(57)【要約】本発明は、a)単球を適切な培地に提供し、b)単球を分化因子の存在下で樹状細胞に分化させ、c)培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを加え、成熟樹状細胞を得る、in vivoで単球を成熟樹状細胞に分化させる方法に関する。本発明はまた、炎症を予防し、かつ/または炎症性疾患および/または自己免疫疾患に対処するための医薬品の製造における、少なくとも1種のL-α-リゾホスファチジルコリン阻害剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
A. 単球を適当な培地中に提供し、
B. 単球の樹状細胞への分化を分化因子の存在下で誘導し、
C. 前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを加え、成熟樹状細胞を得る
ことにより、in vitroで単球を成熟樹状細胞に分化させる方法。
【請求項２】
工程b)で、前記培地に前記L-α-リゾホスファチジルコリンを培地中の最終濃度が約10〜80μMとなるように加える、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
工程b)で、前記培地に前記L-α-リゾホスファチジルコリンを単球分化の3〜6日目に加える、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
工程C)で、少なくとも1種の生物学的因子も培地に加えることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的因子が、細菌、ウイルス、酵母、寄生虫もしくは真菌抗原、自己および/もしくは異種腫瘍細胞溶解物抗原、腫瘍抗原、細菌、ウイルス、酵母、寄生虫もしくは真菌抗原をコードする核酸、または腫瘍抗原をコードする核酸であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
工程C)で、血小板活性化因子(PAF)も培地に加えることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記分化因子が、インターロイキン4、GM-CSF、インターロイキン13およびTNFから選択されることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
A. 単球を適当な培地中に提供し、
B. 単球の樹状細胞への分化を分化因子の存在下で誘導し、
C. 前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを加え、成熟樹状細胞を得て、
D. 前記培地に生物学的因子を加え、工程Cで得られた成熟樹状細胞を前記生物学的因子に対するものとし、
E. 工程Dによる生物学的因子に対する成熟樹状細胞をTリンパ球と接触させ、生物学的因子に対するTリンパ球を得る
ことにより、in vitroでTリンパ球を活性化させる方法。
【請求項９】
A. 未成熟樹状細胞を適当な培地中に提供し、
B. 前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを加え、成熟樹状細胞を得る
ことにより、in vitroで樹状細胞を成熟させる方法。
【請求項１０】
L-α-リゾホスファチジルコリンおよび単球を樹状細胞に分化させる少なくとも1種の因子を含むことを特徴とする、培地。
【請求項１１】
前記L-α-リゾホスファチジルコリンの最終濃度が、培地中で約10〜80μMであることを特徴とする、請求項10に記載の培地。
【請求項１２】
生物学的因子も含むことを特徴とする、請求項10および11のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１３】
前記生物学的因子が、細菌、ウイルス、酵母、寄生虫もしくは真菌抗原、自己および/もしくは異種腫瘍細胞溶解物抗原、腫瘍抗原、細菌、ウイルス、酵母、寄生虫もしくは真菌抗原をコードする核酸、または腫瘍抗原をコードする核酸であることを特徴とする、請求項12に記載の培地。
【請求項１４】
前記分化因子が、インターロイキン4、GM-CSF、インターロイキン13およびTNFから選択されることを特徴とする、請求項10から13のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１５】
細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫起源の感染症または酵母によって引き起こされる感染症の治療および/または予防用の医薬品を製造するための、免疫システムを活性化させる因子としてのL-α-リゾホスファチジルコリンの使用。
【請求項１６】
癌の治療および/または予防用の医薬品を製造するための、免疫システムを活性化させる因子としてのL-α-リゾホスファチジルコリンの使用。
【請求項１７】
免疫システムを活性化させる因子としてのL-α-リゾホスファチジルコリン、および生物学的因子を含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１８】
炎症を予防し、かつ/または炎症性疾患および/または自己免疫疾患に対処する医薬品を製造するための、少なくとも1種のL-α-リゾホスファチジルコリン阻害剤の使用であって、前記阻害剤がトリグリセリド、リン脂質およびグリセロールを含む脂質エマルジョンである使用。
【請求項１９】
前記脂質エマルジョンが、15〜25%のトリグリセリド、0.5〜1.5%のリン脂質および1.8〜2.6%のグリセロールを含むことを特徴とする、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
炎症を予防し、かつ/または炎症性疾患および/または自己免疫疾患に対処する医薬品を製造するための、少なくとも1種のL-α-リゾホスファチジルコリン阻害剤の使用であって、前記阻害剤がPPARγアゴニストである使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単球をそれらの分化に適した培地中に提供し、L-α-リゾホスファチジルコリンを前記培地に加えることによって、単球を成熟樹状細胞に分化させる方法に関する。本発明はまた、炎症を予防し、かつ/または炎症性疾患および/または自己免疫疾患に効く医薬品を製造するための、少なくとも1種のL-α-リゾホスファチジルコリン阻害剤の使用に関する。
【０００２】
樹状細胞は、免疫応答の発生ならびに抗原、特に感染因子の認識、取込みおよび提示における特異的Tリンパ球応答の開始に関与している(Steinmanら、1997年、Immuno. Rev.、156: 25〜37頁; Cellaら、1997年、Curr. Opin. Immunol.、9: 10〜16頁)。未成熟樹状細胞が感染因子の抗原を極めて有効に取込み消化する間に、細菌因子または炎症性サイトカインなどのある種のシグナルは、適応免疫応答を開始させる際の開始工程である成熟プロセスを誘導することによって、それらの細胞を活性化させることができる。実際には、この活性化の間に、樹状細胞は、Tリンパ球が見られるリンパ器官に移動する能力およびナイーブTリンパ球の活性化に必須の副刺激シグナルを伝達する能力を獲得する。この成熟の期間に、樹状細胞は、
