(57)【要約】【課題】平均分子量約3,000〜約6,000、硫酸化度３.２〜４の新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩の提供。  【解決手段】硫酸化度が３.２〜４、平均分子量が約3,000〜約6,000のLMW-K5-N,O-過硫酸塩と中間体LMW-K5-N-硫酸塩を開示し、LMW-K5-N,O-過硫酸塩は対応するK5-N,O-過硫酸塩の解重合又はLMW-K5-N-硫酸塩から出発して、それらの第３級アミン又は第４級アンモニウム塩のＯ-過硫酸化、次いで得たK5-アミン-０-過硫酸塩のＮ-再硫酸化で製造され、LMW-K5-N,O-過硫酸塩を含む医薬組成物は、抗脈管形成作用及び抗ウイルス作用を有す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量が約3,000〜約6,000、硫酸化度が３.２〜４のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項２】
全チェーンの中の主要構成成分が式（Ｉ）を有するチェーンの混合物を含む請求項１に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【化１】
2005530877.tif 000019
ここで、ｑは、４、５、６、７又は８、Ｒ、Ｒ'、Ｒ''は、水素又はSO3-基、硫酸化度が３.２〜４、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項３】
平均分子量が3,750〜4,250である請求項１又は２に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項４】
平均分子量が4,750〜5,250である請求項１又は２に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項５】
平均分子量が5,750〜6,250である請求項１又は２に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項６】
全チェーンの中の主要構成成分が式（Ｉ°）の化合物であるチェーンの混合物を含む請求項１又は２に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【化２】
2005530877.tif 000020
ここで、Ｒ、Ｒ'、Ｒ''は、水素又はSO3-基、Ｘ'は、ホルミル又はヒドロキシメチル基、硫酸化度が３.２〜４、ｍは、４、５又は６、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項７】
平均分子量が3,750〜4,250である請求項６に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項８】
平均分子量が4,750〜5,250である請求項６に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項９】
平均分子量が5,750〜6,250である請求項６に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項１０】
硫酸化度が３.５〜４である請求項１〜９のいずれか１項に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項１１】
硫酸化度が３.５〜３.９である請求項１〜９のいずれか１項に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項１２】
硫酸化度が３.２〜４のLMW-K5-N,O-過硫酸塩を製造する方法で、
（ａ）K5-N-硫酸塩の亜硝酸解重合、次いで、還元によって得たLMW-K5-N-硫酸塩を、酸の形で、第３級アミン又は水酸化第４級アンモニウムで処理し、溶液のｐＨを７に維持して反応混合物を３０〜６０分間放置し、その塩を前記有機塩基で単離すること、
（ｂ）前記多糖類の第３級アミン又は第４級アンモニウム塩を、Ｏ-過硫酸化反応条件下でＯ-硫酸化剤で処理すること、
（ｃ）生成された生成物を、Ｎ-硫酸化剤でえ処理し、得たLMW-K5-N,O-過硫酸塩を単離することを含む、硫酸化度が３.２〜４のLMW-K5-N,O-過硫酸塩を製造する方法。
【請求項１３】
（i）K5-N-硫酸塩を亜硝酸解重合し、次いで、たとえば水素化ホウ素ナトリウムで還元すること、
（ii）LMW-K5-N-酸塩を、酸の形で、第３級アミン又は水酸化第４級アンモニウム塩で処理し、反応混合物を３０〜６０分間放置し、溶液のｐＨを７に維持し、対応する第３級アミン又は第４級アンモニウム塩で単離すること、
（iii）前記LMW-K5-N-硫酸塩の第３級アミン又は第４級アンモニウム塩を、Ｏ-過硫酸化条件下でＯ-硫酸化反応剤で処理すること、
（iv）生成物をＮ-硫酸化剤で処理し、得たLMW-K5-N,O-過硫酸塩を単離することを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記還元を水素化ホウ素ナトリウムで行う請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
全チェーンの少なくとも９０％が式（II）を有するチェーンの混合物を含むLMW-K5-N-硫酸塩を出発物質として使用する請求項１２に記載の方法。
【化３】
2005530877.tif 000021
ここで、ｎは、２〜２０の整数で、前記チェーンの混合物の中の大部分のチェーンの還元端部に構造式（a'）の２,５-無水マニトール単位を含み、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【化４】
2005530877.tif 000022
【請求項１６】
前記K5-N-硫酸塩出発物質が親油物質を含まない請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
LMW-K5-N-硫酸塩出発物質を、ナトリウム塩の形で使用する請求項１２及び１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記K5-N-硫酸塩出発物質が、全チェーンの中の主要構成成分が式（II'）の化合物であるチェーンの混合物を含む請求項１２及び１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【化５】
2005530877.tif 000023
ここで、ｑは、４、５、６、７又は８で、前記チェーンの混合物の大部分のチェーンの還元端部に構造式（a'）
【化６】
2005530877.tif 000024
の２,５-無水マニトール単位を含み、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項１９】
前記K5-N-硫酸塩出発物質が、全チェーンの中の主要構成成分が式（II''）の化合物であるチェーンの混合物を含む請求項１２及び１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【化７】
2005530877.tif 000025
ここで、ｍは、４、５又は６、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容さるカチオンである。
【請求項２０】
前記LMW-K5-N,O-過硫酸塩が、そのナトリウム塩の形で生成され、他の化学的又は薬剤上許容される塩に変換されていてもよい請求項１２〜１９いずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の方法の工程（ａ）及び（ｂ）によって製造されるLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩、又は化学的又は薬剤上許容される塩。
【請求項２２】
硫酸化度が２.２〜３のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩、又はその化学的又は薬剤上許容される塩の一つ。
【請求項２３】
平均分子量が約3,500〜約11,000の請求項２１又は２２に記載のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩、又はその化学的又は薬剤上許容される塩。
【請求項２４】
硫酸化度が２.２〜３で、平均分子量が3,500〜5,200の請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩。
【請求項２５】
Ｎ-アセチル基を殆ど含まない請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩。
【請求項２６】
前記チェーンの少なくとも９０％が式（III）を有していてるチェーンの混合物を含み、前記チェーンの混合物の大部分のチェーンの還元端部に構造式（a''）の２,５-無水マニトール単位を含んでいて、硫酸化度が２.２〜３、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩。
【化８】
2005530877.tif 000026
