(57)【要約】Ｃ−２位のベンゾイルオキシ基に同位体が存在するという特徴を有する安定な標識タキサンを提供する。より詳細には、タキサン骨格のＣ−２位のベンゾイル残基の１つまたはそれ以上の水素または炭素原子が、重水素または１３Ｃでそれぞれ置換される。それらの製法、および有効な抗癌剤であるタキサンを測定するための分析法における内部標準としてのそれらの使用もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2005530715.tif 000008
〔式中、
Ｒ1は、水素原子、アセチル基またはヒドロキシ保護基を表し；
Ｒは、水素原子、ヒドロキシ保護基または式II
【化２】
2005530715.tif 000009
（式中、Ｒ2は、ベンゾイルもしくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を表し；Ｒ3は、水素原子もしくはヒドロキシ保護基を表す）の残基を表し；
Ｘ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4は、独立してＣＤ、13ＣＤ、13ＣＨまたはＣＨを表し；ＹおよびＹ1は、ＹおよびＹ1が両方ともＣである場合にはＸ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4はすべてがＣＨではないという条件で、独立してＣまたは13Ｃを表す〕の安定な標識タキサン。
【請求項２】
ヒドロキシ保護基がシリルヒドロキシ保護基および２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基から選ばれる、請求項１記載の式Ｉの安定な標識タキサン。
【請求項３】
ヒドロキシ保護基がトリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルおよびシアミルジメチルシリル基から選ばれる、請求項２記載の式Ｉの安定な標識タキサン。
【請求項４】
請求項１記載の式Ｉ
〔式中、
Ｒ1は、水素原子またはアセチル基を表し、Ｒは、式II
【化３】
2005530715.tif 000010
（式中、Ｒ2は、ベンゾイルまたはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を表し、そしてＲ3は水素原子を表す）の残基を表し、Ｘ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4は13ＣＨであり、ＹおよびＹ1は両方ともＣである〕の安定な標識タキサン。
【請求項５】
２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセル、
２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−ドセタキセル、または
２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−１０−デスアセチル−バッカチンIII、
である式Ｉの安定な標識タキサン。
【請求項６】
請求項１の定義の通りである式Ｉの標識タキサンの分析法における使用。
【請求項７】
請求項６記載の標識タキサンの、生物学的液体中のタキサンを測定するための使用。
【請求項８】
請求項６記載の標識タキサンの内部標準としての使用。
【請求項９】
生体体液中のパクリタキセルを測定するための分析法における内部標準としての２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセルの使用。
【請求項１０】
請求項１の定義の通りである式Ｉの標識化合物の製法であって、
ｉ）式III
【化４】
2005530715.tif 000011
（式中、Ｒ4はヒドロキシ保護基を表し、そしてＲ、Ｒ1は請求項１の定義の通りである）の化合物を同位体標識安息香酸と反応させ、
ii）生成した式IV
【化５】
2005530715.tif 000012
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ4、Ｘ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、ＹおよびＹ1は請求項１の定義の通りである）の化合物からヒドロキシ保護基を除去し、式Ｉの望まれる標識タキサンを得てそして、所望する場合には、
iii）式Ｉの或る化合物を式Ｉの別の化合物に変換すること、
を含む、上記の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
