(57)【要約】本発明は以下の工程を含むＴＢＯ医薬生成物の改良製造方法に関する：（１）インダミンの合成工程；（２）当該インダミンをＳ−インダミニルチオ硫酸に変換する工程；および（３）当該Ｓ−インダミニルチオ硫酸に酸化触媒、錯化剤、および酸を加え、ＴＢＯとＣ−４−メチル位置異性体、およびその誘導体を形成する工程。また、本発明は形成異常組織の検出、ならびに形成異常組織の処置に有用な新規組成物、すなわち、ピーク８、ピーク６、またはその組合せを主として含有するＴＢＯ生成物に関する。出発原料としてのＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンは、ピーク８、７、６および５がそれぞれ約３３：５：５：１の比で含有されるＴＢＯ生成物の組成物を生じる。一方、出発原料としてのＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンは、ピーク６、５、３および２がそれぞれ約３３：５：５：１の比で含有されるＴＢＯデメチル化生成物の組成物を生じる。本発明はさらに改良ＴＢＯ医薬生成物の改良ＰＬＣ分析法であって、その改良点が、第一移動相にイオン対試薬を添加すること、および５０容量％アルコールを含む第二移動相組成物を形成することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第一反応混合物において、出発原料のＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを酸化する工程、
（ｂ）該第一反応混合物にイオウ含有求核試薬源を導入して、第一中間体の置換Ｓ−フェニルチオ硫酸を形成する工程、
（ｃ）さらに該第一中間体をｏ−トルイジンにより酸化し、縮合させて、第二中間体の置換Ｓ−インダミニルチオ硫酸を形成する工程、
（ｄ）さらに該第二中間体を酸化し、第三反応混合物中にＴＢＯ−含有反応生成物を形成する工程、
（ｅ）少なくとも該反応混合物の一つにＴＢＯ−錯化剤を導入する工程、および
（ｆ）該第三反応混合物からＴＢＯ−含有反応生成物を分離する工程
を連続的に含むＴＢＯ生成物の製造方法において、改良点が
（ａ）第一反応混合物において、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンおよびＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する出発原料をｏ−トルイジンの存在下に酸化して、Ｓ−フェニルチオ硫酸を形成することなしに、第一中間体のインダミンを形成する工程、および次いで、
（ｂ）該第一反応混合物にイオウ含有求核試薬源を導入して、第二中間体のＳ−インダミニルチオ硫酸を形成する工程
を連続的に含むことである製造方法。
【請求項２】
新規組成物であって、Ｃ−２位置に環上メチル基を有するＴＢＯを、該組成物の総有機色素含量の少なくとも７３重量％含む組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）インダミンを合成する工程、および
（ｂ）Ｓ−インダミニルチオ硫酸を合成する工程
を含む製造方法。
【請求項４】
該インダミンを合成する工程が、さらにｏ−トルイジン溶液とＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン溶液とを酸および酸化剤の存在下に酸化する工程を含む請求項４記載の製造方法。
【請求項５】
ヒト組織に請求項２記載のＴＢＯ生成物を投与する工程を含む形成異常組織の同定方法。
【請求項６】
ヒト組織に請求項２記載のＴＢＯ生成物を投与する工程を含む形成異常組織の処置方法。
【請求項７】
さらに光毒性作用を制御するために光発生率を変更することを含む請求項６記載の形成異常組織の処置方法。
【請求項８】
さらに化学療法剤と請求項４記載のＴＢＯ生成物とを混合する工程を含む請求項６記載の形成異常組織の処置方法。
【請求項９】
ＴＢＯのＮ−デメチル化誘導体を含む新規組成物であって、該Ｎ−デメチル化誘導体がＣ−２位置に環上メチル基をもち、該組成物の総有機色素含量の少なくとも７３重量％を含む組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）インダミンを合成する工程、および
（ｂ）Ｓ−インダミニルチオ硫酸を合成する工程
を含む製造方法。
【請求項１１】
該インダミンを合成する工程が、さらにｏ−トルイジン溶液とＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン溶液とを酸および酸化剤の存在下に酸化する工程を含む請求項１１記載の方法。
【請求項１２】
ヒト組織に請求項９記載のＴＢＯ生成物を投与する工程を含む形成異常組織の同定方法。
【請求項１３】
ヒト組織に請求項９記載のＴＢＯ生成物を投与する工程を含む形成異常組織の処置方法。
【請求項１４】
さらに光毒性作用を制御するために光発生率を変更することを含む請求項１３記載の形成異常組織の処置方法。
【請求項１５】
さらに化学療法剤と請求項９記載のＴＢＯ生成物とを混合する工程を含む請求項１３記載の形成異常組織の処置方法。
【請求項１６】
Ｃ−２位置に環上メチル基をもつＴＢＯ、およびＣ−２位置に環上メチル基をもつＴＢＯのＮ−デメチル化誘導体を含む新規組成物であって、該ＴＢＯとＮ−デメチル化誘導体を該組成物の総有機色素含量の少なくとも７０重量％含む組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物の製造方法であって、
（ａ）インダミンを合成する工程、および
（ｂ）Ｓ−インダミニルチオ硫酸を合成する工程
を含む製造方法。
【請求項１８】
前記インダミンを合成する工程が、さらにｏ−トルイジン溶液およびＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンとＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン溶液とを酸および酸化剤の存在下に酸化する工程を含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ヒト組織に請求項１６記載のＴＢＯ生成物を投与する工程を含む形成異常組織の同定方法。
