(57)【要約】  シュードモン酸A（ムピロシン）を調製するための改良された発酵方法が開示されている。代謝的に制御された発酵プロセスにより、シュードモナスsp.(Pseudomonas sp.)を約２０〜３０℃の範囲の温度で、液体培地において培養することが供される。この発酵培地のpHは、当該発酵培地に、同化できる炭素源、鉱物塩又は酸/アルカリ性溶液を供給することにより約５．５〜６．０に調節されている。従って、生成される発酵ブロスには、主成分として、高収率且つ高純度のシュードモン酸Aが含まれる。発酵ブロス中で、不純物であるシュードモン酸Bは有意に減少している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモン酸（pseudomonic acid）を生産するための改良された発酵方法であって：
a) シュードモン酸を生産する微生物を含む発酵ブロスを調製し；
b) 当該発酵ブロスのpHを調節し；そして
c) 当該発酵ブロスからシュードモン酸を回収する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記シュードモン酸がシュードモン酸Aである、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項３】
前記シュードモン酸を生産する微生物が、シュードモナスsp.（Pseudomonas sp.）株、その子孫、シュードモナスsp.の天然の変異体及び突然変異の変異体からなる群から選択されている請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項４】
前記シュードモナスsp.株が、National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organismsに寄託されたNCAIM（P）B ００１２３５である、 請求項３に記載の改良された発酵方法。
【請求項５】
前記発酵が液内培養である、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項６】
前記発酵が約２０℃〜３０℃の温度で維持されている、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項７】
前記発酵ブロスのpHが発酵の生産期の間中、調節されている、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項８】
前記発酵ブロスのpHが約５．５〜６．０で調節されている、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項９】
前記発酵ブロスのpHが約５．７に調節されている、請求項８に記載の改良された発酵方法。
【請求項１０】
前記発酵ブロスのpHが、当該発酵ブロスに、同化できる炭素源を供給することによって調節されている、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項１１】
前記同化できる炭素源の供給が代謝的に制御されている、請求項１０に記載の改良された発酵方法。
【請求項１２】
前記同化できる炭素源が、デキストロース、グリセロール、植物性の、動物性の油及び脂肪からなる群から選択されている、請求項１０に記載の改良された発酵方法。
【請求項１３】
前記同化できる炭素源がデキストロースである、請求項１０に記載の改良された発酵方法。
【請求項１４】
前記発酵ブロス中のデキストロースレベルが約０．５％（wt/wt）未満のレベルに維持されている、請求項１３に記載の改良された発酵方法。
【請求項１５】
前記発酵ブロスのpHが、発酵ブロスに、同化できる炭素源と酸性溶液を同時供給することにより調節されている、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項１６】
前記同化できる炭素源がグリセロールであり、そして前記酸性溶液が塩酸である、請求項１５に記載の改良された発酵方法。
【請求項１７】
前記発酵ブロスのpHが、当該発酵ブロスに鉱物塩を供給することによって調節されている、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項１８】
前記鉱物塩が硫酸マグネシウムである、請求項１７に記載の改良された発酵方法。
【請求項１９】
前記鉱物塩が塩化カルシウム溶液である、請求項１７に記載の改良された発酵方法。
【請求項２０】
前記塩化カルシウム溶液が約０．１％〜０．８％（wt/wt）である、請求項１９に記載の改良された発酵方法。
【請求項２１】
前記塩化カルシウム溶液が約０．１％（wt/wt）である、請求項１９に記載の改良された発酵方法。
【請求項２２】
前記発酵ブロスのpHが、当該発酵ブロスにアルカリ性溶液を供給することによって調節されている、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項２３】