ここで、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3-基、ｎは２〜２０の整数である。
【化９】
2005530877.tif 000027
【請求項２７】
全チェーンの中の主要構成成分が式（III'）の化合物であるチェーンの混合物を含む請求項２６に記載のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩。
【化１０】
2005530877.tif 000028
ここで、ｑは、４、５、６、７又は８、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項２８】
全チェーンの中の主要構成成分が式（III''）の化合物であるチェーンの混合物を含む請求項２７に記載のLMW-O-過硫酸塩化-K5。
【化１１】
2005530877.tif 000029
ここで、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3-基、Ｘ''は、０Ｈ又はOSO3-、硫酸化度が２.２〜３、ｍは、４、５又は６、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項２９】
請求項１２〜２０に記載の方法によって製造されるLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項３０】
前記チェーンの少なくとも９０％が構造式（Ｉ'）であるチェーンの混合物を含み、前記チェーンの大部分の還元端部が構造式（a''）を有しているLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【化１２】
2005530877.tif 000030
ここで、ｎは２〜２０の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-基である。
【化１３】
2005530877.tif 000031
ここで、Ｒ''は、水素又はSO3-基、硫酸化度が３.２〜４、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項３１】
全チェーンの中の主要構成成分が式（Ｉ）の化合物であるチェーンの混合物を含むLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【化１４】
2005530877.tif 000032
ここで、ｑは、４、５、６、７又は８、対応するカチオン化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項３２】
全チェーンの中の主要構成成分が式（I''）の化合物であるチェーンの混合物を含むLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【化１５】
2005530877.tif 000033
ここで、ｍは、４、５及び６、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-基、硫酸化度が３.２〜４、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項３３】
前記カチオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、テトラ（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛である請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項３４】
前記カチオンが、ナトリウム、カルシウム又はテトラブチルアンモニウムイオンである請求項３３に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項３５】
硫酸化度が３.５〜４である請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項３６】
硫酸化度が３.５〜３.９である請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩。
【請求項３７】
K5-N-硫酸塩を、所定の亜硝酸解重合し、次いで、任意に還元及び生成物を単離することを含むLMW-K5-N-硫酸塩及びその化学的又は薬剤上許容される塩を製造する方法。
【請求項３８】
前記K5-N-硫酸塩をナトリウム塩として単離し、任意に他化学的又は薬剤上許容される塩に変換する請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記他の塩が、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、テトラ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛の塩である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記他の塩が、ナトリウム、カルシウム又はテトラブチルアンモニウムの塩である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３７〜４０のいずれか１項により製造されるLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項４２】
前記チェーンの混合物のチェーンの大部分の還元端部に、構造式（a'）
【化１６】
2005530877.tif 000034
の２,５-無水マニト−ル単位を含む請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法により製造されるLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項４３】
LMW-K5-N-硫酸塩又はその化学的又は薬剤上許容される塩。
【請求項４４】
前記チェーンの少なくとも９０％が、約1,500〜約7,500の平均分子量を有するチェーンの混合物を含む請求項４３に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項４５】
分子量分布が、約1,000〜約10,000である請求項４４に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項４６】
アセチル基が０〜５％未満である請求項４１〜４５のいずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項４７】
平均分子量が、約2,000〜約4,000である請求項４１〜４６のいずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項４８】
平均分子量が、約4,000〜約7,500である請求項４１〜４６のいずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項４９】
前記チェーンの少なくとも９０％が構造式（II）を有しているチェーンの混合物を含み、前記チェーンの大部分に構造式（ａ）の単位を含む請求項４１〜４６いずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【化１７】
2005530877.tif 000035
ここで、ｎは、２〜２０の整数である。
【化１８】
2005530877.tif 000036
ここで、Ｘは、ホルミル又はヒドロキシホルミル、対応するカチオンが化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項５０】
全チェーンの中の主要構成成分が式（II'）の化合物であるチェーンの混合物を含み、前記チェーンの大部分に構造式（ａ）の単位を含む請求項４１〜４６のいずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【化１９】
2005530877.tif 000037
ここで、ｑは、４、５、６、７又は８を表す。
【化２０】
2005530877.tif 000038
ここで、Ｘはホルミル又はヒドロキシホルミルを表し、対応するカチオン化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項５１】
全チェーンの中の主要構成成分が式（II''）の化合物であるチェーンの混合物を含む請求項４１〜４６のいずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【化２１】
2005530877.tif 000039
ここで、Ｘはホルミル又はヒドロキシホルミルを表し、ｍは、４、５、又は６、対応するカチオン化学的又は薬剤上許容されるカチオンである。
【請求項５２】
構造式（ａ）のＸがヒドロキシホルミルである請求項４９〜５１のいずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項５３】
前記塩又はカチオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、テトラ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウム、アルミニウム又は亜鉛の塩である請求項４１〜５２のいずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項５４】
