(57)【要約】方法、システムおよび装置は、ポリペプチドにおける改変を同定するための技術を実施する。ポリペプチドの未改変の改変体に潜在的に対応する配列情報を含む候補配列のセットが、同定される。ポリペプチド由来のペプチドを配列決定して、配列タグを同定する。配列タグを候補配列のセットについての配列情報と比較して、配列タグを含む候補配列を同定する。各々のこのような配列タグについて、対応するペプチドの少なくとも１つの部分配列質量と同定された候補配列の少なくとも１つの部分配列質量との間の差が、計算される。配列タグを含む候補配列は、候補配列の同定されたセットに基づいて構築された減少したデータベースを検索することによって同定され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドの改変を同定する方法であって、以下：
１つ以上の候補配列のセットを同定する工程であって、該候補配列は、該ポリペプチドの未改変の改変体に潜在的に対応する配列情報を含み、該未改変の改変体は、公知の配列である、工程；
該ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも一部を配列決定して、該１つ以上のペプチドのペプチドにおける配列タグを同定する工程；
該候補配列のセットについての配列情報と、該同定された配列タグとを比較して、該同定された配列タグを含む候補配列を同定する工程；ならびに
該ペプチドの少なくとも１つの部分配列質量と該同定された候補配列の少なくとも１つの部分配列質量との間の差を計算する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
候補配列のセットを同定する工程が、前記ポリペプチドおよび該ポリペプチドの公知の未改変の改変体の両方に存在し得る候補ペプチドのセットを同定する工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
前記ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも一部を配列決定して、配列タグを同定する工程が、質量分析データに基づいて該１つ以上のペプチドの少なくとも一部を配列決定する工程を包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、以下：
前記計算された質量の差に基づいて、前記ポリペプチドにおける改変を同定する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、候補配列のセットを同定する工程が、以下：
前記ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドについての質量スペクトルを受け取る工程；および
該質量スペクトルに基づいて、公知の配列情報の集合を検索する工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記質量スペクトルに基づいて、公知の配列情報の集合を検索する工程が、以下：
前記１つ以上のペプチドの質量スペクトルと、該公知の配列情報の集合に表されたアミノ酸配列についての質量スペクトルとを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記質量スペクトルに基づいて、公知の配列情報の集合を検索する工程が、以下：
前記１つ以上のペプチドのアミノ酸配列を同定する工程；および
該同定されたアミンの酸配列と、該公知の配列情報の集合に表されたアミノ酸配列とを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、ここで：
前記１つ以上のペプチドのアミノ酸配列を同定する工程が、該１つ以上のペプチドの少なくとも１つのフラグメントを配列決定して、前記対応するペプチドのアミノ酸配列を同定する工程を包含する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ここで：
前記対応するペプチドのアミノ酸配列が、該対応するペプチドの６個以上のアミノ酸の配列を含む、方法。
【請求項１０】
請求項５に記載の方法であって、ここで：
候補配列のセットを同定する工程が、前記同定された候補配列についての配列情報からなる減少したデータベースを構築する工程を包含し；そして
前記同定された配列タグと該候補配列のセットについての配列情報とを比較する工程が、該同定された配列タグに基づいて、該減少されたデータベースを検索する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
前記ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも一部において配列決定して、配列タグを同定する工程が、２〜４個のアミノ酸の配列を同定する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで：
前記ペプチドの少なくとも１つの部分配列質量と前記同定された候補配列の少なくとも１つの部分配列質量との間の差を計算する工程が、該ペプチドのタグプレフィックスまたはタグサフィックスと該同定された候補配列の対応するタグプレフィックスまたはタグサフィックスとの間の質量の差を計算する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
ポリペプチドにおける改変を同定するためのコンピューター読み取り可能媒体上のコンピュータープログラム製品であって、該製品は、プログラム可能プロセッサに、以下：
１つ以上の候補配列のセットを同定させ、該候補配列は、該ポリペプチドの未改変の改変体に潜在的に対応する配列情報を含み、該未改変の改変体は、公知の配列であり；
該ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも一部を配列決定して、該１つ以上のペプチドのペプチドにおける配列タグを同定し；