パクリタキセルは、北米西岸原産のイチイ属の樹木の樹皮から分離された、天然のタキサンジテルペノイドである（E. Baloglu, D.G.I.Kingston; J. Nat. Prod. (1999)62: 1448-72）。該化合物の構造は１９７１年に最初に解明されそして公表された（M.C.Wani, H.L.Taylor, M.E.Wall, P.Coggen, A.T.McPhail; J. Am. Chem. Soc. (1971)93: 2325-7）。細胞の有糸分裂の過程に重要であるチューブリン系を阻害する独特なその能力のために（S.B.Horowitz, J.Fant, P.B.Schiff; Nature(1979)277:665）、クレモホールに溶解されたその製剤型はいくつかのヒトの癌の治療に現在使用されている。他のパクリタキセル類似体は、本明細書ではタキサンと呼ぶが、開発中かまたはすでに細胞障害性薬剤として使用されている。これらのタキサンの中で主要なものはドセタキセルである。結果として、タキサンならびに複雑な生物学的試料（例えば動物およびヒトのプラズマ、尿、胆液および組織、生体外細胞培養培地等）におけるそれらの代謝生成物を測定する分析法には相当な必要性がある。生体体液中のパクリタキセルまたはタキサンを測定するためのいくつかの分析法は公表されている。いずれにしろそれらの大半は、多段階の試料の調製を必要とし、日常の通常の分析としてはあまり便利ではない。試料の自動処理法に続いて液体クロマトグラフィー（ＬＣ）および質量分析検出（ＭＳ）を用いることによって、著しい改善が得られた。確実かつ有効な分析法の１つの重要な局面は、適当な内部標準の利用可能性である。内部標準の既知量を未知試料に添加するのは、関心のある化合物の試料作業中の損失を補うことのできる、公知のそして広く用いられる方法である。この手法に従って、関心のある化合物のどのような損失も、内部標準の相当する部分の損失によって測定できる。この手法の精度および正確さは、関心のある化合物と内部標準との間の構造上の類似性に強く依存する。その結果、ある化合物と同じ分子構造を有する安定な同位体標識類似体が液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）検定には最良の内部標準であることが、一般的に認められている。加えて内部標準は好ましくは、関心のある非標識化合物の分子量に比べて少なくとも３質量単位高い分子量を有するべきである。従って、好ましくは生物学的液体中の薬剤またはその代謝生成物を測定する分析法の正確さおよび特異性を改善するために、骨格において大量の安定同位体で標識したパクリタキセル、ドセタキセルまたは他のタキサンには相当な必要性がある。
【０００２】
パクリタキセルおよびその類似体に関する化学は少なくはない。文献において多くの論文が、パクリタキセルまたはその類似体の分子に安定同位体または放射性同位体を導入するために用い得る方法を報告した（D.Giribone, E.Fontana, J. Labelled Compounds and
Radiopharmaceuticals, 2000, 43, p. 933-41; I.Rodriguez 他, J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 2000, 43, p. 169-76; D.D.Dischino 他, J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1995, 39, p. 173-9; S. deSuzzoni 他, J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1995, 36, p. 739-43; D.G.Walker 他, J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1995, 36, p. 479-91; D.G.Walker 他, J. Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1994, 34, p. 973-80; D.G.I.Kingston 他, J. Nat. Prod., 2000, 63, p. 726-34 および WO01/94328-A1）。これらの手法は、タキサン骨格に結合する側鎖の１つ、大部分はＣ−１３位における側鎖での同位体の導入を含む。しかしこれらの手法は、些細ではない、時間のかかる、多段階の一連の合成によってのみ生成できる合成素子（synthon）が入手可能であることを要求する。パクリタキセルにのみ有効な他の可能性は、２つの論文に記載されていた、１０−Ｏ−アセチル部分における重水素の標識化であった（S.H.Hoke 他., J. Nat. Prod., 1994, 57, p. 277-86; P.Heinstein 他, J. Chem. Soc. Perkin Trans.I, 1996, p. 845-51）。