(57)【要約】【課題】【解決手段】  抗原特異的抗原結合ドメインを、当該抗原特異的抗原結合ドメインをコードする発現可能なＤＮＡ配列を含む形質転換された宿主を用いて製造するための方法であって、上記抗原特異的抗原結合ドメインは魚において見出された免疫グロブリンアイソタイプＮＡＲの可変領域に由来する、方法。
2005515165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的抗原結合ドメインを、当該抗原特異的抗原結合ドメインをコードする発現可能なＤＮＡ配列を含む形質転換された宿主を用いて製造するための方法であって、前記抗原特異的抗原結合ドメインは魚において見出された免疫グロブリンアイソタイプＮＡＲの可変領域に由来する、方法。
【請求項２】
前記形質転換した宿主は、原核生物または下等な真核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記真核生物の宿主はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現可能なＤＮＡ配列は、ファージミドベクターの形態を有する、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
前記魚は板鰓亜綱の種である、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
前記板鰓亜綱の種はサメまたはコザメである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サメはテンジクザメである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原特異的抗原結合ドメインは特定の特異性を有する、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原特異的抗原結合ドメインはモノクローナルである、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原特異的抗原結合ドメインの特異性は、選択された魚に導入される抗原によって決定される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
抗原特異的抗原結合ドメインを製造するための方法であって、
ａ）抗原で前記板鰓亜綱のメンバーを免疫化する工程と、
ｂ）前記メンバーからリンパ球を単離する工程と、
ｃ）ＲＮＡを前記リンパ球から単離する工程と、
ｄ）前記抗原特異的抗原結合ドメインをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅する工程と、
ｅ）前記増幅されたＤＮＡをディスプレイベクターにクローン化する工程と、
ｆ）宿主を形質転換することによりライブラリーを生成する工程と、
ｇ）前記所望のクローンを前記ライブラリーから選択する工程と、
ｈ）前記抗原特異的抗原結合ドメインをこれらのクローンから単離精製する工程と、
ｉ）前記抗原特異的抗原結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローン化する工程と、
ｊ）宿主を形質転換することにより前記発現ベクターの発現を可能にする工程と、
を包含する方法。
【請求項１２】
工程ｄ）の前に、前記抗原特異的抗原結合ドメインのｃＤＮＡを生成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
制限酵素を用いて、前記抗原特異的抗原結合ドメインをコードする増幅されたＤＮＡ配列を消化する、請求項１１または１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記制限酵素はＮｃｏＩおよびＮｏｔＩである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ディスプレイベクターは任意のファージミドベクターである、請求項１１〜１４のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ディスプレイベクターはｐＨＥＮ２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターは可溶性発現ベクターである、請求項１１〜１６のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記可溶性発現ベクターはｐＩＭＳ１００である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のうちのいずれかに記載の方法により製造された抗原特異的抗原結合ドメイン。
【請求項２０】
魚において見出された免疫グロブリンアイソタイプＮＡＲの可変領域に由来する抗原特異的抗原結合ドメインを含む、タンパク質活性を阻害する組成物。
【請求項２１】
前記抗原特異的抗原結合ドメインは、請求項１〜１８のうちのいずれかに記載の方法によって生成される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
タンパク質活性の阻害を濃度依存的に行う、請求項２１または２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
薬剤担体またはその希釈液に含まれる、請求項２０〜２２のうちのいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
ＮＡＲの可変領域から製造された抗原特異的抗原結合ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、魚類由来の抗原特異的抗原結合ドメイン（単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））の製造に関する。ここで、魚類という用語は、軟骨魚（板鰓亜綱）および硬骨魚（硬骨魚綱）の両方を含む。抗原特異的抗原結合ドメインとは、新規な抗原受容体（Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＡＲ））の可変領域を意味する。
【背景技術】
【０００２】
抗体、特にモノクロナール抗体は、その高親和性結合および特異性により、とりわけ、分子診断および治療に有効である。しかしながら、現在では動物モデルを用いてモノクロナール抗体を製造することは比較的に簡単であるにも関わらず、ヒトモノクロナール抗体の製造は困難なままである。理解されるように、ヒト以外のモデルからのモノクロナール抗体がヒトに導入されると、人体は免疫応答を起こすが、これは、モノクロナール抗体が人体システムに対しては外来であるためである。
【０００３】
近頃、関連する抗体の可変鎖から単一ドメイン抗体（ｓｄａ）を製造することにより、ヒトにおけるモノクロナール抗体の活性を保つ一方で、その拒絶を低減し得ることが分かってきた。欧州特許出願第８９３１１７３１．７号は、そのような単一ドメイン抗体、およびマウスにおけるその製造方法を開示している。
【０００４】
単一ドメイン抗体はまた、連結するあらゆる化合物とともに組織を透過し得るため重要である。さらに、タンパク質の表面上の空洞内、例えば、酵素結合部位内で結合することにより機能を破綻させ得る。
【０００５】
Ｃａｍｅｌｉｄａｅから製造された単一ドメイン抗体は、タンパク質の空洞を認識し、そのため、酵素を阻害する能力を有することが示されてきた（Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  １７  ｐｐ３５１２−３５２０  １９９８）。
【０００６】
Ｃａｍｅｌｉｄａｅから製造された小型の単一ドメイン抗体は、タンパク質の空洞の認識、および酵素活性の阻害を可能にしてきたが、対象となり得る範囲は、依然として比較的に狭いものであり得るが、これは、多くのタンパク質の空洞が依然として小さ過ぎて、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ由来の単一ドメイン抗体が透過し得ないからである。
【０００７】
ＷＯ９４／２５５９１および欧州特許出願番号第９９２００４３９．０号は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ重鎖抗体由来の単一ドメイン抗体の製造に関する。Ｃａｍｅｌｉｄａｅ重鎖抗体から製造された単一ドメイン抗体は、マウスの単一ドメイン抗体よりも安定しており、より多くの量で製造され得る。しかしながら、理解されるように、Ｃａｍｅｌｉｄａｅファミリーの小型のメンバー、例えば、ラマでさえ、人道的条件において飼ったとすると、それらは、飼育のためにかなりの面積の土地を必要とする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、上記問題を改善しようとする、抗原特異的抗原結合ドメインの製造方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、上記問題を改善しようとする、タンパク質活性の阻害のための抗原特異的抗原結合ドメインを含む組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の１つの局面に従って、抗原特異的抗原結合ドメインを、当該抗原特異的抗原結合ドメインをコードする発現可能なＤＮＡ配列を含む形質転換された宿主を用いて製造するための方法であって、上記抗原特異的抗原結合ドメインは魚において見出されたＮＡＲの可変領域に由来する、方法が提供される。
【００１１】
魚において見出されたＮＡＲの可変領域から製造された抗原特異的抗原結合ドメインは、Ｃａｍｅｌｉｄａｅファミリーのメンバーから製造された単一ドメイン抗体と同様に安定している。
【００１２】
さらに、単位面積につき、Ｃａｍｅｌｉｄａｅファミリーのメンバーよりも多くの魚を飼うことができる。
【００１３】
現在ではＮＡＲ（新規な抗原受容体）として公知の免疫グロブリンアイソタイプは、天然に軽鎖は有さないホモ２量体重鎖複合体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）として、テンジクザメ（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ  ｃｉｒｒａｔｕｍ）の血清中で見つかっている（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４  ｐｐ１６８−１７３  １９９５）。しかしながら、本発明者らによる本研究以前には、抗原結合ドメインとしてＮＡＲを識別することも、その特異的な抗原に対して生育される能力も完全には認識されていなかった。