【請求項２０】
ヒト組織に請求項１６記載のＴＢＯ生成物を投与する工程を含む形成異常組織の処置方法。
【請求項２１】
さらに光毒性作用を制御するために光発生率を変更することを含む請求項２０記載の形成異常組織の処置方法。
【請求項２２】
さらに化学療法剤と請求項１６記載のＴＢＯ生成物とを混合する工程を含む請求項２０記載の形成異常組織の処置方法。
【請求項２３】
ＴＢＯ色素生成物のＨＰＬＣ分析方法であって、該分析方法が
（ａ）ＴＢＯサンプル溶液を調製する工程、
（ｂ）有機酸の水溶性塩を含む移動相を形成する工程、
（ｃ）ＨＰＬＣカラムを移動相流により平衡化する工程、および
（ｄ）該サンプル溶液をＨＰＬＣカラムに注入する工程
を含み、サンプル色素成分を同定し、また該サンプルの純度をアッセイし、定量するための改良点が、
ヘプタンスルホン酸を含む組成物として該移動相を形成する工程、および
５０容量％アルコールを含む第二移動相組成物を形成する工程
を含む分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国特許第６,０８６,８５２および６,１９４,５７３号明細書に開示されたトルイジンブルーＯ組成物、工程および方法に関する改良であり、これらの特許を参照して本明細書の一部とする。
【０００２】
本発明はヒトでのインビボ投与に適した新規生物学的染色診断用および／または化学療法用組成物に関する。
【０００３】
より詳しくは、本発明は新規のトルイジンブルーＯ（“ＴＢＯ”）色素生成物であって、特定の割合でＴＢＯと特定のＴＢＯ誘導体を含む生成物に関する。
【０００４】
本発明はこれら新規のＴＢＯ生成物を含むＴＢＯ組成物の新規製造方法に関する。
【０００５】
さらに、本発明はこれらの新規ＴＢＯ生成物を含むＴＢＯ構成成分の組成物を確認するＨＰＬＣ分析の新規改良法に関する。改良されたＨＰＬＣ方法は、有機色素含量に対応するＨＰＬＣピークと分解生成物に対応するピークとをより良好な分解能で分離する。さらに、ＨＰＬＣ分析の改良法では、分解生成物と関連して活性有機色素組成物の安定性を示す。
【０００６】
さらに、本発明は形成異常の疑いのある組織、すなわち、異常組織を確認するために、かかる新規ＴＢＯ組成物を使用するインビボ方法に関する。
【０００７】
さらに、本発明は癌組織または前癌組織に対する化学療法剤として、かかる新規ＴＢＯ組成物を使用するインビボ方法に関する。
【０００８】
さらにもう一つのさらなる態様において、本発明は癌組織または前癌組織に対する化学療法剤としての使用に特別に適合させた組成物、そのインビボ診断での使用方法、その治療処置での使用方法、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００９】
扁平上皮癌は、通常表面病変の紅斑とわずかな隆起で始まる。これらの病変は紅色肥厚症と呼ばれ、また初期赤色病変と記載されて、上皮内癌または侵食癌の可能性ありとされる。これらの病変はしばしば無症候性であっても、生検してその組織が悪性であるかどうかを確認すべきである。白斑と呼ばれる他の病変は純白である。これらの内、その１０％のみが上皮内癌または侵食癌と認められる。
【００１０】
扁平上皮癌に共通する部位は、口床、舌、軟口蓋、前扁桃柱、および臼後三角などであり、おそらく、口腔路がしばしばタバコなどで見られるように、より共通して発癌物質に曝されるからである。最近の研究によると、病変の深さは生存率の減少に対応している。
＜２ｍｍ――――９５％
２〜９ｍｍ―――８０％
＞９ｍｍ――――６５％
【００１１】
さらに、初期段階の口腔癌患者は５年生存が７５％であるが、進行した段階では５年生存がわずかに３５％である（非特許文献１）。従って、多様な様式での初期検出と処置が、頭部および頚部癌での良好な予後のために重要である。
【００１２】
上皮染色は、異常な上皮細胞、顆粒、変性上皮細胞、または変性顆粒の目視検出を容易にすることが知られている。
【００１３】
事実、色素ＴＢＯは初期検出のための最適な生検の指標として知られている。該色素は悪性細胞のミトコンドリアにより吸収される。結果として、ＴＢＯはスクリーニングテストとして、また癌組織の位置特定に使用することが可能であるが、その有効性は正常粘膜を染色することなく、悪性および前癌病変部を暗青色に染色することにある。特許文献１（マッシュバーグ（Mashberg））および特許文献２（ツッチ（Tucci）ら）では、形成異常の疑いのある口腔組織を同定し、輪郭を明示するかかるインビボ診断テストについて論じている。
【００１４】
通常の検査は、間接的な鼻咽頭および咽喉のミラー検査とともに頭部および頚部の完全な検査を必然的に伴う。異常性または疑わしい組織が発見された場合、通常、細胞診断のための細い針による吸入生検または切除生検を行う。癌という診断がなされた場合、ワルダイエル輪、下咽頭、鼻咽頭、および他の共通する転移部位と疑わしい病変を無作為に生検すると同時に、全身麻酔のもとに、内視鏡検査を行うことが推奨される。全身に及ぶ通常の血液学検査を実施し、患者の全身にわたる医学的症状と離れた器官への拡大の可能性を評価することが奨励される（非特許文献１）。
【００１５】
２００１年、特許文献３は、ＴＢＯが癌細胞を選択的に殺す有効な色素であると開示した。引続き、特許文献４は、これらの国際公開パンフレットに開示されたＴＢＯ組成物のピーク８またはピーク６により表される化合物が、癌細胞に対する化学療法作用の大部分を示すと開示した。従って、望ましいことは、該薬剤中の他の化合物との関わりで、ピーク８およびピーク６のフラクションにより表される化合物の生成を最大化することである。
【００１６】
