(57)【要約】本出願は、潜在的薬物ターゲットを同定及びバリデートする方法を提供するものである。ある局面では、本出願は、関連するタンパク質又は核酸配列のデータベースを、前記配列の潜在的疾患関連性のアノテーションと共に作製する体系的方法や、生物検定を用いて前記潜在的疾患関連性を検査し、目的の配列の発現を減少させるか、又は、目的の配列の発現を増加させることにより、前記疾患関連性をバリデートする方法を、提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸又はタンパク質配列を含むデータベースを提供するステップであって、前記配列が、前記配列の潜在的疾患関連性についてアノテートされる、ステップと、
前記配列のいずれか１つに潜在的に関連する疾患の疾患特徴を測定する検定を提供するステップと、
前記データベース内に提供された核酸又はタンパク質配列の少なくとも１つの発現又は活性を減少させるステップと、
前記発現又は活性の減少の結果、前記検定の変化が起きるかどうかを判定するステップであって、前記検定の変化が、前記核酸又はタンパク質配列が、前記関連疾患の潜在的薬物ターゲットであることの指標となる、ステップと
を含む、潜在的薬物ターゲットを同定する方法。
【請求項２】
核酸又はタンパク質配列を含むデータベースを提供するステップであって、前記配列が、前記配列の潜在的疾患関連性についてアノテートされる、ステップと、
前記配列のいずれか１つに潜在的に関連する疾患の疾患特徴を測定する検定を提供するステップと、
前記データベース内に提供された核酸又はタンパク質配列の少なくとも１つの発現又は活性を増加させるステップと、
前記発現又は活性の増加の結果、前記検定の変化が起きるかどうかを判定するステップであって、前記検定の変化が、前記核酸又はタンパク質配列が、前記関連疾患の潜在的薬物ターゲットであることの指標となる、ステップと
を含む、潜在的薬物ターゲットを同定する方法。
【請求項３】
核酸又はタンパク質配列を含むデータベースを提供するステップであって、前記配列が、前記配列の潜在的疾患関連性についてアノテートされる、ステップと、
潜在的関連疾患の疾患特徴を示す細胞と、対応する正常細胞とにおける前記核酸又はタンパク質配列の示差的発現又は活性を判定するステップと、
前記核酸又はタンパク質配列の発現又は活性を減少させるステップと、
前記発現又は活性の減少が、前記関連疾患の疾患特徴を示す前記細胞に及ぼす影響を判定するステップであって、前記疾患特徴の変化が、前記核酸又はタンパク質配列が、前記関連疾患の潜在的薬物ターゲットであることの指標となる、ステップと
を含む、潜在的薬物ターゲットを同定する方法。
【請求項４】
核酸又はタンパク質配列を含むデータベースを提供するステップであって、前記配列が、前記配列の潜在的疾患関連性についてアノテートされる、ステップと、
潜在的関連疾患の疾患特徴を示す細胞と、対応する正常細胞とにおける前記核酸又はタンパク質配列の示差的発現を判定するステップと、
前記核酸又はタンパク質配列の発現又は活性を増加させるステップと、
前記発現又は活性の増加が、前記関連疾患の疾患特徴を示す前記細胞に及ぼす影響を判定するステップであって、前記疾患特徴の変化が、前記核酸又はタンパク質配列が、前記関連疾患の潜在的薬物ターゲットであることの指標となる、ステップと
を含む、潜在的薬物ターゲットを同定する方法。
【請求項５】
前記データベースを作製するステップをさらに含む、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記データベースが、ドメイン解析を選択的に含む、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
データベースを作製する前記ステップが、
タンパク質又は核酸に対応する第一組の情報を受け取るステップと、
前記核酸又はタンパク質の特徴を特定する第二組の情報を受け取るステップと、
クラスタ化解析を行って、前記タンパク質又は核酸がどのように、前記第一及び第二組の情報に基づいてクラスタ化されるべきかを判定するステップと
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記第一組の情報が、配列情報及び／又は構造情報を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第二組の情報が、ドメイン情報を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二組の情報が、Hect、Ring、Ubox、Fbox及びPHDから成る群より選択される一つ以上のドメインの有無を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸又はタンパク質配列がヒトE3配列である、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記潜在的疾患関連性が、ウィルス性疾患、増殖性異常、及びユビキチン媒介性異常から成る群より選択される、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
前記検定で、関連疾患の疾患特徴が判定される、請求項１乃至２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患特徴が、前記タンパク質が相互作用性タンパク質と相互作用するかどうかを判定することにより評価され、そして前記相互作用性タンパク質が、前記疾患特徴では異常な分解を起こす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患特徴が、前記タンパク質の細胞内局在化を判定することにより評価される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患特徴が、前記タンパク質の生物活性を判定することにより評価される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記タンパク質がE3タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患特徴が、前記E3タンパク質の生物活性を判定することにより評価される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物活性が、前記E3タンパク質のリガーゼ活性である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記E3が、前記疾患特徴でユビキチン化される基質と相互作用するかどうかを判定することにより、前記疾患特徴が評価される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記関連疾患がレトロウィルス感染である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記レトロウィルス感染がHIV感染である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記検定が、感染細胞からのウィルス様粒子（VLP）の放出を判定するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
E3タンパク質の発現又は活性を減少させると、前記VLPの放出が変化する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記E3タンパク質がWWドメインを含有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記E3タンパク質がHECTドメインを含有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記E3タンパク質がSH3ドメインを含有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記E3タンパク質がRINGドメインを含有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸配列の発現を、RNAiを用いて減少させる、請求項１又は３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸配列の発現を、アンチセンス・オリゴヌクレオチド・コンストラクトを用いて減少させる、請求項１又は３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸配列の発現を、リボザイムを用いて減少させる、請求項１又は３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸配列の発現を、DNA酵素を用いて減少させる、請求項１又は３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質がE3タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項３４】
前記E3の発現減少が、疾患特徴の指標である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記E3が腫瘍抑制物質であり、前記疾患特徴が腫瘍発生である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記E3タンパク質の発現又は活性を増加させると、機能亢進表現型となる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記E3が潜在的薬物ターゲットである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記E3の基質も潜在的薬物ターゲットである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記データベースへのアクセスが、加入者に提供される、請求項５に記載の方法。
【請求項４０】
検査配列が潜在的薬物ターゲットであるかどうかを判定する方法であって、
核酸又はタンパク質配列を含むデータベースを提供するステップであって、前記配列が、前記配列の潜在的疾患関連性についてアノテートされる、ステップと、
前記検査配列を、前記データベース内に提供された配列と比較して、潜在的疾患関連性を予測するステップと、
前記核酸又はタンパク質配列の活性を減少させることにより、前記予測された疾患関連性をバリデートするステップと、
前記検査配列及び関連するアノテーションを含むように、前記データベースを更新するステップと
を含む方法。
【請求項４１】
（ａ）ウィルス感染を治療するためのE3薬物ターゲットを提供するステップと、
（ｂ）リボザイムを投与して、感染細胞における前記E3の発現を減少させるステップと、
（ｃ）前記感染細胞からのウィルス様粒子の放出を判定するステップであって、ウィルス様粒子の放出の減少は、前記リボザイムが、前記ウィルス感染を治療するための治療的リボザイムであることの指標となる、ステップと
を含む、ウィルス感染を治療するための治療的リボザイムを同定する方法。
【請求項４２】
（ａ）癌を治療するためのE3薬物ターゲットを提供するステップと、
（ｂ）リボザイムを投与して、腫瘍細胞における前記E3の発現を減少させるステップと、
（ｃ）前記腫瘍細胞の増殖速度を判定するステップであって、増殖速度の減少は、前記リボザイムが、前記増殖性疾患を治療するための治療的リボザイムであることの指標となる、ステップと
を含む、癌を治療するための治療的リボザイムを同定する方法。
【請求項４３】
（ａ）ウィルス感染を治療するためのE3薬物ターゲットを提供するステップと、
（ｂ）RNAiコンストラクトを投与して、感染細胞における前記E3の発現を減少させるステップと、
（ｃ）前記感染細胞からのウィルス様粒子の放出を判定するステップであって、ウィルス様粒子の放出の減少は、前記RNAiコンストラクトが、前記ウィルス感染を治療するための治療的RNAiコンストラクトであることの指標となる、ステップと
を含む、ウィルス感染を治療するための治療的RNAiコンストラクトを同定する方法。
【請求項４２】
（ａ）癌を治療するためのE3薬物ターゲットを提供するステップと、
（ｂ）RNAiコンストラクトを投与して、腫瘍細胞における前記E3の発現を減少させるステップと、
（ｃ）前記腫瘍細胞の増殖速度を判定するステップであって、増殖速度の減少は、前記RNAiコンストラクトが、前記増殖性疾患を治療するための治療的リボザイムであることの指標となる、ステップと
を含む、癌を治療するための治療的RNAiコンストラクトを同定する方法。
【請求項４３】
E3タンパク質を選択するステップと、
ウィルス感染細胞における前記E3タンパク質の発現又は活性を減少させるステップと、
前記E3の発現又は活性を減少させたときのウィルス様粒子の放出を判定するステップであって、ウィルス様粒子の放出の減少は、前記E3タンパク質が潜在的薬物ターゲットであることの指標となる、ステップと
を含む、潜在的薬物ターゲットとしてのE3タンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項４４】
タンパク質又は核酸に対応する第一組の情報を受け取るステップと、
前記核酸又はタンパク質配列の特徴を特定する第二組の情報を受け取るステップと、
クラスタ化解析を行って、前記タンパク質又は核酸配列がどのように、前記第一及び第二組の情報に基づいてクラスタ化されるべきかを判定するステップと
を含む、E3タンパク質又は核酸のデータベースを作製する方法。
【請求項４５】
前記第一組の情報が、配列情報及び／又は構造情報を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第二組の情報がドメイン情報を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記第二組の情報が、Hect、Ring、Ubox、Fbox及びPHDから成る群より選択される一つ以上のドメインの有無を示す、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
Hect、Ring、Ubox、Fbox及びPHDから成る群より選択される１つ異常のドメインを含むすべてのタンパク質及び核酸配列が、前記データベース内に含まれる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記タンパク質及び核酸配列が、前記ドメインの有無に基づいてさらにクラスタ化される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記タンパク質及び核酸配列が、特定の疾患関連性に基づいてさらにクラスタ化される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記タンパク質及び核酸配列が、相互作用性モチーフの有無に基づいてさらにクラスタ化される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記タンパク質及び核酸配列が、以下：相同性モデリング、二次構造、スレディング、膜貫通ヘリックス、シグナル・ペプチド・ドメイン、及びタンパク質局在化シグナル、のうちの一つ以上に基づいてさらにクラスタ化される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記E3配列が潜在的薬物ターゲットとして評価される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記E3配列が、疾患関連性を検査するための生物学的検定によりスクリーニングされる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
タンパク質又は核酸に対応する第一組の情報を受け取るステップと、
前記核酸又はタンパク質配列の特徴を特定する第二組の情報を受け取るステップと、
クラスタ化解析を行って、前記タンパク質又は核酸配列がどのように、前記第一及び第二組の情報に基づいてクラスタ化されるべきかを判定するステップと
を含む、RINGドメインを含有するタンパク質又は核酸配列のデータベースを作製する方法。
【請求項５６】
１つ以上のRINGドメインを含む全タンパク質及び核酸配列が前記データベース内に含まれる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
E3タンパク質を選択するステップと、
腫瘍細胞における前記E3タンパク質の発現又は活性を減少させるステップと、
前記E3の発現又は活性を減少させたときの前記腫瘍細胞の増殖速度を判定するステップであって、増殖速度の減少は、前記E3タンパク質が潜在的薬物ターゲットであることの指標となる、ステップと
を含む、潜在的薬物ターゲットとしてのE3タンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項５８】
E3タンパク質を選択するステップと、
罹患細胞における前記E3タンパク質の発現又は活性を減少させるステップと、
前記E3の発現又は活性の減少が、ユビキチン媒介性異常に及ぼす影響を判定するステップであって、変化があれば、前記E3タンパク質が潜在的薬物ターゲットであることの指標となる、ステップと
を含む、潜在的薬物ターゲットとしてのE3タンパク質をスクリーニングする方法。
【請求項５９】
発現又は活性を、ドミナント・ネガティブ変異型を用いて減少させる、請求項１又は３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６０】
発現又は活性を、低分子を用いて減少させる、請求項１又は３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６１】
（ａ）構造−機能解析を行って、疾患関連性に関与するドメイン情報及び／又は構造情報を判定するステップと、
（ｂ）核酸又はタンパク質配列を含むデータベースを提供するステップと、
（ｃ）疾患関連性に関係するドメイン及び／又は構造情報を含有する配列を選択するステップと、
（ｄ）前記疾患特徴を測定するための検定を提供するステップと
（ｅ）ステップ（ｃ）で選択された核酸又はタンパク質配列の発現又は活性を減少させるステップと、
（ｆ）前記発現又は活性の減少の結果、前記検定に変化が起きるかどうかを判定するステップであって、前記疾患特徴に変化があれば、潜在的薬物ターゲットの指標となる、ステップと
を含む、関連疾患のための潜在的薬物ターゲットを同定する方法。
【請求項６２】
（ａ）構造−機能解析を行って、疾患関連性に関与するドメイン情報及び／又は構造情報を判定するステップと、
（ｂ）核酸又はタンパク質配列を含むデータベースを提供するステップと、
（ｃ）疾患関連性に関係するドメイン及び／又は構造情報を含有する配列を選択するステップと、
（ｄ）前記疾患特徴を測定するための検定を提供するステップと
（ｅ）ステップ（ｃ）で選択された核酸又はタンパク質配列の発現又は活性を増加させるステップと、
（ｆ）前記発現又は活性の増加の結果、前記検定に変化が起きるかどうかを判定するステップであって、前記疾患特徴に変化があれば、潜在的薬物ターゲットの指標となる、ステップと
を含む、関連疾患のための潜在的薬物ターゲットを同定する方法。
【請求項６３】
前記タンパク質及び核酸配列がE3配列である、請求項６１又は請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記タンパク質及び核酸配列が、Hect、Ring、Ubox、Fbox及びPHDから成る群より選択される一つ以上のドメインを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記疾患関連性が、ウィルス性疾患、増殖性異常、及びユビキチン媒介性異常から成る群より選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記検定で、関連疾患の疾患特徴が判定される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患特徴が、前記タンパク質が相互作用性タンパク質と相互作用するかどうかを判定することにより評価され、そして前記相互作用性タンパク質が、前記疾患特徴では異常な分解を起こす、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記疾患特徴が、前記タンパク質の細胞内局在化を判定することにより評価される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患特徴が、前記疾患特徴でユビキチン化される基質と前記E3が相互作用するかどうかを判定することにより、評価される、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記核酸配列の発現を、RNAiコンストラクトを用いて減少させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項７１】
前記核酸配列の発現を、アンチセンス・オリゴヌクレオチド・コンストラクトを用いて減少させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項７２】
前記核酸配列の発現を、リボザイムを用いて減少させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項７３】
前記核酸配列の発現を、DNA酵素を用いて減少させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項７４】
前記タンパク質の活性を、ドミナント・ネガティブ変異型を用いて減少させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項７５】
発現又は活性を、低分子を用いて減少させる、請求項６１に記載の方法。
【請求項７６】
前記データベースが、少なくとも20、25、50、75、100、125、150、200、250、又は300個の配列を含む、請求項５、４４、又は５５のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、その明細書全文を引用をもってここに援用することとする、２００１年１１月１９日出願の米国仮出願６０／３３１，７０１号の出願日の優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
