(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチドを不純物から分離するための方法を開示する。本発明の方法において、標的オリゴヌクレオチド及び不純物を含んでなる混合物中の標的オリゴヌクレオチドは、滴定可能なアニオン交換組成物を使用して不純物から分離される。標的オリゴヌクレオチドは、滴定可能なアニオン交換組成物に結合され、そして時間をかけてｐＨが増加される溶出溶液が、標的オリゴヌクレオチドがその上に結合されて伴う滴定可能なアニオン交換組成物を通して通過させられる。好ましくは、溶出溶液は、その塩濃度が実質的に増加しない。標的オリゴヌクレオチドは溶出され、そしてこれによって、標的オリゴヌクレオチドより低いｐＨ又は高いｐＨのいずれかで溶出される不純物から分離される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的オリゴヌクレオチドを、不純物から、前記標的オリゴヌクレオチド及び前記不純物を含んでなる混合物中で、滴定可能なアニオン交換組成物を使用して分離する方法であって：
ａ）前記標的ヌクレオチドを、前記滴定可能なアニオン交換組成物に結合させること；
ｂ）前記標的オリゴヌクレオチドをその上に結合して保持する前記滴定可能なアニオン交換組成物を通して溶液を通過させること（ここにおいて前記溶液は時間の経過とともにｐＨが上昇する）；そして
ｃ）前記標的オリゴヌクレオチドを溶出すること（ここにおいて前記不純物は前記標的オリゴヌクレオチドとは異なったｐＨで溶出する）；
の工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記滴定可能なアニオン交換組成物が、第１アミン、第２アミン又は第３アミンを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記滴定可能なアニオン交換組成物が、ポリエチレンイミン、ポリイミザドール、ポリヒスチジン又はポリリシンを含んでなる、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記ｂ）中の溶液が、実質的に金属塩を含まない、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｂ）中の溶液が、その塩の濃度が時間の経過に対して実質的に増加されない、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記滴定可能なアニオン交換組成物が、支持体に接合されている、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記支持体が、合成ポリマーである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記合成ポリマーが、シリカゲル、多糖、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリル及びアガロースからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記滴定可能なアニオン交換組成物が、ポリエチレンイミン−誘導体化シリカゲル又はポリエチレンイミン−誘導体化スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的オリゴヌクレオチドが、合成オリゴヌクレオチドである、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記合成オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、メチルホスホネート類及びホスホロアミデート類からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的オリゴヌクレオチドの前記滴定可能なアニオン交換組成物との結合が、５ないし８間のｐＨで起こる、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｂ）中の溶液が、ｐＨが時間の経過に対して直線的様式で増加する、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｂ）中の溶液が、約８のｐＨから約１１のｐＨに増加される、請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｂ）中の溶液が、一つ又それより多いＮＨ4ＨＣＯ3及び／又はＮＨ4ＯＨを含んでなる、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的オリゴヌクレオチドが、約８ないし約４０個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記不純物が、前記標的オリゴヌクレオチドより短い長さを有する一つ又はそれより多いオリゴヌクレオチドであり、そしてここにおいて前記不純物が、前記標的オリゴヌクレオチドより低いｐＨで溶出する、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記不純物が、一つ又はそれより多い欠損配列である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記不純物が、金属塩である、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的オリゴヌクレオチドが、５’−Ｏ−で保護されている、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的オリゴヌクレオチドが、５’−Ｏ−トリチル、好ましくは５’−Ｏ−ジメトキシ−トリチルで保護されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記滴定可能なアニオン交換組成物に十分な量の酸性溶液を通して通過させて、前記標的オリゴヌクレオチドを溶出する前に、前記５’−Ｏ−トリチル保護基を前記標的オリゴヌクレオチドから開裂する工程を更に含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記酸性溶液が、酢酸水溶液を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｂ）中の溶液が、前記標的オリゴヌクレオチド及び不純物を含んでなる混合物の体積より小さい体積を有し、これによって前記標的オリゴヌクレオチドの濃度を増加させる、請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的オリゴヌクレオチドを溶出する前に、一つ又はそれより多い洗浄工程を更に含んでなる、請求項１ないし２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景
