(57)【要約】ヒト便の一次元陽子磁気共鳴分光法は、結腸直腸がん及び/又は臨床的に有意な腺腫の存在を検出する非侵襲的方法として使用し得る。便試料と緩衝液とを混合して懸濁液を形成し、その懸濁液を遠心分離して上清試料を得、これを磁気共鳴分光法に供し、得られたスペクトルを非がん被検者からの便のスペクトルと比較する。スペクトルの実測差が癌及び/又は臨床的に有意な腺腫を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において結腸直腸腺腫及び結腸直腸がんの存在を検出する方法であって、該患者の便試料に磁気共鳴分光法を施し、得られたスペクトルを非がん性被検者の磁気共鳴スペクトルと比較し、スペクトルの実測差ががん又は臨床的に有意な腺腫を示す、前記方法であって、該患者からの該便試料と緩衝液とを混合して液体懸濁液を形成し、その懸濁液を遠心分離して上清試料を得、それを磁気共鳴分光法に供することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
上清試料が一次元陽子磁気共鳴分光法に供される請求項1記載の方法。
【請求項３】
非がん性被検者からの便のスペクトルに対するスペクトルを含むときに、得られたスペクトルが多変量分析に供される請求項2記載の方法。
【請求項４】
便試料が360 MHz磁気共鳴分光法に供される請求項3記載の方法。
【請求項５】
一次元磁気共鳴分光法から得られたスペクトルから最大限に識別する亜領域を選択するステップ; ほぼ同じ大きさのランダムトレーニングサブセットとランダムテストサブセットにデータを分け、各ランダムトレーニングサブセットに最適な分類器を見つけ、該最適分類器の精度をランダムテストサブセットについて確証させることを繰り返すステップ; 及び多くの個々の成分分類器の分類器係数の加重平均として最後の分類器を求めるステップを含む、請求項4記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結腸直腸腺腫やがんを検出する方法、特に、陽子磁気共鳴分光法を用いてその腺腫やがんを検出する方法に関する。
結腸直腸がんは、米国やカナダにおいて最も一般的ながんの一つであり、1999年には新たに約146,000例が明らかになった。北米における個人が結腸直腸がんを発症する生涯リスクは約5〜6％である。結腸直腸がんに伴う症状は、血便、貧血、腹痛、腸の状態の変化を含み、疾患がかなり進行したときにのみしばしば明らかになる。患者の予後が診断のときの疾患の段階に大きく依存することはよく知られている。実際に、結腸直腸がんが早期に検出された患者の5年間の生存率は92％であるが、局部的に拡散した患者では約60％に低下し、遠くに転移した患者では約6％に低下する。従って、前駆腺腫やがんをできるだけ早く発見し、治療の介入が成功する機会を増やすことが重要である。
疾患のスクリーニングには、その疾患が集団の大部分で流行するとともに疾患の早期発見が死亡率を下げ、生命の質を改善することが必要である。結腸直腸がんは、これらの要求を満たしているので(Mandel JS, Church TR, Ederer F, Bond JH, Colorectal cancer mortality: effectiveness of biennial screening for fecal occult blood. J Natl Canner Inst 1999; 91:434-437; Mandel JS, Bond JH, Church TR, Snover DC, Bradley GM, Schuman LH, Edrer F, Reducing mortality from colorectal cancer by screening for fecal occult blood. Minnesota colon cancer control study, N Eng J Med 1993;328;1365-1371)、そのプログラムの理想的な候補である。結腸直腸がんの自然履歴、即ち、数年(5〜15)かけて生じる腺腫から腺がんへの進行は、それが適切な標的になる。結腸直腸がんの早期発見のコスト効果分析からも好ましいことがわかった(Bolin, TD. Cost benefit of early diagnosis of colorectal cancer. Scand J Gastroenterol 1996;31 Suppl 220:142-146)。
スクリーニング法自体は、一連の基準、例えば、高感度や特異性、低コスト、安全性や簡便さを満たさなければならない。現在、デジタル直腸検査(DRE)、便潜血検査(FOBT)、バリウム注腸検査、直接結腸視覚化(S状結腸検査法や結腸鏡検査法)がこのために用いられている。
【０００２】
DREは、指を使って直腸を調べることを含んでいる。この方法は、触診することができ且つ指のとどく範囲内にあるがんを検出する。陰性DREは、調べている指によって10％より少ない結腸直腸がんしか触診し得ないことから、患者ががんでないという安心を与えない。