・Tリンパ球(CD40、CD80、CD83、CD86ならびに主要組織適合複合体(MHC)クラスIおよびクラスIIの分子など)の活性化に関与する表面分子の増加
・炎症誘発性サイトカイン(インターロイキンIL-12、IL-1β、TNFαおよびIL-6など)の産生
・抗原を取り込み、分解する能力の低下
などの機能的および表現型修飾を受ける。
【０００３】
免疫応答を発生させ、特異的なTリンパ球応答を開始させる能力があるので、成熟樹状細胞は、特定の治療上、特に抗感染および抗腫瘍免疫ならびに免疫療法の分野で重要である(Austin. 1998年、Curr. Opin. Hematol. 5: 3〜15頁; Reise Sousaら、1999年、Curr. Opin. Immunol. 11: 392〜399頁)。これらの樹状細胞はまた、免疫寛容を誘導する能力があるので、患者の免疫応答の阻害が望まれる場合（特に自己免疫または炎症性疾患と闘うために）、有利な標的である。
【０００４】
in vitroでは、成熟樹状細胞は、単球を培養して得ることができる。これらの単球は、in vivoにおける循環細胞であり、特に血管内皮壁を通過するとき、依然として理解されていない方法でそれら細胞のその後の運命に影響を与える周囲因子と接触する。概略的に、これらの単球について3つの可能性が想像される:
・組織を出てリンパ節に戻る
・マクロファージに分化する
・未成熟樹状細胞に分化する。
【０００５】
したがって、培地中の単球から成熟樹状細胞を得るための第1の工程は、特にインターロイキンIL-4およびGM-CSF因子(顆粒球マクロファージ刺激因子)を用いて、単球の未成熟樹状細胞への分化を誘導することである。6日後には、培地中の細胞の95%は未成熟樹状細胞である。
【０００６】
次に、第2の工程は、細菌またはウイルス因子などの外来性因子を用いて、未成熟樹状細胞の成熟樹状細胞への成熟を誘導することからなる。したがって、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)由来のKpOmpAタンパク質によって、これらの未成熟樹状細胞の成熟樹状細胞への成熟が誘導され得る(P. Jeanninら、Nature Immunology、2000年、1: 502〜509頁)。細菌膜のリポ多糖類などの他の外来性分子を用いた未成熟樹状細胞の成熟樹状細胞への成熟についても言及することができる(Dichmanら、Journal of Cellular Physiology、2000年、185: 394〜400頁)。しかし、感染因子由来の外来性分子を使用する場合、安全性およびコストの問題(in vivoにおける直接的または間接的な副作用; 非常に厳格な法律または規制要件に基づき、精製の必要性が極めて重要であること)が生じることから、ワクチンおよび免疫療法において、このタイプの分子の使用が難しい。
【０００７】
つい最近では、2001年にPerrin-Coconら(The Journal of Immunology、167: 3785〜3791頁)によって、分化途中の単球からの成熟樹状細胞の産生は、ある種の酸化血漿リポタンパク質、より具体的には酸化低密度リポタンパク質(LDL)などの内因性分子を用いて誘導できることが記載されている。しかし、酸化LDLは、タンパク質、トリアシルグリセロール、リン脂質、および遊離およびエステル型コレステロールからなる複雑な粒子であり、人工的に合成するのが困難である。
【非特許文献１】Steinmanら、1997年、Immuno. Rev.、156: 25〜37頁
【非特許文献２】Cellaら、1997年、Curr. Opin. Immunol.、9: 10〜16頁
【非特許文献３】Austin. 1998年、Curr. Opin. Hematol. 5: 3〜15頁
【非特許文献４】Reise Sousaら、1999年、Curr. Opin. Immunol. 11: 392〜399頁
【非特許文献５】P. Jeanninら、Nature Immunology、2000年、1: 502〜509頁
【非特許文献６】Dichmanら、Journal of Cellular Physiology、2000年、185: 394〜400頁
【非特許文献７】Perrin-Coconら、The Journal of Immunology、167: 3785〜3791頁、2001年
【非特許文献８】Carson & Lo、2001年、Science、293: 618〜619頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
単球の樹状細胞への分化を刺激することが、ある種の治療応用分野で(免疫感作中、免疫応答の刺激中に)必須であるが、自己免疫または炎症性疾患などの他の治療応用分野で、単球の樹状細胞へのこのような分化を阻害すること、より一般的には未成熟樹状細胞の成熟を阻害することも必須であり得ることに注意することも重要である。コルチコイドの服用またはアスピリンの服用など、炎症に対処するための治療が現在存在している。問題は、炎症が慢性的な場合、こうした治療には患者にとって極めて有害な副作用が生じることである。コルチコイドの長期服用により、特に、脱灰、特発性骨折および糖尿病が観察されるクッシング症候群が生じる可能性がある。アスピリンの長期服用により、胃潰瘍が生じる可能性がある。本発明は、合成が容易であり、比較的安価な、単球の成熟樹状細胞への分化を阻害する抗炎症性分子も提案することによって、現況技術の欠点を解決することを提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、合成が容易であり、比較的安価な、単球の成熟樹状細胞への分化を刺激する内因性分子である炎症誘発性分子を提供することによって、現況技術の欠点を解決することを提案する。本発明はまた、L-α-リゾホスファチジルコリンの作用の阻害による直接作用、または間接作用によって単球の成熟樹状細胞への分化を阻害するための、特にイントラリピッド(登録商標)など、トリグリセリド、リン脂質およびグリセロールを含む脂質エマルジョンの使用に関する。
【００１０】
驚くべきことに、本発明は、in vitroで単球を成熟樹状細胞に分化させるためのL-α-リゾホスファチジルコリンの使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
「L-α-リゾホスファチジルコリン」という用語は、その式が以下のようである分子を表すものである:
【００１２】
【化１】
2005530488.tif 000002
【００１３】
式中、
【００１４】
【化２】
2005530488.tif 000003
【００１５】
は、12〜20個、好ましくは16〜18個の炭素原子を含む飽和脂肪酸の長鎖を表す。
【００１６】
実際に、LDL酸化中に生成する1種の活性分子は、L-α-リゾホスファチジルコリンであり、以下LPCと称する。しかし、LPCが、LPCに対する高親和性受容体であるG2A受容体と結合すると、特にTリンパ球の増殖および活性化が阻害されることがわかっており、むしろ免疫反応の誘発を阻害するLPCの役割を示唆されている(Carson & Lo、2001年、Science、293: 618〜619頁)。さらに、高濃度のLPC(50μM)によって、転写因子NF-κB(核因子κB)の活性が阻害されることもわかっているが、この転写因子は、樹状細胞の成熟期間に活性化されることが知られている。さらに、LPCは、血漿中に高濃度で存在し、このことから血漿中では活性でないことが示唆され、当業者が治療用途に選択しにくいはずである。
