(57)【要約】  本発明は、分子シャペロン熱ショックタンパク質90(Hsp90)と相互作用し、Hsp90活性を促進する(「Aha1」と呼ぶ)新規コファクターの同定に関する。この相互作用に基づく様々なアッセイ方法および治療的な応用を提供する。
2005517184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)Hsp90ポリペプチド、Aha1ポリペプチド、およびテスト化合物を接触させること；ならびに
(ｂ)該Aha1ポリペプチドと該Hsp90ポリペプチドとの相互作用を測定すること
を含む、Aha1とHsp90との相互作用をモジュレートする薬剤を得る方法。
【請求項２】
前記Hsp90ポリペプチドのATPアーゼ活性を測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
(ａ)Hsp90ポリペプチド、Aha1ポリペプチド、およびテスト化合物を接触させること；ならびに
(ｂ)該Hsp90ポリペプチドのATPアーゼ活性を測定すること
を含む、Hsp90のATPアーゼ活性をモジュレートする薬剤を得る方法。
【請求項４】
前記Hsp90ポリペプチドによる無機リン酸塩の生成を測定することを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
リポーター分子の生成を測定することにより、前記無機リン酸塩の生成を測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
カチオン染料とリンモリブデン酸塩複合体との反応により、前記リポーター分子が生成される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Hsp90ポリペプチドがヒトHsp90ポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Hsp90ポリペプチドが、Hsp90α、Hsp90β、GRP94、およびHsp75/TRAP1からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Hsp90ポリペプチドが、データベース登録番号EMBL:SCHSP90 K01387の配列を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Aha1ポリペプチドは、図３に示すAha1ポリペプチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Aha1ポリペプチドが、Genbank受託番号YDR214Wの配列を有する酵母ポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Aha1ポリペプチドが、Genbank受託番号AJ243310の配列を有するヒトポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
１つ以上のマーカータンパク質の細胞レベルをモジュレートする前記テスト化合物の能力を決定することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上のマーカータンパク質は、RAF-1、CDK4、ErbB2およびHsp70からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞成長、細胞運動性、細胞増殖、アポトーシス、細胞周期事象、血管新生、および転移のうちの１つ以上を阻害する前記テスト化合物の能力を決定することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前期テスト化合物を、Hsp90の活性をモジュレートする薬剤として同定することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記テスト化合物を単離および/または精製することを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤を、１つ以上のさらなる成分を含む組成物に処方する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上のさらなる成分が、製薬上許容可能な賦形剤を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を使用して、Hsp90ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を同定すること；および
そこで同定された化合物を、製薬上許容可能な担体と混合すること
を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項２１】
前記化合物を修飾して、その医薬特性を最適化するステップを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
i)AhaIポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの相互作用をモジュレートする化合物を同定すること、
ii)同定された化合物を合成すること；および
iii)該化合物を医薬組成物に組み込むこと
を含む、細胞増殖の障害を治療するための医薬組成物の調製方法。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のアッセイ方法により得られる薬剤。
【請求項２４】
請求項２３に記載の薬剤を含む医薬組成物。
【請求項２５】
Hsp90により仲介される障害を治療するために投与される医薬品の製造における、請求項２４に記載の組成物の使用。
【請求項２６】
前記組成物がAha1ポリペプチドを含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
Aha1ポリペプチドをコード核酸から発現させること；および
Hsp90のATPアーゼ活性を増強する該ポリペプチドの能力を決定すること
を含む、該Aha1ポリペプチドを製造する方法。
【請求項２８】
請求項２３に記載の薬剤を、製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体と混合することを含む、医薬組成物を製造する方法。
【請求項２９】
請求項２４に記載の組成物を個体に投与することを含む、細胞増殖の障害を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
熱ショックタンパク質90アクチベーター
本発明は、分子シャペロン熱ショックタンパク質90(Hsp90)と、コファクターAha1との相互作用の同定に関する。この相互作用は、Hsp90の活性を促進し、Hsp90活性のモジュレーションに基づくアッセイおよび他の方法の開発を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
熱ショックタンパク質90(Hsp90)は、約１〜２％の合計細胞タンパク質を構成し、通常、多数の他のタンパク質の１つと会合した二量体として細胞中に存在する(例えば、Pratt, W.B. (1997) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. Vol. 37, pp. 297-326を参照)。Hsp90は、細胞生存のために必須であり、二重シャペロン機能を示す(Young J.C.ら (2001) J. Cell. Biol., Vol. 154, pp. 267-273)。これは、天然型立体構造が環境ストレス(熱ショック等)により変化した後の多くのタンパク質と相互作用することにより十分なタンパク質折りたたみを確実にし、非特異的な凝集を防止して、細胞ストレス応答において鍵となる役割を果たす(Smithら, (1998) Pharmacological Review, Vol. 50, pp. 493-513)。さらに、最近の証拠は、Hsp90が、おそらく変異型タンパク質の不適切な折りたたみを正すことによって、突然変異の影響を和らげる役割も果たすことを示唆している。
【０００３】
Hsp90は、重要な調節的な役割も有する。正常な生理学的条件下では、Hsp90は、その小胞体ホモログGRP94(受託番号：P14625)と共に、細胞中で管理的(housekeeping)役割を果たし、立体構造安定性、およびいくつかの鍵となるclientタンパク質の成熟を維持する。これらは、３つのグループに細かく分類することができる：すなわち(ａ)ステロイドホルモン受容体、(ｂ)Ser/Thrまたはチロシンキナーゼ(例えば、ErbB2、RAF-1、CDK4およびLCK)、ならびに(ｃ)明らかに関連しないタンパク質の集合(例えば、変異型p53およびテロメラーゼhTERTの触媒サブユニット)。これらのタンパク質は、細胞中の多数の生理学的および生化学的プロセスにおいて鍵となる調節的な役割を果たす。
【０００４】
分子シャペロンHSP90は、腫瘍の表現型を駆動させるのに極めて重要である多数のシグナリング経路の調節に関与するため、抗癌薬開発のための貴重な標的である可能性がある。
【０００５】
酵母Hsp90(Panaretou Bら (1998)、前掲)、大腸菌Hsp90(HtpG)、および哺乳動物ホモログTrap1(Feltsら (2000) J. Biol. Chem. 275 3305-3312: AAC02679)について固有のATPアーゼ活性が示されてきたが、ゲルダナマイシン感受性ATPアーゼ活性を、ヒトHsp90を含む他のHsp90ポリペプチドにおいて実証することが困難であることが分かっている。
【０００６】
本発明者らは、これまで特徴決定されていなかったAha1タンパク質が、Hsp90のATPアーゼ活性を促進することを予想外に発見した。この促進により、初めて、ヒトHsp90のATPアーゼ活性が検出可能になった。Aha1によるHsp90ゲルダナマイシン感受性ATPアーゼ活性の促進により、例えば、Aha1とHsp90との相互作用を妨害することにより、Hsp90活性をモジュレートする(すなわち上昇または低下させる)化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを行うことが可能になる。
【０００７】
本明細書の実験作業および議論に基づき、本発明は、Hsp90とAha1との相互作用(Aha1によるHsp90活性の促進、およびこのAha1仲介型Hsp90活性のモジュレーション)の様々な態様に関する。
【０００８】
本発明の様々な態様は、Hsp90の活性(特にATPアーゼ活性)をモジュレートする薬剤を同定および/または得るためのスクリーニング方法およびアッセイにおけるAha1ポリペプチドの使用を提供する。
【０００９】
本発明の全般的な態様のひとつは、Aha1ポリペプチドの活性をモジュレートする薬剤を同定および/または得る方法を提供し、該方法は；
(ａ)Aha1ポリペプチドとテスト化合物とを接触させること；および
(ｂ)該Aha1ポリペプチドと該テスト化合物との結合を判断すること
を含む。
【００１０】
結合の存在は、テスト化合物が、Aha1活性をモジュレートする推定上の薬剤であることを示す。適切なAha1活性は、Hsp90 ATPアーゼ活性の促進を含み得る。
【００１１】
Aha1とHsp90との相互作用をモジュレートする薬剤を同定および/または得る方法は；
(ａ)Hsp90ポリペプチド、Aha1ポリペプチド、およびテスト化合物を接触させること；ならびに
(ｂ)該Aha1ポリペプチドと該Hsp90ポリペプチドとの相互作用を判断すること
を含み得る。
【００１２】
