(57)【要約】以下のステップ：Ｉ）細菌細胞の培養、ＩＩ）封入体の抽出及び精製、ＩＩＩ）発現されたタンパク質の再生、ＩＶ）イオン交換クロマトグラフィー、Ｖ）逆相クロマトグラフィーを含む、誘導的原核生物発現系で発現された組換え胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を抽出及び精製する方法である。
2005535286.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変した原核細胞の誘導的発現系で発現された組換え胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を抽出及び精製する方法であって、以下のステップ：Ｉ）前記原核細胞の培養、ＩＩ）封入体の抽出及び精製、ＩＩＩ）前記発現されたタンパク質の再生、ＩＶ）イオン交換クロマトグラフィー、Ｖ）逆相クロマトグラフィーを含み、ステップ（Ｉ）は、６００ｎｍにおける培地の吸光度１〜５０（ＯＤ600１〜５０）が得られるまで行われ、続いて誘導が行われ、ステップ（ＩＩ）は、前記培養細胞の溶解、ＤＮＡの破壊及び前記封入体の単離を含み、ステップ（ＩＩＩ）では、前記封入体が変性緩衝液中で可溶化され、前記発現されたタンパク質が少なくとも部分的に二量体型に戻され、ステップ（ＩＶ）及び（Ｖ）では、前記発現された前記二量体型及び多量体型のタンパク質が単量体型から分離され、単離されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）が、ヒトＰＬＧＦ−１又は動物起源であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記原核細胞が、細菌細胞であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップＩが、前記培養ステップで高い細菌密度を得ることを可能にし、且つ動物又はヒト起源の任意の物質を含まない培地中で行われることを特徴とする、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップＩが、１種又は複数の選択薬剤、酵母エキス、グリセロール及びアンモニウム塩を含む培地中で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記誘導的発現系が、発現系Ｔ７であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来の菌株であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記菌株が、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）｛Ｂｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ｝であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記発現が、ラクトース、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）又は機能的に同等の類似体によって誘導されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
誘導時における培養物の前記吸光度が、６００ｎｍにおいて１４〜３０  ＯＤ（１４〜３０  ＯＤ600）、好ましくは１６〜２０（１６〜２０  ＯＤ600）であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップＩが、予備的なステップである前接種を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップＩＩにおいて、前記細胞溶解が凍結／解凍、フレンチプレス又は他の同等の技術によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップＩＩにおいて、前記ＤＮＡ破壊が、抽出若しくは組換え起源のＤＮＡｓｅ、好ましくはベンゾナーゼを用いて、又は化学的−機械的作用によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップＩＩにおいて、前記ＤＮＡ破壊がミキサーを用いて行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ステップＩＩにおいて、遠心分離及び適当な緩衝液への洗浄を少なくとも２サイクル行うことによって前記封入体が単離されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ステップＩＩＩにおいて、前記封入体が、尿素、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン又は任意の他の変性剤を含む変性緩衝液に可溶化され、任意選択でホモジナイズ又は音波破砕されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ステップＩＩＩにおいて、前記封入体の可溶化後、溶液を希釈し、前記溶液に酸化／還元剤を加え、撹拌下で、１０℃〜３０℃、好ましくは２０℃の温度で、１０〜３０時間、好ましくは１８〜２０時間インキュベートすることによって前記タンパク質物質を再生させることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液を、２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ280）０．０１〜２、好ましくは０．５が得られるまで希釈し、且つ前記酸化／還元剤が、二量体型の形成を最大にするような割合及び濃度で還元及び酸化されるグルタチオンであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップＩＶにおいて、前のステップから得られた前記溶液を、１：１〜１０：１の導入容積／カラム容積の比で陰イオン交換カラム上に導入することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記導入容積／カラム容積の比が１０：１であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質が、エタノールアミン−ＨＣｌ、ＮａＣｌ緩衝液で溶出され、且つ前記単量体型のタンパク質は樹脂と結合しない物質を含む画分に主に含まれるが、前記二量体型のタンパク質は１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した後続の画分中に本質的に含まれることを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップＶにおいて、前のステップで１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度で抽出された溶液を希釈し、樹脂１ｍｌ当り２８０ｎｍにおける吸光度４．５〜５．５  ＯＤに相当する量で逆相クロマトグラフィーカラム上に導入することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記タンパク質が、後続の２つの溶出段階によって、増大した勾配の有機溶媒を含む溶出緩衝液を用いて溶出されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１の溶出段階が、有機溶媒の勾配増加条件下で前記単量体型の溶出ピークが現れるまで行われ、これは定組成条件下で前記単量体型の溶出ピークが無くなるまで行われ、且つ前記第２の段階が、有機溶媒の勾配増加条件下で主に二量体型の前記タンパク質の完全な溶出が達成されるまで行われることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶出緩衝液が、エタノール、メタノール又はアセトニトリルを含むことを特徴とする、請求項２２から２４までのいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記溶出緩衝液が、割合を徐々に増加させたエタノールを含む水性アルコール溶液であることを特徴とする、請求項２２から２５までのいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記逆相クロマトグラフィーが、基材直径が３０ミクロンの粒子を有する樹脂で行われることを特徴とする、請求項２２から２６までのいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