該候補配列のセットについての配列情報と、該同定された配列タグとを比較して、該同定された配列タグを含む候補配列を同定し；そして
該ペプチドの少なくとも１つの部分配列質量と該同定された候補配列の少なくとも１つの部分配列質量との間の差を計算させる、
ように作動可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項１４】
請求項１３に記載のコンピュータープログラム製品であって、ここで：
プログラム可能プロセッサに候補配列のセットを同定させるように作動可能な前記命令が、プログラム可能プロセッサに前記ポリペプチドと該ポリペプチドの公知の未改変の改変体の両方に存在し得る候補ペプチドのセットを同定させるように作動可能である命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項１５】
請求項１３に記載のコンピュータープログラム製品であって、ここで：
プログラム可能プロセッサに、前記ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも一部を配列決定して、配列タグを同定させるように作動可能である前記命令が、プログラム可能プロセッサに、質量スペクトルデータに基づいて、該１つ以上のペプチドの少なくとも一部を配列決定させるように作動可能である命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項１６】
請求項１３に記載のコンピュータープログラム製品であって、プログラム可能プロセッサに、以下：
前記計算された質量の差に基づいて、前記ポリペプチドにおける改変を同定させる、
ように作動可能である命令をさらに含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項１７】
請求項１３に記載のコンピュータープログラム製品であって、プログラム可能プロセッサに候補配列のセットを同定させるように作動可能である前記命令が、プログラム可能プロセッサに、以下：
前記ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドについての質量スペクトルを受け取り；そして
該質量スペクトルに基づいて、公知の配列情報の集合を検索させる、
ように作動可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項１８】
請求項１７に記載のコンピュータープログラム製品であって、ここで：
プログラム可能プロセッサに、前記質量スペクトルに基づいて、前記公知の配列情報の集合を検索させるように作動可能である前記命令が、プログラム可能プロセッサに、前記１つ以上のペプチドの質量スペクトルと、該公知の配列情報の集合に表されるアミノ酸配列についての質量スペクトルとを比較させるように作動可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項１９】
請求項１７に記載のコンピュータープログラム製品であって、プログラム可能プロセッサに、前記質量スペクトルに基づいて、前記公知の配列情報の集合を検索させるように作動可能である前記命令が、プログラム可能プロセッサに、以下：
前記１つ以上のペプチドのアミノ酸配列を同定させ；そして
該同定されたアミノ酸配列と、該公知の配列情報の集合に表されたアミノ酸配列とを比較させる、
ように作動可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２０】
請求項１９に記載のコンピュータープログラム製品であって、ここで：
プログラム可能プロセッサに、前記１つ以上のペプチドのアミノ酸配列を同定させるように作動可能である命令が、プログラム可能プロセッサに、該１つ以上のペプチドの少なくとも１つのフラグメントを配列決定して、前記対応するペプチドのアミノ酸配列を同定させるように作動可能な命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２１】
請求項２０に記載のコンピュータープログラム製品であって、ここで：
前記対応するペプチドのアミノ酸配列が、該対応するペプチドの６個以上のアミノ酸の配列を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２２】
請求項１７に記載のコンピュータープログラム製品であって、ここで：
プログラム可能プロセッサに、候補配列のセットを同定させるように作動可能である命令が、プログラム可能プロセッサに、該同定された候補配列についての配列情報からなる減少したデータベースを構築させるように作動可能である命令を含み；そして
プログラム可能プロセッサに、該同定された配列タグと、該候補配列のセットについての配列情報とを比較させるように作動可能である命令が、プログラム可能プロセッサに、該同定された配列タグに基づいて、該減少したデータベースを検索させるように作動可能である命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２３】
請求項１３に記載のコンピュータープログラム製品であって、ここで：
プログラム可能プロセッサに、前記ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも一部を配列決定して、配列タグを同定させるように作動可能である前記命令が、プログラム可能プロセッサに、２〜４個のアミノ酸の配列を同定させるように作動可能である命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２４】
請求項１３に記載のコンピュータープログラム製品であって、ここで：
プログラム可能プロセッサに、前記ペプチドの少なくとも１つの部分配列質量と前記同定された候補配列の少なくとも１つの部分配列質量との間の差を計算させるように作動可能な命令が、プログラム可能プロセッサに、該ペプチドのタグプレフィックスまたはタグサフィックスと該同定された候補配列の対応するタグプレフィックスまたはタグサフィックスとの間の質量の差を計算させるように作動可能である命令を含む、コンピュータープログラム製品。
