(57)【要約】Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する酵素が単離され、その遺伝子の構造が明らかにされた。したがって、該酵素等の遺伝子工学的な生産や該酵素による糖鎖の生産、該遺伝子らに基づく疾患の診断を可能にすること。  本発明は、配列表の配列番号１、３、２６若しくは２８に示されるアミノ酸配列または該アミノ配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該アミノ配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、基質となるＮ−アセチルグルコサミンにβ１−４結合を介してＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を転移する活性を有するタンパク質および該タンパク質をコードする核酸を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、２６および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列の変異体を有し、β１−４結合を介してＮ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンを転移する活性を有する、単離されたタンパク質。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が配列番号１または３に示される、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が配列番号２６または２８に示される、請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
配列番号１または２６に示されるアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質が、配列番号１または２６に示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項７】
配列番号２または４に示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１または２に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項８】
配列番号２７または２９に示される塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、請求項１または３に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
配列番号２に示される塩基配列のヌクレオチド１−３１２０または配列番号４に示される塩基配列のヌクレオチド１−２９９７を有する、請求項７記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号２７に示される塩基配列のヌクレオチド１−３１０５または配列番号２９に示される塩基配列のヌクレオチド１−２９６１を有する、請求項８記載の核酸。
【請求項１１】
請求項６ないし１０のいずれか１項に記載の核酸を含み、宿主細胞中で該核酸を発現することができる組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１１の組換えベクターで形質転換されている宿主細胞。
【請求項１３】
請求項６記載の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする測定用核酸。
【請求項１４】
前記測定用核酸がプライマーとして使用され、配列番号２０、２１、２３および２４からなる群から選択される、請求項１３記載の測定用核酸。
【請求項１５】
前記測定用核酸がプローブとして使用され、配列番号２２または２５である、請求項１３記載の測定用核酸。
【請求項１６】
前記測定用核酸が癌マーカーとして使用される、請求項１３記載の測定用核酸。
【請求項１７】
請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載の測定用核酸、および測定説明書を含む、測定用キット。
【請求項１８】
請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質に結合する抗体。
【請求項１９】
モノクローナル抗体である、請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の前記タンパク質の定量値が、対照の生物試料中の前記タンパク質の定量値よりも大きい場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
請求項１８または１９に記載の抗体を用いてタンパク質を定量する、請求項２０記載の検定方法。
【請求項２２】
生物試料の癌化を検定する方法であって、
（ａ）生物試料中の請求項６記載の核酸を定量し；そして
（ｂ）生物試料中の請求項６記載の核酸の定量値が、対照の生物試料中の前記核酸の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、前記方法。
【請求項２３】
（ａ）生物試料中の請求項６記載の核酸と少なくとも１つの請求項１３記載の測定用核酸とをハイブリダイズさせ；
（ｂ）請求項６記載の核酸を増幅させ；
（ｃ）増幅産物に請求項１３記載の測定用核酸をハイブリダイズさせ；
（ｄ）前記増幅産物とハイブリダイズした前記測定用核酸から生じるシグナルを定量し；そして
（ｅ）前記シグナルの定量値が、対照の生物試料中の対応するシグナルの定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する
工程を含む、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する活性を有する新規な酵素およびそれをコードする核酸、並びに該核酸を測定するための核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な生物において、Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミンの二糖のリンケージを有する構造が、糖タンパク質や糖脂質の糖鎖中に見出されている［非特許文献１、２を参照］。ヒトでは、この二糖構造はβ１−４結合（ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）として知られており、Ｎ−グリカン中にのみ見出されている［非特許文献３を参照］。本構造を含むヒト型糖鎖を入手するには、煩雑な化学合成を行うか、あるいは天然のタンパク質から分取する方法しかない。さらに、生体内では、上記二糖構造において、Ｎ−アセチルガラクトサミンの代わりにガラクトースであるものが含まれるため、標的とする二糖構造を有する糖鎖を分取する場合に非常に労力を要する。
【０００３】
本出願前に、本発明者らは、グルクロン酸やポリペプチドにＮ−アセチルガラクトサミンを転移する活性を有する酵素として、ｐｐＧａｌＮＡｃ−Ｔ１０、−Ｔ１１、−Ｔ１２、−Ｔ１３、−Ｔ１４、−Ｔ１５、−Ｔ１６、−Ｔ１７、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、および−Ｔ２を同定し、さらにこれらの遺伝子構造についても明らかにしている。これまで、上記Ｎ−アセチルガラクトサミンを転移する活性を有するＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素は、少なくとも２２種類知られており（表１）、各々、受容体基質特異性が異なる。
【０００４】
【表１】
2005535340.tif 000002
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｔａ，Ｍ．，Ｓ．Ｉｔｏｎｏｒｉ，Ｆ．Ｉｎａｇａｋｉ  ａｎｄ  Ｔ．Ｈｏｒｉ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｌａｒｖａｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ−ｂｏｔｔｌｅ  ｆｌｙ，Ｌｕｃｉｌｉａ  ｃａｅｓａｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９．２６４，ｐ．１５０２８−３３
【非特許文献２】Ｈｅｌｌｉｎｇ，Ｆ．，Ｒ．Ｄ．Ｄｅｎｎｉｓ，Ｂ．Ｗｅｓｋｅ，Ｇ．Ｎｏｒｅｓ，Ｊ．Ｐｅｔｅｒ−Ｋａｔａｌｉｎｉｃ，Ｕ．Ｄａｂｒｏｗｓｌｉ，Ｈ．Ｅｇｇｅ  ａｎｄ  Ｈ．Ｗｉｅｇａｎｄｔ，Ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｉｎｓｅｃｔｓ．Ｔｈｅ  ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃ  ｍｏｉｅｔｙ，Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ａ  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｕｐａｅ  ｏｆ  Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ  ｖｉｃｉｎａ  (Ｉｎｓｅｃｔａ:  Ｄｉｐｔｅｒａ)．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１．２００，ｐ．４０９−２１
【非特許文献３】Ｗｅｉｓｓｈａａｒ，Ｇ．，Ｊ．Ｈｉｙａｍａ，Ａ．Ｇ．Ｒｅｎｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｎｉｍｔｚ，  ＮＭＲ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ａｔ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｇｌｙｏｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｔｒｏｐｉｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１．１９５，ｐ．２５７−６８
【非特許文献４】Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．，Ｅ．Ｐ．Ｂｅｎｎｅｔ，Ｋ．Ｔａｋｉｏ，Ｔ．Ｓｏｒｅｎｅｓｅｎ，Ｎ．Ｂｏｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈ．Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ:ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５．２７０，ｐ．２４１５６−６５
【非特許文献５】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．，Ｈ．Ｈａｓｓａｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｃｌａｕｓｅｎ，ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧａｌＮＡｃ−ｔ３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６．２７１，ｐ．１７００６−１２
【非特許文献６】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．，Ｈ．Ｈａｓｓａｎ，Ｕ．Ｍａｎｄｅｌ，Ｅ．Ｍｉｒｇｏｒｏｄｓｋａｙａ，Ｐ．Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ，Ｊ．Ｂｕｒｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，Ｍ．Ａ．Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｇ．Ｍｅｒｋｘ，Ａ．Ｇ．ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ，Ｈ．Ｅｉｂｅｒｇ，Ｒ．Ｓｔｅｆｆｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ:ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｔｈａｔ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｔｈｅｒ  ＧａｌＮＡｃ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＵＣ１  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８．２７３，ｐ．３０４７２−８１
【非特許文献７】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．，Ｈ．Ｈａｓｓａｎ，Ｊ．Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．Ａ．Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，Ｎ．Ａｋｉｓａｗａ，Ｙ．Ｉｋｅｍａｔｓｕ，Ｇ．Ｍｅｒｋｘ，Ａ．Ｇ．ｖａｎ  Ｋｅｓｓｅｌ，Ｓ．Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｃｌａｕｓｅｎ，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｌｏｓｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ:ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−Ｔ３，ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ＧａｌＮＡｃ−Ｔ６．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９．２７４，ｐ．２５３６２−７０
【非特許文献８】Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｅ．Ｐ．，Ｈ．Ｈａｓｓａｎ，Ｍ．Ａ．Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｃｌａｕｓｅｎ，  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ:ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧａｌＮＡｃ−Ｔ７，  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｐａｒｔｉａｌ  ＧａｌＮＡｃ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９９．４６０，ｐ．２２６−３０
