(57)【要約】本発明は、蛋白質の再生、蛋白質の凝集低減、および／または蛋白質の熱安定性増大のために置換イミダゾリウム塩を使用すること、蛋白質の再生、蛋白質の凝集低減、および／または蛋白質の熱安定性増大のための方法、並びに本発明による方法によって調製した再生蛋白質に関する。本発明の方法では、処理対象の蛋白質を、置換イミダゾリウム塩を含む液体再生媒体に接触させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質の再生、蛋白質の熱安定性の増大、あるいは蛋白質の凝集の低減のための置換イミダゾリウム塩の使用。
【請求項２】
前記イミダゾリウム塩が、アルキル、アルケニル、アリール、および／またはアラルキル基によって置換されており、それらの基は、官能基、好ましくは窒素、硫黄、および／またはリンを含む基によって置換されていてよいことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記イミダゾリウム塩が、イミダゾリウム環の両窒素原子において置換されていることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記イミダゾリウム塩が、イミダゾリウム環の１つまたは複数の炭素原子において置換されていることを特徴とする請求項１から３の一項または複数項に記載の使用。
【請求項５】
前記イミダゾリウム環が、好ましくはメチル基やエチル基であるＣ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル基、および／または、単環式もしくは二環式アリール基を前記置換基として有することを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項６】
前記イミダゾリウム環が、少なくとも１つの前記Ｎ原子においてメチル基を有することを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項７】
前記イミダゾリウム環が、フェノール、ビフェニル、ビフェノール、ナフタレン、ナフタレンカルボン酸、ナフタレンスルホン酸、ビフェニロール、ビフェニルカルボン酸、フェノール、フェニルスルホン酸、フェノールスルホン酸基、および／または、置換もしくは非置換ベンジル基のうちの１つまたは複数の置換基を含むことを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項８】
前記置換基が、アミン、カルボキシル、カルボニル、アルデヒド、ヒドロキシ、硫酸、スルホン酸、および／またはリン酸基のうちの１つまたは複数の基によってさらに置換されていることを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項９】
前記イミダゾリウム塩が、室温でイオン性の液体であることを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項１０】
プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、特にトロンビン、ファクターＸａ、カスパーゼ、カテプシン、トリプシンおよび／またはキモトリプシン、システインプロテアーゼ、ペプシンやレンニンなどの酸性プロテアーゼ、サーモリシンなどのメタロプロテイナーゼ；
プロテアーゼ阻害剤、好ましくはペプスタチン、アンチパイン、ケモスタチン、エラスチナール、ロイペプチン、ベスタチン、アンチトロンビンＩＩＩ；
ＤＮＡ結合蛋白質、好ましくは転写因子、特にＮＦカッパＢ、およびｊｕｎ、ｆｏｓ、ｋｒｏｘ、ｍｙｃ、Ｅ２Ｆファミリーの構成蛋白質、ならびに／またはウイルスＴ抗原；
ウイルスエンベロープ蛋白質、カプシド蛋白質、ウイルスプロテアーゼ、ポリメラーゼ、および／またはＴ抗原などのウイルス蛋白質；
ホスファターゼ；
プロテインキナーゼ、好ましくはチロシンキナーゼおよび／またはセリンキナーゼ；
免疫グロブリンのスーパーファミリーの蛋白質、たとえば、抗体およびその断片；
増殖因子、好ましくは上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ  ＩおよびＩＧＦ  ＩＩ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、および／または血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）；
リゾチーム、ｒＰＡ、α−グルコシダーゼ、
ならびにこれらの蛋白質に由来する蛋白質および断片を、再生し、熱安定性を増大させ、あるいは凝集を低減させるものである前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項１１】
蛋白質の再生、熱安定性の増大、および／または凝集の低減方法であって、
処理対象の蛋白質を、置換イミダゾリウム塩を含む液体媒体に接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
液体再生媒体を前記液体媒体として使用する請求項１１に記載の蛋白質の再生方法。
【請求項１３】
前記処理対象の蛋白質に適切な緩衝系を前記液体媒体として使用することを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、Ｍｅｓ、Ｍｏｐｓ、酢酸塩、グリシン、および／またはリン酸塩を緩衝物質として使用することを特徴とする請求項１１から１３の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１５】
前記液体媒体中の緩衝物質の濃度が１０〜１０００ｍＭ、好ましくは５〜２００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭであることを特徴とする請求項１１から１４の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１６】
緩衝系のｐＨが４〜１１、好ましくは７．５〜１０．５であることを特徴とする請求項１１から１５の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１７】
前記イミダゾリウム塩が、アルキル、アルケニル、アリール、および／またはアラルキル基によって置換されており、それらの基は、官能基、好ましくは窒素、硫黄、および／またはリンを含む基によって置換されていてよいことを特徴とする請求項１１から１６の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１８】
前記イミダゾリウム塩が、イミダゾリウム環の両窒素原子において置換されていることを特徴とする請求項１１から１７の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１９】
前記イミダゾリウム塩が、イミダゾリウム環の１つまたは複数の炭素原子において置換されていることを特徴とする請求項１１から１８の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２０】
前記イミダゾリウム環が、好ましくはメチル基やエチル基であるＣ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル基、および／または、単環式もしくは二環式アリール基を前記置換基として有することを特徴とする請求項１１から１９の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２１】
前記イミダゾリウム環が、少なくとも１つの前記Ｎ原子においてメチル基を有することを特徴とする請求項１１から２０の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２２】
前記イミダゾリウム環が、フェノール、ビフェニル、ビフェノール、ナフタレン、ナフタレンカルボン酸、ナフタレンスルホン酸、ビフェニロール、ビフェニルカルボン酸、フェノール、フェニルスルホン酸、フェノールスルホン酸基、および／または、置換もしくは非置換ベンジル基のうちの１つまたは複数の置換基を含むことを特徴とする請求項１１から２１の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２３】
