(57)【要約】第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現を可能にする方法および組成物が提供される。より詳細には、ポリペプチドの高レベル発現を生じる改変された第ＶＩＩＩ因子を含む核酸配列およびアミノ酸配列を含む方法および組成物が提供される。本発明の方法および組成物は、例えば、血友病Ａを含む第ＶＩＩＩ因子欠乏症の処置において用途を見出す。配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に対する少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、高レベルの発現によって特徴づけられる、単離されたポリペプチドもまた提供される。
2005518783.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に対する少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ここで該ポリペプチドが、高レベルの発現によって特徴づけられる、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項４】
請求項２に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項５】
配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に対する少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、ここで該ヌクレオチド配列が、高レベル発現によって特徴づけられるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、以下：
ａ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に記載される配列を含むヌクレオチド配列；および
ｂ）  配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列、
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸分子を含むＤＮＡ構築物。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸分子を含むＤＮＡ構築物。
【請求項９】
請求項５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
請求項６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１１】
請求項５に記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項１２】
請求項６に記載の核酸分子を含む細胞。
【請求項１３】
請求項９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１４】
請求項１０に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１５】
ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、以下：
ａ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を細胞に導入する工程であって、ここで該配列が、該ポリペプチドをコードし、そして該ポリペプチドが高発現によって特徴づけられる、工程；および
ｂ）  前記ヌクレオチド配列の発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記核酸分子が、以下：
ａ）  配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列：
ｂ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に記載される配列を含むヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、請求項１６の方法。
【請求項１９】
細胞における第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現レベルを増加させる方法であって、以下：
ａ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記細胞に導入する工程であって、該配列が前記第因子ポリペプチドをコードし、該第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが高い発現によって特徴づけられる、工程；
ｂ）  前記核酸分子の発現を可能にする条件下で該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記核酸分子が、以下：
ａ）  配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列；および
ｂ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に記載される配列を含むヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドを単離する工程をさらに包含する、請求項２０の方法。
【請求項２３】
第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、該方法は、該処置を必要とする被験体に、治療有効量のポリペプチドを含む組成物を投与する工程を包含し、ここで該ポリペプチドは、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして該ポリペプチドが、高レベル発現によって特徴づけられる、方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第ＶＩＩＩ因子欠乏症を処置する方法であって、該方法は、該処置を必要とする被験体に、治療有効量の核酸分子を含む組成物を投与する工程を包含し、ここで該核酸分子は、配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ここで該核酸分子が高レベル発現によって特徴づけられる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで：前記核酸分子が、以下：
ａ）  配列番号１４、配列番号１６または配列番号１８に記載される配列を含むヌクレオチド配列；および
ｂ）  配列番号１５、配列番号１７または配列番号１９に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列を含むヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦によって後援された調査または発現
この仕事は、国立衛生研究所グラントＲＯ１  ＨＬ４０９２１で支えられた
技術分野
本発明は、再結合物分子生物学、特に修正された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドおよび使用方法の分野を関連づける。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
第ＶＩＩＩ因子は、血液凝固の固有の経路の積分要素として機能する大きい（〜  ３００ｋＤａ）グリコプロテインである。それは、Ａ１−Ａ２−Ｂ−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と称される一連の領域を含む。第ＶＩＩＩ因子のＢ領域に、周知の機能がなくて、凝固薬活動の損失なしに削除されることができる。減少されるか不完全な第ＶＩＩＩ因子タンパク質に結果としてなる第ＶＩＩＩ因子遺伝子の突然変異は遺伝病（血友病Ａ）を引き起こす。そして、それは再発する苦しい症状の発現によって特徴づけられる。血友病Ａの処置は、いずれのプラスマ派生または再結合物第ＶＩＩＩ因子もの静脈の注入を必要とする。      
【０００３】
。これは、次のことの故である。血友病の治療のための再結合物第ＶＩＩＩ因子の導入Ａ、供給は第ＶＩＩＩ因子が表されて、低レベルで中で回復したので、需要についていくように努めた異形である商業製造（ガーバーほか（２０００の）ネイチャーＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：１１３３）のために使用する哺乳類の細胞培養システム。加えて、血友病Ａ遺伝子治療裁判の間の第ＶＩＩＩ因子濃度は、表現レベルが制限する特徴であることを示す（ロス（ほか（２００１の）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．）Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４：１７３５−１７４２）．この課題の重要性は、低い第ＶＩＩＩ因子表現障壁を解決する重要な調査努力に結果としてなった。表現を制限するいくつかの要因は、低いｍＲＮＡレベルを含む識別された（ほか（１９９３の）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒにリンチを加える。４：２５９−２７２；Ｈｏｅｂｅｎほか（１９９５の）ブラッド８５：２４４７−２４５４；Ｋｏｅｂｅｒｌほか（１９９５の）Ｈｕｍ．遺伝子Ｔｈｅｒ．６：４６９−４７９）、タンパク質を有する相互作用は、付き添う、そして、非効率的な分泌（パイプほか（１９９８の）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８５３７−８５４４；Ｔａｇｌｉａｖａｃｃａほか（２０００の）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１９７３−１９８１；コーフマンほかブラッドＣｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８つの（１９９７の）Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ３−１４）、そして、フォン・ウィルブラント要因がない場合、急速な腐食‖（コーフマンほか（１９８８の）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．化学２６３：６３５２−６３６２およびコーフマンほか（１９８９の）Ｍｏｌ．細胞Ｂｉｏｌ．  ９：１２３３−１２４２）。Ｂ−領域の削除は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質製造を中で増やすことを示した異形であるシステム（トゥールほか（１９８６の）会報全米科学アカデミー米国８３：５９３９−５９４２）。人間の第ＶＩＩＩ因子のＢ−領域削除された形式（リントほか（１９９５の）Ｅｕｒ  ．Ｊ．生化学２３２：１９−２７）臨床用途のための承認する。    
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子規制に対するこれらの洞察にもかかわらず、表現が他の再結合物タンパク質より在宅中でかなり低くし続けること異形である商業製造において使用するシステム（コーフマンほか（１９９７の）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ。線維素溶解８つのＳｕｐｐｌ  ２：Ｓ３−１４）、ｅｘ−ｖｉｖｏに記載の同様に（ロス（ほか（２００１の）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．）Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４：１７３５−１７４２）、そして、活発な遺伝子工学療法アプリケーションの（Ｃｈｕａｈほか（１９９５の）Ｈｕｍ．遺伝子Ｔｈｅｒ．６：１３６３−１３７７）．方法および組成物は、第ＶＩＩＩ因子の増加する表現度のために必要とされる。    
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の開示
第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現度を考慮に入れる方法および組成物は、提供される。より具体的には、本発明はポリペプチドの高レベル発現度に結果としてなる修正された第ＶＩＩＩ因子を含む核酸およびアミノ酸配列から成っている方法および組成物を提供する。方法および本発明の組成は使用を第ＶＩＩＩ因子欠乏の治療で発見する。そして、例えば、本発明の特定の、唯一の実施例が配列番号に記載されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに提供する血友病Ａ．  Ｉｎを含む：１５、１７または１９；配列番号まで少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有しているアミノ酸配列：前記ポリペプチドが高レベル発現またはそれの断片によって特徴づけられる１５、１７または１９。    
【０００６】
本発明の他の一実施例において、単離された核酸分子は、配列番号に記載されるヌクレオチド配列から成って提供される：１４、１６または１８；アミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列は、配列番号において記載した：１５、１７または１９；そして、配列番号まで少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列：前記ヌクレオチド配列が高レベル発現によって特徴づけられるポリペプチドをコード化する１４、１６または１８。表現カセット、ベクターおよび本発明の核酸分子から成っている細胞は、更に提供される。
【０００７】
核酸分子を含む製薬組成物および本発明のポリペプチドは、また、提供される。    
【０００８】
ポリペプチドの生産のための方法は、提供される。一実施例において、方法が成り立つことアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列を含む核酸分子が配列番号に記載した細胞に、導く：１５、１７または１９；配列を含むヌクレオチド配列は、配列番号において記載した：１４、１６または１８；配列番号まで少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列：ヌクレオチド配列が高レベル発現またはそれの断片によって特徴づけられるポリペプチドをコード化する１４、１６または１８；そして、細胞を培養することは、ヌクレオチド配列の表明を可能にする適当な条件になる。    
【０００９】
Ａｌｓｏが提供した      は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの表現度のレベルを増やす方法である。一実施例において、方法が成り立つことアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列を含む核酸分子が配列番号に記載した細胞に、導く：１５、１７または１９；配列を含むヌクレオチド配列は、配列番号において記載した：１４、１６または１８；配列番号まで少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列：ヌクレオチド配列が高レベル発現またはそれの断片によって特徴づけられるポリペプチドをコード化する１４、１６または１８；そして、細胞を培養することは、ヌクレオチド配列の表明を可能にする適当な条件になる。    
【００１０】
また、血友病Ａを含む、例えば、第ＶＩＩＩ因子欠乏の治療のための方法は、提供される。方法には、管理することが設けられて、中で主題が、それについてポリペプチドが配列番号に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療として効果的量を含む組成物を必要とするように構成されている。１５、１７または１９（少なくとも８５％を有するアミノ酸配列）９０％、９５％、９７％、９８％または配列番号に対する９９％の配列同一性：前記ポリペプチドが高レベル発現またはそれの断片によって特徴づけられる１５、１７または１９。
