(57)【要約】本発明は、オリゴマーまたは「ペイロード（payload）」を、受容体介在性、リガンド指向性の経路を介して細胞内で肝細胞へ導くような肝リガンドを含む、均一なＡ−Ｌ−Ｐ構築物の設計および合成に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：Ａ−Ｌ−Ｐ
の均一なコンジュゲートを含む構築物
（式中、Ａは、肝受容体に特異的に結合し、それによって該受容体を有する細胞への該コンジュゲートの取り込みを容易にする肝リガンドであり；
Ｌは、位置特異的な様式でＡと共有結合しＡ−Ｌを形成する二官能性のリンカーを表し；Ａ−Ｌは、位置特異的な様式でＰと共有結合しＡ−Ｌ−Ｐを形成し；
Ｐは、肝ウイルスのエンキャプシデーション配列に結合する生物学的に安定なオリゴマーを表す（ここでＰは加水分解あるいは少なくとも一つの特異的な生化学的な結合の還元によって該コンジュゲートから放出され、且つ該コンジュゲートから放出される際の酵素的な加水分解あるいは生分解に抵抗性のヌクレオチド間結合を含んでいる）。
【請求項２】
式：Ａ−Ｌ−Ｐ
の均一なコンジュゲートを含む構築物
（式中、Ａは、肝受容体に特異的に結合し、それによって該受容体を有する細胞への該コンジュゲートの取り込みを容易にする肝リガンドであり；
Ｌは、位置特異的な様式でＡと共有結合しＡ−Ｌを形成する二官能性のリンカーを表し；Ａ−Ｌは、位置特異的な様式でＰと共有結合しＡ−Ｌ−Ｐを形成し；
Ｐは、肝ウイルスの配列に結合する生物学的に安定なＤＮＡオリゴマーを表す（ここでＰは加水分解あるいは少なくとも一つの特異的な生化学的な結合の還元によって該コンジュゲートから放出され、且つ該コンジュゲートから放出される際の酵素的な加水分解あるいは生分解に抵抗性のヌクレオチド間結合を含んでいる）。
【請求項３】
式：Ａ−Ｌ−Ｐ
の均一なコンジュゲートを含む構築物
（式中、Ａは、肝受容体に特異的に結合し、それによって該受容体を有する細胞への該コンジュゲートの取り込みを容易にする肝リガンドであり；
Ｌは、位置特異的な様式でＡと共有結合しＡ−Ｌを形成する二官能性のリンカーを表し；Ａ−Ｌは、位置特異的な様式でＰと共有結合しＡ−Ｌ−Ｐを形成し；
Ｐは、肝ウイルスの配列に結合する生物学的に安定なオリゴマーを表す（ここでＰは加水分解あるいは少なくとも一つの特異的な生化学的な結合の還元によって該コンジュゲートから放出され、且つ、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチルリボースメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボースホスホロチオエート及び２’−Ｏ−メチルリボースホスホジエステルからなる群より選択される１又はそれ以上の種類のヌクレオチド間結合を含んでいる）。
【請求項４】
該オリゴマーがオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ又はオリゴヌクレオシドである、請求項１〜３のいずれかに記載の構築物。
【請求項５】
該ウイルスが肝炎ウイルスである、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。
【請求項６】
該オリゴマーがＲＮＡ  ｐｒｅＳ１  オープンリーディングフレーム配列に結合する、請求項１又は３記載のの構築物。
【請求項７】
ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧ、ＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴ及びＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡからなる群より選択される配列を含む、請求項２又は３記載の構築物。
【請求項８】
配列ＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡを含む請求項１〜６のいずれか１つに記載の構築物。
【請求項９】
該オリゴマーがさらにデオキシリボースメチルホスホネートヌクレオチド間結合を含む、請求項１、２又は４記載の構築物。
【請求項１０】
該オリゴマーがデオキシリボースホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１、２又は４記載の構築物。
【請求項１１】
該オリゴマーがホスホジエステル結合を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の構築物。
【請求項１２】
該オリゴマーがデオキシリボースメチルホスホネート／ホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせ、デオキシリボースメチルホスホネート／ホスホジエステルヌクレオチド間結合の組み合わせ、デオキシリボースホスホロチオエート／ホスホジエステルヌクレオチド間結合の組み合わせ、２’−Ｏ−メチルリボースメチルホスホネートヌクレオチド間結合、２’−Ｏ−メチルリボースホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−Ｏ−メチルリボースホスホジエステルヌクレオチド間結合、２’−Ｏ−メチルリボースメチルホスホネート／２’−Ｏ−メチルリボースホスホジエステルヌクレオチド間結合の組み合わせ、２’−Ｏ−メチルリボースメチルホスホネート／２’−Ｏ−メチルリボースホスホロチオエートヌクレオチド間結合の組み合わせ、又は２’−Ｏ−メチルリボースホスホロチオエート／２’−Ｏ−メチルリボースホスホジエステルヌクレオチド間結合の組み合わせである、請求項１、２又は４に記載の構築物。
【請求項１３】
ａ）Ａ−Ｌ構築物を形成すること；
ｂ）Ａ−Ｌ構築物を９５％を超える均一性にまで精製し未反応のリンカーを除去すること；
ｃ）オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログＰを修飾してチオール修飾されたオリゴマーを形成すること；
ｄ）脱気条件下で該チオール修飾されたオリゴマーを精製し未反応の試薬及び不純物を除去すること；
ｅ）該Ａ−Ｌ構築物及び該チオールオリゴマーを、脱気条件下で２成分コンジュゲーション反応で反応させること；ここでＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを形成するために該反応は過剰量のリガンドスキャフォールド又は該チオール修飾されたオリゴマーのいずれかを用いて実施され得る；及びＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを精製すること、
を含む、請求項４記載のコンジュゲートを合成する方法。
【請求項１４】
該Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートがサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ａ）固相合成の際にトリヌクレオチドトレーサーユニット５’−Ｔ−３’−ｐｓ−３’−Ｔ−ｐｓ−Ｔ−５’をオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログＰの３’末端に付加すること；
ｂ）ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）及び放射標識されたホスフェートを含む２−アミノメルカプトエタノール（ＡＴＰ）を用いて該トレーサーユニットを酵素的にリン酸化してＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートに放射標識されたホスフェートを取り込むこと；及び
ｃ）Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲート中に今や存在する放射性ホスフェートをアミンで化学的に修飾し、該コンジュゲートを細胞の酵素的分解から防御すること、
を含む、請求項４記載のコンジュゲートを放射標識する為の方法。
【請求項１６】
ａ）固相合成の際にオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログＰの末端ジスルフィド部分に二官能性のリンカーＬを付加しジスルフィド修飾されたオリゴマーを形成すること；
ｂ）ジスルフィド修飾されたオリゴマーを精製すること；
ｃ）該ジスルフィド修飾されたオリゴマーのジスルフィド部分をチオール基へと還元し、チオール修飾されたオリゴマーを形成すること；
ｄ）脱気条件下でチオール修飾されたオリゴマーを精製すること；
ｅ）リガンドＡと精製されたチオール−オリゴマーを脱気条件下で反応させＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを形成すること；及び
ｆ）Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを精製することを含む、請求項４記載のコンジュゲートを合成する方法。
【請求項１７】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて工程ｂ）−ｆ）を行う、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを電気泳動を用いて精製する、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該Ａ−Ｌ−ＰコンジュゲートをＨＰＬＣを用いて精製する、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
該ジスルフィド修飾されたオリゴマーを９５％を超える均一性にまで精製し僅かに残る低分子量のチオール混入物を除去する、請求項１６〜１９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
該ジスルフィド修飾されたオリゴマーが９９％を超える均一性にまで精製される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ａ）Ｐの５’末端にジスルフィド末端リンカーを付加し、固相合成を用いてトレーサーユニット５’−Ｔ−３’−ｐｓ−３’−Ｔ−ｐｓ−Ｔ−５’のトリヌクレオチドをＰの３’末端に付加すること；
ｂ）ジスルフィド及びトレーサーを含有するＰを精製すること；
ｃ）ジスルフィド官能基をチオール基へと還元し、チオール修飾されたＰを形成すること；
ｄ）該チオール修飾されたＰを、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて脱気条件下で精製し未反応の試薬及び不純物を除去すること；
ｅ）脱気条件下で、Ａ−Ｌ構築物を該精製しチオール修飾されたＰにコンジュゲートしてＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを形成すること；
ｆ）ＰＮＫ及び放射標識されたホスフェートを含むＡＴＰを用いて該トレーサーユニットを酵素的にリン酸化しＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートに放射標識されたホスフェートを取り込むこと；及び
ｇ）Ａ−Ｌ−Ｐ構築物中に今や存在する放射性ホスフェートをアミンで化学的に修飾し、該コンジュゲートを細胞の酵素的分解から防御すること、を含む、請求項４記載のコンジュゲートを放射標識する方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の構築物及び少なくとも１つの医薬上許容され得る賦形剤又は担体を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
該構築物が、ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−５’ＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡ３’である、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２５】
式：Ａ−Ｌ−Ｐ
の均一なコンジュゲートを含む構築物
（式中、Ａは、肝受容体に特異的に結合し、それによって該受容体を有する細胞への該コンジュゲートの取り込みを容易にする肝リガンドであり；
Ｌは、位置特異的な様式でＡと共有結合しＡ−Ｌを形成する二官能性のリンカーを表し；Ａ−Ｌは、位置特異的な様式でＰと共有結合しＡ−Ｌ−Ｐを形成し；
Ｐは、肝病原体に結合する生物学的に安定なオリゴマーを表す（ここでＰは加水分解あるいは少なくとも一つの特異的な生化学的な結合の還元によって該コンジュゲートから放出され、且つ該コンジュゲートから放出される際の酵素的な加水分解あるいは生分解に抵抗性のヌクレオチド間結合を含んでいる）。
【請求項２６】
請求項２５に記載の構築物及び少なくとも１つの医薬上許容され得る賦形剤又は担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生分解に耐性な均一なオリゴヌクレオシドコンジュゲートの、リガンド指向性で受容体介在性のエンドサイトーシス経路を介した組織特異的な様式での細胞への送達に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肝臓は、必須の器官であり、多くの生物学的機能を担っている。その最も重要な機能の幾つかは、そうしなければ有毒となるであろう物質の解毒や排出、より容易な吸収のための消化管からの栄養分や薬物のプロセッシング、食物の消化の助けとなる胆汁の産生、および生命を維持する成長および持続のための食物の化学物質への変換が挙げられる。少なくとも１００種類の肝臓疾患が知られている。肝臓の最も重要な疾患は、ウイルス性肝炎、肝硬変および癌である。
【０００３】
現在、５種類の既知種のウイルス性肝炎が存在する：Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）。しかしながら、疫学的な研究に基づけば、Ａ−Ｅ型肝炎ウイルスで全ての知られている症例に説明がつかないので他の肝向性ウイルスが存在するものと思われる。
【０００４】
ＨＡＶおよびＨＥＶは汚染された食物や水を通じて蔓延するが、慢性的な肝疾患を引き起こすものではない。対照的にＨＢＶ、ＨＤＶおよびＨＣＶは慢性的な感染と慢性肝炎をもたらし得る血液媒介性のウイルスである。最も重要な肝ウイルスの２つは、ＨＢＶとＨＣＶである。ＨＢＶは毎年３２０，０００人が感染していると見積もられ（疾病対策センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ），未公開データ）、慢性感染症を患っているＨＢＶ保有者が約１００〜１２５万人存在する（第３回国立衛生栄養試験調査（Ｔｈｉｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ）（ＮＨＡＮＥＳ  ＩＩＩ，１９９６年）からの血清疫学データ（Ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｄａｔａ）。世界的な見積りでは２億人がＨＢＶに感染していることを示唆している。ＨＤＶは、欠損ウイルスでありＨＢＶとの共感染か、あるいはＨＢＶの先在的な感染（重感染）を必要とし（Ｓｍｅｄｉｌｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８１），  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  ８１：  ９９２−９９７）、いずれの場合にもＨＢＶ感染単独の場合よりもより重篤な症状を招く。ＨＢＶに感染した個体における慢性的なＨＤＶ感染は重度の肝不全を伴う。ＨＣＶ感染は、３５０万人のキャリアを苦しめ、毎年約１５万の新たな感染者を生み出していると推定される。ＨＣＶ感染は、緩和な症状を伴い、慢性疾患に進行するまで診断されないかもしれない。ＨＣＶ感染者の約８０％は慢性となり肝臓疾患へとつながる。インターフェロン療法などの薬物療法は、炎症、症状および感染性を減ずることが目的で、感染した個体からウイルスが排除されることはほとんどない。
【０００５】
国立ガン協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）（１９９８年）によれば、米国における死者１３，９００人は新しい症例の肝細胞ガン（ＨＣＣ）が原因となっていた。世界的には毎年５０〜１００万人がＨＣＣによって死亡している。ＨＣＣは東南アジア、特に香港で蔓延している。Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型あるいは肝硬変を保有している個体はＨＣＣを発症する危険性がより高い。慢性的なウイルス肝炎は、肝硬変、肝細胞不全およびＨＣＣを引き起こすかもしれない。現在、ＨＣＣに有効な治療は知られていない。
【０００６】
マラリアは、プラスモディウム属由来の多くの寄生原虫類によって引き起こされる疾患であり、アノフェレス属の雌の蚊によって伝染される。マラリアを引き起こす４種のプラスモディウム属は、Ｐ．  ｖｉｖａｘ、Ｐ．  ｏｖａｌｅ、Ｐ．  ｍａｌａｒｉａおよびＰ．  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍである。中央アメリカ、南アメリカ、東南アジア、カリブ諸島（Ｃａｒｒｉｂｂｅａｎｓ）、南太平洋諸島およびサハラ砂漠以南アフリカなどの熱帯地方および亜熱帯地方で最も通常的に発生するのはこの病気である。蚊に噛まれてから１週間から１ヶ月程でいたるところに症状があらわれ、症状としては、高熱、悪寒戦慄、発汗、頭痛、筋肉痛、疲労、貧血および時々嘔吐や咳などが挙げられる。マラリアの最も深刻な状態は、熱、精神錯乱、脾臓肥大、吐き気および貧血に特徴付けられ、致命的であり得る。もしこの疾患を治療せずほっておくと、感染が進行し、肺に液が溜まり、肝不全、腎不全、脳膨張、昏睡、そして死へと至る。マラリアを引き起こす寄生虫の生活環は、雌の蚊が、感染したヒトを噛み幾つかのガメトサイトを摂取した時点で始まり、蚊の胃内で減数分裂し成熟する。結果的に、雄性および雌性の配偶子が融合し接合子を形成して、蚊の内部に移住しそして蚊の唾液腺内でスポロゾイトを産生するようになる。これらのスポロゾイトは次のヒト宿主の血液に感染し、そして最終的には宿主の肝臓へと到達する。ついには、幾らかの寄生虫は肝臓を離れ宿主の血液細胞内で再生を開始し、マラリアのよく知られた症状をもたらす。
【０００７】
ウイルスおよび原生動物感染ならびに癌を治療する１つの方法は、アンチセンス療法の効果を利用している。アンチセンス技術をＤＮＡおよびタンパク質の制御に適用することにあたって主要な目的は、必須ｍＲＮＡ標的配列に結合している特異的なオリゴヌクレオチドを介した遺伝子発現の選択的な阻害である。アンチセンス技術をＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質のような遺伝的要素の制御に適用するにあたっての主要な目的は、必須ｍＲＮＡ標的配列に結合している特異的なオリゴヌクレオチドを介した遺伝子発現の選択的な阻害である。ドラッグデザインのためのアンチセンス（アンチコードまたはアンチ遺伝子）方法は、標的ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに結合し被覆することができる合成オリゴデオキシヌクレオチド（オリゴ−ｄＮ）、並びに、それらのアナログの送達による、配列特異的なタンパク質合成の阻害に基づいている（Ｍｉｒａｂｅｌｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３），  Ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  （Ｃｒｏｏｋｅ  およびＬｅＢｌｅｕ編）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ｐｐ．７−３５）。この方法には、オリゴ−ｄＮが細胞膜を通過し、それによってそれらの意図する標的を含む細胞コンパートメントへのアクセスを得、その標的への結合が起こるのに十分な量においてそうなるような潜在的な能力がある。
【０００８】
外来性ＤＮＡの細胞内媒質への送達は、その取り込みを受容体介在性のエンドサイトーシスにつなげることによって大きく高められる。ＷｕおよびＷｕ（１９８７），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：４４２９−４４３２）による先駆的研究は、アシアロオロソムコイドに結合したポリ−Ｌ−リジンと静電気的に錯体を形成する外来遺伝子（Ｗｕ，  （１９８７），  前述；  Ｗｕ，  （１９８８），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３：１４６２１−１４６２４；  Ｗｕ，  （１９８８），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７：８８７−８９２）またはオリゴ−ｄＮｓ（（１９９２），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７：１２４３６−１２４３９）が、アシアログリコプロテイン受容体との直接的な相互作用を介して、効果的におよび特異的にヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ  Ｇ２）に取り込まれることを示した。この初期研究以後、受容体介在性のＤＮＡ送達に関するその他の実施例も文献に現われてきており、そのような文献には、４本鎖ガラクトース  ネオグリコペプチド  ポリ−Ｌ−リジンコンジュゲート（Ｐｌａｎｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２），  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ３：５３３−５３９）；トリガラクトシル化された（trigalactosylated）ビス−アクリジンコンジュゲート（Ｈａｅｎｓｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３），  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ４：８５−９３）；葉酸コンジュゲート（ｋａｍｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３：１３６０１−１３６０９）；抗体コンジュゲート（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２），  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ３：３２３−３２７）；トランスフェリンコンジュゲート（Ｗａｇｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：３４１０−３４１４）；およびジスルフィド結合を介してアンチセンスオリゴ−ｄＮｓに結合している６−ホスホマンノシル化(phosphomannosylated)タンパク質（Ｂｏｎｆｉｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：４６２１−４６２９）が挙げられる。近年、ヒト血清アルブミンにコンジュゲートしてからポリ−Ｌ−リジンに結合する、３本鎖Ｎ−アセチルガラクトサミン  ネオグリコペプチドである、ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ（１９８７），  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．，  ４：３１７−３２８）がＤＮＡをＨｅｐ  Ｇ２細胞へ送達することが示された（Ｍｅｒｗｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４），  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ５：６１２−６２０）。
【０００９】
多数の生成物がオリゴ−ｄＮｓの送達のために記載されており、それらはコンジュゲートの不均一な混合物である。例えば、Ｂｏｎｆｉｌｓらは６−ホスホマンノシル化タンパク質とオリゴヌクレオシドとのコンジュゲート形成を記載している。このコンジュゲート形成は、タンパク質の修飾およびジスルフィド連結の形成が化学部分的に調整されておらず、また部分特異的でもないため、構造的に異なる分子の不均一な混合物を生成する（Ｂｏｎｆｉｌｓ，  前述）。
【００１０】
いくつかの研究がオリゴデオキシヌクレオチドまたはＤＮＡの細胞内送達を記載しており、その中には生分解性のホスホジエステルヌクレオチド間結合が含まれる。ホスホジエステルはもともと加水分解しやすいため、生分解性ヌクレオチド間結合を含むペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）構築物は、細胞内において比較的短い半減期を有し、結果的に効果も減少する（Ｗｉｃｋｓｔｏｒｍ  （１９８６），  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈ．  １３：９７−１０２）。例えば、すべてのホスホジエステル１６−ｍｅｒは細胞内では２、３分で広く分解される（Ｓｈａｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９：７４７−７５０）。オリゴ−ｄＮおよびＤＮＡが有するこの不利な点はアンチセンスコミュニティの中ではよく知られている。
【００１１】
ＭｅｒｗｉｎらはネオグリコペプチドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３を用いたコンジュゲートの合成を記載している。その送達システムは不均一でポリ−Ｌ−リジンを含んでおり、それはＤＮＡを静電気的にコンジュゲートへ結合させる働きをする。この送達方法の不利な点は、その構造的不均一性、ポリカチオン性帯電による潜在的な毒性、および、最適の送達のためにはオリゴ−ｄＮまたはＤＮＡに対する陽イオン輸送体の割合を実験によって決定する必要があるため形成が困難であるということである。