追加の限外ろ過ステップと、それに続く適切な添加剤の存在下又は不在下での凍結乾燥を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主菌株の混合物を含まず、前記単量体型を１．５％以下の割合で含み、本質的に二量体型及び多量体型であることを特徴とする、請求項１から２５までのいずれかに記載の方法によって得られる活性型の胎盤成長因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子改変細胞から組換え胎盤成長因子を抽出及び精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に類似の構造をもつホモ二量体糖タンパク質である。Ｍａｇｌｉｏｎｅ及びＰｅｒｓｉｃｏによって、１９９９年９月２７日付けのイタリアにおける優先権を主張する特許ＥＰ−Ｂ−５５０  ５１９（ＷＯ−Ａ−９２／０６１９４）に、ＰＬＧＦタンパク質をコードする完全なポリヌクレオチド配列が記載されている。ＰＬＧＦのＲＮＡをスプライシングするいずれかの方法により、ポリペプチド配列が異なる胎盤成長因子の３つの相同体型、正確にはＰＬＧＦ−１、ＰＬＧＦ−２及びＰＬＧＦ−３が生成され、これらはすべて文献に記載されている。
【０００３】
上述の特許はまた、誘導性プロモーターの（直接又は間接的な）制御下にあるヒトＰＬＧＦ遺伝子が組み込まれた発現ベクターで改変された宿主細胞を特徴とする誘導的原核生物発現系の使用を含むＰＬＧＦ因子の製造方法についても記載している。適切な活性化剤でＰＬＧＦ発現を誘導した後、細胞を、インキュベートし、単離し、溶解に供する。
【０００４】
このように得られた未処理溶解産物は、発現されたＰＬＧＦタンパク質を少量含むタンパク質と比活性が低いタンパク質の複合混合物である。実際、既知の方法では、タンパク質の発現が、細胞密度の低い培養物中で誘導され、それは６００ｎｍにおいて０．２〜０．６ＯＤである誘導時の低い吸光度から明らかである。さらに、前記の文献に記載されている方法には、発現されたタンパク質の追加の精製段階が含まれない。したがって、出願ＷＯ−Ａ−９２／０６１９４によって得られる溶解産物をそのまま医薬品の調製に直接使用することは不適切である。
【０００５】
同じ胎盤因子を精製するためのより複雑な方法は、Ｍａｇｌｉｏｎｅらによって「Ｉｌ  Ｆａｒｍａｃｏ」５５（２０００年）、１６５〜１６７頁で考察されている。しかし、この開示された方法は、単に既知の適用可能な技術を単純に列記しているだけであり、薬剤としての使用に必要な純度及び量のＰＬＧＦタンパク質を得るために不可欠なその条件及び実験の詳細を記載してはいない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、高純度で、且つ医薬品の調製に工業的に使用するのに適した収量でＰＬＧＦを得ることを可能にする、細菌細胞内で発現された組換えＰＬＧＦを抽出及び精製するための新しい方法を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、主に二量体型（７０％以上）及び多量体型によって構成され、単量体型（ほとんど又は全く活性ではない）の残留物が１．５％以下で、本質的に活性型のＰＬＧＦタンパク質（９８．５％より高い）を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細菌細胞内で発現されるヒトＰＬＧＦの抽出及び精製に特に適した一連の精製技術を同定したことに基づく。本発明はさらに、個々の技術及び精製される物質の化学的、物理的特徴に関し最適操作条件を決定したことに基づく。
【０００９】
即ち、本発明の対象は、Ｉ）細菌細胞を培養し、ＩＩ）封入体を抽出、精製し、ＩＩＩ）発現されたタンパク質を再生し、ＩＶ）イオン交換クロマトグラフィーをし、Ｖ）逆相クロマトグラフィーをし、任意選択でＶＩ）限外ろ過、処方及び凍結乾燥の最終段階を行うステップを含む、誘導的原核生物発現系を用いて発現される組換え胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を抽出及び精製する方法である。この方法では、誘導ステップに進む前に、培地中で高い細菌密度が得られるまで培養（ステップＩ）を行い、それは培地中の高い吸光度によって示される。ステップ（ＩＩ）は、細菌溶解、ＤＮＡの破壊及び封入体の単離を含む。発現タンパク質の再生（ステップＩＩＩ）は、変性緩衝液中で封入体を可溶化し、発現タンパク質を少なくとも部分的に二量体型に変換することによって達成される。最後に、ステップ（ＩＶ）及び（Ｖ）では、発現タンパクの二量体型及び多量体型を単量体型から分離し、純粋な形態で単離して、次いで通常の凍結乾燥及び処方添加剤の存在下で限外ろ過及び凍結乾燥を行う。
【００１０】
本発明の特定の対象は、ヒト起源のＰＬＧＦ−１タンパク質を抽出及び精製するための上述の方法である。但し、この方法は、実質的に動物起源のＰＬＧＦ−１にも有効である。
【００１１】
請求項に係る方法は、前記の技術レベルで記載されている方法によって得られる収量よりも３０〜５０倍高い生成収量で発現タンパク質を得ることを可能にするという利点を有する。さらに、請求項に係る方法は、比活性が高く実質的に二量体型であるタンパク質を高純度で得ることを可能とする。
【００１２】
本発明のさらなる対象は、残留タンパク質も他の細菌混入物も含まず、且つ単量体型残留物が１．５％以下である、本発明の方法を用いて得られる活性胎盤成長因子である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
細菌宿主細胞の遺伝子改変は、Ｍａｇｌｉｏｎｅらによって、前記の特許ＥＰ−Ｂ−５５０５１９（ＷＯ−Ａ−９２／０６１９４）に記載されている。このために、ＰＬＧＦ−１因子をコードするヒト遺伝子に相当する挿入断片を含む発現ベクターを導入することによって細菌細胞を形質転換させる。完全な遺伝子配列は文献から知られており、自由に入手することができる。こうした配列を含むプラスミドは、寄託番号ＡＴＣＣ第４０８９２号でＡＴＣＣに寄託されている。発現は、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼの系の制御下で行われ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）で誘導される。
【００１４】
しかし、他の誘導的原核生物発現系を利用してもよい。市場で得られるこうした系の例を、以下に表す：
１）タンパク質の合成がａｒａＢＡＤプロモーターの制御下に置かれ、その合成がアラビノースを用いて異なる大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）株で誘導可能なｐＢＡＤ発現系（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ）。