前記置換基が、アミン、カルボキシル、カルボニル、アルデヒド、ヒドロキシ、硫酸、スルホン酸、および／またはリン酸基のうちの１つまたは複数の基によってさらに置換されていることを特徴とする請求項１１から２２の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２４】
前記イミダゾリウム塩が室温でイオン性の液体であることを特徴とする請求項１１から２３の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触が、処理対象の蛋白質を前記液体媒体で希釈、透析、および／または透析ろ過によって実施されることを特徴とする請求項１１から２４の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２６】
接触中における前記処理対象の蛋白質中の蛋白質濃度が、５〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約５０〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１１から２５の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２７】
置換イミダゾリウム塩の濃度が、前記液体媒体に基づいて、５〜９５容量％、好ましくは５〜５０容量％、最も好ましくは１０〜４０容量％であることを特徴とする請求項１１から２６の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２８】
置換イミダゾリウム塩のモル濃度が、前記液体媒体に基づいて、０．２５〜５Ｍ、好ましくは０．２５〜３．５Ｍ、最も好ましくは０．５〜３Ｍであることを特徴とする請求項１１から２７の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、再生対象の蛋白質を前記再生媒体へ逐次的に数回、または連続的に加えることによって実施されることを特徴とする請求項１１から２８の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３０】
再生対象の蛋白質と再生媒体との接触を０．１〜１００時間、好ましくは１〜５０時間、より好ましくは５〜２０時間にわたって実施することを特徴とする請求項１１から２９の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３１】
プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、特にトロンビン、ファクターＸａ、カスパーゼ、カテプシン、トリプシンおよび／またはキモトリプシン、システインプロテアーゼ、ペプシンやレンニンなどの酸性プロテアーゼ、サーモリシンなどのメタロプロテアーゼ；
プロテアーゼ阻害剤、好ましくはペプスタチン、アンチパイン、ケモスタチン、エラスチナール、ロイペプチン、ベスタチン、アンチトロンビンＩＩＩ；
ＤＮＡ結合蛋白質、好ましくは転写因子、特にＮＦカッパＢ、およびｊｕｎ、ｆｏｓ、ｋｒｏｘ、ｍｙｃ、Ｅ２Ｆファミリーの構成蛋白質、ウイルスＴ抗原；
ウイルスエンベロープ蛋白質、カプシド蛋白質、ウイルスプロテアーゼ、ポリメラーゼ、および／またはＴ抗原などのウイルス蛋白質；
ホスファターゼ；
プロテインキナーゼ、好ましくはチロシンキナーゼおよび／またはセリンキナーゼ；
免疫グロブリンのスーパーファミリーの蛋白質、たとえば、抗体およびその断片；
増殖因子、好ましくは上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ  ＩおよびＩＧＦ  ＩＩ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）および血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）；
リゾチーム、ｒＰＡ、α−グルコシダーゼ、
ならびにこれらの蛋白質に由来する蛋白質および断片を、再生し、熱安定性を増大させ、および／または凝集を低減させるものである請求項１１から３０の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３２】
還元剤、好ましくはＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシステインの存在下でジスルフィドを含まない蛋白質と前記再生媒体との接触を実施して、前記ジスルフィドを含まない蛋白質を再生することを特徴とする請求項１１から３１の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３３】
ＤＴＴ、ＤＴＥ、グルタチオン、システイン、および／またはメルカプトエタノールなどの還元型および酸化型のチオール物質からなるレドックス系の存在下でジスルフィド架橋蛋白質と前記再生媒体の接触を実施して、前記ジスルフィド架橋蛋白質を再生することを特徴とする請求項１１から３２の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３４】
還元型物質と酸化型物質の濃度比が、１：１０〜２０：１、好ましくは１：５〜１０：１、さらに好ましくは１：１〜５：１であることを特徴とする請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記蛋白質再生用液体媒体が、他の再生物質、好ましくは尿素、グアニジニウム、Ｌ−アルギニン、アルキル尿素、カルボン酸アミド、アルキル化アミン、Ｔｒｉｓ緩衝液、ポリエチレングリコール、および／または洗浄剤を含むことを特徴とする請求項１１から３４の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１１から３５に記載の方法にしたがって調製した再生蛋白質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の再生、蛋白質の凝集低減、および／または蛋白質の熱安定性増大のために置換イミダゾリウム塩を使用すること、蛋白質の再生、蛋白質の凝集低減、および／または蛋白質の熱安定性増大のための方法、並びに本発明による方法によって調製した再生蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
現状では、蛋白質の再生は、蛋白質の生物活性および／または非常に正確な折りたたみの回復または復元であると見なされている。蛋白質再生の問題は生物工学では重要性が高い。分子生物学で達成された発展によって、組換え方式でそのコード配列から始めて蛋白質をクローニングし、宿主生物内でそれらを産生させることが可能である。しかし、こうした場合、組換え蛋白質はしばしば生物不活性な凝集体すなわち封入体の形で沈殿する。これらの封入体中に含まれている蛋白質はその後ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの再生によって生物活性形に変換しなければならない。この再生は非常に複雑な構造上の生物学的過程であり、しばしば非常に少ない収率でしか変性されていない状態の蛋白質をもたらさない。したがって、再生蛋白質の収率の増加がたとえほんの数パーセントであっても大幅な改善および経済的利点をもたらすはずである。
【０００３】
