(57)【要約】本発明は生体分子並びに生物体、細胞、組織、器官の誕生時期もしくは合成時期を判定するための新しい方法を提供する。さらに、生物体の生体分子の誕生時期を判定することによって、生物体の誕生時期を判定するための方法を提供する。本発明に従い、ＡＭＳを基礎とする方法をＤＮＡ中の１４Ｃ測定に利用して、細胞の誕生時期を判定する（例えば齢の決定）。細胞は最終的に分化するとその後は再び分裂しない。最後の細胞分裂は細胞がＤＮＡを合成した最後の時となるため、その染色体ＤＮＡは細胞が作られた時期を反映することとなる。このため、染色体ＤＮＡの１４Ｃ齢を確立することによって細胞の「誕生日」並びに細胞交替の速度を判定することができる。
2005537490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子の誕生時期を判定するための方法であって、以下の工程：
(ａ)生体分子を提供する工程；
(ｂ)該生体分子のΔ１４Ｃの値を決定する工程；
(ｃ)該ＤＮＡのΔ１４Ｃの値を該生体分子の誕生時期を判定するための較正用Δ１４Ｃチャートと比較することによって前記生体分子の誕生時期を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記生体分子が、細胞組織全体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体分子が、組織から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体分子が、動物もしくは植物、ウイルス、またはそれらの部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生体分子が、精製された細胞集団から単離された、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記精製された細胞集団が、神経細胞集団である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生体分子がＤＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ分子が、組織、細胞株または精製された細胞集団から単離される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記精製された細胞集団が、第２の誕生時期選別法に従って精製された、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記第２の誕生時期選別法が蛍光発色セルソーター(ＦＡＣＳ)によって行われて異なる細胞を選別し、該ＦＡＣＳ細胞選別法は、ヒストンアセチル化レベル、ＤＮＡ酸化レベル、細胞性リポフスチンレベル、またはこれらの組み合わせに基づく、方法。
【請求項１１】
前記Δ１４Ｃ値が加速器質量分析装置によって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記Δ１４Ｃチャートが、図１に示された較正用Δ１４Ｃチャートから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Δ１４Ｃチャートが、図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄおよび図１Ｅからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体分子が、細胞に由来するものであり、ここで、
該細胞が、工程（ｂ）に先立って第２の誕生時期選別法によって分析される、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の誕生時期選別法が、ヒストンアセチル化レベル、ＤＮＡ酸化レベル、細胞性リポフスチンレベル、またはこれらの組み合わせの測定からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の誕生時期選別法が、蛍光発色セルソーターを使用して、前記ヒストンアセチル化レベル、ＤＮＡ酸化レベル、細胞性リポフスチンレベルが測定する工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
生物体集団の生体分子の誕生時期を判定する方法であって、以下の工程：
（ａ）生物体集団から該生体分子の試料を集める工程であって、ここで、該生体分子を精製して該生物体集団中の他の含炭素分子を除去する、工程；
（ｂ）該生体分子中の炭素原子のΔ１４Ｃを決定する工程；
（ｃ）該Δ１４Ｃ値を較正用Δ１４Ｃチャートと比較して、該生体分子の誕生時期を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１８】
前記生物体が、動物、植物またはウイルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体分子がＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体分子が、動物由来の歯エナメル質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物が、ヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ウサギ、イヌ、ラット、マウスからなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Δ１４Ｃが、加速器質量分析装置（ＡＭＳ）によって測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記生体分子の誕生時期から前記動物の誕生時期を計算する工程
をさらに包含する、請求項１７に記載に方法。
【請求項２４】
細胞齢の第2の指標を測定する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の指標が、ヒストンアセチル化レベル、ＤＮＡ酸化レベル、細胞性リポフスチンレベル、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
候補薬が、動物体内のある種類の組織の細胞増殖に与える影響を決定する方法であって、以下の工程：
（ａ)請求項１に記載の方法を用いて、該動物に由来する組織型からの第１の細胞試料の第１の誕生時期を決定する工程；
（ｂ）該候補薬を該動物に投与する工程；
（ｃ）請求項１に記載の方法を用いて、該動物に由来する組織型からの第2の細胞試料の第２の誕生時期を決定する工程；および
（ｄ）該第1の誕生時期と該第2の誕生時期とを比較して、該候補薬が細胞増殖に対する影響を有しているか否かを決定する工程
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記組織型がＣＮＳ組織である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞増殖に対する処置の効果を決定する方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１に記載の方法を用いて、該動物の第1の細胞試料で第1の誕生時期を決定する工程；
（ｂ）該動物で事象を誘導する工程；
（ｃ）請求項１に記載の方法を用いて、該同じ動物の第２の細胞試料で第２の誕生時期を決定する工程であって、ここで、該第１の神経細胞試料と該第2の神経細胞試料は同一の組織から採取する工程；および
（ｄ）第1の誕生時期と第2の誕生時期とを比較して、該神経学的事象が細胞増殖に対する影響を有しているか否かを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、前記処置が、外傷、誘導性障害、外科的手順および薬剤の投与からなる群より選択される、方法
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記処置が、神経学的異常を誘発するかあるいは神経学的異常に影響する、方法。
【請求項３１】
生体分子の誕生時期を決定する方法であって、以下の工程：
（ａ)生体分子を提供する工程；
（ｂ)該生体分子の同位体濃度を測定する工程；および
（ｃ)該同位体濃度を、該生体分子の誕生時期を判定するための較正用同位体濃度チャートと比較して該生体分子の誕生時期を決定する工程；
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連する出願の引用）
本出願は２００２年９月３日に出願された表題「Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｒｔｈ  Ｄａｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ  ６０／４０７，８６３に優先する便益を請求する。この明細において引用された全ての特許及び特許出願書、参考文献は、参考として、その全体が援用される。
【０００２】
(発明の分野）
本発明は、生物体の齢に加えて、動物、植物、ウイルス由来の生体分子並びに細胞、組織、器官の齢もしくは誕生時期を判定する新しい方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景）
