(57)【要約】ミスマッチの修復検出(MRD)は、DNA変異を検出するための新規な方法であり、細菌を利用して、マーカー遺伝子の発現における変化によってミスマッチを検出する。変異についてスクリーニングされるべきDNA断片を2つのMRDプラスミドへクローン化し、そして、これらの構築物のヘテロ二本鎖を細菌に形質転換する。その結果生じるコロニーは、ミスマッチがない場合は、マーカー遺伝子を発現し、ミスマッチがある場合は発現しない。MRDは、10kbのDNA内の1つのミスマッチを検出することが可能である。さらに、MRDは、多くの断片を同時に分析でき、ハイスループットのゲノタイピングおよび突然変異変異の検出のための、強力な方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、別個の核酸配列の複数のDNA二本鎖のいずれかにおいてミスマッチを検出する方法であって、該二本鎖が単一のハイブリダイゼーション反応において形成される方法：
該二本鎖のいずれかについて、細胞の特徴における変化を検出する段階であって、該変化が、該細胞内のベクターにおいて該二本鎖と共に存在しているマーカーのインビボのミスマッチ同時修復によりもたらされ、該同時修復が該二本鎖におけるミスマッチにより開始される段階。
【請求項２】
細胞が酵母細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞が細菌細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ミスマッチ同時修復が細菌のメチルミスマッチ修復系により媒介される、請求項3記載の方法。
【請求項５】
細菌が大腸菌であり、メチルミスマッチ修復系が大腸菌dam依存性ミスマッチ修復であり、かつベクターがヘミメチル化されている、請求項4記載の方法。
【請求項６】
マーカーが第一および第二の核酸鎖のヘテロ二本鎖であり、該鎖が配列において少なくとも5個の連続したヌクレオチドにより異なる、請求項5記載の方法。
【請求項７】
開始するミスマッチが3個以下の追加のミスマッチに直接的に隣接している、請求項6記載の方法。
【請求項８】
複数のDNA二本鎖が少なくとも別個の核酸配列の少なくとも10個の二本鎖を含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
複数のDNA二本鎖が少なくとも別個の核酸配列の少なくとも1,000個の二本鎖を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
複数のDNA二本鎖が少なくとも別個の核酸配列の少なくとも10,000個の二本鎖を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
複数のDNA二本鎖が少なくとも別個の核酸配列の少なくとも100,000個の二本鎖を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
複数のDNA二本鎖が真核生物由来の核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
真核生物が哺乳動物である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物がヒトである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
複数のDNA二本鎖がヒト遺伝子のコード領域由来の核酸配列を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
複数のDNA二本鎖がヒトゲノムの非コード領域由来の核酸配列を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
第一核酸鎖を第二核酸鎖にアニーリングすることにより複数のDNA二本鎖を形成する前駆段階をさらに含む方法であって、該第一鎖が少なくとも1つの核酸配列を含み、該第二鎖が複数の別個の核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
複数の第二核酸鎖が共通の供給源由来である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
共通の供給源が単一の個体由来のゲノムDNAまたはcDNAである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
複数の第二核酸鎖がプールされた供給源由来である、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
供給源がファミリーメンバーからプールされている、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
二本鎖を細胞から単離する最終段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
細胞が酵母細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
細胞が細菌細胞である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
細菌細胞がMUTATION SORTER(商標)(MS)株である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
以下のものを含む、別個の核酸配列の複数のDNA二本鎖のいずれかにおいてミスマッチを検出するためのキット：
第一ベクターおよび第二ベクターのそれぞれが細胞における複製に適した起点およびマーカーをコードする配列を含み、該第一および第二ベクターのマーカーが互いと異なる配列をコードし、該配列の差異がインビボのミスマッチ修復を受けることができるが開始しない、第一ベクターおよび第二ベクター。
【請求項２７】
以下の段階を含む、別個の核酸配列の複数のDNA二本鎖のいずれかにおいてミスマッチを同定可能に検出する方法：
該複数の別個の二本鎖から、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始することができるものを表現型的に分別する段階；および
該表現型的に分別された集団に存在する二本鎖を同定する段階であって、該同定が、該表現型的に分別された二本鎖のそれぞれへ特有に連結された少なくとも1つの遺伝子型で検出可能な遺伝因子を同定することにより実施される段階。
【請求項２８】
少なくとも1つの遺伝子型で検出可能な遺伝因子のそれぞれが核酸配列タグであって、該配列タグのそれぞれが該複数の配列タグの中で特有であり、かつ分別された二本鎖が、該配列タグ、タグ化二本鎖、またはそれら由来の核酸を、該複数の配列タグに相補的なプローブを有するマイクロアレイに特異的ハイブリダイゼーションにすることによって同定される、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
複数の別個の配列タグ化二本鎖のそれぞれが少なくとも1つのプライミング配列にそれ自体さらに連結されていて、該少なくとも1つのプライミング配列が、それに連結されたタグ化二本鎖の酵素的増幅を可能にするのに十分である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
配列タグのそれぞれが少なくとも17ヌクレオチド長である、請求項28または29記載の方法。
【請求項３１】
配列タグのそれぞれが少なくとも20ヌクレオチド長である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
配列タグのそれぞれが少なくとも25ヌクレオチド長である、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
複数の別個のDNA二本鎖のうち少なくとも1個が、天然に存在するゲノム配列と配列において同一である少なくとも1つの鎖を有する、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
天然に存在するゲノム配列と同一である配列を有する少なくとも1個の二本鎖のそれぞれが、ゲノムの鋳型からの増幅により得られる、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ゲノム配列が真核生物のゲノム配列である、請求項33または34記載の方法。
【請求項３６】
真核生物のゲノム配列が、酵母のゲノム配列、植物のゲノム配列、および哺乳動物のゲノム配列からなる群より選択される、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
真核生物のゲノム配列が哺乳動物のゲノム配列である、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物のゲノム配列が、マウスのゲノム配列、ラットのゲノム配列、およびヒトのゲノム配列からなる群より選択される、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
哺乳動物のゲノム配列がヒトのゲノム配列である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
複数の別個のDNA二本鎖が、単一のゲノム遺伝子座の異なる対立遺伝子変異体の配列を有する少なくとも2個の二本鎖を含む、請求項33記載の方法。
【請求項４１】
複数の別個のDNA二本鎖が、単一のゲノム遺伝子座の異なる対立遺伝子変異体の配列を有する少なくとも3個の二本鎖を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
複数の別個のDNA二本鎖が少なくとも10個の別個のDNA二本鎖を含む、請求項27、33または40記載の方法。
【請求項４３】
複数の別個のDNA二本鎖が少なくとも100個の別個のDNA二本鎖を含む、請求項32記載の方法。
【請求項４４】
複数の別個のDNA二本鎖が少なくとも1000個の別個のDNA二本鎖を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
複数の別個のDNA二本鎖が少なくとも5000個の別個のDNA二本鎖を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
複数の別個のDNA二本鎖が少なくとも10,000個の別個のDNA二本鎖を含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
以下の段階をさらに含む、請求項27記載の方法：
複数の別個の二本鎖から、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始することができないものを表現型的に分別する段階；および
さらに表現型的に分別された集団に存在する二本鎖を同定する段階であって、該同定段階が、該二本鎖のそれぞれへ特有に連結された少なくとも1つの遺伝子型で検出可能な遺伝因子の同定である段階。
【請求項４８】
ミスマッチ修復検出における使用のための改良された標準ベクターであって、該改良が、遺伝子型で検出可能な遺伝因子をベクターの標準配列に特有に連結することを含む標準ベクター。
【請求項４９】
ミスマッチ修復検出における使用のための改良された標準ベクターであって、該改良が、表現型的に分別可能な遺伝因子を制御された強力なプロモーターおよび異種性リボソーム結合部位に機能的に連結することを含む標準ベクター。
【請求項５０】
表現型的に分別可能な遺伝因子がリコンビナーゼをコードする、請求項48または49記載のベクター。
【請求項５１】
制御された強力なプロモーターがT7プロモーターである、請求項49記載のベクター。
【請求項５２】
標準配列へ特有に連結された遺伝子型で検出可能な遺伝因子をさらに含む、請求項51記載のベクター。
【請求項５３】
改良されたミスマッチ修復ベクターであって、該改良が、表現型的に分別可能な遺伝因子におけるミスマッチを検査二本鎖から200ヌクレオチド以下のところに配置することを含むベクター。
【請求項５４】
以下の段階を含む、ミスマッチ修復検出のための標準ベクターを調製する方法：
dam発現を許容する条件下で細菌株において二本鎖閉環状ベクターを増殖させる段階であって、該ベクターがプラスミド複製起点、繊維状ファージ複製起点、標準配列および表現型的に分別可能な遺伝因子を含む段階；
dam発現を許容しないように増殖条件を変化させる段階；および
ヘルパーファージでの該細菌株の感染により増殖されたベクターから閉環状一本鎖核酸をレスキューする段階。
【請求項５５】
以下の段階を含む、ゲノム遺伝子座の対立遺伝子を同定する方法：
該遺伝子座のそれぞれについての一本鎖標準を複数の別々の個体からプールされた核酸と二本鎖化する段階；
該複数の別個の二本鎖から、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始することができるものを表現型的に分別する段階；および
該表現型的に分別された集団に存在する二本鎖を同定する段階であって、該同定する段階が、該二本鎖のそれぞれに特有に連結された少なくとも1つの遺伝子型で検出可能な遺伝因子の同定である段階。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
連邦政府に支援された研究に関する陳述
本発明は、国立保健研究所により認められた契約番号：HD24610 07-10および契約番号：5T32GM07618に基づく政府援助によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
ゲノムDNAにおける突然変異の検出は、人間の疾患の遺伝的根拠を解明するために努力するにあたり重大な役割を果たす。遺伝的スクリーニングおよび分析の多くの型にとって、遺伝子の突然変異されたコピーの存在を知ることは、不可欠である。そのような情報は、癌細胞やその他の体細胞突然変異の分析はもちろん、出生前やその他の遺伝的検査において用いることができる。多くの遺伝子にとって、機能に影響を及ぼしうる多数の異なる突然変異がある。
【０００３】
糖尿病、心臓病、および精神医学的疾患などありふれた疾患は、同義遺伝子においての遺伝的変異によっていくぶん引き起こされる。遺伝的変異は疾患の発生にからむだけでなく、疾患の進行や治療への反応にもまた主なる決定子である。ありふれた疾患に関連している遺伝的変異の同定は、そのような疾患の診断、予測および治療を大いに進歩させることができる。
【０００４】
ありふれた疾患に関連している引き起こす可能性を秘めた変異の同定への一つの方法としては、大量の候補遺伝子における遺伝的変異について、患者と対照者をスクリーニングすることである。遺伝的コード配列は、ヒトのゲノム全体の5%未満を構成しているが、人間の疾患の大多数はこれらのコード配列における配列変異により引き起こされる。急速に広まっている公開データベースにヒト遺伝子配列のかなりの割合が載っているので、遺伝子の大量のスクリーニングのための試薬はすでに入手可能である。多くのDNA変異スクリーニング方法が発達してきた。たとえば、一本鎖DNA高次構造多型(SSCP)や高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などがある。これらの方法は多くの遺伝子を同時にスクリーニングするように設計されていないので、それらの有用性は少量の候補遺伝子を検査することに限られていた。
【０００５】
疾患にからむ変異の同定にとって、遺伝子の大量スクリーニングが可能なハイスループット技術がないため、関連および連鎖マッピングのような直接前進的研究方法はあまり提案されなかった。これらの研究方法において、ニュートラルな遺伝的変異（多型マーカー）が遺伝子マップへ登載される。これらの多型マーカーは、疾患の遺伝子の染色体位置に近づくための遺伝的連鎖または関連分析に用いられる。
【０００６】
関連の研究は、先祖の疾患を引き起こした変異にきわめて接近しているある多型が今だ今日の患者の個体群に存在しているという見込みに基づいている。連鎖あるいは関連マッピングにおいて、少なくとも１つのマーカーがその疾患を引き起こす変異に十分に近くにあり、それゆえに、家族または個体群においてその疾患とともに同時分離できるであろうと期待している。その分析は、その突然変異のほとんどは起点が1点であったという仮定のもとにある。
【０００７】
連鎖および関連に基づく研究方法は、簡単なメンデル病のマッピングに成功した。しかしながら、遺伝形質が複雑な系をもっている疾患のマッピングはあまり成功しなかった。そのような疾患を引き起こす変異の同定は、何万というマーカーを使った関連分析の実施が要求されるものと広く信じられている。一塩基多型(SNPs)は最も頻繁に存在する多型であるから、それらがこれらの関連の研究にとって選択のマーカーになることを提案されている。
【０００８】
チップハイブリダイゼーションやオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)のような複合的方法は、SNPsのゲノタイピングを発達させた。これらのSNPゲノタイピング方法はすべて、前に同定された一塩基多型をゲノタイプするという共通の原理の上に機能する。多型部位は、まず、多数の個体の配列を決めることによって同定され、それからマップへと編集される。最後に、患者および対照者に対して、おのおのの多型性の有無を検査する。
【０００９】
遺伝的検査の重要な見地として、誰もが容易に二つのDNA分子の間の遺伝的ミスマッチをスクリーニングできる方法に大きな関心がある。二つのDNA分子が一致しているか異なっているかを決定できる簡単な方法で、しかも多重的な分析が可能であれば、これらの分析において大いに恩典をもたらすと考えられる。
【００１０】
全ゲノムを網羅する一塩基多型(SNPs)の同定は、多数の複合形質の関連研究へと導く。そのような研究のためのたいていのシナリオは、すべてまたはほとんどの民族個体群に分布する、比較的頻繁なSNPsの一般的な一組を想定する。一つの広く考慮された方法は、コード配列または制御配列に位置しているSNPsを用いる直接的関連研究を通して感受性対立遺伝子を同定することである。主な代替的な方法は、高密度なゲノムワイドマップから疾患感受性対立遺伝子とSNPsの間の連鎖不平衡(LD)を捜すことである。上記方法のどちらでも、以前に同定されたSNPsの存在または非存在について得点をつけるために効率的なゲノタイピングを必要とする。しかしながら、両方の方法は、疾患感受性の直接的原因であるものもしくはSNPsのいずれでもいいが、変異対立遺伝子がまれである、または特定の集団に特異的である場合、非現実的でありうる。そのような場合、感受性対立遺伝子を同定することは、患者と対照間の包括的配列比較を必要とする可能性がある。そのような配列比較を達成することは、検査される断片においてあらゆる可能性のある変異を同定するためのハイスループットDNA変異スキャニング技術を必要とする。変異体検出アレイ(Variant Detection Array：VDA)法が、おそらく、並列処理について高い潜在能力をもつDNA変異体スキャニングのための唯一現行の方法である。しかしながら、VDAは費用がかかり、最適下限の特異性および感受性でありうる。
【００１１】
関連文献
DNA配列の変異によって生じた構造的変化を電気泳動の移動性における変化として検出する技術は、オリタら(Orita)、(1989) P.N.A.S. 86:2766; オリタら、(1989) Genomics 5:874; マイヤーら(Myers)、(1985) N.A.R. 13:3131; シェフフィールドら(Sheffield) P.N.A.S. 86:231; マイヤーら(Myers)、Meth. Enzym. 155:501; ペリーおよびカレル(PerryおよびCarrell) (1992) Clin. Pathol. 45:158; ホワイトら(White)、(1992) Genomics 5:301に記載されている。
【００１２】
ヘテロ二本鎖DNAにおける配列のミスマッチの部位を検出するために化学物質またはタンパク質を使用する技術は、コットン(Cotton)ら、(1988) P.N.A.S. 85:4397; マイヤー(Myers)ら、(1985) Science 230:1242; マーシャル(Marshal)ら、(1995) Nature Genetics 9:177; ユイル(Youil)ら、(1995) P.N.A.S. 92:87に記載されている。チップハイブリダイゼーションについては、ワング(Wang)ら、Science 280:1077-1082に記載されている。
【００１３】
グロンペ(Grompe)(1993)、Nature Genetics 5:111には、DNAの大きな範囲をスクリーニングする方法を概説している。マッピング設計はリシュ(Risch) (1990) Am.J.Hum.Genet. 46:229-241; ランダーおよびボッツスタイン(LanderおよびBotstein) (1987) Science 236:1567-1570; およびビショップおよびウィリアムソン(BishopおよびWilliamson) (1990) Am.J.Hum.Genet. 46:254-265に見ることができる。サンドラおよびフォード(SandraおよびFord)、(1986) Nucleic Acids Res. 14:7265-7282およびキャスナ(Casna)ら、(1986) Nucleic Acids Res. 14:7285-7303には、遺伝的分析が記載されている。
【００１４】
しかしながら、いくつかの研究方法は、ニールソン(Nielson)ら、(1995) Strategies 8:26に記載されている高忠実性をもつ酵素での長鎖PCR、フェリンおよびキャメリニ-オテロ(Camerini-Otero) (1991) Science 254:1494に記載されているrecA関与の切断、およびブローケス(Brookes)ら、(1995) Human Molecular Genetics 3:2011に記載の多数の特異的断片を同時にPCR増幅するための一組のオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含めて、現在、大きなDNA断片を単離するために利用されている。
【００１５】
大腸菌(E. coli)のメチルミスマッチ修復系は、ワグナーおよびメセルソン(WagnerおよびMesselson) (1976) P.N.A.S. 73:4135; モドリッヒ(Modrich) (1991) Annu.Rev.Genet. 25:229; パーカーおよびマリナス(ParkerおよびMarinus) (1992) P.N.A.S. 89:1730; およびキャラウェイおよびマリナス(CarrawayおよびMarinus) (1993) J.Bacteriology 175:3972に記載されている。大腸菌のメチル依存性ミスマッチ修復系(methyl-directed mismatch repair system)の通常の機能は、不完全なDNA複製から生じる新しく合成されたDNAにおけるエラーを修正することである。その系は、配列GATCにおけるアデニンのメチル化は新しく合成されたDNAに起こるのではなく、複製されていないDNAに起っているという事実を利用して、複製されていないDNAを新しく複製されたDNAから区別している。ミスマッチの修復は、三つのタンパク質、MutS、MutL、およびMutHの作用によって開始され、それらは、メチル化されていない、新しく複製された鎖にヘミメチル化されたGATC部位で、ニックを入れる。メチル化されていないDNA鎖は、それから、消化され、鋳型としてメチル化された鎖を使って再合成される。メチル依存性ミスマッチ修復系は、1塩基対のミスマッチ、および長さが4つまでのヌクレオチドのミスマッチまたはループを修復することができる。5つのヌクレオチドやそれ以上のループは修復されない。
【００１６】
真核細胞における部位特異的リコンビナーゼの利用は、ワール(Wahl)ら、米国特許第5,654,182号、およびソイアー(Sauer)、米国特許第4,959,317号に記載されている。
【発明の開示】
【００１７】
発明の概要
本発明は、第一の局面において、別個の核酸配列の複数のDNA二本鎖のいずれかにおいてミスマッチを検出するインビボの方法を提供することにより、当技術分野におけるこれらおよび他の要求を解決する。本方法は、複数の二本鎖のいずれかについて、細胞の特徴における変化を検出することを含み、細胞の表現型における変化は、細胞内のベクターにおいてその二本鎖と共に存在するマーカーの同時修復により引き起こされ、同時修復は、その二本鎖に存在するミスマッチにより開始される。典型的には、二本鎖は、単一のハイブリダイゼーション反応において形成される。
【００１８】
一つの一連の態様において、細胞は、細菌細胞であり、ミスマッチ同時修復は、細菌のメチルミスマッチ修復系により媒介される。
【００１９】
そのような態様において、方法および組成物は、インビボの細菌アッセイ法として提供され、「ミスマッチ修復検出法」(Mismatch Repair Detection：MRD)と名付けられる。方法は、二本鎖DNA分子におけるミスマッチを検出し、一方の鎖の配列は、わずか単一ヌクレオチドで他方の鎖の配列と異なる。DNA分子の2つの鎖は、異なる起源由来である。一方の鎖は、検出可能なマーカー遺伝子およびミスマッチについて検査されることになっている配列を有する、非メチル化DNAである。他方の鎖は、欠陥が修復機構を活性化しないマーカー遺伝子の不活化コピー、および検査される配列のもう一つのコピーを有する、メチル化DNAである。2つの鎖のハイブリダイゼーションから形成されるヘテロ二本鎖dsDNAは、活性メチルミスマッチ修復系をもつ細菌宿主(MMR宿主)へ形質転換される。
【００２０】
宿主修復系は、対象となる配列におけるミスマッチにより活性化され、その後、マーカー遺伝子を「同時修復」して不活性の二本鎖コピーを産生する。対象となる配列の2つの鎖が完全整合している場合、マーカー遺伝子は変化せず、形質転換された細菌が活性マーカーを産生すると考えられる。ミスマッチが存在する場合、形質転換体は活性マーカーの欠損により容易に同定され、その後、単離され、さらなる分析のために増殖させてもよい。MRDは、同時に、多数の断片の分析のための迅速な方法である。それは、様々な供給源のDNA間の違いを数え上げるためのアッセイ法として、および様々な配列をもつDNAを単離する手段として有用である。
【００２１】
方法は、2つのDNA配列が、10,000個を超えるヌクレオチドの領域において、わずか一塩基の変化により異なっているかどうかを決定する。多数のDNA断片が単一反応において分析されることができ、過程は、並行して多数の反応を行うように容易にスケールアップされる。入力DNAに依存して、MRDは、様々な目的のために用いられうる。それは、変異の存在について真核生物の染色体の大きな領域を分析するために多数の多型マーカーを検査することにより、遺伝子マップ作成において用いられる。ゲノムまたはcDNAのクローンの大量プールにおいて、方法は、対照と被験集団の間にミスマッチがあるそれらのDNAを同定し、特定の遺伝子座または領域から変異対立遺伝子を単離する特に簡単な方法を提供する。方法はまた、腫瘍細胞においてまたは抗体遺伝子の超変異において見出されるもののような、DNAにおける体細胞性変化を検出するために用いられうる。MRDの基本的な利点は、いったん適するベクターを供給されれば、手順は実施するのに極めて容易であるということである。
【００２２】
ハイスループットDNA変異検出を行う能力により、ミスマッチ修復検出法(MRD)を、関連および直接的スクリーニング研究を行うための理想のものにしている。MRDの多重化する潜在能力は、現在知られている方法のそれを上回り、それによって、大規模SNPゲノタイピングについて他の方法を超える進歩を示している。
【００２３】
MRDはまた、疾患を引き起こす変異を同定するために膨大な数の候補遺伝子をスクリーニングするのに用いることができる。限られた数のMRD反応においてすべてのヒト遺伝子のコード領域を検査することが可能である。患者および対照の集団においてすべての遺伝子のコード領域を検査することにより、疾患を引き起こす変異が容易に明らかになる。この直接的方法の感度は、突然変異の起源、および患者集団における疾患を保有する先祖の染色体の普及率についての仮定を必要としないため、関連研究のそれより有意に高い。疾患を引き起こす変異を直接的に検出する方法は、関連方法より、これらの変異を同定するのに成功する可能性が高い。この直接的候補遺伝子スクリーニング方法は、強力かつ効果的で、臨床的意味のある表現型を引き起こす変異の同定を大いに加速することができ、疾患の診断、予後、および治療を大いに向上させる。
【００２４】
疾患遺伝子の直接的スクリーニングに基づく方法の適用は、診断；2つの関係のある疾患の関連遺伝子における変異（例えば、ファクターVIIIとファクターIXの欠失）を区別する補助診断；疾患感受性の予測；治療の発達；および治療の最適化を含む。
【００２５】
本発明はさらに、まれな対立遺伝子検出および得点化のために高度に多重化されたミスマッチ修復検出を促進するベクターおよび方法を含む、組成物を提供する。
【００２６】
第一のそのような局面において、本発明は、各核酸標準が、標準ベクターにおいて、表現型的に分別可能な遺伝因子だけでなく、加えて、遺伝子型で検出可能な遺伝因子にも物理的に連結されているミスマッチ修復検出法を提供する。前者は、検査二本鎖において、開始するミスマッチの存在または非存在によるインビボの表現型の分別を可能にする；後者は、そのように分別された検査二本鎖の改良されたインビトロの同定を可能にする。
【００２７】
一般的に、本発明のこの局面の方法は、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始することができるものを、複数の別個の二本鎖から表現型的に分別し、その後、そのように分別された各二本鎖に特有に連結されている遺伝子型で検出可能な遺伝因子を同定的に検出することを含む。
【００２８】
本発明のこの局面の第一の一連の態様において、それぞれの遺伝子型で検出可能な遺伝因子は、核酸配列タグであり、各配列タグは、複数の配列タグ間で特有なものであり、分別された二本鎖は、配列タグ、配列タグの付いた二本鎖、またはそれ由来の核酸を複数の配列タグに相補的なプローブを有するマイクロアレイに特異的なハイブリダイゼーションすることにより同定される。
【００２９】
本発明において表現型的に分別された標準を検出かつ同定するために、バーコードマイクロアレイへの遺伝子型で連結された配列タグの特異的なハイブリダイゼーションを用いることにより、多数の利点が実現される。
【００３０】
第一に、ほんの少数のヌクレオチドだけにより異なる別個の配列の標準は、配列において実質的に異なる標準が識別されうるのと同じくらい容易に識別されることができ、同時に使用可能な遺伝子座の複数の対立遺伝子変異体が単一の遺伝子座における変異について試料を問い合わせることを可能にする。そのような同時的クエリーは、まれな対立遺伝子(rare allele)がすべての一般的な対立遺伝子(common allele)とは同時的に異なる配列として検出されることを可能にする。任意の与えられた遺伝子座のほんの2個または3個、および4個、5個、6個、7個、10個またはそれ以上までもの対立遺伝子変異体が、単一反応において、別々にタグを付けられた標準として検出可能に含まれうる。
【００３１】
第二に、マイクロアレイは、標準に対してよりむしろ、タグに対して特異的であるため、標準が標準およびMRDベクターにおいて必須の相補的な配列タグに物理的に連結されている限りは、標準の任意のプールについて用いられうる総称的なバーコードマイクロアレイが構築されうる。