【００１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらのアナログを治療剤として使用するのは、特異的な送達が欠けており、細胞取り込みが限定され低細胞内濃度に至ってしまうことにより困難とされてきた（Ｌｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８６：３４７４−３４７８；  Ｌｅｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５），  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．  ＆  Ｄｅｖ．，  ５：２５１−２５９）。これらの分子の細胞取り込みは、それらの送達を様々な構造的に不均一な複合体を用いたエンドサイトーシスを介した受容体とつなげることによって高められてきた（Ｐｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２），  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ３：５３３−５３９；  Ｋａｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３：１３６０２−１３６０９；  Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８７：３４１０−３４１４）。これら複合体の多くは、肝アシアログリコプロテイン受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）を介してより大きな割合で小分子を、特異的にインビトロの肝細胞へ送達することが示されてきた（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ．，  （１９９７），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：４４２９−４４３２；  Ｆｉｎｄｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４），  Ｍｔｄｓ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２４７：３４１−３５１）。これらの複合体としては、３本鎖、Ｎ−アセチルガラクトサミン  ネオグリコペプチド、ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３で製剤化されるものが挙げられ、それらは哺乳類のＡＳＧＰ−Ｒに高い親和性を示す（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  （１９８７），  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．，  Ｊ．，  ４：３１７−３２８；  Ｍｅｒｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４），  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ５：６１２−６２０）。我々は、このネオグリコペプチドへの構造的に定義されたヘテロ二官能性（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）リンカーを介した、メチルホスホネートオリゴマー（ＯＭＮＰ）の共有コンジュゲートが、インビトロでの肝臓癌細胞による促進された特異的な細胞取り込み（Ｈａｎｇｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５），  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．，  ６：６９５−７０１）、およびインビボでのマウスの肝臓への特異的な送達（Ｈａｎｇｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７），  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，  ７：１４１−１４９）をもたらすということをこれまでに示してきた。
【００１３】
アンチセンスとして適用されるたくさんのオリゴ−ｄＮアナログの中でも、非イオン性オリゴヌクレオシド  メチルホスホネート（オリゴ−ＭＰ）が精力的に研究されてきた（Ｔｓ’ｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２），  Ａｎｎ．  ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ６００：１５９−１７７）。オリゴ−ＭＰはヌクレアーゼ分解に対し完全な耐性があり（Ｍｉｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８１），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０：１８７４−１８８０）、単純ヘルペスウイルス１型（Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３：２７８７−２７９１）、水疱性口内炎ウイルス（Ａｇｒｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６），  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２５：６２６８−６２７５）、およびヒト免疫不全ウイルス（Ｓａｒｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：７４４８−７４５１）対して例証的にインビトロ活性を有する有効なアンチセンス剤であり、ｒａｓ  ｐ２１の発現を阻害することができる（Ｂｒｏｗｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９），  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，  ４：２４３−２５２）。しかしながら、オリゴ−ＭＰがアンチセンス活性を示すためには、それらは１００μＭまでの濃度で細胞外媒質に存在していなければならない（Ｂｒｏｗｎ，  前述；  Ｓａｒｉｎ，  前述；  Ｔｓ’ｏ，  前述；  Ａｇｒｉｓ，  前述）。治療目的のためにこれらの濃度を得て保持するには、費用がかかること、オリゴ−ＭＰの非特異的な結合に負うところの潜在的副作用、および免疫原性などのたくさんの問題がある。標的細胞タイプの膜を通るオリゴ−ＭＰの輸送を促進し、それによりオリゴ−ＭＰの局所的な高濃度を得ることによって、および標的細胞タイプへのみ特異的に送達し、それにより他の組織への有毒な副作用を避けることによって、これらの問題は回避できる。どちらの方法も、アンチセンス効果を生むのに必要なオリゴ−ＭＰ濃度を大きく下げ、組織特異性により有毒副作用を避けるのに役立つ。
【００１４】
本発明は、均一で非生分解性であるＡ−Ｌ−Ｐ構築物を送達することによって、このような欠陥を打開した。このことは、促進された有効なおよび／または非毒性な効果のため、細胞内で標的細胞に強力な療法を送達するのに役立つ。
【００１５】
発明のまとめ
本発明の１つの目的は、オリゴマーまたは「ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）」を、受容体介在性、リガンド指向性の経路を介して細胞内で肝細胞へ導くように、肝リガンドを含む均一なＡ−Ｌ−Ｐ構築物を考案し、合成することである。
【００１６】
本発明のもう１つの目的は、肝病原体へと導かれる安定したペイロードまたはオリゴマーを、Ａ−Ｌ−Ｐ構築物を介して肝細胞へ送達することである。肝病原体はウイルス、寄生虫、または癌でありうる。
【００１７】
本発明のもう１つの目的は、構造的に定義され、化学的に均一の送達アセンブリーを提供することである。その送達アセンブリーはリガンド−リンカー−プロドラッグ構築物から成り、その構築物はリガンド指向性で受容体介在性のエンドサイトーシス経路を介し、肝細胞へ導かれる。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、均一な構築物を細胞内の分子標的に提供することである。これには、生物学的に非分解性な「Ｐ」、または加水分解酵素耐性プロドラッグ（該プロドラッグはオリゴｄＮおよび／またはオリゴｄＮアナログを含む）を含むＡ−Ｌ−Ｐ構築物の送達が包含され、そのことにより肝細胞膜を効率的に通り、細胞質へのアクセスを得ることができる。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、例えばＤＮＡのメチルホスホネート、ホスホジエステル、およびホスホロチオエート結合、並びにＲＮＡのメチルホスホネート２’−Ｏ−メチルリボース、ホスホジエステル−２’−Ｏ−メチルリボースおよびホスホロチオエート−２’−Ｏ−メチルリボース部分を含むペイロードのような、ペイロードのＤＮＡおよびＲＮＡタイプの組み合わせを送達することである。
【００２０】
本発明のもう１つの目的は、標的細胞へのペイロードの細胞内送達に関しており、それには細胞標的への侵入における生分解性の程度が異なる、ヌクレオチド間結合の組み合わせが含まれうる。そのような結合としては、ＤＮＡについては、メチルホスホネート／ホスホジエステル（ｍｐ／ｐｏ）結合、ホスホジエステル／ホスホロチオエート（ｐｏ／ｐｓ）結合、およびメチルホスホネート／ホスホロチオエート（ｍｐ／ｐｓ）結合が、並びにＲＮＡについては、メチルホスホネート／ホスホジエステル−２’−Ｏ−メチルリボース（ｍｐ／ｐｏ−ＯＭｅ）、ホスホジエステル／ホスホロチオエート−２’−Ｏ−メチルリボース（ｐｏ／ｐｓ−ＯＭｅ）、メチルホスホネート／ホスホロチオエート−２’−Ｏ−メチルリボース（ｍｐ／ｐｓ−ＯＭｅ）が挙げられる。本発明の好ましい目的は、酵素的に耐性のあるホスホロチオエート  ヌクレオチド間結合を含む、オリゴデオキシヌクレオシド  ホスホロチオロエート(phosphothioroate)コンジュゲートを肝細胞へ送達することである。本発明のもう１つの好ましい目的は、非生分解性メチルホスホネート  ヌクレオチド間結合を含む、オリゴデオキシヌクレオシド  メチルホスホネートコンジュゲートを肝細胞へ送達することである。非イオン性オリゴデオキシヌクレオシドおよびオリゴヌクレオシドアナログのような生物学的に安定したオリゴマーを、肝ウイルスおよび／または癌を含んでいる肝細胞へ細胞内で送達することは、肝病原体を治療する方法である。特に、本発明のさらなる目的は、あらゆる２’−Ｏ−メチルリボースヌクレオシドとメチルホスホネートおよびホスホジエステルを繰り返すヌクレオチド間結合とを含む、あるいは他の任意の生物学的安定なオリゴマーを含むオリゴデオキシヌクレオチドキメラである合成コンジュゲートの送達を提供することである。このような生物学的安定なオリゴマーとしては、オリゴデオキシヌクレオチドアナログが挙げられるが、それに限定されるわけではない。アナログとしては以下のものがある：あらゆる２’−デオキシリボースヌクレオシドおよびホスホロチオエートとメチルホスホネートを繰り返すヌクレオチド間結合、あらゆる２’−デオキシリボースヌクレオシドおよびホスホロチオエートヌクレオチド間結合、あらゆる２’−Ｏ−メチルリボースおよびホスホロチオエートヌクレオチド間結合。
【００２１】
本発明のもう１つの目的は、Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを合成する方法に関している。コンジュゲートを合成する１つの詳しい方法は、Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを合成するための３成分コンジュゲーション方法１を包含する。その方法とは
（ａ）２’−Ｏ−Ｍｅ−ヌクレオチドホスホジエステル結合をオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの５’末端に取り込み、
（ｂ）オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの５’末端をＰＮＫおよびＡＴＰを用いて酵素的にリン酸化し、
（ｃ）オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの５’−ホスフェート基を、５’−ジスルフィド修飾されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログを形成すべくジスルフィド結合を取り込むように修飾し、
（ｄ）５’−ジスルフィド修飾されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの５’−ジスルフィド基をチオール修飾されたオリゴヌクレオチドを形成すべくチオール基に還元し、
（ｅ）ヘテロ二官能性リンカーの１つの反応基をリガンドで共有結合し、ヘテロ二官能性リンカーの２つ目の基が該チオール修飾されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログに共有で結合してＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを形成するというものである。
【００２２】
もう１つの方法は、Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを合成するためのコンジュゲーション方法２を包含する。その方法とは
（ａ）リガンドを二官能性リンカーで修飾してＡ−Ｌ構築物を形成し、
（ｂ）該Ａ−Ｌ構築物が９５％を超える均一性にまで精製し、未反応のリンカーを除去し、
（ｃ）オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログを修飾してチオール修飾されたオリゴマーを形成し、
（ｄ）該チオール修飾されたオリゴマーを脱気条件下で精製し、
（ｅ）２成分コンジュゲーション反応において、精製されたＡ−Ｌ構築物および精製されたチオール−オリゴマーを用いるコンジュゲーション反応を脱気条件下で実施し、未反応の試薬およびその他の低分子量のチオール含有不純物を除去する（その中で、精製Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを形成するためには、該コンジュゲーションは過剰量の該リガンドスキャフォールドまたは該チオール修飾されたオリゴマーのいずれかを用いて実施されうる）、
（ｆ）Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを、例えば、クロマトグラフィーまたは電気泳動で精製するというものである。
【００２３】
もう１つの方法はオリゴヌクレオチド含有コンジュゲートを放射標識することに関しており、それにはＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを放射標識することが包含される。つまり、
（ａ）固相合成の際にトリヌクレオチドトレーサーユニット５’−Ｔ−３’−ｐｓ−３’−Ｔ−ｐｓ−Ｔ−５’をオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログの３’末端に付加し、
（ｂ）該トレーサーユニットをＰＮＫおよびＡＴＰを用いて、酵素的にリン酸化して修飾されたトレーサーユニットを形成し、
（ｃ）該修飾トレーサーユニットをＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの放射性ホスフェート基のアミンで化学的に修飾し、細胞の酵素的分解を防ぐというものである。
【００２４】
もう１つの方法はオリゴヌクレオチド含有コンジュゲートの合成に関するものである。つまり
（ａ）固相合成の際にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログ上にジスルフィド部分で終結する二官能性のリンカーを組み込み、ジスルフィド修飾されたオリゴマーを形成し、
（ｂ）該ジスルフィド修飾されたオリゴマーを精製し、
（ｃ）該ジスルフィド修飾されたオリゴマーのジスルフィド部分をチオール基に還元して、チオール修飾されたオリゴマーを形成し、
（ｄ）脱気条件下で、サイズ排除クロマトグラフィーを用いてチオール修飾されたオリゴマーを精製し、
（ｅ）精製されたＡ−Ｌおよび精製されたチオール−オリゴマーを用いるコンジュゲーション反応を、脱気条件下で実施してＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを形成し、
（ｆ）合成されたＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを、例えば、クロマトグラフィーで精製するというものである。
【００２５】
もう１つの方法は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアナログを含むＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの放射標識を含有する、放射標識されたコンジュゲートの合成に関しており、つまり
（ａ）５’末端にジスルフィドリンカーを組み込み、固相合成の間にトリヌクレオチドトレーサーユニット５’−Ｔ−３’−ｐｓ−３’−Ｔ−ｐｓ−Ｔ−５’をオリゴヌクレオチドアナログの３’末端に組み込み、
（ｂ）ジスルフィドおよびトレーサーを含有するオリゴマーを精製し、
（ｃ）ジスルフィドをチオール基へと還元してチオール修飾されたオリゴマーを形成し、
（ｄ）該チオール修飾されたオリゴマーを、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて脱気条件下で精製し、
（ｅ）脱気条件下で、精製したＡ−Ｌを精製したチオール−オリゴマーにコンジュゲートしてＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを形成し、
（ｆ）ＰＮＫおよび放射標識されたＡＴＰを用いて、該トレーサーユニットを酵素的にリン酸化してＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートに放射標識されたホスフェートを取り込み、
（ｇ）ＡＴＰコンジュゲートの放射性ホスフェート基をアミンで化学的に修飾し、細胞の酵素的分解から保護するというものである。
【００２６】
略語
便宜上、以下の略語を用いた。ＡＥＴ：２−アミノメルカプトエタノール（アミノエタンチオール）、ＡＴＰ：アデノシン３リン酸、ＢＡＰ：細菌性アリカリホスファターゼ、ＣＰＧ：調節された(controlled)孔ガラス支持材、ＤＩＰＥＡ：ジイスプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、Ｄ−ＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、Ｄ−ＰＢＳ：ダルベッコのリン酸緩衝食塩水、ＤＤＴ：ジチオスレイトール、ＥＤＡＣ：１−エチル−３−［３（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド、ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラアセテート、ＦＣＳ：胎児ウシ血清、ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン、ＭＥＭ：Ｅａｒｌｅの塩を加えた最小必須培地、ＳＭＣＣ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル  ４（Ｎ−メチルマレイミド）シクロヘキシル−１カルボキシレート、Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミン、ＰＮＫ：フェニルヌクレオチドキナーゼ。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、リガンド−リンカー−プロドラッグ構築物、すなわち「Ａ−Ｌ−Ｐ」構築物として表される、均一な分子構築物の設計および合成に関するものである。ここで「Ａ」は細胞受容体に特異的に結合するリガンドを表し、「Ｐ」は「ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）」を表し、「Ｌ」はリガンドとプロドラッグをその結合を介して結びつける分子橋として定義されており、また「Ａ」と「Ｐ」はリンカーに共有的に結合しており、さらにＡ−Ｌ−Ｐ構築物は「ペイロード」を肝細胞のような特異的な細胞標的へ、受容体介在性でリガンド指向性のエンドサイトーシス経路を介して送達する。
【００２８】
好ましい実施形態において、Ａ−Ｌ−Ｐ構築物は送達システムとして働き、そこには式Ａ−Ｌ−Ｐの均一なコンジュゲートが含まれる。ここで、「Ａ」は肝受容体に特異的に結合し、それによって該受容体を有する細胞への該コンジュゲートの導入を容易にするリガンドであり、「Ｌ」は位置特異的な様式でＡと化学的に結合しＡ−Ｌを形成する二官能性のリンカーを表し、Ａ−Ｌは位置特異的な様式でＰと化学的に結合しＡ−Ｌ−Ｐを形成し、「Ｐ」はオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体のような生物学的に安定なオリゴマーを表している。さらに、Ｐは加水分解あるいは特異的な生化学的な結合の還元によって該コンジュゲートから放出され、且つコンジュゲートから放出される際の酵素的な加水分解あるいは生分解に抵抗性のヌクレオチド間結合を含んでいる。
【００２９】
リガントとリンカーおよびリンカーとプロドラッグ間の結合は共有結合であり、架橋結合試薬を介して形成される。それによりリガンドおよびプロドラッグとの共有結合が形成される。リガンドおよびプロドラッグに存在する様々な機能基と反応することが可能な、幅広く様々な架橋結合試薬が使用可能であり、そのため、多くの化学的に異なった結合が構築されうる。例えば、リガンドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（図１，１）はそのアミノ末端に遊離アミノ基を含んでいる。これは位置特異的にヘテロ二官能性架橋結合試薬（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）、ＳＭＣＣ（表４；エントリー３）と反応し、アミド結合を形成する。プロドラッグは、遊離スルヒドリル（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ）基（表２、例えばエントリー９〜１４参照）を含むよう化学的に修飾された場合、ＳＭＣＣと化学的に結びついてチオエーテル結合を形成するであろう。この例では、リガンドとプロドラッグ間に形成された結合は、アミド／チオエーテルとしてまとめることができる。リガンド、架橋結合試薬およびプロドラッグをすべての可能な組み合わせ（図１、および表１〜４に例示）で組み合わせることによって、何百という構造が製剤されうることは明らかである。よってその他の結合としては、アミド／アミド、チオエーテル／アミド、ジスルフィド／アミド、アミド／チオエーテル、アミド／ジスルフィドが挙げられるが、これに限定されない。結合はさらに、生物学的に安定なもの（チオエーテル、アミン）、やや生物学的に安定なもの（アミド）、および生物学的に不安定なもの（ジスルフィド）に分類できる。したがって、細胞外および細胞内媒質において直面する様々な化学環境で機能するように、送達システムを構造的に修飾することが可能である。この送達システムのためのリガンドとしては図１に表されるものが挙げられるが、これに限定されない。本明細書で用いられる用語「付加基（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」はこれらの、およびその他の適したリガンドのことをいう。リガンドは、たくさんの糖残基でグリコシル化された、合成的な、化学的に定義された、構造的に均一なオリゴペプチドスキャフォールドから成っている。糖残基としてはグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノースおよびフコースが挙げられるが、それらに限定されない。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「ネオグリコペプチド（ｎｅｏｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ）」は、これらのおよび類似の構造をいう。加えて、これらのオリゴペプチドは、葉酸と多価リガンドを構築する構造を提供する。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「プロドラッグ」とは、特異的な化学結合の加水分解または生体還元によって、コンジュゲートから放出されて活性になる、またはコンジュゲートの一部として含まれていたときよりも活性になる、化合物のことを意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「化学的に均一（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｕｎｉｆｏｒｍ）」とは、送達アセンブリーの少なくとも９５％が、最も好ましくは９９％が、その組成においても接合性においても１種類からできていることを意味する。化学的均一性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、逆相高圧液体クロマトグラフィー、核磁気共鳴、質量分析および化学分析によって測定される。「化学的に定義され、構造的に均一な」というフレーズは「化学的に均一な」と互換可能である。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「効果的に（ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ）」とは、例えば、コンジュゲートが細胞外媒質に存在しており２４時間３７℃で培養された場合、細胞内濃度が細胞外濃度の少なくとも約３倍に、好ましくは約１０倍になることを意味する。
【００３４】