テスト化合物の存在下でのAha1ポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの相互作用は、匹敵する反応培地および条件下でかつテスト化合物の不在下でのAha1ポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの相互作用と比較してもよい。
【００１３】
テスト化合物の存在下および不在下における相互作用の差(すなわち、上昇または低下)は、テスト化合物がAha1とHsp90との相互作用をモジュレートする薬剤であることを示す。
【００１４】
Aha1ポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの相互作用を低減または阻害するテスト化合物は、陽性テスト(positively-testing)剤の不在下で、このような相互作用を生じさせる条件を使用して同定し得る。このような化合物は、例えばHsp90仲介型障害の治療においてHsp90の機能を阻害する薬剤するとして使用され得、例えば以下に記載する増殖等の細胞活性に対して影響を及ぼし得る。
【００１５】
Aha1ポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの相互作用を上昇または増強するテスト化合物が、陽性テスト剤の不在下ではこのような相互作用を生じさせない条件を使用して同定され得る。このような化合物は、例えばHsp90仲介型症状の治療において、Hsp90の機能を増強する薬剤として使用され得、例えば増殖等の細胞機能に対して影響を及ぼし得る。
【００１６】
Aha1ポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの相互作用を決定することは、Aha1ポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの結合を決定すること、および/またはAha1ポリペプチドの存在下でのHsp90活性(例えば、Hsp90 ATPアーゼ活性)の促進もしくは増強を決定することを含み得る。
【００１７】
本発明による使用に適したHsp90ポリペプチドは、真核生物Hsp90、好ましくは、哺乳動物Hsp90、またはその変異体、ホモログ、変種(variant)、誘導体もしくは対立遺伝子である。適切なポリペプチドは、表１に示すHsp90タンパク質の配列を有し得るか、またはその変種、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体であり得る。一部の好適な実施形態では、Hsp90ポリペプチドは、ヒトHsp90ポリペプチドであり、例えば、ヒトアイソフォームHSP90α、Hsp90β、GRP94またはHSP75/TRAP1の１つ、例えば、HSP90α、Hsp90βまたはGRP94であり得る。
【００１８】
表１に示すHsp90ポリペプチドの変種、対立遺伝子、誘導体または変異体であるHsp90ポリペプチドは、表１に示すHsp90ポリペプチドの配列と配列と約50％を上回る、55％を上回る、約60％を上回る、約65％を上回る、約70％を上回る、約75％を上回る、約80％を上回る、約85％を上回る、約90％を上回る、約95％を上回る、または約98％を上回る配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み得る。表１のHsp90ポリペプチドのこのような変種、対立遺伝子、誘導体または変異体は、表１のHsp90ポリペプチドのHsp90活性を有することが好ましい。
【００１９】
本発明の方法において使用するHsp90ポリペプチドは、以下の配列モチーフを１つ以上含むことが好ましい：
(ａ)NKEIFLRELISN(S/A)SDALDKIR
(ｂ)LGTIA(K/R)SGT
(ｃ)IGQFGVGFYSA(Y/F)LVA(E/D)
(ｄ)IKLYVRRVFI
(ｅ)GVVDS(E/D)DLPLN(I/V)SRE
本発明における使用に適したAha1ポリペプチドは、真核生物Aha1であり得る。適切なポリペプチドは、図３に示すAha1タンパク質の配列を有し得るか、または図３に示す配列とは異なるがその変種、対立遺伝子、誘導体もしくは変異体である配列を有し得る。一部の好適な実施形態では、Aha1ポリペプチドは、データベース受託番号YDR214W(サッカロミセスゲノムデータベース番号：S0002622)の配列を有する核酸にコードされる酵母(S.セルヴィシエ(S.cervisiae))ポリペプチドか、ヒトポリペプチド(データベース受託番号：AJ243310)であり得る。
【００２０】
変種、対立遺伝子、誘導体または変異体は、酵母Aha1(データベース受託番号：YDR214W)の配列、または図３に示す他の配列(Hch1等)と約35％を上回る、55％を上回る、約60％を上回る、約65％を上回る、約70％を上回る、約75％を上回る、約80％を上回る、約85％を上回る、約90％を上回る、約95％を上回る、または約98％を上回る配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み得る。
【００２１】
特定のアミノ酸配列変種は、１つのアミノ酸、2、3、4、5〜10、10〜20、20〜30、30〜50、または50を上回るアミノ酸の挿入、付加、置換または欠失により、本明細書に記載する公知のHsp90またはAha1ポリペプチド配列と異なり得る。
【００２２】
Aha1ポリペプチドは、以下の配列モチーフを１つ以上含むことが好ましい：
(ａ)NX*1NWHWXXX(D/N)XXXW(S/A)X*2X(F/L)
(ｂ)G(D/E)XX*3XXRKXK*4(I/L)X(F/Y)(D/E)*5*6
(ｃ)W(R/K)(F/L)X(W/Y)
(ｄ)*7*8XXIXXX(F/L)G(F/Y)
ここで、Ｘは、任意のアミノ酸であり、*は、いくつかの保存的変化を有する位置である。例えば、*1は(N/H)、*2は(D/N/E)、*3は(V/A/I)、*4は(P/V/I/L)、*5は(L/M/W)、*6は(Q/R/K/N/E/S/V)、*7は(Y/I/F)、および*8は(V/F/W/I/L)であり得る。
【００２３】
Hsp90またはAha1ポリペプチドは、完全長Hsp90またはAha1ポリペプチドの活性を保持する、完全長ポリペプチド配列(例えば、表１もしくは図３の配列)の部分、セグメント、または断片からなり得、特にこのような断片はAha1またはHsp90ポリペプチドにそれぞれ結合する。
【００２４】
好適な実施形態では、完全長ポリペプチドの断片であるAha1ポリペプチドは、本明細書に記載のＮ末端ドメインを含み得る。
【００２５】
ポリペプチドの「断片」、「部分」または「セグメント」は、概して、完全長アミノ酸配列よりも短い、例えば、411アミノ酸未満、400アミノ酸未満、350アミノ酸未満、300アミノ酸未満、250アミノ酸未満、200アミノ酸未満、150アミノ酸未満、100アミノ酸未満、50アミノ酸未満、30アミノ酸未満、または25アミノ酸未満のアミノ酸残基の列を意味する。断片は、概して、少なくとも５アミノ酸、例えば、少なくとも７アミノ酸、少なくとも10アミノ酸、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、または少なくとも35アミノ酸からなる。
【００２６】
上記したHsp90のゲルダナマイシン感受性ATPアーゼ活性を促進するAha1ポリペプチドは、本発明の態様として提供される。
【００２７】
配列同一性は、一般的に、アルゴリズムGAP(Genetics Computer Group, Madison, WI)を参照して定義される。GAPは、NeedlemanおよびWunschアルゴリズムを使用して、適合数を最大にし、ギャップ数を最小にするように２つの完全配列をアラインさせる。一般的に、ギャップ作成ペナルティ＝12、およびギャップ延長ペナルティ＝4として、デフォルトパラメータを使用する。
【００２８】
GAPの使用が好ましいが、他のアルゴリズムも使用できる。例えば、BLAST(Altschul ら(1990) J. Mol. Biol. 215:405-410の方法を使用)、FASTA(PearsonおよびLipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を使用) Smith-Watermanアルゴリズム(SmithおよびWaterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197)、またはAltschulら (1990)前掲のTBLASTNプログラムがあり、概してデフォルトパラメータを採用する。特に、psi-Blastアルゴリズム(Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402)が使用できる。
【００２９】
場合に応じて関連するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列と比較して、本明細書に記載の関連する配列の完全長にわたり、またはより好ましくは、約20、25、30、33、40、50、67、133、167、200、233、267、300、333以上のアミノ酸もしくはヌクレオチド３塩基連鎖の連続配列にわたり配列比較を行うことができる。
【００３０】
本明細書に記載する２つのタンパク質間の相互作用とは、２つのタンパク質が、非共有的分子間結合を介して互いと特異的に結合することを意味する。
【００３１】
相互作用または活性の決定は、定量的でも定質的でもあってよく、相互作用または活性の存在を検出することを含んでもよく、例えば、特定の閾値を超える相互作用または活性の存在を検出すること、および該相互作用または該活性の量またはレベルを測定することを含み得る。
【００３２】
本発明の別の態様は、Hsp90のATPアーゼ活性をモジュレートする薬剤を同定および/または得る方法であって：
(ａ)Hsp90ポリペプチド、Aha1ポリペプチド、およびテスト化合物を接触させること；ならびに
(ｂ)該Hsp90ポリペプチドのATPアーゼ活性を決定すること
を含む、方法を提供し得る。
【００３３】
Hsp90 ATPアーゼ活性は、ゲルダナマイシン感受性ATPアーゼ活性であり得る。適切なHsp90およびAha1ポリペプチドは、上により詳細に記載している。
【００３４】
Hsp90ポリペプチド、Aha1ポリペプチドおよびテスト化合物は、テスト化合物の不在下においてHsp90のATPアーゼ活性が見とめられる条件下で接触され得る。
【００３５】
テスト化合物の存在下におけるHsp90ポリペプチドのATPアーゼ活性は、匹敵する反応培地および条件下で、テスト化合物の不在下でのHsp90ポリペプチドのATPアーゼ活性と比較してもよい。
【００３６】
不在の場合と比べた、テスト化合物の存在下におけるHsp90 ATPアーゼ活性における変化(すなわち、上昇または低下)は、テスト化合物がHsp90活性をモジュレートする薬剤であることを示す。
【００３７】
本明細書に記載の標準アッセイを使用して(例えば、無機リン酸(Pi)の産生を決定することにより)ATPアーゼ活性を決定し得る。Pi産生は、例えば、リポーター分子の生成または枯渇を測定または決定することにより決定できる。以下に記載する適切なフォーマットのひとつでは、カチオン性マラカイトグリーン染料とリンモリブデン酸塩複合体との反応により検出可能なリポーター分子を産生する。
【００３８】
ATPアーゼ活性は、テスト化合物の存在下または不在下において測定され得る。テスト化合物の不在下に対する存在下での上記活性の変化(すなわち、上昇または低下等の差)は、該テスト化合物がHsp90のATPアーゼ活性をモジュレートする薬剤であることを示す。活性の低下は、テスト化合物がHsp90のATPアーゼ活性を阻害する薬剤であることを示し、活性の上昇は、テスト化合物がHsp90のATPアーゼ活性を促進する薬剤であることを示す。テストサンプル中のATPアーゼ活性の決定方法は、サンプル中の基質量を定量することを含み得る。
