(57)【要約】【課題】  プロビタミンＣとして、従来知られている2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸よりも、生体内で安定性が向上し、生体内で持続的に利用される新規アスコルビン酸誘導体を提供する。【解決手段】  クコ等の植物から、新規化合物、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を抽出した。2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物は、β-Ｄ-グルコシル糖転移酵素を用いて酵素合成することもできる。これらの組成物から純粋な2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を製造することができる。あるいは2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を化学合成法で製造することも可能である。2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は、対応するα-D-グルコピラノシル誘導体に比べて、生体内に摂取されたとき、生じるビタミンＣの安定性および持続性が高いので、化粧品や食品に用いるプロビタミンＣとして非常に適する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
つぎの式（１）で示される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸またはその人体に安全な塩もしくはエステル。
【化１】
2005518401.tif 000006
【請求項２】
植物体から抽出される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有するプロビタミンＣ組成物。
【請求項３】
植物体が、ナス科の植物である請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
植物体がクコ、クコの生果あるいは乾燥果実である請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
植物体から抽出することによる2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造法。
【請求項６】
植物体が、ナス科の植物である請求項５に記載の製造法。
【請求項７】
植物体がクコ、クコの生果或いは乾燥果実である請求項５または６に記載の製造法。
【請求項８】
つぎの式（２）で示される2-O-(テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸：
【化２】
2005518401.tif 000007
（式中、各Ｒはそれぞれ独立して、炭素数１〜５のアルキル基である。）
【請求項９】
式（２）において、Ｒがすべてアセチル基である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
2-O-(テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸誘導体を中間体として用いる2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造法。
【請求項１１】
アスコルビン酸とβ-Ｄ-グルコシル糖化合物を、β-グルコシル糖転移酵素を用いて反応させることによる2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造法。
【請求項１２】
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が、6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸とともに生成することを特徴とする請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
β-D-グルコシル糖転移酵素がセルラーゼであることを特徴とする請求項１１記載の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造法。
【請求項１４】
請求項１０〜１３で示される製造法により生成される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有するプロビタミンＣ組成物。
【請求項１５】
請求項１０〜１３で示される製造法により生成される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸とともに含有するプロビタミンＣ組成物。
【請求項１６】
請求項１、２、３、４、１４または１５で示される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、またはそれを含有する組成物をプロビタミンＣとして含む食品。
【請求項１７】
ビタミンC強化食品である請求項１６の食品。
【請求項１８】
請求項１、２、３、４、１４または１５で示される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、またはそれを含有する組成物がプロビタミンＣとして配合された紫外線障害保護剤。
【請求項１９】
請求項１、２、３、４、１４または１５で示される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、またはそれを含有する組成物がプロビタミンＣとして配合された美白化粧料。
【請求項２０】
請求項１、２、３、４、１４または１５で示される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、またはそれを含有する組成物がプロビタミンＣとして配合された、しわ・たるみを予防する化粧料。
【請求項２１】
請求項１で示される2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸またはその生体に安全な塩もしくはエステルまたは請求項２、３、４、１４もしくは１５で示される組成物を、プロビタミンＣ成分として含有する、皮膚の老化防止用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、プロビタミンCとして知られていた物質、例えば2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸に比べ、安定性が増大するとともに生体内での半減期が増大し、持続的に作用する効果を有する新規なプロビタミンCである2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸に関する。さらにその新規中間体である2-O-(テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、また、2-O-(テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸誘導体を中間体とする2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造法、植物体から抽出する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造法、特にクコあるいはクコ類縁種から抽出する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造法と、得られた2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物、および酵素法による2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸ならびに6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸と2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物の製造方法、ならびにそれら組成物の食品や化粧品としての用途に関するものである。
【従来の技術】
【０００２】
ビタミンＣはその不足が壊血病の主原因となるコラーゲンの合成を促進したり、生体内抗酸化物質として生体内で生成するフリーラジカルを消去したり、チトクロームCの鉄イオンの酸化還元反応に関与するなどの生理作用以外に、抗がん、免疫賦活、コレステロール生成抑制に伴う抗動脈硬化などの多くの作用が知られている。また、皮膚領域においても、抗酸化やコラーゲン合成促進などに基づく光老化防止、紫外線障害の予防、色素沈着の抑制などの作用を有し、化粧品に添加されている（フレグランスジャーナル、２５巻、３月号、特集、１９９７年）。また、酸化防止剤としても、食品や化粧品に添加されている。ビタミンＣは光、熱、酸素、金属イオンなどに対して非常に不安定であり、これが最大の問題点になっている。
【０００３】
ビタミンCの不安定性を改善するために、また物性を変えることによって体内貯留や吸収性を向上するために種々の変換がなされてきた（日本臨床 ５７巻、 １０号、１７０ページ、１９９９年）。
【０００４】
プロビタミンCと呼ばれる安定なビタミンCへの展開として、ビタミンCの抗酸化モイエティーであり、かつ不安定性の原因となっている２，３−エンジオールの水酸基への置換基の導入がなされた。例えば、2位水酸基への硫酸基（Biochemistry, 8, 2652, 1969）やリン酸基（Gazz. Chim. Ital., 91, 964, 1961およびChem. Pharm. Bull., 17, 381, 1969）の導入である。これらはビタミンCに比べて、安定性がはるかに向上しており、サルファターゼやフォスファターゼにより、生体内や細胞内で加水分解され、ビタミンCに変換されることが知られている。これらの誘導体は化粧品や医薬部外品としてすでに使用されている。また、2位や3位の水酸基が配糖体化された安定型ビタミンCも知られている。糖転移酵素によって得られた2-O-(α- D-グルコピラノシル)アスコルビン酸（Biochim. Biophys. Acta, 1035, 44, 1990、特開平３−１３５９９２、３−１３９２８８、３−１８３４９２、５−１１７２９０）、ガラクトシダーゼによって得られた2-O-（β-D-ガラクトピラノシル）アスコルビン酸（特開平６−２６３７９０）、また化学合成によって得られた3-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸（特開昭５３−９８９５４、特開昭５８−１９８４９８）などである。
【０００５】
これらの中で、2-O-(α- D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が最もよく研究され、現在、化粧品や医薬部外品として使用されており、食品添加物として認可されようとしている。2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸はアスコルビン酸-2-リン酸と同様に種々の酸化的条件に対し極めて安定であり、酸性条件下でははるかに安定である。2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は経口投与で消化管粘膜に存在するα-グルコシダーゼによって加水分解され、活性型のビタミンCとなる。培養細胞においても細胞膜に存在する酵素によって適度に加水分解され、ビタミンCの作用が持続的に発揮される。
