(57)【要約】  酸化鉱物物質の細孔内に、アパタイト結晶、好ましくはヒドロキシアパタイト結晶を有している多孔質の酸化鉱物物質からなる新規な吸着媒が開示される。そのような吸着媒はタンパク質及び核酸の分離に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビーズ容積の約10%を超える細孔容積と少なくとも約500Åの平均細孔径を有する多孔質の酸化鉱物ビーズを含む複合クロマトグラフィー吸着媒であって、前記ビーズがその細孔内にアパタイト結晶を含んでいる、前記複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項２】
前記酸化鉱物が、アルミナ、チタニア、ハフニア、シリカ、ジルコニア及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項３】
前記酸化鉱物がジルコニア、チタニア及びハフニアからなる群から選択され、前記細孔容積がビーズ容積の約30%〜約60%である、請求項2に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項４】
前記酸化鉱物がシリカであり、前記細孔容積がビーズ容積の約40%〜約70%である、請求項2に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項５】
前記細孔容積がビーズ容積の約30%〜約70%である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項６】
前記平均細孔径が約1000Å〜約4000Åである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項７】
前記酸化鉱物がジルコニア、チタニア及びハフニアからなる群から選択され、前記平均細孔径が約1000Å〜約3000Åである、請求項5に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項８】
前記酸化鉱物がシリカであり、前記平均細孔径が約2000Å〜約5000Åである、請求項5に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項９】
前記ビーズが親水性ポリマーの層で被覆されている、請求項1〜8のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項１０】
前記親水性ポリマーがポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、架橋多糖及びビニルポリマーからなる群から選択される、請求項9に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項１１】
前記アパタイト結晶がカルシウムイオン及び金属イオン又はメタロイドイオンを含んでいる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項１２】
前記金属イオン又はメタロイドイオンがストロンチウムイオン、バリウムイオン又はフッ化物イオンである、請求項11に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項１３】
前記アパタイト結晶がヒドロキシアパタイト結晶である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項１４】
前記酸化鉱物がジルコニアである、請求項1、5、6及び9〜12のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項１５】
前記アパタイト結晶がヒドロキシアパタイト結晶であり、前記酸化鉱物がジルコニアである、請求項1、5、6及び9〜12のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒。
【請求項１６】
(a)  入口末端及び出口末端を有する管状部材；
(b)  前記管状部材の内部に配置された第一の多孔質部材及び第二の多孔質部材；
及び、
(c)  前記管状部材の内部で前記第一の多孔質部材と第二の多孔質部材の間に充填された請求項1〜15のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒
を含むクロマトグラフィーカラム。
【請求項１７】
前記カラムの容量が約50リットル〜約5000リットルである、請求項16に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１８】
さらに、前記複合クロマトグラフィー吸着媒の中を通して液体サンプルを上向きに流す手段を含む、請求項16に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項１９】
前記入口末端と前記出口末端の間に、一連の段を有する、請求項16に記載のクロマトグラフィーカラム。
【請求項２０】
クロマトグラフィー分離方法であって、生体分子を含んでいる溶液を、前記溶液が前記酸化鉱物ビーズの細孔に浸透するように請求項1〜15のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒と接触させることを含み、そこで、溶液中のある種の生体分子が前記アパタイト結晶に結合して、別の異なった生体分子は溶液中に留まる、前記方法。
【請求項２１】
クロマトグラフィー分離方法であって、生体分子を含んでいる第一の溶液を、前記溶液が前記酸化鉱物ビーズの細孔に浸透するように請求項16〜19のいずれか1項に記載のクロマトグラフィーカラムの中を通して流すことを含み、そこで、溶液中のある種の生体分子が前記アパタイト結晶に結合して、別の異なった生体分子は溶液中に留まる、前記方法。
【請求項２２】
さらに、第二の溶液を前記クロマトグラフィーカラムの中を通して流すことにより前記アパタイト結晶に結合している生体分子を溶離させることを含む、請求項20又は21に記載のクロマトグラフィー分離方法。
【請求項２３】
前記生体分子がポリペプチドである、請求項20又は21に記載の方法。
【請求項２４】
