(57)【要約】本発明は、哺乳動物の組織または器官への損傷またはそれらの欠損を修復する方法を提供する。これらの方法では、修復される組織または器官以外から作られた粒子状または非粒子状の無細胞マトリクスが、修復される組織または器官の中または表面に配置される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）修復または改善の必要があるレシピエント器官または組織を有する対象哺乳動物を特定し；
（ｂ）ドナーのコラーゲンベースの器官または組織から作られた非粒子状無細胞マトリクスを含む組成物を、前記レシピエント器官または組織の中または表面に配置する；工程を含み、
前記レシピエント器官または組織が、皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心筋、骨膜、動脈、静脈、胃、小腸、大腸、横隔膜、腱、靱帯、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱、尿管、尿道、および腹壁筋膜より成る群から選択され、かつドナーのコラーゲンベースの器官または組織とは異なることを特徴とする治療方法。
【請求項２】
前記コラーゲンベースの器官または組織が真皮であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コラーゲンベースの器官または組織が、筋膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靱帯、腱、動脈、静脈、神経結合組織、および尿管より成る群から選択されることを特徴とすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記対象哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が、前記対象哺乳動物と組織適合する生存細胞をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、前記対象哺乳動物に由来することを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、表皮細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞、成体または胚性間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、単球、前心筋芽細胞、周皮細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、歯肉上皮細胞、および歯周靱帯幹細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
細胞成長因子、血管新生因子、分化因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカインより成る群から選択される一または複数の物質を前記対象哺乳動物に投与する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記一または複数の物質が、対象哺乳動物に配置される前記組成物に含まれることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記一または複数の物質を、前記組成物とは別に前記対象哺乳動物に注射または注入することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記一または複数の物質をコードする一または複数の核酸配列を含み、かつ該一または複数の核酸配列のそれぞれが転写または翻訳調節因子に調節可能に連結している、一または複数の発現ベクターを、前記対象哺乳動物に投与することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記一または複数の発現ベクターが、対象哺乳動物に投与される一または複数の細胞に含まれることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記一または複数の細胞が、前記組成物に含まれることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記レシピエント器官または組織が、重篤な骨の隙間異常を伴う骨膜であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）修復または改善の必要があるレシピエント器官または組織を有する対象哺乳動物を特定し；さらに
（ｂ）ドナーのコラーゲンベースの組織または器官から作られた粒子状無細胞マトリクスから成る組成物を、前記レシピエント器官または組織の中または表面に配置する；工程を含み、
前記レシピエント器官または組織が、皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心筋、胃、小腸、大腸、横隔膜、腱、靱帯、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱、および歯肉より成る群から選択され、かつドナーであるコラーゲンベースの器官または組織とは異なることを特徴とする治療方法。
【請求項１６】
前記コラーゲンベースの器官または組織が真皮であることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記コラーゲンベースの器官または組織が、筋膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靱帯、腱、動脈、静脈、神経結合組織、および尿管より成る群から選択されることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記対象哺乳動物がヒトであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、対象哺乳動物と組織適合する生存細胞をさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が前記対象哺乳動物に由来することを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、表皮細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞、成体または胚性間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、単球、前心筋芽細胞、周皮細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、歯肉上皮細胞、および歯周靱帯幹細胞より成る群から選択されることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
細胞成長因子、血管新生因子、分化因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカインより成る群から選択される一または複数の物質を、前記対象哺乳動物に投与する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記一または複数の物質が、対象哺乳動物に配置される前記組成物に含まれることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記一または複数の物質を、前記組成物とは別に前記対象哺乳動物に注射または注入することを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記一または複数の物質をコードする一または複数の核酸配列を含み、かつ該一または複数の核酸配列のそれぞれが転写または翻訳調節因子に調節可能に連結している、一または複数の発現ベクターを、前記対象哺乳動物に投与することを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記一または複数の発現ベクターが、対象哺乳動物に投与される一または複数の細胞に含まれることを特徴とする請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
当該の一または複数の細胞が、前記組成物に含まれることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、脱灰骨粉末をさらに含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項２９】
前記レシピエント器官または組織が歯肉であり、該歯肉が、後退している歯肉であるかまたは後退している歯肉に隣接することを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項３０】
前記歯肉が抜歯槽を含むことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００１年１０月１８日出願の米国仮特許出願第６０／３４７，９１３号、および２００２年７月２５日出願の米国仮特許出願第６０／３９８，４４８号に基づく優先権を主張する。上記の両方の仮特許出願の開示は、それらの全体が参照により本明細書に含まれる。
【０００２】
本明細書中に記載された研究の一部は、陸軍医学研究収集活動を通じて、国防省からの助成（Ｎｏ．ＤＡＭＤ１７−０１−２−０００１）を受けた。ゆえに政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、組織エンジニアリング、より詳しくは組織のリモデリングに関する。
【背景技術】
【０００４】
無傷の同種または異種組織の移植に内在する問題のために、欠陥のあるまたは損傷した組織を置換または修復するための別の戦略を開発することが極めて重要である。
【０００５】
特許文献１、特許文献２、および同時係属出願の特許文献３、特許文献４は、それらの全体が参照により本明細書に含まれる。
【特許文献１】
米国特許第４,８６５，８７１号明細書
【特許文献２】
米国特許第５，３６６,６１６号明細書
【特許文献３】
米国特許出願第０９／７６２，１７４号明細書
【特許文献４】
米国特許出願第１０／１６５，７９０号明細書
【特許文献５】
米国特許第４,５６７,８４７号明細書
【特許文献６】
米国特許第４,７９９,３６１号明細書
【特許文献７】
米国特許第５,２８４,６５５号明細書
【特許文献８】
米国特許第５,８８５,８２９号明細書
【非特許文献１】
Ｃａｐｌａｎ（１９９１）Ｊ. Ｏｒｔｈｏｐ. Ｒｅｓ. ９：６４１−６５０
【非特許文献２】
Ｃａｐｌａｎ（１９９４）Ｃｌｉｎ. Ｐｌａｓｔ.Ｓｕｒｇ． ２１：４２９−４３５
【非特許文献３】
Ｃａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ.（１９９７）Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ. ３４２：２５４−２６９
【非特許文献４】
Ｂｅｌｔｒａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎｅｗ. Ｅｎｇｌ. Ｊ． Ｍｅｄ. ３４４：１７５０−１７５７
【非特許文献５】