【請求項２５】
ポリペプチドにおける改変を同定するためのシステムであって、以下：
該ポリペプチドの未改変の改変体に潜在的に対応する配列情報を含む、１つ以上の候補配列のセットを同定するための手段であって、該未改変の改変体が、公知の配列である、手段；
該ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも一部を配列決定して、該１つ以上のペプチドのペプチドにおける配列タグを同定するための手段；
該同定された配列タグと、該候補配列のセットの配列情報とを比較して、該同定された配列タグを含む候補配列を同定するための手段；および
該ペプチドの少なくとも１つの部分配列質量と該同定された候補配列の少なくとも１つの部分配列質量との間の差を計算するための手段、
を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、仮出願第６０／３６３，６４７号（２００２年３月１１日提出、本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（背景）
本発明は、プロテオミクスおよびポリペプチド中の改変の同定に関する。
【０００３】
タンデム質量分析法は、生物学的サンプル中のタンパク質の速くかつ効率的な同定のために選ばれる方法となりつつある。さらに、質量分析法は、新規のペプチドの配列決定に使用され得る。例えば、複雑なタンパク質混合物（例えば、細胞抽出物）のタンパク分解によって生成されたペプチドのタンデム質量分析が、もとの混合物中に存在したタンパク質を同定および定量するために使用され得る。単一のｍ／ｚ値を選択し、そのイオンを衝突誘導性解離（ＣＩＤ）に供し得るタンデム質量分析器が、ペプチドの配列決定および同定をするために使用され得ることにより、このような結果が、達成され得る。ＣＩＤによって作製されたペプチドの情報は、ペプチドおよびヌクレオチドの配列データベースを検索し、そのスペクトルによって示されるアミノ酸配列を同定し、従って、そのペプチドが由来するタンパク質を同定するために使用され得る。
【０００４】
タンデム質量分析法は、３種類の情報を作製し、それは、消化されたタンパク質に由来する複雑なペプチド混合物中のペプチドを同定するために使用され得る。第１に、ペプチドの質量が、得られる。この情報のみでも、特にタンパク質が配列特異的なプロテアーゼによって消化された場合に、可能性のあるペプチド配列の数を大きく減らし得る。第２の情報は、ペプチドイオンのＣＩＤにより作製されたフラグメントイオンのパターンである。フラグメントイオンのパターンを、配列データベースからコンピューターによって生成される理論上のフラグメントイオンのパターンと比較する分析方法が、ペプチド配列を同定するために使用され得る。そのような方法により、最も一致するペプチドが同定され、そしてどのペプチド配列がより正確であるかが統計的に決定され得る。予測の正確さは、ＭＳ分析を多段階で使用し、ペプチドの一部の新規の配列を得ることにより、さらに増大し得る。この直接的な配列情報は、フラグメントイオンのパターンに基づく予測の正確さをさらに増大させるために使用され得る。
【０００５】
一旦、ペプチドが同定されると、ある場合において、そのペプチドが生成されたタンパク質が、配列データベースを検索することにより決定される。しかし、その配列が、以前に決定されており、そしてデータベース中に存在する場合にのみ、データベースの検索によって、タンパク質が、同定され得る。タンパク質配列が、利用可能でない場合、またはペプチドが、予期せぬ改変を含んでいた場合、データベース検索は、失敗し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（要旨）
本発明は、ポリペプチド中の改変を同定するためのコンピューターで実行する技術を提供する。概して、本発明の１局面は、ポリペプチド中の改変を同定するための技術を実行する方法、システムおよび装置（コンピュータープログラムを含む）を特徴とする。本技術は、以下の工程を包含する。ポリペプチドの未改変の改変体（配列が公知である）に潜在的に対応する配列情報を含む、１つ以上の候補配列のセットを同定する工程；ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも１部分を配列決定し、この１つ以上のペプチドのペプチド中の配列タグを同定する工程；同定した配列タグを、候補配列のセットについての配列情報と比較し、同定した配列タグを含む候補配列を同定する工程；および少なくとも１つのペプチドの部分質量と少なくとも１つの同定した候補配列の部分質量との差を計算する工程。
【０００７】
特定の実施形態は、以下の特徴の１つ以上を含み得る。候補配列のセットを同定する工程は、ポリペプチドおよび公知のポリペプチドの未改変の改変体の両方に存在し得る候補ペプチドのセットを同定する工程を包含し得る。ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも１部を配列決定し、配列タグを同定する工程は、質量分析データに基づいて１つ以上のペプチドの少なくとも１部分を配列決定する工程を包含し得る。改変は、計算された質量の差に基づいて、ポリペプチド中で同定され得る。
【０００８】
候補配列のセットを同定する工程は、ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの質量スペクトルを受け取る工程、および質量スペクトルに基づいて、公知の配列情報の集合を検索する工程を包含し得る。公知の配列情報の集合を検索する工程は、１つ以上のペプチドの質量スペクトルを、公知の配列情報の集合中に示されるアミノ酸配列の質量スペクトルと比較する工程を包含し得る。質量スペクトルに基づいて、公知の配列情報の集合を検索する工程は、１つ以上のペプチドのアミノ酸配列を同定する工程、および同定したアミノ酸配列を、公知の配列情報の集合中に示されるアミノ酸配列と比較する工程を含み得る。１つ以上のペプチドのアミノ酸配列を同定する工程は、１つ以上のペプチドの少なくとも１つのフラグメントを配列決定し、対応するペプチドのアミノ酸配列を同定する工程を包含し得る。対応するペプチドのアミノ酸配列は、対応するペプチドの６アミノ酸以上の配列を含み得る。
