(57)【要約】本発明は、TNFα産生を増加することにより、少なくとも部分的に改善されうる状態の処置に適した化合物に関する。本発明はさらに、そのような状態の増加した危険性があるかまたはそのような状態に苦しんでいる個体を同定するためのアッセイ、および、TNFα生合成を増強する能力のための化合物スクリーニングの方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TTPのTNFαmRNAへの結合を阻害しおよび／または戻すことにより、TNFα産生を増強する能力のために化合物をスクリーニングする方法であって、
a)化合物を、レポーター遺伝子につながっている、TNFαmRNAを不安定化することが知られたAREフラグメントを包含するTNFαmRNAの3'非翻訳領域の一部を発現することができる発現構築物を含むセルフリー試料に、TTPの存在下、前記レポーター遺伝子が発現しうる条件下で接触させること、および
b)レポータータンパク質の発現レベルを決定し、前記レベルを前記化合物非存在下で得られた発現レベルと比較すること、および、
c)前記化合物非存在下で得られた発現レベルと比べて、レポータータンパク質の発現を増強する化合物を選択すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ：
a)化合物を、TNFα mRNAを含むセルフリー試料に、TTPの存在下、TNFαが発現しうる条件下で接触させること、および
b)TNFαの発現レベルを決定し、産生されたTNFαのレベルを前記化合物非存在下で得られたTNFαのレベルと比較すること、および、
c)前記化合物非存在下で得られた発現レベルと比べて、レポータータンパク質の発現を増強する化合物を選択すること、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ：
a)化合物を、TTPおよびTNFα、または、TNFαの代わりにレポーター遺伝子につながっている、TNFαmRNAを不安定化することが知られたAREフラグメントを包含するTNFαmRNAの3'非翻訳領域の一部を発現する細胞株に接触させること、および
b)TNFαまたはレポータータンパク質の発現レベルを決定し、前記レベルを前記化合物非存在下で得られた発現レベルと比較すること、および、
a)前記化合物非存在下で得られた発現レベルと比べて、TNFαの発現またはレポータータンパク質の発現を増強する化合物を選択すること、
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
個体における上昇したTTP濃度のインビトロでの検出方法であって、前記個体の生体試料中の前記TTPの存在をイムノアッセイにより検出することを含む、前記方法。
【請求項５】
ステップ：
a)個体から得られた生体試料を、抗体のTTPへの結合が起こりうる条件下で、抗TTP抗体に接触させること、
b)TTPの量を測定すること、
を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
個体における上昇したTTP mRNAレベルのインビトロでの検出方法であって、個体の生体試料中のTTP mRNAの存在をハイブリダイゼーションに基づくアッセイにより検出することを含む、前記方法。
【請求項７】
ステップ：
a)個体から得たRNAを含む生体試料を、TTPのmRNAとのハイブリダイゼーションが起きうる条件下で、TTPのmRNAに結合できる検出可能なTTPのcDNAまたはcRNA、あるいはこれらの断片と接触させること、
b)ノザンブロット、ドットブロット、RNAseプロテクションあるいは解析される試料由来の標的RNAへのTTP cDNAまたはcRNAのハイブリダイゼーションに依存する同様の方法などのハイブリダイゼーションに基づく方法によってTTP-mRNAの量を測定すること、
を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
個体が、TNFα産生を増加することにより少なくとも部分的に改善されうる状態への危険性があるかまたは前記状態に苦しんでいる、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
状態が、心臓病および／または心臓傷害である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
心臓病および／または心臓傷害が、血行力学的負荷、心筋再灌流傷害、肥大型心筋症、末期のうっ血性心不全、および／または虚血状態あるいは心筋梗塞または不安定狭心症などのこれらの結果である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
再灌流傷害の阻害のための治療を必要としている個体を同定するための、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
薬学的活性物質としての、抗TTP抗体またはその断片あるいはTTPのmRNAに相補的なcDNAもしくはcRNAまたはその断片。
【請求項１３】
請求項１２に記載の化合物の、TTPのTNFαmRNAへの結合を阻害しおよび／または戻すことにより、個体においてTNFα産生を誘導するかまたは増強する医薬の製造のための使用。
【請求項１４】
請求項１２に記載の化合物の、心臓病および／または心臓傷害の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項１５】
心臓病および／または心臓傷害が、血行力学的負荷、心筋再灌流傷害、肥大型心筋症、末期のうっ血性心不全、および／または虚血状態あるいは心筋梗塞または不安定狭心症などのこれらの結果である、医薬の製造のための請求項１４に記載の化合物の使用。
【請求項１６】
請求項１２に記載の化合物の、再灌流傷害の阻害のための医薬の製造のための使用。
【請求項１７】
少なくとも１つの請求項１２に記載の化合物および任意に薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬。
【請求項１８】
少なくとも抗TTP抗体を含む、請求項４または５の方法を行うのに適した診断キット。
【請求項１９】
少なくともcDNAまたはcRNAあるいはTTPのmRNAに結合できるこれらの断片を含む、請求項６または７の方法を行うのに適した診断キット。
【請求項２０】
TTP mRNAの定量のためのPCRに基づく方法への、TTP cDNA由来のプライマーの使用。
【請求項２１】