【０００６】
また、酸化に対する不安定性の改善にはならないが、アスコルビン酸の6位を脂肪酸エステルにして、脂溶性物質にも溶解しやすい6-O-パルミトイルあるいはステアロイルアスコルビン酸が食品中の酸化防止剤としての食品添加物に使用されている。6位の配糖体も酵素で合成されている（Vitamins, 43, 205, 1971; Biochim. Biophys. Acta, 1035, 44, 1990; 特開平５−３２０１８５）。５位の配糖体も2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の酵素合成の副生成物として開示されている（特開平５−１１２５９４）。
【０００７】
このように既にプロビタミンCとして多様な物質が知られているが、β-D-グルコシル体、特に2位がグルコシル化された物質、とりわけ、本発明の新規化合物である2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸については全く知られておらず、例えば、特開平３−１３５９９などにおいて、β-D-グルコピラノシル型のL-アスコルビン酸誘導体は生体内で分解されないと開示しているなど、βグルコシル配糖体は生体において利用できないとしてその有用性を否定する文献が存在した。
【０００８】
また、種々のアスコルビン酸誘導体とともに、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が特開昭５３−９８９５４に記載されているが、具体的に製造した実施例はなく、また、実際に実施例の方法で合成しても3位の水酸基に優先的にグルコシル化され、3位にグルコシル化された生成物に対して2位にグルコシル化される形で、２，３−ジグルコシル体が生成すると考えられる。したがって、2位だけにβ-グルコシル化された生成物を得ることは不可能であった。
【０００９】
さらに、β-D-グルコピラノシル型のL-アスコルビン酸誘導体の酵素合成に関しては、アーモンド由来β―グルコシダーゼがセロビオースをβグルコシル糖供与体として6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を生成する事が報告されているのみである（Agric. Biol. Chem.,54,1697,1990）。この場合でも、6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の転移収率は１．５％と非常に低いものであり、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が生成する記載はない。以上のように2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸に関しては、酵素法により合成された例は全く知られていなかった。
【００１０】
一方、クコはナス科の植物で、古代中国の医学書「神農本草経」の上品として収載され、その果実は枸杞子（クコシ）、葉は枸杞葉（クコヨウ）と称して食品に、根皮は地骨皮（ジコッピ）と称して漢方処方に用いられている（原色和漢薬図鑑（上）、289、1980）。クコはベタイン、カロチン、ニコチン酸、ゼアキサンチンなどを含み、血糖降下作用、血圧低下作用、抗脂肪肝作用、肝機能保護作用を有することが知られている。 特に、抗脂肪肝作用や肝機能保護作用は、メチル基供与体の作用があるベタインによるものとされている（日薬理誌、56,151§,1960）。 また、枸杞の抽出物には乳酸菌の生長と酸の生産を促進する働きがあることが知られていた（C.A. 64:20530b, 1965）。しかしクコの成分中、ビタミンC誘導体が含まれているとの知見は存在しなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは多様な作用を有するクコに注目し、その活性成分について鋭意研究の結果、新規物質が含まれていることを見出し、それが2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸であることを突き止めて本発明の一部を完成させた。本発明は、まず新規物質2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、およびクコから抽出する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸含有組成物とその製造方法を提供するものである。
【００１２】
本発明の新規物質はプロビタミンCとして有用である。小腸組織では膜結合型、肝臓や腎臓組織では細胞質型のβ-グルコシダーゼが存在していることが知られており（FEBS Letters, 436, 71, 1998）、また、α-グルコシダーゼが唾液や腸消化液、さらに小腸消化管中に多く分布するために、経口吸収時にアスコルビン酸に分解されることが推測され、山本らの報告（J. Pharmacobio-Dyn. 13,688,1990）においても、ラット経口投与実験で血中にはアスコルビン酸のみ検出されていることから、生体において分布率の高いα-グルコシダーゼで活性化されるより、分布率が少ないβ-グルコシダーゼで分解されて活性化される方が組織への移行や作用の持続性に関して有利であるという説があり、βグルコシル配糖体のプロビタミンCにはさらに優れた性質を有する可能性が期待されていた。
【００１３】
そこで本発明の新規化合物2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の活性を研究の結果、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸と比較して安定性が向上し、また生体内で持続的に利用されるなど、プロビタミンCとして極めて有用であることを見出した。さらに、食品や化粧品等に利用するために工業的な製造方法を検討し、化学的製造法、天然の植物体からの抽出による製造法、酵素的製造方法を確立させて本発明を完成させた。
【００１４】
即ち、本発明は、化粧品や医薬部外品、医薬品あるいは食品の分野で応用が期待でき、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸よりその生理作用が優れた新規物質2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、またその新規中間体である2-O-(テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、その中間体を経由する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の化学合成による製造方法、植物体、とりわけ、クコ或いはクコ類縁物から抽出する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含む組成物の製造方法、および、β-D-グルコシル糖転移酵素による2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含む組成物の製造方法、ならびに得られた2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物と、それら組成物を含有する食品や化粧品を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は糖転移酵素反応により得られた2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸あるいは6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を提供するものである。併せて、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する溶液からその夾雑物を容易に除去し、より高純度の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸高含有物を工業的に大量生産する方法を提供するものである。
【００１６】
本明細書において、「組成物」とは2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含む植物体から抽出された、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の含有量を高めた抽出物、またはアスコルビン酸とβ-D-グルコシル糖化合物をβ-グルコシル糖転移酵素を用いて反応させて得られる、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する反応産物を含めて、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する種々の組成物を意味する。
【００１７】
本明細書において、「プロビタミンＣ」とは、それ自体はビタミンＣ活性が弱いまたは示さないが、体内で分解されてビタミンＣを生じる化合物または該化合物を含む組成物の総称である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、クコから発見された新規物質2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸による理想的なプロビタミンCの創製を目指して、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の合成方法を鋭意検討し、2-O-(テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を中間体として、化学的に製造できること、また、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する植物、微生物を鋭意検索し、クコおよびクコシに2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が存在すること、セルラーゼ酵素の糖転移反応により2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が生成すること、そして2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸に比較してヒト皮膚表皮由来角化細胞への紫外線B波の照射による細胞死を顕著に抑制し、またヒト皮膚真皮由来の線維芽細胞におけるコラーゲン合成を顕著に促進することを示し、実際に2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が優れたプロビタミンCであることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は以下のようである。
【００１９】
プロビタミンCとしての性能が2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸より優れた2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を製造するには、2-O-(テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を中間体とする合成方法、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する天然材料からの抽出方法、または酵素による合成方法により製造することができる。
【００２０】
