(57)【要約】本発明は、マイコプラズマに関連した方法および材料を提供する。例えば、本発明は、細胞(例えば、ブタの繊毛のある気管細胞)からのカルシウム放出を増加する能力を有するマイコプラズマポリペプチド、更にはそのようなマイコプラズマポリペプチドに結合する抗体を提供する。加えて、本発明は、ブタの繊毛のある気管細胞からの、マイコプラズマが誘導したカルシウム放出のインヒビターを同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、分子量が約30kDa〜約150kDaである、実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項２】
マイコプラズマポリペプチドである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエから得られる、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項４】
純度約80％である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項５】
純度約90％である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項６】
分子量が約30kDaである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項７】
分子量が約60kDaである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項８】
分子量が約65kDaである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項９】
分子量が約90kDaである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１０】
分子量が約120kDaである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１１】
トリプシン断片である、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１２】
トリプシン消化後の分子量が約35kDaである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１３】
トリプシン消化後の分子量が約50kDaである、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、分子量が約30kDa〜約150kDaであるポリペプチドに結合することが可能な実質的に純粋な抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体である、請求項14記載の抗体。
【請求項１６】
マウス抗体である、請求項14記載の抗体。
【請求項１７】
ポリペプチドが、トリプシン断片である、請求項14記載の抗体。
【請求項１８】
ポリペプチドが、マイコプラズマポリペプチドである、請求項14記載の抗体。
【請求項１９】
ポリペプチドが、病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエから得られる、請求項14記載の抗体。
【請求項２０】
純度約80％である、請求項14記載の抗体。
【請求項２１】
純度約90％である、請求項14記載の抗体。
【請求項２２】
哺乳類における免疫応答を誘導する方法であって、該免疫応答はマイコプラズマポリペプチドに対するものであり、実質的に純粋なマイコプラズマポリペプチドを、該哺乳類が該ポリペプチドに対する抗体を産生する条件下で該哺乳類に投与する工程を含み、ここで該ポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、分子量が約30kDa〜約150kDaである、方法。
【請求項２３】
哺乳類が、マウス、ウサギ、またはブタである、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程を含む、ポリペプチドに抗体を結合する方法であって、該ポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、分子量が約30kDa〜約150kDaである、方法：
a)該ポリペプチドへ結合することが可能な抗体を得る工程、および
b)該抗体が該ポリペプチドに結合する条件下で、該抗体を該ポリペプチドと接触する工程。
【請求項２５】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
抗体がマウス抗体である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドがマイコプラズマポリペプチドである、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
以下の工程を含む、マイコプラズマが誘導した細胞からのカルシウム放出のインヒビターを同定する方法：
a)細胞をマイコプラズマポリペプチドおよび被験化合物と接触する工程であって、該ポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、分子量が約30kDa〜約150kDaである、工程
b)該細胞がカルシウムを放出するのを該被験化合物が阻害するかどうかを決定する工程であって、該被験化合物による該細胞からのカルシウム放出の阻害が、該被験化合物が該インヒビターであることを示す、工程。
【請求項２９】
被験化合物がプロテアーゼである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
被験化合物が抗体である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
以下の工程を含む、マイコプラズマポリペプチドにより誘導された細胞からのカルシウム放出のインヒビターを同定する方法であって、該ポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、分子量は約30kDa〜約150kDaである、方法：
a)細胞を、被験化合物で前処理したマイコプラズマポリペプチドと接触する工程、および
b)該細胞がカルシウムを放出するのを該被験化合物が阻害するかどうかを決定する工程であって、該被験化合物による該細胞からのカルシウム放出の阻害が、該被験化合物が該インヒビターであることを示す、方法。
【請求項３２】
被験化合物がプロテアーゼである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
被験化合物が抗体である、請求項31記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国政府の支援した研究に関する陳述
本明細書に説明された作業の資金拠出は、米国連邦政府によるものであり、米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
背景
1.技術分野
本発明は、マイコプラズマポリペプチド調製物に加え、マイコプラズマポリペプチドに対する抗体を有する抗体調製物に関する。
【背景技術】
【０００３】
2. 背景情報
マイコプラズマは、モリキューテス(Mollicutes)綱を含む、多様な原核生物種の大きなグループである。マイコプラズマは、細胞壁を欠いており、著しく小さいゲノムを有し、系統学的にはグラム陽性真正細菌に関係し、自己複製することが分かっている生物で最も小さい(Razin、Microbiol. Rev.、49:419-455(1985)；Razin、FEMS Microbiol. Lett.、79:423-432(1992)；ならびに、RazinおよびJacobs、J. Gen. Microbiol.、138:407-422(1992))。マイコプラズマの表面は、これらの生物のそれらの宿主細胞との相互作用にとって明らかに重要である(FreundtおよびEdward、1979年、「Classification and taxonomy」、1-42頁、M. F. BarileおよびS. Razin(編集)、「The Mycoplasmas」、Academic press社、ニューヨーク、NY；Rogersら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:1160-1164(1985)；ならびに、Woeseら、J. Mol. Evol.、21:305-316(1984-1985))。
【０００４】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)(Mhyo)は、ブタのマイコプラズマ肺炎の病因物質であり、養豚業者にとって大きい経済的損失を引き起こすことにつながる。この生物は、細胞外病原体であり、ブタの気道上皮に集落形成する。他のブタの呼吸器系病原体との関連において、M.ハイオニューモニエ感染の役割は、重要性が増してきている(Ross, RF、1999年、「Mycoplasmal diseases」495-509頁、B. E. Straw、S. D'Allaire、W. L. Mengeling、およびD. J. Taylor(編集)、「Diseases of Swine」、Iowa State University Press社、Ames、IA)。例えば、M.ハイオニューモニエは、ブタ生殖・呼吸症候群ウイルスが誘導した肺炎を憎悪する(Thackerら、J. Clin. Microbiol.、37:620-627(1999))。M.ハイオニューモニエは、最初に気管、気管支、および細気管支の繊毛のある上皮細胞を損傷することにより肺炎を誘導する(Debeyら、Am. J. Vet. Res.、53:1705-1710(1992)；MebusおよびUnderdahl、Am. J. Vet. Res.、38:1249-1254(1977)；ならびに、TertyshnikovaおよびFein、Cell Calcium、21:331-344(1997))。しかし、M.ハイオニューモニエが誘導した繊毛損傷または繊毛喪失の基礎となる機構はよく分かっていない。最近、気管上皮細胞モデルが開発され、M.ハイオニューモニエ 91-3の病原性を研究することが可能となった(Zhangら、Infect. Immun.、62:4367-4373(1994))。
【０００５】
