(57)【要約】本発明は、生物学的サンプル中の少なくとも１つの微量栄養素の供給プロフィールの測定方法に関する。場合により、細胞を単離した後、特に生物学的サンプル中に含有される細胞の数及び/又は量を測定した後で、前記細胞を溶解することにより、細胞タンパク質、特に細胞膜タンパク質を、前記生物学的サンプルから除去し、そして必要に応じて変性後に微量栄養素を上記溶解物から取り出し、そして上記サンプル中の上記微量栄養素の割合、特に上記微量栄養素の重量を細胞内濃度の尺度として計測する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中の少なくとも１つの微量栄養素の供給プロフィールの測定方法であって、場合により細胞を分離した後、そして特に上記生物学的サンプル中に含まれる細胞の数及び/又は量を測定した後で、上記細胞を溶解することにより、細胞タンパク質、特に細胞膜タンパク質を、上記生物学的サンプルから除去し、そして必要に応じて変性後に、上記溶解物から微量栄養素を得て、そして上記サンプル中の上記微量栄養素の割合、特に上記微量栄養素の重量を、細胞内濃度の尺度として計測する前記方法。
【請求項２】
微量栄養素の細胞内濃度を測定するために、溶解される前記生物学的サンプルとして組織細胞が使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
使用される前記組織細胞が、上皮組織、特に粘膜、例えば頬粘膜細胞に由来する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプル中の微量栄養素の少なくとも１つの割合を、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、ガス・クロマトグラフィ(GC)、イオン・クロマトグラフィ、原子吸光分光測定(AAS)、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MP)、キャピラリー電気泳動(CE)、質量分析(MS)などから成る群から選択される分析方法によって測定する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記微量栄養素が、例えばプロビタミン、ビタミン、ミネラル及び微量元素、アミノ酸、脂肪酸、ポリフェノール、ホルモン及び臓器抽出物、及びその合成産物、例えばパンクレアチン、没食子酸、軟骨基体（cartilage base substance）などから成る群から選択される物質の少なくとも１つである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
前記微量栄養素が、レチノイド構造(ビタミンA)、ビタミンB複合体、アスコルビン酸(ビタミンC)、カルシフェノール(ビタミンD)、トコフェロール(ビタミンE)、ビタミンK、フラボノイド及びビオチンを有する天然化合物及び合成化合物から成る群から選択されるビタミンである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記微量栄養素が、例えばレチノール、レチニル・アセテート、レチニル・パルミテート、3,4-ジデヒドロレチノール(ビタミンA2)、レチナール、レチン酸及びプロビタミン、例えばα-、β-、γ-カロテンから成る群から選択されるレチノイド構造を有する化合物の少なくとも１つである、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項８】
前記微量栄養素が、チアミン(ビタミンB1)又はチアミン塩酸塩又はチアミン・モノナイトレート、リボフラビン(ビタミンB2)又はリボフラビン-5-リン酸ナトリウム、ナイアシン(ビタミンB3)又はニコチン酸又はネアシン、パントテン酸(ビタミンB5)又はD-パントテン酸カルシウム又はD-パントテン酸ナトリウム又はD-パンテノール、ピリドキシン(ビタミンB6)又はピリドキシン塩酸塩又はピリドキシン-5-ホスフェート又はピリドキシン・ジパルミテート又はピリドキサル・ホスフェート、葉酸(ビタミンB9)又はプテロイル・グルタミン酸、コバラミン(ビタミンB12)又はシアノコバラミン又はヒドロキシコバラミン、ビオチン、コリン、イノシトール及びp-アミノ安息香酸から成る群から選択されるビタミンB複合体化合物の少なくとも１つである、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項９】
前記微量栄養素が、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ナトリウム、L-アスコルビン酸カルシウム、L-アスコルビン酸カリウム及びL-アスコルビル-6-パルミテートから成る群から選択されるアスコルビン酸化合物の少なくとも１つである、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項１０】
前記微量栄養素が、エルゴカルシフェロール(ビタミンD2)、コレカルシフェロール(ビタミンD3)、1,25-ジヒドロキシコレカルシフェロール、及びプロビタミン・エルゴステロール又は7-デヒドロコレステロールから成る群から選択されるカルシフェロール化合物の少なくとも１つである、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項１１】
前記微量栄養素が、D-α-トコフェロール、DL-α-トコフェロール、D-α-酢酸トコフェロール、DL-α-酢酸トコフェロール及びD-α-トコフェリル酸スクシネートから成る群から選択されるトコフェロール化合物の少なくとも１つである、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項１２】
前記微量栄養素が、フィロキノン(ビタミンK1)、メノキノン(ビタミンK2)、メナジオン(ビタミンK3)及びメナジオン・ヒドロキシキノン(ビタミンK4)から成る群から選択されるビタミンK化合物の少なくとも１つである、請求項5又は6に記載の方法。
【請求項１３】
前記微量栄養素が、Na、K、Mg、Ca、Fe、I、Cu、Mn、Zn、Co、Mo、Se、Cr、F、Si、Ni、As、Sn、V、P、Cl、B、Al及びBrから成る群から有機体にとって重要な順序で選択されるミネラル又は微量元素の少なくとも１つである、請求項5に記載の方法。
【請求項１４】
前記微量栄養素が、補酵素Q-10、ケルセチン、ブロメライン、イノシトール、コリン、ピクノゲノール、カルニチン、タウリン、メソイノシトールから成る群から選択される成分の少なくとも１つである、請求項5に記載の方法。
【請求項１５】
前記微量栄養素が、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン及びアルギニンから成る群から選択される必須アミノ酸の少なくとも１つである、請求項5に記載の方法。
【請求項１６】
前記微量栄養素が、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸から成る群から選択される脂肪酸の少なくとも１つである、請求項5に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１つの微量栄養素の細胞内濃度を測定するために、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法において使用される、細胞を含む生物学的サンプルを獲得し、そして調製するための分析キットであって、サンプル採取器具、例えばスパチュラ、ブラシ、スティック、毛管、並びに水、緩衝食塩水、0.9%濃度のNaCl溶液、安定化剤及び界面活性剤、特に溶解試薬から成る群から選択される試薬の少なくとも１つを場合により含むシール可能なサンプル容器、そして、場合により、特に上記の細胞を含むサンプル容器を冷却するための断熱されたサンプル容器収容用コンテナを含む分析キット。
