体に有効量の抗ＰＤＧＦ抗体を投与する工程を包含する、方法。
【請求項６２】
前記腫瘍が、神経芽腫、感覚上皮腫、髄膜腫、ユーイング肉腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、カポージ肉腫、中皮腫および中皮腫細胞株、絨毛上皮腫、膵臓癌、胃癌、骨肉腫、食道癌、線維肉腫、原発性ヒト肺癌における悪性上皮細胞、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、傍神経節腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、ＮＯＳ肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、および子宮間質肉腫、乳癌、結腸直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性線維組織球腫、平滑筋細胞腫瘍、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗ＰＤＧＦ抗体が抗ＰＤＧＦ  ＢＢ抗体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗ＰＤＧＦ抗体が化学治療薬剤との組み合わせ治療で使用される、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、アメリカ合衆国仮特許出願第６０／３２３，５３７号（２００１年９月２０日出願）；同第６０／３２３，５４４号（２００１年９月２０日出願）；および同第６０／３７９，９９４号（２００２年５月１３日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本明細書は、抗体に関し、より具体的には、標的物質に選択的に結合し、異生物種内で低減された免疫原性を有する、一生物種由来の設計された抗体および抗体断片に関連する。より具体的には、抗ＰＤＧＦ抗体および設計抗ＰＤＧＦ抗体が提供される。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の背景）
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、元々は血小板α顆粒放出生産物として発見されたが、後に多数の異なるＰＤＧＦ分泌細胞型が同定された。ＰＤＧＦは、少なくとも２つの４同属鎖：ジスルフィド結合で結合するＡ、Ｂ、ＣおよびＤから構成された、ホモダイマーまたはヘテロダイマーのタンパク質である。ＰＤＧＦシグナルは、ＰＤＧＦＲ−αおよびＰＤＧＦＲ−βと呼ばれる２つの高親和性レセプター経由で仲介される。ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢは、両レセプターを通じでシグナル伝達し得るが、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＣＣは、αレセプターだけに結合し得、ＰＤＧＦ−ＤＤは、独占的にβレセプターに結合しシグナル伝達する。ＰＤＧＦは、有効な分裂促進剤、化学誘引物質および間葉細胞の生存因子として作用する。このＰＤＧＦは生理学的な修復機構にて決定的な役割を果たすが、種々の増殖性疾患の病因にも関与する。サル肉腫ウイルスのｖ−シス癌遺伝子が、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖遺伝子のレトロウイルスホモログであるという知見（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８３  Ｊｕｌｙ  １５；２２１（４６０７）：２７５−２７７，Ｄｅｕｅｌ  ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８３  Ｓｅｐｔ．３０；２２１（４６１８）：１３４８−１３５０）は、腫瘍形成におけるＰＤＧＦの役割を示唆した。
【０００４】
脳腫瘍発生におけるＰＤＧＦの関連の最初の証拠は、ｖ−シス運搬サル肉腫ウイルスの脳内注射はサルにおける脳腫瘍形成を誘導し得るという観察（Ｄｅｉｎｈａｒｄｔ  ら，（ｅｄ）Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ３５７−３９８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９８０）から結果として生じた。ＰＤＧＦレセプターを発現する細胞株だけが、ｖ−シスのトランスフェクションによりオートクライン型にて形質転換し得た。ＰＤＧＦ  ＢＢおよびＰＤＧＦ  ＤＤならびにこれらのレセプターの発現は、ヒトの神経芽腫、感覚上皮腫、髄膜腫、ユーイング肉腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、カポージ肉腫、中皮腫および中皮腫細胞株、絨毛上皮腫、膵臓癌、胃癌、骨肉腫、食道癌、線維肉腫、原発性ヒト肺癌における悪性上皮細胞、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、傍神経節腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、ＮＯＳ肉腫（ｓａｒｃｏｍａ  ＮＯＳ）、滑膜肉腫、軟骨肉腫、および子宮間質肉腫、乳癌、結腸直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性線維組織球腫、平滑筋細胞腫瘍、および前立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）癌において証明され、機能するオートクラインループおよびパラクラインループの存在を示唆した。
【０００５】
脳腫瘍細胞に関連する多数の研究が、ＰＤＧＦ阻害剤を用いて行われてきた。例えば、Ｃｈｉｎらは、阻害剤Ｋ２５２ａを神経膠腫細胞株Ｕ８７およびＴ９８Ｇと共に使用した（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｍａｙ；３（５）：７７１−７７６）。Ｋ２５２ａ処理は、ＰＤＧＦに応答してレセプターの自己リン酸化を遮断し、そしてその細胞株における増殖の減少を導く。さらに、Ｕ８７細胞において、アポトーシスが誘導される。
【０００６】
Ｊｏｈｎｓｏｎらは、ＰＤＧＦに対する抗体を使用し、サル肉腫ウイルスによる急性形質転換を阻害した（Ｎａｔｕｒｅ  １９８５  Ｏｃｔ．３；３１７（６０３６）：４３８−４４０）。線維芽細胞が、数日後に病巣が検出され得るようにＳＳＶ／ＳＳＡＶによって、形質転換させられた。抗ＰＤＧＦ抗体は、感染後早期（８〜１２日後）の病巣形成を抑制する。しかし２０日後には、抗ＰＤＧＦ抗体と対照抗体との間に、病巣の数における違いはなかった。
【０００７】
Ｔｏｄｏらは、抗ＰＤＧＦ血清を使用して、馴化培地によって刺激されるＤＮＡ合成を髄膜腫細胞において阻害した。このことは、髄膜腫細胞増殖におけるＰＤＧＦ−Ｂ関連分子の役割を示唆した（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  ８４（５）：８５２−８）。
【０００８】
２つのＰＤＧＦアンタゴニスト（トラピジルおよびスラミン）は、成長因子誘導性神経膠腫細胞増殖および成長因子誘導性髄膜腫細胞増殖を阻害することが証明されている。スラミンは、非特異的プリン作動性（ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ）レセプターアンタゴニストであり、ＥＧＦ、ＩＦＧ−１およびＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性の髄膜腫細胞増殖を４０〜７０％まで阻害する（Ｓｃｈｒｅｌｌ  ら，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １９９５  Ａｐｒｉｌ；８２（４）：６００−６０７）。トラピジルは、ＰＤＧＦ陽性細胞株を、ＰＤＧＦ陰性細胞株より特異的に阻害することが証明されている。しかし、両アンタゴニストはＰＤＧＦに特異的でなく、他のチロシンキナーゼレセプターにも作用する。他の種類のレセプターアンタゴニストとしては、選択的ＰＤＧＦレセプターリン酸化遮断薬およびドミナントネガティブレセプターがある。これらの治療は、正常な脳細胞にも影響し得るという不便性を有している。なぜなら、そのレセプターが、正常脳細胞並びに髄膜腫細胞にも存在するからである。
【０００９】
抗体は、脊椎動物において、Ｂ細胞として知られるリンパ球により、抗原による刺激に対する応答して産生されるタンパク質である。抗体（免疫グロブリン（Ｉｇ）としても知られる）分子の基本構造単位は、大文字の「Ｙ」の形で集まる４つのポリペプチド鎖からなる。この４鎖のうちの２鎖は、同一の軽鎖（Ｌ鎖）であり、２鎖は同一の重鎖（Ｈ鎖）である。５つの異った種類（アイソタイプ）の重鎖が存在し、これらが抗体を、５つのクラス（すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）に分ける。さらに、軽鎖には２つの異なるアイソタイプがあり、κおよびλと呼ばれる。それぞれのクラスの重鎖が、どちらの軽鎖とも結合し得る。重鎖および軽鎖は、それぞれ、抗原との結合に関わる可変領域（各々ＶＨおよびＶＬ）、および定常（Ｃ）領域を含む。抗原結合部分は、六つの超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）としても知られる）から構成される。重鎖の３つのＣＤＲおよび軽鎖の３つのＣＤＲは、４つの比較的保存されている逆並行βシート（フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）と呼ばれる）の間に、それぞれの鎖において、それぞれ位置している。慣習的に、番号付けの規則が、Ｖ重鎖およびＶ軽鎖のコンポーネント部分の位置を表すために利用されてきた。Ｋａｂａｔの定義は、配列の可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造ループ領域の位置に基づく。
【００１０】
抗体は、種々の疾患および症状の治療処置の継続的な探索において、熱い研究開発の対象となっている。これは、抗体の持つ、インビボで特異的な標的を探し出し結合する、天然能力に起因する。抗体を操作する能力は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒ  ら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７６））がマウス抗体を基に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生するハイブリドーマ技術を開発したときに、飛躍的に進歩した。この技術は、通常、マウスを抗原で免疫し、骨髄腫細胞にその免疫されたマウス由来の脾臓細胞を融合してハイブリドーマを生成する工程を包含する。標的抗原に特異的な一種類の抗体すなわちいわゆる「モノクローナル抗体」を分泌する個別の細胞が、ハイブリドーマから選択される。モノクローナル抗体は、種々の標的に対して生じさせられ得、そしてヒトに投与されることでかなりの治療または診断の効果を達成し得ると考えられた。残念なことに、多くの場合において、モノクローナル抗体は、外部由来物質であって、ヒト体内に通常に生じたものではないと、ヒト免疫系によって認識される。このことは、ヒトにおける免疫原性または抗原性と呼ばれる。この理由で、非ヒト起源の抗体がヒトに投与される場合、抗非ヒト抗体が産生される。この非ヒト抗体は、体内からのその非ヒト抗体のクリアランスの増加を生じ、これにより、治療効果または診断効果は、減少するかまたは完全に遮断される。過敏性反応もまた、起こり得る。結果として、多くの研究が、抗体の配列および構造を操作してそれらをよりヒトに似せさせ、それによって、ヒトの免疫原性を回避することに関わり、「ヒト化」として知られる遺伝子工学技術の発展を導いてきた。
【００１１】
最初のヒト化手法は、重鎖および軽鎖の可変ドメインは抗原との結合を担っており、そして定常ドメインはエフェクター機能を担っている、という知見に基づいていた。キメラ抗体は、例えば、げっ歯類ｍＡｂの可変ドメインの、ヒト抗体定常ドメインへの移植（例えば、  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ  ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，２６８−７０，１９８５，および  Ｔａｋｅｄａ  ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，４５２−４，１９８５）により、生成された。これらのキメラ抗体は、ヒトにおいて、よりよくエフェクター機能を誘導し、かつ免疫原性の減少を示すが、げっ歯類可変領域は、なお免疫応答の誘導の危険を与える。可変ドメインが、抗原結合ループ（相補性決定領域またはＣＤＲ）を乗せたβシートフレームワークからなることが理解されたとき、ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク上にグラフトされたげっ歯類ＣＤＲを含むように設計された。いくつかの異なった抗原結合部分が、しばしばげっ歯類配列に最も高い相同性を持つヒトフレームワークを使うことで、同一ヒトフレームワーク上に首尾よく移された（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ＰＴ  ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２−５，１９８６；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２７，１９８８；およびＳａｔｏ  Ｋ．ら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１，３７１−８，１９９４）。あるいは、コンセンサスヒトフレームワークが、いくつかのヒト重鎖に基づいて構築された（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，４８７−９９，１９９２）。しかし、単純なＣＤＲグラフティングは、しばしば抗原親和性の低下を引き起こした。βシートフレームワークとループとの間に起こり得る他の相互作用が、抗原結合部位の改造のために考慮されるべきであった（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ  ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９０１−９１７，１９８７）。
【００１２】
いくつかの抗体のヒト化に必要な不可欠なフレームワーク残基の比較、および抗体結晶構造に基づいたコンピューターモデリングは、「ベルニエ領域（Ｖｅｒｎｉｅｒ  ｚｏｎｅ）残基」（Ｆｏｏｔｅ  Ｊ．ら，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２４，４８７−９９，１９９２）と呼ばれる、おそらく結合部分の完全性に寄与するであろうフレームワーク残基一式を明らかにした。さらに、ＶＨ−ＶＬ境界区域におけるいくつかの残基は、抗原への親和性の保持に重要であり得る（Ｓａｎｔｏｓ  ＡＤ  ら，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ６０，１６９−９４  １９９８）。最初、フレームワーク残基は、徐々にげっ歯類配列へと戻し変異させられた（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ＣＡ  ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎ．４，７７３−７８３，１９９１）。しかしこの変異による手法は、非常に時間のかかるもので、かつ、重要な残基の全てを網羅することはできない。
【００１３】
特定任意の抗体に対し、小さな一連の改変は、結合を最適にするために十分であり得るが、ベルニエおよびＶＨ／ＶＬ残基の組から選び出すことは難しい。選択手法と組み合わせたコンビナトリアルライブラリー手法（ファージディスプレイなど）は、全ての重要なフレームワーク残基においてげっ歯類とヒト配列との間のどちらかを示しかつ全てのヒト化型の結合作用の同時決定を促す、ヒト化分子のライブラリーの生成により、ヒト化技術の大改革を行った（例えば、Ｒｏｓｏｋ  ＭＪ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７１，２２６１１−８，１９９６  および  Ｂａｃａ  Ｍ  ら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，１０６７８−８４，１９９７）。
【００１４】
上記の手法は、６つのげっ歯類ＣＤＲそれぞれをヒトフレームワークにグラフトし、それにより有意な数の潜在的に問題のあるげっ歯類残基を導入する。したがって、起源種由来抗体に基づき、減少した免疫原性を示す一方で至適結合プロフィールを保持する、治療目的および診断目的のために標的種に投与され得る設計抗体の提供は、有利であり得る。減少した免疫原性を示す一方で至適結合プロフィールを保持する、治療目的および診断目的のために標的種に投与され得る設計ＰＤＧＦ抗体の提供もまた、有利であり得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（要約）
高度に選択的で治療に有用な、ＰＤＧＦアンタゴニストとして作用する抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体が、提供される。マウス脾臓および骨髄由来の高親和性ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体が、ファージディスプレイにより単離された。本抗体はヒトＰＤＧＦ−ＢＢを認識するが、ラットＰＤＧＦ−ＢＢは認識しない。マウスＣＤＲまたはヒトＣＤＲのどちらかの選択、およびマウスフレームワークと最も深く関連するヒトフレームワークにおける特定のフレームワークアミノ酸の改変により産生された、ヒト化抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体も、提供される。ヒトＣＤＲまたはウサギＣＤＲのいずれかの選択およびウサギフレームワークにおける特定のフレームワークアミノ酸の改変により産生された、ヒト化抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体も、提供される。マウス抗体（Ｃ１）、ウサギ抗体（Ｆ３）、およびヒト化抗体（Ｅ１およびＢ１）は、ＰＤＧＦ−ＢＢに対してＰＤＧＦβレセプターと有効に競合する。マウスＣ１は、神経芽腫細胞株ＨＴＢ１１（ＩＭＲ３２）およびＣＣＬ１２７（ＮＢ４１Ａ３）、感覚上皮腫細胞株ＨＴＢ１０（ＳＫＮＭＣ）、ユーイング肉腫細胞株ＨＴＢ１６６（ＲＤＥＳ）、星状細胞腫細胞株Ｕ８７、神経膠芽腫細胞株Ｔ９８Ｇ、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩＨ１６５１、ＮＣＩ１８７６、ＮＣＩＨ２２２８、および肺腺癌細胞株ＮＣＩＨ２３の増殖を阻害するが、このことは本抗体が、種々の癌の処置のために、治療学的に有用であることを示している。
【００１６】
抗体Ｃ１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲ由来の少なくとも１つのＣＤＲを図１４ａに表示されるように含む抗体軽鎖も、提供される。
【００１７】
さらに、抗体Ｃ１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲ由来の少なくとも１つのＣＤＲを図１４ｂに表示されるように含む抗体重鎖が、提供される。
【００１８】
必要に応じて、２つ以上のＣＤＲが前述の群より選択される；ある実施形態においては、３つのＣＤＲ全てが、前述の群より選択され得る。ＣＤＲは、アミノ酸の置換、付加、欠失によって改変され得、この改変は抗体設計についての技術分野において公知であり、本明細書中でさらに詳細に議論される方法に従って、行われる。
【００１９】
好ましい重鎖および軽鎖は、図１４ａおよび図１４ｂにそれぞれ表示される。
【００２０】
フレームワーク領域（ＦＲ）は、ヒト化抗体Ｂ１およびＥ１に関して、図１５ａおよび図１５ｂに表示されるＦＲに好ましくは由来するかまたはこれらと同一である。
【００２１】
軽鎖と重鎖は、結合して完全な抗体を形成し得る。抗体は、定常ドメイン、または抗原結合免疫グロブリン断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２，ＦｖおよびｓｃＦｖを含む）を含む、全長の免疫グロブリンであり得る。適当な抗体は、抗体Ｂ１およびＥ１であり、図１５ａおよび図１５ｂに表示される。
【００２２】
別の実施形態においては、以下からなる群より選択された腫瘍の治療の方法が提供されている；神経芽腫、感覚上皮腫、髄膜腫、ユーイング肉腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、カポージ肉腫、中皮腫および中皮腫細胞株、絨毛上皮腫、膵臓癌、胃癌、骨肉腫、食道癌、線維肉腫、原発性ヒト肺癌における悪性上皮細胞、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、傍神経節腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、ＮＯＳ肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、および子宮間質肉腫、乳癌、結腸直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性線維組織球腫、平滑筋細胞腫瘍、および前立腺癌。本方法は、有効量の抗ＰＤＧＦ抗体をその必要がある被験体へ投与する工程を包含する。この抗体は、好ましくは抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体である。この抗体は、種々の癌治療において、他の化学治療薬剤との組み合わせ治療に使用され得る。
【００２３】
別の局面では、標的に対する特異性を有する第一抗体の提供；第一抗体の少なくとも一部分の配列の決定；第一抗体の少なくとも一部分の配列と標的種由来の抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーとの比較；このライブラリーからの、第一抗体の少なくとも一部分と高い相同性を示しＣＤＲ３領域を含む、少なくとも１つの配列の選択；第一抗体からのＣＤＲ３領域の取得；および第一抗体由来のＣＤＲ３領域を、そのライブラリー由来の少なくとも１つの配列の、ＣＤＲ３領域がかつて占めていた位置において組み込み、最適化された設計抗体または設計抗体断片を形成する工程を包含する、最適化された設計抗体または設計抗体断片を提供する方法が、本明細書中で記述される。上で言及した配列は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列であり得る。言及された抗体断片は、ｓｃＦＶ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦＤ、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、抗体軽鎖および抗体重鎖からなる群より選択され得る。上で言及した標的種は、ヒトであり得る。上で言及した第一抗体の少なくとも一部分の配列は、可変領域配列であり得、標的種由来である領域由来の抗体断片配列は、可変領域であり得る。
【００２４】
さらに、第一抗体の可変領域はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２およびＦＲ３からなり、相同性の程度の決定のために、標的種の生殖系列配列または再編成された配列と整列され得る。さらなる局面では、上段落の方法はまた、第一抗体の少なくとも一部分とライブラリー由来の高い相同性を示す少なくとも１つの配列との間における、非相同的位置の決定、および非相同的位置におけるもとの第一抗体残基または同じ非相同的位置における元のライブラリー配列残基のどちらかを含む、最適化された設計抗体または設計抗体断片の改変体の構築も包含する。さらに、最適化された設計抗体または設計抗体断片の改変体を提示するファージミドライブラリーまたはファージライブラリーが、産生され得る。さらに、このファージミドライブラリーまたはファージライブラリーは、標的物に対する活性により選別され得、そして、優先的に標的物に結合するファージ粒子またはファージミド粒子が単離される。
【００２５】
