(57)【要約】骨髄増殖性肉腫ウィルス（MPSV）プロモーターから上流の5’側にサイトメガロウィルス（CMV）エンハンサーを有する、高レベルの異種タンパク質を発現できる発現ベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトメガロウィルス（CMV）エンハンサー及び骨髄増殖性肉腫ウィルス（MPSV）プロモーターを含んで成る非レトロウィルス発現ベクター。
【請求項２】
前記CMVエンハンサーが、前記MPSVプロモーターの5’末端から上流に位置する請求項１記載のベクター。
【請求項３】
前記CMVエンハンサー及びMPSVプロモーターが、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含んで成る請求項２記載のベクター。
【請求項４】
コンセンサスIg イントロン、tPAプレ−プロリーダー配列、ポリオIRES, ΔCD8選択マーカー、及びヒト成長ホルモンポリAシグナル配列から成る群から選択された少なくとも１つの追加の要素をさらに含んで成る請求項１記載のベクター。
【請求項５】
コンセンサスIgイントロン、tPAプレ−プロリーダー配列及びポリオIRESをさらに含んで成る請求項１記載のベクター。
【請求項６】
コンセンサスIgイントロン、tPAプレ−プロリーダー配列及びポリオIRESをさらに含んで成る請求項２記載のベクター。
【請求項７】
コンセンサスIgイントロン、tPAプレ−プロリーダー配列及びポリオIRESをさらに含んで成る請求項３記載のベクター。
【請求項８】
前記CMVエンハンサー及びMPSVプロモーターに対して作用可能に結合された構造遺伝子をさらに含んでなる請求項７記載のベクター。
【請求項９】
ATCCに寄託される場合、参照番号ATCC−を有するベクターpZMP20。
【請求項１０】
請求項１記載のベクターによりトランスフェクトされた哺乳類細胞。
【請求項１１】
前記CMVエンハンサー及びMPSVプロモーターが、配列番号1のポリヌクレオチド配列を含んで成る請求項10記載の哺乳類細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、CHO細胞である請求項11記載の哺乳類細胞。
【請求項１３】
前記CHO細胞が、DXB11株のものである請求項12記載の哺乳類細胞。
【請求項１４】
ａ．請求項１記載のベクターにより哺乳類宿主細胞をトランスフェクトし；
ｂ．請求項１記載のベクターを、そのゲノムに組込んでいるそれらの細胞を選択的に増殖する条件下で前記細胞を増殖し；
ｃ．細胞培地中への組換えタンパク質の分泌を引き起こす条件下で段階ｂ）の細胞を増殖し；
ｄ．前記細胞培地から組換えタンパク質を単離することを含んで成る、組換えタンパク質の生成方法。
【請求項１５】
前記トランスフェクションがエレクトロポレーションにより生じる請求項14記載の方法。
【請求項１６】
請求項１記載のベクターを、そのゲノム中に組込んでいる細胞を選択的に増殖する条件が、メトトレキセートの存在下で細胞を増殖することを含んで成る請求項14記載の方法。
【請求項１７】
ａ．請求項８記載ベクターを、CHO細胞のゲノム中にランダムに組込み；
ｂ．上昇する濃度のメトトレキセートの存在下で前記細胞を増殖し；
c．段階ｂ）からの細胞を単離し、そしてCHO細胞が培養培地中に組換えタンパク質を生成するような条件下で増殖し；
ｄ．前記培養培地から組換えタンパク質を単離することを含んで成る、組換えタンパク質の生成方法。
【請求項１８】
前記CHO細胞がDXB11株のものである請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAプラスミドベクター、特にサイトメガロウィルス（CMV）エンハンサー及び骨髄増殖性肉腫ウィルス（MPSV）プロモーター（その負の制御領域を欠いている）を含んで成るそれらのハイブリッド非レトロウィルスベクターの構成及び利用に関する。このハイブリッド配列は、ベクターが哺乳類細胞系中にトランスフェクトされる場合、その転写制御下で、クローン化された遺伝子の高い発現を促進する。好ましくは、ベクターはまた、クローン化された配列、例えばIgイントロン配列、ウィルス内部リボソーム侵入部位（IRES）、分泌されるタンパク質発現を可能にするためのリーダー配列、及びポリアデニル化シグナルの発現を高めるための他の官能配列を含むことができる。ベクターはまた、選択マーカー、及び哺乳類、酵母及び原核宿主細胞におけるベクターの複製を促進し、従って発現システムが使用されるベクターの安定性を高める他の特徴を含むことができる。
【背景技術】
【０００２】
細菌、酵母又は哺乳類細胞系による外来性タンパク質の発現は、通常に成って来た。１つのタイプの通常使用される手段は、哺乳類細胞においてクローン化された挿入体を発現する能力を有するビリオン−プラスミドハイブリッドベクターの構成を包含する。そのようなハイブリッドベクターと共にクローン化された遺伝子の発現は一時的な染色体外態様で生じるが、しかしより高い生成は通常、宿主細胞ゲノム中へのベクターのランダム挿入により得られる。典型的な哺乳類発現ベクターは、通常ウィルスプロモーターは又はエンハンサー配列配列の形で及び広い宿主及び組織範囲により特徴づけられる調節要素、プラスミドベクター内のDANフラグメントの挿入を促進するポリリンカー配列、及びイントロンスプライシング及びmRNA転写体のポリアデニル化を担当する配列を含むであろう。
【０００３】
プロモーター−ポリリンカー−ポリアデニル化部位のこの連続領域は通常、転写単位として言及される。ウィルスプロモーター及びエンハンサー領域は、哺乳類宿主細胞への使用のための調節要素として長く使用されて来たた。例えば、CMVエンハンサーの強度は、その発現に基づいてそれが真核発現ベクターにおける提案された成分であることを引き起こし（Boshart など., Cell, 41 (2): 521-30 (1985)）、そしてそれはトランスジェニックマウスにおける普遍的細胞制御要素として利用されて来た（Schmidt など. Mol. Cell. Biol. 10: 4406-4411 (1990)）。
【０００４】
MPSVプロモーターは、線維芽細胞及び造血幹細胞を包含する、ウィルスに対する広範囲の宿主細胞特異性を伝達する（Stocking など. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5746-5750 (1985)）。従って、このプロモーターは、多くの細胞型、例えば皮膚線維芽細胞（Pamer など., Blood, 73: 438-445 (1989)）、一次肝細胞（Ponder など. , Hum. Gene Ther. 2: 41-52 (1991)）、及び齧歯細胞及びヒト線維芽細胞系（van den Wollenberg, Gene 144: 237-241 (1994)）において異種遺伝子を発現するために使用されて来た。
【０００５】
一般的に、真核細胞、レトロウィルスに基づいたシステム及び上記ビリオン−プラスミドハイブリッドへの使用のために適切な２種のタイプの発現ベクターが存在する。van den Wollenbergなどは、MPSVプロモーターのU3領域内に遺伝子的に構築されたCMVエンハンサーを含んで成るレトロウィルスベクターを記載する。しかしながら、レトロウィルスベクターは、産業レベルのタンパク質生成への使用のためには有意な欠点を有する。
第１に、タンパク質生成のレベルは、レトロウィルスパッケージング配列、すなわちそのようなベクターの必要な成分により、それが翻訳開始を妨害するので、重度に阻害される。
【０００６】
第２に、タンパク質の生成は、レトロウィルス  メッセンジャーRNAが標準mRNAよりも効果的に低く、そしてレトロウィルスパッケージングと翻訳との間に競争が存在するので、低められる。
第３に、レトロウィルスベクターは個々のランダム組込みのために２種のプロモーターを移植し、従って、細胞に対して有害な効果を有する下流の配列をランダムに活性化する事実のために、増幅選択マーカーを有する標準のベクターにより通常達成される遺伝子コピー数を達成することは不可能である。
【０００７】
第４に、複製能力に対するランダム組換えのために、レトロウィルス培養物の大規模生成に関する重度の安全問題が存在する。
最後に、レトロウィルスにより確立された細胞系は、ウィルス生成細胞系がまず、マスター細胞バンクを製造するために使用され、次に実際の生成細胞系が生成されるので、詳細に記録するには困難であり、且つ開発するには効果的に低く、第２ラウンドの分析及びバンキングを必要とする。従って、タンパク質の産業的生成は、レトロウィルスベクターにより通常実施されていない。
【０００８】
従って商業的に許容できる量での外来性タンパク質の発現は、難題のままである。これは特に、哺乳類の細胞系において事実である。非常にしばしばであるが、哺乳類細胞系における哺乳類タンパク質の発現は、すべての点で、すなわち構造、触媒活性、免疫学的反応性、生物学的機能の点で、タンパク質の生来の形を模倣するために必要とされる。しばしば、グリコシル化又は他の後−翻訳修飾は、タンパク質の所望する形の生成のキーであり、そして細菌又は酵母システムはそれらの修飾を達成できない。従って、哺乳類宿主システム内での商業的に可能な量での哺乳類細胞の生成を提供する改良されたプラスミドの必要性がまだ残っている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の１つの観点は、サイトメガロウィルス（CMV）エンハンサー及び骨髄増殖性肉腫ウィルス（MPSV）プロモーターを含んで成る非レトロウィルス発現ベクターである。好ましくは、前記CMVエンハンサーは、前記MPSVプロモーターの5’末端から上流に位置する。最も好ましくは、前記CMVエンハンサー及びMPSVプロモーターは、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含んで成る。
【００１０】