前記生体分子が核酸である、請求項20又は21に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体分子が抗体である、請求項20又は21に記載の方法。
【請求項２６】
前記生体分子がグリコイソ型である、請求項20又は21に記載の方法。
【請求項２７】
請求項1〜15のいずれか1項に記載の複合クロマトグラフィー吸着媒を製造する方法であって：
(a)  ビーズ容積の約10%を超える細孔容積と少なくとも約500Åの平均細孔径を有する多孔質の酸化鉱物ビーズを供給すること；
(b)  前記多孔質の酸化鉱物ビーズを、(i)塩化カルシウム又は(ii)リン酸カリウム若しくはナトリウムのいずれかの溶液が前記多孔質の酸化鉱物ビーズの細孔に浸透するように、最大一細孔容積の前記溶液と接触させること；
(d)  (c)で得られたビーズを乾燥させること；
(d)  乾燥させた前記ビーズを、(i)塩化カルシウム又は(ii)リン酸カリウム若しくはナトリウムのいずれか他方の溶液が乾燥させた前記ビーズの細孔に浸透し、それによって当該細孔内でリン酸カルシウムを形成するように、最大一細孔容積の前記溶液と接触させること；
(e)  (d)で得られたビーズを水で洗浄して余分なカルシウムイオン又はリン酸イオンを除去すること；
(f)  (f)で得られた洗浄したビーズを水酸化ナトリウムの溶液と接触させること；
(g)  (f)で得られたビーズを水で洗浄すること；
及び、
(h)  (g)で得られた洗浄したビーズをリン酸二ナトリウムの溶液と接触させて、当該ビーズの細孔内でヒドロキシアパタイト結晶を形成させること；
を含む、前記方法。
【請求項２８】
(b)に先だって前記ビーズをリン酸溶液で洗浄する、請求項27に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化鉱物物質の細孔内に、アパタイト結晶、好ましくはヒドロキシアパタイト結晶を有している多孔質の酸化鉱物物質からなる新規な吸着媒に関する。そのような吸着媒はタンパク質及び核酸の分離に有用である。
【背景技術】
【０００２】
アパタイトは、一般式：Ca5(F, Cl, OH, 1/2 CO3)(PO4)3で表される結晶性形態にあるリン酸カルシウム物質である。アパタイトのより一般的な型の一つはヒドロキシアパタイトであり、これは、式：[Ca2(PO4)2]3Ca(OH)2で表される。これは、例えばタンパク質、酵素及び核酸などの生体高分子をクロマトグラフィー分離するためのカラムに詰める充填材として有用である。そのような分子を吸着するアパタイトの能力は、その結晶自体の構造と結晶の露出表面積の両方に依存する。
【０００３】
カラムクロマトグラフィーに利用することができるヒドロキシアパタイトを調製するための技術は、最初に、Tiseliusらによって開発された[Arch. Biochem. Biophys., 65：132-155 (1956)]。カラムクロマトグラフィーで用いるためのヒドロキシアパタイトは、これまで様々な方法で調製されている。通常、ヒドロキシアパタイトは、(1)水溶液中で水溶性カルシウム塩とリン酸イオンを反応させる湿式合成、(2)900℃〜1400℃の水蒸気の存在下でリン酸カルシウムと炭酸カルシウムを反応させる乾式合成、又は、(3)例えば200℃15気圧で、リン酸水素カルシウムを加水分解する水熱合成により合成する。慣習的な方法で製造されたヒドロキシアパタイトは平板の形態を有していて、特に、クロマトグラフィー分離のためのカラム充填材として用いる場合には、微細に分割する必要があった。そのような板状物を分割すると、様々な形と大きさを有する小片となる。不規則な形状のヒドロキシアパタイト片は、クロマトグラフィー分離用のカラムに均一又は密に充填することができない。
【０００４】
板様結晶の形態又は微結晶の集塊物形態にあるヒドロキシアパタイトも機械的強度が劣り、充填操作及び測定の間に破壊されやすい。ヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィー特性は用いる充填方法に応じて変化し、それによって、分離におけるバラツキや吸着床の崩壊に至る。
【０００５】
近年、上記欠点を克服するために微小球形態のヒドロキシアパタイトを製造する方法が提案され、それは、粉末状物質からなる顆粒の製造に広く用いられているいわゆる噴霧乾燥法を利用するものであった(特開昭62-206445号及び特開昭62-230607号)。特開昭62-206445号に開示された方法では、一次粒子としての直径1μm未満のヒドロキシアパタイト微結晶を噴霧乾燥により物理的に凝固させて1〜10μmの直径を有する実質的に球状の粒子を二次粒子として形成させる。
【０００６】
これらの方法で得られた球状のヒドロキシアパタイト粒子を、液体クロマトグラフィー用の充填材として定められた範囲の粒径を有する粒子を収集するために篩い分けにより分級する場合、当該球状粒子は機械的強度が乏しいため破壊されやすく、高圧でカラムに密に充填すると粉々に破壊される。従って、噴霧乾燥によって形成された球状のヒドロキシアパタイト粒子は、充填時の高圧に耐えるのに充分な機械的強度を付与するために、高温で長時間にわたる熱処理に付す必要がある。しかしながら、過酷な熱処理により、前記球状粒子は相互に融合した状態で互いに結合しやすくなり、それによって、部分的に固形状の顆粒を形成する。
【０００７】
特開昭62-230607号には、アパタイトの球状集塊物を調製する方法が開示されており、当該方法では、ゲル化ヒドロキシアパタイトのスラリーを100℃〜200℃に維持してある大気中に噴霧して、1〜10μmの直径を有するヒドロキシアパタイトの球状集塊物を形成させる。ヒドロゲルの網目構造体中に捕捉されたヒドロキシアパタイトは比較的軟質であり、また、所与の容積の吸着媒中に存在するヒドロキシアパタイト結晶の量(約40%)が限られているので結合能力はあまり大きくはない。ヒドロキシアパタイトの結晶の周囲を囲んでいるヒドロゲルが存在することにより、プラスミドなどの極めて大きな分子と直接接触することが妨げられる。上に述べたように、ヒドロキシアパタイトの慣習的な調製方法には、球状ヒドロキシアパタイト粒子の調製において数多くの問題があるばかりでなく、得られた粒子のクロマトグラフィーを目的とした充填材としての使用においても多くの問題がある。
