(57)【要約】本発明は、担体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物などの生体分子を前記担体に結合するようになされている、担体を溶液から分離する方法に関する。この方法は、前記担体を含む溶液を保持する貯蔵容器中に管状部材１３を導入するステップと、前記管状部材の端部を前記溶液中に浸漬するステップと、前記端部に前記担体を誘引し保持するステップと、前記管状部材を前記保持した担体と共に前記溶液から取り出すステップとを含む。この方法は、前記誘引し保持するステップが、前記管状部材の端部中に配設されたフィルタ２５に前記担体を誘引し保持するように前記管状部材内に陰圧を提供するステップを含むことを特徴とする。本発明は、このような方法を実施する装置１０にも関する。
2005517408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体を溶液から分離する方法において、
前記担体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物などの生体分子を前記担体に結合するようになされており、
前記担体を含有する溶液を保持する貯蔵容器中に管状部材（１３）を導入するステップ、
前記管状部材の端部を前記溶液中に浸漬するステップ、
前記端部に前記担体を誘引し保持するステップ、
前記管状部材を前記保持した担体と共に前記溶液から取り出すステップ、
を含み、
前記誘引し保持するステップが、前記管状部材の端部中に配置したフィルタ（２５）に前記担体を誘引し保持するように前記管状部材内に陰圧を提供するステップを含むことを特徴とする、
上記方法。
【請求項２】
前記管状部材内で陰圧を除去し、又は陽圧を生み出すことによって前記フィルタから前記担体を放出するステップをさらに含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
振盪によって前記フィルタから前記担体を放出するステップをさらに含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
掻き落しによって前記フィルタから前記担体を放出するステップをさらに含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
各ステップを複数の場所で同時に実施する請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
蛋白質を精製するために前記方法を使用する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
タグ付き蛋白質を精製するために前記方法を使用する請求項６記載の方法。
【請求項８】
Ｈｉｓタグ蛋白質を精製するために前記方法を使用する請求項７記載の方法。
【請求項９】
担体を異なる貯蔵容器間で移動するための装置において、
前記担体が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物などの生体分子を前記担体に結合するようになされており、
前記担体を含有する溶液を保持する貯蔵容器中に導入される少なくとも１個の管状部材（１３）であって、前記溶液中に浸漬される端部を有する管状部材、
前記端部に前記担体を誘引し保持する手段、
を備え、
前記手段が、前記端部中に配設されたフィルタ（２５）を備えることを特徴とする、
上記装置。
【請求項１０】
前記内部空間の内部で陰圧を生み出すために真空供給源に接続可能な密封内部空間（２７）を有するハウジング（５）をさらに備え、前記管状部材が前記内部空間と流体連通する請求項９記載の装置。
【請求項１１】
前記管状部材が前記内部空間へ突出する請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）などのマルチウェル貯蔵容器の配置に対応する相互配置の複数の管状部材をさらに備える請求項９〜１１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記管状部材がすべて、前記ハウジングから着脱自在な別個の支持ユニット（２３）に組み込まれている請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
内部空間内に陽圧を生み出す手段をさらに備える請求項９〜１３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１５】
