(57)【要約】本発明は、アデノシンＡ３受容体を発現するガン、及び、Ｐ−グリコプロテインあるいはＭＲＰを発現するガンの化学的治療を増強させるための、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの使用を開示している。好ましい態様では、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、タキセンファミリー、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、あるいは抗生化学療法薬の投与前あるいは投与間に投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする哺乳動物に、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの有効量を、ガンの化学治療薬を投与する前あるいは投与間のいずれかにおいて投与することを含む、アデノシンＡ３受容体を発現しているガンの化学的治療を相乗的に増強させる方法。
【請求項２】
ガンの化学治療薬がタキセンファミリー化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガンの化学治療薬がビンカアルイカロイド化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ガンの化学治療薬がカンプトテシン化合物である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ガンの化学治療薬が抗生物質である請求項１の方法。
【請求項６】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが以下の一般式で表される化合物である、請求項１に記載の方法。
【化１】
2005530858.tif 000021
式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール、又はトリアゾール；
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｎＲ１、又はＳＯｎ−Ｎ（Ｒ１）２；
Ｒ１は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、複素環基、低級アルケニル、低級アルカノイル、又は窒素原子に結合している場合には、窒素原子と一緒になってアゼチジン環もしくは、一つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含む５員−６員の複素環を形成してもよく；
Ｒ２は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、置換されたアラルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、またはアリールであり；
Ｒ３は、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、ベンゾピロール、ベンゾチオフェンであり、これらの基はヒドロキシ、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換されたアルキル、置換されたアルコキシ、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、アミノ、置換されたアミノ、アミノアシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルカリール、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環式基、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、チオアルコキシ、置換されたチオアルコキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換されたアルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換されたアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール及びトリハロメチルからなる群から選択される一個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよく；
Ｘは、Ｏ，Ｓ，またはＮＲ１  で表される化合物；及び、
その薬学的に許容される塩。
【請求項７】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが下記の一般式で表される請求項１に記載の方法。
【化２】
2005530858.tif 000022
式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール又はトリアゾール；
Ｒ２は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、置換されたアラルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、又はアリール；
Ｒ３は、フラン；
Ｒ６は、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環、又は置換された複素環で表される化合物；及び、
その薬学的に許容される塩。
【請求項８】
Ｒ２が水素、アルキル、アルケニル、アリールからなる群から選択されるものである請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ａがトリアゾロ環である請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
Ａがピラゾロ環である請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
ガンが、ヒト白血病、メラノーマ、すい臓ガン、胸ガン、前立腺ガン、大腸ガン、卵巣ガン、肺ガン、ヒスチオサイティック（histiocytic）リンパ腫、星状細胞腫、ケラチノサイトーマからなる群から選択されるものである請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
治療を必要とする哺乳動物に、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの有効量を、ガンの化学治療薬を投与する前あるいは投与間のいずれかにおいて投与することを含む、アデノシンＡ３受容体を発現しているガンの化学的治療を相乗的に増強させる方法であり、ここに於いてガンはＰ−グリコプロテイン依存性の多剤耐性である方法。
【請求項１３】
ガンの化学治療薬が、タキセンファミリー化合物である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ガンの化学治療薬が、ビンカアルカロイド化合物である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ガンの化学治療薬が、カンプトテシン化合物である請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ガンの化学治療薬が、抗生物質化合物である請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが以下の一般式で表されるものである請求項１１に記載の方法。
【化３】
2005530858.tif 000023
式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール又はトリアゾール；
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｎＲ１、又はＳＯｎ−Ｎ（Ｒ１）２；
Ｒ１は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、複素環基、低級アルケニル、低級アルカノイル、又は窒素原子に結合している場合には、窒素原子と一緒になってアゼチジン環もしくは、一つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含む５員−６員の複素環を形成してもよく；
Ｒ２は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、置換されたアラルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、またはアリールであり；
Ｒ３は、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、ベンゾピロール、ベンゾチオフェンであり、これらの基はヒドロキシ、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換されたアルキル、置換されたアルコキシ、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、アミノ、置換されたアミノ、アミノアシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルカリール、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環式基、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、チオアルコキシ、置換されたチオアルコキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換されたアルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換されたアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール及びトリハロメチルからなる群から選択される一個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよく；
Ｘは、Ｏ，Ｓ，またはＮＲ１  で表される化合物；及び、
その薬学的に許容される塩。
【請求項１８】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが下記の一般式で表される請求項１１に記載の方法。
【化４】
2005530858.tif 000024
式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール又はトリアゾール；
Ｒ２は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、置換されたアラルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、又はアリール；
Ｒ３は、フラン；
Ｒ６は、ヘテロアリール又は置換されたヘテロアリールで表される化合物；及び、
その薬学的に許容される塩。
【請求項１９】
Ｒ２が水素、アルキル、アルケニル、アリールからなる群から選択されるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
Ａがトリアゾロ環である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
Ａがピラゾロ環である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
ガンが、ヒト白血病、メラノーマ、すい臓ガン、胸ガン、前立腺ガン、大腸ガン、卵巣ガン、肺ガン、ヒストサイティック（histiocytic）リンパ腫、星状細胞腫、ケラチノサイトーマからなる群から選ばれるものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
治療を必要とする哺乳動物に、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの有効量とアデノシン５’三リン酸枯渇試薬を、ガンの化学治療薬を投与する前あるいは投与間のいずれかにおいて投与することを含む、アデノシンＡ３受容体を発現しているガンの化学的治療を相乗的に増強させる方法であり、ここでガンはＰ−グリコプロテイン依存性の多剤耐性である方法。
【請求項２４】
アデノシン５’三リン酸枯渇試薬が、L−アラノシン、アデノシンキナーゼ阻害剤を含むグループから選択される化合物を含むものである請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
２５  アデノシン５’三リン酸枯渇試薬が、２−デオキシグルコース、シアニン、オリゴマイシン、バリノマイシン、アジドを含むグループから選択される化合物を含むものである請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
治療を必要とするヒト患者に、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの有効量を、化学療法ガン治療薬の投与の前あるいは投与間のいずれかにおいて投与することを含む、皮膚ガンの治療方法であり、ここでガンの化学治療薬はタキセンファミリー化合物である方法。
【請求項２７】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストが局所投与されるものである、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞傷害性薬とともにガンの治療で用いられる際に有用な薬剤に関するものである。驚くべきことに、アデノシンＡ３アンタゴニストは相乗的に細胞傷害性治療を増強させ、多剤耐性のいくつかの形態に対抗することが見出された。
【背景技術】
【０００２】
アデノシンは腫瘍の成長と関連している。腫瘍塊の内部では、アデノシンの濃度が増加していることが報告されている。それは、生体内で筋肉組織における腫瘍の成長を妨げ、試験管内において悪性細胞の成長及び生存を減じる抗腫瘍試薬に相当すると推測されている。しかしながら、アデノシンは脳及び心臓において虚血性傷害の間に細胞防御性因子として機能することが知られている。アデノシンは低酸素症において放出されることが知られている。多くの研究が、アデノシンが虚血性傷害から心臓の細胞を保護することを示している。
【０００３】
アデノシンは多くの動物モデル及び人において防御的役割を果たすことが示されている（Am. J. Cardiol., 79(12A): 44-48 (1997)）。たとえば、心臓では
