(57)【要約】  本発明は、ヒト組織因子(TF)と免疫反応し、凝固因子VIIa(FVIIa)の結合を阻害する、単離された完全にヒトの抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する、単離されたヒト抗体。
【請求項２】
ヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害する、請求項１に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１〜２の何れか１項に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項４】
組換え抗体である、請求項１〜３の何れか１項に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項５】
前記抗体がFabフラグメントである、請求項１〜４の何れか１項に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項６】
前記抗体がF(ab)2フラグメントである、請求項１〜４の何れか１項に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項７】
前記抗体がF(ab’’)2フラグメントである、請求項１〜４の何れか１項に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項８】
前記抗体が単一鎖Fvフラグメントである、請求項１〜４の何れか１項に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項９】
前記抗体が、10-15〜10-8Ｍの範囲の、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する、請求項１〜８の何れか１項に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、10-15〜10-9Ｍの範囲の、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する、請求項１〜９の何れか１項に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項１１】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する、治療に効果的な量のヒト抗体を含む薬学的組成物。
【請求項１２】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する、治療に効果的な量のヒト抗体を含む薬学的組成物であって、前記抗体が請求項１〜１０の何れか１項に記載のものである薬学的組成物。
【請求項１３】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応するヒト抗体を含む組成物。
【請求項１４】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応するヒト抗体を含む組成物であって、前記抗体が請求項１〜１０の何れか１項に記載のものである組成物。
【請求項１５】
ヒトにおけるFVIIa/ＴＦ関連障害を治療する方法であって、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する治療に効果的な量のヒト抗体を、前記ヒトに投与することを含む方法。
【請求項１６】
ヒトにおけるFVIIa/ＴＦ関連障害を治療する方法であって、請求項１〜１０の何れか１項に記載の治療に効果的な量の抗体を前記ヒトに投与することを含む方法。
【請求項１７】
ヒト抗体を調製する方法であって、以下のａ）〜ｂ）を含む方法：
ａ）ヒトＴＦに対するヒト抗体を調製すること、
ｂ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、または
ＴＦを含むＴＦ ELISAアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択すること。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ヒトＴＦに対する前記ヒト抗体が、
ａ）ヒトＴＦを用いた哺乳類の免疫処置、
ｂ）免疫処置された哺乳類により産生される抗体の単離
を含む方法により産生される方法。
【請求項１９】
前記哺乳類がマウスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９の何れか１項に記載の方法であって、
ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択することを含む方法。
【請求項２１】
請求項１７〜２０の何れか１項に記載の方法であって、
FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択することを含む方法。
【請求項２２】
請求項１７〜２１の何れか１項に記載の方法であって、
FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択することを含む方法。
【請求項２３】
請求項１７〜２２の何れか１項に記載の方法であって、
FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択することを含む方法。
【請求項２４】
請求項１７〜２３の何れか１項に記載の方法であって、
ＴＦを含むＴＦ ELISAアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択することを含む方法。
【請求項２５】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体であって、以下のａ）〜ｂ）を含む方法により得られるヒト抗体：
ａ）ヒトＴＦに対するヒト抗体を調製すること、
ｂ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、または
ＴＦを含むＴＦ ELISAアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択すること。
【請求項２６】
ヒト抗体を調製する方法であって、以下のａ）〜ｊ）を含む方法：
ａ）ヒトＴＦでマウスを免疫処置すること、
ｂ）免疫処置されたマウスから抗体産生細胞を単離し、ヒト抗体を分泌する不死化細胞を調製すること、
ｃ）産生された抗体を含む不死化細胞由来の培地を単離すること、
ｄ）溶解状態でＴＦを含むＴＦ ELISA間接アッセイにおいて抗体を試験し、溶解状態でヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択すること、
ｅ）FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、
ｆ）FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｇ）FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｈ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｉ）工程ｄ〜ｈの後に、選択された抗体を産生する不死化細胞を選択し、適切な培地で培養すること、
ｊ）選択された不死化細胞の培地から、選択された抗体を単離すること。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
固定されたＴＦを含むＴＦ ELISA直接アッセイにおいて抗体を試験し、固定されたヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択することを更に含む方法。
【請求項２８】
請求項２６〜２７の何れか１項に記載の方法であって、
ＴＦ発現細胞上でFXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ発現細胞上でFXa生成を阻害するヒト抗体を選択することを更に含む方法。
【請求項２９】
請求項２６〜２８の何れか１項に記載の方法であって、
完全細胞ＴＦ結合アッセイにおいて抗体を試験し、完全細胞の細胞表面で発現されるヒトＴＦに結合するFVIIaと競合するヒト抗体を選択することを更に含む方法。
【請求項３０】
請求項２６〜２９の何れか１項に記載の方法であって、
バイオセンサーアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦへの結合に関するＫdが100 nMより低い、例えば10 nMより低い、好ましくは5 nMより低い、好ましくは1 nMより低い、より好ましくは0.5 nMより低いヒト抗体を選択することを更に含む方法。
【請求項３１】
請求項２６〜３０の何れか１項に記載の方法であって、
MAPKシグナリングアッセイにおいて抗体を試験し、MAPKシグナリングのFVIIa誘導活性化を阻害するヒト抗体を選択することを更に含む方法。
【請求項３２】
請求項２６〜３１の何れか１項に記載の方法であって、
エピトープマッピングアッセイにおいて抗体を試験し、ＴＦ上の好ましいエピトープと免疫反応するヒト抗体を選択することを更に含む方法。
【請求項３３】
前記好ましいエピトープが、Trp45、Lys46およびTyr94残基を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記不死化細胞が、ハイブリドーマ細胞である、請求項２６〜３３の何れか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体であって、以下のａ）〜ｊ）を含む方法により得られるヒト抗体：
ａ）ヒトＴＦでマウスを免疫処置すること、
ｂ）免疫処置されたマウスから抗体産生細胞を単離し、ヒト抗体を分泌する不死化細胞を調製すること、
ｃ）産生された抗体を含む不死化細胞由来の培地を単離すること、
ｄ）溶解状態でＴＦを含むＴＦ ELISA間接アッセイにおいて抗体を試験し、溶解状態でヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択すること、
ｅ）FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、
ｆ）FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｇ）FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｈ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｉ）工程ｄ〜ｈの後に、選択された抗体を産生する不死化細胞を選択し、適切な培地で培養すること、
ｊ）選択された不死化細胞の培地から、選択された抗体を単離すること。
【請求項３６】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体であって、請求項２６〜３４の何れか１項に記載の方法により得られるヒト抗体。
【請求項３７】
ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体を産生する細胞。
【請求項３８】
前記細胞が、単離されたリンパ系細胞である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
前記細胞が、マウスから単離されたものである、請求項３７〜３８の何れか１項に記載の細胞。
【請求項４０】
前記細胞が、ハイブリドーマ細胞である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４１】
前記ハイブリドーマ細胞が、抗体産生リンパ系細胞と不死化細胞とを融合し、抗体産生ハイブリドーマ細胞を提供することにより得られる、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
前記抗体が、ヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害する、請求項３７〜４１の何れか１項に記載の細胞。
【請求項４３】
前記抗体が、Trp45、Lys46およびTyr94残基をすべて含む３次元表面と免疫反応する、請求項３７〜４２の何れか１項に記載の細胞。
【請求項４４】
前記抗体が、Fabフラグメントである、請求項３７〜４３の何れか１項に記載の細胞。
【請求項４５】
前記抗体が、F(ab)2フラグメントである、請求項３７〜４４の何れか１項に記載の細胞。
【請求項４６】
前記抗体が、F(ab’’)2フラグメントである、請求項３７〜４４の何れか１項に記載の細胞。
【請求項４７】
前記抗体が、scFvフラグメントである、請求項３７〜４４の何れか１項に記載の細胞。
【請求項４８】
前記抗体が、10-15〜10-8 Ｍの、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する、請求項３７〜４７の何れか１項に記載の細胞。
【請求項４９】
前記抗体が、10-15〜10-10 Ｍの、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する、請求項３７〜４８の何れか１項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、組織因子（ＴＦ）と免疫反応し、凝固因子VIIa（FVIIa）の結合を阻害する単離された抗体に関するとともに、ＴＦに対するヒト抗体を用いて、手術、顕微手術、血管形成術、または外傷と関連する血栓形成を阻害したり、または深静脈血栓症、汎発性血管内凝固症候群（DIC）、冠状動脈疾患、敗血症、炎症、アテローム性動脈硬化症、または癌等の疾患と関連する異常性止血症状において血栓形成および他のＴＦの機能を阻害したりする免疫療法に関する。また、抗体を調製する方法、並びにヒトモノクローナル抗体を調製するための細胞系を開示する。
【発明の背景】
【０００２】
血液凝固は、最終的にフィブリンクロットを生じる、種々の血液成分または因子の複雑な相互作用から構成されるプロセスである。一般に、凝固「カスケード」と称されることに関与する血液成分は、プロ酵素または酵素原、活性化剤の作用によりタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質、活性化された凝固因子そのものである。このような変換を受け、一般に「活性な因子」と称される凝固因子は、小文字「a」の添え字の追加により表される（例えば第VIIa因子）。
【０００３】
活性化された第X因子（「Xa」）は、プロトロンビンをトロンビンに変換するのに必要とされ、トロンビンはその後、フィブリンクロットを形成する際の最終段階としてフィブリノゲンをフィブリンに変換する。第X因子の活性化を促進する二つのシステム、すなわち経路がある。「本質的な経路（intrinsic pathway）」は、血漿にのみ存在する因子の利用によりトロンビン形成に至る反応をいう。一連のプロテアーゼ介在性活性化が、最終的に第IXa因子を生成し、これが第VIIIa因子と結合して、第X因子を第Xa因子に分解する。血液凝固の「非本質的な経路（extrinsic pathway）」において、同一のタンパク分解が、FVIIaおよびその補因子TFにより行われる。TFは膜結合タンパク質であり、通常血漿中を活性型で循環しない。しかし、血管が破壊されると、TFはFVIIaと複合体を形成し、Ca2+およびリン脂質の存在下で第X因子の活性化または第IX因子の活性化を触媒する。止血における２つの凝固経路の相対的な重要度は不明であるが、第VII因子およびTFは、血液凝固の開始に中心的な役割を果たすことが見出されている。
