(57)【要約】本発明は、ヌクレオシドアナログをリン酸化する能力を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素（ｄＮＫ）を含む薬学的調合物、および上記ｄＮＫの医学的使用に関する。より具体的には、本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の医学的使用に関する。また本発明は、前記植物ｄＮＫを使って、プロドラッグに対する細胞の感受性を高める方法および温血動物中の病原体を抑制する方法に関する。もう一つの態様として、本発明は、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）から単離された形態で提供される植物由来のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素に関する。さらなる態様として、本発明は、植物ｄＮＫをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクターコンストラクト、該ベクターを産生する能力を持つパッケージング細胞株、およびそのベクターを使って形質導入／トランスフェクト／形質転換された遺伝子改変型単離宿主細胞を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄＣＫ／ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性を持つ少なくとも１つの植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、または上記少なくとも１つの植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、または該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、または該ベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株、または該ベクターを使って形質導入された単離宿主細胞を、薬学的に許容し得る担体または希釈剤と共に含む、薬学的調合物。
【請求項２】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．項目ｉｉの配列のいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｖ．表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項１記載の調合物。
【請求項３】
上記植物ｄＣＫ／ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、細胞内に形質導入された場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ100）を、ヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼの作用と比べて、少なくとも３倍低下させる、請求項２記載の薬学的調合物。
【請求項４】
該ヌクレオシドアナログが、シチジンアナログ、グアノシンアナログおよびアデノシンアナログより成る群から選ばれ、より好ましくは、該ヌクレオシドアナログがゲムシタビン（ｄＦｄＣ）である、請求項３記載の薬学的調合物。
【請求項５】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼが４つの天然デオキシリボヌクレオシド（ｄＴｈｄ、ｄＣｙｄ、ｄＡｄｏ、ｄＧｕｏ）のすべてを変換することができる多基質キナーゼである、請求項１〜４のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項６】
上記酵素が１〜８０アミノ酸残基程度、好ましくは１〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１〜５０アミノ酸残基、さらに好ましくは１〜４０アミノ酸残基、より一層好ましくは１〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは１〜２０アミノ酸残基のＣ末端欠失を持つ、請求項５記載の薬学的調合物。
【請求項７】
上記酵素が、細胞内に形質導入した場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ100）を、非切断型デオキシリボヌクレオシドキナーゼの作用と比べて、少なくとも３倍低下させる、請求項６記載の薬学的調合物。
【請求項８】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼが、表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上、好ましくは７０％を超える残基、より好ましくは８０％を超える残基、さらに好ましくは９０％を超える残基、より一層好ましくは９５％を超える残基を含み、もっとも好ましくは表１で同定されている保存残基のすべてを含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜７のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項９】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、表１で半保存残基と同定されている位置の６０％以上で、好ましくは７０％を超える位置で、より好ましくは８０％を超える位置で、さらに好ましくは９０％を超える位置で、より一層好ましくは９５％を超える位置で半保存残基も含み、最も好ましくは表１で同定されている半保存残基のすべてを含むアミノ酸配列を有する、請求項８記載の薬学的調合物。
【請求項１０】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼが１〜６０アミノ酸残基程度、好ましくは１〜５０アミノ酸残基、より好ましくは１〜４０アミノ酸残基、さらに好ましくは１〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは１〜２０アミノ酸残基のＮ末端欠失を持つ、請求項１〜９のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１１】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがテーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも７６％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項１記載の薬学的調合物。
【請求項１２】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項２記載の薬学的調合物。
【請求項１３】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項２記載の薬学的調合物。
【請求項１４】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項２記載の薬学的調合物。
【請求項１５】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項２記載の薬学的調合物。
【請求項１６】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼが、
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９または１１のいずれかのポリヌクレオチド配列、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９または１１のいずれかに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の配列一致度を持つポリヌクレオチド配列、
ｉｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９または１１として記載するポリヌクレオチド配列と少なくとも中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力を持つポリヌクレオチド配列、および
ｉｖ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９または１１のいずれかの機能的アナログ、
より成る群から選ばれるポリクレオチド配列によってコードされる、請求項２記載の薬学的調合物。
【請求項１７】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのどちらか一方に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｉｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＮ末端欠失またはＣ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項２記載の薬学的調合物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１つで定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードするポリヌクレオチド配列とそのポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターとを含むベクターコンストラクトを含む、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の薬学的調合物。
【請求項１９】
上記ベクターがウイルスベクター、特に単純疱疹ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターである、請求項１８記載の薬学的調合物。
【請求項２０】
癌の治療において同時投与、個別投与または連続投与するための組合せとして、ヌクレオシドアナログと、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、または該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子、または該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を含むベクター、または該ベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株を含有する、物品。
【請求項２１】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｖ．表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、項目ｉｉまたはｉｉｉのいずれかに定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項２０記載の物品。
【請求項２２】
該ヌクレオシドアナログが、シチジンアナログ、アデノシンアナログおよびグアノシンアナログより成る群から選ばれる、請求項２１記載の物品。
【請求項２３】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのどちらか一方に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｉｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＮ末端欠失またはＣ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項２１記載の物品。
【請求項２４】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項２１記載の物品。
【請求項２５】
あるプロドラッグに対する細胞の感受性を高める方法であって、当該方法が、
（ｉ）該プロドラッグの（細胞毒性）薬への変換を促進する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を該細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）該プロドラッグを該細胞に送達する工程、
を含み、この際該細胞が該（細胞毒性）薬に対して、該プロドラッグに対する感受性よりも高い感受性を持つことを特徴とする、上記方法。
【請求項２６】
該プロドラッグがヌクレオシドアナログである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該プロドラッグがシチジンアナログ、グアノシンアナログおよびアデノシンアナログより成る群から選ばれ、より好ましくは該プロドラッグがゲムシタビンである、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
コードされている植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｖ．表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのどちらか一方に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｉｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＮ末端欠失またはＣ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
温血動物中の病原体を抑制する方法であって、該動物に、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、または該ベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株を投与することを含む、上記方法。
【請求項３２】
コードされている植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｖ．表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該ポリヌクレオチド配列または該ベクターが生体内投与される、請求項３１又は３２記載の方法。
【請求項３４】
該病原体がウイルス、細菌または寄生虫である、請求項３１〜３３のいずれか１つ記載の方法。
【請求項３５】
該病原体が腫瘍細胞である、請求項３１〜３３のいずれか１つ記載の方法。
【請求項３６】
該病原体が自己反応性免疫細胞である、請求項３１〜３３のいずれか１つ記載の方法。
【請求項３７】
該温血動物にヌクレオシドアナログを投与する工程をさらに含む、請求項３１〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３８】
該ヌクレオシドアナログが、シチジンアナログ、グアノシンアナログおよびアデノシンアナログより成る群から選ばれ、より好ましくは該ヌクレオシドアナログがゲムシタビンである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのどちらか一方に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｉｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＮ末端欠失またはＣ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項３２記載の方法。
【請求項４０】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項３２記載の方法。
【請求項４１】
テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４２】
トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、単離された植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４３】
トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、単離された植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４４】
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、単離された植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４５】
イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、単離された植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４６】
１〜８０アミノ酸残基程度、好ましくは１〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１〜５０アミノ酸残基、さらに好ましくは１〜４０アミノ酸残基、より一層好ましくは１〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは１〜２０アミノ酸残基のＣ末端欠失を持つ、請求項４１〜４４のいずれか１つに記載の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４７】
４つの天然デオキシリボヌクレオシド（ｄＴｈｄ、ｄＣｙｄ、ｄＡｄｏ、ｄＧｕｏ）のすべてを変換することができる多基質キナーゼである、請求項４６記載の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４８】
細胞内に形質導入した場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ100）を、非切断型デオキシリボヌクレオシドキナーゼの作用と比べて、少なくとも３倍低下させる、請求項４６又は４７記載の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項４９】
１〜６０アミノ酸残基程度、好ましくは１〜５０アミノ酸残基、より好ましくは１〜４０アミノ酸残基、さらに好ましくは１〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは１〜２０アミノ酸残基のＮ末端欠失を持つ、請求項４１〜４８のいずれか１つに記載の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ。
【請求項５０】
ｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９または１１のいずれかの配列を持つ単離されたポリヌクレオチド、
ｉｉ．請求項４１〜４９のいずれか１つに定義された酵素をコードする単離されたポリヌクレオチド、
ｉｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９または１１の配列のいずれかと整列させた場合に、その重複範囲において、前記配列に対して少なくとも９０％の配列一致度を持つ、単離されたポリヌクレオチド、および
ｉｖ．上記のいずれかの相補配列、
より成る群から選ばれる、植物ｄＣＫ／ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０に記載のポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターとを含む、ベクターコンストラクト。
