(57)【要約】脳卒中は、患者から採取した体液のサンプルのポリペプチドを観測するために、質量分析法を用いてその患者について診断がなされる。ポリペプチドは、脳卒中患者と非脳卒中患者の体液に異なって含まれており、３０００から３００００までの範囲の分子量を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳卒中または脳卒中を患っている疑いのある被験者においてその可能性の診断方法は、
前記被験者から採取した体液のサンプルを質量分析にかけて、それにより該サンプルにおけるポリペプチドのテスト量を決定し、
前記テスト量が脳卒中の診断に対応するか否かを判断することを備え、
前記ポリペプチドは、脳卒中被験者と非脳卒中被験者の前記体液に相違して含まれており、３０００から３００００の範囲で分子量を有する。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、脳卒中被験者の体液に存在し、非脳卒中被験者の体液には存在せず、これにより体液サンプル中の前記ポリペプチドの存在が脳卒中であることを示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、脳卒中被験者の体液に存在せず、非脳卒中被験者の体液には存在し、これにより体液サンプル中の前記ポリペプチドの非存在が脳卒中であることを示す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析は、レーザー脱離／イオン化質量分析である請求項１から３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルは、固定化金属親和性捕獲（ＩＭＡＣ）、前記ポリペプチドと結合する疎水性、強アニオン性、または弱カチオン性交換表面を有するプロープで吸収される請求項１から４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、表面増幅レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）によって決定される請求項１から５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記体液は、脳脊髄液、血漿、血清、血液、または涙である請求項１から６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
複数のポリペプチドは前記サンプル内で決定される請求項１から７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドのテスト量は、診断された脳卒中が虚血型か出血型かを決定するのに用いられる請求項１から８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
約３９００、約３９７０、約３９９０、約６９４５、約１００７０、約１４０４０、及び／または約２８０００の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加または減少が脳卒中であることの指針となる請求項１から９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
約５９２０、約６６６０、及び／または約７７７０の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加または減少が脳卒中であることの指針となる請求項１から１０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
約３９００、約３９７０、約３９９０、約１４０４０、及び／または約２８０００の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加または減少が診断された脳卒中が虚血型か出血型かの指針に用いられる請求項１から１１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
約４４７５、約４６３４、及び／または約４７９７の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの減少が脳卒中であることの指針となる請求項１から１２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
約６４４１、及び／または約６６４３の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加が脳卒中であることの指針となる請求項１から１３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
約１１５３０、及び／または約１１７１２の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの減少が脳卒中であることの指針となる請求項１から１４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
診断、前兆、治療への適用に対して、脳卒中被験者と非脳卒中被験者の体液で相違して含まれるポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドは、３０００から３００００の範囲で分子量を有し、質量分析により決定することができる。
