(57)【要約】臨床診断アッセイが光バイオディスクで実行され、ディスクドライブで読み取られる。光バイオディスクを使用した、生物試料中の特定の血球分析物を検出および定量する方法および装置が開示される。生物試料中の特定の型の血球の量を求める方法は、抗体をディスク上の捕獲帯に結合させること、試料を捕獲帯に用意すること、捕獲帯に結合していない試料の部分を除去すること、および結合細胞を計数することを含む。光ディスクおよびディスクドライブでクラスター標識計数を実行する方法および装置と、そのようなクラスター標識計数を実行するための光アッセイディスクを作製する方法も記載される。
2005517154.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料中の血球分析物を検出するシステムであって、
基体を有する光ディスクと、
前記基体と平行なキャップと、
前記基体とキャップとの間にあるチャンバであって、捕獲帯を含む前記チャンバと、
第一捕獲帯が第一細胞捕獲剤を有し、かつ第二捕獲帯が第二細胞捕獲剤を有するように、捕獲帯で前記基体に付随する捕獲層と、
光を前記ディスクの前記捕獲帯に向ける光源と、
前記ディスクの前記捕獲帯で反射またはそこを透過した光を検出して信号を提供する検出器、および
前記信号を使用して前記捕獲剤に結合した前記試料中の種目を計数するプロセッサーと、を備えるシステム。
【請求項２】
光ディスクおよびディスクドライブを用いて生物試料中の血球分析物を検出する方法であって、
細胞の試料を、一種の捕獲剤を持つ少なくとも１つの捕獲帯を含む前記ディスクのチャンバ内のディスク表面上に用意し、
該ディスクを光学式読み取り機にロードし、
該光ディスクを回転させ、
電磁放射の入射ビームを前記捕獲帯に向け、
前記ディスクと前記捕獲帯で相互作用した後に形成された電磁放射ビームを検出し、
該検出されたビームを出力信号に変換し、そして
該出力信号を分析する工程であって、それにより該出力信号から前記捕獲帯に捕獲された細胞数に関する情報を抽出する、分析する工程を含む、方法。
【請求項３】
前記試料を支持する前記ディスク表面を有するチャンバは、前記ディスク内部にあり、かつ基体およびキャップにより反対側で結合されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記光ディスクは、前記捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が反射されるように、反射層を有して構成される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記光ディスクは、前記捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が該光ディスクを透過するように構成され、該ディスクは前記光源と前記検出器との間にある、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ディスク表面は、細胞捕獲剤の第一群でコーティングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞捕獲剤は、不連続の捕獲帯を規定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞捕獲剤の第二群があらかじめ決められたパターンで第二の不連続の捕獲帯を規定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第一および第二捕獲帯は１つのチャンバにある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞捕獲剤は、細胞表面抗原と結合するためのものである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞表面抗原は、抗原のＣＤファミリーから選択される、請求項１０に記載の方法
。
【請求項１２】
光ディスクおよびディスクドライブを用いてクラスター標識計数を実行する方法であって、
分離勾配を有する第一の管に血液試料を用意し、
該第一の管を、該血液試料を層に分離するのに十分な時間および速度で回転させ、
ＭＮＣ懸濁液を形成するため、Ｔ細胞含有ＭＮＣ層を再懸濁させ、
該ＭＮＣ懸濁液の試料を、少なくとも一種の捕獲剤を持つ少なくとも１つの捕獲帯を含む光ディスク表面上に用意し、
該光ディスクを光学式読み取り機にロードし、
該光ディスクを回転させ、
電磁放射の入射ビームを前記少なくとも１つの捕獲帯に向け、
前記ディスクと前記捕獲帯で相互作用した後に形成された電磁放射ビームを検出し、
該検出されたビームを出力信号に変換し、
該出力信号を分析する工程であって、それにより前記出力信号から該捕獲帯に捕獲された細胞数に関する情報を抽出する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記分離勾配は、遠心分離で密度勾配を形成するマトリクスにより用意される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の管はさらに抗凝固剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗凝固剤はＥＤＴＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗凝固剤はクエン酸デキストランである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗凝固剤はヘパリンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面は、前記ディスク内部にあり、かつ基体およびキャップにより反対側で結合されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記光ディスクは、前記捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が反射されるように、反射層を有して構成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記光ディスクは、前記捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が該光ディスクを透過するように構成され、該ディスクは前記光源と前記検出器との間にある、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記ディスク表面は、捕獲剤の第一群でコーティングされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記捕獲剤は抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、および組換えで作成された抗体を含む群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記捕獲剤は、架橋系により前記ディスク表面に固定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記捕獲剤は、前記ディスク表面に直接固定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記捕獲剤は、１つまたは複数の不連続の捕獲帯を規定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の捕獲帯は、前記光ディスク内の１つまたは複数のチャンバ内に配置される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記捕獲剤は、細胞表面抗原に選択的親和性を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞表面抗原は、抗原のＣＤファミリーから選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４５からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記血液試料は、正常血球、白血病性血球、またはリンパ性血球を含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国出願第０９／９８８，７２８号（２００１年１１月２０日出願）の一部継続出願である。
【０００２】
本出願はまた、米国仮出願第６０／３１５，９３７号（２００１年８月３０日出願）、同第６０／３２８，２４６号（２００１年１０月１０日出願）、同第６０／３８６，０７２号（２００１年１０月１９日出願）、同第６０／３８６，０７３号（２００１年１０月１９日出願）、同第６０／３８６，０７１号（２００１年１０月２６日出願）、同第６０／３４４，９７７号（２００１年１１月７日出願）、同第６０／３３８，６７９号（２００１年１１月１３日出願）、同第６０／３３４，１３１号（２００１年１１月３０日出願）、同第６０／３５５，６４４号（２００２年２月５日出願）、および同第６０／３５８，４７９号（２００２年２月１９日出願）からの優先権を主張する。
【０００３】
これら出願は全て本明細書中に参照としてその全体が援用される。
【背景技術】
【０００４】
［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、概して、生物学的、化学的、細胞、および診断アッセイに関し、詳細には、血液、血液白血病、リンパ腫、骨髄、および幹細胞由来の細胞集団に対して行われる、光バイオディスクを使用したアッセイに関する。より詳細には、ただし最適な実施形態に従って本明細書中以下に記載される特定の実施形態に限定されないが、本発明は、光バイオディスクを使用して生物試料中の細胞性分析物を検出する方法および装置に関する。
【０００５】
２．発明の背景
血球カウントは、診断中、治療中、および追跡中に、患者の健康状態を知るために使用される。全血球計算値（ＣＢＣ）は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均血球ヘモグロビン量、平均血球ヘモグロビン濃度、平均血球体積、血小板数、および白血球数を含む検査の集合である。血球カウントは、全血ｃｕ．ｍｍ．あたりの赤血球および白血球の列挙である。
【０００６】
白血球数（ＷＢＣ、白血球）は、血液の標準試料中の白血球の総数である。正常な健常人では、ＷＢＣ数は通常、１マイクロリットル（μＬ）当たり４０００〜１０８００細胞である。運動、緊張、および疾患などの要因がこれらの値に影響を及ぼす可能性がある。高ＷＢＣは、感染、白血病、または組織損傷を示唆し得る。ＷＢＣが１マイクロリットル当たり１０００個の細胞を下回ると、感染の危険性が増加する。
【０００７】
白血球分画検査は、白血球数自体から得られ得る情報を超える情報を集めるために必須である。白血球分画は、新たに疑われる感染または発熱（たとえＣＢＣが正常であっても）、異常に伴う疾患の疑い、白血球数異常、白血病の疑い、他の異常（好酸球増加症、単球増加症、および好塩基球増加症など）を評価するために使用される。白血球または白血球分画の繰り返し検査は、重篤な白血球減少症（例えば、薬物療法で続発する）の存在下で行われ得る。例えば、化学療法または放射線療法の治療中、癌性細胞に加えて健康な血球を欠乏させていないかどうかを決定するために、血球カウントは非常に重要である。
【０００８】
分画白血球数は、コンピューター細胞計数装置により求められる。この機械は、主な５
種の白血球の合計数および割合を求める。正常な個体では、主に好中球（５０〜６０％）が存在し、続いてリンパ球（２０〜４０％）、次いで単球（２〜９％）、これに少量の好酸球（１〜４％）および好塩基球（０．５〜２％）が伴われる。
【０００９】
リンパ球の範疇で、さらなるリンパ球、およびさらなる細胞サブタイプが存在する。例えば、リンパ球は、大きくはＴ細胞（胸腺由来のリンパ球）とＢ細胞（ブルサ等価（bursal-equivalent）リンパ球）とに分けることができ、これらはそれぞれ、細胞性免疫および体液性免疫を主に担う。白血球内のグループ分けに形態学的特徴が使用されてきたものの、形態学だけでは、リンパ球サブタイプの多くの機能的能力を識別するのに不適切であることがわかってきた。様々な機能を持つリンパ球を識別するために、ロゼット形成、免疫蛍光顕微鏡、酵素組織化学および最近では、モノクローナル抗体による分析を含む技法が開発されてきた。Ｔ細胞は、表面の２種の糖タンパク質を含む表面マーカー、ＣＤ４およびＣＤ８の存在により識別される（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞）。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、抗体性免疫に関与する。それらは、Ｂ細胞により提示される抗原に結合する。その結果、抗原性材料に対して抗体を分泌する形質細胞のクローンが発生する。Ｔ細胞もまた、細胞媒介型免疫に必要である。ＣＤ４＋細胞は、貪食マクロファージおよび樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される抗原に結合する。次いで、Ｔ細胞はリンホカインを放出し、これが他の細胞をその領域へ呼び込む。その結果が炎症、すなわち抗原性材料の囲い込みおよび破壊を試みる細胞および分子の凝集である。
【００１０】
ＣＤ８＋、すなわち細胞毒／抑制因子型細胞は、それらが結合した細胞を破壊する分子を分泌する。標的細胞がウイルスに感染している場合は、これは非常に有用な機能である。なぜなら、細胞は、他の細胞に感染し得るウイルスの新鮮な塊を放出し得る前に、通常は破壊されるからである。
【００１１】
ＨＩＶおよびＡＩＤＳ
ヒト免疫不全ウイルス、レトロウイルスは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に高い親和性を有し、したがってＣＤ４Ｔ細胞はウイルスにとって魅力的な標的である。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、免疫におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性の明瞭かつ悲劇的な例示を提供する。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ＣＤ４分子に結合し、したがってＣＤ＋Ｔ細胞を襲撃してこれに感染する。疾患が進行するに従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞数は、１マイクロリットル（ｕｌ）当たり約１０００個というその正常範囲より下に減少する。説明の１つとして、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が感染したＣＤ４＋細胞を破壊しようとする絶え間ない活動があり得る。
【００１２】
血液中のＣＤ４＋Ｔ細胞数が１マイクロリットル当たり４００個より下に落ち込んだ場合、患者が免疫応答を起こす能力は劇的に減少する。患者は、身体を襲撃する病原だけでなく、微生物、特に我々に害を及ぼさずに我々の組織にも普通に住んでいる細菌も高感染性になる。最終的には、患者は、カンジダ症、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、肺炎、トキソプラズマ症、結核、およびその他のような日和見感染で死亡する。
【００１３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の比の見積もりは、免疫無防備状態（immune-compromised）疾患のヒト患者の免疫の健康状態を評価するのに有用である。例えば、ＡＩＤＳである個体は、免疫におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性を示す。疾患が進行するに従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞数は、１μｌ当たり約１０００個の細胞というその正常範囲より下に減少する。患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が感染したＣＤ４＋Ｔ細胞を破壊するため、未感染のＣＤ４＋細胞はアポトーシスを起こし得る。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞対ＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、疾患の進行の診断的マーカーとなる。米国公衆衛生局は、全ての感染者について３〜６か月ごとにＣＤ４＋レベルをモニタリングする
ことを推奨している（米国の６００ヶ所の検査研究所で、４０００万件の検査が毎年行われる）。
【００１４】
ＣＤ４およびＣＤ８に加えて、リンパ球のサブタイプを同定するために使用され得るその他多くの細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ５６）が存在する。抗体法によりこれらの細胞表面抗原を検出する能力は、診断病理学に新たな側面を加え、そして様々な方法が血液リンパ系（hematolymphoid）疾患（例えば、ＡＩＤＳ、白血病、およびリンパ腫）の免疫表現型研究に利用可能である。放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）などの従来の微量免疫アッセイ（microimmunoassays）は、同位体、酵素、または蛍光物質を使用して、対応する分析物の有無を検出する。
【００１５】
ＡＩＤＳを治療するために、多数の治療アプローチが用いられている。以下のアプローチは、単独で、または他と組み合わせて、疾患を治療するのに首尾よく用いられる。
１．ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＵＫＥＳ）、最初の抗ＨＩＶ薬は、プロセスを中断する「囮」ビルディングブロックを提供することにより、ＲＮＡからウイルスＤＮＡを合成するために必要な逆転写を遮断する（ジドブジン  レトロビル（Retrovir）、ＡＺＴ、ジダノシン  ヴァイデックス、ザルシタビン  ハイビッド、ジデオキシシチジン、スタブジンゼリット、ラミブジン  エピビル、ジドブジン／ラミブジン  コンビビル、アバカビル  ザイアジェン、ジドブジン／ラミブジン／アバカビルなどの薬物）。
２．非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩまたはＮＯＮ−ＮＵＫＥＳ）は、逆転写酵素に結合してその活性を制限することにより、逆転写を遮断する（ネビラピン  ビラミューン、デラビルジン  レスクリプター、エファビレンツ  サスティバなどの薬物）。
３．プロテアーゼ阻害剤、プロテアーゼ（すなわちＨＩＶタンパク質鎖を切断してウイルスの新コピーを組み立てるのに必要な特定タンパク質にする酵素）の作用を遮断する（サキナビル（商品名インビラーゼ）、リトナビル  ノービル、インジナビル  クリキシバン、ネルフィナビル  ビラセプト、サキナビル  フォートベイス、アンプレナビル  エジネラーゼ、サキナビルインビラーゼなどの薬物）。
４．インテグラーゼ阻害剤、インテグラーゼ（ウイルスＤＮＡを感染した細胞のＤＮＡ鎖中に挿入する酵素）の作用を遮断する。インテグラーゼ阻害剤は未だ承認されていない（ジンタービル（Zintevir）はヒト治験の第Ｉ相にある）。
５．付着および融合阻害剤、ＨＩＶウイルスが細胞に付着するのを阻止する。融合阻害剤は未だ承認されていない（ＡＭＤ−３１００、ペンタフュージド（Pentafusided）、Ｔ１２４９、ＰＲＯ４５２、およびＳＣ３５１１２５は、治験の第Ｉ相および第ＩＩ相にある。
６．アンチセンス薬物、ウイルスにロックしてそれが機能することを阻止するＨＩＶ遺伝暗号の一部の「鏡像」が存在する。１つのアンチセンス薬物、EnzoのＨＧＴＶ４３が治験の第Ｉ相にある。
７．免疫刺激剤、身体の化学的メッセンジャーを使用して免疫応答を刺激する。インターロイキン２（ＩＬ−２、アルデスロイキン（Aldesleukin）、プロロイキン（Proleukin）、レチキュロース（Reticulose）、およびマルチカイン（Multikine）、ならびに不活化ウイルス調製物、ＨＩＶ−１免疫原が、治験の第ＩＩＩ相にある。
【００１６】
白血病
白血病は、髄の細胞で発生する悪性疾患である。これは、発育髄細胞の制御されない増殖により特徴付けられる。白血病には、骨髄性またはリンパ性の２つの主な分類があり、これらはそれぞれ急性または慢性であり得る。急性白血病は、急速に進行し、そして一般に、まだ完全に発育していない細胞に影響を及ぼす。それゆえ、これらの未成熟細胞は、それらの正常な機能を完全に実行することができない。一方で、慢性白血病はゆっくりと
進行し、そしてより成熟しかつ機能する細胞の増殖を許容する。白血病は、リンパ球（リンパ性白血病）または骨髄細胞（骨髄性白血病）に影響を及ぼす。リンパ性白血病は、白血球またはリンパ球に影響を及ぼし、一方骨髄性はリンパ球を除くその他全ての型の血球を含む。骨髄性またはリンパ性という用語は、関係する細胞の型を示す。４つの主な型の白血病、急性または慢性骨髄性白血病、および急性または慢性リンパ性白血病が存在する。白血病の原因は未知であるが、発育白血球が成熟するのに失敗することに伴うようである。
【００１７】
正常な、成熟白血球は再生することができず、そして骨髄で産生される新たな細胞で置き換えられる。対照的に、白血病細胞は再生する能力を持つが適切に機能するのに十分なまで発育しない。白血病が進行するにつれて、白血病細胞は正常白血球と置き換わり、患者を感染に対して極度に脆弱にする。白血病には複数の形、急性および慢性の両方があり、これらは影響を受ける白血球の型によって分類される。白血病に関係する白血球の主な型は、リンパ球および多形核白血球を含む。
【００１８】
急性白血病には主に２つの形、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）がある。ＡＬＬはリンパ球に影響を及ぼし、そして子供でより多く発生する。ＡＭＬは多形核白血球を形成する細胞に影響を及ぼし、そして成人でより一般的であるが、もっともこれはどの年齢でも起こり得る。急性白血病は、急速に進行する疾患であり、髄および血液中の、未成熟で機能しない細胞の蓄積をもたらす。しばしば、髄は十分な正常赤血球および白血球ならびに血小板を産生することができなくなる。貧血、すなわち赤血球の欠乏が、実質的に全ての白血病患者で進行する。正常な白血球の欠乏は、身体が感染と戦う能力を損なわせる。血小板の不足は、挫傷および易出血性をもたらす。
【００１９】
慢性白血病には、２つの型、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）がある。ＣＭＬは、未成熟多形核白血球に影響を及ぼし、そして通常は３５歳以上で発生する。ＣＬＬは、リンパ組織およびリンパ球に影響を及ぼし、そして通常は５０歳を過ぎた男性で発生する。慢性白血病である患者らの予後は、疾患が発生した年齢に大きく依存する；ＡＭＬに関しては、症状は制御可能であり、そして延命される。ＣＭＬの患者は、ＣＬＬの患者よりも白血病の結果として死亡する可能性がより高くなる、なぜならＣＭＬは通常、より若い年齢で始まるからである。
【００２０】
白血病に特定した診断は、血球カウント数および骨髄バイオプシーを必要とする。白血病は、血液中の多数の異常白血球の存在、および骨髄中の典型的な白血病細胞の存在により確認される。慢性白血病に関して、患者は疾患に気付いていない可能性があり、そしてしばしば患者が別の理由（定期検診または手術前など）で検査された時にだけ、診断がなされる。
【００２１】
急性および慢性白血病の治療は、しばしば類似しているが、しかしそれは各場合に関係する様々な要因に依存する。治療の目的は、白血病細胞の再生を抑制することである。この目的で、細胞増殖を阻止する細胞毒性薬が使用される。急速に分裂する白血病細胞は、正常白血球よりもこれらの薬物への感受性が高い。急性白血病の治療は、通常、複数の細胞毒性薬の同時使用を伴う。いったん白血病細胞数が減少すると、コルチコステロイドおよび一種または２種の細胞毒性薬のみを使用して改善を維持すればよい。慢性白血病に関して、細胞毒性薬およびコルチコステロイドが同様に使用され得る。場合によっては、輸血が必要になるかもしれない。白血病の診断は、血液または髄中の細胞の検査を必要とする。治療の目的は、完全な寛解を成し遂げることである。完全な寛解とは、疾患の徴候が無く、かつ患者が正常な血液および髄細胞を持つ良好な健康状態に戻ることを意味する。再発は、白血病細胞の復活、および疾患の他の徴候および症状の復活を示す。
【００２２】
急性白血病の臨床的発見の大部分は、正常骨髄成分が悪性細胞で置き換わることからもたらされる骨髄不全によるものである。直接組織浸潤（皮膚、胃腸管、髄膜）が稀に出現する。急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、小児期の急性白血病の８０％を占める。発生率のピークは、３歳〜７歳の間である。しかしながら、ＡＬＬはまた、成人でも見られ、そして成人急性白血病の約２０％を占める。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ；急性非リンパ性白血病、「ＡＮＬＬ」）は、主に成人疾患である。
【００２３】
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）は、Ｂリンパ球（稀にＴリンパ球）クローン悪性である。この疾患は通常、無痛性で、ゆっくりと進行する長命の小リンパ球の蓄積を伴う。これらの細胞は免疫的無能（immunoincompetent）である。慢性リンパ性白血病は、免疫抑制、骨髄不全、およびリンパ球の組織浸潤により、臨床的に発現する。
【００２４】
疾患の評価は、優勢芽細胞分布の系統割当てを評価する一次パネル、続いて一次パネルの結果に依存して、芽細胞分布の明確な表現型および成熟段階を特性決定するｍＡｂｓの二次パネルを使用してなされる。あるいは、あらかじめ決定されたパネルが、試料中の広範な未成熟および成熟造血細胞を即座に直接「大規模」特性決定するために選択される。これらの「大規模」特性決定は、悪性細胞が少数に過ぎない場合には検査の感度を増加させることができ、そしてまた病理細胞の異質性、ならびに随伴する他の細胞系統の成熟への妨害を特性決定する助けともなり得る。また、この戦略は、染色結果の一貫性のより良い制御を提供する。
【００２５】
白血病免疫表現型化
白血病の表面マーカーは、診断および予後目的の腫瘍系統同定に役立つ。総合的白血病表現型化は、病歴および形態を検討することで開始され、そしてマーカーパネルが各場合について選択される。大部分の場合、系統はＴ細胞、Ｂ細胞、または骨髄球と同定され得、そして診断または鑑別診断がなされ得る。
【００２６】
白血病表現型化の目的は、新生物プロセスの細胞型を同定することである。この表現型同定は、白血病またはリンパ腫の分類の助けとして、細胞系譜および成熟レベルの概略を示すはずである。さらに、この表現型同定は、細胞群が正常であるか異常であるかの決定を、および疾患の寛解、発達、または再発をモニタリングするための、試料中の既に特性決定された細胞群の検出を補助するはずである。
【００２７】
次いで、全血球計算値（白血球数を含む）が行われる。血球カウントは、治療に対する疾患の応答の重要な指標である。これらのカウントはまた、薬物治療または放射線療法の効果を知るために重要である。血球カウントは、薬物が働いているかどうかを決める助けとなる。細胞の実際の計数は、通常、高価な電子計数器により行われ、この計数器を使用して検査を行うためには技術的専門知識が必要とされる。各細胞型のパターンは、白血病かどうか、および白血病の型を示す。
【００２８】
平均で、血液１立方ミリメートルあたり約４０００〜１１，０００個の白血球が存在する。全ＷＢＣ数が１１，０００個の細胞／ｍｍ３を超える場合、これは白血球増加症（身体の感染に対する正常な応答）と呼ばれる。しかしながら、過剰な異常ＷＢＣ（白血病性芽球）の存在は白血病と呼ばれる。約５００万個の赤血球／ｍｍ３が血液中に存在する。異常に低いＲＢＣは貧血によるものである可能性がある。貧血は白血病を暗示する。
【００２９】
白血病免疫表現型化は、血液または骨髄標本で行われるが、しかしながら、他の体液または組織が検査されてもよい。ＲＢＣ溶解法または密度勾配単離（フィコール・ハイパックなど）を使用して得られた白血球が使用され得る。可能な場合、処理の前に全白血球数および分画が行われるべきであり、これに従って細胞濃度が調節される。
【００３０】
モノクローナル抗体パネル
多くの研究所では、多色免疫蛍光検出法が使用されるが、もっとも場合によっては、単色免疫蛍光が適切なこともある。ルーチン的に含まれる抗体は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ１０３、ＦＭＣ７、重鎖、κ、およびλである。臨床的または形態的特徴が「Ｔ」または「ＮＫ」リンパ球障害を示唆するならば、以下のさらなる抗体の組合せもまた行われる：ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８、ＣＤ７／ＣＤ５／ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２５／ＣＤ２／ＣＤ３、ＣＤ１６／ＣＤ５６／ＣＤ１９、ＣＤ５７／ＣＤ８／ＣＤ３、ＴＣＲα−β／δ−γ／ＣＤ３。
【００３１】
多数の、現在の生体治療が、白血病と闘うために使用される。例えば、白血病に対して、それらは髄補充療法で有効であり、そしてドナー骨髄の拒絶を阻止する。インターフェロンもまた、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）の治療に使用されている。
【００３２】
白血病性芽細胞の存在もまた、髄の検査により確認される。骨髄液が抜き取られて、顕微鏡で検査される。次いで、白血病性芽細胞が確認される。白血病細胞が骨髄試料中に見い出されたならば、次いで疾患の度合いを決定するために試験が行われる。脊椎穿刺は、脳および脊椎の中および周囲の空間を満たす液、すなわち脳脊髄液中の白血病細胞をチェックし、そして胸部への疾患の伝播をチェックするためにｘ線が使用される。
【００３３】
様々な化学療法薬が、様々な方法で癌細胞を攻撃する。それゆえ、組合せ化学療法治療が通常同時に与えられて、化学療法の効果を最大にする。
【００３４】
リンパ腫
従来、細胞を機能類似性でグループ分けするのに、形態的特徴が用いられてきた。しかしながら、形態のみでは、リンパ球サブセット（Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞など）の多くの機能性能力を識別するのに不適切であることがわかっている。様々な機能を持つリンパ球を識別するために、ロゼット形成、免疫蛍光顕微鏡、酵素組織化学、および最近では蛍光標識化モノクローナルシグナル抗体フローサイトメトリーによる分析を含む技法が開発されてきた。リンパ球は、大きくはＴ（胸腺由来）リンパ球とＢ（ブルサ等価）リンパ球とに分けることができ、これらはそれぞれ細胞性免疫および体液性免疫を担う。
【００３５】
リンパ腫は、白血球の一種であるリンパ球に由来する悪性疾患群の総称である。リンパ球は、身体じゅうに分布するが、髄、リンパ節、脾臓、胃腸管、および皮膚に集中している。これらの部位は、リンパ系を構成する主要な組織である。
【００３６】
リンパ節は非常に数が多く、そして頭皮から足まで身体中に位置する。これらは、リンパ管と呼ばれる特別な循環系で連結されている。これらの管は、リンパと呼ばれる液を運び、液の中にリンパ球が懸濁することで、リンパ球は節から節へ、そして最終的には血液中へ移動する。リンパ球の悪性形質転換がリンパ腫を起こす。通常、これはリンパ節で起るが、胃、腸、皮膚、または他の組織で起こることもある。悪性リンパ球またはリンパ腫細胞は増殖して、もたらされる細胞が蓄積し、肥大したリンパ節（単数または複数）、または別の組織（胃、皮膚、または他の部位など）での塊を産生する。リンパ節では、増殖するリンパ腫細胞が、正常細胞を押し出して異常な細胞パターンを産生し、これがバイオプシー標本で同定かつ分類され得る。あるリンパ腫は髄に関係し、そして血球発達に干渉して、貧血を、そしてより重篤な場合には、低白血球数および低血小板数をもたらし得る。
【００３７】
全てのリンパ腫は、共通して、悪性リンパ球の異常増殖を有する。しかしながら、リンパ腫の型は、影響を受けたリンパ球の種類およびリンパ節の関与パターンで異なる。リンパ腫は、主に３つの型に分けられる：低悪性度、中悪性度、または高悪性度。これらの区分は、存在するリンパ腫細胞の型、リンパ節の分布パターン、リンパ球の免疫表現型（特にＢ細胞対Ｔ細胞）、および染色体異常性の性質に基づく。リンパ腫は、ホジキン型または非ホジキン型のいずれかに属する。ホジキン病またはホジキンリンパ腫は、リンパ系での細胞の悪性増殖である。ホジキン病は、リンパ腫のよく知られた形であり、そしてその他のリンパ腫は、非ホジキンリンパ腫と呼ばれる群に分けられる。しかしながら、１９９６年、ＷＨＯは、起源となる細胞（Ｂ対Ｔ）および分化段階（未成熟または前駆体対成熟または末梢性）に基づく分類系を推奨した。
【００３８】
