(57)【要約】本発明は、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体の結晶、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの間の相互作用を示す詳述な三次元構造情報、ならびに活性を調節する化合物を設計、同定、およびスクリーニングするよう開示された、このような結晶からのＸ線結晶学データおよびその他の構造データを利用する方法を提供する。本発明は、ＲＡＮＫＬ結晶複合体およびそのサブセットの三次元原子構造座標が、本明細書中に開示されるその他の構造データと一緒に埋め込まれる機械読取可能媒体にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶形態でタンパク質複合体を含む組成物であって、該複合体は、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインのアミノ酸配列を含む、組成物。
【請求項２】
前記アミノ酸配列は、ＲＡＮＫＬの細胞外ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
非対称単位中に７個のＲＡＮＫＬモノマーを含む単純（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ）菱面体結晶を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記結晶は、ａ＝ｂ＝１５０．６Å±０．２Åおよびｃ＝１３９．５Å±０．２Åの単位セル寸法を有するＲ３の空間群を有する、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
非対称単位中に３個のＲＡＮＫモノマーを含む単純斜方結晶を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記結晶は、ａ＝６５．３Å±０．２Å、ｂ＝８２．０Å±０．２Åおよびｃ＝９９．５Å±０．２Åの単位セル寸法を有するＰ２１２１２１の空間群を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記結晶は、回析性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記結晶は、未変性結晶である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記結晶は、重原子誘導体結晶である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記タンパク質は、ＲＡＮＫＬ変異体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記変異体は、セレノメチオニン変異体またはセレノシステイン変異体である、請求項１０に記載の結晶。
【請求項１２】
前記変異体は、保存的変異体である、請求項１０に記載の結晶。
【請求項１３】
前記変異体は、短縮型または伸長型の変異体である、請求項１０に記載の結晶。
【請求項１４】
前記結晶は、以下：
（ａ）ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインを含む一定容量の溶液を、沈殿剤を含む一定容量のリザーバ溶液と混合する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）で得られた混合物を、結晶が生成するまで結晶化に適した条件下で密閉容器中の該リザーバ溶液上でインキュベートする工程と、
を包含する方法により生成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ＲＡＮＫＬタンパク質複合体を結晶化する方法であって、以下：
（ａ）ＲＡＮＫＬタンパク質複合体を含む一定容量の溶液を、沈殿剤を含む一定容量のリザーバ溶液と混合する工程と、
（ｂ）該工程（ａ）で得られた混合物を、該結晶が生成するまで結晶化に適した条件下で密閉容器中の該リザーバ溶液上でインキュベートする工程と、
を包含する、方法。
【請求項１６】
ＲＡＮＫ調節活性を有する化合物を同定する方法であって、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン結晶複合体または結合溝を含むそのフラグメントの三次元構造表示を用いて、ＲＡＮＫ結合部位を結合する能力に関して候補化合物をコンピュータースクリーニングする工程、を包含する方法。
【請求項１７】
以下の工程：
（ａ）前記候補化合物を合成する工程と、
（ｂ）骨形成活性に関して該候補化合物をスクリーニングする工程と、
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
三次元構造情報が、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインの原子構造座標を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記三次元構造情報は、ＲＡＮＫＬの受容体結合溝を含む残基の原子構造座標をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＡＮＫＬの受容体結合溝を含む残基の原子構造座標は、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体の原子構造座標から得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＲＡＮＫまたはＯＰＧ調節化合物を同定する方法であって、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体またはＲＡＮＫＬの結合溝を含むそのフラグメントの三次元構造表示を用いて、ＲＡＮＫ  ＯＰＧまたはＲＡＮＫＬを結合する合成可能な候補化合物をコンピューター設計する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記コンピューター設計は、以下：
（ａ）ＲＡＮＫＬの受容体結合溝を模倣可能な化学物質またはフラグメントを同定する工程と、
（ｂ）前記化学物質または断片を単一分子に構築して、前記候補化合物の構造を提供する工程、
を包含する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
以下の工程：
（ａ）前記候補化合物を合成する工程と、
（ｂ）ＲＡＮＫ活性を調節するために前記候補化合物をスクリーニングする工程と、
をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記構造情報は、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインの原子構造座標を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記構造情報は、ＲＡＮＫＬの受容体結合溝を含む残基の原子構造座標をさらに包含する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
結晶ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体あるいはそのフラグメントまたは一部の三次元構造表示に対応する情報とともに埋め込まれる、機械読取可能媒体。
【請求項２７】
前記ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体は、非対称単位中に７個のモノマーを含む菱面体結晶を含む、請求項２６に記載の機械読取可能媒体。
【請求項２８】
前記複合体の少なくとも１つのモノマーが変異体である、請求項２６に記載の機械読取可能媒体。
【請求項２９】
前記ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体は、非対称単位中に３個のＲＡＮＫＬモノマーを含む斜方結晶を含む、請求項２６に記載の機械読取可能媒体。
【請求項３０】
前記複合体の少なくとも１つのモノマーが変異体である請求項２９に記載の機械読取可能媒体。
【請求項３１】
前記情報は、原子構造座標またはそのサブセットを含む、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の機械読取可能媒体。
【請求項３２】
ＲＡＮＫＬのＤＥループ中に非天然変異を含む化合物。
【請求項３３】
前記変異は、残基２４８に存在する、請求項３２に記載の変異体。
【請求項３４】
Ｉ２４８Ｄ置換を含む、請求項３３に記載の変異体。
【請求項３５】
ＲＡＮＫＬのＡＡ”ループ中に非天然変異を含む化合物。
【請求項３６】
前記ＡＡ”ループ変異は、Ｇｌｙ１７７からＬｅｕ１８３までのＡＡ”ループの欠失を含む、請求項３５に記載の変異体。
【請求項３７】
前記ＡＡ”ループ変異は、ＲＡＮＫＬ残基１７７〜１８３のＴＮＦの残基による置換を含む請求項３５に記載の変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第６０／３１１，１６３号（２００１年８月９日出願）および米国特許出願第１０／１０５，０５７号（２００２年３月２２日出願）（これらの記載内容は、参考として本明細書中に援用される）に関連する。
【０００２】
（連邦政府支援の研究または開発に関する記述）
本発明は、一部は、国立衛生研究所助成金ＡＲ３２７８８、ＡＲ４６５２３、ＡＲ４６８５２、ＡＲ０７０３３およびＤＥ０５４１３の下で米国政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（マイクロフィッシュ補遺に対する参照）
適用されない。
【０００４】
（技術分野）
本発明は概して、ＮＦκＢ（ＲＡＮＫ）リガンドの受容体賦活物質およびその類似体または模倣体を用いた骨粗鬆症およびその他の骨欠乏または骨欠損の治療方法に関する。より詳細には、本発明は、結晶形態のＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）タンパク質、高分解能Ｘ線回析構造、原子構造座標、突然変異誘発データならびにそこから得られる三次元構造に関する。本発明のＲＡＮＫＬ結晶および本本出願人らにより得られた構造情報は、ＲＡＮＫと相互作用し、ＲＡＮＫシグナル伝達を活性化し、特に骨細胞（例えば骨芽細胞および破骨細胞）、免疫細胞（例えばＴ細胞およびＢ細胞ならびに樹状細胞）、哺乳動物上皮の分化および機能の生物学、ならびにリンパ節器官形成を調節するＲＡＮＫＬの能力を模倣するかまたは阻害する化合物をスクリーニング、同定および／または設計し、それにより上記組織に関連する疾患または症状を治療、予防、阻害または逆転（治癒）するために有用である。
【背景技術】
【０００５】
（発明の背景）
サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーは、多くの生物学的機能、（炎症、器官形成、宿主防御、自己免疫およびアポトーシスを含む）において不可欠な役割を果たす。これらの強力な生物学的媒介物質の作用は、受容体−リガンド相互作用により達成され、細胞内シグナル伝達および細胞表現型の変化をもたらす。リガンドは、トリマーを生成し、それらの対応する受容体に結合することによりそれらの機能を発揮する。その後の受容体オリゴマー化は、受容体の細胞内ドメインの立体配座変化を生じ、これが次に、アダプタータンパク質のＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）ファミリーのメンバーが結合し、シグナル伝達カスケードを開始するのを可能にする。ＴＮＦ−Ｒ２、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴｒｋＡ、ＮＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ３０、ＯＸ−４０、ＤＲ５、ＤＲ３、ＤＲ４およびＲＡＮＫとしては、種々のＴＲＡＦ分子（１〜６を含めて）と相互作用するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーのいくつかが挙げられる（Ｌｅｗｉｔ−Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ａ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９：３８９−３９２（１９８８），Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｃｅｌ．７３：４３１−４４５（１９９３），Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．３：１０３１−１０３９（１９９５），Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．４：５６３−５７１（１９９９），Ｍｏｎｇｋｉｌｓａｐａｙａ，Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．６：１０４８−１０５３（１９９９），Ｃｈａ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１１７１−３１１７７（２０００））。
【０００６】
受容体のＴＮＦファミリーは、システインリッチドメインを特徴とし、これは細胞外領域に位置し、リガンド結合に関与する。ＴＮＦα、ＴＮＦ、ＣＤ４０ＬおよびＴＲＡＩＬの結晶構造は、リガンドが、それらのモノマー形態で、「ゼリーロール」サンドイッチフォールド（ｓａｎｄｗｉｃｈ  ｆｏｌｄ）を呈する２襞状シートを含有することを示した（Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．３３８：２２５−２２８（１９８９））。リガンドは、疎水性表面で相互作用して、膜結合および可溶性切断形態の両方として存在する非共有結合性トリマーとして自己会合する（Ｉｄｒｉｓｓ，Ｈ．Ｔ．ら、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．５０：１８４−１９５（２０００））。同族リガンド（ｃｏｇｎａｔｅ  ｌｉｇａｎｄ）と受容体との間の認識は高特異的であり、ナノモル〜ピコモルの範囲の解離定数を特徴とする（Ｋｉｍ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１４６７−１４７８（２０００））。
【０００７】
ＴＮＦスーパーファミリータンパク質（ＳＦＰ）を調節する療法は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患および敗血症のような症状を治療するために首尾よく利用されてきた。癌、自己免疫性障害、移植片拒絶および骨関連障害といった疾患に対する潜在的利益を有し得る新規の治療法も生まれつつある。
【０００８】
これらの治療法の重要性は、骨関連障害が単独で、きわめて多くの症状、例えば骨粗鬆症、アテローム硬化症、骨折または骨欠乏、歯周病、転移性骨疾患および骨溶解性骨疾患を包含する、という事実にかんがみて理解され得る。３０００万人の米国人および１億人の全世界の人々が、これらの障害のうち最も一般的である骨粗鬆症の危険に曝されている、と推定される（Ｍｕｎｄｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８６：１９４６−１９４９（１９９９））。
【０００９】
骨リモデリングおよびホメオスタシスは、骨合成および骨吸収として公知の２つの別個の方法により達成される。骨合成は、骨芽細胞、すなわち、その主要機能が骨基質を合成および沈着し、骨質量を増大することである間充織の骨支質細胞により制御される（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８９：１５０４−１５０８（２０００），Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．３９７：３１５−３２３（１９９９），Ｌｉ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１５６６−１５７１（２０００），Ｄｏｕｇａｌｌ，Ｗ．Ｃ．ら、ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１３：２４１２−２４２４（１９９９），Ｋｉｍ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１４６７−１４７８（２０００））。骨質量が失われる反対過程（骨吸収）は、破骨細胞の作用を要する。これらの細胞は、特殊化および多核化されたマクロファージであって、それらの機能としては、成熟および新規合成骨の両方の吸収が挙げられる。
【００１０】
骨芽細胞、支質細胞、活性化Ｔ細胞、活性化内皮および哺乳動物上皮上に発現される膜貫通リガンドであるＲＡＮＫＬは、破骨細胞前駆体細胞上の膜貫通受容体であるＲＡＮＫと相互作用して、破骨細胞前駆体の活性破骨細胞への分化および成熟を最終的にもたらすシグナル伝達カスケードを開始することが見出された。他方、その造血性前駆体からの破骨細胞発達は、デコイ受容体オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）をＲＡＮＫＬと結合させ、それによりＲＡＮＫとのその相互作用を防止することにより防止され得る。ＯＰＧの役割は、この特定の受容体を有するノックアウト動物を生成することにより、さらに確証された。ＯＰＧ−／−マウスにより示される表現型は、骨の強度および無機質密度の劇的な低下を特徴とする重度の骨粗鬆症を伴う。
【００１１】
ＲＡＮＫＬが、骨芽細胞の活性強化、骨芽細胞表現型への骨芽細胞前駆体の拘束、および骨基質沈着を含めて、骨形成を刺激するよう操作され得ることが重要である、ということも本出願人らは発見した（米国特許出願第６０／２７７，８５５号）。このような発見は、骨の置換または修復を促すのに有用な方法のための、ならびに骨形成の同化過程を刺激することにより骨質量の損失を伴う疾患または症状を治療するための基礎を提供する。
【００１２】
