(57)【要約】本発明は、ヒトの疾患検出および治療用分子（MDDT）および、MDDTを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、MDDTの異常発現に関連する障害を診断、治療、または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)乃至(h)からなる群から選択した単離されたポリペプチド。
(a)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド
(b)SEQ ID NO:2-7、SEQ ID NO:11-16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20-21、SEQ ID NO:23-24、SEQ ID NO:26-36からなる群から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(c)SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:22からなる群から選択したアミノ酸配列に対して少なくとも99％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(d)SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:37からなる群のアミノ酸配列に対して少なくとも93％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(e)SEQ ID NO:10のアミノ酸配列に対して少なくとも91％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(f)SEQ ID NO:17から選択した或るアミノ酸配列に対して少なくとも94％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
(g)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
(h)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片。
【請求項２】
SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含む請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１に記載のポリペプチドを生産する方法であって、
(a)前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
(b)そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１２】
以下の(a)乃至(g)からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
(a)SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
(b)SEQ ID NO:39-61およびSEQ ID NO:63-74からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
(c)SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも99％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
(d)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(e)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
(f)(c)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および
(g)(a)〜(f)のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも60の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
(a)前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて前記サンプルをハイブリダイズする過程であって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする過程と、
(b)前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも60の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
(b)前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
機能的MDDTの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項17の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
(b)前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的MDDTの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項21に記載の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝すステップと、
(b)前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項23に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２５】
機能的MDDTの過剰発現に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療を要する患者への請求項24に記載の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項１に記載のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
(b)請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)請求項１に記載のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
(b)請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
(c)試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項5に記載の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
(b)前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
(c)可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
(a)核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
(b)処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも20の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12に記載のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドである、前記過程と、
(c)ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
(d)前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のMDDTの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
(a)前記生物学的サンプルと請求項11に記載の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
(b)前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項11に記載の抗体であって、
(a)キメラ抗体
(b)単鎖抗体
(c)Fab断片
(d)F（ab'）2断片、あるいは
(e)ヒト化抗体のいずれかである抗体。
【請求項３２】
請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者におけるMDDTの発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項32に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者におけるMDDTの発現に関連する症状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の組成物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
(a)抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
(b)前記動物から抗体を単離する過程と、
(c)前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項36に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
【請求項３９】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
(a)抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
(b)前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
(c)前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
(d)前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
(e)SEQ ID NO：1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクロナール抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
【請求項４４】
SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをサンプル中に検出する方法であって、
(a)請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
(b)特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをサンプルから精製する方法であって、
(a)請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
(b)前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製したポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも1つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
(a)サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程
(b)ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項46に記載のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドを接触させる過程
(c)サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程を含む方法
【請求項４８】
固体基板上の別個の物理的位置に固定した異なるヌクレオチド分子群を含むアレイであり、該ヌクレオチド分子の少なくとも１つが標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続するヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーション可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであるアレイ。
【請求項４９】
請求項48に記載のアレイであり、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続するヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
【請求項５０】
請求項48に記載のアレイであり、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続するヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイであり、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が前記標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイであり、マイクロアレイであるアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイであり、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズされた前記標的ポリヌクレオチドをも含むアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイであり、リンカーが少なくとも1つの前記ヌクレオチド分子を前記固体基板に接合するアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイであり、基板上のそれぞれ固有の物理的位置には複数のヌクレオチド分子を含み、またいかなる単一の固有の物理位置の該複数のヌクレオチド分子も同じ配列を有し、基板上の各固有物理的位置には基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列と異なる配列を持つヌクレオチド分子が含まれるアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
SEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
SEQ ID NO:25のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
SEQ ID NO:26のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
SEQ ID NO:27のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
SEQ ID NO:28のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
SEQ ID NO:29のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
SEQ ID NO:30のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
SEQ ID NO:31のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
SEQ ID NO:32のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
SEQ ID NO:33のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
SEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
SEQ ID NO:35のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
SEQ ID NO:36のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
SEQ ID NO:38のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
SEQ ID NO:39のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
SEQ ID NO:40のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
SEQ ID NO:41のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
SEQ ID NO:42のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
SEQ ID NO:43のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
SEQ ID NO:44のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
SEQ ID NO:45のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
SEQ ID NO:46のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
SEQ ID NO:47のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:48のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
SEQ ID NO:49のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
SEQ ID NO:50のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
SEQ ID NO:51のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
SEQ ID NO:52のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
SEQ ID NO:53のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
SEQ ID NO:54のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
SEQ ID NO:55のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
SEQ ID NO:56のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
SEQ ID NO:57のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
SEQ ID NO:58のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
SEQ ID NO:59のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
SEQ ID NO:60のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
SEQ ID NO:61のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
SEQ ID NO:62のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
SEQ ID NO:63のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
SEQ ID NO:64のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
SEQ ID NO:65のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
SEQ ID NO:66のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
SEQ ID NO:67のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
SEQ ID NO:68のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
SEQ ID NO:69のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
SEQ ID NO:70のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
SEQ ID NO:71のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
SEQ ID NO:72のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
SEQ ID NO:73のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
SEQ ID NO:74のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患検出および治療用分子の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、発達障害、および神経障害の診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、疾患検出および治療用分子の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来化合物の効果についての算定に関する。
【背景技術】
【０００２】
推定によれば、哺乳類DNAの2％のみがタンパク質をコードしており、どの時点でも、タンパク質をコードする遺伝子群の僅かな部分のみが特定細胞内で実際に発現される。多細胞生物における種々のタイプの細胞は構造も機能も劇的に異なっており、特定細胞の個性を授けるものは、その独自のパターンの遺伝子発現である。また、異なる細胞タイプは、オーバーラップするが特有のセットの遺伝子群を、発生期を通じて発現する。生物の発達と生存とに寄与する、細胞成長、細胞増殖、細胞分化、免疫応答、アポトーシス及び他のプロセスは、遺伝子発現の調節によって支配される。適切な遺伝子調節はまた、細胞を効率よく機能させる。これを確実にするため、その機能が要求される遺伝子群のみが所定の時期に発現される。遺伝子発現に影響を与える因子の例には、細胞間伝達を仲介し様々な細胞型の作用を協調させる細胞外シグナルを含む。遺伝子発現は、DNAとRNAとの転写レベル、および、mRNA翻訳のレベルにおいて調節される。
【０００３】
遺伝子と遺伝子産物とに異常な発現または突然変異があると、種々のヒト疾患（例えば癌その他の細胞増殖異常など）を起こしたり、またはそれらに対する感受性を増加させることがある。これらの遺伝子と遺伝子産物の同定が、疾患の早期検出のためのマーカーと、疾患の予防と治療との為の標的とを見出すために進展している努力の基礎となる。例えば癌は、細胞増殖異常の或るタイプを意味し、身体のほぼ全ての組織を襲う。癌の発生すなわち発癌は、しばしば、異常発現または突然変異を通じて正常遺伝子が癌を起こす遺伝子すなわち癌原遺伝子へ変換することと相関する。腫瘍性タンパク質（癌原遺伝子の産物）の例には、細胞増殖に影響する種々の分子を含む。このような分子とは例えば成長因子、成長因子受容体、細胞内シグナル伝達因子、核内転写因子、および細胞周期制御タンパク質である。一方、腫瘍抑制遺伝子は、細胞増殖抑制に関係する。腫瘍抑制遺伝子の機能を低減または抑止する突然変異の結果、異常な細胞増殖と癌とが起こる。このように、多種多様な遺伝子と遺伝子産物とが細胞増殖異常（癌など）に関連することが見出されているが、まだ発見されていない多くの遺伝子と遺伝子産物が存在する可能性がある。
【０００４】
DNAベースのアレイは、遺伝子発現と遺伝的変異性とを試験する、効率的で高処理の方法を提供できる。例えばSNP（すなわち一塩基多型）は、最も多いタイプのヒト遺伝的変異である。DNAベースのアレイは、数百、数千もの遺伝子群におけるSNPの発見を劇的に加速できる。同様に、このようなアレイを用いて、SNP遺伝子型解析（SNP genotyping）をなしうる。この解析では、個体群または集団群からのDNAサンプルのアッセイを、選択したSNPの存在について行う。これらのアプローチは、ヒトゲノムにおける全ての遺伝的変異の体系的同定や、特定の遺伝的変異と疾患感受性、薬物治療応答性、およびその他の医学的関連情報との相関の体系的同定を最終的にもたらすだろう(例えばWang, D.G.他 (1998) Science 280:1077-1082.を参照)。
【０００５】
DNAベースのアレイ技術は、全体的な遺伝子発現パターンの迅速な分析に特に重要である。例えば遺伝子的疾病素質、疾患、または治療処置は、直接または間接に、或る組織における多数の遺伝子の発現に影響することがある。この場合、発現される全ての遺伝子と、それらの遺伝子がその特定組織において発現されるレベルとのプロフィールすなわち転写物イメージを作製することは有用である。或る疾患を患う個体または集団、または特定の治療を受けている個体または集団から作製されたプロフィールは、対照の個体または集団から作製されたプロフィールと比較されうる。このような分析には、遺伝子機能の知識を必要としない。理由は、発現プロフィールを数学的に分析でき、この分析では各遺伝子を単にマーカーとして扱うからである。更に遺伝子発現プロフィールは、例えば或る発生段階や特定組織において、または疾患や処置に応答して発現される全ての遺伝子を同定することによって、生物学的経路の詳細な分析を補助しうる(例えばLander, E.S.他 (1996) Science 274:536-539を参照)。
【０００６】
数種の遺伝子は、疾患と関連することが、染色体上の位置から知られている。その例として、マウスとヒトとの筋緊張性ジストロフィー（DM）領域にある遺伝子群がある。DMの根底にある突然変異はDMキナーゼ蛋白をコードする或る遺伝子に限局されているが、別の活性遺伝子であるDMR-N9は、このDMキナーゼ遺伝子に非常に近接した位置にある(Jansen, G.他 (1992) Nat. Genet. 1:261-266)。DMR-N9は、或る650個のアミノ酸のタンパク質をコードし、このタンパク質にはWDリピートがある。WDリピートは細胞シグナル伝達タンパクに見られるモチーフである。DMR-N9は全ての神経組織と睾丸とに発現されるので、重篤例のDMにおける精神症状と睾丸症状との出現におけるDMR-N9の役割を示唆している(Jansen, G.他 (1995) Hum. Mol. Genet. 4:843-852)。
【０００７】
他の複数の遺伝子の同定が、その発現パターンに、または疾病症候群との関連に基づいてなされた。例えば細胞内オルガネラに対する自己抗体は、全身性リウマチ性疾患の患者に見られる。最近同定されたタンパク質であるgolgin-67はゴルジ自己抗原の或るファミリに属しており、αヘリックスのコイルドコイルドメインを持つ(Eystathioy, T.他 (2000) J. Autoimmun. 14:179-187)。Stac遺伝子は、脳に特異的で、発達に応じて調節される遺伝子として同定された。Stacタンパク質はSH3ドメインを持つ。またニューロン特異的シグナル伝達に関わると思われる(Suzuki, H.他 (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229:902-909)。.