本発明のベクターはさらに、コンセンサスIg イントロン、tPAプレ−プロリーダー配列、ポリオIRES, ΔCD8選択マーカー、及びヒト成長ホルモンポリAシグナル配列から成る群から選択された少なくとも１つの追加の要素をさらに含んで成る。好ましくは、ベクターは、コンセンサスIgイントロン、tPAプレ−プロリーダー配列及びポリオIRESをさらに含んで成る。ベクターはまた、構造遺伝子、例えばプレトロンビンを含んで成ることもできる。
【００１１】
本発明のさらなる観点は、前記ベクターによりトランスフェクトされた哺乳類細胞である。本発明の哺乳類細胞は好ましくは、CHO細胞、及び最も好ましくは、DXB11株のCHO細胞である。本発明はまた、本発明のベクターにより哺乳類宿主細胞をトランスフェクトし；前記ベクターを、そのゲノムに組込んでいるそれらの細胞を選択的に増殖する条件下で前記細胞を増殖し； 細胞培地中への組換えタンパク質の分泌を引き起こす条件下で前記組込まれたベクターを有する細胞を増殖し；そして前記細胞培地から組換えタンパク質を単離することを含んで成る、組換えタンパク質の生成方法を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、哺乳類細胞系、例えばチャイニーズハム卵巣細胞（CHO細胞）をトランスフェクトでき、そして外来性タンパク質の生成を予想外に高い量で促進できる新規の非レトロウィルス発現ベクターを供給することにより、この必要性を満たす。本発明のプラスミドは、骨髄増殖性肉腫ウィルス（MPSV）プロモーターの5’末端から上流にサイトメガロウィルスエンハンサーを含んで成る。好ましくは、MPSVプロモーターは、サイトメガロウィルス（CMV）エンハンサーに融合される。
【００１３】
１．概観：
配列番号１は、本発明のCMVエンハンサー/MPSV LTRプロモーター構造体である。CMVエンハンサーは、配列番号１のヌクレオチド１からヌクレオチド374（これも含む）まで及ぶ。MPSV LTRプロモーターは、ヌクレオチド375からヌクレオチド851（これも含む）まで及ぶ。
【００１４】
２．定義：
次の記載においては、多くの用語が広範囲に使用される。次の定義は、本発明の理解を促進するために提供される。
本明細書において使用される場合、“核酸”又は“核酸分子”とは、ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核酸（RNA）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により生成されるフラグメント、及び連結、切断、エンドヌクレアーゼ作用及びエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより生成されるフラグメントを言及する。
【００１５】
核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド（例えばDNA及びRNA）、又は天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば天然に存在するヌクレオチドのα−鏡像異性体形）、又は両者の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾されたヌクレオチドは、糖成分において、及び/又はピリミジン又はプリン塩基成分において変更を有することができる。糖修飾は、ハロゲン、アルキル基、アミン及びアジド基による１又は複数のヒドロキシル基の置換を包含し、又は糖はエーテル又はエステルとして機能され得る。さらに、全糖成分は、立体的に及び電子的に類似する構造体、例えばアザ−糖及びカルボン酸糖類似体により置換さえ得る。
【００１６】
塩基成分における修飾の例は、アルキル化されたプリン及びピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、又は他の良く知られている複素環式置換基を包含する。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合又はそのような結合の類似体により結合さえ得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート、及び同様のものを包含する。用語“核酸分子”とはまた、いわゆる、ポリアミド主鎖に結合される天然に存在するか又は修飾された核酸塩基を含んで成る“ペプチド核酸”も包含する。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。
【００１７】
用語“核酸分子の相補体”とは、相補的ヌクレオチド配列、及び対照ヌクレオチド配列に比較して逆の配向を有する核酸分子である。
用語“contig ”とは、他の核酸分子に対する一連の連続した同一の又は相補的な配列を有する核酸分子を示す。連続した配列とは、核酸分子の全体において、又はその一部に沿って、一定の長さの核酸分子を“オーバーラップ”すると言われる。
用語“構造遺伝子”とは、特定のポリペプチドの特徴のアミノ酸の配列に翻訳されるメッセンジャーRNA（mRNA）に転写される核酸分子を意味する。
【００１８】
“単離された核酸分子”とは、生物のゲノムDNAに組み込まれない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムDNAから分離された成長因子をコードするDNA分子が、単離されたDNA分子である。単離された核酸分子のもう１つの例は、生物のゲノムに組み込まれない、化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種からの染色体の完全なDNA分子よりも小さい。
“核酸分子構造体”とは、天然においては存在しない配置で組み合わされ、そして並置された核酸のセグメントを含むようヒト介在を通して修飾された−本鎖又は二本鎖の核酸分子である。
【００１９】
“線状DNA”とは、遊離5’及び3’及び末端を有する非環状DNA分子を示す。線状DNAは、閉環DNA分子、例えばプラスミドから、酵素消化又は物理的な破壊により調製され得る。
“相補的DNA（cDNA）”とは、逆転写酵素によりmRNA鋳型から形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの一部に対して相補的なプライマーは、逆転写の開始のために使用される。当業者はまた、そのような一本鎖DNA分子及びその相補的DNA鎖から成る二本鎖DNA分子を言及するために用語“cDNA”を用いる。用語“cDNA”はまた、RNA鋳型から生成されたcDNA分子のクローンも意味する。
【００２０】
“プロモーター”とは、構造遺伝子の転写を方向づけるヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に最も近い、遺伝子の5’非コードに領域位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。それらのプロモーター要素は、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化−特異的要素（DSE：McGeheeなど., Mol. Endocrinol. 7: 511 (1993)）、サイクリックのAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE：Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1: 47 (1990)）、グルココルチコイド応答要素（GRE）及び他の転写因子のための結合部位、例えばCRE/ATF（O’Reillyなど., J. Biol. Chem. 267: 19938 (1992)）、AP2 (Yeなど., J. Biol. Chem. 269: 25728 (1994)), SP1, cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)）、及びオクタマー因子（一般的には、Watsonなど., eds., Molecular Biology of the Gene, 4th ed. (The Benjamin Kummings Publishing Company, Inc. 1987), and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)）を包含する。プロモーターが誘発プロモーターである場合、転写の速度は誘発剤に応答して上昇する。対照的に、転写の速度は、プロモーターが構成プロモーターである場合、誘発剤により調節されない。抑制できるプロモーターはまた知られている。
【００２１】
“コアプロモーター”は、TATAボックス及び転写の開始を包含するプロモーター機能のための必須ヌクレオチド配列を含む。この定義によれば、コアプロモーターは、活性を増強し又は組織特異的活性を付与することができる特定の配列の不在下で検出できる活性を有しても又は有さなくても良い。
【００２２】
“調節要素”とは、コアープロモーターのアッセイを調節するか、又はコアープロモーターにより駆動される転写に起因するmRNA生成物の翻訳を高めるヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、転写を基礎レベル異常に高めるか、又は特定の細胞、組織又はオルガネラにおける転写を独占的に又は選択的に付与する細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含むことができる。他の調節要素は、現在、メッセージに包含される配列のために由来するmRNAメッセージ、例えばIRES（高められたリボソーム侵入のために）又はポリ−A末端（高められたmRNA安定性のために）の翻訳を高める。
“エンハンサー”は、転写の開始部位に対してエンハンサーの距離又は配向に関係なく、転写の効率を高めることができるタイプの調節要素である。
【００２３】