潜在的薬物ターゲットのバリデーションには、あるDNA、RNA又はタンパク質分子が疾患プロセスに関与しているかどうか、従って、新規な治療的薬物の開発の適したターゲットであるかどうか、を判断するステップが含まれる。生物活性のある化合物を同定し、特徴付けるプロセスである薬物発見は、ヒト疾患のための新規な治療法の開発において重要なステップである。薬物発見の展望はゲノム革命のために劇的に変化した。DNA及びタンパク質配列は、大量の新規薬物ターゲットや、膨大な量の関連情報を生んでいる。
【０００３】
これらのターゲットのうちどれが疾患に関与しており、その後の薬物開発に有用であるはずかを解き明かす作業には、体系的な手法だけでなくハイスループットのアプローチを開発することが、どのターゲットが、薬物発見プロセスにとって重要な疾患関連経路の一部であるかを判断するために必要である。
【０００４】
タンパク質量は、それらの合成速度と分解速度との間のバランスで決定される。ユビキチンが媒介するタンパク質分解は、細胞内タンパク質の選択的分解にとって主要な経路である。こうして、多種の細胞内ターゲットの選択的ユビキチン化により、例えば遺伝子発現、細胞周期、シグナル伝達、リボソームの生物発生、及びDNA修復といった必須な細胞機能が調節されている。ユビキチンの結合のもう一つの主な機能は、細胞内タンパク質ソーティングの調節である。ポリユビキチン化はタンパク質をプロテアソーム媒介性分解に方向付けるが、ユビキチン分子一個がタンパク質に結合（モノユビキチン化）すると、細胞表面受容体のエンドサイトーシス及びリソゾーム内へのソーティングが調節される。さらに、ユビキチン化はトランス−ゴルジ（TGN）でのタンパク質ソーティングも制御していることが実証されている。
【０００５】
基質タンパク質へのユビキチンの結合は、一般に、３つのクラスの付属酵素により連続反応で行われる。ユビキチン活性化酵素（E1）は、高エネルギのチオールエステル中間体を形成することで、ユビキチンを活性化する。E1によりユビキチンのＣ末端Glyが活性化すると、活性化したユビキチン結合酵素E2が、活性化チオールエステル型のユビキチン担体となり、三番目の酵素ユビキチンプロテインリガーゼE3へユビキチンが直接輸送される際に働く。E3ユビキチンプロテインリガーゼは、この結合プロセスの最終ステップを担い、その結果、ユビキチンの活性化Gly残基と、基質、又は既に結合体形成したユビキチン部分のLys残基のアルファ-NH基との間でイソペプチド結合が形成される。例えば Hochstrasser, M., Ubiquitin-Dependent Protein Degradation, Annu. Rev. Genet., 30:405 (1996)を参照されたい。
【０００６】
E3ユビキチンプロテインリガーゼは、ユビキチン化プロセスの最後の立て役者として、ユビキチン依存的蛋白質分解の標的特異性を担う。数多くのE3ユビキチン-プロテインリガーゼがこれまでに同定されてきた。例えばD'Andrea, A. D., et al., Nature Genetics, 18:97 (1998); Gonen, H., et al., Isolation, Characterization, and Purification of a Novel Ubiquitin-Protein Ligase, E3-Targeting of Protein Substrates via Multiple and Distinct Recognition Signals and Conjugating Enzymes, J. Biol. Chem., 271:302 (1996)を参照されたい。従って、E3酵素は潜在的な薬物ターゲットであり、本出願は、潜在的E3薬物ターゲットを同定及びバリデートする体系的方法を提供するものである。
【０００７】
概要
ある局面では、本出願は、関連するタンパク質又は核酸配列のデータベースを、当該配列の潜在的疾患関連性のアノテーションと共に作製する体系的な方法と；生物学的検定を利用して潜在的疾患関連性を検査し、この疾患関連性を、目的の配列の発現を減少させるか、又は、目的の配列の発現を増加させることにより、バリデートする方法と、を提供するものである。
【０００８】
ある局面では、本出願は、潜在的薬物ターゲットを検査し、バリデートする方法を提供するものである。ある局面では、本出願は、関連するタンパク質及び／又は核酸配列の包括的データベースを作製する方法を提供し、即ち該タンパク質及び核酸配列は、特定の配列情報、構造及び／又は機能情報に基づいて、該データベースに含まれている。ある局面では、本出願は、配列、構造上、機能上及び生物学的活性に基づいて分類された配列を提供する。さらに当該配列を、潜在的疾患関連性に基づいてクラスタ化させてもよく、例えば特定のドメインの有無が、そのタンパク質又は核酸配列の潜在的疾患相関を示す場合がある。さらに本データベースは、関連する疾患相関性を示すアノテーションを含む。
【０００９】
このようにクラスタ化した配列を、生物学的検定により、潜在的な関連疾患相関性について検査してもよい。例えば、関連疾患がウィルス感染である場合、その生物学的検定はウィルス様粒子の放出に関する検定であってもよい。当該疾患が増殖性疾患であれば、罹患細胞の増殖速度を判定する生物学的検定を行ってもよい。別の局面では、前記関連疾患はユビキチン媒介性以上であってよく、当該検定は、タンパク質分解、タンパク質輸送、又はタンパク質の細胞内局在化の一局面を判定するものでもよい。他の実施態様では、当該検定は、生物学的検定により、関連疾患の疾患特徴を判定するものでもよい。
【００１０】
別の局面では、本出願は、目的の配列の発現を減少させ、生物学的検定によりこのような減少の影響を判定することで、疾患関連性をバリデートする方法を提供するものである。ある実施態様では、当該関連疾患がウィルス感染である場合、目的の配列の発現減少が、ウィルス様粒子の放出に及ぼす影響を判定する。従って、目的の配列の発現が減少したことで、該ウィルス様粒子の放出が減少するのであれば、その配列はウィルス感染のための潜在的薬物ターゲットであろう。同様に、目的の配列の発現減少が、腫瘍細胞などの罹患細胞の増殖速度低下につながるのであれば、その配列は、増殖性異常のための潜在的薬物ターゲットであろう。従って、発現が減少したことで、関連疾患の何らかの疾患特徴に変化があれば、その配列は、関連疾患のための潜在的薬物ターゲットであろう。
【００１１】
別の実施態様では、本出願は、目的の配列の発現を増加させることにより疾患関連性をバリデートする方法を提供するものである。例えば、目的の配列が腫瘍抑制物質であれば、その配列の発現を増加させると、関連疾患の疾患特徴が変化するであろう。他の実施態様では、本出願は、E3タンパク質などの多種の酵素の基質などの付加的な薬物ターゲットを提供するものであり、この場合当該リガーゼの発現を増加させるか、又はその基質の発現を減少させると、当該関連疾患の疾患特徴が変化するであろう。例えば、腫瘍抑制物質であるフォン-ヒッペル-リンドーは特定のE3関連疾患に関連しているため、このフォン-ヒッペル-リンドー遺伝子の発現を増加させるか、又は、その基質の発現を減少させると、このE3関連疾患の少なくとも１つの疾患特徴が変化するであろう。従って、ある局面では、当該基質は、E3関連疾患のための潜在的薬物ターゲットである場合がある。
【００１２】
ある局面では、本発明は、ヒトE3核酸又はタンパク質配列を含むデータベースを提供するステップを含む、潜在的ヒトE3薬物ターゲットを同定する方法を提供する。これらの配列は、E3関連疾患特異的データベースを提供するそれらの構造上及び機能上の属性に基づいて分類されている。疾患に対するE3の潜在的関与は、以下：
1.  ユビキチンによるその修飾及び／又は異常な分解が、疾患／病的状態の原因であるようなタンパク質と相互作用しているかも知れないE3。
2.  E3のうちで、相互作用性タンパク質上の特異的ドメイン／モチーフと相互作用していると思われる特異的構造ドメイン及び又はモチーフを含有する潜在的E3が選抜されるであろう。
3.  その細胞局在化が、相互作用性タンパク質との相互作用の可能性を示すようなE3。
4.  疾患／病的状態と相関する独立したE3の異常な発現。
5.  疾患又は病的状態と関連する（変異又は調節異常を原因とする）E3の異常な活性
を含む基準により評価される。
【００１３】
E3配列が、それらの構造上の属性又はそれらのE3疾患関連性に基づいて分類されたら、本発明は、前記E3関連疾患の疾患特徴を測定する検定法を提供する。例えば、このような疾患特徴には、感染細胞や、非感染性ウィルスDNA（例えばHIV-VLP、VP40等）をコードする核酸配列を含有するプラスミドをトランスフェクトした細胞からのウィルス様粒子の放出を判定するステップ、E3関連疾患の少なくとも１つの症状を示す細胞に比較したときの、正常細胞における前記E3の示差的発現を判定するステップ、等が含まれる。E3関連疾患に関与する潜在的E3ターゲットを特定したら、前記E3の発現を変化させ、即ち増減させて、その発現変化が、検定の出力を変化させるかどうかを判定する。
【００１４】
別の局面では、本発明は、ヒトE3核酸又はタンパク質配列を含むデータベースや、E3関連疾患の疾患特徴を示す細胞と、対応する正常細胞とにおける前記ヒトE3の示差的発現の判定を提供するものである。こうして前記E3の発現を変化させて、E3関連疾患の疾患特徴を示す前記細胞に対する、E3発現減少の影響を判定するが、この場合、前記疾患特徴の変化は、前記ヒトE3が、前記E3関連疾患のための潜在的薬物ターゲットであることの指標となる。
【００１５】
潜在的E3薬物ターゲットの同定は、効果的な治療薬を検定する手段となる。
【００１６】
詳細な説明
定義
ここで用いられる場合の以下の用語及び文言は以下に記載した意味を有するものとする。他に定義しない限り、ここで用いられる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に通常理解されている意味と同じ意味を有する。
【００１７】
単数形「１つの（原語：a）」、「１つの（原語：an）」及び「その（原語：the）」には、本文が明白にそうでないと言明しない限り、複数形も含まれる。
【００１８】
文言、罹患細胞の「対応正常細胞」又は「対応する正常細胞」又は「正常な対応する細胞」とは、罹患細胞と同じ種類の正常細胞を言う。例えばBリンパ腫細胞の対応正常細胞はB細胞である。
【００１９】
例えばマイクロアレイなどのアレイの「アドレス」とは、オリゴヌクレオチドなどの要素をアレイの固体表面上に結合させた位置を言う。
【００２０】
ここで用いる用語「抗体」には、あらゆるアイソタイプ（IgG、IgA、IgM、IgE等）の抗体全体が包含されるものと意図されており、哺乳動物などの脊椎動物タンパク質に対して特異的反応性であるそのフラグメントも包含される。抗体は従来技術を用いてフラグメント化することができ、このフラグメントは、抗体全体に関して上述したのと同じ態様で実用性についてスクリーニングすることができる。このように、この用語には、特定のタンパク質と選択的に反応できる抗体分子のタンパク質分解開裂したもしくは組換えにより調製された部分のセグメントが包含される。このような蛋白分解及び／又は組換えフラグメントの非限定的な例には、Fab、F(ab')2、Fab'、Fv、及び、ペプチド・リンカで接合されたV［L］及び／又はV［H］ドメインを含有する一本鎖抗体(scFv)、 がある。複数のscFvを共有結合又は非共有結合により連結して、２つ以上の結合部位を有する抗体を形成してもよい。本発明は、ポリクローナル、モノクローナル、又は抗体の他の精製済み製剤や、組換え抗体を包含するものである。
【００２１】
「アレイ」又は「マトリックス」は、デバイス上でアドレス指定可能な位置、即ち「アドレス」の配置を意味する。前記位置は、二次元アレイ、三次元アレイ、又は他のマトリックス・フォーマット状に配置することができる。位置の数は数個から、少なくとも数十万個までの範囲にすることができる。最も重要なことは、各位置が完全に独立した反応部位であることである。「核酸アレイ」とは、オリゴヌクレオチド又はそれより大きい遺伝子部分など、核酸プローブを含有するアレイを言う。アレイ上の核酸は、好ましくは一本鎖であるとよい。プローブがオリゴヌクレオチドであるようなアレイは、「オリゴヌクレオチド・アレイ」又は「オリゴヌクレオチド・チップ」と呼ばれる。ここで「バイオチップ」又は「生物学的チップ」とも呼ばれる「マイクロアレイ」は、少なくとも約100/cm2、そして好ましくは少なくとも約1000/cm2の個別領域の密度を有する領域のアレイである。マイクロアレイ中の領域は、約10乃至250μmの範囲の典型的寸法、例えば直径、を有し、ほぼ同じ距離で、アレイ中の他の領域から分離されている。
【００２２】
ここで用いる用語「関連疾患」とは、ある特定の核酸又はタンパク質配列に、その核酸又はタンパク質配列の特定の配列情報、構造もしくは機能情報、及び／又は、生物活性の有無により、相関付けられた疾患を言う。
【００２３】
ここで用いる用語「生物試料」とは、ある生物から得られた、又は、ある生物の構成要素（例えば細胞）から得られた、試料を言う。試料はいずれの生物組織又は流体のものであってもよい。しばしば試料は、患者を由来とする試料である「臨床試料」であるであろう。このような試料には、限定はしないが、喀痰、血液、血球（例えば白血球）、組織又は細針生検試料、尿、腹水、及び胸膜易、又はこれらを由来とする細胞、が含まれる。さらに生物試料には、組織学的目的のために採取された凍結切片など、組織切片も含まれよう。
【００２４】
ある疾患の用語「バイオマーカ」とは、当該疾患を有する対象の罹患細胞において、対応する正常細胞に比較して、上方もしくは下方調節された遺伝子であって、当該疾患を特定又は検出するために、それを、選択に応じて他の遺伝子と一緒に、用いることのできる当該罹患細胞に充分特異的な遺伝子、を言う。一般に、バイオマーカは疾患の特徴である遺伝子である。
【００２５】
２つの配列の塩基がそれぞれ適合すれば、即ちワトソン-クリックの塩基対を形成できれば、ヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列に対して「相補的」であることになる。用語「相補鎖」はここでは用語「相補体」と交換可能に用いられている。ある核酸鎖の相補体は、あるコーディング鎖の相補体である場合も、又は、非コーディング鎖の相補体である場合もある。
【００２６】
文言「保存された残基」「又は保存的アミノ酸置換」とは、特定の共通の性質を基にしたアミノ酸のグループ分けを言う。個々のアミノ酸間で共通の性質を定義する機能的な方法は、相同な生物の相当するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化頻度を解析することである (Schulz, G. E. and R. H. Schirmer., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。このような解析によれば、あるグループ内のアミノ酸が相互に優先的に交換され、従って、タンパク質の全体構造に及ぼす影響が互いに最も似ているようなアミノ酸のグループが定義されよう(Schulz, G. E. and R. H. Schirmer., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。この態様で定義されるアミノ酸グループの例には：
(i)  Glu 及びAsp、Lys、Arg 及び Hisから成る荷電グループ、
(ii)  Lys、Arg及びHisから成る正の荷電グループ、
(iii)  Glu 及びAspから成る負の荷電グループ、
(iv）  Phe、Tyr及びTrpから成る芳香族のグループ、
(v)  His 及びTrpから成る窒素環のグループ、
(vi）  Val、Leu 及び Ileから成る大型の脂肪族非極性グループ、
(vii）  Met 及びCysから成る僅かに極性のグループ、
(viii) Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 及びProから成る小型残基のグループ、
(ix） Val、Leu、Ile、Met 及びCysから成る脂肪族のグループ、及び
(x)   Ser 及び Thrから成る小型の水酸基のグループ。
【００２７】
上に挙げたグループに加え、各アミノ酸残基はそれ自身のグループを形成することもあり、個々のアミノ酸で形成されたグループを、当業で通常用いられているそのアミノ酸に対する一文字及び／又は三文字略語で簡単に言及してもよい。
【００２８】
用語「誘導体」とは、あるポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の化学修飾を言う。ポリヌクレオチド配列の化学修飾には、例えば、水素のアルキル、アシル、又はアミノ基への置換を含めることができる。誘導ポリヌクレオチドは、天然分子の少なくとも１つの生物学的もしくは免疫学的機能の残ったポリペプチドをコードしている。誘導ポリペプチドは、それが誘導された元のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的もしくは免疫学的機能を残すような糖付加、PEG化、又は何らかの同様なプロセスにより修飾されたものである。
【００２９】
細胞Ａと細胞Ｂとの間の「示差的遺伝子発現パターン」とは、細胞Ａと細胞Ｂとの間の遺伝子発現の違いを反映したパターンを言う。さらに示差的遺伝子発現パターンは、ある時点での細胞と、別の時点での細胞との間で得ることも、ある化合物とインキュベート又は接触させた細胞と、該化合物とインキュベート又は接触させていない細胞との間で得ることもできる。
【００３０】
ここで用いる用語「ドメイン」とは、当該分子の他の部分とは異なる特定の構造又は機能を含むタンパク質内領域を言う。
【００３１】
「HECTドメイン」又は「HECT」とは、E3ユビキチンリガーゼ活性に関与する「HECTC」ドメインとしても公知のタンパク質である。いくつかのHECTドメインは100乃至400アミノ酸長であり、以下のコンセンサス配列（アミノ酸の名称は表１に記載した通りである）： Pro Xaa3 Thr Cys Xaa2-4 Leu Xaa Leu Pro Xaa Tyr  (配列番号 1)に示す通りのアミノ酸配列を含む。
【００３２】
ここで用いるE3とは、ユビキチン媒介性タンパク質分解、膜輸送、及びタンパク質ソーティングにおいて基質認識に関与する核酸又はコードされたタンパク質を言う。ユビキチン媒介性蛋白質分解は、真核細胞において、細胞内タンパク質の選択的な、制御された分解のための主要な経路である。E3タンパク質は、以下の例示的なドメイン及び／又はモチーフ： HECT、RING、F-BOX、U-BOX、PHD等のうちの１つ以上を含有する。
【００３３】
「E3関連疾患」とは、(1) そのユビキチンによる修飾及び／又は異常な分解が疾患／病的状態の原因であるような相互作用性タンパク質と相互作用するE3；(2)ウィルスたんぱくの後期ドメインなど、相互作用性タンパク質の一ドメインなどの特異的なドメイン／モチーフと相互作用してウィルス感染性を生じるなどに関係するE3タンパク質；(3) その細胞内局在化が、疾患又は病的状態を引き起こすと思われる相互作用性タンパク質との相互作用の可能性を示すようなE3；(4)  疾患／病的状態と相関するE3遺伝子及び又はタンパク質の示差的な発現；及び(5)疾患又は病的状態に関連する（変異又は異常な調節が原因の）E3の異常な活性、であるようなあらゆる疾患を言う。E関連疾患の例には、限定はしないが、ウィルス感染、好ましくはレトロウィルス感染、例えばHIV、エボラ、CMV等、乳癌、肺癌、腎癌等の多種の癌、嚢胞性線維症、及び中枢神経系の特定の疾患、例えば、常染色体劣性若年性パーキンソン病、などがある。
【００３４】
ここで用いる「疾患特徴」とは、以下：ある疾患状態に特徴的なあらゆる表現型、又は、ある疾患状態に特徴的な表現型の代理である人工的表現型；又は、正常細胞から罹患細胞を区別する表現型、のうちの１つ以上を言う。
【００３５】
「関連疾患の罹患細胞」とは、関連疾患Dを有する対象中に存在する細胞であって、正常細胞の改変型であり、疾患Dを有さない対象には存在しない細胞であるか、又は、疾患Dを有さない対象に比較して、疾患Dを有する対象では有意に多いもしくは少ない数、存在するような細胞、を言う。例えば、罹患細胞は癌細胞であってもよい。
【００３６】
「E3関連疾患の罹患細胞」とは、E3関連疾患D'を有する対象中に存在する細胞であって、正常細胞の改変型であり、疾患D'を有さない対象には存在しない細胞であるか、又は、疾患D'を有さない対象に比較して、疾患D'を有する対象では有意に多いもしくは少ない数、存在するような細胞、を言う。例えば、罹患細胞は、ウィルス感染細胞又は癌細胞であってもよい。
【００３７】
用語「薬物ターゲット」とは、関連疾患又は異常と関係するあらゆる遺伝子又は遺伝子産物（例えばRNA又はポリペプチド）を言う。例には、酵素などの多種のタンパク質、腫瘍遺伝子及びそれらのポリペプチド産物、並びに細胞周期調節遺伝子及びそれらのポリペプチド産物、がある。ある局面では、当該薬物ターゲットはE3であってよい。
【００３８】
ここで細胞の「遺伝子発現プロファイル」及び「フィンガープリント」と交換可能に用いられている用語「発現プロファイル」とは、ある一個の細胞中で20個以上の遺伝子のmRNAレベルを表す一組の数値を言う。発現プロファイルは、少なくとも約30個の遺伝子、好ましくは少なくとも約50個、100個、200個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを表す数値を含むことが好ましい。発現プロファイルは、好ましくは、例えばGAPDHなど、複数の細胞及び条件で同様のレベルで発現する遺伝子のmRNAレベルを含むとよい。例えば、E3関連疾患D'の罹患細胞の発現プロファイルとは、罹患細胞中で20個以上の遺伝子のmRNAレベルを表す一組の数値を言う。
【００３９】
