(57)【要約】本発明は、各種の親水性重合体を使用して調製される安定な水性／水性乳化系及びその製造方法を提供する。本発明は更に重合体界面変性剤を使用する上記水性／水性乳化系を提供する。更に、本発明は蛋白質又はペプチドをカプセル化する方法であって、上記乳化系から成ることを特徴とする方法を提供する。また、本発明は上記乳化系から成ることを特徴とするリポソーム基材の薬物製剤；ウイルス、バクテリア、細胞のマイクロカプセル化剤；ナノサイズ製品；及び診断用キットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
各種の親水性重合体を使用して調製した安定な水性／水性型乳化系。
【請求項２】
（ａ）互いに相溶性がなく、生体適応性があり、カプセル化する活性成分がその一方に偏して分配する、分散相及び連続相に適切な重合体材料を選択するステップ；
（ｂ）電荷を有し、毒性がなく、上記二相の間で適度の界面張力を持つ表面変性剤を選択するステップ；
（ｃ）上記の相状態図を作成するステップ；
（ｄ）適切な剪断応力の下で分散相を連続相の中に分散するステップ；
を含む請求項１に記載の安定な乳化系の製造方法。
【請求項３】
重合体表面変性剤を使用した請求項１に記載の水性／水性型乳化系。
【請求項４】
請求項１に記載の乳化系を含む蛋白質又はペプチドのカプセル化方法。
【請求項５】
カプセル化した蛋白質又はペプチドを持続放出製剤又は乾燥粉末製剤に使用する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の乳化系を含むカプセル剤。
【請求項７】
請求項１に記載の乳化系を含むリポソームを基材とする薬物製剤。
【請求項８】
請求項１に記載の乳化系を含むウイルス、バクテリア又は細胞のマイクロカプセル剤。
【請求項９】
請求項１に記載の乳化系を含むナノサイズの生産物。
【請求項１０】
生産物がナノサイズの結晶物、ナノサイズの沈殿物、又は他のナノサイズの集合物である請求項９に記載のナノサイズの生産物。
【請求項１１】
請求項１に記載の乳化系を含む診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な材料系、即ち重合体水性／水性型乳化系、及び医薬及びバイオテクノロジーへの利用におけるその有用性に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
分子生物学、免疫学、微生物学の進展の結果、ますます多くの生化学的治療剤が市販品として入手可能になってきたが、それらにおける蛋白質を体内運搬するための医薬品上の開発（例えば、適切な投与剤形）は、バイオテクノロジーの従来技術よりも遅れている。この状況は、これら薬剤が組織膜の透過性に劣り、投与及び治療部位で非常に分解し易く、保存期間が短く、通常の製剤工程中に分解しやすい構造をしているために、これらの製剤化が困難であることに起因する。これら治療薬剤について、市販品として入手可能で、かつ患者に優しい投与剤形を開発するためには、上記諸課題にそれぞれ対応する必要がある。
【０００３】
持続的放出化、治療部位への標的化、生物活性の延長化、毒性の低減化等、所望の治療目的を達成するために、多くの化学及び生化学的治療剤は、マイクロカプセル化する必要がある（Ｒ．  ＬａｎｇｅｒＪ．と  Ｆｏｌｋｍａｎ，「蛋白質及びマクロ分子の持続的放出のための重合体（Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」Ｎａｔｕｒｅ，  ２６３，  ７９７−８００（１９７６））；及びＳ．  Ｃｏｈｅｎ  とＨ．  Ｂｅｒｓｔｅｉｎ「蛋白質及びワクチンの体内運搬のための微粒子システム（Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９６、参照）。