FOBTは、化学的手段によって便中に隠された出血を検出する。最も費用がかからず且つ最も簡単であるが、FOBT法は感度が低く、特異性が中程度で、通常は早期発見によくない。利用可能なデータによれば、この手法の主な欠点は、この方法に続いてｘ線又は内視鏡によって発見される半数を超えるがんが通常は初期の進展度の限界を超えていることである。10〜12％の擬陽性率は、試験された患者が食事制限されていないときと予想される。陽性予想値の評価は、2.2〜50％の範囲にある。グアヤク検査は、感度が非常に低い、たいてい約50％(Ransohoff DF, Lang CA., Screening for colorectal cancer with the fecal occult blood test; a background paper. Ann intern Med 1997; 126:811-822)。FOBTの使用は、結腸直腸がんが出血を伴うことを前提とするものである。しかしながら、いくつかの結腸直腸がんは断続的に出血し、他は全く出血しない。
バリウム注腸は、造影剤を用いた腸のｘ線を伴う。注腸は単一又は二重造影であり得る。悪性の主なｘ線の徴候は、粘膜破壊、急激な切断や肩部又は局在病巣を含み、関与していない領域からの分画がはっきりしている。がんや大きなポリープに対する二重造影バリウム注腸の推定感度はわずか65〜75％であり、小さな腺腫に対しては更に低い。診断率が良いにもかかわらず、二重造影バリウム注腸の偽陰性率は2〜18％である。更に、この方法は放射線の曝露を含み、その反復使用は安全でないものである。バリウム注腸による穿孔は非常にまれであるが、それが起こるときは致命的となり、バリウムの腹腔への流出の結果として深刻な長期的問題を招く。
腸を調べるのに様々な器具(集団的に内視鏡と呼ばれる)が用いられる。内視鏡は剛性又は可撓性であり、いろいろな長さがある。可撓性S状結腸鏡の長さは60 cmである。結腸鏡は、結腸全体を調べるための130〜160 cmの可撓性観察器具である。生検は、内視鏡によって結腸を観察しつつ疑わしい検査領域で行われる。可撓性S状結腸鏡検査法は、結腸と直腸の左側に限定される。新生物性腫瘍の少なくとも1/3は、S状結腸鏡検査法によって近づきにくい脾湾曲部に近位の領域に存在する。結腸鏡検査法の感度は高く、依然として結腸の可視化や新生物性異常の検出の基準になる検査である。しかしながら、侵襲的で、非常に費用がかかり、被検者が腸穿孔のリスクにさらされる。
【０００３】
磁気共鳴分光法(MRS)は、病気の過程に伴う小さく且つ初期の生化学変化を検出する可能性があるとともにがん患者からの組織生検の実験に有効であることがわかった手法である(Smith I.C.P, Bezabeh T, Tissue NMR Ex Vivo.: Young IR, ed Methods in Biomedical magnetic resonance imaging and spectroscopy, Chicester, UK; Wiley, 2000:891-7)。診断対象である一定の生物試料中の小さく流動性の化学種を検出するために特に有効である。しかしながら、その検査のために組織生検を入手することは、通常侵襲的手順が含まれる。
その段階でがんを検出する現在利用可能な方法がある。生物物理学的方法、例えば、慣用のX線、核医学、直線形スキャナ、超音波、CAT又はMRIはすべてがんの早期発見と治療に重要な役割を果たしている。腫瘍マーカーの臨床検査は、早期がん発見の援助として使用し得る。腫瘍マーカー試験は、診断、病期、病気の進行、治療に対する反応をモニタすること、再発疾患の検出を援助するがん患者に存在する腫瘍関連抗原か又は他の物質を測定する。残念なことに、たいていの腫瘍マーカー試験は、コスト的に有効な方法でスクリーニングツールとして用いられるのに十分な特異性を有しない。具体的ながんの流行が一般集団では比較的少ないことから、非常に特定の試験さえ予想値が悪くなる。大多数の利用できる腫瘍マーカー試験は、高レベルのマーカーが様々な良性疾患にも見られることから、症状を示す患者においてがんを診断するのに有効ではない。腫瘍マーカーの主な臨床値は、腫瘍病期、治療反応をモニタすること、患者の成果を予測すること、がん再発の検出にある。
E.T.Fosselの1990年3月27日と1990年4月17日発行のそれぞれ米国特許第4,912,050号と同第4,918,021号には、血液、血清又は血漿の陽子核磁気共鳴(NMR)によりがんを検出する手法が開示されている。同一発明者の1993年11月16日発行の米国特許第5,261,405号には、プロセスを自動化する装置と方法が開示されている。
Mountfordらの1997年6月7日発行の米国特許第5,318,031号には、一次元NMRと2D-COSY(二次元相関)NMR分光法を用いて生きた動物又はヒト組織の化学的状態を求め、測定値を正常、異常、遷移状態組織の基準測定値と比較する方法が記載されている。