前記陰圧及び／又は前記陽圧を制御する手段をさらに備える請求項９〜１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記フィルタが焼結材料から製造されている請求項９〜１５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１７】
前記フィルタが焼結ポリプロピレンプラスチックから製造されている請求項９〜１６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１８】
２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を調製する方法において、
前記担体及び前記ｄｓＤＮＡを含む第１溶液を保持する第１貯蔵容器中の担体上に前記ｄｓＤＮＡの２本鎖の１本を固定するステップ、
第１溶液中に浸漬した管状部材（１３）に前記担体を誘引し保持するステップ、
前記管状部材を前記保持した担体と共に第１貯蔵容器から第２貯蔵容器へ移動するステップ、
第２貯蔵容器中で前記ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに分離するステップ、
第２貯蔵容器から前記管状部材を取り出し、それによって第２貯蔵容器から固定されたｓｓＤＮＡを有する担体を取り出すステップ、
を含み、
前記誘引し保持するステップが、
前記管状部材中に配設されたフィルタ（２５）に前記担体を誘引し保持するように前記管状部材内に陰圧を提供するステップを含むことを特徴とする、
上記方法。
【請求項１９】
各ステップを複数の場所で同時に実施する請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記使い捨てユニットが、前記担体を保持するためのフィルタ（２５）を備えることを特徴とする請求項９の序文（ｐｒｅａｍｂｌｅ）に記載の装置の前記管状部材に取り付けるように適合された使い捨てユニット。
【請求項２１】
請求項１〜８、及び／又は請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の方法、並びに／或いは請求項９〜１７のいずれか一項に記載の装置の自動ロボットシステムにおける使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、担体を溶液から分離する方法であって、前記担体が生体分子を前記担体に結合するようになされている方法に関し、さらに詳しくは遺伝物質の１本鎖試料の調製のためにそのような分離を使用する方法に関する。本発明は、そのような方法を実施するための装置にも関する。最後に、本発明はこのような装置に取り付けるように適合された使い捨てユニットに関する。
【背景技術】
【０００２】
しばしば、遺伝物質を分析する方法では、初期ステップとして核酸試料を増幅する必要がある。これには、時には２本鎖ＤＮＡ試料（ｄｓＤＮＡ）の２本鎖を分離するステップが必要とされる。その際、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）として知られている関連技術の方法が利用される。この方法の一変形形態によれば、一方をビオチン化したプライマー対を、ｄｓＤＮＡ試料を含む溶液を保持する貯蔵容器に供給することによってｄｓＤＮＡ試料を増幅する。次いで、ストレプトアビジン被覆ビーズを溶液に加え、また結合化緩衝液を加えることによって増幅したｄｓＤＮＡをビーズ上に固定する。
【０００３】
これらのビーズは、セファロース製でよく、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を調製する関連技術の一方法は次のとおりである。最初に、固定したｄｓＤＮＡを保持する貯蔵容器を真空ステーション上に置く。貯蔵容器の底部に、孔径がセファロースビーズの寸法未満であるフィルタが備えられている。それによって、フィルタの下面に陰圧をかけた場合、溶液中のビーズはフィルタ上に残るが、溶液はフィルタを通して、例えば液体収集器へ排出される。次のステップでは、水酸化ナトリウムを貯蔵容器へ供給し、それによってｄｓＤＮＡ鎖をｓｓＤＮＡ鎖に分離し、それから水酸化ナトリウムを排出する。したがって、ビーズに結合していないｓｓＤＮＡ鎖も排出されるが、結合しているｓｓＤＮＡ鎖はフィルタ上に捕捉されたままとなる。さらに次のステップでは、１度又は数度、洗浄緩衝液を加えることによって残りの水酸化ナトリウムを中和し、最終ステップでは、陰圧を除去し、溶液中の捕捉されているビーズを再懸濁化するための溶液を加える。その時、ｓｓＤＮＡ鎖が結合しているビーズは、さらに調製し又はｓｓＤＮＡを分析するために、この貯蔵容器から別の貯蔵容器へ移す準備ができている。
【０００４】
