(57)【要約】Ｆ６４Ｌ変異およびＥ２２２Ｇ変異を有するＧＦＰを提供する。このＧＦＰは、他のＧＦＰに比してより大きいストークシフトを有し、これにより、よりよい分離に起因するハイスループットスクリーニングに適当となる。このＧＦＰは、また、黄色ＧＦＰとシアンＧＦＰとの間に最大励起を有し、そのため、これらのＧＦＰと共に用いると、よりきれいなバンド分離が得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、または任意の機能的ＧＦＰ類似体から得られた蛍光タンパク質であって、クロモホア前の１位のアミノ酸が変異し、２２２位のグルタミン酸が変異し、当該変異ＧＦＰがより高い波長で最大励起(excitation maximum)を有し、当該蛍光は、変異したＧＦＰが３０℃または野生型ＧＦＰと比較して高い温度でインキュベートされる細胞中で発現するときに増大する、蛍光タンパク質。
【請求項２】
クロモホアが、ＧＦＰの予測一次アミノ酸配列の６５−５７位にある、請求項１の蛍光タンパク質。
【請求項３】
タンパク質が、Aequoria victoreaまたはRenillaから得られる、請求項１または２の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項４】
ＧＦＰの６４位のアミノ酸Ｆが、脂肪族アミノ酸で置換されている、請求項１から３の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項５】
ＧＦＰの６４位のアミノ酸Ｆが、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＡおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項１から４の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項６】
ＧＦＰの６４位のアミノ酸Ｆが、Ｌで置換されている、請求項１から５の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項７】
ＧＦＰの２２２位のアミノ酸Ｅが、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＱからなる群から選択されたアミノ酸で置換されている、請求項１から６の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項８】
ＧＦＰの２２２位のアミノ酸Ｅが、Ｇで置換されている、請求項１から７の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項９】
配列番号４に開示のアミノ酸配列を有する、請求項１から８の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項１０】
配列番号８に開示のアミノ酸配列を有する、請求項１から９の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項１１】
ＧＦＰがポリペプチドに連結している、請求項１から１０の何れかの蛍光タンパク質(ＧＦＰ)からなる、融合化合物。
【請求項１２】
ポリペプチドが、キナーゼ、好ましくは、プロテインキナーゼＡまたはプロテインキナーゼＣの触媒サブユニット、またはＥｒｋ１、または細胞骨格エレメントである、請求項１１の融合化合物。
【請求項１３】
請求項１から１０の何れかの蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１４】
配列番号３で示される、請求項１３のヌクレオチド配列。
【請求項１５】
配列番号７で示される、請求項１３または１４のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
ＤＮＡ配列の形式である、請求項１３から１５の何れかのヌクレオチド配列。
【請求項１７】
請求項１３から１６の何れかのＤＮＡ構成物で形質転換した宿主。
【請求項１８】
ポリペプチドを調製し、請求項１７の宿主を培養することを含み、それから、ヌクレオチド配列により発現したポリペプチドを得るための方法。
【請求項１９】
プロテインキナーゼ活性、脱リン酸化活性を測定するため、またはタンパク質再分布を測定するためのインビトロアッセイにおける、請求項１から１０の何れかの蛍光タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、改善された蛍光特性を有する蛍光タンパク質ＧＦＰの新規変異体に関する。
【０００２】
背景技術
クラゲA. victoria由来の緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)は、異種細胞中で発現すると蛍光性を有するという発見は、生物学の研究分野に、新規で特徴的で強力なツールを提供することとなった(Chalfie et al (1994) Science 263: 802; Prasher (1995) Trends in Genetics 11: 320; WO 95/07463)。細胞機能の研究で、組換え体蛍光タンパク質を用いることの重要な特徴は、アッセイの非侵襲性である。これにより、未処理、生存細胞において細胞性イベントの検出が可能となった。
【０００３】
Aequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質の励起スペクトルには、２つのピークが見られる：３９６ｎｍの大きなピーク(ＵＶ範囲であり、強力に細胞を損傷する)および４７５ｎｍの小さなピーク(細胞にとってあまり危険でない励起範囲である)。
【０００４】
野生型ＧＦＰを改良するため、変異の範囲が述べられている。Heim(GFP (Heim et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 12501)は、種々の励起および放射スペクトルを有するプローブの有用性により１を超える方法の同時モニタリングが可能となるため、細胞性イベントまたは機能をモニターする蛍光性組換え体プローブを用いる応用の可能性が非常に増大する、青色蛍光変異体の発見を述べている。しかし、Heim et al,により述べられている青色蛍光変異体、Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰは、特定の制限を受ける：青色蛍光性は弱く(最大放射(emission maximum)４４８ｎｍ)、そのため、検出が困難となり、細胞発現性Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰの励起を長引かせる必要がある。そのうえ、長期間に渡る励起は、特に、励起波長がＵＶ範囲、３６０ｎｍ−３９０ｎｍにあるため、細胞が損傷する。
【０００５】
Heim et al. (1995), Nature, Vol. 373, p. 663-4は、野生型ＧＦＰよりも長い波長の励起および放射、４９０ｎｍおよび５１０ｎｍを有するＧＦＰのＳｅｒ６５Ｔｈｒ変異(Ｓ６５Ｔ)を開示し、この場合、フルオロホア形成は野生型ＧＦＰよりも約４倍早く進む。
【０００６】
Ehrig et al.(1995) FEBS Letters 367, 163-166は、Aequorea緑色蛍光タンパク質のＥ２２２Ｇ変異を開示する。この変異は、最大励起(excitation maximum)４８１ｎｍおよび最大放射(emission maximum)５０６ｎｍを有する。
【０００７】
生存細胞中のＧＦＰまたはその蛍光変異体の発現は、細胞性イベントを研究するための価値あるツールを提供し、哺乳類細胞を含む多くの細胞は、最適および／または生理学的関連増殖を確保するため、約３７℃でインキュベートされる。種々の生体または組織を起源とする細胞系は、繊維芽細胞の約３５℃からマウスβ細胞の約３８℃−３９℃の範囲の種々の関連温度を有し得る。しかし、細胞発現性ＧＦＰの蛍光性シグナルは、細胞が室温よりも高い温度でインキュベートされると、弱くなるかまたは喪失することが、経験からわかる。Webb, C.D. et al., Journal of Bacteriology, Oct. 1995, p. 5906-5911参照。Ogawa H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 92, pp. 11899-11903, December 1995、およびLim et al. J. Biochem. 118, 13-17 (1995)参照。上記、Heim et al. (1995)で述べられた、改善された蛍光変異体Ｓ６５Ｔは、通常の培養温度(３７℃)よりも下でインキュベーションすると、非常に低い蛍光性を示す。Kaether and Gerdes FEBS Letters 369 (1995) pp.267-271参照。細胞代謝の研究を含む多くの実験は、生理学的関連温度、すなわち約３７℃での細胞培養の可能性に依存する。
