(57)【要約】本発明は、２つの異なるVEGF受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する抗原結合蛋白質の生成に関する。二重特異性抗原結合蛋白質は、VEGF受容体の活性化をブロックし、VEGFにより誘発される細胞機能、例えば血管内皮細胞の有糸分裂生起及び白血病細胞の移動を低減又は疎外するのに使用される。本発明の抗原結合蛋白質は、一価又は多価であってよく、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメインから成る抗原結合部位を有し、さらに、免疫グロブリン定常領域を含むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体であって、第1VEGF受容体に対して特異的な第1抗原結合部位と、第2VEGF受容体に対して特異的な第2抗原結合部位とを有することを特徴とする、抗体。
【請求項２】
該第1及び第2のVEGF受容体が哺乳動物受容体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
該第1及び第2のVEGF受容体がヒト受容体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
該第1及び第2のVEGF受容体が、KDR、Flt-1及びFlt-4から成る群から選択される、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第2VEGF受容体がFlt-1である、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位の相補性決定領域（CRD）のアミノ酸配列が：
CDRH1におけるSEQ ID NO:1；
CDRH2におけるSEQ ID NO:2；
CDRH3におけるSEQ ID NO:3；
CDRL1におけるSEQ ID NO:4；
CDRL2におけるSEQ ID NO:5；及び
CDRL3におけるSEQ ID NO:6
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位の可変ドメインのアミノ酸配列が：
重鎖可変ドメイン(VH)に対応するSEQ ID NO:7；及び
軽鎖可変ドメイン(VL)に対応するSEQ ID NO:8
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項８】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位の相補性決定領域（CRD）のヌクレオチド配列が：
CDRH1に対応するSEQ ID NO:9；
CDRH2に対応するSEQ ID NO:10；
CDRH3に対応するSEQ ID NO:11；
CDRL1に対応するSEQ ID NO:12；
CDRL2に対応するSEQ ID NO:13；及び
CDRL3に対応するSEQ ID NO:14
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項９】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位の可変ドメインのヌクレオチド配列が：
重鎖可変ドメイン(VH)に対応するSEQ ID NO:15；及び
軽鎖可変ドメイン(VL)に対応するSEQ ID NO:16
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項１０】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位の相補性決定領域（CRD）のアミノ酸配列が：
CDRH1に対応するSEQ ID NO:1；
CDRH2に対応するSEQ ID NO:21；
CDRH3に対応するSEQ ID NO:3；
CDRL1に対応するSEQ ID NO:4；
CDRL2に対応するSEQ ID NO:5；及び
CDRL3に対応するSEQ ID NO:6
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項１１】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位の可変ドメインのアミノ酸配列が：
重鎖可変ドメイン(VH)に対応するSEQ ID NO:22；及び
軽鎖可変ドメイン(VL)に対応するSEQ ID NO:23
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項１２】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位の相補性決定領域（CRD）のヌクレオチド配列が：
CDRH1に対応するSEQ ID NO:9；
CDRH2に対応するSEQ ID NO:24；
CDRH3に対応するSEQ ID NO:11；
CDRL1に対応するSEQ ID NO:12；
CDRL2に対応するSEQ ID NO:13；及び
CDRL3に対応するSEQ ID NO:14
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項１３】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位の可変ドメインのヌクレオチド配列が：
重鎖可変ドメイン(VH)に対応するSEQ ID NO:25；及び
軽鎖可変ドメイン(VL)に対応するSEQ ID NO:26
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項１４】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位がCDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及びCDRH3におけるアミノ酸配列セットを含み、該セットが、SEQ ID NO:53,54,55,65,66及び67のセット、SEQ ID NO:56,57,58,65,66及び67のセット、SEQ ID NO:59,60,61,65,66及び67のセット、並びにSEQ ID NO:62,63,64,68,69及び70のセットから成る群から選択される、請求項３に記載の抗体。
【請求項１５】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1結合部位が、VHドメインとVLドメインとの対を含み、該ドメイン対が、SEQ ID NO:72及び74、SEQ ID NO:76及び78、SEQ ID NO:76及び81、並びにSEQ ID NO:83及び85から成る群から選択される、請求項３に記載の抗体。
【請求項１６】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1抗原結合部位が、それぞれSEQ ID NO:65,66,及び67によって与えられたアミノ酸配列CDRH1、CDRH2及びCDRH3のセット、並びに、SEQ ID NO:106,107及び108のセットと、SEQ ID NO:109,110及び111のセットと、SEQ ID NO:112,113及び114のセットと、SEQ ID NO:115,116及び117のセットと、SEQ ID NO:118,119及び120のセットと、SEQ ID NO:121,122及び123のセットと、SEQ ID NO:124,125及び126のセットと、SEQ ID NO:127,128及び129のセットと、SEQ ID NO:130,131及び132のセットと、SEQ ID NO:133,134及び135のセットとから成る群から選択されたCDRL1、CDRL2、CDRL3におけるアミノ酸配列セットを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項１７】
該第1VEGF受容体がKDRであり、該第1結合ドメインのVHドメインがSEQ ID NO:76を含み、該第1結合ドメインのVLドメインが、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103及びSEQ ID NO:105から成る群から選択された配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項１８】
該第2VEGF受容体がFlt-1であり、該第2抗原結合部位がMab 6.12(ATCC No. PTA-3344)の重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項６から１７までのいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
該第1VEGF受容体がFlt-1であり、該第1抗原結合部位の相補性決定領域(CDR)のアミノ酸配列が：
CDRH1におけるSEQ ID NO:35；
CDRH2におけるSEQ ID NO:36；
CDRH3におけるSEQ ID NO:37；
CDRL1におけるSEQ ID NO:38；
CDRL2におけるSEQ ID NO:39；及び
CDRL3におけるSEQ ID NO:40
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項２０】
該第1VEGF受容体がFlt-1であり、該第1抗原結合部位の可変ドメインのアミノ酸配列が：
重鎖可変ドメイン(VH)に対応するSEQ ID NO:41；及び
軽鎖可変ドメイン(VL)に対応するSEQ ID NO:42
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項２１】
該第1VEGF受容体がFlt-1であり、該第1抗原結合部位の相補性決定領域（CRD）のヌクレオチド配列が：
CDRH1に対応するSEQ ID NO:43；
CDRH2に対応するSEQ ID NO:44；
CDRH3に対応するSEQ ID NO:45；
CDRL1に対応するSEQ ID NO:46；
CDRL2に対応するSEQ ID NO:47；及び
CDRL3に対応するSEQ ID NO:48
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項２２】
該第1VEGF受容体がFlt-1であり、該第1抗原結合部位の可変領域のヌクレオチド配列が：
重鎖可変ドメイン(VH)に対応するSEQ ID NO:49；及び
軽鎖可変ドメイン(VL)に対応するSEQ ID NO:50
を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項２３】
該第1VEGF受容体がFlt-1であり、該第1抗原結合部位がMab 6.12(ATCC No. PTA-3344)の重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項２４】
第1VEGF受容体の細胞外ドメイン及び第2VEGF受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体であって、該第1又は第2VEGF受容体に対する抗体の結合が、前記VEGF受容体の活性化を中和することを特徴とする、抗体。
【請求項２５】
VEGFの結合をブロックする、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
受容体ホモ二量化をブロックする、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２７】
受容体ヘテロ二量化をブロックする、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２８】
該第1及び第2VEGF受容体が、KDR、Flt-1及びFlt-4から成る群から選択される、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２９】
該第1VEGR受容体がKDRであり、該第2VEGR受容体がFlt-1である、請求項２４に記載の抗体。
【請求項３０】
抗体であって、第1VEGF受容体の細胞外ドメイン及び第2VEGF受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、腫瘍成長を抑制することを特徴とする、抗体。
【請求項３１】
該第1及び第2VEGF受容体が、KDR、Flt-1及びFlt-4から成る群から選択される、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３２】
該第1VEGR受容体がKDRであり、該第2VEGR受容体がFlt-1である、請求項２９に記載の抗体。
【請求項３３】
抗体であって、第1VEGF受容体の細胞外ドメイン及び第2VEGF受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、血管形成を阻害することを特徴とする抗体。