【非特許文献９】Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ｅ．，Ｂ．Ｌｏｒｅｎｚ，Ｔ．Ｍｅｉｔｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ｍ．Ｓｔｒｏｍ  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｅｃｏｎｓ，Ｇｅｎｅ，２０００．２４６，  ｐ．３４７−５６
【非特許文献１０】Ｔｏｂａ，Ｓ．，Ｍ．Ｔｅｎｎｏ，Ｍ．Ｋｏｎｉｓｈｉ，Ｔ．Ｍｉｋａｍｉ，Ｎ．Ｉｔｏｈ  ａｎｄ  Ａ．Ｋｕｒｏｓａｋａ，Ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ:ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ (ＧａｌＮＡｃ−Ｔ９)．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，２０００．７，ｐ．２６４−８
【非特許文献１１】Ｎａｇａｔａ，Ｙ．，Ｓ．Ｙａｍａｓｈｉｒｏ，Ｊ．Ｙｏｄｏｉ，Ｋ．Ｏ．Ｌｌｏｙｄ，Ｈ．Ｓｈｉｋｕ  ａｎｄ  Ｋ．Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｅｔａ  １，４  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｃＤＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＭ２  ａｎｄ  ＧＤ２  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２．２６９，ｐ．１２０８２−９
【非特許文献１２】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｆ．，Ｊ．Ｍａｒｋｅｎ，Ｔ．Ｔｓｕｊｉ，Ｔ．Ｗｈｉｔｅ，Ｈ．Ｃｌａｕｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ:Ｆｕｃ  ａｌｐｈａ  １−−−−２Ｇａｌ  ａｌｐｈａ  １−−−−３ＧａｌＮＡｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  (ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)  ｍＲＮＡ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０．２６５，ｐ．１１４６−５１
【非特許文献１３】Ｘｕ，Ｈ．，Ｔ．Ｓｔｏｒｃｈ，Ｍ．Ｙｕ，Ｓ．Ｐ．Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｈａｓｌａｍ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｆｏｒｓｓｍａｎ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｇｅｎｅ．Ａｎ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９．２７４，ｐ．２９３９０−８
【非特許文献１４】Ｇｕｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｌ．Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｋ．Ｔａｃｈｉｂａｎａ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｎａｒｉｍａｔｓｕ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ:ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ，ｐｐ−ＧａｌＮＡｃ−Ｔ１２(１)．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２００２．５２４，ｐ．２１１−８
【非特許文献１５】Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ｙ．，Ｔ．Ｎｅｍｏｔｏ，Ｍ．Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｋ．Ｆｕｊｉｔａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｎａｋａｎｉｓｈ，Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｙｌｌａｃｔｏｓｅｓ  ｉｎ  ａｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｃｈｅｍ．，１９９９．１８．ｐ．５２３−３３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する活性を有する酵素を単離し、その遺伝子の構造を明らかにすることにより、遺伝子工学的技術を通じた該酵素等の生産や、該遺伝子等に基づく疾患の診断が可能になる。しかしながら、該酵素は、未だ精製分離もされておらず、該酵素の単離および遺伝子の同定についての手がかりはない。そのために、該酵素に対する抗体も作製されていない。
【０００６】
従って、本発明の目的は、Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する活性を有するタンパク質およびそれをコードする核酸を提供することである。また、本発明の目的は、該核酸を宿主細胞内で発現する組換えベクターおよび該核酸が導入され、前記核酸および該タンパク質を発現する細胞を提供することである。また、発現した該タンパク質は抗体作製用に利用することができる。従って、本発明の目的はまた、該タンパク質の生産方法を提供することでもある。さらに、発現したタンパク質および該タンパク質に対する抗体は、免疫組織染色、ＲＩＡおよびＥＩＡ等の免疫測定法に応用できる。さらにまた、本発明の目的は、上記本発明の核酸を測定するための測定用核酸を提供することでもある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の通り、目的とする酵素は、未だ単離されていないので、その部分アミノ酸配列を知ることもできない。一般に、細胞に微量しか含まれていないタンパク質を単離精製することは容易ではない。したがって、現在に至るまで単離されていない酵素を細胞から単離することは容易でないことが予想される。そこで、本発明者らは、目的とする酵素と比較的類似した作用を有する種々の酵素遺伝子の塩基配列間に、同一性が高いと考えられる領域を標的として、その相同配列を有すると思われる目的とする酵素を単離および同定することを試みた。具体的には、本発明者らは、まず公知のβ１，４−ガラクトース転移酵素の塩基配列を検索し、相同領域を見出した。次に、この相同領域をもとにしてプライマーを設計し、ｃＤＮＡライブラリーから５’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法で全長のオープンリーディングフレームを同定した。さらに、ＰＣＲで該酵素の遺伝子のクローニングに成功し、その塩基配列および推定アミノ酸配列を決定することによって、本発明を完成するに至った。
【０００８】
本発明は、Ｎ−アセチルガラクトサミンを転移する活性を有するタンパク質およびこれらをコードする核酸を提供することにより、当該技術分野におけるこれらの多様な必要性を満たすのを援助する。
【０００９】
即ち、本発明によれば、Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する活性を有する哺乳類のタンパク質が提供される。
【００１０】
本発明のヒトタンパク質は、典型的には、配列番号２または４に記載の塩基配列から推定される、配列番号１または３に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
本発明のタンパク質は、配列番号２７または２９の塩基配列から推定される、配列番号２６または２８に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明のタンパク質には、配列番号１、３、２６および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列のみでなく、当該配列と５０％以上の同一性を有するものも含まれ、当該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または当該配列において１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。
【００１３】
本発明のタンパク質は、好ましくは、配列番号１、３、２６および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列と６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらになお好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１４】
本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする核酸が提供される。
【００１５】
本発明の核酸は、典型的には、配列番号２、４、２７および２９からなる群から選択される塩基配列、前記塩基配列中に１から複数個の塩基の置換、欠失、挿入および／または付加を有する塩基配列、または前記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、および上記配列に相補的な核酸も含む。限定されるわけではないが、配列番号２に記載の塩基配列におけるヌクレオチド１−３１２０、配列番号４に記載の塩基配列におけるヌクレオチド１−２９９７、配列番号２７に記載の塩基配列におけるヌクレオチド１−３１０５、および配列番号２９に記載の塩基配列におけるヌクレオチド１−２９６１を含む核酸もまた本発明の一態様である。
【００１６】
本発明によれば、本発明の核酸を含む組換えベクターが提供される。本発明の組換えベクターは、好ましくは発現ベクターである。
【００１７】
本発明によれば、本発明の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体が提供される。
【００１８】
本発明によれば、本発明のタンパク質をコードする核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする測定用核酸が提供される。本発明の測定用核酸をプライマーとして核酸増幅用反応に使用する場合には、配列番号２０、２１、２３および２４のいずれかに記載の配列を有することが好ましい。本発明の測定用核酸をプローブとして前記タンパク質をコードする核酸の測定に使用する場合には、配列番号２２または２４に記載の配列を有することが好ましい。さらに、本発明の測定用核酸は、癌マーカーとして使用することができる。
【００１９】
本発明によれば、本発明の核酸とハイブリダイズする測定用核酸を含む測定用キットが提供される。
【００２０】
本発明によれば、本タンパク質に結合する単離抗体またはモノクローナル抗体が提供される。
【００２１】
さらに、本発明によれば、生物試料における本発明のタンパク質または核酸を定量することを含む、生物試料の癌化を検出する方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
【００２３】
（１）タンパク質
下記実施例において詳述する方法によりクローニングされた、本発明のタンパク質をコードする核酸は、配列番号２または４に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列が、該塩基配列の下に記載されている。なお、配列番号１または３には、該アミノ酸配列のみが記載されている。
【００２４】
下記実施例で得られた本発明のタンパク質（本明細書では「ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１」および「ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２」と命名）は、次の性質を有する酵素である。なお、本発明のタンパク質の性質およびその活性の測定方法は下記実施例において詳述されている。
作用：  Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する。触媒する反応を反応式で記載すると、
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン  +  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−Ｒ  →  ＵＤＰ  +  Ｎ−アセチル-Ｄ−ガラクトサミニル−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−Ｒ
（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ  ＋  ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ  →  ＵＤＰ  +  ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）
基質特異性：  Ｎ−アセチルグルコサミン、例えばＮ−アセチルグルコサミンβ１−３−Ｒ（Ｒは、マンノースやｐ−ニトロフェノール等の水酸基とエーテル結合した残基）。
好ましい態様において、本発明のタンパク質は、少なくとも一つの次の性質を有し、好ましくは、これらの性質：
（Ａ）供与体基質の特異性
（ａ）Ｏ−結合型糖鎖を供与体基質として使用する場合、当該タンパク質はＮ−アセチルガラクトサミンをＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（以下、「コア２−ｐＮｐ」）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（以下、「コア３−ｐＮｐ」）、ＧｌｃＮＡｃβ１−６ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（以下、「コア６−ｐＮｐ」）にβ１−４結合で転移する活性を有し、ここで、使用される省略形は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン；  ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；  Ｇａｌ、ガラクトース；  ｐＮｐ、ｐ−ニトロフェニルである。好ましくは、前記タンパク質は、コア６−ｐＮｐに転移活性を有する。
【００２５】
（ｂ）Ｎ−結合型糖鎖を供与体基質として使用する場合、当該タンパク質はＮ−アセチルガラクトサミンを当該糖鎖の非還元末端でＧｌｃＮＡｃにβ１−４結合を介して転移する活性を有し、ただし、当該糖鎖が次の性質：
（ｉ）当該糖鎖の構造にフコース（Ｆｕｃ）残基を有する；および
（ｉｉ）１以上の分岐鎖を有し、ここで、ＧａｌＮＡｃ残基が非還元末端でＧｌｃＮＡｃ残基に結合する
を有する場合に、当該活性が減少する。
（Ｂ）酵素活性における至適ｐＨ