前記アルカリ性溶液が、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群から選択されている、請求項２２に記載の改良された発酵方法。
【請求項２４】
前記アルカリ性溶液が水酸化カリウムである、請求項２２に記載の改良された発酵方法。
【請求項２５】
前記発酵ブロスのpHが、当該発酵ブロスに酸性溶液を供給することによって調節されている、請求項１に記載の改良された発酵方法。
【請求項２６】
前記酸性溶液が、硝酸（HNO3）、硫酸（H2SO4）及び塩酸（HCl）からなる群から選択されている、請求項２５に記載の改良された発酵方法。
【請求項２７】
前記酸性溶液が塩酸である、請求項２５に記載の改良された発酵方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本発明は、２００１年６月２１日に提出された米国仮出願番号第６０/２９９，９２７号(この内容はその全体を本明細書中に組み込まれている)の３５U.S.C(e)SS.１１９の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、シュードモン酸(pseudomonic acid)を調製するための代謝的制御発酵方法に関連する。更に詳細には、本発明は、発酵培養培地にデキストロース、塩化カルシウムなどの鉱物塩、酸性溶液、又はアルカリ性溶液を供給することによりpHのレベルを調節することによってシュードモン酸Aを調製する発酵プロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ムピロシンとしても公知のシュードモン酸Aは、シュードモン酸の主要な成分である。シュードモン酸は、１９７１年にA.T.Fullerら[(Nature２３４,４１６(１９７１))によって最初に発見された。シュードモン酸Aは以下の化学名及び商用名を有する。その名称とは即ち、[２S−[２α（E）,３β,４β,５α[２R※,３R※（１R※,２R※）]]]−９−[[３−メチル−１−オキソ−４−[テトラヒドロ−3,4−ジヒドロキシ−５−[[３−（２−ヒドロキシ−１−メチルプロピル）オキシラニル]メチル]−２H−ピラン−２−イル]−２−ブテニル]オキシ]ノナン酸、シュードモン酸A、トランス−シュードモン酸、BRL-４９１０A、Bactoderm、Bactroban及びTurixinである。シュードモン酸は局所的抗菌治療作用を有する。
【化１】
2005518780.tif 000002
【０００４】
シュードモン酸Aは、グラム（＋）細菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・ピオゲネシス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）、クレブシエリア・ニューモニアエ（Klebsiella pneumoniae））及びいくつかのグラム（−）細菌（ハエモフィルス・インフルエンザエ（Haemophilus influenzae）、ネイッセリア・ゴノルロエアエ(Neisseria gonorrhoeae)）の双方に対する有力な抗生物質である[A.Ward,D.M. Campoli−Richards：Drugs ３２,pp.４２５〜４４４（１９８６）]。作用の態様は、イソロイシル−tRNA合成酵素を阻害し、細菌におけるペプチド合成に悪影響を及ぼすことに関わると考えられている[J.Hughes及びG.Mellows：Biochem .Jurnal １９１,pp.２０９〜２１９（１９８０）]。これら参考文献に開示された内容は、その全体を参照として本明細書中に組み込まれている。
【０００５】
現在、シュードモン酸は、シュードモナスsp.を培養することによって生産されている。常用の流加培養技術には発酵方法の始めに、ｐHの調節及び栄養の濃度を調節せずに、栄養分を供給することが伴う。流加発酵法では、ｐHレベルが変動し、そして栄養が減少するので、シュードモン酸の収率が往々にして下がってしまう。往々にして、同時に不純物の濃度が増加することが流加培養技術の主な欠点である。
【０００６】
シュードモン酸を調製するための発酵方法を改良すること、特にシュードモン酸A生成物の純度を高めること（事実上、不純物シュードモン酸Bを減らすこと）に関する絶え間ない要請がある。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
１つの観点によれば、本発明はシュードモン酸を生産するための改良された方法を供する。その方法は、
a) シュードモン酸を生産する微生物を含む発酵ブロスを調製し；
b) 当該発酵ブロスのpHを調節し；そして
c) 当該発酵ブロスからシュードモン酸を回収する、
段階を含んで成る。
【０００８】
他の観点によれば、本発明はシュードモン酸を高レベルの純度で生産する(即ち、シュードモン酸Aに対する不純物シュードモン酸Bの比率が３％未満である)ための効率的な方法を供する。従って、本発明は、高純度のシュードモン酸Aを高い収率で調製するための、改良されそして経済的な発酵方法を供する。
【０００９】