【０００４】
患者において凝固カスケードを選択的にブロックすることがしばしば必要である。抗凝固剤、例えばヘパリン、クマリン、クマリン誘導体、インダンジオン（indandione）誘導体、または他の薬剤は、例えば腎臓透析の間、または深静脈血栓症、汎発性血管内凝固症候群（DIC）、および多数の他の内科的疾患を治療するために使用することができる。例えば、ヘパリン治療またはクエン酸イオンによる体外治療は、透析の処置の間に凝固を予防するために使用することができる。またヘパリンは、手術を受けている患者において深静脈血栓症を予防する際に使用される。
【０００５】
しかし、ヘパリンおよび他の抗凝固剤による治療は、望ましくない副作用を有することがある。利用可能な抗凝固剤は、一般に、損傷部位に特異的に作用するというよりむしろ体全体に作用する。例えばヘパリンは、大量の出血を引き起こし得る。更に、ヘパリンは、約80分という半減期で血液から急速に除去されるので、頻繁に投与することが必要である。ヘパリンは、アンチトロンビンIII（ATIII）の補因子として機能し、ATIIIは、DICの治療において急速に消費されるので、適切なヘパリン投与量を維持することはしばしば難しく、ATIIIおよびヘパリンレベルの連続的なモニタリングが必要である。また、ATIIIの欠乏がひどい場合、ヘパリンは効果がない。更に、ヘパリンの長期間の使用は、血小板の凝集を増大させ、血小板の数を減少させることがあり、ヘパリン誘導性血小板減少症の発症につながる。またインダンジオン誘導体は、毒性の副作用を有し得る。上述の抗凝固剤に加えて、幾つかの天然に存在するタンパク質が、抗凝固活性を有することが見出されている。また、ATIIIは、治療用の抗凝固剤として提案されている。
【０００６】
国際出願WO 92/15686は、血液凝固を阻害するための不活性化された第VIIa因子に関する。
【０００７】
抗体は、外来のタンパク質、糖タンパク質、細胞、または他の外来の抗原性物質による抗原投与に応答して脊椎動物の免疫系により産生される、特異的な免疫グロブリン（Ig）ポリペプチドである。外来の細胞による侵入に打ち勝ったり、外来の物質のシステムを除去したりすることを生物に許容する一連の事象について、少なくとも一部は理解されている。このプロセスの重要な部分は、特定の外来の物質に特異的に結合する抗体をつくることである。特定の抗原に対するかかるポリペプチドの結合特異性は、非常に精密であり、個々の脊椎動物により生成可能な特異性の高さは、その複雑性および変異性において顕著である。数百万の抗原が、抗体の反応を誘発することができ、各抗体は、各抗体を誘発した特定の抗原に対してほぼ独占的に誘導される。
【０００８】
脊椎動物の抗体の二つの主な供給源が、現在利用されており、哺乳類Ｂリンパ球によるin situ生成と、Ｂ細胞ハイブリッドによる細胞培養での生成である。抗体は、未成熟Ｂリンパ球の形質細胞への分化の結果、in situで生成され、これは、特定の抗原による刺激に応答して起こる。未分化なＢ細胞では、免疫グロブリン鎖における種々の領域をコードするＤＮＡの部分が、ゲノムＤＮＡにおいて分離されている。その配列は、発現に先立って順次集められる。得られた再編成遺伝子は、成熟Ｂリンパ球で発現し、所望の抗体を産生することができる。しかし、特定の哺乳類が単一の抗原のみに晒された場合であっても、均一な抗体の集団が得られない。任意の特定抗原に対するin situ免疫応答は、抗原上に存在する種々の決定基に対する応答の寄せ集め(mosaic)により規定される。同種の抗体の各サブセットは、単一集団のＢ細胞により提供されるため、抗体のin situ生成は「ポリクローナル」である。
【０００９】
このような限定的であるが固有の異質性は、ハイブリドーマ技術の利用により多くの特定のケースにおいて克服され、Ｂ細胞ハイブリドーマによる細胞培養において「モノクローナル」抗体が作成されている。
【００１０】
このプロセスにおいて、抗原を注入された哺乳類に由来する比較的短命または死ぬべき運命のリンパ球または脾臓細胞（splenocyte）を、不死化腫瘍細胞系統と融合させ、これにより、不死化され、かつＢ細胞の遺伝的にコードされた抗体を産生可能なハイブリッド細胞、すなわち「ハイブリドーマ」が作製される。このようにして作製されたハイブリッドは、選択、希釈、再増殖により単一の遺伝的株に分離され、これにより各株が、単一の遺伝的系統を表す。従って、これらは、所望の抗原に対して均質であることが保証された抗体を産生する。純粋な遺伝的血統を引き継ぐこれら抗体は、「モノクローナル」と称される。
【００１１】
単一の特異性を有するモノクローナル抗体は、免疫学に多大な影響を及ぼし、その有用性は、生物学、薬理学、生化学およびその他の科学で既に実証されている。かかるモノクローナル抗体は、診断の試薬としてだけでなく、治療においても広範な使用が見出されている（例えば、Ritz and Schlossman, Blood, 59: 1-11, (1982) 参照）。
【００１２】
ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、上述のとおり治療に効果的であり、その特異性のためにポリクローナル抗体より明らかに好ましいが、重大な欠点を有する。多くの適用において、非ヒト動物で産生されるモノクローナル抗体の使用は、そのモノクローナル抗体がヒトで使用される場合大きく制限される。ヒトに「外来の」抗体、例えばマウス抗体を繰り返し注入することは、有害な過敏性反応につながり得る。かかる非ヒト由来モノクローナル抗体は、ヒトに注入されると、抗ヒト抗体反応を引き起こす。
【００１３】
ＴＦに対するマウスMabの治療上の使用は、米国特許第6,001,978号および第5,223,427号より公知である。
国際出願WO 99/51743は、ヒトＴＦに対して誘導されたヒト/マウスキメラモノクローナル抗体に関する。
【００１４】
欧州特許出願第833911号は、ヒトＴＦに対するCDRグラフト抗体に関する。
Presta L. et al., Thrombosis and Haemostasis, Vol.85 (3) pp.379-389 (2001) は、ＴＦに対するヒト化抗体に関する。
【００１５】
比較的低投与量で投与することが可能で、かつ従来の抗凝固性組成物と関連した望ましくない副作用を生じない、抗凝固活性を有する改良組成物に対する需要は、当該技術分野でなお残っている。本発明は、非ヒト配列を備えた従来の抗体と関連した副作用を有していない抗凝固剤を提供することによりこの需要を満たし、この抗凝固剤は損傷部位に特異的に作用し、更に他の関連の利点を提供する。更に、本発明は、敗血症、炎症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、または癌等の症状に関係するＴＦの細胞機能を阻害するように作用する化合物を提供する。
【発明の説明】
【００１６】
本発明は、凝固因子VII/VIIaの結合を阻害する、ヒトＴＦに対する非免疫抗原性高親和性ヒト抗体に関し、並びに治療に効果的なヒトＴＦに対するヒト抗体を選択する方法に関する。
【００１７】
第一の側面において、本発明は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する、単離されたヒト抗体に関する。
【００１８】
本明細書で使用される「ヒト組織因子」または「ヒトＴＦ」の用語は、天然のヒト組織因子のアミノ酸配列1〜263を含む完全長のポリペプチドレセプターを指す。
【００１９】
本明細書で使用される「抗体」の用語は、抗原（例えばヒトＴＦ）に特異的に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子およびそのフラグメントを指すものである。完全長の抗体は、ジスルフィド結合により相互に連結された４つのポリペプチド鎖、二本の重(Ｈ)鎖および二本の軽(Ｌ)鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではHCVRまたはVHと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン、CH1、CH2およびCH3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではLCVRまたはVLと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン、CLから構成される。VHおよびVL領域は、相補性決定領域（CDR）と称される超可変領域に更に細分され、CDRには、フレームワーク領域（FR）と称される、より保存された領域が点在する。各VHおよびVLは、３つのCDRおよび４つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。よって、抗体の定義の範囲には、抗原（例えばヒトＴＦ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の一以上のフラグメントも含まれる。抗体の抗原結合機能は、完全長の抗体のフラグメントにより果たされ得ることが示されている。「抗体」の用語の範囲内に包含される結合フラグメントの例には、以下のものが含まれる：(i) Fabフラグメント、VL、VH、CLおよびCH Iドメインから成る一価のフラグメント；(ii) F(ab)2およびF(ab’’)2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより連結された２つのFabフラグメントを含む二価のフラグメント；(iii) VHおよびCH1ドメインから成るFdフラグメント；(iv) 抗体のシングルアームのVLおよびVHドメインから成るFvフラグメント；(v) VHドメインから成るdAbフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）；および(vi) 単離された相補性決定領域（CDR）。更に、Fvフラグメントの２つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によりコードされているが、これら２つのドメインは、VLおよびVH領域がペアになり（単一鎖Fv(scFv)として公知の）一価の分子を形成した単一タンパク質鎖を作成可能な合成リンカーにより、組換え方法を用いて連結することができる（例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl., Acad. Sci. USA 85: 5879-5883参照）。かかる単一鎖抗体も、「抗体」の用語の範囲内に包含されるものである。他の形態の単一鎖抗体、例えばジアボディ（diabody）も包含される。ジアボディは、VHおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、短すぎて同一鎖上で２つのドメインの間でペア形成を許容しないリンカーを用いて、これらドメインを別の鎖の相補性ドメインとペア形成させ２つの抗原結合部位を作成した二価の二重特異性（bispecific）抗体である（例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al., (1994) Structure 2: 1121-1123）。ヒトＴＦは、(1)ヒトＴＦ内において単一ペプチド鎖から成るペプチド抗原決定基；(2)各々のアミノ酸配列がヒトＴＦポリペプチド配列上ではばらばらに位置するが、空間的に隣接する２以上のペプチド鎖から成るコンフォメーション抗原決定基；および(3)翻訳後にヒトＴＦに共有結合した分子構造（例えば炭水化物群など）から全体もしくは一部を構成される翻訳後の抗原決定基；を含む一以上の抗原決定基を有し得ることが理解される。
【００２０】
本明細書で使用される「ヒト抗体 (“human antibody”,“human antibodies”)」、「ヒトＴＦ抗体 (“human TF antibody”,“human TF antibodies”)」の用語は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むものである。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリンによってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により誘導される突然変異）を、例えばCDR、とりわけCDR3に含んでいてもよい。しかし、本明細書で使用される「ヒト抗体」の用語は、別の哺乳類種（例えばマウス）の生殖細胞系に由来するCDR配列がヒトのフレームワーク配列に接合された抗体、例えばいわゆるヒト化抗体またはヒト/マウスキメラ抗体を含むものではない。
【００２１】
本明細書で使用される「単離されたヒト抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まないヒト抗体を指すものである（例えば、ヒトＴＦを特異的に結合する単離された抗体は、ヒトＴＦ以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ヒトＴＦを特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば他の種に由来するＴＦ分子に対して交差反応性を有していてもよい（以下で更に詳述する）。更に、単離された抗体は、他の細胞の材料および/または化学物質を実質的に含んでいなくてもよい。
【００２２】
本明細書で使用される「エピトープ」の用語は、抗体が結合する抗原上の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は、通常、化学的に活性な分子の表面グルーピング（例えばアミノ酸または糖側鎖）から成り、通常、特定の三次元構造特性、並びに特定の電荷特性を有する。
【００２３】
本明細書で使用される「免疫反応する (“immunoreacts”or“immunoreacting”)」の用語は、10-4Ｍ未満の解離定数Ｋdで、抗体がそのエピトープに結合することを意味する。「免疫反応する (“immunoreacts”or“immunoreacting”)」の用語は、適切な箇所で、「特異的に結合する」という用語と交換可能に使用される。
【００２４】