ＲＡＮＫＬは、骨生物学における不可欠なサイトカインである。ＲＡＮＫＬは、単球−マクロファージ前駆体からの骨吸収破骨細胞の分化を媒介し、かつ成熟破骨細胞の生存および機能を調節する（Ｌｉ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１５６６−１５７１（２０００），Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８９：１５０４−１５０８（２０００））。ＲＡＮＫＬまたはその受容体であるＲＡＮＫを欠くマウスは、破骨細胞の完全欠如を示し、重度の大理石骨症および低カルシウム血症を生じる。臨床的には、ＲＡＮＫＬは閉経後骨粗鬆症の病因に結び付けられてきた。この障害において、エストロゲン欠乏は、ＴＮＦおよびＲＡＮＫＬの発現強化、ならびにオステオプロテゲリン（ＯＰＧ、ＲＡＮＫＬに対する可溶性ＴＮＦＲファミリーデコイ受容体）の産生低減をもたらす（Ｃｅｎｃｉ，Ｓ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１２２９−１２３７（２０００），Ｈｏｆｂａｕｅｒ，Ｌ．Ｃ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０：４３６７−４３７０（１９９９））。サイトカイン発現におけるこれらの変化はともに、破骨細胞形成を刺激することにより、骨損失を誘導する。ＴＮＦはインビトロおよびインビボの両方でＲＡＮＫＬと相乗作用を示して、単球−マクロファージ系列の細胞を破骨細胞形成経路に沿って分化させる、ということを本出願人らは最近実証した（Ｌａｍ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１４８１−１４８８（２０００））。この相乗作用は、ＴＮＦＲとＲＡＮＫＬのシグナル伝達受容体であるＲＡＮＫとの両方により活性化される２つの下流転写経路であるＡＰ−１およびＮＦκＢ活性化のレベルで達成される。
【００１３】
ＲＡＮＫＬはまた、免疫生物学においても不可欠な役割を果たす。Ｔ細胞、樹状細胞およびそれらの前駆体上で発現されると、ＲＡＮＫＬはＴおよびＢリンパ球の分化、ならびに免疫系における樹状細胞の生存を媒介する。造血性ＣＤ４＋前駆体は、骨髄から原始リンパ系組織原基に移動しながら、生存および分化のために自己分泌ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達を要する。ＲＡＮＫＬまたはその受容体ＲＡＮＫを欠くマウスは、欠陥末梢リンパ節器官形成および腸間膜リンパ節器官形成を示す（Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．３９７：３１５−３２３（１９９９），Ｄｏｕｇａｌｌ，Ｗ．Ｃ．ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：２４１２−２４２４（１９９９），Ｋｉｍ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１４６７−１４７８（２０００））。臨床的には、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＲＡＮＫＬの発現は、関節炎および炎症性骨溶解の動物モデルにおける骨損失および関節破壊を媒介する（Ｋｏｎｇ，Ｙ．Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．４０２：３０４−３０９  （１９９９），Ｔｅｎｇ，Ｙ．−Ｙ．Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：Ｒ５９−Ｒ６７（２０００））。
【００１４】
骨および免疫系におけるその調節的役割のほかに、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫシグナル伝達は哺乳動物上皮の分化も制御する（Ｆａｔａ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ．１０３：４１−５０（２０００））。ＲＡＮＫＬを欠く妊娠マウスは、コンピテント小葉−胞状腺が完全に存在せず、授乳期乳腺組織を形成できない。ＲＡＮＫを欠く乳房上皮前駆体は、Ａｋｔ活性化の欠陥のために、アポトーシス促進を蒙る。さらに、これらの動物における破骨細胞欠損は、骨から乳汁へのカルシウムの移動を回避する。総合的にこれらの観察は、リンパ系および乳房組織の正常な発達および機能の調整、ならびにカルシウム代謝および骨質量の恒常性調節におけるＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫの顕著な役割を実証する。
【００１５】
大半のＴＮＦスーパーファミリーメンバーの原子構造については、ほとんどわかっていない。同様に、ＲＡＮＫＬの構造的特徴についてもほとんどわかっていない。したがって、この分子のＲＡＮＫおよびＯＰＧへの結合への見通しを得るために、ＲＡＮＫＬの結晶構造と、その三次元配座を確立するために有用な関連データとを確定する必要性が存在する。結晶構造および関連データは、ＲＡＮＫＬの考え得る模倣体および類似体の合成およびスクリーニングに関する決定的な情報を提供し、これは次に、ＲＡＮＫシグナル伝達の調節が望ましい治療目的に適用され得る。
【００１６】
単独またはそれらの受容体との複合体のいずれかでのＴＮＦファミリーサイトカインに関する多くの結晶構造が報告されている−ＴＮＦα（Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．３３８：２２５−２２８（１９８９），Ｌｅｗｉｔ−Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ａ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９：３８９−３９２（１９８８））、ＴＮＦβ（Ｅｃｋ，Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｌｉ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１１９−２１２２（１９９２））、ＴＮＦβ−ＴＮＦＲ複合体（Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｃｅｌｌ．７３：４３１−４４５（１９９３））、ＣＤ４０Ｌ（Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．３：１０３１−１０３９（１９９５））、ＡＣＲＰ３０（脂肪細胞補体（ｃｏｍｐｌｅｎｔ）関連タンパク質）（Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｌ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：３３５−３３８（１９９８））、ＴＲＡＩＬ（Ｃｈａ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１１：２５３−２６１（１９９９））およびＴＲＡＩＬ−ＤＲ５複合体（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．ら、５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．４：５６３−５７１（１９９９），Ｍｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａ，Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：１０４８−１０５３（１９９９），Ｃｈａ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１１７１−３１１７７（２０００））。これらの分析から、ＴＮＦサイトカイン間のアミノ酸保存は主に、トリマーアセンブリーに関与する内部疎水性残基に限定される、ということが明らかである。これに対比して、独特の領域は、種々の組成およびコアβ鎖を連結する長さの表面ループを形成する。しかしながら、リガンドおよび受容体の両方の間の配列保存の全体的欠如が意味のある構造的予測を妨げる、ということは重要である。
【００１７】
したがって、概して、骨損失を防止するかまたは抑制するための、あるいは特に骨形成を強化する（そうでなければ骨吸収が影響を及ぼされない）ための、新規の組成物および方法を計画する必要性が存在する。しかしながら、このような組成物の同定は、今まで、多数の天然および合成化合物の偶然の発見および／またはスクリーニングに依存していた。薬剤スクリーニングのはるかに優れた方法は、構造ベースの薬剤設計による。骨形成に関連するタンパク質またはタンパク質断片の三次元構造が決定された場合には、コンピューターモデリングの支援による潜在的アゴニストおよび／または潜在的アンタゴニストの設計が可能になり得る。しかしながら今までは、骨形成におけるＲＡＮＫＬの役割およびこの重要なタンパク質の三次元構造は未知であった。
【００１８】
したがって、目下、このような設計データの獲得を可能にするＲＡＮＫＬタンパク質の結晶から生成されるデータを含めて、三次元構造情報を得る必要性がある。最終的には、このような結晶学的データおよび原子構造データに基づいた、関連構造ベースの薬剤設計のための手順が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の簡単な概要）
したがって、本発明は、ＲＡＮＫＬの生物学的に活性な細胞外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）を構成する多数の結晶形態のポリペプチドを提供する。したがって、本発明の更なる目的は、結晶から得られる原子構造座標の提供と、ＲＡＮＫＬの独特の溶媒接触可能表面ループの位置、受容体三量体化に必要とされるＲＡＮＫＬのサブユニット間水素結合の特定位置およびＲＡＮＫＬのホモトリマーサブユニット間溝の位置の決定と、骨形成活性を強化または抑制する化合物を設計または同定するために本出願人らにより得られた三次元構造情報の利用方法と、を包含する。別の関連目的は、骨形成化合物または骨形成および吸収抑制化合物を同定または設計するために用いられ得る、本出願人らにより得られた三次元構造情報あるいはその部分またはサブセットが埋め込まれる、機械またはコンピューター読取可能媒体を提供することである。さらなる目的は、本発明の結晶の製造方法を提供することである。
【００２０】
別の態様において、本発明は、結晶化ポリペプチドのＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体に対応する結晶形態のポリペプチドを含む組成物を提供する。
【００２１】
とりわけ、ＲＡＮＫＬホモトリマー結晶のいくつかは、Ｐ２１２１２１という空間群およびにａ＝６５．３Å±０．２Å、ｂ＝８２．０Å±０．２Å、ｃ＝９９．５Å±０．２Åの単位セルか、あるいはＲ３という空間群ならびにａ＝ｂ＝１５０．６Å±０．２Åおよびｃ＝１３９．５Å±０．２Åという単位セルを特徴とし、好ましくは回析性の質を有する。好ましい実施形態では、結晶は、高分解能まで、好ましくは少なくとも約３Å〜２．６Åの分解能に、典型的には約１Å〜約３Åの範囲の分解能まで結晶ポリペプチドの三次元Ｘ線回析構造を決定することを可能にするのに十分な質である。
【００２２】
本発明は、本発明の結晶の製造方法も提供する。概して、本発明の結晶は、ポリペプチドを沈殿させるのに必要な濃度よりわずかに低い濃度での沈殿物を含む水性緩衝液中に実質的に純粋なポリペプチドを溶解することにより、成長する。次に、制御蒸発により水が除去されて沈殿状態を生じ、これは、結晶成長が終了するまで保持される。
【００２３】
別の局面では、本発明は、本発明のＲＡＮＫＬ結晶から得られる三次元構造情報あるいはその部分またはサブセットが埋め込まれる機械またはコンピューター読取可能媒体を提供する。このような三次元構造情報は、典型的には結晶化ポリペプチドの原子構造座標、またはその一部分の原子構造座標、例えば活性または結合部位の原子構造座標を含むが、その他の構造情報、例えば原子構造座標のベクター表示などを含んでもよい。
【００２４】
したがって、本発明の原子構造座標および機械読取可能媒体は、種々の用途を有する。このようなものとして、考え得る用途の中でも、変異体形態を含めたその他のタンパク質の高分解能までの三次元Ｘ線回析および／または溶液構造を解明するための座標を利用する骨形成化合物の同定方法が提供される。構造情報は、例えば、生物学的活性の変更を示す結晶化ＲＡＮＫＬの変異体をインテリジェントに設計するために、そしてＲＡＮＫＬ、その受容体、あるいはＲＡＮＫＬまたはその受容体の一部分または断片を結合する化合物をコンピューターにより設計および同定するために、種々の分子モデリングおよびコンピューターベースのスクリーニングの用途においても用いられ得る。
【００２５】
別の局面では、本発明は、ＲＡＮＫ生物学的活性を調節可能な候補化合物を設計または同定するための、ＲＡＮＫＬ結晶の座標またはこのような構造座標のサブセットの使用方法を提供する。このような候補化合物は、生物学的活性、例えば（好ましくは競合的に）当該サブユニットを結合する能力、または受容体シグナル伝達を中断する能力、あるいは結合を中断する能力に関して評価され得る。一実施形態では、ＲＡＮＫＬ構造が得られる結晶形態は、混合複合体（ｃｏ−ｃｏｍｐｌｅｘ）の三次元構造が約３．０Å〜約２．６Åまたはそれ以上の精度の分解能まで提供されるよう、上記の空間群およびセル寸法を有する。
【００２６】
本発明の更なる局面では、このような考え得る化合物は、生物学的活性に関して評価される。候補化合物は、合成され、かつ骨芽細胞増殖またはその他の骨形成活性を強化することにより骨形成を増大する（あるいは骨損失を抑制または防止する）能力に関してスクリーニングされる、ＲＡＮＫＬ複合体またはそのサブセットの原子構造座標を用いて設計または同定される。化合物の骨形成活性は、米国特許出願第６０／２７７，８５５号に詳細に記載されているようなインビトロおよび動物モデルアッセイにより決定される。
【００２７】
その他の目的および特徴は、一部は明らかであり、一部は本明細書中の以下で示される。
【００２８】
（略語および定義）
本発明の理解を促すために、多数の用語を以下に定義する。
【００２９】
２０個の遺伝子的にコードされたＬアミノ酸に関して本明細書中で用いられるアミノ酸表記法は慣用的であって、以下のように短縮される：
【００３０】
【表１−１】
2005531485.tif 000002
【００３１】
【表１−２】
2005531485.tif 000003
本明細書中で用いる場合、特に別記しない限り、三文字および一文字のアミノ酸略語は、Ｄ−配置またはＬ−配置のいずれかのアミノ酸を意味する。例えば、ＡｒｇはＤ−アルギニンおよびＬ−アルギニンを意味し、ＲはＤ−アルギニンおよびＬ−アルギニンを意味する。
【００３２】
別記しない限り、ポリペプチド配列が一連の一文字および／または三文字略語として示される場合、配列は、一般的慣例に従ってＮ→Ｃ方向に示される。本明細書中で用いる場合、「Ｃ」はアミノ酸残基のアルファ炭素を指す。
【００３３】
本明細書中に記載された種々のポリペプチドにおける保存的アミノ酸置換を確定する目的のために、そして種々のペプチドおよびペプチド類似体化合物を記載するために、アミノ酸は、主としてアミノ酸側鎖の物理的−化学的特性によって、２つの主なカテゴリー−親水性および疎水性−に便宜上分類され得る。これら２つの主要カテゴリーはさらに、アミノ酸側鎖の特性をより明瞭に限定するサブカテゴリーに分類され得る。例えば、親水性アミノ酸のクラスは、酸性、塩基性および極性アミノ酸にさらに細分され得る。疎水性アミノ酸のクラスは、無極および芳香族アミノ酸にさらに細分され得る。アミノ酸の種々のカテゴリーの定義を以下に示す：
「親水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２（１９８４）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロより低い疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝子コード化親水性アミノ酸としては、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＡｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００３４】
「酸性アミノ酸」とは、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は典型的には、水素イオンの損失のために、生理学的ｐＨで負に帯電された側鎖を有する。遺伝子コード化酸性アミノ酸としては、Ｇｌｕ（Ｅ）およびＡｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００３５】
「塩基性アミノ酸」とは、７より大きい側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合により、生理学的ｐＨで正に帯電された側鎖を有する。遺伝子コード化塩基性アミノ酸としてはＨｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）およびＬｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００３６】
「極性アミノ酸」とは、生理学的ｐＨでは帯電されていないが、２つの原子に共有される電子対が原子の１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。遺伝子コード化極性アミノ酸としては、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００３７】
「疎水性アミノ酸」とは、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２（１９８４）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸を指す。遺伝子コード化疎水性アミノ酸としては、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＴｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００３８】
「芳香族アミノ酸」とは、少なくとも１つの芳香族またはヘテロ芳香族環を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。芳香族またはヘテロ芳香族環は、１つ以上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＮ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、は−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ等（ここで、各Ｒは独立して、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、置換（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、５〜２０員へテロアリール、置換５〜２０員へテロアリール、６〜２６員へテロアリールアルキルまたは置換６〜２６員へテロアリールアルキルである））を含有し得る。遺伝子コード化芳香族アミノ酸としては、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）およびＴｒｐ（Ｗ）が挙げられる。