古典的なＴＢＯの合成については、特許文献５（ダンドライカー（Dandliker）ら、１８８９年１１月３０日発行）に詳しく記載されている。この合成は連続する５工程として記載されている：（１）Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを、例えば、チオ硫酸ナトリウムの存在下に二クロム酸カリウムにより酸化して、２−アミノ−５−ジメチルアミノフェニルチオスルホン酸（系統的に“置換Ｓ−フェニルチオ硫酸”と命名する）を形成すること；（２）該チオスルホン酸とｏ−トルイジンとを縮合させて対応するインダミンチオスルホン酸（系統的に“置換Ｓ−インダミニルチオ硫酸”と命名する）を形成すること；（３）該インダミン−チオスルホン酸を、例えば、塩化亜鉛の存在下に、沸騰温度で約３０分間、閉環し、ＴＢＯを形成すること；（４）次いで、反応混合物を冷却し、閉環反応のＴＢＯ生成物を、例えば、塩化ナトリウムと塩化亜鉛で処理することにより、錯体形成し、塩析して、ＴＢＯ複合体、例えば、ＴＢＯ／ＺｎＣｌ2複合体を沈殿させること；および最後に（５）精製は繰り返し再溶解と再沈殿により、例えば、塩化亜鉛水溶液に熱時再溶解し、塩化ナトリウム／塩化亜鉛により再沈殿することにより実施し得る。
【００１７】
これらのＴＢＯ組成物は多くの不純物を含んでおり、またそれらの有機色素含量に限りがあった。例えば、ダンドライカー（Dandliker）らが記載している製造方法では、生成した組成物は一般にその色素含量が８０％未満であった。
【００１８】
典型的なＴＢＯ生成物をＨＰＬＣ分析すると、該組成物中の成分を代表する化合物を象徴する８つの主要ピークを示す。真のＴＢＯは“ピーク８”と呼ばれるが、その分子はＮ7，Ｎ7−ジメチル化されており、以下に示すようにＣ−２にメチル基が付いている：
（ピーク８）
【００１９】
【化１】
2005535605.tif 000002
【００２０】
典型的なＴＢＯ生成物の色素含有物はＴＢＯのＣ−４−メチル位置異性体（ピーク７に相当）プラスこれら物質のＮ−デメチル化およびＮ，Ｎ−ジデメチル化誘導体を含んでいたことが現在判明している。さらに、ＴＢＯのＮ−デメチル化誘導体（ピーク５および６に相当）およびそのＣ−４−メチル位置異性体が色素含量の２０％を超えて形成された。
【００２１】
説明すると、他のフラクションは以下のとおりである：
（１）ピーク７：該分子はＮ7，Ｎ7−ジメチル化されており、以下に示すようにＣ−４にメチル基が付いている：
（ピーク７）
【００２２】
【化２】
2005535605.tif 000003
【００２３】
（２）ピーク６および５：それぞれ、ピーク８および７のＮ−デメチル化によって形成される誘導体であり、以下に示される：
（ピーク６）
【００２４】
【化３】
2005535605.tif 000004
【００２５】
（ピーク５）
【００２６】
【化４】
2005535605.tif 000005
【００２７】
（３）ピーク３および２：それぞれ、ピーク６および５のさらにＮ−デメチル化・分解を受けたピークである。
【００２８】
先行技術のＴＢＯ組成物における高率の不純物、色素含量の変わり易いこと、また真のＴＢＯ含有率が比較的低いことなどのために、ＴＢＯ組成物についてヒトで試験するための法的承認を得るには、不純物含量が低く、色素種含量に矛盾がなく、総有機色素含量が高く、また真のＴＢＯ含量のより高いＴＢＯ薬剤を再現性よく製造するための製造方法の開発が必要であった。
【００２９】
法的承認可能なＴＢＯの組成物を開発する際に、バーケット（Burkett）は特許文献６および特許文献７に記載しているように、ＴＢＯ薬剤の組成物およびその製造方法、用途、および分析に改良を加えた。
【特許文献１】米国特許第４,３２１,２５１号明細書
【特許文献２】米国特許第５,３７２,８０１号明細書
【特許文献３】国際公開第０１／６４１１０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／６４２５５号パンフレット
【特許文献５】米国特許第４１６,０５５号明細書
【特許文献６】米国特許第６,０８６,８５２号明細書
【特許文献７】米国特許第６,１９４,５７３号明細書
【非特許文献１】ジェイ・エマニュエラら（Emmanuella, J.）著、"頭部および頚部癌；扁平上皮癌（Head and Neck Cancer: Squamous Cell Carcinoma）"、メディシン・ジャーナル（Medicine Journal）、第３巻、１号、２００２年１月３日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
ピーク８またはピーク６で表される化合物は、癌細胞および前癌細胞を選択的にマーク
し、また選択的に殺す両方の能力を有することが現在知られているので、製造手法の費用と複雑さを不当に複雑化することなく、ＴＢＯ薬剤におけるこれら化合物の含量を最大化する方法を提供することが強く望まれる。
【００３１】
本発明はピーク８および／またはピーク６それぞれを含むフラクションの最大化して含むＴＢＯ生成物を提供することにより、上記の問題を解決する。従って、本発明は形成異常組織の同定または処置の方法に使用する最も望ましい組成物である。
【００３２】
私はかかる方法、その生成物、およびその薬剤生成物の使用方法と分析法をこの度発見した。
【００３３】
本発明の様々な態様とその実施は、図面と組み合わせて、以下の詳細な説明から当業者にとって明らかであろう。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
先行技術上最も近いＴＢＯの製造方法は、以下の工程、すなわち、（１）第一反応混合物において、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを酸化する工程；（２）当該第一反応混合物にイオウ含有求核試薬源を導入して、第一中間体の置換Ｓ−フェニルチオ硫酸を形成する工程；（３）さらに当該第一中間体をｏ−トルイジンで酸化し、縮合させて、第二中間体の置換Ｓ−インダミニルチオ硫酸を形成する工程；（４）さらに当該第二中間体を酸化し、そのインダミン環を閉環して第三反応混合物中にＴＢＯ−含有反応生成物を形成する工程；（５）当該第三混合物が形成される前に、反応混合物にＴＢＯ−錯化剤を導入する工程；および（６）当該第三反応混合物からＴＢＯ−含有反応生成物を分離する工程；を含んでいた。本発明は前記方法に改良を加えるにあたり、先ず第一反応混合物中、ｏ−トルイジンの存在下に出発原料を酸化する。出発原料は、Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンおよび／またはＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを組合わせてもよいし、単独でもよいが、そのピークに左右されるものであり、ピーク８またはピーク６、またはその組み合わせが最終生成物の主フラクションとして望ましい。本明細書の目的上、ピーク８またはピーク６、またはその組み合わせを主として含有する組成物を“ＴＢＯ生成物”という。