しかし、溶液中のビーズすべてを完全に再懸濁させるのは困難である。ビーズはフィルタ中に捕捉されており、再懸濁を試みても容易にそこから飛び出さないからである。したがって、ピペッティングによってビーズすべての捕捉を試みることは困難である。加えて、ウェルの液柱高が低いと、ピペッティングはさらに困難になり、状況は一層悪化する。さらに、通常、貯蔵容器は、例えば、９６、３８４、１５３６又は６１４４個の別々のウェルを有するマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）などのマルチウェル貯蔵容器の形であり、それによって歪みによる損傷の点から反復ピペッティングは不都合である。
【０００５】
ＧＢ９９２３３２４９号に開示されている他の関連技術の方法は、セファロースビーズの代わりに磁気ビーズを使用する。この方法によれば、磁石を貯蔵容器、例えばＭＴＰウェルに導入し、それによってストレプトアビジン被覆磁気ビーズを磁石によって誘引し保持する。それによってこの貯蔵容器から磁気ビーズ及び結合しているｄｓＤＮＡを取り外し、例えば水酸化ナトリウムなどの鎖分離溶液を含む他の貯蔵容器へ移すことができる。そのようにしてｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに分離し、それによって第１鎖を溶液中に懸濁し場合によっては排出するが、第２鎖はビーズに結合したままである。次に、これら後者の鎖をさらに調製又は分析するために他の貯蔵容器に移すことができる。
【０００６】
しかし、磁気ビーズはセファロースビーズよりも高価であり、セファロースビーズを使用すると合成による配列決定法（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ）で高い品質が得られる。さらに、ＵＳ６１５６５５０号に開示されている別の関連技術の方法は、ビーズを１つの溶液から別の溶液へ移すことに関するものである。この方法は、セファロースビーズをどのようにしてポリマー表面に結合することができるかについて述べている。担体に結合させたビーズに伴う欠点は、表面に結合させたビーズは溶液中のビーズに類似した生化学的又は物理的挙動を示さず、そのためｓｓＤＮＡのその後の分析が困難となることである。
【０００７】
特開昭５８−２２３７５９に開示されている他の関連技術の方法では、２本の試験管間でビーズを移動させる。ノズル１６を第１試験管１７に浸漬し、そこでノズルは真空によってビーズＢを誘引する。次いで、ノズル１６を第２試験管１８に移動し、そこで背圧をかけてビーズＢを第２試験管に放出させる。全動作中、ノズル内で真空が支配する。しかし、ノズルは、ノズル先端に誘引され固着した大型のビーズしか移動させることができない。小型のビーズの場合には、そのようなビーズは試験管に含まれる液体と共に排出されるはずである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、溶液からセファロースビーズなどの担体を分離する改良された方法を提供することであり、前記ビーズは生体分子用担体として機能する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的は、本発明によれば、担体を溶液から分離する方法によって達成され、その担体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物などの生体分子を前記担体に結合するようになされており、この方法は前記担体を含む溶液を保持する貯蔵容器中に管状部材を導入するステップと、前記管状部材の端部を前記溶液中に浸漬するステップと、前記端部に前記担体を誘引し保持するステップと、前記管状部材を前記保持した担体と共に溶液から取り出すステップとを含む。この方法は、前記誘引し保持するステップが、前記管状部材の端部中に配設されたフィルタに前記担体を誘引し保持するように前記管状部材内に陰圧を提供するステップを含むことを特徴とする。
【００１０】
この目的は、担体を異なる貯蔵容器間で移動するための装置によっても実現され、その担体は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ポリペプチド、炭水化物などの生体分子を前記担体に結合するようになされており、この装置は、前記担体を含む溶液を保持する貯蔵容器中に導入される少なくとも１個の管状部材であって、前記溶液中に浸漬される端部を有する管状部材と、前記端部に前記担体を誘引し保持する手段とを備える。この装置は、前記手段が端部中に配設されたフィルタを備えることを特徴とする。
【００１１】
