(57)【要約】本発明は、身体サンプルに由来する疾患に関連する細胞を検出するための方法に関し、ここで身体サンプルの細胞は、以下の構成要素：ａ）細胞中の病理学的変化に起因する変更された活性を示す転写因子に結合するための、少なくとも１つのＤＮＡ部位を含むプロモーターエレメント、およびｂ）病的な細胞を検出可能であり、次いでトランスフェクトされた細胞または感染された細胞を検出するレポーター遺伝子、を含む核酸構築物でトランスフェクトされるかまたは感染されると特徴付けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
身体サンプル中の疾患関連細胞を検出するための方法であって、該身体サンプルの細胞が、以下の構成要素：
ａ）細胞中の病理学的変化に起因する変更された活性を示す転写因子に結合するための、少なくとも１つのＤＮＡ部位を含むプロモーターエレメント、および
ｂ）病的な細胞を検出可能であり、次いでトランスフェクトされた細胞または感染された細胞を検出するレポーター遺伝子、
を含む核酸構築物でトランスフェクトされるか、または感染されると特徴付けられる、方法。
【請求項２】
前記核酸構築物が、ＴＣＦ／ＬＥＦ−１、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｍａｘ、ｍｙｂ、Ｅ２Ｆ、ＤＰ１、ＣＲＥＢ、ｐ５３、ＮＦｋＢ、ＮＦＡＴ、ＰＰＡＲ、ＥＳＴ、ＥＬＫ１、ＡＴＦ、ＤＰＣ、ＳＭＡＤ、ＣＨＯＰ、ＭＥＦ、ＭＡＤＨ４、ＧＲ、ＥＲ、ＳＴＡＴ、ＳＲＦ、ＩＳＲＥ、ＳＲＥ、ＨＳＥ、ＡＰ１およびＣＲＥ、の群由来の、転写因子または応答エレメントに結合するための部位を含むと特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポーター遺伝子が、その酵素の性質、蛍光の性質または構造の性質に基づいて検出され得ると特徴付けられる、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項４】
前記レポーター遺伝子が、酵素のカスケードの活性化または阻害に基づいて検出され得ると特徴付けられる、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項５】
単離された細胞を、増殖、分化、アポトーシス、運動性および代謝活性に関して細胞の活動を変更し得る物質と接触させると特徴付けられる、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記身体サンプルが、癌性に変更された細胞を含むと特徴付けられる、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記プロモーター領域が、Ｗｎｔシグナル形質導入カスケードまたはＲａｓシグナル形質導入カスケードの活性を変更すること、ならびに転写因子ｍｙｃおよびｐ５３によって影響されると特徴付けられる、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法を実施するための試薬を備えるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、身体サンプルから疾患に関係した細胞を検出するための方法に関し、この方法は、身体サンプルの細胞が、以下の成分：ａ）細胞における病理学的変化に起因して、変化した活性を示す転写因子を結合するための、少なくとも１つのＤＮＡ部位を含む、プロモーターエレメント、およびｂ）病的細胞を検出することを可能にし、引き続いて、トランスフェクトされた細胞および感染した細胞検出する、レポーター遺伝子、を含む核酸構築物を用いてトランスフェクトまたは感染されることで特徴付けられる。
【背景技術】
【０００２】
心臓疾患および循環器疾患の後の、癌および悪性の新形成は、ドイツおよび世界の他の工業国において、大差をつけて、二番目に最も頻度の高い死の原因である。西欧の工業国における、死亡につながる癌および悪性疾患の全ての新しい症例の大部分は、悪性上皮腫瘍により引き起こされる。ＥＵにおいて、毎年、約５７７，０００人が癌になり、そして、毎年、約３７６，０００人が最も頻度の高い充実性腫瘍型（乳癌、前立腺癌、肺癌および結腸癌）により死亡する。心臓疾患および循環器疾患に関係する死亡率の急激な下降が続く場合、癌は、ドイツにおける、約１５〜２０歳の最も頻度の高い死亡の原因となると予想され得る。
【０００３】
過去数十年の間に改良された切除術の可能性に起因して、死亡率は、ますます、転移挙動および未成熟の潜伏腫瘍細胞の伝播によって決定される。この転移挙動および未成熟の潜伏腫瘍細胞の伝播は、感度の悪い検出方法論または従来の組織病理学的病期分類法に起因して、検出することが困難であるか、または検出することが出来ない。この状況において、血液中の腫瘍細胞の検出は、特に、重要な、予後の有意水準である。従って、血液またはリンパ節における転移性細胞の検出は、癌性変化の悪性度の指標であると考えられる。このことに加えて、血液中に存在する腫瘍細胞のより正確な特徴付けもまた、治療に関する適切な判断をするために興味がもたれる。
【０００４】
しかし、従来の検出方法論（すなわち、免疫細胞化学、インサイチュハイブリダイゼーション、ＰＣＲ）に関係する特定の問題に起因して、腫瘍細胞を、腫瘍特異的様式で発現される遺伝子を検出することにより、同定、特徴付け、および単離することは非常に困難である。このことは、特に、特定の腫瘍マーカーの発現が特定の腫瘍型に頻繁に制限されるか、または、特定の腫瘍マーカーの発現が、腫瘍中の異種細胞集団において変化し、その結果、腫瘍細胞のいくつかを認識する可能性があるのみであるという事実に起因する。血液における稀な事象の（例えば、転移性細胞の）検出はまた、技術的困難（低すぎる感受性、抗体との特異性の問題、技術的入力の必要性、および費用）に直面する。このことに関して、異常な細胞の可能な限り効率的な検出、または２つの細胞型の混合物における正常な細胞からの生きてきる腫瘍細胞の分離は、治療目的および診断目的のために非常に価値がある。従って、例えば、何時、化学療法を始めるべきかまたは終了すべきかを、可能な限り正確に決定し得ることが重要である。他方で、治療の過程の間の医薬の効力を確かめることにもまた非常に興味がもたれる。このことについて、非常に少量の転移性細胞の存在を定量的に検出するために可能な限り高感度かつ迅速である、利用可能な方法が必要である。
【０００５】
このことに加えて、この方法は、血液から生きている腫瘍細胞を慣用的に単離するために特に有用であり、これを用いて、問題の治療剤が、実際に腫瘍を殺し得るか否かを調査するための分析方法が行われる。しかし、慣用的かつ高い程度の感度で行われ得る単純な方法は、臨床的診断において未だ存在しない。
【０００６】
Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ社およびＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社により開発された方法は、この分野において最も進んでいる方法である。これらの企業は、上皮表面抗原（ＥｐＣＡＭおよび／またはＨＥＡ）に対する抗体を磁気細胞分離法に用いる。これらの抗原は、全ての上皮細胞（すなわち、健康な細胞および悪性細胞の両方）の細胞表面上で異なる程度で発現される。血液細胞は、これらの抗原を保有しないので、これらの方法は、上皮細胞を、血液の約５〜１０倍に濃縮し得る。腫瘍サンプルにおける少数の悪性細胞に起因して、磁気分離の後、細胞の大部分はまだ末梢血細胞から構成される。従って、Ｋｒｕｅｇｅｒら（１９９９；Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １：１３５−１３９）は、ＨＥＡイムノビーズ方法論を使用して、２．６／１０６細胞〜１０．６／１０６細胞に上皮細胞を濃縮することを、腫瘍細胞の有意な損失があるという批判と共に、報告している。さらに、この方法論は、上皮起源ではない腫瘍型を濃縮するためには使用できない。血液サンプル中の癌腫細胞を同定するための他の方法は、細胞を透過化処理および固定する工程を包含し、これは、生きている腫瘍細胞を単離することが出来ないことを意味する。このことに関して、ポジティブに選択された細胞を、その大部分が上皮細胞を検出するために利用される、サイトケラチンに対する抗体を用いる、免疫細胞化学法を使用して染色する。対応するサイトケラチンは、血液細胞中に存在しないので、全ての上皮細胞に存在するこのタンパク質の検出は、転移性腫瘍細胞の検出として計数される。これらの方法は、技術的困難に直面するのみならず、高価であり、労働集約的であり、そして時間がかかる。
【０００７】
この分野における完全に新規のアプローチは、レポーター遺伝子構築物のトランスフェクションを用いて、健康な細胞（例えば、血液細胞）を含む混合物から、生きている腫瘍細胞を特異的に単離するための腫瘍細胞特異的シグナル活性を開発することである。このことは、腫瘍細胞が、健康な細胞に存在しないシグナル活性を示すという頻繁に報告されている事実を利用する。
【０００８】
身体（ｂｏｄｙ）細胞の複製は、通常、細胞内の多数の調節機構によって制御され、その結果、各細胞は、必要とされる場合にのみ、生物全体と協調して分裂を始める。これらのプロセスは、「レセプター細胞」の表面上の特定のレセプター分子に結合し、次いで、選択的遺伝子発現を最終的に生じるシグナル伝達経路と呼ばれるものを活性化する「伝達細胞」により分泌される、単一の分子により調節される。腫瘍細胞において、これらのシグナル活性化を制御する活性化または阻害の調節分子（これに対応する癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子）が、頻繁に変異される。従って、腫瘍細胞は、これらの細胞核において活性を有し、これは、さもなければ、胚発生の特定の発達段階、または組織領域の正確な規定においてのみ見出される。
【０００９】
癌の増殖と関係するこのようなシグナル活性の例は、Ｗｎｔシグナル伝達経路およびＲａｓシグナル伝達経路、ならびに腫瘍サプレッサーｐ５３の機能的損失である。ヒト結腸における癌性事象において、これらのシグナル活性は、腫瘍の発生における異なる段階おいて役割を果たし（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９６）Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  ８７：１５９−７０）、その結果、これらは、腫瘍細胞を病期分類するためか、またはいくつかの癌に関連するシグナル伝達活性を同時分析するために診断的に適切である（治療的アプローチにおいてもまた同様である）。Ｗｎｔシグナル伝達経路の成分は、非常に初期の段階の全ての結腸癌細胞において、既に実質的に変異されており、ここで、腫瘍サプレッサー遺伝子ＡＣＰ（＝腺腫様結腸ポリポーシス）は、８０％の突発性腫瘍において変異により不活化される一方で、β−カテニン癌遺伝子は、１０％の腫瘍おいて変異により活性化されている。全ての可能性において、残りの１０％の腫瘍は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の他の成分における変異を有し、その結果、一般的に、これらの変異は、腫瘍形成の開始の初期の事象として生じると考えられ得る。最終的に、細胞核におけるＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子に対するβ−カテニン癌遺伝子の相互作用に起因するＷｎｔシグナル活性は、全ての結腸癌細胞に存在する。結腸腫瘍形成のさらに進行した段階において、癌遺伝子Ｋ−ｒａｓはまた、７０％の症例において変異により活性化される。通常、Ｒａｓタンパク質は、異なる細胞表面分子（例えば、レセプターチロシンキナーゼ、インテグリンおよびイオンチャネル）に対して特異的なリガンドの結合の後、アダプタータンパク質（例えば、Ｓｈｃ、Ｇｒｂ２、Ｃｒｋなど）および下流のグアニンヌクレオチド交換因子（例えば、Ｓｏｓ、Ｃ３Ｇなど）によって刺激される。結腸癌細胞におけるＲａｓ遺伝子の変異に起因して、活性なＲａｓタンパク質は、構成的に発現され、これらのＲａｓタンパク質は、Ｒａｓシグナル伝達経路の上流の成分がなくても活性である。これは、最終的に、シグナル伝達経路の下流の成分の活性化を生じ、この活性化は、細胞核中の多数の転写因子（ＣＲＥＢ、ＳＲＦ、ｃＦｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ＰＰＡＲ、ＥＲ、ＥＴＳ、ＥＬＫ−１、ＳＴＡＴ、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、ＤＰＣ４、ｐ５３、ＮＦＡＴ４、ＣＨＯＰ、ＭＥＦ２、ＡＴＦ−２など）の機能亢進を生じ、これらの因子は、特に、細胞の分裂増殖をさらに誘導し得る。なおさらに進行した結腸癌段階において、疾患に関係した変化が生じるか、または特定のＤＮＡ配列（ＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＧｐｙＰｙＰｙ）へ結合し、そして増殖阻害遺伝子（例えば、ｐ２１ＣｌＰｌ）を活性化することにより、細胞のプログラム死を導く場合、健康な細胞においておよび活性な転写因子として、細胞の分裂増殖を妨げる腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３は、８０％を超える腫瘍において変異されている。
【００１０】
転写因子を直接活性化することに加えて、これらの腫瘍に関連したシグナル活性はまた、頻繁に、転写因子の発現の増大を導き、そして、これらとしては、他の遺伝子を活性化および抑制し得、結果として、二次的または間接的にのみ活性化される。この著しい例は、ＰＰＡＲδ転写因子（ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターδ）であり、これは、Ｗｎｔシグナル伝達カスケードの機能亢進に起因して結腸癌細胞において発現される。この転写因子のインヒビター（すなわち、スリンダグまたはアスピリンのような、「非ステロイド性抗炎症薬」（＝ＮＳＡＩＤＳ）と呼ばれるもの）は、この転写因子を阻害することにより、腫瘍細胞の増殖を阻害し得ることが実証されている（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．，Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．およびＫｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．（１９９０）ＰＰＡＲｄｅｌｔａ  ｉｓ  ａｎ  ＡＰＣ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ，Ｃｅｌｌ  ９９：３３５−４５）。二次的に誘導された転写因子の別の実施形態では、例は、ｃ−ｍｙｃであり、これはまた、例えば、活性なＷｎｔシグナル活性を示す細胞において過剰発現される（Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．ら（１９９８）Ｉｄｅｔｉｆｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ｍｙｃ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＣ  ｐａｔｈｗａｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５０９−１２）。腫瘍の進行における異なるシグナル活性の相乗作用は、１９８７年にＳｉｎｎらによって、癌遺伝子ｍｙｃおよびｒａｓの例を用いて、既に記載されている（Ｓｉｎｎ，Ｅ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｐａｔｔｅｎｇａｌｅ，Ｐ．，Ｔｅｐｌｅｒ，Ｉ．，Ｗａｌｌａｃｅ，Ｒ．およびＬｅｄｅｒ，Ｐ．（１９８７）Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＭＴＶ／ｖ−Ｈａ−ｒａｓ  ａｎｄ  ＭＭＴＶ／ｃ−ｍｙｃ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ：Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｅｌｌ  ４９：４６５−４７５）。癌原遺伝子（例えば、β−カテニン、Ｒａｓ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ）と腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、Ｒｂおよびｐ５３）との相互作用は、Ｈａｎａｈａｎらによる総説論文に図解により記載されている（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．（２０００）．Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  １００：５７−７０）。
【００１１】