【００１１】
方法が主題に貢献することによって第ＶＩＩＩ因子欠乏を治療することを含むもう一方はそれについて核酸分子の治療として効果的量を含む組成物を必要とする。ここで、前記核酸分子は配列番号に記載されるヌクレオチド配列を含む：１４、１６または１８；アミノ酸配列を含むポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列は、配列番号において記載した：１５、１７または１９；配列番号まで少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列：前記核酸分子が高レベル発現またはそれの断片によって特徴づけられるポリペプチドをコード化する１４、１６または１８。
発明の詳細な説明
概要
本発明は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現度を考慮に入れる方法および組成物を提供する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、以下の命名法を有する異体同形定義のタンパク質領域を含む：Ａ１−Ａ２−Ｂ−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２。本発明は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高水準表明を促進する人間外の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの領域の中で、地方を識別した。より詳しくは、豚のようなものの領域は、ＶＩＩＩポリペプチドを因数に分解するそのは、Ａ１およびａｐ−Ａ３領域、そして、異型、そして、豚のようなものにとって両方とも、高水準式を伝える断片が、それについて識別されたと人間の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドとを備える。本発明は、このように高レベル発現および作動中の異型を伝える人間外の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列を使用する方法および組成物を提供するかまたは、コード化された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現度に結果としてなる修正された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコード化している核酸およびポリペプチド・配列を建設するために、これらの配列の中で分解する。高レベル発現によって特徴づけられる修正された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、本願明細書において「要因ＶＩＩＩＳＥＰ」（表面のＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）と称される。
【００１２】
同じ状況の下で表される対応する人間の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの表現レベルと比較して増加するレベルのポリペプチドの生産は「高レベル発現」によって意味される。ポリペプチド濃度（すなわち、高レベル発現）の増加には、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０倍以上で最も少なくあたりを、要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドの表現度が、匹敵したが設けられて、対応する人間の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの表現レベルように構成されている。あるいは、対応する人間の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドと比較して「高レベル発現」は少なくとも増加を１−２５折り目、１−５折り目、５−１０折り目、１０−１５折り目、１５−２０折り目、２０−２５折り目または要因ＶＩＩＩＳＥＰのより大きな表現レベルのポリペプチド表現レベルに含むことができる。「高レベル発現」を検定する方法は、従来技術においてルーチンであって、更に詳細に下で概説される。
【００１３】
等価なアミノ酸配列を含む第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、「対応する」第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドによって意味される。たとえば、Ａ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２領域を含む修正された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが高レベル発現用に試験されるときに、対応する領域を含んでいる人間であるか豚のような第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが使われる（すなわちＡ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）。修正された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの断片が高レベル発現（すなわちＡ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３）用に試験されるときに、対応する領域を有する人間であるか豚のような第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは試験される（すなわちＡ１−Ａ２−ａｐ−Ａ３）。    
【００１４】
本発明の組成物          Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓは、高レベル発現によって特徴づけられる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコード化している核酸分子を含む。更なる詳細において下で概説する‖豚のような第ＶＩＩＩ因子のＡ１領域（配列番号のアミノ酸残り２０−３９１：１９）、そして、豚のような第ＶＩＩＩ因子のａｐ−Ａ３領域‖（配列番号のアミノ酸１４５０−１８２０：１９）要因ＶＩＩＩ．の高水準表明のための許す本発明は、このように方法および要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドおよび作動中の異型を含む組成物および高レベル発現によって特徴づけられる要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドの活発な断片を提供する。    
【００１５】
特定の          Ｉｎ（発明がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳに示されるアミノ酸配列をコード化しているヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に提供する現在）：１５、１７または１９、そして、活発な断片またはそれの作動中の異型。また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳに記載されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子は、提供される：１４、１６または１８、そして、活発な断片またはそれの作動中の異型。更に、実施例（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳに記載されるそれら）のために、本願明細書において記載されている核酸分子によってコード化されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、提供される：１５、１７、そして、１９、そして、活発な断片およびそれの作動中の異型。    
【００１６】
表１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳにおいて提供される配列の構造の概要を提供する：１４−１９、下に書かれた「Ｐ」が豚のような第ＶＩＩＩ因子および下に書かれた「Ｈ」から領域を示すところは、人的要因ＶＩＩＩ．から領域を示す。    
表１。Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅの概要
【００１７】
【表１】
2005518783.tif 000003
本発明は、単離されたかかなり精製された核酸またはタンパク質組成物を含む。ｇｉｓｏｌａｔｅｄされたｈまたはｇｐｕｒｉｆｉｅｄされたｈ核酸分子、または、実質的にか再結合物技術によって生じるときに、タンパク質またはそれの生物学上活発な部分は他の細胞材料または培養基からかなり自由である化学前駆体または他の化学製品の自由な総合されて化学的に。好ましくは、ｇｉｓｏｌａｔｅｄされたｈ核酸は、当然核酸の側面に位置する配列（好ましくは配列をコード化しているタンパク質）から自由である（配列が位置決めをして、すなわちで５』、そして、３』核酸の端）核酸が誘導される有機体のゲノムＤＮＡの。例えば、さまざまな実施例で、単離された核酸分子は約５ｋｂ未満、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂを含むことができる、または、０．１ｋｂの自然に核酸がある細胞のゲノムＤＮＡの核酸分子の側面に位置するヌクレオチド配列は由来した。２０％、細胞材料からかなり自由であるタンパク質は、５％、タンパク質を汚染する１０％（乾燥した重量によって）、約３０％未満を有するタンパク質の準備を含む。本発明のタンパク質またはそれの生物学上活発な部分がｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙに生じるときに、好ましくは、培養基は約３０％未満、２０％、１０％または化学前駆体またはｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｏｆ−ｉｎｔｅｒｅｓｔな化学製品の５％（乾燥した重量によって）を表す。  
【００１８】
断片およびＶＩＩＩＳＥＰヌクレオチド配列およびタンパク質がそれによってコード化した開示された要因の異型は、また、本発明によって含まれる。配列およびそれゆえに、タンパク質がそれによってコード化した一部のヌクレオチド配列または一部のアミノ酸は、ｇｆｒａｇｍｅｎｔ  ｈによって意味される。ヌクレオチド配列の断片は、配列番号に記載されるポリペプチドの生物学的活動を保持するタンパク質断片をコード化することができる：１５、１７または１９、そして、それゆえに、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現度によって特徴づける。このように、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１０、約２０のヌクレオチド、約５０のヌクレオチド、約１００のヌクレオチド、約５００のヌクレオチド、約１０００のヌクレオチド、約２０００のヌクレオチド、約３０００のヌクレオチド、約４０００のヌクレオチド、約５０００のヌクレオチド、約６０００のヌクレオチド、約７０００のヌクレオチド、約８０００のヌクレオチドから、そして、９０００のヌクレオチドについて本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコード化しているノーカット・ヌクレオチド配列まで変動することができる。    
【００１９】
本発明の要因ＶＩＩＩＳＥＰタンパク質の生物学上活発な部分をコード化する本発明のヌクレオチド配列の断片は、少なくとも１２の、２５の、３０の、５０の、１００の、１５０の、２００の、３００の、４００の、５００の、６００の、７００の、８００の、９００の、１０００の、１１００の、１２００の、１３００の、１４００の、１５００の、１６００の、１７００の、１８００の、１９００の、２０００の、２１００の、２２００の、２３００の隣接するアミノ酸をコード化するかまたはアミノ酸の総数まで本発明の全身の第ＶＩＩＩ因子タンパク質において現れる（例えば、配列番号のための１４５７か、１４６７か１４６７のアミノ酸：１５、１７またはそれぞれ１９）、そして、意志‖第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現度を可能にする。  
【００２０】
ｇｖａｒｉａｎｔによって、ｈは意図されたかなり類似した配列である。ヌクレオチド配列のために、保守的な異型は、遺伝暗号の変質を原因として生じるので、本発明のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコード化するそれらの配列を含む。例えば発生するそれらのような、異型ヌクレオチド配列は合成的に派生ヌクレオチド配列を含む、を用いて部位特異的変異誘発、わずかにいずれがまだ高レベル発現によって特徴づけられる要因ＶＩＩＩＳＥＰタンパク質をコード化する。通常、本発明の特定のヌクレオチド配列の異型は、少なくとも少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％を有する、そして、より好ましくは、９８％、９９％または配列配置プログラムによって定まるその特定のヌクレオチド配列に対する識別が本願明細書において他の場所で記載したより多くの配列について、９７％、９６％。  
【００２１】
配列番号のポリペプチドに由来するタンパク質は、ｇｖａｒｉａｎｔなｈタンパク質によって意味される：１５、１７または一つ以上のアミノ酸の削除（いわゆる打ちきり）または加算によって１９ためにＮ末端基および／またはＣ末端であるタンパク質の端；削除またはタンパク質の一つ以上のサイトの一つ以上のアミノ酸の追加；またはタンパク質の一つ以上のサイトの一つ以上のアミノ酸の置換。本発明によって含まれる異型タンパク質は生物学上活発である、すなわち、それらは配列番号の所望の生物学的活動を所有し続ける：１５、１７または１９、それゆえに、それらは第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現度を考慮に入れ続ける。例えば、この種の異型は、遺伝子の多形性からまたは人間の操作から生じることができる。本発明のポリペプチドの生物学上作動中の異型は、配列番号のためのアミノ酸配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより多くの配列同一性を有する：１５、１７または配列配置プログラムによって定まる１９は、デフォルトのパラメータを本願明細書において使用しているどこか他の所を記載した。本発明のタンパク質の生物学上作動中の異型は、１−１００と同程度少ないもの、１−５０、１−２５、１−１５のアミノ酸残り、１−１０（例えば６−１０、わずか５、わずか４、３、２または１つのアミノ酸残りさえ）と同程度少ないによってそのタンパク質と異なることができる。
【００２２】
