(57)【要約】複数の結合剤を使用して調製される界面バイオマテリアルであって、各結合剤は、非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび生物学的基材に特異的に結合する第２にのリガンドを含む。複数の結合剤を使用して調製される界面バイオマテリアルもまた提供され、各結合剤は、非生物学的基材および非結合ドメインに特異的に結合する、生物学的基材に対する結合を実質的に示すリガンドを含む。結合剤を調製するための方法、界面バイオマテリアルを調整するための方法、および界面バイオマテリアルを使用するための方法もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の結合剤を含む界面バイオマテリアルであって、ここで、各結合剤は、標的非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび標的生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含み、該複数の結合剤は、該標的非生物学的基材と該標的生物学的基材との間の界面を規定する、界面バイオマテリアル。
【請求項２】
前記複数の結合剤が、複数の同一性結合剤を含む、請求項１に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３】
前記複数の結合剤が、複数の非同一性結合剤を含む、請求項１に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４】
前記各複数の非同一性結合剤が、標的非生物学的基材に特異的に結合する同一の第１のリガンドを含む、請求項３に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項５】
前記複数の結合剤が、空間パターンをさらに含む、請求項１に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項６】
リンカーをさらに含む、請求項１に記載の界面バイオマテリアルであって、該リンカーが、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドとを連結する、界面バイオマテリアル。
【請求項７】
前記第１のリガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項１に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項８】
請求項１に記載の界面バイオマテリアルであって、前記第１のリガンドが、標的非生物学的基材に特異的に結合し、該標的非生物学的基材は、合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン材料、セラミック材料、薬物、薬物キャリア、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、界面バイオマテリアル。
【請求項９】
前記合成ポリマーが、ポリグリコール酸を含む、請求項８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１０】
前記第１のリガンドが、配列番号３７〜５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項９に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１１】
前記合成ポリマーが、ナイロンを含む、請求項８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１２】
前記ナイロンが、ナイロン縫合糸を形成する、請求項１１に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１３】
前記第１のリガンドが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるプラスチックに特異的に結合する、請求項８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１４】
前記第１のリガンドが、ポリスチレンを含むプラスチックに特異的に結合する、請求項１３に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１５】
前記第１のリガンドが、配列番号Ｘ〜Ｘのいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１４に記載の界面バイオマテリアル。（ポリスチレン）
【請求項１６】
前記第１のリガンドが、ポリウレタンを含むプラスチックに特異的に結合する、請求項１３に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１７】
前記第１のリガンドが、配列番号Ｘ〜Ｘのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１６に記載の界面バイオマテリアル。（ポリウレタン）
【請求項１８】
前記第１のリガンドが、ポリカーボネートを含むプラスチックに特異的に結合する、請求項１３に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１９】
前記第１のリガンドが、配列番号Ｘ〜Ｘのいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１８に記載の界面バイオマテリアル。（ポリカーボネート）
【請求項２０】
前記第１のリガンドが、チタンを含む金属に特異的に結合する、請求項８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項２１】
前記第１のリガンドが、配列番号Ｘ〜Ｘのいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項２０に記載の界面バイオマテリアル。（チタン）
【請求項２２】
前記第１のリガンドが、ステンレス鋼を含む金属に特異的に結合する、請求項８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項２３】
前記第１のリガンドが、配列番号Ｘ〜Ｘのいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項２２に記載の界面バイオマテリアル。（ステンレス鋼）
【請求項２４】
前記第２のリガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項１に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項２５】
前記第２のリガンドが、標的生物学的基材に特異的に結合し、該標的生物学的基材は、組織、細胞、高分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項２６】
前記標的生物学的基材が、コラーゲンまたはＴｉｅ２レセプターを含む、請求項２４または２５のいずれかに記載の界面バイオマテリアル。
【請求項２７】
複数の結合剤を含む、請求項１に記載の界面バイオマテリアルであって、前記複数の結合剤の１つ以上が、配列番号２７または２８のアミノ酸配列を含む、界面バイオマテリアル。（リンカー）
【請求項２８】
複数の結合剤を含む界面バイオマテリアルであって、ここで、各結合剤は、標的非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび標的生物学的基材への結合を実質的に欠如する非結合ドメインを含む、界面バイオマテリアル。
【請求項２９】
前記複数の結合剤が、複数の同一性結合剤を含む、請求項２８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３０】
前記複数の結合剤が、複数の非同一性結合剤を含む、請求項２８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３１】
前記各複数の非同一性結合剤が、非生物学的基材に特異的に結合する同一のリガンドを含む、請求項３０に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３２】
前記複数の結合剤が、空間パターンをさらに含む、請求項２８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３３】
前記複数の結合剤の１つ以上が、、前記リガンドと前記非結合ドメインとを連結するリンカーを含む、請求項２８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３４】
前記リガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項２９に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３５】
請求項２９に記載の界面バイオマテリアルであって、前記リガンドが、標的非生物学的基材に特異的に結合し、該標的非生物学的基材は、合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン材料、セラミック材料、薬物、薬物キャリア、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、界面バイオマテリアル。
【請求項３６】
前記合成ポリマーが、ポリグリコール酸を含む、請求項３５に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３７】
前記合成ポリマーが、ナイロンを含む、請求項３５に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３８】
前記ナイロンが、ナイロン縫合糸を形成する、請求項３７に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項３９】
前記リガンドが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるプラスチックに特異的に結合する、請求項３５に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４０】
前記リガンドが、ポリスチレンを含むプラスチックに特異的に結合する、請求項３９に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４１】
前記リガンドが、配列番号１〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項４０に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４２】
前記リガンドが、ポリウレタンを含むプラスチックに特異的に結合する、請求項３９に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４３】
前記リガンドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項４２に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４４】
前記リガンドが、チタンを含む金属に特異的に結合する、請求項３５に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４５】
前記リガンドが、配列番号２４〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項４４に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４６】
前記リガンドが、ステンレス鋼を含む金属に特異的に結合する、請求項３５に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４７】
前記リガンドが、配列番号５１〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項４６に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４８】
前記ドメインが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項２８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４９】
前記非結合ドメインが、標的生物学的基材への結合を実質的に示さず、該標的生物学的基材は、組織、細胞、高分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項５０】
前記非結合ドメインが、細胞非親和性剤を含む、請求項４９に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項５１】
前記細胞非親和性剤が、ポリエチレングリコールである、請求項５０に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項５２】
前記界面バイオマテリアルが、前記標的非生物学的基材の汚損を防止する、請求項２８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項５３】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むポリスチレンに特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項５４】
配列番号１〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５３に記載の合成ペプチド。
【請求項５５】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むポリウレタンに特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項５６】
配列番号２３のアミノ酸配列を含む、請求項５５に記載の合成ペプチド。
【請求項５７】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むポリカーボネートに特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項５８】
配列番号６６〜７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の合成ペプチド。
【請求項５９】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むポリグリコール酸に特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項６０】
配列番号３７〜５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５９に記載の合成ペプチド。
【請求項６１】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むナイロンに特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項６２】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むチタンに特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項６３】
配列番号２４〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の合成ペプチド。
【請求項６４】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むステンレス鋼に特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項６５】
配列番号５１〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載の合成ペプチド。
【請求項６６】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むコラーゲンに特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項６７】
２０未満のアミノ酸残基を有するペプチドを含むＴｉｅ２レセプターに特異的に結合する、合成ペプチド。
【請求項６８】
結合剤を調製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）標的非生物学的基材上で種々の分子のライブラリーをパニングする工程であって、これにより、標的非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドが、同定される、工程；ならびに
（ｂ）該第１のリガンドと第２のリガンドとを連結する工程であって、該第２のリガンドは、標的生物学的基材に特異的に結合し、これにより、結合剤が調製される、工程、
を包含する、方法。
【請求項６９】
前記第１のリガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求項６８に記載の方法であって、前記第１のリガンドが、標的非生物学的基材に特異的に結合し、該標的非生物学的基材は、合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン材料、セラミック材料、薬物、薬物キャリア、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項７１】
前記合成ポリマーが、ポリグリコール酸を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記合成ポリマーが、ナイロンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記ナイロンが、ナイロン縫合糸を形成する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１のリガンドが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるプラスチックに特異的に結合する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１のリガンドが、ポリスチレンを含むプラスチックに特異的に結合する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１のリガンドが、配列番号１〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１のリガンドが、ポリウレタンを含むプラスチックに特異的に結合する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１のリガンドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１のリガンドが、ポリカーボネートを含むプラスチックに特異的に結合する、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
前記第１のリガンドが、配列番号６６〜７１のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１のリガンドが、チタンを含む金属に特異的に結合する、請求項７０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１のリガンドが、配列番号２４〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１のリガンドが、ステンレス鋼を含む金属に特異的に結合する、請求項７０に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１のリガンドが、配列番号５１〜６５のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２のリガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８６】
前記第２のリガンドが、組織、細胞、高分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される標的生物学的基材に結合する、請求項６８に記載の方法。
【請求項８７】
前記標的生物学的基材が、コラーゲンまたはＴｉｅ２レセプターを含む、請求項８５または８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
リガンドを標的生物学的基材上でパニングし、これにより、標的生物学的基材に特異的に結合するリガンドが、同定される工程をさらに包含する、請求項６８に記載の方法。
【請求項８９】
請求項６８の方法によって生成される、結合剤。
【請求項９０】
前記結合剤が、配列番号７２または７３のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項８９に記載の結合剤。
【請求項９１】
結合剤を調製するための方法であって、該方法は：
（ａ）標的非生物学的基材に対して種々の分子のライブラリーをパニングし、それによって、標的非生物学的基材に特異的に結合するリガンドが同定される工程；および
（ｂ）該リガンドを非結合ドメインに結合し、それによって結合剤が調製される工程であって、ここで、該非結合ドメインは、標的生物学的基材への結合を実質的に示さない、工程
を包含する、方法。
【請求項９２】
前記リガンドがペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記リガンドが、合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン、セラミック材料、薬物、薬物キャリア、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、標的非生物学的基材を特異的に結合する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記合成ポリマーが、ポリグリコール酸を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記リガンドが、配列番号３７〜５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記合成ポリマーが、ナイロンを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記ナイロンが、ナイロン縫合糸を形成する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記リガンドが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるプラスチックを特異的に結合する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記リガンドが、ポリスチレンを含むプラスチックを特異的に結合する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記リガンドが、配列番号１〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記リガンドが、ポリウレタンを含むプラスチックを特異的に結合する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記リガンドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記リガンドが、ポリカーボネートを含むプラスチックを特異的に結合する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０４】
前記リガンドが、配列番号６６〜７１のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記リガンドが、チタンを含む金属を特異的に結合する、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記リガンドが、配列番号２４〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記リガンドが、ステンレス鋼を含む金属を特異的に結合する、請求項９３に記載の方法。
【請求項１０８】
前記リガンドが、配列番号５１〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記非結合ドメインが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記非結合ドメインが、組織、細胞、高分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される標的生物学的基材に対する結合を実質的に示さない、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記非結合ドメインが、細胞非親和性剤を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記細胞非親和性剤が、ポリエチレングリコールである、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
標的生物学的基材に対してリガンドをパニングし、それによって標的生物学的基材に対する結合を実質的に示さない非結合ドメインが同定される工程をさらに包含する、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１４】
請求項９１に記載の方法によって産生される、結合剤。
【請求項１１５】
界面バイオマテリアルを調製するための方法であって、該方法は：
（ａ）複数の結合剤を非生物学的基材に塗布する工程であって、それによって、該複数の結合剤の各々は、第１のリガンドおよび第２のリガンドを含み、該第１のリガンドは、非生物学的基材を特異的に結合し、該第２のリガンドは、標的生物学的基材を特異的に結合する工程であって、ここで該塗布工程は、カップリングを含まない、工程；
（ｂ）非生物学的基材をサンプルと接触させる工程であって、ここで、該複数の結合剤は、該非生物学的基材に結合され、該サンプルは、該標的生物学的基材を含む、工程；ならびに、
（ｃ）該標的生物学的基材が該複数の結合剤に結合するのに十分な時間放置する工程であって、ここで界面バイオマテリアルが調製される、工程、
を包含する、方法。
【請求項１１６】
前記塗布工程が、空間的制限様式で、該複数の結合剤を塗布する工程を包含する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記非生物学的基材が、合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン材料、セラミック材料、薬物、薬物キャリア、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
前記合成ポリマーが、ポリグリコール酸を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記合成ポリマーが、ナイロンを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ナイロンが、ナイロン縫合糸を形成する、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
前記プラスチックが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記プラスチックが、ポリスチレンを含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記プラスチックが、ポリウレタンを含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記プラスチックが、ポリカーボネートを含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
前記金属が、チタンを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２６】
前記金属が、ステンレス鋼を含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
前記複数の結合剤が、複数の同一性結合剤を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記複数の結合剤が、複数の非同一性結合剤を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１２９】
前記複数の非同一性結合剤の各々が、同一性リガンドを含み、該リガンドが、非生物学的基材に特異的に結合する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記複数の結合剤の１つ以上が、配列番号７２または７３のアミノ酸配列を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３１】
前記結合剤の１つ以上が、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドとを連結するリンカーを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３２】
前記第１のリガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１３３】
前記第１のリガンドが、配列番号３７〜５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記第１のリガンドが、配列番号１〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
前記第１のリガンドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記第１のリガンドが、配列番号６６〜７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３７】
前記第１のリガンドが、配列番号２４〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３８】
前記第１のリガンドが、配列番号５１〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３９】
前記第２のリガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第２のリガンドが、組織、細胞、高分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される標的生物学的基材を特異的に結合する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１４１】
前記標的生物学的基材が、コラーゲンまたはＴｉｅ２レセプターを含む、請求項１３９または１４０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４２】
前記接触工程が、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで接触する工程を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１４３】
請求項１１５に記載の方法に従って調製される界面バイオマテリアル。
【請求項１４４】