M.ハイオニューモニエの繊毛のある上皮への付着は、この生物の集落形成を誘導するために必要であり、これにより繊毛喪失が生じる(MebusおよびUnderdahl、Am. J. Vet. Res.、38:1249-1254(1977)；Zhangら、Infect. Immun.、62:1616-1622(1994)；ならびに、Zhangら、Infect. Immun.、63:1013-1019(1995))。従って、マイコプラズマのその宿主細胞への付着は、マイコプラズマ疾患発病の重要な初期工程である。この付着過程は、主に受容体-リガンド相互作用により媒介される(Zhangら、Infect. Immun.、62:4367-4373(1994)；Zhangら、 Infect. Immun.、62:1616-1622(1994)；Zhangら、Infect. Immun.、63:1013-1019(1995)；ならびに、ZielinskiおよびRoss、Am. J. Vet. Res.、54:1262-1269(1993))。M.ハイオニューモニエの無毒株とは対照的に、M.ハイオニューモニエの有毒株は、インビトロにおいて気管組織の繊毛に付着するという知見は、この概念に一致する(Youngら、Vet. Microbiol.、71:269-279(1999))。
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明は、ブタの繊毛のある気管細胞（porcine ciliated tracheal cell）からカルシウム放出を増加する能力を有するマイコプラズマポリペプチド調製物に関係した方法および材料に関する。このようなポリペプチド調製物は、マイコプラズマが誘導したカルシウム放出をブロックする能力を有するポリペプチド断片の作成に使用することができ、これを使用して、マイコプラズマポリペプチドに結合する能力を有する抗体を作成することができる。本発明は、マイコプラズマポリペプチドに結合する抗体も提供する。このような抗体は、マイコプラズマが誘導したカルシウム放出を阻害するために使用することができ、病原性と非病原性のマイコプラズマを識別するために使用することができる。加えて本発明は、ブタの繊毛のある気管細胞からのマイコプラズマが誘導したカルシウム放出のインヒビターを同定する方法を提供する。このようなインヒビターは、マイコプラズマ肺炎の発症からブタを保護するために使用することができ、マイコプラズマ肺炎のブタを治療するために使用することができる。
【０００７】
全体的に、本発明の一局面は、実質的に純粋なポリペプチドを特徴とし、ここでこのポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、このポリペプチドの分子量は約30kDa〜約150kDaである。このポリペプチドは、マイコプラズマポリペプチドであることができる。このポリペプチドは、病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエから得ることができる。このポリペプチドは、純度約80％または純度約90％であることができる。このポリペプチドの分子量は、約30、60、65、90、または120kDaであることができる。このポリペプチドは、トリプシン性断片であることができる。このポリペプチドのトリプシン消化後の分子量は、約35kDaまたは50kDaであることができる。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ポリペプチドに結合することが可能である実質的に純粋な抗体を特徴としており、ここでこのポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、ここでこのポリペプチドの分子量は、約30kDa〜約150kDaである。この抗体は、モノクローナル抗体であることができる。この抗体は、マウス抗体であることができる。このポリペプチドは、トリプシン性断片であることができる。このポリペプチドは、マイコプラズマポリペプチドであることができる。このポリペプチドは、病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエから得ることができる。この抗体は、純度約80％または純度約90％であることができる。
【０００９】
本発明の別の局面は、哺乳類において免疫応答を誘導する方法を特徴とし、ここで免疫応答は、マイコプラズマポリペプチドに対するものである。この方法は、実質的に純粋なマイコプラズマポリペプチドを哺乳類へ、哺乳類がこのポリペプチドに対する抗体を産生する条件下で投与することを含み、ここでこのポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、ここでこのポリペプチドの分子量は、約30kDa〜約150kDaである。この哺乳類は、マウス、ウサギまたはブタであることができる。
【００１０】
別の本発明の局面は、抗体をポリペプチドに結合する方法を特徴としており、ここでこのポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、ここでこのポリペプチドの分子量は、約30kDa〜約150kDaである。この方法は、(a)このポリペプチドに結合することが可能である抗体を得る工程、および(b)この抗体をこのポリペプチドへ、この抗体がポリペプチドへ結合する条件下で接触する工程を含む。この抗体はモノクローナル抗体であることができる。この抗体はマウス抗体であることができる。このポリペプチドはマイコプラズマポリペプチドであることができる。
【００１１】
別の本発明の局面は、ブタの繊毛のある気管細胞からのマイコプラズマが誘導したカルシウム放出のインヒビターを同定する方法を特徴としている。この方法は、(a)細胞(例えば、ブタの繊毛のある気管細胞)を、マイコプラズマポリペプチドおよび被験化合物と接触する工程であり、ここでこのポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、ここでこのポリペプチドの分子量は約30kDa〜約150kDaであり、ならびに、(b)被験化合物が、細胞がカルシウムを放出するのを阻害するかどうかを決定する工程であり、ここで被験化合物による細胞からのカルシウム放出の阻害は、この被験化合物がインヒビターであることを示す工程を含む。被験化合物は、プロテアーゼまたは抗体であることができる。
【００１２】
別の態様において、本発明は、マイコプラズマポリペプチドにより誘導された細胞(例えば、ブタの繊毛のある気管細胞)からのカルシウム放出のインヒビターを同定する方法を特徴としており、ここでこのポリペプチドは、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加し、ここでこのポリペプチドの分子量は約30kDa〜約150kDaである。この方法は、(a)細胞(例えば、ブタの繊毛のある気管細胞)を、被験化合物で前処理したマイコプラズマポリペプチドと接触する工程、および(b)被験化合物が、細胞のカルシウム放出を阻害するかどうかを決定する工程を含み、ここで被験化合物による細胞からのカルシウム放出の阻害は、この被験化合物がインヒビターであることを示している。被験化合物は、プロテアーゼまたは抗体であることができる。
【００１３】
特に定義しない限りは、本明細書において使用された全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記された方法および材料に類似したまたは同等のものを、本発明の実践または試験において使用することができるが、適した方法および材料が以下に説明される。本明細書において言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照として組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法および例は、単に例証のためであり、限定を意図するものではない。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、下記の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかであろう。
【００１５】
詳細な説明
本発明は、マイコプラズマに関連した方法および材料を提供する。例えば、本発明は、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加する能力を有するマイコプラズマポリペプチドに加え、そのようなマイコプラズマポリペプチドに結合する抗体を提供する。加えて、本発明は、ブタの繊毛のある気管細胞からのマイコプラズマが誘導したカルシウム放出のインヒビターを同定する方法を提供する。
【００１６】
ひとつの態様において、本発明は、実質的に純粋なポリペプチドを提供する。本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、1個または複数の翻訳後修飾(例えば、リン酸化またはグリコシル化)を伴うまたは伴わない、アミノ酸残基のいずれかの鎖を意味する。本明細書において提供されるポリペプチドは、あらゆるサイズであることができる。例えば、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加する能力を有するポリペプチドは、10、25、50、75、100、125、150、175、200、またはそれよりも大きいアミノ酸長であることができる。加えて、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加する能力を有するポリペプチドは、分子量約10kDa〜約150kDaを有することができる。例えば、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を増加する能力を有するポリペプチドは、分子量約10、20、30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、または120kDaを有することができる。加えて、細胞(例えば、ブタの繊毛のある気管細胞)からのカルシウム放出を増加する能力を有するポリペプチドは、トリプシン性の断片であることができる。このような場合、トリプシン消化後のポリペプチドの分子量は、約10kDa〜約80kDaであることができる。例えば、トリプシン消化後のポリペプチドの分子量は、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、または80kDaであることができる。一部の態様において、細胞(例えば、ブタの繊毛のある気管細胞)からのカルシウム放出を増加する能力を有するポリペプチド(例えば、完全長ポリペプチドまたはトリプシン性の断片)は、病原性Mhyo株(例えば、病原性M.ハイオニューモニエ株91-3)に由来することができる。
【００１７】