合成方法においては、相当するアスコルビン酸誘導体の３位の水酸基を選択的にベンジル化して、3-O-ベンジル-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸を得、これとエステルで保護されたグルコースの1-炭酸エステルとを縮合し、その後、脱イソプロピリデン化、脱ベンジル化して得ることができる。天然材料からの抽出方法においては、ナス科の植物体、特にクコの実あるいは乾燥果実（クコシ）から、熱水または水−アルコール抽出することによって、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を得ることができる。また、必要なら、この組成物から2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸をさらに精製することができる。酵素合成法においては、セルラーゼ酵素の糖転移反応により2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を酵素的に合成して、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を酵素合成産物として得ることができる。必要なら、この組成物から2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸をさらに精製することができる。
【００２１】
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸がヒト皮膚表皮由来角化細胞への紫外線B波の照射による細胞死を顕著に抑制し、かつヒト皮膚真皮由来の線維芽細胞におけるコラーゲン合成を顕著に促進すること、また細胞内でビタミンCに変換されること、さらにまた経口摂取によって吸収されることが本発明において示されたことにより、皮膚化粧料や皮膚保護剤としての利用、またプロビタミンCとして食品での利用が期待できる。
【発明の実施の形態】
【００２２】
本発明は、化粧品や医薬部外品、あるいは医薬品あるいは食品の分野で応用が期待でき、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸よりその生理作用が優れた2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸またその中間体である2-O-(テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸およびそれを中間体とした2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造方法、および2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有するクコあるいはクコ類縁種およびそれらの抽出物および2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を提供するものである。
【００２３】
また、糖転移酵素反応により得られた2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸あるいは6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を提供するものである。併せて、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する溶液からその夾雑物を容易に除去し、より高純度の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸高含有物を工業的に大量生産する方法を提供するものである。
【００２４】
以下、発明の内容について詳細に説明する。
１）中間体2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の合成
中間体である2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は以下のようにして合成することができる。すなわち、市販されている5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸を文献既知（J. Med. Chem., 31, 793, 1988）の方法で3位の水酸基を選択的にベンジルエーテル化し、3-O-ベンジル-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸とする。この3-O-ベンジル体をアグリコンとして、通常のグルコシル化反応によってβ-配糖体化し、2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)-3-O-ベンジル-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸を得ることができる。例えば、(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)炭酸エステル（小村啓、東京工業大学博士論文、１９７７年）を3-O-ベンジル体とともに非極性溶媒中で、あるいは無溶媒で１００〜２００℃で加熱することによって得ることができる。炭酸エステルとしてはアルキル、ハロゲン化されたアルキル、あるいは置換されてもよいアリール炭酸エステルとして使用することができる。あるいは(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)ハライドを用いて、クロロホルムや塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素の溶媒やベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素の溶媒中で水銀塩や銀塩の存在下、脱水剤を添加して反応させることによって得ることもできる（Lodd's Chemistry of Carbon Compounds IF, 320, 1967, Elsevier）。
【００２５】
2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)-3-O-ベンジル-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸のイソプロピリデン基は酸触媒で加水分解して、除去することができる。例えば、３０％〜８０％の酢酸水溶液中、４０〜１００℃で加熱する。あるいはアセトンやメチルエチルケトン中でp-トルエンスルホン酸の存在下、室温から還流温度で加熱する。あるいはそこに水を添加して同様に反応させる。
【００２６】
2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)-3-O-ベンジルアスコルビン酸のベンジル基は通常の水素化分解によって除去できる。例えば、酢酸やアルコールなどのプロトン性極性溶媒中で、あるいはベンゼン、トルエン、酢酸エチルなどの非極性溶媒中で、パラジウム炭素やパラジウム黒、あるいはプラチナ炭素やプラチナ黒などを触媒として水素の存在で脱ベンジル化できる。
【００２７】
これらの脱保護基反応の工程を逆の順に行ってもよい。すなわち、2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)-3-O-ベンジル-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸の脱ベンジル化反応の後、得られた2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸を酸触媒で脱イソプロピリデン化してもよい。
【００２８】
以上のようにして、表記中間体である2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を得ることができる。
表記中間体のアシル基として、アセチル基が好ましい。
【００２９】
２）2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の化学合成
2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸のアシル基をアルカリ加水分解することによって、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を得ることができる。アルカリとしては、苛性ソーダ、苛性カリなどの水溶液、あるいは炭酸カリ、炭酸ソーダ、重炭酸カリ、重炭酸ソーダなどの炭酸塩の水溶液、ナトリウムメチラートなどの金属アルコラートを用いることができる。これらの溶液に、原料の2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アシル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を溶解するために、メタノール、エタノールなどのアルコール類の混合液を用いてもよい。反応温度は０℃〜室温が最適である。反応液を塩酸、硫酸あるいはカチオン交換樹脂などで中和する。塩酸や硫酸の場合は生じた塩を除去する必要があるがカチオン交換樹脂の場合はナトリウムやカリウム根を吸着するために脱塩操作は必要ではない。中和された反応液を凍結乾燥あるいは減圧濃縮することによって、目的化合物を得ることができる。また、目的に応じて、カラムクロマトグラムによって精製することもできる。
【００３０】
３）クコからの抽出による2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物の製造
クコの生果あるいは乾燥果実（クコシ）を直接もしくは粉砕した状態で、水性溶媒、例えば熱水または含水エタノールで浸漬し、固液分離によって得た抽出液を減圧濃縮もしくは凍結乾燥、あるいは噴霧乾燥することによって、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する抽出物を得ることができる。 この浸漬時のアルコール濃度は１０％から９５％、浸漬日数は３から７日が好ましい。
【００３１】
クコシ抽出物中の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸含量は、典型的には０．８６から１．２％であるが、以下に述べる方法によってさらに含量を高めた組成物を得ることができる。すなわち、クコシ抽出物を蒸留水に溶かすか、原料に対して５−５０倍量、好ましくは８−10倍量で浸漬した上記抽出液を蒸留水で希釈後、 Dowex１-X8（Dow  Chemical  Co.）、 Amberlite  IRA-400（Rohm  ＆  Haas  Co.）などの強塩基性陰イオン交換樹脂に通導して、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を吸着させる。充分な水洗浄の後、酢酸等の酸溶液を用いた段階溶出もしくは濃度勾配溶出によって該物質を含む画分を得る。該画分を減圧濃縮あるいは凍結乾燥処理による酢酸除去によって、 2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸含量約30-50％の組成物が得られる。
【００３２】
４）酵素法による2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含む組成物の製造
