(57)【要約】Ｍｅｔ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ３及びＫｉｔ  チロシンキナーゼ、又はＲｅｔファミリーの癌タンパク質が関係する腫瘍を治療するためのアリーリデン２−インドリノン誘導体の使用を開示する。本発明は、該アリーリデン２−インドリノン誘導体を含む医薬組成物、その外、該誘導体及び抗癌剤又は抗腫瘍剤を別個の容器に含むキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍｅｔ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ３、Ｋｉｔから選ばれるチロシンキナーゼ、又はＲｅｔファミリーの癌タンパク質に関係する、腫瘍の治療のための医薬を製造するための化合物  １，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−３−［（４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２Ｈ−インドール−２−オン、又はその非害性の塩若しくは異性体の使用。
【請求項２】
活性化配列突然変異を有する、ＲＥＴ癌タンパク質を発現する腫瘍を治療するための、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＲＥＴ癌タンパク質がＭＥＮ２関連突然変異を含む、請求項２記載の使用。
【請求項４】
活性化された配列突然変異が、ＲＥＴ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｒ）、ＲＥＴ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｗ）及びＲＥＴ／ＭＥＮ２Ｂ（Ｍ９１８Ｔ）である、請求項３記載の使用。
【請求項５】
髄様甲状腺癌、クロム親和細胞腫、上皮小体過形成、腸神経節神経腫を治療するための、請求項２〜４に記載の使用。
【請求項６】
Ｍｅｔ活性化変質を有する腫瘍を治療するための、請求項１記載の使用。
【請求項７】
該腫瘍が上皮を起源とするものである、請求項６記載の使用。
【請求項８】
腎腫瘍を治療するための、請求項７記載の使用。
【請求項９】
構成的に活性化されたＫｉｔを発現する腫瘍を治療するための、請求項１記載の使用。
【請求項１０】
Ｋｉｔが、配列突然変異にか、又はオートクリンループとの関係に続いて構成的に活性化される、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
胃腸基質腫瘍、小細胞肺癌、白血病又はセミノーマを治療するための、請求項９記載の使用。
【請求項１２】
ＰＤＧＦ−Ｒの無制御活性化を包含する腫瘍を治療するための、請求項１記載の使用。
【請求項１３】
該腫瘍が神経膠腫及び隆起性皮膚繊維肉腫である、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ＦＧＦ−Ｒ１及び／又はそのリガンドであるｂＦＧＦを強く発現する腫瘍を治療するための、請求項１記載の使用。
【請求項１５】
該腫瘍が黒色腫及び神経膠腫である、請求項１４記載の使用。
【請求項１６】
ＦＧＦ−Ｒ３の構成性活性化形態を発現する腫瘍を治療するための、請求項１記載の使用。
【請求項１７】
該腫瘍が多発性骨髄腫、膀胱癌及び子宮頸癌である、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
腫瘍起因性血管形成を阻害するための、請求項１２及び１４記載の使用。
【請求項１９】
活性成分として、化合物  １，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−３−［（４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２Ｈ−インドール−２−オン、又は薬学的に許容され得るその塩を、薬学的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤と組み合わせて、含有する医薬組成物。
【請求項２０】
該薬学的に許容され得る担体又は希釈剤が、経口又は非経口投与に適している、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
１，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−３−［（４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２Ｈ−インドール−２−オンとは異なる抗腫瘍剤又は抗癌剤を更に含む、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２２】
該抗腫瘍剤又は抗癌剤が、アドリアマイシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンクリスチン、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、５−ＦＵ、ヘキサメチルメラミン、カルボプラチン、シスプラチン、イダルビシン、パクリタキセル、ドシタキセル、トポテカン、イリノテカム、ゲンシタビン、Ｌパム、ＢＣＮＵ及びＶＰ−１６からなる群から選ばれる、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２３】