ホジキン病は、通常、リンパ節（単数または複数）で発生する。免疫系細胞（リンパ球）は、悪性形質転換を起こし、それが増殖し、節の正常リンパ球を押し出してその機能を損なわせ、そしてリンパ節が肥大する。疾患を特徴付ける悪性細胞は、リード−スターンバーグ（Reed-Sternberg）細胞であり、そしてリンパ球に由来する。リンパ節で、疾患に特徴的な、他の異常細胞パターンと併せてリード−スターンバーグ細胞が見いだされる場合、診断がなされる。
【００３９】
ホジキン病は１つのリンパ節で始まり、そして悪性細胞がリンパチャンネル、すなわち隣り合うリンパ節を連結する管のネットワークを通じて移動すると考えられている。より進行したホジキン病では、肺、肝臓、および骨髄が、腫瘍塊に含まれ得る。悪性細胞がリンパ節からリンパ管または血管を通じて広まった場合、疾患は、他の組織に影響を及ぼし得る。症状はほとんどの場合首の片側でのリンパ節の膨張であるが、時々腋窩、鼠径部、または腹部でのリンパ節の膨張を含む。他の症状または徴候として、疲労、反復性発熱、夜間の発汗、かゆみ、背中、脚、または腹部の痛み、骨の痛み、食欲喪失、および体重減少が挙げられる。
【００４０】
リンパ腫の診断は、バイオプシーにより確定する。悪性細胞の存在、型、および配列について、組織が検査される。組織の細胞でも、検査が行われて、それらがリンパ球であるかどうか、およびそれらのリンパ球の型が決定される。疾患がリンパ系じゅうに、または身体の他の部分に広まっているかどうかを決定するために、さらなる検査が行われる。これらの検査には、さらなるバイオプシー、核医学、ｘ線、または核磁気共鳴画像法が含まれ得る。
【００４１】
リンパ腫を検出することは非常に困難である可能性がある。非ホジキン病にはいくつかの症状があるが、それらは特異的なものではない。しばしば、リンパ節が、特に上半身で膨潤する。診断は、組織バイオプシーを採取することで開始される。組織は、癌性細胞について顕微鏡検査される。リンパ腫を評価するために、多数の検査が行われる：リンパ節検査、異常血球カウントのための全血検査、血液化学、異常沈降速度、リンパ節を観るための、および他の組織が関係しているかどうかを見るための胸部ｘ線、疾患の伝播の可能性を判断するための胸部、骨盤、および腹部のコンピュータ断層撮影（ＣＴまたはＣＡＴ）スキャンまたは核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、膨潤および結局は疾患を示すリンパ系へのガリウムの放射能取り込みをチェックするガリウムスキャン、骨髄がリンパ腫により影響を受けているかどうかを決定するための骨髄吸引およびバイオプシー、骨髄液および骨細片が抽出されて顕微鏡検査される。非ホジキンリンパ腫型は、以下の型のものである：リンパ芽球性リンパ腫、切れ込みを有さない（non-cleaved）小細胞リンパ腫（バーキット型／非バーキット型）、および大細胞リンパ腫。リンパ腫の分類は、リンパ球増殖性新生物全てを包含する。より臨床的に有用な無痛性または急速進行性リンパ腫への米国立癌研究所（ＮＣＩ）により記載される２０を超える臨床病理学的実体が存在する。
【００４２】
リンパ腫の診断および治療は、細胞型、リンパ節の関与パターン、および疾患の程度に依存する。疾患の初期局所段階は、放射線で治療することができる。化学療法は、リンパ腫治療でより頻繁に見られる形態である、なぜなら、疾患は、診断された時には、通常身体の複数箇所にあるからである。高悪性度（急速進行性）リンパ腫は、通常、複数の異なる化学療法薬で同時に治療される。
【００４３】
ホジキン型は、組織試料を採取し（バイオプシー）、そしてリード−スターンバーグ細胞（ホジキン病に特異的な細胞）の存在を検査することにより、医学的に診断される。針バイオプシーが用いられることもあるが、確定的な診断に十分な組織を得るには外科的バイオプシー（全節取り出し）が好適である。
【００４４】
疾患の評価は、通常、優勢芽細胞分布の系統割当てを評価する一次パネル、続いて一次パネルの結果に依存して、芽細胞分布の明確な表現型および成熟段階を特性決定するモノクローナル抗体の二次パネルを使用してなされる。あるいは、あらかじめ決定されたパネルが、試料中の広範な未成熟および成熟造血細胞を即座に直接大規模特性決定するために選択される。これらの大規模特性決定は、悪性細胞が少数に過ぎない場合には検査の感度を増加させることができ、そしてまた病理細胞の異質性、ならびに随伴する他の細胞系統の成熟への妨害を特性決定する助けともなり得る。また、この戦略は、染色結果の一貫性のより良い制御を提供する。
【００４５】
リンパ腫免疫表現型化
リンパ腫の表面マーカーは、診断および予後目的の腫瘍系統同定に役立つ。総合的白血病／リンパ腫表現型化は、病歴および形態を検討することで開始され、そしてマーカーパネルが各場合について選択される。大部分の場合、系統はＴ細胞、Ｂ細胞、または骨髄球と同定され得、そして診断または鑑別診断がなされる。
【００４６】
リンパ腫表現型化の目的は、新生物プロセスの細胞型を同定することである。この表現型同定は、リンパ腫の分類の助けとして、細胞系譜および成熟レベルの概要を示すはずである。さらに、この表現型同定は、細胞群が正常であるか異常であるかの決定を、および疾患の寛解、発達、または再発をモニタリングするための、試料中の既に特性決定された細胞群の検出を補助するはずである。
【００４７】
次いで、全血球計算値（白血球数を含む）が行われる。血球カウントは、治療に対する疾患の応答の重要な指標である。これらのカウントはまた、薬物治療または放射線療法の効果を知るために重要である。正常な白血球数は、血液１立方ミリメートルあたり約４０００〜１１，０００個である。全ＷＢＣ数が１１，０００個の細胞／ｍｍ３を超える場合、これは白血球増加症（身体の感染に対する正常な応答）と呼ばれる。血球カウントは、薬物が働いているかどうかを決める助けとなる。従来、細胞の計数は、ＦＡＣＳスキャナーのような高価な電子計数器により行われ、検査を行うためには技術的専門知識が必要とされる。各細胞型のパターンは、リンパ腫かどうか、およびリンパ腫の型を示す。
【００４８】
モノクローナル抗体パネル
多くの研究所では、多色免疫蛍光が使用されるが、もっとも場合によっては、単色免疫蛍光が適切なこともある。ルーチン的に含まれる抗体は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ１０３、ＦＭＣ７、重鎖、κ、およびλである。臨床的または形態的特徴が「Ｔ」または「ＮＫ」リンパ球障害を示唆するならば、以下のさらなる抗体の組合せもまた行われる：ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８、ＣＤ７／ＣＤ５／ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２５／ＣＤ２／ＣＤ３、ＣＤ１６／ＣＤ５６／ＣＤ１９、ＣＤ５７／ＣＤ８／ＣＤ３、ＴＣＲα−β／δ−γ／ＣＤ３。
【００４９】
リンパ腫と闘うために、近年開発された多数の生体治療が用いられる。例えば、モノクローナル抗体（特定の標的細胞を除去するために産生された抗体）が、リンパ腫に使用されている。
【００５０】
リンパ腫の患者でのＷＢＣ分画計数は、次の２つの理由によると思われる、いずれかの白血球増加により、通常は異常である。（ａ）反応性−すなわち感染、異常増殖、または炎症の続発性。リンパ球増加は、子供に多い、（ｂ）新生物性−すなわち、白血病型および関連した障害または白血球減少、これは（ａ）消費または破壊（例えば、脾機能亢進）、（ｂ）髄不全（この場合、通常は、汎血球減少がある）によるものであり得る。
【００５１】
好中球は、感染と闘うために重要である。好中球数が１マイクロリットルあたり１０００細胞より落ち込んだ場合、その状態は好中球減少症と呼ばれる。リンパ腫治療は、リンパ球減少症を引き起こし得る。肥満および喫煙は、好中球数を増加させる。リンパ球は、Ｂ（骨髄成熟）リンパ球とＴ（胸腺成熟）リンパ球とに分けられる。リンパ数が、大人で１マイクロリットルあたり１５００個の細胞、または子供で１マイクロリットルあたり３０００個の細胞より落ち込んだ場合、その状態はリンパ球減少症と呼ばれる。リンパ腫は、リンパ球減少症を引き起こし得る。血小板（plateletes（thrombocytes））は、出血が起こっている部位に集まることで出血を止める細胞様粒子である。次いで、それらは活性化して互いに凝集し、出血を止めて凝固を促進する。患者が骨髄増殖性障害（感染、炎症、悪性を含む）を有する場合、および脾臓が除去されてしまっている場合、血小板数は、精力的な活動中に増加する。血液の標準試料中の血小板数は、代表的には、１マイクロリットルあたり１３３，０００〜３３３，０００個の血小板である。血小板減少症は、血小板数が３０，０００個より落ち込んだ場合に起こり、これは異常な出血をもたらす。５０００個より少ない計数は、命にかかわると判断される。血小板増加は、（ａ）反応性−出血、感染、または異常増殖に対して、および（ｂ）一次的−骨髄増殖性障害などであり得る。血小板減少は、（ａ）破壊性−例えば、免疫血小板減少症、または（ｂ）髄不全−通常、他の血球も同じく関与する（すなわち、汎血球減少である）によるものであり得る。化学療法は血球の産生に影響を及ぼすため、血液中の様々な種類の細胞の量をチェックすることが重要である。
【００５２】
ＣＢＣは、市販のマニュアル、またはヘモグロビンレベル、ヘマトクリット、全白血球、および赤血球数を測定する電子機器により行われ得る。変形として、血小板数、白血球分画計数、および細胞指標が含まれ得る。血液学的分析器は、完全に自動化されており、そして結果は、体液（ＣＳＦ、胸水、腹水、心嚢液、および胃吸引物など）中の細胞数、細胞の型について正確である。
【００５３】
抗体法による細胞関連抗原の検出能力は、診断病理学に新たな側面を加えた。様々な技法が、血液リンパ系障害の免疫表現型の研究に利用可能である。しかしながら、多数の疾患（後天性免疫不全症候群およびＴ細胞白血病などのウイルスベースの疾患、ならびに様々な癌を含む）の全域（global）検出法で、抗体−抗原反応を利用する免疫アッセイ方法のさらなる開発がなされる必要がある。当業者に明らかであるとおり、本発明のアッセイ方法および光バイオディスクシステムは、そのような免疫アッセイを実行するために使用され得る。
【００５４】
放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定（ＦＩＡ）などの従来の微量免疫アッセイは、それぞれ、同位体、酵素、または蛍光物質を使用して、対応する抗体または抗原（それらと特異的に反応する）の有無を検出する。しかしながら、上記の方法は、限界および弱点を有する。ＲＩＡは、特別な設備、注意、限られた半減期、および様々な他の要因を要求する。標識として酵素または蛍光物質を使用する方法は、
着色または蛍光を決定することにより測定されるが、過剰な、未結合、未反応試薬を除去するため複数の洗浄（washing）工程を必要とするのに加えて、熱量測定または蛍光反応を検出する高感度で、高性能な装置を必要とする。そのうえさらに、細胞（特にリンパ球および癌細胞などの標本）への上記検出方法の応用は、高効率での調製、検出、および分析技術の改善を要求する。
【００５５】
細胞表面抗原に特異的な蛍光抗体の使用に関して開発された強力な道具は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）法である。これは、非常に信頼のおける、高速かつ高感度な方法である。フローサイトメーターは、最も実用的な方法であり、これは自動化されていて、定量的である。フローサイトメトリー分析で第一に試料に必要とされることは、試料が単分散懸濁液中にあり、かつ蛍光マーカーで所望の細胞を標識していることである。しかしながら、これは非常に高価な検査であり、全システムが、臨床分析研究所で訓練された技師により操作されること、および高価な装置を必要とする。モノクローナル抗体は、別個のプローブ、および多数の細胞の対象物定量のフローサイトメトリーとして使用される。
【００５６】
さらに、根本的な弱点は、いったん分析された細胞は、もはや繰り返しての分析またはさらなる調査（例えば、稀な現象の細胞の顕微鏡検査）に利用できないことである。フローサイトメーターを超える利点および弱点を有する多数の代替法が開発されてきており、その全てが独自の問題を持っている。
【００５７】
表面マーカー分析は、重要な研究室手段であり、白血病、リンパ腫、および免疫不全疾患を研究するのに、特に非常に有用であった。抗体ベースのマイクロアレイ技術は、確かに、試料（血液試料および組織試料を含む）中の特定抗原の同定用の、特に臨床診断での最新技法である。大部分の診断検査は、分析物（癌、白血病、リンパ腫、甲状腺疾患などのもの）の限られたパネルのみの検出を要求する。それゆえ、小型化技術による極少量の血液試料のみの必要性および、一回の検査での臨床的に関連したパラメーター全ての同時測定による時間および研究所人員のコストの削減は、そのコスト有効性、作業効率、およびその簡便さゆえに、病院検査室および介護拠点（point-of-care）施設に抵抗しがたい魅力になると思われる。
【００５８】
細胞を計数する先行技術のシステムおよび方法の代替として、本発明者らは、血液および他の生体液（ＣＳＦなど）にはびこる寄生虫および病原を含む細胞、特に血球を、分析、検出、および定量する単純で安価なシステムを開発した。関連する情報および信号処理法およびソフトウェアが、様々な血球、寄生虫、および病原を同定するために開発された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００５９】
先行する方法およびシステムと比較して、本発明者らは、単純で、小型化された、超高感度で、安価な、細胞分析システムを開発した。本システムは、光バイオディスク、関連する検出アセンブリ、ならびに情報および信号処理法およびソフトウェアを使用する。
【課題を解決するための手段】
【００６０】
［発明の概要］
光バイオディスクを使用して、生物試料中の血球分析物を検出する方法および装置を提供することが、本発明の第１の態様である。本発明はさらに、細胞単離および型付け（typing）（免疫表現型化を含む）の定性および定量法に関する。本発明は、有利には、以下の同一出願人による同時係属中の特許出願に開示される、任意のディスク、アッセイ、およびシステムと組み合わせて使用され得る：米国仮出願第６０／３０２，７５７号、表題「Clinical Diagnostic Optical Bio-Disc And Related Methods For Selection And Det
ection Of Lymphocytes Including Helper-Inducer/Suppressor-Cytotoxic Cells」（２００１年７月３日出願）、米国仮出願第６０／３０６，０３５号、表題「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」（２００１年７月１７日出願）、米国仮出願第６０／３０５，９９３号、表題「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」（２００１年７月１７日出願）、米国仮出願第６０／３０６，５９２号、表題「Methods for Imaging Blood Cells, Blood- Borne Parasites and Patogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」（２００１年７月１９日出願）、および米国仮出願第６０／３０７，２６３号、表題「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」（２００１年７月２３日出願）。これらの出願全ては、本明細書中、参照として援用される。
【００６１】
別の態様において、本発明は、アッセイのＣＤファミリーを含む細胞型付けに関する。ＣＤ４／ＣＤ８アッセイ、すなわちＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ−リンパ球の絶対数の迅速な測定および血液試料中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球の比を得るための一般的な均質固相細胞捕獲アッセイ。
【００６２】
アッセイのＣＤファミリーを含む細胞型付け、および白血病およびリンパ球（lyphoma）癌の細胞表面マーカーに関するシステムおよび方法を提供することもまた、本発明の態様である。これらのアッセイは、血液試料中の様々な白血病またはＣＤ特異的表面マーカー絶対数の迅速な測定用の均質固相細胞捕獲アッセイである。
【００６３】
本発明はさらに、一次抗体を試料でオフサイトインキュベーションし、続いて表面結合二次抗体により捕獲することによる特異的細胞捕獲法に関する。光バイオディスクおよび支援ソフトウェアおよび処理法は、本発明のさらなる態様である。
【００６４】
さらに別の態様において、本発明は、ディスクの特定位置での局所化細胞捕獲の原理に基づく細胞単離および型付けのシステムおよび方法に関する。複数の特異的細胞捕獲場が、特定のリンパ球（白血球）抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体ベースの捕獲化学種（chemistries）の局所的塗布により、ディスクに作成される。
【００６５】
アッセイは、固相に付着した特異的抗体を有するフローチャンバを含むバイオディスクで行われる。ヘルパー−誘導因子／抑制因子−細胞毒性検査は、全血から単離された単核細胞（ＭＮＣ）７〜１５ｕｌ（チャンバ深度に依存する）を使用して、捕獲帯の特異的抗体により捕獲された、例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ４５＋リンパ球の絶対数を求める。チャンバをＭＮＣ（３０，０００個の細胞／ｕｌ）で溢れさせることで、目的の抗原または表面マーカーを現す細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ４５＋細胞など）が、特異的に、ディスクの捕獲帯に捕獲される。あるいは、本細胞捕獲法を使用して、ＭＮＣの代わりに全血が直接アッセイされてもよい。同じく分析チャンバに組込まれるものは、規定されたネガティブコントロール範囲である。
【００６６】
細胞を検出および計数する光分析ディスクと共同してアッセイを行う方法および装置を提供することもまた、本発明の態様である。本発明のさらなる態様は、リンパ球を検出する光分析ディスクと組み合わせてアッセイを行う方法および装置を提供することである。
【００６７】
本発明の別の態様に従って、ディスク表面中または上に試料を提供することを含む方法が提供され、ディスクは、光学式読み取り機で読み取り可能な符号化された情報を有する。この情報は、ディスクに対する読み取り機の走査を制御するために使用され得る。
【００６８】
本検査またはアッセイは、少なくとも２つの方法で行われ得る。第１の方法は、光バイオディスク上に位置する特別チャンネルの血球の光学画像化の原理に基づく。約５〜２０マイクロリットルの全血を、ディスク上の特別に設計されたチャンネルに注入する。画像は、様々な赤血球および白血球サブタイプを同定して、赤血球および白血球分画計数をそれぞれ生じる、細胞認識ソフトウェアで分析される。第２の方法は、特定の細胞に対する細胞特異的抗体を使用する、特異的細胞捕獲に基づく。その特定の一実施形態において、抗体は、例えば、リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、および好酸球（ＣＤ１５）に対するものである。これらの白血球サブタイプ特異的抗体は、フローチャンバを含むバイオディスク内の固体表面に集められ／付着させられている。他の実施形態において、捕獲抗体は、目的の特定表面マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５など）を有する他の細胞に対するものである。
【００６９】
いったん試料を分析チャンバ（単数または複数）にロードして、捕獲帯のそれら各自の捕獲剤に結合するのに十分な時間を置くと、ディスクは、ディスクドライブまたは任意の等価なスピナー内で、あらかじめ決められた速度および時間で、未結合細胞を捕獲帯から除去するために回転させられる。回転後、次いでディスクは光学式読み取り機内にロードされ、そして放射源からの電磁放射の入射ビームがディスクに向けられる。ディスクを中心軸で回転させ、そして入射ビームを軸に対して放射方向に動かすことにより、ビームはディスク全体を走査する。ディスクを透過するか、またはこれに反射されるかのいずれかの電磁放射ビームが検出および分析されて、試料に特徴的な情報が抽出される。
【００７０】
本発明の実施形態はまた、チャンバを形成するように間をとった基体およびキャップを持つディスクを含む。材料の試料（細胞を含む血液など）が、チャンバに提供される。ディスクが回転すると、試料は捕獲帯を通って動く。捕獲帯は、目的の細胞型の細胞表面マーカーである抗原（ＣＤ４およびＣＤ８など）と結合する、抗体または他の特異的結合パートナーを持つ捕獲層を含む。好ましくは、血液試料中のＣＤ４およびＣＤ８ならびに他の分析物を画像化するために１回の検査が用いられ得る。本発明の別の態様に従って、捕獲帯が位置する標的領域へ光を向け、そして透過光または反射光を検出して捕獲細胞を同定および計数するディスク読み取り機が提供される。これらのＣＤ４およびＣＤ８計数、ならびにその比は、ＡＩＤＳなどの状態をモニタリングするのに有用である。
【００７１】
検査試料は、好ましくは、ディスク内のチャンバに提供される。単一のチャンバは、好ましくは複数の捕獲領域を有し、そのそれぞれが一種または複数の抗体を有し得る。一実施形態において、単一のチャンネルは複数の捕獲帯（それぞれ異なる型の抗体を持つ）を有し、かつ対照帯として働く捕獲帯を有し得る。これらの捕獲帯は、ディスクの１つまたは複数の半径にそって整列し得る。検出法は、特徴の遷移を検出すること、または表示窓を画像化し、そして画像認識ソフトウェアを使用して捕獲された細胞を計数することを含む。計数は、直接（所望の細胞を計数するなど）であっても、または間接（所望のおよび所望でない細胞の集合を計数し、所望でない細胞を計数し、そして引き算して所望の細胞数を得るなど）であってもよい。捕獲帯は１つまたは複数の抗体層を有し得る。
【００７２】
細胞試料がディスクに提供されると、ディスクは、１つまたは複数の台で回転して細胞を捕獲帯へ動かし、次いで未結合細胞を捕獲帯から除去することができる。試料は、他の方法でも処理され得る（例えば、インキュベート、または検出に使用される光源での加熱）。試料のディスク上処理に望ましいと思われる染色または任意の他の液体を加えるために、微小流体工学が使用され得る。この処理は、好ましくは、ディスク上の情報記憶領域の符号化された情報に特定される。記憶された情報は、中間の他の工程（インキュベーションなど）でドライブおよび読み取り機を所望の速度で所望の時間回転させるように、有利なように使用され得る。
【００７３】
微小技術は、細胞型、寄生虫、病原、および他の生体物質の同定の臨床診断に、特に有益である。本発明は、光バイオディスク上で全血の白血球分画計数を行うのに、微小技術を利用する。また、本発明は、血球の画像化、白血球分画計数の実行、および関連する処理法およびソフトウェアに関する。
【００７４】
本発明による別の検査またはアッセイが、少なくとも２つの方法で行われ得る。第１の方法は、光バイオディスク上に位置する特別チャンネルの血球の光学画像化の原理に基づく。約５〜２０マイクロリットルの全血を、ディスク上の特別に設計されたチャンネルに注入する。画像は、様々な白血球サブタイプを同定して、白血球分画計数を生じる、細胞認識ソフトウェアで分析される。第２の方法は、特定の細胞に対する細胞特異的抗体を使用する、特異的細胞捕獲に基づく。この特定の実施形態において、抗体は、例えば、リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、および好酸球（ＣＤ１５）に対するものである。上記に記載される関連アッセイでのように、これらの白血球サブタイプ特異的抗体は、フローチャンバを含むバイオディスク内の固体表面に集められ／付着させられている。
【００７５】
バイオディスクドライブアセンブリは、ディスクを回転させ、ディスクに記憶された任意の符号化された情報を読み取って処理し、そしてバイオディスクのフローチャンバの細胞捕獲帯を分析するために使用される。バイオディスクドライブには、バイオディスクを回転させるモーターと、ディスクの回転速度を制御するコントローラーと、ディスクからの戻り信号を処理するためのプロセッサーと、および処理された信号を分析する分析器とが設けられる。回転速度は、可変であり、そして速度に対して、回転時間も、および回転方向も綿密に制御され得る。バイオディスクはまた、フローチャンバの検査材料および標的帯がドライブの読み取りビームにより検索され（interrogated）、そして分析器により分析される前、最中、またはその後のいずれかで、バイオディスクに情報を書き込むのに利用され得る。バイオディスクは、ディスクの回転を制御し、実行されるべき免疫型化（immunotyping）アッセイの型に特異的な処理情報を提供し、そしてバイオドライブに付随するモニターに結果を表示する、符号化された情報を含み得る。
【００７６】
一般の分画細胞計数プロトコル、特に分画白血球計数プロトコルは、ＣＤ、ＣＤ−Ｒ、またはＤＶＤフォーマット、それらフォーマットの変更版、およびそれらの代替物用に開発される。ドライブの読み取りまたは検索ビームは、分析試料の様々な細胞を検出して画像を作成し、これは分画細胞計数ソフトウェアで分析され得る。
【００７７】
顕微鏡法または高性能細胞計数器は、これらの単調で根気のいる細胞計数アッセイを行うのに必須である。本方法は、光バイオディスクおよび関連するアセンブリを使用する。分析チャンバ中に遊離した、または特異的抗体法により捕獲された様々な白血球サブタイプの光学画像が作成され、そして血液または他の体液中の様々な細胞構成要素を光散乱性により同定する細胞認識ソフトウェアプログラムにより分析される。この戻り光は、入射ビームと目的の試料との間の光／物質相互作用後に検出される。検出された戻り光信号は、処理されて、識別される信号符号（signal signature）またはデジタルＩＤを提供する。先行技術の方法は、代表的には、準備（細胞染色、ＲＢＣ排除、または他の面倒なプロトコルなど）を必要とするが、本方法の実施形態は、どのような試料の前処理も必要としない。これらの方法は、上部検出器、下部検出器、事象計数器（event counter）、または細胞計数器を使用する、ＣＤ型または光ディスク読み取り機での顕微鏡分析または細胞検出を含む。
【００７８】
以下の段落は、バイオディスク製造に関する本発明のある特定の好適な実施形態に従った基本的な方法工程の概要を提供する。
【００７９】
ディスク調製：空気銃を使用して、いかなる埃粒子も除去することにより、金の反射型ディスクまたは透過型ディスクを清浄にする。スピンコーターを使用して、ディスクをイソプロパノールで２回リンスする（rinse）。２％ポリスチレンをディスクにスピンコーティングして、全体に極薄いコーティングを施す。
【００８０】
化学種の堆積：一実施形態は、３工程堆積プロトコルを含み、これは以下のインキュベートを行う：ストレプトアビジン（３０分インキュベートする）；ビオチン標識化（biotynylated）第一抗体（６０分インキュベートする）；および第二捕獲抗体（３０分インキュベートする）。全ての工程は、加湿チャンバ中にて室温で、堆積と堆積の間に、厳密な洗浄工程および乾燥工程を用いて行われる。
【００８１】
簡単には、ストレプトアビジンの１ｍｇ／ｍｌリン酸緩衝生理食塩水１μｌを、各窓に重ねて３０分間インキュベートする。蒸留水を使用して過剰なストレプトアビジンを洗い落とし（rinse off）、ディスクを乾燥させる。等体積のビオチン標識化ＩｇＧ（ＰＢＳ中１２５μｇ／ｍｌ）とアルデヒド活性化デキストラン（２００μｇ／ｍｌ）と合わせることにより、ビオチン標識化ＩｇＧ−デキストラン複合体を調製する。デキストラン−アルデヒドビオチン標識化ＩｇＧ複合体を、各捕獲窓のストレプトアビジンに重ね、冷蔵庫中で６０分間または一晩インキュベートする。過剰な試薬を洗い落とし、ディスクをスピン乾燥させる（spun-dry）。バイオディスクスロットの、指定された点に捕獲抗体を重ねることで、特定のバーコード捕獲パターンを作成する。分画計数のため、例えば、抗好中球（ＣＤ１２８またはその他）、抗リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ５６、およびその他）、抗好酸球（ＣＤ１５）、抗単球（ＣＤ１４）、抗好塩基球（ＣＤ６３）、および抗血小板（ＣＤ３２およびＣＤ１５１）が、各スロットの指定された点に重ねられる。以下の表１、表２、および表３は、捕獲層アセンブリの捕獲パターンの変異体の例を列挙する。３０分間または一晩、冷蔵庫でインキュベートする。２５μｍ、５０μｍ、または１００μｍ（５０μｍチャンネルは、２５μｍチャンバで必要とされるものの２倍の試料体積を必要とする）の、直線、Ｕ字型、または他のチャンネルフォーマットを使用して、ディスクと透明カバーディスク（上部検出器で使用するため）または反射カバーディスク（下部検出器で使用するため）とを組立てる。
【００８２】
【表１】
2005517154.tif 000003
【００８３】
タンパク質（例えば、抗原および抗体）は、非極性タンパク質下部構造とディスク表面との間の疎水的相互作用の結果として、ディスク表面に受動的に吸着される。タンパク質の吸着の速度および程度は、コーティングされた表面積対コーティング溶液の体積の比、吸着される物質の濃度、温度、および吸着時間を含む、多数の要因に依存する。しかしながら、化学種の頑強さは、タンパク質自体の安定性に依存する。
【００８４】
赤血球と比較して、白血球ははるかに大きく、効率的な細胞捕獲のために安定で頑強な化学種を必要とし得る。バイオディスク表面でこれを達成するために、本発明者らは、ビオチンとアビジンとの強力な相互作用を利用した。ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（ヒツジで作製）がアルデヒド活性化デキストランとカップリングした架橋法を、本発明の一実施形態の、一次捕獲抗体とストレプトアビジンコーティングされたディスク表面との間の架橋として使用した。アビジン−ビオチン架橋に加えて、またはその代わりに、活性化アルデヒドデキストラン（ＤＣＨＯ）などの多機能性架橋剤が使用されて、ｏｇ抗体のディスク表面への結合を促進し得る。捕獲層とディスク表面との間の安定で強力な結合は、細胞捕獲を向上させ、かつ抗血清の使用、反応時間、および非特異的結合を減らし得る。
【００８５】
本発明の別の実施形態において、固相での特異的細胞捕獲は、一次抗体に対する特異的親和性を有する二次捕獲抗体を使用して行われる。二次捕獲抗体は固体表面に結合する。試料細胞は、以下に記載されるように、一次抗体とともにオフサイトでインキュベートされて、アッセイチャンバまたは二次抗体に重ねられた一次抗体に注入され得る。簡潔には、例えば、ストレプトアビジンの１ｍｇ／ｍｌリン酸緩衝生理食塩水１μｌを、各層に重ねて３０分間インキュベートする。蒸留水を使用して過剰なストレプトアビジンを洗い落とし、ディスクを乾燥させる。等体積のビオチン標識化ＩｇＧ（ＰＢＳ中１２５μｇ／ｍｌ）と活性化デキストランアルデヒド（２００μｇ／ｍｌ）とを合わせることにより、ＩｇＧ−デキストラン複合体を調製する。デキストランアルデヒドビオチン標識化ＩｇＧ複合体を、各捕獲窓のストレプトアビジンに重ね、冷蔵庫中で６０分間または一晩インキュベートする。過剰な試薬を洗い落とし、ディスクをスピン乾燥させる。バイオディスクスロットの、指定された点に捕獲抗体を重ねることで、特定の捕獲帯パターンを作成する。ヘルパー／誘導因子−抑制因子／細胞毒性アッセイのため、以下の表２に記載されるように、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、および抗ＣＤ３、および抗ＣＤ４５が二次抗体に重ねられる。３０分間または一晩、冷蔵庫でインキュベートする。２５μｍまたは１００μｍの「Ｕ」字型接着剤（３Ｍ）と、上部検出器で使用する透明カバーディスクまたは下部検出器で使用する反射カバーディスクとを組立てる。二重層抗体捕獲法に関するさらなる詳細は、図３５Ａ〜図３５Ｄ、図３６、および図３７に関連して、以下に記載される。
【００８６】
【表２】
2005517154.tif 000004
【００８７】
あるいは、分取したＭＮＣ試料を所定の細胞に対する抗体とともにオフサイトでインキュベートする。ヘルパー／誘導因子−抑制因子／細胞毒性アッセイのため、ＭＮＣは、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、および抗ＣＤ４５とともに、相互作用が完了するように１５分間インキュベートされる。未結合抗体を、洗浄して（１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離）除去する。次いで、洗浄した複合体を、２５〜１００ｕｍで、特異的二次捕獲抗体（特異的ＩｇＧなど）が重ねられているチャンバに注入する（３Ｍ接着剤ま