【００３５】
出発原料としてのＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンは、ピーク８、７、６、および５を、それぞれ３３：５：５：１の大よその比で含有するＴＢＯ生成物の組成物を生じる。
【００３６】
一方、出発原料としてのＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンは、ピーク６、５、３、および２を、それぞれ３３：５：５：１の大よその比で含有するＴＢＯデメチル化生成物の組成物を生じる。
【００３７】
従って、出発原料、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンおよび／またはＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン、およびｏ−トルイジンを含む反応混合物の酸化は、イオウ含有求核試薬源を導入する前に、起こる。上記の変法は全く予測し得ないＴＢＯ生成物の組成物、すなわち、ピーク８および６それぞれの産生を最大化する組成物を生じる。これらの組成物は望まれていながら今日までなお達成されていなかった。
【００３８】
出発原料としてのＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンに関連して、本発明はＴＢＯおよびそのＣ−４−メチル位置異性体および当該異性体のＮ−デメチル化誘導体を含む新規組成物に関する。より詳しくは、該組成物をＨＰＬＣ分析（２９０ｎｍで）すると、当該異性体を表すＨＰＬＣピークの合計面積と、当該Ｎ−デメチル誘導体を表すピークの合計面積の比が少なくとも約７：１であることが明らかとなる。
【００３９】
もう一つの態様において、該組成物はＴＢＯを表すＨＰＬＣピークの面積と、そのＣ−４−メチル位置異性体を表すピークの面積の比が少なくとも約６：１である。
【００４０】
さらにもう一つの態様において、ＴＢＯは当該組成物の総有機色素含量の少なくとも７３重量％含まれる。
【００４１】
出発原料としてのＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンに関連して、本発明はＴＢＯのＮ−デメチル化誘導体およびそのＣ−４−メチル位置異性体を含む新規組成物に関する。より詳しくは、該組成物をＨＰＬＣ分析（２９０ｎｍで）すると、当該Ｎ−デメチル化誘導体を表すＨＰＬＣピークの合計面積と、当該さらなるＮ，Ｎ−デメチル誘導体を表すピークの合計面積の比が少なくとも約７：１であることが明らかとなる。
【００４２】
もう一つの態様において、該組成物はＣ−２位置に環上メチル基をもつＮ−デメチル化誘導体を表すＨＰＬＣピーク面積と、Ｃ−４位置に環上メチル基をもつＮ−デメチル化誘導体を表すピーク面積との比が、少なくとも約６：１である。
【００４３】
さらにもう一つの態様において、Ｃ−２位置に環上メチル基をもつＮ−デメチル化誘導体は、当該組成物の総有機色素含量の少なくとも７３重量％含まれる。
【００４４】
さらにもう一つの態様において、当該組成物の総有機色素含量は、主としてＴＢＯとＣ−２位置に環上メチル基をもつＮ−デメチル化誘導体の混合物を含む。
【００４５】
前述の組成物は形成異常組織の同定法ならびに化学療法処置に重要である。
【００４６】
本発明のさらにもう一つの態様において、ＴＢＯ生成物はＴＢＯ生成物の化学療法処置効果の強さを改変するために、光線力学療法に採用する。それを実施する際の光発生頻度は、ＴＢＯ生成物の適用と組合わせて制御する。化学療法処置における光線力学応答は、光と薬物両者の関与する組合せ療法として１９６０年代以来既知であった。薬物を適用した際、光はその特定波長の性質と強度によりその領域を照らし変化して、薬物の作用を活性化または強める。
【００４７】
ＴＢＯ生成物の製造方法は以下の工程を含む：インダミンを合成する工程；該インダミンをＳ−インダミニルチオ硫酸に変換する工程；さらにＳ−インダミニルチオ硫酸を酸化剤で酸化する工程；および最後に該反応物と錯化剤とを複合反応させてＴＢＯ組成物を形成する工程。新規ＴＢＯ生成物の組成物をさらに正確に同定するために、ＴＢＯ色素生成物のＨＰＬＣ分析改良法をも開示するが、その場合には移動相を特別に移動相組成物に適合させ、イオン対試薬を添加した。開示したＨＰＬＣ法は有機色素生成物に対応するＨＰＬＣピークを分解生成物と対応するピークから、全く新しいレベルの感度で分離を可能とする。
【００４８】
本発明はＴＢＯの新規適用を提供するが、ここではより純粋なＴＢＯ生成物の組成物、例えば、ピーク８および／または６を癌組織に適用し、癌細胞または前癌細胞を選択的に除くかまたは減弱させる。さらに、我々の知識では、本発明はこれまでに製造された中で最も純粋なＴＢＯ組成物を製造する方法を提供する。その結果、本発明は癌組織または前癌組織の位置を確認するための臨床手法に使用するより純粋な染色色素を提供する。
【００４９】
さらに、ＴＢＯおよびＴＢＯ誘導体フラクションの単離および同定において改良された分解能を与えるより高感度のＨＰＬＣ法を開示する。改良はＴＢＯ色素生成物の既知ＨＰＬＣ分析法に基づき構築するもので、該方法は、ＴＢＯサンプル溶液を形成すること、有
機酸の水溶性塩を含有する移動相を形成すること、ＨＰＬＣカラムを移動相流で平衡化すること、およびサンプル溶液をＨＰＬＣカラムに注入することを含む。該改良点は：（１）イオン対試薬を含む組成物として移動相を形成すること；および（２）５０容量％アルコールを含む第二移動相組成物を形成することである。
【００５０】