さらに、第一抗体由来のＣＤＲ１領域が、必要に応じて得られ得、ライブラリー由来の少なくとも１つの配列の少なくとも一部分の、ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置において組み込まれ得る。同様に、第一抗体由来のＣＤＲ２領域が、必要に応じて得られ得、ライブラリー由来の少なくとも１つの配列の少なくとも一部分の、ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に組み込まれ得る。さらに、第一抗体のＣＤＲ１領域もしくはＣＤＲ２領域のいずれかまたはその双方と、標的種のＣＤＲ１領域もしくはＣＤＲ２領域のいずれかまたはその両方との間での選択が、なされ得る。上述の参照ライブラリーは、ヒト再編成抗体配列を含み得る。ある局面においては、標的物はＰＤＧＦである。
【００２６】
最適化された抗体または抗体断片を選択するための設計抗体または設計抗体断片のライブラリーもまた提供され、このライブラリーは、改変体設計抗体または断片を含み、この改変体は、標的種に対してネイティブである抗体由来のフレームワーク領域（このフレームワーク領域は所定の標的に対して特異性を有する第一抗体のフレームワーク領域と高い相同性を示す）、所定の標的に対して特異性を有する第一抗体由来のＣＤＲ３領域、第一抗体または標的種に対してネイティブである抗体のどちらか由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域の組み合わせ、ならびにＶＨ／ＶＬ境界および／またはベルニエ領域におけるアミノ酸の組み合わせ（このアミノ酸の組み合わせは、標的種に対してネイティブである抗体に存在するアミノ酸の組み合わせと第一抗体に存在するアミノ酸の組み合わせとの間の選択を示す）を有する。
【００２７】
さらに別の局面では、本開示に従うヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片は、１つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域および２つの異なる非ヒト供給源由来のＣＤＲ領域を含む。別の局面では、本開示に従うヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片は、生殖系列抗体配列および再編成ヒト抗体配列の双方由来のフレームワーク領域および２つの異なる供給源（そのうち少なくとも片方が非ヒトである）由来のＣＤＲ領域を含む。さらに別の実施形態では、本開示に従うヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片は、１つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域、非ヒトＣＤＲ３、および非ヒト抗体コンセンサス配列由来のＣＤＲ１またはＣＤＲ２のうちの少なくとも１つを含む。
【００２８】
ヒト化複合抗体のための構成物の選択は、以下の工程：（ｉ）標的に結合する非ヒト抗体のパネルから複数メンバーについての抗体コンセンサス配列を確立する工程；（ｉｉ）そのコンセンサス配列のＣＤＲ３を非ヒト抗体の個別のメンバー由来のＣＤＲ３で置換して、複合配列を形成する工程；および（ｉｉｉ）その複合配列をヒト抗体配列データベースと比較し、そしてその複合配列との相同性に基づき少なくとも１つのヒト抗体配列を選択する工程、を包含する方法により達成される。
【００２９】
この様式で選択されるヒト抗体配列は、ヒト化複合抗体のためのフレームワーク領域を提供する。ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片のための、少なくともＣＤＲ３は、抗原に結合する上記の非ヒト抗体のパネルから選択され得る。ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片のためのＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、抗原に結合する上記の非ヒト抗体のパネル、コンセンサス配列、または複合配列との相同性に基づいて選択されたヒト配列から選択され得る。特に有効な実施形態においては、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片に使用されるＣＤＲ３は、コンセンサス配列の中に置換されて複合抗体配列を形成するＣＤＲ３であり、ヒト化複合抗体に使用されるＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、上記のパネルの１つ以上の異なったメンバーから選択されるか、もしくはコンセンサス配列由来である。
【００３０】
ある実施形態においては、複合配列は、再編成抗体配列のデータベース（例えば、Ｋａｂａｔデータベースなど）と比較され、そして、１つのヒト抗体配列が、複合抗体配列との相同性に基づいて選択される。この実施形態においては、１つの抗体からのフレームワーク領域が、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片の生成に使用される。
【００３１】
別の実施形態においては、複合配列の一部分が、生殖系列配列データベース（例えば、Ｖ−ｂａｓｅデータベースなど）と比較され、複合配列の次の一部分が、再編成抗体配列のデータベース（例えば、Ｋａｂａｔデータベースなど）と比較される。少なくとも１つのヒト配列が、それぞれのデータベースから複合配列の少なくとも一部分との相同性に基づいて選択される。この実施形態においては、２つの抗体配列からのフレームワーク領域が、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片の生成に使用され、１つ以上のフレームワーク領域は、生殖系列配列から選択され、１つ以上のフレームワーク領域は再編成抗体配列から選択される。
【００３２】
さらなる相違点は、複合配列と選択されたヒト配列との間の非相同的（ベルニエまたはＶＨ／ＶＬ境界など）位置の決定、および非相同的位置における元の複合配列残基または選択されたヒト配列フレームワーク由来の元の残基のどちらかを有している最適化設計抗体または設計抗体断片の改変体の構築を包含する、上記の方法に関連して導入され得る。
【００３３】
上で言及した配列は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、二重特異性抗体、抗体軽鎖および抗体重鎖であり得る。
【００３４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本明細書中で記載されている技術は、設計抗体を、特に、ＰＤＧＦに対し高度に活性であり、かつ、ヒトにおける免疫原性の危険性を減少する最適化された設計抗体を提供する。本発明の開示に従って操作されてきた標的種由来の抗体の可変領域のＣＤＲ３領域の代わりに、一種由来のＣＤＲ３領域の組み込みは、標的物への高度な親和性を保持するのに十分である一方で、標的種への投与時の有害免疫応答の危険性を減少することが、驚いたことに見出された。特に有用な実施形態においては、設計抗体はヒト化される。
【００３５】
本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、他に本明細書中で定義されない限り、一般に本教示に関わる当業者によって通常理解される意味を有する。当業者によって公知の種々の方法が、本明細書中で参照される。
【００３６】
刊行物および参照された公知の方法を記載する他の資料は、全てを記載したかのように、全体が本明細書中に参考として援用される。本明細書中で記載された方法の実施は、他に指示されない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用し、これらは、当業者の範囲内である。このような従来技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，および  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩおよびＶｏｌｕｍｅ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ  Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  １９８４）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），特にＶｏｌ．１５４およびＶｏｌ．１５５（ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄｓ）；ＰＣＲ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｑｕｉｒｋｅ，およびＴａｙｌｏｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｒｏｉｔｔら，Ｃ．Ｖ．Ｍｏｓｂｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，およびＮｅｗ  Ｙｏｒｋ．；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，Ｍａｌｅら，Ｇｒｏｗｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩおよびＶｏｌｕｍｅ  ＩＩ，１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ  ｅｄ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８６（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，１９８６（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，１９８７（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＷＯ９７／０８３２０；米国特許第５，４２７，９０８号；同第５，８８５，７９３号；同第５，９６９，１０８号；同第５，５６５，３３２号；同第５，８３７，５００号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，６４３，７５６号；同第５，７２３，２８７号；同第５，９５２，４７４号；Ｋｎａｐｐｉｋら，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６；Ｂａｒｂａｓら，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら  １９９９，Ｊ��Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１０：１１９−１３５；Ｋｉｔａｍｕｒａ，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，６７：３５１−３５９；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２９−３４；Ｌｉｔｔｌｅら，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４１：１８７−１９５；Ｃｈａｕｔｈａｉｗａｌｅら，１９９２，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５６：５７７−５９１；Ａｒｕｆｆｏ，１９９１，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：７３５−７４１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ（Ｅｄｉｔｏｒ）ら，１９９６，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈを参照のこと。これらの内容は、本明細書中において参考として援用される。
【００３７】
当業者に公知の任意の適切な材料および／または方法は、本明細書中に記載された方法を実施する際に利用され得る；しかし、好ましい材料および／または方法が記載される。以下の記載および実施例において参照される材料、試薬などは、留意されない限り、市場で購入できる。「含んでいる」、「含んだ」および「含む」という用語は、その広範な意味において使用されることが、理解されるべきである。すなわち、これらの意味は範囲の制限がなく、そして、例えば、含んでいるが限定はされていない、含んだが限定はされなかった、および含むが限定されない、ことを意味する。
【００３８】
設計抗体および設計抗体断片は、完全長の重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、またはそれらの任意の断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、抗体軽鎖および抗体重鎖などを含む。
【００３９】
最初の材料として、所定の標的物が選択され、これに対して抗体が惹起される。標的物に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する技術は、当業者に周知である。標的物は、抗原性を示すことができ、かつ、通常はタンパク質またはタンパク質多糖類である、任意の物質を含む。例として、レセプター、酵素、ホルモン、成長因子、ペプチドなどが挙げられる。天然に存在する抗体で本明細書の開示に従って使用するのに適したものだけでなく、所定の物質に対する設計抗体および設計抗体断片もまた適していることが、理解されるべきである。
【００４０】
本明細書中で表示された技術にさらされ得る抗体（Ａｂ）として、モノクローナルＡｂ、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖および／またはファージディスプレイ技術またはファージミドディスプレイ技術由来の抗体断片のような抗体断片を含む。機能的抗体断片は、通常抗体全体に存在する領域の不在にも関わらず、抗原に結合し得る抗体の断片である。単鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、機能する抗体断片に含まれる。
【００４１】
特定の標的に対する抗体が、一旦同定されると、それらは、望ましい特徴を有するために設計され得る。一実施形態においては、抗体は、以下で記載されるように、少なくとも非標的種由来のＣＤＲ３を含むために設計される。本実施形態は、本明細書中で後に最適化された設計抗体と呼ばれる。他の一実施形態においては、抗体は、以下で記載されるように、少なくとも２種由来のＣＤＲを含むために設計され、これらのＣＤＲは、定常配列を使用して選択されたヒトフレームワーク内に組み込まれる。本実施形態の設計抗体は、「ヒト化抗体」と呼ばれる。
【００４２】
（最適化抗体）
最適化過程を始めるために、標的抗原への特異性を有している起源となる種の抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子の可変部分のＤＮＡ配列が、必要である。起源となる種は、抗体を産生するために使用される任意の種、例えば、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、などである。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生するための技術は、当業者に公知である。一旦可変部分のＤＮＡ配列が得られたら、適切な標的種フレームワークの選択が、不可欠である。一実施形態は、この第一抗体配列と標的種由来の生殖系列可変遺伝子のアラインメントを含む。例えば、もし標的種がヒトであれば、こうした遺伝子配列の起源は、ヒト抗体配列データベースであるＶＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）またはそれらの翻訳産物のような、任意の適切なライブラリーにて見出し得る。あるいは、標的種はやはりヒトであり第一抗体が非ヒトである場合、非ヒト遺伝子とＫａｂａｔ免疫グロブリンデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）にて見出されるようなヒト再編成抗体配列を並列できる。アラインメントがヌクレオチド配列に基づいてなされたら、選択された遺伝子はその部分集合のどの遺伝子が第一抗体と最も近いアミノ酸相同性を有しているかを決定するために、分析されるべきである。ライブラリー中の他の遺伝子と比較して高い相同性に近づく遺伝子が、利用され、かつ、本明細書に記載される手順に従って操作されることが、熟考される。さらに、より低い相同性を有する遺伝子は、本明細書に記載される手順に従って操作されかつ選択された場合に既決定の標的物に対し特異性を示す生産物を、それらがコードする場合に、利用され得る。特定の一実施形態において、受容可能なホモロジーの範囲は、５０％より高かった。代わりのアプローチは、例えば、ＶＢＡＳＥ、Ｋａｂａｔデータベースおよび／またはこうしたデータベースの翻訳産物から決定されるような相同なヒト遺伝子を表示すること、そしてコンセンサスアミノ酸配列をヒトフレームワークとして使用することである。フレームワーク４領域（Ｊ遺伝子）のためのアラインメントの手法は、生殖系列か再編成抗体配列のどちらかを使用することで同様になされ得る。標的種はヒト以外であり得るということが、理解されるべきである。
【００４３】
標的種のフレームワークに組み込まれたＣＤＲは、非標的種ＣＤＲ３および標的種の配列と起源となる種の配列との間のＣＤＲ２および／またはＣＤＲ１の選択物を含む。フレームワーク残基は、一般に特定の位置以外の標的種配列が割り当てられる。例えば、ＶＨ／ＶＬ境界またはベルニエ領域位置のどちらかにおける非相同アミノ酸残基は、最適化Ｆａｂライブラリーの構築において標的物と起源の種との間の選択物として保持される。残基選択が好ましくあり得るさらなるフレームワーク位置は、起源種抗体の中で高度に保存された位置を含む。一般に、表面残基を標的種から守り、起こり得る最適化抗体の免疫原性をさらに避けることが望ましい。しかし、幾らかの表面露出残基は、ＶＨ／ＶＬ境界またはベルニエ領域としても割り当てられる。この場合、起源の種または標的種のどちらかの選択は、まだ与えられる。
【００４４】
最適化抗体または抗体断片のアセンブリは、当業者に公知の従来の方法を使用して完成され得る。例えば、本明細書において記載される改変された可変ドメインをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成によって産生し得る。あるいは、本明細書において記載される改変された可変ドメインをコードする核酸は、プライマー指向されたオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発により構築され得る。すなわち、望ましい変異をコードするオリゴヌクレオチドを変異した領域を含む一本鎖核酸とハイブリダイズし、および一本鎖をオリゴヌクレオチド伸長のためのテンプレートとして使用し、変異を含む鎖を産生することである。部位特異的変異誘発のために使用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成により作製され得、または標的種フレームワークをコードする核酸から適切な制限酵素の使用により単離され得る。ＣＤＲ領域をコードする核酸は、起源である種の抗体から、適切な制限酵素の使用および適切な連結酵素での連結による、標的種フレームワーク中への連結により単離され得る。
【００４５】
抗体断片ライブラリーのアセンブリは、合成オリゴヌクレオチドの使用により選択的に完成される。１つの例では、オリゴヌクレオチドは重複領域を有するように設計され、その結果、それらはアニールし得、かつ、ポリメラーゼによって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で行われるように、埋められた。重複伸長の複数の工程は、ＶＬおよびＶＨ遺伝子挿入を生み出す目的で行われた。これらの断片は、ヒト定常ドメインと重複する領域と共に設計されたため、全長軽鎖およびＦｄ重鎖断片を産生するための重複伸長により融合し得る。軽鎖および重鎖Ｆｄ遺伝子は、したがって重複伸長によって互いに融合され、一本鎖のＦａｂライブラリー挿入部分を作り、ディスプレイベクターの中にクローン化される。ヒト化ライブラリー遺伝子アセンブリのための代替の方法もまた、使用され得る。例えば、ライブラリーは重複オリゴヌクレオチドから、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）手法を使用して組み立てられ得る。例えば、ＣｈａｌｍｅｒｓおよびＣｕｒｎｏｗ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２００１）３０−２，ｐ２４９−２５２を参照のこと。このＬＣＲ技術は、一連（１２個までが最適）の重複オリゴヌクレオチドが、２重鎖遺伝子を産生するような方法において、オリゴ間のニックのみと共にアニーリングすることを含む（不連続部分はない）。オリゴヌクレオチドは、耐熱リガーゼにより、サーモサイクリングレジメントを使用して、互いに連結される。遺伝子アセンブリに続いて、一回のＰＣＲが行われることにより、オリゴヌクレオチド内に余剰が設計され、そしてＰＣＲが純系の形質転換株の産生を確実にする。遺伝子も、多数の冒頭ＬＣＲ断片から、これらをＰＣＲ重複伸長を使用して一緒に結合させることにより、集められ得る。最後に、マウスまたはヒトどちらかのＣＤＲ１およびＣＤＲ２の異なった組合わせと共にある抗体可変遺伝子ライブラリー断片を、ＬＣＲプロトコルと共に、別々の合成混合物におけるオリゴをコードする異なったＣＤＲを組み合わせることにより、開発することが可能である。
【００４６】
抗体断片の種々の形態は、産生され得、かつ適切なベクターの中にクローン化され得、最適化された抗体ライブラリーを作る。例えば可変遺伝子は、フレーム内に必要な定常ドメインの残りの部分を含んだベクターの中にクローン化され得る。クローン化され得る他の断片の例は、軽鎖全体、重鎖のＦｄ部分、または軽鎖および重鎖Ｆｄコード配列の両方を含む断片を含む。あるいは、ヒト化に使用される抗体断片は、一本鎖抗体であり得る（ｓｃＦｖ）。
【００４７】
任意の選択ディスプレイ系が、本明細書の開示に従うライブラリーとの結合に使用され得る。ラージライブラリーの好ましいメンバーを単離するための選択プロトコルは、ファージディスプレイ技術によって代表されるように、当業者に公知である。様々なペプチド配列が糸状のバクテリオファージ表面で示されるこのような系（Ｓｃｏｔｔ  および  Ｓｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６）は、インビトロ選択および、標的抗原に結合する特異的抗体断片の増幅のための抗体断片（およびこれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作るために有用であることが証明されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙に関係するリーダー信号をコードする遺伝子断片と連結し、そしてその結果、結果として生じた抗体断片が、バクテリオファージ被膜タンパク質（例えば、ｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）との典型的な融合として、バクテリオファージの表面に示される。あるいは、抗体断片は、ラムダファージカプシド（ファージボディ）上に外部に示される。ファージベースディスプレイ系の有利性は、これらが生物学的系であり、選択されたライブラリーメンバーが、選択されたライブラリーメンバーを含むファージの細菌細胞における成長によって単に増幅され得るからである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列がファージベクターまたはファージミドベクター上に含まれるため、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作は、比較的まっすぐである。
【００４８】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびラムダファージ発現ライブラリーを構築するための方法は、当技術分野で周知である（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２；Ｋａｎｇら，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３；Ｃｈａｎｇら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７；３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，（１９９１）Ｇｅｎｅ，１０４：１４７；Ｍａｒｋｓら，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｂａｒｂａｓら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９：４４５７；ＨａｗｋｉｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：８６７；Ｍａｒｋｓら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；Ｌｅｒｎｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３１３，これらは本明細書中に参考として援用される）。