２）タンパク質の合成がＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼのプロモーターによって制御され、その合成がラクトース又はその類似体（ＩＰＴＧ）を用いて誘導され得るＴ７発現系（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ又はＰｒｏｍｅｇａ）。この場合、言い換えれば、ラクトース誘導プロモーターの制御下に置かれたＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼの遺伝子のコピーを含むＤＥ３（Ｂｌ２１（ＤＥ３）又はＪＭ１０９（ＤＥ３））型の大腸菌誘導体の使用が必要とされる。
３）タンパク質の合成がｔｒｃハイブリッドプロモーターの制御下に置かれているＴｒｃ発現系（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ）。こうしたプロモーターは、ｔｒｐプロモーター及びｌａｃプロモーターを融解することによって得られ、ラクトース又はその類似体（ＩＰＴＧ）を用いて異なる大腸菌株中で誘導され得る。
４）タンパク質の合成がｔａｃプロモーターの制御下に置かれているＴａｃ発現系（Ａｍｅｒｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。この系では、タンパク質合成は、ラクトース又はその類似体（ＩＰＴＧ）を用いて大腸菌株ｌａｃＩｑ（ＪＭ１０５型）中で誘導される。
５）タンパク質の合成がＰＬプロモーターの制御下に置かれ、その合成がトリプトファンを加えることによって誘導され得るＰＬ発現系。この場合、トリプトファン誘導プロモーターの制御下に置かれたλファージのｃＩリプレッサーをコードする遺伝子のコピーを含む大腸菌誘導体（ＧＩ７２４）の使用が必要とされる。
【００１５】
ステップＩ：培養及び誘導
請求項に係る方法の第１段階は、前記の欧州特許（上記）に記載の菌株に相当する機能的に改変された菌株の培養である。好ましい実施形態において、微生物は、ＰＬＧＦのヒト遺伝子を含む発現プラスミドで改変した大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）の誘導体である。好ましい微生物は、市販の菌株［Ｂ１２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ］（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社）にヒトＰＬＧＦ−１の遺伝子を組み込むことによって得られる［Ｂ１２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  ＰＬＧＦ−１］と呼ばれているものである。しかし、本発明は、ヒトＰＬＧＦ−１因子に限定されず、動物起源（サル、マウス、ウサギなど）のものにも関連する。まして本発明は、大腸菌誘導体の使用に限定されず、遺伝子改変されやすく、封入体の形態の下で異種タンパク質を発現できる任意の原核微生物の使用を含む。
【００１６】
本発明の方法で種菌として利用する菌株は、使用する前には凍結乾燥形態で保持して、その発現能を維持させる。使用するときは、適切な緩衝液を利用して凍結乾燥した物質を再度溶液にする。
【００１７】
市場で入手可能であり、且つ有効に使用できる様々な既知の培地があるが、本発明による培養ステップでは、あらゆる感染リスクを回避するために、動物又はヒト起源の物質を含まない培地で行うことが好ましい。酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）を１種又は複数の適当な抗生物質と一緒に加えることは、この方法に最も適した手段となる。好ましい実施形態において、酵母エキス、グリセロール及び硫酸アンモニウムを含む第１の溶液（Ａ）とリン酸緩衝液を含む第２の溶液（Ｂ）とを無菌条件下で混合することによって得られる培地を使用する。次いで、この混合物を、アンピシリン及びクロラムフェニコール又は相当する抗生物質と合わせる。適切な抗生物質濃度は、アンピシリン５０〜３００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜２００μｇ／ｍｌ、クロラムフェニコール１０〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは３０〜４０μｇ／ｍｌである。
【００１８】
培養ステップに先立って、前接種ステップを行うことができる。この前接種ステップでは、凍結乾燥された微生物を培地中に懸濁し、培養物中の微生物細胞の量が最適となるように連続的なインキュベーション及び希釈ステップに供する。好ましくは、微生物を３７℃で一晩インキュベートし、次いで希釈し、再度数時間インキュベートする。その後選択された前接種物を遠心分離し、アンピシリンで強化した培養液中に再度懸濁させ、培養ステップのために培養容器中に接種する。
【００１９】
培養は、空気で飽和する場合２０％〜４０％、好ましくは３０％の割合の溶存酸素の存在下、微生物に適した温度、通常約３７℃で、アンピシリン及びクロラムフェニコールを加えた上述の培地中で行う。培養中のｐＨは、中性又は弱酸性値（６．４〜７．４）に保持する。さらに、培養プロセスは撹拌下で行うので、消泡剤を使用することが好ましい。
【００２０】
培養が進行するに従って、培地の吸光度は増加する。したがって、本発明では、培養の進行度を観察するためのパラメーターとして吸光度を利用する。６００ｎｍにおける読み取り値が特に適している。
【００２１】
本発明の本質的特徴は、発現誘導時に培養物中で高い細胞密度が得られることである。本発明の培地を用いる結果、６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）は、１〜５０に達することができる。しかし、請求項に係る方法で典型的に高い産生レベルを得るためには、吸光度が１８よりも高いことが好ましい。産生性菌株を誘導し最適な結果を得るためには、吸光度が１６〜２０であることが特に好ましい。次いで、このような吸光度の値に達するまで上述の条件で培養を保持し、次いでタンパク質発現の誘導に進む。
【００２２】
使用する微生物の細胞中で異種タンパク質の発現機構を誘導できる好適な薬剤又は化学的、物理的条件を、利用することができる。Ｔ７ファージのプロモーターを含む発現プラスミドを用いて改変した菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを使用する特定の例において、発現は、ラクトース又はその誘導体、例えばイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を適切な濃度、すなわち約１ｍＭで用いて誘導する。誘導期間は、必要に応じて変えることができる。良好な結果は、数時間、好ましくは３〜４時間の期間で得られ、最適プロセスでは、約１０％と同程度の割合の溶存酸素を用いることによって誘導を３時間２０分保持する。
【００２３】
細胞試料を誘導の前後に採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動法などの照合分析技術により、誘導結果を確認する。
【００２４】
タンパク質発現が所望のレベルに達したとき、培養物を遠心分離し、細胞を次のステップに移す。
【００２５】
ステップＩＩ：抽出及び精製
菌株中で発現された異種タンパク質は、細胞自体の中に封入体の形態で隔離される。したがって、本発明の方法では、細胞の溶解、抽出された核酸物質（ＤＮＡ）の破壊並びに封入体の回収及び洗浄へと進行する。
【００２６】
細胞を、必ずしも必要ではないが、洗浄し、適切な濃度の乳化剤、好ましくは０．５％〜１％の濃度のトリトンＸ１００を含む溶液中に懸濁し、次いで細胞膜の溶解に供する。溶解プロセスは、凍結／解凍、フレンチプレス、音波破砕又は他の類似した既知の技術によって行うことができる。しかし、菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに対して好ましい方法は、凍結／解凍法であり、これは、最も好ましい実施形態で少なくとも２回の連続したサイクルで繰り返される。物理学的溶解の後、溶解段階を、撹拌下、室温で、溶解液中において数分間続ける。