【請求項１７】
診断、前兆、治療への適用に対しての材料の使用であって、
前記材料は、脳卒中被験者と非脳卒中被験者の体液で相違して含まれるポリペプチドを認識したり、該ポリペプチドと結合したり、または該ポリペプチドに対して親和性を有したりし、
前記ポリペプチドは、３０００から３００００の範囲で分子量を有し、質量分析により決定することができる。
【請求項１８】
前記材料は、抗体または抗体チップである請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
脳卒中の診断で使用するためのキットであって、体液のサンプルを受け取って、質量分析で配置するためのプローブからなり、
それにより該サンプルでのポリペプチドのテスト量を決定し、
該ポリペプチドは脳卒中被験者と非脳卒中被験者との体液で相違して含まれており、
該ポリペプチドは、３０００から３００００の範囲で分子量を有する。
【請求項２０】
前記プローブは前記ポリペプチドの吸収のための吸着剤を含む請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
さらに、前記プローブから非結合または弱い結合の前記材料を取り除くための洗浄溶液を備える請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳卒中のための診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳卒中は産業国で第３番目に高い死亡率を有している。それは、血管の破裂による脳内の出血（出血性脳卒中）、または、脳内の血管の閉塞（虚血性または血栓性脳卒中）のいずれかにより起こる。脳卒中は、恒久的または一時的な脳血流の減少に起因している。この血流の減少は、多くの場合、塞栓または局所的な血栓のいずれかに起因して、動脈の閉塞により起こる。脳の損傷の局在化及び壊死した神経の程度に依存して、脳卒中の症状は患者に対して人生のハンディキャップともなりえるし、脳卒中が起こってからの死亡率は、３０％に達する。
【０００３】
最近では、Ｕ．Ｍｉｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．を見ると、“急性虚血性脳卒中における閉塞容量と予後診断の指示薬としての血液中のＳ１００蛋白とニューロン特異的エノラーゼの濃度”，脳卒中  １９９７；２８：１９５６−６０で、Ｓ１００Ｂが脳卒中診断のための潜在的な生化学的マーカーとして記載されている。しかしながら、Ｓ１００Ｂはメラノーマの転移及び頭部損傷と心臓の手術からくる脳の合併症の早期検出のための有用なマーカーとして報告されている。それから、Ｓ１００Ｂ試験の感度と特異性は、４４％と６７％が限界であり、それぞれ、Ｍ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，“イソ型特異性モノクローナル抗体を使った血清Ｓ１００Ｂの測定のための迅速かつ高感度な免疫学的検定”，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．１９９９；４５：１３０７−１１をみれば分かる。新しい脳卒中マーカーの発達は臨床医学者が早期診断を確立するのを助けるだろう。
【０００４】
ＷＯ  ０１／４２７９３は、脳卒中のための診断法に関係するものであり、この中で、体液のサンプルの蛋白（Ｈ−ＦＡＢＰまたはＢ−ＦＡＢＰ）と結合している心臓または脳の脂肪酸の濃度が決定されることについて記載している。
【０００５】
ＵＳ−Ａ−６２２５０４７では、異なるマップを生成するリテンテイトクロマトグラフィーの使用、特に、２つのサンプルに異なって存在する検体を識別する方法を記載している。そのうちの１つの特異的な方法は、レーザー脱離質量分析である。
【０００６】
ＷＯ  ０１／２５７９１には、前立腺ガン診断を支援するための方法が記載されており、これはポリペプチドマーカーのテスト量を決めるものであり、このポリペプチドマーカーは、前立腺ガン患者と前立腺ガン患者でない被験者とのサンプル内に相違するものが存在する。マーカーは質量分析法、好ましくはレーザー脱離質量分析法を使って決められる。
【０００７】
体液に対する新しい非侵襲性脳卒中マーカー及びマーカーを決定する新しい方法の発達により、臨床医学者が早期診断を確立するのを手助けすることであろう。この問題は、今、本発明によって解決される。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、脳卒中の診断方法、または脳卒中を患っている疑いのある被験者においてその可能性の診断方法を提供する。その診断方法は、被験者から取り出した体液のサンプルを質量分析し、それによりサンプル中のポリペプチドのテスト量を決定することからなっている。そのポリペプチドは脳卒中被験者と非脳卒中被験者との体液とで相違して含まれており、３０００から３００００の範囲の分子量を有しており、テスト量は脳卒中の診断と整合をとるか否かで決定される。テスト量は、また、診断された脳卒中の型、特に、出血型か虚血型どうかを決定することに用いることができる。
【０００９】
