(57)【要約】少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、少なくとも1つの標的核酸を選択的に増幅させるための方法。本方法は、少なくとも1つの標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、核酸の変性工程；および、少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、少なくとも1つの標的核酸を選択的に増幅させるための方法であって、
標的核酸が非標的核酸の融解点よりも低い融解点を有し、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、少なくとも1つの標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程を含む方法。
【請求項２】
前記増幅プライマーがフォワードプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅プライマーがリバースプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程で少なくとも1つのフォワードおよび1つのリバースプライマーを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換反応（SDA）核酸配列に基礎をおいた増幅法 (NASBA)、ライゲーションPCR、およびローリングサークル増幅（RCA）からなる群から選択する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅工程をPCR等を用いて行う、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅工程をリアルタイムPCRを用いて行う、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記変性工程を、標的核酸と非標的核酸の融解温度の間の温度で行う、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸を増幅させるために、前記変性工程を、非標的核酸の融解温度より低い温度であるが、標的核酸の融解温度で、または、十分に超える温度で行う、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
異なるが関連している核酸配列を選択的に増幅するための方法であって、前記差異が、少なくとも1つの標的核酸と少なくとも1つの非標的核酸の間における1つ以上の欠失、付加および/または塩基変化である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
【請求項１３】
2つ以上の標的種（標的核酸）および1つ以上の非標的種（非標的核酸）から得られた核酸混合物を含むサンプル中の、種の選択および/または同定方法であって、
標的核酸が非標的核酸の融解点よりも低い融解点を有し、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、少なくとも1つの標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程に前記サンプルを供すること；および
増幅産物の存在を決定すること；
を含む方法。
【請求項１４】
前記種を動物種、細菌種、真菌種および植物種から選択する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記種の集団中の1種以上の種を選択するために使用するときの、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
劣勢種の融解点が優勢種の融解点よりも低い場合において、劣勢種および優勢種からの核酸の混合物である単離核酸の選択的増幅のために使用するときの、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸がDNAである、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸がRNAである、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記種が細菌種である、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
標的核酸の増幅の間において、望まない、または偽増幅産物を抑制し、または除去するための方法であって、
望まない産物の融解温度が標的核酸の融解温度よりも高く、
望まない偽産物の増幅を実質的に抑制するために、標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、望まない産物の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程を含む方法。
【請求項２２】
望まない増幅産物が非変換のまたは部分的に変換された核酸であり、前記標的核酸を化学処理に供して、変換した核酸を産生する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記標的核酸を重亜硫酸塩との処理に供し、前記望まない増幅産物が重亜硫酸塩と部分的に、または、不完全に反応した核酸に由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、少なくとも1つの標的核酸を選択的に増幅させるための方法であって、
(a) 標的核酸の融解温度が非標的核酸の融解温度よりも低く、標的核酸および非標的核酸の相対的融解温度が変化するように、標的核酸および/または非標的核酸を修飾する工程；および
(b) 非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、工程(a)の標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、工程(a)の少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く増幅工程；
を含む方法。
【請求項２５】
工程(a)前に、前記少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸の融解温度が実質的に同じであり、前記化学修飾工程により標的核酸および非標的核酸の相対的融解温度に差異を生じさせる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程(a)前に、前記標的核酸が非標的核酸より低い融解温度を有しており、工程(a)での修飾により標的核酸と非標的核酸の間の融解温度の差異を増大させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾が少なくとも1つの塩基対の変換である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】