上記のシグナル活性は、多数の異なる腫瘍型において重要な役割を果たす。従って、Ｗｎｔシグナル伝達カスケードの成分が、多くの腫瘍において変異されており、そして／または核に位置付けられるβ−カテニンは、腫瘍組織において免疫組織化学的に検出可能であることを示している知見の数が、近年急激に増えている。これは、ヒト腫瘍における癌性事象におけるこれらのシグナル活性の中心的かつ一般的重要性を強調する。従って、β−カテニン癌遺伝子の変異を活性化することは、とりわけ、肝臓、腎臓、膵臓、胃、前立腺、甲状腺、子宮および皮膚の腫瘍、ならびに髄芽細胞腫において見出される。例えば、β−カテニンは、ヒト皮膚腫瘍の７５％（Ｃｈａｎ，Ｅ．Ｆ．，Ｇａｔ，Ｕ．，ＭｃＮｉｆｆ，Ｊ．Ｍ．およびＦｕｃｈｓ，Ｅ．（１９９９）．Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２１：４１０−３）、およびヒト肝腫瘍の８９％（Ｊｅｎｇ，Ｙ．Ｍ．，Ｗｕ，Ｍ．Ｚ．，Ｍａｏ，Ｔ．Ｌ．，Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｈ．およびＨｓｕ，Ｈ．Ｃ．（２０００）．Ｓｔｏｍａｔｉｃ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｐｌａｙ  ａ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｈｅｐｔｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１５２：４５−５１）において変異されている。このことに加えて、変異は、癌の発症について同一の効果を有するＷｎｔシグナル伝達カスケードの他の成分において見出されている（上記；Ｓａｔｏｈ，Ｓ．，Ｄａｉｇｏ，Ｙ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｙ．，Ｋａｔｏ，Ｔ．，Ｍｉｗａ，Ｎ．，Ｎｉｓｈｉｗａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｗａｓｏｅ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｈ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｍ．，Ｔｏｋｉｎｏ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｉｍａｏｋａ，Ｓ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｍ．，Ｓｈｉｍａｎｏ，Ｔ．，Ｙａｍａｏｋａ，Ｙ．およびＮａｋａｍｕｒａ，Ｙ．（２０００）．ＡＸＩＮ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＡＸＩＮ１．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４：２４５−５０を参照のこと）。Ｗｎｔシグナル伝達カスケードの活性はまた、乳癌において中心的な役割を果たし、そしてこのことに加えて、予後において有意である（Ｌｉｎ，Ｓ．Ｙ．，Ｘｉａ，Ｗ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｗｏｎｇ，Ｋ．Ｙ．，Ｓｐｏｈｎ，Ｂ．，Ｗｅｎ，Ｙ．，Ｐｅｓｔｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．およびＨｕｎｇ，ＭＣ．（２０００）．Ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｋｅｒ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ；ｉｔｓ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：４２６２−６）。
【００１２】
多数の腫瘍の発達におけるｐ５３の中心的重要性は、しばしば記載されてきた。ｐ５３は、ヒト腫瘍において最も高頻度で変異している腫瘍抑制遺伝子である（１０，０００を超える変異が、文献中に記載されている；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｂｏｕｓｓａｒｄ，Ｔ．、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔｏｍｅ，Ｐ．、Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，Ｒ．およびＨａｉｎａｕｔ，Ｐ．（１９９９）、ＩＡＲＣ  ｐ５３  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄａｔａｂａｓｅ：ａ  ｒｅｌａｔｉｏｎａｌ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐｉｌｅ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｃ  ｐ５３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  １４：１−８）。ｐ５３は、細胞周期制御およびＤＮＡ損傷後の修復機構に関連するアポトーシスプロセスを調節する。結果として、ｐ５３はまた、ｐ５３が非常に重要な転写因子として機能する能力によって、ゲノムの監視者とも称される（上記を参照のこと）。ｐ５３の変異は、非常に多数の腫瘍型（例えば、結腸、肝臓、乳房、胃、膵臓、血液、肺および甲状腺の腫瘍）において見出されている。ｐ５３の一般的な腫瘍抑制機能はまた、ｐ５３遺伝子の遺伝性変異を有する患者においても見られ、この患者は、非常に多数の異なる腫瘍を発症する（Ｍａｚｏｙｅｒ，Ｓ．、Ｌａｌｌｅ，Ｐ．、Ｍｏｙｒｅｔ−Ｌａｌｌｅ，Ｃ．、Ｍａｒｃａｉｓ，Ｃ．、Ｓｃｈｒａｕｂ，Ｓ．、Ｆｒａｐｐａｚ，Ｄ．、Ｓｏｂｏｌ，Ｈ．およびＯｚｔｕｒｋ，Ｍ．（１９９４）、Ｔｗｏ  ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ｃｏｄｏｎ  ２７５  ｏｆ  ｐ５３  ｇｅｎｅ，ａ  ｒａｒｅ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９：１２３７−１２３９；Ａｋａｓｈｉ，Ｍ．およびＫｏｅｆｆｌｅｒ，Ｈ．Ｐ．（１９９８）、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｔｕｍｏｕｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ、Ｃｌｉｎ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  ４１：１７２−９９）。これに加えて、ｐ５３における変異はまた、とりわけ、化学療法剤に対する耐性を担う（Ａａｓ，Ｔ．、Ｂｏｒｒｅｓｅｎ，Ａ．−Ｌ．、Ｇｅｉｓｌｅｒ，Ｓ．、Ｓｍｉｔｈ−Ｓｏｒｅｎｓｏｎ，Ｂ．、Ｊｏｈｎｓｅｎ，Ｈ．、Ｖａｒｈａｕｇ，Ｊ．Ｅ．、Ａｋｓｌｅｎ，Ｌ．Ａ．およびＬｏｎｎｉｎｇ，Ｐ．Ｅ．（１９９６）、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐ５３  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２：８１１−８１４）。
【００１３】
Ｒａｓシグナル伝達カスケード（ＳＯＳ−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＡＰＫカスケードとも称される）の主な重要性は、文献において度々記載されている。ヒト腫瘍の約２５％において、絶え間ない増殖促進シグナルに等しい、構造的に変更されたＲａｓタンパク質を検出することが可能である（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．およびＷｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．（２０００）、Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃｅｌｌ  １００：５７−７０）。特に結腸腫瘍において、変異頻度は、特定の癌の段階において非常に高い（上記を参照のこと）。しかし、Ｒａｓ遺伝子の変異はまた、多数の他の組織（例えば、肺の腫瘍、胃の腫瘍、膵臓の腫瘍、膀胱の腫瘍、乳房の腫瘍および子宮の腫瘍ならびに肉腫）においても検出されている。
【００１４】
基礎研究において、活性化された転写因子または二次的に誘導された転写因子のシグナル活性を検出するためのレポーター遺伝子構築物と称されるものを使用することは、確立された腫瘍細胞株における生化学的プロセスを調査するために使用される。これに関して、レポーター遺伝子構築物は、特定の転写因子が結合し得るプロモーター領域、および細胞中に通常は存在せず、そして発現される場合に遺伝子産物の酵素活性または蛍光に基づいて比較的容易に検出され得るレポーター遺伝子からなる。従って、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社の２００１年のカタログの２１０〜２１２頁に、名称「ＭｅｒｃｕｒｙＴＭ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ」（これは、転写因子ＮＦＡＴ、ＡＰ１、ＮＦκＢ、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−ＦｏｓおよびＥＬＫの活性を検出するために使用され得る）が販売のためにＣｌｏｎｔｅｃｈ社により提供される。Ｃｌｏｎｔｅｃｈによれば、このシステムは、確立された腫瘍細胞株におけるシグナル活性を調査および定量するために使用される。これに関して、シグナル活性は、外部刺激（例えば、ＰＭＡ、イオノマイシンおよびフォルスコリン）を加えることによって誘導され、そしてレポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、ＳＥＡＰ（＝アルカリホスファターゼの分泌形態）、またはｄ２ＥＧＦＰ（＝「増強された緑色蛍光タンパク質」の不安定化形態）の助けを借りて測定される。これらのアッセイにおいて、リン酸カルシウム沈殿方法論は、細胞にさらにトランスフェクトされ、そしてその遺伝子産物がシグナル活性と相互作用し得る遺伝子構築物の活性を調査するために、腫瘍細胞株にこのレポーター遺伝子構築物を一過的にトランスフェクトするために使用される。結果として、これらの調査アプローチは、シグナル伝達カスケードの分子機構を明確にする目的を有する。
【００１５】
このようなアプローチは、例えば、腫瘍から得られ得るような原発性腫瘍細胞を検出するため、そして特に腫瘍患者の血液由来の悪性細胞を検出するためにこれまで記載されてこなかったことが印象的である。これに加えて、レポーター遺伝子構築物は、通常、１つの特定のシグナル経路の生化学的活性を調査するためだけに使用されることに留意すべきである。細胞株実験は、単一細胞におけるいくつかのシグナル活性の同時分析（この分析は、臨床的診断のために大変重要なものである）の問題に対処しない。
【００１６】
この性質の系の場合、原発性腫瘍細胞のトランスフェクション（＝ＤＮＡ媒介性の遺伝子移入）のためにこの系によって達成されるトランスフェクション効率は、不適切であるので、臨床的診断におけるこれらのレポーター遺伝子系の使用は、意図されも可能でもない。このことに加えて、プロモーター構造は、外部刺激なしでさえ感受性の測定系として最適化されておらず、これらのプロモーター構造は、原発性腫瘍細胞においてレポーター遺伝子が適切に発現されるのを可能にする。同様に、この実験アプローチは、通常誘導された腫瘍細胞株および誘導されていない腫瘍細胞株の活性を比較するが、「健常な」細胞と腫瘍細胞との間のいずれの比較も含まない。このようなレポーター遺伝子系の目的は、全く明らかに腫瘍細胞の臨床的診断ではないが、対照的に、腫瘍細胞株系における一般的シグナル伝達機構の解明である。
【００１７】
現在のレポーター遺伝子系における基本的な欠陥はまた、Ｈａｎｓ  Ｃｌｅｖｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎによる特許（米国特許第５８５１７７５号；出願日２０／０３１９９７）において明らかである。この研究グループは、細胞培養系において、結腸癌細胞株における腫瘍関連Ｗｎｔシグナル活性を検出するためにルシフェラーゼレポーター系を使用している（Ｋｏｒｉｎｅｋ，Ｖ．ら（１９９７）、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ−Ｔｃｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ＡＰＣ−／−  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｓｃｉｅｃｎｃｅ  ２７５：１７８４−１７８７）。この特許は、ＴＣＦ転写因子応答性レポーター遺伝子構築物を使用して、潜在的な治療剤を同定するための方法を記載する。これに関して、この特許は、シグナル伝達成分（ＡＰＣまたはβ−カテニン）における変異を示す細胞の調査を特許請求している。この性質のスクリーニング系は、ＡＰＣおよびβ−カテニンがしばしば変異している結腸癌の特定の状況を扱う（上記を参照のこと）。しかし、この系は、このカスケードの他の成分との相互作用に起因して、Ｗｎｔシグナルカスケードに対して効果を発揮する物質を見出すことができない。これについて、Ｗｎｔシグナル活性が、例えば、細胞外リガンドＷｎｔの過剰発現に帰する、（例えば、乳癌細胞を使用して）細胞系を確立することが重要である。これに加えて、この特許において特許請求されたレポーター遺伝子構築物は、原発性腫瘍細胞を検出または単離するためには特許請求されておらず、そして臨床的診断におけるこのような適用は、これに関して意図されない。
【００１８】
Ｂｅｒｔ  ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｅｎｎｅｔｈ  Ｋｉｎｚｌｅｒによる特許（米国特許第６１４００５２；出願日２０／０８／１９９８）は、Ｗｎｔシグナル活性を決定するためのレポーター遺伝子構築物を特許請求し、この構築物は、プロモーター構造中のＴＣＦ転写因子結合部位についての正確に特定された塩基配列（ＣＴＴＴＧＡＴおよびＡＴＣＡＡＡＧ）を含み、この塩基配列は、これらの著者らによって発見されたｃ−ｍｙｃ標的遺伝子に由来する。これは、この場合に調査されるＴＣＦ因子が、そのＤＮＡ結合部位の塩基配列における変化に対して非感受性であるという事実と、明かに矛盾する。従って、同時結晶化実験を使用して、Ｌｏｖｅら（Ｌｏｖｅ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｂｅｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＬＥＦ−１、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：７９１−７９５）は、すでに、１９９５年に、使用されるＤＮＡ結合部位の塩基配列（ＣＣＴＴＴＧＡＡ）を有する、非常に密接に関連するＬＥＦ−１転写因子のＤＮＡ結合活性が、転写因子のＤＮＡ結合ドメインとの強力な接触を行うことを記載した。これに関して、中間のチミジンの位置が、結合親和性に重要であるが、一方、隣接するチミジンの塩基転換（「Ｔ→Ａ」）は、結合活性に影響を与えないことが報告されている。結果として、他の塩基配列（例えば、ＣＣＡＴＴＧＡＡ）もまた、その結合親和性において同様に効果的である。ＬＥＦ−１因子およびＴＣＦ因子は、構造的に互いに密接に関連しているだけでなく、互いに機能的に置換可能でもあるので、米国特許第６１４００５２におけるようにＬＥＦ−１／ＴＣＦ因子について特定の塩基配列を特許請求することは、ほとんど意味がない。このことに加えて、この特許権者は、１９９６年１０月に、結腸癌形成におけるこれらの因子の重要性を考察している（Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９６）、Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃａｎｃｅｒ、Ｃｅｌｌ  ８７：１５９−７０）。