【請求項５２】
ウイルスベクター、特に単純疱疹ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターである、請求項５１記載のベクターコンストラクト。
【請求項５３】
請求項５１又は５２記載のベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株。
【請求項５４】
請求項５１又は５２記載のベクターを使って形質導入／トランスフェクト／形質転換された単離宿主細胞。
【請求項５５】
ヒト細胞、イヌ細胞、ブタ細胞、サル細胞、ラット細胞またはマウス細胞である、請求項５４記載の宿主細胞。
【請求項５６】
ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのリン酸化を目的とする、請求項４１〜４９のいずれか１つに記載の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の使用。
【請求項５７】
ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログをリン酸化する方法であって、
ｉ）そのヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに、請求項４１〜４９のいずれか１つに記載の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素を作用させる工程、および
ｉｉ）リン酸化されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを回収する工程、
を含む、上記方法。
【請求項５８】
細胞または対象(subject)における本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の導入遺伝子発現の非侵襲的核イメージング法であって、
（ｉ）基質の基質一リン酸への変換を促進する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、該細胞または対象にトランスフェクトする工程、
（ｉｉ）該細胞または対象に前記基質を送達する工程、および
（ｉｉｉ）該細胞または対象における該プロドラッグへの変化を非侵襲的に監視する工程、
を含む、上記方法。
【請求項５９】
工程（ｉｉｉ）で行う監視が、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）もしくはコンピュータ体軸Ｘ線断層撮影法（ＣＡＴ）、またはそれらの組合せによって行われる、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
上記基質が標識ヌクレオシドアナログである、請求項５８又は５９記載の方法。
【請求項６１】
コードされている植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの配列のいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｖ．表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項５８記載の方法。
【請求項６２】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、
ｉ．シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉ．ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
ｉｉｉ．該ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのどちらか一方に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
ｉｖ．１〜８０アミノ酸残基程度のＮ末端欠失またはＣ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる、請求項５８記載の方法。
【請求項６３】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項５８記載の方法。
【請求項６４】
植物ｄＣＫ／ｄＧＫ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む植物細胞を持っている植物の生長を制御または改変する方法であって、その植物または植物細胞をヌクレオシドアナログに曝露する工程を含む、上記方法。
【請求項６５】
該ヌクレオシドアナログがシチジンアナログ、グアノシンアナログおよびアデノシンアナログより成る群から選ばれ、より好ましくは該ヌクレオシドアナログがゲムシタビンである、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
該ポリヌクレオチド配列が、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５によって表されるポリヌクレオチド配列、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の配列一致度を持つポリヌクレオチド配列、
・３〜２４０ヌクレオチド程度の５’欠失及び(又は)３’欠失を持つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５由来のポリヌクレオチド配列、
より成る群から選ばれる、請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
該ポリヌクレオチド配列がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として記載したポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、請求項６４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシドアナログをリン酸化する能力を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素（ｄＮＫ）を含む薬学的調合物、および上記ｄＮＫの医学的使用に関する。より具体的には、本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の医学的使用に関する。また本発明は、前記植物ｄＮＫを使って、プロドラッグに対する細胞の感受性を高める方法および温血動物中の病原体を抑制する方法に関する。
【０００２】
もう一つの態様として、本発明は、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）から単離された形態で提供される植物由来のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素に関する。さらなる態様として、本発明は、植物ｄＮＫをコードするポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドを含むベクターコンストラクト、該ベクターを産生する能力を持つパッケージング細胞株、およびそのベクターを使って形質導入／トランスフェクト／形質転換された遺伝子改変型単離宿主細胞を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡは、新生経路およびサルベージ経路によって供給される４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸から作られる。新生経路の鍵酵素は、ヌクレオシド二リン酸の２’−ＯＨ基の還元を触媒するリボヌクレオチドレダクターゼであり、鍵サルベージ酵素は、デオキシリボヌクレオシドを対応するデオキシリボヌクレオシド一リン酸にリン酸化するデオキシリボヌクレオシドキナーゼである。
【０００４】
さまざまな生物に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼは、その基質特異性、遺伝子発現の調節および細胞局在が異なっている。哺乳類細胞には、重複した特異性を持つ酵素が４つあり、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）、チミジンキナーゼ２（ＴＫ２）、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）およびデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）は、プリンデオキシリボヌクレオシドおよびピリミジンデオキシリボヌクレオシドをリン酸化する。ＴＫ１およびＴＫ２はピリミジン特異的で、デオキシウリジン（ｄＵｒｄ）およびデオキシチミジン（ｄＴｈｄ）をリン酸化し、ＴＫ２はデオキシシチジン（ｄＣｙｄ）もリン酸化する。ｄＣＫはｄＣｙｄ、デオキシアデノシン（ｄＡｄｏ）およびデオキシグアノシン（ｄＧｕｏ）をリン酸化するが、ｄＴｈｄはリン酸化しない。ｄＧＫはｄＧｕｏおよびｄＡｄｏをリン酸化する。哺乳動物では、ＴＫ１は細胞質性であり、ＴＫ２とｄＧＫはミトコンドリアに局在する。ただし最近の報告ではＴＫ２の細胞質局在も示されている。
【０００５】
特許文献1には、昆虫、特にキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）と、両生類アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）とに由来する多基質デオキシリボヌクレオシドキナーゼ変異体が記載されている。
【０００６】
ＧｅｎＢａｎｋ（商標）では、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａのゲノムＤＮＡの一片に、推定デオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）という注釈が付けられており、これがプリンヌクレオシドだけを変換することが示唆されている（アクセッション番号ＡＡＧ５１１４１）。しかし今のところ、植物キナーゼの特徴づけ、特性、局在、用途または生物学的機能に関する実験的研究は、まだなされていない。
【特許文献１】国際特許出願(ＷＯ)第０１／８８１０６号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ヌクレオシドアナログを毒性物質に変換するのに有用であり、ヌクレオシドを一リン酸に変換するのに役立つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼを提供することが、本発明の目的である。特に、医療用の該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼを提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
前記植物由来デオキシリボヌクレオシドキナーゼの特性を利用した薬学的調合物を提供することが、もう一つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様として、本発明は、少なくとも１つの植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、または上記少なくとも１つの植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、または該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、または該ベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株、または該ベクターを使って形質導入された単離宿主細胞を、薬学的に許容し得る担体または希釈剤と共に含む薬学的調合物に関する。
【００１０】
植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼに関して、薬学的調合物への使用または医学的使用が考えられたことは、今まで全くなかった。本発明者らは、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼが他の分類群（特にウイルスおよび動物）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼとは異なる特性を持ち、その特性ゆえに、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼは他のデオキシリボヌクレオシドキナーゼよりも医学的使用に好適であることを確認した。
【００１１】
植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、好ましくは、
・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
・１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる。
【００１２】
本発明者らは、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼが、基質特異性に関して予想外の特性を持つことを確認した。これは、これらの酵素が基本的に多基質植物ｄＣＫ／ｄＧＫ様キナーゼ酵素であることを意味する。またこれは、これらの酵素が既知のｄＮＫ酵素（このなかではヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）由来のデオキシリボヌクレオシドキナーゼが最も有望である）よりも効率がよいことも意味する。例えば、細胞内に形質導入した場合に、本薬学的調合物の好ましい酵素は、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ100）を、ヒト単純疱疹ウイルス、好ましくはヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼの作用と比べて、少なくとも３倍低下させる。参考に用いられるそのようなヌクレオシドアナログの好ましい一例はゲムシタビン（ｄＦｄＣ）である。
【００１３】
さらにもう一つの態様として、本発明は、癌の治療において同時投与、個別投与または連続投与するための組合せとして、ヌクレオシドアナログと、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、または該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子、または該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子を含むベクター、または該ベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株を含有する物品に関する。
【００１４】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、好ましくは、
・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
・１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる。
【００１５】
これらの物品は、特に、癌の処置に使用することができる。
【００１６】
前記物品に含まれるヌクレオシドアナログは、好ましくは、シチジンアナログ、アデノシンアナログおよびグアノシンアナログより成る群から選ばれる。これらのヌクレオシドアナログはいずれも、本明細書に記載するキナーゼによって変換されて、高い治療効率をもたらすことができる。より好ましくは、ヌクレオシドアナログはゲムシタビンである。
【００１７】
さらにもう一つの態様として、本発明は、温血動物中の病原体を抑制する方法であって、その動物に、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドもしくはベクター、または該ベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株を投与することを含む、上記方法に関する。
【００１８】
コードされている植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、好ましくは、
・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
・１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、項目ｉｉまたはｉｉｉのいずれかに定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる。
【００１９】
上述の酵素は今まで知られていなかった改善された速度論的特性を持つので、これらは前記病原体の処置にとりわけ有用である。
【００２０】
本発明の医学的、薬学的および治療的側面の最も好ましい形態では、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼがシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、その酵素はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【００２１】
もう一つの態様として、本発明は、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードするヌクレオチド配列、該ポリヌクレオチド配列とそのポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターとを含むベクターコンストラクト、感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株であって、本発明の前記発現ベクターを含むもの、本発明の発現ベクターを使って形質導入／トランスフェクト／形質転換された単離宿主細胞を提供する。
【００２２】
これら４つの植物種に由来するｄＣＫ／ｄＧＫ様キナーゼ酵素は、純粋な形態では本発明によって初めて提供される酵素である。これらのキナーゼは、予想外に広い基質特異性と、多様なヌクレオシドアナログをリン酸化する能力を持つため、医学的使用を含む広範な用途に使用することができる。
【００２３】
さらにもう一つの態様として、本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログのリン酸化を目的とする、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の使用に関する。
【００２４】
さらにもう一つの態様として、本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログをリン酸化する方法であって、そのヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素を作用させる工程、およびリン酸化されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを回収する工程を含む方法を提供する。
【００２５】
この使用およびそれに対応する方法は、本発明によって提供される酵素が持っている広い基質特異性及び(又は)改善された速度論的特性から派生するものである。
【００２６】