【００３９】
「無極アミノ酸」とは、生理学的ｐＨでは帯電されておらず、２つの原子に共有される電子対が一般的に２つの原子のそれぞれにより等しく保持される（すなわち側鎖は極性でない）結合を有する側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝子コード化無極アミノ酸としては、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）およびＡｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００４０】
「脂肪族アミノ酸」とは、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝子コード化脂肪族アミノ酸としてはＡｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）およびＩｌｅ（Ｉ）が挙げられる。
【００４１】
「ヒドロキシル置換脂肪族アミノ酸」とは、ヒドロキシル置換側鎖を有する親水性極性アミノ酸を指す。遺伝子コード化ヒドロキシル置換脂肪族アミノ酸としては、Ｓｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００４２】
アミノ酸残基Ｃｙｓ（Ｃ）は、その他のＣｙｓ（Ｃ）残基または他のスルファニル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成し得る、という点で例外的である。還元遊離−ＳＨまたは酸化ジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＣｙｓ（Ｃ）残基（および−ＳＨ含有側鎖を有するその他のアミノ酸）の能力は、Ｃｙｓ（Ｃ）残基が正味疎水性または親水性の特性をペプチドに付与するか否かに影響を及ぼす。Ｃｙｓ（Ｃ）はＥｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化コンセンサス尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、上記）に従って０．２９の疎水性を示すが、一方、本発明の目的のために、上記の一般的分類にかかわらず、Ｃｙｓ（Ｃ）は極性親水性アミノ酸と分類される、と理解されるべきである。
【００４３】
当業者に理解されるように、上記のカテゴリーは相互に排他的ではない。従って、２つ以上の物理的−化学的特性を示す側鎖を有するアミノ酸は複数のカテゴリーに包含され得る。例えば、極性置換基でさらに置換される芳香族部分を有するアミノ酸側鎖、例えばＴｙｒ（Ｙ）は、芳香族疎水性部分および極性または親水性特性の両方を示し得、従って芳香族および極性カテゴリーの両方に含まれ得る。別の例としては、Ｈｉｓ（Ｈ）は、芳香族および塩基性カテゴリーに入る側鎖を有する。任意のアミノ酸の適切な分類は、特に明細書中に提供された詳細な開示にかんがみて、当業者には明らかである。
【００４４】
上記のカテゴリーは遺伝子コード化アミノ酸に関して例示されているが、アミノ酸置換は遺伝子コード化アミノ酸に限定される必要はなく、特定の実施形態では好ましくはそれに限定されない。実際、本明細書中に記載された化合物の多くは合成的に生成され得るため、それらは１つ以上の遺伝子非コード化アミノ酸を含み得る。従って、天然遺伝子コード化アミノ酸に加えて、構造（Ｉ）のコアペプチド中のアミノ酸残基が、天然非コード化アミノ酸および合成アミノ酸で置換され得る。
【００４５】
本発明の化合物が構成され得る特定の一般的に認められるアミノ酸としては、が挙げられるが、これらに限定されない：−アラニン（−Ａｌａ）および他のオメガ−アミノ酸（例えば３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、４−アミノ酪酸等）；−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）；ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロへキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））；２−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｆ））；３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；ｐ−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（ｐＮＨ２））；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）およびホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモプロリン（ｈＰｒｏ）、Ｎ−メチル化アミノ酸およびペプトイド（Ｎ−置換グリシン）。
【００４６】
上記のカテゴリーによる遺伝子コード化アミノ酸および一般的非コード化アミノ酸の分類を、以下の表２に要約する。表２は例証目的のみのためであって、本発明に用いられ得るアミノ酸残基の網羅的一覧であることを意図しない、と理解されるべきである。さらなるアミノ酸は、Ｆａｓｍａｎ，１９８９，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．３−７０およびこれらの中に援用される参照に見出され得る。
【００４７】
（表２：一般的非コード化アミノ酸の分類）
【００４８】
【表２】
2005531485.tif 000004
「防止するまたは阻害する」という語句は、別の表現方法では阻害される、または観察される特性が、処置が用いられない場合より測定可能的に低い程度に低減されるということにより影響を受けるものである。阻害の程度の測定は、当業者に公知の方法によりインビトロで決定され得る。
【００４９】
ＲＡＮＫＬを模倣する本発明の化合物および組成物は、「ＲＡＮＫＬ活性」を示すといわれる。
【００５０】
「それを必要とする被験者」という用語は、本発明の状況では、処置を必要とする任意の動物であり得る被験者（例えばヒトを含む）を意味する。「有効量」という用語は、大多数の患者において、疾患が治癒されるかまたは改善される作用を、あるいは物質が予防的に投与される場合には、疾患がそれ自体を現さないようにされる作用を有する目的の物質の量を意味する。「有効量」という用語はまた、それが投与された被験者において軽度の副作用を引き起こすだけであるかまたは副作用をまったく引き起こさない量で物質が投与されること、あるいは該物質が投与された疾患の重症度にかんがみて副作用が医学的および薬学的観点から耐容され得ることも意味する。
【００５１】
本明細書中で用いる場合、「処置」は、予防および療法の両方を包含する。従って、被験者の処置において、本発明の化合物は、症状または疾患をすでに患っている被験者に投与され得るか、あるいはこのような症状または疾患の発症を予防するために投与され得る。
【００５２】
「ＲＡＮＫＬの模倣物」という用語は、ＲＡＮＫに結合し、活性化する能力を有することが確率されている化合物を意味する。
【００５３】
本発明の状況において、「ＲＡＮＫＬの類似体」および「ＲＡＮＫＬの模倣物」という用語は、広い意味で、ＲＡＮＫＬの細胞外ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）の有効部分を（構造的特徴に関して）模倣する任意の物質を意味する、と理解されるべきである。従って、類似体または模倣物は単に、インビボまたはインビトロでＲＡＮＫＬとＲＡＮＫまたはＯＰＧとの間の結合を模倣し得るとみなされる任意の他の化合物であり得る。
【００５４】
「ＲＡＮＫＬの結晶化外部ドメイン」という用語は、ＲＡＮＫＬの細胞外ドメインのアミノ酸配列または相同配列の完全または機能的フラグメントを有し、かつ結晶形態であるポリペプチド複合体を指す。
【００５５】
「結晶」という用語は、結晶形態のポリペプチドを含む組成物を指す。「結晶」という用語は、本明細書中に記載されたような未変性結晶、重原子誘導体結晶および共結晶を包含する。
【００５６】
「未変性結晶」という用語は、ポリペプチドが実質的に純粋である結晶を指す。本明細書中で用いる場合、未変性結晶は、重原子で改変されるアミノ酸を含むポリペプチドの結晶、例えばセレノメチオニン変異体、セレノシステイン変異体等の結晶を包含しない。
【００５７】
「重原子誘導体結晶」という用語は、ポリペプチドが１つ以上の重金属原子と会合して存在する結晶を指す。本明細書中で用いる場合、重原子誘導体結晶は、重金属原子が浸漬される未変性結晶、ならびにセレノメチオニン変異体およびセレノシステイン変異体の結晶を包含する。
【００５８】
「共結晶」という用語は、１つ以上の付加的ポリペプチドまたは他の分子と会合するポリペプチドを指す。例えば、別のポリペプチド（例えば、ＲＡＮＫまたはＯＰＧ）と会合するＲＡＮＫＬの外部ドメイン。
【００５９】
「共結晶」という用語は、結晶形態で、上記のような混合複合体を含む組成物を指す。共結晶は、未変性共結晶および重原子誘導体共結晶を包含する。
【００６０】
「単位セル」という用語は、結晶の単位またはパターンを完全に代表する結晶の最小およびもっとも簡単な容積要素（すなわち平行パイプ形状ブロック）を指す。単位セルの寸法は、６つの数値により規定される：寸法ａ、ｂおよびｃ、ならびに角度α、βおよびγ（Ｂｌｕｎｄｅｌ，ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６））。結晶は、多数の単位セルの効率的にパックされたアレイである。
【００６１】
「実質的に同一の三次元構造を有する」という語句は、座標のＣ原子の少なくとも約５０％〜１００％が重ね合わせて含まれる場合、図１の原子構造座標上に重ね合わせた場合に、約３Å以下またはそれに等しい二乗平均偏差（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．）を有する一組の原子構造座標によって特徴付けされるポリペプチドを指す。
【００６２】
（発明の詳細な説明）
本発明に従って、本出願人らは、ＲＡＮＫＬの生物学的に不可欠な領域を模倣し、それによりＲＡＮＫを活性化するよう機能する化合物を設計し、作製するのに不可欠な三次元構造データを提供した。特に本出願人らは、ＲＡＮＫＬタンパク質の外部ドメインの結晶形態を作製し、高分解能Ｘ線回析分析、原子構造座標、突然変異誘発データ、ならびにそれらから得られる三次元構造を調製し、これを用いて、ＲＡＮＫＬの活性を模倣するかまたは阻害する化合物および方法を発明し得る。
【００６３】
ＲＡＮＫＬの外部ドメインの結晶構造を解像し、２．６Å分解能に精密化したところ、安定な、非共有的に会合したトリマーに自己アセンブリされた分子が明示されている。この三量体化に関与する残基を、表３に示す。ＲＡＮＫＬトリマー界面の顕著な特徴は、分子の基部でコアを裏打ち（ｌｉｎｉｎｇ）する疎水性側鎖の保存環の存在である。ＴＮＦファミリーメンバーに一般的に観察されるこの芳香族タイルは、自己アセンブリのための主要駆動力を構成する。ＲＡＮＫＬにおいては、多数の保存残基（Ｈｉｓ１６７、Ｔｙｒ２１４、Ｔｙｒ２１６、Ｐｈｅ２８０およびＰｈｅ３１０を含む）がこのタイルに関与する。意外にも、トリマー接触物の７０％がアミノ酸レベルで非保存性である。これらの残基のいくつかは、例えばＡＡ”ループ中のＴｒｐ１９２およびＬｙｓ１９４；ＥＦループ中のＴｒｐ２６３；ならびにＦβ鎖の３つの残基（Ｐｈｅ２６９、Ｈｉｓ２７０およびＰｈｅ２７１）のように、他のＴＮＦファミリーサイトカインとのヘテロ会合を構造的に妨げる。ＲＡＮＫＬの独特のトリマー接触物の大部分は、天然で極性である。ＲＡＮＫＬは、典型的ＴＮＦファミリーサイトカインで観察される数の２倍である、トリマー界面での４６の埋没（ｂｕｒｉｅｄ）極性相互作用を用いるに際して、ＴＮＦファミリーの間では例外的である。これらの極性相互作用は配列特異的であり、それにより自己会合の特異性に寄与する。隣接モノマー間の顕著な帯電相互作用としては、Ｌｙｓ１９４−Ａｓｐ３０１、Ｌｙｓ２４３−Ａｓｐ２９９およびＬｙｓ２５６−Ａｓｐ３０３が挙げられる。
【００６４】
ＲＡＮＫＬアミノ酸多様性は、表面曝露ループおよびフランキング鎖においてもっとも甚だしく、この場合、ファミリーとのほとんどの配列および構造的相同性が識別され得る。図２ｅに示したように、ＴＲＡＩＬのＡＡ”ループはモノマーの面を水平に横断し、ＴＮＦの短いＡＡ”ループは堅く締まったヘアピンターンに続いて、Ａ”β鎖と直ちに接合し、ＲＡＮＫＬのＡＡ”ループは分子の尖端に向けて突出する。ＡＡ”ループは、ＣＤループの置換と一緒に、ＲＡＮＫＬ分子の上３分の１に独特の表面を付与する。ＤＥループの微細な外方移動は、ＲＡＮＫＬ分子の基部に受容体結合溝を造形する。これは、リガンドの受容体結合界面に局在する配列多様性ならびに受容体中の残基の相補的多様性が、ＴＮＦファミリーメンバー間の特異性の主要決定因子である、ということを示唆する。
【００６５】
本出願人らは、２つの既知のＴＮＦファミリー受容体−リガンド複合体、ＴＮＦβ−ＴＮＦＲおよびＴＲＡＩＬ−ＤＲ５の構造を用いて、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの相互作用をモデリングするための生物学的状況を提供した。本出願人らは、これらの構造に関するドッキング分析を用いて、有望な受容体接触残基を同定した。これらの接触残基−ＡＡ”ループ中のＬｙｓ１８０、Ａｓｐ１８９およびＡｒｇ１９０；ＣＤループ中のＨｉｓ２２３およびＨｉｓ２２４；ならびにＤＥループ中のＬｙｓ２４７、Ｉｌｅ２４８およびＰｒｏ２４９−の生物学的関連性は、構造ベースの突然変異誘発実験を実施することにより確証された。ＤＥループ中の単一アミノ酸置換はＲＡＮＫＬの効能を有意に低下させ、形態学的に健全な破骨細胞の分化を誘導するその能力を実質的に抑制する。さらにＡＡ”ループの欠失およびＴＮＦの類似ループによるその置換は、このタンパク質がホモトリマーとして容易に且つ自発的に自己集合するので、ＲＡＮＫＬの中心位相をそのままにする。しかしながらこれらのＲＡＮＫＬ変異体が生物学的活性を実証することができないことが、ＲＡＮＫ活性化のためのＡＡ”ループの必要性を確立する。本明細書中に詳述したように、本出願人らの構造的および機能的分析は、治療目的のためのＲＡＮＫＬおよびその受容体の合理的な薬理学的調節方法を提供する。
【００６６】
明らかにされたように、ＲＡＮＫＬは、膜固定ドメイン、連結柄および受容体結合細胞外ドメインを含有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。すべてのＴＮＦサイトカインと同様に、ＲＡＮＫＬは、特徴的ゼリーロールβサンドイッチフォールドを呈する２枚シートの１０個の水素結合鎖からなる構造的コアを有する。ＲＡＮＫＬは、β鎖を連結するその表面ループの長さおよび組成が他のＴＮＦサイトカインと異なる。合成中、ＲＡＮＫＬモノマーは、非共有的に会合したトリマーに自己集合する。コアβ鎖位相幾何学は、他のサイトカインと同様、３回対称軸（ａｘｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ−ｆｏｌｄ  ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を取り囲んでオリゴマー化するＲＡＮＫＬの固有の性質の根底にある。ＲＡＮＫＬの生物学的に活性なトリマーは、膜結合および可溶性切断形態の両方として存在し得る。
【００６７】
ＲＡＮＫＬに対する受容体、ＲＡＮＫおよびＯＰＧは、配列相同性に従ってＴＮＦスーパーファミリーのメンバーとして分類されてきたが、しかし三次元構造は今日まで報告されていない。Ｉ型膜貫通タンパク質として発現される場合、ＴＮＦ受容体はすべて、三次フォールディングパターンを用いて、細胞膜から突出する延長構造を形成すると考えられる。細胞外リガンド結合ドメインは、主として３つの型の小型モジュラーシステインリッチ反復から構築される。概して、アミノ末端システインリッチドメイン（ＣＲＤ）は、前リガンドアセンブリードメイン（ＰＬＡＤ）として機能し、第二および第三のＣＲＤはリガンド結合において機能する。それらのコグネイトリガンドによるＴＮＦファミリー受容体の連結は、特徴的３倍化学量論（３−ｆｏｌｄ  ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ）によりシグナル伝達複合体を生成するように細胞質テールを誘導して、ＴＮＦ受容体会合因子（ＴＲＡＦ）または死ドメインとのＦａｓ会合（Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ）（ＦＡＤＤ）タンパク質に、ＭＡＰ（有糸分裂活性化タンパク質）キナーゼ、ＮＦκＢおよびホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を含む下流エフェクター経路を活性化させる。
【００６８】
ＴＮＦファミリーサイトカインとそれらの受容体との間の認識は高特異的であって、ナノモル〜ピコモル範囲の代表的解離定数を有する。この特異性は、個々の細胞がしばしば１つより多いファミリーメンバーを発現する場合でさえ、ＴＮＦファミリーサイトカイン間のヘテロ三量体化が観察されなかった、という事実により強調される。
【００６９】
ＲＡＮＫＬの独特の領域が、それらの組成および長さに関して他のＴＮＦメンバーと異なる表面ループを形成する、ということを本出願人らは確定した。これらの独特のループは、コアβ鎖を連結する。有意義な構造予測を妨げたＴＮＦリガンドおよび受容体間の配列保存の全体的欠如にもかかわらず、ＲＡＮＫＬのこれらの独特の構造モチーフを本出願人らが解明した、ということは重要である。
【００７０】
本出願人らはＲＡＮＫＬ結晶を首尾よく形成し、マウスＲＡＮＫＬの細胞外ドメインの複合体の結晶構造を２．６Åまで解像し、ＲＡＮＫＬがＴＮＦファミリーサイトカインの特徴的構造フォールドを採用することを決定し、そしてその受容体と相互作用するＲＡＮＫＬの要素を同定した。次に、ＲＡＮＫを活性化するＲＡＮＫＬの能力を媒介する場合のこれらの要素の必要性を、ＲＡＮＫＬ変異体を形成することにより本出願人らは確認した。
【００７１】
（構造決定）
Ｅ．  ｃｏｌｉ中で組換え的に発現されるマウスＲＡＮＫＬの生物学的活性細胞外ドメイン（残基１５８〜３１６、ＱＰＦＡ．．．ＱＤＩＤ）は、２形態で結晶化する。すなわち、対称の結晶学的３回軸上に置かれる第七モノマーと共に２つのトリマーとして整列されたＡＳＵ中に７つのモノマーを含有する菱面体結晶；ならびにＡＳＵ中に単一ＲＡＮＫＬトリマーを含有する斜方晶系結晶。ひとまとめにして、これらの回析性結晶は、ＲＡＮＫＬモノマーの８つの個々の図を提供する。ＲＡＮＫＬの構造は分子置換により段階的に動かされ、２．６Åの分解能まで精密化された。いくつかの可動性ループ領域を除いて、全ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン、アミノ末端のマイナス残基１５８〜１６１は、最終結晶構造中に十分に整列される（結晶学的Ｒ因子２３．５％およびＲｆｒｅｅ２８．０％、図１）。