【０００９】
候補配列のセットを同定する工程は、同定した候補配列についての配列情報からなる減少したデータベースを構築する工程を含み得る。同定した配列タグを、候補配列のセットについての配列情報と比較する工程は、同定した配列タグに基づいて、減少したデータベースを検索する工程を包含し得る。ポリペプチド由来の１つ以上のペプチドの少なくとも１部の配列を決定して、配列タグを同定する工程は、２アミノ酸〜４アミノ酸の配列を同定する工程を包含し得る。少なくとも１つのペプチドの部分質量と少なくとも１つの同定した候補配列の部分質量との差を計算する工程は、ペプチドの前部タグまたは後部タグと同定した候補配列の対応する前部タグまたは後部タグとの間の質量差を計算する工程を含み得る。
【００１０】
本発明は、以下の利点の１つ以上を実現し得るよう実施される。配列タグを使用して、減少したデータベースまたは候補配列の集合を検索することにより、高い信頼水準で、未知のポリペプチド中の改変を同定することが可能になる。未知の改変は、代表的には、従来のデータベース検索を使用して同定し得ないが、重要な知識をほとんどまたは全くもっていなくとも同定し得る。任意の種類の改変（変異、付加、欠失および翻訳後改変が挙げられる）が、同定され得る。配列タグを使用して、減少したデータベースを検索することにより、従来のデータベースの検索よりも、より高い信頼性で改変されたポリペプチドを同定することが可能となる。
【００１１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が、添付した図面および以下の記載において示される。他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。本明細書中で述べられる全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が、支配し得る。本発明の他の特徴および利点が、明細書、図面、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【発明の効果】
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は、ポリペプチド中の改変を同定するための方法および装置（コンピュータープログラムを含む）を提供する。未知のポリペプチドの部分ペプチド由来の配列情報が、未知のポリペプチドの未改変の改変体に潜在的に対応する候補配列と比較される。得られた配列情報の外にある部分ペプチドの未知領域に、改変が、推測され得る。
【００１３】
本明細書中で使用する場合、ペプチドおよびポリペプチドは、ペプチド（アミド）結合で接合された２つ以上のアミノ酸を含むポリマー状分子である。本明細書中で使用する場合、ペプチドは、代表的には、親ポリペプチドのサブユニットを表す。例えば、公知の技術を使用する親ポリペプチドの切断または断片化によって作られるフラグメントである。ペプチドおよびポリペプチドは、天然（例えば、タンパク質またはそのフラグメント）であり得るし、または人工的でもあり得る。ポリペプチドはまた、天然アミノ酸および人工アミノ酸の組合せからなり得る。ペプチドおよびポリペプチドは、任意の源（例えば、動物（例えば、ヒト）、植物、菌、細菌、および／またはウイルス）に由来し得、ならびに細胞サンプル、組織サンプル、体液、または環境サンプル（例えば、土壌サンプル、水サンプル、および空気サンプル）から得られ得る。
【００１４】
本明細書中に記載される技術を使用することで同定され得る改変は、公知のタンパク質改変（変異、付加、欠失、および翻訳後改変、ならびに非自然的な化学的改変（例えば、化学的タグ、蛍光標識または他の共有結合する化学的実体）が挙げられる）あるいは未知のタンパク質改変であり得る。改変は、天然（例えば、改変されたタンパク質が、天然のタンパク質である場合）であり得るし、または人工的であり得る。従って、例えば、本明細書中に記載される技術が、公知の形態のタンパク質の変異、２つの相同するタンパク質（例えば、異なる種由来の関連するタンパク質）の間の差、あるいは元々のアミノ酸配列が公知であるタンパク質の翻訳後のアセチル化または糖化を同定するために使用され得る。
【００１５】
図１は、本発明の１つの局面に従う、ペプチド中の改変を同定するためのシステム１００の１つの実行を示す。システム１００は、従来の構成の汎用プログラム可能なデジタルコンピューターシステム１１０を備え、このデジタルコンピューターシステムは、メモリおよび１つ以上のプロセッサを備え得、このプロセッサは、分析プログラム１２０を実行する。コンピューターシステム１１０は、質量スペクトルデータ１３０の供給源にアクセスし、このコンピューターシステムは、示される実施形態において、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分光計である。あるいは、質量スペクトルデータ１３０の供給源は、ＣＩＤスペクトルを生成し得る任意の質量分光計（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光計、ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分光計、ＩＣＲ−ＦＴ質量分光計）であり得る。分析プログラム１２０は、複数のコンピュータープログラムモジュール（これらのいくつかまたは全ては、代替的に、別々のコンピュータープログラムとして実行され得る）を備え、このコンピュータープログラムモジュールは、検索モジュール１４０、配列決定モジュール１５０、および校正モジュール１６０を備える。コンピューターシステム１１０は、配列情報１７０の供給源（例えば、アミノ酸配列情報またはヌクレオチド配列情報の公的データベース）に連結される。システム１００はまた、入力デバイス（例えば、キーボードおよび／またはマウス）および出力デバイス（例えば、ディスプレイモニター）ならびに従来の通信ハードウェアおよびソフトウェアを備え、この通信ハードウェアおよびソフトウェアによって、コンピューターシステム１１０は、例えば、ネットワークを通じて、他のコンピューターシステム（または質量分析器１３０および／もしくはデータベース１７０）に連結され得る。