【００４９】
特に有利なアプローチの１つは、ｓｃＦｖファージライブラリーの使用であった（Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：１０６６−１０７０；ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）前出；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）前出；；Ｍａｒｋｓら（１９９１）前出；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：８０；Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７）。バクテリオファージ被膜タンパク質において示されたｓｃＦｖライブラリーの種々の実施形態は、記載される。ファージディスプレイ手法の改良も、公知である。例えば、ＷＯ９６／０６２１３およびＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌら）およびＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）これらは本明細書中で参考として援用される。Ｆａｂライブラリーも公知である。例として、ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）およびＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）において記載されている。
【００５０】
抗体ライブラリーまたはポリヌクレオチドライブラリーを産生する他の系は、ライブラリーメンバーのインビトロ合成のための無細胞酵素的装置の使用を含む。１つの方法において、ＲＮＡ分子は、標的リガンドに対する選択の交互の繰り返しおよびＰＣＲ増幅により選択される（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：５０５；ＥｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６：８１８）。類似の技術が、既決定のヒト転写因子に結合するＤＮＡ配列を同定するために使用され得る（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８：３２０３；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：６３５；ＷＯ９２／０５２５８およびＷＯ９２／１４８４３）。類似の方法において、インビトロ翻訳が、抗体分子を合成するためにラージライブラリー産生のための方法として使用され得る。一般に安定化ポリソーム複合体含むこれらの方法は、さらに以下において記載されている；ＷＯ８８／０８４５３，ＷＯ９０／０５７８５，ＷＯ９０／０７００３，ＷＯ９１／０２０７６，ＷＯ９１／０５０５８，およびＷＯ９２／０２５３６。ファージベースでない代替のディスプレイ系は、ＷＯ９５／２２６２５およびＷＯ９５／１１９２２（Ａｆｆｙｍａｘ）のように、選択のための抗体分子を示すためにポリソームを使用する。これらおよび全ての前述の文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００５１】
（ヒト化抗体）
他の局面において、本明細書中に記載された技術は、既決定の標的に対し高度に活性であり、かつ、ヒトにおける免疫抗性の危険を減少させた、作用するヒト化混成設計抗体を、提供する。下でさらに十分に記載されるように、ヒト化抗体は、非ヒト抗体のパネルからの２つ以上の抗体の配列の第一決定によってもたらされる。これらの抗体は、例えば選別技術で決定されたように、特定の標的への高い結合親和性を示す。非ヒト抗体のパネルからの２つ以上のメンバーの抗体のコンセンサス配列は、配列の比較によって確立される。非ヒト抗体のパネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３が、コンセンサス配列のＣＤＲ３に代わって置換され、複合配列が形成される。この複合配列は、複合配列とヒト抗体配列データベースとの比較（通常はコンピューターによってなされる）において、「質問」として使用される。少なくとも１つのヒト抗体配列が、複合配列との相同性に基づいて選択される。選択されたこのヒト抗体配列は、本開示に従って作製される混成設計ヒト化抗体のためのフレームワーク領域を提供する。本開示に従って作製される混成設計ヒト化抗体のためのＣＤＲは、少なくとも２つの起源から選択された。特に、ＣＤＲ３は、非ヒト抗体のパネルの個々のメンバーより選択され、かつ、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２もしくはその両方は、このパネルの他のメンバー、コンセンサス配列、または複合配列との相同性に基づいて同定されたヒト配列を含む、１つ以上の異なった起源から選択される。結果として生じる混成ヒト化抗体は、したがって、標的に対する高い結合親和性およびヒトにおける減少された免疫原性を有するように設計される。
【００５２】
始めに、複数の最初の抗体は、１つ以上の非ヒト起源の種から得られる。より具体的には、標的抗原に対する特異性を有する少なくとも２つの抗体の軽鎖、重鎖またはその両方の可変部分の核酸配列またはアミノ酸配列が、必要とされる。起源となる種は、抗体または抗体ライブラリーを産生に使用される任意の種である。例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、ヒツジ、サル、ヒト、など。モノクローナル抗体を産生およびクローン化する技術は、当業者に周知である。望ましい２つ以上の抗体が得られた後、それぞれの抗体の配列が決定される。すなわち、可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、構成部分（すなわち、フレームワーク（ＦＲ）  、ＣＤＲ、ベルニエ領域およびＶＨ／ＶＬ境界領域）によって、ＣＤＲの任意の可能な定義（例えば、Ｋａｂａｔ単独、Ｃｈｏｔｈｉａ単独、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの組み合わせ、および当業者に公知の任意の他のもの）を使用して、同定され得、このようにして同定された。
【００５３】
本ハイブリダイゼーション法に従い、１つ以上の起源の種由来である、少なくとも２つのおよび望ましくはそれ以上の抗体が、高い親和性、特異性および／または標的に対する活性および高い発現を含む多数の判断基準に基づいて選択される。集合的に、望ましい特性を有する選択された抗体は、本明細書中に抗体のパネルとして参照される。標的に対する高いおよびより高い親和性の抗体を単離するためのスクリーニング方法は、当技術分野において周知である。例えば、糸状バクテリオファージの表面に融合するポリペプチドの発現は、大きな集合のクローンから特定の配列を回収するための強力な方法を提供する（Ｓｍｉｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１３１５−１５１７，１９８５）。ペプチドまたはタンパク質に結合する抗体は、例えば以下のような、比較的単純な選別方法により、ラージライブラリーから選択されてきた；Ｓｃｏｔｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：３８６−２９０，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：４０４−４０６，１９９０；Ｃｗｉｒｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：６３７８−６３８２，１９９０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４，１９９０；Ｌｏｗｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２−１０８３８，１９９２；およびＫａｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３−４３６６，１９９１。抗体ライブラリーのディスプレイとして公知である種々の技術は、以下を含む；ファージディスプレイ、ファージミドディスプレイ、リボゾーマルディスプレイおよび細胞表面ディスプレイ。抗体をスクリーニングするのに有効な選別方法では、標的リガンドは、例えばプレート上、磁気ビーズ、セファロースなど、カラムに使われるようなビーズ上に固定化され得る。特定の実施形態においては、標的リガンドは、例えば、ビオチン、ＦＡＣＳ選別のための２−蛍光色素などの使用により、「タグ標識」される。
【００５４】
抗体を発現しているファージ発現抗体またはファージミド発現抗体のライブラリーは、ファージベクターおよびファージミドベクターを利用する。ここで抗体は、ファージ被膜タンパク質をコードする遺伝子と融合される。標的リガンドは、製造業者の指示書に従って、磁気ビーズに結合体化される。ビーズおよび任意の未反応基への非特異的結合をブロックするため、ビーズは、過剰なＢＳＡと共にインキュベートされ得る。次いで、ビーズはＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０中の懸濁液で多数回洗浄され、プラスチック管の側に沿った強力磁石により、回収される。次いで、ビーズは、それから必要時まで冷蔵される。スクリーニング実験において、ライブラリーのアリコートは、再懸濁ビーズのサンプルと混合され得る。チューブの内容物は、低温（例えば、４〜５℃）で、十分な時間（例えば、１〜２時間）振とうされる。次いで、磁気ビーズは、強力磁石で回収され、液体はアスピレーションによって除かれる。次いで、ＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加し、チューブを数回逆さにすることでビーズを再懸濁し、磁石によってチューブの壁に引き付けるにことよって、ビーズは洗浄される。次いで、内容物は、除去され、そして洗浄はさらに５〜１０回繰り返しされる。５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．２）、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ溶液が洗浄後のビーズに加えられ、タンパク質を熱変性させて結合したファージを遊離する。短いインキュベーション時間の後、ビーズは強力磁石でチューブの横に押しやられ、次いで、液体内容物は、清潔なチューブへ移される。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）または１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）がチューブに加えられ、ファージサンプルのｐＨを中和する。ファージは例えば、１０−３から１０−６くらいに希釈され、アリコートはサンプルのプラーク形成単位の数を決定するために、Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞と共にプレート上で培養される。ある場合では、プラークの色素識別（すなわち、ｌａｃＺ＋プラークは青色で、ｌａｃＺ−プラークは白色である。）のためにＸＧａｌおよびＩＰＴＧ存在下でプレート培養がなされた。投入サンプルの滴定濃度も、比較のために決定される（希釈は一般に１０−６から１０−９である）。
【００５５】
あるいは、抗体を発現するファージのライブラリーのスクリーニングは、例えば、後述のようにマイクロタイタープレートを使用して、達成され得る。標的リガンドは、例えば、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）中で希釈されており、そして、少量のリガンド溶液のアリコートは、マイクロタイタープレートのウェルに吸着される（例えば、４℃で一晩のインキュベーションによって）。ＢＳＡ溶液のアリコート（１ｍｇ／ｍｌ、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中、ｐＨ８．５）を加え、このプレートを室温で１時間インキュベーションする。マイクロタイタープレートの内容物を除去し、ウェルをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で丁寧に洗浄する。プレートは、非結合標的を繰り返し洗い落とされる。ファージ溶液の少量のアリコートをそれぞれのウェルに導入し、このウェルを、室温で１〜２時間インキュベートする。マイクロタイタープレートの内容物は除去し、繰り返し洗浄する。このプレートをそれぞれのウェルに洗浄液を入れて室温で２０分インキュベートし、結合したファージを急速な解離定数で放出させる。全ての未結合のファージを除去するためにウェルをそれから複数回（例えば５回）洗浄する。ウェルに結合したファージを回収するため、ｐＨ変化を利用し得る。５０ｍＭグリシン−ＨＣＬ（ｐＨ２．２）、１００μ／ｍｌ  ＢＳＡ溶液のアリコートを洗浄後のウェルに加えて、タンパク質を変性させ、そして結合したファージを解放する。次いで、５〜１０分後、内容物を清潔なチューブに移し、そして１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）または１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）の少量のアリコートを加えて、ファージサンプルのｐＨを中和する。次いで、ファージを、例えば１０−３から１０−６に希釈し、そしてアリコートを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞と共にプレーティングして、このサンプルのプラーク形成単位の数を決定する。ある場合では、プラークの色識別（すなわち、ｌａｃＺ＋プラークは青色で、ｌａｃＺ−プラークは白色である）のために、ＸＧａｌおよびＩＰＴＧ存在下でこのプレーティングがなされる。投入サンプルの力価も、比較のために決定される（希釈は一般に１０−６から１０−９）。
【００５６】
他の代替の方法に従うと、抗体のライブラリーのスクリーニングは、以下のように第一「富化」工程および第二フィルターリフト工程を包含する方法を使用して、達成され得る。発現コンビナトリアルライブラリー（例えばファージにおいて）由来の、所定のリガンドに結合し得る抗体（「ポジティブ」）は、最初に一回または二回のアフィニティクロマトグラフィにより、富化される。マイクロタイターウェルは、えり抜きのリガンドにより不動態化コーティングされる（例えば、１００μｌ中に約１０μｇ）。次いでこのウェルを、ＢＳＡ溶液によりブロックして、抗体のプラスチック表面への非特異接着を防ぐ。次いで、抗体を発現する約１０１１個の粒子がウェルに加えられ、数時間インキュベーションされる。非結合抗体は、プレートの繰り返し洗浄によって除去され、そして特異的に結合した抗体が、酸性グリシン−ＨＣｌ溶液または他の溶出緩衝液の使用により溶出される。溶出された抗体ファージ溶液は、アルカリで中和され、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの感染および寒天中に培地を含んだ大きなシャーレ上でのプレート培養により増幅される。抗体を発現する増幅された培養物は、滴定濃度分析され、そしてこのプロセスは繰り返される。あるいは、リガンドは、共有結合的にアガロースまたは市販の活性化ビーズ試薬を使用して、アクリルアミドビーズに結合し得る。次いで、抗体溶液は、単純に結合したビーズ基質を含む小さなカラムを通過され、それからカラムはしっかり洗浄され、そして抗体は酸または他の溶出液で溶出される。どちらの場合においても、目的は、約１／１０５の頻度までポジティブを富化することである。富化の後には、フィルターリフトアッセイが行われる。例えば、ファージにおいて抗体が発現するとき、およそ１〜２×１０５ファージを、５００μｌの対数増殖期のＥ．ｃｏｌｉに加え、そして培地中に０．７％アガロースを含む大きなＬＢアガロースプレート上でプレート培養する。アガロースを固めて、そしてニトロセルロースフィルター（例えば、０．４５μ）をアガロース表面に置く。一連の記録印が滅菌針でつけられ、下で記載されるように、後の現像で、フィルターとプレートの再配列ができるようにする。ファージプラークは、３７℃一晩のインキュベーションで現像される（フィルターの存在はこの過程を妨げない）。それからフィルターは、それぞれ個々のプラークからインサイチュで接着しているファージと共にプレートから取り除く。それからフィルターを、ＢＳＡ溶液または他のブロッキング剤に１〜２時間晒し、リガンド（または「プローブ」）の非特異結合を防ぐ。プローブ自体が、例えばビオチン標識（市販のＮＨＳ−ビオチン使用）または直接酵素標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）のどちらかによって標識される。この方法により標識されたプローブは、半永久的に安定であり、かつ、数回再利用し得る。ブロックされたフィルターを、プローブ溶液に数時間晒し、プローブを任意のフィルター上でプローブに有意の親和性を有するペプチドを示すファージにインサイチュで結合させる。それからフィルターを洗浄し、非結合プローブを除去し、そして酵素基質溶液（直接標識プローブの場合）への��出、またはさらに酵素標識アビジン溶液（ビオチン標識プローブ）に晒すことにより現像される。陽性のファージプラークは、フィルター上における着色酵素開裂産物の局在化した付着物により同定され、これらの付着物は元のプレート上のプラークに対応している。現像されたフィルターを、記録印を使用してプレートと共に単純に再配列し、「陽性の」プラークを、アガロースからくり抜き、ファージを回収する。元のプレート上のプラークの高密度ゆえに、通常、第一段階で１つのプラークをプレートから単離するのは不可能である。従って、一回目のくり抜きから回収されたファージは、低密度において再びプレート培養され、このプロセスは繰り返され、個々のプラークの単離をでき、従って、１つのファージクローンが単離できる。
【００５７】
細菌細胞の外表面に抗体を発現するプラスミドベクターのライブラリーのスクリーニングは、磁気ビーズを以下のように使用することで達成され得る。標的リガンドは、ファージベクターのスクリーニングについて本質的に上で記載したように、磁気ビーズと共役させられる。細菌細胞表面に発現する複数の抗体を発現する組換え型プラスミドベクターを含んでいる細菌細胞のサンプルを、再懸濁ビーズの少量のアリコートと混合する。チューブの内容物を、４℃で１〜２時間振とうする。次いで磁気ビーズを、強力磁石で回収し、液体を吸引によって除く。それから、例えば、１ｍｌのＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を添加し、数回逆さにすることでビーズを再懸濁し、磁石によってビーズをチューブの壁に引き付けて液体内容物を除くことによって、ビーズを洗浄する。ビーズを、さらに５〜１０回繰り返し洗浄する。それからビーズを、培養液のサンプル（例えば、ＬＢ＋アンピシリン）を含んだ培養フラスコに移す。結合した細胞は、高栄養培養液の中で細胞分裂を受け、娘細胞が、固定化された標的から切り離される。細胞が対数増殖期にあるとき、誘導物質を培養液に再び加え、より多くの抗体を産生させる。次いで、これらの細胞を、遠心によって集菌し、再スクリーニングする。成功するスクリーニング実験は、複数回使用（例えば、連続のスクリーニング）して、最適に行われる。次いで、回収された細胞を、低密度においてプレート培養し、個々の分析のために単離されたコロニーを得る。個々のコロニーは、選択され、アンピシリン含有のＬＢ培養液への植菌に使用される。３７℃における一晩の培養後、培養液を遠心機で遠心する。次いで、個々の細胞アリコートは、ビーズに接着した標的リガンドへの結合の再試をされる。他のビーズへ結合する、そのビーズに接着している非関連のリガンドは、ネガティブコントロールとして使用し得る。
【００５８】
あるいは、細菌細胞の表面上に抗体を発現するプラスミドベクターのライブラリーのスクリーニングは、以下のように達成し得る。標的リガンドは、上で記載されたように、ファージベクターのスクリーニングのため、マイクロタイタープレートへ吸着される。ウェルの未結合標的リガンドを洗い流した後、細菌細胞のサンプルを、少量の培養液に加え、そして、マイクロタイターウェル中に入れる。十分なインキュベーションの後、未結合の細菌を含まないようにくり返し洗浄する。大量の、約１００ｍｌのＬＢ＋アンピシリンを、それぞれのウェルに加え、このプレートを、３７℃で２時間インキュベートする。結合した細胞は、高栄養培養液中で細胞分裂を受け、娘細胞が、固定化された標的から分離される。次いで、ウェルの内容物を、約１０ｍｌのＬＢ＋アンピシリンを含む培養フラスコに移す。細胞が対数増殖期にある場合、誘導物質が培養液に再び加えられ、より多くの抗体を産生させる。次いで、これらの細胞は、遠心によって集菌され、再スクリーニングされる。スクリーニングは、磁気ビーズを使用したスクリーニングに関して上で記載されたように、連続スクリーニングを使用して行われ得る。
【００５９】
他の実施形態に従うと、ベクターまたは宿主細胞（例えばファージまたは細菌細胞）のいずれかの表面タンパク質として抗体を発現するライブラリーは、ライブラリーの溶液をセファロース、シリカなどのような固体基質に固定化させたリガンドのカラムに通させ、そして、カラムに結合したファージを徹底的な洗浄および溶出の後に回収することにより、スクリーニングされ得る。
【００６０】
ライブラリースクリーニングのある重要な局面は、溶出である。説明を明白にするため、後の文章は、ファージによる抗体発現の点から、記載される。しかしこのような論議は、抗体が表面融合分子において発現する任意の系に適用し得ることが、容易に理解される。ファージ回収中におけるペプチド−標的相互作用の分断の条件は、ファージにおいて発現する複数のタンパク質由来の全ての与えられたペプチド配列それぞれに、特異的であると考えられる。例えば、特定の相互作用は酸性ｐＨにより分断され得るが塩基性ｐＨによっては分断され得ず、逆もまたあり得る。従って、種々の溶出条件（以下を含むが、これらに限定されない：ｐＨ２〜３、ｐＨ１２〜１３、競合における過剰な標的、洗浄剤、穏やかなタンパク質変性剤、尿素、温度変化、光、金属イオンの存在または非存在、キレート剤、など）は、回収されたファージにおいて発現する抗体の一次構造をそれぞれ一式の条件について比較して、それぞれのリガンド／抗体の組み合わせに適切な溶出条件を決定するために調べられるべきである。こうした溶出条件の幾つかは、ファージ感染と不適合性であり得る。なぜなら、それらは殺菌性であり、かつ、透析による除去を必要とするからである。異なった発現タンパク質の異なった条件下で溶出される能力には、標的への結合に関与する特定のペプチド領域の変性によるものだけではなく、隣接領域におけるコンホメーション変化によるものもある。これらの隣接配列も、実際の結合配列との組合わせにおいて変性され得る；これらの隣接領域は、に溶出条件（すなわち、ｐＨ２〜３、ｐＨ１２〜１３、競合における過剰な標的、洗浄剤、穏やかなタンパク質変性剤、尿素、熱、冷却、光、金属イオン、キレート剤、など）への露出に反応して、その二次構造または三次構造を変化し得、これが今度は標的への結合の原因となるペプチドのコンホメーション変形をもたらす。
【００６１】
標的分子に高い親和性を示す抗体の回収に適切な任意の選別方法が、適切であることが、理解されるべきである。回収およびどの抗体が望ましい親和性、活性、特異性および発現を有するかの決定の後、これらの抗体は、抗体のパネルを構成する。次いで、抗体のパネルの複数のメンバーの配列が、当業者に公知の任意の技術を使用して決定される。パネルのメンバーの配列の比較により、抗体は、それらの配列に基づいて、抗体ファミリーに有利に分類され得る。抗体ファミリーは、抗体の公開データベースに描写され、当業者に周知である。
【００６２】