【０００８】
Thastrup et al. (1997) EP0851874は、蛍光タンパク質を発現する細胞において、当該細胞が３０℃またはそれを超える温度でインキュベートされると、高い蛍光性を示す当該蛍光タンパク質について述べている。これは、クロモホア前の１位のアミノ酸を変異させると得られる。その変異の例は、Ｆ６４Ｌ、Ｆ６４Ｉ、Ｆ６４Ｖ、Ｆ６４ＡおよびＦ６４Ｇである。
【０００９】
様々な筆者が、変異の組合せについて実験している。ある組合せは、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ  ＧＦＰ(ＥＧＦＰ)である。ＥＧＦＰは、３０℃またはそれを超える温度で発現すると高い蛍光性を示し、最大励起４８８ｎｍである。
【００１０】
本発明の要旨
本発明は、親タンパク質(すなわち、ＧＦＰ)と比較して、３７℃で発現するとき、および４５０から５００ｎｍで励起するとき、細胞蛍光性をはるかに超える細胞蛍光性を生ずる、Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰのような新規蛍光タンパク質、青色変異体Ｙ６６Ｈ−ＧＦＰ、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ変異体およびＦ６４Ｌ−ＧＦＰを提供する。これは、生存細胞中の細胞性機能を研究する上で蛍光タンパク質の有用性を相当改善する。
【００１１】
６４位でＦからＬへ変異したＧＦＰ(Ｆ６４Ｌ)および２２２位でＥからＧへ変異したＧＦＰ(Ｅ２２２Ｇ)は顕著な特性を有することが示されている。第一に、Ｆ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰは、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰとは全く異なるスペクトルを有することが示されている(実施例２)。対照的に、フォールディング特性には実質的な相違はない(蛍光が、その２つのＧＦＰで観察されるとき、同時に測定した。実施例３)。同様に、その２つのＧＦＰにはｐＨ感受性に相違はない(実施例４)。Ｅ２２２Ｇ対Ｓ６５Ｔ変異Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰの光度は、試験条件に依存する(実施例５)。
【００１２】
本発明の詳細な説明
本発明の１つの態様は、緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)または任意の機能性ＧＦＰ類似体から得られる蛍光タンパク質に関連する。この場合、クロモホア前の１位のアミノ酸が変異し、２２２位のグルタミン酸が変異し、当該変異ＧＦＰがＦ６４Ｌ−ＧＦＰと比べてより高い波長で最大励起を有し、当該蛍光は、変異したＧＦＰが３０℃または野生型ＧＦＰと比較して高い温度でインキュベートされる細胞中で発現するときに増大する。
【００１３】
Ｆ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの励起および放射特性は、野生型ＧＦＰおよびＥＧＦＰとは有意な差がある。今ある蛍光タンパク質は、定量性蛍光顕微鏡のような研究応用のための有用性について解説されている(Patterson, G.H., et al (1997). Biophysical J. 73: 2782-2790; Piston, D.W., et al (1999) Meth. Cell Biol. 58: 31-48)。しかし、薬物発見におけるハイスループットスクリーニング(ＨＴＳ)応用についての最適蛍光タンパク質特性が、研究応用のためのものとは幾分異なることが、今日明らかとなっている(Kain, S.R. (1999) Drug Discovery Tody 4:304-312)。例えば、最適およびシグナル／ノイズのような因子が、薬物発見のＨＴＳ応用では、蛍光タンパク質のようなプローブの確実な(absolute)光度よりも重要となる。本特許出願で記載するＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰは、ＥＧＦＰの最大励起４９０ｎｍおよび最大放射５１０ｎｍのそれぞれに対して、最大励起４７０ｎｍおよび最大放射５０５ｎｍを有する(図３参照)。これは、ＥＧＦＰの２０ｎｍに対して、Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰのストークスシフト３５ｎｍを生ずる。これは、ハイスループットスクリーニングにおけるＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの使用と幾分密接に関わる、ＥＧＦＰ関連Ｆ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの励起−放射バンド分離に有意な増加を生ずる。これらの幾つかを以下に列挙する。
【００１４】
１．Ｆ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの増加ストークスシフトは、その励起および放射ピークのスペクトル分離を増加する。これは、通常の二色性光線−スプリッターを用い、より完全なバンド分離を可能とし、ＥＧＦＰに基づくアッセイに相関するＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰを組み込むアッセイに関するバックグラウンドシグナルを減少する。
【００１５】
２．Ｆ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ蛍光性は、細いバンドフィルターを用いる通常の光源、または４７２ｎｍの商業上利用可能なレーザー発生線(laser producing line)により励起され得る。何れの場合でも、F６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの大きなストークスシフトが、励起光から放射スペクトルの先端までのクロストーク(cross-talk)を低くする。
【００１６】
３．Ｆ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの最大励起は、シアン蛍光タンパク質変異体(ＥＣＦＰ、最大励起〜４３３ｎｍ)のものと、黄色蛍光タンパク質変異体(ＥＹＦＰ、最大励起〜５１３ｎｍ)のものとの間に生じる(fall)。このため、プローブと共に使用するときバンド分離がきれいになり、幾つかのＧＦＰ標識コンポーネントが複合となるアッセイ応用に最適となる。
【００１７】
多くのＧＦＰ源が存在する。例として、Aequorea victoria由来ＧＦＰおよびRenilla由来ＧＦＰがある。種々のＧＦＰが、Renillaから単離され、その例はreniformisおよびmulleriである。実施例および配列番号３および４に記載されるように、Aequorea victoriaのクロモホアは、ＧＦＰの予想一次アミノ酸配列の６５−６７位である。そのため、好ましい実施態様では、ＧＦＰは、Aequorea victoria由来である。
【００１８】
Ｆ６４の変異は、脂肪族アミノ酸への変異が好ましい。例は、Ｆ６４Ｌ、Ｆ６４Ｉ、Ｆ６４Ｖ、Ｆ６４Ａ、およびＦ６４Ｇであり、この場合、Ｆ６４Ｌ置換が最も好ましい。しかし、クロモホア直前の他の変異、例えば、欠失、挿入、または翻訳後修飾が本発明に含まれ、それにより、種々の蛍光タンパク質の蛍光特性が改善する。広範囲の欠失が、ＧＦＰの蛍光特性の喪失を生ずることに注意すべきである。
【００１９】
Ｅ２２２Ｇ、Ｅ２２２Ａ、Ｅ２２２Ｖ、Ｅ２２２Ｌ、Ｅ２２２Ｉ、Ｅ２２２Ｆ、Ｅ２２２Ｓ、Ｅ２２２Ｔ、Ｅ２２２Ｎ、Ｅ２２２Ｑ置換が好ましく、Ｅ２２２Ｇ置換(グリシンへの置換)が最も好ましい。
【００２０】
Aequorea victoria由来ＧＦＰをコードする遺伝子の好ましい配列は、配列番号３(促進された)および配列番号７(クラゲ)に開示されている。配列番号１は、ヒトに適応させたコドンを有するＦ６４Ｌ−ＧＦＰのヌクレオチド配列を示す。配列番号５は、クラゲのコドンを有するＦ６４Ｌ−ＧＦＰのヌクレオチド配列を示す。加えて、新規蛍光タンパク質はまた、上記のような他の蛍光タンパク質から得ることができる。
【００２１】