本発明において、用語「オリゴマー」は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドアナログ、またはオリゴヌクレオシドを含んで使用されており、或いは「ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）」としても知られている。また細胞への侵入の際には、これはプロドラッグから薬剤への転換も含みうる。用語「オリゴヌクレオチドアナログ」は、少なくとも１つの非自然発生部分を有する部分であって、自然発生のオリゴヌクレオチドと同等かそれ以上の機能を果たすものを意味する。オリゴヌクレオチドアナログは、変更した糖部分または変更した糖間結合を有していてもよい。少なくとも１つの、変更した糖間結合のような、非ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドアナログは、あるいは「オリゴヌクレオシド」としてみなされうる。これらのオリゴヌクレオシドは、自然発生したホスホジエステル結合基以外の結合基によって繋げられた複数個のヌクレオシドのことである。オリゴヌクレオチドアナログは、少なくとも１つの「非ホスホジエステルヌクレオチド間結合」、例えば５’ヌクレオチドホスフェートがいくつもの化学基で置き換えられている、１つのヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’末端間のホスホジエステル以外の結合、を含むアナログを包含する。好ましくは、Ａ−Ｌ−Ｐ構築物のオリゴマーは肝病原体に指向するが、そのような病原体は、ウイルス、寄生虫、および癌といったような、任意の病気の原因となる微生物または経過を包含する。さらに好ましくは、ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）およびＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）のような肝炎ウイルスを包含する。特に、本発明の目的は、ウイルス表面抗原、核抗原、転写解読枠、およびエンキャプシデーション配列を直接標的とした配列である。例えば、Ｂ型肝炎ウイルスはＢ型肝炎表面抗原であるＳ−遺伝子、核抗原であるＣ−遺伝子、ｐｒｅＳ１転写解読枠およびウイルスエンキャプシデーション信号／配列を包含する。さらに、寄生虫はマラリア原虫を包含しうる。
【００３５】
メチルホスホネート（ｍｐ）（全て非イオン性）、交互性のメチルホスホネート／ホスホジエステル（ｍｐ／ｐｏ）（半電荷）、およびホスホロチオエート（ｐｓ）（全電荷）のような異なった結合−バックボーンは、カッコ内に示したように異なった電荷を含む異なった性質を有する。その他のヌクレアーゼ耐性バックボーンを有するその他のオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅｓ）（ｐｓ）、および交互性のホスホジエステル／メチルホスホネート（ｐｏ／ｍｐ）結合を有する２’Ｏメチルリボース部分を含むオリゴマーが挙げられる。好ましい合成的な結合としては、アルキルホスホナート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅｓ）、リン酸エステル、カルバミン酸塩、カルボナート、リン酸トリエステル、アセタミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）およびカルボキシメチルエステルが挙げられる。これらの結合のいずれもまた、例えばアミノアルキルホスフェートのような様々な化学基で置換されうる。本発明の１つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート結合を介して結合している。このような結合の生成には、既知の方法（Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  Ｖｏｌ．２０（Ａｇｒａｗａｌ編），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；  Ｕｈｌｍａｎｎ、前述）を用いる。
【００３６】
オリゴヌクレオチドはいくつかのヌクレオチド残基のポリマーを意味する。とりわけ、本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、当分野で通常使われている意味であり、例えば５０ヌクレオチドまでの直鎖的配列（「５０ｍｅｒ」）、またはより好ましくは１５〜３０ヌクレオチドの配列、およびもっとも好ましくは約２０ヌクレオチド（「２０ｍｅｒ」）である。本発明で用いるオリゴヌクレオチドは常にではないが、しばしば、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、特有の細胞または標的細胞内の外来性ＤＮＡ若しくはＲＮＡに対し相補的な配列を有しているオリゴヌクレオチドである。このような分子としてはまたリボザイムが挙げられる。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を意味し、その活性にはｍＲＮＡ、ＲＮＡ含有基質およびリボザイムのようなハイブリッド化されたＲＮＡ分子における、特異的なホスホジエステル結合で切り離す能力が含まれるが、それに限定はされない。一般的に、「Ｐ」がアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、好ましい分子量は約５，０００〜１０，０００ダルトンで、最も好ましい分子量は約５，０００〜７，５００ダルトンである。アンチセンスＲＮＡとは相補的にｍＲＮＡ分子と結合して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する二本鎖領域を形成するＲＮＡ分子を意味している。概して、この特有のシナリオにおいて、本発明のリンカーの分子量は「Ｐ」アンチセンスの分子量以下である。
【００３７】
好ましくは、本発明のオリゴマーは非生分解性で、より具体的には、任意のヌクレアーゼ耐性バックボーン（完全にまたは部分的に耐性なものを含む）である結合を含む。これらのオリゴマーの例としては、メチルホスホノジエステル／ホスホジエステル  キメラ  アンチセンス  オリゴデオキシヌクレオチド、糖修飾されたオリゴヌクレオチドまたは炭水化物修飾されたオリゴヌクレオチド（Ｐｅｒｂｏｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９），  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  １６５：７４２−７４７）、およびアンチセンスホスフェート−メチル化オリゴデオキシヌクレオチド（Ｍｏｏｄｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７：４７６９−４７８２）のような、内部ホスホジエステルと端末メチルホスホノジエステル結合とを包含するキメラ  オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「遺伝子特異的（ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」とは、コンジュゲートによって標的とされている組織または細胞タイプにおいて見られる遺伝子の一部またはｍＲＮＡ分子の一部に対して相補的である配列を有する、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド或いはそれらのアナログを意味する。遺伝子特異的なプロドラッグと標的ｍＲＮＡ間の配列特異的二重鎖の形成は、そのｍＲＮＡの発現の抑制を導くであろう。この送達システムのためのリガンドとしては図１に示されたものが挙げられるが、これに限定されない。したがって、適した付加基およびオリゴヌクレオチド配列によりコンジュゲートが設計され、これは肝炎、特にＢ型肝炎および肝臓癌のような肝臓の疾患および障害を治療する効果的な医薬的化合物になるであろう。加えて、ここで用いられる用語「遺伝子特異的」とは、プロドラッグが、コンジュゲートによって標的とされている組織または細胞タイプにおいて見られる遺伝子の一部またはｍＲＮＡ分子の一部に対して相補的である配列を有する、オリゴヌクレオシド或いはオリゴヌクレオチド（とりわけオリゴデオキシヌクレオシドメチルホスホネートまたはそのアナログ）であることを意味する。遺伝子特異的なプロドラッグと標的ｍＲＮＡ間の配列特異的二重鎖の形成は、そのｍＲＮＡの発現の抑制を導くであろう。
【００３９】
この促進された、細胞特異的な送達の生物学的な効果を評価するため、一連のインビトロ実験において、インテグレートされたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ゲノムを肝特異的なネオグリココンジュゲートによってターゲティングした。ＨＢＶは、急性および慢性肝炎の両方、並びに肝細胞癌腫の主な原因で、小さなエンベロープされたヘパダウイルス（ｈｅｐａｄａｖｉｒｕｓ）（Ｔｉｏｌｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５），  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１７：４８９−４９５）である。このウイルスは圧倒的な範囲で広まっていて、世界中で２億人以上ものヒトが感染している。ＨＢＶ複製の分子生物学はよく特徴付けられており、アシアログリコプロテイン受容体を有し、安定にＨＢＶ（Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５）でトランスフェクトされた肝臓癌細胞のインビトロのモデルシステムが確立されている（Ｓｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．，  Ｓｃｉ．，  ８４：１００５−１００９）；  Ｋｏｒｂａ  ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，  （１９９２），  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，  １９：５５−７０）。規定の培養条件下で、これらの細胞は細胞培養培地にデーン粒子を分泌する。これらの粒子はＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡＧ）およびウイルスＤＮＡ核（ビリオンＤＮＡ）を発現するタンパク質コートから成ることが示されており、両方とも容易にインビトロで評価しうる。これらのＨＢＶ成分に対応するｍＲＮＡは、ホスホロチオエート  アンチセンス  オリゴマー（ｐｓ−オリゴマー）によって修飾を受けやすいことが証明されている（Ｋｏｒｂａ  ａｎｄ  Ｇｅｒｉｎ，  （１９９５），  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，  ２８：２２５−２４２）；  Ｇｏｏｄａｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７１：３０２１−３０２５）；Ｏｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；（１９９５），  Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３８：１１３−１１９）。近年、トランスフェクトされた肝細胞においてＨＢＶ複製の阻害が促進されることが、アシアログリコプロテイン受容体に特異的なＤＮＡ運搬システムに非共有的にコンジュゲートしたｐｓ−オリゴマーによってインビトロで立証されてきた（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  （１９９２），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６７：１２４３６−１２４３９；  Ｍａｄｏｎ  ａｎｄ  Ｂｌｕｍ，  （１９９６），  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２４：４７４−４８１；  Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６），  Ａｃｔａ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａ，  ４０：３５−３９）。
【００４０】
インテグレートされたＨＢＶに指向するアンチセンスオリゴマーの細胞取り込みおよび生物学的有効性は、構造的に定義された均一なリンカーシステムを介して肝臓特異的なネオグリココンジュゲートへ取り込まれることによって著しく上昇する。この場合、ネオグリココンジュゲートは、肝臓特異的リガンドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮａｃ）３と、安定したチオエーテル橋によって共に共有的に結合して定義された均一な構造をつくる所望のアンチセンスオリゴヌクレオチドとから構成されているコンジュゲートとして定義される。アンチセンスＲＮＡとは、相補的にｍＲＮＡ分子と結合して、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する二本鎖領域を形成するＲＮＡ分子を意味している。リンカー修飾されたリガンドのプロドラッグへのコンジュゲーションによって、均一で構造的に定義されたコンジュゲートが生成される。具体的には、ＳＭＣＣ修飾ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３のようなリンカー−リガンドエンティティは、オリゴヌクレオチドと共有的に結合して均一で構造的に定義されたネオグリココンジュゲートを生成する。とりわけ、炭水化物ベースの肝臓リガンドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３はヘテロ二官能性リンカーを介してオリゴヌクレオシド  メチルホスホネート（ＯＮＭＰ）に共有的に付加された。このようなリガンド−リンカー−プロドラッグ構築物はオリゴヌクレオシドをマウスの肝臓へ導いた。
【００４１】
様々な標的箇所へ導かれるＨＢＶ特異的なオリゴヌクレオチドのいくつかの例を表Ａに記述する（Ｇｏｏｄａｒｚｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０），  Ｊ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７１：３０２１−３０２５）；  Ｇａｌｉｂｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７９），  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８１：６４６−６５０）。例えば、コア遺伝子は核タンパク質をエンコードしており、ＨＢＶのＤＮＡ複製に必要で、プレゲノム（ｐｒｅｇｅｎｏｍｅ）ＲＮＡのパッケージングを担っている。コア遺伝子の標的は、ポリアデニル化部分と重なる翻訳開始部分である。表面抗原遺伝子はウイルス体膜の主要な構造タンパク質をエンコードし、肝臓損傷の発生において重要な役割を果たす。表面抗原遺伝子の標的は翻訳開始部分である。エンキャプシデーション遺伝子はエンキャプシデーションタンパク質をエンコードし、ＤＮＡのパッケージングおよびＨＢＶのＤＮＡ合成の開始を担っている。エンキャプシデーション遺伝子はすべてのＨＢＶ株で高度に保存されている。それらの標的は上部ステムループ／対になっていないループである。その他のウイルス特異的なオリゴヌクレオチドは、ウイルス部分に特異的な標的、および癌関連標的を含む遺伝子特異的な標的（例えば、ｒａｆ、ｒａｓ、およびプロテインキナーゼ）を標的とするために合成されてもよい。
【００４２】
表Ａ肝炎ウイルス
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
標的部分          配列（５’ｔｏ  ３’）
ＨＢｘ遺伝子      ＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＴＡＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＡ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：ｌ）
ＨＢＶ表面抗原（Ｓ遺伝子）
Ｃａｐ  サイト／ＳＰＩＩ        ＧＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡ  （ＳＥＱ．  Ｄ  ＮＯ．：２）  
インサイド／ｐｒｅ−Ｓ２．      ＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＣＧＡＧＡ  （ＳＥＱ．  Ｄ  ＮＯ．：３）  
イニシエーター／Ｓ遺伝子        ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：４）  
イニシエーター／Ｓ遺伝子        ＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：５）  
インサイド  Ｉ／Ｓ遺伝子        ＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＡＡＴ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  Ｎ０．：６）  
インサイド  ＩＩ／Ｓ遺伝子      ＡＡＣＡＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡ  （ＳＥＱ．ＩＤ  ＮＯ．：７）  
ＰｒｅＳ  １転写解読枠
ＨＢＶ  核抗原（Ｃ遺伝子）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
配列（５’ｔｏ  ３’）
ＴＦＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：８）  
ＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＣ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：９）  
ＣＡＴＧＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＡＣＧＡＧＡ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１０）  
ＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡＣＡＣＴ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１１）  
ＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡＣ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１２）  
ＧＣＣＴＴＴＣＧＣＧＡＣＣＣＡＡＣ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１３）  
ＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１４）  
ＧＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１５）  
ＣＴＧＣＴＣＡＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１６）  
Ｄ型肝炎ウイルス  （ＨＤＶ）  
配列（５’  ｔｏ  ３’）
ＧＣＧＧＣＡＧＴＣＣＴＣＡＧＴ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１７）  
ＣＴＣＧＧＣＴＡＧＡＧＧＣＧＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１８）  
ＣＴＣＧＧＡＣＣＧＧＣＴＣＡＴ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：１９）  
ＴＣＴＴＣＣＧＡＧＧＴＣＣＧＧ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：２０）  
ＡＴＡＴＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＴＣＣ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：２１）  
ＴＧＡＧＴＧＧＡＡＡＣＣＣＧＣ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：２２）  
ＡＴＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＴＴ  （ＳＥＱ．  ＩＤ  ＮＯ．：２３）
【００４３】
本発明の方法および当分野で既知のその他の方法を用いて、当業者はこれらのおよびその他の配列を標的とする本発明のコンジュゲートを合成することができるであろう。
【００４４】
本発明の化合物、組成物および方法は、腫瘍性および伝染性の疾患の治療に有用であろう。また、それには細胞表面レクチンおよび詳細にはそれらのリガンド結合部分へ導かれる様々な炭水化物含有リガンドのようなものを含む。特に、任意の糖または糖修飾部分を用いてもよい。「生理学的に許容できる担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤、並びにリガンド−リンカー−プロドラッグ（例えばオリゴマー）構築物を含む剤が挙げられる。
【００４５】
本発明のプロドラッグの治療上有効な投与量が、眼内、経口摂取、吸入、あるいは筋肉内、静脈内、皮膚、または皮下注射によって投与され得る。さらに発熱物質なしの非経口的に許容できる水溶液中において投与されてもよい。治療上有効な量とは、Ａ−Ｌ−Ｐ構築物の医薬組成物の個々の活性成分の合計量、または有意義な患者のメリット、例えばウイルスの減少および除去或いは腫瘍量（ｔｕｍｏｒ  ｌｏａｄ）の減少または除去、を示すのに十分な方法を意味する。プロドラッグを標的へ送達するような活性成分を個体に適用する場合、この用語はその成分のみのことをさす。組み合せで適用される場合、この用語は、組み合わせにて連続して投与されようが、同時に投与されようが、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせた量をさす。治療効果に必要とされる減少量は、分子および細胞標的、疾患、並びに患者の健康状態によって依存するであろう。例えば、ＨＢＶにおいて、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは５０％、もっとも好ましくは少なくとも７０％の減少が達成されるであろう。治療上有効な量の本発明を経口で投与する場合、コンジュゲートは錠剤、カプセル、粉末、溶液、またはエリキシルの形態であろう。溶液中の医薬組成物は、生理食塩水、デキストロース、或いはその他の糖液またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールまたは任意のその他の医薬的に許容できる担体を含んでいてもよい。医薬組成物における投与されるコンジュゲートの量は、治療を受ける状態の質や重篤性によるであろう。最終的には、医者が個々の患者を治療するため、年齢、体重、身体全体の健康、食生活、性別、投与される組成物、投与経路、および治療を受ける疾患の重篤性を考慮して、本発明のコンジュゲート投与量と総量を決めるであろう。本発明のＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを含む医薬組成物は、ヒトおよび家畜動物（例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジおよびヤギ）、鳥類および魚類を含む動物に投与されうるが、それに限定はされない。
【実施例】
【００４６】
Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの合成
本発明は２つの一般的なコンジュゲーション方法、コンジュゲーション方法１およびコンジュゲーション方法２を開示しており、それらはオリゴヌクレオチドアナログとネオグリコペプチドを共有的に連結させて、構造的に定義された均一なコンジュゲートをつくるために用いられうる。コンジュゲーション方法１は、そのコンジュゲーション工程において３つの化学種、つまりリガンド、官能化されたオリゴヌクレオチドアナログ、およびそれら２つを連結させるヘテロ二官能性のリンカーを使用する３成分反応である。コンジュゲーション方法２は、定量的コンジュゲーション方法としてもまた言及される２成分反応であり、そのコンジュゲーション工程において２つの反応物、つまり活性化されたリガンドおよび官能化されたオリゴヌクレオチドアナログしか使用しない。またオリゴヌクレオチドアナログおよびそれらのＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを放射標識するための新規の方法を開示し、それには従来の酵素標識方法では前もって標識できなかったそれらのアナログも含まれる。これらの発明によって、実質的にすべてのタイプのオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログのネオグリコペプチドコンジュゲートが合成および放射標識できるようになった。この２つのコンジュゲーション方法およびそれらに関連した放射標識方法の概要を以下に示し、次いでこれらの方法を様々なＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの合成において用いるための詳細な手順を例示する実施例を示す。
【００４７】
コンジュゲーション方法１
この方法は、ヘテロ二官能性架橋試薬を用いる、官能化されたオリゴヌクレオチドアナログおよびネオグリコペプチドのカップリングを必要とし、３成分反応として分類される。オリゴヌクレオチドアナログは固相合成装置で合成される。オリゴマーの５’末端は固相合成後に酵素的にリン酸化され、ヘテロ二官能基架橋試薬に反応する官能基のさらなる取り込みを可能にする。メチルホスホネートオリゴマーのような、５’末端で酵素的にリン酸化できないオリゴヌクレオチドアナログには、追加のヌクレオチドユニット、２’−Ｏ−メチル−ヌクレオチドが、オリゴマーの固相合成の際ににホスホジエステル結合を介して５’末端に付加される。例えば、メチルホスホネートオリゴマーＴ７がリガンドとコンジュゲートされる場合、表１のエントリー１に示されたタイプのオリゴマーＵｍｐＴ７は、それから固相方法によって合成される。オリゴマーは合成後、さらにその５’末端にてチオールリンカー（表２、エントリー１０）によって修飾され、ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３（表３、エントリー１）にＳＭＣＣ（表４、エントリー３）とともにコンジュゲートされ、以下と同一の結合を有するコンジュゲートが得られる：
【００４８】
【化１】
2005518201.tif 000002
【００４９】
コンジュゲーション方法１に付随する放射標識方法