修飾化剤が重亜硫酸塩である、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾により非メチル化シトシンを修飾して、変換した核酸を産生する、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
更に、標的核酸を単離する工程、および、任意に、単離した標的核酸を配列解析に供する工程を含む、請求項１から１２、２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
(i) 異常な低いメチル化核酸を含み、任意にメチル化核酸を含むと疑われるサンプルを重亜硫酸塩処理に供する工程；
(ii) 選択的増幅が1サイクル以上の核酸変性工程を含み、
異常な低いメチル化核酸を含む核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、メチル化核酸を含む核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
核酸の選択的増幅を行う工程；および
(iii) 増幅核酸の存在を決定する工程；
を含む、核酸の異常な低いメチル化のためのアッセイ。
【請求項３２】
対象の病気または癌の診断または予後アッセイであり、前記病気または症状が核酸の異常な低メチル化により特徴付けられ、
(i) 対象から採取した核酸サンプルを重亜硫酸塩と反応させる工程；
(ii) 選択的増幅が、1サイクル以上の増幅工程に先立つ変性工程を含み、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、異常な低いメチル化核酸を含む標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、メチル化または実質的にメチル化された非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
(i)由来の核酸の選択的増幅を行う工程；および
(iii) 増幅核酸の存在を決定する工程；
を含むアッセイ。
【請求項３３】
前記症状または病気が癌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌が、肺癌、乳癌、子宮頚部形成異常および頚癌、大腸癌、前立腺癌および肝臓癌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換反応（SDA）核酸配列に基礎をおいた増幅法 (NASBA)、ライゲーションPCR、およびローリングサークル増幅（RCA）からなる群から選択する、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記増幅工程をPCR等を用いて行う、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記増幅工程をリアルタイムPCRを用いて行う、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法に関する。本方法は、特に、新規の選択的核酸増幅方法に関し、これらの方法の適用に関する。                   
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、二本鎖DNAの変性、次にオリゴヌクレオチドプライマーのDNA鋳型へのアニーリング、DNAポリメラーゼによるプライマーの伸長の反復サイクルに基づく(例えばMullis他の米国特許第4,683,195号、第4,683,202号および第4,800,159号を参照のこと)。PCRで使用するオリゴヌクレオチドプライマーは、DNAの反対側の鎖をアニーリングするために設計されており、DNAポリメラーゼ触媒による1つのプライマーの伸長産物が、他のプライマー用の鋳型の鎖として働くことができるように配置される。PCR増幅法によって、別個のDNAの指数的増加がもたらされ、その長さはオリゴヌクレオチドプライマーの5'末端によって定義される。
【０００３】
PCRにおいて、反応条件は、3つの温度（二本鎖DNA断片を融解（変性）するための高温（通常90から100℃）に続き、DNAへのプライマーの特異的なアニーリングを促進するのに選択される温度（通常50から70℃）が続き、最後に、DNAポリメラーゼによる伸長に適した温度（通常62から72℃）で反応させる）の間を定期的にサイクルする。プライマー、アニーリング温度および緩衝液条件の選択が、標的配列の特異的な増幅を付与するのに用いられる。
【０００４】
その開示の全容が参照により本明細書に組み込まれている、2003年2月25日に出願された「ヘッドループDNAの増幅」という表題の本発明者らの同時係属の国際出願において、本発明者らは、非標的核酸中の逆向き反復配列である領域を含むプライマーを使用して、核酸を選択的に増幅させるための方法を記載する。
【０００５】
本発明により、核酸の選択的増幅が融解温度を変化することによって達成することができることを発見した。PCR生成物の融解温度は、その長さ（長さが増すほど融解温度が上がる）およびその塩基組成（G+C含量が増すほど融解温度が上がる）に依存する。本質的に、本発明者は、変性のための温度よりも高い融解温度を有するDNA断片の増幅が抑制されることに気づいた。我々が知る限り、融解プロファイル(melting profile)の違いは以前からPCR増幅産物を区別および/または同定するのに用いられてきた一方で、融解温度の違いは選択的増幅をもたらすのに用いられていなかった。
【特許文献１】Mullis他の米国特許第4,683,195号
【特許文献２】Mullis他の米国特許第4,683,202号
【特許文献３】Mullis他の米国特許第4,800,159号
【特許文献４】2003年2月25日に出願された「ヘッドループDNAの増幅」という表題の本発明者らの同時係属の国際出願
【特許文献５】国際特許出願公開no.WO99/55905
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第一の側面として、本発明は、少なくとも1つの標的核酸（非標的核酸の融解点よりも低い融解点を有する）および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプルにおいて、少なくとも1つの標的核酸を選択的に増幅する方法を供給する。本方法は、1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程を含み、非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、変性工程は、少なくとも1つの標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で行う。
【０００７】
核酸はDNAとすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の方法は、1つのプライマーの使用を含むことができるが、増幅は「指数的」であることが好ましく、したがって一般に「フォワード」および「リバース」プライマーと呼ばれる1対のプライマーを使用することができ、これらのプライマーの1つは核酸鎖と相補的であり、そのもう1つはその鎖の相補鎖と相補的である。