【００１９】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（これは、発現された場合の蛍光性の挙動に起因して、適切に照射された場合に細胞に発光させる）は、血液サンプルから生きた腫瘍細胞を単離するためのレポーター遺伝子としての使用に適切である。ＧＦＰは、すでに、多くの異なる形態で特許になっている。最も近い特許（米国特許第５９６８７３８号）は、とりわけ、「シグナル伝達活性を分析する」ための、２つのＧＦＰ改変体およびＦＡＣＳ（すなわちフローサイトメトリー）の使用を記載している。しかし、血液から得られた転移性細胞を診断するための特定の特許は存在しない。ほとんど全ての特許は、これまで、治療における実際の適用を扱ってきたか、またはインビトロで細胞株混合物を細胞分類することを記載してきた。ＧＦＰ改変体（「αＧＦＰＴ２０４Ｉ」）（これは、本発明者らの知識では、レポーター遺伝子としての使用のためには、以前に特許請求されていない）が、この特許が基づく実験のために使用された。このＧＦＰ改変体が、改善された蛍光挙動を有するという事実は、すでに、１９９６年に刊行されている（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ，Ｅ．Ａ．、Ｔａｔｅ，Ｅ．およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９６）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３１５−３１９）。これに加えて、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．に由来する、構成的に発現される赤色蛍光タンパク質（＝「ＤｓＲｅｄ」）（これは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって供給される（カタログ番号６９２１−１））が、トランスフェクションコントロールとして使用された。
【００２０】
しかし、蛍光レポーター遺伝子産物とは別に、身体サンプルから生きた腫瘍細胞を単離するために、例えば、構造的特性に基づいて検出され得る多数の他の遺伝子を使用することも可能である。これに関して特に目的であるのは、細胞外で検出され得る産物をコードする遺伝子配列である。細胞表面上に、対応する抗体によって認識される抗原性構造を露出する膜貫通タンパク質は、これに関して非常に特に適切である。内因性のヒト遺伝子発現が検出されないので、非ヒト起源の抗原性配列（その検出は、増加した特異性が、交差反応性を有さない抗体に起因して達成されることを可能にする）は、この文脈で有利である。これに関して、非常に広範な種々の形態の抗原性構造を天然の遺伝子配列と組換えて、その結果、好ましくは抗原性構造が細胞外に提示されるようにするための分子生物学的方法を使用することが可能である。
【００２１】
これに加えて、酵素活性（例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、アセチラーゼおよびホスファターゼ（これは、細胞内に存在し得るか、または細胞外に分泌され得る））を媒介するレポーター遺伝子は、疾患関連のシグナル活性の検出のために適切である。これに関して、検出の稀な事象について、増幅系を含むことによって可能な限り感受性にされた検出方法を使用することが有利である。このような適用系は、免疫組織化学および免疫細胞化学において広く行き渡っており、そして原則的に、シグナルの強度を増大させるために、酵素検出反応と組み合わせた二次抗体またはビオチン−ストレプトアビジン系の使用を含む。
【００２２】
稀な事象（例えば、転移性細胞）が血液中に検出される場合、血液中に天然に存在する天然の増幅系を使用する可能性自体が、存在する。特に、血液凝集カスケードの活性成分が本発明の血液サンプル中の転移性腫瘍細胞によって特異的に分泌されるようにすることが目的であり、これらの活性成分は、腫瘍細胞含有血液サンプルの凝集を導く。通常、損傷が生じた場合、身体は、止血プロセスによって血液損失から身体自体を保護する。これらの状況下で、酵素反応のカスケードは、異なる活性化物質の存在下での動きで示される。本願について特に重要なのは、記載された、タンパク質補因子として組織トロンボプラスチンを使用する第ＶＩＩ因子による凝固系の外因的な活性化である。全ての他の不活性な凝固因子前駆体とは対照的に、第ＶＩＩ因子チモーゲン（これは、血液中を循環する）は、すでにタンパク質分解活性を有するが、組織トロンボプラスチンが存在しない場合、凝固のいずれの活性化をも導かない。組織が損傷される場合、組織トロンボプラスチンは、損傷した細胞のミクロソームから放出される。その天然形態で、組織トロンボプラスチンは、タンパク質およびリン脂質からなる複合体である。タンパク質分解活性なしに、放出された組織トロンボプラスチンは、単鎖第ＩＩ因子チモーゲンにより大きな活性を付与する。カルシウムイオンの存在下で、組織トロンボプラスチン−第ＶＩＩ因子複合体は、リン脂質粒子上に複合体を形成し（血小板因子３）、ここで、第ＩＸ因子および第Ｘ因子の複合体活性化が生じる。血漿凝固系の進行性の活性化の過程において、出発シグナルの大きい増幅は、各々の引き続く酵素反応の活性化に関連する。この雪崩（ａｖａｌａｎｃｈｅ）様反応カスケード（これはまた、血漿凝固とも称される）は、フィブリノゲンのフィブリンへの転換によって終結され、フィブリンの三次元網目構造は、損傷部位での散漫な血小板血栓を通って、これを強固にする。凝固カスケードの外因的な活性化に関して重要なものは、第ＶＩＩ因子チモーゲンへの組織トロンボプラスチンの細胞外ドメイン部分の結合である。天然に存在する組織トロンボプラスチンは、内在性膜タンパク質であり、これは、インタクトな細胞において、細胞の内部（小胞体中）に封入され、そして細胞の完全性が破られた場合にのみ放出され、このことは、血液凝固カスケードが早い時期に活性化されるのが不可能であることを意味する。臨床化学的パラメータであるトロンボプラスチン時間（＝「Ｑｕｉｃｋ値」、ＴＰＴ、プロトロンビン時間）の決定は、臨床的関連事項である。トロンボプラスチン時間は、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子および第Ｘ因子、ならびにフィブリノゲンの任意の可能な減少を同定するために、全ての外科的介入の前に実行されるべき凝固分析の１つである。これについて、フィブリノゲン形成は、血漿において、組織トロンボプラスチンおよびカルシウムイオンを添加することによってクエン酸全血から誘導され、そして凝固時間は、コントロール血漿と比較して決定され；トロンボプラスチン時間は、ヘパリンの投与の間に減少する。
【００２３】
天然組織トロンボプラスチンの分子構成に起因して、これは、トロンボプラスチンの時間を決定する目的のために、機能的タンパク質／リン脂質粒子を単離および精製するための、技術的に精巧な事象である。しかし、トロンボプラスチンの水溶性改変体（この改変体は通常天然には存在しない）を、細菌および他の発現系において組換え的に調製することに現在成功している（総説：Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＪＨ．（１９９５）Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ：ｕｓｅ  ｉｎ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｒａｃｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．７４：１８５−８）。これらの組織トランボプラスチンの水性形態（「可溶性組織因子」＝ｓＴＦ）（アミノ酸１〜２１９からなる）は、（例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ（カタログ番号００２８１）によって提供されるキットの成分として）市販されている。これは、第ＶＩＩａ因子の量を決定し、そしてリン酸化小胞および第ＶＩＩａ因子の存在において第Ｘ因子を活性化し得る（Ｒｕｆ，Ｗ．，Ｒｅｈｅｍｔｕｌｌａ，Ａ．，Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．，Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ  Ｔ．Ｓ．（１９９１）．Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６６：１６２５６）。これらの実験のために、この単離されたトロンボプラスチンの細胞外ドメインは、哺乳動物細胞において発現され、そしてＮｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒらによる実験のように、分泌されたタンパク質として細胞培養物から単離される。この関連において、膜貫通領域の欠損は、第ＶＩＩ因子の自己活性化にとって重要であり、標準的な血液凝集アッセイにおいて凝集の非常に延長した持続時間を生じることが見出された（Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ，Ｐ．Ｆ．＆  Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．（１９９２）Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｂｏｌｉｓｈｅｓ  ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：１４４７７−８２）。しかし、ロイシンジッパー二量体化ドメインに融合することによって、トロンボプラスチンの単離された細胞外ドメインの組換え形態を生成することが現在達成されており、このトロンボプラスチンは、リン脂質の非存在下でさえ第ＶＩＩ因子を自己活性化することを可能にし、そして精製された野生型トロンボプラスチンと類似する第Ｘ因子の活性化に関連する生化学的活性を有する（Ｄｏｎａｔｅ，Ｆ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｃ．Ｒ．，Ｒｕｆ，ＷおよびＥｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｔ．Ｓ．（２０００）．Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｔｏｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ  ａｕｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１１４６７−７６）。
【００２４】
しかし、本発明に従って、レポーター遺伝子（例えば、トロンビン、第Ｖａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子または第ＸＩＩａ因子）のような、血液凝集カスケードの他の活性成分、あるいは他の生物学的カスケード（例えば、キニン系の補体系）または一般的に活性であり、そしてフィブリンもしくは他の物質（例えば、ｔＰＡ、ｕＰＡ、プラスミノゲン／プラスミンあるいはその誘導体および／またはハイブリット）を形質転換する物質を使用することもまた可能である。逆に、改変体がこれらの生物学的カスケードを阻害する成分の改変体を使用することも可能である。従って、例えば、プラスミン（すなわち、プラスミノゲンの活性成分）を、分泌されたレポーター遺伝子として使用することは、価値のあるように考えられる。なぜなら、プラスミンが（第Ｘ因子の活性を変更させることによって）血液凝集を阻害し、そして同時にフィブリン溶解を刺激するからである（Ｐｒｙｚｄｉａｌ，Ｅ．Ｌ．，Ｌａｖｉｇｎｅ，Ｎ．，Ｄｕｐｕｉｓ，ＮおよびＫｅｓｓｌｅｒ，Ｇ．Ｅ．（１９９９））。プラスミンは、第Ｘ因子を凝集チモーゲンからフィブリン溶解補因子に転換し（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：８５００−５）、結果的に、対応する実験条件下で測定可能である（血液凝集アッセイ、色素生産性基質または蛍光基質の形質転換）。
【００２５】
血液サンプルにおける、レポーター遺伝子としての生物学的カスケードの成分の診断的使用は、新規である。最も近い米国特許第６０８０５７５は、活性成分、プロテアーゼ感受性領域および阻害成分からなる融合産物をコードする核酸構築物の使用を記載している。この関連において、融合タンパク質の活性成分は、特に、血液凝集カスケード（すなわち、第Ｘ因子）の成分でもあり得る。しかし、不活性な融合タンパク質との関連において、この活性成分の活性は、阻害成分の存在に起因して阻害される。環境の培地における特定のプロテアーゼの存在のみで、例えば、細胞培地の上清にＰＳＡを添加することによって達成され、これは、核酸構築物で安定にトランスフェクトされている細胞から得られ、活性成分を放出し、そして血液凝集アッセイにおいてカルシウム再沈着に続いてより短い血液凝集時間を導く。本特許の目的は、腫瘍細胞または炎症性プロセスに関連する細胞によるプロテアーゼの分泌を利用することである。この関係において、本特許の意図は、腫瘍および炎症性領域の標的細胞特異的治療を達成することの目的について、記載された治療的方法を利用することである。
【００２６】
米国特許第４７８４９５０号は、血液凝集の活性化という意味において、生物学的活性を有するタンパク質の、哺乳動物細胞における発現について特許を受ける。この関係において、記載されている方法は、対応する欠乏を示す患者を処置するために、第ＶＩＩａ因子および第ＩＸ因子の多くのそして高純度の量を産生するために使用される。またもや、これは、本特許の場合において、純粋な治療臨床的適用の結果的な事象である。
【００２７】
異種細胞混合物から特定の細胞を単離することは、病理学的に変更された細胞を検出および特徴付けるための目的のみではない。健康な細胞の単離はまた、診断的および治療的に重要である。例えば、成体の幹細胞（これは、異なる器官特異的細胞または組織特異的細胞に分化し得る）の単離はまた、すぐれた医療目的である。従って、単離されそしてエキソビボで複製された後、幹細胞は、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｕｐ）および自家移植、器官移植のために使用され得る。この関係において、この目的にとって必要とされる幹細胞はまた、適切な「分化転換」の後、他の起源の器官から誘導される。多能性幹細胞の医療的重要性は、血液の癌を罹患する患者を処置する場合に、特に、造血幹細胞を用いた経験の結果として生じる。しかし、他の器官由来の成体幹細胞の使用は、非常に困難であることがわかっている。なぜなら、分化していない状態で、かつ高い純度で、稀な幹細胞を単離することは非常に難しいからである。
【００２８】
しかし、多くの器官において、このような多能性細胞の存在を検出することが、現在までに可能となっている。従って、例えば、迅速に再生される器官（皮膚、腸および骨格筋）からの幹細胞を、選択的に増殖させる条件下で増やすことは可能である。最近の研究によると、各場合における成体幹細胞は、その脱分化状態を維持するために特定の生化学活性を必要とする。これは特に見事に、小腸の上皮細胞由来の幹細胞の例示において認められ、この幹細胞は、転写因子ＴＣＦ４が枯渇する場合に、消失する（Ｋｏｒｉｎｅｋ，Ｖ．，Ｂａｒｋｅｒ，Ｎ．，Ｍｏｅｒｅｒ，Ｐ．，ｖａｎ  Ｄｏｎｓｅｌａａｒ，Ｅ．，Ｈｕｌｓ，Ｇ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．およびＣｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（１９９８）．Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｔｃｆ−４．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：３７９−８３）。この調査に従うと、小腸の幹細胞は、それらが成体に存在し続けるために、小腸微絨毛の陰窩においてＴＣＦ４によって媒介されるＷｎｔシグナル活性を必要とする。類似の結論は、調査から他の器官系について推測され得、ここで、Ｗｎｔシグナルカスケードの成分は、皮膚において有意に欠失されるか、または活性化形態において発現される。Ｗｎｔシグナルカスケードはまた、造血系の前駆体である細胞において重要であると考えられる。この知見によると、Ｗｎｔ因子は、造血系前駆体細胞の増殖および維持を調節する（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｓｏｌａｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ｆ．Ｃ．，Ｌｉｅｍ，ＬおよびＭａｔｔｈｅｗｓ，Ｗ（１９９７）．Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｎｔ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ：Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ８９：３６２４−３６３５）。この知見は、特に最近の調査も同様であるので、治療的に非常に興味深いものである。従って、成体骨髄組織は高程度の可塑性および／または広範な分化能力を有する幹細胞を含むことが実証される可能性がある（Ｋｒａｕｓｅ，Ｄ．Ｓ．，Ｔｈｅｉｓｅ，Ｎ．Ｄ．，Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ，Ｍ．Ｉ．，Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ，Ｏ．，Ｈｗａｎｇ，Ｓ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｒ．，Ｎｅｕｔｚｅｌ，Ｓ．およびＳｈａｒｋｉｓ，Ｓ．Ｊ．（２００１）．Ｍｕｌｔｉ−Ｏｒｇａｎ，ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．Ｃｅｌｌ  １０５：３６９−７７．）。レシピエント生物への移植後、特定の骨髄幹細胞は、肺、皮膚、肝臓および消化管において幹細胞の機能を引き受ける。対応する幹細胞を増やすために、その著者らは、「ホーミングアッセイ（ｈｏｍｉｎｇ  ａｓｓａｙ）」と称されるアッセイを使用した。このアッセイは、Ｘ線照射したレシピエント動物に、精製しそして標識した骨髄細胞を連続的に移植する工程を包含する。この型の成体幹細胞の単離は、ヒトにおける臨床適用にとって好ましくはない。