本明細書で使用される「阻害する」の用語は、レファレンスと比較して低減することを意味する。一例として、ヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害する抗体は、当該抗体の非存在下でヒト凝固因子VIIaがヒト抗体を結合する能力と比較して、ヒト凝固因子VIIaがヒトＴＦを結合する能力を低減する任意の抗体を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される「親和性」の用語は、抗体がエピトープに結合する強度を意味する。抗体の親和性は、[Ab]×[Ag]/[Ab-Ag]（ここで[Ab-Ag]は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、[Ab]は未結合の抗体のモル濃度であり、[Ag]は未結合の抗原のモル濃度である）で規定される解離定数Ｋdにより測定される。親和性定数Ｋaは、１/Ｋdにより規定される。競合阻害によりMabの特異性および親和性を決定する好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., (1988)、Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol. 92: 589-601 (1983) に見出すことができ、これら参照文献は、その全体を参照により本明細書の開示内容の一部とする。
【００２６】
第二の側面において、本発明は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する、治療に効果的な量のヒト抗体を含む薬学的組成物に関する。
【００２７】
「治療に効果的な量」という用語は、所望の応答を達成する投与量を滴定し得る有資格開業医により決定される効果的な用量である。用量を考慮するための因子には、効力、バイオアベイラビリティ、所望の薬物速度論/薬力学的プロファイル、治療の症状（例えば外傷、炎症、敗血症性ショック）、患者に関連する因子（例えば体重、健康、年齢等）、同時投与される投薬の存在、投与時間、または臨床開業医に公知の他の因子を含む。患者に投与されるＴＦに対するヒト抗体の投与量は、治療すべき症状のタイプおよび重症度により変化するが、一般に0.1〜5.0 mg/kg体重の範囲である。
【００２８】
本明細書で使用される「被検体」は、任意の動物、特に哺乳類、例えばヒトを意味するものであり、適切な箇所で、「患者」という用語と交換可能に使用してもよい。
【００２９】
第三の側面において、本発明は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応するヒト抗体を含む組成物に関する。
【００３０】
第四の側面において、本発明は、FVIIa/TF関連障害を治療するための方法であって、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応する治療に効果的な量のヒト抗体をヒトに投与することを含む方法に関する。
【００３１】
「治療」は、発症する症状または疾患の状態を予防するために、あるいは既に発症した症状または疾患の状態を治癒または緩和するために、治療に活性な本発明の化合物を効果的な量投与することを意味する。よって、「治療」の用語は、予防的治療を含むものである。
【００３２】
本明細書で使用される「FVIIa/TF関連障害」の用語は、ＴＦおよびFVIIaが関与する疾患または障害を意味する。血栓または凝固障害に関連した疾患または障害、例えば炎症性応答およびフィブリン形成と関連した慢性血栓塞栓性疾患または障害、例えば脈管障害、例えば深静脈血栓症、動脈血栓症、外科手術後血栓症、冠状動脈バイパスグラフト（CABG）、経皮経管的冠状動脈形成術（PTCA）、発作、腫瘍増殖、腫瘍転移、新脈管形成、血栓崩壊、動脈硬化および血管形成術後の再狭窄、慢性および急性適応症、例えば炎症、敗血症性ショック、敗血症、低血圧症、成人呼吸促進症候群（ARDS）、汎発性血管内凝固症候群（DIC）、肺動脈塞栓症、血小板沈積、心筋梗塞、または血栓症のリスクがあるアテローム性動脈硬化症の血管を有する哺乳類の予防的治療、およびその他の疾患または障害が含まれる。FVIIa/TF関連障害は、上述障害等のインビボ凝固障害に限定されず、透析処理、血液濾過、または外科手術の間の血液バイパスのようなプロセスにおいて患者からインラインで除去した血液等の血液の体外循環により起こり得る凝固等のex vivoのFVIIa/TF関連プロセスを含む。
【００３３】
「第VIIa因子」または「FVIIa」の用語は、Arg152−Ile153のペプチド結合での特異的な切断により切断された、「二本鎖」の活性化された凝固因子VIIを意味する。FVIIaは、血液から精製してもよいし、組換え手段により産生してもよい。本明細書に記載される方法の実施は、どのようにして精製第VIIa因子を誘導するかとは無関係であり、そのため本発明は、本発明での使用に適した任意の第VIIa因子の調製の利用を包含することが想定される。ヒトFVIIaが好ましい。
「FVII」の用語は、「単一鎖」の凝固因子VIIを意味する。
【００３４】
更なる側面において、本発明は、ヒト抗体を調製する方法であって、以下のａ）〜ｂ）を含む方法に関する：
ａ）ヒトＴＦに対するヒト抗体を調製すること、
ｂ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、1 nMより低いＩＣ50値、例えば500 pMより低いＩＣ50値、好ましくは200 pMより低いＩＣ50値、好ましくは100 pMより低いＩＣ50値、好ましくは50 pMより低いＩＣ50値、好ましくは10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくは5 pMより低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて0.1 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値、例えば10 nMより低いＩＣ50値、好ましくは5 nMより低いＩＣ50値、好ましくは1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくは0.1 nMより低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて10 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値、例えば40 nMより低いＩＣ50値、好ましくは20 nMより低いＩＣ50値、より好ましくは10 nMより低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、または
ＴＦを含むＴＦ ELISAアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦを結合するヒト抗体を選択すること。
【００３５】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００３６】
更なる側面において、本発明は、ヒト抗体を調製する方法であって、以下のａ）〜ｂ）を含む方法に関する：
ａ）ヒトＴＦに対するヒト抗体を調製すること、
ｂ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（前記アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、または
ＴＦを含むＴＦ ELISAアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択すること。
【００３７】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００３８】
本明細書で使用される「ＴＦ誘導クロットアッセイ」の用語は、血漿およびＴＦを含むサンプルにおいて凝固時間を測定する任意のアッセイを意味するものである。ＴＦ誘導クロットアッセイの例は、例１、アッセイ７に記載される。
【００３９】
本明細書で使用される「FXa生成アッセイ」の用語は、ＴＦ、FVIIa、ＦＸ、カルシウムおよびリン脂質を含むサンプルにおいてＦＸの活性化を測定する任意のアッセイを意味するものである。FXa生成アッセイの例は、例１、アッセイ５に記載される。
【００４０】
本明細書で使用される「FVIIa/TFアミド分解アッセイ」の用語は、ＴＦの存在下でFVIIaアミド分解活性（すなわち小さいペプチド基質の切断）を測定する任意のアッセイを意味するものである。FVIIa/TFアミド分解アッセイの例は、例１、アッセイ４に記載される。
【００４１】
本明細書で使用される「ＴＦ ELISAアッセイ」の用語は、ＴＦおよびＴＦに対する抗体を含む任意のELISAアッセイを意味するものである。ELISAアッセイの例は、例１、アッセイ１および２に記載されるＴＦ ELISA直接アッセイおよび間接アッセイである。
【００４２】
本明細書で使用される「ＴＦ ELISA直接アッセイ」の用語は、固定されたＴＦを含む任意のＴＦ ELISAアッセイを意味するものである。ＴＦ ELISA直接アッセイの例は、例１、アッセイ１に記載される。
【００４３】
本明細書で使用される「ＴＦ ELISA間接アッセイ」の用語は、ＴＦが溶解状態にある任意のＴＦ ELISAアッセイを意味するものである。ＴＦ ELISA間接アッセイの例は、例１、アッセイ２に記載される。
【００４４】
更なる側面において、本発明は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体であって、以下のａ）〜ｂ）を含む方法により得られるヒト抗体に関する：
ａ）ヒトＴＦに対するヒト抗体を調製すること、
ｂ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、1 nMより低いＩＣ50値、例えば500 pMより低いＩＣ50値、好ましくは200 pMより低いＩＣ50値、好ましくは100 pMより低いＩＣ50値、好ましくは50 pMより低いＩＣ50値、好ましくは10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくは5 pMより低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて0.1 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値、例えば10 nMより低いＩＣ50値、好ましくは5 nMより低いＩＣ50値、好ましくは1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくは0.1 nMより低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて10 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値、例えば40 nMより低いＩＣ50値、好ましくは20 nMより低いＩＣ50値、より好ましくは10 nMより低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、または
ＴＦを含むＴＦ ELISAアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦを結合するヒト抗体を選択すること。
【００４５】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００４６】
更なる側面において、本発明は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体であって、以下のａ）〜ｂ）を含む方法により得られるヒト抗体に関する：
ａ）ヒトＴＦに対するヒト抗体を調製すること、
ｂ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、または
FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、または
ＴＦを含むＴＦ ELISAアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択すること。
【００４７】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００４８】
本発明の一つの態様において、ヒトＴＦに対するヒト抗体を産生する方法は、ヒトＴＦで哺乳類を免疫処置すること、および免疫処置された哺乳類により産生される抗体を単離することを含む。好ましい態様において、哺乳類はマウスである。免疫処置された哺乳類またはマウスが、ヒト抗体を産生可能であることが理解される。
【００４９】
更なる側面において、本発明は、ヒト抗体を調製する方法であって、以下のａ）〜ｊ）を含む方法に関する：
ａ）ヒトＴＦでマウスを免疫処置すること、
ｂ）免疫処置されたマウスから抗体産生細胞を単離し、ヒト抗体を分泌する不死化細胞を調製すること、
ｃ）産生された抗体を含む不死化細胞由来の培地を単離すること、
ｄ）溶解状態でＴＦを含むＴＦ ELISA間接アッセイにおいて抗体を試験し、溶解状態でヒトＴＦを結合するヒト抗体を選択すること、
ｅ）FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、
ｆ）FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて10 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値、例えば40 nMより低いＩＣ50値、好ましくは20 nMより低いＩＣ50値、より好ましくは10 nMより低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｇ）FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて0.1 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値、例えば10 nMより低いＩＣ50値、好ましくは5 nMより低いＩＣ50値、好ましくは1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくは0.1 nMより低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｈ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、1 nMより低いＩＣ50値、例えば500 pMより低いＩＣ50値、好ましくは200 pMより低いＩＣ50値、好ましくは100 pMより低いＩＣ50値、好ましくは50 pMより低いＩＣ50値、好ましくは10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくは5 pMより低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｉ）工程ｄ〜ｈの後に、選択された抗体を産生する不死化細胞を選択し、適切な培地で培養すること、
ｊ）選択された不死化細胞の培地から、選択された抗体を単離すること。
【００５０】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００５１】
更なる側面において、本発明は、ヒト抗体を調製する方法であって、以下のａ）〜ｊ）を含む方法に関する：
ａ）ヒトＴＦでマウスを免疫処置すること、
ｂ）免疫処置されたマウスから抗体産生細胞を単離し、ヒト抗体を分泌する不死化細胞を調製すること、
ｃ）産生された抗体を含む不死化細胞由来の培地を単離すること、
ｄ）溶解状態でＴＦを含むＴＦ ELISA間接アッセイにおいて抗体を試験し、溶解状態でヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択すること、