カルポニンはアクチン結合タンパク質であり、細胞骨格の機能と組織に関与し得る(Takahashi, K. 他. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 141:20-26)。カルポニンのN末端は、カルシウム結合タンパク質類およびトロポミオシンと相互作用することができる。幾つかの他のアクチン結合タンパク質の構造内に見出されるCH-ドメイン（カルポニン相同ドメイン）も、N末端に位置する(Gusev, N.B. (2001) Biochemistry (Mosc) 66:1112-1121)。
【０００８】
発現プロファイル作成
アレイ技術は、単一の多型遺伝子の発現や、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する、簡単な方法を提供し得る。単一遺伝子の発現を試験するときは、アレイを用いて、或る特定遺伝子又はその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような遺伝子を同定するプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、毒性アッセイにおいてテストされる物質に影響されるか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、ハウスキーピング機能を実行するか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、又は障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの同定である。
【０００９】
遺伝子発現プロファイル作製の潜在的応用は特に、疾患の、診断、予後診断、および治療の向上に関わる。例えば、前立腺癌患者に由来する組織に発現されるレベルと配列との双方を、正常組織に発現されるレベルおよび配列と比較しうる。
【００１０】
前立腺癌は50才以上の男性に一般的な悪性腫瘍であり、年齢と共に発生は増加する。米国では、毎年約13万2千人が前立腺癌と新たに診断され、その疾患により3万3千人以上が死亡する。
【００１１】
一旦前立腺で癌が発生すると、テストステロンによりより急速な成長をするよう刺激される。従って精巣の除去により、癌の急速な成長と転移を間接的に抑制することが可能である。前立腺の癌の95％以上は、前立腺の腺房に由来する腺癌である。残り5％は扁平上皮細胞癌と移行上皮癌に分けられ、両者とも前立腺管または前立腺の他の部分で発生する。
【００１２】
ほとんどの癌と同様、前立腺癌は多段階の進行を通して発生し、最終的に急速進行型（aggressive）転移性表現型をもたらす。腫瘍進行の初めの段階には、正常な管腔細胞または基底上皮細胞の過剰増殖が関係し、これらの細胞が過形成化して初期段階の腫瘍に発展する。初期段階の腫瘍は前立腺内に局在するが、最終的に特に骨、脳、または肺に転移し得る。これらの腫瘍の約80％は、前立腺上皮細胞の成長を制御する重要なホルモンであるアンドロゲン治療に対して応答性を維持する。しかし、ほとんどの進行した状態の場合、癌の成長はアンドロゲンに依存しなくなり、この症状に関しては公知の治療は現在無い。
【００１３】
前立腺癌の主要な診断マーカーは、前立腺特異抗原(PSA)である。PSAは、ほとんど前立腺上皮細胞によってのみで生成される組織特異的セリンプロテアーゼである。PSAの量は前立腺上皮細胞の数と体積に相関する。従ってPSAのレベルは異常な前立腺成長の優れた指標である。前立腺癌を患う男性はPSAレベルの早期の線形増加を示し、次に診断前に指数関数的な増加を示すしかしPSAレベルは炎症、アンドロゲン、その他の成長因子等の因子にも影響されるので、PSAレベルの変化は前立腺癌の個々の事例の検出には有用ではないと主張する科学者もいる。
【００１４】
現在の癌研究の分野は、前立腺癌の潜在的な治療標的だけでなくマーカーに関しても更なる候補を提供している。幾つかの成長因子は、腫瘍の発達、成長、進行において重要な役割を果たすことを示してきた。上皮成長因子(EGF)、線維芽成長因子(FGF)、腫瘍成長因子α(TGFα)等の成長因子は、過剰増殖性の前立腺上皮細胞だけでなく正常な細胞の成長、特に腫瘍の発達と進行の初期段階において重要であり、これらの細胞のシグナル経路に様々な方法で作用する(Lin J 他. (1999) Cancer Res. 59:2891-2897、Putz T 他 (1999) Cancer Res 59:227-233)。成長因子のTGF-βファミリーはヒトの癌で上昇したレベルで通常発現され、多くの場合高い発現レベルは悪性腫瘍の進行段階および生存率の低さと相関する(Gold LI (1999) Crit Rev Oncog 10:303-360)。最後に、前立腺癌のアンドロゲン非依存性、ホルモン不応状態(PC3及びDU-145)と前立腺癌のアンドロゲン依存性段階(LNCap)の両方を示すヒトの細胞株類があり、これらは前立腺癌の進行に関連する遺伝子発現パターン、およびこれらの発現される遺伝子に対する細胞処理の影響とを研究する面で有用であることが示されている、(Chung TD (1999) Prostate 15:199-207)。
【００１５】
腫瘍壊死因子αは、免疫調節と炎症応答を仲介する多面発現性のサイトカインである。TNFα関連サイトカインは、受容体単量体の凝集誘発を通して、分化、増殖、及び核因子κB(NF-κB)活性化、細胞死を含む部分的にオーバーラップする細胞応答を引き起こす(Smith, C.A. 他. (1994) Cell 76:959-962)。TNF-αにより誘発された細胞応答は、特有の細胞表面受容体(TNFR)との相互作用を通して開始される。NF-κBは、損傷や感染への応答また生理的プロセスに関与する遺伝子を誘発する中枢の役割を伴う転写因子である。NF-κBの活性化には、抑制性タンパク質IKBのリン酸化反応、及びそれに続く分解が関係する。およびこのプロセスに関係する、隣接するキナーゼとアダプター分子の多くは、解明されてきた。さらに、IL1及びTNF-αに関する細胞膜から核へのNF-κB活性化経路が今や理解されている(Bowie, A.及びL.A. O'Neill (2000) Biochem. Pharmacol. 59:1323)。
【００１６】
血管平滑筋細胞(SMC)のコンフルエント培養のTNFαでの処理は、コラゲナーゼ消化性タンパク質(CDP)と非コラーゲン性タンパク質(NCP)への[3H]プロリンの取り込みを抑制する。TNFαによるそのような抑制は、コンフルエントなウシの大動脈内皮細胞とヒトの線維芽IMR90細胞においては観察されなかった。TNFαは、コラーゲンタイプIV及びVの相対的な比率を減少し、細胞密度に依存して、TNFαがSMCによるコラーゲン合成を調節し、従ってTNFαがアテローム動脈硬化病変部の形成を変更し得ることを示唆する(Hiraga, S. 他. (2000) Life Sci. 66:235244)。
【００１７】
ヒトの大動脈内皮細胞(HAEC)は、ヒトの大動脈の内皮細胞に由来する初代細胞である。ヒトの腸骨動脈内皮細胞(HIAEC)は、腸骨動脈の内皮細胞に由来する初代細胞である。ヒトの臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、臍帯静脈の内皮細胞に由来する初代細胞である。初代のヒトの内皮細胞株は、in vitroでのヒトの血管生物学における内皮細胞の役割を研究する実験モデルとして用いられてきた。血管内皮の活性化は、血管緊張度調節、凝固、血栓症、アテローム性動脈硬化症、炎症等、広範囲な生理学的及び病理生理学的プロセスの中心的な事象と見なされる。
【００１８】
従って、HAEC、HIAEC、およびHUVEC細胞培養のTNFαでの処理の間に差次的に発現する血管組織遺伝子は、アテローム硬化性過程のマーカーであると期待することは道理的に可能である。
【００１９】
大部分の通常の真核細胞は特定の回数、分裂した後、老化状態に入り、この状態において細胞は生存でき、代謝的に活性であるが、もはや複製はしない。細胞サイズの増加やpH依存性ベータガラクトシダーゼ活性のような多くの形質的変化、および特定遺伝子群の上方制御のような分子的変化が老化細胞(senescent cells)において生じる(Shelton (1999) Current Biology 9:939-945)。老化細胞が分裂促進因子に曝露されると、多数の遺伝子が上方制御されるが、細胞は増殖しない。老化細胞がin vivoで年齢とともに蓄積され、生体の老化(aging)に寄与していることが示されている。さらに、老化は腫瘍形成を抑制し、老化に必要な多くの遺伝子もまた、p５３や網膜芽細胞腫感受性遺伝子のような癌抑制遺伝子として機能する。大部分の腫瘍はその複製限界を凌いだ細胞を含んでいる。つまり、これらは不死化されている。多くの癌遺伝子は腫瘍形成の第1段階として細胞を不死化する。
【００２０】
酸化的ストレス、放射、活性化腫瘍性タンパク質および細胞周期阻害剤のような多様な挑戦によって老化表現型が誘発され、老化が多くの増殖的シグナルや、抗増殖的シグナルによって影響されることが示されている(Shelton 前出)。老化は各々の細胞分裂とともに発生するテロメアの進行的短縮化と相関している。細胞内のテロメラーゼの触媒的成分の発現によってテロメアの短縮化が防がれ、また線維芽細胞や上皮細胞のような細胞が不死化されるが、別種の細胞(例えばCD8+ T細胞)は不死化しない(Migliaccio 他(2000) J. Immunol. 165:4978-4984).。このようにして、テロメアの短縮化および、細胞種によってはその他の機構によって老化は制御される。
【００２１】
加齢における老化と腫瘍形成の役割を理解するための進行中の研究の一部として、老化細胞と前老化細胞の間で異なって発現される多数の遺伝子が同定されている。大部分の老化細胞は細胞周期のG1期において増殖が静止されている。多くの細胞周期遺伝子の発現は老化細胞および前老化細胞で類似している(Cristofalo (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:187-194)が、増殖を抑制するサイクリン依存性キナーゼp21とp16、およびサイクリンD1とEのような他の遺伝子の発現は老化細胞において上昇している。細胞外基質タンパク質（フィブロネクチン、プロコラーゲン、およびオステオネクチン等）およびプロテアーゼ（コラゲナーゼ、ストロメライシンおよびカテプシンB 等）のような、細胞周期に直接関与していない他の遺伝子群もまた、に上方制御される(Chen (2000) Ann. N.Y. Acad. Sci. 908:111-125)。老化細胞において発現不足の遺伝子には、熱ショックタンパク質であるc-fosとcdc-2をコードする遺伝子が含まれる(Chen 前出)。
【００２２】
例えば、アルツハイマー病(AD)は進行性痴呆であり、神経病理学的な特徴は、アミロイドβペプチドを含むプラークの存在と、特定の脳領域における神経原線維変化である。更に、ニューロンとシナプスは失われ、炎症反応は小膠細胞と星状細胞において活性化する。軽度、中程度、重度のAD症例の遺伝子発現プロファイル作成は、機能喪失に関係する分子メカニズムを定義付けするために有用である。
【００２３】
DNAベースのアレイ技術は、細胞シグナル伝達経路を分析する方法としても有用である。例えばプロテインキナーゼC(PKC)は、細胞のシグナル伝達経路において多くの重要な役割を果たすセリン/スレオニンキナーゼのファミリ-である(Kanashiro, C.A.及びKhalil, R.A. (1998) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 25:974-985)。ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート（PMA）は、プロテインキナーゼC依存性経路の一般の活性化因子である。PMAは、PKC経路の過剰活性化することにより細胞において腫瘍を促進する。 PKCは細胞内カルシウムレベルにも影響される。内部のカルシウムフラックスは、特に細胞活性化と増殖の分野において、細胞に大きく影響することが示されてきた(Cole, K,及びKohn, E. (1994) Cancer Metastasis Rev. 13:31-44)。イオノマイシンはカルシウムが細胞に入ることを可能にするカルシウムイオノフォアであり、従って細胞質ゾルのカルシウム濃度を増加する。よってPMAとイオノマイシンの組合せは、環境と相互作用する哺乳類動物細胞によって使用される主要なシグナル伝達経路のうち2つを活性化する。例えばT細胞においては、PMAとイオノマイシンの組合せは最適なT細胞活性化中に誘発される二次シグナル伝達イベントのタイプを模倣するが、内皮細胞においてはPMAとイオノマイシンは炎症の仲介の影響を再現する。
【００２４】
細胞シグナル伝達経路と関係する他のタンパク質はグアニンヌクレオチド結合タンパク質(GTP結合タンパク質)であり、このタンパク質はすべての真核細胞に存在し、代謝、細胞成長、分化、シグナル伝達、細胞骨格組織化、並びに細胞内小胞輸送および分泌を含むプロセスにおいて機能する。高等生物では、免疫応答(Aussel, C. 他 (1988) J. Immunol. 140:215-220)、アポトーシス、分化、および癌化を含めた細胞増殖 (Dhanasekaran, N. 他 (1998) Oncogene 17:1383-1394)等のプロセスを調節するシグナル伝達に関与する。低分子量GTP結合タンパク質は、GDPとGTPの交換により、サイトソルから膜へのタンパク質と可溶性化合物の移動等の細胞タンパク質輸送イベントにおいて重要な役割を果たす(Ktistakis, N.T. (1998) BioEssays 20:495-504)。小胞輸送において、小胞と標的特異的識別因子（v-SNARE および t-SNARE）間の相互作用は、その小胞を受容膜に融合させる。出芽過程は、密接に関連するADPリボシル化因子（ARF）とSARタンパク質等のＧＴＰaseによって調節される(Rothman, J.E.及びF.T. Wieland (1996) Science 272:227-234)。 GTPを結合した活性型とGDPを結合した不活性型の間のLMW GTP結合タンパク質のサイクリングは、他のタンパク質群によって制御されている。グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）は、ヌクレオチドの解離速度を数桁まで増加させ、GDPの放出とGTPとの結合を促進する(Geyer, M.及びWittinghofer, A. (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:786-792)。
【００２５】
対合複合体(SC)は、前期の相同染色体の対を安定化するタンパク質構造である。ストロマリン3(STAG3)は、最近同定されたSCのメンバーである。STAG3遺伝子複製は、神経行動学上の疾患であるWilliams-Beuren 症候群と関連する領域において生殖細胞系染色体再編成の素因であると思われる(Pezzi, N. 他. (2000) FASEB J. 14:581-592)。SCの別のメンバーをコード化する遺伝子である対合複合体タンパク質3(SCP3)は、精巣で排外的に転写され、X連鎖リンパ球調節遺伝子に関連する(Lammers, J.H. 他. (1994) Mol. Cell. Biol. 14:1137-1146)。
【００２６】
新規の疾患検出および治療用分子、並びにそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。この新規の組成物は、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性の疾患、発達障害、および神経疾患の診断・治療・予防において有用であり、また、疾患検出および治療用分子の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外来性化合物の効果についての評価にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、総称して「MDDT」、個別にはそれぞれ「MDDT-1」、「MDDT-2」、「MDDT-3」、「MDDT-4」、「MDDT-5」、「MDDT-6」、「MDDT-7」、「MDDT-8」、「MDDT-9」、「MDDT-10」、「MDDT-11」、「MDDT-12」、「MDDT-13」、「MDDT-14」、「MDDT-15」、「MDDT-16」、「MDDT-17」、「MDDT-18」、「MDDT-19」、「MDDT-20」、「MDDT-21」、「MDDT-22」、「MDDT-23」、「MDDT-24」、「MDDT-25」、「MDDT-26」、「MDDT-27」、「MDDT-28」、「MDDT-29」、「MDDT-30」、「MDDT-31」、「MDDT-32」、「MDDT-33」、「MDDT-34」、「MDDT-35」、「MDDT-36」、及び「MDDT-37」と呼ぶ、精製されたポリペプチドである、疾患検出および治療用分子を提供する。或る実施態様において本発明は、(a)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から成る群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。一実施態様では、本発明はSEQ ID NO:1-37のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００２８】
また、本発明は(a)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列と少なくとも90％同一である或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の実施態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:38-74からなる群から選択される。
【００２９】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-37を有する群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または(d）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【００３０】
また、本発明は、（a）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（b）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（c）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（d）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択したポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（a）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（b）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【００３１】
本発明は更に、(a)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(d)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択されたポリペプチドに特異結合するような単離された抗体を提供する。
【００３２】
本発明は更に、（a）SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（b）SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（c）（a）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（d）（b）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（e）（a）〜（d）のRNA等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも60の連続したヌクレオチドを有する。
【００３３】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは(a)SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(b)SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90%が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(d)(b）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および(e)(a）〜(d)のRNA等価物からなる群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、(a)サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列を含む少なくとも20の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、(b)該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一実施態様では、プローブは少なくとも60の連続したヌクレオチド群からなる。
【００３４】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、(a)SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(b)SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、(c)(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、(d)(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および(e)(a)〜(d)のRNA等価物からなる群から選択された配列のポリヌクレオチドを有する。検出方法は、(a)ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、(b)増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【００３５】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、(a)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、(c)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および(d)SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択される。一実施態様では、SEQ ID NO:1-37からなる一群から選択されたアミノ酸配列を持つ組成物を提供する。更に、本発明は、この組成物を機能的MDDTの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療を必要とする患者に投与する過程を含む方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、(a）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも90％の同一性を有する天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、(c）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（d）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、(a）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、(b）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的MDDTの発現の低下を伴う疾患や症状の治療を要する患者への、この組成物の投与方法を提供する。
【００３７】
本発明は更に、（a）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、（b）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも90％の同一性を有する天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、（c）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（d）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（a）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（b）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別法で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法で本発明は、機能的MDDTの過剰な発現に関連した疾患やその症状の治療を必要とする患者への、この組成物の投与を含む方法を提供する。
【００３８】
本発明は更に、（a）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、(b）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも90％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、（c）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（d）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（a）該ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物に混合させる過程と、（b）この試験化合物と該ポリペプチドとの結合を検出し、それにより該ポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程からなる。
【００３９】
本発明は更に、（a）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、（b）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも90％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、（c）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、および（d）SEQ ID NO:1-37からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性をモジュレートする或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（a）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（b）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（c）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を標示する。
【００４０】
更に本発明は、SEQ ID NO:38-74からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を持つ標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、(a)この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、(b）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（c）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【００４１】
本発明は更に、（a）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、（b）（i）SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物からなる群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも20の連続したヌクレオチドを含むプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:38-74からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を有する。毒性の算定方法には更に（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料および方法に本発明が限定されるものではなく、修正され得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００４３】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、その「抗体」は複数の抗体が含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【００４４】
本明細書中で用いる全ての技術用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００４５】
（定義）
用語「MDDT」は、天然、合成、半合成或いは組換え体などからの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたMDDTのアミノ酸配列を指す。
【００４６】
用語「アゴニスト」は、MDDTの生物学的活性を強める、或いは模倣する分子を指す。アゴニストの例としては、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や組成物の内、MDDTと直接に相互作用することによって、或いはMDDTが関与する生物学的経路の種々の構成成分に作用することによってMDDTの活性を調節するものを含みうる。
【００４７】
「対立遺伝子変異配列」は、MDDTをコードする遺伝子の、別の形態である。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から作製し得る。また、変異RNAまたはポリペプチドを作製し得る。ポリペプチドの構造または機能は、変異することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異体を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異体を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換に帰するものである。これら各変化は、単独で或いは他の変化と共に、所定の配列内で1回若しくは数回生じ得る。
【００４８】
MDDTをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、あるいは置換の結果、MDDTと同じポリペプチド、あるいはMDDTの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドをもたらす配列もある。この定義には、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列にとって正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列との不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、MDDTをコードするポリヌクレオチドの或る特定オリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能なあるいは検出困難な多型性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じて機能的には等価なMDDTと成るような、アミノ酸残基の欠失、挿入、あるいは置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にMDDTの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性についての類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【００４９】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【００５０】
「増幅」は、核酸配列の複製物を作製することに関連する。増幅には通常、当業者に公知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いる。
【００５１】
用語「アンタゴニスト」は、MDDTの生物学的活性を阻害あるいは減弱する分子を指す。アンタゴニストとしては、MDDTと直接相互作用すること、あるいはMDDTが関与する生物学的経路の諸成分に作用することによってMDDTの活性を調節する、抗体などタンパク質、核酸、糖質、小分子、または任意の他の化合物や組成物があり得る。
【００５２】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFaｂ、F(ab')2 及びFv断片を指す。MDDTポリペプチドと結合する抗体は、免疫抗原として、無傷のポリペプチドを用いて、または、目的の小ペプチドを持つ断片を用いて作製可能である。動物（マウス、ラットあるいはウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドは、ＲＮＡの翻訳、または化学合成によって得られるポリペプチドまたはオリゴペプチドに由来し得るもので、好みに応じてキャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。その結合ペプチドを、動物を免疫化するために用いる。