乳化はマイクロカプセル化における鍵となる段階であり、その段階中に活性成分は分散相中に取り込まれる。通常の乳化物は、親水相（分散相）を疎水相（連続相）に分散するか又はこの逆によって形成される（Ｗ／Ｏ型又はＯ／Ｗ型）（Ｒ．  Ｂｏｄｍｅｉｅｒ、Ｈ．  Ｃｈｅｎ、Ｐ．  Ｔｙｌｅ、Ｐ．  Ｊａｒｏｓｚ「経口用懸濁剤形に製剤化したプソイドフェドリン塩酸塩微小球体（Ｐｓｅｕｄｏ  ｐｈｅｄｒｉｎｅ  ＨＣｌ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ａｎ  ｏｒａｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）」Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌ．，  １５，  ６５−７７  （１９９１）参照）。蛋白質治療剤をマイクロカプセル化するには、二重乳化法、いわゆる水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）乳化を利用する。有機溶媒に溶解した重合体溶液に蛋白質溶液をまず分散し、得られた乳液を更に別の重合体の希薄水溶液に分散し、次に溶媒留去又は抽出を行う。通常のマイクロカプセル化の操作に関連する主な問題は、この方法での必須成分である有機溶媒に蛋白質分子が接触して変性する可能性があることである。一番目の乳化において、界面活性剤及び／又は水性ゲル溶液を使用して蛋白質を保護しているが（Ｍ．  Ｊ．  Ａｌｏｎｓｏ，  Ｒ．  Ｋ．  Ｇｕｐｔａ，  Ｃ．  Ｍｉｎ，  Ｇ．  Ｒ．  Ｓｉｂｅｒ，  Ｒ．  Ｌａｎｇｅｒ「痙攣性毒物の放出制御型体内運搬システムとしての生分解性微小球体（Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」Ｖａｃｃｉｎｅ，  １２，  ２９９  （１９９４）  参照；及びＴ．  Ｊｉｎ、Ｋ．  Ｓｏｌｋｏｌｌ、未発表データ）、これらはある特定の比較的安定な蛋白質にしか有効でない。有機溶媒を使用しない乳化方法が強く要求される。
【０００４】
水性系に対しては、粒子は、各種の沈降メカニズム、例えば塩析（Ｂ．  Ｅ．  Ｃｏｎｗａｙ、「化学及び生物物理学におけるイオン水和（Ｉｏｎｉｃ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）」Ｅｌｓｅｖｉｒｅ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８１）、酸塩基反応（Ａ．Ｒ．ｃｒｏｓｓとＣ．Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９２、４２１（１９８０））、ｐＨ支援沈降によって形成可能である。これらのメカニズムのために、塩は濃くし、ｐＨは極端な値にし、あるいは（イオン性）蛋白質の架橋剤は避けられないが、これらは全て生化学的治療剤の活性には化学的に危険であると考えられる。
【０００５】
重合体水性液は、鎖の長さと構造が相違すると相溶性がなくなる場合がある。（Ｂ．  Ｚ．  Ｚａｏｌａｖｓｋｙ「水性二相分配（Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ．  Ｙｏｒｋ  １９９４参照）。その結果得られる重合体水性二相系（乳化物ではなくブロック相）が実用上蛋白質精製に使用されている（Ｂ．  Ｚ．  Ｚａｏｌａｖｓｋｙ「水性二相分配」Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ．  Ｙｏｒｋ  １９９４；及びＰ  Ａ．  