(57)【要約】呼吸系細胞によるムチン分泌を調節するための方法と組成物が提供される。本方法において、有効量のhCLCA2（またはその同族体）調節物質を細胞と接触させて、細胞によるムチン分泌を調節（例えば、ムチン分泌の低下または上昇）する。本方法は、種々の異なる用途で有用であり、呼吸系ムチン分泌に関連する疾患症状（例えば、ムチンの分泌過多または不足）の治療がある。また、呼吸系ムチン分泌の調節物質のスクリーニング法が提供される。最後に、mCLCA4とその非ヒト同族体ならびにこれらをコードする核酸組成物が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然の環境以外に存在するmCLCA4またはその非ヒト同族体。
【請求項２】
配列番号02の配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
mCLCA4またはその非ヒト同族体をコードするヌクレオチド配列を有する、その天然の環境以外に存在する核酸。
【請求項４】
配列番号01のヌクレオチド配列と同じかまたは実質的に同一の核酸配列を有する、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
発現宿主中で機能性の転写開始領域、該転写開始領域の転写制御下にある請求項３に記載の核酸中に見いだされるヌクレオチド配列を有する核酸、および該宿主中で機能性の転写停止領域を含んでなる発現カセット。
【請求項６】
請求項５に記載の発現カセットを染色体外要素として含むか、または宿主細胞への該発現カセットの導入の結果として、宿主細胞のゲノム中に組み込まれた該発現カセットを含む細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞の子孫細胞。
【請求項８】
mCLCA4またはその非ヒト同族体の産生法であって：
請求項６に記載の細胞を培養して、該mCLCA4またはその非ヒト同族体を発現させ；そして
該mCLCA4またはその非ヒト同族体を、他のタンパク質を実質的に含まないように該細胞から単離する、ことを含んでなる方法。
【請求項９】
mCLCA4またはその非ヒト同族体に特異的に結合する抗体またはその結合断片。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記mCLCA4またはその非ヒト同族体の発現が野生型と比較して改変されている、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記発現が野生型と比較して上昇している、請求項11に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記発現が野生型と比較して低下している、請求項11に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記動物がマウスである、請求項11に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
ムチン分泌調節活性を有する候補化合物を得る方法であって：
(a) CLCA2／ムチン分泌モデルに候補化合物を接触させ；
(b) ムチン分泌への候補化合物の作用を観察し；そして
(c) 観察された作用から候補化合物のムチン分泌調節活性を得る、
ことを含んでなる方法。
【請求項１６】
前記モデルがin vitroモデルである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記モデルがin vivoモデルである、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
前記モデルがhCLCA2／ムチン分泌モデルである、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
前記モデルがmCLCA4／ムチン分泌モデルである、請求項15に記載の方法。
【請求項２０】
前記候補化合物が候補CLCA2阻害物質である、請求項15に記載の方法。
【請求項２１】
前記候補化合物が候補CLCA2増強物質である、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
請求項15に記載の方法において活性を有するCLCA2調節化合物。
【請求項２３】
請求項22に記載の化合物と薬剤学的に許容される担体とを含んでなる医薬調製物。
【請求項２４】
症状に関連する呼吸系ムチン産生の治療用組成物の調製のためのCLCA2調節物質の使用。
【請求項２５】
前記CLCA2調節物質がhCLCA2またはその同族体の活性を調節する、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
前記宿主CLCA2調節物質が、hMUC4、hMUC5AC、およびhMUC5Bよりなる群から選択される少なくとも１つのムチンの分泌を調節する、請求項25に記載の使用。
【請求項２７】
前記CLCA2調節物質がムチン分泌を低下させる、請求項24に記載の使用。
【請求項２８】
前記調節物質がアンタゴニストである、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
前記呼吸系ムチン産生関連症状が、慢性気管支炎、喘息、嚢胞性繊維症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、または気管支拡張症である、請求項24に記載の使用。
【請求項３０】
請求項15〜21のいずれか１項に記載の方法の工程；および
(i) 被験体に治療上有効量の該薬剤を提供するのに充分な量で、工程(b)で同定されたかまたは工程(c)で得られた候補化合物またはその類似体もしくは誘導体を合成する工程；および／または
(ii) 工程(b)で同定されたかまたは工程(c)で得られた候補化合物またはその類似体もしくは誘導体と、薬剤学的に許容される担体とを一緒にする工程、
を含む、薬剤の製造方法。
【請求項３１】
宿主のムチン分泌呼吸系関連症状の存在の診断方法であって：
該宿主の呼吸系中のCLCA2発現レベルを測定し；そして
測定された発現レベルを症状の有無と関連付ける、
ことを含んで成る方法。
【請求項３２】
対照と比較して上昇したCLCA2発現レベルが該症状の存在を示す、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記症状がムチン分泌過多に関連している、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
対照と比較して低下したCLCA2発現レベルが該症状の存在を示す、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
前記症状がムチン分泌不足に関連している、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記測定工程が、該宿主の呼吸系から試料を得て、該試料中のCLCA2発現レベルを測定することを含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３７】
前記宿主がヒトである、請求項31に記載の方法。
【請求項３８】
呼吸系細胞によるムチン分泌の調節方法であって：
細胞に、該細胞によるムチン分泌を調節するのに有効な量のCLCA2調節物質を接触させる、ことを含んで成る方法。
【請求項３９】
前記CLCA2調節物質が、hCLCA2またはその同族体の活性を調節する、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記呼吸系細胞がヒト細胞であり、方法が、hMUC4、hMUC5ACおよびhMUC5Bよりなる群から選択される少なくとも１つのムチンの分泌を調節する、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
前記呼吸系細胞がマウス細胞であり、前記調節物質が、mCLCA4の活性を調節し、該方法はmMUC5ACおよび／またはmMUC5Bの分泌を調節する、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が該細胞によるムチン分泌を低下させる、請求項38に記載の方法。
【請求項４３】
前記調節物質がアンタゴニストである、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記方法が該細胞によるムチン分泌を上昇させる、請求項38に記載の方法。
【請求項４５】
前記調節物質がアゴニストである、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
宿主の呼吸系のムチン分泌の調節方法であって：
宿主に、該呼吸系中のムチン分泌を調節するのに有効な量のCLCA2調節物質を投与する、ことを含んで成る方法。
【請求項４７】
前記CLCA2調節物質が、hCLCA2またはその同族体の活性を調節する、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記宿主がヒトであり、方法が、hMUC4、hMUC5ACおよびhMUC5Bよりなる群から選択される少なくとも１つのムチンの分泌を調節する、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
前記宿主がマウスであり、前記調節物質がmCLCA4の活性を調節し、該方法がmMUC5ACおよび／またはmMUC5Bの分泌を調節する、請求項47に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法がムチン分泌を低下させる、請求項46に記載の方法。
【請求項５１】
前記調節物質がアンタゴニストである、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法がムチン分泌を上昇させる、請求項46に記載の方法。
【請求項５３】
前記調節物質がアゴニストである、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
症状に関連する呼吸系ムチン産生を患う宿主の治療方法であって：
宿主に、該症状を治療するのに有効な量のCLCA2調節物質を投与する、ことを含んで成る方法。
【請求項５５】
前記CLCA2調節物質が、hCLCA2またはその同族体の活性を調節する、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記宿主がヒトであり、方法が、hMUC4、hMUC5ACおよびhMUC5Bよりなる群から選択される少なくとも１つのムチンの分泌を調節する、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法がムチン分泌を低下させる、請求項54に記載の方法。
【請求項５８】
前記調節物質がアンタゴニストである、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
前記症状が、慢性気管支炎、喘息、嚢胞性繊維症、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および気管支拡張症よりなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
【請求項６０】
請求項15〜21のいずれか１項に記載の方法で有用なキットであって、CLCA2／ムチン分泌モデルを含有するコンパートメントと、別のコンパートメントに測定法を実施するのに必要な試薬とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムチン分泌とこれに関連する疾患、特に呼吸系ムチン分泌とこれに関連する疾患に関する。
【背景技術】
【０００２】
粘液は、気道、消化管、および粘膜を含有する他の臓器の内側を覆う保護性粘弾性液体の薄膜である。粘液は、その主成分が糖結合体（ムチンとして知られている）である水溶液である。ムチン分泌は構成性で、制御されているか、または外部刺激（例えば、刺激物）に応答して起きることがある。
肺では、正しくないまたは不適切な粘液またはムチン分泌（例えば、粘液分泌過多）が、慢性気管支炎（CB）、喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、および気管支拡張症のような重症の症状を引き起こすことがある。嚢胞性繊維症（CF）患者は、粘液分泌過多に関連する肺障害を示し、胃腸管合併症を有することもある。
【０００３】
種々の組織に広く分布している塩化物チャネルは、筋肉中の膜電位の維持から上皮組織中の液体と電解質輸送のためのCl- の移動のような多様な役割を果たす。いくつかの研究は、Cl-のカルシウム活性化分泌経路が、CF患者の種々の組織の疾患の重傷度の調節においてある役割を果たしていることを示唆している（AndersonとWelsh (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:6003-6007；Knowlesら (1991) New Engl. J. Med. 325:533-538；Masonら (1991) Br. J. Pharmacol. 103:1649-1656；Wagnerら (1991) Nature 349:793-796；および WillumsenとBoucher (1989) Am. J. Physiol. 256 (Cell Physiol. 25) : C226-C235 を参照）。
【０００４】
種々の組織でCa2+活性化Cl- 伝導を仲介する新しいタンパク質の群が最近発見された。この群のメンバーは以下を含むことが確認されている：ウシ肺内皮細胞接着分子、Lu-ECAM-1（Elbleら (1997) J. Biol. Chem. 272:27853-27861）；ウシCa2+活性化Cl-、CaCCまたはbCLCA1（Cunninghamら (1995) J. Biol. Chem. 270:31016-31026）；およびネズミCLCA1、mCLCA1（Gandhiら (1998) J. Biol. Chem. 273:32096-32101）；ヒトCLCA1、hCLCA1（Gruberら （1998) Genomics 54:200-214）；ネズミGob-5、mGob-5（Komiyaら (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 25:347-351；およびヒトCLCA2、hCLCA2（Gruberら (1999) Am. J. Physiol. 276 (Cell Physiol. 45)；C1261-C1270）。最近、Holroydら（PCT広報WO 99/44620）は、IL-9により誘導されるマウスとヒトチャネルを開示した。これらのチャネルはまとめて、カルシウム活性化塩化物チャネル（Calcium-activated Chloride Channels；CLCA）と呼ばれる。
【０００５】
塩化物分泌の刺激は、腸上皮の杯状細胞（goblet cells）からのムチン分泌を引き起こすと報告されている（Halmら (1995) Am. J. Physiol. 269:929-942）。ネズミGob-5遺伝子であるmGob-5は、インサイチューハイブリダイゼーションを介して、胃、小腸、大腸、および子宮の粘液分泌細胞中で発現され、気管中でわずかに発現される（Komiyaら、前述）。同様に、ヒトCLCA1（mGob-5のヒト同族体）もまた、粘液分泌に役割を有することが示唆された。Nakanishiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA（April 24, 2001) 98:5175-5180を参照されたい。
【０００６】
しかし今日まで、ムチン分泌を制御する確定的な塩化物チャネル標的は、特に呼吸系の細胞によるムチン分泌に関して、同定されていない。従って、呼吸系細胞によるムチン分泌の調節に使用できる特異的な塩化物チャネル標的の同定に対するニーズが、継続している。
hCLCA2を開示している刊行物には以下がある：WO 00/73438；WO 99/47674；およびWO 99/44620；ならびにジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AX054697；Z24653；AF043977；AB026833；AF12980；AA726662。またNakanishiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 Apr 24:98(9): 5175-80も参照されたい。
【発明の開示】
【０００７】
呼吸系細胞によるムチン分泌を調節するための方法と組成物が提供される。本方法において、有効量のhCLCA2（またはその同族体）調節物質を細胞と接触させて、細胞によるムチン分泌を調節（例えば、ムチン分泌の低下または上昇）する。本方法は、種々の異なる用途で有用であり、呼吸系ムチン分泌に関連する疾患症状（例えば、ムチン分泌の分泌過多または不足）の治療がある。また、呼吸系ムチン分泌の調節物質のスクリーニング法が提供される。最後に、mCLCA4とその非ヒト同族体ならびにこれらをコードする核酸組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