身体の細胞は定められた寿命を持っている。臓器によっては、細胞はターンオーバーを続け、古い細胞は新しいものに置き換えられる。成熟した、あるいは分化した細胞が分裂能を持ち、同じ種類の細胞を増やしていくことはしばしばある。しかし、ニューロン等の分化した細胞類は分裂することができない。このようなものでは、分化がまだ進んでいない幹細胞あるいは前駆細胞から新しい細胞が生じる。細胞ターンオーバーについての知識は、基本的な生物学的プロセスを理解するのに必須である。多数の疾病が新たな細胞の誕生に影響を及ぼし、細胞ターンオーバーについての知識はこのような疾病の原因と治療についての新たな洞察を提供すると考えられる。
【０００４】
細胞ターンオーバーはいくつかの方法で研究されてきている。一つは、分裂中の細胞に選択的に発現する細胞マーカーを調べる方法である。このようなマーカーの発現は多様な組織について細胞増殖の研究に使用することができる。しかしこの方法は細胞分裂時の細胞のみを検出するものであり、情報量に限界がみられる。多くの細胞は分裂後間もなく死ぬため、細胞分裂マーカーは器官あるいは組織中で作られる新しい細胞の数の正確な評価を提供することができない。さらに、この方法は幹細胞あるいは前駆細胞から生じたばかりの細胞の表現型の測定に用いることはできない。
【０００５】
別の方法は、安定した遺伝性マーカーを用いて分裂細胞を標識するものである。この方法は、分裂細胞のゲノムに入り込む標識したヌクレオチドを投与して実施することができる。ヌクレオチドは放射性同位体（例えば３Ｈ−チミジン）を用いて標識することができ、オートラジオグラフィーあるいは他の方法で検出することができる。またヌクレオチドは化学修飾（例えばチミジン類似物ＢｒｄＵ）を用いて標識することもでき、免疫組織化学的手法によって検出することができる。この方法は有用であるが、いくつか重大な欠点がある。第一に、細胞ターンオーバーの全体像ではなく、ヌクレオチド類似物を加えた時の断片像のみしか得られない。第二に、修飾したヌクレオチドは分裂細胞に対して毒性を有し、その結果実際の細胞ターンオーバーを有意に過小評価することになる（Ｚｈａｏ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３)Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  １００（１３）：７９２５−７９３０）。第三に、この毒性のため、普通、修飾ヌクレオチドをヒトの研究に使用することはできない。第四に、細胞が分裂している時にこのヌクレオチドを生物体に投与しなければならないため、剖検があらかじめ除外される。
【０００６】
一方別の方法では、特別なマーカーを発現するよう作られたレトロウィルスを注射する。この方法では、新たな細胞分裂を終えた細胞のみがレトロウィルスを取り込むことになる。この方法によって細胞分裂の正確な判定が可能になるが、ウィルス性のベクター注射することで注射部位周囲に外傷を引き起こすことになり、ヒトの研究には使用することができない。このため、剖検やヒト器官及び組織に使用することのできる、細胞ターンオーバーを測定するより正確な方法の開発が必要とされている。
【０００７】
これまでは、脳及び脊髄は胚発生及び初期生後発育の後の期間では神経発生がおこらない部位であると考えられてきた。しかし近年、成体哺乳動物の脳にある幹細胞から新たなニューロンが絶えず作られていることが確かなこととなった（ＭｃＫａｙ，１９９７）。鳴鳥の囀りシステムと海馬形成において、神経発生が起きていることが示されており（Ｍａｃｋｌｉｓ）、齧歯動物の海馬形成時及び嗅球形において新生ニューロンが見つかっている（Ａｌｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｄａｓ，１９６５;Ｐａｌｍｅｒ，Ｔ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７)Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ.Ｎｅｕｒｏｓｃｉ.８：３８９−４０４;Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９)Ｃｅｌｌ  ９６：２５−３４）。霊長類では海馬の歯状回及び側脳室の壁に沿ってある脳室下領域で神経発生が報告されている（Ｇｏｕｌｄ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９)Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９６：５２６３−５２６７）。
【０００８】
神経発生が成体類人猿の脳の他の部分で起きているかどうかは、依然意見が分かれるところである（Ｇｏｕｌｄ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９)Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５４８−５５２;Ｂｅｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２;Ｋｏｋｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３;論評については、Ｐａｋｉｃ，Ｐ．，（２００２)Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：６５−７１  を参照する。）成体哺乳類の神経発生についての証拠の大半は、マスス及び霊長類の研究から得られている。一つの研究であるが、末期咽頭癌及び舌癌に対する臨床試験の一部としてＢｒｄＵを投与された患者の脳組織の分析がなされた（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８)Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４（１１）：１３１３−１３１７）。このＢｒｄＵ投与方法は神経発生の検知に最適化されたものではなかったが、筆者らは海馬歯状回及び側脳室の脳室下領域内でＢｒｄＵ陽性細胞を確認し、歯状回のＢｒｄＵ陽性細胞はニューロンに対するマーカーであるＮｅｕＮに対しても陽性を示した。加えて霊長類でなされた研究では、小脳及び大脳皮質で成体神経発生が生じていることが示唆されている（Ｇｏｕｌｄ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９)Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５４８−５５２;Ｂｅｒｎｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００９】
炭素は大気中で１２Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃの三つの同位体が存在する。低量であるが、１４Ｃは宇宙線と窒素との相互作用によって大気中で作られる。しかし大気中の１４Ｃレベルは１９６０年代半ばの熱核実験のために劇的に増加した（Ｎｙｄａｌ  ａｎｄ  Ｌｏｖｓｅｔｈ，１９９７）。熱核実験は大気圏核実験禁止協定が実施され、１９６３年に終わっている。この時以来、大気中の１４Ｃレベルは指数関数的に減少しており、現在のレベルは１９５０年に測定されたレベルの約１１０％である。大気中の１４Ｃ濃度は今後２０年以内に熱核実験を行う前のレベルに達すると見込まれている（Ｌｏｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００１０】
この大気中１４Ｃの指数関数的な減少は、環境貯蔵中のＣＯ２との交換と、１４Ｃを減少させるＣＯ２が化石燃料の燃焼によって発生したことによる。１４Ｃの半減期は５７３０年であり、１４Ｃが崩壊して他の炭素種に変わったためではない。大気中の１４Ｃレベルは全世界に渡る研究者によって測定されており、Δ１４Ｃ（大気中の１４Ｃ測定値を同位体分別と放射性崩壊に応じて補正した値）と時間との関数としてプロットされている。これはボムスパイク（ｂｏｍｂ−ｓｐｉｋｅ）プロットを作成するために使用される。このプロットは、１９６０年代初頭の北半球における対流圏中の放射性炭素レベルが鮮明なピークとなることを示し、原子核兵器実験が最も頻繁に行われた場所を反映している。
【００１１】
従来１４Ｃは、個々の炭素原子の放射性崩壊を計数することによって測定されていた。この技術は比較的反応性が鈍く、統計的な誤りを被りやすい。１４Ｃの半減期は極端に長にため、測定期間中に崩壊する原子の数は非常に少ない。また生体物質には、炭素１ｍｇ当たりにわずか１００アトモルしか含まれておらず、炭素重量のうちの約２３−３０％がＤＮＡに含まれている。このように、２、３年程度の時間の差異を判定するには、これまでの検出方法を使用することができない。
【００１２】
近年の質量分析技術（例えば加速器質量分析、ＡＭＳ）の感度及び精度の進歩によって、試料中の１４Ｃ原子数を１０億分の１から１０１５の１というレベル（１ｘ１０９〜１ｘ１０１５）で計数することが可能となった。この方法は、数百年あるいは数千年単位ではなく数年の単位であるものの誕生時期を特定するのに用いることができる。ＡＭＳは骨や胆石等の生物試料の誕生時期を定めるのに使用されており（Ｍｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、またアルツハイマー病の老人班及び神経原線維濃縮体にも使用されている（Ｌｏｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。現在のところ、ＤＮＡ中の１４Ｃレベルを測定して細胞の誕生時期を定めるためにＡＭＳを使用することを示した研究者はいない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の概要