市販の酵素剤について鋭意検討した結果、セルラーゼ「オノズカ」、パンセラーゼBR（ヤクルト薬品工業）、セルロシン（阪急共栄物産）、セルラーゼ（シグマ）、βグルコシダーゼ（東洋紡）、βグルコシダーゼ（ナカライテスク）酵素剤がβグルコシル転移活性を有する事を見出した。本発明に用いられる糖転移酵素は、βグルコシル基を含む化合物とアスコルビン酸を含む溶液に作用させ、糖転移反応によって2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を合成するものであればよく、起源、種類は限定されないが、収率の点からTrichoderma属由来のセルラーゼ剤、アーモンド由来のβグルコシダーゼ剤が好ましい。
【００３３】
転移酵素反応については、セロビオースおよびアスコルビン酸濃度はできる限り高い方が望ましいが、それぞれ０．３Mおよび０．２M程度が好ましい。酵素の基質となるセロビオースは他のβグルコシル基を含む化合物、例えばセルロース、カルボキシメチルセルロース等の高分子グルカンからも適当な加水分解酵素と組み合わせる事により使用する事が可能である。また各酵素を常法で適当な支持体に固定化して酵素リアクターとすれば効率的に2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の生産が可能である。一方、転移反応の受容体となるアスコルビン酸は、反応中の安定性、転移収率の点から遊離のアスコルビン酸が好ましいが、アスコルビン酸のアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩などのアスコルビン酸塩、または、それらの混合物でも生産が可能である。またイソアスコルビン酸フリー体およびイソアスコルビン酸塩も同様に転移反応の受容体となる事を見出した。従って、糖転移反応に用いるアスコルビン酸およびアスコルビン酸誘導体は目的に応じて用いる事ができるが、通常、遊離のアスコルビン酸だけでなく、必要に応じて、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウムなどが適宜用いられる。
【００３４】
酵素反応はｐH２〜８の範囲の水性溶液中で進行するが、酵素の至適ｐHを勘案し、ｐH４〜６に保つのが好ましい。また反応温度としては２０〜６０℃で進行するが、酵素の安定性および至適温度をを勘案して、３０〜４０℃程度に保つ事が望ましい。また酵素添加量は、セロビオース１ｇあたり２０〜４００単位（１単位とは１分間に１μmolのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素力価を示す）とするのが望ましい。酵素は、一度に添加しても良いが、高速液体クロマトグラフィー等で反応をモニターしながら、数回に分けて添加することも出来る。また適当な樹脂担体、例えばイオン交換樹脂、疎水樹脂等に酵素を固定化して酵素リアクターとして反応することもできる。反応時間は１〜４日間程度で充分であるが、反応をモニターしながら反応終了時点を決定することもできる。
【００３５】
反応終了後生成した組成物中のアスコルビン酸誘導体を、所望によりさらに精製するには、膜分離、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等、通常の分離手段で分離することができる。例えば、強酸性カチオン交換樹脂はスルホン酸基を結合したスチレン−ジビニルベンゼン架橋共重合体樹脂のアルカリ金属塩型、アルカリ土類金属塩型、またはＨ+型などが適宜使用できる。市販品としては、ダウケミカル社製造の商品名ダウエックスTM ５０Ｗ×８、ローム＆ハース社製造の商品名アンバーライトTMＣＧ−１２０、三菱化成工業社製造の商品名ダイヤイオンTM ＳＫ１０４などがある。この際に、分離される未反応のアスコルビン酸とβグルコシル基を含む化合物を、再度酵素反応の原料として利用することも可能である。
【００３６】
さらに、高純度品を得るために、高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。すなわち、糖・有機酸分析用カラムと酢酸、トリフルオロ酢酸など揮発性の酸との組み合わせ、あるいはＯＤＳカラムと昇華性のギ酸アンモニウム、酸性物質分析用の揮発性イオンペアー試薬、Ｄｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ Ａｃｅｔａｔｅとの組み合わせによって純粋な該物質を得ることができる。 目的とする物質であることの同定は、化学的な合成による2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の質量分析や核磁気共鳴スペクトルとの比較解析によって行うことができる。
【００３７】
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は、食品、化粧品、または医薬に適する塩の形で用いることも可能である。塩の例として、無機もしくは有機のアルカリとの塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アミン塩等が挙げられる。2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は、その水酸基が、生体内で容易に分解される脱離基で置換されていてもよい。そのような脱離基として、アセチル(Ｃ２）、プロピオニル（Ｃ３）、ブチリル（Ｃ４）、オクタノイル（Ｃ８）、パルミトイル（Ｃ１６）、ステアロイル（Ｃ１８）が挙げられる。
【００３８】
５）2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の活性（その１）：紫外線照射による障害の抑制
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は紫外線B波（ＵＶＢ）照射によるヒト皮膚表皮由来の角化細胞（ＨａＣａＴ）の細胞死をアスコルビン酸や2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸に比較して、同じ濃度で明らかに強く抑制する。
【００３９】
無毛マウスの皮膚の一部に太陽光の波長スペクトルに近い光（290〜400nm）を照射した場合に、マウス皮膚に含まれる各種の抗酸化因子のうちアスコルビン酸（ビタミンC）が最も急減することが知られている（Photodermatol Photoimmunol Photomed.、10(5)、183、1994）。また、モルモット背部を剃毛後、UVB照射による皮膚炎症の惹起をアスコルビン酸や2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の外用塗布によって抑制することができ、その効果は2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の方が高い（フレグランスジャーナル、２５巻、３月号、５５ページ、１９９７年）。さらに、10%アスコルビン酸水溶液をブタ皮膚に3日から1週間連日前投与することにより、紫外線障害を軽減できることも報告されている（Br. J. Dermatol.、 121、 247、1992）。
【００４０】
これに対して、本発明の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は、紫外線照射による皮膚炎症やその他の紫外線障害の抑制に対して、アスコルビン酸はもちろん2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸よりもさらに効果が高い。その理由は、先に述べたとおり2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸よりも組織への移行や持続性に優れるためであろうと考えられる。
【００４１】
また、ヒト皮膚角化細胞での細胞内アスコルビン酸の濃度についても、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は最も長く、また高濃度に維持される。このような2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸による細胞内アスコルビン酸の高濃度維持がＵＶＢ照射による細胞保護に作用していると考えられる。また、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が細胞内で、アスコルビン酸に変換されるプロビタミンCとして働いていることは明白である。
【００４２】
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の活性（その２）：しわ・たるみの予防
さらに、ヒト皮膚真皮由来の線維芽細胞（ＮＨＤＦ）のコラーゲン合成に関しても、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸やアスコルビン酸に比べて活性が高い。これも、細胞内アスコルビン酸の濃度が持続的に高く維持されているためと考えられる。すなわち、アスコルビン酸のコラーゲン合成促進作用は皮膚由来の線維芽細胞でも起こっており、皮膚の再生や再構築に働いていると考えられる。実際に、熱傷患者に安定型アスコルビン酸の１つであるアスコルビン酸２−リン酸を塗布することによって、瘢痕なく治癒したことが報告されている（日本香粧品学会講演要旨 ５０ページ、１９９８年）。一方、アスコルビン酸がコラーゲンを分解する酵素や皮膚の弾性に必要なエラスチンを分解する酵素を抑制することも知られている（バイオ抗酸化剤プロビタミンＣ，６３ページ、１９９９年、フレグランスジャーナル社）。これらの事実は2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸にしわやたるみを予防する効果があることを示している。
【００４３】
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の活性（その３）：美白
また、アスコルビン酸がチロシナーゼを阻害してメラニン合成を抑制することや2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を配合したクリームをヒトに塗布した時、紫外線照射による色素沈着を抑制すること（フレグランスジャーナル、２５巻、３月号、５５ページ、１９９７年）から、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸も同様に、しかし2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸よりも強い美白効果があることが強く示唆される。
【００４４】
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の活性（その４）：経口摂取時の動態
また、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸をラットに経口摂取させた場合、血中に未変化体である2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸が検出され、腸管から未変化体として吸収されることを示している。一方、前述したように2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸はラットに経口摂取させた場合、血中には未変化体として検出されず、吸収の際、腸管でほとんど分解され、アスコルビン酸として血中に存在する（J. Pharmacobio-Dyn.,13,688,1990）。すなわち、経口摂取した場合、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸はアスコルビン酸として吸収され、血中で速やかに分解される可能性がある。一方、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は血中に未変化体としても存在し、未変化体のまま組織に移行し、組織あるいは細胞内でアスコルビン酸に活性化される可能性が高い。