変化したTTP遺伝子発現を検出する診断ツールとしての、TTP cDNA由来のプライマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、TNFα産生を増加することにより、少なくとも部分的に改善されうる状態の処置に適した化合物に関する。本発明はさらに、そのような状態の増加した危険性があるかまたはそのような状態に苦しんでいる個体を同定するためのアッセイ、および、TNFα生合成を増強する能力に対する化合物スクリーニングの方法に関する。
【０００２】
発明の背景
TNFαは多くの細胞種から放出される強力なサイトカインである。TNFαはまた、細胞上で細胞膜に結合したより大きな分子量の形で存在し、この形はまた種々の生物学的効果を仲介するようである。TNFαは、正常な発達および生理機能においてほとんど役割を果たしていないと考えられいる；しかし、TNFαは、多くの病態では多くの組織において有害かつ破壊的な効果を与える(Tracey et al., Ann. Rev. Med 1994; 45: 491)。TNFαが主要な役割を果たすことが示されている病態には、敗血性ショック症候群、癌悪液質、関節リウマチなどが含まれる。
【０００３】
対照的に、いくつかの研究室からの実験的な研究は、成体の哺乳類の心臓は、あるストレス形成後にTNFαのmRNAを合成することを示している(Bader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994; 91: 11831; Giroir et al., J. Clin. Invest. 1992; 90: 693; Giroir et al., Am. J. Physiol. 1994; 267:H118.)。
【０００４】
TNFαが、限定されることはないが心筋梗塞(Mauri et al., J. Intern. Med. 1989; 225: 333; Basaran et al., Angiology.1993; 44: 332)、不安定狭心症(Matsumori et al., Br. Heart J. 1994; 72: 566)、血行力学的負荷(Kapadia et al., J. Clin. Invest. 1995; 96: 1042)、心筋再灌流傷害(Lefer et al., Science. 1990; 249: 61; Herskowitz et al., Am. J. Pathol. 1995 ; 146: 419)、肥大型心筋症 (Matsumori et al., Br. Heart. J. 1994 ; 72: 561)、および末期のうっ血性心不全(Levine et al., N. Engl. J. Med. 1990; 223: 236; Torre-Amione et al., Circulation. 1996; 93: 704)を含む、大小いずれの哺乳類においても実質的に全ての心臓傷害形成において発現しているという繰り返しなされた知見は、TNFαが、心臓において系統発生学的に保存された「生来のストレス反応遺伝子」として作用しうることを示唆している。
【０００５】
この点において、TNFαが成体の心臓組織における低酸素への抵抗性を与えているという知見は、傷害されたおよび／またはストレスを受けた心臓組織によるTNFα産生が、心臓内で隣接した細胞を保護するための局所的なオートクリン／パラクリン／ジャクスタクリンメカニズムとして働きうることを示唆している(Nakano et al., Circulation. 1998 ; 97: 1392)。
【０００６】
続いて再灌流が起きる短時間の冠状動脈閉塞が、後の他の致死的虚血状態から心臓を保護するということはよく知られている。しかし、この最初の保護段階は数時間で終わる。虚血開始から２４時間後、「保護の第２期」（SWOP)が起こり、これは数日持続しうるが、使用した種および実験条件に依存的である。閉塞／再灌流段階の他に、アデノシンやリポ多糖（LPS)のような物質もまたSWOPを引き起こすことが知られている。
【０００７】
その他の中で、iNOS（誘導型NO合成酵素）の発現は、SWOPの重要なメディエイターであると考えられている。iNOSはそれ自体が、例えばLPSによるSWOP誘導の後に発現するTNFαにより誘導される。TNFαの発現はSWOPの進行に必要なようである。したがって、TNFαのレベルの上昇は、限定されないが心臓病および／または心臓傷害および／または再灌流傷害の阻害を含む、TNFα産生の増加により少なくとも部分的に改善されうる状態における治療的使用に有用であるかもしれない。
【０００８】
それゆえ、上記状態に苦しんでいる個人におけるTNFαのレベルを増強する医薬、TNFαのレベルを増強する能力のための化合物スクリーニングの方法、およびそのような状態の増加した危険性があるかまたはそのような状態に苦しんでいる個体を同定し診断するための方法への必要性がある。
【０００９】
本発明は、TNFα産生の増加により、少なくとも部分的に改善されうる状態の治療への新しいアプローチに関する。このアプローチは、トリステトラプロリン（TTP)タンパク質、TTPのcDNAおよびcRNA、抗TTP抗体ならびにこれらの断片に関連する。
【００１０】
TTP(Lai et al, J.Biol. Chem. 1990; 265: 16556)は、Nup475 (DuBois et al, J. Biol. Chem. 1990; 265: 19185)およびTIS11 (Varnum et al, Oncogene 1989; 4: 119; Varnum et al, Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 1754)としても知られており、最初期応答遺伝子であるZfp-36 によりコードされている広く分布する33kDaのリンタンパク質である(Taylor et al, Nucl. Acids Res. 1991; 19: 3454)。この遺伝子はマウスのクロモソーム7に位置づけられ、それに相当するヒト遺伝子であるZFP36はクロモソーム19q 13.1 に位置づけられた(Taylor et al, Nucl. Acids Res. 1991; 19: 3454)。TTPは、CCCHクラスの2またはそれ以上の高度に保存された推定上のジンクフィンガーを含む一連のタンパク質の典型である(Varnum et al, Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 1754;Taylor et al, Nucleic Acids Res. 1991; 19: 3454;Gomperts et al, Oncogene. 1990; 5: 1081; Ma et al, Oncogene. 1994; 9: 3329)。さらに、このタンパク質はZn2+に結合することが示されており、マウス線維芽細胞において細胞の核に局在することから、転写因子であるかもしれないことが示唆されている(DuBois et al, J. Biol. Chem. 1990; 265: 19185)。静止期にある線維芽細胞への血清または他の分裂促進刺激はTTPの急速なセリンリン酸化および核から細胞質への移行を引き起こし(Taylor et al., J. Biol. Chem. 1995; 270: 13341)、この両者が細胞におけるその機能を調節しているようである。