本発明に従い、ＡＭＳを基礎とする方法をＤＮＡ中の１４Ｃ測定に利用して、細胞の誕生時期を判定する（例えば齢の決定）。細胞は最終的に分化するとその後は再び分裂しない。最後の細胞分裂は細胞がＤＮＡを合成した最後の時となるため、その染色体ＤＮＡは細胞が作られた時期を反映することとなる。このため、染色体ＤＮＡの１４Ｃ齢を確立することによって細胞の「誕生日」並びに細胞交替の速度を判定することができる。本発明の方法を疾病あるいは外傷、変性疾患に伴う異型細胞分裂や細胞分裂の異常の検査に使用することができることが利点である。研究することが可能と考えられる細胞分裂には、ＣＮＳ細胞分裂（神経発生）及び肝臓、心臓、膵臓における細胞分裂が含まれる。別の局面として、本発明の方法は細胞及び組織、器官、ヒトや他の生物種等の生物体の誕生時期判定に使用することができる。
【００１４】
本発明の方法では、生体分子から測定されたΔ１４Ｃの値をボムスパイクΔ１４Ｃチャートとも呼ばれる歴史的なΔ１４Ｃ値のチャートと比較する。望ましい実施例において、使用するボムスパイクチャートは図１に示した多数のボムスパイクチャートのうちの一つである。より望ましい実施例では、使用するボムスパイクチャートは図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅから選択される。
【００１５】
生体分子とは、この明細の目的のためには一つ以上の生体分子を指す。従って、例をあげると、生体分子はＤＮＡ分子、並びに採取されたＤＮＡ分子群、染色体、細胞、全体組織切片、生物体（動物あるいは植物、ウィルスを含む。）であることができる。生体分子が複数種類の分子から構成される場合、誕生時期は分析される全ての生体分子の誕生時期の平均である。
【００１６】
本発明の一実施例は、構成生体分子の誕生時期を判定するための方法に関係する。この方法では、含炭素生体分子を準備する。Δ１４Ｃ値はこの生体分子から得られる。次に、前記ＤＮＡのΔ１４Ｃを較正用Δ１４Ｃチャートと比較することによってこの生体分子の誕生時期を判定する。図１にあるどのチャートも誕生時期の決定に使用することができる。特に、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅで示されたチャートが望ましい。
【００１７】
この方法の一局面では、用いる生体分子は、例えば、脳切片、肝臓切片、心臓切片等の全組織である。別の局面では生体分子は組織から単離される。これらの例では生体分子はＤＮＡ等の細胞内分子であることができる。生体分子は一個体の動物（例えば小動物あるいは単細胞動物）、植物、あるいはウイルスを含むことができる。別例では、生体分子は、例えば単離神経細胞集団、脾臓細胞集団、肝細胞集団等の精製された細胞集団であることができる。こうした細胞集団はＦＡＣＳ等の既知の方法を用いることによってさらに精製することができる。生体分子はこの明細に掲載されているあらゆる組織、細胞集団、生物体から精製されたＤＮＡであることができる。別例では精製された細胞集団はΔ１４Ｃ測定の前に副次的誕生時期分類方法に従ってさらに精製することができる。当該方法の一例には、ヒストンアセチル化レベル、ＤＮＡ酸化レベル、細胞質リポフスチン（ｌｉｐｏｆｕｓｃｈｉｎ）レベル、あるいはこれらの組み合わせに従って細胞を選別するためにＦＡＣＳを用いる方法が含まれる。第２の誕生時期選別法によって選別された細胞のΔ１４Ｃレベルを測定することができる。二者択一的に、幅のある誕生時期を定めることのみが目的である場合、第２の誕生時期選別法によって誕生時期を判定した後に、Δ１４Ｃによって平均誕生時期を判定するために細胞を組み合わせて用いることができる。
【００１８】
Δ１４Ｃの値は、この明細のいかなる方法によるものであっても、例えばシンチレーションカウント等既知の方法によって測定することができる。Δ１４Ｃ測定のための望ましい方法は加速器質量分析装置による方法である。
【００１９】
本発明のもう一つの側面は、生物体集団内の生体分子の誕生時期を判定する方法に関係する。この方法では、生物体集団由来の前記生体分子サンプを採取し、精製してこの生物体集団の他の含炭素分子を除去する。次にΔ１４Ｃレベルを較正用Δ１４Ｃチャート（ボムスパイクチャートとも呼ばれている。）と比較してその生体分子の誕生時期を判定する。
【００２０】
一例では、生体分子は動物由来の歯エナメルであることができる。あらゆる動物を使用することができるが、望ましい動物はヒト並びにウマ、ブタ、ウシ、ウサギ、イヌ、ラット、マウス等の哺乳動物である。誕生時期は、動物体内でエナメル質が概ね形成された時期を知ることで計算することができる。例えばウマでは、門歯のエナメル質は普通そのウマの誕生時期よりも６年若い。このように、エナメル質が１０歳とされた場合は、そのウマはおよそ１６歳と考えられる。この方法は一般に、誕生時期とエナメル質の形成時期との比較がわかっている動物であればいかなるものにも適用することができる。
【００２１】
本発明の別の局面は、候補薬が細胞増殖に対する影響を有しているか否かを判定するスクリーニング方法に関係する。この方法では、組織試料を動物から採取し、本発明の方法を用いて誕生時期の測定を行う。次にその動物に候補薬を投与する。投与した後、同じ部位から同じ種類の別の組織試料をその動物から採取し、誕生時期の判定を行う。この二つの誕生時期を比較して細胞増殖が起こっていたか否かを判定する。細胞増殖が起こっていれば組織の誕生時期は減少している（より若い）はずであり、これは新たな細胞増殖が起こっていることを示している。どんな組織でも試験することができる。組織の例には、この明細にあるあらゆる組織が含まれ、少なくとも神経組織並びにＣＮＳ組織、肝臓、脾臓、心臓、膵臓が含まれる。
【００２２】
本発明の別の局面は、治療が細胞増殖に対する影響を有しているか否かを判定するスクリーニング方法に関係する。この方法は、組織試料を動物から採取し、本発明の方法を用いて誕生時期の測定を行う。次にその動物に治療を施す。治療の後、同じ部位から同じ種類の別の組織試料をその動物から採取し、本発明の方法を用いて誕生時期の判定を行う。この二つの誕生時期を比較して細胞増殖が起こっていた否かを判定する。
【００２３】
治療には例えば電気ショック、外科治療、人為的障害、外科的手段、薬剤の投与等あらゆる治療を含むことができる。
【００２４】
本発明の別の局面は、生体分子の誕生時期を判定する方法を導く。この方法では、生体分子を準備する。その生体分子の同位体濃度を測定する。この同位体は時間に伴い形体変化を呈するあらゆる同位体であることができる。典型的な同位体には窒素と炭素が含まれる。生体分子の誕生時期は同位体濃度較正用チャートを用いて同位体濃度から判定することができる。
【００２５】
本発明のあらゆる方法において、生体分子の誕生時期測定はその生体分子から構成される細胞あるいは組織、生物体の誕生時期の判定に用いることができる。例えば、ＤＮＡは普通細胞が誕生している間に生成される。ＤＮＡの誕生時期はそのＤＮＡを採取した細胞および組織の誕生時期を反映することとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（発明の詳細）
本発明は、生体分子のΔ１４Ｃの値を求めることによって生体分子の齢を判定するための方法を導く。生体分子は生きた生物体によって合成されるあらゆる含炭素分子であると定義される。生体分子は少なくとも、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂肪酸、油脂及び生物体（生きているあるいは生きていないもの。）中の他の含炭素分子を含むことができる。ＤＮＡは細胞分裂時に合成され、このためＤＮＡの形成時期を判定すると細胞の誕生時期の判定となることから、望ましい生体分子の一つはＤＮＡである。しかし、細胞中の他の生体分子の形成時期判定も有用である場合がある。例えば、保存されている組織試料、凍結ワクチン、歴史的な血液サンプル等の保存期間を、Δ１４Ｃを測定して判定することが可能である。
【００２７】
上記のようにＤＮＡは細胞誕生の近い時期に合成され、且つＤＮＡは分裂していない細胞では合成されないため、ＤＮＡ分子の齢の測定は細胞の齢の正確な示唆を提供することとなる。ＤＮＡと同様に、細胞誕生の近い時期に合成されるが細胞が生存している間は合成されない他の含炭素生体分子は細胞の齢を判定するのに利用することができる。
【００２８】
Δ１４Ｃの値は試料の放射性崩壊を測定して求めることもできる。残念なことに、１４Ｃのような半減期の長い放射性同位体は崩壊によってでは効率よく検出されない。わずか０．１％の１４Ｃ（５７３０年）を測定するのに８．３年間絶え間なく計数しなくてはならない（０．１％  ｘ  ５７３０年／  ｌｎ（２））。つまり、崩壊を検出する間に標識となる同位体の感度と特異性が失われる。
【００２９】