ｅ）FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、
ｆ）FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｇ）FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｈ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｉ）工程ｄ〜ｈの後に、選択された抗体を産生する不死化細胞を選択し、適切な培地で培養すること、
ｊ）選択された不死化細胞の培地から、選択された抗体を単離すること。
【００５２】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００５３】
本明細書で使用される「抗体産生細胞」の用語は、抗体を産生可能な任意の細胞を意味する。ハイブリドーマ、トランスフェクトされた細胞系、および抗原を注入された哺乳類に由来する比較的短命または死ぬべき運命の脾臓細胞（splenocyte）またはリンパ球が含まれる。
【００５４】
更なる側面において、本発明は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体であって、以下のａ）〜ｊ）を含む方法により得られるヒト抗体に関する：
ａ）ヒトＴＦでマウスを免疫処置すること、
ｂ）免疫処置されたマウスから抗体産生細胞を単離し、ヒト抗体を分泌する不死化細胞を調製すること、
ｃ）産生された抗体を含む不死化細胞由来の培地を単離すること、
ｄ）溶解状態でＴＦを含むＴＦ ELISA間接アッセイにおいて抗体を試験し、溶解状態でヒトＴＦを結合するヒト抗体を選択すること、
ｅ）FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、
ｆ）FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて10 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値、例えば40 nMより低いＩＣ50値、好ましくは20 nMより低いＩＣ50値、より好ましくは10 nMより低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｇ）FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて0.1 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値、例えば10 nMより低いＩＣ50値、好ましくは5 nMより低いＩＣ50値、好ましくは1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくは0.1 nMより低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｈ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、1 nMより低いＩＣ50値、例えば500 pMより低いＩＣ50値、好ましくは200 pMより低いＩＣ50値、好ましくは100 pMより低いＩＣ50値、好ましくは50 pMより低いＩＣ50値、好ましくは10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくは5 pMより低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｉ）工程ｄ〜ｈの後に、選択された抗体を産生する不死化細胞を選択し、適切な培地で培養すること、
ｊ）選択された不死化細胞の培地から、選択された抗体を単離すること。
【００５５】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００５６】
更なる側面において、本発明は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体であって、以下のａ）〜ｊ）を含む方法により得られるヒト抗体に関する：
ａ）ヒトＴＦでマウスを免疫処置すること、
ｂ）免疫処置されたマウスから抗体産生細胞を単離し、ヒト抗体を分泌する不死化細胞を調製すること、
ｃ）産生された抗体を含む不死化細胞由来の培地を単離すること、
ｄ）溶解状態でＴＦを含むＴＦ ELISA間接アッセイにおいて抗体を試験し、溶解状態でヒトＴＦと免疫反応するヒト抗体を選択すること、
ｅ）FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択すること、
ｆ）FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｇ）FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｈ）ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、前記アッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択すること、
ｉ）工程ｄ〜ｈの後に、選択された抗体を産生する不死化細胞を選択し、適切な培地で培養すること、
ｊ）選択された不死化細胞の培地から、選択された抗体を単離すること。
【００５７】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００５８】
本発明の一つの態様において、不死化細胞はハイブリドーマ細胞である。
【００５９】
更なる側面において、本発明は、ヒトＴＦ上に存在するエピトープと免疫反応し、かつヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害するヒト抗体を産生する細胞に関する。
【００６０】
一つの態様において、細胞は、単離されたリンパ系細胞である。
更なる態様において、細胞は、マウスから単離される。
【００６１】
更なる態様において、細胞はハイブリドーマ細胞である。一つの態様において、ハイブリドーマ細胞は、抗体産生リンパ系細胞と不死化細胞とを融合し、抗体産生ハイブリドーマ細胞を提供することにより得られる。
【００６２】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、ヒト凝固因子VIIaのヒトＴＦへの結合を阻害する。
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体はモノクローナル抗体である。
【００６３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」の用語は、免疫グロブリンの均質な集団を指し、すなわち、抗体集団の個々の分子は、天然に生じる突然変異を除いて同一である。抗体は、骨髄のＢリンパ球に由来するリンパ系細胞により通常合成される。同じクローンに由来するリンパ球は、単一のアミノ酸配列の免疫グロブリンを産生する。リンパ球は、長期間にわたって直接培養して、相当量の特異的抗体を産生することができない。しかし、Kohler et al., 1975, Nature, 256: 495により、体細胞の融合プロセス（具体的にはリンパ球と骨髄腫細胞との間の融合プロセス）が、ハイブリドーマ細胞を産出し、これが培養増殖し、「モノクローナル抗体」と称される特異的な抗体を産生することが実証されている。骨髄腫細胞は、リンパ球腫瘍細胞であり、「非産生」株も知られているか、その細胞株に応じてそれ自体で抗体を産生する。
【００６４】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、組換え抗体である。
【００６５】
本明細書で使用される「組換え抗体」の用語は、組換え手段により調製、発現、作成または単離されるヒト抗体のすべてを含むものであり、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現される抗体（下記セクションIIで更に説明される）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体（下記セクションIIIで更に説明される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関するトランスジェニック動物（例えばマウス）から単離される抗体（例えばTaylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids  Res. 20: 6287-6295）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う任意の他の手段により調製、発現、作成または単離される抗体が含まれる。かかる組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、ある態様において、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発を行い、これにより、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨおよびＶＬ配列に由来しこれら配列に関連するが、インビボでヒト抗体の生殖細胞系レパートリー内に天然には存在しない配列である。
【００６６】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、Fabフラグメントである。
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、F(ab)2フラグメントである。
【００６７】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、F(ab’’)2フラグメントである。
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、単一鎖Fvフラグメントである。
【００６８】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、10-15〜10-8Ｍの範囲の、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。言及されるヒト抗体のヒトＴＦへの結合に関するＫdは、ヒト抗体を固定化するアッセイ（アッセイ６参照）で測定されるものであることが理解される。
【００６９】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、10-15〜10-10Ｍの範囲の、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。
【００７０】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、10-8Ｍより低い、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。本発明の更なる態様において、10-9Ｍより低い、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。本発明の更なる態様において、10-10Ｍより低い、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。本発明の更なる態様において、10-11Ｍより低い、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。本発明の更なる態様において、10-12Ｍより低い、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。本発明の更なる態様において、10-13Ｍより低い、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。本発明の更なる態様において、10-14Ｍより低い、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。本発明の更なる態様において、10-15Ｍより低い、ヒトＴＦへの結合に関するＫdを有する。
【００７１】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、このアッセイにおいて、1 nMより低いＩＣ50値でクロット形成を阻害するヒト抗体を選択することを含む。更なる態様において、ＩＣ50値は500 pMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は200 pMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は100 pMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は50 pMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は10 pMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は5 pMより低い。
【００７２】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、ＴＦ誘導クロットアッセイにおいて抗体を試験し、このアッセイにおいて、FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋200 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 pMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 pMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 pMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、クロット形成を阻害するヒト抗体を選択することを含む。
【００７３】
ＴＦ誘導クロットアッセイで言及される具体的なＩＣ50値は、正常なヒト血漿を用いた場合であることが理解される。
【００７４】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて0.1 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値でFXa生成を阻害するヒト抗体を選択することを含む。更なる態様において、ＩＣ50値は10 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は5 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は1 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は0.1 nMより低い。
