(57)【要約】本発明は、出発エリスロポエチン（ＥＰＯ）グリコアイソフォーム（ｇｌｙｃｏ−ｉｓｏｆｏｒｍ）プロフィールが変化する又は修飾されるような特定クロマトグラフィー段階の組合せを使用することにより、高い純度とＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールを備えたエリスロポエチン（ＥＰＯ）の生産方法を提供する。適用するクロマトグラフィー段階は、少なくとも（ａ）染料アフィニティークロマトグラフィー、及び（ｂ）疎水性クロマトグラフィー及び／又は（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。好ましい実施態様では、該方法は（ｄ）ゲルろ過クロマトグラフィーをさらに含む。本発明はまた、ＥＰＯ含有組成物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）グリコアイソフォームプロフィールの測定方法も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）含有組成物を、
（ａ）染料アフィニティークロマトグラフィー（ｄｙｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、及び
（ｂ）疎水性クロマトグラフィー、及び／又は
（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー
のクロマトグラフィー段階に供することを含み、上記クロマトグラフィー段階後に出発ＥＰＯ含有組成物に比べてＥＰＯグリコアイソフォーム（ｇｌｙｃｏ−ｉｓｏｆｏｒｍ）プロフィールが変化するように実施される、グリコアイソフォーム混合物の形態のエリスロポエチン（ＥＰＯ）の製造方法。
【請求項２】
上記染料アフィニティークロマトグラフィーを基質結合染料Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ  ３Ｇで実施する、請求項１に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項３】
上記疎水性クロマトグラフィーをブチル化基質担体で実施する、請求項１又は２に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項４】
上記クロマトグラフィー段階が、（ｄ）ゲルクロマトグラフィーをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項５】
上記クロマトグラフィー段階が、以下に示す順序：
（ａ）、（ｂ）、場合により（ｃ）及び／又は（ｄ）；あるいは
（ａ）、（ｃ）、場合により（ｂ）及び／又は（ｄ）；あるいは
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ａ）、（ｃ）、（ｂ）、各々の場合により（ｄ）
から成る、請求項１から４のいずれか一項に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項６】
少なくとも１つの間欠的ろ過段階を実施する、請求項１又は５に記載の方法。
【請求項７】
ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの変化が、ＥＰＯ１分子当り３シアル酸基までの範囲に相当するＥＰＯグリコアイソフォームの割合、又はＥＰＯ１分子当り４シアル酸基までの範囲に相当するＥＰＯグリコアイソフォームの割合、又はＥＰＯ１分子当り５シアル酸基までの範囲に相当するＥＰＯグリコアイソフォームの割合が低下しているＥＰＯグリコアイソフォーム混合物を提供するように実施される、請求項１に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項８】
ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの変化が、各々がＥＰＯ１分子につき特定含量のシアル酸を有するＥＰＯグリコアイソフォームの所望混合物を提供するように実施される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項９】
上記所望ＥＰＯグリコアイソフォーム混合物が、上記クロマトグラフィー段階の１又はそれ以上の条件を調整することによって製造される、請求項８に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項１０】
ＥＰＯ１分子当り６−１４シアル酸基の範囲、好ましくは７−１３シアル酸基の範囲、最も好ましくは８−１３シアル酸基の範囲に相当する、ＥＰＯ１分子につき特定含量のシアル酸を有するＥＰＯグリコアイソフォーム混合物が得られる、請求項８又は９に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項１１】
ＥＰＯグリコアイソフォーム混合物のプロフィールを、少なくとも１つの選択クロマトグラフィー段階の前及び／又は後に、請求項１３に記載の方法を実施することによって測定する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のグリコアイソフォーム混合物の形態のエリスロポエチン（ＥＰＯ）を製造すること、及び
製造したＥＰＯと薬学的に許容し得る担体との混合物を提供すること
を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１３】
培養上清から、及び／又は多数のクロマトグラフィー段階を含むＥＰＯの単離及び精製工程の中間段階又は終了時に、及び／又は医薬組成物から、ＥＰＯ含有組成物を提供すること、
上記ＥＰＯ含有組成物をゲル基質中で等電点電気泳動（ＩＥＦ）に供すること、
上記ゲルからタンパク質を膜に移すこと、及び
上記膜上でＥＰＯを免疫検出すること
の段階を含み、グリコアイソフォーム混合物の形態のＥＰＯを製造する工程の前及び／又は工程中の選択段階で、場合によりそれに加えて上記ＥＰＯ製造工程の終了時及び／又は上記医薬組成物の製造後に実施される、ＥＰＯ含有組成物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）グリコアイソフォームプロフィールの測定方法。
【請求項１４】
ＥＰＯグリコアイソフォームをＥＰＯの単離及び精製工程中に少なくとも２回測定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
所定のＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールを得るためにクロマトグラフィー段階の条件を制御するのに使用される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
グリコアイソフォーム混合物の形態のＥＰＯを製造する方法が、請求項１から１２のいずれかに記載の方法である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の組合せのクロマトグラフィー段階を使用することによるエリスロポエチン（ＥＰＯ）の単離のための新しい方法に関する。この方法は、高い純度とＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールを備えたエリスロポエチンの生産を可能にする。
【０００２】
ＥＰＯは、赤血球系前駆細胞の赤血球への増殖と分化において主要な役割を果たす糖タンパク質である。組換えＤＮＡテクノロジーで得られるＥＰＯ（組換えＥＰＯ）は臨床応用に使用される。
【０００３】
ＥＰＯは、タンパク質の荷電糖鎖部分の数が異なるグリコアイソフォームの混合物として存在する。ＥＰＯグリコアイソフォームの種々の混合物の群は、ＥＰＯ−α、ＥＰＯ−β及びＥＰＯ−ωを含む。
【背景技術】
【０００４】
ＥＰＯ及びその生産のための方法は、例えば欧州特許第１４８６０５号、同第２０５５６４号及び同第２５５２３１号に述べられている。
【０００５】
ＥＰＯは、遺伝的に改変された哺乳類細胞も包含する、種々のソースから単離することができる。学術及び特許文献から既知である単離／精製の方法は様々なクロマトグラフィー段階を含む。最も一般的に使用されるのは、陰イオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）である。他のクロマトグラフィー法も使用される：ヒドロキシアパタイト、疎水性、陽イオン交換、アフィニティー（すなわちイムノアフィニティー）及びサイズ排除（ゲルろ過）クロマトグラフィー。中間段階が共通するものもある：塩析、濃縮、ろ過透析（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、限外ろ過、透析、エタノールによる沈殿等。
【０００６】
ＥＰＯの単離のためのプロセスは、いくつかの欧州特許および欧州特許出願に、また科学文献にも記載されている。
【０００７】