本明細書において使用される用語「アミノ酸残基」は、天然のアミノ酸残基、非天然のアミノ酸残基、およびアミノ酸アナログを意味し、構造上許されるならば、それらのD型およびL型立体異性体の全てである。天然のアミノ酸残基は、アラニン(Ala)、アルギニン(Arg)、アスパラギン(Asn)、アスパラギン酸(Asp)、システイン(Cys)、グルタミン(Gln)、グルタミン酸(Glu)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロイシン(Ile)、ロイシン(Leu)、リシン(Lys)、メチオニン(Met)、フェニルアラニン(Phe)、プロリン(Pro)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、およびバリン(Val)を含むが、これらに限定されるものではない。非天然のアミノ酸残基は、アゼチジンカルボン酸、2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノイソ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロ-ヒドロキシリシン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ-イソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ピペコリン酸、およびN-メチルアルギニンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本明細書において使用される用語「アミノ酸アナログ」は、典型的には未変性のポリペプチドにおいて認められるような天然のアミノ酸残基に構造的に類似しているが、C末端カルボキシ基、N末端アミノ基、または側鎖官能基のいずれかが、他の官能基に化学的に修飾されているように組成は異なる、化合物を意味する。アミノ酸アナログは、アスパラギン酸のアナログであるアスパラギン酸-(β-メチルエステル)；グリシンのアナログであるN-エチルグリシン；および、アラニンのアナログであるアラニンカルボキシアミドを含むが、これらに限定されるものではない。アミノ酸残基およびアミノ酸アナログの他の例は、GrossおよびMeienhofer、「The peptides: Analysis, Synthesis, Biology」、Academic Press社、ニューヨーク(1983)に記されている。アミノ酸アナログは、天然であることができ、または合成的に調製することができる。
【００１９】
ポリペプチドのインビボにおける存在を安定化するために、ポリペプチドは、安定化剤をアミノ-またはカルボキシ末端で付加することにより、インビボにおいて使用するために修飾することができる。これは、ペプチド末端が、細胞取込みの前に、プロテアーゼにより分解される傾向がある状況において有用でありうる。このようなブロッキング剤は、ポリペプチドのアミノ-および／またはカルボキシ末端残基に結合することができる、付加的に関連したまたはしていないアミノ酸配列(例えば、N末端アミノ酸に結合したアセチル基またはC末端アミノ酸に結合したアミド基)を含むことができるが、これらに限定されるものではない。このような結合は、ポリペプチド合成の間に化学的に、または標準の方法を使用する組換えDNA技術により、実現することができる。あるいは、ピログルタミン酸または他の分子のようなブロッキング剤は、アミノ-および／またはカルボキシ末端残基に結合することができる。別の態様において、アミノ末端のアミノ基および／またはカルボキシ末端のカルボキシ基は、異なる部分と置き換えることができる。
【００２０】
ポリペプチドは、アミノ酸タグも含むことができる。本明細書において使用される用語「アミノ酸タグ」は、タグに対する抗体との相互作用を通じて、またはタグを認識する他の化合物もしくは分子を通じて、検出および／または精製の容易な手段を提供する一般に短いアミノ酸配列を意味する。例えばc-myc、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、またはFlag(登録商標)のようなアミノ酸タグを使用し、ポリペプチドの精製および検出を補助することができる。例として、ポリヒスチジンタグを付けたポリペプチドは、ニッケルイオン(例えば、Ni-NTAカラム上)とのヒスチジン残基の親和性を基に精製することができ、ポリヒスチジンに対する抗体(例えば、Penta-His antibody；Qiagen社、バレンシア、CA)により、ウェスタンブロットにおいて検出することができる。アミノ酸タグは、ポリペプチド配列内のどの部位にも挿入することができる。例えば、アミノ酸タグは、ポリペプチドのアミノ-またはカルボキシ末端に挿入することができる。
【００２１】
本明細書に説明されるポリペプチドは、任意の方法を用いて得ることができる。例えば、細胞からのカルシウム放出を増加する能力を有するポリペプチドは、天然の給源(例えば、Mhyo細胞)からの抽出、ポリペプチドをコードしている組換え核酸の発現、または化学合成(例えば、固相合成、またはABIペプチドシンセイサイザー；Applied Biosystems社、フォスターシティ、CAを用いた合成を含む当該技術分野において周知の他の方法による)により得ることができる。加えてこれらのポリペプチドは、例えば、高圧液体クロマトグラフィー(例えば、逆相HPLC)により、またはゲル電気泳動を用いて、精製することができる。例えば、特定のポリペプチドに対応するバンドをゲルから切り出し、溶離して、ポリペプチド調製物を得ることができる。
【００２２】
本明細書に提供されたポリペプチドは、実質的に純粋であることができる。本明細書においてポリペプチドに関して使用される用語「実質的に純粋」とは、そのポリペプチドが、天然には会合されている他のポリペプチド、脂質、糖質、および核酸を実質的に含まないことを意味する。従って、実質的に純粋なポリペプチドは、その天然の環境から取り除かれるいずれかのポリペプチドであり、天然にはそれと会合している他の成分を、少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、最も好ましくは90％含まない。本明細書に提供されたポリペプチドは、60、65、70、75、80、85、90、95、または99％純粋であることができる。典型的には、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上で単独の太いバンドを生じる。Mhyoポリペプチドが精製された後、例えばアジュバントまたは医薬担体などと混合された場合には、Mhyoポリペプチドは天然にはそれが会合している細胞成分から分離されているので、これは実質的に純粋であるとみなされることが理解される。任意の方法を用い、本明細書に提供されたポリペプチドを精製することができる。例えば、アフィニティクロマトグラフィー、免疫沈降、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを使用し、Mhyoポリペプチドを精製することができる。精製の程度は、いずれか適当な方法により測定することができ、以下を含むが、これらに限定されるものではない：カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィー。
【００２３】
特定のポリペプチドが、細胞からのカルシウム放出を増加するかどうかを、いずれかの方法を使用し決定することができる。例えば、本明細書に記した技術を用い、ブタの繊毛のある気管細胞からのカルシウム放出を測定することができる。
【００２４】
本発明は、本明細書に提供されたポリペプチドに結合する抗体も提供する。本明細書において使用される用語「抗体」は、無傷の抗体に加え、エピトープに選択的に結合する何らかの能力を保持している抗体断片を意味する。このような断片は、Fab、F(ab')2、およびFv抗体断片を含むが、これらに限定されるものではない。用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープ性決定基は通常、化学的活性のある表面分子集団(例えば、アミノ酸または糖残基)からなり、通常三次元構造特性に加え、帯電特性を有する。
【００２５】
ひとつの態様において、本発明は、本明細書において提供されたポリペプチドに特異的結合親和性を有する抗体を提供する。このような抗体は、液相におけるまたは固相に結合したイムノアッセイにおいて使用することができる。例えば、本明細書に提供された抗体を用い、直接または間接のいずれかの様式の競合的および非競合的イムノアッセイにおいて使用することができる。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ(RIA)およびサンドイッチ(イムノメトリック)アッセイがある。
【００２６】
本明細書に提供された抗体は、いずれかの方法を用い調製することができる。例えば、本明細書に提供される任意の実質的に純粋なポリペプチド、またはそれらの断片を、特異的抗体が産生されるような動物における免疫応答を誘起する免疫原として使用することができる。従って、無傷の完全長ポリペプチドまたは小ペプチドを含有する断片を、免疫感作する抗原として使用することができる。加えて、動物の免疫感作に使用される免疫原は、化学的に合成するか、または翻訳されたcDNAに由来することができる。更に免疫原は、望ましいならば、担体ポリペプチドに複合することができる。免疫感作するポリペプチドに化学的に複合される通常使用される担体は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、チログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および破傷風毒素を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
ポリクローナル抗体の調製は、当業者には周知である(例えば、Greenら、Production of Polyclonal Antisera、「Immunochemical Protocols」(Manson編集)、1-5頁(Humana Press社、1992)、およびColiganら、Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters、「Current Protocols i Immunology」第2.4.1章(1992))。加えて、免疫学の技術分野において一般的である様々な技術を使用し、ポリクローナル抗体、更にはモノクローナル抗体を精製および／または濃縮することができる(Coliganら、単元9、「Current Protocols in Immunology」、Wiley Interscience社、1994)。
【００２８】
モノクローナル抗体の調製も、当業者に周知である(例えば、KohlerおよびMilstein、Nature、256:495(1975)；Coliganら、2.5.1-2.6.7節；および、Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、726頁(Cold Spring Harbor Pub. 1988)。簡単に述べると、モノクローナル抗体は、抗原を含有する組成物のマウスへの注射、血清試料を分析することによる抗体産生の存在の証明、Bリンパ球を得るための脾臓の摘出、ハイブリドーマ作成のためのBリンパ球の骨髄腫細胞との融合、ハイブリドーマのクローニング、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンの選択、ならびにハイブリドーマ培養物からの抗体の単離により得ることができる。モノクローナル抗体は、様々な良く確立された技術により、ハイブリドーマ培養物から単離精製することができる。そのような単離技術は、プロテイン-A Sepharoseによるアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるものではない(Coliganら、2.7.1-2.7.12節および2.9.1-2.9.3節；Barnesら、Purification of Immunoglobulin G (IgG)、「Methods in Molecular Biology」、第10巻79-104頁(Humana Press社、1992))。