本発明は、また、脳卒中被験者と非脳卒中被験者との体液において相違して含まれているポリペプチドであって、３０００から３００００の範囲の分子量を有しており、診断、前兆、治療的応用のために、質量分析によって決定可能なポリペプチドの使用を提供する。
【００１０】
本発明は、さらに、脳卒中の診断で使用するためのキットを提供する。このキットは、体液のサンプルを受け取って質量分析に配置するためのプローブからなり、それによりサンプル中のポリペプチドのテスト量を決定する。そのポリペプチドは脳卒中被験者と非脳卒中被験者との体液において相違して含まれており、３０００から３００００の範囲の分子量を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、脳卒中、または脳卒中を患っている疑いのある被験者においてその可能性の診断方法を提供する。被験者から取り出した体液のサンプルを質量分析にかけて、脳卒中被験者と非脳卒中被験者の体液に相違して含まれるポリペプチドマーカーのサンプルにおける存在または非存在を決定する。ポリペプチドマーカーは、３０００から３００００まで、好ましくは３９００から２９０００までの範囲の分子量を有しており、マーカーの存在または非存在が脳卒中であるかの指針となる。この発明の特徴は、あるマーカーの存在または非存在は、診断された脳卒中が虚血型または出血型のどちらかを決定することに用いることができることである。
【００１２】
ポリペプチドという用語は、例えば、炭水化物、リン酸塩、硫酸塩の非ペプチド残基の付加、または他の翻訳後の修飾による修飾されたペプチドだけでなく、タンパク質とタンパク質フラグメントを含む。
【００１３】
サンプルは、プローブ上のポリペプチドと吸収性材料との間の結合ができる条件下でプローブに吸収される。吸収性材料は、金属イオンと錯化する金属キレート基から構成されるのが好ましく、好ましい金属は銅である。ポリペプチドの検出の前に、プローブと非結合の、または弱い結合の材料は洗浄溶液で取り除かれ、それにより、サンプル中のポリペプチドが豊富になる。サンプルは、固定化金属親和性捕獲（ＩＭＡＣ）性、すなわち、ポリペプチドと結合することができる強アニオン交換（ＳＡＸ）表面を有するプローブに吸収されるのが好ましい。サンプルは、また、ポリペプチドを結合することができる条件下で、疎水性、強アニオン性、または弱カチオン性交換表面を有するプローブに吸収される。プローブは、いくつかの吸着穴を有する細長い片からなり、分光器に入れられ、それからその中で移動して、イオン化手段（例えば、レーザー）によって、各片は順に打たれ、分光器により読み出される。ポリペプチドは、表面増幅レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）によって決定されるのが好ましい。
【００１４】
原理的には、どのような体液でも診断のためのサンプルを提供することに使用することができるが、好ましくは、体液は脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、血清、血液、尿、または涙である。
【００１５】
本発明の１つの実施形態において、約３９００、約３９７０、約３９９０、約６９４５、約１００７０、約１４０４０、及び／または約２８０００の分子量をそれぞれ有する１つまたはそれより多いポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増減が脳卒中の指針となる。３９００のピークは、脳卒中の血漿サンプルでの３９７０及び３９９０のピークよりもかなり高い。
【００１６】
本発明の別の実施形態においては、約５９２０、約６６６０、及び／または約７７７０の分子量をそれぞれ有する１つまたはそれより多いポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増減が脳卒中の指針となる。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態において、約３９００、約３９７０、約３９９０、約１４０４０、及び／または約２８０００の分子量をそれぞれ有する１つまたはそれより多いポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増減が、診断された脳卒中が虚血型か出血型かを指示するのに用いられる。
【００１８】
一般に、次の観察は、別々でもまたはいずれかを組み合わせてもよいが、（対照サンプルと比較したときの）出血性脳卒中の特徴である。：約３９７０でのピークの減少；約５９２０及び／または約１００７０でのピークの減少；約６６６０及び／または約６９４５及び／または約７７７０でのピークの増加；約１４０４０及び／または約２８０００でのピークの減少。
【００１９】
一般に、次の観察は、別々でもまたはいずれかを組み合わせてもよいが、（対照サンプルと比較したときの）虚血性脳卒中の特徴である。：約３９９０でのピークより大きい３９７０でのピークがあるが、約３９００でのピークより共に低い。；約５９２０及び／または約１００７０でのピークの減少；約７７７０でのピークの増加；約１４０４０及び／または約２８０００でのピークの減少はない。
【００２０】