“異種DNA”とは、所定の宿主細胞内に天然において存在しない、DNA分子又はDNA分子の集団を言及する。特定宿主細胞に対して異種であるDNA分子は、宿主DNAが非宿主DNA（すなわち、外来性DNA）と組み合わされる限り、宿主細胞種（すなわち、内因性DNA）に由来するDNAを含むことができる。例えば、転写プロモーターを含んで成る宿主DNAセグメントに作用可能に連結されるポリペプチドをコードする非宿主DNAセグメントを含むDNA分子は、異種DNA分子であると思われる。逆に言えば、異種DNA分子は、外来プロモーターと作用可能に連結される内因性遺伝子を含むことができる。もう１つの例として、野生型細胞に由来する遺伝子を含んで成るDNA分子は、そのDNA分子が野生型遺伝子を欠いている突然変異細胞中に導入される場合、異種DNAであると思われる。
【００２４】
“ポリペプチド”とは、天然又は合成的に生成されても、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約10個よりも少ないアミノ酸残基のポリペプチドは通常、“ペプチド”として言及される。
“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子である。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。
【００２５】
非宿主DNA分子によりコードされるペプチド又はポリペプチドは“異種”ペプチド又はポリペプチドである。
“組み込まれた遺伝子要素”とは、その要素がヒト操作を通して細胞中に導入された後、宿主細胞の染色体中に組み込まれているDNAのセグメントである。本発明においては、組み込まれた遺伝子要素は通常、エレクトロポレーション又は他の技法により細胞中に導入される線状化されたプラスミドに由来する。組み込まれた遺伝子要素は、元の宿主細胞からその子孫に通過される。
【００２６】
“クローニングベクター”は、宿主細胞において自律的に複製する能力を有する、核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、又はバクテリオファージである。クローニングベクターは典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わないで、決定できる態様で核酸分子の挿入を可能にする１又は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、及びクローニングベクターにより形質転換された細胞の同定及び選択への使用のために適切であるマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は典型的には、テトラサイクリン耐性又はアンピシリン耐性を付与する遺伝子を含む。
【００２７】
“発現ベクター”は、宿主細胞において発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子及び転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に配置され、そしてそのような遺伝子はプロモーターに“作用可能に結合される”と言われる。同様に、調節要素及びコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合、作用可能に連結される。
“非レトロウィルス  ベクター発現ベクター”とは、レトロウィルスパッケージング要素をコードするポリヌクレオチド配列を含まない発現ベクターである。
【００２８】
“組換え宿主”とは、異種核酸分子、例えばクローニングベクター又は発現ベクターを含む細胞である。“インテグレイティブ組換え体”は、異種DNAが細胞のゲノムDNA中に組み込まれるようになる組換え宿主細胞である。
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向づけるペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００２９】
“単離されたポリペプチド”は、汚染性細胞成分、例えば炭水化物、脂質又は天然においてポリペプチドに関連している他のタンパク質性不純物を実質的に含まないポリペプチドである。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高く精製された形で、すなわち少なくとも約80％の純度、少なくとも約90％の純度、少なくとも約95％の純度、95％以上の純度、又は99％以上の純度でポリペプチドを含む。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含むことを示すための1つの手段は、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブルー染色によるシングルバンドの出現によるものである。しかしながら、用語“単離された”とは、他の物理形、例えばダイマー又は他のグリコシル化された又は誘導体化された形での同じポリペプチドの存在を排除しない。
【００３０】
用語“アミノ−末端”及び“カルボキシル−末端”とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書において使用される。その情況が可能である場合、それらの用語は、接近性又は相対的位置を示すためにポリペプチドの特定の配列又は一部に関して使用される。例えば、ポリペプチド内の対象配列のカルボキシル末端側に位置する一定の配列は、その対照配列のカルボキシル末端に隣接して位置するが、しかし完全なポリペプチドのカルボキシル末端では必ずしも必要ではない。
用語“発現”とは、遺伝子生成物の生合成を言及する。例えば、構造遺伝子においては、発現はmRNAへの構造遺伝子の転写及び１又は複数のポリペプチドへのmRNAの翻訳を包含する。
【００３１】
用語“相補体／抗−相補体対”とは、適切な条件下で、非共有的に会合される安定した対を形成する非同一性成分を示す。例えば、ビオチン及びアビジン(又はストレプタビジン)は、相補体／抗−相補体対の基本型メンバーである。他の典型的な相補体／抗−相補体対は、受容体／リガンド対、抗体／抗原(又はハプテン又はエピトープ)対、センス／アンチセンス  ポリヌクレオチド対、及び同様のものを包含する。相補体／抗−相補体対の続く解離が所望される場合、その相補体／抗−相補体対は好ましくは、＜１０9Ｍ-1の結合親和性を有する。
【００３２】
“上流”及び“下流”とは、ヌクレオチド配列に存在する２種の要素間の相対的配向を記載するために使用される用語である。もう１つの“上流”である要素は、他の要素よりも配列の5’末端に対してより接近した（すなわち、分子が線状である場合、リボース又はデオキシリボース主鎖の5’炭素に結合されるリン酸基を有する分子の末端に対してより接近した）位置に位置する。要素は、それが、他の要素に比較される場合、配列の3’末端（すなわち、線状分子におけるリボース又はデオキシリボース主鎖の3’末端に結合されるヒドロキシル基を有する分子の末端）に接近した位置に位置する場合、“下流”であると言われる。
【００３３】
真核生物においては、RNAポリメラーゼIIは、mRNAを生成するために構造遺伝子の転写を触媒する。核酸分子はRNAポリメラーゼII鋳型を含むより企画され、ここでRNA転写体は特定のmRNAの配列に対して相補的である配列を有する。RNA転写体は、“アンチセンスRNA”と呼ばれ、そしてアンチセンスRNAをコードする核酸分子は“アンチセンス遺伝子”と呼ばれる。アンチセンスRNA分子は、mRNA分子に結合することができ、mRNA翻訳の阻害をもたらす。
【００３４】
標準分析法の不正確さのために、ポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解される。そのような値が“約”X又は“およそ”Xとして表される場合、Xの言及された値は、±10％で正確であると理解されるであろう。
本発明のポリヌクレオチド、一般的にcDNA配列は、本明細書における記載されるポリペプチドをコードする。本発明のポリペプチドをコードするcDNA配列は、一連のコドンから構成され、ポリペプチドの個々のアミノ酸残基はコドンによりコードされ、そして個々のコドンは３個のヌクレオチドから構成される。アミノ配列残基は、次の通りに、それらのそれぞれのコドンによりコードされる。
【００３５】
アラニン（Ala）は、GCA, GCC, GCG 又はGCTによりコードされる。
システイン（Cys）は、TGC 又は TGTによりコードされる。
アスパラギン酸（Asp）は、GAC 又は GATによりコードされる。
グルタミン酸（Glu）は、GAA 又は GAGによりコードされる。
フェニルアラニン（Phe）は、TTC 又は TTTによりコードされる。
グリシン（Gly）は、GGA, GGC, GGG 又は GGTによりコードされる。
ヒスチジン（His）は、CAC 又は CATによりコードされる。
イソロイシン（Ile）は、ATA, ATC 又は ATTによりコードされる。
リシン（Lys）は、AAA, 又は AAGによりコードされる。
【００３６】
ロイシン（Leu）は、TTA, TTG, CTA, CTC, CTG 又は CTTによりコードされる。
メチオニン（Met）は、ATGによりコードされる。
アスパラギン（Asn）は、AAC 又は AATによりコードされる。
プロリン（Pro）は、CCA, CCC, CCG 又は CCTによりコードされる。
グルタミン（Gln）は、CAA 又は CAGによりコードされる。
アルギニン（Arg）は、AGA, AGG, CGA, CGC, CGG 又は CGTによりコードされる。
セリン（Ser）は、AGC, AGT, TCA, TCC, TCG 又は TCTによりコードされる。
トレオニン（Thr）は、ACA, ACC, ACG 又は ACTによりコードされる。
バリン（Val）は、GTA, GTC, GTG 又は GTTによりコードされる。
トリプトファン（Trp）は、TGGによりコードされる。
チロシン（Tyr）は、TAC 又は TATによりコードされる。
【００３７】