さらにもう一つの態様として、本発明は、細胞または対象における本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の導入遺伝子発現の非侵襲的核イメージング法を提供する。
【００２７】
有効な臨床的自殺遺伝子治療プロトコールを開発するには、導入遺伝子発現の程度、動態および空間的分布を調べるための非侵襲的方法が不可欠である。研究者や医師は、そのようなイメージング法によって、実験的および治療的遺伝子トランスフェクションプロトコールの効率を評価することができ、治療転帰の早期予後判定が可能になるだろう。
【００２８】
生体内の代謝過程を非侵襲的に可視化し定量することができる単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）や陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）などの放射性核種イメージング技術は、生きている動物およびヒトにおける導入遺伝子発現の反復監視に関して、現在、評価されているところである。導入遺伝子発現は、治療遺伝子そのものの発現をイメージングすることによって直接的に監視するか、治療遺伝子と共役しているレポーター遺伝子を使って間接的に監視することができる。さまざまな放射性医薬品が開発されており、それらは、導入遺伝子発現のイメージングに関して、現在、評価されているところである。
【００２９】
さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を持っている植物の生長を制御または改変する方法であって、その植物または植物細胞をヌクレオシドアナログに曝露する工程を含む方法に関する。前記ヌクレオシドアナログは、好ましくは、ゲムシタビンである。
【００３０】
本発明の他の目的は、以下の詳細な説明と実施例から、当業者には明白になるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（薬学的調合物）
一態様として、本発明は、治療有効量の少なくとも１つの植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、または上記少なくとも１つの植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、または該ポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、または該ベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株、または該ベクターを使って形質導入された単離宿主細胞を、薬学的に許容し得る担体または希釈剤と共に含む薬学的調合物に関する。
【００３２】
該植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、好ましくは、
・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
・１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる。
【００３３】
一部の態様では、本薬学的調合物は、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする遺伝子、前記遺伝子を含む発現ベクター、または該ベクターを含む感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つパッケージング細胞株を含む。これらの態様の場合、デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする配列を含む好ましいポリヌクレオチド配列は、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９または１１のいずれかのポリヌクレオチド配列、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９または１１のいずれかに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の配列一致度を持つポリヌクレオチド配列、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９または１１として記載するポリヌクレオチド配列と少なくとも中ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力を持つポリヌクレオチド配列、および
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、３、５、７、９または１１のいずれかの機能的アナログ、
より成る群から選ばれる。
【００３４】
本発明の医学的、薬学的および治療的側面に関して、好ましい植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、
・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）またはトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのどちらか一方に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
・１〜８０アミノ酸残基程度のＮ末端欠失またはＣ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる。
【００３５】
これらの酵素は、既知のｄＮＫと比べて、特にヒト単純疱疹ウイルス由来の、特にヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）由来のデオキシリボヌクレオシドキナーゼと比べて、改善された速度論的特性と、より広い基質特異性とを持っている。
【００３６】
植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に関して言うと、これに対応する好ましい配列は、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５によって表されるポリヌクレオチド配列、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の配列一致度を持つポリヌクレオチド配列、
・３〜２４０ヌクレオチド程度の５’欠失及び(又は)３’欠失を持つＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５由来のポリヌクレオチド配列、
より成る群から選ばれる。
【００３７】
医学的、薬学的および治療的側面のための酵素は、より好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。実施例に記載するアッセイでは、シロイヌナズナ由来のｄＮＫが、デオキシリボヌクレオシドとアナログの両方を、最も効率よくリン酸化した。
【００３８】
ポリヌクレオチド配列に関して言うと、これは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として記載するポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼコード配列に相当する。
【００３９】
治療に使用する場合、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、都合のよい任意の形態で投与することができる。好ましい一態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素が、１つ以上の佐剤、賦形剤、担体及び(又は)希釈剤と共に薬学的調合物に組み込まれ、その薬学的調合物は、当技術分野で知られる通常の方法を使って当業者によって製造される。
【００４０】
本調合物は単独で投与するか、または１つ以上の他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて投与することができる。
【００４１】
本発明の薬学的調合物は、例えば経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、動脈内経路、髄内経路、髄腔内経路、脳室内経路、経皮経路、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、経腸経路、局所経路、舌下または直腸適用、口腔粘膜経路、膣経路、眼窩内経路、脳内経路、頭蓋内経路、脊髄内経路、脳室内経路、槽内経路、嚢内経路、肺内経路、経粘膜経路、または吸入による経路など（ただしこれらに限らない）、任意の適切な経路で投与することができる。
【００４２】
製剤技術および投与技術に関するさらなる詳細は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン）の最新版に見いだすことができる。
【００４３】
有効成分は１日に１回〜数回投与することができる。現時点で予期している適切な投与量は、１回の投与につき体重１ｋｇあたり０．５ｎｇ〜約５０μｇ／ｋｇのデオキシリボヌクレオシドキナーゼ、１日あたり約１．０ｎｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇである。
【００４４】
もちろん投与量は、処置される個体の年齢、体重および状態、ならびに投与経路、剤形、投与計画、および所望する結果に合わせて注意深く調節しなければならず、正確な投与量は、当然のことながら、医師によって決定されるべきである。
【００４５】
さらなる態様として、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、処置方法の項で後述するように、細胞株およびベクターを使って、遺伝子送達によって投与することもできる。
【００４６】
したがって、もう一つの好ましい態様として、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、または本発明のベクター、または本発明のパッケージング細胞、または本発明の宿主細胞を、薬学的に許容し得る担体または希釈剤と共に含む薬学的調合物を提供する。
【００４７】
そのような治療用細胞株を作出するには、本発明のポリヌクレオチドを発現ベクター、例えばプラスミド、ウイルスまたは他の発現媒体に挿入し、発現制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように、ライゲーションによって発現制御配列と作動的に連結することができる。
【００４８】
好適な発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、転写終結因子、開始コドン、イントロンのためのスプライシングシグナル、および停止コドンなどがあり、これらはいずれも、ｍＲＮＡが適正に翻訳されうるように、本発明のポリヌクレオチドの正しい読み枠に維持される。発現制御配列には、例えばリーダー配列や融合パートナー配列などの追加成分も含めることができる。
（処置方法）
ポリヌクレオチドおよびそこから産生されるタンパク質、ポリペプチドまたは誘導体に関する本発明は、ヒトを含む動物の生体の障害または疾患（細胞毒性剤の活性に応答するもの）を処置または軽減するために使用することができる。
【００４９】
上記の障害、疾患または状態として、特に癌またはウイルス感染を挙げることができる。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、特に「自殺遺伝子」、すなわち薬剤感受性遺伝子として使用することができる。標的細胞に自殺遺伝子を導入すると、その細胞は、正常細胞にとっては比較的無毒である化合物または調合物に対して感受性になる。
【００５１】
したがって一態様として、本発明は、プロドラッグに対する標的細胞の感受性を高める方法であって、
（ｉ）該プロドラッグの（細胞毒性）薬への変換を促進する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を標的細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）該プロドラッグを前記標的細胞に送達する工程、
を含み、前記標的細胞が該（細胞毒性）薬に対して、該プロドラッグに対する感受性よりも高い感受性を持つことを特徴とする、上記方法を提供する。
【００５２】
最も広く考えると、任意の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素を使用することができる。しかし、コードされている植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、より好ましくは、
・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのいずれか一つに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上を含むアミノ酸配列を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
・１〜８０アミノ酸残基程度のＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる。
【００５３】
本発明の治療的側面に関して、好ましい植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、
・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのどちらか一方に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
・１〜８０アミノ酸残基程度のＮ末端欠失またはＣ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる。
【００５４】
これらの酵素は、既知のｄＮＫと比べて、特にヒト単純疱疹ウイルスに由来する、特にヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼと比べて、改善された速度論的特性と、より広い基質特異性とを持っている。
【００５５】
医学的、薬学的および治療的側面のための酵素は、より好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。実施例に記載するアッセイでは、シロイヌナズナ由来のｄＮＫが、デオキシリボヌクレオシドとアナログの両方を、最も効率よくリン酸化した。
【００５６】
本発明のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、本デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素に応答する病理学的過程を処置するために、例えば薬学的調合物の注射、植込または摂取などにより、直接的に使用することができる。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドは、その相補配列を含めて、本発明のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の発現に使用することができる。これは、そのような本発明のタンパク質、ペプチドもしくは誘導体を発現させる細胞株によって、またはそのような本発明のタンパク質、ペプチドもしくは誘導体をコードするウイルスベクターによって、またはそのようなタンパク質、ペプチドもしくは誘導体を発現させる宿主細胞によって達成することができる。これらの細胞、ベクターおよび調合物は、細胞毒性剤に応答する疾患過程に影響を与える目的で、処置標的領域に投与することができる。
【００５８】
好適な発現ベクターとしては、単純疱疹ウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルスもしくはワクシニアウイルスに由来するウイルスベクター、または細菌が産生する種々のプラスミドを挙げることができ、これらは生物全体または標的とする器官、組織もしくは細胞集団へのヌクレオチド配列の生体内送達に使用することができる。他の方法には、例えばリポソームトランスフェクション、エレクトロポレーション、核局在シグナルまたは他の局在シグナルを持つ担体ペプチドを使ったトランスフェクション、および徐放系による遺伝子送達などがあるが、これらに限るわけではない。本発明のさらにもう一つの態様として、本発明のヌクレオチドまたはその一部に相補的な「アンチセンス」ヌクレオチド配列を使って、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素発現を抑制または増進することもできる。
【００５９】
もう一つの好ましい態様として、本発明は、温血動物中の病原体を抑制する方法であって、前記の動物に、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明の発現ベクターを投与する工程を含む方法を提供する。
【００６０】
より好ましい一態様では、上記のポリヌクレオチド配列または発現ベクターが生体内投与される。
【００６１】
もう一つの好ましい態様では、該病原体がウイルス、細菌または寄生虫であり、さらには腫瘍細胞である。
【００６２】
もう一つの好ましい態様では、該病原体が自己反応性免疫細胞である。
【００６３】
さらに好ましい一態様では、本方法は、前記温血動物に、ヌクレオシドアナログを投与する工程をさらに含む。
（プロドラッグ／ヌクレオシドアナログ）
本明細書に記載のｄＮＫによって毒性生成物に変換されうるヌクレオシドアナログは数多く存在する。
【００６４】