他の観点によれば、本発明は、シュードモナスsp.の株(National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organismsにおいてコード番号NCAIM(P)B ００１２３５で寄託された)を用いシュードモン酸を生産するための発酵方法を供する。
【００１０】
他の観点によれば、本発明は、発酵培養培地のpHが、発酵の間中、約５．５〜６．０に調節されている発酵方法を供する。一層好ましくは、発酵ブロスのpHが約５．７に調節されている。
【００１１】
他の観点によれば、本発明は、発酵培養培地に同化できる炭素源を供給することによってpHが調節されているシュードモン酸を調製するための発酵方法を供する。一層好ましくは、前記同化できる炭素源はデキストロースである。
【００１２】
他の観点によれば、本発明は、生産期の間中、前記デキストロースが発酵ブロス中で約０．５％未満のレベルで維持されている、シュードモン酸を調製するための発酵方法を供する。
【００１３】
他の観点によれば、本発明は、発酵の生産期の間中、発酵培地には、塩化カルシウム(CaCl2)を０．１％以上含む溶液が供給されている、シュードモン酸を調製するための発酵方法を供する。
【００１４】
他の観点によれば、本発明は、発酵培養培地のpHが、発酵ブロスにアルカリ性溶液及び/又は酸性溶液を供給することによって調節されている、シュードモン酸を調製するための発酵方法を供する。
【００１５】
他の観点によれば、本発明は、デキストロースと酸性溶液供給の至適な組み合わせのための発酵方法を供する。本発明は、発酵の間にシュードモン酸の生合成を刺激し且つブロス中の過剰な炭素源による抑制効果を回避することができる、デキストロース及び酸供給の至適な組み合わせを供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
特に断らない限り、用語「％」とは、％重量に対する重量を意味し、用語「vvm」とは空気の体積/発酵ブロスの体積/分を意味する。「HPLC」とは、高圧液体クロマトグラフィーを意味する。用語「デキストロース」とは、グルコースをも意味する。
【００１７】
本明細書中で用いられた場合、「液内培養」とは、攪拌と通気を伴う液体培養である発酵培養を意味する。「流加培養技術」とは、１又は複数の栄養成分（炭素源又は塩など）が発酵過程の最初でのみ供給される発酵方法を意味する。「代謝的制御」発酵とは、炭素又は窒素源の消費が調節されている発酵方法を意味する。「生産期」とは、必要とされる分子が生合成される、発酵における期間を意味する。そして、「対数増殖期」とは、微生物が対数的に増殖する、発酵における期間である。
【００１８】
本明細書中で用いられた場合、用語「鉱物塩」とは、生物学的に重要な成分及び微量元素を意味する。好適に、pH及び他のいくつかの更なる効果を調節する働きをする鉱物塩として硫酸マグネシウムが用いられている。最も好適には、塩化カルシウムが鉱物塩として用いられている。
【００１９】
本明細書中で用いられた場合、「同化できる」とは、栄養を吸収し、そしてかかる栄養を消費もしくは使用もしくは分解し、当該微生物の複合構成物の生合成において使用するための酵素系を有する所定の微生物に言及する。
【００２０】
本発明の発酵方法を行うための好適なシュードモン酸生産微生物は、シュードモナスsp.株である。代替のシュードモン酸生産微生物には、シュードモナスsp.の子孫、その天然変異体及び突然変異体が挙げられる。最も好的に、用いられたシュードモナスsp.株は、National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organismsに寄託されているコード番号NCAIM(P)B ００１２３５である。
【００２１】
好適に、発酵ブロスのpHは、シュードモン酸Aが増加し且つシュードモン酸Bが減少する（即ち、シュードモン酸Aに対する不純物シュードモン酸Bの比率が３％未満である）ように調節されている。更に好適には、前記発酵ブロスのpHは、約５．２〜６．２のpHレベルに調節されている。最も好ましくは、前記発酵ブロスのpHは、５．７である。
【００２２】
好適に、シュードモナスsp.株は液内培養において培養されている。好適に、発酵培養は、２０〜３０℃以内の温度で行われている。
【００２３】
発酵培養のpHを調節するために、ある好適な実施態様には、同化できる炭素源を発酵培養培地中に供給することが伴われる。同化できる炭素源の好適な実施態様は、デキストロースである。従って、デキストロースを供給することは、炭素源として有効であり、そしてその中間体及び最終産物は往々にして発酵ブロスのpHを下げる。デキストロースの供給が、生産期の間中、発酵ブロス中でのデキストロースが約０．５％未満のレベルに維持されていることが最も好ましい。
【００２４】
同化できる炭素源についての他の好適な実施態様には、グリセロール、植物性及び動物性の油及び脂肪が挙げられる。
【００２５】