発明の詳細な説明
添付の図面は本発明の好適な態様を説明するものであり、この場合には出発原料がＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンである。当該図面は本発明を限定して、出発原料としてのＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを排除しようとするものではなく、これを使用して、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンが反応して、主としてピーク６を含むＴＢＯ生成物を形成する場合と殆ど同じ反応のモデルを提供するものである。
【００５１】
添付の図１および２を参照すると、組成物に関する本発明はピーク８（１０）（本明細書では“ピーク８”という）と指定したフラクションを含み、このピークが生成物全体の重量パーセントを大きく引き上げることとなり、ピーク７（１２）、６（１４）、５（１６）、３、および２との関係においても大きなパーセントとなっている。
【００５２】
より詳しくは、本発明は最大重量パーセントのピーク８（１０）を有する組成物について、その製造と最終的分析に関わり、その場合のＴＢＯおよびＣ−４−メチル位置異性体（ピーク８（１０）および７（１２））は、ＴＢＯとＣ−４−メチル位置異性体のＮ−デメチル化フラクション（ピーク６（１４）および５（１６））の重量出来高の７倍である。より詳しくは、ピーク８（１０）はピーク７（１２）よりも多く、６：１の比で産生される。
【００５３】
ピーク８（１０）および６（１４）はそれぞれＴＢＯおよび対応するＮ−デメチル化誘導体に相当し、この場合の環上メチル基はＣ−２位置である。それに対し、ピーク７（１２）および５（１６）はそれぞれＴＢＯのＣ−４−メチル位置異性体および対応するＮ−デメチル化誘導体に相当し、この場合の環上メチル基はＣ−４位置である。癌患者の検出と処置に関しては、ピーク８（１０）が組織染色と癌の処置のために他のフラクションよりもより効果的であると確信する。
【００５４】
光線力学療法に際し、ＴＢＯ生成物の混合物と光を組合わせる場合の光学的パラメータの決定は、特定の癌のタイプならびに患者の感受性によって異なる。内視鏡または同様の手段により、光の発生率は波長および／または強度により加減し得る。従って、当業者は最適な薬物相互作用のために、ＴＢＯ生成物の混合物と組合わせる最適な光線の特徴を決定するための十分な情報を有している。
【００５５】
本ＴＢＯ組成物の製造方法は、ＴＢＯ生成物の既知製造方法の改良である。より詳しくは、該改良法では、バーケット（Burkett）が米国特許第６,１９４,５７３号明細書に記載している製造方法に記載の第二工程と第三工程を逆にすることを必要とする。工程の逆転は、それによってイオウ含有求核試薬源の導入前に、安定化溶液中でＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンとｏ−トルイジンを混合することであり、全く予期しなかったＴＢＯの組成物を生じる。さらに、得られる組成物は癌の検出と処置において大いに望ましいものであり、化学と薬理学分野の専門家にとって予期せざる生成物である。
【００５６】
一般に、該方法はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンとｏ−トルイジンの溶液の安定化剤による酸化を必然的に伴う。酸化に続いて、酸を導入する。次いで、錯化剤、酸化剤、およびイオウ含有求核試薬源を加える。この時点で、中間体、Ｓ−インダミニルチオ硫酸（４０）が生じる。次いで、Ｓ−インダミニルチオ硫酸（４０）を酸化剤で酸化し、引き続き、錯化剤、酸化触媒、および酸を加える。
【００５７】
図３は以下の工程、表示した工程１〜４の参考として提供するものであり、ＴＢＯ組成物の製造に関し、本発明の好適な態様を詳細に記載するものである。
【００５８】
工程＃１−インダミンの合成
丸底フラスコ中、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩の粉末５ｇをＵＳＰ精製水１５５ｇに加え、３００ｒｐｍで撹拌する。このＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン反応混合物（２０）は≦１０℃に維持すべきであり、１０分間撹拌する。
【００５９】
ｏ−トルイジン塩酸塩はｏ−トルイジン２．８ｇに塩酸（６Ｎ）６．３ｇをゆっくり加えることにより調製する。ｏ−トルイジン塩酸塩溶液（２２）は澄明となるまで撹拌すべきである；もし結晶が出てくるならば、最少量のＵＳＰ精製水を加えて、ｏ−トルイジン塩酸塩結晶を再溶解すべきである。
【００６０】
ｏ−トルイジン塩酸塩の溶液（２２）をＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩の反応混合物（２０）に加え、次いでさらに２ｇのＨＣｌ（６Ｎ）（２４）を添加する。反応混合物（２６）は〜１０℃以下に維持し、氷上４５分間撹拌する。
【００６１】
滴下漏斗を使用することにより、二クロム酸溶液（２８）２９．２５ｇ（二クロム酸カリウム９．３９ｇをＵＳＰ精製水１０８ｇに加えることにより調製）をｏ−トルイジン塩酸塩とＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩の反応混合物（２６）にゆっくりと（２０分を要して）滴下する。二クロム酸溶液（２８）をすべて加えた後、インダミン二塩酸塩反応混合物（３０）は〜１０℃以下に維持し、氷上６０分間撹拌する。反応混合物がインダミン二塩酸塩とその誘導体とを含むことは当業者にも理解される。
【００６２】
理解すべきことは、現在、塩酸は出発原料（Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンおよび／またはＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン）とｏ−トルイジン両方にとって適切な安定化剤である信じられることである。従って、前記工程では成分であるＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩の粉末およびｏ−トルイジン塩酸塩の溶液について、それぞれが塩酸により安定化した形状であると記載している。しかし、本発明はいずれかの特定の安定化剤に限定されるものではなく、従って、塩酸を他の適切な安定化剤に置き換えることも可能であり、当業者も一連の既知安定化剤が包含されることを理解しよう。