【０００９】
本発明の方法は、メチル化特異的プライマーの使用を含むことができる。
【００１０】
本方法の増幅工程は、適切な増幅技法によって行うことができる。
【００１１】
増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換反応（SDA）、核酸配列に基礎をおいた増幅法（a nucleic acid sequence-based amplication(NASBA)）、ライゲーションPCR（ligation-mediated PCR）、およびローリングサークル増幅（RCA）によって達成することができる。
【００１２】
好ましくは、増幅技術は、PCR等である。PCRは、これに限定するものでないが、リアルタイムPCRを含む、任意のPCR技術としうる。
【００１３】
本発明の選択的増幅方法は、標的および非標的核酸の間の融点が異なる、標的および非標的核酸を含む任意のサンプルにおいて、実施することができる。この融点の違いは、核酸に固有とすることができ、あるいは、1つおよび/または両方の標的および非標的核酸の修飾によって生じさせることができ、あるいは、増加させることができる。この修飾は、化学的修飾、例えば、核酸の融点の変化に影響を与える1以上の核酸塩基の変換によって、行うことができる。化学的修飾の例は、以下により詳細に記す、重亜硫酸ナトリウムである。
【００１４】
用いる変性温度は、好ましくは標的および非標的核酸の融解温度の間である。より好ましくは、変性を行う温度は、標的核酸を増幅させるために、非標的核酸の融解温度より低いが、標的核酸の融解温度と同じか高い温度である。
【００１５】
本発明の選択的増幅は、広い範囲の可能性ある応用を有する。例えば、短いDNA断片を増幅することによって、本発明は、少量の欠失および塩基変化、および、選択的増幅のための、異なるが関連するDNA配列（例えば多重遺伝子ファミリー）の検出に適用できる。もしもプライミング部位が標的および非標的と一致するならば、重要であろう。本発明の方法は、また、変異および多型の診断解析に、および、個々の関連遺伝子群の解析に適用できる。本発明は、また、混合したDNAサンプル中の特定の種のゲノムに由来する遺伝子の選択的増幅に適用することができる。
【００１６】
更に、本発明は、また、望む生成物よりも高い融解温度を有する、PCR反応に共通に見られる偽PCR生成物の増幅を抑制するのに用いることができる。
【００１７】
本方法の変性工程は、通常のPCRよりも低い温度で行うので、より低い融解温度を使用することによって、ポリメラーゼ酵素がよりゆっくりと活性を失い、可能性としてより少ない量で使用できることを意味する点において更なる優位性がある。
【００１８】
増幅工程前に、本発明の方法は、少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸の相対的な融解温度を変化させるために、サンプル中の核酸を少なくとも1つの修飾化剤に接触させる工程を含むことができる。
【００１９】
修飾化剤による修飾により、標的核酸および非標的核酸の間の融解温度の差異を増大することができる。
【００２０】
したがって、第二の側面において、本発明は、サンプル中の標的核酸および/または非標的核酸を修飾工程に供して、標的核酸および非標的核酸の間の融解温度の差異を生じさせる、あるいは、増大させる、第一の側面の発明を供給する。
【００２１】
好ましくは、修飾工程により、標的核酸の融解温度を減じさせる。
【００２２】
好ましくは、修飾工程により、少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸の相対的融解温度を変化させる。少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸の融解温度が実質的に異ならない場合、修飾工程により、融解温度の差異を増すことができる。修飾工程により、少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を、異なる程度で修飾することができる。
【００２３】
修飾は、核酸の化学的修飾とすることができる。核酸は、メチル化および非メチル化シトシンを含むことができる。
【００２４】
それゆえ、第三の側面においては、本発明は、サンプル中の核酸を、非メチル化シトシンを修飾して変換した核酸を生成する修飾化剤と接触させる、第二の側面の発明を供給する。
【００２５】
修飾化剤は、重亜硫酸塩とすることができる。
【００２６】
例えば、本発明の方法は、重亜硫酸塩処理したDNAの増幅の特異性を改良することに特に適用できる。PCRにおけるDNA断片を変性するのに用いる温度を下げることによって、我々は、望む標的よりも高い融解温度を有する望ましくない生成物を取り除き、あるいは、抑制することができるようになった。このような生成物は、変換されていない又は部分的に変換されたDNAであろう。
【００２７】
本発明は、重亜硫酸修飾DNAへの適用に制限されないことが理解されよう。
【００２８】
特に、しかしながら限定するわけではない本発明の方法の適用として、異常な低いメチル化(under-methylation)を含む、核酸配列内の部位異常をアッセイまたは検出することがある。
【００２９】
遺伝子発現の研究によって、以前に、遺伝子の制御領域のメチル化と、多様な形態の癌を含む多くの病気または症状の間に強い相関性が示された。実際、いくつかの病気は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GSTP1)遺伝子および/またはその制御フランキング配列内の部位でのシトシンの異常なメチル化によって特徴付けられる。GSTP1遺伝子の異常メチル化の効果は、WO9955905内で開示されており、すべての開示を参照により本出願に組み込む。
【００３０】
不十分なメチル化および/または異常なDNAのメチル化は、癌を含む様々なヒトの病状の発症に関わっていた。低メチル化形態での異常なメチル化は、病気および癌に関連している。低メチル化が関連している癌の例としては、肺癌、乳癌、子宮頚部形成異常および頚癌、大腸癌、前立腺癌および肝臓癌がある。例として、Cui et al, Cancer Research, Vol. 62, p 6442, 2002; Gupta et al, Cancer Research, Vol.63, p 664, 2003; Scelfo et al, Oncogen, Vol.21, p2654を参照せよ。 
【００３１】
本発明の方法は、低いメチル化である、異常なメチル化のためのアッセイとして使用することができる。
【００３２】
従って、他の側面において、本発明は、核酸の異常な低いメチル化のためのアッセイを供給する。本アッセイは、
i)単離した核酸を重亜硫酸塩と反応させる工程；
ii)選択的増幅が、増幅工程前に、1以上の変性工程のサイクルを含み、非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、変性は、異常に低くメチル化された核酸を含む標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、メチル化された、または、実質的にメチル化された非標的核酸の融解温度より低い温度で行う、(i)由来の核酸の選択的増幅を行う工程；および
