(57)【要約】本発明は、カルボキシル基が部分的にプロピオフェノン誘導体の水酸基でエステル化されているヒアルロン酸エステル誘導体、前記ヒアルロン酸エステル誘導体からなるハイドロゲル材料、ヒアルロン酸エステル誘導体を光硬化することによるその調製方法、並びに生物医学、衛生および外科分野での、および薬物の調節放出系として医学分野での用途に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸のまたはヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基の一部が式(I)のプロピオフェノン誘導体とエステル化している、ヒアルロン酸のまたはヒアルロン酸誘導体のエステル誘導体。
【化１】
2005535736.tif 000003
(式中、Ｒが水酸基、１個以上の水酸基を持つＣ１−Ｃ２０アルキル鎖を有するアルコキシ基、および１個以上の水酸基を持つ複素環からなる群から選択され；並びに
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、互いに等しくまたは異なり、水素、水酸基、おそらく１個以上の水酸基で置換されたＣ１−Ｃ２０アルキル基、およびおそらく１個以上の水酸基で置換されたＣ１−Ｃ２０アルコキシ基からなる群から選択される。)
【請求項２】
前記プロピオフェノン誘導体が、４−（２，３−ジヒドロキシプロポキシ）−３−メトキシ−プロピオフェノン、４’−（２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロポキシ）−プロピオフェノン、および２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチル−プロピオフェノンからなる群から選択される、請求項１に記載のエステル誘導体。
【請求項３】
前記プロピオフェノン誘導体が２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノンである、請求項２に記載のエステル誘導体。
【請求項４】
ヒアルロン酸のまたはヒアルロン酸誘導体の、式(I)の前記プロピオフェノン誘導体でエステル化されたカルボキシル基の比率が７５%未満である、請求項１に記載のエステル誘導体。
【請求項５】
式(I)の前記プロピオフェノン誘導体でエステル化されていないカルボキシル基がナトリウムで塩を形成している、請求項１に記載のエステル誘導体。
【請求項６】
前記ヒアルロン酸誘導体がＣ＝Ｃ結合を含まず、および
・７５%以下の比率のカルボキシル基が脂肪族，芳香族−脂肪族(araliphatic)，脂環式，芳香族，環式および複素環式系列のアルコールとエステル化し、エステル化されていない残りの比率のカルボキシル基は第四級アンモニウム塩で塩を形成し、式(I)の前記プロピオフェノン誘導体での第二のエステル化を可能にするヒアルロン酸エステル；
・５０%以下の比率のカルボキシル基が脂肪族，芳香族−脂肪族，脂環式，芳香族，環式および複素環式系列のアミンとアミド化し、アミド化されていない残りの比率のカルボキシル基は第四級アンモニウム塩で塩を形成し、式(I)の前記プロピオフェノン誘導体での第二のエステル化を可能にするヒアルロン酸アミド；
・ヒアルロン酸のＮ−硫酸化またはＯ−硫酸化誘導体の第四級アンモニウム塩；および
・２０%以下のカルボキシル基が同一のヒアルロン酸鎖または別の鎖のアルコール基とエステル化し、エステル化されていない残りの比率のカルボキシル基は第四級アンモニウム塩で塩を形成し、式(I)の前記プロピオフェノン誘導体での第二のエステル化を可能にするヒアルロン酸の内部エステル。
：からなる群から選択される、請求項１に記載のエステル誘導体。
【請求項７】
前記第四級アンモニウム塩がテトラブチルアンモニウム塩である、請求項６に記載のエステル誘導体。
【請求項８】
脂肪族、芳香族−脂肪族、脂環式、芳香族、環式、および複素環式系列のアルコールとの前記ヒアルロン酸エステルがベンジルアルコールとのヒアルロン酸エステルである、請求項６に記載のエステル誘導体。
【請求項９】
脂肪族、芳香族−脂肪族、脂環式、芳香族、環式、および複素環式系列のアミンとの前記ヒアルロン酸アミドがドデシルアミンとのヒアルロン酸アミドである、請求項６に記載のエステル誘導体。
【請求項１０】
前記ヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体が１５０，０００ないし１，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項１に記載のエステル誘導体。
【請求項１１】
式(I)のプロピオフェノン誘導体との前記エステル誘導体が水溶性であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載のエステル誘導体。
【請求項１２】
ヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体と、置換基Ｒの少なくとも１個の水酸基がＢｒで置換されている式(I)のプロピオフェノン誘導体の臭化物とを反応させて、エステル誘導体を得るたことを含む、請求項１〜１１に記載されたエステル誘導体の調製のための方法。
【請求項１３】
前記プロピオフェノン誘導体の臭化物が２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチル−プロピオフェノンの臭化物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１に記載のエステル誘導体を光硬化することによって得られた架橋産物からなるハイドロゲル材料。
【請求項１５】
前記光硬化が２８０ないし７５０ｎｍの範囲の波長を有する光の照射によって実施される、請求項１４に記載のハイドロゲル材料。
【請求項１６】
前記光硬化が紫外光の照射によって実施される、請求項１４に記載のハイドロゲル材料。
【請求項１７】
前記光硬化が波長３６６ｎｍである光の照射によって実施される、請求項１４に記載のハイドロゲル材料。
【請求項１８】
任意に水にまたは水溶液に溶解した、請求項１〜１１に記載のエステル誘導体の光硬化を含む、請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料の調製のための方法。
【請求項１９】
