(57)【要約】  本発明は、生物学的アッセイのための能動的エレクトロニックマトリックスデバイスで用いる改良された合成ポリマーヒドロゲル浸透層を提供する。浸透層は約１００ナノメートルおよび約１０００ナノメートルの間のサイズ範囲のメソポアを持つ規定された多孔性特徴を有し、またマイクロメートルサイズのミクロポアも有することができる。メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、能動的エレクトロニックマトリックス上のナノポーラス合成ヒドロゲル浸透層と比較して、改良されたシグナル強度および直線形特徴を示す。加えて、本発明は、核酸プローブまたは他の生体分子のための共重合化結合部位を含む合成ポリマーヒドロゲル浸透層も提供する。
2005512069.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上の電極に重ねたメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層であって、該浸透層は約１００ｍｍおよび１０００ｍｍ断面の間であるメソポアを含む該浸透層。
【請求項２】
該メソポアが約１００ｍｍおよび約５００ｍｍ断面の間である請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３】
該メソポアが約２００ｍｍおよび約５００ｍｍ断面の間である請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４】
該浸透層が、さらに、約１．０μｍおよび３．０μｍ断面の間であるミクロポアを含む請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５】
該ミクロポアが約１．０μｍおよび約２．０μｍ断面の間である請求項４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６】
該ミクロポアが約１．０μｍおよび約１．５μｍ断面の間である請求項４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項７】
該浸透層が、乾燥した場合に、約０．５μｍおよび約１０μｍの間の厚みである請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項８】
該浸透層が、乾燥した場合に、約１．０μｍおよび約５．０μｍの間の厚みである請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項９】
該浸透層が、乾燥した場合に、約１．０μｍおよび約２．０μｍの間の厚みである請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１０】
該ポリマーが重合されたアクリロイルまたはアクリルアミドモノマーを含む請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１１】
該アクリロイルまたはアクリルアミドモノマーがアクリルアミドである請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１２】
該アクリロイルまたはアクリルアミドモリマーがＮ−置換アクリルアミドである請求項１０記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１３】
該アクリロイルまたはアクリルアミドモノマーがＮ−置換メタクリルアミドである請求項１０記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１４】
該アクリロイルまたはアクリルアミドモノマーがメタクリルアミドである請求項１０記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１５】
該浸透層が電極に共有結合により係留している請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１６】
該電極がケイ素含有導電性材料を含む請求項１５記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１７】
該電極がケイ酸白金、ケイ酸チタン、ケイ酸金およびケイ酸タングステンよりなる群から選択される材料を含む請求項１６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１８】
該浸透層が電極の周りの基材に共有結合している請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項１９】
該浸透層がさらに電極に共有結合により係留している請求項１８記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２０】
該浸透層が特異的結合部位の結合用の共重合化結合部位を含む請求項１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２１】
該特異的結合部位が一般式：
【化１】
2005512069.tif 000014
［式中、Ｐは合成ポリマーおよびもう１つのＰ−Ｘ−Ｒ基のモノマー単位よりなる群から選択される１または２の部位に共有結合した重合性部位であり、ここに、該他のＰ−Ｘ−Ｒ基は第１のＰ−Ｘ−Ｒ基と同一または異なってよく、ここに、点線は、もしＰが２つの部位に共有結合しているならば、第２の部位に対する共有結合である；
Ｘは共有結合または連結部位であり；および
Ｒは生体分子を共有結合または非共有結合させるための機能的部位である］
の構造を介して合成ポリマーヒドロゲルと共重合している請求項２０記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２２】
Ｒが生体分子に結合した請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２３】
該生体分子が核酸である請求項２２記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２４】
該生体分子が蛋白質である請求項２２記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２５】
Ｒがビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびもう１つのビオチン結合部位よりなる群から選択される請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２６】
Ｒがストレプトアビジンである請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２７】
Ｒがアルデヒド、カルボン酸、アシルハライド、スクシンイミジル、マレイミジル、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アミン、エステル、チオエステル、ケタールおよびジスルフィド部位よりなる群から選択される請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２８】
Ｒがヒドラジド部位である請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項２９】
Ｒがスクシンイミジルエステル部位である請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３０】
Ｒがアルデヒド部位である請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３１】
Ｒがプソラレン部位である請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３２】
Ｐがアクリルアミド、アクリレート、メタクリレート、メタクリルアミド、アリル、アミノおよびエポキシ部位よりなる群から選択される請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３３】
Ｐがアクリロイルまたはアクリルアミド部位である請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３４】
Ｘが共有結合である請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３５】
Ｘがポリアルキレングリコールリンカーである請求項２１記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３６】
基材上の電極に重ねたメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層であって、ここに、該浸透層が、標準浸透層組成物Ｓ（アクリルアミド：ビスアクリルアミド１９：１モル／モル、全モノマー含有量２０重量％）と比較した場合、約２．０および約４．０の間のθ値を有する該浸透層。
【請求項３７】
該浸透層が、組成物Ｓと比較した場合、約２．０および約３．８の間のθ値を有する請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３８】
該浸透層が、組成物Ｓと比較した場合、約２．０および約３．０の間のθ値を有する請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項３９】
該浸透層が、組成物Ｓと比較した場合、約３．０および約３．８の間のθ値を有する請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４０】
該浸透層が、乾燥した場合に、約０．５μｍおよび約１０μｍの間の厚みである請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４１】
該浸透層が、乾燥した場合に、約１．０μｍおよび約５．０μｍの間の厚みである請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４２】
該浸透層が、乾燥した場合に、約１．０μｍおよび約２．０μｍの間の厚みである請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４３】
該ポリマーが重合されたアクリロイルまたはアクリルアミドモノマーを含む請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４４】
該アクリロイルまたはアクリルアミドモノマーがアクリルアミドである請求項４３記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４５】
該アクリロイルまたはアクリルアミドモノマーがＮ−置換アクリルアミドである請求項４３記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４６】
該アクリロイルまたはアクリルアミドモノマーがＮ−置換メタクリルアミドである請求項４３記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４７】
該アクリロイルまたは該アクリルアミドモノマーがメタクリルアミドである請求項４３記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４８】
該浸透層が電極に共有結合により係留している請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項４９】
該電極がケイ素含有導電性材料を含む請求項４８記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５０】
該電極がケイ酸白金、ケイ酸チタニウム、ケイ酸銀およびケイ酸タングステンよりなる群から選択される材料を含む請求項４９記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５１】
該浸透層が電極の周りの基材に共有結合により係留している請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５２】
該浸透層がさらに電極に共有結合により係留している請求項５２記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５３】
該浸透層が特異的結合部位の結合用の共重合化結合部位を含む請求項３６記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５４】
該特異的結合部位が一般式：
【化２】
2005512069.tif 000015
［式中、Ｐは合成ポリマーおよびもう１つのＰ−Ｘ−Ｒ基のモノマー単位よりなる群から選択される１または２の部位に共有結合した重合性部位であり、ここに、該他のＰ−Ｘ−Ｒ基は第１のＰ−Ｘ−Ｒ基と同一または異なってよく、ここに、点線は、もしＰが２つの部位に共有結合しているならば、第２の部位に対する共有結合である；
Ｘは共有結合または連結部位であり；および
Ｒは生体分子を共有結合または非共有結合させるための機能的部位である］
の構造を介して合成ポリマーヒドロゲルと共重合した請求項５３記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５５】
Ｒが生体分子に結合している請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５６】
該生体分子が核酸である請求項５５記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５７】
該生体分子が蛋白質である請求項５５記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５８】
Ｒがビオチン、アビジン、ストレプトアビジンおよびもう１つのビオチン結合部位よりなる群から選択される請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項５９】
Ｒがストレプトアビジンである請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６０】
Ｒがアルデヒド、カルボン酸、アシルハライド、スクシンイミジル、マレイミジル、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アミン、エステル、チオエステル、ケタールおよびジスルフィド部位よりなる群から選択される請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６１】
Ｒがヒドラジド部位である請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６２】
Ｒがスクシンイミジルエステルである請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６３】
Ｒがアルデヒド部位である請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６４】
Ｒがプソラレン部位である請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６５】
Ｐがアクリルアミド、アクリレート、メタクリレート、メタクリルアミド、アリル、アミノ、およびエポキシ部位よりなる群から選択される請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６６】
Ｐがアクリロイルまたはアクリルアミド部位である請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６７】
Ｘが共有結合である請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６８】
Ｘがポリアルキレングリコールリンカーである請求項５４記載のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層。
【請求項６９】
ａ）重合性モノマー、架橋剤、およびメソポアを生成できるポロゲンを含む適当な容量の重合混合物をマイクロモールドの金型キャビティーに入れ、ここに、該金型キャビティーは底部および少なくとも１つの側面を含み；
ｂ）当該基材上の複数の電極を含む基材を金型と接触させて、近い容量の重合混合物を形成させ、ここに、該近い容量は基材上の電極の少なくとも１つと接触しており；
ｃ）重合混合物を重合させて、メソ構造合成ポリマーヒドロゲル浸透層を形成させ；次いで
ｄ）該マイクロモールドを取り出す；
ことを特徴とする、基材上の電極に重ねたメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の製法。
【請求項７０】
該ポロゲンが鋳型ポロゲンであり、該製法が、さらに、工程（ｃ）の後に、メソ構造合成ポリマーヒドロゲル浸透層から鋳型ポロゲンを選択的に除去することを含む請求項６９記載の製法。
【請求項７１】
該鋳型ポロゲンがミセル形成性界面活性剤である請求項７０記載の製法。
【請求項７２】
該ミセル形成性界面活性剤がノニオン界面活性剤である請求項７１記載の製法。
【請求項７３】
該ミセル形成性界面活性剤がポリエーテルおよび脂肪族炭素鎖を含む請求項７１記載の製法。
【請求項７４】
該ミセル形成性界面活性剤が１００および１０，０００の間の分子量を持つＢｒｉｊ界面活性剤である請求項７１記載の製法。
【請求項７５】
該ミセル形成性界面活性剤が４５００および５０００の間の分子量を持つＢｒｉｊ界面活性剤である請求項７１記載の製法。
【請求項７６】
鋳型ポロゲンの選択的除去が、浸透層を水性溶媒ですすぐことを含む請求項７１記載の製法。
【請求項７７】
該重合混合物が熱活性化可能重合開始剤を含み、該製法が、さらに、近い容量の重合混合物を加熱して重合を開始させることを含む請求項７０記載の製法。
【請求項７８】
重合混合物が光−活性化可能重合開始剤を含み、該製法が、さらに、近い容量の重合混合物に適当な波長の光を照射して、重合を開始させることを含む請求項７０記載の製法。
【請求項７９】
重合混合物がレドックス−活性化可能重合開始剤を含む請求項７０記載の製法。
【請求項８０】
該マイクロモールドの金型キャビティーの少なくとも一部が適当な波長の光に対して透明である請求項７８記載の製法。
【請求項８１】
近い容量と接触する少なくとも１つの電極の表面が、重合性部位を含むアンカー部位で誘導体化されている請求項６９記載の製法。
【請求項８２】
該重合性部位がアクリロイルまたはアクリルアミド部位である請求項８１記載の製法。
【請求項８３】
基材の表面を近い容量と接触させ、さらに、基材の表面が重合性部位を含むアンカー部位で誘導体化されている請求項６９記載の製法。
【請求項８４】
該重合性部位がアクリロイルまたはアクリルアミド部位である請求項８３記載の製法。
【請求項８５】
該重合混合物が、さらに、特異的結合部位の結合用の重合性結合部位を含む請求項６９記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、生物学的アッセイ用の活性エレクトロニックマトリックスデバイスで用いるための改良された合成ポリマーヒドロゲル浸透層を提供する。該浸透層は規定された多孔性特性を有し、約１００ナノメートルおよび約１０００ナノメートルの間のサイズ範囲のメソポアを持ち、また、マイクロメートルサイズ範囲のミクロポアを有することもできる。該メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層は、活性エレクトロニックマトリックスデバイス上のナノポーラス合成ヒドロゲル浸透層と比較して改良された信号強度および直線性を示す。加えて、本発明は、核酸プローブまたは他の生体分子用の共重合化結合部位を含む合成ポリマーヒドロゲル浸透層も提供する。
【０００２】
背景
以下の記載は、本発明に関連する情報の要約を提供する。それは、本明細書中に供する情報のいずれも現在特許請求する発明に対して先行技術であることを認めるものではなく、また、具体的にまたは黙示的に言及した刊行物が本発明に対して先行技術であることを認めるものでもない。
【０００３】