ＲＰ−ＨＰＬＣの使用を含む、ＥＰＯの単離のための方法は、欧州特許第２０５５６４号、同第１４８６０５号、同第８３０３７６号、同第２６７６７８号、同第２２８４５２号、同第１１２７０６３号、同第２０９５３９号及びＬａｉら（１９８６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６１（７）：３１１６−２１、Ｂｒｏｕｄｙら（１９８８）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，２６５（２）：３２９−３３６、Ｚｏｕら（１９８８）Ｓｅ  Ｐｕ、Ｉｎｏｕｅら（１９９４）Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒ  Ｂｕｌｌ，１７（２）：１８０−４、Ｑｉａｎら（１９８６）Ｂｌｏｏｄ，６８（１）：２５８−６２、Ｋｒｙｓｔａｌら（１９８６）Ｂｌｏｏｄ６７（１）：７１−９及びＬａｎｇｅら（１９８４）Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，１０（２−３）：３０５−１４に述べられている。ＲＰ−ＨＰＬＣは、ほとんどの場合、有機非極性溶媒の使用を必要とする。有機非極性溶媒は毒性であり、環境を汚染し、また所望タンパク質から分離することが難しい。
【０００８】
結合モノクローナル抗体によるイムノアフィニティークロマトグラフィーを含むＥＰＯの単離のための方法は、Ｓａｓａｋｉら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，Ｙａｎａｇａｗａら（１９８４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２５９（５）：２７０７−１０及びＧｈａｎｅｍら（１９９４）Ｐｒｅｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２４（２）：１２７−４２に述べられている。モノクローナル抗体は哺乳類タンパク質であり、大規模生産についてのそれらの安定性は疑わしく、また適切な清掃と衛生の実行は困難である。またウイルスによる感染の危険性もある。
【０００９】
欧州特許第３５８４６３号では、ＥＰＯの分離のためのイオン交換クロマトグラフィーと結合レクチンによるクロマトグラフィーの組合せが述べられている。この方法は低い収率しか提供しない。
【００１０】
塩析及びゲルろ過と組み合わせたレクチン基質の使用が欧州特許第１０１０７５８号に述べられている。やはり低い収率しか得られない。
【００１１】
ＥＰＯの精製のためのジヒドロキシボロニル基質の使用が欧州特許第８２０４６８号に述べられている。これは、ヒト医療においては使用できない低い純度である。
【００１２】
欧州特許第１１２７０６３号は、硫酸アンモニウムによる沈殿、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン及び陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過又は前記クロマトグラフィーの種々の組合せを使用することによるＥＰＯの単離を述べている。この方法は、ヒト医療における使用に適する高い純度を備えた、大規模生産できるＥＰＯを提供する。硫酸アンモニウムの使用は規模の拡張性に関する問題を引き起こす可能性があり、付加的な装置を必要とし、相の変更の必要性がある。
【００１３】
欧州特許第９８４０６２号は、基質結合染色によるクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することによるＥＰＯの単離を述べている。所望プロフィールのアイソフォームの単離、あるいはクロマトグラフィー段階の組合せによってＥＰＯグリコアイソフォームを変化させる可能性は記述されていない。
【００１４】
欧州特許第６４０６１９号では、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することによる特定ＥＰＯグリコアイソフォームの単離が述べられている。しかし、種々のＥＰＯグリコアイソフォームの混合物の製造方法についての記述はない。さらに、その方法では高純度のＥＰＯを単離することは不可能である。
【００１５】
欧州特許第４２８２６７号は、分取等電点電気泳動段階を含む特定ＥＰＯグリコアイソフォームの単離のための方法、及びＲＰ−ＨＰＬＣ精製段階後に実施する陰イオン交換クロマトグラフィー段階を含む、１分子当り１２個又はそれ以上のシアル酸を有するＥＰＯグリコアイソフォームの混合物の単離のための方法を述べている。さらに、この方法は、アイソフォーム、特に１２個未満のシアル酸を有するものの所望混合物を目標とする管理が不可能である。所望プロフィールのアイソフォームの単離、あるいはクロマトグラフィー段階の組合せによってＥＰＯグリコアイソフォームを変化させる可能性は記述されていない。
【００１６】
ＥＰＯ類似体の正確な数のＥＰＯグリコアイソフォームの単離のための方法が欧州特許第１０３７９２１号に述べられている。その方法はＲＰ−ＨＰＬＣを使用する。
【００１７】
キャピラリー等電点電気泳動を使用することによる特定ＥＰＯグリコアイソフォームの分離が、Ｃｉｆｕｅｎｔｅｓら（１９９９）、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ，１５（２）：４５３−６３に述べられている。しかし、この方法では尿素が使用されており、臨床適用を妨げる。キャピラリー等電点電気泳動の使用は産業における大規模生産には適さない。
【００１８】
種々のクロマトグラフィー法を使用した工程によるＥＰＯグリコアイソフォームの分離は、Ｇｏｋａｎａら（１９９７）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔ  Ａ，７９１：１０９−１８にも述べられている。その方法は、結合モノクローナル抗体によるイムノアフィニティークロマトグラフィーの使用を含む。これは、臨床応用にとって有害なウイルス感染の危険性を上昇させ、大規模生産のための安定性は疑問であり、適切な清掃と衛生の実行は困難である。さらにこの方法は、通常は毒性有機溶媒を必要とするＲＰ−ＨＰＬＣの使用を含む。それ故、この系を産業応用に使用することは難しい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ＥＰＯを生産するための方法を改善することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、請求項１に記載のＥＰＯを生産するための方法を提供する。本発明はまた、請求項１２に記載の医薬組成物の製造のための方法及び請求項１３に記載のＥＰＯ含有組成物におけるＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの測定のための方法を提供する。
【００２１】
「グリコアイソフォーム」の語は、単一等電点を有し、同じアミノ酸配列を有するＥＰＯ製剤を指す。異なるＥＰＯグリコアイソフォームは、主としてＥＰＯ１分子当りの荷電糖鎖部分（シアル酸）の含量が異なる。
【００２２】
シアル酸の含量はＥＰＯグリコアイソフォームの酸性に寄与し、それ故、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルにおける各々のバンドの位置を定義する。
【００２３】
ＩＥＦゲルにおけるバンド位置の数字割当ては任意である。より大きな数は酸性度の上昇、すなわちシアル酸のより高い含量を示す。従って、ＥＰＯα（エポエチンα−Ｅｐｒｅｘ（商標））は３−８のＥＰＯグリコアイソフォームを含み、ＢＲＰ標準品（欧州薬局方の標準品−エリスロポエチンＢＲＰバッチ１）は１−８のＥＰＯグリコアイソフォームを含み、ＥＰＯβ（エポエチンβ−Ｎｅｏｒｅｃｏｒｍｏｎ（商標））は１−８のＥＰＯグリコアイソフォームを含む。ＢＲＰ標準品は、現在欧州市場で入手可能な２つのＥＰＯ製剤の５０：５０混合物である（エポエチンα及びエポエチンβ）。
【００２４】
Ｌａｉら（１９８６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ及び欧州特許第４２８２６７号によれば、ＥＰＯαはＥＰＯ１分子当り９−１４シアル酸基を含むＥＰＯグリコアイソフォームの混合物として記述されており、これらのＥＰＯグリコアイソフォームは対応して３−８の任意数に割り当てることができる（本発明のＥＰＯグリコアイソフォームの表示のために使用する）。
【００２５】
本発明の本質的要素は、出発ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールが変化する又は修飾されるように特定クロマトグラフィー段階の組合せを使用することによる、高い純度とＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールを備えたＥＰＯの生産である。本発明の方法に適用されるクロマトグラフィー段階は、少なくとも（ａ）染料アフィニティークロマトグラフィー、及び（ｂ）疎水性クロマトグラフィー及び／又は（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィーを含む。好ましい実施態様では、本発明の方法は（ｄ）ゲルろ過クロマトグラフィーをさらに含む。
【００２６】
