(57)【要約】本発明は、マイナス鎖の天然で非分節型のウイルス（ボルナウイルス科、フィロウイルス科、およびパラミクソウイルス科が挙げられる）に由来し、かつ適用可能な組換えＲＮＡウイルステンプレートおよびこのような組換えＲＮＡウイルステンプレートを産生する方法に関し、ここで、このテンプレートは、２個以上の組換えＲＮＡ分子から産生される。本発明は、適切な宿主細胞系において異種遺伝子産物を発現し、そして／またはこの科からの組換えウイルスを構築し、発現し、パッケージングし、そして／または異種遺伝子産物を提示するための、天然で非分節型のＲＮＡウイルスのための分節型組換えＲＮＡウイルステンプレートの使用に関する。本発明は、発現産物、ならびにこのように産生された組換えウイルスおよびキメラウイルス、ならびに組換えＲＮＡウイルスを含有するワクチンおよび治療処方物を、包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイナス鎖非分節型ウイルスのためのマイナス鎖ＲＮＡウイルスを産生するための方法であって、該方法は、宿主細胞を、以下：
（ａ）２個以上の組換えＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列であって、該組換えＲＮＡ分子は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ならびにウイルス媒介性の複製および転写に必要なシグナルを含み、かつ該宿主細胞において該ウイルスのゲノムｖＲＮＡまたは対応するｃＲＮＡを発現可能である、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｂ）該ウイルスの核タンパク質およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼを発現可能である、発現ベクターまたは発現ベクターのセット、  
によってトランスフェクトする工程、ならびに
培養物から該ウイルスを回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
マイナス鎖非分節型ウイルスのためのキメラマイナス鎖ＲＮＡウイルスを産生するための方法であって、該方法は、宿主細胞を、以下：
（ａ）２個以上の組換えＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列であって、該組換えＲＮＡ分子は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ならびにウイルス媒介性の複製に必要なシグナルおよびウイルス媒介性の転写に必要なシグナルを含み、かつ該宿主細胞において該ウイルスのゲノムｖＲＮＡまたは対応するｃＲＮＡおよび１つ以上の異種ＲＮＡ配列を発現可能である、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｂ）該ウイルスの核タンパク質およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼを発現可能である、発現ベクターまたは発現ベクターのセット、  
によってトランスフェクトする工程、ならびに
培養物から該キメラウイルスを回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
２個以上の分節型組換えＲＮＡ分子のセットであって、天然で非分節型ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼに特異的な結合部位、ならびに該ウイルス媒介性の複製および転写に必要なシグナルを含み、該分節型組換えＲＮＡ分子は、ＲＮＡ配列に作動可能に連結しており、かつ該ＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位を集合的にコードし、ここで、各分節型組換えＲＮＡ分子が、該ＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位のサブセットをコードする、ＲＮＡ分子のセット。
【請求項４】
２個以上の分節型組換えＲＮＡ分子のセットであって、天然で非分節型ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼに特異的な結合部位、ならびに該ウイルス媒介性の複製および転写に必要なシグナルを含み、該分節型組換えＲＮＡ分子は、ＲＮＡ配列に作動可能に連結しており、かつ該ＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位を集合的にコードし、ここで、各分節型組換えＲＮＡ分子が、該ＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位のサブセットをコードし、そしてここで、該組換えＲＮＡ分子のうちの１つ以上は、異種ＲＮＡ配列に作動可能に連結した該ＲＮＡウイルスの機能的転写単位をコードする、ＲＮＡ分子のセット。
【請求項５】
２個以上の分節型組換えＲＮＡ分子のセットであって、天然で非分節型ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼに特異的な結合部位、ならびに該ウイルス媒介性の複製および転写に必要なシグナルを含み、該分節型組換えＲＮＡ分子は、ＲＮＡ配列に作動可能に連結しており、かつ該ＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位を集合的にコードし、ここで、各分節型組換えＲＮＡ分子が、該ＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位のサブセットをコードし、そしてここで、該組換えＲＮＡ分子のうちの１つ以上は、変異、挿入または欠失を含む、ＲＮＡ分子のセット。
【請求項６】
前記異種ＲＮＡが、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物抗原、腫瘍抗原、オンコジーンもしくは改変オンコジーン、リガンドもしくはレセプター結合タンパク質、治療タンパク質、増殖因子、または免疫調節分子からなる群から選択される異種ポリペプチドをコードする、請求項４に記載の組換えＲＮＡ分子のセット。
【請求項７】
前記ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項６に記載の組換えＲＮＡ分子のセット。
【請求項８】
請求項３、請求項４または請求項５に記載の組換えＲＮＡ分子のセットを含むマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含む、組換えウイルスまたはキメラウイルス。
【請求項９】
請求項８に記載のキメラウイルスであって、前記異種ＲＮＡは、ウイルス抗原、腫瘍抗原、細菌抗原、寄生生物抗原、オンコジーンもしくは改変オンコジーン、リガンドもしくはレセプター結合タンパク質、治療タンパク質、増殖因子または免疫調節分子に由来する、キメラウイルス。
【請求項１０】
請求項９に記載のキメラウイルスであって、前記ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、キメラウイルス。
【請求項１１】
分節型ゲノムを有する、天然で非分節型のマイナス鎖ＲＮＡウイルスの組換えウイルスを産生するための方法であって、該方法は、宿主細胞を、請求項３または請求項５の組換えＲＮＡ分子のセットをコードするヌクレオチド配列および複製または転写に必要なウイルス機能をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトする工程、および培養物から該組換えウイルスを回収する工程を、包含する方法。
【請求項１２】
天然で非分節型のマイナス鎖ＲＮＡのキメラウイルス組換えウイルスを産生するための方法であって、該方法は、宿主細胞を、請求項４または請求項５の組換えＲＮＡ分子のセットをコードするヌクレオチド配列および複製または転写に必要なウイルス機能をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトする工程、ならびに培養物から該キメラウイルスを回収する工程を、包含する方法。
【請求項１３】
１つ以上の異種エピトープをコードする、請求項１２に記載の方法によって産生される組換えキメラマイナス鎖ウイルス、および薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルを含有する、ワクチン処方物。
【請求項１４】
前記異種エピトープが、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生生物抗原、または腫瘍抗原である、請求項１３に記載のワクチン処方物。