複数の核酸プローブを表面にのせ、該表面を標的核酸を含む試料に暴露することによって、多くのハイブリダイゼーション反応を同時に試料について行うことができ、これは、いくつかの標的核酸についてハイブリダイゼーションデータを同時に生じさせる（逆ドット−ブロット技術）。同様に、いくつかの試料からの核酸を表面に固定化することによって、いくつかの試料を同時に同一オリゴヌクレオチドプローブでプローブすることができる（ドット−ブロット技術）。元来、ドット−ブロットおよび逆ドット−ブロットハイブリダイゼーションは、核酸−結合膜またはフィルターに粗くブロットされた核酸プローブを用いて行われた。過去２０年において、いくつかのツールが、物理的蒸着のごとき方法（例えば、インクジェット、マイクロスプレイ、ピン蒸着、マイクロチャネル蒸着）によって、または系内重合技術（例えば、光−脱保護方法）によって、種々のタイプの表面（ガラス、ポリマー、窒化ケイ素等）上に高密度に規定された位置に核酸プローブをのせるように設計されてきた。そのような「マイクロチップ」ベースのＤＮＡアレイは、遺伝情報の迅速な解析を促進するその多大な能力のため最近大いに興味が持たれている。非常に先端の技術がこれらのタイプのアレイを生じさせるのに利用されているが、それらは、受動的モードでＤＮＡの固定化された捕獲プローブへの平行ハイブリダイゼーションを依然として使用している。換言すれば、全試料容量に存在する核酸を同一程度に同時に全アレイ表面と相互作用させている。
【０００４】
対照的に、能動的エレクトロニックマトリックスアレイは、マイクロチップ上でのＤＮＡの迅速な輸送およびハイブリダイゼーションを促進するために電場を用いている。一般に、能動的マトリックスアレイデバイスは、基材上の電子的にアドレス可能なミクロ電極のアレイを含み、これは、ＤＮＡ輸送、ハイブリダイゼーションおよび変性を含めた種々の生体分子反応に対して電場制御を与える。電場を核酸のごとき荷電分子を含む溶液に印加するために電極を用いることによって、荷電分子は、分子の電荷と反対に偏った電極まで迅速に輸送し、そこで濃縮することができる。これは、ミクロ位置の結合部位への結合のための非常に効果的かつ特異的な方法にて、核酸プローブまたはアンプリコンをミクロ位置へ輸送することを可能とし（時々、位置を「プログラムする」と言われるプロセス）、ドット−ブロットまたは逆ドット−ブロット様式のアレイの創成を可能とする。プローブまたはアンプリコンをミクロ位置に固定化した後、再度電場を用いて、第二のハイブリダイゼーションアッセイ成分をミクロ位置に向けることができる。かくして、電場調節ハイブリダイゼーションは、同一条件下での受動的ハイブリダイゼーションよりも１ないし３桁速く、受動ハイブリダイゼーションの制限のいくつかを克服する。
【０００５】
能動的プログラム可能エレクトロニックマトリックスデバイス、またはＡＰＥＸデバイスとしても知られているこれらのアレイは、ここに引用して本明細書の一部と見なす、例えば、米国特許第６，０５１，３８０号および第６，２４５，５０８号に記載されている。一般に、該デバイスは基材上の個々に制御可能なミクロ電極のアレイを含み、所望により、反対バイアシング用の追加の電極を含むこともできる。ミクロ電極には薄い浸透層を重ね、これは、ミクロ電極上方のデバイスのミクロ位置を規定する。結合部位に付着させるためのマトリックス（例えば、ストレプトアビジン）を供することによる生体分子の結合の促進に加え、浸透層は、加水分解および他の潜在的に有害な電気化学的反応の起こり得る電極表面から生体分子を分離する。浸透層はミクロ電極に向けての生体分子の移動を遅らせるか、またはそれを禁ずるが、浸透層は、電極表面および緩衝液媒体の間のイオン交換を可能とするように小分子に対して十分に浸透性であり、電流が流れるのを可能とする。能動的エレクトロニックマトリックスチップは、通常、電流および電圧条件を用い、ここに、電流密度は少なくとも０．０４ｎＡ／μｍ２（８０μｍ直径のミクロ位置に対して約２００ｎＡ）でありおよび／または水を加水分解するのに十分なものである。電流密度は、電流を、それを支持するのに用いられる電極の面積で割ったものと定義される。
【０００６】
加えて、能動的エレクトロニックマトリックスチップのごとき電子的に駆動される系内のヌクレオチドオリゴマーのような荷電生体分子の移動の効率は、各々、陽極および陰極による正および負に荷電された電気化学的種の適切な勾配の生成に依存する。例えば、効果的な核酸（すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の輸送は、陽極に置ける電位が「飽和カロメル電極」（ＳＣＥ）に対して＋１．２９Ｖを超える場合に、プロトンおよびヒドロキシルアニオンを生じさせることによって達成することができる。荷電分子の輸送効率は増大する電流に伴い増大し、かくして、より高い電圧降下および電流密度における操作のための希望、かくして、しっかりとした浸透層の必要性を駆り立てる。
【０００７】
浸透層を通じての電流の適用は、電極表面における薄い浸透層コーティングに対してかなりの化学的および機械的応力を生じさせることも見出された。そのような薄い層を電極表面への共有結合ではなくして電極に適用すると、浸透層は電極界面から分離されるかまたは「層脱離」する傾向があることが判明した。この層脱離は、電極における電子ポテンシャルの適用に由来する浸透層および電極の間の界面における化学的様相の変化によって、および電極から生じる荷電イオンおよびガスからの物理的破壊によって引き起こされると考えられる。かくして、浸透層は十分な機械的強度を有するものでなければならず、無秩序な伸長または分解なくして電極表面での変化の厳しさに耐えるためには比較的化学的に不活性でなければならない。
【０００８】
かくして、能動的エレクトロニックマトリックスデバイスの浸透層は、デバイスの総じての機能において重要な要素である。それは、小さな水性イオンに対して十分に透過性でなければならず、生体分子を電極表面から効果的に隔離しなければならない。加えて、その一体性および形状を維持しつつかなりに化学的および機械的力に耐えることができなければならない。これらの品質を与えるいくつかの材料が利用されてきた。グリオキサール架橋ストレプトアビジン（ＳＡ）を含むアガロースは、商業的に入手可能な能動的エレクトロニックマトリックスチップ上の浸透層として用いられ、これらのチップに対するＤＮＡのエレクトロニックハイブリダイゼーションの結果はいくつかの刊行物に報告されている（例えば、Sosnowskiら, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 94:1119-1123 (1997)およびRadtkeyら, Nucl.Acids Resrch.,28(7) e17 (2000.))）。
【０００９】
アガロースは、非共有結合によって架橋した長いポリマーストランドを含む天然に源がある炭水化物ポリマーヒドロゲルである。そのようなヒドロゲルは「物理的ヒドロゲル」といわれる。というのは、それらは、ポリマーストランドの間の共有結合（または架橋）からその構造を誘導する「化学的ヒドロゲル」と比較して、非共有結合相互作用からその構造を誘導するからである。アガロース浸透層は、単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のためのハイブリダイゼーションアッセイおよびアンプリコンおよび捕獲−サンドイッチ様式の短いタンデム反復配列（ＳＴＲ）のような核酸アッセイ、および遺伝子発現解析で用いられてきたプライマー−伸長タイプの核酸アッセイにおいて良好な相対的蛍光強度測定を供する。
【００１０】
しかしながら、浸透層材料としてのアガロースの使用にはいくつかの不利が遭遇する。製造プロセス、およびアガロースは天然起源の産物であるという事実の双方はいくつかの変動を導入し、これはバッチ間の性能を変化させ、より厳しい品質管理を必要とする。これは大規模な製造では理想的ではない。かくして、天然に由来せず、デバイス上の浸透層に容易に形成することができ、かつアガロースの操作標準に適合するか、またはそれを超える代替材料が大いに望ましい。
【００１１】
ポリアクリルアミドおよび他の合成ポリマーゲルは、アガロースヒドロゲル浸透層に対する代替法を供する。これらの材料は全く合成のものであり、かくして、成分の厳しい品質管理を供する。加えて、それらは、全デバイスにわたる高度な均一性でもって、ミクロ電極アレイ表面に容易に成形することができる。乾燥状態で１および２μｍの間の厚みの浸透層はこのようにして容易に製造することができ、高スループット製造が可能である。成形後に、ストレプトアビジンはヒドロゲルの表面に共有結合され、ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブまたはアンプリコンのための結合部位を供する。ミクロ成形プロセスによって作成された伝統的な処方のポリアクリルアミドヒドロゲルは均一であり、良好な製品制御を与えるが、それはほとんどの核酸アッセイでアガロースストレプトアビジン浸透層と同様には働かない。かくして、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスで用いられる高性能合成ポリマーヒドロゲル浸透層に対して依然として要望が存在する。
【００１２】
発明の概要
驚くべきことに、出願人らは、規定された多孔度特性を持つ合成ポリマーヒドロゲル浸透層が能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスに対して高性能特性を供することを見出した。具体的には、ナノメータースケールのナノポアおよびマイクロメートルスケールのマイクロポアの間のサイズのメソポアを持つ合成ポロマーヒドロゲルは、種々の核酸アッセイ様式においてアガロース物理ヒドロゲル浸透層と同様またはそれよりも良好に働く。かくして、第一の態様において、本発明は、能動的エレクトロニックマトリックスデバイスで用いられるメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層を提供する。その最も基本的な様式において、デバイス上での浸透層の組立は、基材上の個々にアドレス可能な電極に重ねられたメソポーラス浸透層を含む。
【００１３】
本発明のこの態様のいくつかの好ましい具体例において、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層は１００および１０００ｎｍの間のポアを含む。より好ましくは、浸透層は、１００および５００ｎｍの間のポアを含み、最も好ましくは浸透層は２００および５００ｎｍの間のポアを含む。ヒドロゲルポアを記載するために本明細書中で用いるごとく、「断面」は、ポアを横切っての最長直線寸法である。（長さが約７０ヌクレオチド（以下、「ｎｔ」）を超える）比較的長い核酸を用いるもの、プライマー伸長−ベースのアッセイ、または固定化核酸を含む他の酵素反応のようないくつかの適用では、浸透層は１．０μｍおよび３．０μｍ断面、より好ましくは１．０μｍおよび２．０μｍ断面の間のミクロポアも含むのが好ましい。浸透層が乾燥状態で３μｍ未満の厚みであるメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の具体例では、下部電極の露出をさけるために、ミクロポアは好ましくは１．０μｍおよび１．５μｍ断面の間である。
【００１４】
本発明のこの態様の他の好ましい具体例において、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層は約２．０および約４．０の間の多孔度測定θを有し、ここに、θは方程式：
【００１５】
【数１】
2005512069.tif 000003
【００１６】
（式中、積分した光強度の読みλは、テストチップ上の乾燥ヒドロゲル層（λ）、中程度の相分離および分離した相なし、または固体を持つ標準相（λλ）、ライカ暗視野複合光学顕微鏡での相（λ０）の暗視野顕微鏡測定を用いて採取し、ここに、標準相はポリアクリルアミドヒドロゲル標準組成（組成Ｓ）
アクリルアミド：ビスアクリルアミド１９：１（モル／モル）
合計モノマー含有量２０重量％；
である）
によって定義される。標準層およびテスト層は同様に調製し、基材上に成形する（または、所望により基材上に置く）。該θ測定では、標準浸透層およびテスト浸透層は共に乾燥状態で約１．７μｍの厚みである。実施例で用いた照射条件下では、標準組成についてのむλｓは６０±１．５であった。より好ましくは、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層は約２．０および約３．８の間のθを有する。長さが約７０ｎｔ以下の比較的短い核酸を用いる適用では、約２．０および約３．０の間のθを持つメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層がより好ましい。長さが約７０ｎｔを超える比較的長い核酸、プライマー伸長−ベースのアッセイ、または固定化された核酸を含む他の酵素反応を用いる適用では、約３．０および約３．８の間のθを持つメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層が好ましい。
【００１７】
本発明の好ましいメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層は、アクリロイルまたはアクリルアミド系合成ポリマーヒドロゲル、より好ましくはアクリルアミド系合成ポリマーヒドロゲル、またより好ましくはメタクリルアミド系合成ポリマーヒドロゲルを含む。また本発明の好ましいメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層は下部の電極およびまたは／基材に共有結合により係留している。加えて、本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層のより好ましい具体例は、特異的結合部位（例えば、核酸、蛋白質など）としての誘導体化された生体分子の共重合体化結合部位を含む。好ましい具体例において、これらの共重合体化結合部位は一般式：
【００１８】
【化１】
2005512069.tif 000004
【００１９】
（式中、Ｐは合成ポリマーおよびもう１つのＰ−Ｘ−Ｒ基のモノマー単位よりなる群から選択される１または２の部位に共有結合した重合性部位であり、ここに、該他のＰ−Ｘ−Ｒ基は第１のＰ−Ｘ−Ｒ基と同一または異なってよく、さらに、もしＰが２つの部位に共有結合しているならば、点線は第２の部位に対する共有結合であり；
Ｘは共有結合または連結部位であり；および
Ｒは生体分子に共有結合または非共有結合するための機能的部位である）
を有する。
【００２０】
より好ましい具体例において、Ｐはアクリロイルまたはアクリルアミド部位、より好ましくはアクリルアミド部位である。また、より好ましい具体例においては、Ｒはビオチン、または、例えば、ストレプトアビジンまたはアビジンのごときビオチン結合部位である。他のより好ましい具体例において、Ｒはアミン、ヒドラジンまたはヒドラジド結合化学で用いる反応性部位である。いくつかの好ましいＲは活性なＮ−ヒドロキシルスミシンイミジルＮＨＳエステル、スルホン化ＮＨＳエステル、アルデヒド、酸、アシルハライド、チオール、ジスルフィド、アミン、エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、ヒドラジンまたはヒドラジドを含む。いくつかのより好ましい具体例においてはＲはスクシンイミジルエステルである。より好ましい具体例のもう１つの群においては、Ｒはアルデヒドである。好ましい具体例のさらにもう１つの群においては、Ｒはヒドラジドである。他の好ましい具体例においては、Ｒはプソラレンである。
【００２１】
共重合化結合部位の使用は、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイス用の合成ポリマーヒドロゲル浸透層に対する核酸または蛋白質のごとき特異的結合体結合用のより大きな密度の結合部位を供するために有利であることが判明したので、いずれかの多孔度の共重合化結合部位を持つ合成ポリマーヒドロゲル浸透層は本発明のもう１つの態様である。これらの浸透層は基材上の少なくとも１つの電極に重ね、それは、前記定義の一般式：
【００２２】
【化２】
2005512069.tif 000005
の共重合化結合部位を含む。
【００２３】
より好ましい具体例においては、Ｐはアクリロイルまたはアクリルアミド部位、より好ましくは、アクリルアミド部位である。また、いくつかの好ましい具体例においては、Ｒは、活性なＮ−ヒドロキシルスクシンイミジル（ＮＥＳ）エステル、スルホン化ＮＨＳエステル、アルデヒド、酸などのごとき、アミン、ヒドラジンまたはヒドラジド結合化学で用いる反応性部位である。他の好ましい具体例においては、Ｒはビオチン−結合対反応に参加することができる部位、すなわち、ビオチン−部位またはビオチン−結合部位である。かくして、本発明におけるこれらの好ましいＲ部位は、ビオチン−部位またはビオチン−結合部位（例えば、ストレプトアビジン）いずれかを含むように誘導体化されている誘導体化生体分子に結合する。多くの生体分子は、ビオチンまたはビオチンアナログで容易に誘導体化することができるので、本発明の好ましい具体例においては、Ｒは、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、またはその化学的または組換えにより作成された誘導体のごときビオチン−結合部位である。当業者に認識されるであろうごとく、該結合分子は、特に、ストレプトアビジンのごとき蛋白質性マルチ−サブユニットＲ部位の場合に、Ｒ部位に結合した１を超えるＰ部位を含むことができる。本発明のいくつかの好ましい具体例においては、該結合分子は、Ｒ上の各ビオチン−結合部位に対して約１つのＰ部位を有する。本発明の他の好ましい具体例においては、該結合分子は、各Ｒにつき約１つのＰ部位を有する。好ましいＸは共有結合、ならびにエステル、アミド、エーテルまたは他の普通の結合化学のごとき普通の結合化学によってＲおよびＰに連結させることができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような通常に利用される親水性リンカー分子を含むことができる。アミド結合のごとき広いｐＨ範囲にわたってより安定な結合化学が好ましい。
【００２４】
本発明の浸透層の態様の好ましい具体例においては、浸透層は共有結合によって電極、基材、または電極および基材に係留させる。これらの具体例においては、共重合性部位を含むシラン系リンカーは、浸透層を共有結合により係留させるのに好ましく利用される。
【００２５】
一般に、本発明の浸透層の好ましい具体例においては、浸透層は乾燥状態で約０．５μｍおよび約１０μｍの間の厚み、より好ましくは乾燥状態で約１．０μｍおよび約５．０μｍの間の厚み、最も好ましくは乾燥状態で約１．０μｍおよび約２．０μｍの間の厚み［あるいは水性緩衝液と平衡である場合、少なくとも約８ないし９μｍの間の厚みである］。また、好ましい具体例においては、浸透層は、乾燥状態で測定して約０．５μｍ未満だけ、より好ましくは０．５μｍ未満だけ、最も好ましくは０．１μｍ未満だけ、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスの電極アレイを横切って厚みが変化する。
【００２６】
もう１つの態様において、本発明は系内重合によって能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイス上のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の製造方法を提供する。これらの方法は、一般に：
重合性モノマー、架橋剤およびポロゲンを含む適当な容量の重合混合物をミクロ金型キャビティーに入れ、ここに、該金型キャビティーは底部および少なくとも１つの側面を含み、
基材上の複数の電極を含む基材を該金型と接触させて、近い容量の重合混合物を形成させ、ここに、該近い容量は基材上の電極の少なくとも１つと接触しており；
該重合混合物を重合し、次いで、
【００２７】
該ミクロ金型を取り出して基材上の少なくとも１つの電極に重なる重合されたメソ構造合成ヒドロゲル浸透層を得ることを含む。好ましい具体例においては、該ポロゲンは、例えば、ミセル形成性ポロゲン、固体鋳型ポロゲンまたは液体鋳型ポロゲンのごとき鋳型ポロゲンである。より好ましくは、該鋳型ポロゲンはミセル形成性界面活性剤、最も好ましくはＢｒｉｊ界面活性剤のごとき脂肪族炭素鎖およびポリエーテルを含むノニオンまたは双イオン界面活性剤である。鋳型ポロゲンを利用する具体例においては、本発明の方法は、好ましくは溶媒で鋳型ポロゲンを選択的に除去するさらなる工程を含む。より好ましい具体例においては、鋳型形成性ポロゲンはミセル形成性界面活性剤であり、該方法は、さらに水で界面活性剤を選択的に除去することを含む。
【００２８】
メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層を製造する方法の好ましい具体例においては、重合混合物はアクリロイルまたはアクリルアミドモノマー、より好ましくはメタクリルアミドのごときアクリルアミドモノマーを含む。加えて、好ましい具体例においては、重合混合物は重合性架橋剤（例えば、モノマーがアクリルアミドである場合には、メチレンビスアクリルアミド）を含む。好ましい具体例においては、重合混合物は重合フリーラジカル開始剤を含む。より好ましい具体例においては、フリーラジカル開始剤は光開始剤であり、該ミクロ金型底部は光開始剤を活性化する波長の放射線に対して透明であり、該重合工程は、光開始剤を活性化するのに適した波長の放射線を金型に照射することを含む。
【００２９】