【００１７】
本発明は、in vitroで単球を成熟樹状細胞に分化させる方法であって、
A. 単球を適当な培地中に提供し、
B. 単球の樹状細胞への分化を分化因子の存在下で誘導し、
C. 前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを加え、成熟樹状細胞を得る
ことによる方法に関する。
【００１８】
「適当な培地」という表現は、細胞の生存に必要とされるすべての元素を含む培地を表すものである。例として、RPMI 1640培地およびその派生物、ならびに当業者によく知られている任意の培地を挙げることができる。この培地には特に、少なくとも1種の、単球を樹状細胞に分化させる因子が含まれている。単球を樹状細胞に分化させる因子は、当業者によく知られており、特に、何ら制限を含むものではないが、インターロイキンIL-4、GM-CFS因子(顆粒球マクロファージ刺激因子)、IL-13またはTNF(腫瘍壊死因子)などのサイトカインを挙げることができる。
【００１９】
工程C)では、特に、前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを培地中の最終濃度が10〜80μM、好ましくは約20〜60μM、有利には30〜50μMとなるように加える。さらに、工程C)では、前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを単球分化の3〜6日目、好ましくは単球分化の4〜5日目に加える。
【００２０】
本発明の特定の実施形態によれば、工程C)で、少なくとも1種の生物学的因子も培地に加えている。「生物学的因子」という用語は、免疫応答の標的である、あるいはこの標的の合成を可能にする分子(または1組の分子)を表すものである。したがって、この生物学的因子は、細菌、ウイルス、酵母、寄生虫または真菌抗原、腫瘍抗原、ならびに自己および/または異種腫瘍細胞溶解物から選択することができる。「自己腫瘍細胞」という用語は、所与の医薬品を投与される個人の腫瘍細胞を表すものである。腫瘍細胞は、特に生検または外科的切除術で癌組織のサンプルを採取することによって得ることができる。「異種腫瘍細胞」という用語は、所与の医薬品を投与されている者と異なる個人が起源である腫瘍由来の細胞を表すものである。異種細胞の使用により、特に腫瘍細胞サンプルが得られない癌に苦しんでいる患者を治療する医薬品を得ることが可能になる。これにより、腫瘍抗原の標準的な供給源の使用も可能になる。「細胞溶解物」という用語は、機械的、化学的または酵素的溶解など、当業者に周知のプロトコルによる細胞の溶解によって得られた細胞内および/または膜抗原の混合物を表すものである。この生物学的因子はまた、細菌、ウイルス、酵母、寄生虫または真菌抗原、および腫瘍抗原から選択される少なくとも1種の抗原をコードする核酸であってもよい。「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍関連ペプチド、特にクラスI分子と相互作用し、CD8 Tリンパ球に提示されるペプチドなどの腫瘍細胞由来の抗原を表すものである。既知の非限定的な形で、以下の腫瘍抗原: MAGE-2、MAGE-3、MART、MUC-1、MUC-2、HER-2、GD2、癌胎児抗原(CEA)、TAG-72、卵巣関連抗原OV-TL3およびMOV18、TUAN、α-フェトプロテイン(AFP)、OFP、CA-125、CA-50、CA-19-9、腎腫瘍関連抗原G250、EGP-40(またはEpCAM)、S100(悪性黒色腫関連抗原)、p53、前立腺腫瘍関連抗原(例えばPSAおよびPSMA)およびp21rasを挙げることができる。
【００２１】
したがって、培地にこの生物学的因子を加えることにより、所与の抗原を対象とするTリンパ球の活性化が可能とする、成熟樹状細胞を得ることが可能になる。次いで、in vitroで得られたこれらの成熟樹状細胞をin vivoに再注入することができる。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、工程Cで、L-α-リゾホスファチジルコリンに相当する化合物を使用することも可能であり、この化合物は、L-α-リゾホスファチジルコリンと同じ作用の細胞メカニズムに基づいて、すなわち、同じ膜受容体、特に受容体G2A、GPR4もしくはPAF(血小板活性化因子)受容体などのGタンパク質結合膜受容体、および/またはPPAR受容体(ペルオキシソーム増殖活性化受容体)などの同じ核受容体によって働く分子である。したがって、この同等化合物は、特に前述の受容体(特にO-メチル-PAF、カルバミル-PAFまたは2-O-メチルPAFなど)のアゴニストであってよいが、PAF自体であってもよい。この化合物は、特にL165041(Merck Research)、GW-5015616(Glaxo)もしくはカルボプロスタサイクリン(Cayman)などのPPARδアゴニスト、または特にビスフェノールAジグリシジルエチル(Sigma)もしくはジクロフェナク(登録商標)などのPPARγアンタゴニストであってもよい。L-α-リゾホスファチジルコリンに相当するこの化合物は、単独で、またはL-α-リゾホスファチジルコリンと一緒に使用することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、L-α-リゾホスファチジルコリンを血小板活性化因子(PAF)と一緒に使用している。
【００２３】
本発明はまた、in vitroでTリンパ球を活性化させる方法であって、
A. 単球を適当な培地中に提供し、
B. 単球の樹状細胞への分化を分化因子の存在下で誘導し、
C. 前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを加え、成熟樹状細胞を得て、
D. 前記培地に上記の生物学的因子を加え、工程Bで得られた成熟樹状細胞を前記生物学的因子に対するものとし、
E. 工程Cによる生物学的因子に対する成熟樹状細胞をTリンパ球と接触させ、生物学的因子に対するTリンパ球を得る
ことによる方法に関する。
【００２４】
工程C)は、上記のように実施することができる。したがって、このような方法により、in vitroで所与の生物学的因子に対するTリンパ球を得ることが可能になり、次いで、これを患者、特に免疫抑制された患者にin vivoに再注入することができる。
【００２５】
本発明はまた、in vitroで樹状細胞を成熟させる方法であって、
A. 未成熟樹状細胞を適当な培地中に提供し、
B. 前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを加え、成熟樹状細胞を得る
ことによる方法に関する。
【００２６】
当業者は、樹状細胞とそれらの様々な成熟段階についてよく知っている。
【００２７】