Ｋａｊｓｔｕｒａ ｅｔ ａｌ.（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ．Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９５：８８０１−８８０５
【非特許文献６】
Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ,（１９６９）Ｊ.Ｔｈｏｒ, Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ. ５７：２２５−２２９
【非特許文献７】
Ａｓｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ １８：９２７−９３６
【非特許文献８】
Ｆｒｅｍｅｓ ｅｔ ａｌ.（１９９５）Ａｎｎａｌｓ. Ｔｈｏｒ. Ｓｕｒｇ, ５９：１１２７−１１３３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、骨および軟骨の欠陥部位に移植された無細胞皮膚マトリクスが、両方の組織でリモデリングされたという観察に基づく。この知見、ならびに幅広い分化細胞、幹細胞および前駆細胞が移植マトリクスを生息させる能力を踏まえると、さまざまなコラーゲンベースの組織に由来する無細胞マトリクスが、欠陥のあるまたは損傷した多数の組織の修復に有用である可能性が高い。
【０００７】
より具体的には、本方法は治療法を提供する。この方法は、（ａ）修復または改善が必要なレシピエント器官または組織を有する対象哺乳動物を特定し；そして（ｂ）コラーゲンベースのドナー組織から作られた非粒子状の無細胞マトリクスを含む組成物をレシピエント器官または組織の中または表面に配置する：工程を含む。レシピエント器官または組織は、皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心筋、骨膜、動脈、静脈、胃、小腸、大腸、横隔膜、腱、靱帯、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱、尿管、尿道、または腹壁筋膜であってよい。さらに、レシピエント器官または組織は、ドナーであるコラーゲンベースの器官または組織とは異なる。レシピエント器官または組織は、重篤な骨の隙間異常を伴う骨膜であってよい。コラーゲンベースの器官または組織は、たとえば、真皮、筋膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靱帯、腱、動脈、静脈、神経結合組織、または尿管であってよく、また対象哺乳動物はヒトであってよい。組成物はまた、対象と組織適合する生存細胞、たとえばその対象哺乳動物から得られた細胞を含んでいてよい。これらの細胞は、たとえば、表皮細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞、成体または胚性間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、単球、前心筋芽細胞、周皮細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、歯肉上皮細胞、または歯周靱帯幹細胞であってよい。本方法はさらに、たとえば細胞成長因子、血管新生因子、分化因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカインといった一または複数の物質の対象への投与を含んでいてよい。そのような物質は、レシピエント器官または組織の内部または表面に配置される組成物に含まれていてよく、または組成物とは別に対象哺乳動物に注射または注入してもよい。さらに、その一または複数の物質をコードする一または複数の核酸配列を含み、かつその一または複数の核酸配列は転写または翻訳調節因子に調節可能に連結している、一または複数の発現ベクターを対象哺乳動物に投与することによって、その物質を投与することができる。これらの発現ベクターは、対象哺乳動物に投与される一または複数の細胞に含まれていてよい。その一または複数の細胞は、組成物に含まれていてもよく、あるいは組成物とは別に対象に投与してもよい。
【０００８】
治療の別の方法もまた本発明に包含される。この方法は、(ａ)修復または改善が必要なレシピエント器官または組織を有する対象哺乳動物を特定し；さらに（ｂ）ドナーのコラーゲンベースの器官または組織から作成した粒子状の無細胞マトリクスを含む組成物をレシピエント器官または組織の中または表面に配置する：工程を含む。レシピエント器官または組織は、皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心筋、胃、小腸、大腸、横隔膜、腱、靱帯、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱、または歯肉であってよい。レシピエント器官または組織は、ドナーであるコラーゲンベースの器官または組織とは異なる。コラーゲンベースの器官または組織は、たとえば、真皮、筋膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靱帯、腱、動脈、静脈、神経結合組織、または尿管であってよく、また対象哺乳動物はヒトであってよい。組成物はまた、対象と組織適合する生存細胞、たとえばその対象哺乳動物から得られた細胞を含んでいてもよい。これらの細胞は、たとえば、表皮細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、線維芽細胞、胚性幹細胞、成体または胚性間葉系幹細胞、臍帯幹細胞、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、単球、前心筋芽細胞、周皮細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、歯肉上皮細胞、または歯周靱帯幹細胞であってよい。本方法はさらに、たとえば細胞成長因子、血管新生因子、分化因子、サイトカイン、ホルモン、ケモカインといった一または複数の物質の対象への投与を含むことができる。そのような物質は、レシピエント器官または組織の内部または表面に配置される組成物に含まれていてよく、または組成物とは別に対象哺乳動物に注射または注入してもよい。さらに、その一または複数の物質をコードする一または複数の核酸配列を含み、かつその一または複数の核酸配列が転写または翻訳調節因子に調節可能に連結している、一または複数の発現ベクターを対象哺乳動物に投与することによって、その物質を投与することができる。これらの発現ベクターは、対象哺乳動物に投与される一または複数の細胞に含まれていてよい。その一または複数の細胞は、組成物に含まれていてよく、あるいは組成物とは別に対象に投与してもよい。組成物はさらに脱灰骨粉末を含んでいてよい。レシピエント組織が歯肉である場合は、その歯肉は後退している歯肉であるかまたは後退している歯肉に隣接する。さらに、レシピエント組織が歯肉である場合は、その歯肉は抜歯槽を含んでいてよい。
【０００９】
本明細書において、「レシピエント器官または組織はコラーゲンベースのドナー器官または組織とは異なる」の語は、無細胞マトリクスがその内部または表面に配置されたレシピエント器官または組織が、その無細胞マトリクスを作成したコラーゲンベースの器官または組織とは、そのコラーゲンベースの器官または組織がレシピエント個体から得られたかまたは一または複数の別の個体から得られたかに関わらず、異なるということを意味する。従って、たとえば、ホスト個体の心臓弁が無細胞マトリクスの移植を受けるレシピエント組織である場合、無細胞マトリクスは心臓弁組織以外の組織から作られる。すなわち、その無細胞マトリクスはレシピエント個体または一または複数の別の個体から得られた心臓弁組織から作られたものであってはならない。同様に、ホスト個体の皮膚が無細胞マトリクスで修復されるレシピエント組織である場合、無細胞マトリクスは皮膚組織以外の組織から作られる。すなわち、その無細胞マトリクスはレシピエント個体または一または複数の別の個体から得られた皮膚組織(たとえば真皮)から作られたものであってはならない。この概念は粒子状および非粒子状無細胞マトリクスの両方に適用される。
【００１０】
本明細書において、組成物を「配置する」の語は、特に限定はされず、組成物を固定する、注射する、注入する、注ぐ、充填する、重層する、噴霧する、および入れることを含む。さらに、レシピエント組織または器官の「上に」配置するとは、レシピエント組織または器官と接触する関係に配置することを意味する。
【００１１】
本明細書において、「調節可能に連結した」の語は、発現調節配列(すなわち、転写および翻訳調節因子)が、目的のコード配列の発現を効果的に調節するように遺伝子構造に組み込まれていることを意味する。転写および翻訳調節因子は、誘導型および非誘導型プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および当該分野の熟練者に既知である遺伝子発現を促進または調節する他の因子を含むが、これらに限定されない。そのような調節因子はサイトメガロウイルスｈＣＭＶ前初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期または後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージＡの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、そして酵母α−ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒを含むが、これらに限定されない。
【００１２】
別に定義されない限り、本明細書において使用するすべての技術および科学用語は、本発明が属する分野の通常の技術を有する者に通常理解されるのと同じ意味を有する。対立する場合は、定義を含む本明細書の記載に従う。好ましい方法および材料を下記に示すが、ここに記載したのと類似または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。ここで言及されるすべての出版物、特許出願、特許および他の文献は、それらの全体が参照によって本明細書に含まれる。ここに開示される材料、方法、および実施例は、単に例示的なものであり、限定することを意図していない。
【００１３】
たとえば、コラーゲンベースの組織から作られた無細胞マトリクスを用いて複数の器官および組織を修復するといった、本発明のその他の特性および長所は、下記の記述、図面、および請求項から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
