(57)【要約】本発明は、上皮腫瘍およびその他のヒト病理学における、新規マーカーおよび分子標的としてのＭＡＬタンパク質の使用に関する。より特別には、本発明は、上皮細胞、Ｔリンパ球、肥満細胞、ミエリン形成細胞、または常態でＭＡＬタンパク質を発現するその他の細胞に影響する腫瘍またはその他の病理学における、診断および予後目的のためのマーカーとしての、ＭＡＬタンパク質検出の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＬタンパク質または遺伝子前駆体の検出のマーカーとしての使用であって、上皮細胞、Ｔリンパ球、肥満細胞、ミエリン形成細胞またはＭＡＬタンパク質を通常に発現するその他の細胞型（縦隔の原発性Ｂ細胞リンパ腫を除く）に影響する、腫瘍またはその他の病理学のための診断または予後目的を有する、、前記使用。
【請求項２】
該腫瘍が、なかでも、腎および甲状腺腫瘍であることを特徴とする、請求項１に記載のＭＡＬタンパク質の検出の使用。
【請求項３】
ＭＡＬタンパク質を特異的に認識する、モノクローナルまたはポリクローナル抗体により実施されることを特徴とする、請求項１および２に記載のＭＡＬタンパク質の検出の使用。
【請求項４】
該抗体がモノクローナル抗体  抗−ＭＡＬ  ６Ｄ９であることを特徴とする、請求項３に記載のＭＡＬタンパク質の検出の使用。
【請求項５】
ＭＡＬタンパク質前駆体の検出の使用であって、ＭＡＬタンパク質をコードするヌクレオチドの検出、なかでも、ノーザンブロットに基づいていることを特徴とする、前記使用。
【請求項６】
腫瘍細胞におけるＭＡＬタンパク質発現の操作の使用であって、腫瘍進行およびその治療的処置の過程を修飾することが可能であることを特徴とする、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、上皮腫瘍およびその他のヒト病理学における新規マーカーおよび分子標的としてのＭＡＬタンパク質の使用を取り扱っている。本発明を含んでなる主分野は医薬／生物診断方面であり、および本発明の応用方面は保健衛生／臨床分野である。
【背景技術】
【０００２】
技術水準
腫瘍の異なった型の診断および／または予後目的のための特徴付けは、腫瘍の形態学的試験、腫瘍細胞の組織学的分析、腫瘍発達に関連するマーカー発現の免疫組織化学的分析により理解され、そして、ある場合には、これらの評価はさらに、遺伝学的、細胞遺伝学的データによっても支持され、またはその他の自然データによっても支持される。特異的マーカーの発現または発現の欠如の免疫組織化学的分析は、異常増殖段階の詳細な特徴付けおよびガイドライン処置の確立を可能にする方法の一つである（ＲｏｓａｉおよびＡｃｋｅｒｍａｎｎ，１９９６）。
【０００３】
ＭＡＬヒト遺伝子はＴリンパ球の分化過程に発現される遺伝子探求の間に最初に同定され（ＡｌｏｎｓｏおよびＷｅｉｓｓｍａｎ，１９８７）、ヒト染色体２の短腕上に位置付けされている（Ａｌｏｎｓｏら、１９８８）。Ｔリンパ球での発現の他にも、ＭＡＬ遺伝子はミエリン形成細胞（乏突起神経膠細胞およびシュヴァン細胞）（Ｋｉｍら、１９９５；Ｓｃｈａｅｒｅｎ−Ｗｉｅｍｅｒｓら、１９９５）およびいくつかの上皮起源の極性（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）細胞株（Ｚａｃｈｅｔｉら、１９９５；Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、１９９８）でさらに発現している。ＭＡＬと単に称される、ＭＡＬ遺伝子によりコードされているタンパク質は、約１７キロダルトンの複合的（ｉｎｔｅｇｒａｌ）膜タンパク質であり、数個の疎水性セグメントおよびいくつかの免疫原性となる可能性を持つ疎水性領域を有している（ＡｌｏｎｓｏおよびＷｅｉｓｓｍａｎ  １９８７；ＷｅｉｓｓｍａｎおよびＡｌｏｎｓｏ  １９８９）。ヒトタンパク質ＭＡＬを認識し、モノクローナル抗体６Ｄ９と称されるマウスモノクローナル抗体の生成により、ＭＡＬの生化学的および機能的特徴付けへの道が開かれた（Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、１９９８；ＭｉｌｌａｎおよびＡｌｏｎｓｏ，１９９８）。ＭＡＬタンパク質は、もし、それが高含量の糖脂質およびコレステロールを示している細胞膜部分へ会合しているならば精製できる。