グリセロールが同化できる炭素源として発酵培養培地に供給するのに用いられている場合、それは、発酵ブロスのpHを下げるのに十分な効果を有さない。従って、往々にして酸性溶液が、発酵ブロスの同時供給に用いられ至適効果が達成される。好適には、前記酸性溶液には、HCl、HNO3及びH2SO4が挙げられる。更に好適には、前記酸性溶液はHClである。
【００２６】
発酵培養培地のpHが低い場合は、往々にしてアルカリ性溶液が用いられ、発酵ブロスに供給され至適pHレベルに達する。好ましくは、発酵ブロスに供給するために用いられたアルカリ性溶液には、NaOH及びKOHが挙げられる。最も好ましくは、前記アルカリ性溶液はNaOHである。
【００２７】
発酵培養培地のpHを調節するための他の好適な実施態様には、鉱物塩を供給することが挙げられる。好適には、塩化カルシウムの溶液が用いられ発酵培養培地に供給されている。一層好適には、０．１〜０．８％（wt/wt）塩化カルシウム溶液が用いられている。最も好適には、０．１％（wt/wt）塩化カルシウム溶液が用いられている。
【００２８】
本発明の方法は、以下に詳細に例示されているが例を制限することはない。
【実施例】
【００２９】
【表１】
2005518780.tif 000003
【００３０】
種培地中でのシュードモナスsp.の培養
種培地（デキストロースなし）を６０L容器において調製した。この調製した種培地（約４０〜６０L）を約４５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。
【００３１】
デキストロース溶液を個別に調製した。このデキストロース溶液のpHは、塩酸を用いて約４．０〜５．０に調節した。この調製したデキストロース溶液を約２５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。この滅菌したデキストロース溶液を種培地に添加し、２０g/Lのデキストロース濃度を得た。
【００３２】
シュードモナスsp.株（即ち、NCAIM（P）B ００１２３５）を滅菌した種培地に接種した（約５００ｍl）。シュードモナスsp.株を種培地中で対数増殖期に至るまで増殖させた。シュードモナス培養を以下のパラメーターを用いて行った。
温度：約２５℃±１℃；
ヘッド圧力：約０．４±０．１bar；
混合速度：約４００rpm；
通気率：約０．５vvm
【００３３】
種期のための総時間は２４時間であった。
【００３４】
発酵培地中でのシュードモナスsp.の培養
本発酵培地を３００L容器において調製した。調製した本発酵培地（約２００L）を約４５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。
【００３５】
デキストロース溶液を個別に調製した。このデキストロース溶液のpHは、塩酸を用いて約４．０〜５．０に調節した。この調製したデキストロース溶液を約２５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。この滅菌したデキストロース溶液を主発酵培地に添加した。
【００３６】
主発酵培地を調製した後、シュードモナスsp.株を含む種培地をシュードモナスの種期の後に添加した。主発酵培地に対する種期培地の比は、約１０％（wt/wt）であった。
【００３７】
発酵ブロスの培養を以下のパラメーターで行った。
温度：約２５℃±１℃；
通気率：約０．５〜１．０vvm
撹拌速度：約３００〜６００rpm；及び
ヘッド圧力：約０．５bar；
【００３８】
発酵過程全体を通して溶存酸素を３０％の一定レベルに制御するために、撹拌速度及び通気率の両方を上記範囲内に調整した。
【００３９】
発酵ブロス培養の継続時間は約６４時間であった。発酵過程の間に、もしブロスに任意の発泡があった場合は、更なる油を発酵ブロスに供給した。
【００４０】
収率：シュードモン酸Aの達成した収率は、HPLCによって測定した場合、約２，０５６μg/g発酵ブロスであった。不純物シュードモン酸Bは、シュードモン酸Aの約１８％（wt/wt）であると見積もられた。
【００４１】
シュードモン酸A及びシュードモン酸Bの含量及び純度の測定：
シュードモン酸A及びシュードモン酸Bの含量及び純度の測定は、USP２４のアッセイ方法に基づいていた。測定アッセイをHPLCで行った。これにおいて、シュードモン酸A及びシュードモン酸Bの各々の濃度を測定し並びにシュードモン酸A及びシュードモン酸Bのｗt/wt比を決定した。
【００４２】
クロマトグラフィーシステムは：
カラム：LiChrosper  １００RP-１８、５ｍ、２５０-４；
検出器：UV２２９nm；
流速：０．７ml/分；
射出体積：２０μl；及び
移動相：pH６．３のリン酸バッファー（０．０５M塩基性リン酸ナトリウム）とアセトニトリルの適切な混合物（７５：２５）を調製する
を含む。
【００４３】
標準溶液：
重量測定したシュードモン酸A及びシュードモン酸Bを１００mlのメスフラスコに加え、しかる後に２５mlのアセトニトリルを加え、混合物を形成させた。この混合物をリン酸バッファー（pH６．３）で希釈して混合した。標準物質の最終濃度は約１００μg/mlであった。
【００４４】
ランニング時間：約１５分
【００４５】
発酵ブロスからの試料調製：