【００３９】
テスト化合物は、ATP等の適切な基質の存在下でHsp90ポリペプチドおよびAha1ポリペプチドと接触され得る。
【００４０】
Hsp90 ATPアーゼ活性は、ゲルダナマイシンの存在下および不在下において決定され得る。ゲルダナマイシンの不在下と比べて存在下におけるATPアーゼ活性の変化(例えば、ATPアーゼ活性の低下、失効、または根絶)は、ATPアーゼ活性がゲルダナマイシン感受性を有することを示す。
【００４１】
本発明の方法は、Hsp90の活性をモジュレートする薬剤として上記テスト化合物を同定することを含み得る。
【００４２】
本発明の方法を使用して、テストサンプル中のHsp90の量またはレベルを決定してもよい。このようなアッセイでは、サンプル中のHsp90のATPアーゼ活性を決定し、較正曲線と比較して、サンプル中に存在するHsp90の量またはレベルを決定してもよい。適切な較正曲線は、例えば、既知純度の組換え/発現タンパク質を使用して、既知量のタンパク質の活性(すなわち、タンパク質基準)を決定することにより作成され得る。
【００４３】
２つの分子間の結合についてテストする本発明の方法のためにタンパク質全体を使用する必要はない。当業者に公知の任意の適切な手法により、断片を作製および使用し得る。断片を作製する適切な手法としては、コードDNAからの断片の組換え発現が挙げられるがこれに限定されない。このような断片は、コードDNAを得て、発現する部分の両側の適切な制限酵素認識部位を識別し、DNAから該部分を切り抜くことにより作製され得る。次いで、この部分を、市販されている標準的な発現系中の適切なプロモーターに作用可能に連結し得る。別の組換えアプローチは、適切なPCRプライマーでDNAの関連部分を増幅することである。当該分野で周知のペプチド合成方法を使用して、(例えば、約20〜30アミノ酸にいたる)小さい断片を作製してもよい。
【００４４】
上記のHsp90の適切な断片は、完全長ポリペプチドのATPアーゼ活性を保持するものである。Aha1の適切な断片は、Hsp90 ATPアーゼ活性を増強する能力を保持するもの、例えばAha1 Ｎ末端ドメインを含む断片である。例えば、欠失分析またはアラニン走査等の技術を使用して同定される、小さい断片、およびこれらの類似体および変種も同様に採用され得る。種間で保存され、Aha1活性において役割を果たす残基は、図３に示す。
【００４５】
テスト化合物は、Aha1とHsp90との相互作用、またはHsp90のAha1仲介型ATPアーゼ活性に対する影響を決定する小さい化学実体、ペプチド、抗体分子、または他の分子であり得る。適切なテスト化合物は、例えば、以下に記載するコンビナトリアル化学を使用して、化合物集合および設計化合物から選択され得る。本発明の方法を使用して、テスト化合物が、Hsp90 ATPアーゼ活性をモジュレートする薬剤であるか否かを決定し得る。
【００４６】
当業者は、常套的な技術および知識をもって、本発明のスクリーニングまたはアッセイ方法のいずれの細かいフォーマットも変えることができる。当業者は、適切な対照実験を採用する必要性を十分承知している。
【００４７】
Aha1とHsp90との相互作用の決定方法、およびHsp90のATPアーゼ活性をモジュレート可能な薬剤のスクリーニング方法は、適切な評価項目を使用して相互作用を評価する方法を含む。相互作用は、当該分野で公知の多数の技術のいずれかにより定質的または定量的に決定され得る。これらとしては、ラジオイムノアッセイ、同時免疫沈降、シンチレーション近接アッセイ、ELISA、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、遺伝子発現マイクロアッセイ、およびノーザンブロット方法等の技術が挙げられる。
【００４８】
他の適切な評価項目としては、以下により詳細に記載する従来方法を使用してATP、ADPまたはPiのレベルの変化を決定することによりHsp90 ATPアーゼに対する影響を測定することが挙げられる。
【００４９】
Aha1とその結合パートナー(Hsp90等)との結合は、いずれか一方を検出可能標識で標識化し、固体支持体上に固定化され得る他方と接触させることにより調査され得る。
【００５０】
特にペプチジル基質のために適切な検出可能標識としては、組換え生成されたペプチドおよびポリペプチドに取り込みうる35S-メチオニンが挙げられる。組換え生成されたペプチドおよびポリペプチドは、抗体で標識化され得るエピトープを含む融合タンパク質としても発現され得る。
【００５１】
固体支持体上に固定化されるペプチドは、固体支持体に結合させるペプチドに対する抗体を使用するか、またはそれ自体で知られている他の技術を介して(例えば、ビオチン/ストレプトアビジン相互作用を使用して)固定化され得る。好適なin vitro相互作用は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)を含む融合ペプチドを利用し得る。これは、グルタチオンアガロースビーズ上に固定化され得る。上記した種類のin vitroアッセイ形式では、テストモジュレーターを、固定化GST-融合ペプチド(例えば、GSTとHsp90含有ペプチドとの固定化融合ペプチド)に結合する標識化ペプチド(例えば、標識化Aha1)の量を減少させる能力を決定することによりアッセイできる。これは、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりグルタチオン-アガロースビーズを分画化することにより決定され得る。あるいはまた、ビーズを濯いで非結合ペプチドを除去し、例えば、適切なシンチレーションカウンターに存在する標識の量を計算することにより結合したペプチドの量を測定してもよい。
【００５２】
Aha1と結合パートナー(Hsp90等)との結合または相互作用は、ツーハイブリッドアッセイを使用しても決定され得る。
【００５３】
例えば、Aha1ポリペプチド、Hsp90ポリペプチド、またはいずれかの断片を、DNA結合ドメイン(酵母転写因子GAL4のもの等)と融合させてもよい。GAL4転写因子は、２つの機能的ドメインを含む。これらのドメインは、DNA結合ドメイン(GAL4DBD)およびGAL4転写活性化ドメイン(GAL4TAD)である。Aha1ポリペプチドまたはその断片をこれらのドメインのひとつと融合、およびHsp90またはその断片をそれぞれの対応物と融合させることにより、２つのペプチドが相互作用する場合にのみ機能的GAL4転写因子が復元する。従って、リポーター遺伝子の転写を活性化可能なGAL4 DNA結合部位に連結した該リポーター遺伝子を使用してこれらのペプチドを測定し得る。
【００５４】
このツーハイブリッドアッセイ系は、FieldsおよびSong, 1989, Nature 340; 245-246に記載されている。これは、哺乳動物細胞および酵母の両方において使用できる。DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインのその他の組合せは、当該分野で利用可能であり、LexA DNA結合ドメインおよびVP60転写活性化ドメイン等が好ましくあり得る。
【００５５】
Aha1ポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの相互作用を妨害し、従ってHsp90のAha1仲介型ATPアーゼ活性をモジュレートする物質を探す場合には、例えばLexA DNA結合ドメインとの融合のためにAha1またはHsp90のペプチド断片を、および例えばVP60との融合のためにHsp90またはAha1を含む対応ペプチド断片を採用してもよい。発現カセットを使用して、宿主細胞中でテストペプチドを発現させてもよい。
【００５６】
上述したように、本発明の方法は、ATPアーゼ活性を決定することを含み得る。HSP90の固有のATPアーゼ活性を測定する２つの方法が記載されており、両方とも酵母HSP90をモデル系として使用する。
【００５７】
第１の方法は、再生(regenerating)共役酵素アッセイを利用する。再生ATPアーゼアッセイは、Aliら, 1993ら Biochemistry Vol. 32, pp. 2717-2724に記載されているピルビン酸キナーゼ/乳酸デヒドロゲナーゼ結合アッセイを使用して、実施できる。
【００５８】
HSP90により生成されるADPは、ホスホエノールピルビン酸(PEP)を基質として利用したピルビン酸キナーゼによりリン酸化され、生成物としてATPおよびピルビン酸を産生する。次いで、ピルビン酸を、NADに変換するNADHを利用して、乳酸デヒドロゲナーゼによって乳酸に変換させる。
【００５９】
NADH濃度のこの消費により、分光高度的にモニタリングされる340 nmにおける吸光度の減少が生じる。従って、HSP90のATPアーゼ活性により生成されるADPのモルごとに１モルのNADHを利用する。HSP90を添加する前に、酵素系は、ATP基質中に存在するあらゆる汚染ATPを変換することを付記しておく。これは、ATPよりもADPの結合に対してより強い親和性を示すHSP90等の酵素にとって重要である。
【００６０】
無機リン酸の測定するためにマラカイトグリーンの使用に基づく第２の方法は、ハイスループットスクリーニング(HTS)のために設計され、新規HSP90阻害剤候補を同定した。リンモリブデン酸複合体の形成に基づき、リン酸を決定するための比色分析アッセイ(マラカイトグリーンATPアーゼアッセイ等)を数ステップで高くない試薬で実施でき、これはハイスループットスクリーニングに必要な自動化によく適している(例えば、Coganら (1999) Anal. Biochem. Vol. 271, pp. 29-35を参照のこと)。
【００６１】
無機リン酸を放出する酵素は、610 nmで最大の吸光度を有して青-緑色を生成する、カチオン染料であるマラカイトグリーンと、リンモリブデン酸複合体との反応を使用してアッセイする(例えば、Baykovら, (1988) Anal. Biochem., Vol. 171, pp. 266-270；Harderら, (1994) Biochem. J. Vol. 298, pp. 395-401.；Maehamaら, (2000) Anal. Biochem. Vol. 279, pp. 248-250を参照のこと)。
【００６２】
本方法は、ハイスループット(例えば、Rumsfeldら, (2000) Protein Expr. Purif. Vol. 18, pp. 303-309を参照)、および超ハイスループットスクリーニングフォーマット(例えば、Laveryら, (2001) J. Biomol. Screen. Vol. 6, pp. 3-9)の両方において使用されてきた。しかし、本方法は、酸性マラカイトグリーン試薬の存在下におけるATPの非酵素加水分解により色が増えて、複雑化している(例えば、Chanら, (1986) Anal. Biochem. Vol. 157, pp. 375-380；Henkelら, 1988 Anal. Biochem. Vol. 169, pp. 312-318)。このプロセスはモリブデン酸塩により仲介されており、試薬の直後にクエン酸ナトリウムを添加することにより打開することができる(例えば、Lanzettaら (1979) Anal. Biohem. Vol. 100, pp. 95-97；Schirmerら (1988) J. Biol. Chem. Vol. 273, pp. 15546-15552；Baginskiら (1975) Ann. Clin. Lab. Sci. Vol. 5, pp. 399-416を参照)。この修飾は、他のATPアーゼについて既に記載されている96ウェルマイクロタイタープレートアッセイに適応されて(例えば、Lanzettaら (1979) 前掲を参照)、ハイスループットスクリーニングに適した、HSP90 ATPアーゼに対する以下のプロトコールが作成されている。