Ａｌｂｅｒｔｓｓｏｎ「細胞粒子及びマクロ分子の分配（Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」３版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６）。これら二相は水性的性質を有しかつ界面張力が比較的に低いために、蛋白質の構造変化を防止でき、従って水溶性蛋白質に対し優れた適応性を有する。蛋白質精製は、蛋白質が水性重合体相の一方に好んで分散し、不純物が他方に分配することに基づく。蛋白質精製を実施してみると、生化学活性を保持したまま蛋白質を水性相の一方に分配できることが明らかとなる。この二相系は混合すると簡単に二つのブロック相を形成する。しかし、マイクロカプセル化のためには、二つの重合体水性溶液のまま安定な乳化液を形成する必要がある。
【０００６】
本発明の目的は、上記課題の解決、即ち不安定な治療剤、特に生化学的薬剤に対する新規な製剤方策の開発である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上で提起した全ての課題を、塩を濃くせず、ｐＨ値を極端にせず、かつ他の化学的な危険を犯さずに、分散相と連続相の両者を水性溶液から形成することによって解決する安定な乳化系を提示する。
【０００８】
水溶性蛋白質、リポソーム、生ウイルス、その他の治療剤は、それらが分散相に好んで分散することに基づいてマイクロカプセル化でき、投与時又は投与前に、それらの本来の形態と活性を保持したままで放出又は再構成できる。
【０００９】
活性成分を含有する乳化液は、凍結乾燥、噴霧乾燥や他の方法により、乾燥して微細粉末にすることができ、更にコーティング、二重マイクロカプセル化、圧縮、その他の処理を加えることができ、それにより、放出制御システム、運搬標的システム等の各種薬物投与剤形を調製できる。
【００１０】
生ウイルス等の生化学的薬剤は、乾燥形態にマイクロカプセル化することにより、安定性及び保存性が向上するばかりでなく、輸送時及び使用時における高価な低温流通方式（−２０℃）を回避することができる。これは、低温流通ができない多くの発展途上国においては重要である。
【００１１】
本発明の乳化系（分散相、連続相、界面安定剤等）で使用される重合体材料は全て生体適応性があり、ヒトでの体内使用に相応しい。
【００１２】
本発明に記載の重合体水性／水性乳化系は、親水相を疎水相に分散又はこの逆によって調製された在来の乳化物とは基本的に異なる。この相違を別に表現すれば、いわゆる水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）乳化である。通常の乳化物においては全て水性相と水に非相溶性の有機相との間に相分離が起こる。本発明では二つの水性相の間に相分離が起こる。
【００１３】
この乳化プロセスは、塩析、酸塩基反応、ｐＨ支援沈降に基づく水溶液からの沈降プロセスとは異なる。本発明の乳化プロセスには、濃い塩濃度及び極端なｐＨ値の利用に依存するメカニズムは介入しない。代わりに、重合体鎖の増加にともない、エンタルピーが正になる混和（ΔＨＭ）と、エントロピーが減少する混和（ΔＳＭ）が生じ、その結果二つの水性相の間に相分離が起こる。
【００１４】
この系は、蛋白質精製に使用される重合体水性二相系とも異なる。相分離させた上に、分散小滴は融合を防止するように安定化する必要がある。これは、電荷を持ち、二つの非相溶性重合体相の間に吸着する、第三の水性重合体の導入によって達成される。第三の重合体がもたらす表面電荷によって、小滴の凝集及び融合は効果的に防止される。
【００１５】
本発明では、医薬製剤への重合体水性／水性型乳化系の利用を三個の代表的薬剤、即ちリポソーム、蛋白質、生ウイルスのマイクロカプセル化によって検討した。新規な乳化系によって、各タイプの薬剤に対する希望を持てる結果が得られ、不安定な薬剤の製剤化に有用であることが判明した。