【００３２】
第三に、バーコードマイクロアレイの総称的な性質は、1組の最適のハイブリダイゼーション条件を決定し、その後は、個別化またはさらなる最適化なしに用いられることを可能にする。
【００３３】
本方法は、酵母、植物および人間を含む哺乳動物に由来する試料のようなゲノムの試料に存在する配列変異の多重的クエリーを容易に可能にする。本方法はまた、単一のゲノムの遺伝子座の複数の対立遺伝子変異体、任意の所望の遺伝子座の2個から3個、4個、5個またはそれ以上までもの対立遺伝子変異体に一致した配列を有する標準の同時的使用を容易に可能にし、かつ10,000遺伝子座までの同時的クエリーを可能にする。
【００３４】
まれな対立遺伝子検出および得点化に向けられた第二の局面において、本発明は、本発明の第一の局面の改良されたミスマッチ修復検出法において使用される改良された標準ベクターを提供し、改良されたベクターは、ベクターの標準配列に特有に連結された遺伝子型で検出可能な遺伝因子を有する。
【００３５】
本発明のこれらの関連局面は、ミスマッチ修復検出法(MRD)の多重化能力を増加させる、すなわち、配列変異の存在について試料を問い合わせるために同時に使用可能な別々の配列の標準の数を増加させる。しかしながら、MRDアッセイ系のバックグラウンドより少ない頻度で集団内に発生する対立遺伝子は、プールされた核酸試料から信頼性をもって検出するのは困難なままである。
【００３６】
従って、第三のそのような局面において、本発明は、MRDアッセイ法においてバックグラウンドを減少させる標準ベクターを提供する。
【００３７】
この局面において、本発明は、表現型的に分別可能な遺伝因子を、制御された強力なプロモーターおよび異種性リボソームの結合部位に機能的に連結し、このように、プラスミド分離前に表現型的に分別可能な遺伝因子の発現を向上させることにより、MRDアッセイ法におけるバックグラウンドを減少させる標準ベクターを提供する。現在、好ましい態様において、制御された強力なプロモーターは、T7プロモーターである。
【００３８】
本発明のこの局面の低バックグラウンドベクターは、標準配列に特有に連結された遺伝子型で検出可能な因子を有効にさらに含んてもよく、増加した多重化能力をもつ「バーコード」ハイブリダイゼーション方法が低バックグラウンドベクターを用いて実施されることを可能にする。
【００３９】
第四のそのような局面において、本発明は、さらにバックグラウンドを減少させる上記の改良された標準ベクターを含む標準ベクターを調製する方法を提供する。
【００４０】
本方法は、dam発現に許容的な条件下で細菌株において二本鎖の閉環状ベクターを増殖させることを含む。ベクターは、プラスミド複製起点、繊維状ファージ複製起点、標準配列、および表現型的に分別可能な遺伝因子を含む。その後、増殖条件は、dam発現に非許容的なように変更され、その後、閉環状一本鎖核酸(標準ベクター)は、細菌株のヘルパーファージでの感染により、増殖したベクターからレスキューされる。
【００４１】
dam−株における増殖期間を短縮することは、検査二本鎖における開始するミスマッチの非存在下でさえも修復を開始しうる自然突然変異の導入を低下させる。
【００４２】
第五のそのような局面において、本発明は、MRD反応においてシグナルを向上させ、シグナル：ノイズ比も向上させる改良されたミスマッチ修復ベクターを提供する。
【００４３】
一つの一連の態様において、改良は、表現型的に分別可能な遺伝因子におけるミスマッチを検査二本鎖から200ヌクレオチド以下に配置することを含む。もう一つの一連の態様において、改良は、繊維状ファージ起点の配向を逆転し、従って、表現型的に分別可能な遺伝因子の発現の前に、プラスミド複製(およびそれと共に、その結果伴う任意の修復)を負わせることを含む。
【００４４】
個々におよび共に、これらの改良点は、まれな対立遺伝子変異体がすべての一般的な対立遺伝子とは異なる配列として検出されることをより容易に可能にし、一般的な対立遺伝子は単一のアッセイ法において同時的標準としてすぐに容易に含まれうる。
【００４５】
第六のそのような局面において、本発明は、そのような一般的な対立遺伝子の迅速な発見を可能にし、従って、まれな対立遺伝子の発見および得点化をさらに促進する。
【００４６】
本発明のこの局面の方法において、問い合わせが行われる試料は、複数の個体からプールされる。試料は、ほんの2個体だけから引き出すことができるが、典型的には、少なくとも3、4、5、10、15個体、少なくとも20、25、30、35個体、または40、45個体、または50個体もしくはそれ以上さえからもプールされる。単一の遺伝子座をスクリーニングすることができるが、複数の遺伝子座が同時に問い合わせされる多重分析により、よりハイスループットを達成することができる。
【００４７】
本方法の第一段階は、複数の個体からプールされた核酸を(クエリー試料として)用いて、スクリーニングされることが望まれる各遺伝子座についてのMRDベクターを調製することを含む。標準は、選択された遺伝子座の同定された対立遺伝子になる。それらのそれぞれの検査二本鎖を有し、結果として生じたMRDベクターは、その後、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始する、それぞれの含まれた二本鎖の能力に基づいて表現型的に分別される。表現型的に分別された集団に存在する二本鎖は、検出かつ同定され、検出および同定は、それらに連結された遺伝子型で検出可能な遺伝因子を検出することにより行われる。
【００４８】
本発明の上記および他の目的ならびに利点は、添付の図面と共になされた以下の詳細な説明を考慮することにより明らかであると思われる。
【００４９】
発明の詳細な説明
ミスマッチ修復検出法(MRD)は、核酸二本鎖においてミスマッチを検出するための迅速、高感度で、かつ容易に多重化されるインビボの方法を提供するために、細胞のミスマッチ修復機構の著しい感度および特異性を利用する。二本鎖の一方の鎖が既知の配列を有する場合、MRDは、たった1個のヌクレオチドによってでさえもそのような標準とは異なる核酸を同定するのに迅速に用いられることができる。
【００５０】
MRDは、大腸菌のdam依存性ミスマッチ修復系(dam-directed mismatch repair system)について特によく記載されている細胞のミスマッチ修復機構の2つの現象を利用する：第一は、そのような修復をそれ自身開始することができない、ヘテロ二本鎖分子におけるの他の場所に位置するミスマッチの「同時修復」を開始する、ヘテロ二本鎖DNA配列における修正可能なミスマッチの能力である；第二は、開始される鎖修正の方向性である。
【００５１】
MRDは、DNA「検査」二本鎖におけるミスマッチを、複製可能なベクター内に含まれる場合、他の状態では「修正不可能な」ヘテロ二本鎖としてベクター内の他の場所に存在する表現型的に分別可能な遺伝因子(「マーカー」)のインビボ同時修復を開始するそれの能力により提示する。「表現型的に分別可能な」とは、区別できる表現型を細胞に与える遺伝因子を意味する。マーカーミスマッチの修復は方向性をもつ（すなわち、再現可能的に、マーカーヘテロ二本鎖の2つの鎖のうちの1つの配列を選ぶ）ため、マーカーヘテロ二本鎖の2つの鎖を、修復が、修復の存在しない場合に得られるものと区別できる表現型を宿主細胞へ与えるように設計することができる。
【００５２】
および、ヘテロ二本鎖化ベクターで形質転換された各細胞は、別個のレポーターとしての役割を果たすため、宿主細胞の大きな集団のそれぞれを、検査二本鎖の複数においてミスマッチの存在または非存在を提示するために同時に用いることができ、高度に多重化された分析を可能にする。
【００５３】
メチル依存性ミスマッチ修復MRD
第一の局面において、本発明は、ミスマッチを提示するために、細菌、特に大腸菌(Escherichia coli)のメチル依存性ミスマッチ修復機構を利用する。
【００５４】
インビボにおいて、メチル依存性ミスマッチ修復機構による修復についての基質は、ミスマッチを含むヘミメチル化二本鎖DNAである。一般的事項として、大腸菌のメチル依存性ミスマッチ修復系は、そのようなヘミメチル化ヘテロ二本鎖において1個〜4個の連続するミスマッチの修復を検出かつ開始し、ミスマッチは、置換、欠失または挿入の任意の組み合わせを示す。そのような開始するミスマッチの存在下において、その内部に改変された配列モチーフGAメチルTCを含むDNAの鎖は、「正しい」配列として修復系により認識され、非メチル化鎖の大部分(時々、全体までも)は、分解され、メチル化鎖は、第二の相補的鎖の合成のための鋳型として細胞により用いられる。
【００５５】
しかしながら、大腸菌のメチル依存性ミスマッチ修復系のタンパク質は、典型的には、ヘミメチル化二本鎖において5ヌクレオチドまたはそれ以上のループを修復しない。そのようなループは、それゆえに、典型的には、他のミスマッチの非存在下では、修正されないままである。しかしながら、DNA分子上の一つの部位において修復が開始される場合には、少なくとも10 kb間に及ぶ領域が、分子上で同時修復されると考えられる。
【００５６】
従って、本発明のこの局面において、DNA「検査」二本鎖は、マーカーヘテロ二本鎖をさらに含む、ヘミメチル化された複製可能なベクターに含まれる。マーカーヘテロ二本鎖は、2つの鎖の間で異なる、5個またはそれ以上の連続するヌクレオチドの少なくとも1つのループを含む；マーカーヘテロ二本鎖は、1個〜4個の連続するヌクレオチドの配列の差異を排除する。このように、マーカーヘテロ二本鎖は、ベクターが活性メチル依存性ミスマッチ修復系をもつ細菌宿主細胞へ導入される場合、修復をそれ自身、開始することができない。しかしながら、ベクターの検査二本鎖部分内に存在する5個より少ない連続するヌクレオチドのいくつかの配列の差異により、表現型の変化を伴うマーカーの同時修復が開始されうる。
【００５７】
ミスマッチの存在または非存在を提示するために用いられる複製可能ベクター(「検査ベクター」)は、4つの別々の部分（第一マーカー鎖を与える第一のベクター、第二のマーカー鎖を与える第二のベクター、第一の検査配列鎖、および第二の検査配列鎖）を有するとして有効に記載されるが、ベクターは必ずしも、4つの別々の構成要素の物理的集合により構築される必要はない。
【００５８】
上記のように、第一および第二のマーカー鎖は、配列において異なる。検査二本鎖において開始されるミスマッチ修復の非存在下において、各鎖は、半保存的複製のための鋳型としての役割を果たし、従って、ベクター複製の単一ラウンド後、細胞内に2つの別個のベクター種を産生する。2つのマーカー型の同時存在により細胞に与えられる表現型は、どちらの型でも優性のマーカー表現型をコードする方により指示されると考えられる。ミスマッチ修復がベクター複製に先行する場合、2つのマーカー型のうちの1つのみが細胞内のベクタープールに存在し、表現型は、修復のための鋳型として働く鎖により指示される。典型的には、非優性マーカー表現型がメチル化鎖上にコードされるように選択される：そのような場合、検査二本鎖におけるミスマッチにより開始される修復は、非優性表現型を有する細胞を生じ、開始するミスマッチを欠いているので、マーカーの2つの型のおのおのをそれぞれ発現させているベクターを有する細胞により示された優性表現型と容易に区別されうる。実例に特によく適した一つの態様において、「優性」マーカー表現型は、「活性」マーカー、すなわち、発現される場合、「不活性」型に対して実質的に優性であるマーカーである。考察の目的のために、それゆえ、マーカーの任意のそのような優性型を、「A」型("a"ctiveとして)と本明細書では名付けるが、表現型の優性の他の型をそれにより排除するつもりはない。かつ、マーカーの優性型を与えるベクターを「A」ベクター、または「標準」と呼ぶ。同様に、考察の目的のために、マーカーの任意のそのような非優性(「劣性」)型を、「I」型("i"nactiveとして)と本明細書では名付けるが、表現型の非優性の他の型をそれにより排除するつもりはない。かつ、マーカーの非優性型を与えるベクターを「I」ベクターと呼ぶ。
【００５９】
検出可能なマーカー遺伝子は、直接的にまたは間接的に検出可能な特性を供給する；すなわち、宿主細胞に検出可能な表現型を与える、宿主細胞において発現される任意の遺伝子でありうる。典型的な表現型は、色、蛍光、抗生物質耐性および/または感受性、ルミネセンス(例えば、ルシフェラーゼの発現による)などにおける変化を含む。
【００６０】
例えば、後述する本明細書の実施例1は、本発明の複製可能ベクターにおいて用いられる比色マーカーとしてLacZα遺伝子の有用性および簡便さを実証している。
【００６１】
「活性」型において、LacZα遺伝子産物は、細胞がイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)で誘導される場合、比色的に容易に検出可能な活性βガラクトシダーゼをコードする。LacZα遺伝子への5塩基対挿入は、酵素活性を消去する、または実質的に低下させる。活性型を含む細菌は、IPTGおよび色素生産性の酵素基質5-ブロモ-4クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド(X-Gal)を追加した培地上で増殖する場合、青色であり、IPTGを追加したマックコンキー(MacConkey)寒天上で増殖する場合、赤色である；どちらの培地においても、LacZα遺伝子の不活性型を有する細菌は、白色である。
【００６２】
定性分析のこの型は単に便利さに過ぎず、本発明の実施に必須ではないことは、当業者により理解されているものと思われる。1つの活性遺伝子により産生されたマーカーの量と2つの活性遺伝子により産生されたマーカーの量を区別することができる定量分析の方法、例えば、ELISA、RIAなどもまた用いることができる。そのような定量的方法は、活性マーカーのみを有する細胞が、活性および不活性のマーカーの混合物を有する細胞と区別されることを可能にし、かつ不活性マーカーのみを有する細胞が、活性および不活性のマーカーの混合物を有する細胞と区別されることを可能にする。
【００６３】
実際に、βガラクトシダーゼ活性についての幅広い種類のアッセイ法、比色、蛍光、およびルミネセンス、が知られており、容易に用いられうる。例えば、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド(ONPG)およびクロロフェノールレッドβ-d-ガラクトピラノシドが、典型的には液体培地において、分光光度(比色)検出のための基質として簡便に用いられる。フルオレセインジ-β-D-ガラクトピラノシド(「FDG」、「フルオレセインジガラクトシド」、カタログ番号F-1179、Molecular Probes, Inc.、Eugene、OR、USA)は、β-ガラクトシダーゼを蛍光で検出するための感度の高い基質である。FDGを使用する蛍光に基づいたアッセイ法は、放射性同位元素に基づいたELISAより100倍〜1000倍感度が高いと報告されている。βガラクトシダーゼについての化学ルミネセンスの基質(Roche、Galacton(商標)Plus β-gal基質)もまた市販されている。
【００６４】
マーカーヘテロ二本鎖は、対向する鎖上にコードされる活性型および不活性型を有し、活性型が不活性型に対して表現型において優性であるとして、都合のよいように、記載されるが、唯一の機能的必要条件は、マーカー遺伝子産物の2つの型が宿主細胞に区別可能な表現型を与えることである。従って、本発明は、他の態様において、不活性対立遺伝子が活性対立遺伝子に対して優性である(「ドミナントネガティブ」)マーカーをさらに含む。
【００６５】
ドミナントネガティブな対立遺伝子が記載されている遺伝子の例は、LacI遺伝子によりコードされるlacリプレッサーである。例えば、Betz、「Cloning and characterization of several dominant-negative and tight-binding mutants of lac repressor」、Gene 42(3):283-292 (1986); Betzら、「Effects of dominant-negative lac repressor mutations on operator specificity and protein stability」、Gene 67(2):147-158 (1988)を参照されたい。ドミナントネガティブな対立遺伝子を生じる欠失は、フレーム単位である可能性が高い(例えば、6 bpまたは9 bpの欠失)。
【００６６】
ドミナントネガティブな対立遺伝子IDを生じるLacIにおける欠失は、不活性マーカーが、検査二本鎖における配列変異により開始される同時修復により除去されるように非メチル化ベクター鎖上に存在する、MRDアッセイ法においてマーカー遺伝子として用いられうる。
【００６７】
LacI機能を、Lacオペレーターの制御下に1つまたは複数の遺伝子を配置することによりモニターすることができる。例えば、テトラサイクリン耐性およびストレプトマイシン感受性を与える遺伝子が、同じプロモーターまたは2つの異なるプロモーターを用いて、LacI制御下に配置されうる。変異が存在しない場合には、LacI+およびLacIDの両方が存在し、ストレプトマイシン感受性、テトラサイクリン耐性の表現型を与える抗生物質カセットの発現を可能にする。他方、変異の存在下においては、LacID対立遺伝子は除去され、細胞にLacI+のみを残して、抗生物質カセットの発現を阻害し、かつストレプトマイシン耐性、テトラサイクリン感受性の表現型を与える。
【００６８】
もう一つの実施例として、マーカーは、比色よりもむしろ、蛍光で検出可能な遺伝子産物をコードしうる。
【００６９】
例えば、マーカーは、基質非依存性で、内因性蛍光のオワンクラゲ(Aequorea victoria)由来の緑色蛍光タンパク質(「GFP」)、DsRed(Matzら、Nature Biotechnol. 17:969-973 (1999))のようなそれに関連したタンパク質、またはその誘導体(ひとまとめにして、「GFP様発色団」)をコードしうる。これらのGFP様発色団は、内因性蛍光の性質を共有する；すなわち、GFP様発色団は、それのアミノ酸配列により完全にコードされ、補助因子または基質の要求なしに蛍光を発しうる。概説として、Chalfieら(編)、「Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols」、Wiley-Liss、ニューヨーク (ISBN:0-471-17839-X)、1998；Conn(編)、「Green Fluorescent Protein」、Mehods in Enzymology、302巻、Academic Press、サンディエゴ (ISBN:0-12-182203-6)、1999を参照されたい。
【００７０】
GFP様発色団は、中心性α-ヘリックスをもつ11鎖β-バレル(β-can)を含み、中心性α-ヘリックスは、2つの芳香環系およびそれらの間のブリッジを含む共役π-共鳴系を有する。中心性α-ヘリックス内の挿入は、タンパク質の蛍光を破壊することができ、細菌宿主細胞の内因性蛍光またはその欠損により、活性型が不活性型と区別されることを可能にする。
【００７１】
マーカーヘテロ二本鎖は、対向する鎖上にコードされる活性型および不活性型を有するとして、都合のよいように、記載されるが、唯一の機能的必要条件は、マーカー遺伝子産物の2つの型が宿主細胞に区別可能な表現型を与えることである。
【００７２】
例としてGFP様発色団を用いるために、マーカーのA型およびI型は、励起および/または発光スペクトルにおいて検出可能に異なるGFP様発色団をコードしてもよい。
【００７３】
幅広い種類のそのような区別可能なGFP様発色団が存在する。GFP様発色団は、オワンクラゲGFP(A. victoria GFP)(GenBankアクセッション番号AAA27721)、ウミシイタケGFP(Renilla reniformis GFP)、FP583(GenBankアクセッション番号AF168419)(DsRed)、FP593(AF272711)、FP483(AF168420)、FP484(AF168424)、FP595(AF246709)、FP486(AF168421)、FP538(AF168423)、およびFP506(AF168422)のような天然に存在するタンパク質において見出されるGFP様発色団から選択されうる。
【００７４】
または、GFP様発色団は、天然において見出されるものから改変されたGFP様発色団から選択されうる。典型的には、そのような改変は、異種性発現系において組換え産生を向上させるために(タンパク質配列における変化をもって、またはもたずに)、天然タンパク質の励起および/もしくは発光スペクトルを変化させるために、精製を容易にするために、促進するためにもしくはクローニングの結果として作製される、または研究調査の偶然の結果である。さらに、GFP様発色団は、発色団の内因性蛍光を保持するために必要とされるだけのタンパク質のみを含む必要がある。蛍光のために必要とされる最小限のドメインを決定するための方法は、当技術分野において知られている(Liら、J. Biol. Chem. 272:28545-28549) (1997))。
【００７５】
例えば、EGFP(「強化GFP(enhanced GFP)」)、Cormackら、Gene 173:33-38 (1996)；米国特許第6,090,919号および第5,804,387号は、哺乳動物細胞においてより明るい蛍光、より高い発現のために、およびフローサイトメーターにおける使用に最適化された励起スペクトルのために操作された、赤方偏移のGFPのヒトコドン最適化変異体である。プラスミドおよびウイルスの両方の様々なEGFPベクターは、細菌発現用ベクター、N末端タンパク質融合発現用ベクター、C末端タンパク質融合の発現用ベクター、および2シストロン性発現用を含め、市販されている(Clontech Labs、Palo Alto、CA、USA)。
【００７６】
発光スペクトルの他の目的では、EBFP(「強化青色蛍光タンパク質(enhanced blue fluorescent protein)」)およびBFP2は、発光を緑色から青色へシフトし、蛍光の明るさを増強し、かつタンパク質の溶解度を向上させる4つのアミノ酸置換を含む(Heimら、Curr. Biol. 6:178-182 (1996); Cormackら、Gene 173:33-38 (1996))。本来のクラゲコドンを保持しているBFP2は、細菌において発現されうるが、EBFPは、哺乳動物細胞における発現のために最適化されている。EBFPおよびBFP2由来のGFP様発色団は、本発明のベクターに有効に含まれてもよく、これらの青方偏移の変異体を含むベクターは、Clontech Labs(Palo Alto、CA、USA)から入手可能である。
【００７７】
同様に、EYFP(「強化黄色蛍光タンパク質(enhanced yellow fluorescent protein)」)は、またClontech Labsから入手可能であるが、発光を緑色から黄色がかった緑色へシフトする、EBFPとは異なる、4つのアミノ酸置換を含む(Ormoら、Science 273:1392-1395 (1996))。シトリーン(Citrine)、改良された黄色蛍光タンパク質変異体は、Heikalら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11996-12001 (2000)に記載されている。ECFP(「強化シアン色蛍光タンパク質(enhanced cyan fluorescent protein)」)(Clontech Labs、Palo Alto、CA、USA)は、6つのアミノ酸置換を含み、そのうちの1つは、発光スペクトルを緑色からシアン色へシフトする。Heimら、Curr. Biol. 6:178-182(1996); Miyawakiら、Nature 388:882-887 (1997)。これらのGFP変異体のそれぞれのGFP様発色団を有効に用いることができる。
【００７８】
GFP様発色団をまた、米国特許第6,124,128号；第6,096,865号；第6,090,919号；第6,066,476号；第6,054,321号；第6,027,881号；第5,968,750号；第5,874,304号；第5,804,387号；第5,777,079号；第5,741,668号および第5,625,048号に記載されるものを含む、他の改変GFPから得ることができ、これらの特許の開示は、完全に参照として本明細書に組み入れられる。
【００７９】
そのような改変されたGFP様発色団を、単独としておよびタンパク質融合の一部としての両方で、操作しかつそれらを蛍光活性について試験するための方法は、当技術分野において周知である。これらの努力の初期の結果は、Heimら、Curr. Biol. 6:178-182 (1996)に概説されており、完全に参照として本明細書に組み入れられている；有用な変異の表がある、より最近の概説は、Palmら、「Spectral Variants of Green Fluorescent Protein」、Conn(編)、「Green Fluorescent Proteins」、Methods Enzymol. 302巻、pp. 378-394 (1999)に見出され、それは完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【００８０】
マーカーにより与えられうる対象となるさらにもう一つの表現型は、抗生物質耐性または感受性である。
【００８１】
細菌がミスマッチ修復検出(MRD)宿主として用いられる場合、幅広い種類の既知の抗生物質耐性および感受性遺伝子を用いることができる。必要とされる耐性または感受性遺伝子の供給源としての役割を果たすことができる幅広い種類のベクターは市販されている。そのようなマーカーの中では、ペニシリン(アンピシリンのような)、テトラサイクリン、カナマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコールに対する耐性、およびストレプトマイシンに対する感受性(または耐性)を与えるものがある。
【００８２】
酵母がミスマッチ修復検出(MRD)宿主として用いられる場合、周知の栄養要求性マーカーと同様に、幅広い種類の既知の抗生物質耐性遺伝子を用いることができる。
【００８３】
複製可能検査ベクター、ならびに検査ベクターにマーカー鎖を与える第一および第二のベクターは、表現型的に分別可能な遺伝因子に加えて、抗生物質耐性遺伝子のようなマーカーを含んでもよい；これらの追加的マーカーは、特に、形質転換された宿主細胞の選択を容易するのに有用である。
【００８４】
マーカーは、ミスマッチ修復を提示することができる表現型を与えるために直接的に検出可能である必要はない。
【００８５】
例えば、もう一つの態様において、直接的に検出可能なマーカーへの効果を通して間接的に検出されるリコンビナーゼ、例えば、creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼ、pSR1リコンビナーゼなどであってもよい。
【００８６】
例えば、活性creの存在を、2つまたはそれ以上の異種性組換え部位間の組換えにより検出することができ、これらの組換え部位間に直接的に検出可能なマーカーが存在している。活性酵素は、部位間を組換えて、それにより、直接的に検出可能なマーカーを除去する；一方、不活性酵素の存在下においては、直接的に検出可能なマーカーが維持される。そのような直接的に検出されるマーカーは、検査ベクター上に存在する必要はなく、その代わりとして、細菌の染色体へ組み込まれてもよく、または別のエピソーム上に常在してもよい。
【００８７】
従って、下の実施例4および5は、MRDのための間接的に検出可能なマーカーとしてcreリコンビナーゼの使用を実証している。そこに記載されているように、活性creは、宿主細菌に常在するF'因子からテトラサイクリン耐性およびストレプトマイシン感受性マーカーの両方を除去し、宿主細胞にテトラサイクリン感受性およびストレプトマイシン耐性を与える。
【００８８】
「異種性組換え部位」という用語は、部位特異的組換えを促進する任意の導入された遺伝子配列を含むことを意味する。一般的に、そのような部位は、2つのそのような部位との特異的酵素の相互作用による組換えを促進する。例示的異種性組換え部位は、必ずしも限定されるものではないが、組換えがCre酵素により媒介されるlox配列；frt配列(Golicら、(1989) Cell 59:499-509；O'Gormanら、(1991) Science 251:1351-1355；FLPリコンビナーゼにより媒介される組換え)、ザイゴサッカロマイセス・ロウキシイ(Zygosaccharomyces rouxii)のpSR1リコンビナーゼについての認識配列(Matsuzakiら、(1990) J. Bacteriol. 172:610-618)などを含む。
【００８９】
lox部位をコードする配列は、本発明における使用として特に対象となる。lox部位は、そこでcre遺伝子の遺伝子産物が部位特異的組換えを触媒する、ヌクレオチド配列である。特に好ましいlox部位は、loxP部位である。loxPの配列（長さが34 bpである）が知られており、合成的に作製可能であるか、または当技術分野において公知の方法によりバクテリオファージP1から単離可能である(例えば、Hoessら、(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3398を参照)。loxP部位は、8 bpスペーサー領域により分離される2つの13 bpの逆方向反復から構成される。loxPの挿入反復およびスペーサー領域のヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
2005517453.tif 000002
【００９０】
他の適するlox部位は、loxB、loxLおよびloxRを含み、大腸菌から単離可能である(Hoessら、(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22:3398)。loxC2の挿入反復およびスペーサー領域のヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
2005517453.tif 000003
【００９１】
本発明において有用な異種性組換え部位は、天然に存在する配列または改変された配列のいずれでもありうる。例えば、国際公開公報第93/19172号は、VH10遺伝子が2つのloxP部位に隣接され、そのうちの1つが変異loxP部位であるファージベクターを記載している。lox部位はまた、当技術分野において知られている様々な合成技術により作製されうる。例えば、lox部位を作製するための合成技術は、Ogilvieら、(1981) Science、210:270により開示されている。
【００９２】
間接的に検出されるマーカーの他の例は、制御因子、例えば、特定のリプレッサーにより制御される1つまたは複数の遺伝子を有するように構築された菌株におけるリプレッサーを含む。
【００９３】
例えば、Lacリプレッサーは、Lacオペレーターを含む転写ユニットの発現を抑制するために用いることができる。例えば、Carrawayら、J. Bacteriol. 175(13):3972-3980を参照されたい。もう一つの実施例として、Tetリプレッサータンパク質(TetR)の誘導体を、Tn10テトラサイクリン耐性オペロンtetオペレーター配列由来のテトラサイクリン応答エレメントを有するプロモーターからの発現を抑制するまたは作動するために用いることができる。例えば、Gossenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(12):5547-5551 (1992); Gossenら、Science 268(5218):1766-1769 (1995)を参照されたい；必要とされるリプレッサーおよび応答エレメントを含むベクターは、市販されている(Clontech Labs.、Palo Alto、CA USA)。