別個の容器内に、化合物１，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−３−［（４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２Ｈ−インドール−２−オン、又は薬学的に許容され得るその塩、及び抗癌剤又は抗腫瘍剤を含むキット。
【請求項２４】
該抗腫瘍剤又は抗癌剤が、アドリアマイシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンクリスチン、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、５−ＦＵ、ヘキサメチルメラミン、カルボプラチン、シスプラチン、イダルビシン、パクリタキセル、ドシタキセル、トポテカン、イリノテカム、ゲンシタビン、Ｌ−パム、ＢＣＮＵ及びＶＰ−１６からなる群から選ばれる、請求項２３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｍｅｔ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ３、Ｋｉｔのチロシンキナーゼ、又はＲｅｔ癌タンパク質が関係する腫瘍の治療における、化合物  （Ｅ）−１，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−３−［（４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２Ｈ−インドール−２−オンの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＲＥＴ／ＰＴＣ癌遺伝子は、ヒトの乳頭様甲状腺腫の形質転換過程に関係し、異なる供与遺伝子によるプロトＲＥＴのチロシンキナーゼドメインの再配置に起源を有する。そのような遺伝子再配置の産物は、リガンド非依存性チロシンキナーゼ活性を示し、細胞質に局在する。Ｒｅｔ／ｐｔｃ１は、Ｈ４／Ｄ１０Ｓ１７０遺伝子によるプロトＲＥＴチロシンキナーゼドメインの再配置に起源を有する、ＲＥＴ／ＰＴＣ１癌遺伝子の産物である。
【０００３】
Int. J. Cancer, 85, 384-390 (2000)は、アリーリデン２−インドリノン化合物によるＲｅｔ／ｐｔｃ１癌タンパク質のチロシンキナーゼ活性の阻害を報告している。１，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−３−［（４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２Ｈ−インドール−２−オン誘導体（以下「Ｃｐｄ１」）は、ＲＥＴ／ＰＴＣ１癌遺伝子で形質転換された、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態学的表現型を回復するのに特に効果的であるとして指定されている。同じ論文で、アリーリデン２−インドリノン化合物によるチロシンキナーゼ阻害が、Ｒｅｔシグナリングの研究のため、かつＲｅｔ／ｐｔｃ類関連疾患における細胞増殖の制御のために提唱されている。
【０００４】
発明の開示
ここに、Ｃｐｄ１は、腫瘍の発病、進行、及び遠隔器官への拡散に中心的な役割を果たす、Ｒｅｔ／ｐｔｃ１以外のチロシンキナーゼを効果的に阻害することが見出された。具体的には、Ｃｐｄ１は、Ｒｅｔ／ＭＥＮ２Ａ（突然変異  Ｃ６３４Ｒ及びＣ６３４Ｗ）、Ｒｅｔ／ＭＥＮ２Ｂ（ｍｕｔＭ９１８Ｔ）、Ｍｅｔ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ３及びＫｉｔ（ｃ−Ｋｉｔ及びｍｕｔΔ５５９）チロシンキナーゼの自己リン酸化を阻害し、その発現を低下させ（ダウンレギュレーション）、そのために形質転換された細胞の表現型を回復させることが示された。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、Ｍｅｔ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ１、ＦＧＦ−Ｒ３及びＫｉｔチロシンキナーゼのうち少なくとも一つが関係するか、又はＭＥＮ２関連突然変異を有するＲｅｔレセプターを包含する、Ｒｅｔファミリーのうち少なくとも一つの癌タンパク質が関係する腫瘍の治療を、細胞の形質転換という初期段階か、又は腫瘍の増殖及び転移という後続段階で行うための、化合物  （Ｅ）−１，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−３−［（４−ヒドロキシフェニル）メチレン］−２Ｈ−インドール−２−オン、又は薬学的に許容され得る塩基とのその塩の使用である。
【０００６】
本発明は、Ｃｐｄ１のいかなる立体異性体又は互変異性形態の使用にも関する。
【０００７】
失調し(deregulated)、構成性活性を有するＲｅｔレセプターの阻害は、散発性の髄様甲状腺癌（ＭＴＣ）、並びにＭＴＣ、クロム親和細胞腫、上皮小体過形成及び腸神経節神経腫を包含するＭＥＮ２関連疾患の治療に役立つ。
【０００８】
Ｍｅｔの阻害は、上皮起源の腫瘍の浸潤性／転移性表現型と拮抗するのに役立つ。Ｍｅｔ活性化変質に関しては、Ｃｐｄ１は、腎腫瘍の治療法に特異的な適応症を有し得る。
【０００９】