【００１４】
哺乳類（ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、ラマ等）およびいくつかの鳥（ニワトリ）のみが、異物の抗原の存在に対する応答として、親和性成熟、抗体クラスの切替等の二次免疫応答にアプローチし得るものとして考えられていた。例えば、サメよりもさらに高等に進化した真骨魚類（硬骨）は、唯一、低親和性非特異的ＩｇＭ応答の生成のみに依存していると思われる（Ｗａｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｓｔ  Ｖｅｔ  J  ７９  ｐｐ５７０―５７４  ２００１）。真骨魚類ＩｇＭの制限的特徴は、その低親和性および複数の抗原に非特異的に結合する能力である。ＩｇＭ中和は、非特異的多重結合を介し、主に凝集等を生じる。補体のない中和は、通常、特定の高親和性結合に関連するものであり、本発明により初めて魚類において見出された。本発明の抗原特異的抗原結合ドメインについては、免疫系の他の構成要素を用いることなく、酵素免疫源の活性を直接的に中和することが示された。
【００１５】
ＮＡＲ可変（Ｖ）領域は、予測されたカノニカルなドメイン内でのジスルフィド結合により、典型的なＩｇスーパーファミリードメインのモデルに適合する。しかしながら、ラクダＶＨＨ領域が、他の哺乳類のＶＨ領域と最大７５％の配列同一性を有する一方で、ＮＡＲ  Ｖと従来のＶＨドメインとの同一性は２５％と低い（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＵＳＡ  ９５  ｐｐ１１８０４−１１８０９  １９９８）。
【００１６】
この低い同一性と、ＫａｂａｔデータベースにＮＡＲ配列がないことにより、ＮＡＲ  Ｖ領域のアミノ酸は、以前は連続して番号をつけられていた（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＵＳＡ  ９５  ｐｐ１１８０４−１１８０９  １９９８）。本研究中に、異なるＮＡＲ  Ｖ分子またはＮＡＲ  Ｖ領域配列の残基と、他の種のものとの容易な比較を可能にするために、ＮＡＲ  Ｖ領域に対する付番システムを、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５th  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｅｄａ，ＵＳＡ）の付番システムに基づいて導出した（注：この付番システムは、本明細書に添付の図面で用いられている）。
【００１７】
ＣＤＲ２の大部分（残基５４−６５）が欠失することにより、ＮＡＲ  Ｖ領域がその特質的な小型になることが、そのアライメントからすぐに分かる（例えば、図２Ａ参照）。
【００１８】
最初の配列分析により、ＮＡＲ  Ｖドメインを、共に１つのＶセグメント、３つのＤセグメント、および１つのＪセグメントから構成される、密接に関連した２つのクラス（タイプＩおよびＩＩ）に分類することが可能になった。タイプＩ領域は、Ｆｒ２（Ｃ３５）およびＦｒ４（Ｃ１０３）に、ドメインを安定させるジスルフィド結合を形成しやすいノンカノニカルなｃｙｓ残基を有する。長い方のＮＡＲ  ＣＤＲ３ループでは、付加的なシステイン残基対が観察され、ほぼ確実に、通常よりも長いＣＤＲ３を有するウシＶＨドメインで見られるようなジスルフィドブリッジをＣＤＲ内に形成する。
【００１９】
タイプＩＩ領域は、タイプＩと全体的に構造が非常に類似しているが、Ｆｒ１（Ｃ２９）およびＣＤＲ３に位置し、ラクダＶＨＨドメインで観察されるような束縛するジスルフィド結合を形成するとされるノンカノニカルなシステイン残基を有する。各ＮＡＲタイプ内に存在するシステインを図１に模式的に示す。
【００２０】
近頃、さらなるＮＡＲタイプが、テンジクザメの幼魚（タイプＩＩＩ）において優勢な発現形態として同定されたが、その生殖細胞系の連結状態により、結合的な多様性は示さない。
【００２１】
タイプＩおよびＩＩのＮＡＲでは、Ｖ領域をコードするＤＮＡが、ゲノムにおいて空間的に離れたＤＮＡセグメントの物理的な連結によって生成される。この連結プロセスはＢ細胞で発生し、これらのＮＡＲタイプについて見られる配列の多様性を生じることに助力する。タイプＩＩＩについては、これらのＤＮＡセグメントは、全ての細胞のＤＮＡにおいてすでに物理的に連結されており、それゆえ、生殖細胞系が連結されたという言葉を用いる。
【００２２】
ＮＡＲは、通常、軟骨魚類のＩｇ受容体について観察されるクラスタータイプのゲノム組織を持つが、５つ未満のＮＡＲ座が存在し、２つまたは３つのみが、機能的再構成および発現を行うことができると考えられている。一次レパートリーで観察された多様性は、組換え機構によって生じ、（３つのＤセグメントが存在するため）広範囲であるが、ＣＤＲ３に局在化する。抗原に遭遇すると、このレパートリーは、集中的変異により急速に拡大する。ＮＡＲでの変異のパターンは、サメＩｇＭで観察された、低度の変異およびＣＤＲに対する弱いクラスター化を示すものとは異なり、むしろ、間違いなく哺乳類のような体細胞突然変異を伴う。
【００２３】
ＮＡＲ  ＶがＶＨ、ＶＬおよびＴＣＲ  Ｖと類似するが、それら３つの全てとは異なる「特異なドメイン構造」を有することが最近見出された。ＮＡＲの連続部分が重鎖であるため、過去においてＶＨという名が用いられていたが、実際には、Ｖ領域はＶＨ（すなわち、系統樹上でより近いグループ）よりもＶＬ／ＴＣＲ  Ｖに似ている。ＮＡＲ  Ｖは、真正な重鎖Ｖ領域に由来するラクダＶＨＨドメインとは異なる。ＮＡＲの抗原結合ドメインは、元々ＶＨを欠いたＶＬドメインにより近く、その逆ではない。
【００２４】
ＮＡＲ  ＶおよびラクダＶＨＨの配列アライメントは、配列が大きく異なることを明確に示す。ＮＡＲ  ＶおよびラクダＶＨＨが同じ物理構造を有する場合（このことは暗に示されてきたが、証明されていない）、このことは、完全に異なるアミノ酸配列を用いて達成されることになり、ラクダＶＨＨライブラリープライマーを用いてＮＡＲ  Ｖ領域ライブラリーを増幅することは出来ない。さらに、ＶＤＪ結合中のＮＡＲ  ＶおよびラクダＶＨＨ遺伝子レパートリーの生成のされ方は、免疫グロブリン遺伝子の構成のために異なる（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １８  ｐｐ５４３−５４９  １９９７）。
【００２５】
好ましくは、上記形質転換した宿主は、原核生物または下等な真核生物である。
【００２６】
既定の原核生物および下等な真核生物の宿主が多く存在する。これらの宿主は、外来のタンパク質を正しく発現することが知られている。
【００２７】
都合良くは、上記真核生物の宿主はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００２８】
好適な実施形態では、発現可能なＤＮＡ配列は、ファージミドベクターの形態を有する。
【００２９】
ファージミド発現は、高い遺伝的安定性を生じ、細菌の形質転換効率が高いために、潜在的により大きくかつより多様なライブラリーの構成を可能にする点でファージゲノム発現に対して利点を有する。
【００３０】
ファージ上に抗体フラグメントを表示するために、その抗体の可変領域をコードする遺伝子が、ファージ表面タンパク質の遺伝子（通常は、遺伝子ＩＩＩまたはＶＩＩＩ）と融合され得る。遺伝子ＩＩＩのフュージョンは、各ファージの先端上のコピー数が限られており（３〜５個）、親和性が高い結合分子（ｂｉｎｄｅｒｓ）を単離しようとする場合には望ましくない、起こり得る結合力効果を最小化するため有利である。抗体フラグメント遺伝子は直接、ファージゲノムにクローン化され得るか、またはファージミドプラスミド内に存在する遺伝子セグメントと融合し得る。
【００３１】
好ましくは、上記魚は、例えば、サメまたはコザメ等の板鰓亜綱のメンバーである。
【００３２】
板鰓亜綱の多数の小型のメンバーについては、同数のラクダ科ファミリーのメンバーが必要とする牧草面積よりも単位面積が小さいタンクで飼うことができる。板鰓亜綱のメンバーはタンクで飼われるため、血液抽出のために容易に捕まえ得る。
【００３３】
都合良くは、上記サメはテンジクザメ、Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ  Ｃｉｒｒａｔｕｍである。
【００３４】
好ましくは、上記抗原特異的抗原結合ドメインは特定の特異性を有する。それゆえ、抗原特異的抗原結合ドメインは、特定の抗原を対象とし得る。
【００３５】
都合良くは、上記抗原特異的抗原結合ドメインはモノクローナルである。これに関して、抗原特異的抗原結合ドメインは単一の抗原に生成される。
【００３６】
好適な実施形態では、上記抗原特異的抗原結合ドメインの特異性は、選択された魚に導入される抗原によって決定される。
【００３７】
本発明のさらなる局面に従って、抗原特異的抗原結合ドメインを製造するための方法であって、
ａ）抗原で魚を免疫化する工程と、
ｂ）上記魚からリンパ球を単離する工程と、
ｃ）抗原特異的抗原結合ドメインのためのＲＮＡを上記リンパ球から単離する工程と、
ｄ）上記抗原特異的抗原結合ドメインをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅する工程と、
ｅ）上記増幅されたＤＮＡをディスプレイベクターにクローン化する工程と、
ｆ）宿主を形質転換することによりライブラリーを生成する工程と、
ｇ）上記所望のクローンを上記ライブラリーから選択する工程と、
ｈ）上記抗原特異的抗原結合ドメインをこれらのクローンから単離精製する工程と、
ｉ）上記抗原特異的抗原結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローン化する工程と、
ｊ）宿主を形質転換することにより上記発現ベクターの発現を可能にする工程と、
を包含する方法を提供する。
【００３８】
特定の結合部位のために表示されたライブラリーのスクリーニングは、バイオパニングのプロセスにおいて所望の抗原を用いた選択のサイクルを繰り返すことを伴う。一般に、選択中は、ファージが提示された抗原結合ドメインのライブラリーを、固定された抗原を用いてインキュベートし、結合していないファージを洗浄し、結合したファージを溶出する。この選択された個体群は、細菌感染により拡張され、さらなる選択にかけられる。各ファージは、それが表示するＶ領域をコードするＤＮＡを封入するので、Ｂ細胞の表面上の膜結合免疫グローブリンに似た、遺伝子型と表現型の機能的なリンクがある。よって、このような周期的なパニングは、生体内での抗体選択と同様に、親和性が高いクローンに濃縮することができることが証明された。