【００１１】
最近、マクロファージでのTNFαの制御においてTTPが役割を果たしていることが示された(Carballo et al., Science 1998; 281: 2001)。TTPの発現はリポ多糖および TNFαにより誘導される。TTPは、TNFαmRNA分子の3'末端のAU-リッチエレメント（ARE)に結合することができ、それによりTNFαmRNAを不安定化する。
【００１２】
WO97/42820では、TTPの特性が敗血性ショック症候群、癌悪液質、関節リウマチなどのTNFαの過剰が関係する病気の治療に用いられている。TTPレベルを増加することによるかかる病気の治療方法が、TNFα産生を阻害する能力のための化合物の選択方法およびTNFα過剰の効果への増加した危険性がある個体の同定方法と同様に記載されている。 
【００１３】
WO 01/12213は、例えば、TNFαをコードするmRNA分子の分解を刺激する方法および顆粒球減少の治療のための顆粒球−マクロファージ刺激因子をコードするmRNA分子の分解を阻害する方法などの、AU-リッチエレメント（ARE)を含むmRNA分子の破壊を制御する方法を提供する。
【００１４】
心臓病および／または心臓傷害（これらに限定されない）を含む、TNFα産生を増加することにより少なくとも部分的に改善されうる状態への危険性があるかまたは状態に苦しんでいる個体におけるTTPの機能は、これまで知られていなかった。
【００１５】
発明の概要
本発明の目的は、TNFα産生を増加する能力のための化合物を選択するスクリーニングアッセイを提供することである。
【００１６】
本発明の目的はまた、心臓病および／または心臓傷害（これらに限定されない）を含む、TNFα産生を増加することにより少なくとも部分的に改善されうる状態への増加した危険性があるかまたは状態に苦しんでいる個体を同定するためのアッセイ、および／または再灌流傷害の阻害のための治療を必要としている個体を同定するためのアッセイを提供することである。
【００１７】
本発明の他の態様においては、配列由来のTTP cDNAは、TTP mRNAの定量のためのPCRに基づく方法に応用されるプライマーのデザインに用いられうる。生体試料中のTTP mRNAレベルの定量は、変化した遺伝子発現を検出するための診断ツールとして用いられうる。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、抗TTP抗体もしくはその断片、TTPmRNAにハイブリダイズできるTTPmRNAのcDNAもしくはcRNAならびにこれらの断片、あるいは上記および下記に記載したアッセイにより選択された他の化合物のように、TTPのTNFαmRNAへの結合を阻害しおよび／または戻すことによりTNFα産生を増加する能力を有する活性化合物およびこれらの化合物を含む医薬を提供することである。
【００１９】
また他の態様においては、本発明は、個体においてTNFα産生を誘導するかあるいは増加するための、TTPのTNFαmRNAへの結合を阻害しおよび／または戻すことができる前記活性化合物に関する。
【００２０】
また本発明の態様は、心臓病および／または心臓傷害（これらに限定されない）を含む、TNFα産生を増加することにより少なくとも部分的に改善されうる状態への増加した危険性があるかまたは状態に苦しんでいる個体を治療するための医薬、および／または再灌流傷害の阻害のための医薬を製造するための活性化合物の使用をも提供する。
【００２１】
本発明のさらなる目的および利用は、下記の記載から明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
RT-PCRによるイヌの心臓中のTTP mRNAの検出。
1.  8時間再灌流コントロール（偽手術）
2.  4時間再灌流コントロール（偽手術）
3.  16時間再灌流（手術）
4.  8時間再灌流（手術）
5.  4時間再灌流（手術）
示した試料から得たRNAをRT-PCR法に用いた。RNAは標準的な方法を用いて逆転写され、引き続いてプライマーとして本来のイヌTTP配列から設計された短いオリゴデオキシヌクレオチドを用いてPCRを行った。
発明の詳細な説明
【００２２】
本発明の目的は、トリステトラプロリン（TTP)タンパク質の発現が、冠状動脈の閉塞とそれに続く再灌流の後に、心臓組織において、時間依存的に上方制御される意外な発見に基づいて達成された（図1）。
【００２３】
上記で示したように、傷害されたおよび／またはストレスを受けた心臓組織によるTNFα産生は、心臓内で隣接した細胞を保護するための局所的なオートクリン／パラクリン／ジャクスタクリンメカニズムとして働きうる。したがって、心臓においてTNFα産生を制御するTTPの能力は薬学的に重要であると考えられる。
【００２４】
再灌流が引き続いて起こる冠状動脈の閉塞後に、心臓においてTTPが発現するという発見、ならびにヒトのアミノ酸配列 (Taylor et al, Nucl. Acids Res. 1991, 19 :3454)およびそれをコードする配列(例えば GenBank accession number M63625)が利用可能であることは、心臓病および／または心臓傷害（これらに限定されない）を含む、TNFα産生を増加することにより少なくとも部分的に改善されうる状態の阻害および／または治療、ならびに／あるいは再灌流傷害の阻害に用いることができる化合物をスクリーニングするためのアッセイ、および、そのような状態への増加した危険性があるかまたはそのような状態に苦しんでいる個体を同定および診断する方法の開発を可能にしている。
【００２５】
「心臓病および／または心臓傷害」とは、血行力学的負荷、心筋再灌流傷害、肥大型心筋症、末期のうっ血性心不全および／または虚血状態のような病気および／または傷害あるいは心筋梗塞または不安定狭心症のようなこれらの結果をいう。
【００２６】