【００７２】
（ＲＡＮＫＬトリマー）
ＲＡＮＫＬのコアβ鎖は、ＴＮＦファミリーサイトカインの特徴であるフォールドを採用する。各ＲＡＮＫＬモノマーは、２つの平坦な逆平行βプリーツ化シートで構成されるａ−サンドイッチからなる。第一シートはβ鎖（Ａ、Ｈ、ＣおよびＦ）により形成され、一方、第二シートはβ鎖（Ｂ、Ｇ、ＤおよびＥ）により形成される（図２Ａ〜２Ｄ、図３）。内部ＡＨＣＦβシートはサブユニット間会合に関与し、一方、ＢＧＤＥβシートは外表面に大きく寄与する。ＲＡＮＫＬモノマーは、３回対称軸に沿って自己会合する。トリマー複合体は、遠位尖端より幅広の膜近位基部を有する切頭ピラミッドとして最もよく説明されている。ＲＡＮＫＬトリマーは高さ５５Åであって、およその直径は、基部で５５Å、尖端で３５Åである。ホモトリマーは、各ＲＡＮＫＬモノマー、鎖ＥおよびＦにおけるβサンドイッチの一縁が隣接モノマーのＡＨＣＦβシートの内部疎水性面に寄るよう、アセンブルされる（図２Ａ、２Ｃ）。このようなものとして、ＲＡＮＫＬホモトリマーのトリマー界面は、縁−面相互作用のプラットホームからなる。側面から見て、各モノマーは、回転軸の周囲でのわずかに左寄りのねじれを取り入れる（図２Ａ、２Ｂ）。各ＲＡＮＫＬモノマーのアミノ酸組成は同一であるが、このトリマーは、結晶学的対称により位相幾何学的に等しくない。
【００７３】
ＲＡＮＫＬモノマーは、三量体化時に約６０９９．５Å２（モノマーＸに関しては２０４２．１Å２、Ｙに関しては２０４３．２Å２およびＺに関しては２０１４．２Å２）の溶媒接触可能表面を覆い隠すが、これに比してその他のＴＮＦファミリーサイトカインは、ＴＲＡＩＬに関しては６５９１．３Å２、ＣＤ４０Ｌに関しては５６７０．６Å２、ＴＮＦαに関しては５６００．８Å２、ＴＮＦβに関しては５８２６．９Å２およびＡＣＲＰ３０に関しては５１３０．０Å２である。三量体界面は、各モノマーの溶媒接触可能表面の約２６％を構成する。ＲＡＮＫＬは、その他のＴＮＦファミリーメンバーとのヘテロトリマーを形成しない。この相互作用の選択は、配列特異的サブユニット間水素結合の影響を受ける。各ＲＡＮＫＬ分子は、４３のこのような埋没極性相互作用を含有するが、一方、典型的ＴＮＦファミリーサイトカインは、平均２６のサブユニット間水素結合／分子を保有する。疎水性相互作用は特異性を引き起こさないが、それらは自己会合のための主な駆動力に寄与する。ＲＡＮＫＬモノマー三量体化に関与する残基のうち、４０％が疎水性である（図３）。サブユニット間相互作用に加わるアミノ酸残基のほとんどすべてが１０の高度保存鎖内に存在して、構造的多様表面ループを受容体−リガンド相互作用に利用可能にさせる（図３）。
【００７４】
ＲＡＮＫＬの溶媒接近可能表面ループはＴＮＦファミリー内で独特であって、顕著に多様な長さおよび立体配座を示す：ＡＡ”ループ（残基１７０〜１９３）は、β鎖ＡおよびＡ”、ＣＤループ（残基２２４〜２３３）、ＤＥループ（残基２４５〜２５１）ならびにＥＦループ（残基２６１〜２６９）を架橋する。特にＲＡＮＫＬは、典型的ＴＮＦファミリーメンバーより長いＡＡ”ループおよび短いＥＦループを保有する。この多様性は、ＴＮＦおよびＴＲＡＩＬの構造の上にＲＡＮＫＬの構造を重ね合わせることにより、最も良く理解される（図２Ｅ）。ＴＮＦコアフォールドを構成する内部鎖はほぼ同一の位相幾何学を示すが、一方、これらの鎖を相互に連結するループは重ね合わせることができない。ＲＡＮＫＬの鎖コアの代表的電子密度を図２Ｆに示す。
【００７５】
したがって、本出願人らは、ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫとの間の結合のメカニズムを解明し、それによりＲＡＮＫＬ媒介性シグナル伝達において重要な役割を果たすこれらの分子間の結合を担う規定された結合部位の必須部分を同定した。さらに本出願人らは、ＲＡＮＫＬ結晶構造を利用して、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ相互作用の過程のさらなる見識を提供した。それにより本出願人らは、必須データによる、骨粗鬆症およびその他の症状の予防および治療のための化合物、組成物および方法を提供した。
【００７６】
したがって、本出願人らの方法は、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫタンパク質結合のこの分子メカニズムの発見を利用して、ＲＡＮＫ生物学を担う規定された結合部位の必須部分を同定する。
【００７７】
（ペプチド化合物）
したがって、本発明は、ＲＡＮＫ分子を結合し、それによりこの受容体を活性化するＲＡＮＫＬの能力を模倣する化合物を対象とする。本出願人らは具体的に、ＲＡＮＫＬおよびＲＡＮＫの結合を可能にするＲＡＮＫＬの独特の構造を示した。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態では、模倣化合物は、ＲＡＮＫを結合可能なペプチドまたはペプチド類似体である。本出願人らにより本明細書中で提供された構造情報から明らかなように、このようなペプチドおよびペプチド類似体のコア配列は、独特のＲＡＮＫＬ構造モチーフに由来し得る。コア配列は、ＲＡＮＫＬ結合モチーフの配列と全く同様に対応し得、あるいはコア配列は、このようなペプチドとＲＡＮＫとの否定的結合、またはそれによるその活性化に対して負に作用しない１つ以上の置換（好ましくは保存的置換）および／または挿入および／または欠失を含み得る。
【００７９】
さらに、コア配列は、無作為配列（すなわち、コア配列が得られるＲＡＮＫＬ細胞外ドメインの他の部分に必ずしも対応しない配列）の残基によって、そのＮ末端および／またはＣ末端のいずれかまたは両方で隣接され得る。含まれる場合、このような隣接残基は、ＲＡＮＫを結合して活性化するコア配列の能力を有意に変更すべきでない。したがって、典型的には、本発明の化合物は、各末端にて、５つより少ない隣接残基、好ましくは３つより少ない隣接残基を含み、もっとも好ましくは隣接残基を含まない。
【００８０】
このような分子は、当業者に既知の多数の改変を含有し得る。例えば置換アミド結合としては一般に、式−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）−（式中、Ｒは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、置換（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、置換（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、置換（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、置換（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、５〜２０員へテロアリール、置換５〜２０員へテロアリール、６〜２６員へテロアリールアルキルおよび置換６〜２６員へテロアリールアルキルである）の基が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００８１】
アミド結合の同配体（ｉｓｏｓｔｅｒ）としては一般に、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−および−ＣＨ２ＳＯ−が挙げられ得るが、これらに限定されない。このような非アミド結合を有する化合物ならびにこのような化合物の調製方法は、当該技術分野で周知である（例えばＳｐａｔｏｌａ，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ．１：３（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（総説）（１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１：４６３−４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７−１８５（１９７９）（−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−ＣＨ２Ｓ−）；Ｈａｎｎ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ．１：３０７−３１４（１９８２）（−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス））；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；欧州特許出願ＥＰ４５６６５（１９８２）ＣＡ９７：３９４０５（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３１：１８９−１９９（１９８２）（−ＣＨ２−Ｓ−）参照）。
【００８２】
さらに、１つ以上のアミド結合が、ペプチドの構造も活性も著しく妨害しないペプチド模倣物またはアミド模倣部分で置換され得る。適切なアミド模倣部分は、例えばＯｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３０３９−３０４９（１９９３）に記載されている。
【００８３】
ペプチド類似体であるＲＡＮＫＬ模倣物を含む化合物は、それらの非ペプチドインターリンケージがプロテアーゼおよび／またはペプチダーゼに対する安定性強化を化合物に付与し、それにより対応するペプチドと比較して、インビボの安定性増大を化合物に付与するので、有意の治療利益を提供し得る。
【００８４】
さらに、種々の残基が、遺伝子コード化アミノ酸の中から、ならびに遺伝子非コード化アミノ酸から選択され得る。さらに、化合物が活性を保持する限り、これらの残基はＤ−立体配置またはＬ−立体配置のいずれかであり得る。Ｄ−アミノ酸を含む化合物は、インビボの安定性を強化し得た。
【００８５】
ペプチドおよびペプチド類似体は、ＲＡＮＫＬ模倣配列のほかに、一端または両端に、１〜５個残基のペプチドまたはペプチド類似体を任意に含み得る。ペプチド類似体は、典型的には少なくとも１つの改変インターリンケージ（例えば上記のような置換アミドまたはアミドの同配体）を含有する。このようなさらなるペプチドまたはペプチド類似体は、ＲＡＮＫＬアミノ酸配列の別の部分に由来するアミノ酸配列を有し得るか、あるいはそれらの配列は完全に無作為であり得る。このような無作為配列を含む化合物は、後述の項に記載される種々のアッセイおよび方法において生物学的活性に関して試験され得る。
【００８６】
このようなさらなるペプチドまたはペプチド類似体を含む残基は、遺伝子コード化でも非コード化でもよく、Ｄ−立体配置またはＬ−立体配置のいずれかであり得る。一実施形態において、式（Ｉ）により定義される配列がペプチドである場合、一端または両端は、プロテアーゼおよび／またはペプチダーゼによるインビボ分解からコア配列を保護するのに役立つ、全体的にＤ−アミノ酸からなる１〜５個の残基ペプチドで「キャップ」される。
【００８７】
Ｎ末端および／またはＣ末端が、Ｎ末端−ＮＨ２またはＣ末端−Ｃ（Ｏ）ＯＨと反応可能な部分で遮断されるペプチドおよびペプチド類似体の「遮断化」形態であるものも、本発明の範囲内に含まれる。このような遮断化合物は、典型的にはＮ末端アシル化および／またはＣ末端アミド化もしくはエステル化される。典型的Ｎ末端遮断基としては、Ｒ１Ｃ（Ｏ）−（式中、Ｒ１は水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルケニル、（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ２０）アリール、（Ｃ６〜Ｃ２６）アリールアルキル、５〜２０員へテロアリールまたは６〜２６員へテロアリールアルキルである）が挙げられる。好ましいＮ末端遮断基としては、アセチル、ホルミルおよびダンシルが挙げられる。典型的Ｃ末端遮断基としては、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ１および−Ｃ（Ｏ）ＯＲ１（式中、Ｒ１は独立して、上記の通りである）が挙げられる。好ましいＣ末端遮断基としては、Ｒ１がそれぞれ独立して、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、好ましくはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであるものが挙げられる。
【００８８】
本発明に基づいて、上記のポリペプチドは、当業者により一般的に用いられる慣用的合成手法を用いて合成され得ることが理解されよう。例えばポリペプチドは、自動ペプチド合成機（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．により製造されたもの、ＬＫＢ  Ｂｉｏｌｙｎｋ  ４１７０またはＭｉｌｌｉｇｅｎ，Ｍｏｄｅｌ  ９０５０（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ，Ｍｉｌｌｆｏｒｄ，ＭＡ））を用いて、Ｓｈｅｐｐａｒｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ，ｐ．５３８（１９８１）の方法に従って化学的に合成され得る。この手法では、Ｎ，Ｎ’−ジクロロヘキシルカルボジイミドがアミノ酸に付加され、そのアミン官能基は、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基により保護され、そして所望のアミノ酸の無水物が生成される。これらのＦｍｏｃ−アミノ酸無水物は次に、ペプチド合成のために用いられ得る。Ｃ末端アミノ酸残基に対応するＦｍｏｃ−アミノ酸無水物は、触媒としてジメチルアミノピリジンを用いて、カルボキシル基を介してＵｌｔｒｏｓｙｎ  Ａ樹脂に固定される。次に樹脂は、ピペリジンを含有するジメチルホルムアミドで洗浄され、Ｃ末端の酸のアミノ官能基の保護基が除去される。所望のペプチドに対応する次のアミノ酸は、Ｃ末端アミノ酸にカップリングされる。次に脱保護化過程が繰り返される。連続的な所望のアミノ酸は、所望配列のペプチド鎖が形成されるまで、同一方法で固定される。次にアセトアミドメチル以外の保護基が除去され、ペプチドが溶媒とともに放出される。
【００８９】
あるいはポリペプチドは、コード核酸配列を含む適切な発現ベクター中の本発明のペプチドをコードする核酸分子を用いることにより合成され得る。このようなＤＮＡ分子は、自動ＤＮＡシーケンサーおよび遺伝暗号の周知のコドン−アミノ酸関係を用いて調製され得る。このようなＤＮＡ分子は、オリゴヌクレオチドプローブおよび慣用的ハイブリダイゼーション法を用いて、ゲノムＤＮＡとして、またはｃＤＮＡとしても得られ得る。このようなＤＮＡ分子は、適切な宿主（例えば細菌（例えば大腸菌）、酵母細胞、哺乳動物細胞または昆虫細胞））中でのＤＮＡの発現およびポリペプチドの産生に適合される発現ベクター（プラスミドを含む）中に組み入れられ得る。
【００９０】
ある種の改変は、ポリペプチドの活性を完全に無効にすることなく成され得る、ということが公知である。改変は、アミノ酸の除去および付加を含む。その他の改変を含有するポリペプチドは当業者により合成され得、このようなポリペプチドを含む化合物は、後述の項に記載される種々のアッセイおよび方法において生物学的活性に関して試験され得る。したがって、ポリペプチドの有効性は、アミノ酸の配列または構造の種々の変化により調節され得る。
【００９１】
さらに、模倣物は当該技術分野で公知の方法を用いて改変されて、結合、特異性、溶解性、安全性または効力を改善し得る、と理解されるべきである。これらの好ましい化合物の必要な特徴は、その活性化中にＲＡＮＫと相互作用することができる能力である。化合物は、ＲＡＮＫとのＲＡＮＫＬの結合およびＲＡＮＫの活性化を模倣する能力を有する任意の化合物、好ましくはペプチドであり得る。
【００９２】
（結晶ＲＡＮＫＬ複合体）
本発明は、Ｘ線結晶学により決定した場合のＲＡＮＫＬの細胞外ドメインの結晶複合体の高分解能三次元構造および原子構造座標を提供する。２．６Å分解能まで得られた結晶ＲＡＮＫＬ複合体の原子構造座標を、図１に列挙する。
【００９３】
さらなるＲＡＮＫ結合化合物は、ＲＡＮＫＬの結晶構造の分解から得られる原子座標を利用して、特にＲＡＮＫＬホモトリマーにより形成される独特の表面ループおよび結合裂け目に関してＲＡＮＫＬ変異体を用いた本出願人らの発見と組合せた場合に、モデル化され、合成され得る。例えば本明細書中で考察されているように、本出願人らは結晶構造および変異体データを利用して、ＲＡＮＫとの相互作用に必要とされる必須構成成分である３つの空間的に別個の、しかし等価の受容体結合領域（例えば図２Ｃ参照）を同定した。
【００９４】
したがって、本発明は、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインの結晶を包含する。好ましい実施形態では、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体に対応するポリペプチドの結晶形態は、約４Åから約２．６Åまたはそれ以上の分解能まで、複合体の原子座標の確定のためにＸ線を有効に回析する。
【００９５】
好ましくは本発明の結晶は、野生型ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインの複合体に対応する結晶化ポリペプチドを含む。本発明の結晶は、結晶化複合体が実質的に純粋であるネイティブ結晶、ならびに結晶化複合体が１つ以上の重金属原子と会合する重原子誘導体結晶を包含する。
【００９６】
本発明の原子構造座標が得られ得る結晶複合体は野生型ＲＡＮＫＬに限定されない、と理解されるべきである。実際、結晶は野生型ＲＡＮＫＬの変異体を含み得る。野生型ＲＡＮＫＬの変異体は、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメインの配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基に置換することにより、あるいは野生型配列内および／またはそのＮ末端および／またはＣ末端の１つ以上のアミノ酸残基を付加または欠失することにより得られる。
【００９７】
本発明により意図される変異体の型としては、保存的変異体、非保存的変異体、欠失変異体、短縮変異体、延長変異体、メチオニン変異体、セレノメチオニン変異体、システイン変異体およびセレノシステイン変異体が挙げられる。変異体はＲＡＮＫ結合活性を有し得るが、有する必要性はない。好ましくは変異体は、野生型ＲＡＮＫＬポリペプチドと実質的に類似した生物学的活性を示す。メチオニン、セレノメチオニン、システインおよびセレノシステイン変異体は、以下で詳細に記載されるように、重原子誘導体結晶を生成するために特に有用である。