１９７０年代後半及び８０年代を通じて、低エネルギー核物理学の研究分野において、１４Ｃや他の長命の同位元素を直接検出するための質量分析法が開発された。現在では、１４Ｃ誕生時期判定法は、高正電荷炭素原子を得るために粒子加速器を使用することによって正確に完成されている。ここで高正電荷炭素原子は質量分析装置によって分離されて直接または間接的に計数される。
【００３０】
ＡＭＳを用いる方法は、イオン源、加速器および様々な検出器から構成される分析装置を利用する。ＡＭＳは炭素イオンビームを加速して非常に高いエネルギー状態とする。高エネルギー状態では、炭素イオンビームは巨大な磁石を用いて操作することができ、様々な同位体（１２Ｃ及び１４Ｃ）を別々の検出器へ向けることができる。
【００３１】
簡単に述べると、実験室にてＤＮＡを純炭素に変換させる。この調製サンプルを脱気箱内に置く。そこでサンプルはセシウム陽イオン（Ｃｓ＋）で衝撃する。セシウム衝撃の結果として、炭素イオンビームは次に加速器中で加速される。加速器からイオンが発生するので、イオンはその質量に応じて磁場及び電場によって分離され、次に様々な検出器で計数される。加速された炭素を分析フィルターで分析する。１４Ｃ分析から得られたデータは、Δ１４Ｃ値という形で得られる。
【００３２】
Δ１４Ｃは同位体分別及び放射性崩壊に合わせて補正された値である。齢に関係する同位体質量分別及び放射性崩壊に合わせて補正した後に、大気中の１４Ｃ含量はΔ１４Ｃとして表わされる（Ｓｔｕｉｖｅｒ  ａｎｄ  Ｐｏｌａｃｈ，１９７７:Ｓｔｕｉｖｅｒ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｐｏｌａｃｈ，Ｈ．Ａ．，（１９９７）Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ:Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  １４Ｃ  ｄａｄｔａ.Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ  １９：３５５−３６３）。Δ１４ＣはＮＩＳＴ（元ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）シュウ酸標準活性から測定された１４Ｃ活性の相対偏差である。
【００３３】
ＡＭＳは当初地質年代学の難題のために開発されたものであり、ＡＭＳの感度は１０億分の１から１０１５分の１に達する。ここで最高位同位体がその自然発生の関数となる。イオン同定技術が作動できるよう十分低い割合になるようにイオン数を減らすために、いくつかの磁気部分と電気部分とが必要となる。
【００３４】
前のパラグラフに記載したが、効率的な処理はグラファイト試料でのみ可能である。この分析を円滑に進めるため、生体試料は全て個別に密封した試験管中で燃焼してＣＯ２にし、次に亜鉛金属と水素化チタンを加えた別の密封試験管中にて、このＣＯ２を鉄もしくはコバルト触媒上で還元してグラファイトとする（Ｖｏｇｅｌ  １９９２）。
【００３５】
ＡＭＳは１４Ｃ誕生時期判定に係わる団体から生まれたものであり、「モダン（Ｍｏｄｅｒｎ）」という単位も導入された。これは宇宙放射線のみによって静止大気中に存在すると考えられる１４Ｃ濃度である。前世紀において、二つの人為改変的影響が大気１４Ｃ濃度に深刻な影響を与えた。産業革命促進のため化石燃料を燃焼したため、１８００年代中期から１４Ｃを含まない遊離ＣＯ２量が増加した。次いで大気圏内核兵器試験によって大気中の１４Ｃ濃度が大きく上昇し、１９６３年までに１４Ｃ濃度は二倍になった。１９６４年に大気圏核実験禁止協定が署名されてから、この多大に過剰な１４Ｃは次第に大気から海洋へ吸収され、１５年の半減期で減少していった。この理由から現在の大気は１．１モダンの放射性炭素平衡状態にある。
【００３６】
３回以上測定した１４Ｃ濃度の標準偏差によって測定すると、ＡＭＳ測定の精度は３〜５％である。ＡＭＳはこの範囲に渡って正確に分子を定量する数少ない方法の一つである。放射性炭素年代測定法は、ＡＭＳを非常に厳密に応用したものであり、国際比較（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）はＡＭＳが液体シンチレーションよりも正確であり、ＣＯ２比例計数法と同程度に正確であることを示している（例えばＳｃｏｔｔ  １９９０を参照）。
【００３７】
本発明の望ましい実施例では、生体分子の合成時期（つまり細胞の誕生時期）は、対応する時期を予測するために１４Ｃ値曲線を参照して判定することができる。１４Ｃ曲線はこの明細の図にて提供されている。この明細にある１４Ｃ曲線は生体分子の齢を予測するために使用することができる。本来、高い精度を持つ曲線が望まれ、試料に適した曲線（例えば北半球Δ１４Ｃ曲線あるいは南半球Δ１４Ｃ曲線）を使用して時期予測の精度を改善することができる。しかし、精度の低い曲線もしくは別の半球用の曲線を用いてもこれまで達成できなかった、ある程度の正確さは得られることに注意すべきである。
【００３８】
大気（様々な層で）、木の年輪、珊瑚、外洋と、Δ１４Ｃ値は様々な所から世界中で集められている。最も包括的なボムスパイク曲線は、Ｉｎｇｅｂｏｒｇ  Ｌｅｖｉｎ（Ｌｅｖｉｎ，Ｉ.ａｎｄ  Ｂ.Ｋｒｏｍｅｒ，Ｔｗｅｎｔｙ  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  １４ＣＯ２  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｓｃｈａｕｉｎｓｌａｎｄ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ.Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ  ３９：２０５（１９９７），Ｌｅｖｅｎ，１９９２;Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）によって集められたものであり、北半球及び南半球にて１８９０年から現在まで多彩なサンプル場所を包含している。さらに、我々はスウェーデンの木の年輪からΔ１４Ｃ曲線を集めた（図６）。このデータはスウェーデンの１４Ｃレベルが北半球のいたる場所で報告されている大気中１４Ｃレベルと一致していることを示している点が重要である。望ましい実施例において、これらの記録は、例えばヨーロッパあるいはスウェーデン等、北半球での誕生時期判定に有用である。これらのデータは最新の１４Ｃレベルについて現在の報告類に欠けているさらなる情報を、スウェーデン中心部のものは特に詳細に、提供する。
【００３９】
本発明の方法は生体分子、細胞、組織、あらゆる細胞の器官に適用することができ、これには動物並びに植物、ウィルス等あらゆる生物体由来の細胞が含まれる。この生物体はマウス並びにウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラット、ウサギ、霊長類（ヒトを含む。）等の哺乳動物であることができる。
【００４０】
本発明の誕生時期判定法の別の応用
本発明の方法は中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞の齢を判定するのに適している。哺乳類の中枢神経系（ＣＮＳ）の発生は胎児成長の初期段階で始まり、生後期まで続く。哺乳類成体のＣＮＳは主に神経細胞（ニューロン）、そしてグリア細胞（星状体と乏突起膠細胞）から構成される。
【００４１】
神経発生の第一段階は細胞の誕生である。これは正確に時間経過的、空間的順番をたどって幹細胞と幹細胞の後代（例えば娘幹細胞並びに前駆細胞）が増殖する。増殖する細胞から神経芽細胞及び神経節芽細胞、新たな幹細胞が生じる。
【００４２】
第二段階は細胞型の分化と移動の期間である。この時未分化の前駆細胞は分化して決まった場所へ移動するニューロンとグリア細胞を生み出す神経芽細胞と神経節芽細胞とになる。神経管由来の細胞からＣＮＳのニューロン及びグリア細胞が生じ、神経冠由来の細胞から末梢神経系（ＰＮＳ）の細胞が生じる。
【００４３】
神経発生の第三段階は、特異的な神経伝達物質の発現等、細胞が表現型的特質を獲得する時である。例えば、この時ニューロンは標的とシナプス形成する突起を伸ばす。ニューロンは主に胎児期に発生するが、乏突起膠細胞と星状体は生後期間の初期に発生する。生後期間の後期までに、ＣＮＳはＣＮＳの全ての神経細胞を持つようになる。
【００４４】
ＣＮＳ発生の最終段階は選択的細胞死である。この段階では特定の細胞及び繊維、シナプス結合が退縮して死に、神経系の複雑な回路を「微調整」する。この「微調整」は宿主生物体が生きている間続く。寿命が進むと、老化による選択的退縮や感染並びに他の未知の病因が神経退縮疾患を引き起こす場合がある。
【００４５】
別の組織にみられる多くの他の細胞と異なり、哺乳類成体ＣＮＳのニューロンには細胞分裂周期に入って新しい神経細胞を生み出す能力がない。星状細胞に限定された、ゆっくりとしたターンオーバーがあること（Ｋｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ.Ｃｏｍｐ.Ｎｅｕｒｏｌ．，１５９：１６９，１９７１）、並びに乏突起膠細胞の前駆体が存在すること（Ｗｏｌｓｑｉｊｋ  ａｎｄ  Ｎｏｂｌｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０５：３８６，１９８９）が認められているが、新たなニューロンは通常発生していない。つまり、神経発生（新たなニューロンの発生）は生後期間の初期にほぼ終了している。