本発明の他の態様においては、本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスは誘導体化生体分子を電子的にアドレスして、該デバイスの１以上のミクロ位置に特異的結合体が結合したアドレスされたメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層を得る。いくつかの好ましい具体例においては、生体分子は核酸、例えば、核酸プロールまたは試料の核酸である。他の好ましい具体例においては、生体分子は（抗体のごとき）ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白質である。
【００３０】
本発明の他の態様においては、本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスは、核酸ベースのアッセイまたは反応で用いられる。アッセイおよび反応のフォーマットの例は、限定されるものではないが、エレクトロニックストリンジェンシーおよび／またはエレクトロニック洗浄を伴いまたは伴わないハイブリダイゼーションアッセイフォーマット（例えば、ドットブロットアッセイフォーマット、逆ドット−ブロットアッセイフォーマット、核酸サンドイッチアッセイフォーマット、塩基−スタッキング安定化ハイブリダイゼーションアッセイフォーマット）、プライマー延長レポーティングアッセイ（例えば、プライマー延長レポーティングアッセイを伴う遺伝子発現解析）、固定化核酸増幅反応（例えば、ストランド置換増幅、連結−依存性ストランド置換増幅、ポリメラーゼ鎖反応増幅、転写媒介増幅または核酸配列ベースの増幅、ローリングサークル増幅）、連結反応、および核酸切断反応（例えば、制限エンドヌクレーゼ反応、エンドヌクレーゼ反応、およびエキソヌクレアーゼ反応）を含む。加えて、本発明のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透デバイスは、ＡＡＰＥＸデバイスで記載されているごとく、核酸またはポリペプチド合成の応用で用いることができる。
【００３１】
本発明のさらなる態様において、本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスは免疫化学ベースのアッセイで用いられる。例示的なアッセイフォーマットは、限定されるものではないが、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、または他のフォーマットによる体液試料中の抗体につきアッセイするための抗原（例えば、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、プロテオグリカン、糖タンパク質等）でのデバイスのマイクロロケーションのアドレシング；およびサンドイッチアッセイ、競合アッセイ、または他のアッセイフォーマットによる試料中の抗原を検出するための、抗体でのデバイスのマイクロロケーションのアドレシングを含む。
【００３２】
発明の詳細な記載
既に記載したごとく、能動的エレクトロニックマトリックスデバイスの機能における鍵となる役割は、これらのデバイスのマイクロロケーションまたは活性部位の電極に重ねられるイオン−透過性の浸透層によって演じられる。その機能の一部としては、浸透層は核酸（または、抗体のごとき他の特異的結合体、またはピラノシル−ＲＮＡのごとき合成結合部位）の結合および固定化用の結合部位を供する。より重要なことには、浸透層は、電極表面で直ちに生じる高度に反応性の電気化学的環境から結合されたまたは連結されたオリゴヌクレオチドおよびハイブリダイズされた標的ＤＮＡを分離することである。この高度に活性な電極表面、および電極表面において濃縮された電気化学的産物は、表面に接触する、またはそれ余りにも近づくＤＮＡプローブおよび標的ＤＮＡ配列を迅速に破壊しかねない。同様な有害な効果は、電極表面に直接に固定化された他のマクロ分子結合体でも遭遇し得る。浸透層は、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ断片が、反応性電極表面およびその直後の環境から保護されつつ、電極表面上よりはむしろ上方に電子的に濃縮され、係留された相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能とする。浸透層は、電気化学的反応生成物（Ｈ＋、ＯＨ−、ガス等）がマイクロロケーションの周りの溶液に徐々に拡散することを可能とし、これらの産物が、イオン交換によって浸透層を通って電荷をバランスさせ、緩衝液種と反応することを可能とする。かくして、マイクロロケーション構造を形成するミクロ電極および浸透層の設計は、電極それ自体によって生じる悪影響を最小化しつつ、高電流密度が非常に限定された領域で達成されるのを可能とする。
【００３３】
一旦核酸のごとき特異的結合体がマイクロロケーションにアドレスされ、固定化されたならば、アドレスされたデバイスは種々のアッセイおよび反応を制御し、能動的にそれを実行することができる。分析物または反応体は自由場電気泳動によっていずれかの特定のマイクロロケーションまで輸送され、そこで、該分析物または反応体は効果的に濃縮され、該マイクロロケーションにおいて特異的結合体と反応する。希薄な試料溶液中の特異的分析物または反応体を検出するための感度は、この濃縮効果により改良される。デバイスで行われるアッセイの特異性も改良したさらなる利点は、いずれかの未結合分析物または反応体が（「エレクトロニック洗浄」としても知られている）マイクロロケーションの極性を逆転させることによって除去することができる。
【００３４】
個々のマイクロロケーションにおける正確に制御された高い電流レベルまたは密度を生じさせる能力はＤＮＡ断片の選択的「脱−ハイブリダイゼーション」さえ可能とし、単一塩基ミスマッチのレベルにおけるハイブリダイゼーション選択性を達成する。かくして、該デバイスが、「エレクトロニックストリンジェンシー」「エレクトロニックストリンジェンシー制御（ＥＳＣ）」として知られた、（温度および化学的環境のより伝統的なパラメーターと共に）ミスマッチ脱−ハイブリダイゼーションを助長するためのもう１つのパラメーターを供することによって、アッセイおよび反応の特異性をさらに改良することができる。異なるストリンジェンシー条件を必要とするＤＮＡハイブリダイゼーション反応では、ＥＳＣは、全アレイにわたる全ての部位に合致するストリンジェンシー条件に頼らなければならない慣用的なアレイ技術の固有の制限を克服する。本発明の能動的デバイスは各マイクロロケーションにおいて異なるストリンジェンシー条件を電子的に作り出すことができる。これは、温度、塩濃度およびカオトロピック剤の存在のごときより伝統的な因子と共にハイブリダイゼーションに影響するもう１つの制御可能な因子を付け加える。かくして、全てのハイブリダイゼーションは、同一バルク溶液中で最適に行うことができ、複数のハイブリダイゼーション反応を最小の外部物理的操作で行うことができる。加えて、いくつかの場合において温度を変化させる必要がなく、複数の洗浄手法の必要性は大いに低下する。
【００３５】
かくして、能動的エレクトロニックマトリックスデバイスの浸透層は、特異的結合体用の結合部位を保持するための機械的支持体よりも単純である。また、それは、その能動的エレクトロニックモードのデバイスの全性能および効率において重要な因子である。結合足場としてヒドロゲルマトリックスを単に用いる米国特許第５，７７０，７２１号に記載されたゲル−ブロックアレイのごとき受動的アレイデバイスについて記載されているコーティングまたはゲル支持体とは異なり、本明細書中に記載した能動的エレクトロニックマトリックスデバイスで用いる浸透層は、生体分子のデバイスのマイクロロケーションへの効果的な能動的エレクトロニック輸送を可能とし、エレクトロニックハイブリダイゼーションおよび／またはストリンジェンシー手法に導く。
【００３６】
前記したごとく、グリオキサール−架橋ストレプトアビジンを含有するアガロースヒドロゲルは、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスで効果的な浸透層材料であることが判明した。一般に、これらの浸透層の処方は最小バックグラウンドで良好な平均蛍光指標を提供した。ＳＡ−アガロースチップ上で行うＳＮＰアッセイは、ホモ接合性およびヘテロ接合性試料双方における対立遺伝子を区別する高い区別比と共に、現実のゲノミック試料で行われたいくつかのテストでほぼ１００％の精度を示した。加えて、非常に良好な結果が、ＳＴＲおよび遺伝子発現分析アッセイにおいてＳＡ−アガロース能動的エレクトロニックマトッリクスチップを用いて得られている。
【００３７】
しかしながら、前記したごとく、浸透層としてのＳＡ−アガロースの使用は製造の点でいくつかの不利を有する。アガロースは物理的ヒドロゲルであり、それは、その半固体構造を長い多糖鎖の間の非共有結合性相互作用に由来する。これらの相互反応は温度依存性であるので、温度の変化はアガロース溶液の粘度を変化させ；より高い温度においては、溶液はより液体状であり、他方、それは室温に置いては固化したゲルを形成する。かくして、アガロース浸透層を能動的エレクトロニックマトリックスチップ電極アレイにコーティングするためにはアガロース溶液は製造プロセスの間、比較的高くかつ一定の温度に維持しなければならない。また、これは、もし温度が余りにも高いと変性しかねない、溶液中のアガロースに架橋したストレプトアビジンの活性を維持することとバランスしなければならない。現在の製造方法は、アガロース溶液を能動的エレクトロニックストレプトアビジンチップ表面にスピンコートすることである。かくして、アガロース浸透層の製造方法は、デバイスの製造において拡大した源をかなり付け加える。
【００３８】
これはかなり均一な厚みを生じるが、チップ上の異なる部位のマイクロロケーションに重ねた浸透層の厚みと比較して、厚みのサブ−ミクロン変動にしばしば遭遇する。加えて、アガロースは天然の産物であるので、バッチ間の変動が、浸透層としてのその化学的特徴およびその性能に関して観察され得る。材料および製造方法双方におけるこの変動は、品質制御標準に適合するであろう能動的エレクトロニックマトリックスチップの数を減少させ、また、アガロース−ベースの浸透層を持つ高品質能動的エレクトロニックマトリックスチップを製造するのに必要な源を増加させる。
【００３９】
アガロースのごとき天然源の物理的ヒドロゲルとは対照的に、合成ポリマー化学ヒドロゲルはより容易に制御される品質および生産の特徴を提供する。合成ポリマーヒドロゲルは個々のモノマー成分から製造され、これは、通常、基本的有機化学成分からそれ自体合成される。該モノマーは、生産バッチ間の物理的および化学的特徴は同一であるような非常に高品質となるまで精製することができる。モノマー成分は架橋部位と種々の方式で混合し、（例えば、光開始剤の紫外線への暴露によって）トリガーされた開始剤によって重合することができる。かくして、化学ヒドロゲルは、プレ−重合鎖によって形成された物理的ヒドロゲルによって供される制御と比較して、重合の速度および得られたヒドロゲルの特徴に対して厳格な制御を供する。
【００４０】
加えて、合成ポリマーヒドロゲルは大量生産に対して多くの利点を供する。それらは、全デバイスにわたって高度の均一性を持ってミクロ電極アレイ表面に容易に成形される。能動的エレクトロニックストレプトアビジンチップの表面に薄く均一な合成ポリマーヒドロゲルの層を形成するためのミクロ反応金型およびそれらを用いる方法は、ここに引用して本明細書の一部とみなすＨＡＶＥＮＳらのＷＯ  ０１／４３９３８に記載されている。開示されたミクロ反応金型は、少なくとも片側が電磁波波長に対して透明である金型キャビティーを含む。これらの系において、非常に小さな容量の重合混合物（モノマー、架橋剤および光活性化剤）を金型キャビティーに仕込む。次いで、ミクロ電極アレイ基材を金型に対してプレスし、基材上に密閉容量の重合混合物を形成する。該重合反応は、光開始剤用の光の適当な波長（例えば、紫外線）を該密閉容量に照射することによって開始され、重合反応を完了するまで進行させる。金型を取り出すと、薄く均一な合成ポリマーヒドロゲル浸透層がミクロ電極アレイ上に形成されている。
【００４１】
厚みのサブミクロン変動を伴い、１および２μｍの間の厚みである浸透層はこのようにして容易に製造することができ、高スループット製造が可能である。多層浸透層（先の層に重ねたものまたはその上にグラフト重合させたもの）は、深さおよび／または幅が異なる一連の金型を用いることによって同様に作成される。加えて、金型は、各個々のミクロ電極上方に個々の浸透層を形成するように設計することができ、個々に形成されたマイクロロケーションを生じる。このようにして、能動的エレクトロニックマトリックスチップのアレイ上で、浸透層の組成をマイクロロケーション間で変化させることさえ可能である。
【００４２】
合成ポリマーヒドロゲル浸透層を用いる利点を仮定し、種々の合成ポリマーヒドロゲル処方を浸透層材料として用いるためにテストした。最初に、表面をＳＡで誘導体化したポリアクリルアミドゲルをテストした。しかしながら、用いた標準ナノポーラスポリアクリルアミド処方は、アガロース−ＳＡ物理的ヒドロゲル浸透層を用いて得られたものに匹敵する蛍光強度、信号直線性、および他の性能特徴を供する浸透層を生じなかった。かくして、ポリアクリルアミド化学的ヒドロゲルマトリックスの物理的特徴を改変する別の処方を開発した。
【００４３】
驚くべきことに、規定された多孔度特徴を持つポリアクリルアミド合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、規定された範囲未満のポアサイズを持つ合成ポリマーヒドロゲル浸透層と比較して、テストした核酸アッセイフォーマットの全てにおいて劇的に良好な性能であることが判明した。これらの浸透層は約１００および約１０００ｍｍ断面間の中央サイズ範囲のポアを有する。かくして、これらの合成ポリマーヒドロゲル浸透層はナノメートル規模のポア（「ナノポーラス」）またはマイクロメートル規模のポア（「ミクロポーラス」）とは異なり「メソポーラス」と命名されている。また、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層は、図２に示すごとくナノポーラス浸透層とは巨視的差を示す。透明なゲルの代わりに、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層は、ゲルおよび溶液相の分離によって引き起こされた層を通じての光の散乱により、乳濁しているかまたは半透明に見える。図９の暗視野顕微鏡写真にも示したこの光散乱効果は、後に議論し、実施例３に記載された多孔度測定θ用の基礎を形成する。
【００４４】
合成ポリマーヒドロゲル処方における増大した多孔度の特徴を、種々の程度の多孔度または相分離を合成ポリマーヒドロゲルに導入するための鋳型ポロゲンを用いてさらに特徴付けした。ヒドロゲルは水性溶液中のポリマーストランドの網目を含むので、それは二相系：網目、または固相、および周囲の溶液相と考えることができる。網目を分離してポア（または網目がない領域）を作り出すと、相はより分離し、より大きくてより区別されるポア／ボイド領域を生じる。ミセル−形成性界面活性剤Ｂｒｉｊ７００を用いることによって、相分離の程度は、重合溶液中の界面活性剤の濃度を変化させることによって制御することができ、かくして、ミセルの有利性および平均サイズを変化させる。
【００４５】
実施例１に記載したごとく、種々の程度の相分離を伴う４つの浸透層処方を用いて、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスを作成し、これは、実験の大部分：０ｍｇ／ｍｍＢｒｉｊ７００の４０１２−１［ポロゲンなし――共重合化ストレプトアビジン結合部位を持つ基本的アクリルアミド／ビスアクリルアミド化学的ヒドロゲル］；１１ｍｇ／ｍｌ  Ｂｒｉｊの４０１２−２；１８ｍｇ／ｍｌ  Ｂｒｉｊ７００の４０１２−３；および７３ｍｇ／ｍｌ  Ｂｒｉｊ７００の４００６−１の主題であった。４０１２−２，４０１２−３および４００６−１は、全て、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層であると考えられる。実施例２に記載したごとく調製した浸透層の電子顕微鏡写真（図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、６Ｂ、７Ａおよび８Ｂ）を撮影した。浸透層の４５，０００および５０，０００倍スキャンから明瞭にわかるように、４０１２−１は比較的平滑であるように見え、ナノメートル範囲のポアを持つ。対照的に、他の３つの処方はこの倍率においてはかなり一致した微細な形態を有し、これは、約１００および５００ｍｍ断面の間のメソポアを示す。加えて、５，０００倍スキャンにおいては、４０１２−３および４００６−１もまたミクロポーラス形態を呈し、約１μｍおよび約２μｍ断面の間のポアを持つ。
【００４６】
浸透層処方の多孔度特徴をより容易に定量するために、暗視野顕微鏡測定下の光散乱分析に基づき実施例３に記載したごとく、測定θを工夫した。標準層はポリアクリルアミドヒドロゲル標準組成（組成Ｓ）である。アクリルアミド：ビスアクリルアミド１９：１（モル／モル）
合計モノマー含有量２０重量％
【００４７】
実施例で用いた照射条件下では、標準組成についてのλｓは６０±１．５であった。
標準組成Ｓと比較することによって、合成ポリマーヒドロゲル浸透層の相分離および、かくして多孔度を定量することができる。４０１２−１のθは１．５であり、他方、メソポーラス浸透層のθは３．０および３．５の間であった。多孔度測定θでの異なる濃度のＢｒｉｊ界面活性剤の効果をより粗く特徴づけるために、実施例７に記載するごとく、Ｂｒｉｊ  ７００界面活性剤の濃度を７．９ないし１７０．４ｍｇ／ｍｌで変化させ、４０１２−１処方に基づいて８つの浸透層を４０１２−１処方と比較した。これらの合成ポリマーヒドロゲル浸透層についてのθ値を図１４に示す。図面で分かるごとく、浸透層の多孔度はθが２である９．３ｍｇ／ｍｌ処方（わずかに４０１２−２未満）、およびθが約３である１８．６ｍｇ／ｍｌ処方（わずかに４０１２−３を超える）の間を迅速に変化する。これは、１０ｍｇ／ｍｌ程度におけるＢｒｉｊ界面活性剤鋳型ポロゲンの使用に対する臨界的な相分離を示唆する：この濃度を超えると、θ値は３．０および３．５の範囲である。出願人らはいずれかの特定の理論に拘束されないが、１つの可能性がＢｒｉｊミセルがより高い濃度においては凝集していることである。これは、４０１２−３電子顕微鏡写真におけるミクロポアの外観を説明し得る。興味深いことには、図３に記載したごとく、共重合での異なるストレプトアビジン部位の使用は増大した多孔度を生じる。図１０で分かるごとく、エステル−ＰＥＧ連結アクリロイルＳＡに代えてのアミノ−連結アクリルアミドＳＡでの置換を除き、４００６−１と同一の処方を持つ浸透層のバッチ（近くについては図３参照）は、θの平均が約３．６であるメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層を生じさせた。かくして、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の多孔度は、ポロゲンの存在、用いた共重合体化結合部位のタイプ、および架橋剤の比率および合計モノマー濃度のようなより慣用的なパラメーターを含めた因子の組合せによって影響され得る。
【００４８】
エレクトロニックアドレシングおよびハイブリダイゼーション技術を用いるいくつかの核酸アッセイにおいて、これらの浸透層は機能において区別される差を示した。実施例５に記載し、図１２に示されたごとく、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層におけるビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって、固定化すべき比較的大きなポリヌクレオチド１１４−量体）の能力は、ナノポーラス浸透層処方（４０１２−１）と比較して、増加した。逆に、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって固定化すべき比較的小さな４６−量体）オリゴヌクレオチドの能力は、ナノポーラス浸透層処方では十分に高く、メソポーラス浸透層では現実にはわずかに減少した。本発明は、いずれかの特定の理論に拘束されないが、これらの結果は、おそらく、エレクトロニックアドレシング条件下では、増大した多孔度の層を通っての、移動の増大した速度は、ストレプトアビジン結合部位とビオチン化４６−量体が相互作用する機会を低下させたことを示唆する。この仮定は、固定化の差が観察されない自動的条件下で、４つの浸透層を４６−量体と共にインキュベートする実験によって強化された。同様の結果が、実施例７に記載し、図１５および１６に示された広い範囲のポロゲン濃度処方で証明された。
【００４９】
