(57)【要約】  本発明は、ヌクレオチドによって誘導されるプロモーターを含んで成る、新規ベクター及び核酸配列に関する。本発明は更に、キサントシンオペロンの因子を利用する発現ベクター及び異種タンパク質の産生のための方法に関する。
2005512597.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質をコードする遺伝子と作用可能に連結されうるプロモーターであって、リン酸基を有することもあれば、又は有さないこともあるヌクレオチドの存在下で、任意の作用可能に連結した異種タンパク質の発現を誘導するプロモーター、を含んで成るベクター。
【請求項２】
プラスミド又はバクテリオファージである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
誘導性の発現ベクターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
プロモーターがxapA遺伝子由来である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
プロモーターによって発現を制御する制御因子を更に含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
制御因子が核酸配列である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
制御因子がxapR遺伝子由来である、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
追加のプロモーターが制御因子と作用可能に連結している、請求項６又は７に記載のベクター。
【請求項９】
追加のプロモーターが誘導的又は構成的プロモーターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０】
追加のプロモーターがxapRプロモーター由来である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
異種タンパク質をコードする遺伝子を含んで成る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
異種タンパク質をコードする遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素又は抗原をコードする、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
キサントシンオペロン由来の制御xapR遺伝子と、xapA遺伝子由来のプロモーターとを含んで成る、単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含んで成る発現ベクター。
【請求項１５】
以下の配列：
ＡＧＧＡＧＧｘｘｘｘｘ又は
ＡＧＧＡＧＧｘｘｘｘｘｘ又は
ＡＧＧＡＧＡｘｘｘｘｘ
ＡＧＧＡＧＡｘｘｘｘｘｘ
を有するリボソーム結合部位を含んで成る核酸。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸配列を含んで成るプロモーター配列。
【請求項１７】
xapAプロモーター由来である、請求項１６に記載のプロモーター配列。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の、１又は複数のベクター又は核酸配列を含んで成る、宿主細胞。
【請求項１９】
異種タンパク質の発現方法であって、異種タンパク質の発現を誘導する条件下で、請求項１８に記載の宿主細胞の培養を含んで成る方法。
【請求項２０】
異種タンパク質の精製を更に含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
異種タンパク質がサイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素又は抗原である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法によって産生されるタンパク質。
【請求項２３】
異種タンパク質の産生における、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の、１又は複数のベクター又は核酸配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド（リン酸基を有するか又は有さない）によって誘導されるプロモーターを含んで成る新規ベクター及び核酸配列に関する。本発明は更に、キサントシンオペロンの因子を利用する発現ベクター及び異種タンパク質の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌内に導入されたクローン化遺伝子の発現は、尚も大量の診断及び治療目的で注目のタンパク質を産生するための最も広範に使用されている機構である。原核生物の宿主において効率的にタンパク質を産生するために、強力な制御プロモーターはその発現系の必須因子である。当業界で既に知られているプロモーター及び発現系には、バクテリオファージラムダｐＬ及びｐＲプロモーターが含まれ、これらは、低温でそのプロモーターからの転写を抑制し、そして温度誘導によって異種タンパク質の発現を可能にする温度感受性リプレッサーによって（ＥＰ−Ａ−４１７６７）、又はより低温でイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用い、同時に強力なｐＬ／ｐＲプロモーターを更に利用することで誘導されうる誘導性抗リプレッサー系の使用によって（ＷＯ９８／４８０２５）制御され得る。しかしながら、高温は通常不溶性凝集物として、又は封入体としての異種タンパク質の形成を招き、これらはその後、毒性の化学物質を用いる費用のかかるリフォールディング段階を必要とする。
【０００３】
他のプロモーターには、lacオペロン及び誘導体、例えばtrp-lacプロモーター又はtacプロモーターが含まれ（ＥＰ−Ａ−６７５４０）、これはＥ．コリにおいて高レベルのタンパク質を産生するために使用されている。このプロモーターは、ＩＰＴＧの存在下で誘導される。プロモーターを抑制にかけるために、それはlacリプレッサーを過剰産生するプラスミドと一緒に、又はlacリプレッサータンパク質を産生するＥ．コリ(E. coli)株内で使用されなければならない。Ｔ７プロモーターベースの系（ＵＳ５８６９３２０）は、誘導的に発現し、そして再びＩＰＴＧを用いて、タンパク質の過剰産生のために研究所で通常使用されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを利用する。しかしながら、そのようなプロモーターの強さはまた、異種タンパク質の封入体、又は凝集物の産生を招くことがある。
【０００４】