【請求項１５】
前記ウイルス抗原が、ヒト免疫不全ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する、請求項１４に記載のワクチン処方物。
【請求項１６】
前記異種エピトープが、免疫増強タンパク質である、請求項１３に記載のワクチン処方物。
【請求項１７】
前記異種エピトープが、腫瘍抗原である、請求項１３に記載のワクチン処方物。
【請求項１８】
異種ポリペプチドをコードする、請求項１２に記載の方法によって産生される組換えキメラマイナス鎖ウイルス、および薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルを含有する、治療処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、天然で非分節型のマイナス鎖ウイルスに由来してこのウイルスに適用可能な組換えＲＮＡウイルステンプレート（ボルナウイルス科、フィロウイルス科、およびパラミクソウイルス科が挙げられる）およびこのような組換えＲＮＡウイルステンプレートを産生する方法に関し、ここで、このテンプレートは、２個以上の組換えＲＮＡ分子から産生される。この組換えＲＮＡウイルステンプレートは、適切な宿主細胞系において異種遺伝子産物を発現するためおよび／またはこの科から得て発現し、パッケージングし、そして／または異種遺伝子産物を提示する組換えウイルスを構築するために使用され得る。このように調製された発現産物およびキメラウイルスは、ワクチン処方において、有利に使用され得る。本発明はまた、弱毒化原型または増強された免疫原性のような、組換えウイルスをワクチンおよび治療処方物における使用のために適切にする改変および／または変異を含む、対応する遺伝操作された組換えウイルスにも関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の記載）
多くのＤＮＡウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなど）が、宿主細胞系における異種タンパク質の発現を導くために、遺伝子操作されている。同様の進歩が、プラス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、ポリオウイルス）を用いてなされている。これらの構築物の発現産物（すなわち、異種遺伝子産物または異種遺伝子産物を発現するキメラウイルス）が、ワクチン処方物（サブユニットウイルスワクチンまたはウイルス全体のワクチンのどちらか）において、潜在的に有用であると考えられる。ワクチンにおいて使用するための組換えウイルスまたはキメラウイルスを構築する際のワクシニアウイルスのようなウイルスの使用の１つの欠点は、主要なエピトープの変化を欠くことである。ウイルス株におけるこの可変性の欠如は、複数のワクチン接種がその株に対する宿主耐性を引き起こし、従って、接種したウイルスは、宿主に感染し得ないという点で、それゆえキメラワクシニアの繰り返し使用に対して厳しい限定を設ける。キメラウイルスでの耐性個体の接種は、効率的な免疫刺激を誘導しない。
【０００３】
対照的に、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、ワクチンにおいて使用するためのキメラウイルスの構築のための、魅力的な候補である。マイナス鎖ＲＮＡウイルスは望ましい。何故なら、幾つかのマイナス鎖ウイルス（例えばインフルエンザウイルス）の遺伝的可変性または複数の血清型は、耐性を発達させる危険なしに免疫を刺激する、ワクチン処方物のレパートリーの構築を許容するからである。感染性組換えマイナス鎖ＲＮＡ粒子または感染性キメラマイナス鎖ＲＮＡ粒子の構築は、インフルエンザウイルスを用いて達成された（Ｐａｌｅｓｅらに対する米国特許第５，１６６，  ０５７号、本明細書中でその全体が参考として援用される）。さらに、ヒトに感染し得るが、天然のヒト病原体ではないウイルスの使用は、ヒトにおける既存の免疫の欠如ゆえに、魅力的である。天然のヒト病原体ではないがヒトに感染し得るマイナス鎖ＲＮＡウイルスの例としては、例えば、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ウシＲＳウイルス（ＲＳＶ）およびトリニューモウイルスが、挙げられる。
【０００４】
（非分節型ウイルス）
ネガティブ−センスゲノムのエンベロープに包まれた一本鎖ＲＮＡを含むウイルス科は、非分節型ゲノムを有する群（パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、ボルナウイルス科およびフィロウイルス科）または分節型ゲノムを有する群（オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科およびアレナウイルス科）に分類される。本明細書中で以下に詳細に記載され、実施例において使用されるパラミクソウイルス科としては、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５、麻疹ウイルスおよびムンプスウイルスのウイルスが挙げられる。ラブドウイルス科としては、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のウイルスが挙げられる。以下の議論は、限定ではなく例示として、パラミクソウイルス科の特定のメンバーに焦点を当てる。
【０００５】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、モノネガウイルス目のパラミクソウイルス科のルブラウイルス属に属するマイナス鎖ＲＮＡウイルスである。このウイルスは、トリ病原体であり、そして幾つかのＮＤＶ株は、単離され、鳥類におけるビルレンスの異なったレベルによって、特徴付けられている。ＮＤＶのビルレント（速現性）の株は、家禽において、非常に病原性の高い疾患を引き起こす。しかし、ＮＤＶの無発病（亜病原性およびレントジェニック）の株は、穏やかな感染または無症候性の感染を引き起こし、これらは現在、家禽においてニューカッスル病に対する生ワクチンとして使用されている。ヒトは、通常ＮＤＶの宿主ではないが、このウイルスはヒトに投与され、安全であることが見出されている（Ｅｍｍｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｔ．（１９９４）Ｉｎ  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＲＧ，Ｇｒａｎｏｆｆ  Ａ（編），Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｌｏｒｅｎｃｅ  ＲＭら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：６０１７−６０２１）。
【０００６】
パラミクソウイルス科の代表的なメンバーであるニューカッスル病ウイルスは、直鎖の一本鎖非分節型ネガティブセンスＲＮＡゲノムを含む、エンベロープウイルスである。ＮＤＶゲノムの分子構成は、他のパラミクソウイルス科ウイルスおよびラブドウイルス科ウイルスの構成と類似である。このゲノムＲＮＡは、３’−ＮＰ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’の順で遺伝子を含む。このゲノムＲＮＡはまた、３’末端において、リーダー配列も、含む。このゲノムの末端の配列は、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの転写および複製に関する。さらに、遺伝子間の連結は、遺伝子末端、ポリアデニル化シグナルおよび遺伝子開始シグナルを含む。
【０００７】
ビリオンの構造的エレメントは、細胞原形質膜に由来する脂質二重層であるウイルスエンベロープを含む。糖タンパク質である赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＨＮ）は、エンベロープから突出し、ウイルスが赤血球凝集素活性およびノイラミニダーゼ活性の両方を含むことを許容する。融合糖タンパク質（Ｆ）（これもまた、ウイルス膜と相互作用する）は、まず不活性な前駆体として産生され、次いで、翻訳後に切断されて２つのジスルフィド連結ポリペプチドを産生する。活性なＦタンパク質は、ウイルスエンベロープと宿主細胞原形質膜との融合を容易にすることによる、ＮＤＶの宿主細胞への穿通に関連する。マトリックスタンパク質（Ｍ）は、ウイルスのアセンブリに関連し、ウイルス膜およびヌクレオカプシドタンパク質の両方と相互作用する。
【０００８】