工程B)では、特に、前記培地にL-α-リゾホスファチジルコリンを培地中の最終濃度が約10〜80μM、好ましくは約20〜60μM、有利には30〜50μMとなるように加える。本発明の特定の実施形態によれば、工程B)で、少なくとも1種の上記の生物学的因子も培地に加えている。
【００２８】
本発明はまた、L-α-リゾホスファチジルコリンおよび少なくとも1種の上記の分化因子を含むことを特徴とする培地に関する。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態では、L-α-リゾホスファチジルコリンの最終濃度は、培地中で約10〜80μM、好ましくは約20〜60μM、有利には30〜50μMである。本発明の特定の実施形態によれば、培地には、特に細菌、ウイルス、酵母、寄生虫または真菌抗原、自己および/または異種腫瘍細胞溶解物抗原、腫瘍抗原、細菌、ウイルス、酵母、寄生虫または真菌抗原をコードする核酸、あるいは腫瘍抗原をコードする核酸である、上記の生物学的因子も含まれる。
【００３０】
本発明はまた、免疫システムを活性化させる因子としてのL-α-リゾホスファチジルコリンの使用に関する。「活性化させる因子」という用語は、薬剤組成物中で薬物の効果を誘発し、または主要薬物の効果を強化もしくは完全なものにする分子を表すものである。ワクチン組成物の場合、L-α-リゾホスファチジルコリンは、所与の抗原に対する宿主生物の免疫応答を刺激するアジュバントの役割を果たす。したがって、本発明は、免疫システムを活性化させる因子としてL-α-リゾホスファチジルコリン(これはその場合アジュバントの役割を果たす)、および上記の生物学的因子(それに対して患者の免疫応答を刺激することが望ましい)を含むことを特徴とするワクチン組成物に関する。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態によれば、L-α-リゾホスファチジルコリンは、細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫起源の感染症または酵母によって引き起こされる感染症の治療および/または予防用の医薬品を製造するための、かつ/または癌の治療および/または予防用の医薬品を製造するための、免疫システムを活性化させる因子として使用している。
【００３２】
細菌感染症としては、特にブドウ球菌、マイコバクテリア、ナイセリア(Nisseria)属の細菌、レジオネラ、サルモネラなどによって誘発される感染症を挙げることができる。
【００３３】
ウイルス感染症としては、特にHIV(ヒト免疫不全ウイルス)、肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、フラビンウイルスなどによって誘発される感染症を挙げることができる。
【００３４】
真菌感染症としては、特にアスペルギルス症、カンジダ症などを挙げることができる。
【００３５】
寄生虫感染症としては、特にマラリア、リーシュマニア症などを挙げることができる。
【００３６】
「癌」という用語は、細胞の異常増殖によるすべての疾患、特に非限定的な形で、黒色腫、リンパ腫、白血病、腎臓、脳、大腸、前立腺、直腸、膵臓、卵巣、肺、肝臓および乳癌、ケラチノーマ(keratinoma)および癌腫から選択される皮膚癌、ならびに黒色腫を表すものである。
【００３７】
本発明による医薬品は、当業者によく知られている少なくとも1種の薬剤として許容される賦形剤と併せた薬剤組成物の形で提供することができる。本発明による薬剤組成物では、経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所、気管内、直腸もしくは経皮投与の場合、L-α-リゾホスファチジルコリンを単位投与形態で、または従来の薬剤支持体との混合物として投与でき、また例えば錠剤、ゲルカプセル剤、経口液剤などの形態での経口投与、または坐剤の形態での直腸投与、特に静脈内、皮内もしくは皮下注射などによる注射剤の形態での非経口投与を対象とする場合、当業者によく知られている従来のプロトコルによって投与することができる。局所投与の場合、L-α-リゾホスファチジルコリンは、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤または点眼剤に使用することができる。
【００３８】
錠剤の形態で固体組成物を調製する場合、L-α-リゾホスファチジルコリンを、ゼラチン、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アラビアゴムなど、薬剤ベヒクルとも呼ばれる薬剤として許容される賦形剤と混合する。錠剤は、スクロース、セルロース誘導体または他の適当な物質でコーティングすることができる。これらは、活性を長期間もたすように、または、遅れて活性が生じるように、かつ所定量のL-α-リゾホスファチジルコリンを連続的に放出するように処理することもできる。L-α-リゾホスファチジルコリンを希釈剤と混合し、この混合物を軟または硬ゲルカプセル中に注ぐことによってゲルカプセルの製剤を得ることも可能である。L-α-リゾホスファチジルコリンが甘味料、特にメチルパラベンおよびプロピルパラベンなどの消毒薬、さらには適当な調味料または色素と一緒に含まれる、シロップ剤の形態のまたはドロップの形態で投与するための製剤を得ることも可能である。水和剤または顆粒水和剤には、L-α-リゾホスファチジルコリンが、当業者によく知られている分散剤もしくは湿潤剤、または懸濁化剤との混合物として含まれていてよい。非経口投与の場合、水性懸濁剤、等張食塩水または特にプロピレングリコールもしくはブチレングリコールなどの薬理学的に適合する分散剤もしくは湿潤剤を含む無菌で注射可能な液剤を利用する。
【００３９】
本発明はまた、炎症を予防し、かつ/または炎症性疾患および/または自己免疫疾患に効く医薬品を製造するための、少なくとも1種のL-α-リゾホスファチジルコリン阻害剤の使用に関する。「L-α-リゾホスファチジルコリン阻害剤」という用語は、特にL-α-リゾホスファチジルコリンで成熟樹状細胞の分化をブロックすることによってL-α-リゾホスファチジルコリンの免疫刺激活性および/または炎症をブロックする分子(または1組の分子)を表すものである。これは、特にPPARδ/PPARγ比を調節することによって、L-α-リゾホスファチジルコリンと反対の効果があるモジュールを表すものでもある。目安として、特にイントラリピッド(登録商標)、リポイドE-80(登録商標)、PPARγアゴニストなどの、トリグリセリド、リン脂質およびグリセロールを含む脂質エマルジョンを挙げることができる。PPARγアゴニストは当業者によく知られており、非限定的な形で、特にシグリタゾン、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンなどの、チアゾリジンジオンクラスの分子を挙げることができる。したがって、こうした阻害剤は、炎症反応、特に関節の、または特に移植中の炎症反応を軽減する医薬品を製造するためにin vivoで使用することができる。本発明の好ましい実施形態によれば、L-α-リゾホスファチジルコリンの阻害剤は、トリグリセリド、リン脂質およびグリセロールを含む脂質エマルジョンである。トリグリセリドは、特に大豆油などの植物油から抽出されたものであることが好ましい。脂質エマルジョンが、15〜25%の大豆油、好ましくは 20%の大豆油、0.5〜1.5%の卵リン脂質、好ましくは1.2%、および1.8〜2.6%のグリセロール、好ましくは2.2%のグリセロールを含むことがさらに好ましい。本発明の別の好ましい実施形態によれば、阻害剤は、上記のPPARγアゴニストである。