「封入体」蛋白質のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの折りたたみでは、しばしば、正しい折りたたみと、不正な折りたたみや凝集などの非生産的副反応との間で速度論的競合が観察されてきた。凝集過程は、大部分折りたたまれていないか、または本来とは異なる、部分的に折りたたまれた中間体のポリペプチド鎖の疎水性相互作用に大部分基づいている。その分子的基礎に関わりなく、これらの凝集の反応次数は２より高い。結果として、こうした非生産的凝集反応の速度は、折りたたまれていないポリペプチド鎖の濃度の増加と共に上昇する。正しい折りたたみ事象はほとんど１次反応によって支配され、このことは、変性された蛋白質の濃度が上昇した場合、凝集反応が正しい折りたたみより優勢となることを意味する。このような訳で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ折りたたみ反応は、しばしば非常に低い蛋白質濃度で実施される。さらに、蛋白質を再生するためにはｐＨ、イオン強度、レドックス系、温度などの物理的パラメーターを最適化しなければならない。しかし、多くの場合、こうした手段でさえ所望の成果をもたらしていない。
【０００４】
さらに、尿素やグアニジニウムなどの緩衝液を非変性濃度で加えることによって、折りたたみの効率に正の影響を与え得ることが長い間知られている。グアニジニウムや尿素に代わるものとして他のカオトロピック物質（chaotrope Stoffe）、たとえば、アルキル尿素、またはカルボン酸アミドやアルキル化アミンなどの有機共溶媒もｉｎ  ｖｉｔｒｏ折りたたみ法に使用されている。
【０００５】
Ｅ．ｃｏｌｉ封入体からのヒトプラスミノゲンアクチベータの再生の場合には、Ｌ−アルギニンを加えることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏ折りたたみの収率を高めることが可能であることが分かっている。抗体断片や免疫毒素などの他の蛋白質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ折りたたみにおいてもＬ−アルギニンが折りたたみ効率を改善させる働きをすることが別の研究によって明らかになっている。アルギニンはグアニジノ基を含むが、その基はグアニジニウムほどその構造を不安定化することはない。よって、アルギニンは、未変性状態の蛋白質構造を著しく不安定化させることなく、折りたたまれていないポリペプチド鎖の溶解度、または折りたたまれている中間体の溶解度を上昇させると思われる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ折りたたみ効率を上昇させる他の添加剤は、高濃度のＴｒｉｓ緩衝液、ポリエチレングリコール、または洗浄剤である。折りたたみ体の収率向上は、（たとえば、ＴｒｉｔｏｎＸ１００およびリン脂質の）混合ミセルを使用することによっても達成されている。これらの混合ミセルは、極性基および無極性基を含み、これらの基はおそらく相互作用し合うことによって折りたたみ中間体の凝集を抑制する。
【０００６】
アマシャムファルマシアバイオテック社の刊行物、データファイル：アフィニティークロマトグラフィー；ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ、１ｍｌおよび５ｍ１；１８−１１３４−７８ＡＢ、１〜６ページ、２０００年５月は、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムでのＨｉｓ６−ｔａｇ付き蛋白質の再生について述べている。その再生緩衝液は２０ｍＭのイミダゾールを含む。この濃度のイミダゾールは、蛋白質とカラムマトリックス間の非特異的相互作用を防止するが、全く再生をもたらさない。それどころか、イミダゾールは変性化剤として知られている。
【０００７】
イェら（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｈｉｅｒａｃｈｉｃａｌ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ；Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．第７巻、４４３〜４４５ページ、２０００年には、イミダゾールがシトクロムｃ蛋白質の折りたたみ速度を促進することが可能であると記載されている。その蛋白質のＨｉｓ３３と共有結合性リガンドとの分子内相互作用はイミダゾールによって抑制された。比較的高濃度のイミダゾールは、本質的に蛋白質に変性効果を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
蛋白質の再生のための複数のプロトコルが文献に述べられているにも関わらず、この技術の工業的利用は進歩しているとはとても言い難い。この事実の原因は、技術的および生化学的困難に基づく。たとえ最適条件下でも蛋白質の再生は非常に低濃度の蛋白質の存在下でしか達成は不可能なので、工業的生成には莫大な再生容量の残渣物がもたらされることは避けがたい。さらにたとえ最適条件下でも多くの蛋白質の再生効率は低い。
【０００９】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの蛋白質の折りたたみ効率を強化するための物質を同定すること、および現在まで得られている収率より高い収率で効率的に蛋白質を再生する方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は本発明にしたがって、蛋白質を再生し、凝集を低減させ、および／または熱安定性を増大させるために置換イミダゾリウム塩を使用すること、ならびに処理対象の蛋白質を、置換イミダゾリウム塩を含む液体媒体に接触させる、蛋白質を再生し、凝集を低減させ、および／または熱安定性を増大させる方法によって実現される。本発明は、本発明による方法の使用によって調製した蛋白質にも関する。
【００１１】
本発明による使用は、蛋白質の再生のための使用であることが好ましい。
本発明によれば、凝集の低減とは、この凝集は通常液体媒体に長期に及ぶ保存期間中に生じ、生物学的機能の消失または低減を伴う、蛋白質の凝集の低減または実質的防止も意味することを企図している。
【００１２】
本発明によれば、熱安定性の増加とは、たとえ室温よりもはるかに高い温度であっても生物活性または蛋白質の正しい折りたたみが、それぞれ長時間にわたって維持されることを意味する。
【００１３】
本発明により使用されるイミダゾリウム塩は、室温でイオン性液体であることが好ましい。これらの化合物が室温で液体でない場合は、本発明によるイミダゾリウム塩は、処理条件下で少なくとも液体の形で、および／または液体媒体に溶解すべきである。本発明の枠内で使用されるイミダゾリウム塩は、環系と結合する有機構成成分の正電荷を含み、この正電荷は通常または好ましくはイミダゾリウム環内で非局在化している。
【００１４】
本方法は、置換イミダゾリウム塩が蛋白質の凝集を抑制し再生効率を高めるという驚くべき発見に基づく。現在まで、こうした有機塩は有機合成および二相接触反応において溶媒として使用されてきたにすぎないが、今までのところ生化学における構造形成過程に対する効果は不明である。また、より効率的な蛋白質の再生を可能にする他の有機塩、たとえば、３−（ｌ−ピリジニオ）−１−プロパン硫酸塩またはトリゴネリン塩酸塩（ＷＯ９９／１８１９６）についても記載されている。これらの物質は、たとえば、複素環式環系内で非局在化している正電荷を持たない。蛋白質の再生に対する効果の直接比較では、本発明のイミダゾリウム誘導体は、明らかにより高い効率を示している（実施例、ならびに図２、３および図８、９を参照のこと）。
【００１５】
本発明のイミダゾリウム塩のイミダゾリウム環は、酸化状態が異なり得る窒素、硫黄、および／またはリンを含む基などの官能基によって置換されていてよいアルキル、アルケニル、アリール、および／またはアラルキル基によってそれ自体置換されていることが好ましい。本発明によるこうした官能基の好ましい例はアミン、カルボキシル、カルボニル、アルデヒド、ヒドロキシ、硫酸、スルホン酸、および／またはリン酸基である。
【００１６】
本発明によればイミダゾリウム環の１つまたは両Ｎ原子は、同一または異なる置換基によって置換されていてよい。好ましくはイミダゾリウム環の両窒素原子は同一または異なる置換基によって置換されている。
【００１７】
本発明によれば、イミダゾリウム環の１つまたは複数の炭素原子で、イミダゾリウム塩が追加として、または排他的に置換されていることも可能であり、または好ましい。