コンジュゲーション方法１がＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの合成のために選ばれた場合、３２Ｐ放射標識は、標識していないＡＴＰをg−３２Ｐ−ＡＴＰと置換することによる酵素的リン酸化工程において、オリゴマーの５’末端で簡単に行うことができる。コンジュゲーションが終わると、放射性コンジュゲートはすぐに細胞取り込みおよび生体分布研究に用いることができる。
【００５０】
この３成分反応のための詳細な手順は、［ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７と命名された、３２Ｐ標識Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの合成（実施例１）でさらに記述する。
【００５１】
コンジュゲーション方法２
この方法では、ネオグリコペプチドはまずそのＮ末端アミノ基にてＳＭＣＣによって修飾され、チオール基に反応するマレイミド活性化リガンドを生成する（表３、エントリー６）。ＳＭＣＣ修飾ネオグリコペプチドは、コンジュゲーション反応に使用する前に均一になるように精製される。オリゴヌクレオチドアナログの５’末端におけるチオール基の導入は、ジスルフィドリンカーをオリゴマーに取り込むことによって固相合成段階にて常套的に成し遂げられる。次いで最終コンジュゲーションは、精製されたマレイミド活性化ネオグリコペプチド及び精製された５’−チオール含有オリゴヌクレオチドアナログを用いることによって行われる。このコンジュゲーション方法では、精製し活性化されたリガンド及びオリゴマーをコンジュゲーション反応において用いることによって、また慎重な実験考案及び実施によって、コンジュゲーション方法１に付随する起こりうるすべての副反応を除外した。オリゴヌクレオチドアナログのコンジュゲーションは定量的に行われ、最終Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの精製を簡単にした。この反応スキームは、２成分反応として分類され、そこではコンジュゲートの「半分」が修飾され、次いでもう「半分」との反応が活性化される。例えば、同じメチルホスホネートオリゴマーＴ７がＳＭＣＣをヘテロ二官能性リンカーとして用いてＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３とコンジュゲートされた場合、コンジュゲーション方法２は以下と同一の結合を有するコンジュゲートを生成する：
【００５２】
【化２】
2005518201.tif 000003
【００５３】
この２成分反応の詳細な手順は実施例２および実施例３にさらに記述する。
【００５４】
同じような方法を用いて、２成分反応のより多くの実施例が可能である。例えば、表３、エントリー２〜５に示したように、ネオグリコペプチドが修飾されうる。チオールの活性化は、例えば２，２’−ジピリジルジスルフィドを用いて成し遂げられうる。活性化チオールを３’又は５’チオール修飾されたオリゴマーのいずれかと反応させることによって、以下に示すようにオリゴマーとネオグリコペプチド間のジスルフィド結合が提供される。このスキームは、商業的に入手可能な架橋試薬を用いても近づけない硫黄原子付近の様々な立体バルク（ｓｔｅｒｉｃ  ｂｕｌｋ）を有するジスルフィドへのアクセスを提供する（表４、エントリー４〜６）。
【００５５】
【化３】
2005518201.tif 000004
【００５６】
コンジュゲーション方法２に付随する放射標識方法
コンジュゲーション方法２がＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの合成のために選ばれた場合、放射標識はコンジュゲートが合成された後に行われる。特定のタイプのオリゴヌクレオチドアナログ（例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）のコンジュゲートの放射標識は、どちらの端に遊離ヒドロキシル基があるかに応じて、従来の３’−または５’−酵素的標識方法によって成し遂げられうる。放射性ホスフェート基はその後化学修飾によって細胞酵素的分解から保護される。
【００５７】
酵素的リン酸化反応に関与しうる遊離ヒドロキシル基を含まないオリゴヌクレオチドアナログ（例えば、メチルホスホネートオリゴマー）のため、酵素的リン酸化反応以外の方法を開発する必要がある。これに関して、我々はいずれのタイプのオリゴヌクレオチドアナログおよびそれらのＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートも３’−末端において、安定した３２Ｐ標識を取り込むための一般的な方法を開発してきた。それには、以前は従来の酵素的標識方法で標識できなかったものが含まれる。本方法は、組み合わせた化学的および酵素的アプローチを用いて標識を可能にし、また以下の工程を含む：
１．固相合成の前に、ハイブリッドまたはキメラオリゴマー構築物が３つの共有結合したセグメントを含むようにつくられる。５’−セグメントはジスルフィドリンカーである。真ん中のセグメントは所望のオリゴヌクレオチドアナログ構造である。３’−末端は、逆極性を伴ったホスホロチオエート  チミジン  トリヌクレオチドユニット、５’−Ｔ−３’−３’−ＴＴ−５’である。このトリヌクレオチドユニットはまたトレーサーユニットとも称され、その構造は図２ｃに示される。このトリヌクレオチドユニットの取り込みは、酵素的にリン酸化されうるオリゴマー構築物の３’−末端に５’−ヒドロキシル基を導入する。
２．オリゴマー構築物の固相合成。
３．コンジュゲーション方法２を用いたリガンドコンジュゲーション。
４．酵素的リン酸化を用いたＡ−Ｌ−Ｐの３’−末端の３２Ｐ標識。
５．細胞の酵素による加水分解から標識を保護するための、３２Ｐ標識されたホスフェート基の化学修飾。
【００５８】
図２ｄおよび図２ｅには、コンジュゲーション方法２およびそれに付随する放射標識方法を使用する、３２Ｐ標識Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲート１ｃの製造のための完全な合成方法を示した。
【００５９】
本発明で開発した２つの方法は、幅広く様々なＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの合成に用いられうる。Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲートに取り込まれうるオリゴヌクレオチドアナログの例を表１に示す。表２はオリゴヌクレオチドアナログへの３’−および５’−修飾の例を一覧表にし、さらなる反応ための主要なアミノ基またはチオール基を提供している。表３はＮ−末端アミノ基を含むネオグリコペプチド、およびアミノ基を修飾しチオール基を提供するための４つの方法、加えてマレイミド基を提供するさらなる方法を示す。最後に、表４は、プロドラッグをリガンドへ結合するために使用しうる、いくつかのヘテロ二官能性架橋試薬およびカテプシンＤ感受性オリゴペプチドを一覧表にしている。多数のその他の適した試薬が入手可能であるということは容易に明らかである。
【００６０】
【表１】
2005518201.tif 000005
【００６１】
【表２】
2005518201.tif 000006
【００６２】
【表３】
2005518201.tif 000007
【００６３】
【表４】
2005518201.tif 000008
【００６４】
実施例１
コンジュゲーション１方法を用いたＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲート［ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７（１０）の合成
材料：メチルホスホンアミダイト  シントンはＪＢＬ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．からの寛大にも贈与されたものであり、商業的に入手可能なものでもある。それらは、通常の技術をもつ専門家によって確立された方法でヌクレオシドから容易に合成されうる。ＵｍｐＴ７（図３）の自動的合成のためのその他のすべての試薬は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．から購入した。ＨｉＴｒａｐ  Ｑ陰イオン交換カラムはＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。逆相高速液体クロマトグラフィーは、Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．から購入したＭｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ−１８カラムを用いて行った。シスタミンヒドロクロリド、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、１−メチルイミダゾール、および無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、並びにＥｌｌｍｅｎ’ｓ試薬はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、さらに精製することなく用いた。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、使用の前に水素化カルシウムから再蒸留した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−（Ｎ−メチルマレイミド）シクロヘキシル  カルボキシレート（ＳＭＣＣ）はＰｉｅｒｃｅから購入した。Ｗａｔｅｒｓ  ＳｅｐＰａｋ  Ｃ−１８カートリッジはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．から購入した。ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３（図２ａ）をＬｅｅら（１９９５、前述）により合成し、４℃で水溶液として保存した。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および［g３２−Ｐ］−ＡＴＰはそれぞれＰ−Ｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  ＩｎｃおよびＡｍｅｒｓｈａｍより購入した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を、１５％ポリアクリルアミド、０．０８９Ｍトリス、０．０８９Ｍホウ酸、０．２ｍＭのＥＤＴＡ（１×ＴＢＥ）および７Ｍの尿素を含む２０ｃｍ×２０ｃｍ×０．７５ｍｍゲルで行った。９０％ホルムアミド、１０％の１×ＴＢＥ、０．２％ブロムフェノールブルーおよび０．２％キシレンブルーを含むローディング緩衝液に試料を溶解した。
【００６５】
ＵｍｐＴ７の合成（６）
確立された方法（Ｍｉｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１），  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｅ編），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ｐｐ．１３７−１５４；  Ｈｏｇｒｅｆｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３），  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．２０：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ  （Ａｒａｇａｗａｌ編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｔｏｗｎ，  ｐｐ．１４３−１６４）によって、５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−メチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホンアミダイト  チミジンを用いてオリゴデオキシヌクレオシド  メチルホスホネートを調節された孔ガラス支持材（ＣＰＧ）上に合成した。５’末端にてオリゴマーに取り込まれた最終シントンは、５’−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホラミダイト  ウリジンであった。最終カップリング工程によって末端５’ヌクレオシドとそれに隣接したヌクレオシド間にホスホジエステル結合が置かれ、そのため５’末端ヒドロキシル基がバクテリオファージＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化され、２’−Ｏ−メチル基の存在によるホスホジエステルの適度な安定性が確かなものになった。粗８−ｍｅｒをＨｉＴｒａｐ  Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィー（２５％未満のアセトニトリルを含む緩衝液でロードし、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）で溶出）、および直線勾配（溶媒Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、２％アセトニトリル；溶媒Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、５０％アセトニトリル；勾配：０−６０％Ｂで３０分）を用いた分取逆相クロマトグラフィー（Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ−１８）で精製した。こうして精製されたオリゴマーは分析用ＨＰＬＣによると約９７％の純度で、ごく僅かな量のｎ−１種が混ざっていたのみであった。
【００６６】
［５’−３２Ｐ］−５’−Ｏ−［（Ｎ−２−チオエチル）ホスホラミデート］−ＵｍｐＴ７（９）の合成（図３）
精製オリゴマー（１６８ｎｍｏｌ）、ＡＴＰ（１６０ｎｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（７５mＬ）、１ＯＸ  ＰＮＫ緩衝液（５ｍＭのＤＤＴ、５０ｍＭのトリス（ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．６、１０mＬ）、［g−３２Ｐ］−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１００mＣｉ、１０mＬ）およびＰＮＫ（５mＬ中１５０Ｕ）を混合し、３７℃で１６時間培養して、蒸発乾固した。残渣を０．２Ｍの１−メチルイミダゾール、ｐＨ７．０（１００mＬ）および０．３ＭのＥＤＡＣ（１００mＬ）を含む１．０Ｍのシスタミンヒドロクロリド、ｐＨ７．２に再溶解して、５０℃で２時間加熱した（Ｃｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １１：６５１３−６５２９；  Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １６：３６７１−３６９１）。過剰な試薬をＳｅｐＰａｋ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、５％アセトニトリルでロードし、水中の５％アセトニトリルで洗浄し、水中の５０％アセトニトリルで溶出）によって取り除いた。溶媒を真空で蒸発させ、粗シスタミン付加物を５０ｍＭのＤＤＴ（２００ｍＬ）を含む１０ｍＭホスフェートに再溶解して３７℃で１時間加熱した。緩衝塩および過剰還元剤を前述の通りに反応混合物から取り除き、粗生成物を真空で乾燥した。６から収率５７％で生成した表題化合物９をさらに精製することなしに次の工程で用いた。
【００６７】
［５’−３２Ｐ］−［ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７（１０）の合成
ネオグリコペプチド５（３３６ｎｍｏｌ）（図２ａ）を無水ＤＭＳＯ（４ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（３３６ｎｍｏｌ）およびＳＭＣＣ（３３６ｎｍｏｌ）で処理した。反応を室温で４時間放置し、次いで調製したばかりのチオール９（図３）に加えた。反応混合物を脱気し、真空下室温でゆっくりと濃縮した。粗生成物をホルムアミドローディング緩衝液（１００mＬ、ＰＡＧＥ（４Ｖ／ｃｍ、１．５時間）で精製）に溶解し、クラッシュアンドソーク方法（ｃｒｕｓｈ  ａｎｄ  ｓｏａｋ  ｍｅｔｈｏｄ）（水中５０％のアセトニトリル）によって回収した。純粋な１０の全体の収率は２５％だった。０．１ＮのＨＣｌ（３７℃、１時間）で処理すると、Ｐ−Ｎ結合の加水分解によって、１０は［５’−３２Ｐ］−リン酸化された６を産生した。しかしながら、６はＤＴＴ（５０ｍＭ、ｐＨ８、３７℃、１時間）、３−マレイミドプロピオン酸（５０ｍＭ、ｐＨ８、３７℃、１時間）、Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬（５０ｍＭ、ｐＨ８、３７℃、１時間）およびＢＡＰ（７０Ｕ、６５℃、１時間）に対し不活性であった。次いで１０を０．１ＮのＨＣｌおよびＢＡＰで処理すると、結果として予想通り［３２Ｐ］−標識が完全になくなった。同様の様式で調整された１０の無標識の試料の化学量論的分析は、予想された構造と一致して、それがコンジュゲートの各モルについて、３モルのＮ−アセチルガラクトサミンを含んでいることを示した。（ＵｍｐＴ７のモル吸光率を、構造に含まれるそれぞれのヌクレオシドについてのモル吸光度の合計をとることによって計算すると、５９，７５０Ｌ／ｍｏｌ−ｃｍになった。この値はコンジュゲート中に含まれていることがわかっているＧａｌＮＡｃ残基のモル数とよく一致した。）空気圧で補助されたエレクトロスプレー質量分析は親イオン（陰イオンモード）をＭ／Ｚ４０８０（計算値４０８０．７）で生成した。
【００６８】
方法１の解説
ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３およびｐＵｍｐＴ７の合成および精製は確立された方法に従って行った（Ｌｅｅ，  （１９８７），  前述；  Ｍｉｌｌｅｒ，  （１９９１），  前述）。ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３およびＵｍｐＴ７の間の共有結合を形成するために、Ｏｒｇｅｌ法を用いてＵｍｐＴ７の５’末端を修飾した（Ｃｈｕ，  （１９８３  ＆  １９８８），  前述）。これはオリゴ−ＭＰにジスルフィドを導入し、このジスルフィドはＤＴＴで５’−チオールに還元することができる。ネオグリコペプチド（図２ａ）を、ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３のＮ末端アミノ基に特異的に結合し得る、ヘテロ二官能性架橋試薬（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）であるＳＭＣＣを用いる相補的方法で修飾した。ＳＭＣＣにより導入されたマレイミド基と修飾オリゴ−ＭＰの５’−チオールとのカップリングの結果、代謝的に安定なチオエーテルを介してオリゴ−ＭＰとネオグリコペプチドとの結合が生じた（図３）。
【００６９】
合成を開始するために、ＰＮＫおよび０．９５当量の［３２Ｐ］−ＡＴＰを用いてＵｍｐＴ７をリン酸化した。５’−リン酸化が成功したことを、５’−ホスフェートの付加により負電荷が−１から−３に増加したこと、および構造中に３２Ｐが取り込まれたことによる、親オリゴ−ＭＰと比較した生成物の電気泳動移動度の増加により確認した（図４，バンドＡ）。このようにして末端標識反応を定式化することにより、約９０％のＡＴＰが確実に消費され、コンジュゲートを放射標識する［３２Ｐ］−ＡＴＰの効率的な使用を可能にした。５’−ホスフェートの修飾は２工程で行った。５’末端−標識オリゴ−ＭＰを０．１Ｍ  １−メチルイミダゾールを含有する緩衝液（ｐＨ７．２、０，１５Ｍ  ＥＤＡＣ存在下）中の０．５Ｍシスタミンヒドロクロリドを用いて５０℃でインキュベートし、５’−シスタミン  ホスホラミデートを収率６５％で得た。反応混合物のＰＡＧＥ分析により、生成物が５’末端−標識オリゴ−ＭＰと比較して有意に低速で移動することが示された。この観察は、Ｐ−Ｎ結合の形成による５’−ホスフェート上の１個のオキシアニオンの損失と、シスタミン基の末端に存在する正に荷電したプロトン化された第１級アミンにより第２の負電荷が中和されたことによって、−３から−１へ変化したことと一致する（図４；バンドＡおよびＢの比較）。この反応の間に、３５％までのチミジン−修飾オリゴ−ＭＰが生成し（図４，バンドＣ）、反応条件の変更を試みたが（例えば、温度を下げる、ＥＤＡＣ濃度を低くする）、所望のシスタミン付加物の収率を低下させることなく、その生成を除去することはできなかった。この副生成物はおそらく、ＥＤＡＣがチミジンのＮ−３と反応して、チミジン−ＥＤＡＣ付加物を形成することによって生じると推定される（Ｃｈｕ，  前述；  Ｇｉｌｈａｍ，  前述）。ジスルフィドの還元は５０ｍＭのＤＴＴを用いｐＨ８で定量的であり、正に荷電したプロトン化された第１級アミノ基の損失によって、より速く移動する種への移動度シフトを伴っていた（図４；バンドＢおよびＣの比較）。別の反応において、ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３をそれぞれ１当量のＳＭＣＣおよびＤＩＰＥＡと無水ＤＭＳＯ中で結合させ、室温でインキュベートした。この反応混合物のチオール９との結合は、ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３によってＳＭＣＣが完全に消費されることなく、実施することができる。なぜなら５、７、および９に存在する反応基が位置特異的に結合され、構造的に定義された均一なコンジュゲートが得られるからである。予想されたように、活性化オリゴ−ｍｐの５’末端への修飾ネオグリコペプチドの付加は、コンジュゲート１０の質量が、親オリゴ−ＭＰの質量より有意に大きいため、ＰＡＧＥによる移動度の実質的な低下を伴っていた（図４，バンドＦ）。このスキームに従って、２当量（出発物質オリゴ−ｍｐ  ６を基準にして）のネオグリコペプチドＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３を使用したとき、９は完全に１０に変換された。コンジュゲート１０の総収率は、オリゴ−ｍｐ  ６を基準にして２４％（３回合成の平均）であった。１０の均一性（ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ）は、エレクトロスプレー質量分析によるｓｉｎｇｌｅ  ｐａｒｅｎｔ  ｉｏｎ（陰イオンモード）によって確認された。
【００７０】
実施例２  コンジュゲーション方法２を用いるＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲート１ｃの合成
本実施例は、新規なタイプのオリゴヌクレオチドアナログ（メチル−ホスホネート−ホスホジエステル  バックボーンを交互に有する２’−Ｏ−メチル  リボース）からのＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの合成においてコンジュゲーション方法２を用いるための詳細な手順を例示する。表５に、このタイプの３つのオリゴマー（オリゴマー１−３）、および肝リガンドＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３を用いて形成したそれらのＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲート（コンジュゲート１ｃ，２ｃ，３ｃ）を記載する。以下に、コンジュゲート１ｃの合成の手順を例示する。他の２つのコンジュゲートを同様にして合成した。
１ｃの合成においてコンジュゲーション方法２を用いるための手順は、次の工程を含む。１）ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３（８）の合成；２）オリゴマー構築物１ｂの設計；３）オリゴマー構築物１ｂの固相合成；および４）１ｂのＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３との結合−１ｃの合成。５）コンジュゲート１ｃの３２Ｐ放射標識。
【００７１】
［表５］
表５．  メチルホスホネートを交互に有するオリゴヌクレオチドアナログ
配列
１  （ｎ＝７）    ＡｐＧｐＵｐＣｐＡｐＧｐＵｐＣｐＡｐＧｐＵｐＣｐＡｐＧｐＵ
２  （ｎ＝７）    ＧｐＵｐＵｐＣｐＵｐＣｐＣｐＡｐＵｐＧｐＵｐＵｐＣｐＡｐＧ
３  （ｎ＝１０）  ＵｐＵｐＵｐＡｐＵｐＡｐＡｐＧｐＧｐＧｐＵｐＣｐＧｐＡｐＵｐＧｐＵｐＣｐＣｐＡｐＵ
式中、ｐ    ：  ホスホジエステル結合
ｐ    ：  メチルホスホネート結合
ｐｓ  ：  ホスホロチオエート結合
【００７２】
【化４】
2005518201.tif 000009
【００７３】
表５において、オリゴマー１〜３を、表の下部にオリゴヌクレオチドａ〜ｅとして表示した置換基に、以下に記載する合成方法を用いて結合して、本発明の化合物のさらなる実施例を形成することができる。例えば、１ｂはＣ６−チオール−ｐｓ、Ｏ−、ＣＨ３、および３’−コンジュゲートの本発明による置換基を有する配列１からなる（その構造を図２ｃに示す）。１ｂ（図２ｅ）および１ｃで示される構造の化合物は、実施例２で詳細に説明したように、図２ｄおよび２ｅに示すスキームに従って合成した。出発原料の適当な置換および合成における変更によりその他の組み合わせも同様にして合成できることが明らかである。
【００７４】
ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３（８）の合成および精製