【請求項３４】
該第1及び第2VEGF受容体が、KDR、Flt-1及びFlt-4から成る群から選択される、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３５】
該第1VEGR受容体がKDRであり、該第2VEGR受容体がFlt-1である、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３６】
第1VEGF受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、第1免疫グロブリン重鎖可変ドメインと第1免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとを含む第1抗原結合部位、並びに、第2VEGF受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、第2免疫グロブリン重鎖可変ドメインと第2免疫グロブリン軽鎖可変ドメインとを含む第2抗原結合部位を有する抗体の形成方法であって、
a)  宿主細胞中に
該第2免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのN末端に該第1免疫グロブリン重鎖可変ドメインが配置された第1ポリペプチドをコードする組換えDNA構築体と、
該第1免疫グロブリン軽鎖可変ドメインのN末端に該第2免疫グロブリン重鎖可変ドメインが配置された第2ポリペプチドをコードする組換えDNA構築体とを、
該ポリペプチドの発現と該抗体の形成とを可能にするのに十分な時間及び方法で、
同時発現させ；そして
ｂ）  該抗体を回収する
ことを特徴とする、抗体の形成方法。
【請求項３７】
該構築体が同一DNA発現ベクター上にある、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
該構築体が異なるDNA発現ベクター上にある、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
該宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞又は哺乳動物細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
該抗体が該宿主細胞から分泌される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
細胞内の第1VEGF受容体及び第2VEGF受容体の活性化を中和する方法であって、該受容体の活性化を中和するのに十分な量の、該第1VEGF受容体に対して特異的な第1抗原結合部位と、該第2VEGF受容体に対して特異的な第2抗原結合部位とを有する抗体で、細胞を処理することを含む、細胞内の第1VEGF受容体及び第2VEGF受容体の活性化を中和する方法。
【請求項４２】
腫瘍成長を抑制する必要のある哺乳動物における腫瘍成長の抑制方法であって、腫瘍成長を抑制するのに有効な量の、第1VEGF受容体に対して特異的な第1抗原結合部位と、第2VEGF受容体に対して特異的な第2抗原結合部位とを有する抗体で、該哺乳動物を治療することを特徴とする、腫瘍成長の低減方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、2つの異なるVEGF受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する二重特異性抗原結合蛋白質の生成に関する。二重特異性抗原結合蛋白質は、VEGF受容体の活性化をブロックし、VEGFにより誘発される細胞機能、例えば血管内皮細胞の有糸分裂生起及び白血病細胞の移動を抑制又は阻害するのに使用される。本発明の抗原結合蛋白質は、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメインから成る抗原結合部位を有し、一価又は二価であってよい。抗原結合蛋白質はさらに、免疫グロブリン定常領域を含むことができる。
【０００２】
発明の背景
血管内皮成長因子(VEGF)、胎盤成長因子(PlGF)及びこれらの受容体VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/KDR及びVEGFR-2/KDR及びVEGFR-3/Flt-4は、脈管形成、血管形成及び腫瘍細胞の成長に重要な役割を有する。
【０００３】
血管内皮成長因子(VEGF)は、胚生育中の脈管形成、及び、成人期の血管形成過程、例えば創傷治癒、糖尿病性網膜症、リウマチ様関節炎、乾癬、炎症障害、腫瘍成長及び転移の重要な調節因子である(Ferrara, 1999, Curr. Top. Micorbiol. Immunol. 237:1-30;Klagsbrun, M.他、1996, Cytokine Rev. 7:259-270; Neufeld, G他, 1999, FASEB J. 13:9-22)。VEGFは強力な血管透過性誘発因子、内皮細胞の移動及び増殖の刺激因子であり、新たに形成された血管のための重要な生存因子である。VEGFは2つのチロシン・キナーゼ受容体、VEGF受容体1(VEGFR-1)、又はFins様チロシン受容体1（Flt-1)及びVEGF受容体2（VEGFR-2)又はキナーゼ挿入ドメイン含有受容体(KDR;マウスにおけるFlk-1)に結合し、主にこれらの受容体を介してその活性を伝達する。VEGFの過剰発現及びその受容体は、腫瘍に関連する血管形成において、ひいては腫瘍の成長及び転移の両方において重要な役割を果たすことが、多くの研究において示されている(Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1:27-31; Zhu, Z.他, 1999, Invest. New Drugs 17:195-212)。この役割はさらに、例えば、VEGFに対する抗体(Kim他, 1993, Nature 362:841-844)及びその受容体(Zhu. Z.他, 1998, Cancer Rex. 58:3209-3214; Prewett, M.他, 1999, Cancer Rex. 59:5209-5218)により、動物モデルにおける腫瘍成長が阻害されることを実証する研究によって支持されている。
【０００４】
Flt-1及びKDRは、胚中の脈管形成において明確な機能を有している。マウスにおけるいずれかの受容体をコードする遺伝子の標的化抹消により、胚は死に至る。このことは、胚生育におけるVEGF経路の生理学的重要性を実証している。KDR欠損マウスは、血島形成障害を有し、成熟内皮細胞を欠いているのに対し、Flt-1がゼロの胚は、脈管形成に問題があるため、豊富な内皮細胞を有しているにもかかわらず、正常な脈管構造を形成することはできない。他方において、チロシン・キナーゼドメインの先端を切除することによりFlt-1信号伝達を不活性化しても、マウスの胚の血管形成及び胚生育が損なわれることはなかった。このことはFlt-1受容体を介した信号伝達が、胚内の血管形成にとって重要ではないことを示唆する。成人におけるVEGFに対するFlt-1及びKDRの生物学的応答も異なっているように見える。KDRは主なVEGF信号のトランスデューサであり、このトランスデューサにより、内皮細胞の増殖、移動、分化、管形成、血管透過性の増大、及び血管完全性の維持がもたらされると一般に考えられる。Flt-1はKDRよりもほぼ10倍高い親和性を持ってVEGFに結合するものの、キナーゼ活性が著しく弱く、VEGFによって刺激されたときに細胞分裂誘起応答を引き起こすことはできない。しかし、Flt-1は、VEGF及び胎盤成長因子(PlGF)により誘発される単球/マクロファージ移動、及び組織因子の生成に関与している。
【０００５】
VEGF及びPlGFとは別に、VEGFに関連するその他のいくつかの成長因子：VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及びVEGF-Eが同定されている。VEGF-BはPlGFと同様に、Flt-1に結合する。VEGF-EはKDRに対して特異的であるのに対して、VEGF-C及びVEGF-DはKDR及び別の受容体VEGFR-3(Flt-4)に結合することができる。これらのそれぞれの特異性受容体に加えて、これらのリガンドはヘテロ二量体を形成することができる。ヘテロ二量体は、種々の受容体ホモ又はヘテロ二量体に差別的に結合し、相異なる経路を介して信号伝達する。
【０００６】
いくつかの小規模の臨床試験において癌画像形成剤及び癌治療剤として、多重特異性抗体が使用されているが、効率的な生成方法がないことが広範囲な臨床評価を阻んでいる。このような蛋白質の設計は今までのところは、主として多重特異性を提供することに関係している。天然抗体分子と関連するその他の有用な機能を提供することに注目している事例はほとんどない。
【０００７】
近年、二重特異性及び/又は多価抗体フラグメントを生成するために、種々の化学的方法及び組換え方法が開発されている。検討の際には、Holliger, P.及びWinter, G., Curr, Opin. Biotechnol. 4, 446-449(1993)；Carter, P.他、J. Hematotherapy 4,463-470 (1995);Plueckthun, A.及びPack, P., Immunotechnology 3, 第83-105頁 (1997)を参照されたい。フレキシブルなリンカー、ロイシン・ジッパー・モチーフ、CHCL-ヘテロ二量化を介して2つのscFv分子を融合し、そしてscFv分子を会合させて、二価単一特異性ダイアボディ(diabody)及び関連構造を形成することにより、二重特異性及び/又は二価性が達成されている。例えばp53、ストレブトアビジン及び螺旋-旋回-螺旋モチーフを使用して、ScFv又はFabフラグメントのカルボキシ又はアミノ末端に多量化配列を加えることによって、多価性が達成されている。例えば、(sdFv1)-ヒンジ-螺旋-旋回-螺旋-(sdFv2)の形のsdFv融合蛋白質の螺旋-旋回-螺旋モチーフを介して二量化することにより、四価二重特異性ミニ抗体が生成される。この四価二重特異性ミニ抗体は、2つの標的抗原のそれぞれに対する2つのscFv結合部位を有する。3つの官能性抗原結合部位を提供することにより、改善されたアビディティを得ることもできた。例えば、VH及びVLドメインを結合する短縮リンカーを有するscFv分子が会合して、トリアボディを形成する(Kortt他, 1997, Protein Eng. 10:423-433)。
【０００８】
或る程度完全なIgG定常ドメイン構造を有する点でIgG抗体と似ているIgG型二重特異性抗体が、2つの異なるIgG分子を化学架橋することによって、又は、同一細胞から2つの抗体を同時発現させることによって生成されている。トランスフェクトされた細胞内にIgG重鎖及び軽鎖の2つの異なるセットが不所望に対合されるのを克服するために開発された1つの戦略は、2つの重鎖のCH3ドメインに変更を加え、これにより、類似抗体重鎖間のホモ二量化を低減することである。Merchant, A.M.他、(1998) Nat. biotechnology 16,677-681。この方法において、軽鎖の誤対合は、これらの二重特異性抗体の各結合部位に対して同一軽鎖の使用を必要とすることにより排除された。
【０００９】
幾つかの事例において、抗原特異性以外の機能的又は構造的側面を維持することが望ましい。例えば、Fc領域重鎖定常ドメインの存在及び機能を必要とする補体媒介性細胞毒性(CMC)及び抗体依存性の細胞媒介性毒性(ADCC)の両方が、大抵の二重特異性抗体内で失われる。Coloma及びMorrisonは、完全重鎖のC-末端にscFvを融合することにより、Fcドメインを有する均質な二価BsAb分子個体群を生成した。抗体軽鎖との融合を同時発現させた結果、均質な二価二重特異性分子個体群が生成される。これらの分子は第1の抗体に一方の末端で結合し、第2の抗体に他方の末端で結合する(Coloma, M.J.及びMorrison, S.L.(1997)Nat.Biotechnology 15, 第159-163頁)。しかし、この分子は、補体を活性化する能力が低減され、CMCを生じさせることはできなかった。さらに、CH3ドメインは高親和性Fc受容体(FcγR1)に、低減された親和性を持って結合された。Zhu他、PCT/US01/16924は、Ig可変ドメインを単鎖Fvsと置換することにより、四量体Ig様蛋白質を生成することを記載している。生成された四量体Ig様蛋白質は(1)二重特異性且つ二価であり、(2)抗原結合部位の選択に関する制約なしに実質的に均質であり、(3)Fc定常ドメインを含み、付随する機能を維持し、そして(4)更なる処理を行うことなしに哺乳動物又はその他の細胞中で生成することができる。同様の方法によって、二重特異性一価Fab様蛋白質を生成することができる。
【００１０】
発明の概要