Ａ１受容体及びＡ３受容体の両方が虚血に対する保護を提供している（Am. J. Physiol., 273(42) H501-505 (1997)）。しかしながら、虚血に対する持続的防御を提供するのは、Ａ３受容体である(PNAS 95: 6995-6999 (1998))。アデノシンが低酸素症に対して腫瘍細胞を防御する能力は他者には認識されていない。
【０００４】
アデノシンはG蛋白質ファミリーの異なるメンバーと結合した糖蛋白質である細胞表面受容体と相互作用する。現在までに４つのアデノシン受容体、Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ及びＡ３がクローニングされ、特徴づけられている。Ａ３受容体の選択的アンタゴニストは、脳における抗炎症及び抗虚血性薬として使用されることが提唱されている。最近、Ａ３アンタゴニストは、抗喘息剤、抗うつ剤、抗不整脈剤、腎臓保護剤、抗パーキンソン剤及び認識増強剤（cognitive enhancing drug）として開発されている。たとえば、Marlene Jacobsonらの米国特許第５６４６１５６号では、選択的Ａ３アンタゴニストを使用して好酸球の活性化を抑制している。
【０００５】
最近のミオサイトに関する研究では、アデノシンＡ３受容体は虚血に対する長期保護において役割を果たすことが示されている(Liang and Jacobson, PNAS, 95 : 6995-6999 (1998))。本発明者らが、ミオサイトに加えて腫瘍細胞を含む他の細胞タイプにおいて、アデノシンが防御的役割を果たすことを仮定している一方で、腫瘍細胞でのアデノシンの防御的な効果を特定するための努力はなされていない。
【０００６】
最近、発明者らは異なるアデノシン受容体の同時刺激による細胞の生存と増殖における矛盾した効果をアデノシンが促進することを実証している。特にＡ３アデノシン受容体は細胞増殖を減じるが、細胞の生存を改良もする。さらに、Ａ３受容体はマスト様細胞（RBL−２H3）におけるUV照射により誘発されるアポトーシスを防御することが示されている。
【０００７】
Leungらの米国特許第６３２６３９０号はまた、抗腫瘍治療におけるアデノシンＡ３受容体の使用を明らかにしている。LeungはＡ３受容体のレベルが増加している腫瘍の治療のために、アデノシンＡ３アンタゴニストを使用することを開示している。米国特許第６３２６３９０号は参照としてここに組み入れられる。
【０００８】
発明者らは、良性腫瘍（non-cancerous tumors)あるいは正常組織と比較して、ガン性腫瘍において増加している、ヒトガン細胞におけるアデノシンＡ３受容体の濃度を検証した。表１及び図１は、発明者らによって、ヒトＡ３７５（ヒトメラノーマ）、Ｐａｎｃ−１（ヒトすい臓ガン）、ＭＸ−１（ヒト胸ガン）、ＰＣ−１（ヒト前立腺ガン）、ＨＴ２９（ヒト大腸ガン）、ＳＫＭＥＳ（ヒト肺ガン）及びＡ２７８０ＡＤ１０（ヒト卵巣ガン）において見出されたアデノシンＡ３受容体の増加したレベルを示している。
【０００９】
表１に示されるデータは、腫瘍組織において発現されるヒトアデノシンＡ３受容体の飽和実験から得られた、［３Ｈ］ＭＲＥ３００８Ｆ２０の解離定数ＫＤ（ｎＭ）とＢＭＡＸ（ｆｍｏｌ／ｎｇ蛋白質）として表される４℃での平衡結合パラメーターである。
【００１０】
【表１】
2005530858.tif 000002
【００１１】
Jacobsonらの米国特許第６０６６６４２号は、10μＭのアデノシンＡ３アゴニストＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡに応答するアポトーシス誘導蛋白質bakの発現を開示している。この応答は試験された二つのセルラインにおいてアデノシンＡ３アンタゴニストにより抑制された。決定的ではないが、発明者らの最近の結果とあわせると、アデノシンＡ３受容体が誘導されたbakを有するJacobsonの試験されたガン細胞において発現しているというのは合理的な仮説である。それらには、ヒトＨＬ−６０白血病、ＭＣＦ７胸アデノカルシノーマ、Ｕ−９３７組織球性リンパ腫及び１３２１Ｎ星状細胞腫が含まれる。しかしながら全てのガンが、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ誘導性のbak発現を示したのではない。たとえば、Jacobsonにより研究されたＵ３７３星状細胞腫は、bak発現を示さなかった。米国特許第６０６６６４２号は
参照としてここに組み入れられる。
【００１２】
現在のヒトガンの化学療法において、化学療法薬と関連する副作用がしばしば深刻である。パクリタキセルあるいはドセタキセル（両者ともタキセンファミリー薬剤である）の腫瘍性疾患の治療における使用は、多くの患者で経験された急激な超過敏性応答により制限される。たとえば、１００ｍｇ／ｍ２で投与されたドセタキセルは、１３％の患者において急激な超過敏性応答を引き起こし、１．２％において深刻な超過敏性応答を引き起こした。これらの反応により、患者は通常経口コルチステロイドを前投与される。
【００１３】
同様に、ビンカアルカロイドの使用に伴う副作用もしばしば有用な投薬量を制限する。たとえば、ビンクリスチンは神経毒性により投与量が制限されることが報告されている。神経保護効果を提供する増強薬がそれゆえに好まれる。
【００１４】
化学療法薬はまた、製造及び患者に提供するうえで費用がかかる。もし薬が低減された用量で使用できるのであれば、経費及び好ましくない副作用の範囲を同様に減じることができるだろう。
【００１５】
他の化学療法においてしばしば出くわす難関は、ガンの成長あるいは多剤耐性（ＭＤＲ）を生み出している細胞による、効果の制限である。ほとんどのガン細胞は遺伝子的に不安定であるので、それらは薬剤耐性細胞を産生しやすいよう変異する傾向がある。
【００１６】
多剤耐性は、疾病が単数もしくは複数の薬剤に応答しない際に、その環境に対して与えられる名称である。ＭＤＲは本質的、すなわちその薬剤に疾病が決して応答しないもの、あるいは獲得されたもの、すなわち以前は応答していた薬剤に対して疾病が応答しなくなったもののいずれかでありえる。ＭＤＲは一つ以上の機能的に及びまたは構造的に関連のない薬剤に対する疾病の交差抵抗性により特徴付けられる。ガンの領域におけるＭＤＲは、Kusmich及びTewによる「Detoxification Mechanism and Tumor Cell resistance to Anticancer Drugs」、特にセクションVII「The Multidrug-Resistant Phenotype（ＭＤＲ）」Medical Research Reviews, Vol.11, No.2, 185-217, (Section VIIは208-213頁)(1991)、及び、Georges、Sharom及びLingによる「Multidrug Resistance and Chemosensitization: Therapeutic Implications for Cancer Chemotherapy」、Advances in Pharmacology, Vol.12, 185-220 (1990)においてより詳細に議論されている。
【００１７】
異なるＭＤＲ機構が報告されている。多剤耐性（ＭＤＲ）の一つの形態は、多面的な糖蛋白質として表される膜結合性１７０−１８０ｋＤのエネルギー依存性流出ポンプあるいはＭＤＲ−１遺伝子によりコードされるP―グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ）により介在される（Endicott JA, Annu Rev Biochem 1989）。P―グリコプロテンはヒト腫瘍の多くにおいて、本質的及び獲得された抵抗性において重要な役割を果たすことが示されている。基質として作用し、その結果としてＰ−ｇｐにより効力を弱められる薬剤には、ビンカアルイカロイド（ビンクリスティン及びビンブラスティン）、アントラサイクリン（アドリアマイシン）およびエピポドフィロトキシン（エトポサイド）が含まれる。
【００１８】
最近、ＭＤＲ−１遺伝子が進行した卵巣ガンにおける追加的な危険因子として同定されている。D.S.Albertsらによる研究において、フェーズIIIの卵巣ガン患者がＭＤＲ−１でスクリーニングされた。高レベルのＭＤＲ−１を有する卵巣ガン患者は、平均９．８ヶ月生存した。低レベルのＭＤＲ−１を有する、もしくはＭＤＲ−１を発現しない患者は平均３０ヶ月あるいはそれ以上生存した。
【００１９】
ＭＤＲに関連したＰ−ｇｐが化学療法試薬に対する腫瘍細胞抵抗性において主要な因子である一方、ＭＤＲ現象は多機能性で多くの異なる機構を含んでいる。アントラサイクリンに対する抵抗性の他の経路一つは、Ｐ−ｇｐではない１９０ｋＤａ蛋白質（ｐ１９０）の出現を含んでいる。T. McGrathら、 Biochemical Pharmacology, 38: 3611 (1989) を参照。蛋白質ｐ１９０は血漿膜において排他的に見出されるものではなく、むしろ小胞体に顕著に局在化しているようである。D.Marquardt及びM.S.Center、Cancer Research, 52: 3157 (1992)参照のこと。
【００２０】
コール（Cole）及びディーレイ(Deeley)の業績により多剤耐性蛋白質（ＭＲＰ)に指定されている蛋白質をコードする１５３１個のアミノ酸からなる翻訳領域（ＯＲＦ）が単離された。ファン（Fan）らにより報告されているように、ＭＲＰ蛋白質は上記の１９０ｋＤ蛋白質と同様のものと考えられる。ＭＲＰは乳ガン（breast cancer）、ヒト白血病、ヒト小細胞肺ガン、ヒト大細胞肺ガン、繊維肉腫、腺ガン、甲状腺ガン及び子宮頸ガンにおいて観察されている。チェン（Chen）により、ＭＲＰはカプトテシン及びそのアナログに対する多剤耐性に関連していることが報告されている。
【００２１】
Ｐ−ｇｐでもＭＲＰ関連でもない他のＭＤＲが報告されている(Kellen編、Alternative Mechanism of Multidrug Resistance in Cancer, Birkhauser, 1995)。発明者らにより得られた結果は、Ｐ−ｇｐあるいはＭＲＰ多剤耐性に対抗するが、他の型のＭＤＲに対抗しないアデノシンＡ３アンタゴニストを用いたものと矛盾しない。
【００２２】
α―[３−〔（２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル）メチルアミノ〕プロピル]−３，４−ジメトキシ−α−（１−メチルエチル）ベンゼンアセトニトリル（ベラパミル）は、ＭＤＲに関連したＰ−ｇｐの効果に対抗するための薬剤として使用されている。ベラパミルはＬタイプのカルシウムチャンネルを遮断し、冠動脈と末梢血管の強力な血管拡張に使用され、心筋の酸素消費を減少させる。ベラパミルの生理学的な効果により、ＭＤＲでのベラパミルの使用は、低血圧、うっ血性心不全、洞房あるいは房室、結節伝導障害、ジギタリス毒性、ウルフパーキンソンホワイト症候群及びさらにβブロッカーあるいはキニジンで治療されていない患者に対して制限されなければならない。
【００２３】
Ｐ−ｇｐはまたアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）依存性であることを認識すると、ＭＤＲと対抗するほかの提唱される方法は、ガン細胞においてＡＴＰの生成を阻害することである。Carsonらの米国特許第６２１０９１７号は、ＭＤＲと対抗するためにＬ−アデノシン及び他のアデノシンキナーゼ阻害剤を使用することを開示している。加えて米国特許第６３９１８８４号は、２−デオキシグルコース、シアニン、オリゴマイシン、バリノマイシン、アジド、およびそれらの塩及び誘導体を含むＡＴＰ枯渇試薬を同定している。ＡＴＰ枯渇に依存するアプローチあるいはＭＤＲと対抗する阻害は、臨床的な成功には至っていない。しかしながら、本発明のアデノシンＡ３アンタゴニストとＡＴＰ枯渇試薬の双方を使用することは、有利に働くであろうことが合理的に予測される。米国特許第６２１０９１７号及び６３９１８８４号はここに組み入れられる。
【００２４】
その結果、ガン治療において単独あるいはＡＴＰ枯渇試薬とともにＭＤＲを阻害あるいはＭＤＲに対抗し、ベラパミルにより課される制限のない、化学治療薬エンハンサーあるいは化合物が必要であると思われる。
【００２５】
治療薬を組み合わせて使用することは、腫瘍疾患の治療において一般的である。たとえば、パクリタキセル（Taxol（登録商標））は、卵巣ガンの治療においてシスプラチンとともに使用されることが、米国ＦＤＡにより承認されている。Bisseryらの米国特許第５９０８８３５号は、ダウノルビシンあるいはドキソルビシンのようなアントラサイクリン抗生物質と共に、パクリタキセルあるいはドセタキセルを使用することによる相乗性をクレームしている。同様に、Bisserらの米国特許第５７２８６８７号は、アルキル化薬、エピドフィロトキシン、アンチメタボライト、あるいはビンカアルカロイドと共にパクリタキセルあるいはドセタキセルを使用することによる相乗性をクレームしている。しかしながら、このような組み合わせは従来、アデノシン受容体アンタゴニスト、特にＡ３受容体アンタゴニストの使用は含んでいない。
【００２６】
Marlene Jacobsonらの米国特許第５６４６１５６号は、好酸球活性化と脱顆粒を阻害し、その結果、喘息や超過敏反応のような状況を防ぐために、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストを使用することを開示している。
【００２７】
それ故、本発明の目的は、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの使用により、細胞上のアデノシンの防御的な効果を最少化あるいは減じることにより、腫瘍の治療を増強する化合物及び方法を提供する。さらに本発明の目的は、Ｐ−ｇｐ及びまたはＭＲＰ関連多剤耐性に対抗するために適した化合物及び方法を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる目的は、患者におけるタキセン誘導性超過敏反応を減じる化合物及び方法を提供することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明は、アデノシンＡ３受容体を発現するガンの化学的治療を増強し、Ｐ−グリコプロテインあるいはＭＲＰを発現するガンにおける多剤耐性に対抗するために、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの使用、そのための治療剤を開示する。好ましい態様では、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、タキセンファミリー、ビンカアルカロイド、カンプトテシンあるいは抗生物質の投与の前あるいは投与間に投与される。好ましい高親和性Ａ３受容体アンタゴニストには、置換基がここで定義される以下の化学式の化合物が含まれる。