該部分は脂質膜の複雑な混合物から構成されており、その主たる特徴は４℃で非イオン性界面活性剤（トリトンＸ−１００のごとき）に不溶性であることである（ＢｒｏｗｎおよびＲｏｓｅ，１９９２）。無傷の細胞において、これらの膜は”脂質ラフト”と名付けられたマイクロドメインを形成し、それらは表面または内部細胞中に分布している（ＳｉｍｏｎｓおよびＩｋｏｎｅｎ，１９９７；ＢｒｏｗｎおよびＬｏｎｄｏｎ，２０００）。脂質ラフトの存在は、極性上皮細胞における特定のタンパク質の頂端（ａｐｉｃａｌ）表面への輸送を説明するために最初は提案されており（ＳｉｍｏｎｓおよびＷａｎｄｉｎｇ−Ｎｅｓｓ，１９９０）、最近になって、これらの脂質ラフトはまた、他の細胞型における細胞内タンパク質輸送、およびＴリンパ球、Ｂリンパ球、肥満細胞および線維芽細胞における細胞シグナル伝達過程にも関与していることが示された（ＳｉｍｏｎｓおよびＩｋｏｎｅｎ，１９９７；ＡｌｏｎｓｏおよびＭｉｌｌａｎ，２００１）。極性上皮細胞において、およびＴリンパ球においても、ＭＡＬは主として細胞内構造物中に広がっており、そしてより低い比率で、原形質膜にも広がっている（Ｍｉｌｌａｎら、１９９７）。マディン−ダービー（Ｍａｄｉｎｅ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）およびフィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）ラット甲状腺（ＦＲＴ）細胞と称される、上皮極性細胞株をモデルとして使用し、ＭＡＬタンパク質レベルを減少させるためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した一連の研究は、ＭＡＬタンパク質が複合的膜タンパク質並びにグリコシルホスファチジルイノシトール−係留タンパク質および分泌タンパク質の頂端表面への輸送に包含されているタンパク質機構の必須成分であることを示した（Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏら、１９９��；Ｃｈｅｏｎｇら、１９９９；Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、２０００，２００１）。Ｔリンパ球においては、細胞内輸送において機能する可能性を有することに加え（Ｍｉｌｌａｎら、２００２）、ＭＡＬタンパク質は、これらの細胞における活性化機構の必須成分であるＬＣＫタンパク質チロシンキナーゼとの会合により示唆されるごとく、細胞シグナル伝達に関与できるであろう（ＭｉｌｌａｎおよびＡｌｏｎｓｏ，１９９８；ＡｌｏｎｓｏおよびＭｉｌｌａｎ，２００１）。
【０００４】
原形質膜へのタンパク質の輸送は、すべての型の細胞での正常機能発現において必須の過程である。細胞極性の喪失は、新生物性（ｎｅｏｐｌａｓｉｃ）形質転換およびその他の病理学においてきわめて共通の現象であり（ＳｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒおよびＭａｔｌｉｎ，１９９１；ＦｉｓｈおよびＭｏｌｉｔｏｒｉｓ，１９９４）、そして最も可能性の高い、これら前述の病理学の原因の一つである。どのように腫瘍性（ｔｕｍｏｒａｌ）形質転換が輸送機構成分に影響できるか、あるいは、どのようにその成分のいくつかの維持または発現の喪失が、腫瘍のその後の発達またはその処置に影響を与えることができるかについては、詳細には知られていない。すべてのこれらの考察から、異なった上皮およびその他の細胞型におけるＭＡＬタンパク質の発現を試験し、そして、その発現を正常組織と、同一組織由来の異なった型の腫瘍とを比較した場合、ＭＡＬタンパク質の細胞内発現および／または分布に相違が存在するかどうかを調査することにした。上皮細胞に関する輸送プロセス機構における重要な機能にもかかわらず、ＭＡＬタンパク質は、上皮細胞に影響する腫瘍またはその他の病理学の特徴付けのためのマーカーとして、これまで使用されていない。ＭＡＬ発現と良好な相関が示されている、縦隔の原発性Ｂ細胞リンパ腫の場合（Ｃｏｐｉｅ−Ｂｅｒｇｍａｎら、１９９９）を除いて、影響を受けた細胞がＴリンパ球、肥満細胞、ミエリン形成細胞またはＭＡＬを一般に発現するその他の細胞型であるような病理学のケースにおいて、マーカーとして使用されていない。前記リンパ腫の場合において、ＭＡＬの発現がこれらの細胞での異常発現により起こされているかどうか、または反対に、縦隔Ｂ細胞リンパ腫の前兆であるかもしれないＢリンパ球の小集団を示しているかどうかは確実ではない。