別の実験の組において、４つの浸透層を実施例６に記載したプライマー−延長レポーティングアッセイフォーマットで用いた。これらの実験は、中程度のサイズのオリゴヌクレオチド（約８０ｎｔ長、遺伝子発現アッセイで用いたものの典型的なサイズ）を用いる酵素プライマー伸長レポーティングによって直線的に増大したハイブリダイゼーションおよび検出を呈するメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の能力を示す。図１３に示すごとく、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層での蛍光強度は、広い濃度範囲に渡って、２倍増加オリゴヌクレオチド濃度ごとにほぼ２倍となる。他方、ナノポーラス４０１２−１浸透層では迅速に平坦となる。これらの結果は、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層処方が、遺伝子発現モニタリングおよびウイルス負荷または病原体の濃度測定のごとく、定量分析が用いられる適用で改良された性能を供する。
【００５０】
能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスでの４００６−１処方浸透層の性能を、実施例４に記載したＳＮＤ−タイプ塩基−スタッキングレポーティングアッセイ（ＳＮＰ１）における標準アガロースＳＡチップ（ＭＳＡ）と比較した。図１１中のデータから分かるように、平均蛍光強度は４００６−１浸透層では非常に強く、これは、ＳＡ−アガロースチップでのＭＦＩ読みに匹敵する。加えて、全ての配列遺伝子プローブは、強い信号を示し、ホモ接合性およびヘテロ接合性試料の間の明瞭な区別を可能とする。７つの他のＳＮＰを用いてこの浸透層の性能をさらにテストした。実施例４のチャートによって示されるごとく、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の処方４００６−１は、対立遺伝子プローブについての信号間の優れた区別比を供し、増幅した試料を用いてテストした全てのＳＮＰを正確に同定した。
【００５１】
これらの実験は能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスを利用する典型的なタイプの核酸アッセイに基づくものであったので、それらは、同様な核酸ハイブリダイゼーション−ベースのアッセイおよび酵素反応またはＤＮＡ−蛋白質相互作用ベースのアッセイにおいて本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスの使用のための直接的な意味を有する。実験データによって示されるごとく、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層は、驚くべきことに、ナノポーラス標準合成ポリマーヒドロゲル処方と比較して、改良された検出性能および動的範囲を提供し、これは、それらを、広い範囲の電子的に援助された核酸アッセイフォーマットに適したものとする。ピラノシル−ＲＮＡコーディングのごとき合成結合系適用は同様なサイズの核酸−様オリゴマーを用いるので、異なる二次構造を作り出したとしても、実験の結果は、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層が、合成結合系を用いる適用において改良されたデバイス性能を供することも示す。加えて、核酸アッセイ、特に酵素反応アッセイにおける新しいメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスの性能は、それらは、イミュノアッセイのごとき蛋白質−ベースの適用において改良された性能を呈することも示す。
【００５２】
合成ポリマーヒドロゲル浸透層における多孔度の精度
前記したごとく、本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスの改良された特徴は、デバイスでの合成ポリマーヒドロゲル浸透層におけるメソポアの存在に依存する。かくして、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の製造において鍵となる工程は、モノマーおよび架橋剤をポリマーネットワークに重合する場合、ヒドロゲルマトリックスを重合するにおける多孔度の制御である。現実的には、種々の多孔度は２つの方法：ａ）ポリマーマトリックスの間の空間が所望のサイズのポアを生じるのに十分は距離である比較的物理的に均質なヒドロゲルマトリックス構造の作成、およびｂ）密な領域およびボイド領域にクラスター化するポリマーストランドの開発を刺激することによって、通常、適当なサイズの除去可能な鋳型構造の周りにマトリックスを形成することによって、比較的物理的に異質な合成ポリマーヒドロゲルマトリックス構造の作成で達成することができる。いずれの戦略も単独、または本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスを生じさせる他の戦略と組み合わせて利用することができる。
【００５３】
物理的に均質な方法：重合の制御
合成ポリマーヒドロゲルは多かれ少なかれ性質が多孔性であり、主として、架橋したポリマーストランドのランダムなネットワークおよびストランド間の空間を満たす水性溶液よりなる。この水和したネットワークは半固体構造を作り出し、これは、ポリマー混合物中のモノマー（例えば、個々のモノマー部位またはブロックコポリマーの単位）およびいずれかの架橋剤分子の合計濃度、重合混合物中の架橋剤（しばしば、２以上の重合性基を持つ分子）の相対的パーセンテージ、および（開始剤分子のタイプ、濃度および活性化、重合反応の温度、および他の公知のパラメーターによって影響され得る）重合速度を含めた重合の条件によって主として決定される多孔度特徴を有する。
【００５４】
本発明のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層で利用する合成ポリマーヒドロゲルのタイプは、アクリルアミド−化学ヒドロゲルに限定されないが、アクリルアミド／ビスアクリルアミド系を実施例における例示的合性ポリマーヒドロゲル系として利用する。一般に、いずれの十分に親水性かつ重合性の分子も、浸透層として用いられる合成ポリマーヒドロゲルの製造で利用することができる。モノマーにおける重合性部位は、限定されるものではないが、置換されたまたは置換されていないα，β不飽和カルボニル（ここに、二重結合は、酸素に結合した二重結合およびもう１つの酸素、窒素、硫黄、ハロゲンまたは炭素に結合した単結合である炭素に直接的に結合する）；ビニル（ここに、二重結合は酸素、窒素、ハロゲン、リンまたは硫黄に結合している）；アリル（ここに、二重結合は酸素、窒素、ハロゲン、リンまたは硫黄に結合している炭素に一重結合している）；ホモアリル（ここに、二重結合は、酸素、窒素、ハロゲン、リンまたは硫黄に一重結合したもう１つの炭素に一重結合した炭素に一重結合している）；アルキニル部位（ここに、２つの炭素原子の間に三重結合が存在する）を含めたアルケニル部位を含むことができる。
【００５５】
アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド等のごときアクリロイルまたはアクリルアミドモノマーは、これらのポリマーを用いるヒドロゲルの形成に関して蓄積された膨大な知識のため有利である。より好ましいアクリルアミドモノマーはアクリルアミド、Ｎ−置換アクリルアミド、Ｎ−置換メタクリルアミド、およびメタクリルアミドを含む。しかしながら、エポキシド系ポリマー、ビニル系ポリマー、アリル系ポリマー、ホモアリル系ポリマー、環状無水物系ポリマー、エステル系ポリマー、エーテル系ポリマー、アルキレングリコール系ポリマー（例えば、ポリプロピレングリコール）のような他のポリマーも有用である。かくして、本発明のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、ポリマー分野の当業者によって容易に工夫することができる多数の合成ポリマーヒドロゲル組成を含む。合成ポリマーヒドロゲルを選択するにおける主な考慮は、浸透層として用いる十分な機械的強度、ゲル中での十分な溶液容量を確保するための十分な親水性、ポリマーヒドロゲルへの核酸のごとき生体分子の非常に低い非特異的結合、およびヒドロゲルマトリックスにおけるメソポーラス構造の生産用の種々の方法に対する合成ポリマーヒドロゲルの適合性である。
【００５６】
重合混合物の調製において、限定されるものではないが、レドックス反応捕獲物質（例えば、Ｈ２用のパラジウム、Ｏ２および過酸化物用の鉄錯体）を含めた、電気分解反応の有害な物理的および化学的効果を減ずることができる物質を浸透層に含めることが可能である。浸透層のサブ層をこの目的で設計することができる。加えて、浸透層は、ＤＮＡハイブリッドの安定性を維持するのを助ける化合物または材料を含有することができ；これらは、限定されるものではないが、ヒスチジン、ヒスチジンペプチド、ポリヒスチジン、リシン、リシンペプチド、および他のカチオン性化合物または物質を含むことができる。
【００５７】
ポリアクリルアミドベースのヒドロゲルでは、モノマー濃度、架橋剤のパーセンテージ、重合条件および多孔度の因子の間の関係は、ゲルマトリックスを通じての電気泳動分離用のゲル処方の意味で研究されており、当業者であれば、これらのパラメーターを用いてポリアクリルアミドヒドロゲルの相対的多孔度を操作する能力を認識するであろう。一般に、重合混合物中の合計モノマー濃度の濃度を低下させると、得られるヒドロゲルの多孔度は増加する。しかしながら、濃度を低下させると、十分な機械的粘着性を欠くより固体状でないポリアクリルアミドヒドロゲルが生じ、この方法を通じて得ることができる最大ポアサイズは約１００ｎｍであるようである。別法として、架橋剤のパーセンテージを増加させて、得られるゲルの多孔度を増加させることができる。しかしながら、架橋剤濃度を増加させると親水性の低いポリマーネットワークを生じ、これは、結局は崩壊し、より高い架橋剤濃度（例えば、メチレンビスアクリルアミドでは３０％、およびＤＨＥＢＡでは約５０％）において水性溶液を排除する。これらの最大実施可能濃度においてさえ、ポアサイズは約２００ないし３００ｎｍまで増加させることができるにすぎない。加えて、高度に架橋したポリアクリルアミドゲルはますます脆性となり、これは、浸透層として用いられるこれらの合成ポリマーヒドロゲル処方の機械的頑強性を増加させる。異なる溶媒系の使用は、合成ポリマーヒドロゲルの多孔度特徴を改変することが証明されている。例えば、ＤＭＳＯのごとき極性の低い共溶媒の導入を用いて、ポリアクリルアミドマトリックス中に架橋したポリマー鎖のより多孔性のネットワークを形成させることができる。
【００５８】
加えて、出願人らは、（後にさらに詳細に記載する）異なる共重合性結合部位の使用は、得られた合成ポリマーヒドロゲルの全多孔度に対して有意なインパクトを有し得ることを見出した。例えば、実施例３において、ＳＡ−ＰＥＧ−アクリロイル分子ｋａｒａＳＡ−Ｎ−アクリルアミド分子にスイッチすると、４００６−１処方の多孔度が約３．０から約３．６のθに増加する。かくして、重合混合物における共重合化結合部位の変化を利用して、得られた合成ポリマーヒドロゲルの多孔度を増加させることもできる。
【００５９】
かくして、重合混合物の基本的な処方に関連するいくつかの技術が、ポリアクリルアミドヒドロゲルの多孔度を増大させるために開発されている。しかしながら、これらの技術の組合せでさえ，メソポアサイズ範囲の下端にあるポリアクリルアミドヒドロゲルのポアを生じさせるのに十分なものであるにすぎない。加えて、高架橋剤濃度を持つ低濃度のポリアクリルアミドヒドロゲルは、機械的に弱く、かつ脆い傾向があり、望ましくない疎水性特性を有し得る。これらの材料は、依然として、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層組成物として用いることができる。しかしながら、浸透層としての使用では、後に記載する方法によって形成することができる物理的に不均一なポリアクリルアミドヒドロゲルを用いるのが好ましい。
【００６０】
しかしながら、これらの機械的制限は主にポリアクリルアミドヒドロゲルに適用されることは当業者に認識されるであろう。モノマー濃度を減少させ、かつ架橋剤濃度を増加させることによって多孔度を増大させる一般的な原理を利用して、有害な機械的強度効果が少ない他のポリマーヒドロゲルの多孔度特徴を改変することもできる。かくして、もしより大きな固有の機械的強度を持つ非−アクリルアミドポリマーを利用すれば、所望の機械的強度を有するであろう物理的に均一なメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層組成物を工夫することができる。
【００６１】
物理的に不均一な方法：テンプレーティングおよび他の戦略
アクリルアミド系合成ポリマーヒドロゲルでの物理的に均一な方法を用いて機械的に強いメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層処方を得るにおける困難性のため、物理的に不均一な構造の戦略はこのポリマー材料で利用するのが好ましい。加えて、ポアのサイズおよび分布に対するさらなる制御のため、これらの戦略は、本発明で用いるメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層を生じさせるのに一般に好ましい。合成ポリマーヒドロゲルマトリックス中にボイド空間を作り出すためのいくつかのツールが、電気泳動分離材料およびゲルクロマトグラフィー材料の関係で記載されており、鋳型ポロゲン（例えばミセル形成性剤、固体メソビーズ、液体エマルジョン）の使用；該ポリマーの横方向凝集、および二相共重合性系のごとき他の方法の使用を含む。
【００６２】
一般にテンプレーティングポロゲンを用いると、規定されたポアサイズを持つ合成ポリマーヒドロゲルの製造において最大の柔軟性が可能となった。基本的なプロセスは単純である：１）所望のサイズの鋳型を重合混合物に混合する；２）次いで、混合物を重合し、鋳型のまわりに重合した架橋モノマーの網目を形成する；３）重合の後、鋳型を溶媒溶液で選択的に除去し、所望のメソポーラス構造を持つ合成ポリマーヒドロゲルを後に残す。かくして、テンプレーティングポロゲン剤を選択するにおける主要な考慮は、浸出プロセスの間に合成ポリマーヒドロゲルに有意には影響せず、またはそれを有意には改変しない溶媒中に該剤を選択的に溶解させる能力である。
【００６３】
いくつかのミセル形成性分子は、それらがかなり密なサイズ分布を持つスフェロイド構造を形成し、それは比較的穏和な溶媒条件で抽出することができるので、鋳型ポロゲンとして用いるのに理想的である。重合溶液はミセル形成性テンプレーティング剤にて二相系を形成する：重合性モノマーおよび架橋剤を含有する「外」相、およびミセル形成性材料より通常は主としてなる「内」相。非−重合相のサイズがあまり制御されておらず、または界面活性剤濃度に依存する単純な非混和性エマルジョン系と比較して、ミセルはより明確なサイズ特徴を持つ秩序立った液体構造である。界面活性剤は本発明で用いるメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の製造で用いるミセル−形成性鋳型ポロゲンとして特に好ましい。適当な界面活性剤分子を選択することによって、所望のミセルサイズ範囲を生じさせることができる。例えば、ナノサイズのミセルはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＢＳ）を用いて容易に製造され、他方、メソサイズのミセルは、Ｂｒｉｊシリーズのごとき商業的に入手可能なポリマー系アニオン界面活性剤を用いて製造することができる。Ｂｒｉｊ界面活性剤は、脂肪族炭素鎖およびポリエーテル鎖を含む。これらは、種々のサイズおよびサイズ分布のミセルを生じさせるのに用いることができる多様なノニオン界面活性剤である。Ｂｒｉｊ７００はここに例示的な界面活性剤鋳型ポロゲンとして用いられるが、当業者であれば、容易に同様にして別のミセル形成性鋳型ポロゲンを用いることができるであろう。
【００６４】
界面活性剤ベースの鋳型ポロゲンは２つの他の利点を有しており、これは、能動的エレクトロニックマトリックスデバイス上でのメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の製造で大いに用いられる。まず、生じるポアのサイズおよび数、およびかくして合成ポリマーヒドロゲルの多孔度特徴は、重合混合物中の界面活性剤鋳型ポロゲンの濃度を変化させることによって改変することができる。図１４に示されるごとく、ポリアクリルアミド合成ポリマーヒドロゲルの多孔度は、界面活性剤の量を適当に増加させることによってほぼ１．５θだけ変化させることができる。有意な範囲にわたって合成ポリマーヒドロゲルのθ値を変化させるこの能力は、メソポーラス構造にミクロポアを導入するのに有用であり、これは、大きな（１００ｎｔを超える）アンプリコンのハイブリダイゼーション適用において、または酵素反応に基づく適用で用いられるであろうメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層で好ましい。
【００６５】
第２に、界面活性剤ベースの鋳型ポロゲンは水に適当に溶解し、単純な蒸留水または水性緩衝溶液が例示的な浸透層におけるごとく、重合後に鋳型を浸出するのに利用されるのを可能とする。有機溶媒またはより化学的に反応性の組成物の使用を回避することによって合成ポリマーヒドロゲルの機械的強度およびメソ構造特徴を維持することができる。対照的に、水不溶性テンプレーティングポロゲン剤は、通常、厳しい浸出条件を必要とし、これは、目的物質の浸透層の構造的一体性を変化させることができる。
【００６６】
界面活性剤または他のミセル形成性テンプレーティングポロゲンの代わりに、固体ビーズタイプのテンプレーティングポロゲンを利用することができるであろう。サブミクロンのメソサイズガラスビーズ（「メソビーズ」）が記載されており、これはポロゲン鋳型を適当なものとするであろう。これらのタイプの鋳型ポロゲンは、これが固体ビーズの安定な物理的パラメーターであり、該ビーズは重合混合物に含めるに先立ってサイズにより分類することができるので、鋳型のサイズおよびサイズ分布に対する厳格な制御の利点を有する。しかしながら、ガラスビーズは、塩酸での溶解による合成ポリマーヒドロゲルメソ構造からの浸出を必要とする。ポリアクリルアミドゲルにおいては、このプロセスは、ゲル構造に対する観察可能な悪影響を示していない。しかしながら、二酸化ケイ素層は、現在、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスの基材材料で用いられており、これらの成分のフッ化水素酸への暴露は電極アレイに悪影響を及ぼすであろう。かくして、ガラスメソビーズの使用は、本発明のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層デバイスの製造のための現在好ましい方法ではない。しかしながら、もし別の非−エッチング性材料が（窒化ケイ素のごとき）絶縁層で利用されるか、または非−ケイ素ベースの基材が能動的エレクトロニックマトリックス電極アレイで用いられるならばフッ化水素酸浸出プロセスに伴う不利は重要ではなくなるであろう。
【００６７】
もう１つの別の鋳型ポロゲン戦略は、重合混合物とで安定な（半安定）エマルジョンを形成するための非混和性液体の使用である。重合成分（モノマー、架橋剤、共重合性結合分子）の多くは水性相に溶解するので、疎水性相が親水性相中で所望のポアサイズの液滴を形成する疎水性／親水性二相系を利用するのが普通である。通常、これらのエマルジョンは界面活性剤で安定化されて、凝集、および親水性相からの疎水性相の分離を妨げる。この方法は、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の製造で用いるのに適するが、マイクロエマルジョン液滴は界面活性剤ミセルの構造程は秩序立っておらず、よく規定されていないので、それはミセル形成性鋳型ポロゲン方法のようには好ましくない。
【００６８】
同様の戦略は気体相ポロゲン鋳型の使用である。よく分布し制御された方法での、重合反応の間における気泡の生成で有用ないくつかのポロゲンがポリマー技術分野で知られている。ガス生成ポロゲンの使用は、形成された気泡は固化する合成ポリマーヒドロゲルマトリックス内でかなりの程度までは凝集しない特に粘性ポリマー混合物で適するであろう。従って、この方法は、ポリアクリルアミドヒドロゲルが余りにも流動性であるので、それを用いるのに好ましくない。
【００６９】
非−テンプレーティング戦略を用いて、最終合成ポリマーヒドロゲルマトリックスにボイド区間を導入し、物理的に不均一なメソ構造を作り出すこともできる。例えば、横方向凝集と呼ばれている現象が記載されており、ここに、ある種の分子量のポリエチレングリコールをアクリルアミド重合混合物に含ませた場合、成長するポリマー鎖がポリエチレングリコール分子間に凝集する。例えば、１０，０００ないし２０，０００ＭＷの範囲のＰＥＧを約２．０ないし２．５％ｗｔ／ｖｏｌの濃度にて重合混合物に添加した場合、５００ｎｍの平均サイズのポアが生成する（例えば、引用してその全てを一体化させるＲｉｇｈｅｔｔｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、６３８：１６５−１７８（１９９３）参照）。かくして、高分子量のＰＥＧの添加を利用して、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層、特に、ポリアクリルアミドヒドロゲルに基づくものを製造することもできる。