合成オリゴヌクレオチドは、広い種類の適用のために重要な生体分子として出現した。このような適用は、ハイブリッド形成のプローブ、リンカー、ＤＮＡ配列決定のためのプライマー、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、逆転写酵素反応）、アンチセンス及び関連する技術の研究の潜在的治療法、並びに遺伝子病及びウイルス性疾病の検出のための診断の道具としての合成オリゴヌクレオチドの使用を含む。更に、合成オリゴヌクレオチド類似体は、ＣＭＶの治療に対してＦＤＡの許可を受け、そして現在、いくつかのオリゴヌクレオチド類似体は臨床試験を受けている。
【０００２】
過去数年にわたって、大規模な（例えば、キログラムの量の）オリゴヌクレオチド及びその類似体の合成において有意な進歩が達成されている。この進歩の多くは、一回の合成でμモルないしモルの量の産物を製造することが可能な、自動化固相ＤＮＡ合成器の開発による。一般的に、合成オリゴヌクレオチドの合成は、特定のオリゴヌクレオチド（その５’ヒドロキシ末端で保護基（例えば、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ））で保護された）の、固相支持体に接続された初期のオリゴヌクレオチド鎖への段階的付加となる、一連の系統的反応によって最もしばしば行われる。
【０００３】
然しながら、合成オリゴヌクレオチドの製造における技術的前進にもかかわらず、初期のオリゴヌクレオチド鎖へのモノマーのそれぞれの段階的付加中に、概略１−２％のカップリング反応が失敗する（即ち、モノマーの付加が起こらない）。従って、得られる産物は、一般的に各種の長さのオリゴヌクレオチドの不均質な混合物であり、ここにおいて所望しない汚染物質（例えば、欠損配列）の量は、所望する産物の長さ及び合成反応の全体収率に比例する。結果として、これは、オリゴヌクレオチドの精製のための製造技術を開発することに対する興味をもたらす。
【０００４】
全長の標的オリゴヌクレオチドを欠損配列から分離又は精製するために、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ））及び液体クロマトグラフィー技術（例えば、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））を含むいくつかの技術が開発されている。合成ヌクレオチドの大規模な分離のために使用されている二つの主要なクロマトグラフィー技術は、アニオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーである。然しながらこれらの慣用的なクロマトグラフ的分離法の両方は、時間がかかり、そして面倒であるだけでなく、更に費用もかかる。
【０００５】
合成オリゴヌクレオチドを逆相クロマトグラフィーを使用して分離する場合、カップリング及び酸化工程中、疎水性の５’保護基、例えば、５’−Ｏ−トリチル基がオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基を保護するために使用される。次いで疎水性の５’−保護基を、全長の“トリチル有り（trityl on）”の標的オリゴヌクレオチドを、疎水性の５’−保護基を保有しないより短い欠損配列（failure sequence）（即ち、“トリチル無し（trityl off）”の配列）から分離するために使用することができる。分離後、トリチル基は、標的オリゴヌクレオチドから酸で開裂することができる。これは有効な方法であるが、時間がかかり、そして面倒であり、そして精製された産物を単離するためにその後の加水分解及び抽出工程を必要とする。
【０００６】
合成オリゴヌクレオチドをアニオン交換クロマトグラフィーを使用して分離する場合、標的オリゴヌクレオチド及び欠損配列（これらの両方はポリアニオンである）を結合するために、固定された正の電荷を含有するアニオン交換組成物が使用される。標的オリゴヌクレオチド及び欠損配列のアニオン交換組成物への結合の強さは、これらの長さに直接比例する。従って、結合された標的オリゴヌクレオチド及び欠損配列を溶出するために、オリゴヌクレオチドのアニオン交換組成物との相互作用を弱めるために、塩の勾配が典型的には使用される。結合の強さがオリゴヌクレオチドの長さに比例するために、最も短いオリゴヌクレオチドが最初に溶出し、一方より長いオリゴヌクレオチドは、より高い塩濃度で溶出する。オリゴヌクレオチドのアニオン交換分離における塩の勾配の使用は、多くの理由のために不都合である。第１に、所望する溶出されたオリゴヌクレオチドは、典型的には下流の適用に使用する前に脱塩されなければならない。従って、これは、分離のために必要な時間、労力及び費用を増加するその後の脱塩工程を必然的に伴う。第２に、溶出溶液中の高濃度の塩の使用は、更にアニオン交換分離に使用される機械のステンレス鋼の部分（例えば、ＨＰＬＣのポンプ、取付部品（fittings）、弁、カラム、配管）の腐食の増加に導くことができる。
【０００７】
従って、現時点の方法に伴う制約及び問題を克服又は改善するオリゴヌクレオチドの分離の改良された方法に対する必要性が存在する。
発明の概要
本発明は、オリゴヌクレオチドを不純物から分離する方法を示す。本発明の方法において、オリゴヌクレオチド及び不純物を含んでなる混合物中の標的オリゴヌクレオチドを、滴定可能なアニオン交換組成物を使用して不純物から分離する。標的オリゴヌクレオチドは、滴定可能なアニオン交換組成物に結合され、そして時間をかけてｐＨが増加される溶出溶液を、標的オリゴヌクレオチドをその上に結合して保持する滴定可能なアニオン交換組成物を通して通過させる。好ましくは、溶出溶液は、実質的に塩の濃度が増加されない。次いで標的オリゴヌクレオチドは、溶出され、これによって標的オリゴヌクレオチドとは異なったｐＨで溶出される不純物からこれが分離される。所望により、標的オリゴヌクレオチドを溶出する前に、一つ又はそれより多い洗浄工程を行うことができる。
【０００８】
本発明の方法は、第１アミン、第２アミン又は第３アミンを含んでなる滴定可能なアニオン交換組成物を含む、各種の滴定可能なアニオン交換組成物と共に使用することができる。適した滴定可能なアニオン交換組成物は、ポリイミザドール、ポリヒスチジン、ポリリシン又はポリエチレンイミンを含んでなるアニオン交換組成物を含む。一つの態様において、滴定可能なアニオン交換組成物は、支持体、例えば、シリカゲル、多糖、ポリスチレン、特にスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、又はアガロース、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅの商標名で入手可能なアガロースのような合成ポリマー支持体に接合している。好ましくは、滴定可能なアニオン交換組成物は、所望によりリンカー基を経由して共有的に支持体に結合されている。支持体は、官能化された支持体（functionalised support）であることができる。このような官能化された支持体の例は、当技術において公知であり、そして例えば、ヒドロキシ又はアミノ官能化支持体、特にヒドロキシ又はアミノ官能化ポリスチレンを含む。