前記光硬化が２８０ないし７５０ｎｍの範囲の波長を有する光の照射によって実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記光硬化が紫外光の照射によって実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記光硬化が波長３６６ｎｍである光の照射によって実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記エステル誘導体が水または水溶液に溶解され、その濃度が０．０１ないし１００%（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記エステル誘導体の濃度が０．１ないし５０%（ｗ／ｗ）の範囲である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記光硬化が２ないし３０分間の範囲の曝露時間に実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記光硬化が３ないし１５分間の範囲の曝露時間に実施される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記光硬化が１から４０℃の範囲の温度にて実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記光硬化が室温にて実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料によって作られたかまたはコーティングされた、生物医学材料、医療製品、および外科用品。
【請求項２９】
カテーテル、ガイドチャンネル、心臓弁、血管ステント、軟組織人工器官、ブタ心臓弁、人工腱及び器官のような動物起源の人工器官、コンタクトレンズおよび眼内レンズ、人工肺、血液バッグ、外科用器具、濾過システム、並びに実験器具からなる群から選択される、請求項２８に記載の生物医学材料、医療製品、および外科用品。
【請求項３０】
前記ハイドロゲル材料によってプラズマコーティング技術を用いてコーティングされた、請求項２８に記載の生物医学材料、医療製品、および外科用品。
【請求項３１】
請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料を含む、ヒトおよび動物の分化したおよび／または未分化の細胞の増殖のための足場。
【請求項３２】
請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料を含む医薬組成物。
【請求項３３】
さらに医薬的におよび／または生物学的に活性である物質またはその連合体を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
医薬的にまたは生物学的に活性である物質が、タンパク質、成長因子、酵素、抗体、および薬物から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
局所、皮下、筋肉内、関節内、および髄内投与のための、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記ハイドロゲル材料が活性である物質の調節された放出のための因子である、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
生物医学，医療、外科の分野での、および薬物の調節放出のための系としての、請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料の使用。
【請求項３８】
外科的接着の防止における、請求項３７に記載のハイドロゲル材料の使用。
【請求項３９】
人工結合組織の作製のための、請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料の使用。
【請求項４０】
人工軟骨の作製のための、請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料の使用。
【請求項４１】
椎間板の髄核の粘弾性代用品の作製のための、請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料の使用。
【請求項４２】
硝子体液の粘性結合材の作製のための、請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料の使用。
【請求項４３】
水にまたは水溶液に溶解した請求項１から１１に記載のエステル誘導体、前記エステル誘導体用の容器、および前記エステル誘導体のｉｎｓｉｔｕ光硬化に適した光ファイバーを使った内視鏡プローブを含む、人工軟骨を内視鏡手術によって移植するためのキット。
【請求項４４】
前記エステル誘導体に加えたヒト繊維芽細胞および／または薬物をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記容器が前記エステル誘導体の注射に適した容器である、請求項４３に記載のキット。
【請求項４６】
前記内視鏡がＵＶ光による前記エステル誘導体のｉｎｓｉｔｕ照射に適した、請求項４３に記載のキット。
【請求項４７】
内視鏡によって投与部位で直接に架橋される人工軟骨の作製のための、請求項１４〜１７に記載のハイドロゲル材料の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒアルロン酸エステル誘導体、および前記エステル誘導体からなるハイドロゲル材料、光硬化によるそれらの調製方法、および、それらの有利な機械的および粘弾性特性の結果の、生物医学および外科分野、ならびに薬物のための調節された放出系としての医学分野におけるそれらの用途に関する。
【０００２】
背景技術
たとえばポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（ＰＨＥＭＡ）（Ｈｏｌｌｙ Ｆ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｒｅｓ． １９７５， ９； ３１５）のような合成ポリマーから開始して、またはたとえばビニルスルホンと架橋したヒアルロン酸 誘導体（Ｂａｌａｚｓ Ｅ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ， １９９１， ２； １７３−１７８）のような 天然多糖の半合成誘導体から開始して調製された、薬物または生物学的に活性なタンパク質の放出または組織修復過程において接着の防止に用いることができる数種類のゲルおよびハイドロゲルが知られている。
【０００３】
数年の間、ポリエステルおよびポリアミドのような非吸収性ポリマー、およびたとえばコラーゲン、グリコール酸と乳酸（Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｓ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， １９８６， ４； １５５−１８０）およびヒアルロン酸といったものを基礎とする生分解性ポリマーの両方が使用される、ハイドロゲルは外科で用いられることが知られている。