【００４６】
ＤＮＡ合成は細胞が誕生した時点で完了し、細胞の誕生は寿命の初期段階で起こるため、ＣＮＳのＤＮＡは細胞の信頼性のある齢の指標質として利用することができる。さらに、本発明の方法によって、ＣＮＳにおける細胞分裂のより詳細な研究が可能となる。本発明の方法は誕生時期の判定に有用であり、つまり成体神経細胞の細胞分裂活性の研究に有用である。この技術は哺乳動物では神経発生が成体期に入っても続くことを示す幹細胞の分野における最近の発見をもたらした点で特に重要である。現在のところ、研究対象となる動物（ヒトを含む。）に有害性がなく、誕生時期（遡及的誕生時期判定（ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｄａｔｉｎｇ）を含む。）あるいは細胞分裂活性の判定に利用できる他の方法は存在しない。
【００４７】
本発明の誕生時期判定法は疾患の研究に用いることができる。疾患の一例はＣＮＳ疾患である。通常の神経発生の異常はいくつかの神経学的状態に結びついている。ストレスが神経発生を抑制することが示されており（Ｇｏｕｌｄ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８)Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９５：３１６８−３１７１）、うつ病及び不安症患者で、前前頭皮質と海馬にてニューロンの減少が認められている。慢性うつ病患者の脳の特異的部位が非うつ病患者のものよりも小さくなっていることが認められている（Ｃｚｅｈ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１)Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９８（２２）：１２７９６−１２８０１）。海馬神経発生が、抗うつ薬の行動効果に必要であることが示されている（Ｓａｎｔａｒｅｌｌｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３)Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（８）：８０５−８０９）。
【００４８】
また、神経発生の調節機能の消失はパーキンソン病やアルツハイマー病等の神経変成性疾患に付随する（Ｂａｒｚｉａｌｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍｅｌａｍｅｄ，Ｅ.（２００３)Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ.Ｍｅｄ.９（３）：１２６−１３２;Ｔａｔｅｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３)Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ.１０５（３）：２２５−２３２）。様々な脳の発作が哺乳類成体の脳における神経発生を増加させることを示唆する証拠が集められている。齧歯類成体のてんかんモデルにおける歯状回の神経発生についての研究によって、発作によって誘発された神経発生は海馬の永続的過興奮に寄与する可能性のある神経芽細胞の移動並びに統合の異常を含むこと、また卒中の後、脳室下領域の神経発生が増加することが示唆される（論評についてはＰａｒｅｎｔ，Ｊ．Ｍ.（２００３)Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔ  ９（４）：２６１−２７２を参照する。）。よって正常脳及び病気の脳、外傷を受けた脳の細胞ターンオーバーの研究に、科学者並びに臨床医らは多大な興味を示すと考えられる。
【００４９】
一実施例では、本発明は生物体における神経発生の存在を判定する方法を導く。その生物体は動物、植物、ウイルスを含むあらゆる生きた生物体であることができる。その動物はヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ラット、マウス等あらゆる哺乳類であることができる。本発明の方法は前記動物の組織に適用して、平均誕生時期を判定することができる。平均誕生時期によって神経発生存在の有無の判定が可能になると考えられる。神経発生は正常発生の一部である場合も、神経退行疾患を含む神経性疾患の一部である場合も、外傷に対する反応の一部である場合も、あるいはその動物に投与された薬剤に対する反応の一部である場合もある。本発明の方法は、細胞あるいは生体分子のターンオーバーに関心が向けられるあらゆる健康状態並びに心身異常の研究に用いることができる。さらに、例えば、細胞分裂あるいは細胞分化の誘発によって、もしくは新しい細胞の注入によって疾患が治癒された場合に、本発明の方法を用いてこの過程をモニターすることができる。
【００５０】
本発明の方法についての別の重要な使用法は、医薬品開発及び治療法開発の分野にある。医薬品スクリーニング目的のため、ＣＮＳ機能、ＣＮＳ機能不全、ＣＮＳ発生の研究のために必要性が存在する。ヒト成体の神経系は、神経管に存在する少数の前駆体から発生する間に生じる、数十億の細胞から構成される。哺乳類のＣＮＳは複雑であるため、ＣＮＳ発生経路の研究は、機能不全のために発生したヒト成体ＣＮＳの変質の研究も同様、困難なものであった。本発明の方法は、例えば患者を候補薬で治療した後にＣＮＳ細胞における細胞分裂をモニターするのに使用することができる。
【００５１】
本発明の一実施例は一細胞あるいは細胞集団の誕生時期を判定するための方法である。誕生時期とは調べる対象である細胞に起こる最後の細胞分裂の時期であると定義される。分析のため複数種類の細胞から生体分子が集められた場合、誕生時期は生体分子試料に関係する全ての細胞の平均誕生時期を指すと理解される。誕生時期は年及び月として表される。誕生時期判定の精度は±５年以下であることができる。望ましい実施例では、誕生時期判定の精度は±３年以下であることが可能であり、例えば±２年以下あるいは±１年以下である。最も望ましい実施例では、誕生時期判定の精度は±６ヶ月である。
【００５２】
本発明の一方法では、目的となる細胞集団を単離することによって誕生時期が判定される。その細胞集団は生物体中のあらゆる細胞集団であることができる。望ましい一実施例では、細胞集団は動物体内でゆっくりとした細胞分裂速度を呈する集団である。本発明の方法は細胞分裂活性の低い細胞に限定されないが、例えば、細胞分裂速度が高いタイプの細胞である血液細胞の判定には利用度が低い。これは大半の血液細胞の誕生期間が一年に満たないためである。細胞分裂活性の低い細胞集団の一例はニューロンである。
【００５３】
疾患の研究における第一段階には、生物体からの細胞集団の単離が含まれる。細胞集団は単純な切開によって単離することができる。二者択一的に、細胞を組織試料から分離することができる。分離した細胞はさらに、受容体あるいは細胞の種類に特異的なタンパク質に対する蛍光抗体並びに蛍光発色セルソーター等既知の技術を用いて選別あるいは精製される。細胞精製の他の方法には、例えばパーコール比重法等密度勾配法の使用が含まれる。本発明の方法は生きた細胞を必要とすることに限定されない点に注意すべきである。つまり、細胞精製技術の範囲は、細胞の生存能力を維持するものに限定されない。
【００５４】
細胞集団を単離後、その細胞集団からＤＮＡを単離する。ＤＮＡ単離の一部分には、細胞集団由来の全ての有機分子（全ての非ＤＮＡ炭素源）からＤＮＡを精製することを含む。他の有機分子にはＲＮＡ、タンパク質、脂肪酸、膜等が含まれる。ＲＮＡは例えばＲＮアーゼ分解等の標準的な技術を用いてＤＮＡから除去することができる。
【００５５】
Δ１４Ｃの値はＤＮＡから判定することができる。例えば液体シンチレーションカウントを含め、Δ１４Ｃを求める方法は数多くあるが、ＡＭＳを用いる方法が望ましい。
【００５６】
ＤＮＡの合成時期はそのＤＮＡのΔ１４Ｃを図１のチャートと比較することで求められる。例えば、Δ１４Ｃを図１Ａに照らし合わせて誕生時期を判定することができる。二者択一的に、よりよい結果を得るためには、ＤＮＡの採取源がわかっている場合、図１Ｂの北半球用チャートあるいは南半球用チャート等より詳細なチャートと照らし合わせることができる。同様にオーストリアもしくはスペイン、ドイツ近辺から採取されたＤＮＡ試料の齢は、図１Ｃと照らし合わせて判定することができる。このようにしてＤＮＡ試料の誕生時期を判定する。
【００５７】
ＤＮＡ合成は細胞の誕生とほぼ同じ時に始まることから、細胞集団の誕生時期はＤＮＡの齢から判定することができる。さらに、細胞の種類とその種類の細胞の動物体内でのライフサイクルがわかっている場合、その動物の齢を判定することができる。例えば、パーキンジ細胞及び小脳細胞は誕生時期の前後がその誕生時期であり、肝細胞はおよそ３ヶ月ごとに分裂を繰り返す。また血液細胞の多くは週１回分裂する。
【００５８】
本発明の方法は、あらゆるＤＮＡあるいは歯エナメル質、細胞、あらゆる誕生時期の生物体の誕生時期の計算に使用することができる。一実施例では生物体の誕生時期は１９６３年以降である。別の例では、本発明の方法は１９６４年以降となる誕生時期の計算に使用することができる。より望ましい例では、本発明の方法は１９６５年以降となる誕生時期の判定に使用する。