好ましい一態様ではプロドラッグがヌクレオシドアナログである。本発明での使用に適したヌクレオシドアナログには、例えばアシクロビル（９−［２−ヒドロキシ−エトキシ］−メチル−グアノシン）、ブシクロビル（ｂｕｃｉｃｌｏｖｉｒ）、ファムシクロビル、ガンシクロビル（９−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシル−メチル］−グアノシン）、ペンシクロビル、バルシクロビル（ｖａｌｃｉｃｌｏｖｉｒ）、トリフルオロチミジン、ＡＺＴ（３’−アジド−３’−チミジン）、ＡＩＵ（５’−ヨード−５’−アミノ−２’，５’−ジデオキシウリジン）、ａｒａ−Ａ（アデノシン−アラビノシド；ビダラビン）、ａｒａ−Ｃ（シチジン−アラビノシド）、ａｒａ−Ｇ（９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニン）、ａｒａ−Ｔ、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、１−［２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、イドクスウリジン（５−ヨード−２’−デオキシウリジン）、フルダラビン（２−フルオロアデニン  ９−β−Ｄ−アラビノフラノシド）、ゲムシタビン、３’−デオキシアデノシン（３−ｄＡ）、２’，３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）、２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、２’，３’−ジデオキシチミジン（ｄｄＴ）、２’，３’−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、２’，３’−ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）、２−クロロ−２’−デオキシアデノシン（２ＣｄＡ）、５−フルオロデオキシウリジン、ＢＶａｒａＵ（（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）、ＢＶＤＵ（５−ブロモビニル−デオキシウリジン）、ＦＩＡＵ（１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル）、３ＴＣ（２’−デオキシ−３’−チアシチジン）、ｄＦｄＣ  ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン）、ｄＦｄＧ（２’，２’−ジフルオロデオキシグアノシン）、５−フルオロデオキシウリジン（ＦｄＵｒｄ）、ｄ４Ｔ（２’，３’−ジデヒドロ−３’−デオキシチミジン）、ａｒａ−Ｍ（６−メトキシプリンアラビノヌクレオシド）、ＩｕｄＲ（５−ヨード−２’−デオキシウリジン）、ＣａＦｄＡ（２−クロロ−２−ａｒａ−フルオロ−デオキシアデノシン）、ａｒａ−Ｕ（１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシル）、ＦＢＶＡＵ  （Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）−１−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシル、ＦＭＡＵ  １−（２−デオキシ−２−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル、ＦＬＴ  ３’−フルオロ−２’−デオキシチミジン、５−Ｂｒ−ｄＵｒｄ  ５−ブロモデオキシウリジン、５−Ｃｌ−ｄＵｒｄ  ５−クロロデオキシウリジン、ｄＦｄＵ  ２’，２’−ジフルオロデオキシウリジン、（−）カルボビル（Ｃ−Ｄ４Ｇ）、２，６−ジアミノ−ｄｄＰ（ｄｄＤＡＰＲ；ＤＡＰＤＤＲ；２，６−ジアミノ−２’，３’−ジデオキシプリン−９−リボフラノシド）、９−（２’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）アデニン（２’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシン；２’−Ｎ３ｄｄＡ）、２’ＦｄｄＴ（２’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）チミン）、２’−Ｎ３ｄｄＡ（β−Ｄ−トレオ）（９−（２’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−トレオペントフラノシル）アデニン）、３−（３−オキソ−１−プロペニル）ＡＺＴ（３−（３−オキソ−１−プロペニル）−３’−アジド−３’−デオキシチミジン）、３’−Ａｚ−５−Ｃｌ−ｄｄＣ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−クロロシチジン）、３’−Ｎ３−３’−ｄＴ（３’−アジド−３’−デオキシ−６−アザチミジン）、３’−Ｆ−４−チオ−ｄｄＴ（２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−４−チオチミジン）、３’−Ｆ−５−Ｃｌ−ｄｄＣ（２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−クロロシチジン）、３’−ＦｄｄＡ（β−Ｄ−エリスロ）（９−（３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロペンタフラノシル）アデニン）、ウラビジン（Ｕｒａｖｉｄｉｎｅ）（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシウリジン；ＡｚｄＵ）、３’−ＦｄｄＣ（３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシシチジン）、３’−Ｆ−ｄｄＤＡＰＲ（２，６−ジアミノプリン−３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシリボシド）、３−ＦｄｄＧ（３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシグアノシン）、３’−ＦｄｄＵ（３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシウリジン）、３’−ヒドロキシメチル−ｄｄＣ（２’，３’−ジデオキシ−３’−ヒドロキシメチルシチジン；ＢＥＡ−００５）、３’−Ｎ３−５−ＣＦ３−ｄｄＵ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−トリフルオロメチルウリジン）、３’−Ｎ３−５−シアノメチルオキシ−ｄｄＵ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−［（シアノメチル）オキシ］ウリジン）、３’−Ｎ３−５−Ｆ−ｄｄＣ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロシチジン）、３’−Ｎ３−５−Ｍｅ−ｄｄＣ（ＣＳ−９２；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−メチルシチジン）、３’−Ｎ３−５−ＮＨ２−ｄｄＵ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−アミノウリジン）、３’−Ｎ３−５−ＮＨＭｅ−ｄｄＵ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−メチルアミノウリジン）、３’−Ｎ３−５−ＮＭｅ２−ｄｄＵ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−ジメチルアミノウリジン）、３’−Ｎ３−５−ＯＨ−ｄｄＵ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−ヒドロキシウリジン）、３’−Ｎ３−５−ＳＣＮ−ｄｄＵ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−チオシアナトウリジン）、３’−Ｎ３−ｄｄＡ（９−（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロペンタフラノシル）アデニン）、３’−Ｎ３−ｄｄＣ（ＣＳ−９１；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシシチジン）、３’−Ｎ３ｄｄＧ（ＡＺＧ；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシグアノシン）、３’−Ｎ３−Ｎ４−５−ｄｉＭｅ−ｄｄＣ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−Ｎ４−５−ジメチルシチジン）、３’−Ｎ３−Ｎ４−ＯＨ−５−Ｍｅ−ｄｄＣ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−Ｎ４−ＯＨ−５−メチルシチジン）、４’−Ａｚ−３’−ｄＴ（４’−アジド−３’−デオキシチミジン）、４’−Ａｚ−５ＣｌｄＵ（４’−アジド−５−クロロ−２’−デオキシウリジン）、４’−ＡｚｄＡ（４’−アジド−２’−デオキシアデノシン）、４’−ＡｚｄＣ（４’−アジド−２’−デオキシシチジン）、４’−ＡｚｄＧ（４’−アジド−２’−デオキシグアノシン）、４’−ＡｚｄＩ（４’−アジド−２’−デオキシイノシン）、４’−ＡｚｄＵ（４’−アジド−２’−デオキシウリジン）、４’−アジドチミジン（４’−アジド−２’−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル−５−メチル−２，４−ジオキソピリミジン）、４’−ＣＮ−Ｔ（４’−シアノチミジン）、５−Ｅｔ−ｄｄＣ（２’，３’−ジデオキシ−５−エチルシチジン）、５−Ｆ−ｄｄＣ（５−フルオロ−２’，３’−ジデオキシシチジン）、６Ｃｌ−ｄｄＰ（Ｄ２ＣｌＰ；６−クロロ−ｄｄＰ；ＣＰＤＤＲ；６−クロロ−９−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロペントフラノシル）−９Ｈ−プリン）、９３５Ｕ８３（２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−クロロウリジン；５−クロロ−２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロウリジン；ＦｄｄＣｌＵ；ラルウリジン（Ｒａｌｕｒｉｄｉｎｅ））、ＡＺｄｄＢｒＵ（３’−Ｎ３−５−Ｂｒ−ｄｄＵ；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−ブロモウリジン）、ＡｚｄｄＣｌＵ；ＡｚｄｄＣｌＵｒｄ（３’−アジド−５−クロロ−２’，３’−ジデオキシウリジン）、ＡＺｄｄＥｔＵ（３’−Ｎ３−５−ＥｔｄｄＵ；ＣＳ−８５；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−エチルウリジン）、ＡＺｄｄＦＵ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロウリジン）、ＡＺｄｄＩＵ（３’−Ｎ３−５−Ｉ−ｄｄＵ；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−ヨードウリジン）、ＡＺＴ−２，５’−アンヒドロ（２，５’−アンヒドロ−３’−アジド−３’−デオキシチミジン）、ＡＺＴ−α−Ｌ（α−Ｌ−ＡＺＴ）、ＡＺＵ−２，５’−アンヒドロ（２，５’−アンヒドロ−３’−アジド−２’，３’−ジデオキシウリジン）、３’−Ｎ３−ｄｄＵのＣ−アナログ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−アザ−６−デアザウリジン）、Ｄ２ＳＭｅＰ（９−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−（メチルチオ）プリン）、Ｄ４Ａ（２’，３’−ジデオキシジデヒドロアデノシン）、Ｄ４Ｃ（２’，３’−ジデヒドロ−３’−デオキシシチジン）、Ｄ４ＤＡＰ（２，６−ジアミノプリン−２’，３’−ジデオキシジデヒドロリボシド；ｄｄｅＤＡＰＲ）、Ｄ４ＦＣ（Ｄ−Ｄ４ＦＣ；２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロシチジン）、Ｄ４Ｇ（２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシグアノシン）、ＤＭＡＰＤＤＲ（Ｎ−６−ジメチルｄｄＡ；６−ジメチルアミノプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド）、ｄＯＴＣ（−）（（−）−２’−デオキシ−３’−オキサ−４’−チオシチジン）、ｄＯＴＣ（＋）（（＋）−２’−デオキシ−３’−オキサ−４’−チオシチジン）、ｄＯＴＦＣ（−）（（−）−２’−デオキシ−３’−オキサ−４’−チオ−５−フルオロシチジン）��ｄＯＴＦＣ（＋）（（＋）−２’−デオキシ−３’−オキサ−４’−チオ−５−フルオロシチジン）、ＤＸＧ（（−）−β−ジオキソラン−Ｇ）、ＤＸＣ−α−Ｌ−（α−Ｌ−ジオキサラン−Ｃ）、ＦｄｄＢｒＵ（２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−ブロモウリジン）、ＦｄｄＩＵ（３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−５−ヨードウリジン）、ＦｄｄＴ（アロブジン；３’−ＦｄｄＴ；ＦｄｄＴｈＤ；３’−ＦＬＴ；ＦＬＴ）、ＦＴＣ（エムトリシタビン；コビラシル（Ｃｏｖｉｒａｃｉｌ）；（−）−ＦＴＣ；（−）−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロ−３’−チアシチジン）、ＦＴＣ−α−Ｌ−（α−Ｌ−ＦＴＣ）、Ｌ−Ｄ４Ａ（Ｌ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシアデノシン）、Ｌ−Ｄ４ＦＣ（Ｌ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロシチジン）、Ｌ−Ｄ４Ｉ（Ｌ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシイノシン）、Ｌ−Ｄ４Ｇ（Ｌ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−デオキシグアノシン）、Ｌ−ＦｄｄＣ（β−Ｌ−５Ｆ−ｄｄＣ）、ロデノシン（Ｆ−ｄｄＡ；２’−ＦｄｄＡ（β−Ｄ−トレオ）；２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ａ；９−（２’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−トレオペンタフラノシル）アデニン）、ＭｅＡＺｄｄＩｓｏＣ（５−メチル−３’−アジド−２’，３’−ジデオキシイソシチジン）、Ｎ６−Ｅｔ−ｄｄＡ（Ｎ−エチル−２’，３’−ジデオキシアデノシン）、Ｎ−６−メチルｄｄＡ（Ｎ６−メチル−２’，３’−ジデオキシアデノシン）またはＲＯ３１−６８４０（１−（２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル）シトシン）などがある。
【００６５】
ヌクレオシドアナログは、より好ましくは、シチジンアナログ、グアノシンアナログまたはアデノシンアナログである。そのようなシチジンアナログ、グアノシンアナログおよびアデノシンアナログの好ましい例には、ｄＦｄＣ  ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン）、２−クロロ−２’−デオキシアデノシン（２ＣｄＡ）、ＣａＦｄＡ（２−クロロ−２−ａｒａ−フルオロ−デオキシアデノシン）、フルダラビン（２−フルオロアデニン  ９−β−Ｄ−アラビノフラノシド）、２’，３’−ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）、２’，３’−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）、２’，３’−ジデオキシグアノシン（ｄｄＧ）、ａｒａ−Ａ（アデノシン−アラビノシド；ビダラビン）、ａｒａ−Ｃ（シチジン−アラビノシド）、ａｒａ−Ｇ（９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニン）、アシクロビル（９−［２−ヒドロキシ−エトキシ］−メチル−グアノシン）、ブシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル（９−［２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エトキシル−メチル］−グアノシン）、ペンシクロビル、バルシクロビル、３ＴＣ（２’−デオキシ−３’−チアシチジン）、ｄＦｄＧ（２’，２’−ジフルオロデオキシグアノシン）、２，６−ジアミノ−ｄｄＰ（ｄｄＤＡＰＲ；ＤＡＰＤＤＲ；２，６−ジアミノ−２’，３’−ジデオキシプリン−９−リボフラノシド）、９−（２’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル）アデニン（２’−アジド−２’，３’−ジデオキシアデノシン；２’−Ｎ３ｄｄＡ）、２’−Ｎ３ｄｄＡ（β−Ｄ−トレオ）（９−（２’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−トレオペントフラノシル）アデニン）、３’−Ａｚ−５−Ｃｌ−ｄｄＣ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−クロロシチジン）、３’−Ｆ−５−Ｃｌ−ｄｄＣ（２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−クロロシチジン）、３’−ＦｄｄＡ（β−Ｄ−エリスロ）（９−（３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロペンタフラノシル）アデニン）、３’−ＦｄｄＣ（３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシシチジン）、３’−Ｆ−ｄｄＤＡＰＲ（２，６−ジアミノプリン−３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシリボシド）、３’−ＦｄｄＧ（３’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシグアノシン）、３’−ヒドロキシメチル−ｄｄＣ（２’，３’−ジデオキシ−３’−ヒドロキシメチルシチジン；ＢＥＡ−００５）、３’−Ｎ３−５−Ｆ−ｄｄＣ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロシチジン）、３’−Ｎ３−５−Ｍｅ−ｄｄＣ（ＣＳ−９２；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−５−メチルシチジン）、３’−Ｎ３−ｄｄＡ（９−（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロペンタフラノシル）アデニン）、３’−Ｎ３−ｄｄＣ（ＣＳ−９１；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシシチジン）、３’−Ｎ３ｄｄＧ（ＡＺＧ；３’−アジド−２’，３’−ジデオキシグアノシン）、３’−Ｎ３−Ｎ４−５−ｄｉＭｅ−ｄｄＣ（３’−アジド−２’，３’−ジデオキシ−Ｎ４−５−ジメチルシチジン）、３’−Ｎ３−Ｎ４−ＯＨ−５−Ｍｅ−ｄｄＣ（３’−アジド−２’，３���−ジデオキシ−Ｎ４−ＯＨ−５−メチルシチジン）、４’−ＡｚｄＡ（４’−アジド−２’−デオキシアデノシン）、４’−ＡｚｄＣ（４’−アジド−２’−デオキシシチジン）、４’−ＡｚｄＧ（４’−アジド−２’−デオキシグアノシン）、５−Ｅｔ−ｄｄＣ（２’，３’−ジデオキシ−５−エチルシチジン）、５−Ｆ−ｄｄＣ（５−フルオロ−２’，３’−ジデオキシシチジン）、６Ｃｌ−ｄｄＰ（Ｄ２ＣｌＰ；６−クロロ−ｄｄＰ；ＣＰＤＤＲ；６−クロロ−９−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−グリセロペントフラノシル）−９Ｈ−プリン）、Ｄ２ＳＭｅＰ（９−（２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−（メチルチオ）プリン）、Ｄ４Ａ（２’，３’−ジデオキシジデヒドロアデノシン）、Ｄ４Ｃ（２’，３’−ジデヒドロ−３’−デオキシシチジン）、Ｄ４ＤＡＰ（２，６−ジアミノプリン−２’，３’−ジデオキシジデヒドロリボシド；ｄｄｅＤＡＰＲ）、Ｄ４ＦＣ（Ｄ−Ｄ４ＦＣ；２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロシチジン）、Ｄ４Ｇ（２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシグアノシン）、ＤＭＡＰＤＤＲ（Ｎ−６−ジメチルｄｄＡ；６−ジメチルアミノプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド）、ｄＯＴＣ（−）（（−）−２’−デオキシ−３’−オキサ−４’−チオシチジン）、ｄＯＴＣ（＋）（（＋）−２’−デオキシ−３’−オキサ−４’−チオシチジン）、ｄＯＴＦＣ（−）（（−）−２’−デオキシ−３’−オキサ−４’−チオ−５−フルオロシチジン）、ｄＯＴＦＣ（＋）（（＋）−２’−デオキシ−３’−オキサ−４’−チオ−５−フルオロシチジン）、ＤＸＧ（（−）−β−ジオキソラン−Ｇ）、ＤＸＣ−α−Ｌ−（α−Ｌ−ジオキサラン−Ｃ）、ＦＴＣ（エムトリシタビン；コビラシル；（−）−ＦＴＣ；（−）−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロ−３’−チアシチジン）、ＦＴＣ−α−Ｌ−（α−Ｌ−ＦＴＣ）、Ｌ−Ｄ４Ａ（Ｌ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシアデノシン）、Ｌ−Ｄ４ＦＣ（Ｌ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロシチジン）、Ｌ−Ｄ４Ｉ（Ｌ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシイノシン）、Ｌ−Ｄ４Ｇ（Ｌ−２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−デオキシグアノシン）、Ｌ−ＦｄｄＣ（β−Ｌ−５Ｆ−ｄｄＣ）、ロデノシン（Ｆ−ｄｄＡ；２’−ＦｄｄＡ（β−Ｄ−トレオ）；２’−Ｆ−ｄｄ−ａｒａ−Ａ；９−（２’−フルオロ−２’，３’−ジデオキシ−β−Ｄ−トレオペンタフラノシル）アデニン）、ＭｅＡＺｄｄＩｓｏＣ（５−メチル−３’−アジド−２’，３’−ジデオキシイソシチジン）、Ｎ６−Ｅｔ−ｄｄＡ（Ｎ−エチル−２’，３’−ジデオキシアデノシン）、Ｎ−６−メチルｄｄＡ（Ｎ６−メチル−２’，３’−ジデオキシアデノシン）またはＲＯ３１−６８４０（１−（２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−トレオ−ペントフラノシル）シトシン）などがある。