【００６３】
スクリーニングし得る化合物は、薬剤スクリーニングプログラムにおいて使用される天然型または合成化学化合物であり得る。いくつかの特徴決定されたまたは特徴決定されていない成分を含む、植物、微生物、または他の生物の抽出物も使用され得る。
【００６４】
コンビナトリアルライブラリー技術は、相互作用をモジュレートする能力について膨大な数の可能性のある異なる物質をテストする効率的な方法の一例である。このようなライブラリーおよびそれらの使用は、とりわけ天然型産物、小分子およびペプチドのあらゆる様式について当該分野で知られている。特定の状況においては、ペプチドライブラリーの使用が好ましい。
【００６５】
本発明の方法に添加し得るテスト物質または化合物の量は、通常、使用する化合物の種類に応じて試行錯誤により決定される。典型的に、約0.001 nM〜1 mM以上、例えば0.01 nM〜100μM、例えば0.1〜50μM(約10μM等)の濃度の推定上の阻害剤化合物が使用できる。弱い影響を引き出す分子でさえも、さらなる調査および開発用の有用なリード化合物となり得る。
【００６６】
推定上の阻害剤化合物の１つのクラスは、Aha1ポリペプチドおよび/またはそれと相互作用するHsp90ポリペプチドから誘導され得る。約5〜40アミノ酸、例えば6〜10アミノ酸の膜浸透性ペプチド断片を、そのような相互作用または活性を妨害する能力についてテストしてもよい。
【００６７】
ペプチド断片は、Aha1配列の欠失分析および/またはアラニン走査の手段により得てもよい(配列中で適切な突然変異を生じさせ、Aha1の変異型断片をHsp90またはその断片と一緒にし、好ましくはHsp90のATPアーゼ活性を測定またはモニタリングすることにより相互作用を決定する)。好適な実施形態では、以下に論述するようにペプチドは短く、Hsp90と相互作用可能なおよび/または関連する相互作用を阻害可能な最小部分であり得る。同様に、Aha1とHsp90との相互作用を阻害可能なHsp90のペプチド断片を、Hsp90のAha1誘導型ATPアーゼ活性を阻害するのに使用してもよい。
【００６８】
当業者は、本明細書に記載の技術、および当該分野で周知の他の技術を使用して、例えばコード核酸からの発現により、大量のペプチドを生成することができる。
【００６９】
ペプチドは、全体的または部分的に、化学合成によっても生成され得る。本発明の化合物は、よく確立された標準液体、もしくは好ましくは固相ペプチド合成方法(これらの全般的な説明は広く入手可能である(例えば、J.M. StewartおよびJ.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 第二版, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)、M. BodanzskyおよびA. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)；ならびにApplied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, Californiaを参照))によって簡単に調製され得るか、または液相方法、もしくは固相、液相および溶液化学の任意の組合せにより(例えば、最初に個々のペプチド部分を完成させてから、所望かつ適切な場合には存在する任意の保護基を除去した後に、個々の炭酸もしくはスルホン酸またはそれらの反応誘導体の反応により残基Ｘを導入することにより)溶液中で調製され得る。
【００７０】
上記のペプチド断片の阻害性質は、以下の基をＣ末端に添加することにより高められ得る：すなわち、クロロメチルケトン、アルデヒドおよびボロン酸。これらの基は、セリン、システインおよびトレオニンプロテアーゼの遷移状態類似体である。ペプチド断片のＮ末端は、カルボベンジルによりブロックされて、アミノペプチダーゼを阻害し、安定を改善することができる(Proteolytic Enzymes 第二版, R. BeynonおよびJ. Bond編, Oxford University Press, 2001)。
【００７１】
Hsp90ポリペプチドまたはAhaポリペプチドのいずれかにおける相互作用の部位に方向付けられた抗体は、推定上の阻害剤化合物のさらなるクラスを形成する。候補阻害剤抗体を特徴決定し、それらの結合領域を決定して、相互作用の妨害の原因となる一本鎖抗体およびそのフラグメントを得ることができる。
【００７２】
抗体は、当該分野で標準的な技術を使用して、得ることができる。抗体を生成する方法としては、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジまたはサル)を、タンパク質またはその断片で免疫化することが挙げられる。抗体は、当該分野で公知の様々な技術のいずれかを使用して免疫化動物から得て、好ましくは目的の抗原と抗体との結合を使用してスクリーニングすることができる。例えば、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降が使用され得る(Armitageら, 1992, Nature 357: 80-82)。動物からの抗体および/または抗体産生細胞の単離は、動物を屠殺するステップを伴い得る。
【００７３】
ペプチドで哺乳動物を免疫化する代わりにまたはそれを補うものとして、発現免疫グロブリン可変ドメインの組換え生成ライブラリーから、タンパク質に特異的な抗体を、例えば、表面上に機能的免疫グロブリン結合ドメインを提示するλバクテリオファージまたは繊維状バクテリオファージを使用して(例えば、WO92/01047を参照)得てもよい。ライブラリーは、いずれのタンパク質(または断片)によっても免疫化されていない生物から得た配列から構築された未処置のものか、または目的の抗原に曝された生物から得た配列を使用して構築したライブラリーであり得る。
【００７４】
本発明による抗体は、多数の手法で改変され得る。実際、「抗体」という用語は、所望の特異性を持つ結合ドメインを有するあらゆる結合物質を対象としている。従って、本発明は、抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物、および抗体のホモログ(合成分子、および抗体またはエピトープに結合することを可能にする抗体の形状を模倣する分子を含む)を対象とする。
【００７５】
抗原または他の結合パートナーに結合可能な抗体フラグメントの例としては、VL、VH、C1およびCH1ドメインからなるFabフラグメント；VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；VHドメインからなるdAbフラグメント；単離CDR領域およびF(ab')2フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結された２つのFabフラグメントを含む二価フラグメントがある。一本鎖Fvフラグメントも含まれる。
【００７６】
サンプル上の抗体の反応性は、任意の適切な手段により決定され得る。個々のリポーター分子でタグ付けすることも候補の１つである。リポーター分子は、検出可能そして好ましくは測定可能なシグナルを直接的または間接的に生成できる。リポーター分子の連結は、直接的または間接的、共有結合(例えば、ペプチド結合を介する)または非共有結合であり得る。ペプチド結合を介した連結は、遺伝子融合コード抗体およびリポーター分子の組換え発現によるものであり得る。結合を決定するモードは、本発明の特徴ではなく、当業者であれば、優先事項および一般的な知識により適切なモードを選択することが可能である。
【００７７】
抗体はまた、(例えば、ポリペプチドまたはペプチドのコード核酸から発現させることによるポリペプチドまたはペプチドの生成の後に)本発明の方法において使用するポリペプチドまたはペプチドを精製および/または単離する際にも使用され得る。
【００７８】
抗体は、Hsp90活性を阻害することを考慮してAha1等のHsp90相互作用コファクターを妨害する(予防を含み得る)治療的な目的のために有用であり得る。抗体は、例えば、(既に上述した)放射線療法および/または化学療法の対象となる細胞(例えば、腫瘍部位)に微量注入され得る。本明細書において別途議論する他の治療目的および非治療目的のために、本発明に従って抗体を採用してもよい。
【００７９】
他の候補阻害化合物は、ポリペプチドまたはペプチド断片の３次元構造をモデリングし、合理的な薬剤設計を使用して、特定の分子形状、大きさ、および電荷特徴を有する可能性のあるモジュレーター(例えば、阻害剤)化合物を得ることに基づき得る。
【００８０】
可能性のあるモジュレーター化合物は、本発明の方法においてAha1/Hsp90結合またはHsp90活性をモジュレートするペプチドまたは他の化合物の「機能的類似体」であり得る。機能的類似体は、問題となるペプチドまたは他の化合物と同じ機能的活性を持つ(すなわち、Aha1とHsp90との結合を妨害し得る)。このような類似体の例としては、接触領域におけるHsp90またはAha1の三次元構造、特に、鍵となる(つまりHsp90またはAha1に現れる)アミノ酸残基のアレンジメントを真似るようにモデリングされた化学化合物が挙げられる。
【００８１】
Hsp90ポリペプチドおよびAha1ポリペプチドは、Hsp90活性を阻害するのに適したこれらの分子の模倣体を設計する方法において使用され得る。
【００８２】
従って、本発明は、Hsp90/Aha1複合体相互作用、またはHsp90の活性をモジュレートする(例えば阻害する)生物学的活性を有するHsp90およびAha1ポリペプチドの模倣体を設計する方法を提供し、該方法は：
(i)生物学的活性を有する物質を分析して、活性に必須かつ重要なアミノ酸残基を決定して、活性基を定義すること；ならびに
(ii)活性基をモデリングして、生物学的活性を有する候補模倣体を設計および/またはスクリーニングすること、を含む。
【００８３】
適切なモデリング技術は当分野で公知である。これには、分子の機能的相互作用の調査、およびこれらの相互作用を再現できるようにアレンジされた官能基を含む化合物の設計を伴ういわゆる「模倣体」の設計が含まれる。
【００８４】
模倣体の生成を含む、特性を最適化するための「リード」化合物のモデリングおよび修飾を、以下にさらに記載する。
【００８５】
１つ以上の一次スクリーニング(例えば、細胞非含有系)を使用して、Hsp90のATPアーゼ活性をモジュレート(例えば、阻害)すると同定された薬剤は、１つ以上の二次スクリーニングを用いてさらに評価され得る。二次スクリーニングは、上記したHsp90の生物学的機能についてテストすることを伴い得る。
【００８６】
二次スクリーニングにおいて評価され得る適切な生物学的機能は、細胞増殖、血管新生、アポトーシス、または移動性/運動性が含まれる。
【００８７】
テスト化合物が、細胞増殖等の機能を調節するか否かの決定は、従来方法を使用して任意の特定の細胞系について実施できる。例えば、特定の化合物により得られる活性を評価するのに都合よく使用できる方法を以下に記載する。
【００８８】
例えば、(例えば、腫瘍から得た)細胞のサンプルをin vitroで成長させ、一次アッセイで同定されたテスト化合物を細胞と接触させる。その後、これらの細胞に対する化合物の影響を観察する。「影響」の例としては、細胞の形態的ステータス(例えば、生死)が決定され得、決定された細胞周期調節を伴う遺伝子の発現レベル、またはアポトーシスもしくは移動性/運動性等の細胞機能の他の要素に対する影響が決定され得る。成長阻害アッセイも、候補Hsp90阻害剤の評価における用途を有する。このようなアッセイのさらなる詳細は以下に提供する。