【００７５】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、FXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて0.1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋0.1 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、FXa生成を阻害するヒト抗体を選択することを含む。
【００７６】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて10 nMのFVIIa濃度を用いて）100 nMより低いＩＣ50値でＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択することを含む。更なる態様において、ＩＣ50値は40 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は20 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は10 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は5 nMより低い。
【００７７】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、FVIIa/ＴＦアミド分解アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて10 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋40 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋20 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ誘導FVIIaアミド分解活性を阻害するヒト抗体を選択することを含む。
【００７８】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、FVIIa競合アッセイにおいて抗体を試験し、FVIIa結合と競合するヒト抗体を選択することを含む。
【００７９】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、ＴＦを含むＴＦ ELISAアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦを結合するヒト抗体を選択することを含む。
【００８０】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、固定されたＴＦを含むＴＦ ELISA直接アッセイにおいて抗体を試験し、固定されたヒトＴＦを結合するヒト抗体を選択することを含む。
【００８１】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、溶解状態でＴＦを含むＴＦ ELISA間接アッセイにおいて抗体を試験し、溶解状態でヒトＴＦを結合するヒト抗体を選択することを含む。
【００８２】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、ＴＦ発現細胞上でFXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（アッセイにおいて1 nMのFVIIa濃度を用いて）500 nMより低いＩＣ50値で、ＴＦ発現細胞上でFXa生成を阻害するヒト抗体を選択することを含む。更なる態様において、ＩＣ50値は100 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は50 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は10 nMより低い。更なる態様において、ＩＣ50値は5 nMより低い。
【００８３】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、ＴＦ発現細胞上でFXa生成アッセイにおいて抗体を試験し、（当該アッセイにおいて1 nM FVIIaを用いて）FFR-rFVIIaのＩＣ50値＋500 nMより低いＩＣ50値、例えばFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋100 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋50 nMより低いＩＣ50値、好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋10 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値＋5 nMより低いＩＣ50値、より好ましくはFFR-rFVIIaのＩＣ50値より低いＩＣ50値で、ＴＦ発現細胞上でFXa生成を阻害するヒト抗体を選択することを含む。
【００８４】
「ＴＦ発現細胞」は、ヒトＴＦを発現する任意の哺乳類の細胞を意味する。
【００８５】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、完全細胞ＴＦ結合アッセイにおいて抗体を試験し、完全細胞の細胞表面で発現されるヒトＴＦに結合するFVIIaと競合するヒト抗体を選択することを含む。
【００８６】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、バイオセンサーアッセイにおいて抗体を試験し、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値が100 nMより低いヒト抗体を選択することを含む。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は10 nMより低い。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は5 nMより低い。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は1 nMより低い。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は0.5 nMより低い。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は10-10 Mより低い。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は10-11 Mより低い。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は10-12 Mより低い。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は10-13 Mより低い。
更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は10-14 Mより低い。更なる態様において、ヒトＴＦへの結合に関するＫd値は10-15 Mより低い。
【００８７】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、MAPKシグナリングアッセイにおいて抗体を試験し、MAPKシグナリングのFVIIa誘導活性化を阻害するヒト抗体を選択することを含む。一つの態様において、ヒト抗体は、MAPKシグナリングのFVIIa誘導活性化を98％阻害する。一つの態様において、ヒト抗体は、MAPKシグナリングのFVIIa誘導活性化を90％阻害する。一つの態様において、ヒト抗体は、MAPKシグナリングのFVIIa誘導活性化を70％阻害する。一つの態様において、ヒト抗体は、MAPKシグナリングのFVIIa誘導活性化を50％阻害する。一つの態様において、ヒト抗体は、MAPKシグナリングのFVIIa誘導活性化を30％阻害する。
【００８８】
「MAPKシグナリング」の用語は、種々の細胞外刺激に応答して、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）またはその相同体の活性化を介在する細胞内イベントのカスケードを意味するものである。３つの異なるグループのMAPキナーゼが、哺乳類の細胞で同定されている：1) 細胞外制御キナーゼ（Erk1/2またはp44/42）、2) c-Jun Ｎ末端キナーゼ（JNK）、および3) p38キナーゼ。Erk1/2経路は、Erk1(p44)および/またはErk2(p42)のリン酸化を伴う。活性化されたMAPキナーゼ、例えばp44/42 MAPKは、核にトランスロケートされ、そこで(Elk1)およびシグナル・トランスデューサ・アンド・アクチベーター・オブ・トランスクリプション(Stat)等の転写因子をリン酸化し活性化することができる。またErk1/2は、細胞質または核においてキナーゼp90RSKをリン酸化することができ、p90RSKは、その後幾つかの転写因子を活性化することができる。
【００８９】
「プロテインキナーゼ」の用語は、ペプチドおよび/またはタンパク質でセリンおよび/またはトレオニンおよび/またはチロシンをリン酸化することができる酵素を示すものである。
【００９０】
「MAPKシグナリングのFVIIa誘導活性化」の用語は、FVIIaが哺乳類の細胞でＴＦに結合し、これによりMAPKシグナリングを誘導することを示すものである。
【００９１】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、遺伝子発現分析アッセイ（アッセイ15）において抗体を試験し、Fra-1、Id2、およびCyr61を含むリストから独立して選択される遺伝子のFVIIa誘導性アップレギュレーションを阻害するヒト抗体を選択することを含む。
【００９２】
ＴＦの活性を阻害するＴＦに対する抗体は、ＴＦ上に存在する種々のエピトープを結合し、ヒトＴＦに対するFVIIaの結合とFXまたはFXaの結合の両方を阻害し得ることが理解される。本発明の目的は、ヒトＴＦに対するFVIIaの結合を阻害し、これによりFVIIa誘導性細胞内シグナリングを阻害する抗体を選択することである。
【００９３】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、ヒト癌アッセイ（アッセイ13）において抗体を試験し、ヒト癌の増殖または転移を阻害するヒト抗体を選択することを含む。
【００９４】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、Fra-1、Id2、およびCyr61を含むリストから独立して選択される遺伝子のFVIIa誘導性アップレギュレーションを阻害する。
【００９５】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、ヒトＴＦに対するFXまたはFXaの結合を阻害しない。
【００９６】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、ＴＦの細胞内活性を阻害する。
【００９７】
本発明の更なる態様において、ヒト抗体を調製する方法は、エピトープマッピングアッセイにおいて抗体を試験し、ＴＦ上で好ましいエピトープを結合するヒト抗体を選択することを含む。一つの態様において、好ましいエピトープは、Trp45、Lys46およびTyr94残基の一つ以上を含む。一つの態様において、好ましいエピトープはTrp45残基を含む。一つの態様において、好ましいエピトープはLys46残基を含む。一つの態様において、好ましいエピトープはTyr94残基を含む。
【００９８】
本発明の更なる態様において、単離されたヒト抗体は、ＴＦとFVIIaの境界面内でエピトープに結合する。
【００９９】
Ｘ線構造から決定された、FVIIaのプロテアーゼドメインとＴＦの間の相互作用を担うＴＦ中の残基は（Banner et al. 1996 Nature, 380: 41-46）、Ser39、Gly43、Trp45、Ser47、Phe50、Arg74、Phe76、Tyr94、Pro92である。FVIIaのプロテアーゼドメインとＴＦの間の境界面は、ＴＦとFVIIaの間で多くの微細なコンタクトを可能にし、FVIIaの結合プロセスにおいて高特異性を獲得する多くの分子間水素結合を含有する複合体境界面領域と特徴づけられる。
【０１００】
また本発明は、ＴＦに対する高親和性ヒトモノクローナル抗体に関する。FVIIaのプロテアーゼドメインのコンタクト境界面を含有するＴＦ表面は、タンパク質−タンパク質相互作用をつくり出すために反応しやすい特異的なトポロジーを保持し、ここで、別のタイプのタンパク質−タンパク質相互作用は、抗体とタンパク質リガンドの複合体形成である。よって、ヒトＴＦ上のこのエピトープに対するモノクローナル抗体は、高親和性Mabを提供する。
【０１０１】
本発明の一つの側面は、FVIIaのプロテアーゼドメインのコンタクト境界面と免疫反応する高親和性ヒトモノクローナル抗体である。
【０１０２】
本発明のヒトＴＦ抗体は、ＴＦ介在性凝固誘導のアンタゴニストとして作用し、凝固FVIIaのＴＦへの結合を阻害し、これによりトロンビンの産生をブロックし、その後のフィブリンの沈積をブロックする。ヒトＴＦ抗体は、脈管内凝固を伴う種々の症状を治療するためのヒトへの投与において特に有効である。そういうものとして、ヒトＴＦ抗体は、例えば血液凝固、血栓症または血小板沈積を阻害することにつながるＴＦ活性の阻害に有効であり得る。更に、本発明のヒトＴＦ抗体は、ＴＦの細胞機能であるＴＦのシグナリング機能を阻害するために作用し、敗血症、炎症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄または癌等の症状に有効であり得る。
【０１０３】
ヒトＴＦ抗体は、種々の疾患に有効であり得る。血栓または凝固障害に関連した疾患または障害、例えば炎症性応答およびフィブリン形成と関連した慢性血栓塞栓性疾患または障害、例えば脈管障害、例えば深静脈血栓症、動脈血栓症、外科手術後血栓症、冠状動脈バイパスグラフト（CABG）、経皮経管的冠状動脈形成術（PTCA）、発作、腫瘍増殖、腫瘍転移、新脈管形成、血栓崩壊、動脈硬化および血管形成術後の再狭窄、慢性および急性適応症、例えば炎症、敗血症性ショック、敗血症、低血圧症、成人呼吸促進症候群（ARDS）、全身性炎症反応症候群（SIRS）、汎発性血管内凝固症候群（DIC）、肺動脈塞栓症、病的血小板沈積、心筋梗塞、または血栓症のリスクがあるアテローム性動脈硬化症の血管を有する哺乳類の予防的治療、末梢血前駆細胞（PBPC）移植後の静脈閉塞病、溶血性尿毒症症候群（HUS）、血栓性血小板減少性紫斑病（TTP）、およびその他の疾患または障害が含まれる。ヒトＴＦ抗体は、外科手術を受ける患者またはうっ血性心不全を有する患者等、高リスクと同定された患者において血栓塞栓性合併症の発症を予防するために使用され得る。ヒトＴＦ抗体は、急性脈管損傷による内膜過形成または再狭窄を治療する際に特に有効であり得る。急性脈管損傷は、生涯にわたって発症する慢性脈管損傷（アテローム性動脈硬化症）とは対照的に、急速に（すなわち数時間から数ヶ月にわたって）発症するものである。急性脈管損傷は、血管形成術、動脈血管内膜切除術、アテローム切除術、脈管グラフトの据え付け等の技術が採用される脈管再構築等の外科手術的処置からしばしば引き起こされる。また過形成は、例えばグラフトの据え付けまたは器官の移植に応答した遅延反応として起こり得る。ヒトＴＦ抗体は、ヘパリンより選択的であり、損傷部位に露出されたＴＦのみを結合するため、またヒトＴＦ抗体は、他の凝固タンパク質を破壊したり阻害したりしないため、深静脈血栓症が起こらないように予防的に使用する場合、ヘパリンより効果的であり、出血性合併症を引き起こしにくい傾向がある。