置換基として好ましいものは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、および／またはイソブチル基などのＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、特に好ましいものはエチルおよび／またはメチル基である。別の好ましい置換基はエチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、および／またはイソブチレンなどのＣ２〜Ｃ４アルケニル基である。これらのＣ１〜Ｃ４アルキル基およびＣ２〜Ｃ４アルケニル基によって、本発明によるイミダゾリウム化合物は、本発明によって特に有用であり、アルキル鎖およびアルケニル鎖が長くなるにつれて減少する水への溶解度を有する。しかし、水への溶解度はアルキル鎖またはアルケニル鎖それ自体上にある溶解性促進置換基、たとえば、硫酸基、スルホン酸基、アミノ基、またはリン酸基によって改善することも可能である。本発明によれば、４個を超えるＣ原子を有するアルキルおよびアルケニル置換基も含まれ、その場合たとえばＣ５〜Ｃ１０アルキルまたはアルケニル置換基も依然として好ましい。これらのＣ５〜Ｃ１０アルキル基またはアルケニル基が１つまたは複数のリン酸基、スルホン酸基、アミノ基、および／またはリン酸基などの他の置換基をそのアルキル基および／またはアルケニル基に含む場合これらはさらに好ましい。
【００１８】
本発明によればアリール置換基として単環式および／または二環式アリール基、フェニル、ビフェニル、および／またはナフタレン；ならびにヒドロキシ、スルホン酸、硫酸、アミノ、アルデヒド、カルボニル、および／またはカルボキシ基を含むこれらの化合物の誘導体が好ましい。好ましいアリール置換基の例には、フェノール、ビフェニル、ビフェノール、ナフタレン、ナフタレンカルボン酸、ナフタレンスルホン酸、ビフェニロール、ビフェニルカルボン酸、フェノール、フェニルスルホナート、および／またはフェノールスルホン酸が含まれる。
【００１９】
好ましいアラルキル基は、ベンジル基または置換ベンジル基である。
イミダゾリウム環は、少なくともその１つのＮ原子においてメチル基を含むことが特に好ましい。
【００２０】
本発明により使用されるイミダゾリウム塩は液体が好ましく、すなわち室温（約２５℃）でイオン性の液体が好ましい。しかし、イミダゾリウム塩が室温で液体ではない場合は、それぞれ再生条件下で液体の形で存在するか、または液体媒体に溶解するイミダゾリウム塩も使用可能である。
【００２１】
イミダゾリウム塩は、イミダゾールとは明確に特性が異なる。特に、イミダゾリウム塩が親水性であるの反して、イミダゾールは疎水性であり、蛋白質に対して変性効果を有する。
【００２２】
本発明による置換イミダゾリウム環の陰イオン性対イオンとしてはハロゲンイオン、およびハロゲンを含むイオンが特に有用である。この点で特に好ましいものは塩化物およびテトラフルオロホウ酸塩である。リン酸、硫酸、およびイソシアン酸の各塩がより好ましい。
【００２３】
本発明にしたがって使用されるより好ましいイミダゾリウム塩は、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩である。
【００２４】
本発明によって以下の蛋白質クラスおよび／または蛋白質を再生することが可能であり、その熱安定性を高め、および／またはその凝集を減少させることが可能であることが好ましく、あるいは以下の蛋白質および／または蛋白質クラスが本発明による方法において使用可能であることが好ましく、それぞれ：
プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、特にトロンビン、ファクターＸａ（Ｆａｋｔｏｒ  Ｘａ）、カスパーゼ、カテプシン、トリプシンおよびキモトリプシン、システインプロテアーゼ、ペプシンやレンニンなどの酸性プロテアーゼ、サーモリシンなどのメタロプロテイナーゼ；プロテアーゼ阻害剤、好ましくはペプスタチン、アンチパイン、ケモスタチン、エラスチナール、ロイペプチン、ベスタチン、アンチトロンビンＩＩＩ；
ＤＮＡ結合蛋白質、好ましくは転写因子、特にＮＦカッパＢ、およびｊｕｎ、ｆｏｓ、ｋｒｏｘ、ｍｙｃ、Ｅ２Ｆファミリーの構成要素、ウイルスＴ抗原、
ウイルス蛋白質、たとえば、ウイルスエンベロープ蛋白質、カプシド蛋白質、ウイルスプロテアーゼ、ポリメラーゼ、および／またはＴ抗原、
ホスファターゼ、
プロテインキナーゼ、好ましくはチロシンキナーゼおよび／またはセリンキナーゼ、
免疫グロブリンのスーパーファミリーの蛋白質、たとえば、抗体およびその断片、
増殖因子、たとえば上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ  ＩおよびＩＧＦ  ＩＩ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、および／または血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）、
ならびにこれらの蛋白質に由来する蛋白質および断片である。
【００２５】
本発明によってジスルフィド不含蛋白質、およびジスルフィド架橋蛋白質それぞれを再生することが可能であり、および／またはその熱安定性を改善することが可能であり、および／またはその凝集を防止または減少させることが可能である。特に好ましくは、マルチドメイン蛋白質および錯体ジスルフィド架橋蛋白質、たとえばリゾチーム、ｒＰＡ（組換えプラスミノゲンアクチベータ、商標名ｒｅｐｌａｓｅ）、αグルコシダーゼ、抗体およびそれに由来する断片、ならびに／または増殖因子などを処理することが可能である。これらの蛋白質／蛋白質クラスは単に例として働き、本発明はこの列挙に限定されない。
【００２６】
蛋白質を再生し、凝集を低減させ、および／または熱安定性を増大させるための本発明による方法の液体媒体として、処理対象の蛋白質に適切な緩衝系を使用することが好ましい。Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、Ｍｅｓ、Ｍｏｐｓ、酢酸塩、グリシン、および／またはリン酸塩が緩衝物質として使用されることが好ましく、液体媒体中の緩衝濃度は１０〜１０００ｍＭであることが好ましく、５〜２００ｍＭがより好ましく、１０〜２００ｍＭがさらに好ましく、１０〜５０ｍＭがよりさらに好ましい。緩衝系のｐＨは４〜１１が好ましく、７．５〜１０．５がより好ましい。リゾチームの場合には再生中のｐＨ値は約８が好ましく、ｒＰＡの再生にはｐＨ値は約１０．５が好ましい。再生対象となる他の蛋白質には、緩衝組成物のパラメーターを個々に適合および最適化させて最大収率の再生蛋白質を得ることも可能である。
【００２７】
本発明による方法、蛋白質の再生では、再生対象または処理対象の蛋白質の接触は、それぞれ、処理対象の蛋白質を液体媒体で希釈、透析、および／または透析ろ過によって実施することが好ましい。原則的に、変性された蛋白質の緩衝液を再生緩衝液へ交換することによって再生は確実なものとなるはずである。
【００２８】
接触中、特に再生中、処理対象の蛋白質の蛋白質濃度は５〜５００μｇ／ｍｌが好ましく、１０〜１００μｇ／ｍｌが好ましく、約５０〜１００μｇ／ｍｌがより好ましい。それぞれの蛋白質の溶解度特性を考慮しながら、それぞれ再生対象の、または処理対象の蛋白質に関してこれらの値を調節することが当業者には可能である。
【００２９】
本発明による方法は、ジスルフィド不含蛋白質およびジスルフィド架橋蛋白質の再生に有用である。ジスルフィド不含蛋白質に関して、これらの蛋白質を置換イミダゾリウム塩を含む再生媒体に、ＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシステインなどの還元剤の存在下、好ましくは濃度１〜１０ｍＭで接触させることが好ましい。
【００３０】
ジスルフィド架橋蛋白質の再生に関して、これらの蛋白質をＤＴＴ、ＤＴＥ、グルタチオン、システイン、メルカプトエタノールなどの、還元型および酸化型のチオール物質からなるレドックス系の存在下、好ましくは濃度１〜１０ｍＭで接触させるのが好ましい。こうした場合、還元型物質と酸化型物質の濃度比（還元型：酸化型）は１：１０〜２０：１が好ましく、１：５〜１０：１が好ましく、１：１〜５：１がより好ましい。