実施例で記載された実験は、コラーゲンベースの組織または器官から作られた無細胞マトリクスを、その無細胞マトリクスが作られた元の組織または器官以外の、損傷または欠陥のある組織または器官の中にまたは直接接触させて移植することが、損傷または欠陥のある組織または器官の修復を促進させることができることを示す。本明細書において、「無細胞マトリクス」とは、（ａ)さまざまなコラーゲンベースの組織の任意のものから作成され；(ｂ)無細胞であり；そして（ｃ)それが作られた元の天然の組織または器官が有する生物学的および構造的機能を保持している、マトリクスである。マトリクスによって保持されている生物学的機能は、細胞認識および細胞接着ならびに、細胞の拡散、細胞増殖、および細胞分化を支持する能力を含む。そのような機能は、未変性コラーゲンタンパク質(たとえばＩ型コラーゲン)およびさまざまな非コラーゲン分子（インテグリン受容体、グリコサミノグリカン（たとえばヒアルロナン）またはプロテオグリカンのような高い荷電密度を持つ分子、または他のアドヘシンのように、両方の分子についてリガンドとして作用するタンパク質）によって提供される。有用な無細胞マトリクスによって保持されている構造的機能は、組織学的構造の維持、組織の構成要素の三次元的配列の維持、そして強度、可塑性、耐久性、一定の多孔性、および高分子の保持といった物理的性質である。無細胞マトリクスの生物学的機能の効率性は、たとえば、細胞増殖を維持する能力によって測定することができ、そしてその無細胞マトリクスが作られた元の天然の組織または器官の少なくとも５０％（たとえば、５０%；６０%；７０%；８０%；９０%；９５%；９８%；９９%；９９.５%；１００%；または１００%以上）である。さらに、電子顕微鏡および／または免疫組織化学によって測定された無細胞マトリクスの基底膜の全体性は、その無細胞マトリクスが作られた元の天然の組織または器官の少なくとも７０％である。
【００１５】
このように、上述したように、移植されたマトリクス材料は、周囲のホスト組織と同一の組織から作成されている必要は無く、単に、たとえば関連するホスト組織の分化細胞、間葉系幹細胞のような幹細胞、または前駆細胞といった、侵入または浸透してくる細胞によってリモデリングされやすいものであるべきである。リモデリングは上記の無細胞マトリクス成分および周囲のホスト組織からのシグナル（たとえばサイトカイン、細胞外マトリクス成分、生体機械的刺激、および生体電気的刺激）によって導かれる。骨髄および末梢循環における間葉系幹細胞の存在が文献に記載されており、さまざまな筋骨格組織を再生することが示されている[非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３]。加えて、リモデリング過程の間は、移植片はある程度の（閾値より大きい）引っ張り強さおよび生体機械力を提供しなければならない。
【００１６】
無細胞マトリクスは、上記の特性がマトリクスによって保持される限り、コラーゲンベースの組織(たとえば、真皮、筋膜、臍帯、胎盤、心臓弁、靱帯、腱、血管組織(たとえば伏在静脈のような動脈と静脈)、神経結合組織、または尿管)のうち任意のものから作成することができると理解される。さらに、上記の自家移植片が配置される組織は、侵入または浸透してくる細胞（上記参照）によってリモデリングされ得る、実質的に任意の組織を含む。該当する組織には、骨、軟骨、靱帯、筋膜、および腱といった骨格組織が含まれる。上記の自家移植片を配置することができる他の組織は、特に限定されず、皮膚、歯肉、硬膜、心筋、血管組織、神経組織、横紋筋、平滑筋、膀胱壁、尿管組織、腸、および尿道組織を含む。本発明の目的において、心筋と骨格筋は同じ組織ではないと理解される。
【００１７】
さらに、無細胞マトリクスは、通常、その無細胞マトリクスのレシピエントと同種である一または複数の個体から作成されが、これは必ずしも絶対でない。従って、たとえば、無細胞マトリクスをブタから作成してヒト患者に移植することができる。無細胞マトリクスのレシピエントおよび無細胞マトリクスの製造のための組織または器官のドナーとして用いることのできる生物種は、特に限定されず、ヒト、非ヒト霊長類(たとえばサル、ヒヒ、チンパンジー)、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、ラット、またはマウスを含む。
【００１８】
無細胞マトリクスが提供される形態は、それが作られた元の組織または器官の数、およびレシピエント組織または器官の性質、ならびにレシピエント組織または器官の損傷または欠陥の性質に依存する。たとえば、心臓弁に由来するマトリクスは、弁全体、小さなシートまたはストリップ、任意のさまざまな形および／または大きさに切った断片、あるいは粒子形状として供給することができる。同じ概念が、上に列記した組織および器官のうち任意のものから製造される無細胞マトリクスに適用される。本発明の目的に有用である無細胞マトリクスは、レシピエント自身のコラーゲンベースの組織から作成することができると理解される。
【００１９】
無細胞マトリクスは、さまざまな方法のうち任意のものによって製造することができる。その製造に用いられる工程の結果として、上述の生物学的および構造的特性が生じさえすればよい。特に有用な製造方法は、特許文献１、特許文献２、および同時係属の特許文献３と特許文献４に記載されたものを含み、これらの全体が参照により本明細書に含まれる。
【００２０】
概説すると、マトリクスの製造に含まれる工程は一般的に、ドナー(たとえばヒトの死体または上に列記した哺乳動物のうち任意のもの)からの組織の採取、組織を安定化し生化学的および構造的劣化を防ぐ化学的処理、それと同時またはその後に、同様に生物学的および構造的機能を保存する条件下での細胞の除去を含む。炎症の原因となる可能性のある死細胞および／または溶解細胞成分、ならびに生物学的に不適合な細胞除去試薬を、徹底的に除去した後、マトリクスは原理的には移植の準備ができており、目的の形または大きさに処理するだけでよい。あるいは、マトリクスの記載された生物学的および構造的機能の維持に必要な条件下で、マトリクスを冷凍保存剤で処理して冷凍保存することができ、必要に応じて、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥後、機能を保存する同様の条件下で、組織を粉砕または微粉化し、粒子状の無細胞マトリクスを製造することができる。
【００２１】
最初の安定化溶液は、浸透圧、低酸素、自己分解、およびタンパク質分解による劣化を停止および予防し、微生物汚染を防ぎ、たとえば平滑筋成分を含む組織（たとえば血管）に生じうる機械的損傷を低減する。安定化溶液は一般的に、適当な緩衝剤、一または複数の抗酸化剤、一または複数の膠質物質(oncotic agents)、一または複数の抗生物質、一または複数のプロテアーゼ阻害剤、そしてある場合には、平滑筋弛緩剤を含む。
【００２２】
次いで組織を処理溶液に入れ、基底膜複合体またはコラーゲンマトリクスの生物学的および構造的全体性を損傷することなく、構造マトリクス由来の生存細胞(たとえば、表皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞）を除去する。処理溶液は一般的に、適当な緩衝剤、塩、抗生物質、一または複数の界面活性剤、架橋を防ぐ一または複数の物質、一または複数のプロテアーゼ阻害剤、および／または一または複数の酵素を含む。組織の処理は、基底膜複合体の分解が回避されかつマトリクスの構造的全体性が維持されるような、（ａ）濃度で活性物質を含む処理溶液を用いて、（ｂ）そのような時間行わなければならない。
【００２３】
組織を無細胞化した後、好ましくは組織を凍結保存溶液中でインキュベートする。この溶液は一般的に、冷凍中に生じ得る構造的マトリクスに対する氷晶による損傷を最小化するための一または複数の凍結保護剤を含む。組織を凍結乾燥する場合は、その溶液は一般的に、乾燥中の構造上の損傷を最小化する一または複数の乾燥保護剤を含み、また凍結中に膨張も収縮もしない有機溶媒と水との混合物を含んでいてよい。別の方法として、無細胞化した組織マトリクスをグルタルアルデヒドのような架橋剤で固定して、移植前に保存してもよい。凍結保護剤および乾燥保護剤は、同一である一または複数の物質であってもよい。組織を凍結乾燥しない場合は、組織を（滅菌容器に入れて）約−８０℃の冷凍庫に入れて、または無菌の液体窒素に入れて凍結し、次いで使用まで−１６０℃以下の温度で保存してよい。使用前に、たとえば入っている滅菌非浸透性容器（下記参照）を約３７℃の水浴に浸して、または周囲条件下で組織を室温にすることによって、試料を融解することができる。
【００２４】
組織を凍結および凍結乾燥する場合は、冷凍保存溶液中でインキュベーションした後、水蒸気は通すが微生物は通さない滅菌容器、たとえば、水蒸気透過性パウチまたはガラスバイアルの中に組織を入れる。好ましいパウチの片面は、医療用多孔性Ｔｙｖｅｋ（デラウェア州ＷｉｌｍｉｎｇｔｏｎのＤｕＰｏｎｔ社の登録商標）膜から成る。この膜は、水蒸気に対して多孔性であり、微生物および塵は通さない。Ｔｙｖｅｋ膜は非透過性のポリエチレンラミネートシートに加熱接着されており、片側が開いたままで、従って両面パウチになっている。開いたパウチは使用前に放射線滅菌する（たとえばガンマ線照射）。組織は滅菌パウチの中に無菌的に入れられる（開いた側を通って）。次いで開いた側を無菌的に加熱接着し、パウチを閉じる。包装された組織はこれから、以後の処理工程を通じて微生物汚染から保護される。
【００２５】
組織の入った容器は、損傷を与える六方晶氷の発生を最小化し、非晶性または立方相の安定性の低い氷を生じるため、特定の凍結保護剤に対応した規定の速度で低温に冷やされる。適当な冷却手順の例については、特許文献２を参照。次いで、組織氷の再結晶無しに水蒸気が連続的に個々の氷の結晶相から除去されるように、低温にて真空条件下で組織を乾燥する。そのような乾燥は、従来の凍結乾燥かまたは以前に特許化された分子蒸留乾燥機を用いることによって達成される。適当な分子蒸留乾燥機は、テキサス州ＷｏｏｄｌａｎｄｓのＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能であり、全体が参照によって本明細書中に含まれる特許文献５および特許文献６に記載されている。
【００２６】
水蒸気透過容器中での試料の乾燥の完了後、凍結乾燥装置の真空を、たとえば窒素、ヘリウムまたはアルゴンといった乾燥不活性ガスで置換する。同じ気相環境中に保持されている間、半透過性容器を不浸透性（すなわち、水蒸気も微生物も通さない）容器（たとえばパウチ）の中に入れ、たとえば加熱および／または加圧によってさらに密封する。組織試料をガラスバイアル中で凍結および乾燥した場合は、バイアルを真空下で適当な不活性キャップで密封し、取り出し前に乾燥機の真空を不活性ガスで置換する。いずれの場合でも、最終製品は不活性ガス雰囲気中に密封されている。
【００２７】
凍結乾燥組織は、このような条件下で、周囲冷却条件下で長期に渡って保存が可能である。輸送は、標準のキャリヤーを用いて、通常の温度曝露および輸送時間に対する標準の条件下で行うことができる。
【００２８】