C.L. Leanら(Magn. Reson Med 20:306-311, 1991; Biochemistry 3:11095-11105, 1992; Magn Reson Med 30:525-533, 1992)には、結腸細胞や組織試料を調べるための磁気共鳴分光法の使用が記載されている。
【０００４】
しかしながら、結腸直腸がんや結腸直腸線腫を検出する費用のかからない非侵襲的の方法がなお求められている。本発明の目的は、高感度で特異性で、低コストで安全な上で定義した基準を満たす結腸直腸腺腫やがんを検出する比較的簡便で非侵襲的方法を提供することである。
202年2月14日に国際出願第02/12879 A2号として公開されたPCT特許出願第CA01/01129号には、患者において結腸直腸腺腫や結腸直腸がんの存在を検出する方法であって、患者からの便試料を磁気共鳴分光法にかけるステップ、及び得られたスペクトルを非がん性被検者からの便の磁気共鳴スペクトルと比較するステップを含み、観察されたスペクトルの差ががん又は臨床的に有意な腺腫を示す、前記方法が記載されている。
ヒト便についてスペクトル分析を行うことは、試料の採取が非侵襲的であり患者に対するリスクがないことから、他の方法より著しく有利である。更に、分析前に試料の特別な処理も必要としない。
便試料の液体懸濁液が本発明者によって開発された磁気共鳴分光法に供する上記PCT出願には代替的方法が記載された。新規な方法の理論的根拠は、試料中の診断マーカーがおそらく少量を超える水溶性化学種であることである。
特に、本発明は、患者において結腸直腸腺腫や結腸直腸がんの存在を検出する方法であって、患者の便試料が磁気共鳴分光法を受け、得られたスペクトルを非がん性被検者の磁気共鳴スペクトルと比較し、観察されたスペクトルの差ががん又は臨床的に有意な腺腫を示す、前記方法であって、患者からの便試料と緩衝液とを混合して液体懸濁液を形成し、懸濁液を遠心分離して上清試料を得、これを磁気共鳴分光法に供することを特徴とする、前記方法を提供する。
【０００５】
方法
遠心分離機を用いて患者の便からの上清試料を調製した。便をホモジナイズしてから回転させた。上述したように、理論的根拠は試料中の診断マーカーがおそらく少量を超える水溶性化学種である。上清は、診断情報を含有すると考えられ、スペクトルは固体を除去することにより改善される。
上記PCT出願の国際出願第02/12879号に記載されているもの、即ち、大腸内視鏡又は手術が予定された被検者からの便試料とした。いわゆる“正常”な試料としては、非新生物性である結腸状態をもつ被検者からのものが含まれる。例としては、多発性憩室症、過形成ポリープ、内痔が挙げられる。
試料の調製
特に、ホモジネートした便の原料を-70℃のフリーザーから取り出し、バイオフードに約10〜15分間入れた。このときに試料は完全に解凍するが、わずかに軟らかくなり、小片を簡単に削り取ることができた。約2グラムの試料をへらを用いて取り、小さなガラスバイアルに入れた。完全に解凍した後、バイアルに6 mlのPBS/D2O緩衝液を加え、緩衝液と便の比を約3:1にした。次に、懸濁液を速度5(Vortex-2 Genie)で2分間混合(撹拌)した。懸濁液を複数の遠心管へ注入し、ベンチトップ遠心ユニット(Biofuge Pico)により3200 RPMで3分間遠心した。次に、上清を注意して分離し、3〜4個のクリオバイアルに集め、-70℃フリーザーで凍結した。
少なくとも12時間の凍結時間後、バイアルを取り出し、バイオフードに入れた。試料を完全に解凍した後、600μlを取り、5 mm NMR管(既に50μlのTSP/D2Oが含有している)に入れた。化学シフト基準(0 ppm)として、また、データ前処理中のスペクトルのアラインメントのためにTSPを用いた。
【０００６】
MRS実験
全試料をAvance 360分光計(Bruker Instruments)により回転せずに実験した。分光計が適切に動作するように実際の試料の前に標準を毎朝実験した。これを行ってから、試料をマグネットに挿入し、時間をノートした。温度を298oＫに設定し、デューテリウムシグナルによりロックした(ロック出力= -20 dB、位相= 113.5、ゲイン=100)。Z、Z2、Z3、X、Yに集中させて手動補正を行った。次に、プローブヘッドを合わせ、整合させた。各試料の新しい実験を書き込んでから、捕捉パラメータを設定した。ウォーターサプレッションを前飽和の手法の使用により行った。各実験のライン幅と01(水の周波数)をノートした。
捕捉パラメータには、パルスプログラムZgpr、温度、TE = 298oＫ; 送信周波数、SF01 = 360.3316979 MHz; 走査数、NS = 32; ダミースキャン、DS = 2; 90度パルス幅、P1 = 9μsec; 前飽和出力レベル、PL9 = 40 dB; タイムドメインデータポイント、TD = 16K; リアルスペクトルサイズ、SI = 16K; インタスキャンの遅れ、D1 = 3.0 sec; スペクタル幅、SW = 4990.02 Hz; 捕捉時間、AQ = 1.64; 遅延時間、D9 = 60 msが含まれる。