活性は、ｐＨ６．５のＭＥＳ（２−モルホリンエタンスルホン酸）緩衝液においてより高い傾向である。ＨＥＰＥＳ（［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）緩衝液では、活性は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１はｐＨ６．７５、およびＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２はｐＨ７．４において高くなる傾向である。
（Ｃ）二価イオンの要求性
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１では、活性は、少なくともＭｎ２＋、またはＣｕ２＋、好ましくはＭｎ２＋を含むＭＥＳ緩衝液において高い傾向である。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２では、活性は、少なくともＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣｏ２＋、好ましくはＭｇ２＋を含むＭＥＳ緩衝液において高くなる傾向である。
【００２６】
本発明のマウスタンパク質をコードする核酸はまた配列表の配列番号２７または２９に示される塩基配列を有し、それがコードする推定アミノ酸配列もまた該塩基配列の下に記載されている。なお、配列番号１または３には、該アミノ酸配列のみが記載されている。本発明のタンパク質（本明細書では「ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１」および「ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２」と命名）はまた、上記性質を有する酵素である。
【００２７】
本発明によれば、Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する活性を有するタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は、本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法等は限定されない。即ち、本発明のタンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現されたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
【００２８】
本発明のタンパク質は、典型的には、配列番号１に記載したアミノ酸残基１０３９個からなるアミノ酸配列、配列番号３に記載したアミノ酸残基９９８個からなるアミノ酸配列、配列番号２６に記載したアミノ酸残基１０３４個からなるアミノ酸配列、または配列番号２８に記載したアミノ酸残基９８６個からなるアミノ酸配列を有する。しかしながら、天然のタンパク質の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型（ｅｃｏｔｙｐｅ）の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在等に起因して、１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。なお、本明細書で使用する用語「変異タンパク質」とは、配列番号１、３、２６または２８に示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、または該アミノ酸配列に１若しくは複数個のアミノ酸が挿入され若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する活性を有するタンパク質等を意味する。ここで、「複数個」とは、好ましくは１−３００個、より好ましくは１−１００個、最も好ましくは１−５０個である。一般的には、部位特異的な変異によってアミノ酸が置換された場合に、元々のタンパク質が有する活性は保存される程度に置換が可能なアミノ酸の個数は、好ましくは１−１０個である。
【００２９】
本発明のタンパク質は、クローニングされた核酸の塩基配列からの推定に基づいて、配列番号１若しくは３、並びに配列番号２若しくは４（下段）のアミノ酸配列、または配列番号２６若しくは２８、並びに配列番号２７若しくは２９（下段）のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。同一性は、少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらになお好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。
【００３０】
本明細書において、同一性のパーセントは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、あるいはＰｅａｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｐ．２４４４−２４４８，１９８８）に記載されているＦＡＳＴＡを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。各プログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。なお、当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００３１】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質はもとのタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００３２】
本発明のタンパク質は、例えば、後述の実施例に従って、本発明の核酸による配列番号２、４、２７または２９に記載のＤＮＡ配列を大腸菌、酵母、昆虫、または動物細胞に、それぞれの宿主で増幅可能な発現ベクターを用いて導入および発現させることにより、当該タンパク質を大量に得ることができる。
【００３３】
本発明のタンパク質について、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）による同一性検索を行うと、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と４７．２％の同一性、ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１と８４．３％の同一性、およびｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と４７．４％の同一性を有する。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１と４６．５％の同一性、およびｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と８２．６％の同一性を有する。ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と４６．３％の同一性を有する。
【００３４】
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１については、ＣＳＧａｌＮＡｃＴ１とはＣ末端２２６アミノ酸で２６．１％の同一性であり、一方、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２については、ＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ１とはＣ末端の４３１アミノ酸で２１．６％、およびＣＳＧａｌＮＡｃ−Ｔ２とはＣ末端の２２４アミノ酸で２５．０％の同一性である。
【００３５】
さらに、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、ヒトコンドロイチン合成酵素１（ｈＣＳＳ１）と１９．３％の同一性、およびマウスコンドロイチン合成酵素１（ｍＣＳＳ１）と１８．０％の同一性を有し、一方、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、ｈＣＳＳ１と１８．２％の同一性、およびｍＣＳＳ１と１８．８％の同一性を有する。
【００３６】
したがって、本発明のタンパク質は新規なタンパク質であると考えられる。
【００３７】
加えて、本発明のタンパク質は、配列番号１または３のアミノ酸配列と２７％以上の同一性を有する。
【００３８】
本発明のタンパク質は、配列番号２６または２８のアミノ酸配列と１９％以上の同一性を有する。
【００３９】
なお、ＧＥＮＥＴＹＸは、核酸解析、タンパク質解析用の遺伝情報処理ソフトウェアで、通常のホモロジー解析やマルチアラインメント解析の他、シグナルペプチド予測やプロモーター部位予測、二次構造予測が可能である。また、本明細書で用いたホモロジー解析プログラムは、高速・高感度な方法として多用されているＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７，１４３５−１４４１（１９８５））を採用している。
【００４０】
本発明によって、これらタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が本明細書に開示されれば、当該配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の核酸増幅反応等の遺伝子工学的手法を用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を容易に単離することができる。このような場合、それらの遺伝子がコードする新規タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００４１】
なお、本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列が上述した通りのものであり、前記酵素活性を有するものであれば、タンパク質に糖鎖が結合していてもよい。
【００４２】
より具体的には、後述する実施例２および５に記載したように、本発明のタンパク質における受容体基質の探索から、該タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃにＧａｌＮＡｃをβ１−４結合を介して転移する活性を有するものである。
【００４３】
さらにより具体的には、本発明のタンパク質は、少なくとも１つの下記の性質（Ａ）−（Ｃ）、好ましくはこれら全ての性質を有する：
（Ａ）供与体基質の特異性
（ａ）Ｏ−結合型糖鎖を供与体基質として使用する場合、当該タンパク質は、Ｎ−アセチルガラクトサミンをＧｌｃＮＡｃβ１−６（Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（以下、「コア２−ｐＮｐ」）、ＧｌｃＮＡｃβ１−３ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（以下、「コア３−ｐＮｐ」）、ＧｌｃＮＡｃβ１−６ＧａｌＮＡｃα−ｐＮｐ（以下、「コア６−ｐＮｐ」）にβ１−４結合を介して転移する活性を有し、ここで、使用される省略形は、ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチルグルコサミン；  ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチルガラクトサミン；  Ｇａｌ、ガラクトース；  ｐＮｐ、ｐ−ニトロフェニルである。好ましくは、前記タンパク質は、コア６−ｐＮｐへの転移活性を有する。
【００４４】
（ｂ）Ｎ−結合型糖鎖を供与体基質として使用する場合、当該タンパク質は、Ｎ−アセチルガラクトサミンを当該糖鎖の非還元末端でＧｌｃＮＡｃにβ１−４結合を介して転移する活性を有し、ただし、前記糖鎖が次の性質：
（ｉ）当該糖鎖の構造にフコース（Ｆｕｃ）前記を有する；および
（ｉｉ）１以上の分岐鎖を有し、ここで、ＧａｌＮＡｃ残基が非還元末端でＧｌｃＮＡｃ残基に結合する
を有する場合に、当該活性が減少する。
（Ｂ）酵素活性における至適ｐＨ
活性は、ｐＨ６．５のＭＥＳ（２−モルホリンエタンスルホン酸）緩衝液においてより高い傾向にある。ＨＥＰＥＳ（［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）緩衝液では、活性は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１はｐＨ６．７５、およびＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２はｐＨ７．４において高くなる傾向にある。
（Ｃ）二価イオンの要求性
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１では、活性は、少なくともＭｎ２＋またはＣｏ２＋、好ましくはＭｎ２＋を含むＭＥＳ緩衝液において高い傾向である。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２では、活性は、少なくともＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣｏ２＋、好ましくはＭｇ２＋を含むＭＥＳ緩衝液において高くなる傾向にある。
【００４５】
（２）核酸
本発明の核酸は、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡ、およびそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸としては、ＤＮＡが好ましい。
【００４６】
本発明の核酸は、配列番号１、３、２６または２８に示されるアミノ酸をコードする核酸（その相補体を含む）である。典型的には、配列番号２、４、２７または２９の塩基配列（その相補体を含む）を有するが、これは本発明の一例を示すにすぎない下記の実施例で得られたクローンの塩基配列である。天然の核酸の中には、それを生産する生物種の品種の違いや、生態型の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の核酸は、配列番号２、４、２７または２９に記載の塩基配列を有する核酸のみに限定されるわけではなく、本発明のタンパク質をコードする全ての核酸を包含する。
【００４７】
特に、本発明によってこのタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列が開示されれば、この配列またはその一部を利用して、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法、例えば、ＰＣＲを用いて、他の生物種から同様の生理活性を有するタンパク質をコードする核酸を容易に単離することができる。このような場合、そのような核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００４８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｖｏｌ．１，７．４２−７．４５  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５ＸＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２ＸＳＳＣ−６ＸＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６８℃、０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識するであろう。