【００１６】
リポソームは静脈（ＩＶ）注射用の投与剤形の製剤に使用される（ＡｍＢｉｓｏｍｅＲ、（ＮｅＸｓｔａｒ社開発）、参照）。ＩＶ投与には、リポソームは単層状の小胞体（ＳＵＶ）の形態に調製され保存される必要がある。しかしＳＵＶは保存中に凝集融合して大粒子になる。リポソームを分散相の中にカプセル化し凍結乾燥して乾燥粉末にすることにより、リポソームのＳＵＶ構造を乳化システムによって保護保存することが可能になる。我々の研究では、保護されたＳＵＶ構造は、単に水を加えて凍結乾燥粉末に再構成された（図６参照）。対照としてカプセル化しないＳＵＶリポソームを凍結乾燥し再び水和したところ、本来のＳＵＶ形態は失われ多層状の大胞体に転換した（図７）。
【００１７】
蛋白質用の放出持続型投与剤形を開発するには、その製剤化工程でこの治療用蛋白質が変性するのを防止することが鍵となる課題である。製剤工程中の蛋白質の変性は、主に使用する有機溶媒との接触及び分散相と連続相の間の強力な界面張力が原因である。本発明が提供する製剤環境には、蛋白質変性の原因と考えられる通常のマイクロカプセル化工程での化学的な危険がない。一例として、立体配位が変化を受けやすい酵素であるβ−ガラクトシダーゼを重合体水性／水性型乳化系の技術でカプセル化し、カプセル化してないもの（正の対照）及び通常のＷ／Ｏ法でカプセル化したもの（負の対照）と活性を比較した。放出後の蛋白質の酵素活性は正の対照に匹敵したが、Ｗ／Ｏ法で製剤化したものは活性を示さなかった。この結果から、蛋白質の立体配位は新規なマイクロカプセル化工程中でも保持可能という我々の考えは確認された。
【００１８】
蛋白質を有機溶媒との接触から防御することに加えて、本システムは、カプセル化した蛋白質治療剤の放出速度及び放出プロフィールを制御する更に有用な物理的化学的メカニズムを提示する。生分解性重合体による薬物運搬システムにおいて、カプセル化治療剤の放出速度は重合体の分解（化学反応）速度に依存する。しかし、温度等の反応条件の変化が制限されるため、生体内で化学反応速度を操作することは困難である。水中油中固体法により作成した微小球体においては、Ｂ相（ＰＥＧ）が疎水性重合体（ＰＬＧＡ等）と共に溶解可能であるから、疎水性マトリックス中のＢ相（ＰＥＧ）の含有量によって、重合体マトリックスの性質、例えば親水性／疎水性、膨潤性、加水分解速度等を調節することができる（図４参照）。更に、ＰＥＧが放出されることにより、Ａ相（デキストラン）が溶解する道が開かれ、蛋白質放出の拡散メカニズムに到達する。
【００１９】
この新規な材料系の利用は生ウイルスの製剤化に発展している。生ウイルスはヒトのある種のワクチン（Ｎ．  Ｔ．  Ｐａｒｋｉｎ、Ｐ．  Ｃｈｉｕ、Ｒ．  Ｃｏｅｌｉｎｐｈ、「遺伝子操作した弱毒化インフルエンザＡ生ウイルスワクチン候補物（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ）」  Ｊ，  Ｖｉｒｏｌ、．７４、２７７２−２７７８  （１９９７）  参照）及び多数の家畜ワクチンに使用されている。感染細胞のウイルス活性を維持するためには、輸送において及びウイルスワクチン等のウイルス製品の利用において低温流通方式（−２０℃）が必要となる。本発明により、ウイルス製品を乾燥粉末として活性を失うことなく製造可能であり、従って室温管理が可能である。予備実験で、サイトメガロウイルスを水性／水性型乳化系にてカプセル化し、続いて凍結乾燥した。次に、乾燥ウイルスを緩衝剤で再構成しヒトの包皮繊維芽細胞で培養した。感染活性に関して、カプセル化ウイルスを新鮮なウイルス（正の対照）及び乳化系なしで凍結乾燥したウイルス（負の対照）と比較した。