グラム陰性細菌であるエスケリッチャ・コリ（Escherichia coli)は、唯一の炭素源としてキサントシンで生育することができる(Hammer-Jespersen et al., 1980)。このことは、少なくとも３つの遺伝子を含んで成り、Ｅ．コリ(E. coli)染色体上の約５２’位にあるキサントシンオペロン内の遺伝子の誘導及び利用を介して生じる（図１）(Seeger et al., 1995)。当該オペロン内の遺伝子は、xapA、xapB及びxapRである。xapAは、キサントシンホスホリラーゼをコードし、これはヌクレオシド分子内のＮ−グリコシド結合の分解を触媒し、遊離塩基及びペントース−１−リン酸塩をもたらす。当該遊離塩基は、続いてプリン及びピリミジンサルベージ経路において、そして更には窒素源として使用されることがあり(Nygaard, 1983)、そしてペントース分子はその後炭素源として利用されることがあり、それ故にＥ．コリ(E. coli)はキサントシン最少培地上で生育する能力を有する。xapBタンパク質の機能は、完全に解明されていないが、他のタンパク質との相同性によって、そしてその細胞での位置によって、細胞膜を通過してヌクレオシドを輸送するのにほぼ確実に関与している膜輸送タンパク質であると思われる(Seeger 上記)。xapRは、遺伝子の活性化に関与しているＤＮＡ結合タンパク質である、転写制御タンパク質のLysRファミリーに対して有意な相同性を示しており(Henikoff et al., 1988)、そして構成的に発現していると思われる。xapA及びB遺伝子は同時発現しているようであり、そしてxapAの発現はキサントシン、及びxapRタンパク質の存在下でのみ見られる(Seeger, 上記)。xapRタンパク質は、真のLysRファミリーのメンバーである場合、xapAプロモーター内の特異的な領域に結合し、その後のＥ．コリＲＮＡポリメラーゼの結合、及びその後のxapA（及びxapB）遺伝子の転写を可能にするであろう。そのようなＤＮＡ結合タンパク質は、逆方向の相補的な共通配列ATATTGTTTを認識するようであり(Bohannon 1989)、そしてxapAプロモーター領域内（図２）のそのような領域は、転写開始領域の１２０ｂｐ上流にあり(CCAATACAGTTTT)、そして対応配列は４０ｂｐ上流にあり、−３５領域（ＡＡＡＡＣＴＧＴＡＴＴＧＧ）重複している(Seeger, 上記)。Ｅ．コリのキサントシンオペロンを含んで成る遺伝子配列は、複数のオンラインの公共データベース、例えばGenBankデータベースに寄託されており、www.ncbi.nlm.nih.govのNational Center for Biotechnology Information (NCBI)(Bethesda, Maryland, USA)のホームページから、AE000328, D90869,D90870又はX73828のアクセス番号を用いてアクセス可能である。
【０００５】
本発明は、新規発現ベクター及び系を用いる異種タンパク質の発現に関するものであり、これは温度誘導に伴う不溶性の封入体又は非常に強力なプロモーターの問題を回避し、そして、治療タンパク質を製造する場合にその不在を証明するための確認手順に費用がかかる毒性の誘導物質、例えばＩＰＴＧの使用を必要としない。
【０００６】
従って、本発明の第一の側面は、異種タンパク質に作用可能に連結することができるプロモーターであって、リン酸基を有することもあり、又は有さないこともあるヌクレオチドの存在下で、任意の作用可能に連結した異種タンパク質の発現を誘導するプロモーターを含んで成るベクターを提供する。リン酸基は、リン酸エステルの分子をもたらすことがある。１又は複数のリン酸基が結合していてもよい。
【０００７】
ベクターは任意のものでよく、プラスミド又はバクテリオファージを含む。好ましくは、ベクターは誘導性の発現ベクターである。
【０００８】
プロモーターの誘導は、媒体（通常培地）中のヌクレオチドの存在による。
【０００９】
用語「リン酸基を有する、又は有さないヌクレオチド」には、ヌクレオチド及びヌクレオシドの両方が含まれる。
【００１０】
本発明によると、ヌクレオチドには、糖分子と共有結合した１又は複数のリン酸基を含む任意の１又は複数のヌクレオシド分子が含まれ、これはオキシ、デオキシ、又はジデオキシ型のものでもよい。それらの例には、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）が含まれる。これらのデオキシ型（一般にｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰと記載され、そして一般に塩基として知られている）は、ＤＮＡの基本構造を形成する。これらのオキシ型（一般にＡＴＰ又はｒＡＴＰ、ＣＴＰ又はｒＣＴＰ、ＧＴＰ又はｒＧＴＰ、ＵＴＰ又はｒＵＴＰと記載され、そして一般にＲＮＡ塩基として知られている）は、ＲＮＡの基本構造を形成する。
【００１１】
本発明によると、ヌクレオシドには、糖、特にオキシ−又はデオキシ−リボース糖分子とＮ−グリコシド結合で連結したプリン又はピリミジンを含んで成る、任意の１又は複数の化合物が含まれる。そのようなヌクレオシドの例には、アデノシン、グアノシン、イノシン、シチジン、チミジン、ウリジン、キサントシン、及びそれらの誘導体のオキシ、デオキシ及びジデオキシ型が含まれる。
【００１２】
キサントシンは、ＵＳＰＴＯ分類のもとでは５３６／２７．８として知られている。これはまた、キサントシン、又は９−ベータ−Ｄ−リボフラノシルキサンチン(Chemical Abstract Service番号５９６８−９０−１）としても知られ、そして無水塩又は二水和物塩のいずれかとしての前記化合物を含む。キサントシンの同義名は、キサンチンリボシド、９−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−９Ｈ−プリン−２，６−ジオール及び９−ベータ−Ｄ−リボフラノシル−９Ｈ−プリン−２，６−（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンである。
【００１３】
誘導物質としてのヌクレオチドの好ましい濃度は、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍｌの範囲内である。
【００１４】
任意のプロモーターは、異種タンパク質をコードする遺伝子と作用可能に連結することができ、且つヌクレオチドの存在下で任意のそのような作用可能に連結した異種タンパク質の発現を誘導するものが使用され得る。
【００１５】
核酸配列を作用可能に連結する工程は当業界で周知であり、そして現在大部分が核酸を切断する制限酵素及び核酸を連結するポリメラーゼの使用に基づいている。そのような工程の例を実施例の項において示す。
【００１６】
プロモーターは、ヌクレオチドの存在によって直接的又は間接的に誘導されうる。適当なプロモーターには、xapA遺伝子由来のものが含まれる。任意のxapA遺伝子が許容される。Ｅ．コリ由来のxapAプロモーター領域を図１ａに記す。本発明に含まれる、修飾されたxapAプロモーター領域を図１ｂ及び１ｃに示す。これらの修飾された領域には、有用な制限酵素部位が含まれている。