【請求項１８】
粘膜細胞中の少なくとも１つの微量栄養素の濃度を測定するための請求項17に記載の分析キットの使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項1及び17の導入部に記載された構成要件を有する形式の、生物学的サンプル中の少なくとも１つの微量成分の供給パターンを測定する方法、及び、少なくとも１つの微量栄養素の細胞内濃度を測定する目的で、細胞を組み込む生物学的サンプルを獲得して調製するための分析キット、並びに、請求項18に記載された、分析キットの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進工業国における人々の間では、近年、栄養及び健康の問題に対する意識が高まっている。しかし、食料が十分に供給されているにもかかわらず、選択される栄養素の欠乏による疾患が、以前と同様に発生し続けている。従って、健康な組織体を確保するためには、特定の栄養素の欠乏又は過剰を認識し、ひいては栄養素の摂取量を補足又は低減することにより、このような栄養素の欠乏又は過剰を補償することが重要である。
【０００３】
栄養素の欠乏は1960年代に初めて認識され、「正分子医療(orthomolecular medicine」という表現のもとで要約された。「正分子」という用語の起源は、「orthos」(ギリシャ語)(すなわち正しい、良好な、の意味)及び「分子」(ラテン語)(=物質のモジュール)である。このコンセプトは、2回にわたるノーベル賞受賞者Linus Paulingによって、1968年に遡って選択される。このようなコンセプトが選択されるのは、これが治療の背後にある原理を完全に表現しているからである。正分子医療の根底を成す治療の原理は、人体の臓器すべてが健康に且つ正しく機能しようとするならば、人体は生体物質(微量栄養素)を必要とするという認識に基づいている。生体物質は、ビタミン、ミネラル、微量元素及び必須脂肪酸を意味する。正分子治療物質は、生体真正物(eubiotics)という用語でも呼ばれる。正しい投与量で、正分子治療物質は最適な健康保護を可能にする。
【０００４】
活性原理はLinus Paulingによって下記のように定義されている：
「正分子医療は、体内に正常な状態で存在して健康を担う物質の濃度を変化させることにより、良好な健康状態を維持し、そして疾患を治療することに基づく。」
健康の保護及び疾患の予防は、正分子物質を最適な投与量で投与することに基づく。正分子医療では、我々の食品中及び体内で完全に自然に生じる物質だけが使用される。これらの物質は、生体物質、例えばビタミン及びミネラルを含む。これらの生体物質を、我々の身体は生成できないか、或いは十分な量では生成することができない。従って我々が元気で健康であり続けようとするならば、これらの生体物質は微量栄養素として規則正しく投与されなければならない。
【０００５】
しかし、生体物質のレベルは各個体によって変動する。個体レベルは、種々の外的及び内的な要因、例えば食習慣及び生活習慣、年齢、健康状態及び環境による影響に依存する。或る特定の環境下では、これらの要因は所要量を著しく増大させるので、ビタミン及びミネラルの最適な所要摂取量は、多くの場合、健康的なバランスのとれた食事をもってしてもカバーすることはできない。従って、生体物質はほとんど避けることはできない。今日、ビタミンレベルの問題は病人、特に慢性病患者の場合にのみ生じる。しかし、健康な人物がビタミンレベルを高めることも重要である。なぜならば、このことは、体内の生体物質の欠乏に関する重要な情報を提供することになり、これにより、欠乏又は過剰によって引き起こされるかもしれない疾患が早期の段階で認識され、予防されるのを可能にする。しかし、現在、ビタミンレベルを高めるための治療は、医師の診察に続いて、血液サンプルを提供し、複雑なラボラトリー分析を行う以外には実施されておらず、多くの時間がかかり、コストも高いことから、予防試験の標準部分になるには至っていない。
【０００６】
種々異なる解決策が、生体物質、特にビタミンの分析手段として従来技術において提供されている。これらの目的を達成するための1つの方法は、ガス・クロマトグラフィ又は質量分析を用いて微量栄養素を測定し、そして定量化することである。例えば米国特許出願公開第5,800,979号明細書には、体液中の葉酸補酵素のin vivo濃度を測定する方法が記載されている。この方法では、既知の量の葉酸が内部標準として、体液中の葉酸濃度と比較される。この体液は少なくとも１つの補酵素を含有する。次いで内部葉酸標準が精製され、葉酸補酵素濃度が定量化され、ガス・クロマトグラフィ又は質量分析によって評価が記述される。定量化は体液、例えば血液、尿脳、脊髄液及び羊水を使用して行われる。
【０００７】
欧州特許出願公開第840127号明細書には、ビタミン及びミネラルのパターンを試験するための表及び方法が記載されている。血中のビタミン及びミネラルの指示値を示す表が示されている。これらの範囲は、健康な人物の目標値を示す。次いで血液分析から生じた値は、表に入力され、これにより、欠乏又は過剰の記録を保存することができる。被験者の健康状態及び加齢プロセスを、差異に基づいて測定することができる。水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン及びミネラルが血液から分析される。
【０００８】
国際公開第95/29628号パンフレットには、ビタミン欠乏が人において迅速に検出されるのを可能にする方法が開示されている。ビタミン欠乏は、その人物の暗さに対する調節能力によって測定される。この能力は、種々の試験システム及び種々異なる光条件を用いて試験される。ビタミンに関連するこれらの試験から得られた分析データは、体液から得られた結果と比較することができる。
【０００９】
国際公開第89/12826号パンフレットには、血清中のビタミンB12の競合結合分析が開示されている。この方法には固定化されたビタミンBが使用され、このビタミンBは、結合相手を巡って、サンプル中のビタミンB12と競合する。固定化ビタミンB12上の結合相手の量が測定され、これはサンプル中の遊離ビタミンB12の濃度に対して反比例する。結合相手はビオチン化され、リポーター基に結合されたアビジンとの反応によって検出される。固定化されたビタミンB12は、タンパク質リンカー、例えば抗ビタミンB12抗体によってビードに結合される。
【００１０】
従来技術の場合、微量栄養素の濃度は、血液、血清またはその他の体液を使用して測定される。これらの方法の欠点は、循環する生体物質の濃度だけしか明示できず、細胞内に含有される実際の濃度を明示できないことである。
従って、本発明の根底を成す目的は、細胞中の微量栄養素レベルを高める方法を提案することである。
【発明の開示】
【００１１】