iii)増幅した核酸の存在を決定する工程；
を含む。
【００３３】
核酸はDNAとすることができる。
【００３４】
他の側面において、本発明は、核酸の異常な低いメチル化によって特徴付けられる、対象となる病気または癌のための診断または予後アッセイを供給する。本アッセイは、
i)単離した核酸を重亜硫酸塩と反応させる工程；
ii)選択的増幅が、増幅工程前に、1以上の変性工程のサイクルを含み、非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、変性は、異常に低くメチル化された核酸を含む標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、メチル化された、または、実質的にメチル化された非標的核酸の融解温度より低い温度で行う、(i)由来の核酸の選択的増幅を行う工程；および
iii)増幅した核酸の存在を決定する工程；
を含む。
【００３５】
後者の側面のアッセイは、低いメチル化の核酸によって特徴付けられる癌の診断または予後に用いることができる。癌は、肺癌、乳癌、子宮頚部形成異常および頚癌、大腸癌、前立腺癌および肝臓癌とすることができる。
【００３６】
用語
本出願で使用する、用語「プライマー」は、ヌクレオチドおよび重合剤の存在下において合成の開始点として働くことができる、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。プライマーが二本鎖である場合、それらの鎖は、増幅反応前に分離させる。本発明で使用するプライマーは、それらが増幅させる異なる鎖の配列と充分相補的であり、したがってプライマーが、増幅反応条件下においてその配列の鎖とハイブリダイズすることができるように選択する。したがって、非相補的塩基または配列をプライマー中に含めることができる。ただしそのプライマーは、対象配列と充分相補的であり、その配列とハイブリダイズするものとする。
【００３７】
オリゴヌクレオチドプライマーは、当分野でよく知られている方法によって作製することができ、あるいは生物源から単離することができる。固形支持体上でオリゴヌクレオチドプライマーを合成するための1つの方法が、米国特許第4,458,068号中に開示されており、その開示は参照により本出願に組み込まれている。
【００３８】
「核酸」は、二本鎖または一本鎖DNAまたはRNA、あるいは二本鎖DNA-RNAハイブリッドおよび/またはその類似体および誘導体であってよい。PCRにおいては、「鋳型分子」は、反応に加える核酸の断片または画分であってよい。詳細には「鋳型分子」は、2つのプライマー間の、およびそれらを含めた配列を指す。特異的な配列の核酸は、ヒト、哺乳動物、脊椎動物、昆虫、細菌、真菌、植物およびウイルスを含めた任意のいくつかの源に由来するものであってよい。いくつかの実施形態では、標的核酸は、診断のような医学または法医学目的、DNAフィンガープリント等のために、その有無を利用することができる核酸である。任意の核酸は本発明を使用して増幅させることができる。ただし、配列の両端の充分な数の塩基が知られており、したがって、増幅させる配列の異なる鎖とハイブリダイズするであろう、オリゴヌクレオチドプライマーを作製することができるものとする。
【００３９】
用語「PCR」は、ポリメラーゼ連鎖反応を指し、これは熱サイクル式の、ポリメラーゼを用いたDNA増幅反応である。PCRは典型的には、鋳型分子、鋳型分子のそれぞれの鎖と相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、耐熱性DNAポリメラーゼ、およびデオキシリボヌクレオチドを含み、元の核酸の増幅を行うために多数回繰り返される3つの異なる方法を含む。この3つの方法(変性、ハイブリダイゼーション、およびプライマー伸長)は、異なる温度で、および、異なる時間の工程において行われることが多い。しかしながら、多くの実施形態で、ハイブリダイゼーションとプライマー伸長法は、同時に行うことができる。
【００４０】
用語「デオキシリボヌクレオシド三リン酸」は、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPまたは他の類似体を指す。
【００４１】
本出願で使用する、用語「重合剤」は、それを使用してプライマーの伸長産物を合成することができる、任意の化合物またはシステムを指す。適切な化合物には、耐熱性ポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼI、大腸菌DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、T4DNAポリメラーゼ、T7DNAポリメラーゼ、T.litoralisのDNAポリメラーゼ、および逆転写酵素だけには限られないが、これらがある。
【００４２】
「耐熱性ポリメラーゼ」は、100℃近い温度などの極端に高い温度に耐えることができる、DNAまたはRNAポリメラーゼ酵素を指す。耐熱性ポリメラーゼは、Thermus aquaticusなどの、極端な温度中に生息する生物に由来することが多い。耐熱性ポリメラーゼの例には、Taq、Tth、Pfu、Vent、deep vent、UlTmaおよびその変異体および誘導体がある。
【００４３】
「大腸菌DNAポリメラーゼI」は、細菌である大腸菌のDNAポリメラーゼIホロ酵素を指す。
【００４４】
「クレノウ断片」は、DNAポリメラーゼIホロ酵素の2つのタンパク質分解断片の大きな方を指し、その断片はポリメラーゼ活性を保持しているが、元の酵素に関連した5'-エクソヌクレアーゼ活性は失っている。
【００４５】
「T7DNAポリメラーゼ」は、バクテリオファージT7からのDNAポリメラーゼ酵素を指す。
【００４６】
「標的核酸」は、ヒト、哺乳動物、脊椎動物、昆虫、細菌、真菌、植物およびウイルスを含めた任意のいくつかの源に由来する、特異的な配列の核酸を指す。いくつかの実施形態では、標的核酸は、診断のような医学または法医学目的、DNAフィンガープリント等のために、その有無を利用することができる核酸である。標的核酸配列は、より大きな核酸に含まれることができる。標的核酸は、約30から1000以上の塩基対のサイズ幅とすることができる。標的核酸は、元の核酸またはその増幅産物とすることができる。
【００４７】
「非標的核酸」は、標的核酸と同じプライマーを用いることによってプライミングすることができる、ヒト、哺乳動物、脊椎動物、昆虫、細菌、真菌、植物およびウイルスを含めた任意のいくつかの源に由来する、特異的な配列の核酸を指す。いくつかの実施形態では、非標的核酸は、診断のような医学または法医学目的、DNAフィンガープリント等のために、その有無を利用することができる核酸である。非標的核酸は、核酸配列内の1以上の塩基を変換するようにデザインした化学反応の後、変換されていない、または、部分的に変換された配列であろう。非標的核酸配列は、より大きな核酸に含まれることができる。非標的核酸は、約30から1000以上の塩基対のサイズ幅とすることができる。非標的核酸は、元の核酸またはその増幅産物とすることができる。