【００９４】
1つまたは複数の直接的に検出されるマーカーに間接的な効果を生じうる遺伝子のさらにもう一つの例は、アンバー(amber)サプレッサーsupF(またはオーカー(ochre)もしくはオパール(opal)サプレッサー)である。
【００９５】
マーカー遺伝子の配列における「修正不可能な」差異を除いては、「A」ベクターおよび「I」ベクター(または最終複製可能検査ベクターに与えられる「A」ベクターおよび「I」ベクターのそれらの部分)は、配列において実質的に同じである。
【００９６】
「配列において実質的に同じ」とは、42℃〜65℃で6X SSCの存在下であるような、標準的インビトロ条件下において、「A」ベクターと「I」ベクターの鎖の間にヘテロ二本鎖が形成されるのを可能にし、かつミスマッチ修復を開始する配列の差異の存在を排除する配列類似性の程度を意味する。
【００９７】
マーカー遺伝子に加えて、「A」ベクターおよび「I」ベクターのそれぞれは、活性メチルミスマッチ修復系をもつ細菌宿主(MMR宿主)において活性のある複製起点を有する。起点は、ベクターの高いまたは低いコピー数を与えることができる。選択的には、ベクターは、表現型的に分別可能な遺伝因子に加えて、抗生物質耐性、またはMMR宿主の代謝的欠損を相補する遺伝子もしくはオペロン、またはファージ感染に対する耐性などのような、選択可能なマーカーをコードする少なくとも1つの遺伝子を含む。ファージベクターは、パッケージングシグナル、ファージコートタンパク質をコードする遺伝子、および制御遺伝子などを含んでもよい。望ましくは、ベクターは、クローニングを促進するために制限エンドヌクレアーゼについての多数の部位を有するポリリンカーを含むと考えられる。
【００９８】
都合のよいことには、「A」ベクターおよび「I」ベクターは、ファージミドベクターでありうる：すなわち、ヘルパーファージでの感染により一本鎖のレスキューを可能にするのに十分なファージ配列(典型的には、f1起点)を含むプラスミド。後述する本明細書に示される実施例において、「A」ベクターおよび「I」ベクターは、pUC19由来である。幅広い種類の他のファージミドは市販されている。(例えば、pBKおよびpBLUESCRIPT-IIファージミドベクター、Stratagene、La Jolla、CA、USA；pGEM(登録商標)-3Zfシリーズ、Promega、マディソン、WI、USA)。
【００９９】
そのようなベクターにおいて、(+)鎖を、R408(カタログ番号2291、Promega、Madison、WI、USA)またはM13K07(カタログ番号N0315S、New England Biolabs、ベヴァリー、MA、USA)のようなヘルパーファージでのレスキューにより得られることができる。対向する鎖は、ファージ起点の方向を逆転させることにより得ることができる；多くの市販ベクターは、f1起点の方向性配向においてのみ異なる、2つの型で提供されている。または、対向する(-)鎖は、感染した細胞から二本鎖DNA(RF型)をまず、得ることにより得られ、(-)鎖は、当技術分野において公知の様々な鎖分離方法、例えば、カラム、ゲル、により二本鎖型から単離されうる。
【０１００】
ベクターは、少なくとも1つのメチル化認識配列、一般的にはGATC、を含む；より通常では、多数の認識配列が存在する。「A」ベクターおよび「I」ベクターを構築するために必要な出発材料として働きうる多くのベクターが、当技術分野において知られており、市販されている。
【０１０１】
ミスマッチの存在または非存在を提示するために用いられる複製可能なベクター(「検査ベクター」)はまた、第一の検査配列鎖および第二の検査配列鎖を含む二本鎖(「検査二本鎖」、「検査配列」)を含む。
【０１０２】
検査配列は、ミスマッチについて検査されることになっている対象となる配列を含む二本鎖DNA分子である。検査配列におけるミスマッチは、MRD宿主細胞においてマーカー遺伝子におけるループの修復を開始する。検査配列の各鎖は、異なる供給源により与えられ、便宜上、本明細書では「X」鎖および「Y」鎖と名付けられる。
【０１０３】
「X」鎖および「Y」鎖は、実質的に相補的である。「実質的に相補的な」とは、42℃〜65℃で6X SSCの存在下のような、標準的インビトロ条件下において、「X」と「Y」が互いにアニーリングすることを可能にする配列類似性の程度を意味する。
【０１０４】
検査配列の「X」鎖と「Y」鎖が完全に相補的である場合、検査ベクターで形質転換されたMRD宿主細胞は、マーカー遺伝子におけるループの修正を開始せず、活性および不活性マーカーの混合物を発現させる。「X」と「Y」がミスマッチである場合には、修復が開始される。活性および不活性マーカーでの典型的態様において、マーカー遺伝子は、同時修復により「修正」され、そのため、両方の鎖は、不活性マーカー配列を有する。形質転換された細菌は、それゆえに、活性マーカーを欠く。
【０１０５】
一般的に、検査配列は、2つの鎖の間で少なくとも約90%の同一性を有する。一般的に、「X」鎖および「Y」鎖の供給源は、密接に関連している、例えば、単一種の個体、密接に関連した種の個体、単一個体由来の生殖細胞系および体細胞組織、種の近交系など。検査配列は、任意の供給源、例えば、原核生物または真核生物、植物、哺乳動物、昆虫などの由来でありうる。本方法は、高等植物および動物において見出されるもののような、複雑なゲノムの分析のために特に有用である。検査DNA配列は、通常、少なくとも約20ヌクレオチド長であり、かつ通常、多くて約104ヌクレオチド長である。長さの上限は、鎖を同時修復するMMR宿主の能力により決定される。
【０１０６】
様々な方法を、「X」鎖および「Y」鎖を作製するために用いることができる。DNA配列を単離および増幅するための方法は、当技術分野において知られている。「X」および「Y」は、逆転写酵素反応からのcDNA、ゲノム、プラスミド、YAC、BAC、ウイルスなどからの制限酵素切断断片；ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)からの増幅産物などでありうる。PCR産物の使用に対する重要な制限は、耐熱性ポリメラーゼの選択である。3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性、例えば、プルーフリーディング機能を有するポリメラーゼが好ましい。当技術分野において知られているプルーフリーディング能力をもつ有用な耐熱性ポリメラーゼは、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)、ピロコッカス・フリオーシス(Pyrococcus furiosis)、およびサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)から単離されたものを含む。市販されているサーマス  アクアティカス(Thermus aquaticus)ポリメラーゼは、増幅されたDNAへ有意の数のエラーを導入することが見出されており、一般的には、非常に短い、例えば、約500ヌクレオチド未満の配列以外のすべてにとって不適切であると思われる。
【０１０７】
PCRに加えて、他の増幅方法は、様々な型の等温性増幅方法を含め、当技術分野において知られている。例えば、Zhangら、Mol. Diagn. 6(2):141-150 (2001); Nuovo、Diagn. Mol. Pathol. 9(4):195-202 (2000); Hallら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15):8272-8277 (2000); 米国特許第5,854,033号、第6,183,960号、第6,221,603号を参照されたい。
【０１０８】
検査配列がインビトロ増幅反応から得られる場合、通常の酵素および方法を用いて、増幅産物をメチル化することが望ましい場合がある。
【０１０９】
一本鎖を単離する、または二本鎖DNAを変性するための多数の技術が当技術分野において知られている。
【０１１０】
例えば、逆転写酵素産物(第一鎖cDNA)は、cDNA鎖のみを残すためにリボヌクレアーゼで処理されてもよい。鎖分離ゲルは、当技術分野において知られており、DNA分子の2つの鎖を分離するために用いてもよい。PCRは、ビオチン、ハプテンなどのような結合パートナーを有する分子に結合された1つのプライマーで行われうる。その後、PCR反応は変性され、その結合パートナー、例えば、アビジン、ハプテンに特異的な抗体など、に結合された固体基質に結合される。そのような場合、PCRは、しばしば、結合されたプライマー(ビオチン化プライマーのような)が対向するプライマーに対して高モル過剰に存在して、非対称的に行われる。検査DNAは、一本鎖実体、例えば、M13ファージ、ファージミドなど、として複製されうる。「X」配列および/または「Y」配列は、制限酵素切断断片、PCR産物、または通常の方法により変性される他の二本鎖DNA分子でありうる。国際特許出願PCT/US93/10722号は、ミスマッチ検査に適したヘテロ二本鎖DNAを作製するための一つの方法を記載している。
【０１１１】
単一の複製可能な検査ベクターにおいて、「A」ベクター、「I」ベクター、「X」検査鎖および「Y」検査鎖を含むための様々な方法がある。
【０１１２】
一つの方法において、「A」ベクターおよび「I」ベクターは、検査二本鎖の「X」および「Y」鎖とは別々に増殖され、その後、それらと結合される。
【０１１３】
2つのベクターの一方(典型的には、優性表現型を与えるベクター、「A」ベクター)は、GATC認識部位でアデニンをメチル化しない条件下において複製されるが、他方(典型的には、「I」ベクター)は、これらの部位でメチル化アデニンを有するように改変される。これは、同時修復の間、マーカー遺伝子が不活性(非優性)型に変換される。多数のマーカーについて、活性遺伝子が不活性に対して優性である。例えば、1つの活性抗生物質耐性遺伝子および1つの不活性遺伝子を含む形質転換体は、選択的条件下で増殖することができると考えられる。これらの同じ条件下において、不活性マーカーを混合された活性/不活性から容易に区別することができる。
【０１１４】
「I」ベクターは、GATC認識部位のアデニンにおいてメチル化されることになるが、大腸菌の多くの通常の実験株において複製されうる。この部位でDNAを改変する他の細菌宿主もまた、「I」ベクターDNAを調製するために用いられうる。一般的に、非細菌の細胞において複製されたDNAは、精製されたDNAメチラーゼを用いる、追加的なエキソビボのメチル化段階を必要とする。実質的に、「I」ベクターにおけるすべてのGATC部位がメチル化される。
【０１１５】
他方のベクター、典型的には「A」ベクターは、このDNA改変系を欠く宿主において複製されなければならない。適する大腸菌dam−株は、Janisch-Perron (1985) Gene 33:103-119に記載されるJM110、およびSCS110(Stratagene、La Jolla、CA、USA)を含む。非細菌の宿主細胞、例えば、酵母、哺乳動物細胞培養物などにおいて複製される「A」ベクターも用いることができる。
【０１１６】
別々に増殖された「A」および「I」ベクターは、その後、同様にヘテロ二本鎖にされた(「X」/「Y」)検査配列の付加の前にヘテロ二本鎖にされる。
【０１１７】
この方法の一つの態様において、「A」ベクターおよび「I」ベクターは、二本鎖DNAとして独立して複製される。ベクターは、典型的には制限エンドヌクレアーゼ消化により、直鎖状化され、その後、一本鎖を形成するために変性され、その後は、ヘテロ二本鎖を形成するためにアニーリングされる。
【０１１８】
そのような方法において、アニーリング後、ホモ二本鎖「A」/「A」および「I」/「I」ベクターを除去することが望ましい。この段階を行う一つの簡便な方法は、2つのベクターの示差的メチル化を利用する。ホモ二本鎖の非メチル化DNA(例えば、MboI)、およびホモ二本鎖のメチル化DNA(例えば、DpnI)を切断するが、1つのメチル化鎖および1つの非メチル化鎖を有するヘテロ二本鎖DNAを切断しない制限酵素が、当技術分野において知られている。二本鎖「A」ベクターおよび「I」ベクターは、変性、結合、および再アニーリングされ、ホモ二本鎖DNA(「A」/「A」ベクター、「I」/「I」ベクター)およびヘテロ二本鎖DNA(「A」/「I」ベクター)の混合物を残す。混合物は、その後、メチル特異的制限酵素で処理される。ホモ二本鎖DNAは切断され、ヘテロ二本鎖は切断されない。ヘテロ二本鎖は、その後、方法の次の段階に用いられる。
【０１１９】
この態様において、二本鎖にされたヘテロ二本鎖「A」/「I」ベクターは、その後、ヘミメチル化されている二本鎖にされたヘテロ二本鎖「X」/「Y」検査DNAにライゲーションされて完全な検査されるベクターを形成する。「X」鎖および「Y」鎖は、「A」ベクターおよび「I」ベクターをヘテロ二本鎖にするために用いられたものと同様の方法を用いてヘテロ二本鎖にされうる。
【０１２０】
様々な制限エンドヌクレアーゼでの消化または末端への特定のリンカーのライゲーションにより形成されるもののような、「X」/「Y」分子および「A」/「I」分子の末端に短い、相補的なオーバーハングを有することは都合がよく、ベクターおよび検査配列が互いにアニーリングする。好ましくは、ベクターの自己環化を防ぐように、一つの分子の各末端に異なるオーバーハングが存在する。平滑末端もまた用いることができ、その場合、自己環化を低減させるためにベクター末端をホスファターゼ処理することが望ましい場合がある。
【０１２１】
アニーリングされたヘテロ二本鎖DNAは、通常の緩衝液および条件を用いる、任意の適するリガーゼ、例えば、T4、大腸菌など、を用いてライゲーション反応により環化される。一般的に、形成されるヘテロ二本鎖DNAの量は、標準的形質転換反応において検出されるのに十分であり、例えば、少なくとも約0.1ピコグラムのDNAである。
【０１２２】
単一の複製可能な検査ベクターにおいて、「A」ベクター、「I」ベクター、「X」検査鎖および「Y」検査鎖を含むための代替の方法において、検査二本鎖の「X」鎖および「Y」鎖の一つまたは両方は、前に記載されたヘテロ二本鎖化段階の前に「A」ベクターおよび「I」ベクターへそれぞれライゲーションされ、キメラのDNA鎖は、その後、ヘテロ二本鎖検査ベクターを形成するために用いられうる。
【０１２３】
そのような方法において、「X」配列および/または「Y」配列は、通常の組換えDNA法(Sambrookら、前記を参照)を用いて、「A」ベクターおよび「I」ベクターへ別々にクローニングされうる。どちらの鎖でも、どちらのベクターへも行くことができる。キメラ分子は、その後、前に記載されているように複製され、メチル化鎖および非メチル化鎖を提供しうる。
【０１２４】
一つの態様において、図1に図式化されているが、「X」検査配列および「Y」検査配列のそれぞれは、ベクターへクローニングされる。示されているように、「X」は、「A」ベクターへクローニングされ、メチラーゼ欠損宿主において増殖されて、非メチル化「AX」キメラを生じる。示されているように、「Y」は、「I」ベクターへクローニングされ、dam＋宿主において増殖されて、メチル化「IY」ベクターを生じる。各ベクターは、直鎖状化され、2つの直鎖ベクターはアニーリングされて、二本鎖にされたヘテロ二本鎖「AX」/「IY」を生じ、その後、ライゲーションされて、二本鎖で、ヘミメチル化の、閉環状検査ベクターを生じる。
【０１２５】
有用な方法において、ただ1つのみの供給源由来の検査DNA(例えば、「X」)は、「A」ベクターまたは「I」ベクターへクローニングされてキメラ分子を形成する。「I」ベクターまたは「A」ベクターのどちらでもそのようなキメラでありうるが、都合のよいことには、「A」ベクターが検査配列のコピーを含む。そのような「A」ベクターは、「標準」ベクターと呼ばれる場合があるが、MRD法により提示されるミスマッチがこの標準と異なるものであるゆえである。
【０１２６】
さらに下記のように、単一の標準が反応に用いられうる、または、それぞれが別個の検査配列を含んでいる複数の標準が単一反応においてハイブリダイズされる多重反応を行うことができる。多重反応では、2個またはそれ以上の標準、通常には少なくとも約10個の標準、より通常には少なくとも約25個、50個、100個、500個、または1,000個の標準、および2,000個、3,000個、4,000個、5,000個、6,000個、7,000個、8,000個、9,000個、10,000個または100,000個までもの標準さえも併用してもよい。
【０１２７】
「AX」キメラ標準は、二本鎖のキメラ標準も用いてもよいが、その後、有効に一本鎖にされる。キメラ標準は、例えば、制限消化および変性により、一本鎖にされうる。しかしながら、典型的には、「A」ベクターは、ファージ起点を含み、ファージ誘導型レスキューおよびキメラベクターの2つの鎖のうちの1つのパッケージングを可能にする。当技術分野において知られているように、ファージレスキューによりパッケージングされる鎖は、「A」ベクターにおけるファージ起点の方向により決定されると考えられる。
【０１２８】
図2に図式化されているように、一本鎖の標準ベクター(「AX」)は、その後、単一のハイブリダイゼーション反応において、(i)直鎖状化された、典型的には二本鎖の、「I」ベクター、および(ii)直鎖状化された、典型的には二本鎖の、「Y」検査配列(「Y」は、変性二本鎖DNA、例えば、PCR産物、ゲノムDNAの断片などであり得、または一本鎖、例えば、cDNAなどであり得る)と結合され得る。いずれの二本鎖分子も、混合物への添加の前または後のいずれかで、典型的には塩基の添加により(または代替として、もしくは追加的に、二本鎖のTmより上で十分に加熱することにより)変性され、その後、条件を二本鎖形成を可能にするように調整する。
【０１２９】
例として、一本鎖の標準(「AX」)DNAは、SCS110(Stratagene)のようなdam−株へ「AX」ベクターを形質転換し、その後、M13K07(New England Biolabs、MA、USA)のようなヘルパーファージを用いて非メチル化一本鎖をレスキューすることにより得られうる。選択的には、二本鎖の混入は、その後、MboI(または、代替的に、ScrFI)を用いて除去されうる。dam＋株において増殖された「I」ベクターは、「I」ベクターにおいて一回切断する制限酵素を用いて直鎖状化される。「Y」ホモ二本鎖は、pfuポリメラーゼのようなプルーフリーディングポリメラーゼをを用いて行われるPCRにより供給されうる；PCR産物は、選択的に精製されるが、その後、インビトロでリン酸化かつメチル化されることができ、メチル化は、例えば、37℃で1〜2時間、damメチラーゼ(New England Biolabs)を用いて行われる。アニーリング後、所望のヘテロ二本鎖におけるニックは、Taq DNAリガーゼのようなニック特異的リガーゼを用いて塞がれうる。選択的に、ニックの入ったヘテロ二本鎖、「Y」/「Y」ホモ二本鎖、および一本鎖「AX」ベクターを形質転換の前に除去することができる。
【０１３０】
単一の複製可能な検査ベクターに「A」ベクター、「I」ベクター、「X」検査鎖および「Y」検査鎖を含むこの後者の方法の利点は、大量の「I」ベクターが、任意の検査二本鎖との引き続きの使用のために調製可能なことである。さらに、この方法は、「AX」標準が大量に調製され、その後、「X」座でのミスマッチの存在について、幅広い種類の起源由来のDNAの問い合わせに用いることを可能にする。
【０１３１】
「A」ベクター、「I」ベクター、「X」検査配列鎖、および「Y」検査配列鎖を含む検査ベクターは、適する宿主へ形質転換される。
【０１３２】
多くの細菌種は、活性メチルミスマッチ修復系をもち、それゆえに、本発明のこの局面において、MMR宿主として用いられうる。適する種は、大腸菌、ならびにシュードモナス(Pseudomonas)、エルウィニア(Erwinia)、シゲラ(Shigella)、サルモネラ(Salmonella)、プロテウス(Proteus)、クレブシエラ(Klebsiella)、エンテロバクター(Enterobacter)およびエルシニア(Yersinia)のような他のグラム陰性桿菌を含む。対象となる他の種は、枯草菌(B. subtilis)、ストレプトマイセス(Streptomyces)などを含む。大腸菌の遺伝的性質および増殖必要条件はよく知られており、多くの場合、それは好ましい宿主である。形質転換技術は既知であり、例えば、Hanahan (1985)、DNA Cloning、1巻、D. Glover編、IRL Press Ltd.、109を参照されたい。
【０１３３】
形質転換された細菌は、一般的に、選択条件下で培養され、「A」ベクターにコードされた選択マーカーを発現させることができる細胞のみが増殖することができる。好ましくは、検査ベクターは、この目的のために、抗生物質耐性のような選択マーカーを含む。形質転換体は、適する培地、例えば、LB培地、SOB培地、2YTなどにおいて、液体培養として増殖されうる、または代替として、プレート上で増殖されうる。いくつかの場合において、増殖培地はまた、観察可能な表現型の発生に必要とされる任意の基質を含む。
【０１３４】
その後、活性および不活性マーカーを発現させる形質転換体の測定が実施される。測定の方法は、上で考察されているように、用いられた特定のマーカーによって異なる。
【０１３５】
活性マーカーを欠く形質転換体は、検査配列において開始するミスマッチを有した。対照、完全に整合した検査配列と比較して、活性マーカーを欠く形質転換体のパーセンテージにおける増加は、ミスマッチを示す。活性マーカーを欠く形質転換された細菌は、「修正された」検査ベクターを増殖させており、ベクターDNAの両方の鎖が、初めからメチル化された鎖の配列を有する。活性マーカーを発現させる形質転換された細菌は、一般的に、「A」ベクターおよび「I」ベクターの混合物を有する。ベクターDNAを、形質転換体から調製し、さらなる精製および特徴付けのために用いてもよい。
【０１３６】
一つの態様において、形質転換体のプレートは、青色を生じるインドリル-β-D-ガラクトシドの切断もしくはルシフェラーゼの発現のような、陽性または陰性の色変化をもつコロニーについてカウントされる。もう一つの態様において、レプリカプレートが作製され、個々のコロニーからの細胞が選択培地において増殖する能力があるかどうかを測定される。液体培養で増殖された形質転換体は、活性マーカーを発現させる細胞の数を測定するために、例えば、選択可能なマーカーに特異的な抗体で染色され、フローサイトメトリーにより分析されうる。マーカーが抗生物質耐性または感受性を(直接的にかまたは間接的にかのいずれかで)与える場合、宿主細胞を、異なる選択条件下の2つのアリコートにおいて増殖させることができる。
【０１３７】
色変化を与えるマーカーの使用は、色変化を可能にする培地において形質転換された細菌を増殖させることにより検出可能であるが、活性マーカーは、増殖には必要ではない。マーカーを発現させる形質転換体は、その後、目視検査、分光光度法、フローサイトメトリーなどにより検出可能である。直接的に検出されるマーカーのもう一つの例は、細菌の表面上に発現されうる遺伝子であり、それゆえに、それに対する抗体により検出されうる。検出可能なマーカーとして抗生物質耐性の使用、例えば、β-ラクタマーゼの発現などはミスマッチの配列を単離するために二重のプレートを必要とする場合がある。または、抗生物質耐性および抗生物質感受性遺伝子が、両方とも存在する場合がある。例えば、ベクターは、ストレプトマイシン感受性およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含みうる。両方の活性遺伝子が存在する場合、細胞を二重の培養において増殖することができ、一方はストレプトマイシンを含み、他方はテトラサイクリンを含む。もう一つの例において、形質転換体は、非選択条件下で増殖され、かつ複製のプレートは選択条件下で増殖される。抗生物質の存在下において増殖することができないコロニーは、ミスマッチの検査配列を有する。
【０１３８】
多重分析
ヘテロ二本鎖の検査ベクターで形質転換された各細胞は、別々のミスマッチレポーターとしての役割を果たすため、宿主細胞の大きな集団のそれぞれは、同時に用いられて、複数の検査二本鎖におけるミスマッチの存在または非存在を提示することができ、高度に多重化された分析を可能にする。MRDは、ハイスループットDNA変異検出を行う能力を提供する。MRDの多重化する潜在能力は、現在知られている方法の能力を上回り、それによって、大規模SNPゲノタイピングについて他の方法を超える進歩を示している。
【０１３９】
一つの方法において、一本鎖「AX」キメラ標準は、異なる配列の複数の所望の配列のそれぞれについて作製される。例えば、一本鎖「AX」キメラ標準は、真核生物もしくは原核生物から予測される各エキソンについて、または配列変異の部位であると知られているもしくは疑われるエキソンのサブセットについて、作製されうる。MRDは検査二本鎖の発現を必要としないため、一本鎖「AX」キメラ標準は、配列変異の部位であることが知られているまたは疑われる上流転写制御領域のような非コード領域から等しく調製されうる。
【０１４０】
複数のそのような標準は、その後、一般にすべての標準へアニーリングする「I」ベクター、および複数の標準内に含まれる遺伝子座における配列変異について検査される複数の核酸と結合されうる。核酸もプールされた供給源由来でありうるが、典型的には、核酸は、単一の供給源由来である。
【０１４１】
多重反応は、検査ベクター間で区別する能力によってのみ指示される制限をもって、2個またはそれ以上の標準、通常には少なくとも約5個の標準、10個の標準、より通常には少なくとも約25個、50個、100個、500個、または1,000個の標準、および2,000個、3,000個、4,000個、5,000個、6,000個、7,000個、8,000個、9,000個、10,000個または100,000個までもの標準さえも併用してもよい。
【０１４２】
後述する本明細書に示される実施例4および実施例5は、MRDの多重化する能力を実証するものである
【０１４３】
実施例4に示されるように、MRD方法は、発表された多型配列タグ部位(Sequence Tagged Sites(STS))の群からランダムに選択される13個のDNA断片におけるDNA配列変異の同定に適用された。標準は、各STSについて作製され、ヘテロ二本鎖は、標準と試験される各個体から増幅されたDNA断片の混合物の間で作製された。ヘテロ二本鎖は、MUTATION SORTER(商標)(MS)株へ、ひとまとめに形質転換され、形質転換体は、一方はテトラサイクリンを、他方はストレプトマイシンを追加された2つの別々の培養でその後増殖される2つのアリコートに分割された。2つの培養のそれぞれからのDNAは、蛍光で標識され、Applied Biosystems(ABI)シーケンシング機に添加された。断片ピークは分析され、特定のDNA断片における変異の存在または非存在は、特定の断片がより優勢であったプールを決定することにより評価された(図7)。
【０１４４】
図7に示されるように、それぞれ、ストレプトマイシンまたはテトラサイクリンを追加された培養から調製される2つの試料は、異なるピークトレースをもつ。トレースは、異なる断片に対応する異なるピークを示す。各ピークは自動的に定量される。検査された個体の対立遺伝子の割当は、2つのプール間での断片の相対的強度から決定される。ストレプトマイシンプールにおける断片の優勢は、変異の非存在を示す。対照的に、テトラサイクリンプールにおける断片の優勢は、両方の対立遺伝子における変異の存在を示す。最後に、両方のプールにおいて断片が大量にあることは、検査される個体がその断片についてヘテロ接合性であることを示す。これらの割当は、独立した検査において再現性がある。ヘテロ接合性変異を検出することについてのシグナル対ノイズ比は、およそ10:1であり、ホモ接合性変異の検出は、実質的により強い。
【０１４５】
実施例5において、MRDを多重化することについてのMRDの能力は、癌病因または進行に関与する遺伝子の32個のエキソンのプールにおいてMRDを行うことにより試験された。32個の標準プラスミドのパネルが作製された。これらのプラスミドは、その後、プールされ、検査DNAと比較するための参照としての役割を果たした。32のPCR反応が、3つの独立した腫瘍細胞系のそれぞれにおいて行われた。MRD方法は、3つの腫瘍のそれぞれのPCRプールで行われた。形質転換後、テトラサイクリンまたはストレプトマイシンの存在下で増殖された2つの細菌培養物からDNAが調製された。DNAプールの挿入断片を遊離した制限消化物について、アガロースゲルが流された。テトラサイクリンプールは、ストレプトマイシンプールと比較して、標準と検査DNAの間により高い比率の変異体を含んでいた。本発明者らは、3つの腫瘍において、4つの別々のエキソンにおける5つのそのような変異体断片を同定した。
【０１４６】
図8は、MRDにより変異について35個の異なる断片をスキャンすることから生じたABI 377シーケンシングゲルトレースの例である。
【０１４７】
実施例4および実施例5に実証されるように(かつ、図7および図8に示されるように)、MRDは、多重分析を容易に可能にし、変異の存在または非存在を、複数の異なる標準について同時に提示することができる。実際において、宿主細胞株は、断片を2つのプール：ミスマッチを有するもの、およびミスマッチを有しないもの、へ分別する。その後、DNA変異検出の問題は、2つのプールの断片内容を同定するという問題へ絞られる。
【０１４８】
実施例4および実施例5において、ゲル電気泳動法は、各標準が異なる長さをもつ、MRD実験における2つのプールの断片内容を測定するために用いられる。しかしながら、多重化のより高いレベルでは、ゲル電気泳動法により解明されうるより多数の標準間の区別を可能にする方法を必要とする。
【０１４９】
一つの解決は、実施例6において例証されているが、検出のためにマイクロアレイを用いることであり、各標準が、アレイに常在する特有のアドレス可能に区別できるプローブにハイブリダイズする。
【０１５０】
マイクロアレイは、当技術分野においてよく知られている。本明細書で用いられる場合、用語「マイクロアレイ」および等価の句「核酸マイクロアレイ」とは、支持体に結合した複数の核酸の収集物を指し、複数の結合した核酸のそれぞれへのハイブリダイゼーションが別々に検出可能である。支持体は、固体または多孔性、平面または非平面、一体または分散型でありうる。そのように定義される場合、用語「マイクロアレイ」および句「核酸マイクロアレイ」は、Schena(編)、「DNA Microarrays: A Practical Approach」 (Practical Approach Series)、Oxford University Press (1999) (ISBN: 0199637768)；Nature Genet. 21(1)(suppl):1-60 (1999)；およびSchena(編)、「Microarray Biochip: Tools and Technology」、Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000) (ISBN: 1881299376)においてそのように呼ばれるすべての装置を含み、それらの文献の開示は、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【０１５１】
まれな対立遺伝子検出および得点化のための高度に多重化されたミスマッチ修復検出