【０００９】
本発明の方法は、例えば、一本鎖及び／又は二本鎖核酸を含む各種のオリゴヌクレオチドを分離するために使用することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のような天然に存在するオリゴヌクレオチドを含む。別の方法として、本発明の方法は、合成オリゴヌクレオチド、例えば、ホスフェート類（phosphates）、ホスホロチオエート類（phosphorothioates）、ホスホロジチオエート類（phosphorodithioates）、メチルホスホネート類（methyl phosphonates）、ホスホロアミデート類（phosphoramidates）及びキメラを分離するために使用することができる。
【００１０】
一つの態様において、分離される標的オリゴヌクレオチドは、５’−Ｏ−で保護（例えば、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルのような５’−Ｏ−トリチル保護基で）されている。所望により、５’−Ｏ−保護基は、溶出の前に標的オリゴヌクレオチドから開裂され、一方標的オリゴヌクレオチドは滴定可能なアニオン交換組成物に結合されている。５’−Ｏ−保護基の開裂は、標的オリゴヌクレオチドの溶出の前に、十分な量の酸性溶液（例えば、酢酸水溶液（例えば、２０−８０容量／容量％の酢酸）を含んでなる溶液）を、標的オリゴヌクレオチドをその上に結合させて伴う滴定可能なアニオン交換組成物を通して通過させることによって達成される。
【００１１】
標的オリゴヌクレオチドを溶出するために、各種の溶出溶液を使用することができるが、これらがｐＨを増加することを条件とする。不純物からの標的オリゴヌクレオチドの分離は、時間をかけて塩濃度を増加させることをせずに達成することができる。適した溶出溶液は、標的オリゴヌクレオチドの滴定可能なアニオン交換組成物への結合に適したｐＨで開始し、そして時間をかけて滴定可能なアニオン交換組成物が標的オリゴヌクレオチドを結合することができないようなｐＨに増加するものである。一つの態様において、溶出溶液は、実質的に金属塩を含まない。
【００１２】
本発明の方法は、標的オリゴヌクレオチドを各種の不純物から分離するために使用することができる。このような不純物は、標的オリゴヌクレオチドと異なった分子構造を保有するいずれもの組成を含む。一つの態様において、標的オリゴヌクレオチドから分離される不純物は、標的オリゴヌクレオチドより短い長さを有する一つ又はそれより多いオリゴヌクレオチド（例えば、一つ又はそれより多い欠損配列）である。この態様において、不純物（即ち、標的オリゴヌクレオチドより短い長さを有する一つ又はそれより多いオリゴヌクレオチド）は、標的オリゴヌクレオチドより低いｐＨで溶出する。もう一つの態様において、標的オリゴヌクレオチドから分離される不純物は、一つ又はそれより多い塩、特に金属塩を含んでなる。
【００１３】
本発明の方法は、標的オリゴヌクレオチドの濃度を増加するためも更に使用することができる。一つの態様において、標的オリゴヌクレオチドは、標的オリゴヌクレオチドが本来その中に溶解されていた溶液の体積より少ない体積で標的オリゴヌクレオチドを溶出することによって濃縮される。
【００１４】
本発明の方法は、これが、オリゴヌクレオチドを分離又は精製するために典型的に必要な、更に面倒な、そして時間を消費する慣用的な分離工程を回避することにおいて好都合である。オリゴヌクレオチドを分離するために必要な工程の数を減少することにおいて、本発明は、オリゴヌクレオチドの大規模な精製のための、迅速な、単純化された、更に効率のよい、そしてより費用のかからない方法を提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様の説明は、以下のとおりである。
本発明は、オリゴヌクレオチドを不純物から分離又は精製する方法を示す。本明細書中で使用される場合、“分離”及び“精製”の用語は、互換的に使用され、そしてこれによって特定の分子構造を有するオリゴヌクレオチドを、異なった分子構造を有する不純物から、物理的に隔離する方法を指す。このような隔離は、部分的又は完全であることができる。
【００１６】
本明細書中で定義されるとおりの“オリゴヌクレオチド”は、所望により修飾されたリン酸ジエステル結合によって共有的に連結されたヌクレオチドのオリゴマー又はポリマーを含んでなる。ヌクレオチドは、次に有機塩基に連結されるペントースに連結された、所望により修飾されたリン酸基を含んでなる共通構造を有する。ペントースがリボースである場合、核酸はＲＮＡであり、そしてヌクレオチドはリボヌクレオチドである。ペントースが２’−デオキシリボースである場合、核酸はＤＮＡであり、そしてヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。約２より大きいｐＨを有する水溶液中で、核酸の非常に親水性の糖−リン酸ポリマー骨格は、それぞれのリン酸ジエステルにつき一つの負の電荷及び末端のリン酸モノエステル毎に一つ又は二つの負の電荷を与える。従って、オリゴヌクレオチドは、その長さに概略比例する正味の負の電荷を保有するポリアニオンである。広い種類の塩基がペントースに結合することができるが、しかし天然に存在するＤＮＡ及びＲＮＡ中で支配的な五つは、アデニン（“Ａ”）、チミン（“Ｔ”、主としてＤＮＡ中）、ウラシル（“Ｕ”、主としてＲＮＡ中）、グアニン（“Ｇ”）、及びシトシン（“Ｃ”）である。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、用語“オリゴヌクレオチド”及び“ポリヌクレオチド”は互換的であり、そして少数、例えば２−２０個ないし多数、例えば２０個ないし数百又はそれより多い、例えば２５０個までのヌクレオチドを有するヌクレオチド多量体又はオリゴマーを指す。オリゴヌクレオチドは、二本鎖及び一本鎖の核酸、例えば一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。オリゴヌクレオチドは、更に天然に存在するオリゴヌクレオチド及び合成オリゴヌクレオチドの両方を含む。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、天然に存在するオリゴヌクレオチドは、生物体中に見出される核酸、例えば、制約されるものではないが、ゲノムＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡを含む核酸である。このような天然に存在する核酸は、更に変更された核酸、例えば、一つ又はそれより多いヌクレオチドの付加、削除又は修飾（例えば、多形又は対立形質的変種）を含有する天然に存在する核酸をも含む。天然に存在するオリゴヌクレオチドは、例えば、本明細書中に記載される方法及び／又は他の既知の方法を使用して、生物体から単離された核酸を含む。