本発明は、第1VEGF受容体に対して特異的な抗原結合部位と、第2VEGF受容体に対して特異的な抗原結合部位とを有する抗体を提供する。これらの抗体は二価以上であり、三価、四価又は多価であってよい。
【００１１】
好ましい実施態様において、抗体は二重特異性であり、第1VEGF受容体に対して特異的な第1抗原結合部位と、第2VEGF受容体に対して特異的な第2抗原結合部位とを有する。VEGF受容体に結合されると、抗体はVEGF受容体とそのリガンドとの相互作用を効果的にブロックする。或いは、又はこれに加えて、抗体は、VEGF受容体蛋白質の二量化をブロックするのに効果的である。単一VEGF受容体に結合するのと比較して、二重結合の結果、VEGF刺激型細胞機能、例えば内皮細胞の増殖、及びヒト白血病細胞のVEGF誘発型及びPlGF誘発型移動をより強力に阻害することができる。抗原結合蛋白質は好ましくは哺乳動物VEGF受容体に対して特異的であり、又はより好ましくはヒトVEGF受容体に対して特異的である。VEGF受容体はヒトKDR、Flt-1及びFlt-4及びこれらの哺乳動物同族体である。特に好ましい実施態様の場合、抗体はKDR及びFlt-1に対して特異的である。
【００１２】
本発明の１実施態様において、抗体はVEGF受容体の細胞外ドメインに対して特異的に結合し、例えばリガンド結合又は受容体二量化をブロックすることにより、VEGF受容体の活性化を中和することができる。本発明の別の実施態様の場合、二重特異性抗体は、VEGF受容体に対して特異的に結合し、血管形成を阻害することができる。本発明のさらに別の実施態様の場合、抗体はVEGF受容体の細胞外ドメインに対して特異的に結合し、腫瘍成長を抑制することができる。
【００１３】
本発明はさらに、2つの異なるVEGF受容体に対して特異的な二重特異性抗原結合蛋白質の生成方法について検討する。抗原結合蛋白質は例えば一価又は二価であってよい。1実施態様の場合、細菌中で2つの蛋白質鎖を同時発現させて分泌させることにより、ダイアボディが生成される。第1の構造は第1VEGF受容体に対して特異的な第1抗体のVHドメインと、第2VEGF受容体に対して特異的な第2抗体のVLドメインとをコードする。第2の構造は第1抗体のVLドメインと、第2抗体のVHドメインとをコードする。発現させられた2つの鎖は、それぞれのVEGF受容体に対応する1結合部位と、ヘテロ二量体として会合する。別の実施態様の場合、Ig様抗体が生成され、この抗体において、VHドメインのそれぞれが、第1VEGF受容体に対して特異的な第1一本鎖Fv(scFv)と置換され、VLドメインのそれぞれが、第2VEGF受容体に対して特異的な第2scFvと置換される。2つの重鎖と2つの軽鎖との会合によって形成された四量体抗体は、二重特異性且つ二価であり、さらに、免疫グロブリン定常領域を含む。
【００１４】
本発明は、第1VEGF受容体及び第2VEGF受容体の活性を中和する方法であって、本発明の二重特異性抗体で細胞を治療することを含む、中和方法について検討する。さらに、血管形成を阻害して腫瘍成長を低減する方法において、結合蛋白質を使用することが検討される。
【発明の開示】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、第1VEGF受容体と第2VEGF受容体とに特異的に結合することができる二重特異性抗体を提供する。特に重要なのは、このような受容体の細胞外ドメインに結合する抗体である。本明細書中に定義されるVEGF受容体の細胞外ドメインは、受容体の細胞外部分のリガンド結合ドメイン、並びに、二量化及びオーバラップ・エピトープに関与する細胞外部分を含む。VEGF受容体の細胞外ドメインに結合されると、抗体は効果的にリガンド結合をブロックし、且つ/又は受容体二量化を妨害する。このような結合の結果として、抗体はVEGF受容体の活性化を中和する。受容体の中和とは、受容体の内在的な信号伝達能力を減少及び/又は不活性化することを意味する。VEGF受容体の中和に関して信頼性の高いアッセイは、受容体リン酸化反応の阻害である。受容体リン酸化反応の測定法は当業者に良く知られており、例えばモノクローナル抗体又は放射性標識によるホスホチロシンの測定を含む。
【００１６】
天然抗体分子は、2つの同一重鎖と2つの同一軽鎖とから成っている。各軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって重鎖に共有結合されている。2つの重鎖はさらに、複数のジスルフィド結合によって互いにリンクされている。図１は、典型的なIgG抗体の構造を示す。個々の鎖は折り重なって、サイズ(110-125アミノ酸)及び構造は同様ではあるがしかし機能が異なるドメインになる。軽鎖は1つの可変ドメイン(VL)と1つの定常ドメイン(CL)とを含む。重鎖は1つの可変ドメイン(VH)と、抗体のクラス又はイソタイプに応じて、3つ又は4つの定常ドメイン(CH1, CH2, CH3及びCH4)とを含む。マウス及びヒトにおいて、イソタイプはIgA, IgD, IgE, IgG及びIgMであり、IgA及びIgGはさらにサブクラス又はサブタイプに分類される。VLドメイン及びVHドメインから成る抗体部分は「Fv」と呼ばれ、抗原結合部位を構成する。単鎖Fv(scFv)は、遺伝子工学的に作り出された蛋白質である。この蛋白質は1つのポリペプチド鎖上にVLドメイン及びVHドメインを含有する。この場合一方のドメインのN末端と他方のドメインのC末端とは、フレキシブルなリンカーによって結合される。「Fab」は、VL, VH, CL, CH1ドメインから成る抗体部分を意味する。
【００１７】
可変ドメインは、特に抗原結合部位の位置で、抗体毎にかなりのアミノ酸配列可変性を示す。「超可変性」又は「相補性決定領域」(CDR)と呼ばれる３つの領域が、VL及びVHのそれぞれに見いだされる。
【００１８】
「Fc」は、対として形成された重鎖定常ドメインを含む抗体部分を意味する。IgG抗体の場合、例えばFcは、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。IgA又はIgM抗体のFcはさらにCH4ドメインを含む。Fcは補体媒介性細胞毒性及び抗体依存性細胞性細胞毒素のFc受容体結合活性化に関連する。複数のIgG様蛋白質の複合体であるIgA及びIgMのような天然抗体の場合、複合体形成はFc定常ドメインを必要とする。
【００１９】
最後に「ヒンジ」領域は、抗体のFab部分とFc部分とを分離し、Fab相互の移動性及びFcに対する相対移動性を提供し、また、2つの重鎖の共有結合のための複数のジスルフィド結合を含む。
【００２０】
本明細書中に使用される「抗体」という用語は、抗体VHドメイン及びVLドメインを含む結合蛋白質を意味する。抗体特異性は、抗原の特定エピトープに対応する抗体の選択的認識を意味する。天然抗体は例えば単一特異的である。二重特異性抗体(BsAb)は、2つの異なる抗体結合特異性又は抗体結合部位を有する抗体である。抗体が2以上の特異性を有する場合には、認識されたエピトープは、単一抗原又は2以上の抗原と会合することができる。本発明の抗体は、少なくとも第1及び第2のVEGF受容体に対して特異的である。これらの受容体は例えばヒトKDR、Flt-1、Flt-2及びヒト以外のこれらの同族体を含む。
【００２１】
価数は、抗体が特定エピトープに対応して有する結合部位の数を意味する。例えば天然IgG抗体は、単一特異性であり、且つ二価である。抗体が2以上のエピトープに対して特異性を有する場合、価数はエピトープ毎に計算される。例えば、4つの結合部位を有して単一エピトープを認識する抗体は四価である。4つの結合部位を有し、このうち2つの結合部位が第1の特異性を有し、2つの結合部位が第2の特異性を有する抗体は二価と考えられる。
【００２２】
本発明において使用するためのVLドメイン及びVHドメインは、例えばハイブリドーマ又はファージ表示ライブラリから、又はVEGF受容体に対して特異的であるとして予め同定された抗体から得ることができる。2つの異なる受容体に対して特異的な二重特異性抗体が例示されるが、3つ以上の抗原に対して特異的な、3つ以上の結合部位を有する抗体を遺伝子工学的に作り出すこともできる。1実施態様の場合、本発明の抗体はKDR及びFlt-1に結合する。別の実施態様の場合、本発明の抗体はKDR及びFlt-4に結合する。
【００２３】
KDR、scFv plC11(SEQ ID NO:27,28)に結合する抗体結合ドメインの例は、マウスscFvファージ表示ライブラリから生成された(Zhu他、1998)。PlC11はVEGF-KDR相互作用をブロックし、VEGF刺激型受容体リン酸化反応、及び、ヒト血管内皮細胞(HUVEC)の有糸分裂生起を疎外する。このscFvは可溶性KDR及び細胞表面発現型KDRの双方に、例えばHUVEC上で高親和性(Kd=2.1nM)を持って結合する。Mab 6.12は、可溶性Flt-1及び細胞表面発現型Flt-1に結合する抗体の例である。Mab 6.12を生成するハイブリドーマ細胞株は、特許手続きを目的とした微生物寄託国際認定及びこれに基づく規則(ブダペスト条約）において、ブダペスト条約規定下でATCC番号PTA-3344として寄託されている。
【００２４】
理論上は、個々の成長因子、例えばVEGFに対する抗体は、単一リガンドの血管形成活性を特異的に中和するだけである。対照的に、VEGF受容体に対するアンタゴニスト抗体は、VEGFの血管形成活性をブロックするだけでなく、受容体を介して、血管形成効果を発揮するその他の成長因子の血管形成活性をもブロックする。例えば、抗KDR抗体は、VEGF、VEGF-C、VEGF-D及びVEGF-Eの血管形成活性を潜在的にブロックするのに対して、Flt-1に対する抗体は、VEGF、PlGF及びVEGF-Bの活性を阻害することになる。さらに、受容体機能が二量化に関与する場合、本発明の抗体は、一方又は両方のモノマーに結合し、機能をブロックすることができる。例えば、KDRに対して特異的な抗体によって、KDR/Flt-1ヘテロ二量体、並びにKDR/KDRホモ二量体をブロックすることができる。Flt-1に対して特異的な抗体は、KDR/Flt-1へテロ二量体及びFlt-1/Flt-1ホモ二量体の形成をブロックすることができる。
【００２５】
本発明の抗体は2又は3以上の結合部位を有しており、少なくとも二重特異性である。すなわち、これらの抗体は、結合部位が3以上ある場合でも二重特異性であってよい。本発明の抗体は、例えば多価一本鎖抗体、ダイアボディ及びトリアボディ、並びに、天然発生型抗体の定常ドメイン構造を有する抗体を含む。これらの抗体は完全に単一種由来であるか、或いはキメラ化又はヒト化されてよい。3以上の抗原結合部位を有する抗体の場合、蛋白質が2又は3以上の異なる抗原に対応する結合部位を有する限り、幾つかの結合部位が同一であってよい。すなわち、第1結合部位が第1VEGF受容体に対して特異的であるのに対して、第2結合部位は第2の異なるVEGF受容体に対して特異的である。好ましい実施態様の場合、抗体は二重特異性である。より好ましい実施態様の場合、抗体は、抗体個体群が均質であるように（すなわち、個体群中の抗体がいずれも、第1VEGF受容体に対して特異的な第1結合部位と、第2VEGF受容体に対して特異的な第2結合部位とを有するように）構成される。
【００２６】
天然抗体と同様に、本発明の抗体の抗体結合部位は典型的には6つの相補性決定領域(CDR)を含有する。これらの領域は、抗原に対応する結合部位の親和性の程度を変えることに関与する。重鎖可変ドメインCDRが3つ(CDRH1, CDRH2及びCDRH3)あり、軽鎖可変ドメインCDRが3つ(CDRL1, CDRL1及びCDRL3)ある。CDR及びフレームワーク領域(FR)の範囲は、アミノ酸配列の蓄積データベースと比較することにより決定される。これらのアミノ酸配列において、これらの領域は、配列内の可変性に基づいて定義されている。また、本発明の範囲には、より少ないCDRから成る官能性抗原結合部位が含まれる（すなわちこの場合には、結合特異性は3,4又は5つのCDRによって決定される）。例えば、6未満のCDRから成る完全セットで、結合には十分な場合がある。幾つかの事例では、VHドメイン又はVLドメインで十分となる。
【００２７】
本発明の抗体は、好ましくは、天然リガンドの親和性に匹敵する、又はこれを上回る親和性をもって、VEGF受容体に結合する。抗原が免疫グロブリン分子(K)と会合するための平衡定数によって表される親和性は、結合部位数とは無関係に、抗原決定因子と抗原結合部位との間の結合強度の尺度になる。解離定数Kdは、Kの逆数である。エピトープとしても知られる抗原決定因子は、所与の抗体が結合する抗原上の部位である。Kdの典型的な値は、10-5M〜10-11Mである。10-4Mよりも大きい任意のKdは、非特異的結合と考えられる。
【００２８】
アビディティは、免疫グロブリンとその抗原との結合強度の尺度である。各結合部位における結合強度の尺度となる親和性とは異なり、アビディティは、親和性及び免疫グロブリン分子の抗原特異的結合部位数（原子価）の両方によって決定される。
【００２９】