呼吸系細胞によるムチン分泌を調節するための方法と組成物が提供される。本方法において、有効量のhCLCA2（またはその同族体）調節物質を細胞と接触させて、細胞によるムチン分泌を調節（例えば、ムチン分泌を低下または上昇）する。本方法は、種々の異なる用途で有用であり、呼吸系ムチン分泌に関連する症状（例えば、ムチンの分泌過多または不足）の治療がある。また、呼吸系ムチン分泌の調節物質のスクリーニング法が提供される。最後に、mCLCA4とその非ヒト同族体、ならびにこれらをコードする核酸組成物が提供される。本発明のさらなる説明において、本方法を最初に説明し、次に本mCLCA4とその非ヒト同族体を説明する。
【０００９】
CLCA2調節物質は、後述のように呼吸系ムチン産生関連疾患の治療のための組成物の調製に使用することができる。
本発明をさらに説明する前に、本発明は後述の本発明の具体例に限定されず、具体例の変更態様を作成しても、添付の特許請求の範囲内にあることを理解されたい。使用される用語は具体例を説明するためであり、決して限定的なものではない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲により確立されることを理解されたい。
【００１０】
本明細書と添付の特許請求の範囲において、単数型「a」、「an」および「the」は、特に明記しない場合は複数の場合も言及している。特に明記しない場合は、すべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野において当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００１１】
方法
上記で要約したように本発明は、呼吸系細胞によるムチン分泌の調節方法を提供する。呼吸系細胞とは、呼吸する生物の呼吸系の細胞を意味し、多くの例では哺乳動物である。目的の呼吸細胞は呼吸系の細胞であり、呼吸系は、肺およびそれと関連する気道（気管および気管支など）を含む。特に関係するのは、ムチン分泌性呼吸系細胞、特に粘液を生成するムチンを分泌する細胞であり、この細胞には呼吸系の杯状細胞、腺細胞などを含む。ある例において標的細胞は、ヒトムチン（特にゲル生成性ヒトムチン）を分泌するヒト細胞、特に限定されないが、hMUC2、hMUC4、hMUC5AC、hMUC5B、およびhMUC6を含み、特に関係する具体的なヒトムチンは、hMUC4、hMUC5AC、hMUC5Bなどを含む。ある例において標的細胞は、マウスムチン（特にゲル生成性マウスムチン）を分泌するマウス細胞であり、mMUC5AC、mMUC5Bなどを含み、特に関係する具体的なムチンは、mMUC5ACなどを含む。
【００１２】
本方法は標的細胞中のムチン分泌を調節する方法であるため、これらは、標的細胞のムチン分泌（すなわち標的細胞により分泌されるムチンの量）を変化させる方法である。従ってある例において本方法は、標的細胞によるムチン分泌を上昇させるかまたは増強する方法である。他の例において本方法は、標的細胞によるムチン分泌を低下させるかまたは阻害する方法である。
【００１３】
本方法の実施において標的呼吸系細胞は、標的細胞によるムチン分泌を調節（例えば、増強または低下）するのに有効な量のCLCA2調節物質と接触される。CLCA2調節物質とは、標的細胞のCLCA2タンパク質の活性を変化させる物質を意味する。標的CLCA2タンパク質は、hCLCA2およびその同族体、特にその機能性同族体（例えば、mCLCA4など）である。その機能性同族体とは、その同族体が、hCLCA2と実質的に同じムチン分泌調節活性（特に呼吸系細胞ムチン分泌調節活性）を有することを意味する。
【００１４】
多くの例において本同族体は、そのアミノ酸配列がhCLCA2のアミノ酸配列と、および多くの例では、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AX054697、AF043977、AB026833、AF127980、およびZ24653に報告され配列番号04に開示のhCLCA2の配列と、その長さの少なくとも実質的な部分、例えば少なくとも約50％、一般的には少なくとも約75％、およびより一般的には少なくとも約90％、およびしばしば少なくとも約95％、およびそれ以上にわたって、少なくとも約55％、一般的には少なくとも約75％、およびより一般的には少なくとも約90％同一であるか、および／または少なくとも約60％、一般的には少なくとも約75％、およびより一般的には少なくとも約90％類似しているタンパク質である。
【００１５】
配列番号03は、hCLCA2のヌクレオチド配列を示す。特に明記しない場合は、配列同一性と類似性は、Genetics Computer Group (GCG) GAP整列プログラムを使用して決定される（パラメータ：Gap Weight 8, Length Weight:2）（GAPは、もともとPaul Haeberliが、NeedlemanとWunsch（J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)）およびSmithとWaterman（Adv. Appl. Math. 2:482-489 (1981))の論文を注意深く読んで、GCGバージョン1.0のために書いたものである）。目的の具体的な物質には、特に限定されないが、hCLCA2調節物質およびmCLCA4調節物質がある。
【００１６】
所望の調節に依存して、調節物質は標的CLCA2活性を増強するかまたは標的CLCA2活性を阻害する物質でもよい。標的CLCA2活性とは、ムチン分泌に影響を与える（例えば、ムチン分泌を増強するかまたは阻害する）活性を意味する。
【００１７】
本方法において広範囲の異なるタイプの物質が使用され、特に限定されないが、小有機分子、核酸、タンパク質などがある。従って、目的の天然に存在するかまたは合成小分子化合物は無数の化学的クラスを含むが、典型的にはこれらは有機分子、好ましくは分子量が50より大きく約2,500ダルトン未満の小有機化合物である。ある実施態様においてこの物質は、タンパク質との構造的相互作用（特に水素結合）に必要な官能基を含み、典型的には少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能性化学基を含む。この物質はしばしば、環状炭素または複素環構造体および／または１つ以上の上記の基で置換された芳香族もしくはポリ芳香族構造体を含む。この物質はまた、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、これらの誘導体、構造的類似体もしくは組合せを含む生物分子中に見いだされる。
【００１８】
また活性物質として関係するものは、宿主中の標的CLCA2活性を調節（例えば、阻害）する抗体である。適当な抗体は、標的タンパク質（例えば、hCLCA2、mCLCA4などのCLCA2タンパク質）のすべてまたは一部を含むペプチドで宿主動物を免疫することにより得られる。適当な宿主動物には、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどがある。タンパク質免疫原の起源は、マウス、ヒト、ラット、サルなどでもよい。宿主動物は一般的には、免疫原（例えば、マウスを免疫するのに使用されるヒトCLCA2など）とは異なる種である。
【００１９】
免疫原は、完全なタンパク質、またはその断片と誘導体を含有してもよい。好適な免疫原には、CLCA2のすべてまたは一部があり、これらの残基は、未変性の標的タンパク質に見いだされる翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、通常の組換え法、HECからの単離などを使用するクローン化遺伝子の発現）により産生される。
【００２０】
ポリクローナル抗体の調製のために、第１の工程は標的タンパク質を用いる宿主動物の免疫であり、標的タンパク質は好ましくは、約１％未満の汚染物質を含む実質的に純粋な型である。免疫原は、完全なタンパク質、またはその断片もしくは誘導体を含有してもよい。宿主動物の免疫応答を増強するために、標的タンパク質はアジュバントと組合わされ、適切なアジュバントには、ミョウバン、デキストラン硫酸、大ポリマー陰イオン、油および水乳剤、フロイントアジュバント、フロインド完全アジュバントなどがある。
【００２１】
標的タンパク質はまた、合成担体タンパク質または合成抗原に結合してもよい。ポリクローナル抗体を産生するために、種々の宿主を免疫してもよい。そのような宿主には、ウサギ、モルモット、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ヒツジ、ヤギなどがある。標的タンパク質は、通常宿主の皮内に、投与され、最初の投与後に、１回以上（通常少なくとも２回）追加の追加免疫用量が投与される。免疫後、宿主から血液が採取され、次に血液細胞から血清が分離される。生じる抗血清中に存在するIgは、公知の方法（例えば、硫酸アンモニウム分画、DEAEクロマトグラフィーなど）を使用してさらに分画される。
【００２２】
モノクローナル抗体は従来法により産生される。一般に免疫した宿主動物の脾臓および／またはリンパ節は、形質細胞の供給源となる。形質細胞は、骨髄腫細胞との融合により不死化されて、ハイブリドーマ細胞を産生する。個々のハイブリドーマからの培養上清は、標準的技術を使用してスクリーニングされ、所望の特異性を有する抗体を産生するものを同定する。ヒトタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生のための適切な動物には、マウス、ラット、ハムスターなどがある。マウスタンパク質に対する抗体を作成するためには、動物は一般的にハムスター、モルモット、ウサギなどである。抗体は、従来法（例えば、不溶性支持体、タンパク質Aセファロースなどに結合したCLCA2を使用する親和性クロマトグラフィー）によりハイブリドーマ細胞上清または腹水液から精製される。
【００２３】
抗体は、通常のマルチマー構造ではなく１本鎖として産生される。１本鎖抗体は、Jostら(1994) J.B.C. 269:26267-73、および他の文献に記載されている。重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域をコードするDNA配列は、小さい中性のアミノ酸（グリシンおよび／またはセリンを含む）の少なくとも約４アミノ酸をコードするスペーサーに連結される。この融合体によりコードされるタンパク質は、元々の抗体の特異性と親和性を保持する機能性可変領域の組み立てを可能にする。
【００２４】
in vivo使用（特にヒトへの注入）のためには、抗体の抗原性を低下させることが好ましい。ブロッキング剤に対する受容者の免疫応答は、治療法が有効である期間を減少させる可能性がある。抗体をヒト化する方法は当該分野で公知である。ヒト化抗体は、トランスジェニックヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子を有する動物の生成物でもよい（例えば、国際特許出願WO 90/10077とWO 90/04036を参照）。あるいは目的の抗体は、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列で置換する、組換えDNA技術により作成される（WO 92/02190を参照）。
【００２５】
キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのIg cDNAの使用は、当該分野で公知である（Liuら (1987) P.N.A.S. 84:3439 および (1987) J. Immunol. 139:3521）。ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞からmRNAが単離され、cDNAを産生するのに使用される。目的のcDNAは、特異的プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅される（米国特許第4,683,195号と4,683,202号）。あるいはライブラリーを作成しスクリーニングして、目的の配列を単離する。
【００２６】
抗体の可変領域をコードするDNA配列は次に、ヒト定常領域配列と融合される。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabatら (1991) Sequences of Poteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242 に記載されている。ヒトＣ領域遺伝子は、公知のクローンから容易に入手できる。イソタイプの選択は、所望のエフェクター機能（例えば、補体結合、または抗体依存性細胞障害）により支配されるであろう。好適なイソタイプは、IgG1、IgG3およびIgG4である。ヒト軽鎖定常領域、カッパまたはラムダのいずれかが使用できる。次に、キメラヒト化抗体は従来法により発現される。
【００２７】
Fv、Ｆ(abN)2およびＦabのような抗体断片は、無傷のタンパク質を切断（例えば、プロテアーゼまたは化学的切断）することにより調製される。あるいは、末端切断型遺伝子が設計される。例えば、Ｆ(abN)2断片の一部をコードするキメラ遺伝子は、CH1ドメインとH鎖のヒンジ領域をコードするDNA配列と、次に翻訳停止コドンを含み、末端切断型分子を与える。
HとLのJ領域のコンセンサス配列を使用して、ヒトC領域セグメントへのV領域セグメントの以後の結合のために、Ｊ領域中に有用な制限部位を導入するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計してもよい。Ｃ領域cDNAは部位特異的突然変異誘発により修飾されて、ヒト配列の類似の位置に制限部位を置くことができる。
【００２８】
発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、YAC、EBV由来エピソームなどがある。便利なベクターは、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードするものであり、VHまたはVL配列が容易に挿入でき発現できるように、適切な制限部位が作成される。そのようなベクターにおいて、スプライシングは通常、挿入されたＪ領域中のスプライスドナー部位とヒトＣ遺伝子に先行するスプライスアクセプター部位の間で起き、ヒトCHエキソン内に存在するスプライス領域でも起きる。ポリアデニル化および転写停止は、コード領域の下流の未変性の染色体部位で起きる。生じるキメラ抗体は、レトロウイルスLTRを含む強いプロモーター、例えばSV-40早期プロモーター（Okayamaら (1983) Mol. Cell. Bio. 3:280）、ラウス肉腫ウイルスLTR（Gormanら (1982) P.N.A.S. 79:6777）、およびモロニーマウス白血病ウイルスLTR（Grosschedlら (1985) Cell 41:855）；未変性のIgプロモーターなどに結合してもよい。
【００２９】
さらに別の実施態様において活性物質は、宿主中の標的タンパク質をコードする遺伝子の発現を、調節および一般的に低下またはダウンレギュレートする。例えば、アンチセンス分子を使用して、細胞中の標的CLCA2（例えば、hCLCA2、mCLCA4など）の発現をダウンレギュレートすることができる。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ODN）、特に未変性の核酸からの化学修飾を有する合成ODN、またはRNAのようなアンチセンス分子を発現する核酸構築体でもよい。アンチセンス配列は、標的遺伝子のmRNAに相補的であり、標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、種々の機構（例えば、翻訳に利用可能なmRNAの量を減少させること、RNAseHの活性化、または立体障害）により遺伝子発現を阻害する。アンチセンス分子の１つまたは組合せを投与してもよく、ここで組合せは、複数の異なる配列を含有してもよい。
【００３０】
適切なベクター中の標的遺伝子配列のすべてまたは一部の発現によりアンチセンス分子を産生してもよく、ここで、アンチセンス鎖がRNA分子として産生されるように転写開始が行われる。あるいは、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的には少なくとも約７、通常少なくとも約12、より一般的には少なくとも約20ヌクレオチドの長さであり、約500を超えることはなく、一般的には約50以下、より一般的には約35ヌクレオチド以下の長さであり、その長さは、阻害の効率、特異性（交差反応の欠如を含む）などにより支配される。７〜８塩基の長さの短いオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の強くて選択的なインヒビターであり得る（Wagnerら、(1996)、Nabure Biotechnol. 14:840-844）。
【００３１】