前記塩又はカチオンが、ナトリウム、カルシウム又はテトラブチルアンモニウムの塩である請求項４１〜５２のいずれか１項に記載のLMW-K5-N-硫酸塩。
【請求項５５】
活性成分と、請求項１〜１１又は２８〜３５のいずれか１項に記載のLMW-K5-N,O-過硫酸塩を含み、製剤担体との混合物の形態である医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の要約
本発明は、Ｋ５多糖類から誘導される新規なＮ,Ｏ-過硫酸化低分子量多糖類、それらを製造する方法、その製造方法における新規な基本中間体、および該過硫酸化低分子量多糖類を含む医薬組成物に関する。特に、本発明は、硫酸化度が３.３〜４で、平均分子量が約3,000〜約6,000であるＮ-脱アセチル化及びＮ-硫酸化Ｋ５に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸デルマタン、硫酸コンドロイチン、及びヒアルロン酸のようなグリコースアミノグルカンは、種々の動物組織から工業的に抽出される生体高分子である。
【０００３】
特に、主として豚腸管粘膜或いは牛肺臓から抽出して製造されるヘパリンは、ウロン酸（グルクロン酸又はイドロン酸）を含むチェーンの混合物、及びα-１→４又はβ-１→４結合により結合されたアミノ糖（グルコースアミン）の混合物により生成された分子量分布がが約3,000〜約30,000Ｄの多分散性コポリマーである。ヘパリンは、ウロン酸単位が、２位でＯ-硫酸化されていて、グルコースアミン単位が、存在するグルコースアミン単位の約０.５％がＮ-アセチル化又はＮ-硫酸化、６-Ｏ-硫酸化及び３-Ｏ-硫酸化されている。
【０００４】
哺乳動物におけるヘパリンの物性及び天然生合成は、Lindahl et al, 1986  Lane, D. 及びLIndahl,U.（編集者）"Heparin, Chemical and Biological Properties; Chemical Applications", Edward Arnold, London, Page 159-190, Lindahl, U, Feingold D. S. e Roden L, 1986 TIBS, 11 221-225 及びConrad H. E. "Heparin Binding Proteins", Chapter 2: Structure of Heparinoids, Academic Press, 1998に記載されている。
【０００５】
主として抗凝血作用及び抗血栓作用以外に、ヘパリンは、脱コレステロール、抗増殖作用、抗ウイルス作用、抗ガン作用、及び抗腫瘍転移作用を示す。然しながら、このような医薬としての用法は、抗凝血作用が出血の原因となる副作用のために、限定されている。
【０００６】
従来技術の説明
W. F. Vann et al(1981), Bur. J. Biochem 116, 359-364に記載されている大腸菌（以下、「Ｋ５」と略記する）の菌株から単離された莢膜多糖類は、Ｄ-グルクロン酸及びβ１→４結合のＮ-アセチルグルコースアミンの繰り返し二糖類単位の混合チェーンを含んでいるが、二糖類単位Ｄ-グルクロン酸-Ｎ-アセチルグルコースアミンは、α１→４結合していて、下記に示した、ヘパリンと硫酸ヘパランのＮ-アセチルヘパロサン生合成前駆体と同じ繰り返しシーケンス（Ａ）を示している。
【化１】
2005530877.tif 000002
Ｋ５とその誘導体の生物活性には無関係であるが、ヘパリン前前駆体Ｎ-アセチルヘパロサンとＫ５多糖類の間の唯一の相違は、ポリマーの幾つかのチェーンの非還元末端で４（５）位に２重結合が在ることである。このことは、たとえば、以下に引用するEP 489647及びEP 544592に記載されている。
【０００７】
これら最初の文献の他に、論文及び特許出願明細書が、分子量が数千〜数十万ダルトン(Dalton)の大腸菌Ｋ５多糖類を記載している。たとえば、EP 333243、IT 1230785、EP 489647、EP 544592、WO92/17507、WO01/02597、及びManzoni et al (1996), Biotechnology Letters, 18(4)383-386に例示される。
【０００８】
EP 489647及びEP 544592は、抗凝結作用と抗血栓作用を有する低分子量及び高分子量のＮ,０-硫酸塩ヘパロサンを開示している。EP 333243、IT 1230785、WO92/17507、WO96/14425、WO97/43317、 WO98/42754、 WO01/72848、及びUS 2002/0062019は、N-脱アセチル化-K5-N-硫酸塩を記載している。これは、Ｃ５位をイズロン単位にエピマー化したグルクロン単位を幾つか有していて、抗血栓作用を有している。また、WO98/09636は、抗腫瘍転移作用を有するN-脱アセチル化-K5-N-硫酸塩を記載している。
【０００９】
US 2002/0062019は、エピ化N,O-硫酸化-K5誘導体を製造する方法を記載している。これは、凝血制御に活性を示し、硫酸化度が２.３〜２.９で、分子量が2,000〜3,000、或いは4,000〜8,000、又は18,000〜30,000である。この方法は、（s-a）Ｋ５多糖類のＮ-脱アセチル化及び生成したＫ-５アミンのＮ-硫酸化と、（s-b）N-硫酸塩-K5のエピマー化と、（s-c）エピK5-N-硫酸塩のＯ-過硫酸化と、（s-d）部分Ｏ-脱硫化と、（s-e）選択６-Ｏ-硫酸化と、（s-f）このようにして得た生成物のＮ-硫酸化を含んでいる。この方法では、工程（s-b）〜（s-f）で生成された生成物は、任意に解重合されている。さらに、US 2002/0062019は、上述した工程（s-a）〜（s-f）に続けて（s-f）の最後に亜硝酸解重合して製造した分子量が7,400で硫酸化度が２.３〜２.９のN-硫酸化-エピK5を記載している。
【００１０】
さらに、US 2002/0062019は、工程（s-a）〜（s-f）で処理することができる分子量が約5,000のＫ５フラクションを記載している。
【００１１】
本願明細書に引用として組み込まれているイタリヤ特許出願 MI2001A/00397（WO02/068477）は、親油性物質又は分子量が約5,000のフラクションの一つを含まないＫ５を出発物質として、（ａ）Ｎ-脱アセチル化／Ｎ-硫酸化、（ｂ）Ｏ-過硫酸化、及び（ｃ）Ｎ-再硫酸化によって製造した硫酸化度が３.２以上のK5-N,O-過硫酸誘導体を記載している。さらに、イタリヤ特許出願 MI2001A/00397（WO02/068477）は、平均分子量が2,000〜5,000のLMW-K5-N,O-過硫酸塩を引用している。これは、上述した工程（ａ）〜（ｃ）によるＫ５のフラクションから直接製造した平均分子量が約6,500のLMW-K5-N,O-過硫酸塩を解重合して製造している。
【００１２】
上述した引用文献は、いずれも、４０〜５０％がエピマー化されていてもよく、NH2又はN-アセチル基が殆ど存在しないLMW-K5-N-硫酸塩を記載していない。
【００１３】
さらに、「Fibroblast Growth Factor 2 Antagonist Activity and Angiostatic Capacity of Sulfated Escherichia coli K5 Polysaccharide Derivatives」、published in J. Biol. Chem 2001(10/12)、276(41)、37900〜37908(Leali 2001)は、平均分子量が15,000で硫酸化度が3.84のK5-N-過硫酸塩を記載しているが、これは良好な抗脈管形成作用を示し、培養から１２日目の間に新たな脈管の形成を７０％阻止する。
【００１４】
学術用語を統一して、その用法を理解し易くするために、本明細書では、単数又は複数形の学術用語の意味と通常の表現を使用する。
【００１５】
「Ｋ５」又は「多等類Ｋ５」は、文献、特にVann 1981、Manzoni M. et al.、Journal of Bioactive and Compatible polymers,1996, 11、301-311( "Manzoni 1996")、WO01/72848又はUS 2002/0062019 A1の例１２に従って製造及び精製される場合は、発酵により大腸菌から生成された莢膜多等類、即ち、上述した非還元末端に二重結合を有していてもよい繰り返し二糖類単位Aを含む混合チェーンを意味しており、当業者にとって、そこに記載されている事項がＮ-アセチルヘパロサンに適用できることは明白である。
【００１６】
「Ｋ５アミン」は、少なくとも９５％がＮ-脱アセチル化されたＫ５を意味し、通常、現在のＮＭＲ装置ではアセチル基の検出が不可能である。
【００１７】
「K5-N-硫酸塩」は、以下に説明するように、少なくとも９５％がＮ-脱アセチル化及びＮ-硫酸化されたＫ５を意味し、通常、現在のＮＭＲ装置ではアセチル基の検出が不可能である。
【００１８】
「K5-アミン-O-過硫酸塩」は、少なくとも２.２の硫酸化度で硫酸化されたO-硫酸化-K5-アミンを意味する。
【００１９】