本発明によれば、ポリヌクレオチドが本明細書に記載されるように請求される場合、請求されるものは、センス鎖、アンチセンス鎖、及びそれらのそれぞれの水素結合により一緒にアニーリングされたセンス及びアンチセンス鎖の両者を有する二本鎖としてのDNAの両者であることが理解されることが認識されるべきである。本発明のポリペプチドをコードし、そして本明細書に記載されるcDNAによりコードされるメッセンジャーRNA（mRNA）がまた請求される。メッセンジャーRNA（mRNA）は、本明細書に定義されるコドンと同じコドンを用いてポリペプチドをコードするが、但し個々のチミンヌクレオチド（T）は、ウラシルヌクレオチド（U）により置換されている。
【００３８】
３．詳細な記載：
本発明のベクターは、産業、治療、診断又は研究において価値を有するポリペプチドを生成するために使用され得る。例示的なタンパク質は、抗体及び抗体フラグメント、受容体、イムノモジュレーター、ホルモン及び同様のものを包含する。例えば、発現ベクターは、医薬的活性分子、例えばプレトロンビン、第VII a因子、プロインスリン、インスリン、卵胞刺激ホルモン、組織型プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン−１（IL-1）〜IL9）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子、及び顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、−γ、−ω、−δ、−τ及び−ε）、幹細胞成長因子、エリトロポイエチン及びトロンボポイエチンをコードする核酸分子を包含することができる。
【００３９】
興味あるタンパク質の追加の例は、抗体、抗体フラグメント、抗−イディオタイプ抗体（又はそのフラグメント）、キメラ抗体、ヒト適合された抗体、抗体融合タンパク質及び同様のものを包含する。そのような抗体融合タンパク質の例は、トランスメンブラン活性因子及びCAML−相互作用体（TACI）タンパク質の細胞外部分の融合体、例えばヒトIgG1のFc部分に融合されるアミノ酸30−110である。Fc部分は、生来の配列であるか、又は免疫グロブリンエフェクター機能を除去するために突然変異誘発されている配列であり得る。そのような突然変異の例は、IgG1 Fc配列のアミノ酸234, 235, 237, 330及び331での変化を包含する。
【００４０】
本発明のベクターは、予測されるレベルよりも高いレベルで、興味あるそれらのタンパク質を生成することが見出された。理論により結びつけられないが、本発明のベクターにより示される平均よりも高いタンパク質発現は、哺乳類宿主細胞のゲノム中に組込まれる場合、少なくとも一部分、このベクターにより示される発現の平均安定性よりも高いためであることが予測される。
【００４１】
興味ある遺伝子は、当業者によく知られている方法を用いて、ゲノム又はcDNA配列から単離されるか又は化学的に合成され得る。化学的に合成され、そして二本鎖DNAが必要とされる場合、個々の相補的鎖が別々に製造される。短い遺伝子（60〜80個の塩基対）の生成は、技術的に簡単であり、そして相補的鎖の合成及び続くそれらのアニーリングにより達成され得る。より長い遺伝子（300個以上の塩基対）の生成に関しては、化学的DNA合成の間、個々のサイクルのカップリング効率はめったに100％ではないので、特別な手段が必要とされる。この問題を克服するためには、合成遺伝子（二本鎖）が、20〜100個の長さのヌクレオチドである一本鎖フラグメントからモジュレーター型でアセンブリーされる。
【００４２】
合成遺伝子を構築するための１つの方法は、それぞれ20〜60個の長さのヌクレオチドである、１組のオーバーラップする相補的オリゴヌクレオチドの初期生成を必要とする。アニーリングの後、遺伝子の２つの末端セグメントがフラグメント末端を付与するために整列されるよう鎖の配列が企画される。遺伝子の個々の内部部分は、隣接する部分を正確に有する塩基対に企画される相補的3’及び5’末端延長を有する。従って、遺伝子がアセンブリーされた後、工程を完結するための唯一の残る必要条件は、T4 DNAリガーゼにより２本の鎖の主鎖に沿ってニックを密封することである。タンパク質コード配列の他に、クローニングベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位中への挿入を促進する末端配列を有する合成遺伝子が企画され、そして転写及び翻訳の正しい開始及び終結のためのシグナルを含む他の配列がまた付加されるべきである。
【００４３】
十分なサイズの遺伝子を調製するための他の手段は、特定組のオーバーラッピングオリゴヌクレオチド（40〜100個のヌクレオチド）を合成することである。3’及び5’延長部分（６〜10個のヌクレオチド）がアニーリングされた後、大きなギャップがまだ残るが、しかし塩基対合された領域は構造体を一緒に保持するために十分に長く且つ十分に安定性である。重複が完結され、そしてギャップがE.コリDNAポリメラーゼIによる酵素的DNA合成により満たされる。この酵素は、複製開始点として3’−ヒドロキシル基を、及び鋳型として一本鎖領域を使用する。
【００４４】
酵素的合成が完結した後、ニックはT4 DNAリガーゼにより密封される。より大きな遺伝子に関しては、完全な遺伝子配列が、４〜16個のオーバーラップするオリゴヌクレオチド（それぞれ20〜60個の塩基対）を連結することにより、それぞれ一緒に置かれる二本鎖フラグメントから通常アッセンブリーされる。個々の合成及びアニーリング段階の後、十分な量の二本鎖フラグメントが存在する場合、それらは単純にお互い連結される。他方では、個々のフラグメントは、利用できるDNAの量を増幅するためにベクター中にクローン化される。
【００４５】
両者の場合、二本鎖構造体は、完全な遺伝子配列を形成するために、お互いに対して連結的に結合される。個々の二本鎖フラグメント及び完全な配列は、化学的に合成された遺伝子が正しいヌクレオチド配列を有することを確証するために、DNA配列により特徴づけられるべきである。ポリヌクレオチドに対する再考に関しては、Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1994), Itakura et al., Annu. Rev. Biochem. 53 : 323 (1984), 及び Climie など., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87 : 633 (1990)を参照のこと。
【００４６】
真核細胞における興味あるアミノ酸配列の生成のために適切である発現ベクターは典型的には、（１）転写の開始及びレベルを制御する真核又はウィルスDNA要素、例えばプロモーター及びエンハンサー；（２）転写体のプロセッシングを制御するDNA要素、例えば転写終結/ポリアデニル化配列；及び（３）１又は複数の選択マーカー及びすべての関与する宿主細胞のための適切な遺伝子発現のために有用な他の配列を含む。配列ベクターはまた、異種ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向ける分泌配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【００４７】
興味ある遺伝子又は選択マーカー遺伝子を発現するためには、アミノ酸配列をコードする核酸分子は、転写発現を制御する調節配列に作用可能に連結され、そして次に、宿主細胞中に導入されるべきである。本発明のベクターは、プロモーター側の5’位置にCMVエンハンサーと共にMPSVプロモーターを含んで成る。MPSVは、Moloneyネズミ肉腫ウィルスファミリーのメンバー（Mo-MuSV）であり、そしてインビトロで線維芽細胞を形質転換し、そしてインビボで肉腫を引き起こす。さらに、MPSVは、成熟マウスにおいて急性骨髄増殖性疾患を引き起こす。ウィルスゲノムの成分であるmos腫瘍遺伝子は、ウィルスの形質転換機能のために必要であるが、しかしそれは、Mo-MuSVに比較される場合、拡張された細胞標的特異性の原因であるその長い末端反復体（LTR）に対して特異的な配列である。
【００４８】
それらの追加の細胞標的物は、MPSV  LTRを、哺乳類細胞系発現のための魅力的プロモーターにする。MPSV LTRは一般的に、LTR配列内に位置する転写開始部位に関して、-416〜＋31のヌクレオチドとして定義されるが、但しプロモーターとして機能するMPSV LTRの他の配列もまた使用され得る。好ましくは、MPSVプロモーターは、配列番号１のヌクレオチド376〜851の配列を有する。MPSV LTRは、転写を負に制御するものとして同定されている配列を含む。それらの配列はタンパク質生成に対して限界の効果を有することがわかっており、その結果、それらはpZMP21において存続するが、それらは任意には、本発明のベクターにおいては欠失され得る。
【００４９】
本発明の第２の調節要素は、CMVエンハンサーであり、そして一般的に、CMVの主要即時−初期遺伝子の転写開始部位の5’側の-118〜-524のヌクレオチドとして定義され得る。好ましくは、CMVエンハンサーは、配列番号１のヌクレオチド１〜374の配列を有する。ウィルスゲノムのこのフラグメントのエンハンサー機能が、エンハンサーを欠いているSV40ウィルスゲノムにより同時トランスフェクトされる場合、組換えウィルスを生成するその能力に基づいて発現された（Boshortなど., Cell, 41 (2): 521-30 (1985)）。本発明のベクターに関しては、この配列又は機能的には、そのフラグメントは、CMVエンハンサーの存在を伴わないでの転写に比較される場合、転写の上昇をもたらすベクター内に位置する。好ましくは、この位置は、MPSVプロモーター配列の5’側である。
【００５０】