【００４８】
本発明をより容易に理解するために、我々は、以下に非限定的な実施例を提供する。
【実施例】
【００４９】
（実施例１）
特異的な細菌DNAの選択的増幅
本発明が任意のタイプのDNA配列に適用できることを調べるために、我々は、異なる細菌種に由来するリボゾームDNAのディファレンシャルな増幅にどのように適用できるかを示した。
【００５０】
16SリボゾームDNAの増幅は、細菌種の同定において使用されることが多く、多数の種の配列が決定されてきている。いくつかの充分に保存された領域の存在が、ほぼすべての細菌リボゾームDNAの増幅用の、プライマー対の設計を可能にしている。図１は、3つの細菌種、大腸菌、SalmonellaおよびSulfobacillus thermosulfidooxidansの16SリボゾームRNAの標的領域、および、プライマーが結合する領域の配列を示す。それぞれの種の細菌のrDNAは、以下に記すフォワードおよびリバースプライマーを用いて増幅した。
【００５１】
【表１】
2005518216.tif 000002
【００５２】
以下のものを含む25μl中における、PCR反応を設定した。
2×PCRマスターミックス(Promega)    12.5μl
フォワードプライマー              0.8μl
リバースプライマー                0.8μl
DNA                               1.0μl
水                                  9.9μl
【００５３】
反応は、Eppendorf Mastercycler装置上で行った。高い（95℃）変性温度を用いた4サイクルの後に、その後に続くサイクルに変性工程のために、ブロックにわたり、温度勾配をかけた。早いラウンドでのより高い温度により、明確なサイズのPCR生成物の存在に先立ち、より長いゲノムDNA断片の完全な変性が保障される。サイクル条件を以下に示す。
【００５４】
【表２】
2005518216.tif 000003
【００５５】
84から93℃の変性温度の幅にわたるPCR反応を、アガロースゲル電気泳動によって解析した（図２）。S. thermosulfidooxidans由来のrDNAは、変性温度が90.2℃以上の反応においてのみ増幅し、大腸菌は87.2℃を超える温度、Salmonellaは85.7℃を超える温度で増幅する。S. thermosulfidooxidans、大腸菌およびSalmonellaのG+C含量は、それぞれ63.2％、55.4％および53.9％である。271bpの大腸菌増幅産物は、Salmonellaに比べて、たった4つ多いG/Cペアを有しているだけだが、これはSalmonellaのrDNAの選択的増幅が可能な、変性温度の十分な差異をもたらす。
【００５６】
大腸菌およびS. thermosulfidooxidansのDNA混合物の増幅
S. thermosulfidooxidans由来のDNAの大過剰存在下における、大腸菌のrDNAの選択的増幅を図３に示す。50fgの大腸菌のrDNA増幅産物を、段階的に量を増やしたS. thermosulfidooxidansの増幅産物（50fgから50pg）と混合し、比率を1:1から1:1000とする混合物を得た。同様に10fg:50pgの混合物も得た。その後、87.2℃または91.2℃の変性温度を用いた30サイクルの増幅を行った。高い変性温度を用いる場合、融解曲線から求めた増幅産物の相対的な量は、大腸菌およびS. thermosulfidooxidansのDNAのインプットレベルに近似する−最上段のパネルでは均等なレベルで、インプットが1:10の時は、はっきりそれとわかる大腸菌増幅産物が存在し、1:100の割合より多い場合は、実質的にS. thermosulfidooxidansのピークだけになる。87.2℃の変性温度でPCRを行うと、増幅産物のプロファイルが劇的にシフトする。インプットDNAにおいて5000倍過剰に存在する場合であっても、S. thermosulfidooxidansの増幅産物に対応する融解プロファイルを有する増幅産物が原則的に存在しない。大腸菌のDNAの増幅は、全てのインプット割合で明確であるが、プライマーダイマー（融解プロファイルの左のブロードなピーク）の実質的な量の増幅により、大腸菌の反応性生物の増加の最終的なレベルが制限されるように思われる。S. thermosulfidooxidansのrDNA増幅産物の融解温度より低いPCRの変性温度を選択することによって、S. thermosulfidooxidansに比較して大腸菌のrDNAの少なくとも5000倍優先的な増幅を得ることができたことは明白である。
【００５７】
過剰の大腸菌が存在している中でのSalmonellaの検出
大腸菌およびSalmonella細菌の異なる割合の混合物に由来するDNAに、ディファレンシャルな融解温度PCRを適用した。混合物は、50ulの10mM Tris、pH8.0、1mM EDTA中で、104、105および106の大腸菌と、104のSalmonellaを混ぜて、10分間ボイルして調製した。細菌の残がいを、15分間、微量遠心管内で遠心分離して除去した。4ulのそれぞれの上清をPCRミックスに加え、86.3℃の変性温度で、前記のようにPCRを行った。非選択的な変性温度（95℃）を用いて、追加の4サイクルのPCRによりα-32P dATPを組み込んだ後、生成物を制限酵素切断によって解析した。図４に示すように、Salmonella増幅産物に対応する制限酵素断片（矢印）は、Salmonellaと大腸菌の比率が1:1および1:10では圧倒的に多かったが、比率が1:100の場合は大腸菌の増幅産物（アスタリスク）と比較して少なかった。本データは、SalmonellaのrDNAの増幅産物が約30倍優先的に増幅されたことを示す。融解温度の小さな差異を付与するならば、
種間の差異を最大とする、より小さな増幅産物を生じるプライマーを選ぶことによって、よりディファレンシャルな増幅が達成することが可能であろう。
【００５８】
（実施例２）
DNAを重亜硫酸ナトリウムで処理すると、シトシン（C）はウラシル（U）に変換されるが、メチルシトシン（meC）は反応しないままである。PCRによる増幅の間に、Uはチミン（T）で置換される；meCは、増幅したDNA中でCのままである。哺乳類のDNAにおいて、大部分のmeCは、CpG部位で見られる。特定の部位または領域で、CpGはメチル化または非メチル化されているかどちらかである。重亜硫酸塩処理後、CpG部位の一部であるCは、CまたはUのどちらかであるが、他のCはUに変換されているはずである。不完全な変性または二次構造により、重亜硫酸塩とDNAの反応は、いつも完全に行われるわけではなく、プライマーおよびPCR条件に依存して、修飾されていない、または、部分的に修飾されたDNAが増幅されるかもしれない。これは、特に、「メチル化特異的PCR」プライマーを用いた時の場合にみられる。なぜならば、一般的に、プライミング部位に近接する（変換されていない）メチル化シトシンを含む分子を増幅するためにデザインされているからである。GSTP1遺伝子のメチル化された配列の増幅において、我々は、いくつかのDNAサンプルで、変換されていない、または、不十分に変換されたDNAの望ましくない増幅を見出し、この増幅によりサンプル内の本当にメチル化された分子の増幅が妨げられることがわかった。本実施例において、我々は、より低い変性温度の使用により、顕著に高い融解温度を有する、非変換DNAの増幅を抑えることができることを示す。