ヌクレオカプシドの主要なタンパク質サブユニットは、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）であり、このヌクレオカプシドタンパク質は、螺旋対称性をカプシドに付与する。ヌクレオカプシドに関連するタンパク質は、Ｐタンパク質およびＬタンパク質である。リン酸化の対象であるリンタンパク質（Ｐ）は、転写において制御の役割を果たすと考えられている。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＬ遺伝子は、Ｐタンパク質と共に、ウイルスＲＮＡ合成に必要である。このウイルスゲノムのコード容量のほぼ半分を占めるＬタンパク質は、最大のウイルスタンパク質であり、転写および複製の両方において重要な役割を果たす。
【０００９】
全てのマイナス鎖ＲＮＡウイルス（ＮＤＶを含む）の複製は、ＲＮＡを複製するために必要な細胞性機構の不在によって、複雑にされる。さらに、マイナス鎖ゲノムは、直接タンパク質へ翻訳され得ず、まずプラス鎖（ｍＲＮＡ）コピーへと転写されなければならない。従って、宿主細胞への侵入の際には、ゲノムＲＮＡ単独では、必要なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを合成し得ない。Ｌタンパク質、Ｐタンパク質およびＮＰタンパク質は、感染の際に、ゲノムと共に細胞に侵入しなければならない。
【００１０】
ＮＤＶ  ｍＲＮＡを転写するウイルスタンパク質のほとんどまたは全てが、その複製もまた行うという仮説が立てられる。タンパク質の同じ相補体の代替の使用（すなわち、転写または複製）を制御する機構は、明らかには同定されていないが、１つ以上の遊離型のヌクレオカプシドタンパク質（特に、ＮＰ）の量に関連すると考えられる。ウイルス穿通の直後、転写は、ヌクレオカプシドにおいて、テンプレートとしてマイナス−センスＲＮＡを使用するＬタンパク質によって開始される。ウイルスＲＮＡ合成は、転写の間、モノシストロン性ｍＲＮＡを産生するように制御される。
【００１１】
転写後、ウイルスゲノム複製は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスによる感染において、第２の不可欠な事象である。他のマイナス鎖ＲＮＡウイルスと同様に、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）におけるウイルスゲノム複製は、ウイルスによって指定されるタンパク質によって媒介される。複製的ＲＮＡ合成の第１産物は、ＮＤＶゲノムＲＮＡの相補的コピー（すなわち、正の極性）（ｃＲＮＡ）である。これらのプラス鎖コピー（アンチゲノム）は、その末端の構造において、プラス鎖ｍＲＮＡ転写物と異なる。ｍＲＮＡ転写物と違い、アンチゲノムｃＲＮＡは、５’端においてキャップ化もメチル化もされず、そして３’末端で切断もポリアデニル化もされない。ｃＲＮＡは、そのマイナス鎖テンプレートと末端を共有し、そして各々のゲノムＲＮＡセグメントにおいて、全ての遺伝子情報を相補的形態で含む。ｃＲＮＡは、ＮＤＶマイナス鎖ウイルスゲノム（ｖＲＮＡ）の合成のためのテンプレートとして作用する。
【００１２】
ＮＤＶマイナス鎖ゲノム（ｖＲＮＡ）およびアンチゲノム（ｃＲＮＡ）は両方とも、ヌクレオカプシドタンパク質によって、カプシドに包まれる；カプシドに包まれない唯一のＲＮＡ種は、ウイルスｍＲＮＡである。ＮＤＶについて、細胞質は、単に転写の部位であると共に、ウイルスＲＮＡ複製の部位にある。ウイルス成分のアセンブリは、宿主細胞原形質膜において起こると考えられ、そして成熟ウイルスは、出芽によって放出される。
【００１３】
（マイナス鎖ＲＮＡウイルスの操作）
組換えＤＮＡまたはクローン化ＤＮＡからのＮＤＶゲノムの遺伝的操作を可能にする逆遺伝学系は、記載されている（Ｐｅｅｔｅｒｓ  ＢＰら（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：５００１−５００９；Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ  Ａら（１９９９）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：２９８７−２９９５；Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｓら（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７８：１６８−１８２；Ｎａｋａｙａ  Ｔら（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１１８６８−１１８７３）。以下を含む、他の非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスのための組換え系もまた、記載されている：狂犬病ウイルス（Ｓｃｈｎｅｌｌ  ＭＪ  ら（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：４１９５−４２０３）、ＶＳＶ（Ｌａｗｓｏｎ  ＮＤら（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１；Ｗｈｅｌａｎ  ＳＰら（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９２：８３８８−８３９２）、麻疹ウイルス（Ｒａｄｅｃｋｅ  Ｆら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：５７７３−５７８４）、感染性ヒトＲＳウイルス（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＰＬら（１９９５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）９２：１１５６３−１１５６７）、センダイウイルス（Ｇａｒｃｉｎ  Ｄら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：６０８７−６０９４；Ｋａｔｏ  Ａら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９）、牛疫ウイルス（Ｂａｒｏｎ  ＭＤおよびＢａｒｒｅｔｔ  Ｔ．（１９９７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：１２６５−１２７１）、パラインフルエンザウイルス（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＭＡ，およびＢａｎｅｒｊｅｅ  ＡＫ．（１９９７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：４２７２−４２７７；Ｄｕｒｂｉｎ  ＡＰら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２）およびパラミクソウイルスＳＶ５（Ｈｅ  Ｂら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９７；２３７：２４９−２６０）。これらの全ての系において、非分節型ゲノムの必要なウイルスタンパク質（ＮＰ、Ｐ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ）が、単一のプラスミドまたは単一のＲＮＡ分子上の組換え核酸からコードされ、このようにしてウイルスゲノムの構成を模倣する。さらに、ウイルス性のＮＰタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質は、同時トランスフェクトされたプラスミドから発現されたか、または同時発現された異種ＲＮＡポリメラーゼもしくはヘルパーウイルスによってそれらの機能が提供された。
【００１４】