【００９８】
本明細書中で意図された変異体の型は突然変異的に限定されず、すなわち、例えば１つのアミノ酸中に保存的突然変異を有するポリペプチドは、さらにＮ末端の残基の短縮、ならびにいくつかのＬｅｕまたはＩｌｅ→Ｍｅｔ突然変異を有し得ることが当業者に認識されよう。
【００９９】
タンパク質ファミリーのポリペプチドの、あるいは相同ポリペプチドドメインの構造ベースの配列アラインメントを用いて、突然変異に関する候補であるポリペプチド配列中の潜在的なアミノ酸残基を同定することができる。ＲＡＮＫＬの三次元構造、特にＲＡＮＫを結合するその特異性を著しく妨害しない、および／または有害作用を及ぼさず、強化することさえし得る変異体を同定する場合、ペプチドの活性は、一部は突然変異が起こる領域に依存している。
【０１００】
保存的アミノ酸置換は当該分野で周知であり、その例としては、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、溶解性、疎水性および／または親水性における類似性に基づいてなされる置換が挙げられる。典型的保存的置換は、アミノ酸が、本明細書中に記載されるようなクラスと同一なクラスまたはカテゴリーのメンバーである異なるアミノ酸で置換されるものである。したがって、典型的保存的置換としては、芳香族−芳香族、無極−無極、脂肪族−脂肪族、酸性−酸性、塩基性−塩基性、極性−極性等が挙げられる。その他の保存的アミノ酸置換は当該分野で周知である。野生型ポリペプチド配列中のアミノ酸は、分子の生物学的活性および／または三次元構造に有害作用を及ぼすことなく、他のアミノ酸と保存的に置換され得るが、ただし、このような置換は上で議論されるような活性に関して重要である残基を包含しないことが当業者に認識されよう。
【０１０１】
本発明の原子構造座標が代替的に得られ得る重原子誘導体結晶は一般に、１つ以上の重金属原子と会合した結晶複合体を含む。ポリペプチドは、必要に応じて、１つ以上の分子とさらに会合し得る野生型または変異体ＲＡＮＫＬ複合体に対応し得る。ポリペプチドの重原子誘導体には２つの型が存在する。すなわち、結晶中に拡散する重金属を含む媒体中に結晶が成長しているか、または結晶の形態の溶液中の重金属へのタンパク質の曝露に起因する重原子誘導体、ならびに複合体中のポリペプチドの少なくとも１つがアミノ酸（例えばセレノメチオニンおよび／またはセレノシステイン変異体）を含有する重原子。
【０１０２】
実際上、結晶を通して拡散し、結晶ポリペプチドと結合し得る重金属原子塩または有機金属化合物、例えば塩化鉛、チオマレイン酸金、チメロサール、酢酸ウラニル、四塩化白金、四酸化オスミウム、硫酸亜鉛およびコバルトヘキサミンを含む溶液中にネイティブな結晶を浸漬することにより、第一の型の重原子誘導体が形成され得る。
【０１０３】
この型の重原子誘導体は、結晶化されるポリペプチドを含む結晶化溶液に、結晶と会合し得、結晶中に組み入れられ得る一定量の重金属塩を付加することによっても生成され得る。結合重金属原子の位置は、結晶のＸ線回析分析により確定され得る。この情報は順次、複合体中のタンパク質の三次元構造を構築するために必要とされる位相情報を作るために用いられ得る。
【０１０４】
本発明の原子構造座標が得られるネイティブな結晶および／または重原子誘導体結晶は、タンパク質結晶学の分野で周知である慣用的手段（例えば、バッチ、液体架橋、透析および蒸気拡散方法を含む）により得られ得る（例えばＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−２３（１９９０）；Ｗｅｂｅｒ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ．４１：１−３６（１９９１）参照）。一般にネイティブな結晶は、タンパク質を沈殿するのに必要な濃度のすぐ下の濃度で沈殿剤を含有する水性緩衝液中にＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体をコードする実質的に純粋なポリペプチドを溶解することにより成長される。沈殿剤の例としては、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウム、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、グリセロール、イソプロパノール、硫酸リチウム、酢酸ナトリウム、蟻酸ナトリウム、酒石酸カリウムナトリウム、エタノール、ヘキサンジオール、エチレングリコール、ジオキサン、ｔ−ブタノールおよびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。水は、結晶成長が終結するまで保持される沈殿条件を生じるために制御蒸発により除去される。
【０１０５】
好ましい実施形態では、ネイティブな結晶は、懸滴中の蒸発拡散により成長される（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−２３（１９９０））。この方法では、ポリペプチド／沈殿剤溶液は、結晶を生成するために最適な沈殿剤濃度を有する大型水性リザーバを備える密閉容器中で平衡させられる。一般に、約２５μｌ未満の実質的に純粋なＲＡＮＫＬポリペプチド溶液が等容量のリザーバ溶液と混合されて、結晶化のために必要な濃度の約半分の沈殿剤濃度を生じる。この溶液は、カバーガラス下の小滴として懸濁され、これはリザーバの上部に密封される。密封容器は、結晶が成長するまで通常は約２〜６週間放置される。
【０１０６】
重原子誘導体結晶は、重金属原子の塩を含有する母液中にネイティブな結晶を浸漬することにより生成され得る。さらに重原子誘導体結晶は、ネイティブな結晶に関して上記されているように、ＳｅＭｅｔおよび／またはＳｅＣｙｓ変異体からも生成され得る。
【０１０７】
変異体タンパク質は、突然変異の性質ならびにタンパク質中のその位置によって、野生型タンパク質とわずかに異なる結晶化条件下で、あるいは非常に異なる結晶化条件下で結晶化され得る。例えば非保存的突然変異は、変異体の親水性の変化を生じ、これが次に、変異体タンパク質を野生型タンパク質より可溶性にまたは低可溶性にさせる。典型的には、タンパク質が突然変異の結果としてより親水性になった場合、それは水溶液中の野生型タンパク質より可溶性になり、それを結晶化するためにはより高い沈殿剤濃度が必要とされる。逆に、タンパク質が突然変異の結果として低親水性になった場合、それは水溶液中で低可溶性になり、それを結晶化させるためにはより低い沈殿剤濃度が必要とされる。突然変異が結晶格子接触物に関与するタンパク質の領域中に存在するよう起こる場合、結晶化条件はより予測可能な方法で影響を及ぼされ得る。
【０１０８】
結晶の単位セルの寸法が、６つの数値、すなわち３つの独自の縁の長さａ、ｂおよびｃ、ならびに３つの独自の角度α、βおよびγにより規定される。結晶を含む単位セルの型は、これらの変数の値による。一実施形態では、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体の結晶は、結晶化複合体の三次元構造が約３Å〜約２．６Åまたはそれ以上の分解能に決定され得るよう、ａ＝６５．３Å±０．２Å、ｂ＝８２．０Å±０．２Åおよびｃ＝９９．５Å±０．２Åという単位セル寸法を有するＰ２１２１２１という空間群を有する。別の実施形態では、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体の結晶は、複合体の三次元構造が約４．０Å〜約３．０Åまたはそれ以上の分解能に決定され得るよう、ａ＝ｂ＝１５０．６Å±０．２Åおよびｃ＝１３９．５Å±０．２Åという単位セル寸法を有する空間群Ｒ３を有する。
【０１０９】
結晶がＸ線ビーム中に置かれる場合、入射Ｘ線は、結晶を作り上げる分子の電子雲と相互作用して、Ｘ線散乱を生じる。Ｘ線散乱と結晶の格子との組合せは、散乱の非均一性を生じ、高強度の領域は回析Ｘ線と呼ばれる。回析ビームが結晶から出る角度は、それが結晶中の原子の等価の平行平面組からの反射であったかのように回析を処理することにより、コンピューター処理され得る（ブラッグの法則）。結晶格子のもっとも明らかな組の平面は、単位セルの面と平行である平面である。これらのおよびその他の組の平面は、格子点を介して描写され得る。各組の平面は、３つの指数ｈｋｌにより特定される。指数ｈは、単位セルの縁が切断される断片の数を示し、指数ｋは、単位セルの縁ｂが切断される断片の数を示し、指数ｌは、単位セルの縁ｃがｈｋｌ平面の組により切断される断片の数を示す。したがって、例えば２３５個の平面は各単位セルの縁を半分に、各単位セルの縁ｂを３分の１に、そして各単位セルの縁ｃを５分の１に切断する。単位セルのｂｃ面と平行である平面は１００平面であり；単位セルのａｃ面と平行である平面は０１０平面であり；そして単位セルのａｂ面と平行である平面は００１平面である。
【０１１０】
回析の球面への切断を実行するに際して、検出器が回析Ｘ線の経路に置かれる場合、一連のスポットまたは反射が記録されて、「スティル（ｓｔｉｌｌ）」回析パターンを生じる。各反射は、一組の平行平面を反射するＸ線の結果であり、単位セル中の分子の分布に関連する強度、ならびにそのスポットを生じるビームが反射された平行平面に対応する指数ｈｋｌにより特性化される。結晶がＸ線ビームに垂直な軸の周りを回転させられると、多数の反射が検出器に記録されて、回析パターンを生じる。
【０１１１】
結晶の単位セル寸法および空間群は、その回析パターンから確定され得る。第一に、反射の間隔は、単位セルの縁の長さに反比例する。したがって、回析パターンが記録される場合、Ｘ線ビームが単位セルの面に垂直であると、単位セル寸法のうちの２つは検出器のｘおよびｙ方向の反対の間隔、結晶−検出器距離、ならびにＸ線の波長から推定され得る。３つの単位セル寸法すべてを得るためには、Ｘ線が単位セルの別の面と垂直であるように結晶が回転されねばならないことを当業者は理解する。第二に、単位セルの角度は、回析パターン上のスポットの線間の角度により確定され得る。第三に、視覚的検査により明らかにされ得るある種の反射および回析パターンの反復性の非存在は、結晶の内部対称または空間群を示す。したがって、結晶は、その単位セルおよび空間群、ならびにその回析パターンにより特性化され得る。
【０１１２】
単位セルの寸法が一旦確定されると、非対称単位中の同様の数のポリペプチドが、ポリペプチドのサイズ、平均タンパク質の密度、ならびに通常は単位セル容積の３０〜７０％の範囲であるタンパク質結晶の典型的溶媒含量から推定され得る。
【０１１３】
回析パターンは、フーリエ変換により分子の三次元形状に関係づけられる。溶液の確定方法は、本質的には、結晶中の分子の三次元像を生じるための回析Ｘ線の再フォーカシング（ｒｅ−ｆｏｃｕｓｉｎｇ）である。Ｘ線の再フォーカシングは、この時点ではレンズを用いて実行できないため数学的操作により実行される。
【０１１４】
回析の球面は、結晶の内部対称による対称を有するが、これは、結晶の一定の配向が同一組の反射を生じることを意味する。したがって、高対称を伴う結晶はより反復的な回析パターンを有し、回析の完全表示を示すために記録される必要がある独特の反射がより少なく存在するに過ぎない。データ収集の目標、即ちデータセットは、できるだけ多数の反射に関する一組の一貫して測定される指示強度である。完全データセットは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、もっとも好ましくは少なくとも９５％の独特の反射が記録される場合に収集される。一実施形態では、完全データセットは、一結晶を用いて収集される。別の実施形態では、完全データセットは、同一種類の１つより多い結晶を用いて収集される。
【０１１５】
Ｘ線源としては、回転アノードＸ線発生器、例えばＲｉｇａｋｕ  ＲＵ−２００、あるいはシンクロトロン光源、例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でのビームラインが挙げられるが、これらに限定されない。回析パターンを記録するための適切な検出器としては、Ｘ線感光フィルム、マルチワイヤ面積検出器、リンで被覆された像平板、およびＣＣＤカメラが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には検出器およびＸ線ビームは静止したままであり、その結果、回析の結晶球面の回析部分から回析を記録するために、結晶それ自体が、ゴニオスタットと呼ばれる移動可能サークルの自動システムにより移動される。
【０１１６】
特に高溶媒含量を有する高分子結晶からのデータ収集における最大問題の１つは、Ｘ線ビーム中での結晶の急速分解である。分解を遅くするために、データはしばしば、液体窒素温度で結晶から収集される。結晶が液体窒素への初期曝露から生き残るためには、凍結防御物質の使用により結晶内の氷の形成を防止しなければならない。適切な凍結防御物質としては、低分子量ポリエチレングリコール、エチレングリコール、スクロース、グリセロール、キシリトールおよびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。結晶は、液体窒素に曝露される前に、１つ以上の凍結防御物質を含む溶液中に浸漬され得るか、あるいは１つ以上の凍結防御物質が結晶化溶液に付加され得る。液体窒素温度でのデータ収集は、一結晶からの全データセットの収集を可能にし得る。
【０１１７】
データセットが一旦収集されると、その情報を用いて、結晶中の分子の三次元構造を決定する。しかしながら、位相情報として既知である、ある種の情報が、分子の三次元形状およびそのフーリエ変換、回析パターン間で失われるので、これは反射強度の単一測定からは実行できない。結晶中の分子の三次元構造を得るために回析パターンでフーリエ変換を実施するために、この位相情報は、下記の方法により取得されねばならない。その方法は、実行に際して、Ｘ線を再焦点合わせして、分子の像を生成する位相情報の測定である。
【０１１８】
位相情報取得の一方法は、重原子誘導体結晶が用いられる同形置換によるものである。この方法では、重原子誘導体結晶中の分子に結合される重原子の位置が確定され、この情報は次に、ネイティブな結晶の三次元構造を解明するために必要な位相情報を得るために用いられる（Ｂｌｕｎｄｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６））。
【０１１９】
位相情報を得るための別の方法は、分子置換によるものである。この方法は、新規の結晶の観察された回析パターンを最も良く説明するために、その構造座標が新規の結晶の単位セル内で既知であるポリペプチドを配向し、位置決定することにより、その構造座標が未知であるポリペプチドまたはポリペプチド複合体の新規の結晶に関する初期位相を算定する方法である。次いで位相はその場合、配向および位置決定されたポリペプチドから算定され、観察された振幅と組合されて、新規の結晶を含む分子の構造のおよそのフーリエ合成を提供する（Ｌａｔｔｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．１１５：５５−７７（１９８５）；Ｒｏｓｓｍａｎｎ，「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ，」Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．１３，Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｂｒｅａｃｈ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２））。
【０１２０】
位相決定の第三の方法は、多重波長異常分散（ＭＡＤ）である。この方法では、Ｘ線回析データは、入射Ｘ線放射のエネルギーに近い吸収縁を有する少なくとも１つの重原子を含有する単一結晶からのいくつかの異なる波長で収集される。Ｘ線および電子軌道間の共鳴は、重原子の位置を同定させるＸ線散乱の差をもたらし、これは次に、ポリペプチドの結晶に関する位相情報を提供する。ＭＡＤ分析についての詳細な考察は、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｔｒａｎｓ．Ａｍ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａｓｓｏｃ．，２１：１１（１９８５）；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１６６５（１９９０）；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４：９１（１９９１）に見られ得る。
【０１２１】
位相情報を決定するための第四の方法は、単一波長異常分散またはＳＡＤである。この技法では、Ｘ線回析データは、単一のネイティブな結晶または重原子誘導体結晶からの単一波長で収集され、位相情報は、ネイティブな結晶中のイオウまたは塩素のような原子から、あるいは重原子誘導体結晶中の重原子からの異常散乱情報を用いて抽出される。この位相整合技法に関してデータを収集するために用いられるＸ線の波長は、異常散乱体の吸収縁に近い必要はない。ＳＡＤ分析の詳細な考察は、Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５６：４３１−４４１（２０００）に見られ得る。
【０１２２】
位相情報を決定する第五の方法は、異常散乱による単一同形置換法またはＳＩＲＡＳである。この技法は、同形置換および異常散乱技法を組合せて、ポリペプチドの結晶に関する位相情報を提供する。Ｘ線回析データは、通常は単一重原子誘導体結晶から、単一波長で収集される。単一重原子誘導体結晶中の重原子の位置からのみ得られる位相情報は、位相角度におけるアンビギュイティーをもたらし、これは、重原子からの異常散乱を用いて解明される。したがって、位相情報は、重原子の位置および重原子の異常散乱の両方から抽出される。ＳＩＲＡＳ分析の詳細な考察は、Ｎｏｒｔｈ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．１８：２１２−２１６（１９６５）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．２０：８２−８６（１９６６）に見出される。
【０１２３】
一旦位相情報が得られると、それは回析データと組合されて、単位セル中の分子を取り囲む電子雲の像である電子密度マップを作り出す。互いに近い原子が解像可能であるので、データの分解能が高いほど、電子密度マップの特徴、例えばペプチド骨格中のアミノ酸側鎖およびカルボニル酸素原子の位置は、より識別可能である。次に高分子のモデルがコンピューターの助けを借りて、ガイドとしてすべての利用可能な情報、例えばポリペプチド配列、ならびに分子構造および立体化学の確立された原則を用いて、電子密度マップに作り上げられる。電子密度マップの解釈は、マップを正確に一致させる化学的実際的立体配座を見出す過程である。
【０１２４】