生物学的アレイを調製する方法であって、該方法は：
（ａ）複数の位置を有する非生物学的基材を提供する工程；
（ｂ）該複数の位置の各々に結合剤を塗布する工程であって、該結合剤は、第１のリガンドおよび第２のリガンドを含み、該第１のリガンドは、非生物学的基材を特異的に結合し、該第２のリガンドは、標的生物学的基材を特異的に結合し、ここで、該塗布工程は、カップリングを含まない、工程；
（ｃ）非生物学的基材をサンプルと接触させる工程であって、ここで、複数の結合剤は、該非生物学的基材に結合され、サンプルは、該標的生物学的基材を含む、工程；ならびに、
（ｄ）該標的生物学的基材が該複数の結合剤に結合するのに十分な時間放置する工程であって、ここで生物学的アレイが調製される、工程、
を包含する、方法。
【請求項１４５】
前記非生物学的基材が、合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン材料、セラミック材料、薬物、薬物キャリア、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記合成ポリマーが、ポリグリコール酸を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記合成ポリマーが、ナイロンを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記ナイロンが、ナイロン縫合糸を形成する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記プラスチックが、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１５０】
前記プラスチックが、ポリスチレンを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記プラスチックが、ポリウレタンを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５２】
前記プラスチックが、ポリカーボネートを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５３】
前記金属が、チタンを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１５４】
前記金属が、ステンレス鋼を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１５５】
前記塗布工程が、ディップペン印刷を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記複数の結合剤が、複数の同一性結合剤を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５７】
前記複数の結合剤が、複数の非同一性結合剤を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１５８】
前記複数の非同一性結合剤の各々が、同一性リガンドを含み、該リガンドが、非生物学的基材に特異的に結合する、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記複数の結合剤の１つ以上が、配列番号７２または７３のアミノ酸配列を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１６０】
前記複数の結合剤の１つ以上が、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドとを連結するリンカーを含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１６１】
前記第１のリガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１６２】
前記第１のリガンドが、配列番号３７〜５０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記第１のリガンドが、配列番号１〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６４】
前記第１のリガンドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６５】
前記第１のリガンドが、配列番号６６〜７１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６６】
前記第１のリガンドが、配列番号２４〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６７】
前記第１のリガンドが、配列番号５１〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６８】
前記第２のリガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１６９】
前記第２のリガンドが、組織、細胞、高分子、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される標的生物学的基材を特異的に結合する、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１７０】
前記標的生物学的基材が、コラーゲンまたはＴｉｅ２レセプターを含む、請求項１６８または１６９の１つに記載の方法。
【請求項１７１】
請求項１４４に記載の方法に従って調製される界面バイオマテリアル。
【請求項１７２】
界面バイオマテリアルを調製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の結合剤を非生物学的基材を塗布する工程であって、ここで、該複数の結合剤の各々は、該非生物学的基材に特異的に結合するリガンドおよび標的生物学的基材に実質的に結合を示さない非結合性ドメインを含み、ここで該塗布する工程は、カップリングを含まない、工程；および
（ｂ）該非生物学的基材を該標的生物学的基材を含むサンプルと接触する工程であって、ここで該複数の結合剤は、該非生物学的基材に結合され、これによって界面バイオマテリアルが調製される、工程、
を包含する、
方法。
【請求項１７３】
前記塗布する工程が、空間的に制限された様式で、前記複数の結合剤を塗布する工程を包含する、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
請求項１７２に記載の方法であって、前記非生物学的基材が、以下：合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン物質、セラミックス物質、薬物、薬物キャリアおよびそれらの混合物からなる群から選択される、方法。
【請求項１７５】
前記合成ポリマーが、ポリグリコール酸を含む、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７６】
前記合成ポリマーが、ナイロンを含む、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１７７】
前記ナイロンが、ナイロン縫合糸を形成する、請求項１７６に記載の方法。
【請求項１７８】
請求項１７４に記載の方法であって、前記プラスチックが、以下：ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタンおよびそれらの組み合せからなる群から選択される、方法。
【請求項１７９】
前記プラスチックが、ポリスチレンを含む、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記プラスチックが、ポリウレタンを含む、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８１】
前記プラスチックが、ポリカーボネートを含む、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８２】
前記金属が、チタンを含む、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１８３】
前記金属が、ステンレス鋼を含む、請求項１７４に記載の方法。
【請求項１８４】
前記複数の結合剤が、複数の同一性結合剤を含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８５】
前記複数の結合剤が、複数の非同一性結合剤を含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８６】
前記複数の非同一性結合剤の各々が、前記非生物学的基材に特異的に結合する同一のリガンドを含む、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
１つ以上の前記結合剤が、前記リガンドおよび前記非結合性ドメインを連結するリンカーを含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８８】
前記リガンドが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８９】
前記リガンドが、配列番号３７〜５０のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記リガンドが、配列番号１〜２２のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】
前記リガンドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチド含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】
前記リガンドが、配列番号６６〜７１のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９３】
前記リガンドが、配列番号２４〜３６のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９４】
前記リガンドが、配列番号５１〜６５のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９５】
前記非結合性ドメインが、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１９６】
請求項１７２に記載の方法であって、前記非結合性ドメインが、以下：組織、細胞、高分子およびそれらの組み合せからなる群から選択される生物学的基材に対して実質的に結合を示さない、方法。
【請求項１９７】
前記非結合性ドメインが、細胞非親和性剤を含む、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記細胞非親和性剤が、ポリエチレングリコールである、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記接触工程が、インビトロ、エキソビボまたはインビボで接触する工程を包含する、請求項１７２に記載の方法。
【請求項２００】
請求項１７９の方法に従って調製された界面バイオマテリアル。
【請求項２０１】
細胞培養のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の結合剤を非生物学的基材に塗布する工程、ここで該複数の結合剤の各々は、非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで、前記塗布する工程は、カップリングを含まない、工程；
（ｂ）該非生物学的基材を細胞と接触する工程であって、ここで複数の結合剤は、該非生物学的基材に結合される、工程；
（ｃ）該複数の結合剤に細胞を結合するために十分な時間放置する工程；および
（ｄ）細胞を培養する工程、
を包含する、
方法。
【請求項２０２】
被験体にデバイスを移植する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の結合剤を移植片に塗布する工程であって、ここで該複数の結合剤の各々は、移植片に特異的に結合する第１のリガンドおよび移植部位で細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで塗布する工程は、カップリングを含まない、工程；および
（ｂ）該移植部位で被験体中に移植片を配置する工程、
を包含する、
方法。
【請求項２０３】
生物学的基材の活性を調節するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）非生物学的基材を複数の結合剤でコーティングする工程であって、ここで該複数の結合剤の各々は、生分解性で非生物学的な物質に特異的に結合する第１のリガンド、および該生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで該コーティングする工程は、カップリングを含まない、工程；
（ｂ）標的部位にコーティングされた該生分解性で非生物学的な基材を配置する工程であって、ここで該生物学的基材は、標的部位に存在する、工程；および
（ｃ）標的部位で該生物学的基材が該結合剤に、結合するのに十分な時間放置する工程であって、ここで該結合は、該生物学的基材の活性を調節する、工程、
を包含する、
方法。
【請求項２０４】
請求項２０３に記載の方法であって、前記生物学的基材が、以下：組織、細胞、高分子およびそれらの組み合せからなる群から選択される、方法。
【請求項２０５】
前記細胞が、血管内皮細胞である、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
前記血管内皮細胞が、腫瘍血管内皮細胞である、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記高分子が、Ｔｉｅ２レセプターである、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０８】
前記標的部位が損傷部位であり、そして前記調節が損傷治癒を増強する、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０９】
前記標的部位が新脈管形成部位であり、そして前記調節が新脈管形成を阻害する、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１０】
前記新脈管形成が、腫瘍新脈管形成である、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
前記第２のリガンドが、Ｔｉｅ２レセプターに特異的に結合する、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２１２】
潤滑性界面を生成する方法であって、該方法は、複数の結合剤を第１の基材に塗布する工程を包含し、ここで、該塗布する工程は、カップリングを含まず、ここで該複数の結合剤の各々は以下：
（ａ）第１の基材に特異的に結合するリガンド；および
（ｂ）第２の基材に対する結合を実質的に示さない非結合性ドメイン、
を含む、
方法。
【請求項２１３】
前記第１の基材が、非生物学的基材を含む、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１４】
請求項２１２に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の結合剤を移植片に塗布する工程であって、ここで、該複数の結合剤の各々は、該移植片に特異的に結合するリガンドおよび移植部位で細胞に対して結合を実質的に示さない非結合性ドメインを含み、ここで、該塗布する工程はカップリングを含まない、工程；および
（ｂ）該移植部位で被験体中に該移植片を配置する工程であって、これによって潤滑性界面が生成される、工程、
をさらに包含する、
方法。
【請求項２１５】
前記第１の基材が、生物学的基材を含む、請求項２１２に記載の方法。
【請求項２１６】
請求項２１２に記載の方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の結合剤を被験体に投与する工程であって、ここで、該複数の結合剤の各々は、第１の生物学的基材に特異的に結合するリガンドおよび第２の生物学的基材に対する結合を実質的に示さない非結合性ドメインを含む、工程；および
（ｂ）該第１の生物学的基材に該複数の結合剤を結合するのに十分な時間放置する工程であって、これにより潤滑性界面が生成される、工程、
をさらに包含する、
方法。
【請求項２１７】
非ファウリング剤を用いて非生物学的基材を調製するための方法であって、該方法は、複数の結合剤で非生物学的基材をコーティングする工程を包含し、ここで該複数の結合剤の各々は、以下：
（ａ）非生物学的基材に特異的に結合するリガンド；および
（ｂ）ファウリング剤に対して結合を実質的に示さない非結合性ドメイン、
を含む、
方法。
【請求項２１８】
被験体に薬物を投与するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）非生物学的薬物または該薬物の非生物学的キャリアに、複数の結合剤を塗布する工程であって、ここで、該複数の結合剤の各々は、該薬物または該薬物キャリアに特異的に結合する第１のリガンドおよび標的細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含む、工程；
（ｂ）被験体に該薬物を投与する工程；および
（ｃ）該標的細胞に該複数の結合剤を結合するのに十分な時間放置する工程、
を包含する、
方法。
【請求項２１９】
前記標的細胞が、その表面にＴｉｅ２レセプターを有する、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２０】
前記第２のリガンドが、前記細胞表面上のＴｉｅ２レセプターに結合する、請求項２１８に記載の方法。
【請求項２２１】
生物学的基材との相互作用のための候補基材をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の生物学的基材を含む生物学的アレイを調製する工程であって、ここで、該複数の生物学的基材の各々は、非生物学的基材上の複数の位置の１つに特異的に結合される、工程；
（ｂ）該生物学的アレイを候補基材と接触させる工程；
（ｃ）該生物学的アレイに該候補基材が結合するのに十分な時間放置する工程；および
（ｄ）１つ以上の該生物学的基材と該候補基材との間の相互作用をアッセイする工程であって、これにより相互作用分子が同定される、工程、
を包含する、
方法。
【請求項２２２】
請求項２２１に記載の方法であって、前記相互作用分子は、前記生物学的基材または前記非生物学的基材のうちの１つ上の検出可能な標識によって、分光技術、酵素学的技術および電気化学的技術からなる群から選択される技術によって同定される、方法。
【請求項２２３】
請求項１に記載の界面バイオマテリアルを含む第１の容器を備えるキット。
【請求項２２４】
請求項２９に記載の界面バイオマテリアルを含む第１の容器を備えるキット。
【請求項２２５】
界面バイオマテリアルを調製するためのキットであって、該キットは以下：
（ａ）非生物学的基材に特異的に結合するリガンドを含む第１の結合剤；および
（ｂ）生物学的基材に特異的に結合するリガンドを含む第２の結合剤、
を含む、
キット。
【請求項２２６】
界面バイオマテリアルを調製するためのキットであって、該キットは以下：
（ａ）非生物学的基材に特異的に結合するリガンドを含む結合剤；および
（ｂ）非結合性ドメインであって、ここで、該非結合性ドメインは、標的生物学的基材に対する結合を実質的に示さない、非結合性ドメイン、
を含む、
キット。
【請求項２２７】
結合剤および非結合性ドメインを連結するための試薬をさらに備える、請求項２２５および請求項２２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２８】
非生物学的基材をさらに備える請求項２２３〜請求項２２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２９】
前記非生物学的基材が、生分解性または非生分解性である、請求項２０３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／３３１，８４３号（２００１年１１月２０日出願）（本明細書中にその全体が参考として援用される）に基づき、これに対する優先権を主張する。
【０００２】
（助成金の陳述）
本研究は、一部で、国立保健衛生研究所からの助成金番号５  Ｔ３２  ＧＭ０８５５５−０８、同１  Ｒ０１  ＣＡ７７０４２−０３、および同１  Ｒ２１  ＣＡ８１０８８−０２による支援を受けた。従って、米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般に、非生物学的基材と生物学的基材との間の相互作用を媒介する界面バイオマテリアル、および同バイオマテリアルを調製および使用する方法に関する。とりわけ、本発明は、各々の基材の特異的結合を介して基材間の結合界面を作り出す、結合剤に関する。本発明は、非生物学的基材への特異的結合を介して基材間の非結合界面（実質的に生物学的基材に非結合である）を作り出す、結合剤にも関する。
【０００４】
（略語の表）
ＡＦＭ        −  原子間力顕微鏡
Ａｎｇ１      −  アンジオポエチン１（Ａｎｇｉｏｐｏｉｔｉｎ−１）
ＢＡＰ        −  細菌性アルカリホスファターゼ
ＢＮＨＳ      −  ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＢＳＡ        −  ウシ血清アルブミン
ＤＭＳＯ      −  ジメチルスルホキシド
ＤＷＩ        −  拡散荷重画像化（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ）
ＥＬＩＳＡ    −  酵素連結イムノソルベントアッセイ
ＥｘＦｍｓ    −  Ｆｍｓレセプターの精製細胞外ドメイン
ＥｘＴｅｋ    −  Ｔｉｅ２レセプターの精製細胞外ドメイン
ＦＭＯＣ      −  Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ｆＭＲＩ      −  機能的ＭＲ画像化
ＦＴＩＲ      −  フーリエ変換赤外分光法
ＧＦＰ        −  緑色蛍光タンパク質
ＧＳＴ        −  グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
ＨＰＬＣ      −  高処理液体クロマトグラフィ
ＨＲＰ        −  西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＩＦＢＭ      −  界面バイオマテリアル
ＩｇＧ        −  免疫グロブリンＧ型
ＩＴＯ        −  インジウムスズ酸化物
Ｉ．Ｕ．Ｂ．  −  国際生化学者連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ）
Ｋａ          −  会合定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）
ＭＲＳ        −  プロトン磁気共鳴分光法
ＭＴＩ        −  磁化転移画像化（ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ）
ＮＨＩ        −  国立保健衛生研究所
ｐＩＩＩ      −  コートタンパク質をコードするＭ１３ファージ遺伝子
ＰＩＩＩ      −  Ｍ１３ファージコートタンパク質
ＰＢＳ        −  リン酸緩衝化食塩水
ＰＢＳ−Ｔ    −  ＰＢＳ＋１％  ＴＲＩＴＯＮ−Ｘ（登録商標）界面活性剤
ＰＥＧ        −  ポリエチレングリコール
ＰＥＬＬ      −  ペレタン（ｐｅｌｌｅｔｈａｎｅ）
ＰＥＰＴ      −  ポリエチレンテレフタレート
ＰＥＴ        −  陽子射出断層撮影法
ＰＦＵ        −  プラーク形成単位
ＰＧＡ        −  ポリグリコール酸
ＰＨＥＭＡ    −  ２−ヒドロキシエチルメタクリレート
ＰＬＡ        −  ポリラクテート
ＰＭＭＡ      −  ポリメチルメタクリレート
ＰＰＡＣＫ    −  Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン
ＴＮＦ        −  腫瘍壊死因子
ｓｃＦｖ      −  単鎖フラグメント可変抗体
ＳＰＥＣＴ    −  単光子射出コンピューター断層撮影
ＳＰＲ        −  表面プラスモン共鳴
ＴＧ１        −  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の一系統
ＴＳＡＲ      −  完全合成的親和性試薬
ＶＥＧＦ      −  脈管内皮増殖因子。
【０００５】
（アミノ酸略語および対応するｍＲＮＡコドン）
【０００６】
【化１】
2005518442.tif 000002
2005518442.tif 000003
（発明の背景）
有機分子によって示される結合および機能の目立った特異性は、新規の手法でこれらの結合活性および機能的活性を使用するための努力を、動機付けてきた。分子ディスプレイ技術は、殆どのすべての標的分子に対する特異的結合剤の迅速な同定を促進することにより、これらの努力を促進してきた。特に、ペプチドおよびタンパク質（抗体を含む）のファージディスプレイは、天然結合部位および設計結合部位の発見へと導いてきた。
【０００７】
ファージディスプレイ系は、コードされる可変タンパク質配列が、ファージコート上に提示されるように、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子にＤＮＡ縮重配列を融合することによって構築される、高度に多様なライブラリーを使用する。望ましい結合特異性を有する個々のファージは、固定化された標的分子または選択可能な標的分子に結合することにより、単離される。結合を付与するペプチドまたはタンパク質は、選択されたファージ内でのＤＮＡ配列決定により、同定される。
【０００８】
独特の結合特性および機能特性を有するペプチドおよびタンパク質は、治療剤として（Ｒａｕｍら（２００１））、分子設計のテンプレートとして（薬物設計を含む（Ｂａｌｌｉｎｇｅｒら（１９９９）；Ｂｏｌｉｎら（２０００）；Ｗｏｌｆｅら（２０００）；Ｍｏｕｒｅｚら（２００１）；ＲｕｄｇｅｒおよびＰａｌｚｋｉｌｌ（２００１）））、薬物送達のためのホーミング分子として（Ａｒａｐら（１９９８）；Ｎｉｌｓｓｏｎら（２０００）；Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ（２０００））、そして組織治癒または組織修復の場合に細胞接着を促進する組成物（例えば、米国特許出願第５，８５６，３０８号；同第５，６３５，４８２号；および同第５，２９２，３６２号）として、使用され得る。
【０００９】
ファージディスプレイは、高い特異性で無機表面へ結合するペプチドを選択するためにもまた、使用されてきた。半導体表面結合ペプチド（第二分子も結合する）は、電子構造物の組み立てについて示唆される。Ｗｈａｌｅｙら（２０００）を参照のこと。
【００１０】
最近の興味は、生物学的分子が相互作用を媒介する認識能力および機能的能力を模倣する組成物（非生物学的物質を含む）において発展してきた。例えば、ペプチドは、プロテーゼデバイスをコートするために使用され得、それによって移植後の内皮細胞の接着を促進する。米国特許出願第６，２８０，７６０号；第６，１４０，１２７号；第４，９６０，４２３号；および第４，３７８，２２４号を参照のこと。
【００１１】
本発明の開示の前に、ペプチドコート表面およびペプチドコートデバイスの調製が、誘導体化された表面へのペプチドのカップリング、または表面に共有結合したリンカー分子へのペプチドのカップリングにより、非特異吸着によって達成された。これらの手順は、比較的退屈で時間がかかり、そしてペプチドと基材との効果的な会合のためには、一般に多くの工程を必要とする。しかし、非生物学的表面および非生物学的デバイス（生物学的コートを含む）の潜在的な利点は、明白である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、当該分野には、非生物学的基材と生物学的基材との間の特異的相互作用を促進するための、効率的かつ広範に適応可能な方法を開発する、長期的に感じられている必要性が、存在する。さらに、分子および／または細胞の間の相互作用を指示するための方法を開発させる、継続中の必要性が、特に診療処置および治療処置に関連して、存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この必要性を満たすため、本発明は、生物学的基材と非生物学的基材との間の選択的相互作用を媒介し得る界面バイオマテリアル、標的非生物学的基材および／または標的生物学的基材に特異的に結合し得る新規結合剤、ならびにこれらを作製し使用する方法を、提供する。
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、複数の結合剤を含む、界面バイオマテリアルを提供し、ここで、各々の結合剤は、非生物学的基材に特異的に結合する第一リガンドおよび生物学的基材に特異的に結合する第二リガンドを含み、そしてその複数の結合剤は、非生物学的基材と生物学的基材との間の界面を含む。
【００１５】
本発明は、複数の結合剤を含む、界面バイオマテリアルもまた、提供し、ここで各々の結合剤は、生物学的基材に特異的に結合する第一リガンドおよび第二リガンドを含み、そしてその複数の結合剤は、生物学的基材間の界面を含む。一実施形態において、第一リガンドおよび第二リガンドは、同じ生物学的基材を結合する。別の実施形態において、第一リガンドおよび第二リガンドは、異なった生物学的基材を結合する。
【００１６】
本発明は、複数の結合剤を含む、界面バイオマテリアルもまた、提供し、各々の結合剤は、標的非生物学的基材に特異的に結合するリガンド、および標的生物学的基材への結合を実質的に欠く非結合ドメインを含む。
【００１７】
界面バイオマテリアルは、複数の同一の結合剤または非同一結合剤を含み得る。界面バイオマテリアルが、複数の非同一結合剤を含む場合、一実施形態において、複数の非同一結合剤の各々は、非生物学的基材を特異的に結合する同一のリガンドを含む。
【００１８】
本発明は、結合剤が空間的に界面の範囲内に制限されている、パターン化された界面バイオマテリアルを、さらに提供する。
【００１９】
代表的な非生物学的基材としては、合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン、セラミック材料、薬物、または薬物キャリア含む非生物学的基材が挙げられるが、限定はされない。一実施形態において、合成ポリマーは、ポリグリコール酸を含む。別の実施形態において、合成ポリマーは、ナイロン縫合糸を含む。プラスチックは、一実施形態においてポリカーボネートを、別の実施形態においてポリスチレンを、およびまた別の実施形態においてポリウレタンを含む。一実施形態において、金属はチタンを含む。別の実施形態において、金属はステンレス鋼を含む。
【００２０】
代表的生物学的基材としては、組織、細胞、または高分子が挙げられるが、限定はされない。一実施形態において、標的生物学的基材は、コラーゲンを含む。別の実施形態において、生物学的基材は、Ｔｉｅ２レセプターを含む。
【００２１】
界面バイオマテリアルの調製のための方法もまた、提供される。従って、本発明の一実施形態において、この方法は、（ａ）非生物学的基材へ複数の薬剤を塗布する工程であって、複数の結合剤の各々は、非生物学的基材に特異的に結合する第一リガンドおよび標的生物学的基材に特異的に結合する第二リガンドを含み、かつこの塗布工程はカップリングを含まない、工程；（ｂ）非生物学的基材を、標的生物学的基材を含むサンプルと接触させる工程であって、複数の結合剤は非生物学的基材に結合されている、工程；および（ｃ）標的生物学的基材の複数の結合剤への結合に充分な時間を与える工程であって、界面バイオマテリアルが調製される、工程、を包含する。開示された発明に従って、接触させる工程は、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで接触させる工程を包含し得る。