組換え系はまた、分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスについて開発されており、この分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスとしては、特にインフルエンザＡウイルスが挙げられるが、これは、このウイルスの複雑な分節型の性質およびウイルス成分発現による、最初の組換え体発現への挑戦を提供している（Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：９３４５−９３５０；Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｅら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６１０８−６１１３；Ｆｏｄｏｒ，Ｅ．ら（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：９６７９−９６８２）。これらの場合において、分節型ゲノムの必要なウイルスタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＨＡ、ＮＡ、およびＮＳ）は、それぞれ別個のプラスミドか、またはＲＮＡにコードされる１つ以上のウイルスタンパク質を発現する複数のプラスミドによって、コードされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、天然で非分節型のマイナス鎖ウイルス由来であってこのウイルスに適用可能な組換えＲＮＡウイルステンプレートおよびこのような組換えＲＮＡウイルステンプレートを産生する方法に関し、ここで、このテンプレートは、２個以上の組換えＲＮＡ分子から産生される。従って、本発明の方法は、マイナス鎖天然非分節型ＲＮＡウイルスゲノムの非分節型の基本的な性質を変化または改変させ、分節型ゲノムを含む組換えＲＮＡウイルスのレスキューを可能にする、複数のゲノムセグメントを作製することに基づく。次いで、本発明の方法は、単一のウイルス非分節型リボ核タンパク質に代わって複数のウイルスリボ核タンパク質から、必要なウイルスタンパク質を発現することを容易にし、このことによって達成される。
【００１６】
本発明の組換えＲＮＡウイルステンプレートは、キメラ組換えＲＮＡウイルステンプレートを含み、ここで、キメラウイルステンプレートは、異種遺伝子産物を適切な宿主細胞系において発現させるために使用されるか、そして／または異種遺伝子産物を、発現し、パッケージングし、および／もしくは提示する、組換えウイルスを構築するために、使用される。このようにして調製される発現産物およびキメラウイルスは、ワクチンおよび治療処方物において、有利に使用され得る。
【００１７】
本発明はまた、対応する遺伝子操作された組換えウイルスにも関し、ここで、天然の非分節型ウイルスは、分節型ゲノムを含むように操作される。本発明の、組換え的に分節型されたウイルスは、例えばウイルスのビルレンスを変え得るような分節型により、改変されたかまたは弱毒化された表現型を保有し得る。本発明はさらに、ウイルスをワクチン処方物における使用のために適切にする、改変および／または変異（例えば、弱毒化原型または免疫原性の増強）を含む、遺伝子操作された組換えウイルスに関する。
【００１８】
本発明は、モノネガウイルス目に適用可能な組換えマイナス鎖ウイルステンプレートを提供し、これらとしては、パラミクソウイルス科、ボルナウイルス科、フィロウイルス科なおかつラブドウイルス科が、挙げられ得る。
【００１９】
パラミクソウイルス科の例として、組換えニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ウイルスＲＮＡテンプレートが記載され、ここで、ＮＤＶの６個の転写単位（ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ）が、２つ以上のセグメントに分割され、従って、組換え天然非分節型ＮＤＶウイルスが、２つ以上のＲＮＡセグメントまたは組換えＲＮＡ分子を含んで、産生される。
【００２０】
本発明は、天然で非分節型のマイナス鎖ウイルスのための、マイナス鎖ＲＮＡウイルスを産生するための方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）２個以上の組換えＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列であって、この組換えＲＮＡ分子は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ならびにウイルス媒介性の複製および転写に必要であって、かつこの宿主細胞内でこのウイルスのゲノムｖＲＮＡまたは対応するｃＲＮＡにおける発現を可能にするシグナルを含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｂ）このウイルスの核タンパク質およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼが発現可能である、発現ベクターまたは発現ベクターのセット、  
によって宿主細胞をトランスフェクトする工程、および培養物からウイルスを回収する工程を、包含する。
【００２１】
組換えマイナス鎖天然非分節型ＲＮＡウイルスからの組換えマイナス鎖ウイルスＲＮＡテンプレートが記載され、これは、異種遺伝子産物を適切な宿主細胞において発現するために使用され得るか、そして／または異種遺伝子をウイルス粒子においてレスキューするために使用され得る。１つの実施形態において、本発明は、パラミクソウイルス科またはラブドウイルス科の組換えマイナス鎖ウイルスに関し、これらとしては、ニューカッスル病ウイルス、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、狂犬病ウイルス、ＲＳウイルス、麻疹ウイルス、およびマンプスウイルスが挙げられ、これらは、１つ以上の異種遺伝子を発現するために使用され得、これらの異種遺伝子としては、例えば、異種ウイルス遺伝子、細菌遺伝子、寄生生物、他の病原体の遺伝子、癌抗原、オンコジーンもしくは改変オンコジーン、リガンドをコードする遺伝子、治療タンパク質の遺伝子、および増殖因子の遺伝子または免疫調節分子の遺伝子が、挙げられる。発現され得る異種遺伝子の例としては、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の遺伝子もしくは抗原、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の遺伝子もしくは抗原、ＲＳＶの遺伝子もしくは抗原、パラインフルエンザウイルス遺伝子、麻疹ウイルスの遺伝子もしくは抗原、マラリアの遺伝子もしくは抗原、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の遺伝子もしくは抗原、および結核菌（ＴＢ）が、挙げられる。
【００２２】
本発明は、天然で非分節型のマイナス鎖ウイルスのためのキメラマイナス鎖ＲＮＡウイルスを産生する方法を提供し、この方法は、以下：
（ａ）２個以上の組換えＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列であって、この組換えＲＮＡ分子は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼの結合部位、ならびにウイルス媒介性の複製および転写に必要であって、かつこの宿主細胞内でこのウイルスのゲノムｖＲＮＡまたは対応するｃＲＮＡの発現を可能にするシグナル、ならびに１つ以上の異種ＲＮＡ配列を含む、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｂ）このウイルスの核タンパク質およびＲＮＡ依存性ポリメラーゼが発現可能である、発現ベクターまたは発現ベクターのセット、  
によって宿主細胞をトランスフェクトする工程、および培養物からキメラウイルスを回収する工程を、包含する。
【００２３】
本発明は、ゲノムが分節型された組換え天然で非分節型のマイナス鎖ウイルスに関し、これらのウイルスとしては、組換えウイルスをワクチンの処方における使用のためにより適切にする表現型（例えば、弱毒化表現型または免疫原性の増強）を生じる改変を含む、パラミクソウイルス科およびラブドウイルス科のウイルスが挙げられる。本発明は、組換えマイナス鎖ウイルスに関し、組換えマイナス鎖ウイルスとしては、組換えウイルスをワクチンの処方における使用のためにより適切にする表現型（例えば、弱毒化表現型または免疫原性の増強）を生じる改変を含む、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、マンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス５が、挙げられる。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、組換え天然非分節型マイナス鎖ウイルスおよび２つ以上の組換えセグメントまたはウイルス核タンパク質からのウイルスベクターの操作に関し、これらは、以下に挙げられるがこれらに限定されない異種遺伝子をさらに含む：他のウイルスの遺伝子、病原体、細胞性遺伝子、腫瘍抗原、治療タンパク質、リガンドまたはレセプター結合分子、免疫調節分子、など。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、ワクチンとしての使用のため組換え天然非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスおよびのウイルスベクターの操作に関する。本発明は、ヒトへの投与および獣医学的使用のために適切なワクチン処方物に関する。本発明のワクチンは、以下への投与のために設計され得る：ネコおよびイヌを含む家庭内動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）；キツネおよびタヌキを含む野生動物；ウマ、ウシ、ヒツジ、シチメンチョウおよびニワトリを含む家畜（ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ）および家禽。