【００５３】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。抗原決定基は、抗体への結合について、無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【００５４】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチド分子を指す。アプタマーはin vitroの進化過程（例えば米国特許番号第5,270,163号に記載されたSELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment））から由来するもので、そのような過程は大きな組み合わせライブラリから標的特異的なアプタマー配列を選択する。アプタマー組成は二本鎖または一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド成分は、修飾された糖基（例えばリボヌクレオチドの2'-OH基が2'-Fまたは2'-NH2で置換し得る）を有することが可能で、そのような糖基はヌクレアーゼへの抵抗性または血液中でのより長い寿命などの望ましい性質に改善し得る。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを高分子量キャリアー等の分子に抱合させることができる。アプタマーは、たとえば架橋剤の光活性化によって、各々の同種リガンドと特異的に架橋させることができる（Brody, E.N.及びL. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照）。
【００５５】
「イントラマー（intramer）」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。
【００５６】
「スピーゲルマー（spiegelmer）」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性のヌクレオチドを含むアプタマーは右旋性ヌクレオチドに作用する天然の酵素による分解に対して耐性がある。
【００５７】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン結合を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖類を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドを含みうる。アンチセンス分子は、化学合成または転写など、任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、細胞に導入されると、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、二重鎖を形成して転写または翻訳を妨害する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味しうる。
【００５８】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然あるいは組換え体のMDDT、合成のMDDT、またはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物の或いは細胞の特異的免疫応答を誘発して特異抗体群と結合する能力を指す。
【００５９】
「相補的」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「5'A-G-T3'」は、相補配列「3'T-C-A5'」と対を形成する。
【００６０】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む(有する)組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む(有する)組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。MDDTをコード、若しくはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を持つ組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。これらプローブは、凍結乾燥形態で貯蔵でき、また、糖質などの安定化剤と結合させ得る。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、脱脂粉乳、サケ精子DNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【００６１】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems, Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片アセンブルシステム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片アセンブリ用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片からアセンブルされた核酸配列を指す。伸長及びアセンブリの両方を行ってコンセンサス配列を作製する配列もある。
【００６２】
「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えない置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2005505251.tif 000002
【００６３】
保存アミノ酸置換では通常、（a）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（b）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（c）側鎖の大部分を保持する。
【００６４】
「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【００６５】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチドの化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【００６６】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子または酵素を指す。
【００６７】
「差次的発現」は、少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または遺伝子発現の欠損またはタンパク発現の欠損を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態サンプルと健常サンプルとの間で行われ得る。
【００６８】
「エキソンシャフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンはコードされるタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定した基礎構造の新規な再構築(reassortment)を介して新しいタンパク質がアセンブリされることが可能であり、これにより新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【００６９】
「断片」は、MDDTの、またはそれをコードするポリヌクレオチドの固有の部分であって、その親配列（parent sequence）と配列は同一であるが親配列より長さが短いものを指す。或る断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば或る断片は、5〜1000の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは500の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、或る分子の特定領域から優先的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、所定の配列に示すようなポリペプチドの最初の250または500アミノ酸（または最初の25％または50％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施態様では、配列表、表および図面を含む本明細書が支持する任意の長さであり得る。
【００７０】
SEQ ID NO:38-74の断片には、固有のポリヌクレオチド配列領域が含まれる。この領域は、SEQ ID NO:38-74を特異的に同定するものであり、例えば断片が得られる同一ゲノム中の他すべての配列とは異なるものである。SEQ ID NO:38-74の或る断片は、例えば、ハイブリダイゼーションや増幅技術、またはSEQ ID NO:38-74を関連ポリヌクレオチド配列から区別する類似の方法に有用である。SEQ ID NO:38-74の断片の正確な長さ及び、断片が対応するSEQ ID NO:38-74の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００７１】
SEQ ID NO:1-37のある断片は、SEQ ID NO:38-74のある断片によってコードされる。SEQ ID NO:1-37のある断片には、SEQ ID NO:1-37を特異的に同定する固有のアミノ酸配列領域が含まれている。例えば、SEQ ID NO:1-37のある断片は、SEQ ID NO:1-37を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO:1-37のある断片の正確な長さ、及びその断片に対応するSEQ ID NO:1-37の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【００７２】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）、オープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【００７３】
「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の配列類似性、または配列同一性を意味する。
【００７４】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「％一致」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。標準化アルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するため、標準化された再現性のある方法で比較対象の２配列内にギャップ群を挿入し得るので、２つの配列をより有意に比較できる。
【００７５】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（DNASTAR, Madison WI）の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp（1989）CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。ポリヌクレオチド配列を２つ１組でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定する。デフォルトとして「重みづけされた」残基の重みづけ表を選択する。「weighted（重み付けされた）」残基重み付け表が、デフォルトとして選択される。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity（類似性パーセント）」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【００７６】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）から提供されており（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも入手可能であり、２つのヌクレオチド配列を直接にペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn及びblastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ及び他のパラメータをデフォルト設定に設定して用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータとして設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００７７】
Matrix:BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap:5 及びExtension Gap:2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter:on
【００７８】
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも20、30、40、50、70、100または200の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図および配列リストを含めた本明細書に記載された配列が支持する任意の断片長を用いて、一致率を測定し得る或る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００７９】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【００８０】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「％一致」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる2つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の酸性度及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【００８１】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（既に説明したのでそれを参照されたい）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスが選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「percent similarity」として一致率を報告する。
【００８２】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (2000年4月21日)でblastpを使用するであろう。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【００８３】
Matrix:BLOSUM62
Open Gap:11 及びExtension Gap:1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter:on
【００８４】
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも15、20、30、40、50、70、または150の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に支持された任意の配列長さの断片を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【００８５】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約6kb 〜10MbのサイズのDNA配列を含み得る、安定した染色体複製の分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の微小染色体である。
【００８６】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が変えられた抗体分子を指す。
【００８７】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容的アニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングのための許容的条件は、当業者が慣例的に決定できる。許容的条件は、どのハイブリダイゼーション実験でも一定でありうるが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験によって変更されうる。アニーリングが許容される条件は、例えば、温度が68℃で、約6×SSC、約1％（w/v）のSDS、並びに約100μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAが含まれる。
【００８８】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは或る程度、洗浄ステップを実行する温度を基準にして表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約5〜20℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の50％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【００８９】
本発明のポリヌクレオチド間の高ストリンジェンシー条件のハイブリダイゼーションには、約0.2x SSCおよび約0.1％のSDSの存在下、68℃で1時間の洗浄条件を含む。あるいは、温度は約65℃、60℃、55℃、または42℃を用い得る。SSC濃度は、約0.1％のSDS存在下で、約0.1〜2×SSCの範囲で変化し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlの、せん断した変性サケ精子DNAがある。例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションのような特定条件下では、有機溶剤、例えば約35〜50%v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。進化的類似性は、ヌクレオチド群、およびヌクレオチドがコードするポリペプチド群について、或る同様の役割を強く示唆する。
【００９０】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【００９１】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加されるアミノ酸配列或いはヌクレオチド配列の変化を指す。
【００９２】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、あるいは伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【００９３】
「免疫原性断片」は、例えば哺乳動物など生物に導入すると免疫応答を引き起こし得る、MDDTのポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片を指す。用語「免疫原性断片」にはまた、本明細書で開示するまたは当分野で既知のあらゆる抗体生産方法に有用なMDDTのあらゆるポリペプチド断片またはオリゴペプチド断片をも含む。
【００９４】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【００９５】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の定義された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【００９６】
用語「モジュレート」または「活性を調節」は、MDDTの活性を変化させることを指す。例えば、モジュレートによって、MDDTのタンパク質活性の増減が、或いは結合特性の、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起き得る。
【００９７】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」および「核酸配列」の語はまた、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるかあるいはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【００９８】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、或るプロモーターが或るコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は、同一のリーディングフレーム内に在り得る。
【００９９】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なくとも約5ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを有する、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、組成物に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化して細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１００】
MDDTの「翻訳後修飾」としては、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解的切断及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、MDDTの酵素環境に依存し、細胞の種類によって異なることとなる。
【０１０１】
「プローブ」とは、核酸配列の内、MDDTやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードし、同一配列や対立遺伝子核酸配列、または関連する核酸配列の検出に用いる配列を指す。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に接着した配列である。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬および酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って延長し得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による、核酸配列の増幅（および同定）に用い得る。
【０１０２】
本発明に用いるプローブおよびプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチド群からなる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも20、25、30、40、50、60、70、80、90、100または少なくとも150の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブおよびプライマーもある。表、図面および配列リストを含む本明細書が支持する、任意の長さのヌクレオチドを用い得るものと理解されたい。
【０１０３】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J.他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻、Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M.他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis, M. 他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１０４】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各100ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、32キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチド及び最大5.000ヌクレオチドまでの大きめのポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、したがってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「ミスプライミングライブラリ」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードは、それぞれの情報源から得てユーザー固有のニーズを満たすように修正し得る）。PrimerGenプログラム（英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンター(英国ケンブリッジ)から一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有なもの、及び保存されたもの双方のオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、あるいは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１０５】
「組換え核酸」は天然の配列ではなく、２つ以上の配列の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメント群の人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えば細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１０６】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部であって、例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなワクシニアウイルスは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１０７】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び5'及び3'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を制御する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１０８】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識化に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分を含む。
【０１０９】
DNA配列に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA配列とヌクレオチドの同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、全ての窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１１０】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。MDDT、それをコードする核酸群、またはその断片群を含むと推定されるサンプルとしては、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、またはcDNAと、組織と、組織プリントなどがあり得る。
【０１１１】
用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識する構造が存在するか否かに依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１１２】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に結合している組成物が少なくとも約60％除去されたものであり、好ましくは約75％以上の除去、最も好ましくは90％以上除去されたものを指す。
【０１１３】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１１４】
「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、壁、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１１５】
「転写物イメージ」あるいは「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による集合的遺伝子発現のパターンを指す。
【０１１６】
「形質転換(transformation)」とは、外来DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。用語「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１１７】
ここで用いる「遺伝形質転換体(transgenic organism)」とは任意の生物体であり、限定するものではないが動植物を含み、生物体の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック(transgenic)技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスでの感染によって行う。或いは核酸の導入は、組換えウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを感染させて成し得る (Lois, C. 他 (2002) Science 295:868-872)。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌および動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他 (1989) 等の参考文献に記載されている。
【０１１８】
特定の核酸配列の「変異体／変異配列」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも40％の配列同一性を有する核酸配列であると定義する。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子との有意な同一性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメイン群を有するか、あるいは参照分子には存在するドメイン群が欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意なアミノ酸同一性を有する。多型性変異体は、所与の種の個体間での特定遺伝子のポリヌクレオチド配列中での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１１９】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で特定のポリペプチド配列に対して少なくとも40％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、ポリペプチドの１つの所定の長さに対して、例えば少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１２０】
（発明）
本発明は、新規のヒト疾患検出および治療用分子群（MDDT）および、MDDTをコードするポリヌクレオチド群の発見に基づく。また、これらの組成物を利用した、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性障害、発達障害、および神経障害の、診断、治療、および予防の開発に基づく。
【０１２１】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチドおよびその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１２２】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースとPROTEOMEデータベースとに対するBLAST分析で同定した、本発明のポリペプチド群に相同な配列群を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）とそれに対応するIncyteポリペプチド配列番号（Incyte ポリペプチド ID）を示す。列３は、GenBankの最も近い相同体のGenBank識別番号（Genbank ID NO :）と最も近いPROTEOMEデータベース相同体のPROTEOMEデータベース識別番号(PROTEOME ID NO:)を示す列４は、各ポリペプチドとその相同体１つ以上との間の一致に関する確率スコアを示す。列５は、GenBankとPROTEOMEデータベースの相同体の注釈を示し、更に該当箇所には関連する引用文献も示す。これらを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１２３】
表３は、本発明のポリペプチドの多様な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyteポリペプチド配列番号（Incyteポリペプチド ID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４および列５はそれぞれ、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示す。列６は、シグネチャ配列、ドメイン、およびモチーフを有するアミノ酸残基を示す。列7は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所には更に、分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１２４】