【０００８】
クロマトグラフィーで使用するための酸化鉱物ビーズは知られており、ヒドロキシアパタイト吸着媒よりも強い強度を持たせることができる。酸化鉱物ビーズに別の物質を導入するような用途では、巨大分子が妨害を受けずに拡散できるようにするために、500Åを超える細孔径が求められる。しかしながら、多孔度及び強度に悪影響を及ぼすことなく大きな細孔径を得ることは困難である。さらに、酸化鉱物の表面は、タンパク質と、静電的相互作用やファンデルワ−ルス相互作用やルイスの酸塩基相互作用などの様々な種類の相互作用を示し、そのような相互作用により、分離の質が改変されたり、さらには、生体分子が変性されたりする可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
アパタイトの分離能力を提供しながら、カラム内や懸濁液中で生体分子を分離するのに有用な特定の環境中でその形状や化学的特性及び機械的特性を維持し、さらに、その密度が吸着及びクロマトグラフィーで用いられる液体とは実質的に異なっている、比較的小さな多孔質粒子が求められている。機械的強度及びクロマトグラフィー特性の点で優れているそのようなアパタイト物質は、これまで、全く記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明により、ヒドロキシアパタイト結晶の分離能力と酸化鉱物網目構造体の強度を合わせ持つクロマトグラフィー吸着媒が提供される。この複合吸着媒は、クロマトグラフィー分離に用いられた場合に優れた特性を示す。即ち、この複合吸着媒は、カラム内に充填された又は詰められた吸着媒として、又は、カラムクロマトグラフィーの固定相薬剤として用いられた場合に、物質の分離又は展開において優れた特性を示す。バッチ式分離における吸着媒として本発明の吸着媒を用いるクロマトグラフィー、又は、固定床カラム若しくは流動床カラムに充填された吸着媒として本発明の吸着媒を用いるクロマトグラフィーは、極めて鋭敏であり、互いに構造上の差がごく僅かしかない物質を正確に分離及び分別することができる。これは、従来技術の吸着媒を用いて達成するのは困難である。そのような物質としては、タンパク質(例えば、免疫グロブリン、インターフェロン又は酵素など)、核酸(RNA、DNA又はプラスミドなど)又はウイルスなどの、104〜109ダルトンの分子量を有する生物学的な巨大分子などを挙げることができる。本発明の複合吸着媒は、遺伝子組換え、細胞融合又は細胞培養の全体で得られる最終的に有用である様々な物質を高純度で分離精製するのに不可欠である。
【００１１】
本発明の複合クロマトグラフィー吸着媒は、アパタイト(特に、ヒドロキシアパタイト)で満たされている細孔を有する酸化鉱物ビーズを含む。当該複合吸着媒の酸化鉱物ビーズの特徴は、多孔度が大きいこと、表面積が小さいこと、平均細孔径が大きいこと、及び、機械的安定性に優れていることである。さらに、それらは、固定床カラムへの充填を容易にし、バッチ内の粒子の沈降速度を増大させ、流動床の高速度での操作を可能にするような密度を示す。アパタイト結晶は、酸化鉱物(好ましくは、ジルコニア)の極めて強い骨格で保護されている。
【００１２】
特に、本発明は、ビーズ容積の約10%を超える細孔容積、好ましくは、約30%と約70%の細孔容積、さらに好ましくは、約30%と約60%の細孔容積と、少なくとも約500Åの平均細孔径、好ましくは、約1000Å〜約4000Åの平均細孔径、さらに好ましくは、約1000Å〜約3000Åの平均細孔径を有する多孔質の酸化鉱物ビーズを含む複合クロマトグラフィー吸着媒を包含する。前記ビーズの細孔には、アパタイト結晶、好ましくは、ヒドロキシアパタイト結晶が含まれている。好ましくは、前記酸化鉱物は、アルミナ、チタニア、ハフニア、シリカ、ジルコニア及びそれらの混合物からなる群から選択される。前記酸化鉱物は、最も好ましくは、ジルコニアである。好ましい実施形態において、前記鉱物はシリカであり、前記細孔容積はビーズ容積の約40%〜約70%であり、且つ、前記平均細孔径は約2000Å〜約5000Åである。
【００１３】
一実施形態において、前記複合クロマトグラフィー吸着媒のビーズは、親水性ポリマー、好ましくは、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、架橋多糖及びビニルポリマーからなる群から選択される親水性ポリマーの層で被覆されている。
【００１４】
好ましい実施形態において、前記アパタイト結晶は、カルシウムイオン及び金属イオン又はメタロイドイオンを含んでいる。好ましくは、前記金属イオン又はメタロイドイオンは、ストロンチウムイオン、バリウムイオン又はフッ化物イオンである。
【００１５】
本発明は、さらにまた、クロマトグラフィー装置及びクロマトグラフィー方法も包含する。クロマトグラフィーカラムは、入口末端(inlet end)及び出口末端(outlet end)を有する管状部材；前記管状部材の内部に配置された第一の多孔質部材及び第二の多孔質部材；及び、前記管状部材の内部で前記第一の多孔質部材と第二の多孔質部材の間に充填された本発明の複合クロマトグラフィー吸着媒を含む。好ましくは、前記カラムの容量は、約50リットル〜約5000リットルである。前記カラムは、さらに、前記複合クロマトグラフィー吸着媒の中を通して液体サンプルを上向きに流す手段を含んでもよい。
【００１６】
前記カラムはクロマトグラフィー分離法で用いることができ、当該方法は、生体分子を含んでいる溶液を当該クロマトグラフィーカラムの中を通して流すことを含み、それにより、前記溶液は前記酸化鉱物ビーズの細孔に浸透し、そこで、溶液中のある種の生体分子は前記アパタイト結晶に結合して、別の異なった生体分子は溶液中に留まる。前記方法に続いて、別の溶液を前記クロマトグラフィーカラムの中を通して流すことにより前記アパタイト結晶に結合している生体分子を溶離させることができる。一実施形態において、前記生体分子はポリペプチドであり、別の実施形態においては、前記生体分子は核酸である。糖ペプチドなどの、タンパク質及び核酸以外の物質も、用語「生体分子」の範囲内に包含される。