【０００４】
ハイドロゲルは合成ポリマー（Ａｍａｒｐｒｅｅｔ Ｓ． Ｓａｗｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， １９９３， ２６； ５８１−５８７）および架橋した重合化 マクロマーのハイドロゲルのような半合成誘導体（米国特許第５，４１０，０１６号）の両方から紫外線照射によって得ることができること、および、ゲルはヒアルロン酸のような天然ポリマーから（米国特許第６，０３１，０１７号）、またはさまざまなグリコサミノグリカンから（欧州特許第０５５４８９８号）調製することができること、そのようにして 広範囲の接着を防ぐためにおよび薬物放出のようなさまざまな生物医学用途のためにハイドロゲル製品を得ることもまた知られている。
【０００５】
前記ハイドロゲル材料はすべて、ヒアルロン酸のようなポリマーをジビニルスルホンまたは少なくともＣ＝Ｃ結合を有するすべての分子のような光反応性架橋化剤を用いて架橋化することによって得られる。
【０００６】
これらの架橋化剤の一部は毒性であり、このことは生物医学材料としての用途または同様の用途に使用することを意図する場合に明らかに影響を与える。さらに、この型の架橋化化合物を用いると、ハイドロゲルの網目構造が形成される時、上の前記架橋化化合物の照射に由来する低分子量化合物はハイドロゲル構造に組み込まれ、除去が困難である。最後に、そのような化合物との架橋によって修飾されたヒアルロン酸誘導体は、水にまたは水溶液に不溶であるゲルを生じる。
【０００７】
生物材料のカプセル化に有用であるゲルを、少なくとも２箇所の不飽和部位を含む水溶性生体高分子から開始して、３２０ないし９００ ｎｍの波長での放射によって活性化されたラジカル開始剤溶液を用いた重合化によって調製することができることもまた知られている （米国特許第６，２５８，８７０号）。
【０００８】
軟骨細胞のような細胞のカプセル封入は人工軟骨を製造するのに用いることができ（Ｂｒｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ． Ｉｎｓｔｒｕｍ． １９９９， ３５； ３０９−３１４）、 一方、プロピレン−フマル酸とのポリマーの光架橋化は骨組織の再構築における用途のための三次元マトリクスの形成に繋がりうる（Ｆｉｓｈｅｒ Ｊ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｍａｔｅｒ． Ｓｃｉ． Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｅｄ． ２００１， １２ （６）； ６７３−６８７）。
【０００９】
したがって、先行技術の材料について前述した欠点を示さないハイドロゲルの調製に有用な新規ヒアルロン酸誘導体の必要性は深く感じられている。
【００１０】
発明の要約
現在、申請者は、ヒアルロン酸のおよびヒアルロン酸誘導体の、以下に報告する式(I)のプロピオフェノン誘導体とのエステル誘導体が、光硬化した場合、有利な機械的および粘弾性特性を有するハイドロゲル材料を生じることを見出している。
それらは、したがって本発明の対象の、ヒアルロン酸のまたはヒアルロン酸誘導体のエステル誘導体であり、ここでヒアルロン酸のまたはヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基の一部が式(I)のプロピオフェノン誘導体とエステル化しており、
【化１】
2005535736.tif 000002
ここでＲは水酸基，１個以上の水酸基を持つＣ１−Ｃ２０アルキル鎖を有するアルコキシ基、および１個以上の水酸基を持つ複素環からなる群から選択され；並びに
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、互いに等しくまたは異なり、水素、水酸基、おそらく１個以上の水酸基で置換されたＣ１−Ｃ２０アルキル基、およびおそらく１個以上の水酸基で置換されたＣ１−Ｃ２０アルコキシ基からなる群から選択される。
【００１１】
本エステル誘導体の調製方法、およびそのエステル誘導体からなるハイドロゲル材料 、ハイドロゲル材料を調製する方法、並びに生物医学および外科分野および薬物の調節された放出系としての医学分野における用途は、さらに本発明の対象である。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１Ａは、実施例１０の通りに作製された、培養２４時間後の本発明のハイドロゲル中の１０倍に拡大した染色された生細胞を示す。
図１Ｂは、実施例１０の通りに作製された、培養２４時間後の本発明のハイドロゲル中の３２倍に拡大した染色された生細胞を示す。
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明のエステル誘導体は、ヒアルロン酸の分子から、または下記に報告するようなその誘導体から、分子内にＣ＝Ｃ型不飽和無しで架橋化する能力がある式(I)のプロピオフェノン誘導体をラジカル開始剤として用いて開始して調製することができる。
本発明に使用することができるヒアルロン酸は任意の起源から、たとえば鶏冠からの抽出によって（欧州特許第０１３８５７２号）、または発酵によって（欧州特許出願公開第０７１６６８８号）、または、バイオテクノロジーによって（伊国特許第ＰＤ９４Ａ００００４２号）得ることができ、４００ないし３，０００，０００Ｄａの分子量、好ましくは１５０，０００ないし１，０００，０００Ｄａの分子量を有しうる。
【００１４】
本発明に記載の可能な用途のヒアルロン酸誘導体はＣ＝Ｃ結合を含まず、好ましくは下記からなる群から選択される；
１）ＨＹＡＦＦ(登録商標)；脂肪族，芳香族−脂肪族(araliphatic)，脂環式，芳香族，環式および複素環式系列のアルコールとのヒアルロン酸エステル（二重Ｃ＝Ｃ結合が前記分子中に存在しない限り）で、ポリマーが水溶性のままであるようにエステル化の比率は使用したアルコールの種類および長さによって異なるが７５%以下であり、一方、エステル化されていない残りの比率のヒアルロン酸は第四級アンモニウム塩で塩を形成し、引用によって本開示に含む米国特許第４，８５１，５２１号で開示されたもののように、式(I)のプロピオフェノン誘導体での第二のエステル化を可能にするもの；
２）ＨＹＡＤＤ(登録商標)；脂肪族，芳香族−脂肪族，脂環式，芳香族，環式および複素環式系列のアミンとのヒアルロン酸アミド（二重Ｃ＝Ｃ結合が前記分子中に存在しない限り）で、ポリマーが水溶性のままであるようにアミド化の比率は５０%以下であり、一方、アミド化されていない残りの比率のヒアルロン酸は第四級アンモニウム塩で塩を形成し、引用によって本開示に含む欧州特許出願公開第１０９５０６４号で開示されたもののように、式(I)のプロピオフェノン誘導体での第二のアミド化を可能にするもの；