一般的に（しかし必ずではなく）、乾燥組織は、移植前に水を加えて戻す。再水和の間、浸透圧および表面張力効果を最低限にすることが重要である。再水和の目的は、細胞外支持マトリクスの選択的な保存を増強することである。適当な再水和は、たとえば、乾燥組織を相対湿度約１００％の環境中でまずインキュベートし、その後適当な再水和溶液に浸漬することによって達成される。あるいは、乾燥組織を先に高湿度環境でインキュベーションせずに、直接再水和溶液に浸漬する。再水和は、試料に浸透圧損傷を与えてはならない。蒸気再水和は、理想的には少なくとも１５％の残存水分を達成すべきであり、液体再水和は、２０％から７０％の組織水分レベルをもたらすべきである。再水和する組織によって、再水和溶液は、たとえば、生理食塩水、乳酸リンゲル液、または標準的な細胞培養培地であってよい。組織が、内因性コラゲナーゼ、エラスターゼ、または既に除去された細胞由来の残存する自己分解活性の作用を受ける場合は、再水和溶液に添加物を加え、これはプロテアーゼ阻害剤を含む。残存するフリーラジカル活性が存在する場合は、抗酸化剤と、フリーラジカル損傷に対して保護する酵素剤を含む、フリーラジカルに対して保護する物質が用いられる。微生物汚染を防ぐために抗生物質を含んでいてもよい。プロテオグリカン、デキストランおよび／またはアミノ酸の形の膠質物質もまた、再水和中のマトリクスへの浸透圧損傷を防ぐために含まれていてよい。乾燥試料の再水和は、再水和溶液中の成分の迅速で均一な分布を可能にするため、この方法に特に適している。さらに、再水和溶液は、以前は用いられなかった特定の成分、たとえば、アルカリホスファターゼを阻害して続く石灰化を防ぐジホスホネートを含んでいてよい。再水和細胞外マトリクスの移植後の血管新生およびホスト細胞の流入を促進させるための物質を、再水和溶液に加えてもよい。あるいは、グルタルアルデヒドのような架橋剤を含む再水和溶液中で再水和を行ってもよい。
【００２９】
ホストによってリモデリングされ得る永久的に受容される移植片を製造するために、組織適合性の生存細胞を無細胞マトリクスに戻してもよい。これは一般的に、対象哺乳動物の中に無細胞マトリクスを配置する直前または直後に行われる。マトリクスが凍結乾燥されている場合は、再水和後に行われる。好ましい一実施形態では、移植前の標準的ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞共培養技術によって、または移植後のｉｎ ｖｉｖｏ再生息(repopulation)によって、組織適合性の生存細胞をマトリクスに加えることができる。
【００３０】
再構成に用いられる細胞型は、無細胞マトリクスから再構成される組織または器官の性質による。たとえば、無細胞マトリクスを用いた完全な厚さの皮膚の再構成に第一に必要なことは、表皮細胞またはケラチノサイトの修復である。それら細胞は、目的のレシピエント患者に由来するものであってよく、小さな網目状の裂けた皮膚移植片の形態で、あるいは細胞培養条件下でシート状に広がった単離ケラチノサイトとして、または無細胞マトリクスに添加したケラチノサイト幹細胞としてであってよい。あるいは、包皮または胎児起源から得られた同種ケラチノサイトを用いて、表皮を培養および再構成することができる。
【００３１】
心臓弁および血管の再構成に最も重要な細胞は内皮細胞であり、この細胞は組織の内表面を覆う。内皮細胞もまた培養で拡大することができ、目的のレシピエント患者から直接得るかまたは臍帯動脈または静脈から得ることができる。
【００３２】
マトリクスで再生息できるその他の細胞は、線維芽細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ)、生体または胚性間葉系幹細胞（ＭＳＣ)、前軟骨芽細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、前骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、単球、前心筋芽細胞、周皮細胞、心筋芽細胞、心筋細胞、歯肉上皮細胞、または歯周靱帯幹細胞を含むがこれらに限定されない。必然的に、無細胞マトリクスはこれらの細胞型のうち２以上（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０）を再生息させることができる。
【００３３】
細胞の除去後、凍結後、乾燥および再水和後、または適当な細胞による無細胞マトリクスの再構成後（凍結または乾燥の有無にかかわらず)、無細胞マトリクスを適当な病院または医療施設へ輸送することができる。製品の最終的な組成の選択は、目的の医療上の用途に依存する。
【００３４】
上記の工程すべてを実施するための試薬および方法は当該分野で公知である。適当な試薬および方法は、たとえば、特許文献２に記載されている。
【００３５】
上記の非粒子状無細胞マトリクスのうち任意のものから、上記の生物学的および構造的機能を保存できる任意の処理によって、粒子状の無細胞マトリクスを作成することができ、特に、切断された線維端を含むコラーゲン線維への損傷は最小限にすべきである。粒子状マトリクスを作成するための既知の湿式および乾式処理は、コラーゲン線維の構造的全体性をあまり保存しない。
【００３６】
一つの適当な方法が特許文献３に記載されている。その方法を、凍結乾燥皮膚無細胞マトリクスに関して下記に簡略に示すが、当該分野の熟練者はその方法を容易に、ここに列記する他の組織のうち任意のものに由来する凍結乾燥無細胞マトリクスでの使用に応用することができる。
【００３７】
無細胞皮膚マトリクスをストリップに切ることができる（たとえば、中断無しの「連続」切断輪を付けたＺｉｍｍｅｒ ｍｅｓｈｅｒを用いて)。結果として得られる長いストリップを、次いで約１ｃｍｋら約２ｃｍの長さに切る。ホモジナイザーと滅菌ホモジナイザープローブ（たとえば、バージニア州ＷａｉｒｅｎｔｏｎのＯｍｎｉ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより入手可能なＬａｂＴｅｃｋ Ｍａｃｒｏホモジナイザー）を組み立てて、ホモジナイザータワーに注ぐ無菌液体窒素で低温にする（すなわち約−１９６℃から約−１６０℃）。ホモジナイザーが極低温に達したら、無細胞マトリクスの断片を液体窒素の入ったホモジナイザータワーに加える。次いで、無細胞マトリクスの断片が低温で破砕されるように、ホモジナイザーのスイッチを入れる。低温破砕段階の回数と時間は、使用するホモジナイザー、ホモジナイズ容器の大きさ、ホモジナイザーの運転速度および時間に依存し、当該分野の熟練者によって容易に決定される。別の方法として、低温粉砕処理は、低温に冷却したクリオミルで実施することができる。
【００３８】
低温粉砕した粒子状無細胞組織マトリクスは、必要に応じて、無菌液体窒素で同様に低温に冷却した一連の金属ふるいを通してホモジナイズ産物を洗浄することによって、粒子径で選別される。一般的に、より小さな孔径のふるい（のうち一つ）に進む前に、相対的に大きな孔径のふるいを用いて、大きな望ましくない粒子を除去することが有用である。分離すると、粒子を凍結乾燥して、処理の間に吸収されたであろう残存水分を確実に除去する。最終製品は、一般的に約１マイクロメートルから約９００マイクロメートル、約３０マイクロメートルから約７５０マイクロメートル、あるいは約１５０から約３００マイクロメートルの粒子径を有する粉末（通常は白色または黄白色）である。本品は、生理食塩水または当該分野で既知である任意の他の再水和剤中に懸濁することによって容易に再水和される。本品はまた、当該分野で既知である任意の適当な賦形剤中に懸濁してもよい（たとえば、引用によって全体が本開示に含まれる特許文献７を参照）。高濃度で懸濁した場合（たとえば約６００ｍｇ／ｍＬ)、粒子状無細胞マトリクスは「パテ(putty)」を形成することができ、やや低濃度で懸濁した場合（たとえば約３３０ｍｇ／ｍＬ)、それは「ペースト」を形成することができる。そのようなパテおよびペーストは、たとえば、組織および器官の穴、隙間、または任意の形状の空隙に、そのような穴、隙間、空隙を実質的に埋めるように充填することができる。
【００３９】
一つの非常に適切な凍結乾燥無細胞マトリクスがＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニュージャージー州Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ）によってヒト真皮から製造され、小さなシートの形でＡｌｌｏＤｅｒｍとして市販されている。そのようなシートは、たとえば１ｃｍ×２ｃｍ、３ｃｍ×７ｃｍ、４ｃｍ×８ｃｍ、および５ｃｍ×１０ｃｍの大きさの長方形のシートとしてＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売されている。Ａｌｌｏｄｅｒｍを凍結および乾燥するために用いられる凍結保護剤は、３５%マルトデキストリンおよび１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ)である。従って、乾燥した最終製品は、重量で約４０％の無細胞マトリクスと重量で約６０％のマルトデキストリンを含む。ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎはまた、ブタ真皮から、ＡｌｌｏＤｅｒｍと同じ無細胞マトリクスとマルトデキストリンの比を有する類似製品をＸｅｎｏＤｅｒｍとして製造している。さらに、ＬｉｆｅＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、ＡｌｌｏＤｅｒｍを低温破砕（上述のように)することによって製造した粒子状無細胞皮膚マトリクスをＣｙｍｅｔｒａ（登録商標）の名称で販売している。Ｃｙｍｅｔｒａの粒子径は、集団で測定したとき約６０マイクロメートルから約１５０マイクロメートルの範囲にある。
【００４０】
任意の特定の場合に使用される無細胞マトリクスの形態は、適用される組織または器官に依存する。一般的に、乾燥形態で供給される非粒子状無細胞マトリクス（たとえばＡｌｌｏＤｅｒｍ）は、使用前に滅菌生理学溶液（たとえば生理食塩水）中で再水和される。しかしそれらは乾燥状態で用いることもできる。
【００４１】
無細胞マトリクスのシート（随意的に適当な大きさに切断された）は：（ａ）損傷または欠陥を有する組織または器官に巻き付けられる；(ｂ）損傷または欠陥を有する組織または器官の表面に配置される；あるいは（ｃ）丸めて組織または器官の中の穴、隙間、または空隙に挿入される。そのような穴、隙間、または空隙は、たとえば：（ｉ）外傷起源である、（ｉｉ）疾患組織（たとえば梗塞心筋組織)の除去が原因である、または（ｉｉｉ）悪性または良性の腫瘍の除去が原因である。無細胞マトリクスは、発育不全の組織または器官を補強するかまたは改善するため、あるいは奇形の組織または器官を補強するかまたは再構成するために用いることができる。一または複数の（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、またはそれ以上）のそのようなストリップを、任意の特定部位に用いることができる。移植片は、たとえば、縫合、ステープル、鋲、または当該分野で既知である組織糊または封止剤によって、所定の位置に保持することができる。あるいは、たとえば、欠陥または空隙に効果的に堅く詰められている場合、それらは固定器具を必要としない。粒子状無細胞マトリクスは、滅菌された薬学的に受容される賦形剤（たとえば生理食塩水）に懸濁し、目的部位へ皮下注射器によって注射することができる。あるいは、乾燥粉末マトリクスまたは懸濁液は、目的部位の中または表面に噴霧することができる。懸濁液はまた、特定部位の中または表面に注ぐことができる。さらに、粉末状無細胞マトリクスを相対的に少ない量の液体賦形剤と混合することによって、「パテ」を作成することができる。そのようなパテ、または乾燥した粒子状無細胞マトリクスさえも、上述の器官または組織内の任意の隙間、穴、空隙に、重層、充填、または入れることができる。さらに、非粒子状無細胞マトリクスは、粒子状無細胞マトリクスと組み合わせて用いることができる。たとえば、骨の中の穴をパテで充填し（上述のように）、そして無細胞マトリクスのシートで覆うことができる。
【００４２】