【００３１】
接触中、特に再生中、置換イミダゾリウム塩の濃度は、再生媒体に基づいて５〜９５容量％が好ましく、５〜５０容量％がより好ましく、１０〜４０容量％がさらに好ましい。こうした場合、個々の蛋白質の最適濃度は簡単な実験によって決定してもよい。通常、置換イミダゾリウム塩を１０〜４０容量％の割合で加えると最高の再生収率が得られる。しかし、既に上述したように、その濃度はそれぞれ使用するイミダゾリウム化合物に応じて９５容量％まで可能である。
【００３２】
モル濃度に関して、上記の容量百分比１０〜４０容量％は約０．５〜３Ｍに相当し、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドの場合、これは厳密には０．６８〜２．７３Ｍをさす。したがって、モル濃度に関して、本発明によれば置換イミダゾリウム塩のモル濃度は再生媒体に基づいて約０．２５〜５Ｍであることが好ましく、０．２５〜３．５Ｍがより好ましく、約０．５〜３Ｍが最も好ましい。
【００３３】
一般に、再生期間は、０．１〜１００時間が好ましく、１〜５０時間がより好ましく、約２〜２０時間がよりさらに好ましい。
高い温度では凝集反応が増加するので、再生は０〜３７℃の低温度で行うことが好ましく、５〜１５℃が好ましい。
【００３４】
再生を最適化するためのパラメーターとして、蛋白質の生物活性および凝集挙動を工程全体にわたって計測することが可能なことが好ましい。
本発明による方法の別の実施形態では蛋白質を再生緩衝液へ連続的に複数回パルス方式でまたは連続方式で加えてもよい。
【００３５】
最後に、本発明による方法は蛋白質の再生のための特に有利な方式に適当である。この点で置換イミダゾリウム塩に加え蛋白質の再生用液体媒体は、他の知られている、たとえば、尿素、グアニジニウム、Ｌ−アルギニン、アルキル尿素、カルボン酸アミド、アルキル化アミン、Ｔｒｉｓ緩衝液、ポリエチレングリコール、洗浄剤など、１種または複数の再生を促進する再生物質を含むことがさらに好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
以下に本発明を実施例に関して記載する。この点において説明を図面に基づいて行う。
【実施例１】
【００３７】
蛋白質の変性
０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、６Ｍのグアニジニウム塩酸塩、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのＤＴＴ中に、蛋白質濃度が０．５〜２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、ｒＰＡ、または封入体蛋白質を少なくとも２時間室温で変性させ還元した。続いて、ＨＣｌを加えることによってｐＨ値を約ｐＨ２に低下させる。場合によっては、６Ｍのグアニジニウム塩酸塩（ｐＨ２）の１０００倍容量に対して変性蛋白質を透析することも可能である。変性蛋白質の濃度は、ブラッドフォードアッセイ（ブラッドフォード、１９７６年）または分光光度法によって定量する。この目的のために、ｒＰＡには吸光係数ｅ（１ｍｇ／ｍｌ、２８０ｎｍ、１ｃｍ）＝１を使用し、リゾチームには吸光係数ｅ（１ｍｇ／ｍｌ、２８０ｎｍ、１ｃｍ）＝２．３７を使用する。
【実施例２】
【００３８】
リゾチームの再生
変性し還元した蛋白質を予め１０℃で平衡にしてある再生緩衝液に１：１００で希釈することによってリゾチームの再生を実施し、その場合蛋白質の最終濃度は２００μｇ／ｍｌである。再生緩衝液として０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＭのＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）、および様々な濃度のイオン性液体１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩を使用する。還元剤としては、変性試料の希釈によって持ち込まれる２ｍＭのＤＴＴが作用する。再生後、０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡの１０００倍容量に対して試料を１晩透析する。リゾチームの酵素活性を測光法によって測定し、検量線で定量して再生率を求める。
【００３９】
図１はリゾチームの再生収率と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩濃度の間の関係を示す。１０〜１５容量％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下で、リゾチームが定量的すなわち１００％酸化再生される。
【実施例３】
【００４０】
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩を使用するｒＰＡの再生
６Ｍのグアニジニウム（ｐＨ２）中に存在するｒＰＡの再生を、様々な濃度の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下で０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＳＧ、２ｍＭのＧＳＨ（還元グルタチオン）中に１：１００希釈することによって実施する。再生を少なくとも１６時間１０℃で実施する。再生後、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡの１０００倍容量に対して試料を１晩透析する。ｒＰＡの酵素活性をＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ  ｔＰＡ  ａｓｓａｙ（ロシュダイアグノスティクス社）によって定量し、未変性状態のｒＰＡの検量線で定量して再生率を求める。
【００４１】
図２は、ｒＰＡの再生収率と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩濃度の間の関係を示す。２０〜３０容量％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下で再生収率は２３％である。
【実施例４】
【００４２】
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドを使用するｒＰＡの再生
６Ｍのグアニジニウム（ｐＨ２）中に存在するｒＰＡの再生を、様々な濃度の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドの存在下で０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＳＧ、２ｍＭのＧＳＨ中に１：１００希釈することによって実施する。再生を少なくとも１６時間１０℃で実施する。再生後、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡの１０００倍容量に対して試料を１晩透析する。ｒＰＡの酵素活性をＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ  ｔＰＡ  ａｓｓａｙ（ロシュダイアグノスティクス社）によって定量し、未変性状態のｒＰＡの検量線で定量して再生率を求める。
【００４３】
図３は、ｒＰＡの再生収率と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド塩濃度の間の関係を示す。２０〜２５容量％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドの存在下で再生収率は２６％である。
【実施例５】
【００４４】
４−メチル−Ｎ−ブチルピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩を使用するｒＰＡの再生（比較例）