本発明によるスクリーニングアッセイの1例においては、（SV40、CMVのような強力なプロモーターまたは誘導プロモーター(例えばtet on-off システム) の制御下で)全長のヒトTTP cDNAが、ネオマイシン、ゼオシン、ハイグロマイシンまたは他の物質などの組換え細胞の選択のための選択マーカーを有する、適当な真核生物の発現ベクターに挿入されている。この発現ベクターを、cDNAの発現のために、H9C2、COS-1、COS-7、HEK293、HEK293 EBNA、CHO、BHK、HeLa細胞または同様の細胞株に標準的な方法により導入し、抗生物質を加えることにより安定発現細胞株が選択される。このようにして、モノクローナルまたはポリクローナル細胞株が選択される。 
【００２７】
２番目のプラスミドは、SV40、CMVまたは同様のものなどのTNFα遺伝子につながっているプロモーターあるいはルシフェラーゼ、CAT、β-ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子、およびTNFαを不安定化することが知られているARE（AUリッチエレメント）フラグメントを含むTNFαmRNAの3'非翻訳領域(塩基1197から1350 GenBankアクセッション番号X02611)の一部を用いて構成されている。さらにこのベクターは、最初のベクターとは異なる選択マーカーを有する。トランスフェクションは当分野でよく知られた技術を用いて効果的になされる。
トランスフェクションおよび２番目のプラスミドの選択の後、細胞株はTTPの活性を阻害する物質を検出するために用いられる。
また、TTPを有するプラスミドおよびTNFα遺伝子またはレポーター遺伝子を有するプラスミドは、混ぜることができ、そして上記で述べたような細胞株に標準的な技術を用いて導入される。
【００２８】
そのような細胞株は、TTPのTNFαmRNAへの結合を阻害しおよび／または戻すことにより、TNFα産生を増強する能力のための化合物のスクリーニングのためのアッセイに用いられる。前記アッセイは下記ステップを含む：
a)化合物を、TTPおよびTNFα、または、TNFαの代わりに、レポーター遺伝子につながっている、TNFαmRNAを不安定化することが知られたAREフラグメントを含むTNFαmRNAの3'非翻訳領域の一部を発現する細胞株に接触させること、および
b)TNFαまたはレポータータンパク質の発現レベルを決定し、そのレベルを化合物非存在下で得られた発現レベルと比較すること、および、
c)TNFαの発現またはレポータータンパク質の発現を、化合物非存在下で得られた発現レベルと比べて、増強する化合物を選択すること。  
【００２９】
供試化合物を加え、24から72時間後にレポーター遺伝子の活性を、酵素活性リーダーまたは蛍光シグナル検出器を用いて、あるいは、TNFαを発現する細胞株の場合はTNFαに直接対する抗体または当分野でよく知られた技術を用いて測定する；観察された数値は、TTP活性の決定に用いられる。
TTP活性を増加する物質は、非処置のコントロール細胞と比べ、レポーター遺伝子のより高い活性により検出できる。
【００３０】
TNFαまたはレポーターmRNAの3'末端にあるAREへのTTPの結合を阻害しおよび／または戻す物質は、mRNAを不安定化し、そのような化合物非存在下よりもTNFαまたはレポータータンパク質のより高い産生をひきおこす。
【００３１】
本発明によるスクリーニングアッセイの他の例においては、アッセイは下記ステップを含む：
a)レポータータンパク質が発現しうる条件下において、TTP存在下、レポーター遺伝子につながっている、TNFαmRNAを不安定化することが知られたAREフラグメントを含むTNFαmRNAの3'非翻訳領域の一部を発現することができる発現構築物を含むセルフリー試料とスクリーニングする化合物を接触させること、および
b)レポータータンパク質の発現レベルを決定し、そのレベルを化合物非存在下で得られた発現レベルと比較すること、および、
c)化合物非存在下で得られた発現レベルと比べて、レポータータンパク質の発現を増強する化合物を選択すること。
【００３２】
本発明によるスクリーニングアッセイのさらなる例においては、アッセイは下記ステップを含む：
a)TNFαが発現しうる条件下において、TTP存在下、TNFαmRNAを含むセルフリー試料と前記化合物を接触させること、および
b)TNFαの発現レベルを決定し、産生されたTNFαレベルを前記化合物非存在下で得られたTNFα発現レベルと比較すること、および、
c)化合物非存在下で得られた発現レベルと比べて、レポータータンパク質の発現を増強する化合物を選択すること。
【００３３】
TTPの阻害活性を阻害しおよび／または戻す化合物は、標準的なプロトコールを用いて安定性、毒性などをさらにアッセイすることができる。
【００３４】
心臓病および／または心臓傷害（これらに限定されない）を含む、TNFα産生を増加することにより少なくとも部分的に改善されうる状態への増加した危険性があるかまたはそのような状態に苦しんでいる個体を同定および／または診断するための、あるいは、再灌流傷害の阻害のための治療を必要としている個体を同定するための、1つのアプローチにおいて、前記個体から得られた生体試料は、TTPまたはTTP mRNAの上昇した量の存在を調べられうる。
例えば、TTPの検出は、試料を抗TTP抗体に接触させ、TTPの量を測定することにより、効果的に行うことができる。
【００３５】
これらのアッセイは、いかなる数多くの方法によっても達成されうる。かかる方法は、限定されないが、いくつか挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインAイムノアッセイなどの、競合的および非競合的アッセイ系を包含するイムノアッセイを含む。
【００３６】
例えば、そのようなアッセイは下記ステップを含む方法により行われうる：
a)抗TTP抗体のTTPへの結合が起こりうる条件下で前記個体から得られた生体試料を抗TTP抗体に接触させること
b)ELISAまたは上記方法によりTTPの量を測定すること。
【００３７】
抗TTP抗体は、検出可能なラベルをさらに含む２次抗体により検出されうる。検出可能なラベルはオートラジオグラフィにより検出されるラジオアイソトープであってもよい。本発明のために特に有用なアイソトープは3H、125I、131I、35Sおよび14Cである。2次抗体は、蛍光化合物でラベルされていてもよい。蛍光ラベルされた抗体の存在は、適切な波長の光に免疫複合体を露光させ、その結果得られた蛍光を検出することにより決定される。蛍光ラベル化合物は、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒドおよびフルオレサミンを含む。
【００３８】
また、２次抗体は、化学発光化合物に結合することにより検出できるようにラベルされることもできる。化学発光標識免疫複合体の存在は、化学反応の過程の間に発生する発光の存在を検出することにより決定される。化学発光ラベル化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルを含む。
【００３９】
同様に、生物化学発光化合物も二次抗体をラベルするのに用いられうる。生物化学発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生体システム中で発見された一種の化学発光である。生物化学発光タンパク質の存在は、化学発光の存在を検出することにより決定される。ラベルに有用な生物化学発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンを含む。
【００４０】
また、２次抗体は、２次抗体を酵素に結合することにより検出できるようにラベルされることもできる。抗体-酵素複合体を適切な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分が、例えば、分光光度的、蛍光定量的または可視的方法により検出されうる化学的部分を産生する基質と反応する。多特異的免疫複合体を検出できるようにラベルするのに用いられうる酵素の例は、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリフォスファターゼを含む。
【００４１】
当業者は、本発明に用いられうる他の適したラベルを知ることができるであろう。抗体への標識部分の結合は、当分野で知られた標準的技術を用いて行われうる。これに関する典型的方法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 1976, 70 :1; Schurs et al., Clin. Chim. Acta 1977, 81 : 1; Shih et al., Intl J. Cancer 1990, 46 : 1101; Stein et al., Cancer Res. 1990, 50 : 1330 に述べられている。
【００４２】
抗体の産生に用いられるTTPまたはその断片は、大腸菌、バキュロウイルス、Cos細胞、Sf9細胞または標準的な文献(例えば Ausubel et al. (eds.): Current Protocols in Molecular Biology. JohnWiley & SonsInc., New York)に記載されている真核細胞などの一般的な発現系を用いて組み換え的に合成されうる。cDNAはまたHis(6)、GST、FLAGまたはタンパク質精製を助ける類似物などのタグにより修飾されうる。その後タンパク質／ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティーおよびサイズ排除カラムクロマトグラフィ）、遠心、異なる溶解性、電気泳動、またはタンパク質精製のためのいかなる標準的技術を含む標準的方法により精製されうる。
また、TTPは、上記当分野でよく知られた技術を用いて、天然の供給源から単離されうる。
【００４３】
アッセイに用いられる、組み換えTTPまたは天然の供給源から単離されたTTPへのポリクローナル抗体は、当業者によく知られた方法を用いて作製されうる(例えば Green et al.,"Production of Polyclonal Antisera, "in Immunochemical Protocols、 Manson, ed., pages 1-5, Humana Press 1992; Williams etal., In DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15, Oxford University Press 1995参照)。
【００４４】
TTPの免疫原性は、ミョウバン（水酸化アルミニウム）あるいはフロイド完全またはフロイド不完全アジュバントなどのアジュバントの使用により増加されうる。免疫に有用なポリペプチドは、またTTPの融合体免疫グロブリンポリペプチドまたはマルトース結合タンパク質を有するその一部などの融合ポリペプチドを含む。免疫原は全長分子またはその一部でもよい。ポリペプチド部分が「ハプテン様」である場合は、その部分は免疫のために巨大分子担体（キーホールリンペットヘモシアニン（KLH)、ウシ血清アルブミン（BSA）または破傷風トキソイドなど）に有利に接合または結合していてもよい。
【００４５】
ポリクローナル抗体は、一般的にウマ、ウシ、イヌ、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ヤギまたはヒツジなどの動物の中で作られるが、本発明の抗Zsig62抗体はまた類人猿の抗体由来であってもよい。ヒヒにおいて診断的および治療的に有用な抗体を作製するための一般的技術は、例えば、WO 91/11465およびLosman et al., Int. J. Cancer. 1990, 46 :310に記載されている。 
【００４６】
また、モノクローナル抗TTP抗体も作ることができる。特異的抗原に対するげっ歯類のモノクローナル抗体は、当業者に知られた方法により得ることができる(例えば、 Kohler et al., Nature 1975, 256 :495; Coligan et al. (eds.)、Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)、Picksley et al.,"Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E coli,"in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995)参照)。簡単には、モノクローナル抗体は、マウスにTTPを含む組成物を注入し、血清試料を取り出して抗体産生があることを確認し、B-リンパ球を得るために脾臓を摘出し、ハイブリドーマを作るためにミエローマ細胞にB-リンパ球を融合させ、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生している陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養から抗体を単離することにより得ることができる。例えば、本発明の抗TTP抗体は、ヒトモノクローナル抗体由来であってもよい。ヒトモノクローナル抗体は、抗原の導入に反応して特異的なヒトの抗体を産生するように改変されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術においては、ヒトの重および軽鎖の位置の部分を、内在性の重および軽鎖の位置が標的として破壊されている胚性幹細胞株由来の系統のマウスに導入する。前記トランスジェニックマウスは、ヒトの抗原に特異的なヒトの抗体を合成でき、かつ、前記マウスはヒトの抗体を分泌するハイブリドーマの産生に用いられうる。