【００３９】
好ましくは、工程ｄ）の前に、上記抗原結合ドメインのｃＤＮＡを生成する。
【００４０】
都合良くは、制限酵素を用いることにより、上記抗原特異的抗原結合ドメインをコードする増幅されたＤＮＡ配列を消化する。制限酵素は、例えば、上記方法で用いられたプライマーの柄（ｈａｎｄｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ）に応じて選択され得る。
【００４１】
好適な実施形態では、上記制限酵素はＮｃｏＩおよびＮｏｔＩである。
【００４２】
都合良くは、上記ディスプレイベクターは、例えば、ｐＨＥＮ２等の任意のファージミドベクターである。
【００４３】
好ましくは、上記発現ベクターは、ｐＩＭＳ１００等の可溶性の発現ベクターである。
【００４４】
上記ベクターは、用いられ得るベクターの単なる例に過ぎない。どのベクターが用いられ得るかは、当業者にとっては技術常識である。
【００４５】
本発明のさらなる局面に従って、上記で規定したような方法により製造された抗原特異的抗原結合ドメインが提供される。
【００４６】
本発明のまたさらなる局面に従って、魚において見出された免疫グロブリンアイソタイプＮＡＲの可変領域に由来する抗原特異的抗原結合ドメインを含む、タンパク質活性を阻害する組成物が提供される。
【００４７】
ＮＡＲ  Ｖ領域がラクダ科由来のあらゆる１５ｋＤａ単一ドメイン抗体よりも２０％小さい１２ｋＤａであるという事実に関わらず、それを用いてもなおタンパク質活性を変更することができた。本発明の抗原特異的抗原結合ドメインの使用によって、組織透過性が増大するという治療上の利益、ならびに立体障害および低減した免疫活性による中和のためのタンパク質の割れ目への良好なアクセスを有する、抗原特異的抗原結合ドメインおよび他の単一ドメイン抗体を治療に応用する上で、サイズは有意なファクターである。
【００４８】
ＮＡＲ由来の抗原特異的抗原結合ドメインは、それゆえ、ラクダ科由来の単一ドメイン抗体よりもサイズが小型であることによって、対象となる個体群の範囲が広い。免疫原性の可能性も低減されるが、これは、タンパク質のサイズが小さくなればなるほど、免疫原性が少なくなるためである。
【００４９】
さらに、ＮＡＲ配列は、本発明者らの研究以前において、ＤＮＡレベルで同定されていたが、親和性が高い特定の結合分子を選択することができる、体細胞において成熟し得るレパートリーがＮＡＲ応答の特徴であり得るという手ががりは、そのＤＮＡによる証明からはなかった。よって、サメ由来の抗原結合ドメインのＮＡＲライブラリーを生成することができ、これから、特異的かつ機能的抗原特異的抗原結合ドメインおよびそれらに対応する受容体遺伝子の選択することは予想外のことである。これらの遺伝子の配列を決定することにより、（魚およびこの進化的な系統の生物に対する）異型の（生殖細胞系列レパートリーからの変異を示す）体細胞において成熟可能な応答が、免疫化処理によって推進されたＮＡＲレパートリー内で発生することを立証する。これによって、結果的に、単離において抗原中和が可能な、特異性が高く、親和性が高い抗原結合ドメインが選択され、魚およびサメにおいて通常見られる、予想された非特異的で親和性が低いＩｇＭのような応答は生じない。
【００５０】
さらにまた、本発明者らはＮＡＲ抗原特異的抗原結合ドメインを単離することができ、ＮＡＲ  Ｖが折り畳まれ、残りの分子からの単離において（およびサメ以外の環境において）機能することが可能であること、抗原特異的抗原結合ドメインが生殖細胞系列の遺伝子から成熟し、抗原に対して特異的になること（ｍＲＮＡ由来のライブラリを用いることによってのみ可能であり、ＤＮＡでは可能でない）、および抗原特異的抗原結合ドメインが免疫化抗原に特異的に結合することが可能であることを初めて示すことができた。要約すると、後述するように、本発明者らは、サメを免疫化し、この免疫化により、親和性が高く、免疫原に特異的な、特定の体細胞において成熟した抗原特異的抗原結合ドメインを導出することができた。さらに、抗原特異的抗原結合ドメインは、免疫系の他の構成要素を呼び出すことなく、免疫原の活性を直接中和することが可能である。上記理解によると、このことはサメ等の原始的な種に対しては可能ではなかった。
【００５１】
都合良くは、上記抗原特異的抗原結合ドメインが上記に規定したような方法の生成物である組成物が提供される。
【００５２】
好ましくは、タンパク質活性の阻害を濃度依存的に行う。
【００５３】
好ましくは、上記組成物は、薬剤担体またはその希釈液をさらに含む。
【００５４】
このような薬剤担体は当該分野で周知である。
【００５５】
本発明のさらなる局面に従って、ＮＡＲの可変領域から製造される抗原特異的抗原結合ドメインが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
次に、下記の実施例および添付図面を参照し、例示目的のみで本発明を説明する。
【００５７】
（実施例）
菌株
電気穿孔コンピテントストック、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ｛ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ［Ｆ’  ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩq  ＺΔＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔr）］｝（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｌｔｄ．）を用いて、ＮＡＲ  Ｖ領域ファージ表示ライブラリーを調製しパニングした。
【００５８】
ＰＣＲ材料
本研究を通じて用いられた全ての特製のオリゴヌクレオチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｌｔｄ．に発注し、脱塩および／またはＨＰＬＣ精製した。ライブラリープライマー配列は以下のとおりである（全て５’から３’まで）：
ＮＡＲ  Ｆ４  Ｆｏｒ１  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ
ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＧＴＧ  ＣＣＡ
ＣＣＴ  Ｃ    （ＳＥＱ  ＩＤ．６４）
ＮＡＲ  Ｆ４  Ｆｏｒ２  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ
ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＧＴＧ  ＣＣＡ
ＴＣＴ  Ｃ    （ＳＥＱ  ＩＤ．６５）
ＮＡＲ  Ｆ１  Ｒｅｖ    ＡＴＡ  ＡＴＡ  ＡＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ
ＣＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＣＣＧ
（ＳＥＱ  ＩＤ．６６）
全てのＰＣＲ反応は、Ｈｙｂａｉｄ０．２ｍｌ薄壁オムニチューブ（ｔｈｉｎ−ｗａｌｌｅｄ  ｏｍｎｉｔｕｂｅｓ）内でＨｙｂａｉｄ  ＰＣＲスプリントブロック上で行った。
【００５９】
ファージ提示のためのＮＡＲ  Ｖ領域ライブラリーの構築
ＲＮＡ調製
免疫ライブラリーの製造を可能にするために、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）を用いて、（約８ヶ月間の期間をかけて）３匹のテンジクザメを５回免疫化した。各免疫化の後に、各サメから血液試料を採取し、末梢血液リンパ球を単離し、各ブリードごとに全ＲＮＡを調製した。３匹のサメの各々について、ブリード４および５からのＲＮＡをプールし、ｃＤＮＡ合成のために必要になるまで−８０℃で保存した。
【００６０】
ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅
ｃＤＮＡ合成のために、ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲビーズ（ｄＮＴＰごとに２００μｍ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、６０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＲＮＡｇｕａｒｄ７、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅなしのＢＳＡ、および２ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）（ＡＰＢ  ＬＴＤ．）を、４５μｌのＤＥＰＣ処理したＨ2Ｏにおいて、氷上で５分間またはビーズが完全に溶解するまでインキュベートすることによって再構成した。各チューブに、２μｌのテンジクザメｔＲＮＡを２μｇ／μｌで、２μｌのＮＡＲ  Ｆ４  ＦｏｒプライマーまたはＦ４  Ｆｏｒ２プライマーを２５ｐＭ／μｌで加えた。これらのプライマーはともに、ＮＡＲフレームワーク領域４に対して特異的であり、その柄にＮｏｔＩ部位が組み込まれていることにより、後にファージミドベクターにクローン化することが可能となっている。チューブを軽くはじいて内容物を混合し、４６℃に予熱されたＰＣＲブロック上で３０分間インキュベートした。ｃＤＮＡ合成に続いて、チューブを９５℃で７分間インキュベートすることによって、逆転写酵素を不活性化し、テンプレートを変性させた。
【００６１】
各チューブに、その柄にＮｃｏＩ部位を含む、２μｌの一般的なプライマーＮＡＲ  Ｆ１  Ｒｅｖを２５ｐＭ／μｌで加え、チューブを９５℃に予熱し、各々に対して１μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを１Ｕ／μｌで加えた後、９５℃で２分間、５５℃で１分間、そして７２℃で１分３０秒間を３２サイクル繰り返した。
【００６２】
ＰＣＲ増幅タイプＩおよびＩＩに続いて、生成物を１．５％ゲル上でＰＡＧＥ精製すると、両方のプライマーセットについて、ＮＡＲ  Ｖ領域の良好な増幅を示す濃いバンドが約４００ｂｐで視覚化された。
【００６３】