ここで、アミノ酸に使用する略語は、J. Biol. Chem. 243 (1968), 3558に記載されたものである。
【００２２】
本発明の１態様は、蛍光タンパク質Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列に関連する。そのＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの例を表２に示す。好ましい態様では、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列の形式である。
【００２３】
新規蛍光タンパク質をコードする本発明のＤＮＡ構成物は、確立された標準方法、例えば、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されているホスホアミダイト法、またはMatthes et al., EMBO Jornal 3 (1984), 801-805に記載されている方法により、合成的に調製され得る。ホスホアミダイト法により、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーで合成し、精製し、アニールし、ライゲートし、適当なベクターにクローニングする。
【００２４】
ＤＮＡ構成物はまた、特異的プライマー、例えば、US4,683,202またはSaiki et al., Science 239 (1988), 487-491に記載されているようなプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により調製され得る。ＰＣＲ法のより近年のレビューには、PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAがある。
【００２５】
本発明のＤＮＡ構成物を、組換えＤＮＡ手順に通常供することができる任意のベクターである組換え体ベクターに挿入し得る。ベクターの選択は、しばしば、導入される宿主細胞に依存する。そのため、ベクターは自己複製ベクター、すなわち、染色体外存在物(extrachromosomal entity)として存在し、その複製は、染色体複製とは独立しているベクターであり得、例えば、プラスミドである。他に、ベクターは、宿主細胞中に導入されると、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、その組み込まれた染色体と共に複製されるものであり得る。
【００２６】
ベクターは、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡの転写に必要な付加セグメントに実施可能なように連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡから得られるか、または両方のエレメントを含み得る。「実施可能なように連結」という語は、目的、例えばプロモーターにおける転写開始のため一斉に機能し、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を介して続行するように、セグメントが配列されることを意味する。
【００２７】
プロモーターは、選択の宿主細胞における転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、天然Aequorea ＧＦＰ遺伝子を含む宿主細胞と相同的または異種的、いずれかのタンパク質をコードする遺伝子から得ることができる。
【００２８】
哺乳類細胞における本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列の転写を目的とする適当なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター(Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854-864)、ＭＴ−１(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiter et al., Science 222(1983), 809-814)またはアデノウイルス２メジャーレイトプロモーターである。
【００２９】
昆虫細胞中で使用する適当なプロモーターの例は、ポリヘドリンプロモーター(US4,745,051; Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7-11)、Ｐ１０プロモーター(J.M. Vlak et al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776)、Autographa californica ポリヘドロシスウイルスベーシックタンパク質プロモーター(EP397485)、バキュロウイルス最初期遺伝子１プロモーター(US5,155,037; US5,162,222)、またはバキュロウイルス３９Ｋ遅延−初期遺伝子プロモーター(US5,155,037; US5,162,222)である。
【００３０】
酵母宿主細胞に使用の適当なプロモーターの例は、酵母糖分解遺伝子(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073-12080; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1(1982), 419-434)またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al., eds.), Plenum Press, New York, 1982)由来のプロモーター、またはＴＰＩ１(US4,599,311)もしくはＡＤＨ２−４ｃ(Russell et al., Nature 304(1983), 652-654)プロモーターを含む。
【００３１】
繊維状真菌宿主細胞に使用の適当なプロモーターの例は、例えば、ＡＤＨ３プロモーター(McKnight et al., The EMBO J. 4(1985), 2093-2099)またはｔｐｉＡプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A. oryzae TAKAアミラーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギンプロテイナーゼ、A. niger 天然α−アミラーゼ、A. niger 酸安定性α−アミラーゼ、A. nigerもしくはA. awamoriグルコアミラーゼ(gluA)、Rhizomucor mieheiリパーゼ、A. oryzaeアルカリプロテアーゼ、A. oryzaeトリオースホスフェートイソメラーゼまたはA. nidulansアセタミダーゼをコードする遺伝子由来のものである。好ましくは、TAKA-アミラーゼおよびgluAプロモーターである。
【００３２】
細菌性宿主細胞に使用に適当なプロモーターの例は、Bacillus stearothermophilusマルトース生成性(maltogenic)アミラーゼ遺伝子、Bacillus licheniformis α−アミラーゼ遺伝子、Bacillus amyloliquefaciens BANアミラーゼ遺伝子、Bacillus subtilisアルカリプロテアーゼ遺伝子、またはBacillus pumilusキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、またはラムダファージＰＲまたはＰＬプロ−モーターまたはE. coli lac、trpまたはtacプロモーターを含む。
【００３３】
本発明の新規蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列はまた、必要ならば、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., op. cit.)または(真菌宿主の場合)ＴＰＩ１(Alber and Kawasaki, op. cit.)またはＡＤＨ３(McKnight et al., op. cit.)ターミネーターのような適当なターミネーターに実施可能なように連結し得る。ベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５ＥＩｂ領域由来)、転写エンハンサー配列(例えば、ＳＶ４０エンハンサー)および翻訳エンハンサー配列(例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの)のようなエレメントを更に含み得る。