本発明に従ったＥＰＯの生産方法では、上記クロマトグラフィー段階の各々を使用することによってＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールが変化する又は修飾される。好ましくは（ｄ）と共に、（ａ）から（ｃ）のすべてのクロマトグラフィー段階を実施することによって、より洗練された、所定のＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールが得られる。そのため、単離工程の間にＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールを制御することが可能であり、それ故高い純度を有するＥＰＯグリコアイソフォームの正確な所望混合物（ＥＰＯα、ＥＰＯβその他）を得ることができる。
【００２７】
ＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールは、個々の工程因子を調整することによって、特に上記クロマトグラフィー段階のために適切な基質を選択すること、それぞれのクロマトグラフィー法の洗浄／溶出段階において適切な条件を適用すること及び／又はクロマトグラフィーカラムから溶出した適切な分画を収集することによって適切に入手される。
【００２８】
本発明はまた、グリコアイソフォーム混合物形態でＥＰＯを製造する多段階工程の間の選択中間段階で、及び場合により工程全体の開始時及び／又は終了時にも得られる、ＥＰＯを含有する試料を、ポリアクリルアミドなどの適切なゲル基質によるＩＥＦに供すること、及びその後固相での免疫検出を実施することにより、ＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールを分析するための方法も提供する。すなわち、該分析は、単離及び精製工程の途中で間欠的インプロセス（ｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ）段階として、好ましくは少なくとも２回実施する。免疫検出は、ニトロセルロース膜などの適切な膜上でのウエスタンブロット手法に基づいて実施することができる。この方法により、精製工程中の試料のインプロセス管理が可能となる。この方法は、それ故、ＥＰＯグリコアイソフォームの特定の所望プロフィールを備えたＥＰＯの生産のための方法の研究、最適化手順及び産業応用にとって有用である。上記で定義したような本発明の所望ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールを有するＥＰＯを生産するための方法と組み合わせたとき、このインプロセス分析は、選択クロマトグラフィー段階で、場合により各々の段階の前及び後に、インライン管理（ｉｎ  ｌｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を可能にする。所望のＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの変化の有効性及び所望ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの見地から精製段階で調整すべき条件についての管理を可能にする。それ故、この分析はＥＰＯの標的開発と生産を可能にする。それ故、プロフィールを指定したＥＰＯの生産を実施することができる。高く且つ均一な製品特異性及び高い製品品質がそれによって維持されうる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、高純度とＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールを備えた生物学的に活性なＥＰＯの大規模製造（高生産量）を可能にする。本発明は、それ故、ＥＰＯの工業生産に適する。
【００３０】
本発明により、同時にいくつかの利点が得られる。本発明の方法は、ＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールを提供する。前記ＥＰＯ純度は高く、ＨＰＬＣ及びゲル電気泳動によって測定したとき、総タンパク質の少なくとも９９％を超える純度、好都合には総タンパク質の９９．９％を超える純度を達成する。該方法はＥＰＯの大規模製造に適する。ＲＰ−ＨＰＬＣ精製段階を実施する必要がないので、毒性非極性有機溶媒を回避することができる。さらに、動物由来のタンパク質又は他の物質は使用されない。それ故、ウイルス等による汚染の危険性、従って患者の感染の危険性が避けられ、臨床的安全性が改善される。得られるＥＰＯはヒト医療における使用に適する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、特定クロマトグラフィー法を適用する様々な方法に関する。本発明の基本的概念によれば、グリコアイソフォーム混合物の形態のエリスロポエチン（ＥＰＯ）を製造するための方法は、ＥＰＯ含有組成物を（ａ）染料アフィニティークロマトグラフィー及び（ｂ）疎水性クロマトグラフィーのクロマトグラフィー段階に供することを含み、ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールが、上記クロマトグラフィー段階後に出発ＥＰＯ含有組成物に比べて変化する。本発明に従ったＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの語は、全混合物中に様々な比率で存在する、定義されたＥＰＯグリコアイソフォームの混合物を意味する。これらの段階（ａ）及び（ｂ）によって、ＥＰＯ１分子当り低い数のシアル酸、例えば３まで、好ましくは４まで、特に５まで（５を含む）のシアル酸基を有するＥＰＯグリコアイソフォームの割合を低下させる、好ましくは排除することによってプロフィールを変化させることが可能であることが認められた。この低い数のＥＰＯグリコアイソフォームの割合が低下すること、好ましくは排除されることは、得られるＥＰＯ生成物にとって安定性及び生物活性の見地から有益である。
【００３２】
クロマトグラフィー段階に供し、それによってプロフィールを変化させるための出発ＥＰＯ含有組成物は、適切には、組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）が発現される細胞培養又は増殖培地の培養上清から得られる組成物である。ｒＨｕＥＰＯは、遺伝的にトランスフェクトされた哺乳類宿主細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）から発現される。該細胞は、ローラーボトル、スピンナーフラスコ又はバイオリアクターにおいて培養することができる。細胞増殖及び培養は、バッチ工程又は連続工程によって実施できる。連続工程を実施するときは、適切な期間のバイオリアクターでの灌流培養及び連続採集として実施しうる。培地から細胞及びおそらくは他の汚染物質を除去するために、培養上清を、例えば硫酸アンモニウムを使用する沈殿段階に供しうる。好ましくは該上清をろ過に供する。ＥＰＯ含有溶液又はろ液を、その後、染料アフィニティーカラムに適用する。
【００３３】
段階（ａ）の染料アフィニティークロマトグラフィーは、適切な基質結合染料で、好ましくはトリアジン染料を使用して実施する。特に好ましい基質結合染料はＣｉｂａｃｈｒｏｎ  ３Ｇであり、適切なカラム材料はＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである。ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールが影響されうる１つの因子は、溶出緩衝液のｐＨである。溶出緩衝液のｐＨは、好ましくは５．０−９．０、より好ましくは６．０−８．０に調整する。様々な種類の溶出法が使用でき、好ましくは直線（勾配）又は段階溶出法、最も好ましくは段階溶出法が使用できる。様々な塩が溶出のために使用でき、好ましくはＮａＣｌ及びＫＣｌ、最も好ましくはＮａＣｌが使用できる。
【００３４】
段階（ｂ）の疎水性クロマトグラフィーは疎水性基質を用いて実施する。適切な基質物質は、ブチルに例示されるアルキル基、又はフェニルに例示されるアリール基などの疎水基によって修飾されるＳｅｐｈａｒｏｓｅである。ＥＰＯ１分子当り低い数のシアル酸基を有するＥＰＯグリコアイソフォームの割合の良好な低下又は排除が、イソプロピル、フェニル又はエーテルなどの疎水基を有するＳｏｕｒｃｅ基質（ポリスチレンジビニルベンゼン）材料、フェニル、ブチル及びエーテルなどの疎水基を有するＴｏｙｏｐｅａｒｌ基質、好ましくはＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどのブチル修飾基質担体の使用によって得られる。様々な種類の溶出法が使用でき、好ましくは直線（勾配）又は段階溶出法、最も好ましくは段階溶出法が使用できる。
【００３５】
グリコアイソフォームプロフィールの所望変化は、陰イオン交換クロマトグラフィーのさらなる段階（ｃ）を実施することによってさらに改善できる。この手段により、該プロフィールは、所望に応じてより洗練され、制御されたＥＰＯグリコアイソフォーム混合物を提供するように有意に変更されうる。好ましい陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ又はＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ（第四級荷電アミノエチルリガンド）又はＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑ（第四級荷電アンモニウムリガンド）などのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、好ましくはＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑである。