【００４５】
以上の実験結果および関連知見から、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸およびそれを含有する組成物は優れたプロビタミンＣとして、皮膚の保護や健全な皮膚の維持に有用であることが明白であり、皮膚化粧料や皮膚保護剤として使うことができ、また食品として、アスコルビン酸を効率よく、体内および組織に移行させるプロビタミンCとして使うことができる。
【００４６】
６）2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物
本発明の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を皮膚化粧料や皮膚保護剤として用いる場合、配合量として特に限定されず広範囲に使用することができるが、組成物の全重量に対して通常０．１〜３０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％である。組成物として、一般に化粧料に用いられる油性成分、界面活性剤、紫外線吸収剤、低級アルコール、防腐剤、殺菌剤、色剤、粉末、香料、水溶性高分子、緩衝剤などその他の成分を本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することができる。これらの組成物は皮膚化粧料としてだけでなく、医薬部外品としてのローション、乳液、クリーム、パック剤、石鹸等の薬用化粧品、および医薬品としてのローション、乳液、クリーム、軟膏等の皮膚外用剤としても使用できる。
【００４７】
また、本発明の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を食品として用いる場合、例えば、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸に関する特許第２８３２８４８号に記載されている通りの食品に応用することができ、ビタミンC強化食品として使用できる。すなわち、特許第２８３２８４８号から引用すると酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの呈味を有する各種物質ともよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、普通一般の飲食物、嗜好物、例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麺つゆ、ソース、ケチャップ、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コーヒーシュガーなどの各種調味料、せんべい、あられ、おこし、カリントウ、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリン、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、バタークリーム、カスタードクリーム、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペーストなどのスプレッド、ペースト類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、パン類、麺類、米飯類、人造肉などの穀類加工食品類、サラダオイル、マーガリンなどの油脂食品類、福神漬、べったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、たくあん漬の素、白菜漬の素などの漬物の素類、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクワ、ハンペンなどの魚肉製品、ウニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干しなどの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、コンブ巻、天ぷらなどのそう菜食品、錦糸卵、乳飲料、バター、チーズなどの卵、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜などのビン詰、缶詰類、合成酒、増醸酒、果実酒、洋酒などの酒類、コーヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキミックス、即席ジュース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなど即席飲食品などに、ビタミンＣ強化剤、呈味改善剤、酸味剤、品質改良剤、安定剤、抗酸化剤などの目的で有利に利用することができる。また、家畜、家禽、蜂蜜、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料などにビタミンＣ強化剤、呈味改善剤、抗酸化剤、嗜好性向上などの目的で配合して利用することも好都合である。
[発明の効果］
【００４８】
本発明は、化粧品や医薬部外品あるいは医薬品あるいは食品の分野で応用が期待でき、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸よりその生理作用が優れた新規物質2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、その新規中間体である2-O-(テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、およびそれを中間体とした2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の製造方法、並びにクコあるいはクコ類縁体から抽出精製する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有組成物の製造法、およびクコあるいはクコ類縁種由来の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を提供するものである。
【００４９】
また、糖転移酵素反応により得られた2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸あるいは6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を提供するものである。併せて、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する溶液からその夾雑物を容易に除去し、より高純度の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸高含有物を工業的に大量生産する方法を提供するものである。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例に基づいて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲をこれらの実施例に限定するものではないことは言うまでもない。
実施例１  2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の合成：
5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸（2g、9.3mmol）をDMSO（20ml）に溶解し、炭酸カリ（1.3g、9.4mmol）および臭化ベンジル（1.1ml、9.3mmol）を加え、50℃で4時間攪拌した。反応液に水を加え、1N-HClで酸性にした後、酢酸エチルで抽出、水洗、飽和食塩水で洗浄後、無水MgSO4で乾燥後、減圧濃縮し、シリカゲルクロマト（AcOEt/n-Hexane=3:1）で精製し、1,1gの3-O-ベンジル-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸を得た（収率：39%）。
【００５１】
このベンジル誘導体（0.6g、2.0mmol）および2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-1-O-（2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル）-β-D-グルコピラノース（2.1g、4.0mmol）の混合物を120-130℃で加熱溶融した。3時間反応後、反応液をカラムクロマト（25%AcOEt/n-Hexaneから50%までのグラジエント）で精製し、2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)-3-O-ベンジル-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸850mgを得た（収率：67%）。
【００５２】
上記配糖体（850mg、1.3mmol）を酢酸エチル（40ml）に溶解し、10%Pd-C（200mg）を加え、水素化分解した。2時間後、触媒をろ去し、濃縮して、約750mgの2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)-5,6-O-イソプロピリデンアスコルビン酸を得た。
【００５３】
この脱ベンジル体（500mg，0.9mmol）を酢酸（5ml）に溶解し、水（5ml）を加え、50-60℃で1.5時間加熱攪拌した。反応液を濃縮後、水洗、飽和食塩水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥後、減圧濃縮し、得られた残査を酢酸エチル−ヘキサンから結晶化し、320mgの2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を得た（収率：48%）。1H-ＮＭＲ （δppm、DMSO-d6）；1.94-2.01(12H), 3.42(3H, m), 3.7-4.3(4H, m), 4.7-5.1(4H, m),5.3-5.4(2H, m), 12.00(1H, br)。 FABMS(+) m/z: 507。
【００５４】
実施例２  2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の合成：
2-O-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸（300mg、0.6mmol）をメタノール（10ml）に溶解し、炭酸カリ（600mg）を水（9ml）に溶解した溶液を添加し、30分間攪拌した。反応液をIR-120(H+)で中和し、樹脂をろ去し、さらにメタノールおよび50%メタノール水溶液で洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせ、濃縮後、水を加え、凍結乾燥し、アモルファスな結晶（190mg、収率：100%）の2-O-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を得た。1H-ＮＭＲ（δppm、D2O）; 3.1-3.3(4H, m), 3.4-3.5(3H, m), 3.58(1H d), 3.80(1H, t), 4.61(1H, d), 4.66(1H, d)。FABMS(-)  m/z: 337。
【００５５】