本発明の抗体は、任意には合成起源のアミノ酸配列によってリンクされた免疫グロブリン可変ドメインだけを含んでよい。例えば、典型的なダイアボディは、2つのFvドメインを有し、2つの鎖を含む。これらの鎖のうち、第1鎖は、第2抗体の軽鎖可変ドメインにリンクされた第1抗体の重鎖可変ドメインを内蔵し、第2鎖は、第2抗体の重鎖可変ドメインにリンクされた第1抗体の軽鎖可変ドメインを含む。ドメインは典型的には、約5〜10のアミノ酸残基、例えば5アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser又は10アミノ酸残基(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2のフレキシブルなポリペプチド・リンカーによって結合される。第1鎖と第2鎖との対合が類似鎖の対合よりも好ましく、実質的に均質なダイアボディ個体群が達成される。
【００３０】
或る特定の実施態様の場合、本発明の抗体はさらに1又は2以上の免疫グロブリン・クラスの免疫グロブリン定常領域を含む。免疫グロブリン・クラスは、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEイソタイプを含み、IgG及びIgAの場合、これらのサブタイプを含む。好ましい実施態様の場合、本発明の抗体はIgG型抗体の定常ドメイン構造を有するが、しかし4つの抗原結合部位を有する。このことは、免疫グロブリン可変ドメインの各ドメインを、完全抗原結合部位(例えば一本鎖Fv)と置換することにより達成される。4つの抗原結合部位は、2つの異なる結合特異性のそれぞれに対して2つの結合部位を含むことが好ましい。
【００３１】
所望の結合特性を有する抗体内に包含するための抗原結合部位は、種々の方法によって得られる。選択された結合ドメインのVL部分及びVH部分のアミノ酸配列は、天然発生型抗体に相当するか、或いは、所望の免疫原特性又は結合特性を得るように選択又は変更される。例えばVLドメイン及びVHドメインは、所望の結合特性を有するモノクローナル抗体から直接的に得ることができる。抗VEGFR-2モノクローナル抗体は、DC101(ラットの抗マウスVEGFR-2；ATCC HB 11534として寄託)、M25.18A1(マウスの抗マウスVEGFR-2；ATCC HB 12152として寄託)、及びM73.24(マウスの抗マウスVEGFR-2；ATCC HB 12153として寄託)を含む。抗VEGFR-1モノクローナル抗体は、KM1730(FERM BP-5697として寄託)、KM1731(FERM BP-5718として寄託)、KM1732(FERM BP-5698として寄託)、KM1748(FERM BP-5699として寄託)、及びKM1750(FERM BP-5700として寄託)を含み、国際公開第98/22616号パンフレット、同第99/59636号パンフレット、オーストラリア国受理出願AU 1998 50666 B2及びカナダ国特許出願CA 2328893に開示されている。
【００３２】
或いは、哺乳動物由来のV遺伝子配列のライブラリから、VLドメイン及びVHドメインを提供することもできる。このようなライブラリの要素は、VLドメイン及びVHドメインのランダムな組み合わせを発現させ、任意の所望の抗原でスクリーニングされ、これにより、所望の結合特性を有するこれらの要素が同定される。特に好ましいのはヒトV遺伝子ライブラリである。このようなスクリーニングの方法は当業者に知られている。選択された非ヒト起源に由来するVLドメイン及びVHドメインは、キメラ抗体内に組み込まれてよい。例えば、ヒトに投与する場合、VLドメイン及びVHドメインが非ヒト起源から選択されている官能性定常ドメインで、二重特異性抗体を使用することが望ましい。定常ドメイン関連機能を最大化するために、又は抗体の免疫原性を低減するためには、ヒト定常領域が好ましい。
【００３３】
或いは、「ヒト化」された二重特異性抗体を形成することができる。ヒト化可変ドメインが構成され、このドメインにおいて、非ヒト起源の1又は2以上の相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列が、ヒト・フレームワーク領域（FR)にグラフトされている。例えば：Jones, P.T.他(1996)Nature 321,522-525; Riechman, L.他(1988)Nature 332, 323-327;米国特許第5,530,101号明細書(Queen他)を参照されたい。例えば非ヒト起源由来の抗原結合ドメインをヒトの治療に使用することが所望される場合、不都合な免疫原性特性を排除するのに、ヒト化構造が特に有益である。可変ドメインは高度な構造相同性を有しており、CDR及びFRに対応する可変ドメイン内のアミノ酸残基を容易に同定するのを可能にする。例えばKabat, E.A.他(1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」第5版、National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda,MDを参照されたい。こうして、抗原結合に関与するアミノ酸が容易に同定される。さらに、グラフトCDRを含むヒト化結合ドメインの抗原に対する親和性を維持又は向上させる方法が開発されている。1つの方法は、受容可変ドメイン内に外来フレームワーク残基を含むことである。これらの外来フレームワーク残基は、CDR領域のコンフォメーションに影響を与える。第2の方法は、外来可変領域に対して最も相同性を有するヒト可変ドメイン上に外来CDRをグラフトすることである。Queen, C.他(1998)Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86, 10029-10033。所望のCDR配列を含むオーバラップ・プライマーを使用して個々のFR配列を先ず増幅し、そして、その結果得られた遺伝子セグメントを続く増幅反応中に結合することにより、異なるFR上にCDRが最も容易にグラフトされる。異なる可変ドメイン上へのCDRのグラフトは、さらに、アミノ酸配列内でCDRに隣接するアミノ酸残基の置換を伴うか、又はCDRのコンフォメーションに影響を及ぼす折畳まれた可変ドメイン構造内のCDRに側に詰まったアミノ酸残基の置換を伴うことができる。従って本発明のヒト化ドメインは、1又は2以上の非ヒトCDRを含むヒト抗体、並びに、結合特性を維持又は向上させるために付加的な置換又は交換が行われているこのようなドメインを含む。
【００３４】
本発明の抗体はまた、表面露出残基を置換して抗体がそれ自体で免疫系に対して出現するようにすることにより、免疫原性をより低くされた抗体を含む(Padlan, E.A.(1991)Mol. Immunol. 28,489-498)。抗体は親和性の損失なしに、このプロセスによって変更されている(Roguska他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 969-973)。抗原結合部位の近くにおけるアミノ酸残基の内部充填状態に変化は生じていないので、親和性は維持される。免疫原性を低減する目的で表面露出残基を置換することは、結合特性に影響を与えるCDR残基又は隣接残基の置換を意味するものではない。
【００３５】
本発明は、本質的にはヒトの結合ドメインを検討する。ヒト結合ドメインはファージ表示ライブラリから得られる。ヒト重鎖可変ドメイン及びヒト軽鎖可変ドメインの組み合わせが、線維状ファージ表面上に表示される(例えばMcCafferty他(1990)Nature 348,552-554; Aujame他(1997) Human Antibodies 8, 155-168参照)。可変ドメインの組み合わせは典型的には、Fab又はscFvの形で線維状ファージ上で表示される。ライブラリは、所望の抗原結合特性を有する可変ドメインの組み合わせを担持するファージに関してスクリーニングされる。好ましい可変ドメインの組み合わせは、選択された抗原に対する高い親和性と、その他の関連抗原に対する低い交差反応性とを示す。抗体フラグメントの極めて広いレパートリーをスクリーニングすることによって(例えばGriffiths他(1994)EMBO J.13,3245-3260)、十分に多様な高親和性Mabが分離され、多くのMabが所望の抗原に対してナノモル未満の親和性を有すると予期される。
【００３６】
或いは、遺伝子組換え動物からヒト結合ドメインを得ることができる。遺伝子組換え動物中には、転位されていないヒトIg遺伝子セグメントが導入されており、遺伝子組換え動物においては、固有のマウスIg遺伝子が不活性化されている(Brueggemann及びTaussig(1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8, 455-458に概説されている)。好ましい遺伝子組換え動物は、1Mbのサイズを上回る極めて大型の連続的なIg遺伝子フラグメントを含有する(Mendez他(1997)Nature Genet. 15, 146-156)が、しかし、より小型の遺伝子座を含有する遺伝子組換え動物から、中程度の親和性を有するヒトMabを生じさせることもできる(例えばWagner他(1994)Eur. J. Immuno. 42, 2672-2681;Green他(1994)Nature Genet,7,13-21)。
【００３７】
生理学的免疫応答において、発現抗体遺伝子を突然変異させて選択させることにより、標的抗原に対して高い親和性を有する抗体が生成される。本発明の抗体内に組み込まれたVLドメイン及びVHドメインに、in vitroでの突然変異及びスクリーニング手順を同様に施し、これにより高親和性変異形を得ることができる。
【００３８】
本発明の結合ドメインは、直接的な突然変異又は親和性熟成法によって結合特性が改善されている結合ドメインを含む。CDRを突然変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位に関してスクリーニングすることにより、親和性及び特異性を変更又は改善することができる(例えばYang他(1995)J.Mol.Bio. 254,392-403参照)。CDRは種々の方法で突然変異される。1つの方法は、個々の残基又は残基の組み合わせをランダム化して、その他の点では同一の抗原結合部位の個体群において、20個の全てのアミノ酸又はそのサブセットが特定の位置で見出されるようにすることである。或いは、変異性PCR法によって、CDR残基範囲全体にわたって突然変異が誘発される(例えばHawkins他(1992)J.Mol.Bio.226,889-896)。重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージ表示ベクターが、E.coli突然変異誘発株中に増殖される(Low他(1996)J.Mol.Bio. 250,359-368参照)。これらの突然変異生成法は、当業者に知られた多くの方法を例示したものである。
【００３９】
本発明の抗体の各可変ドメインは、完全な免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメインであってよい。或いは、本発明の抗体の各可変ドメインは、天然発生型ドメインの官能等価物又は突然変異体又は誘導体、又は、例えば国際公開第93/11236号パンフレット(Medical Research Council他/Griffiths他)に記載されているような技術を用いて、in vitroで構成された合成ドメインであってよい。例えば、1以上のアミノ酸を失った抗体可変ドメインに対応するドメインを結合することが可能である。重要な特徴は、各可変ドメインが相補的可変ドメインと会合して、抗原結合部位を形成できることである。
【００４０】
本発明の別の観点において、抗癌剤又は検出可能な信号生成剤に、抗体を化学的又は生合成的にリンクすることができる。抗体にリンクされた抗癌剤は、抗体が結合している腫瘍を破壊又は損傷する任意の薬剤を含む。又は、この抗癌剤は、抗体が結合している細胞の環境内で腫瘍を破壊又は損傷する任意の薬剤を含む。例えば、抗癌剤は、毒剤、例えば化学療法薬又は放射性同位体である。好適な化学療法薬は当業者に知られており、アントラサイクリン(例えばダウノマイシン及びドキソルビシン)、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、cis-白金、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、5-フルオロウリジン、メルファラン、リシン及びカリーチアミシンを含む。化学療法薬は、コンベンショナルな方法を用いて抗体に複合される(Hermentin及びSeiler(1988)Behring Inst. Mitt. 82, 197-215)。
【００４１】