【００２９】
加えて、モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ増幅の方法は、当業者に周知である。インビトロ増幅は、ダルベッコの変法イーグル培地(MEM)またはRPMI 1640培地などのような適当な培養培地において、任意にウシ胎仔血清のような哺乳類血清、または微量元素および増殖支持補充物、例えば正常マウス腹膜滲出細胞、脾細胞、および骨髄マクロファージなどを補充して、行うことができる。インビトロ生成は、比較的純粋な抗体調製物を提供し、大量の望ましい抗体を得るために大規模化することができる。大規模ハイブリドーマ培養は、エアリフトリアクター、連続攪拌リアクター、または固定されたもしくは捕獲された細胞培養物内での均質懸濁培養により行うことができる。インビボ増幅は、細胞クローンを親細胞と組織適合性である哺乳類(例えば、同系（osyngeneic）マウス)へ注射し、抗体産生腫瘍の増殖を引き起こすことにより行ってもよい。任意にこれらの動物は、注射前に、糖類、特にプリスタン(テトラメチルペンタデカン)のような油分により感作される。1〜3週間後、望ましいモノクローナル抗体が、その動物の体液から回収される。
【００３０】
抗体断片は、無傷の抗体の蛋白質分解性の加水分解によるか、またはその断片をコードしている核酸の発現により、調製することができる。抗体断片は、常法による無傷の抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例えば抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断により作成することができ、これはF(ab')2と称される5S断片を生じる。この断片は更に、チオール還元剤、および任意にジスルフィド連結の切断より生じるスルフヒドリル基のブロッキング基を用いて切断することができ、3.5S Fab'一価の断片を生じる。あるいはペプシンを使用する酵素的切断は、2個の一価のFab'断片およびFc断片を直接生じる。これらの方法は、例えば、Goldenberg(米国特許第4,036,945号および第4,331,647号)およびその他(Nisonhoffら、Arch. Biochem. Biophys.、89:230(1960)；Porter、Biochem. J.、73:119(1959)；Edelmanら、Methods in Enzymology、第1巻、422頁(Academic Press社、1967)；および、Coliganら、2.8.1-2.8.10および2.10.1-2.10.4節)により説明されている。
【００３１】
加えて、本発明は、細胞(例えば、ブタの繊毛のある気管細胞)からのマイコプラズマが誘導したカルシウム放出(例えば、Mhyoポリペプチドにより誘導されたカルシウム放出)を阻害する化合物を同定するために使用することができる方法および材料を提供する。細胞からのマイコプラズマが誘導したカルシウム放出のインヒビターの同定法は、細胞(例えば、ブタの繊毛のある気管細胞)を、マイコプラズマポリペプチド(例えば、病原性Mhyo由来のMhyoポリペプチド)を含有する調製物と共に、被験化合物存在下でインキュベーションすること、ならびに被験化合物がこれらの細胞がカルシウムを放出することを阻害するかどうかを決定することを含みうる。別の態様において、カルシウム放出のインヒビターの同定法は、細胞を、被験化合物で前処理したマイコプラズマポリペプチド調製物と接触すること、ならびに被験化合物がこれらの細胞がカルシウムを放出することを阻害するかどうかを決定することを含みうる。カルシウム放出は、本明細書に説明された方法のいずれかを用い、測定することができる。この調製物は、粗Mhyo膜ポリペプチド調製物、精製したMhyoポリペプチド調製物、またはMhyo膜ポリペプチド調製物のトリプシン性の消化物である。被験化合物は、マイコプラズマポリペプチドを含む調製物により誘導されたカルシウム放出の増加が、その化合物非存在下と比べ、その化合物の存在により減少された場合には、マイコプラズマが誘導したカルシウム放出のインヒビターとして同定することができる。「減少された」とは、被験化合物の存在下において、化合物非存在下よりもカルシウム放出の発生がより低い(例えば、5％、10％、25％、50％、75％、または100％低い)ことを意味する。あらゆる化合物を、被験化合物として使用することができる。例えば、ポリペプチドである分子(例えば、プロテアーゼ、抗体、10〜50個のアミノ酸のポリペプチド)、オリゴヌクレオチド、エステル、脂質、エステル、糖質、またはステロイドを、被験化合物として使用することができる。当業者は、被験化合物の適量および適したインキュベーション時間を容易に確定することができる。
【００３２】
本発明は更に、下記実施例により説明されるが、これは特許請求の範囲において説明される本発明の範囲を限定するものではない。
【００３３】
実施例
実施例1−マイコプラズマ・ハイオニューモニエはブタの繊毛のある気管細胞における細胞内カルシウム放出を増加する
ブタの繊毛のある気管上皮細胞における細胞内遊離Ca2+濃度([Ca2+]i)に対する、無傷の病原性マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、非病原性M.ハイオニューモニエ、およびM.フロキュラーレ（flocculare）の作用を決定した。簡単に述べると、繊毛のある上皮細胞は、基底[Ca2+]i  103±3nM(n＝217細胞)を有した。この[Ca2+]iは、病原性M.ハイオニューモニエ株91-3(300μg/mL)の添加から100秒以内に、基底レベルから250±19nM(n＝47細胞)増加し、これは約60秒間継続した。対照的に、300μg/mLの非病原性M.ハイオニューモニエおよびM.フロキュラーレは、[Ca2+]iの増加に失敗した。Ca2+-非含有培地において、病原性M.ハイオニューモニエは、気管細胞において依然[Ca2+]iを増加した。小胞体におけるCa2+貯蔵を枯渇させるサプシガルギン(thapsigargin、1μM、30分間)による前処理は、M.ハイオニューモニエの作用を無効にした。百日咳毒素(100ng/mL、3時間)またはホスホリパーゼCのインヒビターであるU-73122(2μM、100秒)による前処理も、M.ハイオニューモニエの作用を無効にした。百日咳毒素感受性蛋白質(Gi/o)のアクチベーターであるマストパラン7の投与は、繊毛のある気管細胞において[Ca2+]iを増加した。これらの結果は、病原性M.ハイオニューモニエは、Gi/oに共役する受容体を活性化し、これは次にホスホリパーゼC経路を活性化し、これにより小胞体からCa2+が放出されることを示唆している。従って、Ca2+は、M.ハイオニューモニエの病因のシグナルとして役立つ。
【００３４】
方法および材料
fura-2 AMをMolecular Probes社(ユージーン、OR)から、ならびにU-73122、U-73343およびマストパラン7(Mas7)をBiomol社(プリモスミーティング、PA)から入手した以外は、全ての試薬をSigma Chemical社(セントルイス、MO)から得た。
【００３５】
下記の無傷のマイコプラズマを、本明細書において使用した：(1)病原性M.ハイオニューモニエ株91-3（当初232株からクローニングされたもので、マイクロタイター付着アッセイにおいて繊毛への高い付着性を示す）(Zhangら、Infect. Immun.、62:1616-1622(1994))；(2)非病原性M.ハイオニューモニエ株J(ATCC株25934)（これは繊毛に付着しない）(ZielinskiおよびRoss、Am. J. Vet. Res.、54:1262-1269(1993))；ならびに、M.フロキュラーレ株Ms42(ATCC株27399)（これはブタにおいて非病原性である）。マイコプラズマは、Friis培地(Friis、Nord. Vet. Med.、27:337-339(1975))において、対数増殖期まで培養し、15,000xgで30分間の遠心により収集した。遠心後、マイコプラズマペレットを収集し、PBS 50mLと共に3回、15,000xgで15分間遠心して洗浄した。最後のペレットを、27-ゲージ針を通し、PBS中に分散した。培養物200mLから収集したマイコプラズマ全細胞の数(3.4±1.7x1011 CCU、n＝7)を、Friis培地を含有するチューブによる段階希釈を用い、呈色変化単位(CCU)として決定した。この細胞濃度は、既報(Zhangら、Infect. Immun.、62:4367-4373(1994)およびZhangら、Infect. Immun.、63:1013-1019(1995))のように、ビシンコニン酸法(Pierce社、ロックフォード、IL)により測定された2.70±0.08mg蛋白質に相当していた。最終マイコプラズマ濃度は、PBSで3mg蛋白質/mLに調節した。
【００３６】
気管細胞を、既報のように単離した(Youngら、Vet.Microbiol.、71:269-279(1999))。簡単に述べると、ペントバルビタールナトリウムで麻酔した3〜6ヶ月齢の特異的病原体を持たないブタから、無菌技法を用いて気管を摘出した。繊毛のある細胞を、Ca2+-およびMg2+-非含有のMEM培地中の0.15％プロナーゼおよび0.01％DNaseを用いて解離し、これを4℃で24時間インキュベーションした。上皮細胞を、125xgで5分間の遠心により収集した。細胞ペレットを、5％FBS、インスリン0.12U/mL、およびペニシリン-ストレプトマイシン100U/mLを含有する、DMEM(高グルコース)およびHam's F-12 (1:1)培地混合物中に再懸濁した。細胞懸濁液を90mmの組織培養皿に移し、5％CO2中で60〜90分間インキュベーションし、線維芽細胞を除去した。気管上皮細胞を、使用時まで液体窒素中に貯蔵した。
【００３７】