【００２９】
最近の調査によると、多数の腫瘍が成体および／または「体性」幹細胞から発症すると考えられている。一方、これは、特定のシグナルカスケード（Ｗｎｔおよびヘッジホック）の異常な活性化が、特定の腫瘍を発症させるために高い割合で寄与するだけでなく、幹細胞集団を維持するために同様の組織において必要とされるという知見から導かれる（Ｔａｉｐａｌｅ，ＪおよびＢｅａｃｈｙ，Ｐ．Ａ．（２００１）．Ｔｈｅ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ａｎｄ  Ｗｎｔ  ｓｉｎｇａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：３４９−３５４）。腫瘍が形成されるために、単一体（ｓｏｍａｔｉｃ）細胞において４〜７の間の変異が生じるという事実はまた、生じた腫瘍がそれら自身を迅速に再生する組織（腸、皮膚および血液）においてでさえ、比較的長時間存在しなければならないことを示唆する。腫瘍発症に原因として関連する（そして、本特許における例によって言及される）シグナル活性はまた、結果的に幹細胞において潜在的に活性である。腫瘍細胞を単離するための方法はまた、特定の幹細胞を単離するためにも使用され得る。
【００３０】
Ｔａｎｎｉｓｈｔｈａ  Ｒｅｙａの研究（これは、彼女が２００１  Ｗｎｔ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋで発表した）は、この関係において興味深い。彼女は、β−カテニンのレトロウイルス発現が、造血幹細胞を長期間未分化状態に維持し、そして完全な造血器官を構築する目的で、致死的に照射したマウスの骨髄のコロニーを形成するためのそれらの能力を増大させたことを実証し得た。これは、造血幹細胞の維持におけるＷｎｔシグナルカスケードの機能および重要性を明らかに、そしてこのことは、骨髄由来の血球の単離が、成体幹細胞を増やすために、活性なＷｎｔシグナルカスケードに基づいて使用され得ることを示唆し、この場合、幹細胞を増やすための一連の移植は回避される。まとめると、特定のシグナルカスケード（Ｗｎｔおよびヘッジホッグ）は、少なくともいくつかの幹細胞集団を維持し、かつ増大させるために必要とされることが述べられ得る。
【００３１】
本発明に従って、成体幹細胞における特定のシグナル活性の存在は、細胞を単離するために活用され得る。原則的には、この目的のために核酸構築物が使用され、これは、腫瘍細胞を検出および単離するために記載される核酸構築物に類似する。このために、それぞれのレポーター遺伝子は、成体幹細胞の生化学的活性に感受性のプロモーター構築物の下流にクローニングされる。蛍光レポーター遺伝子産物および膜貫通レポーター遺伝子産物をコードし、そして身体サンプルにおける細胞にウイルス発現系よって導入される、レポーター遺伝子構築物を使用するための選択が与えられる。しかし、他のレポーター遺伝子を使用することもまた、原則的に可能である。次いで、好ましくは、細胞は分化インヒビターの存在下でフローサイトメトリーによって単離される。しかし、他の方法（例えば、誘導された表面構造の検出に基づく方法およびビーズを用いる単離方法）を使用することもまた可能である。原則的に、細胞単離のために必要とされるレポーター遺伝子の他に、分化プロセスのインヒビター（例えば、それぞれの幹細胞の遺伝子の発現に対して適切な効果を有する転写因子）構成的様式、誘導される様式または細胞特異的様式で発現させることもまた価値があり得る。患者から単離された成体幹細胞は、外科的または他の医療処置の後、同一器官を新しく形成または再生するために、あるいは（適切な分化転換後）他の器官を再生させるために使用され得る。例えば、腸に由来する成体幹細胞は、糖尿病を罹患する患者の膵臓の、ランゲルハンス島細胞を再生するために使用され得る。
【００３２】
健常な身体細胞と病原性因子との接触（例えば、ウイルス感染、細菌または細菌性物質との接触、アレルギー性物質の存在）または刺激物質もしくは抑制物質（増殖因子、増殖因子アンタゴニスト、毒物、および化学物質）との接触もまた、細胞混合物の生化学的活性を変化させ得、特定の細胞の単離を容易にする。従って、例えば、増殖阻害物質との接触により、特定の（例えば、健常な）細胞における特定の生化学的活性が抑制されるが、他の細胞（例えば、病理学的に変化した細胞）においてはその接触は効果を有さないことが想定される。次いで、これらの細胞において抑制されていない活性は、細胞を単離するために利用され得る。特定の物質の取り込みの変化もまた、不均一性細胞混合物中の特定の細胞を検出するために使用され得る。これは、輸送タンパク質が、標的細胞において、レポーター遺伝子として発現される場合にしか適用されない。従って、例えば、これらの細胞を単離する目的で、肝臓腫瘍細胞におけるグルタメートトランスポーターの増加した発現を中和することもまた想定される。従って、検出可能な（例えば、蛍光）輸送基質アナログの増加した輸送は、変化した細胞を標識するために使用され得る。
【００３３】
（目的）
本発明は、特定の細胞を検出するため、および適切な場合、その後の調査または治療上の実際の適用のために利用可能なように、血液サンプルまたは他の身体サンプルからこれらの細胞をその生存状態で単離するために、使用され得るプロセスを提供する目的に基づく。
【００３４】
（簡単な説明／解決法）
本発明は、合成プロモーター構造を含むレポーター遺伝子構築物をトランスフェクトすることにより、そのレポーター遺伝子を特異的に発現する特定の細胞の細胞核においてシグナル活性を使用することが可能であるという認識に基づく。合成レポーター遺伝子構築物による不均一性細胞混合物のトランスフェクションの後、その細胞を種々の検出方法で使用することを可能にするレポーター遺伝子産物は、最適化された転写因子結合部位の鎖状連結に起因するかまたは異なる転写因子結合部位の組み合わせに起因して、特定の細胞において強力に過剰発現されるかまたは分泌される。
【００３５】
１つの方法において、病理学的に変化した細胞（例えば、腫瘍細胞）におけるシグナル活性は、蛍光タンパク質を特異的に発現するために使用される。血液サンプルにおいて健常な細胞は、これらのシグナル活性を有さないので、腫瘍細胞検出の特異性は高く、そして生存する蛍光腫瘍細胞を、フローサイトメトリーにより単離することを可能にする。その後、単離された腫瘍細胞は、培養され得、そしてさらなる分析に利用可能である。これに関連して、レポーター遺伝子構築物はまた、細胞培養系のために使用され得、トランスフェクト細胞が潜在的な活性物質と接触される前および後に、レポーター遺伝子の発現が測定される。一方で、これは、調査対象の細胞が患者に由来する場合に、治療に関する個別の決定をするために使用され得、そして他方で、これはまた、細胞株における細胞中の活性を分析するスクリーニング方法において使用され得る。
【００３６】
別の方法において、レポーター遺伝子の構成的領域は、生物学的なカスケードの開始または進行に対する正または負の影響を有する生物学的活性をコードする。血液サンプル中の健常な細胞は、レポーター遺伝子を発現するために必要とされるシグナル活性を有さないか、または有意に異なる程度でこれらの活性を有するので、生物学的カスケードは、病理学的に変化する細胞の存在下でのみ誘導または阻害され、それによって、腫瘍細胞検出における異常に高い程度の特異性を達成する。これに加えて、腫瘍細胞検出の感度は、血液中に少なくとも部分的に存在する天然の増幅系または生物学的カスケードの使用に起因して、非常に高い。このレポーター遺伝子の腫瘍細胞特異的発現は、その後、例えば、古典的な血液凝固アッセイ（Ｑｕｉｃｋ  ｔｅｓｔ、ＴＰＴ）の様式で、対象の生物学的カスケードの活性化または活性化可能性を測定することにより検出される。
【００３７】
さらなる方法において、健常な細胞（例えば、成人幹細胞）におけるシグナル活性は、不均一の細胞混合物から細胞を単離するために使用される。これに関連して、対象の身体サンプル（例えば、生検）中の細胞は、最初に、細胞生物学の標準的な方法を用いて全て別々に単離され、その後、核酸構築物でトランスフェクトされる。適切な場合、単離された（好ましくは、ヒト）幹細胞の機能性が、免疫抑制動物モデルにおいて、適切な外科介入の後に、インビボで試験され得、その後、細胞は、それらが元々由来する患者に戻される。
【００３８】
（詳細な説明）
本発明は、細胞特異的な様式で、身体サンプル中でレポーター遺伝子を発現する核酸構築物に関する。レポーター遺伝子構築物は、以下の成分：ａ）それらの細胞特異的活性またはＤＮＡ結合部位の鎖状配置もしくは特定の組み合わせに起因して、特定の細胞または標的領域における核酸構築物の挿入または組み込みに影響を及ぼす組換え的に関係する領域中で過剰な活性を有する転写因子と結合するための、少なくとも１つ（しかし、好ましくは、いくつか）のＤＮＡ部位を含むプロモーターエレメント、ｂ）これらの特異的な細胞を検出することを可能にするレポーター遺伝子、を含む。その細胞は、好ましくは、血液中に存在する細胞がレポーター遺伝子構築物で効率的にトランスフェクトされ得るウイルス発現系を用いてトランスフェクトされる。これに関連して、特定の優先性が、それらのトランスフェクション系に与えられる。それらの細胞型の優先性に起因して、レポーター遺伝子の発現にさらなる特異性をもたらす。レポーター遺伝子が発現するレベルは、その後、手動でかまたは自動的方法を用いて決定され得る。
【００３９】
プロモーター構造の構成は、各々の場合で検出されるシグナル活性に適合され得る。概して、特異的なシグナル活性のための転写因子結合部位は、コンカテマーとして空間的に配置され、最小プロモーターの上流（例えば、内因性ｃ−Ｆｏｓまたはチミジンキナーゼプロモーターから上流）の短いＤＮＡ配列（スペーサー）により隔てられる。これに加えて、異なるシグナル伝達経路に対する転写因子と結合するためのＤＮＡ部位が、互いに組み合わされる場合、いくつかのシグナル活性が、同時に測定され得る。細胞における異なるシグナル活性の同時の互いに独立した測定は、各々の場合で異なるプロモーター構造を含む、異なるレポーター遺伝子を含むレポーター遺伝子構築物をトランスフェクトすることにより達成され得る。これに関連して、対象のプロモーターおよび下流のレポーター遺伝子からなるこれらの転写ユニットは、１つのＤＮＡ構築物上に存在するかまたは別のＤＮＡ構築物上に存在するかのいずれかであり得る。これに関連して、誘導性（野生型転写因子結合部位を含む）レポーター遺伝子構築物および非誘導性（変異型転写因子結合部位を含む）レポーター遺伝子構築物、または構成的に活性なレポーター遺伝子構築物を同時に使用することが特に価値のあるようである。なぜならば、これにより、特定の転写因子によるレポーター遺伝子の特異的な活性化を分析すること、またはトランスフェクション効率および細胞傷害性を決定することが可能になるからである。他方、プロモーターはまた、レポーター遺伝子が、介在するＩＲＥＳ配列（例えば、脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位配列）により隔てられる場合に、２つの異なるレポーター遺伝子の発現を同時に調節し得る。
【００４０】
特異的な疾患関連転写因子の存在下でそれらのトランス活性化能力の十分な活性を唯一示す基礎転写アクチベーターに結合するための部位をプロモーターに補充することは、おそらく、さらに価値があり得る。プロモーターを活性化させる際の転写因子の協調性のこの原理は、ＭＭＴＶプロモーターを調査した際に獲得された知見に基づく。従って、リガンドにより刺激されるグルココルチコイドレセプターの結合後のプロモーターの最大刺激が、基礎転写アクチベーターＮＦ１との結合によってのみ達成されることが実証された。レポーター遺伝子の発現の活性化は、ポジティブフィードバック機構を確立することによって増強され得る。例えば、Ｗｎｔ感受性プロモーターが、ポジティブエフェクターの発現（例えば、ＬＥＦ−１およびβ−カテニンのトランス活性化Ｃ末端領域からなる融合構築物；Ｖｌｅｍｉｎｃｋｘ，Ｋ．，Ｋｅｍｌｅｒ，Ｒ．＆Ｈｅｃｈｔ，Ａ．（１９９９），Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ａｎｄ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬＥＦ−１／ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ，Ｍｃｃｈ  Ｄｅｖ  ８１：６５−７４）および実際のレポーター遺伝子の発現の両方を決定する核酸構築物が、Ｗｎｔシグナル伝達活性を測定するために使用される場合に、価値がある。これに加えて、合成プロモーター構造の基礎活性はまた、転写レプレッサーに結合するためのＤＮＡ部位を補充することによって抑制され得る。これに関連して、対応する転写レプレッサーは、内因的に存在し得るか、または付加的に導入されそして構成的に発現されるレプレッサー遺伝子により提供され得る。このために、任意の所望の転写因子に属するＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＬＥＦ−１／ＴＣＦ転写因子に属するＨＭＧドメイン、またはｃ−ｍｙｃのカルボキシ末端領域（最後の９０アミノ酸）に属する）および異種レプレッサードメイン（例えば、ＴｃｔレプレッサーまたはＥ２Ｆ６のカルボキシ末端領域（アミノ酸１７９−２８１）に属する）からなる組換えタンパク質をコードする核酸構築物を使用することもまた可能である。これに従って、下流のレポーター遺伝子は、同一シス作用性プロモーターエレメント上の強力な転写アクチベーターの存在下で活性化されるのみであるが、レポーター遺伝子は、転写アクチベーターの非存在下で抑制される。転写レプレッサーが内因性活性により調節される系において（すなわち、レプレッサー遺伝子が、実際に測定され得る報告された遺伝子に加えて付加的なレポーター遺伝子として使用される場合）、この関係で特に興味深い。従って、外因的に導入されるレプレッサー遺伝子の発現は、健常な細胞に存在するｐ５３転写因子の活性により調節され得る。これに従って、レプレッサーは、健常な細胞でのみ発現され、そして変異型ｐ５３を含む細胞で発現されず、適切に細胞を処理することにより（ＵＶ照射またはＤＮＡ損傷物質の使用）、ｐ５３活性を誘導する必要がある可能性があり得ることが確実である。従って、例えば、プロモーター領域に転写レプレッサー結合部位を有するＷｎｔにより調節されるレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ改変体、ルシフェラーゼ、トロンボプラスチンなど）の発現は、レプレッサー遺伝子のｐ５３により調節される発現の非存在に起因して、ｐ５３が変異した細胞において抑制されない。このことは、Ｗｎｔシグナル活性およびｐ５３の欠失の相乗効果が、同時または連続的に測定され得ることを意味する。
【００４１】