検出可能な信号生成剤は、診断を目的としてin vivo及びin vitroで有用である。信号生成剤は、外部手段、普通は電磁輻射線の測定によって検出することができる測定可能な信号を生成する。大部分の場合、信号生成剤は酵素又は発色団であり、或いは蛍光、燐光又は化学発光により発光する。発色団は、紫外域又は可視域内で光を吸収する色素を含み、また、酵素触媒反応の基質、又は分解生成物であってよい。
【００４２】
本発明はさらに、標的部分又はリポータ部分がリンクされた抗体を検討する。標的部分は結合対の第1員である。抗癌剤は例えば、このような対の第2員に複合され、これにより、抗体が結合されている部位に向けられる。このような結合対の一般例はアビジン及びビオチンである。好ましい実施態様の場合、ビオチンは本発明の抗体に複合され、これにより、抗癌剤の標的、又はアビジン又はストレプトアビジンに複合された他の部分の標的を提供する。或いは、ビオチン又は別のこのような部分は本発明の抗体にリンクされ、そして例えば検出可能な信号生成剤がアビジン又はストレプトアビジンに複合された診断システムにおいて、リポータとして使用される。
【００４３】
抗癌剤として使用するのに適した放射性同位体も当業者に知られている。例えば131I又は211Atが使用される。これらの同位体は、コンベンショナルな技術を用いて抗体に取り付けられる(例えばPedley他(1993)Br.J.Cancer 68, 69-73参照)。或いは、抗体に取り付けられた抗癌剤は、プロドラッグを活性化する酵素である。このように、投与されたプロドラッグは、抗体複合体が投与されてプロドラッグが細胞毒素形に変換される腫瘍部位に達するまで、その不活性形のままである。実際には、抗体-酵素複合体が患者に投与され、治療されるべき組織領域に局在化しておかれる。次いでプロドラッグが患者に投与され、これにより、治療されるべき組織領域内で細胞毒素への変換が生じる。或いは、抗体に複合された抗癌剤はサイトカイン、例えばインターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-4(IL-4)又は腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)である。抗体はサイトカインを腫瘍に向けさせ、これにより、サイトカインは他の組織に影響を及ぼすことなしに、腫瘍の損傷又は破壊を引き起こす。サイトカインは、コンベンショナルな組換えDNA技術を用いて、DNAレベルで抗体に融合される。
【００４４】
本発明の蛋白質を付加的なアミノ酸残基、例えばペプチド・タグに融合することより分離又は精製を容易にするか、或いは、信号配列に融合することにより、蛋白質が発現させられた任意の特定宿主内で分泌又は膜輸送を促進することができる。
【００４５】
細菌中に本発明の抗体を構成して発現させるためのベクターが利用可能である。これらのベクターは、分泌信号配列と好都合な制限クローニング部位とを含有する。特定抗原に対して特異的な結合部位をコードするVL遺伝子とVH遺伝子との組み合わせが、B細胞ハイブリドーマのcDNAから分離される。或いは、ゲノムDNAからVL遺伝子とVH遺伝子とのランダムな組み合わせが得られ、生成物が当該抗原に対する結合に関してスクリーニングされる。典型的には、クローニング・ベクター内の制限部位と適合性のあるプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)がクローニングのために採用される(例えばDreher,M.L.他(1991)J.Immunol.Methods 139:197-205; Ward, E.S.(1993) Adv. Pharmacol. 24:1-20; Chowdhury, P.S.及びPastan, I(1999)Nat. Biotechnol. 17:568-572参照)。
【００４６】
VLドメインとVHドメインとの選択された組み合わせ又はランダムな組み合わせを有する抗体を発現させるために、これらのドメインをコードするV遺伝子が細菌発現ベクター内に集成される。例えば、細菌分泌信号配列をコードする配列及びペプチド・リンカーを有し、VL遺伝子とVH遺伝子とを挿入するための好都合な制限部位を有するベクターを使用することができる。或いは、例えばオーバラップ・プライマーを使用したPCR増幅によって、必要な全てのコーディング配列（例えば分泌信号、VL,VH及びリンカー・ペプチド)を先ず集成して単配列にし、続いて、プラスミド又は他のベクター内に連結することが望ましい場合がある。VLドメインとVHドメインとの特異的組み合わせを提供することが望ましい場合には、これらのドメインをコードする配列に対して特異的なPCRプライマーが使用される。多数のVLドメインとVHドメインとの多様な組み合わせを形成することが望ましい場合には、複数配列を増幅するプライマーの混合物が使用される。
【００４７】
本発明の好ましいダイアボディは、1)第2特異性を有する軽鎖可変ドメインに結合された第1特異性に相応する重鎖可変ドメインを含む第1ポリペプチド、及び、2)第2特異性を有する重鎖可変ドメインに結合された第1特異性に相応する軽鎖可変ドメインを含む第2ポリペプチド、を発現させることにより形成される。ダイアボディは一般に、各ポリペプチド鎖の始端に細菌分泌信号配列を含むDNA構造を使用して、E.coli内に生成される。
【００４８】
本発明の或る特定の結合蛋白質の場合、他の宿主細胞内での発現が所望される場合がある。例えば、定常ドメインを含む結合蛋白質は、酵母、昆虫、脊椎動物及び哺乳動物の細胞を含む真核細胞内でしばしばより効率的に発現させられる。発現生成物がグリコシル化されることが望ましい場合には、このような細胞を使用することが必要となる。第1及び第2のポリペプチドをコードするDNAフラグメントは、例えばHCMVベクター内にクローニングすることができる。これらのベクターは、哺乳動物細胞内でヒト重鎖又はヒト軽鎖を発現させるように構成されている(例えば、Bendig他、米国特許第5,840,299号明細書；Maeda他(1991)Hum. Antibod. Hybridomas 2, 124-134参照)。このようなベクターは、軽鎖及び重鎖の構造の高レベルな転写のためのヒトサイトメガロウィルス(HCMV)プロモータ及びエンハンサーを含有する。好ましい実施態様の場合、軽鎖発現ベクターは、ヒトκ軽鎖をコードするpKN100(Dr.S.Tarran Jonesの提供, MRC Collaborative Center, London, England)であり、重鎖発現ベクターは、ヒトγ-1重鎖をコードするpG1D105(Dr.S.Tarran Jonesの提供)である。両ベクターは、哺乳動物細胞及びE.coli内で機能するHCMVプロモータ及びエンハンサー、複製起源、及び選択マーカーを含有する。
【００４９】
選択マーカーは、選択的な培地中で成長した形質転換宿主細胞の生存又は成長に必要な蛋白質をコードする遺伝子である。典型的な選択マーカーは、(a)抗生物質又はその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート又はテトラサイクリンに対する耐性を付与する蛋白質、(b)栄養要求体の欠損を補完する蛋白質、又は(c)複合培地からは入手することができない臨界栄養を供給する蛋白質をコードし、例えばBacilliのD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。特に有用な選択マーカーは、メトトレキサートに耐性を付与する。例えばDHFR選択遺伝子で形質転換された細胞は、先ず、メトトレキサート(Mtx)、DHFRの競合的アンタゴニストを含有する培地内で、形質転換細胞の全てを培養することにより同定される。野生型DHFRが採用される場合の適切な宿主細胞は、DHFR活性が欠損しているチャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞株であり、Urlaub及びChasin(1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216によって記載されているように調製され、そして増殖される。形質転換細胞は次いで、増大したレベルのメトトレキサートに暴露される。これにより、DHFR遺伝子の複数のコピーが合成され、これに付随して、発現ベクター、例えば抗体又は抗体フラグメントをコードするDNAを含む他のDNAの複数のコピーも合成される。別の例において、DNA合成をブロックするのにアミノプテリンが使用される場合、チミジン・キナーゼ(TK)が欠損している突然変異骨髄腫細胞は、外生的に供給されたチミジンを使用することができない。トランスフェクションのための有用なベクターは、チミジンを補足された培地内での成長を可能にする無傷のTK遺伝子を担持する。
【００５０】
酵母中で遺伝子構造を発現させることが望ましい場合、酵母中で使用するための好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドYRp7中に存在するtrp1遺伝子である。Stinchcomb他、1979 Nature, 282, 39; Kingsman他、1979, Gene 7, 141。trp1遺伝子は、トリプトファンにおける成長能力を欠く酵母の突然変異菌株、例えばATCC No. 44076又はPEP4-1のための選択マーカーを提供する。Jones (1977) Genetics 85,12。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるtrp 1損傷の存在は、トリプトファンの不存在における成長による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。同様に、Leu2遺伝子を担持する周知のプラスミドによって、Leu2欠損酵母菌株(ATCC 20,622又は38,626)が補完される。
【００５１】
ベクターの形質転換及び本発明の抗体の発現のための好ましい宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞、例えばCOS-7細胞、チャイニーズ・ハムスター卵巣(CHO)細胞、及び、リンパ起源、例えばリンパ腫、骨髄腫、又はハイブリドーマ細胞の細胞株である。形質転換宿主細胞は、同化可能な炭素源、例えば炭水化物、例えばグルコース又はラクトース、窒素源、例えばアミノ酸、ペプチド、蛋白質又はこれらの分解生成物、例えばペプトン、アンモニウム塩など、及び無機塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、リン酸塩及び/又は炭酸塩を含有する液状培地中で、当業者に知られた方法によって培養される。培地はさらに、例えば成長促進物質、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛及びマンガンなどを含有する。
【００５２】
本発明の抗体は二重特異性を有しており、2つの異なる抗原に同時に結合することができる。異なる抗原は、異なる細胞又は同じ細胞上に配置することができる。例えば、第1抗原が結合されている固体表面を提供し、第1抗原と、やはり結合蛋白質が特異的である第2抗原とに対して特異的な二重特異性抗体を添加し、そして、結合された第2抗原の存在を検出することにより、抗原の架橋をin vitroで示すことができる。
【００５３】
本発明の抗体は、2つの受容体とこれらのそれぞれのリガンドとの間の相互作用をブロックすることができる。例えばKDR及びFlt-1に対して特異的なダイアボディは、VEGF誘導型細胞移動並びにPlGF誘導型細胞移動を阻害する。この場合、一本鎖抗体（scFv)の混合物として、又は二重特異性ダイアボディとして形成された、2つの受容体結合特異性の組み合わせは、個別の親抗体よりも細胞移動を阻害する上で効果的である。
【００５４】
単一特異的な抗体と比較して、二重特異性抗体は、細胞機能のより強力な阻害因子であり得る。例えば、VEGF刺激型細胞機能、例えば内皮細胞の増殖、ヒト白血病細胞のVEGF誘発型及びPlGF誘発型移動は、2つの標的抗原の一方又は両方に対する親和性が低減されている場合でも、二重特異性抗体によってより効率的に阻害することができる。1実施態様の場合、KDR及びFlt-1に対して特異的なダイアボディが形成された。標的抗原のうちのいずれかに対応するscFvは、たとえ最高scFv濃度で試験されたとしても、VEGF誘発型又はPlGF誘発型細胞移動を完全には阻害することができなかった。これとは対照的に、標的抗原の両方に対して特異的なダイアボディは、Flt-1に対するダイアボディの親和性が対応scFvと比較して低減されていても、細胞移動を完全になくした。
【００５５】
本発明の抗体は、ヒト及びその他の哺乳動物における疾患を治療するのに有用である。抗体は、天然抗体及び人工抗体に関して従来知られているのと同じ目的及び同じ形式で使用される。従って本発明による抗体は、当業者に良く知られている研究法、診断法又は治療法に対応して、in vivo及びin vitroで使用することができる。
【００５６】