【００７０】
加えて、制御されたポリマーネットワーク分解技術も記載されている。この技術では、過ヨウ素酸塩酸化してゲル中にミクロポアを開けることによって、ポリアクリルアミドマトリックスを制御して分解した。しかしながら、この方法は、おそらくは、本発明のデバイスで用いるのに好ましくはなかろう。というのは、デバイスのエレクトロニクスまたは結合部位化学に対してきびしい化学条件は有害だからである。
【００７１】
前記議論から明らかなごとく、本発明の浸透層で用いられる所望のメソポーラス（および所望によりミクロポーラス）特性を持つ合成ポリマーヒドロゲルマトリックスを製造する多数の方法が存在する。かくして、ポリマー分野の当業者であれば、本発明のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層は必ずしも特定の方法（例えば、鋳型ポロゲンの使用）によって製造された層に限定されるものではなく、むしろ、種々の方法により種々の合成ポリマーヒドロゲル材料から製造することができる広いクラスのメソ構造合成ポリマーヒドロゲル浸透層を含むことを認識するであろう。
【００７２】
結合部位の共重合での合成ポリマーヒドロゲル処方
本発明で用いる好ましい合成ポリマーヒドロゲルは、特異的結合部位分子（例えば、核酸、蛋白質、ポリペプチド、ピラノシルＲＮＡのごとき合成結合系成分）の結合用の共重合化結合部位を含む。そのような共重合化結合部位は、一般に、一般式：
【００７３】
【化３】
2005512069.tif 000006
【００７４】
［式中、Ｐは合成ポリマーヒドロゲルのモノマー単位およびもう１つのＰ−Ｘ−Ｒ基よりなる群から選択される１つまたは２つの部位に共有結合した少なくとも１つの重合性部位であり、ここに、該他のＰ−Ｘ−Ｒ基は第一のＰ−Ｘ−Ｒ基と同一または異なってよく、ここに、点線は、もしＰが２つの部位に共有結合していれば、第二の部位に対する共有結合であり；
【００７５】
Ｘは共有結合または連結部位であり；および
Ｒは生体分子に共有結合または非共有結合するための機能的部位である］
によって記載することができる。
【００７６】
「Ｐ−Ｘ−Ｒ」と命名される重合性結合分子は、浸透層の製造の間の共重合、または浸透層の一部の製造によって浸透層に一体化されて、共重合化結合部位を含む浸透層が得られる。
【００７７】
Ｘ結合もしくは連結部位は、典型的には、共有結合または標準的なスペーサーもしくはリンカー基である。もしＸが共有結合でなければ、Ｘは、好ましくは、１ないし１０個の炭素原子のアルキル、２ないし１０個の炭素原子のアルケニル、アリルエステル、ケトン、アミド、チオエステル、アルキルエーテル、アミド基、カルボニルおよび／またはそのいずれかの組合せよりなる群から選択される。本発明のいくつかの好ましい具体例においては、Ｘはポリエチレングリコール部位を含み、他方、本発明の他の好ましい具体例においては、Ｘは共有結合を表す。
【００７８】
本明細書中で用いるごとく、アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなどのごとき直鎖および分岐鎖の炭化水素部位を示す。そのようなアルキルは、限定されるものではないが、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、チオ、シアノ、ニトロ、スルホ等を含めた種々の置換基で置換されていてもよい。アルケニルは、炭素−炭素結合の１以上が二重結合であって、非−二重結合炭素がアルキル、または置換されたアルキルである炭化水素を示す。アルケニル炭化水素基は直鎖であってよく、あるいは１以上の分岐を含んでもよい。アミノは、２つの水素原子に結合した窒素原子、アルキル部位およびその組合せを含めた部位をいう。アミドは、酸素原子に二重結合し、かつアミノ部位に一重結合した炭素原子を含めた部位をいう。
【００７９】
結合分子上のＲ部位は、好ましくは、ビオチン−結合対反応に参加することができる部位、ビオチン−部位またはビオチン−結合部位いずれかである。ビオチン−結合部位は抗−ビオチン抗体；遺伝子工学により作成され、酵素により切断され、または化学的に修飾されたアビジンまたはストレプトアビジンのバージョン；およびアビジンまたはストレプトアビジンに機能的に同等である解離常数でもってビオチンに結合する他の合成ビオチン−結合構造を含む。本発明の好ましい具体例におけるＲ部位は、ビオチン−部位またはビオチン−結合部位（例えば、ストレプトアビジン）いずれかを含むように誘導体化されている誘導体化生体分子に結合する。多くの生体分子はビオチンまたはビオチンアナログで容易に誘導体化することができるので、本発明の好ましい具体例においては、Ｒは、例えば、ストレプトアビジン、アビジン、またはその化学的もしくは組換え作成誘導体のごときビオチン−結合部位である。当業者によって認識されるごとく、結合分子は、特に、ホモテトラマー第四級構造を有する、ストレプトアビジンのごとき蛋白質性Ｒ部位の場合には、Ｒ部位に結合した１を超えるＰ部位を含むことができる。本発明のいくつかの好ましい具体例においては、結合分子はＲ上の各ビオチン−結合部位に対して約１つのＰ部位を有し、他方、他の好ましい具体例においては、結合分子は、Ｒ上の各ビオチン結合部位に対して１未満のＰ部位を有する。
【００８０】
Ｒ部位は、生体分子または他の結合体をマイクロロケーションにおいて浸透層に結合させるのに利用される。いくつかの結合化学（非共有結合アフィニティー化学および共有結合反応性化学）が、核酸、蛋白質およびポリペプチド、誘導体化分子の活性を保持しつつもう１つの部位への特異的結合を可能とするための他の分子を特異的に誘導体化するために開発されている。一般に、これらは、ストレプトアビジン、ビオチン、フェニルボロニック酸、サリチルヒドロキサム酸、または特異的ピラノシルＲＮＡ配列のごとき合成結合体（または引用してその全部を一体化させる１９９９年８月１３日に出願された同時係属出願０９／３７４，３３８に記載された「ｐＲＮＡ」）のような非共有結合用の共有結合した化学部位、あるいはＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル、アミン、アルデヒド、アシルクロライド、ヒドラジン、ヒドラジド等のような共有結合用の反応性部位を含む。Ｒへの結合のための誘導体化は、オリゴヌクレオチド含有酸化リボース、アミン停止、または引用してここに一体化させるＨｅｒｍａｎｓｏｎ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ著作権１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって概説されたよく知られたバイオコンジュゲート対のいずれかを含む。好ましくは、生体分子または他の特異的結合体に対する、Ｒへの結合用の化学的部位の結合は共有結合を含む。しかしながら、マイクロアレイの浸透層における共重合体化結合部位への誘導体化生体分子の結合は共有結合または非共有結合いずれかを介するものであってよい。
【００８１】
かくして、別の好ましい具体例においては、Ｒは、アミン、ヒドラジン、あるいは活性Ｎ−ヒドロキシスクシンイジミル（ＮＨＳ）エステル、スルホン化ＮＨＳエステル、アルデヒド、酸、アシルハライド等のごときヒドラジド結合化学、またはヒドラジド、ヒドラジン、アミンによる誘導体化結合分子の共有結合性の反応部位である。ヒドラジド結合化学は（ＵＳを指定する）ＰＣＴ／ＵＳ０１／４１６６３に詳細に説明されており、これは、本発明のデバイスのメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層へ結合体を結合させるのに有用である。加えて、ジスルフィド結合またはチオエステル結合（例えば、チオール）、ホスホロチオレートモノエステル、アセタール、ケトン、アルデヒド、ジアルデヒド、ブロモ−またはヨード−アセトアミドおよびエステルに適したものを含めた、通常の生体分子結合化学で用いられる他の反応性基を用いることができる。加えて、プソラレンは本発明の種々の具体例においてＲとして有用であり得る。用いられる好ましいプソラレンは約３６５ｎｍの波長において光活性化可能である。
【００８２】
本発明の他の代替具体例において、Ｒは、能動的エレクトロニックマトリックスデバイス上の特別のマイクロロケーションに特異的結合体を固定化させるための、ピラノシル−ＲＮＡオリゴマーのごとき合成対合系ユニットであり得る。これらの具体例において、ｐＲＮＡを重合性部位で誘導体化し、一般にＰ−Ｘ−Ｒ分子について記載したごとく、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層に共重合化することができる。しかしながら、後に共重合化特異的結合体について記載するごとく、マイクロロケーション電極の完全なアレイよりはむしろ、ちょうど１つのマイクロロケーション電極またはマイクロロケーション電極のサブセットを被覆する浸透層を生じさせる金型の使用が好ましい。
【００８３】
ストレプトアビジンのごときビオチン結合部位について記載したごとく、Ｒは、通常は、活性状態に共重合化される。しかしながら、特に、Ｒとして反応性基を用いる場合には、Ｒを脱保護または活性化を必要なように修飾して、結合部位として機能させることができる。例えば、ｔ−ブチルまたはもう１つのかさ高い部位を用いて、重合の間に反応性Ｒ基を保護し、次いで、特異的結合体の、能動的エレクトロニックマトリックスデバイスのマイクロロケーションへの結合に先立って切断することができる。あるいは、Ｒは、共重合体化分子において反応性基の前駆体として供することができる、次いで、（例えば、酸化または還元反応によって）反応性基に変換することができる。
【００８４】
Ｐ部位は周りの浸透層のモノマーとまたは第二の結合分子のＰ部位と反応することができる。かくして、添加すべき結合部位は、（例えば、ブロック共重合体、または他の負荷単位の形態で）ベースの浸透層へのその取り込みに先立って部分的に重合させたものであってもよい。重合反応は溶液、スラリー、または他の許容される様式で行うことができ、ここに、Ｐ部位は（「Ｐ」と同一であってよい）成長する浸透層ポリマーのモノマー部位および／またはもう１つの結合分子のＰ部位と反応することができる。Ｐの浸透層への重合は、熱および／または特定波長の電磁放射に感受性であるフリーラジカル重合開始剤のごとき重合開始剤分子を用いることによって非特異的に開始させることができる。そのような活性化可能開始剤の使用により、全ミクロ電極アレイを横切って、またはミクロ電極アレイの特異的部分において適用することができる、外部エネルギー源（熱またはある波長の光）による重合の開始を可能とする。
【００８５】
Ｐは、重合反応においてもう一つのＰ反応中心への結合に参加することができる反応中心を含み、および／または浸透層ポリマーマトリックスの反応中心に結合する化学的部位を含む。加えて、Ｐは、もう一つの官能基のＲ部位に結合することができる。Ｐは、好ましくは、限定されるものではないが、二重結合は、酸素に二重結合し、かつもう一つの酸素、窒素、硫黄、ハロゲンまたは炭素に一重結合した炭素に直接結合した置換されたまたは置換されていないα，β不飽和カルボニル；二重結合が酸素、窒素、ハロゲン、リンまたは硫黄に一重結合したビニル；二重結合が、酸素、窒素、ハロゲン、リンまたは硫黄に結合した炭素に一重結合したアリル；二重結合が、もう一つの炭素に一重結合し、これが、次いで、酸素、窒素、ハロゲン、リンまたは硫黄に一重結合した炭素に一重結合したホモアリル；三重結合が２つの炭素原子の間に存在するアルキニル部位を含めたアルケニル部位よりなる群から選択される。Ｐは、また、アセタール、エポキシド、エステル、カルボン酸、アミド、ハロ−アセトアミド、チオール、ホスホロチオレートモノエステル、チオエステル、ジスルフィド、アルデヒド、ケトン、ヒドラジド、ヒドラジンおよびアミンよりなる群から選択することもできる。より好ましい具体例においては、Ｐはアクリロイルまたはアクリルアミド部位である。特に好ましい具体例においては、Ｐはアクリルアミド部位、最も好ましくはメタクリルアミド部位である。
【００８６】
ポリマー分野の当業者によって認識されるごとく、合成ポリマーヒドロゲルマトリックスのモノマーと容易に共重合して、合成ポリマーヒドロゲル浸透層を通じての結合部位の均一な分布および良好な取り込みを確保する適当なＰが選択されるべきである。一般に、重合混合物のモノマーと同一または類似のＰの使用は、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層を含む良好な共重合体化結合部位を生じさせるであろう。かくして、以下の例においては、アクリルアミドヒドロゲルへの共重合のためにＰとしてアクリロイルまたはアクリルアミド部位を用いる。
【００８７】
共重合化特異的結合体
本発明の別の好ましい具体例においては、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、共重合化特異的結合体を含む。これらの具体例においては、共重合化特異的結合体は、Ｒが特異的結合体であるという変化を除き、前記したのと同一の一般式：
【００８８】
【化４】
2005512069.tif 000007
【００８９】
を有する。前記したごとく、本発明の能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスで行うアッセイで有用な特異的結合体は核酸、蛋白質、ポリペプチド、プロテオグリカン、糖蛋白質、抗原性エピトープ、および生化学または化学アッセイで有用な他の分子を含むがそれらに限定されるものではない。好ましい特異的結合体は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学的に誘導体化されたＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは天然に生じる核酸にハイブリダイズする核酸アナログ）、蛋白質、抗体および抗原を含む。実施例のポリアクリルアミドメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層におけるストレプトアミジンの共重合によって証明されるごとく、蛋白質およびポリペプチドはアクリロイルまたはアクリルアミド基（または他の重合性部位）で容易に誘導体化でき、蛋白質活性の最小喪失にて共重合することができる。加えて、アクリロイルまたはアクリルアミド基のごとき共重合性部位を核酸のいずれかの末端に容易に結合させるためにいくつかのホスホルアミダイト試薬が入手できる（例えば、Ｍｏｓａｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡからのＡｃｒｙｄｉｔｉＴＭ）。かくして、特異的結合体は、共重合によって直接浸透層に取り込むことができる。
【００９０】
能動的エレクトロニックマトリックスデバイスの各マイクロロケーションにおいて同一の特異的結合体を有するのは通常は望まれないので、能動的エレクトロニックマトリックスデバイス上の１つのマイクロロケーションまたはマイクロロケーションのサブセット上に浸透層を生じさせるサイズの能動的エレクトロニックマトリックスミクロ電極アレイ上に浸透層を重合させるための金型を用いるのが有利である。そのような金型は図１に示すごとき電極のアレイのために容易に設計することができ、そこでは、デバイス上の特異的ミクロ電極と整列する複数の金型キャビティーが金型に設けられている。例えば、そのような金型は、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスの個々のマイクロロケーション電極を少なくとも被覆する適当な形状の金型キャビティーのアレイを含むことができる（例えば、図１における電極では直径が少なくとも８０μｍである１００の丸い、四角のまたは六角形のキャビティー）。あるいは、マイクロロケーション電極のサブセット（例えば、４電極の全列または四角）を被覆するキャビティーを含む金型を製造することができる。次いで、特定の共重合性の特異的結合体を含む重合混合物を、特定の特異的結合体を含むメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層で被覆すべきアレイのミクロ電極に対応する金型キャビティーにピペットで入れることができる。そのような金型は標準的なマイクロリソグラフィー技術を用いて水晶、ガラス、または他の材料で製造することができるか、あるいはそのような技術を用いて作成したマスターからプラスチックにて成型することができる。
【００９１】
共重合化特異的結合体の使用は、臨床適用の能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスの製造で特に魅力的であり、ここに、いくつかのあらかじめ負荷された特異的結合体を供して、試料中の特定の核酸配列、抗体または抗原のパネルにつきテストすることができる。臨床使用者はテストデバイスについての便利さおよび時間節約に興味を有するので、そのような予め負荷された能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスは、消費者による特異的結合体を負荷しなければならないジェネリックなデバイスよりもかなりの利点を提供する。加えて、本発明の共重合化特異的結合体デバイスは、比較すべきいくつかの試料中の同一の核酸配列、抗体または抗原につきいくつかの試料をアッセイする研究の意味でも有用である。特異的結合体をミクロ電極の組にわたる浸透層に共重合させることによって、特異的結合体の濃度はマイクロロケーションのその組につき標準化され、試料間の分析物の結合のより厳格な比較を可能とする。ミクロ成形プロセスは、特定の共重合性特異的結合体（例えば、アクリロイル部位に共有結合した特定の核酸プローブ）を含有する重合混合物を相互に交換することができる自動工程に容易になじむので、特定の研究実験用の慣用的な、予め負荷されたチップの製造は容易に実現することができる。
【００９２】
基本的な能動的エレクトロニックマトリックスチップの設計
能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスが多孔性および複数反応を行うことができるためには、そのエレクトロニック成分は水性溶液中に能動的操作を維持することができなくてはならない。この要件を満足するためには、各マイクロロケーションは下にある制御可能かつ機能するＤＣミクロ−電極を有する。しかしながら、結合および親和性反応が能動的ＤＣ電極表面で起こる電解反応によって妨げられないことが、デバイスの性能で、特に感度（シグナル−ノイズ比）で重要である。電極表面に直接接触する感受性試薬および分析物（ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質）のいずれかによって起こされる損傷効果に加えて、電極は、感受性成分を損傷する酸（Ｈ＋）、塩基（ＯＨ−）、水素、酸素、および種々のフリーラジカル種を含む電解性生成物を生じる。デバイスの設計および製造のための他の考慮は、限定されるものではないが、（浸透層との適合性およびその製造、およびデバイスでの種々の化学的または生化学的アッセイで利用される溶液成分を含めた）物質の適合性、特異的結合体ならびに引き続いての反応体および分析物の性質、およびマイクロロケーションの数を含む。
【００９３】
「制御可能な機能するＤＣモードのミクロ−電極」とは、制御可能にデバイス上のいずれかの位置へのまたはそれからの、または試料溶液からの荷電特異的結合体、反応対または分析物の自由場電気泳動輸送に影響し、またはそれを必要とし得る、直流モード（連続的またはパルス的またはＤＣ／ＡＣで作動する、正または負のバイアスされたミクロ−電極）を意味する。
【００９４】
本明細書中で用いるごとく、分子の自由場電気泳動「輸送」は、絶縁材料によって生じる電場の境界または封じ込めに依存しない。慣用的電気泳動分離技術は、絶縁（非−導電性）材料による電界線の封じ込めまたは包括を必要とする（たとえば、毛細管ゲル電気泳動におけるガラス毛細管の側面）。能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスでの自由場電気泳動輸送の場合には、荷電分子は大きな溶液容量を通って１つのマイクロロケーションからいずれかの他のマイクロロケーションに移動するか、または大きな溶液から特異的マイクロロケーションに移動する。従って、絶縁材料による特殊な配置または封じこめは、本発明のこの態様では必要とされない。しかしながら、マイクロロケーションテスト部位の比較的小さな面積は、高い電流密度が生じるのを可能とする。チップの閉鎖された面積にわたるこれらの高い電流密度は、溶液からの荷電核酸または他の生体分子の迅速な濃縮、および脱−ハイブリダイゼーションのための電子的ストリンジェンシーを可能とする。