ｐ５３は、転写因子ファミリーのメンバーであり、このファミリーは、ｐ６３遺伝子およびｐ７３遺伝子もまた含まれる。これらの遺伝子の種々のスプライシング改変体が存在する。これらのスプライシング改変体は、とりわけ、発現パターン、トランス活性化能力、抑制能力、他のタンパク質との相互作用、および生化学的特性が異なる（Ｙａｎｇ，Ａ．，Ｋａｇｈａｄ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｇｉｌｌｅｔｔ，Ｅ．，Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｍ．Ｄ．，Ｄｏｔｓｃｈ，Ｖ．，Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｎ．Ｃ．，Ｃａｐｕｔ，Ｄ．＆  ＭｃＫｅｏｎ，Ｆ．（１９９８）ｐ６３，ａ  ｐ５３  ｈｏｍｏｌｏｇ  ａｔ  ３ｑ２７−２９，ｅｎｃｏｄｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ，ｄｅａｔｈ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ，ａｎｄ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２：３０５−１６）。Ｎ末端トランス活性化ドメインを欠くアイソフォームが重要である。ドミナントネガティブ因子として、これらのタンパク質は、プロモーター構造に対して他のアイソフォームのトランス活性化能力に対する負の影響を発揮し得るかまたは複合体形成によって負の影響を発揮し得る。混合された細胞集団におけるこれらのアイソフォームの天然での出現および技術的になされた出現が、特に興味深い。従って、例えば、Ｎ末端が切断されたｐ６３が、幹細胞を含む可能性があるかまたは幹細胞集団と同一であり得る特定の基底細胞集団において特異的に生じることが知られている（Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉ，Ｓ．，Ｗａｌｔｒｅｇｎｙ，Ｄ．，Ｄｉｌｋｓ，Ｊ．，Ｉｓａａｃ，Ｂ．，Ｌｉｎ，Ｄ．，Ｇａｒｒａｗａｙ，Ｌ．，Ｙａｎｇ，Ａ．，Ｍｏｎｔｉｒｏｎｉ，Ｒ．，ＭｃＫｅｏｎ，Ｆ．＆Ｌｏｄａ，Ｍ．（２０００），ｐ６３  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５７：１７６９−７５）。特に興味深いのは、例えば、ケラチノサイト幹細胞におけるｐ６３の報告された出現である（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｇ．，Ｄｅｌｌａｍｂｒａ，Ｅ．，Ｇｏｌｉｓａｎｏ，Ｏ．，Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ，Ｅ．，Ｆａｎｔｏｚｚｉ，Ｉ．，Ｂｏｎｄａｎｚａ，Ｓ．，Ｐｏｎｚｉｎ，Ｄ．，ＭｃＫｅｏｎ，Ｆ．＆  Ｄｅ  Ｌｕｃａ，Ｍ．（２００１），ｐ６３  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．）。例えば、皮膚の幹細胞における、Ｎ末端が切断されたｐ６３の出現は、皮膚細胞集団中にｐ５３ファミリーの結合メンバーのためのＤＮＡ部位を有するレポーター遺伝子構築物を挿入することにより、これらの細胞を単離するために使用され得る。誘導（ＵＶ照射、核酸損傷因子など）されたｐ５３の蓄積の結果として、レポーター遺伝子は、ｐ５３ファミリーメンバーのうちの１つの優性な干渉改変体（例えば、ΔＮ−ｐ６３（または、異常に変化した組織の場合は、欠失（例えば、ｐ５３変異）を示す）を発現する細胞において特異的に発現される。構成的に発現されるレポーター遺伝子が同時発現される場合、例えば、皮膚幹細胞は、記載される方法を用いてこの様式で単離され得る。
【００４２】
以下の転写因子または転写因子ファミリーおよび／もしくは応答性エレメントファミリーが、特に、細胞におけるシグナル活性を測定するために興味深い：ＴＣＦ／ＬＥＦ−１、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｍａｘ、ｍｙｂ、Ｅ２Ｆ、ＤＰ１、ＣＲＥＢ、ｐ５３、ＮＦκＢ、ＮＦＡＴ、ＰＰＡＲ、ＥＴＳ、ＥＬＫ１、ＡＴＦ、ＤＰＣ、ＳＭＡＤ、ＣＨＯＰ、ＭＥＦ、ＭＡＤＨ４、ＧＲ、ＥＲ、ＳＴＡＴ、ＳＲＦ、ＩＳＲＥ、ＳＲＥ、ＨＳＥ、ＡＰ１、およびＣＲＥ。転写因子ＤＮＡ結合部位は、幾度も記載されており、そして公共に利用可能である。この点で特に興味深いのは、転写因子ＴＣＦの結合部位（５’−ＣＣＴＴＴＧＡＡ−３’；Ｌｏｖｅ，Ｊ．Ｊ．ら（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＬＥＦ−１．Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：７９１〜７９５）、ｐ５３の結合部位（５’−ＰｕＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）（Ｔ／Ａ）ＧｐｙＰｙＰｙ−３’；ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ，Ｗ．Ｓ．，Ｋｅｒｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｐｉｅｔｅｎｐｏｌ，Ｊ．Ａ．，Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９２）Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｐ５３．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １：４５−４９）、ＰＰＡＲδの結合部位（５’−ＣＧＣＴＣＡＣ−３’；Ｈｅ，Ｔ．Ｃ．，Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．およびＫｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．（１９９９）．ＰＰＡＲｄｅｌｔａ  ｉｓ  ａｎ  ＡＰＣ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ．Ｃｅｌｌ  ９９：３３５−４５．）、ｍｙｃの結合部位（５’−ＣＡＣＧＴＧ−３’または５’−ＴＣＴＣＴＴＡ−３’；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｔ．Ｋ．，Ｋｒｅｔｚｎｅｒ，Ｌ．，Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ，Ｅ．Ｍ．，Ｅｉｓｅｎｍａｎ，Ｒ．Ｎ．およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．（１９９０）．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃ−Ｍｙｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１１４９−１１５１）、Ｅ２Ｆの結合部位（５’−ＴＴＴＴＳＳＣＧＳ−３’または５’−ＴＴＴＣＧＣＧＣ−３’；Ｍｕｄｒｙｊ、Ｍ．，Ｈｉｅｂｅｒｔ，Ｓ．Ｗ．およびＮｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．（１９９０）Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅ２Ｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ａ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ９：２１７９−８４）、ＡＰ１の結合部位（５’−ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡ；Ｆｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍ．，Ｐｒｙｗｅｓ，Ｒ．およびＲｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．（１９８９）Ａｎ  ＡＰ−１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｇｅｎｅ  ｃａｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  １２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ  ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅｔａｔｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：１３２７−３１）、ＳＭＡＤの結合部位（５’−ＣＡＧＡＣＡ−３’；Ｊｏｎｋ，Ｌ．Ｊ．，Ｉｔｏｈ，Ｓ．，Ｈｅｌｄｉｎ，Ｃ．Ｈ．，ｔｅｎ  Ｄｉｊｋｅ，Ｐ．およびＫｒｕｉｊｅｒ，Ｗ．（１９８９）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｍａｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  （ＳＢＥ）  ｉｎ  ｔｈｅ  ＪｕｎＢ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｈａｔ  ａｃｔｓ  ａｓ  ａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ，ａｃｔｉｖｉｎ，ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２１１４５−５２．）、ＳＲＥおよびＡＴＦの結合部位（Ｆｉｓｃｈ，Ｔ．Ｍ．，Ｐｒｙｗｅｓ，Ｒ．Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．およびＲｏｅｄｅｒ，Ｒ．Ｇ．（１９８９）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃ−ｆｏｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃＡＭＰ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ３：１９８−２１１）である。
【００４３】
蛍光細胞を検出および／または単離するために、蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子を使用することが必要である。原則として、蛍光タンパク質を直接的または間接的にコードするすべての遺伝子が、この目的のために適切である。以下の遺伝子の改変体が、特に適切である：ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＤＳ−Ｒｅｄ、オビリンおよびエクオリン。これに加えて、（例えば、蛍光色素であるＦＩＴＣに結合する抗カリンをコードする）蛍光色素結合タンパク質をコードする遺伝子を使用することもまた、可能である。しかし、あるいは、翻訳産物が細胞表面上に露出され結果的に二次検出法に利用可能であるコード核酸セグメントを使用することもまた、可能である。これにより、特に、膜貫通タンパク質をコードする核酸セグメントまたは細胞外に提示される分子もしくは露出されるこれらの分子をもたらす分子が、意味される。例えば、特異的検出分子（例えば、抗体、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、リガンドまたはレセプター）が利用可能である、抗原、レセプターまたはリガンドが、シグナル活性の結果として細胞表面上に提示され得る。これに関して、診断方法について、ヒト起源ではないコード核酸セグメントへの優先が示される。例えば、免疫学的検出方法において、トランスフェクトされていない細胞における内因性発現に起因する交差反応性を抑制するために、マウス、ラットなど由来の膜貫通タンパク質（ヒトにおいても見出される）をコードする相同性遺伝子セグメントを使用することが可能である。しかし、対応する検出分子が調製される合成配列を使用することもまた、可能である。例えば、事実上すべての合成ペプチド配列を膜貫通タンパク質と組換えるために、分子生物学的方法を使用することが可能であり、その配列は、単離された形態またはコンカテマー形態で、細胞表面上にこのようにして提示される。同時に、これらのペプチドに対して高度に特異的な抗体を生成することが可能である。これらの検出分子を種々の磁気ビーズまたは非磁気ビーズに結合することによって、ビーズと結合している細胞に起因して、内因性核酸領域の特異的発現に基づいて、磁場を適用することによってかまたは遠心分離工程によって、病理学的に変化した細胞を単離することが可能である。
【００４４】
生物学的カスケードを利用しつつ特定のシグナル活性を検出するために、その生物学的カスケードの活性化成分または阻害成分と等価であるレポーター遺伝子を使用することが、必要である。原理上、プロトロンビン／トロンビン、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＶＩＩａ因子、第Ｖａ因子、フィブリン／フィブリノーゲン、プラスミン／プラスミノーゲン、プロカリクレイン／カリクレイン、ウロキナーゼ、ｔＰＡ、ＣＶＦ、Ｃ３ｂ、プロテインＣ、Ｃ−１  Ｓインヒビター、ヒルジン、α−１−アンチトリプシン、ＡＴ−ＩＩＩ、ＴＦＰＩ、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２またはＰＡＩ−３の遺伝子配列領域をこの目的のために使用することが、可能である。これに加えて、その生物学的カスケードによって、酵素タンパク質を発現させることまたは対応する融合タンパク質を活性化させることもまた、可能である。
【００４５】
レポーター遺伝子の細胞特異的発現のために、そのＤＮＡ構築物は、細胞中に導入されなければならない。多数の市販のトランスフェクション技術が、この目的のために開発されている。古典的リン酸カルシウム沈殿、微粒子銃（「ショットガン」）およびエレクトロポレーション法による直接移入に加えて、リポソーム技術（例えば、ＧｉｂｃｏＢＲＬから入手するリポフェクチンおよびリポフェクタミン）を使用して、哺乳動物細胞をトランスフェクトすることが可能である。しかし、哺乳動物細胞は、ウイルス系を使用して特に効率良くトランスフェクトされ得る。特に、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づく系が、確立されている。これに関する興味深いアプローチは、異なる細胞型において異なるトランスフェクション効率を達成し、結果としてレポーター遺伝子発現の特異性を促進する、トランスフェクション系を使用することである。例えば、アデノウイルスは、造血細胞以外のほとんどのヒト細胞に非常に高効率で感染する。適切なインキュベーション条件を選択することによって、血液から上皮細胞を単離し、それにより構成的レポーター遺伝子発現を使用する場合でさえ腫瘍細胞を富化させることが可能である場合に、この事実を正確に活用することが可能である。
【００４６】
本発明によると、出願人の知見は、疾患関連細胞を診断するための方法に使用される。この方法は、誘導性プロモーター構造を含むレポーター遺伝子構築物をトランスフェクトする工程を包含し、この構築物は、腫瘍細胞が、健常細胞との混合物において自動化可能な様式で検出されそしてその混合物から単離されるのを可能にする。これに加えて、本発明者らの知見はまた、特定の健常細胞（例えば、幹細胞）が不均一細胞混合物から単離されるのを可能にする方法のために、使用され得る。その細胞の自動可能で特異的な検出は、以下の方法によって達成され得る：レポーター遺伝子構築物は、一方で、疾患細胞における変化した遺伝子発現および／または健常細胞における種々の遺伝子発現を部分的に担う転写因子を結合するための部位を保有するプロモーター構築物を含み、他方で、この形態またはこの量で他の身体細胞中には通常は存在しない、容易に測定可能なレポーター遺伝子を含む。誘導性レポーター遺伝子活性化の特異性および感受性は、転写因子結合部位の組み合わせおよび数の多さによって確保される。ヒト細胞中に内因的には存在しない蛍光タンパク質を発現することによって、特異的でありかつフローサイトメトリーにより自動化され得る方法が、定性的および定量的に測定され得る。これに加えて、蛍光強度について閾値を特定することによって、フローサイトメトリーは、特定レベルのレポーター遺伝子発現を示す細胞を単離することを可能にする。さらに、各々が異なる生化学活性により誘導され得る２つの異なる蛍光タンパク質を同時測定することによって、その変性の程度に関してより正確に個々の腫瘍細胞を特徴付けること（病期分類）が可能になる。これは、特に、（結腸腫瘍癌の例を使用して上記で説明されるように）異なる腫瘍進行病期で対応する生化学的活性が存在する、腫瘍型に適用される。類似するが同一ではない２つのレポーター遺伝子の同時使用はまた、レポーター遺伝子発現の特異性を決定するために役立ち得る。従って、インタクトな転写因子結合部位または変異した転写因子結合部位を含むプロモーターは、例えば、蛍光が異なるタンパク質コードするレポーター遺伝子の発現または基質特異性が異なる酵素の発現を、調節し得る。結果として、発現レベルの比較によって、特異的シグナル活性の活性に関して結論を導くことが可能になる。これに加えて、誘導性プロモーターに加えて、異なるレポーター遺伝子を調節する構成的に活性なプロモーターを、トランスフェクション効率または細胞傷害性をモニターできるようにするために使用することもまた、価値があり得る。
【００４７】
表現「シグナル活性」は、細胞核中の遺伝子の発現を生化学的活性が最終的に調節する、細胞中の生化学的活性を包含する。これに関して、変化した遺伝子発現をもたらす生化学的活性が、細胞中の非常に広範な種類の部位で生じ得、そして通常は、シグナル伝達経路と呼ばれる事象の複合ネットワークの一部である。腫瘍細胞において、例えば、細胞表面上のレポーターは、リガンドの存在の増加に起因してか、コードする遺伝子領域中の変異に起因してか、または遺伝子調節領域中の変異に起因して、過剰に活性であり得る。一方、細胞質中のタンパク質もまた、シグナル伝達事象の構成成分の翻訳後修飾（例えば、リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、脱アセチル化、またはユビキチン化）が変化するように、これから生じる調節事象（例えば、安定化、脱安定化、酵素活性の増加もしくは酵素活性の減少、または結合親和性の減少もしくは結合親和性を増加）が変化するように、対応する遺伝子中の変異に起因する活性の変化を示し得る。最終的には、シグナル活性は、この様式で惹起され、これらのシグナル活性は、標的遺伝子の発現を増加または阻害することができる。