【０００５】
参考文献
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の説明
発明の簡単な説明
ＭＡＬと称される複合的（ｉｎｔｅｇｒａｌ）膜タンパク質は、上皮細胞における極性輸送のための機構の必須成分であると特徴付けられてきた（Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏら、１９９９、Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、２０００および２００１）。ＭＡＬタンパク質を発現する、異なった細胞型を特徴付けるため、そして続いて発現および／または分布の変化と、病理学的細胞段階の発達を相関付けるため、ヒトＭＡＬタンパク質を認識する、６Ｄ９と名付けられたマウスモノクローナル抗体を使用し、広い範囲のヒト組織におけるＭＡＬ発現の広範囲な免疫組織化学的分析を最初に実施した。この分析は、上皮細胞、Ｔリンパ球、肥満細胞およびミエリン形成細胞の特定の型におけるＭＡＬ発現を同定することを可能にした。これらの腫瘍型に影響している病理学試料として採取された、多様な腫瘍型の免疫組織化学的研究において、いくつかの特定の型の腫瘍はＭＡＬ発現を示さず、および／またはその細胞分布に何の変化も存在しなかった。この発見は、腫瘍およびその他の病理学的組織中の、ＭＡＬの発現および／または分布の研究が、予後または診断目的のための病理学的試料のより良い特徴付けのため、初発性新生物の検出のため、および腫瘍性形質転換の一層の理解のために有益である、ことを示唆している。特に、本発明は上皮細胞、Ｔリンパ球、肥満細胞およびミエリン形成細胞またはＭＡＬタンパク質を共通して発現するその他の細胞型（縦隔の原発性Ｂ細胞リンパ腫を除いて）に影響する腫瘍またはその他の病理学における、予後または診断目的のためのマーカーとしてのＭＡＬタンパク質検出の使用を取り扱っている。本発明の別の特別な目的は、ＭＡＬタンパク質を特異的に認識する抗体（モノクローナルかまたはポリクローナルのどちらでも）によるＭＡＬタンパク質の検出の使用である。ＭＡＬタンパク質を特異的に認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造および開発におけるプロセスおよび方法は数多く記載され、および現技術水準でよく知られており（Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、１９９８；Ｍｉｌｌａｎら、１９９８）、それ故、腫瘍細胞でのＭＡＬタンパク質の検出におけるこれらの抗体の使用は本発明の一部である。本発明のより具体的な目的は、他の可能性の中でも、免疫組織化学による、正常および腫瘍細胞中のＭＡＬタンパク質の検出および同定方法における、モノクローナル抗体抗−ＭＡＬ  ６Ｄ９の使用である。一方、ＭＡＬタンパク質をコードしているヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）の配列およびその発現の同定は、現技術水準に存在する方法および道具により開発でき（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、なかでも、特異的および相補的プローブを使用するノーザンブロット分析または鋳型ｃＤＮＡを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は本発明の一部である。
【０００７】