【００２７】
溶解媒体中への封入体の放出は、微生物の別の成分及び細胞物質、特に核酸物質の放出を伴う。これらの物質は、次のタンパク質精製プロセスを妨害し、危うくする可能性がある。したがって、溶解によって得られた懸濁液／溶液を、ＤＮＡ分解酵素（天然又はベンゾナーゼなどの組換え体）などの酵素薬、デオキシコール酸などの化学薬品、又は音波破砕若しくは例えばミキサー中でのブレードによる高エネルギー撹拌などの物理的−機械的手段を用いて、こうした核酸物質、特にＤＮＡの破壊に供する。例えばミキサー中で実施するＤＮＡの破壊は、溶解させた細胞をキレート化剤及び洗浄剤、例えばＥＤＴＡ及びトリトンＸ１００を含む適切な量の洗浄液中に再懸濁させたものについて行う。これは、封入体を含む画分から成分及び細胞物質を除去するために、洗浄液への希釈、遠心分離及び上清除去の段階と交互に、より多くのサイクル数、好ましくは２回、繰り返すことが好ましい。
【００２８】
ステップＩＩＩ  タンパク質の再生（リフォールディング）
次いで、精製したＰＬＧＦ−１の封入体を含む画分を、尿素、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジンなどの既知の変性剤を含む変性緩衝液に可溶化させる。変性液は、例えば８Ｍの変性剤濃度の尿素溶液であることが好ましい。可溶化プロセスを促進するためには、画分をホモジナイズ又は音波破砕にかけることが有効である。封入体を可溶化させた後、この溶液を同じ変性緩衝液で、２８０ｎｍで測定した吸光度が約０．８（ＯＤ２８０  ０．８）に達するまで希釈する。その後、この溶液を、さらに希釈緩衝液で、ＯＤ２８０が０．５に達するまで希釈する。適当な希釈液は、塩及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ、塩基性のｐＨ（約８）を有する。希釈液中のＰＬＧＦ−１タンパク質の再生は、溶液に適切な濃度の酸化剤／還元剤ペアを加え、続いて撹拌下で、１０℃〜３０℃、好ましくは２０℃の温度で、１０〜３０時間、好ましくは１８〜２０時間インキュベーションすることによって達成される。こうしたペアの例には、シスチン／システイン、シスタミン／システアミン、２−ヒドロキシエチルジスルフィド／２−メルカプト−エタノールがある。酸化剤／還元剤ペアの好ましい例は、それぞれ０．１ｍＭ〜２．５ｍＭ（好ましくは０．５ｍＭ）及び０．２５ｍＭ〜６．２５ｍＭ（好ましくは１．２５ｍＭ）の濃度における、その酸化型及び還元型のグルタチオンである。再生によって、本質的に単量体型で発現されたＰＬＧＦ−１タンパク質は、部分的に二量体型に戻る（図５）。
【００２９】
ステップＩＶ：陰イオン交換クロマトグラフィー
好ましくは遠心分離及び／又はろ過によって前記ステップから得られた、主に単量体型で部分的に二量体型のタンパク質を含む溶液を、陰イオン交換樹脂上に導入して、二量体型を多く含む混合物にし、且つこの混合物から細菌混入物を取り除く。工業的プロセスに適しているかはさておき、その性能（ｃａｐａｃｉｔｙ）、導入（ｌｏａｄｉｎｇ）及び流速の特徴がＱセファロースファストフローレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のものと類似する限り、陰イオン交換クロマトグラフィーに適したいずれの市販基材も同様に使用することができる。好ましい実施形態では、高流動性樹脂（ａ  ｈｉｇｈ−ｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎｅ）、例えばＱ−セファロースファストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又は相当物を使用する。樹脂は、洗浄し、イオン強度が低い溶液で平衡化する。こうした溶液の例には、塩含有量が低い又は塩を含まないエタノールアミン−ＨＣｌ  ｐＨ８．５が含まれる。同じ溶液を、精製すべきタンパク質混合物の導入、吸着及び洗浄に利用することもできる。使用する樹脂には、大量のタンパク質溶液を１：１〜１０：１の異なる導入容積／カラム容積の比で導入することが可能である。カラムの使用の最適化を可能にするので、ほぼ１０：１のＶｏｌ．／Ｖｏｌ．比が好ましい。しかし、基材の吸着容量の飽和によって、二量体型のタンパク質が多量に失われるので、１０：１よりも高い比率は避けるべきである。
【００３０】
単量体型のＰＬＧＦ−１タンパク質は、低イオン強度での洗浄段階ですでに浸出するが、二量体型及び多量体型の溶出は、出発溶液のイオン強度を増大させることによって得られる。こうしたイオン強度の増大は、平衡溶液と予め定めたより多くの１Ｍ  ＮａＣｌを含む第２の溶液とを混合することによって得られる。好ましい実施形態では、ＮａＣｌ濃度１５０〜２５０ｍＭに相当する、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を１５％〜２５％含む溶液を用いて、二量体型のタンパク質を溶出する。最良の実施形態では、ＮａＣｌ濃度が２００ｍＭの定組成条件（ｉｓｏｃｈｒａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）でタンパク質を溶出する。２８０ｎｍにおける光吸収を測定することによって、様々な種の溶出を自動的にモニターする（図２）。その後、二量体型のＰＬＧＦ−１タンパク質を含む回収した画分を、電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって照査する（図５）。全クロマトグラフィープロセスは、適当なプログラム、例えばソフトウェアＦＰＣＬディレクターシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の制御下で操作されているコンピュータシステムによって自動的に行うと有利である。
【００３１】
ステップＶ：逆相クロマトグラフィー
前記ステップから得られた、活性型が豊富なＰＬＧＦ−１タンパク質を含む画分を回収し、適切な緩衝液で希釈し、逆相クロマトグラフィーカラム上に導入して、活性型のタンパク質をさらに精製する。導入した溶液の量は、クロマトグラフ基材１ミリリットル当りＯＤ２８０  ４．５〜５．５に相当する。このような量は、最大量であると考えられる。
【００３２】
使用目的に適した任意の市販のクロマトグラフ基材を、その導入容量及び流速の特徴がプロセスの要件と適合する範囲で利用することができる。好ましい実施形態では、カラム自体の充填しやすさとともに吸着力の最適な利用を保証できるようなビーズサイズを有する樹脂を使用する。このような基材の例は、ＲＰソース１５又はＲＰソース３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）樹脂である。平衡化、導入、樹脂洗浄及び溶出のための溶液はすべて、有機溶媒を異なる割合で含む水性有機溶液である。このような溶液の例は、エタノール、メタノール又はアセトニトリルを含む溶液である。増大した割合のエタノールを含む水性アルコール溶液を利用することが好ましい。本発明の実施形態では、適切な量の２種類の緩衝溶液を混合する。前者は緩衝液Ａ、すなわちエタノール４０％及びＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）０．１％を含み、後者は緩衝液Ｂ、すなわちエタノール７０％及びＴＦＡ０．１％を含む。
【００３３】