両方の事例において鍵となる工程は、重水素化塩化アセチルと適当な１０−Ｏ−デアセチルパクリタキセルとの反応であった。繰り返すが、前駆物質は容易に入手可能ではなく、収率は低く、そして最終化合物の同位体濃縮は疑問の余地がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は安定な標識パクリタキセル、ドセタキセルまたは他のタキサン、分析法におけるそれらの使用ならびに、パクリタキセル、ドセタキセルまたは他のタキサンから出発して容易に合成できる非標識タキサン中間体および商業的に入手可能な高度に同位体が濃縮された安定な標識前駆物質から出発するそれらの製法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
特に本発明は式Ｉ
【化１】
2005530715.tif 000002
〔式中、
Ｒ1は、水素原子、アセチル基またはヒドロキシ保護基を表し；
Ｒは、水素原子、ヒドロキシ保護基または式II
【化２】
2005530715.tif 000003
（式中、Ｒ2は、ベンゾイルもしくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を表し；Ｒ3は、水素原子もしくはヒドロキシ保護基を表す）の残基を表し；
Ｘ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3およびＸ4は、独立してＣＤ、13ＣＤ、13ＣＨまたはＣＨを表し；ＹおよびＹ1は、ＹおよびＹ1が両方ともＣである場合にはＸ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4はすべてがＣＨではないという条件で、独立してＣまたは13Ｃを表す〕の安定な標識タキサンを提供する。
【０００５】
ヒドロキシ保護基は好ましくはシリル基例えばトリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルまたはシアミルジメチルシリル基および２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基から選ばれる。
【０００６】
好ましくはＲ1は、水素原子またはアセチル基を表し、Ｒは、式II（式中、Ｒ2は、ベンゾイルまたはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を表し、そしてＲ3は水素原子を表す）の残基を表し；Ｘ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4は13ＣＨであり；ＹおよびＹ1は両方ともＣである。
【０００７】
本発明に記載の好ましい化合物は、
ａ）２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセル、
ｂ）２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−ドセタキセル、および
ｃ）２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−１０−デスアセチル−バッカチンIII、
であり、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは９９％を超える同位体濃縮を有する。
【０００８】
本発明の別の目的は、上述の定義の通りである式Ｉの標識タキサンの分析法における、好ましくは生物学的液体中のタキサンを測定するための使用である。
【０００９】
より好ましくは本発明は、上述の定義の通りである式Ｉの標識タキサンの内部標準としての使用を提供する。
【００１０】
さらにより好ましくは本発明は、生物学的液体中のパクリタキセルを測定するための分析法における内部標準としての２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセルの使用を提供する。
【００１１】
本発明はまた、式Ｉの標識化合物の製法であって、
ｉ）式III
【化３】
2005530715.tif 000004
（式中、Ｒ4はヒドロキシ保護基を表し、そしてＲ、Ｒ1は上述の定義の通りである）の化合物を同位体標識安息香酸と反応させ、
【００１２】
ii）生成した式IV
【化４】
2005530715.tif 000005
（式中、Ｒ、Ｒ1、Ｒ4、Ｘ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、ＹおよびＹ1は上述の定義の通りである）の化合物からヒドロキシ保護基を除去し、式Ｉの望まれる標識タキサンを得てそして、所望する場合には、