MRDは、標準と検査配列の間の場合、ミスマッチの性質を提示しない。むしろ、出力はバイナリーであり、検査配列が標準と整合しているか、またはしていないかのみを提示する。選択されたエキソンの変異体のような単一の標準の変異体間を区別するために、複数の標準は、検査配列がそれに対して、別々に、しばしば同時に、比較される対立遺伝子の1つを、それぞれが有するように構築されなければならない。
【０１５２】
ほんの少数だけの一般的な対立遺伝子が支配する場合、この方法を容易に用いることができる。しかしながら、多数の対立遺伝子が存在するところ、またはまれな対立遺伝子が探索される場合は、困難な可能性がある。
【０１５３】
例えば、配列変異について試料を問い合わせるために多数の標準を同時に使用可能なMRDの能力(そのような標準が、単一の標的遺伝子座の多数の対立遺伝子型であろうと、またはその代わりとして、もしくは加えて、複数の別個の遺伝子座から得られるのであろうといずれにせよ)は、そのように同時に用いられる標準が別々に検出可能であるという必要条件により制限される。
【０１５４】
まれな対立遺伝子を検出するためのMRDの効率的使用に対するもう一つの可能性のある障害は、MRDレポーター系に内在するシグナル：ノイズ比である。
【０１５５】
例えば、ミスマッチがβガラクトシダーゼ比色アッセイ法により示される場合、酵素基質の擬似の切断またはlacZ座の自発的復帰突然変異が、不適当にコールされたコロニーのバックグラウンドの一因となりうる。ミスマッチが、抗生物質カセット上のCreリコンビナーゼの作用により与えられる抗生物質耐性表現型により提示される、改良されたMRDレポーター系においてさえも、限られたバックグラウンドレベルが観察される。検出される対立遺伝子が、固有のバックグラウンドの頻度より少ない頻度で生じる場合には、信頼性のある検出は困難であると思われる。
【０１５６】
それゆえに、もう一つの局面において、本発明は、ミスマッチ修復検出(MRD)の多重化する能力を増加させる（すなわち、配列変異の存在について試料を問い合わせるために同時に使用可能な別々の配列の標準の数を増加させる）方法および組成物を提供する。数ある利点の中で、増加した多重化する能力は、多数の対立遺伝子変異体が、変異について問い合わせされる各遺伝子座に対する標準として含まれることを可能にする。本発明は、さらに、MRDのシグナル：ノイズ比を増加させる組成物および方法を提供する。個々におよび共に、これらの改良は、まれな対立遺伝子変異体がより容易に、同定かつ得点化されることを可能にする。
【０１５７】
上記のように、MRDは、DNA「検査」二本鎖におけるミスマッチを、ヘミメチル化された複製可能なベクター内に含まれる場合、他の状態では「修正不可能な」ヘテロ二本鎖としてベクターの他の場所に存在している「表現型的に分別可能な」遺伝因子(「マーカー」)のインビボの同時修復を開始するそれの能力により検出かつ提示する。マーカーミスマッチの修復は方向性をもつ（すなわち、再現可能的に、マーカーヘテロ二本鎖のメチル化鎖の方を選ぶ）ため、マーカーヘテロ二本鎖の2つの鎖は、修復が修復の存在しない場合に示すものと区別できる表現型を宿主細胞へ与えるように、操作される。修復の存在または非存在に依存するそのような区別可能な表現型を生じることができる任意の遺伝因子は、本明細書では、「表現型的に分別可能な」遺伝因子と名付けられる。
【０１５８】
および、ヘテロ二本鎖化ベクターで形質転換された各細胞は、別個のレポーターとしての役割を果たすため、宿主細胞の大きな集団のそれぞれを、ミスマッチの存在または非存在を検出かつ提示するために同時に用いることができ、多重化された分析を可能にする。そのような多重分析において、宿主細胞株は、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始することができるものすべてを二本鎖の収集物から表現型的に分別する；分別されたプール内に存在する二本鎖の同定は、その後、比較して変異が問い合わせされた試料に存在した、すべての標準を同定するのに役立つ。
【０１５９】
方法は、図10A〜図10Cを参照することにより、さらに理解される。
【０１６０】
図面の上端中央に、一本鎖の閉環状標準ベクターのプールが示されている。そのような標準ベクターのそれぞれは、ベクター部分および別個の標準配列を含み、標準が配列変異の存在について試料を問い合わせるために用いられる。標準は、そのような一本鎖標準のサブセットのみを示していることを表すために、図面に連続せずに番号をつけている。
【０１６１】
示されてないが、一本鎖標準ベクターのベクター部分は、とりわけ、二本鎖の増殖を可能にするためのプラスミド複製起点、一本鎖レスキューを可能にするための繊維状ファージ起点、およびCreリコンビナーゼについてのコード領域をさらに含み、その最後のものは、MRD過程において表現型的分別を可能にする。
【０１６２】
一本鎖標準ベクターはメチル化されておらず、典型的には、SCS 110のようなdam−株において増殖される二本鎖プラスミドからのファージレスキューにより得られる。
【０１６３】
図面の上端右に、二本鎖の直鎖状ベクターのプールが示されており、一つの例外：直鎖状二本鎖ベクターは、creリコンビナーゼコード領域において5つの塩基対欠失、活性リコンビナーゼ遺伝子産物の翻訳を防ぐのに十分である欠失をもつことを除いては、一本鎖標準ベクターを作製するために用いられるベクターと配列において同一である。直鎖状ベクターは、それのメチル化の状態において、閉環状一本鎖標準ベクターとさらに異なる：dam＋株において増殖されるため、直鎖状二本鎖ベクターは、GATCメチラーゼ認識配列で完全にメチル化されている。
【０１６４】
上端左に、標準内に含まれる遺伝子座での配列における変異について問い合わされる直鎖状二本鎖核酸のプールが示されている。試料核酸はメチル化されている：図10Aにおいて示されるように、試料プールがゲノムの試料からインビトロでの増幅により得られる場合、試料は、damメチラーゼを用いてインビトロでメチル化される。
【０１６５】
試料核酸、一本鎖標準ベクター、および直鎖状二本鎖Δcreベクターは、混合され、変性され、および再アニーリングするようにされる。図10Aの中央に示されているように、産物の中では、環状ヘテロ二本鎖が形成される。環状ヘテロ二本鎖は、一本鎖標準ベクターのそれぞれへの2つの別々の核酸のアニーリングにより形成される：(i)すべての一本鎖標準ベクターに共通している、直鎖状化されたメチル化Δcreベクターの相補鎖、および(ii)特有にベクターの別個の標準に相補的である試料プールから得られた鎖。
【０１６６】
図10Aの中間に示されるように、その後、Taqリガーゼが、環状ヘテロ二本鎖におけるニックを修復するために用いられる。これらの閉環状二本鎖複製可能ヘテロ二本鎖ベクターは、便宜上、本明細書では「MRDベクター」と名付けられる。MRDベクターは、「マーカーヘテロ二本鎖」に物理的に連結された「検査二本鎖」(第一鎖は、標準ベクターにより与えられ、第二鎖は、問い合わされる試料により与えられる)を含むものと有効にみなされうる。
【０１６７】
直鎖状二本鎖DNAおよび一本鎖DNA産物は除去され、MRDベクターのプール（内部に検査二本鎖のプールを有する）はその後、表現型分別のために宿主細胞株へ形質転換される。
【０１６８】
図10Aの下端パネルに示されるように、MUTATION SORTER(商標)宿主細胞株は、lox部位に隣接される抗生物質カセットを有するF'エピソームを含む。カセットは、テトラサイクリン耐性遺伝子およびストレプトマイシンに対する感受性を与える遺伝子を含む。
【０１６９】
図10Bは、保証するインビボ修復過程の2つの可能性のある結果を示す。
【０１７０】
「検査二本鎖」において変異の存在しない場合、creマーカーヘテロ二本鎖の同時修復は、開始されない(左側に示されている)。プラスミド複製の1ラウンド後、このように、2つのホモ二本鎖プラスミド種が細胞に存在する：活性Creリコンビナーゼ(活性タンパク質は点として示されている)をコードするもの、およびしないもの。活性Creリコンビナーゼは表現型的に優性であるため、エピソーム上のlox部位の間の組換えは実施され、抗生物質カセットは除去され、そして、宿主細胞は、テトラサイクリン感受性およびストレプトマイシン耐性にされる。
【０１７１】
「修正可能」変異が検査ヘテロ二本鎖内に生じている場合、creヘテロ二本鎖の同時修復が開始され、メチル化Δcre鎖が鋳型としての役割を果たす(右側に示されている)。プラスミド複製の1ラウンド後、単一のホモ二本鎖プラスミド種が宿主細胞内に存在し、不活性Creリコンビナーゼをコードする。従って、F'エピソーム上におけるlox部位の間で組換えは実施されず、結果は、テトラサイクリン耐性およびストレプトマイシン感受性である宿主細胞である。形質転換体は、形質転換後、短時間だけ培養され、示される態様においては、培養物は分割され、2つのアリコートはそれぞれ、図10Cに図式化されているように、テトラサイクリンまたはストレプトマイシン選択にかけられる。
【０１７２】
テトラサイクリンでの選択は、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始することができるものすべてを検査二本鎖の最初の収集物から分別する；この分別されたプールに存在する検査二本鎖の同定は、比較して変異が問い合わされた試料に存在した、すべての標準を同定する。
【０１７３】
選択的に、ストレプトマイシンでの対抗する選択は、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始することができないものすべてを検査二本鎖の最初の収集物から分別する；この反対に分別されたプールに提示された検査二本鎖の同定は、比較して変異が問い合わされた試料に存在しなかった、すべての標準を同定する。
【０１７４】
図10Cにおいて、各プールに存在する標準の同定は、ゲル電気泳動法により区別可能な長さをもつ標準の事前の操作に基づいている(図10C、下端を参照)。そのようなサイズ識別は、自動化核酸シーケンサーを用いて改良されているが、同時に同定されうる標準の数は、そのような方法の相対的に低い分解能により制限される。
【０１７５】
一つの解決、固定化されたプローブの中に、標準または特異的にハイブリダイズ可能な部分を含むマイクロアレイへのハイブリダイゼーションは、何千という標準の同時使用を可能にさせる。しかしながら、そのような方法は、変異が1ヌクレオチド程度で異なることが可能なような、互いの対立遺伝子変異体である標準の同時的検出および識別を容易に可能というわけではない。また、そのようなマイクロアレイハイブリダイゼーションは、バックグラウンド率より低い頻度でプールされた試料に生じている対立遺伝子変異体を検出することの問題も解決していない。
【０１７６】
このように、一つの局面において、本発明は、別々の核酸配列の複数のDNA二本鎖のいずれかにおいてミスマッチを同定可能に検出するための、改良されたミスマッチ修復検出方法を提供することにより、これらおよび他の問題を解決する。
【０１７７】
本発明のこの局面の方法において、各核酸標準は、それの標準(および結果生じるMRD)ベクターにおいて、前に記載されたように、表現型的に分別可能な遺伝因子へ、および加えて、遺伝子型で検出可能な遺伝因子(「配列タグ」)へ、物理的に連結される。前者は、検査二本鎖における開始するミスマッチの存在または非存在によるインビボでの表現型的分別を可能にする；後者は、そのように分別された検査二本鎖の改良されたインビトロの同定を可能にする。
【０１７８】
本方法は、(1)複数の別々の二本鎖から、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始することができるものを表現型的に分別する段階；およびその後、(2)表現型的に分別された集団に存在する二本鎖を同定可能に検出する段階であって、検出および同定が、各二本鎖に特有に連結された少なくとも1つの遺伝型的に検出可能な遺伝因子の検出および同定により実施される段階を含む。
【０１７９】
第一段階、ミスマッチ状態により二本鎖を表現型的に分別する段階は、上記のように、任意の既知のMRD法により行われる。従って、本方法の第一段階を、ここでは詳細に考察しない。
【０１８０】
表現型的分別は、同時修復の鎖の性状を誘導するヘミメチル化基質を用いることにより、大腸菌および他のグラム陰性細菌において容易に実施されるが、好ましくは、2つの鎖のうちの1つにニックを入れられた（2つのベクター鎖のうちの1つへのみの非パリンドロームのN.BstNBI部位の操作によるような）ベクターもまた使用される(下記参照)。
【０１８１】
表現型的分別後、少なくとも1つの表現型的に分別された集団に存在する標準が同定される。
【０１８２】
そのような検出を促進するために、複数の標準配列のそれぞれは、それのそれぞれの標準(および結果生じるMRD)ベクターにおいて、少なくとも第一の遺伝子型で検出可能な因子(「核酸配列タグ」または「配列タグ」とも名付けられる)へ物理的に連結され、各タグは、MRD反応において用いられる複数の配列タグの中で特有のものである。
【０１８３】
配列タグの長さは、アッセイにおいて同時に用いられるのに望ましい別々の配列の標準の数、およびそのような標準のそれぞれに連結されるのに望ましい特有タグの数に、一部分、基づいて選択され、利用可能でなければならない特有タグの数に、より低い制限を共に確立する。タグの長さは、望ましい配列選択基準を適用した後、この最少限を達成されうるのに十分な組み合わせをさらに可能にしなければならない。
【０１８４】
単一の大腸菌に基づくMRDアッセイ法において表現型的に分別されうる別々の配列の標準の数は、事実上、制限はなく、細菌が形質転換されかつ選択されうる並はずれて高い効率性を与える；単一反応において表現型的に分別される複数の別々のDNA二本鎖は、このように、ほんの1個程度、または10個、100個、1,000個、10,000個、15,000個、20,000個、25,000個、30,000個、40,000個、50,000個、75,000個もしくは100,000個もしくはそれ以上でありうる。
【０１８５】
さらに、タグを検出するマイクロアレイへのハイブリダイゼーションによる配列タグの検出は、そのようなマイクロアレイの複数を用いることができるため、単一反応において含まれる標準の合計数にほとんど制限をもたらさない。
【０１８６】
単一のMRDアッセイに含まれるのに望ましいものと思われる標準の数における制限は、このように、典型的には、標準の入手可能性および予測される情報内容により指示される。
【０１８７】
例えば、国際公開公報第01/57276号は、13,114個のプローブを記載し、それぞれがヒトゲノム由来の単一の固有のエキソンを含み、そのすべてで骨髄に発現されている。これらの13,114個のプローブは、ヒト遺伝子型変異を造血の疾患に関連づけることを意図された単一のMRD反応に有効に含まれる。そのような努力において、タグ長は、望ましい配列選択基準の適用後、13,114個の特有配列タグの最少限を供給するように選択される。
【０１８８】
同様に、国際公開公報第01/572275号は、ヒト脳に発現される12,821個の固有単一エキソンのプローブを記載しており、遺伝子型変異を神経学的および精神医学的(例えば、DSM軸I)疾患に関連づけることを意図されたMRDアッセイにおいて同時的標準として有効に用いられうる；国際公開公報第01/572274号は、ヒト心臓に発現される9,980個の固有単一エキソンのプローブを記載しており、遺伝子型変異を心臓疾患に関連づけることを意図されたMRDアッセイにおいて同時的標準として有効に用いられうる；国際公開公報第01/572273号は、ヒト肝臓に発現される13,109個の単一エキソンのプローブを記載しており、遺伝子型変異をとりわけ、薬物代謝表現型に関連づけることを意図されたMRDアッセイにおいて同時的標準として有効に用いられうる。これらの場合、タグ長は、望ましい配列選択基準の適用後、それぞれ、12,821個、9,980個および13,109個の特有配列タグの最少限を供給するように選択される。
【０１８９】
従って、典型的には少なくとも約1,000個、2,000個、3,000個、4,000個または5,000個、より典型的には少なくとも約10,000個、ならびに15,000個、20,000個、25,000個および50,000個までさえもの特有配列タグが望ましい；タグ長は、望ましい配列選択基準の適用後、そのような数を供給するように選択される。
【０１９０】
しかしながら、時々、各特有の標準は、複数の配列タグに連結され、望まれる特有タグの数を増加させ、次には、配列タグの望まれる長さを増加させる。
【０１９１】
第一タグに追加の各タグは、検出の特異性を増すことができ、標準に結合されたすべてのタグが表現型的に分別されたプールにおいて同定される場合のみ、変異が得点化される。または、各追加的タグは、検出の感度に寄与することができ、標準に結合された複数のタグのいずれかが表現型的に分別されたプールにおいて同定される場合、変異が得点化される。
【０１９２】
タグ配列の長さはまた、配列選択基準が適用されるストリンジェンシーによっても指示され、このように、タグは、可能性のある組み合わせのプールから排除される。
【０１９３】
配列選択基準は、(i)配列の差異を最大限にする、(ii)高密度オリゴヌクレオチドアレイにおける同時分析を促進するために、類似したハイブリダイゼーション特性、主にTmにおける類似性を保持する、(iii)二次構造を排除する、(iv)単一のヌクレオチドのひと続きを排除する、および(v)塩基組成のバランスをとるように、有効に設計されうる。これらの基準のいずれか1つまたは複数が、様々な程度のストリンジェンシーをもって適用されうる。
【０１９４】
例えば、可能性のある20-mer(420 = 1.1 x 1012)の総数から出発し、様々なストリンジェンシーを有するこれらの基準のすべてを適用して、Shoemakerらは、配列タグとして使用のための51082個、9105個、2643個、853個、170個および42個の20-mersのセットを記載している。Nature Genetics 14:450-456 (1996)、その開示は、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【０１９５】
従って、本発明に用いられる配列タグは、少なくとも15ヌクレオチド長、通常では少なくとも16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長および20ヌクレオチド長またはそれ以上であり、および少なくとも21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、30ヌクレオチド長またはそれ以上までもありうる。典型的には、配列タグは、75ヌクレオチド長より少ない、しばしば、50ヌクレオチド長より少ない、頻繁には40ヌクレオチド長より少ない。
【０１９６】
タグ配列は、標準およびMRDベクターにおいて標準配列に直接的に隣接しうる。
【０１９７】
標準が、天然の核酸（ゲノムDNA、cDNA、mRNA）から直接的に増幅により得られる場合、タグ配列は、しばしば、増幅プライマーにおいて配列特異的プライミング部分の5'側直接的にタグ配列を含んでいた結果であるように、配置される。
【０１９８】
標準が、その代わりとして、事前にクローニングされたまたは事前に増幅された核酸から増幅により得られる場合、タグは、いくらかの距離をおいて標準配列に近接しうる。例えば、標準が、国際公開公報第01/57270号、第01/57271号、第01/57272号、第01/57273号、第01/57274号、第01/57275号、第01/57276号、第01/57277号、第01/57278号、または第01/86003号のいずれかに記載される単一エキソンのプローブから得られる場合、標準配列は、典型的には、少なくとも第一のプライミング部位によりタグ配列と分離され、プライミング部位は、インビトロの増幅によるそれの増殖を可能にするように単一エキソンのプローブに存在する。
【０１９９】
複数のタグが各標準に物理的に連結されている場合、タグは、互いに隣接されうる、または不連続的に存在しうる。互いから分離されている場合、それらは、標準配列の一方側上(すなわち、標準およびMRDベクターにおいて標準配列の5'側または3'側のいずれか)に集合的に配置されうる、または標準の両側上にそれぞれ配置されうる。
【０２００】
標準配列は、さらに、かつ有効に、標準およびMRDベクターにおいて、少なくとも第一のプライミング配列に物理的に連結されうる。
【０２０１】
プライミング配列は、配列タグを付けられた標準のシーケンシングおよび/または増幅を促進する。
【０２０２】
配列タグとは対照的に、プライミング配列は、各標準に特有である必要はない。プライミング配列がすべての標準に共通である場合、1つのオリゴヌクレオチドを、タグを付けられた標準のすべてのシーケンシングおよび/または増幅をプライミングするために共通して用いることができる。
【０２０３】
1つのプライミング配列は、T7、T3またはSP6のようなファージポリメラーゼにより作動される転写によるような、標準の直線的増幅を容易に可能にする。
【０２０４】
他の態様において、単一的にまたは多重的にタグを付けられた標準は、第一プライミング配列および第二プライミング配列に連結され、第一および第二プライミング配列は、それらの間のタグ化標準の幾何級数的な増幅を可能にする。
【０２０５】
有効的には、これらの態様における第一および第二プライミング配列は、互いに異なるが、単一のMRD反応に用いられるために望まれるすべての他の標準の第一および第二プライミング配列と、それぞれ同じである。これは、表現型的に分別されたプラスミドプールにあるすべての標準を増幅するために共通して用いられる5'および3'プライマーの1対を可能にする。
【０２０６】
プライミング部位はまた、1つまたは複数の制限部位、典型的には、MRDベクターにおいて他の場所に見出されない制限部位を有効に含みうる。有効には、プライミング部位は、高密度のそのような制限部位を含むポリリンカーを含みうる。そのような制限部位は、とりわけ、標準ベクターへのタグ化標準のクローニングを促進するため、表現型的に分別されたプラスミドの制限消化により表現型的に分別された標準を回収するために、および他のベクターへ表現型的にタグを付けられた標準のクローニングのために(タグ化標準が、制限または増幅後制限消化により最初に回収されようがされまいがいずれにせよ)有用である。
【０２０７】
分別された二本鎖は、その後、それらに連結された配列タグの検出により同定される。
【０２０８】
第一の一連の態様において、分別された二本鎖は、配列タグに相補的なプローブを有するマイクロアレイへの配列タグ、タグ化二本鎖、またはそれら由来の核酸の特異的ハイブリダイゼーションにより検出される。
【０２０９】
本明細書に用いられる場合、用語「マイクロアレイ」および等価の句「核酸マイクロアレイ」は、支持体に結合した複数の核酸の収集物を指し、複数の結合した核酸のそれぞれへのハイブリダイゼーションは別々に検出可能である。支持体は、固体または多孔性、平面または非平面、一体または分散型でありうる。
【０２１０】
そのように定義される場合、用語「マイクロアレイ」および句「核酸マイクロアレイ」は、Schena(編)、「DNA Microarrays: A Practical Approach」 (Practical Approach Series)、Oxford University Press (1999) (ISBN: 0199637768)；Nature Genet. 21(1)(suppl):1-60 (1999)；およびSchena(編)、「Microarray Biochip: Tools and Technology」、Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000) (ISBN: 1881299376)においてそのように呼ばれるすべての装置を含み、それらの文献の開示は、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【０２１１】
そのように定義される場合、用語「マイクロアレイ」および句「核酸マイクロアレイ」はまた、とりわけ、Brennerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(4):1665-1670 (2000)(その開示は完全に参照として本明細書に組み入れられている)に記載されているように、複数の核酸が、一体の平面支持体上よりもむしろ、ビーズのような複数の支持体上に分散して配置されている、支持体に結合した複数の核酸の収集物を含む；そのような場合、用語「マイクロアレイ」および句「核酸マイクロアレイ」は、全体としての複数の支持体(例えば、ビーズ)を指す。
【０２１２】
ハイブリダイゼーションのための標識核酸を調製するために、表現型的に分別された集団に存在する配列タグまたはタグ化二本鎖は、公知の技術により回収かつ標識されうる。
【０２１３】
例えば、表現型的に分別されたMRDベクターを直鎖状化することができ、標識プローブは、隣接したプライミング部位に配置されるファージプロモーターから作動されるRNA転写により直接的にそこから調製されうる；標識は、転写反応において、適切に標識されたヌクレオチドの使用を通して直接的に取り込まれうる。
【０２１４】
または、配列タグまたはタグ化二本鎖を、最初に、制限消化または増幅により、典型的にはPCRにより、表現型的に分別されたプラスミドから回収することができ、その後は、RNA転写が、そのように回収されたタグまたはタグ化二本鎖上で行われる。
【０２１５】
さらに代替的には、配列タグまたはタグ化二本鎖は、制限消化によるタグもしくはタグ化二本鎖の事前の遊離のある場合またはない場合も、表現型的に分別されたプラスミド集団に存在するプラスミドから増幅により回収される。PCRによるような増幅は、タグまたはタグ化二本鎖に隣接するプライマー対により媒介される。一方または両方の増幅プライマーが、例えば、ビオチンまたは直接的に結合したフルオロフォアにより標識されている場合には、PCR産物は、ハイブリダイゼーションプローブとして直接的に用いられうる。しばしば、そのような場合、増幅は、マイクロアレイ上に固定化されたプローブに相補的である鎖の過剰量を産生するために非対称的に行われる。
【０２１６】
または、第一の増幅を、標識プライマーなしで行い、その後、第二の直線的増幅が標識プライマーを用いて行うことができる。
【０２１７】
マイクロアレイハイブリダイゼーションおよび検出のための方法は、現在よく知られており、ここで詳細に考察する必要はない。例えば、Schena(編)、「DNA Microarrays: A Practical Approach」 (Practical Approach Series)、Oxford University Press (1999) (ISBN: 0199637768)；Nature Genet. 21(1)(suppl):1-60 (1999)；Schena(編)、「Microarray Biochip: Tools and Technology」、Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000) (ISBN: 1881299376)；Shoemakerら、Nature Genetics 14:450-456 (1996)；およびWinzelerら、Science 285:901-906 (1999)を参照されたい。それらの開示は、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【０２１８】
本発明において表現型的に分別された標準を検出かつ同定するために、遺伝子型で連結された配列タグのバーコードマイクロアレイへの特異的なハイブリダイゼーションを用いることにより、多数の利点が実現される。
【０２１９】
第一に、ほんの少数のヌクレオチドのみで異なる別々の配列の標準は、配列において実質的に異なる標準が区別されうるのと同じくらい容易に区別可能であり、同時に用いられる遺伝子座の複数の対立遺伝子変異体が、試料を単一の遺伝子座における変異について問い合わせを行うことを可能にする。そのような同時的クエリーは、まれな対立遺伝子が、一般的な対立遺伝子のすべてとは同時的に異なる配列として検出されることを可能にする。任意の与えられた遺伝子座のほんの2個または3個、および4個、5個、6個、7個、10個またはそれ以上までもの対立遺伝子は、単一反応において、別々にタグを付けられた標準として検出可能に含まれうる。
【０２２０】
第二に、マイクロアレイは、標準に対してよりもむしろ、タグに対して特異的であるため、標準が、標準およびMRDベクターにおいて必須の相補的な配列タグに連結されている限りは、標準の任意のプールについて使用可能な総称的なバーコードマイクロアレイを構築することができる。
【０２２１】
第三に、バーコードマイクロアレイの総称的な性質は、たった1組の最適のハイブリダイゼーション条件を決定し、その後は、個別化またはさらなる最適化なしに用いられることを可能にする。
【０２２２】
バーコードマイクロアレイへのハイブリダイゼーションは、特定の利点をもたらし、現時点では、表現型的に分別された二本鎖に連結された配列タグを検出するために好ましいが、MRDベクターにおける各二本鎖に連結された遺伝子型で検出可能な因子は、他の手段により検出されうる。
【０２２３】
例えば、遺伝子型で検出可能な因子は、遺伝子型で検出可能な因子へ特異的である少なくとも1つのプライマーを用いて、表現型的に分別されたMRDベクターから増幅されうる。プライマーは、固有の質量タグを切断可能に連結している。増幅後、質量タグは、プライマーから切断され、検出され、質量分析法を用いて他のそのような質量タグから区別される。質量タグは、とりわけ、Kokorisら、Molecular Diagnosis 5:329-340 (2000)に概説され、その開示は、完全に参照として本明細書に組み入れられている。
【０２２４】
上記のように、配列変異は、典型的には(しかし、常にではないが)、ゲノムの試料において探索される。典型的には、それゆえに、探索される複数の別々のDNA二本鎖の中の少なくとも1つ(しばしば、1つの反応においてそのような二本鎖すべて)が、「検査二本鎖」の標準鎖として、天然に存在するゲノム配列と同一である配列を有し、問い合わせされる試料は、ゲノムDNA由来である。ゲノム配列は、起源として原核生物または真核生物でありうる。
【０２２５】
ゲノム試料が有用に得られうる真核生物種の中には、ヒト、同類の霊長類、例えば、チンパンジー、サル(アカゲザルを含む)、ヒヒ、オラウータンおよびゴリラ、ならびに実験モデルとして典型的に用いられる齧歯類、例えば、ラット、マウス、ハムスターおよびモルモットがある。試料核酸はまた、ウサギのようなウサギ目から；ならびにウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびバイソンを含む家畜のような大型哺乳動物から、有用に得ることができる。また有用なのは、ニワトリ、ガチョウ、カモ、七面鳥、キジ、ダチョウおよびハトのような家禽；ゼブラフィッシュ、サケ、テラピア、ナマズ、マスおよびバスのような魚；ならびにイヌおよびネコのような家庭用ペット種由来の試料である。
【０２２６】