【００１９】
合成オリゴヌクレオチドは、生物体から単離されたものではなく、人工的手段によって調製されたオリゴヌクレオチドである。例えば、合成オリゴヌクレオチドは、制約されるものではないが、公知の及び／又は商業的に入手可能な手順を使用して（例えば、自動化核酸合成器又は他の化学的合成法を使用して）固相で調製されたオリゴヌクレオチドを含む。合成オリゴヌクレオチドは、更に一つ又はそれより多い修飾されたヌクレオチドを含んでなるオリゴヌクレオチドを含む。本明細書中で使用される場合、修飾されたヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドと異なるように構造的に変更されたヌクレオチドである。このような修飾されたヌクレオチドは、修飾された糖部分、修飾されたリン酸部分及び／又は修飾された核酸塩基を含有するヌクレオチドを含む。
【００２０】
糖部分の修飾は、これらに限定されるものではないが、リボース環のヘキソース、シクロペンチル又はシクロヘキシル環による置換を含む。別の方法として、天然に存在する核酸のＤ−リボース環を、Ｌ−リボース環で置換することができ、或いは天然に存在する核酸のβ−アノマーをα−アノマーで置換することができる。
【００２１】
修飾されたホスフェート部分は、ホスホロチオエート類（phosphorothioates）、ホスホロジチオエート類（phosphorodithioates）、メチルホスホノエート類（methyl phosphonoates）、アルキルホスホネート類（alkylphosphonates）、アルキルホスホノチオエート類（alkylphosphonothioates）、メチルホスフェート類（methyl phosphates）、ホスホロアミデート類（phosphoramidates）等、又はこれらの組合せを含む。このような修飾されたホスフェート連結を含んでなるオリゴヌクレオチドは、ホスフェートジエステル連結のみを含んでなる対応するオリゴヌクレオチドと比較した場合、改良された特性を有することができる。例えば、修飾された連結を含んでなるオリゴヌクレオチドは、生物体中に存在することができるヌクレアーゼによる分解に対する増加した抵抗性を有することができる（例えば、アンチセンス適用に使用した場合）。
【００２２】
修飾された核酸塩基は、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウラシル、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、３−デアザアデノシン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、４−オキソ−５−メチルピリミジン、２−アミノ−プリン、５−フルオロウラシル、２，６−ジアミノプリン、８−アミノプリン、４−トリアゾロ−５−メチルチミン、及び４−トリアゾロ−５−メチルウラシルを含む。修飾された核酸塩基（nucleobases）は、更に塩基脱落（ａｂａｓｉｃ）部分をも含むことができる。
【００２３】
一つ又はそれより多い修飾された糖部分、ホスフェート部分及び／又は核酸塩基を含んでなるオリゴヌクレオチド類似体を生成するための方法は、当業者にとって公知である。キメラのオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホジエステル（phosphodiester）及びホスホロチオエート（phosphorothioate）連結の両方を含有するオリゴヌクレオチドも、更に本発明によって包含される。
【００２４】
修飾されたヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドへの組込みの前、その最中、又はその後のいずれかに、例えば、当技術において公知である方法を使用して、化学的修飾によって製造することができる。例えば、修飾されたヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシド三リン酸を核酸ポリマー鎖に増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して）中に組込むことによって製造することができる。すでに記載したものに加えて、このような修飾されたヌクレオチドは、制約されるものではないが、ジデオキシヌクレオチド、ビオチニル化ヌクレオチド、アミン修飾ヌクレオチド、アルキル化ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、放射標識ヌクレオチド、ホスホロチオエート類、ホスホロアミダイト、亜リン酸、環原子の修飾誘導体等を含む。多数の修飾されたヌクレオチド及び／又は修飾されたヌクレオチドのいずれもの組合せを含有するオリゴヌクレオチドも、更に本発明によって包含される。オリゴヌクレオチドは、更に修飾された骨格、例えば、タンパク質核酸（ＰＮＡ）又はＰＮＡハイブリッドを保有するオリゴヌクレオチドポリマーを包含する。このような修飾されたオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドポリマーを製造するための方法は、当業者にとって公知である。
【００２５】
一つの態様において、本発明の方法は、合成オリゴヌクレオチドを不純物から分離するために使用される。他の態様において、分離される合成オリゴヌクレオチドは、好ましい長さ、例えば、約２ないし約１００個のヌクレオチド、約２ないし約７５個のヌクレオチド、又は約４ないし約５０個のヌクレオチドを有する。現時点で治療的な興味のある多くの合成オリゴヌクレオチドは、８ないし約４０個のヌクレオチドを含んでなる。従って、好ましい態様において、分離されるオリゴヌクレオチドは、約８ないし約４０個のヌクレオチドの長さを有する。
【００２６】
オリゴヌクレオチドを得るために多くの戦術が存在する。天然に存在するオリゴヌクレオチドは、制約されるものではないが、獣医又はヒトの臨床試験試料（例えば、診断及び／又は予後診断の目的のために収集された試験試料）からの生物体、組織及び／又は細胞を含む各種の生物学的物質から得ることができる。このような天然に存在するオリゴヌクレオチドを得るための方法は、当技術において公知である。例えば、細胞を溶解し、そして得られた溶菌液を当業者にとってよく知られた技術を使用して加工して、核酸（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）の水溶液を得ることができる（例えば、Ａｕｓｅｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照されたい）。
【００２７】