ＮＡＲ  Ｖ領域のファージミドベクターｐＨＥＮ２へのクローン化
ＰＡＧＥ精製されたＰＣＲ生成物は、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を用いて、増幅に用いられた柄の付いたプライマーによって組み込まれた部位を消化することによりファージミドベクターｐＨＥＮ２へのクローン化を可能にした。制限されたＤＮＡは、１．５％アガロースゲル上で精製され、このＤＮＡは切除され浄化された。
【００６４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅの一晩放置した培養物から採取し、フェノール：クロロフォルム処理したプラスミドＤＮＡを、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限酵素を用いて同様に切断した。両切りベクターを０．７％アガロースゲル上で精製し、ＤＮＡを抽出した。ライブラリーの構築のために、消化されたベクターは仔ウシアルカリフォスファターゼを用いて処理しなかった。
【００６５】
定量化を可能にするため、２μｌの適切に消化されたＰＣＲ生成物およびｐＨＥＮ２ベクターを、１％アガロースゲル上で２μｌのＤＮＡマーカーＶＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＬＴＤ．）に対して流し、バンド強度を目視によって評価し、存在するＤＮＡの相対量を判定した。同量のベクターを用いて連結反応を行い、２．５μｌの１０ｘリガーゼバッファーおよび１μｌのＴ４リガーゼの存在下でＤＮＡを挿入した。最終的な体積を、Ｈ2Ｏを含めて２５μｌにして、１５℃で一晩インキュベートした。ライブラリーの構築のために、このような連結反応を３０〜４０回行った。
【００６６】
一晩インキュベートした後、連結反応による生成物をプールし、フェノール：クロロフォルム浄化し、結果として生じたＤＮＡペレットを、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．５の１：１０希釈液約１００μｌ中で再構築した。そして、ＤＮＡを電気穿孔コンピテント細胞へ形質転換するための準備ができた。
【００６７】
電気穿孔コンピテント細胞の形質転換および結果として生じたライブラリーの評価
連結したＤＮＡを、冷却した電気穿孔キュベットに分け、それぞれに、４０μｌの新たに解凍した電気穿孔コンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を加えた。細胞は電気穿孔され、１％グルコース（ｗ／ｖ）が加えられた１００μｌの氷冷された２ｘＴＹ培地中で再懸濁された。各形質転換ごとに、１０-2、１０-4、および１０-6で希釈が行われ、１００μ／ｍｌアンピシリンおよび１〜２％のグルコース（ｗ／ｖ）を含むＴＹＥ寒天上にプレーティングした。残りの細菌懸濁液を、アンピシリンおよびグルコース（同上）を有するＴＹＥを含む１４０ｍｍペトリ皿上に直接プレーティングした。全てのプレートを３７℃で一晩成長させた。
【００６８】
一晩インキュベートした後、希釈プレートからのコロニーを数えて、最終的なライブラリーのサイズ、約５×１０6個を見積もった。約１００個のコロニーの各々を、各々１μｌのプライマーＬＭＢ３（５’ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ  ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ．６９）およびｐＨＥＮ  ｓｅｑ（５’ＣＴＡＴＧＣＧＧＣＣＣＣＡＴＴＣＡ  ３’）（ＳＥＱ  ＩＤ．７０）を２５ｐＭ／μｌで、１μｌのｄＮＴＰを各々２５ｐＭで、５０ｍＭのＭｇＣｌ2を２μｌ、１０ｘＴａｑポリメラーゼバッファを５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼ１μｌを（１Ｕ／μｌで）、およびＳｔｅｒｉｐａｋＨ2Ｏを３９μｌ用いてＰＣＲスクリーニングした。ＰＣＲは以下のように行われた；１サイクルを９５℃で３分間（細菌を溶解する）、および２０サイクルを９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間。ＰＣＲ生成物を、ＥｔＢｒを含む１．５％アガロースゲル上で分子量マーカーＶＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｌｔｄ．）に対して流し、ＮＡＲ  Ｖ領域挿入物を保持するライブラリーのパーセンテージを評価した。この方法を用いて、ライブラリーの７５％が、３．７５×１０6個の機能的ライブラリーサイズを示すＮＡＲ  Ｖ領域について予想されるものに近い挿入物を保持していると観察された。次いで、このようにして正しいサイズの挿入物を保持していることが確認された５０個のコロニーの配列を決定し、ライブラリーの多様性を評価した。
【００６９】
得られた配列のコードされたアミノ酸翻訳を図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃに示す。
【００７０】
配列決定された５０個のクローンのうち、６個がＣＤＲ３内のインフレームＴＧＡコドンによってコードされた１つ以上の終止コドンを収容することが分かった。クローン１３および１９の場合、終止コドンは、（それぞれ）Ｄ３セグメントおよびＤ２セグメントが好ましくない読み枠で使用されている結果として存在すると思われる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＵＳＡ  ９５  ｐｐ１１８０４−１１８０９  １９９８）。他の５個のクローンにおいて終止コドンが存在する理由は、明確ではないが、この領域内での体細胞超変異によるものであり得る。
【００７１】
さらに１５個のクローンがフレームシフト変異を保持するため、無意味なまたは短縮されたタンパク質が製造される。これらのクローンの大部分については、おそらくは、組換処理中のヌクレオチドの付加または欠失の結果として、ＣＤＲ３内でフレームシフトが発生した。クローン１４および４１については、フレームシフト変異がそれぞれＦｒ２（図３によると位置４１）およびＦｒ３（位置６７）内で生じ、ライブラリー構築中のポリメラーゼエラーのため、より発生しやすい（クローン１４のフレームシフトはＤＮＡ配列の長いポリ−Ａトラクト（ｌｏｎｇ  ｐｏｌｙ−Ａ  ｔｒａｃｔ）のすぐ後に発生する）。
【００７２】
機能的挿入物をコードする２８個のクローンの配列アライメントおよび可変性プロット（図２および図４）は、十分な多様性を示し、各クローンは特有のアミノ酸配列を有する。可変性は、同様に構築されたナイーブライブラリー（ｎａｉｖｅ  ｌｉｂｒａｒｙ）からのクローンのように、配列および長さの両方において大きく変化したＣＤＲ３全体に渡って集中しているように見られる。このライブラリーの免疫の性質は重要であり、これは、抗原に結合するＮＡＲ  Ｖ領域がナイーブライブラリーから（事前の免疫化なしでは）単離され得ないからである。
【００７３】
両方のＮＡＲタイプは、その約８０％がタイプＩであり、２０％がタイプＩＩであると表現されたが、しかしながら、多くのクローンはＮＡＲタイプを特定することが困難であると分かった。例えば、クローン３３が、タイプＩＩのＦｒ１を有するが、タイプＩのＣＤＲ３およびＦｒ４は有さない一方、クローン０６、４０、および４６は、タイプＩのＦｒ１およびＣＤＲ３を有するが、タイプＩＩのＦｒ２およびＦｒ４は有さない。この知見は、遺伝子変換がＮＡＲ遺伝子間で発生している可能性を示唆する。
【００７４】
他の多くのクローンもまた、ナイーブライブラリー予選択クローン（ｎａｉｖｅ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｅｓ）が観察されなかった変則的な特徴を示す。クローン２４および３６はともに、他の配列特性に基づいて、タイプＩとして特定されるが、タイプＩのＣＤＲ３で通常観察されるシステイン残基の対を保持しない。クローン０６、４０、４６、および４８は全て、奇数個のシステイン残基をコードする。０６のケースにおいて前述したように、これは、遺伝子変換によるものであり得る。奇数個のシステインを有するクローンは、以前はほとんど観察されなかったため、偶数個のシステイン残基を維持してジスルフィド結合の形成を可能にするためには、Ｖ領域がは大きな圧力下になければならないと考えられていた。ＮＡＲ  Ｖ領域内のシステインが対でない場合の結果に関しては依然未知であるが、ドメインの折り畳みにとっては不利益であり得る。これが実際に事実であるならば、このようなクローンはおそらく、発現細菌に対するそれらの毒性により初期のパニング中にライブラリーから排除されるであろう。
【００７５】
クローン０２は、そのＣＤＲ３内の４つのシステイン残基をコードし、このＶ領域に合計で８つのシステイン残基を与え、４つのジスルフィド結合を形成する可能性を生じる。このような４つまたは、場合によっては６つ以上のシステイン残基を保持するタイプＩのドメインは以前にも見受けられた。これらの付加的なジスルフィド結合を形成する能力は、小さいサイズのＮＡＲ  Ｖ領域と組み合わさって、安定性が高い抗体フラグメントのための付加的なソースを提供し得る。
【００７６】
配列決定されなかったコロニーを、滅菌スプレッダーを用いてライブラリープレートから擦り取り、最終的に１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含む１０ｍｌの体積の２ｘＴＹ培地にした。細胞を滅菌グリセロールと２０％（ｖ／ｖ）まで組み合わせ、その後の完全な混合により、５００μｌショットに分け、−８０℃で保存する前に急速冷蔵した。
【００７７】
タンパク質抗原に対するＮＡＲ  Ｖ領域ライブラリーのパニング
ライブラリーの成長
一分割量のライブラリーストックを、１００μｇ／ｍｌでアンピシリンおよび１〜２％グルコース（ｗ／ｖ）を含む２００ｍｌの予熱された２ｘＴＹ培地に加え、対数期（０．４〜０．８のＯＤ600）に達するまで３７℃／２５０ｒｐｍで成長させた。培養物から採取された５０ｍｌの試料に、約１０15のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを加え、その培養物を振盪せずに３７℃でインキュベートして感染させた。インキュベートした後、培養物を、３．５Ｋｒｐｍ／４℃で１０分間スピンさせ、細胞のペレットを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および０．１〜０．２５％グルコースを含む、１００ｍｌの２ｘＴＹで再懸濁し、３０℃／２５０ｒｐｍで一晩インキュベートしてライブラリーの発現および回収をした。