【００３６】
本発明の方法が（ｄ）ゲルクロマトグラフィーのクロマトグラフィー段階をさらに含むとき、所望ＥＰＯグリコアイソフォーム混合物に関してさらなる選択工程が実現できる。該ＥＰＯグリコアイソフォームは、ゲルクロマトグラフィーカラムからプールされる分画に依存して異なる。好ましいゲルクロマトグラフィーカラム材料は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００又はＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００である。
【００３７】
上述したようなＥＰＯを製造するための方法において、クロマトグラフィー段階は、好ましくは、以下に示す順序で次の段階：
（ａ）、（ｂ）、場合により（ｃ）及び／又は（ｄ）；
（ａ）、（ｃ）、場合により（ｂ）及び／又は（ｄ）；あるいは
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ａ）、（ｃ）、（ｂ）、各々の場合により（ｄ）
から成る。クロマトグラフィー段階に示されている順序は、有効な精製及び所望ＥＰＯグリコアイソフォーム調整の両方の見地から好都合である。間欠的段階として、好ましくは緩衝液交換、特にろ過、限外ろ過及び／又はろ過透析を実施する。しかし、段階（ａ）と（ｂ）の間に緩衝液を交換する必要はない。特に、限外ろ過及びろ過透析段階を段階（ｂ）と（ｃ）の間に実施し、さらなる限外ろ過段階を段階（ｃ）と（ｄ）の間に実施する。他の従来の精製方法がそれらに加えて適用できるが、省くこともできる。特に、有機溶媒のさらなる使用を必要とするＨＰＬＣ及びヒドロキシアパタイトのクロマトグラフィー段階を回避することができる。場合によりさらなる緩衝液交換又はろ過手法を補足して、段階（ａ）−（ｄ）だけを適用することにより、既に高品質のＥＰＯを高収率、高純度及びＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールで単離することが可能となる。それ故その生成物をヒト医療における臨床適用のために直接使用することができる。
【００３８】
本発明の製造方法において、ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの変化は、ＥＰＯ１分子当り規定された数のシアル酸基を有するＥＰＯグリコアイソフォームの混合物を製造することを対象とする。所望ＥＰＯグリコアイソフォーム混合物は、（ｉ）適切な基質を選択すること、（ｉｉ）クロマトグラフィー条件を調整すること及び／又は（ｉｉｉ）上記クロマトグラフィー段階（ａ）−（ｄ）の１又はそれ以上においてカラムから溶出した所望分画を収集することによって、適切に製造され、正確に制御される。高い生物活性と安定性を有する、均一で十分に定義されたＥＰＯグリコアイソフォーム混合物を生産するために、クロマトグラフィー段階を、好ましくは、６−１４の範囲に対応するＥＰＯ１分子当りのシアル酸基の特定含量が得られるように調整する。所望する場合、製造されるＥＰＯグリコアイソフォーム混合物は、それ故、ＥＰＯα（８−１３のシアル酸基数）又はＥＰＯβ（６−１３）又は７−１３の範囲のシアル酸基数を有するＥＰＯに対応しうる。さらに、混合物中の特定ＥＰＯアイソフォーム又はすべてのアイソフォームの割合も変化させうる。
【００３９】
上述したそれぞれのクロマトグラフィー段階の条件は、適切なクロマトグラフィー基質を使用すること、クロマトグラフィー条件を調整すること及び／又は溶出分画を選択することによって調整できる。ｐＨ範囲、塩濃度又は勾配及び温度に関する適切なクロマトグラフィー条件を下記の表に示す。
【００４０】
【表１】
2005520550.tif 000003
【００４１】
【表２】
2005520550.tif 000004
【００４２】
得られる所望グリコアイソフォーム混合物を有するＥＰＯ生成物は、治療上有効な量のＥＰＯを含有する医薬組成物の製造に適する。本発明の方法によって得られるＥＰＯを従来の医薬適合性の担体と混合する。好ましい医薬組成物は、ＥＰＯ、緩衝液、ポリソルベート、種々のアミノ酸、場合により糖類及び塩を含有する。
【００４３】
本発明はさらに、
・培養上清から、及び／又は多数のクロマトグラフィー段階を含むＥＰＯの単離及び精製工程の中間段階又は終了時に、及び／又は医薬組成物から、ＥＰＯ含有組成物を提供すること、
・上記ＥＰＯ含有組成物をゲル基質中で等電点電気泳動（ＩＥＦ）に供すること、
・上記ゲルからタンパク質を膜に移すこと、及び
・上記膜上でＥＰＯを免疫検出すること
の段階を含む、ＥＰＯ含有組成物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）グリコアイソフォームプロフィールの測定のための方法を提供する。
【００４４】
ＩＥＦのために使用される適切なゲル基質はポリアクリルアミドである。ゲルから膜への転写、好ましくはニトロセルロース膜への転写は、簡単な拡散転写又はエレクトロブロット法によって実施できる。免疫検出法は、ＥＰＯ特異的抗体及び適切に標識された二次抗体を使用して実施される。該膜上でのＥＰＯに特異的な免疫検出法と組み合わせたＩＥＦの使用は、哺乳類細胞培養の試料及び上述したような本発明の各々のクロマトグラフィー段階後の試料において、ＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールの信頼しうる分析を可能にする。この方法は、精製の工程中に試料を管理すること、すなわちインプロセス管理を可能にする。この方法は、それ故、ＥＰＯグリコアイソフォームの特定プロフィールを備えたＥＰＯの生産方法の研究、最適化手順及び産業応用によって使用されうる。ＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールは、精製ＥＰＯの濃縮試料、タンパク質の複雑な混合物（細胞培養）、及び低濃度のＥＰＯを含む及び特定クロマトグラフィー段階後の溶液において、及び他のタンパク質を含むすべての試料又は溶液において測定することができる。この分析はＥＰＯ及び一部のＥＰＯ類似体に特異的であり、感受性がある。測定されたＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールは、細胞培養から又はクロマトグラフィー段階の種々の溶出液から生じる種々の試料においてＥＰＯグリコアイソフォーム組成物及び定量的比率の直接比較を可能にする。ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールを測定する方法は、好ましくは、上述したような本発明のエリスロポエチン（ＥＰＯ）を製造する工程中にインプロセス管理として適用される。
【００４５】
下記の実施例は本発明の様々な実施態様を例示するために提供するものであり、いかなる意味においても本発明を限定することを意図しない。
【実施例１】
【００４６】
ポリアクリルアミドゲルにおけるＩＥＦ及びニトロセルロース膜上での免疫検出
この方法をＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールの分析のために使用した。ＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールを種々の試料（タンパク質の複雑な混合物中、低濃度のＥＰＯを含む試料中）において測定することができた。分析結果は、種々の試料におけるＥＰＯ品質の直接比較を可能にした。本実施例１は、細胞培養からのＥＰＯのＩＥＦ分析及び免疫検出を示し、あとの実施例２及び３は、ＥＰＯの単離及び／又は精製の個々のクロマトグラフィー段階後の溶出液からの結果を示す。
【００４７】
ＩＥＦ分析用に調製する試料については、限外ろ過膜（ＭｗＣＯ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ  ｏｆｆ、分画分子量）１００００Ｄａ）を使用してろ過透析に供した。ろ過透析段階は１０ｋＤａより小さい分子を排除し、試料の脱塩と濃縮を導く。試料の最終濃度は、ゲルに負荷する試料１５−２０μｌ中ＥＰＯ  ０．５−１．５μｇである。
【００４８】
ポリアクリルアミドＩＥＦゲルの調製：アクリルアミドの総濃度は５％であり、架橋の程度は３％、厚さは０．５ｍｍ、及び尿素と総両性電解質の最終濃度はそれぞれ５Ｍと２％であった。両性電解質の役割は、ゲル中でｐＨ３から６までのｐＨ勾配を得ることである（例えば：総両性電解質７０％：ｐＨ３−５；総両性電解質３０％：ｐＨ３−１０）。電極溶液は両性電解質の選択に適合させ、例えば陽極の電解質は０．１Ｍグルタミン酸及び０．５Ｍリン酸から成り、陰極の電解質はβ−アラニンの０．１Ｍ溶液であった。
【００４９】
図１に示すように、ＩＥＦを使用することによって細胞培養の培養上清試料中のＥＰＯグリコアイソフォームを分離した。レーン１−３では、ＥＰＯ産生細胞培養懸濁液（ＣＨＯ細胞）の試料を、培養の開始から６日目（レーン１）、１０日目（レーン２）及び１１日目（レーン３）に採取し、ゲルに負荷した。レーン４では、ＥＰＯ  ＢＲＰバッチ１をゲルに負荷した。