【００３４】
組換え体ベクターは、更に、目的の宿主細胞中でベクターが複製可能なＤＮＡ配列を含み得る。その配列の例(宿主細胞が哺乳類細胞のとき)は、ＳＶ４０複製オリジンである。
【００３５】
宿主細胞が酵母細胞であるとき、ベクターの複製を可能にする適当な配列は、酵母プラスミド２μ複製遺伝子ＲＥＰ１−３および複製オリジンである。
【００３６】
当該ベクターはまた、選択マーカー、例えば、ジヒドロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ)をコードする遺伝子またはSchizosaccharomyces pombe TPI遺伝子(P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130)、または薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンまたはヒグロマイシンに対する耐性を供与するもののような、宿主細胞の欠如を補う遺伝子産物を含み得る。繊維状真菌の場合、選択マーカーはamdS、pyrG、argB、niaD、sCを含む。
【００３７】
本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列のライゲーションに使用する手順、プロモーターおよび所望によりターミネーターおよび／または分泌シグナル配列、それぞれおよび複製に必要な情報を含む適当なベクターにそれらの配列を挿入することは、当業者に既知である(例えば、Sambrook et al., op.cit.)。
【００３８】
本発明のＤＮＡ構成物または組換え体ベクターが導入される宿主細胞は、本ＤＮＡ構成物を発現し得る任意の細胞であり得、細菌、酵母、真菌およびより高等な細胞を含む。
【００３９】
培養において、本発明のＤＮＡ構成物を発現することができる細菌性宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えば、B. subtilis、B. licheniformis、B. lenfus、B. brevis、B. stearothermophilus、B. alkalophilus、B. amyloliquefaciens、B. coagulans、B. circulans、B. lautus、B. megatheriumまたはB. thuringiensisのようなBacillus株、またはS. lividansまたはS. murinusのようなStreptomyces株またはE. coliのようなグラム陰性細菌である。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換により、または既知の手法のコンピテント細胞を用いることにより、行い得る。
【００４０】
適当な哺乳類細胞系の例は、ＨＥＫ２９３およびＨｅＬａ細胞系、初代細胞、およびＣＯＳ(例えば、ATCC CRL1650)、ＢＨＫ(例えば、ATCC CRL 1632、ATCC CCL10)、ＣＨＬ(例えば、ATCC CCL39)またはＣＨＯ(例えば、ATCC CCL 61)細胞系である。哺乳類細胞をトランスフェクトする方法および細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現する方法は、Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327-341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(1982), 422-426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham and van der EB, Virology 52(1973), 456; およびNeumann et al., EMBO J. 1(1982), 841-845に記載されている。
【００４１】
適当な酵母細胞の例は、Saccharomyces ssp.またはSchizosaccharomyces ssp.特にSaccharomyces cerevisiaeまたはSaccharomyces kluyveriの細胞を含む。異種性ＤＮＡを酵母細胞に形質転換する方法およびそれから異種性ポリペプチドを産生する方法が、US4,599,311、US4,931,373、US4,870,008、5,037,743、およびUS4,845,075に記載されており、それらはすべて引用により本明細書に含める。形質転換細胞は、選択マーカー、通常薬物耐性により決定される表現型または特定養分、例えばロイシンの非存在下で増殖する能力により選択される。酵母に使用のための好ましいベクターはUS4,931,373に開示のＰＯＴ１ベクターである。本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、シグナル配列および所望によりリーダー配列、例えば上記のようなものを目的とし得る。適当な酵母細胞の更なる例は、K. lactisのようなKluyveromyces株、Hansenula、例えばH. polymorpha、またはPichia、例えばP. pastorisである(Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp.3459-3465; US4,882,279)。
【００４２】
他の真菌細胞の例は、繊維状真菌、例えば、Aspergillus spp.、Neurospora spp.、Fusarium spp.またはTrichoderma spp.、特にA. oryzae、A. nidulansまたはA. niger株の細胞である。タンパク質の発現のためのAspergillus spp.の使用は、例えば、EP272277、EP230023、EP184438に記載されている。
【００４３】
繊維状真菌を宿主細胞として使用すると、本発明のＤＮＡ構成物を、通常ＤＮＡ構成物を宿主染色体に組み込むことにより形質転換し組換え体宿主細胞を得ることができる。この組み込みは、通常、ＤＮＡ配列が細胞中により安定に維持されるようであるため、利点となると考えられる。ＤＮＡ構成物を宿主染色体へ組み込むことは、通常の方法、例えば相同性または異種性の組換えにより行うことができる。
【００４４】
昆虫細胞の形質転換およびその異種性ポリペプチドの産生は、US4,745,051; US4,879,236; US5,155,037; 5,162,222; EP397,485)に記載されており、それらの文献は、引用により本明細書にすべて加える。宿主として使用する昆虫細胞系は、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia ni細胞のようなLepidoptera細胞系が適当となり得る(US5,077,214参照)。培養条件は、例えばWO89/01029またはWO89/01028、または任意の前記文献に記載されたものが適当となり得る。
【００４５】
本発明の１の態様は、任意の前記態様によりＤＮＡ構成物で形質転換した宿主に関する。次いで、上記形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞は、本ＤＮＡ構成物を発現し得る条件下の適当な養分培地中で培養され、その後、その細胞は、本発明のスクリーニング法に使用され得る。他に細胞は破壊され、その後、細胞抽出物および／または上清を蛍光性について分析し得る。
【００４６】
細胞培養に使用する培地は、適当な補助養分(supplements)を含む最小または複合培地のような、宿主細胞の増殖に適当な任意の通常培地であり得る。適当な培地は、商業上の供給者から利用可能であるか、または開示の方法に従い調製され得る(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)。
【００４７】
本発明の方法では、本発明のＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした細胞の蛍光は、スペクトロメーターまたは蛍光顕微鏡で適当に測定され、この場合、液体培地の細胞のスペクトル特性は、光励起および放射のスキャンとして決定され得る。
【００４８】
本発明の1つの態様は、蛍光タンパク質(Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ)からなる融合化合物に関し、この場合、(Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ)はポリペプチドに連結する。そのポリペプチドの例は、キナーゼ、好ましくは、プロテインキナーゼＡの触媒サブユニットまたはプロテインキナーゼＣ、またはＥｒｋ１、細胞骨格エレメントである。