Ｋｉｔの阻害は、胃腸基質腫瘍、小細胞肺癌、セミノーマ、並びにマスト細胞症及び急性骨髄性白血病のような血液学的悪性の治療に役立つ。
【００１０】
ＰＤＧＦ−Ｒの無制御活性化、及びオートクリンループのその関係は、慣用の治療法に応答しない腫瘍、たとえば神経膠腫及び隆起性皮膚繊維肉腫におけるＣｐｄ１の治療的使用を支持している。加えて、ＰＤＧＦ−Ｒは、腫瘍起因性血管形成及び血管発生に関係して、そのため、固形性腫瘍における血管新生の制御のためのＣｐｄ１の使用を支持している。
【００１１】
Ｃｐｄ１は、オートクリンループに実質的に関係する、高レベルのＦＧＦ−Ｒ１及びそれぞれのｂＦＧＦリガンドを発現する黒色腫及び神経膠腫の治療に用いることができる。このレセプターは、血管形成過程に重要な役割を有することから、Ｃｐｄ１によるその阻害は、腫瘍の血管形成の制御に役立つ。
【００１２】
ＦＧＦ−Ｒ３の阻害は、多発性骨髄腫、膀胱癌及び子宮頚癌の治療に役立つ。
【００１３】
治療法に用いるには、ＲＰＩ−１及びその塩を、薬学的に許容され得る担体及び賦形剤とともに製剤化することができる。Ｃｐｄ１のフェノール機能は、適切な有機又は無機塩基での処理によって塩化することができる。この医薬組成物は、経口的、非経口的、舌下的又は経皮的経路によって、好ましくは錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、溶液、懸濁液、坐薬、制御放出形態の形態で投与することができる。
【００１４】
該組成物は、慣用の手法により、当技術に公知の成分を用いて調製することができる。活性本体の量は、疾病の重篤度、患者の年齢、投与の形式及び経路に応じて変動させることができるが、一般的には、０．１〜１，０００mg/kg、好ましくは５〜３００mg/kg、より好ましくは２０〜２００mg/kgの量が、単一又は複数回の用量として１日１回以上用いられる。
【００１５】
発明の詳細な説明
構成性チロシンキナーゼ活性を生じる、アミノ酸置換を有するＲｅｔ癌タンパク質は、散発性のＭＴＣ、及び遺伝性２型多発性内分泌新生物症候群（ＭＥＮ２Ａ、ＭＥＮ２Ｂ及び家族制ＭＴＣ）に関係するが、そのすべてがＭＴＣの発生を特徴とする［Jhiang, S.M. et al., Oncogene 19, 5590, 2000］。散発性ＭＴＣでは、ＲＥＴ突然変異は体細胞性であるが、ＭＥＮ２患者では、ＲＥＴ突然変異は、胚芽細胞系列レベルに存在する。これらの突然変異は、レセプターの構成性活性化を細胞膜でのその局在性を変えずに生起する。本研究に用いたＲｅｔ癌タンパク質は、Ｃｙｓ６３４（Ｒｅｔ／ＭＥＮ２ＡC634R及びＲｅｔ／ＭＥＮ２ＡC634Wとして表示する）又はＭｅｔ９１８（Ｒｅｔ／ＭＥＮ２ＢM918Tとして表示する）を含み、それぞれ、ＭＥＮ２Ａ及びＭＥＮ２Ｂにおいて、最も頻繁に発現されるＲｅｔ癌タンパク質を表す。Ｃｐｄ１の阻害効果は、ＲＥＴ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｒ）遺伝子を導入したネズミ細胞（ＮＩＨ３Ｔ３MEN2A(C634R)細胞）、及び、それぞれ、Ｒｅｔ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｗ）及びＲｅｔ／ＭＥＮ２Ｂ（Ｍ９１８Ｔ）の発現により特徴づけられる、ヒト髄様甲状腺癌細胞系であるＴＴ及びＭＺ−ＣＲＣ−１で立証されている（図１、２）。これらの細胞系では、癌タンパク質のチロシンリン酸化及び発現の低下が観察される（図１Ｃ及び２Ａ）。Ｃｐｄ１によるＲｅｔ／ＭＥＮ２Ａ及びＲｅｔ／ＭＥＮ２Ｂレセプター自己リン酸化の阻害は、抗増殖効果と関連する（図１Ｂ及び２Ｂ）。ＮＩＨ３Ｔ３MEN2A(C634R)  トランスフェクタントは、Ｃｐｄ１に接触させた後に、それらの形質転換された表現型を回復させた（図１Ａ）。ＴＴ腫瘍を異種移植したヌードマウスにおいて、有意な用量依存性抗腫瘍活性が観察され、５０〜１００mg/kg（１日２回）の日次用量の経口投与後に、Ｃｐｄ１処理は、毒性の誘導なしに、８０％の腫瘍重量阻害（ＴＷＩ）に達っした（図３）。ＭＴＣ細胞の増殖を制御する、立証されたＣｐｄ１の薬理学的及び生化学的効果は、そのような腫瘍の攻撃性、及び慣用の治療法の無効を考慮すると、特に重要である。
【００１６】
Ｍｅｔ、すなわち肝細胞増殖因子レセプターは、腫瘍の進行及び転移性成長に特徴的な浸潤性過程に関係するタンパク質であるチロシンキナーゼである［Maulik, G. et al., Cytok. Growth Factor Rev., 13, 41, 2000］。突然変異、過剰発現、又はオートクリンループの関係のような変化は、このキナーゼの制御されない構成性活性化の原因である。Ｍｅｔの無制御活性化は、上皮起源の多くの腫瘍の浸潤性に関係している。乳頭様甲状腺癌では、Ｍｅｔは、過剰発現されることが多い。図４に図示された結果は、Ｃｐｄ１で処理された乳頭様甲状腺癌の細胞系ＴＰＣ−１における、Ｍｅｔ自己リン酸化の用量依存性阻害を示す。処理された細胞では、Ｍｅｔタンパク質のレベルも低下している。
【００１７】