【００１６】
図２は、ポリペプチド中の１つ以上の改変を同定する方法２００を示す。方法２００のいくつかまたは全ては、図１に示されるようにシステム１００を使用して実施され得る。この方法は、候補配列のセットを同定することによって始まり、この候補配列は、未知のポリペプチドの１つ以上の未改変の改変体に潜在的に対応する（工程２１０）。候補配列のセットは、種々の従来の技術を使用して同定され得る。
【００１７】
１つの実施形態において、未知のポリペプチドに対する未改変候補配列のセットは、ポリペプチドの改変された改変体および未改変の改変体の両方に存在するペプチドの回収のために、質量データ（例えば、質量スペクトル）に基づいて同定され得る。ペプチドの集合は、ポリペプチドのフラグメントを含み得、このフラグメントは、公知の技術を用いて、ポリペプチドまたはポリペプチドの混合物の切断またはフラグメント化によって生成される。例えば、ペプチドの集合は、標準的な技術を使用して、タンパク質またはタンパク質の混合物の周知の試薬（酵素または化学物質（例えば、ブロモシアン）が挙げられる）での消化によって生成され得る。あるいは、フラグメントは、以下により詳細に議論されるように、イオン化技術または衝突誘導解離（「ＣＩＤ」）技術によって生成され得る。
【００１８】
イオンの質量−対−電荷比（これは、実際に測定されるものである）でいうことは、より正確であるが、イオンの「質量」によって省略された様式でいうことは、質量分光学の分野において共通であることが留意される。便宜上、この明細書は、共通の実施に適合し、質量−対−電荷比、または質量−対−電荷比といわれる量に数学的に由来する量を意味するために、用語「質量」がしばしば使用される。
【００１９】
候補配列のセットは、そのペプチド（ポリペプチドおよびその未改変の改変体の両方に共通である）のいくつかに対する質量スペクトルを、ポリペプチドの未改変の改変体の公知の配列を含むデータベースと相関させることによって同定され得る。例えば、候補配列のセットは、任意の市販のデータベース検索エンジンソフトウェア（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎから入手可能なＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴ（登録商標）タンパク質同定ソフトウェア）を使用し、得られた質量スペクトルを配列情報のデータベース（例えば、公的に利用可能なペプチドまたはヌクレオチドの配列データベース）において示されるペプチドに対して決定される理論的質量スペクトルと比較することによって同定され得る。他のデータベース検索エンジン（例えば、Ｍａｓｃｏｔ、ＰｒｏＦｏｕｎｄ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＭｉｌｌ、ＲＡＤＡＲＳ、Ｓｏｎａｒソフトウェアなど）がまた、使用され得る。データベースそれ自体は、配列情報の任意の公的に入手可能なデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ／ＧｅｎＰｅｐｔ、ＰＩＲ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴおよびＰＤＢデータベース）であり得る。候補配列のセットは、ポリペプチドのセットとして規定され得、このポリペプチドのセットは、スコアが、所定の閾値またはユーザー規定閾値を超過するペプチドを含む。
【００２０】
別の実施形態において、候補配列のセットは、デノボ配列決定技術を使用するポリペプチドの集合中のペプチドの部分配列決定または完全配列決定、続いての、公的に利用可能なデータベース中の得られた配列タグの位置確認によって同定され得る。デノボ配列決定において、ポリペプチドのアミノ酸配列は、イオン化またはＣＩＤのような技術を使用するペプチド骨格に沿ったポリペプチドのフラグメント化およびこのフラグメントを質量分析に供することによって決定される。これは、直列（例えば、ＭＳ２または高次ＭＳｎ）質量分光学を使用して、問題中のポリペプチドについて親イオンを選択し、この選択されたイオンをフラグメント化に供して、実施され得る。得られたペプチドフラグメント（すなわち、フラグメントイオン）の間の質量の差は、フラグメント化プロセスにおける１つ以上のアミノ酸質量の損失に対応する。従って、データの質に依存して、親ポリペプチドの部分配列情報または完全配列情報は、フラグメントスペクトル中のシグナルの相対的部分から誘導され得る。ＣＩＤスペクトルは、以下により詳細に議論されるように、ペプチド改変を同定および位置確認するために特に有用であり、このような改変の存在を示すことおよび化学的にまたは生物学的に改変された正確なアミノ酸を正確に位置を示すことのために情報を潜在的に提供する。
【００２１】
デノボ配列決定由来の配列情報は、公的に入手可能な配列データベース中のまたはそれに由来する、類似配列または一致配列について（例えば、従来の配列類似性検索技術（例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）またはＭＳ−ＢＬＡＳＴ）（データベース中のデノボ配列決定出力を同定するために特に開発されてきた）を使用して）検索し、候補配列のセットを同定するために使用され得る。データベース中の配列を同定するために必要とされるアミノ酸の数は、データベースの性質およびサイズに依存して変化する。例えば、少なくとも６つまたは７つのアミノ酸の配列が、代表的に、ヒトタンパク質のデータベース中のタンパク質を同定するために必要とされる。デノボ配列決定の結果は、所定の質量スペクトルを担い得るペプチドのリスト（例えば、アミノ酸配列）を含み得、適合の厳密性または相関スコアまたは確率は、各アミノ酸配列と関連し、質量スペクトルと一致する可能性を示す。候補配列のセットは、デノボで同定されたペプチドを含むポリペプチドのセットとして定義され得る。これらの実施形態のいずれかにおいて、任意の未知の改変は、一致しないスペクトルにおいて生じなければならず、このスペクトルに対する候補配列は、同定されていない。