本発明のベクターは、哺乳類宿主細胞内での興味ある組換えタンパク質の発現を高めることができる他の調節要素を含んで成ることができる。中でも、包含され得る調節要素は、免疫のグロブリン遺伝子のイントロン内に位置する転写エンハンサーである。哺乳類宿主細胞への使用のために最適化された配列、例えばCHO DXB11を含んで成るコンセンサスIgイントロン配列が特に好ましい。第２の追加の調節要素は、内部リボソーム侵入部位（IRES）、すなわちジシストロンメッセージの翻訳を可能にするウィルスに由来する配列である。ポリオウィルスのIRESが特に好ましい。第３の調節要素は、メッセージ安定性を高めるmRNAメッセージの末端上のアデノシン残基の付加をもたらすポリ−Aシグナル配列である。ヒト成長ホルモン（hGH）遺伝子配列に由来するポリ−Aシグナル配列が特に好ましい。
【００５１】
周囲の培地中に興味あるアミノ酸配列を分泌する組換え宿主細胞が成長され得る。従って、本発明は、“シグナルペプチド”、“リーダー配列”、“プレプロ配列”又は“プレ配列”としても知られている、分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクターを企画する。分泌シグナル配列は、興味ある遺伝子に作用可能に結合され、その結果は、２種の配列は、正しい読み取り枠で連結され、そして興味ある新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるよう位置する。
【００５２】
分泌シグナル配列は通常、興味あるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の5’側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は興味あるヌクレオチド配列の他の部分に位置することができる（例えば、アメリカ特許第5,037,743号（Welchなど.,）；アメリカ特許第5,143,830号（Hollandなど.,）を参照のこと）。本発明は、アメリカ特許第5,651,655号に記載される配列に由来する組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）プレープロリーダーを用いることができる。突然変異がプレ−プロリーダー中に導入され、その結果、それは哺乳類発現システム内への使用のために最適化される。
【００５３】
発現ベクターはまた、興味あるポリペプチドの精製を助けるためにペプチド標識をコードするヌクレオチド配列を含んで成る。組換えポリペプチドを単離するために有用であるペプチド標識は、ポリヒスチジン標識（ニッケル−キレート化樹脂に対する親和性を有する）、c-myc標識、カルモジュリン結合タンパク質（カルモジュリン親和性クロマトグラフィーにより単離される）、物質P, RYIRS 標識（抗−RYIRS抗体と結合する）、Gln−Gln標識及びFLAG標識（抗−FLG抗体と結合する）を包含する。例えば、Luoなど., Srch. Biochem. Biophys. 329: 215 (1996), Morganti など., Biotechnol. Appl. Biochem. 23: 67 (1996), 及びZhengなど., Gene 186: 55 (1997) を参照のこと。そのようなペプチド標識コードする核酸分子は、例えばSigma−Aldrich Corporation (St. Louis, MO) から入手できる。
【００５４】
哺乳類発現ベクターへの使用のための広範囲の種類の選択マーカー遺伝子が入手できる（例えば、Kaufman, Mets. Enzymol. 185 : 487 (1990); Kaufman, Meth. EMZY7nOI. 185 : 537 (1990)を参照のこと）。選択マーカー遺伝子は一般的に、細菌、酵母又は哺乳類宿主細胞における初期の陽性形質転換体の選択を可能にする、化学物質又は薬剤に対する成長耐性を付与する。選択マーカーは、２種の機能的カテゴリー、すなわち劣性及び優性カテゴリーに分類される。劣性マーカーは通常、宿主細胞、すなわち“マーカー”生成物又は機能を欠いている、宿主細胞において生成されない生成物をコードスルで遺伝子である。
【００５５】
チミジンキナーゼ（TK）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）及びヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）のためのマーカー遺伝子が、このカテゴリーに存在する。例えば、Srivastava and Schlessinger, Gene 103 : 53 (1991); Romanos など., "Expression of Cloned Genes in Yeast,"in DNA Cloning 2 : Expression Systenls, 2"d Edition, pages 123-167 (IRL Press 1995); Markie, Methods Mol. Biol. 54 : 359 (1996); Pfeifer など., Gene 188 : 183 (1997); Tucker and Burke, Gene 199 : 25 (1997); Hashida- Okado et al., FEBS Letters 425 : 117 (1998)を参照のこと。
【００５６】
優性マーカーは、成長−制御化合物（例えば、抗生物質又は他の薬物）に対する耐性を付与し、そして/又は代謝的制限の環境における宿主細胞の増殖を可能にする生成物をコードする遺伝子を包含する。このカテゴリ内の通常使用されるマーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与する変異体DHFR遺伝子；マイコフェノール酸/キサンチン含有培地における宿主細胞増殖を可能にするキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのためのgpt遺伝子；及びG418、ゲンタマイシン、カナマイシン及びネオマイシンに対する耐性を付与できるアミノグリコシド3’−ホスホトランスフェラーゼのためのneo遺伝子を包含する。より新しく開発されたマーカーは、ゼオシン、ブレオマイシン、ブラストシジン及びヒグロマイシンに対する耐性を包含する（例えば、Gatignol など., Mol. Gen. Genet. 207: 342 (1987) ; Drocourt など., Nucl. Acids Res. 18 : 4009 (1990)を参照のこと）。
【００５７】
選択マーカーの使用は、高レベルで組換えタンパク質を発現する細胞について選択まで、ベクター配列を組込んでいる細胞の単離を超えて拡張される。この選択工程の例は、組換えタンパク質と共に緑色蛍光タンパク質の同時発現である。自己蛍光タンパク質の使用は、宿主細胞が組換えタンパク質を過剰発現するかどうかを評価するための視覚機構を提供する。類似する選択が、抗体により検出され得る細胞表面タンパク質（例えば、CD4, CD8、クラスI主要組織適合性複合体（MHC）タンパク質、等）により行われ得る。
【００５８】
好ましくは、細胞表面タンパク質の細胞質ドメインは、タンパク質の過剰発現の宿主細胞に対する細胞学的効果を低めるための検出されて来た。そのような選択マーカー遺伝子の発現生成物は、FACS分類又は磁気ビーズ分離技法のような標準手段により、トランスフェクトされていない細胞からトランスフェクトされた細胞を分類するために使用され得る。選択マーカー遺伝子は、公開されているヌクレオチド配列を用いてクローン化されるか、又は合成され得るか、あるいはマーカー遺伝子は商業的に入手可能である。
【００５９】
本発明のベクターは好ましくは、哺乳類宿主細胞への使用のためのSV40プロモーター/エンハンサーを有するDHFRカセット、哺乳類細胞の細胞表面での組換え遺伝子発現を決定するためのCD8Δ構造体（Δは、タンパク質の細胞質ドメインをコードする配列が欠失されていることを示す）、細菌宿主への使用のためのβラクタマーゼ、及び酵母宿主細胞への使用のためのURA3を、選択マーカーとして使用する。
【００６０】
発現ベクターの最終共通成分は、宿主システムにおけるベクターの安定性を高める、哺乳類、酵母及び細菌宿主におけるベクターの複製を促進する配列、例えばセントロメア、複製の起点、クロマチン安定性配列、及び同様のものである。例えば、本発明のベクターは、細菌宿主細胞への使用のための複製のpUC起点、及び酵母宿主細胞への使用のための複製のS. セレビシアエCEN/ARS起点を含んで成る。タンパク質発現レベル及び/又は安定性を調節することができるクロマチン要素は、遺伝子座制御領域（LCR）、マトリックス又は骨格結合領域（MAR又はSAR）又はインスレーターである。
【００６１】
興味あるアミノ酸コード配列を含んで成る発現ベクターの構成の間及びその後、ベクターは典型的には、宿主細胞において増殖される。ベクター増殖は、原核宿主細胞、例えばE. コリにおいて行われ得る。E. コリの適切な下部は、BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS, BL21 (DE3) pLysE, DH1, DH4I, DH5, DHSI, DHSIF', DHSIMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1, Y1088, Y1089, CSH18, ER1451,及び ER1647を包含する（例えば、Brown (ed.), Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991)を参照のこと）。原核宿主におけるベクターの増殖のための標準の技法は、当業者に良く知られている（例えば、Ausubel など. (eds. ), Short Protocols in Molecular Biology, 3d Edition (John Wiley & Sons 1995) ["Ausubel 1995"]; Wu など., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)を参照のこと）。
【００６２】