６Ｍのグアニジニウム（ｐＨ２）中に存在するｒＰＡの再生を、様々な濃度の４−メチル−Ｎ−ブチルピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下で０．０１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＳＧ、２ｍＭのＧＳＨ中に１：１００希釈することによって実施する。再生を少なくとも１６時間１０℃で実施する。再生後、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡの１０００倍容量に対して試料を１晩透析する。ｒＰＡの酵素活性をＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ  ｔＰＡ  ａｓｓａｙ（ロシュダイアグノスティクス社）によって定量し、未変性状態のｒＰＡの検量線で定量して再生率を求める。
【００４５】
図４は、ｒＰＡの再生収率と４−メチル−Ｎ−ブチルピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩濃度の間の関係を示す。ｒＰＡの再生収率は、４−メチル−Ｎ−ブチルピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩の濃度の上昇につれて増加する。濃度９４％（ｖ／ｖ）の４−メチル−Ｎ−ブチルピリジニウムテラフルオロホウ酸塩でのｒＰＡの再生収率は１３．５％である。
【実施例６】
【００４６】
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩を使用するｒＰＡの再生
６Ｍのグアニジニウム（ｐＨ２）中に存在するｒＰＡの再生を、様々な濃度の１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下で０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＳＧ、２ｍＭのＧＳＨ中に１：１００希釈することによって実施する。再生を少なくとも１６時間１０℃で実施する。再生後、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡの１０００倍容量に対して試料を１晩透析する。ｒＰＡの酵素活性をＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ  ｔＰＡ  ａｓｓａｙ（ロシュダイアグノスティクス社）によって定量し、未変性状態のｒＰＡの検量線で定量して再生率を求める。
【００４７】
図５は、ｒＰＡの再生収率と１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩濃度の間の関係を示す。２０％（ｖ／ｖ）の１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下で再生収率は８％である。
【実施例７】
【００４８】
ｒＰＡ再生中の凝集
６Ｍのグアニジニウム（ｐＨ２）中に存在するｒＰＡの再生を、５％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下または不在下で０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＳＧ、２ｍＭのＧＳＨ中に１：１００希釈することによって実施する。攪拌した蛍光キュベット中でｌ０℃にて再生を実施する。動的である間、３６０ｎｍでの励起と３６０ｎｍでの発光を用いた光散乱を測定することによって、蛋白質の凝集をモニターする。
【００４９】
図６は、塩の不在下（白棒）および５容量％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下（黒棒）、緩衝液で補正した、ｒＰＡ再生の凝集測定の平坦域値を示す。少なくとも５容量％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下で再生対象のｒＰＡの凝集はほぼ完全に抑制される。
【実施例８】
【００５０】
ＧＬＰ１受容体のＮ末端ドメイン（ｎＧＬＰ１Ｒ）の溶解度
未変性状態の構造化した受容体ドメインを０．４Ｍのリン酸カリウム（ｐＨ６．３）、０．４Ｍの硫酸アンモニウム中、２０℃で５％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドの存在および不在下、様々な蛋白質濃度で１晩培養した。続いて、蛋白質凝集体を７０，０００ｒｐｍで沈殿させ、可溶性蛋白質画分を２８０ｎｍでの吸収分光光度法によって定量した。図７は、個々の条件下で実現が可能であった可溶性蛋白質の最高濃度の比較を示す。それにより、この実施例は、置換イミダゾリウム塩によって溶解度が増加したことまたは凝集が減少したことを示す。
【実施例９】
【００５１】
ｒＰＡの熱安定性
様々な濃度の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＳＧ、２ｍＭのＧＳＨ中に濃度２０μｇ／ｍｌで存在する未変性状態のｒＰＡを２０℃から９０℃へ加熱速度約０．３℃／分で加熱する。この工程中、蛋白質の凝集状態を光散乱によって分析する。この目的のために、蛍光計中３６０ｎｍで試料の励起を実施し、そのシグナルも３６０ｎｍで検出する。
【００５２】
図８は、熱変性（１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩が黒丸０容量％、黒三角５容量％、白丸１２容量％、白三角２０容量％）中のｒＰＡの凝集挙動を示す。１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の不在下ではｒＰＡの凝集は５５℃で開始する。５容量％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩の存在下では、８０℃より高い温度でのみ凝集の増加は観察可能であるが、高濃度の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩では９０℃まで測定可能な凝集は生じない。
【実施例１０】
【００５３】
３−（１−ピリジニオ）−１−プロパン硫酸塩を使用するｒＰＡの再生（比較例）
６Ｍのグアニジニウム（ｐＨ２）中に存在するｒＰＡの再生を、様々な濃度の３−（１−ピリジニオ）−ｌ−プロパン硫酸塩の存在下で０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＳＧ、２ｍＭのＧＳＨ中に１：１００希釈することによって実施する。再生を少なくとも１６時間１０℃で実施する。再生後、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡの１０００倍容量に対して試料を１晩透析する。ｒＰＡの酵素活性をＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ  ｔＰＡ  ａｓｓａｙ（ロシュダイアグノスティクス社）によって定量し、未変性状態のｒＰＡの検量線で定量して再生率を求める。
【００５４】
図９は、ｒＰＡの再生収率と３−（１−ピリジニオ）−１−プロパン硫酸塩濃度の間の関係を示す。３０％（ｖ／ｖ）の３−（１−ピリジニオ）−１−プロパン硫酸塩の存在下で再生の最大収率は１８％である。
【実施例１１】
【００５５】
トリゴネリン塩酸塩を使用するｒＰＡの再生（比較例）
６Ｍのグアニジニウム（ｐＨ２）中に存在するｒＰＡの再生を、様々な濃度のトリゴネリン塩酸塩の存在下で０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＳＧ、２ｍＭのＧＳＨ中に１：１００希釈することによって実施する。再生を少なくとも１６時間１０℃で実施する。再生後、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡの１０００倍容量に対して試料を１晩透析する。ｒＰＡの酵素活性をＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ  ｔＰＡ  ａｓｓａｙ（ロシュダイアグノスティクス社）によって定量し、未変性状態のｒＰＡの検量線で定量して再生率を求める。