たは関連したもので作成される）。３０分間のインキュベーション後、特に捕獲された細胞を、上部検出器（透明カバー）で、または下部検出器（反射型ゴールドカバーディスク）で画像化する。細胞捕獲のこの方法に関するさらなる詳細は、図３１Ａ〜図３１Ｅに関連して、以下に記載される。この方法は、所定の一つの特定の抗体を評価することを可能にする。それゆえ、ディスクの各スロットまたはチャンバは、所定の１つの特定細胞型を調査に専用のものとなる。例えば、リンパ腫で、系統がＴ細胞（ＣＤ３とインキュベートされる細胞）であるかＢ細胞（ＣＤ１９とインキュベートされる細胞）であるかを決めるため。ディスクは、チャンバ／スロットの必要数と適応するように設計され得る。以下の表３に示される例は、８チャンバ／チャンネルディスクのさらなる捕獲層パターンを示す。
【００８８】
【表３−１】
2005517154.tif 000005
【表３−２】
2005517154.tif 000006
【００８９】
ディスク漏れチェックおよび望ましくない細胞の非特異的結合の遮断：血液、すなわち生物学的有害性材料が分析されているため、本発明の品質管理製造上の態様の一部として、チャンバのいずれも、ディスクの回転中にｉｎ  ｓｉｔｕで試料を漏らさないことを確実にするために、ディスクの漏れをチェックする。各チャンネルに、好ましくはスタビルガード（ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ、市販の遮断剤）を満たし、１時間遮断する。ディスクを５０００ｒｐｍで５分間回転させて、漏れおよびディスク安定性を点検する。漏れをチ
ェックした後、ディスクを真空チャンバに２４時間置く。真空吸引後、ＰＢＳ緩衝液で満たしたチャンバまたは空のチャンバを真空パウチに入れて、使用するまで冷蔵庫に貯蔵する。
【００９０】
全血からのバフィーコートの単離：脱線維素静脈血を、遠心管中にて２８００ｒｐｍで２５分間遠心分離して、バフィーコートを調製する。上清血漿を、極細ピペットで注意深く除去する。次いで、白血球および血小板を含む、下層をなす白層をピペットで取る。遠心分離せずに血液からバフィーコートを得る代替法は、沈降促進剤（フィブリノーゲン、デキストラン、アカシア・ゴム、フィコール、またはメチルセルロースなど）で血液を沈降させることである。Ｂｏｙｕｍ'ｓ試薬（メチルセルロースおよびメトリゾエート（metrizoate）ナトリウム）は、いかなる赤血球混入もなく白血球調製物を得るのに、特に適している。あるいは、リンパ球は、陽性選択または陰性選択、あるいは溶解法により、全血から単離され得る。
【００９１】
ディスクでのアッセイ−基本技術の記載：分画白血球計数ディスク試験の好適な一実施形態は、３つの個別のコンポーネント、すなわち、（１）化学種を含む基礎ディスク、（２）チャンネル層、および（３）カバーディスクを含む。
【００９２】
バフィーコートまたは全血は、好ましくはＰＢＳに希釈されて、ディスクチャンバに注入され、チャンバの入口および出口はテープで密閉され、ディスクは、好ましくは室温で、所望の時間インキュベートされる。第１の方法として、ディスク上の所定範囲（例えば、１平方ミリメートルの範囲）が、上部検出器または下部検出器とともに光ドライブの標準７８０ｎｍレーザーを使用して、走査される。本譲受人により開発されて、米国仮出願第６０／３６３，９４９号、表題「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-disc for Performing Same」（２００２年３月１２日出願）、および米国仮出願第６０／４０４，９２１号、表題「Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same」（２００２年８月２１日出願）に開示される、関連する細胞認識ソフトウェアは、得られた画像（例えば、これは好ましくは１平方ミリメートルに等しい）から分画計数を与えるよう自動化される。第２の方法として、標準７８０ｎｍレーザーを使用してディスクを走査し、リンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板を含み得る捕獲帯を画像化する。本譲受人により開発された細胞認識ソフトウェアは、以下のルーチンを行うよう自動化される：（ａ）ディスクを遠心分離して過剰な未結合細胞を除去する、（ｂ）特定範囲または特定捕獲帯を画像化する、および（ｃ）各捕獲帯に特異的に捕獲された細胞の計数および白血球の異なるサブセットの数の振り分けを含むデータ処理。
【００９３】
処理工程の間、認識ソフトウェアは、各捕獲帯を縦断して読み取り、遭遇した細胞をマークする。各捕獲帯からのデータ処理に続いて、ソフトウェアは、血液１マイクロリットル体積あたりの、リンパ球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、および血小板区画の数を表示する。ディスクを光学ドライブに挿入してから所定の結果を表示するまで、プロセス全体で、約１０〜１５分かかる。
【００９４】
本発明に伴い関連する開示もまた、以下に表され、これらは全て、本明細書中に参照により援用される：米国仮出願第６０／３０７，２６２号、表題「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-discs for Immunophenotyping」（２００１年７月２３日出願）、米国仮出願第６０／３０７，２６４号、表題「Methods for Imaging Blood Cells, Blood-Borne Parasites and Pathogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」（２００１年７月２３日出願）、米国仮出願第６０／３０７，５６２号、表題「Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymmphocy
tes」（２００１年７月２３日出願）、および米国仮出願第６０／３０７，４８７号、表題「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical
Bio-Disc for Performing Same」（２００１年７月２４日出願）。
【００９５】
以下の段落は、本発明のある特定の好適な実施形態に従ったディスク仕様の基本エレメントの概要を提供する。
【００９６】
追跡設計：本発明の好適な一実施形態において、ディスクは、３００ｎｍの金でコーティングされたｆｏｒｗａｒｄ  Ｗｏｂｂｌｅ  Ｓｅｔ  ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０である。この反射型ディスク上、大きさ２×１ｍｍの長円形データ窓がリソグラフィーによりエッチングされている。「Ｕ」字型チャンネルを使用して、高さ２５μｍのチャンバを作る。入口および出口を含むチャンバ全体を満たすのに約７μｌの試料を要する。４窓／４チャンネルフォーマットが、おそらく使用に好適である。しかしながら、透過型ディスクでは、データ窓はエッチングされず、そしてディスク全体が使用に利用可能である。
【００９７】
接着剤および結合：好適な一実施形態において、本「Ｕ」字型流体回路を含む、接着剤またはチャンネル層が、Ｆｒａｙｌｏｃｋ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ＤＢＬ  ２０１  Ｒｅｖ
Ｃ  ３Ｍ９４６６１で作られる。あるいは、直線チャンネルを使用してチャンバが作られる。
【００９８】
カバーディスク：完全反射性の半径２６ｍｍで等距離に位置する直径０．０４０インチの試料入口４８個を持つ透明ディスクを、本ディスクアセンブリの具体的な一実施形態で使用する。
【００９９】
データ収集および処理：本出願人の細胞認識ソフトウェアを使用して、好適な×４速度および２．６７ＭＨｚの試料速度で、ソフトウェアでデータディスクを走査および読み取りする。
【０１００】
ソフトウェア：本発明はさらに、処理法および関連する細胞認識および画像化ソフトウェアを含む。このソフトウェアは、細胞計数および分画細胞計数を実行して表示することに関する。本ソフトウェアは、光ディスクドライブ読み取り装置の光バイオディスクに記憶されてもよいし、その代わりに保護されたサーバーから光学式読み取り機によってのみアクセス可能であってもよい。このサーバーは、コンピューターネットワーク（ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、または所定の用語および条件下インターネットを通じて利用可能にされたその他のものなど）で、実施し得る。そのような配分法は、同一出願人による米国仮出願第６０／２４６，８２４号、表題「Interactive Method and System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Medical Information Using Specially Prepared Bio-Optical Disc, Optical Disc Drive, and Internet Connections」（２０００年１１月８日出願）、および関連する米国特許出願第０９／９８６，０７８号、表題「Interactive System for Analyzing Biological Samples and Processing Related Information and the Use Thereof」（２００１年１１月７日出願）に開示され、この両方が、本明細書中に参照として、その全体が援用される。
【０１０１】
材料：本明細書中に開示される様々な好適な実施形態を実行するために使用される材料として、金メッキしたｆｏｒｗａｒｄ  ｗｏｂｂｌｅフォトレジストディスク、透過型金メッキディスク、ピペットおよびチップ、スピンコーター、遠心分離機、スイングアウトローター、抗凝固剤（クエン酸ナトリウムまたはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）入りＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）ＣＰＴ管、加湿チャンバ、ディスクプレス、接着
剤、カバーディスク、透明カバーディスク、テープまたは等価物、真空装置、イエローチップ、および真空チャンバが挙げられる。
【０１０２】
試薬：本発明のある方法に従って細胞計数を実行するのに使用される試薬として、リン酸緩衝食塩水、イソプロピルアルコール、蒸留水、およびスタビルガードが挙げられる。
【０１０３】
既知の当該技術分野の限界を超えることが本発明の目的である。本発明の別の目的は、光バイオディスクで全血の分画白血球計数を行うために既知の光ディスクシステムを適合させることである。血球を画像化して分画白血球計数を行うことが、本発明のさらなる目的である。
【０１０４】
本発明のこれらのおよび他の目的および利点は、クラスター標識計数を行う光ディスクおよびドライブシステムで達成され、これは、光アッセイディスク、光源、光ディスクドライブの光検出器回路、およびプロセッサーを含む。光アッセイディスクは、基体、基体を覆って配置された活性層、および接着部材またはチャンネル部材チャンネル部材により活性層へ一体化して取り付けられたキャップ部分を含む。接着部材は、そこから除去されて、それによりチャンバを形成する部分を一カ所または複数箇所有し、チャンバ中一種または複数の捕獲剤が固定されている。捕獲剤は、活性層に固定されており、そしてチャンバ内で、別々の捕獲帯を定義する。光源は、光をディスクの捕獲帯に向ける。光ディスクドライブの光検出器回路は、ディスクから反射した、またはそこを透過した光を検出して、光ディスクアセンブリから情報運搬信号を提供するように設定される。プロセッサーは、光検出器回路と連動して、情報運搬信号（光ディスクシステムを操作するのに使用される操作情報）を得て捕獲剤に結合した試料中の種目を計数する。
【０１０５】
本システムの特定の一態様に従って、プロセッサーは、細胞を検出して画像化する画像認識ソフトウェアを含む。一実施形態において、光検出器は、捕獲帯から反射した光を検出するために、ディスクの、光源と同じ側にある。代替的な実施形態において、光検出器は、捕獲帯を透過した光を検出するために、ディスクの、光源と反対側にある。
【０１０６】
本発明はまた、光ディスクおよびディスクドライブを用いてクラスター標識計数を実行する方法に関する。本方法は以下の：分離勾配を有する第一の管に血液試料を用意する工程と、第一の管を、血液試料を層に分離するのに十分な時間および速度で回転させる工程と、Ｔ細胞含有ＭＮＣ層を再懸濁させる工程であって、それによりＭＮＣ懸濁液を形成する、再懸濁させる工程と、ＭＮＣ懸濁液の試料を、少なくとも一種の捕獲剤を含有する少なくとも１つの捕獲帯を含むディスク表面上に用意する工程と、ディスクを光学式読み取り機にロードする工程と、ディスクを回転させる工程と、電磁放射の入射ビームを捕獲帯に向ける工程と、ディスクと捕獲帯で相互作用した後に形成された電磁放射ビームを検出する工程と、検出されたビームを出力信号に変換する工程、および、出力信号を分析する工程であって、それにより捕獲帯に捕獲された細胞数に関する情報を抽出する、分析する工程とを含む。本方法の一実施形態において、光ディスクは、捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が反射されるように、反射層と合わせて構成される。本方法の別の実施形態において、光ディスクは、捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が光ディスクを透過するように構成される。試料中の細胞集団の濃度を求めることに関する他の関連する態様は、同一出願人による同時係属中の米国仮出願第６０／３８４，２０５号、表題「Optical Disc Systems For Determining The Concentration Of Cells or Particles In A Sample And Methods Relating Thereto」（２００２年５月３０日出願）に開示されている。この出願は本明細書中にその全体が参照として援用される。
【０１０７】
本方法の他の態様によれば、ディスク表面は、捕獲剤の第一群でコーティングされる。本方法の一実施形態において、捕獲剤は、架橋系によりディスク表面に固定される。代替
的な実施形態において、捕獲剤は、ディスク表面に直接固定される。
【０１０８】
本方法のさらに別の態様によれば、捕獲剤は、１つまたは複数の不連続の捕獲帯を規定する。本方法の特定の一実施形態において、１つまたは複数の捕獲帯は、光ディスク内の１つまたは複数のチャンバ内に配置される。本方法の別の実施形態において、捕獲剤は、細胞表面抗原に選択的親和性を有する。代替的な実施形態において、捕獲剤は細胞表面抗原に選択的親和性を有する一次捕獲剤と結合するためのものである。好適な実施形態において、細胞表面抗原は、抗原のＣＤファミリーから独立して選択される。さらに好適な実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４５からなる群から選択される。
【０１０９】
本方法のさらに別の態様に従って、回転は、細胞が捕獲剤と結合する機会を得るように、十分な長さの時間、十分な速度で回転することを含む。本方法のこの態様の実施形態において、回転はさらに、未結合細胞が捕獲帯から取り除かれるように、十分な長さの時間、十分な速度で回転することを含む。本方法のこの態様の好適な実施形態において、回転は、単一速度で行われる。
【０１１０】
本発明のこれら態様に従った本方法の実施形態は、有利なように、さらに、ＭＮＣ細胞の試料を捕獲剤の近くに導く工程、捕獲剤の存在下細胞をインキュベートする工程、そして細胞が特に捕獲剤と結合することを可能にする工程を含む。本方法の実施形態はさらに、捕獲された細胞数を分析する工程であって、それにより試料中の細胞濃度を求める、分析する工程を含む。この実施形態の一態様において、分析は、ディスクから反射された、または光を透過した光のレベルの十分に大きな変化を検出することを含む。この実施形態の別の態様において、分析は、画像認識を使用して捕獲された細胞を計数することを含む。本方法の好適な実施形態において、画像認識は、白血球の１つの型を別のものと識別する。
【０１１１】
本方法の別の実施形態は、さらに、捕獲帯のそれぞれで捕獲された細胞を計数する工程、そして細胞計数を含む出力を提供する工程を含む。この実施形態の態様において、出力は、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の計数、ならびに、ＣＤ４細胞対ＣＤ８細胞の比を含む。
【０１１２】
本発明のさらに別の主要な態様によれば、クラスター標識計数を実行する代替的な方法が提供される。この代替的な方法は、（１）分離勾配を含む管に血液試料を用意する工程と、（２）管を、血液試料を層に分離するのに十分な時間および速度で回転させる工程と、（３）Ｔ細胞含有ＭＮＣ層を再懸濁させる工程であって、それによりＭＮＣ懸濁液を形成する、再懸濁させる工程と、（４）一次抗体をＭＮＣ懸濁液に添加する工程であって、それにより一次抗体Ｔ細胞複合体を形成する、添加する工程と、（５）一次抗体Ｔ細胞複合体の試料を、少なくとも一種の捕獲剤を含有する少なくとも１つの捕獲帯を含むディスク表面上に提供する工程と、（６）ディスクを光学式読み取り機にロードする工程と、（７）電磁放射の入射ビームを捕獲帯に向ける工程と、（８）ディスクと捕獲帯で相互作用した後に形成された電磁放射ビームを検出する工程と、（９）検出されたビームを出力信号に変換する工程と、（１０）出力信号を分析する工程であって、それにより捕獲帯に捕獲された細胞数に関する情報を抽出する、分析する工程とを含む。
【０１１３】
同様に、この代替的な方法の一実施形態において、光ディスクは、捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が反射されるように、反射層と合わせて構成される。本方法の別の実施形態において、光ディスクは、捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が光ディスクを透過するように構成される。
【０１１４】
本方法の一態様によれば、ディスク表面は、捕獲剤の第一群でコーティングされる。本方法の一実施形態において、捕獲剤は、架橋系によりディスク表面に固定される。代替的な実施形態において、捕獲剤は、ディスク表面に直接固定される。
【０１１５】
この方法のさらに別の態様によれば、捕獲剤は、１つまたは複数の不連続の捕獲帯を規定する。本方法の特定の一実施形態において、１つまたは複数の捕獲帯は、光ディスク内の１つまたは複数のチャンバ内に配置される。本方法の別の実施形態において、捕獲剤は、細胞表面抗原と結合するためのものである。代替的な一実施形態において、捕獲剤は、細胞表面抗原に選択的親和性を有する捕獲剤の第二群と結合するためのものである。好ましい実施形態において、細胞表面抗原は、抗原のＣＤファミリーから独立して選択される。より好ましい実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４５からなる群から選択される。
【０１１６】
本方法のさらに別の態様によれば、回転は、細胞が捕獲剤と結合する機会を得るように、十分な長さの時間、十分な速度で回転することを含む。本方法のこの態様の実施形態において、回転はさらに、未結合細胞が捕獲帯から取り除かれるように、十分な長さの時間、十分な速度で回転することを含む。本方法のこの態様の好適な実施形態において、回転は、単一速度で行われる。
【０１１７】
本発明のこれら態様に従った本方法の実施形態は、有利なように、さらに、一次抗体Ｔ細胞複合体の試料を捕獲剤の近くに導く工程と、捕獲剤の存在下で複合体をインキュベートする工程と、複合体が特異的に捕獲剤と結合することを可能にする工程とを含む。この方法の実施形態はさらに、捕獲された複合体数を分析する工程であって、それにより試料中の細胞濃度を求める、分析する工程を含む。この実施形態の一態様において、分析は、ディスクから反射された、またはディスクを透過した光のレベルの十分に大きな変化を検出することを含む。この実施形態の別の態様において、分析は、画像認識を使用して捕獲された複合体を計数することを含む。本方法の好適な実施形態において、画像認識は、白血球の１つの型を別のものと識別する。
【０１１８】
本方法の別の実施形態は、さらに、捕獲帯のそれぞれで捕獲された細胞を計数する工程と、細胞計数を含む出力を提供する工程とを含む。この実施形態の態様において、出力は、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の計数、ならびに、ＣＤ４細胞対ＣＤ８細胞の比を含む。
【０１１９】
上記方法のいずれかにおいて、管はさらに、抗凝固剤を含んでもよい。さらに、これらの方法の特定の実施態様および実施形態の多くにおいて、捕獲剤が固定される表面は、ディスクの内部であり、かつ基体およびキャップと反対側で結合されている。
【０１２０】
本発明の製造態様に従って、クラスター標識計数を行う光アッセイディスクの作成法が提供される。この光アッセイディスク作成法は、管に架橋剤を用意する工程、管へ捕獲剤を加える工程、架橋剤と捕獲剤とを組合せる（複合体を形成する）工程、基体を用意する工程、基体を活性層でコーティングする工程、複合体を活性層上に堆積させる工程、そして接着部材を用いてキャップ部分を活性層に付着させる工程を含む。この実施形態において、架橋剤は、アルデヒド活性化デキストランである。捕獲剤は、細胞表面抗原と結合するためのものである。
【０１２１】
この方法の態様に従って、堆積は、複合体を所定の位置へ堆積させて、それにより捕獲帯を形成することを含む。それらの一実施形態において、付着は、捕獲帯に向けられかつ細胞には当たらない光が反射されるような反射層を有するキャップ部分を付着させることを含む。それらの代替的な実施形態において、付着は、捕獲帯に向けられかつ細胞には当たらない光が光ディスクを透過するような半反射層を有するキャップ部分を付着させるこ
とを含む。
【０１２２】
別の実施形態において、捕獲剤は、一次および二次捕獲抗体を含む。二次抗体は、ディスク表面に結合しており、そして一次捕獲抗体に特異的親和性を有する。この実施形態において、一次捕獲抗体は、目的の細胞表面抗原に選択的親和性を有する。それらの好適な実施形態において、細胞表面抗原は抗原のＣＤファミリーから選択される。さらに好適な実施形態において、細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５からなる群より選択される。
【０１２３】
同じく本発明の製造態様に従って、クラスター標識計数を行う光アッセイディスクの代替作成法が提供される。光アッセイディスクを作成するこの代替法は、基体を用意する工程、基体を活性層でコーティングする工程、捕獲剤を活性層上に堆積させる（捕獲帯を形成する）工程、基体をインキュベートする工程、基体を回転させる工程、そして接着部材を用いてキャップ部分を活性層に付着させる工程を含む。この方法の特定の一実施形態において、インキュベートする工程は、捕獲剤を活性層上に固定させるのに十分な長さの時間、十分な温度で、インキュベートすることを含む。この方法の別の実施形態において、回転させる工程は、固定されていない捕獲剤が捕獲帯からはじき出されるように、十分な長さの時間、十分な速度で回転させることを含む。
【０１２４】
この方法の別の態様に従って、捕獲剤は、ＩｇＧ、ビオチン標識ＩｇＧ、抗ＣＤ３抗体、ビオチン標識抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体、ビオチン標識抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８抗体、ビオチン標識抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４５抗体、およびビオチン標識抗ＣＤ４５抗体からなる群より選択される。この態様の一実施形態において、捕獲剤は、一次捕獲剤である。代替的な実施形態において、捕獲剤は、二次捕獲剤である。この代替的な実施形態の一態様に従って、この方法はさらに、回転させる工程後、一次捕獲剤を二次捕獲剤上に堆積させる工程を含む。この代替的な実施形態の別の態様において、この方法はさらに、一次捕獲剤を二次捕獲剤上に堆積させる工程に続いて、基体をインキュベートする工程、そして基体を回転させる工程を含む。
【０１２５】
本発明の別の基本態様に従って、クラスター標識計数を行う光アッセイディスクが提供される。光アッセイディスクは、基体、基体を覆って配置される活性層、接着部材で活性層に完全に付着したキャップ部分（除去されて、それらの間に規定される１つまたは複数のチャンバを形成する１つまたは複数の部分を有する）、および活性層に固定された１つまたは複数の捕獲剤を含む。捕獲剤は、１つまたは複数のチャンバ内に不連続の捕獲帯を規定する。このアッセイディスクの一実施形態において、捕獲剤は、架橋系により固定されている。このアッセイディスクの代替的な実施形態において、捕獲剤は、活性層により固定されている。
【０１２６】
この光アッセイディスクの特定の一実施形態において、捕獲剤は、細胞表面抗原に選択的親和性を有する抗体である。好適な実施形態において、捕獲剤は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５の抗体からなる群より選択される。この光アッセイディスクの別の実施形態において、捕獲剤は、細胞表面抗原に選択的親和性を有する一次抗体に選択的親和性を有する抗体である。同様に、光アッセイディスクのこの態様の好適な実施形態において、一次抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５の抗体からなる群より選択される。光アッセイディスクのこの実施形態において、一次捕獲剤は、マウスで産生された抗ヒトであり、そして二次捕獲剤は、ヤギで産生された抗マウスである。
【０１２７】
本発明に関連する技術態様はまた、以下の：米国仮出願第６０／３０７，４８９号、表題「Optical Analysis Discs Including Microfluidic Circuits for Performing Cell Counts」（２００１年７月２４日出願）、米国仮出願第６０／３０７，８２５号、表題「M
ethods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing
Charged Matter Including Heparin, Plasma, or Poly-Lysine」（２００１年７月２５日出願）、米国仮出願第６０／３０７，７６２号、表題「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents」（２００１年７月２５日出願）、米国仮出願第６０／３０７，７６４号、表題「Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs」（２００１年７月２５日出願）、米国仮出願第６０／３０８，２１４号、表題「Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies」（２００１年７月２７日出願）、および、米国仮出願第６０／３０８，１９７号、表題「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic
T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」（２００１年７月２７日出願）に表され、これらは全て、本明細書中に参照としてその全体が援用される。
【０１２８】
本発明の方法および装置は、先行技術を超える、１つまたは複数の利点を有し、それには、検査を行うための熟練した技術者を必要としない簡単かつ迅速なディスク上処理、少ない試料容量、安価な材料の使用、ならびに既知の光ディスクフォーマットおよびドライブ製造の使用が挙げられるが、それらに限定されない。これらおよび他の特徴および利点は、添付図面および技術例と合わせて取り上げられる場合に、以下の詳細な説明を参照することにより、より良く理解されるだろう。
【０１２９】
本発明のさらなる目的は、それらに寄与するさらなる特徴およびそれらから生じる利点と合わせて、これらは全体にわたり同様のコンポーネントを同様の参照番号で示す添付の図面に示される本発明の好適な実施形態の以下の記載から明らかになるであろう。
【０１３０】
［発明の詳細な説明］
本発明は、ディスクドライブシステム、光バイオディスク、細胞アッセイおよび関連する細胞計数法、画像処理技法、ならびに関連するソフトウェアに関する。本発明のこれらの態様それぞれは、以下にさらに詳細に記載される。
【０１３１】
本明細書中に開示される、ディスクドライブシステム、光バイオディスク、細胞アッセイおよび関連する細胞計数法、画像処理技法、ならびに関連するソフトウェアに関連する本発明の態様はまた、米国仮出願第６０／３３８，６７９号、表題「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」（２００１年１１月１３日出願）、米国仮出願第６０／３３２，００１号、表題「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」（２００１年１１月１４日出願）、米国仮出願第６０／３３４，１３１号、表題「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」（２００１年１１月３０日出願）、米国仮出願第６０／３４９，３９２号、表題「RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」（２００２年１月１７日出願）、米国仮出願第６０／３４９，４４９号、表題「RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」（２００２年１月１８日出願）、米国仮出願第６０／３５３，３００号、表題「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」（２００２年１月３１日出願）、米国仮出願第６０／３５５，６４４号、表題「Cluster Designation Assays Performed on Optical Bio-Disc Including Equi-Radial Analysis Zones」（２００２年２月５日出願）、米国仮出願第６０／３５８，４７９号、表題「Cluster Designation Assays Performed on Optical Bio-Disc Including Equi-Radial Analysis 
Zones and Related Systems and Meyhods」（２００２年２月１９日出願）、米国仮出願第６０／３６３，９４９号、表題「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」（２００２年３月１２日出願）、米国仮出願６０／４０４，９２１号、表題「Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software For Performing Same」（２００２年８月２１日出願）にも提示され、これらは全て本明細書中に参照として援用される。
【０１３２】
ドライブシステムおよび関連するディスク
図１は、本明細書中開示される細胞計数および分画細胞計数を行うために実施される本発明による光バイオディスク１１０の斜視図である。本光バイオディスク１１０は、光ディスクドライブ１１２および表示モニター１１４と一緒に示される。この型のディスクドライブおよびディスク分析システムに関するさらなる詳細は、同一出願人による同時係属中の特許出願第１０／００８，１５６号、表題「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs」（２００１年１１月９日出願）、および特許出願第１０／０４３，６８８号、表題「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」（２００２年１月１０日出願）に開示され、これらの両方が、本明細書中に参照として援用される。
【０１３３】
図２は、光バイオディスク１１０の一実施形態の主要な構造エレメントの分解斜視図である。図２は、本発明で使用され得る反射帯光バイオディスク１１０（以下「反射型ディスク」）の例である。主要な構造エレメントは、キャップ部分１１６、接着部材またはチャンネル層１１８、および基体１２０を含む。キャップ部分１１６は、１つまたは複数の入口１２２および１つまたは複数の排出口１２４を含む。キャップ部分１１６は、ポリカーボネートで形成され得、好ましくは、図２の透視図から見てとれるように、その下側が反射表面１４６（図４）でコーティングされている。好適な実施形態において、トリガーマークまたはマーキング１２６が反射層１４２（図４）の表面に含まれる。トリガーマーキング１２６は、情報で符号化された、バイオディスクの全３層にかかる透明窓、不透明領域、または反射もしくは半反射領域を含み得、情報は図１０に示されるとおりプロセッサー１６６へデータを送り、次いで呼出しまたは入射ビーム１５２（図６および図１０）の操作機能と相互作用する。
【０１３４】