内因性センス鎖mRNA配列の特異的領域は、アンチセンス配列により補完されるように選択される。オリゴヌクレオチドの特異配列の選択は、経験的な方法を使用でき、ここで、いくつかの候補配列がin vitroでまたは動物モデルで標的遺伝子の発現の阻害について測定される。配列の組合せも使用でき、アンチセンス補完についてmRNA配列のいくつかの領域が選択される。
【００３２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の方法により化学合成される（Wagnerら (1993)、前述、およびMilliganら、前述）。好適なオリゴヌクレオチドは、その細胞内安定性と結合親和性を上昇させるために、未変性のホスホジエステル構造から化学修飾される。多くのそのような修飾が文献に記載されており、これらは、骨格、糖または複素環塩基の化学を変化させる。
【００３３】
骨格化学の有用な変化には、ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート（非架橋酸素の両方がイオウにより置換される）；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートがある。アキラル性のリン酸塩誘導体には、3N-ON-5N-S-ホスホロチオエート、3N-S-5N-O-ホスホロチオエート、3N-CH2-5N-O-ホスホネート、および3N-NH-5N-O-ホスホロアミダデートがある。ペプチド核酸は、全リボホスホジエステル骨格をペプチド結合で置換する。安定性と親和性を増強するのに、糖の修飾も使用される。デオキシリボースのa-アノマーが使用され、ここで、天然のb-アノマーについて塩基が逆転される。
【００３４】
リボース糖の2N-OHを改変して、2N-O-メチルまたは2N-O-アリル糖を形成してもよく、これは、親和性を犠牲にすることなく分解に対する耐性を与える。複素環塩基の修飾は、正しい塩基対合を維持しなければならない。いくつかの有用な置換には、デオキシチミジンの代わりにデオキシウリジン；デオキシシチジンの代わりに5-メチル-2N-デオキシシチジンおよび5-ブロモ-2N-デオキシシチジンがある。5-プロピニル-2N-デオキシウリジンと5-プロピニル-2N-デオキシシチジンは、それぞれデオキシチミジンとデオキシシチジンを置換するのに使用されると、親和性と生物活性を上昇させることが知られている。
【００３５】
アンチセンスインヒビターの代替として、触媒性核酸化合物（例えば、リボザイム、アンチセンス結合体など）を使用して遺伝子発現を阻害してもよい。リボザイムはin vitroで合成され、患者に投与されるか、または発現ベクター上にコードされ、そこから標的細胞中でリボザイムが合成される（例えば、国際特許出願WO 9523225、およびBeigelmanら(1995) Nucleic Acids Res. 23:4434-42）。触媒活性を有するオリゴヌクレオチドの例は、WO 9506764に記載されている。mRNA加水分解を仲介することができる金属錯体（例えば、テルピリジルCu(II)）とのアンチセンスODNの結合体は、Bashkinら(1995) Appl. Biochem. Biotechnol. 54:43-56に記載されている。
【００３６】
ある実施態様において、この物質は、CLCA2活性を阻害し、従って標的細胞によるムチン分泌を阻害するかまたは低下させる物質である。これらの実施態様において、この物質は一般的にCLCA2アンタゴニストである。対照（例えば、アンタゴニストと接触していない標的細胞）と比較して、ムチン分泌を少なくとも約５％、一般的には少なくとも約10％、およびより一般的には少なくとも約25％低下させるように、CLCA2活性に影響を与える物質は、CLCA2アンタゴニストと見なされる。目的のアンタゴニストは多様な物質を含み、例えば特に限定されないが、小有機分子、核酸、タンパク質などがあり、ここで具体的なタイプのアンタゴニスト物質には、スクリーニング測定法に関して異なるタイプの前述のおよび後述の候補物質から選択されるものがある。
【００３７】
目的の具体的な阻害物質には、特に限定されないが、既知のカルシウム活性化塩化物チャネル（CLCA）インヒビター、例えばジイソチオシアネートスチルベンスルホン酸（DIDS）；ジチオスレイトール（DTT）；ニフルム酸（NFA）；タモキシフェンなど（例えば、Am. J. Physiol. 1999 Jun；276 （6 Pt 1）：C1261-70；J. Biol. Chem. 1998 Nov 27；273(48):32096-101；およびPflugers Arch 1998 May；435(6):796-803）；などがある。この物質は、塩化物チャネルについて選択的、カルシウム活性化塩化物チャネルについて選択的、特異的カルシウム活性化塩化物チャネル（例えば、hCLCA2またはその同族体、例えばmCLCA4）でもよい。特異的カルシウム活性化塩化物チャネルに選択的な物質は、前述のスクリーニング測定法を使用して容易に同定される。
【００３８】
ある実施態様において、この物質はCLCA2活性を増強させる物質であり、従って標的細胞によるムチン分泌を増強または上昇させる。これらの実施態様において、この物質は一般的にCLCA2アゴニストである。対照（例えば、アンタゴニストと接触していない標的細胞）と比較して、ムチン分泌を少なくとも約５％、一般的には少なくとも約10％、およびより一般的には少なくとも約25％上昇させるように、CLCA2活性に影響を与える物質は、CLCA2アゴニストと見なされる。目的のアンタゴニストは、多様な物質を含み、例えば特に限定されないが、小有機分子、核酸、タンパク質などがあり、ここで具体的なタイプのアゴニスト物質には、スクリーニング測定法に関して異なるタイプの前述のおよび後述の候補物質から選択されるものがある。
【００３９】
上記したように、細胞と接触される物質の量は、細胞からのムチン分泌の所望の調節（例えば、増加または減少）を引き起こすのに有効な量である。変化の量は変動するが、一般的には強さが少なくとも約５％、一般的には少なくとも約10％、およびより一般的には少なくとも約25％変化する量である。具体的な調節物質の性質に依存して有効量は変動するが、当業者は容易に経験的に決定することができる。多くの実施態様において有効量は典型的には、１日に約１〜500mg、好ましくは１日に約１〜100mg、および最も好ましくは１日に約１〜30mgであり、多くの要因（例えば、治療すべき疾患の重症度、被験体の年齢と相対的健康、使用される化合物の力価、および投与経路と型、投与の適応症、および担当医師の好みと経験）に依存する。
【００４０】
本方法の実施においてCLCA2調節物質が接触される標的細胞は、in vitroまたはin vivoの環境でもよく、すなわち、in vitroまたはin vivo系の一部でもよい。in vitro環境の例には細胞表面などがあり、in vivo環境の例には生きた生物（例えば、ヒト、マウスなどの哺乳動物）がある。
【００４１】
CLCA2調節物質は、任意の従来のプロトコールを使用して標的細胞と接触される。使用される特定のプロトコールは、物質の性質と標的細胞の環境（例えば、標的細胞がin vitroまたはin vivo系に存在するかどうか）に依存する。in vitro系では、調節物質は標的細胞のin vitro環境に導入されて、所望の接触が起きるように導入される。（例えば、水溶性組成物のような調節物質の組成物が、標的細胞の細胞培養培地に導入される、例えばピペットまたは他の方法で培養培地に入れられる）。
【００４２】
in vivo環境または系中に標的細胞が存在する場合（例えば標的細胞が生きた生物中に存在する場合、例えば標的細胞が、気管上皮のような呼吸系の杯状細胞である場合）は、一般的に宿主（この中に標的細胞が存在する）への調節物質の投与により接触が行われる。本方法において調節物質は、CLCA2活性の所望の調節（例えば、hCLCA2またはCLCA4に影響を受けたムチン分泌の所望の減少または増加）を引き起こすことができる任意の従来の手段を使用して、宿主に投与される。すなわちこの物質は、治療的投与のための種々の製剤中に取り込むことができる。さらに詳しくはこの物質は、適切な、薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤との組合せで医薬組成物に製剤化され、固体、半固体、液体または気体型（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアゾル剤）の調製物に調製してもよい。
【００４３】
従ってこの物質の投与は、種々の方法（経口、頬、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管支内投与）により行われる。
剤形では、この物質はその薬剤学的に許容される塩の形で投与されるか、または単独でもしくは他の薬剤学的に許容される化合物と組合せて投与される。以下の方法と賦形剤は、例示のためであり、決して本発明を限定するものではない。
【００４４】
経口調製物については、この物質は、単独で、または適切な添加剤と組合せて使用して、例えば、通常の添加剤（例えば、乳糖、マンニトール、コーンスターチまたはポテトスターチ）と組合せて；結合剤（例えば、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン）と組合せて；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトスターチまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム）と組合せて；滑沢剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）と組合せて；および所望であれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および香味剤と組合せて、錠剤、散剤、顆粒剤、またはカプセル剤を作成することができる。
【００４５】
この物質は、水性または非水性溶媒（例えば、植物油もしくは他の同様の油、合成脂肪族酸グリセリド、高級脂肪族酸のエステルまたはポリエチレングリコール）中に；および所望であれば、通常の添加剤、例えば、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤および保存剤とともに、溶解、懸濁、または乳化して、注射用製剤に調製することができる。
この物質は、エアゾル剤で使用して吸入により投与することができる。本発明の化合物は、加圧許容噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）に調製することができる。
【００４６】
さらにこの物質は、乳化性塩基または水溶性塩基のような種々の塩基と混合することにより坐剤に作成することができる。本発明の化合物は、坐剤により直腸投与することができる。坐剤は、ココアバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールのようなビヒクルを含むことができ、これは体温で溶解するが、室温では固化する。
【００４７】
または直腸投与のための単位投与型（例えば、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤）が提供され、各投与単位（例えば、ティースプーン分、テーブルスプーン分、錠剤もしくは坐剤）は、１つ以上のインヒビターを含有するあらかじめ決められた量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位投与型は、無菌水、通常の食塩水または他の薬剤学的に許容される担体中の溶液として、組成物中にインヒビターを含有してもよい。
【００４８】
本明細書において用語「単位投与型」は、ヒトおよび動物被験体の単位投与量として適した物理的に分かれた単位であって、各単位が、薬剤学的に許容される希釈剤、担体またはビヒクルと組合せて所望の作用を与えるのに充分な量で計算された、本発明のあらかじめ決められた量の化合物を含有する単位を意味する。本発明の新規単位投与型の明確化は、使用される特定の化合物と達成すべき効果、および宿主中の各化合物の薬物動態に依存する。
薬剤学的に許容される賦形剤（例えば、ビヒクル、アジュバント、担体または希釈剤）は、公に容易に利用可能である。さらに、薬剤学的に許容される補助物質（例えば、pH調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、安定剤、湿潤剤など）は、公に容易に利用可能である。
【００４９】
物質がポリペプチド、ポリヌクレオチド、これらの類似体もしくはその模倣物（例えば、アンチセンス組成物）である場合、これは任意の数の経路（ウイルス感染、微量注入法、または小胞の融合を含む）により、組織もしくは宿主細胞中に導入される。Furthら(1992)、Anal. Biochem. 205:365-368に記載されるように、筋肉内投与のためにジェット注入も使用される。DNAは金微粒子上に被覆され、文献に記載（例えば、Tangら (1992) Nature 356:152-154）のように粒子衝撃器具または「遺伝子銃」により皮内に送達され、ここで、金微量発射体は、治療用DNAで被覆され、次に皮膚細胞中に衝撃される。
【００５０】
用量レベルは、具体的な化合物、症状の重症度、および副作用に対する被験体の感受性の関数として変動することを、当業者は容易に理解するであろう。ある化合物の好適な投与量は、当業者が種々の手段により容易に決定することができる。
他の適切な薬剤担体およびその製剤は、Martin（編）(1995) Remington：The Science and Practice of Pharmacy、第19版、マックパブリッシング社（Mack Publishing Company）（イートン、ペンシルバニア州）に記載されている。
【００５１】
一般に、調節物質は、治療上有効量で、同様の目的を満足する物質の投与の許容された任意のモード（代表的モードは上記した）により投与される。適切な投与範囲は、典型的には１日１〜500mgであり、好ましくは１日１〜100mgであり、最も好ましくは１日１〜30mgであり、治療すべき疾患の重症度、被験体の年齢と相対的健康、使用される化合物の力価、投与の経路と型、投与の適応症、および担当医師の好みと経験に依存する。そのような疾患治療の当業者は、ある疾患について本発明の化合物の治療上有効量を確認することができるであろう。例えば投与頻度は、１日に１、２、３または複数回でもよい。
【００５２】
症状の治療法
本方法は、特に呼吸系細胞ムチン分泌に関連する疾患（呼吸系細胞ムチン分泌過多および呼吸系細胞ムチン分泌不足）の治療に有用である。本方法により治療が可能な呼吸系のムチン分泌過多に関連する疾患には、特に限定されないが、慢性気管支炎；喘息；COPD；気管支拡張症；および嚢胞性繊維症を引き起こす不適切なムチン分泌などがある。ムチン分泌不足に関連する疾患には、特に限定されないが、乾性角結膜炎（KCSまたはドライアイ）、シェーグレン症候群、一般的口内乾燥（抗コリン薬による一般的な副作用）、潰瘍性大腸炎およびクローン病に関連する粘膜の剥離などがある。
【００５３】
治療とは、宿主に影響を与えるムチン分泌関連症状に関連する症状の緩和を意味し、緩和は、広い意味で治療される症状（例えば、ムチン過剰、ムチン不足など）に関連するパラメータ（例えば、症状）の強度の少なくとも低下を意味する。従って治療はまた、症状または少なくとも関連する症状が完全に阻害される、例えば発症を予防するか停止するか、例えば、症状または少なくとも症状を特徴付ける少なくとも症状に、宿主が二度と罹らないように停止される場合も含む。
【００５４】
本方法に従って種々の宿主が治療される。一般にそのような宿主は、「哺乳動物」または「哺乳動物性」であり、ここでこれらの用語は、哺乳動物綱内の生物を示すのに広く使用され、肉食動物目（例えば、イヌやネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモット、およびラット）、および霊長目（例えば、ヒト、チンパンジー、およびサル）を含む。多くの実施態様において宿主はヒトである。
【００５５】
スクリーニング測定法
CLCA2調節活性を有する物質のスクリーニング測定法、すなわち候補物質がCLCA2調節活性を有するかを決定するための、または候補物質のCLCA2調節活性を同定するための、スクリーニング測定法も提供される。
【００５６】
化合物が、標的CLCA2の活性を調節することができるかどうかを測定するための種々の方法が提供される。多くの実施態様において本方法は、CLCA2（または、その機能性同族体、例えば下記のCLCA4）またはその断片に、候補化合物を適切な条件下で接触させて、次に化合物が標的CLCA2またはその機能性同族体の活性を調節するかどうかを測定することを含む。候補化合物は、CLCA2活性の候補アゴニストまたはアンタゴニストでもよい。CLCA2、その機能性同族体もしくは断片は、内因性にまたは組換え法で細胞または組織上で発現するか、または固相基質（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜、ガラス、ビーズなど）への結合により固定化して発現することができる。