【００１７】
この配列に加え、ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在下で作用可能に連結した核酸の発現を誘導する、任意の修飾された配列が使用され得る。例えば、修飾された配列は、実質的に相同的な配列であってもよい。実質的に相同的な配列は、前記の定義した配列と少なくとも７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８又は１００％の配列同一性を有する。
【００１８】
「同一性（％）」は、２つの核酸又はポリペプチド配列間の関係の測定値であって、それらの配列を比較することによって決定される。通常、比較される２つの配列は、当該配列間で最大の相関を示すよう整列される。２つの配列のアラインメントが試験され、そして正確なアミノ酸又はヌクレオチドの一致を示す位置の数が決定され、そして当該アラインメントの全長によって割られ、そしてその結果に１００をかけて同一性（％）を出す。同一性（％）は、比較する配列の全長に及んで決定されることがあり、これは同一若しくは類似の長さの配列、又は高度に相同の配列の場合特に適しており、あるいはより短い限定した配列に及んで決定されることもあり、これは、同一でない長さで且つより低い相同性を有する配列により適している。
【００１９】
２又はそれ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当業界で知られている。例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package version 9.1 (Devereux J et al.,Nucl Acid Res 12 387-395 (1984), Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USAから入手可能)、例えばBESTFIT及びGAPが使用され得る。
【００２０】
BESTFITは、SmithとWaterman (Advances in Applied Mathematics, 2: 482-489,1981)の「ローカルホモロジー」アルゴリズムを使用し、そして２つの配列間の類似性の最良の単一領域を見つける。BESTFITは、長さが異なる２つのポリヌクレオチド又は２つのポリペプチドを比較するのにより適しており、当該プログラムは、短い配列が長い配列を代表することを想定する。比較して、ＧＡＰは２つの配列を整列させ、NeeddlemanとWunschのアルゴリズムに従い「最大の類似性」を見つける(J. Mol. Biol. 48:443-354, 1970)。
【００２１】
ＧＡＰは、ほぼ同一の長さの配列を比較するのにより適しており、そしてアラインメントは全長に及んで予想される。各プログラムにおいて使用される「ギャップウェイト」及び「レングスウェイト」のパラメーターは、それぞれポリヌクレオチド配列の場合５０及び３であり、そしてポリペプチド配列の場合１２及び４である。好ましくは、同一性及び類似性（％）は、比較される２つの配列が最適に整列した場合に決定される。
【００２２】
配列間の同一性及び／又は類似性を決定するための他のプログラムも当業界では知られており、例えばＢＬＡＳＴプログラムファミリー(Altschul etal., J. Mol. Biol., 215: 403-410, (1990)及びAltschul et al., Nuc Acids Res., 25: 289-3402 (1997)、National Center for Biotechnology Information (NCBI)(Bethesda, Maryland, USA)から利用可能であり、そしてwww. ncbi. nlm. nih.govのNCBIのホームページからアクセス可能である)及びFASTA(Pearson W. R. and Lipman D. J., Proc. Nat. Acac. Sci., USA, 85: 2444-2448 (1988)、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部として利用可能である)である。
【００２３】
本発明に関連して、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションプロトコールにおいて使用する洗浄条件を言及している。通常、洗浄条件は、変性温度が、研究中の核酸の算出されるＴmよりもほぼ５〜２０℃低くなるような温度と塩濃度の組み合わせであるべきである。２０塩基以下の核酸プローブのＴmは、短いオリゴヌクレオチドの場合、Wallaceルールに従い、通常の条件のもと（１ＭのＮａＣｌ）、４℃×（Ｇ＋Ｃ）＋２℃×（Ａ＋Ｔ）として算出される。長いＤＮＡフラグメントの場合、固体の熱力学と実験データとを組み合わせた最近接法が、Breslauer et al., PNAS 83: 3746-3750 (1986)に記載の原理に従い使用されうる。ハイブリダイゼーションに最適な塩及び温度の条件は、フィルター上に固定されたＤＮＡ試料が、注目のプローブとハイブリダイズされ、そして異なるストリンジェンシーの条件のもと洗浄される予備実験において容易に決定されうる。ＰＣＲのための条件は標準的な条件と異なることがあるが、Ｔmは、プライマーの予想される相対的な安定性のための手引きとして使用され得る。約１４個のヌクレオチドの短いプライマーの場合、約４４℃〜５０℃の低いアニーリング温度が使用される。当該温度は、使用するプライマー配列の塩基組成によって、より高い場合がある。適当にストリンジェントな条件は、２１量体のオリゴヌクレオチドプローブの場合、０．５×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ／５８℃／３０分である。
【００２４】
ベクターは、プロモーターを制御するために、前記ヌクレオチドが相互作用する制御因子を更に含んで成ることがある。制御因子は、好ましくは核酸配列である。制御因子がxapR遺伝子である場合、それは、任意の異種タンパク質の発現を増大させるために、発現したタンパク質がヌクレオチドと相互作用し、そしてプロモーターを制御するように発現される必要がありうる。
【００２５】
最も好ましくは、本発明によると、制御因子はxapR遺伝子由来である。任意のxapR遺伝子が許容される。Ｅ．コリ由来のxapR遺伝子を図２に記載する。
【００２６】
この所定のxapR遺伝子に加え、プロモーターに対して同様に作用する、任意の修飾されたxapR配列が使用され得る。例えば、修飾された配列は、実質的に同種のxapR配列（既述のもの）であってもよい。xapR配列は、発現される必要がありうる。適当な修飾されたxapR配列は、Jorgensen and Dandanell, 1999に記載されている。