他方では、ベクター構成の間又はその後、ベクター増殖は、真核細胞、例えば酵母において行われ得る。これに関しての特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia Pastoris）及びピチア・メタノリカ（Pichia methanalice）を包含する。外来性DNAによりS. セレビシアエ細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばアメリカ特許第4,599,311号（Kawasaki）、アメリカ特許第4,931,373号（Kawasakiなど.,）、アメリカ特許第4,870,008号（Brake）、アメリカ特許第5,037,743号（Welchなど.,）及びアメリカ特許第4,845,075号（Murrayなど., ）に開示される。
【００６３】
形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、薬物耐性、又は特定の栄養物（例えば、ロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表原型により選択される。他の酵母、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンペ（Schizosaccharamyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロミセスフラギリス（Kluyveram fragilis）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis）、ピチア・フラギリス）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis）ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア・グイレルモンジ（Pichia guillermondii）、及びカンジダ・マルトリ（Candida maltosa）についての形質転換システムは、当業界において知られている。
【００６４】
例えば、Gleesonなど., J. Gen. Microbiol. 132 : 3459 (1986),及びアメリカ特許第4,882,279号（Cregg）を参照のこと。
究極的には、興味あるアミノ酸配列は、上記のように、いずれかの原核又は真核宿主細胞において発現され得る。好ましくは、本発明のベクターを用いて、興味あるアミノ酸配列が、真核細胞、例えば哺乳類細胞により生成される。適切な哺乳類宿主細胞の例は、アフリカミドリザル腎細胞（Vero; ATCC  CRL1587）、ヒト胚腎細胞（293−HEK; ATCC CRL1573）、子供のハムスター腎細胞（BHK−21, BHK−570；ATCC CRL8544, ATCC CRL10314）、イヌ腎細胞（MDCK；ATCC CCL34）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO−K1; ATCC CCL61; CHO DG44 [Chasinなど., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555 (1986)]、ラット下垂体細胞（CH1；ATCC CCL82）、HeLa S3細胞（ATCC CCL2.2）、ラット肝癌細胞（H−４−II−E；ATCC CRL1548）、SV40−形質転換されたモンキー腎細胞（COS−１；ATCC CRL1650）及びネズミ胚細胞（NIH−3T3；ATCC CRL1658）を包含する。CHO株DXB11が、本発明のベクターを用いてのタンパク質生成のための好ましい宿主細胞である。
【００６５】
発現ベクターは、種々の標準の技法、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム−介在性トランスフェクション、マイクロプロジェクト−介在性供給、エレクトロポレーション及び同様のものを用いて、宿主細胞中に導入され得る。トランスフェクトされた細胞が選択され、そして増殖され、宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれる発現ベクターを含んで成る組換え宿主細胞が供給される。細菌、酵母、昆虫、哺乳類及び植物細胞中に核酸分子を導入するための標準の方法は、例えばAusubel (1995) により提供される。
【００６６】
哺乳類細胞系により生成される外来性タンパク質を発現し、そして回収するための一般的方法は、例えばEtcheverry, "Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture,"in Protein Engineering : Principles and Practice, Cleland など. (eds. ), pages 163 (Wiley-Liss, Inc. 1996)により提供される。
従って、一般的に記載される本発明は、次の例により容易に理解されるが、それらの例は、例示目的であり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６７】
例１．MPSVプロモーター及びpZMP21の構成
MPSV LTRプロモーターを、PCRを用いてオリゴヌクレオチドを４個の対でアセンブリーすることにより合成的に構成した。
【００６８】
第１に、次のオリゴヌクレオチドをPCRにより対でアセンブリーした：配列番号４+５, ６＋７, ８＋９, 10＋11, 12＋13, 14＋15。次に、前記対を、PCR反応において、３組の４個のオリゴヌクレオチド配列番号４＋５及び６＋７（オリゴヌクレオチド配列番号４及び７をプライマーとして用いる）、及び12＋13及び14＋15（オリゴヌクレオチド配列番号12及び15をプライマーとして用いる）にアセンブリーした。３種のPCRフラグメントがアッセンブリーされる場合、予測されるよりも小さな生成物が観察された。新しいプライマー16は、この欠失に導く内部反復体を得るために製造された。４＋７の生成物をプライマー４及び16により延長し、８＋15の生成物との良好なオーバーラップを製造した。４＋16及び８＋15を、プライマー４及び15を用いてPCRによりアセンブリし、十分な長さの生成物を製造した。
【００６９】
PCR反応を次の通りに行った：100μlの最終体積まで、10μlの10× Taqポリメラーゼ反応緩衝液（Perkin Elmer）、８μlの2.5mMのdNTP、78μlの蒸留水、上記２種のプライマーの20mM原液それぞれ２μl、及びTaqポリメラーゼ（2.5単位、Life Technology）を添加した。等体積の鉱油を添加し、そして反応を94℃に２分間、過熱し、続いて、94℃で30秒、45℃で30秒、72℃で30秒、続いて72℃で５分間の延長を25サイクル行った。第１段階のアセンブリーの場合、プライマーはまた、反応の鋳型でもあった。後の段階に関しては、10μlのPCR生成物を、個々のレベルのアセンブリーのための鋳型として使用した。
【００７０】
100μlのPCR反応物10μlを、分析のために、１×TBE緩衝液と共に1.0％アガロースゲル上に負荷する。残りの90μlのPCR反応物を、１MのNaCl 5μl及び無水エタノール250μlの添加により沈殿する。NheIにより切断されたプラスミドpZMP2Oを、PCRフラグメントによる組換えのために使用する。プラスミドpZMP20を、pRS316（the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110- 2209で寄託され, そして 寄託番号77145として示される）から取られた酵母遺伝子要素、ポリオウィルスからのIRES要素、及びトランスメンブランドメインのカルボキシル末端で切断された、CD8の細胞外ドメインを有するpZP9（the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209で寄託され, そして 寄託番号98668として示される）から構成した。
【００７１】
pZMP20はサイトメガロウィルス即時初期プロモーター、免疫グロブリンシグナルペプチドイントロン、コード配列の挿入のための複数の制限部位、停止コドン及びヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カセットを含む哺乳類発現ベクターである。プラスミドはまた、複製のE. コリ起点、SV40プロモーター、エンハンサー及び複製の起点を有する哺乳類選択マーカー発現単位、DHFR遺伝子、SV40ターミネーター、及びS. セレビシアエにおける選択及び複製のために必要とされるURA3及び（CEN−ARS配列を有する。
【００７２】
100μlのコンピテント酵母細胞（S. セレビシアエ）を、上記からの種々のDNA混合物10μlと共にそれぞれ組合し、そして0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母/DNA混合物を、0.75kV（５hV/cm）、∞オーム、25μFで電気パルスする。個々のキュベットに、600μlの1.2Mソルビトールを添加し、そして酵母を、２つのURA−DRA-Dプレート上に２つの300μlのアリコートでプレートし、そして30℃でインキュベートする。約48時間後、単一のプレートからのUra＋酵母形質転換体を、1mlの水に再懸濁し、そして短時間、回転し、酵母細胞をペレット化する。
【００７３】
細胞ペレットを、1mlの溶解緩衝液（２％のTritonX−100、１％SDS、100mMのNaCl、10mMのトリス、pH8.0, 1mMのEDTA）に再懸濁する。500μlの溶解混合物を、300μlの酸洗浄されたビーズ及び200μlのフェノール−クロロホルムを含むEppendorf管に添加し、１分間隔で２又は3度、かき混ぜ、続いてEppendorf遠心分離機において最大速度で５分間、回転する。300μlの水性相を、新しい管に移し、そしてDNAを100μlのエタノール（EtOH）により沈殿し、続いて4℃で10分間、遠心分離する。DNAペレットを、10μlの水に再懸濁する。