【００５７】
細胞表面タンパク質（例えば、受容体）、イオンチャネルなどの活性を調節するシグナルを同定する転写ベースの測定法を使用して、レポーター遺伝子産物発現を刺激するその能力、およびCLCA2またはその機能性同族体（例えば、mCLCA4）を刺激する可能性について、候補化合物をスクリーニングしてもよい。
【００５８】
CLCA2プロモーターに制御されるレポーター遺伝子発現を刺激する化合物を同定するための１つの方法は、レポーター遺伝子に機能できる形で結合したCLCA2プロモーターを含むDNA構築体を細胞に導入し、その細胞を試験化合物と混合し、レポーター遺伝子産物の発現レベルを測定することを含む。レポーター遺伝子産物の発現レベルの変化は、化合物が、CLCA2発現もしくは試験されるその機能性同族体（例えば、mCLCA4）の発現を調節できることを示す。レポーター遺伝子構築体は好ましくは、細胞の染色体DNAに安定に組み込まれるが、本明細書に記載の目的のために、染色体外要素の形でも機能性である。細胞は真核細胞、または哺乳動物遺伝子プロモーターの制御下で構造遺伝子を発現するのに必要な要素を含有する任意の細胞でもよい。
【００５９】
他の転写ベースの測定法は当該分野で公知である（例えば、Zlokarnikら (1998) Science 279:84-88；Siverman、前述；およびGonzalezとNegulescu (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:624-631）。これらの転写ベースの測定法は、制御性プロモーターの制御下でのレポーター遺伝子の導入により修飾される組換え細胞を使用して、細胞外シグナルの細胞内伝達を評価する。
【００６０】
生物活性CLCA2を発現するために、CLCA2またはその機能性同等物をコードするヌクレオチド配列が、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード配列の転写と翻訳に必要な要素を含有するベクター中に挿入される。当業者に公知の方法を使用して、CLCA2をコードする配列および適切な転写と翻訳制御要素を含有する発現ベクターを構築してもよい。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成法、およびin vivo遺伝子組換えがある（例えば、Sambrook, J.ら (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニューヨーク州；およびAusubel, F.M.ら (1989) Current Protocols in Molecular Biology、ジョンワイリーアンドサンズ（John Wiley and Sons）、ニューヨーク、ニューヨーク州を参照）。
【００６１】
多くの発現ベクター／宿主系を使用して、CLCA2またはその機能性同族体（例えば、mCLCA4）をコードする配列を含有し発現してもよい。これらには、特に限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）または細菌発現ベクター（例えば、TiまたはpBR322プラスミド）を感染させた昆虫細胞系；または動物細胞系がある。本発明は、使用される宿主細胞に限定されない。
【００６２】
２ハイブリッド系ベースのアプローチも、化合物スクリーニング、小分子同定、および薬物発見に使用することができる。元々はFieldsとSong (1989) Nature 340:245-246により酵母で記載された２ハイブリッド系の基本的な前提は、目的の生産性タンパク質−タンパク質またはタンパク質−化合物相互作用対と、酵母の測定可能な表現型変化との関連を与える。DNA結合ドメインに認識される上流活性化配列を含有するレポーターカセットは、レポーター遺伝子に機能できる形で結合しており、正しい条件下で発現されると表現型変化を引き起こす。元々の２ハイブリッド系は、高処理量化合物スクリーニングで応用できるように最近修飾されている（例えば、Hoら (1996) Nature 382:822-826；LicitraとLiu (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12817-12821；およびYoungら (1998) Nature Biotech. 16:946-950を参照）。
【００６３】
イオンチャネル活性を調節する化合物の同定方法は、目的のイオンチャネルを発現する細胞またはその断片を、試験化合物とイオンチャネル選択的イオンを含有する溶液に暴露した時のイオンチャネル活性を測定し、測定されたイオンチャネル活性を、試験化合物を含有しない溶液中の同じ細胞または実質的に同一の対照細胞の本来のイオンチャネル活性と比較することにより行われる。そのような測定法を行うための方法は、当業者に公知である（例えば、Mishinaら (1985) Nature 313:364-369；およびNodaら、Nature 322:836-828を参照）。
【００６４】
イオンチャネル活性は、電気生理現象（電極電圧クランプまたは単一電極全細胞パッチクランプ）、グアニジウムイオンフラックス測定法、トキシン結合測定法、蛍光測定イメージングプレートリーダー（FLIPR）測定法のような方法を使用して測定することができる（例えば、Sullivanら (1999) Methods Mol. Bio. 114:125-133；SiegelとIsacoff (1997) Neuron 19:1-20；およびLopatinら (1998) Trends Pharmacol. Sci. 19:395-398を参照）。「インヒビター」は一般に、ある濃度で50％を超えるイオンチャネル活性の低下、好ましくは70％を超えるイオンチャネル活性の低下、さらに好ましくは90％を超えるイオンチャネル活性の低下を引き起こす化合物として定義される。
【００６５】
化合物と標的、またはその断片との結合もしくは相互作用は、放射能標識した目的の化合物を使用して直接（例えば、Wainscottら (1993) Mol. Pharmacol. 43:419-426；およびLoricら (1992) FEBS Lett. 312:203-207を参照）、または候補化合物の相互作用もしくは結合により生じるセカンドメッセンジャー（例えば、LazerenoとBirdsall (1993) Br. J. Pharmcol. 109:1120-1127を参照）により測定することができる。標的シグナル伝達または活性の調節は、検出可能な測定法（例えば、RLIPR測定法）により測定することができる（例えば、Coward, P. (1999) Anal. Biochem. 270:242-248；Sittampalam、前述；およびGonzalezとNegulescu、前述を参照）。いくつかの受容体（特に、GPCR）の活性化は、35S-GTPγS結合測定法を使用して測定することができる（例えば、Lazareno (1999) Methods Mol. Biol. 106:231-245を参照）。
【００６６】
あるいは、候補化合物を競合スクリーニング測定法に付し、ここで、既知のリガンド（好ましくは、分析的に検出可能な試薬、最も好ましくは放射能で標識された試薬）に、試験すべき薬剤を導入し、標識リガンドの結合を阻害または増強するカルボン酸の能力を測定する。化合物は、特異的受容体またはその断片に対する親和性と選択性の上昇についてスクリーニングされる。
【００６７】
多くの実施態様においてスクリーニング測定法は、特に呼吸系のムチン分泌に影響を与えるCLCA2（例えば、hCLCA2またはmCLCA4）活性を調節する物質の同定に関する。スクリーニング測定法のこれらの実施態様において、以下の工程が行われる：(a) CLCA2／ムチン分泌モデルに候補化合物を接触させ；(b) ムチン分泌への候補化合物の作用を観察し；そして(c) 観察された作用から候補化合物のムチン分泌調節活性を得る。
【００６８】
CLCA2／ムチン分泌モデルは、in vivoまたはin vitroモデルでもよい。目的のin vitroモデルには、特に限定されないが、細胞がCLCA2活性の関数としてムチンを分泌するように、細胞（例えば、杯状細胞）がCLCA2（またはその同族体、例えばmCLCA4）とムチン産生／分泌要素の両方を含む細胞培養物がある。代表的なin vitroCLCA2／ムチン分泌モデルは、以下の実験セクションに記載の「空気−液体インターフェース」（ALI）系である。目的のin vivoモデルには、特に限定されないが、CLCA2／ムチン分泌の非ヒト動物モデル、例えばhCLCA2のマウス同族体（すなわち、mCLCA4）、hCLCA2のマウストランスジェニック動物などの改変発現を有するマウスモデルがある。
【００６９】
候補物質の接触後のムチン分泌は、直接または間接的に評価される。直接評価には、モデルの細胞からのムチン分泌の量を測定し、対照（例えば、候補物質と接触しなかった同一の系から産生されたムチンの量）と量を比較することを含む。間接評価は、候補物質との接触後に、１つ以上のムチン遺伝子（特に、細胞外スペース（例えば、hMUC5AC、hMUC5BおよびmMUC5AC））への分泌により粘液を産生するムチン遺伝子）の発現レベルを測定し、観察された発現レベルを、ムチン分泌レベルと比較することを含む。転写レベルを測定する方法は、上記したように当業者に公知である。
観察されたムチン分泌は次に、候補物質のCLCA2調節活性、特に候補物質の呼吸系細胞CLCA2／ムチン分泌調節活性を得るのに使用される。
【００７０】
診断薬とキット
本発明は、種々の診断法キット（特に呼吸系異常ヌクレオチド配列に関連する疾患（例えば、呼吸系ムチンの分泌不足および分泌過多に関連する上記の疾患）の診断法）における、CLCA2ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体の使用を包含する。典型的には、キットは、規定のCLCA2ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または１つまたは他方を認識する試薬（例えば、抗原断片または抗体）を含有するコンパートメントを有する。さらに、キットは、別のコンパートメントに測定法を実施するのに必要な試薬、ならびに使用と正しい廃棄の説明書を含む。
【００７１】
CLCA2を測定するためのELISA、RIA、およびFACSを含む種々のプロトコールは、当該分野で公知であり、CLCA2発現の改変または異常レベルを診断するための基礎となる。これらの方法はまた、CLCA2の発現に及ぼす治療的介入の効果を追跡するのに使用される。例えば、有効な治療化合物は、CLCA2の発現を阻害するかまたはCLCA2の発現を誘導する。上記したようにCLCA2の発現レベルの変化は、粘液分泌の変化を引き起こす。
【００７２】
CLCA2発現の正常値または標準値は、正常な哺乳動物被験体(好ましくはヒト）から取った体液または細胞抽出物をCLCA2に対する抗体と、複合体生成に適した条件下で組合せることにより確立される。標準的複合体生成の量は種々の方法により定量されるが、好ましくは光度測定法により行われる。対照および生検組織から取った疾患試料中で発現されるCLCA2の量が、標準値と比較される。標準値と被験体値とのずれが、疾患を診断するためのパラメータを確立する。この方法はまた、治療の進行を評価するために、少なくとも１つのCLCA2調節物質で被験体を治療中のCLCA2発現を追跡するのに使用することもできる。
【００７３】
本発明の別の実施態様において、CLCA2をコードするポリヌクレオチドを診断目的に使用してもよい。使用されるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNAとDNA分子、およびPNAがある。ポリヌクレオチドを使用して、CLCA2の発現が疾患に相関する生検組織中の遺伝子発現を検出し定量してもよい。診断測定法を使用して、CLCA2の欠如、存在および過剰発現を区別し、上記したように治療介入中のCLCA2レベルの制御を追跡してもよい。
【００７４】
１つの態様において、CLCA2または密接に関連する分子をコードするポリヌクレオチド配列（ゲノム配列を含む）を検出することができるPCRプローブとのハイブリダイゼーションを使用して、CLCA2をコードする核酸配列が同定される。高度に特異的な領域（例えば、5N制御領域中の10個のユニークなヌクレオチド）でもまたはそれほど特異的ではない領域（例えば、特に3Nコード領域）から作成されても、プローブの特異性と、ハイブリダイゼーションまたは増幅の厳密性（最大、高、中、または低）とが、プローブがCLCA2対立遺伝子をコードする天然に存在する配列のみを、または関連配列を同定するかを決定するであろう。
【００７５】
プローブはまた、関連配列の検出に使用され、好ましくはCLCA2をコードする任意の配列からの少なくとも50％のヌクレオチドを含有する。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、DNAまたはRNAでもよく、天然に存在するCLCA2のプロモーター、エンハンサー要素、およびイントロンを含むゲノム配列を含む。
【００７６】
CLCA2をコードするDNAの特異的ハイブリダイゼーションプローブを産生する手段には、CLCA2またはCLCA2誘導体をコードする核酸配列の、mRNAプローブの産生のためのベクター中へのクローニングがある。そのようなベクターは当該分野で公知であり、市販されており、適切なRNAポリメラーゼおよび適切な標識ヌクレオチドの添加を用いて、in vitroでRNAプローブを合成するのに使用される。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター基、例えば放射性核種（32Pまたは35S）、または酵素標識物（例えば、アビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ）などにより標識される。
【００７７】
CLCA2をコードするポリヌクレオチド配列は、CLCA2の発現に関連する症状または障害（例えば、ムチン分泌障害、特に呼吸系のムチン分泌障害に関連する疾患）の診断に使用される。
【００７８】
CLCA2の発現に関連する疾患の診断のための基礎を提供するために、発現のための通常のまたは標準的プロフィールが確立される。これは、正常な被験体（動物またはヒト）から取った体液または細胞抽出物を、CLCA2をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片と、ハイブリダイゼーションまたは増幅に適した条件下で組合せることにより行われる。標準的ハイブリダイゼーションは、正常被験体から得られた値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験からの値と比較して定量される。正常試料から得られる標準値は、疾患症候性の被験体の試料から得られた値と比較される。標準値と被験体値のずれは、疾患の存在を確立するのに使用される。
【００７９】
いったん疾患が確立され治療プロトコールが開始されると、定期的にハイブリダイゼーション測定法が繰り返されて、被験体中のCLCA2の発現レベルが、正常被験体で観察されるレベルに近づき始めるかどうかが評価される。連続的測定から得られる結果は、数時間から数日から数ヶ月の期間わたって治療の効果を示すのに使用される。
【００８０】
CLCA2をコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドの追加の診断用途には、PCRの使用がある。そのようなオリゴマーは化学合成されるか、酵素的に生成されるか、またはin vitroで産生される。オリゴマーは好ましくは２つのヌクレオチド配列からなり、１つはセンス配向（5Nから3N）でもう１つはアンチセンス（3Nから5N）であり、特異的遺伝子または上記の同定のための最適条件下で使用される。同じ２つのオリゴマー、オリゴマーのネスティッドセット、またはオリゴマーの縮重プールは、密接に関連するDNAまたはRNA配列の検出および／または定量のためのあまり厳密性ではない条件下で使用される。
【００８１】
CLCA2の発現を定量するのにも使用される方法は、ヌクレオチドの放射能標識またはビオチン化、対照核酸の同時増幅、および実験結果が補間される標準曲線を含む（例えば、Melby, P.C.ら (1993) J. Immunol. Methods 159:235-244；およびDuplaa, C.ら (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照）。複数の試料の定量速度は、ELISAフォーマット（ここでは、目的のオリゴは種々の希釈率で提供され、分光光学的または比色応答が迅速な定量を与える）で測定することにより加速される。
【００８２】