【００２２】
あるいは、候補配列のセットは、他のタンパク質同定技術（例えば、ゲル電気泳動）を使用して同定され得る。未知のポリペプチドの未改変の改変体が既知である場合、候補配列のセットは、操作者からの直接入力に基づいて同定され得る。可能な配列候補の範囲はまた、サンプルの供給源、サンプルの歴史またはサンプル中に存在することが公知である他の関連する成分の先行知識によって狭くされ得る。
【００２３】
１つの実施形態において、候補配列のセットは、以下により詳細に記載されるように、続いての処理において使用される、候補配列情報の減少したデータベースを構成するために使用される。候補配列情報のデータベースは、より大きなヌクレオチド配列データベースまたはペプチド配列データベース（例えば、上記で同定された公的に利用可能なデータベース）のサブセットであり得る。従って、例えば、未知のポリペプチドに潜在的に対応するとして工程２１０において同定された、公知のポリペプチドに対応するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、従来の技術を使用して検索可能なデータベースにロードされ得る。
【００２４】
ポリペプチドに由来する１つ以上のペプチドに対するデノボ配列決定情報は、１つ以上の配列タグを同定するために使用される（工程２２０）。図３Ａに示されるように、配列タグ３１０は、所定のペプチド３００に対して同定された２つ以上のアミノ酸残基３２０の配列からなる。配列タグは、対応する配列（すなわち、１つ以上のアミノ酸の配列）の部分配列ならびに接頭辞Ｎ１および接尾辞Ｎ２を示す。接頭辞Ｎ１は、タグの部分配列に先行する対応するペプチドの部分（改変されていてもいなくてもよい）の大きさ（例えば、ＭＳ２実験においてｍ／ｚ＝６３５の親イオンに由来するｍ／ｚ＝３５０のイオンを担う部分配列の質量（ここで、配列タグ３１０は、図３Ｂに示されるように同定される））である。このような質量の計算は、イオンの大きさに関与し、そして前駆体イオンおよび他の生成物イオンの質量に関与し得る。同様に、接尾辞Ｎ２は、配列タグに続く対応するペプチドの部分配列の質量（例えば、図３Ｂに示された実験において、ｍ／ｚ＝５６４のイオンに由来する部分配列の質量）を示す。
【００２５】
上記工程２１０における候補配列のセットを同定するための、上記データベース検索アプローチを使用する実施形態（候補配列のセットを同定するための、他の非−ＭＳベースの技術を使用する実施形態）において、配列タグは、１つ以上の一致しないスペクトルに対して、自動的にまたは相互にデノボ配列決定を実施することによって同定され得る。１つの実施形態において、デノボ配列決定は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能なＤｅＮｏｖｏＸ自動デノボ配列決定ソフトウェアを使用して実施され得る。複数タグは、いくつかまたは全てのペプチドにおいて同定され得る。これらの配列タグは、改変されたポリペプチド（すなわち、未知のポリペプチドの未改変の改変体を示す既知のポリペプチド）を同定するために候補配列のセットと比較される（工程２３０）。例えば、候補配列のセットに対応する配列の減少したデータベースは、１つ以上の同定された配列タグを含む候補ペプチドを同定するために検索され得る。候補配列のセットは、公的に利用可能なソフトウェアプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）（潜在的に一致する配列のリストおよび一致の質を示す関連スコアを出力する）を使用して検索され得る。所定の配列タグは、所定のペプチドに保存され得る。（すなわち、タグは、対応する候補配列中に現れるのと逆の順でその対応するペプチド中に現れ得る）。いくつかの実施形態において、相関モジュールは、このような差異および質量データ中の微小な誤差を計算するように構成され得る。
【００２６】
タグの部分配列は、ポリペプチドの潜在的な未改変の改変体に対応する候補配列に位置確認され得る。ＭＳ  ＢＬＡＳＴまたは他のデータベース検索技術は、候補配列中のタグ部分配列を位置決定するために使用され得、そして、例えば、質量データにおける微小誤差から生じ得る、タグ配列と「一致」候補配列との間の差異を考慮するために構成され得る。これは、潜在的に対応する候補配列中の一致しないペプチドに対する可能な位置確認を生じる。
【００２７】
一旦、候補配列のセットが同定されると（例えば、一旦、候補配列情報の減少したデータベースが構築されると）、３または４アミノ酸のタグは、代表的に、高い信頼性で対応する改変ペプチドを同定するのに十分である。サンプルが高い質でない場合でさえも、この長さのタグ（およびしばしばさらにより長い）は、通常、デノボ配列決定を使用して同定され得る。所定の配列タグに対する正確な同定を有する可能性（すなわち、配列タグと候補配列との間の一致の信頼レベル）は、以下の式：
ｐ＝（１−（１／Ａ）Ｌ×２ｐ）Ｎ×Ｓ
によって与えられ、ここで、Ａは、未改変のアミノ酸の数（すなわち、代表的に２０（天然に存在するアミノ酸の数を示す））であり、Ｌは、配列タグのアミノ酸長であり、Ｓは、候補配列のセットのアミノ酸の数であり、ｐは、アイソバリック対を有するタグ上のアミノ酸（例えば、ＬまたはＩ）の数であり、Ｎは、相関するタグの総数である。本明細書中に記載される技術が、なお使用され得るが、デノボ配列決定情報が、データベース中の候補配列情報に正確には一致しない場合か、または１つのタグの同定が他のタグと独立して実施されない場合、この式は適用されないことに留意のこと。
【００２８】