本発明の抗体は、腫瘍の進行、例えば腫瘍の成長、侵襲、転移及び/又は再発を防止又は軽減するのに十分な量で、治療のために癌患者に投与することができる。これを達成するのに十分な量は、治療有効量と定義される。治療有効量は、疾患の重さ及び患者自身の免疫系の全体的な状態に依存することになる。投与スケジュールも、疾患状態及び患者の状態と共に変化することになり、典型的には、一日当たり1回のボーラス投与又は連続輸液から、複数回 (例えば4〜6時間毎）投与の範囲となるか、或いは医師によって患者の状態に応じて指示された通りに行われる。なお、本発明はいかなる特定用量にも限定されない。
【００５７】
本発明は、任意の適宜な腫瘍、例えば胸部、心臓、肺、小腸、大腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部又は肝臓の腫瘍を治療するのに用いることができる。本発明が適用される腫瘍は、好ましくはVEGFRを異常に発現させるか又は信号形成する。VEGFRによって増強された信号化は、ヒトの種々異なる多くの癌において観察されている。神経膠腫に侵入する内皮細胞によって、高レベルのVEGFR-2が発現させられる(Plate, K他、(1992)Nature 359:845-848)。VEGFR-2レベルは、ヒト・グリア芽腫によって生成されたVEGFによって特異的にアップレギュレートされる(Plate, K他、(1993)Cancer Res. 53:5822-5827)。グリア芽腫関連内皮細胞(GAEC)中にVEGFR-2の高レベル発現が見出される場合、このことは、腫瘍形成中におそらく受容体活性が誘発されていることを示唆している。それというのも、VEGFR-2転写物は、正常な脳内皮細胞中では辛うじて検出され得るものだからである。このようなアップレギュレーションは、腫瘍に近接する血管内皮細胞に限定される。
【００５８】
本発明の抗体は、複合治療法に使用することもできる。二重特異性抗体は、抗腫瘍薬、例えば化学治療薬又は放射性同位体と共に投与することができる。好適な化学治療薬は当業者に知られており、アントラサイクリン(例えばダウノマイシン及びドキソルビシン）、パクリタキセル、イリノテカン(CPT-11)、トポテカン、メトトレキサート、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシン・アラビノシド、5-フルオロウリジン、メルファラン、リシン、カリーチアミシン及びこれらの組み合わせを含む。二重特異性抗体及び抗腫瘍薬は、血管形成を阻害して腫瘍成長を抑制するのに効果的な量で、患者に投与される。抗体はまた、その他の治療計画との組み合わせで投与される。例えば、本発明の二重特異性抗原結合蛋白質は、外部（外部ビーム照射療法）又は内部（近接照射療法）の照射と共に投与することができる。
【００５９】
なお、本発明の抗体は、診断又は治療の目的で人体に使用される場合、製薬上許容可能なキャリヤを付加的に含む組成物の形で投与されることになる。製薬上許容可能な好適なキャリヤは例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール及びエタノールなどのうちの1又は2種以上、並びにこれらの組み合わせを含む。製薬上許容可能なキャリヤはさらに、少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、保存剤、緩衝剤を含んでよい。これらの補助物質は、保存期間又は結合蛋白質の有効性を向上させる。本発明の組成物は種々の形を成していてよい。これらの形は例えば、固形、半固形及び液状投与形、例えば錠剤、丸剤、粉剤、溶液、分散体又は懸濁液、リポソーム、座剤、注射剤及び輸液剤を含む。好ましい形は所期の投与様式及び治療様式に依存する。好ましい組成物は注射剤又は輸液剤の形である。
【００６０】
本発明の治療用組成物は、当業者に知られているような、抗体によるヒト受動免疫のために一般に用いられている組成物と類似しており、その一例としては、静脈内、皮下、腹膜内及び筋内投与が挙げられる。さらに複合治療が、抗体及び例えば化学治療薬の異なる方法による投与を伴ってよいことはいうまでもない。
【００６１】
本明細書中に開示された本発明の原理において、当業者によって変更が加えられ得ることは明らかであり、また予期することができる。このような変更形は本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００６２】
下記実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定するものとは決して解釈すべきではない。コンベンショナルな方法、例えばベクター及びプラスミドの構成、このようなベクター及びプラスミド内へのポリペプチド・コード遺伝子の挿入、宿主細胞内へのプラスミドの導入、及び遺伝子及び遺伝子生成物の発現及び発現決定において採用される方法の詳細な説明は、Sambrook, J.他(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを含む多数の刊行物から得られる。本明細書中に記載された全ての参考文献を全体的に引用する。
【００６３】
実施例１：材料及び方法
細胞株
受容体の組換え形で免疫化されたマウスから、抗Flt-1抗体Mab6.12（IgG1, κ)をImClone Systems Incorporated (New York, NY)で確立した。Cornell Medical Center, New YorkのDr. S. Rafiiから、一次培養されたヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を得、そしてEBM-2培地(Clonetics, Walkersvill, MD)内で37℃、5%CO2で維持した。白血病細胞株HL60及びHELを10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI中で維持し、5%CO2で37℃において成長させた。
【００６４】
蛋白質及び抗体
安定的にトランスフェクトされたNIH 3T3中で、可溶性融合蛋白質KDR-アルカリ・ホスファターゼ(AP)を発現させ、Lu, D.他、2000, J.Biol.Chem.,275:14321-14330によって記載されているように、APに対する固定化モノクローナル抗体を使用して、アフィニティ・クロマトグラフィによって細胞培養上澄みから精製した。VEGF 165蛋白質をバキュロウィルス中に発現させ、上述の手順に従って精製した。Id. PlGF及びFlt-1-Fc融合蛋白質をR&Dシステム(Minneapolis, MN)から購入した。
【００６５】
Flt-1特異的scFvの調製
「Antibody Engineering: A Practical Approach」(McCafferty, J., Hoogenboom, H.R., Chiswell, D.J.編、Oxford University Press, Incorporated; p147-168)におけるBendig他(1996)の手順に従って、ハイブリドーマ細胞から分離されたmRNAから、Mab 6.12のVH遺伝子及びVL遺伝子をRT-PCRによってクローニングした。マウス抗体軽鎖リーダー配列の5'末端とハイブリダイズするように特異的に構成された11個の5'プライマーと、マウスκ軽鎖定常領域の5'末端とハイブリダイズする1つの3'プライマーとを使用して、VL遺伝子をクローニングした。マウス抗体重鎖リーダー配列の5'末端とハイブリダイズするように特異的に構成された12個の5'プライマーと、マウスIgG1重鎖定常領域の5'末端とハイブリダイズする1つの3'プライマーとを使用して、VH遺伝子をクローニングした。合計で23回、すなわちVL遺伝子に関しては11回、VH遺伝子に関しては12回にわたって、PCR反応を実施した。製造業者の指示書(TA Cloning(登録商標)Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)に記載されている通りに、サイズ400〜500塩基対の全てのPCR生成フラグメントをpCR(登録商標)2.1ベクター中にクローニングし、続いてE.coli菌株XL-1を形質転換した。
【００６６】
Mab 6.12のVL遺伝子及びVH遺伝子をコードするPCRフラグメントを使用して、オーバラップPCRによってscFv6.12を集成した。このscFvにおいて、Mab 6.12 VHのC末端は、15アミノ酸リンカー(グリシン-グリシン-グリシン-グリシン-セリン)3又は(GGGGS)3を介して、Mab 6.12 VLのN末端にリンクされる。次いで、可溶性scFv蛋白質を発現させるために、scFv 6.12コード遺伝子をベクターpCANTAB 5E(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)中にクローニングした。Mab 6.12 VHドメインのアミノ酸配列はSEQ ID NO:41によって、ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:49によって与えられる。同様に、Mab 6.12 VLドメインのアミノ酸配列はSEQ ID NO:42によって、ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:50によって与えられる。CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3はそれぞれSEQ ID NO:35,36,37,38,39及び40によって示す。対応ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:43〜48によって与えられる。
【００６７】
KDR特異的scFvの調製及び生体パンニング
KDRで免疫化されたマウスの脾細胞から構成されたファージ表示ライブラリから、KDRに対する一本鎖抗体scFv plC11を分離した(Zhu, Z.他、1998, Cancer Res. 58:3209-3214)。雌BALB/Cマウスに、200μlのRIBIアジュバント・システム中の10μg KDR-APを2回腹腔内(i.p.)注射し、続いて、2か月間にわたってRIBIアジュバントなしのi.p.注射を1回施した。これらのマウスにはまた、初回免疫化時に、200μlのRIBI中の10μg KDR-APを皮下(s.c.)注射した。マウスには、安楽死3日前に20μgのKDR-APをi.p.でブーストした。脾臓細胞から抽出された総RNAから、mRNAを精製した。逆転写後、発現させられたVH遺伝子及びVL遺伝子に対応するcDNAを別個に増幅した。それぞれの遺伝子を別個に受容するように構成されるか、又は、(例えばPCR増幅によって）分泌信号配列をコードするヌクレオチド及びポリペプチド・リンカーにリンクされたベクター内に、増幅生成物を挿入し、融合生成物を所望のベクター内に挿入した。例えばZhu他、1998を参照されたい。
【００６８】
線維状ファージ上にscFvを表示するために、抗体VHドメインと抗体VLドメインとを15アミノ酸リンカー(GGGGS)3によって結合した。この構造のC末端をファージ蛋白質IIIのN末端に、アンバー・コドン(TAG)で終わる15アミノ酸Eタグと一緒に結合する。Eタグと蛋白質IIIとの間に配置されたアンバー・コドンは、非サプレッサー宿主(例えばHB2151細胞)中に形質転換されると、可溶形のscFvの生成を可能にし、サプレッサー宿主(例えばTG1細胞)中に形質転換されると、蛋白質IIIを介してファージ表示を可能にする。
【００６９】
scFv-遺伝子III構造をpCANTAB 5Eベクター中に連結した。形質転換TG1細胞を2YTAGプレート(17g/lトリプトン、10g/l酵母抽出物、5g/l NaCL、20g/lグルコース、100μg/mlアンピシリン、15g/lBacto-寒天)上に平板培養し、インキュベートした。コロニーを10mlの2YT培地(17g/lトリプトン、10g/l酵母抽出物、5g/l NaCl)中にスクレーピングし、5mlの50%グリセロールと混合し、そしてライブラリ・ストックとして-70℃で保存した。
【００７０】
ライブラリ・ストックを対数期まで成長させ、M13KO7ヘルパー・ファージでレスキューし、2YTAK培地(100μg/mlのアンピシリン及び50μg/mlのカナマイシンを含有する2YT)中で一晩にわたって30℃で増幅した。ファージ調製物を4% PEG/0.5M NaCl中で沈澱させ、3%無脂肪乳/500μg/mlアルカリ・ホスファターゼ(AP)含有PBS中で再懸濁し、37℃で1時間にわたってインキュベートし、これにより、AP scFvに対して特異性を有するファージ-scFvをブロックし、そして他の非特異的結合をブロックした。
【００７１】