【００４９】
本発明は、更に、前述の任意の態様により宿主を培養すること、およびヌクレオチド配列により発現するポリペプチドを得ること、を含むポリペプチドを調製する方法に関する。
【００５０】
本発明の種々の態様には、多数(plethora)の使用がある。これら幾つかを以下に記載する。
【００５１】
プロテインキナーゼ活性、または脱リン酸化活性を測定するための、またはタンパク質再分布を測定するためのインビトロアッセイにおけるＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの使用。
【００５２】
生存および固定化細胞におけるタンパク質タグとしてのＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの使用。強力な蛍光性のため、新規タンパク質は、低濃度で存在するタンパク質に適当なタグである。基質を必要とせず、細胞の視覚化により細胞を損傷しないため、動力学的分析が行われ得る。
【００５３】
オルガネラタグとしての使用。１を超えるオルガネラ、例えば小胞体および細胞骨格をタグ化し、生存細胞で同時に視覚化し得る。
【００５４】
分泌マーカーとしての使用。シグナルペプチドまたは分泌したペプチドにＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰを融合することにより、分泌は、生存細胞に直結する。そのための前提条件は、検出可能数の新規蛍光タンパク質分子の成熟が、分泌よりも早いことである。
【００５５】
トランスジェニック動物における遺伝学的レポーターまたはタンパク質タグとしての使用。新規タンパク質の強力な蛍光性のため、それは、タンパク質および遺伝子発現のタグとして適当である。ノイズに対するシグナルの比が、野生型ＧＦＰのような従来タンパク質よりも有意に超えて改善されるからである。
【００５６】
細胞またはオルガネラ完全性(integrity)マーカーとしての使用。２つの新規タンパク質(オルガネラを標的とする１つのタンパク質とサイトソル中で発現する他のタンパク質)を共発現することにより、サイトソルタンパク質の相対的な漏れの算出が可能であり、細胞完全性の測定として使用することが可能である。
【００５７】
細胞形態的変化のマーカーとしての使用。細胞における新規タンパク質の発現は、細胞毒性剤またはアポトーシスにより生ずる細胞形態的変化、例えば小疱形成を容易に検出し得る。その形態的変化を、蛍光性プローブを使用することなく、未処理細胞を視覚化することは困難である。
【００５８】
トランスフェクションマーカーとして、およびＦＡＣＳソーティングと組合せて使用するマーカーとしての使用。新規タンパク質の光度の増加により、細胞検出およびソーティングの質は、有意に改善され得る。
【００５９】
生理学的濃度に近い濃度で機能する(working)リアルタイムプローブとしての使用。約３７℃の細胞中で発現し約４９０ｎｍの光で励起するときの野生型ＧＦＰおよびＦ６４Ｌ−ＧＦＰよりもＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰは有意に明るいため、視覚化に必要な濃度が低下し得る。そのため、新規タンパク質、例えばＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ中に作製された酵素の標的部位は、生存細胞において低濃度で細胞中に存在し得る。これは、２つの理由により重要である：１)プローブは、研究されている細胞内プロセスへの妨害が可能な限り小さくなければならない；２)翻訳および転写機構へのストレスを最小限とすること。
【００６０】
新規タンパク質は、真菌のような生体の生存／死滅バイオマスをモニターするレポーターとして使用され得る。真菌におけるＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰの構造的発現により、生存可能なバイオマスは明るくなる。
【００６１】
トランスポゾンベクター変異は、転写および翻訳融合においてマーカーとして新規タンパク質を使用し行うことができる。
【００６２】
新規タンパク質をコードする微生物において使用されるトランスポゾン。トランスポゾンは、翻訳および転写融合として構成され得る。プロモーターとしてスクリーニングに使用されため。
【００６３】
Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰのような新規タンパク質をコードするトランスポゾンベクターは、プラスミドおよび染色体をタグ化するため使用され得る。
【００６４】
新規タンパク質をバクテリオファージのゲノム中へ導入することによる、細菌性検出のためのレポーターとしての使用。
【００６５】
ファージのゲノム中に新規タンパク質、例えばＦ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰを作製することにより、診断ツールが設計し得る。Ｆ６４Ｌ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰは、生存宿主中へのゲノムのトランスフェクションにおいてのみ発現する。宿主特異性は、バクテリオファージにより定義される。
【００６６】
本発明を、更に、添付の配列表を参照して、以下の実施例において解説する。
【表１】
表１配列のリスト
2005518180.tif 000002
【００６７】
図の説明
ＰＳコードは表２に解説している。
【００６８】
図１
ＰＳ１１８９(最大励起４９２ｎｍ)、ＰＳ１１９１(最大励起４６８ｎｍ)、ＰＳ１１８５(最大励起４９０ｎｍ)およびＰＳ１１８６(最大励起４７３ｎｍ)の励起スペクトル。放射は５６０ｎｍで記録した。ＰＳ１１８９およびＰＳ１１９１のサンプルは２倍希釈し、ＰＳ１１８５およびＰＳ１１８６のサンプルは１０倍希釈した。
【００６９】
図２
ＰＳ１１８９(最大放射５０９ｎｍ)、ＰＳ１１９１(最大放射５０５ｎｍ)、ＰＳ１１８５(最大放射５１０ｎｍ)およびＰＳ１１８６(最大放射５０６ｎｍ)の放射スペクトル。励起は４３０ｎｍであった。ＰＳ１１８９、ＰＳ１１９１、およびＰＳ１１８５のサンプルは２倍希釈し、ＰＳ１１８６のサンプルは１０倍希釈した。ＰＳ１１８９およびＰＳ１１９１のカーブは、第一のｙ軸に関連し、その一方、ＰＳ１１８５およびＰＳ１１８６のカーブは、第二のｙ軸に関連する。
【００７０】
図３
ＰＳ１１８９(パネルＡ)、ＰＳ１１９１(パネルＢ)、ＰＳ１１８５(パネルＣ)、およびＰＳ１１８６(パネルＤ)の励起(Ｅｘ)および放射(Ｅｍ)スペクトルのオーバーラッピング。左側の励起カーブおよび右側の励起カーブは、それぞれ、第一のおよび第二のｙ軸に関連する。
【００７１】
図４
この図は、リポフェクタミン２０００トランスフェクション後に回収したイメージを示す。ｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ(ＰＳ６９９)は、Ｅ２２２Ｇとして称する右側カラムの上である。ｅＦ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ(ＰＳ２７９)は、ＥＧＦＰとして称する左側カラムの上である。
【００７２】
図５
ＥＧＦＰ(ＰＳ２７９)とｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ(ＰＳ６９９)とのｐＨ感受性の比較。
【００７３】
実施例
実施例１：ＧＦＰプラスミドの構成
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１(GenBnak accession number U55762)およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１(GenBank accession number U55763)、両方は、ＧＦＰの誘導体を含み、その誘導体には、２位に別のアミノ酸が付加されて、よりよい翻訳開始配列が提供され(Kozak配列)、アミノ酸の総計は、野生型ＧＦＰの２３８から２３９に１増える。そのため、これらプラスミドのＧＦＰ中の変異の決定は、例えば、Ｆ６４ＬよりもＦ６５Ｌのように称するべきである。しかし、混乱を避けるため、およびＧＦＰコミュニティーが、そのコミュニケーションに野生型ＧＦＰのナンバリングシステムを採用しているため、ここで使用するナンバーは、野生型ＧＦＰ中の変異の通常の命名に合わせている。この点の関連変異は、Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５ＴおよびＥ２２２Ｇである。