別の方法として、天然に存在する又は合成のいずれかのオリゴヌクレオチドは、生物学的方法、化学的方法又は生物学的及び化学的方法の組合せを使用して製造することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、組換え型核酸方法論、人工的組換え（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））又は各種のクローニング戦術（例えば、ベクター及び／又は制限酵素を使用するもの）を使用して生物学的に生成することができる。オリゴヌクレオチドは、更に、例えば、自動化核酸合成器又は他の既知の化学的合成法を使用して、化学的にも生成することができる。今日、莫大な大部分のオリゴヌクレオチドは、自動化合成器を使用して製造されている。典型的には、オリゴヌクレオチドは、段階的に、そして所定の順序で５’で保護されたヌクレオチド（そのそれぞれのリン酸基において活性化された）を、それ自体固体の支持体に接続された成長中のオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチド残基の、脱保護された５’位と反応させることによって３’から５’へ合成される。最も一般的な５’位のための保護基は、強い疎水性の、例えば、５’−Ｏ−トリチル保護基（例えば、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル）である。
【００２８】
オリゴヌクレオチドは、本発明の方法に使用する前及び／又は後に各種の分子生物学的及び／又は分離技術にかけることができる。このような分離技術の例は、制約されるものではないが、親和性分離（例えば、核酸ハイブリダイゼーション）、電気泳動分離（例えば、サイズ分画アガロース又はポリアクリルアミドゲルを使用）及び／又はクロマトグラフ的分離（例えば、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー）を含む（例えばＡｕｓｅｂｅｌ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）を参照されたい）。本発明の方法は、更に他の分離方法（例えば、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー）との組合せで使用することもできる。
【００２９】
本発明の方法において、オリゴヌクレオチドは、混合物として存在する。オリゴヌクレオチドを含んでなる混合物は、標的オリゴヌクレオチドを含んでなる溶液を含む。このような混合物は、天然に存在するオリゴヌクレオチドを含有する試料（例えば、生存している若しくは死亡した天然に存在する又は人工的に増殖した単細胞或いは多細胞生物体中に見出される核酸を含有する試料）を含む。別の方法として、混合物は、合成オリゴヌクレオチドを含有する試料を含むことができる。
【００３０】
一つの態様において、混合物は、標的オリゴヌクレオチドより短い長さを有する一つ又はそれより多いオリゴヌクレオチドを更に含んでなる標的オリゴヌクレオチドを含んでなる。好ましい態様において、混合物は、オリゴヌクレオチドの合成混合物、例えば、自動化合成器を使用して得られた合成混合物である。この態様において、混合物は、標的オリゴヌクレオチドを含んでなることに加えて、更にトランケートされた欠損配列を含んでなる。オリゴヌクレオチドを含有することができる他の混合物は、制約されるものではないが、緩衝溶液、例えばトリス基剤溶液、ＭＯＰＳ基剤溶液、ＨＥＰＥＳ基剤溶液、酢酸基剤溶液及びリン酸基剤溶液を含む。化学的又は生物学的適用において典型的に使用される溶液を含んでなる混合物も、更に包含される。このような混合物は、標的オリゴヌクレオチドの合成中に得られた試料（例えば、ＰＣＲ産物を含んでなる試料、自動化合成器から得られた試料）、標的オリゴヌクレオチドのシークエンシング中に得られた試料、又はオリゴヌクレオチドの分離中に得られた試料（例えば、クロマトグラフ的分離から得られた試料）を含む。一つより多い種類のオリゴヌクレオチドの組合せを含有する混合物（例えば、天然に存在する及び合成オリゴヌクレオチドの両方を含有する混合物）も、更に包含される。
【００３１】
本発明の方法は、標的オリゴヌクレオチドを不純物から分離する。本明細書中で定義される不純物は、標的オリゴヌクレオチドとは異なった分子構造を保有する組成である。不純物の標的オリゴヌクレオチドからの分離は、部分的に又は実質的に完結することができる。ある態様において、標的オリゴヌクレオチドから分離される不純物は、標的オリゴヌクレオチドより短い長さを有する一つ又はそれより多いオリゴヌクレオチドを含んでなる。好ましい態様において、標的オリゴヌクレオチドから分離される不純物は、標的オリゴヌクレオチドの合成中に生成された一つ又はそれより多い欠損配列を含んでなる。このような欠損配列は、合成オリゴヌクレオチドの製造において、それぞれの段階的なモノマーの初期のオリゴヌクレオチド鎖への付加中に、約１−２％のカップリング反応が失敗することができる（即ち、モノマーの付加が起こらない）ために生成される。従って、得られた産物は、一般的に各種の長さのオリゴヌクレオチドの不均質な混合物であり、ここで、所望しない不純物又は汚染物質（例えば、欠損配列）の量は、所望する産物の長さ及び合成反応の全体的収率に比例する。殆んどの下流の適用において、標的オリゴヌクレオチドをこのような欠損配列から分離することがしばしば必要である。
【００３２】
更なる態様において、標的オリゴヌクレオチドから分離される不純物は、塩（即ち、イオン性塩）、特に金属塩を含んでなる。塩は、普通の不純物であり、これは標的オリゴヌクレオチドを含有する試料、例えば、アニオン交換クロマトグラフィーを使用して得られた試料中にしばしば見出される。標的オリゴヌクレオチドを含有する試料中の塩の存在は、典型的には標的オリゴヌクレオチドを使用する前に、塩を除去するための一つ又はそれより多いその後の分離又は脱塩工程を必要とする。本明細書中で記載したように、本発明の方法は、これがオリゴヌクレオチドを溶出するために塩の勾配を必要とせず、そして従ってその後の脱塩工程を必要としないことができることにおいて好都合である。従って、本発明の方法は、塩不純物の濃度の実質的減少を達成するために使用することができる。本発明の方法を使用してオリゴヌクレオチドから分離することができる塩は、これらに限定されるものではないが、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＯＨ、ＮＨ4Ｃｌ、ＮａＯＣ（Ｏ）ＣＨ3及びＮａＣｌＯ4を含む。本発明の方法を使用して除去することができる他の塩は、当業者にとって既知である。
【００３３】