【００５６】
図１０は、ｒＰＡの再生収率とトリゴネリン塩酸塩濃度の間の関係を示す図である。この塩の存在下ではｒＰＡの改善した再生は観察されない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】リゾチームの再生収率％と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩濃度の間の関係を示す図。
【図２】ｒＰＡの再生収率と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩濃度の間の関係を示す図。
【図３】ｒＰＡの再生収率と１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド濃度の間の関係を示す図。
【図４】ｒＰＡの再生収率と４−メチル−Ｎ−ブチルピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩濃度の間の関係を示す図。
【図５】ｒＰＡの再生収率と１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩濃度の間の関係を示す図。
【図６】０％および５％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩が含まれる、光散乱によって定量した再生中のｒＰＡの凝集を示すグラフ。
【図７】５％の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドの不在下および存在下で溶解したｎＧＬＰ１Ｒの濃度を示す図。
【図８】光散乱によって定量した、温度に関する、かつ様々な濃度の１−エチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩に対するｒＰＡの凝集挙動を示すグラフ。
【図９】ｒＰＡの再生収率と３−（１−ピリジニオ）−１−プロパン硫酸塩濃度の間の関係を示す図。
【図１０】ｒＰＡの再生収率とトリゴネリン塩酸塩濃度の間の関係を示す図。
【図１】
2005518380.tif 000002
【図２】
2005518380.tif 000003
【図３】
2005518380.tif 000004
【図４】
2005518380.tif 000005
【図５】
2005518380.tif 000006
【図６】
2005518380.tif 000007
【図７】
2005518380.tif 000008
【図８】
2005518380.tif 000009
【図９】
2005518380.tif 000010
【図１０】
2005518380.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月18日(2003.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質の再生、蛋白質の熱安定性の増大、あるいは蛋白質の凝集の低減のための置換イミダゾリウム塩の使用。
【請求項２】
前記イミダゾリウム塩が、アルキル、アルケニル、アリール、および／またはアラルキル基によって置換されており、それらの基は、官能基、好ましくは窒素、硫黄、および／またはリンを含む基によって置換されていてよいことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記イミダゾリウム塩が、イミダゾリウム環の両窒素原子において置換されていることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記イミダゾリウム塩が、イミダゾリウム環の１つまたは複数の炭素原子において置換されていることを特徴とする請求項１から３の一項または複数項に記載の使用。
【請求項５】
前記イミダゾリウム環が、好ましくはメチル基やエチル基であるＣ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル基、および／または、単環式もしくは二環式アリール基を前記置換基として有することを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項６】
前記イミダゾリウム環が、少なくとも１つの前記Ｎ原子においてメチル基を有することを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項７】
前記イミダゾリウム環が、フェノール、ビフェニル、ビフェノール、ナフタレン、ナフタレンカルボン酸、ナフタレンスルホン酸、ビフェニロール、ビフェニルカルボン酸、フェノール、フェニルスルホン酸、フェノールスルホン酸基、および／または、置換もしくは非置換ベンジル基のうちの１つまたは複数の置換基を含むことを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項８】
前記置換基が、アミン、カルボキシル、カルボニル、アルデヒド、ヒドロキシ、硫酸、スルホン酸、および／またはリン酸基のうちの１つまたは複数の基によってさらに置換されていることを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項９】
前記イミダゾリウム塩が、室温でイオン性の液体であることを特徴とする前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項１０】
プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、特にトロンビン、ファクターＸａ、カスパーゼ、カテプシン、トリプシンおよび／またはキモトリプシン、システインプロテアーゼ、ペプシンやレンニンなどの酸性プロテアーゼ、サーモリシンなどのメタロプロテイナーゼ；
プロテアーゼ阻害剤、好ましくはペプスタチン、アンチパイン、ケモスタチン、エラスチナール、ロイペプチン、ベスタチン、アンチトロンビンＩＩＩ；
ＤＮＡ結合蛋白質、好ましくは転写因子、特にＮＦカッパＢ、およびｊｕｎ、ｆｏｓ、ｋｒｏｘ、ｍｙｃ、Ｅ２Ｆファミリーの構成蛋白質、ならびに／またはウイルスＴ抗原；
ウイルスエンベロープ蛋白質、カプシド蛋白質、ウイルスプロテアーゼ、ポリメラーゼ、および／またはＴ抗原などのウイルス蛋白質；
ホスファターゼ；
プロテインキナーゼ、好ましくはチロシンキナーゼおよび／またはセリンキナーゼ；
免疫グロブリンのスーパーファミリーの蛋白質、たとえば、抗体およびその断片；
増殖因子、好ましくは上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ  ＩおよびＩＧＦ  ＩＩ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）、および／または血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）；
リゾチーム、ｒＰＡ、α−グルコシダーゼ、
ならびにこれらの蛋白質に由来する蛋白質および断片を、再生し、熱安定性を増大させ、あるいは凝集を低減させるものである前記した請求項のうちの一項または複数項に記載の使用。
【請求項１１】
蛋白質の再生、熱安定性の増大、および／または凝集の低減方法であって、
処理対象の蛋白質を、置換イミダゾリウム塩を含む液体媒体に接触させることを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
液体再生媒体を前記液体媒体として使用する請求項１１に記載の蛋白質の再生方法。
【請求項１３】
前記処理対象の蛋白質に適切な緩衝系を前記液体媒体として使用することを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、Ｍｅｓ、Ｍｏｐｓ、酢酸塩、グリシン、および／またはリン酸塩を緩衝物質として使用することを特徴とする請求項１１から１３の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１５】