【００６３】
上記工程１にて記載した化学反応図式を図４に示すが、この図はその反応物と生成物を分子の形状で示すものである。
【００６４】
工程＃２−Ｓ−インダミニルチオ硫酸の合成
硫酸アルミニウム溶液（３２）を調製することにより酸とするが、この溶液は硫酸アルミニウム１６水和物８．７５ｇをＵＳＰ精製水１５ｇに添加することにより調製する。この酸をインダミン二塩酸塩の反応混合物（３０）に加え、１０分間撹拌する。硫酸アルミニウム１６水和物以外の酸でも適切であり得る。
【００６５】
錯化剤は塩化亜鉛溶液（３４）を作製することにより調製する；すなわち、塩化亜鉛１２．２２ｇをＵＳＰ精製水１５ｇに添加することにより調製する。この錯化剤はインダミン二塩酸塩の反応混合物（３０）に加え、１０分間撹拌する。理解すべきことは、好適な態様では塩化亜鉛を含むが、他の錯化剤も適切であり、本発明に包含されることである。
【００６６】
酸化剤は二クロム酸溶液（３６）２９．２５ｇを作製することにより調製する；すなわち、二クロム酸カリウム９．３９ｇをＵＳＰ精製水１０８ｇに加えることにより調製する
。この酸化剤は滴下漏斗によりインダミン二塩酸塩の反応混合物（３０）にゆっくり（２０分を要して）加え、氷上で２０分間撹拌する。
【００６７】
イオウ含有求核試薬源はチオ硫酸ナトリウム溶液（３８）を作製することにより調製する；すなわち、チオ硫酸ナトリウム５水和物６．５３ｇをＵＳＰ精製水１５ｇに加えることにより調製する。このイオウ含有求核試薬源はインダミン二塩酸塩の反応混合物（３０）にゆっくりと加え、氷上で６０分間撹拌する。形成する沈殿はＳ−インダミニルチオ硫酸（４０）とその誘導体からなる。当業者には理解し得るように、他のイオウ含有求核試薬源もチオ硫酸ナトリウムの溶液（３８）に替えて使用してもよい。
【００６８】
上記工程２にて記載した化学反応図式を図５に示すが、この図はその反応物と生成物を分子の形状で示すものである。点線は２個の炭素にＳ−ＳＯ3-が結合しているように見えるが、この点線はＳ−ＳＯ3-がいずれの炭素にも付着し得ることを意味する。
【００６９】
工程＃３−ＴＢＯおよびＴＢＯ亜鉛複塩の合成
Ｓ−インダミニルチオ硫酸（４０）は１０℃以下に維持する。酸化剤は、滴下漏斗により、ゆっくり（２０分を要して）Ｓ−インダミニルチオ硫酸（４０）に滴下し、２０分間撹拌する。現在、二クロム酸溶液（４２）２９．２５ｇを酸化剤として使用するのが適当であると信じる。
【００７０】
酸化したＳ−インダミニルチオ硫酸の反応混合物（４４）に、錯化剤、好ましくは塩化亜鉛溶液（４６）２７．０ｇ（塩化亜鉛１２．２２ｇをＵＳＰ精製水１５ｇに加えて調製）を加えて、５分間撹拌する。酸化触媒、好ましくは硫酸銅溶液（４８）１７．３ｇ（硫酸銅２．３８ｇをＵＳＰ精製水１５ｇに加えて調製）を加えて、５分間撹拌する。
【００７１】
温度設定点を６０℃に変える。反応物が６０℃に達した段階で、酸、好ましくは硫酸溶液（９Ｎ）（５０）を加えてｐＨ２．９に下げる。それぞれの添加後に５分間撹拌する。温度設定点を９７℃に変える。反応混合物が９７℃に達した段階で、３５分間撹拌する。反応混合物（５２）をゆっくりと室温まで冷やす。室温に達した時点で、ＴＢＯの粗製混合物（５４）を含む生成物を５℃のクーラーに入れる。５〜１５時間貯蔵する。粗製ＴＢＯ生成物の混合物（５４）の一部を取り出し、０．４５μｍフィルターで濾過する。濾液をバイアルに容れ、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＴＢＯ分析法により分析する。
【００７２】
上記工程３にて記載した化学反応図式を図６に示すが、この図はその反応物と生成物を分子の形状で示すものである。
【００７３】
明らかに、他の錯化剤、イオウ含有求核試薬、酸化剤、酸化触媒、および／または酸も採用し得る；また、前記工程では本発明の好適な態様であると現時点で信じられる錯化剤、還元剤、酸化剤、酸化触媒、および／または酸が開示されていると解釈すべきである。
【００７４】
工程４−精製
当業者は最終の反応混合物がＴＢＯとＣ−４−メチル位置異性体、およびその誘導体を含むことを理解されよう。溶液の精製法（５６）については、米国特許第６,１９４,５７３号明細書に記載されているように、当業者既知であり、従って、参照により本明細書に含まれる。
【００７５】
適切な実験室の備品および安全上の手法については、当業者が理解し、実施しているとおりである。米国特許第６,０８６,８５２号明細書に記載されている実験室備品は、上記の手法を遂行するために適切であり、従って、参照による本明細書の一部である。
【００７６】
ＴＢＯを製造する前記の工程は、すでに記載された方法とは異なるものであり、該方法ではｏ−トルイジン塩酸塩の溶液（２２）と出発原料のＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩の溶液（２０）との混合が、インダミン二塩酸塩反応混合物（３０）を製造する最初の工程で、かつチオ硫酸ナトリウム（３８）添加の前で起こる。さらに、ＴＢＯを製造する前記の工程は、塩酸（２４）とクロム酸カリウム（２８）を加え、次いで、他の試薬類をｏ−トルイジン塩酸塩（２２）と出発原料のＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩（２０）の反応混合物に加える点でも既知方法と異なる。
【００７７】
本発明はまた改良組成物の改良ＨＰＬＣ分析法をも包含する。改良ＨＰＬＣ分析法は、新規のＨＰＬＣ法により定量されたそれぞれのピーク面積に基づき、重量比をより確実なものとして明示する。以下の比はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンが出発原料である場合のＴＢＯ生成物に関する：