本発明のさらなる実施形態において、約４４７５、約４６３４、及び／または約４７９７の分子量をそれぞれ有する１つまたはそれより多いポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの減少が脳卒中の指針となる。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態において、約６４４１、及び／または約６６４３の分子量をそれぞれ有する１つまたはそれより多いポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加が脳卒中の指針となる。
【００２２】
また本発明のさらなる実施形態において、約１１５３０、及び／または約１１７１２の分子量をそれぞれ有する１つまたはそれより多いポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの減少が脳卒中の指針となる。
【００２３】
本発明によれば、脳卒中の診断は、単分子の分子量、または２もしくはそれより多い分子、例えば、上述したそれらの分子の分子量から選択される分子の分子量のあらゆる組み合わせでの測定により行われる。
【００２４】
ポリペプチドまたはポリペプチド群の分子量の測定は、質量分析で達成される。上記で引用した分子量は１％よりもよい精度、好ましくは約０．１％の範囲内の精度で測定することができる。この明細書では、分子量に関して「約」という用語は、上記又は下記で引用された値について、約１％の変動の範囲内、好ましくは約０．１％の範囲内を意味する。
【００２５】
本発明は、また、診断、前兆、治療への適用に対して、脳卒中被験者と非脳卒中被験者の体液に相違して含まれるポリペプチドの使用に関するものであり、そのポリペプチドは、３０００から３００００の範囲の分子量を有し、質量分析により決定することができる。これは、上記で言及したポリペプチドに対して認識したり、結合したり、またはある親和性を有したりする材料の合成、及び／または使用を伴う。そのような材料の例は、抗体及び抗体チップである。ここで使用される用語「抗体」は、ポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体、Ｆａｂ等の抗体のフラグメント、及び遺伝子改変抗体を含む。抗体は、キメラでもよいし、単一種でもよい。上記で言及されている「前兆的」適用は、例えば、体液のサンプルにおいて上記で言及したポリペプチドの量を測定することによって、脳卒中の起こりそうな経過の決定をすることを含む。上記で言及されている「治療的」適用は、例えば、上記で言及したポリペプチドに対して認識したり、結合したり、または親和性を有したりする材料を合成したり、治療においてそのような材料を使用することを含む。その材料は、この場合、例えば、抗体と薬剤を組み合わせることで修飾され、それにより目標となる動物の特異的領域へ薬剤を標的にする。
【００２６】
本発明の方法手順はどのような種類の脳卒中の診断にも適用することができる。体液サンプルは、脳卒中及び非脳卒中の被験者から調達されたものである。サンプル中のポリペプチドの相違的保持のため、結合していない、または弱い結合をしている材料を除去するために洗浄液を選択的に使って、そのサンプルは様々な吸収性媒体で処理された表面を有するプローブへ適用することができる。もし、適しているなら、エネルギー吸収材料も適用することができる。それから、プローブは質量分析へ入れられ、様々な質量分析の設定を使って様々なサンプル／吸収の組み合わせに対して、読み取りが行われる。与えられた１組の条件下での脳卒中と非脳卒中とのサンプルの比較は、脳卒中と非脳卒中とのサンプルで異なって現れる１つまたはそれより多くのポリペプチドを明らかにする。これらのポリペプチドの存在または非存在は、被験者が脳卒中を患っているか否かを決定する同様の条件（吸収剤、分析装置の設定等）下での被験者の流体サンプルのテストで使用されうる。さらに、一方では、出血性脳卒中サンプルと対照サンプルを比較し、他方では、虚血性脳卒中サンプルと対照サンプルを比較することで、同じ条件下での患者からの体液サンプルを試験することにより出血性脳卒中か虚血性脳卒中かの可能性を区別することができる。
【００２７】
ここでのポリペプチドの「存在または非存在」への上述した言及は、脳卒中と非脳卒中とのサンプルにおいて検出されるポリペプチドの量にかなり相違があることを単に意味していることを理解すべきである。このように、テストサンプル中のポリペプチドの「存在」は、ポリペプチドが実際に存在するが、比較テストサンプル中よりかなり少ない量であるという可能性を含む。本発明によれば、診断はポリペプチドの存在または非存在に基づいてなされ、これは比較テストサンプルを参照してかなり少ないまたはかなり多い量においてポリペプチドの存在を含む。
【００２８】
以下の実施例で本発明を証明する。
【実施例１】
【００２９】
本研究の目的は、脳卒中を患っている患者の体液（脳脊髄液、血漿、及びその他）中の特異的ポリペプチドを検出することである。サンプルは、表面増幅レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析（ＭＳ）技術により分析される。この技術は、リテンテイトクロマトグラフィーの異なる型を使用することによるタンパク質の微小規模の親和捕獲と、それから飛行時間型質量分析法による分析とを包含している。相違するマップは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  バイオシステム  ＰＢＳ  ＩＩ  質量分析（フリーモント、ＣＡ，ＵＳＡ）を使って分析されて与えられたサンプルの典型的なタンパク質プロファイリングのそれぞれに対応して生成される。脳卒中患者からの血漿サンプルのグループで発生したスペクトルと、非脳卒中患者の対照サンプルグループで発生したスペクトルとを比較すると、相違して現れたピークは識別される。