ここで用いる用語「ヘテロ接合体」とは、相同染色体上の対応する座に、異なるアレルを持つ個体を言う。従って、ここで用いる用語「ヘテロ接合型の」とは、相同染色体上の一箇所以上の対の座に、異なる対立遺伝子を有する個体又は株を記述するものである。
【００４０】
ここで用いる用語「ホモ接合体」とは、相同染色体上の対応する座に、同じアレルを持つ個体を言う。従って、ここで用いる用語「ホモ接合型の」とは、相同染色体上の一箇所以上の対の座に、同一の対立遺伝子を有する個体又は株を記述するものである。
【００４１】
「ハイブリダイゼーション」とは、一本の核酸鎖が、塩基対形成を通じて相補鎖と結合するあらゆるプロセスを言う。二本の一本鎖核酸は、二本鎖の二重鎖を形成するときに「ハイブリダイズする」ことになる。二本鎖の領域には、一本鎖核酸の一方もしくは両方の完全長が含まれていても、又は、一方の一本鎖核酸の全部と、他方の一本鎖核酸の一部配列が含まれていてもよく、あるいは、二本鎖の領域に、各核酸の一部配列が含まれていてもよい。ハイブリダイゼーションは、さらに、二本の鎖がそれでも尚、二本鎖らせんを形成していることを条件に、いくつかのミス対合を含有する二重鎖の形成も包含する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、基本的に特異的なハイブリダイゼーションを起こすようなハイブリダイゼーション条件を言う。
【００４２】
ここで用いる用語「相互作用する」には、例えばタンパク質−タンパク質間、タンパク質−核酸間、核酸−核酸間、及びタンパク質−低分子間、又は核酸−低分子間など、天然における分子間の検出可能な関係又は結合（例えば生化学的相互作用）が含まれるものと、意図されている。
【００４３】
用語「相互作用性タンパク質」とは、ヒトE3タンパク質などの目的のタンパク質と相互作用、結合及び／又は会合することのできるタンパク質を言う。これらのタンパク質の例には、例えば、ホスト細胞の膜からのビリオン粒子の効率的な放出を促進するGagタンパク質の小さな部分である「後期ドメイン」又は「Lドメイン」がある。Lドメインは、典型的に、一つ以上の短いモチーフ（Lモチーフ）を含む。例示的な配列には、PTAPPEE、PTAPPEY、P(T/S)AP、PxxL、PPxY (例えばPPPY)、YxxL (例えばYPDL)、PxxP、がある。
【００４４】
DNA又はRNAなどの核酸に関してここで用いる用語「単離された」とは、高分子の天然源に存在する、それぞれ他のDNA又はRNAから分離された分子を言う。ここで用いる単離されたという用語は、さらに、組換えDNA技術により作製された場合には細胞物質、ウィルス物質、もしくは培地や、又は、化学合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を、実質的に含まない核酸又はペプチドも言う。さらに、「単離された核酸」には、断片としては天然で生じず、天然状態では見られないであろう核酸断片も含まれることが意図されている。用語「単離された」とは、さらに、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを言うときにもここで用いられており、精製されたポリペプチド及び組換えポリペプチドの両方を包含することが、意図されている。
【００４５】
ここで用いる用語「標識」及び「検出可能な標識」とは、限定はしないが、放射性同位体、蛍光体、化学発光成分、酵素、酵素基質、酵素コファクタ、酵素阻害剤、染料、金属イオン、リガンド（例えばビオチン又はハプテン）等を含め、検出可能な分子を言う。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲の蛍光を示すことのできる物質又はその一部分を言う。本発明で使用できると思われる標識の具体的な例には、フルオレセイン、ローダミン、ダンジル、ウンベリフェロン、テキサス・レッド、ルミノール、NADPH、アルファ-ベータ-ガラクトシダーゼ及び西洋わさびペルオキシダーゼ、がある。
【００４６】
「ある細胞中の遺伝子の発現レベル」とは、mRNAレベルや、細胞内の遺伝子にコードされた、前mRNA発生期転写産物、転写産物プロセッシング中間体、成熟mRNA及び分解産物、を言う。
【００４７】
罹患細胞における「遺伝子の発現を正常化する」と言う文言は、対応する非罹患細胞と基本的に同じレベルで発現するように、罹患細胞内の遺伝子の発現変化を補償する手段を言う。例えば、遺伝子が罹患細胞で過剰発現した場合、罹患細胞でのその発現を正常化するとは、その発現が、対応する正常細胞での発現と基本的に同じになるように、罹患細胞を処理することを言う。「正常化」とは、好ましくは、発現レベルを約50%以内の発現差、より好ましくは約25%以内、そしてさらにより好ましくは10%の発現差にすることであるとよい。求められる発現の近似レベルは特定の遺伝子に応じて左右され、ここで解説するように決定することができる。
【００４８】
「罹患細胞の遺伝子発現を正常化する」という文言は、罹患細胞において基本的に全ての遺伝子の発現を正常化する手段を言う。
【００４９】
ここで用いる用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（DNA）などのポリヌクレオチドと、また適当な場合にはリボ核酸(RNA）も言うものである。この用語は、均等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたRNA又はDNAの類似体や、そして、解説中の実施態様に該当する場合、一本鎖（センス又はアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドも包含するものと、理解されねばならない。EST、染色体、cDNA、mRNA、及びrRNAは、核酸と呼ばれることのある分子の代表的な例である。
【００５０】
用語「同一性のパーセント」とは、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を言う。同一性はそれぞれ、比較を目的としてアライメントされる各配列中の一箇所を比較することにより、決定することができる。比較された配列のうちの均等な位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、それら分子はその位置において同一である。等価な部位が同じ又は類似のアミノ酸残基（例えば立体的及び／又は電子の性質上で類似など）で占められている場合、それら分子を、その位置において相同（類似）であると呼ぶことができる。相同性、類似性、又は同一性のパーセントの表現とは、比較された配列に共通の位置にある同一もしくは類似のアミノ酸の数の関数を言う。隠れマルコフモデル（HMM）、FASTA及びBLASTを含め、多種のアライメント・アルゴリズム及び／又はプログラムを用いてよい。HMM、FASTA 及びBLASTは、メリーランド州ベセズダ、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション、ナショナル・ライブラリー・オブ・メディシン、ナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルスや、ヨーロピアン・バイオインフォマティック・インスティテュートEBIから入手できる。ある実施態様では、２つの配列の同一性パーセントを、これらのGCGプログラムにより、例えば各アミノ酸のギャップに、それが当該２つの配列の間の一個のアミノ酸もしくはヌクレオチドのミス対合であるかのごとく、重みを付けるなど、ギャップ・ウェイトを1にして、決定することができる。アライメントのための他の技術は、Methods in Enzymology, vol. 266: 米国カリフォルニア州サンディエゴのハーコート・ブレース社の一部門であるDoolittle, Academic Press社編集のComputer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996)に解説されている。好ましくは、配列中のギャップを許容するアライメント・プログラムを用いて配列をアライメントするとよい。スミス・ウォーターマンは、配列アライメント中のギャップを許容するアルゴリズムの１種である。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997)を参照されたい。さらに、ニードルマン及びワンシュのアライメント法を用いた GAPプログラムを用いて配列をアライメントすることもできる。HMMの使用を含むより多くの技術及びアルゴリズムが、Sequence, Structure, and Databanks: A Practical Approach (2000), ed. Oxford University Press, Incorporated. In Bioinformatics: Databases and Systems (1999) ed. Kluwer Academic Publishersに解説されている。代替的な検索ストラテジは、MASPARコンピュータで作動するMPSRCHソフトウェアを用いるものである。MPSRCHはスミス・ウォーターマンのアルゴリズムを用いて大規模並列処理コンピュータ上で配列を採点する。このアプローチでは、関係の遠い対合を探し出す能力が向上しており、小さなギャップやヌクレオチド配列のエラーに対して特に許容的である。核酸にコードされたアミノ酸配列を用いて、タンパク質及びDNAデータベースの両方を検索することができる。個々の配列を持つデータベースが、Methods in Enzymology, ed. Doolittleに解説されている。データベースには、Genbank、EMBL、及び 日本のDNAデータベース(DDBJ)、がある。
【００５１】
二重鎖に関する「完全な対合」とは、当該二重鎖を形成しているポリもしくはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖中のヌクレオチド全てが、他方の鎖のヌクレオチドとワトソン・クリックの塩基対形成を起こすように、互いに二本鎖構造を形成することを意味している。さらにこの用語は、利用できると思われる、例えばデオキシイノシン、2-アミノプリン塩基を持つヌクレオシド等のヌクレオシド類似体の対形成も包含している。標的ポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドもしくはオリヌクレオチド（原語：olynucleotide）間の２重鎖中のミス対合とは、この二重鎖のうちで一対のヌクレオチドの対が、ワトソン・クリック結合できないことを意味する。三重鎖に言及する場合、この用語は、この三重鎖が完全に対合した二重鎖と、そのヌクレオチド全てが、この完全に対合した二重鎖の塩基対とフーグスティーン型又は逆フーグスティーン型結合しているような三番目の鎖とから成ることを意味する。
【００５２】
ここで用いる場合の、アレイに結合した核酸又は他の分子とは、「プローブ」又は「捕捉プローブ」を言うものである。あるアレイが一個の遺伝子に対応して複数のプローブを含有する場合、これらのプローブは「遺伝子プローブ・セット」と呼ばれる。遺伝子プローブ・セットは、例えば2乃至10本のプローブ、好ましくは2乃至5本のプローブ、そして最も好ましくは約5本のプローブから構成することができる。
【００５３】
ある細胞の生物学的状態の「プロファイル」とは、薬物処理や、細胞の生物学的状態に対する他の摂動に応答して変化することが公知の、細胞の多種の構成成分のレベルを言う。細胞の構成成分には、RNAレベル、タンパク質豊富度のレベル、又はタンパク質活性レベル、がある。
【００５４】
用語「タンパク質」は、ここでは用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」と交換可能に用いられている。
【００５５】
ある細胞の発現プロファイルは、別の細胞の発現プロファイルと、これらの２つのプロファイル中の遺伝子発現レベルが充分に類似しており、かつ、その類似性が、例えば全く同一の細胞種であるなど、共通の特徴を示すものであるときに、「類似である」ことになる。従って、第一の細胞及び第二の細胞の発現プロファイルは、第一の細胞で発現する遺伝子の少なくとも75%が、第一の細胞に対して２の因数以内のレベルで第二の細胞で発現するときに、類似であることになる。
【００５６】
「RCC1ドメイン」とは、小型GTPaseと相互作用して、GDPの消失及びGTPの結合を促進するようなドメインである。いくつかのRCC1ドメインは約50乃至60アミノ酸長である。しばしばRCC1ドメインは一連の反復配列として見られる。最初のRCC1ドメインは、小型GTPase Ranと相互作用する「染色体凝縮の調節物質」（RCC1）と呼ばれるタンパク質中に同定された。RCC1タンパク質においては、約50乃至60個のアミノ酸から成るドメインの一連の７個のタンデム反復配列が折り畳まれてベータ−プロペラ構造を形成する(Renault et al. Nature 1998 392:9-101)。RCC1ドメインは、 Arf、Rab、Rac 及びRhoファミリーのメンバーを含む他の種類の小型GTPaseと相互作用することが知られている。
【００５７】
用語「組換えタンパク質」とは、組換えDNA技術により作製される本発明のタンパク質を言い、このとき一般に、発現させるタンパク質をコードしているDNAは適した発現ベクタ内に挿入されるが、この発現ベクタを用いてホスト細胞を形質転換させて、異種タンパク質を作製するのである。さらに、組換えタンパク質をコードする組換え遺伝子に関する文言「由来とする」は、天然タンパク質のアミノ酸配列か、又は、天然タンパク質の置換及び欠失を含む変異により作製されたそれに類似のアミノ酸配列を有するようなタンパク質も、「組換えタンパク質」の意味に包含することを意図している。
【００５８】
「RINGドメイン」、「リング・フィンガー」又は「RING」は、システイン及びヒスチジン残基が顕著な八重項になった「ZF-C2HC4」としても公知の亜鉛結合ドメインである。いくつかのRINGドメインは、以下（アミノ酸の名称は表１に記載した通りである）：Cys Xaa Xaa Cys Xaa10 - 20 Cys Xaa His Xaa2-5 Cys Xaa Xaa Cys Xaa13-50 Cys Xaa Xaa Cys (配列番号 2) 又は Cys Xaa Xaa Cys Xaa10 - 20 Cys Xaa His Xaa2-5 His Xaa Xaa Cys Xaa13-50 Cys Xaa Xaa Cys (配列番号 3)として記載されたコンセンサス配列を含む。本発明の好適なRINGドメインは多種のタンパク質相手に結合してユビキチンリガーゼ活性を有する複合体を形成するものである。RINGドメインは、好ましくは以下のタンパク質種：Fボックスタンパク質、E2ユビキチン結合酵素及びキューリン（原語：cullin）のうちの少なくとも１つと相互作用するとよい。
【００５９】
用語「RNA干渉」、「RNAi」又は「siRNA」はすべて、目的の遺伝子に相同な（特に目的の遺伝子のメッセンジャーRNAに相同な）１つ以上の二本鎖RNAを標的細胞に導入することにより、ある遺伝子又は遺伝子産物の発現を減少させる方法を言う。
【００６０】
ここで用いる用語「トランスフェクション」とは、核酸を、発現ベクタなどを介してレシピエント細胞に核酸媒介性遺伝子移入により導入することを意味する。
【００６１】
ここで用いる「形質転換」とは、細胞の遺伝子型が、外因性DNA又はRNAの細胞内取り込みの結果変化するプロセスを言い、例えば、形質転換後の細胞が、組み替えが他のポリペプチドを発現したり、あるいは移入させた遺伝子からのアンチセンス発現の場合には、天然型のポリペプチドの発現を破壊するなどを言う。
【００６２】
ここで用いる用語「導入遺伝子」とは、細胞内に導入された（例えば標的核酸の１つ、又は、それに対するアンチセンス転写産物など、をコードする）核酸配列を意味する。導入遺伝子は、それが導入された先のトランスジェニック動物もしくは細胞に対して部分的もしくは完全に異種、即ち異物であってもよいであろうが、あるいは、導入された先のトランスジェニック動物もしくは細胞の内因性遺伝子に対して相同であるが、挿入された先の細胞のゲノムを変えるような態様で（例えば、それが、天然遺伝子のそれとは異なる位置に挿入されるか、又は、その挿入の結果ノックアウトが起きるように）当該動物のゲノムに挿入されるようデザインされているか、又は挿入される。導入遺伝子はエピソームの形で細胞内に存在させることもできる。導入遺伝子には、１つ以上の転写調節配列や、例えばイントロンなど、所定の核酸の最適な発現にとって必要と思われる他の核酸を含めることができる。
【００６３】
対象の疾患を「治療する」又は疾患を有する対象を「治療する」という用語は、当該疾患の少なくとも１つの症状が減少するように、例えば薬物の投与など、薬学的治療を対象に行うことを言う。
【００６４】
ここで用いる用語「ユビキチン媒介性異常」とは、例えばユビキチン媒介性分解、タンパク質輸送、及び又はタンパク質ソーティングなど、異常なユビキチン媒介性細胞内プロセスの結果起きる異常を言う。
【００６５】
用語「ユニジーン」又は「ユニジーン・クラスタ」とは、GenBank配列を、重複のない組のユニジーン・クラスタに自動的に仕切るための実験系を言う。各ユニジーン・クラスタは、固有の遺伝子を表す配列や、当該遺伝子が発現した組織種やマップ上位置などの関連情報を含有する。加えて、良く特徴付けされた遺伝子には、EST配列もこれらのクラスタに含まれる。このようなクラスタをftp://ncbi.nlm.nih.gov/ repository/Unigene/からダウンロードしてもよい。
【００６６】
文言「ある遺伝子の発現レベルを表す数値」とは、例えばRNAレベルを測定する実験で得られたなど、細胞又は生物試料中の特定の遺伝子のmRNAレベルを反映する粗数を言う。
【００６７】
ポリペプチドXの「バリアント」とは、一個以上のアミノ酸残基が変更されたペプチドXのアミノ酸配列を有するポリペプチドを言う。バリアントは、置換されたアミノ酸が類似の構造上もしくは化学的性質を有する「保存的」変更（例えばロイシンのイソロイシンへの置換など）を有していてもよい。より珍しい例では、バリアントは「非保存的」変更（例えばグリシンのトリプトファンへの置換など）を有していてもよい。類似の小さな変更には、アミノ酸欠失もしくは挿入、又は両者、が含まれよう。生物学的もしくは免疫学的活性を損なうことなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させられるかを判断する指針は、例えばLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）など、当業で公知のコンピュータ・プログラムを用いて見つけられよう。
【００６８】
用語「バリアント」は、ポリヌクレオチド配列の文脈で用いられる場合、遺伝子Xのポリヌクレオチド配列に関係するそれ、又は、そのコーディング配列も包含するであろう。この定義には、さらに、例えば「アレリック」、「スプライス」、「種間」又は「多型」バリアントも含まれよう。スプライス・バリアントは基準分子に対して有意な同一性を有すると思われるが、mRNAプロセッシング中にエキソンの選択的スプライシングがあるために、より多いもしくは少ない数のポリヌクレオチドを有することであろう。対応するポリペプチドは、付加的な機能ドメインを持っていても、又はドメインがなくともよい。種間バリアントは、ある種と別の種との間で異なるポリヌクレオチド配列である。生じるポリペプチドは一般に、相互に対して有意なアミノ酸同一性を有するであろう。多型バリアントは、ある特定の種の個体同士の間での特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列の違いである。多型バリアントはまた、ポリヌクレオチド配列が一塩基分異なるような「単一ヌクレオチド多型（SNP）を包含することもある。SNPの存在が、例えば特定の集団、疾患状態、又は、疾患状態への性向の指標となる場合がある。
【００６９】
「WWドメイン」は、ヒト、線虫、及び酵母を含む多様な種を由来とする数多くのタンパク質で見られる小さな機能ドメインである。WWドメインはほぼ30乃至40アミノ酸長である。いくつかのWWドメインは、以下のコンセンサス配列（Andre and Springael, 1994, Biochem. Biophys. Res. Comm. 205:1201-1205) (アミノ酸の名称は表１に記載したとおりである):  Trp Xaa6-9 Gly Xaa1-3 X4 X4 Xaa4-6 X1 X8 Trp Xaa2 Pro (配列番号 4)で定義できよう。いくつかの場合、WWドメインは、ヒスチジン又はシステインに富むアミノ酸領域でフランクされているであろう。場合によっては、WWドメインの中央にあるアミノ酸は大変疎水性である。好適なWWドメインはレトロウィルスGagタンパク質のLドメインに結合するものである。特に好適なWWドメインは、ProProXaaTyr (配列番号 5)のアミノ酸配列に結合するものである。
【００７０】
表１：アミノ酸のクラスの略語
【００７１】
【表１】
2005525790.tif 000002
【００７２】
*  略語はhttp://smart.embl-heidelberg.de/SMART_DATA/alignments/consensus/grouping.html.から採用された。
【００７３】
データベースの作製
ある局面では、本出願は、関連するタンパク質及び／又は核酸の包括的データベースを作製する方法を提供するものであり、即ち、本タンパク質及び核酸配列は、特定の配列情報、構造及び／又は機能情報に基づいて、本データベース中に含まれているのである。ある局面では、本出願は、配列、構造上、機能上及び生物学的活性に基づいて分類された配列を提供する。該配列を、さらに、潜在的な疾患関連性に基づいてクラスタ化させてもよい。例えば、特定のドメインの有無が、そのタンパク質又は核酸配列の潜在的疾患相関性の指標であるかも知れない。本データベースはさらに、関連する疾患相関性を示すアノテーションを含む。ある例では、本出願は、E3データベースを作製する方法を提供するものである。
【００７４】