「K5-N,O-過硫酸塩」は、少なくとも３.２の硫酸化度で硫酸化されたN,O-硫酸化-K5-アミンを意味する。
【００２０】
さらに、上記で定義した用語と通常の表現は、分子量分布が約1,500〜約50,000、平均分子量が12,000〜25,000、特に15,000〜25,000の発酵後単離したＫ５多糖類に関するものである。
【００２１】
分子量の特定の属性とは別に、上記で定義した用語と通常の表現を、頭字語「LMW（低分子量）」で表現した場合、平均分子量が12,000までの低分子量を意味する。
【００２２】
分子量に付す「約」は、二糖類単位の粘度測定法による測定±理論量の分子量で、Ｎａの分子量を含み、K5-N-硫酸塩の場合461、硫酸化度が3.87のK5-N,O-過硫酸塩の場合756と算出される。
【００２３】
上記で定義した用語と通常の表現の後に「−誘導体」を続けると、天然Ｋ５及び低分子量の誘導体を意味しており、これらはＫ５又はその誘導体、或いは解重合で製造されるという事実とは無関係である。
【００２４】
特記しない限り、「硫酸化度」は、SO3-/COO-比を意味し、二糖類単位に対する硫酸塩基の数として表現することができ、Casu B. et al., in Carbohydrate Research, 1975, 39, 168-176(Casu 1975)に記載されている電導度法によって測定される。
【００２５】
特記しない限り、「分子量」は、分子量をHPLCによって計算したサンプルを標準として使用して、Johnson et al., Crab. Res. n.51 (1976) p.119-127に記載された粘度測定法によって測定されたものである。
【００２６】
「主要構成成分」は、LMW-K5-N-硫酸塩、或いはK5-アミン-O-過硫酸塩、又はLMW-K5-N,O-過硫酸塩を含む混合物の最も代表的な成分である化合物を意味し、HPLCで測定した分子量のピークで決定される。
【００２７】
「Ｏ-過硫酸化状態」は、たとえばCarbohydrate Research にB.Casu et al.が記載した方法Ｃ（1994, 263, 272-284(Casu 1994)）により達成されるＯ-硫酸化を意味する。
【００２８】
用語「アルキル」は、線状又は有枝鎖アルキルを意味し、「テトラブチルアンモニウム」は、テトラ(ｎ-ブチル)アンモニウム基を意味する。
【００２９】
発明の要約
K5-N-硫酸塩を解重合すると新規なLMW-K5-硫酸塩誘導体を製造することができ、これがLMW-K5-N,O-過硫酸塩を製造するための有用な出発物質となることを発見した。有利なことには、非常に低分子量、特に分子量が約2,000〜約4,000の新規なLMW-K5-N-硫酸塩、特に、主要化合物がデカサッカライド又はドデカサッカライド或いはテトラデカサッカライドを含む混合物で製造したLMW-K5-N-硫酸塩を製造することができる。これらの新規なLMW-N-硫酸塩は、抗ウイルス作用及び／又は抗脈管形成性作用を有し、抗凝血作用が無いLMW-K5-N,O-過硫酸塩を製造するための有用な中間体出発物質である。特に、平均分子量が約3,000〜約6,000のLMW-K5-N,O-過硫酸塩、特に、主要化合物がデカ−又はドデカ−、或いはテトラデカサッカライドの混合物を含み、硫酸化度が３.２〜４のLMW-K5-N,O-過硫酸塩が、Leali 2001に記載されたK5-N,O-過硫酸塩に比べて高度の抗脈管形成性作用を有していることが分かった。
【００３０】
平均分子量が約3,000〜約6,000のLMW-K5-N,O-過硫酸塩、特に、主要化合物がデカ−又はドデカ−、或いはテトラデカサッカライドの混合物を含み、硫酸化度が３.２〜４で抗凝血作用が無いLMW-K5-N,O-過硫酸塩が、HIV-1ウイルスに対して良好な作用を及ぼすことが分かった。
【００３１】
さらに、LMW-K5-N-硫酸塩から出発すると、反応混合物のｐHを約７に維持しながら３０〜６０分間維持し、次いで生成した塩を、Ｏ-硫酸化条件下でＯ-硫酸化反応物で処理することに留意して、LMW-K5-N-硫酸塩の３級アミン又は４級アンモニウム塩を製造することにより、高度に硫酸化された新規なLMW-O-硫酸塩-K5-アミンを製造することができることが分かった。上述したLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩をＮ-硫酸化すると、新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩が製造される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
本発明の目的は、平均分子量が約3,000〜約6,000で硫酸化度が３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.７〜３.９の新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩を提供することである。
【００３３】
本発明のLMW-K5-N,O-過硫酸塩の中でも特に興味があるものは、平均分子量が3,750〜4,250、4,750〜5,250、或いは5,750〜6,250のものである。
【００３４】
好ましい化合物は、チェーンの中の主要構成成分が式（Ｉ）の混合物から製造したLMW-K5-N,O-過硫酸塩である。
【００３５】
【化２】
2005530877.tif 000003
ここで、ｑは、４、５、６、７又は８、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-基を表し、硫酸化度が３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.５〜３.９で、対応するカチオンは化学的又は薬剤上許容されるものである。
【００３６】
本明細書で、用語「化学的に許容される」は、化学合成上有用なカチオン、たとえばナトリウム、アンモニウム、テトラ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウム、又は成物の精製に有用なカチオンである。用語「薬剤上許容される」は、文字通りに解釈される。
【００３７】
有用なカチオンは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、テトラ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウム、アルミニウム及び亜鉛である。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明のLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、Leali 2001に記載されているタイプのK5-N,O-過硫酸塩の解重合により、およびそこに記載されている方法により製造することができる。
【００３９】
当該解重合は、ヘパリンを解重合する周知の方法によって遂行され、たとえばEP 37319、 WO82/03627に記載されている方法、又はEP 544592に記載されているN,O-硫酸化−K5の解重合によって遂行される。好ましくは、亜硝酸ナトリムと塩酸による解重合（亜硝酸解重合）に続いて、水素化硼素ナトリムで現場還元する。
【００４０】
解重合反応を適切に制御することにより、特に種々の量の亜硝酸ナトリウムを使用することにより、 希望する分子量を有するLMW-K5-N,O-過硫酸塩が製造される。
【００４１】
好ましい態様により、たとえば、以下の「製造IV」に記載したようにして製造したK5-N,O-過硫酸塩１ｇから出発すると、出発物質を、100〜200mlの脱イオン水に溶解し、４℃に温度調節する。次いで、所定量の亜硝酸ナトリムを添加して約3,000〜約6,000の所望の平均分子量を得る。その結果、分子量が既知のヘパリンを標準物質として使用し、BioSil 250 Bioradカラムを具備したHPLCで測定した分子量が20,000のK5-N,O-過硫酸塩から出発して、160〜230mgの亜硝酸ナトリウムを溶解させた０.２％水溶液を添加する。K5-N,O-過硫酸塩及び亜硝酸ナトリウムを含み４℃に維持した溶液に、４℃に冷却した０.１N HClを添加して、ｐＨを２にする。２０〜４０分間反応させ、次いで０.１N NaOHで中和させる。得た生成物を室温下に置き、水素化硼素ナトリウムのような還元剤（250〜500mgを５０〜100mlの水に溶解させる）で処理し、４〜８時間反応させる。０.１N HClでｐＨ５〜５.５にして過剰量の水素化硼素ナトリウムを除去し、さらに２〜４時間反応させる。最後に、０.１N NaOHで溶液を中和し、減圧下で蒸発させて生成物を濃縮してから、アセトン又はエタノールで沈殿させ、生成物を回収する。
【００４２】
K5-N,O-過硫酸塩の亜硝酸解重合及び、後続の、たとえば水素化硼素ナトリウムによる還元からLMW-K5-N,O-過硫酸塩のオリジンは、前記チェーンの混合物中の大部分のチェーンが還元末端において、構造式（a°）を有する硫酸化２,５-無水マンノースの存在を示している。
【化３】
2005530877.tif 000004
ここで、Ｘ'はホルミル又はヒドロシキメチルを表し、Ｒ''は、水素又はSO3-を表す。
【００４３】