オートクリンループ又は血管新生のいずれかの過程に関係する、その他のレセプターチロシンキナーゼ、たとえばＰＤＧＦ−Ｒ［Rosenkranz, S. & Kazlauskas, A., Growth Factors, 16, 201, 1999］及びＦＧＦ−Ｒ１［Powers, C.J. et al., Endocr. Rel. Cancer, 7, 165, 2000］は、癌の成長に重要な役割を有する。これらのレセプターの失調した活性化が、慣用の治療法に応答しない腫瘍、たとえば神経膠腫及び黒色腫で観察される。図５及び６に図示された結果は、オートクリン刺激によってか（図５Ａ）、又は外来リガンドによって（図５Ｂ及び６Ａ）誘導されたレセプター自己リン酸化のＣｐｄ１による用量依存性阻害を示す。これらの効果は、レセプター発現の低下に関連している。１５μMより高い濃度のＣｐｄ１は、ＰＤＧＦ−Ｒリン酸化の完全な阻害を生起する。
【００１８】
染色体の転座又は点突然変異のような、ＦＧＦ−Ｒ３レセプター  チロシンキナーゼの突然変異の活性化は、失調し、構成性活性な、ＦＧＦ−Ｒ３レセプターを生じ、それが、多発性骨髄腫、膀胱癌及び子宮頚癌に関係している［Powers, C.J. et al., Endocr. Rel. Cancer, 7, 165, 2000］。Ｃｐｄ１が、ＮＩＨ３Ｔ３の核酸導入体で外来的に発現されるＦＧＦ−Ｒ３（ｍｕｔＹ３７３Ｃ）の、チロシン自己リン酸化と発現との双方を下向き調節できることが、図６Ｂに図示される。
【００１９】
Ｋｉｔチロシンキナーゼは、小細胞肺癌、胃腸基質腫瘍、セミノーマ及び白血病のような異なる腫瘍で、オートクリンループの突然変異、又はその関係の結果として、構成的に活性化される［Heinrich, M.C. et al., J. Clin. Oncol., 20, 1692, 2002］。図７に示したとおり、Ｃｐｄ１は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で外来的に発現されるＫｉｔ（Δ５５９）突然変異体の構成性自己リン酸化及び発現を阻害する（図７Ｂ）。そのような阻害は、核酸導入された細胞の形質転換された形態学的表現型の回復に関連する（図７Ａ）。加えて、図７Ｃは、小細胞肺癌細胞系Ｎ５９２におけるオートクリンループを介して活性化されたｃ−ＫｉｔのＣｐｄ１による用量依存性阻害を示す。
【００２０】
ここで用いられる限りで、用語「腫瘍」は、筋、骨又は結合組織、皮膚、脳、肺、性器、リンパ系及び腎系、乳腺又は血球、肝、消化系、膵、及び甲状腺又は副腎のような、様々な組織及び／又は器官の悪性若しくは良性細胞の、異常な細胞増殖を包含するが、これらに限定されない。異常な細胞増殖は、卵巣、胸部、脳、前立腺、結腸、肝、肺、卵巣、子宮、子宮頚部、膵、胃腸管、頭部、頚部、鼻咽腔、皮膚、膀胱、胃、腎又は睾丸、カポジ肉腫、胆管癌、絨毛癌、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ホジキン病、黒色腫、多発性骨髄癌、慢性リンパ球性白血病、及び急性又は慢性顆粒球性リンパ腫を包含することができるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明による化合物は、単独でか、又はアドリアマイシン、ダウノマイシン、メトトレキサート、ビンクリスチン、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、５−ＦＵ、ヘキサメチルメラミン、カルボプラチン、シスプラチン、イダルビシン、パクリタキセル、ドシタキセル、トポテカン、イリノテカム、ゲンシタビン、Ｌパム、ＢＣＮＵ及びＶＰ−１６を包含するが、これらに限定されない、その他の抗腫瘍剤又は抗癌剤と併用して投与することができる。本発明による化合物は、腫瘍の治療のためのキットに含ませることもできる。該キットは、追加の抗癌剤又は抗腫瘍剤を含むことができる。
【００２２】
添付の図面は、本発明を更に詳しく図示する。
【００２３】
材料及び方法
細胞系及び培養条件
本研究では、下記のヒト髄様甲状腺癌（ＭＴＣ）の細胞系を用いた。ＭＥＮ２Ａ関連ＭＴＣに由来するＴＴ細胞系は、突然変異Ｃ６３４Ｗを有するＲＥＴ癌遺伝子の発現を特徴とする。ＭＥＮ２Ｂ関連ＭＴＣに由来するＭＺ−ＣＲＣ−１細胞系は、突然変異Ｍ９１８Ｔを有するＲＥＴ癌遺伝子の発現を特徴とする。ＴＴ細胞は、１５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ：Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）で強化したハムＦ１２培地（Bio Whittaker, Verviers、ベルギー国）で培養し、一方、ＭＺ−ＣＲＣ−１細胞は、１０％ＦＣＳで強化したダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ：BioWhittaker）で増殖させた。Ｍｅｔ過剰発現のモデルとして用いた、ヒト乳頭様甲状腺癌細胞系ＴＰＣ−１は、１０％ＦＣＳでのＤＭＥＭ中で定型的に培養した。ヒトＳＣＬＣに由来するＮ５９２細胞は、ＳＣＦリガンドによるオートクリン刺激を介してのＫｉｔ活性化を特徴とする。Ｎ５９２細胞は、１０％ＦＣＳで強化したＲＰＭＩ１６４０で培養した。マウスＳＷＩＳＳ３Ｔ３及びＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞は、１０％ウシ血清でのＤＭＥＭ（Colorado Serum Company, Denver, CO）中で培養した。加えて、異なる癌遺伝子を導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた。ＮＩＨ３Ｔ３MEN2Aというトランスフェクタントは、ＲＥＴ−ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｒ）癌遺伝子の短いイソ型を発現し；ＮＩＨ３Ｔ３ＫＩＴΔ５５９細胞は、ＧＩＳＴ中で見出された活性化突然変異Δ５５９を有するＫＩＴを発現し；ＮＩＨ３Ｔ３FGFR3(Y373C)は、ヒト多発性骨髄腫細胞系に見出された活性化突然変異Ｙ３７３Ｃを有するＦＧＦ−Ｒ３遺伝子を発現する。２Ｎ５Ａ細胞は、ＰＤＧＦ−Ｒのオートクリン刺激を発生するＣＯＬ１Ａ１／ＰＤＧＦＢ再配置によって形質転換された、ＮＩＨ３Ｔ３細胞である。ＮＩＨ３Ｔ３のトランスフェクタントは、すべて、１０％ＣＯ2雰囲気中で、５％ウシ血清を加えたＤＭＥＭ中で維持した。