細胞極性の喪失は、新生物性形質転換およびその他の病理学で非常に共通の現象であり、影響を受けた細胞の形態学および特性を修飾し（ＳｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒおよびＭａｔｌｉｎ，１９９１；ＦｉｓｈおよびＭｏｌｉｔｏｒｉｓ，１９９４）、輸送機構の成分でもある、カベオリンと称されるタンパク質の場合に示されているように（Ｒａｚａｎｉら、２０００）、その原因病理学に関係している。それ故、病理学的細胞中の輸送機構の必須成分である、ＭＡＬタンパク質のレベルを修飾する処置は、正常極性細胞で起こるように（Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏら、１９９９、Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、２０００）、これらの細胞における輸送を劇的に改変することができ、そして、それ故、疾患またはその治療処置の過程を修飾することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の詳細な説明
広範囲の正常ヒト組織におけるＭＡＬタンパク質の発現および分布の免疫組織化学的研究を実施し、そして、これらの組織に影響を及ぼしている病理学の例として、腫瘍の分析により得られた結果と比較した。正常組織および分析されたいくつかの腫瘍間で、ＭＡＬの発現および／または分布パターンのレベルに相違が観察された。
【０００９】
１．正常ヒト組織で得られたＭＡＬ発現の結果
異なった上皮ならびに内分泌腺および外分泌腺においてのＭＡＬタンパク質発現、ならびに線維芽細胞、内皮細胞および骨格および非横紋筋において検出可能レベルのＭＡＬ発現がないことは、正常ヒト試料で実施した免疫組織化学的分析で観察された共通の特色の一部であり、それらの結果は表１に要約されている。分析の過程で見いだされたその他の一般的所見は、肥満細胞、および末梢神経中で軸索を取り囲んでいるミエリンにおけるＭＡＬ発現の存在である。
【００１０】
正常ヒト試料でのＭＡＬ発現の免疫組織化学的分析で得られたいくつかの際だった結果の簡単な要約を以下に記載する：
皮膚において、ＭＡＬ発現は汗腺の外分泌細胞の頂端領域および尖端汗管部で観察されたが、角質化扁平上皮、または真皮若しくは皮下線維性脂肪組織においては観察されなかった。
【００１１】
胃腸管におけるＭＡＬ発現の評価においては、食道、胃、回腸、結腸、肝臓および膵臓の試料組織が分析された。重層化扁平上皮はＭＡＬ発現が陽性であり、最も頂端細胞層で染色はより濃かった。重層化上皮が胃上皮で終わる場合、粘液産生細胞を含んでいる胃の扁平円柱状上皮は、ＭＡＬ発現の陽性染色を示した。さらに、酸および内因性因子を産生する壁細胞において特に、およびまた消化酵素を分泌する主細胞も、抗−ＭＡＬ抗体と高度に免疫反応性であった。小腸においては、バネート細胞を含むリーベルキューン腺窩の基底細胞が染色で陽性であり、絨毛表面に向かうにつれて徐々に減少した。絨毛中の細胞、腸細胞および粘液産生細胞は他の極性上皮で観察されたものと類似のＭＡＬ分布パターンを示し、顆粒特性の強い核上染色、および基底面または外側面での検出不可能な染色から成っていた。この分布はゴルジ体領域と一致している。バイエル板（Ｐｅｙｅｒ  ｐｌａｑｕｅ）において、傍皮質領域中のリンパ球、ならびに胚中心のいくつかの散在性細胞は陽性であった。高内皮細静脈を形成する内皮細胞は陽性であり、共通のＭＡＬ核上分布を有していた。すべての胃腸管を通して、筋層間神経叢および粘膜下神経叢はＭＡＬ発現に対して強い陽性であった。対照的に、粘膜筋鞘の扁平筋肉および筋鞘の横紋筋は抗体抗−ＭＡＬでの染色を示さなかった。大腸におけるＭＡＬの発現および分布は、小腸で上に説明したことと類似していた。
【００１２】
正常肝臓において、小葉中心領域の周囲に位置する肝細胞は抗体抗−ＭＡＬで染色された顆粒細胞質を示した。洞様表面およびクッパー細胞は陰性であった。胆管上皮は弱い陽性であった。膵臓外分泌腺の腺房細胞は顆粒性核上染色を示した。膵臓内分泌腺において、ランゲルハンス島のいくつかの散在性細胞は、ＭＡＬ発現が陽性であった。
【００１３】
尿生殖器管の多くの領域でＭＡＬ発現が陽性であった。それ故、腎臓において、尿細管の特異的領域でＭＡＬ発現が観察された（図１）。腎皮質においては、ＭＡＬが近位曲尿細管で観察されたが、遠位尿細管では観察されなかった（図１ａ）。染色はいくつかの細胞でその他の細胞より明白であった（図１ｂ）。糸球体は陰性であった。骨髄においてＭＡＬの強い発現が観察され、集合管で特徴的な核上顆粒分布を示した（図１ｃおよびｄ）。尿路上皮の移行上皮（膀胱および尿道）はＭＡＬ発現に対してより高い陽性を示した。
【００１４】