【００３０】
【化５】
2005530858.tif 000003
【課題を解決するための手段】
【００３１】
発明者らは、ガンを発現するアデノシンＡ３受容体の多くの化学的な治療の増強剤として有用な、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストを見い出した。驚くべきことに、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストはまた、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ）流出ポンプ多剤耐性（ＭＤＲ）に拮抗する。最終的に、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストはまた、タキセン誘導性超過敏性を減じるあるいは改良するのに有用である。
【００３２】
ここで使用されるように、「高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニスト」とは、アデノシンアゴニスト（たとえばＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ）によるアデノシンＡ３受容体の活性化による細胞内ｃＡＭＰ量の減少を妨げる、５０ｎＭより低い親和結合測定値を有する化合物である。好ましくは、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストには、以下の一般式の化合物およびその薬学的塩が含まれる。
【００３３】
【化６】
2005530858.tif 000004
【００３４】
式中、
Ａは、イミダゾール、ピラゾール又はトリアゾール；
Ｒは、−Ｃ（Ｘ）Ｒ１、−Ｃ（Ｘ）−Ｎ（Ｒ１）２、−Ｃ（Ｘ）ＯＲ１、−Ｃ（Ｘ）ＳＲ１、−ＳＯｎＲ１、又はＳＯｎ−Ｎ（Ｒ１）２；
Ｒ１は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、複素環基、低級アルケニル、低級アルカノイル、又は窒素原子に結合している場合には、窒素原子と一緒になってアゼチジン環もしくは、一つもしくはそれ以上のヘテロ原子を含む５員−６員の複素環を形成してもよく；
Ｒ２は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、置換されたアラルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、又はアリールであり；
Ｒ３は、フラン、ピロール、チオフェン、ベンゾフラン、ベンゾピロール、ベンゾチオフェンであり、これらの基はヒドロキシ、アシル、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、置換されたアルキル、置換されたアルコキシ、置換されたアルケニル、置換されたアルキニル、アミノ、置換されたアミノ、アミノアシル、アシルオキシ、アシルアミノ、アルカリール、アリール、置換されたアリール、アリールオキシ、アジド、カルボキシル、カルボキシルアルキル、シアノ、ハロ、ニトロ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環式基、ヘテロシクロオキシ、アミノアシルオキシ、チオアルコキシ、置換されたチオアルコキシ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換されたアルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ２−アルキル、−ＳＯ２−置換されたアルキル、−ＳＯ２−アリール、−ＳＯ２−ヘテロアリール及びトリハロメチルからなる群から選択される一個またはそれ以上の置換基で置換されていてもよく；
Ｘは、Ｏ，Ｓ，又はＮＲ１  である。
【００３５】
さらに好ましくは、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、以下の一般式で表される「フェニル−カルバモイル−アミノ化合物」及びその薬学的塩である。
【００３６】
【化７】
2005530858.tif 000005
【００３７】
式中、
Ａはイミダゾール、ピラゾール、又はトリアゾール；
Ｒ２は、水素、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、アラルキル、置換されたアラルキル、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、又はアリール；
Ｒ３は、フラン；
Ｒ６は、アリール、置換されたアリール、ヘテロアリール、置換されたヘテロアリール、複素環、又は置換された複素環である。
【００３８】
化学治療薬――高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは単独で、あるいは他のガンの化学治療薬と共に投与されることができる。ガンの化学治療薬は、ガン細胞を攻撃あるいは殺す試薬として定義される。
【００３９】
ガンの化学治療薬には、タキセン化合物及びその誘導体のような、多くの化合物が含まれる。タキセン化合物は、太平洋イチイの木であるタキサスブレビフォリアからはじめに抽出された。追加的なタキセン誘導体と合成方法は、Holtonらの米国特許第６１９１２８７号、Ojimaらの米国特許第５７０５５０８号、Sistiらの米国特許第５６８８９７７号及び５７５０７３７号、Chenらの米国特許第５２４８７９６号、Gibsonらの米国特許第６０２０５０７号、Bisseryらの米国特許第５９０８８３５号に開示されており、これらの全ては参照としてここに組み入れられる。
【００４０】
あるガンの化学治療薬は分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）である。これらには、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びナベルビン（登録商標）（ビノレルビン、５‘−ノランヒドロブラスチン）が含まれる。
【００４１】
同様に、ガンの化学治療薬には、カンプトテシン化合物のようなトポイソメラーゼI阻害剤が含まれる。ここで使用されるように、「カンプトテシン化合物」にはカンプトサー（登録商標）（イリノテカンＨＣＬ）、ヒカンチン（登録商標）（トポテカンＨＣＬ）、及びカンプトテシンとその誘導体に由来するほかの化合物が含まれる。
【００４２】
ガンの化学治療薬の他のカテゴリーは、エトポシド、テニポシド、ミトポドジドのようなポドフィロトキシン誘導体である。
【００４３】
他のガンの化学治療薬は、アルキル化試薬であって、腫瘍細胞において遺伝物質をアルキル化するものである。それらには、シスプラチン、シクロフォスファミド、ニトロジェンマスタード、トリメチレンチオフォスフォラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロランブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロルナファジン、ダカルバジンが含まれる。
【００４４】
更なるガンの化学治療薬は、腫瘍細胞における代謝拮抗剤である。この種の薬剤の例としては、シトシン、アラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプライム及びプロカルバジンが挙げられる。
【００４５】
ガンの化学治療薬の更なるカテゴリーとして抗生物質が挙げられる。その例には、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミスアマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣおよびダウノマイシンが含まれる。これらの化合物には、リポソーム構造のものが多く、購入可能である。
【００４６】
また、他のガンの化学治療薬には、抗腫瘍抗体、バカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、アイフォスファミド及びミトキサントロンが含まれる。
【００４７】
ここで使用されるように、「Ａ３発現ガン」とは、アデノシンＡ３受容体を発現するあるいは、そうでなければアデノシン受容体の上昇した濃度を含むヒトガン細胞である。濃度の上昇は、類似した細胞型の正常、非ガン性組織と比較することにより決定される。Ａ３を発現するガンの例には、ヒト白血病、メラノーマ、すい臓ガン、卵巣ガン、胸ガン、前立腺ガン、大腸ガン、肺ガン悪性メラノーマ、組織球性リンパ腫、星状細胞腫のいくつかの形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
ここで使用されるように、「増強」とは以下に定義される増強した因子を測定することで決定されるような、相乗的な効果である。一般に、二あるいはそれ以上の増強された因子が相乗的であると考えられるが、一方で一よりも大きい増強された因子も相乗的であるだろう。たとえば、もし化合物の一つには個々の化学治療効果がほとんどない場合には、一よりも大きい増強された因子が、相乗的な効果が生じていることを示す。
【００４９】
ここで使用されるように、「アデノシンキナーゼ阻害剤」とは、Carsonらの米国特許第６２１０９１７号においてアデノシンキナーゼ阻害剤として定義される化合物や、アデノシン５’三リン酸の標的細胞を減少させるというそれに匹敵する効果を奏する化合物である。
【００５０】
Ａ３を発現するガンを処置する好ましい態様では、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストとガンの化学治療薬とが患者に投与される。組み合わせの治療は、ガンの化学治療薬の効果を増強させ、多剤耐性が発展するのを防ぐ。以下の示されるように、本発明はガンの化学治療薬の全ての形態を増強させるには有効ではない。本発明の好ましい応答を示すガンの化学治療薬は、Ｐ−ｇｐあるいはＭＲＰクラスの多剤耐性を増長させることが知られているタイプの試薬である。例として、タキセン化合物、ビンカアルカロイド、カンプトテシン及び化学治療薬として有用な抗生物質が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
同様に、組み合わせの治療は既に多剤耐性が進展したガンの治療においても使用されることができる。この場合、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、ガンの化学治療薬の効果をさらに増強させる一方で、現存するＭＤＲに対抗する。以下に示されるように、本発明は全てのＭＤＲガン形態に有効ではない。本発明に好ましい応答を示すＭＤＲガンは、Ｐ−ｇｐ及びＭＲＰクラスである。
【００５２】
ガンの化学治療薬がタキセン化合物の場合には、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、好ましくはタキセン化合物の投与前あるいは投与間のいずれかにおいて投与される。これは、タキセン試薬への超過敏症の発生を減じるためになされる。タキセンファミリーの購入可能な化合物は、パクリタキセル（ブリストルマイヤー  スクイブ  カンパニー、プリンストン、NYからＴＡＸＯＬという商品名で、及び、イバックス  コーポレーション、マイアミ、フロリダから大衆薬として購入可能）、ドセタキセル（アベンティス  ファーマシューティカルズ、コレジェビル、ＰＡからＴＡＸＯＴＥＲＥという商品名で購入可能）である。さらなるタキセンファミリーガンの化学治療薬が現在開発及び試験中であることが注目されている。
【００５３】
化合物は、化学治療薬により許容される限り、徐放性の様式で投与されることができる。好ましい徐放性デバイスは、当業者によく知られている。たとえば、徐放効果は、異なるｐＨ値で溶けるカプセルや、浸透圧によりゆっくり放出するカプセルや、他のいかなる知られた調整された放出手段により達成される。Delucaらの米国特許第６３０６４０６号は、多くの徐放する方法を開示しており、関連した参考およびその内容はここに組み入れられる。
【００５４】
現存する腫瘍を治療する他の好ましい態様は、アデノシンＡ３受容体アンタゴニストと、たとえばパクリタキセルあるいはドセタキセルというタキセンファミリー化合物である化学治療薬とを、腫瘍の成長を阻害するのに有効な量含む組成である。パクリタキセルは、ブリストルマイヤー  スクイブ  カンパニー、プリンストン、NYからＴＡＸＯＬという商品名で、及び、イバックス  コーポレーション、マイアミ、フロリダから一般薬（generic）として購入可能である。ドセタキセルは、アベンティス  ファーマシューティカルズ、コレジェビル、ＰＡからＴＡＸＯＴＥＲＥという商品名で購入可能である。本態様では、Ａ３アンタゴニストは、ガン細胞の成長速度を抑え、低酸素状態に対するアデノシンの保護効果を妨害し、タキセンの化学治療効果を高め、患者における超過敏性反応を抑え、多剤耐性の発達に対抗するだろう。
【００５５】
材料と方法
化成品及び試薬
ヒトＡ３７５、ＳＫＭＥＳ、ＨＴ２９、Ｐａｎｃ−１、ジャーカット、ＨｅＬ０２３、ＮＣＴＣ２５４４細胞は、アメリカンティッシュカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得られた。組織培養培地及び成長サプリメントは、バイオホワイタッカーから得られた。他に明記されない限り、他の全ての化合物はシグマから購入された。ＭＲＥ３０４６Ｆ２０、５−Ｎ−（４−メトキシフェニル−カルバモイル）アミノ−８−メチルー２（２フリル）−ピラゾロ−[４，３−ｅ]−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、ＩＬ−１０塩、５−Ｎ−（４−ジエチルアミノ−フェニル−カルバモイル）アミノ−８−メチル−２−（（２フリル）−ピラゾロ−[４，３−ｅ]−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、５−Ｎ−（４−メトキシフェニル−カルバモイル）アミノ−８−プロピル−２（２フリル）−ピラゾロ−[４，３−ｅ]１，２，４−トリアゾロ［１、５−ｃ］ピリミジン、ＭＲＥ３０５５Ｆ２０、５−Ｎ−（４−フェニルカルバモイル）アミノ−８−プロピルー２（２フリル）−ピラゾロ[４，３ｅ]−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン、ＭＲＥ３０６２Ｆ２０、５−Ｎ−（４−フェニル−カルバモイル）アミノ−８−ブチル−２（２フリル）−ピラゾロ−[４，３ｅ]−１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジンは、イタリアのフェレーラ大学のP.G.Baraldi教授により合成された。ＣＧＳ１５９４３、５−アミノ−９−クロロ−２−（フリル）１，２，４−トリアゾロ−［１，５−ｃ］キニアゾリン、ＺＭ２４１３８５、４−（２−［７−アミノ−２−（２−フリル）−［１，２，４］トリアゾロ［２，３−ａ］［１，３，５］トリアジン−５−イルアミノ］エチル）フェニルは、ＲＢＩ（ゼネカファーマシューティカルズ、Cheshire、ＵＫ）から得られた。ＰＤ９８０５９、２−アミノ−３−メトキシフラボン（ＭＡＰキナーゼ（ＭＥＫ）の選択的阻害剤）とローダミン１２３はカルビオケムから得られた。Ｕ０１２６（ＭＥＫ−１とＭＥＫ−２の阻害剤）とＳＢ２０３５８０（ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの阻害剤）は、プロメガから得られた。ＲＮＡｓｅはベーリンガーから購入された。