【００４０】
炎症性疾患としては、特に肉腫症、狼瘡、リウマチ様関節炎、脊椎炎、ブドウ膜炎などを挙げることができる。
【００４１】
自己免疫疾患としては、特に1型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、接触過敏症、リウマチ様関節炎、脊椎炎などを挙げることができる。
【００４２】
以下の実施例は、説明として示しているものであり、本質的に限定するものではない。これらにより、本発明をより十分に理解することが可能になる。
【実施例】
【００４３】
（実施例１）L-α-リゾホスファチジルコリン(LPC)の存在下、または不在下における培養単球の樹状細胞への分化
−単球の単離、培地への播種および分化の開始−
フィコール-ハイパック中の第1の密度勾配遠心分離(620g; 20分)、続いて50%パーコール液中の第2の遠心分離(770 g; 20 minutes)によって単球をヒト末梢血から単離する。次いで、抗CD19(ハイブリドーマ4G7)(Becton Dickinson、米国ニュージャージー州Francklin Lakes)、抗CD3(OKT3、米国基準菌株保存機構(American Type Culture Collection)、米国メリーランド州Rockeville)および抗CD56(NKH1、Beckman Coulter、米国カリフォルニア州Fullerton)モノクローナル抗体のカクテルを用いて磁気免疫除去(immunomagnetic depletion)(Dynal、ノルウェー、Oslo)によって単球を精製する。次いで、このようにして得られた単球(CD1aマーカーが存在せず、CD14マーカーが存在することによって示される)を少なくとも90%まで精製する。単球の樹状細胞への分化は、40ng/mlの組換え型ヒトGM-CSF(顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子)および250U/mlの組換え型ヒトインターロイキンIL-4を用いて開始する。
【００４４】
単球は、2mMのグルタミン(Life Technologies)、10mMのHepes(Life Technologies)、40ng/mlのゲンタマイシン(Life Technologies)および10%のリポタンパク質除去ウシ胎児血清(LPDS、Sigma、フランス、St Quentin-Fallavier)を加えたRPMI 1640培地(Life Technologies、米国メリーランド州Rockeville)中に播種する。
【００４５】
この実施例で示している培地は、LPDS培地であることに留意されたい。同様の結果が、FCS培地、すなわち10%の非リポタンパク質除去ウシ胎児血清を含む培地などの他の培地を用いて得られ、あるいは当業者に周知の任意の合成培地を用いて得られる。
【００４６】
−LPCを用いた単球の処理−
単球の分化の開始から5日後に、培地に40μMのLPC(L-α-リゾホスファチジルコリン; Sigma、フランス、St Quentin Fallavier)を24時間加える。また、LPCを含まない培地中で対照細胞を得る。
【００４７】
その結果、「対照」細胞および「LPC」細胞が得られる。
【００４８】
（実施例２）実施例1によって得られた細胞の表現型
この分析で使用した細胞は、実施例1に記載のプロトコルによって分化の6日目に得られたものである。
【００４９】
「対照」および「LPC」細胞の表現型は、FITC(フルオレセインイソチオシアネート)結合抗CD14、抗HLA-DRおよび抗CD80ならびにPE(フィコエリトリン)結合抗CD1a、抗CD83、抗CD86および抗CD40(Beckman Coulter)を用いてFACSCalibur(Becton Dickinson、米国ニュージャージー州Francklin Lakes)でフローサイトメトリーによって分析する。現況技術によれば、単球は優先的にCD14+ CD1a-表現型をもち、未成熟樹状細胞は優先的にCD14- CD1a+ CD86-表現型をもち、また成熟樹状細胞は優先的にCD14- CD1a中間体- CD86+表現型をもつ。
【００５０】
得られた結果を表1に示す。
【００５１】
【表１】
2005530488.tif 000004
【００５２】
LPCの存在下において単球の分化の開始後に得られた「LPC」細胞は、「対照」細胞の表現型と比較して特にCD86マーカーの誘発およびHLA-DRの増加によって示される、成熟樹状細胞と同様の表現型を示す。
【００５３】
（実施例３）実施例1によって得られた細胞の内部移行能力
この分析で使用した「対照」および「LPC」細胞は、実施例1に記載のプロトコルによって分化の6日後得られたものである。これらの細胞は、
・これらの細胞のエンドサイトーシスによる細胞内取込み能力を評価するために、1mg/mlのFITC-T70-デキストラン(Sigma)と一緒に30分間、
・これらの細胞のピノサイトーシスによる細胞内取込み能力を評価するために、1mg/mlのルシファーイエロー(参照L0259、Sigma、フランス、St Quentin-Fallavier)と一緒に30分間、
・これらの細胞のマクロピノサイトーシスによる細胞内取込み能力を評価するために、カルボキシレート修飾黄緑色FluoSpheres(商標名、0.45μm、Molecular Probes、オランダ、Leiden)と一緒に3時間、
37℃でインキュベートする。
【００５４】
細胞内取込みを、0.1%のBSA(ウシ血清アルブミン)および0.05%のNaN3を含む冷PBS緩衝液を用いて氷上で停止させる。「対照」および「LPC」細胞をこの同じ緩衝液中で4℃で3回洗浄し、FACScalibur(商標名、Becton Dickinson)によって蛍光を定量する。
【００５５】
表2に示すように、エンドサイトーシス、ピノサイトーシスおよびマクロピノサイトーシスによる細胞内取込み能力は、LPCの不在下で分化させた対照細胞と比較して、単球の分化の5日目に培地にLPCを加えたことによって大幅に低下している。
【００５６】
【表２】
2005530488.tif 000005
【００５７】
細胞内取込み能力の低下は、成熟樹状細胞の特徴の1つである。これらの結果から、単球は、LPCの存在下において成熟樹状細胞に分化する傾向が強いことがわかる。
【００５８】
（実施例４）実施例1によって得られた細胞のTリンパ球を刺激する能力
この分析で使用した「対照」および「LPC」細胞は、実施例1に記載のプロトコルによって分化の6日後得られたものである。
【００５９】
ナイーブ同種Tリンパ球(naive allogenic T lymphocytes)をヒト末梢血から単離する。末梢血単核細胞は、フィコール-ハイパックの存在下で密度勾配遠心分離(600g、20分)によって単離する。パーコール勾配で単球を除去した後、末梢血リンパ球は高密度画分に見られる。抗CD19(抗体4G7)(Becton Dickinson、米国ニュージャージー州Francklin Lakes)、Beckman Coulterによって販売されているモノクローナル抗体の抗CD16(抗体3G8)、抗CD56(抗体NKH1)、抗グリコホリンA(抗体11E4B7.6)および抗CD14 (抗体RMPO52)のカクテルを用いて磁気免疫除去によってTリンパ球を精製する。