【００２６】
なお別の実施形態において、本発明は、組換え天然非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスベクター、および変異ウイルス遺伝子をコードするかまたはマイナス鎖ＲＮＡウイルスの異なった株由来の遺伝子の組み合わせをコードするために操作された、２つ以上の組換えセグメントまたはウイルス核タンパク質からのウイルスに関する。
【００２７】
本発明は、従って、２個以上の分節型組換えＲＮＡ分子のセットであって、天然で非分節型ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼに特異的な結合部位、ならびにこのウイルス媒介性の複製および転写に必要なシグナルを含み、この分節型組換えＲＮＡ分子は、ＲＮＡ配列に作動可能に連結しており、かつこのＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位を集合的にコードし、ここで、各分節型組換えＲＮＡ分子が、このＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位のサブセットをコードする。
【００２８】
なおさらに、本発明は、２個以上の分節型組換えＲＮＡ分子のセットに及び、このセットは、天然で非分節型ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼに特異的な結合部位、ならびにこのウイルス媒介性の複製および転写に必須のシグナルを含み、この分節型ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ配列に作動可能に連結し、かつこのＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位を集合的にコードし、ここで、各分節型組換えＲＮＡ分子が、このＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位のサブセットをコードし、そしてここで、１つ以上のこの組換えＲＮＡ分子が、異種ＲＮＡ配列に作動可能に連結したこのＲＮＡウイルスの機能的転写単位をコードする。より具体的には、上記異種ＲＮＡは、ウイルス抗原、腫瘍抗原または治療タンパク質をコードし得る。このようなウイルス抗原は、以下からなる群から選択されるウイルスに由来し得る：ヒト免役不全ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルス。
【００２９】
本発明のさらなる実施形態は、本発明は、２個以上の分節型組換えＲＮＡ分子のセットに及び、このセットは、天然で非分節型ＲＮＡウイルスのＲＮＡポリメラーゼに特異的な結合部位、ならびにこのウイルス媒介性の複製および転写に必要なシグナルを含み、ＲＮＡ配列に作動可能に連結し、かつこのＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位を集合的にコードし、ここで、各ＲＮＡ分子が、このＲＮＡウイルスの必要な機能的転写単位のサブセットをコードし、そしてここで、１つ以上のこの組換えＲＮＡ分子は、変異、挿入、または欠失を含む。
【００３０】
上述の組換え分子のいずれかは、キメラウイルスとして調製され得る。さらに、このようなキメラウイルスにおける異種ＲＮＡは、ウイルス抗原に由来し得、そしてこのウイルス抗原は、次に、以下からなる群から選択されるウイルスに由来し得る：ヒト免疫不全ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルス。
【００３１】
本発明は、キメラ天然非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスを産生するための方法に及び、この方法は、上述の組換えＲＮＡ分子のセットならびに複製および転写のために必須であるウイルス機能をコードするヌクレオチド配列で宿主細胞をトランスフェクトする工程、ならびにこのように産生されたキメラウイルスを回収する工程を、包含する。
【００３２】
本発明はまた、本方法により産生された、組換え的に分節型されたゲノムを有する天然非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルス組換え体および薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルを、含有するワクチン処方物にも及ぶ。本発明は、本方法によって産生された、異種エピトープをコードする組換えキメラマイナス鎖ウイルスおよび薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルを含有するワクチン処方物を、提供する。このワクチン処方物は、病原体抗原または癌抗原を含む異種エピトープを用いて調製され得る。この病原体抗原または癌抗原としては、細菌抗原、寄生生物抗原、およびオンコジーンまたは改変オンコジーンが挙げられるが、これらに限定はされない。このワクチン処方物は、ウイルス抗原を含む異種エピトープを用いて調製され得、そしてウイルス抗原は、以下の群から選択されるウイルスに由来し得る：ヒト免疫不全ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、マレック病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性滑液包炎ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、トリインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ネコジステンパーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、牛疫ウイルス、および豚痘ウイルス。さらに、異種エピトープは、免疫促進タンパク質または腫瘍抗原であり得る。本発明は、本発明によって産生された組換え的に分節型されたゲノムを有する天然非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルス組換え体および薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルを、含有する治療処方物にさらに及ぶ。本発明は、本方法によって産生された、異種ポリペプチドをコードする組換えキメラマイナス鎖ウイルスおよび薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルを含有する治療処方物を、提供する。この治療処方物は、オンコジーンまたは改変オンコジーン、リガンド結合タンパク質またはレセプター結合タンパク質をコードする遺伝子、治療タンパク質の遺伝子、および増殖因子の遺伝子または免疫調節分子の遺伝子を含む、異種ポリペプチドを用いて調製され得る。
【００３３】
２シストロン性ｍＲＮＡは、ウイルス配列の内因性の転写開始を許容し、そして通常の末端開始部位から、または外来性タンパク質コード配列の発現もしくはその逆を、可能にさせるように構築され得る。あるいは、外来性のタンパク質は、内因性の転写単位から発現され得、この転写単位は、開始部位およびポリアデニル化部位を有する。別の実施形態において、外来性の遺伝子は、生じるタンパク質が融合タンパク質であるように、ウイルス遺伝子に挿入される。
【００３４】
本発明の組換え変異体マイナス鎖ウイルスＲＮＡテンプレートは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを発現し、補完を可能にする形質転換細胞株をトランスフェクトするために使用され得る。あるいは、適切なプロモーターから発現するプラスミドが、ウイルス特異的（キメラ）ＲＮＡトランスフェクションのために使用され得る。補完はまた、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供するヘルパーウイルスを使用することによっても達成され得る。