本発明の要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドの生物学的活動は、公知技術のいかなる方法にもよって検定されることができる。上記のように、本発明の要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドは、高レベル発現によって特徴づけられる。高レベル発現を測定する分析は、従来技術において周知である。要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドの表現度のレベルが西洋の汚点分析で測定されることができて、例えば、または、ＥＬＩＳＡ。例えば、他の方法は３５Ｓ−メチオニンを有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを表している細胞系にラベルをつけることを含む。そして、放射性同位元素で識別された第ＶＩＩＩ因子分子の免疫沈降が続く。あるいは、要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドの表現度のレベルは、第ＶＩＩＩ因子の活動を測定することによってポリペプチドのために検定されることができる。例えば、増加する第ＶＩＩＩ因子表現は公知技術の標準の分析を使用している第ＶＩＩＩ因子活動を測定することによって検定されることができた。そして、唯一の段階凝固分析または二段階活動分析を含んだ。アメリカ特許番号を参照６，４５８，５６１、そして、下でＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ断面。    
【００２３】
一時的に、凝固分析は、血友病Ａ．患者に由来するプラスマの凝固している時間を短くするために第ＶＩＩＩ因子の能力に基づく。例えば、唯一の段階分析で、０．１ｍｌの血友病Ａプラスマ（ジョージ・キングＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ社）は、動作中の部分的な０．１ｍｌのトロンボプラスチン試薬（ＡＰＴＴ）（原則Ｔｅｋｎｉｋａ）および０．０１ｍｌのサンプルによって暖められるかまたは、３７の５分間、希釈された、ｃｉｔｒａｔｅｄされた通常の人間のプラスマからなる、標準である水浴のＣ。潜伏の後に２０の０．１ｍｌのｍＭ  ＣａＣｌ２の追加が続く、そして、フィブリン凝血塊の発現のための時間は視覚の点検で測定される。第ＶＩＩＩ因子の装置は、１ｍｌのｃｉｔｒａｔｅｄされた通常の人間のプラスマに存在する量として定義される。    
【００２４】
唯一の段階分析は血友病Ａプラスマにおいて形成される活性剤によって、第ＶＩＩＩ因子の内在性起動に依存するのに、二段階分析はｐｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄされた第ＶＩＩＩ因子のｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔな活動を測定する。二段階分析において、トロンビンと作用される第ＶＩＩＩ因子を含んでいるサンプルが３７分に５分間ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｅｄされる動作中の部分的なトロンボプラスチンおよび人間の血友病Ａプラスマの混成に加えられることＣ．上記した同じ人間の標準のカーブに基づいて、結果として生じる凝固している時間は、装置／ｍｌに変わる。米国特許第６，３７６，４６３号参照。
【００２５】
本発明の要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドは、アミノ酸置換、削除、打ちきりおよび挿入を含むさまざまな方法で変えられることができる。この種の操作のための方法は、従来技術において一般に公知である。例えば、要因ＶＩＩＩＳＥＰタンパク質のアミノ酸配列異型は、ＤＮＡの突然変異によって準備されることができる。突然変異生成およびヌクレオチド配列変更のための方法は、公知技術である。キュンケル（１９８５の）会報全米科学アカデミーＵＳＡ  ８２：４８８−４９２参照；Ｅｎｚｙｍｏｌ．のキュンケルほか（１９８７の）Ｍｅｔｈｏｄｓ１５４：３６７−３８２；米国の特許番号４，８７３，１９２；ウォーカーおよびＧａａｓｔｒａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（会社（ニューヨーク）をＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇしているマクミラン）およびその中の引例の編集（１９８３の）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。要因ＶＩＩＩＳＥＰの生物学的活動（すなわち高レベル発現）に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスが、デイホフその他（１９７８）のモデルにおいて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅのアトラスであるとわかることができる（国家は、Ｂｉｏｍｅｄした。物。Ｆｏｕｎｄ．、ワシントン、Ｄ．Ｃ．）、本願明細書において、参照によって組み込まれる。１つのアミノ酸を有している類似した他の特性と交換することのような、保守党の置換は、好まれることができる。あるいは、Ａ１および要因ＶＩＩＩＳＥＰのａｐ−Ａ３領域の豚のようなアミノ酸の数を最小化して、まだ要因ＶＩＩＩＳＥＰの高水準表明を保持し続ける方法は、公知技術である、そして、例えば、含む決める例えば本願明細書において記載されているどこか他の所として重複拡張を継ぐことによって部位特異的変異誘発。明らかに、異型をコード化しているＤＮＡにおいてなされる突然変異は、読出フレームからの配列を配置してはならなくて、好ましくは第２のｍＲＮＡ構造を産生することができた補完的な地方をつくらない。見る、ＥＰ特許出願公開番号７５，４４４。
【００２６】
そうすることに先立って置換、削除または挿入の正確な効果を予測することはむずかしいときに、当業者は効果が分析を隠しているルーチンによって評価されると認める。すなわち、活動は本願明細書において詳述するどこか他の所として第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの高レベル発現度によって評価されることができる。
【００２７】
Ｂｙ「配列同一性」は意味される。そして、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残留物は異型のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の指定された、隣接する部分が整列配置される異型配列および参照配列の範囲内で、そして、参照配列のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列と比較して見つかる。配列配置のための、そして、配列間の識別を決定するための方法は、公知技術である。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの編集（１９９５の）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓは、知る（例えばオースベルその他）  ―  第１９章（Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇしているグリーンおよびワイリー−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（ニューヨーク））以下の通りそして、ＡＬＩＧＮプログラム‖（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５のアトラスのデイホフ（１９７８）：ｓｕｐｐｌ．３（全国Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ財団、ワシントン、Ｄ．Ｃ．）。２つのヌクレオチド配列の最適配置に関して、異型ヌクレオチド配列の隣接する部分は、追加的なヌクレオチドを有することができるかまたは参照ヌクレオチド配列に関してヌクレオチドを削除した。同様に、２つのアミノ酸配列の最適配置のために、異型アミノ酸配列の隣接する部分は、追加的なアミノ酸残りを有することができるかまたは参照アミノ酸配列に関してアミノ酸残りを削除した。参照ヌクレオチド配列または参照アミノ酸配列に比較のために使用される隣接する部分は、少なくとも２０の隣接するヌクレオチドまたはアミノ酸残りから成って、３０、４０、５０、１００またはより多くのヌクレオチドまたはアミノ酸残留物であってもよい。異型のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の隙間の包含に伴う増加する配列同一性のための修正は、すきま刑を割り当てることによってなされることができる。配列配置の方法は、公知技術である。
【００２８】
２つの配列間のパーセント識別の判定は、数学的アルゴリズムを使用して達成される。具体的には、１２のすきま開いた罰則および２のすきま拡張刑を有する姻戚６つのすきま検索を使用しているスミス−ウォーターマン異体同形検索アルゴリズムを使用することは、アミノ酸配列の本発明パーセント・アイデンティティのために決定される、ＢＬＯＳＵＭマトリックス６２。スミス−ウォーターマン異体同形検索アルゴリズムは、スミスてウォーターマン（１９８１の）Ａｄｖにおいて教示される。出願Ｍａｔｈ  ２：４８２−４８９（本願明細書において引用したものとする）。あるいは、２５のすきま開いた罰則および５のすきま拡張刑を使用しているスミス−ウォーターマン異体同形検索アルゴリズムを使用することは、ヌクレオチド配列の本発明パーセント・アイデンティティのために決定される。配列同一性のこの種の決定は、例えば、ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ．からＤｅＣｙｐｈｅｒ  Ｈａｒｄｗａｒｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒを使用して実行されることができる    
アミノ酸識別のパーセンテージを考慮するときに、若干のアミノ酸位置が保守的なアミノ酸置換の結果として、異なることができると更に認識される。そして、それはポリヌクレオチド機能のプロパティを遂行しない。これらの例において、パーセント・配列同一性は、上方を保守的に置換されたアミノ酸の類似性を説明するように調整されることができる。この種の調整は、公知技術である。Ａｐｐｌｉｃなメイヤーズほか（１９８８の）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ参照。生物学科学４：１１−１７．
本発明の配列の異型がＡ１Ｐのアミノ酸残りだけを含む要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに高レベル発現を与えるａｐ−Ａ３Ｐ領域をコード化することができると認識される。従って、高レベル発現を保持することを必要とする残りだけが要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドにおいて保持されるように、Ａ１ＰおよびＡ３Ｐ領域は次第に人間らしくされることができる。この種の方法は、当業者によって公知で、更に更に詳細に下で議論される。例えば、アメリカ特許数字は、また、知る６，３７６，４６３；６，４８，５６３；５，７４４，４６６；５，８８８，９７４；５，６６３，０６０；５，３６４，７７１；５，８５９，２０４；そして、６，１８０，３７１以下の通りいずれが本願明細書において引用したものとするか全て。加えて、人間の第ＶＩＩＩ因子Ａ１−Ａ２  Ａ３領域の三次元モデルが領域インタフェースから離れて地方を識別するために用いることができると認識される。技術のうちの１つは、人間化のための目標アミノ酸残りを識別するためにこのモデルを使用することが可能である。    
【００２９】
Ｉｔは、認識される異型が、ＶＩＩＩＳＥＰを因数に分解するまたはそれの断片が、単離された、プラスマから派生した動物の置換によって、対応する人間のサブユニットまたは動物のサブユニットのためのサブユニットまたは人間のサブユニット（重いか軽いチェーン）とされることができる（１）；人間の領域の置換または対応する動物の領域または人間の領域のための動物の領域（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、Ｃ１およびＣ２）のそばの（２）；人間の領域の一部の置換または動物の領域または人間の領域の一部のための動物の領域のそばの（３）；対応する動物または人間のアミノａｃｉｄ（ｓ）のための一つ以上のユニークな人間であるか動物のアミノａｃｉｄ（ｓ）を含んでいる少なくとも一つの特定の配列の置換による（４）；または一つ以上の特定のアミノ酸ｒｅｓｉｄｕｅ（ｓ）を人間であるか、動物性であるか異なる第ＶＩＩＩ因子に含んでいる少なくとも一つの配列のための第ＶＩＩＩ因子に対する周知の配列同一性を有しないかまたはそれについて分解しないアミノ酸配列の置換による（５）。個々のアミノ酸代わりは、あることができる行われている部位特異的変異誘発対応する部分符号化ＤＮＡの。    
【００３０】
Ｉｎ第ＶＩＩＩ因子分子（「領域」）本願明細書において使用する、内部アミノ酸配列によって定義されるアミノ酸の連続配列は、トロンビンによるタンパク質分解裂開の識別およびサイトである。特に明記しない限り、第ＶＩＩＩ因子領域は、以下のアミノ酸残りを含む、配列が人間のアミノ酸配列に合わせられる、（配列番号：６）：Ａ１（残りＡｌａ１−Ａｒｇ３７２）；Ａ２（残りＳｅｒ３７３−Ａｒｇ７４０）；Ｂ（残りＳｅｒ７４１−Ａｒｇ１６４８）；Ａ３（残りＳｅｒ１６９０−Ｉｌｅ２０３２）；Ｃ１（残りＡｒｇ２０３３−Ａｓｎ２１７２）；Ｃ２（残りＳｅｒ２１７３−Ｔｙｒ２３３２．）Ａ３−Ｃ１−Ｃ２配列は、残りＳｅｒ１６９０−Ｔｙｒ２３３２を含む。残留する配列（残りＧｌｕ１６４９−Ａｒｇ１６８９）は、通常第ＶＩＩＩ因子軽鎖起動ペプチドと称する。第ＶＩＩＩ因子はトロンビンまたは要因Ｘａによってｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙに起動する。そして、ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔな機能を有する第ＶＩＩＩ因子を形成して、それはフォン・ウィルブラント要因からそれを分離する。要因ＶＩＩＩａの生物学的機能は、数桁要因Ｘ起動の方へ要因ＩＸａの触媒効率を増やすことである。トロンビン−動作中の要因ＶＩＩＩａは１６０のｋＤａ  Ａ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２であるヘテロトリマ、複合体を小板の表層または単球上の要因ＩＸａおよび要因Ｘにより形成する。「部分的な領域」本願明細書において使用する、アミノ酸の連続配列は、領域の一部を形成する。本願明細書において使われるように、人間であるか動物性（すなわちマウス、ブタ、イヌその他）第ＶＩＩＩ因子の「サブユニット」はタンパク質の重鎖および軽鎖である。第ＶＩＩＩ因子の重い連鎖は、３つの領域、Ａ１、Ａ２およびＢを含む。第ＶＩＩＩ因子の軽い連鎖も、３つの領域、Ａ３、Ｃ１およびＣ２を含む。本願明細書において使われるように、「ユニークな」アミノ酸残りまたは配列は相応する残りと異なる１つの種または他の種の第ＶＩＩＩ因子分子の配列の第ＶＩＩＩ因子分子のアミノ酸配列または残りに関連する。ここで使用しているように、「哺乳類の第ＶＩＩＩ因子」は、特に明記しない限り、いかなる人間外の哺乳類にも由来するアミノ酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子を含む。本願明細書において使われるように、「動物」はブタおよび他の人間外の哺乳類に関連する。
【００３１】
Ｓｉｎｃｅ電流情報はＢ領域に抑制エピトープがなくて、第ＶＩＩＩ因子機能に周知の影響を及ぼさないことを示す、本発明の要因ＶＩＩＩＳＥＰ異型はＢ領域またはそれの部分を有することができる。加えて、要因ＶＩＩＩＳＥＰ異型は、また、豚のようであるか人間の第５因子からＢ−領域を有する第ＶＩＩＩ因子Ｂ−領域を有することができる。アメリカ特許番号を参照５，００４，８０３。要因ＶＩＩＩＳＥＰまたはそれの断片が本願明細書において使われるように、要因ＶＩＩＩＳＥＰが造る異型の誰にも任せる「Ｂ−ｄｏｍａｉｎｌｅｓｓ」異型は、本願明細書においてそれを記載したＢ領域またはそれの部分を欠いている。  
【００３２】