図２に示される第二のエレメントは、その中に形成される流体回路１２８またはＵ−チャンネルを有する接着部材またはチャンネル層１１８である。流体回路１２８は、膜を打抜くかまたは切断してプラスチックフィルムを取り除き、示されるとおりの形を形成することにより、形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フローチャンネル１３０および戻りチャンネル１３２を含む。図２に示される流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバ１３４を含む。異なる２種の型の混合チャンバ１３４が図示される。第一の混合チャンバは、フローチャンネル１３０に対して対称に形成される対称混合チャンバ１３６である。第二の混合チャンバは、オフセット混合チャンバ１３８である。オフセット混合チャンバ１３８は、示されるとおり、フローチャンネル１３０の片側に形成される。
【０１３５】
図２に示される第三のエレメントは、標的帯または捕獲帯１４０を含む基体１２０である。基体１２０は、好ましくはポリカーボネート製であり、その頂部に堆積した反射層１４２を有する（図４）。標的帯１４０は、示される形で、または代替的に任意の所望の形で反射層１４２を取り除くことにより形成される。あるいは、標的帯１４０は、マスキング技法により形成されてもよく、これは反射層１４２を付着する前に標的帯１４０領域をマスキングすることを含む。反射層１４２は、金属（アルミニウムまたは金など）で形成され得る。
【０１３６】
図３は、図２に示される光バイオディスク１１０の平面図で、流体回路１２８をあらわ
にするために透明であるとして示されるキャップ部分１１６上の反射層１４２、標的帯１４０、およびトリガーマーキング１２６が、ディスク内に配置される。
【０１３７】
図４は、本発明の一実施形態による反射帯型光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。この図は、各主要な層、基体、コーティング、または膜の部分断面図を図示するために切取られた、その様々な層の一部を含む。図４は、反射層１４２でコーティングされた基体１２０を示す。活性層１４４は、反射層１４２を覆って付着される。好適な実施形態において、活性層１４４は、ポリスチレンから形成され得る。あるいは、ポリカーボネート、金、活性化ガラス、修飾ガラス、または修飾ポリスチレン（例えば、ポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）が使用されてもよい。また、ヒドロゲルが使用され得る。あるいは、この実施形態で図示されるとおり、プラスチック接着部材１１８が、活性層１４４を覆って付着される。プラスチック接着部材１１８の露出区分は、流体回路１２８を作成する切取りまたは打抜きＵ字型を図示する。本バイオディスクのこの反射帯実施形態における最後の主要な構造層は、キャップ部分１１６である。キャップ部分１１６は、その下側に反射表面１４６を含む。反射表面１４６は、金属（アルミニウムまたは金など）で形成され得る。
【０１３８】
図５を参照すると、本発明による光バイオディスク１１０の透過型の主要な構造エレメントの分解斜視図が示される。光バイオディスク１１０の透過型の主要な構造エレメントは、同様に、キャップ部分１１６、接着部材またはチャンネル部材１１８、および基体１２０層を含む。キャップ部分１１６は、１つまたは複数の入口１２２および１つまたは複数の排出口１２４を含む。キャップ部分１１６は、ポリカーボネート層で形成され得る。図６および図９に最良に示されるように、光学トリガーマーキング１２６は、薄い半反射層１４３の表面に含まれ得る。トリガーマーキング１２６は、情報で符号化された、バイオディスクの全３層にかかる透明窓、不透明領域、または反射もしくは半反射領域を含み得、情報はプロセッサー１６６へデータを送り（図１０）、次いで呼出しビーム１５２（図６および図１０）の操作機能と相互作用する。
【０１３９】
図５に示される第二のエレメントは、その中に形成される流体回路１２８またはＵ−チャンネルを有する接着部材またはチャンネル層１１８である。流体回路１２８は、膜を打抜くかまたは切断してプラスチックフィルムを取り除き、示されるとおりの形を形成することにより、形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フローチャンネル１３０および戻りチャンネル１３２を含む。図５に図示される流体回路１２８のいくつかは、混合チャンバ１３４を含む。異なる２種の型の混合チャンバ１３４が図示される。第一の混合チャンバは、フローチャンネル１３０に対して対称に形成される対称混合チャンバ１３６である。第二の混合チャンバは、オフセット混合チャンバ１３８である。オフセット混合チャンバ１３８は、示されるとおり、フローチャンネル１３０の片側に形成される。
【０１４０】
図５に示される第三のエレメントは、基体１２０であり、これは標的帯または捕獲帯１４０を含み得る。基体１２０は、好ましくはポリカーボネート製であり、その頂部に堆積した薄い半反射層１４３を有する（図６）。図５および図６に示されるディスク１１０の基体１２０に伴う半反射層１４３は、明らかに、図２、図３および図４に示される反射型ディスク１１０の基体１２０上の反射層１４２よりも薄い。より薄い半反射層１４３は、図６および図１２に示されるように、呼出しビーム１５２の、透過型ディスクの構造層を通過するいくらかの透過を可能にする。薄い半反射層１４３は、金属（アルミニウムまたは金など）で形成され得る。
【０１４１】
図６は、図５に示される光バイオディスク１１０の透過型実施形態の基体１２０および半反射層１４３の拡大斜視図である。薄い半反射層１４３は、金属（アルミニウムまたは金など）で形成され得る。好適な実施形態において、図５および図６に示される透過型デ
ィスクの薄い半反射層１４３は、１０〜３００Åの厚さの範囲にあり得、４００Åを超えない。このより薄い半反射層１４３は、入射ビームまたは呼出しビーム１５２の一部が半反射層１４３を貫通して通り抜け上部検出器１５８により検出されることを可能にし（図１０および図１２）、一方光の一部は反射されるか、または入射径路に沿って戻される。以下に示されるとおり、表４は、膜の厚さに対する金膜の反射および透過特徴を表す。金膜層は、厚さが８００Åより厚いと完全に反射性である。一方、光が金膜を通って透過する閾値濃度は、約４００Åである。
【０１４２】
表４に加えて、図７は、金の厚さに基づく、薄い半反射層１４３の反射性と透過性の反比例関係のグラフ表示を提供する。図７に示されるグラフで使用される反射値および透過値は、絶対値である。
【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
次に図８を参照して、図５および６に示される透過型光バイオディスク１１０の平面図が示され、流体チャンネルをあらわにする透明キャップ部分１１６、トリガーマーキング１２６、および標的帯１４０がディスク内に配置される。
【０１４５】
図９は、本発明の透過型ディスク実施形態による光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。ディスク１１０は、各主要な層、基体、コーティング、または膜の部分断面図を図示するために切取られた、その様々な層の一部とともに図示される。図９は、透明キャップ部分１１６、基体１２０上の薄い半反射層１４３、およびトリガーマーキング１２６を持つ透過型ディスクフォーマットを図示する。この実施形態において、トリガーマーキング１２６は、キャップの頂部に置かれた不透明材料を含む。あるいは、トリガーマーキング１２６は、ディスクの薄い反射層１４３にエッチングされた透明な非反射窓により形成されてもよいし、トリガー検出器１６０から来る信号を吸収または反射しない任意のマークであってもよい（図１０）。図９はまた、指定された領域を示される形で、あるいは任意の所望の形でマーキングすることにより形成される標的帯１４０を示す。標的帯１４０を示すためのマーキングは、基体１２０上の薄い半反射層１４３に作られても、または基体１２０の底部（ディスクの下）に作られてもよい。あるいは、標的帯１４０は、マス
キング技法により形成されてもよく、これは標的帯１４０を除く薄い半反射層１４３全体をマスキングすることを含む。この実施形態において、標的帯１４０は、薄い半反射層１４３上にインクをシルクスクリーン印刷することにより作成されてもよい。図５、図８、および図９に示される透過型ディスクフォーマットにおいて、標的帯１４０は、代替的に、ディスクに符号化されたアドレス情報により規定されてもよい。この実施形態において、標的帯１４０は、物理的に識別可能な縁境界線を含まない。
【０１４６】
図９を続けて参照して、活性層１４４が、薄い半反射層１４３を覆って付着されているとして図示される。好適な実施形態において、活性層１４４は、２％ポリスチレンの４０〜２００μｍ厚さの層である。あるいは、ポリカーボネート、金、活性化ガラス、修飾ガラス、または修飾ポリスチレン（例えば、ポリスチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物）が、使用されてもよい。また、ヒドロゲルが使用され得る。この実施形態で図示されるとおり、プラスチック接着部材１１８は活性層１４４を覆って付着されている。プラスチック接着部材１１８の露出区分は、流体回路１２８を作成する、切取りまたは打抜きされたＵ−字型形態を図示する。
【０１４７】
本バイオディスク１１０のこの透過実施形態の最後の主要な構造層は、透明な、非反射性キャップ部分１１６であり、これは入口１２２および排出口１２４を含む。
【０１４８】
ここで図１０を参照して、光学コンポーネント１４８、入射ビームまたは呼出しビーム１５２を発生させる光源１５０、戻りビーム１５４、および透過ビーム１５６を図示する透視図およびブロック図が表示される。図４に示される反射型バイオディスクの場合、戻りビーム１５４は、光バイオディスク１１０のキャップ部分１１６の反射表面１４６から反射される。本光バイオディスク１１０のこの反射型実施形態において、下部検出器１５７により、戻りビーム１５４が検出されて信号エレメントの存在について分析される。一方で、透過型バイオディスクフォーマットにおいて、上部検出器１５８により、透過ビーム１５６が検出され、同じく信号エレメントの存在について分析される。透過型実施形態において、上部検出器１５８として光検出器が使用され得る。
【０１４９】
図１０はまた、ハードウェアトリガー機構を示し、これはディスク上のトリガーマーキング１２６およびトリガー検出器１６０を含む。ハードウェアトリガー機構は、反射型バイオディスク（図４）および透過型バイオディスク（図９）の両方で使用される。トリガー機構は、呼出しビーム１５２がそれぞれの標的帯１４０にある場合にのみ、プロセッサー１６６がデータを収集することを可能にする。そのうえさらに、透過型バイオディスクシステムにおいて、ソフトウェアトリガーもまた使用され得る。ソフトウェアトリガーは、呼出しビーム１５２がそれぞれの標的帯１４０の縁に当たるとすぐに、下部検出器を使用して、プロセッサー１６６にデータを収集する信号を送る。図１０はさらに、光バイオディスク１１０の回転を制御する、ドライブモーター１６２およびコントローラー１６４を図示する。図１０はまた、透過型光バイオディスクと結びついた戻りビーム１５４および透過ビーム１５６を処理するのに代替的に実施されるプロセッサー１６６および分析器１６８を示す。
【０１５０】
図１１に示されるとおり、本発明による光バイオディスク１１０の反射型ディスク実施形態の部分横断面図が表される。図１１は、基体１２０および反射層１４２を図示する。上記で示されるとおり、反射層１４２は、材料（アルミニウム、金、または他の適した反射材料など）で作られ得る。この実施形態において、基体１２０の頂部表面は、滑らかである。図１１はまた、反射層１４２を覆って付着された活性層１４４を示す。同じく図１１に示されるとおり、標的帯１４０は、所望の場所で反射層１４２の領域または一部を除去することにより、またはその代わりに、反射層１４２を付着させる前に所望の領域をマスキングすることにより形成される。さらに図１１に示されるとおり、プラスチック接着
部材１１８が活性層１４４を覆って付着される。図１１はまた、キャップ部分１１６およびそれに伴う反射表面１４６を示す。したがって、キャップ部分１１６が所望の切取り形を含むプラスチック接着部材１１８に付着されると、フローチャンネル１３０がそれにより形成される。図１１に示される矢印により示されるとおり、入射ビーム１５２の径路は、最初に、ディスク１１０の下から基体１２０へ向けられる。次いで、入射ビームは、反射層１４２に隣接する点で焦点を合わせる。この焦点合わせは、反射層１４２の一部が欠けている標的帯１４０で行われるため、入射は、活性層１４４を通りフローチャンネル１３０に入る径路に沿って連続している。次いで、入射ビーム１５２は、連続してフローチャンネルを通って上方向に横断して、最終的に反射表面１４６に入射して落ちる。この点で、入射ビーム１５２は、入射径路にそって、戻るかまたは反射して返され、それにより戻りビーム１５４を形成する。
【０１５１】
図１２は、本発明によるバイオディスク１１０の透過型実施形態の部分横断面図である。図１２は、基体１２０上に透明キャップ部分１１６および薄い半反射層１４３を持つ透過型ディスクフォーマットを図示する。図１２はまた、薄い半反射層１４３を覆って付着された活性層１４４を示す。好適な実施形態において、透過型ディスクは、１０〜３００オングストロームの厚さでかつ４００オングストロームを超えない金属（アルミニウムまたは金など）で作られた薄い半反射層１４３を有する。この薄い半反射層１４３は、光源１５０（図１０）からの入射ビームまたは呼出しビーム１５２の一部が、ディスクを貫通して上方向に通り抜け上部検出器１５８により検出されることを可能にし、一方光の一部は、入射ビームと同じ径路に沿って、ただし逆方向で反射して返される。この配置において、戻りビームまたは反射ビーム１５４は、反射層１４３で反射される。したがって、この様式では、戻りビーム１５４はフローチャンネル１３０に進入しない。反射光または戻りビーム１５４は、図１３および図１４に関連してより詳細に記載されるとおり、半反射層１４３中または上に形成されるあらかじめ記録された情報トラックで入射ビーム１５２を追跡するために使用され得る。図１２に図示されるディスク実施形態において、物理的に規定された標的帯１４０は存在してもしなくてもよい。標的帯１４０は、基体１２０上の薄い半反射層１４３に作られる直接マーキングにより作成され得る。これらのマーキングは、シルクスクリーン印刷または任意の等価な方法を使用して形成され得る。標的帯を規定するために物理的証が使用されない代替的な実施形態において（例えば、符号化ソフトウェアアドレシングが利用される場合など）、事実上フローチャンネル１３０が、試験中の特徴の検査が実行される、限定された標的範囲として用いられ得る。
【０１５２】
図１３は、本発明によるバイオディスク１１０の反射型ディスク実施形態のトラックを横断して取られた横断面図である。この図は、ディスクの半径およびフローチャンネルに沿って縦に取られている。図１３は、基体１２０および反射層１４２を含む。この実施形態において、基体１２０は、一連の溝１７０を含む。溝１７０は、ディスクの中心近くから外縁に向かって延びる螺旋の形をしている。溝１７０は、呼出しビーム１５２がディスクの螺旋型溝１７０に沿って追跡し得るように実施されている。この型の溝１７０は、「ｗｏｂｂｌｅ溝」として既知である。うねるようなまたは波状の側壁を有する底部分が溝１７０を形成し、一方立ち上がったまたは隆起した部分が螺旋の隣接する溝１７０を分離させる。この実施形態で溝１７０を覆って付着される反射層１４２は、図示されるとおり、本質的に等角的である。図１３はまた、反射層１４２を覆って付着された活性層１４４を示す。図１３に示されるとおり、標的帯１４０は、所望の場所で反射層１４２の領域または一部を除去することにより、またはその代わりに、反射層１４２を付着する前に所望の領域をマスキングすることにより形成される。さらに図１３に図示されるとおり、プラスチック接着部材１１８は、活性層１４４を覆って付着される。図１３はまた、キャップ部分１１６およびそれに伴う反射表面１４６を示す。したがって、キャップ部分１１６が所望の切取り形を含むプラスチック接着部材１１８に付着されると、フローチャンネル１３０がそれにより形成される。
【０１５３】
図１４は、例えば、図１２に記載されるような、本発明によるバイオディスク１１０の透過型ディスク実施形態のトラックを横断してとられた横断面図である。この図は、ディスクの半径およびフローチャンネルに沿って縦に取られている。図１４は、基体１２０および薄い半反射層１４３を図示する。この薄い半反射層１４３は、光源１５０からの入射ビームまたは呼出しビーム１５２が、ディスクを貫通して通り抜け上部検出器１５８により検出されることを可能にし、一方光の一部は、戻りビーム１５４の形で反射して返される。薄い半反射層１４３の厚さは、ディスク読み取り機の追跡能力を維持するために要求される反射光の最小量により決められる。この実施形態において、基体１２０は、図１３で記載されたように、一連の溝１７０を含む。この実施形態において、溝１７０は同じく好ましくは、ディスクの中心近くから外縁に向かって延びる螺旋の形をしている。溝１７０は、呼出しビーム１５２が螺旋に沿って追跡し得るように実施されている。図１４はまた、薄い半反射層１４３を覆って付着された活性層１４４を示す。さらに図１４に図示されるとおり、プラスチック接着部材またはチャンネル層１１８が、活性層１４４を覆って付着される。図１４はまた、反射表面１４６のないキャップ部分１１６を示す。したがって、キャップが所望の切取り形を含むプラスチック接着部材１１８に付着されると、フローチャンネル１３０がそれにより形成され、入射ビーム１５２の一部が実質的に反射されずにそこを通過することが可能になる。
【０１５４】
図１５は、図１１と類似した図で、反射型ディスクの全厚さおよびその初期反射性を示す。図１６は、図１２と類似した図で、透過型ディスクの全厚さおよびその初期反射性を示す。溝１７０は、図１５および図１６では示されない、なぜなら断面は溝１７０に沿って切られているからである。図１５および図１６は、これらの実施形態において、溝１７０に垂直に位置する狭いフローチャンネル１３０の存在を示す。図１３、図１４、図１５、および図１６は、反射型ディスクおよび透過型ディスクそれぞれの全厚さを示す。これらの図において、入射ビーム１５２は、最初に基体１２０と相互作用するように図示され、基体１２０は反射性を有するので図示されるとおり入射ビームの径路を変えてビーム１５２の反射層１４２または薄い半反射層１４３上での焦点化を提供する。
【０１５５】
細胞アッセイ
血液試料のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ−リンパ球集団の絶対数およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球比を迅速に求めるための包括的均一固相細胞捕獲アッセイが、本発明の方法を利用して行われ得る。バイオディスクに組込まれた小フローチャンネル内で実行される検査は、全血から単離された単核細胞（ＭＮＣ）７〜１５μｌで、捕獲帯の特異的抗体により捕獲された、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ１９＋、およびＣＤ４５＋細胞の数を求める。検査は、ディスクの特定位置での局所的細胞捕獲の原則に基づく。複数の特異的細胞捕獲帯が、特定血液細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に基づく捕獲化学種の局所的塗布により、ディスクに作成される。２５〜１００μｌチャンバをＭＮＣ血液（１０，０００〜３０，０００細胞／μｌ）で溢れさせることで、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ４５抗原を発現する細胞が、ディスク内の捕獲帯に捕獲される。同じく捕獲帯内に組込まれるのは、規定されたネガティブコントロール範囲である。
【０１５６】
図１７Ａは、血液試料の分析を示す、絵による流れ図である。工程１において、血液（４〜８ｍｌ）、および抗凝固剤（ＥＤＴＡ、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）またはヘパリンなど）は、４ｍｌまたは８ｍｌ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）に直接集められる。本発明の別の実施形態の等価な工程において、３ｍｌの抗凝固剤中血液が、分離勾配１７６（ヒストパック（Histopaque）（登録商標）１０７７など）を含む管１７２に上乗せされる。いずれの場合においても、血液試料１７４は、好ましくは採血して２時間以内に使用される。分離勾配１７６に上乗せし
た血液試料１７４を含む管１７２を、バイオハザード遠心分離機中、水平回転機およびスイングアウトバケット（swing out buckets）を用いて、室温で２５分間、４００×ｇで遠心分離する。遠心分離後、血漿層１７８を除去し（工程２）、単核細胞（ＭＮＣ）画分１８０上に約２ｍｍの血漿を残す。ＭＮＣ層１８０を集め、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。室温で１０分間、３００ＲＣＦ（１２００ｒｐｍ）で遠心分離することにより細胞をペレットにして、全ての残存血小板を除去する。上清を除去し、管をやさしく叩いてＭＮＣペレット１８０をＰＢＳに再懸濁させる。最終ペレット１８０は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０の高さに依存して、１０，０００〜３０，０００細胞／μｌの細胞数に再懸濁される（工程３）。
【０１５７】
バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０を７μｌのＭＮＣ懸濁液で溢れさせ、チャンバの入口１２２および排出口１２４（図３および図８）を接着タブまたは他の適した密閉員で封じる（工程４）。バイオディスク１１０を、室温で１５分間インキュベートし、次いで、光学ドライブ１１２の７８０ｎｍレーザーを使用して走査して捕獲場を画像化する（工程５）。透過型バイオディスク１１０が使用される場合、光学ドライブ１１２は任意選択で捕獲場を画像化する上部検出器１５８（図１０）を含むことが理解されるべきである。ソフトウェアは、好ましくは、ディスクで符号化されて、ドライブに、自動的に以下のタスクを実行するように指示する：（ａ）１つまたは複数の段階で過剰な未結合細胞をはじき出すためにディスクを遠心分離する、（ｂ）特定の捕獲窓を、ディスプレイモニター１１４に画像化する、そして（ｃ）データを処理する。データ処理は、各捕獲帯に特異的に捕獲された細胞を計数すること、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋の比、またはどの比率が決定されるようにプログラミングされるかを導き出すことを含むが、それらに限定されない。他の望ましい比率が、本発明の代替的な実施形態により容易に提供され得る。
【０１５８】
図１７Ａにさらに示されるように、本発明は、光ディスクおよびディスクドライブを用いてクラスター標識計数を実行する方法に関する。本方法は、分離勾配を有する第一の管に血液試料を用意する工程と、第一の管を、血液試料を層に分離するのに十分な時間および速度で回転させる工程と、Ｔ細胞含有ＭＮＣ層を再懸濁させる工程であって、それによりＭＮＣ懸濁液を形成する、再懸濁させる工程と、ＭＮＣ懸濁液の試料を、少なくとも一種の捕獲剤を含有する少なくとも１つの捕獲帯を含むディスク表面上に用意する工程と、ディスクを光学式読み取り機にロードする工程と、ディスクを回転する工程と、電磁放射の入射ビームを捕獲帯に向ける工程と、ディスクと捕獲帯で相互作用した後に形成された電磁放射ビームを検出する工程と、検出されたビームを出力信号に変換する工程と、出力信号を分析する工程であって、それにより捕獲帯に捕獲された細胞数に関する情報を抽出する、分析する工程とを含む。この方法の一実施形態において、光ディスクは、捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が反射されるように、反射層と合わせて構成される。この方法の他の実施形態において、光ディスクは、捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が前記光ディスクを透過するように構成される。
【０１５９】
分析／処理工程の間、ソフトウェアは各捕獲帯画像を横断して読み込み、ソフトウェアが細胞画像に遭遇することで細胞画像をマーキングする。例えば、捕獲されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の数を計数することに続いて、ソフトウェアは、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞比を計算して、全血１マイクロリットルあたりのＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ４５＋捕獲帯にある細胞の絶対数、またＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の両方を表示する。ディスクを光学ドライブに挿入してから数および比を得るまで、全プロセスで約１２分かかる。試料中の特定の細胞集団の定量に関する他の関連する態様は、同一出願人による同時係属中の米国仮出願第６０／３８２，３２７号、表題「Methods For Calculating Specific Populations Of Cells Captured In An Optical Bio-Disc」（２００２年５月２２日出願）に開示される。この出願は、本明細書中にその全体が参照として援用される。
【０１６０】
一実施形態において、ディスクは、符号化情報層として３００ｎｍの金層でコーティングされたｆｏｒｗａｒｄ  Ｗｏｂｂｌｅ  Ｓｅｔ  ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０ＣＤ−Ｒディスクである。反射型ディスクにおいて、既知のリソグラフィー技法により、大きさ２×１ｍｍの長円形の表示窓が反射層にエッチングされる。透過型ディスクの設計によっては、個別の表示窓はエッチングされず、ディスク全体が使用に利用可能である。具体的な一実施形態において、接着層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ＤＢＬ  ２０１  Ｒｅｖ  Ｃ  ３Ｍ９４６６１である。カバーは、半径２６ｍｍで等間隔に配置された４８個の直径０．０４０インチの試料入口を持つ透明ディスクである。データディスクは、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋計数ソフトウェアを使用して、速度４倍、および試料速度２．６７ＭＨｚでソフトウェアで走査および読み取りされる。
【０１６１】
図１７Ｂを参照して、本発明の一実施形態において、ポリスチレン１１８の厚い層が、基体１２０を覆って形成され、そして（任意選択で）ストレプトアビジン１８２と重ねられる。細胞捕獲抗体は、ビオチンを通じてストレプトアビジン（strepavidin）１８２に結合している。これらの抗体は、捕獲抗体用に十分な数の結合部位を作り出す、ストレプトアビジンを覆ってコーティングされたデキストラン活性化アルデヒドに結合したビオチン標識化抗体を含み得る。これは、白血球（ＷＢＣ）と頑強な結合を特異的に形成し得る強力な捕獲化学種を作り出す。
【０１６２】
図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃは、本発明の実施形態で使用される架橋系の絵図である。架橋系は一種または複数の架橋剤、または共役剤（conjugates）を含んで１つまたは複数の巨大分子部分を他と架橋させることが理解されるはずである。架橋は、２つの巨大分子部分間の共有結合相互作用でも非共有結合相互作用でもよく、通常は２つの巨大分子遊離基が組合わさることで形成される。架橋を達成する化学修飾または共役プロセスは、１つの官能基が他と反応して結合の形成をもたらすことを含む。反応性または選択的反応性の官能基を有する生体共役（bioconjugate）試薬の作成により、単純かつ再現性のある架橋分子またはタグ付け分子または標的分子の基礎が形成される("Bioconjugate Techniques," Greg T. Hermanson, Academic Press, San Diego, CA, (1996))。
【０１６３】
架橋剤として、ホモ二機能性（homobifunctional）リンカー、ヘテロ二機能性（heterobifunctional）リンカー、およびゼロ長架橋剤が挙げられるが、これらに限定されない。ホモ二機能性リンカーは、同じ機能性の反応部位を２つ持つリンカー（グルタルアルデヒドなど）である。これらの試薬は、１つのタンパク質を別のものと、両分子の同じ共通する基で共有結合的に反応することによりつなぎあわせ得る。ヘテロ二機能性共役試薬は、タンパク質および他の巨大分子の２つの異なる機能性標的とカップリングし得る２つの異なる反応基を含む。例えば、架橋剤の一カ所は、アミン反応基を含み得、一方別の箇所はスルフヒドリル反応基からなる。結果として、標的分子の選択された部分での架橋反応を指示することが可能になり、したがって共役プロセスにわたりより良い制御を獲得する。ゼロ長架橋剤は、さらなる原子を含まない結合を形成することにより、２つの分子の共役を媒介する。したがって、分子の１つの原子は、介在するリンカーまたはスペーサーなしに、第二の分子の原子と共有結合する。当業者には「生体共役法」（Greg T. Hermanson,
Academic Press, San Diego, CA, (1996),架橋剤の詳細な記載に関する）と呼ぶ人もいる。
【０１６４】
本発明において、架橋剤は、バイオディスクの表面に結合して標的帯内の捕獲剤を固定する。好適な架橋系は、ビオチン−ストレプトアビジンからなるヘテロ二官能基、すなわちアビジンとカップリングした基体に結合したビオチン標識捕獲剤である。図１８Ａは、ストレプトアビジン１８２の絵図である。制限なしに、ストレプトアビジンは、アビジン、ストレプトアビジン、およびそれらの修飾物を含む。示されるとおり、タンパク質は４つのサブユニットを含み、そのそれぞれが１つのビオチン結合部位を含む（Hermanson）
。ストレプトアビジン１８２は、様々な化学種により、プラスチック（ポリスチレンなど）とカップリングし得る。理想的には、ストレプトアビジン１８２はバイオディスクの活性層１４４（図４および図９）に付けられて、基本的に不可逆的にビオチン標識化検出エレメント（例えば抗体）と結合する。
【０１６５】
図１８Ｂは、ビオチン１８４の絵図である。ビオチン（またはビタミンＨ）は、どの細胞にも少量存在する、天然の成長因子である。ビオチンの、タンパク質、すなわちアビジンおよびストレプトアビジンとの相互作用は、既知のものでも最も強力な非共有性親和性のうちに入る。ビオチン分子１８４は、その吉草酸側鎖を介してタンパク質と直接結合し得るか、または他の有機成分で誘導されてスペーサーアームおよび様々な反応基を作り出し得る。アミン、カルボン酸エステル、スルフヒドリル、および糖基が、ビオチン誘導体の適切な選択を通じたビオチン標識に、特に標的となり得る（Hermanson）。図１８Ｃは、ストレプトアビジン１８２と相互作用したビオチン１８４からなる架橋系の絵図である。
【０１６６】
本発明の実施形態の実施態様は、本明細書中に記載されるアッセイを実行するために捕獲剤を利用する。捕獲剤は、分析物を検出するための任意の巨大分子を示すことが理解されるはずである。本発明の捕獲剤は、目的の分析物に対して、優先的選択性の、または選択的結合親和性を有する巨大分子を含む。捕獲剤として、合成または生体産生された核酸および合成または生体産生されたタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明により用いられ得る捕獲剤の例として、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応法生成物、またはこれらのヌクレオチドの組合せ（キメラ）、抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、細胞膜受容体、および特定抗原決定因子と反応性の抗血清（ウイルス、細胞、または他の材料上のものなど）、薬物、ペプチド、補助因子、レクチン、多糖類、細胞、細胞膜、および細胞小器官が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の捕獲剤は、抗体である。
【０１６７】
抗体として、ポリクローナル、モノクローナル、および組換えで作り出された抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生され得る。抗体の産生法は、当業者に既知である。例えば、「Antibody Production: Essential Techniques」Peter Delves (編)、 John Wiley & Son Ltd, ISBN : 0471970107 (1997)を参照のこと。これは本明細書中にその全体が参照として援用される。あるいは、抗体は、市販品（例えば、Research Diagnostics Inc., Pleasant Hill Road, Flanders, NJ 07836）から入手してもよい。本発明の抗体は、任意の１つの特定種の抗体に限定されることを意味しない。例えば、ヒト、マウス、ラット、およびヤギの抗体は、全て本発明により考慮される。好ましくは、本発明の一次抗体は、マウスで産生された抗ヒト抗体であり、そして本発明の二次抗体はヤギで産生された抗マウス抗体である。