【００５９】
プロモーター領域およびGSTP1遺伝子の転写開始部位の3’の配列を図５に示す；配列およびCpG部位の番号は、転写開始部位に対して示す。一番上のラインは、非修飾の配列を示し、次の二つのラインは、重亜硫酸ナトリウムとの反応後の配列を示す。それぞれ、CpG部位は非メチル化（B-U）またはメチル化（B-M）のいずれかである。本実施例および次の実施例で用いるプライマーおよびTaqManプローブの部位を示す。
【００６０】
本発明の原理を明らかに示すために、我々は、非メチル化DNA、メチル化DNAおよび非変換DNAに対応する配列を含む増幅したGSTP1のDNA混合物を用いた。以下の表に示すプライマーおよびTaqManプローブを用いて、増幅させた。プライマーLUH F2は、非メチル化DNAの増幅を抑えるようにデザインされた（パブリッシュされていない結果）5’「テイル(tail)」を含むが、これは、本出願で求めた融解温度の効果に依存しないことを留意されたい。
【００６１】
【表３】
2005518216.tif 000004
【００６２】
25μl反応液は以下を含む。
Platinum Taq PCRバッファー(Promega)    
Platinum Taq (0.25μ)
プライマーLUHF2(200nM)およびCSPR4(40nM)
dCTP、dGTP、dATPおよびdUTP(200μM)
【００６３】
増幅条件：50℃2分
95℃2分
95℃15秒、60℃1分  5サイクル
XX℃15秒、60℃1分  40サイクル  （XX−異なる温度）
【００６４】
増幅は、Applied Biosystems 7700装置を用いて行い、反応生成物は続いて蛍光プローブを放出する。プローブPRB-M、PRB-UおよびPRB-Wは、それぞれ、メチル化DNA、非メチル化DNAおよび非変換DNAを検出する。その後に続くサイクルにおいて変性温度を下げる前に、より長い開始DNA分子を完全に変性させるために、95℃で変性を行う最初の5サイクルを用いて増幅を行った。異なる変性温度での増幅結果を図６に示す。
【００６５】
90℃の変性温度を用いてPCRを行った場合、3つ全ての鋳型の増幅が検出された。変性温度を80℃に下げると、非変換DNAの増幅を抑制するが、メチル化および非メチル化DNA生成物は、90℃変性温度で見られた結果と同等な効率で増幅された。さらに変性温度を77℃まで下げることによって、非メチル化生成物の増幅の阻害なしに、メチル化DNA生成物の増幅を抑制する。メチル化および非メチル化生成物は、141bpの増幅産物において10塩基異なる。
【００６６】
（実施例３）
通常の変性温度95℃を用いた場合に、非変換DNAの増幅が示された患者DNAサンプルのセットに、変性温度を下げたPCR条件を適用した。プライマーmsp81およびmsp82を用いたことを除いて実施例２と同等の条件で、最初のラウンドのPCR生成物サンプル（外側のプライマーセットを用いて増幅した）を解析した。変性は、95℃または80℃のいずれかで行った。PCR生成物がそれぞれのサンプルおよびプローブの閾値レベルに到達するサイクル数を以下の表に示す。
【００６７】
【表４】
2005518216.tif 000005
【００６８】
80℃変性温度を使用することにより、非変換DNAの増幅を効率的に抑制し、増幅のエンドポイント（50サイクル）まで検出されなかった。メチル化DNA生成物が検出された場合、増幅効率は基本的に両方の温度で一致し、生成物が同等のサイクル数で見られた。
【００６９】
（実施例４）
メチル化され完全に変換されたDNAの検出感度への、非変換DNAの影響を、異なる変性温度で調べた。PCRにより、完全に重亜硫酸塩変換したメチル化DNAに由来するクローンGSTP1配列を含むプラスミドDNAを単独で増幅し、あるいは、高いレベルの非変換DNA配列を産生する1μlのPCR反応液と混合して増幅させた。PCR増幅に用いたプライマーmsp81およびmsp82の外側のプライマーを用いて、プラスミドDNAおよび非変換DNAの両方を得た。プラスミドDNAのインプット量は、PCR反応につき、ゼロから106まで変化させた。実施例３に示すように増幅を行い、PCR生成物が検出される閾値を以下の表に示す。
【００７０】
【表５】
2005518216.tif 000006
【００７１】
プラスミド単独を増幅させた場合、100以上のコピーは、通常（95℃）および80℃の変性温度の両方において容易に増幅した。非変換DNAが存在すると、変性温度が95℃である場合、非変換配列の増幅（11から12サイクルで検出閾値に達する）により、メチル化された変換DNAの増幅は完全に抑制された。しかしながら、変性が80℃である場合、非変換DNAの増幅は完全に抑制され、メチル化された変換DNAの増幅がもたらされた。競合する非変換DNAが存在しないものより、わずかに増幅効率が悪くなった。それゆえ、低い変性温度の使用により、他の方法では競合する関連配列DNAの増幅によってマスクされるであろう配列を、検出できるようになる。
【００７２】
（実施例５）
同じ原理が別々の配列領域に適用できることを明確にするために、GSTP1遺伝子の転写領域内の配列を、プライマーmsp81およびmsp82（図５参照）を用いて増幅させた。増幅は2つの臨床サンプルを用いて行った。これらのサンプルのうち、1つはこの領域に非変換DNAの増幅を示し、他方はメチル化された変換配列のみを示していた。PCR生成物の検出閾値サイクルを以下の表に示す（各条件につき二回測定を行った）。
【００７３】
【表６】
2005518216.tif 000007
【００７４】
サンプル85ESについては、変性温度が95℃または80℃であるに関わらず、8または9サイクル後に、的確なPCR生成物が検出された；それゆえ、増幅は低い温度で阻害されていない。対照的に、サンプル86Uについては、変性温度が95℃の場合に、非変換DNAの増幅が見られたが、変性温度が80℃に下がると、この増幅は抑制された。
【００７５】
上記結果から、本出願の発明は多くの可能性ある応用を有していることが認識されるであろう。それらは、限定するものではないが、DNAおよびRNAの選択的な増幅、種の選択および/または同定、PCRのような増幅反応において望まない偽生成物の抑制、異常なDNAの低メチル化によって特徴付けられる病気または癌の診断および予後アッセイを含む。
【００７６】
本明細書を通じて、「含む(comprise)」という語、または「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などの変形は、記載の要素、整数またはステップ、または要素、整数またはステップの群を含むことを示すが、任意の他の要素、整数またはステップ、または要素、整数またはステップの群を排除するわけではないことが理解されるであろう。
【００７７】