【００７８】
一晩放置した培養物を、１２Ｋ  ｒｐｍ／４℃で２０分間スピンし、８０ｍｌの上澄み液を取り除き、２０ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌに加えて十分に混合し、少なくとも１時間氷上でインキュベートした。沈殿したファージを、１２Ｋ  ｒｐｍ／４℃でペレットし（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）、２ｍｌＰＢＳで再懸濁した。このファージ懸濁液を、１３Ｋ  ｒｐｍで１０分間スピンし、残存するあらゆるバクテリアの残骸を取り除き、ファージ上澄み液を４℃で保存した。ファージストックを、ＰＢＳ中で連続希釈し、９００μｌの対数期の培養物に各希釈液を１００μｌ加えることによって滴定した。３７℃で３０分間インキュベートした後、各希釈液１００μｌを、１００μｇ／ｍｌでアンピシリンおよび１％グルコースを含むＴＹＥプレート上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。ファージの滴定量は、結果として生じたコロニーを計数することによって見積もることができた。
【００７９】
ライブラリー選択
Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏ試験管（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を、４ｍｌのＰＢＳ中において、ＨＥＬまたはＯｖａを用いて一晩４℃でコーティングした。次いで、この試験管を、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）中の２％Mａｒｖｅｌを用いて室温で２時間ブロックし、その後、ＰＢＳでさらに３回洗浄した。このコーティングした免疫試験管を、上下タンブラー（ｏｖｅｒ−ａｎｄ−ｕｎｄｅｒ  ｔｕｍｂｌｅｒ）上の３ｍｌの２％ＭＰＢＳ中で、１ｍｌのファージストックを用いて室温で１時間インキュベートすることによって選択を行った。さらに１時間静置した状態でインキュベートした後、結合していないファージを含む上澄み液を捨て、結合したファージを後述するとおりに溶出した。
【００８０】
抗原結合ファージの溶出および回収
トリエチルアミン溶出
ファージストックＭ１３Ｋ０７上に表示された、抗原特異的抗原結合ドメインライブラリーの結合個体を、アルカリトリエチルアミンを用いて溶出した。
【００８１】
ファージを用いてインキュベートした後、免疫試験管を、ＰＢＳＴで２０回洗浄し、余剰な液体を排出し、１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを加えた。次いで、この試験管を室温で最大１０分間回転させ、結合したファージを溶出した。インキュベートした後、このファージ溶液を５００μｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬと混合することによって中和した。この状態で、このファージ溶液を、さらなる使用のために４℃で（またはグリセロールを１５％ｖ／ｖで加えた場合、−２０℃で長期間）保存した。
【００８２】
７５０μｌのトリエチルアミンを溶出したファージに、１０ｍｌの対数期細菌培養物を加えて、この培養物を３０分間振盪せずに３７℃でインキュベートした。培養物の連続希釈を２ｘＴＹ中で調製し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含むＴＹＥプレート上にプレーティングし、回収したファージの数の見積もりを可能にした。残りの感染した培養物を、１０分間１３Ｋ  ｒｐｍでスピンし、１００μｌの２ｘＴＹ中で再懸濁し、上記のようなＴＹＥを含む１４０ｍｍペトリ皿上にプレーティングした。プレートを３７℃で一晩増殖させた。
【００８３】
選択されたファージの回収
一晩増殖させた後、コロニーを、滅菌スクレーパを用いて、その大型のペトリ皿から擦り取って２ｍｌの２ｘＴＹ培地に入れ、その懸濁液を完全に混合した。この５０μｌの懸濁液を用いて、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１〜２％グルコースを含む５０ｍｌ２ｘＴＹを接種した後に、残りのバクテリア１ｍｌを、１５％グリセロール（ｖ／ｖ）と混合し、−８０℃でストックとして保存した。５０ｍｌの培養物を、ＯＤ600が０．４に達するまで３７℃／２５０ｒｐｍでインキュベートし、このとき、１５ｍｌが取り除かれ、約１０10のヘルパーファージに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、その培養物を、３．５Ｋ  ｒｐｍで１０分間スピンし、結果として生じた細胞のペレットを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および０．１〜０．２５％グルコースを含む２ｘＴＹ中で再懸濁し、３０℃／２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
【００８４】
一晩放置した培養物を、１２Ｋ  ｒｐｍで１０分間スピンし、４０ｍｌの上澄み液を１０ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌに加え、氷上で少なくとも１時間インキュベートする前に十分に混合させた。ファージペレットを再度、２ｍのＰＢＳ中で再懸濁し、１０分間１３Ｋ  ｒｐｍで回転させ、残っているあらゆる細菌碎片を取り除き、そのファージを４℃で短期間保存した。
【００８５】
上記のように、抗原でコーティングされた免疫試験管上で、前回の選択時に回収したファージを用いて、さらに選択を数回行った。
【００８６】
免疫ライブラリーを、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージおよびトリエチルアミン溶出液を用いて、タンパク質抗原ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）およびニワトリオボアルブミン（Ｏｖａ）それぞれに対して５回パニングした。このパニングの結果を表１に示す。
【００８７】
初期の選択におけるクローンの多様性のロスを最小化する試みにおいて、抗原のコーティーング密度を、パン１および２については、１００μｇ／ｍｌで一定に保った。初回のパニングの後、約１０6のファージをＨＥＬコーティングされた免疫試験管およびＯｖａコーティングされた免疫試験管のそれぞれから溶出すると、パン２の後に１０倍に増加した。パン３および４については、抗原コーティング密度が、より親和性が高い結合分子を選択しようとする試みにおいて、各パンについて低減した。ＨＥＬ選択の後に溶出されたファージの数が両方のパンについて、〜１０6で一定のままであったの対して、Ｏｖａ選択では、パン３において１０3に低下し、パン４の後に１０6に上昇した。パン５については、抗原コーティング濃度がさらに低減し、選択には、溶出したファージ数にかなりの低下が伴った。この溶出されたファージ数に低下があったため、ポリクローナルおよびモノクロナールファージＥＬＩＳＡを行い、ＨＥｌまたはＯｖａ結合分子の増菌が発生しているかどうかを判定した（図５）。
【００８８】
ＨＥＬ選択されたポリクローナルファージの結合により、パン１および２に対してＯＤ450に少量の増加が見られ、パン３の後にかなりの増加があった。さらに、パン４の後にシグナルにさらに少量の増加があったが、その後、パン５では、それよりも前のパンで観察されたレベルにまで低下した。同様のパターンが、Ｏｖａ選択されたポリクローナルファージについて観察され、最大の結合がパン４の後に回収されたファージについて得られたが、この例では、ＯＤ450の値は全てのパンについて低い（０．２５未満）ままであった。
【００８９】
モノクロナールファージＥＬＩＳＡでは、パン１〜４に対する両方のセットの選択について、陽性ファージの数に増加が見られた。ＨＥＬ選択の場合、この増加は、パン４の後では１％未満から約８０％であった。Ｏｖａ選択されたクローンについては、陽性の数はわずかに少なかったが、それにも関わらず、第４のパンの後には１％未満から約６６％まで増加した。パン５の後、ＨＥＬ陽性クローンの数は８０％で一定であったが、Ｏｖａ陽性モノクロナールの数は、それよりも前のパンで観察されたレベルにまで低下した（〜１０％）。
【００９０】
パン５の後のＯｖａを結合することができるクローン数の低下は、このパンについては、選択が過度に厳密であり、クローンの大部分が結合できなくなるように、タンパク質コーティング濃度が低減されたことを示す。このような低下は、ＨＥＬ選択されたモノクロナールアッセイについては観察されず、これは、これらのクローンの抗原に対する親和性がより高いものであり得ることを示す。これは、サメがＨＥＬで免疫化されたため、サメによって産生された抗原特異的抗原結合ドメインが非常に特異的であり、ＨＥＬ結合分子のみを単離することができたことを示し、Ｏｖａに関するデータは結合分子を示していない。このため、パン３および４からのクローンの選択では、Ｏｖａについて配列決定されたが、パン４および５では、ＨＥＬについてはされなかった。
【表１】
2005515165.tif 000003
【００９１】
選択分析
ポリクローナルファージＥＬＩＳＡ
９６−ｗｅｌｌ  Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）を、１００μｌの抗原を用いて、１０μｇ／ｍｌで１時間、３７℃でコーティングした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、そのウェルを３００μｌの２％ＭＰＢＳ（２％ｗ／ｖＭａｒｖｅｌを加えたＰＢＳ）で、一晩４℃の室温で（ａｔ  ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ａｔ  ４(Ｃ）さらに１時間ブロックした。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、個々のウェルに、各パンから、１００μｌの２％ＭＰＢＳ中の１０μｌのＰＥＧを沈殿させたファージを加え、そのプレートを室温で１時間インキュベートした。このファージ溶液を捨てて、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。各ウェルに、ＰＢＳ中において５０００分の１に希釈した１００μｌの抗Ｍ１３モノクロナールＨＲＰ結合体（ＡＰＢ  Ｌｔｄ．）を加え、室温で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、１つのウェルにつき１００μｌのＴＭＢ基質で発達させ、反応を１つのウェルにつき５０μｌの１ＭのＨ2ＳＯ4で止め、４５０ｎｍでプレートを読んだ。