【００４９】
核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）［Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５）］、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）［Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９）；  Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  Ｋ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９，１１７−１２２（１９９０）；  Ｂａｒａｎｙ  Ｆ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１８９−１９３（１９９１）］および転写に基づく増幅［Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９）］等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）［Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；  Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２）］、自己保持配列複製（３ＳＲ）［Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０）］およびＱβレプリカーゼシステム［リザイルディら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６，ｐ．１１９７−１２０２（１９８８）］等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００５０】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列表の配列番号２、４、２７または２９に記載の塩基配列に対して少なくとも５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらになお好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する。
【００５１】
同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、使用可能である。
【００５２】
本発明の核酸について、ＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社）による同一性検索を行うと、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と５９．７％の同一性、ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１と８１．４％の同一性、およびｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と５９．０％の同一性を有する。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１と５９．７％の同一性、およびｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と８３．４％の同一性を有する。ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と５９．６％の同一性を有する。
【００５３】
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、ｈＣＳＳ１と４４．６％の同一性、及びｍＣＳＳ１と４６．０％の同一性を有し、一方、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、ｈＣＳＳ１と４７．３％の同一性、及びｍＣＳＳ１と４７．９％の同一性を有する。
【００５４】
ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は、ｈＣＳＳ１と４６．４％の同一性、及びｍＣＳＳ１と４６．６％の同一性を有し、一方、ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、ｈＣＳＳ１と４８．６％の同一性、及びｍＣＳＳ１と４８．７％の同一性を有する。
【００５５】
したがって、本発明の核酸は新規な核酸であると考えられる。
【００５６】
加えて、本発明の核酸は、配列番号２または４の核酸と４８％以上の同一性を有する。
【００５７】
本発明の核酸は、配列番号２７または２９の核酸配列と４９％以上の同一性を有する。
【００５８】
（３）組換えベクターと形質転換体
本発明によればまた、本発明の核酸を含む組換えベクターが提供される。プラスミドなどのベクターに本発明の核酸のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞（例えば、Ｅ−ｃｏｉｌ  ＴＢ１，  ＬＥ３９２  またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ等）に導入される。
【００５９】
プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１６．１（２００１）に記載の塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
【００６０】
べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。用いられるべクターの具体例としては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２などが例示されるがこれらに限定されない。
【００６１】
所望のタンパク質を生産する目的においては、特に、発現べククーが有用である。発現べクターの種類は、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生産する機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌用発現ベクターとして、ｐＱＥ−３０、ｐＱＥ−６０、ｐＭＡＬ−Ｃ２、ｐＭＡＬ−ｐ２、ｐＳＥ４２０などが好ましく、酵母用発現べクターとしてｐＹＥＳ２（サッカロマイセス属）、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＡＯ８１５（以上ピキア属）、昆虫用発現ベクターとしてｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＢＫ２８３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５などが好ましい。
【００６２】
形質転換体は、所望の発現べクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。用いられる宿主細胞としては、本発明の発現べクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に制限はなく、本発明の技術分野において通常使用される天然の細胞、または人工的に樹立された組換え細胞など種々の細胞を用いることが可能である。例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。
【００６３】
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。より具体的には、宿主細胞は、サル腎由来の細胞株であるＣＯＳ細胞が好ましい。
【００６４】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００６５】
宿主細胞として酵母、植物細胞、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター、関始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターを合んでいることが好ましい。またシグナルペブチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、所望の遺伝子の５’側および３’側の非翻訳領域、選択マーカー領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
【００６６】
本発明のべクタ−において、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ＡＴＧ）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡなど）が例示される。
【００６７】
複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを意味し、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたプラスミド）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、Ｅ．ｃｏｉｌではブラスミドｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬもしくはそれらの人工的修飾物（ｐＱＥ３０、ｐＥＴまたはｐＣＡＬを適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母ではプラスミドｐＹＥＳ２もしくはｐＰＩＣ９Ｋが、また昆虫細胞ではプラスミドｐＢａｃＰＡＫ８／９等があげられる。
【００６８】
エンハンサー配列、ターミネーター配列については、例えば、それぞれＳＶ４０に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
【００６９】
選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。
【００７０】
発現べクターは、少なくとも、上述のプロモータ−、開始コドン、所望のタンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、およびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やＴ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素部位など）を用いることができる。
【００７１】
本発明の発現べクターの宿主細胞への導入［形質転換（形質移入）］は従来公知の方法を用いて行うことができる。
【００７２】
例えば、細菌（Ｅ．ｃｏｉｌ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）］やコンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１）］によって、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの場合は、例えばＨｉｎｎｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２７（１９７８）］やリチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］によって、植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１２９（１９８５）］、エレクトロポレ−ション法［Ｎａｔｕｒｅ，３１９，７９１（１９８６）］によって、動物細胞の場合は、例えばＧｒａｈａｍの方法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］、昆虫細胞の場合は、例えばＳｕｍｍｅｒｓらの方法［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２１５６−２１６５（１９８３）］によってそれぞれ形質転換することができる。
【００７３】
（４）タンパク質の単離・精製
本発明のタンパク質は、上記の如く調整された発現ベクターを含む形質転換細胞を栄養培地で培養することによって発現（生産）することができる。栄養培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨおよび培養時間は、本発明のタンパク質が大量に生産されるように適宜選択される。
【００７４】
本発明のタンパク質は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０Ｍ〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５．０〜９．０の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、あるいは培養ろ液はそのまま、または硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明のタンパク質の単離・精製に供することができる。単離・精製の方法としては、以下の方法が挙げることができる。即ち、当該タンパクに６×ヒスチジンやＧＳＴ、マルトース結合タンパクといったタグを付けている場合には、一般に用いられるそれぞれのタグに適したアフィニティークロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。一方、そのようなタグを付けずに本発明のタンパク質を生産した場合には、例えば後述する実施例に詳しく述べられている方法、即ちイオン交換クロマトグラフィーによる方法を挙げることができる。また、これに加えてゲルろ過や疎水性クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィーなどを組み合わせる方法も挙げることができる。
【００７５】
本発明のタンパク質を、Ｎ−アセチルグルコサミンを有する糖タンパク質、オリゴ糖または多糖等に作用させることにより、Ｎ−アセチルガラクトサミンが転移される。従って、本発明のタンパク質は、糖タンパク質の糖鎖の修飾や、糖類の合成に用いることができる。さらに、このタンパク質を免疫原として動物に投与することにより、該タンパク質に対する抗体を作製することができ、該抗体を用いて免疫測定法により該タンパク質を測定することが可能になる。従って、本発明のタンパク質およびこれをコードする核酸は、このような免疫原の作製に有用である。
【００７６】