表２および表３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が、請求の範囲に記載されたポリペプチドが疾患検出および治療用分子であることを確立している。また他の例として、SEQ ID NO:1はヒトのmyoferlin(GenBank ID g6731235)とM1残基からV2061残基まで98％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)によって示された。（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:1はまた、複数のC2ドメイン群を有することが、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:1がferlinファミリータンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。別の例において、SEQ ID NO:9はマウスの精巣特異的ヒストンH2B(GenBank ID g1518338)のM1残基からK127残基に対して92%の同一性があることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって確認された。（表2参照）。BLAST確率スコアは5.0e-56であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:9はまた、コアヒストンH2A/H2B/H3/H4ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS、MOTIFS、及びPROFILESCAN解析よりのデータは、SEQ ID NO:9 がヒストンである、さらに実証的な証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:17はM1残基からV1288残基まで、ラットの5-オクソ-L-プロリナーゼ（GenBank ID g1732065）と93％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは0.0であり、これは観測されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:17はまた、ヒダントイナーゼ／オキソプロリナーゼドメイン群を有することが、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された。別の例において、SEQ ID NO:18はヒトのZnフィンガータンパク質304(GenBank ID g9968290)に対してM96残基からR748残基まで53%同一であることがBLAST分析によって同定された（表2参照）。BLAST確率スコアは4.1e-180である。SEQ ID NO:18はまた、KRABボックスとZnフィンガードメインを有する。 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。MOTIFS解析よりのデータは、SEQ ID NO:18 がZnフィンガータンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。また他の例として、SEQ ID NO:34は、M515残基からT1047残基まで、ヒトの肝細胞癌関連抗原67（GenBank ID g7645038）と99％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは1.2e-287であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:34はまた、１つのプレックストリン相同性(PH)ドメインとSec7GTP交換因子ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS解析および付加的BLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:34が疾患関連タンパク質であることを更に確証する証拠を提供する。別の例において、SEQ ID NO:36はA59残基からD444残基までロイシンリッチ神経タンパク質(GenBank ID g3135309)に52%の同一性を有するが、これはBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって同定される。（表2参照）。BLAST確率スコアは1.9e-126であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:36はまた、ロイシンリッチリピートと潜在的膜アンカーを有するヒトのロイシンリッチ神経タンパク質に同一性があるが、このことはPROTEOMEデータベースを使ったBLAST解析によって示された。SEQ ID NO:36はまた、カルポニン相同ドメインとロイシンリッチリピートドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS、MOTIFS及び付加的なBLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:36がロイシンリッチタンパク質である、さらに実証的な証拠を提供する。SEQ ID NO:2-8、SEQ ID NO:10-16、SEQ ID NO:19-33、SEQ ID NO:35、およびSEQ ID NO:37は同じような方法で解析し、注釈を付けた。 SEQ ID NO:1-37の解析用のアルゴリズム及びパラメータを表７に記載した。
【０１２５】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら2種類の配列を任意に組み合わせてアセンブリした。列１は本発明の各ポリヌクレオチドに対するポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）、対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）、および塩基対での各ポリヌクレオチド配列の長さを示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列をアセンブリするのに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の、また、例えばSEQ ID NO:38-74を同定するため、或いはSEQ ID NO:38-74と、関連するポリヌクレオチド配列群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片の、開始ヌクレオチド（5'）位置および終了ヌクレオチド（3'）位置を示す。
【０１２６】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は特に、例えば組織特異的cDNAライブラリあるいはプールしたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合もある。或いは列2のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列のアセンブリに寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre、（英国ケンブリッジ））データベースから由来した配列を同定し得る（即ち「ENST」命名を含む配列）。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方のアセンブリ体を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 と同定されるポリヌクレオチドは、アルゴリズムが適用される配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であ.り、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「スティッチされた(stitched)」配列である(実施例５参照)。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンのアセンブリ体を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。XXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号であり、Nは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別子（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０１２７】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
2005505251.tif 000003
【０１２８】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために表4に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０１２９】
表５は、Incyte cDNA配列を用いてアセンブリされた完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列群をアセンブリ及び確認するために用いられたIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表される、Incyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織およびベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０１３０】
表8は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型(SNP)を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列識別番号（SEQ ID NO :）およびそれに対応するIncyteプロジェクト識別番号（PID）を示す。列3および列4はそれぞれ、SNPが検出されたESTのIncyte識別番号(EST ID)およびSNPの識別番号(SNP ID)を示す。列5および列6はそれぞれ、SNPがあるEST配列内の位置(EST SNP)および全長ポリヌクレオチド配列内のSNPの位置(CB1 SNP)を示す。列7は、EST配列内に見られるアレルを示す。列8と9は、SNP部位に見られる2つのアレルを示す。列10は、ESTに見られるアレルに基づくSNP部位を含むコドンによってコードされたアミノ酸を示す。列11〜14は4つの異なるヒトの集団のアレル1の頻度を示す。エントリn/d（検出せず）は、集団におけるアレル1の頻度が低すぎて検出できないことを示し、n/a（利用不可）はアレル頻度が集団について決定できなかったことを示す。
【０１３１】
本発明には、また、MDDTの変異配列群をも含む。好適なMDDT変異体は、MDDTの機能的或いは構造的特徴を少なくとも１つ有し、かつ、MDDTアミノ酸配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有する変異体である。
【０１３２】
本発明はまた、MDDTをコードするポリヌクレオチドを提供する。特定の実施態様において、本発明は、MDDTをコードする、SEQ ID NO:38-74からなる一群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:38-74のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルで置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０１３３】
本発明はまた、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチド配列は、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列との、少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、あるいは少なくとも約85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を持つこととなる。本発明の或る特定の態様は、SEQ ID NO:38-74からなる群から選択された１核酸配列との少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約８５％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する、SEQ ID NO:38-74からなる群から選択された１配列を持つポリヌクレオチド配列の変異配列を提供する。上記のポリヌクレオチド変異配列は何れも、MDDTの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０１３４】
更に別の例では、本発明の或るポリヌクレオチド変異配列は、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列のスプライス変異配列である。或るスプライス変異配列はMDDTをコードするポリヌクレオチド配列との顕著な配列同一性を持つ部分複数を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソン群の選択的スプライシングによって生ずる、配列の数ブロックの付加または欠失により、通常より多数またはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。或るスプライス変異配列には、約70％未満、または約60％未満、あるいは約50％未満のポリヌクレオチド配列同一性が、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列との間で全長にわたって見られるが、このスプライス変異配列のいくつかの部分には、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列の各部との、少なくとも約70％、あるいは少なくとも約85％、または少なくとも約95％、なおまたは100％の、ポリヌクレオチド配列同一性を有することとなる。例えば、SEQ ID NO:73の配列を含むポリヌクレオチドはSEQ ID NO:39の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体であり、SEQ ID NO:74の配列を含むポリヌクレオチドはSEQ ID NO:54の配列を含むポリヌクレオチドのスプライス変異体である。上記したスプライス変異配列は何れも、MDDTの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有する或るアミノ酸配列をコードし得る。
【０１３５】
遺伝暗号の縮重により、MDDTをコードする種々のポリヌクレオチド配列が作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のポリヌクレオチド配列群とも最小の類似性しか有しない配列もあることは、当業者には理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るあらゆる可能なポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組合せは、天然MDDTのポリヌクレオチド配列に適用される標準トリプレット遺伝暗号を基に成されるものであり、このような変異は全て明確に開示されていると考慮されたい。
【０１３６】
MDDTとその変異配列とをコードするヌクレオチド配列は一般に、好適に選択されたストリンジェンシー条件下で天然MDDTのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、非天然コドン群を含めるなどの実質的に異なるコドン使用を有する、MDDT或いはその誘導体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは、有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、MDDTおよびその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作られる転写物より例えば長い半減期など好ましい特性を備えるRNA転写物を作ることもある。
【０１３７】
本発明にはまた、MDDTとその誘導体とをコードするDNA配列またはそれらの断片の、完全に合成化学による作製も含む。作製後にこの合成配列を、当分野で周知の試薬類を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入できる。更に、合成化学を用いて、MDDTをコード、またはその任意の断片をコードする或る配列の中に突然変異を導入できる。
【０１３８】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列に、特に、SEQ ID NO:38-74及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列群が含まれる(例えば、Wahl, G.M.及びS.L. Berger (1987) Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R. (1987) Methods Enzymol. 152:507-511等を参照)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０１３９】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。
【０１４０】
当分野で既知の、PCR法をベースにした種々の方法と、部分的ヌクレオチド配列とを利用して、MDDTをコードする核酸配列を伸長し、プロモーターや調節エレメントなど、上流にある配列を検出し得る。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である（例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照）。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えばTriglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照)。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している（例えばLagerstrom, M. 他 (1991) PCR Methods Applic. 1:111119を参照)。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:30553060を参照)。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinder（商標）ライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリ類をスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部の発見に有用である。全てのPCRベースの方法では、市販ソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上で、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。
【０１４１】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、遺伝子群の５'領域を有する配列をしばしば含んでおり、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリ群は、５'非転写調節領域への、配列の伸長に有用であろう。
【０１４２】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシング産物またはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで刺激される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０１４３】
本発明の別の実施例では、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を組換えDNA分子にクローニングして、適切な宿主細胞内にMDDT、その断片または機能的等価物を発現させることが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列を産生し、これらの配列をMDDTの発現に利用し得る。
【０１４４】
MDDTをコードする配列を種々の目的で改変するために、当分野で一般的に知られている方法を用いて、本発明のヌクレオチド配列を組換えることができる。この目的には、遺伝子産物のクローン化、プロセッシングおよび／または発現の調節が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０１４５】
本発明のヌクレオチドを、MOLECULARBREEDING (Maxygen Inc., Santa Clara CA; 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797、Christians, F.C. 他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319)などのDNAシャフリング技術を用いてシャフリングして、MDDTの生物学的または酵素的な活性、或いは他の分子や化合物と結合する能力などのMDDTの生物学的特性を変更或いは改良することができる。DNAシャッフリングは、PCRを介する遺伝子断片組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを作製するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異体群を同定する、選択またはスクリーニングの手順を経る。続いて、これら好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリングおよび選択／スクリーニングを行い得る。かくして、「人工的な」育種及び急速な分子進化によって遺伝的多様性が作られる。例えば、ランダムポイント突然変異を持つ単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングし得る。或いは、所与遺伝子の断片を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝的多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化させることができる。
【０１４６】
別の実施態様によれば、MDDTをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部を合成可能である（例えば、Caruthers, M.H.他 (1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215223、Horn, T.他 (1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225232等を参照）。別法として、化学的方法を用いてMDDT自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行い得る（例えばCreighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60、Roberge, J.Y. 他. (1995) Science 269:202204を参照)。自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更に、MDDTのアミノ酸配列、または任意のその一部を、直接合成の際に改変することにより、及び／または他のタンパク質からの配列群または任意のその一部と組み合わせることにより、変異体ポリペプチドを作製、または、或る天然ポリペプチドの１配列を有するポリペプチドを作製し得る。
【０１４７】
このペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Chiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等を参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。
【０１４８】
生物学的に活性なMDDTを発現させるために、MDDTをコードするヌクレオチド配列またはそれらの誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現ベクターとは、好適な宿主に挿入されたコーディング配列の転写と翻訳との制御に必要なエレメント群を持つベクターである。必要なエレメントの例には、ベクターに、またMDDTをコードするポリヌクレオチド配列における調節配列、例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５'および３'の非翻訳領域などが含まれる。このようなエレメントは、強度及び特異性が様々である。特定の開始シグナル類によって、MDDTをコードする配列の、より効果的な翻訳を達成することも可能である。開始シグナルの例には、ATG開始コドンと、コザック配列など近傍の配列とが含まれる。MDDTをコードする配列、およびその開始コドンや、上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写制御シグナルや翻訳制御シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コード配列あるいはその断片のみが挿入された場合は、インフレームATG開始コドンなど外因性の翻訳制御シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外来性の翻訳エレメント及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（例えばScharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125162を参照)。
【０１４９】
当業者に周知の方法を用いて、MDDTをコードする配列と、好適な転写および翻訳制御エレメントとを持つ発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章、8章及び１6-17章、Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY,9章、13章及び16章等を参照)。
【０１５０】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、MDDTをコードする配列の保持および発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌などの微生物等や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系または動物細胞系がある（例えば前出Sambrook; 前出Ausubel; Van Heeke, GおよびS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、Engelhard, E.K. 他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他. (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307311; The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York NY,191196ページ、Logan, J.およびT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:36553659、Harrington, J.J. 他. (1997) Nat. Genet. 15:345-355を参照)。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813-815; McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M.およびN. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０１５１】
細菌系では、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて多数のクローニングベクターおよび発現ベクターを選択し得る。例えば、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列の慣例的なクローニング、サブクローニング、増殖には、PBLUESCRIPT（Stratagene, La Jolla CA）またはPSPORT１プラスミド（Life Technologies）などの多機能の大腸菌ベクターを用いることができる。ベクターのマルチクローニング部位に、MDDTをコードする配列をライゲーションするとlacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を持つ形質転換された細菌の同定のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509等を参照)。例えば抗体類の産生などに多量のMDDTが必要な場合は、MDDTの発現をハイレベルで指示するベクター類が使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを有するベクターが使用できる。
【０１５２】
酵母の発現系を使用してMDDTを産出することもできる。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の、分泌か細胞内での保持かのどちらかを指示するものであり、安定した増殖のために宿主ゲノムの中に外来配列群を組み込むことを可能にする（例えば前出のAusubel, 1995; Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol. 153:516544、Scorer, C.A. 他. (1994) Bio/Technology 12:181-184を参照)。
【０１５３】
植物系もMDDTの発現に使用可能である。MDDTをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはTMV（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるような、CaMV由来の35Sおよび19Sプロモーターによって駆動し得る。あるいは、RuBisCOの小サブユニットなどの植物プロモーター、または熱ショックプロモーターを用い得る（例えばCoruzzi, G.他 (1984) EMBO J. 3:16711680、Broglie, R. 他. (1984) Science 224:838843、Winter, J. 他 (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85105を参照)。これらの作製物は、直接DNA形質転換にまたは病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページ等を参照）。
【０１５４】
哺乳類細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、後期プロモーターと３連リーダー配列とを持つアデノウイルス転写／翻訳複合体に、MDDTをコードする配列を結合し得る。アデノウイルスゲノムの非必須E1またはE3領域へ挿入することにより、宿主細胞内でMDDTを発現する感染ウイルスを得ることができる(例えば、Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659等を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０１５５】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を送達することもできる。治療のために約6kb〜10MbのHACを作製し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達する(Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照)。
【０１５６】
哺乳類系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、細胞株におけるMDDTの安定した発現が望ましい。例えば、MDDTをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じ或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、複製のウイルス起源、および／または内因性の発現エレメント群を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約1〜2日間、細胞を増殖させ得る。選択可能マーカーの目的は選択剤への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーの存在により、導入した配列をうまく発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０１５７】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−単純細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M. 他. (1977) Cell 11:223-232、Lowy, I. 他. (1980) Cell 22:817-823を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質あるいは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシンおよびG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:35673570、ColbereGarapin, F. 他  (1981) J. Mol. Biol. 150:114等を参照)。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝物のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDが、文献に記載されている(Hartman, S.C及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051等を参照)。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性あるいは安定したタンパク質発現を定量し得る(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照)。
【０１５８】
マーカー遺伝子発現の有無によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、MDDTをコードする配列が或るマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、MDDTをコードする配列群を有する形質転換された細胞群は、マーカー遺伝子機能の欠落により特定できる。または、１つのプロモーターの制御下で、或るマーカー遺伝子が、MDDTをコードする配列とタンデムに配置されることも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【０１５９】