ムピロシン発酵ブロス（５ml）を１０．０mlのメスフラスコに移し、そしてエチルアルコール（９６％）で希釈し；
２０分に渡り超音波処理し；
１５分に渡り５０００rpmで遠心し；
移動相で上清（１．０ml）を希釈して１０．０mlにし；
Milliporeフィルター（０．４５ミクロン）でろ過した。
【００４６】
【表２】
2005518780.tif 000004
【００４７】
種培地中でのシュードモナスsp.の培養
種培地（デキストロースなし）を６０L容器において調製した。この調製した種培地（約４０〜６０L）を約４５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。
【００４８】
デキストロース溶液を個別に調製した。このデキストロース溶液のpHを、塩酸を用いて約４．０〜５．０に調整した。この調製したデキストロース溶液を約２５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。この滅菌したデキストロース溶液を種培地に添加し、２０g/Lのデキストロース濃度を得た。
【００４９】
シュードモナスsp.株（即ち、NCAIM（P）B ００１２３５）を滅菌した種培地に接種した（約５００ｍl）。シュードモナスsp.株を種培地中で対数増殖期に至るまで増殖させた。シュードモナス培養を以下のパラメーターで行った。
温度：約２５℃±１℃；
ヘッド圧力：約０．４±０．１bar；
混合速度：約４００rpm；
通気率：約０．５vvm
【００５０】
種期のための合計時間は２４時間であった。
【００５１】
発酵培地におけるシュードモナスsp.の培養
主発酵培地を３００L容器に調製した。調製した主発酵培地（約２００L）を約４５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。
【００５２】
デキストロース溶液を個別に調製した。このデキストロース溶液のpHは、塩酸を用いて約４．０〜５．０に調整した。この調製したデキストロース溶液を約２５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。この滅菌したデキストロース溶液を主発酵培地に添加し２０mg/Lの濃度を得た。
【００５３】
主発酵培地を調製した後、シュードモナスsp.株を含む種培地をシュードモナスの種期の後に添加した。主発酵培地に対する種期培地の比は、約１０％（wt/wt）であった。
【００５４】
発酵ブロスにおけるシュードモナスsp.の培養を以下のパラメーターで行った。
温度：約２５℃±１℃；
通気率：約０．５vvm
撹拌速度：約３００〜６００rpm；及び
ヘッド圧力：約０．５bar；
【００５５】
発酵過程全体を通して溶存酸素を３０％の一定のレベルに制御するために、撹拌速度及び通気率の両方を上記範囲内に調整した。
【００５６】
発酵ブロスが、約５．５〜５．８のpHに至った場合、pHが増加し始めた。発酵ブロスの全体に渡りpHを約５．５〜６．０の一定のレベルに調節した。このことを塩酸溶液を発酵ブロス中に供給することによって達成した。塩酸の供給速度は、ブロスの実際のpHにより様々だった。
【００５７】
発酵ブロス培養の継続時間は約６６時間であった。発酵ブロスの間に、もしブロスに任意の発泡があった場合、更なる油を発酵ブロスに供給した。
【００５８】
収率：シュードモン酸の達成した収率は、HPLCによって測定した場合、約２，２５１μg/g発酵ブロスであった。不純物シュードモン酸Bは、シュードモン酸Aの約１．６％（wt/wt）であると見積もられた。
【００５９】
実施例３
この例では、種培地、主発酵培地の調製並びに当該種培地及び当該主発酵培地におけるシュードモナスsp.株の培養を実施例２に従って行った。
【００６０】
発酵ブロスの培養も、実施例２で規定した、同じ培養パラメーターで行った。
【００６１】
しかし、この例における発酵ブロスのpHは、異なる方法を用いることで調節した。発酵ブロスに塩酸を供給する代わりに、デキストロース溶液を供給することでpHを調節した。
【００６２】
発酵ブロスが約、約５．５〜５．８のpHに至った場合、pHが増加し始めたことを確認した。この例では、pHを約５．５〜６．０の一定のレベルで調節した。このことを、デキストロース溶液を供給することによって達成した。デキストロース溶液を発酵ブロス中へ供給する速度は、ブロスにおける実際のpH及び実際のデキストロース含量に依存した。デキストロースを供給している間、グルコースのレベルが約０．５％（wt/wt）を超えないようにした。ｐHが５．８〜６．０超に上昇しそしてデキストロースレベルが０．４５％（wt／wt）を超えた場合、デキストロースに代えて塩酸を発酵ブロスへ供給することによってpHを調節した。
【００６３】
発酵ブロスの継続時間は約６５時間であった。発酵過程の間に、もしブロスに任意の発泡があった場合は、更なる油を供給した。
【００６４】
収率：シュードモン酸Aの達成した収率は、HPLCによって測定した場合、約３，０２１μg/g発酵ブロスであった。不純物シュードモン酸Bは、シュードモン酸Aの２．９％（wt/wt）であると見積もられた。