３）引用によって本開示に含む米国特許第６，０２７，７４１号で開示されたもののようなヒアルロン酸のＯ−硫酸化誘導体、または引用によって本開示に含む欧州特許第０９７１９６１号で開示されたもののようなＮ−硫酸化誘導体の第四級アンモニウム塩；
４）ＡＣＰ(登録商標)；ヒアルロン酸の内部エステルで、ポリマーが水溶性のままであるようにエステル化の比率が２０%以下であり、一方、エステル化されていない残りの比率のヒアルロン酸は第四級アンモニウム塩だけで塩を形成し、引用によって本開示に含む欧州特許第０３４１７４５号で開示されたもののように、式(I)のプロピオフェノン誘導体での第二のエステル化を可能にするもの。
【００１５】
好ましい式(I)のプロピオフェノン誘導体は、４−（２，３−ジヒドロキシプロポキシ）−３−メトキシ−プロピオフェノン、４'−（２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロポキシ）−プロピオフェノン、および２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチル−プロピオフェノン （化学物質毒性データ集１９８５〜１９８６年（Ｒｅｇｉｓｔｅｒ ｏｆ Ｔｏｘｉｃ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ， １９８５−８６））からなる群から選択される。
【００１６】
特に好ましいのは２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチル−プロピオフェノンである。
【００１７】
本エステル誘導体は、原料ヒアルロン酸またはヒアルロン酸誘導体と、式(I)のプロピオフェノン誘導体の臭化物、すなわち置換基Ｒの少なくとも１個の水酸基がＢｒで置き換えられている式(I)の化合物とを反応させて、目的のエステル誘導体を得ることを含む方法によって調製することができる。
【００１８】
式(I)のプロピオフェノン誘導体の臭化物は当業者によく知られた手順に従って、たとえばＬｅｗｉｓ ａｎｄ ＢｏｏｚｅｒによってＡｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９５２， ７４， ３０８に記載された臭化反応に従って調製することができる。
【００１９】
本エステル誘導体においては、前記プロピオフェノン誘導体でエステル化されたカルボキシル基の比率は好ましくは７５%以下である。式(I)の前記プロピオフェノン誘導体でエステル化されていない残りのカルボキシル基は、第四級アンモニウム塩で、またはアルカリ金属またはアルカリ土類金属、好ましくはナトリウムで、塩を形成することができる。
【００２０】
上記の本エステル誘導体は、ヒアルロン酸を基礎としたすべての既知のゲルおよびハイドロゲルとは異なる、ヒアルロン酸を基礎としたかまたは他のポリマーをヒアルロン酸と共に含む新規ハイドロゲル材料を調製するために用いることができる。任意に水にまたは水溶液に溶解した、本エステル誘導体を光硬化することによって得られた産物を含む本ハイドロゲル材料。光硬化は１℃ないし４０℃の範囲の温度にて、好ましくは室温にて実施することができる。
【００２１】
水にまたは水溶液に溶解した場合、本エステル誘導体の濃度はたとえば０．０１から１００%（ｗ／ｗ）に及ぶことができ、好ましくは０．１から５０%（ｗ／ｗ）に及ぶ。
【００２２】
本発明による光硬化は、好ましくは２８０ないし７５０ｎｍの範囲の波長を有する光の照射によって、より好ましくは紫外線、特に３６６ｎｍの波長を有する紫外光の照射によって実施される。
【００２３】
本発明による照射は、好ましくは２ないし３０分間の、より好ましくは３ないし１５分間の曝露時間で実施される。
【００２４】
このように得られたハイドロゲル材料は有益な特性を示し、特に下記の特徴を有する；
ａ）架橋化反応の触媒として作用する成分の添加無しに、分子内に不飽和を持たずに、エステル誘導体中にＣ＝Ｃ不飽和が存在しないこと；現在まで、架橋される分子中のＣ＝Ｃ不飽和の存在はラジカル開始剤に不可欠と考えられており、それは化学的手段によってかまたは単にゲルにするポリマーと混合することによって、重合化反応を開始するために添加された；
ｂ）無菌性；エステル誘導体は最初に光硬化の前に上記滅菌されるため、無菌ハイドロゲルを得ることが可能である；
ｃ）優れた粘弾性特性；本ハイドロゲル材料はプロピオフェノンの誘導体によって代表されるラジカル開始剤を用いる部分的エステル化によって、さらに、第四級アンモニウム塩を用いるかまたはアルカリ金属またはアルカリ土類金属を用いる部分的塩形成によって特徴づけられる。これらのハイドロゲルは、ヒアルロン酸の内部または外部エステルによって構成される既知のゲルとは全く異なる化学的−物理的構造を有する。実際に、ヒアルロン酸の内部エステルによって構成されるゲルは、物理的な種類の弱い結合によって結ばれた、架橋ポリマーの微粒子によって形成される。しかし、外部エステルは、エステル化の比率と水中の濃度とに依存して、単純な水和の結果ゲルの形を取ることができる。代わって、本ハイドロゲル材料は、密な、全面的な、三次元構造を示す。本ハイドロゲル材料はしたがって、より大きな機械抵抗によって（したがって医療および外科のさまざまな分野で有利に用いることができる）、および照射に曝露されている長さとハイドロゲルを得るために用いた水溶液の種類によって異なる粘弾性特性によって特徴づけられる。本発明によれば、再蒸留水、たとえばリン酸緩衝液または塩類溶液といった緩衝液または生理食塩水、が好ましくは本エステル誘導体を溶解するのに用いられる。
【００２５】
このように調製された本ハイドロゲル材料は、生物医学、外科、医療、および医薬分野で有利に用いることができ、それらは多数の可能な用途を有しうる。
【００２６】
特に、本ハイドロゲル材料でできた生体材料、医療製品および外科用品を作製することができる。本ハイドロゲル材料は、フィルム、膜、およびガーゼパッドの形に加工することができ、また皮膚科において創傷治癒過程を助けるために、体内手術において表層組織接着を防ぐために、および器官および血管を覆うポリマーとして使用することができる。
【００２７】
さらに、本ハイドロゲルは、タンパク質、成長因子、酵素、抗がん剤、ならびにステロイドおよび非ステロイド抗炎症剤といった一種類以上の有効成分の、局所、皮下、筋肉内、または関節内投与のための、調節放出系において有用である可能性がある。この最後の例では、変形性関節炎の治療における、その疾患の古典的治療法の代替としての本ハイドロゲル材料の使用は特に興味深い。この治療法は、ステロイドまたは非ステロイド抗炎症剤および／または粘性補充の主に機械的な作用を有するその他の「薬物」の関節内注射を必要とする。