【００２７】
発現したxapRタンパク質は、xapAプロモーター内の特定の領域と結合し、これはその後のＲＮＡポリメラーゼの結合、及びその後の任意の作用可能に連結した異種遺伝子の転写を可能にすると考えられている。
【００２８】
xapR、又は他の制御因子が発現するために、ベクターが、発現を調節するために制御因子と作用可能に連結した追加のプロモーターを含んで成る必要があることもある。好ましくは、そのようなプロモーターは、制御因子が構成的に発現するような、構成的又は誘導的プロモーターである。追加のプロモーターは、xapRプロモーター又は任意の他の知られている構成的又は誘導的プロモーター、例えばlac、trc、ラムダpR、ラムダpL又はtrpプロモーターであってもよい。
【００２９】
あるいは、プロモーターによる発現を制御する制御因子は、存在してもよいが、誘導的プロモーターが存在するベクターの一部としてでなくてもよい。制御因子（好ましくは構成的又は誘導的プロモーターを有する）は、別のベクターの一部として細胞内に存在していてもよく、又は細胞のゲノムに組み込まれていてもよい。
【００３０】
本発明の第一の側面におけるベクターは、異種タンパク質をコードする作用可能に連結した遺伝子を有してもよく、又は有さなくてもよい。そのようなゲノムを有さないベクターの形態は、「空のカセット」と称することができ、これは、任意のそのような遺伝子を、その遺伝子の発現における使用のために付加することを可能にする。当該付加は、当業界で知られている工程（主に切断用の制限酵素及び連結用のポリメラーゼの使用による）によってなされ、これらの例を実施例に示す。
【００３１】
任意の異種タンパク質をコードする任意の遺伝子は、本発明の第一の側面におけるベクターに挿入され得る。そのような遺伝子の例には、サイトカイン、ホルモン、ケモカイン、抗原等（好ましくはヒト型）をコードするものが含まれる。サイトカインには、例えばヒトインターロイキン−４が含まれる。ホルモンにはヒト成長ホルモンが含まれる。産生される異種タンパク質は、融合タンパク質、例えばリーダーペプチドに結合しているものであって、細胞膜周辺腔又は細胞外の培地への分泌のために、ompA又はpelBのようなリーダーペプチドを用いるもの、あるいは異種タンパク質と作用可能に連結した第二ポリペプチドであって、異種タンパク質のタンパク質分解的な減成を防ぎ、又は精製のためのアフィニティータグを提供し、又は異種タンパク質の可溶化を補助することが可能な機能を有するもの、であってもよい。そのような第二ポリペプチドの例には、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグが含まれ、そしてそのような第二ポリペプチドは、化学的又は酵素的手段を用いる選択的開裂による第二ポリペプチドの除去のために、開裂部位を含むこともあれば、含まないこともある。そのようなものの例には、臭化シアン、トリプシン、エンテロキナーゼ及び第Ｘａ因子が含まれる。
【００３２】
本発明の第二の側面は、キサントシンオペロンのxapR由来の制御遺伝子とxapA遺伝子由来のプロモーターとを含んで成る、単離された核酸、を提供する。
【００３３】
xapAプロモーターは、図１ａに記載のとおりのこともあり、そして前述のような任意の実質的に同種の配列を含む。
【００３４】
xapR遺伝子は、図２に記載のとおりのものでもよく、そして前述のような任意の実質的に同種の配列を含む。
【００３５】
前記核酸はまた、xapR遺伝子と作用可能に連結している追加のプロモーターを含んで成ることがある。そのようなプロモーターは、本発明の第一の側面について記載したとおりである。それはxapRプロモーター由来であってもよく、又は任意の誘導的又は構成的プロモーターであってもよい。xapRプロモーターは、図２に記載のとおりでもよい。
【００３６】
本発明の第二の側面における単離された核酸は、発現ベクターの一部であってもよい。
【００３７】
第一又は第二の側面におけるベクター又は核酸は、当然ながら、他の因子、例えば表現型選択マーカー、例えば抗生物質耐性、複製遺伝子等を含んで成ることもある。
【００３８】
本発明の第三の側面は、以下の配列のうちのいずれか１つを有するリボソーム結合部位を含んで成る核酸を提供する：
ＡＧＧＡＧＧｘｘｘｘｘ
ＡＧＧＡＧＧｘｘｘｘｘｘ
ＡＧＧＡＧＡｘｘｘｘｘ
ＡＧＧＡＧＡｘｘｘｘｘｘ
（ここで、ｘは任意の塩基である）
【００３９】
任意の塩基（ｘ）は、実施例２に記載のようなものでありうる（ｔａｃｃｃ又はｔａｔｃｃｃ）。
【００４０】
第三の側面における核酸配列は、実施例２に記載のような５’配列を含んで成ることがある。第三の側面における核酸配列は、プロモーター配列の一部であってもよい。プロモーター配列は、xapAプロモーター配列由来のものであってもよい。本発明の第三の側面における核酸配列は、本発明の第一の側面に従い記載されるような、ベクターの一部であってもよい。
【００４１】
本発明の第四の側面は、本発明の第一、第二、又は第三の側面のいずれか１つに従う、１又は複数のベクター又は核酸配列を含んで成る宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、任意のもの、好ましくは商業的規模でのタンパク質産生を提供するための培養において使用され得るものであることがある。そのような宿主細胞の例には、Ｅ．コリ、バチルス種(Bachillus sp.)及び酵母、例えばサッカロマイセス(Saccharomyces)及びピキア(Pichia)が含まれる。
【００４２】
ベクター及び／又は核酸は、任意の技術、例えば形質転換、エレクトロポレーション等によって宿主細胞に導入される。
【００４３】
本発明の第五の側面は、異種タンパク質の発現方法であって、異種タンパク質の発現を誘導する条件下での、本発明の第四の側面に従う、宿主細胞の培養を含んで成る方法、を提供する。そのような方法は、当業界で周知である（例えば、"Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology" "2nd Edition. Demain A, & Davies J, 1999を参照のこと）。適当な条件とは、形質転換宿主細胞を、当該宿主細胞の要求を満たす栄養素、例えば炭素及び窒素源、ビタミン及び微量元素と、選択マーカー、例えば抗生物質耐性遺伝子を含み得る発現ベクターを含むそれらの細胞を選択するのに適した化合物とを含む培養液中で培養することを含む。細胞は、最適な増殖を達成する条件下で、ｐＨに関しては典型的にｐＨ６〜８、温度に関しては典型的に２０〜４２℃で、そして、但し酸素は１０〜５０％の範囲、典型的な最適値としては３０％で培養される。細胞は、適当な密度が達成されるまで（この時点で誘導物質が細胞内での発現ベクターの最大の誘導を達成するのに十分な量で添加される）、そのような条件下で培養され、そしてその結果注目のタンパク質の発現が可能となる。誘導は、注目のタンパク質が採集され得る、最適な、経験的に定められる時間続けられる。