【００７４】
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１は、クロモホア中に以下の変異を含む：Ｆ６４ＬおよびＳ６５Ｔ。ＧＦＰ ＤＮＡ配列のコドン利用は、哺乳類細胞中での発現に最適化されている。Ｎ１およびＣ１は、ＧＦＰ配列に関連するマルチクローニングサイトの位置に言及している。
【００７５】
Ｆ６４ＬおよびＥ２２２Ｇを組合せるプラスミドを構成するため、以下に述べるように、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１およびｐＥＧＦＰ−Ｃ１に、プライマー９８５９および９８６０を用いＰＣＲを行った。当該プライマーは、クロモホア領域周辺のＤＮＡ配列に相補的であり、６５位のスレオニンをセリンに変化する点変異を導入する。加えて、当該プライマーは、サイレント変異により特有のＳｐｅ１制限酵素部位を導入する。４．７ｋｂＰＣＲ産物をＳｐｅ１で消化し、ライゲーションし、E. coliに形質転換した。生じたプラスミドをＰＳ３９９(Ｎ１コンテクスト)およびＰＳ４０１(Ｃ１コンテクスト)と称する。これらのプラスミドは、クロモホア配列６４−ＬＳＹＧ−６７を含む。プラスミドＰＳ３９９およびＰＳ４０１に、以下に述べるように、プライマー０２２５および０２２６と共にＰＣＲを用いるＱｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ変異誘発(Stratagene)をさせる。これらのプライマーは、ＧＦＰのＣ−末端近傍の配列に相補的であり、２２２位のグルタミン酸をグリシンに変え、加えて、サイレント変異によりＡｖｒ２制限酵素部位が導入される。得られたプラスミドをＰＳ６９９(Ｎ１コンテクスト)およびＰＳ７０１(Ｃ１コンテクスト)と称する。それらは、ＬＳＹＧクロモホアを、ヒトに適用したコドンであるＥ２２２Ｇと合わせ、ｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇと称する(配列番号２)。
【化１】
2005518180.tif 000003
【００７６】
Ｆ６４ＬのクラゲからＧＦＰを直接誘導されるＧＦＰをコードするプラスミド(WO97/11094の図４で開示)を、以下に記載したようにプライマー９８４０および９８４１を用いＰＣＲした。ＰＣＲ産物を制限酵素Ａｇｅ１およびＡｃｃ６５で消化し、Ａｇｅ１およびＢｓｒＧ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１にライゲーションした。これにより、ＥＧＦＰをＦ６４Ｌ−ＧＦＰで置換し、Ｃ末端近傍のアミノ酸変化Ｌ２３６Ｇを導入し、その結果、Ａｃｃ６５およびＢｓｒＧ１部位に結合する。このプラスミドをＰＳ３５０と称する。
【００７７】
Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔのクラゲから直接誘導されるＧＦＰをコードするプラスミド(WO97/11094の図５で開示)を、以下に記載したようにプライマー９８４０および９８４１を用いＰＣＲした。ＰＣＲ産物を制限酵素Ａｇｅ１およびＡｃｃ６５で消化し、Ａｇｅ１およびＢｓｒＧ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１にライゲーションした。これにより、ＥＧＦＰをＦ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰで置換し、Ｃ末端近傍のアミノ酸変化Ｌ２３６Ｇを導入し、その結果、Ａｃｃ６５およびＢｓｒＧ１部位に結合する。このプラスミドをＰＳ３５１と称する。
【００７８】
プラスミドＰＳ３５０を、以下に記載したように、プライマー０３１７および０３１８と共にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲ(Stratagene)した。これにより、変異によるＥ２２２Ｇが導入され、サイレント変異によるＡｖｒ２制限酵素部位が導入された。このプラスミドをＰＳ８３２と称する。
【００７９】
プラスミドＰＳ８３２を、以下に記載したように、プライマー０３２５および０３２６と共にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲ(Stratagene)した。これにより、変異によるＬ６４Ｆが導入され、サイレント変異によるＰｓｐ１４０６制限酵素部位が導入された。このプラスミドをＰＳ８４５と称する。
【００８０】
クラゲから直接誘導されるＧＦＰをコードするプラスミド(WO97/11094の図２ａで開示)を、以下に記載したようにプライマー９８４０および９８４１を用いＰＣＲした。ＰＣＲ産物を制限酵素Ａｇｅ１およびＡｃｃ６５で消化し、Ａｇｅ１およびＢｓｒＧ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｎ１にライゲーションした。これにより、ＥＧＦＰを野生型ＧＦＰで置換し、Ｃ末端近傍のアミノ酸変化Ｌ２３６Ｇを導入し、その結果、Ａｃｃ６５およびＢｓｒＧ１部位に結合する。このプラスミドをＰＳ８５４と称する。
【００８１】
プラスミドＰＳ３９９を、以下に記載したように、プライマー０３２７および０３２８と共にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲ(Stratagene)した。これにより、変異によるＬ６４Ｆが導入され、サイレント変異によるＰｓｐ１４０６制限酵素部位が導入された。このプラスミドをＰＳ８４４と称する。
【００８２】
プラスミドＰＳ６９９を、以下に記載したように、プライマー０３２７および０３２８と共にＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲ(Stratagene)した。これにより、変異によるＬ６４Ｆが導入され、サイレント変異によるＰｓｐ１４０６制限酵素部位が導入された。このプラスミドをＰＳ８４６と称する。
【化２】
2005518180.tif 000004
【００８３】
クラゲコドンコンテクストにＧＦＰをコードするプラスミド(ＰＳ３５０、ＰＳ３５１、ＰＳ８３２、ＰＳ８４５、ＰＳ８５４)を、以下に記載したように、プライマー１２５９および１２６０と共にＰＣＲした。約０．８ｋｂ ＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨ１およびＢａｍＨＩで切断し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断したE. coli発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ(Invitrogenより)中にライゲーションした。これにより、ＧＦＰは、ベクター中のＩＰＴＧ誘導性プロモーターの調節下に位置する。ボトムプライマー１２６０はまた、２３６位のグリシンが変化し、ロイシンに戻る。得られたプラスミドをＰＳ１１８４(ｊｆ−Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ)、ＰＳ１１８５(ｊｆ−Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ)、ＰＳ１１８６(ｊｆ−Ｆ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ)、ＰＳ１１８７(ｊｆ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ)およびＰＳ(ｊｆ−ＧＦＰ)と称する。
【００８４】
ヒトに適応させ促進させたコドンコンテクストにＧＦＰをコードするプラスミド(ＰＳ２７９＝ｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clontech)、ＰＳ３９９、ＰＳ６９９、ＰＳ８４４、ＰＳ８４６)を、以下に記載したように、プライマー１２６１および１２６２と共にＰＣＲした。約０．８ｋｂ ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断したE. coli発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ(Invitrogenより)中にライゲーションした。これにより、ＧＦＰは、ベクター中のＩＰＴＧ誘導性プロモーターの調節下に位置する。得られたプラスミドをＰＳ１１８９(ｅ−Ｆ６４Ｌ、Ｓ６５Ｔ−ＧＦＰ＝ＥＧＦＰ)、ＰＳ１１９０(ｅ−Ｆ６４Ｌ−ＧＦＰ)、ＰＳ１１９１(ｅ−Ｆ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ)、ＰＳ１１９２(ｅ−ＧＦＰ)およびＰＳ１１９３(ｅ−Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ)と称する。