【００２８】
本エステル誘導体の関節内注射はまた、本エステル誘導体のｉｎｓｉｔｕ硬化に適した、膝内へ関節鏡検査法によって導入された光ファイバーの内視鏡プローブによるその後の架橋化を伴うことが可能であり、本エステル誘導体からなるハイドロゲル材料の、直接関節腔への形成を可能にする。前記エステル誘導体には、ヒト繊維芽細胞および／または、たとえば抗炎症剤および／またはメタロプロテイナーゼ阻害因子および／またはＮＯ−合成酵素阻害因子または、関節および／または関節炎の治療に用いられる他の生物学的に活性である分子のような薬物を添加することができる。本エステル誘導体に薬物がさらに添加された場合、ｉｎ ｓｉｔｕで照射に続いて形成されるハイドロゲルは薬物の徐放を可能にし、同時に粘性補充の機械的作用を果たす。
【００２９】
さらに、ハイドロゲルの形のヒアルロン酸は、液体の形では粘性補充剤より長い化学分解時間を有する。実際に、組み込まれた薬物無しの本ハイドロゲルの分解時間を確立するために実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、３７℃で本ハイドロゲルはその三次元構造を４週間以上もの期間維持することを示した。
【００３０】
科学文献は、「人工軟骨」として損傷部位に外科的に移植された、生体適合性であるが生分解性ではない合成ポリマーを基礎とするゲルを用いて実施した実験を世界中に報告している（Ｍａｌｍｏｎｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒａｚ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ． ２０００， ３３ （３）； ３０７−３１２）。
【００３１】
本発明のハイドロゲル材料は、無毒性の多糖を放出するだけの高度に生分解性である天然ポリマーであることが知られているヒアルロン酸を基礎とすることの他に、本エステル誘導体は液体の形で注射され、エステル誘導体の光硬化に適していて関節鏡法によって導入される内視鏡プローブを用いて架橋されるので、使用に関節切開が不要であるため、既知のポリマーとは、および前記の型の移植片とは実質的に異なる。
【００３２】
内視鏡手術によって人工軟骨を埋め込むためのキット、水にまたは水溶液に溶解した本発明のエステル誘導体を含む前記キット、前記エステル誘導体の容器、好ましくは注射に適した容器、および光ファイバーを用いた前記エステル誘導体のｉｎ ｓｉｔｕ光硬化に適した内視鏡プローブは、したがって本発明の別の対象である。プローブは好ましくはＵＶ照射に適している。本キットに含まれるエステル誘導体は好ましくは、上記の通りのヒト繊維芽細胞および／または薬物が添加されている。
【００３３】
本ハイドロゲル材料は支持体として用いられる材料の表面に新しい生物学的特性を与えることができるため、本発明の別の対象は、医学分野および産業の他の分野の両方での器具のコーティング処理における本ハイドロゲル材料の用途に関する。本ハイドロゲルによって構成される生体コーティングは、使用中に多糖マトリクスから放出することができる、たとえば薬物、タンパク質、および成長因子といった有効成分を含むこともできる。
【００３４】
コーティングすることができる器具は、たとえば、カテーテル、ガイドチャンネル、心臓弁、血管ステント、軟組織人工器官、ブタ心臓弁のような動物起源の人工器官、人工腱、コンタクトレンズおよび眼内レンズ、人工肺、腎臓、心臓、肝臓、膵臓といった人工臓器、血液バッグ、外科用器具、濾過システム、および実験器具からなる群から選択される。
【００３５】
前記器具の表面をコーティングする方法は、たとえば、本出願者による国際特許出願公開ＷＯ９６／２４３９２に記載されたプラズマコーティング技術であることができる。
【００３６】
本ハイドロゲル材料の別の用途は、特に外傷による損傷後の骨髄神経の再生を助ける目的での髄内投与のための、薬物、神経成長因子、抗体、およびその連合体の、調節された連続的な放出のための用途である。
【００３７】
実際に、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＤＮＦおよび他の神経栄養因子のような一部のタンパク質は、骨髄病変部に持続点滴によって直接投与された場合、運動ニューロンを死滅から守ることができることが知られているが、それらは非常に限られた時間内に投与しなければならない（Ｂｉｌａｋ Ｍ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ２００１， ８， １２ （１１）； ２５３１−３５）。ヒアルロン酸が脊髄に存在し、白質内でミエリンを囲んで、および神経細胞の細胞体の周囲の両方に分布することも知られている（Ｂｉｇｎａｍｉ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １９９２， １１７ （１）； ９０−９３）。
【００３８】
本発明の別の対象は、本発明のエステル誘導体と混合した前出の薬物のｉｎ ｓｉｔｕ投与、すなわち骨髄の損傷部分へ直接、のための本エステル誘導体の用途であり、エステル誘導体はまず注射され次いで骨髄中で直接光重合化される。したがって、既に記載の通り、ヒアルロン酸は骨髄物質の天然の構成成分であるため、外来および／または毒性の製品を骨髄中へ導入することなく、生物学的におよび医薬的に有効な成分の連続的な調節された徐放を得ることが可能である。
【００３９】
外傷を受けた骨髄の治療に用いられるすべての薬物は損傷部位への直接の持続点滴によって投与されるため、この新しい型の髄内投与は以前に記載されたことは無い。
本発明のハイドロゲル材料はまた、分化した（たとえばケラチン生成細胞、繊維芽細胞、骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞）および骨髄の間葉性幹細胞のように分化していないものの両方の、多数の型のヒトまたは動物細胞の増殖のための足場を作製するためにも用いることができる。
【００４０】
以後に報告する実施例は、ＵＶ放射が本発明の（重合化した）エステル誘導体内に組み込まれた細胞の核型を変化させず、また前記細胞の生存能力および特異的形態は変化しないままであることを示す。したがって、成長ならびに表皮、真皮、脂肪組織、骨組織、および軟骨組織といった分化および細胞機能に必要な因子を含むハイドロゲル中に組み込まれた細胞で構成される、特に結合組織由来のさまざまな種類の「人工組織」をｉｎ ｖｉｔｒｏで作製しその後ｉｎ ｖｉｖｏで使用することが可能である。