【００６６】
特に好ましい一態様ではヌクレオシドアナログがゲムシタビンである。実施例では、ゲムシタビンが、本発明の酵素によって毒性生成物に効果的に変換されることを示す。
（植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素）
本発明は、植物ｄＣＫ／ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素に関する。ｄＣＫ／ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素とは、実施例３で示すように少なくともｄＡｄｏ、ｄＧｕｏおよびｄＣｙｄをリン酸化することができる酵素をいうと解される。これは、実施例からわかるように、他のデオキシリボヌクレオシドに対する活性を持つキナーゼを排除するものではない。
【００６７】
一態様として、本植物ｄＣＫ／ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、細胞内に形質導入した場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ100）を、ヒト単純疱疹ウイルス、特にヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼの作用と比べて、少なくとも３倍低下させる。前記少なくとも１つのヌクレオシドアナログは、好ましくは、ゲムシタビンである。
【００６８】
一態様として、本発明の植物ｄＣＫ／ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、シロイヌナズナ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する。
【００６９】
本発明の医学的、薬学的および治療的側面に関して、最も好ましい植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、
・シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、
・上記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯのどちらか一方に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％の一致度を示すアミノ酸配列を含む植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素、および
・１〜８０アミノ酸残基程度のＮ末端欠失またはＣ末端欠失を持つ、上記定義した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、
より成る群から選ばれる。
【００７０】
これらの酵素は、既知のｄＮＫと比べて、特にヒト単純疱疹ウイルスに由来する、特にヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼと比べて、改善された速度論的特性と、より広い基質特異性とを持っている。
【００７１】
医学的、薬学的および治療的側面のための酵素は、より好ましくは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として記載するアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。実施例に記載するアッセイでは、シロイヌナズナ由来のｄＮＫが、デオキシリボヌクレオシドとアナログの両方を、最も効率よくリン酸化した。
【００７２】
一態様として、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、４つの天然デオキシリボヌクレオシド（ｄＴｈｄ、ｄＣｙｄ、ｄＡｄｏ、ｄＧｕｏ）のすべてを変換することができる多基質キナーゼである。これは特に、Ｃ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失によって達成することができる。
【００７３】
もう一つの態様として、本発明は、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）およびイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する単離された植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素（ｄＮＫ）を提供する。より具体的には、本発明の単離された植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）及び(又は)デオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）であり、ここではこれをｄＣＫ／ｄＧＫ様キナーゼと呼ぶ。
【００７４】
テーダマツ、トマト、トウモロコシおよびイネのデオキシリボヌクレオシドキナーゼとシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）由来の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼとのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８）マルチプルアミノ酸配列アラインメントにより、下記の表１に示すように、いくつかの保存残基、半保存（ｓｅｍｉ−ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）残基および低保存（ｌｅｓｓｅｒ−ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）残基が同定された。
【００７５】
表１
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８）マルチプルアミノ酸配列アラインメント
【００７６】
【表１ａ】
2005530511.tif 000002
【００７７】
【表１ｂ】
2005530511.tif 000003
【００７８】
ＡＴ−ｄＣＫ／ｄＧＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
トマト(Tomato)−ｄＣＫ／ｄＧＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
マツ(Pine)−ｄＣＫ／ｄＧＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
トウモロコシ(Maize)−ｄＣＫ／ｄＧＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
イネ(Rice)−ｄＣＫ／ｄＧＫＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
イネ(Rice)−ｄＣＫ／ｄＧＫＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
＋  Ｎ−末端伸長部
★  Ｃ末端伸長部
黒色：一致残基−閾値５０％
灰色：類似残基−閾値５０％
％  保存残基
：  半保存残基
好ましい一態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素のアミノ酸配列は、表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、表１で保存残基と同定されている残基の６０％以上、好ましくは７０％を超える残基、より好ましくは８０％を超える残基、さらに好ましくは９０％を超える残基、より一層好ましくは９５％を超える残基を含み、最も好ましくは表１で同定されている保存残基のすべてを含む。
【００７９】
より好ましい一態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素のアミノ酸配列は、表１に記載の配列から選択される配列と整列させた場合に、保存残基を含むことに加えて、表１で半保存残基と同定されている位置の６０％以上で、好ましくは７０％を超える位置で、より好ましくは８０％を超える位置で、さらに好ましくは９０％を超える位置で、より一層好ましくは９５％を超える位置で半保存残基をも含み、最も好ましくは表１で同定されている半保存残基のすべてを含む。
（ポリペプチドの一致度）
もう一つの好ましい態様として、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として記載するアミノ酸配列を含むか、または前記配列のいずれかに対して、そのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を持つアミノ酸配列を含む。
【００８０】
本発明において、「一致度」とは、配列間の一致アミノ酸残基の度合いを表す尺度である。一致度を特徴づけるには、最も高度な相同性（一致）が得られるように対象配列を整列させる。２つのアミノ酸配列の「一致百分率」は、これらの一般原理に基づいて、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手できるＢＬＡＳＴＰアルゴリズム［Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ「Ｂｌａｓｔ２シークエンス−新しいタンパク質配列およびヌクレオチド配列比較ツール（Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９９  １７４  ２４７−２５０］を、そこで提案されているデフォルト設定（すなわちＭａｔｒｉｘ（行列）＝Ｂｌｏｓｕｍ６２；Ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ（ギャップ開始ペナルティ）＝１１；Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ（ギャップ伸長ペナルティ）＝１；ｇａｂ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ（ギャップＸ＿ドロップオフ値）＝５０；Ｅｘｐｅｃｔ（期待値）＝１０；Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ（ワードサイズ）＝３；Ｆｉｌｔｅｒ（フィルター）オン））で使用することにより、決定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、整列した２つの配列間の重複範囲での配列一致百分率が決定される。本発明の場合、配列一致百分率は、好ましくは、少なくとも５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも７５アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１００アミノ酸の重複範囲で計算され、その範囲はＢＬＡＳＴＰによりデフォルト設定で計算される。
【００８１】
これらＢＬＡＳＴＰ決定の結果を下記の表２Ａ〜２Ｄに示す。
【００８２】
表２
タンパク質配列のＢＬＡＳＴＰ比較
表１に記載の全配列の比較
一致残基（％）／陽性残基（％）／比較した断片の長さ
【００８３】
【表２】
2005530511.tif 000004
【００８４】
好ましい一態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素はテーダマツに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に記載のアミノ酸残基に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７６％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【００８５】
もう一つの好ましい態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素はトマトに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に記載のアミノ酸残基に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【００８６】
もう一つの好ましい態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素はトウモロコシに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に記載のアミノ酸残基に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７６％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【００８７】
もう一つの好ましい態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素はイネに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２に記載のアミノ酸残基に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【００８８】
もう一つの好ましい態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素はイネに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に記載のアミノ酸残基に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【００８９】
好ましい一態様では、本発明の薬学的調合物ならびに医学的および治療的用途に使用される植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載のアミノ酸残基に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７６％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
（変異型ポリペプチド）
最も好ましい一態様では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として記載するアミノ酸配列またはその機能的アナログを含む。
【００９０】
本発明に関して「機能的アナログ」という用語は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として記載する配列とは１つ以上のアミノ酸位置で異なっていて、しかもｄＣＫ／ｄＧＫ活性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチド（またはタンパク質）を意味する。そのような類似ポリペプチドには、例えば保存的置換を含むポリペプチド、スプライス変異体、イソ型、他の種に由来する相同体および多型体などがある。
【００９１】
本明細書にいう「保存的置換」という用語は、あるアミノ酸残基の、生物学的に類似する別の残基による置き換えを意味する。保存的置換の例には、
（ｉ）無極性または疎水性残基（例えばアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニンまたはトリプトファン）同士の置換、特にアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリンもしくはプロリン同士の置換、または
（ｉｉ）中性（非荷電）極性残基（例えばセリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンまたはシステイン）同士の置換、特にアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、もしくはグルタミンによるアスパラギンの置換、または
（ｉｉｉ）正荷電残基（例えばリジン、アルギニンまたはヒスチジン）同士の置換、または
（ｉｖ）負荷電残基（例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸）同士の置換、
が含まれる。
【００９２】
保存的置換という用語は、置換ポリペプチドに対して産生される抗体が非置換ポリペプチドとも免疫反応するという条件下で、親アミノ酸残基に代わる置換アミノ酸残基の使用も包含する。
【００９３】
この一次アミノ酸配列の改変は無改変の対応ポリペプチドと比べて実質的に等価な活性を持つタンパク質をもたらしうるので、親タンパク質の機能的アナログであると見なすことができる。そのような改変は、例えば部位特異的突然変異誘発法などによって、意図的に行うこともできるし、自発的に起こる場合もあり、スプライス変異体、イソ型、他の種に由来する相同体、および多型体はこれに包含される。本発明ではそのような機能的アナログも考えられる。
（Ｃ末端およびＮ末端欠失）
本発明によれば、Ｃ末端及び(又は)Ｎ末端を改変した植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、その特性が、特にターンオーバーなどの速度論的特性や基質特異性に関して、著しく変化することがわかった。したがって、特異性が制限されていて通常はデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）活性およびデオキシグアノシンキナーゼ（ｄＧＫ）活性を持つ酵素から、４つのデオキシリボヌクレオシドのすべてをリン酸化する能力を持つ基本的に多基質性の酵素へと、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素を変換することができる。
【００９４】
好ましい一態様として、本発明の植物キナーゼ酵素は、細胞内に形質導入した場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ100）を、ヒト単純疱疹ウイルス、好ましくはヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼの作用と比べて、少なくとも３倍低下させる。
【００９５】