【００７４】
エレクトロコンピテントE.コリ細胞（DH10B, GibcoBRL）の形質転換を0.5〜2mlの酵母DNA調製物及び40μlのDH10B細胞により行う。細胞を、1.7kV、25μF及び400オームで電気パルスする。エレクトロポレーションに続いて、1mlのSOC（２％Bacto Tryptone（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース）を、４個のLB AMPプレート（LBブイヨン（Lennox）、1.8％のBacto 寒天（Difco）、100mg/Lのアンピシリン）上に250μlのアリコートでプレートする。
【００７５】
正しい構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定し、MPSVプロモーターの存在を確め、そして種々のDNA配列がお互いに対して正しく結合されたことを確める。陽性クローンの挿入体を、配列分析にゆだねる。大規模プラスミドDNAを、Qiagen Maxiキット（Qiagen）を用いて、その製造業者の説明書に従って単離する。pZMP21を、2003年6月17日に、the American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209で寄託し、そしてATCC＃ として命名された。
【００７６】
例２．プレトロンビン発現ベクターの構成
プレトロンビンをコードするポリヌクレオチドのすべて又は一部を含む発現プラスミドを、相同組換えにより構成する。プレトロンビン挿入点を端に有するベクター配列に対応する5’及び3’末端でのフランキング領域と共に、配列番号15のヌクレオチド１〜ヌクレオチド1380からのポリヌクレオチド配列を含む、プレトロンビンcDNAのフラグメントを、PCRを用いて単離する。PCRのためのプライマーはそれぞれ、5’末端から3’末端の方に、ベクターからの40bpのフランキング配列、及びプレトロンビンの読み取り枠からのアミノ及びカルボキシル末端に対応する17bpを含む。
【００７７】
100μlのPCR反応物10μlを、分析のために、１×TBE緩衝液と共に0.8％LMPアガロースゲル（Seaplaque GTG）上に負荷する。残りの90μlのPCR反応物を、１MのNaCl 5μl及び無水エタノール250μlの添加により沈殿する。BglIIIにより切断されたプラスミドpZMP2O及びpZMP21（前の例に記載される）を、PCRフラグメントによる組換えのために使用する。
【００７８】
100μlのコンピテント酵母細胞（S. セレビシアエ）を、上記からの種々のDNA混合物10μlと共にそれぞれ組合し、そして0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母/DNA混合物を、0.75kV（５hV/cm）、∞オーム、25μFで電気パルスする。個々のキュベットに、600μlの1.2Mソルビトールを添加し、そして酵母を、２つのURA−DRA-Dプレート上に２つの300μlのアリコートでプレートし、そして30℃でインキュベートする。約48時間後、単一のプレートからのUra＋酵母形質転換体を、1mlの水に再懸濁し、そして短時間、回転し、酵母細胞をペレット化する。
【００７９】
細胞ペレットを、1mlの溶解緩衝液（２％のTritonX−100、１％SDS、100mMのNaCl、10mMのトリス、pH8.0, 1mMのEDTA）に再懸濁する。500μlの溶解混合物を、300μlの酸洗浄されたビーズ及び200μlのフェノール−クロロホルムを含むEppendorf管に添加し、１分間隔で２又は3度、かき混ぜ、続いてEppendorf遠心分離機において最大速度で５分間、回転する。300μlの水性相を、新しい管に移し、そしてDNAを100μlのエタノール（EtOH）により沈殿し、続いて4℃で10分間、遠心分離する。DNAペレットを、10μlの水に再懸濁する。
【００８０】
エレクトロコンピテントE.コリ細胞（DH10B, GibcoBRL）の形質転換を0.5〜2mlの酵母DNA調製物及び40μlのDH10B細胞により行う。細胞を、1.7kV、25μF及び400オームで電気パルスする。エレクトロポレーションに続いて、1mlのSOC（２％Bacto Tryptone（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース）を、４個のLB AMPプレート（LBブイヨン（Lennox）、1.8％のBacto 寒天（Difco）、100mg/Lのアンピシリン）上に250μlのアリコートでプレートする。
【００８１】
プレトロンビンのための正しい発現構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定し、プレトロンビン挿入体の存在を確め、そして種々のDNA配列がお互いに対して正しく結合されたことを確める。陽性クローンの挿入体を、配列分析にゆだねる。大規模プラスミドDNAを、Qiagen Maxiキット（Qiagen）を用いて、その製造業者の説明書に従って単離する。
【００８２】
例３．タンパク質フリーの懸濁−適合されたCHO細胞におけるプレトロンビンの発現
血清フリーの懸濁−適合されたCHO DG44細胞を、上記の２種のプラスミド、すなわちpZMP21−プレトロンビン及び対照プラスミドpZMP20−プレトロンビンにより、次の方法に従ってエレクトロポレートした。プラスミドを、PvuIによる消化により線状化し、酢酸ナトリウム及びエタノールにより沈殿せしめ、次に70％エタノールによりすすぎ、そして乾燥する。ペレットを、4mMのL−Glut、１％ヒポキサンチン/チミジン、１％ビタミン及び１％ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）により補充されたPFCHO培地に、エレクトロポレーション当たり200μg/100μlの濃度で再懸濁した。
【００８３】
対数増殖期で増殖する細胞をペレット化し、そしてエレクトロポレーション反応当たり５×106/800μlで再懸濁した。エレクトロポレーションを、4mmのキュベットにおいて、300V及び950μFdで、BioRad GenePulser II with Capacitance エキステンダー(BioRad, Hercules, CA)において行った。細胞を、125mlの振盪フラスコにおいて、上記培地25mlに懸濁し、そして37℃で80rpmkで24時間、細胞培養インキュベーターにおけるシェーカー上に置いた。次に、細胞をペレット化し、そして4mMのL-Glut, 1％ビタミン、１％ピルビン酸ナトリウムにより補充されたPFCHOから成る選択培地に2.5×105で再懸濁した。
【００８４】
培養物がヒポキサンチン/チミジン補充の不在下で増殖できるとすぐに、細胞系をさらに、１μMまでの上昇する濃度のメトトレキセートにおいて培養した。培養物が選択培地において活動的に増殖し、そして生存率が95％以上に高まるとすぐに、培養物を、タンパク質の収穫及び分析のために確立した。培養物を、振盪フラスコにおいて25mlで、５×105/mlで接種し、そして48時間、増殖し、次に収穫した。上清液を0.22μmのフィルターを通して濾過し、そしてELISAアッセイにより分析した。
【００８５】
ELISAアッセイを次の２種のポリクローナル抗体を用いて行った：捕獲抗体、ヒツジ抗−ヒトプレトロンビンフラグメント２（Accurate Chemical #20112AP）及び検出抗体、ヒツジ抗−ヒトプレトロンビン−HRP接合体（Accratc Chemical #20110HP）。被覆抗体を、0.1Mの炭酸ナトリウム（pH9.6）において、1μg/mlで希釈し、96ウェル中に分散し、そして4℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（PBS＋0.05％Tween）により５度すすぎ、そしてSuperBlock（Pierce, Rockford IL, #37515）と共に、200μl／ウェルで室温で５分間、２度インキュベートすることによりブロックした。
【００８６】
サンプル及び標準を、結合緩衝液（PBS, 0.05％ Tween, 1mg/mlのBSA）を含むプレートに適用し、そして37℃で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液において５度、洗浄し、そして検出抗体を結合緩衝液において2ng/mlに希釈した。検出抗体をウェルに適用し、そして37℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液により5度すすぎ、そして検出試薬OPDを適用した。
【００８７】
OPDを、製造業者の説明書（Pierce, Rockford, IL, #34006）に従って、使用の直前、過酸化水素を添加することにより調製し、その100μlを個々のウェルに添加し、RTで10分間、進行せしめ、そしてウェル当たり100μlの1NのH2SO4により停止した。プレートを492nmで読み取った。結果はSoftMaxProを通して計算された。CHO細胞プールによるプレトロンビンの生成速度を、細胞の平均数及び培養の日数によりプレトロンビン力価を割り算することにより計算した。それらの比較結果が図２において棒グラフで示されており、そしてpZMP21−プレトロンビンがpZMP20−プレトロンビン対照としての組換えタンパク質の量の約3.6倍、生成することを示す。
【００８８】
例４．zsig37発現ベクターの構成
zsig37をコードするポリヌクレオチドのすべて又は一部を含む発現プラスミドを、相同組換えにより構成する。zsig37挿入点を端に有するベクター配列に対応する5’及び3’末端でのフランキング領域と共に、配列番号16のヌクレオチド１〜ヌクレオチド873からのポリヌクレオチド配列を含む、zsig37 cDNAのフラグメントを、PCRを用いて単離する。PCRのためのプライマーはそれぞれ、5’末端から3’末端の方に、ベクターからの40bpのフランキング配列、及びzsig37の読み取り枠からのアミノ及びカルボキシル末端に対応する17bpを含む。