モデルが作られた後、構造が精密化される。精密化は、観察強度値と算定強度値（Ｒ因子により測定）との間の差であり、そしてモデル中の各非水素原子の位置、温度因子および占有率の一関数である関数Φを最小化する過程である。これは通常は、実空間精密化の交替サイクル、すなわち電子密度マップおよびモデル構築の算定、ならびに逆空間精密化、すなわち原強度データおよび各連続モデルから生じた強度データ間の合致を改良するコンピューターによる試みを包含する。精密化は、関数Φが最小値に収束した場合に終了し、この場合、モデルは電子密度マップに合致し、立体化学的および配座的に合理的である。精密化中、規則化溶媒分子が構造に付加される。
【０１２５】
本発明の原子構造座標および機械読取可能媒体は、種々の用途を有する。本発明は、下記のソフトウエアプログラムならびにその他のソフトウエアプログラムに用いるためのポリペプチドの三次元構造を作るために用いられる構造座標およびその他の情報（例えば、アミノ酸配列、結合性表、ベクターベースの表示、温度因子等）を包含する。例えば座標は、その他のタンパク質（突然変異ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体、他の分子とさらに会合する複合体、および非関連タンパク質を含む）の三次元Ｘ線回析および／または溶液構造を高分解能に解明するのに有用である。構造情報は、例えば、変更した生物学的活性を有する結晶化ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン複合体の変異体をインテリジェントに設計するために、そしてＲＡＮＫを結合する化合物をコンピューター的に設計および同定するために、種々の分子モデリングおよびコンピューターベースのスクリーニング用途にも用いられ得る。このような化合物は、薬学的作用でリード化合物として用いられて、骨質量の損失または骨欠陥に媒介されるかまたはそれらと関連した、いくつかの種類の疾患の処置に向けての療法的アプローチとしてＲＡＮＫシグナル伝達を調節する化合物を同定し得る。
【０１２６】
本発明のさらなる態様では、このような潜在的な化合物は、ＲＡＮＫを結合し、骨形成を強化するそれらの能力に関して評価される。これらの方法は、このような結晶の三次元構造の原子座標ならびに関連構造データを用いて候補化合物を設計および合成し、ＲＡＮＫを結合し、そして／またはＲＡＮＫ調節を強化する能力に関してそれらをスクリーニングすることを含む。化合物のＲＡＮＫ調節活性は、ＲＡＮＫに対するそれらの結合親和性に関して、あるいは骨形成活性のマーカーの存在の増大に関して化合物をアッセイすることにより確定される。ＲＡＮＫを結合し、骨形成を強化し得るこのような化合物は、骨損失の防止または予防に関連した療法的処置に向けられる薬学的組成物において用いられ得る。
【０１２７】
さらに本発明は、本明細書中に記載されたモデルの三次元構造でまたはその部分で包埋された機械読取可能媒体を包含する。本明細書中で用いる場合、「機械読取可能媒体」とは、コンピューターまたはスキャナーにより読み取られ、直接アクセスされ得る任意の媒体を指す。このような媒体としては、磁気保存媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク保存媒体および磁気テープ；光学的保存媒体、例えば光ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ；電気的保存媒体、例えばＲＡＭまたはＲＯＭ；ならびにこれらのカテゴリーの混成物、例えば磁気／光保存媒体が挙げられるが、これらに限定されない。このような媒体はさらに、走査装置により読み取られ、光学的文字認識（ＯＣＲ）で三次元構造に変換され得る原子構造座標、例えばデカルト座標の表示を記録される紙を包含する。
【０１２８】
本発明の原子構造座標もしくはその部分および／またはＸ線回析データをその上に記録されたコンピューター読取り可能媒体を作製するために、種々のデータ保存構造が当業者に利用可能である。データ保存構造の選択は一般に、保存情報にアクセスするために選択される手段に基づいている。さらに種々のデータプロセッサープログラムおよびフォーマットが、コンピューター読取り可能媒体に配列およびＸ線データ情報を保存するために用いられ得る。このようなフォーマットとしては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（「ＰＤＢ」）フォーマット（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｄｏｃｓ／ｆｏｒｍａｔ／ｐｄｂｇｕｉｄｅ２．２／ｇｕｉｄｅ２．２＿ｆｒａｍｅ．ｈｔｍｌ）；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒｍａｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｄｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｃｓｄ＿ｄｏｃ／ｖｏｌｕｍｅ３／ｚ３２３．ｈｔｍｌ）；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｄａｔａ（「ＳＤ」）ファイルフォーマット（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，；Ｄａｌｂｙら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐ．Ｓｃｉ．３２：２４４−２５５（１９９２））、ならびに例えばＳＭＩＬＥＳ（Ｗｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐ．Ｓｃｉ．２８：３１−３６（１９８８））で用いられるような線表記が挙げられるが、これらに限定されない。異なるコンピューターソフトウエアにより読み取られる種々のフォーマット間の変換方法、例えばＢＡＢＥＬ（ｖ．１．０６，Ｗａｌｔｅｒｓ＆Ｓｔａｈｌ，（Ｃ）１９９２，１９９３，１９９４；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｕｎｅｌ．ａｃ．ｕｋ／ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｓ／ｃｈｅｍ．／ｂａｂｅｌ．ｈｔｍ）は、当業者には容易に明らかとなろう。本明細書中に記載されたポリペプチド座標またはその部分のすべてのフォーマット表示は、本発明により意図される。本発明の原子座標をその上に保存したコンピューター読み取り可能媒体を提供することにより、当業者は本発明の原子座標またはその部分に、ならびに以下に詳細に記載されるモデリングおよび設計プログラムに用いるための関連情報にルーチンにアクセスし得る。
【０１２９】
デカルト座標はポリペプチドの三次元構造の重要且つ便利な表示であるが、しかし構造の他の表示も有用であることが当業者は容易に認識されよう。したがって、本明細書中に考察されたようなポリペプチドの三次元構造は、デカルト座標表示だけでなく、原子の三次元分布のすべての代替的表示も包含する。例えば原子座標はＺ行列として示され得るが、この場合、タンパク質の第１の原子が選択され、第２の原子が第１の原子から所定の距離で配置され、第３の原子は、第１の原子と限定角度をなすよう第２の原子から所定の距離に配置される。それぞれのその後の原子は、第３の原子に関して特定角度を有する以前に配置された原子から限定距離で、そして四次原子に関して特定ねじれ角度で配置される。原子座標はパターソン関数としても示され得るが、この場合、原子間ベクトルがすべて描かれ、次に起点にそれらの尾部を有して配置される。この表示は、単位セル中に重原子を置くために特に有用である。さらに原子座標は、大きさおよび方向を有する一連のベクトルとして表示され、選択された起点からポリペプチド構造中の各原子までを描写され得る。さらに三次元構造中の原子の位置は、単位セルの分画として（分別座標（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ））として、あるいは球面極性座標で表示され得る。
【０１３０】
付加的情報、例えば構造中の各原子の運動を測定する熱パラメーター、原子が配置される多鎖タンパク質またはタンパク質複合体の特定鎖を同定する鎖同定物、ならびにどの原子に特定原子が結合されるかを示す連結性情報も、三次元分子構造を表示するのに有用である。
【０１３１】
（原子構造座標の使用）
典型的には原子構造座標の形態での構造情報は、例えば結晶化ポリペプチドあるいはその部分または断片を結合する化合物を設計し、スクリーニングおよび／または同定するために、あるいは生物学的特性変更を示す変異体をインテリジェントに設計するために、種々のコンピューター的またはコンピューターベースの方法に用いられ得る。
【０１３２】
一実施形態では、それから得られる結晶および構造座標は、新規の治療薬を開発するためのアプローチとしてＲＡＮＫを結合する化合物を同定および／または設計するのに有用である。例えば、高分解能Ｘ線構造はしばしば、タンパク質周囲に、特にタンパク質上の推定結合部位またはその付近に規則化溶媒分子の位置を示す。次にこの情報を用いて、これらの部位を結合する分子を設計することができ、化合物が合成され、生物学的アッセイにおける結合に関して試験され得る（Ｔｒａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６２：１３７４（１９９３））。
【０１３３】
さらに別の実施形態では、構造は、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬと、全体的にまたは部分的に結合し得る化学的存在物または化合物に関して小分子データベースをコンピューターによりスクリーニングするために用いられ得る。このスクリーニングでは、結合部位に対するこのような存在物または化合物の合致の特質は、形状相補性により、または概算相互作用エネルギーにより判定され得る（Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１３：５０５−５２４（１９９２））。
【０１３４】
本発明によるＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬと結合する化合物の設計は一般に、２つの因子についての考慮を包含する。第一に、化合物はＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬと物理的および構造的に会合可能でなければならない。この会合は、共有的または非共有的であり得る。例えば共有的相互作用は、タンパク質の自殺または不可逆的阻害剤を設計するために重要であり得る。ＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの会合に重要な非共有的分子相互作用としては、水素結合、イオン的相互作用およびファンデルワールスおよび疎水性相互作用が挙げられる。第二に、化合物は、その化合物をＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬと会合させる配座を推定できなければならない。化合物のある部分はタンパク質とのこの会合に直接参与しないが、しかしそれらの部分は依然として分子の全体的配座に影響を及ぼし得る。これは次に、効能に有意の影響を及ぼし得る。このような配座要件としては、結合部位の全部または一部に関連する化学基または化合物の全体的三次元構造および配向、あるいはタンパク質と直接相互作用するいくつかの化学基を含む化合物の官能基間の間隔が挙げられる。
【０１３５】
ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬに及ぼす化学化合物の潜在的阻害または結合作用は、コンピューターモデリング技法の使用により、その実際的合成および試験の前に分析され得る。所定の化合物の理論的構造が所定の化合物とタンパク質との間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合、化合物の合成および試験は不必要である。しかしながらコンピューターモデリングが強い相互作用を示す場合には、分子は合成され、そしてタンパク質と結合するとともにその活性を阻害するその能力に関して試験され得る。このように、効力のない化合物の合成は回避され得る。
【０１３６】
ＲＡＮＫＬ模倣物は、各タンパク質の個々の結合ポケットまたは界面と会合するそれらの能力に関して化学基または断片がスクリーニングされて選択される一連の過程により、コンピューター評価され、設計され得る。当業者は、ＲＡＮＫと会合するそれらの能力に関して化学基または断片をスクリーニングするために、いくつかの方法のうちの１つを用い得る。この方法は、例えば結晶複合体座標に基づいたコンピュータースクリーンでのタンパク質／タンパク質界面または結合部位の視覚的検査により開始され得る。選択された断片または化学基は次に、種々の配向で位置決めされるか、またはタンパク質／タンパク質界面にまたは結合ポケットに関与するＲＡＮＫＬの個々の表面でドッキングされる。ドッキングは、クアンタ（ＱＵＡＮＴＡ）およびＳＹＢＹＬのようなソフトウエアを用いて、その後、チャーム（ＣＨＡＲＭＭ）およびアンバー（ＡＭＢＥＲ）といったような標準分子応用力学力場を用いたエネルギー最小化ならびに分子動力学により、成し遂げられ得る。
【０１３７】
特殊化コンピュータープログラムも、断片または化学基の選択過程に役立ち得る。これらの例を以下に挙げる：
１．ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９−８５７（１９８５））。ＧＲＩＤは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である。
【０１３８】
２．ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ＆Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１：２９−３４（１９９１））。ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから入手可能である。
【０１３９】
３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ＆Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．８：１９５−２０２（１９９０））。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能である。
【０１４０】
４．ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９−２８８（１９８２））。ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能である。
【０１４１】
適切な化学基または断片が選択されると、それらは単一化合物または阻害剤にアセンブルされ得る。アセンブリーは、その構造座標と関連して、コンピュータースクリーンに表示される三次元画像で、断片と互いとの関係を視覚的に検査することにより進行し得る。これに続いて、クアンタおよびＳＹＢＹＬのようなソフトウエアを用いて手動モデル構築がなされる。
【０１４２】
個々の化学基または断片を連結するに際して当業者の手助けをするための有用なプログラムを以下に挙げる：
１．ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔら、「ＣＡＶＥＡＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（１９８９）。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．，Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７８：１８２−１９６）。ＣＡＶＥＡＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡから入手可能である。
【０１４３】
２．  ３Ｄデータベースシステム、例えばＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆ．）。この領域は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２１４５−２１５４（１９９２）で総説されている。
【０１４４】
３．ＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓから入手可能）。
【０１４５】
上記のように同時に一断片または化学基を一段階方式で、ＲＡＮＫＬ模倣物を構築するよう進行する代わりに、このような化合物は、任意に既知の活性剤（単数または複数）の何らかの部分（単数または複数）を含めたタンパク質／タンパク質相互作用に参与するタンパク質の空結合部位または表面を用いて、全体としてまたは「ｄｅ  ｎｏｖｏ」に設計され得る。これらの方法を以下に挙げる：
１．ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ  ６：６１−７８（１９９２））。ＬＵＤＩは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。
【０１４６】
２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ＆Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７：８９８５（１９９１））。ＬＥＧＥＮＤは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．から入手可能である。
【０１４７】
３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ，Ｍｏ．から入手可能）。
【０１４８】
その他の分子モデリング技法も、本発明に従って用いられ得る（例えばＣｏｈｅｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：８８３−８９４（１９９０）参照）。Ｎａｖｉａ＆Ｍｕｒｃｋｏ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２０２−２１０（１９９２）も参照されたい。
【０１４９】