iii）式Ｉの或る化合物を式Ｉの別の化合物に変換すること、
を含む、上記の方法を提供する。
【００１３】
工程ｉ）は同位体標識安息香酸（例えば[環−Ｕ−13Ｃ]安息香酸）を用いて、縮合剤（例えばＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド）および必要であれば触媒（例えば４−ピロリジノピリジン）の存在下で行う。
【００１４】
この反応は不活性雰囲気下、例えば窒素下で、不活性有機溶媒、例えば芳香族炭化水素例えばトルエン中で、そして高温、例えば６０℃で実施する。
【００１５】
標識安息香酸および式IIIの化合物のモル比は１〜２０対１、好ましくは５〜１０対１である。標識安息香酸および縮合剤のモル比は好ましくは１対１である。存在する場合には触媒および標識安息香酸のモル比は約１対１５である。この反応の進行は、分析法例えば薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーまたは質量分析によって確認し、そして式IIIの出発物質が検出されない時点で、通常約２８時間以内に終了する。反応終了時に、その混合物を好ましくは反応副産物を溶解しない溶媒で希釈し、そして例えば焼結ガラス濾過漏斗を通して濾過して固形物質を除去する。溶媒を蒸発乾固した後、式IVの化合物を含有する粗製物質を回収する。
【００１６】
式IVの化合物を含有するその粗製物質を、当業者に公知の技術を用いて次の工程ii）の前に精製するのが好ましい。例えば、有機溶媒といった適当な溶離剤およびシリカゲルを用いた分取用カラムクロマトグラフィーを、望まれた化合物を効率的に精製し、その結果、以下の開裂反応をうまく実施するために使用し得る。
【００１７】
工程ii）は、式IVの化合物の酸素−保護基結合の開裂によって実施する。ヒドロキシル基を保護するシリルのシリコン−酸素結合の開裂は、例えば酸の処理によって達成され得る。一方、アセチル化ヒドロキシル基の炭素−酸素結合の開裂は、例えば過酸化作用を介して塩基によって達成され得る。シリルに保護されたヒドロキシル基のシリコン−酸素結合の開裂は好ましくは、不活性雰囲気下、例えば窒素下で、無水極性プロトン性有機溶媒、例えばメタノールのようなアルカノール中で、そして室温、例えば２５℃で実施する。酸の濃度は好ましくは１〜２Ｍの範囲内である。この反応の進行は分析法、例えば薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーまたは質量分析によって確認し、そして式IVの出発物質が検出されない時点で、通常約１時間以内に、終了する。
【００１８】
この反応の終了時に混合物を、水と非混和性の溶媒、例えば酢酸エチルで希釈し、次いで最初は塩基の溶液、例えば炭酸水素ナトリウム水溶液で、そして最終的には無機塩、例えば塩化ナトリウムの飽和水溶液で洗浄する。
【００１９】
関心のある化合物の有機溶液を乾燥した後、例えば相分離膜または焼結ガラス濾過漏斗を通して、無機乾燥剤、例えば硫酸ナトリウムを用いて濾過して、そして溶媒を蒸発乾固した後、化合物Ｉを含有する粗製物質を回収する。
【００２０】
式Ｉの化合物を含有する粗製物質は、当業者に公知の技術を用いて精製するのが好ましい。
【００２１】
例えば、水および有機溶媒の混合物といった適当な溶離剤およびＣ−８逆相ＨＰＬＣを用いた分取カラムクロマトグラフィーを、望まれた化合物を効率的に精製するために使用し得る。その純粋な化合物Ｉを、水と非混和性の溶媒例えば酢酸エチルと無機塩例えば塩化ナトリウムの飽和水溶液との間で所望のＨＰＬＣ溶離液を分配することによって、有機溶媒溶液として回収する。
【００２２】
溶媒を蒸発乾固した後、式Ｉの純粋な化合物を白色固体として回収する。
【００２３】
式Ｉ（Ｒは、水素原子またはヒドロキシ保護基を表す）の化合物すなわち標識バッカチン誘導体は、式Ｉ（Ｒは、上述の定義の通りである式IIの残基を表す）の化合物に、公知の手法によって容易に変換し得る。特に、本発明者はWO97/42167-Aに記載された方法を参
照する。式III（Ｒ、Ｒ1およびＲ4は上述の定義の通りである）の出発化合物は、以下のスキームに要約された当業者に公知の技術によって容易に得ることができる。
【００２４】
【化５】
2005530715.tif 000006
【００２５】
式III〔式中、例えばＲ1はアセチル基であり、Ｒ4はトリエチルシリル基であり、そしてＲは式II
【化６】
2005530715.tif 000007