もう一つの態様として、本発明は、親非切断型（親）酵素と比べてＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素を提供する。そのような欠失は、部位特異的突然変異誘発法などの従来技術によって、または実施例に記載するようにして達成することができる。
【００９６】
好ましい一態様として、本キナーゼ酵素は、細胞内に形質導入した場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ100）を、非切断型デオキシリボヌクレオシド酵素の作用と比べて、少なくとも３倍低下させる。
【００９７】
好ましい一態様では、本発明のキナーゼ酵素は、約１００アミノ酸までのＣ末端欠失及び(又は)Ｎ末端欠失を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素である。より好ましい一態様では、本発明のキナーゼ酵素は、１〜８０アミノ酸残基程度、好ましくは１〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１〜５０アミノ酸残基、さらに好ましくは１〜４０アミノ酸残基、より一層好ましくは１〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは１〜２０アミノ酸残基のＣ末端欠失を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素である。特に好ましい一態様では、本発明のキナーゼ酵素は、６１アミノ酸残基のＣ末端欠失を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素である。特に好ましい一態様では、前記Ｃ末端欠失変異体がトマトに由来する。
【００９８】
もう一つの好ましい態様では、本発明のキナーゼ酵素は、１〜８０アミノ酸残基程度、好ましくは１〜６０アミノ酸残基、より好ましくは１〜５０アミノ酸残基、さらに好ましくは１〜４０アミノ酸残基、より一層好ましくは１〜３０アミノ酸残基、最も好ましくは１〜２０アミノ酸残基のＮ末端欠失を持つ植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素である。このＮ末端欠失変異体ｄＣＫ／ｄＧＫ酵素は、より好ましくは、トマトに由来する。
【００９９】
本発明によれば、Ｃ末端欠失により、非切断型（親）酵素と比べて、基質特異性が変化した（多くの場合、基質特異性が広くなった）酵素が生成することがわかった。
（植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードするポリヌクレオチド）
一態様として、本発明は、細胞内に形質導入した場合に、少なくとも１つのヌクレオシドアナログの致死量（ＬＤ100）を、ヒト単純疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼの作用と比べて、少なくとも３倍低下させる、植物ｄＣＫ/ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１００】
一態様として、本発明は、テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）またはイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）に由来する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードする（好ましくは本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードする）単離されたポリヌクレオチドに関する。
（ハイブリダイゼーションプロトコール）
一態様として、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として記載するポリヌクレオチド配列またはその相補鎖とハイブリダイズする能力を持つ。
【０１０１】
ハイブリダイゼーションは少なくとも低ストリンジェンシー条件下で行われるべきであるが、好ましくは中または高ストリンジェンシー条件下で行われるべきである。
【０１０２】
ヌクレオチドプローブと相同ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーションをそれぞれ低、中または高ストリンジェンシー条件で決定するのに好適な実験条件では、ハイブリダイズさせるＤＮＡ断片またはＲＮＡを含有するフィルターを５×ＳＳＣ［塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム；Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版，コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９参照］に１０分間予備浸漬し、フィルターを５×ＳＳＣ，５×デンハート液［Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前掲書参照］、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ［Ｓａｍｂｒｏｏｋらの前掲書参照］中でプレハイブリダイズした後、ランダムプライム法［Ｆｅｉｎｂｅｒｇ  Ａ  ＰおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３  １３２  ６−１３］による32Ｐ−ｄＣＴＰ−標識（比活性＞１×１０9ｃｐｍ／μｇ）プローブ（濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を含む同じ溶液中、約４５℃で１２時間、ハイブリダイゼーションを行う。
【０１０３】
次に、フィルターを２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中、少なくとも５５℃（低ストリンジェンシー条件）、より好ましくは少なくとも６０℃（中ストリンジェンシー条件）、さらに好ましくは少なくとも６５℃（中／高ストリンジェンシー条件）、より一層好ましくは少なくとも７０℃（高ストリンジェンシー条件）、さらに好ましくは少なくとも７５℃（超高ストリンジェンシー条件）の温度で３０分間、２回洗浄する。
【０１０４】
これらの条件下でオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする分子は、ハイブリダイゼーションを検出するために標識することができる。相補的核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの存在を検出するために、当技術分野で知られる通常の方法によって、標識することができる。最も一般的な検出方法は、例えばＸ線フィルムを使って検出することができる3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃまたは32Ｐ−標識プローブによるオートラジオグラフィーを使用する方法である。他のラベルには、標識抗体に結合するリガンド、蛍光団、化学発光剤、酵素、または標識リガンドの特異的結合対メンバーとして役立ちうる抗体などがある。
（ＤＮＡ配列の一致度）
もう一つの好ましい態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として記載するポリヌクレオチド配列に対して、そのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯの全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を持つ。本発明の場合、配列一致百分率は、ＢＬＡＳＴＮが少なくとも１００ヌクレオチドの重複範囲（この範囲はデフォルト設定で決定される）をもたらす場合に計算される。重複範囲は、より好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２２５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドである。
【０１０５】
本発明において「一致度」とは、ヌクレオチド配列の相同性の度合いを表す尺度である。一致度を特徴づけるには、最も高度な相同性（一致）が得られるように対象配列を整列させる。２つのアミノ酸配列または２つの核酸の「一致百分率」は、これらの一般原理に基づいて、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから入手できるＢＬＡＳＴＮアルゴリズム［Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ「Ｂｌａｓｔ２シークエンス−新しいタンパク質配列およびヌクレオチド配列比較ツール（Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９９９  １７４  ２４７−２５０］を、そこで提案されているデフォルト設定（すなわちＲｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ａ  ｍａｔｃｈ（一致スコア）＝１；Ｐｅｎａｌｙｔ  ｆｏｒ  ａ  ｍｉｓｍａｔｃｈ（不一致ペナルティ）＝−２；Ｓｔｒａｎｄ  ｏｐｔｉｏｎ（鎖オプション）＝ｂｏｔｈ  ｓｔｒａｎｄｓ（両鎖）；Ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ（ギャップ開始ペナルティ）＝５；Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ（ギャップ伸長ペナルティ）＝２；ｂａｐ  ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ（ギャップＸ＿ドロップオフ値）＝５０；Ｅｘｐｅｃｔ（期待値）＝１０；Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ（ワードサイズ）＝１１；Ｆｉｌｔｅｒ（フィルター）オン））で使用することにより、決定される。ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムでは、整列した２つのヌクレオチド配列間の重複範囲での配列一致百分率が決定される。本発明の場合、配列一致百分率は、好ましくは、少なくとも１００ヌクレオチドの重複範囲で計算され、その範囲はＢＬＡＳＴＮによりデフォルト設定で決定される。重複範囲は、より好ましくは、少なくとも３００ヌクレオチドである。
【０１０６】
そのようなＢＬＡＳＴＮ比較の結果を表３に示す。
【０１０７】
表３
ＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴＮ比較
表１に記載の全配列の比較
一致残基（％）／比較した断片の長さ
【０１０８】
【表３】
2005530511.tif 000005
【０１０９】
*  配列の５’からソートした断片
ｎ．ｄ．＝有意な類似性は検出されなかった
したがって、好ましい一態様では、医学的／薬学的用途のための単離されたポリヌクレオチドはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として記載したポリヌクレオチドに対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【０１１０】
また、好ましい一態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはテーダマツに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３として記載したポリヌクレオチド配列に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【０１１１】
もう一つの好ましい態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはトマトに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５として記載するポリヌクレオチド配列に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【０１１２】
もう一つの好ましい態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはトウモロコシに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７として記載するポリヌクレオチド配列に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも７９％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【０１１３】
もう一つの好ましい態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはイネに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として記載するポリヌクレオチド配列に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
【０１１４】
もう一つの好ましい態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドはイネに由来し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９として記載するポリヌクレオチド配列に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。
（類似ＤＮＡ配列）
最も好ましい態様では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として記載するポリヌクレオチド配列またはその機能的アナログを含む。
【０１１５】
本発明に関して「機能的アナログ」という用語は、保存的に改変されたポリヌクレオチドと、機能的に等価なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。機能的に等価なポリペプチドとは、本明細書に記載するｄＣＫ／ｄＧＫ酵素活性を持つポリペプチドを意味する。
【０１１６】
本発明に関して「保存的に改変されたポリヌクレオチド」という用語は、同じアミノ酸配列もしくは本質的に同じアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または、核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、本質的に同じ配列を指す。
【０１１７】
遺伝暗号は縮重しているので、どのタンパク質でも、そのタンパク質をコードする機能的に同一な核酸は、数多く存在する。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵというコドンはいずれもアミノ酸アラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが指定されている位置では、どの位置でも、コードされているポリペプチドを変えずに、そのコドンを対応する上記のコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸変異を「サイレント変異」といい、これは保存的に改変された変異の一つである。ポリペプチドをコードする本明細書に記載の核酸配列は、いずれも、その核酸の考えうるすべてのサイレント変異体も表す。核酸中の各コドン（通常はメチオニンをコードする唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を改変して機能的に同一な分子を得ることが可能であることは、当業者には理解されるだろう。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異体は、記載されている各配列に暗示されている。
（発現ベクター）
一態様として、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターとを含む組換え発現ベクターを提供する。単離されたポリヌクレオチドは、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９または１１のいずれかの配列を持つ単離されたポリヌクレオチド、
・本発明のｄＣＫ／ｄＧＫキナーゼ酵素をコードする単離されたポリヌクレオチド、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９または１１の配列のいずれかと整列させた場合に、その重複範囲において、前記配列に対して少なくとも９０％の配列一致度を持つ、単離されたポリヌクレオチド、および
・上記のいずれかの相補配列、
より成る群から選ばれる。
【０１１８】
本発明の発現ベクターは、好ましくは、真核生物における発現を実施するのに適したものである。
【０１１９】
より好ましい一態様では、本発明の発現ベクターはウイルスベクター、特に単純疱疹ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはワクシニアウイルスベクターである。
（パッケージング細胞株）
一態様として、本発明は、本発明のベクターを含み、感染性ウイルス粒子を産生する能力を持つ、パッケージング細胞株を提供する。
【０１２０】
パッケージング細胞とは、感染性組換えウイルスの産生に必要な要素であって組換えウイルスベクターに欠けている要素を持っている細胞を指す。パッケージング細胞を作製する方法は先行技術で知られている。
（宿主細胞）
一態様として、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましい一態様として、本発明は、本発明の発現ベクターを使って形質導入、トランスフェクトまたは形質転換された単離宿主細胞を提供する。
【０１２１】
好ましい一態様では、本発明の宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳類細胞、卵母細胞、または酵母細胞である。
【０１２２】
より好ましい一態様では、本発明の宿主細胞は、ヒト細胞、イヌ細胞、サル細胞、ラット細胞またはマウス細胞である。
（自殺系）
本発明のｄＣＫ／ｄＧＫ酵素コード遺伝子の極めて重要な使用法の一つは、細胞治療および遺伝子治療における自殺系への使用である。哺乳動物に対するどのタイプの細胞治療および遺伝子治療でも、移植された細胞または遺伝子治療によって形質導入されている細胞の不可逆的殺滅を可能にする系が必要とされている。
【０１２３】
細胞治療には基本的に２つのタイプがあり、どちらのタイプも、本発明のデオキシリボヌクレオシドキナーゼに基づく組込み型（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）自殺系の恩恵を受けることができる。細胞補充療法では、体内で本来の機能を果たすことができなくなった細胞を補充するために、または死んだ細胞を補充するために、裸の細胞を対象に移植する。いったん、これらの細胞が移植され、対象の身体に完全に統合されてしまうと、外科的手段ではこれらを容易に取り除くことができない。本発明のキナーゼが構成的または誘導的に発現される組み込み型の自殺系があれば、治療有効量のヌクレオシドアナログ、例えばゲムシタビンなどをその個体に投与することによって、それらの細胞を殺すことができる。移植された細胞が無制約に増殖を始めたら、ヌクレオシドアナログを投与することができる。また単に、もはや補充細胞が必要でなくなったから、または他の何らかの経路で別の処置を行うからという理由で、処置を停止したいと考える場合もありうる。