無細胞マトリクスは、その組織または器官および／または隣接する組織または器官を修復または再生するために、組織または器官に使用することができると理解される。従って、たとえば、無細胞マトリクスのストリップを、重篤な長骨の隙間に巻き付けてその隙間を取り巻く骨膜の同等物を生成させることができ、その骨膜の同等物が、骨の隙間内部での骨産生を刺激する。同様に、無細胞マトリクスを抜歯槽に移植することによって、損傷した歯茎組織を修復および／または弛緩することができ、「新しい」歯茎組織は、たとえば抜歯の結果として失われた歯槽の基部の任意の骨の修復および／または再生を助けることができる。歯茎組織（歯肉)に関して、後退している歯茎もまた、適当な歯茎組織への粒子状無細胞マトリクスの懸濁液の注入によって、またはパテの充填によって置換することができる。ここでもまた、歯肉組織の修復に加えて、この処置は歯周疾患および／または抜歯の結果として、失われた骨の再生をもたらす。上記の歯肉の欠陥のうち任意の物を治療するのに用いられる組成物は、たとえば、脱灰骨粉末、成長因子、または幹細胞といった、ここに列記した一または複数の他の成分を含んでいてよい。
【００４３】
非粒子状および粒子状無細胞マトリクスの両方を、他の足場すなわち物理的支持成分と組み合わせて使用することができる。たとえば、無細胞マトリクスの一または複数のシートを、たとえばバージニア州Ｖｉｒｇｉｎｉａ ＢｅａｃｈのＬｉｆｅＮｅｔのような組織バンクによって供給される放射線照射軟骨、またはたとえばニュージャージー州ＥｄｅｎｔｏｗｎのＯｓｔｅｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって供給される骨楔または形状のような、無細胞マトリクス以外から作られた一または複数のシートと重ねることができる。あるいは、そのような非−無細胞マトリクスシートは、たとえばジョージア州アトランタのＢｉｏｃａｒｅ, Ｉｎｃ.によって供給されているように、ポリグリコール酸またはヒドロゲルといった合成材料から作成することができる。その他の適当な足場または物理的支持材料は特許文献８に開示されている。そのような追加の足場または物理的支持成分は、たとえば、シート、立方体、長方形、円板、球、または粒子といった任意の便利な大きさまたは形状であってよいと理解される（粒子状無細胞マトリクスについて上述の通り)。
【００４４】
粒子状無細胞マトリクスと混合することができるかまたは非粒子状無細胞マトリクスに含浸させることのできるその他の活性物質は、骨粉末、脱灰骨粉末、および上記で開示されたもののうち任意のものを含む。
【００４５】
マトリクスに組み込むことができるか、無細胞マトリクス移植片の配置部位に投与することができるか、または全身投与することができる因子は、当該分野で既知である幅広い細胞成長因子、血管新生因子、分化因子、サイトカイン、ホルモン、およびケモカインの任意のものを含む。下記に示す方法のうち任意のものによって、その因子のうち２またはそれより多くのものの任意の組み合わせを、対象哺乳動物に投与することができる。対応する因子の例には、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ)（たとえばＦＧＦ１〜１０)、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、血管内皮細胞成長因子（ＶＢＧＦ)（たとえばＶＥＧＦ Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ)、血小板由来成長（ＰＤＧＦ)、インターフェロン（ＩＦＮ)（たとえばＩＦＮ−α、β、またはγ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ)（たとえばＴＧＦαまたはβ)、腫瘍壊死因子α、インターロイキン（ＩＬ)（たとえばＩＬ−１〜ＩＬ−１８)、Ｏｓｔｅｒｉｘ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇｓ（たとえばｓｏｎｉｃまたはｄｅｓｅｒｔ)、ＳＯＸ９、骨形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、プロスタグランジン、またはアスコルビン酸を含む。
【００４６】
また、（ａ）タンパク質である上記の因子の任意の一または複数をコードする核酸配列を含む発現ベクター（たとえば、プラスミドまたはウイルスベクター）；または（ｂ）そのような発現ベクターで（安定的にまたは一時的に）トランスフェクトまたは形質導入された細胞：を対象哺乳動物に投与することによって、レシピエント対象にタンパク質である因子を与えることができる。そのようなトランスフェクトまたは形質導入された細胞は好ましくは、レシピエントに由来するかまたはレシピエントと組織適合する。しかし、その因子への短い曝露だけが必要である可能性があり、従って組織適合でない細胞もまた用いることができる。無細胞マトリクス（粒子状または非粒子状）が対象中に配置される前に、細胞をマトリクスに組み込むことができる。あるいは、既に対象の中で定位置にある無細胞マトリクスの中へ、既に対象の中で定位置にある無細胞マトリクスの近くの部位へまたは全身的に、細胞を注射することができる。必然的に、無細胞マトリクスおよび／または上記の他の物質のうち任意のものの投与は、単回、または反復（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５，４０、５０、６０、８０、９０、１００、または必要な回数)であってよい。反復投与の場合は、投与は当該分野の熟練者が容易に決定できる間隔で行うことができる。さまざまな物質および因子の投与量は、対象の生物種、年齢、体重、大きさ、性別によって大きく変化し、同様に当該分野の熟練者が容易に決定できる。
【００４７】
マトリクスを使用できる症状は多様である。従って、たとえば、上記の損傷または欠陥のうち任意のものを有する骨および／または軟骨の修復にマトリクスを用いることができる。粒子状および非粒子状マトリクスの両方を、上に列記された工程の任意のものによって、形態の任意のものに用いることができる。そのような治療方法を適用することのできる骨は、特に限定はされず、長骨（たとえば、脛骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、腓骨、手足の骨（たとえば、踵骨または舟状骨)、頭や首の骨（たとえば側頭骨,頭頂骨,前頭骨、上顎骨、下顎骨)、または脊椎を含む。上述のように、重篤な骨の隙間異常(critical gap defect of bone)は無細胞マトリクスで治療することができる。そのような重篤な骨の隙間異常では、隙間を、たとえば、粒子状無細胞マトリクスのパテまたは無細胞マトリクスの押し固めたシートで充填し、無細胞マトリクスのシートで包むことができる。あるいは、隙間を無細胞マトリクスのシートで包み他の材料で充填することができる（下記参照）。これらすべての骨および／または軟骨の治療において、修復過程をさらに助けるために追加の材料を用いることができる。たとえば、隙間を海綿状の骨および／または硫酸カルシウムペレットで充填し、粒子状無細胞マトリクスを、脱灰骨粉末と混合した骨損傷または骨欠陥の部位に与えることができる。さらに、無細胞マトリクスはレシピエント由来の骨髄および／または骨片と組み合わせることができる。
【００４８】
無細胞マトリクスはまた、たとえば腹壁筋膜または骨盤底筋膜のような、筋膜を修復するのに用いることができる。そのような方法では、無細胞マトリクスのストリップを一般的に、たとえば、周囲の筋膜またはホスト組織またはクーパー靱帯のような安定した靱帯または腱に縫合することによって、腹底部または骨盤底に付ける。
【００４９】
梗塞心筋は、無細胞マトリクスによるリモデリングのもう一つの候補である。以前の定説に反して、すべての心筋細胞が、増殖能力、すなわち再生能力を失っているわけではないことが現在では知られている（たとえば非特許文献４；非特許文献５）さらに、たとえば骨髄および血液中にまた血管に随伴する周皮細胞として存在する幹細胞は、心筋細胞に分化することができる。梗塞組織自体を除去して適当な大きさに切った無細胞マトリクスのシートで置換するかまたは、粒子状無細胞マトリクスの懸濁液を梗塞組織に注射することができる。先天性心臓発育不全、またはその他の構造的欠陥は、たとえば、組織に切り込みを入れ、切開によって作られた隙間を拡張し、目的の大きさに切った無細胞マトリクスのシートを挿入し、または無細胞マトリクスのシートを心内および心外表面に配置し粒子状無細胞マトリクスをそれらの間に配置することによって、修復することができる。ある種の条件下では、切開によって隙間を作成することは不十分であり、一部の組織を摘出することが必要であると理解される。必然的に、当該分野の熟練者は、無細胞マトリクスは同様に他の種類の筋肉、たとえば、膀胱または尿管または二頭筋、胸筋、または広背筋のような骨格筋の損傷または欠陥を修復するのに同様に用いることができることを理解する。
【００５０】
さらに、無細胞マトリクスのシートは、食道、胃、そして小腸および大腸を含む、損傷しまたは摘出された腸組織を修復または置換するのに用いることができる。この場合、無細胞マトリクスのシートは腸の穿孔すなわち穴を修復するのに用いることができる。あるいは、無細胞マトリクスのシートは、たとえば、腸の隙間（たとえば腸の腫瘍または疾患部位を除去するための手術によって作られた隙間）を補うのに用いることができる円筒の形に形成することができる。そのような方法は、たとえば、横隔膜ヘルニアを治療するのに用いることができる。シート形状の無細胞マトリクスはまたこの状態の横隔膜自体、ならびに修復または置換または組織の追加を必要とするその他の横隔膜の状態を修復するのにも用いることができると理解される。
【００５１】
以下の実施例は、本発明を例示したものであり、限定することを意図していない。
【実施例】
【００５２】
実施例１.  全層の骨軟骨性損傷の形成の７日後に評価した無細胞皮膚マトリクスの骨および軟骨へのリモデリング
この最初の実施例では、再増殖、再血管形成、および一体化を含む初期のリモデリング現象を実証するために、移植後の初期（１週間）の修復現象を検討した。さらに、異なる構成の無細胞マトリクス材料を試験した。Ｘｅｎｏｄｅｒｍ（無細胞ブタ皮膚マトリクスシート）および微粒子状Ｘｅｎｏｄｅｒｍ（凍結破砕無細胞ブタ皮膚マトリクス）が関節の軟骨および骨の損傷を修復する有効性を評価するために、ユカタンミニブタモデルを使用した。動物の飼育および手術は、所内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ)の必要条件に従って実施した。一般的に、動物をテラゾール（８ｍｇ／ｋｇ）、ケタミン（４ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ)を用いて筋肉内（ＩＭ)麻酔した。動物は挿管し、２〜３%イソフルランおよび１〜２Ｌ／分のＯ２で維持した。術前投薬にはセファゾリン約４０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与（ＩＶ)、ブプレノルフィン０．００７ｍｇ／ｋｇ ＩＭ、およびグリコピロレート０．０１ｍｇｋｇ ＩＭが含まれた。術後の抗菌物質はセファゾリン３.０〜３．５ｇ ＩＶであった。術後の鎮痛としては、ブプレノルフィン０．００７ｍｇ／ｋｇ ＩＭ、および必要に応じて１〜３日毎に貼付したフェンタニル５０、７５μｇ／ｈｏｕｒ（経皮）パッチが含まれた。