この目的は、請求項1の特徴部に記載された構成要件を組み込んだ方法の結果として、本発明により達成される。この方法の利点は、物質の細胞内及び細胞外双方の濃度が、生理的機能、例えば信号伝達にとって、ひいては細胞の(病理)生理的状態にとっても極めて重要であるという事実にある。別の利点は、細胞内濃度を測定することにより、単に血液中を循環する物質の量に基づいて微量栄養素(生体真正物)及び生体異物双方の生体利用効率を測定するのではなく、細胞によって吸収された微量栄養素の実際の量が測定されるのが可能になるという事実である。細胞内濃度を測定する別の利点は、例えば補給治療中の連続的なモニタリングを可能にし、これにより、生体物質調製物の非選択的な摂取を回避することにある。生体物質調製物の非選択的な摂取は、この物質の過剰な供給を招くおそれがある。さらに、生体物質の範囲全体を、補給治療に取りかかる前にスクリーニングすることができるので、どの微量栄養素の補給が必要なのかを確立することができる。
【００１２】
請求項2に定義された実施態様も有利である。なぜならば、この実施態様は、血液上での測定の場合のように有機体全体の濃度を測定するのではなく、瞬時のレベル増大と、各組織の継続的な制御とを別個に可能にするからである。
【００１３】
請求項3に定義された別の有利な実施態様は、上皮細胞、特に粘膜を使用する。粘膜は容易にアクセス可能であり、分析のために容易に取り出すことができ、これにより生検又は血液サンプルの採取の必要性を取り除く。
【００１４】
さらに有利であるのが判ったのは、医師の処方箋なしで薬局でOTC(オーバー・ザ・カウンター)調剤として微量栄養素製品を購入する人々のために、この方法を用いることもできる点である。購入者は次いで、微量栄養素の自己レベルをモニターし、これにより、これらの調剤を使用する場合に過剰供給を防止することができる。さらに別の利点は、この方法を単純且つ迅速に実施することができるという事実である。なぜならば、この方法は、医学的な熟練者を必要とする血液サンプルを不要にするからである。そしてこれによりこの方法は、全体的に単純化され、財政的に逼迫する健康保険制度のコストを軽減することができる。
【００１５】
請求項4に定義された実施態様は有利である。この実施態様の場合、濃度が種々の分析法を用いて、或いは種々異なる分析法の組み合わせを用いて測定される。この実施態様が有利であることが証明されたのは、この分析法が、複数のサンプル中の濃度が極めて迅速に測定されるのを可能にするからである。
【００１６】
請求項5に定義された別の実施態様は、多くの種々異なる物質の濃度を測定することができるので有利である。これらの物質のうちの1つ、又はこれらの物質の組み合わせの細胞内濃度は、疾患の予防治療に関連した重要なデータを提供する。しかしこのデータはもちろん、疾患、特に慢性疾患の進行に関する重要な情報をも含有する。別の利点は、幾つかの微量栄養素濃度を測定することにより、生体異物濃度を測定する場合よりも著しく広い治療範囲を得ることがしばしば可能であるという事実である。なぜならば、複数の生体真正物を組み合わせると相乗効果が生じ、その結果として、微量栄養素の薬理学的特性は、身体に対して異物性の薬物とは或る程度まで明らかに区別することができるからである。微量栄養素を吸収すると例えば酸化的保護がもはや生じず、これに対して、抗酸化的特性を有する2つ又は3つ以上の微量栄養素の組み合わせが、抗酸化的効果を示すことになることを、濃度を測定することによって証明することができる。正分子手段は生化学的な刺激を開始する。この刺激を有機体は評価し、そして有意義な方法でこの刺激に対して応答する。なぜならば、身体は「オリジナル部分」、すなわち身体がなじんだ物質に対処するからである。このことは、代謝への早期の介入、修復メカニズムの最適化、フリー・ラジカルの固定及びその他の多くのことを可能にする。
【００１７】
請求項6に定義されているように、この方法により、生物の重要な機能に不可欠ではあるが、しかし、代謝によっては十分な量を合成することができず、従って食事とともに規則的に取り込まなければならないビタミンの供給量の濃度を測定することが可能になる。特定の機能のうち、ビタミンは代謝を触媒する補酵素の要素でもある。通常必要とされるビタミン量は極めて低いにもかかわらず、最小濃度未満に低下すると、特定の欠乏症(ビタミン欠乏症)、例えば夜盲症(ビタミンA)、壊血病(ビタミンC)、くる病(ビタミンD)、悪性貧血(ビタミンB12)、脚気(ビタミンB1)及び凝固異常(ビタミンK)を強調することがなおも可能である点で有利であることも判っている。他方において、この方法は、特定のビタミン(A,D)の補給量が多すぎると、中毒(ビタミン過剰症)の発生を示すことができる。
【００１８】
請求項7に定義された別の実施態様からも利点を得ることができる。この実施態様の場合、レチノイド構造を有する化合物の濃度を測定することにより、視覚、成長、上皮組織の発生及び分化、生殖(精子形成、胎盤の発育、胎児の発育)、及びテストステロンの生成に関連する生化学的機能の証拠を強調することができるようになる。濃度の検出により、特にハイリスク群、例えば未熟児、若い女性及び65歳を上回る年齢の男性におけるビタミンA欠乏症の証拠を早期に提供することができる。少食、消化不良および吸収不良(例えばクローン病)、完全非経口栄養法、すい臓病及びアルコール関連疾患に起因するより持続的な欠乏症は、暗さに対する適応の遅延、成長、骨形成、移植の問題、及び妊娠中の胎児の発育異常を招くおそれがある。ビタミンAの欠乏は、先進工業国においては稀である傾向があるが、しかしビタミンA栄養補助食品を制御しない状態で、又は正しくない状態で自己投与すると、ビタミンA濃度レベルを増大させ、吐き気、嘔吐、頭痛、乾燥皮膚及び乾燥粘膜を招き、究極的には骨膜の膨張、出血、脱毛、神経過敏、特発性骨折及び催奇形効果を引き起こすおそれがある。発展途上国の場合、ビタミンA欠乏症は、主要なビタミン欠乏症の1つである。
【００１９】
請求項8に定義されているように、ビタミンB複合体の濃度を測定すると有利であることも判っている。ビタミンB複合体は、代謝における多くの制御的機能を担っている。ビタミンB複合体の濃度を測定することにより、これらの機能をモニターすることができるようになる。人体は、このビタミン複合体を貯蔵するためのキャパシティを僅かにしか有していないので、健康状態を確保し、そして生理的機能を維持するために、定期的に濃度を測定する必要がある。
【００２０】
濃度測定は、食事に起因する供給の問題を強調することができる。この食事は例えば、もっぱら機械によって殻を除去されて研がれた米及び穀物製品に基づく食事である。処理中には、チアミンの大部分が含有される殻が少なくとも部分的に除去される。チアミン欠乏症の早期症状は疲労、緊張、記憶低下、不眠、拒食症、腹部不調、便秘である。
【００２１】
リボフラビン欠乏症は主として、不十分な乳タンパク質及びその他の動物タンパク質に基づく食事から生じる。リボフラビン欠乏症は主として、外胚葉起源の組織内に発現する。
【００２２】
ナイアシン濃度を測定すると有利であることが判っている。なぜならば、重症のナイアシン欠乏症はペラグラを引き起こすからである。一次性欠乏症は、典型的には、トウモロコシが食事の主な要素を構成する地域に発生する。トウモロコシにおいて発生する形の結合ナイアシンは、事前のアルカリ処理なしでは腸内に同化されない。ペラグラの兆候は、皮膚、粘膜、中枢神経系及び胃腸管において観察することができる。
【００２３】
パントテン酸は、多くの食材中に存在し、多くの酵素反応において、例えばクエン酸回路や脂肪酸回路において、アシル転移補因子として作用する補酵素Aの主成分であり、そしてその濃度の検出により、早期の段階における生理的平衡からのいかなる離脱をも防止することができる。
【００２４】