本発明の別の実施態様において、CLCA2をコードする核酸配列はまた、天然に存在するゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを生成するのにも使用される。配列は特定の染色体、染色体の特定の領域、または人工的染色体構築体（例えばヒト人工的染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工的染色体（BAC）、細菌P1構築体、または単一の染色体cDNAライブラリー）にマッピングされる（例えば、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、およびTrask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154を参照）。
【００８３】
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）は、他の物理的染色体マッピング法および遺伝子地図データと関連付けされる（例えば、Vermaら (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, パーガモンプレス（Pergamon Press）、ニューヨーク、ニューヨーク州参照）。遺伝子地図の例は、種々の科学雑誌またはOnline Mendelian Inheritance in Man (OMIM)中にある。物理的染色体地図上のCLCA2をコードする遺伝子の位置と具体的な疾患または具体的な疾患に対する性向の関連付けは、その遺伝疾患に関連するDNAの領域を限定するのに有用である。本発明のヌクレオチド配列は、正常個体、キャリアー、または疾患個体の遺伝子配列の差を検出するのに使用される。
【００８４】
染色体調製物のインサイチューハイブリダイゼーションおよび物理的マッピング法（例えば、樹立された染色体マーカーを使用する連鎖解析）を、遺伝子地図の拡張に使用してもよい。別の哺乳動物種（例えば、マウス）の染色体上の遺伝子の配置は、たとえ特定のヒト染色体の数またはアームが未知でも、しばしば関連するマーカーを明らかにする。物理的マッピングにより染色体アームまたはその一部に新しい配列を割り当てることができる。
【００８５】
これは、ポジショナルクローニングまたは他の遺伝子発見法を使用して疾患遺伝子を探索している研究者に、貴重な情報を提供する。特定のゲノム領域への遺伝子連鎖（例えば、Gatti, R.A.ら (1988) Nature 336:577-580）により、疾患または症候群がいったんおおまかに局在化されると、その領域にマッピングされるすべての配列が、さらなる研究のための関連または制御遺伝子となる。本発明のヌクレオチド配列はまた、正常個体、キャリアー、または疾患個体の、転座、倒置などによる、染色体位置の差を検出するのに使用される。
【００８６】
さらに、本核酸配列は、hCLCA2および他のCLCAとヒト分泌過多疾患との関連を確認するための「単一ヌクレオチド多型（SNP）」分析で有用である。SNPアプローチの説明については、Riley JH, Allan CJ, Lai E, Roses A. Pharmacogenomics 2000 Feb; 1(1):39-47 「共通疾患遺伝子の単離における単一ヌクレオチド多型の使用」、およびSchork NJ, Fallin D, Lanchbury JS., Clin Genet 2000 Oct; 58(4):250-64 「単一ヌクレオチド多型と遺伝子疫学の未来」を参照されたい。
【００８７】
hCLCA2の非ヒト同族体
本発明により、hCLCA2の非ヒト同族体ならびにこれをコードする核酸組成物と関連発明が提供される。
【００８８】
ポリペプチド組成物
hCLCA2の同族体ならびにこれに関連するポリペプチド組成物が提供される。本明細書においてポリペプチド組成物という用語は、完全長タンパク質ならびにその一部もしくは断片を意味する。具体的な目的の非ヒトhCLCA2同族体は、mCLCA4である。mCLCA4は、配列番号02に記載のアミノ酸配列を含む。
【００８９】
また本発明により、関連するポリペプチド組成物が提供される。ポリペプチド組成物という用語は、完全長タンパク質ならびにその一部もしくは断片を意味する。またこの用語には、天然に存在するタンパク質の変種が含まれ、ここでそのような変種は、天然に存在するタンパク質、天然に存在するマウスタンパク質、または他の種からのタンパク質（これは、hCLCA2の非ヒト（通常哺乳動物種）同族体を天然に発現する）に対して相同的であるかまたは実質的に同じである。
【００９０】
候補の相同的タンパク質は、本発明のmCLCA4タンパク質と実質的に類似しており、従って、候補タンパク質が、D.G. Higgins とP.M. Sharp、「マイクロコンピューター上の迅速かつ高感度複数配列整列」(1989) CABIOS, 5:151-153に記載のMegAlign, DNAstar (1998) クラスタルアルゴリズムを使用して測定する時、mCLCA4と少なくとも約35％、一般的には少なくとも約45％、およびより一般的には少なくとも約60％の配列同一性を有するなら、本発明のmCLCA4同族体またはhCLCA2の非ヒト同族体である（使用されるパラメータは、ktuple1、gap penalty 3、window 5およびdiagonals saved 5である）。本発明の以下の説明における用語「非ヒトhCLCA2同族体」とは、mCLCA4のみではなく、ヒトではない種（例えば、ラットおよび他の哺乳動物種）で発現されるその同族体も意味する。
【００９１】
また、開示されたタンパク質と実質的に同一のタンパク質も提供され、ここで実質的に同一とは、そのタンパク質は、開示されたタンパク質の１つの配列と、少なくとも約60％、一般的には少なくとも約65％、およびより一般的には少なくとも約70％の配列同一性を有することを意味する。多くの好適な実施態様において配列同一性は、タンパク質の全長にわたって、少なくとも約90％、一般的には少なくとも約95％、およびより一般的には少なくとも約99％である。
【００９２】
本発明の非ヒトhCLCA2同族体は塩化物チャネルであり、好ましくはムチン分泌に影響を与える塩化物チャネルであり、さらに好ましくは呼吸系細胞のムチン分泌に影響を与える塩化物チャネルである。
【００９３】
上記のタンパク質以外に、他の種（すなわち、他の動物種）からの同族体またはタンパク質（またはその断片）が提供され、ここでそのような同族体またはタンパク質は、種々の異なるタイプの種、通常哺乳動物、例えばげっ歯類（例えばマウス、ラット）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ）およびヒト由来である。同族体とは、上記のmCLCA4と少なくとも約35％、一般的には少なくとも約40％、およびより一般的には少なくとも約60％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を意味し、ここで配列同一性は上記したように決定される。
【００９４】
本発明のタンパク質は、天然の環境中には存在せず、例えばこれらは、天然の環境から分離されている。ある実施態様において本タンパク質は、天然の環境と比較すると本タンパク質が濃縮されている組成物中に存在する。例えば、精製されたタンパク質が提供され、ここで精製されたとは、タンパク質が非CLCA2タンパク質が実質的に存在しない組成物中であることを意味し、ここで実質的に存在しないとは、90％未満、一般的には60％未満、およびより一般的には50％未満の組成物が非CLCA2タンパク質からなることを意味する。
【００９５】
本発明のタンパク質はまた、単離体中に存在してもよく、これは、このタンパク質が、他のタンパク質および他の天然に存在する生物学的分子（例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよびこれらの断片）などを実質的に含まないことを意味し、ここで用語「実質的に含まない」とは、単離されたタンパク質を含有する組成物の70％未満、一般的には60％未満、およびより一般的には50％未満が、他の天然に存在する生物学的分子であることを意味する。ある実施態様においてこのタンパク質は、実質的に純粋な形で存在し、ここで「実質的に純粋な形」とは、少なくとも95％、一般的には少なくとも97％、およびより一般的には少なくとも99％の純度であることを意味する。
【００９６】
天然に存在するタンパク質以外に、天然に存在するタンパク質とは異なるポリペプチド（例えば、mCLCA4ポリペプチド）が提供される。mCLCA4ポリペプチドとは、後に詳述されるmCLCA4をコードする遺伝子の読みとり枠（ORF）によりコードされるアミノ酸配列を意味し、完全長タンパク質およびその断片、特に生物活性断片および／または機能性ドメインに対応する断片などを含み、本ポリペプチドと他のタンパク質またはその一部との融合体を含む。
【００９７】
目的の断片は、典型的には少なくとも約10aaの長さ、一般的には少なくとも約50aaの長さであり、および300aaまたはそれ以上の長さでもよいが、約1000aaの長さを超えることはなく、断片は、少なくとも約10aa、一般的には少なくとも約15aa、および多くの実施態様は少なくとも約50aaの長さの、本タンパク質と同一アミノ酸の範囲を有する。ある実施態様において、断片は好ましくは、野生型タンパク質mCLCA4タンパク質の少なくとも実質的な部分を含有し、ここで実質的な量とは、mCLCA4タンパク質の少なくとも50％、一般的には少なくとも60％、およびより一般的には少なくとも70％の長さを意味し、多くの実施態様においてこのパーセントは、はるかに高く、例えば75、80、85、90、または95％またはそれ以上、例えば99％である。
【００９８】
本タンパク質とポリペプチドは、天然の起源から得られるかまたは合成される。例えばこのタンパク質は、このタンパク質を発現する生物学的供給源（例えば、呼吸細胞、例えば杯状細胞など）から得られる。本タンパク質はまた、合成法により、例えば後に詳述されるように、適切な宿主中の目的のタンパク質をコードする組換え遺伝子を発現することにより得られる。任意の便利なタンパク質精製法が使用され、適切なタンパク質精製法は、Guide to Protein Purification (Deucher編）（アカデミックプレス（Academic Press）、1990）に記載されている。例えば、元々の供給源（例えば、杯状細胞または発現宿主）から溶解物が調製され、HPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性クロマトグラフィーなどを使用して精製される。
【００９９】
核酸組成物
mCLCA4タンパク質またはその断片、ならびに本発明のmCLCA4同族体をコードする核酸組成物も提供される。核酸組成物とは、本発明のmCLCA4ポリペプチドをコードし（すなわちmCLCA4遺伝子）、適切な条件下でmCLCA4として発現される読みとり枠を有するDNAの配列を含む組成物を意味する。またこの用語には、mCLCA4タンパク質をコードする核酸と、相同的または実質的に類似もしくは同一の核酸が含まれる。すなわち本発明は、本発明のmCLCA4タンパク質およびその同族体をコードする遺伝子を提供する。mCLCA4をコードする配列には、配列番号01に記載の配列を含む。
【０１００】
相同的遺伝子の供給源は任意の種であり、例えば霊長類；げっ歯類、例えばラットおよびマウス、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、線虫などがある。哺乳動物種（例えば、マウスとラット）の間で、同族体は典型的には実質的な配列類似性、例えばヌクレオチド配列の間で、少なくとも75％の配列同一性、一般的には少なくとも90％、より一般的には少なくとも95％の配列類似性を有する。配列類似性は参照配列に基づいて計算され、これは、大きな配列のサブセット（例えば、保存されたモチーフ、コード領域、フランキング領域など）でもよい。参照配列は、一般的には少なくとも約18ntの長さ、より一般的には少なくとも約30ntの長さであり、比較されている完全な配列まで延長してもよい。
【０１０１】
配列解析のアルゴリズムは、当該分野で公知であり、例えばAltschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に記載のBLSATがある（デフォールト設定を使用、すなわちパラメータw=4およびT=17）。本明細書に記載の配列は、データベース検索における、mCLCA4関連および相同的タンパク質、およびこれをコードする核酸を認識するのに必須である。ある実施態様において特に関係するものは、配列番号01の核酸と実質的に同じ長さ（例えば、同じ長さの少なくとも50％、しばしば少なくとも75％、およびさらにしばしば少なくとも90％）であり、核酸の全長にわたって、これらの配列の１つと少なくとも約90％、一般的には少なくとも約95％、およびより一般的には少なくとも約99％の配列同一性を有する核酸である。
【０１０２】
本発明のタンパク質およびポリペプチドをコードする核酸は、cDNAまたはゲノムDNAまたはその断片でもよい。用語「CLCA4遺伝子」とは、具体的なタンパク質とポリペプチドをコードする読みとり枠、およびイントロン、ならびに、コード領域を超えて約20kbまでの、しかしできれば１方向の、発現の制御に関与する隣接5'および3'非コードヌクレオチド配列を意味する。この遺伝子は、染色体外維持のためのまたは宿主ゲノムへの組み込みのための適切なベクター中に導入される。
【０１０３】
本明細書において用語「cDNA」は、配列要素はエキソンと5'および3'非コード領域である未変性の成熟mRNA種中に存在する、配列要素の整列を共有するすべての核酸を含む。一般的にはmRNA種は、介在イントロン（存在する時）と連続するエキソンを有し、核RNAスプライシングにより除去されて、MPTSタンパク質をコードする連続的読みとり枠を生成する。
【０１０４】
目的のゲノム配列は、リストした配列で定義されるように、開始コドンと停止コドンの間に存在する核酸を含み、未変性の染色体中に通常存在するすべてのイントロンを含む。これはさらに、成熟mRNA中に見いだされる5'と3'非翻訳領域を含んでよい。これはさらに、特異的な転写制御配列および翻訳制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含んでよく、転写領域の5'または3'末端の約１kb（しかし可能であればさらに多く）のフランキングゲノムcDNAを含む。ゲノムDNAは、100kbpまたはそれ以下の断片として単離されてよく、フランキング染色体配列を実質的に含まない。コード領域をフランクするゲノムDNA（3Nまたは5N）または時にイントロン中に見いだされる内部制御配列は、正しい組織特異的およびステージ特異的発現に必要な配列を含有する。
【０１０５】
本発明の核酸組成物は、本mCLCA4タンパク質のすべてまたは一部をコードしてもよい。従来法に従って、制限酵素消化、PCR増幅などにより、オリゴヌクレオチドを化学合成することにより、DNA配列から２本鎖または１本鎖断片が得られる。大体、DNA断片は、少なくとも15nt、一般的には少なくとも18ntまたは25ntであり、少なくとも約50ntでもよい。
【０１０６】
本遺伝子は、一般的に無傷の染色体以外のものとして、単離された実質的に純粋な形で得られる。一般的にはこのDNAは、mCLCA4遺伝子配列またはその断片を含まない他の核酸配列を実質的に含まないものとして得られ、一般的に少なくとも約50％、一般的には少なくとも約90％の純度であり、典型的には「組換え体」であり、すなわち、天然に存在する染色体上には通常関連しない１つ以上のヌクレオチドにフランクされる。
【０１０７】
mCLCA4ポリペプチドの調製
後のセクションで詳述される複数の用途以外に、本核酸組成物は、上記したようにmCLCA4ポリペプチドのすべてまたは一部の調製に使用できる。物理的または完全な遺伝子産物を発現するために、提供されるポリヌクレオチド（例えば、配列番号01の配列を有するポリヌクレオチド）、対応するcDNA、または完全長遺伝子が使用される。配列番号01の配列を有するポリヌクレオチドの構築体は、合成法で作成してもよい。あるいは、遺伝子と、多くのオリゴデオキシリボヌクレオチドからの完全なプラスミドとの単一工程組み立てが、Stemmerら、Gene（アムステルダム） (1995) 164(1):49-53に記載されている。
【０１０８】
この方法では、アセンブリーPCR（多くのオリゴデオキシリボヌクレオチド（oligo）からの長いDNA配列の合成）が記載される。この方法は、DNAシャフリング（Stemmer, Nature (1994) 370:389-391）に由来し、DNAリガーゼには依存せず、DNAポリメラーゼに依存して、組み立てプロセス中に徐々に長いDNA断片を構築していく。例えばSambrook, J.ら Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第２版 (1989) コールド・スプリング・ハーバー・プレス、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク州、に記載のように、および米国保健社会福祉省（HHS）、組換えDNA研究の国立衛生研究所ガイドラインに記載の規制に従って、標準的組換えDNA法を使用して、適切なポリヌクレオチド構築が精製される。
【０１０９】