【００９５】
能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスは、２つと少ないアドレス可能マイクロロケーション、または数万と多いマイクロロケーションを有するように設計することができる。一般に、非常に多数のマイクロロケーションを持つ複雑なデバイスは、マイクロリソグラフィー技術またはミクロ製造およびマイクロマシーニングの組合せを用いて製造される。製造は、ケイ素、あるいはガラス、二酸化ケイ素、プラスチック、絶縁された金属またはセラミック材料のような他の適当な基材材料で行われる。これらのミクロ電極「チップ」は、考慮された大規模なアレイまたは複数分析デバイスであろう。
【００９６】
図１は、フォトリソグラフィー技術を用いて製造された１００部位ＮａｎｏＣｈｉｐＲデバイスの電極アレイを示す。マイクロロケーションは、絶縁体層／ベース材料上に蒸着されている露出された金属電極パッド上方の浸透層中またはその上の領域である。金属パッドはミクロ−電極構造として働く。電極材料限定されるものではないが、アルミニウム、銅、炭素、鉄、銀、金、パラジウム、白金、チタン、タングステン、多結晶ケイ素、および酸化インジウム錫、並びにケイ化白金、ケイ化チタン、ケイ化金、またはケイ化タングステンのようなケイ化物材料を含むことができる。絶縁性基材材料（ＳｉＯ２）への適切な結合を確保するための当該分野で知られた特別の技術を種々の金属で用いる。例えば、周辺接触パッド用のアルミニウム、相互結合回路用のチタン、およびミクロ−電極用の貴金属（金または白金）を用い、種々の金属および他の物質をデバイスの種々の導電性成分で用いることができる。加えて、より反応性の低い貴金属、または貴金属合金の表面層をもう１つの金属層に重ねる層上電極構造を用いるのが有利であろう。たとえば、図１に示した電極では、電極は、（改良された接着のための）チタン／タングステン合金の支持体層に蒸着された白金である。あるいは、ポリアニリンまたはポリピロリジンのような導電性ポリマーを電極材料として用いることもできる。能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスのマイクロロケーションの基礎となる電極に加えて、チップデバイス上にマイクロロケーションの基礎とならない他の電極を設けることもできる。これらは、たとえば、溶液中での生体分子の電気分解輸送の間のカウンター−バイアス電極として簡便に用いられる対電極を含む。それらは、マイクロロケーション電極として利用されないので、それらは通常は浸透層によって被覆されない。これらの電極の例が図２に示されており、そこでは、対電極チップデバイスのマイクロロケーションの基礎となるミクロ電極パッドの中央アレイを囲む円に位置する。対電極に加え、電極に供給された一定電流または電圧を測定し、それを維持するのに参照電極または偽参照電極（例えば、銀ペースト電極など）のような他の電極をチップデバイスに組み込むことができる。
【００９７】
仕上げたチップデバイスの表面では、絶縁体材料は、チップデバイスの面において相互に金属電極パッドを分離させる。絶縁材料による電極の分離は、チップデバイスにわたる溶液を通じて指令されるよりもむしろ、チップデバイスの表面を通じての電流の「短絡」を防止する。一般に、絶縁体材料（例えば、二酸化ケイ素）は、図１に示すごとく基材上に蒸着された金属層、またはサンドイッチ型電極および鉛ワイヤー構造上に、またはその間に蒸着させた層である。この製造戦略において、電極パッド上に蒸着された絶縁層を取り除いて、機能するミクロ−電極を露出する。これは、図２で容易に理解でき、ここに露出された電極断面は導電性電極材料により暗い丸として現れる。暗い外観は、絶縁性二酸化ケイ素層におけるエッチングされた「穴」での浸透層の増大した深さによって引き起こされる。しかしながら、他の製造戦略は、マイクロエレクトロニック分野における当業者に明らかであろう。絶縁体材料は、限定されるものではないが、二酸化ケイ素、チッ化ケイ素、ガラス、レジスト、ポリイミド、ゴム、プラスチックまたはセラミック材料を含む。示したＮａｎｏＣｈｉｐＲデバイス上のミクロ電極は二酸化ケイ素層によって分離され、該層は、電極パッドを（図１の外側の）チップの周辺にある電気コネクションに連結するミクロワイヤリングを被覆し、それを絶縁する。
【００９８】
かくして、マイクロリソグラフィー技術によって形成された個々のマイクロロケーションの基本的な特徴は；アドレス可能なマイクロロケーションの位置を規定し、かつ浸透層の共有結合のための層を一体化させることができる金属パッド；ミクロ電極に重ねられる浸透層；浸透層、またはベース浸透層に重ねられる結合部位負荷浸透層材料のもう１つの層に重ねられる結合層である。
【００９９】
マイクロリソグラフィーにより製造されたデバイスについての浸透層の厚みはほぼ１ナノメートル（ｎｍ）ないし１００ミクロン（μｍ）の範囲とすることができ、２ｎｍないし１０μｍが最も好ましい。一般に、本発明の浸透層の好ましい具体例においては、浸透層は乾燥状態の厚みが約０．５μｍおよび約１０μｍの間、より好ましくは乾燥状態の厚みが約１．０μｍおよび約５．０μｍの間、最も好ましくは乾燥状態の厚みが約１．０μｍおよび約２．０μｍ間（あるいは、水性緩衝液と平衡にある場合には少なくとも約８ないし９μｍの厚みである）。また、好ましい具体例においては、浸透層は、乾燥状態で測定して０．５μｍ未満、より好ましくは０．２μｍ未満、最も好ましくは０．１μｍ未満だけ、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスの電極アレイを横切った厚みが変化する。
【０１００】
前記したごとく、合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、単一層として、または複数の層として能動的エレクトロニックマトリックスミクロ電極アレイに成形することができる。いくつかの場合において、浸透層および結合層は、実施例に示すごとく、同一材料から形成することができる。別法として、ベースの浸透層をミクロ電極アレイに成形し、続いて、共重合化結合部位または共重合化特異的結合体を含む浸透層を成形することができる。１を超える層が浸透層を形成する場合、引き続いての層を以前の層に共有結合させる（またはそれにグラフトさせる）のが好ましい。多層浸透層の使用は、共重合性特異的結合体のごときより高価なまたは特殊な試薬を用いる場合に特に好ましい。
【０１０１】
最適には、結合層は、特異的結合体の結合用にミクロン平方（μｍ２）当たり１０５ないし１０７の結合部位（結合後にはまたは特異的結合体）を有する。かくして、共重合化結合部位が本発明のメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層デバイスに設けられる場合、それらは、重合混合物中に十分な濃度で存在させて、この範囲内の結合部位の密度を供するべきである。特異的結合体の結合は表面に過剰塗布したり、または絶縁して、ミクロ−電極が機能するのを妨げるべきでない。機能的デバイスは、浸透層を通って溶媒（Ｈ２Ｏ）分子に接近可能なままであり、かつ対イオン（例えば、Ｎａ＋およびＣｌ−）および電解ガス（例えば、Ｏ２およびＨ２）の拡散が起こるのを可能とするある分率の（ほぼ５％ないし２５％）の現実の金属ミクロ−電極表面を必要とする。拡散が起こるのを可能とするように中間浸透層も設計される。加えて、浸透層は、より大きな結合体、反応体、および分析物がミクロ−電極表面に物理的に接触するのを阻止し、または妨げるポア制限特性を有すべきである。かくして、浸透層は、能動的ミクロ−電極表面を、マイクロロケーションの結合体層から物理的に区別する。
【０１０２】
アドレス可能なマイクロロケーションは（例えば、丸、四角または三角形のごとき）いずれの形状とすることもできる。アドレス可能なマイクロロケーションのサイズはいずれのサイズとすることもでき、好ましくはサブミクロン（ほぼ０．５μｍ）ないし数センチメートル（ｃｍ）の範囲であり、５μｍないし１００μｍが、マイクロリソグラフィー技術を用いて製造されたデバイスで最も好ましいサイズ範囲である。図１に示したデバイスについてのマイクロロケーションサイズは８０μｍである。マイクロロケーションの間の間隔は製造の容易性、マイクロロケーションの間のディテクター分解能についての要件、およびデバイスで望まれるマイクロロケーションの数により決定される。例えば、図２に示したチップデバイスのマイクロロケーションの間の距離はエッジ間が１２０μｍであり、または中心から中心が２００μｍである。しかしながら、マイクロロケーション間の特定の間隔、またはマイクロロケーションの空間的は位置または幾何学は、マイクロロケーション（すなわち、ミクロ−電極の基礎となるもの）のいずれの組合せも完全なデバイス領域にわたって作動できる点で、デバイス機能では必要ではない。マイクロロケーションの数が数百を超えて増大するにつれ、マイクロロケーションの基礎となる回路の複雑性は増加する。この場合、マイクロロケーショングルーピングパターンは変化されなければならず、空間距離はそれに比例して増加しなければならず、あるいは複数層回路を基本的デバイスに製造でき、すなわち、トランジスターおよび半導体制御エレメントをケイ素に直接取り込むことができる。前記したごとく、各個々の基礎となるミクロ−電極についての結合回路は、好ましくは、金属接触パッドの周辺の外側まで存在する。これらの接触パッドが標準的形状で製造される場合、チップデバイスは標準的クワドパッケージに設置することができ、チップ接触パッドはクワドパッケージピンに配線される。
【０１０３】
誘電性または絶縁性電池でデバイスを囲み、またはマイクロロケーションを完全に封じ込める必要はない。なぜならば、複雑なエレクトロニック場パターンまたは誘電体境界は、電極のいずれかの間の空間または媒体に特異的分子を選択的に移動させ、分離し、保持し、または配向させる必要はないからである。能動的エレクトロニックマトリックスは、特異的結合分子および引き続いて分析物および反応体をアドレス可能なマイクロロケーションの表面に結合させることによって、空間的分離を達成する。しかしながら、本発明の能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスは、試料および試薬のデバイスの表面への制御された導入を可能とするために、フローセル内に含ませるか、またはパッケージするのが好ましい。一般に、そのようなフローセルは少なくとも１つの入力ポートおよび少なくとも１つの出力ポートと共に能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスにわたり閉鎖容量を含むのが好ましい。このように、試料導入、すすぎ、および試薬導入の機能は、標準的な流体技術を用いて能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスで容易に行うことができる。
【０１０４】
１を超えるチップおよび追加のパッケージングおよび周辺成分を含む系は、臨床的診断に関連する問題（すなわち、試料物質の添加、流体移動、およびバイオハザード物質の封じ込め、および例えば蛍光、化学ルミネセント、色原性、または放射性部位のごとき標識部位の検出）に取り組むように設計することができる。次いで、パッケージされたチップを、当該デバイスを制御し操作できるマイクロプロセッサーで制御されたＤＣ電源およびマルチメーター装置に差し込むことができる。（アドレッシングに先立つ）デバイスの製造は、結合体が結合した基本的チップデバイス；フローセル流体封じ込め成分；および、所望により、オンボード能動的エレクトロニックマトリックスコントローラ成分のごとき本質的に一緒にアセンブリングにサンドイッチされるディスポーザブルデバイスへの種々の基本的成分の組込みを含むことができる。この戦略は、製造技術および材料適合性に関連する多数の問題を解決する。
【０１０５】
浸透層のための係留
前記した物のごとき合成ポリマーヒドロゲル材料は所望の機能的性質を有するが、ヒドロゲル浸透層は電極表面から分離されるかまたは「層脱離」する傾向がある。出願人らはいずれかの特定の理論に拘束されるものではないが、この層脱離は、電極における電気ポテンシャルの適用に由来する浸透層および電極の間の界面における化学的状況の変化によって、および電極から生じる荷電イオンおよびガスからの物理的破壊によって引き起こされると考えられる。そのような層脱離は、「ミクロ層脱離」および「マクロ層脱離」の観点から総括することができる。
【０１０６】
ミクロ層脱離は、浸透層および電極それ自体の間の化学的界面の電気化学的劣化を含む。それは、浸透層における上昇した膨らみの形成によって、または共焦点顕微鏡で適切に観察した場合の層脱離した光の屈折による目に見える小リングおよび（恐らくは、電場不均一性に対する制御の喪失による）浸透層性能における合致性の喪失の結果によって観察される。他方、マクロ層脱離は、浸透層およびチップ基材の間の表面エネルギーのミスマッチ、および全マクロチップ表面を横切って伸びることができる浸透層剥離（リフト−オフ）の結果によって引き起こされる。浸透層は、液体重層に存在する分析物に対する特異的結合体の結合用の手段を供するので、マクロ層脱離は、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスで典型的に行われるアッセイに対して有害である。本発明の合成ポリマーヒドロゲル能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスの好ましい具体例においては、ミクロ−およびマクロ層脱離の問題は、能動的エレクトロニックマトリックス電極および浸透層ヒドロゲルマトリックスの間の化学的共有結合の使用によって軽減されるであろう。この化学は、ポリアクリルアミドを含めた種々の浸透層合成ポリマーヒドロゲル組成物に適用することができ、少なくとも０．０４ｎＡ／μｍ２の電流密度および／または１および３Ｖの間の電圧降下に耐えることができる。
【０１０７】
アルミニウムまたはケイ素のような金属／貴金属混合物の場合には、金属酸化物の層は、浸透層の共有結合カップリングのためのベースを提供する。金属酸化物およびヒドロキシル基（単独または組合せいずれか）、および表面コーティング化学の技術分野における当業者に知られた他の同様な界面表面は、それから浸透層を構築し、または保持するための共有結合部位を供する。好ましい金属／ケイ化物電極は、ケイ化白金（ＰｔＳｉ）、ケイ化タングステン（ＷＳｉ）、ケイ化チタン（ＴｉＳｉ）、およびケイ化金（ＡｕＳｉ）を含む。というのは、それらは、後記する試薬を用いるシアノカップリングで容易に利用できる部位を供するからである。
【０１０８】
しかしながら、浸透層は金属電極表面に共有結合により係留されていることは必須ではない。ミクロ−およびマクロ−層脱離に対する有意なさらなる抵抗性は、浸透層を、マイクロロケーションの現実のミクロ電極を囲う基材または絶縁材料に単に付着させることによって得ることができる。浸透性材料の物理的重ねは、やはり本発明の範囲内である別の方法を表す。かくして、いくつかの好ましい具体例においては、本発明のデバイスの合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、ミクロ電極を加工能動的エレクトロニックマトリックスデバイスの基材に共有結合により係留している。この方法を記載するのに用いるごとく、「基材」は、ミクロ電極がその上で形成される支持体材料の層のみならず、電極の金属に重ねることができるいずれの絶縁性材料層（例えば、二酸化ケイ素）も含めるよう考慮し、かくして、マイクロロケーションの境界を規定する。例えば、白金および金のような金属の場合には、浸透層は物理的に重ねることができ、次いで、電極を囲う二酸化ケイ素の層に係留させることができる。実施例１に記載されたこの「テンティング」アプローチは、浸透層のマクロ層脱離を防止するのに非常に有用なことが立証された。浸透層を能動的エレクトロニックマトリックスデバイスに係留させるための架橋剤の使用は、一般に、引用してその全体を一体化させる米国特許第６，３０３，０８２号に記載されている。
【０１０９】
これらの好ましい具体例においては、共有結合は、リンカーをケイ素担持表面（例えば、金属／Ｓｉ電極または基材のケイ素含有表面）のシラノール部位に結合させるための部位、およびリンカーを結合させるための別の部位を供する。特に好ましい具体例においては、連結部位は式：
【０１１０】
【化５】
2005512069.tif 000008
【０１１１】
によって規定され、ここに、Ｘはアクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アリル、ビニル、アセチル、アミン（置換されているかまたはされていない）、エポキシまたはチオールであり；
ＳＰＡＣＥＲはアルキル、アリール、（エチレングリコールまたはポリエチレングリコールのごとき）モノ−またはポリアルコキシ、モノ−またはポリアルキルアミン、モノ−またはポリアミド、チオエーテル誘導体、またはモノ−またはポリジスルフィドであり；
ＡおよびＢは酸素−Ｒのいずれかの組合せであり、ここに、ＲはＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルのごときアルキル、または他の直鎖または分岐鎖炭化水素、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＸ−ＳＰＡＣＥＲのそれと同様な部位機能性であり；および
Ｃは酸素−Ｒであり、ＲはＨ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルのごときアルキル、または他の直鎖または分岐鎖炭化水素、Ｃｌ、Ｂｒ、またはいずれかの他の加水分解性部位である。
【０１１２】
金属／Ｓｉマイクロロケーション電極を用いる具体例においては、シラノール部位は、電極表面のケイ素部位に結合したヒドロキシル基と反応することができる。ケイ素−含有基が電極に存在しないが、基材には存在する具体例においては、シラノール部位は、基材表面のケイ素部位に結合したヒドロキシル基と反応することができる。リンカーの他端では、Ｘ部位は、浸透層ポリマーの反応中心と共有結合により反応するのに利用できる化学基を含む。
【０１１３】
図４に示すごとく、浸透層は、少なくとも１つの共重合性反応中心を有する連結部位によって電極に連結させることができる。適当な特徴を有するリンカーは以下の表に掲げる。
【０１１４】
【表１−１】
2005512069.tif 000009
【０１１５】
【表１−２】
2005512069.tif 000010
【０１１６】
特に好ましい具体例においては、共有結合化学を有する能動的エレクトロニックマトリックスは、ＡＰＳ、ＡＥＡＰＳ、ＡＨＡＰＲ、ＭＯＴＳおよびＡＭＰＴＳよりなる群から選択されるリンカーを用いる。
【０１１７】
実施例１は、白金マイクロロケーション電極を囲う基材に浸透層を係留させるためのシラノールリンカーの使用も説明する。あるいは、もし貴金属／ケイ化物電極を用いるならば、チップの電極アレイを、まず、２５０ミリトールおよび２５０ワットにおいてアルゴンプラズマで５分間処理することができる。次いで、室温にて、上記蒸着によってチップをリンカーで１５分間にわたって処理し、次いで、９０℃にて２時間加熱することによってチップに硬化させる。これは、電極中のケイ化物部位のヒドロキシル基にリンカーを共有結合させる。一旦リンカーをマイクロチップに結合させたならば、ＵＶ−開始フリーラジカル重合反応をモノマー間で行うことができ、これにより、浸透層およびリンカー−誘導体化電極の表面存在するビニル部位を作成し、それにより、浸透層を合成し、単一工程でそれを電極に共有結合により係留させる。
【０１１８】
メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層と共に能動的エレクトロニックマトリックスデバイスを利用する適用
一般に、本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスは、これまでに開示された能動的エレクトロニックチップデバイス同様にして取り組み、用いることができる。エレクトロニックアドレッシング手法の記載は米国特許第６，０５１，３８０号に見出すことができる。簡単に述べれば、（通常はフローセル区画にある）能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスにアドレスすべき結合−誘導体化分子種を含む溶液を導入し、電極が分子手法の種の電荷と反対にバイアスされるように（例えば、もし分子種が核酸であれば正）、それに分子種をアドレスすべきマイクロロケーション下で、電極をバイアスすることによってデバイスをアドレスすることができる。次いで、分子種は溶液を通ってマイクロロケーションまで移動し、（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して）浸透層中の結合部位に結合−促進部位を介して結合するようになる。米国特許第５，０５１，３８０号に記載されているごとく、用いられる好ましい溶液は、ヒスチジン（好ましくは約５０ｍＭ）または他の双子イオン緩衝液のごとき有意な緩衝能力を持つ低コンダクタンス緩衝液である。このように、核酸プローブ、試料核酸、試料からのアンプリコン、抗原、抗体、または他の荷電分子種をデバイスの特異的マイクロロケーションにアドレスし、種々のアッセイ様式で用いるために結合させることができる。