【００１７】
本発明の複合吸着媒は、さらにまた、バッチ式のクロマトグラフィー装置及び方法でも用いることができる。バッチ式方法では、生体分子を含んでいる溶液を前記複合クロマトグラフィー吸着媒と接触させ、その結果、前記溶液が前記酸化鉱物ビーズの細孔に浸透し、そこで、溶液中のある種の生体分子が前記アパタイト結晶に結合して、別の異なった生体分子は溶液中に留まる。
【００１８】
本発明は、さらにまた、本発明の複合クロマトグラフィー吸着媒を製造する方法も提供し、当該方法は、(1)ビーズ容積の約10%を超える細孔容積と少なくとも約500Åの平均細孔径を有する多孔質の酸化鉱物ビーズを供給すること；(2)前記多孔質の酸化鉱物ビーズを、(i)塩化カルシウム又は(ii)リン酸カリウム若しくはナトリウムのいずれかの溶液が前記多孔質の酸化鉱物ビーズの細孔に浸透するように、最大一細孔容積（one pore volume）の前記溶液と接触させること；(3)前記ビーズを乾燥させること；(4)乾燥させた前記ビーズを、(i)塩化カルシウム又は(ii)リン酸カリウム若しくはナトリウムのいずれか他方の溶液が乾燥させた前記ビーズの細孔に浸透し、それによって当該細孔内でリン酸カルシウムを形成するように、最大一細孔容積の前記溶液と接触させること；(5)前記ビーズを水で洗浄して余分なカルシウムイオン又はリン酸イオンを除去すること；(6)洗浄した前記ビーズを水酸化ナトリウムの溶液と接触させること；(7)前記ビーズを水で洗浄すること；及び、(8)洗浄した前記ビーズをリン酸二ナトリウムの溶液と接触させて、当該ビーズの細孔内でヒドロキシアパタイト結晶を形成させること；を含む。好ましい実施形態において、前記多孔質の酸化鉱物ビーズを最大一細孔容積の(i)塩化カルシウム又は(ii)リン酸カリウム若しくはナトリウムのいずれかの溶液と接触させる前に、当該ビーズをリン酸溶液で洗浄する。
【００１９】
上記の一般的な記載及び下記の詳細な記載は、いずれも、例示及び説明を目的としたものであって、特許請求の範囲に記載されている本発明についてさらに説明することを意図したものである。別の目的、有利な点及び新規な特質について、当業者は、以下に記載してある本発明の詳細な説明から容易に理解するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の複合クロマトグラフィー吸着媒は、酸化鉱物ビーズを用いて、アパタイト吸着媒に機械的な安定性を付与する。当該酸化鉱物ビーズは、ビーズ容積の少なくとも約10%の細孔容積と少なくとも約500Åの平均細孔径を有する。
【００２１】
好ましい実施形態において、さらに大きな細孔容積を有する酸化鉱物ビーズ、好ましくは、少なくとも約30%、さらに好ましくは、少なくとも約40%、最も好ましくは、少なくとも約50%の細孔容積を有する酸化鉱物ビーズを使用する。大きな細孔容積を有する酸化鉱物ビーズの調製方法は国際公開第99/51335号に記載されている。前記特許の内容は、その全体を本明細書に組み入れる。前記ビーズは、大きな細孔容積と高い機械的安定性及び化学的安定性を示すものであれば、小さな分離したビーズ粒子や不規則な形状の粒子であってもよい。本発明にかかるビーズは、安定で且つ大きな多孔度を有するので、充填床、流動床若しくは撹拌バッチ式吸着又は巨大分子のクロマトグラフィー分離に特に有用である。
【００２２】
前記酸化鉱物ビーズは、四価の金属の酸化物を細孔誘導剤(pore inducing agent)としての三価の金属の塩又は酸化物と組み合わせることにより調製する。そのような組合せによって不安定な懸濁液が形成され、その懸濁液は、アグロメレーションにより球状粒子又は不規則な形状の粒子を形成した後、マクロ多孔度及び大きな細孔径を示す。前記多孔度及び細孔径は、前記三価の金属の塩又は酸化物の非存在下で得ることができるものより大きい。
【００２３】
前記酸化鉱物は、好ましくは、チタニア、ジルコニア、シリカ又はハフニウムの酸化物であり、好ましくは、シリカ又はジルコニアの酸化物であり、最も好ましくは、ジルコニアの酸化物である。前記酸化鉱物は、さらにまた、2種又はそれ以上の四価の金属の酸化物の混合物であってもよい。好ましくは、前記酸化鉱物粉末は、粉末の形態であり、最も好ましくは、約0.1〜約10μmの粒径を有する粉末の形態である。
【００２４】
前記三価の金属は、酸化物の形態、塩の形態又は酸化物と塩の混合物の形態で使用することができる。特に好ましい塩は、硝酸塩である。前記金属は、(IIIB)属の金属や希土類金属などの、+3の原子価を示す任意の金属であることができる。好ましい三価の金属は、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スカンジウム、イットリウム、ランタン、セリウム、ネオジム、エルビウム、イッテルビウム及びアクチニウムである。その中に含まれる三価の金属の酸化物又は塩が2種又はそれ以上のそのような酸化物又は塩の混合物である組成物も包含される。そのような混合物には、同一であるか又は異なっている三価の金属の塩/酸化物混合物、塩/塩混合物、及び、酸化物/酸化物混合物などがある。
【００２５】
前記組成物を非常に高い温度で焼成しても、細孔容積の低下はごく僅かしか観察されなかった。それに対して、三価の金属の塩又は酸化物を用いないで得た酸化鉱物ビーズは、焼成プロセスで細孔容積が激しく低下するため、非常に高い温度で焼成するとその細孔容積は小さなものとなる。三価の金属の塩又は酸化物は、酸化鉱物の結晶形態を補足的に安定化させ、粒子の成長や最終生成物のクラッキングを防止する。
【００２６】
場合により、アグロメレーション促進物質又は結合剤などの、粒子のアグロメレーションを惹起してビーズ状の最終生成物を形成させる薬剤を含有させてもよい。それらは、三価又は四価の金属の塩であることができ、上記で記載したばかりの三価又は四価の金属と同じ金属を含むことができる。好ましい実施形態において、前記結合剤は、三価の金属の硝酸塩及び四価の金属の硝酸塩などの、硝酸塩の混合物を含む。例えば、酸化ジルコニウムを酸化鉱物ビーズの構成要素として使用し、且つ、酸化セリウムを三価の細孔誘導剤として使用する場合、結合剤として、硝酸ジルコニウムと硝酸セリウムの混合物を使用するのが都合がよい。別の適する結合剤には、例えばシリカゲルなどの、酸化鉱物の基本粒子を内部に封じ込めることができる鉱物ヒドロゲルを形成する物質などがある。鉱物ヒドロゲルは、1種以上の補足的な結合剤と組み合わせて用いることもできる。