【００５０】
プレフォーカシング：定電力Ｐ＝１２Ｗで２５分間（２５×１１ｃｍのゲルサイズについて）。試料（１５−２０μｌ）を陰極の近くに負荷した。
【００５１】
フォーカシング：定電力Ｐ＝１５Ｗで７５分間（２５×１１ｃｍのゲルサイズについて）。電気泳動中、ゲルを１５℃に保持した。電気泳動のための条件は、種々のソースからの両性電解質の種々の特徴を考慮して変化させうる。
【００５２】
拡散転写：ゲルから膜へのタンパク質の拡散転写を次のように実施した。膜をゲル上に置き、数層のろ紙をその膜上に置いた。ゲル、膜及びろ紙は同じ大きさであった。膜とろ紙をあらかじめ転写緩衝液中で湿らせた。
【００５３】
転写緩衝液：４８ｍＭトリス−ＨＣｌ、３９ｍＭグリシン、０．０３７％ＳＤＳ、２０容量％メタノール、ｐＨ８．３。転写時間は４０℃で９０分間である。
【００５４】
ニトロセルロース膜上での免疫検出：
転写後、脱脂粉乳遮断液の５％溶液を使用してニトロセルロースを遮断した。次に、一次抗体としてのマウスモノクローナル抗ｈＥＰＯ抗体（ＩｇＧ）と共に膜をインキュベートした。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４を使用して膜を洗浄した。その後、二次抗体としてのホースラディッシュペルオキシダーゼと複合したウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ）と共に膜をインキュベートした。
【００５５】
染色反応のために、ペルオキシダーゼについての基質、例えば４−クロロ−１−ナフトールを使用した。
【００５６】
特異的ＥＰＯグリコアイソフォームを、ＥＰＯ  ＢＲＰと比較することによって特定した。デンシトメトリーを使用してバンドの強度を測定した。その後、特定ＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールを算定した。
【００５７】
この方法によって得た電気泳動図を図１に示す。
【００５８】
電気泳動図で認められる別々のバンドに３−９の任意の数字を割り当てる。それらは、陰極から陽極へアイソフォームの酸性度の上昇に従って割り当てる（より高い数は、より多くのシアル酸を有する、それ故より低いｐＩを有するアイソフォームを示す）。図１及びその後の図面において、電気泳動図における任意の数とＥＰＯ１分子当りのシアル酸基の数の相関は次のとおりである：アイソフォーム９、８、７、６・・・は、それぞれ１分子当り１４、１３、１２、１１・・・シアル酸基に帰せられる。
【００５９】
図２は、図１で提示したＣＨＯ細胞培養懸濁液培養に由来する試料中のＥＰＯグリコアイソフォームの相対比率のプロフィールを示す。膜上のバンドの強度（図１）を、デンシトメトリーを用いて測定している。各々のバンドの強度を、各々の試料（レーン）について検出されたすべてのバンドの強度の合計の相対的割合（相対強度、％）として示している。
【００６０】
図１及び２は、本発明に従って免疫検出と組み合わせたＩＥＦ分析が、多くの他のタンパク質が存在する粗細胞培養からのＥＰＯグリコアイソフォーム生産に対して良好で特異的な制御を可能にすることを示している。この分析により、目標とするグリコアイソフォームプロフィールの見地から、さらなる単離及び精製のための良好な基礎を提供する、採集のための適切な時点を見出すことができる。
【００６１】
図４及び６は、本発明に従ったＥＰＯグリコアイソフォーム混合物の製造工程中のＥＰＯグリコアイソフォーム分析についてのさらなる電気泳動図を示す（それぞれ実施例２ｂ及び２ｄ）。
【実施例２】
【００６２】
種々のクロマトグラフィー段階によるＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの変化
実施例２ａ：基質結合染色Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ３Ｇでのクロマトグラフィー
ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞培養懸濁液をバイオリアクターにおいて調製し、最初に１０μｍプレフィルターで、次に０．２μｍ膜滅菌フィルターでろ過して細胞を分離した。基質結合染色Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ３Ｇを使用してろ液を最初のクロマトグラフィーカラムに負荷した。クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
カラム          基質Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
粒径４５−１６５μｍ；
ＣＶ（カラム容量）＝７．８５ｍｌ、Ｈ（カラムの長さ）＝１０ｃｍ、Ｄ（カラムの直径）＝１ｃｍ
温度            室温
流速            １．５ｍｌ／分；１１５ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、２．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．０
試料            １５０ｍｌ；６ｍｇ
緩衝液Ａ  ５ＣＶ（カラム容量）でカラムを平衡させた。試料を負荷した後、カラムを最初に緩衝液Ａ  ３ＣＶ、次に緩衝液ＡとＢの混合物（９０：１０）５ＣＶで洗浄した。大部分のＥＰＯは緩衝液Ｂ（５ＣＶ）で溶出した。同じ分離を、ｐＨ６．４と８．０の緩衝液Ａ及びＢを使用して実施した。
【００６３】
緩衝液Ｂでの溶出後のプール分画を、ポリアクリルアミドゲル中ＩＥＦを用いて分析し、タンパク質をニトロセルロース膜に移して、実施例１で述べたように免疫検出を実施した。膜上のバンドの強度をデンシトメトリーで測定した。各々のバンドの強度を、各々の試料（レーン）について検出されたすべてのバンドの強度の合計の相対的割合（相対強度、％）として示している。電気泳動図で認められる別々のバンドに−３から９までの任意の数字を割り当てる（実施例１で定義したように、指示される数字とＥＰＯ１分子当りのシアル酸の含量の間に相関が存在する）。この分析は、図３に示すように洗浄及び溶出緩衝液の異なるｐＨを使用することによって、ＥＰＯグリコアイソフォームの異なるプロフィールが得られることを示した。
【００６４】
実施例２ｂ：疎水性クロマトグラフィー（１）
所望グリコアイソフォームプロフィールを有するＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ｐＨ７の緩衝液Ｂ）からの溶出液を、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに負荷した。疎水性クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
カラム          基質Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
平均粒径９０μｍ；
ＣＶ＝１ｍｌ、Ｈ＝２．５ｃｍ、Ｄ＝０．７ｃｍ
温度            室温
流速            １ｍｌ／分    １５０ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、２．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｂ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、１．０Ｍ塩化ナトリウム、３０％（Ｖ／Ｖ）イソプロパノール、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｃ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、３０％（Ｖ／Ｖ）イソプロパノール、ｐＨ＝７．０
試料            １５０ｍｌ、０．９ｍｇ
緩衝液Ａでカラムを平衡させた。試料を負荷した後、カラムを緩衝液Ａ  ３ＣＶ、次に緩衝液Ｂ  ８ＣＶで洗浄した。大部分のＥＰＯは緩衝液Ｃで溶出した。緩衝液Ｃでカラムを洗浄することによって得たＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールを、図４に示すように、ポリアクリルアミドゲル中ＩＥＦ及びニトロセルロース膜上でのＥＰＯの免疫検出によって分析した。
レーン１：Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗクロマトグラフィーカラムからの溶出後の試料（精製手順の段階１）（実施例２ａ、緩衝液Ｂ、ｐＨ７．０）
レーン２：細胞培養上清（精製手順の段階１の前）
レーン３：Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムからの溶出後の試料（緩衝液Ｃによる溶出後のプール分画）。
【００６５】
ＩＥＦ及び免疫検出分析は、実施例１におけるように実施し、評価した。
【００６６】
図４から明らかになるように、より低いシアル酸含量を有するＥＰＯグリコアイソフォームの大部分が排除されるクロマトグラフィー条件が確立された。