【０１１９】
アドレッシングの後、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスは、膨大なアッセイフォーマットで利用することができる。例えば、核酸プローブまたはアンプリコンで取り扱われるデバイスは、米国特許第５，０５１，３８０号に記載されたドットブロットまたは逆ドットブロット分析、ＵＳＳＮ  ０９／２９１，１２９に記載された塩基−スタッキング単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）分析、ＵＳＳＮ  ０９／７２７，０３０に記載されたエレクトロニックストリンジェンシーにてのＳＮＰ分析、または米国特許第６，２０７，３７３号に記載されたＳＴＲ分析で利用することができる。加えて、そのようなアドレスされたデバイスは、酵素核酸修飾、または例えば、ＵＳＳＮ  ０９／７１０，２００に記載された酵素レポーティングを用いる遺伝子発現のごとき蛋白質−核酸相互作用、米国特許第６，２３８，８６８号に記載された係留された核酸増幅、または酵素エンドヌクレアーゼ切断、エンド−エキソ−ヌクレアーゼ切断を含めた固相フォーマットに適した他の核酸修飾、従たる溝結合蛋白質アッセイ、末端トランスフェラーゼ反応、ポリヌクレオチドキナーゼまたはホファターゼ反応、リガーゼ反応、トポイソメラーゼ反応、および他の核酸結合または修飾蛋白質反応でのフォーマットで利用することができる。
【０１２０】
加えて、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスは、一般に、イムノアッセイフォーマットで有用である。例えば、デバイスのマイクロロケーションは抗原（例えば、ペプチド、蛋白質、炭水化物、脂質、プロテオグリカン、糖蛋白質など）でアドレスして、サンドイッチアッセイ、競合アッセイまたは他のフォーマットにより体液試料中の抗体につきアッセイすることができる。別法として、デバイスのマイクロロケーションを抗体でアドレスして、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、または他のアッセイフォーマットにより試料中の抗原を検出することができる。抗体および蛋白質の等電点は実験またはｐＨ／電荷の計算によってかなり容易に決定することができるので、デバイスのエレクトロニックアドレッシングおよびエレクトロニック濃縮の利点は、アドレスされたまたは分析物種が荷電されるように、単に緩衝液のｐＨを調製することによって利用することができる。
【０１２１】
前記した単純な能動的エレクトロニックアッセイフォーマットにおいて、生体分子の結合用の誘導体化部位として特異的対合成分を利用するフォーマットが、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスについて記載した。これらのフォーマットは、特異的対合成分（例えばピラノシルＲＮＡオリゴマー）を用いることによって、マイクロロケーションの組に対するいくつかの分子種の同時エレクトロニックアドレッシングが、既にマイクロロケーションにおける浸透層に結合された相補的特異的対合成分に特異的に結合するのを可能とする。これらのフォーマットは、能動的エレクトロニックマトリックスアッセイで数ダースの区別される結合体組成物のアレイを作り出すのに必要な時間の量を劇的に減少させることができる。本発明のメソポーラス合成ヒドロゲル浸透層デバイスはこれらのフォーマットでも有用であり、これはイムノアッセイ−タイプのアッセイ（ＵＳＳＮ０９／７８３，７６３参照）および核酸アレイ（ＵＳＳＮ  ０９／９１０，４６９）につき記載されている。
【０１２２】
本明細書中で言及した全ての特許、特許出願、公開された特許出願、および他の刊行物はそれがあたかも十分に本明細書中で再現されたごとく引用によりここにその全体を一体化させる。
【実施例】
【０１２３】
さて、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスでのメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の製造および使用に関し、以下の非限定的な実施例を参照して本発明をかなり詳細に記載する。
【０１２４】
以下の実施例における緩衝液、溶液および媒体についてのレシピは、J. Sambrook, E. F. Fritsch,およびT. Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されている。
【０１２５】
実施例１：例示的メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層
Ａ. アクリロイルまたはアクリルアミドストレプトアビジンの製造
メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層処方への取込みでは、ポリマー骨格への取込みのためのペンダントアクリル基を持つ機能性化ストレプトアビジン誘導体を調製した。ストレプトアビジンは図３中の反応図式に従い、アクリルアミド基、またはアミド−連結ＰＧ３４００−エステル−アクリロイル基いずれかで誘導体化した。Ｎ−アクリルオキシスクシンイミドはPolysciences からのものであり、これは受け取ったまま用いた。ポリエチレングリコールのα−アクリロイル，ε−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル−プロピオン酸（分子量３４００）（ＰＥＧ−ＮＨＳ）はShearwater Polymers, Inc.からのものであった。ストレプトアビジン（ＳＡ）はRoche Molecular Biochemicalsから購入した。
【０１２６】
天然ＳＡ１６５ｍｇおよび過剰のＭＨＳ試薬（２．４ｍｇ）を１５−ｍｌのディスポーザブルポリプロピレンセル培養チューブに秤量した。リン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＬ，ＰＨ９，１２ｍＬ）を添加し、全ての固体が十分に溶解するまで軽く試験管を撹拌した。反応を暗所で３０分間継続させた。ストレプトアビジン誘導体化反応の生成物は、AKTATM エクスプローラーＨＰＬＣシステム、(Amersham Pharmacia Biotech)でのゲル浸透からのＨｉＰＲＥＰ２６／１０  ＧＰＣ脱塩カラム、(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精製した。溶出は、１０ｍｌ／分の速度にてリン酸ナトリウム５０ｍｌ，ｐＨ７で行った。最初のピークは１０および２４ｍｌの間で溶出し、第２のピークは３０ｍｌを超えて溶出した。第２のピークはＮＨＳおよび過剰のアクリル酸を含み、これはＳＡ誘導体化反応から、および加水分解からのものである。最初のピーク下の全ての画分を集め、３５℃にてロタロ−エバポレーター（ＳｐｅｅｄＶａｃ）で６〜７時間濃縮した。濃縮した溶液を室温とし、蛋白質濃度を２８０ｍｍにおけるＵＶ分光測定法によって測定した。濃度は脱イオン水で３５ｍｇ／ｍｌに調整した。
【０１２７】
未修飾ＳＡ、Ｎ−アクリルＳＡおよびＰＥＧ−アクリロイルＳＡの相対的結合アッセイを標準ＨＡＢＡアッセイによって測定した。未修飾ＳＡは４．０のＨＡＤＡ活性を有し、他方、Ｎ−アクリルＳＡは３．８の活性を有した。ＰＥＧ−アクリロイルＳＡは、おそらくは、かさ高いＰＥＧ基による立体障害のため、３．０の比較的低い活性を有した。その高い保持された結合アッセイのため、Ｎ−アクリルＳＡは、実施例３に記載され、図１０に特徴付けられているごとき、多−バッチ製造ラウンドにおいてテスト処方で利用された。
【０１２８】
Ｂ．共有結合浸透層アンカリングのための能動的エレクトロニックマトリックス表面の活性化
能動的エレクトロニックマトリックスチップ表面への浸透層の接着を改良するために、表面をアクリロイル部位（Ｂｉｎｄ−ＳｉｌａｎｅＴＭ（３−メタクリルオキシ−プロピル−トリメトキシシラン）、Pharmacia Biotechの製品）で表面をシラン化した。能動的エレクトロニックマトリックス基材をアルゴンプラズマエッチング（１００Ｗ，  ３０分）によって洗浄し、引き続いて、蒸気相条件下でＢｉｎｄ−ＳｉｌａｎｅＴＭと反応させた。蒸気相シラン化はポリスチレンペトリ皿（１５０ｘ１５ｍｍ）中で行った。５つの基材は皿中に中央に対して対称に置いた。水（２００μｌ）を５つの異なる周辺位置に置いてさらに分注した。Ｂｉｎｄ−ＳｉｌａｎｅＴＭ（２００μｌ）を大きな皿の中央に置いたペトリ皿（３５ｘ１０ｍｍ）に導入した。大きなペトリ皿を閉じ、室温にて反応を１５分間継続させた。基材を取り出し、９０℃のオーブン中での２時間の引き続いての加熱のためにガラスペトリ皿に入れた。
【０１２９】
能動的エレクトロニックマトリックスチップ上の浸透層としてのヒドロゲルの効果的機能を改良する１つの方法は、ヒドロゲルおよびチップの間に強力な接着を有することである。引き続いて共重合を介してヒドロゲルに連結させることができる重合性基を有するシランでチップを予め処理することによって、ヒドロゲルの基材表面への共有結合を達成することができる。Ｂｉｎｄ−ＳｉｌａｎｅＴＭ（３−メタクリルオキシ−プロピル−トリメトキシシラン）はプラズマで洗浄した能動的エレクトロニックマトリックスに容易に吸着される。引き続いて、チップ上のミクロ電極の周りの領域でのプラズマエッチングによって、吸着されたシランを表面ヒドロキシル基と反応させ、安定なシラン化表面の形成がもたらされる。完全な表面結合を確保するために、シラン吸着後に基材を空気オーブン中で９０℃にて２時間加熱した。このプロセスの結果、シランのオリゴ層（１０ないし１００層）の蒸着および固定化がもたらされる。（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＳ）での表面の蒸気相シラン化についての同様な実験は、正味のＡＰＳ蒸気の吸着の結果、安定な化学収着相ならびに排気によって除去することができる安定性の低い物理収着相がもたらされることを示した。
【０１３０】
Ｃ．例示的重合混合物処方
出願人らは、能動的エレクトロニックマトリックスチップで使用するためのいくつかのポリアクリルアミド−ベースの浸透層処方を開発し、その代表的な組をここに示す。単一のベースポリマー処方を用いるが、浸透層の合成ポリマー成分としてよく機能する別の処方も当業者によって工夫され得るであろう。同様に、誘導体化ＳＡはこれらの実施例に記載した浸透層で共重合されるが、もし非−ビオチン結合［例えば、共有結合化学またはサリチルヒドロキサム酸／フェノールボロニック酸化学］を利用してマイクロロケーションをアドレスするならば、他の適当な結合部位を浸透層と共重合できるであろう。同様に、もし浸透層が後に表面が誘導体化されるか、あるいは結合層がベースの浸透層に重ねるべきであれば、結合部位を完全に省略することができよう。しかしながら、前記した理由で、結合部位を単一層にて浸透層に共重合させるのが好ましいことが判明した。
【０１３１】
ＳＡのアクリル誘導体の製造は前記した。ポリオキシエチレン１００ステアリンエーテル（Ｂｒｉｊ７００）はSigmaから購入した。DMSOはAldrichの製品であった。DarocurR4265はCibaによって供給された。モノマー溶液は、Darocuroまず他の成分の添加の前にDMSOに溶解させた以外は、単に成分を一緒に混合し、撹拌することによって製造した。本明細書中に記載した例示的浸透層で用いる基本的処方は：
全アクリルアミド／メチレンビスアクリルアミド１８％w/v、１０モル％ビスアクリルアミド
アクリロイル−PEG-SA 14mg/ml
Darocur(DMSO中の1.9%w/v)溶液として添加
0.2%w/v 
Brij700:
式４０１２−１：mg/ml
式４０１２−２：１１mg/ml
式４０１２−３：１８mg/ml
式４００６−１：７３mg/ml
の水溶液であった。式４０１２−１は以下の機能的実験において対照合成ポリマーヒドロゲル組成物として供し、他方、４０１２−２、４０１２−３および４００６−１はテンプレーティングポロゲンの量を増加させる効果を示す。
【０１３２】
Ｄ.合成ポリマーヒドロゲル浸透層の能動的エレクトロニックマトリックスチップ表面へのミクロ成形
特別に設計された成形システムを、ヒドロゲル層の厚みおよびＵＶ照射強度の均一な分布双方の正確な制御のために開発した。該システムは、標準マイクロリソグラフィー技術によって製造された精度−形成窪みを持つ水晶ミクロ反応金型、およびＵＶ光源アセンブリーよりなる。重合混合物（０．３５μｌ）の溶液を金型表面に分注し、ミクロ電極アレイ基材を約１Ｎの圧力にて金型に押しつけた。重合は１５秒間の７００μＷ／ｃｍ２の初期強度、続いてのさらに１５秒間の７０ｍＷ／ｃｍ２のより高い強度において２工程で行った。チップを金型表面から取り出し、蒸留水の流れ中で５秒間洗浄し、窒素流下で乾燥した。次いで、このプロセスを次のチップについて反復した。
【０１３３】
チップ表面でのイン・サイチュ重合およびヒドロゲルの沈積を図４中の反応図式によって説明する。反応成形は、成形された層の優れた厚み制御を供する制御されたプロセスである。加えて該プロセスはＵＶ強度を制御するように設計され、さらに、重合速度およびヒドロゲル相の分離の程度の制御を行う。１０×アレイ基材上での成形されたヒドロゲルの立体顕微鏡暗視野像を図２に示す。１３６の成形された浸透層のバッチにわたる厚み制御をテストした。平均厚みはかなり均一であり、１．８±０．３μｍである。重合条件（ＵＶ強度および暴露時間）は光ＤＳＣを用いて最適化した。重合の間における形成性ポリマーおよび界面活性剤鋳型の間の最適な相分離は、２工程ＵＶ硬化プロセス：低強度（１５秒間のμＷ／ｃｍ２）への初期暴露、続いての高強度暴露（１５秒間の７０μＷ／ｃｍ２）を用いて達成された。より低い光強度での重合の開始は、発熱重合反応からのガス気泡の形成を最小化することが判明した。
【０１３４】
当業者が認識するごとく、このプロセスは、モノマー溶液を金型に分注し、チップをモールドに位置させ、チップをモールドに押しつけ、モールドを照射し、などを行うように設計されたロボットで容易に自動化される。かくして、このタイプのプロセスは、能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスの高スループット製造に容易に適合させることができる。
【０１３５】
界面活性剤の完全な除去を達成するため、基材を十分に水で洗浄した。それを、一晩振とうしつつ、ペトリ皿中の蒸留水に入れ、続いて、流れる蒸留水で徹底的にすすいだ。これは、ＢＲＩＪ界面活性剤物質を除去し、後にメソ構造の合成ポリマーヒドロゲル浸透層残すのに十分なことを保証した。
【０１３６】
実施例２：メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層構造の走査型電子顕微鏡観察
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用い、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の形態を調べた。ＳＥＭ用の試料は、グラジエント様式でエタノールを水で徐々に交換し、引き続いて、超臨界ＣＯ２を用いる臨界点乾燥技術による乾燥によって調製した。この手法は、ほとんど改変することなく、ポリマーのゲル構造を維持すると報告されている。走査型電子顕微鏡写真が図５ＡおよびＢ（４０１２−１）、６ＡおよびＢ（４００１２−２）、７ＡおよびＢ（４０１２−３）および８ＡおよびＢ（４００６−１）に示す。これらの顕微鏡写真は５，０００×走査におけるゲルの微細構造を明瞭に示し、４５，０００×走査におけるゲルのメソ構造を示す。これらの写真より、特に、４０１２−１の比較的物理的に均一な性質と比べて、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の物理的な不均一な性質が明らかである。
【０１３７】
５，０００倍率で調べると、４０１２−１（ポア鋳型なし）は、他の浸透層と比べた場合に、比較的平滑な非多孔性形態を有するようであった。４０１２−３および４００６−１はより大きなポアの広い分布を持つ非常に多孔性の構造を呈した。ゲル構造中のポアはおおまかに３つのクラスに分類することができる：
クラスＩ−１００ｎｍ未満のポア（ナノポーラス）
クラスＩＩ−主として、１００ないし５００ｎｍの範囲の１００ないし１０００ｎｍのオーダーのポア（メソポーラス）
クラスＩＩＩ−１ないしμｍのオーダー
クラスＩＩポアはこの倍率では存在するように見えなかったが、大きなポアクラスＩＩＩ（ミクロンオーダー）は処方番号４０１２−２では明らかでなかった。
【０１３８】
これらの浸透層のより高い倍率の像（４５，０００×）は、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層の微細なポア構造が、メソポーラス構造を示す４０１２−２、４０１２−３および４０６６−１と非常に似ていることを示した。また、より高い鋳型濃度の合成ポリマーヒドロゲル浸透層４０１２−３および４０６６−１は、メソポーラス浸透層材料のミクロポアの分離領域を示す。そのようなヒクロポアは、おそらく、４０１２−３および４０６６−１の間の比較的不変の形態を除き、４０１２−２および４０１２−３の間の形態のシャープな差を説明する、重合混合物中のある濃度を超える界面活性剤ミセルの業種を示す。
【０１３９】
かくして、合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、３つのグループに分けることができる：４０１２−１はナノポーラスであり（クラスＩ）、４０１２−２はメソポーラスであり（クラスＩＩ）、他方４０１２−３および４０６６−１はメソポーラスであってマイクロポーラスである（クラスＩＩおよびＩＩＩ）。
【０１４０】
実施例３：
メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の多孔度を定量するためのθの使用
走査型電子顕微鏡写真によって示されるごとく、合成ポリマーヒドロゲルの多孔度は、重合混合物で用いたＢｒｉｊ界面活性剤のごとき鋳型ポロゲンの量を変化させることによって変化させることができる。ＳＥＭ顕微鏡写真は、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の形態を定性的かつ定量的に評価するのに有用であるが、より労働の少ない強い定量的多孔度測定が望まれた。その目的のために、暗視野顕微鏡を用いて、相分離による形態学的変化を定量した。
【０１４１】
無次元パラメーターθ（θ）を用いて、暗視野顕微鏡での光散乱測定に基づき、相分離または多孔度の程度を表した。相分離の無次元の程度（θ）は、ＬｅｉｃａＩＮＭ  １００暗視野顕微鏡でのテストチップ上の乾燥ヒドロゲル層（λ）、中程度の層分離を持つ標準層（λｓ）、および層分離なしのまたは固体の層（λ０）の暗視野光強度の読みを積分することにより決定し、以下の式で計算した。λ０＞＞１の場合、式は以下のごとく単純化することができる：
【０１４２】
【数２】
2005512069.tif 000011
【０１４３】
理想的な相分離なしの相に近づく表面の例は、エレクトロニクスグレードのシリコンウエハー上の気相蒸着白金のごとく非常に平滑な表面であろう。多孔度の関数としてのポリマー相のθの変化を４０１２−１，４０１２−２，４０１２−３および４００６−１について測定した。標準的な相は以下の組成のポリアクリルアミドヒドロゲルであった（組成Ｓ）：
アクリルアミド：ビスアクリルアミド１９：１（モル／モル）
全モノマー含有量  ２０重量％
【０１４４】
実施例で用いた照射条件下では、λｓは６０±１．５であり、これを３つの実験で用いた。鋳型コロゲンなくして重合した４０１２−１についてのθ値は１．３５であった。Brijを該処方に添加すると相分離または多孔度を増加させ、かくして、θ値を増加させる。処方４０１２−２は、３．０６のθを有し、４０１２−３は３．２７のθを有し、４００６−１は３．００のθを有した。かくして、例示的なメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の全ては範囲３．０ないし３．５のθを有した。
【０１４５】