実施例３  クコ中の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の含量測定
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の化学合成品の高速液体クロマトグラフィー（島津製作所（株）製 ＬＣ−１０Ａｉシステム、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス（株）製、４．６Ｘ１５０ ｍｍ、５μｍ）、移動相：２０％ ＭｅＯＨ−２０ ｍＭ リン酸−５ ｍＭ 臭化テトラ−ｎ−アミルアンモニウム、流速：１．０ ｍＬ／分、カラム温度：３５℃、検出波長：２５４ nm）における保持時間２．６３分を指標に、乾燥植物３ｇに対して10倍量の70％  エタノールにて室温７日間浸漬することによって得た抽出液を１．５％ メタリン酸／５ Ｍ ＫＯＨ（ｐＨ３．５）にて10倍希釈し、これを被検試料として、天然に存在する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を検索した。その結果、寧夏産および河北産クコシの抽出液中に、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸に相当するピークの存在を認めた。また、寧夏産クコの生果100ｇに対して2倍量の70％エタノールを加え、同様に処理した試料にも同じように、その存在を認めた。一方抽出固形分は、上記抽出液の一部、５ｍＬを減圧濃縮後の凍結乾燥重量測定によって求めた。抽出固形分、化学合成品を用いた検量線、抽出液中の濃度、および希釈倍率を併せ考慮したところ、抽出物あたりの含量は０．８６から１．２％であった。
【００５６】
実施例４  クコシに含まれる2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の精製
寧夏産クコシ１００ｇを（株）トーショー製錠剤粉砕器ＴＳ-10Ｍ型にて砕き、30％  エタノール８００ｍＬを添加して、室温下６日間浸漬し、ろ過後、減圧濃縮、凍結乾燥により６５．７ｇを得た。この抽出物の一部１．９４ ｇ（2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸含量０．８６％）を蒸留水にて溶解させ、４０ ｍＬとした（ｐＨ４．５、電導度１．７ｍＳ/ｃｍ）。この試料をDowex 1-X８カラム（酢酸型、１．５Ｘ１２ｃｍ）にＳＶ＝１にて通導した。通導後、約10カラム体積（200 ｍＬ）の蒸留水による洗浄、0-0.1 Ｍ酢酸の直線濃度勾配溶出（100 ｍＬＸ２）、そして0.1-1.0 Ｍ酢酸の直線濃度勾配溶出（100 ｍＬＸ2）、さらに1.0 Ｍ  酢酸による溶出を行った。280 nmにおける吸光度を測定するとともに、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の溶出を化学合成品の保持時間を対照に、高速液体クロマトグラフィーによって調べた。装置、カラム温度は実施例１に同じだが、他の条件を、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス（株）製、３．０Ｘ１５０ ｍｍ、５μｍ）、流速：０．３ ｍＬ／分、検出波長：245 nm、移動相：２％ ＭｅＯＨ-0.2 Ｍ ＫＨ2ＰＯ4/Ｈ3ＰＯ4（ｐＨ 3.0）-0.2 ｍＭ ＥＤＴＡ-0.5 ｍＭ 塩化ドデシルトリメチルアンモニウムに変更したところ、化学合成品2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の保持時間は６．５分であった。高速液体クロマトグラフィーによる検討の結果、カラムに吸着した該物質は0.1-1.0 Ｍ酢酸直線濃度勾配溶出の画分19-25に溶出した（26 ｍｇ、画分19-25の総回収率７８％、純度５０％）。結果を図１に示す。
【００５７】
この2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸に相当する画分19-25の一部を高速液体クロマトグラフィーに供することによって高純度品を得た。 条件は、ＧＩＬＳＯＮ  社製 ＬＣシステム（マスターポンプ３０５型、ＵＶ検出器１１６型）、カラム：ODS −UG−5（野村化学（株）製、4.6 X 250 ｍｍ、５μｍ）、移動相：５％ メタノール−20 ｍＭ ギ酸アンモニウム−５ ｍＭ Ｄｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ、流速：０．５ ｍＬ／分、検出波長：254 nmで、0.5分ずつ、フラクションコレクターＦＣ−２０３Ｂ型（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて分取した。相当する画分を減圧濃縮、凍結乾燥後、重水に溶解させ、核磁気共鳴スペクトルを測定することにより、合成品と比較した。結果を図２に示した。
【００５８】
実施例５  2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の酵素合成
2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の化学合成品のＧＩＬＳＯＮ社製 ＬＣシステム（マスターポンプ３０５型、ＵＶ検出器１１６型）、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス（株）製、４．６Ｘ１５０ ｍｍ、５μｍ）、移動相：２０％ ＭｅＯＨ−２０ ｍＭ リン酸−５ ｍＭ 臭化テトラ−ｎ−アミルアンモニウム、流速：０．５ml／分、検出波長：２５４ nm）における保持時間５．２分を指標に、市販のセルラーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルカナーゼ酵素剤について検索した。なお、酵素反応系はセロビオース０．３Mおよびアスコルビン酸０．２Mとなるように１０ｍM酢酸緩衝液（ｐH5.0）で溶解して１ｍｌとした。これに酵素液を５０μl添加して３７℃で反応を開始した。１００℃、５分間加熱して反応停止した後、高速液体クロマトグラフィーで生成したβ-D-グルコピラノシルーアスコルビン酸を分析した。その結果、セルラーゼ（シグマ社製）、β−グルコシダーゼ（東洋紡、ナカライテスク）、セルロシンT2（阪急共栄物産）、セルラーゼ「オノズカ」RS、「オノズカ」FAおよびパンセラーゼBR（ヤクルト薬品工業）にβグルコシル転移活性を有する事を見出した。遊離のアスコルビン酸が４．０分の位置に現れたのに対し、この前後の３．６分と５．２分の位置にピークが認められ、それぞれ物質X、物質Yとした。なお、物質Xの転移率は１５．７％、物質Yの転移率は０．８％を示した。この物質Xと物質Yは化学合成品とのコクロマト分析より、物質Xは6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、物質Yは2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸と保持時間が一致した。
【００５９】
さらに、分子量１万カットのUF膜にて共存するタンパク質を除去した後、遊離のアスコルビン酸を除去するため、高速液体クロマトグラフィー[ＧＩＬＳＯＮ  社製 ＬＣシステム（マスターポンプ３０５型、ＵＶ検出器１１６型）、カラム：SUGAR SH1011（昭和電工（株）製）、移動相：０．１Ｍ 酢酸、流速：０．５ ｍＬ／分、カラム温度：３０℃、検出：示差屈折計、０．２５ｍｌ分画] を用いて分取した。物質Xと物質Yを含む画分は２９−３１に溶出され、収率９６％で２４．７μｇの標品を得た。
【００６０】
さらに、高速液体クロマトグラフィーに供することによって高純度品を得た。 条件は、  ＧＩＬＳＯＮ  社製 ＬＣシステム（マスターポンプ３０５型、ＵＶ検出器１１６型）、カラム：ODS −UG−5（野村化学（株）製、4.6 X 250 ｍｍ、５μｍ）、移動相：５％ メタノール−20 ｍＭ ギ酸アンモニウム−５ ｍＭ Ｄｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ Ａｃｅｔａｔｅ、流速：０．５ ｍＬ／分、検出波長：254 nmで、0.5分ずつ、フラクションコレクターＦＣ−２０３Ｂ型（ＧＩＬＳＯＮ社製）を用いて分取した。物質Xと物質Yに相当する画分を減圧濃縮、凍結乾燥後、重水に溶解させ、核磁気共鳴スペクトルを測定することにより、化学合成品2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸と比較した。HSQCスペクトルにおいて、化学合成品のアスコルビン酸部分構造中４位、５位、６位炭素の化学シフトはそれぞれ７３、７３、６６ｐｐｍであるのに対して、物質Xでは４位、５位、６位炭素の化学シフトはいずれも７３ｐｐｍと、６位に相当する炭素のみ低磁場シフトしていることから、物質Xは6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸と考察された。
【００６１】
物質Yは化学合成品2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸との一次元1H-ＮMRスペクトル比較で一致したことから2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸であると結論づけた。結果を図３および図４に示した。
【００６２】
実施例６  転移酵素反応条件
１）  硫安分画
セルラーゼ剤（Sigma）４％となるよう20ｍM酢酸緩衝液（ｐH5.0）に溶解し、これに20％飽和毎の硫安を順次添加することにより、0−20％、20−40％、40−60％、60−80％飽和硫安沈殿画分を調製した。各画分は20ｍM酢酸緩衝液（ｐH5.0）に溶解した後、実施例５に準じて転移生成物の確認を行った。その結果、転移活性は硫安20−40％飽和画分に認められた。
【００６３】
２）  ｐHの影響
セロビオース０．３Mおよび遊離のアスコルビン酸０．２Mとなるように、各ｐHに調整した０．１M酢酸緩衝液で溶解して１ｍｌとした。これに酵素液を５０μl添加して３７℃で４０時間反応した。反応後、高速液体クロマトグラフィーで生成した（β-D-グルコピラノシル）アスコルビン酸を分析した。
【００６４】
結果を表１に示した。ｐH３から転移生成物は認められるが、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸はｐH５反応下で０．８％、ｐH６反応下で１．０％生成した。また、6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸はｐH５反応下で１１．８％、ｐH６反応下で１１．２％生成した。
【００６５】
【表１】
2005518401.tif 000002
【００６６】
３）  アスコルビン誘導体での反応
セロビオース０．３Mおよび遊離のアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウムおよび遊離のイソアスコルビン酸、イソアスコルビン酸ナトリウムを各々０．２Mとなるように、各ｐHに調整した０．１M酢酸緩衝液で溶解して１ｍｌとした。これに酵素液を５０μl添加して３７℃で２０時間反応した後、上記と同様に生成した（β-D-グルコピラノシル）アスコルビン酸を分析した。結果を表２に示した。各アスコルビン酸誘導体は転移反応の受容体となり得て、各々の2-O-(β-D-グルコピラノシル)誘導体が生成された。
【００６７】
【表２】
2005518401.tif 000003
【００６８】
４）  部分精製