下記の技術を用い、単独細胞における[Ca2+]i測定値を得た。気管細胞に、Krebs-Ringer炭酸水素塩(KRB)緩衝液(136mM NaCl、4.8mM KCl、1.5mM CaCl2、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、10mM HEPES、5.5mMグルコース、および0.1％BSA、pH7.4)中の4μM fura-2アセトキシメチルエステル(fura-2AM)を負荷し、37℃で30分間インキュベーションした。負荷した細胞を遠心し(700xg、2分間)、その後KRBに再懸濁して濃度500〜1000細胞/mLとした。fura-2AMを負荷した気管細胞を、注文生産したペトリ皿上のポリリシンで被覆したカバースリップ上に配置した。fura-2負荷した細胞を含有する皿を、倒立蛍光顕微鏡(Carl Zeiss社、NY)のステージ上に搭載した。生存している繊毛のある気管細胞のみに焦点を合わせ、24℃で[Ca2+]iを決定した。fura-2負荷したブタの繊毛のある気管細胞は、37℃で急激に劣化した。蛍光画像(励起波長334および380nm；放出波長510±20nm)を得、これを使用し、ピクセル毎の単位で画像を分割してバックグラウンドを差し引くことにより、[Ca2+]iの空間的に分解されたマップを作成した。放出シグナルをデジタル化して記録し、Attofluorデジタル蛍光画像システム(Atto Instruments社、ロックビル、MD)を用いて処理した。150秒間蛍光を読みとった後、マイコプラズマをこの細胞システムと混合した。[Ca2+]iは、既報(Grynkiewiczら、J. Biol. Chem.、260:3440-3450(1985))のように計算した。Atto Instruments社により提供された手順に従って、標準としてFura-2ペンタK+を用い、インサイチューでキャリブレーションを行った。
【００３８】
病原性M.ハイオニューモニエ株91-3、非毒性M.ハイオニューモニエ、およびM.フロキュラーレに対し反応した気管細胞の[Ca2+]iを比較するために、これらの細胞を、同じ濃度300μg/mLで処理した。各実験において1〜5個の繊毛のある単独の気管細胞を選択し、[Ca2+]i変化を調べた。マイコプラズマは、気管細胞に適用するまでは、氷上に維持した。
【００３９】
Ca2+シグナル伝達経路を調べるために、百日咳毒素(PTX、100ng/mL)を、気管細胞と共に3時間予備インキュベーションした。細胞を、マイコプラズマを添加する前に、サプシガルギン(TG、1μM)により37℃で30分間前処理し、ER Ca2+貯蔵を枯渇させた(Thastrupら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:2466-2470(1990))。細胞を、ホスホリパーゼCインヒビター(BleasdaleおよびFisher、Neuroprotocols、3:125-133(1993))であるU-73122(2μM)、またはその不活性アナログU-73343で、100秒間37℃で前処理し、その後マイコプラズマを添加した。マイコプラズマがGi/o蛋白質の活性化により[Ca2+]iを増加することを確認するために、この蛋白質のアクチベーター(Higashijimaら、J. Biol. Chem.、265:14176-14186(1990))であるMas7(10μM)を用い、それが気管細胞において[Ca2+]iを増加することができるかどうかを決定した。加えて、PTXが、Mas7に起因した[Ca2+]iの増加をブロックすることができるかどうかを決定した。
【００４０】
[Ca2+]iに関するデータは、ANOVAまたはスチューデントt-検定により解析した。有意水準は、P＜0.05に設定した。
【００４１】
ブタの繊毛のある気管上皮細胞中の[Ca2+]iに対するマイコプラズマの作用
M.ハイオニューモニエ株91-3は、ブタの気管細胞の繊毛に結合する(Debeyら、Am. J. Vet. Res.、53:1705-1710(1992)；MebusおよびUnderdahl、Am. J. Vet. Res.、38:1249-1254(1977)；ならびに、TajimaおよびYagihashi、Infect. Immun.、37:1162-1169(1982))。この[Ca2+]iの変化は、株91-3を繊毛のある気管細胞へ接種した後に決定した。繊毛のある上皮細胞は、基底[Ca2+]i 103±3nM(n＝217細胞)を有した。M.ハイオニューモニエ株91-3の300μg/mLに曝露した後、これらの細胞の89％(10実験において53細胞中の47個)に、[Ca2+]iの増加が認められた。図1および2に示したように、病原性M.ハイオニューモニエ株91-3(300μg/mL)の投与は、100秒以内に、繊毛のある細胞の[Ca2+]iを増加した。対照的に、非病原性M.ハイオニューモニエ(6実験において18細胞)およびM.フロキュラーレ(8実験において24細胞)は、同じマイコプラズマ濃度(300μg/mL)で、[Ca2+]iを増加しなかった(図1)。
【００４２】
用量-反応試験において、M.ハイオニューモニエ株91-3の30μg/mL(6実験において18細胞)は、[Ca2+]iの有意な変化を生じなかった(図2)。しかし、100μg/mL(7実験において16細胞；反応した細胞の84％)および300μg/mL(10実験において47細胞；反応した細胞の89％)は、各々、[Ca2+]iを110±9nMおよび250±19nM増加した(図2)。
【００４３】
M.ハイオニューモニエ株91-3は、その分泌産物を介して、繊毛のある細胞の[Ca2+]iを増加している可能性があるので、15,000xgで15分間の遠心後、マイコプラズマ(300μg/mL)から上清を収集し、その[Ca2+]iを増加する能力を試験した。これらの上清は、繊毛のある細胞の[Ca2+]iを増加しなかった。
【００４４】
Ca2+非含有培地におけるM.ハイオニューモニエ株91-3の作用
細胞外Ca2+の関与を決定するために、Ca2+キレート剤である10μM EGTAを補充したCa2+非含有培地を用いて実験を行った。M.ハイオニューモニエ株91-3(300μg/mL)は、依然[Ca2+]iを増加した(前：117±6nM、後：324±31nM、4実験において10細胞；反応した細胞の84％)(図3a)。これらの結果は、この増加には、Ca2+流入機構を通じてよりもむしろ、細胞内貯蔵からのCa2+放出が寄与することを示している。
【００４５】
M.ハイオニューモニエが誘導した[Ca2+]i増加に対するTGの作用
小胞体(ER)がCa2+放出給源であるかどうかを決定するために、繊毛のある細胞を、ミクロソームCa2+-ATPaseインヒビターである1μM TGで30分間処理した。以前の研究において、TGは、ブタの繊毛のある気管細胞からのイオノマイシンが誘導した細胞内Ca2+放出を無効にして、ER Ca2+貯蔵を枯渇することが分かっている(Thastrupら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87:2466-2470(1990))。同様に、TG処理は、M.ハイオニューモニエ株91-3(300μg/mL)が誘導した[Ca2+]i増加を無効にし、この生物がブタの気管上皮細胞からのER Ca2+放出を誘起することが明らかとなった(図3b)。
【００４６】
M.ハイオニューモニエが誘導した[Ca2+]i増加に対するU-73122およびU-73433の作用
イノシトール1,4,5-三リン酸(IP3)はERからCa2+を放出し、IP3生成はホスホリパーゼC(PLC)により触媒されることから、下記実験を行った。M.ハイオニューモニエ株91-3による接種前の、気管細胞の特異的PLCインヒビターである2μM U-73122(BleasdaleおよびFisher、Neuroprotocols、3:125-133(1993))による前処理は、繊毛のある細胞におけるマイコプラズマが誘導した[Ca2+]iの増加を無効にした(図3c)。対照的に、U-73122の不活性アナログであるU-73343は、マイコプラズマに対する[Ca2+]i反応を妨害しなかった(基底：90±12nM、ピーク：330±25nM、4実験において10細胞；反応した細胞の82％)(図3d)。これらの知見は、M. ハイオニューモニエによる[Ca2+]iの増加がPLCの活性化により媒介されることを裏付けている。
【００４７】
M.ハイオニューモニエおよびMas7-誘導した[Ca2+]i増加に対するPTXの作用
下記実験を行い、PTX感受性G蛋白質がM.ハイオニューモニエ株91-3の作用を媒介するかどうかを評価した。未処理の対照細胞において、M.ハイオニューモニエ株91-3は[Ca2+]iを増加した(254±57nM、3実験において9細胞；反応した細胞の81％；図4a)。対照的に、繊毛のある細胞の100ng PTX/mLによる3時間の前処理は、[Ca2+]iのM.ハイオニューモニエが誘導した増加を無効にした(図4b)。これらの結果は、M.ハイオニューモニエがPTX感受性G蛋白質(Gi/o)受容体を活性化することを示している。Gi/o蛋白質が気管細胞における[Ca2+]i増加に関与することを確認するために、Gi/oのアクチベーターであるMas7(Higashijimaら、J. Biol. Chem.、265:14176-14186(1990))の[Ca2+]iの作用を試験した。10μM Mas7の繊毛のある気管細胞への投与は、100秒以内に基底レベル103±4nMから351±24nMへの[Ca2+]iの増加を誘起した(3実験においてn＝9細胞、反応した細胞の82％)(図4c)。これらの細胞のPTXによる前処理は、Mas7の作用を無効にした(図4d)。これらの結果は、繊毛のある気管細胞におけるGi/oの活性化は[Ca2+]iを増加することを明らかにした。
【００４８】
M.ハイオニューモニエは、ブタ気道において、繊毛のある上皮細胞へ結合することにより集落形成する(MebusおよびUnderdahl、Am. J. Vet. Res.、38:1249-1254(1977)；TajimaおよびYagihashi、Infect. Immun.、37:1162-1169(1982)；および、Zhangら、Infect. Immun.、62:1616-1622(1994))。付着は、表面蛋白質P97により媒介される(HsuおよびMinion、Infect. Immun.、66:4762-4766(1998)；Hsuら、J. Bacteriol.、179:1317-1323(1997)；および、Minionら、Infect. Immun.、68:3056-3060(2000))。繊毛静止(ciliostasis)および繊毛喪失が、直ぐに起こる(DebeyおよびRoss、Infect. Immun.、62:5312-5318(1994))。本明細書に示したように、Ca2+流動は、繊毛喪失に関連している。病原性M.ハイオニューモニエ株91-3は、ブタの繊毛のある気管細胞の[Ca2+]iを増加した。対照的に、M.ハイオニューモニエの非病原株JおよびM.フロキュラーレはそれに失敗し、このことにより、繊毛への結合はCa2+流動誘導の必要条件であることが示された。M.ハイオニューモニエ株Jは、ブタ繊毛に結合しない(Zhangら、Infect. Immun.、63:1013-1019(1995))。[Ca2+]iの反応は急速な事象であり、この増加は、マイコプラズマ濃度に左右された。好中球におけるM.ハイオニューモニエによる[Ca2+]iの増加の別の試験において、107〜1010 CCUの病原株は、ザイモサン（zymosan）が誘導した[Ca2+]iの増加を増強したのに対し、非病原株は増強しなかった(Debeyら、Vet. Res. Commun.、17:249-257(1993))。病原性M.ハイオニューモニエ株91-3(109 CCU)の気道上皮の繊毛に対する付着は、マイコプラズマ投与の90分間以内に、絡み合って塊形成し、長手方向の断裂を生じるのに対し、非病原性M.ハイオニューモニエ株は、繊毛損傷を示さない(Debeyら、Am. J. Vet. Res.、53:1705-1710(1992)、およびYoungら、Vet. Microbiol.、71:269-279(1999))。従って、気管上皮の[Ca2+]iの変化は、M.ハイオニューモニエの病態形成に関連している。