異なるバッチの重合混合物から作成したいくつかのミクロ成形浸透層を前記技術を用いてテストした。浸透層の処方は、N-アクリル-SAをアクリロイル−ＰＥＧ−ＳＡの代わりに用いる以外は４００６−１と同一であった。結果を図１０のチャートに示す。θ多孔度測定は２０の異なるバッチにわたって、非常に合致する（３．６３±０．０７の平均θ）。興味深いことには、N-アクリル−ＳＡの使用は、アクリロイル−ＰＥＧ−ＳＡと比較して、浸透層の相対的相分離または多孔度を増大させた。これは、重合処方におけるわずかな変化が多孔度に対して有し得るインパクトを示す。これらのデータは、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層が一様に能動的エレクトロニックマトリックスデバイスに成形することができるのをさらに示す。同様に、光−散乱測定技術の合致性も有効とする。
【０１４６】
実施例４：ＳＡ−アガロース浸透層に対するメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の比較
メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層の性能をNanogenの現在のＳＡ−アガロース浸透層(MSP)と比較するために、２層を持つ能動的エレクトロニックマトリックスチップを用い、単一ヌクレオチド多形アッセイ（SNPアッセイ）を行った。SNP１アッセイにおいては、〜１２０ntのビオチン化アンプリコン（50mMヒスチジン中５nM）を２．１Ｖの一定電位にて２分間で双方のチップ上のマイクロロケーションに電子的にアドレスさせた。次いで、C-対立遺伝子のためのCy３標識レポーターオリゴヌクレオチドおよびT-対立遺伝子のためのCy5標識レポーターオリゴヌクレオチド（共に12nt長）を、高塩緩衝液（50mMリン酸ナトリウム，５００ｍＭ塩化ナトリウム）中５００nMの濃度にて、チップに受動的にハイブリダイズさせた。
【０１４７】
結果を図１１に示す。４００６−１浸透層を持つ３つの能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスで行った。SNP1アッセイについての平均蛍光強度の読みは、一般に、全てのテストした３つのチップについて２０００を超えるものであった。双方の対立遺伝子プローブ（Ｃ−対立遺伝子―Ｃｙ―３，およびＴ−対立遺伝子−Ｃｙ−５）は、よく検出され、ヘテロ接合性アンプリコン試料の容易な同定が可能であった。標準ＳＡ−アガロース浸透層チップで行った同一アッセイの結果と比較して、４００６−１メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層処方はＳＮＰアッセイにおいて改良されたシグナル強度を呈した。４００６−１チップでの蛍光強度の読みは、一般に、ＳＡ−アガロースチップを用いて得られたものよりも高かった。
【０１４８】
長さが約１５０ないし約２５０ntの試料核酸からのアンプリコン、および塩基−スタッキング様式レポータープローブを用い、臨床的に注目される同様なＳＮＰアッセイを２０の４００６−１  Ｎ−アクリル−ＳＡチップで行った。一般に、比較的低い濃度のビオチン化アンプリコンを５０ｍＭヒスチジン緩衝液中の能動的エレクトロニックマトリックスチップ上のマイクロロケーションに電子的にアドレスした。次いで、安定化剤プローブおよび塩基−スタッキング安定化可能対立遺伝子特異的レポータープローブ（Ｃｙ−３およびＣｙ−５標識）を、より高い濃度および高塩条件下で、アドレスされたアンプリコンに受動的にハイブリダイズさせた。次いで、熱的ストリンジェンシーを適用した後、平均蛍光強度測定を行った。アッセイについての性能結果を以下の表に示す：
【０１４９】
【表２−１】
2005512069.tif 000012
【０１５０】
【表２−２】
2005512069.tif 000013
【０１５１】
前記表の結果から分かるように、４００６−１能動的エレクトロニックマトリックスチップはテストしたＳＮＰアッセイで非常によく働き、対立遺伝子（Ｃｙ−３およびＣｙ−５標識レポーターオリゴ）の間には優れた区別比率が伴った。SNP2およびＳＮＰ３を多重アッセイフォーマットでテストし、ここに、双方のアンプリコンを核酸試料から個々に増幅し、次いで、同一マイクロロケーションに同時にアドレスし、順次レポーターオリゴマーとのハイブリダイゼーションによってテストした。熱的ストリンジェンシーを適用して、一組のレポーターオリゴマーを除去した後、蛍光結果を順次読み取った。ＳＮＰ２についての２つの判定なしは、特定の核酸試料における増幅は失敗したことが後に示された。
【０１５２】
実施例５：  メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層における小さなおよび中程度の長さの核酸結合の比較
商業的に入手可能なＮａｎｏｇｅｎ  NanoChipR Molecular Biology Workstation (Nanogen, Inc.)チップアドレッシングモジュールは、実質的に同一条件下で、同一時刻に４つのチップにアドレスすることができる。かくして、合成ポリマーヒドロゲル浸透層の比較実験のために、４つの異なるアクリロイル−ＰＥＧ−ＳＡヒドロゲル処方（４０１２−１，  ４０１２−２，  ４０１２−３および４００６−１）を持つ４つのチップをアドレッシングモジュールに入れ、以下の手法に従って、１対１アドレスした：
【０１５３】
（正常な架橋されたアクリルアミドヒドロゲルのごとき）ナノポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層と比較したメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層における共重合化ＳＡ結合部位に結合する（長さが５０ｎｔ下の）比較的小さな核酸の能力を直接的結合アッセイによって確認した。これは、捕獲プローブで用いられるごとく、比較的小さな核酸の合成ポリマーヒドロゲル浸透層チップへの結合の程度の直接的尺度である。フルオロフォアー標識４６−ｎｔ  ＤＮＡ（５’末端はビオチン化）５ｎＭをチップに対して電子的にアドレスした（２．０ｖ；６０秒）。核酸はフルオロフォアーで直接的に標識したので、チップでの蛍光強度はＤＮＡ結合の程度の直接的尺度であった。アッセイの結果を図２中の菱形で記した線で示す。
【０１５４】
ナノポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層と比較してメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層中の共重合化ＳＡ結合部位に対する中程度のサイズの核酸（長さが約６０ないし１８０ヌクレオチド）の能力を測定するために、ドットブロットアッセイを用いた。５’末端がビオチン化された１１４ｎｔ一本鎖ＤＮＡアンプリコンを同一電子条件下でチップに電子的にアドレスさせた。次いで、フルオロフォアー標識レポーターオリゴヌクレオチド（１２ｂｐ）を、チップに結合したアンプリコンに受動的にハイブリダイズさせた。異なる合成ポリマーヒドロゲル浸透層処方についての蛍光強度の結果を図２で四角の印によって示す。
【０１５５】
かくして、番号４０１２−１のごときナノポーラスヒドロゲルは、より短いオリゴヌクレオチドとの結合相互作用に好都合のようである。１１４−量体についてのＭＦＩの読みは４６−量体のそれよりもほとんど３倍低かった。メソポーラス浸透層を用いた場合（４０１２−２，４０１２−３，および４００６−１）、より長いＤＮＡ（１１４−量体）の結合は劇的に増加した（〜４倍）。増大したシグナル強度は、約３．０を超えるθ（すなわち、組成物４００６−１）まで増大した多孔度（θ）とより直接的に創刊する。これらのデータは、このタイプのアッセイについての最大性能が、約２ないし約３のθを持つ多孔度を有するメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層を用いて得ることができることを示唆する。これらのデータにおいて、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、ＳＮＰ、ＳＴＲ、または遺伝子発現分析でしばしば用いられるサイズのアンプリコンにアドレシングした場合、ナノポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層よりも優れた明瞭な利点を示した。これは、より長いポアを介する長いＤＮＡへの固定化されたＳＡの増大した接近性の結果であろう。
【０１５６】
しかしながら、より短いＤＮＡ（４６−ｂｐ）は、増大した多孔度での結合においてわずかな減少を示した。さらなる実験の結果は、電子的アドレシング条件下では、より短いＤＮＡが、ストレプトアビジン−ビオチン複合化を達成するための十分な時間なくしてメソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層を介して浸透することができるのを示唆する。これは、さらに、短いＤＮＡがメソポーラスおよび非ポーラス層双方に同等によく結合した受動的ＤＮＡ結合実験（すなわち、いずれの適用された電場もない）によって確認された。
【０１５７】
実施例６：メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層におけるプライマー延長レポーティング直線性の比較
非常に多数のアンプリコンの存在および／または量を検出すべき多重アッセイに置いて、アンプリコンのプライマー延長検出はレポーター／安定化剤プローブの二量体化を回避するのに望ましい。かくして、４つの合成ポリマーヒドロゲル処方につきテストするために、標的デオキシリボ核酸（７８ｎｔ）の電子的ハイブリダイゼーションを行い、続いてチップで合成レポーティングを行った。最初に、標的ＤＮＡ配列に相補的な捕獲オリゴヌクレオチド（５００ｎＭ）をチップに負荷し、引き続いて、異なる濃度（０．５ｎＭ、１．０んＭ、２．０ｎＭ、４．０ｎＭ、８．０ｎＭ、および１６．０ｎＭ）の標的に電子的にハイブリダイズさせた。ｄＤＴＰ−Ｃｙ５を含有するｄＮＴＰを用いる酵素プライマー延長を用いて、標的ハイブリダイゼーションの程度を定量した。
【０１５８】
これらのアッセイにおいて、チップで測定した蛍光強度は２つの主な因子：ＤＮＡのチップへの結合の効率、およびポリメラーゼ酵素による捕獲プライマー延長の効率によって影響される。延長反応は、ポリマー表面の多孔度、および引き続いてのマトリックス中のＤＮＡへの接近性に依存する。結果を図１３に示す。
【０１５９】
図１３に示されるごとく、ナノポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層４０１２−１は、〜２ｎＭまでの標的濃度につきＭＦＩで比較的直線的増加を示した。濃度のさらなる増加はシグナルの強度を増加させなかった。この現象は１）標的ハイブリダイゼーションの減少および／または、２）ポリメラーゼ酵素によるハイブリダイズした核酸に対する接近の現象の組み合わされた効果によるものであろう。対照的に、メソポーラス合成ポリマーヒドロゲル浸透層（４０１２−２，４０１２−３，および４００６−１）は、二桁の大きさにわたる全濃度範囲での標的濃度の増加に対してシグナル強度の良好な直線的増加を呈した。このタイプの直線的応答曲線は、遺伝子発現分析、またはウイルス負荷／集団実験におけるごとく、標的核酸の間の定量的な関係を調べる適用で望ましい。
【０１６０】
実施例７：光−散乱θ技術および逆ドットブロット核酸アッセイを用いる種々の合成ヒドロゲル浸透層処方の比較
θによって測定した、合成ポリマーヒドロゲル浸透層の多孔度に対する種々の量の鋳型ポロゲンの効果を調べるために、種々の量のＢｒｉｊ７００界面活性剤を添加した基本的重合混合物を用い、前記したごとく、浸透層を能動的エレクトロニックマトリックスチップ基材上に形成した。用いた濃度（ｍｇ／ｍｌ）は０．０、３．９、９．３、１８．６、５５．８、７１．３、８０．６、１０２．３および１７０．４であった。ほとんどのＢｒｉｊ界面活性剤についての臨界ミセル濃度は１ｍｇ／ｍｌであるので、３．９は用いた最低濃度であった。θ測定で用いた標準λは６０±１．５であった。図１４で見られるように、合成ポリマーヒドロゲル浸透層は、より低い濃度の界面活性剤鋳型を通じて相分離または多孔度のむしろ顕著な増加を示した。これは、約３．５の最小θ範囲に対する約８０ｍｇ／ｍｌ  Ｂｒｉｊ７００界面活性剤においてレベルオフした。これは、実施例２に記載したごとく、浸透層のＳＥＭ調査による多孔度の観察と一致する。
【０１６１】
前記発明は明瞭性および理解の目的で説明および例示によりある程度詳しく記載したが、添付の請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、ある種の変形および修飾をなすことは本発明の教示に照らして当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、８０μｍの電極直径を持つ電極を有し、２００μｍの中心間隔に対して中心にあるNanoChipR １００部位デバイスのエレクトロニクスの写真である。ここに制御可能な電極はデバイスの能動的部位を規定する。示された電極は、二酸化ケイ素基材の層の上に形成された、チタン／タングステンの層の上に形成された白金（非反応性貴金属）の層である。電極の導電層には絶縁性二酸化ケイ素の層が重ねられており、これは、エッチングされて電極パッドを露出していることに注意されたし。また、（＋）または（−）バイアス状態にあるマイクロロケーション電極の全ての使用を可能とするように反対に偏らせることができる、１０アレイだけ中央１０を囲う対電極のリングに注意されたし。
【図２】図２は、メソポーラス浸透層を持つ、同一タイプのデバイスの立体顕微鏡暗視顕微鏡写真である。浸透層はデバイスにミクロ成形された。
【図３】図３は、アクリルアミドヒドロゲルとの共重合のための２つの誘導体化ストレプトアビジン（ＳＡ）蛋白質の形成を示す反応図式である。ＳＡとＮ−アクリルオキシスクシンイミドとの反応によりアクリルアミド基が生じ、他方、ＳＡとアクリルイル−ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとの反応により、ＰＥＧ−エステルが連結したアクリレート部位を持つＳＡが生じる。エステルが連結したＳＡ誘導体は、広い範囲のｐＨにわたるその安定性の低下のため、ヒドロゲル形成で用いるのにより好ましくない。同様に、結合化学は塩基−または酸−不安定ではなく、一般により好ましいが、浸透層形成の合成ポリマーヒドロゲルで用いるのに必ずしもそうではない。例えば、Ｎ−アクリロイルスクシンイミドは、もしアミン、ヒドラジド、または同様な化学を用いて、例えば、核酸プローブまたはアンプリコンをデバイスの浸透層に共有結合させるならば、共有結合用の結合基として用いることができる。
【図４】図４は、ＳＡ結合部位を含浸させたメソポーラスアクリルアミド架橋ヒドロゲルを形成するための、アクリロイル−ＰＥＧ−ＳＡ誘導体とアクリルアミドとのBrijミセルの存在下での共重合を示す反応図式である。（3-メタクリルオキシ−プロピル−トリメトキシシランとも呼ばれるBind SilaneTMのごとき）リンカーシラン誘導体で活性化されている表面を持つ能動的エレクトロニックアレイデバイス上方で重合が起こる場合、リンカー部位のポリマーへの取り込みによって、ポリマーヒドロゲルマトリックスはデバイスの表面に共有結合するようになることに注意されたし。
【図５Ａ−Ｂ】図５ＡおよびＢは、デバイス上の成形された物理的に均一なナノポーラスポリアクリルアミドヒドロゲル浸透層（４０１２−１）の表面の走査型電子顕微鏡写真である。この形成では、テンプレーティング剤（Brij界面活性剤）を用いなかった。ゲルの表面は５，０００ｘ走査（５Ａ）（スケールバー５．００μｍ）において比較的平滑なようである。該表面は、４５，０００×走査（５Ｂ）（スケールバー５００ｎｍ）においてナノメートル−スケールのポアのみを示す。これは、他の箇所で報告した均一に重合されたアクリルアミドヒドロゲルにおける見積もられたポアサイズに合致する。サイズが１００ｎｍ未満のこれらのポアを本明細書中で「クラスＩポア」という。
【図６Ａ−Ｂ】図６ＡおよびＢは、デバイス上の成形された物理的に不均一なメソポーラスポリアクリルアミドヒドロゲル浸透層（４０１２−２）の表面の走査型電子顕微鏡写真である。この形成では、１１ｍｇ／ｍｌのテンプレーティング剤（Brij700界面活性剤）を用いた。ゲルの表面は５，０００ｘ走査（６Ａ）（スケールバー５．００μｍ）において穴がたくさん開いて見える。該表面は、５０，０００ｘ走査（６Ｂ）（スケールバー５００ｎｍ）における１００ないし５００ナノメートル−スケールのポアを示す。サイズが約１００ｎｍないし５００ｎｍのこれらのポアを本明細書中では「クラスＩＩポア」という。
【図７Ａ−Ｂ】図７ＡおよびＢは、デバイス上の成形された物理的に不均一なメソポーラス／ミクロポーラスポリアクリルアミドヒドロゲル浸透層（４０１２−３）の表面の走査型電子顕微鏡写真である。この形成では、１８ｍｇ／ｍｌのテンプレーティング剤（Brij700界面活性剤）を用いた。ゲルの表面は、５，０００ｘ走査（７Ａ）（スケールバー５．００μｍ）において穴が開き、ごつごつして見える。マイクロメートルスケールのポアはこの倍率で目に見える。約５００ｎｍないし約２．００μｍのこれらのポアを本明細書中では「クラスＩＩＩポア」という。表面は、５０，０００ｘ走査（７Ｂ）（スケールバー５００ｎｍ）においてクラスＩＩのポアを示す。
【図８Ａ−Ｂ】図８およびＢは、デバイス上の成形された物理的に不均一なメソポーラス／ミクロポーラスポリアクリルアミドヒドロゲル浸透層（４００６−１）の表面の走査型電子顕微鏡写真である。この形成では、７３ｍｇ／ｍｌのテンプレーティング剤（Brij700界面活性剤）を用いた。ゲルの表面は、５，０００ｘ走査（８Ａ）（スケールバー５．００μｍ）において穴が開き、ごつごつして見え、これはクラスＩＩのポアを呈する。該表面は５０，０００ｘ走査（８Ｂ）（スケールバー５００ｎｍ）においてクラスＩＩのポアを示す。
【図９】図９は、θ計算用の光散乱値を測定するのに用いたもののようなデバイスの単一マイクロロケーションまたはパッドの暗視野複合顕微鏡写真（OppromicsTMビデオカメラでのLeica iNM 100)である。パッド直径は８０μｍである。
【図１０】図１０は、NanoChipRデバイス上に形成されたいくつかのバッチの４００６−１浸透層についてのθ測定を示すチャートである。θ多孔度測定は２０の異なるバッチにわたって非常に合致している（平均３．６３θ，標準偏差±０．０７θ）。これらのデータは、メソポーラス合成ヒドロゲル浸透層が、終始一貫して能動的エレクトロニックマトリックスデバイスに成形することができることを示す。同様に、光散乱測定技術の合致も有効化される。
【図１１】図１１は、４００６−１浸透層を持つ３つの能動的エレクトロニックマトリックスチップデバイスで行った、実施例４に記載したＳＮＰ１アッセイについての平均蛍光強度（MFI)の読み、および標準的ＳＡ−アガロース浸透層チップで行った同一アッセイの結果を示すチャートである。４００６−１チップでの蛍光強度の読みは、一般に、ＳＡ−アガロースチップでのそれよりも高く、双方の対立遺伝子プローブ（Ｃ−対立遺伝子−Cy−3、およびT-対立遺伝子−Cy−5)は良好な読みを与え、ヘテロ接合性アンプリコン混合物の容易な同定を可能とすることに注意されたし。
【図１２】図１２は、実施例５に記載した２つの核酸固定化実験からのＭＦＩの読みを示すチャートである。４６ntオリゴマーの固定化実験の結果は菱形（◆）によって示され、１１４ntアンプリコンの固定化実験の結果は四角（■）によって示される。より大きな核酸の相対的結合効率は多孔度の増大と共に有意に増加し、他方、小さな核酸の結合効率は多孔度の増大に伴い非常にわずかに減少することに注意されたし。
【図１３】図１３は、実施例６に記載したプライマー延長アッセイ実験からのＭＦＩの読みを示すチャートであり、ここに、０．５ｎｍ、１．０ｎｍ、２．０ｎｍ、４．０ｎｍ、８．０ｎｍ、および１６．０ｎｍ濃度の試料をアンプリコンを、４０１２−１、４０１２−２、４０１２−３または４００６−１浸透層処方を持つチップ上の複数部位に向けた。蛍光強度は、ナノポーラス浸透層チップ４０１２−１（◆）での増大する核酸濃度と共に直線的には増加しないが、メソポーラス浸透層チップ４０１２−２（▲）、４０１２−３（■）および４００６−１（●）上で直線的に増加する。
【図１４】図１４は、鋳型ポロゲンとして種々の量のBrij700界面活性剤を用いることによってなした合成ポリマーヒドロゲル浸透層についてのθ測定を示すチャートである。
【図１５】図１５は、ミクロ成形プロセスの模式図である。光波長（hv)に対して透明な底を持つミクロ金型で出発し、重合混合物の滴を工程１で金型に入れる。工程２においては、能動的エレクトロニックマトリックスチップ基材を該混合物および金型と接触させ、密な容量の重合混合物を形成する。工程３において、金型に重合を開始するのに適切な波長の光を照射させることによって混合物を重合する。工程４においては、電極上の新しく形成された浸透層に沿って基材を除去し、プロセスが、工程５における新しい能動的エレクトロニックマトリックスチップ基材で再度出発することを可能とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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