（式中、Ｒ2はベンゾイルまたはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であり、そしてＲ3はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である）の残基である〕の化合物は、当業者に公知の技術によってパクリタキセルまたはドセタキセルから出発して得ることができる（例えばH.Park他, J. Med. Chem., 1996, 39, p. 2705-2709; D.G.I.Kingston 他, J. Med. Chem., 1998, 31, p. 3715-3726; G.I.Georg 他, Tetrahedron Letters, 1994, 35, p. 8931-8934を参照）。例えば、式VIの化合物のジクロロメタン溶液をメタノール中のベン
ジルトリメチルアンモニウムヒドロキシドの溶液（トリトンＢ(R)）を用いて低温で窒素雰囲気中、厳密な制御条件下で処理することによって、選択的２−Ｏ−ベンゾイル開裂を達成できる。式III（式中、例えばＲおよびＲ4はトリエチルシリル基であり、Ｒ1はアセチルまたはトリエチルシリル基である）の化合物はバッカチンまたは１０−デアセチルバッカチンIIIから出発して、当業者に公知の技術によって得ることができる（例えばS-H.Chen 他, Bioorg. Med. Chem. Letters, 1998, 8, p. 2227-2230; I.Ojima 他, Bioorg. Med. Chem. Letters, 1999, 9, p. 3423-3428を参照）。
【実施例】
【００２６】
実施例１
２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−７−Ｏ−（トリエチルシリル）パクリタキセル
約２５℃の無水トルエン（１.５ml）中の[環−Ｕ−13Ｃ]−安息香酸（０.１９８２ｇ、１.４８mmol）の攪拌した懸濁液に、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（０.３０８５ｇ、１.５０mmol）および４−ピロリジノピリジン（１５mg、０.１mmol）を窒素下で加えた。５分間攪拌後、化合物２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デベンゾイル−７−Ｏ−（トリエチルシリル）パクリタキセル（０.１４４５g、０.１５mmol、パクリタキセルから出発して H.Park, M.Hepperle, T.C.Boge, R.H.Himes, G.I.Georg, J. Med. Chem. (1996)39:2705-9およびby D.G.I.Kingston, A.G.Chaudhary, M.D.Chordia, M.Gharpure, A.A.L.Gunatilaka, P.Giannakakou, Y.Q.Jiang, C.M.Lin, H.Hamel, B.H.Long, C.R.Fairchild, K.A.Jhonston, J. Med. Chem. (1998)31:3715-26に記載された通りに生成）を反応フラスコに投入した。その懸濁液を２８時間攪拌しながら窒素下で６０℃に維持した。次いで、出発物質のタキサンが存在しないことを示した（容積比７５：２５：０.１〜１０：９０：０.１の水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の混合物である溶離液を用いたＣ−８逆相カラム上のＨＰＬＣによって確認）混合物を約２５℃に冷却し、酢酸エチル（１５ml）で希釈した後、濾過して透明な溶液を得た。減圧下で溶媒を蒸発させた後、化合物２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−７−Ｏ−（トリエチルシリル）パクリタキセルを含有する粗製物質を回収した。その粗製物質を酢酸エチルおよびｎ−ヘキサン（容積比３：７、５ml）の混合物中に溶解した後、酢酸エチルおよびｎ−ヘキサン（容積比３：７、２.５Ｌ）の混合物によって調製した溶媒系を溶離液として用いたシリカゲルカラム（１５０×内径６.０mm）上でクロマトグラフィー処理した。約５０mlの画分を回集し、そして容積比７５：２５：０.１〜１０：９０：０.１の水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の混合物である溶離液を加えたＣ−８逆相カラム上のＨＰＬＣによって確認した。１３番〜２８番の画分を必要に応じて貯蔵し、そして蒸発乾固した。それぞれ約９０％および６０％の純度を有する７７mgおよび４７mgから成る標題化合物の２つのバッチを白色固体として回収した。純度はＨＰＬＣ（容積比７５：２５：０.１〜１０：９０：０.