【００２２】
本発明の別の一実施形態において、界面バイオマテリアルは、生物学的アレイを含む。一実施形態において、界面バイオマテリアルを調製するための方法は、（ａ）複数の位置を有する非生物学的基材を提供する工程；（ｂ）複数の位置の各々に、非生物学的基材に特異的に結合する第一リガンドおよび標的生物学的基材に特異的に結合する第二リガンドを含む結合剤を塗布する工程であって、この塗布工程はカップリングを含まない、工程；および（ｃ）非生物学的基材を、標的生物学的基材を含むサンプルと接触させる工程であって、複数の結合剤が非生物学的基材に結合されている、工程；および（ｄ）標的生物学的基材の複数の結合剤への結合に充分な時間を与える工程であって、ここで生物学的アレイが調製される、工程、を包含する。一実施形態において、複数の結合剤を投与するための方法は、ディップペン印刷（ｄｉｐ−ｐｅｎ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）を含む。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態において、界面バイオマテリアルの調製のための方法は、（ａ）非生物学的基材へ複数の薬剤を塗布する工程であって、複数の結合薬物が各々、非生物学的基材に特異的に結合するリガンド、および標的生物学的基材への結合を実質的に示さない非生物学的ドメインを含み、かつこの塗布工程はカップリングを含まない、工程；および（ｂ）非生物学的基材を、標的生物学的基材を含むサンプルと接触させる工程であって、複数の結合剤が非生物学的基材に結合されており、ここで界面バイオマテリアルが調製される、工程、を包含する。
【００２４】
本発明は、結合剤を調製するための方法をさらに提供する。本発明の１つの実施形態において、この方法は、（ａ）標的非生物学的基材上で種々の分子のライブラリーをパニングする工程であって、これにより、標的非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドが、同定される、工程；ならびに（ｂ）この第１のリガンドと第２のリガンドとを連結する工程であって、この第２のリガンドは、標的生物学的基材に特異的に結合し、これにより、結合剤が調製される、工程、を包含する。この方法は、リガンドを標的生物学的基材上でパニングする工程をさらに包含し得、これにより、標的生物学的基材に特異的に結合するリガンドが、同定される。
【００２５】
本発明の別の実施形態において、結合剤を調製するための方法は、（ａ）標的非生物学的基材に対して種々の分子のライブラリーをパニングし、それによって、標的非生物学的基材に特異的に結合するリガンドが同定される工程；および（ｂ）リガンドを非結合ドメインに結合する工程であって、ここで、非結合ドメインは、標的生物学的基材への結合を実質的に示さず、それによって結合剤が調製される、工程、を包含する。この方法は、標的生物学的基材に対してリガンドをパニングし、それによって標的生物学的基材に対する結合を実質的に示さない非結合ドメインが同定される工程をさらに包含し得る。
【００２６】
また、上記方法により生成される結合剤も提供される。本発明の１つの実施形態において、結合剤は、第１のリガンドと第２のリガンドとを連結するリンカー、または第１のリガンドと非結合ドメインとを連結するリンカーを、さらに含む。
【００２７】
本発明の１つの実施形態において、第１のリガンドは、非生物学的基材に特異的に結合するペプチドまたは単鎖抗体を含む。代表的なプラスチック結合リガンドは、配列番号１〜２３および６６〜７１に示される。代表的な金属結合リガンドは、配列番号２４〜３６および５１〜６５に示される。１つの実施形態において、第２のリガンドまたは非結合領域は、ペプチドまたは単鎖抗体を含む。
【００２８】
従って、本発明はまた、ポリスチレン結合リガンド、ポリウレタン結合リガンド、ポリカーボネート結合リガンド、ポリグリコール酸結合リガンド、チタン結合リガンド、ステンレス鋼結合リガンドを含む、合成ペプチドを提供する。１つの実施形態において、この合成リガンドは、約２０個未満のアミノ酸残基を含む。代表的なポリスチレン結合リガンドは、配列番号１〜２２に示される。代表的なポリウレタン結合リガンドは、配列番号２３に示される。代表的なポリカーボネート結合リガンドは、配列番号６６〜７１に示される。代表的なチタン結合ペプチドリガンドは、配列番号２４〜３６に示される。代表的なステンレス鋼結合リガンドは、配列番号５１〜６５に示される。
【００２９】
本発明は、界面バイオマテリアルを使用するための代表的な方法をさらに提供する。これらの方法としては、細胞培養のための方法、被験体においてデバイスを移植するための方法、生物学的基材の活性を調節するための方法、非ファウリング（ｆｏｕｌｉｎｇ）コーティングを調製するための方法、薬物送達のための方法、および生物学的基材との相互作用について試験物質をスクリーニングするための方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本発明に従う細胞培養のための方法は、（ａ）複数の結合剤を非生物学的基材に塗布する工程であって、ここでこの複数の結合剤の各々は、非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび細胞、高分子、またはその組み合わせに特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで、上記塗布する工程は、カップリングを含まない、工程；（ｂ）この非生物学的基材を細胞と接触する工程であって、ここで複数の結合剤は、この非生物学的基材に結合される、工程；（ｃ）この複数の結合剤に細胞を結合するために十分な時間放置する工程；および（ｄ）細胞を培養する工程、を包含し得る。
【００３１】
本発明はまた、被験体にデバイスを移植する方法を提供する。本発明の１つの実施形態において、この方法は、（ａ）複数の結合剤を移植片に塗布する工程であって、ここでこの複数の結合剤の各々は、移植片に特異的に結合する第１のリガンドおよび移植部位で細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで塗布する工程は、カップリングを含まない、工程；および（ｂ）この移植部位で被験体中に移植片を配置する工程、を包含する。被験体に移植された場合、そのように調製されたデバイスは、そのデバイスへの細胞ファウリングを促進し得る。
【００３２】
本発明はまた、潤滑性界面を生成する方法も提供し、この方法は、複数の結合剤を第１の基材に塗布する工程を包含し、ここで、この塗布する工程は、カップリングを含まず、ここでこの複数の結合剤の各々は、（ａ）第１の基材に特異的に結合するリガンド；および（ｂ）第２の基材に対する結合を実質的に示さない非結合性ドメイン、を含む。この第１の基材は、非生物学的基材または生物学的基材を含み得る。
【００３３】
従って、本発明の別の実施形態において、被験体にデバイスを移植する方法は、（ａ）複数の結合剤を移植片に塗布する工程であって、ここでこの複数の結合剤の各々は、移植片に特異的に結合するリガンド、および移植部位への結合を実質的に示さない非結合ドメインを含み、ここで塗布する工程は、カップリングを含まない、工程；および（ｂ）この移植部位で被験体中に移植片を配置する工程、を包含し得る。被験体に移植された場合、そのように調製されたデバイスは、移植部位にて潤滑活性を提供し得る。
【００３４】
境界潤滑剤を含む界面バイオマテリアルを調製するための方法はまた、（ａ）複数の結合剤を対象に施す工程であって、ここで、この複数の結合剤の各々は、第１の生物学的基材に特異的に結合するリガンドと、第２の生物学的基材への結合を実質的に示さない非結合ドメインとを含む、工程；ならびに（ｂ）、第１の生物学的基材へのこの複数の結合剤の結合のために十分な時間を放置することによって、界面バイオマテリアルが生成される、工程、を包含し得る。
【００３５】
また、生物学的基材の活性を調節するための方法が提供され、この方法は、（ａ）生分解性非生物学的基材を複数の結合剤でコーティングする工程であって、ここでこの複数の結合剤の各々は、生分解性の非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンド、およびこの生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここでこのコーティングする工程は、カップリングを含まない、工程；（ｂ）標的部位にコーティングされたこの生分解性で非生物学的な基材を配置する工程であって、ここでこの生物学的基材は、標的部位に存在する、工程；および（ｃ）標的部位でこの生物学的基材がこの結合剤に結合するのに十分な時間放置する工程であって、ここでこの結合は、この生物学的基材の活性を調節する、工程、を包含する。１つの実施形態において、生物学的基材は、脈管内皮細胞である。別の実施形態において、生物学的基材は、腫瘍脈管内皮細胞である。なお別の実施形態において、生物学的基材は、Ｔｉｅ２レセプターである。１つの実施形態において、標的部位は、創傷部位であり、この調節工程は、創傷治癒を促進する。別の実施形態において、標的部位は脈管形成部位であり、この調節工程は、新脈管形成（腫瘍新脈管形成を含むが、これに限定されない）を阻害する。
【００３６】
本発明はさらに、非ファウリング（ｆｏｕｌｉｎｇ）コーティングを伴う非生物学的基材を調製するための方法を提供する。このコーティングは、複数の結合剤を含み、この複数の結合剤の各々は、（ａ）非生物学的基材に特異的に結合するリガンド、および（ｂ）ファウリング（ｆｏｕｌｉｎｇ）因子への結合を実質的に示さない非結合ドメイン、を含む。
【００３７】
本発明はまた、界面バイオマテリアルを含む薬物送達のための方法を提供する。この方法は、（ａ）非生物学的薬物またはその薬物の非生物学的キャリアに、複数の結合剤を塗布する工程であって、この複数の結合剤の各々は、その薬物または薬物キャリアに特異的に結合する第１のリガンドと、標的細胞に特異的に結合する第２のリガンドとを含む、工程；（ｂ）この薬物を被験体に投与する工程；ならびに（ｃ）その標的細胞への複数の結合剤の結合のための十分な時間を放置する工程、を包含する。
【００３８】
また、生物学的基材との相互作用について試験物質をスクリーニングする方法が提供される。１つの実施形態において、この方法は、（ａ）複数の生物学的基材を含む生物学的アレイを調製する工程であって、ここで、この複数の生物学的基材の各々は、非生物学的基材上の複数の位置の１つに特異的に結合される、工程；（ｂ）この生物学的アレイを候補物質と接触させる工程；（ｃ）この生物学的アレイにこの候補基材が結合するのに十分な時間放置する工程；および（ｄ）１つ以上のこの生物学的基材とこの候補基材との間の相互作用をアッセイする工程であって、これにより相互作用分子が同定される、工程を包含する。
【００３９】
従って、基材間の直接結合相互作用および非結合相互作用を媒介し得る界面バイオマテリアルを提供することが、本発明の目的である。この目的は、本発明によって、全体的にかまたは部分的に達成される。
【００４０】
本発明の目的が上記に述べられているが、本発明の他の目的および利点が、本発明の以下の説明および非限定的実施例の研究の後に、当業者に明らかになる。
【００４１】
（発明の詳細な説明）
（１．定義）  
以下の用語は、当業者により十分に理解されると考えられるが、以下の定義は、本発明の説明を容易にするために示される。
【００４２】
用語「リガンド」は、本明細書中で使用される場合、基材への結合についての能力を有する分子または他の化学的実体を指す。リガンドは、ペプチド、オリゴマー、核酸（例えば、アプタマー）、低分子（例えば、化合物）、抗体もしくはそのフラグメント、核酸−タンパク質融合物、ポリマー、多糖類、および／または他の任意の親和性因子を包含し得る。
【００４３】
用語「非結合ドメイン」は、本明細書中で使用される場合、標的物質への結合を実質的に示さない、分子、高分子、または他の化学的実体を指す。非結合ドメインは、標的物質への結合を実質的に示さない、ペプチド、オリゴマー、核酸（例えば、アプタマー）、低分子（例えば、化合物）、抗体もしくはそのフラグメント、核酸−タンパク質融合物、ポリマー、多糖類、および／または他の任意の親和性因子を包含し得る。
【００４４】
用語「基材」とは、本明細書中で使用される場合、界面バイオマテリアルを調製するために使用される生物学的組成物または非生物学的組成物を指す。従って、用語「基材」は、本発明のリガンドへの結合についての能力を有する組成物、ならびに本発明の非結合ドメインに対する結合を実質的に示さない組成物を包含する。
【００４５】
用語「標的」は、代表的には、異なる結合特異性を有する複数の基材のうちの１つとしてある基材の説明を条件付けるために使用される。従って、用語「標的」は、一般的には、本発明のリガンドにより特異的に結合された基材、または本発明の非結合ドメインへの結合を実質的に示さない基材を指す。
【００４６】
用語「結合」は、２つの分子間（例えば、ペプチドと基材との間）の親和性を指す。本明細書中で使用される場合、「結合（する）」とは、分子混合物中の基材に対するペプチドの優先的結合を指す。基材へのペプチドの結合は、その結合親和性が約１×１０４Ｍ−１〜約１×１０６Ｍ−１以上である場合に、特異的であるとみなされ得る。
【００４７】
句「特異的（または選択的）に結合する」とは、リガンドの結合能力を言及する場合、他の基材の不均質集団における基材の存在を確定する結合反応を指す。特異的結合は、非特異的吸着、化学反応を介する共有結合、および連結部分を介するカップリングを除外する。
【００４８】
用語「結合のために十分な時間」とは、一般的には、リガンドと基材との特異的結合のために十分な時間的期間を指す。
【００４９】
句「結合を実質的に欠く」または「結合を実質的に示さない」とは、基材へのリガンドまたは非結合ドメインの結合を記載するために本明細書中で使用される場合、非特異的結合またはバックグラウンド結合を包含する結合レベルを指すが、特異的結合を包含しない。
【００５０】
用語「被験体」とは、本明細書中で使用される場合、任意の非脊椎動物種または脊椎動物種を指す。本発明の方法は、温血脊椎動物の処置および診断において特に有用である。従って、本発明は、哺乳動物および鳥類に関する。より詳細には、哺乳動物（例えば、ヒト）、絶滅しつつあるのに起因して重要な哺乳動物（例えば、シベリアトラ（Ｓｉｂｅｒｉａｎ  ｔｉｇｅｒ）、ヒトにとって経済的に重要な哺乳動物（（ペットとしてかもしくは動物園において飼育される動物）ヒトによる消費のための飼育場で飼育される動物）、ヒトにとって社会的に重要な哺乳動物（例えば、ヒト以外の肉食動物（例えば、ネコおよびイヌ）、ブタ（イノシシ・ブタ類、食用ブタ、およびイノシシ）、反芻動物（例えば、ウシ類、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、およびラクダ）およびウマ）の、処置および診断が、企図される。絶滅の危機にある種類の鳥類、動物園に飼育される種類の鳥類、ならびに家禽（より詳細にはニワトリ）、例えば、家禽（例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガン、ホロホロチョウなど）の処置を包含する、鳥類の処置もまた、企図される。なぜなら、これらもまた、ヒトにとって経済的に重要であるからである。従って、家畜（家畜用イノシシ・ブタ（イノシシ・ブタ類およびイノシシ）、反芻動物、ウマ、家禽などを含むが、これらに限定されない）の処置が、企図される。
【００５１】
用語「約」は、本明細書中で使用される場合、測定可能な値（例えば、アミノ酸の数など）に言及する場合、特定された量から、１つの実施形態においては±２０％または±１０％の変動を、別の実施形態においては±５％の変動を、別の実施形態においては±１％、そしてなお別の実施形態においては±０．１％の変動を、そのような変動が開示される方法を実施するために適切である場合には、包含することになっている。
【００５２】
（ＩＩ．界面バイオマテリアル）
本発明は、複数の結合剤を含む界面バイオマテリアルを提供する。本発明の一実施形態において、各結合剤は、非生物学的基材および生物学的基材に特異的に結合し、それにより、非生物学的基材と生物学的基材との間に界面を生成する。以下に本明細書中にさらに記載されるように、これらを結合剤およびこの結合剤を作製する方法もまた提供される。
【００５３】
用語「界面バイオマテリアル」は、広義に、複数の結合剤を含む組成物であって、これらの複数の結合剤が、２つ以上の基材の間に機能的界面を生成する、組成物をいうために本明細書中で使用される。結合剤の各々は、２種以上の所望の結合特異性、または結合特異性の所望の組み合わせを含み、これらとしては、以下が挙げられる：（ａ）少なくとも１種の非生物学的基材の特異的結合；および（ｂ）少なくとも１種の標的生物学的基材の特異的結合または標的生物学的基材に実質的に結合しないこと。
【００５４】
いくつかの以前の研究は、２つ以上の結合特異性を有するリガンドを記載している。例えば、Ｋａｙらへの米国特許第５，９４８，６３５号は、二価の融合ペプチドを含む、全体的に合成の親和性試薬（ＴＳＡＲ）を開示する。その中に定義されるとおり、二価ペプチドは、２つの機能的領域（結合ドメイン、および発現されたＴＳＡＲの発現および／または検出を増強するために有用であるエフェクタードメイン）を含む。Ｋａｙらへの米国特許第５，９４８，６３５号に記載される二価ペプチドと対照的に、本発明の界面バイオマテリアルは、２つ以上の結合ドメインを含み、そして界面バイオマテリアルの発現および／または検出を増強するためのエレメントを必要としない。さらに、Ｋａｙらへの米国特許第５，９４８，６３５号は、複数の結合剤を含む界面バイオマテリアルであって、これらの複数の結合剤が、２つ以上の基材間に機能的界面を生成する、界面バイオマテリアルの生成を開示しない。
【００５５】
用語「機能的界面」とは、その界面の機能性が、複数の結合剤を必要とする、界面をいう。より詳細には、機能的界面は、単一の結合剤と基材との間の結合反応により生成されるのではない。例えば、固体支持体（例えば、精製カラム）と目的の分子との間の結合相互作用は、相互作用の機能性（精製）が単一の試薬および目的の単一の分子を含み得るという点において機能的界面を構成しない。
【００５６】
代表的な機能的界面としては、複数の結合剤が、結合界面、非結合界面、またはその組み合わせを構成する、コーティングが挙げられる。用語「結合界面」とは、第１の基材（例えば、非生物学的基材）に特異的に結合する第１のリガンド、および第２の基材（例えば、生物学的基材）に特異的に結合する第２のリガンドを含む結合剤を使用して生成される界面をいう。従って、結合界面は、２つ以上の基材の各々について親和性を与えることにより、２つ以上の基材間の相互作用を媒介する。一実施形態において、２つ以上の基材は、全て同じものである。別の実施形態において、２つ以上の基材は、全てが同じというわけではない。
【００５７】
用語「非結合界面」とは、第１の基材（例えば、非生物学的基材）に特異的に結合する第１のリガンド、および第２の基材（例えば、標的生物学的基材）への結合を実質的に示さない第２のリガンドを含む結合剤を使用して生成される界面をいう。従って、非結合界面は、標的非生物学的基材への結合を実質的に示さない第１のリガンド、および生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含む結合剤を使用して生成され得る。従って、非結合界面は、２つ以上の基材間の相互作用の欠如を確実にする。
【００５８】
機能的界面はまた、生物学的アレイを構成し得、このアレイにおいて、複数の結合剤の各々は、所定位置で基材に接着され、そして複数の結合剤の各々の合計が、パターンを構成する。本発明によるパターン化された界面バイオマテリアルの一実施形態において、本発明の結合剤は、本明細書中以下にさらに記載されるように、空間的に制限された様式で非生物学的界面に塗布される。
【００５９】
本発明の界面バイオマテリアルは、複数の結合剤の各々が同一である、均質な界面バイオマテリアルを含み得る。あるいは、界面バイオマテリアルは、複数の非同一な結合剤を使用して界面バイオマテリアルを構築することにより、不均質であり得る。一実施形態において、複数の非同一な結合剤の各々は、以下を含む：（ａ）第１の基材（好ましくは、非生物学的基材）に特異的に結合する同一のリガンド；および（ｂ）可変ドメイン。この可変ドメインは、基材についての種々のリガンドまたは非結合ドメインのいずれかの中から選択され得（一実施形態において、生物学的基材）、その結果、複数の基材（一実施形態において、生物学的基材）は、結合し得、そして／または結合し得ない。
【００６０】
例えば、不均質界面バイオマテリアルは、複数の非同一の結合剤を含み得、ここで複数の非結合剤の各々は、以下を含む：（ａ）ポリスチレンに特異的に結合する第１のリガンド；および（ｂ）種々の細胞型のうちの１つに特異的に結合する第２のリガンド。この複数の結合剤は、ポリスチレン基材に接着され得る。混合された細胞集団を含むサンプル（ここで、この混合された細胞集団中の異なる型の細胞の各々が、複数の第２のリガンドのうちの１つに特異的に結合する）は、ポリスチレン基材に対して提供され得る。この混合細胞集団が、複数の結合剤に結合するために十分な時間の後、不均質な界面バイオマテリアルは、ポリスチレン基材と混合細胞集団との間に形成される。
【００６１】
本発明の一実施形態において、不均質な界面バイオマテリアルの調製は、以下を包含し得る：（ａ）非生物学的基材の無作為な位置に、複数の非同一の結合剤の各々を接着する工程；または（ｂ）非生物学的基材上の既知の位置に、複数の非同一の結合剤の各々を接着する工程。従って、不均質な界面バイオマテリアルは、無作為に不均質な界面バイオマテリアルまたはパターン化された不均質な界面バイオマテリアルを含み得る。
【００６２】
パターン化された界面バイオマテリアルは、一実施形態において、複数の結合剤の各々を、非生物学的基材上の個別の位置に、結合剤を分配するのに適切な任意の技術を使用して送達することにより調製され得る。この技術としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：吹き付け、塗装、インクジェット、ディップペン式ライティング（実施例１５）、マイクロコンタクトプリンティング（米国特許第６，１８０，２３９号および同第６，０４８，６２３号）、スタンピング（米国特許第５，５１２，１３１号および同第５，７７６，７４８号）、またはリソグラフィー（Ｂｈａｔｉａら、１９９３）、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／５６３７５。
【００６３】
本発明はさらに、界面バイオマテリアルを調製するための方法を提供する。本発明の一実施形態において、結合界面バイオマテリアルを調製するための方法は、以下を包含する：（ａ）非生物学的基材に複数の結合剤を塗布する工程であって、ここでこの複数の結合剤の各々は、非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンド、および標的生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含み、そしてここでこの塗布する工程が、カップリングすることを含まない、工程；（ｂ）非生物学的基材（ここで、複数の結合剤が、この非生物学的基材に結合している）を、標的生物学的基材を含むサンプルと接触させる工程；および標的生物学的基材の複数の結合剤への結合に十分な時間の間放置し、それにより界面バイオマテリアルが調製される、工程。
【００６４】
あるいは、非生物学的基材および生物学的基材の各々への複数の結合剤の結合は、特定の塗布に依存して、同時にかまたは逆の順序で行われ得る。従って、結合界面バイオマテリアルを調製するための方法はまた、以下を包含し得る：（ａ）複数の結合剤（ここで、この結合剤の各々は、非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンド、および標的生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含む）を接触させる工程であって、そしてここでこの塗布する工程が、カップリングすることを含まない、工程；（ｂ）非生物学的基材に、複数の結合剤を塗布する工程；ならびに（ｃ）非生物学的基材の複数の結合剤への結合に十分な時間の間放置し、それにより界面バイオマテリアルが調製される、工程。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、非結合界面バイオマテリアルを調製するための方法は、以下を包含する：（ａ）非生物学的基材に、複数の結合剤を塗布する工程であって、ここでこの複数の結合剤の各々は、非生物学的基材に特異的に結合するリガンド、および標的生物学的基材への結合を実質的に示さない非結合ドメインを含み、そしてここでこの塗布する工程が、カップリングすることを含まず、そして共有結合を含まない、工程；ならびに（ｂ）非生物学的基材（ここで、複数の結合剤は、この非生物学的基材に結合している）を、標的生物学的基材を含むサンプルと接触させて、それにより、界面バイオマテリアルが調製される、工程。
【００６６】
（ＩＩ．Ａ．非生物学的基材）
用語「非生物学的基材」は、生物系の性質でも構成要素でもない基材を記載するために、本明細書中で使用される。代表的な非生物学的基材としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：一般的なプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリカーボネート）、シリコーン、合成ポリマー、金属（混合金属合金を含む）、金属酸化物（例えば、ガラス）、非金属酸化物、セラミック、薬物、薬物キャリア、およびこれらの組み合わせ。
【００６７】
非生物学的基材は、その意図された用途に適切な任意の形態を含み得、これらとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：平坦な表面（例えば、培養プレート）、平坦でない表面（例えば、皿、移植物、または管）、または溶液中の基材。一実施形態において、非生物学的基材は、少なくとも約２０ｎｍの最小寸法を含む。例えば、非生物学的基材は、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約２００ｎｍ、約５００ｎｍ、約１μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約５００μｍ、または約１ｍｍの最小寸法を含み得る。
【００６８】
代表的な合成ポリマーとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ポリテトラフルオロエチレン、発泡ポリテトラフルオロエチレン、ＧＯＲＥ−ＴＥＸ（登録商標）（Ｇｏｒｅ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化エチレンプロピレン、ヘキサフルオロプロピレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ペレタン（ｐｅｌｌｅｔｈａｎｅ）（市販のポリウレタン、ＰＥＬＬ）、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＰＴ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミノ酸、およびこれらの組み合わせ。一実施形態において、合成ポリマーは、発泡ポリマーまたは多孔性ポリマーを含む。別の実施形態において、合成ポリマーは、ナイロン構造を含む。
【００６９】
本発明の方法に従って使用され得る代表的な金属としては、チタン、ステンレス鋼、金、銀、ロジウム、亜鉛、白金、ルビジウム、および銅が挙げられるが、これらに限定されない。適切なセラミック材料としては、酸化シリコーン、酸化アルミニウム、アルミナ、シリカ、ヒドロキシアパタイト、ガラス、石英、酸化カルシウム、リン酸カルシウム、酸化インジウムすず（ＩＴＯ）、ポリシラノール、酸化リン、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
他の非生物学的基材としては、炭素ベースの材料（例えば、グラファイト、カーボンナノチューブ、カーボン「バッキーボール」、およびメタロ−炭素複合材）が挙げられる。
【００７１】
薬物送達のための界面バイオマテリアルの調製は、薬物または薬物キャリアを含む非生物学的基材を使用し得る。用語「薬物」とは、本明細書中で使用される場合、生物学的活性または検出可能な活性を有する任意の物質をいう。従って、用語「薬物」は、薬学的薬剤、検出可能な標識、またはこれらの組み合わせを含む。用語「薬物」はまた、標的細胞に望ましく送達される任意の物質を含む。
【００７２】
非生物学的基材を記載するために本明細書中で使用される場合の用語「薬物キャリア」とは、薬物調製および／または薬物投与を容易にする組成物をいう。任意の適切な薬物送達ビヒクルまたはキャリアが使用され得、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：遺伝子治療ベクター（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド）、ミクロカプセル（例えば、ミクロスフェアまたはナノスフェア、Ｍａｎｏｍｅら、１９９４；ＳａｌｔｚｍａｎおよびＦｕｎｇ，１９９７）、脂肪乳濁液（米国特許第５，６５１，９９１号）、ナノ懸濁液（米国特許第５，８５８，４１０号）、ポリマーミセルまたは結合体（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９７；米国特許第４，５５１，４８２号、同第５，７１４，１６６号、同第５，５１０，１０３号、同第５，４９０，８４０号および同第５，８５５，９００号）、リポソーム（米国特許第６，２１４，３７５号；同第６，２００，５９８号；同第６，１９７，３３３号）；およびポリソーム（米国特許第５，９２２，５４５号）。
【００７３】
用語「検出可能な標識」とは、検出され得る任意の基材をいい、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：非侵襲性の方法（例えば、シンチグラフィ法、磁気共鳴画像化、超音波、分光法、酵素、電気化学、および／または蛍光）を使用して検出され得る因子。非侵襲性画像化に有用な代表的な基材は、本明細書中以下に記載される。
【００７４】
非生物学的基材は、生体適合性、分解性、表面積対体積比、および機械的完全性を含むがこれらに限定されない多数の要因に基づいて、所望の塗布について選択される。臨床塗布には、非生物学的基材は、生体適合性の非生物学的基材（例えば、チタン、合成ポリマー（例えば、シリコーン）、および任意のその他の生体適合性非生物学的基材）を含み得る。非生物学的基材はまた、本明細書中に開示されるような複数の結合剤の塗布により生体適合性にされ得る。適切な非生物学的基材の選択は、当業者の技術範囲内である。
【００７５】
（ＩＩ．Ｂ．生物学的基材）
用語「生物学的基材」とは、本明細書中で使用される場合、生物系に関与する性質または構成要素をいう。とりわけ、「生物学的基材」は、器官、組織、細胞またはその構成要素を含み得る。従って、生物学的基材は、高分子（タンパク質（例えば、抗体、コラーゲン、レセプター）が挙げられるがこれらに限定されない）、ペプチド、核酸（例えば、アプタマー）、オリゴマー、低分子（例えば、化学化合物）、核酸−タンパク質融合物、および／または任意の他の生物学的親和性因子を含み得る。用語「生物学的基材」はまた、生物系から単離された基材、および組み換え的または合成的に産生された基材を含む。
【００７６】
（ＩＩＩ．結合剤）