【００４４】
当該方法は、異種タンパク質の精製を更に含んで成ることもある。そのような精製段階も当業界で知られている（例えば、"Protein Purification", 2nd Edition, Janson, J-C & Ryden, L, 1998を参照のこと）。細胞内で産生される異種タンパク質の抽出のための基本的段階は、典型的に、種々の手段、例えばホモジェナイゼーション、又は化学的溶解、又は凍結融解、又は超音波によって細胞をこじ開ける段階を包含する。可溶性の抽出物中に存在した細胞内タンパク質は、当業界で周知の広範なクロマトグラフィー段階、例えば疎水性相互作用、アフィニティークロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィー、サイズ排除又はゲルろ過及び限外ろ過によってすぐに捕捉され得る。典型的には、宿主細胞タンパク質又は不純物を含まぬように当該異種タンパク質を更に精製するために追加のクロマトグラフィー段階が用いられ、その結果高度に精製したタンパク質が生じる。抽出物の不溶性部分に存在した、例えば封入体として存在した細胞内タンパク質は、当業界で知られている多数の方法を用いて、グアニジン、ウレア、又はドデシル硫酸ナトリウム等の化合物を用いて可溶化されることがあり、そしてその後上文で言及したような１又は複数のクロマトグラフィー段階を用いて精製されうる。上述のようなリーダーペプチドを採用した発現ベクターを用いて細胞膜周辺腔において産生された異種タンパク質は、スクロース、又は硫酸マグネシウム、又はリゾチーム／ＥＤＴＡのような化合物を用いて培地中に細胞膜周辺腔の中身を放出するために、浸透圧ショックを利用することによって前記腔から放出されることがあり、この後１又は複数のクロマトグラフィー段階が前記タンパク質を精製するために用いられる。
【００４５】
本発明の第六の側面は、本発明の第五の側面の方法によって産生されるタンパク質を提供する。
【００４６】
本発明の第七の側面は、異種タンパク質の産生における、本発明の第二又は第三の側面のうちのいずれか１つに従う、１又は複数のベクター又は核酸配列の使用を提供する。
【００４７】
本発明の種々の側面の全ての好ましい特徴は、互いに準用する。
【００４８】
本発明の目的は、商業的価値のある異種タンパク質の発現のための、Ｅ．コリのキサントシン代謝のためのオペロンに由来する、プロモーター及び制御リプレッサーを含んで成る発現ベクターを提供することである。本発明の１つの特定の態様において、xapR制御タンパク質は、そのプロモーターと共に、単離され、そして、xapA遺伝子由来のプロモーターと作用可能に連結した異種遺伝子と一緒に、発現ベクター内に導入される。生成した発現ベクターは、適当な宿主細胞を形質転換させ、これは続いて最適な生育を達成するための適当な条件下で生育される。異種タンパク質の発現は、キサントシンの添加まで起こらず、これはxapRタンパク質を活性化させ、それがxapAプロモーター領域に結合するのを可能にし、xapAプロモーターから異種タンパク質を発現させる。
【００４９】
本発明の別の目的は、キサントシンオペロンのための新規なリボソーム結合部位を提供することにあり、これは異種タンパク質の発現レベルを増大させ、それによって特異的な変化が第一の態様において詳述したようにxapAオペロンの天然のリボソーム結合部位に起こり、そしてそれによってスクリーニング法が利用されて増大した発現レベルをもたらす突然変異が同定される。
【００５０】
本発明の別の目的は、ヌクレオチド、例えばキサントシンで誘導可能な発現系を用いる異種タンパク質の産生方法を提供することにある。以下の実施例において、キサントシン誘導発現ベクターの構築を記載し、そして本発明の有用性をＥ．コリにおけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びヒトインターロイキン−４の産生を用いて例示する。
【００５１】
他の遺伝子が本明細書に記載の系において発現されうることは、当業者にとって自明であると思われる。尚、そのような系は、Ｅ．コリ、又は他の生物のゲノム内に組み込まれることがあり、又は類似の発現系が、サルモネラ、シュードモナス、バチルス又はストレプトコッカス等のような属を含む他の生物由来のキサントシンオペロン由来の相同遺伝子を利用して構築されることがある。
【００５２】
本発明は、添付図面を参照して説明される。
【００５３】
本発明を以下の限定しない実施例を参照して説明する。
【実施例】
【００５４】
使用した材料と方法を以下に記載し、そして本発明を実施例において説明する。当該方法の多くのサポートとして、以下の本について言及する：
Sambrook et al., (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2 Edition, and Miller, J. (1972) "Experiments in Molecular Genetics", both from Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, and Dieffenbach C. W & Dveksler G. S.(1995) ; PCR Primer : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York。
【００５５】
実施例１：キサントシン誘導発現ベクターの構築
XapR遺伝子（制御タンパク質）のＰＣＲ増幅
XapR遺伝子は、それ自身のプロモーターと共に、フォワードプライマーxap2（配列番号１）5'-ACGGTACCTTTTGCTATCTGCGATTTGCG-3'及びリバースプライマーxap5（配列番号５）5'-CTCATTAAAAGGATCCGCGGCTCTGCTCTTCAG-3'ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ番号７００９２６）由来のＥ．コリのゲノムＤＮＡから増幅された。反応混合物は、Ｐｆｕ緩衝液（２５℃でｐＨ８．８の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ；１０ｍＭの硫酸アンモニウム；１０ｍＭの塩化カリウム；０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００；０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及び２ｍＭの硫酸マグネシウム）、０．２５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５００ｍｇのＥ．コリゲノムＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各プライマー、１．２５ユニットのpfuＤＮＡポリメラーゼ（MBI Fermentas）及び最終量が５０μｌとなるような水を含んでいた。使用したＰＣＲ増幅法は以下のとおりとした：