【００２４】
抗増殖アッセー
細胞を、Ｃｐｄ１による処理の３日後（ＮＩＨ３Ｔ３及びＮＩＨ３Ｔ３MEN2A細胞）又は７日後（ＭＴＣ細胞）にトリプシン処理し、クールター計数器（Coulter Electronics, Luton、英国）で計数した。用量応答曲線から、細胞増殖を５０％阻害できる濃度（ＩＣ50）を算出した。各実験は、二重に実施した。
【００２５】
抗体
下記のポリクローナル抗体を用いた：２種類のＲｅｔイソ型に共通するＣＯＯＨ末端配列（第１０００〜１０１４アミノ酸）を認識する抗Ｒｅｔ［Borrello, M.G. et al., Mol. Cell. Biol., 16, 2151, 1996］；Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）からの抗ｃＫｉｔ、抗Ｍｅｔ及び抗ＦＧＦ−Ｒ３；Sigma（St. Louis, MO）からの抗アクチン；Upstate Biotechnology（Lake Placid, NY）からの抗ＰＤＧＦ−Ｒα／β；Cell Signaling Technology（Beverly, MA）からの抗ホスホｃＫｉｔ（Ｔｙｒ７１９）。マウスモノクローナル抗ホスホチロシン（抗ｐＴｙｒ）４Ｇ１０及び抗ＦＧＦ−Ｒ１抗体は、Upstate Biotechnologyからであった。
【００２６】
免疫沈降及びウエスタンブロット分析
全細胞抽出物の調製のため、細胞を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）サンプル緩衝液（６２．５mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH６．８）、２％ＳＤＳ）中で、１mM  ＰＭＳＦ、１０μg/ml  ペプスタチン、１２．５μg/ml  ロイペプチン、１００KIU  アプロチニン、１mM  オルトバナジン酸ナトリウム、１mM  モリブデン酸ナトリウムとともに溶解した。タンパク質濃度を、適切に希釈したアリコートにおいて、ビシンキオン酸（ＢＣＡ）法（Pierce, Rockford, IL）によって決定し、次いで、サンプルを、１０％グリセロール、５％β−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルーの最終濃度に調整した。
【００２７】
免疫沈降の実験のため、細胞を、Ｃｐｄ１又は溶媒で指定された時間処理した。細胞の単層を、０．１mM  オルトバナジン酸ナトリウムを加えた冷リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、次いで溶解用緩衝液（５０mM  ＨＥＰＥＳ、pH７．６、１５０mM  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％トリトンＸ−１００、１．５mＭ  ＭｇＣｌ2、１mM  ＥＧＴＡ、１００mＭ  ＮａＦ、１０mM  ピロリン酸ナトリウム、１０μg/ml  抗パイン、２０μg/ml  キモスタチン、１０μg/ml  Ｅ６４、１mg/ml  ペファブロックＳＣ）中、氷上に，２０分間放置した。次いで、細胞を捕集し、２２ゲージの針を通じて吸引し、４℃で２０分間、10,000（x）gで遠心分離した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ試薬（Pierce）によって決定した。細胞抽出物を、プロテインＡ−アガロース及び指定されたとともに、４℃で２時間、回転しながら、温置した。２０mM  ＨＥＰＥＳ（pH７．６）、１５０mM  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％トリトンＸ−１００で３回洗浄した後、免疫沈降物を、完全なサンプル緩衝液とともに溶出した。
【００２８】
標準化した免疫沈降物（細胞抽出物０．５〜４mg）又は全細胞溶解物（３０〜６０μg）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、ニトロセルロースフィルターに移転した。膜を、一次抗体とともに４℃で終夜温置した。Amersham Biosciences（Little Chalfont、英国）又はPierceからの強化化学発光検出システムを用い、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス又は抗ウサギ抗体によって、免疫反応性の帯域を顕在化した。
【００２９】
in vivoでの研究