一般に、MDDTをコードする核酸配列を含み且つMDDTを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーションと、PCR増幅とがあり、また、核酸配列或いはタンパク質配列の検出、定量、或いはその両方を行うための、膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含む、タンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法もある。
【０１６０】
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてMDDTの発現の検出と計測とを行うための免疫学的方法は、当分野で既知である。このような技術の例としては、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などが挙げられる。MDDT上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当分野で周知である（例えばHampton, R.他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN, Sect. IV、Coligan, J.E. 他. (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJを参照)。
【０１６１】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。MDDTをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化)、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、MDDTをコードする配列、またはその任意の断片を、mRNAプローブを生成するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6などの好適なRNAポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、U.S. Biochemicalなどから市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子あるいは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子のほか、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤などがある。
【０１６２】
MDDTをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、あるいはその両者に依存する。MDDTをコードするポリヌクレオチドを持つ発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通してのMDDTの分泌を誘導するシグナル配列群を持つように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０１６３】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現をモジュレートする能力、または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０１６４】
本発明の別の実施態様では、MDDTをコードする、天然の核酸配列、修飾された核酸配列、または組換えの核酸配列を、或る異種配列に結合させることができ、この結果、上記した任意の宿主系の、或る融合タンパク質の翻訳を生じる。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラMDDTタンパク質は、MDDT活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分および異種ペプチド部分も、市販されている親和性マトリックスを用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-mycおよび赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販のモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いた、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、MDDTをコードする配列と異種タンパク質配列との間にタンパク質分解切断部位を融合タンパク質が持つように遺伝子操作すると、MDDTが、精製の後に異種部分から切断され得る。融合タンパク質の発現および精製方法は、前出のAusubel（1995）10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現および精製を促進することもできる。
【０１６５】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射能標識したMDDTの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０１６６】
本発明のMDDTまたはその断片を用いて、MDDTに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、MDDTへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０１６７】
或る実施態様では、このように同定された化合物は、MDDTの天然リガンドに密接に関連し、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである(Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5等を参照)。 同様に、この化合物は、MDDTが結合する天然受容体に、あるいは例えばリガンド結合部位など少なくともこの受容体の或る断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施態様では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてMDDTを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、あるいは大腸菌からの細胞が含まれる。MDDTを発現する細胞またはMDDTを含有する細胞膜分画を試験化合物と接触させて、MDDTまたはこの化合物のどちらかの結合、刺激、または活性の阻害を分析する。
【０１６８】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、蛍光色素、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたMDDTと混合するステップと、MDDTとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、アッセイでは標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然の生成混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０１６９】
本発明のMDDTまたはその断片を用いて、MDDTの活性をモジュレートする化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物としては、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは逆アゴニストなどが含まれ得る。一実施態様では、MDDTが少なくとも１つの試験化合物と結合する、MDDTの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、試験化合物の存在下でのMDDTの活性を、試験化合物不在下でのMDDTの活性と比較する。試験化合物の存在下でのMDDTの活性の変化は、MDDTの活性をモジュレートする化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、MDDTの活性に適した条件下で、DMEを有するin vitro系すなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、MDDTの活性をモジュレートする試験化合物は間接的にモジュレートする場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つ、または複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１７０】
別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、MDDTまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号および第5,767,337号などを参照）。例えば129/SvJ細胞系などのマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R.（1989）Science 244:1288-1292）などのマーカー遺伝子で破壊した、目的の遺伝子を持つベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより、宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。或いは、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002、Wagner, K.U.他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330)。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株などから採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、潜在的な治療薬や毒性薬物で検査されうる。
【０１７１】
MDDTをコードするポリヌクレオチドを、in vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することも可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞タイプを含む、少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他 (1998) Science 282:1145-1147)。
【０１７２】
MDDTをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することも可能である。ノックイン技術を用いて、MDDTをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について試験し、潜在的医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばMDDTを乳汁内に分泌するなどMDDTを過剰に発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０１７３】
（治療）
MDDTの各領域と疾患検出および治療用分子類との間には、例えば配列およびモチーフの内容における、化学的および構造的類似性が存在する。更にMDDTを発現する組織の例は表6に見出すことが可能であり、例11にも見出され得る。従って、MDDTは、細胞増殖異常、自己免疫／炎症性疾患、発達障害、および神経疾患においてある役割を果たすと考えられる。MDDTの発現または活性の増大に関連する疾患の治療においては、MDDTの発現または活性を低下させることが望ましい。また、MDDTの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、MDDTの発現または活性を亢進させることが望ましい。
【０１７４】
したがって、一実施態様において、MDDTの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にMDDTまたはその断片や誘導体を投与し得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、発達障害、および神経障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。神経障害には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病および代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞および他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれる。
【０１７５】
別の実施態様では、限定するものではないが上記した疾患を含む、MDDTの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、MDDTまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与しうる。
【０１７６】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、MDDTの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、実質的に精製されたMDDTを有する組成物を、好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与し得る。
【０１７７】
更に別の実施態様では、限定するものではないが上に列記した疾患を含む、MDDTの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、MDDTの活性を調節するアゴニストを被験者に投与し得る。
【０１７８】
更なる実施例では、MDDTの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にMDDTのアンタゴニストを投与し得る。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、発達障害、および神経障害が含まれる。一態様では、MDDTと特異的に結合する抗体が直接アンタゴニストとして、或いはMDDTを発現する細胞または組織に薬剤を運ぶターゲッティング機構或いは送達機構として間接的に用いられ得る。
【０１７９】
別の実施態様では、MDDTをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現するベクターを被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含む、MDDTの発現または活性の増大に関連した疾患の治療または予防を成し得る。
【０１８０】
別の実施態様では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法により、少量の各薬物で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０１８１】
MDDTのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造できる。詳しくは、精製されたMDDTを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリ群をスクリーニングしてMDDTと特異結合する薬物を同定できる。MDDTに対する抗体も、本技術分野で公知の方法を用いて製造することが可能である。限定するものではないがこのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fab断片、およびFab発現ライブラリによって作られた断片が含まれ得る。中和抗体（すなわち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体(例えば、ラクダまたはラマ)は有力な酵素阻害剤であり、またペプチド擬態物質の設計および免疫吸着剤やバイオセンサーの開発に利点があるであろう(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０１８２】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒトその他の種々の宿主が、MDDTまたは任意の断片の注入、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH）、ジニトロフェノールなどの界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０１８３】
MDDTに対する抗体を誘導するために用いるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約5個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものが好ましく、一般的には約10個以上のアミノ酸からなるものとなる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることも望ましい。MDDTアミノ酸類の短いストレッチ群は、KLHなど他のタンパク質の配列と融合され、このキメラ分子に対する抗体群が産生され得る。
【０１８４】
MDDTに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他 (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D.他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P.他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０１８５】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81−4851−4855、Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608、Takeda, S.他. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、MDDT特異的一本鎖抗体を生成し得る。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリ類からチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０１８６】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る（例えばOrlandi, R.他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:38333837、Winter, G. 他. (1991) Nature 349:293299を参照)。
【０１８７】
MDDTに対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab'）2断片と、F（ab'）2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。或いは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D他 (1989) Science 246:12751281等を参照)。
【０１８８】
種々の免疫学的検定（イムノアッセイ）を用いてスクリーニングすることにより、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる免疫放射定量測定法または競合結合試験に対する数々のプロトコルは、本技術分野において公知である。このようなイムノアッセイは通常、MDDTとその特異抗体との間の複合体形成の計測を含む。２つの非干渉性MDDTエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体群を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合結合試験も利用できる(Pound、前出)。
【０１８９】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、MDDTに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態下でのMDDT-抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原とのモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様なMDDTエピトープに対する親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、MDDT抗体群の平均親和性または結合活性を表す。特定のMDDTエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体製剤のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が109〜1012Ｌ／ｍｏｌの高親和性抗体製剤は、MDDT-抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が106〜10７L／molの低親和性抗体試薬は、MDDTが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい(Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC、Liddell, J. E.およびCryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０１９０】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような製剤の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも1〜2mg／mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg／mlの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、MDDT-抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のCattyの文献、同Coligan他の文献等を参照）。
【０１９１】
本発明の別の実施例では、MDDTをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列を、治療目的で使用できる。ある態様では、MDDTをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNA、または修飾したオリゴヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはより大きな断片が、MDDTをコードする配列の制御領域から、またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である(Agrawal, S.編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ等を参照)。
【０１９２】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を適切な標的細胞に導入するのに好適な、任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で細胞内に送達することが可能である（例えばSlater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475、Scanlon, K.J. 他. (1995) 9(13):1288-1296を参照)。アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.及びW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（例えばRossi, J.J.（1995）Br. Med. Bull. 51（1）:217-225; Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他. (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736を参照)。
【０１９３】
本発明の別の実施態様では、MDDTをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞の遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. 他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重度の複合型免疫欠損(SCID)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重度の複合型免疫欠損（Blaese, R.M. 他(1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. 他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. 他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G. 他 (1995) Hum. Gene  Therapy 6:643-666、Crystal, R.G. 他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. 及びSomia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、あるいは（iii）細胞内の寄生虫（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生虫、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。MDDTの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からMDDTを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０１９４】
本発明の更なる実施態様では、MDDTの欠損による疾患や異常症を、MDDTをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってMDDT欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソンの使用（Morgan, R.A.およびW.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510、Boulay,J-L.およびH. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）がある。
【０１９５】
MDDTの発現に影響を及ぼし得る発現ベクターには、限定するものではないが、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター(Invitrogen, Carlsbad CA)、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH／PERV (Stratagene, La Jolla CA)、PTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG (Clontech, Palo Alto CA)が含まれる。MDDTを発現させるために、（i）恒常的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M. 及び H. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V.及びH.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V. 及び H.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するMDDTをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０１９６】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者はポリヌクレオチドを培養中の標的細胞に送達することが可能になる。また、実験パラメータ群を最適化するのに必要な努力が最小限になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L.及びA.J. Eb（1973）Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B. 他 (1982) EMBO J. 1:841-845)を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳類の形質移入プロトコルの修正が必要である。
【０１９７】
本発明の別の実施態様では、MDDTの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や障害を、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは或る独立プロモーターのコントロール下でMDDTをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナル群と、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列と、効率的なベクター増殖に必要なコーディング配列とを伴うRev応答性エレメント（RRE）と、からなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。このベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖される。VPCLは、各標的細胞上の受容体への親和性を持つエンベロープ遺伝子を、またはVSVgなど汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他. (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A及びA.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他. (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他. (1998) J. Virol. 72:9873-9880)。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞株を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクター類の繁殖や、細胞集団（例えばCD4+Ｔ細胞群）の形質導入、および形質導入した細胞群の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に周知の手法であり、多数の文献に記載がある（Ranga, U.他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G. 他. (1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U. 他. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290)。
【０１９８】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、MDDTの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を有する細胞群に、MDDTをコードするポリヌクレオチド群を送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内に導入する目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他 (1995) Transplantation 27:263268)。 使用できる可能性のあるアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544、  Verma, I.M.及びN. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０１９９】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の或る送達系を用いて、MDDTの発現に関連する１つ以上の遺伝子異常を持つ標的細胞群に、MDDTをコードするポリヌクレオチド群を送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターの利用は、HSVが向性を持つ中枢神経細胞にMDDTを導入する際に特に有用たり得る。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）１型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res. 169:385395)。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus strains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外在性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92の使用についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F. 他 (1999) J. Virol. 73:519-532、Xu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、巨大ヘルペスウイルスのゲノムの異なったセグメント群を含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２００】