本発明のタンパク質はまた、精製および同定を容易にするために添加されるペプチドを含んでもよい。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４，１９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号３０）であり、該ペプチドは非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下で、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号ＨＢ  ９２５９下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネチカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００７７】
具体的には、後述される実施例１に記載されるように、本発明のタンパク質を発現する発現ベクターにＦＬＡＧのｃＤＮＡを挿入し、ＦＬＡＧ標識したタンパク質を発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体によって、該タンパク質の発現を確認することができる。
【００７８】
（５）測定用核酸
本発明によれば、本発明の核酸とハイブリダイズする核酸（以下、「測定用核酸」と称する）が提供される。本発明の測定用核酸は、典型的には、本発明のタンパク質をコードする核酸の天然由来のまたは合成されたフラグメントであり、プライマーまたはプローブを含むが、これらに限定されるものではない。なお、本明細書において使用される用語「測定」には、検出、増幅、定量、および半定量のいずれもが包含される。
【００７９】
（ａ）プライマー
本発明の測定用核酸を核酸増幅反応用のプライマーとして使用する場合、本発明の測定用核酸は、オリゴヌクレオチドであって、
配列番号１、３、２６または２８に示すタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−５０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−７０％であること；
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造する
ことを含む方法により製造された当該オリゴヌクレオチドが提供される。
【００８０】
本発明のプライマーは、本発明の核酸の部分領域と相同的な配列を有することが好ましいが、１または２塩基の不一致があっても差し支えない。
【００８１】
なお、本発明のプライマーの塩基数は１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは２１塩基以上であり、５０塩基以下である。
【００８２】
本発明のプライマーは、典型的には、配列番号２０、２１、２３および２４からなる群から選択された塩基配列を有し、単独、または適当な２種を組み合せたプライマー対として用いることができる。このヌクレオチド配列は、配列番号１または３のアミノ酸配列に基づいて、各々のタンパク質をコードする遺伝子断片のクローニングのためのＰＣＲ用プライマーとして設計したものであり、当該アミノ酸をコードすることが可能な全ての塩基をミックスしたプライマーである。
【００８３】
（ｂ）プローブ
本発明の測定用核酸をプローブとして使用する場合、本発明の測定用核酸は、配列番号２、４、２７または２９に記載の塩基配列の全体または部分領域と相同的な配列を有することが好ましいが、１または２塩基の不一致があっても差し支えない。なお、本発明のプローブの塩基数は１５塩基以上、好ましくは２０塩基以上であり、コード領域の全長、即ち、３１２０塩基（配列番号２に対応）、２９９７塩基（配列番号４に対応）、３１０５塩基（配列番号２７に対応）、または２９６１塩基（配列番号２９に対応）以下である。本発明のプローブは、典型的には、配列番号２２または２５に記載された塩基配列を有する。プローブは天然由来の核酸より、制限酵素処理によって得てもよいし、合成したオリゴヌクレオチドであってもよい。
【００８４】
本発明のプローブには、該プローブが標的配列とハイブリダイズしたことを検出または確認するために、蛍光標識、放射標識、ビオチン標識等の標識を付した標識プローブが含まれる。被検核酸またはその増幅物を固相化し、標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、固相に結合された標識を測定することにより、検体中に被検核酸が存在するかを決定することができる。あるいは、測定用核酸を固相化し、被検核酸をハイブリダイズさせ、固相に結合した被検核酸を標識プローブ等で検出することも可能である。このような場合、固相に結合した測定用核酸もプローブと呼ぶ。
【００８５】
一般的に、ＰＣＲのような核酸増幅法自体は、この分野において周知であり、そのための試薬キットおよび装置も市販されているので容易に行うことができる。上記した本発明の測定用核酸の一対をプライマーとして用い、被検核酸を鋳型として用いて核酸増幅法を行うと、被検核酸が増幅されるのに対し、検体中に被検核酸が含まれない場合には増幅が起きないので、増幅産物を検出することにより検体中に被検核酸が存在するか否かを知ることができる。増幅産物の検出は、増幅後の反応溶液を電気泳動し、バンドをエチジウムブロミド等で染色する方法や、電気泳動後の増幅産物をナイロン膜等の固相に不動化し、被検核酸と特異的にハイブリダイズする標識プローブとハイブリダイズさせ、洗浄後、該標識を検出することにより行うことができる。また、クエンチャー蛍光色素とレポーター蛍光色素を用いたいわゆるリアルタイム検出ＰＣＲを行うことにより、検体中の被検核酸の量を定量することも可能である。なお、リアルタイム検出ＰＣＲ用のキットも市販されているので、容易に行うことができる。さらに、電気泳動バンドの強度に基づいて被検核酸を半定量することも可能である。なお、被検核酸は、ｍＲＮＡでも、ｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡであってもよい。被検核酸としてｍＲＮＡを増幅する場合には、上記一対のプライマーを用いたＮＡＳＢＡ法(３ＳＲ法、ＴＭＡ法)を採用することもできる。ＮＡＳＢＡ法自体は周知であり、そのためのキットも市販されているので、上記一対のプライマーを用いて容易に実施することができる。
【００８６】
（ｃ）マイクロアレイ
本発明の測定用核酸は、マイクロアレイとして使用することができる。マイクロアレイは、ゲノム機能の大量のデータを迅速に解析することができる手段である。具体的には、固相基板、例えばガラス基板上に高密度に固定した多数の異なった核酸プローブに、標識した核酸をハイブリダイズさせ、各々のプローブからのシグナルを検出し、および回収したデータを解析するものである。本明細書において使用するように、「マイクロアレイ」というときは、固相基板、例えば、メンブラン、フィルター、チップ、またはガラス上に、本発明の測定用核酸を配列したアレイをいう。
【００８７】
（６）抗体
本発明のタンパク質に免疫反応性である抗体が本明細書に提供される。こうした抗体は、（非特異的結合と対照的に）抗体の抗原結合部位を介して、該タンパク質に特異的に結合する。したがって、上述のような、配列番号１、配列番号３、配列番号２６および配列番号２８のタンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などを、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。より具体的には、タンパク質、断片、変異体、融合タンパク質などは、抗体形成を引き出す抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でも高次構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらでもよい。なお、該抗原決定基またはエピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によって同定してもよい。
【００８８】
したがって、本発明の１つの側面は、本発明のタンパク質の抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のタンパク質由来のエピトープは、アッセイにおいて、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマ由来の上清などの物質から特異的に結合する抗体を精製する研究試薬として使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、タンパク質の化学的または酵素的切断などの、当該技術分野に公知の技術を用いて、あるいは組換えＤＮＡ技術を用いて、産生することが可能である。
【００８９】
本発明のタンパク質によって誘導される可能性がある抗体に関しては、該タンパク質の全部若しくは一部が単離されていても、またはエピトープが単離されていても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はどちらも、慣用的技術によって調製することが可能である。例えば、Ｋｅｎｎｅｔら（監修），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９８０を参照されたい。
【００９０】
本発明のタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物を該タンパク質で免疫し；免疫された動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し；そして該タンパク質に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含む。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。
【００９１】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型が含まれる。こうしたヒト化抗体を既知の技術によって調製し、そして抗体がヒトに投与されるとき、免疫原性の減少という利点を提供してもよい。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を欠く）を含んでもよい。
【００９２】
慣用的技術によって産生可能な、抗体の抗原結合断片もまた、本発明に含まれる。こうした断片の例には、限定されるわけではないが、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。遺伝子工学技術によって産生される抗体断片および誘導体もまた提供される。
【００９３】
１つの態様において、抗体は本発明のタンパク質に特異的であり、そして他のタンパク質と交差反応しない。こうした抗体を同定することが可能なスクリーニング法が公知であり、そして例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴ってもよい。
【００９４】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかで、本発明のタンパク質または断片の存在を検出するアッセイで用いることが可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【００９５】
さらに、結合パートナー、例えば受容体基質への本発明のタンパク質の結合を遮断することが可能な抗体を用いて、こうした結合から生じる生物学的活性を阻害することが可能である。こうした遮断抗体は、受容体基質を発現している特定の細胞への該タンパク質の結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて、同定してもよい。あるいは、遮断抗体は、標的細胞の結合パートナーに結合している本発明のタンパク質から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定することが可能である。
【００９６】
こうした抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用するか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。したがって、本発明のタンパク質と結合パートナーとの相互作用によって、（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、結合パートナー仲介生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片が使用される。
【００９７】
（７）癌マーカーおよび検出方法
本発明のタンパク質または核酸は、癌マーカーとして使用することができ、癌の診断、治療等に応用することが可能である。ここで、本明細書において使用される用語「癌」には、典型的には、悪性腫瘍全般をいい、該悪性腫瘍による疾病状態を含む。限定されるわけではないが、「癌」としては、例えば肺癌、肝臓癌、腎臓癌、白血病が含まれる。
【００９８】
本明細書において「癌マーカー」というときは、生物試料が癌化されている場合に、癌化されていない生物試料と比べて多く発現される本発明のタンパク質または核酸をいう。なお、「生物試料」というときには、組織、器官および細胞を含む。好ましくは血液、より好ましくは病理組織である。
【００９９】
具体的には、本発明のタンパク質を癌マーカーとする場合、本発明の検出方法には、（ａ）生物試料の前記タンパク質を定量し；そして（ｂ）生物試料中の前記タンパク質の定量値が、対照の生物試料中の前記タンパク質の定量値よりも大きい場合には癌化していると判断する工程が含まれる。前記検出方法には、生物試料の該タンパク質を定量するために、本発明の抗体を使用することができる。本発明によれば、一般的には、タンパク質を定量する方法は、上記方法に限定されるものではなく、当該技術分野において周知の定量方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロットを使用することが可能である。前記定量値の比は、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは１０倍以上である。
【０１００】
一方、本発明の核酸を癌マーカーとする場合、本発明の検出方法は、（ａ）生物試料中の前記核酸を定量し、そして（ｂ）生物試料中の前記核酸の定量値が、対照の生物試料中の前記核酸の定量値の１．５倍以上である場合には癌化していると判断する工程を含む。好ましくは、（ａ）生物試料中の前記核酸と少なくとも１つの前記測定用核酸とをハイブリダイズさせ；（ｂ）前記核酸を増幅させ；（ｃ）増幅産物に前記測定用核酸をハイブリダイズさせ；（ｄ）前記増幅産物とハイブリダイズした前記測定用核酸から生じるシグナルを定量し；そして（ｅ）前記シグナルの定量値が、対照の試料生物中の対応するシグナルの定量値１．５倍以上である場合には癌化していると判断する工程を含む。
【０１０１】
より具体的には、後述する実施例に記載されているように、癌化されている組織と正常な組織での核酸の発現レベルの比を定量ＰＣＲによって測定することによって癌化していることを判断することができる。本発明によれば、核酸の定量には、これに限定されるものではなく、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡマイクロアレイを使用することができる。定量には、同一組織等に広く一般的に存在する遺伝子の核酸、例えばグリセルアルデヒド−３リン酸−脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチンをコードする核酸を対照として利用することができる。癌化していると判断されるシグナルの定量比は、１．５以上であり、好ましくは３以上、さらにより好ましくは１０以上である。