実験は、すべて、雌の無胸腺ヌードＣＤ−１マウス、８〜１１週齢（Charles River, Calco、イタリア国）を用いて実施した。マウスを、一定の温度及び湿度の層流飼育室内で維持した。実験プロトコールは、癌研究指針［Workman, P. et al., Brit. J. Cancer, 77, 1, 1998］に関する英国調整委員会に従って、Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura dei Tumori（Milan、イタリア国）の動物実験に関する倫理委員会によって承認された。
【００３０】
ＭＴＣ細胞のＴＴ（１．６ｘ１０7細胞）を、in vitro細胞培養からの細胞懸濁液として、マウスに皮下接種した。対照又は薬物処理群は、それぞれ、８〜１０個の腫瘍を有した。０日目に、腫瘍細胞を注入し、２週ごとのベルニエルクリッパーによる腫瘍直径の測定によって、腫瘍の成長を追跡した。腫瘍重量（ＴＷ）を、式：
ＴＷ（mg）＝腫瘍体積（mm3）＝ｄ2ｘＤ／２
［式中、ｄ及びＤは、それぞれ、最短及び最長直径である］
に従って算出した。薬物処理は、腫瘍がまさに測定可能になったとき（平均ＴＷが約５０mg）、すなわち腫瘍細胞の接種の２５日後に開始した。Ｃｐｄ１を、５％エタノール、５％クレモホルＥＬ、９０％生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に溶解し、１０日間の日次時間割によって１日２回（２ｑｄ）、経口的に送達した(delivered)。対照マウスは、溶媒溶液を受けた(received)。
【００３１】
薬物の薬効は、ＴＷ阻害の百分率（ＴＷＩ％＝１００−（処理ＴＷの平均／対照ＴＷの平均 ｘ １００）として表した、薬物処理マウス  対  対照マウスのＴＷＩ％）として査定した。統計的解析のために、対照及び処理マウスのＴＷを、ＴＷＩ％評価の日に、スチューデントのｔ検定（両側）によって比較した。０．０５以下のＰ値を、統計的に有意であると見なした。
【００３２】
（Ｅ）−１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシベンジリデン−５，６−ジメトキシ−（１Ｈ）−インドール−２−オン（Ｃｐｄ１）の製造
（１）２−ニトロ−４，５−ジメトキシフェニル酢酸の合成
【００３３】
【化１】
2005537277.tif 000002
【００３４】
３，４−ジメトキシフェニル酢酸４５g（０．２３mole、１当量）を氷酢酸１００ml（２．２容）に、２８〜３５℃で、Ｎ2雰囲気下で、機械的に撹拌しつつ溶解した。溶液を１５〜２０℃に冷却し、氷酢酸（２５ml）中の発煙硝酸（９８％、３３ml）の混合物を４５分間にわたって加えた。添加が完了すると、赤色固体の沈澱が観察された。この懸濁液を、氷水（６００ml）に注入し、撹拌しつつ２時間保った。固体を濾過し、水洗し、６０℃で８時間乾燥した。最終生成物４４gを得た。
収率：７９．３％（mmol/mmol）
ＴＬＣ（ＳｉＯ2；酢酸エチル１０／ＡｃＯＨ０．５）、Ｒｆacid＝０．６；Ｒｆproduct＝０．５
ｍ．ｐ．＝１９９〜２０２℃
【００３５】
【表１】
2005537277.tif 000003
【００３６】
（２）１，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−（１Ｈ）−インドール−２−オンの合成
【００３７】
【化２】
2005537277.tif 000004
【００３８】
３，４−ジメトキシ−２−ニトロフェニル酢酸９．２g（３８．１４mmol、１当量）を、氷酢酸（９２ml、１０容）に、２８〜３５℃で、Ｎ2雰囲気下で、機械的に撹拌しつつ懸濁させた。懸濁液に、等しい２部分としたＦｅ°粉末、３２５メッシュ、９７％（１２．０g、２１４．８６mmol、５．６当量）を加えた。第一の部分は室温で加え、次いで混合物を、３０分間還流させ、その後、第二のＦｅ°部分を加えた。３０分後に、反応は完了した。ＴＬＣ（ＳｉＯ2；ＣＨＣｌ3９／ＭｅＯＨ１）、Ｒｆnitro＝０．６５；Ｒｆindolinone＝０．７１。
【００３９】
灰色の懸濁液を、室温に冷却し、酢酸を、低圧下で、未精製固体にまで蒸発させて、該固体をクロロホルム（２００ml）に懸濁させた。塩を濾去し、有機相を、ＮａＣｌ飽和溶液（１００ml）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥し、乾固した。固体を、エチルエーテル（３５ml）に３０分間懸濁させ、濾過し、５０℃で２時間乾燥した。ベージュ色の固体６．７gを得た。
収率：９０．９％（mmol/mmol）
ｍ．ｐ．＝１９９〜２１０℃
ＴＬＣ（ＳｉＯ2；酢酸エチル１０／ＡｃＯＨ０．５）、Ｒｆacid＝０．６；Ｒｆproduct＝０．５
【００４０】
【表２】
2005537277.tif 000005
【００４１】
（３）（Ｅ）−１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシベンジリデン−５，６−ジメトキシ−１Ｈ−インドール−２−オンの合成
【００４２】
【化３】
2005537277.tif 000006
【００４３】
１，３−ジヒドロ−５，６−ジメトキシ−（１Ｈ）−インドール−２−オン６．７g（３６．９mmol、１当量）を、無水ＤＭＳＯ（５０ml）に室温で溶解した。溶液に、４−ヒドロキシベンズアルデヒド（５．４１g、４４．３mmol、１．２当量）及びピペリジン（４．３８g、４４．３mmol、１．２当量）を加え、次いで１６時間撹拌した。混合物を、Ｈ2Ｏ（２５０ml）及び０．５ＮのＨＣｌ（１５０ml）に注入し、固体の沈澱を観察した。溶液を、５〜１０℃に１時間冷却し、濾過し、減圧下、８０℃で２時間乾燥した。湿潤固体１３gを得て、次いで無水エタノールから結晶化させて、最終生成物６．７７gを得た。