図１は、目的の疾患又は他の生物学的プロセスに関与していると思われるヒトE3タンパク質及び／又は核酸配列を同定するプロセス100を示す。図示のように、本プロセスは、ヒトタンパク質又は核酸配列を記述したデータに基づいて作動する。このようなデータは、NCBI (ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション) 又はSwiss Prot データベースから公的に入手可能なものや、又は、例えばIncyte社又はCelera 社が所有するデータベースなどの個人の所有するデータベースなど、多種のソースからダウンロード102してもよい。公的に入手可能なデータベースには、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/batch.html.のWorld Wide Webにあるヒトタンパク質配列のNCBIデータベースや、EBIがある。
【００７５】
図示のように、プロセス100では、配列をきれいにして104、ヒトタンパク質配列を特定してもよい。例えばプロセス100で重複する配列情報を消去してもよい。さらにプロセス100では、ポリペプチド長に基づいて配列部分を消去してもよい。例えば、プロセス100で、特定の明示されたアミノ酸長（例えば10又は20）未満、又は、ある範囲の長さ（例えば25乃至30）のポリペプチドを消去してもよい。 
【００７６】
次にプロセス100では、どの配列がヒトE3タンパク質配列に相当するかを特定する106。例えばプロセス100で、ある特定の配列が、E3タンパク質に関連する１つ以上のドメインを示すかどうかを判定してもよい。ドメインとは繰り返しになった配列パターン又はモチーフである。一般に、これらのドメインは別個の進化上の起源及び機能を有する。具体的には、ヒトE3タンパク質にはHECT、Ubox、RING、PHD、及び／又はfboxドメインが含まれているであろう。これらのドメインが存在するか、又は他の特徴のいずれかに基づき、プロセス100で、ある疾患又は他の生物活性をE3タンパク質と関連させる108ことができる。E3タンパク質は、少なくともHECT、RING、Ubox、Fbox、ZN3 又はPHD ドメインを有するものとして同定される。いくつかの実施態様では、E3タンパク質は、少なくともHECT 又はRINGドメインを有するものとして同定される。
【００７７】
図２は、このプロセスの実例としての実施200をより詳細に示す。図示のように、実施200は配列データのデータベース202を含む。やはり、データベース202は、例えばナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス（NIH）ヒトゲノムデータベース又はEBIヒトゲノムデータベースなどの多種のソースからアセンブル又はダウンロードしてもよい。タンパク質配列の代わりに、又はタンパク質配列に加えて、データベース202には、特定のタンパク質に関連するヌクレオチド及び／又は遺伝子配列をさらに含めてもよい。データベース202にはさらに配列アノテーションも含めてよい。
【００７８】
配列解析ソフトウェア204には、配列により示されるE3特徴206を特定させることができる。このような特徴206には、RING、HECT、Ubox、Fbox、PHD ドメイン又はPTA/SP モチーフなどのドメイン及びモチーフを含めることができる。例えば、該ソフトウェアに、特定のドメイン／モチーフのコンセンサス配列を検索させることができる。これらの例示的モチーフのいくつかのコンセンサス配列は、上に提供した定義の項で解説されている。
【００７９】
上に論じた配列解析ソフトウェア 204には、数多くの様々なツールを含めてよい。例えば、NCBIが提供するCD-検索サービスである。このサービスは、あるタンパク質配列中に存在するであろう保存ドメインを特定する便利な方法を提供するものである。CDD (保存ドメインデータベース) は、Smart 及びPfamという２つの収集から得られるドメインを含有する。具体的には、Smart (シンプル・モジュラー・アーキテクチャ・リサーチ・ツール）はこのようなドメインを調べるためのウェブ・ベースのツールである（http://SMART.embl-heidelberg.de）。それには、シグナル伝達、細胞外、及びクロマチン関連タンパク質に見られる400を越えるドメイン・ファミリーが含まれている。これらのドメインは、系統発生的な分布、機能クラス、三次構造、及び機能上重要な残基について、広汎にアノートされている。同様に、Pfam (http://pfam.wustl.edu) は、共通のタンパク質ドメインを網羅した、多重配列アライメント及び隠れマルコフ・モデルの大規模な収集である。２００１年８月の時点で、Pfamは3071種のタンパク質ファミリーのアライメント及びモデルを含有する。
【００８０】
配列解析ソフトウェア 204を個人的に開発してもよい。あるいは、公共のソフトウェアを用いてもよい。例えば、本プロセスにおいてリバース・ポジション・スペシフィック(RPS)Blast（ベイシック・ローカル・アライメント・サーチ・ツール) ツールを用いてもよい。このアルゴリズムでは、照会配列を、基礎的な保存ドメイン・アライメントから調製された位置特異的スコア・マトリックスに比較する。ヒットは、代表的なドメイン配列との照会配列の対のアライメントとして、又は多重アライメントとして、表示される。
【００８１】
特徴206にはさらにユニジーン・クラスタを含めてもよい。こうして、各ヒトE3タンパク質を、ダウンロードされたクラスタに比較して、それが属する特定のクラスタを決定する。E3タンパク質があるクラスタに一致したら、どのような他のタンパク質がこのクラスタに属するかを判定し、これらをE3データベースに導入する。
【００８２】
図示のように、配列データ202の解析204の結果、E3タンパク質及び他の関連するタンパク質の包括的リストができる210。このような情報を、関係データベースなどのデータベース208に編成してもよい。データベース208には、さらに、WW、RCCI、C2、Cue、SH3、SH2、及びさらにUbox、fbox、RING、HECT 及び PHD 自体などのドメインの有無など、様々なタンパク質の特徴212を保存してもよい。これらの特徴212に基づき、ソフトウェアはタンパク質210を異常、疾患、又は他の生物活性に関連させることができる。例えば、該ソフトウェアは、様々なタンパク質特徴218を様々な生物活性220と関連づけるデータベース216にアクセスしてもよい。言うまでもないが、データベース208を定期的に更新して、新しいタンパク質210、又は他の関連する特徴212及び生物活性220を含めていってもよい。
【００８３】
この議論から分かるように、関連する配列を含むデータベースを、構造、機能及び生物活性に基づいてタンパク質及び核酸配列を分類することで、作製してもよい。従って、特定のドメイン又はモチーフについて、関連する配列を調べた後、多種の関連疾患との潜在的相関に基づいて、さらにクラスタ化してもよい。
【００８４】
生物学的検定法
ある局面では、本出願は、特定の配列が、関連疾患に相関しているかどうかを判定又は検査する方法を提供するものである。ある実施態様では、本出願は、例えばE3遺伝子又はコードされたヒトE3タンパク質などの特定の遺伝子又はコードされたタンパク質が、目的の疾患又は他の生物学的プロセスに関与しているかどうかを判定する手段を提供するものである。ある局面では、本出願は、タンパク質及び核酸配列を、関連疾患又は病的状態と相関付けるための機能的生物学的検定法を提供する。
【００８５】
ヒトE3タンパク質などのタンパク質の、目的の疾患又は病的プロセスへの潜在的関与は、当業者に公知の数多くの方法を用いて評価できよう。疾患相関性、又は、目的の生物学的プロセスへのタンパク質の関与を評価するいくつかの例示的な方法には、以下のものがある。
【００８６】
Ｉ．  ヒトE3タンパク質などのタンパク質の、相互作用性タンパク質の特異的ドメイン又はモチーフとの相互作用。正常な活性の過程では、E3タンパク質は細胞質内で遊離しているか、又は、核、ゴルジ網などの細胞内オルガネラに結合していると考えられている。しかしながら、ウィルスに感染すると、特定のE3タンパク質などの特定のホストタンパク質が細胞膜に召集されて、ユビキチン化及び膜融合を含むウィルス成熟に関与している可能性がある。例えば、HECTドメイン、RINGドメイン、及びWW もしくはSH3 ドメインを含有するヒトE3タンパク質はgagタンパク質などのウィルスタンパク質と相互作用する。ある局面では、これらE3タンパク質のWW ドメインは、コンセンサス配列 PxxYを有するgagタンパク質の後期ドメインと相互作用する。従って、このようなドメインを有するE3タンパク質がgagのユビキチン化を媒介してウィルス成熟を促している可能性があり、従って、レトロウィルス感染などのウィルス感染を治療するための潜在的薬物ターゲットかも知れない。
【００８７】
更なる局面では、本出願は、ある細胞がウィルスに感染したかどうかを判定すると共に、感染の性質、進行及び／又は感染性を特徴付けるための診断検定法を提供するものである。その結果、 細胞膜画分に結合したE3タンパク質の検出が、ウィルス感染の指標となるであろう。また、細胞膜にE3タンパク質が存在することは、感染性ウィルスが増殖の過程にあり、従って（溶原性又は休眠活性ではなく）感染活性又は溶解活性が活発であることの示唆ともなるであろう。
【００８８】
数多くの検定法が、ヒトホストタンパク質のウィルス相互作用性タンパク質との潜在的相互作用を研究する上で有用であろう。例えば、このような検定法には、ウィルスをトランスフェクトした細胞からや、又は、レトロウィルスなどのウィルスに感染した細胞からのウィルス様粒子の検出が含まれるであろう。
【００８９】
E3タンパク質などの本発明のタンパク質の細胞膜との結合は、当業で公知の多種の技術を用いて検出してもよい。例えば、細胞を（音波処理又は界面活性剤による溶解により）破壊した後、サイトソル画分から膜成分を遠心分離することで、膜標品を調製してもよい。タンパク質の膜画分への偏りは、目的タンパク質に特異的な抗体で、ウェスタン・ブロット分析又はELISA技術を用いて検出することができる。細胞膜は、細胞内の膜から、密度勾配遠心分離を用いて、密度を基に分離できよう。あるいは、細胞表面を化学又は酵素修飾し、そして、この修飾を選択的に結合させることにより、細胞膜を親和性精製することで、細胞膜を得てもよい。修飾法の一例には、細胞表面のタンパク質の非特異的ビオチン化がある。さらに細胞膜は、豊富な細胞膜タンパク質を親和性精製することでも、選抜できよう。
【００９０】
細胞外ドメインを含有するE3タンパク質などの膜貫通タンパク質はFACS分析を用いて検出できる。FACS分析の場合、細胞全体を、目的タンパク質の細胞外ドメインを認識できる蛍光標識抗体（例えばFITC標識抗体）と一緒にインキュベートする。次に、細胞の蛍光染色のレベルをFACS分析で判定してよい（例えば Weiss and Stobo, (1984) J. Exp. Med., 160:1284-1299を参照されたい）。このようなタンパク質は、非感染細胞では細胞内の膜に、そして、感染細胞では細胞膜に、存在すると予測される。FACS分析では、当該タンパク質が細胞膜に存在しない限り、細胞外ドメインを検出はできないであろう。
【００９１】
例えば本発明のE3タンパク質など、目的タンパク質の局在は、組織化学的技術を用いても判定してよい。例えば、細胞を固定し、目的タンパク質に特異的な蛍光標識された抗体で染色してもよい。次に染色した細胞を顕微鏡検査して、抗体に結合したタンパク質の細胞レベル下での局在を判定してもよい。
【００９２】
ＩＩ．  潜在的な薬物ターゲットタンパク質は、正常細胞に比較して、罹患細胞においてユビキチンで修飾されるか、又は、異常な分解を起こすだろうと思われる相互作用性タンパク質との相互作用に基づいても、同定できよう。例えば、数多くの疾患が、異常なタンパク質折り畳み及び／又はタンパク質凝集体形成に関係していると予測されている。これらの場合、プロセッシング異常のあるタンパク質を特定し、E3薬物ターゲットなどの薬物ターゲットを、それとの相互作用に基づいて同定してもよい。相互作用は、例えば、多種の方法（ハイスループットの免疫沈降法、ハイスループットの二種ハイブリッド分析等）で作製されたプロテオーム相互作用データベースなどを用いて、バイオインフォマティック的に特定してもよい。多種のデータベースには、タンパク質機能に関する文献から抜粋された情報が含まれ、プロセッシング異常のあるタンパク質と相互作用する薬物ターゲットE3を特定するためにも、このような情報を用いてもよい。さらに相互作用は、上述したものなどの技術を用いて、de novoで判定してもよい。 E3などの潜在的薬物ターゲットを特定したら、その生物学的作用を検査するために、多数の検定法を用いてよい。
【００９３】
一例では、異常にユビキチン化する、分解するもしくは凝集するタンパク質を、候補薬物ターゲットの活性操作に応答したユビキチン化、分解又は凝集について観察する。例えば、ユビキチン化は、腫瘍抑制たんぱくであるp53や、他の細胞周期調節因子、例えばサイクリンA及びサイクリンB、キナーゼc-mos、そしてc-jun、c-fos及び I.kappa B/NF kappa.Bなどの多種の転写因子のターンオーバーとの関係が示されている。これらの細胞内タンパク質の半減期を変更することに、大きな治療上の可能性が、特に自己免疫疾患、炎症、癌や、他の増殖性異常の分野においてあると予測されている。Rolfe, M., et al., The Ubiquitin-Mediated Proteolytic Pathway as a Therapeutic Area, J. Mol. Med., 75:5 (1997)。ここで解説した、そして本出願を鑑み、当業者に公知の、数多くの検定法を用いて、E3などの潜在的薬物ターゲットの生物学的効果を検査してよい。
【００９４】
ＩＩＩ．  E3タンパク質などの潜在的薬物ターゲットタンパク質を、細胞内局在化に基づいて選抜してもよい。多種の疾患状態において、細胞の機能不全は、１種以上の細胞内区画まで追跡することができる。この区画に局在化するE3などのタンパク質は、疾患、特に機能不全タンパク質がユビキチン化系と相互作用していると思われる疾患で、関係しているであろう。例えば嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症シグナル伝達調節因子（CFTR）の表面発現低下に関係する遺伝性異常である。患者のほぼ70%が、CFTRΔF508変異についてホモ接合型である。変異型CFTRは小胞体（ER）で、ユビキチン蛋白質分解系を通じて急速に分解するため、表面での発現が少ない。ER関連タンパク質分解を調節すると、非折り畳み性タンパク質応答 (UPR) が惹起され、その結果、タンパク質折り畳みを媒介する数多くのタンパク質が産生される。ユビキチン化の減少と、タンパク質折り畳みの増加という組合せが、タンパク質の大部分が成功裏に成熟に向かう要因であると予測されている (Travers et al. (2000) Cell 101:249-258)。従って、ERに局在化することが知られているか、又は、一体型膜E3タンパク質であるようなヒトE3タンパク質は、変異型CFTRの分解を媒介し、ひいては嚢胞性線維症を治療するための潜在的薬物ターゲットであろう。
【００９５】
E3の局在化などのタンパク質局在化を、例えばデータベース中にあるE3のアミノ酸配列に存在するタンパク質局在化シグナルを調べるなど、バイオインフォマティックス分析により、判定又は予測してもよい。局在化シグナルの例には、（当該タンパク質がER媒介性分泌経路に誘導されることを示す）シグナル・ペプチド、前記分泌経路中の一箇所異常の位置、例えばER、ゴルジの一部分等、で保持されることを示す保持配列、核内局在化シグナル、膜ドメイン、脂質修飾配列等、がある。本明細書を鑑みれば、当業者であれば、タンパク質局在化を示す多種の配列情報を特定できるであろう。別の変形例では、細胞株、好ましくは哺乳動物細胞株、でのE3の発現により、局在化を直接判定してもよい。タンパク質は天然タンパク質として発現させてもよいが、この場合、典型的には局在化を免疫蛍光顕微鏡法で判定することになるであろう。あるいは、タンパク質を、蛍光タンパク質（例えばGFP、BFP、RFPなど）検出可能なタグと一緒に発現させてもよく、その局在化を、直接的な免疫蛍光顕微鏡法で判定してもよい。局在化を、細胞分画により、例えば二次元電気泳動法及び質量分光法の組合せなどのハイスループットのタンパク質同定法を行うことで、判定してもよい。これにより、多種の細胞区画に存在するタンパク質の迅速な同定が可能である。
【００９６】
１種以上の薬物ターゲットE3タンパク質を同定したら、数多くの様々な検定を、疾患状態におけるこのE3の役割を検査するために利用できる。例えば、多くの疾患において膜タンパク質が適性にプロセッシングされておらず、細胞膜に局在化していない。従って、E3の機能を操作し（下記を参照）、細胞膜に到達する膜タンパク質のレベルを測定してもよい。E3機能の操作に応答して、膜に送達されるタンパク質量が増えれば、このE3が、疾患治療薬として有効なターゲットであることの指標となる。上述したように、CFTR成熟は嚢胞性線維症で異常になっている。ある例では、当該E3を操作し、細胞膜に蓄積した変異型CFTRΔF508のレベルを判定することにより、E3をバリデートする。同様に、エリスロポエチン受容体の98%が成熟できず、分泌経路で分解する。エリスロポエチン受容体の産生を増加させれば、造血の臨床上重要な刺激物質であるエリスロポエチン自体の効果を模倣することができるであろう。従って、細胞表面のエリスロポエチン量に対するE3の作用を上下させた場合の影響を評価することにより、E3をバリデートしてもよい。
【００９７】
更なる例では、ERを通過するホストタンパク質の分解に影響を与えるウィルスタンパク質に、多種のE3酵素を相互作用させてもよい。多くのウィルスが、ウィルス感染に不利なホストタンパク質を不安定化させるために、ER関連タンパク質分解経路を選ぶ。例えば、ヒトサイトメガロウィルス(HCMV)はMHCクラスI重鎖の破壊を起こさせることで、免疫系を部分的に逃れる。二種のHCMVタンパク質、US11及びUS2が、MHCクラスI重鎖を、ERからサイトソルまで迅速に逆行性輸送させ、そこでこれらはプロテアソームにより分解される。このプロセスはユビキチン依存的である。加えて、HIVウィルスは、ER関連性ユビキチン依存的タンパク質分解経路を通じてホストCD4タンパク質の破壊を狙う。ER中のCD4はHIV糖たんぱくgp160に結び付き、その成熟を阻害するため、CD4の破壊は重要である。従って、例えばMHCクラスI重鎖（又は他のMHCクラスI複合体）又はCD4のプロセッシング又は局在化に対する影響を評価することで、E3をバリデートしてもよい。
【００９８】
ＩＶ．  潜在的な薬物ターゲットは、正常細胞に比較したときの罹患細胞における特定の核酸又はタンパク質の示差的発現によっても、同定できよう。
【００９９】
ある局面では、関連疾患の症状を発現している細胞など、罹患細胞に比較したときの正常細胞におけるタンパク質の示差的発現が、この示差的に発現した遺伝子が、関連疾患又は他の生物学的プロセスに関与している可能性の指標である。例えば、正常組織に比較したときの腫瘍組織におけるあるE3タンパク質の示差的発現は、そのE3タンパク質が腫瘍発生に関与している可能性の指標であろう。
【０１００】
ある実施態様では、本発明は、E3関連疾患由来の細胞の遺伝子発現プロファイルに基づく。罹患細胞は、E3関連疾患の症状を有さない正常細胞に比較して、高レベルで発現する（即ち上方調節される）遺伝子及び／又は、低レベルで発現する（即ち下方調節される）遺伝子、を有することがある。特に、いくつかのE3遺伝子は、正常細胞に比較して罹患細胞では少なくとも約１倍、好ましくは２倍、より好ましくは５倍、上方調節される場合がある。あるいは、いくつかのE3遺伝子は、対応する正常細胞に比較して、罹患細胞では少なくとも約１倍、好ましくは２倍、より好ましくは５倍、下方調節される場合がある。
【０１０１】
好適な方法は、対応する正常細胞に比較したときの、罹患細胞での１種以上のE3遺伝子の発現レベルを判定するステップを含むものである。対応する正常細胞に比較したときの罹患細胞における数十種、数百種、又は数千種の遺伝子の発現を判定する方法には、例えば、マイクロアレイ技術を用いるなどがある。こうしてE3遺伝子の発現レベルを、正常細胞などの１種以上の他の細胞での同じE3遺伝子の発現レベルと比較する。
【０１０２】
発現レベルの比較を視覚的に行うこともできる。ある好適な実施態様では、比較をコンピュータで行う。
【０１０３】
別の実施態様では、E3関連疾患に特徴的な遺伝子の発現レベルを表す数値を、２個以上の細胞から得られた基準発現レベルを持つ１種以上のデータベースを含むコンピュータ・システムに入力する。例えば、該コンピュータは、罹患細胞及び正常細胞の発現データを含む。命令をコンピュータに提供すると、このコンピュータは、入力データとコンピュータ内にあるデータとを比較して、入力データが、正常細胞のもの、又は、罹患細胞のもののいずれにより類似であるかを判断することができる。 
【０１０４】
ある実施態様では、本発明は、特定のE3関連罹患細胞で上方もしくは下方調節される１種以上のE3遺伝子の発現レベルを判定して、これらの発現レベルを、当該疾患に罹患していることが判明している対象由来の罹患細胞でのE3遺伝子の発現レベルと比較することで、遺伝子の発現レベルが類似していれば、それは、このE3遺伝子が当該疾患に関係していることの指標であるとする、方法を提供するものである。 
【０１０５】
E3関連疾患に関与する１種以上のE3遺伝子の発現レベルの、基準発現レベル、例えば、罹患細胞又は正常な対応する細胞での発現レベル、との比較は、好ましくはコンピュータ・システムを用いて行われるとよい。ある実施態様では、発現レベルを２つの細胞から得、これら２つの組の発現レベルを、比較用のコンピュータ・システムに導入する。ある好適な実施態様では、一組の発現レベルをコンピュータ・システムに入力して、既にこのコンピュータ・システム内に存在する数値と比較するか、あるいは、後で当該コンピュータ・システムに入力される、コンピュータで読み取り可能な形の数値と比較する。
【０１０６】
ある実施態様では、本発明は、１つ又は複数の遺伝子に関する遺伝子発現データを受け取る手段と；前記１つ又は複数の遺伝子からの遺伝子発現データを、共通の基準フレームと比較する手段と；前記比較の結果を提示する手段と、を含むシステムを提供するものである。このシステムには、さらに、前記データをクラスタ化する手段を含めてもよい。