【００５６】
細胞培養
化学治療増強試験のために、ヒトメラノーマＡ３７５、ヒト肺ガンＳＫＭＥＳ、大腸ガンＨＴ２９、すい臓ガンＰａｎｃ−１セルラインは、もともとＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から得られ、ＰＲＣで保持された。Ａ２７８０ＡＤ１０セルラインはヨーロピアンコレクションカルチャーズ、サリスバリー、ＵＫから得られる。セルラインは、１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧ塩、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンサルフェイト、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（スンギゾーン）、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、２５μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１０％熱不活性化胎児ウシアルブミンが添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で保持された。細胞は湿ったインキュベータ内のＴ２５ファルコン組織培養フラスコ内で、５％二酸化炭素−９５％空気下、３７℃で培養される。細胞は一週間に２回継代培養される。Ａ３７５、ＳＫＭＥＳ、ＨＴ２９、Ｐａｎｃ−１培養の倍増時間は、各々約２２，４６，４８，６０時間である。
【００５７】
多剤耐性試験のために、Ａ３７５及びＮＣＴＣ２５４４細胞は、各々が１０％胎児子ウシ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）で、５％二酸化炭素／９５％空気下で、３７℃でＤＭＥＭ及びＥＭＥＭ培地で付着させて成長させ、保持される。ＨＥＬ２０３及びジャーカットは、１０％胎児子ウシ血清、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）で、５％二酸化炭素／９５％空気下で、３７℃で、ＲＰＭＩ−１６４０培地で成長させられる。細胞は１：５と１：１０間の比率で、一週間に２あるいは３回継代される。リンパ球はフェラーラ大学病院の血液バンクから好意で提供された軟膜ら単離された。研究のためのインフォームドコンセントの後に、健康なボランティアから提供された血液が得られた。リンパ球は密度勾配遠心（フィコール／ヒストパーク１．０７７ｇ／ｍｌ）により単離された。細胞は精製されたフィトヘモアグルチニン（１μｇ／ｍｌ）で刺激され、インターロイキン２（２０ユニット／ｍｌ）と１０％胎児子ウシ血清が加えられたＲＰＭＩ培地で増やされた。
【００５８】
コロニー形成アッセイ
指数的に成長したＡ３７５細胞は、２ｍｌの新鮮な培地の６ウエルプレートにおいてプレートあたり３００細胞植え付けられ、ＤＭＳＯ溶液に溶解されたパクリタキセル、ビンデシン、アデノシン受容体アゴニスト及びアンタゴニストで処理された。対照のプレートには、同量のＤＭＳＯのみを入れた。５％二酸化炭素を含む、湿った雰囲気下、３７℃で７日間成長させた後、細胞は無水メタノールで５分間で固定化され、１／１０のギエムサ／リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）染色溶液で１０分間染色された。染色溶液は取り除かれ、３０細胞以上のコロニーが生存したものとして数えられた。それぞれの処置において、６つの異なるウエルが数えられた。
【００５９】
フローサイトメトリー分析
Ａ３７５及びＮＣＴＣ２５４４固着細胞は、トリプシナイズされ、浮遊細胞と混合され、ＰＢＳで洗浄され、少なくとも２４時間、４℃で７０％（容量／容量）エタノール／ＰＢＳ溶液で浸透された。ジャーカット、ＨｅＬ０２３、ＰＢＭＣ細胞は１０分間、１０００ｘｇで遠心された。細胞ペレットは、それから再懸濁され、少なくとも２４時間、４℃で７０％（容量／容量）エタノール／ＰＢＳ溶液で浸透された。細胞はＰＢＳで洗浄され、ＤＮＡは２０μg／ｍｌのプロピジウムアイオダイドと１００μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅを含むＰＢＳ溶液で、室温で３０分間染色された。細胞はＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン−デッキンソン）で分析され、ＤＮＡの含有量はＣｅｌｌ−ＬＩＳＹＳプログラム（ベクトン−デッキンソン）で算出された。細胞サイクル内の細胞分配とアポトーシス細胞とは既に記載されているように（Secchieroら、２００１）測定された。端的には、細胞サイクル分配は、２ｎ（Ｇ１期）、４ｎ（Ｇ２及びM期）、４ｎ＞ｘ＞２ｎを含む細胞の割合として示される。ＤＮＡ量（Ｓ期）はプロピジウムアイオダイド染色で決定される。アポトーシス集団は、２ｎよりも低いＤＮＡ含量の細胞の割合である。
【００６０】
化学治療増強の測定
化合物の抗増殖活性は、細胞成長阻害アッセイを使用する慣用な実験により、容易に測定することができる。そのようなアッセイのためのセルラインの選択は、希望される将来の薬学的使用に基づく。多くのセルラインがアメリカンタイプカルチャーコレクション、Manassas、VAから研究のために入手可能である。
【００６１】
アッセイに適したセルラインには、ＨＬ−６０ヒト白血病、Ａ３７５ヒトメラノーマ、ＳＫＭＥＳヒト肺ガン、ＨＴ２９ヒト大腸ガン、Ｐａｎｃ−１ヒトすい臓ガン細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。セルラインは１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧ塩、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン塩、０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（フンギゾン）、２ｍＭのグルタミン、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０％の熱不活性化胎児ウシ血清が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で保持されることができる。そのように保持された細胞は、Ｔ２５ファルコン組織培養フラスコ内で３７℃、５％二酸化炭素−９５％空気下の湿ったインキュベータ内で培養されることができる。たとえば、そのように保持された細胞は、Ａ３７５ヒト白血病では約２２時間、ＳＫＭＥＳヒト肺ガンでは４６時間、ＨＴ２９ヒト大腸ガンでは４８時間、Ｐａｎｃ−１ヒトすい臓ガンでは６０時間の倍増時間である。
【００６２】
成長阻害アッセイのひとつはＭＴＴアッセイである。細胞（１０００−１５００細胞／ウエル）が総容量１００μｌ／ウエルで９６穴マイクロ培養プレートに植え付けられる。３７℃、５％二酸化炭素−９５％空気下の湿ったインキュベータ内で一晩培養された後、様々な濃度の培地で希釈された化学治療薬を、個々のウエルに１００μｌ添加する。プレートは、３７℃、５％二酸化炭素−９５％空気下の湿ったインキュベータ内に７−１０日置かれる。それからプレートは簡単に遠心され、１００μｌの増殖培地が除去される。細胞培養物は５０μｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム  ブロマイド）試薬（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水内で１ｍｇ／ｍｌ）と共に３７℃で４時間インキュベートされる。結果として生じる紫ホルマザン沈殿物が２００μｌのイソプロパノール中の０．０４N  塩酸で溶解される。吸光度が、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０マイクロプレートリーダーを用いて、５９５ｎｍの波長と、参照となる６５５ｎｍの波長で測定される。好ましくは、全ての試験は個々の投薬量レベルにおいて２回実行される。
【００６３】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ製マイクロプレートリーダーは、適切に設置されている場合には、試験結果をＥＺＥＤ５０プログラムのようなコンピュータプログラムを介してパーソナルコンピュータへ送信する。ＥＺＥＤ５０コンピュータプログラムは、対照細胞と比較して５０％細胞成長を阻害する試薬の濃度を見積もる。これはＩＣ５０と呼ばれるもので、以下の４つの対数の式を用いる曲線フィッティングテストデータにより決定される。
【００６４】
Ｙ＝（Ａｍａｘ−Ａｍｉｎ）／｛１＋（Ｘ／ＩＣ５０）ｎ｝＋Ａｍｉｎ
【００６５】
ここでＡｍａｘは対照細胞の吸光度、Ａｍｉｎは最も高い濃度で試薬が存在する際の細胞の吸光度、Ｙは測定された吸光度、Ｘは試薬の濃度、ＩＣ５０は対照細胞に比較して細胞成長を５０％阻害する試薬の濃度、ｎは曲線の傾きである。
【００６６】
もし試験濃度が適切に選択されれば（すなわち、低濃度では全くもしくはほとんど成長が阻害されず、高濃度では完全に阻害される）、ＥＺＥＤ５０プログラムはデータを非常によくフィットさせ、ＩＣ５０値を正確に見積もる。もし試験薬があまりに強力で、全ての試験された濃度において５０％以上細胞成長を阻害する場合には、ＥＺＥＤ５０プログラムではＩＣ５０を正確に見積もることができない（誤ってフィットされたＡｍａｘ値により表されたものとして）。これらの例では、データはＡｍａｘ値を修正することにより、再分析されることができるだろう。
【００６７】
一方、仮に試験される化合物が最も高い試薬濃度において不完全にしか阻害しない場合には、ＥＺＥＤ５０は試験試薬の能力を過大評価するだろう（フィットされたＩＣ５０値は実際のＩＣ５０値より低い）。この場合、ＩＣ５０値はＡｍａｘとＡｍｉｎ値の両方が修正された場合には、より正確に評価されるだろう。Ａｍａｘ及び／またはＡｍａｘとＡｍｉｎを、実験を繰り返すことなく修正することによりＩＣ５０値を見積もることは便利かもしれないが、ＩＣ５０を正確に決定するのに最もよい方法は、試験試薬の濃度を減少もしくは増加させて試験を繰り返すことである。
【００６８】
阻害アッセイ試験はまた、Ａ３受容体アンタゴニストを他の腫瘍阻害薬と組み合わせることにより増強された治療効果を決定するために使用される。細胞成長阻害アッセイは、Ａ３受容体アンタゴニストを選択された濃度で含んでもしくは含まずに、行われる。腫瘍阻害薬のＩＣ５０がＡ３受容体アンタゴニストの共存下でより低い場合には、増強された治療効果が奏されている。
【００６９】
定量的には、増強係数（ＥＦ）は腫瘍抑制薬のＩＣ５０値を同じセルラインのＡ３受容体アンタゴニストとともに腫瘍阻害薬を用いた場合のＩＣ５０値で割ることで算出される。
【００７０】
増強係数（ＥＦ）＝抗腫瘍薬のＩＣ５０／（抗腫瘍薬とＡ３受容体アンタゴニストのＩＣ５０）
【００７１】
ＥＦの解釈は試験されるＡ３受容体アンタゴニストの濃度に依存する。たとえば、Ａ３受容体アンタゴニストを非常に低い濃度で使用する場合には、もしＡ３受容体アンタゴニストの濃度が細胞成長阻害の閾値よりも下の場合には、１．０より大きいＥＦは相乗的である。一方、Ａ３受容体アンタゴニストの高い濃度では、１．０より大きいＥＦでも非相乗的であって、一義的にＡ３受容体アンタゴニストの効果による結果であろう。Ａ３受容体アンタゴニストのＩＣ５０近傍のＡ３受容体アンタゴニスト濃度では、２．０より大きいＥＦは相乗的であると考えられ、１．０から２．０間のＥＦは、抗腫瘍試薬とＡ３受容体アンタゴニストの幾何学的な組み合わせから予測されることができる。
【００７２】
ローダミン１２３流出アッセイ
個々のサブライン由来の５ｘ１０５細胞に、５０ｎｇ／ｍｌのローダミン１２３が３０分間３７℃で負荷された。細胞は洗浄され、ローダミンを流出させるために３７℃で３時間培地のない染色試薬内に再懸濁された。細胞はそれから２回洗浄され、細胞内のローダミン１２３の蛍光がフローサイトメーター（残った蛍光ＦＲＥＳ）で分析された。蛍光度は、薬剤の放出を抑制するために４℃で保持された、負荷された細胞と比較された（最大蛍光ＦＭＡＸ）。細胞には、アデノシン受容体がＰ−ｇｐ薬剤流出活性を防ぐ能力を評価するために、アデノシン受容体アンタゴニストが処理された。ローダミン１２３にさらされていない個々のサブライン由来の細胞は、陰性コントロールとして使用された。
【００７３】
代謝阻害剤
細胞は、アデノシン受容体アンタゴニストとパクリタキセルあるいはビンデシンを添加するのに先立って、３０分間代謝阻害剤あるいは薬剤媒体（ＤＭＳＯ）で処理された。２４時間後、細胞はフローサイトメトリー分析のために収集された。ＭＥＫ−１活性化を抑制するために、ＭＥＫの阻害剤として２０μＭのＰＤ９８０５９が使用された。Ｕ０１２６は細胞外シグナル制御性キナーゼＥＲＫ−１及びＥＲＫ−２活性化を阻害するために、ＭＥＫ−１及びＭＥＫ−２の阻害剤として１０μＭ使用された。ＳＢ２０３５８０はｐ３８ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）の阻害剤として１μＭ使用された。
【００７４】
統計分析
図面と本文における全ての値は、ｎ回の観測（ｎ＞３）の平均値±標準偏差（ＳＤ）として表される。データセットはバリアンス（ＡＮＯＶＡ）及びドネット試験（必要であれば）の分析により調べられた。０．０５よりも小さいP値は、統計的に意義があると考えられた。ＦＡＣｓｃａｎにより得られた代表的なイメージが、少なくとも３回の異なる試験で得られた同様の結果とともに報告された。