【００８９】
テスト化合物が細胞に対して影響を及ぼすことが分かった場合、患者における同じ型の細胞(例えば、腫瘍または同じ細胞型の腫瘍)を治療する方法における化合物の効力の予防的または診断的マーカーとして使用され得る。
【００９０】
その他の二次スクリーニングでは、HSP90阻害を示す分子マーカー(例えば、Whitesell, L. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 91, pp. 8324-8328；Clarke, P.A.ら (2000) Oncogene, Vol. 19, pp. 4125-33を参照)が、ウェスタンブロッティング技術または細胞利用型ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)を使用して測定され得る(例えば、Stockwellら (1999) Chem. Biol., Vol. 6, pp. 71-83；Versteegら (2000) Biochem. J., Vol. 350, pp. 717-722を参照)。
【００９１】
従って、本発明のアッセイ方法は、上記テスト化合物が細胞増殖を阻害する能力を決定することを含む。
【００９２】
上記したように、二次スクリーニングを実施して、本明細書に記載したアッセイ方法により同定された化合物のHsp90活性に対するモジュレートの影響を確認できる。Hsp90阻害剤の細胞的影響は、いくつかの分子マーカーを使用して測定できる。既に言及したように、HSP90阻害により、いくつかの重要な細胞シグナリングタンパク質の枯渇が生じる。RAF-1は、ウェスタンブロッティングにより検出し易く、HSP90阻害剤へ曝された後にいくつかのヒト腫瘍細胞系において枯渇することが示されている(例えば、Kellandら, 1999 前掲；Hosteinら, (2001) Cancer Research Vol 61 pp. 4003-4009；Schulteら, (1998) Cancer Chemother. Pharmacol. Vol. 42, pp. 273-279；Clarkeら, 2000 前掲を参照)。枯渇は、通常、６時間までに見とめられ、24時間で最大枯渇が生じる。RAF-1と共に、いくつかのその他のHSP90クライアント(client)タンパク質が、イムノブロッティングにより測定できる(例えば、CDK4、ErbB2)。しかし、これらのタンパク質の一部は細胞系に特異的であることに留意することが重要である(例えば、ErbB2は胸、甲状腺、腎臓、および一部の卵巣腫瘍細胞系において主に発現される)。HSP90阻害の別の非常に重要なマーカーは、熱ショックタンパク質70(HSP70)である。HSF-1(熱ショック因子１)に依存したHSP70レベルの増加が報告されており(例えば、Whitesellら (1994) 前掲；Clarkeら (2000) 前掲を参照)、この影響は、HSP90阻害剤作用の陽性指示体として役目を果たしうる。これらのマーカーの有無を決定するための免疫ブロッティング方法は、標準的な技術を用いて実施され得る。
【００９３】
ウェスタンブロッティングは、細胞系および組織溶解物中のタンパク質発現レベルを評価するための一般的に使用される技術となり、本明細書に記載するアッセイ方法を実施するために使用され得る。適切なプロトコールは当該分野で周知である。
【００９４】
ウェスタンブロッティングは、いくつかの潜在的な欠点を有している。各ゲル上に含まれ得るサンプルの数は限定されており、低レベルで発現されるタンパク質を検出するのに比較的多数の細胞が必要である。また、正確な定量が異なる。
【００９５】
細胞利用型ELISA方法(例えば、Stockwellら, 1999 前掲；Versteegら (2000) 前掲を参照)は、新規メカニズム利用型阻害型の薬力学的効果を評価するいくつかの利点を提供し、リード同定および最適化の繰返しプロセスの間に同定された阻害剤を比較するための選択方法であり得る。この技術を使用して、化合物の有効性を迅速にランク付けし、それらの作用の分子メカニズムを調査できる。ELISAで可能なサンプルスループットの上昇は、化合物が、異なる用量および露出時間の複数の複製を同時に調査できることを意味する。また、観察ごとに必要な細胞の数は、イムノブロッティングに必要なものと比較して、大幅に減少できる。アッセイは、マイクロタイタープレート上で成長および処置された細胞上で直接実施され得る。あるいはまた、処置された細胞は、別個のプレート上でのELISAの前に、マイクロタイタープレートのウェル中で直接溶解され得る。ELISA技術は、抗体が利用可能なあらゆる細胞タンパク質または翻訳後修飾に応用でき、結果は少なくとも半定量的である。
【００９６】
適切な成長阻害剤アッセイは、公知方法に基づき得る(Kellandら (1993) Cancer Research Vol. 53, pp. 2581-2586)。簡単に言うと、HCT116およびHT29ヒト結腸腫瘍細胞(American Tissue Culture Collection)は、96ウェル組織培養プレートに播種され(１ウェルにつき約1600〜2000細胞)、36時間付着させた。８つのウェルを、様々な化合物濃度のうちの単一の濃度で処置し、96時間インキュベートし得る。氷冷10％トリクロロ酢酸(TCA)を使用して細胞を固定できる。次いで、プレートを水で５回洗浄し、空気乾燥させ、１％酢酸に入った0.4％スルホローダミンＢ(SRB)で10分間染める。SRB染料は、10 mM Tris-HCl中で可溶化され、Titertek Multiscan MCC/340MKIIプレートリーダー(Flow laboratories, IEC, Basingstoke, Hampshire)を用いて540 nmにおいて吸光度を測定する。吸光度値は、合計タンパク質含量に対応し、細胞成長の測定値として使用し得る。これらの値は、対数/直線グラフ紙上でプロッティングされ得、対照細胞成長と比べて50％阻害する薬剤濃度としてIC50を計算した。
【００９７】
本発明のアッセイ方法を実施した後に、Aha1とHsp90との相互作用をモジュレートする、および/またはHsp90のAha1仲介型ATPアーゼ活性をモジュレート(すなわち、上昇、増強、低下または阻害)する能力について陽性であるとテストされたテスト化合物を単離および/または製造および/または使用してもよい。
【００９８】
モジュレート活性を有する薬剤としてテスト化合物を同定した後、テスト化合物をさらに精製および/または単離および/または調査してもよい。
【００９９】
これは、個体に投与され得る医薬、医薬組成物または薬剤等の組成物の調製(すなわち、製造もしくは処方)において製造および/または使用され得る。
【０１００】
例えば、細胞増殖を伴う障害の治療において使用するために医薬組成物を製造する方法は；
上記方法を使用してHsp90ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を同定すること；および
該同定された化合物を、製薬上許容可能な担体と混合すること
を含み得る。
【０１０１】
製薬上許容可能な担体について、以下でさらに詳細に議論する。
【０１０２】
本方法は、化合物を修飾してその製薬的特性を最適化するステップを含み得る。
【０１０３】
生物学的に活性であると同定された「リード」化合物の修飾は、医薬開発の公知アプローチであり、活性化合物が合成するのに困難もしくは費用がかかる場合、または特定の投与方法に適さない場合(例えば、ペプチドは、消化器官中のプロテアーゼにより素早く分解される傾向があるために経口組成物の活性剤としてあまり適していない)に望ましくあり得る。(例えば、模倣体を生成するために)公知活性化合物を修飾して、標的特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避してもよい。
【０１０４】
医薬特性を最適化するための「リード」化合物の修飾は、一般的に、いくつかのステップを含む。まず、標的特性を決定するのに重大および/または重要である化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これは、ペプチド中のアミノ酸残基を系統的に(systematically)変えることにより(例えば、各残基を順に置換することにより)行うことができる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、「活性基」として知られている。
【０１０５】
活性基を見つけた後、様々なソース(例えば、分光分析技術、Ｘ線回折データ、およびNMR)から得たデータを使用して、物理的特性(例えば、立体化学、結合、大きさおよび/または電荷)に応じてその構造をモデリングする。
【０１０６】
このモデリングプロセスでは、コンピュータ分析、(原子間の結合ではなく、活性基の電荷および/または容量をモデリングする)類似性マッピング、ならびにその他の技術が使用できる。
【０１０７】
このアプローチの改変版では、リガンドおよびその結合パートナーの三次元構造がモデリングされる。これは、リガンドおよび/または結合パートナーが結合の際に立体構造を変える場合に特に有用であり、リード化合物の最適化においてこれを考慮したモデリングを可能にする。
【０１０８】
次いで、活性基を模倣する化学基をグラフティング可能な鋳型分子を選択する。鋳型分子およびその上にグラフティングされる化学基は、修飾化合物が、リード化合物の生物学的活性を保持しつつ、合成し易く、生理学的に許容可能である可能性が高く、かつin vivoで分解しないように、都合よく選択され得る。次いで、このアプローチにより分かった修飾された化合物をスクリーニングして、標的特性を有するか否か、またはどの程度それを発揮するのかを知ることができる。修飾化合物は、リード化合物の模倣体を含む。
【０１０９】
次いで、さらなる最適化または修飾を実行して、in vivoまたは臨床テストのための１つ以上の最終的な化合物を得ることができる。
【０１１０】
細胞増殖の障害を治療するための医薬組成物を調製する方法は；
i)AhaIポリペプチドとHsp90ポリペプチドとの相互作用をモジュレートする化合物を同定すること；
ii)同定された化合物を合成すること；および
iii)該化合物を医薬組成物に組み込むこと
を含み得る。
【０１１１】
同定された化合物は、従来の化学合成方法論を使用して合成され得る。合成経路の開発および最適化の方法は、当業者に周知である。
【０１１２】
上記アッセイにおいてHsp90活性に影響を及ぼす能力を有することが分かった化合物は、いくつかの状況において、特に、Hsp90活性により仲介される障害の治療のために、議論した治療的およびその他の可能性を有する。治療的処置のためにこのような化合物を、任意の(例えば、抗腫瘍療法のための)他の活性物質、別の抗腫瘍化合物または治療法(放射線療法もしくは化学療法等)と組み合わせて使用してもよい。
【０１１３】
モジュレート剤として同定されたテスト化合物を使用して、(例えば、当業者に周知の方法および本明細書で議論する方法により)ペプチジルまたは非ペプチジル模倣体を得てもよい。これは、以下に議論するように治療的状況において使用され得る。
【０１１４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載のアッセイ方法により得られるかまたは同定される薬剤を提供する。
【０１１５】
本発明が提供する方法のいずれか１つにより同定された薬剤は、単離および/もしくは精製、ならびに/またはさらに調査および/もしくは製造され得る。このような化合物の様々な方法および用途は、本明細書において別途議論している。
【０１１６】