【００５９】
本発明の別の方法は歯エナメル質の誕生時期判定の方法を導く。この方法では歯エナメル質試料を動物から採取し、精製して他の含炭素分子を除去する。他の含炭素分子には、象牙質や歯髄等歯の他の部分が含まれる。歯エナメル質からΔ１４Ｃを判定する。望ましい実施例では、Δ１４Ｃの値はＡＭＳを用いて求める。エナメル質の齢もしくは誕生時期は、歯エナメル質のΔ１４Ｃの値を図１のチャートと比較して判定することができる。歯エナメル質の誕生時期から、動物の齢を計算することができる。
【００６０】
治療薬剤のスクリーニング
本発明の方法は疾患治療のための薬剤のスクリーニングに使用することができる。「薬剤」という語は生物学的状態に影響をおよぼすことのできるものを指す。この語はしばしば「（単一の）刺激物」あるいは「（複数の）刺激物」、「手技」と同義となる。薬剤は物質、照射（電磁放射線並びに粒子放射線を含む。）、力（機械力、電気力、磁力、核力を含む。）、場等であることができる。薬剤として使用することのできる物質の例には、有機・無機化合物、核酸等の生体物質、炭水化物、タンパク質・ペプチド、脂質、及びこれらの混合物が含まれる。他の薬剤の具体的な例には、非大気温度、非大気圧、音響エネルギー、あらゆる周波数の電磁放射、特定の物質の除去（例えば虚血状態のような酸素の除去）、その他が含まれる。また薬剤という語は、神経発生に関係する成長因子も指す。これらの成長因子には、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ４／５、ＩＧＦ−１、エストロゲン、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１と２、ＮＴ−３、ＣＮＴＦ、レチノール酸、ＩＬ−６、ＬＩＦが含まれるがこれらに限定されない。
【００６１】
パーキンソン病では黒質細胞の６０％が失われ、その結果運動緩慢と震えを含む臨床症状が発現する。最近の治療法は、欠損している神経伝達物質ドーパミンの置換と、あるいはこれの代謝を阻害することによる存在量の維持とに向けられている。神経細胞を含む様々な候補薬（潜在的治療薬）の投与によってパーキンソン病に対する治療を探究することができる。
【００６２】
例えば候補薬あるいはドーパミン作動性細胞（神経幹細胞、基底核由来の前駆細胞、大脳辺縁系、黒質、視床下部、髄質、皮質、あるいは神経もしくは副腎由来（ＰＣ１２等）の他の細胞）あるいはドーパミンを、パーキンソン病を患う患者に投与することができる。投与の前後に黒質における平均誕生時期をモニタリングすることによって、研究者は投与の結果神経発生が起こっているか否かを判定することが可能である。即ち、もし神経発生が起こっていれば、より若い細胞集団であることを反映して黒質の細胞の平均齢は落ち込む。また本発明の方法は、新たなＤＮＡ合成によって確認される細胞分裂を直接測定することによって、間接的多面発現的効果（例えばセカンダリーメッセンジャー等によって）を通じて薬剤が神経発生を誘発することができるか否かを判定するのに適している。
【００６３】
この方法は、例えばアルツハイマー病があるが、様々なタイプの疾患に適用することが可能である。簡単に説明すると、基底前脳の平均誕生時期を判定し、次に候補薬をその患者に投与する。投与後に基底前脳の平均誕生時期を再び判定して候補薬が基底前脳において神経発生を誘導したか否かを判定する。
【００６４】
上記ではパーキンソン病とアルツハイマー病という二つの具体的な例について述べたが、本発明の方法は、何らかの過程で細胞分裂に関係する患者のあらゆる疾患の治療のためのあらゆる薬剤のスクリーニングに適している。本発明の方法で分析する細胞はあらゆる種類の細胞であることができる。
【００６５】
神経細胞は組織から分離した後に分析することができる。実施齢の箇所で示すように、蛍光発色細胞分離分別法あるいは他の分画方法によって、神経細胞を精製あるいは濃縮することができる。神経細胞を目的として細胞集団を濃縮した後、本発明の方法によって細胞の誕生時期を判定することができる。
【００６６】
本発明の方法の利点の一つは、細胞が生きていることに依存していない点である。実際、本発明の方法は死細胞にも等しく適用される。このため、本発明の方法は、科学的目的あるいは法医学の目的のために死んだ組織に適用することができる。本発明の別の利点は、その細胞が分析可能な生体分子を有している限り、その起源に係わらず、全ての細胞に適用される点である。このため例えば、植物細胞を動物細胞と同じ正確さで分析することも可能である。さらに、一種類以上の生体分子を、その分子を単離してΔ１４Ｃレベルを判定することによって、分析することもできる。本発明のあらゆる方法において、生体分子は細胞全体、あるいは組織全体であることができる。全細胞のΔ１４Ｃレベルは細胞成分を精製せずに判定することが可能である。
【００６７】
細胞あるいは核の齢範囲をより厳密にするために用いることが可能な別の方法には、細胞齢指標質の濃度に基づいた細胞（神経細胞を含む。）誕生時期判定法がある。
【００６８】
細胞齢指標質の一つはリポフスチンである。全ての細胞でリポフスチン（脂褐素）と呼ばれる産生物が時間と共に蓄積される。この色素の正確な分子組成は完全には解明されていない。しかし、リポフシンは黄色及び緑色の自己蛍光特性を持つ。４００から６００  ｎｍの光を用いてリポフスチンを励起するとこの蛍光特性が現れ、４００〜６４０ｎｍの自己蛍光を測定する。リポフスチンの蛍光特性を利用してリポフスチン濃度が異なる細胞小集団をフローサイトメトリーによって分離し、上記の１４Ｃの方法で様々なリポフスチン濃度の細胞小集団の齢を判定することが可能である。
【００６９】
別の細胞齢指標はヒストンのアセチル化である。ヒストンアセチル化は多数の方法によって測定することができる。このうち二つの方法では、蛍光標識した抗体を細胞から抽出して精製した（この明細の別の部分に記載する。）神経細胞核に直接加える。別の方法ではＮｅｕＮ陽性選別ニューロンからヒストンを抽出する。抽出されたヒストンは次に抗ヒストン蛍光結合抗体で標識する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６，Ｚｅｎｏｎ  Ｏｎｅ  キット等）。簡単に述べると、０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４でヒストンを抽出して４倍量のエタノールで沈殿させ、１５％シュークロースを含む０．９Ｍ酢酸中に溶解させる（Ｓｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。次に、核あるいはヒストンの集まりをＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ;蛍光発色細胞分析分離装置）選別装置に通して、標識化ヒストンをアセチル化レベルに応じて選別する。アセチル化レベルが高いもの、即ち古い細胞は、若いアセチル化レベルの低い細胞よりもはるかに強く蛍光を発し、試験に用いた細胞集団において若い細胞と古い細胞との割合に関して補助となる情報が得られる。ヒストンを精製してヒストンのアセチル化レベルを測定する別の方法は、アメリカ合衆国特許  Ｕ．Ｓ.Ｐａｔｅｎｔ  ６，０６８，９８７に記載されている。
【００７０】
第三の細胞齢指標はＤＮＡの酸化である。ＤＮＡ酸化はｏｘｏ８ｄｇレベルを見ることで測定される。ｏｘｏ８ｄｇレベルは、齧歯動物の全ての組織で齢が進むにつれて増加することが示されている（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。アビジン並びにこれの類似物によってｏｘｏ８ｄｇを直接検出することができ、核齢分析分離の別の方法となりうる。ここでも分析には、蛍光標識アビジン結合ｏｘｏ８ｄｇをＦＡＣＳで選別する方法が考えられる（Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００７１】
いずれの方法でも、細胞齢指標に応じて細胞を種々の小グループに選別することができる（必要な場合はＦＡＣＳによって。）。本発明の１４Ｃ分析方法を各小グループに適用して、その誕生時期を判定することができる。このように本発明の方法を用いて、細胞ターンオーバーのより厳密な像を得ることができる。
【実施例】
【００７２】
実施例１
抽出したＤＮＡのＡＭＳ分析を正確に成功させるためには、三つの点が望まれる。１）高収量のＤＮＡが必要である。２）ＤＮＡはできる限り純粋である必要がある。３）放射性混入物あるいは炭素混入物は除去されるべきである、もしくは最小限にするべきである。質量分析装置によるヒト小脳ＤＮＡの分析によって、ＤＮＡ全質量の２３から３０％が炭素から構成されていることが示されている。測定の精度を最適にするため、測定に用いる各試料から約２００μｇ以上のＤＮＡを抽出した。
【００７３】