ａ）ピーク８（１０）／ピーク７（１２）は約６：１である。
ｂ）ピーク（８（１０）＋７（１２））／ピーク（６（１４）＋５（１６））は約７：である。
ｃ）ピーク５（１６）＋６（１４）＋７（１２）＋８（１０）は、色素含量の約９５重量％である。
ｄ）ピーク５（１６）＋６（１４）＋７（１２）＋８（１０）は、不純物を含む総生成物の約７５重量％である。
ｅ）ピーク（３＋６（１４）＋８（１０））／（２＋５（１６）＋７（１２））は、約７：１である。
【００７８】
同様に、以下の比はＮ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンが出発原料である場合のＴＢＯ生成物に関する：
ａ）ピーク６／ピーク５は約６：１である。
ｂ）ピーク（６＋５）／ピーク（３＋２）は約７：１である。
ｃ）ピーク２＋３＋５＋６は色素含量の約９５重量％である。
ｄ）ピーク２＋３＋５＋６は不純物を含む総生成物の約７５重量％である。
ｅ）ピーク（３＋６）／（２＋５）は、約７：１である。
【００７９】
図１および２はそれぞれ、本明細書に記載の改良ＨＰＬＣ分析法、および既知ＨＰＬＣ分析法での分析から得られるクロマトグラムである。図１および２の観察結果は、各方法論が教示する流れ勾配が異なり比較し得ること、ならびに本発明に関する図１においてピーク７（１２）、ピーク６（１４）、およびピーク５（１６）と比較してピーク８（１０）の面積が増加していることを示している。クロマトグラフィーの専門家は、本発明手法がＴＢＯ生成物の組成物の分解能に優れていること、また安定性を示していることを観察するであろう。さらに、この優れた分解能は、開示したＨＰＬＣ分析が証明するように、ＴＢＯ分解生成物のさらなる同定を可能とする。かかる同定は、これまで従前の方法では達成が難しかったものである。
【００８０】
新規ＨＰＬＣ分析方法
本実験室方法では、ＴＢＯ生成物混合物とその誘導体の検出および定量のアッセイ手法につき記載する。クロマトグラフィーの専門家が理解しているように、様々の仕分けした計量ピペットとフラスコが、カラムおよびＨＰＬＣ分析計とともに必要である。カラムとＨＰＬＣ分析計については、５μｍの充填物の２５０×４．６ｍｍのＣ１８ウオーターズ・シンメトリーカラムおよびＨＰＬＣ分析計ＨＰ１１００、１０５０またはその等価機器が適当である。
【００８１】
改良ＨＰＬＣ分析は既知分析法に基づく改良であり、移動相にイオン対試薬としてヘプタンスルホン酸ナトリウム塩を加えたものである。ここで、該イオン対試薬は特にＴＢＯ
組成物の分離を容易にするものである。さらに、ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩は他の化合物、とりわけ酸性またはカチオン性化合物の分離を容易にする。すでに開示されているイオン対試薬では、ＴＢＯ有機色素に対応するピークと分解生成物に対応するピークとの間の分解能を達成することができない。
【００８２】
既知ＨＰＬＣ分析法に対するもう一つの重要な改良点は、アルコールを含む第二移動相を設けたこと、および移動相溶媒を５０：５０のＨＰＬＣ移動相溶媒／アルコール移動相としたことである。
【００８３】
さらにもう一つの重要な改良点は、流速を１．５ｍＬ／分から１．０ｍＬ／分に調整し、活性ピークと分解生成物の間の分解能を上げたことである。
【００８４】
クロマトグラフィーの専門家が理解しているＨＰＬＣ分析の分解能と精度を最適化する他の特定パラメーターは、操作条件によっても変わり得る。これらのパラメーターは分析条件を取り巻く種々の環境に依存的に変わり得るが、それらは本発明によって本明細書に包含されるものである。
【００８５】
本発明の範囲を限定するものではないが、ＴＢＯ生成物のＨＰＬＣ分析に関する好適な態様は、以下の特定のパラメーターである：（１）波長：２９０ｎｍ；（２）流速：１．０ｍＬ／分；（３）注入容量：２０μＬ；（４）温度：４０℃；（５）２つの移動相：
［Ａ］：１０ｍＭ酢酸アンモニウム＠１．０ｇ／Ｌの１−ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩によりｐＨ３．５；および
［Ｂ］：５０：５０のＡＣＮ／メタノール；および
（６）以下の流れ勾配：
時間（分）      移動相Ｂ％
０．０        ３０．０
１５．０        ３０．０
２０．０        ２９．０
５６．０        ２９．０
６３．０        ５０．０
７５．０        ５０．０
７６．０        ３０．０
８３．０        ３０．０
【００８６】
ＨＰＬＣ調製：
以下にはＴＢＯ組成物の別個の成分を分析するＨＰＬＣ分析法の好適な態様について記載する。改良ＨＰＬＣ法を実施するために必要な試薬は以下のとおりである：精製水、移動相溶媒（例えば、ＨＰＬＣ用基準アセトニトリル（ＡＣＮ））、バッファー塩（例えば、酢酸アンモニウム（ＣＨ3ＣＯＯＮＨ4））、試薬用の酸（例えば、氷酢酸）、試薬用の塩基（例えば、水酸化アンモニウム（ＮＨ4ＯＨ））、第二基準（Ｚ９７２３１Ａ．ＤＳ）または等価物、およびヘプタンスルホン酸ナトリウム塩。
【００８７】
移動相Ａは一般に適切なバッファー塩とＨ2Ｏとを混合することにより、好ましくは約０．７７ｇの酢酸アンモニウムを１．０ＬのＨ2Ｏに溶解し、混合することにより調製する。ｐＨは酸または塩基により３．５に調整するが、例えば、氷酢酸またはナトリウム塩を加えて混合する。最後に、この溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過する。
【００８８】
移動相Ｂは一般に等容量の移動相溶媒とアルコールを加えることにより調製する；例えば、好ましくは１０００ｍＬのメスシリンダーに５００ｍＬのＡＣＮと５００ｍＬのメタノールを加え、混合することにより調製する。好適な態様として、容量比５０：５０の移
動相溶媒とアルコールを記載しているが、明らかにしておくべきことは、操作条件と他のパラメーターによっては移動相とアルコール間の容量測定比の異なる第二移動相をも包含することである。
【００８９】