各配列タグに対して、ペプチドと、対応する候補配列の部分配列との間の質量差が計算される（工程２４０）。図４を参照すると、プレフィックス配列質量Ｘ１およびサフィックス配列質量Ｘ２が、候補配列４００について計算される。プレフィックス配列質量は、タグ位置に先行する候補配列の部分配列の質量を表し、一方で、サフィックス配列質量は、タグ位置の後の候補配列の部分配列の質量を表す。候補配列のプレフィックス配列質量およびサフィックス配列質量は、候補配列の関連する部分配列についてのアミノ酸質量を加算することによって、計算され得る。
【００２９】
プレフィックス質量差Δｍ１＝Ｎ１−Ｘ１は、タグプレフィックスＮ１の質量を候補配列プレフィックス配列質量Ｘ１から減算することによって、計算される；サフィックス質量差Δｍ２＝Ｎ２−Ｘ２は、同様に、タグサフィックスＮ２の質量を候補配列サフィックス配列質量Ｘ２から減算することによって、計算される。
【００３０】
質量差を使用して、対応するペプチドにおいて改変が存在することを判断し得る（工程２５０）。候補配列のプレフィックス部分およびサフィックス部分の正しい同定を仮定すると、０（または質量データの精度に依存して、ほぼ０）の質量差は、改変が、関連するペプチド部分配列に存在しないことを示す。Δｍ１またはΔｍ２が０ではない場合、質量差は、ペプチド部分配列に対する１つ以上の改変の質量を示す。いくつかの実施において、分析プログラムは、使用者に、既知の配列（すなわち、候補配列の関連する部分）および対応する質量差を出力する。あるいは、またはさらに、０ではない質量差を使用して、ペプチドに存在する実際の化学的改変（単数または複数）を、プレフィックスまたはサフィックスに存在するアミノ酸に限定された、既知のアミノ酸改変のコレクション（例えば、このような改変の公共で利用可能なデータベース）を検索し、質量差を説明し得る改変を同定することによって、同定し得る。
【００３１】
従って、上記技術の適用は、高い信頼性での改変されたペプチドの同定、改変の質量の推定、プレフィックス部分配列またはサフィックス部分配列内の改変の局在、ならびにプレフィックス部分配列およびサフィックス部分配列の推定を提供する。
【００３２】
本発明の局面は、デジタル電子回路構造、またはコンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはこれらの組み合わせにおいて実施され得る。本発明のいくつかまたは全ての局面は、コンピュータープログラム製品（すなわち、情報キャリア（例えば、機械読取り可能な格納デバイスまたは伝搬される信号）に明白に埋包され、データプロセシング装置（例えば、プログラム可能なプロセッサ、コンピューター、または複数のコンピューター）による実施のための、またはこの操作を制御するための、コンピュータープログラム）として実施され得る。コンピュータープログラムは、任意の形態のプログラミング言語（編集された言語または翻訳言語が挙げられる）で書かれ得、そして任意の形態（独立型プログラム、またはモジュール、成分、サブルーチン、あるいは電算環境における使用に適切な他のユニットが挙げられる）で展開され得る。コンピュータープログラムは、１つのコンピューターまたは複数のコンピューターにおいて、１つのサイトでかまたは通信ネットワークによって相互接続されて複数のサイトに分布して、実行されるように展開され得る。
【００３３】
本発明の方法工程のいくつかまたは全ては、入力データを演算して出力を生じることによって、コンピュータープログラムを実行して本発明の機能を実施するための、１つ以上のプログラム可能なプロセッサによって実施され得る。方法工程はまた、専用論理回路構造（例えば、ＦＰＧＡ（現場でプログラム可能なゲート列）またはＡＳＩＣ（アプリケーション特殊集積回路））によって実施され得、そして本発明の装置は、専用論理回路構造として実行され得る。本発明の方法は、コンピューターの制御下で自動的に実施される工程の組み合わせとして実行され得、そして工程は、人間の使用者（例えば、科学者）によって手動で実施され得る。
【００３４】
コンピュータープログラムを実行するために適切なプロセスとしては、例として、汎用マイクロプロセッサと専用マイクロプロセッサとの両方、および任意の種類のデジタルコンピュータの任意の１つ以上のプロセッサが挙げられる。一般に、プロセッサは、読取専用メモリまたはランダムアクセスメモリ、あるいはこれらの両方から、命令およびデータを受け取る。コンピューターの本質的な要素は、命令を実行するためのプロセッサ、ならびに命令およびデータを格納するための１つ以上のメモリデバイスである。一般に、コンピューターはまた、データ格納のための１つ以上の質量格納デバイス（例えば、磁気ディスク、磁気光学ディスク、または光ディスク）からのデータの受信またはこのデバイスへのデータの移動のため、あるいはその両方のために、これらのデバイスを備えるか、または必要に応じてこれらと接続される。コンピュータープログラムの命令およびデータを実施するために適切な情報キャリアとしては、全ての形態の不揮発性メモリ（例として、半導体メモリデバイス（例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、およびフラッシュメモリデバイス）；磁気ディスク（例えば、内部ハードディスクまたはリムーバブルディスク）；磁気光学ディスク；ならびにＣＤ−ＲＯＭディスクおよびＤＶＤ−ＲＯＭディスクが挙げられる）が挙げられる。プロセッサおよびメモリは、特殊論理回路構造によって補助され得るか、またはこの構造に組み込まれ得る。
【００３５】
使用者との対話を提供するために、本発明は、使用者に情報を表示するためのディスプレイデバイス（例えば、ＣＲＴ（陰極線管）またはＬＣＤ（液晶ディスプレイ）モニタ）、ならびにキーボードおよびポインティングデバイス（例えば、マウスまたはトラックボール）（これらによって、使用者は、コンピューターに入力を提供し得る）を有するコンピューターで実行され得る。他の種類のデバイスが、同様に、使用者との対話を提供するために使用され得る。