特に好ましい生成物は、K5-N,O−過硫酸塩の亜硝酸解重合、及び、たとえば水素化ホウ素ナトリムによる任意の後続還元反応によって製造することができるLMW-K5-N,O-過硫酸塩で、全チェーンの主要構成成分が式（Ｉ°）の化合物であるチェーンの混合物を含んでいる。
【化４】
2005530877.tif 000005
ここで、ｍは４、５又は６、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は水素又はSO3-、Ｘ'はホルミル又はヒドロシキメチルを表す。硫酸化度が３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.５〜３.９で、対応するカチオンが、化学的又は薬剤上許容できるものである。各混合物の主たる分子量は、3,750〜4,250、4,750〜5,250、5,750〜6,250である。
【発明の効果】
【００４４】
これら新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、全抗凝血作用に対してかなり高い比率の抗脈管形成作用を有していて、薬剤投与における脈管形成依存性病理の処理に使用する医薬組成物を製造するのに使用することができる。この場合、出血性副作用のリスクが顕著に低減されている。
【００４５】
LMW-K5-N,O-過硫酸塩で処理することができる脈管形成依存性疾病は、たとえば、ヒトに観察される疾病として、糖尿病性網膜症、移植角膜の血管新生、脈管緑内障、トラコーマ、水晶体後繊維異常、乾癬、膿化性緑内障、アテローム硬化性斑の進行、血管腫及び繊維性血管腫、動脈−静脈奇形、関節炎がり、さらに充実性腫瘍の併用療法に観察されるものがある。
【００４６】
特に、本発明の新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、Ribatti D.et al., J. Vasc. Res.1997, 34,455-463(Ribatti 1997)による鶏エンブリヨのコロアランティオイックメンブラン（CAM)に対する抗脈管形成抑制インビボ試験で活性であった。この試験では、Gelfoam(Upjohn)のスポンジインプラントを、進行から８日目に鶏エンブリヨのCAMに適用し、適用後直ちに、LMW-K5-N,O-過硫酸塩５０μgを含む生理食塩水３μlを適用し、又は、参照化合物としてLeali 2001に記載されている分子量が15,000で硫酸化度が3.84のK5-N,O-過硫酸塩溶液を適用した。培養から１２日目になるまで、毎日スポンジを検査した。脈管形成性の点数は、進行してから異なる日にスポンジの周囲に肉眼で観察される脈管の数、及び適用した化合物が活性を示すエンブリヨ（卵）の数を数えて得る。
【００４７】
LMW-K5-N,O-過硫酸塩を埋封したスポンジの周囲に成長する脈管の数は、K5-N,O-過硫酸塩を埋封したスポンジの周囲に観察される数に等しいが、適用されたLMW-K5-N,O-過硫酸塩が活性であるエンブリヨの数の方が多いことが観察された。
【００４８】
平均分子量が約3,000〜約6,000のLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、文献には記載されていない方法で製造することもできる、通常、平均分子量が約3,000〜約12,000の新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩を製造するのに適用することがができる。この新規な方法と新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩も、本発明の特徴である
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
従って、本発明は、硫酸化度が３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.５〜３.９の新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩を製造する方法を提供する。この方法は、（ａ）酸の形のLMW-K5-N硫酸塩を第３級アミン又は第４級水酸化アンモニウムで処理し、反応混合物を３０〜６０分間放置し、溶液のｐＨを７に維持し、塩を前記有機塩基で単離することと、
（ｂ）生成されたLMW-K5-N硫酸塩の第３級アミン又は第４級水酸化アンモニウム塩を、Ｏ-過硫酸化反応条件下でＯ-硫酸化反応物で処理することと、
（ｃ）生成された生成物を、Ｎ-硫酸化剤でえ処理し、得たLMW-K5-N,O-過硫酸塩を単離することを含む。通常、最終生成物はナトリウム塩として単離されるが、これは他の化学的又は薬剤上許容される塩に変換してもよい。
【００５０】
上述したように、実用上完全なＮ-脱アセチル化、続いてＮ-硫酸化、最終亜硝酸解重合、更にLMW-K5-N-硫酸塩の還元によりＫ５から製造したLMW-K5-N-硫酸塩は、本発明の方法の出発物質として有用である。LMW-K5-N-硫酸塩は、後続工程で、２,５-無水マンノースラジカルのホルミル基に対する影響が未知の反応を受けるので、この反応は必要である。また、この場合、上述した解重合を制御することにより、多糖類チェーン内部のグルコースアミンのアノマーカチオンの信号をもつ２.５-無水マニトールのＣ-２に起因する信号の積分による13Ｃ-ＮＭＲスペクトルから計算される平均分子量が約1,500〜約10,000、好ましくは約1,500〜約7,500であるLMW-K5-N-硫酸塩を製造することができる。
【００５１】
平均分子量が約1,500〜約7,500のLMW-K5-N-硫酸塩及び化学的或いは薬剤上許容される塩は、中間体として有用な新規生成物で、薬理的に活性である。このLMW-K5-N-硫酸塩の分子量分布は、約1,000〜約10,000の範囲である。通常の反応進行に従うと、たとえば１ｇのK5-N-硫酸塩を出発物質として使用する場合、出発物質を、100〜200mlの脱イオン水に溶解し、４℃に温度調整する。次いで、所定量の亜硝酸ナトリウムを添加して約2,000〜約4,000の所望の平均分子量を得る。この結果、分子量が既知のヘパリンを標準物質として使用し、BioSil 250 Bioradカラムを具備したHPLCで測定した分子量が20,000のK5-N,O-過硫酸塩から出発して、330〜480mgの亜硝酸ナトリウムを溶解させた０.２％水溶液を添加する。K5-N,O-過硫酸塩及び亜硝酸ナトリウムを含み４℃に維持した溶液を、４℃に冷却した０.１N HClを添加して、ｐＨを２にする。２０〜４０分間反応させ、次いで０.１N NaOHで中和させる。得た生成物を室温まで暖め、水素化硼素ナトリウムのような還元剤（250〜500mgを５０〜100mlの水に溶解させる）で処理し、４〜８時間反応させる。０.１N HClでｐＨ５〜５.５にして過剰量の水素化硼素ナトリウムを除去し、さらに２〜４時間反応させる。最後に、０.１N NaOHで溶液を中和し、減圧下で蒸発させて生成物を濃縮してから、アセトン又はエタノールで沈殿させ、生成物を回収する。
【００５２】
同じようにして、１ｇのK5-N-硫酸塩を出発物質として使用する場合、分子量が約4,000〜約4,500、特に少なくとも6,000（6,000〜7,500）のLMW-K5-硫酸塩を生成する亜硝酸ナトリウムの量も確定することができる。
【００５３】
K5-N-硫酸塩は文献に多数記載されて公知であり、本明細書で引用した文献に記載されていて、当業界の状態を説明している。上記で引用した出発物質は、Ｎ-脱アセチル化及び生成されたK5-アミンの後続工程でのＮ-硫酸化により必ず製造される。然しながら、実用上アセチル基又はNH2を含まないK5-アミンの製造は、Ｋ５が特に純粋な場合、特に親油性物質を含まない場合に加速される。さらに、親油性物質を含まないＫ５から製造したK5-N-硫酸塩が、容易に過硫酸化される。このことは、イタリヤ特許出願 MI2001A00397（WO02/068477）に記載されている。解重合は、下記の「製造Ｉ」に記載したように精製されたＫ５から製造したK5-N-硫酸塩から出発して行われる。13C-NMRスペクトルがトレース量のアセチル基又はNH2を示さないK5-N-硫酸塩は、下記の「製造II」に記載してある。
【００５４】
本発明の方法で有利な出発物質は、Ｋ５の亜硝酸ナトリウムの解重合、次いでたとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元で製造された新規なLMW-K5-硫酸塩で、少なくとも９０％のチェーンが式（II）を有しているチェーンの混合体を含んでいる。
【化５】
2005530877.tif 000006
ここで、ｎは２〜２０の数を表し、対応するカチオンは、化学的或いは薬剤上許容されるものである。
【００５５】
さらに有利なことには、出発物質は新規なLMW-K5-N-硫酸塩で、全チェーンの主要構成成分が式（II'）を有しているチェーンの混合物を含んでいる。
【化６】
2005530877.tif 000007
ここで、ｑは４、５、６、７又は８を表し、対応するカチオンは、化学的或いは薬剤上許容されるものである。本発明に包含されるこれらLMW-K5-N-硫酸塩は、上述したように、K5-N-硫酸塩を、亜硝酸解重合、次いで、たとえば水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって製造することができる。これらの平均分子量は、約2,000〜約4,000である。