【０１６８】
用語「抗体」はまた、任意のまたは全ての抗体型が細胞表面抗原に結合するのに使用され得るとして、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を包含する。医薬診断の分野での抗体使用は、当業者に既知である。例えば、「Diagnostic And Therapeutic Antibodies (Methods in Molecular Medicine)」、 Andrew J. T. George and Catherine E. Urch (編)、 Humana Press; ISBN : 0896037983 (2000) 、および「Antibodies in Diagnosis and Therapy: Technologies, Mechanisms and Clinical Data (Studies in Chemistry Series)」、 Siegfried Matzku and Rolf A. Stahel (編)、 Harwood Academic Pub.; ISBN : 9057023105 (1999)を参照のこと。これらは本明細書中に参照として援用される。
【０１６９】
本発明の少なくとも複数の実施形態において、目的の分析物を検出するために複数の捕獲剤が使用される。図１８Ｄは、二次捕獲剤１８６として本発明の方法で使用されるＩｇ
Ｇクラスの抗体の絵図である。本発明の二次捕獲剤は、別の捕獲剤（これは目的の分析物に親和性を有する）に親和性を有する薬剤を含むが、これらに限定されないことが理解されるはずである。図１８Ｅは、二次捕獲剤、ビオチン分子１８４に結合したＩｇＧ１８６（以下、ビオチン標識ＩｇＧとして示す）を示す。
【０１７０】
図１８Ｆは、一次捕獲剤１８８の絵図である。本発明の一次捕獲剤１８８は目的の分析物に選択的親和性を有することが理解されるはずである。好ましくは、一次捕獲剤は、白血球に親和性を有する抗体である。より詳細には、これらの抗体は、リンパ球（ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、好酸球（ＣＤ１５）、および他の目的の細胞表面マーカーに対するものである。図１８Ｇは、ビオチン分子１８４に結合した一次捕獲剤１８８を示す。ＣＤ４およびＣＤ８に加えて、その他多くの細胞表面抗原に対する抗体があり（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ５６）、これらは、リンパ球のサブタイプを同定するために使用され得る。
【０１７１】
図１８Ｈは、ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０の絵図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（貪食マクロファージおよび樹状細胞など）により発現される特異的抗原に結合して、他の免疫系細胞をこの領域へ引き寄せるリンホカインを放出する。その結果が、炎症ならびに細胞および分子の蓄積であり、これが抗原性材料を囲い込んで破壊しようと試みる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞表面全体にわたり多数の抗原１９２を有することが理解されるはずである。しかしながら、図１８Ｈは、例示の目的のみのため、４つの抗原１９２を有するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０を示す。
【０１７２】
図１８Ｉは、ＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の絵図である。これらのＴ細胞は、それらが結合した細胞を破壊する分子を分泌する。このことは、ウイルス感染と闘うのに重要である。なぜならＣＤ８＋Ｔ細胞は、他の細胞に感染可能なウイルスの新鮮な塊を感染細胞が放出することができる前に、それらを破壊するからである。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、細胞表面全体にわたり多数の抗原１９６を有することが理解されるはずである。しかしながら、図１８Ｉは、例示の目的のみのため、４つの抗原１９６を有するＣＤ８＋Ｔ細胞１９４を示す。
【０１７３】
図１８Ｊは、アルデヒド活性化デキストラン（ＤＣＨＯ）１９８の三次元マトリクスに結合し、それによりＤＣＨＯ−抗体複合体１９９を形成する、二次抗体１８６を示す絵図である。デキストランは、主に直鎖の多糖類で、グリコシド結合により互いに連結したＤ−グルコースの繰り返し単位からなる。架橋剤として広く使用され、デキストランは基本的に多価であり、これにより、分子がポリマー鎖に沿って多数の部位で結合することを可能にしている（Hermanson)。例示の目的のみのため、デキストラン１９８に結合した抗体１８６は、図１８Ｋに示されるとおりに描写されるだろう。
【０１７４】
本発明の細胞アッセイに関連する態様はまた、以下の：米国仮出願第６０／３０８，１７６号、表題「Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」（２００１年７月２７日出願）、米国仮出願第６０／３１２，２４８号、表題「Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」（２００１年８月１５日出願）、米国仮出願第６０／３１３，５１４号、表題「Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc Including Same」（２００１年８月２０日出願）、米国仮出願第６０／３１３，７１５号、表題「RBC Lysis Protocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」（２００１年８月２０日出願）、米国仮出願第６０／３１３，５３６号、表題「RBC Sieving Protocol Evaluations of Helper
/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc」（２００１年８月２０日出願）、および米国仮出願第６０／３１５，９３７号、表題「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」（２００１年８月３０日出願）に開示され、これらは全て本明細書中に参照として援用される。
【０１７５】
実施Ｉ
図１９Ａ〜図１９Ｄは、本発明の第１の実施態様の分析物捕獲の絵図である。図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のビオチン標識化一次抗体（図１８Ｇ）による捕獲を示す。抗体１８８は、架橋剤ストレプトアビジン１８２によりバイオディスク１１０の活性層１４４（図４および図９）に固定されている。図１９Ｃおよび図１９Ｄは、本発明の同じ実施態様の、架橋系がない別の実施形態を示す。この実施形態において、一次抗体１８８は、バイオディスク１１０の活性層１４４に直接固定されている。
【０１７６】
図２０Ａ〜図２０Ｉは、本発明の第１の実施態様の実施形態の構成を示す断面図である。第１の実施形態は、バイオディスクのフローチャンネル内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用する反射型ディスクの構成を示す。図２０Ａを参照して、光バイオディスク１１０の、光透過性基体１２０、反射層１４２、および活性層１４４が示される。反射層１４２の一部が除去されて（または堆積する時に開口部が作られる）表示窓２００を形成し、ここを通じて光が、抗体が加えられる（affixed）予定の捕獲帯１４０の場所へ向けられ得る。図２０Ａは、５つのそのような捕獲帯１４０を示し、そのうちの最初のものが捕獲帯１４１として示されている。活性層１４４は、好ましくはポリスチレンであり、これは反射層１４２を覆ってスピンコーティングされているか、または当該技術分野で既知の方法により堆積されて、約４０〜３００ミクロンの厚さの滑らかな表面を形成する。次いで、ストレプトアビジン１８２が、各捕獲帯１４０および１４１を覆って堆積し、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされる（図２０Ｂ）。ディスク１１０は洗浄されて未結合のストレプトアビジン１８２が除去され、次いでスピン乾燥されてディスク１１０の表面から水分が完全に除去される（図２０Ｃ）。参照マークまたは較正点２０２は、第一捕獲帯１４１を覆って堆積し、ビオチン標識化一次抗体１８８は、各連続捕獲帯１４０を覆って堆積する（図２０Ｄおよび図２０Ｅ）。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされる。未結合抗体１８８がＰＢＳで洗浄されて除去され、そしてディスク１１０はスピン乾燥されて表面の水分が除去される（図２０Ｆ）。接着部材１１８が、活性層１４４に接着される（図２０Ｇ）。キャップ部分１１６（図２）は、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図４に最良に示されるように、その底部が反射表面１４６でコーティングされる。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それによりディスク内にフローチャンネル１３０を形成する（図２０Ｇ）。遮断剤２０４（スタビルガード（Stabil Guard）（登録商標）など）が各フローチャンネル１３０に注入され、迅速かつ有効に、活性層１４４の、どのような残存する非特異的結合部位も遮断する（図２０Ｈ）。ディスク１１０は、好ましくは３０分のあらかじめ定められた時間加湿チャンバ中で室温でインキュベートされ、全ての残存する溶液が真空で完全に除去される（図２０Ｉ）。
【０１７７】
本発明の第１の実施態様の第２の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用しない反射型ディスク１１０の構成に関する。この実施形態において、参照マークまたは較正点２０２は、第一窓１４１を覆って堆積し、非ビオチン標識化一次抗体１８８（図１８Ｆ）は、各連続捕獲帯１４０を覆って、活性層１４４（図２０Ａ）上に直接堆積する（図２０Ｄおよび図２０Ｅ）。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で好ましくは３０分間室温でインキュベートされる（図２０Ｅ）。未結合抗体１８８がＰＢＳで洗浄されて除去され、ディスク１１０はスピン
乾燥されて表面の水分が除去される（図２０Ｆ）。接着部材１１８が、活性層１４４に付けられる。キャップ部分１１６（図２）は、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図４に最良に示されるように、その底部が反射表面１４６でコーティングされる。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それによりディスク内にフローチャンネル１３０を形成する（図２０Ｇ）。遮断剤２０４（スタビルガード（登録商標）など）が各フローチャンネル１３０に注入され、迅速かつ有効に、活性層１４４の、どのような残存する非特異的結合部位も遮断する（図２０Ｈ）。ディスクは、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされ、どのような残存する溶液も真空で完全に除去される（図２０Ｉ）。図２１は、完成した、架橋系を利用しない反射バイオディスク１１０の断面図を示す。
【０１７８】
本発明の第１の実施態様の第３の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用する透過型ディスク１１０の構成を含む。この実施形態において、図５に示されるように、基体１２０、表示窓２００（図２０Ａ）のない半反射層１４３、および活性層１４４が存在する。ストレプトアビジン１８２、ビオチン標識化一次抗体１８８、参照点２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上記で記載されるとおりであり、図２０Ｂ〜図２０Ｈに示されるとおりである。それぞれの接着部材１１８が活性層１４４に接着される。光学的に透明なキャップ部分１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成され得る。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それによりディスク１１０内にフローチャンネル１３０を形成する（図２０Ｇ）。図２２は、完成した、架橋系を利用する透過型バイオディスク１１０の断面図を示す。第１の実施態様の第４の実施形態が当業者により構築され得ることが理解されるはずである。第４の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル内に捕獲剤を固定するのに架橋系を使用しない透過型ディスク１１０の構成を含む（図２１および図２２）。
【０１７９】
実施ＩＩ
図２３Ａ〜図２３Ｄは、本発明の第２の実施態様の分析物捕獲の絵図である。図２３Ａおよび図２３Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のビオチン標識化一次抗体１８８（図１８Ｆ）による捕獲を示す。一次抗体１８８は、架橋剤ストレプトアビジン１８２によりバイオディスク１１０の活性層１４４（図４および図９）に固定されたビオチン標識化二次抗体１８６（図１８Ｅ）に結合する。図２３Ｃおよび図２３Ｄは、本発明の同じ実施態様の、架橋系がない別の実施形態を示す。この実施形態において、二次抗体１８６は、バイオディスク１１０の活性層１４４に直接固定されている。
【０１８０】
図２４Ａ〜図２４Ｌは、本発明の第２の実施態様の実施形態の構成を示す断面図である。第１の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用する反射型ディスクの構成を含む。図２４Ａを参照して、光バイオディスク１１０の、光透過性基体１２０、反射層１４２、および活性層１４４が示される。反射層１４２の一部が除去されて（または堆積する時に開口部が作られて）表示窓２００を形成し、ここを通じて光が、抗体が加えられる予定の捕獲帯１４０の場所へ向けられ得る。図２４Ａは、５つのそのような捕獲帯１４０を示し、そのうちの最初のものが捕獲帯１４１として示されている。活性層１４４は、好ましくはポリスチレンであり、これは反射層１４２を覆ってスピンコーティングされているか、約４０〜３００ミクロンの厚さの滑らかな表面を形成する。次いで、ストレプトアビジン１８２が、各捕獲帯１４０および１４１を覆って堆積し、ディスク１１０は、加湿チャンバ中でおよそ３０分間室温でインキュベートされる（図２４Ｂ）。ディスク１１０は洗浄されて未結合のストレプトアビジン１８２が除去され、次いでスピン乾燥されてディスク１１０の表面から水分が完全に除去される（図２４Ｃ）。参照マークまたは較正点２０２は、第一捕獲帯１４１を覆って堆積し、ビオチン標識化二次抗体１８６は、各連続捕獲帯１４０を覆って堆積する（図
２４Ｄおよび図２４Ｅ）。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中に好ましくは３０分間室温でインキュベートされる（図２４Ｅ）。未結合二次抗体１８６がＰＢＳで洗浄されて除去され、ディスク１１０はスピン乾燥されて表面の水分が除去される（図２４Ｆ）。次に一次抗体１８８（図１８Ｆ）は、各捕獲帯１４０を覆って堆積する（図２４Ｇ）。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中でおよそ３０分間室温でインキュベートされる（図２４Ｈ）。未結合一次抗体１８８がＰＢＳで洗浄されて除去され、ディスク１１０はスピン乾燥されて表面の水分が除去される（図２４Ｉ）。各々の接着部材１１８が、活性層１４４に接着される。キャップ部分１１６（図２）は、同様に、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図４に最良に示されるように、その底部が反射表面１４６でコーティングされる。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それによりディスク内にフローチャンネル１３０を形成する（図２４Ｊ）。遮断剤２０４（スタビルガード（登録商標）など）が各フローチャンネル１３０に注入され、迅速かつ有効に、活性層１４４の、どのような残存する非特異的結合部位も遮断する（図２４Ｋ）。ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされ、どのような残存する溶液も真空で完全に除去される（図２４Ｌ）。
【０１８１】
本発明の第２の実施態様の第２の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用しない反射型ディスク１１０の構成に関する。この実施形態では、参照マークまたは較正点２０２は、窓１４１を覆って堆積し、非ビオチン標識化二次抗体１８６（図１８Ｄ）は、各連続捕獲帯１４０を覆って活性層１４４（図２４Ａ）上に直接堆積する。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされる（図２４Ｅ）。未結合二次抗体１８６がＰＢＳで洗浄されて除去され、ディスク１１０はスピン乾燥されて表面の水分が除去される（図２４Ｆ）。次いで、一次抗体１８８（図１８Ｆ）は、各捕獲帯１４０を覆って堆積する（図２４Ｇ）。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされる（図２４Ｈ）。未結合一次抗体１８８がＰＢＳで洗浄されて除去され、ディスク１１０はスピン乾燥されて表面の水分が除去される（図２４Ｉ）。接着部材１１８が、活性層１４４に接着される。従来の実施形態と同様に、この実施形態のキャップ部分１１６は、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図４に最良に示されるように、その底部が反射表面１４６でコーティングされる。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それによりディスク内にフローチャンネル１３０を形成する（図２４Ｊ）。遮断剤２０４（スタビルガード（登録商標）など）が各フローチャンネル１３０に注入され、迅速かつ有効に、活性層１４４の、どのような残存する非特異的結合部位も遮断する（図２４Ｋ）。ディスクは、本実施形態において好ましくは３０分間加湿チャンバ中で室温でインキュベートされ、どのような残存する溶液も真空で完全に除去される（図２４Ｌ）。図２５は、完成した、架橋系を利用しない反射バイオディスク１１０の断面図を示す。
【０１８２】
本発明の第２の実施態様の第３の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用する透過型ディスク１１０の構成を含む。この実施形態において、図５に示されるように、基体１２０、表示窓２００（図２４Ａ）のない半反射層１４３、および活性層１４４が存在する。ストレプトアビジン１８２、ビオチン標識化二次抗体１８６、一次抗体１８８、参照点２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上記で記載されるとおりであり、図２４Ｂ〜図２４Ｋに示されるとおりである。接着部材１１８は、同様に活性層１４４に接着される。光学的に透明なキャップ部分１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成され得る。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それによりディスク１１０内にフローチャンネル１３０を形成する（図２４Ｊ）。図２６は、完成した、架橋系を利用する透過型バイオディスク１１０の断面図を示す。第２の実施態様の第４の実施形態が当業者により構築され得ることが理解されるはずである。第４の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル
内に捕獲剤を固定するのに架橋系を使用しない透過型ディスク１１０の構成を含む（図２１および図２２）。
【０１８３】
実施ＩＩＩ
図２７Ａ〜図２７Ｄは、本発明の第３の実施態様の分析物捕獲の絵図である。図２７Ａおよび図２７Ｂは、ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の一次抗体１８８（図１８Ｆ）による捕獲を示す。一次抗体１８８は、二次抗体１８６に結合され（図１８Ｄ）、これはＤＣＨＯ鎖に結合される。ＤＣＨＯは、バイオディスク１１０の活性層１４４（図４および図９）に固定されている。図２７Ｃおよび図２７Ｄは、本発明の同じ実施態様の、二次抗体１８６がない別の実施形態を示す。この実施形態において、一次抗体１８８は、ＤＣＨＯに直接結合され、これはバイオディスク１１０の活性層１４４に固定されている。
【０１８４】
図２８Ａは、抗体−ＤＣＨＯ複合体の調製を示す絵による流れ図であるが、一方図２８Ｂ〜図２８Ｊは、本発明の第３の実施態様の実施形態の構成を示す複数の図である。この第３の実施態様の第１の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋剤ＤＣＨＯを利用する反射型ディスクの構成を含む。図２８Ａは、ＤＣＨＯ−抗体複合体１９９の調製を示す。等濃度のＤＣＨＯ１９８と二次抗体１８６とを混合して組合せ、それによりＤＣＨＯ−抗体（二次）複合体１９９を形成する。図２８Ｂを参照して、光バイオディスク１１０の、光透過性基体１２０、反射層１４２、および活性層１４４が示される。反射層１４２の一部が除去されて（または堆積する時に開口部が作られる）表示窓２００を形成し、ここを通じて光が、抗体が加えられる予定の捕獲帯１４０の場所へ向けられ得る。図２８Ｂは、５つのそのような捕獲帯１４０を示し、そのうちの最初のものが捕獲帯１４１として示されている。活性層１４４は、好ましくはポリスチレンであり、これは反射層１４２を覆ってスピンコーティングされて、約４０〜３００ミクロンの厚さの滑らかな表面を形成する。この特定の実施形態において、次いで、ＤＣＨＯ−抗体複合体（二次）１９９が、各捕獲帯１４０を覆って堆積し、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされる（図２８Ｃ）。ディスク１１０は洗浄されて未結合のＤＣＨＯ−抗体複合体（二次）１９９が除去され、次いでスピン乾燥されてディスク１１０の表面から水分が完全に除去される（図２８Ｄ）。参照点２０２は第一捕獲帯１４１を覆って堆積し、一次抗体１８８は、各連続捕獲帯１４０を覆って堆積する（図２８Ｅ）。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされる（図２８Ｆ）。未結合一次抗体１８８がＰＢＳで洗浄されて除去され、ディスク１１０はスピン乾燥されて表面の水分が除去される（図２８Ｇ）。接着部材またはチャンネル層１１８が、活性層１４４に付けられる。上記実施形態と同様に、キャップ部分１１６（図２に概して示される）は、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図４に最良に示されるように、その底部が反射表面１４６でコーティングされる。本実施形態において、図２８Ｈに示されるように、キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して付けられ、それによりディスク内にフローチャンネル１３０を形成する。遮断剤２０４（スタビルガード（登録商標）など）が各フローチャンネル１３０に注入され、迅速かつ有効に、活性層１４４の、どのような残存する非特異的結合部位も遮断する。この工程は図２８Ｉに示される。ディスク１１０は、この実施形態において、図２８Ｊに表されるように、約３０分間加湿チャンバ中で室温でインキュベートされ、どのような残存する溶液も真空で完全に除去される。
【０１８５】
本発明の製造態様に従って、図２８Ａ〜図２８Ｊはまた、クラスター標識計数を実行する光アッセイディスクの作製法を示す。この光アッセイディスクの作製法は、架橋剤を管に用意する工程、捕獲剤を管に加える工程、架橋剤と捕獲剤とを組合せる（複合体を形成する）工程、基体を用意する工程、基体を活性層でコーティングする工程、複合体を活性層上に堆積させる工程、そして接着部材を使用してキャップ部分を活性層に接着させる工
程を含む。この実施形態において、架橋剤は、アルデヒド活性化デキストランである。捕獲剤は、細胞表面抗原と結合するためのものである。代替的な実施形態において、捕獲剤は、細胞表面抗原に選択的親和性を有する一次捕獲剤と結合するためのものである。好適な実施形態において、細胞表面抗原は、独立して抗原のＣＤファミリーから選択される。さらに好適な実施形態において、細胞表面抗原は、独立して、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５からなる群より選択される。
【０１８６】
本発明の第３の実施態様の第２の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に一次捕獲剤を固定するために二次抗体を使用しない反射型ディスク１１０の構成を含む。この実施形態において、等濃度のＤＣＨＯ１９８と一次抗体１８８とが混合されて組合され、それにより図２８Ａに表されるＤＣＨＯ−抗体（一次）複合体１９９を形成する。参照または較正点２０２は、第一窓１４１を覆って堆積し、ＤＣＨＯ−抗体（一次）複合体１９９は、各連続捕獲帯１４０を覆って活性層１４４上に堆積する（図２８Ｃ）。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で好ましくは３０分間室温でインキュベートされ、未結合ＤＣＨＯ−抗体１８８（一次）複合体１９９がＰＢＳで洗浄されて除去される。ディスク１１０は、図２８Ｄに図示されるように、スピン乾燥されて表面の水分が除去される。接着部材またはチャンネル層１１８が、同様に活性層１４４に付けられる。キャップ部分１１６は、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図４に最良に示されるように、その底部が反射表面１４６でコーティングされる。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それにより、図２８Ｈに示されるように、ディスク内にフローチャンネル１３０を形成する。遮断剤２０４（スタビルガード（登録商標）など）が各フローチャンネル１３０に注入され、迅速かつ有効に、活性層１４４の、全ての残存する非特異的結合部位を遮断する（図２８Ｉ）。ディスクは、図２８Ｊに示されるように、約３０分間加湿チャンバ中で室温でインキュベートされ、どのような残存する溶液も真空で完全に除去される。図２９は、完成した、二次抗体を使用しない反射型バイオディスク１１０の断面図を示す。
【０１８７】
本発明の第３の実施態様の第３の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋剤ＤＣＨＯを利用する透過型ディスク１１０の構成を含む。この実施形態において、図５に示されるように、基体１２０、表示窓２００（図２８Ｂ）のない半反射層１４３、および活性層１４４が存在する。ＤＣＨＯ−抗体（二次）複合体１９９、一次抗体１８８、参照マークまたは点２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上記で記載されるとおりであり、図２８Ｃ〜図２８Ｉに示されるとおりである。接着部材またはチャンネル層１１８が活性層１４４に接着される。光学的に透明なキャップ部分１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成され得る。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それによりディスク１１０内にフローチャンネル１３０を形成する。図３０は、完成した、ＤＣＨＯ−抗体（二次）複合体１９９および一次抗体１８８を利用する透過型バイオディスク１１０の断面図を示す。第３の実施態様の第４の実施形態が当業者により構築され得ることが理解されるはずである。第４の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル内に一次捕獲剤を固定するのに二次抗体を使用しない透過型ディスク１１０の構成を含む（図２９および図３０）。他の実施形態は、バイオディスク１１０の活性層１４４に一次抗体または二次抗体を固定するためのストレプトアビジン１８２（図１８Ａ）およびビオチン１８４（図１８Ｂ）の使用を含む。固定された抗体（一次および二次の両方）は、その後、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内の捕獲剤の濃度増加のため、ＤＣＨＯ１９８と複合化し得る。
【０１８８】
実施ＩＶ
図３１Ａは、光バイオディスク１１０の平面図であり、それぞれ特異的細胞表面マーカーおよびネガティブコントロール帯用の複数の捕獲帯１４０を有する４つの流体回路１２８を示す。図示されるように、各流体回路は、具体的にはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およ
びＣＤ４５のための専用の捕獲帯１４０を有する。任意の他の所望の細胞表面抗原パターンまたは組合せ（例えば、他のＣＤマーカーまたは細胞表面マーカーなど）を用いてもよい。この特定の実施態様において、それぞれ別個の流体回路は、捕獲帯１４０のそれぞれに一種類だけの共通する捕獲剤を有することが必要である。図３１Ａに示されるディスクは、以下の図３１Ｂ〜図３１Ｅ、図４４Ａ〜図４４Ｄ、図４５、および図４６に記載される細胞捕獲化学種および方法で使用するのに、特に適している。図３１Ａに表示されるバイオディスク１１０は、反射型ディスクまたは透過型ディスクのいずれでもよい。
【０１８９】
ここで図３１Ｂ〜図３１Ｅに移って、本発明の第４の実施態様での分析物捕獲の絵図が示される。図３１Ｂおよび図３１Ｃは、あらかじめ一次抗体１８８（図１８Ｆ）と組合わさって一次抗体−細胞複合体を形成したＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４の、二次抗体１８６による捕獲を示す。一次抗体１８８は、バイオディスク１１０の活性層１４４（図４および図９）に、架橋剤ストレプトアビジン１８２により固定されたビオチン標識化二次抗体１８６（図１８Ｅ）に結合する。図３１Ｄおよび図３１Ｅは、本発明の同じ実施態様の、架橋系のない別の実施形態を示す。この実施形態において、二次抗体１８６は、バイオディスク１１０の活性層１４４に直接固定されている。
【０１９０】
図３２Ａ〜図３２Ｉは、本発明の第４の実施態様の実施形態の構成を示す断面図である。第１の実施形態は、バイオディスクのフローチャンネル内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用する反射型ディスクの構成を示す。図３２Ａを参照して、光バイオディスク１１０の、光透過性基体１２０、反射層１４２、および活性層１４４が示される。反射層１４２の一部が除去されて（または堆積する時に開口部が作られる）表示窓２００を形成し、ここを通じて光が、抗体が加えられる予定の捕獲帯１４０の場所へ向けられ得る。図３２Ａは、５つのそのような捕獲帯１４０を示し、そのうちの最初のものが捕獲帯１４１として示されている。活性層１４４は、好ましくはポリスチレンであり、これは反射層１４２を覆ってスピンコーティングされて、約４０〜３００ミクロンの厚さの滑らかな表面を形成する。次いで、図３２Ｂに表示されるように、ストレプトアビジン１８２が、各捕獲帯１４０および１４１を覆って堆積し、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされる。図３２Ｃに示されるように、ディスク１１０は洗浄されて未結合のストレプトアビジン１８２が除去され、次いでスピン乾燥されてディスク１１０の表面から水分が完全に除去される。図３２Ｄおよび図３２Ｅに示されるように、参照マークまたは較正点２０２は、第一捕獲帯１４１を覆って堆積し、ビオチン標識化二次抗体１８６は、各連続捕獲帯１４０を覆って堆積する。この実施形態では、次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で約３０分間室温でインキュベートされる。この工程は、図３２Ｅに図示される。未結合二次抗体１８６がＰＢＳで洗浄されて除去され、ディスク１１０はスピン乾燥されて表面の水分が除去される。本方法のこの工程は、図３２Ｆに表示される。接着部材またはチャンネル層１１８が、同様に活性層１４４に付着される。それぞれのキャップ部分１１６は、好ましくはポリカーボネートから形成され、図４に最良に示されるように、その底部が反射表面１４６でコーティングされる。図３２Ｇに示されるように、キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して付着され、それによりディスク内にフローチャンネル１３０を形成する。遮断剤２０４（スタビルガード（登録商標）など）が各フローチャンネル１３０に注入され、迅速かつ有効に、活性層１４４の、どのような残存する非特異的結合部位も遮断する。この工程は、図３２Ｈに示される。図３２Ｉに表示されるように、ディスク１１０は、好ましくは３０分間加湿チャンバ中で室温でインキュベートされ、どのような残存する溶液も真空で完全に除去される。