【００４７】
トランスジェニックマウスからヒトの抗体を得る方法は、例えば、Green et al., Nature Genet. 1994, 7 :13; Lonberg et al., Nature 1994, 368 :856; Taylor et al., Int. Immun. 1994,6 : 579 に記載されている。
【００４８】
モノクローナル抗体は、種々のよく確立された技術によってハイブリドーマから単離され精製されうる。そのような単離技術は、プロテインAセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含む(例えば、Baines et al.,"Purification of Immunoglobulin G (IgG),"in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104(The Humana Press, Inc. 1992) 参照)。
【００４９】
心臓病および／または心臓傷害（これらに限定されない）を含む、TNFα産生を増加することにより少なくとも部分的に改善されうる状態への増加した危険性があるかまたはそのような状態に苦しんでいる個体を同定および診断するための、あるいは、再灌流傷害の阻害のための治療が必要な個体を同定するための、他のアプローチにおいては、前記個体から得られる生体試料は、TTP-mRNAの上昇した量の存在を調べられうる。
【００５０】
例えば、TTP mRNAの検出は下記のようになされうる：
a)前記個体から得たRNAを含む生体試料を、TTPのmRNAとのハイブリダイゼーションが起きうる条件下で、TTPのmRNAに結合できるTTPのcDNAまたはcRNA、あるいはこれらの断片と接触させること
b)ノザンブロット、ドットブロット、RNAseプロテクションあるいは解析される試料由来の標的RNAへのTTP cDNAまたはcRNAのハイブリダイゼーションに依存する同様の方法などのいかなるハイブリダイゼーションに基づく方法によってTTP-mRNAの量を測定すること。
【００５１】
本発明のさらなるアプローチにおいては、配列由来のTTP cDNAは、TTP mRNAの定量のためのいかなるPCRに基づく方法に適用されうるプライマーの設計に用いられうる。生体試料中のTTP mRNAレベルの定量は、変化した遺伝子発現を検出するための診断ツールとして用いられうる。
【００５２】
本発明によれば、「cDNA」または「cRNA」とは、逆転写酵素によりmRNAテンプレートからつくられる一本鎖DNAまたはRNA分子をいう。典型的には、mRNAの一部に相補的なプライマーは、逆転写の開始に用いられる。
上記条件は、指針となるように作られており、これらの条件をそれぞれのアッセイに用いるために適合させることは当業者の能力の範囲内である。
【００５３】
冠状動脈閉塞および引き続く再灌流の後に心臓組織においてTTPの発現が上方制御されているという発見は、特に心臓病および／または心臓傷害の処置のための治療、ならびに／あるいは再灌流傷害のための治療の基礎を提供している。
例えば、個体は抗TTP抗体、好ましくはヒト化された抗体またはTNFαへのTTP結合を阻害してそれによりTNFαの産生を増加するTTPに対する抗体断片を処置されてもよい。
【００５４】
本発明の意味において「抗体断片」という言葉は、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fabおよびそれと同様のものなどの抗体の一部をいう。構造に関係なく、抗体断片は、完全な抗体により認識される同じ抗原に結合する。前記言葉はまた、軽鎖可変領域を含むポリペプチド、重および軽鎖の可変領域を含む「Fv」断片、重および軽鎖の可変領域がペプチドリンカーにより結合されている組み換え一本鎖ポリペプチド分子（「scFvたんぱく」）および超可変領域を模倣したアミノ酸残基を含む最小認識単位などの特異的な抗原に結合する合成または遺伝子的に改変されたポリペプチドを含む。
【００５５】
「ヒト化された抗体」という言葉は、モノクローナル抗体の相補性決定領域が、マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変領域に移し換えられている組み換えタンパク質をいう。
前記抗体は、上記記載のように産生されうる。それぞれの使用には、抗TTP抗体の断片を作製することが望ましい。前記抗体断片は、例えば、タンパク質質の加水分解により得ることができる。抗体断片は、従来の方法による抗体全体のペプシンまたはパパイン切断により得ることができる。説明としては、抗体断片は、F(ab')2で示される5S断片を与える、ペプシンによる抗体の酵素的切断により産生されうる。この断片は、さらに、3.5S Fab' １価断片を産生するチオール還元剤を用いて、切断することができる。任意には、切断反応は、ジスルフィド結合の切断に起因するスルフヒドリル基のための保護基を用いて行われうる。別の方法として、ペプシンを用いた酵素的切断で２つの１価Fab断片およびFc断片を直接産生する。これらの方法は、例えば、米国特許第4,331, 647号明細書, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 1960, 89 :230; Porter, Biochem. J. 1959, 73 :119; Edelman et al., in Methods in Enzymology Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967)に記載されている。１価の軽-重鎖断片を形成する重鎖の分離、さらなる断片の切断、あるいは他の酵素的、化学的、または遺伝学的技術などの抗体を切断する他の方法は、断片が完全な抗体により認識される抗原に結合する限りにおいて、用いられる。
【００５６】