技術の          Ｏｎｅは、従来技術において、個々のサブユニット、領域または動物であるか人間の第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの領域の連続一部がクローンをつくられて、それによって、そして、確立した突然変異生成技術によって対応する人間であるか豚のようなサブユニット、領域または領域の一部と置換されることができる技術が要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型を生成するかまたはそれについて分解することを知っている。例えば、リュバンほか（１９９４の）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．化学２６９（１２）：８６３９−８６４１は、豚のようなＡ２領域を便利な制限部位を使用している人間の領域と置換することの技術を記載する。他の種の第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのための１つの種の第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡの領域を置換することのための他の方法は、重複拡張（「ＳＯＥ）によって継ぐことを含むホートンその他（１９９３）によって記載するメソジストＥｎｚｙｍｏｌ  ２１７：２７０−２７９。
ＤＮＡ構築物およびベクター
要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドまたは作動中の異型をコード化している          Ｔｈｅヌクレオチド配列またはそれの断片は、ＤＮＡ構築物に含まれることができる。所望の細胞タイプの要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドの表現度をドライブするウィルスで哺乳類のソースから、ＤＮＡ構築物は、様々なエンハンサ／プロモータを含むことができる。ＤＮＡ構築物は、更に３を含むことができる』ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇするのを容易にする監査機関配列および核酸配列、そして、ＤＮＡの回復。    
【００３３】
Ｔｈｅ転写プロモータおよび要求される場合転写エンハンサ要素は、使用可能な状態で第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの核酸配列に連結される。ｇｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｈは、核酸配列の転写を導くのに十分である最小のＤＮＡ配列として定義される。ｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌなエンハンサ要素ｈは、隣接した遺伝子の書換えを刺激する監査機関ＤＮＡ配列に関連する。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコード化している核酸配列は、使用可能な状態でプロモータ・配列に連結される。Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０の）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ参照：Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（アカデミック・プレス、サンディエゴ、ＣＡ）における方法。
【００３４】
Ｂｙ  ｇｏｐｅｒａｂｌｙな連結されたｈは、意味される第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコード化している監査機関プロモータおよび核酸配列間の機能的な結合。適当な転写活性剤タンパク質があるときに、機能的な結合は第ＶＩＩＩ因子の遺伝子表現度ができるようにする。
【００３５】
Ｔｈｕｓ、ＤＮＡ構築物は、含むことができる固有でもよいか外国人のでもよいプロモータ。ｇｆｏｒｅｉｇｎ  ｈによって、それは自国の有機体で見つからない配列を定められる。さらに、転写監査機関要素が、あってもよい異形である要因ＶＩＩＩ．をコード化しているヌクレオチド配列に第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコード化している配列の上流で自然に分からないいかなるヌクレオチド配列も、ｇｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓなｈによって意味される。プロモータは、自然な配列または合成配列であってもよい。加えて、プロモータは構成的に能動態（組織特性）であってもよい、または、誘導性である。起動する所で、組織に特有のプロモータは与えられた組織において優先して起動して、組織の遺伝子製品の表現度に結果としてなる。    
【００３６】
Ｆｏｒが哺乳類の細胞において使用する、プロモータがそうすることができる      は、ウイルスに由来する。例えば、共通して使うプロモータは、ポリオーマ、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０（ＳＶ４０）およびＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ２に由来する。アデノウイルスの主な遅いプロモータであるにつれて、ＳＶ４０ウイルスの初期で遅いプロモータは役立つ。更に、それはまた、可能で、通常所望の遺伝子配列をこの種の制御配列が宿主細胞システムと互換性を持つならば、伴うプロモータまたは対照配列を利用するために、しばしば望ましい。
【００３７】
Ｉｎ特定の実施例、細胞に第ＶＩＩＩ因子をコード化しているヌクレオチド配列の導入は、試験管内で識別されることができるかまたは標識をＤＮＡ構築物に含むことによって生体内である。標識は、遺伝的に変わる細胞の定義可能な変化に結果としてなる。薬選択標識は、例えばネオマイシン（ピューロマイシン）を含むハイグロマイシン（ＤＨＦＲ）ＧＰＴ、ｚｅｏｃｉｎ、そして、ヒスチジノール。あるいは、単純疱疹ウイルス・チミジン・キナーゼ（ＴＫ）または免疫学的標識のような酵素が、使われることができる。選択可能な標識の更なる実施例は、公知技術である。
【００３８】
多数の変更が本発明の方法で使用されるＤＮＡ構築物の設計のために想像されることができるために、Ｉｔは認識される。たとえば、構築物は相応するか特定地域向けの組換えシステム（すなわちＣｒｅまたはＦＬＰ組換えシステム）を使用している要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列の挿入のために設計されることができる。
【００３９】
Ｔｈｅ  ＤＮＡ構築物がそうすることができるも、共同宿主細胞にもたらす少なくとも一つの追加的な遺伝子を含む。    
【００４０】
本発明のヌクレオチド配列は、表現ベクターに含まれることができる。「表現ベクター」は、ＤＮＡ要素であるしばしば、所望の宿主細胞において独立して複製するかまたは宿主細胞ゲノムに統合される能力を有して、更に、例えば、適当なサイトにベクター・配列に嵌入される符号化ＤＮＡの、そして、適当な方位の表現ができるようにする特定の周知の特徴を備えて、円形の構造の。この種の特徴は、符号化ＤＮＡおよび他のＤＮＡ要素（例えばエンハンサ）の直接の転写開始に、一つ以上のプロモータ・配列を含むが、これに限定されるものではなくなることができるポリアデニル化サイトなど、同様に公知技術の全部。    
【００４１】
プラスミドおよび真核生物ウィルス・ベクターを含んで、          Ｏｔｈｅｒベクターは、優先および熟練した実務家の判断に従い真核生物細胞の再結合物遺伝子構築物を表すために用いることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋその他参照、第１６章）。例えば、多くのウィルス・ベクターがレトロウイルスを含む公知技術で、例えばアデノ随伴ウイルス、そして、アデノウイルス。細胞への遺伝子の導入に役立つ他のウイルスは、含む、しかし、制限する（ヘルペス・ウイルス）耳下腺炎ウイルス、ポリオウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスおよび痘疹ウイルス（例えばカナリア色の痘瘡ウイルス）。複製が不足しているウィルス分子を産生するための、そして、ウィルス・ゲノムを操るための方法は、周知である。実施例のために、ローゼンフェルドその他（１９９１）は知るサイエンス２５２：４３１−４３４、ローゼンフェルドその他（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５および米国特許第５，８８２，８７７号（アデノウイルス）；米国特許第５，１３９，９４１号（アデノ随伴ウイルス）；米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，６８１，７４６号、そして、ミラーその他（１９９３）Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１７のＭｅｔｈｏｄｓ：５８１（レトロウイルス）いずれが本願明細書において引用したものとするか全て。したがって、従来技術において知識を与えられて、ウィルス・ベクターは、細胞に第ＶＩＩＩ因子配列の導入ために、直ちに造られることができる。他のベクターおよび表現システム以下を含む細菌（イースト）、そして、昆虫細胞システム、使用されることができて、しかし、中で違いにより好まれなくてまたは欠如するの、グリコシル化。
【００４２】
本発明のＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩポリペプチドは、培養組織て再結合物哺乳類のタンパク質表現のために、共通に使用される様々な細胞において表されることができる。特に、多くの齧歯目の細胞系が、大きいタンパク質の表現度のための特に役立つホストであるとわかった。好適な細胞系（アメリカのＴｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、メリーランドから入手可能な）は、ルーチン手順およびメディアを使用して培養される小型のハムスター腎臓電池およびｃｈｉｎｅｓｅハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含むが、これに限定されるものではない。重要な追加的な細胞は、脊椎動物細胞（例えばＶＥＲＯ、ヒーラー細胞、Ｗ１３８、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系）を含むことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋほか（１９８９の）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒクローニングの章１６および１７は、他の適切な表現システムのために見える：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙマニュアル（２ｄの編集、コールドスプリングハーバーＬａｂｏｒａｔｏｒｙプレス、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）。見る、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＧｏｅｄｄｅｌ（１９９０）：Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（アカデミック・プレス、サンディエゴ、ＣＡ）における方法。    
表現および隔離の方法
本発明の          Ｔｈｅ  ＤＮＡ構築物は、細胞に導入されることができる（原核、または、真核生物である）標準の方法によって。ここで使用しているように、条件「変換」および「トランスフェクション」は、ＤＮＡを宿主細胞にもたらすために様々な技術認識された技術に関連することを目的とする。例えば、ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｐｏｌｙｂｒｅｎｅを含むがこれに限らず、この種の方法は、トランスフェクションを含むＤＥＡＥデキストランによって媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション（リン酸カルシウム沈殿）顕微鏡下注射または速度被駆動ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ（ｇｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ  ｈ）。この種の技術は、当業者によって周知である。見る、ＣｌｏｎｉｎｇしているＳａｍｂｒｏｏｋほか（１９８９の）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎａｕａｌ（２編集コールドスプリングハーバーＬａｂプレス、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）。あるいは、１は遺伝子交付車両のＤＮＡ構築物を届けるシステムを使用することができた。遺伝子交付車両は、ウィルスでもよいか化学製品でもよい。さまざまなウィルス遺伝子交付車両が、本発明によって使われることができる。一般に、ウィルス・ベクターは、自然に起こっているウイルスに由来するウィルス分子を含む。自然に起こっているウイルスは、不完全な複製であるために遺伝子が組み替えられていて、追加的な伝染性のウイルスを生成しない。ウィルス・ベクターも、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を表すことができるＤＮＡ構築物を含む。
【００４３】
要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化している核酸配列を含んでいる          Ｔｈｅ  ＤＮＡ構築物は、また、非ウィルス遺伝子交付車両によって、細胞に与えられることができる。例えば、この種の化学遺伝子交付車両はＤＮＡ−を含む、または、ＲＮＡ−ｌｉｐｏｓｏｍｅは公式化または裸のＤＮＡを合成する。ワングその他（１９８７）を参照会報全米科学アカデミー米国８４：７，８５１、米国特許第５，８４４，１０７号、米国特許第５，１０８，９２１号およびワグナー‖その他（１９９１）会報全米科学アカデミー米国８８：４２５５−４２５９（いずれが本願明細書において引用したものとするか全て）。    
【００４４】
Ｉｔは認識される。そして、要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドまたは異型を導く方法または細胞にそれの断片は細胞ゲノムまたは一時的な、ｅｐｉｓｏｍａｌな表現へのいずれの安定した統合にも結果としてなることがありえる。
【００４５】
本願明細書において定められる          Ａｓ、要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドまたは断片をコード化しているＤＮＡの「表現製品」またはそれの異型は適切な宿主細胞の参照されたＤＮＡの表現度から得られる製品である。そして、ｐｒｅ−のこの種の特徴または、グリコシル化、タンパク質分解裂開などを含むがこれに限らず、参照されたＤＮＡによってコード化されるタンパク質の翻訳後の変更態様を含む。この種の変更態様が起こることができて、宿主細胞タイプおよび他の要因によって、いくぶん異なることができて、ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔな活動の保持については、製品の分子のｉｓｏｆｏｒｍｓに結果としてなることがありえることは、公知技術である。リントその他参照、（１９９５の）ヨーロッパ人。Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３２：１９２７は、ここにて結合した。
【００４６】