ピリドキシンはピリドキソール(アルコール)、ピリドキサル(アルデヒド)及びピリドキサミン(アミン)として発生する。これらの物質はピリドキシン群に含まれ、質及び量に関してビタミンと同じ効果を有する。ピリドキサールホスフェートを生成するために体内でホスホリル化されるピリドキシンの濃度を測定することにより、このビタミンの欠乏又は過剰を早期に検出できるようになる。このビタミンは、血液、皮膚および中枢神経系の代謝を制御し、そして多くの反応(アミノ酸の脱カルボキシル化及びアミノ基転移、ヒドロキシアミノ酸及びシステインの脱アミノ化、トリプトファンからナイアシンへの変換、及び脂肪酸代謝)における補酵素として機能する。
【００２５】
出産適齢期の女性における葉酸の濃度を検出することが特に重要である。なぜならば、このビタミンの不足は、胎児の発育異常を招くおそれがあるからである。妊娠前及び妊娠初期に、食事に葉酸を補給することが、骨脊椎管の発育上の奇形(脊椎披裂)、並びに、脊髄及び脳のその他の奇形を防止するのに特に効果的であることが、包括的な研究によって疑う余地なしに示されている。予防効果は100%確実というわけではないが、しかし一生涯に及ぶ障害をもたらすこれらの重度の奇形を、全ての事例の約4分の3の確率で防止することができる。
【００２６】
コバラミンは、動物組織体のみに実際に発生する唯1つのビタミンである。このビタミンの濃度の測定は、特に、肉食しないだけでなくほかの動物性食品、例えばミルク及び卵も食べない菜食主義者に必要とされる。ビタミンB12欠乏症は、主として高速の細胞分裂を伴う組織において明らかになり、そしてDNAの生合成に影響を与えるおそれがある。
【００２７】
脂肪及び炭水化物の双方の代謝における必須補酵素であるビオチンの含量の測定は、特に有利である。なぜならば、ビオチンの欠乏は、精神的及び肉体的発育の遅れ、脱毛、角結膜炎、並びにT及びB細胞に関連する免疫の衰弱の形で現れるので、早期に検出されれば、ビオチンの欠乏の結果として生じる問題を防止することができる。
【００２８】
請求項9に定義されている実施態様も有利である。この実施態様の場合、コラーゲンを生成し、そして間充織起源の物質(結合組織、骨の骨様物質、歯の象牙質)を維持するのに不可欠なアスコルビン酸の濃度を検出することにより、予防治療が可能になり、これに付随する目安の量を慢性疾患期間中に処方できるようになる。ビタミンCの所要量はまた、妊娠中及び授乳期において、また急性炎症性疾患、手術及び火傷、並びに甲状腺亢進の場合に増加する。濃度の検出により、ビタミンC栄養補助食品の正しい投与量を処方するのを可能にするデータを提供することができるので有利である。強力な還元剤として、アスコルビン酸は水素又は電子を可逆的に転移させることができ、フェニルアラニン及びチロシン代謝に関与し、そして還元剤として酵素を活性化し、これらの酵素は翻訳後にプロトコラーゲンのプロリン及びリシンをヒドロキシル化によりヒドロキシプロリン及びヒドロキシリシンにする。
【００２９】
ビタミンCはまた、栄養素の成分とカップリングされた葉酸をこれらの接合から放出させ、鉄の吸収をも促進する。従って、アスコルビン酸の濃度を検出すると有利である。なぜならば、ビタミンCの結果としての投与量は、多くの相乗効果を生むからである。アスコルビン酸濃度の検出が有利な別の理由は、成人の場合、一次性欠乏が普通、ダイエットの流行又はアンバランスな食事に基づいて生じるからである。特に低温又は高温条件では、尿中のビタミンCの損失が増加する。多くの人は、多くの果物及び野菜がアスコルビン酸の十分な供給量を保証すると思い込んでいる。しかし、熱(例えば栄養素溶液の滅菌中又は調理中)が、食材中のビタミンCを破壊し、依然として欠乏症が発生するおそれがあることが良く知られている。このことは濃度の検出によって強調することができる。
【００３０】
請求項10に定義されているように、カルシフェロールの濃度を検出することも有利である。それというのも、これらのカルシフェロールはヒトの健康に関して重大な結果をもたらし得るからである。カルシフェロールの主な源は、皮膚において行われ、UV光に依存する合成である。7-デヒドロコレステリンを伴う光化学プロセスによって、プロビタミンD3が皮膚内で生成され、そしてプロビタミンD3はゆっくり異性体化され、これによりビタミンD3を生成する。ビタミンD3はビタミンD結合タンパク質によって運び去られる。カルシフェロール濃度の検出はまた、骨粗鬆症のリスクを排除する助けにもなる。1,25-デヒドロキシコレカルシフェロールの主な効果は、これが腸のカルシウム吸収量を増大させ、ひいては正常な骨形成及びミネラル化を促進することである。
【００３１】
請求項11に定義されているように、トコフェロールの証拠を検出すると有利であることが判っている。なぜならば、このことは細胞内の多数の不飽和脂肪酸の脂質過酸化反応を、抗酸化物質によって防止するのを可能にするからである。ビタミンEはまた、セレニウムと代謝上密接な関係を有する。特に未熟児、乳児、及び高割合の不飽和脂肪酸を含む食事を摂取する幼児において、濃度の検査が特に重要であることが判っている。なぜならば、一次性トコフェロール欠乏を極めて迅速に検出することができるからである。成人の場合、ビタミンE欠乏は、赤血球の寿命を短くし、 ケラチン尿及び筋細胞内のセロイド沈着を引き起こす。
【００３２】
請求項12に定義されているように、健康な血液凝固パターンを維持するのに十分な量があることを保証するために、ビタミンKの濃度を検出すると有利であることが判っている。ビタミンK欠乏症は、血液凝固能力の低下の形、及び出血(大量出血)しやすさの形で現れる。ビタミンKは体内の腸内細菌によって生成することもできるので、ビタミンKレベルをモニタリングするために定期的に濃度を検査すると有利である。
【００３３】
請求項13に定義されているように、温血動物にとって不可欠なミネラル及び微量元素の濃度を検査すると有利であることが判っている。生理的濃度の元素ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムは、ホメオスタシスの維持を担う。遺伝性欠損による代謝異常の治療に際して合成的な食事を導入すること、医原性のリスクをカバーするために腎不全患者の静脈内栄養補給及び透析を開発することは、これらの元素を補給できるように濃度を測定することの重要性を示している。体内で最小濃度(体重の0.005%未満)で生じる微量元素は、ヒトの生理において重要な役割を演じる。しかし、合成食品の開発が増大すると、これらの元素を過剰に摂取するおそれが生じる。過剰な摂取は必ずしも数年後まで明らかにはならないかもしれないものの、毒性症状を招くおそれがある。例えば多くの健康関連誌及び健康改善組織は、カルシウム及びマグネシウムが豊富であるという理由から、白雲石を賞賛している。人口の大部分はこの種の情報を受け入れがちである。しかし、発表された声明の指摘によれば、白雲石は金属、例えば鉄、クロム、リン、ニッケル、ケイ素、亜鉛及びカドミウムをも潜在的に毒性の濃度で含有している。本発明によって提案された方法は、ミネラル及び微量元素のこのような複雑な効果を伴う状況において、特定の利点をもたらす。なぜならば、複数の微量栄養素を検出することができるからである。
【００３４】
請求項14に定義された実施態様は、これらの物質の濃度の検出が、ヒトの健康状態の重要なインジケータになるという別の利点が得られる。例えば、必須アミノ酸であり、且つほとんどの動物種の組織内に見出されるタウリンは、タンパク質のビルディング・ブロックとしては存在せず、多くの組織内で遊離形として存在する。タウリンは、一連の生理的プロセス、例えば没食子酸の接合、浸透圧調節、生体異物の解毒化、細胞膜の安定化、細胞カルシウム流の制御、ニューロン刺激の調節を伴う。タウリン・レベルの低下は、網膜の変性、成長の遅延及び心筋症と関連している。