【００６７】
限外ろ過のためのシステム、ＭＩＮＩＴＡＮ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してプール分画を濃縮した。ろ過透析は、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を緩衝液として使用して実施した。
【００６８】
実施例２ｃ：疎水性クロマトグラフィー（２）
所望グリコアイソフォームプロフィールを有するＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ｐＨ７の緩衝液Ｂ）からの溶出液を、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに負荷した。疎水性クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
カラム          基質Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
平均粒径９０μｍ；
ＣＶ＝１ｍｌ、Ｈ＝２．５ｃｍ、Ｄ＝０．７ｃｍ
温度            室温
流速            １ｍｌ／分；１５０ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、２．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｃ        １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３０％（Ｖ／Ｖ）イソプロパノール、ｐＨ＝７．０
試料            緩衝液Ａに溶解したＥＰＯ  ＢＲＰ標準品；０．５ｍｌ；０．２５ｍｇ
緩衝液Ａでカラムを平衡させた。試料を負荷した後、カラムを緩衝液Ａ  ３ＣＶ、次に緩衝液ＡとＣの混合物（５０：５０）５ＣＶで洗浄した。緩衝液Ａ中、緩衝液Ｃの直線勾配でカラムからＥＰＯを溶出した（４５分で緩衝液Ｃの５０％から１００％までの直線勾配（＝４５ＣＶ））。３つの重複するピークがクロマトグラムに認められる。ＥＰＯは分画１５−２３中に溶出した。次に分画１５、１９及び２１を、実施例１で述べたようにＩＥＦ及び免疫検出を使用して分析した。図５に示す結果は、ＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールが分画ごとに異なることを示している。
【００６９】
低いｐＩ（より高いシアル酸含量）を有するＥＰＯグリコアイソフォームは、より高いｐＩを有するものよりも早期の分画中に溶出される。この特徴は、この方法がＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールを備えた分画を収集することを可能にすることを示唆する。
【００７０】
実施例２ｄ：陰イオン交換クロマトグラフィー（１）
所望グリコアイソフォームプロフィールを有する、実施例２ｃで述べたようなＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムからの溶出液を、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに負荷した。陰イオン交換クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
試料            ０．２ｍｇ
カラム          基質ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
平均粒径９０μｍ；
ＣＶ＝１ｍｌ、Ｈ＝２．５ｃｍ、Ｄ＝０．７ｃｍ
温度            室温
流速            １ｍｌ／分；１５８ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｂ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０；０．０３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液Ｃ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０；０．１Ｍ塩化ナトリウム
緩衝液Ｄ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０；０．３Ｍ塩化ナトリウム
緩衝液Ａでカラムを平衡させた。試料を負荷した後、カラムを緩衝液Ａ  ３ＣＶ、次に緩衝液Ｂ  ５ＣＶで洗浄した。大部分のＥＰＯは緩衝液Ｃ（８ＣＶ）で溶出した。残りのタンパク質は緩衝液Ｄで溶出した。カラムを２Ｍ塩化ナトリウムで再生した。
【００７１】
緩衝液Ｃでカラムを洗浄することによって得たＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールを、実施例１で述べたようにＩＥＦ及びニトロセルロース膜上でのＥＰＯの免疫検出によって分析した。その結果を図６に示す。
レーン１：ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗからの溶出液（緩衝液Ｃによる溶出後のプール分画）
レーン２：ＥＰＯ  ＢＲＰバッチ１。
【００７２】
上述した条件は、ＥＰＯ  ＢＲＰ標準品のプロフィールと基本的に同様のプロフィールを得ることを可能にした。
【００７３】
実施例２ｅ：陰イオン交換クロマトグラフィー（２）
所望グリコアイソフォームプロフィールを有する、実施例２ｃで述べたようなＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムからの溶出液を、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに負荷した。陰イオン交換クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
カラム          基質ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
平均粒径９０μｍ；
ＣＶ＝１ｍｌ、Ｈ＝２．５ｃｍ、Ｄ＝０．７ｃｍ
温度            室温
流速            １ｍｌ／分；１５０ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｂ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０；０．１Ｍ塩化ナトリウム
試料            緩衝液Ａに溶解したＥＰＯ  ＢＲＰ標準品；０．５ｍｌ；０．２５ｍｇ
緩衝液Ａでカラムを平衡させた。試料を負荷した後、カラムを緩衝液Ａ  ３ＣＶ、次に緩衝液ＡとＢの混合物（９４：６）５ＣＶで洗浄した。緩衝液Ａ中、緩衝液Ｂの割合を連続的に上昇させてカラムからＥＰＯを溶出した（６０分で緩衝液Ｂの６％から１１．５％までの直線勾配（＝６０ＣＶ））。３つの重複するピークがクロマトグラムに認められた。ＥＰＯは分画８−２４中に溶出した。
【００７４】
分画１１、１４、プール分画２１と２２（２１＋２２）及び２４を、ＩＥＦを用いて分析した。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＥＰＯを免疫検出して、バンドの強度を実施例１で述べたようにデンシトメトリーで測定した。
【００７５】
ＩＥＦ分析は、ＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールが分画ごとに異なることを示した（図７）。より高いｐＩ（より低いシアル酸）を有するＥＰＯグリコアイソフォームはより早くカラムから溶出される。それ故この方法は、ＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールの生産のために使用することができる。
【００７６】
実施例２ｆ：陰イオン交換クロマトグラフィー（３）
所望グリコアイソフォームプロフィールを有する、実施例２ｃで述べたようなＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムからの溶出液をＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに負荷した。陰イオン交換クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
カラム          基質ＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
粒径１５μｍ；
ＣＶ＝１ｍｌ、Ｈ＝３ｃｍ、Ｄ＝０．６４ｃｍ
温度            室温
流速            １ｍｌ／分；１８０ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｂ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０；１Ｍ塩化ナトリウム
試料            緩衝液Ａに溶解したＥＰＯ  ＢＲＰ標準品；０．５ｍｌ；０．２５ｍｇ