次いで、樹脂上に導入し、適当に洗浄したタンパク質物質は、増大する勾配の有機溶媒を含む溶出液を利用する後続の２つの段階を含む溶出プロセスによって溶出する。第１の段階は、単量体型の溶出ピークが得られるまで、有機溶媒の勾配が増大する条件下で行う。このような勾配は、各溶出カラム容積につき３％の緩衝液Ｂの増加割合で、緩衝液Ｂを４％〜４０％の比率で緩衝液Ａに加えることによって得られる。タンパク質の単量体型に相当する溶出ピークが出現したらすぐに、定組成条件下で単量体型の溶出ピークが無くなるまで溶出を続ける。そのように設定した定組成条件は、単量体型及び二量体型の２種に相当するクロマトグラフピークの分離を最大限可能にし、それで、分析タイプではなく、産業上のプロセス向けの分解能が最もよく得られる。第２の段階は、二量体型が主のタンパク質の完全な溶出が達成されるまで、有機溶媒の勾配が増大する条件下で再度行う。この第２の段階では、勾配は、各溶出カラム容積につき４０．９％の緩衝液Ｂの増加割合で、緩衝液Ｂを１０％〜１００％の比率で緩衝液Ａに加えることによって得られる。２８０ｎｍにおける光吸収を測定することによって、様々な型のＰＬＧＦ−１タンパク質の溶出を自動的にモニターする（図３及び図４）。続いて、本質的に二量体型のＰＬＧＦ−１タンパク質を含む回収画分を、電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって照査する（図５）。適当なプログラム、例えばソフトウェアＦＰＣＬディレクターシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の制御下で操作されているコンピュータシステムによって、全逆相クロマトグラフィープロセスを自動的に行うことが便利である。
【００３４】
電気泳動の結果から、逆相クロマトグラフィーの第２段階で得られたＰＬＧＦ−１タンパク質は、高純度な活性型、すなわち二量体型及び部分的に多量体型のタンパク質を含むが、本質的に単量体型の混入がないことがわかる。そのように得られた生成物は、活性型を９８．５％以上、好ましくは９９．５％以上含み、このうちの７０％以上が二量体型である。単量体型の残留物は、１．５％以下である。活性型のタンパク質は、細菌培養物１リットル当り１６０ｍｇの平均量で得られる。上述の方法によって得られた純粋なタンパク質は、膜を用いた限外ろ過などの追加の処理段階に供してもよい。この場合、生成物を、カットオフ値が３０ｋＤ以下の膜でろ過し、希釈倍率１：１０６までＴＦＡ酸性化水に対するダイアフィルトレーションにかける。そのように得られた最終生成物は、凍結乾燥添加剤と共に適当に処方し、凍結乾燥して、その最大の生体活性を保持することができる。
【００３５】
本発明を以下に実施例によって説明するが、これらの実施例は、目的を例示するものに過ぎず、それを限定するものではない。
【実施例１】
【００３６】
（培養）
以下の手順は、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いた培養容器中での遺伝子改変した微生物（ＭＯＧＭ）［Ｂｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  ＰＬＧＦ−１］の培養及び誘導方法に関する。
【００３７】
材料：
溶液ＳＢＭは以下のものから構成される：
溶液Ａ（１リットル当り）
バクト酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）                ３４ｇ
硫酸アンモニウム                              ２．５ｇ
グリセロール                                  １００ｍｌ
Ｈ２Ｏ                                 十分量：９００ｍｌ
溶液Ｂ（１０Ｘ）（１００ｍｌ当り）
ＫＨ２ＰＯ４                                   １．７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４−３Ｈ２Ｏ                          ２０ｇ、又は
ＫＨ２ＰＯ４                                   １５．２６ｇ
Ｈ２Ｏ                                十分量：１００ｍｌ
【００３８】
溶液Ａ及びＢは個々に加圧滅菌し、使用時に無菌条件下で混合する。或いは、溶液Ａ及びＢを無菌条件下で混合し、ろ過する。
【００３９】
２００ｍＭ（２００Ｘ）のＩＰＴＧを、純粋な物質５ｇを蒸留水１００ｍｌ中に溶解することによって生成する。この溶液を０．２２μｍフィルターを用いてろ過し、小分けし、−２０℃で凍結する。
【００４０】
利用した消泡剤は、Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−１０（シリコン系ではない）Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ  Ａ−８２０７である。
【００４１】
使用した菌株は、［ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ  ＰＬＧＦ−１  ＷＣＢ］（ワーキングセルバンク）である。
【００４２】
前接種：凍結乾燥した遺伝子改変した微生物（ＭＯＧＭ）ＷＣＢのチューブを取り、それを１ｍｌのＳＢＭ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに懸濁させる。
【００４３】
この懸濁液を、３０ｍｌのＳＢＭ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに希釈する。
【００４４】
この懸濁液を３７℃で一晩インキュベートする（Ｏ／Ｎ）。次の日、Ｏ／Ｎ培養物３０ｍｌを８００ｍｌのＳＢＭ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに希釈し、それらを各４１リットルエレンマイヤーフラスコに２００ｍｌずつ分ける。
【００４５】
各フラスコの内容物を３７℃で２４時間インキュベートする。４本のフラスコ中の内容物を混合し、水で１／２０に希釈（５０μｌ＋９５０μｌの水）してＯＤ６００を読み取る。
【００４６】
次いで、所定量の前接種物を滅菌チューブ中４℃で、７．５００ｘｇで１０分間遠心分離する。
【００４７】
次いで、各培養物１リットル当り２０ｍｌのＳＢＭ＋２００μｇ／ｍｌのアンピシリン＋１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール中で、室温で２０分間４２０ｒｐｍで撹拌することによって、細菌を再懸濁させる。同時に、培養容器を準備し、酸素センサーを較正する。
【００４８】
酸素センサーは、６００ＲＰＭで撹拌しながら、３７℃の温度で窒素０％、次いで、消泡剤なしで空気１００％で較正する。
【００４９】
培養は、以下の実験条件下で実施する：
培地：ＳＢＭ＋２００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール
温度：３７℃
溶存酸素％：３０％（空気で飽和した場合）
ｐＨ：６．４〜７．４
消泡剤：水で１：１０に希釈し；強く撹拌してから培地７５０ｍｌ当り１４０μｌの量で加える。
【００５０】
誘導：
誘導は、以下の実験条件下で実施する：
誘導物のＯＤ６００：１６〜２０
誘導剤：ＩＰＴＧ最終濃度１ｍＭ
溶存酸素％：１０％（空気で飽和する場合）
誘導の長さ：３時間２０分
【００５１】
誘導の直前に、細菌２０μｌを取り、水８０μｌに加え、誘導前検査のために保持する。
【００５２】
誘導時に、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるまで加える。
【００５３】
溶存酸素の割合は、１０％にする。
【００５４】
誘導の終了時に、最終的なＯＤ６００を読み取り、全容積を測定する。
【００５５】
次いで、細菌１０μｌを取り、水９０μｌに加え、誘導後検査のために保持する。
【００５６】
誘導は、前もって沸騰させた２つの試料２０μｌを導入することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を使用して照査する。