本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ベクター中に分子を入れて増やすことができる。ウイルスおよび非ウイルスベクター（プラスミドを含む）が使用される。プラスミドの選択は、増殖が好ましい細胞のタイプと増殖の目的に依存する。多量の所望のDNA配列を増幅し作成するのに有用ないくつかのベクターがある。培養物中の細胞を発現するのに適した他のベクターがある。動物またはヒト全体中の細胞の移動と発現に適したさらに別のベクターがある。
【０１１０】
適切なベクターの選択は、当業者の技術の範囲内である。多くのそのようなベクターが市販されている。典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位へのDNAリガーゼの結合を介して、ベクター中に物理的または完全長ポリヌクレオチドが挿入される。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、相同的組換えによりin vivoで挿入することができる。典型的にはこれは、相同性の領域を所望のヌクレオチド配列のフランク上のベクターに結合させることにより行われる。例えば、相同性の領域は、オリゴヌクレオチドの結合により、またはポリメラーゼ連鎖反応により、相同性の領域と所望のヌクレオチド配列の部分を含むプライマーを使用して付加される。
【０１１１】
発現には、発現カセットまたは発現系が使用される。本発明のポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物は、任意の便利な発現系（細菌、酵母、昆虫、両生類、および哺乳動物系を含む）で発現される。適切なベクターおよび宿主細胞は、米国特許第5,654,173号に記載されている。発現ベクターでは、配列番号01に記載のmCLCA4をコードするポリヌクレオチドが、適宜制御配列に結合されて、所望の発現性が得られる。これらには、プロモーター（センス鎖の5N末端またはアンチセンス鎖の3N末端で結合される）、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、レプレッサー、およびインデューサーがある。プロモーターは、制御性でも構成性でもよい。ある場合には、条件的に活性なプロモーター、例えば組織特異的または成長段階特異的プロモーターを使用することが好ましい。
【０１１２】
これらは、ベクターへの結合のために前記の方法を使用して、所望のヌクレオチド配列に結合される。当該分野で公知の任意の方法が使用できる。すなわち発現ベクターは、転写および翻訳開始領域を提供し、これは誘導性または構成性でもよく、コード領域は、転写開始領域、および転写と翻訳停止領域の転写制御下で機能できる形で結合している。これらの制御領域は、本MPTS遺伝子本来のものであるか、または外因性起源から得られてもよい。
発現ベクターは一般的に、プロモーター配列の近傍に位置して、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供する。発現宿主中で機能する選択マーカーが存在してもよい。発現ベクターは、融合タンパク質の産生のために使用され、外因性融合タンパク質は、追加の機能（すなわち、タンパク質合成、安定性、規定の抗血清との反応性、酵素マーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ）などの増加）を提供する。
【０１１３】
転写開始領域、その遺伝子または断片、および転写停止領域を含む発現カセットが調製される。特に関係するのは、機能性エピトープまたはドメインの発現を可能にする配列、一般的には少なくとも約８アミノ酸の長さ、より一般的には少なくとも約15アミノ酸の長さから約25アミノ酸、および遺伝子の完全な読みとり枠までの配列の使用である。DNAの導入後、選択マーカーを用いて、構築体を含有する細胞が選択され、細胞が拡張され、次に発現のために使用される。
【０１１４】
mCLCA4タンパク質とポリペプチドは、発現の目的により従来法に従って原核生物または真核生物中で発現される。タンパク質の大規模生産のために、発現宿主細胞として、単細胞生物、例えば大腸菌（E. coli）、枯草菌（B. subtilis）、エス・セレビッシェ（S. cerevisiae）、バキュロウイルスベクターと組合せた昆虫細胞、または脊椎動物（特に哺乳動物）のような高等生物の細胞、例えばCOS7細胞、HEK293、CHO、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞が使用される。ある場合には、真核細胞中で遺伝子を発現することが好ましく、発現されるタンパク質は、自然の折り畳みと翻訳後修飾からの恩恵を受ける。小ペプチドも実験室で合成することができる。完全なタンパク質配列のサブセットであるポリペプチドは、機能に重要なタンパク質の部分を同定し試験するために使用される。
目的の特異的発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳動物細胞由来の発現系がある。これらの範疇のそれぞれからの代表的な系を以下に示す：
【０１１５】
細菌。細菌の発現系には、Changら, Nature (1978) 275:615; Goeddelら, Nature (1979) 281:544; Goeddelら, Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057; EP 0036,776; 米国特許第4,551,433号; DeBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80:21-25; およびSiebenlistら, Cell (1980) 20:269に記載されているものがある。
【０１１６】
酵母。酵母の発現系には、Hinnenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75:1929; Itoら, J. Bacteriol. (1983) 153:163; Kurtzら, Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142; Kunzeら, J. Basic Microbiol. (1985) 25:141; Gleesonら, J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459; Roggenkampら, Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302; Dasら, J. Bacteriol. (1984) 158:1165; De Louvencourtら, J. Bacteriol. (1983) 154:737; Van den Bergら, Bio/Technology (1990) 8:135; Kunzeら, J. Basic Microbiol. (1985) 25:141; Creggら, Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376; 米国特許第4,837,148号と4,929,555号；BeachとNurse, Nature (1981) 300:706; Davidowら, Curr. Genet. (1985) 10:380; Gaillardinら, Curr. Genet. (1985) 10:49; Ballanceら, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112:284-289; Tilburnら, Gene (1983) 26:205-221; Yeltonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:1470-1474; KellyとHynes, EMBO J. (1985) 4:475479; EP 0244,234;およびWO 91/00257に記載されているものがある。
【０１１７】
昆虫細胞。昆虫での異種遺伝子の発現は、米国特許第4,745,051号；Friesenら、「バキュロウイルス遺伝子発現の制御」、The Molecular Biology of Baculoviruses (1986) (W. Doerfler編）；EP 0127,839; EP 0155,476;およびVlakら、J. Gen. Virol. (1988) 69:765-776; Millerら, Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177; Carbonellら, Gene (1988) 73:409; Maedaら, Nature (1985) 315:592-594; Lebacq-Verheydenら, Mol. Cell. Biol. (1988) 8:3129; Smithら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82:8844; Miyajimaら, Gene (1987) 58:273;およびMartinら, DNA (1988) 7:99に記載のように行われる。多くのバキュロウイルス株と変種および宿主からの対応する許容昆虫細胞が、Luckowら, Bio/Technology (1988) 6:47-55, Millerら, Genetic Engineering (1986) 8:277-279、およびMaedaら, Nature (1985) 315:592-594に記載されている。
【０１１８】
哺乳動物細胞。哺乳動物発現は、Dijkemaら, EMBO J. (1985) 4:761, Gormanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6777, Boshartら, Cell (1985) 41:521および米国特許第4,399,216号に記載のように行われる。哺乳動物発現の他の特徴は、HamとWallace, Meth. Enz. (1979) 58:44, BarnesとSato, Anal. Biochem. (1980) 102:255, 米国特許第4,767,704号、4,657,866号、4,927,762号、4,560,655号、WO 90/103430, WO 87/00195, およびU.S. RE 30,985に記載のように促進される。
【０１１９】
上記宿主細胞のいずれか、または他の適切な宿主細胞または生物を使用して、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製および／または発現する時、生じる複製核酸、RNA、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物の生成物として本発明の範囲内である。生成物は、当該分野で公知の任意の適切な手段により回収される。
選択されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子がいったん同定されると、その発現は、遺伝子本来の細胞中で制御することができる。例えば、米国特許第5,641,670号に記載のように、細胞の内因性遺伝子は、外因性制御配列により制御することができる。
【０１２０】
本ポリペプチドと核酸成分の使用
本ポリペプチドと核酸成分は、種々の異なる用途で使用される。目的の一般的用途には：mCLCA4同族体の同定；新規プロモーター要素の供給源として；mCLCA4発現制御因子の同定；ハイブリダイゼーション用途（例えば、PCR）のプローブおよびプライマーとして；生物的試料中の発現パターンの同定；mCLCA4機能の細胞または動物モデルの調製；mCLCA4機能のin vitroモデルの調製；などがある。
【０１２１】
本遺伝子の同族体は、多くの方法のうちの任意の方法により同定される。提供されるcDNAの断片は、目的の標的生物からのcDNAライブラリーに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用され、ここでは低厳密性条件が使用される。プローブは、大きい断片、または１つ以上の短い縮重プライマーでもよい。配列類似性を有する核酸は、低厳密性条件下のハイブリダイゼーション（例えば、50℃と６×SSC（0.9M 塩化ナトリウム／0.09M クエン酸ナトリウム））により検出され、55℃と１×SSC（0.15M 塩化ナトリウム／0.015M クエン酸ナトリウム）での洗浄に付される。配列同一性は、厳密性条件下、例えば50℃またはそれ以上かつ0.1×SSC（15mM 塩化ナトリウム／01.5M クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションにより決定される。
【０１２２】
厳密性ハイブリダイゼーション条件の別の例は、溶液（50％ホルムアミド、５×SSC（150mM NaCl、15mM クエン酸三ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム（pH7.6）、５×デンハルツ溶液、10％デキストラン硫酸、および20mg/ml変性剪断サケ精子DNA）中で42℃で一晩インキュベーション、次に0.1×SSC中で約65℃で洗浄する。厳密性ハイブリダイゼーション条件は、上記代表的条件のように少なくとも厳密性のハイブリダイゼーション条件である。他の厳密性ハイブリダイゼーション条件は当該分野で公知であり、本発明の具体的な実施態様の核酸を同定するのに使用してもよい。
【０１２３】
提供された配列と実質的に同一性の領域を有する核酸、例えば対立遺伝子変種、遺伝子の遺伝的改変バージョンなどは、提供された配列に厳密性ハイブリダイゼーション条件下で結合する。プローブ、特にDNA配列の標識したプローブを使用して、相同的または関連遺伝子を単離することができる。
【０１２４】
5Nフランキング領域の配列は、本mCLCA4遺伝子が発現される組織中で成長制御を提供するプロモーター要素（エンハンサー結合部位を含む）のために使用される。組織特異的発現は、発現パターンを決定するのに、および発現の本来のパターンを模倣するのに有用である。プロモーター領域中の天然に存在する多型は、発現の天然の変種、特に疾患に関連するものを決定するのに有用である。
【０１２５】
あるいは、実験的に規定される系での発現を改変する効果を調べるために、プロモーター領域に突然変異を導入してもよい。転写因子の結合に関与する特異的DNAモチーフの同定法（例えば既知の結合モチーフとの配列類似性、ゲル遅延研究など）は、当該分野で公知である。例えば、Blackwellら(1995)、Mol. Med. 1:194-205; Mortlockら (1996), Genome Res. 6:327-33; およびJoulinとRichard-Foy (1995), Eur. J. Biochem. 232:620-626を参照されたい。
【０１２６】
特に異なる組織または成長段階での、mCLCA4遺伝子発現の転写または翻訳制御に必要なシス作用性配列を同定するのに、およびmCLCA4遺伝子発現を制御または仲介するシス作用性配列およびトランス作用性因子を同定するのに、制御配列を使用してもよい。そのような転写または翻訳制御領域は、培養細胞または胚、胎児または成体組織でのおよび遺伝子治療のための、野生型または改変mCLCA4または目的の他のタンパク質の発現を促進するために、mCLCA4遺伝子に機能できる形で結合してもよい。
【０１２７】
小DNA断片は、PCRのプライマー、ハイブリダイゼーションスクリーニングプローブなどとして有用である。より大きなDNA断片（すなわち、100ntを超える）は、上記セクションに記載のように、コードされるポリペプチドの産生に有用である。ジオメトリック増幅反応（例えば、ジオメトリックPCR）で使用するために、一対のプライマーが使用されるであろう。プライマー配列の正確な組成は本発明にとって決定的に重要ではないが、ほとんどの応用で、当該分野で公知のようにプライマーは厳密性条件下で本配列にハイブリダイズするであろう。少なくとも約50nt、好ましくは少なくとも約100ntの増幅産物を生成する一対のプライマーを選択することが好ましい。プライマー配列の選択のためのアルゴリズムは一般に公知であり、市販のソフトウェアパッケージから入手できる。増幅プライマーは、DNAの相補鎖にハイブリダイズし、互いをプライムする。
【０１２８】
DNAはまた、生物的試料中の遺伝子発現を同定するのにも使用される。ゲノムDNAまたはRNAのような特定のヌクレオチド配列の存在についてあるDNAが細胞をプローブ探索する方法は、文献で充分確立されている。簡単に説明すると、DNAまたはmRNAが細胞試料から単離される。逆転写酵素を使用してRT-PCRによりmRNAが増幅されて、相補的DNA鎖を生成し、次に対象のDNA配列に特異的なプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応増幅が行われる。
【０１２９】
あるいは、ゲル電気泳動によりmRNA試料が分離され、適当な支持体（例えば、ニトロセルロース、ナイロンなど）に移され、次にプローブとして対象のDNAの断片とプローブ結合される。他の方法、例えばオリゴヌクレオチド結合測定法、インサイチューハイブリダイゼーション、および固相チップ上に整列したDNAプローブへのハイブリダイゼーションも使用される。対象の配列にハイブリダイズするmRNAの検出は、試料中のmCLCA4遺伝子発現を示す。