塩が標的オリゴヌクレオチドを含有する混合物中に存在する場合、塩は、標的オリゴヌクレオチドから二つの機構によって分離することができる。塩が標的オリゴヌクレオチド又はアニオン交換組成物に結合していない場合、これは、単純に滴定可能なアニオン交換組成物を通して通過させるものであり、そして従って結合する標的オリゴヌクレオチドから分離され、そしてこれは、その後より高いｐＨで溶出されるるものである。別の方法として、塩が標的オリゴヌクレオチド又はアニオン交換組成物に結合している場合、これは、標的オリゴヌクレオチドをその上に結合して伴うアニオン交換組成物を、標的オリゴヌクレオチドを溶出する前に、適した洗浄溶液で洗浄することによって除去することができる。従って、本発明の一つの態様において、標的オリゴヌクレオチドをその上に結合して伴うアニオン交換組成物は、溶出の前に、一つ又はそれより多い洗浄工程にさらされる。本発明の方法のために適した洗浄溶液は、適したｐＨを有し、そして標的オリゴヌクレオチドを、滴定可能なアニオン交換組成物からの放出を起こすことなく、不純物を除去することができるものである。このような洗浄溶液は、制約されるものではないが、水及び緩衝溶液（例えば、トリス基剤溶液、ＭＯＰＳ基剤溶液、ＨＥＰＥＳ基剤溶液、酢酸基剤溶液、リン酸基剤溶液）を含む。標的オリゴヌクレオチドをその上に結合して伴うアニオン交換組成物を洗浄するために使用することができる他の適した溶液は、当技術において公知である。
【００３４】
本発明の方法は、核酸を精製するために滴定可能なアニオン交換組成物を使用する。本明細書中に記載したように、アニオン交換組成物は、正の電荷及び負の電荷の置換可能なイオン（対イオン）を含有する組成物である。このように、アニオン交換組成物は、負の電荷の分子（例えば、オリゴヌクレオチド）を結合することが可能であり、そしてこれによって負に荷電された対イオンを置換する。本発明のアニオン交換組成物は、好ましくは固体の組成物である。
【００３５】
本発明において使用されるアニオン交換組成物は、滴定可能である。本明細書中で使用される場合、“滴定可能なアニオン交換組成物”は、ｐＨが増加した場合に、正の電荷を喪失することが可能なアニオン交換組成物である。好ましくは、本発明において使用される滴定可能なアニオン交換組成物は、ｐＨが約７．０ないし約１２．０に増加された場合に正の電荷を喪失する。滴定可能なアニオン交換組成物は、第１アミン、第２アミン又は第３アミンを含んでなる組成物を含む。適した滴定可能なアニオン交換組成物は、ポリイミザドール、ポリヒスチジン、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、修飾されたポリエチレンイミン及びポリ（エチレン−イミン／オキシエチレン）を含んでなるアニオン交換組成物を含む。好ましい態様において、滴定可能なアニオン交換組成物は、ｐＨが約８ないし約１１に増加された場合に正の電荷を喪失するポリエチレンイミンである。
【００３６】
特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明において使用される滴定可能なアニオン交換組成物は、プロトン化された原子（例えば、窒素原子）を保有し、そして従って中性又は低いｐＨにおいて正に荷電されていると考えられる。例えば、ポリエチレンイミンは、約５−８のｐＨ（又はより低いｐＨ）で正に荷電された窒素原子を保有する。溶出溶液のｐＨが徐々に増加された場合、ポリエチレンイミンの窒素原子は、脱プロトンされ始める。従って、例えば、標的オリゴヌクレオチドを欠損配列から分離する場合、ポリエチレンイミンの使用は、標的オリゴヌクレオチドより短い（そして従ってより少ない負の電荷を有する）欠損配列が、より長いより負に荷電された標的オリゴヌクレオチドより低いｐＨでポリエチレンイミンから放出されることを可能にする。ｐＨが増加された場合、ポリエチレンイミンの更に多くの窒素原子が脱プロトンされ、これは、より長い欠損配列を、そして最終的には標的オリゴヌクレオチドを放出することを可能にする。最後に、より高いｐＨにおいて、ポリエチレンイミンの全ての窒素原子が脱プロトンされ、そして従って負に荷電したオリゴヌクレオチドを保持することができなくなる。
【００３７】
従って、滴定可能なアニオン交換組成物（例えば、ポリエチレンイミン）の使用は、結合したオリゴヌクレオチドを溶出するために塩の勾配を使用する必要性を排除し、そしてオリゴヌクレオチドの分離の更に迅速な、効率のよい、そして経済的な方法を提供する。
【００３８】
一つの態様において、滴定可能なアニオン交換組成物は、支持体に接合している。滴定可能なアニオン交換組成物の支持体への接合は、当技術において既知である方法（例えば所望によりジビニルスルホンリンカー又はエピクロロヒドリンリンカーのようなリンカー基を経由して共有的に結合）によることができる。好ましくは、接合は、滴定可能なアニオン交換組成物の固定された正の電荷及び負の電荷の置換可能なイオン（対イオン）が、オリゴヌクレオチドに接近可能な（即ち、表面に暴露される）ように行われる。適した支持体は、固体又は半固体の支持体、例えば、シリカ（例えば、シリカゲル）、多糖、ポリスチレン（例えば、スチレン−ジビニルベンゼンコポリマー）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリル（例えば、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート）を含む合成ポリオレフィン、及びアガロース、例えばＳｅｐｈａｒｏｓｅの商標名で商業的に入手可能なアガロースのような合成ポリマー支持体を含む。当技術において既知の他の適した支持体も、更に本発明によって包含される。好ましい態様において、滴定可能なアニオン交換組成物は、ポリエチレンイミン−誘導体化シリカゲル又はポリエチレンイミン−誘導体化スチレン−ジビニルベンゼンコポリマーである。もう一つの態様において、滴定可能なアニオン交換組成物は、支持体に接合していない。むしろ、固体の滴定可能なアニオン交換組成物は、それ自体オリゴヌクレオチドが結合し、そして放出される支持体として作用する。
【００３９】
本発明のある態様において、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからＭａｔｒｅｘ  Ｓｉｌｉｃａの商標名で商業的に入手可能なポリエチレンイミン−誘導体化シリカの滴定可能なアニオン交換組成物、例えばＭａｔｒｅｘ  Ｓｉｌｉｃａ  ＰＥＩ−３００及びＭａｔｒｅｘ  Ｓｉｌｉｃａ  ＰＥＩ−１０００の使用によって良好な結果が達成されている。
【００４０】
本発明の方法において使用される滴定可能なアニオン交換組成物の濃度及び量は、多くの因子、例えば、オリゴヌクレオチドを含んでなる混合物の量及び特質、混合物中のオリゴヌクレオチドの濃度及び特質、並びに混合物中の不純物の濃度及び特質に依存する。当業者は、標的オリゴヌクレオチドを結合するために適した滴定可能なアニオン交換組成物の適当な量を、過度の実験を行うことなく容易に決定することができる。
【００４１】