標的に対する最も高い親和性を有するパネルメンバーを含むファミリー内のパネルメンバーについてコンセンサス配列が、確立される。与えられた一群の抗体配列のコンセンサス配列に到達することは、当業者の範囲内である。一般に、ファミリー内の個々のパネルメンバーの配列は、比較され、そして、配列に沿ったそれぞれの位置においてもっとも頻繁に現れるアミノ酸は、コンセンサス配列内のその位置を割り当てられる。複数の配列を比較し、自動的にコンセンサス配列を提供するコンピュータープログラム（例えば、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎより）は、市販されている。
【００６３】
コンセンサス配列は、複合配列を提供するために改変される。コンセンサス配列を改変するために、特定のパネルメンバー由来のＣＤＲ３が、コンセンサス配列のＣＤＲ３に代わって置換される。ＣＤＲ３が選択される特定のパネルメンバーは、発現効率、標的への親和性、標的への特異性および活性を含むがこれらに限定されない多数の因子に基づいて、選ばれ得る。これらそれぞれの因子を評価する技術は、当業者の範囲内である。
【００６４】
複合配列が決定された後、複合配列と１つ以上の公知のヒト抗体配列データベース（例えば、生殖系列、再編成、またはその双方）との比較がなされる。比較は、複合配列をデータベースの配列と整列し、比較される配列間の相同性の度合いを決定することによって、なされる。アラインメントを検索するためのコンピュータープログラムは、当技術分野で周知である（例えば、ＢＬＡＳＴなど）。例えば、ヒトアミノ酸配列または遺伝子配列の供給源は、以下のような任意の適切な参照データベースにおいて見出され得る；Ｇｅｎｂａｎｋ、ＮＣＢＩタンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ、ＶＢＡＳＥ、ヒト抗体遺伝子のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）、（生殖系列配列）、およびＫａｂａｔ免疫グロブリンデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）（再編成配列）またはそれらの翻訳産物。アラインメントがヌクレオチド配列に基づいてなされる場合、選択された遺伝子は、分析され、その部分集合のどの遺伝子が、起源の種の抗体に対し最も近いアミノ酸相同性を有するかを、本明細書に記載されたように、決定されるべきである。データベースの他の配列と比較してより高い相同性に近づくアミノ酸配列または遺伝子配列が、本明細書に記載される手順に従って、利用され、操作され得ることが、企図される。ある特定の実施形態において、受容可能な相同性の範囲は、約５０％より高い。パネルの供給源によっては、より高い相同性が求められ得る。具体的には、例えば、マウス抗体のパネルが、複合配列を形成するのに使用される場合、６０％またはより高い相同性が有利に求められ得る。とにかく、複合配列それぞれと比較して最高度の相同性を持つヒト配列が、同定される。選ばれたヒト配列は、少なくともフレームワーク領域を、本開示に従って生成された設計複合ヒト化抗体に提供する。少なくとも１つの非ヒトＣＤＲ（望ましくは非ヒトＣＤＲ３）が、これらのヒトフレームワーク領域間に置かれ、本開示による設計複合ヒト化抗体を産生する。
【００６５】
１つより多くのヒト配列が、本開示に従う設計複合ヒト化抗体の異なった部分を提供するように選択され得ることもまた、企図される。ある特に有用な実施形態において、本発明の設計複合ヒト化抗体のある部分がヒト生殖系列配列由来であり、かつ、本発明の設計複合ヒト化抗体の別の部分は再編成ヒト抗体配列由来である。例えば、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３を含む複合配列の部分は、ヒト生殖系列配列データベースと比較し得る。複合配列のこの部分を、生殖系列データベースの配列と整列することにより、複合配列のこの部分と高い相同性を持つ生殖系列配列が、同定され得る。この方法で同定された生殖系列配列は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３（および下でより詳細に記載されるように、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２）を、構築中の設計複合ヒト化抗体のために提供し得る。それとは別に、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４を含む複合配列の部分は、再編成ヒト抗体配列のデータベースと比較し得る。複合配列のこの部分を、データベースの配列と整列することにより、複合配列のこの部分と高い相同性を持つ配列を、同定し得る。この方法で同定された配列は、ＦＲ３およびＦＲ４を、構築中の設計複合ヒト化抗体のために提供し得る。
【００６６】
ヒト化複合抗体または機能抗体断片の構築における次の工程は、以前に選択したヒト配列のフレームワーク領域に組み込まれるＣＤＲを選択する工程を包含する。選ばれるＣＤＲは、少なくとも２つの供給源由来である。ＣＤＲ３に関しては、特定のパネルメンバー由来のＣＤＲ３が、選択される。好ましくは、コンセンサス配列の中に置き換えられたものと同じＣＤＲ３が、設計複合ヒト抗体への組み込みに選ばれる。上で示されたように、ＣＤＲ３が選択された特定のパネルメンバーは、発現効率、標的への親和性、標的への特異性および活性を含むがこれらに限定されない多数の因子に基づいて、有利に選ばれ得る。これらそれぞれの因子を評価する技術は、当業者の範囲である。
【００６７】
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２に関しては、選択は１つ以上の後述の供給源よりなされる。ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２は、別々のパネルメンバーから選択され得るが、ただしＣＤＲ１またはＣＤＲ２の少なくとも１つはＣＤＲ３が選ばれたパネルメンバーとは別のパネルメンバーに由来する。あるいは、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２は、複数のパネルメンバーの配列由来のコンセンサス配列から選択され得る。さらに別の代替として、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２は、複合配列との比較により同定されたヒト配列から選択され得る。
【００６８】
フレームワーク残基は、一般に、特定位置を除くアクセプタ種配列として割り当てられる。例えば、ＶＨ／ＶＬ境界またはベルニエ領域位置のどちらかにおける非相同アミノ酸残基は、複合ドナー配列とアクセプタ配列の間の選択として保持される。一般に、表面残基をヒト抗体由来のアクセプタフレームワークから離しておき、ヒト化複合抗体の起こり得る免疫原性をさらに避けることが望ましい。しかし、ある表面に露出した残基も、ＶＨ／ＶＬ境界またはベルニエ領域と呼ばれる。この場合、複合ドナーまたはアクセプタフレームワーク配列のどちらかの選択は、まだ与えられる。
【００６９】
ＣＤＲの選択およびアクセプタフレームワーク領域への割り当ての後、ヒト化複合抗体または機能抗体断片のアセンブリは、当業者に公知の従来の方法を使用することで達成し得る。例えば、本明細書中に記載された、改変された可変ドメインをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成によって産生され得る。それに続き、本明細書中に記載された、改変された可変ドメインをコードする核酸は、プライマー指向性オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発、すなわち、変異される領域を含む一本鎖核酸に望ましい変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、そしてオリゴヌクレオチドの伸長のための鋳型としての一本鎖の使用して変異を含んだ鎖を生産することによって構築され得る。部位特異的変異誘発に使用されるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成によって作製され得るか、または標的種フレームワークをコードする核酸から、適切な制限酵素の使用により単離され得る。
【００７０】
ディスプレイべクターの中にクローン化された設計（上述のように最適化されるかまたはヒト化のどちらか）抗体または抗体断片は、適切な抗原に対し、良好な結合親和性を維持していた改変体を同定する目的で、選択され得る。なぜなら、抗体は、ファージまたはファージミド粒子の表面に存在するからである。例えば、Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（この内容は本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。任意のファージまたはファージミドディスプレイベクターが機能するが、本方法論には以下のようなベクターが有用である；ｆｄｔｅｔＤＯＧ、ｐＨＥＮ１、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ、ｐＲＬ４（図１を参照のこと）またはｐＲＬ５（図２を参照のこと）。例えば、Ｆａｂ断片の場合、Ｆｄ産物の軽鎖および重鎖は、ｌａｃプロモーターの制御下にあり、それぞれの鎖は、細菌宿主のペリプラズム部分に指向させるために、その鎖に融合するリーダー信号を有する。この間隙において、抗体断片を正確にアセンブルすることができる。重鎖断片は、ファージ被膜タンパク質ドメインとの融合体として発現し、これは、アセンブルした抗体断片を、新たに作られたファージ粒子またはファージミド粒子の被膜に組み込ませる。新しいファージミド粒子の産生は、必要なファージ遺伝子全てを含むヘルパーファージの付加を必要とする。一旦、抗体断片のライブラリーがファージまたはファージミド表面に提示されると、選別と呼ばれる過程が続く。これは、ｉ）ファージ粒子またはファージミド粒子の表面上に提示される抗体が望ましい抗原に結合し、ｉｉ）非結合抗原は洗い流され、ｉｉｉ）結合した粒子は抗原から溶出され、そしてｉｖ）溶出された粒子はさらなる選択のために富化されたプールを増幅するために、新鮮な細菌宿主に晒される、方法である。代表的に、特異的な結合について抗体クローンをスクリーニングする前に、三回または四回の選別が行われる。この方法において、ファージ／ファージミド粒子は、結合表現型（抗体）を遺伝子型（ＤＮＡ）と連結させ、抗体ディスプレイ技術の使用を非常に成功させている。しかし、他のベクター形式が、ハイブリダイゼーション過程に使用され得る；選択および／またはスクリーニングのための、抗体断片ライブラリーの、溶解ファージベクター（改変Ｔ７系またはＬａｍｂｄａ  Ｚａｐ系）へのクローニングなど。
【００７１】
望ましい設計抗体および／または設計抗体断片の選択の後、これらが当業者に公知の任意の技術（例えば、インビトロ合成、組換えＤＮＡ産生などの技術）により、大量に産生され得ることが企図される。例えば、抗体または断片は、抗体重鎖をコードするオペロンを含む発現ベクターを構築するための、従来の技術を使用することで産生され得る。この抗体重鎖において、ＣＤＲ、およびドナー抗体結合特異性を保持するために必要とされる可変領域フレームワークの最小部分（本明細書中で記載された技術に従って設計される）は、起源の種の抗体由来であり、かつ抗体の残りの部分は標的種免疫グロブリン由来である。この標的種免疫グロブリンは、本明細書中に記載されたとおりに操作し得、それにより抗体重鎖発現のためのベクターを産生する。
【００７２】
さらに、抗体軽鎖をコードするオペロンを含む発現ベクターが、構築され得る。この抗体軽鎖において、１つ以上のＣＤＲ、およびドナー抗体結合特異性を保持するために必要とされる可変領域フレームワークの最小部分（本明細書中で記載されたように設計される）は、起源の種の抗体由来であり、かつ抗体の残りの部分は標的種免疫グロブリン由来である。この標的種免疫グロブリンは、本明細書中に提供されるとおりに操作され得、それにより抗体軽鎖の発現のためのベクターを産生する。
【００７３】
次いで、発現ベクターは、従来の技術によって適切な宿主細胞へ移入されて、設計抗体または抗体断片の発現のためのトランスフェクションされた宿主細胞を産生し得、移植され得る。次いで、トランスフェクションされた宿主細胞は、当業者に公知の任意の適切な技術を使用して培養されて、抗体または抗体断片を産生する。
【００７４】
特定の実施形態において、宿主細胞は、２つの発現ベクターを共トランスフェクションされ得る。第一ベクターは、重鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを含み、第二ベクターは、軽鎖由来ポリペプチドをコードするオペロンを含む。この２つのベクターは、異なる選択マーカーを含み得るが、重鎖および軽鎖をコードする配列は除いて、好ましくは同一である。この手順は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現を提供する。あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターが使用され得る。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたはその両方を含み得る。
【００７５】
特定の実施形態において、抗体または抗体断片の発現に使用される宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような細菌細胞、または好ましくは真核細胞のどちらかでもよい。好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞または２９３ＥＢＮＡのような哺乳動物細胞が、使用され得る。発現ベクターの選択は、宿主細胞の選択に左右され、選択された細胞において望ましい発現および調節特性を有するように選択され得る。
【００７６】
一旦産生されると、設計抗体または設計抗体断片は、以下を含む当該技術分野の標準的手順により精製され得る；交差フローろ過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、アンモニウムスルフェート沈殿、アフィニティカラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動など。
【００７７】
本明細書において言及される場合、「抗ＰＤＧＦ抗体」は、ＰＤＧＦに特異的に結合する免疫グロブリン分子である。好ましくは、ある実施形態において、この分子はＰＤＧＦのＢＢ形態に結合する。別の実施形態においては、この分子はＰＤＧＦのＤＤ形態に結合する。本発明の抗ＰＤＧＦ抗体は、好ましくはマウスまたはヒトのモノクローナル抗体のような、モノクローナル抗ＰＤＧＦ抗体である。好ましい実施形態においては、この抗体はヒト化マウス抗体である。抗体は、軽鎖−重鎖免疫グロブリン四量体または抗原結合活性を保有するその断片を指すと、理解され得る。ある実施形態において、この用語はまたＴ細胞レセプターなどを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーをいい、これらは選択的にＰＤＧＦに結合するように選択され、設計されまたは取得され得る。ヒト化抗ＰＤＧＦ抗体は、本明細書中に記載された新規な方法、または、一旦明らかにされた後は、従来の技術によって、調製され得る。
【００７８】
モノクローナル抗ＰＤＧＦ抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の調製プロセスは、例えば、以下の工程を包含する；１つ以上のＰＤＧＦポリペプチドもしくはその抗原断片、またはＰＤＧＦポリペプチドを含む抗原性キャリアを用いて適切な哺乳動物（例えばＢａｌｂ／ｃマウス）を免疫する工程；免疫化哺乳動物の抗体産生細胞を、適切な骨髄腫細胞株と融合させる工程、融合によって得られたハイブリッド細胞をクローニングする工程、および望ましい抗体を分泌する細胞クローンを選択する工程。例えば、ＰＤＧＦで免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を、骨髄腫細胞株ＰＡｌまたは骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合させて、得られたハイブリッド細胞を、望ましい抗体の分泌についてスクリーニングし、ポジティブなハイブリドーマ細胞をクローン化する。
【００７９】
１つの実施例において、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１μｇと１００μｇとの間のＰＤＧＦおよび（フロイントアジュバントのような）適切なアジュバントの、数回（例えば４〜６回）、数ヶ月にわたる（例えば二ヶ月と四ヶ月との間）皮下および／または腹膜への注射により免疫し、そして、免疫したマウスの脾臓細胞は最後の注射より二日から四日後に摘出し、融合プロモーター（好ましくはポリエチレングリコール）存在下で骨髄腫細胞株ＰＡｌ細胞と融合させる。好ましくは、骨髄腫細胞は、３から２０倍過剰な免疫マウス由来脾臓細胞と、約３０％から約５０％のポリエチレングリコール（分子量約４０００）含有溶液中で融合させる。融合の後、これらの細胞は、本明細書中で前に記載されたような選択培地によって補充された適切な培養培地（例えば、ＨＡＴ培地）に、定期的な間期において、通常の骨髄腫細胞を望ましいハイブリドーマ細胞の過成長から防ぐために、広げられる。
【００８０】
本発明に従う抗体の産生のために好ましい技術としては、ＰＤＧＦで免疫した動物から抗体ドメインまたはその抗原性断片をインビトロで単離する技術、およびこのようなドメインを使用して、構築された合成ライブラリーから抗体を選択する技術が挙げられる。
【００８１】
ＲＮＡは、免疫したマウスの脾臓細胞および骨髄細胞から、例えば、Ｔｒｉ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）の使用によって、得られ得る。代替の方法も、当該分野で公知であり、使用され得る。これらの方法の例としては、以下が挙げられる：グアニジンチオシアネート処理後の単離およびセシウムクロライド密度勾配遠心分離（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５２９４−５２９９，１９７９）ならびにベルニエジウム化合物のようなリボヌクレアーゼ阻害剤の存在下での界面活性剤処理、それに続くフェノール処理（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，５１４３−５１４９，１９７９）。
【００８２】
ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡを得る目的で、ＲＮＡに相補的な一本鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が、鋳型としてＲＮＡを使用し、そして、３’末端のポリＡ鎖に相補的なおよびオリゴ（ｄＴ）をプライマーとして使用する逆転写酵素処理により、合成され得る（Ｌａｒｒｉｋ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９３４−９３８，１９８９）。さらに、ランダムプライマーも、この際に使用し得る。ｃＤＮＡ合成のためのキットは、当該分野において広く利用可能である。
【００８３】
マウス抗体Ｖ領域遺伝子の特異的増幅は、上述のｃＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を使用して行われ得る。Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，またはＪｏｎｅｓ，Ｓ．Ｔ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８８−８９，１９９１において記載されているようなプライマーは、マウス抗体Ｖ領域遺伝子の増幅に使用され得る。ＰＣＲはまた、遺伝子特異的プライマーによって行われ得る。Ｖ領域遺伝子を増幅する代替の方法は、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」および「Ｎｅｓｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ａ  Ｈａｉｒｐｉｎ  Ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」と題された、共有に係る出願において記載される。これらは両方とも、２００１年９月１９日に出願され、本明細書中に参考として援用される。
【００８４】
Ｖ領域遺伝子は、ファージもしくはファージミド、または別の適切な選択系の中にクローン化され、ＰＤＧＦ抗原に対する選択のためのライブラリーとして提示され得る。ライブラリー構築およびパニング技術は、当該分野において周知である。
【００８５】
ＰＤＧＦに特異的な抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸はまた、酵素的または化学的に合成された、原物に忠実な核酸配列を有する核酸（例えば、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン、あるいはその変異体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。原物に忠実な核酸の変異体は、上述の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸であり、ここで１つ以上のアミノ酸が、欠失されるか、または１つ以上の他のアミノ酸と置換されている。好ましくは、上述の改変は、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲの外側にある。こうした変異核酸はまた、サイレント突然変異体も意図する。この場合、１つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドと置換して、新しいコドンは同じアミノ酸をコードする。このような変異体配列には、縮重配列もある。縮重の配列は、元々コードされていたアミノ酸配列の変化をもたらさずに、ヌクレオチドが数に限りなく他のヌクレオチドと置換されるという、遺伝コードの意味の範囲内で縮重される。このような縮重配列は、その異なった制限部位および／または特定コドンの頻度に起因して、重鎖マウス可変ドメインおよび／または軽鎖マウス可変ドメインの最適の発現を得るために有用であり得、これらは特異的な宿主（特にＥ．ｃｏｌｉ）に好まれる。
【００８６】
用語変異体は、当該分野に公知の方法に従って、原物に忠実な核酸配列のインビトロでの突然変異誘発によって得られる核酸変異体を含むことを意図する。完全な四量体免疫グロブリン分子のアセンブリおよびキメラ抗体の発現のために、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードする組換えヌクレオチド挿入物は、重鎖定常ドメインおよび軽鎖定常ドメインをコードする、対応する核酸と融合され、次いで例えばハイブリッドベクターに組み込まれた後に、適切な宿主に転移される。
【００８７】
ヒト定常ドメイン
【００８８】
【化１】
2005512962.tif 000002
（ｙ）（例えば、ｙ１、ｙ２、ｙ３またはｙ４、好ましくは、ｙ１またはｙ４）と融合された抗ＰＤＧＦ抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードする挿入物を含む組換え核酸は、当業者によって本開示に従って構築され得る。同様に、ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκと融合されたＰＤＧＦに特異的な抗ＰＤＧＦ抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードする挿入物を含む組換え核酸もまた、構築される。さらに、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインがスペーサー群を介して連結される、組換えポリペプチドをコードする組換え核酸が、構築され得る。この核酸は、宿主細胞において抗体のプロセシングを促進するシグナル配列、ならびに／あるいは抗体の精製を容易にするペプチドをコードする核酸、および／または切断部位をコードする核酸および／またはペプチドスペーサーおよび／またはエフェクター分子をコードする核酸を、必要に応じて含み得る。エフェクター分子をコードする核酸は、診断的適用および治療的適用に有用であり得る。従って、毒素または酵素（特に、プロドラッグの活性化を触媒し得る酵素）であるエフェクター分子が、特に示される。このようなエフェクター分子をコードする核酸は、天然に存在する酵素または毒素の配列、あるいはそれらの変異体の配列を有し、そしてこれは、当該分野に周知の方法で調製され得る。
【００８９】