上記の方法により化合物が設計または選択されると、その化合物がＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬを結合し得る効率が試験され、コンピューター評価により最適化され得る。例えばＲＡＮＫＬ模倣物として機能するよう設計されるかまたは選択された化合物は、好ましくは、ＲＡＮＫが結合される場合、ＲＡＮＫＬ結合部位残基により占められる容積と重複しない容積を占めなければならない。有効模倣物は、好ましくはその結合および遊離状態間のエネルギーの相対的に小さい差を実証しなければならない（すなわち、有効模倣物は結合の小変形エネルギーを有さなければならない）。したがって、最も効率的な阻害剤は、好ましくは約１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の、好ましくは７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下の結合の変形エネルギーを有して設計されるべきである。阻害剤は、全体的結合エネルギーにおけるのと同様の１つより多い配座中のタンパク質と相互作用し得る。それらの場合、結合の変形エネルギーは、遊離化合物のエネルギーと阻害剤がタンパク質と結合する場合に観察される配座の平均エネルギーとの間の差であると考えられる。
【０１５０】
ＲＡＮＫとの結合のために選択されるかまたは設計される化合物は、その結合状態において、化合物が好ましくは標的タンパク質との反発的静電的相互作用を欠くように、さらにコンピューターにより最適化され得る。このような非相補的静電的相互作用としては、反発的電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用が挙げられる。特に阻害剤とタンパク質との間のすべての静電的相互作用の和は、模倣物がそれに結合される場合、好ましくは、結合のエンタルピーに対して中性であるかまたは好都合に働く。
【０１５１】
化合物変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価するために、特定のコンピューターソフトウエアが当該技術分野で利用可能である。このような使用のために設計されるプログラムの例としては、以下のものが挙げられる：ガウス（Ｇａｕｓｓｉａｎ）９２、改訂版Ｃ（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ．（Ｃ）１９９２）；アンバー、バージョン４．０（Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，（Ｃ）１９９４）；クアンタ／チャーム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，（Ｃ）１９９４）；およびインサイト（Ｉｎｓｉｇｈｔ）ＩＩ／ディスカバー（Ｄｉｓｃｏｖｅｒ）（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，（Ｃ）１９９４）。これらのプログラムは、例えば当該技術分野で周知であるようなコンピューターワークステーションを用いて実行され得る。その他のハードウエアシステムおよびソフトウエアパッケージは、当業者に既知である。
【０１５２】
上記のようにＲＡＮＫＬ模倣化合物が最適に選択されるかまたは設計されると、次に、その結合特性を改良または修飾するために、その原子または化学基のうちのいくつかにおいて置換がなされ得る。一般に、初期置換は保存的であり、すなわち置換基は元の基とほぼ同一のサイズ、形状、疎水性および電荷を有する。配座を変更するための当該技術分野で既知の置換は回避されるべきであることが当業者には理解されよう。このような変更化学化合物は次に、上記に詳述されたのと同一のコンピューター法によりＲＡＮＫとの結合の効率に関して分析され得る。
【０１５３】
このような複合体は１つより多い結晶形態で結晶化し得るため、ＲＡＮＫＬ複合体またはその一部の構造座標は、その他の結晶形態の構造を解明するのに特に有用である。それらは別の分子とさらに複合された変異体ＲＡＮＫＬの構造、あるいはＲＡＮＫＬの任意の機能性ドメインと有意のアミノ酸配列相同性を有する任意の他のタンパク質またはタンパク質複合体の結晶形態の構造を解明するためにも用いられ得る。同様に、構造座標は、ＲＡＮＫＬおよびその受容体の他の共結晶形態の構造を解明するのに特に有用である。それらは、ＲＡＮＫＬの任意の機能性ドメインと有意のアミノ酸配列相同性を有する変異体の、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫ混合複合体の、あるいは結晶形態の任意のその他のタンパク質またはタンパク質混合複合体の構造を解明するためにも用いられ得る。
【０１５４】
この目的のために用いられ得る一方法は、分子置換である。この方法では、未知の結晶構造は、それが別の結晶形態のＲＡＮＫＬ複合体であるか、変異体であるか、ＲＡＮＫＬ−ＲＡＮＫであるか、またはＲＡＮＫＬ−ＯＰＧ複合体または別の分子とさらに複合された混合複合体であるか、あるいは混合複合体結晶中のタンパク質の１つの任意の機能的ドメインと有意のアミノ酸配列相同性を有するいくつかのその他のタンパク質またはタンパク質混合複合体の結晶であるか否かにかかわらず、ＲＡＮＫＬ複合体構造座標からの位相情報を用いて決定され得る。この方法は、最初のこのような情報を確定するための試みよりも迅速且つ効率的に、新規の結晶中の未知のタンパク質またはタンパク質混合複合体に関する正確な三次元構造を提供する。
【０１５５】
未知の結晶形態が既知の混合複合体結晶形態と同一の空間群および類似のセル寸法を有する場合には、既知の結晶形態から誘導される位相は未知の結晶形態に直接適用され、次いで、未知の結晶形態に関する電子密度マップが算定され得る。次に、差電子密度マップを用いて、未知の結晶形態と既知の結晶形態との間の差を検査し得る。差電子密度マップは、ある電子密度マップ、例えば既知の結晶形態から誘導されるものを、別の電子密度マップ、例えば未知の結晶形態から誘導されるものから差し引いたものである。したがって、２つの電子密度マップの類似の特徴はすべて、引き算で排除され、２つの構造間の差だけが残る。同様に、アミノ酸側鎖が２つの結晶形態中に異なる立体配座を有する場合には、それらの差は、差電子密度マップ中のピーク（陽電子密度）および谷（陰電子密度）により強調されて、２つの結晶形態間の差の検出を容易にする。しかしながら、２つの結晶形態の空間群および／またはセル寸法が異なる場合には、この手法はうまくいかず、未知の結晶形態に関する位相を誘導するためには分子置換を用いなければならない。
【０１５６】
上記の複合体はすべて、周知のＸ線回析技法を用いて試験されることができ、コンピューターソフトウエア、例えばＸ−ＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，（Ｃ）１９９２，（販売：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．））を用いて、１．５Å以上〜３Åの分解能のＸ線に対して、約０．２０またはそれ以下のＲ値と算定されるよう精密化され得る（例えばＢｌｕｎｄｅｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１１４＆１１５，Ｗｙｃｋｏｆｆら、ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８５参照）。したがって、この情報を用いて、既知の種類のＲＡＮＫＬ模倣物を最適化し、さらに重要なことには、新規の種類のＲＡＮＫＬ模倣物を設計し、合成し得る。
【０１５７】
原子構造座標のサブセットは、上記の方法のいずれかに用いられ得る。特に有用なサブセットの座標としては、活性部位を裏打ちする残基（ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｌｉｎｉｎｇ  ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ）の座標、界面での重要なタンパク質間接触に参与する残基の座標、およびＣα座標が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、活性部位を含有するタンパク質の１つのドメインの座標は、タンパク質がより多くの組の原子座標により十分に説明されるとしても、その部位に結合する模倣物を設計するために用いられ得る。したがって、以下の特定の実施形態に関して詳細に説明されているように、全ポリペプチド鎖を規定するある組の原子座標は、多数の用途に関して有用ではあるが、本明細書中に記載された方法に必ずしも用いられる必要はない。
【０１５８】
（特定の実施形態における原子座標のサブセットの使用）
本発明の構造座標およびそのサブセットは、ＲＡＮＫＬを模倣する化合物に関して設計またはスクリーニングするために有用である。本発明のＲＡＮＫＬ複合体の高分解能Ｘ線構造は、特に本出願人らの構造ベースの突然変異誘発分析から誘導される機能情報と組合せた場合、その独特の界面残基の詳細を示す。この情報は、ＲＡＮＫ相互作用の部位と結合する化合物に関して設計および／またはスクリーニングするために用いられ得る。
【０１５９】
一実施形態では、ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン座標、またはＲＡＮＫがＲＡＮＫと相互作用するＲＡＮＫＬホモトリマーの溝領域中の残基である、このような座標のサブセットは、溝中で結合する化合物に関して設計および／またはスクリーニングするために有用である。本発明のこの実施形態に有用なＲＡＮＫＬの構造座標のサブセットとしては、図３に記載されたものが挙げられる。
【０１６０】
以下の実施例では本発明を説明するが、本発明の種々の局面を説明されたように限定すると解釈されるべきではない。
【０１６１】
（タンパク質の発現および精製）
ＲＡＮＫＬの生物学的に活性な細胞外ドメインを、ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）中で発現させた。要するに、マウスＲＡＮＫＬ残基１５８〜３１６のコア細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、ＳａＩＩおよびＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の下流でｐＧＥＸ−６Ｐ−Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にクローニングした。プロテアーゼ欠損ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）中でのタンパク質発現のＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）−媒介性誘導後、細胞を、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および１ｍＭのＥＤＴＡを含む非変性溶解緩衝液中で粉砕した。溶解物を融合タンパク質のアフィニティー精製のためにグルタチオンセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともにインキュベートし、その後、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む緩衝液で過度に洗浄した。グルタチオンとの競合的溶離により、ＧＳＴ融合タンパク質をアフィニティーマトリックスから放出させた。次に、単離タンパク質を陰イオン交換に付して、その後、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２に対して透析した。そのＧＳＴ融合相手からのＲＡＮＫＬの分離を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴ中で４℃で４時間実施した１４型ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いたタンパク質分解性切断により成し遂げた。グルタチオンアフィニティーマトリクス上を通過させることにより、非切断融合タンパク質、ならびにＧＳＴ−タグ化プロテアーゼを除去した。スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより最終生成物をさらに精製したが、この際、最終生成物は、ホモトリマーのサイズと一致する分子量５５ｋＤで移動した。質量分光測定法により同定を継続し、１９，０３４Ｄａという質量は、予測値±１Ｄａと合致した。精製ＲＡＮＫＬを、２０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中で２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１６２】
（結晶化およびデータ収集）
２０℃での懸滴での蒸気拡散により、ＲＡＮＫＬの結晶を成長させた。８０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１６ｍＭのＣａＣｌ２および１１〜１４％のＰＥＧ４０００を含む沈殿剤を用いて、回析品質の結晶を得た。２つの結晶形態が優勢であった：典型的サイズ０．４ｍｍ×０．４ｍｍ×０．２ｍｍに成長し、単位セル寸法ａ＝ｂ＝１５０．６Å×ｃ＝１３９．５Åで、非対称単位（ＡＳＵ）中に７個のＲＡＮＫＬモノマーを含有する単純菱面体結晶（空間群３）；ならびに典型的サイズ０．３ｍｍ×０．３ｍｍ×０．４ｍｍに成長し、単位セル寸法ａ＝６５．３Å×ｂ＝８２．０Å×およびｃ＝９９．５Åで、ＡＳＵ中に３ＲＡＮＫＬモノマーを含有する単純斜方結晶（空間群Ｐ２１２１２１）。結晶を２０％グリセロール中で凍結保護し、液体Ｎ２中でフラッシュ冷却した。菱面体結晶に関して３．０Å分解能に対する完全データを、また斜方結晶に関しては２．６Å分解能データを、ＹａｌｅミラーおよびＲ−ＡｘｉｓＩＶ検出器を装備し、ＣｕＫα線を用いるＲｉｇａｋｕ回転アノード発生器を用いて、振動法（１．５°）により、収集した。データセットを、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いて処理した。
【０１６３】
（構造決定および精密化）
最初に、ＴＮＦβ（ＰＤＢコード１ＴＮＲ）およびＴＲＡＩＬ（ＰＤＢコード１Ｄ４Ｖ）座標から構築されたモデルを用いて分子置換により、ＲＡＮＫＬ構造を決定した。インサイトＩＩプログラムモジュールＨｏｍｏｌｏｇｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いる分岐領域の欠失およびＲＡＮＫＬ配列の組み入れにより、これらの構造をキメラ探索モデル中に併合した。ＡＭＯＲＥ（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：５８１−５９１（１９９７））を用いた翻訳機能探索により、菱面体結晶のＡＳＵ中に７個のＲＡＮＫＬモノマーが生じ、結晶学的な３回対称軸上に存在する第７モノマーを有する２つのトリマーとして整列された。データセットに対するキメラモデルの剛体精密化により、２０〜４Åの分解能のすべてのデータに関して４６％のＲ因子が得られた。初期ＲＡＮＫＬモデルを、３Å分解能で算定した７倍平均電子密度マップに作り上げた。プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ．４７：１１０−１１９（１９９１））を用いて、複合体２ＦｏＦｃ省略マップへのモデル構築を実行した。ＣＮＳ（３３）を用いて、厳密且つ制限されたＮＣＳオペレーターを用いたモデルの構築および精密化を何度も繰り返して実行した。菱面体結晶座標での分子置換により、斜方晶系ＲＡＮＫＬに関する位相を得た。翻訳機能をすべての可能な単純斜方晶系鏡像体で実行し、最高シグナルは空間群Ｐ２１２１２１で明瞭に認められた。ＡＳＵ中に存在する３つのモノマーの剛体精密化は、２０〜４Åの分解能データに関して３７％のＲ因子を生じた。モデル構築は、非結晶学的３回平均化（ｔｈｒｅｅ−ｆｏｌｄ  ａｖｅｒａｇｉｎｇ）を用いて算定したマップ上で開始し、原子精密化は、各モノマーの構造的分岐ループ領域を除いて、制限ＮＣＳオペレーターを用いて実行した。
【０１６４】
（構造解析）
ＮＡＣＣＥＳＳｖ２．１．１を用いて、原子的接触可能領域を算定した（Ｈｕｂｂａｒｄ，Ｓ．Ｊ．＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｌｏｎｄｏｎ）。要するに、溶媒接触可能表面積を算定するために、半径１．４Åプローブを、ＲＡＮＫＬおよびその他のＴＮＦファミリーサイトカイン構造のファンデルワールス表面に転がした。ＨＢＰＬＵＳｖ３．０（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｉ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３８：７７７−７９３（１９９４））を用いて、隣接物相互作用および水素結合の幾何学的配置を評価した。
【０１６５】
（突然変異誘発）
ポリメラーゼ連鎖反応により、ネズミＲＡＮＫＬの部位特異的突然変異誘発を実施した。上記のように大腸菌中で突然変異化ＲＡＮＫＬ構築物を発現させて、核酸配列決定および質量分光測定により同一性を確証した。ホモ三量体化は、サイズ排除クロマトグラフィーでの移動により示されるように、適正タンパク質のフォールディングおよびアセンブリーに関する証拠とみなした。カブトガニ・アメボサイト・ライセート（ＬＡＬ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）により、内毒素夾雑の欠如を確証した。
【０１６６】
（細胞培養）
ネズミ破骨細胞前駆体の純粋集団を、Ｌａｍ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１４８１−１４８８（２０００）に記載された骨髄から単離した。１０％ウシ胎仔血清を含有するα−ＭＥＭ中で、細胞を培養し、１０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）および種々の濃度のＲＡＮＫＬを添加して、破骨細胞分化を誘導した。６％ＣＯ２を含有する湿潤大気中で３７℃で細胞をインキュベートし、新しい培地およびサイトカインを毎日補充した。培養５日目〜９日目の間に、典型的な成熟破骨細胞形成を観察した。
【０１６７】
（細胞化学）
破骨細胞形成を、Ｂｕｒｓｔｏｎｅ（Ｂｕｒｓｔｏｎｅ，Ｍ．Ｓ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２０：６０１−６０６（１９５８））の方法により、組織化学的に同定した。要するに、細胞性酸性ホスファターゼ活性を用いて、０．０５Ｍの酒石酸ナトリウムの存在下で、色素生成基質としてナフトールＡＳ−Ｂｌホスフェートを切断した。１０ｍＭの酒石酸ナトリウム、ｐＨ４．５の存在下で、比色基質として５．５ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェートの添加により、酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性の定量を行った。反応生成物を、４０５ｎｍの吸光度の分光分析的測定により定量した。
【０１６８】
（構造決定）