悪性細胞の細胞増殖またはその他の細胞性質(例えば、アポトーシス、細胞周期、血管新生または転移)を調節する方法において、薬剤を使用してもよい。このような方法は、細胞を、有効量の活性化合物(好ましくは、製薬上許容可能な組成物の形態)と接触させることを含み得る。このような方法は、例えば、in vitroまたはin vivoにて実施され得る。
【０１１７】
上述したように、推定上のモジュレーター化合物の１クラスは、Aha1ポリペプチド配列に基づき得る。ペプチド断片、またはこのような断片の対立遺伝子、変異体もしくは誘導体は本明細書に記載する。このようなペプチドをコードする核酸、このような核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにこのようなペプチドをコードする核酸を発現する方法は、本発明のさらなる態様である。
【０１１８】
Aha1の適切なペプチド断片は、Hsp90と相互作用およびまたはAha1とHsp90との相互作用を阻害可能である。このような断片を使用して、Hsp90のATPアーゼ活性をモジュレートしてもよい。
【０１１９】
本発明の別の態様は、Hsp90ポリペプチドに結合、および/またはHsp90ポリペプチドのゲルダナマイシン感受性ATPアーゼ活性を促進する、本明細書に記載のAha1ポリペプチドを提供する。本発明はまた、異種調節エレメントに作用可能に連結しうるおよび/またはベクターに含まれうる、Aha1ポリペプチドをコードする核酸も包含する。
【０１２０】
本発明の別の態様は、Aha1ポリペプチドを生成する方法を提供し、該方法は；
コード核酸から該ポリペプチドを発現させること；および
Hsp90のATPアーゼ活性を増強する該ポリペプチドの能力を決定すること
を含む。
【０１２１】
本発明はさらに、(i)Aha1ポリペプチドまたは断片；(ii)本発明のスクリーニング方法により同定されたモジュレーター；(iii)Hsp90のAha1仲介型ATPアーゼ活性をモジュレートする上記物質のいずれかの模倣体、から選択される１つ以上の物質の様々な治療方法および使用を提供する。
【０１２２】
このような方法または使用により、Hsp90とコファクターAha1との相互作用により仲介されるHsp90活性がモジュレート(例えば、阻害、低下、増強または上昇)され得る。
【０１２３】
治療的/予防的目的は、Hsp90により仲介される症状の治療であり得る。
【０１２４】
本明細書で使用する「Hsp90により仲介される症状」という用語は、Hsp90および/またはHsp90の作用が(例えば、その症状の発症、進行、発現等に)重要または必要な症状に関する。Hsp90により仲介される症状の例としては、症状を駆動するクライアントタンパク質に対するHsp90作用を特徴とする該症状；Hsp90により作用する１つ以上のクライアントタンパク質を特徴とする症状；Hsp90クライアントタンパク質であり、かつHsp90による作用(例えば、シャペロニング)の不在下では症状を駆動できない１つ以上のタンパク質に駆動される症状；Hsp90クライアントタンパク質であり、かつHsp90による作用(例えば、シャペロニング)で症状を駆動する１つ以上のタンパク質により駆動される症状が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
このような症状の例としては：癌；自己免疫疾患等の免疫抑制適用；関節炎；プリオン病(例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型CJD)；タンパク質折り畳みおよび凝集の欠陥を伴うその他の疾患(例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病)が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２６】
例えば、多くの癌タンパク質はHSP90クライアントタンパク質である。HSP90のシャペロニング作用の不在下では、これらのタンパク質は、例えばユビキチン依存型プロテアソーム分解により分解される。同様に、多くの自己免疫疾患の特徴であるLCKタンパク質も、HSP90クライアントタンパク質である。HSP90のシャペロニング作用の不在下では、LCKレベルは低下する。
【０１２７】
一実施形態では、本発明は、抗癌剤を得る方法を提供する。本明細書で使用する「抗癌剤」という用語は、癌を治療する化合物(すなわち癌の治療に有用な化合物)に関する。抗癌効果は、細胞増殖の調節、細胞周期進行の阻害、血管新生(新しい血管の形成)の阻害、転移(元の部位からの腫瘍の広がり)の阻害、侵襲(隣接する正常構造への腫瘍細胞の広がり)の阻害、またはアポトーシス(プログラム細胞死)の促進を含む(ただしこれらに限定されない)１つ以上のメカニズムを介して生じ得る。
【０１２８】
当業者は、候補化合物が、任意の特定の細胞型について癌性症状を治療するか否かを容易に決定できる。例えば、特定の化合物により得られる活性を評価するために都合よく使用され得る方法は、本明細書で記載する。
【０１２９】
本発明はまた、増殖抑制剤である活性化合物も提供する。本明細書で使用する「増殖抑制剤」という用語は、増殖性症状を治療する化合物(すなわち、増殖性症状の治療に有用な化合物)に関する。
【０１３０】
当業者は、候補化合物が、任意の特定の細胞型について増殖性症状を治療するか否かを容易に決定できる。例えば、特定の化合物により得られる活性を評価するために都合よく使用され得る方法は、以下の実施例で記載する。
【０１３１】
「細胞増殖」、「増殖性症状」、「増殖性障害」および「増殖性疾患」という用語は、本明細書において互換的に使用され、in vitroまたはin vivoに関わらず、望ましくない過剰または異常細胞の望ましくないまたは制御下にない細胞性増殖(新生物成長または過形成性成長)に関する。
【０１３２】
増殖性障害は、in vitroまたはin vivoに関わらず、望ましくない過剰または異常細胞の望ましくないまたは制御下にない細胞性増殖(新生物成長または過形成性成長)である。増殖性症状の例としては、前悪性および悪性細胞性増殖(悪性新生物および腫瘍、癌(例えば、組織球腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨種)、癌(例えば、肺癌、小細胞肺癌、消化管癌、腸癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、肝癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、脳癌、肉腫、骨肉腫、カポジ肉腫、黒色腫)、白血病、乾癬、骨疾患、(例えば、結合組織の)繊維増殖性(fibroproliferative)障害、白内障、ならびにアテローム動脈硬化が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３３】
増殖性障害は、あらゆる細胞型において生じ得、肺、結腸、胸、卵巣、前立腺、肝臓、膵臓、脳、および皮膚が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３４】
本発明の方法により得られる化合物は、「抗癌剤」および「増殖抑制剤」の一方または両方のいずれかであり得る。
【０１３５】
上述したように、薬剤は、例えば、化学療法および/または放射能療法と組み合せられて癌治療または癌予防のために使用され得る。抗癌効果は、細胞増殖の調節、細胞周期進行の阻害、血管新生(新しい血管の形成)の阻害、転移(元の部位からの腫瘍の広がり)の阻害、侵襲(隣接する正常構造への腫瘍細胞の広がり)の阻害、またはアポトーシス(プログラム細胞死)の促進を含む(ただしこれらに限定されない)１つ以上のメカニズムを介して生じ得る。
【０１３６】
従って、更なる様々な態様では、本発明は、以下のものを提供する：すなわち、本明細書に記載の１つ以上の化合物または薬剤を含む、医薬組成物、医薬、薬剤、またはこのような目的のためのその他の組成物；薬物療法におけるこのような組成物の使用；例えば医学的症状(例えば、Hsp90が仲介する症状(転写制御、DNA複製または細胞周期制御の欠陥または障害を伴う症状等))の治療(予防的治療も含み得る)(癌または細胞性増殖の他の障害の治療等)のためにこのような組成物を個体または患者に投与することを含む方法；このような目的(例えば、Hsp90が仲介する障害の治療)のために投与する組成物、医薬品または薬剤の製造における本明細書に記載する化合物または薬剤の使用；Hsp90が仲介する症状を治療するための化合物薬剤または組成物；ならびにこのような物質を製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体、および任意に他の成分と混合することを含む医薬組成物の製造方法。
【０１３７】
症状を治療することに関して本明細書で使用する「治療」という用語は、全般的に、いくらかの所望の治療的効果(例えば、症状の進行の阻害)が得られる、ヒトまたは動物(例えば、獣医学的用途)の治療および療法に関し、進行速度の低減、進行速度の停止、症状の緩和、および症状の治癒が挙げられる。防止的措置(すなわち、予防)としての治療も含む。
【０１３８】
「治療」という用語は、２つ以上の治療または療法を(例えば、順次または同時に)併用した併用治療および療法を含む。治療および療法の例としては、化学療法(例えば薬剤、(例えば、免疫療法に見られるような)抗体、(例えば、光線力学療法、GDEPT、ADEPT等に見られるような)プロドラッグを含む活性剤の投与)；手術；放射線療法；および遺伝子療法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３９】
本発明の薬物治療方法において使用する化合物または薬剤が何であろうと、投与は、個体に対する有効性を示すのに十分な「予防的有効量」または場合により「治療的有効量」(ただし、予防は治療と考慮され得る)であることが好ましい。実際の投与量、ならびに投与の速度および時間的経過は、治療するものの性質および重度に拠る。治療の指示(例えば、投薬量の決定等)は、一般開業医およびその他の医師の責任範囲内にある。
【０１４０】
本明細書で使用する「治療的有効量」という用語は、いくらかの望ましい治療的効果をもたらすのに有効な、すなわち適正な有効性/危険性比に見合った、活性化合物の量、または活性化合物を含む物質、組成物もしくは調剤の量に関する。
【０１４１】
活性化合物、および活性化合物を含む組成物の適切な投薬量は、患者によって変化し得ることが理解されよう。最適投薬量を決定するのには、通常、本発明の治療のあらゆる危険性または有害な副作用に対して治療的有効性のレベルを調和させることを伴う。選択した投薬量レベルは、特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の分泌速度、治療の持続期間、併用するその他の薬剤、化合物および/もしくは物質、ならびに患者の年齢、性別、体重、症状、全般的な健康状態およびこれまでの病歴を含む(ただしこれらに限定されない)様々な要因に依存する。化合物の量および投与経路は、最終的には、医師の決断にゆだねられるが、一般的には、投薬量は、所望の効果を得る作用部位において局所的濃度を得るようにする。
【０１４２】
in vivoでの投与は、治療の過程を通じて連続的にまたは断続的に、１つの用量で行える。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に使う処方、治療目的、治療する標的細胞、および治療する被検体に応じて異なる。治療する医師により選択された用量レベルおよびパターンで、単発または複数回で投与できる。
【０１４３】