一旦、マウス抗体、ウサギ抗体またはヒト抗体が同定されると、キメラまたは再形成された抗体が調製され得る。キメラ抗ＰＤＧＦ抗体は、マウスまたはウサギのＶ領域の連結によって得られ得、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡをパニングし、次いでそれらを発現させることによって同定される。
【００９０】
キメラ抗体を産生する基本的な方法は、クローン化されたｃＤＮＡにおけるマウスまたはウサギのリーダー配列および可変領域配列と、哺乳類細胞発現得ベクターに既に存在するヒト抗体定常領域をコードする配列を連結させる工程を包含する。ヒト抗体定常領域は、任意のヒト軽鎖定常領域またはヒト重鎖定常領域であり得、これらの例としては、ヒト軽鎖Ｃｋまたはヒト重鎖ｙＣ１またはｙＣｒ４が挙げられる。可変領域遺伝子および定常領域遺伝子は、さらに重複ＰＣＲによって結合し得、そして、このように産生された遺伝子は、選択のためのファージディスプレイベクターにクローニングされる。
【００９１】
キメラ抗体を産生するため、マウスまたはウサギの軽鎖可変領域およびヒト軽鎖定常領域を、適切なエンハンサー／プロモーターのような発現制御領域の制御下にコードするＤＮＡを含む発現ベクター、ならびにマウスまたはウサギの重鎖可変領域およびヒト重鎖定常領域をまた、発現制御領域の制御下にコードするＤＮＡを含む発現ベクターが、使用され得る。哺乳動物細胞のような宿主細胞は、これらの発現ベクターを同時に形質転換され、形質転換された宿主はキメラ抗体を産生させるために、培養される（例えば、ＷＯ９１／１６９２８を参照のこと）。
【００９２】
あるいは、マウスまたはウサギの軽鎖可変領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡ、ならびにマウスまたはウサギの重鎖可変領域およびヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡは、１つの発現ベクター中に導入され得、宿主細胞はこのベクターを使用して形質転換され、この形質転換された宿主は望ましいキメラ抗体を産生するために培養される。
【００９３】
マウス抗体またはウサギ抗体由来のＣＤＲは、選ばれたヒトフレームワーク、例えば、適切なオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲによりヒト配列を変異させたフレームワークのようなフレームワークの中に、移植される。同時に、バリエーションがフレームワークおよび／またはＣＤＲ配列へ導入され得る。例えば、結合部位のコンフォメーションに影響を与えることが公知であるＦＲ残基またはＣＤＲ残基が、変えられ得る。露出されることが公知の残基は、好ましくは、より公知の配列またはコンセンサスヒト配列へ変異される。こうした変異は、それぞれ個々に作用され、または１つ以上の他のものと一緒に作用して、抗ＰＤＧＦマウスＶ領域遺伝子およびヒト抗体フレームワーク（しかしこれらに導入された変異を含む）から選択されたＣＤＲに基づく、さらなる抗体ライブラリーの産生を導く。特に有利な特徴を有する抗体が、例えば上で示された選択手順を使用して、このようなライブラリーから選択され得る。
【００９４】
極めて好ましい、Ｃ１（マウス）、Ｅ１およびＢ１（ヒト化）と呼ばれるマウスモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、図に示される。Ｃ１は、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢで免疫されたマウス由来のＶＨ領域およびＶＬ領域の増幅によって作製されたマウス抗体ライブラリーからの選択によって同定される。ヒト化を上に記載されたように行った。従って、ある実施形態においては、本明細書におけるＰＤＧＦ抗体は、本明細書中に示されたマウスＣ１抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含む。好ましくは、少なくともＣＤＲ３は、Ｃ１抗体由来である。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、ヒト抗体の優先に従って変えられ得、そして、例えばその結果により生じたライブラリーをパニングすることにより、適切な抗体が、選択される。同様に、結合部位のコンフォメーションに影響することが公知であるフレームワーク残基は変えられ得、成功した抗体は選択される。
【００９５】
本明細書中に記載される抗体は、本明細書中に示したように、Ｂ１抗体またはＥ１抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含み得る。必要に応じて、２つもしくは三つのＣＤＲが、前述の抗体に由来され得る。ＣＤＲは全て同一の抗体由来であり得るか、また異なる抗体由来であり得る。無論、ＣＤＲは、上で記載したように導入される１つ以上の変異を含み得ることが理解される；このような変異ＣＤＲは、本明細書で使用されるように、用語「由来する」に含まれる。
【００９６】
抗ＰＤＧＦ抗体または抗ＰＤＧＦ抗体断片は、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体のような、他の抗体（またはそれらの部分）との結合または接着に使用され得る。これら他の抗体は、触媒抗体であり得、そして／または抗体に対する疾患について特徴的な他のマーカー（エピトープ）に反応し得る。この疾患は、抗体が関連する疾患、または抗体が、例えば、標的種の分子または細胞（例えば、レセプター、標的タンパク質、疾患細胞など）を補充するために選ばれた異なった特異性を有し得る疾患である。抗体（またはその部分）は、このような抗体（またはその部分）を、別々に投与される組成物としてか、あるいは、定型的な化学的方法または分子生物学的方法により結合される２つの薬剤を含む単一の組成物として、投与され得る。さらに、この抗体の診断上の価値および治療学的な価値が、検出可能なシグナル（インビトロまたはインビボのどちらか）を産生する標識、または治療特性を有する標識で抗体を標識することによって増強され得る。いくつかの標識、例えば、放射性ヌクレオチド（ｒａｄｉｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は、検出可能シグナルを産生し得、また治療特性を有し得る。放射性ヌクレオチド標識の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ，１４Ｃが挙げられる。他の検出可能な標識の例としては、蛍光顕微鏡検査のための緑色蛍光タンパク質、フルオレセイン、フィコビリプロテイン（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）またはテトラエチルローダミンのような蛍光クロモスフィア（ｃｈｒｏｍｏｓｐｈｅｒｅ）、蛍光、吸光度、可視色によって検出するための蛍光もしくは有色産物を生成する酵素、または電子顕微鏡検査の実証のための電子密集産物を生成する凝集；あるいは直接または間接の電子顕微鏡検査可視化のためのフェリチン、ペルオキシダーゼまたは金ビーズのような電子密集分子が挙げられる。
【００９７】
本明細書中における抗ＰＤＧＦ抗体または抗ＰＤＧＦ抗体断片は、代表的に、薬学的キャリアを含む組成物において患者に投与され得る。薬学的キャリアは、モノクローナル抗体を患者に送達するのに適した、適合性の、非毒性の任意の物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス、不活性固体が、キャリアの中に含まれ得る。薬学的に受容されたアジュバント（緩衝剤、分散剤）も、薬学的組成物に組み込まれ得る。組成物は完全な抗体および抗体断片の両方を含み得ることが、理解されるべきである。
【００９８】
本開示に従って設計（操作）された抗体および／または断片組成物は、種々の方法で患者に投与され得る。好ましくは、薬学的組成物は、非経口（例えば、皮下、筋肉内、硬膜外または静脈内）で投与され得る。従って、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与のための組成物は、抗体、抗体断片、またはその混合物を受容可能なキャリア（好ましくは、水溶性キャリア）に溶かした溶液を含み得る。種々の水溶性キャリア（例えば、水、緩衝液、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなど）が使用され得る。これらの溶液は、滅菌され、通常は粒状物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌され得る。組成物は、生理学的状態に近づけるのに必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど）を、含み得る。これらの処方物における抗体および抗体断片の濃度は、例えば、約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１重量％または少なくとも約１重量％から１５重量％もしくは２０重量％程度まで非常に広く変動し得、そして主として流体の体積、粘性などに基づいて、選択された特定の投与様式に従って、選択可能である。
【００９９】
脳の癌の場合においては、本明細書で記載されたような薬学的組成物は、好ましくは血液脳関門を越え得る。例えば、組成物は、以下のような脳標的化部分を含み得る：抗インスリンレセプター抗体（Ｃｏｌｏｍａら（２０００）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １７：２６６−７４）、抗トランスフェリンレセプター抗体（ＺｈａｎｇおよびＰａｒｄｒｉｄｇｅ，（２００１）Ｂｒａｉｎ  ｒｅｓ  ８８９：４９−５６）または活性化Ｔ細胞（Ｗｅｓｔｌａｎｄら，（１９９９）Ｂｒａｉｎ  １２２：１２８３−９１）。あるいは、ブラジキニンのような血管作用性ペプチドの使用、または浸透圧性ショックのような他の技術による脈管構造の改変を生じる技術（以下において論評されている：Ｂｅｇｌｅｙ，（１９９６）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４８：１３６−４６；Ｎｅｕｗｅｌｔら，（１９８７）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ２０：８８５−９５；Ｋｒｏｌｌら，（１９９８）Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  ４３：８７９−８６；Ｔｅｍｓａｍａｎｉら，（２０００）Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ３：１５５−１６２）が、使用され得る。
【０１００】
さらなる局面において、本明細書中で前に規定されるような、疾患の処置における使用のための抗体および／または抗体断片が提供される。その結果、神経細胞増殖または本明細書中に言及される任意の他の状態に関連する疾患の処置用の、医薬の製造のための、本発明の抗体の使用が提供される。本明細書中で記載されるような抗体または抗体断片で処置され得る癌としては、以下が挙げられる：神経芽腫、感覚上皮腫、髄膜腫、ユーイング肉腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、カポージ肉腫、中皮腫および中皮腫細胞株、絨毛上皮腫、膵臓癌、胃癌、骨肉腫、食道癌、線維肉腫、原発性ヒト肺癌における悪性上皮細胞、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、傍神経節腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、ＮＯＳ肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、および子宮間質肉腫、乳癌、結腸直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性線維組織球腫、平滑筋細胞腫瘍、前立腺癌。本明細書中に記載される抗体または抗体断片は、他の治療剤との組み合わせにおいて使用され得ることが、企図される。ＰＤＧＦ−βレセプターを介するシグナル伝達の遮断は、腫瘍における間質性の高血圧（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）を軽減させ、薬物の取り入れを増加させる（例えば、Ｐｉｅｔｒａｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１，２９２９−３４（２００１）を、参照のこと）。
【０１０１】
非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法および被験体への投与に必要な調節は、当業者に公知または明らかであり、より詳細には、例えば、以下に記載されている：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  第１７版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８５）（これは本明細書中に参考として援用される）。
【０１０２】
後述の実施例は、例示の目的で提供され、本明細書中に記載される任意の発明の特定事項を限定するように判断されるべきではない。
【実施例１】
【０１０３】
（ウサギＦ３抗体のヒト化）
（Ｉ．ウサギＦ３抗ＰＤＧＦ抗体の産生）
（ウサギの免疫）
一匹のＮＺＷウサギを、組換えヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ−ＢＢ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で免疫した。フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中の１５ｍｇＰＤＧＦ−ＢＢを、ウサギ後肢の５から６箇所に渡って皮下投与した。最初の注射から３週間後および６週間後に、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中の同じ用量のＰＤＧＦ−ＢＢを使用して、注射を繰り返した。ウサギは、１回目および３回目の注射に先立って採血した。その血清をＥＬＩＳＡにおいて使用し、ウサギの抗ＰＤＧＦ抗体反応をモニタリングした。３回目の注射の５日後、ウサギを屠殺し、脾臓、骨髄、および末梢血リンパ球を採取した。ＲＮＡを、Ｔｒｉ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ）を使用して、製造業者の指示に従って単離した。第一鎖ｃＤＮＡを、「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ」をオリゴ（ｄＴ）プライミング（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｒｏｃｈｖｉｌｌｅ，ＭＤ）と共に使用して、製造業者の指示に従って、合成した。
【０１０４】
（抗体ライブラリーの構築および選択）
ウサギＶＬ領域およびＶＨ領域を、第一鎖ｃＤＮＡから、重鎖および軽鎖の以下に記載されるプライマーを使用する２０サイクルのＰＣＲにより、増幅した：Ｂａｒｂａｓ，ＣＦら，Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。続けて、融合ＰＣＲ反応を行い、単一Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を作製した。これにより、ＶＬおよびＶＨは、以下の配列５’ｇｇｔｇｇｔｔｃｃｔｃｔａｇａｔｃｔｔｃｃ３’（配列番号１）を有する２１ｂｐのリンカーで結合された。ｓｃＦｖ断片は、ファージミドベクターｐＲＬ４中に、制限酵素ＳｆｉＩを使用してクローン化した。ＥＲ２５３７細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）中への形質転換が、６×１０７個の独立したクローンのライブラリーを生じた。ライブラリーは固定化組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に対し、４回選別した。マイクロタイターウェルを、１ラウンドおよび２ラウンドにおいて５００ｎｇ抗原／ウェルで、そして３ラウンドおよび４ラウンドにおいては２５０ｎｇ抗原／ウェルでコートした。ウェルを、０．５％Ｔｗｅｅｎ含有のＴＢＳで、１ラウンドには３回、２ラウンドには５回、後の２ラウンドでは１０回、洗浄した。残留した抗体−ディスプレイ粒子を、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ含有の０．１Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ２．２）を用いて溶出し、続けて２Ｍ  Ｔｒｉｓで中和した。ラウンド４の後で得られたクローンを、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する結合について、固相ＥＬＩＳＡにおいて試験した。
【０１０５】
（ＰＤＧＦ  ＥＬＩＳＡ）
高度タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ）を、１００ｎｇの組換えＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）中、４℃で一晩コートした。プレートを、１％ＢＳＡで３７℃にて１時間ブロックし、続けてＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ溶液で３回洗浄した。Ｅ．Ｃｏｌｉ培養上清または精製した抗体を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中種々の濃度で加え、２時間、３７℃で振とう機に置いた。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回の洗浄の後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中１：１０，０００の希釈で抗ＨＡ一次抗体（１２ＣＡ５腹水）を加え、２時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に２時間インキュベーションした。インキュベーションの後、これらのプレートを、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＮＰＰ緩衝液（１０ｍＭジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣＬ２（ｐＨ９．５））中Ｓｉｇｍａ１０４基質の添加後の発色を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＯＤ４０５で決定した。強いＥＬＩＳＡシグナルを実証する抗ＰＤＧＦ抗体を、ＰＤＧＦ−ＢＢサイトカインとの結合についてそのうちどれがＰＤＧＦ−βレセプターと競争し得るかを決定するため、下に記載するようにさらなる分析について同定した。
【０１０６】
（抗体精製）
Ｈｉｓ６精製タグをを含む候補ｓｃＦｖを、トランスフェクトした細胞培養物のペリプラズム調製物から、Ｎｉ−カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。ペリプラズム画分は、２０％ショ糖含有３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）の細菌ペレットへの２０分間の添加により得た。上清を９０００ｇで１０分間、４℃にて遠心分離した。上清を氷上に置き、そしてペレットを滅菌冷水に再懸濁し、１０分間氷上に置いた。１０，０００ｇでの遠心分離後、上清をショ糖上清と合わせ、１２，０００ｇにて２０分間遠心分離した。０．２Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾール中、ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を調製し、混合物に加えた。ろ過後、ペリプラズム画分を、Ｎｉ−ｃｈａｒｇｅｄ  ５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にロードした。この精製工程に使用した洗浄緩衝液には、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４，０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  イミダゾールを含め、ｐＨ７．４に調整した。溶出緩衝液には、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４，０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび５００ｍＭ  イミダゾールを含め、ｐＨ７．４に調整した。１ｍｌの画分を回収し、高められたＯＤ２８０値を持つこの画分をプールし、そしてＰＢＳ緩衝液で透析した。
【０１０７】
（競合ＥＬＩＳＡ）
ウサギｓｃＦｖのＰＤＧＦ−ＢＢサイトカインへの結合をめぐってＰＤＧＦ−βレセプターと競争する能力を、競合アッセイにおいて決定した。ｓｃＦｖｓの、ＰＤＧＦ−ＢＢサイトカイン上の標的エピトープへの結合は、プレート上にコートされたＰＤＧＦレセプターへのＰＤＧＦ−ＢＢ結合を防ぐ。高タンパク質結合９６ウェルプレートを、１０ｎｇ／ウェルの組換えヒトＰＤＧＦレセプターβ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）含有ＰＢＳで、一晩４℃でコートした。これらのプレートを、５％ショ糖／１％ＢＳＡ／ＰＢＳで一時間３７℃でブロックした。精製した抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の一連の希釈物を、ブロックして洗浄したプレートに添加する前に、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢと一緒に室温で３０分間インキュベートした。室温で２時間後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、続けてビオチン化抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）と共に室温でさらに２時間インキュベーションした。次に、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）をプレートに加え、室温で３０分間インキュベーションした。プレートを、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＮＰＰ緩衝液に懸濁したＳｉｇｍａ  １０４基質を、最後の洗浄工程後に加え、そしてＯＤ４０５でシグナルを決定した。競合アッセイの結果は、Ｆ３クローンがＰＤＧＦ−ＢＢ標的レセプターへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合を阻害したことを示した。次いで、Ｆ３を、ヒト化のために選択した。
【０１０８】
（ＩＩ．Ｆ３抗体のヒト化）
（相同ヒト配列の選択）
Ｆ３の変異遺伝子（ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３）を、ＶＢａｓｅヒト生殖系列配列データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）に対して並列した。Ｆ３変異配列に対し最高のヌクレオチド相同性を有する一組のヒト生殖系列遺伝子が、同定された。図３ａ〜図３ｂを参照のこと。これらの配列を、ウサギ遺伝子とヒト遺伝子との間のアミノ酸相同性の決定により、さらに分析し、重鎖配列ＤＰ−７７／ＷＨＧ１６＋および軽鎖配列ＤＰＫ４／Ａ２０＋を、Ｆ３のヒト化において使用される生殖系列Ｖ遺伝子として、同定した。
【０１０９】
ヒト化に使用されるヒトＦＲ４配列を、Ｋａｂａｔ免疫グロブリンデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ  に在り）を用いた、Ｆ３配列のアミノ酸相同性に基づいて同定した。同定された配列は、ＫａｂａｔＩＤ：００４９２７およびＩＤ：００７８４であった。
【０１１０】
（重要フレームワーク残基の同定）