同様に、当業者は、分離を行うための適当なパラメーターを、過度の実験を行うことなく決定することができる。例えば、標的オリゴヌクレオチドを含んでなる比較的純粋な混合物、又は標的オリゴヌクレオチドと構造的にまったく異なった不純物を含んでなる混合物に対して、分離は、比較的迅速に、例えば、増加た流速を使用して行うことができる。別の方法として、高度に不均質な混合物、又は標的オリゴヌクレオチドと同様な不純物を含有する混合物に対して、分離をゆっくりとする（例えば、減少した流速を使用して）及び／又は更なる滴定可能なアニオン交換組成物を使用することによって、分離能を増加することが望ましいことであることができる。
【００４２】
適した分離を達成するために変更することができるもう一つの重要な変数は、溶出溶液のｐＨの変化の速度である。再び、分離の特質に依存するが、当業者は、適したｐＨの溶出特性（例えば、連続したｐＨの勾配、段階的ｐＨの勾配、早い速度のｐＨの変化、ゆっくりした速度のｐＨの変化）を決定することができるものである。
【００４３】
所望するｐＨを達成するために適当に緩衝する溶液、例えばトリス基剤溶液、ＭＯＰＳ基剤溶液、ＨＥＰＥＳ基剤溶液、酢酸基剤溶液、リン酸基剤溶液を含む、ｐＨを増加する広い種類の溶出溶液を本発明の方法において使用することができる。アニオン交換分離において典型的に使用され、そして当技術において既知の他の溶液も、更に包含される。溶出溶液は、更に一つ又はそれより多いイオン性塩、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2、ＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＯＨ、ＮＨ4Ｃｌ、ＮａＯＨ等を含有することもできるが、然しながら、本明細書中で記載したように、溶出溶液は塩の勾配を使用しない。本発明の方法において使用される溶出溶液の体積は、滴定可能なアニオン交換組成物を飽和するために十分でなければならない。
【００４４】
好ましい態様において、標的オリゴヌクレオチドをその上に結合して伴う滴定可能なアニオン交換組成物を通って通過する溶出溶液は、時間をかけてｐＨが増加されるが、しかしその塩濃度は、同じ期間に実質的に増加されない。本明細書中で定義されるように、塩濃度の“実質的な増加”の欠如は、発生する塩濃度のいずれもの増加が標的オリゴヌクレオチドの滴定可能なアニオン交換組成物からの溶出に有意に影響しないことを意味する。
【００４５】
もう一つの態様において、本発明において使用される溶出溶液は、実質的に一定な塩濃度を有する。本明細書中で使用される場合、“実質的に一定な”塩濃度は、塩の濃度のいずれもの変化（増加又は減少）が、これが標的オリゴヌクレオチドの滴定可能なアニオン交換組成物からの溶出に有意に影響しないほど十分に小さいことを意味する。別の方法として、溶出溶液の塩濃度は、時間をかけて減少することができる。もう一つの態様において、溶出溶液は、実質的に金属塩を含まない。本明細書中で使用される場合、“実質的に金属塩を含まない”は、溶液が、実体のない量の金属塩（即ち、金属塩がないか、又はオリゴヌクレオチドを使用する下流の適用（downstream applications）に影響しないような非常にわずかな金属塩）を含有するという事実を指す。本発明の一つの重要な側面は、オリゴヌクレオチドの典型的なアニオン交換分離とは異なり、本発明の方法は、溶出にｐＨ勾配を使用し、そして塩の勾配を使用しないことである。
【００４６】
本発明において使用される溶出溶液は、ｐＨが段階的様式で増加される溶液、並びにｐＨが連続様式で増加される溶液を含む。一つの態様において、標的オリゴヌクレオチドを溶出するために使用される溶液は、ｐＨが時間をかけて直線的様式で増加される。もう一つの態様において、標的オリゴヌクレオチドを溶出するために使用される溶液は、約８のｐＨから約１１のｐＨに増加される。好ましくは、この態様において、使用される滴定可能なアニオン交換組成物は、ポリエチレンイミンを含んでなる。溶出溶液は、更にｐＨを適当に変化するために、一つ又はそれより多い緩衝剤を含んでなることもできる。一つの態様において、溶出溶液は、一つ又はそれより多いＮａＨＣＯ3、Ｎａ2ＣＯ3、ＮａＯＨ、ＮＨ4ＯＨ及び／又はＮＨ4ＨＣＯ3を含んでなる。好ましい態様において、溶出溶液は、金属塩を含まず、そして好都合にはＮＨ4ＨＣＯ3、そして特にＮＨ4ＯＨのような乾燥時に揮発する塩を含んでなる。溶出の速度は一般的に重要ではないが、標的オリゴヌクレオチドを溶出するために使用される溶液は、一般的に約３５０ないし５５０ｃｍ／時の流量で、そして更に普通には約４２０ないし４５０ｃｍ／時の間の流速で管理される。
【００４７】
塩を含んでなる溶出溶液が、塩の勾配の溶出において使用される塩濃度より実質的に低い塩濃度を有することは認識されるものである。しばしば、ｐＨの勾配の溶出溶液中の塩の濃度は、約０．０１ないし約０．０７Ｍ、例えば約０．０５Ｍのように０．１Ｍより多くない。多くの態様において、ｐＨの勾配によるｐＨの全体的増加は、溶出溶液中の塩濃度を約１００％より多くは増加しない。ある特別の態様において、塩濃度は、実質的に一定のままであるか、又は減少することができる。溶出溶液の塩濃度は、普通０．２Ｍを超えず、そして好ましくは０．１Ｍより大きくない。これは、塩濃度が典型的には少なくとも約０．５Ｍ、普通には２Ｍ又は３ないし４のようになお高い塩の勾配の使用と対照的である。
【００４８】
本発明の方法は、５’−Ｏ−保護オリゴヌクレオチドの分離のために使用することができる。ある態様において、５’−Ｏ−保護基は、これが、なお滴定可能なアニオン交換組成物に結合している間に標的オリゴヌクレオチドから開裂することができる。適した５’−Ｏ−保護基は、当技術において既知であり、そして例えば、置換された又は置換されていないトリチル基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ））を含む。好ましい態様において、本発明の方法は、５’−Ｏ−トリチル保護オリゴヌクレオチド（例えば、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル保護オリゴヌクレオチド）の分離のために使用される。結合したオリゴヌクレオチドからの保護基の開裂（即ち、滴定可能なアニオン交換組成物からの溶出の前に）は、適した試薬を滴定可能なアニオン交換組成物を通して通過させることによって達成することができる。標的オリゴヌクレオチドからのトリチル保護基の開裂に対して、適した試薬は、十分な量の酸性溶液である。多くの態様において、トリチル保護基（例えば、５’−Ｏ−ＤＭＴ）は、酢酸水溶液、例えば２０％−８０容量／容量％の酢酸水溶液を使用して標的オリゴヌクレオチドから開裂することができる。
【００４９】
本発明の方法は、これが、オリゴヌクレオチドを分離又は精製するために典型的に必要な更に面倒な、そして時間のかかる慣用的な分離工程を回避することにおいて好都合である。アニオン交換分離における塩の勾配の使用の必要性を排除することにおいて、本発明の方法は、オリゴヌクレオチドを分離するために、典型的に必要とする工程の数を減少する。従って、本発明は、迅速な、簡素化された、更に効率のよい、そしてより経費のかからない方法を、オリゴヌクレオチドの大規模な精製のために提供する。更に、溶出溶液中の高濃度の塩の使用を排除することにおいて、本発明の方法は、クロマトグラフ及び他のアニオン交換分離機械のステンレス鋼及び／又は可動部分（例えば、ＨＰＬＣのポンプ、取付部品、弁、カラム、配管）の損傷を減少する。