用語「結合剤」とは、２つの基材の間の結合的相互作用または非結合的相互作用を媒介する構成物をいう。１つの実施形態では、結合剤は、生物学的基材と非生物学的基材との間での相互作用を媒介する。従って、本発明の１つの実施形態では、結合剤は、以下を含む：（ａ）非生物学的基材に特異的に結合するリガンド；および（ｂ）生物学的基材に特異的に結合するリガンド。本発明の別の実施形態では、結合剤は、以下を含む：（ａ）非生物学的基材を特異的に結合するリガンド；および（ｂ）標的生物学的基材への結合を実質的に示さない非結合ドメイン。
【００７７】
非生物学的基材を特異的に結合するリガンドは、共有結合も連結部分を介する結合もない状態で、特異的結合を示す。例えば、このリガンドとこの非生物学的基材との間での結合は、例えば、結合剤の第１リガンドと第２リガンドとの連結に関連すると本明細書中で以下に記載されるいずれの形態の連結も含まない。
【００７８】
生物学的基材を特異的に結合するリガンドは、特異的結合の結果として、さらなる生体活性を有し得る。例えば、リガンドは、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ＤＮＡ修復活性、癌遺伝子活性、腫瘍サプレッサー活性、新脈管形成刺激活性、新脈管形成阻害活性、マイトジェン活性、シグナル伝達活性、輸送活性、酵素活性、汚れ止め活性、抗細菌活性、抗ウイルス活性、抗原活性、免疫原性活性、アポトーシス誘発活性、抗アポトーシス誘発活性、細胞傷害性活性、潤滑活性、およびそれらの組み合わせをさらに示し得る。
【００７９】
結合剤は、第１リガンドと第２リガンドとを、またはリガンドと非結合ドメインとを連結して、単一の分子または複合体を形成するすることによって構築され得る。連結は、実施例１２および実施例１３に記載のように、合成の間に２以上のペプチドリガンドを融合することを含み得る。必要に応じて、２つのドメインの間のペプチドリンカー領域もまた、合成の間に組み込まれ得る。あるいは、第１リガンドおよび第２リガンド、またはリガンドおよび非結合ドメインは、本明細書中以下にさらに記載されるように、共有結合または化学的カップリングにより、リンカーを介して組み合わされ得る。
【００８０】
（ＩＩＩ．Ａ．ペプチド）
本発明の１つの実施形態では、リガンドは、非生物学的基材および／または生物学的基材に特異的に結合するペプチドリガンドを含む。同様に、１つの実施形態では、非結合ドメインは、標的生物学的基材への結合を実質的に示さないペプチドを含む。
【００８１】
用語「ペプチド」とは、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、遺伝的にコードされるアミノ酸、遺伝的にコードされないアミノ酸、およびそれらの組み合わせを包含する、アミノ酸鎖を広範にいう。ペプチドは、Ｌ型およびＤ型の両方のアミノ酸を包含し得る。本発明のペプチドは、種々の変更、置換、挿入、および欠失に供され得、ここで、このような変更は、その用途において特定の利点を提供する。従って、用語「ペプチド」は、アミド、タンパク質との結合体、サイクロン（ｃｙｃｌｏｎｅ）ペプチド、重合ペプチド、保存的置換改変体、アナログ、フラグメント、化学的に改変されたペプチド、およびペプチド模倣物を包含する種々の形態のペプチド誘導体のうちのいずれをも包含する。
【００８２】
本発明の１つの実施形態では、このペプチドは、少なくとも約３残基、別の実施形態では約３〜約５０残基、そしてなお別の実施形態では約３〜約２５残基を含むアミノ酸配列を包含する。特異的結合特性を示す任意のペプチドリガンドは、本発明の実施において用いられ得る。１つの実施形態では、約２５未満のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントが用いられる。別の実施形態では、約２０未満のアミノ酸のペプチドフラグメントが用いられる。
【００８３】
遺伝的にコードされない代表的なアミノ酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：２−アミノアジピン酸；３−アミノアジピン酸；β−アミノプロピオン酸；２−アミノ酪酸；４−アミノ酪酸（ピペリジン酸）；６−アミノカプロン酸；２−アミノヘプタン酸；２−アミノイソ酪酸；３−アミノイソ酪酸；２−アミノピメリン酸；２，４−ジアミノ酪酸；デスモシン；２，２’−ジアミノピメリン酸；２，３−ジアミノプロピオン酸；Ｎ−エチルグリシン；Ｎ−エチルアスパラギン；ヒドロキシリジン；アロ−ヒドロキシリジン；３−ヒドロキシプロリン；４−ヒドロキシプロリン；イソデスモシン；アロ−イソロイシン；Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）；Ｎ−メチルイソロイシン；Ｎ−メチルバリン；ノルバリン；ノルロイシン；およびオルニチン。
【００８４】
代表的な誘導体化アミノ酸としては、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が挙げられる。遊離のカルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルもしくはヒドラジドを形成し得る。遊離のヒドロキシル基は、誘導体化されて、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成し得る。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成し得る。
【００８５】
用語「保存的に置換された改変体」とは、１以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されている、参照ペプチドの配列に実質的に同一なアミノ酸残基配列を有するペプチドをいう。１つの実施形態では、保存的に置換された改変体は、参照ペプチドと比較した場合、類似の結合特異性または非結合性を提示する。用語「保存的に置換された改変体」はまた、残基が、化学的に誘導体化された残基で置換されているが、ただし、得られるペプチドは、本明細書中に記載されたとおりの結合特異性または非結合性を有する、ペプチドを包含する。
【００８６】
保存的置換の例としては、以下が挙げられる：１つの非極性（疎水性）残基（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）での別の非極性残基の置換；１つの極性（親水性）残基での別の極性残基の（例えば、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間での）置換；１つの塩基性残基（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）での別の残基での置換；または１つの酸性残基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）での別の酸性残基での置換。
【００８７】
本発明のペプチドはまた、このペプチドの必要な結合特異性または非結合性が維持される限り、配列が本明細書中に開示されるペプチドの配列に対して、１以上の付加および／または欠失もしくは残基を有するペプチドを包含する。用語「フラグメント」とは、本明細書中に開示されるペプチドのアミノ酸残基配列よりも短いアミノ酸残基配列を有するペプチドをいう。
【００８８】
ペプチドは、末端ＮＨ２アシル化（例えば、アセチル化、またはチオグリコール酸アミド化）または末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニアまたはメチルアミンを用いる）によって改変され得る。末端改変は、プロテイナーゼ消化による感受性を低減するため、それゆえ、溶液（特に、プロテアーゼが存在し得る生物学的流体）中でのペプチドの半減期を延期するために有用である。
【００８９】
ペプチド環化もまた、環化によって形成される安定な構造およびこのような環状ペプチドについて観察される生物学的活性の観点から、有用な改変である。代表的なペプチド環化方法は、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＥｂｅｒｌｅ（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９９２：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｗｅｎｔｙ−Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １３−１９，１９９２，Ｉｎｔｅｒｌａｋｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｅｓｃｏｍ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓによって記載される。代表的に、ｔｅｒｔブトキシカルボニル保護ペプチドメチルエステルは、メタノール中に溶解され、水酸化ナトリウム溶液が添加され、そして混合物が２０℃にて反応させられて、加水分解によってメチルエステル保護基が除去される。溶媒をエバポレートした後、このｔｅｒｔブトキシカルボニル保護ペプチドを、酸性化水性溶媒から酢酸エチルで抽出する。次いで、ｔｅｒｔブトキシカルボニル保護基は、ジオキサン共溶媒中で、穏やかな酸性条件下で除去される。このようにして得られた、遊離のアミノ末端およびカルボキシル末端を有する、保護されていない直鎖状ペプチドは、その直鎖状ペプチドの希釈溶液を、ジクロロメタンおよびジメチルホルムアミド混合物中で、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよびＮ−メチルモルホリンの存在下でジシクロヘキシルカルボジイミドと反応させることによって、その対応する環状ペプチドへと転換される。次いで、得られる環状ペプチドは、クロマトグラフィーによって精製される。
【００９０】
必要に応じて、本発明のリガンドまたは非結合ドメインは、本明細書中以下にさらに記載されるリンカー分子への連結を容易にするために１以上のハロゲン（例えば、フッ素、臭素、またはヨウ素）を含むように改変された１以上のアミノ酸を含み得る。
【００９１】
用語「ペプトイド」は、本明細書中で用いられる場合、ペプチド結合のうちの１以上が、以下を含むがこれらに限定されない偽ペプチド結合によって置換されているペプチドをいう：カルバ（ｃａｒｂａ）結合（ＣＨ２−ＣＨ２）、デプシ結合（ＣＯ−Ｏ）、ヒドロキシエチレン結合（ＣＨＯＨ−ＣＨ２）、ケトメチレン結合（ＣＯ−ＣＨ２）、メチレン−オキシ結合（ＣＨ２−Ｏ）、還元結合（ＣＨ２−ＮＨ）、チオメチレン結合（ＣＨ２−Ｓ）、Ｎ−改変結合（−ＮＲＣＯ−）、およびチオペプチド結合（ＣＳ−ＮＨ）。例えば、Ｇａｒｂａｙ−Ｊａｕｒｅｇｕｉｂｅｒｒｙら，１９９２；Ｔｕｎｇら，１９９２；Ｕｒｇｅら，１９９２；Ｃｏｒｒｉｎｇｅｒら，１９９３；Ｐａｖｏｎｅら，１９９３を参照のこと。
【００９２】
非生物学的基材に特異的に結合する代表的なペプチドは、配列番号１〜７１として示される。実施例２〜８を参照のこと。
【００９３】
生物学的基材に特異的に結合するペプチドリガンドとしては、以下を包含するがこれらに限定されない、既知の結合特異性を有するペプチドが挙げられる：（ａ）表１（配列番号７４〜９８）に列挙した細胞結合ペプチド；（ｂ）標的基材を特異的に結合することが公知の他のペプチド；または（ｃ）本明細書中に以下に記載されるディスプレイ技術によって見出されるペプチド。
【００９４】
【表１】
2005518442.tif 000004
本発明のペプチド（ペプトイドを包含する）は、ペプチド合成の分野の当業者に公知の任意の技術によって合成され得る。合成化学技術（例えば、固相Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型合成）は、純度、抗原特異性、望ましくない側鎖保護がいらないこと、生成の容易さなどから用いられる。代表的な技術の要約は、とりわけ、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９６９）Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６９）Ａｄｖ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  Ｒｅｌａｔ  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：２２１−２９６；ＦｉｅｌｄｓおよびＮｏｂｌｅ（１９９０）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  ３５：１６１−２１４；ならびにＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２改訂版．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見出され得る。代表的な固相合成技術は、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら（２０００）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５５：２２７−２５０、その中に引用される参考文献、ならびに米国特許第６，０１５，５６１号；同第６，０１５，８８１号；同第６，０３１，０７１号；および同第４，２４４，９４６号に見出され得る。溶液中でのペプチド合成は、ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ（１９６５）Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａに記載される。ペプチド合成に有用な適切な保護基は、上記の教科書およびＭｃＯｍｉｅ（１９７３）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される。本発明の１つの実施形態では、ペプチドは、実施例１１〜１３に記載される自動ペプチド合成機を用いて生成される。
【００９５】
ペプチドはまた、米国特許第６，１８４，３４４号に記載されるようなネイティブ化学連結によって合成され得る。手短には、この連結工程は、保護されていない２つのペプチドセグメントの化学選択的反応を用いて、一過性のチオエステル連結中間体を生成する。この中間体は、自発的に再配置されて、全長連結生成物を作製する。
【００９６】
ペプチド（遺伝的にコードされないアミノ酸を含むペプチドを含む）はまた、無細胞翻訳系（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら（２００１）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：７５１−７５５によって記載される系）において生成され得る。さらに、特定のアミノ酸配列を有するペプチドは、商業的供給源（例えば、Ｂｉｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．，ＬＬＣ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、およびＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃｓ，  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）から購入され得る。
【００９７】
ペプチドの内部の位置またはカルボキシル末端に１以上のチロシン残基を保有するペプチドは、例えば、ヨウ素化または放射性ヨウ素化によって便利に標識され得る。
【００９８】
用語「ペプチド模倣物」とは、本明細書中で用いられる場合、参照ペプチドの抗原性が実質的に重複するが、ペプチドでもペプトイドでもないことによって、参照ペプチドの生物学的活性を模倣するリガンドをいう。１つの実施形態では、ペプチド模倣物は、約７００ダルトン未満の分子量を有する。ペプチド模倣物は、当業者に公知の方法を用いて設計または選択され得る。例えば、米国特許第５，８１１，３９２号；同第５，８１１，５１２号；同第５，５７８，６２９号；同第５，８１７，８７９号；同第５，８１７，７５７号；および同第５，８１１，５１５号を参照のこと。
【００９９】
本発明の任意のペプチドまたはペプチド模倣物は、薬学的に受容可能な塩の形態で用いられ得る。本発明のペプチドとともに用いられ得る適切な酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：無機酸（例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、塩酸（ＨＣｌ）、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、ケイ皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸など。１つの実施形態では、薬学的に受容可能な塩は、ＨＣｌである。別の実施形態では、薬学的に受容可能な塩はＴＦＡである。
【０１００】
本発明のペプチドと塩を形成し得る適切な塩基としては、無機塩基（たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなど）；ならびに有機塩基（例えば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、およびトリアルキルアミン、ならびにモノアリールアミン、ジアリールアミン、およびトリアリールアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）、ならびに必要に応じて置換されたエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミンなど））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明のペプチドリガンドは、１つ以上の架橋部分（例えば、光架橋可能な部分、イオン的に架橋可能な部分、または末端架橋可能な部分）をさらに含み得る。架橋部分は、二次元または三次元の界面バイオマテリアルを作製するために使用され得る。
【０１０２】
（ＩＩＩ．Ｂ．抗体）
本発明の別の実施形態において、リガンドまたは非結合ドメインは、単鎖抗体を含み得る。用語「単鎖抗体」とは、直接的にかまたはペプチドリンカーを介してかのいずれかで一緒に接合されて、連続的なポリペプチドを形成する、可変重鎖および可変軽鎖を含む抗体をいう。従って、用語「単鎖抗体」は、免疫グロブリンタンパク質またはその機能的部分を包含し、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体、変異誘発抗体、ヒト化抗体、および抗原結合部位を含む抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ抗体フラグメントおよびＦｖ抗体フラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
抗体リガンドは、本明細書中以下に記載されるパニング方法によって、同定され得る。あるいは、所望の結合特異性または所望の非結合性質を有する、既知の単鎖抗体が使用され得る。例えば、Ｒｏｃｋｗｅｌｌらに対する米国特許第５，８７４，５４２号は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプターに特異的に結合する単鎖抗体を開示する。ＶＥＧＦは、マクロファージ中および増殖中の上皮ケラチノサイトで発現され、従って、創傷治癒を促進するために使用され得る（Ｂｒｏｗｎら、１９９２）。癌細胞に特異的に結合する多数の単鎖抗体（例えば、米国特許第５，９７７，３２２号および同第５，８３７，２４３号）、ヒト免疫不全ウイルスに特異的に結合する多数の単鎖抗体（例えば、米国特許第５，８４０，３００号）、および分泌されたシグナル伝達分子に特異的に結合する多数の単鎖抗体（例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；米国特許第５，９５２，０８７号）が、同定されている。これらの抗体リガンドは、例えば、本明細書中以下に記載される、薬物送達および検出方法のために有用である。
【０１０４】
（ＩＩＩ．Ｃ．他のリガンドおよび非結合ドメイン）
本発明の結合剤はまた、ペプチドまたは抗体リガンド以外の特異的結合を示すリガンドを包含し得る。同様に、標的基材に対して実質的に結合を示さない、任煮の適切な非結合ドメインが、結合剤を調製するために使用され得る。従って、本発明のリガンドまたは非結合ドメインはまた、タンパク質、合成ポリマー、天然ポリマー、多糖類、核酸（例えば、アプタマー）、低分子（例えば、化合物）、核酸−タンパク質融合物、および／または任意の他の親和性因子もしくは非結合剤を包含し得る。
【０１０５】
例えば、非結合ドメインは、アニオン性ポリマーまたはアニオン性炭水化物を含み得る。これらの分子は、実質的に細胞結合を示さず、従って、線維症、瘢痕形成、および外科的接着の阻害のために有用である。例えば、米国特許第５，７０５，１７７号を参照のこと。代表的なアニオン性ポリマーとしては、天然プロテオグリカン、プロテオグリカンのグリコサミノグリカン部分、硫酸デキストラン、ペント酸ポリスルフェート、硫酸デキストラン、またはセルロース誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。アニオン性ポリマーは、市販の供給源（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）から入手され得るか、天然の供給源から精製され得るか、または合成的に調製され得る。ポリマーの精製および合成のための方法は、とりわけ、Ｂｕｄａｖａｒｉ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ：Ａｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ    Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，第１２版、Ｍｅｒｃｋ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ    Ｓｔａｔｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａに見出され得る。
【０１０６】
非結合ドメインはまた、血小板に対する結合を実質的に示さない多糖類を含み得、これは、米国特許第４，３７８，２２４号に記載されるように、石灰化インヒビターとして使用され得る。適切な石灰化インヒビターとしては、天然タンパク質の多糖類（例えば、コンドロイチン硫酸およびヒアルロネート）、硫酸化多糖類、ジホスホネート、リンタンパク質、および他のポリアニオンが挙げられる。
【０１０７】
リガンドまたは非結合ドメインはまた、低分子を含み得る。用語「低分子」とは、本明細書中において使用される場合、１つの実施形態においては約１，０００ダルトン未満、別の実施形態においては約７５０ダルトン未満、別の実施形態においては約６００ダルトン未満、そしてなお別の実施形態においては約５００ダルトン未満の分子量を有する、化合物（例えば、有機化合物）をいう。１つの実施形態において、低分子は、約−４〜約＋１４の範囲の計算されたｌｏｇオクタノール−水分配係数を有し、そして別の実施形態においては、約−２〜約＋７．５の範囲である。
【０１０８】
（ＩＩＩ．Ｄ．リンカー）
界面バイオマテリアルの調製のために有用な結合材は、必要に応じて、第一のリガンドと第二のリガンドとの間、またはリガンドと非結合領域との間に、リンカーをさらに含む。リンカーは、２つ以上のリガンドの組み合わせを容易にし得る。さらに、リンカーは、２つ以上のドメイン間の潜在的な立体障害を最小にするために、スペーサー機能を含み得る。
【０１０９】
１つの実施形態において、リンカーは、リガンド結合強度、リガンド結合特異性、または非結合ドメインの実質的に結合しない性質を、廃止も変更もしない。１つの実施形態において、リンカーは、その連結活性および／またはスペーサー活性を除いて、実質的に、生物学的に不活性である。
【０１１０】
適切なリンカーは、２炭素原子〜約５０炭素原子の、１つ以上の直鎖または分枝鎖を含み、ここで、この鎖は、完全に飽和されているか、完全に不飽和であるか、またはこれらの組み合わせである。代表的に、リンカーは、リガンド結合のための２と約１００との間の部位を含む。連結のために使用される方法は、選択されるリガンド、非結合ドメイン、およびリンカーの各々の、化学的性質に従って変動する。
【０１１１】
リンカーの適切な反応性基としては、アミン、カルボン酸、アルコール、アルデヒド、およびチオールが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーにおけるアミン基は、リガンドのカルボン酸基（例えば、ペプチドリガンドのカルボキシル末端）と共有結合を形成し得る。リンカーにおけるカルボン酸基またはアルデヒドは、ペプチドリガンドのアミノ末端または他のリガンドアミン基と、共有結合を形成し得る。リンカーにおけるアルコール基は、ペプチドリガンドのカルボキシル末端または他のリガンドカルボン酸基と共有結合を形成し得る。リンカーにおけるチオール基は、ペプチドリガンドのシステインまたはリガンドチオール基と、ジスルフィド結合を形成し得る。
【０１１２】
連結反応のために使用され得るさらなる反応性基としては、ホスフェート、スルフェート、ヒドロキシド、−ＳｅＨ、エステル、シラン、尿素、ウレタン、チオール−ウレタン、カーボネート、チオ−エーテル、チオ−エステル、スルフェート、エーテル、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本発明の１つの実施形態において、リンカーは、ペプチドを含む。１つの実施形態において、ペプチドリンカーは、１〜約４０のアミノ酸を含む。ペプチドリガンドに対するリガンド結合のための部位としては、アミノ酸側鎖官能基ならびにアミノ末端基およびカルボキシル末端基が挙げられる。複数の反応性部位を有する代表的なペプチドリンカーとしては、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリシステイン、ポリグルタミン酸およびポリアスパラギン酸が挙げられる。あるいは、実質的に不活性なペプチドリンカーとしては、ポリグリシン、ポリセリン、ポリプロリン、ポリアラニン、および他のオリゴペプチド（アラニルアミノ酸残基、セリニルアミノ酸残基、プロリニルアミノ酸残基、またはグリシニルアミノ酸残基を含む）が挙げられる。
【０１１４】
ペプチドリンカーは、ペナント（ｐｅｎｎａｎｔ）またはカスケーディング（ｃａｓｃａｄｉｎｇ）であり得る。用語「ペナントポリペプチド」とは、直鎖ペプチドをいう。代表的に天然に見出されるポリペプチドと同様に、ペナントポリペプチドのアミド結合は、１つのアミノ酸残基の末端アミンと、隣のアミノ酸残基の末端カルボン酸との間で形成される。用語「カスケーディングポリペプチド」とは、分枝ペプチドをいい、ここで、アミド結合のうちの少なくともいくつかは、アミノ酸残基の側鎖官能基と、隣のアミノ酸残基のアミノ末端基またはカルボキシル末端基との間で形成される。
【０１１５】
本発明の別の実施形態において、リンカーは、ポリマーを含み得、このポリマーとしては、合成ポリマーまたは天然ポリマーが挙げられる。代表的な合成ポリマーとしては、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール；ＰＥＧ）、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリアミド（例えば、ナイロン）、ポリアミン（例えば、ポリメチルメタクリレート；ＰＭＭＡ）、ポリアクリル酸、ポリウレタン、ポリスチレン、および約２００ダルトン〜約１０００キロダルトン分子量を有する他の合成ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な天然ポリマーとしては、ヒアルロン酸、アルギネート、コンドロイチン硫酸、フィブリノゲン、フィブロネクチン、アルブミン、コラーゲン、および約２００ダルトン〜約２０，０００キロダルトン分子量を有する他の天然ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。ポリマーリンカーとしては、ジブロックポリマー、マルチブロックコポリマー、櫛形ポリマー、スターポリマー、樹状ポリマー、ハイブリッド直鎖−樹状ポリマー、またはランダムコポリマーが挙げられ得る。
【０１１６】
リンカーとしてはまた、メルカプト（アミド）カルボン酸、アクリルアミドカルボン酸、アクリルアミド−アミドトリエチレングリコール酸、およびこれらの誘導体が挙げられ得る。米国特許第６，２８０，７６０号を参照のこと。
【０１１７】
リンカー分子をリガンドまたは非結合ドメインに連結するための方法は、各分子上に存在する反応性基に従って変動する。上記反応性基および分子を使用する連結のためのプロトコルは、当業者に公知である。例えば、Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９７；Ｃｈｅｎｇ  １９９６；Ｎｅｒｉら、１９９７；Ｎａｂｅｌ  １９９７；Ｐａｒｋら，１９９７；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７；ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ  １９８０；米国特許第６，２８０，７６０号および同第６，０７１，８９０号；ならびに欧州特許番号０  ４３９  ０９５および同第０  ７１２  ６２１号を参照のこと。
【０１１８】
（ＩＶ．ファージディスプレイを使用するリガンドの同定）
ディスプレイ技術は、基材を特異的に結合するリガンドの同定のために、効果的なアプローチである（例えば、ファージディスプレイ法）。このアプローチに従って、さまざまなリガンドのライブラリーが、標的基材に対して提示され、そしてこの基材を特異的に結合するリガンドが、選択される。逆に、標的基材に対して実質的に結合を示さないリガンドもまた、発見され得る。リガンドおよび非結合ドメインは、パニングと称される、複数回の連続回の選択に従って、選択され得る。
【０１１９】
種々のライブラリーおよびパニング法の任意のものが、以下にさらに記載されるように、本発明の方法において有用なペプチドを同定するために使用され得る。
【０１２０】
（Ｖ．Ａ．ライブラリー）
本明細書中において使用される場合、用語「ライブラリー」とは、分子のコレクションを意味する。ライブラリーは、約１０の分子〜数十億の分子またはそれより多くまで変動し得る、少数または多数の異なる分子を含み得る。分子としては、天然に存在する分子、または合成分子（これは、天然には見出されない）が挙げられ得る。必要に応じて、複数の異なるライブラリーが、インビボパニングのために同時に使用され得る。
【０１２１】
代表的なライブラリーとしては、ペプチドライブラリー（実施例１ならびに米国特許第６，１５６，５１１号、同第６，１０７，０５９号、同第５，９２２，５４５号、および同第５，２２３，４０９号）、オリゴマーライブラリー（米国特許第５，６５０，４８９号および同第５，８５８，６７０号）、アプタマーライブラリー（米国特許第６，１８０，３４８号および同第５，７５６，２９１号）、低分子ライブラリー（米国特許第６，１６８，９１２号および同第５，７３８，９９６号）、抗体または抗体フラグメントのライブラリー（米国特許第６，１７４，７０８号、同第６，５０７，０９８号、同第５，９２２，２５４号、同第５，８４０，４７９号、同第５，７８０，２２５号、同第５，７０２，８９２号、および同第５，６６７，９８８号）、核酸−タンパク質融合物のライブラリー（米国特許第６，２１４，５５３号）、ならびに潜在的に標的基材に結合し得る他の任意の親和性因子のライブラリー（例えば、米国特許第５，９４８，６３５号、同第５，７４７，３３４号、および同第５，４９８，５３８号）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