【００２７】
増大させた細孔容積を有する複合酸化鉱物は、四価の酸化鉱物の懸濁液を調製することにより製造する。当該懸濁液の液体部分は、水であるか、又は、別の適切な任意の溶媒であることができる。前記酸化鉱物は、約0.1〜約10μmの粒径を有する粉末の形態であるべきであり、その際、特定の粒径は、当該多孔質粒子の所望の細孔径に応じて選択する。この懸濁液を、1種以上の三価の細孔誘導剤と混合する。前記懸濁液には、場合により、1種以上の結合剤も含有させる。
【００２８】
1種以上の金属酸化物結合剤又は金属塩結合剤を含有する典型的な組成物においては、最初に当該結合剤を水などの液体中に混合し、次いで、撹拌しながら、酸化鉱物及び細孔誘導剤を添加して、懸濁液を生成させる。前記撹拌は、穏やかに行って、前記混合物中へ気泡が入り込むのを避けるべきである。
【００２９】
最初の懸濁液中で用いる細孔誘導剤の量は、用いる酸化鉱物の量にほぼ比例する。最終生成物において、四価の金属の酸化物が最終的な粒子の約50〜約99%を構成し、残りの約1〜約50%は、細孔誘導剤と場合により用いる結合剤により構成される。しかしながら、最初の懸濁液においては、多孔質ビーズの主要な構成要素である酸化鉱物粒子は、用いた成分の総重量を基準にして、約10〜約95重量%の濃度である。さらに好ましくは、前記酸化鉱物は、約20〜約60重量%であるべきである。細孔誘導剤の濃度は、約5〜約50重量%である。最適濃度は、用いる特定の化合物の種類に応じて変わる。前記アグロメレーション促進物質又は結合剤の濃度は、約0〜約20重量%であり、これも、結合剤の種類に依存する。溶液の粘度を変えるために、場合により、最初の懸濁液に有機化合物を添加してもよい。
【００３０】
次いで、所望の全ての成分を含有している懸濁液を用いて、ビーズを形成させる。当技術分野でよく知られている様々な技術、例えば、噴霧乾燥、乳化重縮合及びゾルゲル法などを用いて、前記組成物にアグロメレーションを起こさせることができる。基本粒子をアグロメレーションによりビーズ形状とした後、高温で加熱して、基本粒子を部分的に融合させることにより多孔質の鉱物ビーズの構成を安定化させる。用いる加熱速度、焼成温度及び浸漬時間は、酸化鉱物と鉱物質細孔誘導剤の種類に依存する。多孔度を低下させることなく、より強い粒子を得るために、焼結は制御下に行うのが望ましい。典型的には、約800〜約1400℃の温度、約1〜約10時間の期間、及び、約1〜約100℃/時間の範囲の加熱速度を用いる。逐次的な焼成処理を用いて、最初に、水、有機物質及び硝酸塩などの揮発性物質を除去し、次いで、基本粒子を焼結させることもできる。
【００３１】
焼成したビーズを、次いで、室温まで冷却し、例えば、酸性溶液、アルカリ性溶液、中性溶液又はヒドロ-有機希釈溶液で、順次洗浄する。前記粒子は、場合により、粒度分布を求められる粒度分布となるように調節するために、篩い分けの処置に付すことができる。本発明により、少なくとも約30%、少なくとも約40%、又は、少なくとも約50%の典型的な細孔容積を得ることができる。細孔容積の上限は約70%である。
【００３２】
アパタイト結晶(好ましくは、ヒドロキシアパタイト)を取り入れて複合クロマトグラフィー吸着媒を調製するには、より大きな細孔容積及び/又は平均細孔径を有するビーズが特に適している。細孔容積は、ビーズの材料物質に基づいてさまざまである。例えば、前記酸化鉱物がジルコニア、チタニア及びハフニアからなる群から選択される場合、細孔容積はビーズ容積の約30%〜約60%である。前記鉱物がシリカである場合、細孔容積はビーズ容積の約40%〜約70%である。
【００３３】
細孔径もまた、ビーズの材料物質に依存してさまざまであり、当該複合吸着媒により分離しようとする物質に基づいて選択することができる。2000Åを超える平均細孔径が必要とされ得るプラスミドなどの大きな生体分子を分離する用途に対しては、より大きな平均細孔径を選択する。平均細孔径は、一般に、約1000Å〜約4000Åである。前記鉱物がジルコニア、チタニア及びハフニアからなる群から選択される場合、平均細孔径は約1000Å〜約3000Åであるのに対して、前記鉱物がシリカである場合、平均細孔径は約2000Å〜約5000Åである。
【００３４】
前記細孔にヒドロキシアパタイトを充填するために、酸化鉱物ビーズを、場合によるが、好ましくは、最初、リン酸の溶液で洗浄して不純物を除去し、次いで、リン酸一カリウムと一緒にインキュベーションする。次いで、ビーズを洗浄し、乾燥させる。必要に応じて、公知方法により細孔容積を測定することができる。次いで、ビーズを、(i)塩化カルシウム又は(ii)リン酸カリウム若しくはナトリウムのいずれかの溶液と接触させて、当該溶液を前記細孔に浸透させる。ビーズを乾燥させた後、(i)塩化カルシウム又は(ii)リン酸カリウム若しくはナトリウムのいずれかの溶液と接触させる。ビーズを第一段階で塩化カルシウムと接触させた場合には、第二段階では、リン酸カリウム若しくはナトリウムと接触させる。逆の場合も同様である。前記溶液を細孔に浸透させ、充分な時間、細孔内でリン酸カルシウム結晶構造を形成させた後、ビーズを洗浄して余分なカルシウムイオン又はリン酸イオンを除去する。次いで、ビーズを水酸化ナトリウムの溶液と接触させ、再度洗浄する。最後に、ビーズをリン酸二ナトリウムの溶液と接触させて、ビーズの細孔内でヒドロキシアパタイト結晶を形成させる。
【００３５】
前記鉱物ビーズを塩化カルシウム溶液及びリン酸カリウム又はナトリウム溶液と接触させる場合、最大一細孔容積の溶液を用いるのが好ましく、好ましくは、正確に一細孔容積の溶液を用いる。一細孔容積を用いることで、前記酸化鉱物ビーズの細孔の外側に結晶を成長させることなく、ビーズの細孔内に最大量のヒドロキシアパタイト結晶が正確に生成される。
【００３６】
別の実施形態において、リン酸イオンを用いて製造したヒドロキシアパタイトに少量の別の金属イオンを混入させることができる。混入させた金属イオンを用いて、複合吸着媒の吸着特性を変えることができる。