【００５３】
個体１（ＩＤ＃８０−６）軟骨修復モデル。
【００５４】
両後肢の後膝関節（膝の関節）の露出および手術は過剰な歩行困難およびその結果の痛みと苦痛を生じるため、個体の右後肢だけを処置した。
【００５５】
遠位大腿骨から近位脛骨へ側面の切開を行い、関節包を露出した。関節腔を切開し、外側および内側顆を露出した。損傷深さの削りすぎを防ぐためのスリーブ付きの６ｍｍドリル用ビットを使用して、最終的な損傷を作成した。滅菌生理食塩水を用いて試験マトリクスを移植前に水和した。損傷を生理食塩水で洗浄して骨の破片およびこぼれた骨髄因子を除去後、適当なマトリクス複合物を損傷部位に充填した。関節腔は生理食塩水で洗浄し、３−０ ＰＤＳ（硫酸ポリジオキサノン縫合糸、Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ、ニュージャージー州Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ）を用いて非連続縫合パターンで閉じた。筋肉および皮下層は２−０プロレン（ポリプロピレン縫合糸、Ｅｔｈｉｃｏｎ Ｉｎｃ、ニュージャージー州Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ）を用いて連続縫合パターンで閉じた。
【００５６】
直径６ｍｍで軟骨下骨部に６〜８ｍｍ伸びている全層損傷を外側顆に作成した。損傷は、滅菌生理食塩水中に約３３０ｍｇ／ｍＬで再懸濁した微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍ(Ｃｙｍｅｔｒａのブタ同等物）で充填した。ＸｅｎｏＤｅｒｍのシート（ＡｌｌｏＤｅｒｍのブタ同等物）（２ｃｍ２）を大きさに合わせて切り、損傷の上に配置し、ポリＬ−ラクチド（ＰＬＬＡ）生体吸収性鋲（ＡｕｔｏＴａｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｈｏｒｉｚｏｎｓ、アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）を用いて外側顆の非加重点に固定したＸｅｎｏＤｅｒｍシートの位置決め後、さらに微粉末化したＸｅｎｏｄｅｒｍ懸濁液を、シートを通して２６ゲージ針を用いて注射することによって損傷の充填を確実にした。
【００５７】
同一の損傷（直径６ｍｍ、軟骨下骨に６〜８ｍｍ侵入）を内側顆に形成した。損傷は、ＸｅｎｏＤｅｒｍの、「巻きたばこ」状の構造の６ｍｍ幅のストリップで充填した。「巻きたばこ」ストリップの移植後、移植片の上に残っている空隙は、ＸｅｎｏＤｅｒｍシートの円形の６ｍｍ円板３枚を損傷に押し込んで充填した。ＸｅｎｏＤｅｒｍのシート（２ｃｍ２）を大きさに合わせて切り、内側顆の上に配置し、６−０ ＰＤＳを用いて７つの等間隔の縫合で固定した。
【００５８】
個体２（ＩＤ＃８０−２）骨移植片モデル
手術が関節腔に入るものと比較して傷害性が低いと考えられたため、両後肢を処置した。大腿骨の外側面から脛骨粗面へ伸びる皮膚切開を伴う、後膝関節（膝の関節）への側面からのアプローチを用いた。皮下組織を切開し、骨膜起子を用いて筋膜の遠位大腿骨および近位脛骨への結合を除去した。
【００５９】
直径１ｍｍ、骨に４〜５ｍｍ侵入した損傷を、直径１ｍｍのドリル用ビットを使用して、両肢の遠位大腿骨および近位脛骨の外側面上に作成した。
【００６０】
右肢の遠位大腿骨の損傷は予め切ってある直径１ｃｍのＸｅｎｏＤｅｒｍシートで充填した。ＸｅｎｏＤｅｒｍの２ｃｍ２シートを、移植片を覆って６−０プロレンを用いて周囲の骨膜に縫合した。右後肢の近位脛骨の損傷は、滅菌生理食塩水中に約３３０ｍｇ／ｍＬに再水和した微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍで充填した。移植片は、傷の閉部に重なる筋膜および筋肉を接触して並置することによって定位置に保たれた。
【００６１】
左肢の遠位大腿骨の損傷は乾燥微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍで充填した。ＸｅｎｏＤｅｒｍの２ｃｍ２シートを、損傷を覆って配置し、４個のＰＬＬＡ鋲（ＡｕｔｏＴａｃ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｈｏｒｉｚｏｎｓ、アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）で定位置に固定した。左肢の近位脛骨の損傷は、４つの骨損傷を作成する間に採取した骨の集積から得られた自家骨で充填した。自家骨は滅菌生理食塩水で湿潤に保ち、移植前に乳鉢と乳棒で細片化した。移植片は、傷の閉部に重なる筋膜および筋肉を接触して並置することによって定位置に保たれた。
【００６２】
動物は術後少なくとも２時間保定器具に置いた。麻酔からの回復後、動物は動きと重量支持が制限される制限檻内に維持された。手術から２４時間後、両方の動物は動くことができた。個体１（軟骨損傷）は手術肢を庇っていたが処置肢には制限された重量支持を行っていた。個体２（骨損傷）は動くことができた。
【００６３】
手術から７日後、動物を屠殺し両方の個体の後肢を股関節で関節を外し、個体２の骨移植肢はＸ線に供した。関節領域を肢から切り離し、肉眼および顕微鏡検査に供した。
【００６４】
個体１（＃８０−６)に関しては、下記の肉眼的観察が得られた。
【００６５】
(ａ）大腿骨外側顆
微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍを充填した損傷では、ＸｅｎｏＤｅｒｍシートは外れていたが鋲止めの一ヶ所で定位置に保たれていた。顆と膝蓋骨関節表面の間で出血が明らかであった。損傷は外観上僅かに凹（表面下１〜１.５ｍｍ)、赤みがかって、出血性であった。鋲止めの穴は明らかに視認され、色は黒であった。軟骨−骨ブロックを摘出して１０%ホルマリン固定液中に４日間、４℃にて置いた。ＸｅｎｏＤｅｒｍシートは別に同条件下で１０%ホルマリン中で固定した。
【００６６】
(ｂ）大腿骨内側顆
ＸｅｎｏＤｅｒｍの覆いはそのままであって軟骨表面によく固定されていた。縫合を切断し覆いは上記の通り１０%ホルマリン中に置いた。縫合糸は損傷に癒着していた。損傷は軟骨表面と連続的であり触れると固く、いくらか血があった。軟骨表面全体は綺麗に見えた。軟骨−骨を摘出して１０%ホルマリン中で上記の通り固定した。
【００６７】
両方のブロックを４日後にホルマリンから取り出し、「脱石灰」溶媒中の処理のために剃刀の刃で厚さ３〜４ｍｍに２分割した。
【００６８】
要約すると、移植の１週間後に移植材料は骨軟骨性損傷内に存在すること、周囲の組織と連続性があり、また容量が維持されていたことが、肉眼観察で明らかになった。
【００６９】
個体２（＃８０−２)については、下記の肉眼的観察が得られた。
【００７０】
肉眼分析
(ａ）右肢、遠位大腿骨
損傷を覆うＸｅｎｏＤｅｒｍシートは定位置にあったが、手術部位周辺の血腫が明らかであった。覆いの中央に僅かな窪みがあった(約１ｍｍ)；移植片全体と周囲の骨を骨のこを用いて摘出し、ブロックを１０%ホルマリン中に置いた。ホルマリン中で４日後、ブロックを２分割し移植片の肉眼的外観を観察した。
【００７１】
(ｂ）右肢、近位脛骨
損傷の周縁は識別が容易でなく、顕著な血腫が明らかであった。移植片の表面は不規則で、しかしプローブを用いた貫通に対しては固かった。移植片全体と周囲の骨を骨のこを用いて摘出し、ブロックを１０%ホルマリン中に置いた。ホルマリン中で４日後、ブロックを２分割し移植片の肉眼的外観を観察した。
【００７２】
(ｃ）左肢、遠位大腿骨
ＰＬＬＡ鋲を用いて固定したＸｅｎｏＤｅｒｍシートはそのままで、目立たず、周囲の骨膜に癒着したように見えた。シートの下の移植材料はプロービングに対して固かった。移植片全体と周囲の骨を骨のこを用いて摘出し、ブロックを１０%ホルマリン中に置いた。ホルマリン中で４日後、ブロックを２分割し移植片の肉眼的外観を観察した。
【００７３】
(ｄ）左肢、近位脛骨
自家骨移植片は突出した骨性の断片を有する粗い表面を示した。移植片はプロービングに抵抗性であった。移植片全体と周囲の骨を骨のこを用いて摘出し、ブロックを１０%ホルマリン中に置いた。ホルマリン中で４日後、ブロックを２分割し移植片の肉眼的外観を観察した。
【００７４】
肉眼レベルでは、すべての骨移植片は容量の保持および周囲の組織への良好な密着を示した。感染または移植片の検出可能な拒絶の証拠は無かった。
【００７５】
組織学的分析
効果的な組織修復および再生には、移植材料が再血管形成される必要がある。再血管形成は、リモデリング過程を推進する修復細胞の再増殖を促進する。微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍで充填した、個体１に形成した骨軟骨性損傷の組織学的分析は、すべての無細胞移植片構成において生じるこれらの過程を代表する。移植後７日の骨軟骨性損傷のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色は、下にある骨の軟骨下骨にはっきりと侵入している直径６ｍｍの穴で、最初の損傷のおよその大きさが明瞭に明確化されることを示している。周囲のホスト関節軟骨、および下にある小柱骨および骨髄因子もまた同定された。このような早い時点でさえ、表面での軟骨の内殖、および損傷の両壁面および底部に沿った新しい骨形成の証拠があった。移植片と周囲のホスト軟骨との間の効果的な一体化、移植片全体の多数の血管によって証明された高度な再血管形成、および移植片の底部から生じる、新しい骨形成を代表する小柱の伸長が観察された。これらの現象はすべての無細胞移植材料において、移植片の構成に依存してさまざまな程度でみられた。微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍはこの早い時点では、シート状ＸｅｎｏＤｅｒｍと比較してより高度な再血管形成および細胞の再増殖を示した。しかし、一般的な結論は、７日目に、軟骨および骨の修復を促進する適当なリモデリング現象が生じているということであった。
【００７６】
実施例２.全層の骨軟骨性損傷の形成の８週間後に評価した無細胞皮膚マトリクスの骨および軟骨へのリモデリング
関節の軟骨損傷の基礎となる骨の損傷の修復について無細胞皮膚マトリクス足場の有効性を実証するために、ユカタンミニブタ骨軟骨性プラグ損傷モデルを使用した試験を実施した。移植片の３種類の処方を評価し、どの処方でも充填されていない損傷と比較した。試験した処方は：（１)表面をフィブリン糊で密封した微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍパテ（〜６００ｍｇ／ｍＬ）（２）フィブリノゲンおよびトロンビンと組み合わせてゲルを作成し、表面をフィブリン糊で密封した、微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍ（〜３３０ｍｇ／ｍＬ）、または（３）軟骨損傷の周囲に縫合したＡｌｌｏＤｅｒｍのシートで定位置に保った微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍペースト（〜３３０ｍｇ／ｍＬ）、であった。従って、処方（１）および（３）の無細胞マトリクス成分は、微粉末化（粒子状）ＸｅｎｏＤｅｒｍの濃度に関してのみ異なった。