【０１０２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
本発明のタンパク質の調製
１．遺伝子データベースの検索と新規Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素遺伝子の塩基配列決定
既存のβ−１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子を用いて、遺伝子データベースから類似遺伝子の検索を行った。用いた配列はβ−１，４−ガラクトース転移酵素遺伝子の配列番号：ＡＬ１６１４４５、ＡＦ０３８６６０、ＡＦ０３８６６１、ＡＦ０２２３６７、ＡＦ０３８６６３、ＡＦ０３８６６４である。また検索は、Ｂｌａｓｔ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］等のプログラムを利用した。
【０１０４】
その結果、ＥＳＴ配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．Ｎ４８７３８およびゲノム配列ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＣ００６２０５が見出された。その後の検討の結果、両配列は異なる遺伝子を含んでいると考えられた（本明細書ではＮ４８７３８を含む遺伝子をＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ＡＣ００６２０５に含まれる遺伝子をＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と呼ぶ）。両遺伝子とも翻訳開始点が不明で、全長を予測することが不可能であったので、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ若しくはＳｔｏｍａｃｈ）を用いてコード領域情報の取得（５’ＲＡＣＥ：Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）並びにクローニングを行った。
【０１０５】
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１のコード領域情報の取得
Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ付属のＡＰ１プライマーと（ｃＤＮＡ断片の両側にＡＰ１、ＡＰ２のアダプターがついている）、見出した配列部分に設定したプライマーＫ１２Ｒ６（5’−GCT CCT GCA GCT CCA GCT CCA−3’（配列番号５））でＰＣＲ（９４℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル）を行った。さらに、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ付属のＡＰ２プライマーと、配列部分に設定したプライマーＫ１２Ｒ５（5’−AAG CGA CTC CCT CGC GCC GAG T−3’（配列番号６））でｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ（９４℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル）を行った。その結果得られた約０．６  ｋｂの断片を常法により精製し、塩基配列を解析した。しかし、糖転移酵素特有の膜貫通配列（疎水的な２０アミノ酸）が出現しなかったので、得られた配列と後述のＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の塩基配列を参考にゲノムデータベース検索でＥＳＴ配列（GenBank Accession No.  ＰＦ０５８１９７）を見出した。この塩基配列情報をもとに２種のプライマー（Ｋ１２Ｆ１０１：5’−ATG CCG CGG CTC CCG GTG AAG AAG−3’（配列番号７）とＫ１２Ｒ５）によりＲＴ−ＰＣＲを行い、増幅が確認できたことから、このＥＳＴ配列と５’ＲＡＣＥで得られた配列は１本のｍＲＮＡ上に存在すること明らかになった。全長３１２０塩基のヌクレオチド配列を配列番号２に示した。
【０１０６】
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２のコード領域情報の取得
Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ付属のＡＰ１プライマーと（ｃＤＮＡ断片の両側にＡＰ１、ＡＰ２のアダプターがついている）、見出した配列部分に設定したプライマーＫ１３−Ｒ３（5’−CAA CAG TTC AAG CTC CAG GAG GTA−3’（配列番号８））でＰＣＲ（９４℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル）を行った。さらに、Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ付属のＡＰ２プライマーと、配列部分に設定したプライマーＫ１３Ｒ２（5’−CTG ACG CTT TTC CAC GTT CAC AAT−3’（配列番号９））ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ（９４℃２０秒、６０℃３０秒、７２℃２分を３０サイクル）を行なった。その結果得られた約１．０  ｋｂの断片を常法により精製し、塩基配列を解析し、タンパク質のコード領域を決定した。しかし、糖転移酵素特有の膜貫通配列（疎水的な２０アミノ酸）が出現しなかったので、さらに３度の５’ＲＡＣＥを行った。ここで使用したプライマーを表２に示した。
【０１０７】
その結果、得られた全長２９９７塩基のヌクレオチド配列を配列番号４に示した。
【０１０８】
【表２】
2005535340.tif 000003
【０１０９】
２．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子の発現ベクターへの組込み
ＧａｌＮＡｃ−Ｔの発現系を作成するため、まずＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子の一部をシグマ社のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１に組込んだ。以下に詳細を述べる。
【０１１０】
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１への組込み
Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  （Ｈｕｍａｎ  Ｂｒａｉｎ）を鋳型として、フォワードプライマーＫ１２−Ｈｉｎ−Ｆ２：  5’−CCC AAG CTT CGG GGG GTC CAC GCT GCG CCA T−3’（配列番号１６）、リバースプライマーＫ１２−Ｘｂａ−Ｒ１：  5’−GCT CTA GAC TCA AGA CGC CCC CGT GCG AGA−3’（配列番号１７）を用いて、宝酒造ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより配列番号１若しくは２の６２番目から１０３９番目のアミノ酸に相当する領域を増幅した。この断片を、プライマー中に含まれる制限部位（ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ）で切断し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで切断したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１に東洋紡社のＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いて挿入し、ｐＦＬＡＧ−ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を作製した。
【０１１１】
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２のｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１への組込み
Ｍａｒａｔｈｏｎ  ｃＤＮＡ  （Ｈｕｍａｎ  Ｓｔｏｍａｃｈ）を鋳型として、フォワードプライマーＫ１３−Ｅｃｏ−Ｆ１：  5’−GGA ATT CGA GGT ACG GCA GCT GGA GAG AA−3’（配列番号１８）、リバースプライマーＫ１３−Ｓａｌ−Ｒ１：  5’−ACG CGT CGA CCT ACA GCG TCT TCA TCT GGC GA−3’（配列番号１９）を用いて、宝酒造ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼにより配列番号３若しくは４の５７番目から９９８番目のアミノ酸に相当する領域を増幅した。この断片を、プライマー中に含まれる制限部位（ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ）で切断し、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで切断したｐｃＤＮＡ３．１に一旦挿入した。これをＥｃｏＲＩとＰｍｅＩで切断し、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の活性部位を含む断片をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＶ部位に東洋紡社のＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈを用いて挿入し、ｐＦＬＡＧ−ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を作製した。
【０１１２】
３．トランスフェクションとリコンビナント酵素の発現
１５μｇのｐＦＬＡＧ−ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１若しくはｐＦＬＡＧ−ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を、２×１０６のＣＯＳ−１細胞を１０％  ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で１晩培養したものにリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を用い、同社のプロトコールに従い導入した。４８時間から７２時間培養した上清を回収し、上清１０  ｍｌにＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０  ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２  ｍＭ）、抗Ｍ１レジン（シグマ社）（５０ μｌ）を混合し、４℃で一夜攪拌した。反応混合液を遠心分離して（３０００  ｒｐｍ、５分、４℃）ペレットを回収し、２  ｍＭのＣａＣｌ２・ＴＢＳを９００μｌ加えて再度遠心分離（２０００  ｒｐｍ、５分、４℃）し、ペレットを２００μｌ の1 ｍＭ  ＣａＣｌ２ ・ＴＢＳ に浮遊させ活性測定のサンプル（ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１若しくはＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素液）とした。
【０１１３】
酵素液は常法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロッテイングを行い、目的とするタンパク質の発現を確認した。抗体は抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ（Ａ−８５９２、ＳＩＧＭＡ社）を用いた。
【０１１４】
実施例２
本発明酵素を用いた活性測定
１．供与体基質の探索
各種単糖受容体基質の混合液に対し、酵素液５μｌと様々な供与体基質を用いて、本発明酵素の供与体基質の探索を行った。
【０１１５】
受容体基質は、Ｇａｌ−α−ｐＮｐ、Ｇａｌ−β−ｏＮｐ、ＧａｌＮＡｃ−α−Ｂｚ、ＧａｌＮＡｃ−β−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃ−α−ｐＮｐ、ＧｌｃＮＡｃ−β−ｐＮｐ、Ｇｌｃ−α−ｐＮｐ、Ｇｌｃ−β−ｐＮｐ、ＧｌｃＡ−β−ｐＮｐ、Ｆｕｃ−α−ｐＮｐ、Ｍａｎ−α−ｐＮｐ（以上、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）、Ｘｙｌ−α−ｐＮｐ、Ｘｙｌ−β−ｐＮｐ（以上、シグマ社）が各２．５  ｎｍｏｌ／２０μｌ含まれるように調製した。また、各種供与体基質（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、ＧＤＰ−Ｍａｎ、ＵＤＰ−ＧｌｃＡ、ＵＤＰ−ＸｙｌおよびＧＤＰ−Ｆｕｃ、何れもシグマ社）に対する反応液は表３にまとめたとおりである。
【０１１６】
【表３】
2005535340.tif 000004
【０１１７】
また、反応時間はすべて１６時間とした。反応後、ＳｅｐＰａｃｋ  Ｃ１８カラム（ウォーターズ社）で未反応の放射活性を有する供与体基質を除去し、受容体に取り込まれた供与体由来の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２とも、ＵＤＰ−ＧｌｃＡでも若干のバックグラウンドが見られたが、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを供与体基質に用いたときのみ、最も高い活性が検出できた。
【０１１８】
２．受容体基質の探索
さらに、受容体基質を調べる目的で、それぞれの受容体基質を単独で使用し（１０  ｎｍｏｌ／２０μｌ）、反応を行った。その結果、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の場合に２５６．２６ ｄｐｍ、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の場合に１２２１．２２  ｄｐｍと、ＧｌｃＮＡｃ−β−ｐＮｐを用いたときのみ、有意な放射活性が検出された。以上の結果から、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１およびＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は共にＧｌｃＮＡｃ−ＴにＧａｌＮＡｃを転移する糖転移酵素であることが明らかになった。
【０１１９】
３．至適ｐＨの検討
以上のように、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１およびＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２がＧｌｃＮＡｃにＧａｌＮＡｃを転移する糖転移酵素であることが明らかになった。そこで、両酵素の至適ｐＨを検討した。ここで用いた緩衝液はＭＥＳ（ｐＨ  ５．５、６．０、６．２６、６．５、６．７５）、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ６．７５、７．０、７．４）である。その結果、表４にまとめたように、ｐＨ  ６．５で活性が高くなる傾向がみられた。