【００４１】
ここで例として説明される軟骨組織は、分化した細胞（軟骨細胞）または未分化細胞（幹細胞）を含むハイドロゲルで構成されるマトリクスによって形成される新しい種類の人工軟骨を代表し、ここでヒアルロン酸には成長因子および／または分化因子および／またはその他の医薬的におよび／または生物学的に活性な成分を、それが含む細胞の増殖または分化のために追加しうる。
【００４２】
このように作製された構造（ハイドロゲル＋細胞）は、関節に注射し、その後、関節鏡法によって関節腔内に直接導入された線源による照射によって架橋することができる。この新しい種類の人工軟骨を用いて、したがって損傷軟骨を関節鏡法によって修復することが可能である。関節内で直接に光重合化した、細胞を含むゲルの使用は以前に記載されたことは無い。このテーマに関する世界の科学文献は、コラーゲン−フィブリンゲルに組み込まれた（Ｐｅｒｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．， ２０００， １８ （１）； １３−２２）、またはアルギン酸マトリクスに含まれた（Ｐａｉｇｅ Ｋ． Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｓ． Ｒｅｃｏｎｓｔｒ． Ｒｕｇ． １９９６， ９７ （１）； １７９−１８０）、またはアガロースゲル内で増殖させた軟骨細胞を用いて実施した、外科的に損傷軟骨に投与した実験を報告するだけであるが、これらの実験のどれも、細胞を含むゲルは投与部位で直接重合化されていない。
【００４３】
本発明の別の目的は、脊髄の変性疾患またはヘルニアの後の、椎間板の髄核の粘弾性代用品としての選択的に細胞を含むハイドロゲルの用途に関する。この場合にはまた、光ファイバーを使った内視鏡プローブを用いたｉｎ ｓｉｔｕ光架橋化による生体ポリマーのゲル化の可能性は非常に興味深くまた革新的である。
【００４４】
さらに、本エステル誘導体の光架橋化によって得られるハイドロゲルの特有の粘弾性特性に関連して、それらは硝子体液の粘性結合材として眼科手術の分野で用いることができる可能性がある。
【００４５】
純粋に説明の目的で、それに制限することなく、我々は以下に本発明に記載のハイドロゲルの調製の一部の実施例を報告する；
【００４６】
実施例１
７０%のカルボキシル基が２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（ＨＨＭＰ）でエステル化され、残りの３０%のカルボキシル基がナトリウムで塩を形成したヒアルロン酸誘導体の調製。
分子量１８０，０００Ｄａの、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩６．２１ｇ（１０ｍｅｑ．）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２４８ｍｌに室温にて溶解する。この溶液に、臭化ＨＨＭＰ２ｇ（７ｍｅｑ）を加え、得られた溶液は３７℃に４８時間保つ。ＮａＣｌの２．５%（ｗ／ｗ）水溶液をその後加え、結果として生じる混合物を攪拌しながらアセトン７５０ｍｌへ注ぐ。沈澱が生じ、その後それを濾過して、アセトン：水＝５：１の混合物１００ｍｌで３回洗浄し、最後に２４時間３０℃にて真空乾燥する。標記の産物５．３ｇがこのように得られる。ＨＨＭＰの含量の定量的測定は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によって、アルカリ加水分解後に実施する。エステル基の総含量は、『官能基による定量的有機分析』第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・パブリケーションズ（"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ"ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の１６９〜１７２ページに記載された鹸化法に従って測定する。
【００４７】
実施例２
５０%のカルボキシル基が２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（ＨＨＭＰ）でエステル化され、残りの５０%のカルボキシル基がナトリウムで塩を形成したヒアルロン酸誘導体の調製。
分子量１８０，０００Ｄａの、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩６．２１ｇ（１０ｍｅｑ．）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２４８ｍｌに室温にて溶解する。この溶液に、臭化ＨＨＭＰ１．４ｇ（５ｍｅｑ）を加え、得られた溶液は３７℃に３６時間保つ。ＮａＣｌの２．５%（ｗ／ｗ）水溶液をその後加え、結果として生じる混合物を攪拌しながらアセトン７５０ｍｌへ注ぐ。沈澱が生じ、それを濾過して、アセトン：水＝５：１の混合物１００ｍｌで３回洗浄し、最後に２４時間３０℃にて真空乾燥する。
【００４８】
標記の目的の産物４．９ｇがこのように得られる。ＨＨＭＰの含量の定量的測定は、ＨＰＬＣによって、アルカリ加水分解後に実施する。エステル基の総含量は、『官能基による定量的有機分析』第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・パブリケーションズ（"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ"ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の１６９〜１７２ページに記載された鹸化法に従って測定する。
【００４９】
実施例３
２５%のカルボキシル基が２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（ＨＨＭＰ）でエステル化され、残りの７５%のカルボキシル基がナトリウムで塩を形成したヒアルロン酸誘導体の調製。
分子量１８０，０００Ｄａの、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩６．２１ｇ（１０ｍｅｑ．）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２４８ｍｌに室温にて溶解する。この溶液に、臭化ＨＨＭＰ０．７２ｇ（２．５ｍｅｑ）を加え、得られた溶液は３７℃に２４時間保つ。ＮａＣｌの２．５%（ｗ／ｗ）水溶液をその後加え、結果として生じる混合物を攪拌しながらアセトン７５０ｍｌへ注ぐ。沈澱が生じ、それを濾過して、アセトン：水＝５：１の混合物１００ｍｌで３回洗浄し、最後に２４時間３０℃にて真空乾燥する。