【００６０】
平底96穴培養プレート中で精製したTリンパ球を「対照」または「LPC」細胞と一緒に培養する。
【００６１】
LPC/T細胞比(DC/LT比)1:5、1:10または1:20が存在する場合または存在しない場合に分化させた単球に基づいて、2×105個のT細胞を培地200μl中で培養する。4日後に、培養上清50μlを使用して、IL-2(インターロイキン2)およびγIFN(γインターフェロン)の分泌をELISAキット(Endogen、米国マサチューセッツ州Woburn)を用いて測定する。
【００６２】
表3に示すように、従来、樹状細胞/Tリンパ球比(DC/LT比)によって表されてきたTリンパ球によるIL2およびγIFNの分泌は、対照の結果(「対照」細胞)と比較して、単球分化の開始から5日後に加えたLPCの存在下における単球の分化から生じた細胞(「LPC」細胞)によって大幅に刺激されている。
【００６３】
【表３】
2005530488.tif 000006
【００６４】
これらの結果から、LPCの存在下で分化した単球の同種Tリンパ球を刺激する能力（成熟樹状細胞の特徴である）が増大したことがわかる。目安として、LPCがエタノールに溶解していようと脂質エマルジョンの形態であろうと同様の結果が得られている。
【００６５】
（実施例５）実施例1によって得られた細胞の特性: 酸化LDLの存在下における単球の分化によって得られた成熟樹状細胞との比較
この実施例の目的は、LPCの存在下における単球の成熟樹状細胞への分化に関与する作用のメカニズムが、酸化LDLの存在下における単球の成熟樹状細胞への分化に関与するもの(Perrin-Coconら、The Journal of Immunology、167: 3785〜3891頁、2001年)と異なり得ることを示すことである。
【００６６】
この実施例では、使用した細胞は、実施例1で得られた「対照」および「LPC」細胞、さらには科学文献(Perrin-Coconら、The Journal of Immunology、167: 3785〜3891頁、2001年)に記載のように、すなわち分化の開始から5日後に培地に加えた酸化LDLの存在下で培養単球が分化した後に得られた「LDLox」細胞である。
【００６７】
本発明者らは、単球の成熟樹状細胞への分化に対する酸化LDLの作用の阻害剤が、単球の成熟樹状細胞への分化に対するLPCの作用も阻害したかどうか調べた。
【００６８】
したがって、イントラリピッド(登録商標)(50μg/mlのリン脂質、Fresenius Kabi、フランス、Sevres)の溶液、または本質的に脂質である合成分子(リポイド(登録商標)E-80、リポイドAg、ドイツ、Ludwigshafen、50μg/mlのリン脂質)の溶液を、分化5日目の培地に加えた。これらの阻害剤の存在下における「LPC」および「LDLox」細胞によるCD86の発現を、実施例2に記載のプロトコルによって分析し、その結果を表4に示す。
【００６９】
【表４】
2005530488.tif 000007
【００７０】
イントラリピッド(登録商標)を加えると、酸化LDLおよびLPCによる単球の成熟樹状細胞への分化が、同じように(80%程度の阻害)、阻害される。
【００７１】
これに反して、驚くべきことに、リポイドE-80を加えると、酸化LDLの存在下で単球を培養した場合にはCD86の発現が81%阻害されるが、LPCの存在下で単球を培養した場合にはこの阻害は24%にすぎない。
【００７２】
これらの結果から、単球の成熟樹状細胞への分化に関するLPCの作用のメカニズムが、酸化LDLの作用のメカニズムと異なることが示唆される。
【００７３】
（実施例６）LPCの存在下における単球の成熟樹状細胞への分化に関与する細胞メカニズム
単球の成熟樹状細胞への分化におけるLPCの作用の細胞メカニズムについての調査をさらに進めるために、本発明者らは、どの受容体が関与し得るか調べた。
【００７４】
最初に、単球の成熟樹状細胞への分化におけるLPCの作用に関与する受容体がGタンパク質共役型受容体のファミリーに属しているかどうか判定するために、Giタンパク質をブロックすることが知られているPTX(百日咳毒素; 100ng/ml)を培地に3時間加えた。次いで、培地を交換し、実施例1に記載のようにLPCを加えた。
【００７５】
表5に示す結果は、単球をPTXでプレインキュベーションするとLPCによって誘導されるCD86の増大がブロックされることを示しており、LPCの作用がGiタンパク質共役型受容体に関与していることが示唆される。
【００７６】
【表５】
2005530488.tif 000008
【００７７】
これらの受容体は、特に以下の受容体であり得る:
・G2A受容体(G2A-R): LPCは、リンパ球で発現される受容体と結合したGタンパク質であるG2Aタンパク質に対する高親和性リガンドであることが最近実証された。さらに、LPCによるG2Aの刺激によって、細胞外キナーゼ(ERK1/2: 細胞外シグナル関連キナーゼ)のリン酸化が誘導される。さらに、このリン酸化は、培地にLPCを加えた場合に観察でき、LPCによる単球の成熟樹状細胞への分化におけるG2A受容体の関与を示唆している。
・上記のPAF受容体(PAF-R); LPCのある種の効果が様々なタイプの細胞中のPAF受容体に関与し得る。
・GPR4受容体: LPCは、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して高親和性の受容体と結合した別のGタンパク質であるGPR4タンパク質に対するリガンドでもある。
【００７８】
次に、本発明者らは、LPCによって誘導される成熟プロセスに関与する転写因子を調べた。PPARがLPC誘導性の成熟に関与しているかどうかを判定するために、ゲルシフト法を用いて、2つの転写因子PPARγおよびPPARδの結合能力を分析した。PPAR核受容体(ペルオキシソーム増殖活性化受容体)には3つのアイソタイプ: α、γおよびδが存在する。PPARγは、II型糖尿病の治療に用いられる、シグリチゾン(ciglitizone)などのチアゾリジンジオンクラスの分子に対する標的である。PPARδは、よりブロードに発現し、PPARγのリプレッサーになり得る。分化途中の単球は、LPC(40μM)の溶液と一緒に2時間インキュベートした(「LPC」細胞)。「対照」細胞はまた、LPCを含まない培地中で得る。細胞を回収した後、核抽出キット(Sigma)を用いて核タンパク質を抽出した。次いで、核タンパク質を、PPARによって認識される応答エレメントを含む放射標識したプローブと接触させた。非変性ゲル上での泳動後、スーパーシフト法によって、抗体を用いてPPARγを含むバンドおよびPPARδを含む二重線が確認された。PPAR結合活性は、これらのバンドの強度を測定することによって決定した。これらの活性を「対照」細胞に対するパーセント値として表す。
【００７９】
【表６】
2005530488.tif 000009
【００８０】
LPCを用いた処理によって、完全な消失がもたらされるようなPPARγの結合活性の大きな低下が誘導され、PPARδの活性が大幅に刺激される。