【００５６】
亜硝酸解重合工程、及び後続の、たとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元から、LMW-K5-N-硫酸塩のオリジンは、前記チェーンの混合体の大部分の還元端部に構造式（a'）の２,５-無水マニトール単位の存在を示している。
【化７】
2005530877.tif 000008
従って、前記チェーンの混合体の大部分の還元端部は、実際には構造式（ｂ）で表される。
【化８】
2005530877.tif 000009
【００５７】
構造式（a'）が存在しても、LMW-K5-N-硫酸塩及びその誘導体の物性には何ら影響を与えない。この理由は、硫酸化が、１個以上の硫酸基を導入するだけであり、導入された硫酸基がＯ-硫酸化誘導体の硫酸化度にはそれほど影響を与えないと推断されるからである。好ましいLMW-K5-N-硫酸塩は、実際には、アセチル基を含まない。
【００５８】
本発明の特に有用なLMW-K5-N-硫酸塩は、チェーンの主要構成成分が式（II'）の化合物の混合物から製造される。
【化９】
2005530877.tif 000010
ここで、ｍは４、５、又は６を表し、対応するカチオンは、化学的或いは薬剤上許容されるものである。
【００５９】
本発明の別の特徴によれば、本発明は、新規なLMW-K5-N-硫酸塩及び化学的或いは薬剤上許容される塩を製造する方法に関し、この方法は、K5-N-硫酸塩に対して所定の亜硝酸解重合を行い、次いで所望により還元、及び単離して生成物を得ることを含んでいる。当該生成物は、通常、ナトリウム塩の形で、他の化学的或いは薬剤上許容される塩に変換することができる。生成物を構成する大部分のチェーンの還元端部において、LMW-K5-N-硫酸塩は、構造式（ａ）の２,５-無水マンノ単位を有している。
【化１０】
2005530877.tif 000011
ここで、Ｘは、ホルミル又はヒドロキシホルミルを表す。そして、好ましくは、これらは、少なくとも９０％のチェーンが式（II）を有するチェーンの混合体から、又は主要構成分が式（II'）又は（II''）を有するチェーンの混合体から製造される。これら新規なLMW-K5-N-硫酸塩は、医薬組成物の活性成分として有用である。
【００６０】
上述した構造式（ａ）において、Ｘがヒドロキシホルミルの場合、新規なLMW-K5-N-硫酸塩は、本発明のLMW-K5-N,O-過硫酸塩を製造する方法の出発物質になる。
【００６１】
有利なことに、LMW-K5-N-硫酸塩出発物質の分子量分布は、約1,000〜約10,000の範囲である。
【００６２】
上述した工程（ａ）により製造された第３級アミン又は第４級アンモニウム塩、好ましくはテトラブチルアンモニウム塩が利用できない場合は、本発明の方法のLMW-K5-N-硫酸塩出発物質は、ナトリウム塩の形で使用することが好ましい。
【００６３】
本発明の他の有利な態様によれば、工程（ａ）は、出発物質としてのLMW-K5-N-硫酸塩のナトリウム塩の溶液を、タイプIR 120 H+のような酸性イオン交換樹脂を通過させ、樹脂の残滓を含む排出液を採集し、排出液を第３級アミン又は第４級水酸化アンモニウム、好ましくは水酸化テトラブチルアンモニウムの水溶液で中和することにより実行される。同じ塩基を添加してｐＨを７に維持して溶液を１時間放置し、生成された塩を凍結乾燥して単離する。
【００６４】
工程（ｂ）では、Ｏ-過硫酸化は、極性溶媒中で、過剰量のＯ-硫酸化剤を温度２０〜７０℃で２４時間までの時間使用して実行する。有利な方法は、工程（ａ）で生成されたLMW-K5-N-硫酸塩の第３級アミン又は第４級アンモニウム塩を、ジメチルホルアミドに溶解させ、遊離ヒドロキシ基に対して、２〜１０モルのＯ-硫酸化剤で、温度４０〜６０℃で１０〜２０分間処理する。Ｏ-硫酸化剤としてのピリジン・SO3付加物を、遊離ヒドロキシ基に対して２.５〜５モル、好ましくは２.５〜４モルを使用し、温度５０〜６０℃、好ましくは５５℃で一昼夜実行する。次いで、０.１〜１容量の水を添加し、好ましくは水酸化ナトリウムで中和し、塩化ナトリウムの飽和溶液でアセトン中に沈殿させ、必要に応じて限外濾過して、反応終了時点で生成された生成物を単離する。
【００６５】
このようにして生成された生成物は、好ましくは、LMW-K5-アミン-O-過硫酸塩ナトリウム塩で、硫酸化度が２.３〜３である。このようにして生成されたナトリウム塩は、他の塩に変換することができる。この生成物の平均分子量は、約3,500〜約11,000である。
【００６６】
工程（ｃ）では、LMW-K5-アミン-O-過硫酸塩を、Ｎ-硫酸化させ、それらの水溶液を炭酸ナトリウム及びＮ-硫酸化剤、たとえばトリ(Ｃ1−Ｃ4)アルキルアミン・SO3又はピリジン・SO3で処理し、混合物を３０〜５０℃で８〜２４時間維持し、LMW-K5-N,O-過硫酸塩を、たとえば濾過(diafiltration)して単離する。
【００６７】
工程（ａ）及び（ｂ）に限ると、上述した方法により生成されたLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩及びその化学的及び製剤上許容される塩は新規生成物で、本発明に包含される別の特徴を構成する。驚くべきことに、LMW-K5-アミン-O-過硫酸塩は、中間体として使用できる以外に、医薬活性を有していることが分かった。
【００６８】
従って、本発明は、硫酸化度が２.３〜３のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩及びその化学的及び製剤上許容される塩を提供する。有利には、それらの平均分子量は、約3,500〜約10,000、好ましくは約3,500〜約5,200である。
【００６９】
好ましくは、本発明のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩は、Ｎ-アセチル基を含まない。
【００７０】
全チェーンの少なくとも９０％が上述した式（II）を有しているチェーンの混合物を含むLMW-K5-N-硫酸塩を出発物質として使用する場合は、全チェーンの少なくとも９０％が式（III）を有しているチェーンの混合物を含むLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩は、工程（ｂ）の終了時に生成される。
【化１１】
2005530877.tif 000012
ここで、ｎは２〜２０の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3-基を表していて、硫酸化度は２.２〜３、及び対応するカチオンは、化学的及び薬剤上許容されるものである。
【００７１】
主要構成成分が式（II'）を有しているチェーンの混合物を含むLMW-K5-N-硫酸塩を出発物質として使用する場合は、主要構成成分が式（III'）を有しているチェーンの混合物を含む新規なLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩は、工程（ｂ）の終了時に生成される。
【化１２】
2005530877.tif 000013
ここで、ｑは４、５、６、７又は８、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は上記定義の通り、硫酸化度は２.２〜３、及び対応するカチオンは、化学的及び薬剤上許容されるものである。
【００７２】
これらLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩は、新規な生成物で、Ｎ-硫酸化誘導体の製造の中間体として有用であり、且つ、それ自体、非常に貴重な薬理特性を有している、特に遊離ラジカルに対して非常に貴重な薬理特性を有している。
【００７３】
亜硝酸解重合及び後続の、たとえば水素化ホウ素ナトリウムによる還元によって生成されたLMW-K5-N-硫酸塩から新規なLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩のオリジンは、式（a''）の２,５-無水マニトール硫酸化単位の存在を示している。
【化１３】
2005530877.tif 000014
ここで、Ｒ''は、チェーンの混合体の大部分の還元端部において、水素又はSO3-を表している。
【００７４】
従って、チェーンの混合体の大部分の還元端部は、構造式（b'）で表される。
【化１４】
2005530877.tif 000015
【００７５】
上述した新規なLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩の中でも、全チェーンの中の主要構成成分が式（III''）の化合物の混合物を含むものが好ましい。
【化１５】
2005530877.tif 000016
ここで、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3-、Ｘ''は、OH又はOSO3-、硫酸化度は２.２〜３、ｍは４、５又は６、対応するカチオンは、化学的及び薬剤上許容されるものである。
【００７６】
本発明により、K5-N-硫酸塩から出発すると、LMW-K5-N,O-硫酸塩及びその化学的及び薬剤上許容される塩を下記の方法で製造することができる。
（i）K5-N-硫酸塩を亜硝酸解重合し、次いで、たとえば水素化ホウ素ナトリウムで還元すること、