【０１０７】
ある実施態様では、本発明は、コンピュータ読み取り可能な形の、本発明のE3遺伝子発現プロファイル・データ、又は、コンピュータ読み取り可能な形の、罹患細胞におけるE3関連疾患に関係する少なくとも１つのE3遺伝子の発現レベルに相当する数値、を提供するものである。この数値は、例えばマイクロアレイ分析など、実験から得られるmRNA発現レベルでもよい。さらにこの数値は、例えばGAPDHなど、その発現が多数の細胞で多数の条件下で一定であるような基準遺伝子に対して標準化されたmRNAレベルであってもよい。他の実施態様では、コンピュータ内の数値が、様々な試料間で標準化された、又は、標準化されていないmRNAレベルの比、又はその間の違い、である。
【０１０８】
遺伝子発現プロファイル・データは、例えばエクセルの表など、表の形であってもよい。データは単独であっても、あるいは、例えば他の発現プロファイルを含むなど、より大きなデータベースの一部であってもよい。例えば、本発明の発現プロファイル・データは、公共データベースの一部であってもよい。本コンピュータ読み取り可能な形はコンピュータ内にあってもよい。別の実施態様では、本発明は、遺伝子発現プロファイル・データを表示するコンピュータを提供するものである。
【０１０９】
ある実施態様では、本発明は、対象の細胞などの第一の細胞におけるE3関連疾患の特徴である１種以上のE3遺伝子の発現レベルと、第二の細胞でのそれとの類似性を判定する方法であって、第一の細胞におけるE3関連疾患に特徴的な１種以上の遺伝子発現レベルを得るステップと、第二の細胞における前記E3関連疾患に特徴的な１種以上の遺伝子の発現レベルに相当する数値を含む記録を含むデータベースと、コンピュータ内に保存されたデータとの比較を目的とした１種以上の数値の選択を受け取ることのできる、ユーザ・インターフェースなどの処理装置命令とを含むコンピュータ内に、これらの数値を入力するステップと、を含む方法を提供するものである。当該コンピュータには、さらに、該比較データを、図もしくは表又は他の種類の出力に変換する手段を含めてもよい。
【０１１０】
別の実施態様では、本発明は、（ｉ）複数の遺伝子に関する遺伝子発現データを入力として受け取るコンピュータコードと、（ｉｉ）前記複数の遺伝子の個々からの前記遺伝子発現データを、共通の基準フレームに比較するコンピュータコードと、を含む遺伝子発現データを解析するためのコンピュータ・プログラムを提供するものである。
【０１１１】
さらに本発明は、以下のステップ：（ｉ）照会細胞内でのE3関連疾患に特徴的な１種以上の遺伝子発現レベルに相当する複数の数値を、１種以上の基準細胞の基準発現もしくは発現プロファイルデータと、細胞種のアノテーションとを含む記録を含むデータベースに比較するステップと、（ｉｉ）発現プロファイルの類似性に基づいて、どの細胞に当該照会細胞が最も類似しているかを示すステップと、を行うためのプログラム命令を含む機械読み取り可能又はコンピュータ読み取り可能な媒体を提供するものである。基準細胞は、E3関連疾患の様々な段階にある患者由来の細胞であってよい。
【０１１２】
二種の生物試料でのmRNAの相対的豊富度を、摂動、及び、判定されたその程度（即ち、検査した２つのmRNAのソース間で豊富度が異なる）として、又は、摂動無し（即ち相対的豊富度が同じ）として、採点することができる。多種の実施態様では、２つのRNA源間の、少なくとも約25%多い（一方のソースからのRNAが他方のソースよりも一方のソースにおいて、25%豊富である）、より通常は約50%多い、さらによりしばしば約2倍（２倍豊富）、3倍（３倍豊富）、又は5倍（５倍豊富）の違いを、摂動として採点する。摂動を、計算及び発現の比較のためにコンピュータに使わせることができる。
【０１１３】
好ましくは、正もしくは負の摂動を特定することに加え、摂動の大きさを判定すると有利である。これは、上述したように、示差的な標識に用いた２つの蛍光体の発光比を計算したり、又は、当業者には容易に明白であろう同様な方法により、行うことができる。
【０１１４】
作動時、遺伝子発現データを受け取る手段、前記遺伝子発現データを比較する手段、提示する手段、標準化する手段、及び、本発明のシステムの前後関係内でクラスタ化する手段には、ここで解説したそれぞれの機能性を、ハードウェア又はハードウェア及びソフトウェアで実施するプログラム済みコンピュータ；コンピュータ・プログラムにより命令される、ここで具体的に特定されたオペレーションを行う、プログラム済みコンピュータの論理回路又は他の構成要素；又は、ここに解説された特定の態様でコンピュータを機能させることのできるコンピュータ・プログラムを表す実行可能な命令で暗号化されたコンピュータ・メモリ、を含めることができる。
【０１１５】
当業者であれば、ここで解説したシステム及び方法は、例えばLinuxもしくはBSDなど多種のUNIX（登録商標）オペレーティング・システム、又は、MS-DOS又はマイクロソフト・ウィンドウズ（登録商標）などの適したオペレーティング・システムなどを実行するIBM互換性パーソナル・コンピュータなど、市販のハードウェア・システムを含め、いずれの適したプラットホームでも、支援され、また実行されようことは、理解されるであろう。ある実施態様では、本データ・プロセッサは、IRIX6.2を作動させる、マレット−プロセッサ、シリコン−グラフィック・チャレンジ・サーバに基づくMIPS R10000であってもよい。あるいは、そして選択的に、ここで解説したシステム及び方法を、本発明のプロセスを実施する埋め込み型プログラム可能データしょりシステムとして実現してもよい。例えば、本データ処理システムに、上述のデータ解析を行うためのラボラトリ装置の一部に組み込まれたシングルボード・コンピュータ・システムを含めることができる。該シングルボード・コンピュータ(SBC) システムは、マイクロプロセッサ、データ・メモリ及びプログラムメモリや、拡張可能なバス形状及びオンボード・オペレーティング・システムを含め、Micro/Sys 社が販売するSBCを含め、いずれの適したSBCであってもよい。
【０１１６】
選択によっては、本データ処理システムに、当業者に公知の充分なクロック速度及び充分なメイン・メモリを持つ Intel Pentium(R)ベースのプロセッサ又はAMDプロセッサ、あるいはこれらの均等物を含めてもよい。選択的な外部構成要素に、（典型的にはプロセッサ及びメモリと同梱された）一つ以上のハードディスク、テープ駆動装置、CDROMS デバイス、記憶領域ネットワーク、又は他のデバイスでもよい大量記憶システムを含めてもよい。他の外部構成要素には、「マウス」でもよい入力装置と一緒の、モニタでもよいユーザ・インターフェース・デバイス、又は、他のグラフィック入力装置、及び／又は、キーボード、がある。印刷装置も本コンピュータに取り付けることができる。
【０１１７】
典型的には、本コンピュータ・システムは、他のローカル・コンピュータ・システムに対するEthernet（登録商標）・リンクの一部や、遠隔コンピュータ・システム、又は、インターネットなどの広域コミュニケーション・ネットワークであってもよい、ネットワーク・リンクにも接続されている。このネットワーク回線により、本コンピュータ・システムに、他のコンピュータ・システムとデータ及び処理作業を共有させることができる。該ネットワークは、例えば、Apacheウェブ・サーバ・エンジンなど、Postgres SQL関係型データベース・エンジン及びウェブ・サーバを持つNFSネットワークであってもよい。しかしながら、当該サーバは、Apacheサーバを含むいずれのHTTPサーバ・プロセスを含め、いずれの適したサーバ・プロセスであってもよい。適したサーバが当業で公知であり、その教示を引用をもってここに援用することとするJamsa, Internet Programming, Jamsa Press (1995)に解説されている。従って、いくつかの実施態様では、ここで解説したシステム及び方法を、ネットワーク・アクセス及び遠隔アクセスを可能とするウェブ・ベースのシステム及びサービスとして実施してもよいことは理解されるはずである。この目的のために、本サーバにクライアント・ステーションと通信させてもよい。このクライアント・ステーションのそれぞれは、クライアント・ステーションがウェブ・ページなどのコンピュータ・ファイルをサーバからダウンロードできるようにする、例えばNetscape Navigatorブラウザ・プロセス、Microsoft Explorerブラウザ・プロセス、又はいずれの他の従来又は個人所有のブラウザ・プロセスなど、ブラウザとして動作できるクライアント・プロセスを備えた、PC互換性コンピュータ・システムなどの従来のパーソナル・コンピュータ・システムであってよい。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、ここに解説したシステム及び方法を、オペレーション中にメモリにロードできる一つ以上のソフトウェア・コンポーネントを含むソフトウェア・システムとして実現する。これらのソフトウェア・コンポーネントは集合的に、本コンピュータ・システムを、本発明の方法に従って機能させる。このような実施態様では、本システムを、Ｃ言語コンピュータ・プログラムとして実施しても、又は、Ｃ＋＋、Fortran、Java（登録商標）又はBASICを含む高レベル言語のいずれかで書かれたコンピュータ・プログラムとして実施してもよい。加えて、SBCを利用する実施態様では、本システム及び方法を、マイクロコードで書かれるか、あるいは、高レベル言語で書かれ、利用するプラットホームで実行可能なマイクロコードに圧縮された、コンピュータ・プログラムとして実現してもよい。このようなシステムの開発は当業者に公知であり、このような技術は、Digital Signal Processing Applications with the TMS320 Family, Volumes I, II, and III, Texas Instruments (1990)に記載されている。加えて、高レベルプログラミングのための概略的技術が公知であり、そして例えばStephen G. Kochan, Programming in C, Hayden Publishing (1983)に記載されている。
【０１１９】
加えて、いくつかの実施態様では、これらのソフトウェア・コンポーネントを、用いる予定のアルゴリズムを含め、プロセッシングの等式及び高レベル仕様の記号入力を可能にすることで、ユーザが個々の等式又はアルゴリズムを処理手順毎にプログラムしなくともよいようにする数学的ソフトウェア・パッケージ中にプログラムしてもよい。このようなパッケージには、Mathworks (マサチューセッツ州ナティック)社のMatlab、Wolfram Research 社（イリノイ州キャンペーン)のMathematica、又はMath Soft (マサチューセッツ州ケンブリッジ)社のS-Plus、がある。従って、ソフトウェア・コンポーネントは、本発明の解析方法を、手続き形言語又は記号パッケージでプログラムされた形で表す。ある好適な実施態様では、本コンピュータ・システムは、E3関連疾患に特徴的である１種以上の遺伝子の発現レベルを表す数値を含むデータベースも含有する。該データベースが、異なる細胞における、E3関連疾患に特徴的な遺伝子の１種以上の発現プロファイルを含んでいてもよい。
【０１２０】
用いるデータベースは、市販のMicrosoft Accessデータベース、Postgre SQL データベース・システム、MySQL データベース・システム、を含め、いずれの適したデータベース・システムでもよく、また選択に応じて、構内又は分散型データベース・システムでもよい。適したデータベース・システムのデザイン及び開発は、McGovern et al., A Guide To Sybase and SQL Server, Addison-Wesley (1993)に記載されている。本データベースには、 例えばハードディスク駆動装置、RAIDシステム、テープ駆動システム、フロッピー（登録商標）・ディスク、又はいずれの他の適したシステムなど、いずれの適した永久的データメモリの支援を受けさせてもよい。図２に示したシステム200は、複数の別々のデータベース・デバイスを示す。しかしながら、当業者であれば、他の実施態様では、該データベース・デバイスを、単一のシステムに統合できることを理解されよう。
【０１２１】
例示的な実施では、本発明の方法を実施するために、ユーザはまず発現プロファイルデータを本コンピュータ・システムにロードする。これらのデータをユーザにより、モニタ及びキーボードから直接入力することも、又は、ネットワーク接続で接続された他のコンピュータ・システムから入力することも、CD-ROM又はフロッピー（登録商標）・ディスクなどの取り外し可能な記憶媒体又はネットワークを通じて入力することもできる。次にユーザは、比較するステップと、例えばそれぞれ異なる遺伝子を遺伝子グループにクラスタ化するステップなどとを行う発現プロファイル解析ソフトウェアを実行する。
【０１２２】
例示的な実施では、本発明の方法を実施するために、ユーザはまず発現プロファイルデータを本コンピュータ・システムにロードする。これらのデータをユーザにより、モニタ及びキーボードから直接入力することも、又は、ネットワーク接続で接続された他のコンピュータ・システムから入力することも、CD-ROM又はフロッピー（登録商標）・ディスクなどの取り外し可能な記憶媒体又はネットワークを通じて入力することもできる。次にユーザは、比較するステップと、例えばそれぞれ異なる遺伝子を遺伝子グループにクラスタ化するステップなどとを行う発現プロファイル解析ソフトウェアを実行する。
【０１２３】
別の例示的な実施では、発現プロファイルを米国特許第 6,203,987号に解説された方法を用いて比較する。ユーザはまず、発現プロファイル・データを本コンピュータ・システムにロードする。ジーンセット・プロファイル定義を当該メモリに、記憶媒体又は遠隔コンピュータから、好ましくは動的ジーンセット・データベース・システムから、ネットワークを通じてロードする。次にユーザは、発現プロファイルの投影発現プロファイルへの変換ステップを行う投影ソフトウェアを実行する。こうして投影発現プロファイルが表示される。
【０１２４】
さらに別の例示的な実施では、ユーザはまず、投影プロファイルをメモリにロードする。次にユーザは、基準プロファイルのメモリへのローディングを行う。次にユーザは、プロファイルの客観的比較ステップを行う比較ソフトウェアを実行する。
【０１２５】
やはり、罹患細胞で示差的に発現する１種以上の薬物ターゲットタンパク質を同定したら、数多くの様々な検定を利用して、この薬物ターゲットタンパク質の当該疾患状態における役割を検査することができる。
【０１２６】
例えば、E3タンパク質が、ある特定の腫瘍種で過剰発現していると特定されたら、当業者であれば、数多くの検定を行うことにより、このE3の役割を容易に検査することができ、例えばアンチセンス・コンストラクト、RNAiコンストラクト、DNA酵素等の技術を用いて、腫瘍細胞株においてE3の発現を減少させて、このE3を阻害すると増殖が減少するかどうかを判定してもよいだろう。他の実施態様では、ドミナント・ネガティブ変異体、低分子、抗体等の技術を用いて、E#の活性を減少させてもよい。他の技術には、チミジン取り込みの判定など、増殖検定がある。
【０１２７】
Ｖ．  特定のヒト薬物ターゲットタンパク質の異常な活性が、さらに、疾患状態又は病的状態に関連している場合がある。
【０１２８】
例えば、E3タンパク質の、特定の疾患又は異常との関連付けにより、この疾患又は異常に関係している可能性のあるヒトE3タンパク質を包含する疾患特異的なデータベースが提供される。
【０１２９】
潜在的薬物ターゲットをバリデートする
別の局面では、本出願は、E3タンパク質などの所定のタンパク質を貴重な薬物ターゲットとしてバリデートする方法を提供するものである。ある実施態様では、本方法は、潜在的薬物ターゲットの発現を減少させ、このような発現の減少の影響を判定することを提案するものである。薬物ターゲットの発現は、例えばアンチセンス法、ドミナント・ネガティブ変異体、DNA酵素、RNAi、リボザイムの使用など、他にも多くあるが、当業で公知の数多くの方法により、減少させられよう。
【０１３０】
別の実施態様では、本方法は、潜在的薬物ターゲットの発現を増加させ、このような発現の増加の影響を判定することを、提案するものである。
【０１３１】
本発明の局面の１つは、単離された「アンチセンス」核酸を用いて、潜在的薬物ターゲットの転写及び／又は翻訳を阻害するなどにより、発現を阻害することに関する。該アンチセンス核酸は、通常の塩基対相補性により潜在的薬物ターゲットに結合しても、又は、例えばDNA二重鎖への結合の場合は、二重らせんの大溝との特異的相互作用を通じて、潜在的薬物ターゲットに結合してもよい。概略的には、これらの方法は、当業で広く用いられる技術範囲を言うものであり、その中には、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合に依拠するあらゆる方法が含まれる。
【０１３２】
本発明のアンチセンス・コンストラクトは、例えば、細胞内で転写されたときに、潜在的薬物ターゲットをコードする細胞内mRNAの少なくとも固有の部分に相補的なRNAを産生するような発現プラスミドなどとして、送達することができる。あるいは、該アンチセンス・コンストラクトは、ex vivoで作製され、そして細胞内に導入されたときに、潜在的薬物ターゲットのmRNA及び／又はゲノム配列とハイブリダイズすることにより、発現の阻害を起こすようなオリゴヌクレオチド・プローブである。このようなオリゴヌクレオチド・プローブは、好ましくは、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼなどの内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であり、従ってin vivoで安定な修飾されたオリゴヌクレオチドであるとよい。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとして用いられる核酸分子の例は、DNAのホスホールアミデート、ホスホロチオエート及びメチルホスホネート類似体である（さらに米国特許第5,176,996号；第5,264,564号；及び第5,256,775号も参照されたい）。加えて、アンチセンス治療法で有用なオリゴマを構築する概略的アプローチは、例えばVan der Krol et al. (1988) BioTechniques 6:958-976；及びStein et al. (1988) Cancer Res 48:2659- 2668にレビューがある。
【０１３３】
アンチセンスDNAの場合、翻訳開始部位、例えば潜在的薬物ターゲットの-10乃至＋10領域の間、を由来とするオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。アンチセンス法には、潜在的薬物ターゲットをコードするmRNAに相補的なオリゴヌクレオチド（DNA又はRNAのいずれでも）のデザインが含まれる。このアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、mRNA転写産物に結合して翻訳を妨げることとなる。絶対的な相補性は、確かに好ましいが、必要ではない。従って、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖DNAの一本の鎖を検査しても、又は、三重鎖形成を検定してもよい。ハイブリダイズ能は、アンチセンス核酸の相補性の程度及び長さの両方に依存するであろう。一般的には、ハイブリダイズする核酸が長いほど、安定な二重鎖（又は該当する場合には三重鎖）を形成しながらも、それが含有するRNAとの塩基ミス対合が多くなるであろう。当業者であれば、標準的な手法を用いて、ハイブリダイズした複合体の溶融点を決定することにより、ミス対合の許容可能な程度を確認することができる。
【０１３４】
例えば5'末端非翻訳配列から、AUG開始コドンを含むこのAUG開始コドンまでなど、mRNAの5'末端に相補的なオリゴヌクレオチドが、翻訳を阻害する上で最も効率的に働くはずである。しかしながら、最近、mRNAの3'非翻訳配列に相補的な配列も同様に、mRNAの翻訳を阻害する上で効果的であることが示された (Wagner, R. 1994.  Nature 372:333)。従って、ある遺伝子の5'もしくは3'非翻訳、非コーディング領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドを、mRNAの翻訳を阻害するアンチセンス法で用いることができよう。mRNAの5'非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドには、AUG開始コドンの相補体も含まれるはずである。mRNAコーディング領域に相補的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、効率の低い翻訳阻害物質ではあるが、やはり、本発明に従って利用できよう。mRNAの5'、3'、又はコーディング領域のいずれにハイブリダイズするように、デザインされているかに関係なく、アンチセンス核酸は少なくとも6ヌクレオチド長でなければならず、また好ましくは約100未満、そしてより好ましくは約50、25、17又は10 ヌクレオチド長未満でなければならない。
【０１３５】
ターゲット配列の選択にかかわらず、in vitro研究をまず行って、遺伝子発現を阻害する上での当該アンチセンス・オリゴヌクレオチドの阻害能を定量するために、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの能力を定量することが好ましい。これらの研究では、アンチセンス遺伝子阻害と、オリゴヌクレオチドの非特異的生物学的効果とを区別する制御を利用することが好ましい。また、これらの研究では、標的RNAもしくはタンパク質レベルと、内部コントロールRNAもしくはタンパク質のそれとを比較することも好ましい。加えて、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いて得られた結果を、コントロール・オリゴヌクレオチドを用いて得られたものと比較することも、想到されている。該コントロール・オリゴヌクレオチドが、検査オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さのものであり、そしてオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、アンチセンス配列と、標的配列への特異的ハイブリダイゼーションを妨げるのに必要な分を越えずに、異なることが好ましい。