【００５０】
本発明は、以下の非制約的実施例によって更に説明されるものである。本明細書中に引用した全ての刊行物の教示は、本明細書中に参考文献としてその全てが援用される。
実施例
実施例１−固相合成によって調製されたオリゴヌクレオチドの精製
以下の機器及び試薬が本明細書中で言及され、そして便宜上関連する情報を伴って一旦列挙するものである。他に示されない限り、全ての機器及び試薬は、製造業者の指導書に示されたように使用した。更に、他に示されない限り、当業者にとって公知であるように、他の同様な機器及び試薬で置き換えることができる。
【００５１】
試薬
ポリエチレンイミン−誘導体化シリカゲル（Ｍａｔｒｅｘ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｌｉｃａ  ＰＥＩ−３００−１５；製品番号Ｓ６７４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）；
緩衝液Ａ；５０ｍＭのＮａＨＣＯ3溶液；ｐＨ８．２；
緩衝液Ｂ；５０ｍＭのＮａＨＣＯ3／Ｎａ2ＣＯ3溶液；ｐＨは０．１ＭのＮａＯＨで１１．１に調節；
緩衝液Ｃ；０．１のＮａＯＨ溶液；
緩衝液Ｄ；０．１Ｍのトリス、２ＭのＮａＣｌ溶液；ｐＨ７．５；
オリゴヌクレオチドＴＣＧ−ＴＣＧ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＴＡ−ＴＴＴ−ＴＣＧ−ＵＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を、固体の支持体及びホスホラミダイト化学反応を使用して合成した。５’−Ｏ−トリチル保護基を、塩化メチレン中の３％のジクロロ酢酸を使用してオリゴヌクレオチド合成の最後に除去した。次いでオリゴヌクレオチドを支持体から放出させ、そして保護基を濃水酸化アンモニウム溶液で除去した。次いで標的オリゴヌクレオチドを含有する溶液を１．０Ｍのリン酸溶液を加えることによって、ｐＨ７．５に調節した（全オリゴヌクレオチドは、１２１，９５０ＯＤであった）。
【００５２】
オリゴヌクレオチドの分離
ＰＥＩ−誘導体化シリカゲル（１００ｍＬ）のスラリーを緩衝液Ｄ中で製造し、そして８ｍＬ／分の流速でガラスカラムに充填した。その後、カラムを緩衝液Ｃ、緩衝液Ｄ及び緩衝液Ａで、得られた洗液がｐＨ８．２に達するまで洗浄した。カラムを、４カラム体積の緩衝液Ａで３５ｍＬ／分の流速で洗浄することによって平衡させた。
【００５３】
標的オリゴヌクレオチドを含有する試料を３５ｍｌ／分の一定の流速でカラムに付加した。試料を付加した後、カラムを４カラム体積の緩衝液Ａで洗浄した。標的オリゴヌクレオチドをｐＨの勾配（８．２から１１．１）を使用して分離し、これは緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂを使用することによって得た（４３５ｃｍ／時の流速で２０カラム体積の０から８０％の緩衝液Ｂ）。画分を収集し、そして分析用アニオン交換ＨＰＬＣを使用して所望するオリゴヌクレオチドについて分析した。９０％より大きい純度を持つ画分をプールした。オリゴヌクレオチド産物の濃縮及び脱塩は、ＵＦ膜濾過を使用するか、又はＰＥＩ−誘導体化シリカゲルに結合するかのいずれかを使用して行った。ついでオリゴヌクレオチド産物を凍結乾燥した。
【００５４】
カラムの再生
標的オリゴヌクレオチドの分離後、カラムを、これを、緩衝液Ｃ（１カラム体積）、緩衝液Ｄ（２カラム体積）、そして最後に緩衝液Ａ（洗液が８．５のｐＨに達するまで）で洗浄することによって再生した。これでカラムは更なる分離のために適している。
【００５５】
実施例２−固相合成によって調製され、そしてイオン交換クロマトグラフィーによって精製されたオリゴヌクレオチドの脱塩
試薬
ポリエチレンイミン−誘導体化シリカゲル（Ｍａｔｒｅｘ  Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｌｉｃａ  ＰＥＩ−３００−１５；製品番号Ｓ６７４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）；
緩衝液Ａ；０．２５ＭのＮＨ4ＨＨＣＯ3溶液；ｐＨ７．５；
緩衝液Ｂ；０．１ＭのＮＨ4ＯＨ；
緩衝液Ｃ；ＭＩＬＬＩ−Ｑ水
緩衝液Ｄ；０．１ＭのＮＨ4ＯＨ、２ＭのＮａＣｌ溶液；ｐＨ７．５
ＰＥＩ−誘導体化シリカゲル（１００ｍＬ）のスラリーを緩衝液Ｄ中で製造し、そして８ｍＬ／分の流速でガラスカラムに充填した。その後、カラムを２カラム体積の緩衝液Ｄで洗浄した。次いでカラムを緩衝液ＡでｐＨが８より低くなるまで再平衡させた。
【００５６】
オリゴヌクレオチドＴＣＧ−ＴＣＧ−ＴＧＴ−ＴＴＴ−ＣＴＡ−ＴＴＴ−ＴＣＧ−ＵＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）を、実施例１に記載したように合成した。合成後、標的オリゴヌクレオチドを、標準的手段を使用したイオン交換クロマトグラフィーによって副産物から分離し、精製されたオリゴヌクレオチド及び約１．５−２．０Ｍの塩化ナトリウムを含有するｐＨ１２を持つ溶液を得た。次いでこの溶液のｐＨを１．０Ｍの酢酸で７．５に調節した。次いで試料を８ｍＬ／分の流量でカラムに付加した（１０００ＯＤ／ｍＬ樹脂）。
【００５７】
付加されたカラムを、最初に５カラム体積の緩衝液Ａで洗浄し、続いて緩衝液Ｃで伝導率が０．０１ミリジーメンス／ｃｍより小さくなるまで洗浄した。次いでオリゴヌクレオチドを緩衝液Ｂでカラムから溶出した。溶出後、カラムを２カラム体積の緩衝液Ａで洗浄することによって再生した。
【００５８】
実施例３
６６％の全長の産物（full length product：ＦＬＰ）を含有する完全にホスホロチオエート化されたデオキシリボヌクレオチドの１８−マーを、緩衝液Ａが６．０のｐＨを有していたことを除いて、実施例１の方法を使用して５’−ジメトキシトリチル付きで精製した。精製された溶出したヌクレオチドの分析は、＞９４％のＦＬＰの産物純度を示した。匹敵する結果が、ＰＥＩ−誘導体化ポリスチレンビーズを滴定可能なアニオン交換支持体として使用した場合にも更に達成された。
【００５９】
本発明は、その好ましい態様に関して特に示され、そして説明されてきたが、形態及び詳細の各種の変更が、特許請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなくそれに行うことができることは当業者によって理解されるものである。
【配列表】
2005520547.tif 000002
【国際調査報告】
2005520547.tif 000003
2005520547.tif 000004
2005520547.tif 000005