【０１０４】
以下の実施例で示すとおり、本発明のヒトＴＦ抗体は、細胞表面ＴＦに選択的に結合し、凝固FVIIaのＴＦへの結合を阻害することによりその機能的活性を阻害することができる。ＴＦに対する結合を維持するヒトＴＦ抗体は、トロンビンの産生をブロックし、その後フィブリンの沈積をブロックすることにより、脈管の損傷部位に血小板が蓄積することを阻害する。
【０１０５】
ヒトＴＦ抗体が、トロンビン生成をブロックし、脈管の急性損傷部位で血小板の沈積を制限する能力を有しているため、ＴＦへの結合を維持することによりFVIIaの結合を阻害するヒトＴＦ抗体は、脈管の再狭窄を阻害するために使用することができる。
【０１０６】
ヒトＴＦ抗体を含む組成物は、薬学的組成物に製剤化すると、患者を治療する方法において特に有効であり、ここで、当該組成物を種々の疾患状態に病んでいる個体に投与し、凝固関連の症状を治療することができる。かかるヒトＴＦ抗体は、ＴＦを結合し、ＴＦに対するFVIIa結合を阻害することができ、他の抗凝固剤と比較すると、より長い血漿での半減期を有し、それに対応してより長い期間の抗凝固活性を示すことができる。本組成物の医療上の適応症は、抗凝固剤で一般に治療されるもの、例えば、深静脈血栓症、肺動脈塞栓症、発作、汎発性血管内凝固症候群（DIC）、敗血症と関連した肺および腎臓でのフィブリン沈積、抗リン脂質症候群（APS）、アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞である。本組成物は、機械的な脈管損傷、例えば、外科手術、顕微手術、バルーン血管形成術、動脈血管内膜切除術、整復性アテローム切除術、ステント配置、レーザー治療またはロータブレーション（rotablation）により引き起こされる損傷の後に起こったり、あるいは脈管グラフト、ステント、バイパスグラフトまたは器官移植に副次的に起こったりする脈管の再狭窄を阻害するために使用することができる。よって、本組成物は、血小板の沈積および関連する障害を阻害するために使用することができる。従って、凝固、脈管の再狭窄または血小板の沈積を阻害する方法は、例えば、凝固、脈管の再狭窄または血小板の沈積を効果的に阻害するのに充分な量でヒトＴＦ抗体を含む組成物を患者に投与することを含む。また本方法は、個体において冠状動脈の急性閉鎖（例えば急性心筋梗塞）を治療する際の使用が見出され、これは、ヒトＴＦ抗体を組織プラスミノゲン活性化因子またはストレプトキナーゼと一緒に投与することを含み、tPA誘導性血栓崩壊を促進することができる。ヒトＴＦ抗体は、血栓崩壊剤、例えば組織プラスミノゲン活性化因子の投与前、投与と一緒に、または投与直後に投与される。
【０１０７】
本発明によれば、ヒトＴＦに対するヒトモノクローナル抗体は、マウス機構というよりむしろヒト免疫機構の一部を有する（Medarexから入手した）トランスジェニックマウスをヒトＴＦで免疫処置することにより作成することができる。これらトランスジェニックマウス由来の脾臓細胞を使用して、上述のヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作成する（例えば、Wood et al. 国際出願 WO 91/00906、Kucherlapati et al. PCT公報 WO 91/10741; Lonberg et al. 国際出願 WO 92/03918; Kay et al. 国際出願 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368: 856-859; Green, L. L. et al. 1994 Nature Genet. 7: 13-21; Morrison, S. L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7: 33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90: 3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21: 1323-1326参照）。
【０１０８】
また、ヒトＴＦに対するヒトモノクローナル抗体は、ファージディスプレイにより作成することができる。ヒト抗体ライブラリーは、免疫処置されたヒトから構築し、糸状ファージの表面に展示させることができる。高親和性ヒト単一鎖Fv（ScFv）およびFab抗体フラグメントは、多くのケースにおいて、対象の抗原を固体表面（すなわちマイクロタイタープレートまたはビーズ）上に固定したパニング（pannning）技術を用いて、かかるライブラリーから単離されている（Barbas C. F., III and Burton, D. R. Trends. Biotechnol. 1996, 14: 230-234; Aujame L. et al, Hum. Antibodies 1997, 8: 155-68）。また、大きくてナイーブなライブラリーのファージディスプレイにより、免疫処置をすることなく直接ヒト抗体を単離することが可能になった（DeHaard H. J. et al J. Biol. Chem. 1999, 18218-18230）。
【０１０９】
本発明について、添付の図面を参照しながら実施例において更に詳細に説明する。
【０１１０】
本発明は、以下の実施例により更に説明されるが、これを、保護の範囲を制限するものとして解釈してはならない。前述の説明および後述の実施例で開示される特徴は、別々でも、任意の組み合わせでも、本発明をその種々の形態で理解するための材料であり得る。
【実施例】
【０１１１】
例１
ヒトＴＦに対して免疫特異的なヒトMabの調製
試薬
ヒトＴＦは、Rao, L. V. M., Thrombosis Research, 51: 373-384 1988に記載されるとおり、ヒトの脳から単離することができる。
【０１１２】
また、脂質化（lipidated）組換えヒトＴＦ (Dade Innovin, Baxter) は、ヒトトロンボプラスチン試薬として使用することもできる。ラット、ラビット、ヒヒ、およびブタのトロンボプラスチンは、脳組織から調製される。２倍体積の45℃ 0.9 % NaClを脳組織に添加し、その組織を手動ガラスホモジナイザーでホモジナイズする。時々振盪しながら45℃で30分インキュベートした後、サンプルを2000 x gで20分間遠心分離する。沈殿を捨て、上清を小分けにし、使用するまで-80℃で保存する。
【０１１３】
再脂質化（Relipidated）ＴＦは、完全長の組換えヒトＴＦ (American Diagnostica #4500) をリン脂質小胞 (PC/PS 75/25) に再構成することにより得ることができる。
【０１１４】
ビオチン化（biotinylated）ヒトＴＦは、以下のとおり作成される：ビオチン-NHS (n-スクシンイミどビオチン, Sigma H-1759) をDMF (ジメチルホルムアミド) 中に1.7 mg/mLの濃度で溶解する。0.1 M NaHCO3バッファー中の1 mg/mLのヒトＴＦを、60μLのビオチン-NHS溶液に添加し、室温で4時間反応させる。ビオチン化ＴＦを含有する反応溶液を、一晩PBSバッファーに対して透析する。
【０１１５】
使用したFVllaは、Thim, L. et al. Biochem 27: 7785-7793, 1988に記載されるとおり調製された組換えヒトFVIIaである。
sTF: E. coliで発現され、かつFreskgard, P. -O. et al. Protein Sci. 5, 1531-1540 (1996) に記載されるとおり本質的に精製された可溶性組換えヒトＴＦ。
S2288: H20中で17.24 mg/mLに再構成 (Chromogenix)。
FX: 精製されたヒト血漿FX (HFX, Enzyme Research Laboratories Ltd.)。
FXa: ラッセルクサリヘビ蛇毒 (Russel's Viper Venom) で活性化された、精製されたヒト血漿FX (HFXa, Enzyme Research Laboratories Ltd.)。
クロモザイム (Chromozyme) X: H20中で1.25 mg/mLに溶解 (Boehringer Mannheim)
125I-FVIIaは、標準的な放射性同位元素標識法により得られる。
FFR-rFVIIa: D-Phe-L-Phe-L-Arg-クロロメチルケトンで活性部位においてブロックされたFVIIa。Sorensen B. B. et al. J. Biol. Chem. 272: 11863-11868, 1997に記載されるとおり調製される。
【０１１６】
免疫処置
ヒトＴＦをフロイント完全アジュバント中に乳化する。HuMabマウスまたはそのハイブリッド (Medarex) に皮下注入により40μg投与する。14日および28日後、その後14日の間隔で複数回、マウスにフロイント不完全アジュバント中の20μg ＴＦを同様の注入でブースター投与する。最後の注入から10日後、血液サンプルを採取し、血清をTF ELISA によりヒトＴＦ特異的抗体について試験する (アッセイ1および2)。
【０１１７】
融合
アッセイ1〜3のポジテイィブ血清試験のマウスに、静脈内注入により20μgのヒトＴＦをブースター投与し、3日後に屠殺する。脾臓を無菌的に取り出し、単一の細胞懸濁液に分散させる。
【０１１８】
キツネの骨髄腫細胞は、CDハイブリドーマ培地 (Gibco 11279-023) で増殖させる。
【０１１９】
融合に関して、脾臓細胞と骨髄腫細胞 (P3x63 Ag8.653, ATCC CRL-1580) との融合、およびSp2/0 (ATCC CRL-1581) 骨髄腫細胞系統との融合は、PEG法により為される (Kohler, G & Milstein C. (1976), European J. Immunology, 6: 511-19)。細胞をマイクロタイタープレートに播き、37℃でインキュベートする。培地は次の2週間にわたって3回交換する。ハイブリドーマ細胞由来の100μLの上清を、各ウェルから取り出し、TF ELISAで、ＴＦ特異的抗体についてい試験する (アッセイ1および2)。
【０１２０】
例２
スクリーニング
特異的な選択された抗体について血清および培養上清のスクリーニングで使用した種々のアッセイは、以下に記載のとおりである：
【０１２１】
直接TF ELISAアッセイ (アッセイ1)：
Nuncイムノプレートを、PBS中の1μg/mL ヒトsTFで4℃で一晩被覆する。プレートをブロッキングバッファー (5 mM CaCl2および2% BSAを含むTBS) でブロックし、TBS + 0.05 % Tween 20で洗浄し、ハイブリドーマ細胞由来の上清を添加する。室温で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ホースラディシュペルオキシダーゼ (HRPO) で標識された抗ヒトIgGを添加する。更に1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、製造社により記載されるとおりTMB基質 (Kem-EN-Tec) で発色させる。450 nmにおける吸光度をELISAリーダーで測定する。
【０１２２】
間接TF ELISAアッセイ (アッセイ2)：
Nuncイムノプレートを、PBS中の0.5μg/mL ヤギ抗ヒトIgG (Southern Biotechnology Associates, Cat-#2040-1) で被覆し、4℃で一晩インキュベートする。プレートをブロッキングバッファー (5 mM CaCl2および2% BSAを含むTBS) でブロックし、TBS + 5 mM CaCl2 + 0.05 % Tween 20で洗浄する。ハイブリドーマ細胞由来の培養上清を添加し、プレートを室温で1時間インキュベートする。更に洗浄した後、ビオチン化ヒトsTFを1μg/mLの濃度で添加し、1時間インキュベートする。洗浄した後、100μLのストレプトアビジン-HRPO溶液を添加し、1時間インキュベートする。プレートを、アッセイ1で記載したとおりTMB基質で発色させる。
【０１２３】
FVIIa競合アッセイ (アッセイ3)：
NuncイムノプレートをヒトsTF (PBS中の濃度 5μg/mL) とともに4℃で一晩インキュベートする。プレートを洗浄し、5 mM CaC12および2 % BSAを含むTBSバッファーでブロックする。抗ヒトTF Mabを添加し、プレートを2時間インキュベートする。プレートを洗浄し、次いでビオチン化ヒトFVIIa (5 mM CaC12および2 % BSAを含むTBSバッファー中1μg/mL) を添加し、プレートを1時間インキュベートする。プレートを洗浄し、次いでHRPO標識されたストレプトアビジンを添加し、45分間インキュベートする。プレートを再度洗浄し、次いで製造社により記載されるとおりTMB基質 (Kem-EN-Tec) で発色させる。
【０１２４】
FVIIa/sTFアミド分解活性の阻害 (アッセイ4)：
FVIIa-TFにより触媒されるアミド分解活性が抗ヒトTF Mabにより阻害されることを、可溶性ヒトTF (10 nM)、組換えヒトFVIIa (10 nM) および増大する濃度のMab (0.0122〜50 nM) を用いて試験する。変動する濃度の抗ヒトTF MabまたはFFR-rFVIIaを、BSAバッファー (50 mM Hepes、pH 7.4、100 mM NaCl、5 mM CaC12および1 mg/mL BSA) 中で10 nM sTFおよび10 nM FVIIaとともに室温で60分間プレインキュベートし、その後基質S2288 (1.2 mM, Chromogenix) を添加する。発色を405 nmで30分間連続して測定する。アミド分解活性は、mOD/分で表す。MabによるFVIIa/TFアミド分解活性の阻害に関するIC50値を計算することができる。FFR-rFVIIaに関するIC50値は、このアッセイにおいて7+/-3 nMである。
【０１２５】
FXa生成の阻害 (アッセイ5)：
脂質化TF (10 pM)、FVIIa (100 pM) および抗TF MabまたはFFR-rFVIIa (0〜50 nM) を、BSAバッファー (アッセイ4参照) 中で室温で60分間インキュベートし、その後FX (50 nM) を添加する。更に10分後、1/2体積の停止バッファー (50 mM Hepes、pH 7.4、100 mM NaCl、20 mM EDTA) を添加することにより、反応を停止させる。生成されたFXa量を、基質S2765 (0.6 mM, Chromogenix) を添加し、405 nmで10分間連続して吸光度を測定することにより決定する。FVIIa/脂質化TF-介在性FX活性化のMab阻害に関するIC50値を計算することができる。FFR-rFVIIaに関するIC50値は、このアッセイにおいて51+/-26 pMである。
【０１２６】
バイオセンサーアッセイ (アッセイ6)：