【０１３６】
当該オリゴヌクレオチドはDNAでも、又はRNAでも、又はこれらのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは改変型でも、一本鎖又は二本鎖でもよい。当該オリゴヌクレオチドを塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格部分で修飾して、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を向上させることなどができる。当該オリゴヌクレオチドには、他の付属の基、例えばペプチド（例えばホスト細胞受容体を標的化するため）、又は、細胞膜透過輸送を促す作用物質（例えば Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Publication No. W088/09810, published December 15, 1988を参照されたい)もしくは血液脳関門（例えば PCT公報No. W089/10134、１９８８年４月２５日公開、を参照されたい）を透過した輸送を促す作用物質、ハイブリダイゼーション惹起性開裂剤、（例えばKrol et al., 1988, BioTechniques 6:958- 976を参照されたい）又は介在物質（例えば、 Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549を参照されたい）を含めてもよい。この目的のために、当該オリゴヌクレオチドを別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション惹起性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション惹起性開裂剤等、に結合させてもよい。
【０１３７】
本アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、限定はしないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5- (カルボキシヒドロキシチエチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6- イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸 (v)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3- N-2-カルボキシプロピル) ウラシル、(acp3)w、及び2,6-ジアミノプリンを含む群より選択される少なくとも１つの修飾された塩基部分を含んでもよい。
【０１３８】
さらに本アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、限定はしないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群より選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含んでもよい。
【０１３９】
さらに本アンチセンス・オリゴヌクレオチドには、中性のペプチド様骨格を含有させることもできる。このような分子はペプチド核酸（PNA）-オリゴマと呼ばれ、例えばPerry-O'Keefe et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670 及び Eglom et al. (1993) Nature 365:566に解説されている。PNAオリゴマの長所の１つは、DNAの骨格が中性であるために、培地のイオン強度とは基本的に独立に、相補DNAに結合できるというそれらの能力である。さらに別の実施態様では、本アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホールアミドチオエート、ホスホールアミデート、ホスホールジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタル又はこれらの類似体、から成る群より選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸骨格を含む。
【０１４０】
更なる実施態様では、本アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、 -アノマー位オリゴヌクレオチドである。 -アノマー位のオリゴヌクレオチドは、特異的二本鎖ハイブリッドを、相補RNAと共に形成するが、このとき、通常の  -ユニットとは対照的に、それらの鎖は相互に並行に並ぶ（Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641)。このオリゴヌクレオチドは2'-0-メチルリボヌクレオチド (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148)、又はキメラRNA-DNA類似体 (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330)である。
【０１４１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成装置（例えばバイオサーチ社、アプライド・バイオシステムズ社等から市販されているものなど）を使用するなど、当業で公知の常法により合成できよう。例として、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドは、Stein et al.  (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209)の方法により合成でき、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチドは、制御されたポア・ガラスのポリマ支持体を用いるなどで、調製できる (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451)。
【０１４２】
mRNA配列のコーディング領域に相補的なアンチセンス・ヌクレオチドを使用することができるが、転写される非翻訳領域やこの領域に相補的なもの。
【０１４３】
いくつかの場合では、内因性mRNAの翻訳を抑制するのに充分な細胞内濃度のアンチセンスを達成することが難しいかも知れない。従って、好適なアプローチでは、アンチセンス・オリゴヌクレオチドが強力なpol III 又は pol II プロモータの制御下に置かれた組換えDNAコンストラクトを利用する。標的細胞をこのようなコンストラクトを用いてトランスフェクトすると、充分な量の一本鎖RNAが転写されて、内因性潜在的薬物ターゲット転写産物と相補的塩基対を形成して、翻訳を妨げることになるであろう。例えば、細胞に取り込まれ、アンチセンスRNAの転写を命令するように、ベクタを導入することができる。このようなベクタは、エピソームのままであっても、又は、転写されて 所望のアンチセンスRNAを生じることができる限り、染色体に組み込まれてもよい。このようなベクタは、当業で標準的な組換えDNA技法により、構築することができる。ベクタは、哺乳動物細胞での複製及び発現に用いられる、当業で公知のプラスミド、ウィルス、又は他のものであってもよい。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞で働くことが当業で公知の、いずれのプロモータによってもよい。このようなプロモータは、誘導性でも、又は構成的でもよい。このようなプロモータには、限定はしないが、：SV40初期プロモータ領域 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウィルスの3'末端の長い末端反復配列に含まれたプロモータ(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797)、疱疹チミジン・キナーゼ・プロモータ (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al, 1982, Nature 296:39-42)等、がある。いずれの種類のプラスミド、コスミド、YACもしくはウィルス・ベクタを用いても、本組換えDNAコンストラクトを調製でき、このコンストラクトを組織部位に直接導入することもできる。
【０１４４】
選択的には、目的の遺伝子の調節領域（即ちプロモータ及び／又はエンハンサ）に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列をねらい撃ちして、身体の標的細胞内で当該遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成させることにより、潜在的薬物ターゲット遺伝子発現を低下させることもできる。（概略的には、Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene, C., et al., 1992, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:27-36; and Maher, L.J., 1992, Bioassays 14(12):807-15を参照されたい）。
【０１４５】
転写阻害のために三重らせんを形成させるのに用いる核酸分子は、好ましくは、一本鎖で、デオキシリボヌクレオチドから成るとよい。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、二重鎖の一方の鎖にプリン又はピリミジンのいずれかから成る大きな領域が存在することが一般に必要なフーグスティーン型塩基対の規則を通じて、三重らせん形成を促進するはずである。ヌクレオチド配列はピリミジンをベースにしていてもよく、その場合、でき上がる三重らせんの三本の結合鎖全体にTAT及びCGC三重項が生ずるであろう。このピリミジン−リッチな分子は、二重鎖の一本の鎖のプリン−リッチな領域に対して、この鎖と平行な方向の塩基相補性を提供する。加えて、例えばG残基が続く領域を含有するなど、プリン−リッチな核酸分子を選んでもよい。これらの分子は、GCペアが豊富にあるDNA二重鎖と三重らせんを形成し、この場合プリン残基の大半が、標的となった２重鎖の一本の鎖の上に位置しており、その結果、三重鎖の三本の鎖全体にCGC三重項が延びることになるであろう。
【０１４６】
代替的には、三重らせん形成の標的とできる潜在的配列を、所謂「スイッチバック」核酸分子を作製することにより、増加させてもよい。スイッチバック分子は、5'-3'、3'-5'と交互の態様で合成されるため、二重鎖の一番目の一本の鎖と塩基対を成し、そして次に他方と成す結果、二重鎖の一本の鎖上にプリン又はピリミジンの大きな領域が存在する必要が無くなる。
【０１４７】
本発明のアンチセンスRNA及びDNA、リボザイム、並びに三重らせん分子を、DNA及びRNA分子の合成について当業で公知のいずれの方法でも、調製してよい。これらには、例えば固相ホスホロアミジト化学合成など、当業で公知の、オリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドの化学合成技術が含まれる。あるいは、RNA分子を、当該アンチセンスRNA分子をコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写により、作製してもよい。このようなDNA配列を、T7もしくはSP6ポリメラーゼ・プロモータなど、適したRNAポリメラーゼ・プロモータを導入した多種のベクタ内に導入してもよい。あるいは、アンチセンスRNAを、用いるプロモータに応じて構成的もしくは誘導により合成するアンチセンスcDNAコンストラクトを、細胞株内に安定に導入することもできる。
【０１４８】
本発明の好適な実施態様は、RNA干渉（RNAi）により１種以上の標的遺伝子の抑制を行う材料及び方法を利用するものである。RNAiは、真核細胞内で起こさせることのできる配列特異的転写後遺伝子抑制のプロセスである。概略的には、このプロセスは、ある特定の配列のmRNAの、その配列に相同な二本鎖RNA（dsRNA）により誘導される分解に関係する。例えば、ある特定の一本鎖mRNA（ss mRNA）の配列に対応する長いdsRNAが発現すると、そのメッセージが不安定になって、対応する遺伝子の発現に「干渉」することになるであろう。従って、いずれの所定の遺伝子も、その遺伝子のmRNAの全部又は実質的な部分に対応するdsRNAを導入することにより、抑制できよう。長いdsRNAを発現させると、それはまずリボヌクレアーゼIIIでプロセッシングされて21乃至22塩基対長という短いdsRNAオリゴヌクレオチドになるようである。さらに、従って、RNAiは、比較的に短い相同dsRNAを導入又は発現させても、起こさせられるようである。実際、比較的に短い相同dsRNAの使用は以下に論じるようにいくつかの利点を有するであろう。
【０１４９】
哺乳動物細胞は、二本鎖RNA（dsRNA）の影響を受ける少なくとも２つの経路を有する。RNAi（配列特異的）経路においては、上に解説したように、最初のdsRNAがまず短い干渉性（si）RNAに分割される。このsiRNAは、各3'末端に２つのヌクレオチドの突出部を持つほぼ19ヌクレオチドのsiRNAを形成する約21ヌクレオチドのセンス及びアンチセンス鎖を有する。短い干渉性RNAは、特定のメッセンジャーRNAを分解の標的にできる配列情報を提供すると考えられる。対照的に、非特異的経路は、少なくとも約30塩基対長あればいずれの配列のdsRNAによっても、惹起される。この非特異的作用が起きるのは、dsRNAが２つの酵素を活性化するからである。２つの酵素の１つは、活性化型のときに翻訳開始因子eIF2をリン酸化して、タンパク質合成のすべてを停止させるPKRと、あらゆるmRNAを標的とする非特異的酵素であるRnase Lを活性化する分子を合成する2',5'オリゴアデニル酸シンターゼ（2', 5'-AS)である。この非特異的経路は、ストレス又はウィルス感染に対するホスト応答を表していると思われ、そして一般的には、この非特異的経路の作用を、本発明の好適な方法で最小限にすることが好ましい。意味深いことに、長いdsRNAが、この非特異的経路を誘導するのに必要なようであり、従って、約30塩基対より短いdsRNAが、RNAiによる遺伝子抑制を起こさせるには好適である(Hunter et al. (1975) J Biol Chem 250: 409-17; Manche et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 5239-48; Minks et al. (1979) J Biol Chem 254: 10180-3; 及び Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-8を参照されたい）。
【０１５０】
RNAiはカエノルハブジティス−エレガンス（原語：Caenorhabditiis elegans）（例えばFire et al. (1998) Nature 391: 806-11を参照されたい）、マウス卵及び胚（Wianny et al. (2000) Nature Cell Biol 2: 70-5; Svoboda et al. (2000) Development 127: 4147-56）、及び培養RAT-1線維芽細胞（Bahramina et al. (1999) Mol Cell Biol 19: 274-83）を含め、数多くの様々な生物で標的遺伝子の発現を低下又は消失させる上で効果的であることが示されており、真核性植物及び動物に見られる古代に進化した経路であるようである(Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-90)。RNAi は、HeLa 細胞、NIH/3T3 細胞、COS 細胞、293 細胞及びBHK-21 細胞を含め、様々な細胞種で遺伝子発現を減少させる効果的な手段であることが立証されており、典型的には、アンチセンス技術を用いて達成されるよりも低いレベルまで、遺伝子発現を減少させ、そして実際に、発現を完全に消失させることもしばしばある（Bass (2001) Nature 411: 428-9を参照されたい）。哺乳動物細胞においては、siRNAは、アンチセンス実験で典型的に用いられる濃度よりも数分の１に低い濃度で効果的である (Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-8)。
【０１５１】
RNAiを起こさせるために用いられる二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは30塩基対長未満、そしてより好ましくは約25、24、23、22、21、20、19、18 又は17 塩基対のリボ核酸を含むとよい。選択的には、本発明のdsRNAオリゴヌクレオチドは、3'突出末端を含んでいてもよい。2-ヌクレオチド3' 突出部の例は、いずれの種類のリボヌクレオチド残基から成るものでもよく、そしてRNA合成のコストを低くする2'-デオキシチミジン残基から成っていてもよく、そして細胞培地及びトランスフェクト細胞でのsiRNAのヌクレアーゼ耐性を高めるものでもよい（Elbashi et al. (2001) Nature 411: 494-8を参照されたい）。50、75、100 又はさらに500 塩基対長以上の長いdsRNAも、本発明のいくつかの実施態様では使用してよい。RNAiを起こさせるdsRNA濃度の例は、約0.05 nM、0.1 nM、0.5 nM、1.0 nM、1.5 nM、25 nM 又は100 nMであるが、処理する細胞の性質、遺伝子ターゲットや、当業者に容易に認められる他の因子に応じて、他の濃度を用いてもよい。例示的なdsRNAは、化学合成されるか、又は、適した発現ベクタを用いてin vitro又はin vivoで産生されるものであろう。合成RNAの例には、 当業で公知の方法を用いて化学合成される21ヌクレオチドRNAがある（例えばエクスピダイトRNAホスホールアミジト及びチミジンホスホールアミジト（ドイツ、プロリゴ社）。好ましくは合成オリゴヌクレオチドを、当業で公知の方法を用いて脱保護及びゲル精製するとよい（例えばElbashir et al. (2001) Genes Dev. 15: 188-200を参照されたい）。長いRNAは、当業で公知の、例えばT7ポリメラーゼ・プロモータなどのプロモータから転写させてよい。一個のRNA標的を、in vitroプロモータの下流の可能な両方の方向に配置すると、この標的の両方の鎖を転写して、所望の標的配列のdsRNAオリゴヌクレオチドを生じるであろう。
【０１５２】
オリゴヌクレオチドのデザインで用いる具体的な配列は、標的の発現遺伝子メッセージ内に含有されたヌクレオチドから成る、いかなる連続的配列であってもよい。当業で公知のプログラム及びアルゴリズムを用いれば、適した標的配列を選択できよう。加えて、特定の一本鎖核酸配列の二次構造を予測するようデザインされ、また折り畳まれたmRNAのうちで露出した一本鎖領域に来ると思われる配列を選択できるプログラムを用いて、最適な配列を選択することができる。適したオリゴヌクレオチドをデザインする方法及び組成物は、例えば、その内容を引用をもってここに援用することとする米国特許第6,251,588号に見られよう。メッセンジャRNA (mRNA) は一般に、リボヌクレオチドの配列内にタンパク質合成を命令する情報を含有した線形の分子であると考えられているが、数々の研究で、数多くの二次及び三次構造が大半のmRNAに存在することが判明している。RNA中の二次構造要素は、同じRNA分子の異なる領域間でのワトソン−クリック型相互作用により概ね形成される。重要な二次構造要素には、分子内二本鎖領域、ヘアピン・ループ、二重鎖RNAのバルジ、及び内部ループ、がある。三次構造要素は、二次構造要素が互いに又は一本鎖領域と接触して、より複雑な三次元構造を生じるときに形成される。多数の研究者が、多くのRNA二重鎖構造の結合エネルギを測定しており、RNAの二次構造を予測するために使用できる一組の規則を得ている（例えばJaeger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706 (1989)；及び Turner et al. (1988) Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 17:167を参照されたい）。これらの規則は、RNA構造要素の特定、そして特に、サイレンシングRNAi、リボザイム又はアンチセンス技術の標的にするのに好適なmRNA部分であろう一本鎖RNA領域を特定する上で、有用である。従って、mRNA標的の好適な部分を特定して、RNAi媒介性dsRNAオリゴヌクレオチドのデザインに使用したり、また、本発明の適したリボザイム組成物やハンマーヘッド・リボザイム組成物のデザインに使用することができる。
【０１５３】
該dsRNAオリゴヌクレオチドは、接着細胞株についてメーカが解説した例えばリポフェクタミン2000（ライフ・テクノロジーズ社）など、当業で公知のリポソームなどの担体組成物を用いて、異種標的遺伝子をトランスフェクトすることにより、細胞内に導入してよい。内因性遺伝子を狙うdsRNAオリゴヌクレオチドのトランスフェクションを、オリゴフェクタミン（ライフ・テクノロジーズ社）を用いて行ってもよい。hGFPをコードしたpAD3 (Kehlenback et al. (1998) J Cell Biol 141: 863-74)の同時トランスフェクト後の哺乳動物細胞株に、蛍光顕微鏡法を用いて、トランスフェクション効率をチェックしてもよい。RNAiの効果は、dsRNAの導入後に、数多くある検定法のいずれによっても、評価してよい。これらには、新たなタンパク質合成を抑制した後に、内因性プールのターンオーバーに充分な時間経過してから、標的遺伝子産物を認識する抗体を用いるウェスタン・ブロット分析や、既存の標的mRNAのレベルを判定するノーザン・ブロット分析がある。