約１−２μｍｏｌのＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３を１ｍＬガラスリアクチ−バイアル（Ｒｅａｃｔｉ−ｖｉａｌ）中で乾燥した。この溶液に、無水ＤＭＳＯ（２５０μＬ）および無水ＤＩＰＥＡ（３μＬ）を添加し、次いで、真空乾燥したＳＭＣＣ（６ｍｇ）を含有する無水ＤＭＳＯ溶液（１５０μＬ）で処理した。混合物をボルテックスミキサーで軽く撹拌し、室温で放置した。反応の進行を逆相ＨＰＬＣ分析により３０分間隔でモニターした。ＨＰＬＣ法：Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８  ２５０ｘ４．６ｍｍ。  ０−５分，０−４０％Ｂ；５−２０分，４０−１００％Ｂ。Ａ：２％  ＣＡＮ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ５．８中；Ｂ：５０％  ＣＡＮ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ５．８中。流速１ｍＬ／分。検出：Ａ２８０ｎｍ。ＨＰＬＣ分析の結果は、出発物質ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３（溶出時間：７．３分）が２時間で所望の生成物ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３（溶出時間：９．８分）に完全に変換されたことを示した。この反応混合物を、次いで２％  ＣＨ３ＣＮを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８）で１０ｍＬに希釈し、Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジに充填した。このカートリッジを２％  ＣＨ３ＣＮを含有する１０ｍＬの５０ｍＭ（ｐＨ  リン酸ナトリウム  ５．８）で洗浄し、生成物を１０ｍＬの２５％  ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで溶出した。生成物をＳｐｅｅｄ−ｖａｃで減圧濃縮し、セミ分取逆相Ｃ１８カラムでさらに精製した。ＨＰＬＣ法：  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８  ２５０ｘ７．５ｍｍ。０−６０分，２０−６０％Ｂ。Ａ：２％  ＣＡＮ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ５．８中；Ｂ：５０％  ＣＡＮ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ  ５．８中。流速２ｍＬ／分。検出：Ａ２８０ｎｍ。純粋なＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３を含有するフラクションをプールし、Ｓｅｐ−Ｐａｋで脱塩した。生成物の最終収率：１．８９（０．Ｄ．２７６または１．３５μｍｏｌ）：ＵＶ（２５％  ＣＡＮ）：３０５（ｂｒ），２８２（ｓｈ），および２７６ｎｍ。相対強度：ε３０５：ε２８２：ε２７６＝１：２．７：３．０。ＭＳ（エレクトロスプレー，陽イオンモード）：１５６５（Ｍ＋Ｈ）＋。分析逆相ＨＰＬＣ：９．８分に単一ピーク（ＨＰＬＣ条件：Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８  ２５０ｘ４．６ｍｍ。０−５分，０−４０％Ｂ；５−２０分，４０−１００％Ｂ。Ａ：２％  ＣＡＮ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ５．８中；Ｂ：５０％  ＡＣＮ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ５．８中。流速１ｍＬ／分。検出：Ａ２８０ｎｍ。）。
【００７５】
オリゴマー構築物１ｂの設計（表５）
以下の記載は、オリゴヌクレオチドアナログ１をＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３に結合する目的でオリゴマー構築物をどのように設計するか、および形成されたＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの３２Ｐ−標識をどのようにして可能にするかを例示する。オリゴマー１は、ホスホジエステルおよびメチルホスホネートのヌクレオチド間結合を交互に有する２’−Ｏ−メチルリボースを含有する、新規なタイプのオリゴマーに属し、その配列を表５に示す。オリゴマー１ｂ（表５）は、オリゴマー１にリガンドを結合させ、そのコンジュゲートを３２Ｐ−標識して設計した構築物である。オリゴマー１ｂは３つの部分を含む。中間部分は、オリゴマー１そのものの構造、すなわち、Ａ−Ｌ−ＰのＰ部分を含む。５’−部分は、Ｃ６−チオールリンカーを含み、ホスホロチオエート結合を介してオリゴマー１の５’−Ａに結合する。このチオール基は、ＳＭＣＣ−修飾リガンド、すなわち、Ａ−Ｌ−ＰのＡ部分との結合に使用される。３’部分はトレーサーユニットであり、メチルホスホネート結合を介してオリゴマー１の３’−Ｕに共有結合する。トレーサーユニットは、逆の極性（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｏｌａｒｉｔｙ）を有するホスホロチオエート  チミジン  トリヌクレオチドユニット、５’−Ｔ−３’−３’−ＴＴ−５’であり、その構造を図９または２ｃに示す。このトリヌクレオチドユニットがなければ、最終のコンジュゲートは、その３’−末端に、５’−メチルホスホネート結合を有する２’−Ｏ−メチル−ウリジンを有していただろう。この３’−末端を放射標識することは通常の酵素的方法では不可能となったであろう。このトリヌクレオチドユニットを取り入れることにより、オリゴマー構築物の３’−末端に５’−ヒドロキシル基が導入され、これは酵素的にリン酸化することができ、コンジュゲートの３２Ｐ−標識が可能となる。
【００７６】
３’−トレーサーユニットは、最終のコンジュゲートを３２Ｐで標識することを所望する場合にのみ必要である。放射標識されたコンジュゲートを必要としない適用には、このトレーサーユニットを省略し、オリゴマー構築物はチオールリンカーおよびＰ部分のみを含む。
【００７７】
オリゴマー構築物１ｂの固相合成
修飾されたオリゴマー１ｂを、対応する市販のホスホラミダイトおよびメチル−ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、固相ＤＮＡシンセサイザーで合成した。トレーサーは、ｄＴ−５’−Ｌｃａａ−ＣＰＧ担体上のホスホロチオエート化学を用いて、担体に、３’−ＤＭＴ−ｄＴ−５’−ＣＥ  ホスホラミダイト、続いて５’−ＤＭＴ−５−［Ｎ（−）トリフルオロアセチル）ヘキシル−３−アクリルアミド］−２’−デオキシウリジン  ３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホラミダイト（ＣＰＧおよびシントンはＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから商業的に入手可能である）をカップリングすることによって組み立てられ（図１０）、次いで、トレーサー含有ＣＰＧ上に２’−Ｏ−メチル  メチルホスホンアミダイト  シントンおよび２’−Ｏ−メチル−シアノエチエルホスホラミダイト  シントンを順次カップリングすることによって、オリゴマー１に対応する配列が組み立てられた。次いで、固相合成の最終カップリング工程において、ホスホロチオエート化学を用いて、Ｃ６−ジスルフィド  シアノエチル−ホスホラミダイト  シントン（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をカップリングすることにより、５’−ジスルフィドリンカーをオリゴマーに導入した。必要であれば、低水分酸化剤（ｌｏｗ  ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｏｘｉｄｉｚｅｒ）の代わりにＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ホスファイトの硫化を行い、標準的な確立された手順に従ってホスホロチオエートを得た。オリゴマーは５’−ＤＭＴ基を除去することなく合成された。オリゴマーをＧｅｎｔａ  ワンポット法（Ｈｏｇｒｅｆｅ，  Ｒ．Ｉ．，  Ｖａｇｈｅｆｉ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｍ．Ａ．，  Ｙｏｕｎｇ，  Ｋ．Ｍ．  および  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｌ．Ｊ．  （１９９３）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２１，  ２０３１−２０３８）で脱保護し、トリチル−ｏｎ法で精製した。ジスルフィド含有オリゴマーは、セミ分取逆相Ｃ  １８カラムを用いて最終的に精製した。ＨＰＬＣ条件：Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８  ２５０ｘ７．５ｍｍ。０−５０分，２０−６０％Ｂ。Ａ：２％  ＣＡＮ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７中；Ｂ：５０％  ＣＡＮ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７中。流速２ｍＬ／分。検出：Ａ２５４ｎｍ。
【００７８】
ジスルフィド部分のチオールへの還元は、５’−ジスルフィド含有オリゴマーをＤＴＴで処理することにより行った。すなわち、２．５  Ｏ．Ｄ．  ２６０（〜１６ｎｍｏｌ）ジスルフィドオリゴマーを、調製したばかりの脱気した、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ８中の５０ｍＭ  ＤＴＴ溶液（４００μＬ）に溶解した。混合物を３７℃で２時間インキュベートした。チオールオリゴマーが親ジスルフィドオリゴマーより速く溶出することを示す逆相ＨＰＬＣ分析により、定量的な還元が確認された。次いで、チオールオリゴマーをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（ｌ０×３００ｍｍ）上で精製し、ＤＴＴおよび塩を除去した。カラムパッケージおよび試料溶出は、脱気した２０％エタノール−水を用いて行った。望ましくない酸化を最小限にするために、純粋なチオールオリゴマーを含有するＧ−２５フラクションを直ちに次の反応で使用した。ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３含有オリゴマー１ｃの合成。
【００７９】
１．８  Ｏ．Ｄ．  ２６０（１２ｎｍｏｌ）の純粋なチオールオリゴマー（１ｂ）を含有するＧ−２５フラクションを集めた直後にＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３（５０ｎｍｏｌ）と混合した。混合物をｓｐｅｅｄ−ｖａｃ中で濃縮乾固した。残渣を、脱気した５０％ＣＨ３ＣＮを含有する０．１Ｍ  リン酸ナトリウム，ｐＨ７（１００μＬ）に溶解した。この溶液をさらにｓｐｅｅｄ−ｖａｃ中で約５分間真空にして脱気した。この溶液に堅くふたをし、室温で終夜インキュベートして、コンジュゲーションを完全にした。あるいは、コンジュゲーションは、集めたばかりのチオールオリゴマーＧ２５フラクションを、５０％ＣＨ３ＣＮを含有する０．１Ｍ  リン酸ナトリウム，ｐＨ７中のＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３の溶液と混合することによって行うことができる。この溶液を直ちにｓｐｅｅｄ−ｖａｃにおき、約１ｍｌまで濃縮した。この溶液に堅くふたをし、室温で終夜インキュベートして、コンジュゲーションを完全にした。両方の手順で、チオール含有オリゴマーの定量的なコンジュゲーションが得られたことを確認した。
【００８０】
コンジュゲーション反応の収率を決定するために、反応物の約０．５μＬ部分を乾燥し、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰおよびＰＮＫを用いてリン酸化し、２０％変性ＰＡＧＥにより分析した。コンジュゲートの移動度をコンジュゲートされていないオリゴマーの移動度と同じゲル内で比較した。無標識のコンジュゲートもまたＵＶシャドーイング法によって同様の形式で分析されうる。ＰＡＧＥの結果はチオールオリゴマーのネオグリコペプチドとの定量的なコンジュゲーションを示した。コンジュゲートは、キモトリプシン消化による有意なゲル移動度のシフト、およびＤＴＴ処理においてはシフト不可能であることから確かめられた。コンジュゲートを最終的に、２０％エタノールで溶出するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムで精製した。精製された１ｃは生物有効性実験およびその他の放射標識されたコンジュゲートを必要としない実験に直接用いられうる。
【００８１】
コンジュゲート１ｃの３２Ｐ放射標識
１ｃを細胞取り込みおよび生体分布実験に用いるため、従来の５’−酵素的放射標識方法にしたがい、g−３２Ｐ  ＡＴＰおよびＰＮＫを使用することによって１ｃを32Ｐで標識した。精製されたコンジュゲート１ｃ（１０ｎｍｏｌ）、ＡＴＰ（１０ｎｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（７０mＬ）、１Ｏ×ＰＮＫ緩衝液（５ｍＭのＤＤＴ，５０ｍＭのトリス（ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．６；１０mＬ）、［g−３２Ｐ］−ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１５０mＣｉ，１５mＬ）、およびＰＮＫ（１０mＬ中３００Ｕ）を混合し、３７℃で１６時間培養した。３２Ｐのコンジュゲートへの取り込みは１５％ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。次いで標識溶液に０．２Ｍの１−メチルイミダゾール、ｐＨ７．０（１００mＬ）および０．３ＭのＥＤＡＣ（１００mＬ）を含む１．０Ｍのエチレンジアミン  ヒドロクロリド、ｐＨ７．２を加えた。次に溶液を５０℃で２時間インキュベートした（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８３），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １１：６５１３−６５２９；  Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １６：３６７１−３６９１）。過剰な試薬は、２０％水性エタノールで溶出されるＮＡＰ−２５カラムによって取り除いた。それから純粋な３２Ｐ標識コンジュゲートをＵＶ吸収測定およびシンチレーションカウンティングで分析した。比活性を計算すると約５〜８Ｃｉ／ｍｍｏｌになった。再び１５％ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって精製された３２Ｐ標識コンジュゲートが、いかなる低分子量の３２Ｐ混入物もないことを分析した。
【００８２】
実施例３  コンジュゲーション方法２を用いた、Ａ−Ｌ−ＰコンジュゲートＮＧ１からＮＧ５の合成
本発明の実施例２に記載したように、コンジュゲーション方法２は、いかなるオリゴヌクレオチドアナログのＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを形成するのにも用いられうる一般的な方法である。以下の記載は異なったタイプのＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲート合成のためにコンジュゲート方法２を用いるもう１つの実施例である。この実施例において、コンジュゲートされるオリゴヌクレオチドアナログは、オリゴデオキシリボヌクレオシド  ホスホロチオエートのタイプ、つまり現在世界中のアンチセンス薬剤開発において用いられている主要なアナログの１つに属する。オリゴデオキシリボヌクレオシド  ホスホロチオエートは古典的な３’−酵素的標識方法によって３’末端が容易に標識されるため、実施例２にて用いられた３’トレーサーユニットを、コンジュゲートを放射標識するために必要とすることはない。したがって、設計されたオリゴマー構築物は２つの部分、ホスホロチオエートオリゴマー部分および５’−ジスルフィドリンカー部分のみを含んでいる。
【００８３】
これらの５’−ジスルフィド含有ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、ＡＢＩ３９２ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーにて自動化ホスホロチオエート  オリゴヌクレオチド合成方法によって合成した。これには、正常３’−ＣＰＧ支持体、５’−ＤＭＴ−ヌクレオシド  ３’−・−シアノエチルホスホラミダイト、およびＣ６−チオールリンカー・−シアノエチル  ホスホラミダイトを用いた。（これらすべての試薬はＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡから商業的に入手可能である。）オリゴマーを、５’−ＤＭＴ基を取り除くことなく合成した。オリゴマーを濃水酸化アンモニウムで１６〜２０時間、５５℃にて脱保護した。次いでトリチル含有オリゴマーを、ｐＨ７．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム中のアセトニトリルの直線勾配を用いた、Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ−１８カラムの分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。精製されたトリチル含有オリゴマーをＳｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）における０．５％ＴＦＡによって脱トリチル化した。すべてのオリゴヌクレオチドを次の実験に用いる前にＳｅｐ−Ｐａｋで脱塩した。
【００８４】
次に精製されたジスルフィド含有オリゴマーを、実施例２に記載したものと同様に、ＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３とのコンジュゲーションに用いた。ほとんどのコンジュゲーション反応は、チオールオリゴマーに１．５〜２当量のＳＭＣＣ−ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３を用いることによって行った。行ったすべての反応においてオリゴマーの定量的コンジュゲーションが結果として生じた。過剰なリガンドおよび緩衝塩を２０％エタノールによって溶出するＧ−２５カラムによって容易に取り除き、高純度のコンジュゲートを得た。コンジュゲーション反応を、代わりに過剰量のチオールオリゴマー、例えば１．５当量のチオールオリゴマーをリガンドへ用いることによってもまた行った。これらの場合において、すべてのリガンドは反応で消費され、残った過剰量のチオールオリゴマーを分取逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって取り除いた。以下は、上記方法によって合成された５つのオリゴデオキシリボヌクレオシド  ホスホロチオエートＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの配列である（図５）。ＮＧ１：  ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−５’ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧ３’、標的はＨＢＶ  ｓａ−ｇｅｎｅ、ＮＧ２：  ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−５’ＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴ３’、標的はＨＢＶ  ｃ−ｇｅｎｅ、ＮＧ３：  ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−５’ＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡ３’標的はＨＢＶ  ｅ−サイトおよびランダム対照、  ＮＧ４：  ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−５’ＴＧＡＧＣＴＡＴＧＣＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴ３’、およびＮＧ５：  ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３ＳＭＣＣ−５’ＴＣＣＡＡＴＴＡＧＡＴＣＡＧ３’。
【００８５】
いくつかの方法を用いてオリゴマーコンジュゲーションの収率およびコンジュゲートの純度を判定した。１）３５Ｓ標識したコンジュゲーション反応混合物のＰＡＧＥ分析。反応物の約０．５mＬ部分を乾燥し、３’−末端を［３５Ｓ］−ＡＴＰ−Ｓ（以下に記載した３’標識方法参照）で標識して、２０％変性剤によって分析した；２）ＵＶシャドーイング法によって視覚化された無標識コンジュゲーション反応混合物のＰＡＧＥ分析；３）無標識コンジュゲーション反応混合物のＨＰＬＣ分析。すべての試料を上記３つの分析にかける前にＤＤＴで処理した。コンジュゲートされていないチオール−オリゴマーを比較目的のため、並行して処理および分析した。ＰＡＧＥ分析において、コンジュゲートはすべて対応するチオールオリゴマーより有意に遅い移動度を示し、すべてのチオールオリゴマーは完全に対応するコンジュゲートに転換されることがわかった。逆相ＨＰＬＣ分析において、すべてのコンジュゲートは単独のピークを示し、それらの保持はコンジュゲートされていないチオール−オリゴマーのものと比べると２〜３分長かった。
【００８６】
いくつかの方法を用いて最終コンジュゲートが特徴付けられてきた。コンジュゲートを以下の処理にかけて、次いでＰＡＧＥおよびＨＰＬＣ分析の両方で分析した：１）キモトリプシン消化；２）ＮＡＧＡ消化；および３）ＤＴＴ処理。キモトリプシン消化はオリゴマー種を生成し、それはゲル上をコンジュゲートおよびチオールオリゴマーの両方より速く移動した。このことによりトリペプチド構造がコンジュゲート中にあることが確認された。またＨＰＬＣ分析も消化における保持時間の変化を示した。ゲル上でコンジュゲートよりほんの僅かに速く移動するだけのオリゴマー種を生成するＮＡＧＡでの消化によって、糖部分の存在を確認した。しかしこのオリゴマー種は、ＨＰＬＣにおいてコンジュゲートより有意に長い保持率を示した。ＤＴＴ処理は、ゲルおよびＨＰＬＣ分析に基づいたコンジュゲート構造に何の変化も起こさなかった。これはジスルフィドが構造中になく、すべてのチオール基がコンジュゲーション反応に加わっていることを示している。コンジュゲートの構造を、空気圧で補助されたエレクトロスプレー質量分析によってもまた確認した。
【００８７】
コンジュゲートＮＧ１の３５Ｓ放射標識
代表的（ＮＧ１）コンジュゲートを３５Ｓで標識し、Ｈｅｐ  Ｇ２およびＨｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞の両方において細胞取り込みを分析した。３５Ｓ放射標識を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）および［３５Ｓ］ｄＡＴＰ・Ｓ（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）の組み合わせ作用を用いて３’−末端に取り込まれた。すべての３５Ｓ標識オリゴマーを、細胞実験に用いる前に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラムまたはＳｅｐ−Ｐａｋカートリッジのいずれかを用いて精製した。
【００８８】
コンジュゲーション方法１およびコンジュゲーション方法２の比較
コンジュゲーション方法１は、本発明において先に開発された一般的なコンジュゲーション方法であった。これは、オリゴヌクレオシド  メチルホスホネート（例えばコンジュゲート１０）からＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを、およびホスホジエステル−メチルホスホネートバックボーン（例えばコンジュゲート１ｄ、表５）を交互に含むそれらのアナログを合成するのに首尾よく使われてきた。この方法はこれらの化学的に定義され構造的に均一なＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートの構築のための方法を提供し、本発明において重要な役割を果たした。しかしながら、この方法にはいくつかの改善が必要であった：１）副作用を小さくする必要がある。副作用としては、ＥＤＡＣ付加物形成、未反応なＳＭＣＣのチオールオリゴマーへのコンジュゲーション、および加水分解されたＳＭＣＣのチオールオリゴマーへのコンジュゲーションが挙げられる。これらの副作用は、生成物形成の収率を下げ、ＰＡＧＥを精製方法の１つとして使う必要のある混合物を生成することによって、さらに全体の収率を約２５％にまで下げてしまう。２）この方法を使って他のバックボーンのオリゴマーのＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲート、例えばホスホロチオエート、を合成するため、化学的性質を絞り込む必要がある。５’−ホスフェートの修飾におけるＥＤＡＣおよびシスタミンの使用は、この種のオリゴマーには適さない。３）３２Ｐ標識はリガンドコンジュゲーションが終了した後では行うことができない。この標識の半減期は比較的短いため、コンジュゲーション方法全体を新鮮な３２Ｐ標識が必要なときにはいつも準備する必要がある。
【００８９】
コンジュゲーション方法２は、オリゴマーのリガンドとの定量的コンジュゲーション、すべてのタイプのオリゴマーバックボーンとの普遍的な適合性、コンジュゲートの容易な精製、およびコンジュゲートの放射標識における柔軟性において、方法１より有意な改善点を提供する。これらの改善点は方法２における以下の独特な方法によって成し遂げられた：
１）固相合成の際にチオールリンカーをオリゴマー構築物へ取り込むことによって、オリゴヌクレオチドアナログの合成後の修飾は回避される。これによって方法１で見られたようなＥＤＡＣ付加物の形成は解消された。またこれによってＥＤＡＣ修飾を受けやすい特定のバックボーンタイプのオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエート  オリゴヌクレオチドのコンジュゲートの合成が可能になった。したがって、チオールリンカーがそれらの構造に取り込まれうるような、すべてのタイプのオリゴヌクレオチドアナログのＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートを合成することが可能である。