KDR-AP(10μg/ml)を塗被されたMaxisorp Star管(Nunc, Denmark)を先ず3%乳/PBSで、37℃で1時間にわたってブロックし、次いで、室温で1時間にわたってファージ調製物と一緒にインキュベートした。管をPBST(0.1%Tween 20を含有するPBS)で10回洗浄し、続いてPBSで10回洗浄した。結合ファージを、調製したばかりの100mMトリエチルアミン溶液1 mlで、室温で10分間にわたって溶離した。溶離されたファージを10 mlの中対数期TG1細胞と一緒に、37℃で30分間にわたって定置でインキュベートし、30分間にわたって震盪しながらインキュベートした。次いで、感染TG1細胞を2YTAGプレート上で平板培養し、ファージ・ストックを形成するために、上記のように30℃で一晩インキュベートした。
【００７２】
連続的なスクリーニング手順ラウンドを採用することにより、所期結合特異性を有する表示scFvを富化した。パンニングの2又は3ラウンド後、個々の細菌コロニーを個別にスクリーニングして、所期KDR結合特性を有するクローンを同定した。同定されたクローンを、VEGF結合のブロックに関してさらに試験した。クローンのDNAフィンガープリント法を用いて、固有クローンを区別した。それぞれの消化パターンを有する代表的なクローンを採取し、DNA配列決定した。
【００７３】
KDR特異的ヒト抗体
3.7 x 1010個のクローンを含有する大型ヒトFabファージ表示ライブラリ(DeHaard他、J.Biol.Chem. 274:18218-30(1999))を選択のために使用した。このライブラリは、ヒト定常鎖遺伝子(κ及びλ)に融合されたPCR増幅抗体可変軽鎖遺伝子と、ヒトIgG1重鎖CH1ドメインをコードするDNAに融合された可変重鎖遺伝子との組み合わせから成っている。重鎖構造及び軽鎖構造の双方には、信号配列、すなわち軽鎖の場合にはpelBが、また重鎖の場合には遺伝子III信号配列が先行する。重鎖構造はさらに、ファージ表示に対応する遺伝子III蛋白質部分、ヘキサヒスチジン・タグ、及び11アミノ酸長c-mycタグをコードし、この重鎖構造にはアンバー・コドン(TAG)が続く。ヘキサヒスチジン及びc-mycタグは、精製又は検出のために使用することができる。アンバー・コドンは、サプレッサー宿主(例えばTG1細胞)を使用してファージ表示を可能にするか、又は、非サプレッサー宿主(例えばHB2151細胞)内に形質転換されると可溶形のFabフラグメントの生成を可能にする。
【００７４】
ライブラリ・ストックを対数期まで成長させ、M13-KO7ヘルパー・ファージでレスキューし、2YTAK培地(100μg/mlのアンピシリン及び50μg/mlのカナマイシンを含有する2YT)中で一晩にわたって30℃で増幅した。ファージ調製物を4% PEG/0.5M NaCl中に沈澱させ、3%無脂肪乳/500μg/ml AP蛋白質含有PBS中で再懸濁し、37℃で1時間にわたってインキュベートし、これにより、抗AP Fabフラグメントを表示するファージを補足し、その他の非特異性結合をブロックした。
【００７５】
KDR-AP(PBS中の10μg/ml)を塗被されたMaxisorp Star管(Nunc, Rosklide, Denmark)を先ず3%乳/PBSで、37℃で1時間にわたってブロックし、次いで、室温で1時間にわたってファージ調製物と一緒にインキュベートした。管をPBST(0.1%Tween-20を含有するPBS)で10回洗浄し、続いてPBSで10回洗浄した。結合ファージを、調製したばかりの100mMトリエチルアミン溶液1 ml(Sigma, St. Louis, MO)で、室温で10分間にわたって溶離した。溶離されたファージを10 mlの中対数期TG1細胞と一緒に、37℃で30分間にわたって定置でインキュベートし、30分間にわたって震盪しながらインキュベートした。感染されたTG1細胞をぺレット化し、幾つかの大型2YTAGプレート上で平板培養し、一晩にわたって30℃でインキュベートした。プレート上で成長したコロニー全てを、3〜5mlの2YTA培地中にスクレーピングし、グリセロール(10%最終濃度)と混合し、アリコートし、そして-70℃で保存した。次の選択ラウンドでは、100μlのファージストックを25mlの2YTAG培地に添加し、そして中対数期まで成長させた。培養をM13KO7ヘルパー・ファージで介助し、増幅し、沈澱させ、そして、免疫管上に固定化されたKDR-APの濃度を低減し、結合プロセス後の洗浄回数を増大した状態で、上述の手順に従って選択に使用した。
【００７６】
蛋白質濃度及び初期結合プロセス後の洗浄回数を変えながら、固定化されたKDR上で、全部で3ラウンドの選択を行った。各選択ラウンド後毎に、93個のクローンをランダムに採取し、ファージELISAによって、KDRに対する結合に関して試験した。第2回選択後回収された93個のクローンのうち70個(75%)、及び第3回選択後回収されたクローンのうちの90%超が、KDR結合において陽性であった。このことは選択プロセスの効率が高いことを示唆している。第2回選択において同定された全70個のバインダーから得られたFabコードDNAセグメントを増幅し、BstNIで消化させ、そしてフィンガープリント・パターンに関して比較した。合計42の異なるパターンを観察した。このことは、分離された抗KDR Fabの際立った多様性を示唆している。交差反応性試験は、42個の抗体のうち19個が特異的KDRバインダーであるのに対し、残りの23個の抗体はKDR及びそのマウス同族体Flk-1の双方に結合することを実証した。競合的VEGF結合アッセイを用いてさらに選択を行った。このアッセイの場合、抗KDR Fabフラグメントの存在又は不存在において、固定化されたVEGFに対する可溶性KDRの結合が見極められた。アッセイは、VEGFとKDRとの結合をブロックすることができる4つのFabクローンを同定した。このうち3つはKDR特異的バインダーであり、1つはFlk-1と交差反応させられるものであった。DNAフィンガープリント法及び配列決定分析により、4つの全てのKDR/VEGFブロック抗体が互いに異なっており(図1A)、固有のDNA及びアミノ酸配列を有することを確認した。
【００７７】
4つのクローンに対応するVH及びVLのCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
2005518336.tif 000002
【００７８】
VH鎖及びVL鎖の完全な配列を下記配列リストに示す。D1F7: SEQ ID NO:71及び72のVHヌクレオチド及びアミノ酸配列；SEQ ID NO:73及び74のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。D2C6: SEQ ID NO:75及び76のVHヌクレオチド及びアミノ酸配列；SEQ ID NO:77及び78のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。D2H2: SEQ ID NO:82及び83のVHヌクレオチド及びアミノ酸配列；SEQ ID NO:84及び85のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。D1H4: SEQ ID NO:79及び76のVHヌクレオチド及びアミノ酸配列；SEQ ID NO:80及び81のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【００７９】
D2C6の単重鎖と、元のライブラリから誘導された軽鎖の多様な固体群との組み合わせから成る第2ライブラリを作成し、スクリーニングした。10個の付加的なFabを同定し、これらをSA1, SA3, SB10, SB5, SC7, SD2, SD5, SF2, SF7及び1121とした。完全なVLヌクレオチド及びアミノ酸配列を下記配列リストに示す。SA1: SEQ ID NO:86及び87のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。SA3: SEQ ID NO:88及び89のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。SB10: SEQ ID NO:90及び91のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。SB5: SEQ ID NO:92及び93のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。SC7: SEQ ID NO:94及び95のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。SD2: SEQ ID NO:96及び97のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。SD5: SEQ ID NO:98及び99のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。SF2: SEQ ID NO:100及び101のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。SF7: SEQ ID NO:102及び103のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。1121: SEQ ID NO:104及び105のVLヌクレオチド及びアミノ酸配列。
【００８０】
VLCDR配列を表2に示す。
【表２】
2005518336.tif 000003
【００８１】
抗KDR x 抗Flt-1ダイアボディの構成
ダイアボディを構成するために、plC11及びscFv6.12の可変ドメインをPCR特異的集成のために使用して、発現プラスミドpDAB-KF1（図１Ａ）を形成した。先ず、plC11及びMab 6.12のVHドメイン及びVLドメインから、下記遺伝子フラグメントをPCRによって生成した；plC11のVLドメインには、5アミノ酸リンカーGGGGSコードセグメントが続き、Mab 6.12のVHドメインには、E.coli熱安定性エンテロトキシンII(stII)信号配列コードセグメントが先行し(Picken, R.N.他、1983、Infect. Immun. 42:269-275)、且つ、GGGGSリンカーコードセグメントが続き；そしてplC11のVMドメインには、GGGGSリンカーコードセグメントが先行する。それぞれPCRフラグメントplC11 VL、Mab 6.12 VH、及びMab 6.12 VL及びplC11 VHをアニールすることにより、クロスオーバーscFv、PLH-1C11-6.12及びpLH-6.12-1C11を構成し、続いてPCR増幅することにより、続くクローニングのために適切な制限部位を導入した。それぞれpLH-1C11-6.12及びpLH-6.12-lC11に由来するSfiI/NheI及びNheI/NotIフラグメントを、ベクターpCANTAB 5E中に連結することにより、2つのクロスオーバーscFvの同時分泌のための発現プラスミドpDAB-KF1を構成した。クロスオーバーscFvフラグメントをコードする全ての配列をDNA配列決定することにより評価した。
【００８２】
ダイアボディの発現及び精製
前記手順(Lu, D他、1999, J.Immunol Methods 230:159-171)に従って、シェーカーフラスコ内で30℃で成長させられた発現プラスミドを含有するE.coli菌株HB2151から、ダイアボディを調製した。20%(w/v)サッカロースを含有する25mM Tris(pH7.5)、200mM NaCl、1mM EDTA及び0.1mM PMSF中で細胞ぺレットを最懸濁することにより、細胞のペリプラスム抽出物を調製し、続いて、静かに震盪させながら4℃で1時間にわたってインキュベートした。15,000rpmで15分間にわたって遠心分離したあと、RPAS精製モジュール(Amersham Pharmacia Biotech)を使用した抗Eタグ・アフィニティ・クロマトグラフィによって、上澄みから可溶性ダイアボディを精製した。ダイアボディ調製純度を試験するために、E.coliペリプラスム抽出物及び精製されたダイアボディの両方を18%ポリアクリルアミド・ゲル(Novex, San Diego, CA)中で電気泳動させ、Colloidal Blue Stain キット(Novex)で着色することにより視覚化した。
【００８３】
KDR及びFlt-1に対するダイアボディの二重特異性