【００７５】
実施例
以下の実施例は本発明の態様を説明するものであるが、限定として解釈されるものではない。これらの実施例で使用される記号と約束事（convention）は、たとえばジャーナルオブアメリカンケミカルソサエティー（AJ.Am.Chem.Soc.(C)）やテトラヘドロンといった最新の国際的な化学文献において使用されるものと一致させているつもりである。
【００７６】
３つのＡ３受容体アンタゴニストが、成長阻害活性と、公知抗腫瘍薬の成長阻害活性の増強程度を試験された。表２は３つのＡ３受容体アンタゴニスト化合物の受容体結合アッセイ結果を示している。３つの化合物の構造は以下のとおりである。
【００７７】
【化８】
2005530858.tif 000006
【００７８】
ＭＲＥ３００８Ｆ２０、５−［［（４−メトキシフェニル）アミノ］カルボニル］アミノ−８−プロピル−２−（２−フリル）−ピラゾロ［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン
【００７９】
【化９】
2005530858.tif 000007
【００８０】
ＩＬ−１０、Ｎ−１−（４−ジエシルアミノ−フェニル）−Ｎ‘−５−［８−メチル−２−（２−フリル）−ピラゾロ［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン］−尿素
【００８１】
【化１０】
2005530858.tif 000008
【００８２】
ＩＬ−１１、Ｎ−１−（４−ジメチルアミノ−フェニル）−Ｎ‘−５−［８−メチル−２−（２−フリル）−ピラゾロ［４，３−ｅ］１，２，４−トリアゾロ［１，５−ｃ］ピリミジン］−尿素
【００８３】
表２  ｒＡ１、ｒＡ２Ａ、ｈＡ３アデノシン受容体への結合親和性
【００８４】
【表２】
2005530858.tif 000009
【００８５】
表２は、ＭＲＥ３００８Ｆ２０，ＩＬ−１０、ＩＬ−１１が、ヒトアデノシンＡ３受容体の選択的なアンタゴニストであることを示す。
【００８６】
これら３つの化合物の結合親和試験に加え、成長阻害試験もまた遂行された。他の化合物と一緒でない、化合物の成長試験結果が表３に示されている。表３はまた、一般的な抗腫瘍試薬の成長阻害活性も示している。
【００８７】
表３  Ａ３アンタゴニストと抗腫瘍試薬が別々に使用される際の成長阻害活性
【００８８】
【表３】
2005530858.tif 000010
【００８９】
化合物ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０，ＩＬ−１１は、キングファーマシューティカル社から得られた。イリノテカン塩酸（カンプトサー（登録商標）、２０ｍｇ／ｍｌ）はファルマシアアンドアップジョン社から得られた。パクリタキセル（タキソール（登録商標）、６ｍｇ／ｍｌ）は、ブリストルマイヤースクイブ社から得られた。ドセタキセル（タキソテール（登録商標））は、ローヌプーランポレーから得られた。ビンブラスチン硫酸塩はシグマ化学社から得られた（Ｖ１３７７）。イリノテカンは培養培地で希釈された。他の全ての試薬は１００％ＤＭＳＯで適切な濃度に希釈された。ＤＭＳＯのストック溶液は成長培地で１００倍に希釈されたので、ＤＭＳＯの最終濃度は１％である。われわれは以前１％までの濃度のＤＭＳＯは培養細胞の成長に影響を与えないことを示している。ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）はシグマ化学社から得られた。ＲＰＭＩ−１６４０培地、１００００ユニット／ｍｌのペニシリンＧ塩を含む抗生抗カビ性１００X、１００００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩、２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（フンギゾン）、グルタミン（２００ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１Ｍ）、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ソディウムビカルボネート（７．５％）、胎児ウシ血清は、ＧｉｂｃｏＢＲＬから得られた。胎児ウシ血清の補足物は、５６℃、３０分間で不活性化された。
【００９０】
ヒトメラノーマＡ３７５、ヒト肺ガンＳＫＭＥＳ、大腸ガンＨＴ２９、すい臓ガンＰａｎｃ−１セルラインはもともとＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）から得られ、１００ユニット／ｍｌのペニシリンＧ塩、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン流さ、０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ（フンギゾン）、２ｍＭのグルタミン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン、１０％熱不活性化胎児  ウシ血清が添加されたＲＰＭＩ−１６４０培地で保持された。
【００９１】
ほとんどの試薬はこれらの４つの組織学的に異なるヒト腫瘍セルライン（Ａ３７５メラノーマ、ＨＴ２９大腸ガン、Ｐａｎｃ−１すい臓ガン、ＳＫＭＥＳ肺ガン）に対して、広範囲で同程度の成長阻害活性を示した。ＩＣ５０値は４つのセルラインに対してほとんど同じであった。興味あることに、ＨＴ２９はＡ３７５セルラインに比べてドキソルビシン（ＩＣ５０値が０．２１１対０．００６４μｇ／ｍｌ）、ミトキサントロン（ＩＣ５０値が０．１対０．００３２μｇ／ｍｌ）各々に対して約３０倍の難治性であった。ＨＴ２９はトポイソメラーゼＩＩの変異した形態を有しており、それゆえトポイソメラーゼＩＩ、ＤＮＡ，薬剤三成分からなる複合体で捕獲することで成長阻害活性を媒介するドキソルビシンとミトキサントロンに対してより難治性である可能性がある。
【実施例１】
【００９２】
ヒトメラノーマA３７５
ヒトメラノーマA３７５セルラインに対するパクリタキセルの成長阻害活性は、１０μｇ／ｍｌのＭＲＥ３００８Ｆ２０、あるいは５μｇ／ｍｌのＩＬ−１０とＩＬ−１１の存在下及び非存在下で測定された（表４）。
これらの非細胞毒性濃度において、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１（Ａ３アンタゴニストのみの存在下で約３０−４５％成長を阻害する）は、パクリタキセルの成長阻害活性を８−１２倍増強させ、ＩＣ５０値は０．００４６μｇ／ｍｌ（パクリタキセル単独）から０．０００４−０．０００５４μｇ／ｍｌ（パクリタキセルとＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１）に減少した。
【００９３】
表４  Ａ３７５細胞に対して、Ａ３アンタゴニストと抗腫瘍試薬を共に使用した際の成長阻害活性
【００９４】
【表４】
2005530858.tif 000011
【００９５】
ＩＬ−１０とＩＬ−１１が濃度依存的にパクリタキセルの成長阻害活性を増強することもまた測定された。タキセンファミリー化合物による増強効果のさらなる試験の結果は、表５に開示されている。一般的なタキセン化合物であるパクリタキセル（タキソール（登録商標））とドセタキセル（タキソテール（登録商標））の両方も包含されている。
【００９６】
表５は１、３、１０μｇ／ｍｌのＭＲＥ３００８Ｆ２０と、０．５、１．５、５μｇ／ｍｌのＩＬ−１０及びＩＬ−１１化合物の濃度依存性を示している。ＭＲＥ３００８Ｆ２０は濃度非依存的にパクリタキセルの成長阻害活性を増強する（増強因子は３つの濃度全てにおいて６．４−７．１）。一方、ＩＬ−１０とＩＬ−１１の濃度依存的にパクリタキセルの成長阻害活性を増強させる。この試験はまた化合物ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１がドセタキセルとともに相乗的効果を示す増強因子を有することを示している。
【００９７】
表５  Ａ３７５細胞に対して、Ａ３アンタゴニストとタキセン化合物を共に使用した際の成長阻害活性
【００９８】
【表５】
2005530858.tif 000012
【実施例２】
【００９９】
ヒト肺ガンＳＫＭＥＳ
ヒト肺ガンＳＫＭＥＳにおいて、全ての３つのＡ３アンタゴニストがパクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、ビンデシンの成長阻害活性を増強させた（表６）。
【０１００】
表６  ＳＫＭＥＳ細胞に対して、Ａ３アンタゴニストと抗腫瘍試薬を共に使用した際の成長阻害活性
【０１０１】
【表６】
2005530858.tif 000013
【０１０２】
表６をＡ３７５ヒトメラノーマで得られた結果を比較すると、ＳＫＭＥＳ細胞におけるタキセン化合物の増強の大きさはＡ３７５メラノーマにおいて観測されたものに比べて低い。相乗効果の絶対的な大きさにおける違いは試験条件が採用された、異なる腫瘍におけるP−ｇｐの活性と関連しているだろう。しかしながら、Ａ３アンタゴニストとタキセン化合物の間の増強は一貫して観測されている。ＳＫＭＥＳ細胞における増強もまた、ビンブラスチンの場合にＰ−ｇｐを阻害する機構と、イリノテカン塩酸の場合にＭＲＰを阻害する機構と一貫している。
【実施例３】
【０１０３】
ヒト大腸ガンＨＴ２９
ヒト大腸ガンＨＴ２９セルラインに対するパクリタキセルとドセタキセルの成長阻害活性が、１μｇ／ｍｌのＭＲＥ３００８Ｆ２０あるいは、０．５μｇ／ｍｌのＩＬ−１０とＩＬ−１１の存在下あるいは非存在下で決定された（表７）。Ａ３アンタゴニストがパクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、イリノテカンの成長阻害活性を増強させることが見出された。
【０１０４】
表７  ＨＴ２９細胞に対して、Ａ３アンタゴニストとタキセン化合物を共に使用した際の成長阻害活性
【０１０５】
【表７】
2005530858.tif 000014
【実施例４】
【０１０６】
ヒトすい臓ガンＰａｎｃ−１
ヒトのすい臓ガンＰａｎｃ−１において、Ａ３アンタゴニストはタキセンファミリー化合物であるパクリタキセルとドセタキセルの成長阻害活性を増強した（表８）。しかしながら、観測された増強作用は、Ａ３７５メラノーマにおいて観測されたものと比較してより小さい大きさである。
【０１０７】
表８  Ｐａｎｃ−１細胞に対して、Ａ３アンタゴニストとタキセン化合物を共に使用した際の成長阻害活性
【０１０８】
【表８】
2005530858.tif 000015
【０１０９】
上述のデータと表から、ガンの化学治療薬と共に高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストを使用することは、多くの薬において顕著な増強効果を奏したことがわかる。
【０１１０】
実施例  ＭＤＲガン細胞治療
本発明者らは、ガンの化学治療薬はそれらが関連するＭＤＲの形態から、そのＡ３アンタゴニスト増強作用によって選択きることに注目し、高親和性Ａ３アデノシン受容体アンタゴニストは多剤耐性と関連するＰ−ｇｐやＭＲＰに対抗するために使用できることをさらに確立した。
【０１１１】
はじめに、発明者らはＡ３アデノシン受容体が慣用的な化学治療薬の毒性作用に対して細胞を防御できるかどうかを評価した。増強した濃度のパクリタキセル（０．２５−７５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＡ３７５メラノーマ細胞においてコロニー形成アッセイ試験を行った。Ａ３のブロッキングが選択的なアンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０で得られた一方、Ａ３の刺激は選択的アゴニストであるＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡで達成された。Ａ３７５細胞のコロニー形成は、パクリタキセル（０．７５ｎｇ／ｍｌ）とＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）の両方が適用された際に阻止されたが、パクリタキセル単独あるいはＭＲＥ３００８Ｆ２０が単独で適用された場合には、コロニー形成は部分的にしか減少しない（図２）。
【０１１２】
アデノシンＡ３アゴニストＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（１０μＭ）が適用された際に、Ａ３７５細胞のコロニー形成は約３０％増加する。これは、図２のバー「Ｃ」がＤＭＳＯコントロールのバー「Ｄ」の１３０％であることからわかる。図２はさらに、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡがタキセンファミリー化合物パクリタキセル（０．７５ｎｇ／ｍｌ）と共に用いられる際に、増強したコロニー形成が起こることを示している。パクリタキセルが単独で添加された場合には（図２のバー「Ｔ」）、コロニー形成は対照の６４％である。コロニー形成はＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡが共に用いられた場合に、３２％から８５％増加する（図２のバー「ＴＣ」）。
【０１１３】
アデノシンＡ３アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）の単独使用は、コロニー形成を対照の５９％まで減少させる（図２のバー「Ｍ」）。驚くべきことに、Ａ３アンタゴニストがタキセン化合物と共に用いられた場合には、ほとんどすべてのコロニー形成が阻止される（図２のバー「ＴＭ」）。これは、Ａ３アンタゴニストを化学治療薬と共に使用することによる相乗的な性質と明らかに合致している。０．２％のコロニー形成という驚くべき結果に比較して、相加的な組み合わせは３８％という結果を予測する。
【０１１４】
この結果の一つの説明は、Ａ３の閉塞がパクリタキセル介在の有害な効果を増強させるが（ｐ＜０．０１、図２のバー「ＴＭ」対バー「Ｔ」）、Ａ３受容体はプロサバイバルシグナルを誘発し、タキセンパクリタキセルで処理されたＡ３７５細胞のコロニー形成能力を取り戻せないというものである。
【０１１５】
コロニー形成試験に続いて、発明者らはまたＡ３アデノシン受容体アンタゴニストが、タキセンファミリー化合物パクリタキセルとビンカアルカロイドビンデシンでＡ３７５細胞を急激に処理することで、化学治療効果を増強させる能力を分析した。細胞増殖とアポトーシスはプロピジウムアイオダイド（ＰＩ）によるＤＮＡ染色の後、フローサイトメーターで定量された。露出の２４時間後、パクリタキセルとビンデシンは用量依存的な細胞のＧ２／Ｍ細胞周期への集積と、それに平行したＧ１集団の減少を誘導した。