２）活性化リガンドスキャフォールド、ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣを合成し、コンジュゲーション反応においてそれを使用する前に均一となるよう精製することによって、未反応のＳＭＣＣや加水分解されたＳＭＣＣとのコンジュゲートのような、不要のコンジュゲートが除去された。精製された活性化リガンドは大量に作って−２０℃で冷凍庫に保存し、コンジュゲーションのときに使えるようにしておいてもよい。これにより、活性化リガンドを繰り返し合成する必要がなくなる。
３）厳密な脱気条件下でチオールオリゴマー精製およびコンジュゲーション反応を行うことによって、チオールオリゴマーの二量化を検出できないレベルにまで抑えた。本発明の脱気条件とは、やや嫌気性の状況、より好ましくは低酸素、そしてもっとも好ましくは酸素がないことを意味する。反応しなかった試薬およびその他の低分子量チオール含有不純物のどんな痕跡も除くことが好ましい。これは、チオールオリゴマーのＧ−２５精製における溶媒を脱気すること、回収したてのチオールオリゴマーＧ−２５フラクションを直ちにコンジュゲーション反応に用いること、および真空状態でコンジュゲーションを行うことによりなしえた。これらの予防措置と、コンジュゲーション反応における純粋なＳＭＣＣ修飾リガンドおよび純粋なチオールオリゴマーの使用と組み合わせて、オリゴマーの定量的コンジュゲーションをなしえるための土台を形成する。
４）副作用の解消および結果として得られる定量的なコンジュゲーション反応によって、単純なＧ−２５精製方法を使って純粋なコンジュゲートを得ることが可能になった。したがって、方法１で必要とされていたＰＡＧＥ精製は排除された。これによって純粋なコンジュゲートの全体収率が９５％を超えた。
５）３’−トレーサーユニットのオリゴマー構築物への任意の取り込みは、すべてのバックボーンタイプの最終コンジュゲートの放射標識における柔軟性を非常に高める。コンジュゲートを、大量に一時に調製し貯蔵することができ、後で必要なとき（例えば、細胞取り込みおよび生体分布実験における使用の前）にいつでも標識しうる。このことにより、方法１の場合にそうであったように、放射標識するために同じコンジュゲートの合成を繰り返す必要がなくなった。
【００９０】
これらのコンジュゲーション方法２の利点により、その発明以降、方法２は我々の常套的なコンジュゲーション方法となった。我々の生物有効性研究において用いたＡ−Ｌ−Ｐコンジュゲートは、すべてこの方法で合成した。
【００９１】
細胞取り込み実験
実施例４
本実施例は、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞、ＨＴ１０８０細胞またはＨＬ−６０細胞の細胞取り込み実験に使用される材料および方法を例示する。
材料：Ｌ−グルタミンが添加されたＥａｒｌｅ’ｓ塩を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）、Ｌ−グルタミンが添加されたＲＰＭＩ培地１６４０（ＲＰＭＩ）、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、非必須アミノ酸（１０ｍＭ）、炭酸水素ナトリウム水溶液（７．５％）、およびトリプシン（０．２５％；１．０ｍＭのＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ中で調製）はＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ．から購入した。ヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ  Ｇ２）（ＡＴＣＣ  ＨＢ  ８０６５）、ヒト線維肉腫（ＨＴ  １０８０）、および骨髄球性（ｐｒｏｍｙｌｅｏｃｙｔｉｃ）白血病（ＨＬ−６０）細胞はＡＴＣＣから購入した。Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５、ヒトＢ型肝炎ウイルスＤＮＡで安定的にトランスフェクションされたヒト肝細胞癌（ＨｅｐＧ２  ２．２．１５）（Ｓｅｌｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８４：１００５−１００９）は、Ｇ．Ｙ．  Ｗｕ博士から贈与された。その他の適した細胞系は当業者には周知のものであり、例えばＰＬＣ／ＰＲＦ／５（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ細胞）、Ｂ型肝炎表面抗原を分泌するヒト肝癌が記載されており（Ｊａｃｉｎｔａ，  Ｓ．，  （１９７９），  Ｎａｔｕｒｅ，  ２８２：６１７−６１８）、これはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手可能である。
【００９２】
１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および０．１ｍＭ非必須アミノ酸を添加した１×ＭＥＭ、或いは１０％ＦＣＳを添加した１×ＲＰＭＩ（Ｈｅｐ  Ｇ２）、１０％ＦＣＳを添加した１×ＲＰＭＩ（Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５）、１０％ＦＣＳを添加した１×Ｄ−ＭＥＭ（ＨＴ−１０８０）、または１０％ＦＣＳを添加した１×ＲＰＭＩ（ＨＬ−６０）中で細胞を維持した。シリコンオイルは、当初はＧｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  （＃ＳＦ  １２５０）から贈与されていたが、その後はＮｙｅ  Ｌｕｂｒｉｃａｎｔｓ  Ｉｎｃ  （＃９８−０７０４）から購入した。細胞をＣｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓから購入したＣｏｕｌｔｅｒ細胞計数器を用いて数えた。
方法：Ｈｅｐ  Ｇ２、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５、およびＨＴ１０８０細胞を２ｃｍウェルに継代培養し、ウェル当たり２〜４×１０５細胞の密度になるように適切な培地で増殖させた。維持培地を吸引し、細胞を３７℃にて２％ＦＣＳを含み、［５’−３２Ｐ］−標識１０が１μＭの０．５ｍＬ培地で培養した。所定の時間が経過した後、培地の５ｕＬアリコートをシンチレーション計数のため保存し、残りはウェルから吸引した。細胞をＤ−ＰＢＳ（２×０．５ｍＬ）で洗浄し、０．２５％トリプシンで処理して（３７℃で２分）、１０％ＦＣＳを含む新鮮な生育培地に懸濁した。懸濁した細胞を１．７ｍＬ微量遠心コニカルチューブにてシリコンオイル（０．５ｍＬ）上に積層化し、１４，０００ｒｐｍ（１２，０００ｇ）で３０秒間の遠心分離によって沈殿させた。上澄みを注意深くデカントし、細胞沈殿物を０．５％ＮＰ４０、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１４ｍＭのトリス（ＨＣｌおよび３０％アセトニトリル）を含む１００ｕＬ溶液で溶解した。放射活性の量、および推論による細胞溶解物と結合した１０の量を、シンチレーション計数によって測定した。
【００９３】
２％ＦＣＳを添加し、［３２Ｐ］−１０が１μＭのＲＰＭＩ培地で、７．５×１０６ＨＬ６０細胞を室温にて５分間、前処理した。細胞を遠心分離（５分間）で取り除いた。培地をデカントし、７．５×１０６の新鮮なＨＬ−６０細胞に加えた。細胞を均等に懸濁して、細胞懸濁液を６つの０．４ｍＬ分量にわけた。残りは処分した。細胞を所定の時間培養してから、遠心分離（５分間）によって回収し、０．５ｍＬのＤ−ＰＢＳに再懸濁し、および１．７ｍＬ微量遠心コニカルチューブにてシリコンオイル上に積層化した。細胞を遠心分離（１２，０００ｇ、３０秒）で沈殿させ、溶解させ、そしてその細胞と結合した［３２Ｐ］−標識された物質の量をシンチレーション計数によって測定した。
【００９４】
実施例５
本実施例はインビトロでのＨｅｐＧ２細胞による１０の取り込みを例示する。ここで、１０はコンジュゲーション方法１を使用して合成した。
コンジュゲート１０の細胞結合を、単独および１００当量の遊離ネオグリコペプチド５の存在下の両方でＨｅｐ  Ｇ２細胞を用いて試験し、細胞による取り込みが１０のネオグリコペプチド部分の肝炭水化物受容体への結合によって起こされるということを示した。対照として、５’末端をエチレンジアミンで修飾したオリゴ−ｍｐ（図２）もまた、同様の条件下でＨｅｐ  Ｇ２細胞と培養した。５’−ホスフェートのエチレンジアミンによる修飾は、５’−リン酸化２を０．１ＭのＥＤＡＣと０．１Ｍのイミダゾールを含む緩衝液中にてｐＨ７で３７℃にて２時間培養し、次いでｐＨ７．０に緩衝した０．３Ｍのエチレンジアミン  ヒドロクロリド水溶液で一晩培養することによって行った（Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｐ．Ｓ．；  Ｌｅｖｉｓ，  Ｊ．Ｔ．，  未発表の結果）。この修飾は、細胞ホスファターゼ活性による５’−ホスフェートの除去を防ぐ。
【００９５】
それぞれの例において、修飾されたオリゴ−ｍｐは２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地中にて１μＭの濃度で存在し、培養は３７℃で行った。単独で培養された場合、コンジュゲートは急速に細胞と結合し、わずか２時間後には細胞を直線型にロードして１０６細胞当たり７．８ｐｍｏｌにまでした（図６）。対して、１００倍過剰量の遊離５が１μＭコンジュゲートといっしょに存在していた場合、１０のアソシエーションは１０６細胞当たりわずか０．４２ｐｍｏｌであり、この値はネオグリコペプチドを含んでいない対照のオリゴ−ｍｐ６ｂで得られたものと基本的に同一であった（１０６細胞につき０．４９ｐｍｏｌ）。別の対照として、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞を１０倍過剰量の５が存在する中で６ｂと培養し、５と６ｂの間に共有結合がなくても、５がＨｅｐ  Ｇ２細胞による６ｂの取り込みを引き起こす可能性について調べた。２時間の培養後の６ｂとアソシエートした細胞の量は、１０６細胞当たりわずか０．６０ｐｍｏｌであり、これはコンジュゲート１０のときのものより有意に少ない。さらに、より長時間でのＨｅｐ  Ｇ２細胞による１０の取り込みを調べたところ（１μＭコンジュゲート、３７℃）、約２４時間で線形となり１０６細胞当たり２６．６ｐｍｏｌの値に達することがわかった（図７）。これらの実験の結果は以下のことを示す：（１）コンジュゲート１０は、アシアログリコプロテイン受容体に特異的に結合することによってＨｅｐ  Ｇ２とアソシエートする；（２）オリゴ−ｍｐとネオグリコペプチドの間の共有結合は、オリゴ−ｍｐとＨｅｐＧ２細胞とのアソシエーションの有意な増強のために必要である；および（３）ＨｅｐＧ２による１０の取り込みは、本研究で用いられた条件下では、２４時間まで飽和する様子はなかった。
【００９６】
実施例６
本実施例は、肝臓由来の細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）に対する１０の特異性を例示する。
化合物の細胞タイプ特異性もまた試験した。アシアログリコプロテイン受容体が肝細胞の表面に見られ、選択的にこの組織を標的にして様々な薬剤を送達するための効果的な方法であるということはよく立証されている（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  （編），  （１９９１），  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｔａｒｇｅｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。３つのヒト細胞系、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＬ−６０およびＨＴ１０８０を１ｕＭのコンジュゲート１０および２％ＦＣＳを含む培地で３７℃にて３時間および２４時間培養することによって、組織特異性を試験した。１０の有意な取り込みを示した唯一の細胞系はＨｅｐ  Ｇ２であった。３時間および２４時間培養した後、それぞれ１０６細胞当たり８．５および２６．７ｐｍｏｌがＨｅｐ  Ｇ２細胞とアソシエートした（図８）。それにひきかえ、ＨＬ−６０細胞およびＨＴ１０８０細胞は２４時間後に、それぞれ１０６細胞当たり０．１０および０．５３ｐｍｏｌしかアソシエートしなかった。
【００９７】
実施例７（図９）
本実施例はその他のヌクレアーゼ耐性バックボーンから成るオリゴマーを含む肝臓特異性ネオグリココンジュゲートの取り込みを例示する。
上記の実施例は、ＯＭＮＰ’ｓが肝臓特異的なリガンドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３にコンジュゲートされ、均一で定義されたネオグリココンジュゲートを生成できることを示している。さらに、このネオグリココンジュゲートは、特異的におよびインビトロで増強された割合で、肝癌由来の細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）によって取り込まれる。上記の結果によって、２’Ｏメチルリボース部分および交互のホスホジエステル／メチルホスホネート結合を含むホスホロチオエート（ｐｓ）オリゴマー（２’Ｏｍｅ−ｐｏ／ｍｐ）のような、その他のヌクレアーゼ耐性バックボーン修飾を伴ったオリゴヌクレオチドを考慮に入れるようになった。実験方法は実施例４および５で使用したものと同一である。これらの実験の結果はネオグリコ−コンジュゲートを含むＯＭＮＰで観察されたものと非常に類似していた。ホスホロチエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）オリゴマーを含むネオグリココンジュゲートは、コンジュゲート方法２によって合成した。ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ｐｓ５’ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧ３’（ＮＧ−１）を、コンジュゲーション方法２に記載した３’末端標識方法を用いて３５Ｓで標識すると、２４時間で１０６細胞当たり１７．２５ｐｍｏｌまでの直線的な取り込みを示した。それにひきかえ、対応のコンジュゲートされていないオリゴマーｐｓ５’ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧ３’は減少した割合でＨｅｐ  Ｇ２細胞によって取り込まれ、２４時間で１０６細胞当たり１．０１ｐｍｏｌであった。同様の様式において、２’ＯＭｅ交互性ｐｏ／ｍｐオリゴマー（ＹＥＥ（ａｈ−ＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−２’ＯＭｅ５’ＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵ３’）を含むネオグリコ−コンジュゲートは、２４時間で１０６細胞当たり２４．３ｐｍｏｌまでの直線的な取り込みを示した。対応するコンジュゲートされていないオリゴマー（２’ＯＭｅ５’ＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵ３’）は、分析したどの時点においても、１０６細胞当たり１ｐｍｏｌ未満の最小の取り込みを示した。全オリゴマーおよびネオグリココンジュゲートは２４時間まで細胞培養培地中で安定であった。これらの結果は独特のリガンド−リンカー複合体の送達有用性を示し、このシステムを他の治療薬剤の送達へ広げる基盤を我々に与えた。
【００９８】
実施例８（図１０）
本実施例は、インビトロにおけるＨｅｐ  Ｇ２．２．１５細胞による、ヌクレアーゼ耐性バックボーンから成るオリゴマーを含む肝臓特異性ネオグリココンジュゲートの取り込みを例示する。
Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞は、安定してＢ型肝炎ウイルスでトランスフェクトされた肝臓癌細胞である。実施例７で言及された２’ＯＭｅ  ｐｏ／ｍｐおよびｐｓオリゴマーの細胞取り込みは（両方とも、コンジュゲーション方法２で合成され、標識された）、実施例４および５に記載した方法を用いて分析した。結果は実施例７に記載された細胞取り込み実験と非常に類似していた。ｐｓオリゴマーを含むネオグリココンジュゲートは２４時間で１０６細胞当たり２０ｐｍｏｌまでの直線的で急速な取り込みを示し、一方で、対応のコンジュゲートされていないｐｓ−オリゴマーは２４時間で１０６細胞当たり１．０ｐｍｏｌ未満とよくアソシエートしなかった（図１０）。同様の様式で、２’ＯＭｅ  ｐｏ／ｍｐオリゴマーを含むネオグリココンジュゲートはＨｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞によって１０６細胞当たり２８．５２ｐｍｏｌまでの直線的で急速な取り込みを示し、一方で、２４時間の培養後、対応のコンジュゲートされていないオリゴマーは１０６細胞当たり１ｐｍｏｌ未満が取り込まれた。ネオグリココンジュゲートおよび細胞培養培地中のコンジュゲートされていないオリゴマーの安定性を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定した。どちらの場合にも、分解生成物は３７℃にて９６時間培養するまで見つからなかった。
【００９９】
前述の、３２Ｐ−標識オリゴ−ｍｐコンジュゲートを使用する細胞取り込み実験を拡大して、ネオグリコペプチド５およびその他のヌクレアーゼ耐性バックボーン（とりわけ、ｐｓおよび２’ＯＭｅ  ｐｏ／ｍｐ）から成るネオグリココンジュゲートとＨｅｐ  Ｇ２細胞との細胞アソシエーションを試験した。ホスホロチオエートオリゴマーを含むネオグリココンジュゲート、ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ｐｓ５’ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧ３’（ＮＧ−１）を、コンジュゲーション方法２を用いて標識すると、２４時間で１０６細胞当たり１７．２５ｐｍｏｌまでの直線的な取り込みを示した。それにひきかえ、対応のコンジュゲートされていないオリゴマーｐｓ５’ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧ３’は減少した割合でＨｅｐ  Ｇ２細胞によって取り込まれ、２４時間で１０６細胞当たり１．０１ｐｍｏｌであった。同様の様式において、２’ＯＭｅ交互性ｐｏ／ｍｐオリゴマー（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−２’ＯＭｅ５’ＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵ３’）を含むネオグリコ−コンジュゲートは、２４時間で１０６細胞当たり２８．５２ｐｍｏｌまでの直線的な取り込みを示した（図９；表６）。対応のコンジュゲートされていないオリゴマー（２’ＯＭｅ５’ＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵＣｐＡＧｐＵ３’）は、１０６細胞当たり１ｐｍｏｌ未満の最小の取り込みを示した。これらの結果は独特のリガンド−リンカー複合体の送達有用性を示し、このシステムを他の治療薬剤の送達へ広げる基盤を我々に提供した。
【０１００】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞において見られる増強された細胞取り込みは、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞においてもまた明らかである（図１０ａ）。ｐｓオリゴマーを含むネオグリココンジュゲートは２４時間で１０６細胞当たり２０ｐｍｏｌまでの直線的で急速な取り込みを示し、一方で、対応のコンジュゲートされていないｐｓ−オリゴマーは２４時間で１０６細胞当たり１．０ｐｍｏｌ未満とよくアソシエートしなかった。同様の様式で、２’ＯＭｅ  ｐｏ／ｍｐオリゴマーを含むネオグリココンジュゲートはＨｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５によって１０６細胞当たり２８．９７ｐｍｏｌまでの急速で直線的割合で取り込みを示し（図１０ｂ；表７）、一方で、２４時間の培養後、対応のコンジュゲートされていないオリゴマーは１０６細胞当たり１ｐｍｏｌ未満が取り込まれた。その他の肝臓特異的なリガンドを用いた研究者たちによって同じような結果が観察され、ＨＢＶとの安定したトランスフェクションはこれらの細胞における受容体活性を変えないという結論を出している（Ｗａｎｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，前述）。しかしながら、これらの送達システムは荷電されたｓａ−オリゴマーのみを送達することが明示されていただけだった。非荷電のＯＮＭＰ’ｓ、荷電ｓａ−オリゴマーおよび同程度の効果を伴う半荷電２’−ＯＭｅ  ＯＮＭＰ／ホスホジエステル交互性オリゴマーの細胞取り込みを増強するという意味で、本報告にて用いられた肝臓特異的リガンドは増大した実用性を示した。
【０１０１】
【表６】
2005518201.tif 000010
【０１０２】
【表７】
2005518201.tif 000011
【０１０３】
全動物生体分布および薬物動態学
実施例９
本実施例は、例として、３２Ｐ−標識Ａ−Ｌ−Ｐコンジュゲート（１０）を用いた全動物実験において利用される動物および方法を例示する。
材料：ダルベッコのホスフェート緩衝化生理食塩水ｐＨ  ７．２は、Ｍｅｄｉｔｅｃｈ，  （Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡ．）から購入した。溶媒和可能な組織可溶化剤は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  （Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）から購入した。Ｃｙｔｏｓｃｉｎｔシンチレーション流体は、ＩＣＮ  （Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，  ＣＡ）から購入した。シンチレーションバイアルは、Ｋｉｍｂｌｅ  Ｇｌａｓｓ，  （Ｖｉｎｅｌａｎｄ，  ＮＪ）から購入した。無水エーテルは、Ｊ．  Ｔ．  Ｂａｋｅｒ，  Ｓａｎｆｏｒｄ，  ＭＥから購入した。ＣＤ−１雄マウス（体重２２−３５グラム）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  （Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）から得た。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  フィルター（３０，０００  ＭＷＣ）は、（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）から得た。組織試料は、ＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーＭｏｄｅｌ  ＰＣＵ  ２−１１０  （Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔ．，  Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，  ＮＹ）を用いてホモジナイズした。
方法：簡潔には、親オリゴデオキシヌクレオシド  メチルホスホネート（オリゴ−ＭＰ），ＵｍｐＴ７を、［３２Ｐ］−ＡＴＰおよびＡＴＰで５’末端標識化して、３００μＣｉ／１４ｎｍｏｌの比活性を有するｐ＊ＵｍｐＴ７を得た（＊は、放射性核の位置を示す）。５’ホスフェートを、１−メチルイミダゾールおよび水溶性カルボジイミドの存在下で、シスタミンを用いて修飾した。得られたジスルフィドを、過剰のジチオスレイトールで還元し、ヘテロ二官能性架橋剤ＳＭＣＣを用いてリガンドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３とコンジュゲートした。コンジュゲート１０、［ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、ゲルから抽出し、ＳｅｐＰａｋカートリッジを用いて脱塩した。純粋なコンジュゲートを、酵素的および化学的の両方で特徴付けた。コンジュゲートの一部分を、ＧａｌＮＡｃ残基を完全に除去するために、Ｎ−アセチルグルコサミダーゼで処理し、１１、［ＹＥＥ（ａｈ）３］ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７、（Ｔｒｕｂｅｓｔｓｋｏｙ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２），  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ３：  ３２３−３２７）を得た。１０および１１の両方とも、ＰＡＧＥ分析によって判断して９９％を越える純度であった。コンジュゲートを含む溶液を、全動物生体分布および薬物動態学実験の準備において、滅菌試験管に置き、無菌条件下で凍結乾燥した。
【０１０４】
コンジュゲート１０および１１を、滅菌水に再溶解した。雄ＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（体重２２〜３５ｇ）に、尾静脈を介して、０．２  ｍＬの生理食塩水に含ませた７−３０ピコモルの［３２Ｐ］−［ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７（１０）または７ｐｍｏｌの［３２Ｐ］−［ＹＥＥ（ａｈ）３ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７（１１）の単回注射を受けさせた。１５、３０および６０分ならびに２、４、６および２４時間で、頸部の脱臼によってマウスを屠殺した。血液、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、上部および下部胃腸管、および便を収集し、重量を測定した。これらの器官および組織からの代表的な試料を、重量を測定し、ガラスバイアルに置いた。尿（注射後２時間）を収集するために、短いエーテル麻酔下でマウスの外尿道を結紮し、屠殺後、膀胱を取り出し、ガラスバイアル中に置いた。Ｓｏｌｖａｂｌｅｓ（登録商標）（ＮＥＮ；１ｍＬ）を各試料に加えた。次いで、試料を、スライドウォーマー上に置き、一晩消化させ、翌朝取り出して冷却した。消化した試料を、３〜７滴のＨ２Ｏ２（３０％ｗ／ｖ）で脱色し、１０ｍＬのＦｏｒｍｕｌａ  ９８９（ＮＥＮ）シンチレーションカクテルを加えた。放射能の量を、シンチレーション計数によって測定した（Ｐａｃｋａｒｄ  １９００  ＴＲ  ；＜３％誤差）。注射した用量のアリコートを、試料と共に計数し、器官またはグラム組織当たりのパーセント用量を計算した。