モジュレート活性を有する薬剤として同定された化合物は、細胞培養添加物として使用されて、HSP90を阻害して、例えば、細胞増殖、アポトーシス、細胞周期、または血管新生/移行をin vitroで調節してもよい。このような化合物は、in vitroアッセイの一部として使用されて、候補宿主が問題の化合物での治療によって益を得られ易いか否かを決定してもよい。これらはまた、他の活性化合物、他のHSP90阻害剤、他の増殖抑制剤等を同定するために、例えばアッセイにおいて、基準としても使用され得る。
【０１４４】
物質または組成物は、単独で、または他の治療と組み合わせられて(治療する症状に応じて同時にもしくは順次に)投与され得る。
【０１４５】
本発明による医薬組成物は、本発明による使用のために、活性成分に加えて、製薬上許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者に周知のその他の物質を含み得る。このような物質は、非毒性であって、活性成分の効力を妨害するものであってはならない。
【０１４６】
従って、本発明は、上記定義した医薬組成物、および上記定義した少なくとも１つの活性成分を、本明細書に記載の１つ以上の製薬上許容可能な担体、賦形剤、緩衝剤、アジュバント、安定剤またはその他の物質と混合させること、を含む医薬組成物を製造する方法をさらに提供する。
【０１４７】
「製薬上許容可能」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併が無く、適正な有効性/危険性比に見合い、被検体(例えば、ヒト)の組織と接触させるのに適した化合物、物質、組成物、および/または投薬形態に関する。担体、賦形剤等もそれぞれ、剤形のその他の成分と適合する点で「許容可能」でなければならない。担体またはその他の物質の厳密な性質は、投与経路(経口、または例えば、皮膚、皮下もしくは静脈注射等)に依存する。
【０１４８】
剤形は、都合良くユニット投薬量形態にされ、薬学分野で周知の任意の方法により調製され得る。このような方法は、活性成分を、１つ以上の捕捉成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般的に、剤形は、活性成分を、液体担体、細かく分離された固体担体、またはその両方と、均一かつ密接に会合させることにより調製され、所望であればその後生成物を成形する。
【０１４９】
剤形は、液体、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ロゼンジ、顆粒、粉末、カプセル、カシェット(cachet)、丸薬、アンプル、坐剤、ペッサリー、軟膏、ジェル、ペースト、クリーム、スプレー、泡、ローション、油、ボーラス、舐剤、またはエアロゾルの形態を取り得る。
【０１５０】
活性化合物、または活性化合物を含む医薬組成物は、全身/末梢または局部(すなわち所望の作用部位)に関わらず、任意の都合の良い投与経路により被検体に投与され得る。
【０１５１】
投与経路としては以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：すなわち、(例えば、消化による)経口投与；口腔投与；舌下投与；(例えば、パッチ、絆創膏等による)経皮投与；(例えば、パッチ、絆創膏等による)経粘膜(transmucosal)投与；(例えば、鼻腔スプレーによる)鼻腔内投与；(例えば、点眼による)眼投与；(例えば、口もしくは鼻を介するエアロゾルを介した、例えば吸入もしくは吹送療法による)肺投与；(例えば、坐剤もしくは浣腸による)直腸投与；(例えば、ペッサリーによる)膣投与；例えば、皮下、皮内、筋内、静脈内、動脈内、心臓内、鞘内、脊髄内、嚢内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、および胸骨内の注射を含む注射による非経口投与；例えば皮下または筋内的な、持続性薬剤もしくはリザーバの移植。
【０１５２】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体形態を取り得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバント等の固体担体を含み得る。液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油、または合成油等の液体担体を含む。生理学的食塩水、デキストロースもしくはその他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール等のグリコールが含まれてもよい。
【０１５３】
錠剤は、任意に１つ以上の補助成分と共に、圧縮または成形されて製造され得る。圧縮錠剤は、適切な機械において、粉末または顆粒等の自由に流れる形態の活性成分を、任意にバインダー(例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、潤滑剤、不活希釈剤、保存料、錠剤分解物質(例えば、グリコール酸デンプンナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、表面活性剤または分散剤と共に混合させて、圧縮させることにより調製され得る。成形錠剤は、適切な機械において、不活液体希釈剤で湿らせた粉末化化合物の混合物を成形することにより調製され得る。錠剤は、任意に、例えば、様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して所望の放出プロファイルを得る等、中に含まれる活性成分がゆっくりとまたは制御しながら放出させるように、コーティングまたはスコアリングおよび処方され得る。錠剤は、任意に、腸溶性コーティングを施されて、胃以外の消化管部分において放出されるようにしてもよい。
【０１５４】
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または苦痛部位における注射のためには、活性生物は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性および安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態を取る。当業者は、例えば、塩化ナトリウム液、リンガー液、乳酸化リンガー液等の等張ビヒクルを使用して適切な溶液を容易に調製できる。保存料、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、および/または他の添加剤も必要に応じて含まれ得る。
【０１５５】
リポソーム、特に陽イオンリポソームが、担体剤形中で使用され得る。
【０１５６】
上記技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版, Osol, A.(編), 1980で知ることができる。
【０１５７】
本発明の別の態様では、上記アッセイにより同定された薬剤を、製薬上許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体と混合することを含む、医薬組成物の製造方法を提供する。
【０１５８】
組成物は、腫瘍部位もしくはその他の所望の部位に局所的に投与され得るか、または腫瘍もしくはその他の細胞を標的化するように送達され得る。
【０１５９】
標的化療法を使用して、抗体または細胞特異的リガンド等の標的化系を使用し、活性成分または薬剤をより特異的に特定の細胞型に送達してもよい。標的化は、様々な理由のため(例えば、薬剤が許容不可能なほど毒性である場合、さもなくば必要とする投薬量が高すぎる場合、さもなくば標的細胞に侵入可能でない場合)に望ましくあり得る。
【０１６０】
このような薬剤は、直接投与される代わりに、細胞に導入されたコード核酸(例えば、ウイルスベクター)から発現させることにより標的細胞中で生成され得る。ベクターは、治療する特定の細胞を標的化させてもよいし、または標的細胞によって事実上選択的に作動する調節エレメントを含んでいてもよい。
【０１６１】
従って、薬剤(例えば、モジュレート(例えば、Aha1とHsp90との相互作用を妨害して、Hsp90活性に影響を及ぼすことが)可能なペプチド)をコードする核酸が、遺伝子療法において、例えば、個体の治療において(例えば、障害を(全体的にまたは部分的に)予防または治癒する目的で)使用され得る。
【０１６２】
ウイルスベクター等のベクターが、先行技術において、核酸を幅広い異なる標的細胞に導入するために使用されてきた。典型的に、ベクターは、標的細胞に曝されて、十分な割合の細胞においてトランスフェクションが生じて、所望のペプチドの発現から有用な治療的または予防的効果が得られるようにする。トランスフェクト核酸は、各標的化細胞のゲノムに永久的に取り込まれて、長期持続性効果を提供してもよく、あるいはまた治療を周期的に繰り返さなければならないかもしれない。
【０１６３】
ウイルスベクターおよびプラスミドベクターの両方の様々なベクターが当該分野で公知である(米国特許第5,252,479号およびWO 93/07282を参照)。特に、パポバウイルス(SV40等)、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス(HSVおよびEBVを含む)、およびレトロウイルスを含むいくつかのウイルスが、遺伝子導入ベクターとして使用されてきた。先行技術の多くの遺伝子療法プロトコールにおいて、弱毒化(disabled)マウスレトロウイルスが使用されてきた。
【０１６４】
遺伝子療法においてウイルスベクターを使用する代わりに、核酸を細胞に導入するその他の公知方法としては、微量注入、リポソーム仲介型導入、および受容体仲介型DNA導入等の機械的技術が挙げられる。
【０１６５】
ポリリシンを介して、核酸を、標的細胞の表面上に存在する受容体に特異的なタンパク質リガンドに連結させる受容体仲介型遺伝子導入は、核酸を特定の細胞に特異的に標的化させる技術の一例である。
【０１６６】
Aha1とHsp90との相互作用および/もしくはHsp90のAha1仲介型ATPアーゼ活性をモジュレートもしくは妨害する能力を有するペプチドもしくはその他の化合物、またはその能力を有するペプチドをコードする核酸分子は、(例えば、内容物を外部環境から保護する適切な容器に封入されて)キットに入れて提供されてもよい。このようなキットは、使用指示書を含み得る。
【０１６７】
本発明のさらなる様々な態様および実施形態は、本開示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
【０１６８】
以下、本発明の特定の態様および実施形態を、実施例により、および図面を参照しながら説明する。
【０１６９】
実験
材料および方法
タンパク質の発現
Aha1(YDR214W)遺伝子を、T7プロモーターを担持するベクターpRSETAにクローニングした。大腸菌BL21(DE3)pLysS中のpRSETAベクターから遺伝子を発現させ、1 mMのIPTGで誘導させることによりタンパク質を生成した。細胞を収穫し、100 mM NaCl(緩衝液Ａ)およびプロテアーゼ阻害剤(EDTAを含まないBoehringerプロテアーゼ阻害剤錠剤)を含む20 mM Tris(pH 8.0)に溶解させ、遠心分離にかけた。
【０１７０】
次いで、溶解物を、Talon金属アフィニティーカラムに入れて、同じ緩衝液で洗浄し、その後10 mMイミダゾール(pH 8.0)を含む緩衝液Ａで洗浄した。タンパク質を、300 mMイミダゾール(pH 7.6)を含む緩衝液Ａで溶出させた。10 mM EDTAおよび1mM DTTを溶出タンパク質に添加し、次いでそれを濃縮し、1 mM EDTAおよび500 mM NaClを含む20 mM Tris(pH 7.4)で平衡化したSuperdex 200 PGカラムに入れた。
【０１７１】
次いで、Aha1を含む画分を透析し(20 mM Tris(7.4)、1 mM EDTA)、20 mM Tris(7.4)、1 mM EDTA中で平衡化したQ-セファロースカラムに入れた。結合タンパク質を、同じ平衡化緩衝液に入った0〜1 MのNaCl勾配で溶出させ、Aha1を含む画分を、20 mM Tris(7.4)および1 mM EDTAに対して透析した。その後、Vivaspin5K濃縮器を用いてタンパク質を濃縮した。