１サイクル：
９４℃  ５分の最初の変性
７２℃  維持（ポリメラーゼ添加）
１４サイクル：
６５℃  １分のアニーリング（１サイクルごとに−１℃の低下）
７２℃  ５分の伸長
９４℃  １分の変性
１９サイクル：
５５℃  １分のアニーリング
７２℃  ５分の伸長（１サイクルごとに＋０．０２分の増大）
９４℃  １分の変性
５５℃  １分のアニーリング
７２℃  ７分の最後の伸長
【００５６】
xapR遺伝子に相当する１．２ｋｂのフラグメントが増幅された。このＰＣＲ反応から生じたＤＮＡフラグメントは、０．８％ＴＡＥ／アガロースゲル上で解析され、これを０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色した。当該フラグメントは、続いてゲルから精製された。
【００５７】
xapAプロモーターのＰＣＲ増幅
xapAプロモーター領域は、菌株ＭＧ１６５５由来のＥ．コリのゲノムＤＮＡから、フォワードプライマーxap1（配列番号３）5'-CCAAGCTTAGCATAATTCCCTATGCCGATC-3'、及びリン酸化された逆流プライマーxap4（配列番号４）5'-GAACCTGAGACATATGTATCCTTTTG-3'、又はリン酸化されたxapNco R（配列番号５）5'-GTGGTCACCATGGGTATCCTTTTTCTGTAGG-3'を用いて、上述のような反応混合物を用いてＰＣＲ増幅された。使用した増幅方法は、以下の通りであった：
１サイクル：
９４℃  ５分の最初の変性
７２℃  維持（ポリメラーゼ添加）
３５サイクル：
６５℃  １分のアニーリング
７２℃  ０．５分の伸長
９４℃  １分の変性
１サイクル：
６５℃  １分のアニーリング
７２℃  ３分の最後の伸長
【００５８】
xapAプロモーターに相当する２７０ｂｐのフラグメントが増幅された。これらのＰＣＲ反応から生じるＤＮＡフラグメントは、１％のＴＡＥ／アガロースゲル上で解析され、これを０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムで染色し、そして再びゲルから精製した。
【００５９】
発現ベクターの構築
構築する最初のベクターはpUC19Xであった。このベクターを構築するために、pUC19は、SacI及びNdeIで消化され、そして生じた突出は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(Promega)を用いて、取扱説明書に従い埋められた。生じた２．４ｋｂのフラグメントはすぐにセルフライゲーションされ、そしてXL1-Blueコンピテント細胞(Stratagene)の形質転換に利用された。精製したxapR遺伝子及びxapAプロモーターのＰＣＲ産物は、上述のように、制限エンドヌクレアーゼ、xapR遺伝子の場合にはBamHI及びKpnI、そしてxapAプロモーターの場合にはHindIII及びHincIIを用いて、pUC19X内に挿入された。生じたプラスミドは、pXap1aとpXap1bと称され、これらは独特なNcoI部位又はNdeI部位のいずれかの存在のみが異なる。最初のコンストラクト及び発現ベクターコンストラクトのマップを図３に記す。
【００６０】
当該コンストラクトは、xapRタンパク質が、それ自身のプロモーター（上述のようにＰＣＲ産物に組み込まれている）の支配下で、構成的に発現するように設計される。xapAプロモーターは、ベクターの適当な領域に挿入され、NcoI部位(pXap1a)又はNdeI部位(pXap1b)内への異種遺伝子のクローニングを可能にする。このことは、任意のそのような異種遺伝子が、xapAプロモーターのプロモーター領域に関して、転写開始部位、リボソーム結合部位及びプロモーターのＲＮＡポリメラーゼ結合部位に関して、正確に配置され、キサントシンを用いた誘導による異種タンパク質の正確な発現を可能にするが、キサントシンの不在下での非誘導型の発現を可能にはしないことを保証する。
【００６１】
実施例２．リボソーム結合部位突然変異体の作製及び活性解析
β−ガラクトシダーゼを用いたpXap1bの発現解析
Ｅ．コリのβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子は、上述の増幅方法を用いて、フォワードプライマーβ−Ｇａｌ−１（配列番号６）5'-ATATGGGCCCATGGATCCCGTCGTTTTAC-3'、及びβ−Ｇａｌ−２（配列番号７）5'-AGTGTGAAGCTTATTATTTTTGACACCAG-3'を用い、菌株Ｍ１６５５由来のＥ．コリのゲノムＤＮＡ由来のβ-gal遺伝子のＰＣＲ増幅によって最初に得られた。ＰＣＲフラグメントは、Nco/HindIIIの二重消化を用い、発現ベクターpSE420(Invitrogen)内にライゲーションされ、そしてコンピテントＤＨ５細胞(Gibco-BRL)を化学的に形質転換するために使用された。ポジティブなクローンは、制限解析によって同定された。
【００６２】
続いて、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、HindIIIによるpSE420-β-Galの消化、続くクレノウ酵素を用いるフラグメントの平滑末端化、続くNcoIによる消化によってpXapベクターの１つ、すなわちpXap1bにクローニングされた。
【００６３】
精製したフラグメントは、すぐに、xapAプロモーターとインフレームとなるように、同様に消化されたpXap1bに導入された。ライゲーション及び形質転換の後、ポジティブなクローンは、ＬＡＸＸプレート（１ｍｇ／ｍｌのキサントシン、８０μｇ／ｍｌのX-galを添加したＬＢ／アンピシリンアガープレート）上に据えたときの青色の発色によって同定された。キサントシンは、β-gal遺伝子の発現を誘導し、これはその後、基質であるX-galの加水分解により青色の生成物を形成する。ポジティブな青色のコロニーは、Milller(1972)のアッセイによってβ-Gal活性についてスクリーニングされ、そして１つのそのようなコロニーがプラスミドpXap1b-β-Galと称された（図４）。
【００６４】
pXap1b-β-Galのリボソーム結合部位領域の突然変異誘発
発現が増大する新規ベクターを開発するために、変異ＰＣＲがプラスミドpXap1b-β-Gal上で実施され、天然のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を変化させ、そして増大した発現について解析された。２つのそのような変異体、ＲＢＳ１及びＲＢＳ２が構築された。ＲＢＳ１は、xapAの天然のＲＢＳ、ＡＧＧＡをより強力なＲＢＳ配列に共通のＡＧＧＡＧＧと交換するために設計された。ＲＢＳ２は、同様に強力なＡＧＧＡＧＡのＲＢＳ配列を、ＲＢＳと開始コドンとの間の追加の塩基と共に導入して、ＲＢＳと開始コドンとの間の間隔の変化がポジティブ又はネガティブに他の発現系において発現レベルに作用し得ることが観察されるように設計された(Marquis et al., 1986; Chen et al., 1994)。