表４  ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１およびＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の酵素活性における至適ｐＨの検討結果
【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
なお、ここでは、酵素を添加しない場合のブランク値に、ＭＥＳ（ｐＨ  ６．７５）のときの値（２６３．２１  ｄｐｍ）を採用した。また、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１でｐＨ  ７．４のときに最も高い値を示したが、必ずしも高いｐＨにすると活性も高くなるわけではないので、今後の実験にはＭＥＳ（ｐＨ  ６．５）を使用することにした。
【０１２２】
４．２価陽イオン要求性の検討
一般に、糖転移酵素には２価の陽イオンを要求するものが多い。そこで、各種２価陽イオンを添加して、それぞれの酵素の活性を検討した。その結果、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１ではＭｎ２＋、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２ではＭｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋を添加したときに高い活性を示した（表５参照）。これに対し、キレート剤であるＥＤＴＡを添加するとどちらの酵素も活性を示さなかった。以上の結果から両酵素が２価陽イオンを要求することが明らかになった。
表５  ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１およびＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の酵素活性における２価陽イオン要求性の検討結果
【０１２３】
【表５】
2005535340.tif 000006
【０１２４】
実施例３
ヒト種々組織での発現解析
ヒト正常組織のｃＤＮＡを用いて、定量的ＰＣＲにより該遺伝子の発現量を定量した。正常組織のｃＤＮＡとしてはクロンテック社の総ＲＮＡから逆転写を行ったものを使用し、株化細胞に関しては総ＲＮＡを抽出し、常法によりｃＤＮＡを作製し使用した。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の定量的発現解析に使用したプライマーはＫ１２−Ｆ３(5’−ctg gtg gat ttc gag agc ga−３’（配列番号２０）)、Ｋ１２−Ｒ３（5’−tgc cgt cca gga tgt tgg−3’（配列番号２１））、プローブはＫ１２−ＭＧＢ３（5’−gcg gta gag gac gcc−3’（配列番号２２））である。また、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の定量的発現解析に使用したプライマーはＫ１３−Ｆ３(5’−atc gtc atc act gac tat agc agt ga−3’（配列番号２３）)、Ｋ１３−Ｒ３（5’−gaa tgg cat cga tga ctc cag−3’（配列番号２４））、プローブはＫ１３−ＭＧＢ３（5’−ctc gtg aag gac ccg ca−3’（配列番号２５））である。プローブにはアプライドバイオシステムズ社のマイナーグルーブバインダーを結合したものを使用した。酵素および反応液にはＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ともにアプライドバイオシステムズ社）により反応液量２５μｌで定量を行った。定量の標準遺伝子としてはグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を使用し、既知濃度の鋳型ＤＮＡにより定量の検量線を作成し該遺伝子の発現量の標準化を行った。また、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１およびＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の標準ＤＮＡとして、ｐＦＬＡＧ−ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１およびｐＦＬＡＧ−ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を用いた。反応温度は５０℃２分、９５℃１０分の後、９５℃１５秒、６０℃１分を５０サイクル行った。結果を図１に示した。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１は神経系で、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は胃や精巣でそれぞれ発現量が高いことが明らかになった。
【０１２５】
実施例４
ヒト癌組織での発現解析
ヒト肺癌組織と同患者の肺正常組織での両遺伝子の発現を解析した。方法は実施例３と同様である。ただし、コントロール遺伝子としてβ-アクチン遺伝子を用い、定量にはアプライドバイオシステムズ社のPre-Developed TaqMan Assay Reagents Endogenous Control Human Beta-actinを使用した。その結果、殆どの患者で発現が上昇していた（図２）。この結果から、両遺伝子は少なくとも肺癌のマーカーとして用いることが可能であることが明らかになった。
【０１２６】
実施例５
受容体基質に対する糖転移酵素活性のアッセイ
ＧａｌＮＡｃ−Ｔアッセイの反応のために、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）、１ｍＭ  ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、及び５００μＭの各受容体基質を使用した。各反応混合物の２０μｌに対して酵素溶液１０μｌを添加し、様々な期間について３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、混合物をＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）でろ過し、１０μｌのアリコートをＯＤＳ−８０Ｔｓ ＱＡカラム（４．６×２０５ｍｍ；Ｔｏｓｏｈ、東京、日本）上で逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。１２％のアセトニトリルを有する０．１％  ＴＦＡ／水を流出液として使用した。紫外線分光光度計（吸光度２１０ｎｍにおける）、ＳＰＤ−１０Ａｖｐ（Ｓｈｉｍａｚｕ、京都、日本）を使用し、ピークを検出した。ピリジルアミノ標識糖鎖を受容体基質として利用した場合、５０ｎＭの基質を反応混合物に添加した。ピリジルアミノ標識糖鎖由来の生成物の解析のために、１００ｍＭ  酢酸／トリエチルアミン（ｐＨ４．０）を流出液として使用し、そして、流出液中の１％  １−ブタノールの３０−７０％の勾配で、流速１．０ｍｌ／分、５５℃で溶出した。
【０１２７】
反応生成物の２００μｇを１５０μｌのＤ２Ｏ中に溶解し、１Ｈ  ＮＭＲ実験の試料として使用した。１次元及び２次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをＤＭＸ７５０（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１Ｈ核に対して７５０．１３  ＭＨｚ）、及びＥＣＡ８００（ＪＥＯＬ、東京、日本、１Ｈ核に対して８００．１４  ＭＨｚ）分光計を用いて２５℃で記録した。より高いフィールド（４．５７６ｐｐｍ）におけるベンジル基のメチレンプロトンは、１Ｈ  ＮＭＲケミカルシフトの参照として試験的に使用した。
【０１２８】
受容体基質の特異性を調べるために、非還元末端のＧｌｃＮＡｃを含むＮ−及びＯ−グリカンを利用した。表６及び７に示すように、試験した全ての受容体基質はＧａｌＮＡｃ残基を受け入れることができた。
【０１２９】
【表６】
2005535340.tif 000007
【０１３０】
【表７】
2005535340.tif 000008
【０１３１】
１Ｈ  ＮＭＲ分光計を実行し、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２生成物の新規に形成したグリコシド結合を決定した。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２生成物の１次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを図５に示す。ＮＭＲスペクトルにおいて、シグナルの積分値（示さないが、Ｂｚの５つのフェニルプロトン、Ｂｚの２つのメチレンプロトン、２つのアノメリックプロトン、アノメリックプロトンを除く１２個の糖プロトン、２つのＮ−アセチル基の６つのメチルプロトン）は、ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｏ−Ｂｚの構造と良好に一致した。図５及び表８に示すように、２つのアノメリックプロトンは、８Ｈｚより大きなカップリング定数（Ｊ１，２）を有する非常に近接した磁場フィールドで共鳴を示した。これは、試料中の２つのピラノースがβ−グルコ−立体配置にあることを示した。全ての１Ｈシグナルは、ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、及びＮＯＥＳＹ実験の高分解検出後に割り当てることができた。より低いフィールドにおけるアノメリック共鳴は、試料中のベンジル基の２つのメチレンプロトンを有するＮＯＥを示し（データ示さず）、他方では、より高いフィールドにおけるアノメリックプロトンは、メチレンプロトンを有するＮＯＥを示さなかった（データ示さず）。この事実は、より低いフィールドにおけるアノメリックプロトンが基質のピラノース（β−ＧｌｃＮＡｃ、Ａとして定義される）のアノメリックプロトンに起因し、より高いフィールドにおけるアノメリックプロトンが転移されたピラノース（β−ＧａｌＮＡｃ、Ｂとして定義される）のアノメリックプロトンに相当することを意味する。試料の糖部分のケミカルシフト及びカップリング定数を図８に示す。Ｂ−４共鳴のケミカルシフト及びシグナルスプリッティングは、β−Ｇａｌの立体配置において特徴的であり（非特許文献１５を参照）、そして、Ａ１−Ａ６プロトンのケミカルシフトの次数は、ＬＮｎＴ（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）中のβ−ＧｌｃＮＡｃの観察されたスペクトルに特徴的に類似していた。図６に示すように、Ｂ１とＡ４との間の弱いＮＯＥクロスピークとＢ１と２つのＡ６との間の非常に弱いＮＯＥクロスピークが、Ｂ１とＢ５との間、及びＡ１とＡ５との間の強い内部の残余ＮＯＥに加えて観察された。これらは、２つのピラノース間のβ１−４結合の存在を示唆している。即ち、ＮＭＲ実験の結果は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２による生成物がＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ−Ｏ−Ｂｚであることを明確に示した。
【０１３２】
【表８】
2005535340.tif 000009
【０１３３】
実施例６
アシアロ／アガラクト−ス−ウシ胎児フェツインに対するＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２のＬａｃｄｉＮＡｃ合成活性
表６及び７に示すように、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１及び−Ｔ２は共に、Ｏ−及びＮ−グリカン基質の両方に対してＧａｌＮＡｃを転移した。ＬａｃｄｉＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ）基質は、ヒトのいくつかの糖タンパク質のＮ−グリカンに見出されている。従って、糖タンパク質にＧａｌＮＡｃを転移するＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２の活性を測定するために、Ｎ−及びＯ−グリカンの両方を有するウシ胎児フェツイン（ＦＣＦ）を受容体基質として利用した。
【０１３４】
ウシ胎児フェツイン（ＦＣＦ）、ノイラミニダーゼ、β１−４ガラクトシダーゼ、及びグリコペプチダーゼＦは、それぞれＳｉｇｍａ、Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ（京都、日本）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、及びＴａｋａｒａから購入した。アシアロ／アガラクト−ＦＣＦは、４μＵのノイラミニダーゼ及び１２μＵのβ１，４−ガラクトシダーゼを用いて、３７℃で１６時間インキュベートすることによって２００μｇのＦＣＦから調製した。ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２による糖タンパク質へのＧａｌＮＡｃの転移は、グリコシダーゼ処理によって製造した５０μｇのアシアロ／アガラクト−ＦＣＦを含む標準反応混合物の２０μｌにおいて行った。３７℃で１６時間インキュベート後、反応混合物の各５μｌは、取扱い説明書に従って、グリコペプチダーゼＦ（ＧＰＦ）で消化した。転移したＧａｌＮＡｃを検出するために、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合レクチン、Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｎ（ＷＦＡ）（ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ、ＣＡ）を使用した。１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した１μｌの反応混合物をニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に転写し、０．１％  ＨＲＰ結合ＷＦＡレクチンで染色した。増強したケミルミネッセンス（ＥＣＬ）及びＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてシグナルを検出した。
【０１３５】
図３に示すように、アシアロ／アガラクト−ＦＣＦは、約５５及び６０ｋＤａのバンド（レーン１）として出現した。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、アシアロ／アガラクト−ＦＣＦに効果的にＧａｌＮＡｃを転移した（レーン５）。さらに、バンドは、ＧＰＦ処理によってほとんどが消失し、その分子サイズは、クーマシー染色によって約４５及び５５ｋＤａの位置で検出された（図３、レーン３及び６）。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の場合は、アシアロ／アガラクト−ＦＣＦに対する活性は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２と同じであった（データは示さず）。