今回も、カプセル化ウイルスは正の対照に匹敵する活性を示したが、負の対照は感染力を示さないという明白な結果を得た。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、物理的化学的プロセスである乳化が、二つの水性相に関して生起可能となる。そのプロセスには有機相がないので、蛋白質及び他の脆い薬剤のマイクロカプセル化の過程における変性を回避できる。また、本乳化系により、カプセル化成分を制御的に放出するプロフィールと速度が調節可能となる便利なメカニズムが提供される。
【００２１】
【実施例】
実施例１  重合体水性／水性型乳化系の調製
方法１
デキストラン（分子量１００，０００から１，０００，０００）とアルギン酸ナトリウム（低又は中粘性）を水に溶解して、デキストラン濃度を１０から５０重量／容量％、デキストラン対アルギン酸塩の比を１０：１から３０：１とした。この溶液を溶液Ａと命名する。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、分子量１，０００から１２，０００）含有水溶液をＰＥＧ濃度が１０から４０重量／容量％の範囲となるように調製し、溶液Ｂと命名した。剪断力を加えながら（攪拌又は均質化）溶液Ａを溶液Ｂに加え、容積比１：０．７から１：５とした。粒子径の分布は、適切な範囲の整粒器を使用して測定可能だが、加えた剪断力の関数となる範囲であった。乳化系の安定性を室温に数週間置くことにより検討した。融合は観察されなかった（図１参照）。
方法２
溶液Ａをデキストラン（分子量１００，０００から１，０００，０００）だけで調製し、その濃度を１０から５０重量／容量％とした。上記分子量のＰＥＧとアルギン酸塩を含有する溶液Ｂを調整した。ＰＥＧの濃度範囲は１０から４０重量／容量％、ＰＥＧ対アルギン酸塩の比の範囲を１０：１から３０：１とした。上と同様にして溶液Ａを溶液Ｂに分散した。方法１と同様に安定な乳化液が調製された。
実施例２  リポソームのマイクロカプセル化
リポソームの分配
デキストラン３０重量／容量％の溶液ＡとＰＥＧ２５重量／容量％の溶液Ｂを調製した。リン脂質（ＤＯＰＣ及び２％蛍光性脂質）の水懸濁液（脂質／水＝５〜１０ｍｇ／ｍｌ）を超音波処理して単層状小胞体（ＳＵＶ）リポソームを調製した。超音波処理の前に脂質−水懸濁液を窒素で封緘した。乳状の懸濁液が透明な液体相になるまで、各２分間の間隔を置いて超音波処理を続けた。得られた液体を顕微鏡観察したところ、目視可能なリポソームはなかった。リポソーム懸濁液を溶液Ａに加え、よく混合し、その結果溶液Ａは着色（黄色）した。次に、リポソーム懸濁液を含む溶液Ａを同容量の溶液Ｂに加え、１０分間攪拌した。（ＡとＢを含有する）乳化溶液を１０分間静置すると、濁った乳液が二つの透明なブロック相になった。下方のデキストラン相は黄色であり、ＰＥＧ相は無色であった。このことから、リポソームは主にデキストラン相に分配することが判る。
リポソームのカプセル化と凍結乾燥
溶液Ａと溶液Ｂを、実施例１と同様に調製した。蛍光性脂質を除いて上記と同様に小リポソーム（ＳＵＶ）を調製した。まずリポソームを溶液Ａに分散し、続いて溶液Ｂと乳化した。得られた乳液を一夜静置したが、沈殿は観察されなかった。試料を凍結し、１０−２トールを超える真空度で一夜凍結乾燥機に架けた。
【００２２】
得られた乾燥粉末は水に容易に溶けて再構成された。溶液は透明で、顕微鏡下に目視可能なリポソームは見られなかった（図６参照）。比較のために、同じリポソーム懸濁液を、重合体溶液に分散せずに直接に凍結乾燥した。直接凍結乾燥粉末に水を加えたところ、乳状の懸濁液となり、顕微鏡下に大きな（明白な）リポソームが確認された（図７参照）。この実験から、ＳＵＶ構造が凍結乾燥工程中に破壊されることを水性乳化系によって効果的に防止可能であることが判る。リポソーム（ＳＵＶ）懸濁液をデキストラン溶液（実施例３の溶液Ａ）の中に分散し、続いて凍結乾燥した。この操作により微粉末ではなくて、硬いブロックが得られた。ブロック試料を溶解させるには約５分間渦を与える必要があった。