【００３７】
前記細孔内で、ヒドロキシアパタイト以外のアパタイトを成長させることができる。この場合、カルシウムをストロンチウム、バリウム又は別の元素で置き換えてもよい。結果として得られたアパタイトは、ヒドロキシアパタイトとは異なる吸着特性を有し得る。ヒドロキシアパタイト以外の結晶質アパタイト、例えば、F、Cl又はCO3を含むアパタイト誘導体は公知であり、前記酸化鉱物ビーズの細孔内で成長させることができる。例えば、フルオロアパタイトの調製に関しては、Matsumotoら, Caries Res., 34(1)：26-32 (2000)；Okazakiら, Biomaterials, 20(15)：1421-6 (1999)；Okazakiら, Biomaterials, 19(10)：919-23 (1998)；Okazakiら, Biomaterials, 19(7-9)：611-6 (Apr-May, 1998)に記載されている。
【００３８】
前記アパタイト結晶、より好ましくは、ヒドロキシアパタイト結晶は、カルシウムイオン及び金属イオン又はメタロイドイオンを含有する。金属イオン又はメタロイドイオンを用いる実施形態において、好ましい金属イオン又はメタロイドイオンは、ストロンチウムイオン、バリウムイオン又はフッ化物イオンである。
【００３９】
前記酸化鉱物ビーズの細孔内でアパタイト結晶を形成させる前に、ビーズを最初に親水性ポリマーの層で被覆してもよい。好ましくは、前記親水性ポリマーは、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、架橋多糖及びビニルポリマーからなる群から選択される。そのような被覆により、生体分子についての非特異的な結合が低減される。
【００４０】
本発明の複合吸着媒を用いる別のクロマトグラフィー技術を用いて生体分子を分離することができる。そのような技術は、生物学的な巨大分子を含んでいる溶液を本発明の複合吸着媒と接触させて、当該溶液中の分子を吸着媒により選択的に吸着させることを含む。所望の巨大分子が前記樹脂に固定されている場合は、後者を溶離させることによって、所望の巨大分子を分離し、精製濃縮された形態で分離および回収することができる。所望の巨大分子が処理溶液中に留まっている場合は(その他の巨大分子は前記吸着媒に固定されている)、所望の分離は直接的に得られる。
【００４１】
バッチ式クロマトグラフィーを用いる場合、本発明の複合吸着媒を生体分子の溶液に直接添加して、生体分子が吸着媒に結合するのに充分な時間、吸着媒-生体分子混合物を穏やかに撹拌する。次いで、遠心分離又は濾過により生体分子が結合している吸着媒を除去することができる。その後、生体分子は、別の独立した処置により溶離させる。
【００４２】
別法として、カラムクロマトグラフィーを用いてもよい。固定床カラムクロマトグラフィーでは、本発明の複合吸着媒をカラムに充填し、分離すべき生体分子を含んでいる溶液を、生体分子が吸着媒に結合できるような速度で前記溶液を吸着媒の中を通して流すことにより、吸着媒に適用する。固定床クロマトグラフィーの有利な点としては、カラムの容積及び水の消費量が最少量であることなどを挙げることができる。前記カラムクロマトグラフィー法の不利な点は、カラムの中を通って流れる液体の流速が遅く、従って、多大な時間を必要とすることである。この流速は、カラムに適用される物質が微粒子を含んでいる場合はさらに遅くなり得る。それは、そのような粒状物質が吸着媒をある程度「詰まらせ」得るからである。
【００４３】
流動床カラムクロマトグラフィーでは、上昇力に対して平衡を維持するために、密度の高い粒子よりはむしろ大きな粒子と上昇濾過流(rising filtration flow)を用いる。別の段の上端の上に位置している2つ〜5つの段から構成されている本質的に直立しているカラムを使用し、溶液は連続的に段を通過して、上部段の上部からの流出によって排出される。各段は、最上段を除いて、穴の空いた2つの分配系によって分離されている。分配系の1つは、その段の基部で溶液を分配し、もう1つの分配系は、直ぐ上に位置する段に対して溶液を分配する。
【００４４】
流動床の有利な点は、固定床クロマトグラフィーと比較して、低い圧力で流速が大きいということである。流速が大きいことは、クロマトグラフィー分離に対して多少の有利性をもたらすが、流動床を用いる方法には幾つかの欠点がある。当該方法では、重力に対して中立であるか又は浮揚性である大きな直径の樹脂が必要である。そのような大きな直径の吸着媒は、固定床カラムで用いる小さな吸着媒よりも単位容積当たりの表面積が小さく、それに相応して表面結合能が劣っている。流動床の最も重大な問題は、混合である。カラムは静的な混合手段を有していないので、流動床は、通常、空気ジェットを用いて混合するか又は分離しようとする液体を大きな流速でカラム内を通して再循環させることにより混合する。流速が大きいこと及び混合が制限されていることにより、樹脂から生成物を溶離させる際に必要な均一な相変化が妨げられる。
【００４５】
他方においては、流動床クロマトグラフィーは、目詰まり、洗浄の必要性、圧縮及び洗浄による樹脂の劣化など、固定床の重大な欠点の多くを回避する。実際、流動床では、溶液中の不純物は目詰まりのリスクを伴わずに自由に通過できるし、洗浄の必要性がないことにより樹脂の寿命は極めて長くなっている。しかしながら、一般に、生物学的巨大分子用のクロマトグラフィー吸着媒は、粒度分布が極めて小さく、又は、水の密度に非常に近い密度を有するため、流動床クロマトグラフィーには適さない。これにより、粒子をフラックス中に引き入れることなく流動させるのは不可能となる。生物学的巨大分子の流動床クロマトグラフィーに伴う別の問題は、分子間の空間が大きいことに関連し、その結果、流動床環境中での効率が低下する。
【００４６】
これらの要因に基づいて、バッチ式クロマトグラフィー及び固定床クロマトグラフィーが、生物学的巨大分子を分離するために従来技術で選択された方法である。それに対して、本発明の複合吸着媒は、バッチ式クロマトグラフィー、固定床クロマトグラフィー又は流動床クロマトグラフィーで用いることができる。
【００４７】