別法では、或るαウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いて、MDDTをコードするポリヌクレオチド群を標的細胞群に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターはSFVゲノムに基づいている（Garoff, H.及びK.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、通常はウイルスのカプシドタンパク質をコードするサブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、MDDTをコードする配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に挿入することによって、ベクター形質導入細胞において多数のMDDTをコードするRNAが産生され、高いレベルでMDDTが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他 (1997) Virology 228:74-83)。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にMDDTを導入できることとなる。或る集団における或るサブセットの細胞群の特異的形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNAおよびRNAの形質移入方法およびαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２０１】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位(transcription initiation site)とは例えばスタート部位(start site)から数えて約−10と約＋10の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために充分に開く、二重らせんの能力を阻害するので有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E.他 (1994) in: Huber、B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ページ等を参照）。 相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２０２】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、人工的に作製されたハンマーヘッド型リボザイム分子が、MDDTをコードする配列の、内ヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２０３】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜20リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチド群とのハイブリダイゼーションへのアクセス可能性をテストすることによって行い得る。
【０２０４】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野で既知の任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、MDDTをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6などの好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA産物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２０５】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾としては、分子の5'末端、3'末端、あるいはその両方において隣接配列群を追加することや、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2'O-メチルを使用することが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を含める。
【０２０６】
本発明の更なる実施態様には、MDDTをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現変化を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を変異し得る。このように、MDDTの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、MDDTをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、MDDTの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、MDDTをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２０７】
特異ポリヌクレオチドの発現改変における有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変異させる場合と、既に市販のまたは私的な、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。MDDTをコードするポリヌクレオチドを持つサンプルを、このようにして得た試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、または透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。MDDTをコードするポリヌクレオチドの発現における改変は、当分野で周知の任意の方法でアッセイする。通常は、MDDTをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特定のヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ以上の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの発現改変に有効な化合物に対して、例えば分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）遺伝子発現系（Atkins, D. 他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M. 他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の或る特定の実施態様は、或る特定ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性について、オリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾したオリゴヌクレオチド）の組合せライブラリをスクリーニングする過程に関する（Bruice, T.W. 他 (1997) U.S. Patent No. 5,686,242、Bruice, T.W. 他. (2000) U.S. Patent No. 6,022,691)。
【０２０８】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを、患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（例えばGoldman, C.K.他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466を参照)。
【０２０９】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルなどの哺乳類を含めて治療が必要な全ての被験体に適用できる。
【０２１０】
本発明のさらなる実施態様は、通常薬剤として許容できる賦形剤で処方される活性成分を有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴムおよびタンパク質がある。様々な剤型が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、MDDT、その抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターなどからなる。
【０２１１】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２１２】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２１３】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２１４】
MDDTまたはその断片を含む高分子を直接細胞内に輸送するべく、特殊な種々の形状の組成物が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、その高分子の細胞融合と細胞内送達とを促進し得る。別法では、MDDTまたはその断片を、HIV Tat-1タンパク質から得た短い陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572)。
【０２１５】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、先ず治療上の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量および投与経路を決定することができる。
【０２１６】
治療有効量とは、症状や容態を回復させる、たとえばMDDTまたはその断片、MDDTの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、またはインヒビターなど活性成分の量を指す。治療有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の50％の治療有効量）またはLD50（集団の50％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を策定するのに用いられる。このような組成物に含まれる投与量は、毒性を殆どあるいは全く持たず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２１７】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、あるいは所望の効果を維持すべく、用法および用量を調整する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、被験者の全身健康状態、被験者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、薬剤の併用、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって、3〜4日毎に1度、1週間に1度、或いは2週間に1度の間隔で投与し得る。
【０２１８】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100.000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、タンパク質またはインヒビターに対する処方とは異なる、ヌクレオチドに対する処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、症状、部位などに特異的なものとなる。
【０２１９】
（診断）
別の実施態様では、MDDTに特異的に結合する抗体を、MDDTの発現によって特徴付けられる障害の診断に、または、MDDTやそのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用い得る。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。MDDTの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてMDDTを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２２０】
MDDTを測定するための、ELISA，RIA，及びFACSなど、種々のプロトコルは、当分野では周知であり、変容した或いは異常なレベルのMDDT発現を診断するための基盤を提供する。正常或いは標準的なMDDTの発現の値は、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験体から採取した体液または細胞とMDDTに対する抗体とを複合体の形成に適した条件の下で結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験体、対照および生検組織からの疾患サンプル中で発現するMDDTの量を標準値と比較する。標準値と被験体との偏差が、疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２２１】
本発明の別の実施態様によれば、MDDTをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、MDDTの発現が疾患と相関し得る生検組織における遺伝子発現を検出し定量し得る。この診断アッセイを用いて、MDDTの存在の有無、更には過剰な発現を判定し、治療時のMDDTレベルの調節を監視する。
【０２２２】
一実施形態では、MDDTをコードまたは近縁の分子をコードするポリヌクレオチド配列（例えばゲノム配列）を検出可能なPCRプローブ類とのハイブリダイゼーションによって、MDDTをコードする核酸配列を同定できる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかにかかわらず、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェントによって、プローブがMDDTをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０２２３】
プローブはまた、関連する配列の検出に利用でき、また、MDDTをコードする任意の配列との少なくとも50％の配列同一性を有し得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:38-74の配列、あるいはMDDT遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２２４】
MDDTをコードするDNA群に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブ群の作製方法としては、MDDTをコードまたはその誘導体群をコードするポリヌクレオチド配列群を、mRNAプローブ群の作製のためのベクター類にクローニングする方法を含む。mRNAプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２２５】
MDDTをコードするポリヌクレオチド配列は、MDDTの発現に関係する疾患の診断の為に用い得る。限定するものではないが、このような疾患には細胞増殖異常、自己免疫／炎症疾患、発達障害、および神経障害が含まれ、細胞増殖異常の中には日光角化症、動脈硬化、アテローム硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合性結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、および奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、および子宮の癌が含まれる。自己免疫／炎症疾患には、後天性免疫不全症候群（AIDS）、アジソン病（慢性原発性副腎機能不全）、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血、喘息、アテローム性動脈硬化、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィー（APECED）、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ様関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれる。発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄異形成症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれる。神経障害には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、脳腫瘍、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病およびその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化およびその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、網膜色素変性症（色素性網膜炎）、遺伝性運動失調、多発性硬化症および他の脱髄疾患、細菌性およびウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎および神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、プリオン病（クールー、クロイツフェルト‐ヤコブ病、およびGerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含む）、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病お��び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管腫症（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳３叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞および他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経障害、脊髄疾患、筋ジストロフィー他の神経筋障害、末梢神経疾患、皮膚筋炎および多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、および中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺、精神障害（気分性、不安性の障害、統合失調症／分裂病）、季節性感情障害（SAD）、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、遅発性ジスキネジア、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、トゥーレット病、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、および家族性前頭側頭型痴呆とが含まれる。MDDTをコードするポリヌクレオチド配列は、変容したMDDT発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術や、PCR法や、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、およびマイクロアレイに使用可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０２２６】
或る特定の態様では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、MDDTをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。MDDTをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化されうる。また、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液あるいは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく改変された場合は、サンプル内のMDDTをコードするヌクレオチド配列の変容したレベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を評価するため、あるいは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０２２７】
MDDTの発現に関連する疾患の診断の基礎を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロフィールが確立される。これは、ハイブリダイゼーションあるいは増幅に好適な条件の下、動物あるいはヒトのいずれかの正常な被験者から抽出された体液あるいは細胞と、MDDTをコードする配列あるいはその断片とを混合させることにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量で用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０２２８】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０２２９】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供し得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０２３０】
MDDTをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、あるいはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、MDDTをコードするポリヌクレオチドの断片を、或いはMDDTをコードするポリヌクレオチドに対し相補的なポリヌクレオチドの断片を好ましくは含む。また、最適化した条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェント条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０２３１】
或る特定の態様において、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列群由来のオリゴヌクレオチドプライマー類を用いて、一塩基多型（SNP）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、SSCP(single-stranded conformation polymorphism)及び蛍光SSCP（fSSCP）法がある。SSCPでは、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列群に由来のオリゴヌクレオチドプライマー類とポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）とを用いた、DNAの増幅を行う。DNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列へアセンブリされるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、また統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０２３２】
ヒト疾患の遺伝的根拠を研究するためにSNPを用いることができる。例えば、少なくとも16の一般的SNPが、非インスリン依存型真性糖尿病と関連がある。SNPは、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血あるいは慢性肉芽腫症等の単一遺伝子病の転帰の差異を研究する面でも有用である。例えば、マンノース結合レクチンの変異体であるMBL2は、嚢胞性線維症の肺での有害な転帰と相関することが示されてきた。SNPはまた、生命を脅かす毒性等の薬剤への患者の反応に影響する遺伝変異体の同定という薬理ゲノミックスにおいても有用性がある。例えば、ALOX5遺伝子のコア・プロモーターにおける或る変異は5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息剤を用いた治療への臨床反応の減少につながるが、Nアセチルトランスフェラーゼの或る変異は抗結核薬剤イソニアジドに反応する末梢神経障害の高発生率と関連する。異なる集団におけるSNP分布の分析は、集団の起源と移動の追跡以外にも遺伝的浮動、突然変異、組換え、選択の調査において有用である(Taylor, J.G. 他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y及びZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P. 他 (2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０２３３】
MDDTの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、および標準曲線から得た結果の補間もある（例えばMelby, P.C.他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235244、Duplaa, C. 他. (1993) Anal. Biochem. 212:229236を参照)。目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０２３４】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列に由来するオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、或るマイクロアレイにおけるエレメント群として用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写物イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異および多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬物の活性を開発およびモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０２３５】
別の実施態様では、MDDT、その断片群または、MDDTに特異的な抗体類を、或るマイクロアレイ上のエレメント群として用い得る。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬物−標的相互作用および遺伝子発現プロファイルをモニターまたは測定することが可能である。
【０２３６】
或る実施態様は、或る組織または細胞タイプの転写イメージを作製する、本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写イメージは、特定の組織または細胞タイプによる遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。当該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写または逆転写全体に本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体をハイブリダイズすることにより、転写イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体がマイクロアレイ上のエレメントのサブセットを複数含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写イメージは、遺伝子活性のプロファイルを提供し得る。
【０２３７】
転写イメージは、組織、細胞株、生検またはその生体サンプルから単離した転写物を用いて作製し得る。転写イメージはしたがって、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、細胞株の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０２３８】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写物イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用および毒性のメカニズムを標示し、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称される、特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:153-159、Steiner, S及びN.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471、これらを引用することを以って本明細書の一部とする)。試験化合物が既知の毒性を有する化合物のシグネチャと類似のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子および遺伝子ファミリからの発現情報を含んでいる場合に、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が、最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変容しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒物シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャを統計的に一致させる過程に、遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば2000年2月29日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０２３９】
或る実施例では、核酸を有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより、この試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写物レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０２４０】
別の実施態様は、本発明のポリペプチド配列群を用いて或る組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更なる分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターンすなわちプロファイルは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数および相対存在量を定量することにより分析し得る。したがって、或る細胞のプロテオームのプロファイルは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離および分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、次に２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のSteinerおよびAnderson）。タンパク質は、通常はクーマシーブルー、あるいは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独自の位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られる同等に位置するタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。或るスポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０２４１】
プロテオームのプロフィールは、MDDTに特異的な抗体を用いてMDDT発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施態様では、マイクロアレイ上のエレメントとしてこれら抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイエレメントへのタンパク質結合レベルを検出することにより、タンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他 (1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他. (1999) Biotechniques 27:778-788)。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオール反応性またはアミノ反応性蛍光化合物とサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０２４２】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。数種の組織の数種のタンパク質に対しては、転写物とタンパク質との存在量の相関が乏しいので（Anderson, N.L.及びJ. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写物イメージには有意に影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒物シグネチャは有用たり得る。更に、体液中の転写物の分析はmRNAの急速な分解のために困難なので、プロテオームのプロファイル作成はこのような場合により信頼し得、情報価値があり得る。
【０２４３】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生体サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０２４４】
別の実施例では、タンパク質を含有する生体サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生体サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０２４５】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他 (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他 (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他 (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０２４６】