【００５０】
標記の目的の産物４．４ｇがこのように得られる。ＨＨＭＰの含量の定量的測定は、ＨＰＬＣによって、アルカリ加水分解後に実施する。エステル基の総含量は、『官能基による定量的有機分析』第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・パブリケーションズ（"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ"ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の１６９〜１７２ページに記載された鹸化法に従って測定する。
【００５１】
実施例４
２５%のカルボキシル基が２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（ＨＨＭＰ）でエステル化され、２５%のカルボキシル基がベンジルアルコールでエステル化され、残りの５０%のカルボキシル基がナトリウムで塩を形成したヒアルロン酸誘導体の調製。
分子量１８０，０００Ｄａの、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩６．２１ｇ（１０ｍｅｑ．）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２４８ｍｌに室温にて溶解する。この溶液に、臭化ＨＨＭＰ０．７２ｇ（２．５ｍｅｑ）を加え、得られた溶液は３７℃に２４時間保つ。溶液を室温へ戻し、臭化ベンジル０．２９ｍｌ（２．５ｍｅｑ）を添加する；それをその後３７℃へさらに３６時間再加熱する。ＮａＣｌの２．５%（ｗ／ｗ）水溶液をその後加え、結果として生じる混合物を攪拌しながらアセトン７５０ｍｌへ注ぐ。沈澱が生じ、それを濾過して、アセトン：水＝５：１の混合物１００ｍｌで３回、次いでアセトン１００ｍｌで３回洗浄し、最後に２４時間３０℃にて真空乾燥する。
【００５２】
標記の目的の産物４．６ｇがこのように得られる。ＨＨＭＰおよびベンジルアルコールの定量的測定は、ＨＰＬＣによって、アルカリ加水分解後に実施する。エステル基の総含量は、『官能基による定量的有機分析』第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・パブリケーションズ（"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ"ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の１６９〜１７２ページに記載された鹸化法に従って測定する。
【００５３】
実施例５
１５%のカルボキシル基がドデシルアミンでアミド化され、２５%のカルボキシル基がＨＨＭＰでエステル化され、残りの６０%のカルボキシル基がナトリウムで塩を形成したヒアルロン酸誘導体の調製。
分子量１８０，０００Ｄａの、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩６．２１ｇ（１０ｍｅｑ．）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２４８ｍｌに室温にて溶解する。この溶液に、９９%メタンスルホン酸０．６ｍｌ（９ｍｅｑ）を加え、その後１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）０．２４０ｇ（１．５ｍｅｑ）を加える。これを室温にて６０〜９０分間放置して反応させる。これを３７℃へ加熱し、ドデシルアミン０．４６５ｇ（２．５ｍｅｑ）を加える。これを２４時間３７℃にて放置して反応させる。溶液を室温へ戻し、臭化ＨＨＭＰ０．７２ｇ（２．５ｍｅｑ）を加える。溶液をその後３７℃へ２４時間再加熱する。ＮａＣｌの２．５%（ｗ／ｗ）水溶液をその後加え、結果として生じる混合物を攪拌しながらアセトン７５０ｍｌへ注ぐ。沈澱が生じ、それを濾過して、アセトン：水＝５：１の混合物１００ｍｌで３回、次いでアセトン１００ｍｌで３回洗浄し、最後に２４時間３０℃にて真空乾燥する。標記の目的の産物４．５ｇがこのように得られる。ＨＨＭＰおよびドデシルアミンの定量的測定は、ＨＰＬＣによって、アルカリ加水分解後に実施する。エステル基の総含量は、『官能基による定量的有機分析』第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・パブリケーションズ（"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ"ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の１６９〜１７２ページに記載された鹸化法に従って測定する。
【００５４】
実施例６
硫酸化度が３である硫酸化ヒアルロン酸から開始する、５０%のカルボキシル基がＨＨＭＰでエステル化され、残りの５０%のカルボキシル基がナトリウムで塩を形成したヒアルロン酸エステルの調製（硫酸化度＝ヒアルロン酸の繰り返し単位内の、ＳＯ3基で置換されたＯＨ基の数）
ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩１ｇを、ＤＭＳＯ４０ｍｌに溶解する。この溶液に、ＤＭＳＯ４０ｍｌに溶解したＳＯ3−ピリジン複合体５．２２ｇを加える。溶液を４℃に冷却し、攪拌しながら１時間保つ。その後、水２００ｍｌを加え、終溶液のｐＨを８．５ないし９．５に、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を用いて調整する。そのように得られた溶液に無水エタノール８５０ｍｌを加えることによって、沈澱が得られ、それを透析して残存する塩を除去する。そのように得られた産物を水に溶解し、テトラブチルアンモニウム型のスルホン酸樹脂に浸透させ、そのようにして最初の塩を得る。テトラブチルアンモニウム塩の形の、硫酸化度が３である硫酸化ヒアルロン酸１２．７ｇがこのように得られる。
【００５５】
上記の通り調製された、分子量１８０，０００Ｄａの、硫酸化ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩７．９ｇ（５ｍｅｑ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２４８ｍｌに室温にて溶解する。この溶液に、臭化ＨＨＭＰ０．７g（２．５ｍｅｑ）を加え、得られた溶液は３７℃に３６時間保つ。ＮａＣｌの２．５%（ｗ／ｗ）水溶液をその後加え、結果として生じる混合物を攪拌しながらアセトン７５０ｍｌへ注ぐ。沈澱が生じ、それを濾過して、アセトン：水＝５：１の混合物１００ｍｌで３回、次いでアセトン１００ｍｌで３回洗浄し、最後に２４時間３０℃にて真空乾燥する。標記の目的の産物４ｇがこのように得られる。ＨＨＭＰの定量的測定は、ＨＰＬＣによって、アルカリ加水分解後に実施する。エステル基の総含量は、『官能基による定量的有機分析』第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・パブリケーションズ（"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ"ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の１６９〜１７２ページに記載された鹸化法に従って測定する。