【０１７２】
ヒトhsp90βタンパク質の精製は、Aha1タンパク質の精製とほぼ(Sephacryl 400 HRカラムでゲルろ過を行い、Vivaspin 30K濃縮器中で濃縮すること以外は)同一であった。使用した緩衝液は同一である。
【０１７３】
完全長Aha1のＮおよびＣ末端ドメインに対応するHch1および平滑末端化Aha1ポリペプチドを、上述したように発現および精製した。Ｎ末端ドメインポリペプチド(nAha1)は、Ｎ末端MVVNNPからGNDIQVまでの162アミノ酸から構成されていた。Ｃ末端ドメインポリペプチド(cAha1)は、Aha1配列の残りから構成されていた。
【０１７４】
Hsp90のATPアーゼ活性を決定する比色アッセイ
無機リン酸塩を放出する酵素の活性は、カチオン染料マラカイトグリーンと、リンモリブデン酸複合体との反応(610 nmの最大吸光度で青緑色を生成する)を利用して上述したように測定できる(Cogan, E.B.ら(1999) Anal. Biochem. 271, 29-35；Baykov, A.A.ら (1988) Anal. Biochem. 171, 266-270；Harder, K.W.ら (1994) Biochem. J. 298, 395-401；Maehama, T.ら (2000) Anal. Biochem. 279, 248-250)。
【０１７５】
アッセイ試薬
化学物質は、市販されている最も純度が高いもので、全ての水溶液はAR水中で作られる。
【０１７６】
１．完全長Aha1について、45 mM Tris-HCl(pH 7.5)、9 mM KCl、3 mM MgClのアッセイ緩衝液が使用され得る。Aha1またはHch1ホモログのＣおよびＮ末端ドメインについては、20 mM Tris-HCl(pH 7.5)、4 mM KCl、1.2 mM MgCl。100 mM Tris-HCl(pH 7.4)、20 mM KCl、6 mM MgCl2のアッセイ緩衝液も使用され得る。４℃にて保存。
【０１７７】
２．0.0812％(w/v)マラカイトグリーン(Sigma M 9636)。室温にて保存。
【０１７８】
３．2.32％(w/v)ポリビニルアルコールUSP(Sigma P 1097)。室温にて保存。ポリビニルアルコールは沸騰水に溶解し難く、２〜３時間の攪拌が必要。
【０１７９】
４．6M 塩酸に入った5.72％(w/v)モリブデン酸アンモニウム。室温にて保存。
【０１８０】
５．34％(w/v)クエン酸ナトリウム。室温にて保存。
【０１８１】
６．ATP、ジナトリウム塩、特別の品質(special quality)(Boehringer Mannheim 519979)。４℃にて保存。
【０１８２】
７．大腸菌発現型酵母HSP90タンパク質、>95％で精製(10)、および0.5mgのタンパク質を含む10μlアリコートとして-80℃で保存。
【０１８３】
アッセイプロトコール
使用当日、マラカイトグリーン試薬を保存用溶液から調製した。２部のマラカイトグリーンを、各１部のポリビニルアルコールおよびモリブデン酸アンモニウム、ならびに２部の水と混合した。
【０１８４】
最初、試薬は濃い茶色であったが、室温にて約２時間放置した後、金色がかった黄色となり、使用に適する状態となった。全てのアッセイは、Immulon96ウェル平底透明ポリスチレンプレートにおいて実施した。
【０１８５】
ATPを、アッセイ緩衝液に溶解させて、1.5 mMの保存用濃度を得て、室温にて保存した。ATP溶液の10μlアリコートを、各ウェルに添加して、0.6 mMの最終的なアッセイ濃度を得た。使用直前に、Aha1およびヒトHSP90タンパク質を氷上で解凍させ、冷却したアッセイ緩衝液中に、それぞれ50μM(2.03μg/μl)および25μM(2.11μg/μl)の保存用濃度まで懸濁させて、溶液を氷上で保持した。
【０１８６】
Aha1(5μl)を各ウェルに添加して10μMの最終濃度を得て、5μl緩衝液を、Aha1を含まないウェルに添加した。7.5μlの保存用HSP90を各ウェル(7.5μlのアッセイ緩衝液を添加したバックグラウンドウェルを除く)に添加してインキュベーションを開始して、25μlの最終アッセイ容量を得た。プレートシェーカー(例えば、Wellmixx(Thermo Labosystems)またはMTS4(IKA-Schuttler))を使用してプレートを(約２分間)振とうさせ、プラスチックフィルムで密封し、37℃にて３時間インキュベートした。
【０１８７】
インキュベーションを停止するために、80μlのマラカイトグリーン試薬を各ウェルに添加し、プレートを再度振とうした。10μlの34％クエン酸ナトリウムを各ウェルに添加し、プレートを再度振とうした。620 nmでの吸光度を、適切なプレートリーダー(例えば、Victor2、PerkinElmer Life Science)を用いて測定した。
【０１８８】
Hsp90阻害剤のIC50測定のために、DMSOに入った、一連の保存用濃度の化合物を調製した。４つの適切な濃度を、各化合物の関連能力に応じて使用した。各濃度の１μlアリコートを、アッセイプレートのウェルに移し、上述したようにアッセイを実施した。マラカイトグリーン試薬とクエン酸ナトリウムとの添加の時間間隔は、ATPの非酵素的加水分解を低減させるために可能な限り短くしておくべきである。クエン酸ナトリウムを添加した後、色は、室温にて４時間安定していた。
【０１８９】
結果
0.6 mM ATPの基質濃度における時間およびタンパク質について、アッセイ条件を最適化して、記載のプロトコールにおける酵素活性の直線性を得た。
【０１９０】
コアクチベーターAha1の存在によって、濃度を高くしていくヒトHSP90のATPアーゼ活性が有意に上昇することを観察した(図１)。
【０１９１】
Aha1の存在下におけるATPアーゼ活性の上昇は、少なくとも数時間進行し続けた(図２)。
【０１９２】
Hsp90の最大半活性は、１μM Aha1未満の濃度において生じることが分かった(矢印；図４)。
【０１９３】
Aha1のＣ末端ドメインは、Hsp90活性に対してほとんどまたは全く影響がないことが見とめられた(図５)が、Aha1のＮ末端ドメイン(図６―◇―)およびホモログHch1(図６―□―)の両方が、Hsp90 ATPアーゼ活性を活性化することが示された(ただし、完全長Aha1ポリペプチド(図６)よりも低い程度であった)。
【０１９４】
IC50測定
IC50測定のために、全てのアッセイを7.5μmヒトHSP90および10μM Aha1を用いて実施した。
【０１９５】
1.6μMタンパク質、および1 mMのATPを使用して、酵母アッセイを実施した。ヒトタンパク質を上述したようにアッセイした。全ての場合において、アッセイ容量は25μlとし、プレートを37℃にて３時間インキュベートした。結果は、表２にIC50値として示す。単位はμMで、利用可能であれば±はn=3〜5のSDを示す。
【０１９６】
使用した３つの化合物(ラジシコール、ゲルダナマイシンおよび17AAG)は、酵母HSP90 ATPアーゼ活性の可能性のある阻害剤である。採用した濃度では、ヒトタンパク質のみで見とめられた基準活性を阻害することが見とめられなかった。換言すると、Aha1の不在下では、測定したATPアーゼ活性は、ゲルダナマイシンまたは他の公知酵母HSP90 ATPアーゼ阻害剤の阻害に対して感受性がない。
【０１９７】
基準ゲルダナマイシン不感受性活性は、ヒトHsp90または汚染ATPアーゼによるものであり得る。
【０１９８】
ヒトHsp90の活性は、Aha1の存在下で約２倍上昇する。さらに、高い活性はゲルダナマイシンに感受性を有する。コアクチベーターAha1の存在下におけるヒトHSP90 ATPアーゼに対するラジシコール、ゲルダナマイシンおよび17AAGの阻害能力は、酵母酵素に対して示されたものと同様であった。
【０１９９】
ラジシコール、ゲルダナマイシンまたは17-AAG等の公知阻害剤を使用した酵母Hsp90 ATPアーゼ活性の阻害は、コシャペロン(co-chaperone)の補充を防ぎ、ある種のHsp90ヘテロ複合体の形成を促すことが示されており、これにより、これらのクライアントタンパク質がユビキチンプロテオソーム経路を介した分解のために標的化されている(例えば、Neckers Lら (1999) Invest. New Drugs, Vol. 17, pp. 361-373；Kellandら (1999) J. Natl. Cancer Inst. Vol. 91, pp. 1940-1949を参照)。従って、Hsp90阻害剤での処置は、細胞増殖、細胞周期調節、およびアポトーシスに関与する重要なタンパク質の選択的分解を生じる。これらのプロセスは全て、癌等の症状において根本的に重要である。
【０２００】
従って、コアクチベーターAha1の存在下においてヒトHsp90の活性を測定するための本明細書に記載の方法は、臨床的用途のためのHsp90の新規阻害剤の開発において有用である。
【０２０１】
表１は、公知HSP90タンパク質の限定しない一覧を示す(典拠：Gupta (1995) Mol Biol Evol 12 (6) 1063-1073)。SPはSwissProt、EMはEMBL、およびGBはGenbankを指す。
【０２０２】
表２は、Aha1の存在下および不在下において酵母およびヒトHsp90を使用した、ラジシコール、ゲルダナマイシンおよび17AAGについてのIC50実験の結果を示す。IC50±SD値は、>３測定について示している。
【表１】
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【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、濃度を高くしていくヒトHSP90のATPアーゼ活性に対する、コアクチベーター(co-activator)Aha1の影響を示す。各値は、0.6 mMのn=4 ATPの平均±SD。
【図２】図２は、Aha1の存在下におけるヒトHSP90のATPアーゼ活性および時間の関係を示す。各点は、0.6 mMのn=4 ATPの平均±SD。
【図３】図３は、異なる種(Sc＝サッカロミセス・セレヴィシエ、Ca＝カンジダ・アルビカンス、At＝シロイヌナズナ、Dm＝キイロショウジョウバエ、Ce＝シノラブディス・エレガンス、Hs＝ホモ・サピエンス、Sp＝シゾサッカロミセス・ポンベ)に由来するAha1ポリペプチドのアライメントを示す。
【図４】図４は、Hsp90のゲルダナマイシン依存性ATPアーゼ活性に対するAha1濃度の影響を示す。半活性(half activation)は、< 1 mM Aha1にあることが示されている。45 mM Tris(pH 7.5)、9 mM KCl、3 mM MgCl2からなる緩衝液に入った0.2μM Aha1を使用した。
【図５】図５は、Hsp90のゲルダナマイシン依存性ATPアーゼ活性に対する、濃度を高くしていくAha1のＣ末端ドメインの影響を示す。20 mM Tris(pH 7.5)、4 mM KCl、1.2 mM MgCl2からなる緩衝液に入った2μM Aha1を使用した。
【図６】図６は、Hsp90のゲルダナマイシン依存性ATPアーゼ活性に対する、濃度を高くしていくAha1のＮ末端ドメインの影響を示す。20 mM Tris(pH 7.5)、4 mM KCl、1.2 mM MgCl2からなる緩衝液に入った2μM Aha1を使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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