本発明の複合吸着媒を用いて、「源液(source liquid)」に含まれている生体分子を分離する。ここで、「源液」は、同様に存在している他の物質から精製されることが求められる少なくとも1種の、あるいは2種以上の価値のある生物学的な物質又は生成物を含有している液体である。本発明の実施に際して、源液は、例えば、水溶液、有機溶媒系、又は、水/有機溶媒混合液若しくは溶液であり得る。源液は、しばしば、タンパク質、抗体、ホルモン及びウイルスなどの多くの生物学的な分子や、さらに、塩、糖及び脂質などの小分子を含有する複合混合物又は複合溶液である。生物学的な起源を有する典型的な源液は水溶液又は水性懸濁液として生じ得るが、それは、溶媒沈澱や抽出などの先行して行われた分離段階において用いられた有機溶媒を含有していてもよい。本発明の精製方法で容易に精製できる価値のある生物学的な物質を含み得る源液の例としては、限定するものではないが、バイオリアクターから得た培養上清、均質化した細胞懸濁液、血漿、血漿画分、牛乳、初乳及び乳清などを挙げることができる。
【００４８】
そのような源液は、当該源液から精製すべき少なくとも1種の「生体分子」を含んでいる。生体分子は生物学的な生成物であり、例えば、核酸、免疫グロブリン、凝固因子、ワクチン、抗原、抗体、選択されたタンパク質又は糖タンパク質、ペプチド及び酵素などを包含する。そのような生体分子は、源液中に、懸濁液として又は溶液状態で存在し得る。便宜上、用語「生体分子」は、本明細書中では単数で用いられているが、当該用語は、副産物として一緒に精製するか、又は、回収された別個の成分として別々に(例えば、順次に)精製する2種以上の物質を表し得ることは理解されるべきである。
【００４９】
「溶離液」又は「溶離バッファー」は、グリコイソ型(glyco-iso-form)などの生体分子を本発明の複合吸着媒から解離させるために使用される。溶離液は、生体分子を不可逆的に変性させることなく解離させるように作用する。典型的な溶離液は、クロマトグラフィーの技術分野ではよく知られており、高濃度の塩、遊離アフィニティーリガンド若しくは類似体、又は、クロマトグラフィー吸着媒からの標的物質の解離を促進する別の物質を有し得る。「溶離条件」は、生体分子が結合しているクロマトグラフィー吸着媒に課せられる、クロマトグラフィー吸着媒から変性されていない生体分子を解離させるプロセス条件、例えば、生体分子が結合しているクロマトグラフィー吸着媒を溶離液又は溶離バッファーと接触させて解離を起こさせることなどを表す。
【００５０】
「洗浄液」又は「洗浄バッファー」は、分離工程が完了した後、クロマトグラフィー吸着媒を洗浄するために使用される。洗浄液は、洗浄剤、ウイルス不活性化薬又は比較的高濃度の塩を含有し、また、精製工程に際して使用される液体のpHよりも高いpH又は低いpHを有し得る。その目的は、クロマトグラフィー吸着媒を完全に除洗して、再使用できる状態にすることである。典型的な洗浄液は、クロマトグラフィーの技術分野ではよく知られてる。
【００５１】
使用と使用の間は、本発明の複合吸着媒は、「貯蔵液」又は「貯蔵バッファー」中に保存する。貯蔵液は、緩衝イオンに加えて、殺菌薬又は別の保存薬を含有し得る。そのような貯蔵液は、クロマトグラフィーの技術分野ではよく知られてる。
【００５２】
本発明の複合吸着媒は、バッチ式分離で使用することができるか、又は、固定床又は流動床のいずれかのクロマトグラフィーカラムに充填することができる。前記カラムは、入口末端及び出口末端を有する管状部材、並びに、前記管状部材の内部に配置されたガラスフリットなどの第一及び第二の多孔質部材を含む。本発明の複合クロマトグラフィー吸着媒は、前記管状部材の内部で前記第一の多孔質部材と第二の多孔質部材の間に充填する。流動床カラムには、典型的には、複数の段が存在する。好ましい実施形態において、カラムの容量は約50リットル〜約5000リットルである。流動床クロマトグラフィーに関しては、当該カラムは、さらに、前記複合クロマトグラフィー吸着媒の中を通して液体サンプルを上向きに流す手段を含む。
【００５３】
バッチ式クロマトグラフィー分離は、適切な容器内で本発明の複合吸着媒を源液と混合し、穏やかに撹拌することを含む。カラムクロマトグラフィーを用いるクロマトグラフィー分離は、生体分子を含んでいる第一の溶液を前記カラム内を通して流すステップを含み、それによって、前記溶液中の生体分子が前記酸化鉱物ビーズの細孔に浸透して当該細孔内の前記アパタイト結晶に結合し；さらに、その後、第二の溶液を前記カラムの中を通して流すことにより前記アパタイト結晶に結合している生体分子を溶離させるステップを含む。固定床カラムでは、源液は重力により下方に向かって流れるが、流動床カラムでは、源液を前記カラムの中で上方に向かって移動させる。分離される生体分子は、通常、ポリペプチド又は核酸である。本発明の複合吸着媒は、抗体の分離などの、困難なタンパク質の分離に特に有用である。それは、さらにまた、プラスミドに関して、RNAの除去及び開環物を除去するのにも優れている。
【００５４】
以下の実施例は、本発明の範囲内に含まれる特定の実施形態に関するものであり、制限を加えるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例(1)：ゾルゲルによるジルコニア粒子の調製
150mLのケイ酸ナトリウム35%に、200mLの水、100mLの水及び100mLの氷酢酸を連続的且つ段階的に混合することによりシリカゾルを調製する。得られた懸濁液に、乾燥した固体の不規則なジルコニア粉末(寸法0.3〜3μmのもの350mg)を分散させる。次いで、激しく撹拌しながら、酸化セリウム(10g)及び硝酸セリウム(10g)を添加する。上記条件下、周囲温度で、15〜60分以内でゲル化が起こる。
【００５６】
ゲル化が完結した後(ゲル化が完結するのに数時間を要する)、得られたゲルを200μシーブで加圧濾過することにより、小片に分割する。粒子を清浄水に懸濁させ、濾過により回収し、洗浄し、次いで、空気流下80℃で乾燥させる。
【００５７】
固体のジルコニアとセリアの複合微粒子を捕捉しているシリカゲルを漸進的に脱水する。この時点で、粒子は軟質であり、その多孔度はそれほど大きくはない。次いで、粒子を1300℃で2時間焼成する。これらの条件下で、シリカゲルは完全に脱水されて、固体サブ粒子の周囲に連続層を形成する程度まで収縮する。サブ粒子間の空隙がマクロ多孔を構成する。