【００４８】
表現「レポーター遺伝子構築物」は、遺伝子調節配列または組換えにより機能的な配列と、コード配列領域とから少なくともなる、核酸構築物を包含する。これにより、特に、コード領域の発現に対して直接的に影響を発揮する（その構築物が含む転写因子結合部位に起因する）か、または間接的に影響を発揮する（例えば、レポーター遺伝子が、ゲノムＤＮＡセグメント中に特異的に組み込まれるか、挿入されるか、または組換えられることを可能にすることによる）、遺伝子調節配列を含むＤＮＡ構築物が、意味される。レポーター遺伝子の発現に直接影響する遺伝子調節配列は、ほとんどの場合、プロモーター領域、エンハンサー領域、またはサイレンサー領域であり、これらは、タンパク質分子との相互作用が原因で、コード核酸領域の転写に対して正の影響および負の影響の両方を発揮可能である。遺伝子調節配列がレポーター遺伝子の発現に間接的に影響する方法は、幹細胞集団中へのレポーター遺伝子の特異的組み込みを包含し、この方法において、組み込みのための標的領域は、（例えば、ＣｒｅリコンビナーゼについてのｌｏｘＰ組換え配列を使用する）組換え工程によって以前に特異的に標識されており、そして内因性標的遺伝子は、組換え配列に加えて、おそらく１つ以上のＩＲＥＳ配列が補充されているか、またはレポーター遺伝子は、内因性遺伝子座の発現が誘導された場合にさらなるレポーター遺伝子配列が転写されるように、ＩＲＥＳ配列を含む。哺乳動物の胚性幹細胞または部分的に分化した幹細胞が、これらの目的のために使用される場合、合成遺伝子調節配列または内因性遺伝子調節配列を使用して、特定のシグナル活性の存在を可視化することまたは測定可能にすることが、可能である。レポーター遺伝子の構成に依存して、病理学的変化の非常に初期の段階または健常な生理学的プロセス（例えば、分化プロセス、または組織領域におけるアポトーシスプロセスもしくは増殖プロセス）を検出することが、結果的に可能である。このようにして、小器官、モデル系から組換え改変された生物全体までが、試験物質に曝露され得、病理学的変化が、レポーター遺伝子発現に基づいて初期段階で認識されるか、または異なる時点で病理学的に変化した細胞を単離することもしくは活性物質の効果を分析することが、可能である。
【００４９】
表現「細胞特異的発現」は、異種細胞集団中の特定の細胞におけるコード配列領域の転写および／または翻訳を包含する。例えば、その細胞は、健常細胞を含む身体サンプル中に存在する、病理学的に変化した細胞であり得る。詳細には、意味されるものは、腫瘍細胞における遺伝子の特異的発現であり、その発現は、腫瘍細胞中の特定の生化学的活性に帰せられ、その活性は、健常細胞中でこの形態では生じない。これに関して、レポーター遺伝子発現は、細胞特異的なレポーター遺伝子の転写、翻訳、もしくはレポーター遺伝子産物の分解によってか、またはその核酸構築物の細胞特異的なトランスフェクションによって、特異的に達成され得る。
【００５０】
表現「レポーター遺伝子」とは、分析されるべき標的細胞中にこの形態で内因的には天然では存在しないので細胞中に導入されなければならない、コード核酸セグメントを包含する。これらのコード核酸セグメントはまた、変化した配列もしくは合成核酸構築物における新たな状況に起因して、内因性遺伝子産物と比較して機能上変化しているかまたは変化した様式で発現される、構成セグメントまたは通常は内因的に存在する配列領域全体を含む。
【００５１】
表現「身体サンプル」は、核酸構築物でトランスフェクトされ得る生きた細胞を含む任意の身体サンプルを包含する。このような身体サンプルの例は、血液リンパ液、便、器官斑点（ｏｒｇａｎ  ｐｕｎｃｔａｔｅ）および検体である。特に意味されるものは、病理学的に変化した細胞を含むと疑われる血液サンプルである。検体は、その細胞が、従来の標準方法（細かく刻みこむこと、徐々に細いニードルを用いて懸濁すること、プロテーゼで処理などを行うこと）を使用してその組織塊から分離された後に核酸構築物でトランスフェクトされるのに適切であるので、（身体サンプルという）この表現はまた、検体を含む。
【００５２】
表現「病理学的変化」は、細胞における生物学的活性を包含し、この生物学的活性は、同じ組織の比較可能な細胞においては、この時点で存在せず、そして／または、この組織の他の領域において、あるいは分化の他の相または発生の段階において活性である。
【００５３】
表現「転写因子」は、核酸領域と、直接的または間接的に会合し、そして、それによって、これらの核酸領域において変更された活性を誘起するタンパク質分子を包含する。
【００５４】
表現「発現レベル」は、アミノ酸の配列をコードしているか、またはコード核酸配列に相補的である核酸領域に関連する、転写または翻訳の変化を包含する。しかし、これに加え、それがまた意味することは、アミノ酸配列の翻訳後改変に関連し、そして、改変された、安定性、位置、または活性を生じる変化である。
【００５５】
表現「自動化（された）方法」は、人間の作業者の手動による労力を、完全に、または構成する工程おいてのみのいずれかを置き換え、そして、トランスフェクション、検出、単離、ドキュメンテーション、または他の情報処理における工程において特に使用される方法を包含する。このことに関して、この検出は、使用されるレポーター遺伝子の特性に依存する。
【００５６】
発現が特定の細胞を検出、単離することを可能にする、発現レポーター遺伝子のための、哺乳動物細胞におけるシグナル活性の探索は、診断的問題および治療的問題の両方について有利である。この技術を適用するための可能な領域は、身体サンプルにおける減少した細胞の検出、およびそれらのサンプルからの単離、治療にともなうモニタリング、薬物スクリーニング、ならびに治療目的のためのエキソビボでの患者サンプルの試験である。適用の他の領域は、幹細胞技術の方法であり、ここで、その幹細胞は単離され、そして適切である場合、分化されるかまたは分化転換され、そして移植臓器を発達させるため、または発生過程のために使用される。
【００５７】
（１．ＳＷ４８０結腸癌腫細胞における腫瘍関連Ｗｎｔシグナル活性に基づく、それらの細胞におけるαＧＦＰＴ２０４Ｉの過剰発現）
腫瘍特異的様式で、緑色蛍光タンパク質（αＧＦＰＴ２０４Ｉ）の改変体を発現させるために、Ｗｕｔ応答レポーター遺伝子構築物が、第１の工程において調製される。そのプロモーター領域は、ＬＥＦ−１／ＴＣＦ転写因子に結合するための、３つの機能部位または３つの非機能部位（それぞれ、ＣＣＴＴＴＧＡＴＣおよびＣＣＴＴＴＧＧＣＣ）あるいはこれらの結合部位の改変体（それぞれ、ＣＣＴＴＴＧＡＡまたはＣＣＡＴＴＧＡＡおよびＣＣＴＴＴＧＧＡまたはＣＣＡＴＴＧＧＡ）を含む。Ｗｎｔ応答性ＧＦＰレポーター遺伝子構築物を生成するための、記載されている開始ベクターである、ｐＴＯＰＦＬＡＳＨ、ｐＦＯＰＦＬＡＳＨ、ｐＴＯＰＣＡＴおよびｐＦＯＰＣＡＴ（Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．，Ｃａｖａｌｌｏ，Ｒ．，Ｄｏｏｉｊｅｓ，Ｄ．，Ｖａｎ  Ｂｅｅｓｔ，Ｍ．，Ｖａｎ  Ｅｓ，Ｊ．，Ｌｏｕｒｅｉｒｏ，Ｊ，Ｙｐｍａ，Ａ．，Ｈｕｒｓｃｈ，Ｄ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．，Ｂｒｊｓｏｖｅｃ，Ａ．，Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ，Ｍｏｒｔｉｎ，Ｍ．＆  Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（１９９７）．Ａｒｍａｄｉｌｌｏ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｇｅｎｅ  ｄＴＣＦ．Ｃｅｌｌ  ８８：７８９−９９；Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．，Ｏｏｓｔｅｒｗｅｇｅｌ，Ｍ．，Ｄｏｏｉｊｅｓ，Ｄ．＆Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（１９９１）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＴＣＦ−ｌ，ａ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＨＭＧ  ｂｏｘ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：１２３−３２）が、はじめの実験において使用される。その後の実験において、このプロモーター領域は、ＬＥＦ−１、ＰＰＡＲδ、ｍｙｃなどの結合部位を含む特別に合成された二重鎖オリゴヌクレオチドを連結することによって増やされる（以下を参照のこと）。
【００５８】
以下の文書において言及されているが、詳細は説明されていない全ての分子生物学における標準的方法（例えば、分析規模でのプラスミドＤＮＡ調製、制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡ切断、線状ＤＮＡの脱リン酸化、突出末端の補填、ＤＮＡ分子の連結、細菌の形質転換、アガロースゲル上の核酸の画分など）は、原則として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらにより著述されているような実験マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。
【００５９】
ｐＴＯＰＦＬＡＳＨベクターおよびｐＦＯＰＦＬＡＳＨベクターの場合に、ルシフェラーゼ遺伝子は、制限酵素ＮＣＯ１およびＮＯＴ１によって消化することにより切断され、そして、それらのベクターは、引き続いて、アルカリホスファターゼとともにそれらをインキュベートすることにより脱リン酸化される。次いで、これらの反応生成物は、エチジウムブロマイド含有アガロースゲルでのゲル電気泳動によって分離され、その後、そのベクターのバンド（サイズが約３．８ｋｂ）がそのゲルから切り出され、そして、そのＤＮＡが、Ｑｉａｇｅｎ製の「ＱｉａｅｘＲＩＩ  ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ」を使用して単離される。αＧＦＰＴ２０４Ｉ遺伝子は、ＰＣＲ反応によって増幅され、その一方で、Ｍａｘｙｇｅｎにより供給されるｐＫＵ２３ベクターまたはα＋ＧＦＰｃｙｃｌｅ３ベクター（これらのベクターは、αＧＦＰＴ２０４Ｉ遺伝子を含む）から、５’に位置するプライマー（５’−ＣＣＣ  ＧＧＧ  ＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＣＴＴ  ＴＴＣ  ＡＣ−３’）に関してＮＣＯ１のための対応する制限切断部位、ならびに３’位置するプライマー（５’−  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＣ−３’）に関してＮＯＴ１のための対応する制限切断部位を導入することによって導入され（Ｃｒａｍｅｒｉ，Ａ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｒｎ，Ｅ．Ａ．，Ｔａｔｅ，Ｅ．＆  Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９６）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ３０  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３１５−３１９）、制限エンドヌクレアーゼＮＣＯ１および制限エンドヌクレアーゼＮｏｔ１で消化され、フェノール／クロロホルムでそれを処理することのよって精製され、沈殿され（１０分の１の体積の３Ｍ  ＮａＡｃおよび２．５体積の１００％エタノールを添加）、７０％エタノールで洗浄され、乾燥され、そして、１×ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液で回収される。この反応生成物（サイズが約７００ｂｐである）は、その後、ゲル電気泳動によって分離され、そして、アガロースゲルから単離される（上記を参照のこと）。このＴＯＰベクターおよび／またはＦＯＰベクターは、Ｍｇ２＋およびＡＴＰを含有する適切な緩衝液中のＴ４−ＤＮＡリガーゼを使用して増幅されたαＧＦＰＴ２０４Ｉ  ｃＤＮＡに連結される。この連結混合物は、細菌へと形質転換され、その後プラスミドＤＮＡは増幅した単一のコロニーから単離され（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製「ＤＨ５αＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ」）、その後、これらの細菌は、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレートに画線され；アンピシリン耐性の単一コロニーは、体積５ｍｌのＬＢ液状培養液に接種するために使用され（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製「ＣｏｎｃｅｒｔＴＭ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ」）、ＮＯＴ１およびＮＣＯ１での制限消化およびセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用する配列���定（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製「Ｂｉｇ  ＤｙｅＴＭ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」）により大量生成され、そして、確認された。所望の配列を有するプラスミドＤＮＡが、続いて、大量に生成および精製され（Ｑｉａｇｅｎ製の「ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ」）、そして、ＳＷ４８０結腸癌腫細胞をトランスフェクションするために使用される。
【００６０】
レポーター遺伝子構築物が、所望する場合、製造会社ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの指示書に従い「ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＲ  ｒｅａｇｅｎｔ」、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＰｌｕｓＴＭ  ｒｅａｇｅｎｔ」または「ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ」を使用して、トランスフェクトされ、このトランスフェクションの前に、６ウェルプレート中にＳＷ４８０細胞が接種され（ウェル当たり約３０００００細胞）、そして、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇのペニシリン中で、３７℃、湿度９０％、７．５％ＣＯ２含有量にて、一晩インキュベートする。１μｇと１０μｇとの間の、ＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４ＩベクターＤＮＡとＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４ＩベクタＤＮＡが、また、コントロールとして１μｇと１０μｇとの間の、α＋ＧＦＰｃｙｃｌｅ３ベクターＤＮＡを、ポリエチレンチューブの中で１０μｌのリポフェクチンまたはリポフェクタミンおよび９０μｌのＯｐｔｉｍｅｍと混合され、そして、この混合物は１時間、室温にてインキュベートされる。その後、８００μｌのＯｐｔｉｍｅｍが添加され、そして、１時間のインキュベーション後、この混合物は細胞に添加され、この細胞はＰＢＳで数回洗浄され、そして、この細胞を一晩インキュベートされる。次の日の朝に、このトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞は、ＰＢＳで１回洗浄され、そして、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中でインキュベートされる。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＡＸ７（Ｍｕｌｔｉｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｏｘ  ２００−３および「Ｍｏｄｕｌｅ  Ｓｔａｇｅ」分析ドライバソフトウェアを備える）下での適切な励起の後に、α＋ＧＦＰｃｙｃｌｅ３およびＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉでトランスフェクトされた細胞は発光を始めるが、ＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉでトランスフェクトされた細胞は、いずれの顕著な蛍光の増大を示さない。これらの知見は、フローサイトメーター（ＦＡＣＳｓｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）における蛍光強度を測定することによって確認され、このフローサイトメーターは、緑色蛍光のためのレーザー励起装置が備え付けられている。この蛍光強度がプロットされ、蛍光強度についての規定された閾値を有すると陽性シグナルとして割り当てられる。ＧＦＰ蛍光検出を最適化するために、標準フルオレセインフィルターは、適切な場合、３４０ｎｍと４４０ｎｍとの間で起きる励起および４７５ｎｍと４９０ｎｍとの間で起きる励起をそれぞれ可能にするブロードバンドバイオレットフィルター（例えば、オリンパス製のＵ−ＭＢＶ）を用いて置換する。