収率：６１．６％（mmol/mmol）
ｍ．ｐ．＝２３８〜２４０℃
Ｒｆ（シリカ；酢酸エチル１００％）＝０．６８
【００４４】
【表３】
2005537277.tif 000007
【００４５】
２位のエソ(eso)環二重結合のＥ立体配置は、１Ｄ−ＮＯＥ−ＮＭＲ実験によって決定した。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】外来ＲＥＴ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｒ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３MEN2A(C634R)  トランスフェクタントに対するＣｐｄ１の効果を示す図である。図１Ａは、ＮＩＨ３Ｔ３MEN2A(C634R)細胞の形質転換された形態学的表現型の回復を示す。細胞を、６μMのＣｐｄ１に２４時間接触させ、次いで、位相差顕微鏡（当初倍率：ｘ１００）下で写真撮影した。
【図１Ｂ】外来ＲＥＴ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｒ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３MEN2A(C634R  トランスフェクタントに対するＣｐｄ１の効果を示す図である。図１Ｂは、抗増殖効果を示す。ＮＩＨ３Ｔ３MEN2A(C634R)細胞及び親細胞  ＮＩＨ３Ｔ３を、上昇する濃度の薬物で７２時間処理し、次いで、クールター計数器で計数した。用量応答曲線（これから報告されたＩＣ50値を算出した）は、薬物に対するＲｅｔ癌タンパク質陽性細胞系の薬物へのより高い感受性を示した。
【図１Ｃ】外来ＲＥＴ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｒ）を発現するＮＩＨ３Ｔ３MEN2A(C634R)  トランスフェクタントに対するＣｐｄ１の効果を示す図である。図１Ｃは、Ｒｅｔ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｒ）自己リン酸化及び発現の阻害を示す。細胞を、溶媒（−）又は１０μMＣｐｄ１（＋）で図示された時間処理した。全細胞溶解物を調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ｐＴｙｒ抗体によるウエスタンブロット分析に付した。ストリッピングの後、フィルターを、抗Ｒｅｔ抗体で再ブロットした。矢印は、Ｒｅｔ／ＭＥＮ２Ａレセプターの、部分的におよび完全にグリコシル化された形態を示す。薬物との２時間の接触後、レセプターは、部分的に脱リン酸化されたようであった。より長い時間では、完全なチロシン脱リン酸化が、レセプターの低下した発現に付随した。
【図２Ａ】ＭＥＮ２関連ＲＥＴ突然変異体を宿すヒトＭＴＣ細胞系に対する、Ｃｐｄ１の効果を示す図である。図２Ａは、Ｒｅｔ自己リン酸化の阻害を示す。それぞれ、ＲＥＴ／ＭＥＮ２Ａ（Ｃ６３４Ｗ）及びＲＥＴ／ＭＥＮ２Ｂ（Ｍ９１８Ｔ）を発現する、ＴＴ及びＭＺ−ＣＲＣ−１細胞を、図示される濃度のＣｐｄ１で２４時間処理した。対照細胞（Ｃ）は溶媒を受けた。全細胞抽出物を、ウエスタンブロット分析で処理し、抗ｐＴｙｒ及び抗Ｒｅｔ抗体と共に調べた(probed)。抗ｐＴｙｒ抗体のブロットで立証されるとおり、化合物による細胞の処理は、いずれの細胞系でも、Ｒｅｔレセプターのチロシンリン酸化の用量依存性阻害を誘導した。最高濃度の薬物で処理した細胞では、レセプター濃度の発現低下が観察された。
【図２Ｂ】ＭＥＮ２関連ＲＥＴ突然変異体を宿すヒトＭＴＣ細胞系に対する、Ｃｐｄ１の効果を示す図である。図２Ｂは、抗増殖効果を示す。ＴＴ及びＭＺ−ＣＲＣ−１細胞を、上昇する濃度のＣｐｄ１で７日間処理し、次いでクールター計数器で計数した。用量応答曲線は、薬物が二つのＭＴＣ細胞系の増殖能に干渉できることを記録で証明した。
【図３】ＴＴ  髄様甲状腺癌の異種移植片を宿すヌードマウスにおける、Ｃｐｄ１の抗腫瘍活性を示す図である。腫瘍細胞を皮下接種した２５日後に、薬物処理を開始した。Ｃｐｄ１を、５０または１００mg/kgにて１日２回（２ｑｄ）、連続１０日間経口的に与えた（矢印で示す）。対照マウスは担体を受けた。この処理は、腫瘍成長の有意な用量依存性阻害を誘導した。ＴＷＩは、５０mg/kg及び１００mg/kgの用量で、それぞれ６０％（Ｐ＜０．００５）及び８０％（Ｐ＜０．０００５）であった。
【図４Ａ】Ｃｐｄ１で処理したヒト乳頭様甲状腺癌細胞（ＴＰＣ−１）における、Ｍｅｔ自己リン酸化及び発現の阻害を示す図である。図４Ａ：ＡＴＰＣ−１細胞を、溶媒（−）又は図示される濃度のＣｐｄ１に７２時間接触させた。抗Ｍｅｔ抗体で免疫沈降させるか（ＩＰ）、又は全細胞溶解物（ＷＣＬ）を調製するために、等量のタンパク質を用いた。免疫沈降させたタンパク質及びＷＣＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に移し、抗ｐＴｙｒ又は抗Ｍｅｔ抗体によるウエスタンブロット分析に付した。
【図４Ｂ】Ｃｐｄ１で処理したヒト乳頭様甲状腺癌細胞（ＴＰＣ−１）における、Ｍｅｔ自己リン酸化及び発現の阻害を示す図である。図４Ｂ：Ａのように細胞を処理した。細胞抽出物を、抗ｐＴｙｒ抗体で免疫沈降させ、抗Ｍｅｔ抗体と共に調べた。