ライブラリーの分子は、インビトロで生成され得るか、またはこれらは、例えば、インビボでの分子の発現によって、インビボで合成され得る。また、ライブラリーの分子は、任意の関連する支持体上（例えば、細菌ピリ（ｐｉｌｉ）（Ｌｕら、１９９５）またはファージ（Ｓｍｉｔｈ，１９８５））にディスプレイされ得る。
【０１２３】
ライブラリーは、分子のランダムなコレクションを含み得る。あるいは、ライブラリーは、特定の配列、構造、またはコンホメーションについての偏りを有する分子のコレクションを含み得る。例えば、米国特許第５，２６４，５６３号および同第５，８２４，４８３号を参照のこと。種々の型の分子のさまざまな集団を含むライブラリーを調製するための方法は、当該分野において公知であり、例えば、本明細書中上記で引用された米国特許に記載されている。多数のライブラリーがまた、市販されている。
【０１２４】
１つの実施形態において、開示されるパニング法のために使用されるライブラリーは、１つのライブラリーあたり少なくとも約１×１０８〜約１×１０９の異なる分子の複雑さを有する。従って、１×１０１１のファージの投入を伴う代表的なパニング実験は、ライブラリーにおける各分子の、平均１００コピー〜１０００コピーをサンプリングする。
【０１２５】
本発明の１つの実施形態において、パニングのための方法は、ファージライブラリーを使用して実施される。ファージは、組換えライブラリーをディスプレイするための足場として、ならびにまた、所望の結合特異性を有するリガンドの回収および増幅を提供するために、使用される。
【０１２６】
Ｔ７ファージは、その溶解段階の間に遺伝子１０によってコードされる、４１５のタンパク質から作製される十二面体キャプシドを有する。Ｔ７ファージディスプレイシステムは、１５アミノ酸の大きさまでのペプチドを、高いコピー数（１つのファージあたり４１５）で表示する能力を有する。フィラメント状ファージディスプレイシステムとは異なり、Ｔ７ファージの表面に表示されるペプチドは、ペプチド分泌が可能ではない。Ｔ７ファージはまた、他のファージと比較すると、より迅速に複製し、そして極度に強力である。
【０１２７】
本発明のパニング法に従って使用されるファージライブラリーはまた、フィラメント状ファージ（例えば、Ｍ１３またはＭ１３由来ファージ）で構築され得る。１つの実施形態において、リガンドは、例えば、Ｍ１３ウイルスタンパク質８への融合によって、ファージの外側表面で表示される。Ｍ１３ライブラリーを調製するための方法は、とりわけ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａに見出され得る。Ｍ１３ファージにおいて調製され、そして本発明の方法において有用な、代表的なペプチドライブラリーは、実施例１に記載されている。
【０１２８】
他の適切なファージベクターとしては、ｍＡＥＫベクターおよびｍＡＣＫベクターが挙げられ、これらは、Ｍ１３ｍｐ１８骨格から誘導される。これらの広範なベクターは、広範なスクリーニング形式（細胞ベース、溶液相、および固相のパニングが挙げられる）と適合性である。ｍＡＥＫベクターは、結合のためのペプチドの定量およびパニング以外の機能的アッセイにおいて有用な、独立したペプチドエピトープを提供する。ｍＡＥＫベクターはまた、特異的に結合したファージの非常に効率的かつ選択的な溶出のための、トロンビン切断部位を含む。トロンビン切断はまた、「オフファージ」アッセイを可能にし、このアッセイにおいて、ペプチド分子は、アッセイを実施する前に、ファージからクリップされる。このパニング法はまた、完全なファージ粒子が存在する場合に、認容不可能に高い骨格結合を生じる実験のために使用され得る。
【０１２９】
ファージベクターは、代表的に、ウイルスコート遺伝子ｐＩＩＩの１つの対立遺伝子を含み、従って、３〜５コピーの同一のリガンド−ｐＩＩＩ融合タンパク質が、各組換えファージの表面上に生成される。この多価により、標的基材についての選択されたリガンドの増大した結合力が生じる。従って、ファージベクターは、その目的が、代表的には、さらなる特徴付けのための１またはいくつかの標的特異的結合モチーフを同定することであり、高親和性リガンドが必須でない一次スクリーニングのために使用され得る。
【０１３０】
本発明の別の実施形態において、パニングに使用されるライブラリーは、ファージミドベクターを含む。ファージミドは、ファージｆ１複製起点（パッケージシグナルとしても作用する）および単一コピーのＰＩＩＩをコードする遺伝子（上記に記載の発現カセットを含む）の両方を含むファージミドである。有用なファージミドベクターは、ｐＡＥＫプラスミドおよびｐＡＣＫプラスミドを含み、これらのベクターは、ベクターｐＧＥＭ−３ｚ−ｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）に由来する。
【０１３１】
ファージミドライブラリーは、プラスミドとして維持され、それらは、パッケージ欠損ヘルパーファージでの重感染によってレスキューされる。子孫ウイルスは、ｐＩＩＩ融合遺伝子以外のファージ遺伝子を欠くファージミドＤＮＡを優先的にパッケージする。このヘルパーウイルスは、野生型ｐＩＩＩのコピーを提供する一方、そのファージミドは、より少ない量の組換えリガンド−ｐＩＩＩ融合タンパク質を発現する。従って、リガンド−ｐＩＩＩ融合タンパク質を発現する大部分の組換えウイルスは、わずか１コピーを発現する。これらの一価のライブラリーは、より高い親和性リガンドを生じる傾向がある。なぜなら、低い親和性結合は、増大した結合力により補完され得ないからである。従って、ファージミドベクターは、結合モチーフを最適化するためおよび高親和性リガンドを生成するための二次スクリーニングのために使用され得る。
【０１３２】
プラスミド発現系は、標準的結合アッセイにおけるさらなる特徴付けのための十分な量のリガンドおよび非結合ドメインを生成するために使用され得る。あるいは、パニングによって選択されるリガンドおよび非結合ドメインは、適切な量に合成され得る。
【０１３３】
化学合成に対する前駆体として、標準的な発現カセット（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および細菌性アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）（ＹａｍａｂｈａｉおよびＫａｙ，２００１））において融合タンパク質として発現されるペプチドリガンドの活性を決定することは、しばしば有用である。これらの発現モジュールは、ペプチドリガンドの発現、安定化および精製を容易にし、ペプチド結合の指標としても働き得る。
【０１３４】
（ペプチドライブラリー）  本発明の１つの実施形態において、ペプチドライブラリーは、開示されるパニング法を行うために使用され得る。ペプチドライブラリーは、１つの実施形態において、３つ以上のアミノ酸、別の実施形態においては、少なくとも５つ、６つ、７つまたは８つのアミノ酸、別の実施形態においては、５０個までのアミノ酸、別の実施形態においては、１００個までのアミノ酸、別の実施形態においては、約２００個までのアミノ酸、なお別の実施形態においては、約３００個までのアミノ酸を含むペプチドを含む。１つの実施形態において、ペプチドライブラリーは、約５００ダルトン〜約３５００ダルトンの分子量を有するペプチドを含む。
【０１３５】
ペプチドは、直鎖状、分枝状、または環状であり得、非ペプチジル部分を含み得る。ペプチドは、天然に存在するアミノ酸、合成アミノ酸、遺伝的にコードされるアミノ酸、遺伝的にコードされないアミノ酸、およびこれらの組み合わせを含み得る。
【０１３６】
偏ったペプチドライブラリーもまた使用され得、偏ったペプチドライブラリーは、そのペプチドのうち１以上の（しかし全てではない）残基が一定であるペプチドを含む。例えば、内部残基は、一定であり得、その結果、そのペプチド配列は、以下：
（Ｘａａ１）ｍ−（ＡＡ）１−（Ｘａａ２）ｎ
として示され、ここで、Ｘａａ１およびＸａａ２は、任意のアミノ酸であるか、またはシステイン以外の任意のアミノ酸であり、ここでＸａａ１およびＸａａ２は、同じアミノ酸または異なるアミノ酸であり、ｍおよびｎは、Ｘａａ残基の数を示し、ここで１つの実施形態において、ｍおよびｎは、独立して、２残基〜２０残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および／または２０残基）の範囲から選択され、別の実施形態において、ｍおよびｎは、４残基〜９残基（例えば、４、５、６、７、８、および／または９）の範囲から選択され、ＡＡは、ライブラリー中の全てのペプチドに関して同じアミノ酸である。１つの実施形態において、ＡＡは、ペプチドの中心付近または中心に位置する。１つの実施形態において、ｍおよびｎは、２を超える残基が異なることはなく；別の実施形態において、ｍおよびｎは、等しい。
【０１３７】
１つの実施形態において、ライブラリーは、ＡＡがトリプトファン、プロリン、またはチロシンであるライブラリーである。別の実施形態において、ライブラリーは、ＡＡがフェニルアラニン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、ロイシン、またはイソロイシンであるライブラリーである。別の実施形態において、ライブラリーは、ＡＡがアスパラギン、セリン、アラニン、またはメチオニンであるライブラリーである。なお別の実施形態において、ライブラリーは、ＡＡがシステインまたはグリシンであるライブラリーである。
【０１３８】
代表的なライブラリーは、ＮＮＫとしてコードされる縮重コドンを使用して調製され得る。ここでＮ＝Ａ、Ｃ、ＧまたはＴであり、Ｋ＝ＧまたはＴである。コドンの揺らぎ位置の制限は、その遺伝コードに固有のコドンバイアス（例えば、セリン、アルギニンおよびロイシンについては６つのコドンであるが、メチオニンおよびトリプトファンについてはそれぞれ１つだけ）を減少させるが、排除するのではなく、そして３つの終止コドンのうちの２つを排除する。さらなるライブラリー形式としては、表２に示される形式が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において、Ｘ６ＰＸ６ライブラリーが使用される。別の実施形態において、ＳＣＸ１６Ｓライブラリーが使用される。なお別の実施形態において、Ｘ６ＹＸ６ライブラリーが使用される。ライブラリー合成についての代表的なアプローチはまた、実施例（例えば、実施例１を参照のこと）に開示される。
【０１３９】
【表２】
2005518442.tif 000005
注：Ｘは任意のアミノ酸である。実線は、ペプチド結合を示し、破線は、システイン−システイン結合を示す。
【０１４０】
（抗体ライブラリー）  本発明の別の実施形態において、パニング法は、抗体ライブラリーを使用する。抗体ライブラリーの構築のためのベクターは、ｐＣＡＮＴＡＢ−５ＥまたはｐＣＡＮＴＡＢ−６ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を含む。これらのベクターは、定常領域単鎖フラグメント可変抗体（ｓｃＦｖ）足場を含み、可変配列は、抗体重鎖および抗体軽鎖をコードするベクター配列にクローニングされる。抗体リガンドは、例えば、本明細書中上記のようにＭ１３ファージベクターを使用して提示され得る。Ｍ１３またはＭ１３由来ファージにおいて抗体ライブラリーを構築するための方法は、とりわけ、米国特許第６，２２５，４４７号；同第５，５８０，７１７号；および同第５，７０２，８９２号において見いだされ得る。
【０１４１】
開示されるパニング法に使用される抗体ライブラリーは、未処理の（naive）ライブラリーまたは免疫ライブラリーを含み得る。未処理の抗体ライブラリーは、正常被験体および／または免疫学的に欠損した被験体からプールされた末梢血リンパ球に由来するＩｇＧ超可変領域を用いて構築され得る。未処理のライブラリーは、あまり免疫原性エピトープを含まない標的をスクリーニングするにあたって特に有用である。あるいは、ＩｇＧ超可変領域が、標的基材で以前に免疫したマウスの脾細胞に由来する免疫ライブラリーが調製され得る。
【０１４２】
（ＩＶ．Ｂ．パニング法）
本発明の方法において使用されるパニング技術は、固相スクリーニング、液相スクリーニング、抗体指向性近位（antibody-directed proximity）スクリーニング、細胞ベースのスクリーニング、組織ベースのスクリーニング、またはそれらの組み合わせを含み得る。スクリーニング形式は、本明細書中以下にさらに記載される。実施例２〜８もまた参照のこと。
【０１４３】
基材に結合するリガンドを回収するための方法は、そのライブラリーに存在する分子に共通する１以上の特徴に基づいて選択される。例えば、質量分析法および／またはガスクロマトグラフィーは、共通のコア構造を共有する分子を分離するために使用され得る。従って、ライブラリーが、概して有機分子の構造に基づいて多様な分子を含む場合、特定の分子についての親ピークの存在を決定することにより、リガンドが同定され得る。
【０１４４】
あるいは、ライブラリーの多様な分子の各々は、回収および同定を容易にするタグを含み得る。例えば、代表的なタグは、オリゴヌクレオチドまたはビオチンのような低分子である。例えば、ＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ  １９９２；Ｎｏｒｒｉｓら，１９９９；Ｐａｉｇｅら，１９９９；米国特許第６，０６８，８２９号を参照のこと。
【０１４５】
タグはまた、分子が結合され得る支持体または表面であり得る。例えば、支持体は、生物学的タグ（例えば、バクテリオファージ（「ファージ」）のようなウイルスまたはウイルス様粒子；細菌；または真核生物細胞（例えば、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物細胞）（例えば、内皮前駆細胞または白血球））であり得るか；またはリポソームまたはマイクロビーズのような物理的タグであり得る。分子が支持体に連結される場合、基材と相互作用すると疑われる分子の一部は、相互作用に関与し得るように配置され得る。
【０１４６】
（固相スクリーニング）  固相スクリーニング法は、結合基材が非生物学的表面を含む場合に使用される。実施例２〜８を参照のこと。固相スクリーニングはまた、実施例９に記載されるように、生物学的標的が固相支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル中）にコーティングされるパニング法を包含する。このアプローチは、標的生物学的基材が、支持体上に固定化された場合に、ネイティブな構造および機能に少なくとも近い構造および機能を維持することが必要である。
【０１４７】
（液相スクリーニング）  このアプローチは、溶液中で生物学的基材に特異的に結合するリガンドを同定するために使用され得る。特に、この方法は、生物学的基材に特異的に結合するリガンドの同定に適している。ここで、この生物学的基材は、複合体の一部として他の生物学的成分に結合される。液相スクリーニングはまた、生物学的基材の結合能力が、基材に対する固定化によって減少される場合に適切である。このアプローチに従って、本明細書中に記載されるように、生物学的基材、この基材と複合体化される成分、またはリガンドが、基材の回収を容易にするタグを含むように改変される。
【０１４８】
（抗体指向性近位スクリーニング）  精製された標的を得ることができない場合、標的に特異的に結合する抗体は、その標的にも結合するリガンドを回収するために使用され得る。この方法は、代表的には、標的基材を結合するリガンド（ここで、この標的基材は、抗体または別のタンパク質と複合体化される）は、抗体または他の関連するタンパク質により結合される領域に隣接する標的基材上の部位において結合するという観察に基づく。結合したリガンドは、過酸化水素の存在下でビオチン−チラミンの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性化によって検出される。活性化されたビオチン−チラミンは、次いで、接触される任意の分子をビオチン化する。しかし、活性化されたビオチン−チラミンは、水によってクエンチされ、その結果、極めて制限された拡散半径を有する。このようにして、ＨＲＰに近位にある分子（近くの部位に結合されるファージを含む）のみが、ビオチン化される。ビオチン化ファージは、ストレプトアビジン磁性ビーズに対する親和性により集団から分画される。回収されたファージは、感染により増幅され、次いで、特徴付けられ得るか、またはさらなる回のパニングに供され得る。Ｏｓｂｏｕｒｎら，１９９８ａ；Ｏｓｂｏｕｒｎら，１９９８ｂを参照のこと。
【０１４９】
（細胞ベースのスクリーニング）  細胞表面上に存在するレセプターまたは他の分子を含む標的基材は、細胞ベースのスクリーニングにおいて使用され得る。このアプローチは、細胞集団に対してファージライブラリーをパニングする工程を包含する。細胞表面分子を結合するファージを選択するために、この方法は、細胞膜に存在する他の分子に対するファージ結合を検出する工程を最小にするための工程を包含する。実施例９を参照のこと。
【０１５０】
非標的結合の検出を最小にするための１つのアプローチは、レセプターを発現する「標識細胞」およびレセプターを欠く大過剰の「非標識」細胞の混合した集団を使用するディファレンシャルスクリーニングを包含する。この方法に従って、両方の細胞集団に共通する分子を結合する任意のファージは、過剰な非標識細胞に優先的に結合され、多数回の選択にわたって除去される。標的レセプターに結合するファージは、それにより、多数回の選択の間に富化される。
【０１５１】
別のアプローチは、抗体指向性スクリーニング方法と細胞ベースのスクリーニング方法とを組み合わせる。抗体が、細胞表面分子またはそのエピトープタグ化バージョンに対して利用可能である場合、抗体は、細胞表面上の標的分子に結合される。この場合、標的レセプター以外の分子に結合する多数のファージは、それらがビオチン化されるので、検出されない。
【０１５２】
（組織スクリーニング）  生物学的基材に特異的に結合するペプチドの同定はまた、米国特許第６，０８６，８２９号に記載されるように、インビボパニングにより同定され得る。この方法に従って、多様なペプチドのライブラリーは、被験体に、または被験体から入手される単離された標的組織もしくは器官、またはその一部に投与され、標的組織または器官を特異的に結合するファージが回収される。
【０１５３】
（Ｖ．塗布）  本発明の界面バイオマテリアルは、２つの基材の間（例えば、非生物学的基材と生物学的基材の間）の相互作用が、望ましくは制御される、任意の塗布において使用され得る。本発明の界面バイオマテリアルの代表的な使用は、本明細書中以下に簡単に記載される。その相互作用は、結合相互作用、非結合相互作用、またはこれらの組み合わせを含み得る。相互作用の性質および量は、界面バイオマテリアルを作製するために使用される複数の結合剤の結合特異性、結合強度、または非結合量に依存する。
【０１５４】
（Ｖ．Ａ．細胞培養）
本発明の１つの実施形態において、界面バイオマテリアルは、細胞培養のために表面に対する細胞接着を媒介するコーティングを包含する。実施例１４は、細胞およびポリスチレンに特異的に結合する結合剤を含む界面バイオマテリアルを記載する。界面バイオマテリアルは、ポリスチレン培養プレートに複数の結合剤を接着し、次いで、複数の結合剤を細胞に接着することにより作製される。
【０１５５】
細胞培養のための界面バイオマテリアルは、任意の型の細胞の培養を容易にするために使用され得、これらの細胞型としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：線維芽細胞、大動脈内皮細胞、幹細胞、胚細胞および新生児の組織細胞、脊椎動物の内皮細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞、ならびに筋芽細胞。細胞は、任意の種に由来し得、これらの種としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト、霊長類、ブタ、マウス、および昆虫の細胞。
【０１５６】
非生物学的基材と細胞を含む生物学的基材との間の結合界面を生成するために、複数の結合剤の各々が、細胞接着分子由来のペプチドリガンド（例えば、表１に列挙されるリガンド（配列番号７４〜９８）のいずれか））を含み得る。用語「細胞接着分子」とは、細胞接着、または細胞の表面への結合を促進することが見出された任意のファミリーのタンパク質およびペプチドをいう。あるいは、結合剤は、細胞外マトリクスタンパク質を特異的に結合するペプチドリガンドを含み得る。結合界面を調製するための代表的な方法は、実施例１６に記載される。
【０１５７】
培養物表面への細胞接着についての界面バイオマテリアルは、複数の非同一の細胞結合ペプチドを含む不均質界面を含む。複数の結合剤の各々は、（ａ）培養物表面基材を特異的に結合するリガンド；および（ｂ）可変性細胞結合リガンド、を含む。
【０１５８】
細胞培養物は、界面バイオマテリアルと、二次元または三次元の組織様構造（例えば、骨様組織または血管化組織）を生成するのに十分な条件および時間、接触されたままにされ得る。
【０１５９】
本発明はまた、後に被験体に移植するためのインビトロまたはエキソビボの細胞培養物を包含する。培養された細胞は、界面バイオマテリアルから分離され得、そして被験体に提供され得る。別のアプローチは、被験体に、非生物学的基材、界面バイオマテリアルおよび細胞基材を含む組成物を移植する工程を包含する。
【０１６０】
（Ｖ．Ｂ．生物学的アレイ）
本発明は、生物学的アレイを調製する方法をさらに提供する。用語「アレイ」とは一般に、接着スポットのパターンおよびこれに特異的に結合された生物学的基材のパターンをいう。用語「スポット」は、非生物学的基材に特異的に結合された本発明の結合剤を含む領域を示すために本明細書中で使用される。
【０１６１】
本発明の一実施形態において、生物学的アレイを調製する方法は、以下を包含する：（ａ）複数の位置を有する非生物学的基材を提供する工程；（ｂ）これらの複数の位置の各々に、非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンド、および標的生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含む結合剤を塗布する工程であって、ここで、この塗布は、カップリングを含まない、工程；（ｃ）この非生物学的基材を、標的生物学的基材を含むサンプルと接触させる工程であって、ここで、複数の結合剤が非生物学的基材に結合している、工程；ならびに（ｄ）この標的生物学的基材が複数の結合剤に結合するのに十分な時間放置し、それにより生物学的アレイを調製する工程。複数の結合剤を複数の位置に塗布する例示的な方法は、実施例１５に記載されるような、ディップペン（ｄｉｐ−ｐｅｎ）印刷工程を包含する。
【０１６２】
分配される結合剤の量、スポットの大きさおよびスポットの形状は、分配されるリガンドの濃度および容量、分配が行われる温度、および／または塗布技術を改変することによって、変化し得る。代表的には、スポットの寸法は、約０．２μｍ〜約１．０μｍの最小寸法を含むが、特定の用途のために所望されるようなより大きな最小寸法を含み得る。本明細書中に示される開示を精査した後に、特定の用途のために、結合剤のスポットの大きさ、形状および量を最適化することは、当業者の技量内である。
【０１６３】
スポットは、標的生物学的基材への結合に適切であるような任意の適切な大きさおよび形状であり得る。例えば、細胞結合剤を含有する結合剤を分配することによって調製されるスポットは、接着した細胞の大きさより小さい最大寸法、またはこのサイズにほぼ等しい最大寸法を含み得る。例えば、白血球は、約２０μｍの直径であり、そしてＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ卵母細胞は、１ｍｍほどの大きさの直径である。表面に置かれる場合、これらの細胞は、表面に接着した場合には実質的に平坦化されない。内皮細胞は代表的に、表面に接着した場合に平坦化し、そして約２５０〜４，０００μｍ２の面積を有し得る。同様に、肝細胞は、約５００〜１０，０００μｍ２の面積を有し得る。
【０１６４】
用語「スポット間寸法」とは、アレイのスポットの間の距離をいう。本発明の一実施形態において、スポット間寸法は、隣接するスポットを区別するのに十分であり、そしてアレイに特異的に結合した生物学的基材である。例えば、パターン化された界面バイオマテリアルが、細胞アレイを調製するために使用される場合、スポット間寸法は、隣接するスポットにおける細胞の間の接触を防止するのに十分である。スポット間寸法はまた、アレイに結合した基材の相互作用を可能にしつつ、隣接するスポットを区別するように決定され得る。
【０１６５】
従って、スポットは、単一の細胞の結合のための寸法にされ得る。さらに、平坦化された細胞の寸法よりも実質的に小さいスポットが、接着細胞を丸い形態に維持するために使用され得る。細胞の性質（例えば、生存率、成長、増殖、分化、タンパク質プロセシング、配向、拡散）に影響を与えるために細胞−細胞接触が所望される場合、１つよりも多くの細胞に接着し得るスポットが使用され得る。
【０１６６】
用語「境界領域」は、１つ以上のスポットを除く領域を示すために、本明細書中で使用される。非生物学的基材の境界領域は、境界に吸着されたかまたは境界に結合された生物学的基材をさらに含み得るか、あるいは任意の他の処理が所望される。例えば、細胞は、細胞結合を促進するための血清を使用して、境界領域に接着され得る。
【０１６７】
異種のパターン化された界面バイオマテリアルは、サイトメトリーのような細胞操作のために有用である。例えば、サンプル中の異なる細胞型の数および比は、以下によって決定され得る：（ａ）結合剤を、非生物学的基材上の複数の位置の各々に塗布すること；（ｂ）細胞懸濁液と非生物学的基材を接触すること；および（ｃ）この非生物学的基材に結合した細胞の数を決定すること。サンプルは、任意の細胞サンプル（例えば、血液、尿、脳脊髄液、パパニコラウスミア、生検、土、水、および１つ以上の細胞型の存在、数または相対度数を決定することが所望される任意の他の塗布）を含み得る。自動化検出装置が、スポット位置における細胞を検出するように設計されたプログラムを使用して、結合した細胞の数を決定するために使用され得る。細胞の存在または非存在は、分光光度法、細胞標識（例えば、蛍光標識）の検出または顕微鏡分析を使用して検出され得る。
【０１６８】
本明細書中に開示されるようにして調製された細胞アレイはまた、マイクロインジェクション実験のための細胞を固定化するために有用である。
【０１６９】
より一般的には、本発明の生物学的アレイは、試験基材の存在下で、複数の生物学的基材をスクリーニングするために有用である。相互作用している細胞を同定するための方法は、以下を含み得る：（ａ）複数の生物学的基材を含む生物学的アレイを調製する工程であって、ここで複数の生物学的基材の各々は、非生物学的基材上の複数の位置の１つに特異的に結合される、工程；（ｂ）この生物学的アレイと候補物質とを接触させる工程；（ｃ）この候補物質が生物学的アレイに結合するのに十分な時間放置する工程；および（ｄ）この生物学的基材の１つ以上と候補物質との間の相互作用をアッセイし、それにより相互作用している分子を同定する工程。
【０１７０】
例えば、試験基材をスクリーニングするために使用される生物学的アレイは、細胞アレイを含み得る。相互作用している分子は、生物学的結果（例えば、細胞形態の変化、試験物質の存在の変化）を観察することによって同定され得る。
【０１７１】
細胞アレイをスクリーニングする方法は、細胞アレイと検出試薬とを接触させる工程をさらに包含し得る。代表的な検出試薬としては、標識リガンドおよび標識核酸が挙げられるが、これらに限定されない。組換えＤＮＡ技術を使用してトランスフェクトされた細胞集団が調査されて、トランスフェクトされたＤＮＡを首尾良く発現する細胞のサブセットが決定され得る。
【０１７２】
（Ｖ．Ｃ．生物学的材料間の相互作用の増大）
本発明は、２つ以上の材料の間の相互作用を増大するための界面バイオマテリアルを提供する。これらの材料は、同じかまたは異なり得、そして生物学的または非生物学的であり得る。本発明は、複数の結合剤を含む界面バイオマテリアルを提供し、ここで、各結合剤は、生物学的基材に特異的に結合する第１および第２のリガンドを含み、そしてここで、複数の結合剤は、生物学的基材の間の界面を含む。一実施形態において、この第１および第２のリガンドは、同じ生物学的基材に結合する。別の実施形態において、この第１および第２のリガンドは、異なる生物学的基材に結合する。
【０１７３】
本発明はまた、生物学的材料の間の相互作用を増大するための界面バイオマテリアルを調製するための方法を提供する。生物学的材料の間の相互作用を増大するための界面バイオマテリアルを調製する方法は、以下を包含する：（ａ）第１の生物学的材料に、複数の結合剤を接着する工程であって、ここで複数の結合剤の各々が、第１の生物学的材料に特異的に結合する第１のリガンド、および第２の生物学的材料に特異的に結合する第２のリガンドを含む、工程；（ｂ）この第２の生物学的材料と、接着した結合剤を有する第１の生物学的材料とを接触させる工程；および（ｃ）第２の生物学的材料が複数の結合剤に結合するのに十分な時間放置する工程。
【０１７４】
（Ｖ．Ｃ．１．コーティングされた移植デバイス）
本発明は、インビボにおける改善された使用のために移植片をコーティングするための界面バイオマテリアルをさらに提供する。この界面バイオマテリアルは、移植デバイスの移植の前（インビトロまたはエキソビボ）または後（インビボ）で形成され得る。用語「コーティング」とは、基剤にコーティングを塗布することを示すために本明細書中で使用される場合、リガンドまたはリガンドを含む結合剤と基材とを接触させること、およびこの基材にリガンドまたは結合剤が結合するのに十分な時間放置することをいう。非生物学的基材をコーティングするための代表的な方法は、実施例１４に記載される。
【０１７５】
用語「移植片」とは、一般に、損傷した組織の機能を回復させるためにヒトまたは動物の身体に導入され得る非生物学的材料をいう。移植デバイスは、本明細書中に開示されるように、結合剤が特異的に結合し得る任意の生体適合性基材を使用して作製され得る。例示的な移植片としては、股関節部内蔵式人工臓器、人工関節、顎および顔の移植片、腱および靱帯の置換物、皮膚置換物、骨置換物および人工骨ネジ、血管プロテーゼ、心臓ペースメーカー、人工心臓弁、乳房移植片、陰茎インプラント、ステント、カテーテル、シャント、神経成長誘導装置、眼内レンズ、創傷包帯および組織シーラントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
一実施形態において、非生物学的移植片基材は、生体適合性であり、別の実施形態において、生分解性であり、そして細胞増殖および細胞輸送を可能にするために、大きな表面積  対  容量の比を有する。例えば、適切な非生物学的基材としては、合成ポリマーおよび／またはポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマーが挙げられ、これらは、高度に多孔性の分解性の骨格に処理され得る。例えば、Ｍｉｋｏｓら，１９９４；Ｈａｒｒｉｓら，１９９８を参照のこと。
【０１７７】
本発明の一実施形態において、界面バイオマテリアルは、非生物学的移植片への細胞接着を媒介する結合界面を生成し得る。本発明の方法に従って調製された移植デバイスは、細胞接着の量および速度を制御し、従って、インビボにおけるデバイスの組織組み込みの速度を制御する。増大した細胞接着および組織組み込みは、移植部位を細胞の保護層で封止することによって、感染を最小限にするように働く。この保護細胞層はまた、瘢痕を軽減し得る。
【０１７８】
従って、本発明によると、被験体にデバイスを移植するための方法（ここで、コーティングされた移植片は、細胞接着を促進する）は、以下を包含する：（ａ）複数の結合剤を移植片に塗布する工程であって、ここでこの複数の結合剤の各々は、移植片に特異的に結合する第１のリガンド、および移植部位の細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここでこの塗布は、カップリングを含まない、工程；（ｂ）被験体の移植部位に、この移植片を配置する工程；および（ｃ）この複数の結合剤に細胞が結合するのに十分な時間放置する工程。用語「結合するのに十分な時間」とは、宿主細胞が、移植片付近まで移動し得、そして結合剤を介してこの移植片に結合し得る時間をいう。