実施例３  マイクロカプセル化後のβ−ガラクトシダーゼの活性
β−ガラクトシダーゼのカプセル化
β−ガラクトシダーゼ（１０００単位／ｍｌ）２μｌを０．２５ｍｌの溶液Ａ（実施例１と同じ）に加え、ピペット操作で混合した。得られた溶液を室温で攪拌しながら溶液Ｂ（実施例１）の中にゆっくり分散した。溶液Ａと溶液Ｂの容積比は１：１であった。
【００２３】
この分散相（デキストラン相）中への蛋白質のカプセル化効率を、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの加水分解におけるこの蛋白質の酵素活性によって検討した。酵素活性テストの前に５００Ｇにて２分間遠心分離して分散相を連続相から分離した。
【００２４】
３０ｍＭのＭｇ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（基質）を含有する溶液を酵素活性測定用に調製した。この反応液０．３ｍｌを、上記のようにそれぞれ分離したデキストラン相とＰＥＧ相の各０．５ｍｌと混合した。次に二つの測定試料を３７℃で３０分間培養し、続いて１ＭのＮａ２ＣＯ３を各々に０．５ｍｌ加えて反応を停止した。反応物は黄色を呈するので、試料を分光計にかけ４２０ｎｍの吸収を測定した。デキストラン相とＰＥＧ相の各々に対し、吸光度は０．８２と０．０８であった。この結果から、カプセル化効率は約９０％であることが判る。
蛋白質活性の保護
本乳化プロセスと立体配位が変化を受けやすい蛋白質との相応性を検討するために、カプセル化したβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を二つの参照例と比較した。一つは正の対照であって、β−ガラクトシダーゼ溶液を反応溶液に直接添加した。他は負の対照であって、２μｌの酵素溶液を０．２５ｍｌの溶液Ａ（実施例１と同様に調製）に加え、続いて鉱物油に分散した。アセトンで油分を洗い去ってＷ／Ｏ乳化液中の蛋白質を回収し、そのペレットを再溶解した。反応液を加え上記のごとく培養してから吸光度を測定したところ、正の対照と負の対照に対しそれぞれ０．８１と０．００であった。この結果から、β−ガラクトシダーゼの酵素活性は、水性／水性乳化系を伴うマイクロカプセル化工程中では保存されたが、通常のＷ／Ｏを伴う場合には破壊されたことが明らかである。
実施例４  生ウイルスの乾燥製剤
サイトメガロウイルスのマイクロカプセル化
実施例２のリポソームの場合と類似の操作によって、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）をマイクロカプセル化した。２５重量／容量％のデキストラン５００Ｔ、２重量／容量％のアルギン酸ナトリウム（中粘性）、５０ｍＭのトリス緩衝液、１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する溶液Ａ、及び２５重量／容量％のＰＥＧ８０００を含有する溶液Ｂをマイクロカプセル化用に調製した。任意単位のＣＭＶ懸濁液５μｌを０．４ｍｌの溶液Ａと混合し、次に０．３ｍｌの溶液Ｂにマグネチックスターラーで攪拌しながら分散した。溶液Ａは溶液Ｂよりも最初の容積が大きかったにもかかわらず、前者はやはり分散相を形成した。乳化試料を実施例２のリポソームに対すると同様に凍結乾燥し乾燥粉末を作成した。
感染活性
感染性細胞のウイルス活性を測定するために四種の試料を調製した。