様々なＤＮＡ抽出方法について、抽出したＤＮＡの純度と収量を調べた。高いＤＮＡ収量を提供する方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９)Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓのフェノール抽出法）と、高純度のＤＮＡを提供する方法（Ｄｉｎｇｌｅｙ，Ｋ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３)ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｉｔｏｎ  ａｎｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｄｕｃｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  Ａｃｃｅｌａｔｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ.Ｍｏｌ.Ｔｏｘ.Ｐｒｏｔ．；出版準備中）の二つが確立された。これらの方法は公開されている実験で使用され、マウス並びにウマ、ブタ、ヒト材料からのＤＮＡの抽出に成功している。全てのケースにおいて、滅菌かつ放射線のない領域を保つ最高レベルの配慮を伴って実験を行った。
【００７４】
ＤＮＡ最終抽出物にいかなる含炭素物も混入していない限り、あらゆるＤＮＡ抽出法が本発明の方法に有効である点に注意する。ＤＮＡ抽出の一方法を例として提供する。全組織を組織用ホモジェナイザーでホモジェナイズし、ＲＮアーゼで処理することができる。ＲＮアーゼ処理後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、非核酸成分を除く。水相ＤＮＡの抽出調製品は、０．３Ｍ（最終濃度）酢酸ナトリウムを加えたエタノールで沈殿させることができる。その沈殿物を７０％エタノールで洗い、乾燥させる。次のこのＤＮＡを滅菌Ｈ２Ｏに再懸濁し、ＤＮＡとタンパク質及びタンパク質分解酵素を含むもののために部分標本を取り分け、無水ＤＮＡサンプルを１４Ｃレベル判定のためにＡＭＳへ送る。
【００７５】
脳組織（小脳、皮質、海馬、並びに特に歯状回、側脳室、嗅球）及び筋肉、肝臓、腸、心臓、血液等の様々な種類の組織を採取した。歯はウマ及びヒトから採取した。体内における最も新しい１４Ｃ源の代表として全血を採取した。また体内における最も古い１４Ｃ源の代表として歯エナメル質を採取した。エナメル質は一旦でき上がると更新も改変もされない。このためエナメル質の１４Ｃ含有量はその動物の歯が形成された時期を反映することとなる。これらのサンプルを各被検体につき二つ使用して、内部コントロールとした。
【００７６】
全組織ＤＮＡ抽出に関する実験はウマ及びヒトの組織を用いて行い、優れた結果を示した。全組織、脳及び体躯の特定部分から抽出したＤＮＡ、及び歯エナメル質について分析を行った。Δ１４Ｃの値は、図１Ａもしくは１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅにあるボムスパイク曲線のうちの一つと比較した。全組織について予測したとおり、この１４Ｃレベルは最近の形成（図１Ｆ及び１Ｇ）であると一致した。全組織にはタンパク質等ターンオーバーが早い成分が多く含まれることから、これは予測されていたことである。血液細胞等ターンオーバーが速いことが知られている細胞の多くは、若い誕生時期を示す（図１Ｊ及び１Ｋ。）ウマとヒトの双方で、小脳組織のＤＮＡは大脳皮質のＤＮＡよりも数年若いことが判定された（図１Ｇ及び１Ｊ、１Ｋ）。小脳は皮質よりも神経細胞の密度が高い構造であり、皮質にはより増殖性の高い（即ちより若い）グリア細胞がより高い密度で含まれることから、この結果もまた我々の予測の線上である。
【００７７】
また、ウマ及びヒトの脳と体躯の様々な部位からＤＮＡを抽出した。この部位には、小脳（神経発生が起きていないと思われる部位）及び皮質（成体神経発生が提唱されている部位）、側脳室と海馬（神経形成性が高い部位）、並びに筋肉、肝臓、腸、血液（高い頻度で細胞ターンオーバーを示す部位）が含まれる。小脳のＤＮＡは非常に古く、披検査体とほぼ同じ齢であると判定された（図１Ｇ、１Ｊ及び１Ｋ）。上述のニューロン組成の違いから予測されたように、大脳皮質のＤＮＡはおよそ６年若いと判定された。側脳室は、神経発生特性から予測されたように、皮質よりも若いと判定された（図１Ｊ）。
【００７８】
予測されたとおり、細胞ターンオーバーが盛んな部分、例えば筋肉、肝臓、腸、血液のＤＮＡでは、１４Ｃレベルが最近の形成であることと一致することが示された（図１Ｊ及び１Ｋ）。これらの結果をまとめると、１４Ｃ測定は全組織並びにエナメル質等含炭素構造物（図１Ｉ）、前記ＤＮＡを含む組織、当該組織を含む器官、当該器官を含む動物に加えて、染色体ＤＮＡの誕生時期判定に使用してよい結果が得られると考えられる。即ち、ＤＮＡの誕生時期を判定し、これから細胞並びに組織、器官、生物体の齢を計算することができる。この技術は１４Ｃ分析に限定されず、１４Ｃと同様の特性を示すあらゆる他の化合物を使用することができる。
【００７９】
ウマ及びヒトのエナメル質もまた、齢とのよい相関性を示す（図１Ｉと１Ｌ）。ウマで誕生時期を判定した種類の歯は約５年前に生まれたものであり、６歳のウマの年齢とほぼ一致している。予測のとおり、１９歳ウマの同じ種類の歯から採取したエナメル質はおよそ１４歳である。
【００８０】
実施例２
様々に異なる部位に渡って異なる種類の細胞間の１４Ｃ値の違いについての研究を進めるため、さらに実験を行い、直接神経発生レベルを判定した。これらの実験のため、ニューロンをグリア細胞から分離してニューロンＤＮＡを集めた。核集合物全体からニューロン核を選別して行った。核はあらゆる核抽出プロトコールによって選別することが可能である。この実施例のため、機械的に組織をホモジェナイズし、その細胞をジチオスレイトールとトリトンＸ１００を含む溶解溶液中に置き、一連のシュークロース密度勾配法によって核を精製して核を全組織から分離した。分析のためにその核から少量の部分標本を取り、その一部はトリパンブルーで染色し、位相差を用いた光学顕微鏡分析によって定量した。次に核をＤＡＰＩ（核染色剤）で標識し、蛍光マーカーＡｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（Ｚｅｎｏｎ  Ｏｎｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ;Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を結合させた抗ニューロン抗体ＮｅｕＮ（ニューロン核タンパク質）とともにインキュベートした。
【００８１】
蛍光色素で標識した核を、蛍光顕微鏡を使用して目視し、ＮｅｕＮで標識された核の存在を確認した。核のＤＡＰＩ染色を示した図５ａを参照する。ＤＡＰＩあるいはＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｓｐａｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｔ.（２００２））で染色すると、ニューロン核はグリア細胞核と容易に区別できると考えられる。ＤＡＰＩ染色核とＮｅｕＮ陽性核とを顕微鏡分析すると、ニューロンの標識が広がる範囲が示された。新鮮ブタ大脳皮質核と凍結ヒト核を用いた予備実験では、広範囲に明確なニューロン核のＮｅｕＮ標識が示された。ブタ細胞の位相差顕微鏡像を示す図５Ｂ及び５Ｅ、ＮｅｕＮ陽性核の存在（ピンク色で示されている。）を示した図５Ｃと５Ｄ、５Ｆを参照する。同様の結果がヒト核調製物でも見られた。ＤＡＰＩ染色した核調製物を示した図５Ｇと５Ｊを参照する。ヒト核の位相差顕微鏡像を示す図５Ｈと５Ｋを参照する。ＮｅｕＮ染色（ピンク色）陽性である神経細胞の存在を示す図５Ｉと５Ｌを参照する。図５Ｍでは、神経細胞（細い矢印）とグリア細胞（太い矢印）の存在が示されており、位相差顕微鏡像の列（左側）のニューロン・グリア形態分析をＮｅｕＮ染色（右側）で確認した。
【００８２】
新鮮ブタ細胞と凍結ヒト細胞で、先に記載した細胞及び核の精製を行った。肯定的な結果と共にニューロン核の単離に成功したことで、世界中の病理学並びに法医学研究所で凍結品として保存されている様々な健常脳物質並びに疾患脳物質の分析が可能であることが示唆された。
【００８３】
抽出した核の少量部分標本を顕微鏡分析に使用したが、大部分は蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いる選別のために調製した。先に記述したように、核をＮｅｕＮとヨウ化プロピジウム（ＰＩ）等ＤＮＡ染色剤で染色した。ＰＩ標識によって単一の核が二重核、三重核等から選別される（図６Ｈから６Ｋ）。これによって選別がニューロンのみの集団に対してなされ、グリア核がニューロン核（ＮｅｕＮ＋）に接着していないことが確認された。新鮮ブタ脳及び齢が進んでいるが凍結していないブタ脳、凍結ヒト脳から核を抽出した後に選別した。これらの結果は、ＰＩとＮｅｕＮ＋を関門として用いる選別法が、ニューロン単独集団に対しほぼ完璧な精度で使用できる可能性のあることを示唆している（図６Ａ〜６Ｇ）。
【００８４】
また、全細胞はパーコール比重法によって分離した（図３Ａと３Ｆ）。パーコール比重法では破片と高位浮遊細胞・低位浮遊細胞という二つのはっきりと分かれた集団を区別することができる。図４Ａは両分画の細胞のＤＡＰＩ核染色を示す。このデータは、細胞の大部分が最低位浮遊分画にあることを示唆している。最低位浮遊分画の細胞をさらに核染色（ＤＡＰＩ、図では青色）及び神経細胞に特異的な染色（ＮｅｕＮ、図ではピンク色）によって分析した。図４Ｃは４Ｂの二つの図を合成したものである。
【００８５】