【００４９】
M.ハイオニューモニエに反応した単離された繊毛のある細胞における[Ca2+]i増加の大きさは、細胞毎に異なるが、概して、マイコプラズマ濃度の増加と共に増加した。気道上皮細胞におけるCa2+反応のこの非均一性は、グリア細胞(VandenPolら、J. Neurosci.、12:2648-2664(1992))、胆管細胞(Nathansonら、Am. J. Physiol.、271:G86-G96(1996))、巨核球(TertyshnikovaおよびFein、Cell Calcium、21:331-344(1997))、および軟骨細胞(D'AndreaおよびVittur、J. Bone Miner.Res.、11:946-954(1996))において報告された細胞外ATPの作用に類似していた。ウサギの気道上皮細胞において、Ca2+反応の非均一性は、個々の細胞の細胞外ATPへの感受性に起因している(EvensおよびSanderson、Am. J. Physiol.、277:L30-L41(1999)、およびKorngreenら、J. Physiol.(Lond.)、508:703-720(1998))。
【００５０】
微生物またはそれらの毒素により増加した[Ca2+]iは、他の細菌において報告されている。無傷のネズミチフス菌(S. typhimurium)は、腸上皮において[Ca2+]iを増加し、これがこれらの細胞からのIL-8分泌の増加を媒介する(Gewirtzら、J. Clin. Invest.、105:79-92(2000)、およびPaceら、Cell、72:505-514(1993))。ネズミチフス菌がどのようにして[Ca2+]i増加を誘導するかは、まだ明らかではない。大腸菌のエンテロトキシンは、HEp-2細胞からのER Ca2+の放出により[Ca2+]iを上昇する(Baldwinら、Infect. Immun.、59:1599-1604(1991))。この作用はリアノジン受容体アンタゴニストであるダントロレンによりブロックされるので、この放出はリアノジン受容体Ca2+放出チャネルの活性化によるものである(Dankoら、Biochim. Biophys. Acta.、816:18-24(1985)、ならびにHeineおよびWicher、Neuroreport、9:3309-3314(1998))。しかし、無傷のベロ細胞毒を生成する大腸菌は、IP3経路により、HEp-2細胞からCa2+を放出する(Ismailiら、Infect. Immun.、63:3316-3326(1995))。緑膿菌により分泌される酸化毒性因子であるピオシアニンは、ヒト気道上皮細胞におけるIP3形成および[Ca2+]iを増加するが、G蛋白質共役受容体アゴニストが誘導したIP3および[Ca2+]iの増加は低下する(Denningら、 Am. J. Physiol.、274:L893-L900(1998))。ピオシアニンが誘導した酸化によりIP3形成が増加する可能性がある(Denningら、Am. J. Physiol.、274:L893-L900(1998))。パスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)毒素(PMT)は、Gq-共役したPLC-β1アイソザイムの活性化により、様々な無傷の動物細胞において[Ca2+]iを増加する(Wilsonら、J. Biol. Chem.、272:1268-1275(1997))。形質膜受容体を介さないアフリカツメガエル(Xenopus)卵母細胞へのPMTの微量注入でもGq-PLCが活性化されるので、PMTのこの作用は、Gq-PLC経路のその直接的な活性化が大きな原因である(Wilsonら、J. Biol. Chem.、272:1268-1275(1997))。
【００５１】
一部の細胞外細菌構造は、宿主細胞の[Ca2+]iを増加することができる。例えば、病原性ナイセリア(Neisseria)のIV型ピリ線毛(pili)は、子宮頚癌由来の上皮様ヒト細胞株ME180に付着し、ピリ線毛受容体を介して[Ca2+]iを増加する(Kallstromら、J. Biol. Chem.、273:21777-217782(1998))。[Ca2+]iの上昇は、細菌と宿主細胞の間に安定した接触を確立するための最初の工程として必要である(Kallstromら、J. Biol. Chem.、273:21777-217782(1998))。しかし、どのようにしてナイセリアのピリ線毛が[Ca2+]iの増加を引き起こすかはわかっていない。
【００５２】
病原性M.ハイオニューモニエ株91-3は、Ca2+-非含有培地において、繊毛のある細胞の[Ca2+]iを増加したが、これは[Ca2+]iの増加が、細胞内貯蔵からのCa2+放出が原因であることを示している。ER Ca2+貯蔵を枯渇するための気管細胞のTGによる前処理は、マイコプラズマの作用を無効にし、これによりCa2+放出におけるこの細胞小器官の関与が確認された。特異的PLCインヒビターであるU-73122による気管細胞の前処理も、マイコプラズマが誘導した[Ca2+]i増加を妨害し、ERからのマイコプラズマが誘導したCa2+放出は、PLC経路を介していることが示された。
【００５３】
本明細書に示した結果は、気道上皮中のM.ハイオニューモニエの受容体は、Gi/oに共役していることを示している。PLCの活性化は、A1アデノシン受容体を介する現象についての知見にも一致している(Tomuraら、J. Biol. Chem.、272:23130-23137(1997))。Gi/o蛋白質は、通常アデニリルシクラーゼの阻害、K+およびCa2+チャネルの調節、ならびにcGMPホスホジエステラーゼの活性化に寄与している。Gi/o蛋白質の中でも、Gi2およびGi3は、下記の二つのシグナル伝達経路の変調を媒介することができる：PLCの活性化はGβγ二量体で媒介され、アデニリルシクラーゼの阻害はαiにより媒介される(Tomuraら、J. Biol. Chem.、272:23130-23137(1997))。
【００５４】
まとめると、本明細書に提供された結果は、病原性M.ハイオニューモニエの受容体は、Gi/oと共役していることを示している。一旦これらの受容体の結合が生じると、このG蛋白質は、PLC経路を刺激し、ERからのCa2+放出を生じることにより[Ca2+]iを増加する(図5)。加えて、アドヘシンによる実験は、P97を含むM.ハイオニューモニエ由来のアドヘシンは、[Ca2+]i増加に失敗したことを明らかにした。同じく、ブタの繊毛のある気管細胞のM.ハイオニューモニエ株91-3による接種は、接種の3分以内に繊毛の運動頻度(beating frequency)を増大し、これはこれらの細胞における[Ca2+]iの増加に対応している。これらの結果は、ヒツジの気道上皮細胞の繊毛の運動頻度に対するCa2+の作用について観察されていることと一致しており(SalatheおよびBookman、J. Physiol.、(Lond.)、520:851-865(1999))、マイコプラズマの病態形成における[Ca2+]iの変化の関与を裏付けている。
【００５５】
実施例2−ブタの繊毛のある気管細胞における[Ca2+]i増加を誘導するMhyoポリペプチドの特徴決定および精製
マイコプラズマは細胞壁を欠き、ただ一種類の膜、形質膜を有する(Razin S.、(1993年)、「Mycoplasma membrane as models in membrane research」(第2章)、「Subcellular Biochemistry」第20巻、「Mycoplasma Cell Membranes」、Rottem S、Kahane I.編集、Plenum Press社、ニューヨーク、1-28頁)。Mhyo膜を、この生物の浸透圧溶解により調製し、それが繊毛のある気管細胞において[Ca2+]iを増加したかどうかを決定するために試験した。Mhyo膜は、繊毛のある気管細胞において[Ca2+]iを増加した(図6A)。この膜の蛋白質分解酵素プロテイナーゼKまたはパパインによる8時間の前処理は、膜のこの作用を無効にした(図6B)。これらの結果は、膜ポリペプチドがこの作用に寄与していることを示している。興味深いことに、トリプシンによる30分間の前処理は、[Ca2+]i増加の抑制に失敗したのみならず、この膜の作用を増強すらした(図6C)。トリプシンによる16時間の前処理も、膜の[Ca2+]iに対する作用の低下に失敗した。膜のトリプシン処理は、その受容体に関するより多くのエピトープを含むポリペプチド断片を生じることができる。マイコプラズマのトリプシン性の断片に、超遠心(100,000xg、60分間)を施した。可溶性ポリペプチドを含む得られた上清も、繊毛のある上皮における[Ca2+]iを増加した。この可溶化された膜ポリペプチドの[Ca2+]iを上昇する活性は、未消化の膜よりも、少なくとも10倍より強力であった(図6D)。
【００５６】
ウェスタンブロット技術を用い、病原性Mhyo(91-3)および非病原性Mhyo(株J)由来の外膜ポリペプチドを比較した。病原性Mhyo由来の試料は、非病原性Mhyo由来の試料では示されない5本のポリペプチドバンドを示した(図7)。これら5本のポリペプチドバンドは、各々、分子量30、60、65、90および120kDaに相当していた。
【００５７】
ウェスタンブロット技術を用い、トリプシンによる消化後の、病原性Mhyo(91-3)および非病原性Mhyo(株J)由来の外膜ポリペプチドを比較した。病原性Mhyo由来の試料は、非病原性Mhyo由来の試料では示されない2本のポリペプチドバンドを示した(図8)。これら2本のポリペプチドバンドは、各々、分子量35および50kDaに相当していた。
【００５８】
ゲル電気泳動(21cm x 50cm)を用い、これらの5種のポリペプチドを約10μgを超える量で集めた。収集した後、このポリペプチド調製物を使用して[Ca2+]iアッセイを行い、どのポリペプチドが繊毛のある気管細胞中の[Ca2+]iを増加するかを確認した。加えて、2次元電気泳動を用い、各ポリペプチドを更に精製した。質量分析により各ポリペプチドの純度を確認した後、N末端蛋白質配列決定を行った。N末端アミノ酸配列を決定した後、配列データベースを検索して完全長Mhyoポリペプチドのアミノ酸配列を同定する。
【００５９】
可溶化したMhyoポリペプチドを、アニオン交換カラムを使用するHPLCにより、Tris緩衝液中の0〜0.5M NaClの直線勾配を使用し(pH8.5；図9)、精製した。初期フラクション、フラクション#4は、繊毛のある気管細胞において[Ca2+]iを上昇する活性を示した(図10)。ウェスタンブロット解析は、フラクション#4が、65kDaバンドを含み、これは抗Mhyo回復期血清により認識された(図11)ことを明らかにした。この65kDaポリペプチドバンドは、Mhyo全細胞調製物においても現れた。
【００６０】