【００６１】
（２．ＬＥＦ−１／ＴＣＦおよびＰＰＡＲδのついての転写因子結合部位のコンビナトリアル用途に基づいたＳＷ４８０細胞中のαＧＦＰＴ２０４Ｉの過剰発現）
Ｗｎｔシグナル活性に起因して、ＳＷ４８０細胞は、転写因子ＰＰＡＲδを過剰発現する（Ｈｅ  Ｔ．Ｃ．，Ｃｈａｎ  Ｔ．Ａ．，Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ．＆  Ｋｉｎｚｅｒ  Ｋ．Ｗ．（１９９９）ＰＰＡＲδ  ｉｓ  ａｎ  ＡＰＣ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ．Ｃｅｌｌ  ９９：３３５−４５）。レポーター遺伝子が発現しているときの、転写因子結合部位の相乗効果を測定するために、ＰＰＡＲα応答エレメントは、ＴＯＰ−αＧＦＰＴ２Ｏ４ＩベクターおよびＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉベクターにクローニングされる。このために、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＡＧＣＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＧＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＧ−３’（＝機能的ＰＰＡＲδＤＮＡ結合部位）、または５’−ＣＴＡＧＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＣＡＣＧＴＴＣＧ−３’（＝機能的ＰＰＡＲδＤＮＡ結合部位およびＰＰＡＲγＤＮＡ結合部位）は、等量の対応する、合成の相補的な対となる鎖（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔｒａｎｄ）であるオリゴヌクレオチドと十分に混合された後に、加熱および冷却によって、二両体化され、上流、つまり、機能的および／または非機能的なＬＥＦ−１／ＴＣＦ結合部位の５’で、平滑末端連結によってこのレポーター構築物のプロモーター領域へと挿入される。この連結混合物は、細菌へと形質転換され、この細菌は、次いで、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に画線される；このプラスミドＤＮＡは、増殖した単一のコロニーから単離され、ＮＯＴ１およびＮＣＯ１を使用する制限消化ならびにいくつかのセンス鎖プライマーおよびアンチセンス鎖プライマーを使用する配列決定によって分析され、そして、確認される。所望する配列を有するプラスミドＤＮＡは、続いて、より多い量で生成され、そして、精製され、上記の様式でリポフェクチンまたはリポフェクタミンを使用してＳＷ４８０結腸癌腫細胞をトランスフェクトするために使用される。フローサイトメーターにおける蛍光強度の測定によって、機能的ＬＥＦ−１／ＴＣＦ−ＤＮＡ結合部位およびＰＰＡＲδ  ＤＮＡ結合部位の存在下におけるαＧＦＰＴ２０４Ｉの増大した発現に関する測定可能な相乗効果、すなわち蛍光強度を示す。このことに加え、トランスフェクトした細胞を、非ステロイド抗炎症性物質（すなわち、３００μＭ  スリンダウスルフィド、インドメタシンおよびアスピリン）を１０時間のインキュベーションすることによって、機能的なＰＰＡＲδ−ＤＮＡ結合部位の存在下でＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉレポーター遺伝子の観察される活性が有意に阻害され、その結果、αＧＦＰＴ２０４Ｉの発現は、事実上、機能的ＰＰＡＲδ  ＤＮＡ結合部位を有さないＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉレポーター遺伝子活性のバックグラウンドレベルに戻る。
【００６２】
（３．フローサイトメトリーによる異種細胞混合物由来の結腸癌細胞の単離）
上記の様式でＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉまたはα＋ＧＦＰｃｙｃｌｅ３でトランスフェクトした蛍光ＳＷ４８０細胞を単離するために、トリプシン溶液（ＰＢＳ中０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２％トリプシン）を添加することによってＳＷ４８０細胞を基底から解離させ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中に再懸濁した。この細胞を、所望ならば、引き続きＩＳＯＴＯＮ  ＩＩ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）に取り込むか、またはフローサイトメーター（ＦＡＣＳｓｃａｎ，Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて直接測定した。規定したシグナル強度を上回る蛍光を発する細胞を単離し、そして規定された数値部分において、別の組織起源由来のトランスフェクトした細胞またはトランスフェクトしていない細胞（すなわち、結腸ではない；例えば、ＩＩＡ１．６Ｂ細胞、Ｃ５７ＭＧ乳癌細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞またはＢＷ５１４７  Ｔ細胞（これらの細胞は、Ｗｎｔシグナル活性をいずれも有さず、そして結果として実験（実施例１に示したように）において、ＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉでのトランスフェクションの後の蛍光と比較してＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉでのトランスフェクション後の有意に増強した蛍光をいずれも示さない））の細胞懸濁物と混合した。これらの異種細胞混合物を、フローサイトメーター中で続いてもう一度測定し、そして検出した蛍光細胞の数を、もともと添加した蛍光ＳＷ４８０細胞の数と比較する（＝回収率）。
【００６３】
（４．異種細胞集団のトランスフェクト後の、フローサイトメトリーによる異種細胞混合物からの結腸癌細胞の単離）
Ｈｅｌａ子宮頸癌細胞、３Ｔ３繊維芽細胞またはＳＶ４０形質転換ＣＯＳ細胞を、ＳＷ４８０結腸癌細胞と種々の量的割合で混合するか、またはコントロールの目的で異種細胞集団のままにした。その後、異種細胞混合物の細胞、または異種細胞集団の細胞を、３０００００細胞／ウェルの割合で６ウェルプレートのウェル中に播種し、ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇペニシリン中にて、３７℃、９０％湿度およびＣＯ２含量７．５％で一晩インキュベートする。プラスミドＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ、ＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉおよびα＋ＧＦＰｃｙｃｌｅ３を、実施例１に記載したように、リポフェクチン試薬およびリポフェクトアミン試薬を使用して連続してトランスフェクトする。トランスフェクション後の種々の時間（４時間、１６時間、２４時間および４８時間）で、トリプシンでの処理によって、細胞を解離させ、そしてフローサイトメトリーによって測定する。腫瘍細胞検出の特異性および感度を決定するために、検出した蛍光細胞の数／混合物を、もともと添加したＳＷ４８０細胞の数と比較する。
【００６４】
（５．Ｗｎｔシグナル活性を有する結腸癌細胞から構成される異種細胞集団、およびＷｎｔシグナル活性を欠くコントロール細胞のアデノウイルストランスフェクション。ならびに引き続くフローサイトメトリー）
トランスフェクション効率を増加させるために、アデノウイルスレポーター遺伝子構築物を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって供給される「Ａｄｅｎｏ−Ｘ  ＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ１６５０−１）を使用して調製する。これについて、プロモーター領域（αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列を含む）を、ＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４ＩベクターおよびＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４ＩベクターからのＰＣＲ反応によって増幅する。この組み合わせにおいて、酵素Ｉ−ＣＥＵ  Ｉおよび酵素ＮＯＴ  １についての制限切断部位を反応産物のそれぞれ５’末端および３’末端で導入するプライマー（５’センスプライマー：
【００６５】
【化１】
2005525779.tif 000002
；３’アンチセンスプライマー：
【００６６】
【化２】
2005525779.tif 000003
）を作製して使用する。この反応産物を、続いて、制限アンチヌクレアーゼＩ−ＣＥＵ  ＩおよびＮＯＴ  １で消化し、フェノール／クロロホルムで処理して精製し、（１／１０容の３Ｍ  ＮａＡｃおよび２．５容の１００％エタノールの添加で）沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、そして１×ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中に得る。ゲル電気泳動精製の後に、この反応産物を、アガロースゲルより単離する。ｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより提供される）を、酵素Ｉ−ＣＥＵ  Ｉおよび酵素ＮＯＴ  １で対応して切断し、脱リン酸化し、ゲル電気泳動で分離し、そしてゲルから抽出する（実施例１に記載するように）。ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターを、適切な緩衝液（Ｍｇ２＋およびＡＴＰを含む）中でＴ４−ＤＮＡリガーゼを使用して、増幅したＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列またはＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列に連結する。この連結混合物を、続いて細菌に形質導入し、次いで、この細菌をアンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上に広げ；プラスミドＤＮＡを、増殖した単一コロニーから単離し、制限消化によって分析し、いくつかのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用して配列決定し、そして確認する。所望の配列のプラスミドＤＮＡを、比較的大きな量で産生し、そして精製する。
【００６７】
次の工程が、製造業者Ｃｌｏｎｔｅｃｈによって提供される手引書（「Ａｄｅｎｏ−Ｘ  ＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ」を参照のこと）に従って行われる。ＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列またはＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列を、制限酵素Ｉ−ＣＥＵ  ＩおよびＰＩ−ＳＣＥＩを使用してｐＳｈｕｔｔｌｅベクターより切り出し、（上記のような慣用的な分子生物学的中間工程に従って）対応して切断したａｄｅｎｏ−ＸウイルスＤＮＡに連結する。インビトロでの連結物を、続いて制限酵素ＳＷＡＩで消化し、そして対応する混合物を、細菌を形質転換するために使用する。アンピシリン耐性形質転換体からのＤＮＡ調製物を、適切な制限消化によって分析し、そしていくつかのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用して配列決定し、そして確認する。所望の配列の組換えアデノウイルスプラスミドＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのマニュアルの指示に従って小規模で続いて調製し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの手引きに従ってＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを使用して大規模で産生させて、確認する。精製したプラスミドＤＮＡを、制限酵素ＰＡＣ  Ｉで消化し、反応混合物の精製の後に、リポフェクトアミンまたはリポフェクチンを使用して、ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトするために使用した。４〜７日後、細胞の主要部分は解離し、その結果、ＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列またはＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列を有する組換えアデノウイルスを含む上清を、標的細胞を感染させるために遠心分離後に使用し得る。
【００６８】
実施例２および実施例３に従って、ＳＷ４８０細胞の異種細胞集団を、次いで、組換えアデノウイルスとインキュベートする。このために、約５×１０５個のＳＷ４８０細胞を、これらの細胞が一晩で（でなければ４８時間まで）細胞培養ディッシュの底に接着し得るように、１００ｍｍ細胞培養ディッシュに播く。続いて、１ｍｌのウイルス含有培地を、この細胞に約１時間添加する。その後、この細胞をＤＭＥＭ＋１０％  ＦＣＳで一度洗浄し、インキュベーター中で４８時間までインキュベートする。２時間後、４時間後、８時間後、１６時間後、２４時間後、および４８時間後、ＧＦＰの発現を、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーによって測定する。ＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列での感染後のＧＦＰ発現細胞の数は、非常に多く（２４時間後で７０〜９５％）、その一方、ＦＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列でトランスフェクトした細胞は、いずれの有意なＧＦＰ発現も示さない。異種細胞混合物の感染（上記を参照のこと）は、結腸癌細胞においてＴＯＰ−αＧＦＰＴ２０４Ｉ配列での感染後のＧＦＰ遺伝子の特異的な過剰発現を導き、この細胞は、活性なＷｎｔシグナル活性を有する。次の工程において、ＳＷ４８０細胞を種々の量で添加し、各場合において、健康なヒト由来のヒト全血サンプル１ｍｌおよびウイルス含有培地１ｍｌを、次いで、この細胞懸濁液に１時間添加する。数回の注意深い遠心分離工程によってこのサンプルを洗浄し、培地を交換し、そしてインキュベーター中で緩やかに攪拌しながら、３７℃でさらに１２〜１８時間インキュベートする。続いて、ＧＦＰの発現を、フローサイトメトリーによって測定し、ポジティブな蛍光シグナルの数を、各々の場合において添加したＳＷ４８０細胞の数と相関させる。これに加え、蛍光細胞を、適切な閾値設定を使用して単離し、高度に特異的なサイトケラチン−ＦＩＴＣ抗体および抗Ｆｉｔｃアルカリホスファターゼを製造業者の手引きに従って使用して、形態学的観察またはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃによって提供される標準的免疫組織化学法（Ｃａｔ．Ｎｏ．６０３−０１）によって上皮細胞（すなわち、結腸癌細胞）として純粋に同定する。
【００６９】
（６．ＳＷ４８０結腸癌細胞における腫瘍関連Ｗｎｔシグナル活性を基礎とする、ＳＷ４８０結腸癌細胞におけるｓＴＦ−ＬＺの過剰発現）