【００３５】
アセチル-L-カルニチンの濃度の検出が有利である。なぜならば、アセチル-L-カルニチンは、脂肪酸の酸化中にミトコンドリア内のアセチル補酵素Aの吸収を促進し、アセチルコリンの生成を増強し、そしてタンパク質及び膜リン脂質の合成を刺激するからである。アセチル-L-カルニチンはアセチルコリンと構造が類似しているため、アセチル-L-カルニチンは副交感神経模倣体としても働く。高濃度のアセチル-L-カルニチンはまた、アルツハイマー病、老年性痴呆症、HIV感染症、糖尿病性ニューロパシー、脳虚血及びアルコール誘発性認知障害の進行に対して好ましい効果をもたらす。
【００３６】
別の利点は、試験的研究が、ケルセチンがヒトの組織体に対して多くの方法で作用するという証拠を提供しており、この微量栄養素の濃度を測定することにより、人の全身的な健康状態に関する重要な情報を提供できるという事実である。例えばケルセチンは心臓循環系を保護し、癌及び潰瘍形成の発生を阻止し、アレルギー反応を防止し、白内障の発生を防止し、そして抗ウィルス効果及び抗炎症効果を有する。
【００３７】
また、ブロメラインの濃度を検出すると有利であることも判っており、そしてこのことは、凝固障害患者及び免疫系が弱った患者に特別な恩恵をもたらす。ブロメラインの抗炎症効果は、種々の生理的メカニズムに基づいている。証明された1つの原点は、炎症部位のブラディキニンの生成が、消耗に起因して阻害され、そして、凝固系の特定の中間生成物が低減することにより、フィブリン形成が抑制されるという事実である。さらに、ブロメラインはプラスミノゲンからプラスミンへの変換を促進し、ひいてはフィブリン溶解を刺激することが判っている。
【００３８】
請求項15に定義された方法の実施態様の結果として、アミノ酸の濃度を測定することにより、生物学的に有用なタンパク質の欠乏を強調することができる。アミノ酸はタンパク質及びホルモンのビルディング・ブロックである。必須アミノ酸の欠乏は、人体の生理的機能を停止させる。例えば、アルギニンはリンパ球の総数を上昇させ、一般に免疫応答細胞の形成を促進する。アルギニンはまた、マクロファージ及びNK細胞の細胞溶解能力を高める。加えて、アルギニンは創傷を治癒する上で重要な役割を演じる。ヒスチジンは抗アレルギー作用を有し、ヒスタミンの前駆体でもある。イソロイシン、ロイシン及びバリンは、筋肉タンパク質の重要な要素である。リシンはコラーゲン、カルニチン抗体、ホルモン及び酵素の主要要素であり、創傷治癒を助け、そして単純ヘルペスの治癒を促進する。メチオニンは抗酸化物質であり、肝臓を解毒化し、セレニウムの作用(吸収、輸送、生体利用効率)にとって不可欠である。フェニルアラニンは抗鬱効果を有し、エンドルフィン作用を延長し、エンドルフィン活性を増大させる。トレオニンは脂向性因子である。トリプトファンはビタミンB3の合成に重要であり、セロトニン及びメラトニン(睡眠率)の前駆体である。
【００３９】
請求項16に定義されているように、必須脂肪酸の濃度を測定することができる。有機体にとって、最適濃度の必須脂肪酸は、成長中に特に重要であり、人生後半において極めて重要である。例えば、脂肪酸は、全ての体細胞の膜及びミトコンドリアの弾性を保証し、そして細胞の再生を担う。脂肪酸はまた、防御細胞及び攻撃細胞を形成するために、免疫系によって必要とされる。脂肪酸はまた生殖腺内に生じ、そして内分泌系で、また細胞組織内でも、身体の自己ホルモン生成のためのビルディング・ブロックを形成する。必須脂肪酸の中で、極めて重要な役割を演じるのはリノール酸及びα-リノレン酸である。リノール酸及びα-リノレン酸は細胞膜の構造要素として働き、これらが生じさせる生成物、例えばプロスタグランジン、トロンボキサン及びロイコトリエンと相俟って、生命にとって重要な有機体内の多くのプロセスを制御する。アラキドン酸は動物性脂肪内にだけ生じ、プロスタグランジン合成のための出発生成物である。過剰のアラキドン酸は、リューマチ関節炎症に対して不都合な影響を及ぼすおそれがある。
【００４０】
本発明の目的はまた、請求項17の特徴部に定義された構成要件を組み込んだ分析キットによって独立して達成することができる。このアプローチの利点は、分析キットが、粘膜細胞を獲得して保存するための装置及び必要な全ての試薬を含有することである。別の利点は、分析キットは、家庭において室温で保存することができるほど、極めて保存しやすいという事実である。
【００４１】
本発明の目的はまた、請求項18の特徴部に定義された構成要件を組み込んだ分析キットを使用することによって独立して達成することができる。この場合の利点は、分析キットを使用することにより、微量栄養素の濃度を迅速に難なく測定できるようになることである。
【００４２】
次に、存在し得る複数の微量栄養素の濃度をいかにして測定することができるかについて、以下に説明する。但し、実施例に具体的に記載したもの以外の微量栄養素の濃度を測定することももちろん可能であり、これらは本発明に範囲内に含まれる。明示はしないが、検出可能な濃度を有する他のこれらの微量栄養素が、本発明の教示内容の一部を形成し、従って本発明の権利範囲内に含まれることは、当業者には明らかである。
下記のパーセンテージは重量%に基づいている。
【００４３】
粘膜細胞サンプルの採取
頬粘膜細胞を得るために、10 ml〜1000ml、特に50 ml〜500 ml、好ましくは100 ml〜250 mlの範囲から選択される容積で、例えば滅菌水、生理的塩化ナトリウム溶液(0.9% NaCl)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などで口腔を数回すすがなければならない。木製又はプラスチック製のスパチュラ、スティック、例えば綿棒、又はブラシ、例えば歯ブラシを、PBS又は0.9%濃度のNaCl溶液で湿潤し、そして次いで、それぞれの頬の内側を上から下に、軽く押し付けながら10回〜30回、好ましくは15回〜20回にわたって擦るか又はブラッシングする。擦っている間又はブラッシング中に唾液を飲み込まないことが重要である。
【００４４】
5ml〜100ml、特に10ml〜50ml、好ましくは20ml〜30mlの範囲から選択される容積で、PBS、0.9%濃度のNaCl溶液又は水で口腔を1〜5回、好ましくは2〜3回すすぎ、すすぎ液をサンプル溶液内に捕集する。スパチュラ又はブラシもこの溶液中ですすぎ、サンプル容器の縁の周りで拭う。サンプル容器内に、場合により緩衝溶液又は水を既に入れておくことができる。しかし、サンプル容器はまた、すすぎ液中で細胞を安定化又は溶解するための試薬を含有することもできる。サンプル容器を次いで冷却する。このことは、冷却装置、例えば冷蔵庫又は冷凍庫内で行うか、或いは、氷又は凍結されたクーラー・ブロックが入れられたアルミニウム・バッグ、ポリスチレン・ボックス又はクーラー・バッグのようなコンテナ内で行うことができる。これは冷却された状態でラボラトリーに搬送されなければならない。
【００４５】
ラボラトリーにおいて、サンプル容器内のすすぎ液を遠心分離する。この遠心分離は、30分間、好ましくは20分間、特に10分間にわたって、2000g、好ましくは1500g、特に1400gで、温度範囲-10℃〜15℃、好ましくは0℃〜10℃、特に4℃〜8℃で続ける。
【００４６】