【０１９１】
本発明の第４の実施態様の第２の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用しない反射型ディスク１１０の構成を含む。本実施形態において、参照マークまたは較正点２０２は、第一窓１４１を覆って堆積し、非ビオチン標識化二次抗体１８６は、図１８Ｄに概して示されるように、各連続捕
獲帯１４０を覆って、活性層１４４上に直接堆積する。次いで、ディスク１１０は、加湿チャンバ中で３０分間室温でインキュベートされる。未結合二次抗体１８６がＰＢＳで洗浄されて除去され、ディスク１１０はスピン乾燥されて表面の水分が除去される。接着部材１１８が、活性層１４４に接着される。キャップ部分１１６は、ポリカーボネートから形成されてもよく、好ましくは、図４に最良に示されるように、その底部が反射表面１４６でコーティングされる。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、ディスク内にフローチャンネル１３０を形成する。遮断剤２０４（スタビルガード（登録商標）など）が各フローチャンネル１３０に注入され、迅速かつ有効に、活性層１４４の、どのような残存する非特異的結合部位も遮断する。ディスクは、およそ３０分間加湿チャンバ中で室温でインキュベートされ、どのような残存する溶液も真空で完全に除去される。図３３は、完成した、架橋系を利用しない反射バイオディスク１１０の断面図を示す。
【０１９２】
本発明の第４の実施態様の第３の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０内に捕獲剤を固定するために架橋系を利用する透過型ディスク１１０の構成を含む。この実施形態において、図５に示されるように、基体１２０、表示窓２００（図３２Ａ）のない半反射層１４３、および活性層１４４が存在する。ストレプトアビジン１８２、ビオチン標識化一次抗体１８８、参照点２０２、および遮断剤２０４の堆積は、上記で記載され、図３２ｂ〜図３２Ｈで示されるとおりである。接着部材１１８が活性層１４４に付けられる。光学的に透明なキャップ部分１１６（図５）は、ポリカーボネートから形成され得る。キャップ部分１１６は、接着部材１１８に一体化して接着され、それによりディスク１１０内にフローチャンネル１３０を形成する（図３２Ｇ）。図３４は、完成した、架橋系を利用する透過型バイオディスク１１０の断面図を示す。第４の実施態様の第４の実施形態が当業者により構築され得ることが理解されるはずである。第４の実施形態は、バイオディスク１１０のフローチャンネル内に二次捕獲剤を固定するのに架橋系を使用しない透過型ディスク１１０の構成を含む（図３３および図３４）。
【０１９３】
クラスター標識計数−実施態様Ｉ
図３５Ａは、光バイオディスク１１０の平面図であり、それぞれ、４種の異なる特異的細胞表面マーカーおよびネガティブコントロール帯用の複数の捕獲帯１４０を有する４つの流体回路１２８を示す。図示されるように、各流体回路は、それぞれが具体的にはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ４５のための専用の４つの捕獲帯１４０を有する。任意の他の所望の細胞表面抗原パターンまたは組合せ（例えば、他のＣＤマーカーまたは細胞表面マーカーなど）を用いてもよい。この特定の実施態様において、それぞれ別個の流体回路は、捕獲帯１４０のそれぞれに一種類だけの共通する捕獲剤を有することが必要であるという制限はない。反対に、この実施態様では、異なる捕獲剤を持つ捕獲帯を有することが望ましい。これらの捕獲帯は、例えば、少なくとも２×２のマトリクスを有するアレイフォーマットで、配置され得る。図３５Ａに示されるディスクは、以下の図３５Ｂ〜図３５Ｄ、図３６、図３７、図３８Ａ〜図３８Ｃ、図３９、図４０、図４１Ａ〜図４１Ｃ、図４２、および図４３に記載される細胞捕獲化学種および方法で使用するのに、特に適している。図３５Ａに表示されるバイオディスク１１０は、反射型ディスクまたは透過型ディスクのいずれでもよい。
【０１９４】
次に図３５Ｂ〜図３５Ｄを参照して、本発明の第１の実施態様のバイオディスクを使用する、精製および洗浄したＭＮＣ試料（図１７Ａ）の分析が示される。図３５Ｂに表示されるように、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。図３５Ｃに示されるように、一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４のいずれかと接
触することになり、次いでこれらを捕獲する。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２０Ｉ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４と相互作用し（図３５Ｄ）、戻りビーム１５４が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ反射される。
【０１９５】
図３６は、本発明の第１の実施態様の第２の実施形態を使用する、図３５Ｂ〜図３５Ｄからの同一検査試料の分析を示す。バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる（図３５Ｂ）。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のいずれかと接触することになり、次いでこれらを捕獲する（図３５Ｃ）。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２０Ｉ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し（図３５Ｄ）、戻りビーム１５４が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ反射される。
【０１９６】
図３７は、本発明の第１の実施態様の第３の実施形態を使用する、図３５Ｂ〜図３５Ｄからの同一検査試料の分析を示す。バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる（図３５Ｂ）。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のいずれかと接触することになり、次いでこれを捕獲する（図３５Ｃ）。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２０Ｉ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し（図３５Ｄ）、透過ビーム１５６が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ通過される。
【０１９７】
クラスター標識計数−実施態様ＩＩ
次に図３８Ａ〜図３８Ｃを参照して、本発明の第２の実施態様のバイオディスクを使用する、精製および洗浄したＭＮＣ試料（図１７Ａ）の分析が示される。図３８Ａに表示されるように、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４のいずれかと接触することになり、次いでこれを捕獲する。この工程は図３８Ｂに示される。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２４Ｌ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４と相互作用し（図３８Ｃ）、戻りビーム１５４が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ反射される。
【０１９８】
図３９は、本発明の第２の実施態様の第２の実施形態を使用する、図３８Ａ〜図３８Ｃからの同一検査試料の分析を示す。バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる（図３８Ａ）。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のい
ずれかと接触することになり、次いでこれを捕獲する（図３８Ｂ）。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２４Ｌ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し（図３８Ｃ）、戻りビーム１５４が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ反射される。
【０１９９】
図４０は、本発明の第２の実施態様の第３の実施形態を使用する、図３８Ａ〜図３８Ｃからの同一検査試料の分析を示す。バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる（図３８Ａ）。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のいずれかと接触することになり、次いでこれを捕獲する（図３８Ｂ）。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２４Ｌ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し（図３８Ｃ）、透過ビーム１５６が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ通過される。
【０２００】
クラスター標識計数−実施態様ＩＩＩ
次に図４１Ａ〜図４１Ｃを参照して、本発明の第３の実施態様のバイオディスクを使用する、精製および洗浄したＭＮＣ試料（図１７Ａ）の分析が示される。図４１Ａに表示されるように、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４のいずれかと接触することになり、次いでこれを捕獲する。本方法のこの工程は図４１Ｂに示される。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２８Ｊ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋細胞１９０およびＣＤ８＋細胞１９４と相互作用し（図４１Ｃ）、戻りビーム１５４が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ反射される。
【０２０１】
図４２は、本発明の第３の実施態様の第２の実施形態を使用する、図４１Ａ〜図４１Ｃからの同一検査試料の分析を示す。バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる（図４１Ａ）。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のいずれかと接触することになり、次いでこれを捕獲する（図４１Ｂ）。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２８Ｊ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し（図４１Ｃ）、戻りビーム１５４が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ反射される。
【０２０２】
図４３は、本発明の第３の実施態様の第３の実施形態を使用する、図４１Ａ〜図４１Ｃからの同一検査試料の分析を示す。バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０をＭＮＣ試料で溢れさせる（図４１Ａ）。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、一次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体は、検査試料内に存在するＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４のい
ずれかと接触することになり、次いでこれを捕獲する（図４１Ｂ）。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図２８Ｊ）の未結合Ｔ細胞を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲されたＣＤ４＋Ｔ細胞１９０およびＣＤ８＋Ｔ細胞１９４と相互作用し（図４１Ｃ）、透過ビーム１５６が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ通過される。
【０２０３】
クラスター標識計数−実施態様ＩＶ
ここで図４４Ａ〜図４４Ｄを参照して、本発明の第４の実施態様のバイオディスクを使用する、精製および洗浄したＭＮＣ試料（図１７Ａ）の分析が示される。図４４Ａは、一次抗体−Ｔ細胞複合体の調製を示す、絵による流れ図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞１９０とＣＤ８＋Ｔ細胞１９４の両方を含むＭＮＣ懸濁液を一次抗体１８８と混合して結合させ、それにより一次抗体−Ｔ細胞複合体を形成する。当業者に明らかであるように、異なる表面マーカーを持つ他の細胞もまた、本実施態様を使用してタグ付けされ得る。図４４Ｂに示されるように、バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０を一次抗体−Ｔ細胞複合体で溢れさせる。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された二次抗体１８８との接触を達成させる。図４４Ｃに示されるように、一次抗体−Ｔ細胞複合体に親和性を有する二次抗体１８６が、複合体を捕獲する。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図３２Ｉ）の未結合複合体を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲された複合体と相互作用し（図４４Ｄ）、戻りビーム１５４が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ反射される。
【０２０４】
図４４Ａ〜図４４Ｄはまた、本発明の方法の別の主要な態様を示す。図１７Ａと関連して、クラスター標識計数を実行する別の方法が提供される。この方法は、以下の：（１）分離勾配を含有する管に血液試料を提供する工程、（２）血液試料を層に分離するのに十分な時間および速度で、管を回転させる工程、（３）Ｔ細胞含有ＭＮＣ層を再懸濁させる工程であって、それによりＭＮＣ懸濁液を形成する、再懸濁させる工程、（４）一次抗体をＭＮＣ懸濁液に添加する工程であって、それにより一次抗体−Ｔ細胞複合体を形成させる、添加する工程、（５）一次抗体−Ｔ細胞複合体を、少なくとも一種の捕獲剤を含有する少なくとも１つの捕獲帯を含むディスク表面に提供する工程、（６）ディスクを光学式読み取り機にロードする工程、（７）電磁放射の入射ビームを捕獲帯に向ける工程、（８）ディスクと捕獲帯で相互作用した後に形成された電磁放射ビームを検出する工程、（９）検出されたビームを出力信号へ変換する工程、および（１０）出力信号を分析する工程であって、それにより捕獲帯に捕獲された細胞数に関する情報を抽出する、分析する工程を含む。この方法の一実施形態において、光ディスクは、捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が反射されるような反射層で構成される。この方法の別の実施形態において、光ディスクは、捕獲帯に向けられかつ細胞に当たらない光が光ディスクを透過するように構成される。
【０２０５】
図４５は、本発明の第４の実施態様の第２の実施形態を使用する、図４４Ａ〜図４４Ｄからの同一検査試料の分析を示す。バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０を一次抗体−Ｔ細胞複合体で溢れさせる（図４４Ｂ）。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された二次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体−Ｔ細胞複合体に親和性を有する二次抗体１８６が、複合体を捕獲する（図４４Ｃ）。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図３２Ｉ）の未結合複合体を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲された
複合体と相互作用し（図４４Ｄ）、戻りビーム１５４が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ反射される。
【０２０６】
図４６は、本発明の第４の実施態様の第３の実施形態を使用する、図４４Ａ〜図４４Ｄからの同一検査試料の分析を示す。バイオディスク１１０のフローチャンネル１３０を一次抗体−Ｔ細胞複合体で溢れさせる（図４４Ｂ）。毛管作用、外部アプリケーターでかけられる圧力、および／または遠心力（すなわち、回転の中心または屈曲または軸から外へ向かう曲線運動で本体にかかる力）が検査試料に作用して、バイオディスク１１０の活性層１４４に固定された二次抗体１８８との接触を達成させる。一次抗体−Ｔ細胞複合体に親和性を有する二次抗体１８６が、複合体を捕獲する（図４４Ｃ）。光学ドライブモーター１６２（図１０）はディスクを回転させ、これが捕獲帯１４０（図３２Ｉ）の未結合複合体を一掃する。光ディスクドライブ１１２（図１）の入射ビーム１５２は、捕獲された複合体と相互作用し（図４４Ｄ）、透過ビーム１５６が、処理および分析用検出器１５７（図１０）へ通過される。
【０２０７】
当業者は、これらの教示に照らし合わせて、本発明の方法の１つまたは複数の実施態様の１つまたは複数の実施形態が本発明の範囲および精神から逸脱することなく組合わされ得ることを、理解するだろう。
【０２０８】
細胞検出および関連するソフトウェア
ここで図４７を参照して、試料保持用流体回路１２８を含む光バイオディスク１１０が示される。図４７はまた、異なる捕獲帯または標的帯１４０ならびに参照マークまたは較正点２０２を含む標的帯１４１を図示するために拡大された流体回路４７を示す。この特定の実施形態において、５つの捕獲帯１４０が用いられ、それぞれが、各自ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、およびネガティブコントロールとしてミオグロビンを捕獲するように実施される。
【０２０９】
図４８Ａは、６つの捕獲帯１４０を含む異なる実施形態で得られた画像であり、捕獲帯はそれぞれ、各自ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ１５＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞を捕獲するように、およびＣＤ１５＋細胞用第二捕獲帯、およびＣＤ４５＋細胞用第二捕獲帯として実施される。この実施形態において、２つのＣＤ４５捕獲帯およびＣＤ１５捕獲帯は、捕獲効率と予想される計数結果が一致していることを検証するために検証用対照またはチェックとして使用され得る。図４８Ａはまた、ＣＤ４、ＣＤ８、および対照の一連の細胞表面抗原を拡大図で示す。本明細書で示されるとおり、画像は、バックグラウンドフィールドに対して示される細胞数のものである。図４８Ｂは、対照、ＣＤ４、およびＣＤ８捕獲帯の接近図を表示し、実際の顕微鏡画像からのものを本発明によるバイオディスク由来画像と比較している。図４９は、実際の顕微鏡画像と、対応する本発明によるバイオディスク由来画像との別の比較をより詳細に図示する。図４８Ｂおよび図４９に表示されるとおり、本発明者らは、バイオディスク画像が、顕微鏡から得られ得るものと比較して同等な品質および分解能のものであることを見いだした。したがって、これらの画像は、本発明の装置および方法を使用して、個々の細胞がバックグラウンドに対し可視化され得ることを実証する。治験用特徴を検出する方法は、同一出願人による米国仮出願第６０／２７０，０９５号、および第６０／２９２，１０８号、表題「Signal Processing Apparatus and Methods for Obtaining Signal Signatures of Investigational Features Detected on a Surface of an Optical Bio-Disc Assembly」（それぞれ２００１年２月２日および２００１年５月１８日出願）に、および同一出願人による特許出願第１０／０４３，６８８号、表題「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」（２００２年１月１０日出願）に、より詳細に記載され、これらは全て本明細書中に参照として援用される。
【０２１０】
これらの細胞は、様々な異なる方法のうちの１つを通じて検出され得、例えば、透過光または反射光レベルの十分に大きな変化を検出および計数し、したがって遷移、よって細胞を計数する、縁検出ハードウェアまたはソフトウェアの使用を含む。別の方法は、以下により詳細に記載されるが、画像またはパターン認識ソフトウェアを使用して、バックグラウンドに対して細胞を同定する。画像認識は、ＲＢＣとＷＢＣを識別することができ、同じく好中球、単球、好塩基球、好酸球、顆粒球、およびリンパ球も識別することができる。
【０２１１】
約１．６ミクロンで離れたトラックを持つ光ディスクが、ディスクに細胞または会合体を画像化するために使用され得る。例えば、白血球は通常、少なくとも５〜多くて１２トラックの直径を有し、それゆえその白血球の画像を得ることができる。
【０２１２】
そのような画像を得るために、図２、図３、および図４に示される型の透過型ディスクが用いられ（反射型ディスクが操作可能であるが）、図１０に示される型のディスクドライブシステムがトリガーセンサー１６０および上部検出器１５８を含む。トリガー検出器１５８は、透過型ディスクのトリガーマーク１２６を検出してコンピューターに信号を提供し、マークが検出された時にデータが収集および／または処理されることになっている。光源が表示窓のトラックを横切って通ることで、受信透過光で画像が得られる。この場合上部検出器は、単一の検出器、あるいは半径および／または円周方向に並んだ複数の検出器エレメントの配列であり得る。そのような検出器および検出方法は、例えば、同一出願人による米国仮出願第６０／２４７，４６５号、表題「Optical Disc Drive For Bio-Optical Disc」（２０００年１１月９日出願）、米国仮出願第６０／２９３，０９３号、表題「Disc Drive Assembly For Optical Bio-Discs」（２００１年５月２２日出願）、および、米国仮出願第１０／００８，１５６号、表題「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-discs」（２００１年１１月９日出願）に記載され、これらはそれぞれ本明細書中にその全体が参照として援用される。
【０２１３】
図４８Ａ、図４８Ｂ、および図４９のような画像が得られた後、画像データは、所望の特徴を同定するように設計された画像認識ソフトウェアでさらに処理され得る。画像認識ソフトウェアは、細胞をバックグラウンドと識別する能力を有するだけでなく、１つの型の細胞を別のものと識別する能力を有することがさらに望ましい。
【０２１４】
ここで図５０を参照して、赤血球および白血球の両方を含む治験用データに由来する画像が示される。拡大図に示されるとおり、これら白血球および赤血球は、明らかに異なる特性を有し、したがってバックグラウンドに対して検出され得、かつまた画像認識で互いに識別され得る。また、リンパ球、単球、好中球、好酸球、顆粒球、および好塩基球を含む白血球の型を互いに識別することも可能である。
【０２１５】
図５１は、多数の細胞のある試料フィールドを示し、ここで＋記号は細胞として同定された各物体を示す。各帯または任意の数の所望の帯で細胞数が検出された後、結果として得られる細胞計数データは、図５２に示されるような見やすい表示を提供する一枚の画面に表示され得る。図５２に描写されるとおり、特定の細胞数が、細胞の相対数を表示する棒グラフとともに提供される。ＣＤ４／ＣＤ８分析の場合、システムはまた、ＣＤ４／ＣＤ８比、ならびに任意の他の所望の数学計算または比較を算出し得る。図５３は、プロセスの異なる表示を提供し、これはＣＤ４数、ＣＤ８数、および比率に変換された画像フィールドの細胞を、その比率が正常範囲にあることを示す出力と合わせて示す。
【０２１６】
細胞検出および伴う処理法に関連する本発明の態様も、同じく以下の：米国仮出願第６０／３１６，２７３号、表題「Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping」（２００１年８月３１日出願）、米国仮出願第６０／３１８，０２６
号、表題「Methods for Imaging Blood cells, Blood-Borne Parasites and Pathogens, and Other Biological Matter Including Related Optical Bio-Discs and Drive Assemblies」（２００１年９月７日出願）、米国仮出願第６０／３２２，５２７号、表題「Optical Analysis Discs Including Microfluidic Circuits for Performing Cell Counts」（２００１年９月１４日出願）、米国仮出願第６０／３２２，０４０号、表題「Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes」（２００１年９月１１日出願）、米国仮出願第６０／３２２，８６３号、表題「Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」（２００１年９月１２日出願）、および米国仮出願第６０／３２２，７９３号、表題「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin, Plasma, or Poly-Lysine」（２００１年９月１７日出願）に開示され、それらは全て本明細書中に参照として援用される。
【０２１７】
分画細胞計数法および関連するソフトウェア
光ディスクデータを使用する、白血球計数の多数の方法および関連アルゴリズムが、本明細書中でさらに詳細に記載される。これらの方法および関連アルゴリズムは、白血球の計数に限定されず、赤血球、白血球、ビーズ、および光学式読み取り機で検出され得る同様な光痕跡を発生する任意の他の物体（生体および非生体の両方）を含むが、これらに限定されない任意の型の細胞性物質の計数を行うのに容易に応用され得る。
【０２１８】
例示を目的として、本発明に関連する方法およびアルゴリズムの以下の説明は、図５４〜図５８を参照して記載されるとおり、白血球計数に関する。何か修飾することで、これらの方法およびアルゴリズムは、白血球と大きさが類似した他の型の細胞または物体を計数することに応用され得る。細胞計数法およびアルゴリズムのデータ評価態様は、本明細書中で一般的に記載されて、本発明の方法および装置に関連する背景を提供する。光バイオディスクから治験用データを獲得して処理する方法およびアルゴリズムは、一般的な広い応用性を有し、同一出願人による米国仮出願第６０／２９１，２３３号、表題「Variable Sampling Control For Rendering Pixelation of Analysis Results In Optical Bio-Disc Assembly And Apparatus Relating Thereto」（２００１年５月１６日出願）、（これは本明細書中に参照として援用される）、および上記の援用される米国仮出願第６０／４０４，９２１号、表題「Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatus And Software For Performing Same」に、より詳細に開示される。
【０２１９】
以下の論考において、方法およびアルゴリズムの基本スキームが、簡単な説明と合わせて表される。図１０に示されるとおり、生体検査試料の属性に関する情報は、検査試料との相互作用により修飾または調節された電磁放射ビームの形で、光バイオディスク１１０から読み出される。図２、図３、図４、図１１、図１３、および図１５に関連して論考された反射型光バイオディスクの場合、戻りビーム１５４が生物試料についての情報を伝える。上記で記載されるとおり、そのような生物試料についての情報は、基本的に、入射ビームがフローチャンネル１３０または標的帯１４０内にあり、したがって試料と接触する場合にかぎり、戻りビームに含まれる。バイオディスク１１０の反射型実施形態において、戻りビーム１５４はまた、反射層１４２中または上で符号化される、またはそうでなければ図１３および図１４に示されるｗｏｂｂｌｅ溝１７０で符号化される情報を伝え得る。当業者に明らかであるように、あらかじめ記録された情報は、対応する入射ビームが反射層１４２と接触する場合に限り、標的帯を持つ反射型ディスクの戻りビーム１５４に含まれる。そのような情報は、入射ビーム１５２が、情報保持反射層１４２が除去されてしまっているかそうでなければ存在しない領域にある場合、戻りビーム１５４に含まれない。図５、図６、図８、図９、図１２、図１４、および図１６に関連して論考された透過型光バイオディスクの場合、透過ビーム１５６が生物試料についての情報を伝える。
【０２２０】
続けて図１０を参照して、生体検査試料についての情報は、それが反射型ディスクの戻りビーム１５４から得られるのであっても、透過型ディスクの透過ビーム１５６から得られるのであっても、信号処理用プロセッサー１６６に向けられる。この処理は、下部検出器１５７（反射型ディスク）または上部検出器１５８（透過型ディスク）で検出されたアナログ信号を不連続のデジタル型へ変換することを含む。
【０２２１】
次に図５４を参照して、信号変換は、一定の時間間隔２１２でアナログ信号２１０をサンプリングし、信号の対応する瞬間アナログ振幅２１４を不連続の二進整数２１６として符号化することを含む。サンプリングは、ある開始時間２１８で開始されて、ある終了時間２２０で停止する。どのようなアナログからデジタルへの変換プロセスにも付随する２つの共通値は、サンプリング周波数およびビット深度である。サンプリング周波数（サンプリングレートとも呼ばれる）は、単位時間あたりに取られるサンプル数である。サンプリング周波数が高いほど、連続する試料間の時間間隔２１２は小さくなり、このことは最初のアナログ信号２１０と比較してデジタル信号２２２のより高い忠実性をもたらす。ビット深度は、アナログ信号２１０のサンプリングされた振幅２１４を符号化するために各サンプリング点で使用されるビット数である。ビット深度が大きくなるほど、二進整数２１６は最初のアナログ振幅２１４をより良く近似するようになる。本実施形態において、１試料あたり１２ビットのビット深度でサンプリングレートは８ＭＨｚであり、０〜４０９５（０〜（２ｎ−１）（ここでｎはビット深度である）の整数試料範囲を可能にする。この組合せは、他の実施形態で必要な特定の精度に対応するために変更され得る。制限ではなく例として、一般に細胞よりも小さいビーズを計数する方法を含む実施形態において、サンプリング周波数を増加させることが望ましいかもしれない。次いで、サンプリングされたデータは、アナログからデジタルへの変換用プロセッサー１６６に送られる。
【０２２２】
アナログからデジタルへの変換の間、レーザー径路に沿った、各連続したサンプル点２２４は、連続して、ディスク上またはメモリ中に、一次元配列（array）２２６として記憶される。各連続したトラックは、独立した一次元配列を与え、これが、画像に相似する二次元配列２２８（図５７Ａ）をもたらす。
【０２２３】
図５５は、本発明の光バイオディスク１１０の斜視図であり、示される切取り部分の拡大詳細斜視図は、光バイオディスクのトラック２３２に対して位置する捕獲された白血球２３０を示す。図示されるように、入射ビーム１５２の白血球２３０との相互作用は、反射型ディスクの戻りビーム１５４または透過型ディスクの透過ビーム１５６のいずれかの形で信号含有ビームをもたらし、これが、検出器１５７または１５８のいずれかで検出される。
【０２２４】