さらにその上、本明細書中に含まれている任意の書物対話、行動、物質、装置、物品などは、単に本発明の概念を与える目的のものである。従来技術の一部からの任意またはすべてのこれらの事項は、本発明と関係がある当分野における共通の一般的知識であったか、あるいはそれに基づくものであることは、認められることとして考えるべきではない。なぜならそれは、本出願のそれぞれの特許請求の範囲の優先日前に、オーストラリアに存在していたからである。
【００７８】
最後に、多数の変更形態および/または変形形態を、具体的な実施形態中に示したように、広範囲に記載した本発明の精神または範囲から逸脱せずに、本発明に対して作製することができることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、本発明の実施形態は、あらゆる点において例示的なものとして解釈すべきであり、制限的なものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】大腸菌、SalmonellaおよびSulfobacillus thermosulfidooxidansからの16SリボゾームRNA遺伝子の増幅領域の配列を比較した図である。3つすべての種で同一である塩基は黒で影を付け、大腸菌およびSalmonellaのみ同一である塩基はグレーで影を付ける。プライマーの標的領域に対応する配列を示す。
【図２】異なる変性温度を用いた細菌rDNAをPCR増幅させた図である。本文に記載するNR-FliおよびNR-Rliを用いて、異なる細菌種に由来するDNAを増幅した。84.4から92.8℃の変性温度幅にわたる増幅を行った。ここの反応の温度は、84.4℃、85.7℃、87.2℃、88.7℃、90.2℃、91.6℃および92.8℃であった。反応生成物を1.5％アガロースゲル上で分析し、増幅がそれぞれの種で最も低い温度を示す。
【図３】過剰のS. thermosulfidooxidansのrDNAが存在している中で大腸菌のrDNAを増幅させた図である。パネルに示す比率で、大腸菌およびS. thermosulfidooxidansのrDNA混合物を、91.6℃または87.2℃の変性温度を用いたPCRによって、増幅させた。SyberGreenを用いて、Applied Biosystems ABI PRISM7700配列決定システムにて増幅産物の融解プロファイルを求めた。右のピークは、S. thermosulfidooxidansのrDNAの増幅産物に対応し、左のピークは、大腸菌のrDNAの増幅産物に対応する。左のブロードなピーク（70℃と80℃の間の）は、プライマーダイマーに対応する。それぞれのパネルにおいて、S. thermosulfidooxidansのrDNAのピークを示すトレースは、91.6℃増幅からであり、他のトレース（このピークが喪失している）は、87.2℃増幅である。
【図４】86.3℃の変性温度を用いて、本文で示す細菌の混合物に由来するDNAを増幅した図である。放射線標識した反応生成物を、大腸菌およびSalmonella増幅産物を識別するTaq1で切断した。生成物を、10％ポリアクリルアミド、7M尿素ゲル上で電気泳動して分析した。矢印は、SalmonellaのrDNA増幅産物に由来する制限酵素断片の部位を示し、アスタリクスは、大腸菌の増幅産物のものを示す。
【図５】重亜硫酸ナトリウムでの反応前後における、GSTP1遺伝子のプロモーター領域の配列を示す。
【図６】非変換および重亜硫酸変換した、メチル化および非メチル化GSTP1プロモーター配列の増幅における変性温度変化の影響を示す。
【図１】
2005518216.tif 000008
【図２】
2005518216.tif 000009
【図３】
2005518216.tif 000010
【図４】
2005518216.tif 000011
【図５】
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2005518216.tif 000014
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【図６】
2005518216.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成16年11月5日(2004.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、少なくとも1つの標的核酸を選択的に増幅させるための方法であって、
標的核酸が非標的核酸の融解点よりも低い融解点を有し、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、少なくとも1つの標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程を含む方法。
【請求項２】
前記増幅プライマーがフォワードプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅プライマーがリバースプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅工程で少なくとも1つのフォワードおよび1つのリバースプライマーを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換反応（SDA）核酸配列に基礎をおいた増幅法 (NASBA)、ライゲーションPCR、およびローリングサークル増幅（RCA）からなる群から選択する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅工程をPCR等を用いて行う、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅工程をリアルタイムPCRを用いて行う、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記変性工程を、標的核酸と非標的核酸の融解温度の間の温度で行う、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸を増幅させるために、前記変性工程を、非標的核酸の融解温度より低い温度であるが、標的核酸の融解温度で、または、十分に超える温度で行う、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
異なるが関連している核酸配列を選択的に増幅するための方法であって、前記差異が、少なくとも1つの標的核酸と少なくとも1つの非標的核酸の間における1つ以上の欠失、付加および/または塩基変化である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法を含む方法。
【請求項１１】
2つ以上の標的種（標的核酸）および1つ以上の非標的種（非標的核酸）から得られた核酸混合物を含むサンプル中の、種の選択および/または同定方法であって、
標的核酸が非標的核酸の融解点よりも低い融解点を有し、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、少なくとも1つの標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程に前記サンプルを供すること；および