上相をデカントし、そして細胞ぺレットを洗浄し、そして30ml、好ましくは25ml、特に20mlのPBS中、好ましくは低温PBS中に再懸濁する。15ml、特に10mlの容積を用いると有利であることが判っている。均質化された細胞を、1分間〜15分間、特に2分間〜10分間、好ましくは3分間〜5分間にわたって、1000g、特に1400g、好ましくは1800gで、再び遠心分離する。この遠心分離工程は、温度範囲-10℃〜20℃、特に-5℃〜15℃、好ましくは0℃〜10℃で操作する。2℃〜8℃、特に4℃〜6℃の範囲から温度を選択すると有利であることが判っている。
【００４７】
上相を再びデカントし、そして細胞ぺレットを洗浄し、そしてPBS、0.9%濃度のNaCl溶液又は水中に入れる。ぺレットを再懸濁するための溶液の容積は、0.5ml〜5ml、特に1ml〜3ml、好ましくは1.25ml〜2mlの範囲にある。10 ml、好ましくは5 mlピペットで均質化を行い、1 ml、好ましくは0.5 mlのピペットでさらにより良好な均質化を得ることができる。細胞を、0.5分間〜5分間、特に1分間〜4分間、好ましくは1.5分間〜3分間にわたって、10,000g、特に15,700g、特に18,000gで、再び遠心分離する。
【００４８】
上相を引き出し、細胞ぺレットを、1秒間〜60秒間、好ましくは5秒間〜30秒間、特に10秒間〜20秒間にわたって窒素に対して暴露し、次いで-20℃、好ましくは-80℃で凍結させる。この最終再懸濁工程中、均質化溶液には、例えば500μl又は400μl又は300μl部分まで補充することができる。細胞ぺレットを冷凍するか、又は直接的に処理する。
【００４９】
粘膜細胞は、背景技術文献に記載された標準的な方法を用いて、その他の粘膜から得ることもできる。
【００５０】
粘膜細胞の代わりに、少なくとも１つの微量栄養素の細胞内供給パターンを測定する手段として、血液細胞を使用することももちろん可能である。血液細胞は、背景技術文献に記載されたタイプの標準的な分離手順を用いて分離するか、或いは、例えば、血液細胞を精製するために、Qiagen社によって販売されている分析キットで分離する。
【００５１】
細胞を溶解する前に、周知の細胞カウント法によって、例えば、顕微鏡と共にカウント室を使用して細胞をカウントするか、或いは、例えばCoulterカウンターを使用した自動カウント法によって、細胞総数を測定する。
【００５２】
細胞の溶解
分離された粘膜に溶解を施す。第1サンプル容器内の細胞ぺレットを、50μl〜100μl、好ましくは100μl〜300μl、特に200μl〜250μlのPBS、0.9%濃度のNaCl溶液又は水中に再懸濁した。それぞれ0.1 %〜10 %、好ましくは0.5 %〜5 %、特に1 %〜2 %の範囲から選択される濃度のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)及びブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)と置換された50μl〜500μl、好ましくは100μl〜300μl、特に200μl〜250μlの容積のエタノールを添加した。次いでこの溶液を、1秒間〜60秒間、特に10秒間〜50秒間、好ましくは30秒間〜40秒間の範囲から選択される時間にわたって混合し、好ましくは渦流処理する。
【００５３】
高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)のためのサンプルの調製
次いで、100μl〜1000μl、特に200μl〜800μl、好ましくは300μl〜400μlの容積でn-ヘキサンを添加し、これに続いて1秒間〜60秒間、好ましくは5秒間〜50秒間、特に10秒間〜20秒間にわたってさらに混合し、好ましくは渦流処理する。この溶液を、10秒間〜5分間、好ましくは30秒間〜3分間、特に1分間〜2分間の範囲から選択される時間にわたって、1000g、好ましくは10,000g、特に16,000gで遠心分離する。遠心分離後、n-ヘキサン相を第2サンプル容器内にピペットで入れる。元の第1サンプル容器に、100μl〜1 ml、好ましくは200μl〜500μl、特に300μl〜400μlの容積でn-ヘキサンを塗布する。1秒間〜60秒間、特に5秒間〜50秒間、好ましくは10秒間〜30秒間の範囲から選択される時間にわたって溶液を渦流処理し、次いで、10秒間〜5分間、好ましくは30秒間〜3分間、特に1分間〜2分間の範囲から選択される時間にわたって、1000g、好ましくは10,000g、特に16,000gで遠心分離する。上相を再び取り出し、前の相が移されたのと同じ第2サンプル容器内にピペットで入れ、そして第1及び第2の遠心分離工程の上相を合体させる。窒素流中(蒸発器)で完全に蒸発させることにより、サンプルの調製を完了する。10μl〜1000μl、特に100μl〜500μl、好ましくは200μl〜300μlの範囲から選択される容積の液体中に、細胞ぺレットを再懸濁し、そしてオートサンプラー・バイアルのミクロ挿入部内にピペットで入れる。
【００５４】
HPLC実施
HPLCを実施するのに適用される複数の可変パラメーターから選択される実施例に基づいて、以下に説明するが、しかし、下記実施例に具体的に記載されたもの以外のパラメーターを採用することももちろん可能である。これらの他のパラメーターも本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００５５】
HPLCのために使用されるカラムは、Nucleosil 120, C 18, 300 x 3mmカラムである。液体Aはアセトニトリル、メタノール、及び0.1%〜10%、特に1%〜5%、好ましくは2%〜3%の範囲から選択される濃度の酢酸アンモニウムから成る。液体A中の物質、アセトニトリル：メタノール：酢酸アンモニウムは、171:29:15、特に171:17:7、好ましくは163:21:19の比で存在する。テトラヒドロフラン(THF)を液体Bとして使用する。液体クロマトグラフィのために、下記の3つのアプローチのうちの1つを用いて、溶離液勾配を発生させる。
【００５６】
【表１】
2005517926.tif 000002
【００５７】
又は
【００５８】
【表２】
2005517926.tif 000003
【００５９】
又は
【００６０】
【表３】
2005517926.tif 000004
【００６１】
流量を0.1ml/分〜5 ml/分、特に0.2ml/分〜4 ml/分、好ましくは0.5ml/分〜3 ml/分から選択される範囲内にある。0.6ml/分〜2 ml/分、特に0.8ml/分〜1.5 ml/分の範囲を選ぶと特に有利であることが判っている。検出を目的として可視光と共にUV光を使用する。波長はUV光の場合、282nm〜396nm、特に293nm〜348nm、好ましくは298nm〜326nmの範囲から選択され、そして、可視光の場合、400nm〜800nm、特に456nm〜721nm、好ましくは532nm〜678nmの範囲から選択される。液体クロマトグラフィの温度は、20℃〜60℃、特に30℃〜50℃、好ましくは40℃〜45℃の範囲内にある。また、内部標準を添加することにより、HPLC系の校正を可能にする。
【実施例】
【００６２】
実施例1
頬粘膜細胞におけるトコフェロール供給プロフィールの測定