（１）ＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス緩衝液、１００ｍＭ塩化ナトリウム）中のＣＭＶ、凍結乾燥無し（正の対照）；
（２）ＴＮ緩衝液中のＣＭＶ、凍結乾燥有り（負の対照）；
（３）マイクロカプセル化したＣＭＶ、凍結乾燥無し；
（４）マイクロカプセル化しかつ凍結乾燥有り。
【００２５】
凍結乾燥後、試料２と４は室温で一日放置し、重合体粉末を溶解しているＴＮ緩衝液を加えて再構成した。次に四種の試料をヒトの包皮繊維芽細胞と培養した。各試料を希釈して６段階の濃度（隣り合わせの濃度の間には１０倍の差がある）とし、６皿の細胞にそれぞれ加えた。感染の有無を線状細胞の斑点が皿上に生成するか否かでモニターした。一週間の培養後、マイクロカプセル化したウイルス（試料３と４）は感染性細胞に匹敵する活性を示したが、それは正の対照（試料１）よりも低かった。しかし負の対照（試料２）は６つの皿のいずれにおいても感染を示さなかった。この結果から、本マイクロカプセル化の手法は凍結乾燥中のウイルスを保護し、活性の乾燥粉末ウイルス製剤を可能にすることが判る。
他の応用例
治療剤の制御放出と標的運搬
分散滴の荷電表面は、反対電荷の重合体を使用するイオン架橋によって更に変性することができる（図２）。分解性で、生体適応性があるそのような荷電重合体は、入手可能である（例えば、ポリペプチド、ポリアミノ酸［５］、キトサン）。架橋剤を（分解速度と溶解速度に基づいて）選択することにより、カプセル化治療剤の放出速度を調節することができる。
【００２６】
表面荷電を利用する表面への標的部分の固定により、細胞への治療剤の標的運搬が可能である。リガンド又は抗体を荷電ポリアミノ酸と共重合して（Ｔ．  Ｊｉｎ、Ｋ．  Ｓｏｌｋｏｌｌ、未発表データ）、粒子表面に固定化できる（図２）。
【００２７】
又、表面荷電を利用してリン脂質二重層を構築し粒子を封入できる（Ｅ．  Ｓａｋｍａｎｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７，  ４３−４８，  （１９９６）；及びＲ．  Ｊ．  Ｌｅｅ，  Ｌ．  Ｈｕａｎｇ「遺伝子導入のための人工自己構築システム（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）」Ｐ．  Ｌ．  Ｆｅｌｇｎｅｒ等編、米国化学協会、ワシントンＤＣ、１９９６参照）。担持されるリン脂質二重層によって人工表面は生体機能及び細胞表面的環境を有するようになるので（Ｒ．  Ｊ．  Ｌｅｅ，  Ｌ．  Ｈｕａｎｇ「遺伝子導入のための人工自己構築システム」Ｐ．  Ｌ．  Ｆｅｌｇｎｅｒ等編集、米国化学協会、ワシントンＤＣ、１９９６参照）、その表面に機能的な膜蛋白質の固定化及び再構成が可能になる。
ナノサイズの製品
ナノメーターサイズの結晶及び他の固体粒子が、治療剤（ナノ螺旋体：（ａ１）  Ｊｉｎ，  Ｔ．，  Ｚａｒｉｆ．，  Ｌ，  Ｍａｎｎｉｎｏ  Ｒ．  Ｊ．米国特許６，１５３，２１７（２０００））及び（ｂ）  Ｌ．  Ｚａｒｉｆ，  Ｉ．  Ｓｅｇａｒｒａ，  Ｔ．  Ｊｉｎ，  Ｄ．  Ｈｙｒａ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｍａｎｎｉｎｏ「真菌感染症治療用の新規な経口薬物運搬システムとしてのアムフォテリシンＢ螺旋体（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ  Ｂ  ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）」、生物活性材料の制御放出に関する第２６回国際シンポジウム、ボストン、米国、１９９９、参照）及び診断薬（コロイド金）において積極的に利用されている。水性／水性乳化系を使用すると、反応物の一方をマイクロ滴の中に単独存在させ、他方の反応物、即ちイオンでも沈澱化／結晶化剤でもよい反応物がその滴の中に拡散してくるのを待機し、反応を開始させる。一方の反応物はマイクロサイズの滴の中に単独存在しているので、反応物分子相互の接近が制限され、結晶あるいは他の生成物の成長が制約される。