【００３０】
ＳＥＬＤＩ分析は、金属親和性を有する特異的ポリペプチドを検出するために、未精製のヒト血漿サンプルの２μｌを使用して行う。固定化銅親和性アレイ（ＩＭＡＣ−Ｃｕ++）は、サンプルからタンパク質の特異的サブセットに対して選択する銅に対して親和性を有するタンパク質を捕獲するためにこのアプローチで使用される。捕獲されたタンパク質は、ＰＢＳＩＩ  タンパク質チップアレイリーダ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  バイオシステム、フリーモント、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して直接検出される。
【００３１】
次の手順は、クロマトグラフィックＴＥＤ−Ｃｕ（ＩＩ）吸着アレイを使用してタンパク質チップアレイのプロセッシングや分析のために使用される。ＴＥＤは、シリコンオキシドでコーティングされたステンレス鋼基板上にコーティングされた（トリス（カルボニルメチル）エチレンジアミン−Ｃｕ）吸着剤である。
【００３２】
・表面は、最初に各スポットに対して１００ｍＭの硫酸銅１０μｌでロードされ、保湿槽で１５分間インキュベートされる。
・その後、過剰な非結合銅を取り除くため、チップを約１０秒間脱イオン水で２回すすぐことにより洗う。
【００３３】
・サンプルをロードする前、Ｉ−ＭＡＣ３アレイは、５分間ＰＢＳ  ＮａＣｌ  ０．５Ｍの５μｌで一度平衡になる。
・平衡バッファを取り除いた後、同じバッファ３μｌを加えた後、血漿２μｌを適用する。チップは保湿槽で２０分間インキュベートされる。
【００３４】
・サンプルはその後取り除かれ、その表面を平衡バッファ（５分おきに）で３回洗う。
・最後に２回水でそそぐ。
・その表面を空気乾燥した後、５０％アセトニトリルと０．５％トリフルオロアセチル酸中で合成された飽和シナピン酸（ＳＰＡ、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  バイオシステム）の０．５μｌを加える。
【００３５】
・チップを再び空気乾燥した後、レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法で各スポットの保持されたタンパク質の分析をする。
・いったん、データ収集を自動化するために適切な検知感度とレーザーエネルギーを確立して、タンパク質チップアレイを装置の中へ入れ、分析する。
【００３６】
・得られたスペクトルは、デルディメンション４１００ＰＣ上で起動するバイオマークウィザードソフトウェア（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  バイオシステム、フリーモント、ＣＡ、ＵＳＡ）で分析される。それは、マルチプルスペクトルに交差して一致するピークセットを生じる。
【００３７】
出血性脳卒中患者からの４つの血漿（ｐｌａｓｍａ）サンプル（血漿Ｈ１−４）と非脳卒中患者からの４つの血漿サンプル（血漿ＣＴＲＬ１−４）についての上述のテストの結果を、図１から図３に示す。図１は、正常なサンプルと比較したときの出血性脳卒中サンプルの約３９７０Ｄａのピークの強い減少を示している。対照サンプルでは、約３９９０でピークが対になっているが、出血性脳卒中サンプルでは、約３９００でのピークに隠れてほとんど見えなくなっている。しかし、約３９００でのピークは強く増加している。図２は、正常なサンプルと比較したときの出血性脳卒中サンプルの約５９２０Ｄａと１００７０の２つのピークの強い減少を強調している。図２は、また、正常なサンプルと比較したときの出血性脳卒中サンプルの約６６６０，６９４５，及び７７７０Ｄａのピークの増加を示している。図３は、正常なサンプルと比較したときの出血性脳卒中サンプルの約１４０４０と２８０００Ｄａのピークの減少した強度を示している。
【実施例２】
【００３８】
実施例１の手順では、虚血性脳卒中患者からの４つの血漿サンプル（血漿I１−４）と非脳卒中患者からの４つの血漿サンプル（血漿ＣＴＲＬ１−４）について報告されている。その結果は図４から図６に示している。図４は、虚血性脳卒中サンプルについて、３９７０と３９９０でのピーク対を示しており、対照サンプルと対照的に、３９７０のピークは３９９０のピークよりも高いが、３９００のピークより低い強度のピークとなっている。図５は、正常なサンプルと比較したときの虚血性脳卒中サンプルの約５９２０と１００７０の２つのピークの減少を強調している。図５は、また、虚血性脳卒中サンプルでは７７７０のピークが増加しているが、出血性脳卒中サンプルでのピークより小さい。図３での出血性脳卒中サンプルに関して示された相違とは対照的に、図６は虚血性脳卒中サンプルと正常なサンプルとの間での約１４０４０と２８０００Ｄａのピークの減少を示してはいない。
【実施例３】
【００３９】