（ii）酸の形のLMW-K5-N-硫酸塩を、第３級アミン又は第４級水酸化アンモニウム塩で処理し、反応混合物を、３０〜６０分間放置し、溶液のｐＨを７に維持し、対応する第３級アミン又は第４級アンモニウム塩で単離すること、
（iii）前記LMW-K5-N-硫酸塩の第３級アミン又は第４級アンモニウム塩を、０-過硫酸化条件下で０-硫酸化反応剤で処理すること、
（iv）生成物をＮ-硫酸化剤で処理し、得たLMW-K5-N,O-過硫酸塩を単離すること。
【００７７】
本発明の方法終了時に生成された新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、通常、ナトリウム塩として存在している。このナトリウム塩は、化学的及び薬剤上許容される他の塩に変換することができる。たとえば、カルシウムイオンによる変換は、限外濾過膜を使用して実行される。特に有利な塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、テトラ(Ｃ1〜Ｃ4)アルキルアンモニウム、アルミニウム、及び亜鉛の塩である。ナトリウム、カルシウム、及びテトラブチルアンモニウムの塩が好ましい。
【００７８】
本発明の方法によって製造したLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、全チェーンの少なくとも９０％が式（I'）を有しているチェーンの混合体を含んでいる。
【化１６】
2005530877.tif 000017
ここで、ｎは２〜２０の整数、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3-基、チェーンの大部分の還元端部は（a''）を有していて、硫酸化度は３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.５〜３.９、対応するカチオンは、化学的及び薬剤上許容されるものである。
【００７９】
本発明の方法によって製造したこれら新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩の中でも、全チェーンの主要構成成分が式（Ｉ）を有していて、チェーンの大部分の還元端部が構造式（a''）を有しているチェーンの混合物を含んでいるものが特に好ましい。
【００８０】
本発明の方法によって製造したものの中で、好ましいLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、全チェーンの主要構成成分が式（Ｉ''）の化合物であるチェーンの混合物を含んでいる。
【化１７】
2005530877.tif 000018
ここで、Ｒ、Ｒ'及びＲ''は、水素又はSO3-基、Ｘ''は、OH基又はOSO3-、硫酸化度は３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.５〜３.９、ｍは４、５又は６、対応するカチオンは、化学的及び薬剤上許容されるものである。
【００８１】
本発明の新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、抗ウイルス性、特に抗HIV-1活性及び優れた抗脈管形成性活性を有しているので、治療に有用な活性薬剤として重要である。特に重要なものは、分子量が3,750〜4,250（ｍ＝４）、4,750〜5,250（ｍ＝５）、又は5,750〜6,250（ｍ＝６）で、硫酸化度が３.５〜３.９のものである。
【００８２】
上述したLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、抗ウイルス性及び抗脈管形成性活性を有しているので、前述した病変・疾病を治療する薬剤として重要である。治療用法として、本発明の活性薬剤及びその塩は、従来の方法により、無菌液、局所剤のような適切な投与剤形で調剤され、そして、通常、現在まで提案されたあらゆる剤形で、グリコースアミノグリカン−型誘導体として調剤される。また、治療薬剤は、公知の天然化合物で研究した結果から類推して選択される。
【００８３】
活性薬剤は、経口、経皮、又は好ましくは非経口、特に、皮下注射、筋肉内注射又は静脈内注射、或いは局所経路によって投与される。
【００８４】
ヒトの場合、毎日の非経口投与量は、０.５〜500mg/kg/die、有利には５〜250mg/kg/die、好ましくは１０〜150mg/Kg/dieである。一方、局所経路投与量は、１〜1,000mg/Kg/die、有利には１０〜500mg/Kg/die、好ましくは２０〜100mg/Kg/dieである。
【００８５】
従って、本発明は、医薬組成物を提供する。本発明が提供する医薬組成物は、活性薬剤として、有利には全チェーンの主要構成成分が式（Ｉ）、（Ｉ°）、（Ｉ''）の化合物であるチェーンの混合物、又は全チェーンの少なくとも９０％が式Ｉ'のチェーンの混合物を含み、硫酸化度が３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.５〜３.９のLMW-K5-N,O-過硫酸塩又はその薬剤上許容される塩を医薬賦形剤との混合物として薬理効果がある量を含んでいる。このLMW-K5-N,O-過硫酸塩又はその塩は、大部分が上述したものである。薬剤上許容される塩は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム及び亜鉛の塩である。
【００８６】
本発明の経口、皮下注射、静脈、経皮又は局所経路投与用医薬組成物の場合、活性薬剤は、好ましくは、従来から使用されている医薬品添加剤又は医薬賦形剤との混合物として投与量単位で投与される。投与は、投与による悪作用と投与経路の厳密さと同じように、年齢、体重、及び患者の健康状態等諸条件に応じて十分に変更することができる。この投与薬剤は、１〜1,000mg、有利には１０〜750mg、好ましくは250〜500mgの投与量で、１日当たり１〜３回、静脈、筋肉、経口、皮下注射、経皮、経粘膜又は局所経路により投与される。
【００８７】
本発明の医薬組成物は、種々の投与経路に適した医薬担体と一緒に調剤される。クリ−ム、ポマード、軟膏、ゼル、経膣オブルス(ovukus)、座薬、局所投与される溶液又はサスペンションの剤形で調剤される。
【００８８】
特に、本発明は、脈管形成依存性病変の治療又はHIV感染治療用医薬組成物を提供する。この医薬組成物は、活性薬剤として、有利には全チェーンの主要構成成分が式（Ｉ）、（Ｉ°）、（Ｉ''）の化合物であるチェーンの混合物、又は全チェーンの少なくとも９０％が式（Ｉ'）のチェーンの混合物を含み、硫酸化度が３.２〜４、有利には３.５〜４、好ましくは３.５〜３.９のLMW-K5-N,O-過硫酸塩又はその薬剤上許容される塩を医薬賦形剤又は担体との混合物として薬理効果がある量を含んでいる。
【００８９】
最後に、本発明は、上述した方法の工程（ａ）及び（ｂ）で製造した新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩、特に硫酸化度が２.２〜３、有利には平均分子量が約3,500〜約11,000、より有利には約3,500〜約5,200で、好ましくは、全チェーンの少なくとも９０％が式（III）のチェーンの混合物、又は全チェーンの中の主要構成成分が式（III'）又は（III''）、又はその薬剤上許容される塩の一つを含むLMW-K5-N,O-過硫酸塩を活性薬剤の一つとして含み、医薬担体との混合物の形の医薬組成物に関する。
【００９０】
下記の例は、本発明を説明するが、それに限定されない。
［製造例Ｉ］
米国特許 2002/0062019の例の段落［0251］及び［0252］に記載されているようにして製造したＫ５で、その1Ｈ-ＮＭＲスペクトル（図３）の親油性物質に起因する信号により、親油性物質の存在が１.５ppm以下の範囲であるＫ５ １ｇを、塩化ナトリウムの飽和水溶液100mlに溶解し、温度を４℃に維持した。生成された溶液に、３容量の冷イソプロパノールを添加した。塩化ナトリウムの飽和溶液の計算量を添加して溶液の塩濃縮を３Ｍにし、冷溶液を一昼夜冷温（約４℃）で維持した。形成された沈殿物を、10,000rpmで２０分間遠心分離して分離し、生成物の純度を一昼夜透析して調整し、1Ｈ-ＮＭＲ分析により、１.５ppm以下の領域にある信号が存在しないことを確認する。必要ならば、４ＭのNaClを含む水への溶解とイソプロパノールによる沈殿を繰り返す。沈殿物を水に溶解し、10,000ＤカットオフのMiniplate膜Milipore上に、塩が消滅するまで限外濾過する。純度が少なくとも９９％で、1Ｈ-ＮＭＲスペクトルにより、１.５ppm以下の領域にある親油性不純物のトレースが検知不可能であるＫ５が製造される。
【００９１】
［製造例II］
K5-N-硫酸塩の製造
（i）Ｎ-脱アセチル化
製造例Ｉに記載したようにして製造した１ｇの純粋Ｋ５を、２Ｎの水酸化ナトリウム100mlに溶解し、生成された溶液を６０℃で２４時間維持する。溶液を室温に維持し、次いで６Ｎ塩酸で中和する。
（ii）Ｎ-硫酸化