【００３６】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載される。この実施例は、例示的であるのみであり、そして特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定することを意図されない。
【実施例】
【００３７】
ウシユビキチン、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）およびウシカルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ  ＩＩ）（すべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡから入手した）の混合物を調製した。このタンパク質混合物を、ジチオトレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでカルボキシアミドメチル化し、そしてトリプシンで消化した（全て、従来のタンパク質生化学技術を使用した）。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＨＰＬＣ  ＳｕｒｖｅｙｏｒＴＭシステムと直列のＬＣＱ  ＤＥＣＡＴＭイオントラップ質量分析計（これらの両方は、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎから入手可能である）を使用して収集した。獲得した全てのスペクトルを、不在バッチ配列決定モードで、最初はデフォルトパラメータを用い、引き続いてより低い許容閾値のカルボキシアミドメチル化を特定して、ＰＡＲＳＥＫ  ＩＩプログラムを使用して分析した。分析プログラムの配列決定モジュールからの出力を、従来のデータベース検索をいずれも行わず、手動でデータベース全体と相関付けた。
【００３８】
分析プログラムの配列決定モジュールからの例示的な出力ファイルが、図５に示される。各タグについての絶対的な確率および相対的な確率が、右側に示される。完全な配列には下線が引かれている；正確な部分配列およびタグは、枠内に示される。この情報を効果的に利用するためには、さらなる情報（すなわち、プレフィックス質量情報およびサフィックス質量情報）が必要とされる。
【００３９】
合計６５個のペプチドが同定された（従来のデータベース検索を使用するより多い）。全てが、ウシデータベースを用いるコレクションの後に、明白に同定された。同定されたペプチドのうちの６３個が、図６に列挙されている。トリプシンから、あと２つのペプチドが同定された。図６において、ＣＮとは、プログラム出力における位置Ｎにおいて見出される完全配列を表す（すなわち、Ｃ１は、最初の選択肢として見出される配列を意味する）；ＴＮとは、Ｎ個のアミノ酸の最も高い確率のタグを意味する。改変されたペプチドは、「＊」を用いて同定される。
【００４０】
同定されたペプチドは、図７に関して示される。下線を引いた囲みは、デノボ配列決定のみを使用して（すなわち、以前のデータベース検索が行われなかった）同定されたペプチドを用いて得られた。デノボ配列決定出力を、タンパク質の既知の配列と相関付けることによって同定される改変は、太字で強調して示される。４つの人工的に導入された改変（カルボキサミドメチル化、枠によって表される）は、その改変がデノボ配列決定ソフトウェアに対して未知である場合でさえも、デノボで同定された。
【００４１】
９個の改変が、図８に示されるように、４つの周知のタンパク質において見出された。全てが、明白に同定された。示されるように、アセチル化セリンは、３つの異なる変化部位において見出された。ペプチドＬＧＥＹＧＦＱＮＡＬＩＶＲは、３つの形態で見出された：未修飾、および２つの異なる様式での修飾。ＢＳＡにおいて、可能な未知の変異ＡからＥが存在する。これらの場合のうちの４つにおいて、改変は、２つまたは３つのアミノ酸のうちの１つに局在されるが、改変の位置は、それより正確には決定され得ない。同定された改変の全てのうちの、アセチル化およびユビキチンにおける改変のみが、以前に報告された。
【００４２】
カルボキシアミドメチル化は、この情報が操作者に開示されない場合でさえも、複数のファイルから判断された。さらなる２つのタンパク質が、デノボで見出された：スーパーオキシドジスムターゼおよびウシトリプシノゲン（両方、夾雑物である）。
【００４３】
本発明が、特定の実施形態の観点から記載された。他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。例えば、本発明の工程は、異なる順序で実施され得、なお所望の結果を生じる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
種々の図面における同じ参照番号および名称は、同じ要素を示す。
【図１】図１は、本発明の１つの局面に従う、ペプチド中の改変を同定するために作動可能なシステムを示す概略図である。
【図２】図２は、ペプチド中の改変を同定するための方法の１つの実施形態を示すフロー図である。
【図３】図３Ａは、ペプチド中の配列タグを示す概略図である。図３Ｂは、ペプチド中の配列タグを同定するために使用され得る模範的なＭＳ２実験において生成されるデータを示す。
【図４】図４は、候補配列中の配列タグの同定を示す概略図である。
【図５】図５は、本発明の１局面に従う、分析プログラムの配列決定モジュールの模範的な出力ファイルである。
【図６】図６は、本発明の１局面に従う、模範的実験において同定された多くのペプチド（同定された多くの改変を含む）を列挙する表である。
【図７】図７は、図６の模範的実験において同定されたペプチドを示し、これは、対応するタンパク質に関連して、同定された改変を含む。
【図８】図８は、図６および７の模範的実験において同定された改変を、より詳細に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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