【００６５】
プラスミドpXap1b-β-Galは、以下のプライマー：
pXapRBS1A
5'-CCTACAGAAAAAGGAGGTACCCATGGATCCCGTCG-3'（配列番号１２）と
pXapRBS1B
5'-CGGGATCCATGGGTACCTCCTTTTTCTGTAGGGTGG-3'（配列番号１３）（RBS1突然変異体用）、及び
pXapRBS2A 5'-
CCCTACAGAAAAAGGAGATATCCCATGGATCCCGTCGTTTTACAACG-3'（配列番号１４）とpXapRBS2B
5'-CGACGGGATCCATGGGATATCTCCTTTTTCTGTAGGGTGGAATCTAACG-3'（配列番号１５）（ＲＢＳ２突然変異体用）を用いて、別々の反応において、以下の条件を用いてＰＣＲ増幅された。
【００６６】
反応混合物は、１ｎｇの精製したpXap1b-β-Galが鋳型として使用されたことを除き、実施例１に記載の通りであった。使用した反応条件は：
１サイクル：
９４℃  ５分の最初の変性
７２℃  維持（ポリメラーゼ添加）
１８サイクル
５５℃  １分のアニーリング
７２℃  １５分の伸長
９４℃  １分の変性、
であった
【００６７】
DpnI制限エンドヌクレアーゼ(Fermentas)をすぐに反応混合物に添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。５μｌの反応混合物がコンピテントＤＨ５細胞を化学的に形質転換するために使用され、そして形質転換細胞が上述のようにＬＡＸＸプレート上にプレーティングされた。複数のポジティブなコロニーがスクリーニングされ、そして制限消化によって同定された。
【００６８】
pXap1b-β-Gal及びＲＢＳ変異体の発現活性のスクリーニング
ＤＨ５コンピテント細胞を形質転換するpXap1b-β-Gal及びポジティブなＲＢＳ変異体の培養物を、アンピシリンを添加した合成培地中で３７℃で生育し、そしてそれらのＯＮＰＧアッセイ(Miller, 1972)（表１）で測定されるようなそれらのβ−ガラクトシダーゼ活性を決定するために１ｍｇ／ｍｌのキサントシン（終濃度）で誘導した。
【表１】
2005512597.tif 000003
【００６９】
ＲＢＳとＡＴＧ開始コドンとの間の５個のヌクレオチド（ｎｔ）の間隔が、Ｅ．コリのプロモーターにおける最適な間隔であると考えられている(Chen et al., 1994)。これは、天然のxapAのＲＢＳの場合である。pXap1b-β-GalのＲＢＳの共通配列ＡＧＧＡＧＧへの変化が高レベルの発現をもたらし（ＲＢＳ１）、そして、驚いたことに、共通配列と開始コドンとの間の間隔の増大（ＲＢＳ２）が、発現レベルをより更に増大させた。
【００７０】
プラスミドpXap1b-β-Galと比較した、ＲＢＳ１及びＲＢＳ２プラスミドのＲＢＳ領域
CCACCCTACAGAAAAAGGAtacccATGGATC-pXap1b-β-Gal（５ｎｔの間隔）
CCACCCTACAGAAAAAGGAGGtacccATGGATC-pXap1b-β-Gal-RBS1（５ｎｔの間隔）
CCACCCTACAGAAAAAGGAGAtatcccATGGATC-pXap1b-β-Gal-RBS2（６ｎｔの間隔）
【００７１】
実施例３：異種遺伝子の発現
ヒト成長ホルモンの発現
ヒト成長ホルモン遺伝子（ｈＧＨ）は、プライマーhGH-Nde（配列番号８）5'AAGAATCCCATATGTTCCCAACCATTCCCTTATCC3'及びhGH- Rev（配列番号９）5'CGCGGATCCAAGCTTATTAGAAGCCACAGCTGCCCTCC3'を用いて、プラスミドphgh107（ＡＴＣＣ番号４００１１）からＰＣＲ増幅された。
【００７２】
増幅条件及びパラメーターは、実施例に記載のとおりとした。増幅されたフラグメントは、NdeI/BamHI制限部位を用いてpXap1a内にクローニングされた（図５）。この新規クローンによるヒト成長ホルモンの産生は、Ｅ．コリの菌株ＴＧ１において３０℃で両複合体（ＬＢ）及び合成培地中で試験された(Miller 1992)。
【００７３】
hGHの発現は、培地に対する１ｍｇ／ｍｌのキサントシンの添加によって誘導された。産生されるヒト成長ホルモンの存在及び同定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットによって確認され、そしてBIO-RADのヤギ抗マウスIgG-APを用いて、取扱説明書に従い検出された（図６）。デンシトメトリー解析は、組換えhGHタンパク質が、いずれの培地中でも、わずかに２時間の誘導の後であっても２０％超の全細胞タンパク質を提示したことを示した。
【００７４】
ヒトインターロイキン−４の発現
インターロイキン−４遺伝子（ＩＬ−４）は、プライマーL4-Nde（配列番号１０）5'AAGAATCCCATATGCACAAGTGCGATATCACC 3'及びIL4-Rev（配列番号１１）5'AAGGATCCCAAGCTTAGCTCGAACACTTTGAATATTTC 3'を用いて、hIL-4プラスミド−pPlc299hIL4 (Dr. Nico Mertens, VIB, Belgium)からＰＣＲ増幅された。
【００７５】
増幅条件及びパラメーターは前述の通りとした（xapR遺伝子のＰＣＲ増幅の項）。増幅されたフラグメントは、NdeI/BamHI制限部位を用いてpXap2aにクローニングされた（図５）。インターロイキン−４の存在及び同定は、ＬＢ培地中で、２０℃及び２８℃で評価された。ＩＬ−４の発現は、培養液に対する１ｍｇ／ｍｌのキサントシンの添加によって誘導され、そしてBIO-RADのヤギ抗マウスIgG-APを用いて、取扱い説明書に従い検出された（図７）。デンシトメトリー解析は、組換えＩＬ−４が、両方の温度で３０％超の全細胞タンパク質を構成したことを示した。
【表２】
2005512597.tif 000004
【表３】
2005512597.tif 000005
【表４】
2005512597.tif 000006
【表５】
2005512597.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】原文に記載無し。
【図１ａ】図１ａは、Ｅ．コリのxapAプロモーター領域のヌクレオチド配列を示す。（ＲＢＳ−リボソーム結合部位）
【図１ｂ】図１ｂは、Ｅ．コリのxapAプロモーター領域のヌクレオチド配列と、新規なHindIII及びNdeI制限部位とを示す。
【図１ｃ】図１ｃは、Ｅ．コリのxapAプロモーター領域のヌクレオチド配列と、新規なHindIII及びNcoI制限部位とを示す。
【図２】図２は、Ｅ．コリのxapR遺伝子のヌクレオチド及びアミノ酸配列（大文字）及びxapRプロモーター領域（小文字、イタリック）と新規制限部位BamHI及びKpnIとを示す。