セルラーゼ剤（Sigma）、セルラーゼ「オノズカ」RSおよびパンセラーゼBR（ヤクルト薬品工業）について、酵素タンパク質を硫安沈殿させた後、20ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．０）で平衡化したQ-セファロース（Amersham Pharmacia Biotech社製）イオン交換樹脂に供した結果、転移活性は全て素通り画分に認められた。結果を表３に示した。
【００６９】
【表３】
2005518401.tif 000004
【００７０】
５）  酵素の固定化
食品添加物として市販されている酵素製剤；パンセラーゼBR中には、酵素（５％）以外に乳糖95％が存在している。パンセラーゼBR酵素剤６ｇを２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．０）６０ｍｌに溶解し、同緩衝液で平衡化したMarathon WBA（樹脂２ｍｌ、ダウケミカル社製）に供して素通り画分を得た。これに２０％飽和となるように硫安を添加し、２０％飽和硫安／２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．０）で平衡化したキトパールBCW３５１０（樹脂２ｍｌ、富士紡績（株）製）に固定化して固定化酵素を調製した。この固定化酵素樹脂を、アスコルビン酸０．３５ｇとセロビオース１ｇを溶解した２０％飽和硫安／20ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．０）１０ｍｌに添加して３７℃で反応させた。結果を表４に示した。
【００７１】
【表４】
2005518401.tif 000005
【００７２】
実施例７  （β-D-グルコピラノシル）アスコルビン酸の精製
セルラーゼ剤（Sigma）２０ｍｇを２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．０）１ｍｌに溶解し、同緩衝液で平衡化したMarathon WBA（樹脂０．５ｍｌ、ダウケミカル社製）に供して素通り画分を得た。この酵素液を、アスコルビン酸０．３５ｇとセロビオース１ｇを溶解した２０ｍM酢酸緩衝液（ｐH５．０）１０ｍｌに添加して３７℃で２日間反応させた結果、6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸１１．８％、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸０．８％の反応液を得た。本溶液をＵＦ膜で濾過して酵素を回収除去した液（ｐＨ４．３、電導度１．６ｍＳ/ｃｍ）をDowex １-X８カラム（酢酸型、１．５Ｘ１２ｃｍ）にＳＶ＝２．５にて通導した。通導後、約１０カラム体積（２００ ｍＬ）の蒸留水による洗浄、０−０．１M酢酸の直線濃度勾配溶出（８０ ｍＬＸ２）、そして０．１−１．０M酢酸の直線濃度勾配溶出（８0 ｍＬＸ2）を行った。6-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸高含有画分（フラクション６５−６８）、未反応アスコルビン酸高含有画分、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸高含有画分（フラクション１０１−１０８）の順に分画された。このフラクション１０１−１０８画分を2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸高含有画分として採取した（２．４ｍｇ、回収率４５％）。
【００７３】
実施例８  紫外線B波（ＵＶＢ）照射によるヒト皮膚表皮由来の角化細胞（ＨａＣａＴ）の細胞死に対する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の保護効果：
ヒト皮膚角化細胞ＨａＣａＴ(ハイデルベルグ大学Fusenig博士から恵与された細胞株)を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で２４ウェルプレートに１００００細胞／ウェルを蒔いて１８時間後に３５ミリジュール／平方センチメートル（ mJ/cm2）のＵＶＢ（極大波長３１２nm）を照射する。照射前２時間に2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を２０−１００ μM添加しておき、照射直前に除去しリンスする。照射は薬剤非存在下ＰＢＳ中で行ない、照射後はＦＢＳ１０％含有ＤＭＥＭ培地で培養を継続し、照射後24時間に細胞生存率を２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、一ナトリウム塩（ＷＳＴ−１）を用いたミトコンドリア脱水素酵素活性測定法で調べた。結果を図５に示す。同様に、比較例として、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、アスコルビン酸も検討し、同じく図５に示した。
【００７４】
実施例９  ヒト皮膚角化細胞での細胞内アスコルビン酸の濃度に対する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の効果：
ヒト皮膚角化細胞ＨａＣａＴ細胞を１００ミリメートル 直径のディッシュに３７００００細胞蒔く。 培養１６時間後に、 ＨａＣａＴの２４時間無血清培養液を４０％添加した１０％FBS含有ＤＭＥＭ培地に溶かした2-O-(β-D-グルコピラノシル) アスコルビン酸を１００μM加える。 添加後３−２４時間に培地を除去して、 氷冷したＰＢＳで２回リンスし、トリプシンで細胞シートを剥離し、 単一細胞の状態とする。これを50 μＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有したＰＢＳで懸濁し、遠心処理によって３回リンスする。細胞懸濁液をポッター型 テフロンホモジェナイザで破砕し、 次いで液体窒素中で２回凍結・融解させる。この上澄み液をモルカット（日本ミリポア（株）製、加圧式限外ろ過ユニット、分画分子量 １００００、ポリエーテルスルホン膜）処理して高速液体クロマトグラフィー（東ソー（株）製 ＡＳ−８０２０システム、カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＯＤＳｐａｋ（昭和電工（株）製、 ４．６Ｘ１５０ ｍｍ）、移動相：０．１ Ｍ ＫＨ2ＰＯ4−Ｈ3ＰＯ4 （ｐＨ ２．３５）−０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ−２Ｎａ、 流速：１．５ ｍＬ／分）で細胞内アスコルビン酸量をクーロメトリック電気化学検出器（ＥＳＡ Ｃｏ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ、 ２００ ｍＶ）で分析する。結果を図６に示す。同様に、比較例として、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、アスコルビン酸も検討し、同じく図６に示した。
【００７５】
実施例１０  ヒト皮膚真皮由来の線維芽細胞（ＮＨＤＦ）のコラーゲン合成に関する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の促進効果：
ヒト皮膚繊維芽細胞ＮＨＤＦを１００ミリメートル 直径のディッシュに３７００００細胞蒔く。 １６時間後に、 ＮＨＤＦの２４時間無血清培養液を４０％添加した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中に、 2-O-(β-D-グルコピラノシル) アスコルビン酸を１００μＭ加える。 さらに１時間後にL-[2,3-3H]プロリンを０．１２ｍＬ（１２０μＣｉ）添加して、４８時間培養する。培養後に培地を除去し、細胞シートをＰＢＳで４回リンスする。次いで細胞をトリプシン剥離し、アルカリで細胞溶解した後、中和して細胞内蛋白質を得る。これをClostridiumのコラゲナーゼでコラーゲン分解して得られた蛋白質画分を、シンチゾールEX-Hを用いた液体シンチレーションカウンタで放射活性として測定する。また、コラーゲナーゼで処理しない細胞内蛋白質画分を、 同じく液体シンチレーションカウンタで放射活性として測定する。それぞれの放射活性の差を求めて、コラーゲン合成活性とする。結果を図７に示す。同様に、比較例として、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、アスコルビン酸も検討し、同じく図７に示した。
【００７６】
実施例１１  ラットにおける2-O-(β-D-グルコピラノシル) アスコルビン酸の腸管吸収
一終夜絶食した日本チャールスリバー社製Wistar系 １０週齢 雄性ラット（ｎ＝３）に、１００ ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純水（ミリポアコーポレーション製）に溶かした2-O-(β-D-グルコピラノシル) アスコルビン酸（１００ ｍｇ／４ ｍＬ）をゾンデにて覚醒下、強制経口投与し、０、０．５、２、４時間後に門脈よりヘパリン採血し、遠心分離（６０００ｘｇ、１０分）にて血漿を分離した。 氷冷した１０％メタリン酸（４０ ｍＭ デフェロキサミンメシレート含有）を等量添加後、遠心分離する（１００００ｘｇ、１０分）ことによって除タンパク処理した門脈血血漿に含まれる未変化体（2-O-(β-D-グルコピラノシル) アスコルビン酸）およびアスコルビン酸を高速液体クロマトグラフィー（島津製作所（株）製 ＬＣ−１０Ａｉシステム、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３（ジーエルサイエンス（株）製、３．０Ｘ１５０ ｍｍ、５μｍ）、移動相：１５％ ＭｅＯＨ−１７ ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4/H3PO4（ｐＨ ３．５）−５ ｍＭ 臭化テトラ−ｎ−アミルアンモニウム、流速：０．３ ｍＬ／分、カラム温度：３５℃、検出波長：２５４ nm）にて測定した。投与３０分後を最大とする未変化体（2-O-(β-D-グルコピラノシル) アスコルビン酸）および代謝物（アスコルビン酸）の存在が認められた。その結果を図８に示した。
【００７７】
以上の結果から、本発明の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸よりその安定性・活性持続の点で生理作用が優れたプロビタミンCであることが示された。このことから食品、化粧品、医薬部外品あるいは医薬品の分野で応用が期待される。また2-O-(テトラ-O-アセチル-β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸は2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を製造する上で有用な新規中間体となる。また、クコシあるいはクコシ類縁植物から抽出することにより2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を含有する組成物を得ることができる。また、化学合成以外にも糖転移酵素反応により2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を得ることができる。
【００７８】
実施例１２  ヒト皮膚真皮由来の繊維芽細胞の細胞分裂通算回数(population doubling level(PDL))に関する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の効果