【００６５】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施態様による範囲に限定されない。実際に、先の記載及びそれに伴う図から、本明細書中で記載したものに加えて、本発明の様々な改変が当業者により明らかになるだろう。かかる改変は実際には本発明の範囲にある。様々な刊行物が本明細書中で引用されており、その内容は全体を本明細書中に参照として組み込まれている。
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月2日(2004.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモン酸（pseudomonic acid）を生産するための発酵方法であって：
a)  シュードモン酸を生産する微生物を含む発酵ブロスを調製し；
b)  当該発酵ブロスのpHを調節し；そして
c)  当該発酵ブロスからシュードモン酸を回収する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記シュードモン酸がシュードモン酸Aである、請求項１に記載の発酵方法。
【請求項３】
前記シュードモン酸を生産する微生物が、シュードモナスsp.（Pseudomonas sp.）株、その子孫、シュードモナスsp.の天然の変異体及び突然変異の変異体からなる群から選択されている請求項１又は２に記載の発酵方法。
【請求項４】
前記シュードモナスsp.株が、National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organismsに寄託されたNCAIM（P）B ００１２３５である、 請求項３に記載の発酵方法。
【請求項５】
前記発酵が液内培養である、請求項１、２、３、又は４のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項６】
前記発酵が、約２０℃〜３０℃の温度で維持されている、請求項１、２、３、４、又は５のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項７】
前記発酵ブロスのpHが発酵の生産期の間中、調節がされている、請求項１、２、３、４、５、又は６のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項８】
前記発酵ブロスのpHが約５．７に調節されている、請求項１、２、３、４、５、６、又は７のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項９】
前記発酵ブロスのpHが、当該発酵ブロスに、同化できる炭素源を供給することによって調節されている、請求項１、２、３、４、５、６、７、又は８のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項１０】
前記同化できる炭素源の供給が代謝的に制御されている、請求項９に記載の発酵方法。
【請求項１１】
前記同化できる炭素源がデキストロースである、請求項９又は１０に記載の発酵方法。
【請求項１２】
前記発酵ブロスのpHが、発酵ブロスへ同化できる炭素源と酸性溶液を同時供給することにより調節されている、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項１３】
前記同化できる炭素源がグリセロールであり、そして前記酸性溶液が塩酸である、請求項１２に記載の発酵方法
【請求項１４】
前記発酵ブロスのpHが、当該発酵ブロスに鉱物塩を供給することによって調節されている、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項１５】
前記鉱物塩が塩化カルシウム溶液である、請求項１４に記載の発酵方法。
【請求項１６】
前記塩化カルシウム溶液が約０．１％〜０．８％（wt/wt）である、請求項１５に記載の発酵方法。
【請求項１７】
前記塩化カルシウム溶液が約０．３％（wt/wt）である、請求項１５に記載の発酵方法。
【請求項１８】
前記発酵ブロスのpHが、当該発酵ブロスにアルカリ性溶液を供給することによって調節されている、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項１９】
前記アルカリ性溶液が、水酸化ナトリウム及び水酸化カリウムからなる群から選択されている、請求項１８に記載の発酵方法。
【請求項２０】
前記アルカリ性溶液が水酸化カリウムである、請求項１８に記載の発酵方法。
【請求項２１】
前記発酵ブロスのpHが、当該発酵ブロスに酸性溶液を供給することによって調節されている、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項２２】
前記酸性溶液が、硝酸（HNO3）、硫酸（H2SO4）及び塩酸（HCl）からなる群から選択されている、請求項２１に記載の発酵方法。
【請求項２３】
前記酸性溶液が塩酸である、請求項２１又は２２に記載の発酵方法。