脱アセチル化して４０℃に維持したＫ５を含む溶液に、１.６ｇの炭酸ナトリウムウ、次いで１.６ｇの三酸化硫黄ピリジンを４時間で添加する。２４時間後、反応終了時に、溶液を室温にし、次いで塩酸の５％溶液でｐＨを６.６〜７にする。このようにして生成されたＫ５-Ｎ-硫酸塩を、1,000Ｄの円錐膜(Prepscale Cartridge-Milipore)を使用して濾過して精製する。透過度導電度が1,000μS、好ましくは100μSになった時点で、この方法を終了する。イントラダイアリシスを還元して、濃縮透析において同じものを使用して、多糖類が１０％にする。濃縮した溶液を凍結乾燥する。Ｋ５-Ｎ-硫酸塩の13Ｃ-ＮＭＲスペクトルは、Ｎ-アセチル又はNH2基が残留している信号を示していない。
【００９２】
［製造例III］
LMW-K5-N-硫酸塩
製造例IIで得た生成物を、亜硝酸による分解法、次いで生成されたアルデヒドの還元による方法で解重合する。１ｇのＫ５-Ｎ-硫酸塩１ｇを、200mlの蒸留水に溶解し、240mlの蒸留水中に溶解した亜硝酸ナトリム480mgを添加する。次いで、この溶液を４℃に冷却し、０.１N HClでｐＨを２にし、３０分間維持する。反応の終了時点で、この溶液を０.１N NaOHでｐＨ７にし、次いで室温にする。次いで、この溶液に450mgのNaBH4を添加し、４時間放置する。ｐＨを５〜６にすることによりHClで過剰量のNaBH4を除去する。４℃で３容量のアセトンで沈殿させ、ガラス漏斗で濾過し、真空オーブン内で４０℃で乾燥して０.１N NaOHで中和した生成物を回収する。このようにして、平均分子量が約2,000のLMW-K5-N-硫酸塩900mgを得る。
【００９３】
［製造例IV］
K5-N,O-過硫酸塩
製造例IIに記載したようにして得たK5-N-過硫酸塩１ｇを、100mlの脱イオン水に溶解し、溶液を冷却浴で１０℃に冷却し、次いでカチオン交換樹脂 IR 120 H+又は同等物（５０〜200ml）中を通過させる。カラムと溶出物溜の両方を１０℃に維持する。サンプルを含む溶液が通過後、樹脂を脱イオン水で洗浄して、透過物のｐＨを６以上にする（約３容量の脱イオン水）。酸性溶液を、水酸化テトラブチルアンモニウム（１５％水溶液）で中和し、次いで最低量に減量させ、凍結乾燥する。テトラブチルアンモニウム塩を、４０mlのDMFに溶解し、固体のピリジン・S03付加物３.５ｇを添加する。この溶液を、５０℃で２４時間維持する。反応の終了時に、この溶液を室温に冷却し、アセトン中の塩化ナトリウム飽和溶液３容量を添加して、完全に沈殿させる。濾過により沈殿物を溶媒から分離し、最低量の脱イオン水（たとえば、100ml）で可溶化し、塩化ナトリウムを添加して、０.２Ｍの溶液を得る。この溶液を２Ｎの水酸化ナトリウムでｐＨを７.５〜８にし、２容量のアセトンを添加して完全に沈殿させる。沈殿物を濾過して、溶媒と分離する。生成した固体を、100mlの脱イオン水で可溶化し、1,000Ｄカットオフ(prepscale cartridge-Millipore)円錐膜を使用して限外濾過して残留物から精製する。
【００９４】
Ｏ-硫酸化生成物を含む溶液を、製造例IIの工程（ii）で前述したようにＮ-硫酸化処理する。生成物は、Casu et al.による電導度で測定して3.87のカルボキシ比、分子排除HPLCで測定して平均分子量が20,000の硫酸塩を有している。
【実施例１】
【００９５】
製造例IVに記載したようにして製造したK5-N,O-過硫酸塩１ｇを、200mlの脱イオン水に溶解し、温度を４℃に維持する。次いで、０.２％亜硝酸ナトリウム水溶液230mgを添加する。K5-N,O-過硫酸塩と亜硝酸ナトリウムを含み４℃に維持した溶液に、４℃に冷却した０.１N HClを添加して、溶液のｐＨを２にする。この溶液を、３０分間ゆっくりと攪拌しながら反応させ、次いで０.１N NaOHで中和する。このようにして得た、全チェーンの主要構成成分が式Ｉ°（ｍが４、Ｘ'がホルミル）のデカサッカライドであるチェーンの混合物を含むLMW-K5-N,O-過硫酸塩を室温にし、250mgの水素化ホウ素ナトリウムの５０ml水溶液で処理し、４時間反応させる。０.１N HClでｐＨを約５にして過剰量の水素化ホウ素ナトリウムを溶出させ、さらに２時間放置する。最後に、この溶液を０.１N NaOHで中和し、減圧下で蒸発させて生成物を濃縮させた後、アセトンで沈殿させて生成物を回収する。このようにして得たLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、K5-N,O-過硫酸塩出発物質と同じ硫酸化特性を示し、粘度で測定した平均分子量が約4,250で、全チェーンの主要構成成分が式Ｉ'（ｍが４、Ｘ'がCH2OH）のデカサッカライドであるチェーンの混合物を含んでいる。
【実施例２】
【００９６】
製造例IVに記載したようにして製造したK5-N,O-過硫酸塩１ｇを、実施例１に記載したように、200mgの亜硝酸ナトリウムを使用して処理する。得た生成物は、K5-N,O-過硫酸塩出発物質と同じ硫酸化特性を示し、粘度で測定した平均分子量が約5,250で、全チェーンの主要構成成分が式（Ｉ'）（ｍが５、Ｘ'がCH2OH）のデカサッカライドであるチェーンの混合物を含んでいる。
【実施例３】
【００９７】
製造例IVに記載したようにして製造したK5-N,O-過硫酸塩１ｇを、実施例１に記載したように、160mgの亜硝酸ナトリウムを使用して処理する。このようにして得たLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、K5-N,O-過硫酸塩出発物質と同じ硫酸化特性を示し、粘度で測定した平均分子量が約6,000で、全チェーンの主要構成成分が式（Ｉ'）（ｍが６、Ｘ'がCH2OH）のテトラデカサッカライドであるチェーンの混合物を含んでいる。
【実施例４】
【００９８】
（ａ）LMW-K5-N-硫酸塩のテトラブチルアンモニウム塩
水５０mlに、製造例IIIに記載したようにして製造したLMW-K5-N-硫酸塩500mgを溶解させた水溶液を４℃に維持し、次いで４℃の水で事前調整したIR 120 H+イオン交換樹脂を通過させる。このようにして得た、ｐＨが約２の溶液125mlを含有する溶出液を、水酸化テトラブチルアンモニウムの１５％溶液で中和し室温で１時間放置し、水酸化テトラブチルアンモニウムの１５％溶液を添加してｐＨを７に維持し、最後に凍結乾燥する。LMW-K5-N-硫酸塩のテトラブチルアンモニウム塩１ｇを得る。
【００９９】
（ｂ）LMW-K5-アミン-O-過硫酸塩
このようにして得た塩１ｇを２０mlのジメチルホルムアミドに溶解した溶液を５５℃に維持し、１.７ｇのピリジン・SO3付加物を含むジメチルホルムアミド２０mlで処理する。５５℃での反応を一昼夜実行し、次いで混合物に水４０mlを添加する。１N NaOHで中和した後、NaClのアセトン飽和溶液の３容量で沈殿させ、一昼夜４℃に維持する。Ｇ４ガラス漏斗への濾過、次いで1,000カットオのTFF Milliporeシステムで限外濾過し、減圧下で乾燥して、沈殿物を回収する。かくて、全チェーンの主要構成成分が式（III''）（ｍが４）であるチェーンの混合物を含み、硫酸化度が約２.９のLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩683.2mgを得る。
【０１００】
（ｃ）LMW-K5-N,O-過硫酸塩
工程（ｂ）で得たLMW-K5-アミン-O-過硫酸塩500mgを３０mlの水に溶解させた溶液に800mgの炭酸ナトリウムを添加し、次いでこの溶液に800mgの固体状のピリジン・SO3付加物を４時間で段階的に添加する。反応混合物を一昼夜５５℃に維持し、次いで０.１N HClを添加してｐＨを７にして反応を終了させる。1,000Ｄ膜上に限外濾過した後、NaClのアセトン飽和溶液の３容量を添加し、5,000rpmで５分間の遠心分離により沈殿物を回収する。このようにして、LMW-K5-N,O-過硫酸塩502mgを得る。このLMW-K5-N,O-過硫酸塩の粘度測定による平均分子量は約4,100で、全ェインの主要構成成分が式（Ｉ''）（ｍが４）のデカサッカライドであるチェーンの混合物を含み、硫酸化度が約３.９である。
【実施例５】
【０１０１】
製造例IIIに記載したようにして製造したLMW-K5-N-硫酸塩１ｇを、実施例４の工程（ａ）及び（ｂ）に付す。アセトン中のNaClの飽和溶液の３容量による沈殿、得た沈殿物の水中への溶解、1,000Ｄカットオフ膜上への限外濾過、及び凍結乾燥によって、LMW-K5-アミン-O-過硫酸塩を回収する。このようにして得た生成物は、LMW-K5-アミン-O-過硫酸塩で、粘度測定による平均分子量は約3,600で、全チェーンの主要構成成分が式（III''）（ｍが４）のデカサッカライドであるチェーンの混合物を含んでいる。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によて提供される平均分子量が約3,000〜約6,000で硫酸化度が３.２〜４の新規なLMW-K5-N,O-過硫酸塩は、抗凝血作用に対してかなり高い比率の抗脈管形成作用を有していて、薬剤投与における脈管形成依存性疾病、たとえば、糖尿病性網膜症、移植角膜の血管新生、脈管緑内障、トラコーマ、水晶体後繊維異常、乾癬、膿化性緑内障、アテローム硬化性斑の進行、血管腫及び繊維性血管腫、動脈−静脈奇形、関節炎、充実性腫瘍の併用療法に使用することができ、出血性副作用のリスクを顕著に低減することができる。
【国際調査報告】
2005530877.tif 000040
2005530877.tif 000041
2005530877.tif 000042