分析された造血組織には、胸腺、リンパ節および扁桃腺が含まれる。胸腺において、ＭＡＬ発現は主として皮質に限られており、髄質での染色は非常に少なかった。リンパ節および扁桃腺において、染色パターンは非常に類似していた。染色は濾胞内部のリンパ球傍皮質（Ｔ細胞領域）および散在性リンパ球に限られていた。他の内皮細胞でＭＡＬ発現がないのと対照的に、高位内皮細静脈（後毛細管細静脈）の内皮では、共通の頂端分布を有し、ＭＡＬに対して陽性に染色された。樹状細胞および濾胞樹状細胞は陰性であった。
【００１５】
肺において、線毛円柱上皮および気管支および細気管支の粘液産生細胞は陽性染色を示した。染色は細胞の頂端部分に制限されていた。腺房において、肺胞壁を区分するタイプ１肺細胞は陰性であったが、一方、表面活性成分を分泌するタイプ２肺細胞は高度に陽性であった。
【００１６】
副腎において、髄質は、典型的な顆粒状分布でＭＡＬ発現の強い標識付けを示した。すべての皮質層が陽性であったが、ＭＡＬ発現は網様領域でより明白であった。前に説明したごとく（Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、１９９８）、甲状腺上皮は、その特徴的顆粒状核上分布で、ＭＡＬが染色された。精巣において、ライジッヒ細胞は抗体で高度に染色されたが、セルトリ細胞はより弱い染色を示した。前立腺の上皮もまたＭＡＬ発現が陽性であることが示された。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
２．ヒト腫瘍で得られたＭＡＬ発現の結果
正常組織と比較されるべき、腎臓および甲状腺腫瘍の異なった型において、免疫組織化学的方法に従ってＭＡＬ発現および分布を試験した。研究された腎臓腫瘍には、腎癌の主な種類が含まれていた：明細胞腎癌（５ケース）、乳頭腎細胞癌（５ケース）、クロモフォビック（ｃｒｏｍｏｐｈｏｂｉｃ）腎細胞癌（５ケース）、肉腫様腎細胞癌（２ケース）、および腎膨大細胞腫（３ケース）。研究された甲状腺腫瘍には、甲状腺乳頭癌（４ケース）、濾胞癌（２ケース）、および未分化癌（１ケース）が含まれていた。腫瘍試料は、腎臓腫瘍（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９２）および甲状腺腫瘍（Ｒｏｓａｉら、１９９２）の分類で確立された基準に従い、ヘマトキシリンで染色された切片を使用して形態学的基準により定義した。
【００１９】
腎腫瘍
明細胞腎癌は７０−８０％の腎細胞癌から構成される。組織学的には、それらは細胞質の透明または顆粒状様相により２つの型へ分化できる。ＭＡＬ発現は明細胞腎癌では検出されなかった（図２ａ）。反対に、顆粒型腫瘍は、顆粒状パターンを伴い、ＭＡＬタンパク質に対する強い細胞質染色を示した（図２ｂ）。クロモフォビック癌は約５％の腎細胞癌から構成される。クロモフォビック癌の細胞は散在性の分布で強い染色を示し、頂端部分およびいくつかの細胞で他よりも強かった（図２ｃ）。乳頭細胞癌は１０−１５％の腎細胞癌から構成される。これら後者の癌腫における染色は正常腎臓に類似していた（図２ｄ）。良性腎腫瘍のうち、膨大細胞腫は約５％の腎新生物から構成される。試験された腎膨大細胞腫はＭＡＬに対して強い細胞質染色を示した（図２ｅ）。肉腫様癌は約１％の腎細胞の腫瘍から構成される。肉腫様腎癌におけるＭＡＬ発現は検出不能であった（図２ｆ）。
【００２０】
甲状腺腫瘍
乳頭癌は約６５−８０％の甲状腺腫瘍から構成される。乳頭甲状腺細胞癌のすべての場合で抗体抗−ＭＡＬによる染色を示さなかった。１０−１５％の甲状腺腫瘍から構成される、濾胞甲状腺癌は、正常甲状腺で観察された顆粒性染色と対照的に頂端領域での散在性染色を示した。希であり、および５％未満の甲状腺癌から構成される侵略的腫瘍である未分化癌においては、正常甲状腺濾胞の典型的顆粒パターンとは異なった膜パターンを示すいくつかの細胞が染色された。
【００２１】
結論として、我々の結果は以下のことを示している：１）ＭＡＬタンパク質は広範囲の細胞型で発現し、２）腫瘍のいくつかの型において、ＭＡＬタンパク質発現の劇的変化が生み出され、そして３）腫瘍のいくつかの型におけるＭＡＬ発現で観察された変化は、悪性進行に必要であるようであり、そしてその形態学および特性を決定するようである。それ故、ＭＡＬタンパク質は、ＭＡＬが通常発現される腫瘍のより詳細な特徴付けのためのマーカーとして使用でき（項目１および２）、およびＭＡＬ発現レベルの臨床的操作が、腫瘍進行およびその治療処置の過程を変えるために使用できる（項目３）。我々の研究は上皮腫瘍の分析を中心においてきたが、我々の観察は現在研究中のその他の非同定細胞型および腫瘍形質転換病理学のその他の異なった型へ拡張することができる。