ＶＨ／ＶＬ境界またはＣＤＲループコンフォメーション（ベルニエ領域）に含まれることが報告されているフレームワーク残基位置を、同定した。下の表１の特定の重要残基のリストを参照のこと。これらの位置のうち、４つはヒト配列とウサギ配列との間で非相同なアミノ酸を、軽鎖において有し、８つは重鎖において非相同であった。これらのフレームワーク残基を多様化のための標的とし、ヒト化抗体遺伝子の構築の際に、これらの位置において、ウサギとヒトとの間で選択を行った。図３ａおよび図３ｂの下線で示されたフレームワーク残基を参照のこと。しかしながら時々、これらの２つのアミノ酸のコードにおいて、縮重したコードが原因で、さらなる選択が、結果として生じた。軽鎖におけるさらなる位置（残基６３）を、多様化の標的とした。なぜなら、この位置は、Ｋａｂａｔデータベース由来の、近縁に関連するウサギ配列において、高度に保存的であったからである。表面露出残基について、いくらかにおいて考慮したが、割り当ては、使用した参照に依存して変わる（Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，ｐｐ８０５−８１４．Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５，ｐｐ９５９−９７３．）。一般に、ヒトの表面残基は、ヒト化抗体の起こり得る免疫原性を避けるために維持することが望ましい。しかし、ある表面に露出している残基は、ＶＨ／ＶＬ境界またはベルニエ領域とも呼ばれる（例えば、ＨＣ残基９１）。この場合、ウサギまたはヒトの選択は、まだ与えられる。
【０１１１】
【表１】
2005512962.tif 000003
2005512962.tif 000004
（オリゴヌクレオチド設計）
ＶＬまたはＶＨ遺伝子をコードする一連のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ遺伝子アセンブリに使用するための、重複領域を含むように設計した（図４ａ、４ｂ）。オリゴヌクレオチドは、長さにして８０から１００塩基対であり、アミノ酸選択ができるように、設計位置に縮重を含んだ。さらに、オリゴヌクレオチドの対を、ヒトまたはウサギのＣＤＲ１の選択を提供するように設計した。例えば、「オリゴヌクレオチド２ＨＣ」は、ヒトＣＤＲ１を提供し、「オリゴヌクレオチド２ｂＨＣ」はウサギＣＤＲ１を生じる。ＣＤＲ２およびＣＤＲ３におけるアミノ酸残基は、ウサギのアミノ酸残基のみで維持した。完全なオリゴヌクレオチドアセンブリの生成物は、重要なフレームワーク位置において縮重アミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１にＣＤＲ選択を含むヒト化Ｆ３可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）ライブラリーをコードする。この実施例において、ヒトＣＤＲと非ヒトＣＤＲとの間の選択は、ＣＤＲ１についてのみしか与えなかったが、他の場合のヒト化には、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の双方において選択を有し得ることが望ましい。
【０１１２】
（ヒト化Ｆ３抗体ライブラリーの合成アセンブリ）
ヒト化Ｆ３ライブラリーのＶＨおよびＶＬドメインを、連続ＰＣＲ反応により、構築した。ＰＣＲにより組み立てられたＶＨおよびＶＬ配列を、それぞれの完全ヒト定常領域と融合させ、そして、軽鎖および重鎖を、ヒト化Ｆ３  Ｆａｂ挿入部分への重複伸長ＰＣＲにより、結合させた（図６ａ−６ｇ）。
【０１１３】
工程１：
オリゴヌクレオチド（それぞれ６０ｐｍｏｌ）を、下の表で示されたように、ＰＣＲ重複伸長のためにＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、結合させた。
【０１１４】
【表２】
2005512962.tif 000005
反応混合物を９４℃で加熱し、１５回の熱サイクル（９４℃を１５秒、４８℃を３０秒および７２℃を４５秒）をかけ、続けて７２℃で２分、そして４℃で保温した。反応生成物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、回収した。ＤＮＡ生成物を、ＯＤ２６０により定量した。
【０１１５】
工程２：
工程１のＰＣＲ生成物を、下の表に従い、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いたＰＣＲによって、さらなるアセンブリのために結合した。それぞれのＰＣＲ生成物の対は、アニーリングおよびポリメラーゼによる重複伸長に必要な重複領域を有していた。伸長生成物は、下の表で詳述されるように加えられたフランキングプライマーオリゴヌクレオチドにより、増幅させ得た。工程２におけるＰＣＲ生成物＃５は、工程１におけるＰＣＲ生成物Ｖと同じであり、さらなるＰＣＲ増幅は必要ないことに留意されたい。反応混合物を、９４℃で加熱し、１５回の熱サイクル（９４℃を１５秒、４８℃を３０秒および７２℃を４５秒）をかけ、続けて７２℃で２分、そして４℃で保温した。反応生成物を、エタノール沈殿により回収し、１％ＬＭＰゲル上を泳動した。望ましい増幅生成物を示すバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１１６】
【表３】
2005512962.tif 000006
【０１１７】
【表４】
2005512962.tif 000007
工程３：
工程２からのＰＣＲ生成物を、下の表に従い、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いたＰＣＲによって、工程２において記載されたように、さらなるアセンブリのために結合させた。これらのＰＣＲ生成物は、構築されたＶＬおよびＶＨ遺伝子である。
【０１１８】
【表５】
2005512962.tif 000008
【０１１９】
【表６】
2005512962.tif 000009
工程４：
κ定常領域または重鎖ＣＨ１ドメインをコードする断片を、抗破傷風毒素κ軽鎖遺伝子およびＦｄ重鎖遺伝子を含むベクター、ｐＲＬ−ＴＴのＰＣＲ増幅により産生した。軽鎖定常領域増幅のために使用されたプライマーにより、ＬＣ定常領域の３’末端に、重鎖遺伝子のベクター由来の調節領域を組み込んだ。ＬＣ定常領域増幅に使用されたプライマーは、ＨｋＣ−Ｆ  ５’ＣＧＧＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣ３’（配列番号２）およびＬｅａｄ  Ｂ  ５’ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣ３’（配列番号３）である。重鎖ＣＨ１増幅に使用したプライマーにより、ＣＨ１ドメインの３’末端に、後のクローニングに必要な制限酵素切断部位のような、ベクター由来のエレメントを、組み込んだ。ＨＣ  ＣＨ１定常領域増幅に使用されたプライマーは、ＨｌｇＧＣＨ１−Ｆ  ５’ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＧＧＴＣ３’（配列番号４）およびＮ−ｄｐ  ５’ＡＧＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＡＣＧＴＣＧＴＡＣＧＧ３’（配列番号５）であった。定常領域配列は、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、増幅した。ｐＲＬ４ＴＴ、ｄＮＴＰ、反応緩衝液およびそれぞれのプライマーセット（軽鎖のためにＨＫＣ−Ｆおよびｌｅａｄ  Ｂ；重鎖のためにＨｌｇＣＨ−ＦおよびＮ−ｄｐ）を含むＰＣＲ反応混合物を、調製した。反応混合物を、９４℃で加熱し、１５回の熱サイクル（９４℃を１５秒、４８℃を３０秒および７２℃を９０秒）をかけ、続けて７２℃で２分、そして４℃で保温した。反応生成物を、エタノール沈殿により回収し、１％ＬＭＰゲル上を泳動した。望ましい増幅生成物を示すバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１２０】
工程５：
工程３におけるＶＬ生成物（ＶＬａ−ｄ）を、工程４で全長軽鎖を産生する重複伸長ＰＣＲにより産生されたκ定常領域（Ｃｋ）生成物と結合させた。ＶＬ遺伝子の３’末端（センス鎖）および定常領域ＰＣＲ生成物（アンチセンス鎖）に位置する相補鎖によってＶＬおよびＣｋを融合させた。ＰＣＲ反応物は、ＶＬおよびＣＫ  ＤＮＡ、プライマーＲＳＣ−Ｆ  ５’ｇａｇｇａｇｇａｇｇａｇｇａｇｇａｇｇｃｇｇｇｇｃｃｃａｇｇｃｇｇｃｃｇａｇｃｔｃ３’（配列番号６）およびｌｅａｄ  Ｂ、ｄＮＴＰ、およびＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の反応緩衝液および酵素を含んだ。反応物を、９４℃で加熱し、１５回の熱サイクル（９４℃を１５秒、４８℃を３０秒および７２℃を４５秒）をかけ、続けて７２℃で２分、そして４℃で保温した。反応生成物を、エタノール沈殿により回収し、１％ＬＭＰゲル上を泳動した。望ましい増幅生成物を示すバンドを切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。
【０１２１】
上に軽鎖アセンブリのために記載されたのと同じ技術を使用して、工程３のＶＨ生成物（ＶＨａ−ｄ）を工程４のＣＨ１  ＰＣＲ生成物と融合させ、Ｆｄ重鎖断片を産生した。Ｆｄ生成物の増幅に使用されたプライマーは、ｌｅａｄＶＨ  ５’ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣ３’（配列番号７）およびＮ−ｄｐであった。
【０１２２】
工程６：
工程５において産生された軽鎖および重鎖Ｆｄ生成物を、重複伸長ＰＣＲによって結合させ、インフレームにＳｆｉＩ制限酵素切断部位、軽鎖遺伝子、リボゾーム結合部位、ｐｅｌ  Ｂリーダーを、２つ目のＳｆｉＩ制限酵素切断部位、Ｈｉｓ６エピトープタグ、ＨＡエピトープタグに続く重鎖Ｆｄ遺伝子と共に含むＦａｂ挿入部分を産生した。軽鎖定常領域は、ｐｅｌ  Ｂリーダーを含むように、ベクターからのＰＣＲにより作製された。重鎖Ｆｄ生成物もｐｅｌ  Ｂリーダーの一部を含むため、従って、軽鎖生成物との結合時には、２つの生成物はこの領域でアニールし得、そしてポリメラーゼによって伸長させ得、Ｆａｂ挿入部分全長を産生する。この挿入部分を、外側のプライマーＲＳＣ−ＦおよびＮ−ｄｐを使用して、さらに増幅した。
【０１２３】
ヒト化Ｆ３Ｆａｂ生成物を、ゲル精製し、上に記載されたように回収し、ＳｆｉＩ制限酵素で切断した。切断した断片を、再びゲル精製し、ＳｆｉＩ切断したクロラムフェニコール耐性ｐＲＬ４−ｓｓベクターの中にクローン化した。
【０１２４】
（ヒト化Ｆ３ディスプレイライブラリーの選択）
ヒト化Ｆ３Ｆａｂを提示するファージミドライブラリーを、固定化ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ抗原（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）に対する４回の選別（パニング）により選択した。１回目および２回目において５００ｎｇＰＤＧＦ−ＢＢ／ウェルを、マイクロタイターウェルをコートするために使用し、そして続けて３回目および４回目においては２５０ｎｇ抗原を、使用した。ライブラリーを、ＰＤＧＦ−ＢＢコートされたウェルに適用し、３７℃２時間で結合させた。非特異結合は、０．５％ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで、１回目には３回、２回目には５回、後の２回では１０回、洗い落とした。抗原コートされたウェルに残留した提示Ｆａｂは、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ含有の０．１Ｍ  ＨＣｌ  ｐＨ２．２で溶出し、続けて２Ｍ  Ｔｒｉｓで中和した。数回の選別の後、溶出されたＦａｂを担うファージミド粒子を、次の選別のためにファージミド粒子の富化プールを増幅する目的で、新鮮なＥＲ２５３７細菌細胞と混合させた。
【０１２５】
４回目選別の後、ヒト化Ｆ３抗体のＰＤＧＦ−ＢＢ抗原に結合する能力を、ＥＬＩＳＡにおいて査定した。高度タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ）を、１００ｎｇの組換えＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．６中で４℃で一晩コートした。プレートは１％ＢＳＡで３７℃１時間ブロックし、続けてＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。Ｅ．Ｃｏｌｉ培養上清または精製抗体を、種々の濃度で加え、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で２時間、３７℃で振とう機に置いた。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回の洗浄の後、ＰＢＳ／１％中１：１０，０００の希釈の抗ＨＡ一次抗体（１２ＣＡ５腹水）を加え、２時間インキュベートした。ウェルは、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に２時間インキュベーションした。インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ水溶液で３回、ＰＢＳ水溶液で３回洗浄した。Ｓｉｇｍａ１０４基質を含有するＰＮＰＰ緩衝液（１０ｍＭジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣＬ２，ｐＨ９．５）の添加後の発色は、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＯＤ４０５において決定した。図７を参照のこと。ＢＳＡと比較し、有意に高いＰＤＧＦ−ＢＢへの結合を示した３つのヒト化Ｆａｂ（Ｃ１１、Ｃ１２、およびＡ１２）を、さらに分析した。クローンの配列分析は、ＣＤＲ１の多様化の達成に成功したことを明らかにした。クローンＣ１１は、軽鎖および重鎖の両方において、ヒトＣＤＲ１を保持していた。クローンＡ１２およびＣ１２は、両方とも軽鎖ＣＤＲ１位置においてヒトＣＤＲを選択し、一方で重鎖ＣＤＲ１位置においてはウサギＣＤＲが両方のクローンによって選択された（図８ａおよび図８ｂ）。
【０１２６】
（ＩＩＩ．ＰＤＧＦレセプター競合アッセイ）
（抗体精製）
ｓｃＦｖ  Ｆ３精製のために上述されたように、Ｈｉｓ６精製タグを含むヒト化Ｆ３Ｆａｂ（Ｃ１１、Ｃ１２、およびＡ１２）を、トランスフェクションした細菌培養液のペリプラズム調整物から、Ｎｉ−カラムクロマトグラフィーを使用して精製した。精製されたＦａｂを、ＰＢＳ緩衝液で透析した。
【０１２７】
（競合ＥＬＩＳＡ）
ヒト化Ｆ３Ｆａｂ（Ｃ１１、Ｃ１２、およびＡ１２）のＰＤＧＦ−ＢＢサイトカインとの結合をめぐってＰＤＧＦ−ｂｂレセプターと競合する能力を、上述のように、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定した。競合アッセイの結果は、３つ全てのヒト化Ｆ３Ｆａｂ（Ｃ１１、Ｃ１２、およびＡ１２）が、親抗体ｓｃＦｖ  Ｆ３と同じく、ＰＤＧＦ−ＢＢが標的レセプターに結合するのを阻害していたことを明らかにした（図９）。これらの結果は、ヒト化Ｆａｂは、ウサギＦ３  ｓｃＦｖと同様の親和性を有することを示す。
【０１２８】
（ルシフェラーゼアッセイ）
ヒト化Ｆａｂ  Ｃ１１、Ｃ１２、およびＡ１２の、細胞ベースのアッセイにおいて、ＰＤＧＦ−ＢＢとそのレセプターとの間の相互作用を機能的に遮断する能力を、ルシフェラーゼアッセイを使用して決定する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢサイトカインに結合し得るマウスＰＤＧＦレセプターを発現する。ＰＤＧＦ−ｂレセプター活性化の程度を決定する目的で、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ｆｏｓプロモーター／ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクトでトランスフェクションする。サイトカインへの結合において、レセプターは活性化され、そして最終的にルシフェラーゼレポーター遺伝子と連結しているＦｏｓプロモーターを活性化させるシグナルカスケードを誘導する。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ発現量と相関しており、ルミノメーターの使用により定量される。
【０１２９】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、６ｃｍシャーレにつき３×１０５細胞に撒き、後日トランスフェクションする。トランスフェクションは、Ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ  ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により、０．１μｇのｐＥＧＦＰ（トランスフェクション効率定量トレーサ）およびプレートにつき０．２μｇのＦｏｓプロモーター／ルシフェラーゼコンストラクトを使用して行う。トランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、トランスフェクションに続けて０．５％血清中に２４時間置き、Ｆｏｓプロモーターのバックグラウンド活性を低下させるため、さらに２４時間インキュベーションする。次にＦａｂを、ＰＤＧＦ−ＢＢを伴う細胞に加え、６時間置く。細胞を回収し、５０μｇの細胞溶解産物を使用して、ルシフェラーゼ活性をアッセイする。
【実施例２】
【０１３０】
（マウス抗ＰＤＧＦ抗体の調製）
（マウスの免疫化）
２匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、組換えＰＤＧＦ−ＢＢで免疫した。まず、フロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）中の１５ｍｇＰＤＧＦを、腹腔内に投与した。２週間後、マウスにフロイント不完全アジュバント中の同じ量のＰＤＧＦを腹腔内注射し、同様の注射を３週間後に続いて行った。さらに３週間後、マウスにＰＢＳ水溶液中の１５ｍｇＰＤＧＦ−ＢＢを皮下注射をし、追加免疫を行った。３日後、血清の抗ＰＤＧＦ抗体の力価が１：２０，０００に達したことを、固相ＥＬＩＳＡにより決定した。マウスを殺し、脾臓および骨髄を摘出し、ＲＮＡをＴｒｉ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）によって抽出した。第一鎖ｃＤＮＡを、「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ」をオリゴ（ｄＴ）プライミング（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と共に使用した。
【０１３１】
（マウス抗体ライブラリー）
マウス軽鎖および重鎖のｆｄ領域を、第一鎖ｃＤＮＡから、重鎖および軽鎖の以下に記載されるプライマーを使用した２０サイクルのＰＣＲにより、増幅した；Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．９．５４−９．５７。さらなるプライマーは、以下；ＭＣＫａｐｐａＢ：５’ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＡ３’（配列番号８）およびＭＩＧＧＩＢ：５’ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＴ３’（配列番号９）。軽鎖ＤＮＡを、ファージミドベクターｐＲＬ４内に、Ｓａｃ１およびＸｂａ１を使用してクローン化し、そして、重鎖ＤＮＡは、Ｓｐｅ１およびＸｈｏ１を使用してクローン化した。ＥＲ細胞を形質転換した結果、６×１０７個の独立したクローンのライブラリーを生じた。ライブラリーは、固定化組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対し、４回パニングした。パニングは、１回目および２回目において５００ｎｇタンパク質／ウェルで始め、３回目および４回目においては２５０ｎｇタンパク質／ウェルで行った。結合ファージは、０．５％Ｔｗｅｅｎ含有ＴＢＳで、１回目には３回、２回目には５回、後の２回では１０回、洗浄した。ファージを、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ含有の０．１Ｍ  ＨＣｌ  ｐＨ２．２で溶出し、続けて２Ｍ  Ｔｒｉｓで中和した。４回目の後で得られたクローンについては、ＰＤＧＦ−ＢＢに対する結合を、固相ＥＬＩＳＡにおいて試験した。高度タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＮＹ）を、１００ｎｇの組換えＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）で、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．６において４℃で一晩コートした。プレートは１％ＢＳＡで３７℃１時間ブロックし、続けてＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養上清または精製抗体を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ水溶液中の種々の濃度で加え、２時間、３７℃で振とう機に置いた。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回の洗浄の後、ＰＢＳ／１％中１：１０，０００の希釈の抗ＨＡＣＡ５（腹水）を２時間の間加えた。プレートは、アルカリホスファターゼ結合体化抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と共に２時間インキュベーションし、続けてＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで３回、ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＮＰＰ緩衝液（１０ｍＭジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣＬ２，ｐＨ９．５）中におけるＳｉｇｍａ１０４基質の添加後の発色は、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、ＯＤ４０５において決定した。
【０１３２】
ＰＤＧＦにおけるマウスＰＤＧＦライブラリーのパニングは、多数の非常に類似したクローンを結果として生じた。軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ２における差に基づいて、クローンを２つのファミリーに分類した。ファミリー間を見分ける幾つかの残基を、同定した。その残基を以下の表に示す。
【０１３３】
【表７】
2005512962.tif 000010
（新脈管形成アッセイ）
抗ＰＤＧＦ抗体Ｃ１が血管形成に影響するか否かを決定するため、ＨＵＶＥＣアッセイを、行った。２４ウェルプレートのウェルを、５００μｌのマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）で、それぞれ３７℃で３０分コートした。ウェルにつき四千細胞のＨＵＶＥＣ細胞を、抗ＰＤＧＦ抗体Ｃ１または対照抗体ＴＴの添加または非添加で、加えた。細胞を、５時間後および２４時間後に撮影し、管形成が観察された。５時間後の結果を図１１に示す。
【０１３４】
クローンＣ１（Ｃ１型ファミリークローン）を、ライブラリーから選択し、以下のヒト化手順において使用した。Ｃ１マウス抗ＰＤＧＦ  Ｆａｂ軽鎖および重鎖の配列を、それぞれ図１４ａおよび図１４ｂに示す。ＡＫ型ファミリーからの抗体も、ヒト化設計に貢献した。軽鎖の＃３１および＃５１、重鎖の＃５７の位置におけるＡＫ型ファミリーのアミノ酸は、ヒト化過程の間の選択に含めた（図１５ａおよび図１５ｂにおける「合成Ｃ１」配列のＸを意味する）。
【実施例３】
【０１３５】
（ヒト化）