【０１１６】
パクリタキセルとビンデシンが細胞増殖を変化させる効果を定量するために、発明者らはＧ２／Ｍ集積の５０％を発揮する濃度（ＥＣ５０）と決定した。増強した濃度の化学治療薬にさらされた場合には、ＥＣ５０はパクリタキセルとビンデシン各々に対して１６．６０±２．００ｎｇ／ｍｌと１．９０±０．２０ｎＭであった（４回の実験の平均）。さらなる分析が、Ｇ２／ＭアレストのＥＣ５０に比較して、Ｇ１集団の減少によるパクリタキセルとビンデシンのＥＣ５０の効果はそれほどかわらないことを示している。ＤＮＡ複製の代表であるＳ期の集団は感知できるほどに変化しない。
【０１１７】
追加実験により、アポトーシスが進行中の細胞の代表であるサブＧ１集団が定量された。Ａ３７５細胞において、アポトーシス細胞の割合はパクリタキセルの濃度とともに徐々に増加し、最大値は（異なる実験で３５乃至５３％幅があるが）５ｎｇ／ｍｌまで達する。パクリタキセル濃度の増加はサブＧ１のＡ３７５細胞を減少させる。最大のアポトーシスを発揮する濃度（ＥＣＭＡＸ）は、６．００±０．６３ｎｇ／ｍｌである（４回の実験の平均）。同様にビンデシンによる実験結果のＥＣＭＡＸ値は３．５４±０．４２ｎＭである（４回の実験の平均）。
【０１１８】
パクリタキセルあるいはビンデシンを、Ａ３アデノシン受容体選択的Ａ３アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０と共にあるいはアンタゴニストなしで処理されたＡ３７５細胞は、増強を示した。図３Ａ及び３Ｃは、ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）がビンデシンとパクリタキセルが細胞増殖を変化させる能力を向上させることを示している。ＭＲＥ３００８Ｆ２０は、パクリタキセルとビンデシンのＥＣ５０を各々１．９倍、４倍減少させた。同様な結果がＧ１集団を計算するＥＣ５０値を分析することで得られた。
【０１１９】
さらに、ＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）は、パクリタキセルとビンデシンのＥＣＭＡＸを各々２．０倍と２．１倍減少させた（図３Ｂ及び３Ｄ）。
【０１２０】
Ａ３７５細胞（Ａｐｏ（サブジブロイド細胞）、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ期）におけるＤＮＡ含量の代表的なフローサイトメトリープロファイルが図４に示されている。図４Ｃは両方の処置において（Ａ３アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０とビンカアルカロイドビンデシン）、ビンデシンのみが処理された細胞に比較して、細胞がＧ１からＧ２／Ｍ期へ進化するようにビンデシン応答が増加した（図４Ｂ）。同様な結果がタキセン化合物パクリタキセルで得られた（図４Ｅ−Ｆ）。
【０１２１】
増強活性がＭＲＥ３００８Ｆ２０溶液に存在する毒性の混在物に関連するものではなく、Ａ３アデノシン受容体毒意的遮断によるものであるか否かを確かめるために、発明者らは他のアデノシン受容体アンタゴニストがビンデシとパクリタキセルへのＡ３７５細胞応答を増強させる能力を測定した。
【０１２２】
Ａ３７５細胞はビンデシン（１ｎＭ）と増加した濃度のアデノシン受容体アンタゴニスト（ＭＲＥ３０５５Ｆ２０、ＭＲＥ３０６２Ｆ２０、ＭＲＥ３０４６Ｆ２０，ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＩＬ−１０、ＣＧＳ１５９４３、ＺＭ２４１３８５）で処理された。図５Ａに示されるように、アデノシンアンタゴニストがビンデシンの効果を増強させる能力の順番は、ＭＲＥ３０５５Ｆ２０（最も高い）＞ＭＲＥ３０６２Ｆ２０＞ＭＲＥ３０４６Ｆ２０＞ＭＲＥ３００８Ｆ２０＞ＩＬ−１０＞ＣＧＳ１５９４３＞ＺＭ２４１３８５（最も低い）であった。増強活性の５０％を発揮する濃度（ＳＥＣ５０）は、４回の実験の平均として表９に示される。ＳＥＣ５０値はアデノシンＡ３受容体への結合実験において観測された阻害均衡結合定数（Ｋｉ）とよく一致している（図５Ｂ）。
【０１２３】
表９  Ａ３７５細胞における、ビンデシンの活性を増強させるアデノシン受容体アンタゴニストパラメータと、Ａ３アデノシン受容体への結合親和性
【０１２４】
【表９】
2005530858.tif 000016
【０１２５】
ＳＥＣ５０：ビンデシン（１ｎＭ）への増強した活性の５０％を誘導するアデノシン受容体アンタゴニスト用量が、Ｇ２／Ｍ蓄積用量応答曲線で計算された。
Ｋｉ：ヒトＡ３アデノシン受容体への結合親和性の平行定数。データは４回の別々の実験での平均を表している。
【０１２６】
パクリタキセルとビンデシン介在性の細胞増殖の変化とアポトーシスへのＡ３受容体アンタゴニストの役割を確かめるために、さらなるセルラインにおいて試験が行われた。セルラインはＡ３７５セルラインと同様のアデノシン受容体の表面発現パターンを有するもの、すなわちＨｅＬ０２３，ジャーカット、ＮＣＴＣ２５４４、ＰＢＭＣ胚が選択された。実験条件はＡ３７５細胞試験における条件と同様である。Ａ３アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０の処理によるビンデシンとパクリタキセル介在性細胞周期分配変化（Ｇ２／Ｍ集積）のＥＣ５０値への効果が、表１０に示されている。ＥＣＭＡＸ値において反映されるアポトーシスレベルにおける変化もまた示されている。
【０１２７】
表１０では、ＨｅＬ０２３セルラインはパクリタキセルとビンデシン単独に対して最も低い感受性を示している。興味深いことに、ＨｅＬ０２３細胞はまたＭＲＥ３００８Ｆ２０をさらに処理することにより、最も高い増強を示している。
【０１２８】
表１０  パクリタキセルとビンデシンを、Ａ３受容体アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０と共にもしくは同アンタゴニストなしで処理した場合の、異なる細胞におけるＧ２／Ｍ蓄積とアポトーシスの誘導
【０１２９】
【表１０】
2005530858.tif 000017
2005530858.tif 000018
【０１３０】
ＥＣ５０値はＧ２／Ｍ蓄積用量応答曲線を分析することにより得られた。ＥＣＭＡＸ値はまたサブＧ１蓄積用量応答曲線を分析することにより得られた。パクリタキセル値はｎｇ／ｍｌのユニットである。ビンデシンの値はｎＭのユニットである。ｎｄとは行われていないことである。
＊ Ｐ＜０．０１対ＤＭＳＯ、分析はドネッド試験にしたがうＡＮＯＶＡによるものである。
【０１３１】
ＨｅＬ０２３セルラインにおけるより大きな相対的な増強は、他のセルラインにおいては欠如している因子か、P−グリコプロテイン薬剤排除活性により調節される細胞内の活性濃度に関連しているようである。
【０１３２】
ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）保持率、Ｐ−ｇｐ機能的アッセイが、全てのセルラインにおいて研究された。このアッセイは、細胞をＲｈ１２３と共にインキュベートして、その蛍光を測定することによりＲｈ１２３の蓄積を決定することで行われた。Ｒｈ１２３の最大負荷（ＦＭＡＸ）が、細胞を収穫して、活性なＲｈ１２３流出を防ぐために細胞を４℃に保持する処理の最後において測定された。Ｐ−ｇｐ薬剤流出は、新鮮な新しいＲｈ１２３非混在培地内、３時間３７℃でＲｈ１２３が負荷された細胞をインキュベートして行われた。インキュベーションの後、残った蛍光（ＦＲＥＳ）が測定され、ＦＭＡＸと比較された。
【０１３３】
Ａ３７５細胞におけるＲｈ１２３保持率の結果が図６Ａと図６Ｂに示されている。図６ＡはアデノシンＡ３アンタゴニスト非存在下でのＡ３７５細胞によるＲｈ１２３蓄積を表すフロークロマトグラムを示している。二つの細胞集団が見出され、ＦＲＥＳは、ＦＭＡＸよりも低い平均蛍光強度を有することで特徴付けられる。最も低い蛍光を有し、総細胞の２６±５％にあたるものは、機能的なＰ−ｇｐを発現し、細胞内Ｒｈ１２３のレベルが低い細胞を表している。
【０１３４】
あらかじめ注記した通り、上記で考察した要素のいくつかは拡張可能である。総対照的に、図６ＢはＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）存在下でのＲｈ１２３のＡ３７５細胞性蓄積を示している。高親和性アンタゴニストの存在で、応答はＦＭＡＸと同程度のＦＲＥＳクロマトグラムを生じ、Ｐ−ｇｐ介在性Ｒｈ１２３輸送の完全な閉塞と一致している。
【０１３５】
ヒトヘリスロ白血病（herithro-leukemia）  HｅL０２３細胞におけるＲｈ１２３保持率の結果が、図６Ｃと図６Ｄに示されている。図６Ｃは、ＨｅＬ０２３細胞はＡ３７５細胞よりも高いＰ−ｇｐ活性を有していることを示している。ＦＲＥＳ（黒く影になっている領域）はＲｈ１２３を処理されていない細胞で得られたクロマトグラム（自動蛍光）と類似している。この一致はほとんど全て（１００±１％）の高いレベルの機能的なＰ−ｇｐを発現している細胞において一致している。
【０１３６】
Ａ３アンタゴニストＭＲＥ３００８Ｆ２０を添加することで、ＨＥＬ０２３細胞はＰ−ｇｐ阻害性を示した（図６D）。ＭＲＥ３００８Ｆ２０存在下でのＦＲＥＳは、ＦＭＡＸと類似している。これはほとんど全てのＰ−ｇｐの阻害を示唆している。
【０１３７】
試験されたジャーカット及びＮＣＴＣ２５４４細胞は、３７℃で３時間のインキュベーションの後に顕著なＲｈ１２３蛍光の変化を示さず、これらの細胞では検出可能なＰ−ｇｐ薬剤ポンピング活性がほとんどないあるいは検出できないことと一致している。
【０１３８】
Ａ３アンタゴニストの抗Ｐ−ｇｐ活性がＭＲＥ３００８Ｆ２０溶液における毒性混在物に関連したものではないことを確かめるために、他のアデノシン受容体アンタゴニストがＰ−ｇｐ介在性薬剤流出を妨害する能力が測定された。ＨｅＬ０２３細胞はアデノシン受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１０、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＭＲＥ３０５５Ｆ２０，ＭＲＥ３０６２Ｆ２０、ＭＲＥ３０４６Ｆ２０、ＺＭ２４１３８５、ＣＧＳ１５９４３）で処理された。結果は表１１に示されている。
【０１３９】
表１１はアデノシン受容体アンタゴニスト存在下でのＰ−ｇｐ活性を発現する細胞の割合（Ｒｈ１２３ネガティブ細胞のパーセンテージ）を示している。高親和性アデノシンＡ３アンタゴニストであるＩＬ−１０、ＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＭＲＥ３０５５Ｆ２０，ＭＲＥ３０６２Ｆ２０、ＭＲＥ３０４６Ｆ２０は、Ｐ−ｇｐ活性の強力な阻害剤である。これに対して低親和性アンタゴニストであるＺＭ２４１３８５とＣＧＳ１５９４３はＰ−ｇｐ活性に対してより低い効果を有していた。これは高いＡ３親和性あるいはアデノシン受容体アンタゴニストにより介在されるＰ−ｇｐ薬剤排除活性の阻害との構造活性関係の存在によるものであるだろう。
【０１４０】
表１１  アデノシン受容体アンタゴニストの存在及び非存在下でのＨｅＬ０２３細胞におけるローダミン１２３流出（Ｒｈ１２３）評価
【０１４１】
【表１１】
2005530858.tif 000019
2005530858.tif 000020
【０１４２】
表１１は４回の異なる実験の平均を示している。
【０１４３】
Ａ３アンタゴニスト介在性のビンデシンとパクリタキセルへの応答による抗増殖効果を維持する分子メカニズムを強調（underline）するために、シグナリングの研究が行われた。
【０１４４】
以前の研究ではパクリタキセルとビンカアルカロイド誘導体の致死率をマイトジェンアッセイ化プロテインカイネース（ＭＡＰＫ）ファミリーと関連付けた（Lieu、Sequence-dependent potential mol. Pharmacol. 2001）。三つのＭＡＰＫファミリー、ＥＲＫ（あるいはｐ４２／４４ＭＡＰＫ）、ＪＮＫ（あるいはＳＡＰＫ）、ｐ３８ＭＡＰＫがこれまでに特徴付けられている。シグナリングの研究はＭＲＥ３００８Ｆ２０介在のビンデシンとパクリタキセルの増強におけるＥＲＫとｐ３８ＭＡＰＫの効果について行われた。ＪＮＫ経路は商業的に利用可能なＪＮＫ阻害剤がないため、研究されなかった。結果は図７Ａ及び図７Ｂに示されている。
【０１４５】
ＰＤ９８０５９はＭＥＫ１／２の選択的阻害剤であり（dudley dt, PNAS 92:7686, 1995）、ＭＥＫ経路を阻害するために用いられた。Ｕ０１２６はＰＤ９８０５９の約１００倍強力な試薬であり、ＥＲＫ活性化の阻害剤として用いられた。ＳＢ２０３５８０は、選択的にｐ３８ＭＡＰＫ活性を阻害する（Young PR JBC 272: 12116 1997）。Ａ３７５細胞はＰＤ９８０５９（２０μＭ）、Ｕ０１２６（３０μＭ）、ＳＢ２０３５８０（１μＭ）あるいはＤＭＳＯ（対照として）で前処理され、それからビンデシン（１ｎＭ）あるいはパクリタキセル（１５ｎｇ／ｍｌ）でチャレンジされた。処理から２４時間後、細胞は収穫され、アポトーシスと細胞周期が分析された。
【０１４６】
ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＢ２０３５８０とパクリタキセルあるいはビンデシンとの組み合わせは、パクリタキセルあるいはビンデシン単独と比較して、Ｇ２／Ｍ蓄積割合を変化させなかった。ＰＤ９８０５９とＳＢ２０３５８０はＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）を阻害できず、Ａ３７５細胞のビンデシンとパクリタキセルへの感受性を改良した。ＰＤ９８０５９とパクリタキセルとの結果は図７Ａのバー「ＴＰ」として示されており、ビンデシンとの結果はバー「ＶＰ」で示されている。ＳＢ２０３５８０とパクリタキセルとの結果は図７Ａのバー「ＴＳ」として示されており、ビンデシンとの結果はバー「ＶＳ」である。
【０１４７】
Ｕ０１２６は、パクリタキセル（図７Ａのバー「ＴＵ」）もしくはビンデシン(図７Ａのバー「ＶＵ」)の存在下でＭＲＥ３００８Ｆ２０誘導性のＧ２／Ｍ蓄積を２３±５％、４８±５％阻害した。これは、増強活性の仲介分子はＥＲＫであったことを示唆している。
【０１４８】
経路の選択的阻害における効果が図７Ｂに示されている。ＰＤ９８０５９（図７Ｂ、列５、３５±６％）、Ｕ０１２６（図７Ｂ、列３、７３±１０％）で処理された細胞におけるパクリタキセル２５ｎｇ／ｍｌで誘導されるアポトーシスの顕著な減少が見出された一方でＳＢ２０３５８０は効果を発揮しなかった（図７B、列７）。しかしながら、ＰＤ９８０５９とＳＢ２０３５８０は（それぞれ図７Ｂの列６と列８）、Ｕ０１２６（図７Ｂ、列４）の存在下で観測されたのと同様に、パクリタキセルにより誘導されたアポトーシスにおけるＭＲＥ３００８Ｆ２０の防御的な効果を増強させることができなかった。。