大腸菌中で組換え的に発現されるネズミＲＡＮＫＬの生物学的活性細胞外ドメイン（残基１５８〜３１６、ＱＰＦＡ．．．ＱＤＩＤ）は、２形態で結晶化する：結晶学的な３回対称軸上に置かれる第７モノマーを有する２つのトリマーとして整列されたＡＳＵ中に７個のモノマーを含有する菱面体結晶；およびＡＳＵ中に単一のＲＡＮＫＬトリマーを含有する斜方結晶。これらの回析性結晶は、まとめて、ＲＡＮＫＬモノマーの８個の個々の図を提供する。ＲＡＮＫＬの構造は、分子置換により段階的に変化され、２．６Åの分解能に精密化された。いくつかの可動性ループ領域を除いて、全ＲＡＮＫＬ細胞外ドメイン、アミノ末端のマイナス残基１５８〜１６１は、最終結晶構造中に整列される（結晶学的Ｒ因子２３．５％およびＲｆｒｅｅ２８．０％、図１）。
【０１６９】
（ＲＡＮＫＬトリマー）
ＲＡＮＫＬのコアβ鎖は、ＴＮＦファミリーサイトカインの特徴である襞を採用する。各ＲＡＮＫＬモノマーは、２つの平坦な逆平行β襞状シートで構成されるβ−サンドイッチからなる。第１のシートはβ鎖Ａ、Ｈ、ＣおよびＦにより形成され、第２のシートはβ鎖Ｂ、Ｇ、ＤおよびＥにより形成される（図２Ａ〜図２Ｄ、図３）。内部ＡＨＣＦβシートはサブユニット間会合に関与し、ＢＧＤＥβシートは外表面に主に寄与する。ＲＡＮＫＬモノマーは、３回対称軸に沿って自己会合する。トリマー複合体は、遠位尖端より幅広の膜近位基部を有する切頭ピラミッドとして最もよく説明されている。ＲＡＮＫＬトリマーは高さ５５Åであって、およその直径は、基部で５５Å、尖端で３５Åである。ホモトリマーは、各ＲＡＮＫＬモノマー、鎖ＥおよびＦにおけるβサンドイッチの一縁が近隣モノマーのＡＨＣＦβシートの内部疎水性面に寄るよう、アセンブルされる（図２Ａ、図２Ｃ）。従って、ＲＡＮＫＬホモトリマーのトリマー界面は縁−面相互作用のプラットホームからなる。側面から見て、各モノマーは回転軸を中心としてわずかに左寄りにねじれる（図２Ａ、図２Ｂ）。各ＲＡＮＫＬモノマーのアミノ酸組成は同一であるが、トリマーは結晶学的対称により位相幾何学的に等しくない。
【０１７０】
ＲＡＮＫＬモノマーは、三量体化時に約６０９９．５Å２の溶媒接触可能表面を包み隠す（ｂｕｒｙ）（モノマーＸに関しては２０４２．１Å２、Ｙに関しては２０４３．２Å２およびＺに関しては２０１４．２Å２）が、その他のＴＮＦファミリーサイトカインは、ＴＲＡＩＬに関しては６５９１．３Å２、ＣＤ４０Ｌに関しては５６７０．６Å２、ＴＮＦαに関しては５６００．８Å２、ＴＮＦβに関しては５８２６．９Å２およびＡＣＲＰ３０に関しては５１３０．０Å２である。三量体界面は、各モノマーの溶媒接触可能表面の約２６％を構成する。ＲＡＮＫＬは、その他のＴＮＦファミリーメンバーとのヘテロトリマーを形成しない。この相互作用の選択性は、配列特異的サブユニット間水素結合の影響を受ける。各ＲＡＮＫＬ分子は、４３のこのような埋没極性相互作用を含有するが、典型的なＴＮＦファミリーサイトカインは、１つの分子につき平均２６のサブユニット間水素結合を保有する。疎水性相互作用は特異性を引き起こさないが、自己会合のための主な駆動力となる。ＲＡＮＫＬモノマー三量体化に関与する残基のうち、４０％が疎水性である（図３）。サブユニット間相互作用に加わるアミノ酸残基のほとんどすべてが１０個の高保存鎖内に存在して、構造的に多様な表面ループを受容体−リガンド相互作用に利用可能にさせる（図３）。
【０１７１】
ＲＡＮＫＬの溶媒接近可能表面ループはＴＮＦファミリー内で独特であって、顕著に多様な長さおよび立体配座を示す：ＡＡ”ループ（残基１７０〜１９３）は、β鎖ＡおよびＡ”、ＣＤループ（残基２２４〜２３３）、ＤＥループ（残基２４５〜２５１）ならびにＥＦループ（残基２６１〜２６９）を架橋する。特に、ＲＡＮＫＬは、典型的なＴＮＦファミリーメンバーより長いＡＡ”ループおよび短いＥＦループを保有する。この多様化は、ＴＮＦおよびＴＲＡＩＬの構造の上にＲＡＮＫＬの構造を重ね合わせることにより、最も良く理解される（図２Ｅ）。ＴＮＦコアフォールドを構成する内部β鎖は、ほぼ同一の位相幾何学を示すが、これらの鎖を相互に連結するループは、重ね合わせることができない。ＲＡＮＫＬのβ鎖コアの代表的電子密度を図２Ｆに示す。
【０１７２】
（受容体結合部位）
ＲＡＮＫＬに対する２つの受容体、すなわちＲＡＮＫおよびＯＰＧは、ＴＮＦＲファミリーに属する。ＴＮＦファミリー受容体−リガンド複合体に関する２つの既知の結晶構造に基づいて、ＴＮＦファミリーサイトカインは、ホモトリマーの隣接モノマーにより形成される３つの溝のそれぞれに沿って、１つの延長受容体分子を結合する、ということが認められる。これらのサブユニット間溝は、３回対称軸に沿って下方に見えると理解され得る（図２Ｃ、図２Ｄ）。この斜視図から、溝は、ＲＡＮＫＬホモトリマーの２つの隣接モノマーにより形成され、従って受容体結合のためにはリガンドホモ三量体化が必要とされる、ということが明らかである。このように、ＲＡＮＫＬトリマーは３つの空間的に異なってはいるが等価の受容体結合領域を示す。ＲＡＮＫＬの構造的に独特なＡＡ”、ＣＤ、ＤＥおよびＥＦループの部分は、受容体結合溝の側面を裏打ちする（図２Ｃ）。多数の天然に存在する、および合成のＴＮＦファミリーサイトカイン改変体は、これらのループの突然変異に起因する受容結合に際しての親和性変更を示す（図３）が、これは、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ５複合体（Ｈｙｍｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｇ．ら、５．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．４：５６３−５７１（１９９９）、Ｍｏｎｇｋｏｌｓａｐａｙａ，Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：１０４８−１０５３（１９９９）、Ｃｈａ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３１１７１−３１１７７（２０００））、およびＴＮＦβ−ＴＮＦＲ複合体（Ｂａｎｎｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｃｅｌｌ．７３：４３１−４４５（１９９３））の結晶構造中で受容体分子と直接接触することが実証されている。
【０１７３】
それらの受容体との複合体中のＴＮＦファミリーサイトカインの２つの結晶構造、すなわちＴＲＡＩＬ−ＤＲ５およびＴＮＦβＴＮＦＲが報告されている。これらの構造は、その他のＴＮＦファミリーメンバーの受容体−リガンド相互作用をモデリングするための枠組みを提供する。ＤＲ５およびＴＮＦＲは、１３０個の非システイン細胞外残基のうち１６個を共有するに過ぎないが、それらのリガンド結合ドメインは、それらのそれぞれの複合体中でほぼ等価の位置を占める。ＤＲ５リガンド結合ドメインのＣα痕跡をＴＮＦＲのものの上に重ね合わせると、０．７Åのみの二乗平均偏差（ｒｍｓｄ）を生じる。従って、これらの複合体中のリガンドの代わりにＲＡＮＫＬを重ね合わせると、ＲＡＮＫＬ上の界面残基の合理的予測が可能になると思われる。このような分析を用いて、ＤＲ５またはＴＮＦＲの４Å以内に置かれたＲＡＮＫＬの残基を同定した（図３および図４Ａ〜図４Ｃ）。これらの受容体のリガンド結合ドメイン中の顕著な構造的一致のために、これらの残基がＲＡＮＫおよびＯＰＧに関する界面残基として同様に機能し得る、ということは合理的推測である。ＤＲ５およびＴＮＦＲ接触物（ｃｏｎｔａｃｔｓ）の両方がＲＡＮＫＬの表面にマッピングされる場合、両受容体に関する予測接触部位（図４Ｄ）がＲＡＮＫＬの構造的に独特の要素を包含する、ということは明らかである。さらに、配列保存もＲＡＮＫＬの表面にマッピングされる場合、両受容体（図４Ｄの黄色陰影部）により用いられる受容体接触パッチの一部がファミリー全体（図４Ｅの白色陰影部）に保存されるわけではない、と理解され得る。この観察は、ＴＮＦファミリーサイトカインとそれらの受容体との間で起こることが既知である高特異的認識とよく合致する。
【０１７４】
（構造ベースの突然変異誘発）
既知のＴＮＦ−ＴＮＦＲ構造との比較は、ＲＡＮＫＬがその独特の溶媒接触可能ループを介してその受容体を結合し得る、ということを示唆する。本発明者らは、構造ベースの突然変異誘発実験を実施することにより、これらの予測の生物学的関連性を調べた。ＲＡＮＫＬの生物学的機能に影響を及ぼす３つの突然変異：ＡｓｐでＩｌｅ２４８を置換する、ＤＥループにおける単一アミノ酸置換（Ｉ２４８Ｄ）；Ｇｌｙ１７７からＬｅｕ１８３のＡＡ”ループの欠失（ＡＡ”ループ欠失）；およびＲＡＮＫＬ（１７７〜１８３）のＡＡ”ループのＴＮＦのＡ”ループでの置換（ＡＡ”ループ交換）を生成した（図５Ａ）。ＡＡ”ループ欠失およびループ交換変異体を保有するＲＡＮＫＬは、破骨細胞前駆体がインビトロで分化するよう誘導できないが、Ｉ２４８Ｄ置換変異体は、ネイティブＲＡＮＫＬと比較して、効力が８分の１に低減することが示される（図５Ｂ）。さらに、Ｉ２４８Ｄ  ＲＡＮＫＬにより誘導された破骨細胞は、機能障害性形態、すなわち典型的にはネイティブＲＡＮＫＬにより誘導された多核化良好伝播性（ｗｅｌｌ−ｓｐｒｅａｄ）破骨細胞と比較して、単核性および小サイズを示す（図５Ｃ）。従って、ＲＡＮＫＬのＡＡ”ループ欠失およびＡＡ”ループ交換変異体は、ＲＡＮＫを介した細胞分化を誘導することができない。これに対比して、構築物Ｉ２４８Ｄは、ＲＡＮＫを活性化するが、ネイティブＲＡＮＫＬの濃度の８倍で投与された場合にのみ匹敵するレベルの細胞分化を誘導する、新規の形態のＲＡＮＫＬを示す。
【０１７５】
本発明のその他の特徴、目的および利点は当業者には明らかである。本明細書中に示した説明および例証は、本発明、その原理およびその実際的用途を当業者に熟知させるよう意図される。特定の使用の要件に最も適している場合、当業者は、多数の形態で本発明を適合および適用し得る。従って、記載されたような本発明の特定の実施形態は、本発明を網羅するものでも、限定するものでもない。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１は、マウスＲＡＮＫＬに関する結晶学データおよび精緻な統計学的数値である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＲＡＮＫＬトリマーの立体リボン図である。標準ＴＮＦβ−サンドイッチ一覧表に従って標識された１つのＲＡＮＫＬモノマーのβ鎖および連結ループに関して示す。その他の２つのＲＡＮＫＬモノマーは、２つの異なる陰影で現れる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＲＡＮＫＬトリマーの立体リボン図である。図２Ａと同一に配向されたこの図では、ＲＡＮＫＬ膜貫通柄が画像の上部に突出するが、膜遠位領域は底部に向く。ホモトリマーは、切頭ピラミッドの形状を示し、膜近位端でわずかに広い。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＲＡＮＫＬトリマーの立体リボン図である。前方に膜遠位面を配向された３回対称軸を見下ろしたＲＡＮＫＬトリマーのリボン図である。モノマーＸの二次構造は、図２Ａの場合と同様に標識される。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＲＡＮＫＬトリマーの立体リボン図である。３つの異なる陰影として現れているモノマーＸ、ＹおよびＺの分子表面に関して示したＲＡＮＫＬトリマーである。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＲＡＮＫＬトリマーの立体リボン図である。単一ＲＡＮＫＬモノマーとＴＮＦおよびＴＲＡＩＬのものとの比較。３つの構造すべてのβ鎖は同一陰影で現れるが、連結ループは異なる陰影で現れる：最も明るいのはＲＡＮＫＬ、中等度の明度はＴＮＦ（ｐｄｂコード１ｔｎｒ）、最も暗いのはＴＲＡＩＬ（ｐｄｂコード１ｄ４ｖ）。これらのタンパク質の構造を重ね合わせた場合、ＲＡＮＫＬのβ鎖が、ＴＮＦおよびＴＲＡＩＬのものとほぼ同一に重なり合う。これに対比して、ＲＡＮＫＬのＡＡ”、ＣＤ、ＥＦおよびＤＥループは、ＴＮＦファミリーサイトカインのものと比較した場合、独自の位相幾何学を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＲＡＮＫＬトリマーの立体リボン図である。ＲＡＮＫＬモノマーのＥ−Ｄ−Ｇβ鎖の電子密度である。図２Ｅと同様の配向で、ＲＡＮＫＬモノマーの溶媒接触可能表面から見た構造である。異なる陰影で示されているのは、２．６Å合成省略マップ（１．２で輪郭を描く）であり、ＲＡＮＫＬ構造は炭素、酸素、窒素および硫黄を示す。
【図３】図３は、ＲＡＮＫＬを伴うＴＮＦファミリーサイトカインの構造ベースアラインメントである。ＴＮＦファミリーサイトカインＴＲＡＩＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦα、ＴＮＦβおよびＡＣＲＰ３０の細胞外コアドメインの配列を、マウスＲＡＮＫＬの配列と並べて示す。ＲＡＮＫＬに対する構造アラインメントは、ＲＡＮＫＬの結晶構造の、ＴＲＡＩＬ（１ｄ４ｖ）、ＣＤ４０Ｌ（１ａ１ｙ）、ＴＮＦα（２ｔｎｆ）、ＴＮＦβ（１ｔｎｒ）およびＡＣＲＰ３０（１ｃ２８）の結晶構造との対をなす位相幾何学的な残基の重ね合わせに基づく。ＲＡＮＫＬに関する残基数および二次構造割り当てを配列上に示す。ＴＮＦファミリーβ−サンドイッチを構成する１０個のβ鎖を、中間陰影矢印（ｓｈａｄｅｄ  ａｒｒｏｗｓ）として、標準一覧表とともに示す。β鎖を連結する溶媒接触可能ループおよびコイル領域を、より暗い陰影線として示す。β鎖ＡおよびＡ”を連結するＡＡ”ループ（明るい陰影線）は、Ａ”β鎖を包含する。残基上の暗い陰影三角は、ＲＡＮＫＬのトリマー界面に関与するものを示す。ファミリーメンバー間の構造的に等価な位置での相同の程度を、配列下の着色円で示す：０〜５０％保存（円なし）、５０〜９０％（明色）、＞９０％（暗色）。四角で囲んだＴＲＡＩＬ残基は、ＴＲＡＩＬ上のＤＲ５受容体接触部位を意味する。四角で囲んだＴＮＦ残基は、ＴＮＦ上のＴＮＦ受容体接触部位を指す。ＴＲＡＩＬ：ＤＲ５およびＴＮＦ：ＴＮＦＲ共結晶構造中のリガンドの代わりにＲＡＮＫＬを置換することにより、ＲＡＮＫＬ上のこれらの受容体の両方に関する考え得る接触部位を算定した。ＲＡＮＫＬの四角で囲んだ残基は、ドッキング分析中にＤＲ５（中間陰影）、ＴＮＦＲ（暗陰影）または両方の（明陰影）受容体と物理的に接触すると算定されたものを示す。ＲＡＮＫＬに独特である構造要素は、溶媒接触可能ＡＡ”、ＣＤ、ＤＥおよびＥＦループ中に集まっている。
【図４Ａ】図４Ａは、ＲＡＮＫＬの受容体領域である。その受容体ＲＡＮＫ（ここでは、非常に明るい４つのシステインリッチドメインとして描かれている）とドッキングしたＲＡＮＫＬトリマー（明、中間、暗陰影モノマー）の模式図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＲＡＮＫＬの受容体領域である。図４Ａと同様に配向され、Ｔｒａｉｌ受容体であるＤＲ５のモノマー（明陰影Ｃ骨格ワーム）とドッキングしたＲＡＮＫＬトリマーの表面図である。ＤＲ５をかみ合わせるために算定したＲＡＮＫＬの表面の面積は、図３における配列上と同様に、中間陰影で現れる。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＲＡＮＫＬの受容体領域。ＴＮＦ受容体のモノマー（明陰影Ｃ骨格ワーム）とドッキングしたＲＡＮＫＬトリマーの表面図である。ＴＮＦＲをかみ合わせるために算定したＲＡＮＫＬの表面の面積は、中間陰影で現れる。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＲＡＮＫＬの受容体領域である。ＲＡＮＫＬの表面のＤＲ５（中間陰影）およびＴＮＦＲ（暗陰影）接触部位の比較である。両受容体と接触する重複領域は明陰影で示されている。
【図４Ｅ】図４Ｅは、ＲＡＮＫＬの受容体領域である。表面にマッピングされた保存度を有するＲＡＮＫＬトリマーの表面図である。保存度は、色の濃度に正比例する（明＝保存なし、暗＝保存化）。両受容体と接触する部分は、サイトカインのこのファミリー全体でほとんどまたはまったく配列保存がないことを示す（明陰影）。これらの独特の領域は、このサイトカインファミリーにおける受容体およびリガンド間の交差反応性の欠如の基礎を成す受容体−リガンド認識に対する特異性を提供する。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＲＡＮＫＬの受容体領域である。構造ベースの突然変異誘発に関して標的化されたＲＡＮＫＬの潜在的受容体接触面積は暗陰影で現れる。
【図５Ａ】図５Ａは、ＲＡＮＫＬの構造ベースの突然変異誘発である。ＡＡ”ループ欠失およびＡＡ”ループ交換変異体を示すＡＡ”ループのリボン図である。ＡＡ”ループ欠失に関しては、ＳＧＳＨＫＶＴＬＳＳは、暗陰影で現れる断片（ＧＳＨＫＶＴＬ）の除去により、ＳＳＳに突然変異された。ＡＡ”ループ交換変異体に関しては、ＳＧＳＨＫＶＴＬＳＳは、明および暗陰影で描かれた断片をＴＮＦからの類似の断片で交換することにより、ＳＬＬに突然変異された。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＲＡＮＫＬの構造ベースの突然変異誘発である。ＲＡＮＫＬのネイティブおよび変異体形態に関する用量応答曲線（黒四角−ネイティブＲＡＮＫＬ；黒丸−Ｉ１２８Ｄ点置換；黒三角−ＡＡ”ループ欠失；白三角−ＡＡ”ループ交換）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ破骨細胞形成に関してプロットする。ネイティブＲＡＮＫＬのＥＤ５０は約１２ｎｇ／ｍｌで、これに比してＩ１２８ＤＲＡＮＫＬは約１００ｎｇ／ｍｌである。ＡＡ”ループ欠失およびＡＡ”ループ交換変異体は、任意の投与量で検出可能な破骨細胞形成を誘導できなかった。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＲＡＮＫＬの構造ベースの突然変異誘発である。種々の形態のＲＡＮＫＬへの曝露後７日目の同一倍率での破骨細胞形成培養を示す。破骨細胞特異的な酒石酸塩耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性（暗陰影反応産物）に関して、培養を染色した。ネイティブＲＡＮＫＬは大型の多核化ＴＲＡＰ発現破骨細胞の形成を誘導する。Ｉ１２８ＤＲＡＮＫＬは、破骨細胞の特徴的形態を欠くＴＲＡＰ陽性細胞を生成し、大多数の細胞は多核性を示した。ＡＡ“ループ欠失およびループ交換変異体は、破骨細胞形成経路に沿って分化を誘導できない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年7月13日(2005.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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