【００５６】
実施例７
２５%のカルボキシル基が２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（ＨＨＭＰ）でエステル化され、１０%のカルボキシル基が内部エステル結合の形成に関与し、残りの６５%のカルボキシル基がナトリウムで塩を形成したヒアルロン酸誘導体の調製。
分子量１８０，０００Ｄａの、ヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩６．２１ｇ（１０ｍｅｑ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２４８ｍｌに室温にて溶解する。この溶液に、臭化ＨＨＭＰ０．７２ｇ（２．５ｍｅｑ）を加え、得られた溶液は３７℃に２４時間保つ。その後、トリエチルアミン０．４０４ｇ（４ｍｅｑ）を溶液に加え、３０分間攪拌する。ヨウ化２−クロロ−１−メチル−ピリジン１．０２２ｇ（４ｍｅｑ）を含むＤＭＳＯ１００ｍｌの溶液を加え、混合物を３０℃に１５時間保つ。ＮａＣｌの２．５%（ｗ／ｗ）水溶液をその後加え、結果として生じる混合物を攪拌しながらアセトン７５０ｍｌへ注ぐ。沈澱が生じ、それを濾過して、アセトン：水＝５：１の混合物１００ｍｌで３回、次いでアセトン１００ｍｌで３回洗浄し、最後に２４時間３０℃にて真空乾燥する。
標記の目的の産物４．６ｇがこのように得られる。ＨＨＭＰおよびベンジルアルコールの定量的測定は、ＨＰＬＣによって、アルカリ加水分解後に実施する。エステル基の総含量は、『官能基による定量的有機分析』第４版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・パブリケーションズ（"Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｖｉａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ"ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の１６９〜１７２ページに記載された鹸化法に従って測定する。
【００５７】
実施例８
７０%のカルボキシル基が２−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（ＨＨＭＰ）でエステル化され、残りの３０%のカルボキシル基がナトリウムで塩を形成したヒアルロン酸誘導体からのハイドロゲルの調製。
上の実施例１に記載した通り調製したエステル誘導体を室温にて精製水に濃度２５ｇ／ｌで溶解する。そのように得られた溶液を、波長３６６ｎｍの紫外線に、ＣＡＭＡＧ型（２２０Ｖ；０．１８Ａ）ＵＶ灯を用いて曝露時間３０分間にわたって曝露する。
【００５８】
実施例９
照射されたヒト繊維芽細胞の核型に及ぼす紫外線（ＵＶ）照射の影響の評価。
ヒト繊維芽細胞（２ｘ１０6個）の３標本に紫外光を、３種類の異なる曝露時間、３、１５、および３０分間照射した。
【００５９】
照射後、各細胞標本を２つの部分標本に分割し、下記の通り処理した；
・第一の部分標本を直ちに分析し核型を判定する；
・第二の部分標本は、ウシ胎仔血清（以後ＦＣＳと称する）１０%を含むダルベッコ改変イーグル培地（以後ＤＭＥＭ培地と称する）を入れた培養皿に再播種する。
細胞の第二の標本は３細胞周期の間増殖させ、その終わりに繊維芽細胞を核型判定のために処理する。
【００６０】
照射直後の細胞について、および３細胞周期の間ｉｎ ｖｉｔｒｏに置いた繊維芽細胞について実施した分析は、ＵＶ放射への曝露時間のうちどれも、染色体内に変化は生じなかったことを示した。
【００６１】
実施例１０
本発明に記載のハイドロゲルに含まれるヒト繊維芽細胞の培養
２ｘ１０6個の繊維芽細胞が培養皿から剥離され、１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離され、ＦＣＳ１０%を含むＤＭＥＭ培地３ｍｌに再懸濁された。細胞をその後、緩やかに攪拌しながら、上記の実施例３の通り調製したヒアルロン酸誘導体の、濃度１００ｍｇ／ｍｌの溶液３ｍｌに加え、２ｘ１０6個の細胞を含む６ｍｌの終溶液を得る。この溶液を培養ウェルに再播種し、直ちに紫外光を１２分間照射し、その後３７℃に設定したインキュベーターに入れる。２４時間後、細胞を生存能についてＭＴＴ試験する；『生存可能な繊維芽細胞のミトコンドリア酵素だけによる酸化還元反応に曝露したテトラゾリウム塩』（ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔ ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｎｌｙ ｂｙ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ （Ｄｅｚｉｎｏｔ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８６， ２２ （８９）； ２７１−２７７））。
【００６２】
図１Ａおよび１Ｂは、培養２４時間後の本ハイドロゲル内の染色された生存可能な細胞（それぞれ１０倍および３２倍に拡大）を示す。
【００６３】
このように本発明は説明され、これらの方法をさまざまな形で改変できることは明らかである。そのような改変は本発明の精神および目的からの逸脱とは見なされず、当業者に明らかとなるいかなる改変も下記の請求項の範囲内に入る。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１Ａは、実施例１０の通りに作製された、培養２４時間後の本発明のハイドロゲル中の１０倍に拡大した染色された生細胞を示す。図１Ｂは、実施例１０の通りに作製された、培養２４時間後の本発明のハイドロゲル中の３２倍に拡大した染色された生細胞を示す。
【図１】
2005535736.tif 000004
【国際調査報告】
2005535736.tif 000005
2005535736.tif 000006
2005535736.tif 000007