対応するマウス配列と最高の相同性を有するヒト生殖系列ＶＬおよびＶＨ配列を、ヒトＶ遺伝子配列のＶｂａｓｅ  ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ）に基づいて、ヌクレオチド配列アラインメントにより、同定した。ヒト化に使用されたヒトＦＲ４配列は、Ｃ１配列のＫａｂａｔ免疫グロブリンデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ  に在る）とのアミノ酸相同性に基づいて同定した。エピトープのコンフォメーションの維持に重要であることが公知である残基（Ｆｏｏｔｅ  Ｊ，  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９９２  Ｍａｒ２０；２２４（２）：４８７−４９９）は、多様化されて、表面露出であることが公知の位置におけるマウス残基（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４，２３５，９５９−９７３ならびにＳａｎｔｏｓおよびＰａｄｌａｎ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６０，１６９−１９４）を避けつつ、マウスまたはヒト配列のどちらかの使用を許容した。また、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、マウスまたはヒトの使用において多様化される一方、マウスＣＤＲ３はグラフティングされた。重複オリゴヌクレオチドを、図１６ａおよび１６ｂに示されるように合成し、１５サイクルのそれぞれＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した続発性重複ＰＣＲ（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ）反応において集めた。図１５ａおよび図１５ｂを参照のこと。合成ＶＬおよびＶＨコード配列を、ｐＲＬ４にクローン化された破傷風毒素抗体のＰＣＲによって得られたヒトＣｋおよびＣＨ１コード配列と融合させた。最終構築物は、カルベシリン耐性遺伝子の代わりにクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するｐＲＬ４内に、Ｓａｃ１／Ｘｂａ１を軽鎖にＸｈｏ１／Ｓｐｅ１を重鎖に使用して、クローン化した。結果として得られた１×１０６個の独立クローンのライブラリーは、ＰＤＧＦ−ＢＢにおいて、マウスライブラリーに関して記載されたように、パニングした。
【０１３６】
（抗体精製）
抗体は、トランスフェクションした細胞培養液のペリプラズム調整物から精製し、続いてＮｉ−カラムクロマトグラフィーを通した。ペリプラズム分画は、２０％ショ糖含有３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８の菌体ペレットへの２０分間の添加により得られた。上清は９０００ｇで１０分、４℃にて遠心した。上清を氷上に置き、そしてペレットは滅菌冷水に再懸濁し、１０分氷上に置いた。１０，０００ｇでの遠心の後、上清をショ糖上清と合わせ、１２，０００ｇにて２０分遠心した。１錠のＥＤＴＡ非含有Ｒｏｃｈｅ  Ｍｉｎｉ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌおよびＮａＣｌを０．２Ｍまでおよびイミダゾールを１０ｍＭまで、混合物に加えた。ろ過の後、ペリプラズム画分を、ｓｕｐｅｒｌｏｏｐに載せ、それからＮｉ−ｃｈａｒｇｅｄ  ５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、２ｍｌ／分の流速で、ＡｋｔａｆＰＬＣマシーン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて流した。洗浄緩衝液は、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４，０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．４から構成され、および溶出緩衝液は、ｐＨ７．４において２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４，０．５Ｍ  ＮａＣｌ  および  ５００ｍＭ  イミダゾールから作製した。１ｍｌの分画を回収し、上昇したＯＤ２８０値を持つこの分画を溜め、そしてＰＢＳに対して透析した。細胞に基づいたアッセイのために、内毒素を、精製抗体の透析分画から、発熱因子非含有４ｍｌＡｆｆｉ−Ｐｒｅｐ  Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）液滴カラムを、１ｍｌ／分の流速で、ＰＢＳを平衡緩衝液として使用して通すことにより、除去した。内毒素のレベルは、ＬＡＬ法（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ＱＣＬ−１０００）を使用して定量され、そして、さらなる内毒素の除去が必要だった場合、サンプルは、再びポリミキシン樹脂に通した。別の方法は、サンプルをＱ１５  Ｓｔｒｏｎｇｌｙ  Ｉｏｎｉｃ  Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に、１ｍｌ／分の流速で、５０ｍｌの２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２を平衡緩衝液として使用して通すことであった。
【実施例４】
【０１３７】
（抗ＰＤＧＦ抗体の反応性）
Ｃ１抗ＰＤＧＦ抗体の結合を、固相ＥＬＩＳＡにより、上述のように、種々の起源のＰＤＧＦに対し、試験した。結果は図１７に示す。
【０１３８】
Ｃ１抗ＰＤＧＦ抗体は、ヒトおよびブタＰＤＧＦ−ＢＢに強く反応したが、ラットＰＤＧＦ  ＢＢには反応しなかった。ヒトＰＤＧＦ  ＡＡに対する反応は、弱かった。
【実施例５】
【０１３９】
（ＰＤＧＦβレセプター競合アッセイ）
高度タンパク質結合９６ウェルプレートを、１０ｎｇ／ウェルの組換えヒトＰＤＧＦレセプターβ／Ｆｃキメラ（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＰＢＳ中において４℃で一晩コートした。プレートは５％ショ糖１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃１時間ブロックした。精製抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の連続の希釈物は、ブロックおよび洗浄済みプレートに添加する前に、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢと共に室温で３０分インキュベートした。室温で２時間後、プレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎで洗浄し、続けてビオチン化抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体（Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、２時間室温でインキュベーションした。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）を、３０分室温で添加した。ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ水溶液で３回、ＰＢＳで３回の洗浄の後、ＰＮＰＰ緩衝液中のＳｉｇｍａ１０４基質を添加し、ＯＤ４０５におけるシグナルを決定した。
【０１４０】
図１８は、マウス抗体Ｃ１について得られた結果を、ウサギ抗ＰＤＧＦ抗体（Ａ８）との比較において示す。
【実施例６】
【０１４１】
（ＰＤＧＦ−ＢＢとの競合）
抗体Ｃ１を、シグナル伝達経路においてＰＤＧＦ  ＢＢと競合する能力について、試験した。ルシフェラーゼアッセイを、読み出しとして使用した。
【０１４２】
競合性の測定のため、ＰＤＧＦ−ＢＢと混合された細菌上清含有Ｆａｂ（２ｍｌ）を、Ｆｏｓプロモーター／ルシフェラーゼレセプター構築物と共トランスフェクションされたＮＩＨ３Ｔ３細胞に、適用した。３Ｔ３細胞の共トランスフェクションは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を６ｃｍディッシュあたり３×１０５細胞でプレートし、翌日トランスフェクションすることによって行った。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ｅｆｆｅｃｔｉｎｅ  ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、各プレートに０．１μｍ  ｐＥＧＦＰ（トランスフェクション効率を測定するトレーサー）および０．９μｇのＦｏｓプロモーター／ルシフェラーゼレセプター構築物と共に、トランスフェクションした。３Ｔ３細胞は、トランスフェクション後０．５％血清中に２４時間置き、Ｆｏｓプロモーターのバックグラウンド活性を下げるため、さらに２４時間この低血清培地において、インキュベートした。それから、抗体上清を、これらの細胞に、６時間適用した。細胞を回収し、ルシフェラーゼアッセイを、５０μｇの細胞溶解産物を使用して行った。
【０１４３】
結果は、図１９に示す。Ｃ１は，ＰＤＧＦ−ＢＢによるシグナル伝達を阻害し得るが、ｔＰＡは阻害しない。
【実施例７】
【０１４４】
（ＢＩＡＣｏｒｅ親和性測定）
本来のおよびヒト化抗ＰＤＧＦクローンのＢＩＡｃｏｒｅ分析を、標準的手順に従って行った。サイトカインは、一級アミンを介する化学結合によりＢＩＡｃｈｉｐ上に固定化され、そして抗体の結合挙動を、３０分にわたって分析した。結果は、表２に示す。
【０１４５】
【表８】
2005512962.tif 000011
2005512962.tif 000012
2005512962.tif 000013
【実施例８】
【０１４６】
（細胞増殖の阻害）
（細胞株）
全ての細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。細胞株は、１０％熱非活性化ＦＢＳ、５ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有ＥＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，ＮＹ）中で維持した。
【０１４７】
（細胞増殖アッセイ）
細胞は、２０００〜８０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５ｍＭグルタミンを補充されたＥＭＥＭ中で一晩増殖させた後、培地交換し、抗体を、ＥＭＥＭ  １％ＦＢＳ中で種々の濃度において加えた。内毒素は、Ａｆｆｉ−Ｐｒｅｐ  Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、抗体調製物から除去した。３日後、上清を除去し、そして細胞を１．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解した。細胞数の測定として、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を、製造業者の指示に従いＣｙｔｏ  Ｔｏｘ  ９６ａｅ非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を使用して、溶出産物において検出した。抗体非添加サンプル由来の値は、０％の阻害を決定するのに使用し、そしてポジティブコントロールとしてのスタウロスポリンを含有するサンプル由来の値は、１００％の阻害を決定するのに使用した。抗体による増殖の阻害の比率は、線形回帰に基づいて算出した。
【０１４８】
細胞増殖アッセイの結果を、図１２から図２８および表３に示す。試験された脳癌細胞型７つのうちの中の６つが、抗ＰＤＧＦ抗体処理した場合に増殖の阻害を示したが、コントロール抗体処理した場合には示さなかった。
【０１４９】
【表９】
2005512962.tif 000014
【実施例９】
【０１５０】
（増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）アッセイ）
細胞を、１０，０００細胞／ウェルで、Ｌａｂ  Ｔｅｃ  １６ウェルチャンバースライドに、１％ＦＢＳ補充ＥＭＥＭ中で播種した。翌日、培地を除去し、抗体を、ＥＭＥＭ  １％ＦＢＳ中で種々の濃度において加えた。３日後、スライドをＰＢＳ中で洗浄し、７０％エタノールで２０分４℃で固定した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール中３％ＮａＮ３を用いて、１０分間ブロックした。細胞増殖のマーカーとしてのＰＣＮＡ発現は、製造業者の指示に従ってＺｙｍｅｄ  ＰＣＭＡ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ，ＣＡ）を使用し、決定した。所定のサイズの５つの異なった領域を、それぞれのウェルにおいて数え、数値を平均した。抗体非添加サンプル由来の値は、０％の阻害を決定するのに使用し、そしてポジティブコントロールとしてのスタウロスポリンを含有するサンプル由来の値は、１００％の阻害を決定するのに使用した。抗体による増殖の阻害の比率は、線形回帰に基づいて算出した。
【０１５１】
結果は、表４、５および６において示す。
【０１５２】
【表１０】
2005512962.tif 000015
【０１５３】
【表１１】
2005512962.tif 000016
【０１５４】
【表１２】
2005512962.tif 000017
【実施例１０】
【０１５５】
（３Ｈチミジン増殖アッセイ）
細胞は、９６ウェルプレートにおいて２０，０００〜４０，０００／ｍｌで、１０％ＦＢＳ含有の適切な培地中でプレートした。４時間の接着の後、培地をＦＢＳ非含有培地に交換し、一晩インキュベートした。翌日、抗ＰＤＧＦ抗体またはコントロール抗体含有または非含有の１％ＦＢＳ含有の新鮮な培地を、加えた。４８時間後、ウェルあたり１μＣｉ３Ｈチミジンを加え、そして細胞は翌日ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して回収した。組み込まれたトリチウム化チミジンは、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して評価した。半最大値の阻害が、線形回帰に基づいて算出された。結果は、図１０に示す。
【実施例１１】
【０１５６】
（アポトーシスアッセイ）
細胞の抗ＰＤＧＦ抗体処理が細胞死を誘導するか否か決定するため、アポトーシスアッセイを使用した。アポトーシスは、Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の「細胞死検出ＥＬＩＳＡ」キットを使用して測定した。このアッセイは、細胞質内のヒストン結合ＤＮＡ断片（アポトーシス誘導後にしか存在しない）を決定する。細胞は、９６ウェルプレートにおいて２０，０００細胞／ｍｌで、１０％ＦＢＳ含有の適切な培地中でプレートした。４時間の接着の後、培地をＦＢＳ非含有培地に交換し、一晩インキュベートした。翌日、抗ＰＤＧＦ抗体またはコントロール抗体含有または非含有の１％ＦＢＳ含有の新鮮な培地を、加えた。製造業者の指示に従い、アポトーシスを種々のタイムポイントで決定した。そして、２細胞株の結果を、図１２に示す。ＯＤにおける増加は、アポトーシスを示す。
【０１５７】
抗ＰＤＧＦはカスパーゼ依存経路においてアポトーシスを誘導するか否か試験するため、全カスパーゼ阻害剤（ｐａｎ−ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｚ−ｖａｄを加えた。結果は、カンプトテシン誘導アポトーシスと比較し、図１３に示す。ここで示すように、ｖ−ｚａｄの存在は、本抗体によって達成されたアポトーシスの程度に、さほど大きく影響しなかった。従って、本抗ＰＤＧＦ抗体は、主としてカスパーゼ非依存性様式においてアポトーシスを引き起こし得、これは特に種々の癌の処置に通常使用される化学療法薬剤との組合わせにおいて、特に有用であり得る。
【０１５８】
上記明細書記載の全ての刊行物は、本明細書中に参考として援用される。記載された実施形態の種々の改変および変更、局面および実施例は、当業者に明らかであり、本明細書における開示の範囲および精神から逸脱しない。好ましい特定の実施形態に関連して記載されたが、主題はこのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実に、当業者は、特に述べられはしないが、本開示に含まれる、種々の改変を想到する。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】図１は、ファージミドｐＲＬ４を描いた説明図である。
【図２】図２は、ファージミドｐＲＬ５を描いた説明図である。
【図３ａ】図３ａは、ウサギ抗体Ｆ３軽鎖可変配列に対して高い程度の相同性を有するヒト生殖系列遺伝子配列一式を描く。Ｆ３軽鎖配列とヒト生殖系列配列との間のＶＢＡＳＥヌクレオチド配列アラインメントが、示される。ダッシュは、Ｆ３と同一のヌクレオチドを表す。多様性について選択されたフレームワーク位置は、下線で示される。
【図３ｂ】図３ｂは、ウサギ抗体Ｆ３重鎖可変配列に対して高い程度の相同性を有するヒト生殖系列遺伝子配列一式を描く。Ｆ３重鎖配列とヒト生殖系列配列との間のＶＢＡＳＥヌクレオチド配列アラインメントが、示される。ダッシュは、Ｆ３と同一のヌクレオチドを表す。多様性について選択されたフレームワーク位置は、下線で示される。
【図４ａ】図４ａは、ヒト化Ｆ３軽鎖アセンブリのための重複する領域を有するオリゴヌクレオチドを描く。
【図４ｂ】図４ｂは、ヒト化Ｆ３重鎖アセンブリのための重複する領域を有するオリゴヌクレオチドを描く。
【図５】図５は、Ｆ３抗体のヒト化において多様な鍵となるフレームワーク残基を描く。アスタリスクは、連結位置（ＶＨ：４８−４９およびＶＬ：８０−８３）を認識し、かつ、選択を他のヒト配列または両ウサギ配列に限定する、連携した多様性を示す。￥は、その位置における多様性のために使用された縮重コードの結果生じた、ヒトでもマウスでもないアミノ酸の選択を示す。
【図６ａ】図６ａは、重複縮重ヌクレオチドを使用したＰＣＲによる、ヒト化Ｆ３ライブラリー合成アセンブリの略図を描く。図６ａは、Ｆ３軽鎖のアセンブリを表す。
【図６ｂ】図６ｂは、重複縮重ヌクレオチドを使用したＰＣＲによる、ヒト化Ｆ３ライブラリー合成アセンブリの略図を描く。図６ｂは、Ｆ３重鎖のアセンブリを表す。
【図６ｃ】図６ｃは、重複縮重ヌクレオチドを使用したＰＣＲによる、ヒト化Ｆ３ライブラリー合成アセンブリの略図を描く。図６ｃは、完全ヒト化Ｆ３ライブラリーのアセンブリを表す。
【図６ｄ】図６ｄは、重複縮重ヌクレオチドを使用したＰＣＲによる、ヒト化Ｆ３ライブラリー合成アセンブリの略図を描く。図６ｄは、縮重重複オリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図６ｅ】図６ｅは、重複縮重ヌクレオチドを使用したＰＣＲによる、ヒト化Ｆ３ライブラリー合成アセンブリの略図を描く。図６ｅは、縮重重複オリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図６ｆ】図６ｆは、組み立てられた縮重重複オリゴヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図６ｇ】図６ｇは、組み立てられた縮重重複オリゴヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、固相ＰＤＧＦ  ＥＬＩＳＡにおける４回の選別後のヒト化Ｆ３クローンのスクリーニングの結果を描く。クローンＣ１１、Ｃ１２およびＡ１２は、配列決定および結合アッセイのために選択された。
【図８ａ】図８ａは、ウサギおよび望ましいヒトの配列を含むヒト化軽鎖の図式比較を描く。ヒトＣＤＲは、下線で示される。全てのＣＤＲは、太字である。
【図８ｂ】図８ｂは、ウサギおよび望ましいヒトの配列を含むヒト化重鎖の図式比較を描く。ヒトＣＤＲは、下線で示される。全てのＣＤＲは、太字である。
【図９】図９は、ヒト化Ｆ３抗体がサイトカインＰＤＧＦ−ＢＢについてＰＤＧＦ−βレセプターと競合する能力を描くグラフである。この能力は競合アッセイにおいて決定された。ヒト化抗ＰＤＧＦ  Ｆ３抗体改変体（Ｃ１１、Ｃ１２、Ａ１２）の、ＰＤＧＦ−ＢＢサイトカインにおけるそれらの標的エピトープへの結合は、ＰＤＧＦ−ＢＢがプレート上にコートされたＰＤＧＦレセプターへ結合することを阻害する。３つの全てのヒト化Ｆ３改変体が、本来の非ヒト化Ｆ３抗体のプロフィールと同様の結合プロフィールを示した。
【図１０】図１０は、トリチウム化チミジン増殖アッセイの要約を示す。
【図１１】図１１は、新脈管形成アッセイの結果を示す。
【図１２】図１２は、Ａ１７２細胞およびＴ９８Ｇ細胞における抗ＰＤＧＦ抗体による３日後のアポトーシス誘導を示す。
【図１３】図１３は、全カスパーゼ阻害剤ｚ−ｖａｄ存在下におけるアポトーシス誘導を示す。
【図１４ａ】図１４ａは、Ｃ１マウス抗ＰＤＧＦ  Ｆａｂ軽鎖の配列を示し、フレームワークとＣＤＲを表す。
【図１４ｂ】図１４ｂは、Ｃ１マウス抗ＰＤＧＦ  Ｆａｂ重鎖の配列を示し、フレームワークとＣＤＲを表す。
【図１５ａ】図１５ａは、ヒト化クローンＥ１およびＢ１の配列を図解し、選択のあるヒトまたはマウスのフレームワーク位置およびＣＤＲを示す。配列の重複領域は、同系色で示される。マウス残基は紫で示され、ヒト残基は青で示される。
【図１５ｂ】図１５ｂは、ヒト化クローンＥ１およびＢ１の配列を図解し、選択のあるヒトおよびマウスのフレームワーク位置およびＣＤＲを示す。配列の重複領域は、同系色で示される。マウス残基は紫で示され、ヒト残基は青で示される。
【図１６ａ】図１６ａは、軽鎖ヒト化のためのオリゴヌクレオチドのアセンブリを図解する。
【図１６ｂ】図１６ｂは、重鎖ヒト化のためのオリゴヌクレオチドのアセンブリを図解する。
【図１６ｃ】図１６ｃは、ヒト化軽鎖領域のアセンブリのために使用された、オリゴヌクレオチドプライマーのリストであり、ヒトおよびマウスのＣＤＲ領域に一致するオリゴヌクレオチドを記す。ＢまたはＤで示されたオリゴヌクレオチドは、ヒトＣＤＲである他は、マウスＣＤＲである。
【図１６ｄ】図１６ｄは、ヒト化重鎖領域のアセンブリのために使用された、オリゴヌクレオチドプライマーのリストであり、ヒトおよびマウスのＣＤＲ領域に一致するオリゴヌクレオチドを記す。Ｂで示されたオリゴヌクレオチドは、ヒトＣＤＲであり、他は、マウスＣＤＲである。
【図１７】図１７は、マウスＣ１の、種々のＰＤＧＦ供給源への反応性を図解するグラフである。Ｃ１の、種々の型のＰＤＧＦへの結合は、固相ＥＬＩＳＡにおいて決定された。
【図１８】図１８は、競合ＥＬＩＳＡの結果を図解するグラフである。マウスＣ１抗ＰＤＧＦ抗体およびウサギＡ８抗ＰＤＧＦ抗体は、ＰＤＧＦ−ＢＢとの結合をについてＰＤＧＦ−βレセプターと競合する。
【図１９】図１９は、ルシフェラーゼアッセイの結果を図解する棒グラフである。Ｃ１は、ＰＤＧＦ−ＢＢとの結合についてＰＤＧＦ−βレセプターと競合し、ルシフェラーゼ活性により測定された場合、それによりＰＤＧＦ−ＢＢによるシグナル誘導を阻害する。
【図２０】図２０は、競合ＥＬＩＳＡの結果を図解するグラフである。マウスＣ１抗ＰＤＧＦ抗体およびヒト化Ｅ１抗ＰＤＧＦ抗体およびヒト化Ｂ１抗ＰＤＧＦ抗体は、ＰＤＧＦ−ＢＢとの結合についてＰＤＧＦ−βレセプターと競合する。
【図２１】図２１は、ＨＴＢ１１細胞を使用するＬＤＨに基づく増殖アッセイの結果を図解するグラフである。結果は、Ｃ１抗ＰＤＧＦ抗体による細胞増殖の阻害を示すが、コントロール５７−３８．１抗Ｆタンパク質抗体による阻害は示さない。実験は、２連で行われ、３回繰り返された。Ｐ値は、両側スチューデントｔ検定を使用して決定された。
【図２２】図２２は、ＣＣＬ１２７細胞を使用するＬＤＨに基づく増殖アッセイの結果を図解するグラフである。
【図２３】図２３は、ＨＴＢ１０細胞を使用するＬＤＨに基づく増殖アッセイの結果を図解するグラフである。
【図２４】図２４は、ＨＴＢ１６６細胞を使用するＬＤＨに基づく増殖アッセイの結果を図解するグラフである。
【図２５】図２５は、Ｕ８７細胞を使用するＬＤＨに基づく増殖アッセイの結果を図解するグラフである。
【図２６】図２６は、Ａ１７２細胞を使用するＬＤＨに基づく増殖アッセイの結果を図解するグラフである。
【図２７】図２７は、Ｔ９８Ｇ細胞を使用するＬＤＨに基づく増殖アッセイの結果を図解するグラフである。
【図２８】図２８は、ＣＣＬ１４７細胞を使用するＬＤＨに基づく増殖アッセイの結果を図解するグラフである。
【図１】
2005512962.tif 000018
【図２】
2005512962.tif 000019
【図３ａ】
2005512962.tif 000020
【図３ｂ】
2005512962.tif 000021
【図４ａ】
2005512962.tif 000022
【図４ｂ】
2005512962.tif 000023
【図５】
2005512962.tif 000024
【図６ａ】
2005512962.tif 000025
【図６ｂ】
2005512962.tif 000026
【図６ｃ】
2005512962.tif 000027
【図６ｄ】
2005512962.tif 000028
【図６ｅ】
2005512962.tif 000029
【図６ｆ】
2005512962.tif 000030
【図６ｇ】
2005512962.tif 000031
【図７】
2005512962.tif 000032
【図８ａ】
2005512962.tif 000033
【図８ｂ】
2005512962.tif 000034
【図９】
2005512962.tif 000035
【図１０】
2005512962.tif 000036
【図１１】
2005512962.tif 000037
【図１２】
2005512962.tif 000038
【図１３】
2005512962.tif 000039
【図１４ａ】
2005512962.tif 000040
【図１４ｂ】