【図４Ｃ】Ｃｐｄ１で処理したヒト乳頭様甲状腺癌細胞（ＴＰＣ−１）における、Ｍｅｔ自己リン酸化及び発現の阻害を示す図である。図４Ｃ：細胞を、２４時間血清飢餓に付し、最後の１８時間は溶媒又はＣｐｄ１（６０μM）に接触させた。次いで、それらを１０分間、未処理（−）のまま放置するか、又は２０ng/mlＨＧＦで刺激した。細胞溶解物を、抗Ｍｅｔで免疫沈降させ、抗ｐＴｙｒ又は抗Ｍｅｔ抗体と共に調べた。薬物処理は、構成的又はＨＧＦ誘導Ｍｅｔチロシンリン酸化を抑止し、Ｍｅｔ発現の低下を誘導した。
【図５Ａ】全細胞における、ＰＤＧＦ−Ｒ自己リン酸化及び発現の、Ｃｐｄ１による阻害を示す図である。図５Ａ：２Ｎ５Ａ細胞（ＰＤＧＦ−Ｒのオートクリン刺激を発生するＣＯＬ１Ａ１／ＰＤＧＦＢ再配置によって形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３）を、図示された濃度のＣｐｄ１で７２時間処理した。細胞抽出物を、抗ＰＤＧＦ−Ｒ抗体で免疫沈降させ、抗ｐＴｙｒ又は抗ＰＤＧＦ−Ｒ抗体によるウエスタンブロット分析に付した。
【図５Ｂ】全細胞における、ＰＤＧＦ−Ｒ自己リン酸化及び発現のＣｐｄ１による阻害を示す図である。図５Ｂ：Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を、２４時間血清飢餓に付し、次いで図示された濃度のＣｐｄ１で１８時間処理した。１nM  ＰＤＧＦで５分間刺激した後、全細胞溶解物を調製し、抗ｐＴｙｒ又は抗ＰＤＧＦ−Ｒによるウエスタンブロット分析に付した。抗アクチンブロットによるタンパク質負荷を示す。いずれの細胞培養系でも、レセプターのチロシンリン酸化及び発現の用量依存性薬剤誘導阻害が、記録で証明された。
【図６Ａ】全細胞における、ＦＧＦ−Ｒ１及びＦＧＦ−Ｒ３レセプターの自己リン酸化及び発現のＣｐｄ１による阻害を示す図である。図６Ａ：スイス３Ｔ３細胞を、２４時間血清飢餓に付し、次いで図示された濃度のＣｐｄ１で１８時間処理した。１００ng/ml  ＦＧＦで５分間刺激した後、全細胞溶解物を調製し、抗ｐＴｙｒ又は抗ＦＧＦ−Ｒ１によるウエスタンブロット分析に付した。抗アクチンブロットによるタンパク質負荷を示す。
【図６Ｂ】全細胞における、ＦＧＦ−Ｒ１及びＦＧＦ−Ｒ３レセプターの自己リン酸化及び発現のＣｐｄ１による阻害を示す図である。図６Ｂ：ＦＧＦ−Ｒ３の突然変異体Ｙ３７３Ｃによって形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３を、図示された濃度で７２時間処理した。細胞抽出物を、抗ＦＧＦ−Ｒ３で免疫沈降させ、次いで抗ｐＴｙｒ又は抗ＦＧＦ−Ｒ３によるウエスタンブロット分析に付した。いずれの細胞系でも、Ｃｐｄ１によるレセプター  チロシンリン酸化及び発現の用量依存性阻害が、記録で証明された。
【図７Ａ】Ｋｉｔの構成的に活性化された形態を発現する細胞系に対する、Ｃｐｄ１の効果を示す図である。図７Ａ：外来性の突然変異ＫＩＴ（Δ５５９）を発現するＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクタントの、形質転換した形態学的表現型の回復を示す。細胞を、２０μM  Ｃｐｄ１で処理し、２４時間後に、位相差顕微鏡（当初倍率：ｘ１００）下で写真撮影した。
【図７Ｂ】構成的に活性化された形態のＫｉｔを発現する細胞系に対する、Ｃｐｄ１の効果を示す図である。図７Ｂ：ＮＩＨ３Ｔ３  トランスフェクタントにおけるＫｉｔ（Δ５５９）の自己リン酸化及び発現の阻害を示す。細胞を、図示された濃度のＣｐｄ１で７２時間処理した。細胞溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体で免疫沈降させ、抗ｐＴｙｒ又は抗Ｋｉｔ抗体によるウエスタンブロット分析に付した。
【図７Ｃ】構成的に活性化された形態のＫｉｔを発現する細胞系に対する、Ｃｐｄ１の効果を示す図である。図７Ｃ：ＳＣＬＣ細胞系  Ｎ５９２における、ｃ−Ｋｉｔの発現、及びオートクリンループにより活性化された自己リン酸化の阻害を示す。細胞を、図示された濃度のＣｐｄ１で２４時間処理した。全細胞溶解物を、抗Ｋｉｔ抗体、又はチロシンリン酸化された／活性化されたＫｉｔ（ｐ−Ｋｉｔ）を特異的に認識する抗体によるウエスタンブロット分析に付した。いずれの細胞系でも、レセプター  チロシンリン酸化及び発現の、用量依存的、薬物誘導阻害が、記録で証明された。
【図１】
2005537277.tif 000008
【図１Ｂ】
2005537277.tif 000009
【図１Ｃ】
2005537277.tif 000010
【図２Ａ】
2005537277.tif 000011
【図２Ｂ】
2005537277.tif 000012
【図３】
2005537277.tif 000013
【図４】
2005537277.tif 000014
【図５】
2005537277.tif 000015
【図５Ｂ】
2005537277.tif 000016
【図６Ａ】
2005537277.tif 000017
【図６】
2005537277.tif 000018
【図７】
2005537277.tif 000019
【国際調査報告】
2005537277.tif 000020
2005537277.tif 000021
2005537277.tif 000022