【０１３０】
mCLCA4遺伝子の配列（フランキングプロモーター領域とコード領域を含む）は、当該分野で公知の種々の方法で突然変異されて、プロモーターの強度、コードされるタンパク質の配列などの標的とする変化が得られる。そのような突然変異のDNA配列またはタンパク質生成物は通常、本明細書に記載の配列と実質的に類似であり、すなわちそれぞれ少なくとも１つのヌクレオチドまたはアミノ酸が異なり、少なくとも２つ、しかし約10を超えないヌクレオチドまたはアミノ酸が異なってよい。配列変化は、置換、挿入、欠失またはこれらの組合せでもよい。欠失はさらに、より大きな変化、例えばドメインまたはエキソンの欠失を含んでよい。目的の他の修飾には、例えばFLAGシステム、HAなどによるエピトープタギングを含む。細胞レベル下局在化の試験のために、緑色蛍光タンパク質（GFP）との融合タンパク質も使用される。
【０１３１】
クローン化遺伝子のin vitro突然変異誘発法も公知である。部位特異的突然変異誘発のプロトコールの例は、Gustinら(1993)、Biotechniques 14:22; Barany (1985), Gene 37:111-23; Colicelliら (1985), Mol. Gen. Genet. 199:537-9;およびPrentkiら (1984), Gene 29:303-13に見いだされる。部位特異的突然変異誘発法は、Sambrookら Molecular Cloning: A Laboratory Manual、CSH プレス、1989、pp.15.3-15.108; Weinerら (1993), Gene 126:35-41; Sayersら (1992), Biotechniques 13:592-6; JonesとWinistorfer (1992), Biotechniques 12:528-30; Bartonら (1990), Nucleic Acids Res. 18:7349-55; MarottiとTomich (1989), Gene Anal. Tech. 6:67-70;およびZhu (1989), anal Biochem 177:120-4に見いだされる。そのような突然変異遺伝子を使用して、MPTSタンパク質の構造−機能相関を研究したり、またはその機能または制御に影響を与えるタンパク質の性質を改変したりできる。
【０１３２】
対象の核酸を使用して、トランスジェニック非ヒト動物または細胞株中の部位特異的遺伝子修飾体を生成することができる。トランスジェニック動物は、相同的組換えにより作成され、ここでは内因性遺伝子座が改変される。あるいは、核酸構築体が、ゲノム中にランダムに組み込まれる。安定な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス、YACなどがある。
【０１３３】
修飾細胞または動物は、mCLCA4機能と制御の研究に有用である。特に関係があるのは、mCLCA4／hCLCA2関連症状（ムチン分泌関連症状、例えば呼吸系のムチン分泌に関連する症状、例えば上記の分泌不足および過多を含む）のトランスジェニック動物モデルを構築するための、対象の遺伝子の使用である。すなわち、本発明のトランスジェニック動物モデルには、内因性mCLCA4遺伝子発現プロフィールが調節されているかまたは改変されているモデル（例えば内因性mCLCA4が排除されてはいないが少なくとも低下している、またはmCLCA4発現が上昇している、ノックアウト）を含む。通常は発現されている細胞または組織中の遺伝子またはその変種中での、そのような細胞または組織中に通常は存在しないレベルでの遺伝子またはその変種の発現も提供する。
【０１３４】
相同的組換えのためのDNA構築体は、本発明のmCLCA4遺伝子の少なくとも一部を含み、ここで遺伝子は、所望の遺伝子修飾を有し、標的遺伝子座に対する相同性の領域を含む。ランダム組み込みのためのDNA構築体は、組換えを仲介するために相同性の領域を含む必要は無い。陽性および陰性選択のためのマーカーを含めることが便利である。相同的組換えによる目的の遺伝子修飾を有する細胞の作成法は、当該分野で公知である。哺乳動物細胞をトランスフェクトするための種々の方法については、Keownら (1990), Meth. Enzymol. 185:527-537を参照されたい。
【０１３５】
胚幹（ES）細胞については、ES細胞株が使用されるか、または宿主（例えば、マウス、ラット、モルモットなど）から新に胚細胞が得られる。そのような細胞は、適切な繊維芽細胞−フィーダー層上で培養されるか、または白血病阻害因子（LIF）の存在下で培養される。ESまたは胚細胞が形質転換されている時、これらを使用してトランスジェニック動物を作成してもよい。形質転換後、細胞は適切な培地中でフィーダー層上に蒔かれる。構築体を含有する細胞は、選択培地を使用して検出される。
【０１３６】
コロニーが増殖する充分な時間後、これらを取り上げ、相同的組換えの存在または構築体の組み込みについて分析する。次に陽性のコロニーを使用して、胚操作と胚盤胞注入を行う。胚盤胞は、４〜６週齢の過排卵の雌から得られる。ES細胞をトリプシン処理し、修飾細胞を、胚盤胞の分割腔中に注入する。注入後、胚盤胞を、偽妊娠雌の各子宮角に戻す。次に雌を満期まで進ませ、生じる子孫を構築体についてスクリーニングする。異なる表現型の胚盤胞および遺伝子修飾細胞を提供することにより、キメラ子孫が容易に検出される。
【０１３７】
キメラ動物を、修飾遺伝子の存在についてスクリーニングし、修飾を有する雌を交配させて、ホモ接合性の子孫を得る。遺伝子改変が成長のある時点で致死を引き起こすなら、組織または臓器を、同種のまたは類遺伝子性の移植片または移植物として、またはin vitro培養で維持することができる。トランスジェニック動物は、任意の非ヒト哺乳動物（例えば、実験室動物、家畜動物など）である。トランスジェニック動物は、機能試験、薬物スクリーニングなどで使用して、例えば候補薬物のアグリカナーゼ活性に及ぼす作用を調べることができる。
【０１３８】
mCLCA4抗体
また、mCLCA4タンパク質およびその同族体に結合する抗体も提供される。適切な抗体は、宿主動物を、mCLCA4のすべてまたは一部を含むペプチドで免疫することにより得られる。適切な宿主動物には、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどがある。タンパク質免疫原の起源は、マウス、ラット、サルなどでもよい。宿主動物は一般に、免疫原（例えば、ウサギを免疫するのに使用されるmCLCA4）とは異なる種である。
【０１３９】
免疫原は、完全なタンパク質、その断片および誘導体を含有してもよい。好適な免疫原は、mCLCA4のすべてまたは一部を含有し、ここでこれらの残基は、未変性の標的タンパク質に見られる翻訳後修飾（例えば、グリコシル化）を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、従来の組換え法を使用するクローン化遺伝子の発現、HECからの単離など）で産生することができる。
【０１４０】
ポリクローナル抗体の調製のために第１の工程は、標的タンパク質による宿主動物の免疫であり、ここで、標的タンパク質は好ましくは実質的に純粋な形であり、約１％未満の汚染物質を含む。免疫原は、完全な標的タンパク質、その断片または誘導体を含んでよい。宿主動物に対する免疫応答を上昇させるために、標的タンパク質は、アジュバントと一緒にされ、ここで適切なアジュバントには、ミョウバン、デキストラン硫酸、大ポリマー陰イオン、油および水乳剤、例えばフロイントアジュバント、フロインド完全アジュバントなどがある。
【０１４１】
標的タンパク質はまた、合成担体タンパク質または合成抗原に結合してもよい。ポリクローナル抗体を産生するために、種々の宿主を免疫してもよい。そのような宿主には、ウサギ、モルモット、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ヒツジ、ヤギなどがある。標的タンパク質は通常宿主の皮内に、投与され、最初の投与後に、１回以上（通常少なくとも２回）追加の追加免疫用量が投与される。免疫後、宿主から血液が採取され、次に血液細胞から血清が分離される。生じる抗血清中に存在するIgは、公知の方法（例えば、硫酸アンモニウム分画、DEAEクロマトグラフィーなど）を使用して分画される。
【０１４２】
モノクローナル抗体は、従来法により産生される。一般に免疫した宿主動物の脾臓および／またはリンパ節は、形質細胞の供給源となる。形質細胞は、骨髄腫細胞との融合により不死化されて、ハイブリドーマ細胞を産生する。個々のハイブリドーマからの培養上清は、標準的技術を使用してスクリーニングされ、所望の特異性を有する抗体を産生するものが同定される。ヒトタンパク質に対するモノクローナル抗体の産生のための適切な動物には、マウス、ラット、ハムスターなどがある。マウスタンパク質に対する抗体を作成するために、動物は一般的にハムスター、モルモット、ウサギなどである。抗体は、従来法（例えば、不溶性支持体、タンパク質Aセファロースなどに結合したMPTSを使用する親和性クロマトグラフィー）により、ハイブリドーマ細胞上清または腹水液から精製される。
【０１４３】
抗体は、通常のマルチマー構造ではなく１本鎖として産生される。１本鎖抗体は、Jostら (1994) J.B.C. 269:26267-73、および他の文献に記載されている。重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域をコードするDNA配列は、小さい中性のアミノ酸（グリシンおよび／またはセリンを含む）の少なくとも約４アミノ酸をコードするスペーサーに連結される。この融合体によりコードされるタンパク質は、元々の抗体の特異性と親和性を保持する機能性可変領域の組み立てを可能にする。
【実施例】
【０１４４】
以下の例は、例示のためであり、決して本発明を限定するものではない。
実施例１．正常組織（正常な肺を含む）でのすべての既知のヒトCLCAおよびムチンの発現
ヒトにmCLCA3の別の機能性同族体があるかどうかを調べるために、すべての既知のヒトCLCA（CLCA1、2、3、4）について定量「リアルタイム」RT-PCR（Taqman（登録商標））測定法を開発した。この測定法のプロトコールは、パーキンエルマーバイオシステムズ（Perkin Elmer Biosystems）により販売されているTaqman Gold RT-PCRキットのユーザーマニュアルに記載されている。
【０１４５】
正常なヒト組織中のCLCA遺伝子発現（mRNAレベル）の相対レベルと絶対レベルの正確な定量を可能にするために、文献の配列を参照として使用して、各クローン化遺伝子の標準曲線を作成した。表１は、評価した各ヒトとマウス遺伝子のすべてのqRT-PCRプライマーとTaqmanプローブを記載する。組織は、市販の業者（クロンテク（Clontech））から得た；これらは典型的には、死亡時には健康であったと推定される外傷犠牲者（すなわち自動車事故）から取ったプールした試料である。結果については、hCLCA1、図１；hCLCA2、図２；hCLCA3、図３；hCLCA4、図４を参照されたい。
【０１４６】
分泌過多疾患に関与すると推測される既知のヒトムチンのqRT-PCR発現測定法も開発された。hMUC1（図５）を対照ムチン（非ゲル形成性および非分泌性）として評価し、これはムチンの産生に関与すると考えられる。これに対して、hMUC2、hMUC4、hMUC5AC、hMUC5B、およびhMUC6はすべて、種々の粘膜組織での粘液産生において推定の役割を有する大きなゲル形成性分泌ムチンであると考えられる。従って、これらの６つのムチンの発現を、hCLCA1について上記で使用した正常組織の同じパネルで評価した（図６、７、８、９、10を参照）。
【０１４７】
定量結果は、ムチンとCLCA発現について劇的な組織特異性があることを示す。特にhMUC5ACとhMUC5Bは両方とも気管組織に局在化し、程度は小さいが唾液腺（hMUC5B）と胃（hMUC5AC）に局在化している（図８と９）。これに対してhMUC6は、主に胃ムチン（図10）、およびhMUC2は腸（大腸と小腸の両方）ムチン（図６）に局在化している。hMUC4はまた、肺と気管ならびに骨格筋と前立腺で発現される（図７）。結果は、hMUC5ACとhMUC5Bが、健康なヒトの気道（および特に気管）中の粘液分泌に密接に関連したムチンであることを示す。
【０１４８】
正常なヒト組織中のCLCA発現の結果もまた否定できないものである。先行技術（例えば、WO 99/44620、およびNakanishiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 Apr 24;98(9):5175-80）に報告された知見とは反対に、hCLCA1は、正常なヒトの気道ではなく正常ヒトの小腸に局在化している（図１）。hCLCA1は小腸中でhMUC2と同様の発現パターンを示し（図６）、この塩化物チャネルが、正常なヒトでの小腸粘液（hMUC2からなる）の産生を制御することを示唆する。これに対して、hCLCA4は主に大腸で発現され（図４）、小腸ではなく特に大腸でのこのチャネルの明確な役割を示唆している。hCLCA1とhCLCA4についてのこれらの知見は、粘液過剰産生および産生不足の消化管疾患（例えば、炎症性腸疾患）を治療するための薬剤を開発するのに有用である。
【０１４９】
hCLCA3は、異常な末端切断型および分泌過多カルシウム活性化塩化物チャネルタンパク質であると報告されており、従って機能性イオンチャネルである可能性は非常に小さい。hCLCA3が、多くの組織（主に睾丸）で低レベルで発現されることは驚くべきことではない（図３）。最後にかつ最も重要なことは、hCLCA2は正常なヒト気管と肺で発現され（図２）、おそらくhMUC4、hMUC5ACおよびhMUC5B（気道で発現される主要なムチン）を制御することにより、hCLCA2が気道粘液産生において決定的に重要な役割を有することを示す。hCLCA2はまた、骨格筋、乳腺、睾丸、子宮、胎盤、および前立腺で高レベルに発現され、これらの臓器でのCLCA2の機能も示唆している。
【０１５０】
正常組織におけるヒトムチンとCLCAの顕著な示差的発現パターンを強調するために（図１〜10に示す）、粘膜組織からのデータを取り、図11〜12に報告した。これらのグラフは明らかに、hCLCA1が主に小腸で発現される塩化物チャネルであり、hCLCA4が大腸でのみ発現され、hCLCA3は広く発現されるが低レベルであることを示す。これに対して、hCLCA2は気管と肺で発現される（図11）。ゲル形成性ムチンのうち、hMUC4、hMUC5AC、およびhMUC5Bは気管中に見いだされ、はるかに低いレベルで肺中に見いだされる（図12）。上記結果は、hCLCA1ではなくhCLCA2（上記で引用した先行技術の知見とは反対に）が、ヒトの気道中のムチンhMUC4、hMUC5AC、およびhMUC5Bの産生において役割を有することを示す。
【０１５１】
実施例２．ヒト分泌過多肺疾患中のムチンの発現
正常なヒト肺中でhCLCA1が検出できないことが証明された（この遺伝子が、肺での粘液分泌に関与しないことを示す）が、この塩化物チャネルが、WO 99/44620と、Nakanishiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 Apr 24;98(9):5175-80に報告されたマウスの結果と同様に、杯状細胞過形成に関連して強く誘導される可能性が残った。hCLCA1は、mCLCA3（mGob-5としても知られている）に最も近い公知の同族体である。上記の初期証拠は、正常なマウス気道中に検出可能なmCLCA3が無いが、この遺伝子は、分泌過多マウスで強く誘導され、mMUC5AC、粘液分泌、および杯状細胞過形成に相関している。粘液分泌過多のヒトの肺疾患は、分泌過多マウスモデルと似ていることは当然であり、従って第１の仮説は、正常なヒトの肺ではなく分泌過多肺でのみ高レベルのhCLCA1発現が検出されるというものである。
【０１５２】
正常なヒト気道中の塩化物チャネルhCLCA2とムチンhMUC5ACとhMUC5Bとの強い相関を証明した後、次の工程は、既知の分泌過多疾患患者で、これらのムチンとCLCA遺伝子の発現が誘導されるかどうかを測定することであった。充分性状解析されたMilan粘液分泌過多患者から、気管支生検試料を得た。これらの患者についての情報はすでに公表されており、これらの生検はこの分析には理想的なものとなっている。これらの組織はさらに、Saettaら「慢性気管支炎と慢性空気流制限の両方の症状を有する喫煙者の末梢気道での杯状細胞過形成と上皮炎症」、Am J Respir Crit Care Med 2000 Mar;161(3 Pt 1):1016-21Pに記載されている。
【０１５３】