【請求項２４】
前記発酵ブロスのpHが５．２〜６．２に調節されている、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
シュードモン酸を生産するための発酵方法であって：
a)シュードモン酸を生産する微生物及び塩化カルシウムを含む発酵ブロスを調製し；
b)当該発酵ブロスのpHを、デキストロース、しかる後に、もし必要ならば酸を供給することによって調節し；そして
c)当該発酵ブロスからシュードモン酸を回収する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２６】
前記pHの調節にはpHを約５．５〜６に維持することを含む、請求項２４又は２５に記載の発酵方法。
【請求項２７】
前記pHの調節には最大デキストロースレベルを約０．５％(wt/wt)にすることを含む、請求項１１、２５又は２６のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項２８】
pHが約５．８以上であり且つデキストロースレベルが約０．４５％(wt/wt)以上である場合に酸が添加されている、請求項２５、２６又は２７のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項２９】
前記プロセスが、シュードモン酸Bに対してシュードモン酸Aを約８２％(wt/wt)以上の純度でシュードモン酸をもたらす、請求項１、２５、２６、２７、又は２８のいずれか１項に記載の発酵方法。
【請求項３０】
前記純度が約９７％以上である、請求項２９に記載の発酵方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法によって調製されたシュードモン酸。
【請求項３２】
シュードモン酸Aをシュードモン酸Bに対して約９７％(wt/wt)以上のレベルで含んで成るシュードモン酸を生産する微生物の発酵ブロスであって、ここでシュードモン酸A及びBは、微生物の発酵により存在する、発酵ブロス。
【請求項３３】
シュードモン酸A及び医薬的に許容できる賦形剤を含んで成るシュードモン酸の医薬組成物であって、ここで当該シュードモン酸Aのレベルは、シュードモン酸Bのレベルに比べて約９７％(wt/wt)以上である、医薬組成物。
【請求項３４】
請求項３３に記載の医薬組成物を投与することを含んで成る、動物におけるシュードモン酸に敏感な感染症を治療する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
発酵培養培地のpHを調節するための他の好適な実施態様には、鉱物塩を供給することが挙げられる。好適には、塩化カルシウムの溶液が用いられ発酵培養培地に供給されている。一層好適には、０．１〜０．８％（wt/wt）塩化カルシウム溶液が用いられている。最も好適には、０．３％（wt/wt）塩化カルシウム溶液が用いられている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
種培地中でのシュードモナスsp.の培養
種培地（デキストロースなし）を６０L容器において調製した。この調製した種培地（約４０L）を約４５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
種培地中でのシュードモナスsp.の培養
種培地（デキストロースなし）を６０L容器において調製した。この調製した種培地（約４０L）を約４５分に渡り約１２０℃の温度で滅菌した。
【手続補正書】
【提出日】平成16年9月15日(2004.9.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
他の観点によれば、本発明は、発酵の生産期の間中、発酵培養物には、塩化カルシウム(CaCl2)を０．１％以上含む溶液が供給されている、シュードモン酸を調製するための発酵方法を供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
【表１】
2005518780.tif 000005
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【表２】
2005518780.tif 000006
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
発酵ブロスにおけるシュードモナスsp.の培養を以下のパラメーターで行った。
温度：約２５℃±１℃；
通気率：約０．５〜１．０vvm
撹拌速度：約３００〜６００rpm；及び
ヘッド圧力：約０．５bar；
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
収率：シュードモン酸Aの達成した収率は、HPLCによって測定した場合、約３，０２１μg/g発酵ブロスであった。不純物シュードモン酸Bは、シュードモン酸Aの約２．９％（wt/wt）であると見積もられた。
【国際調査報告】
2005518780.tif 000007
2005518780.tif 000008