可溶性トロンボプラスチン（＝可溶性組織因子（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ）；アミノ酸１〜２２０）および酵母転写因子ＧＣＮ４由来のロイシンジッパードメイン（＝ロイシンジッパー（ｌｅｕｃｉｎｅ  ｚｉｐｐｅｒ）から構成される融合産物を腫瘍特異的様式で発現するために、Ｗｎｔ応答性レポーター遺伝子構築物を、第１工程において調製する。プロモーター領域は、ＬＥＦ−１／ＴＣＦ転写因子を結合するための３つの機能部位または３つの非機能部位（それぞれ、ＣＣＴＴＴＧＡＴＣおよびＣＣＴＴＴＧＧＣＣ）、またはこれらの結合部位の改変体（それぞれ、ＣＣＴＴＴＧＡＡまたはＣＣＡＴＴＧＡＡ、およびＣＣＴＴＴＧＧＡまたはＣＣＡＴＴＧＧＡ）を含む。Ｗｎｔ応答性ｓＴＦ−ＬＺレポーター遺伝子構築物を作製するために、記載した出発ベクターｐＴＯＰＦＬＡＳＨ、ｐＦＯＰＦＬＡＳＨ、ｐＴＯＰＣＡＴおよびｐＦＯＰＣＡＴ（Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．，Ｃａｖａｌｌｏ，Ｒ．，Ｄｏｏｉｊｅｓ，Ｄ．，Ｖａｎ  Ｂｅｅｓｔ，Ｍ．，Ｖａｎ  Ｅｓ，Ｊ．，Ｌｏｕｒｅｉｒｏ，Ｊ．，Ｙｐｍａ，Ａ．，Ｈｕｒｓｃｈ，Ｄ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．，Ｂｒｊｓｏｖｅｃ，Ａ．，Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．，Ｍｏｒｔｉｎ，Ｍ．＆Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（１９９７）．Ａｒｍａｄｉｌｌｏ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｇｅｎｅ  ｄＴＣＦ．Ｃｅｌｌ  ８８：７８９−９９；Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ，Ｍ．，Ｏｏｓｔｅｒｗｅｇｅｌ，Ｍ．，Ｄｏｏｉｊｅｓ，Ｄ．＆Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．（１９９１）．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＴＣＦ−１，ａ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＨＭＧ  ｂｏｘ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：１２３−３２）を、第１の実験において使用する。ｐＴＯＰ−ＦＬＡＳＨベクターおよびｐＦＯＰ−ＦＬＡＳＨベクターの場合において、ルシフェラーゼ遺伝子を、制限酵素ＮＣＯ１およびＮＯＴ１で消化することにより取り出し、続いてこれらのベクターをアルカリホスファターゼとともにインキュベートすることによって脱リン酸化する。その後、この反応産物を、エチジウムブロミド含有アガロースゲル中でのゲル電気泳動で分離し、約３．８ｋｂのサイズのベクターバンドをゲルから切り出した後に、ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎによって供給される「Ｑｉａｅｘ（登録商標）ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を使用して単離する。
【００７０】
下記で言及するが詳細には説明しない標準的な分子生物学的方法の全て（例えば、分析規模でのプラスミドＤＮＡ調製、制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡの切断、線状化したＤＮＡの脱リン酸化、突出末端の充填（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、ＤＮＡ分子の連結、細菌の形質転換、アガロースゲルでの核酸の分画など）は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって書かれたマニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に原則的に記載される。
【００７１】
ロイシンジッパードメインについてのｃＤＮＡを、以下のプライマー対：
【００７２】
【化３】
2005525779.tif 000004
を使用して酵母ゲノムＤＮＡからポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する。これに関して、コードセンスプライマーは、Ｎａｒ１制限酵素切断部位を含み、これに加え、短いリンカー配列（すなわち、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ（これは、ロイシンジッパー配列Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕの上流に位置する））をコードする。引き続くクローニング工程のために、アンチセンスプライマーは、制限酵素Ｈｉｎｄ３およびＮｏｔ１についての制限部位を含む。可溶性トロンボプラスチン（アミノ酸１〜２２０、シグナル配列を含むおよび含まない）についてのｃＤＮＡを、以下のコード配列プライマー：
【００７３】
【化４】
2005525779.tif 000005
ならびにアンチセンスプライマー：
【００７４】
【化５】
2005525779.tif 000006
を使用するＰＣＲによって増幅する。これに関して、センスプライマーは、次のクローニング工程のために、制限酵素ＢａｍＨ１およびＮｏｔ１についての制限部位を含む。アンチセンスプライマーは、ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインとの融合のためのＮａｒ１切断部位を含む（上記を参照のこと）。対応する制限酵素で消化した後、フェノール／クロロホルムでの処理によって精製し、（１／１０容の３Ｍ  ＮａＡｃおよび２．５容の１００％エタノールの添加で）沈殿させ、７０％エタノールで洗浄し、そしてこのＰＣＲフラグメントを、乾燥し、そして１×ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中に得た。
【００７５】
この反応生成物は、次にゲル電気泳動的に分離され、そしてアガロースゲルから単離される（上記を参照のこと）。ＢａｍＨ１切断およびＨｉｎｄ３切断され、脱リン酸化され、ゲル電気泳動的に分離され次いで単離されたｐＴｒｃＨｉｓＣベクター（Ｓｔｏｎｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｒｕｆ，Ｍ．，Ｍｉｌｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，Ｔ．Ｓ．＆  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｐ．Ｅ．（１９９５）．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３１０：６０５〜６１４を参照のこと）を用いるＰＣＲ産物のライゲーションを、Ｍｇ２＋およびＡＴＰを含む適切な緩衝液中でＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して行う。このライゲーション混合物を、細菌中に形質転換した（「ＤＨ５αＴＭコンピテント細胞」ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）。この細胞を、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上にストリークし；増殖させ、アンピシリン耐性単一コロニーを、５ｍｌ  ＬＢ液体培養物に接種するために使用し、そしてプラスミドＤＮＡを、増殖単一コロニーから単離し（「ＣｏｎｃｅｒｔＴＭ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ」ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、そして制限消化およびいくつかのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを使用する配列決定（「Ｂｉｇ  ＤｙｅＴＭ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）により分析しかつ確認した。次いで、所望の配列を有するプラスミドＤＮＡを、多量に生成し、精製し（「ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ」Ｑｉａｇｅｎ製）そして、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ中で融合タンパク質を発現させるために使用した。
【００７６】
細菌によって発現したタンパク質を、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を使用して細菌から抽出し、そして、Ｎｉキレートカラム（ＱｉａｇｅｎのＮｉ−ＮＴＡ）を通して精製した後、緩衝液Ａ（６Ｍ  ＧｕＨＣｌ；０．５Ｍ  ＮａＣｌ；２０ｍＭ  リン酸ナトリウム；ｐＨ８）および緩衝液Ｂ（０．８Ｍ  ＧｕＨＣｌ；０．３Ｍ  ＮａＣｌ；５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；２．５ｍＭ還元型グルタチオン；０．５Ｍ酸化型グルタチオン；ｐＨ８）の直線勾配を使用してカラムにおいて折り畳む（ｆｏｌｄ）。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／２０ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．５での徹底的な洗浄の後、このタンパク質を、さらに５０ｍＭイミダゾールを含む同じ緩衝液に溶出し、そして融合タンパク質の機能性を証明するためか、または血液凝固アッセイにおいてポジティブコントロールとして使用する。
【００７７】
制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ１およびＮｏｔ１を用いる消化により、この融合遺伝子を、ｐＴｒｃＨｉｓＣ−ｓＴＦ−ＬＺ発現ベクターから切除し、そして対応するように消化されたＴＯＰ／ＦＯＰベクターにライゲーションする（上記を参照のこと）。ベクターを細菌に形質転換した後、寒天プレート上で増殖させた単一コロニーを、上記の様式で複製し、そして分析する。所望の核酸構築物を保有する細菌のクローンを、多量に生成し、そしてこのそれぞれのプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＳＷ４８０細胞をトランスフェクトするために使用する。
【００７８】
トランスフェクションに先立ち、ＳＷ４８０細胞を、６ウェルプレート（およそ１ウェルあたり３０００００細胞）中に播種し、そしてＤＭＥＭ（１０％ウシ胎仔血清、１００μｇのペニシリン）中にて３７℃、大気湿度９０％およびＣＯ２含量７．５％にて一晩インキュベートし、「ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＲ  ｒｅａｇｅｎｔ」、「Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＰｌｕｓＴＭ  ｒｅａｇｅｎｔ」または「ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ」を製造業者（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示書に従って使用し、レポーター遺伝子構築物を、所望のようにトランスフェクションする。１μｇと１０μｇとの間のＴＯＰ−ｓＴＦ−ＬｚベクターＤＮＡおよびＦＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺベクターＤＮＡを、１０μｌのリポフェクチンまたはリポフェクタミンおよび９０μｌのＯｐｔｉｍｅｍを小ポリスチレン管中にて、徹底的に混合し、そして室温で１時間インキュベートした。次いで、８００μｌのＯｐｔｉｍｅｍを加え、インキュベーションの１時間後、この混合物を、ＰＢＳで数回洗浄した細胞に加え、そして細胞を一晩インキュベートする。次の朝、このトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞を、ＰＢＳで再度洗浄し、そして再度ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中でインキュベートする。ＦＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺ／ＴＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺでトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞の平行バッチ由来の細胞培養上清を、異なる時間（トランスフェクションの１２時間後、２４時間後および３６時間後）に取り除き、そして１００００×ｇの遠心分離によって細胞残渣を取り除く。次いではじめの実験において、この上清を、ｔｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）およびＥＤＴＡの濃度を（これらの化合物を、それぞれ５０ｍＭおよび１０ｍＭを加えることによって）調整し、そして、フィルター遠心分離（Ａｍｉｃｏｎの「Ｓ１Ｙ１０  ｓｐｉｒａｌ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ」）によって、１０倍に濃縮する。これらの濃縮された細胞培養上清を、−８０℃にて保存するか、または直接に血液凝固アッセイのために使用する。ｓＴＦ２１７−ＬＺ、ｓＴＦ２２０−ＬＺまたはｓＴＦ２２６−ＬＺを含む上清を、プールされたヒト血液サンプル（全血クエン酸塩）のアリコートに加える（これらのサンプルのうちいくつかは、さらに第ＶＩＩａ因子および２８μＭのホスファチジルセリン／ホスファチジルコリン混合物（０．１％ＢＳＡを含むＴＢＳ中、４０％ＰＳ対６０％ＰＣ）を含む。）。カルシウム再沈着の後、異なる血液サンプル混合物が凝集するまでの経過の期間を、手動で測定する。ＴＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺでトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞由来の細胞培養上清の添加が、当該血液サンプルの有意に促進された凝集を導くこと（ｓＴＦ２１７−ＬＺおよびｓＴＦ２２０−ＬＺを用いると特に活性である）が見出されている。対照的に、ＦＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺでトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞由来の細胞培養上清の添加後の血液凝集時間は、細胞培養上清を加えないコントロール混合物と比較して、有意に変更される。
【００７９】
（７．血液サンプル中のＴＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺトランスフェクトされた細胞の検出）
まず、ＳＷ４８０細胞を、プラスミドα＋ＧＦＰｃｙｃｌｅ３およびＴＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺまたはＦＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺを用いて、実施例１に記載の様式で、全て同時トランスフェクトする。その後、トリプシン溶液（ＰＢＳ中に０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２パーミルトリプシンを含む）を加えることにより、ＳＷ４８０細胞を、下層から放出し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で再懸濁する。上記にて規定されたシグナル強度の蛍光を発する細胞を、フローサイトメトリーによって単離し（上記を参照のこと）、そしてプールされたヒト血液サンプルのアリコートに、規定された割合の数値にて加えた。カルシウム再沈着の後、異なる血液サンプル混合物が凝集するまでの経過の期間を、手動で測定する。血液凝集時間の減少が、加えられるＴＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞の量に直接的に関連することが、見出されている。一方、ＦＯＰ−ｓＴＦ−ＬＺトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞の添加は、血液凝集時間の減少に関していかなる劇的な効果も示さない。
【配列表】
2005525779.tif 000007
2005525779.tif 000008
2005525779.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年3月24日(2005.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2005525779000001.app
【国際調査報告】
2005525779.tif 000010
2005525779.tif 000011
2005525779.tif 000012
2005525779.tif 000013
2005525779.tif 000014
2005525779.tif 000015