Ｉｎ  １つの一実施例（要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型をコード化しているｃＤＮＡまたはそれの断片）は、哺乳類の表現ベクター（例えばＲｅＮｅｏ）に嵌入される。要因ＶＩＩＩＳＥＰの事前の特徴描写は、ＣＯＳ−７細胞の要因ＶＩＩＩＳＥＰ構築物を含んでいるＲｅＮｅｏ表現ベクターの一時的な表現によって達成される。活性要因ＶＩＩＩＳＥＰタンパク質が表されるかどうかの、判定がそれからなされることができる。表現ベクター    構築物は、更に安定してリポソームによって媒介されるトランスフェクション（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ．ＴＭ．（ライフＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社））のような培養組織（例えば従来技術においてルーチンである方法を用いて小型のハムスター腎臓電池）の細胞をトランスフェクションさせるために用いる。例えば、要因ＶＩＩＩＳＥＰタンパク質の表現度は、塩基配列決定（ノーザンおよび西側に拭く）によって確認されることができるまたはポリメラーゼ連鎖反応‖（ＰＣＲ）。    
【００４７】
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドまたは断片、または、タンパク質を安定して表しているトランスフェクションする細胞が維持される培養メディアでそれの異型は沈殿することができて、小球をぶつけられることができて、洗われることができて、適当なバッファおよび要因ＶＩＩＩＳＥＰタンパク質において再懸濁されることができる、または、異型またはそれの断片は標準の技術によって純化される免疫親和性、例えば、単クローンａｎｔｉ−Ａ２−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用しているクロマトグラフィ
本願明細書において使われるように、          Ａ「融合タンパク質」または「融合要因ＶＩＩＩＳＥＰまたはそれの断片」は、例えば、１つのタンパク質のための符号化配列が融合タンパク質をコード化する複合型遺伝子を産生するために異なる遺伝子から第２のタンパク質のための符号化配列まで、それの部分を溶かすことによって広範囲に変えられる複合型遺伝子の製品である。
【００４８】
Ｉｎ更なる実施例、要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型、または、タンパク質をコード化している配列または、例えば、安定性、分泌、検出、隔離、等を強化するペプチドが配列をコード化している第ＶＩＩＩ因子に隣接して適所に嵌入される再結合物分子から、それの断片は、融合タンパク質として表される。哺乳類の宿主細胞の第ＶＩＩＩ因子を産生する組み換えＤＮＡ方法および人的要因ＶＩＩＩ．の浄化を開示する米国特許第４，９６５，１９９号参照。ＣＨＯ（中国のハムスター卵巣）細胞およびＢＨＫＣ（小型のハムスター腎臓電池）上の人間の第ＶＩＩＩ因子表現は、報告された。用途のためのプロトコルを決めた相応する、または、異形である、実施例、プロモータ、オペレータおよび融合の準備の調節装置のために、タンパク質を含んでいる種表現制御配列が、公知で、従来技術において通常使われる。見る、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ワイリーＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．ＹのオースベルほかＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓは本願明細書において参照によって結合した。表現がＢ−領域の部分を含むことによって強化される点に更に注意される。特に、Ｂ領域のそれらの一部の包含は、「ＳＱ」を示した（リントほか（１９９５の）ヨーロッパ人Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２３２：１９２７は、本願明細書においてここにて結合した）有利な表現の結果。「ＳＱ」構築物は、Ｂ領域の５つのアミノ酸を除いて、人間のＢ領域の全てを欠いているＮ末端基、そして、Ｂ領域Ｃ末端の９つのアミノ酸。    
【００４９】
Ｉｔは更に認識されるその要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドまたは異型、または、本発明でそれの断片は還元方法を経て備えができていてもよい。本実施例におけ要因ＶＩＩＩＳＥＰ、異型またはそれの断片はサブユニット、領域またはプラスマから派生した第ＶＩＩＩ因子の領域の連続一部の隔離によって作られる。そして、本発明の要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドを産生するために還元および浄化が続く。あるいは、要因ＶＩＩＩＳＥＰ、異型または断片はそれについて組み換えＤＮＡ方法によって作られることができる。そして、還元および浄化が続く。  
【００５０】
特に          Ｍｏｒｅ、還元方法によるＶＩＩＩＳＥＰが実行されることができる要因にファーイによって報告される手順の変更態様を用意する方法その他（１９９０）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．化学２６５：６１９７；そして、Ｌｏｌｌａｒその他（１９８８）、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．化学２６３：人間で動物性第ＶＩＩＩ因子のサブユニット（重鎖および軽鎖）の隔離を含む１０４５１は、人間の重いチェーンおよび動物の軽鎖の組換えによってまたは人間の軽鎖および動物の重いチェーンの組換えによってあとに続いた。  
【００５１】
人間で動物の個々のサブユニットの          Ｉｓｏｌａｔｉｏｎは、軽鎖／重鎖二量体の分離を含む。例えば、これはエチレンジアミン四酢酸を有するカルシウムのキレート化によって達成される（ＥＤＴＡ）、ｍｏｎｏＳが続くＨＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）。複合型人間の／動物性第ＶＩＩＩ因子分子は、カルシウムがある場合には、単離されたサブユニットから再構成される。重いチェーンまたは動物性軽鎖／人間重いチェーン第ＶＩＩＩ因子がｍｏｎｏＳに反応していない重いチェーンから分離される複合型人間の軽鎖／動物豚のような第ＶＩＩＩ因子の隔離のための手順によってＨＰＬＣ、Ｌｏｌｌａｒその他（１９８８）によって例えば記載されている‖ブラッド７１：１３７−１４３、そして、米国特許第６，３７６，４６３号（いずれが本願明細書において引用したものとするか両方とも）の。    
診断検査法
Ａｓが本願明細書において使われて、「診断検査法」は若干の方法の医学治療の選択を援助するために試験サンプルに存在する特定の抗体の量を検出しておよび／または定量化するために抗原−抗体相互作用を利用する分析を含む。多くが従来技術において技術のそれらにとって公知のこの種の分析であってそこで。ここで使用しているように、（しかし）要因ＶＩＩＩＳＥＰ  ＤＮＡまたは異型、または、そこから（全体的にあるいは部分的に）表されるそれの断片およびタンパク質はそれ以外は周知の分析の対応する試薬と置換されることができる。それによって、修正された分析は第ＶＩＩＩ因子に対する抗体を検出しておよび／または定量化するために用いることができる。それはこれらの試薬、要因ＶＩＩＩＳＥＰ  ＤＮＡまたは異型の用途であるかまたはそれについて分解する、または、タンパク質がそこから表されて、それは人間であるか動物性第ＶＩＩＩ因子に対するまたは複合型人間の／動物性第ＶＩＩＩ因子に対する抗体の検出の周知の検査法の変更態様ができるようにする。ここで使用しているように‖要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型、または、タンパク質のエピトープが使われることができる最少のもので、それが臨床検査薬を含むことをそれについて分解する。  
【００５２】
例えば、要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型の配列またはそれの断片が使われることができる  Ｔｈｅ  ＤＮＡまたはアミノ酸が第ＶＩＩＩ因子欠乏人間の患者の血清および体流体のサンプルを含む人間であるか動物性第ＶＩＩＩ因子に対する抑制抗体の検出のための臨床検査薬として、検定する      。これらの抗体分析は、例えば分析を含むＥＬＩＳＡ分析、ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｓ、標識免疫検定法、免疫拡散分析、そして、第ＶＩＩＩ因子生物学的活動（例えば、凝固分析によって）の分析。他の中で分析の実施例それ‖要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型、または、それの断片が、使われることができるベセズダ分析および血液凝固の阻止分析を含む。これらの試薬を調合することの技術およびそれの使用のための方法は、当業者にとって公知である。例えば、寛容な血清サンプルの抑制抗体の検出の免疫測定は試験サンプルを少なくとも一つの抗原性サイトを含む要因ＶＩＩＩＳＥＰの充分な量と作用することを含むことができる。そこにおいて、量は検出可能な複合体をサンプルの抑制抗体により形成するのに十分である。  
【００５３】
Ｎｕｃｌｅｉｃ酸およびアミノ酸調査が要因ＶＩＩＩＳＥＰ  ＤＮＡまたはタンパク質分子の配列または断片に基づいて用意されることができる      またはそれの異型。実施例によっては、これらは市販である染料または酵素であるか、蛍光であるか、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔであるか放射性ラベルを使用してラベルをつけられることができる。例えば、アミノ酸調査が、人間であるか、動物性であるか複合型人間の／動物性第ＶＩＩＩ因子に対する抑制剤の存在が疑われる血清または他の体流体を隠すために使われることができる。抑制剤のレベルは、患者において数量化されることができて、健康な対照と比較されることができて、例えば、第ＶＩＩＩ因子欠乏患者が要因ＶＩＩＩＳＥＰで扱われることができるかどうか決定するために用いられることがありえるか活発な断片にされることがありえるかそれの異型にされることがありえる。例えば、ｃＤＮＡ調査が、ＤＮＡライブラリを隠すことにおける調査意図のために使われることができる。  
製薬組成物
更なる          Ｔｈｅ本発明は核酸分子を含む製薬組成物を提供する、そして、高レベル発現をコード化しているポリペプチドは本発明または異型のＶＩＩＩＳＥＰおよびそれの断片を因数に分解する。この種の組成物は、一人の本発明の核酸およびポリペプチドを含むことができるかまたはマーティンその他に記載されているように、適当な製薬安定化合成物、交付車両および／またはキャリア車両と組み合わせて周知の方法によれば備えができているレミントンのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（本願明細書において引用したものとする）。
【００５４】
Ｉｎ一実施例、好適なキャリアまたは静脈の注入の交付伝達手段は生理的食塩水である、または、リン酸塩は食塩水を緩衝した。
【００５５】
他の実施例、適切な安定化合成物、交付車両およびキャリア車両が他の人間であるか動物性タンパク質を含むが、これに限定されるものではない          Ｉｎアルブミン。  
【００５６】
Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ小嚢またはｌｉｐｏｓｏｍａｌなサスペンションが、また、薬学的に受け入れられるキャリアまたは交付車両として使われることができる。これらは周知の方法によれば準備されることができて、例えば、リン脂質のｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅまたはその他組成または一緒に負電荷を表層に与える洗剤を含むことができる。これは、次のことの故である。第ＶＩＩＩ因子は否定的に充電されるリン脂質膜に結合する。リポソームは、適当なｌｉｐｉｄ（ｓ）を溶かすことによって備えができていてもよい（例えばステアロイル・ホスファチジル基エタノールアミン、ステアロイル・ホスファチジル基コリン、ａｒａｃｈａｄｏｙｌホスファチジル基コリン、そして、コレステロール）それから蒸発する、去っているビハインドである無機溶媒のコンテナの表層上の乾燥脂質の薄膜。本発明の要因ＶＩＩＩＳＥＰの水溶液は、それからコンテナに導入される。コンテナはそれから脂質材をコンテナの側面から解いて、脂質集計を分散させるために手によって渦を巻く。そして、それによってｌｉｐｏｓｏｍａｌなサスペンションを形成する。  
【００５７】
要因を凝結させて依存しているビタミンＫ（組織要因）を含む、そして、Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ要因（ｖＷｆ）またはサイトおよび多糖類（例えば蔗糖）を結合している第ＶＩＩＩ因子を含むｖＷｆの断片の、本発明の          Ｔｈｅ要因ＶＩＩＩＳＥＰ分子は、他の適切な安定化合成物、交付車両および／またはキャリア車両と結合されることができる。  
【００５８】
本発明の          Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩＳＥＰ分子は、また、レトロウイルスのベクターのような分配部材を使用している遺伝子治療によって届けられることができる。この方法は、要因ＶＩＩＩＳＥＰ不十分な患者に、直接移植される、または、移植可能な手段（第ＶＩＩＩ因子分子に浸透するが、それから移植される細胞を通さない）で配置される人間の細胞に、本発明の所望の要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列の編入を含む。    
【００５９】
Ｉｎ一実施例、方法は決意する。そして、レトロウイルスの調停された遺伝子は転送である。この方法では、本発明の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコード化しているヌクレオチド配列は、修正されたレトロウイルスのゲノムにクローンをつくられる。それが細胞によって表されるウィルス機械によって、遺伝子は宿主細胞のゲノムに嵌入される。それがウイルスを生産しないために、レトロウイルスのベクターは修正される。そして、ホストのウィルス性伝染病を予防する。この種の治療のための一般の原理は、当業者にとって公知で、文献（コーンほか（１９８９の）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２９：８１２−８２０）においてチェックされた。
【００６０】
本発明の          Ｔｈｅ要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドは、半減期を増やすｖＷｆおよびポリペプチド分子の貯蔵寿命に対する格納された境界でありえる。その上、要因ＶＩＩＩＳＥＰの凍結乾燥は、ｖＷｆがある場合には、活性分子の産出高を改善することができる。商業的な供給元によって使用する人間で動物性第ＶＩＩＩ因子の保管のための現在の方法は、再結合物第ＶＩＩＩ因子の保管のために使用されることができる。これらの方法は、以下を含む：部分的に精製された状態（要因として、更なる浄化なしで注ぐＶＩＩＩは、「集中する」）の要因ＶＩＩＩＳＥＰの（１）凍結乾燥；ツィンマーマン方法による要因ＶＩＩＩＳＥＰおよび第ＶＩＩＩ因子を安定させるアルブミンがある場合には、凍結乾燥の（２）  ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；アルブミンがある場合には、再結合物要因ＶＩＩＩＳＥＰの（３）凍結乾燥。  
【００６１】
Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、格納されることができる４０．６ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭＥＳおよびｐＨ  ６．０の５ｍＭのＣａＣｌ２のＣ。ポリペプチドは、また、これらのバッファにおいて凍って格納されることができて、活動の最小の損失によって解けた。  
【００６２】
治療の方法