【図３】図３は、ベクターpUC19x、pXap1a及びpXap1bを示す。
【図４】図４は、pXap1b-βgalのマップを示す。
【図５】図５は、Xap1a-hGH及びpXap-IL4のマップを示す。
【図６】図６は、pXap-hGHのタンパク質解析を示す：（Ａ）−ＳＡＳ−ＰＡＧＥ；（Ｂ）−ウェスタンブロット。レーン：１）ｈＧＨタンパク質のスタンダード；２）分子量マーカー；レーン３〜７、ＬＢ培地３）０時間誘導；４）２時間誘導；５）３時間誘導；６）４時間誘導；７）６時間誘導レーン８〜１２、合成培地８）０時間誘導；９）２時間誘導；１０）３時間誘導；１１）４時間誘導；１２）６時間誘導。当該図面のＡ部は、注目のタンパク質が最も明確且つ豊富に存在するものであり（矢印で示す）、そしてこれはレーン１においてタンパク質のスタンダードと共に移動した。Ｂ部において、ウェスタンブロットは、求めるタンパク質（特異的抗体による）が存在することを示す。
【図７】図７は、２０℃及び２８℃でのpXap-IL4画分のタンパク質解析を示す。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；（Ｂ）ウェスタンブロット。レーンＭ：タンパク質マーカー。レーン１〜４：２０℃、０時間、２時間、５時間及び一晩の誘導。レーン５〜７：２８℃、２時間、５時間及び一晩の後の誘導。当該図面のＡ部において、注目のタンパク質は最も明確且つ豊富に存在するものであり（矢印で示す）、そしてこれは、右側のＳｔｄで記したレーンに存在するタンパク質のスタンダードと共に移動した。Ｂ部において、ウェスタンブロットは、求めるタンパク質（特異的抗体による）が存在することを示す。
【図１】
2005512597.tif 000008
【図１ａ】
2005512597.tif 000009
【図１ｂ】
2005512597.tif 000010
【図１ｃ】
2005512597.tif 000011
【図２−１】
2005512597.tif 000012
【図２−２】
2005512597.tif 000013
【図３】
2005512597.tif 000014
【図４】
2005512597.tif 000015
【図５】
2005512597.tif 000016
【図６】
2005512597.tif 000017
2005512597.tif 000018
【図７】
2005512597.tif 000019
2005512597.tif 000020
【配列表】
2005512597000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成16年2月23日(2004.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質をコードする遺伝子と作用可能に連結されうるプロモーターであって、リン酸基を有することもあれば、又は有さないこともあるヌクレオチドの存在下で、任意の作用可能に連結した異種タンパク質の発現を誘導するプロモーター、を含んで成るベクター。
ここで、当該プロモーター配列は、以下の配列：
ＡＧＧＡＧＧｘｘｘｘｘ又は
ＡＧＧＡＧＧｘｘｘｘｘｘ又は
ＡＧＧＡＧＡｘｘｘｘｘ又は
ＡＧＧＡＧＡｘｘｘｘｘｘ
を有するリボソーム結合部位を含んで成るxapAプロモーターである。
【請求項２】
プラスミド又はバクテリオファージである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
誘導的発現ベクターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
プロモーターが、キサントシンの存在下で作用可能に連結した異種タンパク質の発現を誘導する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
プロモーターによって発現を制御する制御因子を更に含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
制御因子が核酸配列である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
制御因子がxapR遺伝子由来である、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
追加のプロモーターが制御因子と作用可能に連結している、請求項６又は７に記載のベクター。
【請求項９】
追加のプロモーターが誘導的又は構成的プロモーターである、請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０】
追加のプロモーターがxapRプロモーター由来である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
異種タンパク質をコードする遺伝子を含んで成る、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
異種タンパク質をコードする遺伝子が、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素又は抗原をコードする、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
キサントシンオペロン由来の制御xapR遺伝子と、xapA遺伝子由来のプロモーターとを含んで成る、単離された核酸を含んで成る発現ベクター。
【請求項１４】
以下の配列：
ＡＧＧＡＧＧｘｘｘｘｘ又は
ＡＧＧＡＧＧｘｘｘｘｘｘ又は
ＡＧＧＡＧＡｘｘｘｘｘ又は
ＡＧＧＡＧＡｘｘｘｘｘｘ
を有するリボソーム結合部位を含んで成る、xapAプロモーター配列。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、１又は複数のベクター又は核酸配列を含んで成る宿主細胞。
【請求項１６】
異種タンパク質の発現方法であって、異種タンパク質の発現を誘導する条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞の培養を含んで成る方法。
【請求項１７】
異種タンパク質の精製を更に含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
異種タンパク質がサイトカイン、ケモカイン、ホルモン、酵素又は抗原である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法によって産生されるタンパク質。
【請求項２０】
異種タンパク質の産生における、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の、１又は複数のベクター又は核酸配列の使用。
【国際調査報告】
2005512597.tif 000021
2005512597.tif 000022
2005512597.tif 000023
2005512597.tif 000024