例えば総量500mlのPBSで口腔を数回すすぐことにより頬粘膜細胞を得る。ブラシ、例えば歯ブラシをPBSで湿潤し、次いで、それぞれの頬の内側を上から下に10回、軽く押し付けながらブラッシングする。唾液はブラッシング中飲み込まないことが重要である。口腔を50mlのPBSで1回すすぎ、次いでそのすすぎ液をサンプル容器内に捕集する。サンプル容器内には事前に10mlの緩衝溶液を入れておく。加えて、ブラシもこの溶液中ですすぎ、サンプル容器の縁の周りで拭う。次いで、サンプル容器を冷却する。このことは冷蔵庫内で行う。ラボラトリーへの搬送は、アイス・キューブが満たされたポリスチレン・ボックスによって行う。
【００６３】
ラボラトリーにおいて、サンプル容器内のすすぎ液を、30分間にわたって2000gで、そして0℃の温度で遠心分離する。上相をデカントし、細胞ペレットを30ml PBS中に再懸濁する。均質化された細胞を1分間にわたって1800gで再び遠心分離する。遠心分離は0℃の温度で行われる。上相を再びデカントし、そして、細胞ぺレットを1mlピペットで、0.5mlのPBS中に入れる。細胞を、さらに5分間にわたって10,000gで遠心分離する。上相を引き出し、細胞ぺレットを窒素ガスに対して30秒間にわたって暴露する。
【００６４】
細胞の溶解
第1サンプル容器内の細胞ぺレットを100μl PBSの容積中に再懸濁する。次いで、0.5% SDS及び0.5% BHTと置換された100μlエタノールを添加し、そして溶液を30秒間にわたって渦流処理する。
【００６５】
HPLCのためのサンプルの調製
300μlのn-ヘキサンを添加することにより、HPLCのためにサンプルを調製し、サンプルを30秒間にわたって再び渦流処理する。次いで溶液をさらに3分間にわたって10,000gで遠心分離する。遠心分離後、次いで、n-ヘキサン相を第2サンプル容器内にピペットで入れる。元の第1サンプル容器に、300μlのn-ヘキサンを塗布し、30秒間にわたって渦流処理し、そして10,000gで3分間にわたって遠心分離する。上相を再び取り出し、そして相が前に移されたのと同じ第2サンプル容器内にピペットで入れ、第1及び第2の遠心分離工程の上相を合体させる。窒素流でサンプルを完全に蒸発させることにより、サンプルの調製を完了する。300μlの液体中に、細胞ぺレットを再懸濁し、そしてオートサンプラー・バイアルのミクロ挿入部内にピペットで入れる。
【００６６】
HPLC実施
HPLCのために使用されるカラムは、Nucleosil 120, C 18, 300 x 3mmカラムである。液体Aはアセトニトリル、メタノール、及び0.5%の酢酸アンモニウムから成る。液体Aの物質、アセトニトリル：メタノール：酢酸アンモニウムは、163:21:19の比で使用する。THFを、液体Bとして使用する。液体クロマトグラフィのために、下記溶離勾配を用いる。
【００６７】
【表４】
2005517926.tif 000005
【００６８】
流量は0.5ml/分であり、検出は、292nm及び456nmのUV-VISを用いて行う。液体クロマトグラフィ中の温度は20℃である。また、内部標準を添加することにより、HPLC系の校正を可能にする。
【００６９】
実施例2
膣粘膜細胞の葉酸含量の測定
膣粘膜細胞を得るために、膣を例えば総量200mlの水で、数回すすぐ。スティック、例えば綿棒を水で湿潤し、そして膣粘膜を軽く押さえながら細胞を拭う。膣を20mlの水で再びすすぎ、そしてそのすすぎ液をサンプル容器内に捕集する。綿棒をすすぎ液中ですすぎ、これにより綿棒に付着しているかもしれないいかなる細胞をも引き離す。次いでサンプル容器を冷蔵庫内で4℃で冷却する。ラボラトリーへの搬送は、凍結された冷却ブロックを満たされたクーラー・バッグによって行う。
【００７０】
ラボラトリーにおいて、サンプル容器内のすすぎ液を、20分間にわたって1500gで、そして15℃の温度で遠心分離する。上相をデカントし、細胞ペレットを20mlの水中に再懸濁する。均質化された細胞をさらに10分間にわたって1000gで再び遠心分離する。遠心分離は15℃の温度で行われる。上相を再びデカントし、そして、細胞ぺレットを5mlピペットで、1 mlの水中に入れる。細胞を、さらに4分間にわたって18,000gで遠心分離する。上相を引き出し、細胞ぺレットを窒素ガスに対して1分間にわたって暴露する。
【００７１】
細胞の溶解
サンプル容器内の細胞ぺレットを50μlの水中に再懸濁する。次いで、2% SDS及び2% BHTと置換された50μlエタノールを添加し、そして溶液を40秒間にわたって渦流処理する。
【００７２】
HPLCのためのサンプルの調製
200μlのn-ヘキサンを添加することにより、HPLCのためにサンプルを調製し、サンプルをさらに40秒間にわたって再び渦流処理する。次いで溶液を2分間にわたって10,000gで遠心分離する。遠心分離後、次いで、n-ヘキサン相を第2サンプル容器内にピペットで入れる。元の第1サンプル容器に、200μlのn-ヘキサンを塗布し、40秒間にわたって渦流処理し、そして10,000gで3分間にわたって遠心分離する。上相を再び取り出し、そして相が前に移されたのと同じ第2サンプル容器内にピペットで入れ、第1及び第2の遠心分離工程の上相を合体させる。窒素流でサンプルを完全に蒸発させることにより、サンプルの調製を完了する。300μlの液体中に、細胞ぺレットを再懸濁し、そしてオートサンプラー・バイアルのミクロ挿入部内にピペットで入れる。
【００７３】
HPLC実施
HPLCのために使用されるカラムは、Nucleosil 120, C 18, 300 x 3mmカラムである。液体Aはアセトニトリル、メタノール、及び1%の酢酸アンモニウムから成る。液体Aの物質、アセトニトリル：メタノール：酢酸アンモニウムは、171:29:15の比で使用する。THFを、液体Bとして使用する。液体クロマトグラフィのために、下記液体勾配を用いた。
【００７４】
【表５】
2005517926.tif 000006
【００７５】
流量は1 ml/分であり、検出は、292nm及び456nmのUV-VISを用いて行う。液体クロマトグラフィ中の温度は20℃である。また、内部標準を添加することにより、HPLC系の校正を可能にする。
【００７６】
実施例3
頬粘膜細胞におけるカルシウム供給プロフィールの測定
実施例1及び2に記載されているのと同じように、細胞を獲得し、そして溶解する。細胞の溶解後、細胞上相中に溶解された要素を原子吸光機器にポンプ供給する。この機器において、使用されたそれぞれの装置の操作説明書に従って、カルシウムの濃度を分析する。
【００７７】
実施例4
頬粘膜細胞におけるマグネシウム供給プロフィールの測定
実施例1及び2に記載されているのと同じように、細胞を獲得し、そして溶解した。細胞の溶解後、使用されたそれぞれの装置の操作説明書に従って、誘導結合プラズマを用いた質量分析によって、マグネシウム濃度を測定する。質量分離に基づくICP-MSによって、個々のイオンを検出するので、極めて少量の元素を検出することができる。
【００７８】
生体材料としてヒト起源以外の細胞、例えば動物又は植物の細胞を使用して、少なくとも１つの微量栄養素を有する供給プロフィールを測定することももちろん可能である。
上述のように、測定可能な生じ得る濃度の例は、本発明の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。
【手続補正書】