例えば、Fv断片はVHおよびVL鎖の結合を含む。この結合は、非共有であってよく、Inbar et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 1972, 69 : 2659に記載されている。また、可変鎖は分子間のジスルフィド結合により結合し、またはグルタルアルデヒドなどの試薬により架橋されうる(例えばSandhu, Crit. Rev. Biotech. 1992, 12 : 437参照)。
【００５７】
Fv断片は、ペプチドリンカーにより結合されたVHおよびVL鎖を含んでもよい。これら一本鎖抗原結合タンパク質(scFv)は、オリゴヌクレオチドにより結合されたVHおよびVL領域をコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することにより作製される。構造遺伝子は、大腸菌などの宿主細胞に引き続き導入される発現ベクターに挿入される。組み換え宿主細胞は、２つのV領域を架橋するリンカーペプチドを伴った一本鎖ポリペプチドを合成する。scFvを産生する方法は、例えば、Bird et al., Science 1988, 242 :423; 米国特許第 4,946,778号明細書; Pack et al., Biol. Technology 1993,11 : 1271に記載されている。
【００５８】
抗体断片の他の形は、１つの相補性決定領域（CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド（「最小認識単位」）は、興味のある抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することにより得られる。そのような遺伝子は、例えば、抗体産生細胞のmRNAから可変領
域を合成するポリメラーゼ連鎖反応を用いるなどして、作製することができる(例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2 :106(1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, "in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press 1995、およびWard et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,"in Monoclonal Antibodies: Principlesand Applications, Birch et al., (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc. 1995参照)。
【００５９】
また、抗TTP抗体はヒト化された抗体由来であってもよい。ヒト化されたモノクローナル抗体は、マウスの相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変領域に移し換えることにより産生される。ヒトの抗体の典型的残基は、その後、マウスの相当する部分の構造領域に置換される。ヒト化されたモノクローナル抗体由来の抗体部分の使用は、マウスの普遍領域の免疫原性に関連した潜在的問題を未然に防ぐ。マウス免疫グロブリン可変領域をクローニングする一般的な技術は、例えば、Orlandi et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 1989, 86: 3833に記載されている。ヒト化されたモノクローナル抗体の産生のための技術は、例えば、Jones et al., Nature 1986, 321 :522; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89 :4285; Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 1992, 12 :437; Singer et al., J. Immun. 1993, 150 : 2844および米国特許第5,693,762号明細書に記載されている。
【００６０】
他の治療法は、TTPのcDNAまたはcRNA配列あるいはこれらの一部の使用である。RNAまたはDNA部分への保護末端基および自然発生的修飾は、数日以上有効な分子とすることができるさらなる安定性を与える。そのような修飾されたDNAまたはRNA部分は、ATUGEN, Berlin, Germanyから市販されている。
そのような修飾されたDNAまたはRNA部分は、TTP mRNAとのハイブリダイゼーションのためおよびTTP産生の抑制のために用いられうる。
【００６１】
核酸の細胞への送達は種々のメカニズムを介しうる。核酸は、DNAを細胞に導入するのを助けるいかなる試薬と組み合わせて存在してもよい。水、PBSなどを含む、様々な滅菌された溶液が、前記組成物の投与に用いられうる。DNAの濃度は、治療の用量を提供するのに十分なものであろう。
上記に記載されたようなcDNA、cRNA、抗体またはこれらの断片の実際の送達は、直接注入、肺および他の上皮表面への投与、静注ならびに他の物理的方法を含む様々な技術により行われうる。
【００６２】
本発明による適切な導入方法の例は、標的細胞に直接導入できる当分野の標準的な方法により開発された他のリポソームと同様に、Lipofectine、Lipofectaminee(GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, MD)、Superfecto(Qiagen, Inc. Hilden, Germany)およびTransfectarno (Promega Biotec, Inc., Madison, WI)などの市販されているリポソーム製品または脂質混合物を用いたリポソームあるいは脂質混合物中でのcDNAまたはcRNAの物理的導入である。一度細胞に入ると、TTP mRNAに相補的なcDNAまたはcRNAは、TTP mRNAに結合し、TNFα産生の増加を起こすTTPの翻訳を阻害する。そのような脂質混合物は、また、ATUGEN, Berlin, Germanyから市販されている。リポソームを介したDNA導入は、様々な研究者により述べられてきた(Liu et al, Gene Therapy 1994, 1 :7; Miller and Vile, FASEB J. 1995, 9 :190)。
【００６３】
哺乳類の細胞に核酸を導入する正確な方法は、もちろん上記の方法に限定されない。他の技術は、受容体を介したおよび他のエンドサイトーシスメカニズムなどの使用を含むこの方法に幅広く利用できる。本発明は、これらのいずれかまたは他の一般的に用いられる導入方法とともに用いられうる。