フラクション#4は、NaCl勾配の適用直前または直後に溶離したピークに相当したので、更に後期のフラクションの分析を行った。この分析により、フラクション#8が同じく、繊毛のある気管細胞中の[Ca2+]iを増加したことが明らかとなった(図12および13)。フラクション#8は、0.4MのNaCl勾配で流出した。これらの結果は、フラクション#8は、繊毛のある気管上皮において[Ca2+]iを上昇する活性を示す精製された外膜Mhyoポリペプチドを含有することを示した。
【００６１】
遠心濾過を用い、繊毛のある気管上皮において[Ca2+]iを増加することが可能なトリプシン性ポリペプチド断片のサイズを決定した。30kDa孔サイズフィルターを使用した後の濾液は、[Ca2+]iを増加することに失敗したのに対し、100kDa孔サイズフィルターを使用した後の濾液は、繊毛のある気管上皮内の[Ca2+]iを増加した。これらの結果は、繊毛のある気管上皮における[Ca2+]i増加に寄与するトリプシン性ポリペプチド断片は、約30〜約100kDaのサイズであろうことを示している。
【００６２】
最近の報告によると、0.1U/mLのトリプシンは、モルモット気管上皮中の[Ca2+]iを増加することができる(Oshiroら、Life Sci.、71:547-558(2002))。本明細書において説明された[Ca2+]i実験における推定トリプシン濃度は約1U/mLであるので、本発明者らは、観察されたトリプシン性の断片が誘導した[Ca2+]i増加において、トリプシンが役割を果たすかどうかを試験した。トリプシン単独（≧1U/mL）では、 ブタの繊毛のある上皮において[Ca2+]iを増加することが分かった。しかし、ダイズトリプシンインヒビター(10U/mL)による処理は、トリプシン(10U/mL)が誘導した[Ca2+]i増加を阻害したが、観察されたトリプシン性のMhyoポリペプチド断片が誘導した[Ca2+]i増加の妨害には失敗した(図14)。これらの結果は、トリプシン性のMhyo調製物の[Ca2+]iに対する刺激作用はトリプシンではなくMhyoポリペプチドが原因であることを明らかにしている。
【００６３】
実施例3−ブタの繊毛のある気管細胞において[Ca2+]i増加を誘導するMhyoポリペプチドのアミノ酸配列の獲得
病原性Mhyo株91-3を、既報のように、20％マイコプラズマ-非含有ブタ血清を補充したFriis培地において増殖し、遠心により収集した(Zhangら、Infect Immun、62:1616-1622(1994))。この生物に、既報のように浸透圧溶解を施し、遠心し(35,000xg、60分間)、膜調製物を得た(Pollack JD.、(1998年)、「Enzyme analysis」(第10章)、「Methods in Molecular Biology」第104巻、「Mycoplasma Protocols」、Miles R & Nicholas A.編集、Humana Press社、イオトワ、NJ.、79-93頁)。この膜調製物を、PBS中に懸濁し、トリプシンの17:1の比(w/w)で、37℃で30分間処理し、その後超遠心した(100,000xg、60分間)。活性のあるトリプシン性の断片を含む得られた上清は、アニオン交換カラム(Waters社、モデルDEA 5TW)およびTris緩衝液(pH8.5)中の0〜0.5M NaClの直線勾配を使用するHPLCにより精製する。溶離液は、280nmの吸光度でモニタリングし、フラクション4および8を収集し、更に水中の0.08％トリフルオロ酢酸中の0〜60％アセトニトリル直線勾配を使用するC18逆相HPLCにより精製する。あるいは、ゲルろ過、疎水性相互作用、またはサイズ排除カラム技術を用い、このポリペプチドを更に精製する。精製したポリペプチドをSep-パックを用い濃縮し、アセトニトリル-メタノールを溶媒系として溶離する。この溶媒を、窒素流下で除去する。加えて、SDS-PAGEを用い、このポリペプチドの分子量を確認する。精製に続き、注目すべきピークから収集した溶離液を、繊毛のある気管細胞におけるそれらの[Ca2+]i増加の能力について試験する。得られたポリペプチド調製物の純度は、質量分析により決定した(Voyager、モデルDE PRO)。
【００６４】
C18 HPLCにより精製し質量分析により確認したポリペプチドは、Applied Biosystems社の蛋白質配列決定装置(モデル494)を用いてN末端アミノ酸を決定した。あるいは、内部配列情報を、臭化シアン切断およびエンドプロテアーゼLys-Cなどの酵素切断を用いて作成された断片から得る。この切断断片を精製し、N末端アミノ酸配列決定を施した。N末端アミノ酸配列が決定された後、配列データベースを検索し、完全長Mhyoポリペプチドのアミノ酸配列を同定する。
【００６５】
下記の方法を使用し、繊毛のある気管細胞における[Ca2+]i増加を測定する。気管細胞は、Yamayaらにより述べられているように、Mhyo-非含有ブタから得る(Am. J. Physiol.、262:L713-L724(1992))。簡単に述べると、繊毛のある気管上皮細胞を、Ca2+およびMg2+-非含有MEM培地中の0.15％プロナーゼおよび0.01％DNaseを使用して酵素消化により単離し、4℃で24時間インキュベーションする。酵素消化は、ウシ胎仔血清の添加により停止する。これらの細胞を、気管から取り出し、ダルベッコのMEMおよびHam's F-12(1:1)培地の中での遠心により洗浄する。これらの細胞は、液体窒素中で凍結する。使用するためには、細胞を37℃で迅速に解凍し、Krebs-Ringer炭酸水素塩緩衝液(KRB)中のポリシンで被覆した注文生産した30mmペトリ皿の5mmウェルのカバースリップに付着させる。このような皿のインキュベーションの容量は、200μLである。単独の細胞の[Ca2+]i決定手法は、既報の画像システムを用いて行う(ZhuGeおよびHsu、J.Pharmacol. Exp. Ther.、275:1077-1083(1995))。
【００６６】
特定の実験からの[Ca2+]iデータは、同じ処理群の少なくとも5個の単独細胞からの[Ca2+]i増加のピークの平均化により計算し、プラセボ(KRB)を添加した対照群と比較する。Ca2+バイオアッセイは、先の結果を確認するために、もう一度反復する。このデータは、ANOVAを用いて解析し、Tukey's検定を用いて平均比較を行う。α水準は、P≦0.05に設定する。
【００６７】
実施例4 -ブタの繊毛のある気管細胞において[Ca2+]i増加を誘導する組換えMhyoポリペプチドの発現および特徴決定
[Ca2+]iを上昇する組換え膜Mhyoポリペプチド(またはその断片)を、他で説明された方法(HsuおよびMinion、Infect.Immun.、66:4762-4766(1998))と同様の方法を用いて得る。マイコプラズマは、通常は停止コドンであるUGAを、トリプトファンのコードコドンとして使用する。従ってサプレッサーシステムが、大腸菌におけるほとんどのマイコプラズマ遺伝子配列の発現に使用される。あるいは、位置指定突然変異誘発を用い、UGAコドンを修飾する。
【００６８】
Mhyoポリペプチド(またはその断片)をコードしている核酸を、pTrcHisのようなポリヒスチジン融合発現ベクターにクローニングし、組換え産物の精製を促進する。組換え大腸菌をIPTGにより誘導し、組換えMhyoポリペプチドの生成を、抗ポリヒスチジンを用いて免疫ブロットによりモニタリングする。誘導した大腸菌を、B-PER試薬(Pierce社)により透過化し、細胞片を遠心により除去する。組換え蛋白質を、Talon樹脂(Clontech社)またはProBond樹脂(Invitrogen社)のいずれかを使用する金属キレートクロマトグラフィーにより精製する。このポリペプチドの生物学的活性を試験し、繊毛のある気管細胞における[Ca2+]i増加の能力を確認する。大規模バッチのためには、Bio-Rad Biologic Chromatographyシステムを使用する。
【００６９】
組換えMhyoポリペプチドを、その繊毛のある気管細胞における[Ca2+]i増加の能力および気管上皮において繊毛損傷を誘導する能力について試験する。非病原性Mhyo(株J)から単離した膜調製物は、これらの実験において陰性対照として使用する。インサート(insert)中の気管上皮細胞は、以下の7種の処理の中の一つで処理する：(1)陰性対照(例えば、非病原性Mhyo(株J)由来の膜調製物、100μg/mL)、(2)陽性対照(例えば、Mhyo株91-3由来の膜調製物、100μg/mL)、(3)可溶性トリプシン性Mhyoポリペプチド断片(10μg/mL)、(4)組換えMhyoポリペプチド(0.1μg/mL)、(5)組換えMhyoポリペプチド(1μg/mL)、(6)組換えMhyoポリペプチド(10μg/mL)、および(7)組換えMhyoポリペプチド(100μg/mL)。各条件は、全ての実験を3つ組で行い、少なくとも3回繰り返す。[Ca2+]iの決定は、前述のように行う。
【００７０】
下記技術を用い、付着、繊毛損傷、および繊毛喪失を評価する。他に説明されたように(Youngら、Vet. Microbiol.、71:269-279(2000))、酵素消化した上皮細胞を滅菌技術を用い調製し、Millicell-PCFインサート(孔サイズ0.45μm、面積0.6cm2、Millipore社、ベッドフォード、MA)上に濃度4〜5x105細胞/cm2で播種する。本インサートは、ヒト胎盤コラーゲンで被覆されており、24-ウェル培養プレート上に配置されている。これらの細胞を、気相-液相界面で増殖し、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した2％ ultroser G血清代用物(USG培地)を含有する無血清DMEM/F-12(1:1)の下で栄養を与える。
【００７１】
18〜22日間増殖した後の、繊毛のある気管上皮細胞の培養物を使用する。培養培地を廃棄し、未処理のMhyo膜蛋白質または組換えMhyoポリペプチドを含有する新鮮なDMEM/F-12培地と置き換え、37℃、7.2％CO2中、90分間(付着および繊毛損傷の決定のため)または2日間(繊毛喪失の決定のため)のいずれかの期間インキュベーションする。インキュベーション後、インサートをPBSで3回洗浄し、付着していないマイコプラズマを除去する。細胞は、トリプシン-EDTAを用いてインサートから解離し、PBSで洗浄する。これらの細胞を、グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒドによりインサイチューで固定し、先に説明された(Youngら、Vet. Microbiol.、71:269-279(2000))ように、走査型電子顕微鏡で、Mhyoの繊毛のある細胞への付着ならびに繊毛の損傷および喪失の程度を決定する。各試料について5種のランダム視野(16x23μm2)から撮影し、画像解析を行い、繊毛が占める面積(繊毛喪失の決定のため)およびマイコプラズマの繊毛への付着に関するデータを得る。
【００７２】
あるいは、付着および繊毛喪失を、Zhangらにより説明された(Infect. Immun.、62:1616-1622(1994)))マイクロタイタープレート付着アッセイならびに／またはDeBayおよびRossにより(Infect. Immun.、62:5312-5318(1994))に説明された気管外植片モデルを用いて評価する。