2005512962.tif 000041
【図１５ａ】
2005512962.tif 000042
【図１５ｂ】
2005512962.tif 000043
【図１６ａ】
2005512962.tif 000044
【図１６ｂ】
2005512962.tif 000045
【図１６ｃ】
2005512962.tif 000046
【図１６ｄ】
2005512962.tif 000047
【図１７】
2005512962.tif 000048
【図１８】
2005512962.tif 000049
【図１９】
2005512962.tif 000050
【図２０】
2005512962.tif 000051
【図２１】
2005512962.tif 000052
【図２２】
2005512962.tif 000053
【図２３】
2005512962.tif 000054
【図２４】
2005512962.tif 000055
【図２５】
2005512962.tif 000056
【図２６】
2005512962.tif 000057
【図２７】
2005512962.tif 000058
【図２８】
2005512962.tif 000059
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月3日(2004.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法であって、該方法は、以下：
標的に対し特異性を有する抗体のパネルを提供する工程であって、該抗体のパネルは第一種由来の複数の抗体メンバーを含む、工程；
該抗体のパネルの第一メンバーの少なくとも一部の配列を決定する工程；
該パネルの該第一メンバーの配列を、標的種由来の抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーと比較する工程であって、該標的種は該第一種とは異なっている、工程；
該パネルの該第一メンバーの配列と高い相同性を示し、かつＦＲ３領域を含む、少なくとも一つの配列を、該参照ライブラリーの第一メンバーから選択する工程；
該パネルの該第一メンバーからＣＤＲ３領域を得る工程；および
該パネルの該第一メンバー由来の該ＣＤＲ３領域を、該参照ライブラリーの該第一メンバー由来の該少なくとも一つの配列の該ＦＲ３領域に隣接して組み入れることで、設計抗体または設計抗体断片を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法であって、該方法は、以下：
前記パネルの前記第一メンバーの配列を、抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーと比較する工程；
少なくともＦＲ４配列を、該参照ライブラリーの第二メンバーから選択する工程；および
該ＦＲ４配列を、該設計抗体または設計抗体断片に、該パネルの該第一メンバー由来の前記ＣＤＲ３領域に隣接して組み入れる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３】
前記パネルのメンバー由来のＣＤＲ１領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項３に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項５】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項３に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項６】
前記パネルの第二メンバー由来のＣＤＲ１領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項７】
前記パネルの前記メンバーの一つ以上に由来するＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項８】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの異なったメンバー由来であ
る、請求項７に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項９】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項７に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１０】
前記パネルの第二メンバー由来のＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１１】
前記パネルの前記メンバーの一つ以上に由来するＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のそれぞれがかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１２】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１３】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１４】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１５】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１６】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域、前記ＣＤＲ２領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルのそれぞれ異なったメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１７】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域、前記ＣＤＲ２領域および前記ＣＤＲ１領域のすべてが、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項１１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１８】
前記パネルの一つ以上のメンバー由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域を、それぞれ前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含し、組み込まれた該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のうち少なくとも一つが該パネルの第二メンバー由来である、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項１９】
前記標的がＰＤＧＦである、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項２０】
前記抗体断片がｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、二重特異性抗体、抗体軽鎖、および抗体重鎖からなる群から選択される、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項２１】
前記標的種がヒトである、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項２２】
前記参照ライブラリーがヒト再編成抗体配列を含む、請求項１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法に従って、複数の設計抗体または設計抗体断片を調製する工程を包含する、設計抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項２４】
前記ライブラリーが、設計抗体または設計抗体断片の改変体をさらに含み、該設計抗体または設計抗体断片の改変体が、前記パネルの前記メンバーの前記配列、前記参照ライブラリーの前記第一メンバーの前記配列からなる群より選択される一つ以上の配列に由来する、ＶＨ／ＶＬ境界および／またはベルニエ領域におけるアミノ酸の組み合わせを含む、請求項２３に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項２５】
設計抗体または設計抗体断片を提示するファージミドライブラリーまたはファージライブラリーを生成する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項２６】
前記ファージミドライブラリーまたは前記ファージライブラリーを前記標的に対する活性についてパニングし、該標的に優先的に結合するファージ粒子またはファージミド粒子を単離する工程をさらに包含する、請求項２３に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項２７】
抗体または抗体断片を選ぶための方法であって、該方法は、以下：
請求項１に記載の方法に従って複数の設計抗体を調製する工程；
標的に対する複数の抗体の結合親和性を決定する工程；および
結合親和性に基づき、前記ライブラリーから抗体を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の抗体または抗体断片を選ぶための方法であって、該方法は、以下：
前記複数抗体の免疫原性を決定する工程；および
結合親和性および免疫原性に基づき、抗体を選択する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項２９】
設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法であって、該方法は、以下：
標的に対する特異性を有する抗体のパネルを提供する工程であって、該抗体のパネルは、第一種由来の複数の抗体メンバーを含む、工程；
該標的に関して望ましい結合特性を有する該パネルの第一メンバーを選択する工程；
該抗体のパネルの複数メンバーの少なくとも一部の配列を決定し、該複数メンバーのコンセンサス配列を決定する工程；
該コンセンサス配列を標的種由来の抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーと比較する工程であって、該標的種は、該第一種と異なっている、工程；
該参照ライブラリーの第一メンバーから、該コンセンサス配列と高度の相同性を示し、かつ、ＦＲ３領域を含む、少なくとも一つの配列を選択する工程；
該パネルの該第一メンバーからＣＤＲ３領域を得る工程；および
該パネルの該第一メンバー由来の該ＣＤＲ３領域を、該ライブラリーの該第一メンバー由来の該少なくとも一つの配列の該ＦＲ３領域に隣接して組み入れ、設計抗体または設計抗体断片を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法であって、該方法は、以下：
前記コンセンサス配列を、抗体配列または抗体断片配列の参照ライブラリーと比較する工程；
該参照ライブラリーの第二メンバーから、少なくともＦＲ４配列を選択する工程；および
該ＦＲ４配列を、前記設計抗体または設計抗体断片に、前記パネルの前記第一メンバー由来の前記ＣＤＲ３領域に隣接して組み入れる工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３１】
前記パネルのメンバー由来のＣＤＲ１領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法。
【請求項３２】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項３１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項３３】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ１領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項３１に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項３４】
前記パネルの第二メンバー由来のＣＤＲ１領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法。
【請求項３５】
前記パネルの前記メンバーの一つ以上に由来するＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法。
【請求項３６】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの異なったメンバー由来である、請求項３５に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項３７】
前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列に組み込まれている前記ＣＤＲ３領域および前記ＣＤＲ２領域が、前記パネルの同じメンバー由来である、請求項３５に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項３８】
前記パネルの第二メンバー由来のＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ２領域がかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供するための方法。
【請求項３９】
前記パネルの前記メンバーの一つ以上由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のそれぞれがかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含する、請求項３０に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４０】
前記パネルの一つ以上のメンバー由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域を、前記ライブラリーの前記第一メンバー由来の前記少なくとも一つの配列の、該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のそれぞれがかつて占めていた位置に、組み入れる工程をさらに包含し、組み込まれた該ＣＤＲ１領域および該ＣＤＲ２領域のうち少なくとも一つが該パネルの第二メンバー由来である、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４１】
前記標的がＰＤＧＦである、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４２】
前記抗体断片がｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、二重特異性抗体、抗体軽鎖、および抗体重鎖からなる群から選択される、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４３】
前記標的種がヒトである、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４４】
前記参照ライブラリーがヒト再編成抗体配列を含む、請求項２９に記載の設計抗体または設計抗体断片を提供する方法。
【請求項４５】
請求項２９に記載の方法に従って、複数の設計抗体または設計抗体断片を調製する工程を包含する、設計抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項４６】
前記ライブラリーが、設計抗体または設計抗体断片の改変体をさらに含み、該設計抗体または設計抗体断片の改変体が、前記パネルの前記メンバーの前記配列、前記参照ライブラリーの前記第一メンバーの前記配列からなる群より選択された一つ以上の配列に由来する、ＶＨ／ＶＬ境界および／またはベルニエ領域におけるアミノ酸の組み合わせを含む、請求項４５に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項４７】
前記設計抗体または設計抗体断片を提示するファージミドライブラリーまたはファージライブラリーを生成する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項４８】
前記ファージミドライブラリーまたは前記ファージライブラリーを前記標的に対する活性についてパニングし、該標的に優先的に結合するファージ粒子またはファージミド粒子を単離する工程をさらに包含する、請求項４５に記載の抗体ライブラリーを提供する方法。
【請求項４９】
抗体または抗体断片を選ぶための方法であって、該方法は、以下：
請求項２９に記載の方法に従って複数の設計抗体を調製する工程；
複数の抗体の結合親和性を決定する工程；および
結合親和性に基づき、抗体を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の抗体または抗体断片を選ぶための方法であって、該方法は、以下：
前記複数抗体の免疫原性を決定する工程；および 
結合親和性および免疫原性に基づき、抗体を選択する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５１】
抗体または抗体断片を選択するための設計抗体または設計抗体断片の参照ライブラリーであって、該ライブラリーは、設計抗体または設計抗体断片の改変体を含み、該改変体は、標的種に対してネイティブな抗体由来のフレームワーク領域であって、該フレームワーク領域が所定の標的に対する特異性を有する第一抗体のフレームワーク領域と高度の相同性を示す、フレームワーク領域、所定の標的に対する特異性を有する該第一抗体由来のＣＤＲ３領域、該第一抗体または該標的種に対してネイティブな抗体のいずれかに由来のＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域の組み合わせ、ならびにＶＨ／ＶＬ境界および／またはベルニエ領域におけるアミノ酸の組み合わせであって、該アミノ酸の組み合わせが該標的種にネイティブな抗体に存在するアミノ酸および該第一抗体に存在するアミノ酸に相当する、アミノ酸の組み合わせを有する、ライブラリー。
【請求項５２】
一つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域、および少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域を含む、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片。
【請求項５３】
生殖細胞系ヒト抗体配列および再編成ヒト抗体配列の双方の由来であるフレームワーク領域、および少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域を含む、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片。
【請求項５４】
一つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域、非ヒトＣＤＲ３、ならびに非ヒト抗体配列のコンセンサス由来であるＣＤＲ１またはＣＤＲ２のうち少なくとも一つを含む、ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片。
【請求項５５】
ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片を提供する方法であって、一つ以上のヒト抗体配列由来のフレームワーク領域を、少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域と合わせる工程を包含し、該フレームワーク領域が、以下：
（ｉ）標的に結合する非ヒト抗体のパネルからの複数メンバーについて、抗体コンセンサス配列を確立する工程；
（ｉｉ）該非ヒト抗体のパネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３を、該コンセンサス配列のＣＤＲ３の代わりに置き換え、複合配列を形成する工程；および
（ｉｉｉ）該複合配列をヒト抗体配列データベースと比較し、そして、該複合配列との相同性に基づき、少なくとも一つのヒト抗体配列を選択する工程、
によって選択されるヒト抗体配列由来である、方法。
【請求項５６】
ヒト化複合抗体またはヒト化複合抗体の機能断片を提供する方法であって、２つの異なるヒト抗体配列由来のフレームワーク領域を少なくとも片方は非ヒトである２つの異なる起源由来のＣＤＲ領域と合わせる工程を包含し、該フレームワーク領域が、以下：
（ｉ）標的に結合する非ヒト抗体のパネルからの複数のメンバーについて、抗体コンセンサス配列を確立する工程；
（ｉｉ）該非ヒト抗体のパネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３を、該コンセンサス配列のＣＤＲ３の代わりに置き換え、複合配列を形成する工程；
（ｉｉｉ）該複合配列の第一部分をヒト生殖細胞系抗体配列データベースと比較し、そして、該複合配列の該第一部分との相同性に基づき、少なくとも一つのヒト抗体配列を選択する工程；および
（ｉｖ）該複合配列の第二部分をヒト再編成抗体配列データベースと比較し、そして、該複合配列の該第二部分との相同性に基づき、少なくとも一つのヒト抗体配列を選択する工程、
によって選択される２つのヒト抗体配列由来である、方法。
【請求項５７】
標的配列に結合する非ヒト抗体のパネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３を含む設計複合抗体配列であって、該設計抗体配列の残余が、該非ヒト抗体のパネルからの複数メンバーの抗体コンセンサス配列由来である、設計複合抗体配列。
【請求項５８】
非ヒトドナー抗体由来のＣＤＲ領域をヒトアクセプタ抗体由来のフレームワーク領域に組み入れる工程を包含する、ヒト化抗体を作製する方法であって、該ヒトアクセプタ抗体配列を、以下：
（ｉ）標的に結合する非ヒト抗体のパネルからの複数のメンバーについて、抗体コンセンサス配列を確立する工程；
（ｉｉ）該非ヒト抗体のパネルの個々のメンバー由来のＣＤＲ３を、該コンセンサス配列のＣＤＲ３の代わりに置き換え、複合配列を形成する工程；および、
（ｉｉｉ）該複合配列をヒト抗体配列データベースと比較し、そして、該複合配列との相同性に基づき、少なくとも一つのヒトアクセプタ抗体配列を選択する工程、
によって選択する工程を包含する、方法。
【請求項５９】
抗体Ｃ１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲ由来の少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体軽鎖。
【請求項６０】
抗体Ｃ１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなる群より選択されるＣＤＲ由来の少なくとも一つのＣＤＲを含む抗体重鎖。
【請求項６１】
有効量の抗ＰＤＧＦ抗体を含む、腫瘍を処置するための薬学的組成物。
【請求項６２】
前記腫瘍が、神経芽腫、感覚上皮腫、髄膜腫、ユーイング肉腫、星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、カポージ肉腫、中皮腫および中皮腫細胞株、絨毛上皮腫、膵臓癌、胃癌、骨肉腫、食道癌、線維肉腫、原発性ヒト肺癌における悪性上皮細胞、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、傍神経節腫、血管肉腫、血管周囲細胞腫、ＮＯＳ肉腫、滑膜肉腫、軟骨肉腫、および子宮間質肉腫、乳癌、結腸直腸癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、悪性線維組織球腫、平滑筋細胞腫瘍、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項６１に記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
前記抗ＰＤＧＦ抗体が抗ＰＤＧＦ  ＢＢ抗体である、請求項６１に記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
前記抗ＰＤＧＦ抗体が化学治療薬剤との組み合わせ治療で使用される、請求項６１に記載の薬学的組成物。
【国際調査報告】
2005512962.tif 000060
2005512962.tif 000061
2005512962.tif 000062