【００６４】
核酸および本発明の核酸の送達媒体は、対象にインビボ(in vivo)で投与するための薬学的に許容される担体中に含まれうる。生物学的でなくまたはそうでなければ好ましくない物質、すなわち、前記物質は、核酸または媒体とともに、いかなる望ましくない生物学的効果を引き起こすことまたはそれが含まれる薬学的組成物の他の一部のいずれにも有害に相互作用することなく、対象に投与されうることが、「薬学的に許容される」により意味される。前記担体は、当業者によく知られたように、活性成分のいかなる分解をも最小にするためおよび対象におけるいかなる副作用をも最小にするために、必然的に選択される。
【００６５】
核酸または媒体は、経口、非経口（例えば静注）、筋注、腹腔内投与、経皮、体外、局所または同様の方法により投与される。必要な核酸または媒体の正確な量は、対象の種、齢、重量、および一般的状態、治療される疾患の重症度またはメカニズム、用いられる個々の核酸または媒体、その投与方法などに依存して、対象により変わるであろう。
上記のアッセイにより選択された化合物、抗TTP抗体およびこれらの断片は、経口、非経口（例えば静注）、筋注、腹腔内投与、経皮、体外、局所または同様の方法により投与される。 
【００６６】
目的とする投与方法に依存して、本発明の化合物は、例えば、タブレット、坐剤、錠剤、カプセル、粉剤、液剤、懸濁液、ローション、クリーム、ゲルなどの個体、半個体または液体の剤型の形で薬学的組成物中に存在することができる。前記組成物は、上記のように、薬学的に許容される担体と組み合わせて、選択された組成物の効果的な量を含み、かつ、他の薬剤、医薬製剤、担体、アジュバント、希釈剤などを含んでもよい。本発明の化合物の非経口投与は、用いる場合には、一般的には注射により特徴づけられる。注入物質は、溶液または懸濁液のいずれかとして、注射前の懸濁液に適した個体、あるいはエマルジョンとして、従来の形で調製されうる。ここでいう「非経口」は、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、気管内を含む。より最近の修正された経口投与のアプローチは、継続的用量が維持される徐放あるいは持続放出システムの使用を含む。例えば、参考文献として組み込まれている米国特許第3,610,79号明細書参照。これらの化合物は、適切なアジュバントをも含みうる、薬学的に許容される担体中に存在しうる。生物学的でなくまたはそうでなければ好ましくない物質、すなわち、前記物質は、選択された化合物とともに、物質的に有害な生物学的効果を引き起こすことまたはそれが含まれる薬学的組成物の他の一部のいずれにも有害に相互作用することなく、個体に投与されうることが、「薬学的に許容される」により意味される。
【００６７】
本発明による投与量単位は、１日に要求される本発明による化合物の量または、望ましい投与量に用意されたこれらの数倍量を含みうる。最適な治療許容投与量および患者（ヒトを含む哺乳類）への投与量率は、用いた特異的な活性化合物の活性、齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与の時間および経路、クリアランス率、治療の目的、すなわち、治療または予防、および当業者に知られている治療されるべき病気の性質、などの種々の要因に依存する。
【００６８】
したがって、組成物および組み合わせにおいて、治療される患者（インビボ）に対する、本発明の活性化合物の薬学的効果的１日投与量は、約０．０１〜１００mg/kg体重であり、好ましくは約０．１〜１０mg/kg体重である。本出願によれば、１回の投与量は活性化合物０．０１〜１０mgを含む。
実施例
【００６９】
麻酔下開胸されたイヌにおいて、虚血前処置の保護の第２期を調べた。イヌは左心室圧および大動脈圧の測定のために装置につないだ。イヌは、左前下行枝冠状動脈の冠状動脈閉塞を５分行い、前壁を還流し引き続いて４時間、８時間または１６時間のいずれか再灌流した。２番目のイヌ群（コントロール群）は、冠状動脈閉塞を行わなかった。実験プロトコールにしたがって、前壁およびコントロールの後壁の中心から心臓組織の貫壁部分を取り出し、すぐに凍結させた。閉塞後引き続いて異なる時間再灌流したイヌの心臓において上方制御されたmRNAを同定するため、これらの心臓から得たRNAについてRDA（representational difference analysis)を行った。前記方法は、１番目のしばしば処置された組織（「試料」という）のほうが2番目の組織（ドライバーという）より多い量が存在するmRNAを同定するように設計されている。
【００７０】
急速凍結した左心室筋から得たRNAは、標準的なグアニジンチオシアネート抽出を用い、引き続き塩化セシウム勾配遠心により抽出した(Pharmacia, LKB, Freiburg, Germany)。poly(A)-RNAは、製造者の使用説明書に従い磁性ビーズに結合したoligo-d(T)を用いて単離した(DYNABEADS, Dynal, Norway)。個体の遺伝子発現の変化を調べるため、３つの心不全でないコントロールの心臓（ドライバー）および３つの心不全の心臓（試料）から得たmRNAを、とりおきした試料と同様に比較した。逆転写(cDNA synthesis system, Gibco)の後、二重らせんcDNAをDpnIIで切断し、リンカーにつなげて、増幅させ、少し修飾(Frohme et al. (2000): Ann N Y Acad Sci., 910, 85-104)してRDA(Hubank, M. and Schatz, D.G.(1994): Nucleic Acids Res., 22, 5640- 5648)に用いた。3回ハイブリダイゼーションを行い、大腸菌DH5αでpBluescript II-SK+にクローニングされた異なる産物２および３となった。クローンライブラリーの挿入部分は、ゲルによる分析で標準的PCRにより増幅した。塩基配列の決定は自動シークエンサー(Applied Biosystems, USA)により標準的方法で行われた。BLASTXおよびBLASTN解析は、同定された配列の、DNAおよびタンパク質の相同性をスクリーニングするのに用いた。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】RT-PCRによるイヌの心臓中のTTP mRNAの検出を示す。
【図１】
2005512579.tif 000002
【国際調査報告】
2005512579.tif 000003
2005512579.tif 000004