【化３】
2005518180.tif 000005
【００８５】
上記プラスミドをE. coli株ＤＨ５α(Life Technologies)に形質転換した。シングルコロニーをピックし、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地中で３７℃で一夜増殖させた。０．５ｍｌ細胞をペレットとし、分析するまで−２０℃で保存した。
【表２】
2005518180.tif 000006
【００８６】
実施例２：タンパク質ＥＧＦＰおよびｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇのスペクトル特性の決定
プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１(またＰＳ２７９とも称する)由来のＥＧＦＰを発現するプラスミド、およびプラスミドＰＳ６９９由来のｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇを発現するプラスミドを、製造者推奨に従い、リポフェクタミン２０００(Life Technologiesより)を用い、E. coliＴＯＰ１０細胞(Invitrogen)にトランスフェクトした。５日後、細胞を回収し、１ｍＭ ＤＴＴを有する抽出緩衝液
５０ｍＭ ＴＲＩＳ(ｐＨ８．０)中に再懸濁した。３回、凍結−融解を繰り返し、細胞を溶解させた。細胞の残骸を、冷却遠心分離で１００００ｇで遠心分離した。ＮａＣｌを１００ｍＭとなるまで加えた。
【００８７】
細胞ペレットをＨ２Ｏ１０００μｌにそれぞれ懸濁し(ペレット培養液の体積に対し２倍希釈)、１．０×０．５ｃｍプラスチックキュベットに移し、その後、励起および放射スペクトルをPerkin Elmer LS50Bルミネセンススペクトロメーターで記録した。
【００８８】
励起スペクトル：
励起３５０−５２５ｎｍ(スリット幅５ｎｍ)  放射５６０ｎｍ(スリット幅１０ｎｍ)
図１にデータを示した。
【００８９】
放射スペクトル：
励起４３０ｎｍ(スリット幅１０ｎｍ)  放射４５０−５５０ｎｍ(スリット幅５ｎｍ)
図２にデータを示した。
【００９０】
同じセッティングを使用し、１０倍(水８００μｌと混合した２倍希釈細胞２００μｌ)希釈細胞の励起および放射スペクトルを、クラゲバックボーン(ＰＳ１１８５およびＰＳ１１８６)のｃＤＮＡから発現する強力な蛍光サンプルについて記録した。
【００９１】
発現レベルとは対照的に、プローブの蛍光特性は、コドン利用とは独立していた。Ｔｈｒ６５：Ｅ２２２を有するプローブ(ＰＳ１１８５およびＰＳ１１８９)について記録したスペクトルは、非常に似ており(最大励起および最大放射はそれぞれ４９０−４９２ｎｍおよび５０９−５１０ｎｍ)、１７−２０ｎｍのストークスシフトを有していた。同様に、Ｓｅｒ６５：Ｇ２２２を有するプローブ(ＰＳ１１８６およびＰＳ１１９１)について測定したスペクトルは、非常に似ており(最大励起および最大放射はそれぞれ４６８−４７３ｎｍおよび５０５−５０６ｎｍ)、３３−３７ｎｍのストークスシフトを有していた。
【００９２】
実施例３：ＣＨＯ細胞中のＥＧＦＰおよびｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇの蛍光時間の決定
ＣＨＯｈＩＲ細胞を有する３つの２ウェルチャンバーを、リポフェクタミントランスフェクション法を用い、ＥＧＦＰを発現するプラスミドＰＳ２７９およびｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇを発現するプラスミドＰＳ６９９でトランスフェクトした。
【００９３】
細胞の蛍光性を、トランスフェクション後、一定のインターバルで測定した。
【００９４】
リポフェクタミン２０００トランスフェクション法を用い、ＥＧＦＰおよびｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇを、ＣＨＯｈＩＲ細胞を有する１つの８ウェルチャンバー中にトランスフェクトした。細胞由来の蛍光を、上記のようにトランスフェクション後、一定インターバルで測定した。各インターバルで同じ細胞視野からイメージをとった。３種の視野を各プラスミドに関し観察した。顕微鏡およびカメラセッティングは各イメージで同じであった。最適露光時間を、完全ＥＧＦＰを発現する細胞(２４時間前にトランスフェクトした)のチャンバーから採用し、確実に露光を飽和(saturate)させなかった。最初のイメージを、トランスフェクション後４５分から１時間取得し、その後、トランスフェクション後、最初の７．５時間は３０分毎に取得し、イメージはトランスフェクション後２６．５時間回収した。５つの視野を、各プラスミドについて観察した。ｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇの蛍光は、トランスフェクション後２．５時間の１視野で検出された。残りの視野では、蛍光は、トランスフェクション後、４時間よりも後では検出されなかった(図４)。
【００９５】
実施例４：ｐＨ４．０からｐＨ１２．０の範囲におけるＥＧＦＰとｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇとの間のｐＨ感受性の比較
ＣＯＳ７細胞発現で産生する、幾分精製した(semi-purified)、ＰＳ２７９由来ＥＧＦＰタンパク質およびＰＳ６９９由来ｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇタンパク質のサンプルを、０．５ポイントインターバルで、ｐＨ４．０からｐＨ１２．５の範囲においてｐＨ感受性を試験した。励起および放射スキャンを、ｐＨ４．０、８．０および１２．５で各タンパク質で行った。そのスキャン結果から、ＥＧＦＰは最大励起４９０ｎｍおよび最大放射は５１０ｎｍであり、ｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇの最大励起は４７５ｎｍおよび最大放射は５０４ｎｍであることがわかった。ｐＨ値の相違は、最大励起または最大放射に影響を与えなかった。シングルリードは、励起４７０ｎｍおよび放射５１０ｎｍで生じ、１０ｎｍスリットで生じる。結果では、ｐＨ感受性に関してＥＧＦＰとｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇとの間に明白な相違はない。但し、ランダムな変動の原因となるものは除かれる(図５)。この実験は、繰り返しても実質的に同じ結果を生ずる。
【００９６】
実施例５：ＧＦＰの相対的光度の比較
１０プラスミドを、以下の特徴のうちの幾つかを組合せるように構成した：
６４位でのＦまたはＬ
６５位でのＳまたはＴ
２２２位でのＥまたはＧ
「クラゲ」または「ヒトに適応させ、促進させた」ＧＦＰバックボーン。
【００９７】
プラスミドをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。１、２および４日後、当該細胞を、二人により蛍光顕微鏡で視覚的に観察した。励起は４７５／４０＝青色光および放射５１０−５６０＝緑色光であった。細胞は、実質的に黒色から極度の光輝(extremely bright)までの範囲で「緑色」のスケールで評価した(表３)。結果は、時間ではほとんど変わらなかった。
【表３】
2005518180.tif 000007
【００９８】
プラスミドをＨｅＬａ細胞中にまたトランスフェクトした。トランスフェクト２４時間後、当該細胞を、全体の細胞蛍光性の特性解析のために、５３０／３０ｎｍ(５１５−５４５ｎｍ)にセットした蛍光フィルターで調べる放射および励起４８８ｎｍを用いたFACS Caliburフローサイトメーターにかけた。１００００のイベントを各トランスフェクションについて回収し、２つへの複製を各構成物について行った。ＦＡＣＳ分析からの平均蛍光密度を、幾何平均として得(ｌｏｇスケールにおける平均蛍光)、結果を表４に示す。
【表４】
2005518180.tif 000008
【００９９】