【０１０５】
雄ＣＤ−１マウス（体重２２〜３５ｇ）に、尾静脈を介して、４０ｐｍｏｌの［３２Ｐ］−［ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３］ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７（１０）の単回注射を受けさせた。１５、６０および１２０分後、動物を屠殺した。前述のように肝臓および膀胱を収集し、プラスチックバイアル中に置き、直ちに−８０℃で凍結させた。肝臓の試料を、０℃で解凍し、重量を測定した（平均質量０．２５ｇ）。組織を、４容積のアセトニトリル／水（１：１）中でホモジナイズした（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  ＰＣＵ−２−１１０  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）。遠心分離（１０，０００ｇ、２０分、０℃；Ｓｏｒｖａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ＲＣ−５Ｂ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｓｕｐｅｒｓｐｅｅｄ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）によって組織デブリスを除去した。上澄みを取り出し、抽出手順を繰り返した。肝臓試料からの放射能の典型的な回収は、脱色したホモジネートおよび上澄みのアリコート比較によって判断して、９０％であった。上澄みの一部分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルター（３０，０００  ＭＷＣ；２０分、０℃、１０，０００ｇ；Ｈｅｒｍｌ  Ｚ  ３６０  Ｋ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を通してろ過し、凍結乾燥した。残渣を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ、１５％、２０ｘ２０ｘ０．７５ｃｍ、２Ｖ／ｃｍ、４５分）による分析の準備において、１０ｍＬのホルムアミドローディング緩衝液（９０％ホルムアミド、１０％  １ｘＴＢＥ、０．２％ブロモフェノールブルーおよび０．２％キシレンブルー）に再溶解した。膀胱から尿を収集し、０℃まで解凍し、０℃にて３０分間、エタノール（１：２ｖ／ｖ）でタンパク質除去した。沈殿したタンパク質を、遠心分離（１６，０００ｇ、２０分、０℃）によって除去した。放射能の回収は、上澄みおよびタンパク質ペレットのアリコートを比較することによって、９０％であると概算した。上澄みの一部分を凍結乾燥し、ホルムアミドローディング緩衝液に再溶解し、ＰＡＧＥ（１５％、２０ｘ２０ｘ０．７５ｃｍ、２Ｖ／ｃｍ、４５分）によって分析した。標準は、完全長のコンジュゲート１０を、別々の反応において、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０中のＮ−アセチルグルコサミダーゼ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  （２００ｍＭ  ＫＣ１、ｐＨ８．０および０．１Ｎ  ＨＣ１を含有するＨＣｌ）中のキモトリプシンを用いて、それぞれ３７℃で３０分間、インキュベートすることによって作製した。
【０１０６】
細胞（約１０５）を、１μＭ［３２Ｐ］−標識１０を含有する媒質中で、２、４、８、１６および２４時間培養し、ＰＢＳ（２ｘ）で洗浄し、シリコンオイルに通してペレットにし、そして溶解した（０．５％  ＮＰ  ４０、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１４ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、３０％  ＡＣＮ）。溶解物を５０％水性アセトニトリル（ｖ／ｖ）で２回抽出した。抽出物を凍結乾燥し、ホルムアミドローディング緩衝液に再溶解し、そしてＰＡＧＥ（１５％、２Ｖ／ｃｍ、３０分）によって分析した。
【０１０７】
実施例１０
本実験は、アシアログリコプロテインリガンドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３を含有し、かつ３２Ｐで放射性標識された送達ビヒクルの、合成オリゴＭＰをマウスの肝臓に特異的に送達する能力を試験するためになされた全動物実験を例示する（図１１および１２）。
【０１０８】
比較のために、３つの末端ＧａｌＮＡｃ残基を欠損するコンジュゲートもまた、合成し、試験した。この糖なしコンジュゲートは、マウスにおけるリガンド（ＧａｌＮＡｃ）特異的取り込みの研究のための対照として役立った。
【０１０９】
コンジュゲート１０のインビボ組織および器官分布を調査するために、上記のように尾静脈を介してマウスに放射性標識したコンジュゲートを注射し、各器官に関連した放射能の量をシンチレーション計数によって決定した。表８は、コンジュゲートが肝臓と最も高程度にアソシエートし、注射後１５分で注射した用量の６９．９％の値まで達した。注射後１５分で測定した他の組織における合計の放射能の順位は、筋肉＞腎臓＞血液＞脾臓の順に減少した。尿の放射能のピーク値は、注射した用量の２８％であり、３０分後に到達した。腎臓および血液に関連する放射能の量は、時間の経過に伴い減少した。肝臓において生成したコンジュゲートの代謝産物は、胆汁排出を介して胃腸管に堆積するようになることが予想され得るが、放射能は、胆嚢、上部および下部胃腸管、および便にはほとんど関連しなかったことに注目すべきである。同様の結果が、マウスに低用量（７ｐｍｏｌｓ）のネオグリココンジュゲート１０を注射した場合に観察された（図１１；表９）。
【０１１０】
表１０は、３つの末端ＧａｌＮＡｃ残基を欠損するコンジュゲート１１が、筋肉＞血液＞腎臓＞肝臓＞脾臓の順で分布したことを示す。筋肉および肝臓の放射能の量は、一定に維持されているようであったが、血液および腎臓に関連する放射能の量は、２４時間の研究にわたって減少した。尿中の放射能のピーク値は、注射後３０分で３９．９％であった（図１２）。
【０１１１】
実施例１１
本実験は、アシアログリコプロテインリガンドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３を含有し、かつ３５Ｓで放射性標識された本発明の送達ビヒクルの、合成ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートオリゴマーをマウスの肝臓に特異的に送達する能力を試験するためになされた全動物実験を例示する（図１３）。
【０１１２】
実施例９に記載のように、雄ＣＤ−１マウスに、コンジュゲーション方法２に記載の３’−末端標識化方法を利用して標識した３０ｐｍｏｌｓのネオグリココンジュゲートＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３−ＳＭＣＣ−ｐｓ−（ＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴ）−｛３５Ｓ｝（ｐｓＡ）ｎを注射した。比較のために、３つの末端ＧａＩＮＡｃ残基を欠損するコンジュゲートＹＥＥ（ａｈ）３−ＳＭＣＣ−ｐｓ−（ＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴ）−（ｐｓＡ）ｎ［３５Ｓ］もまた合成した。この糖なしコンジュゲートは、マウスにおけるリガンド（ＧａｌＮＡｃ）特異的取り込みの研究の対照として役立った。実験結果は、実施例１０で観察された結果に非常に類似していた。末端糖残基を含有するコンジュゲートは、肝臓と最も高程度にアソシエートしており、注射後１５分で注射した用量の４６．１９  ％の値に達した。注射後１５分で測定した他の組織における合計の放射能の順位は、筋肉＞血液＞腎臓＞脾臓の順に減少した。尿の放射能のピーク値は、注射した用量の４．５１％であり、１５分後に到達した。腎臓および血液に関連する放射能の量は、時間の経過に伴って減少した。
【０１１３】
３つの末端ＧａｌＮＡｃ残基を欠損するコンジュゲートは、肝臓によって減少したレートで取り込まれ、３０分で注射した用量の２３．６７％のピークに到達した。このコンジュゲートは、４時間以内に血液および尿から除去された。
【０１１４】
【表８】
2005518201.tif 000012
【０１１５】
【表９】
2005518201.tif 000013
【０１１６】
【表１０】
2005518201.tif 000014
【０１１７】
実施例１２
本実施例は、マウス肝臓およびＨｅｐ  Ｇ２細胞から単離されたコンジュゲート１０の代謝産物のポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を例示する。
【０１１８】
図１４は、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞とともに２〜２４時間インキュベーションした後のコンジュゲート１０の代謝のＰＡＧＥ分析の結果を示す。コントロール反応に対するそれらの電気泳動での移動度に従って、３つの種類の代謝産物が同定される（図１４；Ｉ〜ＩＩＩと分類した）。種類Ｉは、４つの化学的に異なる種からなるようであり、ここで、ＩおよびＩＩは全ての時点で優勢である。ＩおよびＩＩの分布は、最も初期の時点で約１：１であり、インキュベーション時間が長くなるとＩＩの優勢にシフトする。この種類の第３の代謝産物は、Ｉのキモトリプシン消化によって産生する物質と同時に移動し、また各時点で観察される。この種類の相対量は、最終時点（２４時間）（ここではほとんど残っていない）まで本質的に一定のままである。第４の未同定の種は、３よりもわずかに遅い移動度を有し、最終を除いて全ての時点で観察される。全ての種類Ｉの代謝産物は、最終時点までに徐々に量が減少するようである。種類ＩＩの代謝産物は、種類Ｉの種と比較した場合により大きな電気泳動の移動度を有する放射性標識された種からなる。少なくとも５つのバンドが観察されるが、それらの全てが各時点で存在するとは限らない。例えば、最も高い移動度および最も低い移動度の位置でのバンドは、２４時間で減少するよりも１６時間の時点までで増加するようである。同様の挙動は、優勢な種について観察される。このバンドの最大強度は、８時間で生じ、続いて２４時間までに徐々に減少する。種類Ｉの代謝産物で観察されたように、すべての種類ＩＩの代謝産物は、２４時間の時点までに量が減少するようである。種類ＩＩＩの代謝産物は、ゲルマトリクス中で非常に不動であり、大部分はポリアクリルアミドゲルの壁に留まっている。このバンドの強度は、時間の経過と共に増加し、２４時間で最大値に到達する。
【０１１９】
無傷のマウス肝臓における１０の代謝の結末の分析を、同様の方法で実施した。図１５は、［３２Ｐ］標識化コンジュゲート１０を注射したマウスの肝臓試料から得た肝臓ホモジネート抽出物のＰＡＧＥ分析の結果を示す。
【０１２０】
注射後１５分後、有意な量の無傷のコンジュゲート１０が残存している（図１４；種類Ｉの代謝産物）。ゲルの解析は、２つの種間の識別を可能にするのに十分ではない。この試料中の残りの放射標識された種は、ＩおよびＩＩよりも有意に早く移動し、いずれの対照とも同時に移動しなかった。これらの代謝産物は、より広範囲の移動度を有しているようであり、最も遅いものは、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞で同定された種類ＩＩの代謝産物よりも有意に移動しない（種類ＩＩ’）。より後の時点では、ほとんど全ての無傷な１０（図１６）は消失し、一方、種類ＩＩ’の代謝産物の量が増加するようである。
【０１２１】
図１７は、放射標識されたコンジュゲート１０の静脈内投与後のマウス尿において観察された代謝産物のパターンを示す。種類Ｉの代謝産物は、検出された唯一の放射標識された種である。コンジュゲートは、２つの種（これらの両方とも、いずれの対照とも同時に移動しない）に変換された少ないが有意な量の物質と大いにインタクトであるようである。各々の相対量は、実験期間にわたって一定のままであるようである。マウス尿中では、種類ＩＩ、ＩＩ’またはＩＩＩの代謝産物は観察されない。
【０１２２】
本明細書中に記載した証拠は、［３２Ｐ］標識されたコンジュゲート１０（これは、化学的に定義され、均一である）が、リガンドおよび細胞型の両方に特異的であるようにＨｅｐ  Ｇ２細胞の細胞膜を交差できることを示す。これらの研究の論理的な拡張は、インビボでのＩの組織分布を決定すること、インビトロとインビボでの１０の代謝の結末を比較すること、およびそのデータを３つの末端ＧａｌＮＡｃ残基を欠損するコンジュゲート１１で得られたデータと比較することであった。
【０１２３】
インビボ組織分布のデータは、培養したヒト細胞で得られた結果を確証する。肝臓に対するオリゴデオキシヌクレオシドメチルホスホネートの高度に選択的なターゲティング（ｉ．ｄ．の７．０±１０％）は、オリゴマーとアシアログリコプロテインレセプター（ＡＳＧＰ）リガンド、ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３との共有結合を介して効果的に達成された。実際、全組織測定に基づいて、肝臓中のコンジュゲートの濃度は、血液中で見出される濃度よりも２５倍高く、筋肉中の濃度よりも約１０倍高かった（図１１）。肝臓にとってのコンプレックスの優位性は、重要ではなかった。なぜなら、脾臓、肺、および腎臓は、同様に放射標識オリゴ−ｄＮを蓄積したからである（例えば、各組織の分布は、注射後５分後で、それぞれグラムあたり、注射した用量の約６、４、２および２％であった（Ｌｕら、１９９４、前述）。我々の結果を、Ｅｉｃｈｌｅｒら（１９９２、前述）によって報告された結果（ここでは、肝臓取り込みの生体分布およびレートを、脂質低下（ｈｙｐｏｌｉｐｉｄａｅｍｉｃ）薬であるアンサマイシンについて、単独または別の三本鎖ＡＳＧＰリガンドＮ−［トリス［（β−Ｄ−ガラクトピラノシロシル）メチル］−メチル］−Ｎ−α−（アセチル）グリジンアミド（トリス−ガラセテート）に共有結合したものの両方について、ラットにおいて測定した）と比較することは、さらに興味深い。著者は、遊離薬物およびコンジュゲートの肝臓取り込みがおおよそ等価であり、それらを三本鎖ＡＳＧＰリガンドがラット肝臓による薬物の取り込みを増強しなかったとの結論に導いたことを報告した。この結果は、マウス肝細胞による取り込みがリガンドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３の共有結合によって大いに容易になるという我々の知見とは対照的である。
【０１２４】
対照として、マウスにコンジュゲート１１を注射した（これは３つの末端ＧａｌＮＡｃ残基を欠損し、従って、ＡＳＧＰレセプターによって認識されない）。予想されるように、肝臓では、放射能はほとんど検出されず、はるかに多くの量の放射能が他の組織と関連していた（図１２）。この結果は、肝細胞に対する放射標識オリゴ−ｍｐのターゲティングが、リガンドに対するその共有結合の結果であったという我々の以前の知見に拡張された。
【０１２５】
トリチウム標識１２ｍｅｒ（ｄ−Ｔｐ＊ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧ）（最後の５’末端ホスホジエステル結合以外は全てメチルホスホネートバックボーンからなる）を、マウスに単回用量で静脈内注射した。薬物投与後２、５、１０、３０、６０および１２０分で器官を収集した。データは、放射能が、肝臓、肺、筋肉または脾臓に配分されておらず、血漿から腎臓および尿に迅速に消失したことを示す。ＨＰＬＣ研究は、インタクトな１２ｍｅｒが、末端ヌクレオチドの酵素的開裂によって１１ｍｅｒに代謝され、その両方が静脈内注射後に迅速に尿に排出されたことを示した。従って、本明細書中で報告した結果は、以前に得られた結果と良好に一致し、オリゴマーコンジュゲートの取り込みを肝臓に指向することにおけるＧａｌＮＡｃ末端の重要性を示す。
【０１２６】
上記結果を、ＣＤ−１マウスの肝臓への荷電したヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートオリゴマーの送達を考慮することに拡張した。この結果は、末端糖残基を含有するコンジュゲートが、末端ＧａｌＮＡｃ残基を欠損するコンジュゲートのレベルの２倍よりも大きなレベルで送達されたことを示した。ＯＮＭＰ’ｓと比べて肝臓における末端ＧａｌＮＡｃ残基を欠損するコンジュゲートを含むホスホロチオエートの高い濃度は、ホスホロチオエートオリゴマー自体の特徴であり、文献にも記載されてきた。しかしながら、末端ＧａｌＮＡｃ残基を含むコンジュゲートによるこれらのオリゴマーの肝臓への送達が上昇することは、異なる荷電構成の生体分子の特異的送達に適応できるような本方法の実用性を示している。
【０１２７】
コンジュゲート１０のインビトロおよびインビボの代謝経路を調べるために、我々は培地で増殖させたＨｅｐ  Ｇ２細胞から、並びにマウスの肝臓および尿から得た抽出物をＰＡＧＥ分析で試験した。我々は、３つの種類の代謝物質（種類Ｉ〜ＩＩＩ）がＨｅｐ  Ｇ２細胞およびマウスの肝臓で生成される一方で、マウスの尿からは種類Ｉの代謝物質しか単離されなかったことに気づいた。種類Ｉ代謝物質はリガンドの分解によって生じるようであった。２つの酵素反応を使ってこれらの種の生成をモデル化しようと試みた（Ｎ−アセチルグルコサミダーゼおよびキモトリプシン）。前者の処理は２を産出し、それは３つの末端ＧａｌＮＡｃ残基の欠損に起因する僅かな質量の減少により、１より僅かに速く移動した。後者の処理は、大部分のリガンドの欠損および全体の荷電の−１から−２への増加の両方に起因する実質的に増強された移動度をもたらした（図１６）。これらの２つのモデル反応は、無傷の放射標識オリゴ−ｍｐに共有的に結合したままの修飾されたリガンドを伴う化合物を生成した。したがって、ゲルの同じ部分へ移動するその他の種が、Ｉのその他の不安定な箇所における結合切断によるものではなく、リガンドの分解によるものであると結論付けることは理にかなっている。例えば、１つのアミノヘキシル側鎖アミド結合の加水分解は２と３の間の質量を有する５（図１６）を産出し、負荷電の−１から−２への増加をもたらす。本実施例において、２と３の間の移動度を有する種がＰＡＧＥ分析によって予想される。種類ＩＩ代謝物質は種類Ｉとして同定されるものよりもかなり速く移動する。それは、オリゴ−ｍｐの５’末端にある単ホスホジエステル結合の予期しない加水分解によって生じると我々は提案する。切断が見られないヘビ毒ホスホジエステラーゼによって行われるモデル反応に基づいて、この箇所がエンドヌクレアーゼによる切断に対し安定である（Ｓｐｏｒａｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９，前述）ということが予想された。この箇所での切断は１０の残りからオリゴ−ｍｐの末端７ヌクレオチドを放出し、そして、もっとも重要なことには、放射標識されたホスフェートを含む単ヌクレオチドをもつ比較的低分子量の種を生成する（図１６；１５）。リガンドのさらなる分解は種類ＩＩ代謝物質として同定される多数の種を生成する。Ｈｅｐ  Ｇ２細胞のみで見られた種類ＩＩＩ代謝物質は、ゲルへと短距離を移動する放射性リンを含有する高分子量の種のようである。Ｉからの放射性ホスフェートの放出および続くその高分子量細胞構造（核酸または蛋白質）への取り込みは、このバンドの原因となる。エンドソームコンパートメントが成熟するにつれて酸性化し、リソソームと融合する前に５．５という低さのｐＨに達することはよく立証されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  １９８５，  前述）。さらに、オリゴ−ｍｐとリガンドを結んでいるホスホロアミデートは酸性条件下で加水分解して１３を生じる傾向がある（図１６）。エンドソームコンパートメントの酸性化がＰ−Ｎ結合の加水分解を起こすという可能性を調べるため、Ｉを３７℃にて、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム中においてｐＨ５．５および６．０でインキュベートした。ＩはｐＨ６では安定していたが、ｐＨ５．５��は２４時間で実質的に１３へ加水分解（＞５０％）されたこと、およびＰＡＧＥ分析によってわかったように加水分解はホスホロアミデートＰ−Ｎ結合において特異的に起こったということを、我々は観察した（データ示さず）。したがって、Ｉを含むエンドソームコンパートメントの酸性化によるＰ−Ｎ結合の加水分解によって、放射性ホスフェートの細胞構造への取り込みが起こり、そしてホスファターゼ活性による末端ホスフェートの細胞環境への放出が起こるということを結論付けるのは理にかなっている。
【０１２８】
Ｈｅｐ  Ｇ２細胞からの抽出物において見られる代謝物質のプロファイルは、それぞれの種類の代謝物質を含む。早い時点では、放射活性の大部分は種類Ｉ種、主にＩおよびＩＩに含まれている。遅い時点では、代謝物質の分布は種類Ｉから種類ＩＩおよびＩＩＩへ変動し、サンプリングした最後の時点では、放射性リンの大部分は種類ＩＩＩ代謝物質に属している。これは、Ｐ−Ｎ結合の実質的な加水分解が実験の経過中に起こっていたことを示している。いったんＨｅｐ  Ｇ２細胞に取り込まれるとＩは有意に代謝されるということは容易に明らかであり、これはアンチセンスオリゴ−ｍｐまたはその他の剤の細胞内送達が本方法によって実現可能になることを示唆している。
【０１２９】
Ｎ−Ｐ結合においてリンだけが３２Ｐで標識されるという事実により、オリゴヌクレオチドアナログの代謝経路を調べるのは不可能である。オリゴヌクレオチドの広範な代謝は、細胞内の相補核酸配列と特異的に相互作用する能力に不利に作用するので、他の位置で標識されたオリゴヌクレオチド配列を用いる研究がこれから行われる必要がある。
【０１３０】
マウスの肝臓および尿から得た抽出物のＰＡＧＥ分析の結果は、マウスの肝臓における代謝物質の生成が２つの点でＨｅｐ  Ｇ２細胞で見られたものと異なるということを示している。１つ目は、肝臓における種類ＩＩ’代謝物質を生成するための１０の消化が有意により早く、わずか１時間後には放射活性のほとんどがこれらの種で見つかった。２つ目に、肝臓における種類ＩＩ’代謝物質の移動度およびプロファイルが培養された細胞における種類ＩＩ代謝物質と異なり、このことはＩによって見つかった酵素活性がマウスの肝臓においてと、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞においてとでは異なることを示唆している。２時間の時間経過の間、種類ＩＩＩ代謝物質はほんの僅かしかまたはまったく生成されなかった。この結果はＨｅｐ  Ｇ２細胞の結果と一致する。マウスの肝臓における１の広範な分解とは対照的に、尿における代謝物質のパターンはそれほど複雑ではなく、もっぱら種類Ｉ代謝物質から成るようである。肝臓および尿で見られた代謝物質のパターンが異なるということは、コンジュゲートが肝臓細胞へ送達されたこと、そして器官の間隙には単独で存在していなかったということを示唆している。
【０１３１】
化学的に定義され、構造的に均一なネオグリコペプチド−オリゴデオキシヌクレオシドメチルホスホネートコンジュゲート１０のインビボ分布および代謝は、このコンジュゲートの送達が非常に効率的であり、注入の１５分後の肝臓において注入した量の約７０パーセント（７０％）のレベルに達することを示している。リガンドの急速で広範な分解と合わせて、これらの結果は、メチルホスホネートかその他のアナログのいずれかであるアンチセンス剤および他の治療上有効な薬を送達するための本方法が非常に有用であるということを示している。さらに、これらの結果は、アンチセンス部分の核酸特異性へ結合するリガンドの組織特異性を利用する画像診断法の可能性を示し、インビボでの細胞機能の局所異常性を従来知られていない特異性で測定する方法を提供する。
【０１３２】
抗ＨＢＶ  ネオグリココンジュゲートの生物有効性
実施例１３
本実施例は抗ＨＢＶネオグリココンジュゲートの生物有効性を評価するために用いる材料および方法を例示する。
材料：ダルベッコのリン酸緩衝食塩水ｐＨ７．２、トリプシン／ＥＤＴＡ（．０５％トリプシン：０．５３ｍｍ  ＥＤＴＡ）、ＲＰＭＩおよびＦＣＳはＭｅｄｉａｔｅｃｈ  （Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，  ＶＡ）より購入した。Ｇ４１８およびニック翻訳キット（Ｔｈｅ  Ｎｉｃｋ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  ＮＹ）から購入した。ＡｕｓｙｍｅモノクローナルＨＢｓＡＧ検出キットはＡｂｂｏｔｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｎａｐｉｅｒｖｉｌｌｅ，  ＩＬ）から購入した。ＨＢｓＡＧ標準はＣｈｅｍｉｃｏｎ  （Ｔｅｍａｃｉａ，  ＣＡ）から得、３２Ｐ  ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から得て、そしてＰｒｏｂｅｑｕａｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｐｉｎカラムはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から購入した。４８ウェル組織培養処理プレートはＣｏｓｔａｒ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）から、１．５ｍｌ微量遠心チューブはＳａｒｓｔａｄｔ  （Ｎｅｗｔｏｎ，  ＮＣ）から、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎナイロン膜はＮＥＮ  （Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）から、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＩＡプレートリーダーおよび−４９２ｎｍ波長フィルターはＢｉｏＴｅｋ  （Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  ＶＴ）から、そしてＦｕｊｉｘ  Ｂａｓ  １０００ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）およびイメージングプレートはＦｕｊｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｓｔａｍｆｏｒｄ，  ＣＮ）から購入し、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞はＤｒ．  Ｇ．  Ｗｕからの親切な贈呈物であり、４％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ培地で維持した。細胞はＣｏｕｌｔｅｒ計数器モデルＺＢＩ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，  Ｈｉａｌｅａｈ，  ＦＬ）を用いて数えた。ＨＢＶ特異性のプローブ（ＡＭ−１２の３．２ｋｂフラグメント）はＧｅｏｒｇｅｔｏｗｎ大学のＤｒ．  Ｂｒｅｎｔ  Ｋｏｒｂａからの親切な贈呈物であった。