【００７７】
直径６．４ｍｍで軟骨を通じて伸び軟骨下骨部に５ｍｍ伸びている全層損傷を、２個体の骨格的に成熟したユカタンミニブタの内側および外側顆に一側性に作成した。骨格的に成熟したユカタンミニブタは、その解剖学的大きさおよび軟骨厚みがヒトと似ているために選択された。選択された２個体は、同一年齢で似通った体重であり（８２ｋｇおよび８４ｋｇ)、術前にＸ線検査を行って、適当な大きさ、骨格の成熟、および明白な骨の異常が存在しないことを確認した。
【００７８】
両方のブタはテラゾール（８ｍｇ／ｋｇ）、ケタミン（４ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（４ｍｇ／ｋｇ)を用いてＩＭ麻酔した。動物は挿管し、２〜３%イソフルランおよび１〜２Ｌ／分のＯ２で維持した。術前投薬にはセファゾリン約４０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与ＩＶ、ブプレノルフィン０．００７ｍｇ／ｋｇ ＩＭ、およびグリコピロレート０．０１ｍｇｋｇ ＩＭが含まれた。術後の抗菌物質はセファゾリン３.０〜３．５ｇ ＩＶであった。術後の鎮痛としては、ブプレノルフィン０．００７ｍｇ／ｋｇ ＩＭ、および必要に応じて１〜３日毎に貼付したフェンタニル５０、７５μｇ／ｈｏｕｒ（経皮）パッチが挙げられた。
【００７９】
遠位大腿骨から近位脛骨へ伸びる側面の切開を行い、関節包を露出した。関節腔を切開し、外側および内側顆を露出した。損傷深さ（５ｍｍ）の削りすぎを防ぐためのスリーブ付きの６.４ｍｍドリル用ビットを使用して、最終的な損傷を作成した。滅菌生理食塩水を用いて試験マトリクスを移植前に水和した。損傷を生理食塩水で洗浄して骨の破片およびこぼれた骨髄因子を除去後、注射器と鈍プローブを用いて適当なマトリクス複合物を損傷部位に充填した。充分量の材料を損傷に入れ、損傷が関節表面と同一平面になるようにした。関節腔は生理食塩水で洗浄し、３−０ ＰＤＳを用いて単純結節縫合パターンで閉じた。筋肉および皮下層は２−０プロレンを用いて連続縫合パターンで閉じた。
【００８０】
動物は手術終了後少なくとも２時間ブタ用保定器具に置いた。ＲｏｂｅｒｔＪｏｎｅｓ包帯を処置肢に巻き、膝（ひざ）関節の過剰な動きを低減した。動物は術後８週間で安楽死させ、後肢を取って分析のために処理した。
【００８１】
骨および軟骨の治癒を所定の手順を用いて肉眼的におよび組織学的に評価した。関節を露出して損傷を写真撮影した。損傷は全体を摘出し、ホルマリン固定液中に３日間置いた。最初の固定後、損傷を半分に二分割し、骨軟骨性損傷の深さにわたるリモデリングが見えるようにした。半分の一方は限定脱灰化に供し、切断して、必要に応じてＨＥおよびその他の色素で染色した。半分のもう一方はＩＩ型コラーゲンの発現について免疫細胞化学処理を行った。
【００８２】
肉眼分析
採取した損傷のそれぞれを肉眼的外観について検査した。この主観的分析は、関節内障害の形成、関節表面の回復、軟骨の侵食および外観について得点を分配する。肉眼的評価尺度を下記に示す：
2005506121.tif 000002
これらの視覚的観察は、Ｃｙｍｅｔｒａ／フィブリンで充填した損傷について、無処置対照と比較して軟骨表面の修復の顕著な改善を示している。
【００８３】
固定したブロックは２分割して写真撮影しており、図１に示す。この分析は、下にある小柱骨の８週間目の修復を示す。空の損傷（図１のＢ）と比較して、Ｃｙｍｅｔｒａパテで充填した損傷について顕著な骨修復が明らかである（図１のＤ）。フィブリンポリマーとＣｙｍｅｔｒａとの組み合わせは骨リモデリングを阻害したように見え（図１のＣ)、Ｃｙｍｅｔｒａパテで充填した損傷（図１のＡ）だけがごくわずかな新しい骨性物質を伴う顕著な容量の減少を示している。
【００８４】
免疫組織化学および組織学
本物の関節軟骨の同定は、超微細構造および／または生化学パラメータを試験することによって達成することができる。関節軟骨は、同定可能な領域を有する軟骨組織の連続的な層を形成する。表層は、平らな形態を持つ軟骨細胞、およびトルイジンブルーで染色されにくい、硫酸化グリコサミノグリカン（主にアグリカン）の相対的な不在を示す細胞外ネットワークによって特徴づけられる。中層および深層の軟骨細胞は球状の外観を持ち、マトリクスはトルイジンブルーでの染色によって証明されるように豊富な硫酸化プロテオグリカンを含む。
【００８５】
Ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ染色は石灰化組織の濃い黒色の染色を示す。この染色は、カルシウム塩への銀の沈着を通じて、既存のおよび新しく再生された骨を表す。典型的には、対比染色はサフラニンＯであり、これは軟骨を赤橙に染色する。この方法で新しいおよび既存の骨は切片中で形態学的に容易に識別することができる。サフラニンＯ／ファストグリーンはトルイジンブルーより多くの性質を識別することができる。サフラニンＯは関節軟骨中のプロテオグリカンを赤橙に染める塩基性色素であり、そして下にある軟骨下骨は薄くしか染まらない。ファストグリーンは細胞質を灰緑に染める酸性色素である。この染色は既存のおよび再生した軟骨を明瞭に同定することができるだけでなく、その２つの領域の違いを識別することもでき、それによってプロテオグリカンの含量の違いを示す。
【００８６】
ＨＥは骨を暗赤色に染色し、プロテオグリカンに富む軟骨は薄くしか染まらない。
【００８７】
マッソントリクロームは修復組織の違いを区別する。軟骨および硫酸化グリコサミノグリカンに富む修復組織は赤く染色され、骨のコラーゲンは青く染色される。
【００８８】
組織学的評価は下記の一または複数の評価を含むことができる：修復軟骨中のグリコサミノグリカン含量；軟骨および軟骨細胞の形態；そして損傷境界面の構造的全体性と形態。修復軟骨の形態は形成された軟骨の型によって識別することができる：グリコサミノグリカン含量による関節軟骨対線維軟骨、軟骨沈着の程度、細胞およびコラーゲン線維の組織。
【００８９】
ＩＩ型コラーゲンの存在は、分化した軟骨細胞の表現型マーカーとして認められている。標準的なゲル電気泳動、ウェスタンブロット分析、および／または免疫組織化学染色でＩＩ型コラーゲンの存在を識別できる。Ｉ型およびＩＩ型コラーゲンについての染色は、再生した軟骨下骨と再生組織の間の境界を決定するのに有用である。一般的に、線維性の再生組織はより薄く染色される。さらに、新しく形成された軟骨下骨は、残存する軟骨の小さな針状体中のＩＩ型コラーゲンの局在によって同定されうる。
【００９０】
骨軟骨性損傷の修復を評価するのに用いられる共通尺度はＯ'Ｄｒｉｓｃｏｌｌによって開発されており、改変をここに示す：
【表１−１】
2005506121.tif 000003
【表１−２】
2005506121.tif 000004
空の損傷は新しい骨形成が本質的にみられず、損傷の大きさは変化しなかった；しかし、線維性組織に重なる、また損傷の壁部まで貫通する、限られた軟骨形成の証拠があった。最も頑健な骨修復はＣｙｍｅｔｒａパテで充填した損傷で見られ、損傷の７０％を超える小柱骨を含んだ。対照的に、Ｃｙｍｅｔｆａ／フィブリンの組み合わせは元のマトリクス材質で充填した損傷のリモデリングに阻害的であるように見えたが、この移植片について観察された軟骨修復は空の損傷および他の移植片材料より優れていた。
【００９１】
骨および軟骨の両方を包含する骨軟骨性修復についてのこれらの移植片の得点は、以下の通りである：
移植片                                  得点合計
空の損傷                                  ７
Ｃｙｍｅｔｒａ                            ７
Ｃｙｍｅｔｒａ＋フィブリン              １７
Ｃｙｍｅｔｒａパテ                      １８
すべての移植材料は無処置対照より顕著に良好に得点した。しかし、Ｃｙｍｅｔｒａ／フィブリンの組み合わせは軟骨修復の指標についてより良好に得点し、またＣｙｍｅｔｒａパテは小柱骨修復についてより良好に得点したことが注目された。にもかかわらず、無処置損傷と比較して、無細胞マトリクス移植片の組み合わせは骨誘導性であり（すなわち、骨修復を可能にする)、そして軟骨修復の足場として作用する。
【００９２】
実施例３．ブタ分断損傷モデルにおける骨膜のリモデリング
骨の直径の２倍に達する骨幹中部の分断損傷(約３ｃｍ）を、ブタ２個体のそれぞれの一つの大腿骨に一則性に、外科的に作成した。損傷はこのように自然には治癒しない臨界サイズ損傷であった。骨にネジ止めした金属製の骨板を損傷上にわたって適用し、それによって骨切除された骨を正しい解剖学的位置に固定した。Ｘｅｎｏｄｅｒｍのシートは、外科的適用の前に約１０分間生理食塩水に浸漬することによって再構成した。ＸｅｎｏＤｅｒｍシートを円筒形の骨損傷の周りに巻き付け、チューブを形成した。シートは隙間の両側の骨の近位および遠位端に約５ｍｍ重ね、縫合で骨膜に固定した。ＸｅｎｏＤｅｒｍのチューブを閉じる前に、ＸｅｎｏＤｅｒｍシートによって定義されるチューブを、ＯＳＴＥ０ＳＥＴ（登録商標）（硫酸カルシウム）ペレットと、レシピエントブタの近位上腕骨から得た海綿状自家骨との１：１混合物で充填した。チューブを移植材料で充填した後、ＸｅｎｏＤｅｒｍシートを長さに沿って縫合糸を用いて連続パターン縫合で閉じた。
【００９３】
Ｘ線分析を手術後に、３および６週間の時点で実施した。組織学的分析を、６週間の試験の終了時に実施した。定型のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色を、分断損傷領域について実施した。
【００９４】
ブタは処置肢での重量支持を手術後５日以内に回復し、槽は通常の様態で治癒した。術後および３週間目のレントゲン写真は、両方のブタで骨の破損あるいは骨板またはネジの破損無しに、損傷が安定化して保たれたことを示した。ブタのそれぞれで術後３週間までにネジ１本がゆるみ、１個体では６週間目に数本のネジがゆるんでいた。６週間後、両方のブタは大腿骨の頭側および側面に骨板を覆ってさまざまな程度、骨膜反応（その結果、仮骨の形成が生じる）を有した。両方のブタの損傷内に、さまざまな量の新しい骨が存在した。天然の大腿骨の近位および遠位端は、骨膜、皮層、および髄の表面から骨の増殖を示した。この骨は、骨幹骨髄腔の再生の初期段階として損傷内へ伸長した。
【００９５】
解剖レントゲン写真（図２）は損傷内で形成された相当量の新しい骨を示し、移植された膜の境界内で貫通するように見える初期の管状構造に類似している。この早期の６週間の時点では固い管状構造は完全には再構築されていなかったが、損傷を埋める新しい骨の形成の支柱が存在した。
【００９６】
２個体のブタの組織切片は、無細胞マトリクス（ＸｅｎｏＤｅｒｍ）が、治癒のための環境を提供することによって、分断損傷において新しい骨の形成の生化学的および物理的ガイドとして機能することを示す。組織切片は、移植されたマトリクスの三次元マトリクス内を貫通する新しい骨の形成を実証した。このように、マトリクスのコラーゲン束は新しく形成された骨と絡み合って観察され、新しい骨は実際に、マトリクスに隣接してと同様にマトリクス内で形成されたことを示す。マトリクス内の新しい骨の一部は、組織学から、最初の軟骨期を通じて形成するように見えた。
【００９７】