ダイアボディの二重抗原結合キャパシティを見極めるために、2つのアッセイを実施した。第1に、架橋アッセイを用いることにより、ダイアボディがその標的抗原の両方に同時に結合することができるか否かを調査した。簡潔に云えば、Flt-1-Fc融合蛋白質(一晩で4℃で1ウェル当たり1μl/ml x 100ml)を予塗被された96ウェルMaxi-sorpマイクロタイター・プレート(Nunc, Roskilde, Denmark)内でダイアボディ又はその親scFvを室温(RT)で1時間にわたって先ずインキュベートした。プレートを、0.1%Tween(PBST)を含有するPBSで3回洗浄し、続いて、RTでさらに1時間にわたってKDR-AP融合蛋白質と一緒にインキュベートした。次いで、AP基質、リン酸p-ニトロフェニル(Sigma, St. Louis, MO)を添加することにより、プレートに結合されたKDR-APを定量し、続いて、405nm(Lu, D.他、1999)における吸光度を読み取った。第2に、直接結合アッセイにおいて、KDR又はFlt-1を塗被された96ウェル・プレートに、種々の量のダイアボディ又はscFvを添加し、RTで1時間にわたってインキュベートし、その後プレートをPBSTで3回洗浄した。次いで、100μlの抗Eタグ抗体-HRP複合体(Amersham Pharmacia Biotech)と一緒に、プレートをRTで1時間にわたってインキュベートした。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ基質を添加し、前記手順(Lu, D.他、1999)に従って450nmにおける吸光度を読み取った。
【００８４】
VEGF/KDR、VEGF/Flt-1、及びPlGF/Flt-1ブロッキング・アッセイ
前記プロトコル(Zhu,Z.他、1998;Lu, D.他,1999)に従って、アッセイを行った。簡潔に云えば、種々の量のダイアボディ又はscFvを固定量のKDR-AP(100ng)又はFlt-1-Fc融合蛋白質(50ng)と混合し、RTで1時間にわたってインキュベートした。次いで混合物を、VEGF165(200ng/ウェル)又はPlGF(200ng/ウェル)を予塗被した96ウェル・マイクロタイターに移し、RTでさらに2時間にわたってインキュベートし、その後プレートをPBSで5回洗浄した。KDR-APアッセイに際しては、APに対応する基質を添加し、続いて405nmにおける吸光度を読み取ることにより、プレートに結合されたKDR-APを定量した。Flt-1-Fcアッセイに際しては、プレートをマウス抗ヒトFc-HRP複合体と一緒にインキュベートし、これにより、プレートに結合されたFlt-1-Fcを定量した。次いで、IC50、すなわち、VEGF又はPlGFにKDR又はFlt-1が結合するのを50%阻害するのに必要となる抗体濃度を計算した。
【００８５】
結合動力学特性の分析
KDR及びFlt-1に対するダイアボディ及びその親scFvの結合動力学特性を、BIAコア・バイオセンサー(Pharmacia Biosensor)を使用して測定した。KDR-AP又はFlt-1-Fc融合蛋白質をセンサーチップ上に固定化し、可溶性抗体を1.5nM〜100nMの範囲の濃度で注入した。それぞれの濃度でセンサーグラムを得、BIA Evaluation 2.0プログラムで分析し、これにより速度定数kon及びkoffを測定した。親和定数Kdを速度定数koff/konの比から計算した。
【００８６】
抗マイトジェン・アッセイ
VEGF、塩基性線維芽細胞増殖因子又は上皮成長因子(EGF)を含有しないEBM-2培地200μl中で、96ウェル組織培養プレート上でHUVEC(5 x 103細胞/ウェル)を平板培養し、37℃で72時間にわたってインキュベートした。種々の量の抗体を二重ウェルに添加し、37℃で1時間にわたって予めインキュベートした。その後VEGF165を最終濃度16ng/mlまで添加した。18時間のインキュベーション後、0.25μCiの[3H]-TdR(Amersham)を各ウェルに添加し、さらに4時間にわたってインキュベートした。細胞をPBSで1回洗浄し、トリプシン処理し、ガラス繊維フィルター(Printed Filtermat A, Wallach)上に細胞収集器(Harvester 96, MACH III M, TOMTEC, Orange, CT)で収集した。膜をH2Oで3回洗浄し、そして空気乾燥した。シンチレーション流体を添加し、DNA内蔵放射能をシンチレーション・カウンター(Wallach, Model 1450 Microbeta Liquid Scintillation Counter)で測定した。
【００８７】
白血病移動アッセイ
無血清プレーンRPMI1640培地で3回、HL60及びHEL細胞を洗浄し、1 x 106/mlで培地内に懸濁した。100μl細胞懸濁液のアリコートを3μmポア・トランスウェル・インサート(HL60細胞の場合)、又は8μmポア・トランスウェル・インサート(HL細胞の場合)(Costar(登録商標)、Corning Incorporated, Corning, NY)に添加し、30分間37℃で抗体と一緒にインキュベートした。次いで、VEGF165を有する又は有さない0.5mlの無血清RPMI 1640を含有する24ウェル・プレートのウェル内に、インサートを挿入した。HL60細胞の場合には16〜18時間にわたって、又はHL細胞の場合には4時間にわたって、37℃で5%CO2で移動を行った。低い方の区画から移動細胞を捕集し、Coulterカウンター(Model Z1, Coulter Electronics Ltd., Luton, England)でカウントした。
【００８８】
実施例2:抗KDR x 抗Flt-1ダイアボディ
ダイアボディ構造
実施例1に従って形成された抗KDR x 抗Flt-1ダイアボディを精製し、SDS-PAGEによって分析した。2成分ポリペプチドを電気泳動条件下で解明し、予期されるものに近い移動度を有する2つの主要なバンドを生じさせた(図1B)；低い方のバンドは第1ポリペプチド(m.w.,25179.6ダルトン)を表し、高い方のバンドはE-タグを有する第2ポリペプチド(m.w.,26693.8ダルトン)と相関する(図1A)。
【００８９】
二重特異性
抗KDR x 抗Flt-1ダイアボディがその標的抗原の両方に同時に結合できるか否かを調査するための架橋アッセイ。Flt-1に結合されたダイアボディが可溶性KDRを捕捉する能力を試験するために、ダイアボディを先ず固定化Flt-1に結合させておき、続いてKDR-APと一緒にインキュベートした。図2Aに示すように、プレート結合AP活性によって実証される通り、ダイアボディは可溶性KDRを固定化Flt-1に効率的に架橋させたが、しかし親単一特異性scFvはこのような架橋をもたらさなかった。
【００９０】
ダイアボディの抗原結合効率を、固定化されたKDR及びFlt-1において測定した。ダイアボディは、親scFv plC11と同じ効率でKDRに結合した(図2B)。Flt-1に対するダイアボディの結合効率は、親scFv6.12と比較して僅かに低減された(図2C)。予期した通り、KDR特異的scFv plC11はFlt-1には結合せず(図2B)、Flt-1特異的scFv 6.12はKDRに結合しなかった(図2C)。図２に示されたデータは3部の試料の平均±SDを表す。
【００９１】
KDR及びFlt-1に対するダイアボディの結合動力学的特性を、BIAコア装置を使用して表面プラズモン共鳴によって測定し(表3)、これらの特性は図2のELISAの結果と一致した。ダイアボディは、1.4nMのKdでその親scFv plc11と同様の動力学的特性をもってKDRに結合する。Flt-1に対するダイアボディの結合親和性は、主としてダイアボディの動作速度が遅いことに起因して、scFv 6.12と比較してやや低減された(表3)。
【表３】
2005518336.tif 000004
【００９２】
図3Aが示すように、ダイアボディはscFv plC11と同じ効率で、用量に応じて、約2nMのIC50で、KDRが固定化VEGFに結合するのをブロックする。ダイアボディはまた、約15nMのIC50で、Flt-1がVEGFに結合するのをブロックする。その効力は親scFv 6.12よりも約10分の1だけ少ない(図3B)。さらにダイアボディは約4nMのIC50で、PlGF(Flt-1特異的リガンド)が固定化Flt-1に結合するのをブロックする(図3C)。予期通り、scFv plC11は、Flt-1/VEGF及びFlt-1/PlGF相互作用に効果を及ぼさなかった。これに対して、scFv 6.12はKDR/VEGF相互作用に効果を及ぼさなかった。示したデータは3部から成る試料の平均±SDを表す。
【００９３】
実施例3:生体活性
VEGF誘発型白血病細胞移動及びHUVEC有糸分裂生起の阻害
ダイアボディを先ず、VEGF及びPlGFによって誘発される細胞移動の阻害活性におけるその活性に関して試験した。VEGF及びPlGFの両方は、用量に応じてヒト白血病細胞HL60及びHELの移動を誘発した(図4A及び4D)。scFv plC11及びscFv6.12はVEGF誘発型及びPlGF誘発型の細胞移動を阻害した(図4B,4C,4E及び4F)。示したデータは3回以上の別個の試験の代表であり、3部から成る試料の平均±SDを表す。2つのscFvは異なる有効性パターンを示した：scFv plC11はVEGF誘発型細胞移動のより強力な阻害因子であるのに対して、scFv6.12は、PlGF誘発型細胞移動の阻害において僅かにより大きな効力を有する。対照的に、ダイアボディはVEGF及びPlGFの両方によって誘発された細胞移動をブロックする上で等しい効果を有する。単純な混合物として、又はダイアボディ形式で形成されたscFv plC11及びscFv6.12双方の組み合わせは、scFv単独の場合よりも、より強力な阻害効果を有することを実証した。注目すべきなのは、scFv plC11もscFv6.12も、最高抗体濃度(すなわち200nM)で試験しても、単独ではVEGF又はPlGF誘発型細胞移動を完全には阻害することはできなかったことである。対照的に、混合物又はダイアボディとして形成されたscFv plC11及びscFv6.12の組み合わせは、抗体濃度200 nMで細胞移動を完全になくした。表皮成長因子受容体に対する抗体である、C225のFabフラグメントは、このアッセイでは細胞移動の有意な阻害を示さなかった。
【００９４】
HUVECマイトジェン・アッセイを用いて、二官能性ダイアボディのVEGF中和活性をさらに見極めた。示したデータは2部から成るものの平均であり、3回以上の別個の試験の代表である。既に明らかなように、scFv plC11は、用量に応じて、約2nMのIC50で、VEGF刺激型HUVEC有糸分裂生起を阻害した([3H]-TdR混和により測定）。抗Flt-1 scFv 6.12は、このアッセイにおいて、極めて弱い抗マイトジェン効果を示した。二官能性ダイアボディは、ほぼ0.5nMのIC50で、試験抗体濃度毎に、scFv plC11及びscFv6.12のいずれよりも著しく強力な阻害効果を有することを実証した。示したデータは2部から成るものの平均であり、3回以上の別個の試験の代表である。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１Ａ】図１Ａは、scFv plC11, scFv 6.12、及び、plC11抗原結合部位とMab 6.12抗原結合部位とを含む抗KDR x 抗Flt-1二官能性ダイアボディをE.coli中に発現させるために使用されるDNA構築体を概略的に示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、scFv及びダイアボディの発現及び精製を示す図である。抗体はE.coli中に発現させ、アフィニティ・クロマトグラフィによって精製し、そしてSDS-PAGEによって分析した。レーン1はscFv plC11;レーン2はscFv 6.12；そしてレーン3は二官能性ダイアボディである。マーカーの分子量はkDaで表す。
【図２】図２は、抗KDR x 抗Flt-1二官能性ダイアボディの二重特異性を実証する図である。図２Ａは、ダイアボディがKDR及びFlt-1の両方に同時に結合することを示す。図２Ｂ及び図２Ｃは、固定化されたKDR(B)及びFlt-1(C)に対する抗体の特異的結合を示す。
【図３】図３は、抗KDR x 抗Flt-1二官能性ダイアボディによって、固定化されたVEGF又はPlGFに対するKDR及びFlt-1の結合が阻害されることを示す図である。種々の濃度の抗体を、固定濃度のKDR-AP(A)又はFlt-1-FC融合蛋白質(B及びC)と一緒に溶液中に室温(RT)で1時間にわたってインキュベートし、その後、これらの混合物を、VEGF(A及びB)又はPlGF(C)を塗被した96ウェル・プレートに移した。
【図４】図４は、抗KDR x 抗Flt-1二官能性ダイアボディによって、ヒト白血病細胞のPlGF及びVEGF誘発型移動が阻害されることを示す図である。パネルA及びD：PlGF(A)及びVEGF(D)は、用量に応じてHL60細胞及びHEL細胞の移動を促進する。パネルB,C,E及びF：抗KDR x 抗Flt-1二官能性ダイアボディによって、ヒト白血病細胞のPlGF(B及びC)誘発型及びVEGF(E及びF)誘発型の移動が阻害される。
【図５】図５は、抗KDR x 抗Flt-1二官能性ダイアボディによって、VEGF刺激型HUVEC有糸分裂生起が阻害されることを示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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