【０１４９】
これらの結果はＭＲＥ３００８Ｆ２０誘導性のパクリタキセルのアポトーシス減少は、ＥＲＫの活性化に依存していることを確かにしている。追加の試験がＨｅＬ０２３、ＮＣＴＣ２５４４、ジャーカットセルラインにおいて行われた（データは示されていない）。
【０１５０】
さらなる試験により、Ｐ−ｇｐの妨害とＥＲＫ関与はお互いに独立して生じることができることが示唆された。Ａ３７５細胞ははじめにＵ０１２６（３０μＭ）で３０分間処理され、続いてＭＲＥ３００８Ｆ２０（１０μＭ）とともにインキュベートされた。Ｐ−ｇｐ活性が、ＭＲＥ３００８Ｆ２０単独で処理された細胞のものと比較された（たとえば図６Ｂの細胞）。Ｕ０１２６はＰ−ｇｐのＭＲＥ３００８Ｆ２０による閉塞を防ぐことができなかった。これはＰ−ｇｐ妨害とＥＲＫの介在がお互い独立して起こることができることを確認している。
【０１５１】
考察
示された結果は、いくつかのアデノシン受容体アンタゴニストが化学治療薬に増強した活性を発揮することを示している。注目すべきことに、この増強活性はＡ３アデノシン受容体依存的である。薬学的な特異性が用量依存的な生理学的効果（Ｇ２／Ｍ蓄積で定量されるＳＥＣ５０）と、異なるアデノシン受容体アンタゴニストのＡ３アデノシン受容体への結合能（Ｋｉ）（図５Ｂ、ｒ＝０．９６）間の、正確なＳｐｅｒｍａｎ’ｓランク相関関係により決定された。この増強の機構に関しては、既知の明快な説明というのはない。しかしながら、Ｇ２／Ｍ蓄積におけるＳＥＣ５０値と、受容体親和値間の高統計学的に重要なＳｐｅｒｍａｎ’ｓランク相関関係は、非常に顕著な正の相関関係を示している。
【０１５２】
Ａ３アデノシン受容体アンタゴニストが化学治療薬の抗増殖およびアポトーシス効果を増強することが結果により示されている。Ａ３アデノシン受容体アンタゴニストは化学治療薬のＥＣ５０（Ｇ２／Ｍ蓄積割合を分析することで定量される）を、ＨｅＬ０２３、Ａ３７５、ジャーカットセルライン各々がチャレンジされた際に、パクリタキセルで１２．３、１．９、１．２倍、ビンデシンで３６．３、４．０、２．５倍減少させた。この増強効果はまたアポトーシスの程度が評価された際に確認された。化学治療薬のＥＣＭＡＸ用量はＨｅＬ０２３、Ａ３７５、ジャーカットセルラインにおいてパクリタキセルで１０．５、２．０、１．５倍、ＨｅＬ０２３、Ａ３７５細胞においてビンデシンで３１．５倍、２．０倍減少している。
【０１５３】
様々な程度のＥＣ５０（及びＥＣＭＡＸ）値が異なる細胞のタイプにおいて観測されたことは、薬剤誘導性の増強には細胞型特異的な関与があることを示唆している。注目すべきことに、薬剤活性の必要条件は標的部位へのその運搬である。しかしながら薬剤の効果は現れる抵抗性、すなわち投与された薬剤への細胞の感受性の欠如により制限される。多剤耐性（ＭＤＲ）フェノタイプの腫瘍細胞は、それらが抵抗性の化合物のより低い細胞内蓄積により特徴付けられる。
【０１５４】
さらにほとんどのＭＤＲ表現型セルラインは、エネルギー依存性流出ポンプとして機能する、１７０ｋＤａの膜関連Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ）の過剰発現を示している。この蛋白質は、毒性の外来性代謝物の輸送において重要な役割を果たしており、抵抗性の細胞において観測される減少した細胞内薬剤蓄積を担っているようだ。以前の研究が、メラノーマとＨｅＬ造血性セルラインが機能的なＰ−ｇｐを発現することを報告している。
【０１５５】
一方、ＭＲＰとＰ−ｇｐでないトランスポーターがジャーカット白血病細胞（Ｔリンパ腫セルライン）において発現している。これはＨｅＬ０２３とＡ３７５細胞がＰ−ｇｐ流出活性を産生した一方で、ジャーカット細胞では低いローダミン１２３流出であったという結果と合致している。アデノシンＡ３アンタゴニストが、Ｐ−ｇｐ発現およびＭＲＰ発現セルラインの両方において増強に有用であることが示されている。
【０１５６】
ＣＧＳ１５９４３とＺＭ２４１３８５がＰ−ｇｐとＭＲＰを阻害する能力がより低いことは、これらの化合物のより低いアデノシンＡ３親和性と関連している。試験された高親和性Ａ３アンタゴニスト化合物は、Ｐ−ｇｐとＭＲＰ薬剤抵抗性の増強と阻害においてより大きな有効性を有している。これは、より高い親和性あるいはそのような化合物の分子構造によるものだろう。たとえば、試験された高親和性化合物は２−フリルピラゾロ−トリアゾロ−ピリミジン構造のＮ５位に、フェニル−カルバモイル−アミノ誘導体を有するものである。ＣＧＳ１５９４３とＺＭ２４１３８５は、より低いＡ３親和性を有していることに加えて、非常に異なる分子構造を有している。
【０１５７】
例―アデノシンＡ３受容体アンタゴニストを含む薬剤
アデノシンＡ３受容体のアンタゴニストとして有効であるために必要とされる化合物の量は、もちろん選択された活性部分、処置される哺乳動物個々において様々であり、最終的には医師あるいは獣医の決定である。考慮されるべき要因には、活性体の結合親和性、投与方法、処方物の性質、哺乳動物の体重、表面積、年齢及び患者の状況、並びに投与される特定の化合物が含まれる。しかしながら、適した効果的な用量は、一日に体重１ｋｇに対して、約０．１ｐｇから約１０ｍｇであり、好ましくは一日あたり１ｍｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇである。
【０１５８】
一日の総用量は、単独投与、複数回投与、たとえば一日に２乃至６回、あるいは選択された期間内の静脈注入で与えられるだろう。上述の範囲よりも高いあるいは低い範囲も容量も、本発明の範囲内のものであり、所望もしくは必要により個々の患者に投与されるだろう。たとえば７５ｋｇの哺乳動物では、用量範囲は一日あたり約７５ｍｇから約２２０ｍｇであり、典型的な用量は一日あたり約１５０ｍｇであろう。決定する複数用量が示唆されている場合には、投与は典型的には一日３回、本発明の化合物５０ｍｇであろう。
【０１５９】
処方物
本発明の薬学的治療のための治療剤（医薬組成物）には、活性化合物、すなわち高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニスト、その許容できる担体とともに、追加的に他の治療的に活性な成分と共に用いることが含まれる。担体は処方物のほかの成分と合致するという意味において薬学的に許容可能なものでなくてはならず、その受容者に有害であってはならない。
【０１６０】
本発明はそれゆえ、薬学的に許容可能な担体と共に高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストを含む薬学的な処方物（治療剤）を提供する。
【０１６１】
処方物には、経口投与、直腸投与、局所投与、あるいは非経口投与（皮下投与、筋肉注射、静脈内投与を含む）に適したものが含まれるが、これらに限定されない。経口あるいは非経口投与に適したものが好まれる。
【０１６２】
ここに開示される薬学的に許容可能な担体、たとえば、媒体、アジュバント、賦形剤、あるいは希釈剤は、当業者によく知られており、一般に容易に入手できる。薬学的に許容可能な担体は、活性化合物に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用や毒性がないものが好まれる。
【０１６３】
担体の選択は、組成物の投与に使用される特有の方法によるのと同様に、特有の活性試薬によって部分的に決定されるだろう。したがって、本発明の薬学的組成物の適した処方物には様々なものが存在する。経口、エアゾール、非経口、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内、硬膜下腔内、直腸および膣投与である以下の処方物は単なる例であり、限定するものではない。
【０１６４】
経口投与に適した処方物は、（ａ）水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈剤に溶解させた化合物の有効量のような溶液、（ｂ）カプセル、カシュ剤、錠剤、トローチ剤、トローチ、固体(solid)あるいは顆粒のように、各々は活性成分の所定量を含んでいる、（ｃ）粉末、（ｄ）適切な液体中の懸濁、（ｅ）適したエマルジョンからなることができる。液体処方物は、薬学的に許容可能な界面活性剤、懸濁試薬、あるいはエマルジョン化試薬を添加、あるいは添加せずに、水やアルコール、たとえばエタノール、ベンジルアルコール、ポリエチレンアルコールのような希釈剤を含むだろう。カプセル形態は、たとえば界面活性剤、潤滑剤、ラクトース、シュクロース、カルシウムフォスフェート、コーンスターチのような、不活性フィルターを含む、一般的なハードあるいはソフト殻で覆われたゼラチンタイプであることができる。
【０１６５】
錠剤形態には一つもしくはそれ以上のラクトース、シュクロース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、ミクロクリスタリンセルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイダルシリコンダイオキシド、クロスカルメロース塩、タルク、マグネシウムステアレート、カルシウムステアレート、亜鉛ステアレート、ステアリン酸、他の賦形剤、コロラント、希釈剤、緩衝試薬、崩壊させる試薬、湿らせる試薬、防腐剤、フレーバー試薬、薬学的に両立できる担体を含むことができる。トローチ剤形態は、ゼラチンやグリセリンのような不活性基剤（base）において活性な成分を含む香錠、シュクロース、アカシア、エマルジョン、ジェル等の、当該分野で知られているようなキャリアーを活性成分に加えて含んでいるものを含むことができる。
【０１６６】
錠剤は圧縮あるいは造粒により製造されることができ、追加的に一つあるいはそれ以上の副成分を含んでいてもよい。圧縮された錠剤は適切な機械で活性化合物を自由浮遊（free-flowing）形態、たとえば粉末あるいは顆粒、追加的にたとえばバインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、表面活性あるいは分散剤の副成分と混合して圧縮することで調製されることができる。造粒された錠剤は適切な機械で、粉末化した活性化合物の適したキャリアーとの混合物を造粒することで製造することができるだろう。
【０１６７】
シロップあるいは懸濁液は、例えばシュクロースのような糖の濃縮された水溶液であって、副成分も添加されていてもよいものに、活性化合物を添加することにより製造されることができるだろう。そのような副成分にはフレーバー、糖の結晶化を遅らせる試薬あるいは、たとえばグリセロールやソルビトールといった多価アルコールのような他の成分の溶解性を上昇させる試薬を含むことができる。
【０１６８】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、単独であるいは他の適切な構成要素と組みあわせて吸入で投与されるようにエアゾール形態へと作られることができる。このエアゾール処方物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、ニトロジェン等のような圧力がかけられた許容可能な推進薬とすることができる。それらはまた、ネブライザーやアトマイザーのような、圧力をかけない調製の薬剤として処方されることができる。
【０１６９】
非経口投与に適した処方物には、水性、非水性の、等張の殺菌された投与溶液であって、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、対象となる受容者の血液と等張の処方物を与える溶質を含むものや、懸濁試薬、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、保存剤を含む水性、非水性の殺菌された懸濁液が含まれる。
【０１７０】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、殺菌された液体あるいは、水、生理食塩水、水溶性デキストロース、関連した糖水溶液、エタノール、イソプロパノール、ヘキアデシルアルコールのようなアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールのようなグリセロール、２，２−ジメチル１，３−ジオキソラン−４−メタノールのようなグリセロールケタール、ポリ（エチレングリコール）４００のようなエーテル、油、脂肪酸、脂肪酸エステルあるいはグリセリド、あるいはアセチル化脂肪酸グリセリドを、薬学的に許容可能な、石鹸あるいは界面活性剤のような表面活性化剤ペクチン、カルボマー（carbomer）、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースのような懸濁試薬、あるいはエマルジョン化試薬や、他の薬学的賦形剤とアジュバントと共にあるいはこれらなしで、上述した薬物キャリアーにおいて生理学的に許容可能な希釈剤で投与されることができる。
【０１７１】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの局所処方物には、薬剤の技術分野において知られている従来の方法により調製されることができる軟膏、クリーム、ジェル、ローションが含まれる。軟膏、クリーム、ジェル、あるいはローション基剤とＡ３アンタゴニストに加えて、これらの局所処方物はまた防腐剤、香料、及びその他の活性な薬剤を含んでいてもよい。好ましい他の薬剤にはＡ３アンタゴニストによって増強あるいは利益を与えることが言及されている（例えばＭＤＲを防ぐことにより）ガン治療のための化学治療薬が含まれる。好ましい局所処方物の例には、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストとタキセンファミリー化合物が含まれる。
【０１７２】
非経口投与処方物において使用できる油には、鉱物油、動物油、植物油、あるいは合成油が含まれる。油の特定の例には、ピーナッツ、ダイズ、ゴマ、綿の実、トウモロコシ、オリーブ、ペトロラツム、鉱物が含まれる。非経口投与処方物での使用に適した脂肪酸には、オレイン酸,ステアリン酸、イソステアリン酸が含まれる。非経口投与処方物での使用に適した石鹸には、脂肪アルカリ金属、アンモニウム、トリエタノールアミン塩が含まれ、適した界面活性剤には、（ａ）たとえばジメチルジアルキルアンモニウムハライド、アルキルピリジニウムハライドのようなカチオン性界面活性剤、（ｂ）たとえばアルキル、アリール、オレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、モノグリセリドサルフェート、スルホサクシネートのようなアニオン性界面活性剤、（ｃ）たとえば脂肪アミンオキサイド、脂肪酸アルカノアミド、ポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーのような非イオン性界面活性剤、（ｄ）たとえば、アルキル−β−アミノプロピネート、２−アルキルイミダゾリン四級アンモニウム塩、（ｅ）それらの混合物が含まれる。