この目的は、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を調製する方法によっても実現され、この方法は、前記担体及び前記ｄｓＤＮＡを含む第１溶液を保持する第１貯蔵容器中の担体上に前記ｄｓＤＮＡの２本鎖の１本を固定するステップと、第１溶液中に浸漬した管状部材に前記担体を誘引し保持するステップと、保持した前記担体と共に前記管状部材を第１貯蔵容器から第２貯蔵容器に移すステップと、第２貯蔵容器中で前記ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡに分離するステップと、第２貯蔵容器から前記管状部材を取り出し、それによって第２貯蔵容器から固定されたｓｓＤＮＡを有する担体を取り出すステップとを含む。この方法は、前記誘引し保持するステップが、前記管状部材中に配設されたフィルタに前記担体を誘引し保持するように前記管状部材内に陰圧を提供するステップを含むことを特徴とする。
【００１２】
この目的は、請求項９のプリアンブルに記載の装置の前記管状部材に取り付けるように適合された使い捨てユニットによっても実現され、前記使い捨てユニットは前記担体を保持するためのフィルタを備える。
【００１３】
このような方法及び装置によって、ストレプトアビジン被覆セファロースビーズなどの担体を異なる溶液を保持する異なる貯蔵容器間で移動することができる。これにより、例えばｓｓＤＮＡを調製する手順全体、又は他の手動の試料調製が簡潔になり、関連技術のセファロース法と比較して労力が少なくてすむが、磁気ビーズの使用が回避されるのでコストは安くなる。もちろん、本発明の方法及び装置を生体分子の担体として機能する磁気ビーズと共に使用することも依然として可能である。
【００１４】
適切には、前記方法が、管状部材内で陰圧を除去し、又は陽圧を生み出すことによってフィルタから前記担体を放出するステップを含む。これによりフィルタからの担体の放出が改善される。
【００１５】
有利には、前述の各ステップはそれぞれ、複数の場所で同時に実施される。これにより、この方法は、９６、３８４、１５３６又は６１４４個のウェルを有するマイクロタイタープレート（ＭＴＲ）などのマルチウェル貯蔵容器での使用に適合する。
【００１６】
この方法は、好ましくは蛋白質を精製するために使用され、より好ましくはタグ付き蛋白質の精製に、最も好ましくはＨｉｓタグ蛋白質の精製に使用される。これにより、マルチウェル形式の精製を、例えば蛋白質産生用組換え細菌のスクリーニングに適用できることが実現される。
【００１７】
適切には、前記装置は、内部空間の内部で陰圧を生み出すための真空供給源に接続可能な密封内部空間を有するハウジングを備え、管状部材は前記内部空間と流体連通し、より適切には管状部材は内部空間中に突出する。この突出により、内部空間から陰圧が除去されても溶液は逆流せず、それによって異なる溶液の混合が防止される。
【００１８】
この装置は、マルチウェル貯蔵容器の配置に対応する相互配置を有する複数の管状部材を備えることが好ましい。これにより装置をマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）で使用することができる。
【００１９】
有利には、管状部材はすべて、ハウジングから着脱自在な別個の支持ユニットに組み込まれている。これにより使い捨てユニットが提供される。さらに、管及びフィルタの洗浄が容易になる。
【００２０】
適切には、装置は、前記内部空間内に陽圧を生み出す手段を備える。これによりフィルタに捕捉されている担体の放出が促進される。
【００２１】
装置は、前記陰圧及び／又は前記陽圧を制御する手段を備えることが好ましい。これにより異なる器具への適合が実現される。
【００２２】
有利には、この方法及び／又は装置は自動ロボットシステムで使用される。これにより、人間の介入がほとんど不要になり、性能が向上する。したがって、自動的に人間によらずに制御される形で溶液及び／又はウェル間で担体が移動されるようにロボットアームによって装置を運搬することができる。この点に関連して、陰圧が除去された後フィルタから担体が放出されるように、振盪、振動、又は掻き落しによって放出ステップを実施することができる。
【００２３】
次に、本発明の好ましい実施形態を添付図面に関して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