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩＳＥＰまたは断片、そして、それの異型は、抑制抗体をもつ、そして、のない血友病患者の、そして、抑制抗体の発現による後天性第ＶＩＩＩ因子欠乏患者の第ＶＩＩＩ因子不足（例えば、関節内であるか、頭蓋内であるか胃腸出血）に、抑制できない苦しい会費を扱うために用いることができる。能動物質は、静注で好ましくは管理される。  
【００６３】
「Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ欠乏症」は、本願明細書において使われるように、欠乏症を不完全な第ＶＩＩＩ因子の製造によって生じる活動を凝結させることに含む不十分な、または、第ＶＩＩＩ因子のまたは抑制剤による第ＶＩＩＩ因子の部分的であるか完全な抑制による製造でない。血友病Ａは、Ｘにリンクされた遺伝子および不在の欠陥またはそれがコード化する第ＶＩＩＩ因子タンパク質欠乏症から生じている一種の第ＶＩＩＩ因子欠乏である。
【００６４】
ＡｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙはＶＩＩＩＳＥＰまたは断片を因数に分解する、そして、それの異型は要因ＶＩＩＩＳＥＰを生じるために遺伝子工学による細胞の移植によってまたは、上記の通りに、この種の細胞を含んでいる装置の移植によって管理されることができる。  
【００６５】
Ｉｎ一実施例、要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは断片の製薬構成およびそれの異型は、単独でかスタビライザ、交付車両および／またはキャリアと組み合わせて要因ＶＩＩＩＳＥＰの注入のために使われる同じ手順に、静注で一致している患者に吹き込まれる。  
【００６６】
要因ＶＩＩＩＳＥＰ内済金または異型の          Ｔｈｅ治療投薬量またはそれの断片、この種の治療意志を必要とする患者に与えられなければならない第ＶＩＩＩ因子欠乏の厳しさに従い変化する。通常、投薬量レベルは、厳しさおよび各々の患者の苦しいエピソードの継続期間に合わせて頻度、持続期間および装置において調整される。したがって‖要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型、または、それの断片薬学的に受け入れられるキャリア、交付車両または患者に配達するのに十分な量のスタビライザの含む、測定されてとして標準の凝固している分析によって、放出するのを止めるハイブリッドの治療として効果的な量。  
【００６７】
「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ活動」本願明細書において使用する、人間の第ＶＩＩＩ因子不十分なプラスマの凝固欠陥を修正する活動に関連する。特定の活動は、活動を凝結させることを単位にして測定されるミリグラム人間の第ＶＩＩＩ因子不十分なプラスマの凝固している時間が通常の人間のプラスマのそれと比較してある標準の分析の全体の第ＶＩＩＩ因子タンパク質。第ＶＩＩＩ因子活動の１台の装置は、１ミリリットルの通常の人間のプラスマに存在する活動である。分析（より短いもの）凝血塊構造のための時においてより大きい‖検定されている第ＶＩＩＩ因子の活動。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（異型またはそれの断片）の特定の活動は、少なくなることができて、等しくなることができるために、または、いずれのプラスマ派生または再結合物人的要因ＶＩＩＩ．ものそれ大きい
プラスマの凝固している欠陥を修正する通常の血漿に存在するその物質が血友病Ａをもつ個人から生じたので、          Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩは古典的に定められる。要因ＶＩＩＩＳＥＰの精製されて部分的に精製された形式で試験管内の凝固薬活動は、人間の患者の注入のための第ＶＩＩＩ因子の服用を算出するために用いて、患者プラスマから取り戻される活動の、そして、修正の信頼性が高いインジケータであるの生体内である苦しい欠陥。そこで、イヌ注入モデルの試験管内の新規な第ＶＩＩＩ因子分子およびそれらの挙動のまたは人間の患者の標準の分析の間の報告された相違でない、Ｌｕｓｈｅｒによればその他が、ニューＥｎｇｌ．であるＪ．  Ｍｅｄ．  ３２８：４５３−４５９；ピットマンほか（１９９２の）ブラッド７９：３８９−３９７；そして、Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓなほか（１９８５の）会報全米科学アカデミー８２：８７５２−８７５５．
プラスマの要因ＶＩＩＩＳＥＰの          Ｔｈｅ増加は、治療的な効果を発生するのに十分である。ｇｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃな効果ｈは、要因ＶＩＩＩＳＥＰ分子の管理の前に、主題において観察される凝固活動より大きい患者のプラスマの血液凝固活動の増加として定義される。標準の血液凝固分析（凝血塊構造のためのより短い時間）においてより大きい‖検定されている第ＶＩＩＩ因子の活動。少なくとも１％以上の第ＶＩＩＩ因子不十分なプラスマの第ＶＩＩＩ因子活動の増加は、治療として有益である。
【００６８】
Ｕｓｕａｌｌｙ、要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型の管理で、患者において成し遂げられる所望のプラスマ第ＶＩＩＩ因子濃度またはそれの断片は、３０−１００％の範囲であるの通常の。要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは断片の管理またはそれの異型の１つのモードにおいて、組成物は約５から、より好ましくは、１０−５０のｕｎｉｔｓ／ｋｇ体重の範囲で、５０のｕｎｉｔｓ／ｋｇ体重まで、そして、最も好ましくは２０−４０のｕｎｉｔｓ／ｋｇ体重の適用量で範囲の好適な投薬量で、静注で与えられる；間隔頻度は、約８から２４時間（高度に影響を受ける血友病患者の）まで、範囲においてある；そして、日の治療の継続は、１から１０日への範囲においてあるかまたは苦しいエピソードまで分解される。ロバーツほか（１９９０の）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、ウィリアムズほか編集章１５３、１４５３−１４７４（本願明細書において引用したものとする）参照。抑制剤をもつ患者はより多くの要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは異型を必要とすることができる、または、それの断片または患者はより少ない要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは断片を必要とすることができる、または、それの異型。中で、人間であるか豚のような第ＶＩＩＩ因子、要因ＶＩＩＩＳＥＰまたは断片の量または注がれる異型を有する治療が唯一の段階第ＶＩＩＩ因子凝固分析によって中傷されて、選択された例で、生体内である、回復は注入の後、患者のプラスマの第ＶＩＩＩ因子を測定することで測定される。いかなる特定の主題のためにも、特定の投薬法が個々の必要に従う時間および組成物の管理を管理しているかまたは監督している人の専門の判断を通じて調整されなければならない、そして、本願明細書において記載される集中範囲が典型的で、請求された組成物の範囲または実行を制限することを目的とするだけではないと理解されることになっている。  
【００６９】
必要に応じて、          Ｔｒｅａｔｍｅｎｔは、組成物の単一の静脈の管理またはその延長期間にわたる周期的であるか連続管理という形をとることができる。あるいは、ＶＩＩＩを因数に分解する‖ＳＥＰ、または、断片またはそれの異型は、時間の間隔を変化させることで１またはいくつかの服用のリポソームによって、皮下にまたは口で管理されることができる。  
【００７０】
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ＳＥＰ、または、断片またはそれの異型が、また、人的要因ＶＩＩＩ．に対する抗体を開発した血友病患者の第ＶＩＩＩ因子不足に、抑制できない苦しい会費を扱うために用いることができる実験的である
ＥＸＡＭＰＬＥ  １
第ＶＩＩＩ因子の配列特徴描写
豚のようで人間の要因ＶＩＩＩは、２つのサブユニット・タンパク質としてプラスマから分離される。カルシウムまたは他の二価金属イオンを必要とする非共有結合によって、サブユニット（重いチェーンおよび軽鎖として公知の）は一緒に保たれる。第ＶＩＩＩ因子の重い連鎖は３つの領域、Ａ１、Ａ２およびＢを含む。そして、それは共有結合して連結される。第ＶＩＩＩ因子の軽い連鎖も３つの領域を含む。そして、Ａ３、Ｃ１およびＣ２と称される。Ｂ領域は、周知の生物学的機能を有されないか、取り除かれることができるかまたは第ＶＩＩＩ因子のいかなる測定できるパラメータもの重要な変更のない組み換えＤＮＡ技術方法によって、かｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙに部分的に分子から取り除かれる。人間の再結合物第ＶＩＩＩ因子は、プラスマから派生した第ＶＩＩＩ因子に類似した構造および効果があるそれがそうでない、グリコシル化する哺乳類の細胞において表される。人間および豚のような動作中の第ＶＩＩＩ因子（「要因ＶＩＩＩａ」）は、Ａ１およびＡ２領域間の重いチェーンの裂開のために、３つのサブユニットを有する。この構造は、Ａ１／Ａ２／Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と称される。
【００７１】
一致している豚のような第ＶＩＩＩ因子の          Ｔｈｅ  ｃＤＮＡ配列、領域、Ａ１、Ｂ、軽鎖活動ペプチド領域Ａ３、Ｃ１およびＣ２領域を符号化している信号ペプチドは、配列番号において提供される：１．豚のようなｃＤＮＡの翻訳は、配列番号において提供される：２．    
予測されたアミノ酸の          Ｔｈｅ配置全身の豚のような第ＶＩＩＩ因子の配列（配列番号：２）発表された人間（木のほか（１９８４の）ネイチャー３１２：３３０−３３７）を有する（配列番号：６）、そして、ネズミ（エルダーその他以前に（１９９３））（配列番号：８）、配列は他の高分子によって翻訳後の変更態様、タンパク質分解裂開および認識の場所とともに、図１Ａ−１Ｈに示す。    
【００７２】
潜在的Ｎにリンクされたグリコシル化サイト（ＸがプロリンでないＮＸＳ／Ｔ）は、図１Ａ−１Ｈに示すことができる。８つの保全されたＮにリンクされたグリコシル化サイトが、ある：Ａ１領域の１、Ａ２領域の１、Ｂ領域の４、Ａ３領域の１およびＣ１領域の１。１９のＡおよびＣ領域システインは節約されるのに、Ｂ領域システインの相違がある。第ＶＩＩＩ因子の７つの二硫化物結合のうちの６つが、第５因子およびＣｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎの相応するサイトおよび二硫化物リンクが見つかる両方のＣ領域で第５因子であるとわかる（マクミューレンほか（１９９５の）Ｐｒｏｔｅｉｎ科学４：７４０−７４６）．人間の第ＶＩＩＩ因子は、位置３４６、７１８、７１９、７２３、１６６４および１６８０で、硫酸で処理されたチロシンを含む（ピットマンほか（１９９２の）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：３３１５−３３２５；Ｍｉｃｈｎｉｃｋほか（１９９４の）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．化学２６９：２００９５−２０１０２）。これらの残りはマウス第ＶＩＩＩ因子および豚のような第ＶＩＩＩ因子（図１）において節約される。但し、ＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムは人的要因ＶＩＩＩ．のＴｙｒ３４６に対応するマウス・チロシンを整列配置することに失敗した。第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのさまざまな領域のエピトープは、図１で概説される。  
ＥＸＡＭＰＬＥ  ２つのＳｕｍｍａｒｙ
人間の第ＶＩＩＩ因子表現レベルは、生体内に他の凝固タンパク質のレベルよりかなり低い、そして、の異形である試験管内の表現システム。再結合物人間第ＶＩＩＩ因子の低レベルの表現度は、再結合物タンパク質注入および遺伝子治療実施要項を使用している血友病Ａの処置を拘束した。しかし、再結合物Ｂ−領域削除された豚のような第ＶＩＩＩ因子は、レベル１０で表される試験管内の再結合物Ｂ−領域削除された人間の第ＶＩＩＩ因子より１４倍大きな。この所有物のために必要な豚のような第ＶＩＩＩ因子の配列を識別するために、対応する豚のような配列を有する人間の配列の置換を含んだＢ−領域削除された人間の／豚のような複合型第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡｓが、生じた。これらのｃＤＮＡｓは一時的にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションするかまたはＢＨＫから派生した細胞に安定してトランスフェクションした、そして、細胞外メディアへの第ＶＩＩＩ因子表現は唯一の段階凝固分析で測定された。１を含んでいる人間の／豚のような複合型第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡｓ）Ａ１、豚のような第ＶＩＩＩ因子および人間の第ＶＩＩＩ因子のＣ１およびＣ２領域のＡ２およびＡ３領域または２）豚のような第ＶＩＩＩ因子およびＡ２のＡ１およびＡ３領域、Ｃ１および人間の第ＶＩＩＩ因子のＣ２領域が、豚のような要因ＶＩＩＩ．と同等の第ＶＩＩＩ因子表現レベルを示した高レベル発現を示している人間の／豚のような複合型第ＶＩＩＩ因子分子は、静脈の注入のための第ＶＩＩＩ因子製造を改善するためにまたは血友病Ａの体細胞遺伝子治療のために価値があってもよい。    
材料
ダルベッコのものリン酸塩緩衝食塩水（胎児のウシ血清（ＦＢＳ））ペニシリン、ストレプトマイシン、ＤＭＥＭ：Ｆ１２（血清のないＡＩＭ  Ｖ培養メディア）リポフェクチン、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００およびｇｅｎｅｔｉｃｉｎは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入された。ハムスター腎臓を大切に扱う−派生細胞（指定されたＢＨＫ−Ｍ細胞（ファンクほか（１９９０の）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１６５４−１６６０））はロスＭａｃｇｉｌｌｉｖｒａｙ博士（ブリティッシュ・コロンビア大学）からの贈り物であった。一時的なトランスフェクションは、ＲＬ−ＣＭＶベクターを使用しているトランスフェクション効率およびＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔのために制御された（プロメガ（マディソン）ＷＩ）。Ｃｉｔｒａｔｅｄされた第ＶＩＩＩ因子が不足しているプラスマおよびプールされたｃｉｔｒａｔｅｄされた通常の人間のプラスマ（ＦＡＣＴ）は、ジョージ・キングＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ（オーヴァーランド・パーク（ＫＡ））から購入された。動作中の部分的なトロンボプラスチン試薬（ａＰＴＴ）は、Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ（ダラム（ＮＣ））から購入された。オリゴヌクレオチド下塗りは、ライフＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって総合された。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、そして、Ｂｌｕｅ細胞が購入された大腸菌ＸＬ−１ストラタジーン（ラ・ホーヤ（ＣＡ））。    