ヒトIgGに対する抗体を固定したチップ上を抗ヒトTF Mabの標準溶液を通過させることにより、抗体をビアコア (Biacore) 機器で試験する。この後、150 mM NaCl、10 mM CaCl2および0.0003 % ポリソルベート 20を含有する10 mM hepes pH 7.4中の種々の濃度のsTFを通過させる。Kd値は、統合型ビオコア (Biacore) 評価ソフトウェアを用いてセンサーグラムから計算する。
【０１２７】
TF依存性凝固アッセイ (アッセイ7)：
アッセイは、ACL300 リサーチ凝固装置 (ILS Laboratories) で行う。50 mM イミダゾール、pH 7.4、100 mM NaCl、0.1 % BSA中の抗ヒトTF Mabの希釈物を、25 mM CaCl2と2〜5の比率で混合し、凝固装置のサンプルカップに添加する。イミダゾールバッファーで希釈され、抗体を含有しないサンプル中で約30秒の凝固時間を示すヒト、ラット、ラビット、ヒヒ、またはブタ由来のトロンボプラスチンを、試薬リザーバ2に置き、ヒト、ラット、ラビット、ヒヒ、またはブタの血漿を試薬リザーバ3に置く。分析の間、70μLの抗体とCaCl2の混合物を、25μLトロンボプラスチン試薬に移し、900秒間プレインキュベートし、その後60μL血漿を添加し、凝固時間を測定する。最大凝固時間を400秒に設定する。トロンボプラスチンの希釈物は、抗TF MabまたはFFR-rFVIIaを添加しないコントロールに対するTF活性に凝固時間を変換するための標準曲線として使用する。FFR-rFVIIaに関するIC50値は、このアッセイにおいて4.4 +/- 0.4 pMである。
【０１２８】
FVIIa/細胞表面TFにより触媒されるFX活性化のMabによる阻害 (アッセイ8)：
ヒトＴＦを発現する単一層の細胞、例えばヒト肺線維芽細胞 WI-38 (ATTC No. CCL-75)、ヒト膀胱癌腫細胞系統 J82 (ATTC No. HTB-1)、ヒトケラチノサイト細胞系統 CCD 1102KerTr (ATCC no. CRL-2310)、ヒト神経膠芽腫 (glioblastoma) 細胞系統 U87、またはヒト乳癌細胞系統 MDA-MB231が、FVIIa/TFにより触媒されるFX活性化におけるTF供給源として使用される。24-、48-または96-ウェルプレート中の集密状態の細胞単一層を、バッファーA (10 mM Hepes、pH 7.45、150 mM NaCl、4 mM KCl、および11 mM グルコース)で１回洗浄し、バッファーB (1 mg/mL BSAおよび5 mM Ca2+を添加したバッファーA)で１回洗浄する。バッファーB中のFVIIa (1 nM)、FX (135 nM)および変動する濃度のMab (またはFFR-rFVIIa)を、細胞に同時に添加する。あるいは、細胞を、抗TF MabまたはFFRrFVIIaとともに15分プレインキュベートし、その後rFVIIaおよびFXを添加する。37℃で15分間FXaを生成させる。各ウェルから一部50μLを取り出し、50μL停止バッファー (10 mM EDTAおよび1 mg/mL BSAを添加したバッファーA) に添加する。生成されたFXa量を、50μLの上記混合物マイクロタイタープレートに移し、25μL クロモザイム(Chromozym) X (最終濃度 0.6 mM) をウェルに添加することにより決定する。405 nmにおける吸光度を連続して測定し、発色の初期速度を、FXa標準曲線を用いてFXa濃度に変換する。FFR-rFVIIaに関するIC50値は、このアッセイにおいて1.5 nMである。
【０１２９】
細胞表面TFへの125I-FVIIa結合のMabによる阻害 (アッセイ9)：
結合の研究は、ヒトTFを発現する細胞、例えばヒト肺線維芽細胞 WI-38 (ATTC No. CCL-75)、ヒト膀胱癌腫細胞系統 J82 (ATTC No. HTB-1)、ヒトケラチノサイト細胞系統 CCD 1102KerTr (ATCC no. CRL-2310)、ヒト神経膠芽腫細胞系統 U87、またはヒト乳癌細胞系統 MDA-MB231を用いて行う。24ウェルの組織培養プレートを中で集密状態の単一層を、バッファーA (アッセイ8参照)で一回洗浄し、バッファーB (アッセイ8参照)で一回洗浄する。単一層を、100μLの冷却バッファーBとともに2分間プレインキュベートする。変動する濃度のMab (またはFFR-rFVIIa) および放射性標識されたFVIIa (0.5 nM 125I-FVIIa) を、細胞 (最終体積 200μL) に同時に添加する。プレートを4℃で2時間インキュベートする。インキュベーションが終了すると、未結合の物質を除去し、細胞を氷冷バッファーBで4回洗浄し、300μL 溶解バッファー (200 mM NaOH、1 % SDSおよび10 mM EDTA)で溶解する。放射能をガンマカウンター (Cobra, Packard Instruments) で測定する。結合データを分析し、GraFit4 (Erithacus Software, Ltd., (U. K.) を用いて曲線をフィットさせる。FFR-rFVIIaに関するIC50値は、このアッセイにおいて4 nMである。
【０１３０】
FVIIa/TF-誘導性p44/42 MAPK活性化のMabによる阻害 (アッセイ10)：
リン酸化されたp44/42 MAPKおよび/またはAkt、および/またはp90RSKの量は、ウェスタンブロット分析に由来する化学発光の定量的検出 (Fujifilm LAS-1000) により決定される。ヒトＴＦを発現する細胞、例えばCCD1102KerTr、NHEK P166、ヒト神経膠芽腫細胞系統U87、またはヒト乳癌細胞系統MDA-MB231を、細胞を静止させる実験に先立って、0〜0.1 % FCSを含む培地で24または48時間培養する。実験日に、細胞は70〜80%の集密状態でなければならない。実験は、過剰のMabまたはFFR-rFVllaとともに細胞を37℃で30分間、血清を含まない培地でプレインキュベートし、その後10〜100 nM FVllaを添加し10分間インキュベートすることにより行う。細胞シグナリングのポジティブコントロールとして、細胞を10 % FCSで10分間処理する。細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、次いで細胞を溶解バッファー (20 mM Tris、0.1% Triton X-100、1 mM EDTA、1 mM EGTA、50 mM フッ化ナトリウム、10 mM グリセロリン酸ナトリウム、5 mM ピロリン酸ナトリウム、150 mM NaCl、pH 7.5、該バッファーは、0.1 mM 4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド(AEBSF)および1 mM ベンズアミジンを含有し、使用直前に1 mM オルトバナジン酸ナトリウム、5μg/mL ロイペプチン、10μg/mL アプロチニンを添加する) 中で溶解する。溶解物をSDS-サンプルバッファーと混合し、SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードする。ビオチン化タンパク質の標準マーカーを各ゲルにロードする。SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離されたタンパク質を、エレクトロブロッティングによりニトロセルロースに移し、キナーゼp44/42 MAPK、Aktおよびp90RSKを、ホスホ特異的抗体を用いたイムノブロッティングにより可視化し、化学発光をFujifilm LAS1000により定量する。
【０１３１】
エピトープマッピングアッセイ (アッセイ11)：
可溶性TF (sTF) 変異体の調製
sTF変異体 (I22C、W45C、K46C、Y94C、F140C、W158C、K201C) は、テンプレートとして野生型プラスミド (Freskgard et al. Protein Sci. 5, 1531-1540, 1996) を用いた逆PCR (QuikChange, Stratagene, La Jolla, CA, USA) を利用して構築する。野生型および変異体は、他に記載されるとおり (Freskgard et al., Protein Sci. 5, 1531-1540, 1996) 幾つかの改変を加えてE. coliで発現され精製される。細胞の溶解は、10 mM Tris-HCl バッファー、pH 7.5中でX-プレス (Biox, Sweden) 技術により行われ、その後1 mgのDNAseを添加した同バッファー中に再懸濁する。その溶液を4℃で20分間11000 x gで遠心分離し、封入体を75 mLの6 M GuHCl、0.5 M NaCl、20 mM Tris-HCl、pH 8.0中で変性させる。約2時間穏やかに攪拌しながら50 mM Tris-HCl、0.25 M NaCl、pH 8.0を含有する1 L溶液に変性タンパク質を滴下希釈することにより、室温で1時間インキュベーション後、リフォールディング (Refolding) が達成される。精製は、Freskgard et al. (1996)に記載されるとおり、Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Sweden) およびFVIIaアフィニティークロマトグラフィーを用いて行われる。タンパク質の均質性は、SDS-PAGEにより確認する。濃度はA280 nmで測定し、計算された吸光率37440 M-1cm-1を用いて決定する (Gill and von Hippel, 1989)。
【０１３２】
MaxiSorpプレート (Nunc-Immuno) を、TBS中の野生型sTFおよび変異体 (10μg/mL) で被覆し、ブロッキングバッファー (0.1% Tween 20および0.5% BSAを含むTBS) でブロックする。プレートを洗浄バッファー (TBSおよび0.1 % Tween 20) で洗浄する。抗ヒトTF Mabを、ブロッキングバッファー中1 ng/mLの濃度で添加し、1時間インキュベートする。その後、プレートを洗浄バッファーを用いて洗浄(6x)する。その後、抗体の結合を、HRP-標識された抗ヒトIgG (Helica Biosystems, Inc) をブロッキングバッファー中で1: 2000希釈で用いて、TMBplus-基質 (Kem Tech Cat. 4390A) を用いて検出する。最終ELISAシグナル (OD450-620) を、各抗体の結合の全sTF変異体への結合の尺度として使用する。
【０１３３】
血栓弾性記録 (アッセイ12)：
ヒトトロンボプラスチン (例えばInnovin, Dade Behring, 最終希釈50,000 x) を、CaCl2 (最終濃度16.7 mM) および抗TF Mabと混合し、室温で15分間インキュベートする。クエン酸により安定化されたヒト全血 (280μL) を、RoTEGサンプルカップ (Pentapharm) に添加し、37℃で5分間予め加熱し、次いで40μLのトロンボプラスチン/CaCl2/抗TF Mab 混合物を添加する。血栓弾性記録 (thromboelastography) は、RoTEG装置 (Pentapharm) で1時間追跡する。速度プロファイルは、CoagPro Software (MedScience, Arhus, Denmark) を用いてトロンボグラム (thrombograms) から得る。
【０１３４】
例３
ヒト癌アッセイ。マウスモデルにおいてヒト癌の増殖および転移に対するヒト抗TF Mabを用いた処置の効果を調査する (アッセイ13)：
処置：
ヒト抗TF Mabは静脈内にボーラス注入により投与する；10 mg/kg = 0.1 mg/10 g；注入体積は、3つの処置溶液の何れもマウス10 gあたり0.1 mLである：
A. 賦形剤コントロール
B. 1 mg/mL ヒトFFR-rFVIIa
C. 1 mg/mL 抗TF Mab
【０１３５】
モデルの説明：
I. 結腸癌の一次性増殖および肝臓転移
7〜8週齢の健康なメス無胸腺症マウス (nulnu) を使用する。ヒト細胞の移植に対するヌードマウスの残りの免疫抵抗性を破壊するため、ヒト腫瘍を移植する2日前に、5 Gyで定期的にマウスに放射線を照射する (Vogel et al., 1997)。記述されるとおり (Li et al., Human Gene Therapy 10: 3045-3053, 1999)、15% ウシ胎仔血清 (FCS) を含むRPMI 1640で培養したLS174T ヒト結腸癌細胞 (ATCC CCL 188) の腫瘍移植によりマウスに抗原投与を行う。簡単にいうと、細胞をトリプシン-EDTAを用いて収穫し、2回洗浄し、ナトリウム−ヘパリネート(sodium-heparinate) 溶液 (1 U/mL) を添加した血清フリーのRPMI中に再懸濁する。その後、マウスの左肋骨下の小切除を麻酔下で行い、50 mLのリン酸バッファー塩類溶液 (PBS) 中の3 3 106 LS174T細胞を、脾臓に注入する。3〜5分後、脾臓の脈管を連結し、脾臓を外科的に除去する。この手法により、肝臓転移が安定して発症する (95%以上)。抗TF Mabによる処置は、移植直後に開始され、残りの研究期間継続される。腫瘍細胞の接種から15日後および30日後にマウスを屠殺し、肝臓を除去して重量をはかり、肝臓表面に目に見える腫瘍小節 (nodule) の数を数える。肝臓サンプルを、AFA (5% 酢酸、75% エチルアルコール、2% ホルマリン、18% 水) 中で一晩固定し、100% エタノールに移し、パラフィンに包埋し、転移性小節の組織学的定量のため、免疫組織化学およびアポトーシス定量化のために、5 mmの切片を調製する。
【０１３６】
研究I-1：
目的: ヌードマウスにおけるLS174T 結腸腫瘍の肉眼的増殖および肝臓転移に対する、静脈内に10 mg/kgボーラス注入された抗TF Mabの効果を調査するため。
マウス: 60匹のホモ接合性 nu/nu 6週齢のNMRI オス。
グループ: マウスは、無作為に15匹ずつの4つのグループに割り当て、溶液A、B、またはCで処置する。
終了: 20%を超える体重の減少または激しい毒性の他の他覚的徴候で、動物は終了する。
パラメータ: 腫瘍サイズは、増殖期の間、2本の直交する直径で毎日記録する。体重は、最初と週に2〜3回記録する。肝臓における転移の形成を死後に決定する。
【０１３７】
II. 乳癌の一次性増殖および肺転移
ヒト乳癌細胞 MDA-MB-231 (ATCC HTB26) を、10% ウシ胎仔血清 (FCS) を添加したダルベッコの改変イーグル培地 (DMEM) で培養する。MDA-MB-231細胞 (3 3 106) を、ヌードマウス (7〜8週齢のメスマウス) の皮下に注入する。一次性腫瘍増殖および転移は、前述のとおり評価する (Li et al., Human Gene Therapy 12: 515-526, 2001)。
【０１３８】
研究II-1：
目的: ヌードマウスにおけるMDA-MB-231 乳房腫瘍の肉眼的増殖および肺転移に対する、静脈内に10 mg/kgボーラス注入された抗TF Mabの効果を調査するため。
マウス: 60匹のホモ接合性 nu/nu 6週齢のNMRI オス。
グループ: マウスは、無作為に15匹ずつの4つのグループに割り当て、溶液A、B、またはCで処置する。
終了: 20%を超える体重の減少または激しい毒性の他の他覚的徴候で、動物は終了する。