１の水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の混合物である溶離液を加えたＣ−８逆相カラム上、１３分間の線形勾配および８分間の定組成溶離、検出波長＝２４０ｎＭ）によって測定し、標題化合物の保持時間（Ｒｔ＝１７.７分）は非標識基準試料の保持時間と同じであった。標題化合物の質量スペクトルを、陽イオンを検出するエレクトロスプレーイオン化技術（ＥＳＩ）を用いて記録した。ＥＳＩ質量スペクトルはm/z１０８８amuにおいてプロトン化分子イオンを、そしてまたm/z１１０５amu（Ｍ＋ＮＨ4+）において別の特有のクラスターを示した。ＣＤＣｌ3中４００ＭＨｚで記録したＮＭＲスペクトルは、化学シフト（ppm）で表現される以下のシグナルを示した：8.27-8.38, m; 7.89-7.99, m; 7.67-7.83, m; 7.27-7.52, m; 7.03-7.09, d; 6.45, s; 6.22-6.30, m; 5.72-5.77, dd; 5.69, d; 4.96, dd; 4.68, d; 4.48, dd; 4.32, d; 4.22, d; 3.85 d; 2.58, m; 2.47-2.56, m; 2.33-2.46, m; 2.17,
s; 2.05-2.15, m; 2.03, d; 1.87-2.02, m; 1.71, d; 1.69, s; 1.27, s; 1.22, s; 0.87-0.98, t; 0.80, s; 0.54-0.64, m; -0.02, s; -0.29, s。
【００２７】
実施例２
粗製２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセル
実施例１で生成した化合物２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−７−Ｏ−（トリエチルシリル）パクリタキセル（７３mg、純度約９０％）を、冷却した（約４℃）無水メタノール（４ml）中の塩化水素の１.５Ｍ溶液に窒素下で溶解した。５分間攪拌後、その透明な溶液を約２５℃に加温し、そしてさらに６０分間攪拌した。出発物質のタキサンが存在しないことを示した（容積比７５：２５：０.１〜１０：９０：０.１の水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の混合物である溶離液を加えたＣ−８逆相カラム上のＨＰＬＣによって確認）その反応混合物を酢酸エチル（４０ml）で希釈した後、炭酸水素ナトリウムの４質量％水溶液を用いて４回洗浄した（各回３ml）。すべての水性洗液を集め、そして酢酸エチル（６ml）で抽出した。すべての有機相を集め、飽和塩化ナトリウム水溶液を用いて４回洗浄し（各回３ml）、相分離膜を通して濾過した後、減圧下で蒸発乾固した。化合物２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセル（[13Ｃ６]パクリタキセルとも呼ぶ、６７mg、純度約６０％）を含有する粗製物質を白色固体として回収した。純度はＨＰＬＣ（容積比７５：２５：０.１〜１０：９０：０.１の水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の混合物である溶離液を加えたＣ−８逆相カラム上、１３分間の線形勾配および８分間の定組成溶離、検出波長＝２４０ｎＭ）によって測定し、標題化合物の保持時間（Ｒｔ＝１７.７分）は非標識基準試料と同じであった。標題化合物の質量スペクトルを、陽イオンを検出するエレクトロスプレーイオン化技術（ＥＳＩ）を用いて記録した。ＥＳＩ質量スペクトルはm/z８６０amuにおいてプロトン化分子イオンを、そしてまたm/z８７７amu（Ｍ＋ＮＨ4+）および８８２amu（Ｍ＋Ｎａ+）において２つの他の特有のクラスターを示した。
【００２８】
実施例３
粗製２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセル
実施例１で生成した化合物２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセル（４５mg、純度約６０％）を、冷却した（約４℃）無水メタノール（４ml）中の塩化水素の１.５Ｍ溶液に窒素下で溶解した。５分間攪拌後、その透明な溶液を約２５℃に加温し、そしてさらに６０分間攪拌した。出発物質のタキサンが存在しないことを示した（容積比７５：２５：０.１〜１０：９０：０.１の水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の混合物である溶離液を加えたＣ−８逆相カラム上のＨＰＬＣによって確認）その反応混合物を酢酸エチル（４０ml）で希釈した後、炭酸水素ナトリウムの４質量％水溶液を用いて４回洗浄した（各回３ml）。すべての水性洗液を集め、そして酢酸エチル（６ml）で抽出した。