【００３５】
さらに、非分節型マイナス鎖ウイルスのための非ウイルス依存性複製系もまた、記載される。非分節型マイナス鎖ウイルスタンパク質の、このウイルスの特異的複製および発現のために必要とされる最小のサブセットは、３種のタンパク質（Ｌ、ＰおよびＮＰ）であり、これらは、プラスミド（例えば、ワクシニアウイルスＴ７系）から発現され得る。なお別の実施形態において、このマイナス鎖ウイルスゲノムのアンチセンス性ゲノムをコードするプラスミドが使用されてそのゲノムを提供する場合、このウイルスの特異的複製および発現のために必要とされるニューカッスル病ウイルスタンパク質の最小のサブセットは、Ｌタンパク質およびＰタンパク質である。
【００３６】
得られた発現産物および／または組換えビリオンもしくはキメラビリオンは、ワクチンの処方において、有利に利用され得る。本発明の発現産物およびキメラビリオンは、広範な範囲の病原体（ウイルス抗原、腫瘍抗原、および自己免疫に関わる自己抗原を含む）に対するワクチンを作製するように操作され得る。特定の実施形態かつ例証として、本発明のキメラウイルスは、抗ＨＩＶワクチンを作製するために操作され得、ここで、ｇｐ１６０および／またはＨＩＶの内因性タンパク質からの免疫原性ポリペプチドは、マイナス鎖ウイルスタンパク質（例えば、糖タンパク質であるＨＮタンパク質）へと操作され、脊椎動物体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を誘発し得るワクチンを構築し得る。この目的のための組換えニューカッスル病ウイルスの使用は、ニューカッスル病ウイルスがヒトにおいて病原性でないため、特に魅力的である。さらに、ニューカッスル病ウイルスおよび種々の他のマイナス鎖ウイルス（ＶＳＶ、トリＲＳＶ  およびウシＲＳＶが挙げられるが、これらに限定されない）は、ヒトの通常の病原体ではないため、ヒトは、これらのウイルスに対し、既存の抗体を有さずそして有意の反応を誘発し得、ワクチン処方物におけるこれらのウイルスを使用するワクチン接種の際に、抗原に対して未経験である。さらに、例えばニューカッスル病ウイルス組換え体の、腫瘍抗原の送達のための使用は、特に魅力的であり、ウイルスの公知の抗新生物特性および免疫強化特性を付与される。
【００３７】
本発明の系および方法は、その利点の中で、複数のゲノムセグメント使用が、より速い速度およびより高い効率性で進むので、ウイルス複製およびウイルス転写が、高い確率で効率的に達成されるという格別の利点を有する。また、複数のゲノムセグメントの使用は、挿入および外来性挿入物のパッケージングにおけるより高い許容度を与え、そして後の発現を強化し、なおさらに、分節型からもたらされる、対応する弱毒化の増加における、さらなる安全性の尺度を確認する。最後に、この系は、その特徴および利点の１つとして、組換えウイルスは、単一の粒子として調製され得、集められ得る。このことは、補完の必要を避け、そして生じた組換えウイルスの使用における、対応する有効性を得る。
【００３８】
（定義）
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、示した意味を有する：
ｃＲＮＡ  ＝  アンチゲノムＲＮＡ  
ＨＩＶ  ＝  ヒト免疫不全ウイルス  
Ｌ  ＝  高分子タンパク質
Ｍ  ＝  マトリックスタンパク質（エンベロープの内側の系統）  
ｍｏｉ  ＝  感染の多重度
ＮＡ  ＝  ノイラミニダーゼ（エンベロープ糖タンパク質）  
ＮＤＶ  ＝  ニューカッスル病ウイルス  
ＮＰ  ＝  核タンパク質（ＲＮＡと結合し、ポリメラーゼ活性に必須である）  
ＮＳ  ＝  非構造タンパク質（機能未知）  
ｎｔ  ＝  ヌクレオチド  
ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２  ＝  ＲＮＡ指親和性ＲＮＡポリメラーゼ成分  
ＲＮＰ  ＝  リボ核タンパク質  
ｒＲＮＰ  ＝  組換えＲＮＰ  
ｖＲＮＡ  ＝  ゲノムウイルスＲＮＡ
（発明の詳細な説明）
本発明は、遺伝子操作されたマイナス鎖非分節型ＲＮＡウイルスおよび１つ以上の生物学的に活性名ウイルスリボ核タンパク質（ＲＮＰ）から産生されるウイルスベクターに関する。本発明は、マイナス鎖ＲＮＡウイルスおよび２つ以上の組換えＲＮＡ分子または組換えセグメントから、本発明の方法を使用して産生される天然非分節型ＲＮＡウイルスのためのウイルステンプレートに関する。
【００３９】
本発明は、マイナス鎖ウイルス組換え体、および異種遺伝子もしくは変異同種マイナス鎖ウイルス遺伝子またはマイナス鎖ＲＮＡウイルスの異なった株由来のウイルス遺伝子の組み合わせを発現するウイルステンプレートに、関する。本発明は、分節されたマイナス鎖ウイルスＲＮＡ組換え体のテンプレートまたは分子の構築物または使用に関し、これらのテンプレートまたは分子は、ウイルスＲＮＡ指親和性ＲＮＡポリメラーゼとともに使用されて、適切な宿主細胞中で異種遺伝子産物を発現し得、そして／または、ウイルス粒子中で異種遺伝子をレスキューし得る。本発明の１つの実施形態において、異種遺伝子産物は、ヒト免疫不全ウイルスのゲノムに由来するペプチドまたはタンパク質である。本発明のＲＮＡテンプレートは、適切かつ効率的なポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージのＴ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼおよびＳＰ６ポリメラーゼのようなＤＮＡ指親和性ＲＮＡポリメラーゼ、またはポリメラーゼＩのような適切な真核生物ポリメラーゼが挙げられる）を使用した適切なＤＮＡ配列の転写によって、インビトロまたはインビボのどちらかにおいて調製され得る。当業者は、本発明に従うＲＮＡ分子またはＲＮＡテンプレートの調製における使用のために適当または効率的なこれらのポリメラーゼを、容易に評価または決定し得る。
【００４０】
組換えＲＮＡテンプレートまたは組換えＲＮＡ分子は、ＲＮＡ指親和性ＲＮＡポリメラーゼタンパク質を発現して補完を許容する、連続的にトランスフェクトされた細胞株を、トランスフェクトするために使用され得る。好ましい実施形態において、非ウイルス依存的複製系は、キメラマイナス鎖ウイルスを回収するために使用され、ここで、セグメントマイナス鎖ゲノムまたはアンチゲノム（１個、２個もしくはそれより多いセグメント）をコードするプラスミドＤＮＡは、ウイルスの特定の複製および発現に必須のマイナス鎖ウイルスタンパク質の最小のサブセットをコードするプラスミドＤＮＡと共発現し、本明細書中で記載する実施例によって実証される。
【００４１】
マイナス鎖ウイルスをインビボで組換え的に再構築する能力は、外来遺伝子を発現するか、または変異ウイルス遺伝子を発現する、新規のキメラマイナス鎖ウイルスの設計を許容する。マイナス鎖ウイルスをインビボで組換え的に再構築する能力はまた、異なった株または特定のマイナス鎖ウイルスの改変体由来の遺伝子を発現する新規のキメラウイルスの設計も、許容する。この目標を達成するための１つの方法は、存在するウイルス遺伝子を改変することを含む。例えば、ＨＮ遺伝子は、その外部ドメインに、外来性の配列を含むように改変され得る。異種配列が、病原体のエピトープまたは抗原である場合、これらのキメラウイルスは、決定因子由来のこれらの疾患因子に対する防御免疫応答を誘導するために使用され得る。
【００４２】
本発明の１つの実施形態に従い、２つ以上のＲＮＡセグメントまたは２つ以上のＲＮＰが産生され、これらのうちの１つが、キメラＲＮＡを含み、この中で、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ｇｐ１６０コード領域）に由来するコード配列が、マイナス鎖ＲＮＡウイルスＮＤＶのＨＮコード配列内に挿入され、そしてキメラ組換えウイルスは、このキメラＲＮＡセグメントが他のウイルスＲＮＡセグメント、ならびに必須のウイルス核タンパク質（Ｎ）およびＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＬおよびＰ）を発現するＴ７応答性プラスミドと共に、Ｔ７ポリメラーゼを発現する宿主細胞内にトランスフェクションされることによって、産生される。さらに、このようなキメラウイルスは、脊椎動物体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を誘導し得るべきである。
【００４３】