図１ａ〜ｂは、本発明の好ましい実施形態による装置１０の斜視図を示す。装置は、一緒になってハウジング５を形成する、上部カバー１及び底部カバー３を備える。上部カバーと底部カバーの間にシール７が配設される。導管９を一端で連結部１１を介してハウジングに結合し、他端で例えば図示されていない真空供給源、液体分離デバイス、及び／又は圧力供給源に結合することもできる。管１３の形をした複数の管状の細長い部材をそれぞれ、底部カバー３の下面１７に配設した開口部１５に結合する。管１３を密封するために各開口部には密封リング１９が設けられている。管は、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）などのマルチウェル貯蔵容器のウェルの配置に対応する平行な行、列に配列される。支持プレート２１をねじ２２によって底部カバーの下面に取り付け、支持プレートは、管に適合し底部カバー中の開口部と整合する複数の穴２３を備える。フィルタ２５を各管１３の端部中に横断させて配設する。
【００２５】
図２ｃから分かるように、上部カバー及び底部カバーを組み付けると上部カバー１及び底部カバー３の間には内部空間２７が作り出される。この内部空間は、ハウジングの壁部中に配設した凹部２９を介して導管９と流体連通し、したがって、例えば、先に述べた真空供給源とも流体連通する。底部カバーの開口部１５は内部空間へ達し、それによって各管は内部空間と流体連通する（これを１本の管について図２ｃに示す）。図２ｂ〜ｃから分かるように、さらに各管は内部空間中へ少しだけ突出し、それによって煙突様突出部３１を形成する。
【００２６】
操作
通常、５０〜２０００ヌクレオチドを含む１本鎖ＤＮＡ試料の調製を説明する例によってのみ装置の操作を説明する。しかし、当業者ならばこの装置はこの器具だけに限定されず、生体分子の担体を溶液から分離、又は異なる貯蔵容器間で移動する必要があるいくつかの器具で使用ことができることを理解するであろう。一例としてストレプトアビジン−ビオチンを結合分子対として利用するが、上記の例では他の結合分子も考えられる。
【００２７】
例では、ＭＴＰなどのマルチウェル貯蔵容器が提供（図示せず）され、ストレプトアビジン被覆セファロースビーズなどのビーズに固定されている、増殖させた２本鎖ＤＮＡ試料を含む溶液が各ウェルに保持される。装置１０をＭＴＰの上方に位置させ続いて下げ、それによって装置の管１３がＭＴＰのウェル中に挿入され、次いで溶液中に浸漬される。真空供給源を作動させ、それによってハウジング５の内部空間２７に、したがってフィルタ２５の第１面上の各管にも陰圧がもたらされる。適当な陰圧を選択することにより、溶液を管中へ引き込みフィルタを通過させる。溶液は内部空間へ進入し、続いて導管９を通って液体分離デバイスに排出される。固定ビーズを有する担体もフィルタに向けて引かれるが、第２面すなわちフィルタの第１面の反対側で捕捉され、他方溶液はフィルタを通して排出される。フィルタは、他の材料も考えられるが、焼結ポリプロピレンプラスチックなどの焼結材料から製造されることが好ましく、ビーズが直径約３８μｍのセファロースで製造されている場合、フィルタ孔径は約１０μｍでなければならない。
【００２８】
次に、陰圧を維持しつつ装置１０を持ち上げ、それによってフィルタに担体が保持された管を取り出すことができる。さらに、装置を例えば水酸化ナトリウムなど鎖分離溶液を含む溶液を保持する他の貯蔵容器に移す。それによって管を溶液中に浸漬したときｄｓＤＮＡがｓｓＤＮＡに分離し、よって第１鎖は溶液中に懸濁し、他方第２鎖は依然としてビーズに結合されたままとなる。次いで、各ウェルがなお溶液を保持する他のＭＴＰに装置を移動する。管をウェルの溶液中に浸漬し真空供給源を作動停止し、それによって担体をフィルタから放出させ溶液中に再懸濁する。煙突様突出部３１は、真空供給源を作動停止したときに内部空間に含まれている溶液が貯蔵容器へ逆流するのを防止するのに役立つ。そのような逆流があれば、普通なら、次の貯蔵容器中に存在する溶液を汚染する危険を招くはずである。
【００２９】
懸濁を促進するためにウェルの底部でフィルタを掻き取ることができる。装置を振盪又は振動して担体の放出をさらに高めることもできる。あるいは、圧力供給源を作動させ、それによってハウジングの内部空間に、したがって各フィルタの第１面にも陽圧を提供することができる。しかしこの圧力逆転は、フィルタを介するブロー作用により、また溶液中に乱流動を生み出し、それによりフィルタを漱ぐ効果を生じることによって、フィルタの第２面からの担体の放出をさらに高める。担体が溶液中で懸濁したとき、圧力供給源を作動停止させ、装置を持ち上げ、それによってウェルから管を取り出す。次に、ｓｓＤＮＡ調製を完了し、溶液中に含まれるｓｓＤＮＡの適当な分析を開始することができる。このような分析は、それぞれＵＳ５４０５７４６号及びＷＯ９８／１３５２３号に記載されているような配列決定法、又は合成配列決定法でよい。
【００３０】
装置使用後、フィルタの洗浄が必要となるかもしれない。フィルタを洗うには管を、例えば、水やエタノールに単に浸漬するが、装置を分解して完全に装置を清浄化することもできる。さらに洗浄効果を改善するために、真空供給源及び／又は圧力供給源を作動させてもよい。この場合、陰圧供給と陽圧供給を交互に実施することができ、それにより洗浄効果が改善されるはずである。