この試験は、困難な分断損傷モデルにおいて、無細胞マトリクスがその下にある骨損傷部位を保護し治癒のための保護された環境を提供する能力を示す。移植されたマトリクスは損傷部位に留まり、マトリクス自体の内部で豊富な細胞活動が存在した。実際、一部の新しい骨はマトリクスの境界でと同様にマトリクス内で形成された。従って、移植された無細胞皮膚マトリクス（ＸｅｎｏＤｅｒｍ）は、リモデリングしてそれに隣接する新しい骨の形成を刺激することにおいて正常骨膜と本質的に同じ様態で機能し、またそれ自体の内部で新しい骨形成を誘導したように見える。
【００９８】
実施例４.先天性心筋欠陥を補正し損傷心室を修復するための無細胞マトリクスの使用
２種類のラット異所性心移植モデルを試験した。一方は虚血心室異常のモデル（「虚血モデル」）であり、もう一方は先天性左心肥厚（「形成不全左心モデル」)である。虚血モデルでは、左主冠状動脈は結紮され、虚血範囲は摘出され、そして心筋の適当な部分が摘出部分と同一の比率を有するマトリクスで置換されている。その操作は全体的な心室の形および構成を保存する。形成不全左心モデルは、動脈結紮または摘出は含まないが、心室の空洞の全体的な大きさを拡大する必要に応じて、左心室壁の切開および継ぎ当て拡大を含んだ。さらに、これらのモデルの両方で、ドナー心臓の吻合接続を適当に操作することによって（非特許文献６；非特許文献７）、機能する（すなわち、正常な心室充満）または無負荷（心室バイパス）左心室のいずれかを作成することができる。心室に移植されたマトリクスは、強度と支持のためのゴアテックス（登録商標）（ポリテトラフルオロエチレン；ＰＴＦＥ)（Ｗ.Ｌ. Ｇｏｒｅ ＆ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ, Ｉｎｃ、アリゾナ州Ｆｌａｇｓｔａｆｆ）の１ｍｍの層と、組織の再生を誘導する無細胞マトリクス（たとえば、ＡｌｌｏＤｅｒｍ、ＸｅｎｏＤｅｒｍ、または無細胞血管マトリクス）の内層との２層の形に構成されている。別の方法として、粒子状マトリクスをシートの間に挟んだ、無細胞マトリクスの２枚のシートを用いることができる。
【００９９】
広範囲に記載された異所性心移植モデルにおいて、同系オスＬｅｗｉｓラットを心ドナーおよびレシピエントの両方として使用した（非特許文献６；非特許文献７）。ドナーの全身ヘパリン化および冷却血液加心筋保護法の後、上大静脈（ＳＶＣ）、下大静脈、左ＳＶＣを含む左右肺を結紮し、４本の別々の結紮糸を用いてドナー心臓を胸郭から取り出す。
【０１００】
形成不全左心モデルを作成するには、左心室内に左前下行枝の側方に５ｍｍの切開を入れる。次いで心室の空洞を、４ｍｍ×４ｍｍ×２ｍｍの２層構造物（上記の通り)の挿入によって拡大する。その後、構造全体を８０ナイロン糸で連続閉縫合によって定位置に固定する。閉縫合は止血を適切に達成し、この吻合における出血が問題となる可能性は低い。ドナー大動脈弓のレシピエント腎臓下動脈への、およびドナー肺動脈のレシピエント腎臓下下大静脈への端側吻合によるこの移植片の移植は、完全に無負荷の左心室を生成し、移植された心臓は動静脈シャントとして機能する。酸素に富む動脈血は、レシピエント大動脈からドナー大動脈および冠状動脈を通過し、心筋を潅流し、冠状静脈洞を通じて右心房および右心室へ排出され、レシピエント下大静脈へ拍出される。小さな改変で、ドナー肺動脈をドナー左心房へ吻合することによって、容積負荷された、完全に機能する左心室を作成することができる。心臓は次いでドナーＳＶＣのレシピエント腎臓下下大静脈への端側吻合およびドナー大動脈弓のレシピエント腎臓下動脈への端側吻合によって移植される。レシピエント下大静脈からの静脈血はドナーＳＶＣに入り、右心房および右心室を通過し、ドナー左心房へ拍出される。左心房および左心室を通過後、レシピエント大動脈へ拍出される。
【０１０１】
無負荷および完全負荷左心室心臓は、この技術の小さな改変によって、左前下行枝を第一対角枝のすぐ遠位で結紮、虚血した左心室壁の４ｍｍ×４ｍｍの範囲の全層切除、およびその欠損への４ｍｍ×４ｍｍ×２ｍｍの構造物の移植によって作成される。この再構築は左心室の全体的な構成を保存する。対照動物は、心筋の切除を行わずまた心室の継ぎ当てを移植しないことを除き、同一の手順を受ける。
【０１０２】
直ちに閉じる単純な心室開口術は形成不全モデルの対照となり、虚血心筋の切除を行わない左前下行枝の結紮は虚血モデルの対照となる。
【０１０３】
４つの実験群は以下の通りである：（１）虚血および負荷＋マトリクス；(２)虚血および無負荷＋マトリクス；(３）形成不全および負荷＋マトリクス；および（４）形成不全および無負荷＋マトリクス。
【０１０４】
４つの対照群は以下の通りである：（１）虚血および負荷、マトリクス無し；(２）虚血および無負荷、マトリクス無し；(３）形成不全および負荷、マトリクス無し；および（４）形成不全および無負荷、マトリクス無し。
【０１０５】
Ａｌｌｏｄｅｒｍ、ＸｅｎｏＤｅｒｍ、および同等の無細胞血管マトリクスを別々の実験で試験した。
【０１０６】
外科手順の完了時に、動物は飼料および水の自由摂取下で回復させられた。すべての群の動物は試験期間中５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ)を飲水中に（０．８ｍｇ／ｍＬ）投与され、移植後１ヶ月および２ヶ月で心筋再生について分析された。これらの時点で、動物を屠殺し、心臓を１０％リン酸緩衝ホルマリンを用いて膨張状態で固定し、パラフィン包埋し、移植された細胞外マトリクスを含む代表的な領域を５マイクロメートルの冠状切片に切断した。これらの切片の一部をＨＥで染色し、細胞内殖の細胞の形態、細胞質、および組織化パターンを周囲の心臓のものと比較する。ＢｒｄＵはチミジンアナログであって細胞周期のＳ期の間にＤＮＡに組み込まれるため、分裂した細胞だけがそのヌクレオチドアナログを組み込むことができる。抗ミオシン重鎖モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）および抗トロポニンＣマウスモノクローナル抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ.）のような心筋細胞特異的抗体、ならびに抗ＢｒｄＵ特異的抗体を利用する免疫組織化学的評価によって、分裂して心筋に分化した心筋細胞または心筋前駆細胞を同定することができる。新生心室組織の血管分布像は、マウス抗内皮細胞抗体（ＣＤ３１；ＰＥＣＡＭ−１)（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ.，カリフォルニア州Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ)を用いた血管内皮の免疫組織化学染色後に毛細管および動脈密度を計測することによって評価する。再生の実験群と対照群の間の定量的比較は、ＢｒｄＵを組み込んでいる再生している心筋細胞の数を計測することによって実施する。
【０１０７】
心筋機能は卓上Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ調製を利用して評価する。全身ヘパリン化後、異所性心を摘出して、５%二酸化炭素と９５%酸素で平衡化した濾過したＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液を用いてＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ還流装置で還流する（非特許文献８）。ラテックスバルーンが僧帽弁を通じて左心室へ通され、圧力変換器に接続されている。バルーンの大きさを次いで０.０２ｍＬ刻みで０.０４から０.４６ｍＬへ、生理食塩水の添加によって増大させ、その間に収縮期圧および拡張期圧を記録する。それぞれの容積で明らかになる圧は左心室機能を反映し、収縮期圧と拡張期圧の差として計算される。
【０１０８】
心筋の傷の部分に直接投与された粒子状無細胞マトリクスの再生能力を別の一連の実験で調査した。この現象を試験するために、ドナー心像を上記の通り摘出し、左主冠状動脈を結紮する。上記の通り負荷または無負荷左心室を作成するため、ドナー心臓を次いで同系レシピエントの腹部に移植する。
【０１０９】
梗塞の１ヶ月後、傷のリモデリングおよび炎症反応によるマトリクス溶解の完了時、異所性心を冷却血液加心筋保護法によって一時的に停止させ、梗塞の部分に、２つの別々の実験群で微粉末化形状のＡｌｌｏＤｅｒｍ（すなわちＣｙｍｅｔｒａ）およびＸｅｎｏＤｅｒｍをそれぞれ注射する。対照群は、傷の部分に生理食塩水だけを注射することを除いて、同一の操作を受ける。
【０１１０】
４つの実験群は以下の通りである：（１）虚血および負荷＋微粉末化ＡｌｌｏＤｅｒｍ；(２）虚血および無負荷＋微粉末化ＡｌｌｏＤｅｒｍ；(３）虚血および負荷＋微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍ；および（４）虚血および無負荷＋微粉末化ＸｅｎｏＤｅｒｍ。
【０１１１】
２つの対照群は以下の通りである：（１）虚血および負荷＋生理食塩水のみ；および（２虚血および無負荷＋生理食塩水のみ。
【０１１２】
外科手順の完了時に、動物は飼料および水の自由摂取下で回復させられた。実験群および対照群の両方の動物は、試験期間中（ＢｒｄＵ)を飲水中に投与され（上記参照）、移植後２週間、１ヶ月、２ヶ月、および３ヶ月で上記の方法によって分析された。心筋細胞特異的構造タンパク質およびＢｒｄＵについての免疫組織化学染色を用いて、傷の部分または細胞外マトリクスで再増殖した、分裂した心筋細胞または心筋前駆細胞を同定した。
【０１１３】
本発明のいくつかの実施例を記載している。にもかかわらず、本発明の精神および範囲を外れることなくさまざまな改変を行い得ると理解される。従って、他の実施例は以下の請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】図１Ａ−Ｄは、軟骨を通って伸び軟骨下骨部に５ｍｍ入り込んだ損傷が作られた、外側顆または内側顆を含むブタの骨および軟骨組織の写真を示す図である。対照損傷には移植片が配置されなかった(図１Ｂ)。他の損傷は下記のものを充填した：高濃度(約６００ｍｇ／ｍＬ)のＣｙｍｅｔｒａ（登録商標）を用いて作成したパテと、表面をフィブリン糊で密封（図１Ｄ)；低濃度(約３３０ｍｇ／ｍＬ)のＣｙｍｅｔｒａをフィブリノゲンとトロンビンと合わせて作成したゲルと、表面をフィブリン糊で密封（図１Ｃ)；および低濃度(約３３０ｍｇ／ｍＬ)のＣｙｍｅｔｒａを用いて作成したパテを、軟骨損傷周辺に縫合したＡｌｌｏＤｅｒｍ（登録商標）のシートで保持(図１Ａ)。写真は手術から８週間後に撮影された。
【図２】図２は、Ｘｅｎｏｄｅｒｍ（登録商標）のシートで巻き、硫酸カルシウムペレットと海綿状自家移植骨の１：１混合物を充填したブタ大腿骨における重篤な隙間異常を示している２枚のレントゲン写真を示す図である。レントゲン写真は手術から６週間後に撮影された。
【国際公開パンフレット】
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2005506121.tif 000006
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【国際調査報告】
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