【００５７】
次いで、誘導した細菌を含む培地を、４℃で、７．５００ｘｇで１０分間又は３０００ｘｇで２５分間遠心分離し、その上清を除去する。
【００５８】
結果：誘導の結果は、図１に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によってチェックする。
【実施例２】
【００５９】
（封入体の抽出及び精製）
以下の手順は、ＰＬＧＦ−１の封入体の調製及びリフォールディングに関する。リフォールディングによって、ＰＬＧＦ−１細菌タンパク質を部分的に二量体型に戻す。
【００６０】
材料：
適切な性能をもつミキサー
溶解液：１ｍＭ  Ｍｇ２ＳＯ４＋２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８＋トリトンＸ１００  １％
洗浄液：０．５％トリトンＸ１００＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８
ＢＤ（変性緩衝液）：８Ｍ  尿素、５０ｍＭトリス  ｐＨ８、エチレンジアミン２０ｍＭ
Ｈ２Ｏに溶解し、ボリュームにする。
酸化型グルタチオン２００ｘ：１００ｍＭの水溶液
還元型グルタチオン２００ｘ：２５０ｍＭの水溶液
希釈緩衝液：最終濃度６００μＭのＰＥＧ４０００（２．４ｇ／ｌ）、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、２０ｍＭ  ＮａＣｌ
消泡剤：Ａｎｔｉｆｏａｍ  Ｏ−１０（シリコン系ではない）Ｓｉｇｍａ
ＰＬＧＦ−１封入体の調製。
【００６１】
溶解液及び洗浄液を室温（ＲＴ）で平衡化する。
【００６２】
凍結／解凍を−８０／３７℃で２サイクル行う。
【００６３】
細菌４５０  ＯＤ６００当り溶解液１ｍｌに細菌ペレットを溶解する。
【００６４】
次いで、それを撹拌下（２５０ＲＰＭ）に室温で３０分間インキュベートする。
【００６５】
適切な容量をもつミキサー中に溶液を注ぎ、細菌４５０  ＯＤ６００当り３ｍｌの量の洗浄液を加える。
【００６６】
必要に応じて、試料１ミリリットル当り無希釈消泡剤０．４μｌを加える。
【００６７】
この溶液を最大速度で１分間又は試料が十分均質になるまで回転させる。
【００６８】
次いで、ミキサーの内容物を適切な容量をもつ容器内に移し、細菌４５０  ＯＤ６００当り６．５ｍｌの洗浄液を加える。これを撹拌下に室温で４５分間インキュベートする。
【００６９】
そのように得られた懸濁液を２５℃で、１３．０００ｘｇで４５分間遠心分離し、その上清を捨てる。
【００７０】
沈降したペレットを、細菌４５０  ＯＤ６００当り４ｍｌの量の洗浄液中に再懸濁させ、ミキサーのサイクルを再度繰り返す。
【００７１】
この懸濁液を、適切な容量をもつ容器内に移し、４５０  ＯＤ６００当り６．５ｍｌの洗浄液で希釈し、撹拌下で室温で３０分間インキュベートする。
【００７２】
次いで、上記に見られる条件下において遠心分離を繰り返し、その上清を取り除く。
【実施例３】
【００７３】
（タンパク質の再生）
封入体は、変性緩衝液ＢＤ（８Ｍ尿素を含む）７ｍｌ中に可溶化させ、さらにＯＤ２８０が０．８になるまでＢＤで希釈する。続いて、０．６ボリュームの希釈緩衝液を加えて、最終尿素濃度を５Ｍにする。
【００７４】
その後、１／２００の還元型グルタチオン２００Ｘ（最終濃度１．２５ｍＭ）及び１／２００の酸化型グルタチオン２００Ｘ（最終濃度０．５ｍＭ）を加える。検査（ｐｒｅｒｅｆｏｌ）のための試料１５μｌを取り、次いで溶液を撹拌下に２０℃で１８〜２０時間インキュベートする。
【００７５】
インキュベーションの終了時に、培地を２０℃で１０分間、１０．０００ｘｇで遠心分離し、０．４５又は０．８μｍのフィルターを用いてろ過し、検査（ｐｏｓｔｒｅｆｏｌ）用に試料１５μｌを取る。
【００７６】
結果：リフォールディング前後の溶液の１５μｌの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いて分析する（図５）。
【実施例４】
【００７７】
（陰イオン交換クロマトグラフィー）
以下の手順は、リフォールディング後のＰＬＧＦ−１タンパク質の精製の第１ステップに関する。試料をカラムに導入した後、吸着していないＰＬＧＦ−１単量体が大量に失われる。導入量は、カラム容積の１０倍を超えないべきである。というのは、このことにより、ＰＬＧＦ−１二量体が著しく失われるからである。
【００７８】
溶出は、ＮａＣｌ濃度２００ｍＭに相当する、２０％の緩衝液Ｂ（下記参照のこと）の定組成条件下で行う。溶出ピークは、依然としてリフォールディングに使用したグルタチオンを含み、このグルタチオンは、ＯＤ２８０の約５０％を占める。
【００７９】
材料及びパラメーター：
ＦＰＬＣシステム：ＦＰＬＣディレクターと称されるソフトフェアによって操作されるＡｍｅｒｓｈａｍ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
モニターパラメーター
Ｕ．Ｖ．：波長＝２８０ｎｍ；スケール上限＝２
温度：２０℃（最低１５、最高２５）
樹脂：Ｑセファロースファストフロー（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
カラム容積／高さ：  容積：導入すべき試料の容積の１／１０；高さ：１３〜１６ｃｍ
平衡化：緩衝液Ｂ  ２カラム容積（ＣＶ）、次いで緩衝液Ａ  １．５ＣＶ
試料：再生、遠心分離及び／又はろ過したＰＬＧＦ−１。その１０ＣＶ以下を導入する。
緩衝液Ａ：２０ｍＭエタノールアミン−ＨＣｌ  ｐＨ８．５
緩衝液Ｂ：緩衝液Ａ＋１Ｍ  ＮａＣｌ
注入速度：１ｃｍ／分（小型カラムで試験した最高速度＝１．８８７ｃｍ／分；試験した最低速度＝０．５ｃｍ／分）
溶出速度：１ｃｍ／分（小型カラムで試験した最高速度＝１．８８７ｃｍ／分；試験した最低速度＝０．５ｃｍ／分）
注入後の洗浄：緩衝液Ｂを０％含む１．５ＣＶ
回収したピーク：緩衝液Ｂ  ２０％の定組成条件で約３ＣＶ流して溶出したピーク。
最終洗浄：１００％Ｂで２ＣＶ
【００８０】
手順：
緩衝液Ｂ  ２０％の定組成条件下で溶出したピークを回収し、次いでそこに０．２７１容量の水、０．００４５容量のＴＦＡ及び０．２２５容量のエタノールを加える。このように、試料は、１．５倍に希釈され、エタノール１５％及びＴＦＡ  ０．３％を含むことになる。これら２種類の物質を追加することにより、逆相樹脂へのＰＬＧＦ−１の結合が容易になる（実施例５参照のこと）。
【００８１】
結果：クロマトグラフィーステップは、図２に示すように２８０ｎｍにおける吸光度をモニターすることによって、連続的に照査している。
【００８２】
単離したタンパク質物質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を用いて分析する（図５）。
【実施例５】
【００８３】
（逆相クロマトグラフィー）
以下の手順は、平均粒径が１５ミクロン又は３０ミクロンのＲＰソース樹脂を用いて行うことができる。しかし、３０ミクロンのＲＰソース樹脂は、精製プロセスの任意の改変を伴わずに、樹脂自体の経済的な節約（約５０％）を可能にし、カラムの充填手順をより容易にし、背圧をより低くする。
【００８４】
この手順は、ＱＦＦ樹脂上を通過させた後の、ＰＬＧＦ−１タンパク質の精製の第２フェーズに関する。試料注入中に高い吸光度が明らかになり、これは樹脂と結合しないグルタチオンの非吸着ピークに相当する。この手順は２つのサブ段階からなる。ＲＰＣｍｏｎと呼ばれる最初の段階は、ＰＬＧＦ−１の単量体成分の大部分を除去するのに使用し、一方、後の段階は、タンパク質における本質的に二量体の成分を溶出するのに使用し、これをＲＰＣｄｉｍと呼ぶ。
【００８５】
＜第１のサブ段階（ＲＰＣｍｏｎ）＞
材料及びパラメーター：
ＦＰＬＣシステム：ＦＰＬＣディレクターと称されるソフトフェアによって操作されるＡｍｅｒｓｈａｍ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ
モニターパラメーター
Ｕ．Ｖ．：波長＝２８０ｎｍ；フルスケール＝０．０５
温度：２０℃（最低１５、最高２５）
樹脂：逆相ソース３０（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
樹脂容積／高さ：  容積：導入すべき試料の全ＯＤ２８０の１／５〜１／６；高さ：２７〜３３ｃｍ
平衡化：緩衝液Ｂを２カラム容積（ＣＶ）、次いで緩衝液Ａを２ＣＶ
試料：前記ステップ（実施例４）で得られたＰＬＧＦ−１。１．５倍に希釈され、エタノール１５％及びＴＦＡ  ０．３％を含む。導入の最大値は、樹脂１ｍｌ当り４．５〜５．５  ＯＤ２８０。
緩衝液Ａ：エタノール４０％＋ＴＦＡ０．１％
緩衝液Ｂ：エタノール７０％＋ＴＦＡ０．１％
注入速度：１．８８７ｃｍ／分
溶出速度：１．８８７ｃｍ／分
注入後の洗浄：４％緩衝液Ｂ  １．５ＣＶ
単量体ピーク：１２ＣＶにおいてＢの勾配が４〜４０％（３％Ｂ／ＣＶ）。このピークの溶出を開始した直後、ＯＤ２８０がフルスケールの２５％に達することにより、その瞬間に達した緩衝液Ｂの濃度の定組成条件で、ピーク溶出が完了するまで溶出を続ける（約２．５〜３．５ＣＶ）。
【００８６】
操作
「単量体」ピークに相当する適当な量の溶液を取り、それを濃縮して検査する（図５のｍｏｎ）。
【００８７】
＜第２のサブ段階（ＲＰＣｄｉｍ）＞
材料及びパラメーター：
カラムを再度平衡化しないが、ＵＶモニターのスケール範囲を値２に単にシフトさせることによって、勾配が１０〜１００％の緩衝液Ｂを２．２ＣＶ（４０．９％Ｂ／ＣＶ）で流す。
【００８８】
操作：
「二量体」ピークに相当する画分を取る。図４はその例を示す。それらを回収し、その容積及び２８０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００８９】
凍結乾燥前に得られる全収量（ｍｇで表す）は、ＯＤ２８０と容積と希釈率を乗ずることによって計算する。このような収量の平均値は、標準偏差が２３．２１で、細菌培養物１リットル当り純粋なＰＬＧＦ−１  １．６４ｍｇである。これは、培養した細菌の１０００  ＯＤ６００当りのｍｇで表すこともでき、標準偏差が０．８で、培養した細菌の１０００  ＯＤ６００につき純粋なＰＬＧＦ−１  ５．５８ｍｇになる。
【００９０】
そのように得られた二量体溶液は、ウルトラダイアフィルトレーション及び凍結乾燥にかけるまで−２０℃で保持する。このような溶液の試料を、図５に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかける。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】還元条件下におけるステップＩをモニターするための電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られた結果を示す図である。Ｐｒｅ１及びＰｒｅ２は、以下のように調製した誘導前検査物を表す。誘導する直前に、６００ｎｍで測定した光吸収約０．０６４単位（ＯＤ６００）を取り、水で５倍希釈する。この希釈物のうち２０μｌを取り、これに還元緩衝液２０μｌを加え、煮沸する。この最終溶液２０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに導入する。Ｐｏｓｔ１及びＰｏｓｔ２は、上記のように調製した誘導後検査物を表す。Ｍは、分子量マーカーの混合物を表す。誘導後カラム（Ｐｏｓｔ１及びＰｏｓｔ２）では、分子量１４．３の指標のすぐ上に、封入体内で発現及び分離されたＰＬＧＦ−１タンパク質に相当する誘導前カラム（Ｐｒｅ１及びＰｒｅ２）では実質的に見られないバンドが示されている。
【図２】Ｑ−セファロースファストフローレジンに対する陰イオン交換クロマトグラフィーをモニターしたクロマトグラムを示す図である。Ｘ軸は溶出容積（ＭＬ）を示し、ｙ軸は光吸収単位（ＯＤ）を示す。緩衝液Ｂ（２００ｍＭ  ＮａＣｌ）を用いて２０％溶出することによって得られた最初の溶出ピークは、実質的に二量体型のＰＬＧＦ−１タンパク質に相当するが、これは不純物及び単量体型を含む。緩衝液Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌ）を用いて１００％溶出したその後のピークは不純物を含み、その不純物は除去される。
【図３】ＲＰソース３０樹脂に対する逆相クロマトグラフィーの第１の溶出段階をモニターしたクロマトグラムを示す図である。Ｘ軸は溶出容積（ｍｌ）を示し、ｙ軸は光吸収単位（ＯＤ）を示す。最初の大量の溶出ピークは、樹脂と結合しない様々な不純物に相当する。第２の溶出ピークは、定組成条件下で溶出した単量体型のＰＬＧＦタンパク質に相当する（緩衝液Ｂの約１０％〜１５％で実験的に検出された）。
【図４】ＲＰソース３０樹脂に対する逆相クロマトグラフィーの第２の溶出段階をモニターしたクロマトグラムを示す図である。Ｘ軸は溶出容積（ｍｌ）を示し、ｙ軸は光吸収単位（ＯＤ）を示す。溶出ピークは、二量体型−多量体型のＰＬＧＦタンパク質に相当する。
【図５】全プロセスを最終的にモニターするためのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動で得られた結果を示す図である。Ｐｒｅｒｅｆｏｌ及びＰｏｓｔｒｅｆｏｌは、発現されたタンパク質の再生（ステップＩＩＩ）前後の検査物を示す。ＱＦＦは、Ｑセファロースファストフローレジンから溶出された、主に二量体型のタンパク質を含むピークを表す。Ｍｏｎは、単量体型を含むピークを表す。Ｄｉｍは、ＲＰソース３０樹脂を用いた逆相クロマトグラフィーの第２のサブステップで溶出されたピークを表す。再生前には、発現されたタンパク質は主に単量体型であることを指摘する。再生後には、タンパク質の一部が二量体型である。ＱＦＦ及びＲＦ３０クロマトグラフィーによるその後の精製によって、高純度でＰＬＧＦ−１タンパク質が得られる。
【図１】
2005535286.tif 000003
【図２】
2005535286.tif 000004
【図３】
2005535286.tif 000005
【図４】
2005535286.tif 000006
【図５】
2005535286.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成15年12月8日(2003.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変した原核細胞の誘導的発現系で発現させることによって、単量体型が１．５％以下となる、２量体型及び多量体型の組換え胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を抽出及び精製する方法であって、
Ｉ）前記原核細胞を培養し、ＩＩ）封入体を抽出、精製し、ＩＩＩ）前記発現されたタンパク質を再生し、ＩＶ）イオン交換クロマトグラフィーを行ない、Ｖ）逆相クロマトグラフィーを行う、ステップを含み、
ステップ（Ｉ）を、６００ｎｍにおける培地の吸光度が１４〜５０（ＯＤ600  １４〜５０）となるまで行った後、誘導を行い、
ステップ（ＩＩ）は、前記培養細胞を溶解し、ＤＮＡを破壊し、前記封入体を単離することを含み、
ステップ（ＩＩＩ）では、前記封入体を変性緩衝液中で可溶化し、前記発現されたタンパク質を少なくとも部分的に二量体型に戻し、
ステップ（ＩＶ）では、陰イオン交換クロマトグラフィーにより、前記発現された前記二量体型及び多量体型のタンパク質を単量体型から分離し、
ステップ（Ｖ）では、定組成条件下の溶出と最終的な分離に分けられる、有機溶媒の勾配が増大する、２つの連続する溶出段階を有する逆相クロマトグラフィーにより、前記発現されたタンパク質の前記二量体型及び多量体型を前記単量体型から更に分離し、単離することを特徴とする、２量体型及び多量体型の組換え胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）を抽出及び精製する方法。