【０１５４】
RNAi技術の更なる組成物、方法及び用途は、引用をもってここに援用することとする米国特許出願第6,278,039号、第5,723,750号及び第5,244,805号に紹介されている。
【０１５５】
潜在的薬物ターゲットmRNA転写産物を触媒作用で開裂させるようデザインされたリボザイム分子を用いても、mRNAの翻訳を妨げることができる（例えば1990年10月４日公開のPCT国際公報WO90/11364；Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225 及び米国特許第5,093,246号を参照されたい）。部位特異的認識配列でmRNAを開裂させるリボザイムを用いて特定のmRNAを破壊することもできるが、ハンマーヘッド・リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド・リボザイムは、mRNAを、標的mRNAと相補的塩基対を形成する領域でフランクされたことで決定される位置で開裂させる。唯一の必要条件は、標的mRNAが以下、２つの塩基から成る配列：5'-UG-3'を有することである。ハンマーヘッド・リボザイムの構築及び作製は当業で公知であり、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591に、より十二分に解説されている。
【０１５６】
さらに本発明のリボザイムには、テトラヒメナ−サーモフィラ（原語：Tetrahymena thermophila ）（IVS、又はL-19 IVS RNAとして知られる)に天然で存在し、Thomas Cech 及び共同研究者 (Zaug, et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324:429-433; published International patent application No. WO88/04300 by University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47:207-216)が広汎に解説したものなど、RNAエンドリボヌクレアーゼ（以後「Cech型リボザイム）がある。このCech型リボザイムは８塩基対の活性部位を有するが、この部位が標的RNAにハイブリダイズすると、標的RNAの開裂が起きる。本発明は、８塩基対活性部位配列を標的決定してあるこのようなCech型リボザイムを包含するものである。
【０１５７】
アンチセンス法と同様に、本リボザイムを、（例えば安定性、標的決定性等を高めるなどのために）修飾されたオリゴヌクレオチドから構成することができるが、潜在的薬物ターゲットを発現している細胞に送達されねばならない。好適な送達方法は、トランスフェクトされた細胞が、標的とされたメッセージを破壊し、翻訳を阻害するのに充分な量のリボザイムを産生するように、当該リボザイムを強力な構成的pol III又はpol IIプロモータの制御下で「コードしている」DNAコンストラクトの使用を含む。アンチセンス分子とは違い、リボザイムは触媒性であるために、効率のために必要な細胞内濃度は低い。
【０１５８】
本発明の更なる局面は、DNA酵素を用いて潜在的薬物ターゲットの発現を減少させることに関する。DNA酵素はアンチセンス及びリボザイム技術の両方の機械的特徴をいくつか取り入れたものである。DNA酵素は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドと大変に同様に特定の標的核酸配列を認識するが、またリボザイムと大変同様に触媒性で、かつ、標的核酸を特異的に開裂させるように、デザインされる。
【０１５９】
現在、２つの基本的な種類のDNA酵素があるが、それらの両者とも、サントロ氏及びジョイス氏により同定されたものである（例えば米国特許第6110462号を参照されたい）。（図１に概略的に示された）この10-23DNA酵素は、二本のアームを接続するループ構造を含む。これら二本のアームは、特定の標的核酸配列を認識することで特異性を提供するが、他方、ループ構造は、生理条件下における触媒機能を提供する。
【０１６０】
簡単に説明すると、標的核酸を特異的に認識し、開裂させる理想的なDNA酵素をデザインするためには、当業者はまず、固有の標的配列を特定しなければならない。これは、アンチセンス・オリゴヌクレオチドに関して概説したのと同じアプローチを用いて行うことができる。好ましくは、該固有もしくは実質的な配列は約18乃至22個のヌクレオチドから成るG/Cリッチである。G/Cの含有量が高いことは、DNA酵素と標的配列との間の強力な相互作用を確実に起こさせる助けとなる。
【０１６１】
DNA酵素を合成する場合、酵素の標的を当該メッセージに設定するであろう特異的アンチセンス認識配列を、それがDNA酵素の二本のアームを含むように分割し、そのDNA酵素のループを２つの特異的アーム間に配置する。
【０１６２】
DNA酵素を作製し、投与する方法は、例えば米国第6110462号に見ることができる。同様に、in vitro又はin vivoでDNAリボザイムを送達する方法には、上に概説したRNAリボザイムを送達する方法が含まれる。加えて、当業者であれば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドと同様に、DNA酵素を、安定性を高めたり、また分解に対する耐性を高めるために、選択的に修飾することができることは認識されよう。
【０１６３】
さらに本発明を以下の実施例で描出することとするが、以下の実施例を何ら限定的なものとして捉えられてはならない。本出願全般を通じて引用された参考文献、発行済特許、公開済みもしくは未公開の特許出願を含め、全ての引用文献の内容を、引用をもってここに援用することを明示しておく。本発明の実施にあたっては、そうでないと明示しない限り、当業者の通常の技術水準である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の常法を用いることになるであろう。このような技術は文献に十二分に説明されている（例えばMolecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. 米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984);  (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); , Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986を参照されたい）。
【０１６４】
実施例
実施例
実施例１：  データベースを作製する方法
以下の手法では、データベースの作製の一例を示す。
【０１６５】
１．  NCBIタンパク質データベースをNCBI ftp サイト: ftp.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードする。
２．  hum nrを検索する：以下の url: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/batch.html. からヒト配列をすべて、自動的に検索する。HTMLフォームで、検索対象のホモ・サピエンスのタンパク質配列すべてを明示することができる。
３．  タンパク質がヒトタンパク質であるかどうかを、完全nrファイルをncbi ftp サイトからfastaフォーマットでダウンロードすることで、判定する。記述文章（即ち１行目）の末尾にあるパターン［ホモ−サピエンス］を有する配列をすべて、解析する。
４．  配列をきれいにする：次にこれらの配列をきれいにする。ヒトnr fastaファイルをきれいにするために２つのスクリプトを実行する。最初のスクリプトでは、重複する配列がすべて消去され、１つしかない配列が全て残される。２番目のスクリプトでは、短い（30 aa未満）配列が全て除かれる。
５．  RPS-Blastを実行する：RPS-Blastを（Pfam、SMART及びLOAD ドメインを含有する）CDDデータベースに対して構内実行する。加えて、我々はプロサイト・データベース内のドメインを探す。さらに我々は配列内の様々な特徴を探す：膜貫通領域(alom2、tmap)、シグナル・ペプチド及び他の内側ドメイン／特徴。
６．  E3タンパク質を発見する：この検索は自動的に行われる。我々は以下のドメイン(Hect、Ring、Ubox、Fbox、PHD)のうちの１つ以上を有するタンパク質をすべて、探す。これら５つのドメインは、異なるデータベース(pfam、smart 及びprosite)に異なる名称で出ている。我々の検索では、我々は、全てのデータベースの、すべて異なる名称で出ているこれらのドメインを探す。
７．  ユニジーン・クラスタ・データ：我々はクラスタ（Hs.データ・ファイル）を以下のurl: ftp://ncbi.nlm.nih.gov/repository/UniGene/. からダウンロードする。
８．  E3対ユニジーン：我々は、E3表の各E3タンパク質を見る。：こうしてそれがどのユニジーン・クラスタに属するかを判断する。
９．  我々は、どの他のタンパク質がE3クラスタ中にあるか、どれがE3タンパク質でないかをチェックし、それらをE3データベースに導入する。
【０１６６】
加えて、多重配列アライメントを全クラスタ・メンバ間で、相対的なゲノム断片に対して行ってもよい。この方法で、我々は遺伝子の選択的転写産物を見ることができる。
【０１６７】
具体的には、RPS-Blastを少なくとも２回、実行してもよい。１回目の実行では、0.0lのE値を用いてもよく、次に全てのドメインを、ヒトnrに対して実行してもよい。２回目の実行では、10のE値を用いてもよく、E3 ドメイン (hect、ring、ubox、fbox、phd)のみを、ヒトnrに対して実行する。この態様では、本データベースは、有する偽陽性の数は少なくなる一方で、E3ドメインに対する感受性は高くなるであろう。
【０１６８】
さらに、本E3データベースには、記事へのリンク、特許へのリンク、タンパク質のアノテーション、及び特定のタンパク質に関して入手可能な他の生物学的情報を統合することができる。
【０１６９】
１種以上のデータベースに取り入れてもよいE3ポリペプチド及び核酸の例を、本文末尾に添付した表２に挙げる。出願人は、表２に提供した登録番号に対応する核酸及びアミノ酸配列を、引用をもってここに援用するものである。
【０１７０】
実施例２：  目的のドメイン及び／又はモチーフ
Ａ．  ウィルスの生物発生、成熟及び放出で役割を果たしていると思われるタンパク質ドメイン
E3−  E3ユビキチン−タンパク質・リガーゼのドメイン
【０１７１】
RING - 
SMART SM0184; RING = RNF、E3ユビキチン−タンパク質・リガーゼ活性はc-Cb1のRINGドメインに固有であり、このドメインの全体的機能である可能性が高い；多種のRINGフィンガーはE2、即ちユビキチン結合酵素（UBC）、に対する結合活性を示す。
【０１７２】
HECTc -
SMART SM0119; Pfam PF00632; HECTc = HECT、E3ユビキチン−タンパク質・リガーゼ。E2酵素に結合できる。名称HECTは「E6-AP カルボキシル末端に相同」を由来とする。このドメインをＣ末端に含有するタンパク質は、CDC25のユビキチン化を調節するユビキチン−タンパク質・リガーゼ活性を有する。ユビキチン−タンパク質・リガーゼは、E2ユビキチン結合酵素からユビキチンをチオエステルの形で受け取り、その後、このユビキチンを標的の基質に直接輸送する。システイン残基がユビキチン−チオエステル形成に必要である。ヒト甲状腺受容体相互作用性タンパク質１２も、このドメインを含有すると共に、甲状腺ホルモン受容体のリガンド結合ドメインと相互作用するATP依存的多サブユニットタンパク質の構成要素である。それはE3ユビキチン−タンパク質・リガーゼであるかも知れない。ヒトユビキチン−タンパク質リガーゼE3Aは、癌関連ヒト乳頭腫ウィルス16及び18型のE6タンパク質と相互作用する。そのE6/E6-AP複合体は、ユビキチン媒介性タンパク質分解のために、P53腫瘍抑制タンパク質に結合して標的決定する。
【０１７３】
F-BOX -
SMART SM0256; Pfam PF00646; F-BOX = FBOX = F-box = Fbox。F-box ドメインは最初、タンパク質SKP1と相互作用するサイクリン-F内に見られる配列ドメインとして、解説された。このドメインは多くのタンパク質に存在し、標的タンパク質とユビキチン結合酵素との間のリンクとして働く。SCF複合体（例えばSkp1-キューリン-F-box) は、ユビキチンタンパク質分解経路においてE3リガーゼと同様の役割を果たす。
【０１７４】
U-BOX
SMART SM0504.  U-box ドメイン は、Zn2＋結合リガンドの完全補体のない修飾されたRINGフィンガー・ドメインである。それは pre-mRNAスプライシング因子、いくつかの仮定タンパク質、及びユビキチン融合分解タンパク質2に見られ、これらにおいてE2依存的ユビキチン化に関与しているかも知れない。
【０１７５】
PHD -
SMART SM0249.  PHDドメインは、クロマチン媒介性転写調節に関与していると考えられる核内タンパク質に見られるC4HC3亜鉛フィンガー様モチーフである。PHDフィンガー・モチーフ は、C3HC4型RINGフィンガーを思わせるが、C3HC4型RING フィンガーとは異なる。RINGフィンガー及びLIMドメインと同様に、PHDフィンガーは２つの亜鉛イオンに結合すると予測されている。
【０１７６】
B.  ウィルスの生物発生、成熟及び放出において、E3ユビキチン−タンパク質リガーゼとの組み合わせで役割を果たしているであろうタンパク質ドメイン
RCC1 -   AP1を活性化してクラスリンを重合させるARF1など、小型GTPaseと相互作用するドメイン
Pfam PF00415; この染色体凝縮調節物質(RCC1) [MEDLINE: 93242659] は、クロマチンに結合する真核性タンパク質であり、核内GTP結合タンパク質IPR002041であるranと相互作用して、結合したGDPの消失や、新鮮なGTPの取り込みを促進することで、グアニン−ヌクレオチド解離刺激物質（GDS）として働く。RCC1のranとの相互作用は、おそらく、遺伝子発現の調節にとって重要な役割を果たしているであろう。RCC1は、酵母のPRP20又はSRM1、分裂酵母のpim1及びドゥロソフィラのBJ1としても知られ、約50乃至60個のアミノ酸から成るドメインの７回タンデム反復配列を含有するタンパク質である。以下の概略図に示すように、この反復配列は、このタンパク質の全長のうちで主要な部分を成す。この反復領域の外側には、約40乃至50個の残基から成る小さなN-末端ドメインがあるのみであり、そしてドゥロソフィラタンパク質だけに、約130個の残基から成るC-末端ドメインがある。
【０１７７】
WW - HIVのgag L-ドメイン上のPxxPP 配列と相互作用するドメイン
SMART SM0456; Pfam PF00397; WWP 又はrsp5 ドメインとしても知られる。プロリン−リッチなポリペプチドに結合する。このWW ドメイン (rsp5 又はWWPとしても知られる)は、数多くの無関係なタンパク質間での短い保存領域であり、その中に、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの原因であるジストロフィンがある。この短いドメインは、いくつかのタンパク質では最高４回まで、繰り返される。このWWドメインは、特定のプロリン-ドメイン、[AP]-P-P-[AP]-Yを持つタンパク質に結合し、一般的にはTrpである保存された芳香族位置を有する。名称WW 又はWWPはこれらのTrpの存在や、保存されたProの存在を由来とする。それはしばしば、シグナル伝達プロセスのためのタンパク質に典型的な多のドメインとも関連付けられる。このWWドメインを含有する多種のタンパク質が公知である。これらには、多ドメイン細胞骨格タンパク質であるジストロフィン；機能が未知のジストロフィン様タンパク質であるユトロフィン；未知のセリンキナーゼの基質である脊椎動物YAPタンパク質：胚の発生や、中枢神経系の分化に関与するマウスNEDD-4；その分子機構がNEDD-4に似た酵母RSP5；肝臓で優先的に発現する転写因子アクチベータであるラットFE65；タバコDB10 タンパク質等、がある。
【０１７８】
C2 - ホスホリピド、イノシトールポリホスフェート、及び細胞内タンパク質と相互作用するドメイン
SMART SM0239; Pfam PF00168；（とりわけ）ホスホリパーゼ、プロテインキナーゼＣ、及びシナプトタミン（原語：synaptotamin）に存在するCa2+結合ドメイン。中にはCa2+結合部位を含有しなさそうなものもある。特定のC2は、ホスホリピド、イノシトールポリホスフェート、及び細胞内タンパク質に結合するようである。パーフォリンには普通は存在しない。シナプトタグミン（原語：synaptotagmin）及びPLC C2は、Ｎ及びＣ末端ベータ鎖について配列上、置換している。SMARTでは、C2 ドメインが、２つのプロファイルの一方又は両方を用いて検出される。
【０１７９】
Interpro 抄録 (IPR000008): プロテインキナーゼＣ（PKC）のいくつかのイソ酵素が、（ホルボールエステル及びジアシルグリセロールに結合する） C1ドメイン及びプロテインキナーゼ触媒ドメインの２つのコピー間に位置する。このC2ドメインに有意な相同性を有する領域が多くのタンパク質で見つかっている。このC2 ドメインは、カルシウム依存的ホスホリピド結合に関与していると考えられる。このC2 ドメインに関係するドメインは、カルシウムを結合させないタンパク質にも見られるため、例えば, イノシトール-1,3,4,5-テトラホスフェートへの結合など、このC2ドメインの他の推定上の機能が示唆されている。シナプトタグミンのC2ドメインの三次元構造で、このドメインが、C2 keyと命名された、保存された４ストランド・ドメインの周りに構築された８ストランドのベータ−サンドイッチを形成していることが報告されている。カルシウムは、このC2-keyドメインのＮ末端及びＣ末端ループで形成されたカップ型の窪みに結合する。
【０１８０】
CUE - E2をER膜近傍に召集するドメイン
SMART SM0546; Pfam PF02845; ユビキチン結合性酵素（UBC）の結合に関与していると思われるドメイン。CUEドメインはまた、IL-1シグナル伝達経路の２つのタンパク質であるtollip 及びTAB2にも存在する。
【０１８１】
SH3＆SH2 - SMART SM0252; Pfam PF00017; Src ホモロジー2 ドメインはホスホチロシン含有ポリペプチドに２つの表面ポケットを介して結合する。特異性は、ホスホチロシンとは異なる残基との相互作用により提供される。SH2ドメインが一個のみ存在することがＳ．セレビジエで発見されている。Srcホモロジー2 (SH2) ドメインは、最初、オンコプロテインSrc及びFps間で保存された配列領域として同定された、約100個のアミノ酸残基から成るタンパク質ドメインである。同様な配列が後に、数多くの他の細胞内シグナル伝達タンパク質にも発見された。SH2ドメインは、ホスホチロシン含有標的ペプチドと高親和性で、配列特異的及び厳密なリン酸化依存的態様で相互作用することにより、細胞内シグナリング・カスケードの調節モジュールとして機能する。これらは多種のタンパク質関連で見られる。例えば、ホスホリパーゼCy（PLCy）及び非受容体タンパク質チロシンキナーゼの触媒ドメインとの関連；フォドリン及びテンシンなどの構造タンパク質内；そして小型アダプター分子、即ちCrk及びNck、のグループ内である。多くの場合、SH2ドメインが存在するとSH3ドメインも存在するため、それらの機能が相互に関連していることが分かる。これらドメインはしばしば、一個のタンパク質配列状の反復配列として見られる。SH2ドメインの構造は、アルファ＋ベータ・クラスに属し、その全体的形状はコンパクトでつぶれた半球を形成している。そのコア構造要素は、中央の疎水性anti／パラレルベータ−シートの両側に２本の短いアルファ−ヘリックスがあるものから成る。v-src腫瘍遺伝子産物SH2 ドメインにおいては、ストランド２と３の間のループが、そのホスホペプチド・リガンドのリン酸基との結合相互作用の多くを提供するため、リン酸結合ループと命名されている。
【０１８２】
SH3ドメイン (SMART SM0326)は、WWドメインと３次元上の類似性を共有するが、ウィルスgagタンパク質のPxxPP配列に結合すると思われる。Srcホモロジー3 (SH3) ドメインは、標的タンパク質に、プロリン及び疎水性のアミノ酸を含有する配列を通じて結合する。Pro含有ポリペプチドはSH3ドメインに２つの異なる結合方向で結合するようである。SH3 ドメインは、５つ又は６つのベータ・ストランドが、２つの密にパッキングされたアンチ−パラレル・ベータ−シートとして並んだものから成る特徴的な折り畳みを有する。このリンカ領域は短いらせんを含有しているであろう。
【０１８３】
タンパク質ドメイン情報は、以下のウェブサイト：SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)、Pfam (http://smart.embl-heidelberg.de/)、InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html) のいずれから得てもよい。
【０１８４】
実施例３：  E3タンパク質の生物活性をスクリーニングし、潜在的薬物ターゲットとしてのE3の役割をバリデートする方法