【００２８】
註１：中国語明細書では、本引例は米国特許出願０９／２３５４００である。
【図面の簡単な説明】
【図１】重合体水性／水性型乳化系
重合体溶液Ａと重合体溶液Ｂは非相溶性なので、Ａは剪断力を受けてＢの中に分散できる。第三の重合体は電荷があり、低濃度ではＡにもＢにもかなり非相溶性なので、ＡとＢの間の界面に豊富に集合する傾向があり、電荷のある表面が形成される。電荷のある表面は、分散相の凝集融合を効果的に防止する（実施例１参照）。蛋白質、リポソーム、ウイルス等の治療剤は分散相に分配しカプセル化され、凍結乾燥される（実施例２、３、４参照）。
【図２】重合体水性／水性型乳化系の顕微鏡像
【図３】重合体水性連続相に分散した重合体水性小滴の第二の界面変性
図１の分散相の表面を更に変性して機能化することができる（「別の応用例」参照）。即ち、反対荷電の分解性重合体によりイオン性の架橋をさせる、あるいは反対荷電の脂質二重層を構築させることによって、表面に、透過に対するバリアーを構築できる。カプセル化治療剤の放出速度は、所望の分解速度を持った架橋用重合体を鎖長及び構造に基づいて選択（例えば、ポリアミノ酸、ポリペプチド）して、調節可能である。標的用部分（抗体あるいはリガンド）をイオン性相互作用あるいは疎水性相互作用によって表面上に固定化できる（脂質二層構造の場合）。
【図４】水中油中固体乳化を経由する二重マイクロカプセル化によって調整された微小球体
水性／水性乳化系を乾燥して作成した粉末は、疎水性かつ分解性重合体の微小球体中にカプセル化することができる。メタンジクロライドは重合体微小球体の製造で通常使用される溶媒であり、Ｂ相（Ａ／Ａ乳化系の連続相）を溶解するがＡ相（分散相）には作用しないので、この溶媒で単に洗浄するだけで凍結乾燥粉末からＢ相を除去することができる。凍結乾燥粉末をカプセル化した微小球体は、Ｂ相を除去した場合には疎水性の多いマトリックス構造となるが、Ｂ相が残留している場合には疎水性は少ない。この構造上の相違は重合体マトリックスの分解速度及び重合体マトリックスを抜ける拡散速度に影響するので、カプセル化治療剤の放出プロフィールを残存Ｂ相の含有量によって調節できる。
【図５】重合体水性／水性乳化系を使用するナノサイズ製剤
ナノザイズの結晶及び二つの反応物から形成した構築物が乳化系を使用して製造できる（引例１４参照）。反応物Ａは通常分散相に分配しカプセル化する。反応物Ｂは両方の相に分布する。Ａは各マイクロサイズの小滴中に限られた量で、単独で存在する。一体化のプロセスが進行すると、両反応物は接触が限られているので確実に小サイズの生産物となる。ナノサイズの製品は治療剤及び診断剤の製造に有用である。
【図６】重合体乳化系の中に収納した後に凍結乾燥した再構成ＡｍＢ／リポソーム（ＳＵＶの）の顕微鏡像
重合体乳化システム中にカプセル化し続いて凍結乾燥したリポソームは、再構成後には目視不能であり、従ってそれらの小さな単層状構造は重合体乳化システムによって保護されていることが判る。
【図７】重合体乳化系の中に収納せずに凍結乾燥した再構成ＡｍＢ／ＳＵＶの顕微鏡像
直接に凍結乾燥した後の小さいリポソーム（ＳＵＶ）は、再構成すると大粒子となり、従って保護されていないリポソームが乾燥工程中に凝集融合したことが判る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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