慢性気管支炎（およびCOPD）を有する３人の患者と一人の喘息患者からの気管支生検と比較した、一人の正常な気管支生検中のhMUC2、hMUC5AC、およびhMUC5BのmRNA発現レベルを評価した。結果は、すべての４人の患者でhMUC5ACが正常レベルを超えて強く誘導されることを示す（図13）。３つのゲル形成性ムチン（hMUC2、5AC、5B）のうち、hMUC5ACが最も高レベルで発現される。hMUC5Bもまたすべての４人の患者で誘導されるが、相対的レベルはhMUC5ACについてのレベルより約10倍低い（図14）。最後に、hMUC2は主に喘息患者で誘導され、相対的レベルは、同じ試料中でhMUC5ACに対するものより約10〜50倍低い（図15）。正常な個体からの上記データと一緒にすると、上記結果は、hMUC5ACとhMUC5Bが、正常なヒト気道で見いだされ、粘液分泌過多を有する患者の気道で強く誘導されることを示す。hMUC2は通常小腸中に見いだされるが、一人の喘息患者では、その発現はまた気道中で有意に誘導される。
【０１５４】
実施例３．hCLCA2は、粘液分泌過多を有する患者の気道で誘導される；hCLCA1は検出されないままである
次に、MilanヒトCOPDと喘息生検について、同じ高度に選択的かつ定量的なRT-PCR「Taqman」測定法を使用して、hCLCA1対hCLCA2 mRNAレベルを評価した。結果は、正常個体、または粘液分泌過多患者の気管支生検中で、hCLCA1発現が検出できないことを示す（図16）。
【０１５５】
結果はまた、正常肺ではhCLCA1ではなくhCLCA2が発現され、粘液分泌過多疾患の患者の肺では、hCLCA2が誘導されることを示す（図17参照）。１つの正常な気管支生検（Milan）といくつかのプールした正常気管と肺試料（クロンテク（Clontech））では、非常に低レベルのhCLCA2が発現されるが、分泌過多疾患のすべての４人の患者（Milan試料）では強く誘導される。これらの結果は、hCLCA1ではなくhCLCA2が、疾患のヒト肺でムチンhMUC5ACおよびhMUC5B（hMUC2は異なる）と相関することを示す。従って、hCLCA2（他の研究者が主張するようにhCLCA1ではない）のイオンチャネル活性が、杯状細胞制御と粘液産生（気道における杯状細胞の主要な機能）に関与する。
【０１５６】
ヒト肺でhCLCA1を検出できないことを確認するために、hCLCA1対hCLCA2についてTaqman測定法を使用する以外にインサイチューハイブリダイゼーション（ISH）を使用して、疾患肺でhCLCA1 mRNAの存在を評価した。ISHについて、粘液分泌過多者（Saettaらの文献、前述）としてすでに選択された５人の異なる患者で一人の患者につき少なくとも３つの気管支を分析した。すべての気道で杯状細胞が見られた（すなわち、これらはムチンを含有する）が、これらの杯状細胞はCLCA1染色が陰性であった。対照の「センス」プローブもまた、バックグランド染色を示さなかった。これらの結果は、これらの分泌過多者では、予想通り杯状細胞と粘液のレベルが上昇しているが、杯状細胞上のhCLCA1は検出できないままであることを示す。従ってこれらの結果は、hCLCA1がヒト疾患のムチン産生と粘液分泌過多には関与していないことを示す。
【０１５７】
従って、ヒトの疾患肺を研究（qRT-PCRとISH）して得られた上記証拠は、マウス分泌過多モデルが、ヒト疾患におけるhCLCAタンパク質機能を予測できるものではないことを示す。すなわち、ヒト疾患におけるhCLCA1の役割に注目した先行技術の研究者らは、1)マウスモデルに依存することにより、そして2)ヒト肺中の異なるhCLCAの発現を区別するのに充分に強力な技術を使用しないため、誤解している。本データは、hCLCA1は、mCLCA3が分泌過多マウス肺で有するような機能性役割と同じ役割をヒト肺で持っていないことを証明する。hCLCA1とhCLCA2についてのqRT-PCRとISH結果は、hCLCA1についての先行技術の主張と、mCLCA3が、ムチン肺分泌性症状に関与するヒトチャネルのマウス同族体であるという教示の両方を否定する。要約すると、マウスとヒトの間の最良のCLCA配列同族体は、肺中の真のCLCA機能性同族体ではないようである。
【０１５８】
実施例４．ヒト肺上皮の細胞培養モデルで発現されるCLCAとムチン
正常なヒト組織と疾患肺中のhCLCA2、hMUC5AC、およびhMUC5Bの間の否定できない関連に基づき、ヒト肺上皮での塩化物チャネルの発現とムチン産生についてin vitro測定法を評価した。この培養系を開発することの主要な目標は、分泌過多疾患の可能な治療薬を同定するための化合物をスクリーニングすることである。また、ヒト肺を模倣する制御された実験系で、杯状細胞中のCLCAとMUCの機能的関連を評価することでもあった。従って、特殊な細胞培養で増殖させた１次正常ヒト気管気管支上皮細胞（NHTBE）から、RNAを単離した。この培養系では、肺細胞を誘導して線毛細胞と杯状細胞に分化させ、こうして、in vitroでヒト気道の上皮構造を再生した。
【０１５９】
NHTBEについての「空気−液体界面」（ALI）分化系の説明とプロトコールについては、Norfordら, Exp. Lung Res. (1998) 23(3):355-366を参照されたい。
【０１６０】
２つの起源−NIEHS（上記）のJS Koo博士と販売業者MatTek（world wide webアドレスは、"mattek"の前にwwwと"mattek"の後ろに".com"である）から得られたヒト気道ALI培養物からのRNA中の、hCLCA1、hCLCA2、hCLCA3、およびhCLCA4と比較した２つの主要な分泌ムチン（hMUC5ACとhMUC5B）の発現を評価した。両方の系の分化した杯状細胞は、hMUC5ACとhMUC5Bを発現する（図18を参照）。in vitro系ではhCLCA1とhCLCA3は発現されず（図18）、正常および疾患ヒト肺組織中のこれらのhCLCAについての結果と非常によく一致する（図１、３、16）。
【０１６１】
これに対して、hCLCA2および程度は小さいがhCLCA4は、hMUC5ACとhMUC5Bと組合せた両方のALI系で発現される。この規定されたヒト気道杯状細胞培養系でのhCLCA1発現の欠如は、先行技術の教示に反して、hCLCA1はヒト気道では関係無いことのさらなる証拠である。これに対して、ヒトin vitro系でのhCLCA2発現は、この塩化物チャネルの予測される重要性と、in vitro（図18）とヒト分泌過多気道疾患（図13、14、17）でのhMUC5ACとhMUC5B発現との関連を強調する。従って次に、通常使用されるヒト粘液産生肺細胞株NCI-H292が、同様のhCLCAとhMUC発現パターンも示すかどうかを調べた。
【０１６２】
ヒト肺細胞株NCI-H292の詳細については、Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000 Jul 21;274(1):112-6を参照されたい。NCI-H292細胞の発現データは、これらの未分化ヒト肺細胞が、ALI-培養分化ヒト杯状細胞のように、hMUC5AC、hMUC5B、およびhCLCA2を発現することを証明する（図19）。NCI-H292細胞はhCLCA1、hCLCA3またはhCLCA4を、低いかまたは検出不可能なレベルで発現し、1)未分化細胞で、2)in vitro杯状細胞培養で、および3)正常および分泌過多ヒト肺で、hCLCA2がムチン発現に最も密接に関連することを示唆する。従ってヒト肺細胞株NCI-H292は、hCLCA2機能を調節し粘液分泌過多を制御する化合物のスクリーニングにも適している。
【０１６３】
実施例５．マウス対ヒトCLCAとMUC発現、および肺生理不一致：疾患関連ヒトCLCA2の新しいマウス同族体（mCLCA4）の発見
典型的にはマウスとヒト遺伝子およびタンパク質同族体は、同様の組織分布と機能的役割を有すると予測される。これは現在、マウスCLCA3とヒトCLCA1について受け入れられている仮説である。先行技術の仮説は、hCLCA1が、その最も近いマウス同族体（mCLCA3）がマウス分泌過多肺モデルで関係があることが証明されているため、ヒト肺分泌過多疾患で関係があるはずであるというものである。上記結果は、この仮説が誤りであることを示す。
【０１６４】
CLCA3は、肺分泌過多のマウスモデルに重要であるが、ここに報告されたデータは、正常個体であろうと分泌過多疾患（COPDまたは喘息）の患者であろうと、hCLCA1がヒト肺中で検出できないことを示す。この知見は、ヒト肺疾患に関与する他のCLCAを探索することになった最初の主要な結果であり、ここで我々は、ヒト肺疾患においてhCLCA2が、ヒトの肺疾患においてhMUC5AC、hMUC5B（ならびにhMUC4）の分泌過多に関連することを、最終的に確認した。さらに重要なことは、hCLCA1結果は、hCLCA1が喘息およびCOPD患者で誘導されることを示唆した先行技術の教示に反する。すなわち、制限された先行技術と、肺疾患でhCLCA1の役割を主張するこの分野の教示は正しくない。
【０１６５】
既知のマウスおよびヒトCLCAアミノ酸配列（図20）から構築されたCLCA系統樹は、ヒトCLCA2が、他の公知のCLCA（関連する既知の（公表されたかまたは特許化された）イオンチャネル遺伝子）とは明らかに異なることを示す。
肺疾患に関連するカルシウム活性化塩化物チャネルとしてのヒトCLCA2への関心に基づき、Incyte ESTデータベースを検索して、ヒトCLCA2のマウス同族体を同定した。マウスESTを同定し、公のIMAGEクローンとして得て、これをまずIncyte ZooSeqマウスESTデータベース中で同定した。このEST配列の公の記載は、ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AA726662である。
【０１６６】
この公のクローンをIncyteから得て、完全な挿入体の配列を決定した。そのヌクレオチド配列が配列番号01である完全な挿入体は、公のデータベースには見つからない新規遺伝子である。他のヒトおよびマウスCLCAへの新規mCLCA4の整列は、この遺伝子が、ヒトCLCA2に最も近いマウス同族体であり、従ってそこで発現されるマウス組織中の機能性同族体であることを示した（マウスMUCとCLCAについては、発現データを含むそれぞれ図21と22を参照されたい）。公のヌクレオチド配列データベースの最も近い一致は、すべてのヒトCLCA2である（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号AF043977、AF127980、AX054697、AB026833）。mCLCA4のヌクレオチド配列は、hCLCA2と非常に良く一致する（GCG GAPプログラムを使用すると77％の一致、パラメータ：gap weight 50、lengh weight 3）。
【０１６７】
mCLCA4とhCLCA2の推定タンパク質配列を比較するために、次にmCLCA4 cDNA配列を、停止コドンを除去してちょうど500アミノ酸の１つの長い読みとり枠を作成した（配列番号02）。新規mCLCA4のhCLCA2タンパク質（AF043977の943aa）へのGAP(GGG)整列では、２つの配列は75.2％類似であり、69.8％同一である（gap weight＝８、length weight＝２）。この関係は、mCLCA3とhCLCA1（似た配列でマウスとヒトの間の機能性同族体として文献に認められている２つのタンパク質）の相同性レベル（80.6％類似で、76.2％同一）よりほんのわずかに弱い。mCLCA4−hCLCA2同一性は、全配列にわたって均等に分布しており、mCLCA4が、ヒトカルシウム活性化塩化物チャネルhCLCA2のマウスでの機能性同等物である可能性が非常に高い。
【０１６８】
種々のマウス組織でこの推定の新しい塩化物チャネルの発現を調べるために、mCLCA4のqRT-PCR Taqman測定法を開発した。mCLCA4（ヒトCLCA2の最も近い同族体）の発現を、既知のmCLCA3（ヒトCLCA1の最も近い同族体）とmCLCA1/2（ヒトCLCA3の最も近い同族体）（進化樹については図20参照）と比較した。mCLCA1とmCLCA2は、異なる研究室から報告されているほとんど同じ配列であり、903アミノ酸にわたって95％同一である（ジーンバンク（GenBank）受け入れ番号：mCLCA1、AF047838；mCLCA2、AF108501）。このため、qRT-PCR測定法は、推定のmCLCA1とmCLCA2転写体を確実に区別できないかも知れない（Taqman測定法の詳細については表１を参照）。
【０１６９】
mCLCA1/2、mCLCA3、およびmCLCA4発現もまた、マウスムチンmMUC1、mMUC2およびmMUC5ACと比較した（重要なヒトMUC5B配列のマウス同族体はまだ文献に報告されていない）。マウスBalb/c株から組織RNAを調製した。健康なマウスでは、ヒトにおけるようにmMUC2は小腸ムチン（図21）であり、肺または主気道（気管と気管支）では発現されない。ヒトと異なり、マウスMUC5ACは主に胃ムチンであり、最初に胃からクローン化された。しかし、マウス肺中のmMUC5AC発現は、分泌過多モデルでは劇的に増加することが証明された（データは示していない）。hMUC5ACとmMUC5ACこの異なる組織分布は、マウスとヒトの異なる肺生理のさらなる証拠である。ヒトは通常気管に杯状細胞を有するが、マウスは、粘液を過剰に分泌するように外部刺激により誘導されない限り、杯状細胞は無い。
【０１７０】
マウスカルシウム活性化塩化物チャネルはまた、顕著な組織特異性を示す。mCLCA1-2は、正常なマウス気道と肺で発現される（図22）。mCLCA3は、正常な小腸で発現されるが、正常なマウス肺では発現されず、mMUC5ACの結果とよく一致する。最後に、新規塩化物チャネルmCLCA4は、気管−気管支組織、胃、および大腸で発現されるが、比較的低レベルである（図22）。これは、同定された新規mCLCA4がマウス粘膜組織で発現され、特にそのmRNAが正常なマウス気道中に存在することを確認している。これは、マウス分泌過多モデルを使用して、ヒトの肺疾患の薬物候補としてhCLCA2/mCLCA4の調節物質を評価し、またヒトの消化管疾患の薬物候補としてhCLCA1/mCLCA3の調節物質を評価することができることを示唆する。
【０１７１】
上記結果と考察から、本発明は、特に呼吸系中の、ムチン分泌に関連する疾患の有効な治療法を提供することは明らかである。特に本発明は、呼吸系のムチン分泌過多または分泌不足に関連する症状を治療するための重要かつ有効な新しい方法を提供する。従って本発明は、当該分野への重要な貢献をしている。
上記発明は、理解を明確にするために説明と実施例によりある程度詳細に記載したが、本発明の教示から当業者は、特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなくいくつかの変更や修飾が可能であることは、容易に明らかであろう。
【０１７２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、正常ヒト組織におけるhCLCA1の発現プロフィールを示す。
【図２】図２は、正常ヒト組織におけるhCLCA2の発現プロフィールを示す。
【図３】図３は、正常ヒト組織におけるhCLCA3の発現プロフィールを示す。
【図４】図４は、正常ヒト組織におけるhCLCA4の発現プロフィールを示す。
【図５】図５は、正常ヒト組織におけるhMUC1の発現プロフィールを示す。
【図６】図６は、正常ヒト組織におけるhMUC2の発現プロフィールを示す。
【図７】図７は、正常ヒト組織におけるhMUC4の発現プロフィールを示す。
【図８】図８は、正常ヒト組織におけるhMUC5ACの発現プロフィールを示す。
【図９】図９は、正常ヒト組織におけるhMUC5Bの発現プロフィールを示す。
【図１０】図10は、正常ヒト組織におけるhMUC6の発現プロフィールを示す。
【図１１】図11は、選択された正常粘膜組織におけるhCLCA1、2、3、および4の発現の発現プロフィールを示す。
【図１２】図12は、選択された正常粘膜組織におけるhMUC1、2、3、5AC、5Bおよび6の発現の発現プロフィールを示す。
【図１３】図13は、ムチン分泌過多の個体からの生検組織中のhMUC5ACの誘導を示すグラフである。
【図１４】図14は、ムチン分泌過多の個体からの生検組織中のhMUC5Bの誘導を示すグラフである。
【図１５】図15は、ムチン分泌過多の個体からの生検組織中のhMUC2の誘導を示すグラフである。
【図１６】図16は、ムチン分泌過多の個体からの生検組織中のhCLCA1発現の誘導を示すグラフである。
【図１７】図17は、正常のおよびムチン分泌過多組織中のhCLCA2の発現レベルの比較を示すグラフである。
【図１８】図18は、インビトロの分化したヒト杯状細胞（ALI培養物）中のhCLCA1、2、3および4対hMUC5ACとhMUC5B遺伝子発現を示すグラフである。
【図１９】図19は、粘液産生ヒト粘膜表皮肺細胞株NCIH292中の、hMUC5AC、hMUC5B、およびhCLCA1、2、3、4の発現を示すグラフである。
【図２０】図20は、ヒトとマウスCLCAの系統樹を示す。
【図２１】図21は、正常マウス粘液組織中のマウスムチン（mMUC1、2、5AC）遺伝子発現を示すグラフである。
【図２２】図22は、正常マウス粘液組織中のmCLCA1-2、3、および4遺伝子発現を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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