哺乳類ＨｅＬａ細胞で発現させるとき、ヒトに適応させたコドンを有するＧＦＰは、クラゲコドンを有するＧＦＰよりもはるかに明るいことが上記の表からわかる。ＥＧＦＰおよびｅ−ＢｉｏＥ２２２Ｇがもっとも明るい。これらの条件下でＥＧＦＰがＥ−ＢｉｏＥ２２２Ｇの約２倍の明るさを有することは驚くべきことではない。ＦＡＣＳの励起は４８８ｎｍであり、ＥＧＦＰの最大励起４９０ｎｍに近い。以下の表５に解説するように、ＥＧＦＰの放射９７％が捕捉され、その一方、ｅ−ＢｉｏＥ２２２Ｇでは８６％のみとなる。更に、ｅ−ｂｉｏＥ２２２Ｇの最大励起４７０ｎｍで励起したときの、ＥＧＦＰとｅ−ｂｉｏＥ２２２Ｇとの強度の相違は、検知できない。
【表５】
2005518180.tif 000009
【０１００】
促進された哺乳類細胞では、ＧＦＰは、クラゲＧＦＰよりも明るかった。E. coliでは、クラゲＧＦＰは、促進されたＧＦＰよりも明るかった。そのため、ＧＦＰバックボーンを選択するときには、その後の宿主によって相当に注意が必要となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＰＳ１１８９(最大励起４９２ｎｍ)、ＰＳ１１９１(最大励起４６８ｎｍ)、ＰＳ１１８５(最大励起４９０ｎｍ)およびＰＳ１１８６(最大励起４７３ｎｍ)の励起スペクトルを示す。
【図２】  図２は、ＰＳ１１８９(最大放射５０９ｎｍ)、ＰＳ１１９１(最大放射５０５ｎｍ)、ＰＳ１１８５(最大放射５１０ｎｍ)およびＰＳ１１８６(最大放射５０６ｎｍ)の放射スペクトルを示す。
【図３】  図３は、ＰＳ１１８９(パネルＡ)、ＰＳ１１９１(パネルＢ)、ＰＳ１１８５(パネルＣ)、およびＰＳ１１８６(パネルＤ)の励起(Ｅｘ)および放射(Ｅｍ)スペクトルのオーバーラッピングを示す。
【図４】  図４は、リポフェクタミン２０００トランスフェクション後に回収したイメージを示す。
【図５】  図５は、ＥＧＦＰ(ＰＳ２７９)とｅＦ６４Ｌ、Ｅ２２２Ｇ−ＧＦＰ(ＰＳ６９９)とのｐＨ感受性の比較を示す。
【配列表】
2005518180.tif 000010
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2005518180.tif 000017
【図１】
2005518180.tif 000018
【図２】
2005518180.tif 000019
【図３】
2005518180.tif 000020
2005518180.tif 000021
2005518180.tif 000022
2005518180.tif 000023
【図４】
2005518180.tif 000024
【図５】
2005518180.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成15年7月15日(2003.7.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)、または任意の機能的ＧＦＰ類似体から得られた蛍光タンパク質であって、クロモホア前の１位のアミノ酸が変異し、２２２位のグルタミン酸が変異し、当該変異ＧＦＰがより高い波長で最大励起(excitation maximum)を有し、当該蛍光は、変異したＧＦＰが３０℃または野生型ＧＦＰと比較して高い温度でインキュベートされる細胞中で発現するときに増大する、蛍光タンパク質。
【請求項２】  クロモホアが、ＧＦＰの予測一次アミノ酸配列の６５−５７位にある、請求項１の蛍光タンパク質。
【請求項３】  タンパク質が、Aequoria victoreaまたはRenillaから得られる、請求項１または２の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項４】  ＧＦＰの６４位のアミノ酸Ｆが、脂肪族アミノ酸で置換されている、請求項１から３の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項５】  ＧＦＰの６４位のアミノ酸Ｆが、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＡおよびＧからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている、請求項１から４の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項６】  ＧＦＰの６４位のアミノ酸Ｆが、Ｌで置換されている、請求項１から５の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項７】  ＧＦＰの２２２位のアミノ酸Ｅが、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＱからなる群から選択されたアミノ酸で置換されている、請求項１から６の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項８】  ＧＦＰの２２２位のアミノ酸Ｅが、Ｇで置換されている、請求項１から７の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項９】  配列番号４に開示のアミノ酸配列を有する、請求項１から８の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項１０】  配列番号８に開示のアミノ酸配列を有する、請求項１から９の何れかの蛍光タンパク質。
【請求項１１】  ＧＦＰがポリペプチドに連結している、請求項１から１０の何れかの蛍光タンパク質(ＧＦＰ)からなる、融合化合物。
【請求項１２】  ポリペプチドが、キナーゼ、好ましくは、プロテインキナーゼＡまたはプロテインキナーゼＣの触媒サブユニット、またはＥｒｋ１、または細胞骨格エレメントである、請求項１１の融合化合物。
【請求項１３】  請求項１から１０の何れかの蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１４】  配列番号３で示される、請求項１３のヌクレオチド配列。
【請求項１５】  配列番号７で示される、請求項１３のヌクレオチド配列。
【請求項１６】  ＤＮＡ配列の形式である、請求項１３から１５の何れかのヌクレオチド配列。
【請求項１７】  請求項１３から１６の何れかのＤＮＡ構成物で形質転換した宿主。
【請求項１８】  ポリペプチドを調製し、請求項１７の宿主を培養することを含み、それから、ヌクレオチド配列により発現したポリペプチドを得るための方法。
【請求項１９】  プロテインキナーゼ活性、脱リン酸化活性を測定するため、またはタンパク質再分布を測定するためのインビトロアッセイにおける、請求項１から１０の何れかの蛍光タンパク質の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
ベクターは、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡの転写に必要な付加セグメントに作動可能なように連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターはプラスミドまたはウイルスＤＮＡから得られるか、または両方のエレメントを含み得る。「作動可能なように連結」という語は、目的、例えばプロモーターにおける転写開始のため一斉に機能し、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列を介して続行するように、セグメントが配列されることを意味する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明の新規蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ配列はまた、必要ならば、ヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiter et al., op. cit.)または(真菌宿主の場合)ＴＰＩ１(Alber and Kawasaki, op. cit.)またはＡＤＨ３(McKnight et al., op. cit.)ターミネーターのような適当なターミネーターに作動可能なように連結し得る。ベクターは、ポリアデニル化シグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５ＥＩｂ領域由来)、転写エンハンサー配列(例えば、ＳＶ４０エンハンサー)および翻訳エンハンサー配列(例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの)のようなエレメントを更に含み得る。
【国際調査報告】
2005518180.tif 000026
2005518180.tif 000027
2005518180.tif 000028