増幅産物の存在を決定すること；
を含む方法。
【請求項１２】
前記種を動物種、細菌種、真菌種および植物種から選択する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記種の集団中の1種以上の種を選択するために使用するときの、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
劣勢種の融解点が優勢種の融解点よりも低い場合において、劣勢種および優勢種からの核酸の混合物である単離核酸の選択的増幅のために使用するときの、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸がDNAである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸がRNAである、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記種が細菌種である、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項１１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸の増幅の間において、望まない、または偽増幅産物を抑制し、または除去するための方法であって、
望まない産物の融解温度が標的核酸の融解温度よりも高く、
望まない偽産物の増幅を実質的に抑制するために、標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、望まない産物の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く少なくとも1つの増幅プライマーを用いた増幅工程を含む方法。
【請求項２０】
望まない増幅産物が非変換のまたは部分的に変換された核酸であり、前記標的核酸を化学処理に供して、変換した核酸を産生する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸を重亜硫酸塩との処理に供し、前記望まない増幅産物が重亜硫酸塩と部分的に、または、不完全に反応した核酸に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸を含むサンプル中の、少なくとも1つの標的核酸を選択的に増幅させるための方法であって、
(a) 標的核酸の融解温度が非標的核酸の融解温度よりも低く、標的核酸および非標的核酸の相対的融解温度が変化するように、標的核酸および/または非標的核酸を修飾する工程；および
(b) 非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、工程(a)の標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、工程(a)の少なくとも1つの非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、1サイクル以上の、核酸変性工程、その後に続く増幅工程；
を含む方法。
【請求項２３】
工程(a)前に、前記少なくとも1つの標的核酸および少なくとも1つの非標的核酸の融解温度が実質的に同じであり、前記化学修飾工程により標的核酸および非標的核酸の相対的融解温度に差異を生じさせる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程(a)前に、前記標的核酸が非標的核酸より低い融解温度を有しており、工程(a)での修飾により標的核酸と非標的核酸の間の融解温度の差異を増大させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記修飾が少なくとも1つの塩基対の変換である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
修飾化剤が重亜硫酸塩である、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記修飾により非メチル化シトシンを修飾して、変換した核酸を産生する、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
更に、標的核酸を単離する工程、および、任意に、単離した標的核酸を配列解析に供する工程を含む、請求項１から１０、２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
(i) 異常な低いメチル化核酸を含み、任意にメチル化核酸を含むと疑われるサンプルを重亜硫酸塩処理に供する工程；
(ii) 選択的増幅が1サイクル以上の核酸変性工程を含み、
異常な低いメチル化核酸を含む核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、メチル化核酸を含む核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
核酸の選択的増幅を行う工程；および
(iii) 増幅核酸の存在を決定する工程；
を含む、核酸の異常な低いメチル化のためのアッセイ。
【請求項３０】
対象の病気または癌の診断または予後アッセイであり、前記病気または症状が核酸の異常な低メチル化により特徴付けられ、
(i) 対象から採取した核酸サンプルを重亜硫酸塩と反応させる工程；
(ii) 選択的増幅が、1サイクル以上の増幅工程に先立つ変性工程を含み、
非標的核酸の増幅を実質的に抑制するために、異常な低いメチル化核酸を含む標的核酸の融解温度で、または、より高い温度であるが、メチル化または実質的にメチル化された非標的核酸の融解温度より低い温度で変性工程が行われる、
(i)由来の核酸の選択的増幅を行う工程；および
(iii) 増幅核酸の存在を決定する工程；
を含むアッセイ。
【請求項３１】
前記症状または病気が癌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記癌が、肺癌、乳癌、子宮頚部形成異常および頚癌、大腸癌、前立腺癌および肝臓癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅工程を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、鎖置換反応（SDA）核酸配列に基礎をおいた増幅法 (NASBA)、ライゲーションPCR、およびローリングサークル増幅（RCA）からなる群から選択する、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記増幅工程をPCR等を用いて行う、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅工程をリアルタイムPCRを用いて行う、請求項３４に記載の方法。
【国際調査報告】
2005518216.tif 000017
2005518216.tif 000018
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