緩衝液Ａでカラムを平衡させた。負荷後に、カラムを緩衝液Ａ  ３ＣＶ、次に緩衝液ＡとＢの混合物（９４：６）５ＣＶで洗浄した。緩衝液Ａ中、緩衝液Ｂの割合を連続的に上昇させてカラムからＥＰＯを溶出した（６０分で緩衝液Ｂの６％から１１．５％までの直線勾配（＝６０ＣＶ））。３つの重複するプロフィールがクロマトグラムに認められる。ＥＰＯは分画８−３１中に溶出した。ＩＥＦ分析は、ＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールが分画ごとに異なることを示した（図８）。分画１３、１９及び２６をＩＥＦで分析し、次にタンパク質をニトロセルロース膜に移して、ＥＰＯを実施例１で述べたように免疫検出した。
【００７７】
より高いｐＩ（より低いシアル酸含量）を有するＥＰＯグリコアイソフォームはより早くカラムから溶出される。それ故この方法は、ＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールの単離のために使用することができる。
【００７８】
実施例２ｇ：ゲルろ過
実施例２ｄで述べたようなＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムからの溶出液をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）カラムに負荷した。ゲルろ過を次の条件下で実施した：
試料            ０．０９ｍｇ；０．５ｍｌ
カラム          基質Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
平均粒径１３μｍ；
ＣＶ＝２４ｍｌ、Ｈ＝３０ｃｍ、Ｄ＝１ｃｍ
流速            ０．２ｍｌ／分；１５．２ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．２
ＥＰＯは、カラムから分画５９−６８中に溶出した。
【００７９】
図９は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムからの溶出後のＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールを示す。分画６１、６３、６５及び６７をＩＥＦで分析し、次にタンパク質をニトロセルロース膜に移して、ＥＰＯを免疫検出し、バンドの強度を実施例１で述べたようにデンシトメトリーで測定した。
【００８０】
ＩＥＦ分析は、ＥＰＯグリコアイソフォームが個々の分画間で異なることを明らかにした。より低いｐＩ（より高いシアル酸含量）を有するＥＰＯグリコアイソフォームはより早くカラムから溶出される。それ故この方法は、カラムからの溶出後に適切な分画を選択することにより、ＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィールの単離を可能にする。
【００８１】
実施例２ｈ：所望ＥＰＯグリコアイソフォーム混合物の製造
図１０は、実施例２ｅのＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム及び実施例２ｆのＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑカラムからの勾配溶出後のＥＰＯグリコアイソフォームのプロフィールを示す。ＥＰＯ  ＢＲＰバッチ１をカラムに負荷した。Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑからのプール分画１３−３１及びＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗからのプール分画１４−２８を、ＩＥＦを使用して分析した。比較のためにＥＰＯ  ＢＲＰ及びＥＰＯα（Ｅｐｒｅｘ）も分析した。次にタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ＥＰＯを免疫検出して、バンドの強度を実施例１で述べたようにデンシトメトリーで測定した。両方の陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに関して、所望ＥＰＯαアイソフォームプロフィールとの良好な相関がみられる。
【実施例３】
【００８２】
ＥＰＯグリコアイソフォームの所望プロフィール：ＥＰＯαのプロフィールを得るための方法
ＥＰＯ産生ＣＨＯ細胞培養懸濁液をバイオリアクターにおいて調製し、最初に１０μｍプレフィルターで、次に０．２μｍ膜滅菌フィルターでろ過して細胞を分離した。基質結合染色Ｃｉｂａｃｈｒｏｎ  Ｂｌｕｅ  ３Ｇを使用してろ液を最初のクロマトグラフィーカラムに負荷した。クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
カラム          基質Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
粒径４５−１６５μｍ；
カラム容量（ＣＶ）＝３０ｍｌ、カラムの長さ（Ｈ）＝１５ｃｍ、カラムの直径（Ｄ）＝１．６ｃｍ
温度            室温
流速            ５ｍｌ／分；１５０ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｂ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、２．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．０
試料            ４００ｍｌ；３６ｍｇタンパク質
緩衝液Ａ  ５ＣＶでカラムを平衡化させた。試料を負荷した後、カラムを緩衝液Ａ  ５ＣＶ、次に緩衝液Ａと緩衝液Ｂの混合物（９２：８）４ＣＶで洗浄した。カラムを緩衝液Ｂ（６ＣＶ）で洗浄することによってＥＰＯが溶出した溶出液をさらにその後のクロマトグラフィー段階のために使用した。
【００８３】
最初のクロマトグラフィー段階からの溶出液を第二クロマトグラフィー段階（疎水性クロマトグラフィー）のカラムに負荷した。疎水性クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
カラム          基質Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
平均粒径９０μｍ；
ＣＶ＝１ｍｌ、Ｈ＝２．５ｃｍ、Ｄ＝０．７ｃｍ
温度            室温
流速            １ｍｌ／分；１５０ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、２．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｂ        １０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３０％（Ｖ／Ｖ）イソプロパノール、ｐＨ＝７．０
試料            ９０ｍｌ、１．５ｍｇ
緩衝液Ａ  ５ＣＶでカラムを平衡化させた。試料を負荷した後、カラムを緩衝液Ａ  ５ＣＶ、次に緩衝液ＡとＢの混合物（１：１）１２ＣＶで洗浄した。緩衝液Ｂ（１５ＣＶ）でＥＰＯが溶出した溶出液をその後のクロマトグラフィー段階のために使用した。
【００８４】
第二クロマトグラフィー段階からの溶出液を濃縮し、限外ろ過用のシステム、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して緩衝液Ｂを１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝７．０に置換した。濃縮物を第三クロマトグラフィー段階（陰イオン交換クロマトグラフィー）のカラムに負荷した。クロマトグラフィーを次の条件下で実施した：
カラム          基質ＳＯＵＲＣＥ  １５Ｑ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；
粒径１５μｍ；
ＣＶ＝１ｍｌ、Ｈ＝３ｃｍ、Ｄ＝０．６４ｃｍ
温度            室温
流速            １ｍｌ／分；１８０ｃｍ／時
緩衝液Ａ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０
緩衝液Ｂ        １０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．０；１Ｍ塩化ナトリウム
試料            ２ｍｌ；０．４ｍｇ
緩衝液Ａ  ５ＣＶでカラムを平衡化させた。試料を負荷した後、カラムを緩衝液Ａ  ５ＣＶで洗浄した。緩衝液Ａ中、緩衝液Ｂの直線勾配でＥＰＯを溶出した（６０分で緩衝液Ｂの０から１３％までの直線勾配（＝６０ＣＶ））。ＥＰＯは分画２０−５６中に溶出し、所望グリコアイソフォームプロフィールは分画３７−５１中に認められた。
【００８５】
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ及びＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑを使用した３つの連続的クロマトグラフィー段階後の単離ＥＰＯのグリコアイソフォームの最終プロフィールを図１１に示す。
【００８６】
Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑからのプール分画３７−５１を、図１で述べたようにＩＥＦで分析した。比較のために他の２つの試料を負荷した：すなわち、ＥＰＯα（Ｅｐｒｅｘ）及びバイオリアクターでの細胞培養からの非精製培養上清である。図１１から明らかなように、所望のＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールとＥＰＯαの間の卓越した相関が、３つの特徴的クロマトグラフィー段階だけを使用することによってみられた。同時に、得られるＥＰＯ生成物の純度は、ＨＰＬＣ及びゲル電気泳動によって測定したとき９９％以上であった。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、ＥＰＯを発現するＣＨＯ細胞の培養６日目、１０日目及び１１日目の上清試料中のＥＰＯグリコアイソフォームの分離を示す。分離は実施例１に従ってＩＥＦ及び免疫検出を使用して実施した。
【図２】図２は、図１に示したＣＨＯ細胞懸濁液培養に由来する試料中のＥＰＯグリコアイソフォームの相対比率のプロフィールを示す。
【図３】図３は、実施例２ａにおいて溶出緩衝液のために使用したｐＨ条件に依存する、染料アフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出後のＥＰＯグリコアイソフォームの相対比率のプロフィールを示す。
【図４】図４は、実施例２ｂで得られるようなＩＥＦ及び膜上でのＥＰＯの免疫検出後のＥＰＯグリコアイソフォームの電気泳動図を示す。レーン１：染料アフィニティークロマトグラフィーカラムからの溶出後の試料（精製手順の段階１）（実施例２ａ、緩衝液Ｂ、ｐＨ７．０）レーン２：細胞培養上清（精製手順の段階１の前）レーン３：疎水性クロマトグラフィーカラムからの溶出後の試料。
【図５】図５は、実施例２ｃで得られるようなカラムからの勾配溶出による疎水性クロマトグラフィー実施後の種々のＥＰＯグリコアイソフォーム分画の相対比率のプロフィールを示す。
【図６】図６は、ＩＥＦ及び膜上でのＥＰＯの免疫検出によって分析したときの、実施例２ｄで得られるＤＥＡＥカラムの陰イオン交換クロマトグラフィー実施後のＥＰＯグリコアイソフォームの電気泳動図を示す。レーン１：ＤＥＡＥカラムからの溶出液レーン２：ＥＰＯ  ＢＲＰ標準品
【図７】図７は、実施例２ｅで得られるＤＥＡＥカラムからの勾配溶出による陰イオン交換クロマトグラフィー実施後の種々のＥＰＯグリコアイソフォーム分画の相対比率のプロフィールを示す。
【図８】図８は、実施例２ｆで得られるＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑカラムからの勾配溶出によるもう１つの陰イオン交換クロマトグラフィー実施後の種々のＥＰＯグリコアイソフォーム分画の相対比率のプロフィールを示す。
【図９】図９は、ゲルクロマトグラフィー、次いでＩＥＦ分析の実施後の種々のＥＰＯグリコアイソフォーム分画の相対比率のプロフィールを示す。（実施例２ｇ）。
【図１０】図１０は、ＥＰＯ標準品と比較して、ＤＥＡＥ及びＳｏｕｒｃｅ  １５Ｑカラムからの勾配溶出後にプールした分画中に存在するＥＰＯグリコアイソフォームの相対比率のプロフィールを示す（実施例２ｈ）。
【図１１】図１１は、ＩＥＦで分析したとき、染料アフィニティー、疎水性及び陰イオン交換クロマトグラフィー段階を含む３つの連続的クロマトグラフィー段階後のＥＰＯグリコアイソフォームの相対比率のプロフィールを示す。比較のために、バイオリアクターからの、細胞培養上清からのＥＰＯα及び非精製ＥＰＯをＩＥＦによって分析した。この特定の場合には、アイソフォーム８は、ゲルに負荷した物質の量が少なかったため検出されなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月7日(2003.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）含有組成物を、
（ａ）染料アフィニティークロマトグラフィー（ｄｙｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、
（ｂ）疎水性クロマトグラフィー及び
（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー
のクロマトグラフィー段階に供することを含み、上記クロマトグラフィー段階が、以下に示す順序：
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ａ）、（ｃ）、（ｂ）、各々の場合により（ｄ）ゲルクロマトグラフィー
だけから成ることを特徴とし、製造されるＥＰＯ含有組成物のＥＰＯグリコアイソフォーム（ｇｌｙｃｏ−ｉｓｏｆｏｒｍ）プロフィールが上記クロマトグラフィー段階後に出発ＥＰＯ含有組成物に比べて変化している、グリコアイソフォーム混合物の形態のエリスロポエチン（ＥＰＯ）の製造方法。
【請求項２】
上記染料アフィニティークロマトグラフィーを基質結合トリアジン染料で実施する、請求項１に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項３】
上記疎水性クロマトグラフィーをブチル化基質担体で実施する、請求項１又は２に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項４】
ろ過、限外ろ過及び／又はろ過透析の少なくとも１つの間欠的段階を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの変化が、ＥＰＯ１分子当り３シアル酸基までの範囲に相当するＥＰＯグリコアイソフォームの割合、又はＥＰＯ１分子当り４シアル酸基までの範囲に相当するＥＰＯグリコアイソフォームの割合、又はＥＰＯ１分子当り５シアル酸基までの範囲に相当するＥＰＯグリコアイソフォームの割合が低下しているＥＰＯグリコアイソフォーム混合物を提供する、請求項１に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項６】
ＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールの変化が、各々がＥＰＯ１分子につき特定含量のシアル酸を有するＥＰＯグリコアイソフォームの所望混合物を提供する、請求項１から５のいずれか一項に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項７】
上記所望ＥＰＯグリコアイソフォーム混合物が、上記クロマトグラフィー段階の１又はそれ以上の条件を調整することによって製造される、請求項６に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項８】
ＥＰＯ１分子当り６−１４シアル酸基の範囲、好ましくは７−１３シアル酸基の範囲、最も好ましくは８−１３シアル酸基の範囲に相当する、ＥＰＯ１分子につき特定含量のシアル酸を有するＥＰＯグリコアイソフォーム混合物が製造される、請求項６又は７に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項９】
ＥＰＯグリコアイソフォーム混合物のプロフィールを、少なくとも１つの選択クロマトグラフィー段階の前及び／又は後に、請求項１１に記載の方法を実施することによって測定する、請求項１から８のいずれか一項に記載のＥＰＯの製造方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載のグリコアイソフォーム混合物の形態のエリスロポエチン（ＥＰＯ）を製造すること、及び
製造したＥＰＯと薬学的に適合し得る担体との混合物を提供すること
を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１１】
培養上清から、及び／又は多数のクロマトグラフィー段階を含むＥＰＯの単離及び精製工程の中間段階又は終了時に、及び／又は医薬組成物から、ＥＰＯ含有組成物を提供すること、
上記ＥＰＯ含有組成物をゲル基質中で等電点電気泳動（ＩＥＦ）に供すること、
上記ゲルからタンパク質を膜に移すこと、及び
上記膜上でＥＰＯを免疫検出すること
の段階を含み、グリコアイソフォーム混合物の形態のＥＰＯを製造する工程の前及び／又は工程中の選択段階で、場合によりそれに加えて上記ＥＰＯ製造工程の終了時及び／又は上記医薬組成物の製造後に実施され、グリコアイソフォーム混合物の形態のＥＰＯを製造する方法が請求項１から９のいずれか一項に記載の方法であるか又は上記医薬組成物の製造が請求項１０に記載の方法である、ＥＰＯ含有組成物におけるエリスロポエチン（ＥＰＯ）グリコアイソフォームプロフィールの測定方法。
【請求項１２】
ＥＰＯグリコアイソフォームをＥＰＯの単離及び精製工程中に少なくとも２回測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
所定のＥＰＯグリコアイソフォームプロフィールを得るためにクロマトグラフィー段階の条件を制御するのに使用される、請求項１１又は１２に記載の方法。
【国際調査報告】
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