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ表現ベクターの構造
この研究の第ＶＩＩＩ因子表現ベクターの全ては、ＲｅＮｅｏ哺乳類の表現プラスミドに含まれた（リントほか（１９９５の）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７）．第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ挿入物は、内因性第ＶＩＩＩ因子５’−ＵＴＲ配列を欠いていて、人間の１８０５ｎｔ第ＶＩＩＩ因子３’−ＵＴＲの一番目７４９を含む。  
【００７３】
設計されたＨＳＱ（図２）が哺乳類の表現ベクターＲｅＮｅｏに、人間の第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのクローンをつくることによって作成された人間のＢ領域−削除された第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡは、以前記載した（Ｄｏｅｒｉｎｇしているほか（２００２の）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）．ＨＳＱ  ｃＤＮＡは、１ＳのＦ  Ｓ  Ｑをコード化するＮ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｋ  Ｒ  Ｈ  Ｑ  Ｒ（配列番号：９）Ａ２およびａｐ領域間のリンカー・配列。このリンカーは、Ｒ  Ｈ  Ｑ  Ｒを含む（配列番号：１０）ＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６０２−６０７のＳｅｉｄａｈほか（１９９７の）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ）による細胞内タンパク質分解処理のための認識配列。この裂開イベントは、一つのチェーン第ＶＩＩＩ因子を変換するヘテロダイマ（リントほか（１９９５の）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３２：１９−２７）．Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃな第ＶＩＩＩ因子は、第ＶＩＩＩ因子（ファスほか（１９８２の）ブラッド５９：５９４−６００）の生理学上の形状と考えられる。      
【００７４】
以前記載されているように、豚のような第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡのＢ−ｄｏｍａｉｎ−ｄｅｌｅｔｅｄされた形式は、ＲｅＮｅｏに結さつされた（Ｄｏｅｒｉｎｇしているほか（２００２の）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）．ｃＤＮＡ（指定されたＰ／ＯＬ（図２））、豚のような由来のリンカー・配列Ｓ  Ｆ  Ａ  Ｑ  Ｎ  Ｓ  Ｒ  Ｐ  Ｐ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｈ  Ｑ  Ｒをコード化する（配列番号：１１）ＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ認識のためのＡ２およびａｐ領域間の。  
【００７５】
ＨＰ１（それは豚のようなＡ２領域および人間Ａ１、ａｐ−Ａ３、Ｃ１およびＣ２領域を含む）と称されるＢ−ｄｏｍａｉｎｌｅｓｓ複合型人間の／豚のような第ＶＩＩＩ因子分子は、以前記載されて、備えられた（リュバンほか（１９９４の）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：８６３９−８６４１）．人間の由来のリンカー・配列Ｓ  Ｆ  Ｓ  Ｑ  Ｎ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｋ  Ｒ  Ｈ  Ｑ  Ｒをコード化しているｃＤＮＡ（配列番号：９）Ａ２およびｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ拡張（ＳＯＥ）突然変異生成によるＨＰ１のａｐ領域間の嵌入した（ホートンほか（１９９３の）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０−２７９）、生成ＨＰ１／ＳＱ（図２）。  
【００７６】
すでに記載されている（手押し車ほか（２０００の）ブラッド９５：５５７−５６１）ように、ＨＰ３０（それは豚のようなａｐ−Ａ３領域および人間Ａ１、Ａ２、Ｃ１およびＣ２領域を含む）は準備された。豚のような由来のリンカー・配列Ｓ  Ｆ  Ａ  Ｑ  Ｎ  Ｓ  Ｒ  Ｐ  Ｐ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｈ  Ｑ  Ｒをコード化しているｃＤＮＡ（配列番号：１１）Ａ２および、ＨＰ３０／ＯＬ（図２）を生産して、ＳＯＥ突然変異生成によるＨＰ３０のａｐ領域間の嵌入した。  
【００７７】
ＨＰ４４／ＯＬ（それは、豚のようなＡ１、Ａ２、ａｐ−Ａ３領域を含む）豚のような由来のリンカー・配列Ｓ  Ｆ  Ａ  Ｑ  Ｎ  Ｓ  Ｒ  Ｐ  Ｐ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｈ  Ｑ  Ｒ（配列番号：１１）、そして、領域（図２）が準備されたＣ１およびＣ２が続く人間。Ｐ／ＯＬ  ＲｅＮｅｏはＡｖｒＩＩによって消化された、そして、Ａ１、Ａ２およびＲｅＮｅｏ配列を含んでいる断片は精製されるゲルであった。ＨＰ３０／ＯＬはＡｖｒＩＩによって消化された、そして、豚のようなａｐ−Ａ３て人間のＣ１およびＣ２配列を含んでいる断片は精製されるゲルであった。すでに記載されている（ヒーリーほか（１９９８の）ブラッド９２：３７０１−３７０９）ように、製品のくくること、大腸菌ＸＬ−１細胞の転換およびプラスミド浄化は実行された。  
【００７８】
ＨＰ４６／ＳＱ（それは、豚のようなＡ１領域および人間のＡ２を含む）ａｐ−Ａ３、Ｃ１およびＣ２領域、そして、人間のＳ  Ｆ  Ｓ  Ｑ  Ｎ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｋ  Ｒ  Ｈ  Ｑ  Ｒ（配列番号：１１）、リンカー・配列（図２）は、ＳＯＥ突然変異生成によって備えができていた。ＲｅＮｅｏのＲｅＮｅｏおよびＨＳＱのＰ／ＯＬが、第１の丸いＳＯＥ反応のテンプレートとして使われた。５』Ｐ／ＯＬ反応の下塗りが、ＲｅＮｅｏ配列５と相補的だった』第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ．に３』、下塗りは豚のようなＡ１領域の側面に位置した。５』、ＨＳＱ反応の下塗りは、部分的に相補的だったために３』第１の反応において使用する下塗り。３』、下塗りは人間のＡ２配列と相補的だった。第１の丸い反応からの製品のゲル浄化後の、第２のＳＯＥ反応が実行されたこと（ＲｅＮｅｏ配列５を含んでいる製品を産すること）』ｃＤＮＡが挿入する第ＶＩＩＩ因子、豚のようなＡ１領域および人間のＡ２領域の一部に。この製品は、ＲｅＮｅｏおよび第ＶＩＩＩ因子挿入物の接合および人間のＡ２領域のＭｌｕＩで、ＸｈｏＩによって消化されて、ＸｈｏＩ／ＭｌｕＩ消化されたＨＳＱ／ＲｅＮｅｏに結さつされた。結果として生じるプラスミドは、上記の通りに大腸菌ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞への変換によって拡大された。  
【００７９】
ＨＰ４７／ＯＬ（それは、豚のようなＡ１を含む）、ａｐ−Ａ３領域は、リンカー・配列Ｓ  Ｆ  Ａ  Ｑ  Ｎ  Ｓ  Ｒ  Ｐ  Ｐ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｐ  Ｐ  Ｖ  Ｌ  Ｒ  Ｒ  Ｈ  Ｑ  Ｒをｐｏｒｃｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄした（配列番号：１１）、そして、Ａ２、Ｃ１および領域（図２）が準備されたＣ２が続く人間。ＲｅＮｅｏのＨＰ４６／ＳＱはＡｖｒＩＩによって消化された。そして、それは第ＶＩＩＩ因子挿入物に、そして、Ａ２−ａｐ接合でＲｅＮｅｏ配列５のプラスミドを裂く。Ａ１およびＡ２領域を含んでいる断片は、ＡｖｒＩＩ消化によって生じられるＲｅＮｅｏのＨＰ３０／ＯＬの断片に結さつされて精製されるゲルであった。  
【００８０】
ＳＯＥ突然変異生成によって生じられる配列は、確認されたジデオキシＤＮＡ塩基配列決定。
ＣＯＳ−７細胞からのＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩの一時的な表明
ＣＯＳ−７細胞は、７０まで発達した１ｍｌのＤＭＥＭを含んでいる２つのｃｍ２井の８０％の合流点：１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００で補充されるＦ１２グラム／ミリリットル・ストレプトマイシン。細胞は、トランスフェクションした２０００：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用している第ＶＩＩＩ因子プラスミド：発光酵素プラスミドＤＮＡの１つの質量比。２４時間トランスフェクションの後、細胞は二回１ｍｌのＰＢＳできれいにされた、そして、０．５ｍｌの血清のないＡＩＭ  Ｖ媒体はよい各々に加えられた。条件付きのメディアが収穫された、そして、第ＶＩＩＩ因子活動が下記のように測定された前に、細胞は２４時間培養された。  
小型のハムスター腎臓−派生（ＢＨＫ−Ｍ）電池からのＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩの安定した表明  
ＢＨＫ−Ｍ細胞は、トランスフェクションしたリポフェクチン第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを含んでいるＲｅＮｅｏプラスミドとともに、そして、ＤＭＥＭ：１０％のＦＢＳを含んでいるＦ１２、１００単位／ｍｌペニシリン、１００がある場合には、培養するグラム／ミリリットル・ストレプトマイシン、そして、５００グラム／ミリリットル１０日間ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ。ＲｅＮｅｏベクターは、ネオマイシンを含むホスホトランスフェラーゼ抗生ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ．に対する抵抗のための遺伝子７２台のｇｅｎｅｔｉｃｉｎ抵抗するクローンに対する２４は、第ＶＩＩＩ因子製造のために隠された。第ＶＩＩＩ因子活動の最高レベルが７５のｃｍ２フラスコ（９０まで発達する）に変えられることを表示した各々のｃＤＮＡ構築物からのクローン９５％の合流点、そうすると、血清のない２５ｍｌのＡＩＭ  Ｖメディアへ切り替えた。２４時間、条件付きのメディアが最新の血清のない２５ｍｌのメディアＡＩＭ  Ｖと取り替えられて、追加的な２４時間の間培養されたあと、各々の時間位置からのＨａｒｖｅｓｔｅｄされたメディアは下記のように第ＶＩＩＩ因子活動のために検定された。
第ＶＩＩＩ因子分析
第ＶＩＩＩ因子活動は、ＳＴ技術Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｅｓ、フランス）を使用している唯一の段階凝固分析で測定された。５サンプルまたは標準のｌは５０に加えられた第ＶＩＩＩ因子が不足しているプラスマのｌは５０の加算によってあとに続いたｌ  ａＰＴＴ試薬、そして、３７の３分間潜伏Ｃ．２０ｍＭのＣａＣｌ２の５０マイクロリットルは反応を始めるために加えられた、そして、フィブリン凝血塊を開発することを必要とする時間はｖｉｓｃｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙに測定された。標準のカーブは、プールされた通常の人間のプラスマのいくつかの希薄を使用して発生して、相互のプラスマ希薄の対数対、凝固している時間の線形後退分析を受けた。第ＶＩＩＩ因子活動の判定のために、標準のカーブの範囲の中の集中に食塩サンプルは、緩衝されるＨＥＰＥＳにおいて希釈されてあった。      
【００８１】
結果
高レベル発現を与える豚のような第ＶＩＩＩ因子の地方を識別するために、図２に示される人間の／豚のような複合型第ＶＩＩＩ因子分子は造られた、そして、ＣＯＳ−７およびＢＨＫ−Ｍ細胞のそれらの表現レベルは測定された。ＣＯＳ−７つの細胞トランスフェクションの後、表現プラスミドは、ゲノムＤＮＡに組み込まれなくて、ｅｐｉｓｏｍａｌなＤＮＡとして一時的にある。ＣＯＳ−７細胞からの表現レベルは、細胞人口の平均を表す。図３は、中でトランスフェクションする井戸が４倍にするＣＯＳ−７の結果を示す。Ｐ／ＯＬ、ＨＰ４４、ＨＰ４７およびＨＰ４６の表明の重要な増加が、ＨＳＱと比較してある。対照的に、ＨＰ１およびＨＰ３０の表明は、ＨＳＱと比較して増加しなかった。        
【００８２】
ＢＨＫ−Ｍ細胞からの第ＶＩＩＩ因子の表現度は、ＣＯＳ−７細胞の結果と整合していた。ＢＨＫ−Ｍ細胞トランスフェクションの後、安定してゲノムに組み込まれるプラスミドＤＮＡを含んでいるクローンは、抗生ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを使用して選ばれる。ネオマイシンを含まない細胞ホスホトランスフェラーゼ・プラスミドに含まれる遺伝子が、ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ．がある場合には、生存しない図２に示される構築物を有するＢＨＫ−Ｍ細胞のトランスフェクションから生じているクローンのほぼ５０％は、第ＶＩＩＩ因子（示されないデータ）の検出可能なレベルを表さなかった。これは、ＨＳＱおよびＰ／ＯＬを有する前の結果と整合している（Ｄｏｅｒｉｎｇしているほか（２００２の）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）、そして、第ＶＩＩＩ因子表現が本質的にｇｅｎｅｔｉｃｉｎの間、選択のために選ばれないので、予想されてある。第ＶＩＩＩ因子生成クローンのための平均表現レベルはＰ／ＯＬ、ＨＰ４４、ＨＰ４７およびＨＰ４６のためにかなりより高かった、しかし、ＨＰ１およびＨＰ３０構築物はＨＳＱ（示されないデータ）に匹敵しなかった。各々の第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ構築物のために、第ＶＩＩＩ因子の最高レベルを生産しているクローンは、拡大されて、血清のないＡＩＭ  Ｖ媒体へ切り替えた。上記の結果と整合して、ＨＰ４４、ＨＰ４７および、ＨＰ１およびＨＰ３０以外でない、ＨＰ４６のための第ＶＩＩＩ因子濃度は、Ｐ／ＯＬ（図３）と同等だった。  
【００８３】
図３は、示す異形である再結合物豚のような第ＶＩＩＩ因子ＯＬおよび再結合物人間第ＶＩＩＩ因子ＳＱ．の表現ＣＯＳ−７細胞（固い棒）は、個々の第ＶＩＩＩ因子表現構築物および発光酵素プラスミドＤＮＡによってトランスフェクションして、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓにて説明したように、２４時間の血清のない媒体で培養された。条件付きのメディアは、唯一の段階凝固分析によって第ＶＩＩＩ因子活動のために検定された。メディア収穫の後、細胞は溶解して、発光酵素活動のために検定された。データは第ＶＩＩＩ因子活動の比率として示される：発光酵素活動（各々のサンプルのためのトランスフェクションする細胞の４つの井戸の＋／−標準偏差を意味する）は、平均ＨＳＱレベルに正常化した。示されるデータは、ＣＯＳ−７細胞の３つの別々の培養組織を含んでいる実験の典型である。ＢＨＫ−Ｍ細胞（孵化された棒）は、個々の第ＶＩＩＩ因子表現構築物によってトランスフェクションして、安定したｔｒａｎｓｇｅｎｅ統合のために選ばれた。各々の構築物のための一番上の生成クローンは、７５のｃｍ２フラスコに分割されて、９０％を超える合流点に育てられて、二回ＰＢＳできれいにされて、２４時間、血清のないメディアで培養された。２４時間の後、メディアは収穫されて、第ＶＩＩＩ因子活動のために検定された。データはＨＳＱ表現と関連して表される。そして、それはＢＨＫ−Ｍ細胞の２．８のｕｎｉｔｓ／１０６  ｃｅｌｌｓ／２４  ｈであった。