図５６Ａは、図５５に示される、光バイオディスク１１０のトラック２３２に対して位置する白血球２３０の別のグラフ表示である。図５５および図５６Ａに示されるように、白血球２３０は、約４つのトラックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを覆う。図５６Ｂは、図５５および図５６Ａの白血球２１０に由来する一連の微量痕跡を示す。図５６Ｂに示されるように、検出系は、トラックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤに対応する４つのアナログ信号Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを提供する。図５６Ｂにさらに示されるように、アナログ信号Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤのそれぞれは、白血球２３０についての特定の情報を運ぶ。したがって図示されるように、白血球２３０にまたがる走査は、入射ビームの明白な摂動をもたらし、これは検出および処理され得る。次いで、アナログ微量痕跡（信号）２１０は、図５７Ａおよび図５７Ｃに示されるように、相似するデジタル信号２２２への変換用プロセッサー１６６に向けられ、以下でさらに詳細に記載される。
【０２２５】
図５７は、図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃ、および図５７Ｄ間の関連を示すグラフ表示
である。図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃ、および図５７Ｄは、図５６Ｂの微量痕跡のデジタル信号２２２への変換の絵によるグラフ表示であり、デジタル信号２２２は、一次元配列２２６として記憶され、組合わされてデータ入力２４４のための二次元配列２２８になる。
【０２２６】
ここで特に図５７Ａを参照して、図５５および図５６Ａに示される光バイオディスクのトラックＡおよびトラックＢからサンプリングされたアナログ信号２１０が示される。次いで、プロセッサー１６６が、アナログ信号２１０の対応する瞬間アナログ振幅２１４を不連続の二進整数２１６に符号化する（図５４参照）。得られる一連のデータ点がデジタル信号２２２であり、これはサンプリングされたアナログ信号２１０と相似である。
【０２２７】
次に図５７Ｂを参照して、トラックＡおよびトラックＢからのデジタル信号２２２（図５７Ａ）は、独立した一次元メモリ配列２２６として記憶される。各連続したトラックは、対応する一次元配列を寄与し、これが先の一次元配列と組合わされると、画像に相似した二次元配列２２８をもたらす。次いで、デジタルデータは、試料範囲の特定の点での戻りビーム１５４または透過ビーム１５６（図５５）の相対強度を表すサンプル点２２４（図５４）の二次元配列２２８として、メモリ中またはディスク上に記憶される。ついで、二次元配列は、図５７Ｂに表示されるように、生ファイルまたは画像ファイル２４０の形で、メモリ中またはディスク上に記憶される。次いで、画像ファイル２４０に記憶されたデータは、メモリへ読み出され２４２、図１０に示される分析器１６８へのデータ入力２４４として使用される。
【０２２８】
図５７Ｃは、図５５および図５６Ａに示される光バイオディスクのトラックＣおよびトラックＤからサンプリングされたアナログ信号２１０を示す。次いで、プロセッサー１６６が、アナログ信号２１０の対応する瞬間アナログ振幅２１４を不連続の二進整数２１６に符号化する（図５４）。得られる一連のデータ点がデジタル信号２２２であり、これはサンプリングされたアナログ信号２１０と相似である。
【０２２９】
ここで図５７Ｄを参照して、トラックＣおよびトラックＤからのデジタル信号２２２は、独立した一次元メモリ配列２２６として記憶される。各連続したトラックは、対応する一次元配列を寄与し、これが先の一次元配列と組合わされると、画像に相似した二次元配列２２８をもたらす。上記のように、次いで、デジタルデータは、試料範囲の特定の点での戻りビーム１５４または透過ビーム１５６（図５５）の相対強度を表すサンプル点２２４（図５４）の二次元配列２２８として、メモリ中またはディスク上に記憶される。ついで、二次元配列は、図５７Ｂに表示されるように、生ファイルまたは画像ファイル２４０の形で、メモリ中またはディスク上に記憶される。上記で示されるように、次いで、画像ファイル２４０に記憶されたデータは、メモリへ読み出され２４２、分析器１６８（図１０）へのデータ入力２４４として使用される。
【０２３０】
本発明の計算および処理アルゴリズムは、分析器１６８（図１０）に記憶され、入力データ２４４に適用されて有用な出力結果２６２（図５８）を算出し、これはディスプレイモニター１１４（図１０）に表示され得る。ここで図５８を参照して、本発明の処理法および計算アルゴリズムによるデータ評価の主要な工程の論理流れ図が示される。本処理法の第１の主要な工程は、入力データ２４４の受取を含む。上記に記載されるとおり、データ評価は、０〜４０９６の範囲の整数の配列で開始される。
【０２３１】
次の主要な工程２４６は、計数のためディスクの範囲を選択することである。いったんこの範囲が規定されると、次いで目標は、規定された範囲に含まれる全白血球の実際の計数を行うことになる。工程２４６の実施態様は、ディスクおよび使用者の選択肢の構成に依存する。制限ではなく例として、図２および図５に示される標的帯１４０などの窓を持
つディスクを使用する本発明の実施形態で、ソフトウェアは窓を認識して、分析および計数のためその一区分を刈り込む。好適な一実施形態において、図２に図示されるもののように、標的帯または窓は、その各端に半円部分のある１×２ｍｍの長方形をしている。この実施形態において、ソフトウェアはそれぞれの窓の中の１×２ｍｍ範囲の基準長方形を刈り込む。この実施形態の態様において、読み取り機は、複数の異なる窓で、細胞数を比較するために、複数の連続した試料値を取り得る。
【０２３２】
図５、図６、図８、および図９に示されるように、窓のない透過型ディスクを使用する本発明の実施形態において、工程２４６は、２つの異なる様式のうちの１つで行われ得る。基準長方形の位置は、その中心を一定の配置で点に対して位置決めすることによるか、または暗い染料の点である参照マーク２０２（例えば、図２４Ｌ、図２５、および図２６を参照）を見つけることによるかのいずれかで選択される。参照マーク２０２が用られる場合、所望のコントラストを持つ染料が、細胞のクラスター２つに対して、ディスク上の特定の位置１４１（例えば、図２０Ｅ）に沈着する。次いで、光ディスク読み取り機は、細胞のクラスターのうち１つの中心にスキップして向けられ、次いで、基準長方形が選択されたクラスターの周囲に集中する。
【０２３３】
工程２４６に関して上記に記載される使用者の選択肢に関して、使用者は、マウスでの選択または他の方法で直接やりとりすることにより、細胞計数のための所望の試料範囲の形（長方形範囲など）を指定し得る。ソフトウェアの本実施形態において、これは、マウスを使用して、モニター１１４に表示される光バイオディスク由来の画像の所望の位置をクリックして長方形をドラッグすることを含む。評価範囲選択法に関わらず、それぞれ長方形範囲は次の工程２４８で計数するために評価される。
【０２３４】
図５８の第３の主要な工程は、工程２４８であり、これはバックグラウンド照度均一化に関する。このプロセスは、あるハードウェア構成で引き起される可能性のあるバックグラウンド均一性の変動を補正する。バックグラウンド照度均一化は、バックグラウンド全体、または細胞がない画像部分が、任意のバックグラウンド値Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄである平面に近付くように、各サンプル点の強度レベルを補正する。Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは基準長方形試料範囲にわたり平均値を取るようにしていろいろな方法で決定され得るものの、本実施形態においては、この値は２０００に設定される。選択された長方形試料範囲の各点Ｐでの値Ｖは、数字（Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ＋（Ｖ−ｐの近傍にわたる平均値））で置き換えられ、必要であれば切り捨てられて、値の事実上可能な範囲（本発明の好適な実施形態では０〜４０９５）に合わせられる。近傍の大きさは、細胞の大きさよりも十分に大きく、かつ基準長方形の大きさよりも十分に小さいように選択される。
【０２３５】
図５８の流れ図における次の工程は、規格化工程２５０である。規格化工程２５０の実行において、標準偏差６００で平均が２０００になるように、基準長方形試料範囲のデータで線形変換が行われる。必要であれば、値は切り捨てられて０〜４０９６の範囲に合わせられる。この工程２５０、ならびにバックグラウンド照度均一化工程２４８は、ソフトウェアを、ハードウェア修飾およびチューニングの影響を受けにくくする。制限ではなく例として、検出回路（上部検出器１５８（図５５）など）の信号利得は、得られる細胞計数に顕著に影響を与えることなく、変わり得る。
【０２３６】
図５８に示されるように、フィルタリング工程２５２が次に行われる。基準長方形の各点Ｐについて、工程２４８で示されるものより小さい大きさで、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄと十分に識別される値を持つ、Ｐ近傍の点の数が計算される。計算される点は、画像の細胞の大きさに近似するはずである。この数字が十分に大きい場合は、Ｐでの値はそのままである。そうでなければ、Ｖｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに割り当てられる。このフィルタリング操作は、ノイズを除去するために行われ、最適な場合では、細胞のみが画像に残り、一
方バックグラウンドはＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに一様に等しい。
【０２３７】
図５８に示されるように、邪魔な成分を除去することに関する任意の工程２５４が行われ得る。不具合（引っ掻きキズ、気泡、埃、および他の似たような不整など）は、フィルタリング工程２５２を通り抜ける可能性がある。これらの不具合は、直接、または画像ヒストグラムの分布全体に影響を及ぼすことによるかのいずれかで、細胞計数エラーを引き起こし得る。一般的には、これら欠陥は、大きさが細胞よりも十分に大きいので、以下のように工程２５４で除去され得る。最初に、選択領域と同じ大きさのバイナリー画像を形成する。バイナリー画像のＡを、原画像の対応する点での値がＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄに等しければ、白と定義し、その他は黒とする。次に、黒点の結合したコンポーネントを抽出する。次いで、続く減退および拡大を適用して成分の表示を一般化する。そして最後に、規定された閾値よりも大きい成分を除去する。この任意選択工程の一実施形態において、原画像の対応するサンプル点にＶｂａｃｋｇｒｏｕｎｄの値を割り当てることにより、成分は原画像から除去される。どの成分が計数対象を構成してどれが除去されるべきかを決める閾値は、使用者定義値である。この閾値はまた、計数される治験用特徴、すなわち白血球、赤血球、または他の生体物質に依存して、変更され得る。任意選択工程２５４後、工程２４８、工程２５０、および工程２５２は、好ましくは繰り返される。
【０２３８】
図５８に示される次の主要な処理工程は、工程２５６であり、これは、輝中心による細胞計数に関する。計数工程２５６は、複数のサブ工程からなる。これらのサブ工程の第一は、畳み込みを行うことを含む。この畳み込みサブ工程において、畳み込みピクチャ（convolved picture）として示される補助配列が形成される。点Ｐでの畳み込みピクチャの値は、Ｐの円形近傍でのフィルタリング後のピクチャの積分の結果である。より正確には、特定の一実施形態について、積分される関数は、ｖが２０００より大きい場合にｖ−２０００に等しく、かつｖが２０００より小さいかまたは等しい場合に０である、関数である。計数工程２５６で実行される次のサブ工程は、細胞の大きさほどの半径の近傍での畳み込みピクチャの極大を見つけることである。次に、お互いの閉ざされた近傍で同じ値を持つ同じ極大が回避される。計数工程２５６の最後のサブ工程において、残存する極大を、細胞をマークするとして表す。
【０２３９】
ハードウェア構成によっては、ある細胞は輝中心なしで現れ得る。この場合、暗縁のみが可視化され、以下の２つの任意選択工程２５８および２６０が有用である。
【０２４０】
工程２５８は、見いだした細胞をピクチャから除去することに関する。工程２５８において、輝中心および暗縁の両方を持つ細胞が２度見つけられないように、各見いだされた細胞の中心周りの円形領域は、値２０００で埋め尽くされる。
【０２４１】
工程２６０は、暗縁でさらに細胞を計数することに関する。工程２５８後、２つの変換が画像になされる。このルーチンの第一サブ工程、サブ工程（ａ）において、各点での値ｖは（２０００−ｖ）で置き換えられ、結果が負の場合にはそれはゼロで置き換えられる。サブ工程（ｂ）において、次いで、得られるピクチャを内部半径Ｒ１および外部半径Ｒ２のリングで畳み込みする。Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、細胞の最小および最大予想半径であり、続いてリングは、サブ工程（ｄ）で左右および上下に移動させられる。サブ工程（ｃ）において、４つの移動の結果が合計される。この変換後、暗縁細胞の画像は、４枚の花びらの花のようになる。最後に、サブ工程（ｄ）で、サブ工程（ｃ）で得られた関数の最大が、計数工程２５６で用いられるような様式で見つけられる。それらは、工程２５６で除外された細胞をマークするとして表される。
【０２４２】
計数工程２５６後の、または任意に用いられた場合は計数工程２６０後の、図５８に示される最後の主要な工程は結果出力工程２６２である。基準長方形中に見いだされた細胞
数は、図１および図５に示されるモニター１１４に表示され、同定された各細胞は、表示される、光バイオディスク由来Ｏ画像上、赤十字でマークされる。
【０２４３】
図５９を参照して、白血球分析用の異なる捕獲帯を有する分析チャンバを示す絵図が描かれる。バフィーコートまたは白血球試料は、様々な方法（溶解、ポジティブまたはネガティブ選択、および勾配遠心分離、またはこれらの方法の任意の組合せを含む）により全血から単離される。試料調製に関するさらなる詳細は、以下の実施例１、実施例２、および実施例３に記載され、また、例えば、同一出願人による同時係属中の米国仮出願第６０／３８２，３１９号、表題「Methods For Isolation Of T-Lymphocytes For Use In Differential Cell Counting And Use Of Optical Bio-Disc For Performing Same」（２００２年５月２２日出願）に開示される。この出願は、本明細書中にその全体が参照として援用される。いったんＭＮＣまたはバフィーコートが単離されると、次いでＭＮＣは分析チャンバ中に導入され、ここで目的の細胞がそれぞれの捕獲剤と結合し、例えば、以下の実施例７で概要される手順に従って分析が行われる。
【０２４４】
ここで図６０Ａおよび図６０Ｂを参照して、赤血球および白血球の分析用の異なる捕獲帯を有する分析チャンバを示す絵図が図示される。図６０Ａは、赤血球ＡＢＯ分析およびＣＤマーカー２、１９、４４、４、および８用捕獲帯を有するバフィーコートＣＤマーカーアッセイを示す。図６０Ｂは、Ａ、Ｂ、Ｏ、およびＲｈ表面マーカーに特異的親和性を持つＩｇＭ捕獲抗体を使用する、別の赤血球分析を示す。図６０Ｂにはまた、試料として全血を使用する白血球分析も示される。このアッセイにおいて、白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、好酸球、好塩基球、好中球、単球、およびリンパ球）は、特異的捕獲帯に捕獲され、捕獲された細胞数を同定および定量するために二次ゲートが使用される。目的の細胞を同定するために使用される二次ゲートは、ビーズの群であり、その各群は、独特の物理的特性、およびそれらに付着する細胞の型に特異的な信号剤を有する。物理的特性として、大きさ、形、質感、色、蛍光、および燐光が挙げられ得る。例えば、群Ａのビーズは、それらに付着した抗Ｔ細胞信号抗原を有する１ｕｍ黄緑（ＹＧ）蛍光ビーズであってもよい。次いで、群Ａ細胞は、捕獲されたＴ細胞に特異的に結合し、それにより１ｕｍＹＧ蛍光ビーズでＴ細胞にタグ付けする。例えば、別の郡のビーズ、すなわち群Ｂ、それらに付着した単球に対する抗体を有する２ｕｍ赤色蛍光ビーズが、単球にタグ付けするのに使用され得る。二次ゲートは、捕獲された細胞数のより正確な評価を可能にする、なぜならそれは特定の捕獲帯内の、目的の細胞のみをタグ付けして、非特異的に結合した細胞はタグ付けしないからである。目的の細胞をタグ付けするためのビーズまたは小球体の使用に関するさらなる詳細は、例えば、同一出願人による同時係属中の米国仮出願第６０／３８２，９４４号、表題「Methods and Apparatus for Use in Detection and Quantitation of Cell Populations and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」（２００２年５月２４日出願）に開示される。この出願は、本明細書中にその全体が参照として援用される。
【０２４５】
次に図６１を参照して、光バイオディスクを使用したＣＤマーカーアッセイの捕獲帯内の細胞濃度の関数として、血液試料からの、捕獲されたＣＤ４＋細胞数を示すグラフが示される。グラフは、試料中の細胞数の増加に関連して細胞捕獲が増加することを示す。細胞は、２つの供給元からのＣＤ４抗体（DAKOからの抗体ＡおよびSerotechからの抗体Ｂ）を使用して捕獲された。グラフはさらに、両捕獲抗体を使用しての、類似した傾向および捕獲効率を示す。この実験の実行に続く実験手順に関するさらなる詳細は、以下の実施例７に記載される。
【０２４６】
ここで図６２Ａおよび図６２Ｂを参照して、本発明の光バイオディスクおよびＦＡＣＳ分析を用いて分析された血液試料からのＣＤ４／ＣＤ８比のデータ散布図を示す。これらのグラフを作るのに使用されたデータは、以下の表８に示される。示されるデータの収集に続く実験手順に関する詳細は、以下の実施例８に論考される。
【０２４７】
［実験の詳細］
本発明は図面を参照して詳細に記載されてきたが、本発明の特定の実施例およびさらなる図示が以下に表される。
【実施例１】
【０２４８】
図１７Ａは、試料の調製、バイオディスクの使用、および結果の提供を示す絵による流れ図を図示し、結果は図５２および図５３に、より詳細に示される。以下の実施例の詳細（プロセス工程の各所要時間、回転速度、および他の詳細など）は、図１７Ａ、図５２、および図５３を参照して上記で記載されたものよりも具体的である。とはいえ、本実施例の基本工程は、上記で記載されたものと同様である。
【０２４９】
Ａ．基体調製および化学種堆積を含むディスク製造
この実施例において、反射型ディスクまたは透過型ディスク基体１２０（それぞれ、図２および図５）を、空気銃を使用してどのような埃粒子も除去してきれいにする。スピンコーターを使用して、ディスクを、イソプロパノールで２回リンスする。２％ポリスチレンをディスクにスピンコーティングして、全体に非常に厚いコーティングを付ける。
【０２５０】
次いで、化学種(chemistry)を堆積させる。一実施形態は、３工程堆積プロトコルを含み、これは以下をインキュベートする：ストレプトアビジン、３０分間インキュベートされる；ビオチン標識化第一抗体で、６０分間インキュベートされる；および第二捕獲抗体、３０分間インキュベートされる。第一抗体は、第二種（例えばマウス）の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）の型に対して第一種（例えばヒツジ）で産生され得る。第二捕獲抗体は、特異的細胞表面抗原例えば、ＣＤ４、ＣＤ８）に対して第二種で産生される。工程は、加湿チャンバ中室温で、堆積の間に、洗浄工程および乾燥工程を用いて行われる。
【０２５１】
１μｌ比のリン酸緩衝食塩水中１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンを、各窓を覆って重ね、そして３０分間インキュベートする。過剰なストレプトアビジンを、蒸留水を用いて洗い落とし、そしてディスクを乾燥させる。等体積のビオチン標識化抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳ中１２５μｇ／ｍｌ）と活性化デキストランアルデヒド（２００μｇ／ｍｌ）とを組合わせる。デキストランアルデヒド（ＤＣＨＯ）ービオチン標識化抗マウスＩｇＧを、各捕獲窓中ストレプトアビジンを覆って重ね、そして冷蔵庫中６０分間または一晩インキュベートする。過剰な試薬を洗い落とし、そしてディスクをスピン乾燥させる。
【０２５２】
図４７に示されるとおり、これらのヒト細胞表面抗原に対するマウスＩｇＧ抗体を使用して、多数の放射状に配向した、異なる検査（ＣＤ４（窓２）、ＣＤ８（窓３）、ＣＤ３（窓４）、およびＣＤ４５（窓５）、ならびにネガティブコントロール（窓６）など）についての表示窓が存在し得る。この調製された基体を、冷蔵庫中３０分間または一晩インキュベートする。
【０２５３】
化学種体積のパターンを以下の表５に提示する。
【０２５４】
【表５】
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【０２５５】
Ｂ．ディスクアセンブリ
打抜き部分（Ｕ−字型または「等半径(e-rad)」チャンネルなど）を持つ、例えば、２５、５０、または１００ミクロンの厚さなどの接着層（図２および図５のチャンネル層１１８）を用いて、ディスクを組み立て、流体チャンネル、および透明キャップ１１６（図５、透過型ディスクで上部検出器を用いて使用するため）または捕獲帯を覆って配置される反射層１４２を持つキャップ１１６（図２、反射型ディスクで下部検出器を用いて使用するため）を作成する。
【０２５６】
一実施形態において、ディスクは、符号化情報層として３００ｎｍの金でコーティングされたｆｏｒｗａｒｄ  Ｗｏｂｂｌｅ  Ｓｅｔ  ＦＤＬ２１：１３７０７またはＦＤＬ２１：１２７０ＣＤ−Ｒディスクである。反射型ディスクでは、大きさ２×１ｍｍの長円形表示窓が、既知のリソグラフィー法により反射層にエッチングされる。透過型ディスクの設計によっては、別々の表示窓はエッチングされずに、ディスク全体が利用可能となる。この特定の実施例において、チャンネル層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ＤＢＬ  ２０１  Ｒｅｖ  Ｃ  ３Ｍ９４６６１で形成される。カバーは、半径２６ｍｍで等間隔に配置された４８個の直径０．０４０インチの試料入口を持つ透明ディスクである。データディスクは、ＣＤ４／ＣＤ８計数ソフトウェアを使用して、速度４×、および試料速度２．６７ＭＨｚでソフトウェアで走査および読み取りされる。
【０２５７】
Ｃ．ディスク漏れチェック
血液が分析されるため、チャンバのいずれも、ディスクの回転中にｉｎ  ｓｉｔｕで試料を漏らさないことを確実にするために、最初にディスクの漏れがチェックされ得る。各チャンネルに、遮断剤（スタビルガードおよびＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎなど）を満たす。遮断は、少なくとも１時間である。ディスクを５０００ｒｐｍで５分間回転させて、漏れ検査およびディスク安定性を点検する。漏れをチェックした後、ディスクを真空チャンバに２４時間置く。２４時間の真空吸引後、ディスクを真空ポーチに入れて、使用するまで冷蔵庫に貯蔵する。
【０２５８】
Ｄ．試料の収集、調製、およびディスクへの塗布
以下の段落は、試料処理工程に関し、これは概して図１７Ａに示される。単核細胞（ＭＮＣ）を、密度勾配遠心分離法により（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒを使用して）精製する。血液（４〜８ｍｌ）を、４ｍｌまたは８ｍｌのＥＤＴＡ含有ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒに直接採取する。管を、バイオハザード遠心分離機中、水平回転機およびスイングアウトバケットを用いて、室温で２５分間、１５００〜１８００×ｇで遠心分離する。血液は、好ましくは採取から２時間以内に使用される。遠心分離後、単核細胞分画の上層をなす血漿を除去し、ＭＮＣ層上に約２ｍｍの血漿を残す。ＭＮＣを集めてＰＢＳで洗浄する。室温で１０分間、３００×ｇで遠心分離することにより細胞をペレットにする。上清を除去し、そして管を穏やかに叩いてＭ
ＮＣ含有ペレットをＰＢＳ中に再懸濁させる。室温で各１０分間、３００×ｇで１回より多い洗浄を行い血小板を除去する。最終ペレットを、１０，０００細胞／μｌの細胞数に再懸濁する。１８μｌ体積のＭＮＣを、１つまたは複数の分析チャンバまたはチャンネルへ導入して、ディスクステーショナリーで、室温で１５分間インキュベートする。チャンネルを密閉する。次いで、ディスクドライブを使用して、ディスクを３０００ｒｐｍで３〜４分間回転させる。ディスクは、好ましくは、速度４×、および試料速度２．６７ＭＨｚでソフトウェアで走査および読み取りされる。
【０２５９】
血液試料をただちに処理することができない場合、最初の遠心分離後、単核細胞を、ＣＰＴ管を数回穏やかに反転させることで血漿中に再懸濁させて、室温で２４時間まで貯蔵することが可能である。２４時間内であれば、血漿中の細胞は、上記で記載されるとおり、収集され洗浄され得る。
【０２６０】
Ｅ．ＣＤ４／ＣＤ８アッセイフォーマット
この実施例のアッセイは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ−リンパ球母集団の絶対数および血液試料中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球の比の迅速な決定のための包括的均一固相細胞捕獲アッセイである。ＣＤ−ＲＯＭに組込まれた小チャンバ内で実行される検査は、全血から単離された７μｌの単核細胞（ＭＮＣ）で、捕獲帯の特異的抗体により捕獲された、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ４５＋細胞の数を求める。検査は、ディスクの特定位置での局所的細胞捕獲の原則に基づく。複数の特異的細胞捕獲帯が、特定血液細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体に基づく捕獲化学種の局所的塗布により、ディスクに作成される。チャンバをＭＮＣ血液（３０、０００細胞／μｌ）で溢れされることで、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ３、およびＣＤ４５抗原を発現する細胞が、ディスクの捕獲帯に捕獲される。同じくバーコード内に組込まれるのは、規定されたネガティブコントロール範囲である。
【０２６１】
Ｆ．オンディスク分析
上記の工程Ｄで調製されたＭＮＣ細胞（ＰＢＳ中１８μｌ）、をディスクチャンバに注入し、そしてチャンバの入口および排出口を密閉する。ディスクを、室温で１５分間、インキュベートし、次いで上部検出器を用いて光学ドライブ中７８０ｎｍレーザーを使用して走査し、上記で記載されるとおり、捕獲場を画像化する。
【０２６２】
ソフトウェアはディスク上に符号化されており、以下の作用を自動的に実行するようにドライブに指示する：（ａ）１つまたは複数の段階で、ディスクを遠心分離して過剰な未結合細胞をはじき出す、（ｂ）特定捕獲窓を画像化する、そして（ｃ）各捕獲帯に特異的に捕獲された細胞の計数およびＣＤ４／ＣＤ８比の振り分け（またはどの比が決定されるようにプログラミングされているか）を含むデータの処理を行う。
【０２６３】
処理工程の間、認識ソフトウェアは、各捕獲帯画像を縦断して読み取り、そしてそれが遭遇した細胞をマークする。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞数の見積もりに続いて、ソフトウェアは、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞比を計算し、そして全血１マイクロリットルあたりの、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ４５＋捕獲帯中の細胞の絶対数、および同じくＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の両方を表示する。ディスクを光学ドライブに挿入してから個数および比を得るまで、プロセス全体で、約１２分かかる。
【０２６４】
Ｇ．使用される試薬
ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ．＃Ｓ−４７６２）：脱イオン水を加えて５ｍｇ／ｍｌ溶液を作り、分取して−３０℃で貯蔵する。使用するために、Ｔｒｉｓ緩衝液を加えて最終濃度１ｍｇ／ｍｌにする。
ポジティブコントロール：ＣＤ４５（Ｓｉｇｍａ、Ｌｏｔ＃０３８Ｈ４８９２、ｃａｔ
＃Ｃ７５５６）。２〜８℃で貯蔵。
二次捕獲抗体：ビオチン標識化抗マウスＩｇＧ（ヒツジで産生、Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｌｏｔ＃Ｌ０６０２、Ｃａｔａｌｏｇ＃ＢＡ−９２００）蒸留水で作成された貯蔵溶液１．５ｍｇ／ｍｌ。作用ｂ−ＩｇＧ溶液、０．１ＭＰＢＳ中１２５μｇ／ｍｌ。２〜８℃で貯蔵。長期貯蔵には、−３０℃で保存し得る。
アルデヒド活性化デキストラン（Ｐｉｅｒｃｅ、ｌｏｔ＃９７１１１７６１、ｃａｔ＃１８５６１６７）。貯蔵溶液、ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ、２〜８℃で貯蔵。
一次捕獲抗体：ＣＤ４（ＤＡＫＯ、ｃａｔ＃Ｍ０７１６）、ＣＤ８（ＤＡＫＯ、ｃａｔ＃Ｍ０７０７）、ＣＤ２（ＤＡＫＯ、ｃａｔ＃Ｍ７２０）、ＣＤ４５（ＤＡＫＯ、ｃａｔ＃Ｍ０７０１）、ＣＤ１４（ＤＡＫＯ、ｃａｔ＃Ｍ８２５）、およびＣＤ３（ＤＡＫＯ、ｃａｔ＃Ｍ７１９３）。２〜８℃で貯蔵。
ネガティブコントロール：マウスＩｇＧ１（ＤＡＫＯ、ｃａｔ＃Ｘ０９３１）。２〜８℃で貯蔵。
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、ｃａｔ．＃１００１０−０２３）、または同等物。室温で貯蔵。
イソプロピルアルコール、９０〜１００％
【０２６５】
Ｈ．ＲＢＣ溶解プロトコル
塩化アンモニウム溶解緩衝液
１×貯蔵の塩化アンモニウム溶解緩衝液は、２〜８℃で貯蔵されるべきである。０．１５５ＭのＮＨ４ＣＩ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、および０．１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムからなる；ｐＨ７．３〜７．４。２〜８℃で貯蔵。使用前に室温に戻す。
【０２６６】
手順
１．１００μｌ毎の血液に２ｍｌの溶解緩衝液を加える。（バイオハザードフード中でこの手順を行うことが望ましい。）
２．ボルテックスし、そして室温で１５分間インキュベートする。
３．バイオハザードフード中、遠心分離機を使用して、血液を、室温で、５分間５００×ｇで遠心分離する。
４．上清を除去し、そして細胞をＰＢＳ中２％のＦＣＳまたはＦＢＳで洗浄する。細胞を遠心分離する。
５．ＷＢＣの全量を計数して、試料注入用にＷＢＣの最終濃度を１０、０００細胞／μＩにする。
【実施例２】
【０２６７】
単核細胞分離手順
Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ（ＢＤｃａｔａｌｏｇ＃３６２７６０（４ｍｌのもの）、＃３６２７６１（８ｍｌのもの））、クエン酸ナトリウム入り細胞調製管、を使用する。全てのバイオハザード対策に従って、手順をバイオハザードフード中行う。工程：
１．血液を直接４ｍｌまたは８ｍｌのＥＤＴＡ含有ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒに採取する。血液試料が既に抗凝固剤中にある場合、最初にＶａｃｕｔａｉｎｅｒ中のＥＤＴＡを流し出し、ついで６〜８ｍｌの血液試料をＣＰＴ管に注ぐ。
２．バイオハザード遠心分離機中、水平回転機およびスイングアウトバケットを用いて、室温で２５分間、１５００〜１８００×ｇで管を遠心分離する。最良の結果のためには、血液は採取の２時間以内に遠心分離されるべきである。しかしながら、２時間以降の血液も、ＭＮＣ数が減少してＲＢＣ混入が増大しつつ遠心分離され得る。
３．遠心分離後、ＭＮＣ層上に約２ｍｍの血漿を残して、血漿を除去する。白色がかった単核層を収集して１５ｍｌのコニカル遠心管に移す。
４．１０〜１５ｍｌのＰＢＳをＭＮＣ層へ加え、遠心管を数回反転させることにより細胞
を穏やかに混合する。
５．バイオハザード遠心分離機中、室温で１０分間、２００×ｇで遠心分離することにより細胞を洗浄する。
６．上清を除去する。管を穏やかに叩いて細胞を再懸濁させる。
７．１０ｍｌのＰＢＳ中でもう一度洗浄する。室温で１０分間、２００〜３００×ｇで遠心分離することにより血小板を除去する。