【００８１】
次いで、本発明者らは、PPARγアゴニスト、シグリチゾンを使用した。実施例1に記載のように、単球分化の5日目に、LPC(40μM、2時間)の溶液を加える15分前にシグリチゾン(Sigma、50μM)の溶液を培地に加えた。得られた細胞は、「LPC+シグリチゾン」細胞である。「シグリチゾン」細胞は、同じプロトコルによって（ただしLPCの不在下において）得、「LPC」細胞は、シグリチゾンの不在下で実施例1に記載のように得た。
【００８２】
上記のゲルシフト法によって、これらの細胞でPPARγおよびPPARδ転写因子の活性を測定した。
【００８３】
【表７】
2005530488.tif 000010
【００８４】
これらの結果から、PPARγを活性化させるシグリチゾンは、PPARγおよびPPARδに対するLPCの効果を大幅に阻害し、その結果LPCに誘導される樹状細胞の成熟がブロックされることが示されている。
【００８５】
次いで、これらの細胞(「対照」、「シグリタゾン」および「LPC+シグリタゾン」細胞)のTリンパ球 (LT)を刺激する機能的な能力を分析した。これらの細胞を、精製した同種Tリンパ球の存在下において、実施例4に記載のように培養した。実施例4と同様にしてγIFNの分泌を測定した。
【００８６】
【表８】
2005530488.tif 000011
【００８７】
これらすべての結果は、LPC誘導性の樹状細胞の成熟におけるPPARの重要な役割、さらに機能を有する成熟樹状細胞の産生におけるPPARγ/PPARδ比の重要性を強調している。この比は、LPCおよびシグリチゾンによって調整される。
【００８８】
（実施例７）LPCに相当する化合物の存在下における単球の成熟樹状細胞への分化
本発明者らは、LPCに相当する、すなわち同じ膜または細胞内受容体による同じ作用の細胞メカニズムを伴う化合物が、単球の成熟樹状細胞への分化も誘導できるかどうか判定した。
【００８９】
このことについて、本発明者らは、培地にPAFを加えることにより、単球の成熟樹状細胞への分化に対するLPCの作用が増大するかどうか調べた。
【００９０】
したがって、単球分化の5日目にPAF(Sigma、5μM)の溶液を培地に加えた。PAFの存在下または不在下で得た、「対照」細胞および「LPC」細胞によるCD86の発現は、実施例2に記載のプロトコルによって分析し、その結果を表9に示す。
【００９１】
【表９】
2005530488.tif 000012
【００９２】
これらの結果から、CD86の発現の470%増大を誘導するLPCとは異なり、PAF単独ではCD86のわずかな過剰発現が誘導されることが示唆されている。その反面、2つの化合物の作用により、CD86の発現において1200%の増大が誘導されるので、PAFはLPCと相乗的に作用することに留意することが重要である。
【００９３】
PAF受容体が関与しているという考えを強固にするために、本発明者らは、LPCによる単球の成熟樹状細胞への分化に対するこの受容体のアンタゴニストの作用を研究した。
【００９４】
したがって、単球分化の5日目にPAFアンタゴニストBN52021(Biomol、米国、Plymouth Meeting、100μM)の溶液を培地に加えた。BN52021の存在下または不在下で得た、「対照」および「LPC」細胞によるCD86の発現は、実施例2に記載のプロトコルによって分析し、その結果を表10に示す。
【００９５】
【表１０】
2005530488.tif 000013
【００９６】
これらの結果から、LPCの作用が明らかにPAF受容体に関与していることが示唆されているが、LPCの作用が他の受容体に関与していてよいことも示唆される。
【００９７】
目安として、本発明者らは、酸化LDLによって誘導された単球の成熟樹状細胞への分化の5日目に培地に加えたアンタゴニストBN52021が、酸化LDLの作用の100%阻害を誘導することを示し、このことによりLPCおよび酸化LDLの作用のメカニズムが異なることをここで再度示唆される。
【００９８】
（実施例８）LPCによる、抗原に対する免疫応答のin vivo刺激
この実施例の目的は、LPCが、免疫システムのアジュバントであり、抗原に対して特異的なT応答を増大させるために免疫において使用することができる分子であることを示すことである。
【００９９】
−LPCは炎症性産物である−
この実施例では、100〜500nmolのLPCをPBS 50μlに溶解させた溶液を、0日目にBALB/cマウス(Charles River Laboratories)の足蹠に注入する。注入の前後および10日目までマイクロメーターを用いて足蹠を測定し、PBS(50μl)の注射によって得られた「対照」マウスの足蹠と比較する。炎症の強さは、足の肥厚に反映する。最大肥厚は、1日目、注射から24時間後に観察される。
【０１００】
【表１１】
2005530488.tif 000014
【０１０１】
これらの結果から、LPCによって注射した用量に対する炎症依存性が誘導されることがわかる。
【０１０２】
in vivoでLPCが樹状細胞の成熟、それによる流入領域リンパ節への移動を誘導することを示すために、LPC(フタル酸ジブチル中0.1M)溶液をBALB/cマウス(Charles River Laboratories)の耳の皮膚に塗布した10分後に、1.5% FITC(Sigma)の1:1フタル酸ジブチル/アセトン溶液を塗布した。この蛍光標識は、皮膚の樹状細胞によって取り込まれる。24時間後、耳および上顎のリンパ節を取り出し、これらの細胞を懸濁液中に入れる。メトリザミド(Sigma)勾配遠心分離によって、この細胞懸濁液に樹状細胞を多く含める。これらの細胞を、主要組織適合複合体(MHC)クラスI分子を認識する抗体(Pharmingen)で標識し、フローサイトメトリーによる分析によって、MHCクラスII分子を発現し、FITCを含む大細胞(樹状細胞)の比率を定量することが可能になる。これらの細胞は、末梢でFITCを取り込み、リンパ節まで移動した提示細胞である。
【０１０３】
【表１２】
2005530488.tif 000015
【０１０４】
これらの結果から、LPCの塗布によって皮膚の樹状細胞の流入領域リンパ節への移動が刺激されることがわかる。
【０１０５】
LPCは、同時注入した可溶性抗原に特異的なT応答を刺激する。PBSに溶解させたLPC(50μl中250または500nmol)を雌鶏卵リゾチーム(HEL、50μg)と混合し、この混合物をBALB/cマウスの足蹠に注入する。7日後に膝窩リンパ節を取り出し、それらの細胞を3組に分けてin vitroで、30μMのHEL抗原を含む培地中、またはHELの不在下で再刺激する。3日後に、16時間の粉末チミジンの取込みによってTリンパ球増殖を測定する。
【０１０６】
【表１３】
2005530488.tif 000016
【０１０７】
これらの結果から、抗原と一緒に同時注入したLPCが、in vivoでこの抗原に特異的なTリンパ球の活性化を促進することがわかる。
【０１０８】