議論
再結合物Ｂ領域−削除された豚のような第ＶＩＩＩ因子は、再結合物人間第ＶＩＩＩ因子より大きい１４−折り目まで、レベルで表される（Ｄｏｅｒｉｎｇしているほか（２００２の）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）．レベルは、第ＶＩＩＩ因子表現（表ＩＩ）の前に発表された報告のかなり大きい。高い表現現象のための機構は、決められなかった。しかし、Ｐ／ＯＬおよびＨＳＱ表現カセットが内因性第ＶＩＩＩ因子５’−ＵＴＲ配列を含まないので、高レベル発現は翻訳された配列の人間で豚のようなＢ領域−削除された第ＶＩＩＩ因子の違いによる。その一方で、両方とも人間の第ＶＩＩＩ因子３’ＵＴＲの最初の７４９のｎｔ（１８０５ｎｔの）を所有する。さらに、Ｐ／ＯＬおよびＢＨＫ−Ｍ細胞のＨＳＱ  ｍＲＮＡレベルの違いがないので、効果は転写後のレベルで起こる（Ｄｏｅｒｉｎｇしているほか（２００２の）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３８３４５−３８３４９）．    
表ＩＩ。前のレポートＦＡＣＴＯＲ  ＶＩＩＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．の
【００８４】
【表２】
2005518783.tif 000004
ｕｎｉｔｓ／ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ／２４時間ｂ  ｕｎｉｔｓ／１０６  ｃｅｌｌｓ／２４時間ｃ中国のハムスター卵巣  
ＥＸＡＭＰＬＥ  ３
本発明の要因ＶＩＩＩＳＥＰ配列の異型は、発生することができる。例えば、ＨＰ６３／ＯＬ要因ＶＩＩＩＳＥＰは、発生することができる。図１２−１４を参照。    
【００８５】
抑制抗体によって認識される２つの主要人間の第ＶＩＩＩ因子エピトープは、識別された：残り４８４−５０８によって行きの部分のＡ２領域の（ヒーリーほか（１９９５の）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４５０５−１４５０９）、そして、残り２１８１−２２５２に囲まれている部分のＣ２領域の（ヒーリーその他（１９９８）ブラッド９２：３７０１−３７０９、そして、バローその他（２００１）ブラッド９７：１６９−１７４（いずれが本願明細書において引用したものとするか全て））。配列番号付けは、標準の慣例（Ｖｅｈａｒほか（１９８４の）ネイチャー３１２：３３７−３４２）による全身の、成熟した人間の第ＶＩＩＩ因子に関連する。軽鎖起動ペプチド（ａｐ）（手押し車ほか（２０００の）ブラッド９５：５５７−５６１）を認識する抗体も識別された、そして、領域のＡ３領域は残り１８０４−１８１９（Ｚｈｏｎｇほか（１９９８の）ブラッド９２：１３６−１４２）によって境を接した、しかし、それらはより一般的でない（プレスコットほか（１９９７の）ブラッド８９：３６６３−３６７１）。他のエピトープは時々識別された、しかし、それらは珍しいとみなされる。
【００８６】
要因ＶＩＩＩＳＥＰ分子の異型は、人間のＡ２、ａｐおよびＣ２領域（人間の配列１８０４−１８１９および豚のようなＡ１領域および約１６９０から１８０３まで、そして、約１８２０から２０１９まで豚のようなＡ３配列）を含むために発生することができる。この要因ＶＩＩＩＳＥＰ異型は、ＨＰ６３として図１２において図解される。アミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列番号において提供される：２０および２１。この種の分子は、人的要因ＶＩＩＩ．の抗原性特徴を有する超意見を述べる人であると予測される。ＨＰ６３異型の高レベル発現活動を測定する分析は、本願明細書において他の場所で開示される。    
表ＩＩＩ配列ＩＤリスト
【００８７】
【表３】
2005518783.tif 000005
Ｔｈｅ本発明は添付の図面に関して上記していた。そこにおいて、いくつかが本発明の全ての実施例以外の示されるというわけではない。実に、本願明細書において記載される実施例に限られているにつれて、本発明は多くの異なる形式において実施されることができて、解釈されてはならない；むしろ、この開示が適用できる法的要求を満たすために、これらの実施例は提供される。同じ数は、全体にわたって同じ要素を表す。
【００８８】
本発明が前述の説明および関連する図面に示される教示の利点を有する関係する当業者に、多くの変更態様および本願明細書において記載される発明の他の実施例は思い浮かぶ。したがって、発明が開示される特定の実施例に限られていることになっていないと理解されることになっている、そして、その変更態様および他の実施例は添付の請求の範囲の範囲内で含まれることを目的とする。特定の期間が本願明細書において使用されるにもかかわらず、それらが一般的で図形感覚だけにおいて、そして、限定以外のために使われる。    
【００８９】
仕様において言及される全ての公報及び特許出願は、本発明が関係する当業者のレベルを表す。あたかも各々の個々の刊行または特許出願が特に、そして、個々に、引用したものとすることを示されるかのように、全ての公報及び特許出願は同じ範囲を参照することで本願明細書において組み込まれる。    
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１Ａ】一緒にされる図１Ａ−１Ｈは、整列配置されたアミノ酸配列に人間の比較を提供する（配列番号：６）、豚のような（配列番号：２）、そして、マウス（配列番号：８）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列。
【図１Ｂ】一緒にされる図１Ａ−１Ｈは、整列配置されたアミノ酸配列に人間の比較を提供する（配列番号：６）、豚のような（配列番号：２）、そして、マウス（配列番号：８）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列。
【図１Ｃ】一緒にされる図１Ａ−１Ｈは、整列配置されたアミノ酸配列に人間の比較を提供する（配列番号：６）、豚のような（配列番号：２）、そして、マウス（配列番号：８）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列。
【図１Ｄ】一緒にされる図１Ａ−１Ｈは、整列配置されたアミノ酸配列に人間の比較を提供する（配列番号：６）、豚のような（配列番号：２）、そして、マウス（配列番号：８）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列。
【図１Ｅ】一緒にされる図１Ａ−１Ｈは、整列配置されたアミノ酸配列に人間の比較を提供する（配列番号：６）、豚のような（配列番号：２）、そして、マウス（配列番号：８）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列。
【図１Ｆ】一緒にされる図１Ａ−１Ｈは、整列配置されたアミノ酸配列に人間の比較を提供する（配列番号：６）、豚のような（配列番号：２）、そして、マウス（配列番号：８）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列。
【図１Ｇ】一緒にされる図１Ａ−１Ｈは、整列配置されたアミノ酸配列に人間の比較を提供する（配列番号：６）、豚のような（配列番号：２）、そして、マウス（配列番号：８）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列。
【図１Ｈ】一緒にされる図１Ａ−１Ｈは、整列配置されたアミノ酸配列に人間の比較を提供する（配列番号：６）、豚のような（配列番号：２）、そして、マウス（配列番号：８）第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド・配列。
【図２】図２は、Ｂ領域−削除された人間で、豚のようで複合型人間の／豚のような第ＶＩＩＩ因子構築物の概略図を提供する。Ａ２およびａｐ領域間の実線は、リンカー・配列を表す。
【図３】図３は、グラフィック・データ開示を提供する異形である再結合物Ｂ領域−削除された豚のような第ＶＩＩＩ因子タンパク質、指定されたＰ／ＯＬ、再結合物Ｂ領域−削除された人間の第ＶＩＩＩ因子タンパク質および５つの再結合物Ｂの表明が、複合型人間の／豚のような第ＶＩＩＩ因子タンパク質、指定されたＨＰ１、ＨＰ３０、ＨＰ４４、ＨＰ４６およびＨＰ４７．をｄｏｍａｉｎ−ｄｅｌｅｔｅｄしたＣＯＳ−７細胞（固い棒）およびベビー・ハムスター腎臓−派生細胞（指定されたＢＭＫ−Ｍ細胞）（孵化された棒）は、個々の第ＶＩＩＩ因子表現構築物および発光酵素プラスミドＤＮＡによってトランスフェクションして、２４時間の血清のない媒体で培養された。データは、Ｐ／ＯＬ、ＨＰ４４、ＨＰ４７およびＨＰ４６の表明の重要な増加がＨＳＱと比較してあることを示す。対照的に、ＨＰ１およびＨＰ３０の表明は、ＨＳＱと比較して増加しなかった。
【図４】図４は、アミノ酸配列を要因に提供する本願明細書においてＨＰ４４／ＯＬに指定されるＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド（配列番号：１５）．
【図５Ａ】図５Ａ−５Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１４）本願明細書においてＨＰ４４／ＯＬに指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化する。
【図５Ｂ】図５Ａ−５Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１４）本願明細書においてＨＰ４４／ＯＬに指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化する。
【図５Ｃ】図５Ａ−５Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１４）本願明細書においてＨＰ４４／ＯＬに指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化する。
【図５Ｄ】図５Ａ−５Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１４）本願明細書においてＨＰ４４／ＯＬに指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化する。
【図６】図６は、要因のためのアミノ酸配列に本願明細書においてＨＰ４６／ＳＱに指定されるＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドを提供する（配列番号：１７）．
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１６）本願明細書においてＨＰ４６／ＳＱ．に指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド・コード化する
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１６）本願明細書においてＨＰ４６／ＳＱ．に指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド・コード化する
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１６）本願明細書においてＨＰ４６／ＳＱ．に指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド・コード化する
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１６）本願明細書においてＨＰ４６／ＳＱ．に指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド・コード化する
【図８】図８は、要因のためのアミノ酸配列に本願明細書においてＨＰ４７／ＳＱに指定されるＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドを提供する（配列番号：１９）．
【図９Ａ】図９Ａ−９Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１８）本願明細書においてＨＰ４７／ＳＱ．に指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド・コード化する
【図９Ｂ】図９Ａ−９Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１８）本願明細書においてＨＰ４７／ＳＱ．に指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド・コード化する
【図９Ｃ】図９Ａ−９Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１８）本願明細書においてＨＰ４７／ＳＱ．に指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド・コード化する
【図９Ｄ】図９Ａ−９Ｄは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１８）本願明細書においてＨＰ４７／ＳＱ．に指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチド・コード化する
【図１０Ａ】図１０Ａ−１０Ｄは、アミノ酸配列を提供する人間の第ＶＩＩＩ因子Ｂ−領域は、ポリペプチドを削除した（配列番号：１３）
【図１０Ｂ】図１０Ａ−１０Ｄは、アミノ酸配列を提供する人間の第ＶＩＩＩ因子Ｂ−領域は、ポリペプチドを削除した（配列番号：１３）
【図１０Ｃ】図１０Ａ−１０Ｄは、アミノ酸配列を提供する人間の第ＶＩＩＩ因子Ｂ−領域は、ポリペプチドを削除した（配列番号：１３）
【図１０Ｄ】図１０Ａ−１０Ｄは、アミノ酸配列を提供する人間の第ＶＩＩＩ因子Ｂ−領域は、ポリペプチドを削除した（配列番号：１３）
【図１１Ａ】図１１Ａ−１１Ｂは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１２）、人間の第ＶＩＩＩ因子Ｂ−領域をコード化することは、ポリペプチドを削除した。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｂは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：１２）、人間の第ＶＩＩＩ因子Ｂ−領域をコード化することは、ポリペプチドを削除した。
【図１２】図１２は、本発明の１つの可能な要因ＶＩＩＩＳＥＰ異型の概略図を提供する。ＨＰ６３／ＯＬと称され、異型は豚のようなＡ１領域および部分的に人間らしくされたａｐ−Ａ３領域を含むそのには、約１６９０の乃至約１８０４からの、そして、約１８１９からの豚のようなアミノ酸が設けられて、約２０１９ように構成されている。
【図１３】図１３は、アミノ酸配列を提供する（配列番号：２１）本願明細書においてＨＰ６３／ＯＬに指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化する。
【図１４Ａ】図１４Ａ−１４Ｂは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：２０）本願明細書においてＨＰ６３／ＯＬに指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化する。
【図１４Ｂ】図１４Ａ−１４Ｂは、ヌクレオチド配列を提供する（配列番号：２０）本願明細書においてＨＰ６３／ＯＬに指定される要因ＶＩＩＩＳＥＰポリペプチドをコード化する。
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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