【０１２４】
もう一方のタイプの細胞療法では、一定の位置で増殖因子などを分泌させるために、治療用細胞が体内に移植される。そのような治療用細胞はカプセル化されることが多く、比較的容易に身体から再び除去することができるが、外科手術を用いなくてもそれらの細胞を選択的に殺すことができるので、自殺系を組み込むことは好ましい。
【０１２５】
生体内遺伝子治療でも細胞補充療法の場合と同じことが言える。自殺遺伝子の組込みは、治療遺伝子と本発明のｄＣＫ／ｄＧＫとをどちらも含んでいるウイルスベクターを構築することによって達成することができる。治療遺伝子とｄＣＫ／ｄＧＫは、好ましくは、同じプロモーターの制御下に挿入され、要すれば、それらをＩＲＥＳコンストラクトで分離することによって、これが行われる。
【０１２６】
移植される細胞が移植前に条件的に不死化されている場合は、移植後に癌遺伝子が転写を開始し、移植された細胞が結果として腫瘍原性になるという危険が、理論的には存在する。本発明により、この状況を制御する手段を入手することが可能になる。誘導性プロモーター（例えばＴｅｔオン−オフ系、Ｍｘ１プロモーターなど）の制御を受ける癌遺伝子を使った形質導入によって細胞を不死化する場合はいつでも、ｄＣＫ／ｄＧＫ酵素をそのベクターコンストラクト中の同じプロモーターの制御下に（またはＩＲＥＳコンストラクトを使って）挿入する。これにより、癌遺伝子が転写される場合は常に、デオキシリボヌクレオシドキナーゼも転写され、ゲムシタビンなどのヌクレオシドアナログを投与することによって、形質導入された腫瘍原性細胞を選択的に殺しうることが保証される。
（ヌクレオシドをリン酸化する方法）
本発明のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素は、治療的用途や、生物工学的用途を含めて、さまざまな有用性を持ちうる。
【０１２７】
最後の一態様として、本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログをリン酸化するための本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の使用に関する。
【０１２８】
好ましい一態様として、本発明は、ヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログをリン酸化する方法であって、
ｉ）そのヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログに、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素を作用させる工程、および
ｉｉ）リン酸化されたヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを回収する工程、
を含む方法を提供する。
（イメージング）
自殺遺伝子療法、すなわち、プロドラッグに対する標的細胞の感受性を高めるいわゆる自殺遺伝子のトランスフェクションは、興味深い悪性腫瘍の処置方法になる。有効な臨床自殺遺伝子治療プロトコールを開発するには、導入遺伝子発現の程度、動態および空間的分布を調べるための非侵襲的方法が不可欠である。研究者や医師は、そのようなイメージング法によって、実験的および治療的遺伝子トランスフェクションプロトコールの効率を評価することができ、治療転帰の早期予後判定が可能になるだろう。
【０１２９】
生体内の代謝過程を非侵襲的に可視化し定量することができる単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）や陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）などの放射性核種イメージング技術は、生きている動物およびヒトにおける導入遺伝子発現の反復監視に関して、現在、評価されているところである。導入遺伝子発現は、治療遺伝子そのものの発現をイメージングすることによって直接的に監視するか、治療遺伝子と共役しているレポーター遺伝子を使って間接的に監視することができる。さまざまな放射性医薬品が開発されており、それらは、導入遺伝子発現のイメージングに関して、現在、評価されているところである。
【０１３０】
したがって、もう一つの態様として、本発明は、細胞または対象における本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素の導入遺伝子発現の非侵襲的核イメージング法であって、
（ｉ）基質の基質一リン酸への変換を促進する植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を、該細胞または対象にトランスフェクトする工程、
（ｉｉ）該細胞または対象に前記基質を送達する工程、および
（ｉｉｉ）該細胞または対象における該プロドラッグへの変化を非浸潤的に監視する工程、
を含む方法を提供する。
【０１３１】
好ましい一態様では、工程（ｉｉｉ）で行う監視が、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）もしくはコンピュータ体軸Ｘ線断層撮影法（ＣＡＴ）、またはそれらの組合せによって行われる。
【０１３２】
より好ましい一態様では、基質が、上述したものから選択される標識ヌクレオシドアナログである。標識ヌクレオシドアナログは、好ましくは、少なくとも１つの放射性核種をラベルとして含有している。陽電子放出放射性核種はすべて使用候補である。本発明の場合、放射性核種は、好ましくは、2Ｈ（重水素）、3Ｈ（三重水素）、11Ｃ、13Ｃ、14Ｃ、15Ｏ、13Ｎ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ、18Ｆおよび99mＴｃから選択される。
【０１３３】
標識ヌクレオシドアナログの製造に使用することができる市販標識剤の例は、［11Ｃ］Ｏ2、18Ｆ、およびさまざまなヨウ素同位体を含むＮａＩである。特に［11Ｃ］Ｏ2は、［11Ｃ］Ｈ3Ｉや［11Ｃ］−メチルトリフレートなどの［11Ｃ］−メチル化剤に変換することができる。
（遺伝子改変植物）
本発明のデオキシリボヌクレオシドは、植物の生長を改変または制御する方法にも役立ちうる。したがって、さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明の植物ｄＣＫ／ｄＧＫ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む植物細胞を持っている植物の生長を制御または改変する方法であって、その植物または植物細胞をヌクレオシドアナログに曝露する工程を含む方法に関する。今まで知られていなかった植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼの特性、特に本明細書に記載の特性を発見したことにより、本発明者らは、ヌクレオシドアナログの除草剤としての使用を検討している。植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼはヌクレオシドアナログを毒性物質に変換するので、これらのｄＣＫ／ｄＧＫ酵素を元から持っている植物または異種遺伝子として持っている植物には、ヌクレオシドアナログを除草剤として使用することができる。これらの特性を持つデオキシリボヌクレオシドキナーゼを持っていない植物に本発明のデオキシリボヌクレオシドキナーゼを挿入すれば、その植物はヌクレオシドアナログに対して感受性になる。
【０１３４】
本発明の植物ｄＣＫ／ｄＧＫ酵素をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、異種ポリヌクレオチドであり、本発明の方法が施される植物は、好ましくは、トランスジェニック植物である。
【０１３５】
したがって、さらにもう一つの態様として、本発明は、異種核酸がトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物の祖先に導入される、本発明の植物デオキシリボヌクレオシド酵素をコードする発現可能な異種核酸を含むトランスジェニック植物を提供する。
【０１３６】
トランスジェニック植物は、遺伝子改変植物を作出するための既知の技術によって、例えば植物細胞中に本発明の発現ベクターを導入することなどによって得ることができる。
【０１３７】
また、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼをノックアウトすること、及び(又は)特定のヌクレオシドアナログを変換することができない別の植物ｄＣＫ／ｄＧＫで機能的に置き換えることもできる。そうすれば、ヌクレオシドアナログを使って、この遺伝子改変植物の周りの他の植物をすべて殺すことができる。
【０１３８】
本発明に従って得られる形質転換植物はいずれも、同じ特徴を持つ形質転換植物をより多く生産するために、通常の育種法またはインビトロ植物繁殖法で使用することができ、そして／または、同じ種の他の品種または関連種に同じ特徴を導入するために使用することができる。そのような植物も本発明の一部である。形質転換植物から得られる種子は同じ遺伝的特徴を持ち、やはり本発明の一部を構成する。
【０１３９】
植物ｄＣＫ／ｄＧＫをコードするポリヌクレオチド配列は、好ましくは、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５に記載のポリヌクレオチド配列、
・ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５に対して、その全長にわたって一致度を決定した場合に、少なくとも８０％の配列一致度を持つポリヌクレオチド配列、
・３〜２４０ヌクレオチド程度の５’及び(又は)３’欠失を持つ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１または５由来のポリヌクレオチド配列、
より成る群から選ばれる。
【０１４０】
これらのポリヌクレオチド配列は、好ましい速度論的特性を持つ植物ｄＣＫ／ｄＧＫ酵素をコードしている。
【０１４１】
より好ましくは、ポリヌクレオチド配列はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）に由来し、その配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として記載するポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の一致度を示す。シロイヌナズナｄＣＫ／ｄＧＫは、ヌクレオシドアナログの変換に関して、最も高効率である。
【０１４２】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく例示するが、これらの実施例は決して、本願特許請求の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１４３】
（植物ｄＮＫ配列の同定と決定）
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａとＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍに由来する登録配列をＤｍ−ｄＮＫ（ＡＣＣＮ  ＣＡＢ４１８８１）との相同性について解析したところ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａについては、１０８６ｂｐの完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を持つ推定デオキシリボヌクレオシドキナーゼ（計算分子量４１．２ｋＤａの３６１アミノ酸からなるタンパク質）（ＡＣＣＮ  ＡＡＧ５１１４１）が、またＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍについては、５４１ｂｐのＥＳＴ（ＡＣＣＮ  ＡＷ２２３７９２、クローンｃＬＥＮ１３Ｌ２３）が見つかった。ＡＣＣＮ  ＡＷ２２３７９２（クローンｃＬＥＮ１３Ｌ２３）を含むプラスミドをクレムソン大学遺伝学研究所（Ｃｌｅｍｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手し、そのインサートを配列決定した。ｃＬＥＮ１３Ｌ２３については、４２．２ｋＤａの計算分子量を持つ３６５アミノ酸のタンパク質をコードする１０９８ｂｐのＯＲＦが見つかった。このＯＲＦはＡＣＣＮ  ＡＦ５１４７７６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）としてＧｅｎＢａｎｋ（商標）に提出された。
【０１４４】
Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ由来のＡＣＣＮ  ＡＦ５１４７７６との相同性について、登録されている植物ＥＳＴ配列を解析したところ、テーダマツに由来する５９４ｂｐのＥＳＴ（ＡＣＣＮ  ＡＷ０１１１５８、クローンＳＴ１７Ｄ０６）、トウモロコシに由来する６３１ｂｐのＥＳＴ（ＡＣＣＮ  ＡＷ０３６８４７）、およびイネに由来する４５５ｂｐのＥＳＴ（ＡＣＣＮ  Ｃ７３８１３、クローンＥ２０２０７）が見つかった。ＡＣＣＮ  ＡＷ０１１１５８を含有するプラスミドは、ノースカロライナ州立大学林学部森林バイオテクノロジーグループ（ノースカロライナ州２７６９５−８００８ローリー、ジョーダン・ホール６１１３、ノースカロライナ州立大学）の  Ｒｏｓｓ  Ｗｈｅｔｔｅｎから入手した。ＡＣＣＮ  ＡＷ０３６８４７を含有するプラスミドは、スタンフォード大学生物科学部（米国カリフォルニア州９４３０４パロ・アルト、カリフォルニア・アベニュー８５５）のＶ．Ｗａｌｂｏｔから入手した。ＡＣＣＮ  Ｃ７３８１３を含有するプラスミドは、農業生物資源研究所イネゲノム研究プロジェクト（３０５−８６０２茨城県つくば市観音台２−１−２）の佐々木卓治から入手した。
【０１４５】
これら３つのプラスミドのインサートを全配列決定し、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ（テーダマツ、トウモロコシおよびイネＩ）の部分配列を見いだした（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、７および９を参照）。
【０１４６】
これら植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ配列のアラインメントを表１に示す。
【０１４７】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａデオキシリボヌクレオシドキナーゼとＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍデオキシリボヌクレオシドキナーゼの完全長ＯＲＦをイネのゲノム配列と比較し、またＡＣＣＮ  ＡＰ００３９２２から得られるいくつかのＤＮＡ断片を組み合わせることにより、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として記載する下記のイネ由来デオキシリボヌクレオシドキナーゼの完全長ＯＲＦをアセンブルすることができた。このＯＲＦはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２として記載するタンパク質をコードしている。
【０１４８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と完全には同一でないという事実から、イネデオキシリボヌクレオシドキナーゼにはイソ型（イネｄＮＫＩおよびイネｄＮＫＩＩ）が存在することが示唆される。
【実施例２】
【０１４９】
（細菌発現プラスミドの構築）
この実施例では、完全長デオキシリボヌクレオシドキナーゼならびにＮ末端及び(又は)Ｃ末端切断型デオキシリボヌクレオシドキナーゼ用の細菌発現プラスミドの作製について説明する。Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ由来のデオキシリボヌクレオシドキナーゼとその切断型突然変異体を、以下のように増幅し、サブクローニングした。
【０１５０】
プライマー
TOMfor1:  
5' TAT CGC GGA TCC ATG GTT GAG TTC TTG CAA AGC TCA ATT GGA 3' (SEQ ID NO: 13), 及び
TOMrev1A:
5' CCG GAA TTC GTC GAC TTA GTG AGA CAT GAA TGA CAT ATT TC 3' (SEQ ID NO: 14)
を使用し、またクローンｃＬＥＮ１３Ｌ２３をテンプレートとして用い、ＡＦ５１４７７６のＯＲＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を、ＰＣＲにより増幅した。
【０１５１】
次に、そのＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断し、それを、同じくＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断しておいたｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に連結した。得られたプラスミドをpGEX-2T-TOM-dCK/dGKと名付けた。
【０１５２】
同様に、Ｎ末端欠失及び(又は)Ｃ末端欠失を行って、そのＰＣＲ断片をpGEX-2Tに連結した。
【０１５３】
Ｎ末端欠失には、プライマー
TOMDELfor:
5’ TAT CGC GGA TCC GTG AAG TCA ACA CAA AAG AAA CGA CTT ACT 3’ (SEQ ID NO: 15), 及び
TOMrev1A (SEQ ID NO: 14)を使用し、得られたプラスミドをpGEX-2T-TOM-ΔNdCK/dGKと名付けた。
【０１５４】
Ｃ末端欠失には、プライマー
TOMfor1 (SEQ ID NO: 13), 及び
TOMDELrev: 
5' CCG GAA TCC TTA AGC AAC TTG ACG AGC ATA CTG CCT CTT TGC 3' (SEQ ID NO: 16) 
を使用し、得られたプラスミドをpGEX-2T-TOM-dCK/dGKΔCと名付けた。
【０１５５】
Ｎ末端およびＣ末端欠失には、プライマーTOMDELfor (SEQ ID NO: 15) 及びTOMDELrev (SEQ ID NO: 16) を一緒に使用し、得られたプラスミドをpGEX-2T-TOM-ΔNdCK/dGKΔCと名付けた。
【０１５６】
Arabidopsis thaliana由来のデオキシリボヌクレオシドキナーゼは、以下のようにサブクローニングした。ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｇｅｎｅ）から以下のプライマーを使ってＯＲＦを増幅した：
1MSAtdGK-B: 
5' CGC GGA TCC ATG GTT GAT TAT CTT AGG AGC TCT GTT GGG 3' (SEQ ID NO: 17) 及び
2MSAtdGK-E: 
5' CCG GAA TTC TCA CGC AGA CGG TCT AGT GAG GAG TGA CTT G 3' (SEQ ID NO: 18)。
【０１５７】
次に、そのＰＣＲ断片をEcoRI/BamHIで切断し、それを、同じくEcoRI/BamHIで切断しておいたpGEX-2Tベクターに連結した。得られたプラスミドをpGEX-2T-AT-dCK/dGKと名付けた。
【０１５８】