【００５８】
上記処置が終了した後、最終的な細孔容積は、多孔質粒子の総容積の50%を超える。乾燥した不規則な粒子の密度は、約2.1g/cm3である。冷却後、ビーズには、鉱物の結晶形態の容積の変化に起因するクラックは全く見られない。
【００５９】
実施例(2)：懸濁重合によるジルコニア粒子の調製
150mLのケイ酸ナトリウム35%に、200mLの水、100mLの水及び100mLの氷酢酸を連続的且つ段階的に混合することによりシリカゾルを調製する。得られた懸濁液に、乾燥した固体の不規則なジルコニア粉末(寸法0.3〜3μmのもの350mg)を分散させる。次いで、激しく撹拌しながら、酸化セリウム(10g)及び硝酸セリウム(10g)を添加する。
【００６０】
2%のセスキオレイン酸ソルビタンを含有しているパラフィン油浴を撹拌しながら、それに、前記で得られた均質な懸濁液をゆっくりと注いで、小滴として分散させる。得られた懸濁液を撹拌しながら80℃で加熱する。上記条件下、周囲温度で、15〜30分以内でゲル化が起こる。
【００６１】
10〜500μmの範囲の直径を有するビーズは、その網目構造体の内部に予め形成させておいたジルコニアとセリアの固体微粒子を取り込んでいるシリカヒドロゲルを含んでいる。それらを濾過により回収し、洗浄し、空気流下80℃で乾燥させる。前記ゲルは、漸進的に脱水されて、固体のジルコニアとセリアの複合微粒子の結合剤として作用する。次いで、ビーズを1300℃で2時間焼成して、細孔容積の低下が最小限となるようにビーズサブ粒子を焼く。上記処置が終了した後、最終的な細孔容積は、ビーズの総容積の50%を超える。乾燥したビーズの密度は、約2.1g/cm3である。冷却後、ビーズには、鉱物の結晶形態の容積の変化に起因するクラックは全く見られない。
【００６２】
実施例(3)：噴霧乾燥によるジルコニアビーズの調製
1000mLの蒸留水中で231gの硝酸ジルコニウムと143.6gの硝酸イットリウムを混合することにより溶液を調製する。気泡が混入するのを防止するために穏やかに撹拌しながら、酸化イットリウム(144g)及びジルコニア粉末(寸法0.3〜3μmのもの752g)を添加する。
【００６３】
次いで、得られた懸濁液を、熱ガス流(好ましくは、空気又は窒素)と一緒に、回転円盤(revolving disk)、噴霧ノズル又は超音波ネブライザーなどの噴霧装置により垂直な乾燥室に注入する。熱ガス流により、微小液滴から水分が急速に蒸発する。前記ガスは、典型的には、300〜350℃で注入して、100℃を僅かに超える温度で乾燥装置から排出される。もとの酸化鉱物の微粒子は、統合されて球状形態の個々の凝集体となる。乾燥したミクロビーズを、次いで、酸化ジルコニウムの融点に近い温度で焼成して、網目構造体を不可逆的に固める。冷却後、ビーズには、鉱物の結晶形態の容積の変化に起因するクラックは全く見られない。上記操作により、ビーズ容積の50%を超える大きな細孔容積を有する安定なビーズが形成される。
【００６４】
実施例(4)：ヒドロキシアパタイトが充填されているジルコニアビーズの調製
実施例(3)で得たビーズをリン酸の1M溶液で洗浄して不純物を除去し、次いで、2倍容積の1Mのリン酸一カリウムと一緒に、室温で、時々振盪しながら一晩インキュベーションする。処理されたビーズを、次いで、pHが中性になるまで水で洗浄し、減圧下に60〜80℃で乾燥させて、残留水を全て除去する。乾燥したビーズの細孔容積を、よく知られている方法で測定する。
【００６５】
74gのCaCl2・2H2Oを500mLの蒸留水(最終容積)に溶解させて、塩化カルシウムの溶液を調製する。処理されたジルコニアの乾燥ビーズを一細孔容積の前記塩化カルシウム溶液と混合する。30〜60分間混合した後、溶液が前記鉱物物質の細孔内に確実に充分に浸透するように、上記と同様に、ビーズを再度乾燥させる。
【００６６】
180gのNa2HPO4・12H2Oを500mLの水(最終容積)に溶解させて、リン酸二ナトリウムの溶液を調製する。乾燥させた前記ビーズを一細孔容積の前記溶液と混合し、得られた混合物を再度30〜60分間充分に振盪して、確実に充分に浸透させる。温度を25〜40℃に維持して、得られた物質を一晩放置する。
【００６７】
前記物質を、次いで、大量の水と混合して、余分なカルシウムイオンが除去されるまで水で数回洗浄する(NaOHによるCa(OH)2の沈澱が生じてはならない)。洗浄した前記物質を数倍容積(少なくとも10倍)の0.5M濃度の水酸化ナトリウムに添加する。得られた懸濁液を、次いで、1時間95〜100℃とし、一晩放置する。その間に、温度は室温まで低下する。
【００６８】
処理された前記物質を、再度、水で大規模に洗浄し、3g/Lのリン酸二ナトリウムの溶液と混合する。そのpHを6.8に調節し、得られた懸濁液を約20分間95〜100℃に加熱する。得られた物質を、最後に水で洗浄し、1Mの塩化ナトリウムと20%のエタノールを含有する中性のpHのリン酸バッファー中に保存する。
【００６９】
本発明は、新規な複合吸着媒、その使用方法及び製造方法を提供する。特定の実施例を示したが、上記記載は例示であって、制限的なものではない。本発明の上記実施形態の1以上の任意の特質を、本発明の別の任意の実施形態の1以上の特質と任意の方法で組み合わせることができる。さらに、本発明の多くの変形態様は、本明細書を精読すれば当業者には明らかになるであろう。従って、本発明の範囲は、上記記載を参照して決定すべきではなく、代わりに、添付してある特許請求の範囲とその等価なものの全範囲を参照して決定すべきである。
【００７０】
本出願で引用されている全ての刊行物及び特許文献は、あたかも個々の刊行物又は特許文献がそれぞれ個別的に示されているのと同じ範囲まで、意図されている全てに関して、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。本文献の中のさまざまな参考文献の引用に基づいて、本発明者らは、どの特定の参考文献も本発明者らの「発明」に対する「先行技術」であるとは認めない。
【国際調査報告】
2005512070.tif 000002
2005512070.tif 000003