試料核酸が有用に得られうる植物は、例えば、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)、サイスコミトレラ  パテンス(Physcomitrella patens)、およびシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のような実験モデル植物；カリフラワー(Brassica oleracea)、アーティチョーク(Cynara scolymus)のような作物用植物；リンゴ(Malus、例えば、Malus domesticus)、マンゴー(Mangifera、例えば、Mangifera indica)、バナナ(Musa、例えば、Musa acuminata)、ベリー(フサスグリのような、Ribes、例えば、rubrum)、キーウィフルーツ(Actinidia、例えば、chinensis)、ブドウ(Vitis、例えば、vinifera)、ピーマン(Capsicum、例えば、Capsicum annuum)、サクランボ(セイヨウミザクラのような、Prunus、例えば、avium)、キュウリ(Cucumis、例えば、sativus)、メロン(Cucumis、例えば、melo)、ナッツ(クルミのような、Juglans、例えば、regia；ピーナッツ、Arachis hypogeae)、オレンジ(Citrus、例えば、maxima)、モモ(Prunus、例えば、Prunus persica)、西洋ナシ(Pyra、例えば、communis)、プラム(Prunus、例えば、domestica)、イチゴ(Fragaria、例えば、moschataまたはvesca)、トマト(Lycopersicon、例えば、esculentum)のような果実；アルファルファ(Medicago、例えば、sativaまたはtruncatula)、キャベツ(例えば、Brassica oleracea)、エンダイブ(Cichoreum、例えば、endivia)、ネギ(Allium、例えば、porrum)、レタス(Lactuca、例えば、sativa)、ホウレンソウ(Spinacia、例えば、oleraceae)、タバコ(Nicotiana、例えば、tabacum)のような葉および飼草；クズウコン(Maranta、例えば、arundinacea)、ビート(Beta、例えば、vulgaris)、ニンジン(Daucus、例えば、carota)、キャッサバ(Manihot、例えば、esculenta)、カブ(Brassica、例えば、rapa)、ラディッシュ(Raphanus、例えば、sativus)、ヤムイモ(Dioscorea、例えば、esculenta)、サツマイモ(Ipomoea batatas)のような根；マメ(Phaseolus、例えば、vulgaris)、エンドウ(Pisum、例えば、sativum)、ダイズ(Glycine、例えば、max)、カウピー(Vigna unguiculata)、モスビーン(Vigna aconitifolia)、コムギ(Triticum、例えば、aestivum)、ソルガム(Sorghum、例えば、bicolor)、オオムギ(Hordeum、例えば、vulgare)、トウモロコシ(Zea、例えば、mays)、コメ(Oryza、例えば、sativa)、ナタネ(Brassica napus)、キビ(Panicum sp.)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、オートムギ(Avena sativa)、ヒヨコマメ(Cicer、例えば、arietinum)のような脂肪種子を含む種；コールラビ(Brassica、例えば、oleraceae)、ジャガイモ(Solanum、例えば、tuberosum)などのような塊茎；アマ(Linum、例えば、Linum usitatissimum)、ワタ(Gossypium、例えば、hirsutum)、マツ(Pinus spp.)、オーク(Quercus sp.)、ユーカリノキ(Eucalyptus sp.)などのような繊維および木材用植物；ならびに、芝草(Lolium、例えば、rigidum)、ペチュニア(Petunia、例えば、x hybrida)、ヒヤシンス(Hyacinthus orientalis)、カーネーション(Dianthus、例えば、caryophyllus)、デルフィニューム(Delphinium、例えば、ajacis)、ジュズダマ(Coix lacryma-jobi)、キンギョソウ(Antirrhinum majus)、ケシ(Papaver、例えば、nudicaule)、ライラック(Syringa、例えば、vulgaris)、アジサイ(Hydrangea、例えば、macrophylla)、バラ(Gallicas、Albas、Damasks、Damask Perpetuals、Centifolias、Chinas、TeasおよびHybrid Teasを含む)、ランおよび観賞用アキノキリンソウ(例えば、Solidago spp.)のような観賞用植物を含む。
【０２２７】
試料核酸はまた、酵母、特に、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、メタノリカ(methanolica)のようなピチア(Pichia)種、ウスティラゴ・メイディス(Ustillago maydis)、およびカンジダ(Candida)種のような下等真核生物から、または線虫(C. elegans)、ゼブラフィッシュ、およびショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)のような多細胞性真核生物から有用に得られうる。
【０２２８】
一般的な対立遺伝子の同定
上で言及されているように、本発明の方法は、まれな対立遺伝子をすべての一般的な対立遺伝子とは異なる配列として検出することを可能にし、一般的な対立遺伝子は、単一のアッセイにおいて標準としてすぐに容易に含まれることができる。
【０２２９】
もう一つの局面において、本発明は、そのような一般的な対立遺伝子の迅速な発見を可能にし、それに伴って、さらに、まれな対立遺伝子の発見および得点化を促進する。
【０２３０】
本発明のこの局面の方法において、問い合わせされる試料は、複数の個体からプールされる。試料は、ほんの2個体から得られうるが、典型的には、少なくとも3、4、5、10、15、少なくとも20、25、30、35、もしくは40、45もしくは50個体またはそれ以上までもからプールされる。単一の遺伝子座がスクリーニングされうるが、複数の遺伝子座が同時に問い合わせされる多重分析により、より高い処理量が達成される。
【０２３１】
その中の各検査二本鎖が標準鎖およびプールされた核酸試料由来の鎖を含んで、MRDベクターが調製される。標準は、選択された遺伝子座の同定された対立遺伝子である。同定された対立遺伝子は、一般的な対立遺伝子を表していることが統計的により可能性が高いが、この最初の標準配列は、問い合わせされる集団において一般に生じている必要はない。上記のように、各標準は、表現型的に分別可能な遺伝因子、および遺伝因子が好ましくはいずれか1つのMRD反応において用いられるそのような因子の中で特有である、少なくとも第一の遺伝子型で検出可能な遺伝因子の両方に連結されている。
【０２３２】
結果として生じるMRDベクター(それぞれの検査二本鎖を含む)は、その後、インビボでミスマッチ同時修復事象を開始する各二本鎖の能力に基づいて表現型的に分別される。表現型的に分別された集団に存在する二本鎖は、検出かつ同定され、検出および同定は、検査二本鎖に連結された配列タグを検出することにより実施される。
【０２３３】
上記のMRD態様においてのように、鎖修復の方向性が、変異体配列を鋳型として用いるように操作されている場合、表現型的に分別される二本鎖は、変異体配列を有する、すなわち、試料核酸がプールされた集団に存在した、かつ最初の標準とは異なる配列を有する。
【０２３４】
変異対立遺伝子を、その後、追加の標準を作製するために用いることができ、追加の標準は、その後、MRDの1ラウンドまたは複数の次のラウンドに用いられ、続いて、標準の単離および構築が行われうる。そのような追加のラウンドのそれぞれは、さらなる対立遺伝子を同定することができ、集団において最も一般的に生じる対立遺伝子は、より頻繁にかつ容易に同定される。
【０２３５】
追加の対立遺伝子標準を、その後、まれな対立遺伝子の変異体を同定するために、本発明の方法において最初の標準と共に同時に用いることができる。
【０２３６】
そのようなまれな対立遺伝子検出への一つの方法において、核酸は、複数の個体からプールされ、1つまたは複数の所望の遺伝子座の一般的な対立遺伝子に対応する標準を含むMRD反応において問い合わせが行われる。その結果生じる表現型的に分別されたプールは、一般的な対立遺伝子とは異なる変異体の中に濃縮される。前に記載されているようにMRD系に示されるバックグラウンドレベルをもって、最初の試料プールに5%の頻度をもつ対立遺伝子は、変異体プールにおいて約50%まで濃縮され、従って、直接的シーケンシング、または変性高圧液体クロマトグラフィー(DHPLC)のような他の周知の方法により、容易に検出可能である。
【０２３７】
MRDの第二ラウンドにおいて同じ標準により問い合わせされる試料として、表現型的に分別された二本鎖のプールを用いて、MRD反応を繰り返すことにより、さらなる濃縮を得ることができる。例えば、最初の試料プールにおいて1%の頻度をもつ対立遺伝子は、バックグラウンドのレベルが前に記載されているようにMRD系により示されるとすれば、2ラウンド後、約50%まで濃縮されると推定され、従って、その時点において、直接的シーケンシングまたは他の手段により容易に検出可能である。
【０２３８】
しかしながら、まれな対立遺伝子が、MRD反応においてバックグラウンドの頻度より低い頻度で、問い合わせされる集団に生じる場合、検出は混同される。バックグラウンドとは、本明細書において、非変異検査二本鎖が、あたかもそれらがミスマッチ同時修復を開始することができるミスマッチを有したかのように、表現型的に分別される比率として定義される。
【０２３９】
それゆえに、もう一つの局面において、本発明は、MRD反応においてバックグラウンドを減少させ、それに従って、まれな対立遺伝子を検出するMRDの能力を向上させる、組成物および方法を提供する。
【０２４０】
図10A〜図10Cに示され、かつ上で考察されている態様において、検査二本鎖における修正可能なミスマッチの存在は、Creリコンビナーゼを不活性で、かつこのように非優性の型へと同時「修復」する。
【０２４１】
本発明者は、そのような態様におけるバックグラウンドの主な源が、驚くべきことに、Creリコンビナーゼの遅い、および/または不十分な発現であり、それが、Cre媒介の組換えにより抗生物質カセットがF'エピソームから除去されうる前にプラスミド分離が生じるのを許していることを現在、発見している。結果は、最初の形質転換体の娘細胞の若干数が、誤ったことに、Creリコンビナーゼの表現型的に非優性(すなわち、不活性)の型および組換えられていないF'エピソームのみを有し、それに従って、リコンビナーゼを不活性型に同時修復された細胞を期待させる抗生物質表現型を示すことである。
【０２４２】
図10A〜図10Cに図式化されたMRDベクターにおいて、Cre発現は、ラクトースプロモーターにより作動される。理論に結びつけるつもりはないが、本発明者は、グルコースのような炭素源の存在下におけるこのプロモーターのカタボライトリプレッションが、図10A〜図10CのMRDベクターを用いて観察されるバックグラウンドのいくらかについての原因であると思われる。すなわち、MRD方法に用いられるリッチ培地(ルリア培地(Luria Broth))におけるグルコースの消耗後のみ、ラクトースプロモーターが活性になる。
【０２４３】
加えて、理論に結びつけるつもりはないが、本発明者は、バックグラウンドのいくらかは、上記のMRDベクターに用いられるcre構築物の弱いリボソーム結合部位(ribosome binding site：RBS)に起因しうると考えられる。
【０２４４】
さらに、前記のMRDベクターにおいて、creATG開始部位の上流を終結する短い翻訳されるリーダー配列があるように思われ、Cre翻訳は、翻訳再開により明らかに促進されており、リボソームのS30サブユニットが、終結後mRNAに結合されたままで、近くの開始部位で翻訳を再開させる。
【０２４５】
このように、もう一つの局面において、本発明は、ミスマッチ修復検出(MRD)に使用される改良されたベクターを提供する。
【０２４６】
改良されたベクターにおいて、表現型的に分別される遺伝因子は、密接に制御される強力なプロモーターから転写され、翻訳は、異種性の、典型的には強力なコンセンサス配列、リボソーム結合部位(RBS)を用いて開始される。
【０２４７】
典型的態様において、表現型的に分別される遺伝因子は、リコンビナーゼ、典型的にはcreリコンビナーゼのコード領域を含む。
【０２４８】
密接に制御される強力なプロモーターは、T7プロモーターであってもよく、下の実施例7にさらに示されているように、T7 RNAポリメラーゼの存在および量により制御される。それの同族のプロモーター配列に対するバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼの強力な選択性、ポリメラーゼの高レベルの活性、およびT7遺伝子10個の翻訳開始シグナルにより媒介される翻訳の高効率性は、有意な利点を提供する。
【０２４９】
他の密接に制御される強力なプロモーターもまた、用いることができる。例えば、プロモーターは、大腸菌においてアラビノース代謝経路を制御するaraBADオペロン由来でありうる；pBADベクター(Invitrogen、カールズバッド、CA)は、正確に調節された異種性発現を可能にする。もう一つの例として、テトラサイクリン制御型プロモーター、PLtet0-1を用いることができ、高特異的Tetリプレッサーおよび無水テトラサイクリン(aTc)による誘導により密接に制御される発現を可能にする。
【０２５０】
異種性リボソーム結合部位(RBS)は、強力な天然または合成のコンセンサス配列RBSであってもよく、リコンビナーゼATG開始部位の上流に最適に配置される。そのような配列は当技術分野において知られている。例えば、Shultzabergerら、「Anatomy of Escherichia coli Ribosome Binding Sites」、J. Mol. Biol. 313(1):215-228 (2001)を参照されたい(開示は、完全に参照として本明細書に組み入れられている)。
【０２５１】
ベクターは、しばしば、使用の間、配列が試料を配列変異について問い合わせに使用される標準配列、および少なくとも第一の遺伝子型で検出可能な因子、つまり配列タグをさらに含む。
【０２５２】
従って、本発明のこの局面のベクターを、上記の方法に用いることができ、そのような方法を提供することが本発明のもう一つの局面である。
【０２５３】
実施例7で実証され、かつ図11に例証されているように、改良されたベクターは、宿主細胞分裂の前にCreリコンビナーゼの高レベル発現を促進することにより、実質的にバックグラウンドを低減させる。
【０２５４】
バックグラウンドにおけるさらなる低減は、代替としてまたは加えて、逆のアプローチ：最初の細胞分裂を遅らせることにより達成されうる。
【０２５５】
例えば、最初の細胞分裂は、細菌の中隔形成を抑制する抗生物質の使用により遅らせることができる。ピペラシリン(piperacillin)およびフラズロシリン(furazlocillin)のような抗生物質は、特に、中隔形成の間、敷設されるムレインを抑制するが、細胞伸長の間はしない。これらの抗生物質は、5分間未満作用し、それらの効果は、除去により可逆性である。
【０２５６】
このように、適切な宿主細胞株へのMRDベクターのプールの形質転換後、ピペラシリンが1時間、加えられ、その後、細胞は、ピペラシリンではない選択的抗生物質(アンピシリンおよびテトラサイクリンかまたはストレプトマイシンかのいずれか)を含む培地において回転させられて再懸濁される。
【０２５７】
しかしながら、ピペラシリンは、ampR MRDプラスミドにより発現されるβ-ラクタマーゼに感受性が高い。ピペラシリンの不適当な不活性化を未然に防ぐために、ピペラシリンの追加量を形質転換後添加することができる；さらに、カナマイシン耐性のような代替の選択マーカーが、標準(およびそれに伴ってMRD)ベクター上の構成的選択マーカーとして用いられうる。
【０２５８】
中隔形成を抑制する抗生物質の使用に代わるものは、中隔形成に影響を及ぼす温度感受性変異を有する表現型的分別のための株を用いることである。数個の遺伝子のいずれかにおける変異は、限定的温度下において繊維性増殖の表現型を生じうる。例えば、変異ftsA、ftsIおよびftsZを有する株は、大腸菌遺伝子保存センターから自由に入手可能であり、そのような変異は、このように、MUTATION SORTER(商標)株のような表現型的分別のために用いられる株へ容易に操作されうる(実施例5を参照)。
【０２５９】
形質転換後、細胞は、表現型的に分別可能な遺伝因子が修復されかつ発現される時間の間、中隔形成を抑制する限定的温度で保持されうる。1時間のような限定的温度での適切な期間後、細胞は、適当な選択抗生物質と共に許容的温度でインキュベートされうる。
【０２６０】
ヘミメチル化MRDベクターを用いて実施される場合のMRDアッセイ法におけるバックグラウンドのもう一つの原因は、damメチラーゼ欠損株(dam−)における増殖により引き起こされる標準ベクターにおいての擬似変異の蓄積である。
【０２６１】
Dam−株は、野生型株より約50倍変異原性が高い。
【０２６２】
世代あたりの塩基あたり10-9の野生型変異率、4*103塩基対のプラスミドサイズ、および50世代の増殖(初期コロニー、可能な精製、貯蔵のための培養、および一本鎖の調製を形成するために)を仮定すると、変異した画分は、10-9*50*4*103*50 = 0.01になる。100世代の増殖を仮定すると、画分は0.02になり、本発明の前にMRDに観察されたバックグラウンドの約半分である。
【０２６３】
従って、もう一つの局面において、本発明は、誘導性dam遺伝子を有する株において増殖された標準ベクターおよびそれらの調製のための方法を提供する。dam遺伝子は、最終世代、典型的には最後の5〜10世代を除いては、標準を生成する細菌の増殖の間ずっと発現される。「最終世代」とは、プラスミド回収、または標準ベクターが、一本鎖のファージ援助によるssDNAレスキューになる予定のところの直前にあるそれらの世代を意味する。dam活性の非存在下において増殖の世代数を低下させることにより、変異したプラスミドの画分は、それに応じて低下する。
【０２６４】
代替の態様において、標準ベクターは、dam＋宿主において調製され、形質転換されて、その後に、MRD反応のためのベクターを調製するためにdam−宿主のみにおいて増殖される。この後者の方法は、上記の誘導性dam遺伝子の使用が引き起こすより、dam−宿主においてより長期間の増殖(およびそれゆえに変異したプラスミドのより高い画分)を引き起こす。従って、2つの方法を組み合わせることができ、標準ベクターをdam＋宿主において調製し、その後、標準ベクターの回収の前の最後の数世代までメチラーゼが発現される、誘導性damメチラーゼを有する宿主へ標準を形質転換する。
【０２６５】
さらにもう一つの態様において、dam−宿主は使用されず、同時修復の鎖の性状は、さらに本明細書で記載されているように、その代わりとして、「鎖極性化」ニックまたはギャップのような他の方法により誘導される。
【０２６６】
シグナル：ノイズ比もまた、シグナル損失を減少させることにより向上させることができる。
【０２６７】
シグナルの損失は、ミスマッチを有するヘテロ二本鎖が、あたかもそれらが変異を欠いているホモ二本鎖であったかのように表現型的に分別される比率として定義される。表現型的に分別可能な遺伝因子がCreリコンビナーゼをコードしている態様において、図10A〜図10Cでのように、そのような誤って分別されたヘテロ二本鎖は、ストレプトマイシンの存在下において増殖するコロニーのプールに寄与する。
【０２６８】
例えば実施例5において例証されているベクターおよび宿主株を用いて実施される場合、シグナル損失は、一般的に20%未満であるが、いくつかの配列変異についてはより高い。
【０２６９】
本発明者は、MRDベクターの検査二本鎖における開始するミスマッチから、表現型的に分別可能な遺伝因子における他の状態では「修正不可能な」ミスマッチまでの修復の非効率的な伝達に起因しうることを現在発見している。
【０２７０】
下記の実施例5に用いられるベクターにおいて、表現型的に分別可能な遺伝因子における「修正不可能な」ループは、それ自体は検査二本鎖から約100塩基対にあるcreコード領域のATG開始部位の下流の200個より多い塩基対である。
【０２７１】
従って、さらに改良されたベクターは、できる限り検査二本鎖に接近してループを配置し、このように、検査二本鎖内で開始される効果的同時修復に必要とされる距離を縮める。
【０２７２】
加えて、シグナルの損失のある特定の画分は、修復前に存在するCre活性に二次的なものである。すなわち、形質転換されたヘテロ二本鎖は、表現型的に非優性の不活性型へのその後の「修復」にもかかわらず、F'エピソーム上の抗生物質カセットの組換えを生じるのに十分な、修復事象前のcreメッセージを発現させる。
【０２７３】
本発明者は、Creリコンビナーゼの早発の発現が、宿主細胞株への形質転換により即時の発現ができるMRDベクターの鎖上に活性Creリコンビナーゼ対立遺伝子を配置することに起因することを現在発見している。
【０２７４】
その問題を解決するために、本発明は、ファージ複製起点が、上記のMRDベクターにおけるそれとは配向が逆である標準(およびそれに伴って結果生じるMRD)ベクターをさらに提供する。結果は、対向の鎖が一本鎖標準ベクターの調製の間にレスキューされることである。メチル化の鎖の性状において変化はもたらされず、従って、表現型的分別の動態において変化はもたらされない。しかしながら、ファージ起点の配向における変化は、プラスミド複製前、およびそれに伴って可能性のあるミスマッチに開始される同時修復の前のCre発現を防ぐ。
【０２７５】
代替の態様において、ファージ起点の前に存在した配向をもつベクターが用いられるが、形質転換後のIPTGの添加において遅延がある。
【０２７６】
5ヌクレオチドより大きいループの代替物
上記の態様は、検査二本鎖において開始するミスマッチの非存在下でマーカーヘテロ二本鎖を修正不可能にさせるために5個またはそれ以上の連続したヌクレオチドのミスマッチループを用いるが、他の態様もまた、本発明の範囲内にある。実際、それだけで修復されないが、同時修復されうる任意のミスマッチを用いることができる。
【０２７７】
例えば、4ヌクレオチドのヌクレオチドループは、わずかにのみ修復されることが知られている；いくつかの4-ヌクレオチドループは全く修復されない可能性が高く、従って、ヘテロ二本鎖マーカーを修正不可能にさせるのに役立ちうると思われる。いくつかの単一塩基変異さえも、ベクター上の他の場所での開始するミスマッチの存在下においてのみのマーカー変異修復として役立つ；修復されないいくつかの単一ヌクレオチド変異が報告されている。
【０２７８】
MRDそれ自体、単に、「XY」検査二本鎖自体へ「修正可能性」についてアッセイされる変化を組み込むことにより、そのような「修正不可能な」変化についてスクリーニングするためのアッセイとして用いることができる。そのような変化が修正されることができない場合には、マーカーの同時修復は起きない。逆に、変化が修正されることができる場合には、同時修復が起きる。
【０２７９】
ヘミメチル化の代替物
代替的には、ヘミメチル化よりむしろ、ニックまたはギャップが、修復されるべき鎖を誘導するために用いられる。一つの利点は、ニック(またはギャップ)の使用が、マーカーまたは検査二本鎖のいずれかで、それ自体、擬似の配列変化を導入可能なdam−株において核酸のいずれかを増殖する必要を回避することである。
【０２８０】
修復の鎖の性状を方向付けるためにニックを利用するために、複製可能な検査ベクターが、上記のように、第二の直鎖状マーカーベクターおよび第二の検査鎖と閉環状ベクターキメラ(マーカーおよび検査配列の両方を含むキメラ)のアニーリングにより構築されうる。上記の方法とは対照的に、形質転換前のライゲーション段階は省かれ、ニックの鎖が優先的に修復される。
【０２８１】
しかしながら、欠点は、修復される鎖が、標準としての役割を果たす対立遺伝子よりむしろ、問われている検査二本鎖の対立遺伝子を有するものであるということである。それゆえに、この方法は、変異対立遺伝子が濃縮されることになっている実験、および/またはMRDの多数のラウンドが望ましい実験に、容易には適用されない。
【０２８２】
一つの解決は、1つの鎖のみがニッキングエンドヌクレアーゼN.BstNBI(カタログ番号R0607SおよびR0607L、New England Biolabs、ベヴァリー、MA、USA)により認識される制限部位を含み、それの非パリンドロームの認識配列
2005517453.tif 000004
から4塩基下流に一本鎖ニックを生じるように、「A」ベクターおよび「I」ベクターを操作することである。「A」ベクターおよび「I」ベクターにおけるf1起点の適切な配向は、標準検査鎖、および配列が相補鎖には存在しないN.BstNBI認識配列の少なくとも1つの出現の両方を有する一本鎖ベクターキメラ(例えば、「AX」キメラ)のレスキューを可能にする。変性、アニーリングおよびライゲーション後、ヘテロ二本鎖検査ベクターは、N.BstNBIを用いて、全く「標準」鎖上だけにニックを入れられる。形質転換後、検査二本鎖におけるミスマッチで開始される同時修復は、変異の非標準の対立遺伝子を鋳型として用いて、「標準」鎖へ向けられ、その後の変異体の単離が望ましい単離であることを可能にする。
【０２８３】
修復の鎖の性状を誘導するためにギャップを利用するために、アニーリング段階に用いられる直鎖状ベクターは、閉環状分子におけるベクター配列より小さく、アニーリング後にギャップを残す。ヘテロ二本鎖における長い一本鎖のひと続きは、形質転換前に一本鎖およびホモ二本鎖種を除去するために用いられる技術により分解にさらされる可能性があるため、通常には、ギャップは、サイズが小さい(< 20ヌクレオチド)。同時修復は、優先的に、ギャップの入った鎖へ向けられる。
【０２８４】
しかしながら、欠点は、修復される鎖が、標準としての役割を果たす対立遺伝子よりむしろ、問われている検査二本鎖の対立遺伝子を有するものであるということである。それゆえに、この方法は、変異対立遺伝子が濃縮されることになっている実験、および/またはMRDの多数のラウンドが望ましい実験に、容易には適用されない。
【０２８５】
一つの解決は、図9Aおよび図9Bに示されている。
【０２８６】
この態様において、断片が、制限酵素AおよびBでの二重消化クローニングにより、活性(優性)マーカーを有する「A」ベクター(「A」ベクター)へクローニングされる(示されず)；その後に、これらの標準は、Aからほんの数塩基離れて切断することができる制限酵素Cで消化されて、直鎖状二本鎖ベクターの収集物を生じる(図9A、上端左に示される)。不活性(すなわち、非優性)マーカーを有するベクター(「I」ベクター、図9A、上端右)は、AおよびBで消化される。Dは、活性ベクターにはなく、不活性ベクターに存在するDNAの小さいセグメントを表す。
【０２８７】
AおよびBで消化された検査PCR産物(図9A、上端中央)は、単一の変性-再アニーリング反応において直鎖状標準および直鎖状「I」ベクターと結合されて、図9Aの中間に描かれている、4クラスのハイブリダイゼーション産物を生じる。ハイブリダイゼーション産物は、以下のものを含む：PCR産物の自己ハイブリダイゼーション、「I」ベクターの自己ハイブリダイゼーション、2つの異なる断片を有する2つの標準鎖のハイブリダイゼーション、および所望のヘテロ二本鎖。
【０２８８】
多数の異なる断片が検査されることになっているため、同じ検査断片を有する2つの標準鎖が自己ハイブリダイズする可能性はほとんどなくなる。他の標準とヘテロ二本鎖を形成する標準は、部分的一本鎖種の除去により排除されうる。
【０２８９】
希釈した条件下においてライゲーションを行うことにより、図9Aの中間の右に示されている所望のヘテロ二本鎖は、環状化し、ギャップが標準鎖に位置するギャップの入ったヘテロ二本鎖検査ベクターを生じる(図9B)。これらの環状分子は、その後、細菌へ形質転換され、MRD反応の残りは、通常のプロトコールに従って行われる。
【０２９０】
細菌の代替物
上記のMRDの態様は、細菌のミスマッチ修復系を利用しているが、真核生物の細胞もまた、ミスマッチを提示するのに用いられうる活性のあるミスマッチ修復系をもつ。
【０２９１】
例えば、酵母は、ヘテロ二本鎖のある特定の型を修復しないことが示されている。特に、安定なステム-ループ構造を形成するパリンドロームは、単一点ミスマッチで同時修復される場合を除いては、修復されない。Nagら、「Palindromic sequences in heteroduplex DNA inhibit mismatch repair in yeast」、Nature 340:318-320 (1989)；Nagら、「Seven-base-pair inverted repeats in DNA form stable hairpins in vivo in Saccharomyces cerevisiae」、Genetics 129、669-673 (1991)；Wengら、「Evidence for independent mismatch repair processing on opposite sides of a double-strand break in Saccharomyces cerevisiae」、Genetics 148:59-70 (1998)を参照されたい。さらに、ギャップは、酵母において修復を特定の鎖へ向けることができることが示されている(Yangら、「Strand interruptions confer strand preference during intracellular correction of a plasmid-borne mismatch in Saccharomyces cerevisiae」、Current Genetics 35:499-505 (1999))。
【０２９２】
このように、サッカロマイセス・セレビシエのような酵母においてMRDを行うために、マーカーは、もう一つの開始するミスマッチの存在下において修復されうるのみであるパリンドローム配列を導入することにより「不活性化」される(非優性、または「活性」型と表現型的に区別可能にされる)。これらのMRDの酵母態様において、ヘテロ二本鎖検査ベクターは、検査二本鎖における開始するミスマッチの存在下において、不活性マーカー鎖を鋳型として用いて、鎖修正を活性マーカー鎖へ向けるギャップをもつ活性マーカーを有する鎖と共に形成される。
【０２９３】
上記のように、マーカーは、比色で、蛍光で、ルミネセンスで、または宿主細胞の示差的増殖により、区別される表現型を与えることができる。
【０２９４】
細菌のMRDに関して、マーカーのドミナントネガティブなバージョンを、酵母MRDに使用することができる。実際、野生型の選択を可能にするマーカーと野生型に反する選択を可能にするマーカーを設計することができる。例えば、マーカーはura3でありうる：活性遺伝子産物を有する細胞のみがウラシルを欠く培地で増殖し、不活性型を有する細胞のみが5 FOAを追加された培地に増殖する。セントロメア(CEN)ベクターを、ランダムな分離の確率を低下させるために用いることができる。
【０２９５】
安定なステム-ループ構造を形成するパリンドロームの代替物もまた、酵母において、「修正不可能な」マーカー変異として使用可能である。細菌のMRDについて上で記載されているように、代替物は、既知の変異を検査二本鎖へ導入し、そのような変異が、改めて、修正可能ではないことが知られている差異を有するマーカーヘテロ二本鎖の同時修復を引き起こすかどうかを観察することにより、MRD自体により試験されうる。例えば、マーカーヘテロ二本鎖の鎖は、同時修復がなければ修正可能ではないことが知られているパリンドロームのステム-ループ構造の内挿により異なることができ、2つの検査二本鎖の鎖の1つでの非パリンドロームの挿入が、その後、マーカーの同時修復を開始するそれらの能力について試験される。同時修復が観察されない場合には、検査二本鎖になされた改変は、MRDの実施において、マーカーヘテロ二本鎖での使用に適している。