方法：本研究で利用された３つの治療用ネオグリココンジュゲートは、以前からインビトロでＨＢＶ複製を阻害することが示されている（Ｋｏｒｂａ  ａｎｄ  Ｇｅｒｉｎ，  １９９５，前述）以下のｐｓ−オリゴマーの肝臓特異的なリガンドドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３へのコンジュゲーションによって合成した。：（１）表面抗原遺伝子（ｓａ−ｇｅｎｅ）の翻訳開始部位を標的とする５’ＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＣＡＧ３’、（２）コア遺伝子（ｃ−ｇｅｎｅ）の翻訳開始部位を標的とし、ＨＢＶポリアデニル化部位と重複する５’ＴＴＴＡＴＡＡＧＧＧＴＣＧＡＴＧＴＣＣＡＴ３’、（３）ＨＢＶプレゲノムのエンキャプシデーション部位（ｅ−ｓｉｔｅ）の不対ループを標的とする５’ＡＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡ３’。本研究でオリゴマーを合成するために使った塩基配列は、ＨＢＶサブタイプａｙｗ（Ｇａｌｉｂｅｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７９），  Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄｏｎ），  ２８１：６４６−６５０）であり、これはＨｅｐＧ２  ２．２．１５によってインビトロで発現されたサブタイプと同じである（Ａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７），  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８４：４６４１−４６４４）。加えて、ＨＢＶゲノムに非相補的である２つのさらなるｐｓ−オリゴマー、ＮＧ４：５’ＴＧＡＧＣＴＡＴＧＣＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＴＴ３’およびＮＧ５：５’ＴＣＣＡＡＴＴＡＧＡＴＣＡＧ３’を、ｐｓ−ネオグリココンジュゲートの非特異的な効果を評価するための対照として調製した。
【０１３３】
オリゴヌクレオチドの抗ウイルス活性を、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞のコンフルエント培養を用いて評価した。ＨＢＶトランスフェクションしたヒト肝臓癌細胞系、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞を４ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭＩ＋４％ウシ胎児血清で維持し、３７℃にて加湿雰囲気中の５％ＣＯ２で培養した。培養は週に２〜３回再フィード（ｒｅ−ｆｅｄ）した。細胞をＧ４１８で選択し、２〜３継代ごとに再選択した。４ｍＭのグルタミンを含むＲＰＭＩ＋２％ウシ胎児血清で、３〜５×１０４細胞／ウェルの密度にて４８ウェルプレートへ細胞を植え、コンフルエントになるまで３〜４日生育させた。この時点で、１．０μＭから２０μＭの範囲の濃度における、上記ｐｓ−オリゴマーを含むネオグリココンジュゲートか、またはそれに対応するコンジュゲートされていないオリゴマーのみで、処理を開始した。細胞数をモデルＺＢ  Ｉ  Ｃｏｕｌｔｅｒを用いて計った。Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞では、ＨＢＶ複製はこの密度でのみ安定した最大レベルに達することが示されている（Ｓｅｌｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８），  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：８３６−８４４）という事実に基づいて、コンフルエント培養を用いた。すべての処理を３回行い、９６時間続けた。抗ウイルス効果を以下に詳述するように評価し、阻害の程度を判定するために未処理の対照培養と比較した。値は６回の試行の平均±１標準偏差として報告した。
【０１３４】
Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞によるＨＢＶ表面抗原発現への抗ウイルス性処理の効果を、Ａｕｓｙｍｅモノクローナルキット（値がアッセイの直線的なダイナミック・レンジ内になるように試験試料を希釈した）を用いた半定量ＥＩＡ分析（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２），  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  １６５：９２９−９３３）によって判定した。ＨＢｓＡＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，  Ｔｅｍｅｃｉａ，  ＣＡ）を用いた標準曲線を各分析セットに含めた。値をＢｉｏ−Ｔｅｋ  ＥＩＡプレートリーダーで、４９２ｎｍの固定波長にて計った。
【０１３５】
すでに記載されている手順の変形（Ｋｏｒｂａ  ａｎｄ  Ｍｉｌｍａｎ，  （１９９１），  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，  １５：２１８−２２８；  Ｋｏｒｂａ  ａｎｄ  Ｇｅｒｉｎ，  （１９９２），  前述）を用いる定量的ドットブロットハイブリダイゼーション法によって、細胞外ＨＢＶのＤＮＡを分析した。実験および対照の培地試料を遠心分離し、同量の１ＮのＮａＯＨ−１０×ＳＳＣで処理して、室温で３０分間インキュベートした。次いで、ドットブロット装置を用いて、予浸した（０．４トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）ナイロン膜に試料を直接付与した。膜を０．５ＭのＮａＣｌ−０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和し、２×ＳＳＣにてすすぎ、８０℃で２時間ベーキングした。
【０１３６】
精製された３．２ＫｂのＥｃｏ  Ｒ１  ＨＢＶフラグメント（Ｋｏｒｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）を、ニック翻訳キットを用いて［３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識し、ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｐｉｎカラムを用いて精製した。６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳおよび１２５μｇ／ｍｌの変性した、剪断したサケ精子ＤＮＡを含んだ溶液にて、ブロットを４２℃で３〜４時間プレハイブリダイズした。同じ組成に１０％硫酸デキストランを加えた溶液において、ハイブリダイゼーションを１８〜２２時間行った。続いてブロットを４２℃で洗浄し、Ｆｕｊｉｘ  Ｂａｓ  １０００ホスホイメージャーで濃度測定した。これらの測定値を各々のブロットに対応する既知量のＨＢＶ  ＤＮＡ標準と比較することによって、ビリオンＤＮＡレベルを判定した。
【０１３７】
実施例１４
本実施例は、インビトロでＨｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞におけるＨＢＶ複製の重要な要素を標的とする肝臓特異的なネオグリココンジュゲートの生物有効性を例示する。
ネオグリココンジュゲートのＨＢＶ遺伝子発現に対する効果を評価するため、表面抗原遺伝子、コア遺伝子若しくはエンキャプシデーションシグナルを標的とする、ネオグリココンジュゲートまたは対応するオリゴマーのみのどちらかが単量存在する中で、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞のコンフルエントな単層を９６時間培養した。培地中のＨｂｓＡＧおよびＨＢＶビリオンＤＮＡの蓄積の両方に対するこれらの処理の効果を評価した。結合の特異性は、ランダムｐｓ−オリゴマーを含むネオグリココンジュゲートで、またはランダムｐｓ−オリゴマーのみで、細胞を処理することによって確かめた。
【０１３８】
細胞培養培地中のＨＢｓＡＧ蓄積への抗ウイルス処理の影響は、どの遺伝子配列を標的とするかによって変化した（図１８、Ａ：抗−Ｓ、Ｂ：抗−Ｃ、Ｃ：抗−Ｅ、  塗りつぶした棒＝未処理の対照、斑点の棒＝ネオグリココンジュゲート、斜線の棒＝コンジュゲートされていないオリゴマー）。ＨＢＶ表面抗原遺伝子を標的とするＮＧ１の処理は、２０μＭの濃度にて培地中のＨｂｓＡＧ蓄積を１１６３ｎｇ／１０６細胞から３４２ｎｇ／１０６細胞へと７０％減少させ、１０μＭで６２２ｎｇ／１０６細胞へと４７％減少させた。その一方、対応するコンジュゲートされていないオリゴマーは、ＨＢｓＡＧ発現を２０mＭで５００ｎｇ／１０６細胞へ４３％減らし、１０μＭで８８５ｎｇ／１０６細胞へと２４％減少させた。ネオグリココンジュゲートもオリゴマー単独のどちらも、１０μＭ以下の濃度ではＨＢｓＡＧ発現に大きな影響を有さなかった。またコア遺伝子を標的とするネオグリココンジュゲートのＨＢＶ複製への影響を試験した。ＮＧ２での処理は、ＨＢｓＡｇの１０６１ｎｇ／１０６細胞から６９９．９ｎｇ／１０６細胞への穏やかな減少をもたらし、これは未処理の対照と比較すると３５％の阻害であった。それより低い濃度では顕著な阻害は見られなかった。ｃ−遺伝子を標的とするコンジュゲートされていないオリゴマーとの処理は、顕著なＨｂｓＡｇの阻害をもたらさなかった。Ｅ−部位の上部ステムループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を標的とする、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞のＮＧ−３との処理は、どの濃度においても顕著なＨｂｓＡＧ蓄積の減少をもたらさなかった。対応するコンジュゲートされていないオリゴマーで同様の結果が見られた。
【０１３９】
より特筆すべきは、細胞培養培地中のＨＢＶビリオンＤＮＡ蓄積に対する抗ウイルス処理の効果である（図１９、Ａ：抗−Ｓ、Ｂ：抗−Ｃ、Ｃ：抗−Ｅ、  塗りつぶした棒＝未処理の対照、斑点の棒＝ネオグリココンジュゲート、斜線の棒＝コンジュゲートされていないオリゴマー）。この場合、それぞれのネオグリココンジュゲートはビリオンＤＮＡ蓄積を、対応するコンジュゲートされていないオリゴマーより有意に大きな度合いで阻害した。用量応答はすべての場合に見られた。
【０１４０】
ＮＧ３での処理は、培地中のＨＢＶビリオンＤＮＡの減少に一番大きな影響を有していた。未処理の対照と比較して８０％以上の減少が、１に至るまでのすべての濃度において見られた。より低い濃度のＮＧ−３は徐々に効果を失い、０．１μＭで有意な阻害は見られなくなった。対応するコンジュゲートされていないオリゴマーでの処理は、ビリオンＤＮＡをそれぞれ２０および１０μＭの濃度で８０％未満に減少させた。より低い濃度では、未処理の対照レベルが１〜２μＭの間の濃度に達するまで、ビリオンＤＮＡレベルは徐々に増加した。
【０１４１】
コア遺伝子を標的とするＮＧ−２はビリオンＤＮＡ蓄積を有意に減少させるが、ＮＧ−３よりは度合いが少ない。この場合、ＤＮＡは５μＭの濃度に至るまで８０％を超えて減少した。対応するコンジュゲートされていないオリゴマーもまた２０μＭの濃度で８０％を超えてビリオンＤＮＡ生成を減少させた。しかしながら、その後、未処理の対照レベルが１μＭに達するまでのすべての濃度において、ネオグリココンジュゲートは約４倍より効果的であることが判明した。
【０１４２】
ＮＧ−１処理での処理はまた、細胞培養培地におけるビリオンＤＮＡの有意な減少をもたらした。未処理の対照と比較して、レベルは１０μＭの濃度で７０％を超えて減少した。より低い処理濃度において、対照レベルが１〜２μＭに達するまで、ビリオンＤＮＡレベルは上昇した。再度、コンジュゲートされていないオリゴマーは、２０μＭの濃度でビリオンＤＮＡを同様の程度に抑制した。しかしながら、ネオグリココンジュゲートはその後２μＭに至るまですべての濃度において４〜５倍より効果的であることが判明した。
【０１４３】
上記の処理の特異性を確認するため、ＨＢＶゲノムのあらゆる部分に対して非相補的であるランダムｐｓ−オリゴマーを合成した（ＮＧ４およびＮＧ５）。オリゴマーまたはネオグリコ−コンジュゲートのいずれかにおけるＮＧ４およびＮＧ５との処理は、３０μＭの濃度において細胞培養培地でのＨＢｓＡＧまたはビリオンＤＮＡ蓄積に対し顕著な影響は有さなかった（図２０、Ａ：ＨＢｓＡＧ蓄積に対するＮＧ−４の影響、Ｂ：ＨＢｓＡＧ蓄積に対するＮＧ−５および対応するオリゴマーの影響、Ｃ：ＨＢＶビリオンＤＮＡ蓄積に対するＮＧ−４および対応するオリゴマーの影響、Ｄ：ＨＢＶビリオンＤＮＡ蓄積に対するＮＧ−５および対応するオリゴマーの影響。塗りつぶした棒＝未処理の対照、斑点の棒＝ネオグリココンジュゲート、斜線の棒＝コンジュゲートされていないオリゴマー）。
【０１４４】
実施例１５
本実施例は細胞培養培地におけるホスホロチオエート  ネオグリココンジュゲートの安定性の研究を例示する。
本研究にて用いられたネオグリココンジュゲートおよびコンジュゲートされていないホスホロチオエートオリゴマーのインビトロ安定性を、ＰＡＧＥ分析によって測定した。ネオグリココンジュゲートＮＧＩ−５およびそれらのコンジュゲートされていない形態のものを、ＲＰＭＩ＋２％ＦＣＳ中にて、３７℃で２４時間、４８時間、９６時間培養した。２μＭのネオグリココンジュゲートまたはコンジュゲートされていないオリゴマーのいずれかを含むアリコートを、１０μＭのゲルローディング緩衝液に加え、７Ｍの尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル上で８００Ｖにて２０分間、電気泳動にかけた。結果として得られたゲルをＦｕｊｉｘ  Ｂａｓ  １０００ホスホイメージャー（Ｆｕｊｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｔａｍｆｏｒｄ，  ＣＴ）で分析した。すべてのネオグリココンジュゲートおよびオリゴマーは９６時間まで細胞培養培地中で無傷で残っていた。
【０１４５】
実施例１６
本実施例は、ホスホロチオエート  ネオグリココンジュゲートの毒性分析を例示する。
本実施例で用いるそれぞれの処理の毒性を、トリパンブルー排除法によって測定した。測定は抗ウイルス実験で用いたものと同じ培養条件下で行った。どの濃度においても、いずれの処理でも大きな毒性は見られなかった。処理期間後、生き残った細胞の数を、トリパンブルー排除法を用いて顕微鏡で測定した。それぞれのウェルで、最小で少なくとも２００細胞が数えられた。すべての測定は３つ組のウェルで行った。
【０１４６】
本発明は、その精神またはその必要な性質から離れることなく、その他の形態で実施しうる。したがって本実施形態は、例示されたすべての側面において考慮に入れられるが、制限的なものではない。よって、ここで記載された方法を用いて、莫大な数の化合物を合成できるということは理解されるべきである。ここに記載されたすべての方法は、他に記述がないか、文脈から明らかに矛盾していない限り、適したどのような順においても行うことができる。本明細書で挙げた特許、特許出願、およびその他の文献はすべて、それぞれの引用が個々に、そして具体的に言及することによって本願に含まれ、すべてここに規定されるのと同様に、本願に含まれる。
【０１４７】
本発明を表す文脈における、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および似たような対象は（特に請求項の文脈におけるもの）、他に記述がないか、文脈から明らかに矛盾していない限り、単数および複数の両方を網羅すると解釈する。ここでの値の範囲の列挙は、他に記述がない限り、単に範囲内の個々の値を個別に言及する簡略方法として挙げることを意図しており、ここの値は個別に本明細書に言及されているのと同様に、明細書に含まれる。
【０１４８】
ここで提供されたすべての実施例、または例示的な言葉（例えば、「〜のような（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）は、単に本発明をより解明することを意図しており、他に請求されていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるどの言葉も、本発明の実行に必要な非請求の要素を意図していると解釈されるべきではない。本発明は、規定の法によって許されているように、ここに付加する請求項において言及された題材のすべての改変および同等物を含む。さらに、他に記述がないか、文脈から明らかに矛盾していない限り、すべての可能なバリエーションにおける、上記要素のいかなる組み合わせも本発明によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
図面の簡単な説明
【図１】図１は化学的に均一なコンジュゲートのための付加基を示す。ｎの値は（１０も含めて）０から１０の間である。（化合物１〜４）。
【図２】図２は、ネオグリコペプチドＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３（５）（図２ａ）、オリゴ−ＭＰ  ＵｍｐＴ７（６）、および５’−エチレンジアミン  でキャップされたＵｍｐＴ７（６ｂ）（図２ｂ）の構造、トレーサー３’コンジュゲート（図２ｃ）の構造、５’−チオール修飾因子で自動化された合成のための反応スキーム（図２ｄ）、１ｃの合成のための反応スキーム（図２ｅ）を示す。
【図３】図３は［ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３］−ＳＭＣＣ−ＡＥＴ−ｐＵｍｐＴ７（１０）の合成のための反応スキームを表す。
【図４】図４は、コンジュゲート１０の合成における中間体のＰＡＧＥ分析（１５％ポリアクリルアミド、４Ｖ／ｃｍ、２時間）を示す。レーン１：［５’−３２Ｐ］−標識６（バンドＡ）、レーン２：［５’−３２Ｐ］−シスタミン付加物（バンドＢ）および対応するチミジン−ＥＤＡＣ付加物（バンドＣ）、レーン３：［５’−３２Ｐ］−チオール５（バンドＤ）および対応するチミジン−ＥＤＡＣ付加物（バンドＥ）、レーン４：［５’−３２Ｐ］−コンジュゲート１０（バンドＦ）および対応するチミジン−ＥＤＡＣ付加物（バンドＧ）。
【図５】図５は、［３５Ｓ］３’−末標識されたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ネオグリココンジュゲートの構造を例示する。
【図６】図６はＨｅｐ  Ｇ２細胞による、単独（白丸）および１００当量の遊離の５の存在下（黒丸）での１μＭコンジュゲート１０、並びに単独（白三角）および１００当量の遊離の５の存在下（黒三角）でのオリゴ−ＭＰ１１の取り込みの時間経過を示す。細胞を３７℃で、０、１、および２時間培養し、試料を実験欄に記載したようにして回収した。それぞれのデータ点は３回の試行の平均±１標準偏差を表す。
【図７】図７はＨｅｐ  Ｇ２細胞による、コンジュゲート１０取り込みの２４時間の時間経過を示す。細胞を３７℃で培養し、実験欄に記載したようにして回収した。それぞれのデータ点は３回の試行の平均±１標準偏差を表す。
【図８】図８は、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＬ−６０およびＨＴ１０８０細胞による、コンジュゲート１０の組織特異的な取り込みを示す。細胞を回収し、それぞれの細胞系で、［３２Ｐ］の量を３時間および２４時間にて測定した。実験は３回行い、データはその平均±１標準偏差で表した。
【図９】図９はＨｅｐ  Ｇ２細胞による、ヌクレアーゼ耐性バックボーン１０を含むネオグリココンジュゲートの取り込みを示す。
【図１０】図１０は、Ｈｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞による、ヌクレアーゼ耐性バックボーン１０を含むネオグリココンジュゲートの取り込みを示す。
【図１１】図１１はコンジュゲート１０の組織分布を示し、これは、Ｎ−アセチル−グルコサミダーゼでコンジュゲート１０の末端ＧａｌＮＡｃ残基を除去することによって生成される。グラム組織あたりの初期用量％対コンジュゲート１０注入後の時間。
【図１２】図１２はコンジュゲート１２の組織分布を示し、これは、Ｎ−アセチル−グルコサミダーゼでコンジュゲート１０の末端ＧａｌＮＡｃ残基を除去することによって生成される。グラム組織あたりの初期用量％対コンジュゲート１２注入後の時間。
【図１３】図１３（ａ）はマウスにおける、ネオグリココンジュゲートを含むＳ３５標識アンチセンスホスホロチオエート(phosphorothiate)の組織分布示す。（ｂ）は末端ｇａｌＮＡｃを除去されたネオグリココンジュゲートを含む、Ｓ３５標識アンチセンスホスホロチオエート(phosphorothiate)のマウスにおける組織分布示す。値を３回の試行の平均±１標準偏差として報告する。血液は体重の約７％、筋肉は４０％と仮定する。
【図１４】図１４はＨｅｐ  Ｇ２細胞における、１０の代謝物質のオートラジオグラフ分析を示す。レーン１：１、レーン２：Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼで処理した１、レーン３：キモトリプシンで処理した１、レーン４〜８：それぞれ２、４、８、１６および２４時間、１と培養した後のＨｅｐ  Ｇ２細胞抽出物。
【図１５】図１５はマウスの肝臓における、１０の代謝物質のオートラジオグラフ分析を示す。レーン１：１、レーン２：Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼで処理した１、レーン３：キモトリプシンで処理した１、レーン４：０．１ＮのＨＣｌで処理したもの、レーン５〜９：注入後、２時間、１時間および１５分での肝臓ホモジネート抽出物。レーン５と６、レーン７と８は重複測定である。
【図１６】図１６は１０の構造を示す。コンジュゲートは、オリゴＭＰ部分の５’−ＯＨに位置する放射性ホスフェートを用いて合成された。矢印は３２Ｐ標識の位置を示す。１０の構造を略号で記す。構造１１および１２〜１５は、ＰＡＧＥ分析によって同定された代謝物質の予想構造である。構造１２〜１５は、それぞれＮ−アセチルグルコサミン、キモトリプシンまたは０．１ＨＣｌで１０を処理することによって得る。
【図１７】図１７はマウスの尿における、１０の代謝物質のオートラジオグラフ分析を示す。レーン１：１、レーン２：Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼで処理した１、レーン３：キモトリプシンで処理した１、レーン４：０．１ＮのＨＣｌで処理したもの、レーン５〜８：注入後、２時間、１時間および１５分での尿抽出物。レーン５と６は重複測定である。
【図１８】図１８はＨｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞の培養培地における、ＨＢｓＡＧの蓄積に対する抗ＨＢＶネオグリココンジュゲートの効果を示す。Ａ：抗−Ｓ、Ｂ：抗−Ｃ、Ｃ：抗−Ｅ、  塗りつぶした棒＝未処理の対照、斑点の棒＝ネオグリココンジュゲート、斜線の棒＝コンジュゲートされていないオリゴマー。
【図１９】図１９はＨｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞の培養培地における、ＨＢＶビリオンＤＮＡの蓄積に対する抗ＨＢＶネオグリココンジュゲートの効果を示す。Ａ：抗−Ｓ、Ｂ：抗−Ｃ、Ｃ：抗−Ｅ、  塗りつぶした棒＝未処理の対照、斑点の棒＝ネオグリココンジュゲート、斜線の棒＝コンジュゲートされていないオリゴマー。
【図２０】図２０は培養中のＨｅｐ  Ｇ２  ２．２．１５細胞の培地における、ＨＢｓＡＧおよびＨＢＶビリオンＤＮＡの蓄積に対するランダムネオグリココンジュゲートおよびオリゴマーの効果を示す。Ａ：ＨＢｓＡＧ蓄積に対するＮＧ−４の影響、Ｂ：ＨＢｓＡＧ蓄積に対するＮＧ−５および対応するオリゴマーの影響、Ｃ：ＨＢＶビリオンＤＮＡ蓄積に対するＮＧ−４および対応するオリゴマーの影響、Ｄ：ＨＢＶビリオンＤＮＡ蓄積に対するＮＧ−５および対応するオリゴマーの影響。塗りつぶした棒＝未処理の対照、斑点の棒＝ネオグリココンジュゲート、斜線の棒＝コンジュゲートされていないオリゴマー。
【図１】
2005518201.tif 000015
【図２ａ】
2005518201.tif 000016
【図２ｂ】
2005518201.tif 000017
【図２ｃ】
2005518201.tif 000018
【図２ｄ】
2005518201.tif 000019
【図２ｅ】
2005518201.tif 000020
【図３】
2005518201.tif 000021
【図４】
2005518201.tif 000022
【図５】
2005518201.tif 000023
【図６】
2005518201.tif 000024
【図７】
2005518201.tif 000025
【図８】
2005518201.tif 000026
【図９】
2005518201.tif 000027
【図１０】
2005518201.tif 000028
【図１１】
2005518201.tif 000029
【図１２】
2005518201.tif 000030
【図１３】
2005518201.tif 000031
【図１４】
2005518201.tif 000032
【図１５】
2005518201.tif 000033
【図１６】
2005518201.tif 000034
【図１７】
2005518201.tif 000035
【図１８】
2005518201.tif 000036
【図１９】
2005518201.tif 000037
【図２０】
2005518201.tif 000038
【国際調査報告】
2005518201.tif 000039
2005518201.tif 000040
2005518201.tif 000041