【０１７９】
例えば、シリコーン乳房移植片の組み込みを促進するための界面バイオマテリアルは、複数の結合剤を使用して調製され得、ここで各結合剤は、（ａ）シリコーン移植片に特異的に結合するリガンド；および（ｂ）脂肪細胞に特異的に結合するリガンド、を含む。複数の結合剤は、シリコーン乳房移植片上にコーティングされ、この移植片が次いで、宿主に移植される。脂肪細胞に特異的に結合するリガンドは、移植片への細胞接着を促進、そして移植片の首尾良い組み込みを促進する。
【０１８０】
別の例として、結合剤は、チタン移植片に特異的に結合するリガンド、および移植部位付近の細胞に特異的に結合するリガンドを含み得る。実施例１３を参照のこと。チタンに結合するために適切な代表的なペプチドリガンドは、配列番号２４〜３６として記載される。代表的な細胞結合ペプチドは、表１および配列番号７４〜９８に列挙される。
【０１８１】
本発明の別の実施形態において、縫合糸材料が、この縫合糸材料に特異的に結合する結合剤でコーティングされる。コーティングされた縫合糸は、創傷部位における結合剤の結合特異性に依存して、タンパク質または細胞を固定することによって、組織の回復および修復を促進し得る。従って、コーティングされた縫合糸は、機械的強度および創傷の閉鎖を提供し得る。
【０１８２】
容易に受容可能ではない創傷部位について、または縫合糸なしの処置が所望される場合、組織シーラントを含む界面バイオマテリアルが使用され得る。このような治療用「接着剤」は、簡単さ、投与および細胞回復の迅速性、ならびに安全性を含む利点を提供する。一実施形態において、組織封止のための界面バイオマテリアルは、組織回復（壊死細胞および／または異常な量の水分を含む組織の修復を含む）を促進するのに十分な接着力をさらに含む。一実施形態において、界面バイオマテリアルは、創傷部位における組織機能および構造的完全性を実質的に減じない。
【０１８３】
創傷治癒を促進するための界面バイオマテリアルを調製するための方法は、以下を包含する：（ａ）複数の結合剤を生分解性ポリマーに接着する工程であって、ここで複数の結合剤の各々は、生分解性ポリマーに特異的に結合する第１のリガンド、および細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含む、工程；（ｂ）このポリマーを創傷部位に移植する工程；および（ｃ）この複数の結合剤に細胞が結合するのに十分な時間放置する工程。
【０１８４】
組織シーラントを含む界面バイオマテリアルは、封鎖を必要とする任意の創傷（漏出間ブレブ（ｉｎｔｅｒｌｅａｋｉｎｇ  ｂｌｅｂ）；外科的介在（整形外科または再建外科を含む）によって切断された組織；気管支胸腔瘻、消化性潰瘍；鼓膜穿孔；角膜穿孔；角膜移植；網膜孔；裂傷または破裂した腱；および整形的および再建的修復に供せられた組織を含むがこれらに限定されない）の修復を促進するために有用である。
【０１８５】
本発明のさらなる実施形態は、高度に配向された細胞構造（例えば、器官、皮膚、または筋肉）のための移植可能なテンプレートとしての界面バイオマテリアルの使用である。界面バイオマテリアルは、テンプレート材料および細胞またはタンパク質に特異的に結合する結合剤を使用して作製される。標的細胞またはタンパク質は、界面バイオマテリアルによってテンプレートに組み立てられ、次いで、さらなる細胞またはマトリクスを補充して、増殖し、または分化して、多細胞器官または組織を作製する。界面バイオマテリアルは、本明細書中において上記のようにインビトロまたはエキソビボで形成され得る。あるいは、界面バイオマテリアルは、複数の結合剤でコーティングされた非生物学的基材の移植によってインビボで形成され得る。
【０１８６】
本発明の別の実施形態において、移植片コーティングは、非結合界面を作製するために使用され得る。非結合移植片コーティングを調製するための方法は、以下の工程を包含する：（ａ）移植片に複数の結合剤を塗布する工程であって、ここで、この複数の結合剤の各々が、移植片に特異的に結合するリガンドおよび移植片部位における細胞に実質的に結合を示さない非結合ドメインを含み、この塗布する工程が、カップリングがない、工程；ならびに（ｂ）移植片を被験体の移植部位に配置する工程。
【０１８７】
本発明の非結合界面は、外科的癒着を妨げるかまたは最小化するために有用である。臨床的に有意な癒着が、約５％〜約１０％の外科的手順において、いくらかに手順についてほぼ１００％までで生じる。外科的癒着は、閉塞、不妊、疼痛、および第２の手術的手順の必要性を含む合併症を生じ得る。ｄｉ  Ｚｅｒｅｇａ  １９９３；Ｓｔａｎｇｅｌら、１９８４を参照のこと。
【０１８８】
非結合界面は、損傷した組織間の界面バイオマテリアルの配置により、損傷組織間の癒着の形成を妨げるために使用され得る。例えば、２つの表面を含むバリア基材は、健常な細胞のファウリングおよび損傷した細胞の非ファウリングを差示的に媒介し得る。バリアの第１表面は、複数の結合剤でコーティングされ、各々の結合剤が、非生物学バリア基材に特異的に結合するリガンドおよび実質的に細胞結合を示さない非結合ドメインを含む。バリア基材の第２表面は、複数の結合剤で必要に応じてコーティングされ、各々の結合剤が、非生物学バリア基材に特異的に結合するリガンドおよび創傷部位の細胞に特異的に結合するリガンドを含む。コーティングされるバリアは、被験体の損傷の部位に配置される。１つの実施形態において、非生物学的バリア基材は、生分解性基材（例えば、生分解性ポリマー）を含み、その結果、最小の瘢痕または癒着形成を伴って治癒が生じる。
【０１８９】
手術後の癒着の予防のためのアプローチは、線形合成ポリマーおよび天然ポリマーの投与を含んだ（米国特許大６，０６０，５８２号；（Ｄｉａｍｏｎｄ  ＆  Ｄｅｃｈｅｒｎｅｙ；Ｌｉｎｓｋｙら、１９８７；Ｌｅａｃｈ  ＆  Ｈｅｎｒｙ，１９９０；Ｓｔｅｉｎｌｅｉｔｎｅｒら、１９９１）。本明細書中に開示される手術後癒着を妨げるかまたは最小化するための方法と対照的に、これらのアプローチは、複数の結合剤（ここで、複数の結合剤の各々が、非生物学的基材に特異的に結合するリガンドおよび生物学的基材に実質的に結合を示さない非結合ドメインを含む）を含む界面バイオマテリアルを使用しない。
【０１９０】
非結合界面バイオマテリアルはまた、生物学的潤滑剤として機能し得る。効果的な境界潤滑剤は、多くの移植状況について重要であり、ここで、過剰な摩耗が、合成移植片と宿主との間で生じる。従って、潤滑剤のための界面バイオマテリアルは、複数の結合剤を使用して調製され得、ここで、複数の結合剤の各々は、（ａ）移植片に特異的に結合するリガンド；および（ｂ）移植部位において宿主細胞に対して実質的に結合を示さない非結合ドメインを含む。
【０１９１】
本発明の別の実施形態において、境界潤滑剤を含む界面バイオマテリアルは、複数の結合剤を使用して調製され得、ここで、この複数の結合剤の各々は、（ａ）第１の生物学的基材に特異的に結合するリガンド；および（ｂ）第２の生物学的基材に実質的に結合を示さない非結合ドメインを含む。例えば、境界潤滑剤を作製するために使用される複数の結合剤の各々は、（ａ）関節軟骨に特異的に結合するリガンド；および（ｂ）滑液に存在する生物学的基材に実質的結合を示さない非結合ドメインを含む。このように調製された界面バイオマテリアルは、例えば、関節軟骨を保護し、そして滑液の粘弾性特性を保存することによって、変性関節疾患を管理するために使用され得る。
【０１９２】
本発明のなお別の実施形態において、移植片コーティングを含む界面バイオマテリアルは、異種界面を含み得、この界面の領域は、異なる結合特異性を示し、そして異なるインビボプロセスを媒介する。例えば、移植片コーティングは、バリア基材について本明細書中に上記されるように、結合界面および非結合界面の両方を含む。１つの実施形態において、異種界面は、結合剤を非生物学的基材に空間的に制限された様式で接着させることによってパターン化される。
【０１９３】
（Ｖ．Ｄ．移植のためのコーティング組成物）
本発明は、さらに、移植片の改善された生存力を誘発するために、ドナー移植片細胞または組織をコーティングするための方法を提供する。合成ポリマー膜は、移植のために細胞をカプセル化するために使用され得る。糖尿病の処置のために、ランゲルハンス細胞の島は、合成マイクロカプセルに移植されて、宿主細胞における移植後の免疫応答を最小化し得る（Ｍａｒｉｋら、１９９９）。このアプローチの欠点としては、おそらく、血管再生の欠如の乏しい組み込みの結果として、カプセル化された島細胞の制限された生存力が挙げられる。
【０１９４】
カプセル化された細胞または組織の首尾良い移植を促進するために、複数の結合剤を含む界面バイオマテリアルが、調製され得、ここで、この複数の結合剤の各々が、（ａ）非生物学的マイクロカプセルに特異的に結合する第１のリガンド；および（ｂ）移植部位において宿主細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含む。移植に続いて、第２のリガンドは、移植部位におけるカプセル化ドナー細胞および宿主細胞の細胞一体化を媒介する。
【０１９５】
（Ｖ．Ｅ．診断および薬物送達）
本発明は、さらに、治療界面または診断階面を含む界面バイオマテリアルを調製するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）複数の結合剤を非生物学的基材にファウリングさせる工程であって、ここで、この複数の結合剤の各々が、薬物、検出可能な標識、または薬物キャリアに特異的に結合する第１のリガンド、および標的細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含む、工程；（ｂ）非生物学的基材を被験体に投与する工程；および（ｃ）複数の結合剤への標的細胞の結合に十分な時間を可能にし、それによって、界面バイオマテリアルを形成する工程。
【０１９６】
標的細胞に特異的に結合し、そして本明細書中に開示される結合剤を調製するために使用され得る代表的なリガンドは、米国特許第６，０６８，８２９号および同第６，１８０，０８４号；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ９８／１０７９５およびＷＯ  ０１／０９６１１；Ａｒａｐら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０；Ｓｔａｂａら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：１３−１９；Ｗｉｃｋｈａｍら（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２：７５０−７５６に記載される。
【０１９７】
代表的な非生物学的薬物および薬物キャリアは、本明細書中の上記に記載される。本発明の１つの実施形態において、薬物は、検出可能な標識を含む。別の実施形態において、標識は、インビボで検出され得る。画像化剤（シンチグラフィー、磁気共鳴画像、超音波、および蛍光のための薬剤を含む）を含むさらなる非生物学的基材は、本明細書中において以下に記載される。
【０１９８】
シンチグラフィー画像化方法としては、ＳＰＥＣＴ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ＰＥＴ（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ガンマカメラ画像化、および直線走査が挙げられる。シンチグラフィー画像化のための標識を含む非生物学的基材は、１つの実施形態において、放射性核種標識を含み、別の実施形態において、１８フッ素、６４銅、６５銅、６７ガリウム、６８ガリウム、７７臭素、８０ｍ臭素、９５ルテニウム、９７ルテニウム、１０３ルテニウム、１０５ルテニウム、９９ｍテクネチウム、１０７水銀、２０３水銀、１２３ヨウ素、１２４ヨウ素、１２５ヨウ素、１２６ヨウ素、１３１ヨウ素、１３３ヨウ素、１１１インジウム、１１３インジウム（ｍｉｎｄｉｕｍ）、９９ｍレニウム、１０５レニウム、１０１レニウム、１８６レニウム、１８８レニウム、１２１ｍテルル、１２２ｍテルル、１２５ｍテルル、１６５ツリウム、１６７ツリウム、１６８ツリウム、およびこれらから誘導される窒化物または酸化物からなる群より選択される放射性核種標識を含む。
【０１９９】
磁気共鳴画像化に基づく技術は、独特の化学環境における水プロトンの相対的な緩和速度に基づいて、画像を作成する。本明細書中で使用される場合、用語「磁気共鳴画像化」とは、磁気供給源技術（従来の磁気共鳴画像化、磁化移動画像化（ＭＴＩ）、プロトン磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、拡散強調（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ）画像化（ＤＷＩ）および機能的ＭＲ画像化（ｆＭＲＩ）を含む）をいう。Ｒｏｖａｒｉｓら，２００１；Ｐｏｍｐｅｒ  ＆  Ｐｏｒｔ  ２０００；およびこれらに引用される参考文献を参照のこと。
【０２００】
磁気供給源画像化のための造影剤を含む非生物学的基材は、常磁性または超常磁性のイオン、酸化鉄粒子（Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒら，１９９２；Ｓｈｅｎら，１９９３）、および水溶性造影剤を含むがこれらに限定されない。常磁性イオンおよび超常磁性イオンは、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム、およびガドリニウムからなる群より選択され得る。１つの実施形態において、金属は、鉄であり、別の実施形態において、マンガンであり、そしてなお別の実施形態において、ガドリニウムである。
【０２０１】
超音波画像化は、標的組織の定量的情報および構造的情報を得るために使用され得る。インビボでマイクロバブルを提供するために含む非生物学的基材としては、ガス充填親油性バブルまたは脂質ベースのバブル（例えば、米国特許第６，２４５，３１８号；同第６，２３１，８３４号；同第６，２２１，０１８号；および同第５，０８８，４９９号）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ガスまたは液体は、被験体への送達において、マイクロバブル放出を容易にする多孔性無機粒子に捕捉され得る（米国特許第６，２５４，８５２号および同第５，１４７，６３１号）。
【０２０２】
非侵襲性画像化方法はまた、蛍光標識の検出を含み得る。蛍光標識を含む非生物学的基材は、カルボシアニンおよびアミノスチリル色素（特に、長鎖ジアルキルカルボシアニン（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｉｆ  Ａｍｅｒｉｃａから入手可能なＤｉｌ、ＤｉＯ、およびＤｉＤ）、およびジアルキルアミノスチリル色素を含むが、これらに限定されない。蛍光標識としてはまた、スルホン化シアニン色素（Ｃｙ５．５およびＣｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｏｆ  Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａから入手可能）を含む）、ＩＲＤ４１およびＩＲＤ７００（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）、ＮＩＲ−１（Ｄｅｊｉｎｄｏ  ｏｆ  Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎから入手可能）、ならびにＬａＪｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ（Ｄｉａｔｒｏｎ  ｏｆ  Ｍｉａｍｉ，Ｆｌｏｒｉｄａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａから入手可能）が挙げられる。さらに、蛍光標識としては、ランタノイドイオン（例えば、テルビウムおよびユーロピウムの蛍光キレート）から誘導される有機キレートが挙げられ得る（米国特許第５，９２８，６２７号）。
【０２０３】
（Ｖ．Ｆ．診断、アフィニティークロマトグラフィー、および濾過塗布）
本発明は、リガンドの検出および決定ならびにリガンドの単離のための界面バイオマテリアルを使用するための組成物および方法を提供する。この界面バイオマテリアルは、非生物学的基材と生物学的基材との間の相互作用を媒介する。より詳細には、本発明は、各々の基材の特異的な結合を介して基材間で結合界面を作製する結合剤に関連する。本発明は、リガンドが液体媒体において決定される診断塗布において使用される方法を記載する。本発明はまた、液体媒体からのリガンドの単離のための方法を包含する。
【０２０４】
（Ｖ．Ｆ．１  診断塗布についての一般的な考慮）
本発明は、液体媒体においてリガンドを定性的にまたは定量的に決定するための均質および異種特異的結合型において使用されるアッセイ方法および試薬を提供する。液体媒体中のリガンドの量は、非競合的結合プロセス（例えば、「サンドイッチ（Ｓａｎｄｗｉｃｈ）」技術）を使用して決定され得る。一般的に、このアッセイは、特異的結合物質およびビオチン標識特異的結合物質を含む不溶／基材相の両方をに結合するために、少なくとも２つの反応性部位を必要とする。上記は、競合結合プロセスが使用される場合、必要ではない。
【０２０５】
大部分の以前のアッセイは、ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンとの相互作用に依存する（Ｈｉｌｌｅｒら、１９８７）。ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉによって産生される四量体タンパク質）は、水溶性ビタミンビオチンと非常に強力かつ特異的な非共有結合複合体を形成する。結合親和性は、リガンドとタンパク質との間の非共有相互作用について最も高いことが示され、解離定数（Ｋａ）は、１０１３Ｍ−１〜１０１５Ｍ−１の範囲であると推定される。結合親和性は、ストレプトアビジンとビオチンの結合が、大部分の生理学的条件下において基本的に非可逆であり、幅広い種々の臨床的および産業的塗布においてこれらの化合物の有用性の基礎を提供するような結合親和性である（Ｇｒｅｅｎ、１９７５）。
【０２０６】
ストレプトアビジンおよび相同なタンパク質アビジン（これは、ビオチンに対するその高い親和性を共有する）の両方は、それらが強いリガンド−タンパク質相互作用を示すので、調査されている。ストレプトアビジンおよびアビジンのＸ線結晶構造（両方とも、それらのアポおよびホロ形態にある）は、記載されている。両方の配列、ならびにいくつかのストレプトアビジン融合タンパク質の構成が記載されている。例えば、ＳａｎｏおよびＣａｎｔｏｒ、１９９１；米国特許第４，８３９，２９３号を参照のこと。
【０２０７】
今日、ストレプトアビジン／アビジンは、商業的目的について以下の４つの技術的分野において重要な役割を果たしている：１）生体分離／細胞選別；２）画像化；３）薬物送達；および４）診断（ＷｉｌｃｈｅｋおよびＢａｙｅｒ、１９９０）。分離分野において、これらのタンパク質は、細胞選別塗布において広範囲に使用されており、例えば、これらは、骨髄移植の前に、造血幹細胞から混入する細胞を取り除くために使用され得る（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら、１９９２）。ストレプトアビジンはまた、種々の腫瘍特異的バイオマーカーの存在について、試験するために研究設定および臨床設定の両方において広範囲に使用されている。
【０２０８】
アビジン／ビオチン系がアッセイにおいて使用され得る前に、ビオチンおよびアビジンの両方が、適切な機能を組み込むために、化学的に改変される必要がある。ビオチン標識試薬（例えば、ビオチン標識特異的結合物質またはビオチン標識リガンド）の調製は、標識される実体を、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＮＨＳ）とともに、適切な溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド）中で混合することによって達成され得る。ＢＮＨＳが商業的に使用されるが、他の適切な試薬および／または方法が使用され得る。
【０２０９】
決定されるべきリガンドに対する特異的な結合物質を含む基材または不溶相の調製は、公知の方法によって達成される。例えば、特定の結合物質は、架橋によってか、共有結合によってか、または物理学的カップリングによって固体キャリアに接着され得る。固体キャリアとしては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：ポリプロピレンチューブ、ポリスチレンマイクロタイタープレートおよびナイロンビーズ。検出されるべきリガンドが抗原である場合、その不溶性相の調製は、そのチューブまたはプレートを適切な抗体でコーティングすることによって達成され得る。この結合は、非特異的であり、そして、結果としてその抗体が以下の２つの役割を担う：基材結合およびビオチン結合。ナイロンビーズが使用される場合、その適切な抗体は、Ｆａｕｌｓｔｉｃｈの方法（Ｆａｕｌｓｔｉｃｈら，１９７４）によってそのビーズに共有結合され得る。
【０２１０】
種々の酵素が、酵素標識されたアビジン試薬またはストレプトアビジン試薬を生成するために使用され得る。アビジンまたはストレプトアビジンに結合体化される酵素は、その酵素を定性的または定量的な検出のいずれかを行うために使用され得るアッセイシステムの有効性に基づいて選択される。例えば、リンガンドの定性的決定において、その酵素が着色された生成物を生じるアッセイを使用して検出されることを可能にする試薬が、市販されている。
【０２１１】
本発明における用途に適切な酵素としては、国際生化学者連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）によって分類されるような酵素（例えば、酸化還元酵素、加水分解酵素、および脱離酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な酸化還元酵素としては、ＣＨＯＨ基、アルデヒド基、またはケト基、ＣＨＮＨ２基に作用する酸化還元酵素およびアクセプターとして過酸化水素に作用する酸化還元酵素が挙げられるがこれらに限定されない。１実施形態において、酸化還元酵素は、グルコースオキシダーゼである。別の実施形態において、酸化還元酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼである。例示的な加水分解酵素としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：エステル結合（有機エステルおよび無機エステルの両方）に作用する加水分解酵素、およびグリコシル化合物に作用する加水分解酵素、例えば、グリコシドヒドロラーゼが挙げられるがこれらに限定されない。１つ実施形態において、加水分解酵素は、アルカリホスファターゼである。別の実施形態において、加水分解酵素は、β−ガラクトシダーゼである。
【０２１２】
生物学的物質または非生物学的物質に対するＩＦＢＭの結合をモニタリングするための他の技術としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光法、ラマン分光法、および質量分析法。例えば、米国特許第６，４２９，０１５号および同第６，４２８，９５５号を参照のこと。
【０２１３】
「サンドイッチ」技術を使用してリガンド抗原を決定するための一般的な手順は、実施例２０に記載されており、そしてＰａｒｉｋｈらに対する米国特許第４，２９８，６８５号に基づく。簡潔には、適切に希釈された抗原標準物または未知サンプルは、抗体コーティングポリプロピレンチューブに添加され、次いで、これは、室温でインキュベートされて、標準物またはサンプル中に存在する抗原が結合することを可能にする。これらのチューブは、吸引され、洗浄され、そして、ビオチン標識化抗体が添加され、そして、一晩の間４℃にて結合を可能にする。次いで、これらのチューブは、再度、吸引および洗浄され、そしてＨＲＰ標識アビジンの適切な希釈物が添加される。これらのチューブは、室温にて５〜６０分間に亘ってインキュベートされ、吸引され、次いで、洗浄される。不溶相中の酵素活性が、設定した時間間隔で決定される。この反応生成物の着色強度が適切であると考えられる場合に、その酵素反応は終了され、そしてその吸光度が適切な波長にて測定される。アビジンはまた、ＨＲＰの代わりにアルカリホスファターゼで標識され得る。
【０２１４】
アルカリホスファターゼ標識アビジンが、ＨＲＰ標識化アビジンの代わりに使用される場合、その不溶相における酵素活性は、１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート含有する１ｍｌの０．０５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加することによって決定される。適切なインキュベート期間の後に、その反応は、１００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨで停止され、そして、４００ｎｍでの吸光度が測定される。
【０２１５】
マイクロタイタープレート中で実施される酵素免疫アッセイが、上述したものと本質的に同一の様式で実施される。この酵素アッセイは、２５０μｌの基材溶液のみを使用して実施され、そして５０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを用いて停止される。その着色強度が、定性的に推定されるか、または２５０μｌのマイクロキュベトにその溶液を移して分光光度計を読み取ることによって定量的に測定される。
【０２１６】
本発明に使用され得る他の免疫アッセイ系としては、米国特許第４，２８２，２８７号；同第４，２９８，６８５号；同第４，２９８，６８５号；同第４，２７９，９９２号；同第４，２５３，９９５号；同第４，２３０，７９７号；同第４，２８８，２３７号；および４，２０８，４７９号（これらの各々は、本明細書中で、その全体が援用される）に記載のアッセイ系が挙げられる。
【０２１７】
（Ｖ．Ｆ．２  アフィニティクロマトグラフィー用途に関する一般的な考察）
アフィニティクロマトグラフィー分離技術の原理は、周知である。本発明は、種またはリガンドに選択的に結合するための支持体に接着した界面バイオマテリアルの使用を記載する。代表的には、支持体とリガンドとの間の相互作用は、非特異的である。しかし、本発明は、特異的な相互作用を利用し、その特異的な相互作用の強度は、その特異的な相互作用の特異性を最適化することによって調整され得る。結果的に、他の種は、カラムの最初の部分から離れて反応混合物の流れによって保持され得、ここで、この固定化された種は、それによって、結合した種と遊離した種との固有の分離をもたらす。この技術は、Ｗａｇｎｅｒらに対する米国特許第４，２０５，０５８号（これらは、本明細書中で、その全体が参考として援用される）に記載される。
【０２１８】
本発明の開示に先立って、ペプチドコーティング表面およびペプチドコーティングデバイスの調整は、非特異的吸着によって、誘導体化表面へのそのペプチドのカップリングによって、またはその表面に共有結合したリンカー分子に対するそのペプチドの結合によって、達成された。これらの手順は、比較的単調でかつ時間がかかり、一般的に、そのペプチドおよびその基材の効率的な結合のために複数の工程を必要とし、しばしば固定化のための化学反応を必要とし、そして、再生可能な表面の範囲および最大限の活性の消失を達成する難度によって特徴付けられ得る。本発明は、診断クロマトグラフィーまたはアフィニティクロマトグラフィーの用途において使用され得る新規の多官能性表面バイオマテリアルで基材をコーティングして、それによって、具体的にあつらえられた強度の相互作用が存在する簡単な方法を表す。
【０２１９】
従って、非生物学的基材と生物学的基材との間の特異的相互作用を促進するための効率的で広範に塗布可能な方法を開発するための長期にわたる必要性が当該分野に存在する。さらに、分子および／または細胞のなかでの（特に、診断クロマトグラフィーおよび親和性クロマトグラフィーにおける）相互作用を指向する方法を開発するという継続的な必要性が存在する。
【０２２０】
これらの必要性を満たすために、本発明は、生物学的基材と非生物学的基材との間の選択的な相互作用を媒介し得る界面バイオマテリアル、標的非生物学的基材および標的生物学的基材に特異的に結合し得る新規の結合剤、ならびに診断クロマトグラフィー塗布およびアフィニティクロマトグラフィー塗布において同様のものをなすためそしてそれらを使用するための方法を提供する。
【０２２１】
（Ｖ．Ｇ.非ファウリングコーティング）
本発明の別の実施形態において、界面バイオマテリアルは、非ファウリング界面を含み、これは、１種の非結合界面の１種である。非ファウリングコーティングは、ファウリング物に対して感受性である任意の非生物学的基材のための保護処理として有用である。この非生物学的基材としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：医療装置、医療デバイス、衣類、および海洋用機械、および製造製品。
【０２２２】
本発明はまた、非接着性の界面をつくりだし、それによって、ファウリングおよび侵食を防ぐ界面バイオマテリアルを提供する。この「ファウリング（ｆｏｕｌｉｎｇ）」との用語は、汚染され、夾雑され、侵食され、また動きを妨げる（ｃｌｏｇｇ）プロセスをいう。逆に、「非ファウリング」との用語は、ファウリングを防ぎまたはそれを最小限にする性質をいう。したがって、非ファウリング界面バイオマテリアルは、病原体および他の生物体がその界面に結合することを低減させるために、そして、ファウリングによる美観的結果および操作の結果を低減するために使用され得る。
【０２２３】
現在の抗ファウリングコーティングは、消費される毒性の化学物質および環境を汚染する化学物質を含む。したがって、非毒性および持続性の保護コーティングで種々の基材を処理するための方法に対する必要性が当該分野に存在する。
【０２２４】
ファウリングは、以下の工程を包含する：（１）病原体による表面の接着および定着、（２）細胞外マトリクスの分泌および生体フィルムの形成；ならびに（３）他の病原体および／または多細胞生物のその生体フィルムへの接着。したがって、標的病原体と実質的に結合しないことを示す表面を含む界面バイオマテリアルは、ファウリングを効率的に低減し得る。
【０２２５】
非ファウリング界面バイオマテリアルは、複数の結合剤を使用して調製され、ここで、複数の結合剤の各々は、ファウリングに感受性である非生物学的基材に特異的に結合する第１リガンドおよびファウリングを媒介する標的生物に実質的に結合をしないことを示す第２のリガンドを含む。
【０２２６】
ファウリングに感受性であるが、本発明の界面バイオマテリアルを使用して保護され得る基材としては、水性環境に供される、医療デバイス、テキスタイル、および表面が挙げられるが、これらに限定されない。各々の場合において、ファウリングに対して感受性である非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドは、本明細書中で開示されるパニング法を使用して同定され得る。同様に、疑われる病原体または病原体の組み合わせに特異的に結合し得る第２のリガンドは、パニングによって同定され得る。
【０２２７】
本発明の界面バイオマテリアルはまた、移植可能なデバイスのための非ファウリングコーティングを含み得る。このようなコーティングは、例えば、化学療法、抗生物質、およびイオンチャネル型支持体、静脈栄養注入（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、診断試験のために、血液動態、静脈管のモニタリングなどに使用される中心カテーテルをコーティングするのに有用であり得る。院内感染の発生数は、中心カテーテルのような侵食性デバイスを有する患者において７倍高く（Ｄｏｂｂｉｎｓら、１９９９）、そしてカテーテル関連感染は、３５％もの致死率を有する（Ｃｏｌｌｉｎ、１９９９）。従って、カテーテルおよび他の移植可能デバイスのファウリング物を阻害するための信頼性の高い方法に対する必要性が存在する。
【０２２８】