【００７３】
Mhyoポリペプチドの活性部位を、欠失突然変異誘発および／または重複ペプチド配列を用いてマッピングする。加えて、Mhyoポリペプチド調製物を用い、ブタを免疫処置してブタのマイコプラズマ肺炎管理を補助し、および／またはこの活性部位に対応するペプチド配列のアナログを使用し、Mhyo膜ポリペプチドに対する細胞の受容体をブロックする。
【００７４】
実施例5−ブタの繊毛のある気管細胞において[Ca2+]i増加を誘導するMhyoポリペプチドに対する抗体作成
5匹の雌性BALB/cマウス(8〜10週齢)を、精製したMhyo膜ポリペプチドで免疫感作する。繊毛のある気管細胞において[Ca2+]iを増加する能力を有する精製したMhyoポリペプチドを、HPLC、SDS-PAGE、または他の精製技術により得る。各マウスに、フロイントのアジュバント中のこのポリペプチド50μgを、2週間に3回腹腔内注射して投与する。生理食塩水中のこのポリペプチド5μgの最終静脈内追加投与を3回目の注射の1ヶ月後に与え、その3日後にSP2/0骨髄腫細胞と融合する。約500個の個別のクローンを、各融合期間にスクリーニングし、5匹全てのマウスをMAb作成に使用する。ELISAプレートを、M.フロキュラーレおよび非病原性Mhyo(株J)の対照膜ポリペプチドと共に、精製したMhyo膜ポリペプチドで被覆する、間接ELISAを用いて、ハイブリドーマスクリーニングを行う。ヤギ抗マウスIgG-ホースラディッシュ複合体を用い、MAbを検出する。
【００７５】
実施例6−ブタの繊毛のある気管細胞におけるMhyoポリペプチドが誘導した[Ca2+]i増加を阻害する抗体の同定
様々に希釈した抗体を、[Ca2+]i測定に組み込む前に、マイコプラズマ膜調製物または精製したMhyoポリペプチドに添加する。これらの抗体は、非特異的抗体作用を制御するために、抗原非含有試料にも添加する。[Ca2+]iの変化を試験する方法は、先に説明した。
【００７６】
下記技術を使用し、Mhyo付着ならびにMhyoにより誘導された繊毛損傷および繊毛喪失を阻害する抗体能を評価する。繊毛のある細胞中のMhyo-および組換えMhyoポリペプチドにより誘導した[Ca2+]i増加をブロックする能力を示すポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を使用する。インサート中の気管上皮細胞を、下記処理中の一つで処理する：(1)対照、(2)Mhyo株91-3(109CCU)、(3)抗体調製物(希釈A)＋Mhyo株91-3、(5)抗体調製物(希釈B)＋Mhyo株91-3、(6)抗体調製物(希釈C)＋Mhyo株91-3、(7)抗体調製物(希釈D)＋Mhyo株91-3。この抗体を、Mhyo-非含有試料に添加し、非特異的抗体作用を制御する。加えて、熱で失活した抗体を用い、加熱が、Mhyoにより誘導した付着および繊毛喪失の特異的阻害を無効にすることを確認する。各条件を、3つ組で行い、全実験を少なくとも3回繰り返す。
【００７７】
繊毛が占める面積およびMhyoの繊毛への付着に関するデータをANOVAを用いて解析し、Tukey's検定を用いて平均比較を行う。α水準は、P≦0.05に設定する。
【００７８】
その他の態様
本発明はその詳細な説明と組合わせて説明されているが、上述の説明は例証を意図するものであり、添付された特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を制限する意図のものでないことが理解されるべきである。他の局面、利点、および変更は、特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図1は、繊毛のあるブタ気管細胞における[Ca2+]i反応をプロットしている3種のグラフを含む。データは、(a)病原性M.ハイオニューモニエ株91-3(n＝10、合計47細胞)、(b)非病原性M.ハイオニューモニエ(n＝6、合計18細胞)、および(c)M.フロキュラーレ(n＝8、合計24細胞)の作用を示す代表的トレースである。3種全てのマイコプラズマ調製物の蛋白質濃度は、300μg/mLであった。矢印は、マイコプラズマが投与された時点を示している。
【図２】図2は、示された処置に関する基底レベルを超える[Ca2+]i増加をプロットしている棒グラフである。PMHは、病原性M.ハイオニューモニエ株91-3を示し；NPMHは、非病原性M.ハイオニューモニエを示し；および、MFは、M.フロキュラーレを示している。データは、平均±SEで表わしている。無傷のM.ハイオニューモニエ91-3は、30(6実験においてn＝18気管細胞)、100(7実験においてn＝16細胞)、および300μg/mL(10実験においてn＝47細胞)で投与した。M.フロキュラーレ(8実験においてn＝24細胞)および非病原性M.ハイオニューモニエ(6実験においてn＝18細胞)は、300μg/mLで投与した。アスタリスクは、他の処置との有意差を示している(P＜0.05)。
【図３】図3は、M.ハイオニューモニエ株91-3を接種した、繊毛のあるブタ気管細胞における[Ca2+]i反応をプロットしている4種のグラフを含む。データは、[Ca2+]iのM.ハイオニューモニエ誘導した増加に対する、(a)Ca2+非含有培地(n＝5細胞)、(b)サプシガルギン(TG；1μM)による30分間の前処理(n＝5細胞)、(c)U-73122(2μM；n＝5細胞)100秒、および(d)U-73343(2μM；n＝5細胞)の作用を示す、代表的トレースである。矢印は、無傷のマイコプラズマ(300μg/mL)が投与された時点を示している。
【図４】図4は、百日咳毒素(PTX；100ng/mL)で3時間前処理した後の、マストパラン7(Mas7)またはM.ハイオニューモニエを接種した、繊毛のあるブタ気管細胞における[Ca2+]i反応をプロットしている4種のグラフを含む。データは、(a)M.ハイオニューモニエ対照(n＝9細胞)、(b)PTX処理したM.ハイオニューモニエ(n＝11細胞)、(c)Mas7(10μM)対照(n＝9細胞)、および(d)PTX処理したMas7(n＝9細胞)に関する代表的トレースである。
【図５】図5は、M.ハイオニューモニエ−繊毛のある気管細胞の相互作用の提唱されたモデルの略図である。Rc＝受容体；ER＝小胞体。
【図６】図6は、Mhyo膜を接種した繊毛のあるブタ気管細胞における[Ca2+]i反応をプロットしている4種のグラフを含む。各トレースは、各気管細胞における[Ca2+]i変化を示している。矢印は、投与した時点を示している。(A)膜調製物(100μg/mL)は、[Ca2+]iを増加した。(B)プロテイナーゼKによる消化は、[Ca2+]iの膜が誘導した増加をブロックした。膜(100μg/0.1ml PBS)は、プロテイナーゼK(2μg)と共に37℃で8時間インキュベーションし、その後0.9mL Krebs-Ringer炭酸水素塩(KRB)緩衝液中の気管細胞に適用した。(C)トリプシンによる消化は、[Ca2+]iの膜が誘導した増加を増強した。膜(100μg/0.1mL PBS)は、トリプシン(6μg)と共に37℃で30分間インキュベーションし、その後0.9mL KRB中の気管細胞に適用した。(D)可溶性膜蛋白質は、(A)の未消化の膜よりも大きい活性を示した。可溶性蛋白質は、トリプシン処理された膜を超遠心(100,000xg、60分間)し、上清を得ることにより調製した。
【図７】図7は、ブタ抗Mhyo血清(1:80)によりプロービングした、病原性(P)および非病原性(N)Mhyo由来のMhyo膜ポリペプチドの免疫ブロットの写真である。マーカーレーンは、kDaでの見かけの分子量により確定した(10μg/レーン)。矢印は、病原性Mhyoにおいては認められたが、非病原性Mhyoにおいては認められなかったポリペプチドバンドを示している。
【図８】図8は、病原性(P)および非病原性(N)Mhyo由来のMhyo膜ポリペプチドの免疫ブロットの写真である。試料は、トリプシンで消化し、ブタ抗Mhyo血清(1:80)でプロービングした。マーカーレーンは、kDaでの見かけの分子量により確定した(10μg/レーン)。矢印は、病原性Mhyoにおいて認められたが、非病原性Mhyoにおいて認められなかったポリペプチドバンドを示している。
【図９】図9は、アニオン交換HPLCを使用する、Mhyo膜ポリペプチドのトリプシン断片の精製をプロットしているグラフである。Tris緩衝液(pH8.5)中の0-0.5M NaClの直線勾配を用い、ポリペプチドを溶離した。溶離液は、吸光度280nmでモニタリングした。番号3はフラクション3を示し；番号4はフラクション4を示している。
【図１０】図10は、ブタの繊毛のある気管細胞(n＝8細胞)における、フラクション4(10μg/ml)が誘導した[Ca2+]i増加をプロットしているグラフである。このフラクションは、[Ca2+]i増加を誘起した。矢印は、このポリペプチドフラクションの投与を示している。
【図１１】図11は、抗Mhyoブタ回復期血清でプロービングした、Mhyoポリペプチドの免疫ブロットの写真である。マーカーレーンは、kDaでの見かけの分子量を確定している。レーン1：フラクション#4(10μg/レーン)；レーン2：精製前のMhyoの可溶性トリプシン性断片(10μg/レーン)；レーン3：フラクション#4(別の精製の試行から；5μg/レーン)；レーン4：Mhyo全細胞抗原(10μg/レーン)；レーン5：ブランク(無抗原)。一次抗体は、ブタ抗血清(1:100)であった。二次抗体は、ヤギ抗ブタ血清(1:1000)であった。陽性バンドは、レーン1および3において約65kDaで認められる。
【図１２】図12は、アニオン交換HPLCを使用する、Mhyo膜蛋白質のトリプシン性断片の精製をプロットしているグラフである。Tris緩衝液(pH8.5)中の0-0.5M NaClの直線勾配を用い、ポリペプチドを溶離した。溶離液は、吸光度280nmでモニタリングした。溶離液のフラクション8は、Ca2+放出能を示した。
【図１３】図13は、ブタの繊毛のある気管細胞(n＝4細胞)における、フラクション8(1μg)-誘導した[Ca2+]i増加をプロットしているグラフである。このフラクションは、唯一[Ca2+]i増加を誘起したフラクションであった。矢印は、ポリペプチドフラクションの投与を示している。
【図１４】図14は、ダイズトリプシンインヒビター(TI)で前処理したトリプシン性のMhyo膜調製物と共にインキュベーションしたブタの繊毛のある気管細胞における[Ca2+]i増加をプロットしているグラフである。TIは、繊毛のある気管上皮細胞における、Mhyoのトリプシン性の膜調製物により誘導された[Ca2+]i増加を阻害することに失敗した。TIは、トリプシン性の膜調製物と共に、37℃で10分間インキュベーションしてから投与した。縦軸は、nMでの[Ca2+]iを示す。各トレースは、ひとつの細胞での[Ca2+]i変化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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