【０１７３】
非経口投与処方物は典型的には約０．５から約２５重量％の活性成分を溶液中に含むだろう。適した防腐剤と緩衝剤もそのような処方物に用いられることができる。注入部位における炎症を最小化あるいは減じるために、そのような組成物は約１２乃至約１７の親水親油バランス（ＨＬＢ）である一つもしくはそれ以上の非イオン性界面活性剤を含むだろう。そのような処方物中の界面活性剤の量は、約５から約１５重量％である。適した界面活性剤には、プロピレンオキサイドをプロピレングリコールと濃縮することで形成される、ソルビタンモノオレートやエチレンオキサイドと疎水性塩基の高分子量アダクトのようなポリエチレンソルビタン脂肪酸エステルが含まれる。非経口投与処方物はアンプルやバイアルのようなユニット用量あるいは複数用量で封された容器内で存在することができ、使用直前に注入のためにたとえば水のような殺菌された液体担体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で貯蔵することができる。即座に注入できる溶液と懸濁液は、既に記載した種類の殺菌した粉末、顆粒、錠剤から調製されることができる。
【０１７４】
高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは注射できる処方物へと製造されることができるだろう。注射可能な組成物の効果的な薬学的担体の必要性は当該分野において当業者によく知られている。Pharmaceutics and Phamacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker及びChalmers編、 p.238-250 (1982)、及び ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., p.622-630 (1986)を参照のこと。
【０１７５】
加えて、高親和性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストはエマルジョン化する基剤あるいは水溶性基剤（base）のような様々な基剤と混合することで支持体へと製造されるだろう。膣投与に適した処方物は、活性成分に加えて、当該分野において適切であることが知られているような担体含むペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースタ、泡あるいはスプレー形態として存在するだろう。
【０１７６】
直腸投与のための処方物は、例えばココアバターあるいはＷｉｔｅｐｓｏｌ  Ｓ５５（Dynamite Nobel Chemical, Germanyの登録商標）のような、支持体基剤のための慣用的な担体と共に支持体として存在するだろう。
【０１７７】
処方物は慣用的にユニット用量形態で存在し、製剤分野においてよく知られた方法により調製されるだろう。全ての方法には、活性化合物を一つもしくはそれ以上の副成分を構築する担体と結合させる段階を含んでいる。一般に、処方物は、活性化合物を液体担体あるいは細かく分けられた固体担体と均一に親密に結合させ、必要であれば産物を望ましいユニット用量形態の形とすることにより調製される。
【０１７８】
既に述べられた成分に加えて、本発明の処方物は、例えば希釈剤、緩衝剤、香料、結合剤、表面活性試薬、増粘剤、潤滑剤、懸濁試薬、防腐剤（抗酸化剤を含む）のような薬学処方物の分野において使用される一つもしくはそれ以上の追加的な副成分と同様に、一つもしくはそれ以上の細胞傷害性薬をさらに含むことができるだろう。
【０１７９】
処方物の例
以下の例は本発明の態様を説明するものであるが、それを限定するものであってはならない。これらの例において使用される記号と約束事（convention）は、たとえばthe Journal of the American Chemical SocietyやTetrahedronという最新の国際的な化学雑誌において使用されるものと一致させているつもりである。
【０１８０】
例−薬学的処方物
（Ａ）経皮投与−１０００パッチ分
成分                              量
活性化合物                        １００ｇ
シリコン液体                      ４５０ｇ
コロイドシリコンダイオキシド      ２ｇ
【０１８１】
シリコン液体と活性化合物は一緒に混合され、コロイドシリコンダイオキシドが粘度を増すために添加される。物質はそれから、ポリエステル放出ライナー、シリコンあるいはアクリルポリマーから構成される皮膚接触付着、ポリオレフィンであるコントロール膜、ポリエステルマルチラミネートからなる不透水支持膜を含む、続いて熱で封じられるポリマーラミネートへと添加される。その結果としてラミネートされたシートはそれから１０ｃｍ２パッチへと切断される。
【０１８２】
（Ｂ）経口錠剤−１０００錠剤分
成分                              量
活性化合物                        ５０ｇ
スターチ                          ５０ｇ
マグネシウムステアレート          ５ｇ
【０１８３】
活性化合物とスターチは水で顆粒化されて乾燥される。マグネシウムステアレートが乾燥された顆粒へと添加され、混合物は完全に混和される。混和された混合物は錠剤へと圧縮される。
【０１８４】
（Ｃ）注射−１ｍｌアンプル、１０００個分
成分                            量
活性化合物                      １０ｇ
緩衝試薬                        適量
プロピレングリコール            ４００ｍｇ
注入のための水                  適量、１０００ｍＬ
【０１８５】
活性化合物と緩衝試薬は約５０℃でプロピレングリコール内に溶解される。注入のための水がそれからかき混ぜながら添加され、その結果得られた溶液は濾過され、アンプルへとつめられて封がされ、オートクレーブで殺菌される。
【０１８６】
（Ｄ）継続的な注射−１０００ｍＬ分
成分                            量
活性化合物                      １０ｇ
緩衝剤                          適量
注入のための水                  適量、１０００ｍＬ
【０１８７】
活性化合物と緩衝試薬は約５０℃で水に溶解される。その結果得られた溶液は濾過され、適切な投与容器へとつめられて封がされて殺菌される。
【０１８８】
（Ｅ）局所軟膏−１ｇパック１０００個分
成分                            量
活性化合物                      １０ｇ
白いワセリン基剤                適量、９９０ｇ
【０１８９】
活性化合物は殺菌条件下でワセリン基剤へと混和され、１グラムパックへと詰められる。
【０１９０】
本発明は特定な態様において記載されているが、物質や条件の様々な置換が、当業者が知られているようになされることができる。例えば他の賦形剤が薬学的処方物を調製する際に使用されることができるだろう。加えて活性アデノシンＡ３受容体アンタゴニストの多くが一つもしくはそれ以上の非対称中心を含んでおり、それゆえそのラセミ体と同様にエナンチオマーやジアステレオマーが生じ、エナンチオマーとしてあるいはジアステレオマーとして純粋な形態で溶解され、また薬学的に許容可能なその塩を生じるだろう。アデノシンＡ３受容体アンタゴニストは、細胞傷害性薬と同時に与えられることがしばしば望まれる。この場合、本発明の利用者はＡ３受容体アンタゴニストと細胞傷害性物質とを一回の用量形態へと合成することが有利であると発見するだろう。これらおよび他の変化が当業者にとって明らかであり、ここに含まれることが意味されるだろう。本発明の範囲は以下のクレームによってのみ限定されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】図１Ａ乃至図１Ｈは、ヒトのガンにおける［３Ｈ］−ＭＲＥ  ３００８−Ｆ２０のＡ３アデノシン受容体への結合の飽和を説明している。ＫＤおよびＢｍａｘ値は表１に記載されている。値は三回の独立して行われた実験の平均値と標準誤差（ＳＥ)である。同データのスキャッチャードプロット挿入が示されている。
【図２】図２は、Ａ３７５細胞のコロニー形成アッセイを示している。細胞は異なる薬剤で処置され、７日後にコロニーが数えられた。数値は、４回の異なる実験の平均値±ＳＥＭである。Ｄ＝ＤＭＳＯ（対照）、Ｔ＝パクリタキセル  ０．７５ｎｇ／ｍｌ、Ｍ＝ＭＲＥ３００８Ｆ２０  １０μＭ、Ｃ＝ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ  １０μＭ、ＴＭ＝パクリタキセルおよびＭＲＥ３００８Ｆ２０、ＴＣ＝パクリタキセル及びＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡで処置された細胞。＊Ｐ＜０．０１  ＴＭ対Ｔ。分析はドネット（Dunnett’s）テストにしたがってＡＮＯＶＡにより行われた。
【図３】図３Ａ乃至図３Ｄは、増加した濃度の細胞傷害性薬ビンデシン（図３Ａ、図３Ｂ）及びタキソール（登録商標）ブランドパクリタキセル（図３Ｃ、図３Ｄ）にさらされたＡ３７５細胞の典型的な用量応答曲線を表す。△、□は細胞傷害性薬単独の場合を表す。▲、■は、１０μＭ  ＭＲＥ  ３００８Ｆ２０１０の存在下での細胞傷害性薬の場合を表す。図３Ａ及び図３Ｃは、処置されていない細胞（対照）に対する割合として計算されるＧ２／Ｍ期アレストを示す。図３B及び図３Dは、サブＧ１（アポトーシス）集団の蓄積（総生存細胞に対する割合）を示す。細胞は７０％エタノールで固定化され、ＰＩで染色され、フローサイトメトリーで分析された。
【図４】図４Ａ乃至図４Ｆは、パクリタキセルあるいはビンデシンで処置された指数的に成長しているＡ３７５細胞における、ＭＲＥ３００８Ｆ２０によるＧ２／Ｍ期アレストの誘導を示す。A３７５細胞は、対照として薬剤媒体で（図４Ａ,図４Ｄ）、１ｎＭのビンデシンで（図４Ｂ）、２５ｎｇ／ｍｌのパクリタキセルで（図４Ｅ）、１ｎＭのビンデシンと１０μＭのＭＲＥ ３００８Ｆ２０で（図４Ｃ）、あるいは２５ｎｇ／ｍｌのパクリタキセルと１０μＭのＭＲＥ ３００８Ｆ２０で（図４Ｆ）、２４時間処置される。細胞は７０％エタノール下で固定化され、ＰＩで染色され、フローサイトメトリーで分析された。Ｇ１、Ｓ、及びＧ２／Ｍ期の細胞の割合が測定された。アポトーシス細胞（Ａｐｏ）もまた検出された。
【図５】図５Ａは、１ｎＭのビンデシンの存在下でＡ３アデノシン受容体アンタゴニストの増加した濃度にさらされたＡ３７５細胞のＧ２／Ｍ期アレストの用量応答性曲線を示す。細胞は７０％エタノール下で固定化され、ＰＩで染色され、フローサイトメトリーで分析された。図５Ｂは、Ａ３７５細胞におけるアデノシン受容体アンタゴニストによるビンデシンの増強された活性（ＳＥＣ５０）とＡ３アデノシン受容体への結合親和性（Ｋｊ）間の比較を示す（ｒ＝０．９６、Ｐ＜０．０１）。
【図６】図６Ａ乃至図６Ｄは、Ａ３７５細胞及びＨｅＬ０２３細胞によるローダミン１２３（Ｒｈ１２３）の蓄積のフロークロマトグラムを示す。図６Ａは、Ａ３７５細胞による蓄積を示す。図６Ｂは、１０μＭのＭＲＥ ３００８Ｆ２０存在下での蓄積を示す。図６Ｃは、ＨｅＬ０２３細胞による蓄積を示す。図６Ｄは、１０μＭのＭＲＥ ３００８Ｆ２０存在下でのＨｅＬ０２３による蓄積を示す。全てのケースにおいて、ＦＭＡＸはＲｈ１２３の最大負荷（load）を表す（灰色で占められている領域）。ＦＲＥＳは、３時間のＰ−ｇｐ介在性薬剤流出後に残ったＲｈ１２３の蛍光を示す（黒で占められている領域）。Ｒｈ１２３非染色細胞クロマトグラムは、色が塗られていない領域として報告される。
【図７】図７Ａは、パクリタキセル（黒いバー）及びビンデシン（白いバー）により誘導されたＧ２／Ｍ期アレストにおける、ＭＥＫ−（ＰＤ９８０５９）、ＥＲＫ１／２−（Ｕ０１２６）及びｐ３８ＭＡＰＫ−（ＳＢ２０３５８０）−シグナリングの阻害剤の効果を示す。残ったＧ２／Ｍ期アレストは、対照細胞に対する割合として報告される（ＴＵ、ＴＳ、ＴＰとしてパクリタキセルとＭＲＥ ３００８Ｆ２０、あるいは、ＶＵ、ＶＳ、ＶＰとしてビンデシンとＭＲＥ ３００８Ｆ２０）。図７Ｂは、パクリタキセルにより誘導されたアポトーシスにおける、ＭＥＫ−（ＰＤ９８０５９）、ＥＲＫ１／２−（Ｕ０１２６）及びｐ３８ＭＡＰＫ−（ＳＢ２０３５８０）−シグナリングの阻害剤の効果を示す。Ｔ＝パクリタキセル（２５ｎｇ／ｍｌ）、Ｖ＝ビンデシン１ｎＭ、Ｕ＝Ｕ０１２６  ３０μＭ、Ｐ＝ＰＤ９８０５９  ２０μＭ、Ｓ＝ＳＢ２０３５８０  １μＭ、Ｍ＝ＭＲＥ  ３００８Ｆ２０  １０μＭ、Ｃ＝代謝阻害媒体（ＤＭＳＯ）で処理された細胞（対照）。それぞれのバーは、Ａ３７５細胞において独立して４回実施された実験の平均値±標準誤差（ＳＥ）を表す。以下のとおりＰ＜０．０１、＊ＴＵ対内部対照（パクリタキセルとＭＲＥ ３００８Ｆ２０）、＃ＶＵ対内部対照（ビンデシンおよびＭＲＥ ３００８Ｆ２０）、§Ｐ＜０．０５、２対１、４対３、６対５、８対７。分析はドネット（Dunnett’s）試験にしたがうＡＮＯＶＡによって行われた。
【図１−１】
2005530858.tif 000025
【図１−２】
2005530858.tif 000026
【図２】
2005530858.tif 000027
【図３−Ａ】
2005530858.tif 000028
【図３−Ｂ】
2005530858.tif 000029
【図３−Ｃ】
2005530858.tif 000030
【図３−Ｄ】
2005530858.tif 000031
【図４】
2005530858.tif 000032
【図５−Ａ】
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【図５−Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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