本発明の別の実施態様では、MDDTをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列よりも非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子族のメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1産物、あるいは単一染色体cDNAライブラリ群に対してマッピングされる(Harrington, J.J. 他. (1997) Nat. Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149154等を参照)。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば或る病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る(例えば、Lander, E.S及びD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照)。
【０２４７】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る（例えばHeinz-Ulrich,他 (1995) in Meyers, 前出 965-968ページを参照)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。物理的染色体地図上の、MDDTをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０２４８】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。疾患または症候群に関与する遺伝子が、血管拡張性失調症の11q22-23領域のように、特定のゲノム領域への遺伝的連関によって大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされた任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子或いは調節遺伝子を提示している可能性がある（例えばGatti, R.A. 他 (1988) Nature 336:577580を参照)。転座、反転などに起因する、健常者、保有者、罹病者の三者間における染色体位置の相違を検出する場合にも、本発明のヌクレオチド配列を用い得る。
【０２４９】
本発明の別の実施態様では、MDDT、その触媒作用断片群、或いは免疫原断片群、またはそのオリゴペプチド群を、種々の任意の薬物スクリーニング技術における、化合物群のライブラリ類のスクリーニングに用い得る。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置しうる。MDDTと試験する薬剤との結合による複合体の形成を測定し得る。
【０２５０】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen, 他 (1984) PCT 出願番号 WO84/03564等を参照)。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、MDDT、或いはその断片と反応してから洗浄される。結合したMDDTを次に、当分野で周知の種々の方法で検出する。精製したMDDTはまた、上記した薬物スクリーニング技術に用いるプレート上に直接コーティングもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０２５１】
別の実施態様では、MDDTと特異結合可能な中和抗体がMDDTとの結合について試験化合物と競合する、競合的薬物スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体を用いて、１つ以上の抗原決定基をMDDTと共有するどのペプチドの存在をも検出できる。
【０２５２】
別の実施態様では、MDDTをコードするヌクレオチド配列群を、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列群の諸特性（限定はされないが、トリプレット遺伝コード、特異的な塩基対相互作用等を含む）に依存するあらゆる新技術に用い得る。
【０２５３】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。したがって、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０２５４】
前述した、および以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物、米国特許出願第60/287,152号、同第60/288,599号、同第60/290,364号、同第60/293,837、同第60/353,284および同第60/351,107号も含めて、言及することをもって本明細書の一部とする。
【実施例】
【０２５５】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。幾つかの組織はホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解し、他の組織はホモジナイズしてフェノールにまたは変性剤群の好適な混合液に溶解した。混合液の１例であるTRIZOL（Life Technologies）は、フェノールとグアニジンイソチオシアネートとの単相溶液である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムクッション上で遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０２５６】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０２５７】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, 5.1-6.6ユニット等を参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（300〜1000bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは分取アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位へ連結された。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1 プラスミド(Life Technologies)、PCDNA2.1 プラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド(Stratagene)、PCR2-TOPOTAプラスミド(Invitrogen)、PCMV-ICISプラスミド(Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)またはplNCY（Incyte Genomics）等およびその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bを含む大腸菌細胞に形質転換した。
【０２５８】
2  cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。
【０２５９】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを384ウェルプレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroskan II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０２６０】
3  シークエンシング及び分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したIncyte cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。ｃＤＮＡのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコル及び塩基呼び出し(base calling)ソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。ｃＤＮＡ配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, 7.7ユニットに概説）を用いて決定した。cDNA配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０２６１】
IncyteのcDNA配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM、INCY、TIGRFAM(Haft, D.H. 他. (2001) Nucleic Acids Res. 29:41-43)等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMART(Schultz 他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864、Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)のようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースから選択したデータベースに対して問い合わせた。（HMMは、遺伝子ファミリーのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えばEddy, S.R. (1996) Cuff. Opin. Struct. Biol. 6:361-365等を参照）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するようにアセンブリされた。あるいは、GenBank cDNA群、GenBank EST群、スティッチされた配列群、ストレッチされた配列群、またはGenscan予測コード配列群（実施例４および５を参照）を用い、Incyte cDNAのアセンブリ体を完全長まで伸長させた。PhredとPhrapとConsedとに基づくプログラムを用いてアセンブリし、GenMarkとBLASTとFASTAとに基づくプログラムを用いて、cDNAの集団を、オープンリーディングフレームについてスクリーニングした。完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳し、対応する完全長ポリペプチド配列を誘導した。あるいは、本発明のポリペプチドは、完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。完全長ポリペプチド配列群の続いての分析としての問い合わせを、GenBankタンパク質データベース群（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータベース群、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOMおよびProsite等のデータベースや、PFAM、INCY、およびTIGRFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）ベースのタンパク質ファミリーデータベース群、並びにSMART等のHMMベースのタンパク質ドメインデータベース群に対し行った。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）およびLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析する。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって特定されるデフォルトパラメータを用いて生成する。
【０２６２】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリに利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表7の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は適切な参照文献であり、全ての文献は全体を引用を以って本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、また確率値が低いほど、２配列間の同一性が高くなる）。
【０２６３】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列のアセンブリ及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:38-74のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約20〜約4000ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０２６４】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定及び編集
推定上の疾患検出および治療用分子類の同定には、先ずGenscan遺伝子同定プログラムを、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）に対して実行した。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C及びS. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C及びS. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。プログラムは予測エキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶアセンブリされたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、30kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が疾患検出および治療用分子をコードするかを決定するために、コードされるポリペプチドを、PFAMモデル群に対し疾患検出および治療用分子について問合せて分析した。潜在的な疾患検出および治療用分子はまた、既に疾患検出および治療用分子として注釈が付けられたIncyte cDNA配列群に対する相同性により、同定した。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは省略されたエキソンなど、Genscanが予測した配列におけるエラーを補正した。BLAST分析はまた、Genscan予測配列の、いかなるIncyte cDNAまたは公共cDNAカバレッジ（coverage）の発見にも用いられ、したがって転写の証拠を提供した。Incyte cDNAカバレッジが利用できた場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を補正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載したアセンブルプロセスを用いて、Incyte cDNA配列および／または公共cDNA配列でGenscan予測コード配列をアセンブリして得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集した、または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０２６５】
５  ｃDNA配列データとのゲノム配列データのアセンブリ
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。間隔全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された間隔は推移性により等しいと考えられた。例えば、１つのcDNA及び２つのゲノム配列に間隔が存在する場合、３つの間隔は全て等しいと考えられた。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列（parent sequence）に沿って現われる順にステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した間隔と間隔との連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、翻訳されてBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【０２６６】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたようにアセンブリされた部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体を、BLAST分析により、Incyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体と比較して、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを判定した。
【０２６７】
６  MDDTをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:38-74をアセンブリするために用いた配列を、BLAST及びSmith-Watermanアルゴリズムを用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:38-74と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどのアセンブリアルゴリズム（表７）を使用して、連続及びオーバーラップした配列のクラスターにアセンブリした。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が既にマッピングされていたかを決定した。マッピングされた配列が或るクラスターに含まれている場合、そのクラスターの全配列が、個々の配列番号と共に、地図上の位置に割り当てられた。
【０２６８】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン間隔の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する。（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。但し、この値は組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する。）cM距離は、各クラスタ内に配列が含まれる放射線ハイブリッドマーカー類に対して境界を提供するGenethonによってマッピングされた遺伝マーカー群に基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap/）などの一般個人が入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子群が、上記した区間内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０２６９】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している（例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照）。
【０２７０】
BLASTを適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）等のcDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密な或いは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０２７１】
【数１】
2005505251.tif 000004
【０２７２】
積スコアは、２つの配列間の類似度と、配列が一致する長さとの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）に一致する各塩基に＋５のスコアを割り当て、各不一致塩基対に−４を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。2つの配列は、2以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離される）。2以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア100は、比較した2つの配列の短い方の長さ全体にわたって100％一致する場合のみ得られる。積スコア70は、一端が100％一致し、70％オーバーラップしているか、他端が88％一致し、100％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア50は、一端が100％一致し、50％オーバーラップしているか、79％一致し、100％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０２７３】
あるいは、MDDTをコードするポリヌクレオチド配列を、由来する組織源について分析する。例えば幾つかの完全長配列は、少なくとも一部は、オーバーラップするIncyte cDNA配列群を用いてアセンブリされる（実施例３を参照）。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。即ち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液及び免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリー即ち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。得られるパーセンテージは、MDDTをコードするcDNAの、組織特異的発現および疾患特異的発現を反映する。cDNA配列およびcDNAライブラリ／組織の情報は、LIFESEQ GOLD データベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）から得ることができる。
【０２７４】
８  ポリヌクレオチドをコードするMDDTの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。或るプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、別のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマー群の設計にはOLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用い、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上となり、約68〜約72℃の温度で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造およびプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチド群の伸長は、全て回避した。
【０２７５】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０２７６】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、PTC-200サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて96ウェルプレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200nmolの各プライマー、Mg２+と(NH4)2SO4と２−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマー対、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：60℃で1分間、ステップ4：68℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す、ステップ6：68℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。別法では、プライマー対であるT7とSK+とに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：57℃で1分間、ステップ4：68℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す、ステップ6：68℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。
【０２７７】
各ウェルのDNA濃度は、1X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25％(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット5〜10μlを1％アガロースゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを判定した。
【０２７８】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローンをＴ4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質移入した細胞群の選択を、抗生物質を含む培地で行い、それぞれのコロニーを採取し、LB/2Xカルベニシリン培養液中の384ウェルプレート群に37℃で一晩培養した。
【０２７９】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：60℃で1分間、ステップ4：72℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を29回繰り返す、ステップ6：72℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（1：2, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０２８０】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて5'調節配列を得る。
【０２８１】
９  MDDTをコードするポリヌクレオチドの一塩基多型の同定
一塩基多型性（SNP）として知られる一般的なＤＮＡ配列変異体は、LIFESEQデータベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:38-74において同定された。実施例３に記述されているように同じ遺伝子からの配列は共にクラスター化され、アセンブリされ、遺伝子内の全ての配列変異体を同定することができた。一連のフィルタから成るアルゴリズムは、ＳＮＰを他の配列変異体から区別するために用いられる。前段フィルタ群が、最小限のPhredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アラインメントエラーと、ベクター配列、キメラ、スプライス変異体の、不適切なトリミングに起因するエラーを除去した。先進の染色体分析の自動化した手順により、推定上のSNPの近傍の本来のクロマトグラムファイルを分析した。クローンエラ−フィルタ群は、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼあるいは体細胞性突然変異によって引き起こされる等の、実験プロセッシング中に導入されたエラ−を同定した。クラスタリングエラ−フィルタ群は、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体あるいは偽遺伝子のクラスタリングに起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションによるエラ−を同定した。フィルタの最終セットは、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に見出される重複とSNPを除去した。
【０２８２】
異なる4つのヒト集団のＳＮＰ部位における対立遺伝子頻度を分析するために、高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.)を用いる質量分析によって、更なる特徴付けのためにいくつかのＳＮＰが選択された。白人集団は92人（男性46人、女性46人）から成り、そのうち83人はユタ州、4人はフランス、3人はベネズエラ、2人はアーミッシュの出身である。アフリカ系集団は194人（男性97人、女性97人）から成り、全てアフリカ系米国人である。ラテンアメリカ系集団は324人（男性162人、女性162人）から成り、全てメキシコ出身である。アジア系の集団は126人（男性64人、女性62人）からなり、中国人43％、日本人31％、コリアン13％、ベトナム人5％、他のアジア系8％の親の構成が報告されている。対立遺伝子頻度は最初に白人集団で分析された。この集団で対立遺伝子変異を示さないＳNＰの時には他の３つの集団で更に試験されない場合もあった。
【０２８３】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化及び使用
SEQ ID NO:38-74から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても本質的に同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ−32P] アデノシン三リン酸（Amersham Pharmacia Biotech)及びＴ4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて実質的に精製する。下記のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの、典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分107カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。すなわちAse I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba I、またはPvu II(DuPont NEN)である。
【０２８４】
各消化物から得たＤＮＡは、0.7％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、40℃で16時間行う。非特異的シグナル群を除去するため、最大で例えば0.1×クエン酸ナトリウム食塩水および0.5％ドデシル硫酸ナトリウムの条件下で、ブロット群を室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０２８５】
１１  マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、ピエゾ式印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである（Schena（1999）前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(例えばSchena, M. 他. (1995) Science 270:467-470、Shalon, D.他. (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.及びJ. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31等を参照)。
【０２８６】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメント群を、生体サンプル中のポリヌクレオチド群とハイブリダイズする。生体サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識などの分子タグに抱合させる。ハイブリダイゼーション後、生体サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントでのハイブリダイゼーションを検出する。あるいは、レーザー脱離および質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上の或るエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの、相補性の度合と相対存在度とを算定し得る。 一実施例におけるマイクロアレイの調製及び使用について、以下に詳述する。
【０２８７】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジニウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、200ｎｇのポリ（A）+RNAを含有する体積25ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。結合後、２つの反応サンプルは、1mlのグリコーゲン（１mg/ml）を用いて析出させたエタノール、60mlの酢酸ナトリウム及び300mlの100％エタノールである。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、14μlの5×SSC／0.2％SDS中で再懸濁する。
【０２８８】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを生成する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサートを有するベクターを含有する細菌細胞から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。30サイクルのPCRで1〜2ngの初期量から5μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅したアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製する。
【０２８９】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理の間及び処理後に０.１％のSDS及びアセトン中で超音波処理をかけ、蒸留水で充分に洗浄する。スライドグラスは、4％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で充分に洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０２９０】