パラメータ: 腫瘍サイズは、増殖期の間、2本の直交する直径で毎日記録する。体重は、最初と週に2〜3回記録する。肺における転移の形成を死後に決定する。
【０１３９】
III. 神経膠腫 (glioma tumor) 異種移植の一次性増殖
腫瘍細胞系統 MG U373は、ヒト神経膠芽腫多形細胞系統であり、ヌードマウスにおいて高い脈管形成活性、高い脈管密度、および迅速な増殖を示す。腫瘍は、標準的な手法に従って側腹部に接種する (実験プランに同封のプロトコール参照)。マウスは、毒性の徴候について毎日2回観察し、腫瘍は、2本の垂直な直径で毎日測定する。
【０１４０】
腫瘍は、NMRIバックグラウンドのnu/nuホモ接合性ヌードマウスの側腹部に移植する。マウスは、M & B (Ry, Denmark) から入手した7週齢のオスである。動物は、ノトバイオートの環境で飼育し、滅菌済みの食物ペレットおよび飲料水を適宜摂取する。
【０１４１】
3種類の研究を、神経膠腫モデルを用いて実施する：
研究III-1：
目的: ヌードマウスにおけるU373 腫瘍の肉眼的増殖に対する、静脈内に10 mg/kgボーラス注入された抗TF Mabの効果を調査するため。
マウス: 60匹のホモ接合性 nu/nu 6週齢のNMRI オス。
グループ: マウスは、無作為に15匹ずつの4つのグループに割り当て、溶液A、B、またはCで処置する。
終了: 20%を超える体重の減少または激しい毒性の他の他覚的徴候で、動物は終了する。
パラメータ: 腫瘍サイズは、増殖期の間、2本の直交する直径で毎日記録する。体重は、最初と週に2〜3回記録する。
【０１４２】
研究III-2：
目的: 治療前の腫瘍増殖が確認された後、ヌードマウスにおけるU373 腫瘍の肉眼的増殖に対する、静脈内に10 mg/kgボーラス注入された抗TF Mabの効果を調査するため。
マウス: 60匹のホモ接合性 nu/nu 6週齢のNMRI オス。
グループ: マウスは、無作為に15匹ずつの4つのグループに割り当て、溶液A、B、またはCで処置する。処置は、6つの継続性 (毎日の) 測定が、ゴンペルツ (Gompertzian) 増殖を示すときに開始する。これは100〜200 mm3に相当する。
終了: 腫瘍が約1.0 cm3の最大サイズを超えて増殖する（すなわち15 mmより大きい腫瘍直径ではない）まで、あるいはゴンペルツ再増殖が6つの継続性測定により確認されるまで、処置は継続する。終了時に、組織学的および免疫化学的評価のために各グループから腫瘍を切除する。20%を超える体重の減少または激しい毒性の他の他覚的徴候で、動物は終了する。
パラメータ: 腫瘍サイズは、増殖期の間、2本の直交する直径で毎日記録する。体重は、最初と週に2回記録する。
【０１４３】
研究III-3：
目的: ヌードマウスにおける頭蓋内U373 腫瘍の増殖に対する抗TF Mabの効果を調査するため。
マウス: 60匹のホモ接合性 nu/nu 6週齢のNMRI オス。
腫瘍: 標準的手法に従って右半球に同所移植されたU373。
グループ: マウスは、無作為に15匹ずつの4つのグループに割り当て、溶液A、B、またはCで処置する。
終了: 慢性神経学的欠陥の徴候を示すマウスを安楽死させる。
データ: 生存 (すなわち神経学的欠陥までの時間) を、カプラン-マイヤー (Kaplan-Meyer) 統計により定量する。
【０１４４】
例４ (アッセイ14)
TF遺伝子がノックアウトされ、ヒトTF遺伝子が挿入されたマウス (mTF-KO/hTF-KI マウス) において、0.5 mL マトリゲルプラグ (matrigel plug) を腹部皮膚の皮下に置く。マトリゲルに、b-FGF (5 ng) を組み込み、1週間後、ゲルにおける新たな開存性血管の形成を、ヘモグロビンの含量を測定することにより定量する（新脈管形成）。ヒト抗TF Mabの阻害能 (ヘモグロビン含量の% 阻害) は、タンパク質の単回または繰返しの腸管外投与後に評価することができる。
【０１４５】
例５ (アッセイ15)
TFに対するFVIIa結合を妨害する抗体とTFに対するFX結合を妨害する抗体とを識別するための遺伝子発現分析アッセイ
FVIIaで処理したBHK-TF細胞における3遺伝子の特異的アップレギュレーションを、cDNAマイクロアレイ分析で観察した。これら遺伝子には、Fos関連抗原1をコードする遺伝子のFra-1、ヘリックスループヘリックスクラスのタンパク質のメンバーをコードする遺伝子のId2、および細胞外マトリクスシグナリングタンパク質をコードするCyr61を含む。以下のアッセイは、FVIIa誘導性Fra-1、Id2またはCyr61のアップレギュレーションを妨害する抗TF Mabを検査するためにデザインされた。
【０１４６】
細胞培養
試薬は、特に記載しない限り、GIBCO-BRL Life Technologiesから購入する。
BHK-TF細胞は、Poulsen L. K. et al., J Biol. Chem. 273, 6228-6232, 1998に記載されるとおり作成され、10% FCS、100 IU/mL ペニシリン、および100μg/mL ストレプトマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地で増殖させ、95〜100%の集密状態を得、洗浄し、更に16〜18時間FCSを含まない培地で増殖させる。再度細胞を洗浄し、100 nM FVIIaを含有するFCSフリー培地に晒す。
【０１４７】
ノザンブロット分析のためのフラグメントをクローニングするため、細胞を以下のとおり処理する。BHK-TF細胞は、10% FCS、100 IU/mL ペニシリン、および100μg/mL ストレプトマイシンを含有するダルベッコの改変イーグル培地で増殖させ、95〜100%の集密状態を得、洗浄し、更に16〜18時間FCSを含まない培地で増殖させる。再度細胞を洗浄し、100 nM FVIIaを含有するFCSフリー培地に1時間晒す。CRL2091細胞 (ATCC) は、10% FBS、100 U/mL ペニシリン、および100μg/mL ストレプトマイシンを含有するイサコブの (Iscove's) 改変ダルベッコ培地で増殖させ、95〜100%の集密状態にする。その後、細胞を16〜18時間血清飢餓の状態にし、100 nM FVIIaを含有するFBSフリー培地で6時間処理する。ネズミ 3T3-L1細胞 (ATCC) は、10% ウシ胎仔血清、100 U/mLペニシリン、および100μg/mL ストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地で維持する。細胞は、集密状態まで増殖させ、1μM デキサメタゾン (Sigma)、10μg/mL ヒトインスリン (Novo Nordisk A/S)、および1μM BRL49653 (Novo Nordisk A/S) を含有する培地で1時間誘導する。
【０１４８】
ノザンブロット分析のためのフラグメントのクローニング
Fra-1は、製造社の使用説明書に従ってスーパースクリプト11キット (Life Technologies) を使用して、デキサメタゾン、インスリン、およびBRL49653で1時間処理した3T3-L1細胞から単離したRNAから、逆転写PCRによりクローニングする。Id2およびCyr61は、それぞれ、FVIIaで1時間処理したBHK-TF細胞およびFVIIaで6時間処理したCRL2091細胞から単離したRNAから、逆転写PCRによりクローニングする。上流および下流プライマーは、以下のとおりである：Fra-1については 5'-GCGGCCGCCATGTACCGAGACTACGGGGAACCG-3'および5'-GCGGCCGCTCACAAAGCCAGGAGTGTAGG-3'、Id2については 5'-CAGCATGAAAGCCTTCAGTC-3'および5'-CTCTGGTGATGCAGGCTGAC-3'、Cyr61については 5'-CGTCACCCTTCTCCACTTGA-3'および5'-CTTGGTCTTGCTGCATTTCT-3'。PCRのパラメータは、94℃で10秒間の変性、65℃で15秒間のアニーリング、および72℃で1.5分間の伸長を1サイクル、94℃で10秒間の変性、64℃で15秒間のアニーリング、および72℃で1.5分間の伸長を1サイクル、94℃で10秒間の変性、63℃で15秒間のアニーリング、および72℃で1.5分間の伸長を1サイクル、94℃で10秒間の変性、62℃で15秒間のアニーリング、および72℃で1.5分間の伸長を1サイクル、94℃で10秒間の変性、61℃で15秒間のアニーリング、および72℃で1.5分間の伸長を1サイクル、94℃で10秒間の変性、60℃で15秒間のアニーリング、および72℃で1.5分間の伸長を1サイクル、94℃で10秒間の変性、55℃で15秒間のアニーリング、および72℃で1.5分間の伸長を40サイクルである。全フラグメントは、TOPO 2.1 (Invitrogen) にクローニングし、メガベースシークエンサー (Megabase sequencer) を用いて配列決定する。
【０１４９】
ノザンブロット分析
全RNAは、販売元の使用説明書に従ってTriZolを使用して、FVIIa、FX、ASIS、1F44A1またはTF85G9とインキュベートしたBHK-TF細胞から単離する。20μgのRNAは、1% アガロース、20 mM MOPS、5 mM NaOAc、6% ホルムアルデヒド、および1 mM EDTAを含有する変性ゲルでサイズ分画を行い、キャピラリーブロッティングによりハイボンド N+ メンブレン (Amersham) に移し、UV クロスリンキングにより固定する。Fra-1、Id2またはCyr61をコードするcDNAを、[α-32P] dATP (Amersham) を用いてPrime It kit (Stratagene) で標識し、製造社の使用説明書に従ってExpress Hyb (Clontech) を用いてハイブリダイズさせ、結果をオートラジオグラフィーにより可視化する。
【０１５０】
例６ (アッセイ16)
Elk1 転写因子/ルシフェラーゼレポーター (PathDetect) を介したMAPKアッセイ
HeLa細胞を、トランスフェクションの1日前にT-80フラスコに40 %集密状態で播く。細胞は、マニュアルに記載されるとおり36μL FuGene (Roche) を用いて、150 ng pFA-Elk1 (Stratagene)、3μg pFR-Luc (Stratagene)、3μg ヒトTF/pcDNA3および3μg マウスプロテアーゼ活性化レセプター (Protease Activated Receptor) 2/pcDNA3,1+ でトランスフェクトする。翌日、細胞をVerseneTM (Invitrogen) により引き離し、ブラック96ウェルビュープレート (Packard) に、ウェルあたり20,000細胞の細胞密度で播く。細胞をプレートに再接着させた後、培地を、ウェルあたり160μLの血清フリーのダルベッコの改変イーグル培地 (Invitrogen) と交換し、16時間インキュベートする。
【０１５１】
20μL 血清フリー培地 (コントロール)、20μL 2,5μM FFR-rFVIIa (コントロール)、20μL 2,5 M 抗TF Mab Bまたは20μL 2,5μM 抗TF Mab Aの何れかと、細胞を1時間プレインキュベートする。20μL 0,5μM FVIIaをウェルの半数に添加し、他の半数に培地を添加する。インキュベーションから4時間後、細胞にルシフェラーゼ遺伝子アッセイを行う。製造社により記載されるとおりLucLite (Packard) 試薬を細胞に添加する。ルシフェラーゼの発現レベルは、トップカウント・マイクロプレート・シンチレーション (TopCount Microplate Scintillation (Packard)) で読取る。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】ＴＦに対するヒトモノクローナル高親和性抗体を選択するためのスクリーニングアッセイ例の模式図。
【図２】例１に記載されるスクリーニングアッセイ１〜３の詳細な模式図。
【図３】例１に記載されるスクリーニングアッセイ４〜７の詳細な模式図。
【図４】例１に記載されるスクリーニングアッセイ８〜１０の詳細な模式図。
【図５】アッセイ番号４により抗体をスクリーニングする例。FFR-rFVIIa（黒丸）およびヒト抗ＴＦモノクローナル抗体HuTF-31F2（白丸）によるsTF/FVIIaアミド分解活性の阻害。
【図６】アッセイ番号５により抗体をスクリーニングする例。FFR-rFVIIa（黒丸）およびヒト抗ＴＦモノクローナル抗体HuTF-31F2（白丸）による第Xa因子生成の阻害。
【図７】アッセイ番号７により抗体をスクリーニングする例。FFR-rFVIIa（黒丸）およびヒト抗ＴＦモノクローナル抗体HuTF-31F2（白丸）によるヒトＴＦ誘導性凝固の阻害。
【図８】アッセイ番号１０により抗体をスクリーニングする例。FVIIa結合を妨害する抗ＴＦモノクローナル抗体のみがTF/FVIIa介在性シグナリングを阻害する。
【図９】ヒト抗ＴＦ Mabは、p44/42 MAPKのFVIIa誘導リン酸化を阻害する（アッセイ番号１０）。ＴＦでトランスフェクトされたBHK細胞は、２時間血清飢餓の状態にし、細胞を静止させた。FVIIa（15 nM）を添加する15分前に、抗体HuMab 30F5（500 nM）およびHuMab 31F2（500 nM）を細胞に添加した。細胞を溶解し、タンパク質はSDS-PAGEで分離し、エレクトロブロッティングによりニトロセルロースに移した。ウェスタンブロット解析は、p44/42 MAPKに対するポリクローナルホスホ特異的抗体を用いて行った。二次抗体は、ホースラディシュペルオキシダーゼを結合した抗ラビットIgGであった。化学発光の検出は、冷却されたCCDカメラを用いて行った。デジタル画像上のバンドを定量し、FVIIaを用いて得たバンドを100％に設定した。細胞をHuMab 30F5（500 nM）とともにプレインキュベートした場合、リン酸化されたバンドの50％低下が観察され、細胞をHuMab 31F2（500 nM）とともにプレインキュベートした場合、25％低下が観察された。結論として、この実験は、ＴＦに対するヒト抗体（30F5および31F2）は、p44/42 MAPKのFVIIa誘導リン酸化を部分的に阻害することを示す。同様の結果が、50 nM FVIIaを用いて得られた。
【図１０】アッセイ番号１６により抗体をスクリーニングする例。この図は、ＴＦに対するモノクローナル抗体により、ＴＦ発現細胞においてＴＦ細胞内活性が阻害されることを実証する。抗TF Mab Bは、ＴＦ細胞内活性を阻害するが、抗TF Mab Aは阻害しない。
【図１１】アッセイ番号１２により抗体をスクリーニングする例。0.5 nMのFFR-rFVIIaおよびヒト抗ＴＦ抗体HuTF-31F2を用いて得られた血栓弾性記録図の速度プロファイル。
【図１】
2005512970.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2005512970.tif 000010
【図１０】
2005512970.tif 000011
【図１１】
2005512970.tif 000012
【国際調査報告】
2005512970.tif 000013
2005512970.tif 000014
2005512970.tif 000015
2005512970.tif 000016