【０２９６】
実際、いくつかの非パリンドロームのループおよび単一塩基ミスマッチが、酵母において十分に修復されないことが報告されており、このように、マーカーを不活性化するために用いられることができた。
【０２９７】
マーカー変異の代替物
上記のMRDの態様は、ベクターの他の場所に位置している検査二本鎖における開始するミスマッチの存在を提示するためにマーカーの同時修復を利用する。代替物は、ヘテロ二本鎖マーカーの必要性を不要にする。
【０２９８】
別の者が、RecJ、ExoVIIおよびExoIを欠損する細菌の三重突然変異体、ならびにRecJ、ExoVII、ExoIおよびExoXを欠損する四重突然変異体が、変異原性剤に対して耐性が低いことを示している。これらの突然変異体の染色体におけるミスマッチ修復事象が失敗に終わり、死へと導くことが示唆された。ミスマッチ修復の同様の中断が、プラスミド上にあるミスマッチに対して起きる場合には、これらの株を、検査ベクター上のマーカー変異の必要なしにミスマッチを検出するために利用することができる。
【０２９９】
上記の方法のいずれかにより調製されたヘテロ二本鎖は、これらの突然変異体へ形質転換されうる。ミスマッチ修復系は、検査二本鎖におけるミスマッチの存在下で活性化される；しかしながら、これらの突然変異株において、そのような修復は決して完了せず、プラスミドは複製することができない。プラスミドが、抗生物質耐性遺伝子のような選択可能なマーカーを有する場合、プラスミドが複製できないことは、選択条件下で細胞死を引き起こす。これらの突然変異体の形質転換により回収された検査断片対野生型の形質転換により回収された検査断片を比較することにより、変異をもつ断片が同定されうる。
【０３００】
方法の適用
MRDは、配列変異の存在を同定するための、迅速で、感度が高く、かつ容易に多重化される方法を提供する。
【０３０１】
MRDは、配列変異の存在または性質の事前の知識を必要としないため（かつ実際に、複製可能な検査ベクターに所望の遺伝子座由来の検査二本鎖を含みうる能力のみを必要とするため）、MRDは、そのような変異の発生についてのハイスループットスクリーニングに特有に適している。
【０３０２】
例えば、MRDを、天然に存在する対立遺伝子の変異体を有するエキソンについての真核生物ゲノムのハイスループットスクリーニングのために用いることができる。そのような試みのためのエキソン選択は、ヒトゲノムのような真核生物ゲノムにおいてエキソンを予測し、かつその後発現を確認する大規模な試みにより作成されたデータに有効に基づくことができる。例えば、Pennら、「Mining the human genome using microarrays of open reading frames」、Nature Genet. 26(3):315-318 (2000)；Shoemakerら、「Experimental anntation of the human genome using microarray technology」、Nature 409(6822):922-927 (2001)；国際公開公報第01/57270号、第01/57271号、第01/57272号、第01/57273号、第01/57274号、第01/57275号、第01/57276号、第01/57277号、および第01/57278号を参照されたい。
【０３０３】
標準は、ゲノムにおけるあらゆるエキソンについて、またはより大きいゲノムについて、エキソンのサブセットについて構築されることができ、その後、複数の標準が、1回の多重化されたMRD実験において、または連続してまたは並行して行われる一連のMRD実験において用いられる。有用なサブセットは、例えば、それぞれ既知のまたはありうる遺伝子由来の少なくとも1つの代表するエキソンを有するサブセットを含む。および、上で言及されているように、MRDは検査二本鎖の発現を必要としないため、非コード領域をスクリーニングするためにも用いられうる。特に有用な非コード領域は、プロモーターおよびエンハンサーのような遺伝子発現を制御する領域を含む。
【０３０４】
MRDは、このように、一塩基多型(SNPs)を含む天然に存在する配列変異の高密度マップを作成するために迅速に用いられうる。
【０３０５】
標準は、問い合わせされる各遺伝子座について1度のみ構築される必要があるため、MRDは、単一の遺伝子座（または実際には複数の遺伝子座）を、高い情報内容をもつそれらの配列変異を同定するための問い合わせに繰り返して使用することができる；特に、MRDは、対象となる表現型に関連しているそれらの配列変異を同定するために容易に用いることができる。
【０３０６】
例えば、100,000個もの異なる遺伝子座またはそれ以上を含む1組の標準を、各集団がそれのメンバーに共通した表現型により定義される、複数の集団において配列変異を分類するために用いることができる。集団の1つに特有の変異、または集団の1つにおいて優勢である変異は、その集団を定義する表現型と関連している可能性がより高い変異である。
【０３０７】
MRDまたは他の技術のいずれで同定されようが、推定上の関連は、疑わしい遺伝子座を有する標準を用いて多数の個々の試料を問い合わせるためにMRDを用いることにより、容易かつ網羅的に検査されうる。
【０３０８】
このように、MRDを、疾患を引き起こす変異を同定するために膨大な数の候補遺伝子をスクリーニングするのに用いることができる。実際、限られた数のMRD反応においてすべてのヒト遺伝子のコード領域を検査することが可能である。患者および対照の集団においてすべての遺伝子のコード領域を検査することにより、疾患を引き起こす変異が容易に明らかになる。この直接的方法の感度は、突然変異の起源、および患者集団における疾患を保有する先祖の染色体の普及率についての仮定を必要としないため、標準的関連研究のそれより有意に高い。疾患を引き起こす変異を直接的に検出する方法は、関連方法より、これらの変異を同定するのに成功する可能性が高い。この直接的候補遺伝子スクリーニング方法は、強力かつ効果的であり、臨床的意味のある表現型を引き起こす変異の同定を大いに加速させて、疾患の診断、予後、および治療を著しく向上させることができる。
【０３０９】
関連した表現型がない場合でさえも、複数の遺伝子座に渡ってMRDにより提示された表現型の変異のパターンは、遺伝子のフィンガープリントとしての役割を果たし著しい有用性をもつ。
【０３１０】
遺伝子のフィンガープリント法は、現在、当技術分野において公知である。MRDによる遺伝子のフィンガープリント法は、すべての現行のフィンガープリント法の適用に利用可能であり、より多い数の遺伝子座のクエリーを可能にし、増幅断片長多型(amplified-fragment length polymorphism：AFLP)分析(Savelkoulら、J. Clin. Microbiol. 37(10):3083-3091 (1999))のような標準的技術により提供されるより、詳細で、高分解能のフィンガープリントを作成する。
【０３１１】
MRDによる遺伝子のフィンガープリント法は、例えば、病原性の可能性のある大腸菌もしくはサルモネラ(Salmonella)株、またはマイコバクテリウム・ツベルキュロシス(Mycobacterium tuberculosis)、クラミジア・トラコマティス(chlamydia trachomatis)、ナイセリア・ゴノルヘア(neisseria gonorrhea)を含むナイセリア種のような既知の病原体などの、臨床的対象となる原核生物を、それらの病原性を確認するかまたは病原性菌株の伝染を追跡するかのいずれかのために分類するのに用いられうる。MRDによる遺伝子のフィンガープリント法は、同様に、HIV、HBV、HCV、HPV、エボラウイルスのような臨床的対象となるウイルスを分類するのに用いられうる。MRDによる遺伝子のフィンガープリント法は、植物品種を分類するために、および法医学の適用においてヒトゲノムを分類するために用いられうる。
【０３１２】
遺伝子座が表現型と関連していることが知られている場合、そのような遺伝子座の収集物を、診断的または予後的情報を提供するために用いることができる。
【０３１３】
例えば、多くの腫瘍細胞は、1個または複数の発癌遺伝子および/または癌抑制遺伝子において突然変異を含む。後述する本明細書の実施例5は、MRDが、臨床的に影響された個体由来の試料において、癌の病因または進行に関連していることが知られている遺伝子における配列変異を同定することができることを実証している。
【０３１４】
MRDを、予知的に、例えば、出生前スクリーニングのために用いることができる。疾患の一因となることが知られているすべての遺伝子座を含む多数の遺伝子座の同時的クエリーを可能にすることにより、MRDは、標準的な配列に基づく検査 （より高価で大きな労働力を要する）を野生型配列とは異なることが同定されたそれらの遺伝子座のみの追跡調査のために残しておくことを可能にする。例えば、1回のスクリーニングは、鎌状赤血球貧血から嚢胞性線維症まで、代謝の先天性欠陥の一因となることが知られている遺伝子座の複数または実際にはすべてを含むことができる。例えば、出生前診断において、特定の遺伝子、例えば、ヘモグロビン、ジストロフィン、ADA、CFTR、p53、RB、CDKN2Aなどにおける突然変異が胎児DNA試料に見出されるかどうかを決定を望む場合がある。
【０３１５】
MRDは、集団または個体の間で変異を同定するためだけでなく、腫瘍細胞における体細胞性突然変異のような個体内での変異を同定するために用いられうる。実際、MRDは、1つの個体由来の生検試料の長期的クエリーが腫瘍進行をモニターすることを可能にして、包括的な腫瘍についての遺伝的悪性度評価系を提供することができる。
【０３１６】
特定の遺伝子が腫瘍細胞試料において変化しているかどうかを決定することは、それゆえに、関心対象となる。そのような変化している可能性のある遺伝子の中には、新生物形成過程に原因となって関与しているもの（癌抑制因子および発癌遺伝子）ならびに治療剤に対する抵抗性を媒介しうる遺伝子がある。
【０３１７】
後者には、例えば、CYP1A2、CYP2C17、CYP2D6、CYP2E(「CYP2E1」)、CYP3A4、およびCYP4A11のような、薬剤代謝に影響を及ぼすことが知られているシトクロムP450ファミリーのメンバーを含み、それらは、処方される薬および処方不要の薬の大部分の代謝についての原因であると思われる。最近の概説として、Anzenbacherら、「Cytochromes P450 and metabolism of xenobiotics」、Cell. Mol. Life Sci. 58(5-6):737-747 (2001)、およびDrug. Ther. Bull. 38(12):93-95 (2000)を参照されたい。
【０３１８】
CYP1B1(別名：CP1B、GLC3A)、CYP1A1(シトクロムP450、サブファミリーI(芳香族化合物誘導性)、ポリペプチド1)、CYP2A6、CYP2A13(CPADとしても知られている)、CYP2B6(またはCPB6、IIB1、P450およびCYPIIB6と呼ばれる)、抗痙攣薬メフェニトイン、ベンゾ(a)ピレン、7-エトキシクマリンおよび抗癌薬パクリタキセル(Taxol(登録商標))を含む多くの生体異物を代謝することが知られている、シトクロムP450、サブファミリーIIC(メフェニトイン4-ヒドロキシラーゼ)、ポリペプチド8をコードするCYP2C8(CPC8、P450 MP-12/MP-20と同じ)のような、他のシトクロムP450酵素もまた、有用に検査されうる。CYP2C8はまた、証明された脂質低下効力をもつ高効能、第三世代合成スタチンである、セリバスタチン(cerivastatin)を代謝する。
【０３１９】
癌設定におけるMRD評価のための標準を有用に供給しうる他のP450遺伝子は、CYP2C9(シトクロムP450、サブファミリーIIC(メフェニトイン4-ヒドロキシラーゼ)、ポリペプチド9)(その発現は、リファンピンにより誘導され、フェニトイン、トルブタミド、イブプロフェン、アスピリンおよびS-ワルファリンを含む多くの生体異物を代謝することが知られている、Biglerら、「CYP2C9 and UGT1A6 genotypes modulate the protective effect of aspirin on colon adenoma risk」、Cancer Res. 61(9):3566-3569 (2001))、CYP11A(P450SCC、シトクロムP450C11A1と同じ)、CYP2C19(CPCJ、CYP2C、P450C2C、P450IIC19、ミクロソームのモノオキシゲナーゼ、生体異物のモノオキシゲナーゼ、メフェニトイン4'-ヒドロキシラーゼ、フラビンタンパク質結合モノオキシゲナーゼと同じ)、CYP2F1、CYP2J2、CYP3A5、CYP3A7(胎児期のレチノイン酸の4-ヒドロキシル化を触媒し、レチノイン酸誘導胎児毒性からヒト胎児を保護するのに重要な役割を果たす、Chenら、「Catalysis of the 4-hydroxylation of retinoic acids by cyp3a7 in human fetal hepatic tissues」、Drug. Metab. Dispos. 28(9):1051-1057 (2000))、CYP4B1、CYP4F2、CYP4F3、CYP6D1、CYP6F1(CYP6D1に関連し、昆虫におけるピレスロイド解毒に関与する)、CYP7A1、CYP8、CYP11A、CYP11B1、CYP11B2、CYP17、CYP19、CYP21A2、CYP24、CYP27A1およびCYP51である。
【０３２０】
薬剤耐性に影響を及ぼす他の遺伝子座もまた、癌設定におけるMRDにより有用に問い合わせが行われる。
【０３２１】
そのような非P450座の中には、細胞外および細胞内の膜を横切って様々な分子を輸送するATP結合カセット(ABC)タンパク質をコードする遺伝子がある。ABC遺伝子は、7つの別々のサブファミリー(ABC1、MDR/TAP、MRP、ALD、OABP、GCN20、White)へ分割される；いくつかのメンバーは、腫瘍細胞に多剤耐性表現型を与えることがよく知られている。
【０３２２】
ABCタンパク質の中で最もよく知られているのは、ABCB1(ATP結合カセット、サブファミリーB(MDR/TAP)、メンバー1)であり、またはMDR1(多剤耐性1)、P-GP(P-糖タンパク質)、PGY1、ABC20およびGP170としても知られており、そのヒト相同体は7q21.1に位置する。ABCB1(MDR1)の対立遺伝子変異体は、それの選択性および/または活性に影響を及ぼすことが知られている。Hoffmeyerら、「Functional polymorphisms of the human multidrug-resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P-glycoprotein expression and activity in vivo」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(7):3473-3478 (2000)；Choiら、「An altered pattern of cross-resistance in multidrug-resistant human cells results from spontaneous mutations in the mdr1 (P-glycoprotein) gene」、Cell 53(4):519-529 (1988)。
【０３２３】
ABCB4(ATP結合カセット、サブファミリーB(MDR/TAP)、メンバー4)(MDR3、PGY3、ABC21、MDR2/3、PFIC-3としても知られている)(ヒト相同体は7q21.1に位置する)は、ABCC1、ABCC2(DJS、MRP2、cMRP、ABC30、CMOAT、小管多特異的有機陰イオン輸送体と同じ)、ABCC3(MLP2、MRP3、ABC31、CMOAT2、MOAT-D、EST90757としても知られている)、ATP結合カセット、サブファミリーC(CFTR/MRP)、メンバー4、ABCC4(MRP4、MOATB、MOAT-B、EST170205としても知られている)と同様に、もう一つの有用な遺伝子座である。配列変異について有用に問われうる他のABC輸送体タンパク質は、ABCC4(MRP4)、ABCC5(MRP5)(6-メルカトプリンおよびチオグアニンのようなチオプリン抗癌薬、ならびに抗HIV薬9-(2-ホスホニルメトキシエチル)アデニンに対する抵抗性を与える；このタンパク質は、急性リンパ芽球性白血病におけるチオプリンおよびHIV感染患者における抗レトロウイルスヌクレオシド類似体に対する抵抗性に関与している可能性がある)；ABCC6(MRP6)、MRP7(CFTR)、ABCC8(MRP8)、ABCC9、ABCC10、ABCC11(HI、SUR、MRP8、PHHI、SUR1、ABC36、HRINSと同じ)、およびABCC12(MRP9と同じ)を含む。
【０３２４】
標準を供給し、かつそれに関して遺伝子座配列変異が問われうる他の有用な遺伝子座は、EPHX1(エポキシドヒドロラーゼ1、ミクロソーム生体異物)、EPHX2(エポキシドヒドロラーゼ2)、LTA4H(ロイコトリエンA4ヒドロラーゼ)、TRAG3(Taxol(登録商標)抵抗性関連遺伝子3、多くのメラノーマ細胞において過剰発現され、パクリタキセル、Taxol(登録商標)に対する抵抗性を与える)、GUSB(β-グルクロニダーゼ)、TMPT(チオプリンメチルトランスフェラーゼ)、BCRP(乳癌抵抗性タンパク質、ATP輸送体)、ジヒドロピリジンデヒドロゲナーゼ、HERG(カリウムイオンチャネルによる薬剤輸送に関与)、hKCNE2(カリウムイオンチャネルによる薬剤輸送に関与)、UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ(UGT)(肝臓代謝酵素、異なるシトクロムP450(CYP)アイソフォーム後の多くの発癌物質についての解毒酵素)、スルフォトランスフェラーゼ、スルファターゼ、およびグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)-α、-μ、-π(治療薬、特に、数個の抗癌薬を解毒する)、ACE(ペプチジル-ジペプチダーゼA)、およびKCHN2(カリウム電位開口型チャネル、サブファミリーH(eag関連)、メンバー2、位置7q35-q36)を含む。
【０３２５】
集団における配列多型の発生および頻度を測定することは、遺伝的変異および連鎖不平衡の動態を理解するにおいて重要である。
【０３２６】
この型の分析を行うために、対象となる配列の対照(X)コピーは、「A」ベクターまたは「I」ベクター、通常では「A」ベクター、へクローニングされる。遺伝子が多型であることが知られている場合、それぞれが異なる対立遺伝子型をもっている数個の異なるベクターを用いることができる。「Y」配列は、行われることになっている分析の型に依存して、DNAの適する供給源から得られる。「Y」配列もまた、「A」ベクターへクローニングされうる。しかしながら、特に有用な態様において、ヘテロ二本鎖は、一本鎖「Y」DNAと結合された、「AX」鎖および「I」鎖から形成され、「Y」は変性したPCR産物、cDNAなどでありうる。核酸はアニーリングされ、ライゲーションが行われて検査ベクターを生じる。
【０３２７】
遺伝子検査について、染色体の定義された領域、例えばBRCA1遺伝子またはCFTR遺伝子を有する「A」ベクターまたは「I」ベクターのパネルを設定することができ、遺伝子配列のコピーはベクターへクローニングされる。同様に、臨床的表現型に関与する変異の同定について、SNPsもしくは遺伝子変異について検査する多数の断片を有する「A」ベクターまたは「I」ベクターのパネルを設定しうる。対立遺伝子変異のために、対照ベクターの数組を比較する必要がありうる。いくつかの遺伝子の長さは、領域全体を網羅するために、一連のベクターを必要とする場合がある。「Y」配列DNAは、DNAの任意の都合のよい供給源を用いて、検査されることになっている個体から得られる。「Y」配列は、「AX」/「I」ハイブリダイゼーション反応へ添加されうる、または別途の反応において「I」ベクターへクローニングされうる。「X」配列ベクターのパネルの、対応する「Y」配列とのハイブリダイゼーションは、並行して、または多重反応において行われうる。その後、特定の配列の存在は、活性マーカー遺伝子の存在または非存在と相関する。その後、個体配列が標準、対照配列とは異なる大きい領域のDNAまたは多数の遺伝子について決定することができる。
【０３２８】
上記方法から結果生じたコロニーは、対照配列と一致したDNA配列を有することによる活性マーカー発現、および検査配列において開始するミスマッチがあるところの活性マーカーの欠損の混合である。結果を分析するために、これらの2つの集団の頻度を測定することが望ましい場合がある。これは、活性および不活性コロニーを2つの異なるプールへ分離することにより達成されうる。分離は、コロニーの抜き取り、フローサイトメトリー、マーカーの結合に基づくカラム分離、免疫磁気ビーズ分離などにより達成されうる。これらのプールから単離されたベクターDNAは、挿入断片を遊離するために適切な制限エンドヌクレアーゼで消化される。その後、ゲル電気泳動を、ベクターバンドを内部標準として用いて各プールにおける挿入DNAの量を定量するために用いることができ、それから変異体クローンと同一のクローンの割合を決定することができる。アクリルアミドゲル(または他の分離方法)が使用されうる。または、各プールからの挿入DNAが、検査されることになっている断片に対応する断片のハイブリダイゼーションフィルターまたはマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションプローブとして用いられる。活性および不活性の挿入断片のプールとのハイブリダイゼーションからのシグナル強度の比率は、変異配列と同一配列の割合を決定するために用いられうる。これは、多くの異なる断片について配列変異の同時的分析を可能にする。
【０３２９】
「X」/「Y」配列の性質は様々である。一つの態様において、検査配列は、特定の生物体、例えば、ヒト、酵母など、についてのすべてのコード領域およびそれらの制御エレメントを含む。もう一つの態様において、それらは、遺伝子マッピングのために用いられうる多型マーカーである。さらにもう一つの態様において、それらは、患者についての診断、予後、または治療を向上させる目的のためへの臨床的設定において検査される1個または数個の遺伝子である。
【０３３０】
この多重化は、特定の断片または対象となる遺伝子配列について、同時に多数の個体の遺伝子型を評価することにより増加されうる。または、細胞集団、例えば癌細胞など、において体細胞性突然変異の程度を測定するために個体から多数の試料が採取されうる。試料核酸は、増幅産物、クローン化断片などでありうる。集団において遺伝子変異を評価することにより、一つの実験において、様々な遺伝子における特定の集団での変異の頻度を推定することができる。正常な集団と比較して対象となる集団においてより高い変異の頻度をもつ遺伝子を同定することにより、臨床的関連性のある表現型に関連した遺伝子を同定することができる。さらに、この方法を、変異をもつ断片を同定するために用いることができ、それゆえに、SNP検査に関して有用でありうる。
【０３３１】
臨床的表現型、例えば、疾患の発生、進行または治療に影響を及ぼす表現型、に関与するヒト遺伝子変異の同定のためのMRDの使用に加え、MRDは、明らかに、非ヒト種において変異を検査するために用いられうる。マウス、ショウジョウバエ、酵母および他の種における表現型へと導く変異の同定は、研究者にとって関心がある。さらに、HIVウイルスまたはマイコバクテリウム・ツベルキュロシスのようなヒト病原体において変異を同定することは、重要な臨床的意義をもつ。最後に、他のMRD使用は、農業用表現型に関連性のある変異、例えば、ウシにおける増加したミルク産生またはトマトにおける長期の新鮮さへと導く変異、を同定することにおいてである。
【０３３２】
MRDは、特定の遺伝子座または領域由来の変異対立遺伝子のような配列変異体を同定するためだけでなく、単離するためにも用いられうる。
【０３３３】
配列（特にゲノムの配列）の変異体の単離が望まれる。いくつかの場合、対照配列は、部分的のみ特徴付けされている。例えば、多くの遺伝的疾患または状態は、それらの表現型および一般的なマップの位置、例えば、乳癌、肥満などの高い疾病素質、によってのみ知られている。特定のマップ領域、またはBACもしくはYACクローンへの遺伝子の位置推定は、可能性のある遺伝子候補を含むDNAの何十万という塩基をまだ残している。MRDは、変異体配列を同定かつ単離する手段を提供する。
【０３３４】
DNAは2つの供給源から単離される。DNAは、YACまたはBAC挿入断片由来、ヒト染色体由来の制限酵素切断断片などでありうる。DNAの一方の供給源は、推定の変異体配列を有し、他方は、対照配列、例えば野生型、を有する。好ましくは、2つの供給源は関連している。例えば、マウスの近交系、1個体由来の組織試料、ヒト親または兄弟など。
【０３３５】
MRDを行う。変異体について濃縮された形質転換体プール、すなわち、同時修復により分別されたプールは、その後、変異体核酸の準備された供給源になる。
【０３３６】
変異体配列を有するDNAを供給しうるMRDの能力は、多数のDNA断片が単一反応において分析される、「多重化」手順に用いられうる。多重反応は、DNAの特定の断片または染色体の領域などについて設定されうる。多重反応において、一般的に、MRDの2サイクルが行われる。MDRの第一ラウンドは、DNA断片のプール由来の変異または同一の対立遺伝子を有する多数の細菌コロニー(MRDが細菌において実施される場合)を供給する。MDRの第二ラウンドは、変異体配列についてさらに濃縮する。
【０３３７】
DNAの領域は、多重反応において比較されうる。1つまたは多数の異なる断片は、単一反応において単離されうる。一般的に、一方の供給源由来のDNAが、適した方法、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化など、により断片化され、適切なベクターへクローニングされ、他方のベクターおよび他方の供給源由来のDNAとハイブリダイズされ、単一反応においてMRD分析の第一ラウンドが行われる。第一ラウンド後の不活性マーカーを有するコロニーは、変異体配列について濃縮される。変異体についてさらに濃縮するMRDの追加のラウンドを用いて、これらのコロニーから単離されたDNAは、対照配列と比較されうる。第二ラウンドからの不活性コロニーの大部分は、対照とは異なるDNA配列を有する。エラーを起こしやすいポリメラーゼがDNAを作製するために用いられた場合は、下に記載されている「クリーニング」の方法が真の変異体について濃縮するために用いられうる。
【０３３８】
変異体断片の単離は、同じ実験において、多数の人々由来の多数の断片について行うことができる。例えば、個体のプールからのPCRは、多数の断片について行うことができる。これらのPCR産物は、アニーリングされ、ヘテロ二本鎖「A」/「I」ベクターへライゲーションされうる。または、それらは、「A」ベクターへすでにライゲーションされた「X」配列を有する「A」ベクターへアニーリングされうる。2回のMRD手順が、上で記載されているように、変異体断片について濃縮するために行ってもよい。この方法は、変異をもち、かつそれゆえに遺伝子マーカーとして用いられうる断片を集団において同定するのに有用でありうる。さらに、この方法は、特定の臨床的表現型に関与している可能性があるコード領域における変異を同定しうる。この方法は、特定の集団に特異的であるそれらの変異を単離するために異なる集団で(集団につき1実験)行われうる。換言すれば、MRDは、多数の遺伝子について集団におけるまれな対立遺伝子を同定するために用いられうる。類似した適用は、1つの個体における体細胞性突然変異または精子により生じたまれな対立遺伝子の同定である。この例には、腫瘍細胞の画分におけるまれな対立遺伝子、正常細胞のプールにおける前癌性変化、環境的変異原により引き起こされた突然変異、または免疫疾患もしくは老化のような過程に関連している可能性のある体細胞性突然変異の同定を含む。
【０３３９】
MRDは、PCRに引き起こされたエラーを含まない分子について濃縮するために、Taqポリメラーゼと共に用いられうる。この「クリーニング」プロトコールに従って、クローニングされたPCR産物は、さらなる分析のために単離される。Taq PCR反応の産物は、対照ベクターおよび検査ベクターへクローニングされ、その後、ハイブリダイズおよび形質転換される。Taq PCRに引き起こされたエラーを含む形質転換体の大部分は、ミスマッチを含むヘテロ二本鎖分子として現れ、活性マーカーを生じない。対照的に、PCRに引き起こされたエラーをもたないPCR産物は、ミスマッチを含まず、活性マーカーを生じる。これらのコロニーを単離してもよく、望ましい場合には、クリーニングの第二ラウンドを受ける。同様のプロトコールを、集団由来の非変異体配列を単離するために用いてもよい。
【０３４０】
また、MRDを、鋳型作動クローニングとして用いることができる。
【０３４１】
上記のように、複製可能な検査ベクターを構築するための一つの特に有用な(しかし、限定的ではない)方法は、所望のヘテロ二本鎖を作製するために相補的ベクターおよび検査鎖を配列させるのに鋳型として一本鎖閉環状標準を用いる。その後のライゲーション段階は、分子内のニック閉鎖を触媒する。実際、PCR産物の1つの鎖は、標準配列へのハイブリダイゼーションによりクローニングされた；すなわち、通常のクローニング法による標準プラスミドの構築は、さらなるクローニングがその標準配列へのハイブリダイゼーションにより誘導されるようにさせておく。
【０３４２】
鋳型作動クローニングは、MRDのほかに、多くの異なる供給源由来の特定の断片がクローニングされる必要がある適用に用いられうる。そのような場合の目的は、特定の断片における変異を検出することではなく、むしろ、これらの断片をクローニングすることであると思われる。
【０３４３】
上記のように、そのような鋳型作動クローニングの最初の産物は、標準と捕獲された鎖間のヘテロ二本鎖である。捕獲された鎖のみを得るために、鋳型作動クローニングに引き続いて、修復が標準鎖へ向けられる、ミスマッチ修復を起こすことができる。マーカーがもう一つの開始するミスマッチの存在下においてのみ修正可能なヘテロ二本鎖変異をもたなければならないMRDとは対照的に、鋳型作動クローニング適用については、マーカーヘテロ二本鎖は、修復を開始することができるミスマッチを含むことができ、およびしばしば含むようになり、標準鎖が必ず、捕獲された鎖からコピーされることを保証する。
【０３４４】
本発明のすべての局面に関することであるが、この方法は、検査断片を供給するために、PCRまたは他の増幅スキームをあてにせず、制限酵素切断断片および他の増幅されていない断片を等しく用いることができる。
【０３４５】
キット
キットは本発明の実施のために提供されることが企図される。最小限、キットは「A」ベクターおよび「I」ベクターを含む。ベクターは、一本鎖または二本鎖でありうる。一本鎖ベクターは、「A」/「I」ヘテロ二本鎖においてあらかじめアニーリングされうる。非メチル化およびメチル化ベクターを増殖するためのコンピテント宿主細菌も、MMR宿主菌株を加えて、含まれうる。特定のDNA配列、例えば、発癌遺伝子、癌抑制遺伝子、ヒトβ-グロビン、ヒトα-グロビンcDNAならびにBRCA1およびBRCA2のゲノムコピー、ヒトジストロフィン遺伝子を網羅するパネルなど、の分析のために、「X」（対照)配列を含むキメラの「A」ベクターが供給されるキットが、提供されうる。この場合の「A」および「I」ベクターはまた、「AX」/「I」ヘテロ二本鎖を形成するようにあらかじめアニーリングされうる。そのようなキットはまた、「Y」配列DNAを増幅するための特異的なプライマー、および選択的に、耐熱性ポリメラーゼを含みうる。