本発明は、新規のキメラマイナス鎖ウイルスの設計にさらに関連し、このウイルスは、例えば、ヒト細胞の認識および複製許容性感染のためにレセプター結合タンパク質の発現によってか、または例えば、特定の細胞、細胞型、または組織の認識、これらに対する結合、もしくはそれらの感染のために親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を変更することによって、親和性を変更または増強した。マイナス鎖ウイルスをインビボで組換え的に再構築する能力はまた、改変された親和性、特異的な親和性または増強された親和性を有する新規のキメラウイルスの設計も、許容する。この目的を達成するための１つの方法は、存在するウイルス遺伝子を改変することを含む。例えば、レセプター結合タンパク質は、ヒト細胞を認識するためまたはこれに結合するため、あるいはより効果的または効率的にこれらを行うために、改変され得る。例えば、ＮＤＶの場合、ＨＮ赤血球凝集素タンパク質（これはレセプター結合タンパク質である）が、ヒト細胞がより効果的またはより効率的に認識されそして感染されるように、改変されるかまたは置換され得る。他の天然非分節型マイナス鎖ウイルスのレセプター結合タンパク質は、同様に改変されるかまたは置換され得、これらとしては、例えば、麻疹ウイルスにおけるＨタンパク質、ＶＳＶ、ＲＳＶまたはラブドウイルスにおけるＧタンパク質、およびＲＳＶにおけるＦタンパク質が、挙げられる。さらなる実施形態において、このウイルスは、改変され得るか、または特定の組織または標的特異的細胞に対しウイルスをより選択的にする異種遺伝子を発現し得る。例えば、マイナス鎖ウイルスの癌細胞への標的化において、マイナス鎖ウイルスは、レセプタータンパク質または癌細胞上に発現される表面タンパク質（例えば、Ｆｃレセプター）を認識するかまたはこれに結合するように操作され得る。
【００４４】
本発明は、本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスの、広範な範囲のウイルスおよび／または抗原（腫瘍抗原を含む）に対するワクチンを処方するための使用に関する。本発明のウイルスベクターおよびキメラウイルスは、体液性免疫応答、細胞性免疫応答または抗原に対する耐性を刺激することにより、被験体の免疫系を調節するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、被験体は、以下を意味する：ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、トリ種およびげっ歯類。腫瘍抗原を送達する場合、本発明は、拒絶反応媒介性の免疫を受けやすい疾患（例えば、非固形腫瘍または小さいサイズの固形腫瘍）を有する被験体を処置するために、使用され得る。本明細書中で記載されるウイルスベクターおよびキメラウイルスによる腫瘍抗原の送達もまた企図される。この送達は有用であり、その結果、大型の固形腫瘍を除去する。本発明はまた、癌を有することが疑われる被験体を処置するために使用され得る。
【００４５】
（組換え異種ＲＮＡテンプレートの構築）
本発明のウイルスポリメラーゼ結合部位／プロモーターの補体（例えば、３’−ＮＤＶウイルス末端の補体）、または３’−  ＮＤＶ末端および５’−ＮＤＶ末端によって隣接される配列をコードする異種遺伝子は、当該分野で公知の技術を用いて構築され得る。生じたＲＮＡテンプレートは、ネガィブ極性であり得、そしてウイルスＲＮＡ合成装置がこのテンプレートを認識し得るような、適切な末端配列を含む。あるいは、ウイルスＲＮＡ合成装置がこのテンプレートを認識し得るような適切な末端配列を含むプラス極性ＲＮＡテンプレートもまた、使用され得る。これらのハイブリッド配列を含む組換えＤＮＡ分子は、クローン化され得、そしてＤＮＡ指親和性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、バクテリオファージのＴ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼおよびＳＰ６ポリメラーゼ、またはポリメラーゼＩのような真核生物ポリメラーゼなど）によって転写され、ウイルスポリメラーゼの認識および活性を許容する適切なウイルス配列を保有する組換えＲＮＡ分子をインビトロまたはインビボで産生し得る。
【００４６】
なお別の実施形態において、実質的に任意の異種配列（１つ以上の異種配列を含む）が、本発明のキメラウイルス内に構築され得る。異種配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：例えば、１）病原体の特性である抗原；２）自己免疫疾患の特性である抗原；３）アレルゲンの特性である抗原；４）腫瘍の特性である抗原。例えば、本発明のキメラウイルス内に操作された異種遺伝子配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定はされない：ｇｐ１６０のようなヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のエピトープ；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；肝炎ウイルスの糖タンパク質（例えば、ｇＤ、ｇＥ）；ポリオウイルスのＶＰ１；および非ウイルス性病原体（例えば、細菌およびほんの数例しか命名されていない寄生生物）の抗原性決定因子。
【００４７】
自己免疫疾患特性である抗原は、代表的には、哺乳動物組織の、細胞表面、細胞質、核、ミトコンドリアなどに由来し、これらの抗原は、糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、悪性貧血、アジソン病、強皮症、自己免疫性萎縮性胃炎、若年性糖尿病、および円板状エリテマトーデスの特徴のある高原を含む。
【００４８】
アレルゲンである抗原は、一般に、花粉、塵、カビ、胞子、ふけ、昆虫および食品に由来する抗原が挙げられる。
【００４９】
腫瘍抗原の特性である抗原は、代表的に、腫瘍組織の細胞の、細胞表面、細胞質、核、細胞内小器官などに由来する。腫瘍タンパク質の特性を有する抗原を含む例としては、変異オンコジーンによってコードされるタンパク質；腫瘍に関連するウイルス性タンパク質；および糖タンパク質が、挙げられる。腫瘍としては、以下の癌の型に由来する腫瘍が挙げられるが、これらに限定はされない：口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌および口腔癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、膵臓癌、喉頭癌、肺癌および気管支癌、皮膚の黒色腫、乳癌、頚部癌、子宮（ｕｔｅｒｉｎｅ）癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮（ｕｔｅｒｕｓ）癌、脳の癌および神経系の他の部分の癌、甲状腺癌、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、および白血病。
【００５０】
本発明の１つの特定の実施形態において、異種配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のゲノム、好ましくはヒト免疫不全ウイルス−１のゲノムまたはヒト免疫不全ウイルス−２のゲノムに由来する。本発明の別の実施形態において、異種コード配列は、ウイルス遺伝子コード配列の間に挿入され、従って、異種ペプチド配列をウイルスタンパク内に含むキメラ遺伝子産物が、発現される。本発明のこのような実施形態において、異種配列はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のゲノム、好ましくはヒト免疫不全ウイルス−１のゲノムまたはヒト免疫不全ウイルス−２のゲノムに由来し得る。
【００５１】
異種配列がＨＩＶに由来する場合、このような配列としては、以下のような配列に由来する腫瘍が挙げられ得るが、これらに限定はされない：ｅｎｖ遺伝子（すなわち、ｇｐｌ６０、ｇｐｌ２０、および／またはｇｐ４１の全ての部分をコードする配列）、ｐｏｌ遺伝子（すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および／またはインテグラーゼの全ての部分をコードする配列）、ｇａｇ  遺伝子（すなわち、ｐ７、ｐ６、ｐ５５，ｐｌ７／１８、ｐ２４／２５の全ての部分をコードする配列）ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、および／またはｖｐｘ。
【００５２】