前記液体媒体中の緩衝物質の濃度が１０〜１０００ｍＭ、好ましくは５〜２００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭであることを特徴とする請求項１１から１４の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１６】
緩衝系のｐＨが４〜１１、好ましくは７．５〜１０．５であることを特徴とする請求項１１から１５の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１７】
前記イミダゾリウム塩が、アルキル、アルケニル、アリール、および／またはアラルキル基によって置換されており、それらの基は、官能基、好ましくは窒素、硫黄、および／またはリンを含む基によって置換されていてよいことを特徴とする請求項１１から１６の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１８】
前記イミダゾリウム塩が、イミダゾリウム環の両窒素原子において置換されていることを特徴とする請求項１１から１７の一項または複数項に記載の方法。
【請求項１９】
前記イミダゾリウム塩が、イミダゾリウム環の１つまたは複数の炭素原子において置換されていることを特徴とする請求項１１から１８の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２０】
前記イミダゾリウム環が、好ましくはメチル基やエチル基であるＣ１〜Ｃ４アルキル基、Ｃ１〜Ｃ４アルケニル基、および／または、単環式もしくは二環式アリール基を前記置換基として有することを特徴とする請求項１１から１９の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２１】
前記イミダゾリウム環が、少なくとも１つの前記Ｎ原子においてメチル基を有することを特徴とする請求項１１から２０の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２２】
前記イミダゾリウム環が、フェノール、ビフェニル、ビフェノール、ナフタレン、ナフタレンカルボン酸、ナフタレンスルホン酸、ビフェニロール、ビフェニルカルボン酸、フェノール、フェニルスルホン酸、フェノールスルホン酸基、および／または、置換もしくは非置換ベンジル基のうちの１つまたは複数の置換基を含むことを特徴とする請求項１１から２１の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２３】
前記置換基が、アミン、カルボキシル、カルボニル、アルデヒド、ヒドロキシ、硫酸、スルホン酸、および／またはリン酸基のうちの１つまたは複数の基によってさらに置換されていることを特徴とする請求項１１から２２の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２４】
前記イミダゾリウム塩が室温でイオン性の液体であることを特徴とする請求項１１から２３の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２５】
前記接触が、処理対象の蛋白質を前記液体媒体で希釈、透析、および／または透析ろ過によって実施されることを特徴とする請求項１１から２４の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２６】
接触中における前記処理対象の蛋白質中の蛋白質濃度が、５〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約５０〜１００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１１から２５の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２７】
置換イミダゾリウム塩の濃度が、前記液体媒体に基づいて、５〜９５容量％、好ましくは５〜５０容量％、最も好ましくは１０〜４０容量％であることを特徴とする請求項１１から２６の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２８】
置換イミダゾリウム塩のモル濃度が、前記液体媒体に基づいて、０．２５〜５Ｍ、好ましくは０．２５〜３．５Ｍ、最も好ましくは０．５〜３Ｍであることを特徴とする請求項１１から２７の一項または複数項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、再生対象の蛋白質を前記再生媒体へ逐次的に数回、または連続的に加えることによって実施されることを特徴とする請求項１１から２８の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３０】
再生対象の蛋白質と再生媒体との接触を０．１〜１００時間、好ましくは１〜５０時間、より好ましくは５〜２０時間にわたって実施することを特徴とする請求項１１から２９の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３１】
プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、特にトロンビン、ファクターＸａ、カスパーゼ、カテプシン、トリプシンおよび／またはキモトリプシン、システインプロテアーゼ、ペプシンやレンニンなどの酸性プロテアーゼ、サーモリシンなどのメタロプロテアーゼ；
プロテアーゼ阻害剤、好ましくはペプスタチン、アンチパイン、ケモスタチン、エラスチナール、ロイペプチン、ベスタチン、アンチトロンビンＩＩＩ；
ＤＮＡ結合蛋白質、好ましくは転写因子、特にＮＦカッパＢ、およびｊｕｎ、ｆｏｓ、ｋｒｏｘ、ｍｙｃ、Ｅ２Ｆファミリーの構成蛋白質、ウイルスＴ抗原；
ウイルスエンベロープ蛋白質、カプシド蛋白質、ウイルスプロテアーゼ、ポリメラーゼ、および／またはＴ抗原などのウイルス蛋白質；
ホスファターゼ；
プロテインキナーゼ、好ましくはチロシンキナーゼおよび／またはセリンキナーゼ；
免疫グロブリンのスーパーファミリーの蛋白質、たとえば、抗体およびその断片；
増殖因子、好ましくは上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ  ＩおよびＩＧＦ  ＩＩ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）および血小板増殖因子（ＰＤＧＦ）；
リゾチーム、ｒＰＡ、α−グルコシダーゼ、
ならびにこれらの蛋白質に由来する蛋白質および断片を、再生し、熱安定性を増大させ、および／または凝集を低減させるものである請求項１１から３０の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３２】
還元剤、好ましくはＤＴＴ、ＤＴＥおよび／またはシステインの存在下でジスルフィドを含まない蛋白質と前記再生媒体との接触を実施して、前記ジスルフィドを含まない蛋白質を再生することを特徴とする請求項１１から３１の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３３】
ＤＴＴ、ＤＴＥ、グルタチオン、システイン、および／またはメルカプトエタノールなどの還元型および酸化型のチオール物質からなるレドックス系の存在下でジスルフィド架橋蛋白質と前記再生媒体の接触を実施して、前記ジスルフィド架橋蛋白質を再生することを特徴とする請求項１１から３２の一項または複数項に記載の方法。
【請求項３４】
還元型物質と酸化型物質の濃度比が、１：１０〜２０：１、好ましくは１：５〜１０：１、さらに好ましくは１：１〜５：１であることを特徴とする請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記蛋白質再生用液体媒体が、他の再生物質、好ましくは尿素、グアニジニウム、Ｌ−アルギニン、アルキル尿素、カルボン酸アミド、アルキル化アミン、Ｔｒｉｓ緩衝液、ポリエチレングリコール、および／または洗浄剤を含むことを特徴とする請求項１１から３４の一項または複数項に記載の方法。
【国際調査報告】
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