ヒト皮膚繊維芽細胞(NHDF)を100ミリメートル直径のディッシュに370,000細胞蒔く。10% FBS含有DMEM培地にて培養16時間後に、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を100μM溶解させた自家conditioned mediumを40% 添加した10% FBS含有DMEM培地に交換し、ほぼコンフルエントに達するまで46-188時間培養した。なお、自家conditioned mediumとは、別途、ほぼコンフルエント状態にまで増殖させたNHDF細胞を無血清培養液で24時間培養した後に採取した上清を指し、採取して冷蔵保存し3日以内に使用した。上述の46-188時間培養の場合、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸を100μM溶解させた自家conditioned mediumを40% 添加した10% FBS含有DMEM培地に培地交換するが、この時に廃棄する培養液の中に含まれる細胞数も計測して、PDL評価に算入する。3日以上培養底に付着した細胞数をCoulterカウンターによって計測した。培養開始時のPDLを0とみなし、その後のPDLはつぎの式：
log2 (集めた細胞数/シードの細胞数)
によって求めた。結果を図９に示す。同様に、比較例として、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸およびアスコルビン酸も検討し、同じく図９に示した。
【００７９】
実施例１３  テロメアDNAの短縮速度に関する2-O-(β-D-グルコピラノル)アスコルビン酸の効果
NHDF細胞からゲノムDNAを抽出し、テロメア配列を切断しない制限酵素によってテロメア全長を含むDNA断片(Terminal Restriction Fragment, 略してTRF)を取得した。これを電気泳動で分離した後、テロメアと結合する標識プローブで検出する原理に基づき、テロメアDNAの長さを測定した。具体的な実験方法はLife Sciences, Vol.63, No.11, 935-948 (1998)の方法に従った。
NHDF細胞のTRFの調製とアガロース電気泳動
ヒト皮膚真皮由来の繊維芽細胞(NHDF)をトリプシン処理によって単一化し、この細胞懸濁液を106細胞／チューブになるように1.5ml チューブに入れ、遠心分離(4℃、1200回転、2分)後、上清は除去した。細胞ペレットをRNase-フリーのPBS(-) 1mlで2回洗浄した後、上清を完全に除去し、-80℃で保存した。凍結保存試料を常温に戻した後、Iso-Quick Nucleic Acid Extraction Kit (ORCA Research Inc.)を用いてゲノムDNA抽出を行った。抽出したDNAは10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0 に溶解し、4℃で保存した。DNA濃度は、DNA結合試薬Hoechist 33258を用いた蛍光プレートリーダー(Cytofluor 2350、Millipore社製)法で求め、DNA制限酵素Hinf1処理によるTRFの調製を行った。すなわち、1.5mlチューブに10 x H緩衝液(TaKaRa, Kyoto) 2μl、抽出ゲノムDNA溶液(2μg)、滅菌水を全量19μlになるように加え、最後にHinf1(6U/μl 、TaKaRa, Kyoto) 1μlを加え、37℃、3-4時間反応後、-20℃で保存した。ブリッジ部1%、ベッド部分が0.8%になるようにアガロース(type I、Sigma)ゲル板を作成し、1 x Boyer緩衝液(50mM Tris-HCl、20mM酢酸ナトリウム、2mM EDTA、18mM NaCl、pH8.0)を使用した。サイズマーカーの1Kb DNA Ladder (GIBCO BRL) 0.5μg/レーンとLoading Buffer 3μlずつ加えた試料をアプライし、35V/cmで20時間泳動を行った。
トランスブロット
電気泳動終了後、アガロースゲルを切り出し、エチジウムブロマイド(2μg/ml)で15分染色し、UVトランスイルミネーターにゲルを乗せて写真撮影を行った。次いで、ゲルを変性液(0.2N NaOH、0.6M NaCl)に浸して室温で25分振とうした後、蒸留水で軽く1回洗浄した。次いで、再び中和液に浸して30分振とうした。6 x SSCを満たしたブロッティング装置にセットした3MMろ紙上に空気が入らないようにゲルを乗せ、次いで、6 x SSCに浸しておいたニトロセルロース膜フィルター(OPTITRAN BA-S85、Schleicher & Schuel)、6 x SSCに浸しておいた3MMろ紙、ペーパータオル、ガラス板、重り(2kg)の順に乗せ、一晩ブロッティングを行った。ブロッティング終了後、膜フィルターを3 x SSCに浸し、軽く水分を切ってからUVトランスイルミネーター上でウェルの位置を記入した。膜フィルターをろ紙にはさみ、80℃で一晩加熱(baking)した。
(TTAGGG)4プローブの標識とハイブリダイゼーション
Bakingしたフィルターは3 x SSCに浸した後、ハイブリダイゼーション緩衝液(10 x Denhart solution、1M NaCl, 50mM Tris-HCl (pH7.4)、10mM EDTA、0.1% SDS、50μg/ml変性鮭精子DNA)に浸して65℃で3-4時間振とうし、プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション後、シールドバックに膜フィルターを入れ、[32P]5'末端標識(TTAGGG)4プローブ(TaKaRa)と10mg/ml変性鮭精子DNA 1μlを加えたハイブリダイゼーション緩衝液を2ml入れ、泡が入らないように封入し、50℃で一晩インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行った。
オートラジオグラフィー
ハイブリダイゼーション後、膜フィルターを洗浄緩衝液(4 x SSC、0.1% SDS)に浸し、55℃で15分振とうした。4回繰り返した後、フィルターの水分をよく切って、X線フィルム(Scientific Imaging Film, Kodak)とともに増感紙を付けたカセットにセットして一晩オートラジオグラフィーを行った。スメア状に現れるTRFの密度ピークをレーザーデンシトメーター(Ultroscan XL、ファルマシア製)で検出し、その移動度を求めた。
【００８０】
結果を図１０に示す。同様に、比較例として、2-O-(α-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸 およびアスコルビン酸も検討し、同じく図１０に示した。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】クコシから抽出した2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸のイオン交換クロマトグラフィーの結果である。
【図２】図１の画分19-25の一部を用いて、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸をさらに高速液体クロマトグラフィーで精製して、1Ｈ−ＮＭＲで化学合成品と比較した結果を示す。上のチャートがクコシ由来2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、下のチャートが化学合成による2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸のスペクトルを示す。
【図３】酵素合成した2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸（物質Ｙ）を1Ｈ−ＮＭＲで化学合成品と比較した結果を示す。上のチャートが化学合成による2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸、下のチャートが酵素反応生成物（物質Ｙ）の2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸のスペトクルを示す。
【図４】酵素合成した６-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸（物質Ｘ）を二次元1Ｈ−ＮＭＲで化学合成による2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸と比較したＨＳＱＣスペクトルを示す。上のチャートが酵素反応生成物の６-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸（物質Ｘ）のスペクトル、下のチャートが化学合成した2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸のスペクトルを示す。
【図５】紫外線B波（ＵＶＢ）照射によるヒト皮膚表皮由来の角化細胞（ＨａＣａＴ）の細胞死に対する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の保護効果を示す。
【図６】ヒト皮膚角化細胞での細胞内アスコルビン酸の濃度に対する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の効果を示す。
【図７】ヒト皮膚真皮由来の線維芽細胞（ＮＨＤＦ）のコラーゲン合成に関する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の促進効果を示す。
【図８】2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸１００mg／kg経口投与後のラット門脈血および血漿中の濃度推移を示す。
【図９】ヒト皮膚真皮由来の繊維芽細胞(NHDF)の細胞分裂通算回数(PDL)に関する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の効果を示す。NHDFはPDLが20.1回で細胞老化のために死滅するが、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸添加によって2.62倍多いPDLを示すようになり、顕著な延命効果が認められた。これらの結果は、生涯細胞供給総数(lifelong cell-supplying ability)が2の2.62乗増大したことを示し、皮膚真皮の老化防御効果と死細胞穴埋め効率に多大の貢献をこのアスコルビン酸誘導体がもたらすことを示唆する。
【図１０】テロメアDNAの短縮速度に関する2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸の効果を示す。無添加では平均225bp/PDLであったのが、2-O-(β-D-グルコピラノシル)アスコルビン酸添加によって平均94bp/PDLに減速された。細胞寿命が尽きる時の臨界テロメア長はいずれの場合もほぼ一定であることから、このアスコルビン酸誘導体によって、臨界テロメア長にまで短縮する速度がほぼ42%に遅延されて細胞寿命延長が図られたと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４−１】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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