【０３４６】
本発明が、特定の方法、プロトコール、細胞系、動物種または属、および記載される試薬に限定されず、それなりに変わりうることは、理解されるべきである。本明細書で用いられる用語が、特定の態様のみを記載する目的のためであり、かつ添付された特許請求の範囲によってのみ限定されるものである本発明の範囲を限定することを意図されないこともまた、理解されるべきである。
【０３４７】
本明細書に用いられる場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかに別なふうに規定しない限り、複数の指示対象を含む。このように、例えば、「一つの細胞(a cell)」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「その細胞(the cell)」への言及は、一つまたはそれ以上の細胞および当業者に公知のその等価物への言及を含む、などである。本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、明らかに別なふうに規定されない限り、本発明が属する当業者にとって一般に理解されるのと同じ意味をもつ。
【０３４８】
本明細書および添付された特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明らかに別なように規定しない限り、複数の指示対象を含む。このように、例えば、「一つの複合体(a complex)」への言及は、複数のそのような複合体を含み、「その製剤(the formulation)」への言及は、一つまたはそれ以上の製剤および当業者に公知のその等価物への言及を含む、などである。
【０３４９】
他に定義されない限り、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者にとって一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されるものと類似したまたは等価の任意の方法、装置および材料が、本発明の実施または試験に用いられうるが、好ましい方法、装置および材料は、現在記載されている。
【０３５０】
本明細書で挙げられるすべての刊行物は、例えば、現在記載される本発明に関連して用いられうる刊行物に記載される方法および方法体系を記載かつ開示する目的のために、参照として本明細書に組み入れられている。上記および本文を通して考察される刊行物は、本出願の出願日より前の開示についてのみ提供される。本明細書において、本発明者らが先発明によるそのような開示に先立つ権利を与えられないという承認として解釈されるべきことはない。
【０３５１】
次の実施例は、当業者に本発明を製造または使用する方法の完全な開示および記載をもって提供するために出されるものであり、本発明として関係しているところの範囲を限定しようというものではない。使われる数（たとえば、量、温度、濃度など）については、正確さを確保するように努力が払われたが、いくらかの実験的誤差およびずれは容認されるべきであろう。そうではないことを示されているのではないかぎり、部分とは重量による部分であり、分子量とは平均の分子量であり、そして圧力は大気中での、または大気に近い状態においてである。
【０３５２】
実験
実施例1
2つのpUC由来のプラスミド、Aプラスミド(pMF200)およびIプラスミド(pMF100)は、MRDの工程に使われる。そのプラスミドの地図は図3に示されている。これらのプラスミドは、pMF100のLac Zα遺伝子への5bpの挿入のことを除いて、一致している。この挿入により、Iプラスミドで形質転換された細菌が、インドリル-β-D-ガラクトシド(Xgal)およびイソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)を追加したLB培地で増殖させると、白色のコロニーを生じる。対照的に、Aプラスミドで形質転換された細菌は、これらの条件下で増殖させると、青色のコロニーを生じる。
【０３５３】
MRD工程の最初の段階は、相違についてスクリーニングされるべき2つのDNAフラグメントのうちの1つをAプラスミドへクローニングし、第2のDNAフラグメントをIプラスミドへクローニングすることからなる。Aプラスミド構築物は、それから、dam- 細菌株へ形質転換され、完全にメチル化されていないプラスミドを生じる。一方、Iプラスミド構築物は、dam+ 細菌株へ形質転換され、完全にメチル化されたプラスミドを生じる。その2つのプラスミドはそれから、直鎖状にされ、変性され、そして再アニーリングされて、2つのヘテロ二本鎖プラスミドおよび2つのホモ二本鎖プラスミドを生じる。ホモ二本鎖のみを消化するMboIおよびDpnIの消化に引き続き、残っているヘミメチル化されているヘテロ二本鎖を環状化し、大腸菌へ形質転換して、XgalおよびIPTGを追加された寒天上で培養する。
【０３５４】
2つの検査DNA断片の間にミスマッチがない場合、IプラスミドおよびAプラスミド間のヘテロ二本鎖形成から生じるLac Zα遺伝子の5つのヌクレオチドループは、ミスマッチの修復システムによって修復されない。続いてのプラスミドの複製は、単一コロニーにおいてIプラスミドとAプラスミドの両方を産生し、青色を呈する。対照的に、ヘテロ二本鎖DNAにミスマッチが存在するならば、Lac Zαの5つのヌクレオチドループも同様に、DNAのミスマッチの両方を含めて、同時修復事象が起こる。この場合、Aプラスミドのメチル化されていないLac Zα遺伝子は分解されて、Iプラスミドのメチル化された鎖からのLac Zα遺伝子によって置き換わり、その結果、白色のコロニーを生じる。そのデータは、MRDシステムにおいてミスマッチおよびLac Zα遺伝子の同時修復が、それらの間の距離が5kbより大きい時でさえも起こることを示している。
【０３５５】
方法
MRDベクター：pMF100およびpMF200はpUC19由来であり、Lac Zα領域から置換されたマルチクローニング部位をもつ。さらに、MRDベクターは、BglI断片(2166-472)およびpBluescriptのマルチクローニング部位のほとんどを含んでいる(Stratagene, La Jolla, CA)。MRDベクターのクローニング部位は、制限エンドヌクレアーゼXbaI、SpeI、BamHI、SmaIおよびApaIの部位をもっていない。EcoRI部位は、唯一ではない。pUC19マルチクローニング部位、ヌクレオチド400〜454は、4つのGATC部位を含む配列をもつ70ヌクレオチドの長いオリゴヌクレオチドを使って、置換される。さらに、pMF200におけるpUC19マルチクローニング部位を置換している部位は、pMF100と比較すると、5bpの挿入をもち、pMF200において機能しないLac Zαにしている。図3における「ループ」というラベルはこの違いを示している。
【０３５６】
ヘテロ二本鎖DNAの形成：非メチル化プラスミドおよびメチル化プラスミドからのDNAを直鎖状にし、変性して、再アニーリングする。その結果生じる分子は、完全非メチル化「A」プラスミドホモ二本鎖、完全メチル化「I」プラスミドホモ二本鎖、およびヘミメチル化ヘテロ二本鎖である。その混合物を、完全非メチル化DNAを消化するMboI、および完全メチル化DNAを消化するDpnIで消化する。ヘテロ二本鎖のヘミメチル化DNAのみが残る。
【０３５７】
実施例2
MRDシステムの感受性および特異性の最初の検査として、マウスのβ-グロビン遺伝子のプロモーター由来の550塩基対DNA断片において、一つのヌクレオチドのミスマッチを検出した(Myersら、(1985) Science 229:242)。MRDは、位置-49（遺伝子の機能的転写開始部位に関連）にTを含むこのDNA断片を、位置-49がCである点を除いては、配列において一致している第二のDNA断片とを比較するために使われた。そのミスマッチは、ベクターにおいて、5つのヌクレオチドLac Zαループから約700塩基対のところに位置していた。MRD使用による2つのDNA分子の比較は、90%が白色コロニーという結果になった。対照的に、ミスマッチをもたない同じ2つのDNA分子（位置-49T/位置-49T）の比較では、たった7%しか白色コロニーを生じなかった。そのデータは表1に示す。
【０３５８】
（表１）MRDを用いた既知点突然変異の検出
2005517453.tif 000005
* A_T変異とは、比較される2つの断片間の変異の位置のみにおいて、dam-増殖される変異体はAをもち、dam+増殖される変異体は同じ鎖の同じ位置にTをもつことを意味する。それゆえ、そのような実験において製造されるミスマッチは、A/AおよびT/Tである。
^ キロベース
@ 率を決めるために、少なくとも250のコロニーを数えた。
1. マウスβ-グロビンの遺伝子の断片を使った実験。
2. ヒトアグーチ(agouti)遺伝子の断片を使った実験。
3. ヒトシスタチオニン-β-シンターゼ遺伝子の断片を使った実験で、それぞれ、位置341、502、992、および833にある。
【０３５９】
MRDを使って、位置-49における、すべての可能性のある一つのヌクレオチドのミスマッチの比較は、白色コロニーの割合が80%から90%までの範囲であることが明らかになった。これらの結果は、MRDが、この位置において可能性のある異なるDNA変異のすべてを高効率で検出できることを証明している。
【０３６０】
MRDシステムは、表1に示されているように、2つの異なるDNA断片において一つのヌクレオチドのミスマッチを加えて全部で5つのヌクレオチドを検出するために使われた。ヒトシスタチオニン-β-シンターゼの遺伝子においては、4つのこれらのミスマッチは、異なるヌクレオチド位置にある(KrugerおよびCox (1995) Human Molecular Genetics 4:1155)。ヒトアゴーチの遺伝子において、一つのミスマッチが残っているということは、一つのヌクレオチドの変化を表している(Wilsonら、(1995) Human Molecular Genetics 4:223)。それぞれの場合において、一つのヌクレオチドのミスマッチが検出された。
【０３６１】
ミスマッチは、Lac Zαループから2.3kbほど離れている時でさえも、検出された。白色のコロニーの割合が50%より大きくなっているので、ミスマッチおよび非メチル化鎖のループの同時修復が、ミスマッチのどちら側がループと関連しているかに関係なく起こった。
【０３６２】
ミスマッチとベクターループの間の距離がさらに大きくなった場合に、ミスマッチの検出の有効性が高く留まっていられるかどうかを測定するために、次の実験が行われた。λバクテリオファージ由来の9kbの検査DNA断片をMRDプラスミドシステムへクローン化し、断片の一つの末端から5kbの位置に2つの塩基対の挿入を含む同じ検査DNAと比較した。ミスマッチが存在しない時の10%の白色コロニーと比較して、2つの塩基対のミスマッチの追加は70%の白色コロニーという結果となった。これらの結果は、MRDは、10kbのDNAにおけるミスマッチを検出できることを示している。
【０３６３】
実施例3
MRDは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって産生されたゲノムDNA断片において未知の突然変異を検出するために使われた。PCRは、多くの異なる個体から対象となる特別なゲノムDNA断片を得るための実用的な方法である。PCR技術における最近の発達により、長さが10kb以上のDNA産物を単離することが可能である(Barnes (1994) P.N.A.S. 91:2216; Chengら(Cheng)、(1994) P.N.A.S. 91:5695)。しかしながら、PCR反応の間のエラーの導入により、個々のクローン化されたPCR産物の使用を厳しく制限せざるおえない。この制限を克服する努力において、MRD実験手順が開発され、PCR誘導によるエラーのない分子を高められるようになった。この「クリーニング」実験手順に続いて、そのクローン化したPCR産物は、上記のMRD工程の使用によってDNA配列の相違を比較することができる。
【０３６４】
MRDクリーニング実験手順の根幹をなす基礎的原理は、どの単一PCR誘発性突然変異も、PCRによって産生されたすべての分子のうちのとても小さなフラクションを作り上げているだろうという事実である。結果として、PCR反応の産物を、Aの「青色」MRDベクターおよびIの「白色」MRDベクターへクローン化し、上記のとおり測定すると、PCR誘発性エラーを含む産物の大部分は、ミスマッチを含むヘテロ二本鎖分子として現れ、白色のコロニーを生じるだろう。対照的に、PCR誘発性エラーをもたないそれらのPCR産物は、ミスマッチを含まず、結果として青色のコロニーを生じるだろう。すべてのミスマッチが100%の効率で修復されるわけではないとするならば、いくつかの青色のコロニーは、第一回の集積化にともなうPCR誘発性エラーを含むものと予想することができる。しかしながら、もし、青色コロニーを単離し、第二回のMRDクリーニングに使うならば、PCR誘発性エラーを含むそれらの分子をいっそうさらに減らすことができる。おのおのの青色コロニーは、青色MRDプラスミドおよび白色MRDプラスミドの両方を含んでいるので、第二回のMRDクリーニングは次のように行われる。第一回クリーニングに続いて、青色コロニーから単離されたプラスミドDNAは、dam-細菌株およびdam+細菌株の両方に形質転換するために使われる。青色コロニーと白色コロニーの両方がおのおの形質転換から生じたが、dam-形質転換から青色コロニーだけを単離し、そしてdam+形質転換から白色コロニーだけを単離する。プラスミドDNAはそのようなコロニーから調製され、ヘテロ二本鎖を上記のとおり単離される。これらのヘテロ二本鎖をもつ形質転換から生じた青色コロニーは、PCR誘発性エラーのない産物がさらに高められている。75%の分子がPCRにともなう1つ以上のPCR誘発性エラーを含んでいる実験において、ミスマッチの修復効率が95%で、ミスマッチをもたない白色コロニーが10%の頻度であると仮定するならば、予想としては、第一回MRD集積化の結果、10%の青色コロニーを生じ、そのようなコロニーにおいてPCR誘発性エラーのない分子は66%であることになる。青色コロニーからのプラスミドDNAは、第二回MRD集積化に用いたならば、41%の青色コロニーを生じ、そのようなコロニーにおいてPCR誘発性エラーのない分子は96%になるものと予想される。
【０３６５】
MRDクリーニング実験手順の効率性と同様に、実用性の試験として、2kbのヒト染色体21特異的PCR産物を、単一の個体の2つの染色体21相同物のおのおのから単離した。2つの染色体21相同物は、独立したハムスター-ヒトの体細胞ハイブリッドクローンにおいてお互い分離させた。これらの体細胞ハイブリッドクローンから単離されたゲノムDNAは、PCR産物の供給源である。おのおのの相同物由来のPCR産物は、上記のとおり、MRDを使って比較すると、おのおのの場合において、約10%の青色コロニーが観察された。
【０３６６】
2回のMRDクリーニングの結果、表2に示されるデータのとおり、青色コロニーの割合は、60〜80%である。対照的に、2つの相同物由来のこれらの「クリーン化された」PCR産物をMRDを使ってお互いに比較すると、生じたコロニーの約90%が白色で、これは2つの異なる染色体21相同体由来の2kbのPCR産物において少なくとも一つの塩基の相違が存在することを示している。PCR産物におけるDNA配列変異は、独立して、制限酵素消化により確かめた。これらの結果より、MRDは、PCR誘発性エラーがほとんどないPCR産物を高めるために使用することができ、そしてそのような産物は、MRDと関連して、ヒトDNA配列変異を検出するために使用することができることを明らかにしている。
【０３６７】
（表２）2つの体細胞ハイブリッドからの2kb PCR産物を含むプラスミドの相違比較における不活性コロニーの割合
2005517453.tif 000006
* 1および2は、2つのハイブリッドからの産物を表す。1/1は、dam-株で増殖されて、かつハイブリッド1からのPCR産物を含む「A」ベクターと、dam+株で増殖されて、かつハイブリッド1からのPCR産物を含む「I」ベクターとの比較を表す。A1/A1は、比較1/1の活性コロニーから得られた、dam-宿主において増殖されたAベクターと、同じ供給源から得られた、dam+で増殖されたIベクターとの比較を表す。AA1/AA1は、比較A1/A1の活性コロニーから得られたdam-で増殖されたAベクターと、同じ供給源からのdam+で増殖されたIベクターとの比較を表す。最後に、AA1/AA2は、比較A1/A1の活性コロニーから得られたdam-で増殖されたAプラスミドと、比較A2/A2の活性コロニーから得られたdam+で増殖されたIベクターとの比較を表す。
【０３６８】
上記の結果から、本発明は、2つのDNA配列間のミスマッチを検出する効率的で簡単な方法を提供していることは明らかである。その方法は、ただ単にミスマッチの存在を検出する手段を提供する、または、適正対合のDNAおよびミスマッチのDNAの両方の複製を単離するのに使うことができる。MRDは、遺伝子配列において体細胞の変化を測定したり、出生前または他の遺伝的スクリーニングのために生殖系列の突然変異を同定したり、ヒト遺伝子のマッピング、および突然変異のクローニングにとって、有用である。MRDの主な利点とは、一つの実験において、多くの断片を同時に分析するというこのシステムの潜在能力であり、何百キロベースというDNAを表す領域における突然変異の検出を可能にし、または同時に多くの座をゲノタイピングすることができる。MRDは、未知の突然変異の検出、大きなゲノム領域におけるDNA変異の検出、および高処理量のゲノタイピングにとって、強力な技術を提供している。
【０３６９】
実施例4
検出マーカーとしてのCre-Loxの使用
標準の構築：  MRDは、一方のベクター上の、Creリコンビナーゼをコードする遺伝子における5つの塩基対の欠失を除いて、一致している2つのベクターを利用する。DNA断片は、野生型Creを含むベクターでクローン化される。これらのクローン、標準と呼ぶことにするが、たった一度だけ作製され、検査されるべき各人からの配列に対して、配列比較鋳型として供給される。標準は、メチル化を欠損した大腸菌宿主において増殖され、実質的に、非メチル化一本鎖DNAが得られる。
【０３７０】
DNA変異スクリーニングのためのヘテロ二本鎖の調製：DNA変異のためのスクリーニングを行うために、検査されるべきDNA断片は、各個体から増幅される。そのPCR産物のインビトロのメチル化後、すべての標準からの一本鎖DNAは、プールされ、PCR産物を含む試験管に添加される。5塩基対欠失しているCre遺伝子を含む直鎖状化されたベクターもまた、同じ試験管に添加される。その3つの構成要素（PCR産物、一本鎖標準、および直鎖状化Cre欠失ベクター）は、NaOHによって変性され、中和化により再アニーリングされる。この過程は、図6に示しているが、非メチル化一本鎖標準、その相補的PCR産物および直鎖状化Cre欠失ベクターの間で、ヘテロ二本鎖を形成する。
【０３７１】
残存する一本鎖成分を分解するために、ヤエナリヌクレアーゼを添加する。その後、閉環状ヘミメチル化ヘテロ二本鎖を作製するために、Taqリガーゼを添加する。この時点において、1本のチューブは、標準および検査されることになっている遺伝子断片に対応する、すべてのヘテロ二本鎖を含む。1つの反応混合物において、ヘテロ二本鎖DNAを、2つのlox部位により隣接されるテトラサイクリン耐性(tetR)およびストレプトマイシン感受性(strepS)遺伝子のカセットをFエピソーム上に有するように操作されたエレクトロコンピテントな大腸菌株(MUTATION SORTER(登録商標)、MS)へ形質転換する。
【０３７２】
変異DNA断片および非変異DNA断片の分離：ミスマッチをもたないそれらのヘテロ二本鎖分子（すなわち、標準と検査されるべきDNA断片の間に変異がない）は、正常に複製され、活性Creおよび不活性Creの両方をもつプラスミドが存在するようになる。活性Creは、2つのlox部位間のカセットを結合し直しtetR遺伝子およびstrepS遺伝子の欠失へと導く。これは、その細胞をテトラサイクリン感受性およびストレプトマイシン耐性にする。したがって、それは、ストレプトマイシンの存在下では増殖するが、テトラサイクリン存在下では増殖しないであろう。
【０３７３】
ヘテロ二本鎖分子において、ミスマッチが存在するならば（すなわち、標準と検査されるDNA断片との間に変異があれば）、そのようなミスマッチの修復が起こる。そのミスマッチの修復過程において、活性Cre遺伝子をもつ非メチル化鎖は、分解され、不活性Creをもつ鎖が、複製されるための鋳型として使われる。その結果として、ミスマッチのあるヘテロ二本鎖で形質転換された細胞は、いかなるCre活性もなく、細胞はそのtetRおよびstrepSカセットを保有したままにおかれ、それゆえ、細胞は、テトラサイクリンの存在下では増殖するが、ストレプトマイシン存在下では、増殖しない。
【０３７４】
テトラサイクリンまたはストレプトマイシンのいずれかを含む2本の試験管でその形質転換混合物を増殖させることにより、変異を含む断片および変異を含まない断片は、別々に単離される。DNA変異検出の評価は、プールしているところにおいてどんな断片が存在しているかを同定するということに引き下げられる。この作業は、ゲル電気泳動やハイブリダイゼーションを含む多様な方法で、行ってもよい。
【０３７５】
変異DNA断片および非変異DNA断片の同定
ABIシーケンシングゲルの使用：おのおののプールからのDNAは、検査される断片をはずすために制限酵素で消化される。2つの制限消化物の試料は、蛍光標識され、ABIシーケンシングゲルの上で泳動する。断片における変異の有無は、その特別の断片が存在しているプールを測定することにより評価される。これは、異なる断片がそれぞれの大きさによりお互い分離されるという理由から、達成しうる。
【０３７６】
DNAマイクロアレイ技術の使用：この工程において、標準に現れるすべての断片をスライド上へ点に並べていく。続いて、テトラサイクリン含有の培養およびストレプトマイシン含有の培養から得られたDNAを蛍光標識し、ハイブリダイゼーションのプローブとして使用される。テトラサイクリン含有培養からのプローブは、変異を含むDNA断片に対応しているスポットへハイブリダイズさせる。一方、ストレプトマイシン含有培養からのプローブは、変異を含まないDNA断片に対応するスポットへハイブリダイズさせる。おのおののプールの断片内容を分析するために、他の方法を利用することは可能であり、質量分光学が含まれる。
【０３７７】
臨床的関連の表現型に関係してくる変異を同定するという目標を達成するためには、多くの遺伝子を検査する必要がある。この圧倒される作業は、MRDの多重化する能力により、大幅に容易になっている。多くの研究者は、10,000以上の標的を含むマイクロアレイ上に、細胞の全cDNA内容をプローブとして使っていた。それゆえ、4,000標的を含むマイクロアレイ上に、4,000の断片のプールをプローブとして使うことは、比較的簡単であるといえる。さらに試料が多様化されうるとしても、これは、4,000の断片を同時に検査することが可能である。一人の人間の個体の遺伝子の全コード領域を検査するためには、それぞれ300bpの平均の大きさをもつ400,000断片を検査することになる。その時、その作業を達成するには、100回のMRD反応を行うことになるだろう。
【０３７８】
疾患原因の変異は、定義により、対照においてよりも患者個体群における頻度が増加した。ハプロタイプの構築およびあらゆる個人の遺伝子型の知識は、疾患原因変異を同定するために必要ではないので、患者または対照はプールされて、おのおのの個体群における異なるDNA変異の頻度を評価することで検査することができる。MRDは、個体群における多数の変異の頻度を同時に評価するという潜在能力をもっている。まず、多数の個体からのゲノムDNAを物理的にプールし、続きのMRD段階のための鋳型として使われる。あらゆる変異断片の頻度は、工程の終わりに得られる2つのプールにおけるその占有率を測定することにより、評価される。異なる個体群、たとえば、患者と対照者、における異なる変異遺伝子断片の頻度を得るということは、疾患原因変異をもつ断片を速く同定することができる。
【０３７９】
多重化MRD
多重化するというMRDの潜在能力を明らかにするために、本発明者らは、公開されている多型性配列標識化部位(polymorphic Sequence Tagged Sites; STSs)のグループから無作為に選択された13のDNA断片におけるDNA配列変異の同定にMRD工程を用いた。簡単に言えば、標準は各STSとして作製され、ヘテロ二本鎖は、標準および検査される各個体から増幅されたDNA断片の混合物の間で形成された。ヘテロ二本鎖は、ひとまとめに、MUTATION SORTER（商標）(MS)株へ形質転換し、一つにはテトラサイクリンが追加され、もう一つにはストレプトマイシンが追加された2つの別々の培養において増殖させた。2つの培養のおのおのからのDNAは、蛍光標識し、ABIシーケンシング装置に装填した。断片ピークは分析され、特別なDNA断片における変異の有無は、特殊な断片がより優勢であるプールを測定することにより、評価される（図7）。
【０３８０】
図7が示すように、ストレプトマイシンまたはテトラサイクリンを別々に追加された培養から調製された2つの試料は、異なるピーク線をもっている。その線は、異なる断片に対応する異なるピークを示している。おのおののピークは、自動的に定量される。検査される個体の対立遺伝子の認定は、2つのプール間での断片の相対的強度から決定される。ストレプトマイシンのプールにおいて優勢の断片は、変異がないことを示している。対照的に、テトラサイクリンのプールにおいて優勢の断片は、両方の対立遺伝子に変異があることを示している。最後に、両方のプールにおいて多量である断片は、検査される個体がその断片のヘテロ接合体であることを示している。これらの配置は独立した検査において再現可能である。ヘテロ接合体の変異を検出するためのシグナル対ノイズ比は10：1であり、ホモ接合体の検出は、実質的により堅固である。
【０３８１】
上記実験は、3個体の核家族において行われた。各個体は、独立した3回、検査された。すべての3個体において変異が検出された。強いシグナル対ノイズ比が得られた；ヘテロ接合性対立遺伝子は、10:1の平均シグナル対ノイズ比に応じて有効に同定された。3つの独立した実験のそれぞれにおいて、個体に正確に同じ変異体断片が検出されたため、これらの結果は、完全に再現性があった。別々の断片は、別々の個体で異なった；3人の間の変異のパターンは、遺伝のメンデル様式に従った。これらの実験において、MRDによりDNA変異を検出する感度、特異性および再現性、加えてハイスループット変異スクリーニングについてのそれの可能性が実証された。
【０３８２】
MRD技術は、ありふれた疾患を現実の可能性へと引き起こす変異を同定するために候補遺伝子の大量スクリーニングを行う。この研究方法の核心に、正常の個体群より特別な患者グループにおいてより頻繁にあるゲノム配列変異を同定する能力がある。これらの変異を同定することは、現代医学の多くの局面、人間の疾患に対する診断の決定、予測の評価および治療の工夫に影響を及ぼしうる。ありふれた疾患を引き起こす遺伝的因子の知識は、すでにまれで単純なメンデル疾患に対する治療に影響を及ぼしているのと同様に、医学的治療に強い影響を与えると考えられる。
【０３８３】
実施例5
多重化MRD
材料および方法
MRDベクターおよび菌株の構築
用いられるすべての制限および修飾酵素は、(New England Biolabs)(NEB)からである。すべての反応は、(Gibco BRL)ライゲーション緩衝液を用いて行われる平滑末端ライゲーションを除いては、その酵素製造会社の推奨に従って行われた。すべての形質転換および増殖に用いられる細菌株は、別に指定されない限り、DH5αであった。
【０３８４】
ベクターの構築
Cre遺伝子は、Creを有する構築物を鋳型として用いて、PCR増幅された。PCRは、タンパク質の開始ATGの5'側13 bpを残した。PCR産物は、Pst/BamHI消化されたpBSK(Stratagene)においてクローニングされた。その後、Cre遺伝子は、pMF200においてLacZα遺伝子を置換するために用いられた。このために、Cre断片は、Eco RI/Xba I二重消化により遊離され、末端は、クレノウフラグメントを用いて充填された。pMF200は、Bgl Iで部分的に消化され、3'オーバーハングを咀嚼するためにT4 DNAポリメラーゼで処理され、続いてBam HIで消化され(Bam HI部位はpMF100のLacZαのリーダー配列に存在する)、末端はクレノウフラグメントで充填された。平滑末端ライゲーションは、Cre遺伝子によりpMF100のBgl I-Bam HI断片上でLacZα遺伝子を置換するpMRD100を生じた。この構築物において、placプロモーターはCreの発現を誘導する。
【０３８５】
PCRは、鋳型としてのpMR100およびCreに5 bpの欠失を生じるプライマーと共のM13リバースプライマーを用いて行われた。欠失は、ATG開始部位から207 bp下流、配列CTACAについてだった。PCR産物はNru IおよびSph Iで消化された。PMRD100もまた、Nru IおよびSph Iで消化され、小さい断片は、PCR産物由来の消化物と置換された。組換えプラスミドは、Creに5 bp欠失をもつpMRD200であるが、他の点ではpMRD100と同一であった。配列分析により、Creにおいて5 bp欠失を除いては他に変化は生じていないことが確認された。
【０３８６】
MUTATION SORTER(商標)株の構築
出発ベクターは、pML11、マルチクローニング部位に、2つのlox部位により隣接されたテトラサイクリン遺伝子をクローニングされたpBKS(Stratagene)誘導体であった。野生型ストレプトマイシン感受性遺伝子(StrS)をクローニングするために、鋳型としての野生型遺伝子を有する細菌株および以下のプライマーを用いてPCRを行った：
2005517453.tif 000007
【０３８７】
StrS PCR産物のサイズは、約700 bpであった。T4ポリメラーゼ処理は、末端を整えるために行われ、続いて、方向性クローニングのための基質を作製するためにEco RI消化を行った。この断片は、Eco RI/Sam I消化されたpML11にクローニングされ、テトラサイクリン遺伝子を置換し、pMLstrpを生じた。ストレプトマイシンおよびテトラサイクリン遺伝子を直列に配置するために、Kpn I/Sma Iで消化されたpML11の大きい断片を、Eco RI消化され、クレノウで充填され、その後、Kpn I消化されたpMLstrpの小さい断片とライゲーションした。作製された組換え体はpMLSTであった。その後、pMLSTは、Xho I/Sac Iで消化されて、テトラサイクリン/ストレプトマイシン/loxカセットを遊離した。断片を、Xho I/Sac Iで消化されたpLitmus 29(NEB)にクローニングした。結果として生じたプラスミド、pMLSTBをKpn Iで消化し、Bgl IIリンカーを挿入した。
【０３８８】
細菌のF'エピソーム上に構築物を配置するために、トランスポザーゼ遺伝子を有するベクターpNK2859(41)を利用した。このプラスミドは、プラスミド上に所有されるトランスポザーゼ遺伝子はそれ自身伝達されないため、安定的な転位事象を起こす。対象となるカセットを有するpMLSTBのBgl II断片をpNK2859のBam HI消化物とライゲーションした。得られたプラスミドpNKMLSTは、転位シグナルに隣接された対象となる断片を有した。プラスミドはまた、転位事象を触媒するがそれ自身伝達されないトランスポザーゼ遺伝子を有した。