２１名の脳卒中患者（出血型１０名、虚血型１０名、不明型１名を含む）と２１名の正常な患者とから採取した血漿サンプル間の比較調査は、これ以後で言及されるバリエーションを除いて、実施例の手順と同様に、ＳＥＬＤＩ技術を用いて実行される。ＳＡＸタンパク質チップ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）とＳＰＡ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）マトリックスはこの研究のために保有していた。４２回のテストの間、４つの脳卒中スペクトルと４名の正常な患者のスペクトルの例を図７から図９に示す。バイオマーカーウィザード（マン  アンド  ウィットニー統計分析）を使って、現れた７つのピークは、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）サンプルと正常な対照サンプルとの間で違った形で表される。４４７５Ｄａ，４６３４Ｄａ、及び４７９７Ｄａでのピークのシグナルの減少は、それぞれ０．０００１３８、０．００２２４、及び０．０１３２のｐ値とともに脳卒中であることを示している。６４４３Ｄａと６６４１Ｄａでのピークの増加は、０．０８９５０と０．０２１３４のｐ値を用いて脳卒中であることを示している。そして、対照サンプルと比較して、１１５３０Ｄａと１１７１２Ｄａでのピークの減少は、それぞれ０．００６３４と０．０４０３４のｐ値とともに脳卒中であることを示している。
【００４０】
以下の手順は、ＳＡＸタンパク質チップのプロセッシングと分析のために用いられる。
タンパク質チップ：
１．疎水性ペンを使って各スポットをアウトラインする。空気を乾燥させる。
【００４１】
２．各点についてバインディングバッファ（２０ｍＭ  トリス−５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ９．０）１０μｌを適用し、５分間室温で保湿槽でインキュベートする。スポットが乾燥しないようにする。 
【００４２】
３．活性表面に触れないようにスポットから過剰なバッファを除去する。ステップ２と３をさらに２回繰り返す。
４．粗血漿サンプル１μｌ＋バインディングバッファ２μｌ（２０ｍＭ  トリス−５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ９．０）をロードする。
【００４３】
５．３０分間保湿槽でインキュベートする。
６．バインディングバッファ５μｌ（２０ｍＭ  トリス−５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ９．０）で５回各スポットを洗う（１洗浄につき５μｌ）。
【００４４】
７．スポット周辺をふき取って乾燥させる。また、濡れてはいないが、まだ湿っている間に各スポットに対してＳＰＡ飽和マトリックス（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）０．５μｌを適用する。２回目のＳＰＡ飽和マトリックス（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）０．５μｌを適用し、再び空気乾燥をした後に、レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法を使って、各スポット上に保持されたタンパク質の分析をする。
【００４５】
８．いったん、データ収集を自動化するために適切な検知感度とレーザーエネルギーを確立して、タンパク質チップアレイを装置の中へ入れ、分析する。
上記で引用した各公開公報は、この明細書中で依存される範囲で参照されることにより、この明細書中に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】３７５０から４７５０Ｄａの分子量の範囲における、レーザー脱離／イオン化質量分析を使った４人の出血性脳卒中患者からの血漿（Ｈ１−４）及び４つの対照サンプル（ＣＴＲＬ１−４）のスペクトル図である。
【図１Ｂ】３７５０から４７５０Ｄａの分子量の範囲における、レーザー脱離／イオン化質量分析を使った４人の出血性脳卒中患者からの血漿（Ｈ１−４）及び４つの対照サンプル（ＣＴＲＬ１−４）のスペクトル図である。
【図２Ａ】図１に対応する図であるが、５０００から１１０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図２Ｂ】図１に対応する図であるが、５０００から１１０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図３Ａ】図１に対応する図であるが、１２０００から３００００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図３Ｂ】図１に対応する図であるが、１２０００から３００００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図４Ａ】３７５０から４７５０Ｄａの分子量の範囲における、レーザー脱離／イオン化質量分析を使った４人の虚血性脳卒中患者からの血漿（Ｉ１−４）及び４つの対照サンプル（ＣＴＲＬ１−４）のスペクトル図である。
【図４Ｂ】３７５０から４７５０Ｄａの分子量の範囲における、レーザー脱離／イオン化質量分析を使った４人の虚血性脳卒中患者からの血漿（Ｉ１−４）及び４つの対照サンプル（ＣＴＲＬ１−４）のスペクトル図である。