【０１３６】
実施例７
ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１及びＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２遺伝子をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞由来のグリコデリンのＮ−グリカン構造の解析
上述したように、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１及びＮＧａｌＮＡＣ−Ｔ２の両方は、モノ−及びオリゴ糖鎖受容体上にＬａｃｄｉＮＡｃ構造を合成することができた。実際、ＬａｃｄｉＮＡｃ構造は、いつくかの糖タンパク質にＮ−グリカンで存在することが知られている。したがって、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＬａｃｄｉＮＡｃ構造を担持する主な糖タンパク質の１つであるグリコデリン上にＬａｃｄｉＮＡｃを構築するＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１の能力を調べた。ＣＨＯ細胞をこの目的のために使用した。これは、ＣＨＯ細胞において生産されるグリコデリンには、全くＬａｃｄｉＮＡｃをベースとする鎖がないためである。
【０１３７】
グリコデリン発現ベクターをＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１又は−Ｔ２遺伝子を発現するＣＨＯ細胞のトランスフェクトし、培地は、４８時間の培地から集めた。グリコデリンは、ＷＦＡアフィニティーカラムを用いて培地から回収した。回収したグリコデリンをＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、ＷＦＡを用いてレクチンブロッティングに使用した。
【０１３８】
図７に示すように、非還元末端のＧａｌＮＡｃは、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１又は−Ｔ２遺伝子がグリコデリン遺伝子と共にトランスフェクトした場合にのみ検出された。これらのバンドは、Ｎ−グリカナーゼＴＭ処理によって消失した。したがって、これらのＧａｌＮＡＣ残基はＮ−グリカンに存在し得る。
【０１３９】
実施例８
本発明のマウスタンパク質の調製
１．新規なマウスのＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼの塩基配列のデータベース検索と決定
マウスゲノムデータベース（ＵＣＳＣ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎｏｖ．２００１  ｍｏｕｓｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｒｃｈｉｖｅｄ  Ｓｅｐ．１５，２００２，ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ａｒｃｈｉｖｅ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）を介した類似遺伝子の検索を既存のヒトＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１及び−Ｔ２に対する遺伝子を用いて行った。使用した配列は、配列番号１、３、２６、及び２８であった。Ｂｌａｓｔ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］のようなプログラムを用いて検索を行った。
【０１４０】
結果として、２つのホモロガスな遺伝子がマウスの７番と６番染色体上に見出された。７番染色体の第一の遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は、ヒトＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１のオルソログであり、配列番号２６と２８に示した。６番染色体の第二の配列は、配列番号２７と２９に記載した。
【０１４１】
２．ＧａｌＮＡｃ−Ｔ遺伝子の発現ベクターへの組込み
マウスＮＧａｌＮＡｃ−Ｔの各々の発現系を調製するために、各遺伝子の一部をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ１（Ｓｉｇｍａ）にまず組み込んだ。
【０１４２】
ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１のｐＦＬＡＧ−ＣＭＡＶ１への組込み
推定の触媒ドメイン（アミノ酸４５−１，０３４）をコードするマウスＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１）遺伝子を２つのプライマー、５’−ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＴＡＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＧＡＴ−３’（配列番号３１）、及び５’−ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＧ  ＣＴＧ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  Ａ−３’（配列番号３２）を用い、鋳型としてマウス脳由来のｃＤＮＡを使用して増幅した。マウス脳からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを調製し、その後、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲでは、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。増幅した２．７ｋｂの断片は、エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｂａ  Ｉで消化し、その後、消化した断片をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１に挿入し、ｐＦＬＡＧ−ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１を構築した。
【０１４３】
ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２のｐＦＬＡＧ−ＣＭＡＶ１への導入
推定の触媒ドメイン（アミノ酸５７−９８６）をコードするマウスＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２）遺伝子を２つのプライマー、５’−ＣＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＧＧＡ  ＡＣＣ−３’（配列番号３３）、及び５’−ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＣ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＧＡ−３’（配列番号３４）を用い、鋳型としてマウス胃由来のｃＤＮＡを使用して増幅した。マウス胃からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを調製し、その後、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲでは、ＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用した。増幅した２．７ｋｂの断片は、エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏＲ  Ｉで消化し、その後、消化した断片をｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１に挿入し、ｐＦＬＡＧ−ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を構築した。
【０１４４】
３．組換え酵素のトランスフェクション及び発現
１５μｇのｐＦＬＡＧ−ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１又はｐＦＬＡＧ−ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２を１０％  ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＮ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）中で一晩培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞２×１０６にリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．）を同会社によるプロトコール通りに使用して導入した。４８−７２時間の培養上清を回収した。上清をＮａＮ３（０．０５％）、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）、及び抗Ｍ１レジン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）（５０μｌ）と混合し、混合物を一晩撹拌（３０００ｒｐｍ、５分、４℃）し、ペレットを回収した。ペレットを２ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＴＢＳの９００μｌと一緒にして再度撹拌し（２０００ｒｐｍ、５分、４℃）、その後、ペレットを１ｍＭ  ＣａＣｌ２／ＴＢＳの２００μｌに懸濁し、活性を測定するための試料を提供する（ｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１又はｍＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２酵素溶液）。
【０１４５】
酵素を慣用的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングに供し、意図されるタンパク質の発現を確認した。抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ペルオキシダーゼ抗体（Ａ−８５９２、ＳＩＧＡＩＡ  Ｃｏ．）を抗体として使用した。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明により、Ｎ−アセチルグルコサミンにＮ−アセチルガラクトサミンをβ１−４結合を介して転移する酵素が単離され、その遺伝子の構造が明らかにされた。したがって、該酵素等の遺伝子工学的な生産や該酵素による糖鎖の生産、該遺伝子らに基づく疾患の診断が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、ヒト各種組織におけるＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１またはＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法により定量した結果を示す。縦軸はコントロールのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現量に対するＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１またはＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２遺伝子の発現量の相対比を表す。各組織におけるＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１遺伝子の発現は黒バーで示し、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２遺伝子の発現は白バーで示す。
【図２】図２は、ヒト肺癌組織と正常組織におけるＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１（パネルＡ）またはＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２（パネルＢ）遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法により定量した結果を示す。縦軸はコントロールのヒトβ−アクチン遺伝子の発現量に対するＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１またはＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２遺伝子の発現量の相対比を表す。横軸は、各患者の番号を示す。正常組織を白バー、癌組織を黒バーで示す。
【図３】図３は、アシアロ／アガラクト−ウシ胎児フェツインに対するＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２のＬａｃｄｉＮＡｃ合成活性を示す。アシアロ／アガラクト−ＦＣＦは、約５５及び６０ｋＤａのバンドとして出現する（レーン１）。ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２は、ＧａｌＮＡｃをアシアロ／アガラクト−ＦＣＦに効率的に転移する（レーン５）。バンドの大部分はＧＰＦ処理により消失した（レーン６）。
【図４】図４は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１及びＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２遺伝子をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞からグリコデリンのＮ−グリカン構造の合成を示す。非還元末端のＧａｌＮＡｃは、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ１又はＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２遺伝子がグリコデリン遺伝子とともにコトランスフェクトされた場合のみ検出される。
【図５】図５は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によって生成されたＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌａｃＮＡｃ−Ｏ−Ｂｚの構造の１次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】図６は、ＮＧａｌＮＡｃ−Ｔ２によって生成されたＧａｌＮＡｃβ１−４ＧｌａｃＮＡｃ−Ｏ−Ｂｚの構造の２次元１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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