LPCは、同時注入した可溶性抗原に対して特異的な抗体の産生を刺激する。PBSに溶解させたLPC(50μl中350nmol)を雌鶏卵リゾチーム(HEL、1mg/ml)と混合し、この混合物をBALB/cマウスの足蹠に注入する。「HEL+LPC」バッチのマウスの2本の後足の足蹠に、この混合物を50μl投与する。「HEL」バッチのマウスの2本の足に、HEL溶液(PBS中1mg/ml)50μlを投与する。15日後に、両側腹部の皮下にブースター注射を行う。「HEL+LPC」バッチでは、各側腹部に、LPC(5mM)とHEL(1mg/ml)のPBS溶液100μlを投与する。「HEL」バッチでは、各側腹部に、HEL(1mg/ml)のPBS溶液100μlを投与する。2週間後に血液をマウスから採取し、標準的なIgG溶液範囲について、HEL抗原に特異的なIgGをELISAによって分析する。吸光度(Abs)を血清希釈液の対数の関数として示す滴定曲線を図1に示す。
【０１０９】
これらの結果から、抗原と一緒に同時注入したLPCは、免疫システムの活性化を促進し、抗原に特異的な抗体の合成を誘導するが、抗原単独での注入は応答を誘導しないことが示唆される。LPCは、抗原に対する体液性応答を誘導し、そのアジュバント能力を示す。
【０１１０】
LPCは、in vivoでCD8+Tリンパ球応答を誘導することができる。この実施例では、ハプテンに対する遅延接触過敏症についての試験を使用した。このモデルでは、BALB/cマウスの背中にハプテン、DNFB(1-フルオロ-2,4-ジニトロベンゼン、0.5%の1:1オリーブ油/アセトン溶液)を塗布することによって感作する。5日後、左耳には非刺激量のDNFB(0.2%の1:1オリーブ油/アセトン溶液)を塗布するが、右耳には溶媒を投与する。この誘発期では、ハプテン化タンパク質に特異的なCD8+Tリンパ球が補充されて耳に浸潤し、γIFNを分泌させ浮腫を生じさせる。
【０１１１】
「対照」バッチのマウスをDNFB単独で感作し、DNFBを塗布する10分前にLPCのエタノール溶液20μlを背中の皮膚に塗布することによって別のバッチ(「LPC」マウス)に500nmolのLPCを投与した。5日後に、誘発期において2つのバッチを同様に処理し、この塗布の48時間後にマイクロメーターを用いて耳の肥厚を測定した。
【０１１２】
【表１４】
2005530488.tif 000017
【０１１３】
これらの結果から、ハプテンでの感作10分前にLPCを塗布することにより、ハプテンの2回目の塗布中に誘導される浮腫が増大する(誘発)ことがわかる。これは、LPCがCD8+Tリンパ球によってリレーされる応答を刺激することを表す。
【０１１４】
（実施例９）単球の成熟樹状細胞への分化に対するイントラリピッド(登録商標)などの脂質エマルジョンの作用
イントラリピッド(登録商標)などの脂質エマルジョンがLPC誘導性の成熟樹状細胞の産生をブロックすることが実施例5でわかったので、本発明者らは、このブロッキングが、LPCの作用の阻害によるこの脂質エマルジョンの間接作用および/またはこの脂質エマルジョンの直接作用によってもたらされるのかについても調べた。
【０１１５】
イントラリピッド(登録商標)は、PPARをin vitroで調節する。最初に、実施例6に記載のものと同様のプロトコルによって、単球分化の5日目にイントラリピッド(登録商標)(50μg/mlのリン脂質)の溶液を培地に加えた。イントラリピッド(登録商標)と一緒に1時間、2時間または8時間インキュベートした後、細胞を回収し、実施例6に記載のように核タンパク質を抽出し、PPARγおよびPPARδの活性を測定した。
【０１１６】
【表１５】
2005530488.tif 000018
【０１１７】
これらの結果から、イントラリピッド(登録商標)は単独でPPARγを活性化させ、PPARδの活性を阻害することがわかる。イントラリピッド(登録商標)の作用はLPCのものと反対である。
【０１１８】
第2に、単球分化の5日目に、LPC(40μM)の溶液を加える15分前にイントラリピッド(登録商標)(50μg/mlのリン脂質)の溶液を培地に加えた(「LPC+イントラリッピッド」細胞)。「イントラリピッド」細胞もLPCの不在下で得た。「LPC」細胞は、イントラリピッド(登録商標)の不在下で得た。2時間インキュベートした後にこれらの細胞を回収し、実施例6に記載のように核タンパク質を抽出し、PPARγおよびPPARδの活性を測定した。
【０１１９】
【表１６】
2005530488.tif 000019
【０１２０】
イントラリピッド(登録商標)は、PPARγおよびPPARδの活性を調節することによってLPCの作用もブロックする。
【０１２１】
イントラリピッド（登録商標）は、in vivoでLPCによって誘導される炎症および免疫応答をブロックする。この実施例では、溶液50μlを足蹠に注入することによって、3バッチのBALB/cマウスを雌鶏卵リゾチーム(HEL)抗原に対して免疫する。「HEL」対照バッチには、HEL 50μgを投与し、「HEL+イントラリピッド」バッチには、イントラリピッド(登録商標)(45μl)とHEL 50μg(10mg/mlの溶液5μl)の混合物を投与する。「HEL+LPC」バッチには、HEL 50μgを、PBSに溶解させた350nmolのLPCと一緒に投与する。「HEL+LPC+イントラリピッド」バッチには、イントラリピッド(登録商標)45μlに溶解させた350nmolのLPCと混合したHEL 50μgを投与する。24時間後に、マイクロメーターを用いて足蹠の厚さを測定し、注入前に採取した測定値と比較する。厚さの差は炎症の強さに比例する。
【０１２２】
【表１７】
2005530488.tif 000020
【０１２３】
これらの結果から、LPCと同時にイントラリピッド(登録商標)を注入すると、足蹠のLPC誘導性の炎症が70%軽減することがわかる。
【０１２４】
注入してから7日後に膝窩リンパ節を取り出し、それらの細胞を3組に分けてin vitroで、10μMのHELを含む培地中、またはHELの不在下で再刺激する。3日後に、16時間の粉末チミジンの取込みによってHEL特異的Tリンパ球の増殖を測定する。
【０１２５】
【表１８】
2005530488.tif 000021
【０１２６】
これらの結果から、LPCと同時に注入したイントラリピッド(登録商標)は、T応答のLPC誘導性刺激をブロックすることがわかる。
【０１２７】
これらすべての結果から、イントラリピッド(登録商標)は、LPCの作用の阻害によるイントラリピッド(登録商標)の間接作用によってLPC誘導性の成熟樹状細胞の発生をブロックするが、LPCのアンタゴニストであるPPARに対するイントラリピッド(登録商標)の直接作用によってもブロックすることがわかる。これらの結果から、イントラリピッド(登録商標)は単独で抗炎症性の役割があることがわかる。
【０１２８】
これらのすべての結果は、機能成熟樹状細胞の発生におけるPPARγ/PPARδ比の重要性を示している。この比は、LPCによって調節されるが、逆にイントラリピッド(登録商標)などの脂質エマルジョンまたはシグリチゾンによっても調節される。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】吸光度(Abs)を、雌鶏卵リゾチーム(HEL、1mg/ml)と混合したLPC、またはHEL単独を投与したバッチのマウスの血清希釈液の対数の関数として示す滴定曲線を示す図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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