【００９２】
モノクロナールファージＥＬＩＳＡ
ＴＹＥプレート上で成長している個々のコロニーを、各パンについて、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１〜２％グルコースを含む、滅菌９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート上の１００μｌ２ｘＴＹ培地に採取し、３７℃／２５０ｒｐｍで一晩成長させた。成長の後、９６−ウェル転写デバイスを用いて、１つのウェルにつき２００μｌの２ｘＴＹを含む新鮮な９６−ウェルプレートに１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１〜２％グルコースを接種した。細菌を３７℃／２５０ｒｐｍで２時間成長させた。元の一晩放置したプレートに、グリセロールを加えて、１５％の最終濃度にし、そのプレートを細菌ストックとして−８０℃で保存した。
【００９３】
２時間インキュベートした後、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１〜２％グルコース、および１０10のヘルパーファージを含む、２５μｌの２ｘＴＹを各ウェルに加えた。次いで、このプレートを、３７℃／２５０ｒｐｍでさらに１時間インキュベートした後、２Ｋ  ｒｐｍで１０分間スピンして細菌をペレットした。上澄み液をプレートから吸引し、結果として生じたペレットを、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、および０．２５％（ｗ／ｖ）のグルコースを含む２００μｌの２ｘＴＹ中で再懸濁した。次いで、このプレートを、３０℃／２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。
【００９４】
この一晩放置したプレートを、２Ｋ  ｒｐｍで１０分間スピンして、モノクロナールファージ上澄み液を含む上澄み液を得た。適切にコーティングしブロックしたプレートに、５０μｌのＭＰＢＳ中のこのファージ上澄み液５０μｌをウェルごとに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベートした後、このプレートを、抗Ｍ１３ＨＲＰで結合した抗体を用いてインキュベートし、通常に発達させた。
【００９５】
陽性モノクロナールファージクローンのサブクローニングおよび配列決定
抗原結合に対する陽性のシグナルを出す個々のクローンを判定した後、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌの２ｘＴＹを、適切なクローンソースから接種した。モノクロナールファージＥＬＩＳＡの結果を考慮して、１５個のＨＥＬ陽性クローンをパン４および５からランダムに採取する一方、ＯＶａについてもパン３および４から採取した。この培養物を３７℃／２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした後、プラスミドを上述のとおりに調製した。次いで、２０μｌのプラスミド試料を、制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＮＡＲ  Ｖ領域フラグメントに対応する〜４００ｂｐフラグメントをＰＡＧＥ精製して回収した。次いで、精製されたＶ領域フラグメントを、同様に切断され、アルカリフォスファターゼで処理および洗浄されたｐＩＭＳ１００発現ベクターにリゲートした。１５℃で一晩インキュベートした後、ＨｕＣＫドメインおよび６Ｈｉｓテールの上流に融合したＮＡＲ  Ｖ挿入物を収容する、結果として生じたベクターを電気穿孔コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。コロニーを採取し、（２％グルコース（ｖ／ｖ）、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含む）５ｍｌＴＢ中において、培養物を一晩放置して成長させ、グリセロールストックおよびプラスミドを調製した。
【００９６】
Ｍ１３リバース（５’  ＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ  ３’）（ＳＥＱ ＩＤ．６７）およびＨｕＣｋフォワード（５’  ＧＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣ ３’）（ＳＥＱ ＩＤ．６８）プライマーを用いて、プラスミドから挿入物の配列を決定した。一旦配列データを生成すると、クローンに、識別を可能にする固有の名前を付けた。
【００９７】
翻訳の際、１５個のＨＥＬ選択されたクローンからは、異なる配列を２つだけ取得し、そして、１５個のＯｖａ選択されたクローンから２つ取得した。
【００９８】
選択したクローン５Ａ７および４Ｆ１１は、ＨＥＬ選択された陽性のクローン内で見つけた２つの異なるアミノ酸配列を表わす（図６および７）。この２つのクローンはともに、従来のＮＡＲタイプＩであり、図８に示すように典型的なタイプＩのクローンに対してアライメントされている。これら２つのクローンは、ともにＦｒ２内にある２つの位置（４３および４４）においてのみ相互に異なり、同じＣＤＲ３領域を保持する。
【００９９】
選択したクローン４Ｈ１１および３Ｅ４は、Ｏｖａ選択された陽性のクローン内で見つけた２つの異なるアミノ酸配列を表わす（図９および１０）。同様に、これらのクローンはともに、従来のＮＡＲタイプＩであり、図１１に示すように、典型的なタイプＩのクローンに対してアライメントされている。これらクローンは６個のアミノ酸が異なる；Ｆｒ１内で３つ（位置１３、１４、および３０）、Ｆｒ２内で２つ（位置４６および４７）、そしてＣＤＲ３内で１つ（位置１０１）。
【０１００】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける抗原結合ドメインの発現
大規模発現
形質転換したＥ．ｃｏｌｉの単一のコロニーを用いて、１％グルコース（ｖ／ｖ）、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、および５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢを接種し、３７℃／２５０ｒｐｍで一晩成長させた。この培養物を用いて、１％グルコース（ｖ／ｖ）、１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン、および５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌのＴＢ培地を、１％ｖ／ｖで２５０ｍｌバッフルドフラスコ（ｂａｆｆｌｅｄ  ｆｌａｓｋｓ）に供給した。この５０ｍｌの培養物を２５℃／２５０ｒｐｍで２４時間成長させた。このとき、約１０時間成長させた後に培地を一度交換した。全ての培養物は良好に成長し、一晩放置した後のＯＤ600は１０〜２０ＯＤ単位のオーダーであった。
【０１０１】
一晩放置した培養物を４Ｋ  ｒｐｍ／４℃で２０分間ペレットした。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む５０ｍｌの新鮮なＴＢ中においてペレットを再懸濁し、２５℃／２５０ｒｐｍで１時間かけて回収した後、１．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて３．５〜４時間誘導してペリプラズム成分を放出した。
【０１０２】
ペリプラズムバースト放出法（Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ  ｂｕｒｓｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｍｅｔｈｏｄ）
遠心分離によって生じた細胞のペレットを、分画バッファの元々の培養物体積の１０％（１００ｍｌの２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、２０％スクロース、ｐＨ  ７．５、１ｍｌの１００ｍＭのＥＤＴＡ／Ｌ培養物）中で再懸濁した。この懸濁液を１５分間ゆっくりと振盪し、その後同量の氷冷した滅菌Ｈ2Ｏを加えながら氷上で１５分間インキュベートし、さらにもう１５分間インキュベーションを継続した（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ＆Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９  ｐｐ３３２−３３８  １９９６を改変した方法）。この懸濁液を１３Ｋ  ｒｐｍ／４℃で２０分間スピンし、ペリプラズムフラクションを含む懸濁液を回収し、０．２２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．）にかけた。
【０１０３】
これらの培養物には、４時間の誘導期間中に細菌溶解の兆候を示すものはなく、１リットルにつき１ｍｇのオーダーの粗製ＮＡＲタンパク質の発現収量を得た。本実施例では、選択された４つのクローンから発現されたタンパク質を６Ｈｉｓテールを介してＩＭＡＣ精製した。
【０１０４】
抗原結合ドメインのＥＬＩＳＡ分析
抗原結合ＥＬＩＳＡ
Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４  ９６−ウェル平底ＥＬＩＳＡプレートを、１つのウェルにつき１００μｌで、適切な濃度の所望の抗原でコーティングし、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。２％Ｍａｒｖｅｌ（ｗ／ｖ）を含む、１ウェルにつき２００μｌのＰＢＳを用いて３７℃で１時間ブロックする前に、このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。試料を加える前に、ウェルをＰＢＳＴでさらに３回洗浄した。
【０１０５】