【００８９】
100μlのPCR反応物10μlを、分析のために、１×TBE緩衝液と共に0.8％LMPアガロースゲル（Seaplaque GTG）上に負荷する。残りの90μlのPCR反応物を、１MのNaCl 5μl及び無水エタノール250μlの添加により沈殿する。BglIIIにより切断されたプラスミドpZMP2O及びpZMP21（前の例に記載される）を、PCRフラグメントによる組換えのために使用する。
【００９０】
100μlのコンピテント酵母細胞（S. セレビシアエ）を、上記からの種々のDNA混合物10μlと共にそれぞれ組合し、そして0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移す。酵母/DNA混合物を、0.75kV（５hV/cm）、∞オーム、25μFで電気パルスする。個々のキュベットに、600μlの1.2Mソルビトールを添加し、そして酵母を、２つのURA−DRA-Dプレート上に２つの300μlのアリコートでプレートし、そして30℃でインキュベートする。約48時間後、単一のプレートからのUra＋酵母形質転換体を、1mlの水に再懸濁し、そして短時間、回転し、酵母細胞をペレット化する。
【００９１】
細胞ペレットを、1mlの溶解緩衝液（２％のTritonX−100、１％SDS、100mMのNaCl、10mMのトリス、pH8.0, 1mMのEDTA）に再懸濁する。500μlの溶解混合物を、300μlの酸洗浄されたビーズ及び200μlのフェノール−クロロホルムを含むEppendorf管に添加し、１分間隔で２又は3度、かき混ぜ、続いてEppendorf遠心分離機において最大速度で５分間、回転する。300μlの水性相を、新しい管に移し、そしてDNAを100μlのエタノール（EtOH）により沈殿し、続いて4℃で10分間、遠心分離する。DNAペレットを、10μlの水に再懸濁する。
【００９２】
エレクトロコンピテントE.コリ細胞（DH10B, GibcoBRL）の形質転換を0.5〜2mlの酵母DNA調製物及び40μlのDH10B細胞により行う。細胞を、1.7kV、25μF及び400オームで電気パルスする。エレクトロポレーションに続いて、1mlのSOC（２％Bacto Tryptone（Difco, Detroit, MI）、0.5％酵母抽出物（Difco）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース）を、４個のLB AMPプレート（LBブイヨン（Lennox）、1.8％のBacto 寒天（Difco）、100mg/Lのアンピシリン）上に250μlのアリコートでプレートする。
【００９３】
zsig37のための正しい発現構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定し、zsig37挿入体の存在を確め、そして種々のDNA配列がお互いに対して正しく結合されたことを確める。陽性クローンの挿入体を、配列分析にゆだねる。大規模プラスミドDNAを、Qiagen Maxiキット（Qiagen）を用いて、その製造業者の説明書に従って単離する。
【００９４】
例５．MPSV対CMV発現ベクターによりトランスフェクトされた細胞によるzsig37の生成の安定性の分析
血清フリーの懸濁−適合されたCHO DG44細胞を、上記のプラスミドにより、次の方法に従ってエレクトロポレートした。プラスミドを、PvuIによる消化により線状化し、酢酸ナトリウム及びエタノールにより沈殿せしめ、次に70％エタノールによりすすぎ、そして乾燥する。ペレットを、4mMのL−Glut、１％ヒポキサンチン/チミジン、１％ビタミン及び１％ピルビン酸ナトリウム（Invitrogen）により補充されたPFCHO培地に、エレクトロポレーション当たり200μg/100μlの濃度で再懸濁した。
【００９５】
対数増殖期で増殖する細胞をペレット化し、そしてエレクトロポレーション反応当たり５×106/800μlで再懸濁した。エレクトロポレーションを、4mmのキュベットにおいて、300V及び950μFdで、BioRad GenePulser II with Capacitance エキステンダー(BioRad, Hercules, CA)において行った。細胞を、125mlの振盪フラスコにおいて、上記培地25mlに懸濁し、そして37℃で80rpmkで24時間、細胞培養インキュベーターにおけるシェーカー上に置いた。次に、細胞をペレット化し、そして4mMのL-Glut, 1％ビタミン、１％ピルビン酸ナトリウムにより補充されたPFCHOから成る選択培地に2.5×105で再懸濁した。
【００９６】
培養物がヒポキサンチン/チミジン補充の不在下で増殖できるとすぐに、細胞系をさらに、１μMまでの上昇する濃度のメトトレキセートにおいて培養した。培養物が選択培地において活動的に増殖し、そして生存率が95％以上に高まるとすぐに、培養物を、タンパク質の収穫及び分析のために確立した。培養物を、３ヶ月にわたって継代培養し、そしてサンプルをELISAによる分析のために毎週、除去した。上清液を0.22μmのフィルターを通して濾過し、そしてELISAアッセイにより分析した。
【００９７】
ELISAアッセイを次の２種のポリクローナル抗体を用いて行った：捕獲抗体、ヒツジ抗−ヒトzsig37及び検出抗体、ヒツジ抗−ヒトzsig37−HRP接合体。被覆抗体を、0.1Mの炭酸ナトリウム（pH9.6）において、1μg/mlで希釈し、96ウェル中に分散し、そして4℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（PBS＋0.05％Tween）により５度すすぎ、そしてSuperBlock（Pierce, Rockford IL, #37515）と共に、200μl／ウェルで室温で５分間、２度インキュベートすることによりブロックした。サンプル及び標準を、結合緩衝液（PBS, 0.05％ Tween, 1mg/mlのBSA）を含むプレートに適用し、そして37℃で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液において５度、洗浄し、そして検出抗体を結合緩衝液において2ng/mlに希釈した。検出抗体をウェルに適用し、そして37℃で１時間インキュベートした。
【００９８】
プレートを洗浄緩衝液により5度すすぎ、そして検出試薬OPDを適用した。OPDを、製造業者の説明書（Pierce, Rockford, IL, #34006）に従って、使用の直前、過酸化水素を添加することにより調製し、その100μlを個々のウェルに添加し、RTで10分間、進行せしめ、そしてウェル当たり100μlの1NのH2SO4により停止した。プレートを492nmで読み取った。結果はSoftMaxProを通して計算された。CHO細胞プールによるzsig37の生成速度を、細胞の平均数及び培養の日数によりzsig37力価を割り算することにより計算した。時間の関数としての生産性のレベルを、比較のために２種の培養物について計算する。
前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために本明細書において記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、本発明のMPSV/CMVプロモーター/エンハンサーを含むプラスミド地図を示す。時計回りに、プラスミドは次のものを含む：CMVエンハンサー、負のシグナル配列を欠いているMPSV LTRプロモーター、コンセンサスIgイントロン、tPAプレ−プロリーダー、ポリオIRES、ΔCD8選択マーカー、ヒト成長ホルモン（hGH）ポリA配列、SV40プロモーター/エンハンサー及びSV40ポリAを有するジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）選択カセット、pUC ori, βラクタマーゼ選択、酵母CEN/ARS及びURA３選択。このベクターは、pZMP21と命名された。
【図２】図２は、pZMP20（CMVプロモーター/エンハンサー）又はpZMP21（MPSVプロモーター/CMVエンハンサー）によりトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞についての１日当たりのピコグラムでのプレトロンビン生成（pg/細胞−日）を比較する。
【図１】
2005535310.tif 000002
【図２】
2005535310.tif 000003
【配列表】
2005535310000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年6月28日(2005.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
ATCCに寄託されており、受託番号ATCC PTA-5266を有するベクターpZMP21。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
正しい構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定し、MPSVプロモーターの存在を確め、そして種々のDNA配列がお互いに対して正しく結合されたことを確める。陽性クローンの挿入体を、配列分析にゆだねる。大規模プラスミドDNAを、Qiagen Maxiキット（Qiagen）を用いて、その製造業者の説明書に従って単離する。pZMP21を、2003年6月17日に、the American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209で寄託し、そしてATCC PTA-5266として命名された。
【国際調査報告】
2005535310.tif 000004
2005535310.tif 000005