核のニューロン特異集団を集めた後、そのＤＮＡを抽出、精製、乾燥し、Ｈ２Ｏに再懸濁した。次に分光器を使用してこのＤＮＡを定量し、純度を確認した。ＲＮＡの存在を判定するために、ＤＮアーゼ並びにＲＮアーゼを加えてプレインキュベーションしたもの、しないものについて、アガロースゲル分析を行った。タンパク質の存在を判定するために、マイクロブラッドフォード分析を行った。塩その他の残余物の存在を判定するために、ＨＰＬＣ分析を行った。産生物の判定を行った上で、このＤＮＡサンプルを用いてさらに分析を続けた。
【００８６】
分析に先立ち、全てのＤＮＡサンプルから放射性不純物を除去した。除去後、サンプルを分析手順のために処理した。１ｍｌのサンプルを脱水して２００μｌとし、個々に密封した試験管中で燃焼してＣＯ２にした。次にこのＣＯ２を鉄あるいはコバルト触媒上で還元してグラファイトとした（Ｄｉｎｇｌｅｙ，Ｋ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００３)ＤＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｄｕｃｔ  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  Ａｃｃｅｌａｔｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ.Ｍｏｌ.Ｔｏｘ.Ｐｒｏｔ．;出版準備中）。長命の放射性同位体を検出する質量分析装置、ＡＭＳを用いて、高い特異性と高い感度とを伴った１４Ｃ分析を行った。大半のＡＭＳ測定は１分から１０分で行われ、高い精度で数万の計数が得られた。注目すべきは、本発明のＡＭＳ使用方法によって溶液中のＤＮＡ等液体試料が使用できるようになった点である。データ解析のため、実験で得られた１４Ｃの値を、これまでの地球物理学の分析から得られた放射性炭素ボムスパイク測定値と比較して分析した。
【００８７】
実施例３
歯エナメル質及び樹木の誕生時期判定のために、別の実験を行った。一方法では、歯エナメル質を注意深く削り取り、エナメル質の下部にあり、絶えず細胞ターンオーバーが起きている象牙質から分離した。別の方法では歯冠部を切除して、象牙質の除去を容易にする激しい化学処理を行う（Ｗｉｅｓｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００１)Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  ５４：７９３−７９９）。後者の方法では、純エナメル質が高収量で得られ、誕生時期判定法の精度が上昇する。
【００８８】
本発明のＡＭＳ分析を用いると、１９歳ウマの歯のエナメル質は１４歳であると判定され、また６歳ウマのエナメル質は誕生したばかりであると判定された（図１Ｉ）。分析した種類のウマの歯はおよそ５歳になるまで出現しないことから、これらの結果は予測の範囲内である。ウマの歯はスウェーデンの動物屠殺場から入手し、ヒト歯は歯科医院とＫａｒｏｌｉｎｓｋａ法科学局から入手した。歯をＫａｒｏｌｉｎｓｋａ法科学局から入手し、開示されているＡＭＳ分析法を用いて歯エナメル質の１４Ｃ誕生時期を判定し、その人間の齢の同定を補助した。
【００８９】
１４Ｃ分析から得られたデータを使用してΔ１４Ｃ値を求めた（図１Ｅを参照。）。Δ１４Ｃ値に相当する誕生時期を判定するために、ボムスパイク曲線を使用した。大気（様々な層の）、樹木年輪、珊瑚、海洋等、１４Ｃの値は世界中の様々なものから集めた。最も包括的なボムスパイク曲線はＩｎｇｅｂｏｒｇ  Ｌｅｖｉｎによって編纂され（Ｌｅｖｉｎ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｂ.Ｋｒｏｍｅｒ，Ｔｗｅｎｔｙ  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  １４ＣＯ２  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ａｔ  Ｓｃｈａｕｉｎｓｌａｎｄ  Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ.Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ  ３９：２０５(１９９７）;Ｌｅｖｉｎ，Ｉ．，（１９９２)Ｉｎ：Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｆｏｕｒ  ｄｅｃａｄｅｓ:ａｎ  ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ.Ｔａｙｌｏｒ，Ｒ．Ｅ．，Ｌｏｎｇ，Ａ．，Ｋｒａ，Ｒ．Ｓ．，ｅｄｓ.Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ:Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  ｐ５０３;Ｌｅｖｉｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８５)Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ  ２７：１−１９）、１８９０年から２０００年までの北半球及び南半球における様々な測定箇所を網羅している。
【００９０】
本発明に従い、スウェーデンマツの年輪を用いてデータを集め、スウェーデンについてのボムスパイク曲線を作成した。この作業は、過去数十年に渡る、核実験後のスウェーデン国民への１４Ｃ暴露レベルの正確な測定を確実にするために始められた。また、２０００年についての他の情報が公開されていなかったため、このデータは現在の１４Ｃレベルの情報を提供するために使用された。４つのスウェーデンマツの横断切片を採取した。分析のため各年輪について樹木生体組織検査を行った。その樹木を処理して全てのセルロースを取り除き、燃焼してＣＯ２にした。そのＣＯ２をグラファイト用鉄あるいはコバルト触媒上で還元してグラファイトとした。スウェーデンマツ年輪の１４Ｃ分析は北半球用に公表されている大気１４Ｃ値と非常によく一致した（図１Ｅ）。
【００９１】
【数１−１】
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【００９２】
【数１−２】
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【００９３】
【数１−３】
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【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１−１】図１（ａ）大気中ＣＯ２のΔ１４Ｃ；（ｂ）北半球及び南半球のΔ１４Ｃ；（ｃ）１９５８年から１９９７までの北半球のΔ１４Ｃ；（ｄ）１８９０年以降のボムスパイク曲線；（ｅ）１９７０年から現在までのボムスパイク曲線；（ｆ）１９歳ウマの小脳及び大脳皮質の齢判定を示す１９８５年以降のボムスパイク曲線；（ｇ）１９歳ウマ及び６歳ウマの小脳及び大脳皮質の齢判定を示す１９８５年以降のボムスパイク曲線；（ｈ）１９歳ウマ及び６歳ウマの血液の齢判定を示す１９８５年以降のボムスパイク曲線；（ｉ）１９歳ウマ及び６歳ウマのエナメル質の齢判定を示す１９８５年以降のボムスパイク曲線；（ｊ）ヒトのＤＮＡあるいは様々な組織（ＬＶは側脳室）の齢判定を示すボムスパイク曲線；（ｋ）別のヒトのＤＮＡと様々な組織（ＯＢは嗅球）の齢判定を示すボムスパイク曲線；（ｌ）エナメル質の形成時期とヒトの誕生時期との相関性を示す、２人のヒトのエナメル質の齢判定を示す１９８５年以降のボムスパイク曲線；を示す。
【図１−２】図１−２は、図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−３は、図１−２のつづきである。
【図１−４】図１−４は、図１−３のつづきである。
【図２】図２(ａ上）様々な組織から調製したＤＮＡの精製度を示すゲル。ＤＮＡはエチジウムブロミドで染色されている（左端が分子量基準。）。（ａ下）左から右の順に、分子量基準、単離ＤＮＡ、ＤＮアーゼ処理単離ＤＮＡ、ＲＮアーゼ処理単離ＤＮＡ；（ｂ）タンパク質混入量が無視できる程度である、ヒトＤＮＡ調製物を示す棒グラフ。図はＸ軸にそって８つに分割されており、各部分は２つの棒グラフから成っている。各部分右側の高い方の棒グラフはＤＮＡ量を示し、各部分左側の低い方（ゼロをわずかに超える程度。）はタンパク質含有量を示す。タンパク質含有量は常に無視できる程度であり、ＤＮＡ量と比べると小さな割合である。
【図３−１】図３  誕生時期判定のために細胞を精製する目的で使用したフィコール及びパーコール比重法を示す。
【図３−２】図３−２は、図３−１のつづきである。
【図４】図４  比重によって精製した細胞及び核のＤＡＰＩ染色並びにＮｅｕＮ染色を示す。
【図５−１】図５  誕生時期判定のために精製した核を示す。
【図５−２】図５−２は、図５−１のつづきである。
【図５−３】図５−３は、図５−２のつづきである。
【図６−１】図６  新鮮ブタ及び凍結ヒト核のＦＡＣＳ分析結果を示す。
【図６−２】図６−２は、図６−１のつづきである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【国際調査報告】
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