疾患又は病的状態に関する機能的生物検定が、場合毎に開発されている。RNA干渉（RNAi）技術又はドミナント・ネガティブ型の候補E3を用いても、又は、関連する標的タンパク質の発現を阻害するために、当業で用いられている他の技術のいずれを用いてもよい。疾患／病的状態を起こす異常を治療する上でのこれらの方法の能力は、特定のE3の役割や、潜在的薬物ターゲットとしてのその関係をバリデートするものである。
【０１８５】
ユビキチン媒介性ウィルス放出に関与するE3の同定
実験の証拠が、感染細胞からのウィルス様粒子（VLP）の放出が、gagなどのウィルス性タンパク質のユビキチン化に依存しているというモデルを裏付けている。gagのユビキチン化は、ヒトE3タンパク質が関与していることを示している。後期ドメインなどのgagタンパク質は、E3タンパク質のHECTドメイン及びWWもしくはSH3ドメインと相互作用することが知られている。従って、HECT又はWW又はSH3ドメインのいずれかを有するであろうヒトE3タンパク質は、gagのユビキチン化を媒介して、ウィルス放出を促していると考えられる。
【０１８６】
レトロウィルスに感染した細胞からのVLPの放出の検出及び／又は測定は、便利な生物検定となる。
【０１８７】
潜在的薬物ターゲットの発現を減少させることで、VLP放出を阻害すると、この潜在的薬物ターゲットをバリデートすることになる。
【０１８８】
相互作用性タンパク質のユビキチン媒介性分解に関与するE3の同定
CFTRのユビキチン化を媒介するユビキチン−タンパク質・リガーゼを同定する。嚢胞性線維症（CF）は遺伝性の異常であり、嚢胞性線維症シグナル伝達調節物質（CFTR）の機能不全又は表面発現低下を原因とする。患者のほぼ70%が、CFTRΔF508変異に関してホモ接合型である。変異型CFTRは小胞体(ER)でユビキチンタンパク質分解系を通じて急速に分解されるため、その表面発現が阻害される。ER関連E3がCFTRのユビキチン化を媒介していると思われる。従って、好適なE3候補は、ERに局在化するものや、又は、CUEドメインを有するものである。CFTRΔF508の細胞表面発現は、機能的生物検定として用いられる。最後に、ドミナント・ネガティブ型の候補E3を同時発現している細胞か、又は、候補E3を由来とする特異的RNAiをトランスフェクトした細胞において、CFTRΔF508の表面発現増加を検出することにより、標的をバリデートする。
【０１８９】
実施例４：  抗ウィルス剤用の薬物ターゲットとしてのPOSHの同定及びバリデート
ここで開示された系の一例を用いて、抗ウィルス剤のための、特にHIV及び関連ウィルスに対して効果的な薬剤のための薬物ターゲットを成功裏に同定した。
【０１９０】
500種を越えるE3タンパク質のデータベースをアセンブルした。このデータベースは、表２に挙げたタンパク質の多くを含有していた。例えばRING及びSH3ドメイン又はHECT及びRCCドメインの存在など、多種の特徴に基づいて、タンパク質のうちのサブセットを選択した。このタンパク質サブセットを表３に示す。このサブセットのタンパク質を、HIVの生活環にそれらが及ぼす影響について、ウィルス様粒子（VLP）検定系を用いて検査した。表３の各タンパク質に相当するmRNA配列に特異的なsiRNAコンストラクトに検定細胞を接触させることにより、各タンパク質のノックダウンを作製した。POSH及びタンパク質1-6の結果を図５に示す。siRNAにより、POSH産生を減少させた結果、VLP産生が完全又はほぼ完全に破壊された。検査した他のE3のうちの１、２種が、VLP産生に対して部分的な影響を与えたが、大半のE3は何の影響も及ぼさなかった。Tsg101 を陽性コントロールとして用いる。
【０１９１】
表３：  VLP検定に選択されたE3サブセット
【０１９２】
【表３】
2005525790.tif 000003
【０１９３】
図６は、POSH機能を低下させると、VLP産生が完全又はほぼ完全に阻害されることの裏付けとなるパルス−チェイスVLP検定を示す。従って、ここに開示した系は、薬物ターゲットを高速で作製するために効果的である。
【０１９４】
VLP検定及びsiRNAノックダウン実験を行うための詳細なプロトコルは以下の通りである。
【０１９５】
定常状態VLP検定：
１．  目的：RNAiを用いて、POSH遺伝子発現を阻害し、処理細胞及び非処理細胞でウィルス出芽並びにGAG発現及びプロセッシングの効率を比較する。
【０１９６】
２．  研究のプラン：
標的タンパク質をノックダウンするために、HeLa SS-6 細胞にmRNA特異的RNAiをトランスフェクトする。RNAiによる標的タンパク質の減少が最大に起きるのは４８時間後であるため、細胞をまず、標的mRNAを減少させるため、そして次にウィルスGagタンパク質を発現させるため、の２回、トランスフェクトする。２回目のトランスフェクトは、pNLenv (HIVをコードするプラスミド)及び少量のRNAiで行って、gag発現及びVLP出芽時の間、標的タンパク質の発現ノックダウンが維持されるようにする。RNAi効果によるmRNAレベルの減少を、標的mRNAのRT-PCR増幅で確認する。
【０１９７】
３．  方法、材料、溶液
ａ．  方法
ｉ．  メーカのプロトコル通り、そして手法で解説した通りのトランスフェクション。
ｉｉ．  ブラッドフォード検定によりタンパク質を判定する。
ｉｉｉ．  Hoeffer miniVE 電気泳動システムでSDS-PAGEを行う。Bio-Rad mini-protean II ウェット・トランスファー・システムに移す。ブロットを、Typhoonシステム及びImageQuant ソフトウェア (ABバイオテック社）を用いて視覚化する。
【０１９８】
ｂ．材料
【０１９９】
【表４】
2005525790.tif 000004
【０２００】
Ｃ．溶液
【０２０１】
【表５】
2005525790.tif 000005
【０２０２】
４．  手法
ａ．スケジュール
【０２０３】
【表６】
2005525790.tif 000006
【０２０４】
ｂ．  １日目
HeLa SS-6 細胞を6-ウェル・プレート (35mm ウェル)に5×105細胞/ウェルの濃度になるようにプレートする。
【０２０５】
ｃ．  ２日目
トランスフェクションの２時間前に、成長培地を、抗生物質なしの2mlの成長培地と取り替える。
【０２０６】
トランスフェクションＩ：
【０２０７】
【表７】
2005525790.tif 000007
【０２０８】
トランスフェクション：
LF2000混合液を調製する：各反応用に250μlのOptiMEM + 5μlのLF2000。５回の反転で混合する。５分間、室温でインキュベートする。
【０２０９】
RNAのOptiMEM 希釈液を調製する（表１、コラムＡ）。LF2000混合液を希釈済みRNAに滴下で加える（表１、コラムＢ）。静かに渦流させて混合する。室温で２５分間、インキュベートし、アルミ箔で覆う。
【０２１０】
500μlのトランスフェクション混合液を細胞に滴下で加え、横に振って混合する。
【０２１１】
一晩、インキュベートする。
【０２１２】
ｄ．  ３日目
２４時間後に1:3に分割する。（各反応用に４ウェルにプレートし、例外として反応2では３個のウェルにプレートする。
【０２１３】
ｅ．  ４日目
トランスフェクションの２時間前に、培地を、抗生物質なしのDMEM成長培地と取り替える。
【０２１４】
トランスフェクションＩＩ
【０２１５】
【表８】
2005525790.tif 000008
【０２１６】
LF2000混合液を調製する：各反応用の250μlの OptiMEM ＋5μlのLF2000。５回反転させて混合する。５分間、室温でインキュベートする。
【０２１７】
RNA＋DNAのOptiMEM 希釈液を調製する（トランスフェクションＩＩ、A＋B＋C）LF2000 混合液（トランスフェクションＩＩ、D）を、希釈後の RNA＋DNAに滴下で加え、静かに渦流して混合し、アルミ箔で光線から保護しながら１時間、インキュベートする。
【０２１８】
LF2000 及びDNA＋RNA を細胞に500μl/ウェルになるように加え、静かに揺らしながら混合し、一晩インキュベートする。
【０２１９】
ｆ．  ５日目
以下の手法（各試料の１つのウェルからの細胞を、RT-PCRによるRNA検定用に採取する）により、VLP検定（トランスフェクションからほぼ２４時間後）用の試料を採集する。
【０２２０】
ｇ．  細胞抽出物
ｉ．  浮遊細胞を遠心分離（５分間、４０℃で3000rpm）でペレットにし、上清を採り（上清でステップhにすぐに続く）、ウェル中に残った培地にとけた残存細胞を剥がし採り、対応する浮遊細胞ペレットに加え、５分間、４０℃で1800rpmで遠心分離する。
ｉｉ．  細胞ペレットを氷温のPBSで２回、洗浄する。
ｉｉｉ．  細胞ペレットを100μlの溶解緩衝液に再懸濁させ、２０分間、氷上でインキュベートする。
ｉｖ．  14,000rpmで１５分間、遠心分離する。上清をきれいな試験管に移す。これは細胞抽出物である。
ｖ．  SDS-PAGE試料緩衝液を１×になるように加え、１０分間沸騰させることで、10μlのSDS-PAGE用細胞抽出試料を調製する。残った試料の１アリクォートをタンパク質決定用に取り出して、最初の総開始材料を確認する。残りの細胞抽出物を-80℃で保存する。
【０２２１】
ｈ．  細胞培地からのVLPの精製
ｉ．  ステップgの上清を0.45mのフィルタで濾過する。
ｉｉ．  上清を14,000rpmで４０℃で少なくとも２時間、遠心分離する。
ｉｉｉ．  上清を慎重に吸引する。
ｉｖ．  VLPペレットを熱い（少なくとも１０分間、１００℃に加熱した）１×試料緩衝液中に再懸濁させる。
ｖ．  試料を１０分間、１００℃で沸騰させる。
【０２２２】
ｉ．  ウェスタン・ブロット分析
ｉ．  段階Ａ及びＢの全試料をTris-グリシンSDS-PAGE 10% で泳動させる(120V で１．５時間)。
ｉｉ．  試料をニトロセルロース・メンブレンに転写する（65Vで１．５時間）。
ｉｉｉ．  メンブレンをポンソーＳ溶液で染色する。
ｉｖ．  10%低脂肪乳TBS-T溶液で１時間、ブロッキングする。
ｖ．  抗p24ウサギ1:500のTBS-T溶液と一緒に一晩、インキュベートする。
ｖｉ．  各洗浄毎に７分間、TBS-Tで３回洗浄する。
ｖｉｉ．  二次抗体抗ウサギcy5の 1:500希釈液と一緒に３０分間、インキュベートする。
ｖｉｉｉ．  １０分間、TBS-Tで５回、洗浄する。
ｉｘ．  Typhoonゲル撮像システム（モラキュラー・ダイナミクス／ＡＰバイオテック社）で蛍光シグナルを観察する。
【０２２３】
POSH用のRT-PCRプライマの例
【０２２４】
【表９】
2005525790.tif 000009
【０２２５】
siRNA二重鎖：  
siRNA 番号: 153
siRNA 名: POSH-230 
mRNA中の位置 426-446
標的配列： 5' AACAGAGGCCTTGGAAACCTG 3'  配列番号: 14
siRNAセンス鎖： 5'  dTdTCAGAGGCCUUGGAAACCUG 3'  配列番号: 15
siRNA アンチセンス鎖： 5'dTdTCAGGUUUCCAAGGCCUCUG 3'  配列番号: 16
【０２２６】
siRNA番号: 155
siRNA 名: POSH-442 
mRNA中の位置 638-658
標的配列： 5'  AAAGAGCCTGGAGACCTTAAA 3'  配列番号: 17
siRNAセンス鎖： 5'  ddTdTAGAGCCUGGAGACCUUAAA 3'  配列番号: 18
siRNA アンチセンス鎖： 5'  ddTdTUUUAAGGUCUCCAGGCUCU 3'  配列番号: 19
【０２２７】
siRNA 番号: 157
siRNA 名: POSH-U111  
mRNA中の位置 2973-2993
標的配列： 5' AAGGATTGGTATGTGACTCTG  3'  配列番号: 20
siRNAセンス鎖： 5'  dTdTGGAUUGGUAUGUGACUCUG 3'  配列番号: 21
siRNA アンチセンス鎖：5'  dTdTCAGAGUCACAUACCAAUCC 3'  配列番号: 22
【０２２８】
siRNA 番号: 159
siRNA 名: POSH-U410 
mRNA中の位置 3272-3292
標的配列： 5' AAGCTGGATTATCTCCTGTTG 3'  配列番号: 23
siRNA センス鎖：5'  ddTdTGCUGGAUUAUCUCCUGUUG 3'  配列番号: 24
siRNA アンチセンス鎖：5'  ddTdTCAACAGGAGAUAAUCCAGC 3'  配列番号: 25
【０２２９】
VLP放出の動態に対するPOSH siRNAの影響を評価するためのプロトコル
Ａ１．  トランスフェクション
１．  トランスフェクションの１日前に細胞を5×106細胞／ウェルの濃度になるように15cmのプレートにプレートする。
２．  トランスフェクションの２時間前に、細胞培地を、抗生物質のない20mlの完全DMEMに交換する。
３．  DNA希釈液：  各トランスフェクション用に62.5μlのRNAiを2.5mlのOptiMEMに下の表に従って希釈する。RNAi ストックは20μMである（推奨濃度：50nM、総媒質量1:400になるように希釈）。
４．   LF 2000希釈液：  各トランスフェクション用に、50μlのリポフェクタミン2000試薬を2.5ml のOptiMEMに希釈する。
５．  希釈後のRNAi 及びLF 2000を５分間、室温でインキュベートする。
６．  希釈済みのRNAiを、希釈済みのLF2000と混合し、20乃至25分間、室温でインキュベートする。
７．  前記混合液を細胞に（滴下で）加え、２４時間、３７℃でCO2インキュベータ内でインキュベートする。
８．  RNAiトランスフェクションから１日後に、細胞を（完全MEM培地を入れた２枚の15cmプレートに、６ウェルプレートの１つのウェルに）分割する。
９．  細胞分割から１日後に、HIVトランスフェクションをSP 30-012-01に従って行う。
１０．  HIVトランスフェクションから６時間後に、培地を完全MEM培地に交換する。
＊POSHに関するRT-PCRを行って、ノックダウンの程度を評価する。
【０２３０】
Ａ２．  総RNA精製
１．  トランスフェクションから１日後に、細胞を無菌PBSで２回、洗浄する。
２．  細胞を2.3ml/200μl（15cm プレート/６ウェルプレートの１ウェル）の Tri 試薬 (滅菌済みスクレーパで)中に剥がし取って、-70℃で凍結させる。
【０２３１】
【表１０】
2005525790.tif 000010
【０２３２】
Ｂ．  標識付け
１．  枯渇培地を取り出し、解凍し、３７℃に置く。
２．  細胞を成長培地中に剥がし取って、15ml入りの円錐型試験管に静かに移す。
３．  1800rpmで５分間、室温で遠心分離して細胞をペレットにする。
４．  上清を吸引し、試験管を１０秒間、放置する。上清の残りを200μlのピペットマンで取り除く。
５．  10mlの暖かい枯渇培地を静かに加え、10mlピペットを上下に動かして慎重に再懸濁させる。かき混ぜるだけでは細胞ペレットが溶解しないかも知れない。
６．  細胞を10cmの試験管に移し、インキュベータ内に６０分間、置く。エッペンドルフ・サーモ・ミキサを３７℃に設定する。
７．  1800rpmで５分間、室温で遠心分離して細胞をペレットにする。
８．  上清を吸引し、試験管を１０秒間、放置する。上清の残りを200μlのピペットマンで取り除く。
９．  先端から200μlチップを切断し、細胞（Metを加えていない150μlのRPIMに溶かした~1.5 107細胞、しかし細胞数がこれより多い場合は250μlを越えないようにする）を150μlの枯渇培地に静かに懸濁させる。細胞をエッペンドルフ試験管に移し、サーも・ミキサ内に置く。１０秒間待ってから細胞の残りを10ml試験管からエッペンドルフ試験管に移し、必要であればさらに50μlを加えて、この細胞の残りを跳ね飛ばす（標本はすべて、同じ量の標識付け反応液を有していなければならない！）。
１０．  パルス：  50μlの35S-メチオニン(特異活性 14.2μCi/μl）を加え、試験管をきつく密封してサーモ・ミキサ内に置く。混合速度を可能な最も低速（700rpm）に設定し、２５分間、インキュベートする。
１１．  1mlの氷温のチェイス／停止培地を加えてパルスを停止させる。試験管を大変優しく３回振ってから、細胞を6000rpmで６秒間、遠心分離してペレットにする。
１２．  上清を1mlチップで取り除く。1mlの氷温のチェイス／停止培地をペレットになった細胞に加えてから、静かに反転させて再懸濁させる。
１３．  チェイス：  全ての試験管をサーモ・ミキサに移し、必要なチェイス時間(830:1、2、3、4 及び5 時間；828: 3 時間のみ)、インキュベートする。総チェイス時間の終了時に試験管を氷上に置き、1mlの氷温のチェイス／停止液を加え、細胞を１分間、14,000rpmで遠心分離してペレットにする。上清を取り除き、上清を２本目のエッペンドルフ試験管に移す。その細胞ペレットを、試験管の準備がすべて整うまで-80℃に凍結させる。
１４．  上清を２時間、14,000rpm。４℃で遠心分離する。上清を大変静かに取り除き、20μlを試験管に残し（Vとラベルする）、時間経過終了時まで-80℃に凍結させる。
＊＊＊全てのステップを、氷温の緩衝液で氷上で行う。
１５．  時間が経過したら、全ての試験管を-80℃から取り出す。500μlの溶解緩衝液（溶液の項を参照されたい）を加えてVLPペレットを（ステップ14のもの）及び細胞ペレット（ステップ13のもの）を溶解させ、ピペットで３回、上下にさせて良く再懸濁させる。氷上で１５分間、インキュベートし、エッペンドルフ遠心分離管で１５分間、４℃、14,000rpmで回転させる。上清を新しい試験管に取り出し、ペレットを捨てる。
１６．  全ての試料に対して抗p24ヒツジでIPを行う。
【０２３３】
Ｃ．  免疫沈降
１．プレクリーニング：  全ての試料に15μlのImmunoPure PlusG (ピアース社)を加える。１時間、４℃でサイクラで回転させ、５分間、４℃で回転させ、IP用の新しい試験管に移す。
２．  全ての試料に20μlのp24タンパク質Ｇ結合ビーズを加え、４時間、４℃のサイクラ内でインキュベートする。
３．  免疫沈降後、すべての免疫沈降液を新しい試験管に移す。
４．  ビーズを高塩緩衝液で１回、培地塩緩衝液で１回、及び低塩緩衝液で１回、洗浄する。各回転後は、すべての溶液を取り除かず、50μlの溶液をビーズ上に残す。最後の回転後に、充填チップで上清を慎重に取り除き、最高10μlの溶液を残す。
５．  各試験管に20μl  の2×SDS試料緩衝液を加える。７０℃まで１０分間、加熱する。
６．  試料を10%SDS-PAGEで分離する。
７．  ゲルを25% エタノール及び10%酢酸中に１５分間、固定する。
８．  固定溶液を捨て、ゲルをAmplify溶液(NAMP 100 アマーシャム社)で１５分間、すすぐ。
９．  ゲルを暖かなプレート（60-80℃）で真空下で乾燥させる。
１０．  ゲルをスクリーニングに２時間暴露して、スキャンを行う。
【０２３４】
実施例５：  抗新生物剤のための薬物ターゲットの同定
500種を越えるE3タンパク質のデータベースをアセンブルする。このデータベースは表２に挙げたタンパク質の多くを含む。例えば特定のドメインの存在など、多種の特徴に基づいてタンパク質のサブセットを選択する。該タンパク質をコードする遺伝子の発現を、癌性及び非癌性組織で評価して、癌性組織で過剰発現又は低発現しているデータベースの遺伝子を特定する。検査対象となる癌性及び非癌性組織の例には：肺、喉頭咽頭、膵臓、肝臓、直腸、結腸、胃、乳房、子宮頚管、子宮、卵巣、精巣、前立腺及び皮膚、がある。
【０２３５】
癌において過剰発現していると特定された遺伝子に、HeLa細胞などの癌細胞株でsiRNAノックダウンを行う。このノックダウンの結果、癌細胞株の増殖が低下するのであれば、この遺伝子及びコードされたタンパク質は、抗新生物剤を開発するためのターゲットである。
【０２３６】
POSHはいくつかの癌組織で過剰発現しており、POSH siRNAにより、HiLa細胞の増殖が低下する。
【０２３７】
引用による援用
ここに引用した特許及び公開文献すべてを、引用をもってここに援用することとする。
【０２３８】
均等物
当業者であれば、慣例的な実験によって、ここに解説した本発明の具体的な実施態様の均等物を数多く、認識し、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと、意図されている。
【０２３９】
【表２】
2005525790.tif 000011
2005525790.tif 000012
2005525790.tif 000013
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【図面の簡単な説明】
【０２４０】
【図１】図１は、目的の疾患又は他の生物学的プロセスに関与していると思われるヒトE3タンパク質を同定するプロセスのフローチャートである。
【図２】図２は、ヒトE3タンパク質のデータベースの作製を示すフローチャートである。
【図３】図３は、E3タンパク質に存在するE3ドメインのいくつかの例示的な概略図である。
【図４】図４は、HIV及び関連するウィルスの治療のための薬物ターゲットであるE3タンパク質を同定するためのスクリーニング結果を示す。ウィルス様粒子（VLP）検定を用いた。図面は、細胞画分中（上側パネル）及び関連するVLP（下側パネル）中のウィルスタンパク質を示す。このVLP検定は、野生型ウィルスp6タンパク質及び変異型p6タンパク質をそれぞれ陽性及び陰性コントロールとして用いて行われた。多種のmRNAのsiRNAノックアウトを、VLP産生に対する影響について検査した。POSHをノックダウンすると、VLP産生が完全か、又はほぼ完全に阻害された。
【図５】図５は、正常な（WT）VLP検定条件及びPOSHノックダウン（POSH＋WT）における、VLP産生の動態を比較したパルス-チェイスVLP実験を示す。POSHをsiRNA ノックダウンすると、VLP産生が完全又はほぼ完全に阻害された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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