【提出日】平成16年5月7日(2004.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル、特に頬粘膜細胞中の微量栄養素濃度の測定方法であって、以下のステップ：粘膜細胞サンプルを得；場合により安定化させ；遠心分離し；上部相をデカントし；上記細胞を再懸濁し、そして再度遠心分離し；上記細胞の膜を破壊し；上記細胞の成分を遠心分離により分離し；分離目的でクロマトグラフィー法を使用し；そして、分析方法により上記粘膜細胞の微量栄養素プロフィールを測定する、を特徴とする前記方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルとして上皮組織、特に粘膜、例えば頬粘膜細胞、膣粘膜細胞、子宮頸部粘膜細胞など由来の細胞が使用されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記微量栄養素を、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)、ガス・クロマトグラフィ(GC)、イオン・クロマトグラフィ、原子吸光分光測定(AAS)、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MP)、キャピラリー電気泳動(CE)、質量分析(MS)などから成る群から選択される分析方法によって測定することを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記微量栄養素が、例えばプロビタミン、ビタミン、ミネラル及び微量元素、アミノ酸、脂肪酸、ポリフェノール、ホルモン及び臓器抽出物、及びその合成産物、例えばパンクレアチン、没食子酸、軟骨基体（cartilage base substance）などから成る群から選択される物質の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記微量栄養素が、レチノイド構造(ビタミンA)、ビタミンB複合体、アスコルビン酸(ビタミンC)、カルシフェノール(ビタミンD)、トコフェロール(ビタミンE)、ビタミンK、フラボノイド及びビオチンを有する天然化合物及び合成化合物から成る群から選択されるビタミンであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記微量栄養素が、例えばレチノール、レチニル・アセテート、レチニル・パルミテート、3,4-ジデヒドロレチノール(ビタミンA2)、レチナール、レチン酸及びプロビタミン、例えばα-、β-、γ-カロテンから成る群から選択されるレチノイド構造を有する化合物の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項７】
前記微量栄養素が、チアミン(ビタミンB1)又はチアミン塩酸塩又はチアミン・モノナイトレート、リボフラビン(ビタミンB2)又はリボフラビン-5-リン酸ナトリウム、ナイアシン(ビタミンB3)又はニコチン酸又はネアシン、パントテン酸(ビタミンB5)又はD-パントテン酸カルシウム又はD-パントテン酸ナトリウム又はD-パンテノール、ピリドキシン(ビタミンB6)又はピリドキシン塩酸塩又はピリドキシン-5-ホスフェート又はピリドキシン・ジパルミテート又はピリドキサル・ホスフェート、葉酸(ビタミンB9)又はプテロイル・グルタミン酸、コバラミン(ビタミンB12)又はシアノコバラミン又はヒドロキシコバラミン、ビオチン、コリン、イノシトール及びp-アミノ安息香酸から成る群から選択されるビタミンB複合体化合物の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項８】
前記微量栄養素が、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ナトリウム、L-アスコルビン酸カルシウム、L-アスコルビン酸カリウム及びL-アスコルビル-6-パルミテートから成る群から選択されるアスコルビン酸化合物の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項９】
前記微量栄養素が、エルゴカルシフェロール(ビタミンD2)、コレカルシフェロール(ビタミンD3)、1,25-ジヒドロキシコレカルシフェロール、及びプロビタミン・エルゴステロール又は7-デヒドロコレステロールから成る群から選択されるカルシフェロール化合物の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項１０】
前記微量栄養素が、D-α-トコフェロール、DL-α-トコフェロール、D-α-酢酸トコフェロール、DL-α-酢酸トコフェロール及びD-α-トコフェリル酸スクシネートから成る群から選択されるトコフェロール化合物の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項１１】
前記微量栄養素が、フィロキノン(ビタミンK1)、メノキノン(ビタミンK2)、メナジオン(ビタミンK3)及びメナジオン・ヒドロキシキノン(ビタミンK4)から成る群から選択されるビタミンK化合物の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4又は5に記載の方法。
【請求項１２】
前記微量栄養素が、Na、K、Mg、Ca、Fe、I、Cu、Mn、Zn、Co、Mo、Se、Cr、F、Si、Ni、As、Sn、V、P、Cl、B、Al及びBrから成る群から有機体にとって重要な順序で選択されるミネラル又は微量元素の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項１３】
前記微量栄養素が、補酵素Q-10、ケルセチン、ブロメライン、イノシトール、コリン、ピクノゲノール、カルニチン、タウリン、メソイノシトールから成る群から選択される成分の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項１４】
前記微量栄養素が、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、バリン及びアルギニンから成る群から選択される必須アミノ酸の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項１５】
前記微量栄養素が、リノール酸、リノレン酸及びアラキドン酸から成る群から選択される脂肪酸の少なくとも１つであることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの微量栄養素の細胞内濃度を測定するために、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法において使用される、細胞を含む生物学的サンプルを獲得し、そして調製するための分析キットであって、サンプル採取器具、例えばスパチュラ、ブラシ、スティック、毛管、並びに水、緩衝食塩水、0.9%濃度のNaCl溶液、安定化剤及び界面活性剤、特に溶解試薬から成る群から選択される試薬の少なくとも１つを場合により含むシール可能なサンプル容器、そして、場合により、特に上記の細胞を含むサンプル容器を冷却するための断熱されたサンプル容器収容用コンテナを含む分析キット。
【請求項１７】
分析を実施するための非侵襲性の手段によって得た生物学的サンプルを素早く処理するための請求項16に記載の分析キットの使用方法。
【国際調査報告】
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2005517926.tif 000008
2005517926.tif 000009
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