【図５Ａ】図４に対応する図であるが、５０００から１１０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図５Ｂ】図４に対応する図であるが、５０００から１１０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図６Ａ】図４に対応する図であるが、１２０００から３００００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図６Ｂ】図４に対応する図であるが、１２０００から３００００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図７Ａ】約４３００から５０００Ｄａの分子量の範囲における、レーザー脱離／イオン化質量分析を使った４人の脳卒中患者からの血漿（１５５脳卒中、１８４脳卒中、１９４脳卒中、及び１９５脳卒中として識別される）及び４つの対照サンプル（３８０ｎｅｇ，３８６ｎｅｇ，３８７ｎｅｇ，及び３９０ｎｅｇとして識別される）のスペクトル図である。
【図７Ｂ】約４３００から５０００Ｄａの分子量の範囲における、レーザー脱離／イオン化質量分析を使った４人の脳卒中患者からの血漿（１５５脳卒中、１８４脳卒中、１９４脳卒中、及び１９５脳卒中として識別される）及び４つの対照サンプル（３８０ｎｅｇ，３８６ｎｅｇ，３８７ｎｅｇ，及び３９０ｎｅｇとして識別される）のスペクトル図である。
【図７Ｃ】約４３００から５０００Ｄａの分子量の範囲における、レーザー脱離／イオン化質量分析を使った４人の脳卒中患者からの血漿（１５５脳卒中、１８４脳卒中、１９４脳卒中、及び１９５脳卒中として識別される）及び４つの対照サンプル（３８０ｎｅｇ，３８６ｎｅｇ，３８７ｎｅｇ，及び３９０ｎｅｇとして識別される）のスペクトル図である。
【図８Ａ】図７に対応する図であるが、約５０００から８０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図８Ｂ】図７に対応する図であるが、約５０００から８０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図８Ｃ】図７に対応する図であるが、約５０００から８０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図９Ａ】図７に対応する図であるが、１００００から１６０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図９Ｂ】図７に対応する図であるが、１００００から１６０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【図９Ｃ】図７に対応する図であるが、１００００から１６０００Ｄａの分子量の範囲においてのものである。
【００４７】
図において、横軸はＤａ（ｍ／ｚ比）での分子量を表し、縦軸はシグナル強度、すなわちその分子量を与えられた物質の量を表している。
【図１Ａ】
2005517927.tif 000002
【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年3月15日(2004.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳卒中または脳卒中を患っている疑いのある被験者においてその可能性の診断方法は、
前記被験者から採取した体液のサンプルを質量分析にかけて、それにより該サンプルにおけるポリペプチドのテスト量を決定し、
前記テスト量が脳卒中の診断に対応するか否かを判断することを備え、
前記ポリペプチドは、脳卒中被験者と非脳卒中被験者の前記体液に相違して含まれており、約３９００、約３９７０、約３９９０、約６９４５、約１００７０、約１４０４０、約２８０００、約５９２０、約６６６０、約７７７０、約４４７５、約４６３４、約４７９７、約６４４１、約６６４３、約１１５３０、または約１１７１２Ｄａの分子量を有する。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、脳卒中被験者の体液に存在し、非脳卒中被験者の体液には存在せず、これにより体液サンプル中の前記ポリペプチドの存在が脳卒中であることを示す請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、脳卒中被験者の体液に存在せず、非脳卒中被験者の体液には存在し、これにより体液サンプル中の前記ポリペプチドの非存在が脳卒中であることを示す請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記質量分析は、レーザー脱離／イオン化質量分析である請求項１から３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルは、固定化金属親和性捕獲（ＩＭＡＣ）、該ポリペプチドと結合する疎水性、強アニオン性、または弱カチオン性交換表面を有するプロープで吸収される請求項１から４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、表面増幅レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）及び飛行時間型質量分析法（ＴＯＦ−ＭＳ）によって決定される請求項１から５のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記体液は、脳脊髄液、血漿、血清、血液、または涙である請求項１から６のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