８．上清を除去し、ペレットを５０ｕｌのＰＢＳ中に再懸濁させる。
９．試料中の細胞数を見積もる。ＣＢＣを実行するか、または２ｕｌの細胞を１８ｕｌのトリパンブルーに希釈し、穏やかに混合して、血球計数器で細胞を計数する。分析用に、試料を最終細胞数１０，０００細胞／ｕｌにする。
１０．細胞をただちに処理することができない場合、最初の遠心分離（上記の工程２）後、単核細胞を、ＣＰＴ管を数回穏やかに反転させることで分離した血漿中に再懸濁させて、室温で２４時間まで貯蔵する。２４時間内であれば、血漿中の細胞は、上記で記載されるとおり、収集され、続いて洗浄される。
１ｕｌ当たりの全細胞数＝２５の小正方形の細胞数×（倍）１００。
【実施例３】
【０２６８】
ヒストパック−１０７７を使用する全血からのＭＮＣＳ分離
１ｍｌのヒストパック−１０７７を１５ｍｌの遠心管に入れ、そして１ｍｌの全血をその上に静かに重ねる。次いで、室温で３０分間、４００×ｇで遠心分離する。パスツールピペットで混合物を注意深く吸引し、そして不透明な界面を遠心管に移した。次いで、１０ｍｌのＰＢＳを遠心管に添加した。次いで、溶液を１０分間、２５０×ｇで遠心分離した。上清をデカントし、そして細胞ペレットを１０．０ｍｌＰＢＳ中に再懸濁させて、１０分間、２５０×ｇで回転させた。次いで、１０ｍｌのＰＢＳ中にペレットを再懸濁させて２５０×ｇで回転させることにより、細胞をもう一度洗浄した。最終的な細胞ペレットを、０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。
【実施例４】
【０２６９】
ディスク調製および化学種堆積
Ａ．基体調製および化学種堆積を含むディスク製造
この実施例において、空気銃を使用して埃を除去することにより、透過型ディスク基体を清浄にした。次いで、ディスクをスピンコーターにマウントし、一定流のイソプロパノールで２回リンスした。次いで３１０ｍｌのトルエンおよび６５ｍｌのイソプロパノールに溶解した２％ポリスチレンを含むポリスチレン溶液をディスク上に均一にコーティングした。
【０２７０】
二次抗体堆積については、活性化デキストランアルデヒド（ＰＢＳ中２００ｕｇ／ｍｌ）の新しい溶液を等体積のベクターＩｇＧ（ＰＢＳ中１２５ｕｇ／ｍｌ）と混合させた。手動ピン堆積を用いて、約１ｕｌのＩｇＧ＋ＤＣＨＯ複合体を、ディスク上の各捕獲帯に堆積させた。ディスクを、加湿チャンバ中６０分間インキュベートした。過剰な抗体を脱イオン（D.I.）水で洗い落とし、そしてディスクをスピン乾燥させた。
【０２７１】
一次抗体については、ＤＡＫＯ  ＣＤ４をＰＢＳ中５０ｕｇ／ｍｌに希釈し、ＤＡＫＯ
ＣＤ８をＰＢＳ中２５ｕｇ／ｍｌに希釈し、そしてＤＡＫＯ  ＣＤ４５をＰＢＳ中１４５ｕｇ／ｍｌに希釈した。手動ピンアプリケーターを用いて、約１ｕｌの各一次抗体を、吸着された二次抗体の頂部に堆積させた。加湿チャンバ中３０分間インキュベートした。過剰な抗体をＰＢＳで洗い落とし、そしてディスクをスピン乾燥させた。
【０２７２】
Ｂ．ディスクアセンブリ
使用したカバーディスクは、透明で、その上に取り付けられたＦｒａｙｌｏｃｋ接着チ
ャンネル層を持つ。接着層を４つのＵ−字型チャンネルに打抜いて流体回路を作成した。流体チャンネルが抗体帯を覆うようにして、カバーを透過型ディスク基体上に置いた。次に、ディスクを一緒に固定するために、それらをディスクプレスに８回通した。
【０２７３】
Ｃ．ディスク漏れチェック、遮断 
各流体チャンネルに、スタビルガードを満たし、そして１時間インキュベートした。インキュベーション中、ディスクをスピンコーター中５０００ｒｐｍで５分間回転させた。回転後、漏れについてディスク チャンネルを点検した。次に、スタビルガードをチャンネルから吸引し、そしてディスクを真空チャンバ中一晩真空下に置いた。翌朝ディスクを真空ポーチに入れて、４℃で貯蔵した。
【実施例５】
【０２７４】
リンパ腫細胞株
Ａ．細胞株の記載
細胞株は、ＳＵＰ−ＴＩの名称を持つヒトＴ細胞リンパ腫である。ＡＴＣＣｃａｔ＃はＣＲＬ−１９４２である。この株は、Ｔ−ＬＬを持つ８歳児の悪性胸水から収集された悪性細胞に由来するものであった。細胞は、複数のＴ系列マーカーを発現する。抗原発現は、ＣＤ１ａ＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ５＋、およびＣＤ８＋である。１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ媒体の２週間ごとの添加および交換により、培養物は、２×１０５〜２×１０６細胞／ｍｌの間に維持される。培養物は懸濁液であり、これは５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で水平にインキュベートされる。
【０２７５】
Ｂ．ＳＵＰ−ＴＩ調製
血球計数器を使用して細胞濃度を見積もる。遠心分離して過剰な上清を除去することにより、細胞を濃縮して所望の濃度にする。
【実施例６】
【０２７６】
リンパ腫細胞株を用いたディスクチェック
Ａ．ＳＵＰ−ＴＩ細胞での抗体検査
実施例４に従って、２５ｕｍ接着／チャンネル層を用いてディスクを調製した。ＳＵＰ−ＴＩ細胞濃度を、血球計数器を使用して決定した。細胞を３０，０００細胞／ｕｌに濃縮した。それらを分析ディスクの２つのチャンネルに注入した。１５分後、ディスクを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。捕獲帯に捕獲された細胞について光学顕微鏡写真を取り、そして細胞を計数した。この実験からの結果を以下の表６に示す。
【０２７７】
【表６】
2005517154.tif 000009
【実施例７】
【０２７８】
血液試料のＣＤマーカー検査
Ａ．臨床血液試料の調製
１２ｍｌの血液（試料＃１７６）を、午前１０：００にＥＤＴＡ管に引入れた。午後１２：００、３ｍｌの血液を、４×１５ｍｌ管中、３ｍｌのヒストパック１０７７上に重ねた。管を、室温で３０分間、４００×ｇで遠心分離した。遠心分離後、０．５ｃｍの不透明ＭＮＣ層内の上部血漿を、吸引して除いた。残存する不透明ＭＮＣ層をきれいな１５ｍ
ｌ管に移して、１２ｍｌのＰＢＳを添加した。残りの３本の管についてもこれを繰り返した。
【０２７９】
洗浄
次いで、細胞懸濁液を２５０×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、上清を、吸引して除いた。そして細胞を１４ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。再度、懸濁液を２５０×ｇで１０分間遠心分離した。上清を吸引して除き、そして各細胞ペレットを１７５ｕｌのＰＢＳで再懸濁させた。次いで、４つのＭＮＣ懸濁液を全て合わせて、Ｃｅｌｌ  Ｄｙｎｅ１６００細胞計数器でＣＢＣを走らせることにより細胞濃度を決定した。最終体積は、６５０ｕｌで、濃度が２３．５Ｋ細胞／ｕｌであった。次いで、６回の連続希釈を行い、最終的に、以下の表７に示される、１０００細胞／ｕｌ〜１００，０００細胞／ｕｌの範囲の濃度にした。
【０２８０】
Ｂ．ＤＡＫＯおよびＳｅｒｏｔｅｃ製ＣＤ４抗体の比較
１００ｕｍ接着層を使用して、それぞれ６つのチャンネルを持つ２枚のディスク（＃３３８および３３９）を、実施例４に従って作成した。別のＳｅｒｏｔｅｃ製一次ＣＤ４抗体（５０ｕｇ／ｍｌ、ｃａｔ＃ＬＮ１２９８）もまた、この実施例で使用された。
【０２８１】
ディスク３３８の各チャンネルに試料１７６の一連の希釈を注入した。１５分後、ディスクを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。化学種帯に捕獲された細胞の光学顕微鏡写真を取り、そして細胞計数ソフトウェア（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ）を使用して、細胞を計数した。あるいは、捕獲された細胞数は、光ディスク読み取り機および付随するソフトウェアを使用して評価され得る。ディスク３３９についてはこの手順であった。ＤＡＫＯ  ＣＤ４化学種帯に捕獲された細胞数を、ＳｅｒｏｔｅｃＣＤ４化学種帯に捕獲された細胞と比較した。この実験から集められたデータは、表７に、および図６１に示される。
【０２８２】
【表７】
2005517154.tif 000010
【実施例８】
【０２８３】
ディスクＣＤ４／ＣＤ８比対ＦＡＣＳＣＤ４／ＣＤ８比の比較
臨床試料（番号１５４、１５６、１５７、１５９、および１７５）を、実施例７と同様に調製し、それぞれ３ｍｌの血液のみを使用し、最終試料濃度は、１０，０００細胞／ｕ
ｌであった。
【０２８４】
ディスク（番号２７２、２７５、２７６、２６７、および３２７）を、１００ｕｍ接着チャンネルを使用して、実施例４と同様に調製した。
【０２８５】
各試料を、以下の表８に示されるとおり、それぞれ対応するディスクに注入した。１５分後、ディスクを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。化学種帯に捕獲された細胞の光学顕微鏡写真を取り、そして細胞を計数した。各臨床試料には、ＦＡＣＳ分析も行われた。この実験からの結果は、下記の表８に、ならびに図６２Ａおよび図６２Ｂに示される。
【０２８６】
【表８】
2005517154.tif 000011
【０２８７】
記載のまとめ
本明細書中開示される装置、方法、およびプロセスに関連する本発明の態様はまた、以下にも記載され、これらは全て本明細書中に参照により援用される：米国仮出願第６０／３２３，６８２号、表題「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents」（２００１年９月２０日出願）、米国仮出願第６０／３２４，３３６号、表題「Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniques for Achieving Same in Optical Bio-Discs」（２００１年９月２４日出願）、米国仮出願第６０／３２６，８００号、表題「Sealing Methods for Containment of Hazardous Biological Materials within Optical Analysis Disc Assemblies」（２００１年１０月３日出願）、米国仮出願第６０／３２８，２４６号、表題「Methods for Calculating Qualitative and Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor /Cytotoxic T-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform」（２００１年１０月１０日出願）、米国仮出願第６０／３８６，０７２号、表題「Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood Cells Including Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」（２００１年１０月１９日出願）、米国仮出願第６０／３８６，０７３号、表題「Methods for Quantitative and Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells Including Lymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform」（２００１年１０月１９日出願）、米国仮出願第６０／３８６，０７１号、表題「Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of Primary Antibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc Including Same」（２００１年１０月２６日出願）、米国仮出願第６０／３４４，９７７号、表題「Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing Including Immunophenotyping」（２００１年１１月７日出願）、ならびに米国仮出願第６０／３４９，９７５号、表題「Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin, Plasma, or Poly-Lysine」（２００１年１１月９日出願）。
【０２８８】
本発明は、ある好適な実施形態および技術的実施例を参照して詳細に記載されてきたが、本発明はそれらのまさにその実施形態または実施例に限定されないことが理解されるべきである。むしろ、本発明を実行するための現在の最良の形態を記載する本開示の観点から、多くの修飾および改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかになるだろう。それゆえ、本発明の範囲は、上記の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲により示される。特許請求項の意味および等価範囲に入る全ての変更、修飾、および改変は、その範囲内にあると判断されるはずである。
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１】本発明によるバイオディスクシステムの絵図である。
【図２】本発明とともに利用される反射型バイオディスクの分解斜視図である。
【図３】図２に示されるディスクの平面図である。
【図４】図２に図示されるディスクの、ディスクの異なる層を示す切欠断面の斜視図である。
【図５】本発明とともに利用される透過型バイオディスクの分解斜視図である。
【図６】図５に示されるディスクの、ディスクの半反射層の機能的態様を示す切欠断面の斜視図である。
【図７】金薄膜の厚さと透過との間の関連を示すグラフ表示である。
【図８】図５に示されるディスクの平面図である。
【図９】図５に図示されるディスクの、図６に示される半反射層の型を含むディスクの種々の層を示す切欠断面の斜視図である。
【図１０】図１のシステムをより詳細に図示する透視図およびブロック図である。
【図１１】図２、図３、および図４に示される反射型光バイオディスクの半径に対して垂直に取られた部分断面図であり、そこに形成されるフローチャンネルを示す。
【図１２】図５、図８、および図９に示される透過型光バイオディスクの半径に対して垂直に取られた部分断面図であり、そこに形成されるフローチャンネルおよび上部検出器を示す。
【図１３】図２、図３、および図４に示される反射型光バイオディスクの部分縦断面図であり、そこに形成されるｗｏｂｂｌｅ溝を図示する。
【図１４】図５、図８、および図９に図示される透過型光バイオディスクの部分縦断面図であり、そこに形成されるｗｏｂｂｌｅ溝および上部検出器を図示する。
【図１５】反射型ディスクの全厚さおよびその初期反射性を示す、図１１と同様な図である。
【図１６】透過型ディスクの全厚さおよびその初期反射性を示す、図１２と同様な図である。
【図１７Ａ】本発明の方法を用いた血液試料分析を示す絵による流れ図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａに示されるディスクで使用する抗体の白血球との連結を示す、絵による詳細図である。
【図１８】Ａはストレプトアビジンの絵図である。    Ｂはビオチンの絵図である。    Ｃはストレプトアビジンおよびビオチンからなる架橋系の絵図である。    Ｄは二次抗体の絵図である。    Ｅはビオチン標識化二次抗体の絵図である。    Ｆは一次抗体の絵図である。    Ｇはビオチン標識化一次抗体の絵図である。    Ｈは４つのＣＤ４表面抗原を示すＣＤ４＋細胞の絵図である。    Ｉは４つのＣＤ８表面抗原を示すＣＤ８＋細胞の絵図である。    Ｊはアルデヒド活性化デキストランに結合した二次抗体を示す、絵図である。    Ｋは図１８Ｊの絵による横断面図である。
【図１９】Ａは、本発明の第１の実施態様で、架橋系により基体へ結合した一次抗体による細胞捕獲を示す、絵図である。    Ｂは、本発明の第１の実施態様で、架橋系により基体に結合した一次抗体による細胞捕獲を示す、絵図である。    Ｃは、本発明の第１の実施態様で、基体に直接結合した一次抗体による細胞捕獲を示す、絵図である。    Ｄは、本発明の第１の実施態様で、基体に直接結合した一次抗体による細胞捕獲を示す、絵図である。
【図２０Ａ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２０Ｂ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２０Ｃ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２０Ｄ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２０Ｅ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２０Ｆ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２０Ｇ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２０Ｈ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２０Ｉ】本発明による架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第１の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２１】図２０Ａ〜図２０Ｉで示される反射型ディスクの、架橋系を使用しない代替的な実施形態である。
【図２２】透過型ディスクフォーマットで実施される、図２０Ａ〜図２０Ｉで利用される捕獲化学種を示す。
【図２３】Ａは二次抗体に結合した一次抗体による細胞捕獲を示す絵図であり、二次抗体は、本発明の第２の実施態様で、架橋系により基体に結合している。    Ｂは二次抗体に結合した一次抗体による細胞捕獲を示す絵図であり、二次抗体は、本発明の第２の実施で、架橋系により基体に結合している。    Ｃは二次抗体に直接結合した一次抗体による細胞捕獲を示す絵図であり、二次抗体は、本発明の第２の実施態様で、架橋系により基体に直接結合している。    Ｄは二次抗体に直接結合した一次抗体による細胞捕獲を示す絵図であり、二次抗体は、本発明の第２の実施態様で、架橋系により基体に直接結合している。
【図２４Ａ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｂ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｃ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｄ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｅ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｆ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｇ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｈ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｉ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｊ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｋ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２４Ｌ】本発明による一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２５】図２４Ａ〜図２４Ｌで示される反射型ディスクの、架橋系を使用しない代替的な実施形態である。
【図２６】透過型ディスクフォーマットで実施される、図２４Ａ〜図２４Ｌで利用される捕獲化学種を示す。
【図２７】Ａは二次抗体に結合した一次抗体による細胞捕獲を示す絵図であり、二次抗体は、本発明の第２の実施態様で、ＤＣＨＯ鎖により基体へ結合している。    Ｂは二次抗体に結合した一次抗体による細胞捕獲を示す絵図であり、二次抗体は、本発明の第２の実施態様で、ＤＣＨＯ鎖により基体へ結合している。    Ｃは、発明の第２の実施態様で、ＤＣＨＯ鎖により基体へ直接結合している一次抗体による細胞捕獲を示す絵図である。    Ｄは、発明の第２の実施態様で、ＤＣＨＯ鎖により基体へ直接結合している一次抗体による細胞捕獲を示す、絵図である。
【図２８Ａ】抗体−ＤＣＨＯ複合体の調製を示す、絵による流れ図である。
【図２８Ｂ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２８Ｃ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２８Ｄ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２８Ｅ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２８Ｆ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２８Ｇ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２８Ｈ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２８Ｉ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２８Ｊ】一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第２の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図２９】図２８Ｂ〜図２８Ｊに示される反射型ディスクの、二次抗体を使用しない代替的な実施形態である。
【図３０】透過型ディスクフォーマットで実施される、図２８Ｂ〜図２８Ｊで利用される捕獲化学種を示す。
【図３１Ａ】光バイオディスクの平面図であり、それぞれ複数の特異的細胞表面マーカー用捕獲帯およびネガティブコントロール帯を有する４つの流体回路を示す。
【図３１Ｂ】本発明の第３の実施態様で、架橋系により基体に結合した二次抗体による一次抗体−細胞複合体の捕獲を示す、絵図である。
【図３１Ｃ】本発明の第３の実施態様で、架橋系により基体に結合した二次抗体による一次抗体−細胞複合体の捕獲を示す、絵図である。
【図３１Ｄ】本発明の第３の実施態様で、基体に直接結合した二次抗体による一次抗体−細胞複合体の捕獲を示す、絵図である。
【図３１Ｅ】本発明の第３の実施態様で、基体に直接結合した二次抗体による一次抗体−細胞複合体の捕獲を示す、絵図である。
【図３２Ａ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３２Ｂ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３２Ｃ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３２Ｄ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３２Ｅ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３２Ｆ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３２Ｇ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３２Ｈ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３２Ｉ】架橋系を使用する、反射型バイオディスクの捕獲帯上への捕獲剤の堆積法の第３の実施態様の実施形態を示す、横断側面図である。
【図３３】図３２Ａ〜図３２Ｉに示される反射型ディスクの、架橋系を使用しない代替的な実施形態である。
【図３４】透過型ディスクフォーマットで実施される、図３２Ａ〜図３２Ｉで利用される捕獲化学種を示す。
【図３５Ａ】光バイオディスクの平面図であり、それぞれ複数の異なる細胞表面マーカー用捕獲帯およびネガティブコントロール帯を有する４つの流体回路を示す。
【図３５Ｂ】反射型光バイオディスクの横断側面図であり、架橋系を使用する血液試料分析法の第１の実施態様の実施形態を示す。
【図３５Ｃ】反射型光バイオディスクの横断側面図であり、架橋系を使用する血液試料分析法の第１の実施態様の実施形態を示す。
【図３５Ｄ】反射型光バイオディスクの横断側面図であり、架橋系を使用する血液試料分析法の第１の実施態様の実施形態を示す。
【図３６】図３５Ｂ、図３５Ｃ、および図３５Ｄに示される反射型ディスクの、架橋系を使用しない代替的な実施形態である。
【図３７】透過型ディスクフォーマットで実施される、図３５Ｂ、図３５Ｃ、および図３５Ｄで利用される捕獲化学種を示す。
【図３８】Ａは反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、血液試料分析法の第２の実施態様の実施形態を示す。    Ｂは反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、血液試料分析法の第２の実施態様の実施形態を示す。    Ｃは反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、血液試料分析法の第２の実施態様の実施形態を示す。
【図３９】図３８Ａ、図３８Ｂ、および図３８Ｃに示される反射型ディスクの、架橋系を使用しない代替的な実施形態である。
【図４０】透過型ディスクフォーマットで実施される、図３８Ａ、図３８Ｂ、および図３８Ｃで利用される捕獲化学種を示す。
【図４１】Ａは反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、血液試料分析法の第３の実施態様の実施形態を示す。    Ｂは反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、血液試料分析法の第３の実施態様の実施形態を示す。    Ｃは反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次抗体ならびにＤＣＨＯ鎖を使用する、血液試料分析法の第３の実施態様の実施形態を示す。
【図４２】図４１Ａ、図４１Ｂ、および図４１Ｃに示される反射型ディスクの、二次抗体を使用しない代替的な実施形態である。
【図４３】透過型ディスクフォーマットで実施される、図４１Ａ、図４１Ｂ、および図４１Ｃで利用される捕獲化学種を示す。
【図４４Ａ】一次抗体−細胞複合体の調製を示す、絵による流れ図である。
【図４４Ｂ】反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、血液試料分析法の第４の実施態様の実施形態を示す。
【図４４Ｃ】反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、血液試料分析法の第４の実施態様の実施形態を示す。
【図４４Ｄ】反射型光バイオディスクの横断側面図であり、一次および二次捕獲抗体ならびに架橋系を使用する、血液試料分析法の第４の実施態様の実施形態を示す。
【図４５】図４４Ｂ、図４４Ｃ、および図４４Ｄに示される反射型ディスクの、架橋系を使用しない代替的な実施形態である。
【図４６】透過型ディスクフォーマットで実施される、図４４Ｂ、図４４Ｃ、および図４４Ｄで利用される捕獲化学種を示す。
【図４７】本発明の実施形態によるバーコード技術を示すための、チャンバを有する光ディスクの絵図である。
【図４８Ａ】本発明の実施形態によるバーコードフォーマットを使用するアッセイから得られる結果の図である。
【図４８Ｂ】ＣＤ４、ＣＤ８、およびコントロール領域に対応する顕微鏡およびディスク画像を示す。
【図４９】本発明の方法および装置により得られ得る結果を示すための、顕微鏡およびディスク画像のより大きな表示を示す。
【図５０】本発明の実施形態による画像認識の使用を図示する。
【図５１】本発明の実施形態による画像認識の使用を図示する。
【図５２】本発明の実施形態によるバーコードから予想される出力の画面ショットの例である。
【図５３】本発明の実施形態による捕獲された細胞から利用可能な出力へ進行する方法を示す。
【図５４】サンプリングされたアナログ信号から、一次元配列として記憶される対応するデジタル信号への変換の絵によるグラフ表示である。
【図５５】バイオディスクのトラックに対して位置決めされた捕獲白血球が、入射ビームと相互作用した後に信号を含むビームをもたらすことを示す、指示された区域の拡大詳細図と合わせた光ディスクの斜視図である。
【図５６】Ａは、本発明による、光バイオディスクのトラックに対して位置決めされた白血球のグラフ表示である。    Ｂは、本発明による、図５６Ａの白血球に由来する痕跡追跡のシリーズである。
【図５７Ａ】総合された場合に、図５６Ｂからの痕跡追跡を一次元配列として記憶されるデジタル信号へ変換して、二次元配列へ組み合わせてデータ入力とする、絵によるグラフ表示を形成する。
【図５７Ｂ】総合された場合に、図５６Ｂからの痕跡追跡を一次元配列として記憶されるデジタル信号へ変換して、二次元配列へ組み合わせてデータ入力とする、絵によるグラフ表示を形成する。
【図５７Ｃ】総合された場合に、図５６Ｂからの痕跡追跡を一次元配列として記憶されるデジタル信号へ変換して、二次元配列へ組み合わせてデータ入力とする、絵によるグラフ表示を形成する。
【図５７Ｄ】総合された場合に、図５６Ｂからの痕跡追跡を一次元配列として記憶されるデジタル信号へ変換して、二次元配列へ組み合わせてデータ入力とする、絵によるグラフ表示を形成する。
【図５７Ｅ】図５７Ｅは、図５７Ａ、図５７Ｂ、図５７Ｃ、および図５７Ｄ間の関連を図示するグラフ表示である。
【図５８】本発明に関連する処理法および計算アルゴリズムに従ってデータを評価する基本工程を表す論理流れ図である。
【図５９】白血球分析用の様々な捕獲帯を有する分析チャンバを示す、絵図である。
【図６０Ａ】赤血球および白血球の分析用の様々な捕獲帯を有する分析チャンバを示す、絵図である。
【図６０Ｂ】赤血球および白血球の分析用の様々な捕獲帯を有する分析チャンバを示す、絵図である。
【図６１】本発明による光バイオディスクを使用するＣＤマーカーアッセイで、捕獲されたＣＤ４＋細胞数を細胞濃度の関数として示すグラフである。
【図６２】Ａは、本発明の光バイオディスクを使用して分析された血液試料からのＣＤ４／ＣＤ８比を示すデータの散布図である。    Ｂは、ＦＡＣＳ分析を使用して分析された図６２Ａと同じ血液試料からのＣＤ４／ＣＤ８比を示すデータの散布図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２４Ｈ】
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【図２４Ｉ】
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【図２４Ｊ】
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【図２４Ｋ】
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【図２４Ｌ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２８Ｇ】
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【図２８Ｈ】
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【図２８Ｉ】
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【図２８Ｊ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
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【図３２Ｉ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５７Ｄ】
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【図５７Ｅ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１】
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【図６２】
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【国際調査報告】
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