粗製ペリプラズム放出溶液の５分の１希釈液を調製し、プレートの最上部のウェルに１つのウェルにつき２００μｌずつ加え、ＰＢＳにおいて倍加希釈を行った。次いで、プレートを４℃で１時間インキュベートした。各プレートをＰＢＳＴでさらに５回洗浄した。ヤギ抗ＨｕＣＫペルオキシダーゼ結合抗体をＰＢＳ中で１：１０００に希釈し、１００μｌを抗原結合ドメインを含むウェルに加えた。プレートを４℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで６回洗浄した後、ＥＬＩＳＡを前述したとおりに発達させ、プレートを４５０ｎｍで読んだ。
【０１０６】
ＨＥＬ選択されたクローン５Ａ７（図１２）は、適用された最上部の希釈液ではＨＥＬへの良好な結合示し、試料を続けて希釈していくにつれて、結合が低減していく。密接に関連するタンパク質であるシチメンチョウ卵白リゾチーム（ＴＥＬ）への結合に限界があることが最大希釈で観察されるが、タンパク質であるニワトリオボアルブミン（Ｏｖａ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、または遮断剤Ｍａｒｖｅｌに対しては結合が観察されない。同一のパターンのタンパク質結合も、ＨＥＬ選択されたクローン４Ｆ１１（図１３）に対して観察されるが、これは、これら２つのクローン（１１１／１１３  ａａ  同一）間ではアミノ酸配列の類似性の度合いが高いことを考慮すると驚くべきことではない。３Ｆ１１について観察されたＯＤ450シグナルは、５Ａ７について得られたものよりもわずかに高いが、これは単に、試料中に存在するタンパク質の量が少し異なることによるものであり得る。
【０１０７】
Ｏｖａ選択されたクローン４Ｈ１１（図１４）は、選択された抗原であるＯｖａを含む、テストされたタンパク質のいずれにも結合を示さなかった。これが単にアッセイにおいて存在したタンパク質が少なすぎた結果ではないことを確認するために、希釈されていないペリプラズム放出溶液を用いて結合アッセイを行った。この例では、４Ｈ１１タンパク質の初期の希釈液を含むウェルについては、すべてのタンパク質に対していくらかの結合が観察された。この結合は、試料が希釈されるとすぐに失われたため、非特異的である可能性があり、存在するタンパク質の濃度が非常に高かった結果生じたことに疑いがない。このデータは、４Ｈ１１クローンがＯｖａに対して有意に結合しないという最初の知見を裏付けた。４Ｈ１１のように、３Ｅ４クローンは、タンパク質ＨＥＬ、ＢＳＡ、ＫＬＨ、ＴＥＬまたは遮断剤Ｍａｒｖｅｌに対して結合を示さなかったが、このクローンは、選択抗原Ｏｖａに対しては低度に結合することが観察された。このクローンのＯｖａに対する結合のパターンは、最大タンパク質濃度での結合が低く、試料を希釈した際に大きな低下を示さなかった点で通常とは異なる。タンパク質濃度が、希釈されていないペリプラズム溶液を用いてアッセイを繰り返すことによって増加したときに、同様の結合パターンが観察されたため、タンパク質濃度が最初から低すぎたという可能性は否定される。この通常とは異なる結合の理由は依然分からないが、３Ｅ４結合がＯｖａに対しては低い親和性のみで結合することによるものであり得る。
【０１０８】
未処置の動物由来の材料から事前に構築されたライブラリーの抗原に結合し得るＮＡＲクローンがないことが明確であること、およびＯｖａ結合ではなくＨＥＬ結合クローンをＨＥＬ免疫化された動物から構築されたライブラリーから単離したことは、抗原投与した後のＮＡＲ応答の特異的性質が高いことを示す。換言すれば、特定の特異性を備えた抗原特異的抗原結合ドメインが製造される。
【０１０９】
選択されたクローンの安定性分析
クローン５Ａ７および４Ｆ１１が、抗原結合ＥＬＩＳＡにおいてＨＥＬを結合することができることが示されたので、これらのクローンの熱変性に対する安定性をテストすることができた。抗原結合曲線で確認された、両方のクローンの亜飽和希釈液を調製し、一定範囲の温度で３時間インキュベートした後、それらをＨＥＬコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加えた。次いで、それらの試料を、ＥＬＩＳＡプレート上において４℃で１時間インキュベートし、抗ＨｕＣＫ  ＨＲＰ結合抗体を用いて結合を検出した。抗原結合ドメインの安定性を、熱処理されなかったコントロール試料について得られたもののパーセンテージとしてプロットした（図１５）。
【０１１０】
クローン５Ａ７およびクローン４Ｆ１１はともに、不可逆変性に対して有意な抵抗を示し、約８５℃で５０％の機能を失い、９５℃で３時間後に約３０％の機能を保持した。この高い安定性はおそらく、付加的なノンカノニカルなシステイン残基がＮＡＲ  Ｖドメイン内で見つかった結果である。両方のクローンは６つのシステイン残基をコードするため、３つのドメイン内ジスルフィド結合を形成することができる。これは、（形成された場合）これらのドメインの高安定性に大きく寄与する。両方のクローンの安定性曲線の形状はほぼ同一であり、クローン間におけるわずかな安定性の相違は単に、アッセイの可変性によるものであり得る。
【０１１１】
抗Ｈｉｓ  ＨＲＰ結合抗体を利用して結合を検出するこのアッセイを繰り返すことによって、抗ＨｕＣＫ二次抗体を用いて得られた場合と有意には変わらない値を生成したが、これは、シグナルの低下が、ＨｕＣＫタグを介する検出が単に低減されたのではなく、変性によるＮＡＲ  Ｖドメインの結合が低減されたことによって生じたことを示す。
【０１１２】
タンパク質活性の阻害
ＨＥＬ−５Ａ７のＨＥＬの酵素活性を阻害する能力を、１２．５μｌのＨＥＬと１２．５μｌの精製されたＨＥＬ−５Ａ７タンパク質を滅菌９６ウェル組織培養プレートにおいて混合することによってテストし、１０μｇ／ｍｌの最終ＨＥＬ濃度および２５００ｎＭ、２５０ｎＭ、および２５ｎＭのＨＥＬ５Ａ７濃度を得た。コントロールウェルを、ＨＥＬ−５Ａ７を置換するバッファを用いてセットした。凍結乾燥させたＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓの試料を、０．０９％ＮａＣｌを含む０．１Ｍリン酸／クエン酸バッファ（ｐＨ５．８）中で再構築し、完全に混合し、１７５μｌを調製されたウェルに加えた。このプレートを（１分間隔で）３０分間の間４５０ｎｍで読んだ。各試料について、酵素活性を時間に対する初期吸光度のパーセンテージとしてプロットした。
【０１１３】
ＨＥＬ−５Ａ７タンパク質をアッセイに導入することによって、コントロールに対して、濃度依存的に細胞溶解率を低減した（図１６）。２５００ｎＭの最終濃度のＨＥＬ−５Ａ７では、コントロール（１７×１０-3ＯＤ単位／分）と比較して、細胞溶解率（９．３×１０-3ＯＤ単位／分）がほぼ半減し、これは、ＨＥＬ−５Ａ７領域がリゾチーム活性部位のキャビティ内でまたはそれに隣接して結合することを示す。同様に調製され、関連のない抗原に対して惹起された抗原特異的抗原結合ドメインは、同じ濃度でアッセイに導入した場合、細胞溶解率に対して影響を示さなかった。
【０１１４】
上述の実施形態が本発明の一用途を例示目的のみで示すことが理解される。実際には、本発明は多くの異なる構成に適用され得、当業者には実施する詳細な実施形態は明白である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、比較のために、各ＮＡＲタイプ、ならびにヒト、ウシ、およびラクダの可変領域内のシステインアミノ酸残基の存在を示す。カノニカルなシステインを○で示し、ノンカノニカルなシステインを●で示す。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃは、実施例において得られた配列（ＳＥＱ  ＩＤ．１〜５１）のアミノ酸翻訳を示す。この配列は、典型的なタイプＩおよびタイプＩＩのクローン配列に対してアライメントされ（各図面上ではＣＤＲを太字で強調している）、ダッシュ記号はタイプＩクローンに対する同一性を示し、★はインフレームの終止コドンを示す。
【図３】図３は、ＮＡＲタイプＩおよびＩＩの可変領域アミノ酸配列アライメント（ＳＥＱ  １および２）を示す。タイプＩについて生殖細胞系配列を示す一方で、タイプＩＩについては、体細胞が突然変異したｃＤＮＡ配列で観察されるもののうち代表的なものを示す（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．ＵＳＡ  ９５  ｐｐ１１８０４−１１８０９  １９９８）。配列の同一性をダッシュ記号で示し、両方の配列のＣＤＲを太字で示す。配列の上の数字は、保存された残基（下線）について他の種との比較に基づいて付されたものであり、ＮＡＲ  Ｖ領域配列の比較を可能にするために用いられる。
【図４】図４は、実施例において識別された２９の免疫ライブラリー配列の可変プロット（予選択および機能）を示す。各位置での変異性は、Ｗｕ＆Ｋａｂａｔ（１９７０）（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３２  ｐｐ２１１−２５０）の方法に従って求められた。カノニカルなシステイン残基、Ｃ２２および９２をアスタリスクで示す。
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）（図５Ａ）およびニワトリオボアルブミン（Ｏｖａ）（図５Ｂ）に関する選択についてのポリクローナルおよびモノクローナルファージＥＬＩＳＡの結果を示す。ファージ数は、ポリクローナル分析の前に、各パンについて正規化した。提示されたデータは、3重ウェルの平均であり、少なくとも3つのアッセイに対応する。モノクロナールの結果は、各パンについて、９６個のクローンから得たパーセンテージである。
【図６】図６は、α−ＨＥＬ  ５Ａ７クローンのＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．５３および５４）、およびコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ．５２）を示す。ＣＤＲは太字で強調している。
【図７】図７は、α−ＨＥＬ  ４Ｆ１１クローンのＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．５６および５７）、およびコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ．５５）を示す。ＣＤＲは太字で強調している。
【図８】図８は、典型的なタイプＩクローン（ＳＥＱ  ＩＤ．１）に対する、２つのα−ＨＥＬクローン、５Ａ７（ＳＥＱ  ＩＤ．５２）および４Ｆ１１（ＳＥＱ  ＩＤ．５５）のアミノ酸アライメントを示す。比較を容易にするため、配列は図３に従って番号を付されており、選択されたクローン間の違いを下線で強調し、ＣＤＲを太字で強調し、★は全ての配列において保存された残基であり、：は保存された置換基であり、．は半分保存された置換基である。