【請求項２】
前記胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）が、ヒトＰＬＧＦ−１又は動物起源であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記原核細胞が、細菌細胞であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップＩが、前記培養ステップで高い細菌密度を得ることを可能にし、且つ動物又はヒト起源の物質を含まない培地中で行われることを特徴とする、請求項１から３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップＩが、１種又は複数の選択薬剤、酵母エキス、グリセロール及びアンモニウム塩を含む培地中で行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記誘導的発現系が、発現系Ｔ７であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細菌細胞が、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来の菌株であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記菌株が、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）｛Ｂｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ｝であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記発現が、ラクトース、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）又は機能的に同等の類似体によって誘導されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
誘導時における培養物の前記吸光度が、６００ｎｍにおいて１４〜３０  ＯＤ（１４〜３０  ＯＤ600）、好ましくは１６〜２０（１６〜２０  ＯＤ600）であることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ステップＩが、予備的なステップである前接種を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ステップＩＩにおいて、前記細胞溶解が凍結／解凍、フレンチプレス又は他の同等の技術によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップＩＩにおいて、前記ＤＮＡ破壊が、抽出若しくは組換え起源のＤＮＡｓｅ、好ましくはベンゾナーゼを用いて、又は化学的、機械的作用によって行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップＩＩにおいて、前記ＤＮＡ破壊がミキサーを用いて行われることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ステップＩＩにおいて、遠心分離及び適当な緩衝液への洗浄を少なくとも２サイクル行うことによって前記封入体が単離されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ステップＩＩＩにおいて、前記封入体が、尿素、イソチオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン又は任意の他の変性剤を含む変性緩衝液に可溶化され、任意選択でホモジナイズ又は音波破砕されることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ステップＩＩＩにおいて、前記封入体の可溶化後、溶液を希釈し、前記溶液に酸化／還元剤を加え、撹拌下で、１０℃〜３０℃、好ましくは２０℃の温度で、１０〜３０時間、好ましくは１８〜２０時間インキュベートすることによって前記タンパク質物質を再生させることを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記溶液を、２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ280）０．０１〜２、好ましくは０．５が得られるまで希釈し、且つ前記酸化／還元剤が、二量体型の形成を最大にするような割合及び濃度の還元及び酸化グルタチオンであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップＩＶにおいて、前のステップから得られた前記溶液を、１：１〜１０：１の導入容積／カラム容積の比で陰イオン交換カラムに導入することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記導入容積／カラム容積の比が１０：１であることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質を、エタノールアミン−ＨＣｌ、ＮａＣｌ緩衝液で溶出し、前記単量体型のタンパク質が樹脂と結合しない物質を含む画分に主に含まれ、その一方前記二量体型のタンパク質が１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出した後続の画分中に本質的に含まれることを特徴とする、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップＶにおいて、前のステップで１５０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ濃度で抽出された溶液を希釈し、樹脂１ｍｌ当り２８０ｎｍにおける吸光度４．５〜５．５  ＯＤに相当する量で逆相クロマトグラフィーカラムに導入することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の溶出段階を、前記単量体型の溶出ピークが現れるまで、有機溶媒の勾配が増大する条件下で行い、前記単量体型の溶出ピークが無くなるまで、定組成条件下で行い、
前記第２の段階を、有機溶媒の勾配が増大する条件下で、主に二量体型の前記タンパク質の完全な溶出が達成されるまで行うことを特徴とする、請求項１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶出緩衝液が、エタノール、メタノール又はアセトニトリルを含むことを特徴とする、請求項２２及び２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記溶出緩衝液が、割合を徐々に増加させたエタノールを含む水性アルコール溶液であることを特徴とする、請求項２２から２４までのいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記逆相クロマトグラフィーが、基材直径が３０ミクロンの粒子を有する樹脂で行われることを特徴とする、請求項２２から２５までのいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
追加の限外ろ過ステップと、それに続く適切な添加剤の存在下又は不在下での凍結乾燥を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主菌株の混合物を含まず、前記単量体型が１．５％以下であり、本質的に二量体型及び多量体型であることを特徴とする、請求項１から２４までのいずれかに記載の方法によって得られる活性型の胎盤成長因子。
【国際調査報告】
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