データ処理
271試料(MRスペクトル)の全部を3段階統計的分類戦略を用いてデータに完全に分析した。分類器を開発するためにこれらのうちの245(正常147、がん及び/又は腺腫98)を用いた(トレーニングセットにおいて)。トレーニングデータ(ファジー分類を含む)に対する全体の精度は87％であった。バリデーションセット(n = 26; 正常11、がん/ポリープ15)に対する全体の精度は88.5％であった。感度は93.3％であり、特異性は81.8％であった。
上記3段階の統計的分類戦略においては、第一段階は前処理ステップであり、信頼できる分類に必須であることがわかった。遺伝アルゴリズム(GA)由来最適化法に基づき最適領域選択(ORS)アルゴリズムを用いてスペクトルからいくつかの最大限に識別する亜領域を選択することからなる(Nikulin A E, Dolenko B, Bezabeh T, Somorjai R L, NMR in Biomedicine 11, 209-217(1998),“Near-optimal region selection for feature space reduction: Novel preprocessing methods for classifying MR spectra”Bezabeh, T et al. The use of 1H Magnetic Resonance Spectroscopy in Inflammatory Bowel Disease: Distinguishing Ulcerative Colitis From Crohn's Disease, Am. J. Gastroenterol 2001; 96:442-448; Somojai, R.L. et al, Distinguishing Normal from Rejecting Renal Allographs: Application of a Three-Stage Classification Strategy to MR And IR Spectra of Urine, Vibrational Spectroscopy 28(1) 97-102(2002))。分類の信頼性については、これらの亜領域数は分類すべき試料の数より少ないオーダでなければならない。連続置き換えの方法が示す過度に楽観的な分類結果を避けるために、上記PCT出願の国際出願第02/12879号での名前の発明者らはブートストラップ法を用いてクロスバリデーション法を開発した。
【０００７】
ブートストラップ法は、データをほぼ同じ大きさのランダムトレーニングサブセットとランダムテストサブセットへ繰り返し分ける方法である(置換とともに)。ランダムトレーニングサブセットの各々のについて最適分類器が見出され、その精度をランダムテストサブセットで確証させた。このプロセスを何回も繰り返す(あまり重要でないORS前処理段階で1000回、最終分類器には5000回)。一旦最適亜領域が同定されると、第二段階は5000回の個々の成分分類器の分類係数の加重平均として最後の分類器である。この方法によって、n試料すべてが効果的に用いられる。標準多変量統計法、線形判別分析(LDA)は、速度と信頼性があることからすべての段階においてすべての分類器が選択する。分類器のクリスプさの概念も、分類器がクラス確率を与えることから用いられる。試料の2クラス分類は、その試料のクラス割り当て確率が＞75％である場合にはクリスプと呼ばれる。
分類の難しい問題については、第三段階は集計法(コンピュータコンセンサス診断、CCD)によっていくつかの分類器の成果を個々の分類器より信頼性があり正確な分類器全体へ組合わせることからなる。用いられる具体的な分類器の集計は、ウォルパートの積み重ねジェネラライザ(Wolpert's Stacked Generalizer)である。WSGは、最後の分類器に対する入力特徴として個々の分類器によって得られた出力クラス確率を用いる。2クラス問題については、特徴の数が1/分類器(K独立分類器においてはこれは入力特徴としてK確率を示す)。分類の品質全体は一般的には高くなる。分類器のクリスプさは必ず大きくなる。これは、わずかな患者が再検査されなければならないことから臨床環境において重要である。
一次元スペクトルの多変量分析はがん生検については非常に成功してきた(Somorjai, R. et al, J. Mag. Reson. Imaging 6, 437(1996))。これらのスペクトルは、獲得に数分しか必要とせず、様々なデータポイントを与え、一旦診断アルゴリズムが確証されると、自動的に分析し得る。
【国際調査報告】
2005539227.tif 000002
2005539227.tif 000003