【図９】図９は、α−Ｏｖａ  ４Ｈ１１クローンのＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．５９および６０）、およびコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ．５８）を示す。ＣＤＲは太字で強調している。
【図１０】図１０は、α−Ｏｖａ  ３Ｅ４クローンのＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ．６２および６３）、およびコードされたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ．６１）を示す。ＣＤＲは太字で強調している。
【図１１】図１１は、典型的なタイプＩクローン（ＳＥＱ  ＩＤ．１）に対する、２つのα−Ｏｖａクローン、４Ｈ１１（ＳＥＱ  ＩＤ．５８）および３Ｅ４（ＳＥＱ  ＩＤ．６１）のアミノ酸アライメントを示す。比較を容易にするため、配列は図３に従って番号を付されており、選択されたクローン間の違いを下線で強調し、ＣＤＲを太字で強調し、★は全ての配列において保存された残基であり、：は保存された置換基であり、．は半分保存された置換基である。
【図１２】図１２は、α−ＨＥＬクローン５Ａ７の結合分析を示す。粗製ペリプラズム放出溶液の連続希釈を、各試験タンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに１０μｇ／ｍｌで塗布し、Ｍａｒｖｅｌでブロックした。提示されたデータは、3重ウェルの平均であり、少なくとも3つの繰り返しアッセイに対応する。
【図１３】図１３は、α−ＨＥＬクローン４Ｆ１１の結合分析を示す。粗製ペリプラズム放出溶液の連続希釈を、各試験タンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに１０μｇ／ｍｌで塗布し、Ｍａｒｖｅｌでブロックした。提示されたデータは、3重ウェルの平均であり、少なくとも3つの繰り返しアッセイに対応する。
【図１４】図１４は、α−Ｏｖａクローン４Ｈ１１の結合分析を示す。粗製ペリプラズム放出溶液の連続希釈を、各試験タンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに１０μｇ／ｍｌで塗布し、Ｍａｒｖｅｌでブロックした。提示されたデータは、3重ウェルの平均であり、少なくとも3つの繰り返しアッセイに対応する。
【図１５】図１５は、抗−ＨＥＬクローン５Ａ７および４Ｆ１１の不可逆熱変性に対する安定性を示す。提示されたデータは、3重ウェルの平均であり、少なくとも3つの繰り返しアッセイに対応する。
【図１６】図１６は、リゾチーム酵素阻害アッセイを示す。２５００ｎＭ（黒丸）、２５０ｎＭ（白抜き三角）、または２５ｎＭ（黒四角）の最終濃度の精製されたＨＥＬ−５Ａ７  ＮＡＲ  Ｖドメインタンパク質を、Ｍ．ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ細菌の導入前に、ＨＥＬでプリインキュベートした。コントロールウェル（白抜きダイヤ）は、ＨＥＬ−５Ａ７タンパク質の代わりにバッファを含む。提示されたデータは、３つの複製の平均であり、少なくとも3つの繰り返し実験からの典型的なデータセットである。
【配列表】
2005515165.tif 000004
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2005515165.tif 000052
【図１】
2005515165.tif 000053
【図２Ａ】
2005515165.tif 000054
【図２Ｂ】
2005515165.tif 000055
【図２Ｂ−１】
2005515165.tif 000056
【図２Ｃ】
2005515165.tif 000057
【図２Ｃ−１】
2005515165.tif 000058
【図３】
2005515165.tif 000059
【図４】
2005515165.tif 000060
【図５Ａ】
2005515165.tif 000061
【図５Ｂ】
2005515165.tif 000062
【図６】
2005515165.tif 000063
【図７】
2005515165.tif 000064
【図８】
2005515165.tif 000065
【図９】
2005515165.tif 000066
【図１０】
2005515165.tif 000067
【図１１】
2005515165.tif 000068
【図１２】
2005515165.tif 000069
【図１３】
2005515165.tif 000070
【図１４】
2005515165.tif 000071
【図１５】
2005515165.tif 000072
【図１６】
2005515165.tif 000073
【手続補正書】
【提出日】平成15年11月10日(2003.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的抗原結合ドメインを、当該抗原特異的抗原結合ドメインをコードする発現可能なＤＮＡ配列を含む形質転換された宿主を用いて製造するための方法であって、前記抗原特異的抗原結合ドメインは、板鰓亜綱の種において見出された免疫グロブリンアイソタイプＮＡＲの可変領域に由来する、方法。
【請求項２】
前記形質転換した宿主は、原核生物または下等な真核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記真核生物の宿主はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現可能なＤＮＡ配列は、ファージミドベクターの形態を有する、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
前記板鰓亜綱の種は、サメまたはコザメである、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
前記サメはテンジクザメである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原特異的抗原結合ドメインは特定の特異性を有する、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原特異的抗原結合ドメインはモノクローナルである、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原特異的抗原結合ドメインの特異性は、選択された魚に導入される抗原によって決定される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
抗原特異的抗原結合ドメインを製造するための方法であって、
ａ）抗原で前記板鰓亜綱のメンバーを免疫化する工程と、
ｂ）前記メンバーからリンパ球を単離する工程と、
ｃ）ＲＮＡを前記リンパ球から単離する工程と、
ｄ）前記抗原特異的抗原結合ドメインをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅する工程と、
ｅ）前記増幅されたＤＮＡをディスプレイベクターにクローン化する工程と、
ｆ）宿主を形質転換することによりライブラリーを生成する工程と、
ｇ）前記所望のクローンを前記ライブラリーから選択する工程と、
ｈ）前記抗原特異的抗原結合ドメインをこれらのクローンから単離精製する工程と、
ｉ）前記抗原特異的抗原結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を発現ベクターにクローン化する工程と、
ｊ）宿主を形質転換することにより前記発現ベクターの発現を可能にする工程と、
を包含する方法。
【請求項１１】
工程ｄ）の前に、前記抗原特異的抗原結合ドメインのｃＤＮＡを生成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
制限酵素を用いて、前記抗原特異的抗原結合ドメインをコードする増幅されたＤＮＡ配列を消化する、請求項１０または１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記制限酵素はＮｃｏＩおよびＮｏｔＩである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ディスプレイベクターは任意のファージミドベクターである、請求項１０〜１３のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ディスプレイベクターはｐＨＥＮ２である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターは可溶性発現ベクターである、請求項１０〜１５のうちのいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記可溶性発現ベクターはｐＩＭＳ１００である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１８のうちのいずれかに記載の方法により製造された抗原特異的抗原結合ドメイン。
【請求項１９】
板鰓亜綱の種において見出された免疫グロブリンアイソタイプＮＡＲの可変領域に由来する抗原特異的抗原結合ドメインを含む、タンパク質活性を阻害する組成物。
【請求項２０】
前記抗原特異的抗原結合ドメインは、請求項１〜１８のうちのいずれかに記載の方法によって生成される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
タンパク質活性の阻害を濃度依存的に行う、請求項２０または２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
薬剤担体またはその希釈液に含まれる、請求項１９〜２１のうちのいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
ＮＡＲの可変領域から製造された抗原特異的抗原結合ドメイン。
【国際調査報告】
2005515165.tif 000074
2005515165.tif 000075
2005515165.tif 000076
2005515165.tif 000077
2005515165.tif 000078