【０３８９】
pNKMLSTを、F'エピソームを有するDH5α株へ形質転換した。この菌株を増殖させ、いくらかの細胞において、エピソームに転位事象が起こったものと思われた。それらの細胞を単離するために、培養物を、温度感受性複製およびクロラムフェニコール(Cm)耐性遺伝子を有するプラスミドを含むHB101へ接合した。転位産物を有するF'エピソームのHB101への伝達は、テトラサイクリン耐性表現型を伝達するはずである。接合は、以前に記載されているように(42)、行われた。テトラサイクリンおよびクロラムフェニコール耐性についての選択を行った。選択されたコロニーをカルベニシリン(Carb)およびストレプトマイシン感受性についてスクリーニングした(HB101はストレプトマイシン耐性である)。所望の接合体は、以下の表現型：TetR、CmR、CarbSおよびStrpSをもった。42℃での増殖は、Cm耐性遺伝子を有するプラスミドを除くために行われた。おそらく、F'エピソーム上の異なる場所にtet/str/loxカセットを有する異なる単離物を得た。pMRD100、pMRD200およびヘテロ二本鎖での形質転換を通して、最少のバックグラウンドをもつ、conj5と名付けられる菌株を選択した。
【０３９０】
conj5は、いくつかのMRD実験に用いられたが、むしろDH5αバックグラウンドを用いる方を選んだ。ストレプトマイシン耐性突然変異についての選択は、DH5αにおいて、(10 mg/ml)ストレプトマイシンを含むプレート上に培養物を蒔くことにより行われた。新規株をDH5αSと呼んだ。conj5のF'エピソームを、大過剰のDH5αSと接合することにより、DH5αS株へ伝達させた。接合は、2つの株を1:1000比で混合し、テトラサイクリンXgal/IPTGプレート上での選択の前にそれらを37℃で一晩、放置することにより、行われた。F'エピソームを獲得したDH5αSは、conj5と、IPTG/Xgalプレート上において後者は青色であるのに対して、前者は白色に見えることから、コロニー色により区別された。tet/str/loxカセットを有するF'エピソームを含むDH5αSは、MUTATION SORTER(商標)株と呼ばれた。
【０３９１】
標準の構築
pMRD100をdam−宿主、SCS110(Stratagene)、において増殖させ、非メチル化DNAを調製した。ベクターDNAをHinc IIで消化し、直鎖状分子をアガロースゲル電気泳動により精製した(ゲル精製は必須ではない)。個体からのPCR反応は、pfuポリメラーゼ(Stratagene)を用いて行われた。いくつかの場合、少数の産物がプールされた。PCR産物は、製造会社プロトコールに従って、DNA結合カラム(Qiagen)を用いてクリーニングされた。ライゲーション反応は、直鎖状ベクターと1個〜10個のPCR産物との間に設定され、後者が過剰に用いられた。室温で一晩のライゲーション後、(Qiagen)カラム精製を、リガーゼおよび塩を除くために行った。その後、Sal I消化反応を、挿入断片を含まないDNAベクターを直鎖状化するために行った。以前に記載されているように(43)、(Biorad)エレクトロポレーション装置を用いるSCS110細胞へのエレクトロポレーションの前に、もう1回の(Qiagen)カラム精製を行った。組換え分子を含むコロニーを同定するために、プライマーとしてT3およびT7を用いて、個々のコロニーからPCRを行った。その後、挿入断片を含むPCR産物を、ジデオキシ化学を用いるシーケンシングにかけ、シーケンシングプライマーとしてT3を用いた。シーケンシングにより決定される場合の正しいクローンが、検査DNAとの比較のための参照として用いられる標準である。または、ライゲーション産物を、SCS110の代わりにDH5αへ形質転換した。正しいクローンは、後で、SCS110へ形質転換された。標準の一本鎖非メチル化DNAは、製造会社の推奨に従って、ヘルパーファージM13K07(NEB)を用いることにより調製された。後の実験において、標準構築のためのより効率的な方法を展開した。100個のPCR断片を共にプールし、これらのクローンについてのライブラリーを作製するためにクローニングする。クローンのシーケンシングは、標準としての役割を果たしうるものを同定する。クローニングのもう1ラウンドは、第一ラウンドにおいて得られなかったそれらのクローンについて行われる。
【０３９２】
MRDプロトコール
各MRD反応について、非メチル化一本鎖DNAのプールの合計約1 mgを、いずれの二本鎖混入をも破壊するために、37℃で30分〜60分間、5ユニットのMbo Iで消化した(後の実験では、Mbo Iの代わりにScr FIを用いている)。(Qiagen)カラムを用いて酵素および緩衝液を除去した。不活性Cre遺伝子を有する約2 mgのベクターをHinc IIで消化し、ゲル電気泳動により精製した(ゲル精製は必須ではない)。上記の2つの準備段階を、たいてい、大きいバッチにおいて行い、アリコートをその後のMRD反応において用いた。
【０３９３】
検査される個体からのPCR反応をpfuポリメラーゼを用いて行った。多数の断片を同時に検査する最初の実験において用いられる鋳型腫瘍細胞系DNAは、(ATCC)から得られた。MRDの特異性および感度を試験する実験についての鋳型DNAは、NIH DNA多型発見資源(NIH DNA Polymorphism Discovery Resource)(44)からの個体についてであった。1個体からのPCR産物をプールし、(Qiagen)カラムを用いる精製を行った。その後、PCRプールを、37℃で1時間〜2時間、10ユニットのポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)でリン酸化した(プライマーが合成からの5'リン酸をもたなかった場合)。その後、酵素および緩衝液を(Edge Biosystems)(EB)からのSOPE樹脂/カラムでの処理により除去した。その後、damメチル化を、製造会社推奨の緩衝液により、37℃で1時間〜2時間、damメチラーゼ(NEB)を用いて行った。その後、(Qiagen)カラム精製を、酵素および緩衝液を除去するために行った。メチル化PCRを、1 mgの上記の非メチル化標準および2 mgの不活性Creを有する精製された直鎖状ベクターと混合した。5 mlの0.5 M EDTAおよび1.5 mlの3 M NaClを添加し、容量をTEで100 mlに調整した。12.5 mlの新しく希釈された1 M NaOHを添加し、続いて、室温で15分間、インキュベーションした。その後、12.5 mlの2 M トリス、pH=7.2および125 ml ホルムアミドを添加し、30℃で一晩、再アニーリングを行った。ヘテロ二本鎖を(Qiagen)カラムを用いてクリーニングし、30 ml H2Oに再懸濁した。3.5 ml Taqリガーゼ緩衝液、1 mlの臭化エチジウム(300 mg/ml)および1 ml Taqリガーゼ(NEB)を添加した。臭化エチジウムの添加は必須ではないが、シグナル対ノイズ比を向上させうる。ニック閉鎖反応を65℃で15分間、行った。SOPE樹脂/(EB)カラムを用いて酵素および緩衝液を除去した。その後、50ユニットのエキソヌクレアーゼIII(NEB)を適切な緩衝液と共に用いて、ニックの入ったDNAを一本鎖分子へ変換した。SOPE樹脂/(EB)カラム段階をもう1回利用して、酵素、緩衝液および一本鎖DNAを除去した。すべての一本鎖DNAの除去を確認するために、0.7 mg ベンゾイル化ナフトイル化DEAEセルロース(BNDC)を添加し、NaClを1 Mの最終濃度まで添加し、室温で振盪しながら、15分間、インキュベーションを行った。BNDCは、優先的に一本鎖DNAに結合する。混合物を(EB)カラムを通して流し、塩および結合した一本鎖DNAを含むBNDCを除去した。この作業において記載される結果はBNDC段階を利用しているが、この段階の削除は、結果に影響を及ぼさなかった。一本鎖DNAを除去した後、閉環状ヘテロ二本鎖分子をスピード減圧により濃縮した。32個のエキソンを検査する最初の実験のための閉環状ヘテロ二本鎖分子の調製は、代替のプロトコールを用いて行われた。閉環状分子をアガロースゲル電気泳動を用いて精製した。この段階を削除するために、上記のように後の実験において、エキソヌクレアーゼIII段階を使用した。
【０３９４】
MS株の形質転換をエレクトロポレーションにより行った。エレクトロコンピテントMS細胞調製およびエレクトロポレーション手順は、推奨されている(43)とおりに行われた。1時間の回復期の間、1 mlの1 M IPTGをSOC培地へ添加した。培養物は、カルベニシリン(75 mg/ml)、ストレプトマイシン(10 mg/ml)およびIPTG(64 mg/ml)、またはカルベニシリン(75 mg/ml)、テトラサイクリン(3.25 mg/ml)およびIPTG(64 mg/ml)を追加された2つのプレート上へ蒔かれる2つの部分に分割された。典型的には、合計約百万個の形質転換体が得られる。1 mlのLBを2つのプレートのそれぞれに入れ、その後、プレートからのすべてのコロニーをチューブへ収集する。記載されるすべての実験は、形質転換混合物を適切な選択培地での2つの培養液において増殖させる、32個の異なる断片での最初の実験を除いては、プレートを用いた。どちらの場合も(プレートまたは培養液)、選択培地での一晩の増殖後得られる細胞からのDNAは、製造会社により推奨されるとおりに、Qiagenカラムを用いてミニプレップされた。ミニプレップにおいて得られるDNAの15〜30パーセントを37℃で1〜2時間、Cla IおよびXho I(NEB)で消化した。アガロースゲルを用いる場合、DNAを4% New Sieveゲル上で流した。ABI 377ゲルを用いる場合、消化されたDNAをフィルターカラム(EB)を通して通過させ、塩を除去した。制限酵素切断断片は、蛍光dUTPを利用して標識された。これは、0.5ユニットのampliTaqポリメラーゼ(Perkins Elmer)、Taq緩衝液および推奨される濃度でのMgCl2、加えて0.8 mMの最終濃度でのR6G dUTP(Perkins Elmer)を添加することにより達成された。ヌクレオチド伸長反応は、72℃で10分間、行われ、その後、(EB)カラムを用いて過剰蛍光を除去した。試料をスピード減圧により濃縮し、その後、ABI 377シーケンシングゲル上に流した。データは、Gene Scanソフトウェア(Perkin Elmer)により分析された。ストレプトマイシンプールに対するテトラサイクリンプールにおける比率が非変異体断片のそれよりも有意に高い場合には、断片は、変異を有すると決定された。
【０３９５】
結果
多重化についてのMRDの能力を試験するために、癌病因または進行に関与する遺伝子の32個のエキソンのプールにおいてMRDを行った。最初に、活性Cre遺伝子を含むpMRD100において1個体由来の特定のエキソンのPCR産物をクローニングすることにより、32個の標準プラスミドのパネルを構築した。その後、これらのプラスミドは、プールされ、検査DNAと比較するための参照としての役割を果たした。3つの独立した腫瘍細胞系のそれぞれにおいて、32個のPCR反応が行われた。MRD方法は、3つの腫瘍のそれぞれのPCRプールで行われた。形質転換後、DNAは、テトラサイクリンまたはストレプトマイシンの存在下で増殖された2つの細菌培養物から調製された。DNAプールの挿入断片を遊離する制限消化についてアガロースゲルが泳動された。テトラサイクリンプールは、ストレプトマイシンプールと比較して、標準と検査DNA間の変異体をより高い割合で含んだ。3つの腫瘍において、4つの別々のエキソンでの5つのそのような変異体断片を同定した。
【０３９６】
MRDにより変異をもつと予測されたエキソンは、パッチエキソン17、カドヘリンエキソン14、変異型血管拡張性運動失調症(ATM)エキソン31、およびP53エキソン7であった。パッチ17エキソンは、2つの腫瘍において異なっていた。すべての3つの腫瘍においてパッチエキソン17、カドヘリンエキソン14、およびP53エキソン7をシーケンシングし、ATMエキソン31を、変異をもつと予測された腫瘍においてのみシーケンシングした。シーケンシング分析は、MRDにより同定されたすべての変異体を確認した。
【０３９７】
上の実験のPCR産物を、それらをプールする前にアガロースゲル上に泳動した。これらのPCR産物のいくつかは、少数の種を示している正しい産物と全く混合していた。この不純物は、MRD結果に干渉せず、MRDが高い度合いのPCR不純物を許容することができることを示した。
【０３９８】
MRD特異性の試験
癌病因および進行に関与する遺伝子のエキソン由来の45個の断片を同時にスキャンするために自動化シーケンシング装置(ABI377)を用いることによる上の実験においてより複雑なバックグラウンドにおいてMRDの特異性を試験した。多数の変異を同定することができたが(データ示されず)、いくつかの断片は、同じサイズをもち、それゆえに分析することができなかった。
【０３９９】
シーケンシングゲル上で分離されることができなかった断片を排除し、次の実験においては、35個の断片のみを検査した。14個体における10 kbを超えるDNAを含むこれらの35個の断片を変異についてスキャンするためにMRDを用いた。
【０４００】
図8は、自動化シーケンシング装置に流されたMRD実験のストレプトマイシンプールおよびテトラサイクリンプールの典型的トレースを実証している1つのそのようなスキャンの結果を示す。おそらくPCR失敗のために、一つの断片はすべての個体における両方のプールにおいて欠けており、もう一つはほんの少数の個体だけにおいて存在していた。これらの14個体において、7つの変異を同定した(表3)。
【０４０１】
（表３）14個体の変異について35エキソンをスキャンすることでMRDにより同定された変異
2005517453.tif 000008
a 断片は、すべての14個体においてシーケンシングされた。
b 検査された断片は、エキソン全体を含まない。
【０４０２】
すべての7つの変異は、その後のシーケンシングにより確認され、5つのトランジション、トランスバージョン、および1塩基対(bp)欠失/挿入の変異から構成された。これらの断片のうちの3個について14個体全てをシーケンシングすることにより、異なる試料において同じ変異を検出することにおけるMRDの一貫性を評価した。変異をもつとMRDにより予測された個体のみが、シーケンシングにより変異体を示した。上の2つの実験において、400個より多い断片をMRD-スクリーニングし、偽陽性を得なかった。すべての断片をシーケンシングしたわけではないので、この実験は感度について扱わなかった。
【０４０３】
MRD感度の試験
MRDの感度を試験するために、以前に同定された変異を検出するそれの能力を評価した。SNPsをもつことが知られている配列タグ部位(STSs)を選択し、シーケンシングおよびMRDを用いて、合計5個の血縁でない個体を検査した。これらのSTSsは、直接的シーケンシングを通して本発明者らにより確認された発表されている報告からの8個のSNPs、およびシーケンシングを用いて本発明者らにより同定された2個のSNPsを含んだ。STSsのそれぞれについて標準を作製した。これらのSNPsのすべての10個は、MRDにより検出された(表4)。
【０４０４】
（表４）
2005517453.tif 000009
【０４０５】
考察
本発明者らの結果より、MRDは、高い特異性および感度をもって、同時に、多数のゲノム断片において変異についてスキャンすることができ、PCR不純物の高い寛容性があり、かつ単一の条件が、最適化のための少しの必要性もなく、検査されるすべての断片について用いられうることが示されている。これらの特徴のすべては、ハイスループット適用のために重要である。
【０４０６】
MRDのこの方法における標準の使用は、ハイスループット変異体検出についていくつかの恩典を提供する。第一に、常に、検査DNAを同じ参照配列と比較している。第二に、標準を使用することにより、任意の分子間ライゲーション段階を避けることによって効率性を増加させる。最後に、2つの選択的な一般的な対立遺伝子について2つの標準で検査DNAを分析することにより、ありふれた変異体を他の対立遺伝子から区別することが可能である。
【０４０７】
上記の実験において検査される断片の数は、シーケンシングゲルの相対的に低い分解能のために制限される。断片間を区別するよりすぐれた力をもつ方法は、MRDの最大限の可能性を達成するために必要である。例えば、マイクロアレイハイブリダイゼーションは、何千というDNAを同時に用いる様々な定量アッセイのために現在、広く利用されている。MRD方法における最後の検出段階としてマイクロアレイハイブリダイゼーション技術を適合させることにより、何千という断片が同時に変異についてスキャンされうることを本発明者らは期待している。
【０４０８】
ヘテロ二本鎖形成へ導くハイブリダイゼーション段階および形質転換段階を含む、異なるMRD段階は、同時に5,000個までの断片を適応させうる可能性が高い。このハイブリダイゼーションは、以前に成功裡に実施された溶液ハイブリダイゼーション(28)より複雑性が低い。典型的には、MRD方法の終わりに、百万個の形質転換体を得る；この数は、約5,000個までの断片を分析するのに十分であるはずである。マイクロアレイハイブリダイゼーション段階は、標的として10,000個より多い遺伝子、およびプローブとして細胞全体のRNAを用いる典型的マイクロアレイ発現適用より単純であると思われる。MRDについてのシグナル対ノイズ比は、各断片が独立して検出されるため、何千という断片を含む適用までスケールアップする場合、好ましいままである可能性が高い。本発明者らの実験は、ここまでは、この比が2個から45個までの断片のスケールアップにおいて一定のままであることを示した。
【０４０９】
多重化のための潜在能力のため、MRDは、多数の個体における多数の断片が変異についてスキャンされるそれらの適用に最も適している。現在、意味ある程度の多重化に適応させうるスキャニング技術はVDAであり、30 kbほどものヒトDNA、本明細書に提示されている作業において網羅されているものより約3倍大きいDNA、において変異についてスキャンするために用いられた。しかしながら、このVDAの適用は、感度および特異性の両方についての問題に出くわした。さらに、必要とされる多数のプローブは処理量を制限し、VDAの費用を増加させる。例えば、変異について300 bp断片をスキャンするためにVDAを用いる場合、アレイ上に少なくとも3,000個のオリゴが必要とされる。対照的に、上で提案されているように、読み出しとしてのアレイハイブリダイゼーションと共にMRDを使用する場合、300 bpの断片は、アレイ上の1つのプローブを用いて変異についてスキャンされうる。各断片を検索するために必要とされるプローブの数における差異は、MRDについての可能性的に非常により高い処理量およびより低い費用に反映される。
【０４１０】
ハイスループットスキャニング技術の不在およびSNPゲノタイピング方法体系の相対的価値を考慮すれば、ありふれた疾患についての感受性対立遺伝子を同定するための提案は、ありふれたSNPの一般的なセットをゲノタイピングすることに集中させた。これらの方法は、疾患感受性対立遺伝子がありふれていることを想定している。ありふれた疾患の一因となるほんの少数の遺伝子がすでに同定されている。いくつかの例におけるこれらの疾患に関与する対立遺伝子は、ありふれていたものであったが、数個の他の例において、相対的にまれな対立遺伝子が疾患に関連しているまたは疾患の原因となる。最近の研究は、ありふれた疾患との関与について可能性のある候補とみなされる多数の遺伝子において、変異体についてスキャンした；これらの研究は、一般的に、非同義のコード配列変異体は相対的にまれであり、かつしばしば、特定の民族の集団に特異的であることを示した。ありふれた疾患が、一般的な対立遺伝子およびまれな対立遺伝子の組み合わせにより引き起こされる可能性が高い。患者と対照間の包括的な遺伝子の配列比較は、まれな、または民族的に特異的な対立遺伝子のハイスループット検出を可能にし、それゆえに、ありふれた疾患の遺伝的根拠の解明のために現在提案されているものより包括的なモデルを提供する。そのような比較は、直接的シーケンシングにより行われうるが、これは、現在のところ、著しく高額の費用がかかる事業である。
【０４１１】
すべての遺伝子のすべてのコード領域および制御領域のMRD分析は、疾患関連変異体を同定するために、選択された患者と対照の包括的な配列比較を提供しうることを本発明者らは提案する。単一のMRD反応において長さが平均して300 bpである5,000個の断片を検査することにより、1.5メガベース(Mb)のゲノムDNAにおけるそのような配列比較を行うことができた。それゆえに、100個のMRD反応において、150 MbのDNA、個体におけるコード領域の推定される合計よりも大きい量、までスキャンすることができた。MRDがこのスケールで適用されうる前に、すべての遺伝子およびそれらの制御領域についての完成した配列の同定、数十万個の標準の構築、およびPCR多重化における向上かまたは多数のDNA断片を捕獲するための代替方法かのいずれかを含む、多数の開発が起こる必要がある。短期的観点からは、本発明者らは、MRDまたは他のゲノタイピング方法により得点化されうるSNPsを同定するためにMRDを用いること、ならびに患者および対照における候補遺伝子のパネルにおいて変異についてスキャンするためにMRDを用いることを提案する。
【０４１２】
実施例6
マイクロアレイ検出
MRD多重化においてマイクロアレイ検出の利用を実証するために、Lys5遺伝子において1塩基により異なる2つの酵母株、S288CおよびS31を用いる。
【０４１３】
標準クローンは、S288CのPCR産物から構築される。PCR産物は、ゲノムにおける様々な部位においての異なるオープンリーディングフレーム(ORF)についてであり、それらのサイズは、700 bpの平均をもつ80 bp〜1000 bpの範囲である。標準を構築するために、PCR産物をプールし、活性cre遺伝子を有するMRDベクターへライゲーションし、dam−株へ形質転換した。dam−株の個々の形質転換体を、クローニングされた断片を決定するためにシーケンシングする：576個の異なるクローンを同定し、後で、標準として用いる。標準のプール由来の一本鎖DNAが調製される。
【０４１４】
標準のプール由来の一本鎖DNAを、不活性creおよびS288C由来のPCR産物のプールおよびS31由来のLys5 PCR産物を有する直鎖状ベクターにハイブリダイズさせる。ヘテロ二本鎖形成およびMUTATION SORTER(商標)株への形質転換は、上に記載されるように行われる。2つのプールのコロニー由来DNA（テトラサイクリンの存在下で増殖されたものおよびストレプトマイシンの存在下で増殖されたもの）は後で調製かつ直鎖状化される。
【０４１５】
フルオロフォア標識dUTP(ストレプトマイシンプールについてはフルオレセイン、およびテトラサイクリンプールについてはビオチン)でのT3 RNA転写反応は、2つのDNA試料のそれぞれについて別々に行われる。その後、その結果生じたRNAを、2つの別々の反応において、酵母ゲノムマイクロアレイチップへハイブリダイズさせる(市販されている1つのそのようなマイクロアレイチップは、各ORFについて、16対のオリゴヌクレオチドを含み、各対のオリゴヌクレオチドの一方がハイブリダイズされたRNAへ完全なマッチを示し、かつ他方がミスマッチをもつ対照である)。
【０４１６】
テトラサイクリンで増殖されたプールおよびストレプトマイシンで増殖されたプールを用いて得られるハイブリダイゼーションシグナルは、別々に測定かつ比較される。結果は、ストレプトマイシンプールよりテトラサイクリンプールにおいて大いに増加したシグナルをもつ、変異を示す、9個の遺伝子を同定する。予想されたとおり、9個のうちの1個は、Lys5における変異である。9個のうちの4個は、メンバーがファミリーメンバー間で少数の塩基の差異をもつ遺伝子ファミリーを表しており、通常に増幅されて擬似的にヘテロ二本鎖を形成した。9個のうちの2個は、標準においてPCRエラーを有する。
【０４１７】
実施例7
改良されたMRDからバックグラウンドを低減させる
ベクター/宿主株系
最初に記載されるミスマッチ修復検出(MRD)ベクターによるCreリコンビナーゼの不十分な転写および/または翻訳がMRDアッセイにおいてバックグラウンドの一因となるかどうかを試験するために、強力なT7プロモーターにより作動されるcreを含み、Φ10のRBSを有するプラスミドを構築した。2つのベクター(pT7MRD100およびpT7MRD200)は、pT7MRD200におけるcreでの5 bpの不活性にする欠失の存在によってのみ異なる。
【０４１８】
新規の大腸菌宿主株、5HT71は、λDE3(遺伝子型：imm21、Δnin5、sam7、int::lacUV5-T7 RNAポリメラーゼをもつ)でHB101を溶原化し、その後、接合により、上の実施例5に記載されるMUTATION SORTER(商標)株由来のF'エピソームを導入し、このように、以下の遺伝子型をもつ株を作製することにより構築された：F'(lox TetR Rpsl Lox)/Δ(gpt-proA)62、leuB6、SupE44、Ara-14、galK2、LacY1、Δ(mcrR-mrr)、rpsl20、xyl-5、mlt-1、recA13、λDE3(imm21、Δnin5、sam7、int::lacUV5-T7 RNAポリメラーゼ)。本発明者らは、この5HT71株をMUTATION SORTER PRO(商標)株と名付ける。
【０４１９】
2つのベクターをエレクトロポレーションにより別々のアリコートへ形質転換し、形質転換後の回復のために用いられる培地にIPTGを追加した；IPTGは、ラムダ溶原由来のT7ポリメラーゼの発現を誘導する。形質転換体を、1時間の回復後、IPTGを欠く選択プレートに蒔いた。
【０４２０】
活性creを有するプラスミド、pT7MRD100の形質転換体は、予想どおり、アンピシリンおよびストレプトマイシンを追加したプレート上で増殖したが、アンピシリンおよびテトラサイクリンを追加したプレート上では増殖しなかった。不活性creを有するプラスミド、pT7MRD200の形質転換体は、予想どおり、アンピシリンおよびテトラサイクリンを追加したプレート上で増殖したが、アンピシリンおよびストレプトマイシンを追加したプレート上では増殖しなかった。
【０４２１】
新規のベクターがMRDアッセイにおいてシグナル：ノイズ比に少しでも変化をもたらしたかどうかを試験するために、特定の変異を含むことが知られている2つの対照断片を分析した。2つの断片を、活性creを有するプラスミド、pT7MRD100へクローニングした。これらのクローン由来の一本鎖DNAを用いて、直鎖状pT7MRD200および検査断片のPCR産物とハイブリダイズさせた。
【０４２２】
一つの実験において、検査断片の一方は、ヘテロ接合性状態で変異をもち、他方の断片は変異をもたなかった。アニーリング後、TaqリガーゼおよびエキソヌクレアーゼIII処理、加えてSOPE樹脂による一本鎖除去を行った。
【０４２３】
H5T71をエレクトロポレーションにより形質転換し、細胞を、アンピシリンおよびテトラサイクリン、またはアンピシリンおよびストレプトマイシンのいずれかの組み合わせを含むプレート上に蒔く前に、1時間または2時間、IPTGの存在下において回復するようにさせておいた。2つの選択条件のそれぞれからのコロニーを別々にプールし、ミニプレップし、制限エンドヌクレアーゼ消化により二本鎖断片を遊離させた。制限消化物を、断片の分離および定量化のためにアガロースゲル電気泳動にかけた。
【０４２４】
図11は、染色されたアガロースゲルの写真である。第一レーンはサイズマーカーである。他のレーンのすべてにおいて、上端のバンドは変異体断片であり、下端バンドは非変異体断片であり、サイズに基づいて区別可能である。第二レーン(左から)は、IPTGの存在下での1時間の回復をもったストレプトマイシン(分別されていない)プール由来である。第三レーンは、IPTGの存在下での2時間の回復をもったストレプトマイシン(分別されていない)プール由来である。
【０４２５】
第四および第五レーンは、同じ試料：1時間の回復をもったテトラサイクリンプール(分別されたプール)の2つの異なる量の負荷である。第六および第七レーンは、2時間の回復をもったテトラサイクリンプールの2つの異なる量の負荷である。
【０４２６】
図11に示されるように、分別された(tet+)プール対分別されていない(strp+)プールにおけるヘテロ接合性断片の強度比(便宜上、「分別比」と名付けられる)は、非変異体断片のそれより非常に大きく、ミスマッチのある二本鎖が正しくcre同時修復を開始し、正しい表現型的分別へ導いたことを示している。
【０４２７】
シグナル対ノイズ比は、既知のヘテロ二本鎖と既知のホモ二本鎖の間の相対的分別比として計算されうる。
【０４２８】
これらの新規のベクターをMUTATION SORTER PRO(商標)株へ形質転換して、相対的分別比は、約20、実施例5に記載されるベクターおよび菌株で見られるものより約4倍良い。同様の実験をホモ接合性状態での変異を用いて行った。シグナル対ノイズ比における同様の向上がまた実証された(示されず)。
【０４２９】
図11にまた示されるように、IPTGでの1時間の回復またはIPTGでの2時間の回復の間に検出可能な相違はなく、1時間で、組換え事象を触媒するのに十分なcreが発現されたことを示唆した。
【０４３０】
示されていないが、pT7MRD100またはpT7MRD200がMUTATION SORTER PRO(商標)株へ形質転換され、プレートはIPTGを追加された場合、コロニーは増殖しなかった。他方、対照プラスミドpuc19で形質転換された場合、H5T71は、IPTGアンピシリンプレート上で容易にコロニーを生じた。これは、強力なプロモーターT7によるcre(活性型であろうと不活性型であろうといずれにしろ)の連続的誘導が致死性であることを示唆する。これはまた、lacプロモーターから直接的に作動されるCreを有する後者が日常的にIPTGを追加された培地上に蒔かれうるため、新規のベクターは本来のベクターより高いcre発現をもつことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０４３１】
【図１】インビボのミスマッチ修復検出(MRD)についての本発明の方法の態様を示す。
【図２】一本鎖または二本鎖のベクターおよび検査配列としての増幅産物を用いる図1の方法を示す。
【図３】pMF200およびpMF100のプラスミドマップを示す。
【図４】ヘテロ二本鎖DNAの形成を示す。
【図５】ハイブリダイゼーションによるMRD結果の分析を示す。
【図６】図6A〜図6Cは、検出可能マーカーとしてcre/loxを利用するMRDの概略図である。
【図７】スクリーニングされた断片のアクリルアミドゲル読み出しである。
【図８】MRDにより変異について35個の異なる断片をスキャンすることの結果として生じたシーケンシングゲルトレースの例である。
【図９】図9Aおよび図9Bは、ギャップの入ったベクターを構築するための方法を図式化する。
【図１０】図10A〜図10Cは、標準核酸配列からの変異が大腸菌宿主株の抗生物質耐性および感受性におけるCre媒介性変化により提示される、ミスマッチ修復検出(MRD)の好ましい態様を図式化する。
【図１１】染色後のアガロース電気泳動ゲルの写真であり、改良されたMRDベクター/菌株組み合わせにより向上した表現型的分別を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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