【００３１】
もちろん、使用後廃棄する使い捨てユニットを形成するために、管及びフィルタを組み込んだ支持プレートを設計することも考えられる。このようなユニットは必要に応じて容易に交換される。
【００３２】
各管の最外端部から少しだけフィルタをずらすことも考えられる。したがって溶液の担体密度が高い場合、又は各ウェル中に高い液柱が生じた場合に、担体保持能力を増大させることができる。
【００３３】
超音波でフィルタを処理、例えば、超音波槽中にそれらを置くことによって管状部材中のフィルタから担体を取り外すこともできる。このように次の使用の前に管状部材及びフィルタを清浄化する。
【００３４】
さらに、管状部材１３に使い捨てチップユニット５０を備えることも考えられる。このようなユニットは図３に示され、管状部材１３に結合する第１端５２、及び貯蔵容器の溶液中に浸漬する第２端５４を有する。ユニット５０はテーパー形であり、先に述べたように担体を保持するためにフィルタ２５を備え、したがって管状部材自体にフィルタを備えることは必ずしも必要でない。これらのユニットは使い捨てであり、通常、使用後放棄される。
【００３５】
実験
細菌溶解物からＨｉｓタグ蛋白質（Ｈｉｓ−クレノー）を優れた選択性及び収率で精製することができるかどうかを調査の目的とした研究も実施した。以下の説明では、本発明による装置の使用を一般的に説明し、本発明の装置として参照するだけにしておく。しかし、当業者ならば、先の発明を実施するための最良の形態及び操作の節と併せ、本発明の装置を用いてＨｉｓタグ蛋白質の精製中個々のステップをどのように実施するか理解するであろう。
【００３６】
Ｈｉｓ−クレノーは、Ｎ末端にヘキサヒスチジンを付加したＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片である。産生目的で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で蛋白質を過剰に発現させる。手直しを加えた市販マトリックスを使用し固定化金属アフィニティークロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）によって蛋白質を精製することが可能になる。その手順は、蛋白質を固定化Ｎｉ２＋イオンに結合させること、不結合物質を洗い流すこと、０，２Ｍイミダゾールを含む緩衝液で結合している蛋白質を溶離させるものである。
【００３７】
Ｈｉｓ−クレノーのクロマトグラフィ精製をするための関連技術の方法を本発明の装置の形式に採用することによって研究を実施した。結合特性及び溶離特性などの重要なパラメータはすべて確立されているので、これらをさらに研究することは必ずしも必要でなかった。ゲルの量が回収に影響すると疑われるので、唯一の変数はそれぞれのウェルに加えるゲルの量であった。
【００３８】
材料
ＨｉＴｒａｐキレート（１ｍｌ）カラム    アマシャムバイオサイエンス社
ライセートＨｉｓ−クレノー              バッチ１０１２
ＰＣＲプレート、９６穴                  ミリポア社
ＮａＨ２ＰＯ４                            メルク社
ＮａＣｌ                                メルク社
イミダゾール                            ＵＳＢ社
本発明の装置                            Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｐｈａｓｔ電気泳動装置                  アマシャムバイオサイエンス社
Ｐｈａｓｔ１０〜１５％ゲル              アマシャムバイオサイエンス社
ＳＤＳバッファストリップ                アマシャムバイオサイエンス社
【００３９】
低分子量
キャリブレーションキット                アマシャムバイオサイエンス社
クーマシーブリリアントブルー染料        アマシャムバイオサイエンス社
Ｐｈａｓｔ銀染色キット                  アマシャムバイオサイエンス社
ＥＤＴＡ                                メルク社
脱イオン水
ＮｉＣｌ２×６（Ｈ２Ｏ）                  シグマ社
【００４０】
緩衝液
結合化及び洗浄用緩衝液：１０ｍＭのＮａＰｉ、０，５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７，４