複数のポリペプチドは前記サンプル内で決定される請求項１から７のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドのテスト量は、診断された脳卒中が虚血型か出血型かを決定するのに用いられる請求項１から８のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
約３９００、約３９７０、約３９９０、約６９４５、約１００７０、約１４０４０、及び／または約２８０００の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加または減少が脳卒中であることの指針となる請求項１から９のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
約５９２０、約６６６０、及び／または約７７７０の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加または減少が脳卒中であることの指針となる請求項１から１０のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
約３９００、約３９７０、約３９９０、約１４０４０、及び／または約２８０００の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加または減少が診断された脳卒中が虚血型か出血型かの指針となる請求項１から１１のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
約４４７５、約４６３４、及び／または約４７９７の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの減少が脳卒中であることの指針となる請求項１から１２のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
約６４４１、及び／または約６６４３の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの増加が脳卒中であることの指針となる請求項１から１３のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
約１１５３０、及び／または約１１７１２の分子量を有する１またはそれより多くのそれぞれのポリペプチドが決定され、対照サンプルと比較して、そのようなポリペプチドに対応するピークの減少が脳卒中であることの指針となる請求項１から１４のうちいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
診断、前兆、治療への適用に対して、脳卒中被験者と非脳卒中被験者の体液で相違して含まれるポリペプチドの使用であって、
前記ポリペプチドは、約３９００、約３９７０、約３９９０、約６９４５、約１００７０、約１４０４０、約２８０００、約５９２０、約６６６０、約７７７０、約４４７５、約４６３４、約４７９７、約６４４１、約６６４３、約１１５３０、または約１１７１２Ｄａの分子量を有し、質量分析により決定することができる。
【請求項１７】
診断、前兆、治療への適用に対しての材料の使用であって、
該材料は、脳卒中被験者と非脳卒中被験者の体液で相違して含まれるポリペプチドを認識したり、該ポリペプチドと結合したり、または該ポリペプチドに対して親和性を有したりし、
前記ポリペプチドは、約３９００、約３９７０、約３９９０、約６９４５、約１００７０、約１４０４０、約２８０００、約５９２０、約６６６０、約７７７０、約４４７５、約４６３４、約４７９７、約６４４１、約６６４３、約１１５３０、または約１１７１２Ｄａの分子量を有し、質量分析により決定することができる。
【請求項１８】
前記材料は、抗体または抗体チップである請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
脳卒中の診断で使用するためのキットであって、体液のサンプルを受け取って、質量分析で配置するためのプローブからなり、
それにより該サンプルでのポリペプチドのテスト量を決定し、
該ポリペプチドは脳卒中被験者と非脳卒中被験者との体液で相違して含まれており、
該ポリペプチドは、約３９００、約３９７０、約３９９０、約６９４５、約１００７０、約１４０４０、約２８０００、約５９２０、約６６６０、約７７７０、約４４７５、約４６３４、約４７９７、約６４４１、約６６４３、約１１５３０、または約１１７１２Ｄａの分子量を有する。
【請求項２０】
前記プローブは前記ポリペプチドの吸収のための吸着剤を含む請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
さらに、前記プローブから非結合または弱い結合の前記材料を取り除くための洗浄溶液を備える請求項２０に記載のキット。
【国際調査報告】
2005517927.tif 000023
2005517927.tif 000024
2005517927.tif 000025
2005517927.tif 000026