すべての有機相を集め、飽和塩化ナトリウム水溶液を用いて４回洗浄し（各回３ml）、相分離膜を通して濾過した後、減圧下で蒸発乾固した。化合物（[13Ｃ６]パクリタキセル、４２mg、純度約４５％）を含有する粗製物質を白色固体として回収した。純度はＨＰＬＣ（容積比７５：２５：０.１〜１０：９０：０.１の水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の混合物である溶離液を加えたＣ−８逆相カラム上、１３分間の線形勾配および８分間の定組成溶離、検出波長＝２４０ｎＭ）によって測定し、標題化合物の保持時間（Ｒｔ＝１７.７分）は非標識基準試料と同じであった。標題化合物の質量スペクトルを、陽イオンを検出するエレクトロスプレーイオン化技術（ＥＳＩ）を用いて記録した。ＥＳＩ質量スペクトルはm/z８６０amuにおいてプロトン化分子イオンを、そしてまたm/z８７７amu（Ｍ＋ＮＨ4+）および８８２amu（Ｍ＋Ｎａ+）において２つの他の特有のクラスターを示した。
【００２９】
実施例４
２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセルを含有する粗製物質の精製
実施例２または実施例３で生成した粗製物質の約７mg／mlの濃度を有する溶液を、溶媒系ジメチルスルホキシド／水／アセトニトリル（容積比２５：２５：５０）中に調製した。この溶液の１〜４mlのアリコートを、以下の分取用高速液体クロマトグラフィーシステムに注入した。カラム＝シンメトリー・プレップＣ８（１５０×内径１９mm、粒径７μm）；移動相Ａ＝７５：２５（容積比）の水／アセトニトリル；移動相Ｂ＝１０：９０（容積比）の水／アセトニトリル；溶離＝移動相Ａ１００％〜移動相Ｂ１００％の１３分間における線形勾配、次いで移動相Ｂ１００％での８分間の定組成溶離；流速＝２０ml／分；実施中の検出＝ＵＶ（波長：２５４nm、試料採取速度は最小で２ポイント／秒）；画分収集＝フラクションコレクターの手動作動。化合物２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセルのピークを識別しそしてその純粋な生成物に対応する溶離液を収集するために実験中のＵＶ吸光度のプロットを目でリアルタイムで追跡した。純粋な化合物２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセルを含有するすべての収集した分画を貯蔵した後、減圧下で回転蒸発によって当初の容積の約２分の１に濃縮した。その溶液を分液漏斗へ移し入れ、飽和塩化ナトリウム水溶液の同量を加え、そして酢酸エチルで４回抽出した（各回６ml）。すべての有機相を集め、相分離膜を通して濾過した後、ｎ−ヘキサンから蒸発乾固した。化合物２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセルを、９８％を超えて化学的に純粋な白色固体として得た。純度はＨＰＬＣ（容積比７５：２５：０.１〜１０：９０：０.１の水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の混合物である溶離液を加えたＣ−８逆相カラム上、１３分間の線形勾配および８分間の定組成溶離、検出波長＝２４０ｎＭ）によって測定し、標題化合物の保持時間（Ｒｔ＝１０.２分）は非標識基準試料の保持時間と同じであった。ＥＳＩ質量スペクトルはm/z８６０amuにおいてプロトン化分子イオンを、そしてまたm/z８７７amu（Ｍ＋ＮＨ4+）および８８２amu（Ｍ＋Ｎａ+）において２つの他の特有のクラスターを示した。ＣＤＣｌ3中５００ＭＨｚで記録したＮＭＲスペクトルは、化学シフト（ppm）で表現される以下のシグナルを示した：8.24-8.36, m; 7.94-8.04, m; 7.64-7.85, m; 7.33-7.57, m;6.98, d; 6.30, s; 6.22-6.28, m; 5.78-5.85, dd; 5.68-5.74, d; 4.98, d; 4.96, d; 4.82, dd; 4.39-4.47, m; 4.34, d; 4.24, d; 3.84 d; 3.54, d; 2.53-2.64, m; 2.47, d; 2.41, s; 2.29-2.39, m; 2.27, s; 1.86-1.96, m; 1.83, d; 1.79, s; 1.71, s; 1.27, s; 1.17, s。２−[環−Ｕ−13Ｃ]−ベンゾイル−パクリタキセルの同位体濃縮は、質量分析による測定によれば９９％超であった。
【国際調査報告】
2005530715.tif 000013
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