米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度100ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを、高速ロボット装置（robotic apparatus）により、開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約5nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０２９１】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において0.2％SDSで１度洗浄し、蒸留水で3度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の0.2％カゼイン中において60℃で30分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように0.2％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０２９２】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応に用いる9μlのサンプル混合体には、Cy3またはCy5で標識したcDNA合成産物群の各0.2μgを、5×SSC、0.2％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中に含む。サンプル混合体は、65℃まで5分間加熱し、マイクロアレイ表面上で等分して1.8cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡用スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに140μlの5×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100％に保持する。アレイを含むチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第１洗浄緩衝液中（１×SSC、0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第２洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において各々45℃で10分間、3度洗浄して乾燥させる。
【０２９３】
検出
レポーター標識ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには488nm、Cy5の励起のためには632nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。励起レーザ光の焦点をアレイ上に置くため、20×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを、顕微鏡の、コンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通してラスタースキャンする。本実施例で用いる1.8cm×1.8cmのアレイは、解像度20μmでスキャンする。
【０２９４】
2回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは2つの蛍光色素を連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。好適なフィルタ群をアレイと光電子増倍管との間に設置して、シグナルをフィルタする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方の蛍光色素からのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルタを用いて、蛍光色素１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０２９５】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を、ハイブリダイズする種の重量比1：100,000に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なる蛍光色素で標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、較正するcDNAのサンプルを２つの蛍光色素で標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０２９６】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０２９７】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０２９８】
細胞成長と処理
次の細胞株はATCC(Manassus, VA)から得られ、製造者のプロトコルに従った培地で培養した。PrECは正常な提供者から単離した初代前立腺上皮細胞株であり、PC-3は骨に転移したグレード4の前立腺癌を患う62才の男性から単離した前立腺癌細胞株であり、DU-145は広範囲な転移性疾患を患う69才の男性から単離した前立腺癌細胞株である。DU-145は脳転移から単離したものであり、検出可能なホルモン感応性がなく、LNCaPは転移性前立腺癌を患う50才の男性のリンパ節生検から単離した前立腺癌細胞株である。LNCaP細胞は5-α-ジヒドロテストステロンに応答し、アンドロゲン受容体を発現する。全ての細胞培養は、処理前に低血清培地で48時間インキュベートした。
【０２９９】
SEQ ID NO:38については、IncyteクローンID 4765137及びIncyteクローンID 1975430を有する、このポリヌクレオチド配列の2つの成分の発現は、PrEC細胞と比較するとLNCaP細胞で少なくとも2倍で下方調節された。IncyteクローンID 4765137は、Incyteポリヌクレオチド6024998CB1(SEQ ID NO:38)のヌクレオチド353から758にまたがる。IncyteクローンID 1975430は、Incyteポリヌクレオチド6024998CB1(SEQ ID NO:38)のヌクレオチド5789から5918にまたがる。
【０３００】
別の例では、マイクロアレイは乳房、肺、結腸の正常な組織と比較してそれぞれの腫瘍組織におけるSEQ ID NO:58の発現のレベルを決定するために使用される。このようにして、マイクロアレイ分析はSEQ ID NO:58が乳癌組織と肺腫瘍組織において、正常な乳房組織や肺組織と比較して、少なくとも2倍少なく発現されていることを示すが、SEQ ID NO:58は正常な結腸組織と比較して結腸癌組織においては少なく発現されていない。
【０３０１】
さらに、限定するわけではないが、SEQ ID NO:58の発現はブデソニド、プレドニゾン、デキサメサゾン、カテコール等のステロイドホルモンで処理される細胞において下方調節されるようであり、SEQ ID NO:58の発現は肝臓毒性と密接に関連することを示唆する。これらのデータは、SEQ ID NO:58が肝臓機能に影響する医薬品成分と生体異物化合物の中毒学的スクリーニングのための遺伝子マーカーとして有用であることを示唆する。
【０３０２】
別の例では、例えばSEQ ID NO:66は差次的発現を炎症応答で示すが、これはマイクロアレイ分析で判定した。SEQ ID NO:66の発現は、PMA（プロテインキナーゼC依存性(PKC)経路の一般の活性化因子）とイノマイシン（カルシウムが細胞に入ることを可能にするカルシウムイオノフォア）で処理した8つの異なる細胞型において1時間前（初期遺伝子）に少なくとも2倍増加した。試験された細胞型には、骨髄性前駆体細胞株であるK-562、前単球細胞株であるTHP-1、B細胞リンパ腫細胞株であるRPMI 6666、急性T細胞白血病細胞株であるジャーカット（Jurkat）、内皮細胞株であるECV304が含まれる。SEQ ID NO:66の応答は、十分に研究されたストレス応答遺伝子群(AP1遺伝子及び制御因子、初期成長応答遺伝子、MAP キナーゼ経路制御因子、アポトーシス制御因子)の応答と相関した。それはSEQ ID NO:66が多くの細胞型のPKCおよびカルシウムシグナル伝達経路において重要な役割を有することを示唆する。したがってSEQ ID NO:66は、炎症応答の診断アッセイにも有用である。
【０３０３】
別の例でSEQ ID NO:71は正常な脳と比較してアルツハイマー病患者の特定の切開した脳領域で差次的発現を示した。SEQ ID NO:71の発現は、正常な脳組織と比較してアルツハイマー病患者の線条、海馬、小脳、後部帯状組織において少なくとも2倍減少した。したがってSEQ ID NO:71は、アルツハイマー病の診断アッセイに有用である。
【０３０４】
別の例では、SEQ ID NO:72は、マイクロアレイ分析が実証するように、正常な乳房上皮細胞に比較して乳房腫瘍細胞株において差次的発現を示した。SEQ ID NO:72の発現は、７中4の乳房腫瘍細胞株で少なくとも2倍減少した。したがってSEQ ID NO:72は、乳癌の診断アッセイに有用である。
【０３０５】
１２  相補的ポリヌクレオチド
MDDTをコードする配列群或いはその任意の部分に対する相補配列群を用いることにより、天然MDDTの発現が検出、低減、または阻害される。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さなあるいは大きな配列の断片の場合でも、本質的に同じ手順を用いる。適切なオリゴヌクレオチドを設計するため、Oligo 4.06ソフトウェア（National Biosciences）およびMDDTのコーディング配列を用いる。転写を阻害するためには、最も独特な５'配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いて、プロモーターがコーディング配列に結合するのを防止する。翻訳を阻害するには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、MDDTをコードする転写物にリボソームが結合するのを防ぐ。
【０３０６】
１３  MDDTの発現
MDDTの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でMDDTを発現するには、cDNAを好適なベクターにサブクローニングする。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子と、cDNA転写レベルを高める誘導性プロモーターとを持つものを用いる。このようなプロモーターの例には、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及び、trp-lac (tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性細菌にMDDTを発現させるには、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発する。真核細胞でのMDDTの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に、一般にバキュロウイルスとして知られるAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須ポリヘドリン遺伝子をMDDTをコードするcDNAで置換するには、相同組換えを行うか、或いは、転移プラスミドの媒介を伴う、細菌の媒介による遺伝子転移を行う。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945等を参照）。
【０３０７】
殆どの発現系では、MDDTが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)と、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を、迅速に１ステップで行い得る。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性および抗原性を維持した状態で、固定化したグルタチオン上での融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。精製の後、GST部分を、特異的に操作した部位でMDDTからタンパク分解的に切断できる。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂上での精製を可能にする（QIAGEN）。タンパク質の発現および精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したMDDTを直接用いて以下の実施例18および19のアッセイを行うことができる。
【０３０８】
１４  機能的アッセイ
MDDTの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理的に高められたレベルでの、MDDTをコードする配列の発現によって算定する。cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを持つ哺乳動物発現ベクターにcDNAをサブクローニングする。選択されるベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3.1プラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤あるいは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に、一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。 また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザ光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方光散乱と90°側方光散乱によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパンク質の発現の変化、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M.G.（1994）Flow Cytometry, Oxford, New York NYに記述がある。
【０３０９】
遺伝子発現へのMDDTの影響は、MDDTをコードする配列と、CD64またはCD64-GFPのどちらかとが形質移入された、高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質移入された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質移入された細胞と形質移入されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された磁気ビーズを用いて効率的に分離することができる（DYNAL, Lake Success NY）。mRNAは、当業者に周知の方法で細胞から精製することができる。MDDTと、目的とする他の遺伝子とをコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３１０】
１５  MDDTに特異的な抗体の作製
実質的に精製されたMDDTを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；例えば、Harrington, M.G.（1990）Methods Enzymol 182:488-495）または他の精製技術を用いて実質上精製されたNZMSを用いて、標準プロトコルで動物（ウサギ、マウス等）を免疫化して抗体を産出する。
【０３１１】
別法では、MDDTアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【０３１２】
通常は、長さ約15残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいて、オリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性および抗MDDT活性を検査するには例えば、ペプチドまたはMDDTを基板に結合し、１％BSAを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに、放射性ヨウ素標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３１３】
１６  特異的抗体を用いる天然MDDTの精製
天然MDDTあるいは組換えMDDTを実質的に精製するため、MDDTに特異的な抗体類を用いるイムノアフィニティー（免疫親和性）クロマトグラフィを行う。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化したSEPHAROSE（Amersham Pharmacia Biotech）のような活性化クロマトグラフィー用レジンと抗MDDT抗体とを共有結合させることにより形成する。結合後に、製造者の使用説明書に従ってこのレジンをブロックし、洗浄する。
【０３１４】
MDDTを有する培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、MDDTを優先的に吸着できる条件で（例えば、界面活性剤の存在下において高イオン強度のバッファーで）そのカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とMDDTとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで）溶出させ、MDDTを収集する。
【０３１５】
１７  MDDTと相互作用する分子の同定
MDDTまたは生物学的に活性なMDDT断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する(例えばBolton A.E.およびW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照)。マルチウェルプレートの各ウェルに予め配列しておいた候補の分子群を、標識したMDDTと共にインキュベートし、洗浄して、標識されたMDDT複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なMDDT濃度で得られたデータを用いて、MDDTの数量、候補分子との親和性、および会合についての値を計算する。
【０３１６】
別法では、MDDTと相互作用する分子を、Fields, S.およびO. Song(1989, Nature 340:245-246)に記載の酵母２−ハイブリッドシステム（yeast two-hybrid system）や、MATCHMAKERシステム(Clontech)などの、２−ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０３１７】
MDDTはまた、ハイスループット型の酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリによってコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定し得る（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３１８】
１８  MDDT活性の実証
5オクソ-L-プロリナーゼ(EC 3.5.2)は、5オキソプロリンのL−グルタミン酸へのATP依存性切断を触媒する。MDDT 5オクソ-L-プロリナーゼ活性は、100 mMのNaHepesバッファ(pH 8.0)、2 mMの5オクソLプロリン(100 cpm/nmol 5オクソL[U14C]プロリンを含む)、5 mMのATP、8 mMのMgCl2、2 mMのPエノールピルビン酸、150 mMのKCl、2 mMのジチオスレイトール、ピルビン酸キナーゼ(5 unit)、MDDTを含む反応混液（最終容量、0.5 ml）において測定される。37℃で30分間のインキュベーション後、1MのHClを0.1の容積で反応混液は処理され、0℃で5分間置かれた。次に同容量の1 MのTrisが添加された。変性したタンパク質を遠心分離により除去した。次に中和した反応混液は、Dowex 50上でクロマトグラフィにより未処理の5オクソプロリンの除去後、液体シンチレーションカウンターで[14C]グルタミン酸を分析された(Williamson, J. M.及びMeister, A. (1982) J. Biol. Chem. 257:91619172)。活性の1単位は、標準アッセイ条件下で1.0μmolのグルタミン酸/時間の生成のために必要な酵素の量として定義される。生成される[14C]グルタミン酸の量は、MDDTの5-オクソ-L-プロリナーゼ活性に比例する。
【０３１９】
当業者には、本発明の範囲及び精神から逸脱しない、本発明の記載した方法及びシステムの種々の修正および変更は自明であろう。本発明について説明するにあたり幾つかの実施例に関連して説明を行ったが、本発明の請求の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な修正は、下記の特許請求の範囲内にあるものとする。
【０３２０】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０３２１】
表２は、本発明のポリペプチド群のGenBank識別番号と、最も近いGenBank相同体の注釈（annotation）と、PROTEOMEデータベース識別番号と、PROTEOMEデータベース相同体群の注釈とを示す。各ポリペプチドとその相同体が一致する確率スコアも併せて示す。
【０３２２】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリペプチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０３２３】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列をアセンブリ（構築）するために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０３２４】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０３２５】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０３２６】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、引用文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０３２７】
表８は、本発明のポリヌクレオチド配列に見られる一塩基多型を、種々のヒト集団での対立遺伝子(アレル)頻度と共に示す。
【０３２８】
【表１−１】
2005505251.tif 000005
【０３２９】
【表１−２】
2005505251.tif 000006
【０３３０】
【表２−１】
2005505251.tif 000007
【０３３１】
【表２−２】
2005505251.tif 000008
【０３３２】
【表３−１】
2005505251.tif 000009
【０３３３】
【表３−２】
2005505251.tif 000010
【０３３４】
【表３−３】
2005505251.tif 000011
【０３３５】
【表３−４】
2005505251.tif 000012
【０３３６】
【表３−５】
2005505251.tif 000013
【０３３７】
【表３−６】
2005505251.tif 000014
【０３３８】
【表３−７】
2005505251.tif 000015
【０３３９】
【表３−８】
2005505251.tif 000016
【０３４０】
【表３−９】
2005505251.tif 000017
【０３４１】
【表３−１０】
2005505251.tif 000018
【０３４２】
【表３−１１】
2005505251.tif 000019
【０３４３】
【表３−１２】
2005505251.tif 000020
【０３４４】
【表３−１３】
2005505251.tif 000021
【０３４５】
【表３−１４】
2005505251.tif 000022
【０３４６】
【表３−１５】
2005505251.tif 000023
【０３４７】
【表３−１６】
2005505251.tif 000024
【０３４８】
【表３−１７】
2005505251.tif 000025
【０３４９】
【表４−１】
2005505251.tif 000026
【０３５０】
【表４−２】
2005505251.tif 000027
【０３５１】
【表４−３】
2005505251.tif 000028
【０３５２】
【表４−４】
2005505251.tif 000029
【０３５３】
【表４−５】
2005505251.tif 000030
【０３５４】
【表４−６】
2005505251.tif 000031
【０３５５】
【表４−７】
2005505251.tif 000032
【０３５６】
【表４−８】
2005505251.tif 000033
【０３５７】
【表４−９】
2005505251.tif 000034
【０３５８】
【表４−１０】
2005505251.tif 000035
【０３５９】
【表４−１１】
2005505251.tif 000036
【０３６０】
【表４−１２】
2005505251.tif 000037
【０３６１】
【表４−１３】
2005505251.tif 000038
【０３６２】
【表４−１４】
2005505251.tif 000039
【０３６３】
【表５−１】
2005505251.tif 000040
【０３６４】
【表５−２】
2005505251.tif 000041
【０３６５】
【表６−１】
2005505251.tif 000042
【０３６６】
【表６−２】
2005505251.tif 000043
【０３６７】
【表６−３】
2005505251.tif 000044
【０３６８】
【表６−４】
2005505251.tif 000045
【０３６９】
【表６−５】
2005505251.tif 000046
【０３７０】
【表６−６】
2005505251.tif 000047
【０３７１】
【表６−７】
2005505251.tif 000048
【０３７２】
【表６−８】
2005505251.tif 000049
【０３７３】
【表７−１】
2005505251.tif 000050
【０３７４】
【表７−２】
2005505251.tif 000051
【０３７５】
【表８】
2005505251.tif 000052
【国際公開パンフレット】
2005505251.tif 000053
2005505251.tif 000054
2005505251.tif 000055
2005505251.tif 000056
2005505251.tif 000057
2005505251.tif 000058
2005505251.tif 000059
2005505251.tif 000060
2005505251.tif 000061
2005505251.tif 000062
2005505251.tif 000063
2005505251.tif 000064
2005505251.tif 000065
2005505251.tif 000066
2005505251.tif 000067
2005505251.tif 000068
2005505251.tif 000069
2005505251.tif 000070
2005505251.tif 000071
2005505251.tif 000072
2005505251.tif 000073
2005505251.tif 000074
2005505251.tif 000075
2005505251.tif 000076
2005505251.tif 000077
2005505251.tif 000078
2005505251.tif 000079
2005505251.tif 000080
2005505251.tif 000081
2005505251.tif 000082
2005505251.tif 000083
2005505251.tif 000084
2005505251.tif 000085
2005505251.tif 000086
2005505251.tif 000087
2005505251.tif 000088
2005505251.tif 000089
2005505251.tif 000090
2005505251.tif 000091
2005505251.tif 000092
2005505251.tif 000093
2005505251.tif 000094
2005505251.tif 000095
2005505251.tif 000096
2005505251.tif 000097
2005505251.tif 000098
2005505251.tif 000099
2005505251.tif 000100
2005505251.tif 000101
2005505251.tif 000102
2005505251.tif 000103
2005505251.tif 000104
2005505251.tif 000105
2005505251.tif 000106
2005505251.tif 000107
2005505251.tif 000108
2005505251.tif 000109
2005505251.tif 000110
2005505251.tif 000111
2005505251.tif 000112
2005505251.tif 000113
2005505251.tif 000114
2005505251.tif 000115
2005505251.tif 000116
2005505251.tif 000117
2005505251.tif 000118
2005505251.tif 000119
2005505251.tif 000120
2005505251.tif 000121
2005505251.tif 000122
2005505251.tif 000123
2005505251.tif 000124
2005505251.tif 000125
2005505251.tif 000126
2005505251.tif 000127
2005505251.tif 000128
2005505251.tif 000129
2005505251.tif 000130
2005505251.tif 000131
2005505251.tif 000132
2005505251.tif 000133
2005505251.tif 000134
2005505251.tif 000135
2005505251.tif 000136
2005505251.tif 000137
2005505251.tif 000138
2005505251.tif 000139
2005505251.tif 000140
2005505251.tif 000141
2005505251.tif 000142
2005505251.tif 000143
2005505251.tif 000144
2005505251.tif 000145
2005505251.tif 000146
2005505251.tif 000147
2005505251.tif 000148
2005505251.tif 000149
2005505251.tif 000150
2005505251.tif 000151
2005505251.tif 000152
2005505251.tif 000153
2005505251.tif 000154
2005505251.tif 000155
2005505251.tif 000156
2005505251.tif 000157
2005505251.tif 000158
2005505251.tif 000159
2005505251.tif 000160
2005505251.tif 000161
2005505251.tif 000162
2005505251.tif 000163
2005505251.tif 000164
2005505251.tif 000165
2005505251.tif 000166
2005505251.tif 000167
2005505251.tif 000168
2005505251.tif 000169
2005505251.tif 000170
2005505251.tif 000171
2005505251.tif 000172
2005505251.tif 000173
2005505251.tif 000174
2005505251.tif 000175
2005505251.tif 000176
2005505251.tif 000177
2005505251.tif 000178
2005505251.tif 000179
2005505251.tif 000180
2005505251.tif 000181
2005505251.tif 000182
2005505251.tif 000183
2005505251.tif 000184
2005505251.tif 000185
2005505251.tif 000186
2005505251.tif 000187
2005505251.tif 000188
2005505251.tif 000189
2005505251.tif 000190
2005505251.tif 000191
2005505251.tif 000192
2005505251.tif 000193
2005505251.tif 000194
2005505251.tif 000195
2005505251.tif 000196
2005505251.tif 000197
2005505251.tif 000198
2005505251.tif 000199
2005505251.tif 000200
2005505251.tif 000201
2005505251.tif 000202
2005505251.tif 000203
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505251.tif 000204
2005505251.tif 000205
【国際調査報告】
2005505251.tif 000206
2005505251.tif 000207
2005505251.tif 000208
2005505251.tif 000209
2005505251.tif 000210
2005505251.tif 000211
2005505251.tif 000212
2005505251.tif 000213
2005505251.tif 000214
2005505251.tif 000215
2005505251.tif 000216
2005505251.tif 000217
2005505251.tif 000218
2005505251.tif 000219
2005505251.tif 000220