カーテル関連感染としては、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓ．ａｕｒａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、真菌類（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ）、ならびに他の感染因子が挙げられる。宿主タンパク質（例えば、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ラミニン）ならびにカーテル表面の性質（例えば、電荷、疎水性）は、カテーテル表面に対する感染因子の接着に寄与し得る。
【０２２９】
したがって、界面バイオマテリアルは、複数の結合剤を含み得、ここで、複数の結合剤の各々は、カテーテル基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび１以上の感染因子に実質的に結合しないことを示す第２のリガンドを含む。したがって、そのように調製された界面材料は、カテーテルの細菌および／または真菌の定着を防ぎ、そして、それによって、カテーテル関連感染を低減し得る。
【０２３０】
非ファウリング界面バイオマテリアルはまた、天然起源または合成起源の織物、衣類、衣料用繊維にコーしティングするために使用され得る。例えば、長期の磨耗または細菌増殖を許す条件で使用され得ることが意図される衣類は、非ファウリング特性を有する界面バイオマテリアルによって保護される場合に長期間にわたって使用され得る。
【０２３１】
非ファウリング界面バイオマテリアルはまた、水性環境に供される表面をコーティングされるのに有用である。このような非ファウリングコーティングは、侵食速度および操作を損なう他の効果を最小化し得る。処理され得る代表的な表面としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
船体、ドリルプラットフォーム、ピリング、クーリングタワー、ポンドリテイナー、ポンプ、バルブオイルパイプ、導水管、ガラス、および他の透明な観測窓、ソナードーム、お濾過膜。例えば非ファウリングコーティングは、海洋環境において必要とされる、フジツボの接着を防ぐことに使用され得る。
【０２３２】
（Ｖ．Ｈ．生物学的基材の活性を調節する）
別の実施形態において、本発明は、生物学的基材の活性を調節する方法を提供し、この方法は以下を包含する：（ａ）複数離合因子で、生体分解性・非生物学的基材をコーティングする工程であって、ここで、複数の結合剤の各々は、生分解性の非生物学的基材に特異的結合する第１のリガンド、および生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで、このコーティングはカップリングを含まない工程；（ｂ）コーティングした生体分解性の非生物学的基材を標的部位におく工程であって、ここで、生物学的基材はその標的部位に存在する、工程；（ｃ）結合剤に対するその標的部位に御生物学的基材での生物学的基材の活性を調節する工程。
【０２３３】
本明細書中で使用される場合、「調節」、「調節する」、および「調節された」との用語は、全て、生物学的基材の任意または全ての化学的な活性および特性ならびに生物学的な活性および特性の増大、減少、または他の変更をいう。１つの実施形態において、生物学的基材は、組織、細胞、高分子またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。別の実施形態において、細胞は、血管内皮細胞である。別の実施形態において、細胞は、腫瘍、血管性内皮細胞である。１つの実施形態において、高分子は、Ｔｉｅ２レセプターである。
【０２３４】
本明細書中で使用される場合、「モジュレーター（調節因子）」との用語は、その生物学
的基枷ヒ特異的に結合する方法の第２のリガンドをいう。本発明の１つの実施形態におい
て、モジュレーターは、生物学的基材のアゴニストである。本明細書中で使用される場合、
「アゴニスト」との用語は、生物学的基材の生物学的活性を協同させるかまたは強化する
物質を意味する。本発明の別の実施形態において、モジュレーターは、生物学的基材のアンタゴニストである。本明細書中で使用される場合、「アンタゴニスト」または「インヒビター」との用語は、生物学的基材の生物学的活性をブロックするかまたは弱める物質をいう。１つの実施形態において、モジュレーターは、Ｔｉｅ２レセプターに特異的に結合する。
【０２３５】
本明細書で使用される場合、「標的部位」との用語は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボのいずれかでの細胞または細胞の群の任意のものをいう。この用語は、単一の細胞および細胞の集団を含み得る。この用語は、腺および器官（例えば、皮膚、肝臓、心臓、腎臓、脳、膵臓、肺、胃および生殖器官）を含む細胞集団を含むが、これらに限定されない。この用語はまた、混合された細胞集団（例えば、骨髄）を含むがこれらに限定されない。さらに、これは、固形腫瘍または転移腫瘍の個々のものであろうとそれらの一部分であろうと、新生物細胞または腫瘍細胞のような異常細胞を含むがこれらに限定されない。
【０２３６】
さらに本明細書中で使用される場合に標的部位との用語は、被験体への投与の後にリガンドが蓄積することが意図される部位をいう。１つの実施形態において、標的部位は創傷部位であり、この調節によって創傷治癒が増進される。別の実施形態において、標的部位は脈管新生部位（腫瘍の脈管新生部位を育むがこれらに限定されない）であり、そして、この調節によって、脈管新生が阻害される。
【実施例】
【０２３７】
以下の実施例は、本発明の方法を説明するために包含される。以下の実施例の特定の局面は、本発明の実施において十分に作用することが、本発明の共同発明者によって見出されるかまたは企図される、技術および手順に関して記載される。これらの実施例は、本発明の共同発明者の標準的な実験作業を説明する。本発明の開示および当該分野の一般的な技術レベルを鑑みて、当業者は、以下の実施例が単に例示を意図し、多くの変化、改変、および変更が本発明の範囲から逸脱することなく使用され得ることを理解する。
【０２３８】
（実施例１）
（ペプチドライブラリー）
以下の３つのファージペプチドライブラリーを使用した：（ａ）式Ｘ６ＹＸ６のペプチドをコードするライブラリー；（ｂ）式Ｘ６ＰＸ６のペプチドをコードするライブラリー、および（ｃ）式ＳＣＸ１６Ｓのペプチドをコードするライブラリー。
【０２３９】
Ｘ６ＹＸ６ライブラリーを、繊維状ファージＭ１３の遺伝子ｐＩＩＩの５’末端に連結された３９ヌクレオチドを含む可変配列を用いて構築した。このライブラリーによって精製されたペプチドは、各鎖上に、６つのランダムアミノ酸に隣接して中央に固定されたチロシン残基を有する１３マーのペプチド配列であった。
【０２４０】
Ｘ６ＹＸ６ライブラリーについての例示的ライブラリー構築スキームを以下に提供する。類似のストラテジーが他のライブラリー（これもまた、当該分野において周知の技術を用いて生成され得る）のために使用され得る。
【０２４１】
Ｘ６ＹＸ６ライブラリーを生成するために、配列
【０２４２】
【化２】
2005518442.tif 000006
（配列番号９９）のオリゴヌクレオチドを構築し、ここで、ＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＴＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫＮＮＫモジュール（配列番号１００）は、このライブラリーを示す。下線を付したＣＴＣＧＡＧおよびＴＣＴＡＧＡ配列は、ファージベクター中にライブラリーをクローニングするために使用したＸｈｏｌ制限エンドヌクレアーゼ部位およびＸｂａｌ制限エンドヌクレアーゼ部位を示す。太字のＴＡＴ配列は、チロシンコドンを示す。Ｎは、等モルのＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合を示す。Ｋは、等モルのＧおよびＴを示す。
【０２４３】
Ｘ６ＰＸ６ライブラリーを、繊維状ファージＭ１３を使用して構築した。ライブラリーによって生成したペプチドは、各側に、６つのランダムアミノ酸が隣接した中央に固定されたプロリン残基を有する１３マーのペプチド配列であった。
【０２４４】
ＳＣＸ１６Ｓライブラリーは、１９マーペプチドをコードする。このライブラリーでは、各ペプチドは、中央に１６個のランダムアミノ酸、各末端に１つのセリン、そして１つのシステイン残基を含む。これらのペプチドは、Ｍ１３ファージのＰＩＩＩコートタンパク質のアミノ末端上に提示された。
【０２４５】
（実施例２）
（ポリスチレンに特異的に結合するペプチドの単離）
Ｘ６ＰＸ６ライブラリー、Ｘ６ＹＸ６ライブラリーおよびＳＣＸ１６Ｓライブラリー（実施例１に記載される）を、９６ウェル高結合マイクロタイタープレート（ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）ポリスチレンプレート、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｏｆ  Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａから入手可能）を用いてポリスチレンへの結合についてスクリーニングした。非特異的タンパク質結合部位を、リン酸緩衝化生理食塩水＋ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＰＢＳ−Ｔ）中の５％粉乳（１００μｌ）を用いてブロックした。このプレートをシールし、そして５０ｒｐｍで振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、これらのウェルをＰＢＳ−Ｔ（３００μｌ）で５回洗浄し、これらのウェルを乾燥させないようにした。このライブラリーをＰＢＳ−Ｔ中で希釈し、そして全容量１００μｌ中、１０１０ｐｆｕ／ｍｌの濃度で添加した。室温で、５０ｒｐｍで振盪しながらさらに１時間インキュベートした後、結合していないファージをＰＢＳ−Ｔ（３００μｌ）での５回の洗浄によって除去した。結合したファージを、３μｌ／μｌのトロンビンを用いて、１５０ｒｐｍにて３０分間溶出した。溶出後、１．５μｌ  ｍＭ  Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）を添加し、そして連続希釈を力価測定のために作製した。
【０２４６】
最も高い力価のファージストックの生成を確実にするために、溶出したファージを、２×  ＹＴ培地中の、希釈していない対数期のＴＧ１培養物（５ｍｌ）に添加した。この混合物を、２１０ｒｐｍで３７℃のシェイカー中で約３時間にわたってインキュベートした。次いで、ファージの上清を、８５００×ｇで１０分間の遠心分離後に、力価測定のために回収した。選択の２ラウンド目および３ラウンド目を、インプットとして、以前のラウンドから増幅したファージをもちいて、第１ラウンドと同じ様式で実施した。
【０２４７】
チタンに特異的に結合するファージを検出するために、伝統的なＥＬＩＳＡを、ＨＲＰに結合体化した抗Ｍ１３ファージ抗体を用いて、次に１０％過酸化水素中の発色剤ｏ−フェニレンジアミンを添加して実施した。ファージの相対的な結合強度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、４９０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。
【０２４８】
ポリスチレンに特異的に結合したペプチドをコードするＤＮＡを、ｐＩＩＩ配列に従って設計された逆プライマーを用いる鎖ターミネーター法（ｃｈａｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｍｅｔｈｏｄ）によって配列決定した。ペプチド挿入物をコードする配列をファージゲノムに配置して翻訳し、ファージ表面に提示される対応アミノ酸配列を得た。
【０２４９】
ポリスチレンに特異的に結合する代表的なペプチドを表３に列挙し、そして配列番号１〜２２として示す。
【０２５０】
【表３】
2005518442.tif 000007
（実施例３）
（ポリウレタンに特異的に結合するペプチドの単離）
ＳＣＸ１６Ｓライブラリー（実施例１に記載される）を、ポリウレタンへの結合についてスクリーニングした。ファージを、実施例２に記載されるように、検出、単離、増幅および配列決定した。
【０２５１】
ポリウレタンに特異的に結合する代表的なペプチドは、ＳＣＹＶＮＧＨＮＳＶＷＶＶＶＦＷＧＶＳ（配列番号２３）である。
【０２５２】
（実施例４）
（ポリグリコール酸（ＰＧＡ）に特異的に結合するペプチドの単離）
ＳＣＸ１６Ｓライブラリー（実施例１に記載される）を、ポリグリコール酸への結合についてスクリーニングした。ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュを、過剰な水中でパニングする前に繰り返し洗浄した。
【０２５３】
ＰＧＡ足場にファージを添加する前に、集団からポリスチレン結合ファージおよび非特異的結合ファージを抽出するために、ファージをポリスチレンウェル標的間に連続して移した。この工程を、パニングの各ラウンドで実施した。非特異的結合部位をまた、パニングの奇数のラウンド間に、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで、そしてパニングの偶数のラウンド間に、ＰＢＳ−Ｔ中の５％粉乳でブロッキングした。ＢＳＡブロッキングタンパク質と粉乳ブロッキングタンパク質との交換は、各ラウンド間でＢＳＡおよび粉乳に特異的に結合するペプチドの生存を防いだ。ファージを、実施例２に記載されるように、検出、単離、増幅および配列決定した。
【０２５４】
ポリグリコール酸に特異的に結合する代表的なペプチドを表４に列挙し、そして配列番号３７〜５０として示す。
【０２５５】
【表４】
2005518442.tif 000008
（実施例５）
（ポリカーボネートに結合するペプチドの単離）
Ｘ６ＮＸ６ライブラリー、ＳＣＸ１６Ｓライブラリー、およびＸ６ＰＸ６ライブラリー（実施例１に記載される）を、ポリカーボネートへの結合についてスクリーニングした。ポリカーボネートシートを、使用する前にエタノールおよび水で繰り返し洗浄した。
【０２５６】
ポリカーボネートシートにファージを添加する前に、集団からポリスチレン結合ファージおよび非特異的結合ファージを抽出するために、ファージをポリスチレンウェル標的間で連続して移した。この工程を、パニングの各ラウンドで実施した。非特異的結合部位をまた、パニングの奇数のラウンド間に、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで、そしてパニングの偶数のラウンド間に、ＰＢＳ−Ｔ中の５％粉乳でブロッキングした。ＢＳＡブロックングタンパク質と粉乳ブロッキングタンパク質との交換は、各ラウンド間でＢＳＡおよび粉乳に特異的に結合するペプチドの生存を防いだ。ファージを、実施例２に記載されるように、検出、単離、増幅および配列決定した。
【０２５７】
ポリカーボネートに特異的に結合する代表的なペプチドを表５に列挙し、そして配列番号６６〜７１として示す。
【０２５８】
【表５】
2005518442.tif 000009
（実施例６）
（ナイロン縫合糸に結合するペプチドの単離）
Ｘ６ＹＸ６ライブラリー（実施例１に記載される）を、ナイロン縫合糸への結合についてスクリーニングした。ナイロン縫合糸を、使用する前にエタノールおよび水で繰り返し洗浄した。
【０２５９】
ナイロン縫合糸にファージを添加する前に、集団からポリスチレン結合ファージおよび非特異的結合ファージを抽出するために、ファージをポリスチレンウェル標的間で連続して移した。この工程を、パニングの各ラウンドで実施した。非特異的結合部位をまた、パニングの奇数のラウンド間に、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで、そしてパニングの偶数のラウンド間に、ＰＢＳ−Ｔ中の５％粉乳でブロッキングした。ＢＳＡブロッキングタンパク質と粉乳ブロッキングタンパク質との交換は、各ラウンド間でＢＳＡおよび粉乳に特異的に結合するペプチドの生存を防いだ。ファージを、実施例２に記載されるように、検出、単離、増幅および配列決定した。代表的な配列（配列番号１０５〜１１６）は、以下の通りである：
ｓｓＭＡＳＭＴＧＧＱＹＭＧＨｓｒ
ｓｓＭＡＳＭＴＧＧＱＷＭＧＨｓｒ
ｓｓＳＣＦＹＱＮＶＩＳＳＳＦＡＧＮＰＷＥＣｓｒ
ｓｓＳＣＮＭＬＬＮＳＬＰＬＰＳＥＤＷＳＡＣｓｒ
ｓｓＳＣＰＦＴＨＳＬＡＬＮＴＤＲＡＳＰＧＣｓｒ
ｓｓＳＣＦＥＳＤＦＰＮＶＲＨＨＶＬＫＱＳＣｓｒ
ｓｓＳＣＶＦＤＳＫＨＦＳＰＴＨＳＰＨＤＶＣｓｒ
ｓｓＳＣＧＤＨＭＴＤＫＮＭＰＮＳＧＩＳＧＣｓｒ
ｓｓＭＡＳＭＴＧＧＱＷＭＧＨｓｒ
ｓｓＳＣＤＦＦＮＲＨＧＹＮＳＧＣＥＨＳＶＣｓｒ
ｓｓＳＣＧＤＨＭＴＤＫＮＭＰＮＳＧＩＳＧＣｓｒ
ｓｓＳＣＹＹＮＧＬＶＶＨＨＳＮＳＧＨＫＤＣｓｒ。
【０２６０】
（実施例７）
（チタンに特異的に結合するペプチドの単離）
ＳＣＸ１６Ｓライブラリー（実施例１に記載される）を、チタンビースへの結合についてスクリーニングした。直径約２５μｍの市販の純チタンビーズを、パニングする前に、過剰なヘキサンおよびエタノール中で繰り返し洗浄し、表面の有機物を全て除去した。２５個のチタンビースを、９６ウェルポリスチレンプレートウェル内に入れた。
【０２６１】
チタンビーズにファージを添加する前に、集団からプラスチック結合ファージおよび非特異的結合ファージを抽出するために、ファージをポリスチレンウェル標的間で連続して移した。この工程を、パニングの各ラウンドで実施した。非特異的結合部位をまた、パニングの奇数のラウンド間に、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、そしてパニングの偶数のラウンド間に、ＰＢＳ−Ｔ中の５％粉乳でブロッキングした。ＢＳＡブロッキングタンパク質と粉乳ブロッキングタンパク質との交換は、各ラウンド間でＢＳＡおよび粉乳に特異的に結合するペプチドの生存を防いだ。ファージを、実施例２に記載されるように、検出、単離、増幅および配列決定した。
【０２６２】
チタンに特異的に結合する代表的なペプチドを表６に列挙し、そして配列番号２４〜３６として示す。
【０２６３】
【表６】
2005518442.tif 000010
（実施例８）
（ステンレス鋼に結合するペプチドの単離）
Ｘ６ＨＸ６ライブラリー、ＳＣＸ１６Ｓライブラリー、Ｘ６ＹＸ６ライブラリー、Ｘ７ライブラリー、およびＸ６ＮＸ６ライブラリー（実施例１および表１に記載される）を、ステンレス鋼への結合についてスクリーニングした。ステンレス鋼ビーズを、使用する前に、エタノールおよび水で繰り返し洗浄した。
【０２６４】
ステンレス鋼ビーズにファージを添加する前に、集団からプラスチック結合ファージおよび非特異的結合ファージを抽出するために、ファージをポリスチレンウェル標的間に連続して移した。この工程を、パニングの各ラウンドで実施した。非特異的結合部位をまた、パニングの奇数のラウンド間に、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで、そしてパニングの偶数のラウンド間に、ＰＢＳ−Ｔ中の５％粉乳でブロッキングした。ＢＳＡブロッキングタンパク質と粉乳ブロッキングタンパク質との交換は、各ラウンド間でＢＳＡおよび粉乳に特異的に結合するペプチドの生存を防いだ。ファージを、実施例２に記載されるように、検出、単離、増幅および配列決定した。
【０２６５】
ステンレス鋼に特異的に結合する代表的なペプチドを表７に列挙し、そして配列番号５１〜６５として示す。
【０２６６】
【表７】
2005518442.tif 000011
（実施例９）
（軟骨細胞に特異的に結合するペプチドの単離）
ＳＣＸ１６Ｓライブラリー（実施例１に記載される）を、軟骨細胞への結合についてスクリーニングした。このライブラリーのペプチドは、式ＳＣＸ１６Ｓであり、これは、１６個の中央ランダムアミノ酸、末端に固定されたセリン、そして１つのシステイン残基を含む。これらのペプチドは、Ｍ１３ファージのｐＩＩＩコートタンパク質のアミノ末端上に提示される。
【０２６７】
ヒト軟骨細胞を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）から入手し、そして補充したＦ−１２培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）中で、ポリスチレン６ウェルプレートのうちの１つのウェルにおいてコンフルエントまで増殖させた。全細胞パニング手順は界面活性剤を含まなかった。このライブラリーを、細胞標的に添加する前に、２時間にわたってポリスチレンウェル中でファージをインキュベートすることによって、ポリスチレンを特異的に結合するファージまたは非特異的に結合するファージを予め取り除いた。各ラウンドにおいて、非特異的結合部位を、ＰＢＳ中５％粉乳を用いてブロッキングした。ファージを、実施例２に記載されるように、検出、単離、増幅および配列決定した。代表的なペプチドは、配列ＳＣＳＶＹＤＨＫＩＧＲＤＳＦＹＳＧＣＳ  （配列番号１０１）を有する。代表的なペプチドはまた、内皮細胞よりも、１０倍より高い軟骨細胞への優先性を有する。
【０２６８】
（実施例１０）
（コラーゲンに結合するペプチドの単離）
コラーゲンビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ製の、ウシＩ型およびＩＩＩ型コラーゲン）を、本発明者らが以前に記載したような様式でスクリーニングした。混合ライブラリー（Ｘ７、Ｘ６ＧＸ６、Ｘ６ＰＸ６、Ｘ６ＨＸ６、Ｘ６ＹＸ６、Ｘ６ＮＸ６、ＳＣＸ１６Ｓ、ＳＳＸ１６ＳおよびＸ６ＣＸ４ＣＸ６）を使用して、コラーゲンへの優先的結合を保有するペプチド構造的モチーフが存在するか否かを決定した。以前のように、コラーゲンサンプルを、ミルクまたはＢＳＡのいずれかで、ファージが添加される前に、各回にてブロッキングする。結合したファージを有するコラーゲンビーズを、洗浄し（５×）、次いで、引き続く感染および増幅のために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に添加する。ファージを細胞から単離して、新たなコラーゲンサンプルに添加し、そしてこの手順を繰り返す。
【０２６９】
ファージを、実施例２に記載されるように、検出し、単離し、増幅し、そして配列決定した。
【０２７０】
（実施例１１）
（標識ポリスチレン結合ペプチドの合成）
ペプチドフルオレセイン−ＦＬＳＦＶＦＰＡＳＡＷＧＧ（配列番号１）を、製造業者により提供される指示に従って、自動化ペプチド合成機を使用して合成した。樹脂からの切断後、ペプチドを洗浄し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、そして質量分析によって特徴付けた。このペプチドは、プラスチック結合ドメイン（ＦＬＳＦＶＦＰＡＳＡＷＧＧ；配列番号１）および蛍光プローブ（フルオレセイン）を有する。
【０２７１】
（実施例１２）
（ポリスチレン結合ペプチドおよび細胞結合ペプチドを含む結合剤の合成）
ペプチドＦＬＳＦＶＦＰＡＳＡＷＧＧＳＳＧＲＧＤ（配列番号７２）を、製造業者により提供される指示に従って、自動化ペプチド合成機を使用して合成した。樹脂からの切断後、ペプチドを洗浄し、ＨＰＬＣによって精製し、そして質量分析によって特徴付けた。このペプチドは、細胞結合ドメイン（ＲＧＤ；配列番号７５）およびプラスチック結合ドメイン（ＦＬＳＦＶＦＰＡＳＡＷＧＧ；配列番号１）を有する。
【０２７２】
（実施例１３）
（チタン結合ペプチドおよび細胞結合ペプチドを含む結合剤の合成）
ペプチドＳＣＳＤＣＬＫＳＶＤＦＩＰＳＳＬＡＳＳＲＧＤ（配列番号１０３）を、製造業者により提供される指示に従って、自動化ペプチド合成機を使用して合成した。樹脂からの切断後、ペプチドを洗浄し、ＨＰＬＣによって精製し、そして質量分析によって特徴付けた。このペプチドは、細胞結合ドメイン（ＲＧＤ；配列番号７５）およびチタン結合ドメイン（ＳＣＳＤＣＬＫＳＶＤＦＩＰＳＳＬＡＳＳ；配列番号２７）を有する。
【０２７３】
（実施例１４）
（ペプチドリガンドによる、ポリスチレンのコーティング）
一片のポリスチレンを、ポリスチレンに特異的に結合するペプチド（例えば、配列番号１〜２２のいずれか）を含む結合剤水溶液中に浸漬した。次いで、ポリスチレンを、多量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで乾燥させた。７０°から２８°への接触角の減少が観察され、これは、ペプチドリガンドが、ポリスチレン表面上にコーティングされたことを示す。
【０２７４】
ペプチドリガンドまたは結合剤を、非生物学的基材に塗布するためのさらなる方法は、リガンドまたは結合剤を含む溶液を、ブラッシングすることおよびスプレーすることを含む。非生物学的基材はまた、溶解可能な犠牲材料でコーティングされ、次いで、リガンドまたは結合剤でコーティングされ得、その後、犠牲材料が除去されて、パターンが得られる。犠牲材料を使用するための代表的な方法は、とりわけ、Ｃｌａｒｋら（２００１）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２３：７６７７−７６８２中に見出され得る。
【０２７５】
（実施例１５）
（ピン−ディップ技術を使用する、ポリスチレンへの結合剤の塗布）
ポリスチレンに特異的に結合するペプチド、またはポリスチレンに特異的に結合するペプチドを含む結合剤を、９０部のＰＢＳ（ｐＨ７．４）および１０部のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の溶液中に、２５ｍｇ／ｍｌの濃度まで希釈した。次いで、溶液を、ピンアレイヤー（ｐｉｎ  ａｒｒａｙｅｒ）（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して、１２ウェルの組織培養ポリスチレンプレートの別個のウェル上に２連でパターン形成した。１０×１０の島のアレイを、１００個のスポットを塗布することによって調製し、各スポットは、直径約４０μｍであり、垂直および水平に、５００μｍの間隔が空けられている。直線パターンを、水平に７０μｍおよび垂直に７５０μｍの間隔の空いた４００個のスポットのアレイを用いて塗布した。
【０２７６】
（実施例１６）
（細胞培養のための、界面バイオマテリアルの調製）
２５ｍｇ／ｍＬの溶液を、９０部のＰＢＳ（ｐＨ７．４）および１０部のＤＭＳＯの混合物中にペプチド配列ＲＧＤＦＬＳＦＶＦＰＡＳＡＷＧＧ（配列番号７２）を含む結合剤を使用して調製した。５０μｌの結合剤溶液を、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートの３つのウェルの各々に、１時間にわたって添加した。別の３つのウェルにおいて、５０μｌのコントロールペプチド２５ｍｇ／ｍＬフルオレセイン標識ＦＬＳＦＶＦＰＡＳＡＷＧＧ（配列番号１）を添加した。これらのウェルを、ＰＢＳで３回洗浄し、非特異的タンパク質結合部位を、滅菌濾過ＢＳＡ（ＰＢＳ中３％）で、２５ｒｐｍで振とうしながら、３０分間ブロッキングした。ネガティブコントロールとして、３つのさらなるウェルを、ＢＳＡ溶液でブロッキングし、これらのウェルは、ポリスチレン結合ペプチドも、ポリスチレン結合ペプチドを含む結合剤も含まなかった。ＰＢＳでの４回の洗浄後、補充ＥＢＭ培地中のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、各ウェルに播種した。細胞の接着および広がりを、１時間、２時間または一晩の培養後に、光学顕微鏡によってモニタリングした。配列番号７２を含む結合剤でコーティングしたウェルは、ポリスチレンに特異的に結合するが細胞結合ドメインを欠くペプチドでコーティングしたウェル、または非コーティング細胞と比較して、細胞接着の増加および細胞の広がりの増加を示した。
【０２７７】
（実施例１７）
（Ｔｉｅ２レセプターに対する単鎖抗体の単離）
ヒトＴｉｅ２の細胞外ドメインで免疫したマウスの脾臓由来のｍＲＮＡを調製した。マウスＢリンパ球において発現される重鎖可変領域および軽鎖可変領域に特異的なプライマー対を使用して、これらの抗体フラグメントを逆転写および増幅した。重鎖および軽鎖の遺伝子を、可撓性リンカーと連結して、単鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）抗体を形成した。これらの単鎖抗体を、ｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅファージミドベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｕｎｔｉｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）中にクローニングして、ファージ表面での融合タンパク質としての発現を可能にした。Ｔｉｅ２レセプターに結合するファージクローンについての選択を、精製されたＴｉｅ２レセプターの細胞外ドメイン（ＥｘＴｅｋ）を使用して実施した。繰り返される選択の間、プールされた選択されたファージクローンの、標的化ＥｘＴｅｋタンパク質への結合レベルは、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、各回の選択と共に増大し、そして第二回目までにプラトーに達するようであった。無関係のコントロールタンパク質およびブロッキング剤に対する、これらの選択されたファージクローンの結合は、繰り返される選択を通じて、無視可能でありつづける。
【０２７８】
個々のクローンを、ＤＮＡフィンガープリント分析によってクローンの不均一性の評価のために、第一回目および第二回目に選択されたプールから選別した。これらの研究は、優性種が、第二回目までに既に出現し始めていることを示した。従って、引き続く分析は、第一回目に選択されたプールから単離されたより不均一なクローンに限定された。
【０２７９】
第一回目に選択されたプール由来の個々のクローンを、Ｔｉｅ２およびコントロールに対する親和性について試験した。代表的なクローンは、精製されたＴｉｅ２レセプターの細胞外ドメイン（ＥｘＴｅｋ）に対する特異的結合を実証したが、精製された密接に関連するレセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメイン（ＥｘＦｍｓ）に対しては、特異的結合を実証しなかった。非結合クローン（１Ｃ８）を、ネガティブコントロールとして行った。
【０２８０】
これらのクローンをまた、細胞ＥＬＩＳＡによって、２３９細胞の表面上で発現されたＴｉｅ２を認識する能力について試験した。Ｔｉｅ２を発現するように安定にトランスフェクトされた２９３細胞に結合する多数のクローンが同定された。これらのクローンは、Ｔｉｅ２レセプターを欠く親２９３細胞には結合しなかった。
【０２８１】
可溶性単鎖抗体を、非サプレッサー株で発現させ、そして可溶性ｓｃＦｖ上のＣ末端Ｅ−ペプチドタグに対する抗体を使用して、ペリプラズム抽出物から精製した。この系は、詳細な分子分析のために十分高い量（１リットルの細菌のペリプラズム抽出物から、＞５００ｇ）で、純粋なｓｃＦｖを生成する。
【０２８２】
さらなる実験により、これらのｓｃＦｖのうちの１つである１Ｂ１が、アンギオポイエチン−１（Ａｎｇ１）媒介性のＴｉｅ２のリン酸化およびＴＮＦ誘導性アポトーシスのＡｎｇ１保護の両方を阻害するそれらの能力によって測定されるように、ＥＣ上のＴｉｅ２レセプターの活性化を阻害し得ることが実証された。このような抗体は、機能改変界面生体物質（ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）（ＩＦＢＭ）へと展開され得る。他のｓｃＦｖは、Ｔｉｅ２生理学に対して何の影響も示さず、これは、これらの抗体が、ＩＦＢＭ親和性モジュールとして有用であり得ることを示唆する。
【０２８３】
（実施例１８）
（ポリスチレンへのペプチドの接着）