比較用に、ヒト単純疱疹ウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）の発現プラスミドも構築した。ヒトＨＳＶ１由来のチミジンキナーゼは、プライマー
HSV-for A:
5' CGC GGA TCC ATG GCT TCG TAC CCC GGC CAT C 3' (SEQ ID NO: 19), 及び
HSV-rev:
5' CCG GAA TTC TTA GTT AGC CTC CCC CAT CTC CCG 3' (SEQ ID NO: 20) 
を使用し、またKarreman [Christiaan Karreman; Gene 1998 218 57-62]が記載したプラスミドpCMV-pacTKをテンプレートとして用い、ＰＣＲにより増幅した。
【０１５９】
次に、そのＰＣＲ断片をEcoRI/BamHIで切断し、それを、同じくEcoRI/BamHIで切断しておいたpGEX-2Tベクターに連結した。得られたプラスミドをpGEX-2T-HSV-TKと名付けた。
【実施例３】
【０１６０】
（組換え発現および酵素アッセイ）
この実施例では、本発明の植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼ酵素を発現させて、その活性を特徴づける。
【０１６１】
植物ｄＣＫ／ｄＧＫのＮ末端部分およびＣ末端部分の重要性を調べるために、ＴＯＭ−ｄＣＫ／ｄＧＫを、他の真核生物ＴＫ２またはｄＣＫ／ｄＧＫ様デオキシリボヌクレオシドキナーゼの全長にほぼ匹敵する２６３アミノ酸の中心部分まで段階的に短縮した。
【０１６２】
大腸菌ＫＹ８９５株（Ｆ-，ｔｄｋ−１，ｉｌｖ）［Ｋｎｅｃｈｔ  Ｗ，Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＢおよびＰｉｓｋｕｒ  Ｊ「キイロショウジョウバエに由来する高効率多基質デオキシリボヌクレオシドキナーゼの特異性および調節に関与する残基の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）」Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２０００  ３０１  ８２７−８３７］を、標準的技術を使って、種々の発現プラスミドで形質転換した。形質転換したＫＹ８９５株を３７℃のＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）培地でＯＤ600nmが０．５〜０．６になるまで生育し、１００μＭ  ＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導した。細胞を２５℃でさらに４時間生育した後、遠心分離によって採取した。
【０１６３】
ペレットを活性試験まで−８０℃で保存した。抽出緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）））中で、ペレットに、短い超音波処理を施した。
【０１６４】
ＫＹ８９５抽出物中のデオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性は、三重水素標識ヌクレオシド基質を使ったＤＥ−８１ろ紙アッセイにより、４時点の試料に基づいて初速度を測定することで決定した。このアッセイには４〜２０μｇの抽出物を使用した。アッセイは、Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎら［Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｂ．、Ｋｎｅｃｈｔ，Ｗ．、Ｌｅｎｚ，Ｃ．、Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ，Ｌ．およびＰｉｓｋｕｒ，Ｊ「キイロショウジョウバエ由来の多基質デオキシリボヌクレオシドキナーゼおよびそのＣ末端欠失突然変異体の機能的発現（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｅｌｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ）」；Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００  ２７５  ６６７３−６６７９］が記載しているとおりに行った。
【０１６５】
タンパク質濃度は、ＢＳＡを標準タンパク質として、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法で決定した［Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＭＭ「タンパク質−色素結合の原理を利用した、マイクログラム量のタンパク質の迅速かつ高感度な定量方法（Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７６  ７２  ２４８−２５４］。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ  ＵＫ「バクテリオファージＴ４の頭部の組立て時に起こる構造タンパク質の切断（Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４）」；Ｎａｔｕｒｅ１９７０  ２２７  ６８０−６８５］に従って行い、タンパク質をクーマーシー染色で可視化することによって、組換えタンパク質発現を確認した。
【０１６６】
４つの天然デオキシリボヌクレオシドを１００μＭの固定濃度で試験した。各抽出物において最も高い比活性を１００％に設定した。
【０１６７】
これらの実験の結果を下記の表４に示す。
【０１６８】
表４  
ＫＹ８９５形質転換体の抽出物に含まれるデオキシリボヌクレオシドキナーゼ活性
【０１６９】
【表４】
2005530511.tif 000006
【０１７０】
*  ｐＧＥＸ−２Ｔはベクターであり、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手することができる。
【０１７１】
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＯＭ−ｄＣＫ／ｄＧＫは、トマトｄＮＫ酵素をコードする遺伝子を含有しているベクターである。
【０１７２】
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＯＭ−ΔＮｄＣＫ／ｄＧＫは、Ｎ末端部分を欠失させたトマトｄＮＫ酵素をコードする遺伝子を含有しているベクターである。
【０１７３】
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＯＭ−ｄＣＫ／ｄＧＫΔＣは、Ｃ末端部分を欠失させたトマトｄＮＫ酵素をコードする遺伝子を含有しているベクターである。
【０１７４】
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＯＭ−ΔＮｄＣＫ／ｄＧＫΔＣは、Ｎ末端部分およびＣ末端部分を欠失させたトマトｄＮＫ酵素をコードする遺伝子を含有しているベクターである。
【０１７５】
ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＡＴ−ｄＣＫ／ｄＧＫは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ  ｄＮＫ酵素をコードする遺伝子を含有しているベクターである。
【０１７６】
括弧内の数字は１００％に相当する比活性（単位：ｍＵ／ｍｇ）を表す。
【０１７７】
ｎ．ｄ．＝検出不能。
【０１７８】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＡＴ−ｄＣＫ／ｄＧＫ）およびトマト（ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＯＭ−ｄＣＫ／ｄＧＫおよびｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＯＭ−ΔＮｄＣＫ／ｄＧＫ）に由来するデオキシリボヌクレオシドキナーゼは、ｄＣｙｄ、ｄＡｄｏおよびｄＧｕｏをリン酸化することができたが、ｄＴｈｄをリン酸化することはできなかった。トマトｄＣＫ／ｄＧＫ様キナーゼのＣ末端部分を欠失させると（ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＴＯＭ−ｄＣＫ／ｄＧＫΔＣ）、基質特異性が著しく変化して、ｄＴｈｄが最も速く変換される基質になった。これは、基質特異性の決定にとってＣ末端が重要であることを示している。
【０１７９】
要するに、Ｎ末端およびＣ末端の伸張部分は全体として、植物デオキシリボヌクレオシドキナーゼの基質特異性と構造上の完全性に、極めて重要な役割を果たしている。
【実施例４】
【０１８０】
（ＫＹ８９５形質転換体のＬＤ100の決定）
デオキシリボヌクレオシドキナーゼは、癌またはウイルス感染の遺伝子治療に用いられる自殺遺伝子として興味がもたれる。この実施例では、種々のヌクレオシドアナログを変換するという本発明の植物キナーゼの能力を、ヒト単純疱疹ウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ＴＫ）の能力と、細菌試験系で比較する。
【０１８１】
実験は基本的にＫｎｅｃｈｔらが記載しているとおりに行った［Ｋｎｅｃｈｔ  Ｗ，Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＢおよびＰｉｓｋｕｒ  Ｊ「キイロショウジョウバエに由来する高効率多基質デオキシリボヌクレオシドキナーゼの特異性および調節に関与する残基の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｕｌｔｉｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）」；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０  ３０１  ８２７−８３７］。簡単に述べると、ＫＹ８９５形質転換体の終夜培養物を１０％グリセロールで２００倍に希釈し、その希釈液の液滴各２μｌを、０．２％グルコース、４０μｇ／ｍｌイソロイシン、４０μｇ／ｍｌバリン、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含み、ヌクレオシドアナログを含むかまたはヌクレオシドアナログを含まないＭ９最少培地プレート［Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ，Ｂｒｅｎｔ  Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ  ＤＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ  ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ  ＪＡおよびＳｔｒｕｈｌ  Ｋ（編）「Ｓｈｏｒｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」第３版（１９９５）１〜２頁，米国Ｗｉｌｅｙ］にスポットした。３７℃で２４時間培養した後、成長を目視検査した。
【０１８２】
この実験の結果を下記の表５に示す。
【０１８３】
表５
ＫＹ８９５形質転換体細胞の成長に関するヌクレオシドアナログｄＦｄＣのＬＤ100値
【０１８４】
【表５】
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【０１８５】
*  表４の脚注参照
表５からわかるように、ｄＦｄＣプレートでのＫＹ８９５の殺滅についてはＡＴ−ｄＣＫ／ｄＧＫが最も高効率であったことが、最も低いＬＤ100に反映されている。そのＬＤ100は、細胞を鋭敏にする効果が空プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔと同程度であるＨＳＶ１−ＴＫの１００００分の１だった。ＴＯＭ−ｄＣＫ／ｄＧＫまたはＴＯＭ−ΔＮｄＣＫ／ｄＧＫの発現プラスミドをトランスフェクトした細胞は、ｐＧＥＸ−２Ｔ−ＨＳＶ−ＴＫまたはｐＧＥＸ−２Ｔで形質転換した細胞と比較すると、１０分の１の濃度で殺すことができた。
【実施例５】
【０１８６】
（植物キナーゼを発現させるレトロウイルスベクターの構築）
モロニーネズミ白血病（ＭＬＶ）ウイルスに基づくレトロウイルスベクターに植物キナーゼのｃＤＮＡをクローニングすることにより、当該キナーゼを含有する複製欠損性組換えレトロウイルスを作製した。
【０１８７】
隣接制限酵素部位が組み込まれていて、５’末端にコザック配列を含有しているプライマーを使って、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により、ＤＮＡ断片を増幅した。
【０１８８】
ＰＣＲ断片に基づくＡ．ｔｈａｌｉａｎａコンストラクトおよびトマトコンストラクトをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断し、ＣＭＶプロモーターの制御を受けるように、ｐＬＣＸＳＮプラスミドベクター（ＮｓＧｅｎｅ  Ａ／Ｓ）のＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングした。
【０１８９】
２つのコンストラクト、すなわちＡｔｄＣＧＫ（ＰＺＧ１９０）とＴｏｍｄＣＧＫ（ＰＺＧ１９３）を得た。対照としては、ＬＣＸＳＮを単独で使用した。
【０１９０】
Ｑｉａｇｅｎプラスミドキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使ってプラスミドを精製し、構築したプラスミドのＤＮＡ配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１９１】
以下のプライマー配列を使用した：
At dCK/dGK +コザック
5' TCCCTCGAGCGCCATGGTTGATTATCTTAGGAGC 3'
At dCK/dGK 3'末端
5' CGGGATCCTCACGCAGACGGTCTAGTGAGGAG 3'
トマト dCK/dGK +コザック
5' TCCCTCGAGCGCCATGGTTGAGTTCTTGCAAAGC 3'
トマト dCK/dGK 3'末端
5' CGGGATCCTTAGTGAGACATGAATGACATATTTC 3'
ＨＥ２９３Ｔパッケージング細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）をＯＰＴＩＭＥＭ１培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）中、３７℃で培養した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を供給者が用意したプロトコールに従って使用することにより、構築済みのｐＬＣＸＳＮプラスミドベクターをパッケージング細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にトランスフェクト細胞から培地を採取し、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、超遠心分離（５０，０００×ｇ、４℃で９０分）によってペレット化し、ＤＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒカタログ番号１２−７４１−Ｆ）に溶解した。
【０１９２】
次に、そのウイルス含有培地を使用し、ＭＯＩを５にして、癌細胞株の形質導入を行った。
（細胞培養およびレトロウイルス形質導入）
ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２２）および神経膠芽腫細胞Ｕ−１１８−ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１５）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。細胞は、１０％（ｖ／ｖ）オーストラリア原産ウシ胎仔血清（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒカタログ番号１２−６１１）と１ｍｌ／ｌのゲンタマイシン（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒカタログ番号１７−５１８）とを含むＲＰＭＩ、Ｅ−ＭＥＭまたはＤ−ＭＥＭ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒカタログ番号１２−１１５−Ｆ、１２−６１１および１２−７４１−Ｆ）で培養した。細胞は、気相が５％ＣＯ2である湿潤培養器中、３７℃で生育した。
【０１９３】
５μｇ／ｍｌのポリブレンと混合したレトロウイルス含有培地を使って細胞の形質導入を行い、それを４８時間インキュベートした後、３００〜４００μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔiｃｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の存在下で３週間連続して培養した。
（細胞増殖アッセイ−細胞毒性）
ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ６２８２）で被覆した９６穴プレートに、１，５００〜３，５００細胞／ウェルの密度範囲で、細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ2で２４時間インキュベートした後、ゲムシタビン（デンマークのＯｒｉｆａｒｍ  Ａ／Ｓから入手）を加え、培地はヌクレオシドアナログを含有した。各実験は４重に行った。９６〜１２０時間の薬剤曝露後に細胞の生存をＸＴＴ細胞増殖キット（ＸＴＴキットＩＩ、Ｒｏｃｈｅカタログ番号１  ４６５  ０１５）でアッセイした。データをバックグラウンド培地単独の吸光度について補正してから、５０％細胞死滅薬剤濃度（ＩＣ50値）を計算した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）（ＳＰＳＳ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｙｒｂｅｒｇ  Ｔｒａｉｄｉｎｇ，デンマーク）を使って、調査対象薬剤／化合物のＩＣ50値を、これらの実験の平均値として計算した。
（植物ｄＣＧＫの発現）
非形質導入細胞の感受性と、レトロウイルベクターのみを使って形質導入した細胞または植物キナーゼを含むベクターを使って形質導入した細胞のゲムシタビンに対する感受性を決定した。
【０１９４】
９６〜１２０時間の薬剤曝露後に細胞毒性（ＩＣ50値）を決定した。結果を以下の表に示す。
【０１９５】
表６
ゲムシタビンに対する神経膠芽腫細胞株および乳癌細胞株の感受性（ＩＣ50）
５０％致死率をもたらす濃度を各コンストラクトおよび親細胞株について示す。感受性増加倍率は親細胞株との比較である。
【０１９６】
【表６】
2005530511.tif 000008
【０１９７】
親細胞株と、ｐＬＣＸＳＮベクターのみで形質導入された細胞の感受性との相違は、１倍未満だった。
【０１９８】
植物キナーゼを発現させる細胞株は、ゲムシタビンに対する感受性の増加を示した。最も大きな増加は、Arabidopsis thaliana dCK (PZG190)を発現させる神経膠芽腫細胞株(U-118-MG)で検出され、ＩＣ50では、非形質導入細胞と比べて２０倍増加した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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