サンプル希釈剤は、９０：１０の移動相Ａ：移動相溶媒溶液によるものであり、一般に１０．０ｍＬのＡＣＮを純移動相Ａ９０．０ｍＬ（ヘプタンスルホン酸ナトリウム塩は含まず）に加え、混合することにより調製する。理解すべきことは、サンプル希釈剤はＡＣＮを含むものに限定されるものではなく、技術上既知の様々な移動相が適当であり得ることである。
【００９０】
分析用には、工程１〜３に従い、１００ｍＬ計量フラスコに約１５０ｍｇのＴＢＯ生成物を重量測定して容れ、サンプル希釈剤中０．１５ｍｇ／ｍＬサンプル溶液とする。サンプル希釈剤で容量希釈し、混合する。この最初の保存液１０ｍＬを第二の１００ｍＬ計量フラスコにピペットで入れる。サンプル希釈剤で容量的に希釈し、混合する。
【００９１】
品質対照基準サンプルは、１００．０ｍＬ計量フラスコに約１５０ｍｇのＴＢＯを重量測定して容れ、サンプル希釈剤中０．１５ｍｇ／ｍＬサンプル溶液とすることにより調製する。サンプル希釈剤で容量希釈し、混合する。この最初の保存液１０ｍＬを第二の１００ｍＬ計量フラスコにピペットで容れ、サンプル希釈剤にて１００．０ｍＬ容量に希釈し、混合する。一般に標準操作手順および品質管理を考慮して２種類の標準サンプルを調製する。
【００９２】
ＨＰＬＣシステムの安定性を評価するために、先ずＨＰＬＣに標準液２０μＬを注入し、キャパシティファクター（ｋ’）、ピーク５（１６）≧ピーク８（１０）を得る。活性ピーク（５（１６）、６（１４）、７（１２）、および８（１０））についてのテーリングファクターは２．５以下とすべきである。さらに、いずれかの活性ピークとその最も近くの隣接位ピーク間の分解能は１．０を下回らないこととする。
【００９３】
第二標準を分析し、調製の精度を作業標準に対して評価する；第二標準は理論濃度の９７．０％と１０３．０％の間でなければならない。
【００９４】
実験作業の終末点で標準について２回注入を行い、当初の標準総面積の９６．０〜１０４．０％内に入ることを確認する。
【００９５】
ＨＰＬＣ分析：
最初に標準溶液２０μＬずつを少なくとも５回ＨＰＬＣに注入し、繰返し注入に対する活性ピーク面積≦２．０％ＲＳＤの総ピーク面積応答を得る。次に、各サンプル調製物を２回ずつ、標準検定に使用されると同じクロマトグラフ条件下で、ＨＰＬＣに注入する。
【００９６】
サンプル調製物におけるＴＢＯ生成物混合物のピークの相対的保持時間（ＲＲＴ）は、標準調製物におけるＴＢＯ生成物混合物活性ピークの相対的保持時間に対応しているべきである。ピーク間の比は０．９８〜１．０２の範囲内になければならない。
【００９７】
個々のピークの％重量／総重量を計算するための指標は以下のとおりである：
＊ピーク５（１６）[ＴＢＯ]、％ｗ／ｗ＝（Ｃｎ/Ｃsx）(Ｒsx/Ｒstd)
（標準におけるピーク５（１６）の重量％）
式中、
Ｃn＝標準品におけるＴＢＯの濃度、ｍｇ／ｍＬ
Ｃsx＝サンプル調製品におけるＴＢＯ生成物混合物の濃度、ｍｇ／ｍＬ
Ｒsx＝サンプル調製品におけるＴＢＯ生成物混合物の平均ピーク５（１６）の面積
Ｒstd＝標準調製品におけるＴＢＯの平均ピーク５（１６）の面積
＊標準におけるこれらピークの対応する重量パーセントを用い、ピーク６（１４）、７（１２）、および８（１０）についての計算を繰り返す。
【００９８】
４つすべての主要ピーク（５（１６）、６（１４）、７（１２）、８（１０））を総計することにより、ＴＢＯ生成物混合物の総重量パーセントを計算する指標は以下のとおりである：
総アッセイ値＝％ｗ／ｗピーク５（１６）＋％ｗ／ｗピーク６（１６）＋
％ｗ／ｗピーク７（１２）＋％ｗ／ｗピーク８（１０）
【００９９】
クロマトグラフ純度（面積％純度）を計算する指標は以下のとおりである：
面積％純度＝［サンプル中ピークの平均合計（５（１６）、６（１４）、７（１２）、８（１０））］／（サンプル中すべてのピークの平均合計）  ×  １００％
【０１００】
以上、私の発明につき、当業者がそれを理解し、実施することの可能な用語を用いて記載し、また現時点で好適な最良のその形態を示した；私は別添の「特許請求の範囲」に記載した通りに特許を請求する。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明のＴＢＯ生成物組成物の特徴的なピークを描出する２９０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである；この場合の出発原料はＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンである。
【図２】ＴＢＯの最大量単離と産生について以前に記載されたＴＢＯ生成物組成物の特徴的なピークを描出する２９０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】ＴＢＯ生成物製造のための本発明の好ましい態様を描出する工程図であり、出発原料をＮ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンとした場合の本発明の新規ＴＢＯ生成物組成物について示す。
【図４】Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを出発原料とするＴＢＯ製造方法の第一工程における化学反応であり、反応物と中間体の化学構造により示す。
【図５】Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを出発原料とするＴＢＯ製造方法の第二工程における化学反応であり、反応物と中間体の化学構造により示す。
【図６】Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミンを出発原料とするＴＢＯ製造方法の第三工程における化学反応であり、反応物と生成物の化学構造により示す。
【図１】
2005535605.tif 000006
【図２】
2005535605.tif 000007
【図３】
2005535605.tif 000008
【図４】
2005535605.tif 000009
【図５】
2005535605.tif 000010
【図６】
2005535605.tif 000011
【国際調査報告】
2005535605.tif 000012