結合の接着強度および様式は、ＩＦＢＭおよび基材の両方に依存的である。ＩＦＢＭと合成の生物学的基材との間の接着力を特徴づけおよび定量するために、約０．５ｎｍの位置解像度を有する容量性変位センサ（ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｓｅｎｓｏｒ）を備える、高精度の圧電駆動撓みステージ（ｐｉｅｚｏ  ｄｒｉｖｅｎ  ｆｌｅｘｕｒｅ  ｓｔａｇｅ）を用いる最新の力分光器（ｆｏｒｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用した。Ｘ６ＹＸ６ペプチドライブラリー由来のポリスチレン結合ペプチド（順方向でポリスチレン結合ドメインを含む、システインが末端にあるペプチド；ＣＧＳＳＬＶＧＬＨＳＹＷＳＳＰＦＦ；配列番号１１７）を使用した。次いで、このシステインが末端にあるペプチドを、このペプチドの溶液（１ｍｇ／ｍｌ）中で片持ち梁をインキュベートすることによって、金コーティングした原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）片持ち梁に連結した。引っ張り（ｐｕｌｌ−ｏｆｆ）力の測定を、３００ｎｍ／秒の速度で、ポリスチレン表面と改変片持ち梁先端とを繰り返し係合することによって、ＭｕｌｔｉＭｏｄｅ  ＡＦＭ  （Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ｎｏｗ  Ｖｅｅｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）で、ＰＢＳ緩衝溶液中で実施した。このペプチドについての平均接着力は、約３００ｐＮであった。
【０２８４】
（実施例１９）
（細胞非親和性（ｃｙｔｏｐｈｏｂｉｃ）コーティング）
ペプチド配列を同定した後、標準的なＮ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）プロトコルに従う自動化固相ペプチド合成を使用して、Ｃ末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）タグ（２５００分子量ＰＥＧ）を有するポリスチレン接着ペプチド（ＦＦＰＳＳＷＹＳＨＬＧＶＬ；配列番号１８）を生成した。ＰＥＧを、界面生体物質の細胞忌避セグメントとして選択した。なぜなら、ＰＥＧは、細胞の接着および広がりを阻害／防止することが周知であるからである。４ｃｍ２平方のポリスチレンサンプルを、汚損のない界面生体物質でコーティングした（ｐＨ＝７．４で、９０％／１０％  ＰＢＳ／ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ；一晩）。ＩＦＢＭコーティングしたポリスチレンを、過剰のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で引き続き洗浄した。対応する処理ポリスチレンおよび未処理ポリスチレンに対する接触角の測定により、界面生体物質がこの表面をコーティングしたことが確認された。
【０２８５】
多機能ペプチドまたは界面生体物質（ＩＦＢＭ）ＦＦＰＹＳＨＬＧＶＬＳＳＧ−ＰＥＧ（配列番号１０４）が、表面をコーティングし得、そして細胞接着を防止または低減することを実証するために、本発明者らは、成体ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）またはヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が、ＩＦＢＭコーティングしたポリスチレンに接着するか否かを決定した。第一に、ＦＦＰＹＳＨＬＧＶＬＳＳＧ−ＰＥＧ（配列番号１０４）の１．０  ｍｇ／ｍｌ溶液を、水で調製した。この溶液を、９６ウェルのポリスチレン培養プレートのウェルに添加し、そして一晩５０℃でインキュベートした。次いで、これらのウェルを、ＰＢＳで２回洗浄し、その後、いずれかの細胞型３００μｌを播種した。ヒト線維芽細胞および内皮細胞を、未処理のポリスチレン上（Ｎ＝３）およびペプチド（非ペグ化）コーティングポリスチレン（Ｎ＝３）にも播種した。３７℃で一晩インキュベートした後、ウェルを、過剰のＰＢＳで５回洗浄し、次いで、エタノール中に固定し、そして細胞計数および光学顕微鏡のために、エオシンＹで染色した。ＮＨＤＦ細胞およびＨＵＶＥＣ細胞の両方が、それらの丸い形態、広がりおよび未処理のコントロールプラスチックに対する接着を喪失する。より高い倍率で、顕著な膜ラッフリング（ｒｕｆｆｌｉｎｇ）が明らかである。処理されたポリスチレン上に播種されたＮＨＤＦまたはＨＵＶＥＣは、丸い形態を維持し、表面には密に接着しない。細胞計数研究は、接着が、ポリスチレンがＦＦＰＹＳＨＬＧＶＬＳＳＧ−ＰＥＧ（配列番号１０４）でコーティングされる場合に、実質的に低下し、細胞数が劇的に減少することを示す。
【０２８６】
（実施例２０）
（「サンドイッチ」技術を使用する、リガンド抗原の決定）
抗体コーティングしたポリプロピレンチューブ（１２ｍｍ×７５ｍｍ）を、０．５％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）を含む０．９％  ＮａＣｌで、使用前に３回洗浄する。各チューブに、２００μｌの適切に希釈した抗原標準または未知のサンプルを添加する。これらのチューブにキャップをし、そして室温で３時間インキュベートする。その後、これらのチューブを吸引し、そして前述のように、０．５％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）を含む０．９％  ＮａＣｌで３回洗浄する。２００μｌの適切に希釈されたビオチン標識化抗体を各チューブに添加し、そしてこれらのチューブを、４℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、これらのチューブを吸引し、そして０．５％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）溶液を含む０．９％  ＮａＣｌで３回洗浄する。洗浄後、２００μｌの適切な希釈のＨＲＰ標識化アビジンを各チューブに添加し、そしてこれらのチューブを、室温で５〜６０分間インキュベートし、吸引し、次いで、上記のように洗浄する。不溶相中の酵素活性を、５．４  ｍＭ  ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび０．０３％  Ｈ２Ｏ２を含む、０．０３３Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．６）１ｍｌを、時間間隔を空けて、各チューブに添加することによって決定する。色強度が適切であるとみなされた時点で（１５〜３０分）、この酵素反応を停止させ、そして吸光度を、適切な波長で測定する。
【０２８７】
アルカリホスファターゼ標識化アビジンを、ＨＲＰ標識化アビジンの環境において使用する場合、不溶相中の酵素活性を、１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェートおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む、０．０５Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．８）１ｍｌを添加することによって、決定する。適切なインキュベーション時間後、この反応を、１００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨで停止させ、そして４００ｎｍでの吸光度を測定する。
【０２８８】
マイクロタイタープレートで実施した酵素イムノアッセイを、本質的に上記と同じ様式で実施する。酵素アッセイを、２５０μｌの基材溶液を使用して実施し、そして５０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨで停止させる。色強度を、２５０μｌのマイクロキュベットを使用して、マイクロタイタープレートの各ウェルの内容物の分光学的分析によって、定性的に推定するか、または定量的に決定し得る。
【０２８９】
（参考文献）
以下に列挙される参考文献ならびに本明細書中に引用される全ての参考文献は、それらが、本明細書中で使用される方法論、技術および／または組成物についての背景を補充し、説明し、提供し、またはこれらを教示する程度まで、本明細書中で参考として援用される。
【０２９０】
【表８】
2005518442.tif 000012
2005518442.tif 000013
2005518442.tif 000014
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2005518442.tif 000020
2005518442.tif 000021
本発明の種々の詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変化され得ることが理解される。さらに、上記の記載は、例示の目的のためのみであり、特許請求の範囲によって規定される本発明を限定するためではない。
【配列表】
2005518442.tif 000022
2005518442.tif 000023
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2005518442.tif 000052
【手続補正書】
【提出日】平成16年6月14日(2004.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の結合剤を含む界面バイオマテリアルであって、ここで該結合剤の各々は、標的非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび標的生物学的基材を特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで該複数の結合剤は、該標的非生物学的基材と該標的生物学的基材との間の界面を規定する、界面バイオマテリアル。
【請求項２】
複数の結合剤を含む界面バイオマテリアルであって、ここで該結合剤の各々は、標的非生物学的基材に特異的に結合するリガンドおよび標的生物学的基材への結合を実質的に欠く非結合性ドメインを含む、界面バイオマテリアル。
【請求項３】
前記複数の結合剤が、複数の同一性結合剤または非同一性結合剤を含む、請求項１または２に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項４】
請求項３に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで前記複数の非同一性結合剤の各々は、請求項１に記載の第１の同一性リガンドまたは標的非生物学的基材を特異的に結合する請求項２に記載の同一性リガンドを含む、界面バイオマテリアル。
【請求項５】
前記複数の結合剤が、空間的なパターンをさらに含む、請求項１または２に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項６】
リンカーをさらに含む請求項１に記載のバイオマテリアルであって、ここで該リンカーは、前記第１のリガンドと前記第２のリガンドを連結するか；または請求項２に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで１つ以上の前記複数の結合剤が、該リガンドと前記非結合性ドメインを連結するリンカーを含む、界面バイオマテリアル。
【請求項７】
請求項１に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで前記第１のリガンドまたは第２のリガンドは、ペプチドもしくは単鎖抗体、または請求項２に記載の界面バイオマテリアルを含み、該リガンドは、ペプチドもしくは単鎖抗体を含むか、あるいは、前記ドメインは、ペプチドまたは単鎖抗体を含む、界面バイオマテリアル。
【請求項８】
請求項１に記載の界面バイオマテリアルであって、前記第１のリガンドが、以下：合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン物質、セラミックス物質、薬物、薬物キャリアおよびそれらの混合物から選択される標的非生物学的基材に特異的に結合するか；または請求項２に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで前記リガンドが、以下：合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン物質、セラミックス物質、薬物、薬物キャリアおよびそれらの混合物から選択される標的非生物学的基材に特異的に結合する、界面バイオマテリアル。
【請求項９】
前記合成ポリマーが、ポリグリコール酸またはナイロンを含む、請求項８に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１０】
請求項９に記載の界面バイオマテリアルであって、請求項１の第１のリガンドまたは請求項２のリガンドが、配列番号３７〜５０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、界面バイオマテリアル。
【請求項１１】
前記ナイロンが、ナイロン縫合糸を形成する、請求項１０記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１２】
請求項８に記載の界面バイオマテリアルであって、請求項１に記載の第１のリガンドまたは請求項２に記載のリガンドが、以下：ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタンおよびそれらの組み合せから選択されるプラスチックに特異的に結合する、界面バイオマテリアル。
【請求項１３】
請求項１２に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで：
請求項１に記載の第１のリガンドまたは請求項２に記載のリガンドが、配列番号１〜２２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、該リガンドは、ポリスチレンを含むプラスチックに特異的に結合するか；または
請求項１に記載の第１のリガンドまたは請求項２に記載のリガンドが、配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチドを含み、該リガンドは、ポリウレタンを含むプラスチックに特異的に結合するか；または
請求項１に記載の第１のリガンドまたは請求項２に記載のリガンドが、配列番号６６〜７１のうちのいずれかの１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、該リガンドは、ポリカーボネートを含むプラスチックに特異的に結合する、
界面バイオマテリアル。
【請求項１４】
請求項８に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで請求項１に記載の第１のリガンドまたは請求項２に記載のリガンドが、チタンまたはステンレス鋼を含む金属に特異的に結合する、界面バイオマテリアル。
【請求項１５】
請求項１４に記載の界面バイオマテリアルであって、請求項１に記載の第１のリガンドまたは請求項２に記載のリガンドが、以下：
チタンに特異的に結合する、請求項２４〜３６のいずれか１項に記載のアミノ酸配列；または
ステンレス鋼に特異的に結合する配列番号５１〜６５のいずれか１項に記載のアミノ酸配列、
を含むペプチドを含む、
界面バイオマテリアル。
【請求項１６】
請求項１に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで前記第２のリガンドは、標的生物学的基材に特異的に結合し、該標的生物学的基材は、以下：組織、細胞、高分子およびそれらの組み合せからなる群から選択される、界面バイオマテリアル。
【請求項１７】
前記標的生物学的基材がコラーゲンまたはＴｉｅ２レセプターを含む、請求項１６に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項１８】
複数の結合剤を含む請求項１に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで１つ以上の該複数の結合剤は、配列番号２７または配列番号２８のアミノ酸配列（リンカー）を含む、界面バイオマテリアル。
【請求項１９】
請求項２に記載の界面バイオマテリアルであって、ここで前記非結合性ドメインは、標的生物学的基材に対して結合を実質的に示さず、該標的生物学的基材は、以下：組織、細胞、高分子およびそれらの組み合せからなる群から選択される、
界面バイオマテリアル。
【請求項２０】
前記非結合性ドメインが、細胞非親和性剤を含む、請求項１９に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項２１】
前記細胞非親和性剤が、ポリエチレングリコールである、請求項２０に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項２２】
前記界面バイオマテリアルが、前記標的非生物学的基材のファウリングを阻害する、請求項２に記載の界面バイオマテリアル。
【請求項２３】
合成ペプチドであって、以下：ポリスチレン、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリグリコール酸、ナイロン、チタン、ステンレス鋼、コラーゲンまたはＴｉｅ２レセプターに特異的に結合する、２０未満のアミノ酸残基を含む、合成ペプチド。
【請求項２４】
請求項２３に記載の合成ペプチドであって、以下：
ポリスチレンに特異的に結合する、配列番号１〜２２のいずれか１つのアミノ酸配列；
ポリウレタンに特異的に結合する、配列番号２３のアミノ酸配列；
ポリカーボネートに特異的に結合する、配列番号６６〜７１のいずれか１つのアミノ酸配列；
ポリグリコール酸に特異的に結合する、配列番号３７〜５０のいずれか１つのアミノ酸配列；
チタンに特異的に結合する、配列番号２４〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列；または
ステンレス鋼に特異的に結合する、配列番号５１〜６５のいずれか１つのアミノ酸配列、
を含む、
合成ペプチド。
【請求項２５】
請求項１、２または７〜２２のいずれか１項に規定される結合剤を調製するための方法であって、該方法は、以下：
請求項１に規定される結合剤の場合：
（ａ）標的非生物学的基材に対して種々の分子のライブラリーをパニングする工程であって、これによって、標的非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドが同定される工程；および
（ｂ）第２のリガンドに該第１のリガンドを連結する工程であって、ここで該第２のリガンドが標的生物学的基材を特異的に結合し、ここで、該第２のリガンドが、標的生物学的基材に特異的に結合し、それによって、結合剤が調製される、工程；
または請求項２に規定される結合剤の場合：
（ａ）標的非生物学的基材に対して種々の分子のライブラリーをパニングする工程であって、これによって、標的非生物学的基材に特異的に結合するリガンドが同定される工程；および
（ｂ）該リガンドを非結合性ドメインに連結する工程であって、ここで該非結合性ドメインが標的生物学的基材に対する結合を実質的に示さず、これによって、結合剤が調製される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２６】
標的生物学的基材に対してリガンドをパニングし、それによって標的生物学的基材に特異的に結合するリガンドまたは非結合性ドメインを同定する工程をさらに包含する請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の方法によって生成された結合剤。
【請求項２８】
前記結合剤が、配列番号７２また７３のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の結合剤。
【請求項２９】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の界面バイオマテリアルを調製する方法であって、該方法は、以下：
請求項１に記載の界面バイオマテリアルの場合：
（ａ）非生物学的基材に、複数の結合剤を塗布する工程であって、ここで、該複数の結合剤の各々は、該非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび標的生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで該塗布する工程はカップリングを含まない、工程；
（ｂ）該非生物学的基材を該標的生物学的基材を含むサンプルと接触する工程であって、ここで該複数の結合剤は、該非生物学的基材に結合される、工程；および
（ｃ）該複数の結合剤に該標的生物学的基材を結合するのに十分な時間放置する工程であって、ここで界面バイオマテリアルが調製される工程；
または請求項２に記載の界面バイオマテリアルの場合：
（ａ）非生物学的基材に、複数の結合剤を塗布する工程であって、ここで、該複数の結合剤の各々は、該非生物学的基材に特異的に結合するリガンドおよび標的生物学的基材に対する結合を実質的に示さない非結合性ドメインを含み、ここで該塗布する工程は、カップリングを含まない、工程；および
（ｂ）該非生物学的基材を該標的生物学的基材を含むサンプルと接触する工程であって、ここで該複数の結合剤は、該非生物学的基材に結合され、これによって界面バイオマテリアルが調製される工程、
を包含する、
方法。
【請求項３０】
前記塗布する工程が、空間的に制限された様式で前記複数の結合剤を塗布する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記接触する工程が、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで接触する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法に従って調製された界面バイオマテリアル。
【請求項３３】
生物学的アレイを調製するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の位置を有する非生物学的基材を提供する、工程；
（ｂ）該複数の位置の各々に請求項１、７または９〜１７に規定される結合剤を塗布する工程であって、ここで該塗布する工程はカップリングを含まない、工程；
（ｃ）該非生物学的基材を標的生物学的基材を含むサンプルと接触させる工程であって、ここで複数の結合剤は、非生物学的基材に結合される、工程；および
（ｄ）該複数の結合剤に該標的生物学的基材を結合するために十分な時間放置する工程であって、これにより生物学的アレイが調製される、工程、
を包含する、
方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、前記非生物学的基材が、以下：合成ポリマー、プラスチック、金属、金属酸化物、非金属酸化物、シリコーン物質、セラミックス物質、薬物、薬物キャリアおよびそれらの組み合せからなる群から選択される、方法。
【請求項３５】
前記塗布する工程が、ディップペン印刷を包含する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数の結合剤が、請求項３または請求項４に規定される複数の同一性結合剤を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数の非同一性結合剤の各々が、非生物学的基材に特異的に結合する同一性リガンドを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数の結合剤の１つ以上が、配列番号７２または７３のアミノ鎖配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３３に記載の方法に従って調製された生物学的アレイ。
【請求項４０】
細胞培養のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の結合剤を非生物学的基材に塗布する工程であって、ここで該複数の結合剤の各々は、該非生物学的基材に特異的に結合する第１のリガンドおよび細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで、該塗布する工程は、カップリングを含まない、工程；
（ｂ）該非生物学的基材を細胞と接触させる工程であって、ここで該複数の結合剤は、該非生物学的基材に結合される、工程；
（ｃ）該複数の結合剤に該細胞を結合するために十分な時間放置する工程；および
（ｄ）該細胞を培養する工程、
を包含する、
方法。
【請求項４１】
被験体にデバイスを移植するシステムであって、該システムは、以下：
（ａ）複数の結合剤を移植片に塗布するための手段であって、ここで該複数の結合剤の各々は、該移植片に特異的に結合する第１のリガンドおよび移植部位で細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで該塗布する工程は、カップリングを含まない、手段；および
（ｂ）該移植部位で被験体中に該移植片を配置するための手段、
を含む、
システム。
【請求項４２】
生物学的基材の活性を調節するためのシステムであって、該システムは、以下：
（ａ）非生物学的基材を複数の結合剤でコーティングするための手段であって、ここで該複数の結合剤の各々は、生分解性で非生物学的な物質に特異的に結合する第１のリガンド、および該生物学的基材に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで該コーティングは、カップリングを含まない、手段；
（ｂ）標的部位に、コーティングされた該生分解性で非生物学的な基材を配置するための手段であって、ここで該生物学的基材は、標的部位に存在する、手段；および
（ｃ）該標的部位で該生物学的基材が該結合剤に結合するのに十分な時間放置するための手段であって、ここで該結合は、該生物学的基材の活性を調節する、手段、
を含む、
システム。
【請求項４３】
請求項４２に記載のシステムであって、前記生物学的基材が、以下：組織、細胞、高分子およびそれらの組み合せからなる群から選択される、システム。
【請求項４４】
前記細胞が、血管内皮細胞である、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
前記血管内皮細胞が、腫瘍血管内皮細胞である、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記高分子がＴｉｅ２レセプターである、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４７】
前記標的部位が損傷部位であり、そして前記調節が損傷治癒を増強するか、または該標的部位が、新脈管形成部位であり、そして該調節が新脈管形成を阻害する請求項４３に記載のシステム。
【請求項４８】
前記新脈管形成が、腫瘍新脈管形成である、請求項４７に記載のシステム。
【請求項４９】
前記第２のリガンドが、Ｔｉｅ２レセプターに特異的に結合する、請求項４２に記載のシステム。
【請求項５０】
潤滑性界面を作製するための組成物であって、該組成物は、第１の基材および複数の結合剤を含み、ここで該複数の結合剤の各々は以下：
（ａ）該第１の基材に特異的に結合するリガンド；および
（ｂ）第２の基材に対する結合を実質的に示さない非結合性ドメイン、
を含む、
組成物。
【請求項５１】
以下の工程を包含する方法に使用される請求項５０に記載の組成物であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の結合剤を移植片に塗布する工程であって、ここで、該複数の結合剤の各々は、該移植片に特異的に結合するリガンドおよび移植部位で細胞に対して結合を実質的に示さない非結合性ドメインを含み、ここで、該塗布する工程はカップリングを含まない、工程；および
（ｂ）該移植部位で被験体中に該移植片を配置する工程であって、これによって潤滑性界面が作製され、ここで前記第１の基材は、生物学的基材または非生物学的基材を含む、工程、
包含する、
組成物。
【請求項５２】
以下の工程を包含する方法に使用される請求項５０に記載の組成物であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の結合剤を被験体に投与する工程であって、ここで、該複数の結合剤の各々は、第１の生物学的基材に特異的に結合するリガンドおよび第２の生物学的基材に対する結合を実質的に示さない非結合性ドメインを含む、工程；および
（ｂ）該第１の生物学的基材に該複数の結合剤を結合するのに十分な時間放置する工程であって、これにより潤滑性界面が作製される、工程、
を包含する、
組成物。
【請求項５３】
非ファウリング剤を用いて非生物学的基材を調製するための方法であって、該方法は、複数の結合剤で非生物学的基材をコーティングする工程を包含し、ここで該複数の結合剤の各々は、以下：
（ａ）非生物学的基材に特異的に結合するリガンド；および
（ｂ）該ファウリング剤に対して結合を実質的に示さない非結合性ドメイン、
を含む、
方法。
【請求項５４】
被験体に薬物を投与するための組成物であって、該組成物は、以下：
非生物学的薬物または該薬物の非生物学的キャリア、複数の結合剤を含み、
ここで、該複数の結合剤の各々は、該薬物または該薬物キャリアに特異的に結合する第１のリガンドおよび標的細胞に特異的に結合する第２のリガンドを含み、ここで該組成物は、被験体に投与され、そして該標的細胞に該複数の結合剤を結合するのに十分な時間放置する、
組成物。
【請求項５５】
前記標的細胞が、その表面にＴｉｅ２レセプターを有する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記第２のリガンドが、前記細胞表面上のＴｉｅ２レセプターに結合する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
生物学的基材との相互作用のための候補基材をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
（ａ）複数の生物学的基材を含む生物学的アレイを調製する工程であって、ここで、該複数の生物学的基材の各々は、非生物学的基材上の複数の位置の１つに特異的に結合される、工程；
（ｂ）該生物学的アレイを候補基材と接触させる工程；
（ｃ）該生物学的アレイに該候補基材が結合するのに十分な時間放置する工程；および
（ｄ）１つ以上の該生物学的基材と該候補基材との間の相互作用をアッセイする工程であって、これにより相互作用分子が同定される、工程、
を包含する、
方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、前記相互作用分子は、前記生物学的基材または前記非生物学的基材のうちの１つ上の検出可能な標識によって、分光技術、酵素学的技術および電気化学的技術からなる群から選択される技術によって同定される、方法。
【請求項５９】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の界面バイオマテリアルを含む第１の容器を備えるキット。
【請求項６０】
界面バイオマテリアルを調製するためのキットであって、該キットは以下：
（ａ）非生物学的基材に特異的に結合するリガンドを含む第１の結合剤；および
（ｂ）生物学的基材に特異的に結合するリガンドを含む第２の結合剤、
を含む、
キット。
【請求項６１】
界面バイオマテリアルを調製するためのキットであって、該キットは以下：
（ａ）非生物学的基材に特異的に結合するリガンドを含む結合剤；および
（ｂ）非結合性ドメインであって、ここで、該非結合性ドメインは、標的生物学的基材に対する結合を実質的に示さない、非結合性ドメイン、
を含む、
キット。
【請求項６２】
前記結合剤と前記非結合性ドメインを連結するための試薬をさらに備える、請求項６０および請求項６１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６３】
非生物学的基材をさらに備える請求項５９〜６１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６４】
前記非生物学的基材が、生分解性または非生分解性である、請求項４２に記載のシステム。