【実施例】
【００２２】
実施例
実施例１．モノクローナル抗体抗−ＭＡＬ  ６Ｄ９を用いた、正常および腫瘍組織の調製、染色および同定。
【００２３】
組織試料は、手術により得られる通常の標本として、Ｐｒｉｎｃｅｓａ病院（マドリッド）の病理学部門から受け取った。すべての試料は１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、通常の処理により試験し、およびパラフィン包理した。パラフィンブロックから５μｍ切片を調製し、ポリ−Ｌ−リジン被覆スライド上にマウントした。いったんパラフィンを除去したら、切片は２００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１分間の圧力釜処理にかけた。以前に記載されているように（Ｍａｒａｚｕｅｌａら、１９９５）、その後、正常ウサギ血清をトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、緩衝塩溶液で１：２０に希釈した液を用いて試料を遮断した。切片は、モノクローナル抗体の産生ハイブリドーマを接種したマウスから得られた、腹水のモノクローナル抗体抗−ＭＡＬ  ６Ｄ９（Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｌｍｏｎｔｅら、１９９８；Ｍｉｌｌａｎら、１９９８）の１：５０希釈調製液で、およびその後、ウサギＩｇＧに対して特異的な、ペルオキシダーゼへ結合させたウサギ抗体（Ｄａｋｏ  Ａ／Ｓ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｉｎａｍａｒｃａ）で連続的にインキュベートした。各々のインキュベーション後には、トリス−ＨＣｌ緩衝塩溶液で洗浄した（３回）。切片は、３，３’−ジアミノベンジジン  テトラクロリド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，セントルイス，ＵＳＡ）および過酸化水素を含んでいるグラハム−カルノフスキー（Ｇｒａｈａｍ−Ｋａｒｎｏｖｓｋｙ）媒質で発色させた。切片はまた、ヘマトキシリンでも染色し（キャラッジ（Ｃａｒａｚｚｉ）法）、脱水し、そして通常の方法に従ってマウントした。少なくとも、各々の標本について４つの試料を秘密のコードで標識付けし、２人の専門家により独立して分析した。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ヒト腎臓における、ＭＡＬタンパク質の発現および分布の免疫組織化学的分析。（ａ）腎皮質。近位曲尿細管（矢じり形）はＭＡＬ発現が陽性であり、一方、糸球体（矢印）は陰性であった。（ｂ）より高倍率では、近位尿細管中で異なった染色パターンが観察され、いくつかの細胞において、他の細胞においてよりもより強調された染色があることが評価できる。（ｃ）骨髄。集合管は抗体抗−ＭＡＬで非常に強く染色された。（ｄ）より高倍率では、集合管において、ＭＡＬタンパク質の典型的顆粒性核上分布が評価できる（矢印）。
【図２】ヒト腎腫瘍の異なった型における、ＭＡＬタンパク質の発現および分布の免疫組織化学的分析。（ａ）明細胞腎癌。腫瘍細胞での発現は観察されなかったが、正常隣接細胞が陽性に染色された。（ｂ）顆粒型腫瘍。すべての細胞において強い染色が観察された。（ｃ）クロモフォビック腎細胞癌。すべての細胞で散在性の染色が観察され、その強度はいくつかの細胞では他の細胞とは異なっていた。（ｄ）乳頭腎細胞癌。染色は頂端側でより明白であり、そしてその強度はいくつかの細胞では他の細胞とは異なっていた。（ｅ）腎膨大細胞腫。上皮細胞は強い顆粒性細胞質染色を示した。（ｆ）肉腫様腎細胞癌。抗体抗−ＭＡＬとの反応性は観察されなかった。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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