溶離緩衝液：１０ｍＭのＮａＰｉ、０，５ＭのＮａＣｌ、０，２Ｍのイミダゾール、ｐＨ７，４
【００４１】
ゲルの調製
製造業者提供の指示書にしたがってゲルを調製した。
１．カラムを５０ｍＭのＥＤＴＡ２ｍｌで洗浄した。
２．水５ｍｌで洗浄する。
３．０，１ＭのＮｉＣｌ２２ｍｌでチャージさせる。
４．水５ｍｌで洗浄する。
５．結合化緩衝液５ｍｌで洗浄する。
【００４２】
続いてカラムを開放しゲルを回収し結合化緩衝液の添加によって５０％スラリーを作成する。
【００４３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び染色
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：方法ＳＤＳ１０〜１５
ＣＢＢ染色：方法ＳＤＳ
銀染色：方法Ａｇ
【００４４】
方法はＰｈａｓｔ電気泳動装置における方法をさす。
【００４５】
本発明の装置を使用する精製
１．ＰＣＲプレート中の７個のウェルに２５μｌのライセートを分注した（カラムＡ）。
２．２５μｌの結合化緩衝液をそれぞれのウェルに加えた。
３．１０、５、４、３、２、１及び０，５μｌのゲルスラリーをそれぞれウェルＡ〜Ｇに加えた。
４．プレートをシェーカー上で５分間培養した。
５．本発明の装置を使用して使用ウェルからゲルを吸引した。
６．本発明の装置を結合化緩衝液を含むスルー（ｔｈｒｏｕｇｈ）に移動することによってゲルを１０〜２０秒洗浄した。
７．５０μｌ溶離緩衝液を含む新鮮ＰＣＲプレートに本発明の装置を移動することによって結合蛋白質を溶離した。
８．分析用に各ウェルから試料を抜き取った。出発物質の試料すなわちライセートも採取した。
９．ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し続いてＣＢＢ又は銀で染色した。
【００４６】
結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析では、ＨｉｓＫｌｅｎｏｗはゲルに結合し溶離緩衝液での処理によって回収できることが示されている。図４ａ、ｂを参照のこと。両方の像を操作してスキャン像の可視性を増大させてある。番号は、それぞれのウェルに加えたゲル（５０％スラリー）の量（μｌ）を示す。「ｌｙｓ」は出発物質を示す。
【００４７】
考察
初期実験では、極めて大型のウェルを備えた通常の９６穴プレートを結合及び溶離に使用した。これらの極めて幅広のウェルから吸引できるゲルはさほど多くないことがこの実験から明らかであった。乾燥すると残りのゲルはウェル中に明瞭に視認できたからである。
【００４８】
加えたゲルの量の同時発生変数を用いてＰＣＲプレートでさらに実験を実施した。図４ａ、ｂに示すように、加えるゲルの量が減少するにつれて回収等は増加する（図４ａを参照のこと、ＣＢＢ染色）。これは、おそらく、少量のゲルを使用すると回収されるゲルのサブセットが大きくなり、より多くの蛋白質の回収がもたらされることを反映している。したがってゲルの結合量はこの実験では問題ないと思われる。
【００４９】
出発物質と比較して、溶離した画分中に汚染物質を見出すことはできないので、精製効率は非常に良好である（図４ｂを参照のこと、銀染色）。
【００５０】
結論
本発明の装置は、複雑な混合物、この場合、細菌溶解物からの蛋白質の単離に首尾よく使用することができる。この研究では金属アフィニティゲルと組み合わせたＨｉｓタグ蛋白質をモデルとして使用したが、その原理は他の系、例えば、アフィニティゲル、蛋白質−蛋白質、受容体リガンド相互作用にも働くはずである。
【００５１】
適用された系はいかなる意味でも最適化されておらず、そのことが回収及び速度に関して改善を行うことができると想像される理由である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１ａ】本発明の好ましい実施形態による装置を示す斜視図である。
【図１ｂ】図１ａの装置の分解図である。
【図２ａ】装置の上面図である。
【図２ｂ】上部カバーを取り除いた装置の上面図である。
【図２ｃ】図２ａのＢ−Ｂ線に沿った断面図である。
【図２ｄ】図２ａのＣ−Ｃ線に沿った断面図である。
【図３】本発明の別の態様による使い捨てユニットの正面図である。
【図４ａ】ＣＢＢ染色での溶離した蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図４ｂ】銀染色での溶離した蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【国際調査報告】
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