さらなる実施形態において、キメラウイルス内に操作され得る異種遺伝子配列としては、オンコジーンもしくは改変オンコジーン（例えば、ドミナントネガティブオンコジーン）、リガンド結合タンパク質をコードする遺伝子もしくはレセプター結合タンパク質をコードする遺伝子、治療タンパク質の遺伝子、および増殖因子の遺伝子または免疫調節分子の遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。なお別の実施形態において、キメラウイルス内に操作され得る異種遺伝子配列としては、免疫増強活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。免疫増強タンパク質の例としては、サイトカイン、インターフェロン１型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−１２が挙げられるが、これらに限定されない。異種遺伝子配列は、所望のポリペプチドの天然の遺伝子配列であり得るか、または配列変異、配列挿入または配列欠失によって改変され得る。このような改変異種配列は、新規の表現型または特徴（例えば、酵素活性の増強）を提供するため、抗原性部位を含むため、リガンド結合部位を含むため、さらなる酵素能力もしくは他の機能を追加するために改変され得るか、または、キメラウイルス系においてより効率的に発現されるため（例えば、ウイルスのコドン使用法または優先度を考慮するため）に、配列が改変され得る。
【００５３】
これらのハイブリッド分子を構築するための１つのアプローチは、異種コード配列を、天然で非分節型のマイナス鎖ウイルスのウイルス遺伝子のＤＮＡ相補体に挿入して、その異種配列が、ウイルスポリメラーゼ活性のために必要なウイルス配列（すなわち、ウイルスポリメラーゼ結合部位プロモーター（本明細書中で以後、ウイルスポリメラーゼ結合部位と呼ぶ）およびポリアデニル化部位）に隣接されるようにすることである。好ましい実施形態において、この異種コード配列は、５’末端および３’末端の複製プロモーター、遺伝子開始配列または遺伝子終止配列、ならびに５’末端および／または３’末端において見出されるパッケージングシグナルを含む、ウイルス配列に隣接される。代替のアプローチにおいて、このウイルスポリメラーゼ結合部位をコードするオリゴヌクレオチド（例えば、このウイルスゲノムセグメントの３’末端または両末端の相補体は、上記ハイブリッド分子を構築するために異種コード配列に連結され得る。標的配列の範囲内に外来遺伝子または外来遺伝子セグメントを配置することは、その標的配列の範囲内の適切な制限酵素部位の存在によって、前もって決定付けられた。しかし、分子生物学における近年の進歩は、この問題を大幅に軽減している。制限酵素部位は、部位特異的変異誘発の使用を介して、標的配列内の任意の場所に容易に配置され得る（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２；４８８によって記載される技術を参照のこと）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術の変化形（後述）もまた、配列（すなわち、制限酵素部位）の特異的挿入、およびハイブリッド分子の容易な構築を可能にする。あるいは、クローニングを必要とせずに組換えテンプレートを調製するために、ＰＣＲ反応が使用され得る。例えば、ＤＮＡ指親和性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＴ７またはバクテリオファージＳＰ６）と、上記異種遺伝子およびＮＤＶポリメラーゼ結合部位を含むハイブリッド配列とを含む、二本鎖ＤＮＡ分子を調製するために、ＰＣＲ反応が使用され得る。次いで、ＲＮＡテンプレートは、この組換えＤＮＡから直接転写され得る。なお別の実施形態において、この組換えＲＮＡテンプレートは、ＲＮＡリガーゼを用いて、異種遺伝子の負の極性を特定するＲＮＡをウイルスポリメラーゼ結合部位と連結することによって、調製され得る。ウイルスポリメラーゼ活性および本発明に従って使用され得る構築物の配列必要条件は、以下の小節で記載される。
【００５４】
（ウイルスのＨＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、ＮＰ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、Ｌ遺伝子への異種遺伝子配列の挿入）
本発明の実施形態において、ＨＮタンパク質、Ｐタンパク質、ＮＰタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、またはＬタンパク質をコードする遺伝子セグメントが、異種遺伝子産物の挿入のために使用され得る。外来遺伝子配列を、これらのセグメントのいずれかへ挿入することは、外来遺伝子にはウイルスコード領域のとの完全な置換または一部置換のどちらかによって達成され得る。完全な置換は、ＰＣＲ指向的変異誘発の使用を介して、おそらく最もよく達成される。簡潔には、ＰＣＲプライマーＡは、５’から３’末端へと、以下を含む：クラスＩＩＳ制限酵素部位（すなわち、「シフター（ｓｈｉｆｔｅｒ）」酵素；特定の配列を認識するが、その配列の上流または下流のどちらかのＤＮＡを切断する）のような独特な制限酵素部位；特定のウイルス遺伝子の領域に相補的な一続きのヌクレオチド；および、外来遺伝子産物のカルボキシ末端コード部分に相補的な一続きのヌクレオチド。ＰＣＲプライマーＢは、５’末端からから３’末端へとに、以下を含む：独特な制限酵素部位；特定のウイルス遺伝子に相補的な一続きのヌクレオチド；外来遺伝子の５’コード部分に対応する一続きのオヌクレオチド。外来遺伝子のクローン化コピーと共に、これらのプライマーを使用するＰＣＲ反応の後、生成物は、その独特の制限酵素部位を用いて、切断され、そしてクローン化され得る。クラスＩＩＳ酵素を用いる消化および精製ファージポリメラーゼを用いた転写は、外来遺伝子挿入を有する特定のウイルス遺伝子の正確な非転写末端を含むＲＮＡ分子を生成する。代替の実施形態において、ＰＣＲプライム反応は、バクテリオファージプロモーター配列およびハイブリッド遺伝子配列を含む２本鎖ＤＮＡを調製するために使用され得、その結果、ＲＮＡテンプレートは、クローニングすることなく直接転写され得る。
【００５５】
（ＨＮ遺伝子への異種遺伝子配列の挿入）
ＮＤＶの赤血球凝集素活性およびノイラミニダーゼ活性は、単一の遺伝子ＨＮによってコードされる。ＨＮタンパク質は、ウイルスの主要な表面糖タンパク質である。インフルエンザウイルスのような種々のウイルスについて、赤血球凝集素タンパク質およびノイラミニダーゼタンパク質は、多くの抗原性部位を含むことが実証されている。従って、このタンパク質は、感染後の体液性免疫応答の強力な標的である。従って、ＨＮ内の抗原部位を外来性タンパク質の一部で置換すると、この外来性ペプチドに対し、強い体液性応答を提供し得る。配列が、ＨＮ分子内に挿入され、そしてこの配列がＨＮの外側表面上で発現する場合、この配列は、免役原性である。例えば、ＨＩＶのｇｐ１６０に由来するペプチドは、ＨＮタンパク質の抗原性部位を置換し得、細胞性免役応答および体液性免役応答の両方の誘発を生じる。異なったアプローチにおいて、外来ペプチド配列は、ウイルス配列を少しも欠失することなく、抗原性部位内に挿入され得る。このような構築物の発現生成物は、外来性抗原に対するワクチンにおいて有用であり得、そして上で議論された問題（ワクチン接種された宿主における組換えウイルスの伝播の問題）を上手に避け得る。抗原性部位のみにおける置換を有するインタクトなＨＮ分子は、ＨＮ機能を可能にし得、従って、生存可能なウイルスの構築を可能にする。従って、このウイルスは、さらなるヘルパー機能の必要なしに増殖し得る。このウイルスはまた、いかなる偶発的漏出の危険も避ける他の方法において、弱毒化され得る。他のハイブリッド構築物は、細胞表面上にタンパク質を発現するように作製され得るか、またはこれらのタンパク質が細胞から放出されることを可能にするように作製され得る。表面の糖タンパク質としては、ＨＮは、細胞表面への輸送に必要なアミノ末端切断可能なシグナル配列および膜の固定に必要なカルボキシ末端配列を有する。細胞表面上のインタクトな外来性タンパク質を発現するために、これらのＨＮシグナルを使用してハイブリッドタンパク質を作製することが、必要であり得る。この場合、その融合タンパク質は、さらなる内部プロモーター由来の別個の融合タンパク質として発現され得る。あるいは、輸送シグナルだけが存在し、かつ膜固定ドメインが存在しない場合、そのタンパク質は、細胞外に分泌され得る。
【００５６】
（２シストロン性ＲＮＡの構築および異種タンパク質発現）
２シストロン性ｍＲＮＡが、ウイルス配列の翻訳の内部開始を許容し、そして正規の末端開始部位からの外来タンパク質コード配列の発現を可能にするように、構築され得る。あるいは、ウイルス配列が正規の末端オープンリーディングフレームから翻訳され、一方で外来配列が内部部位から開始される２シストロン性ｍＲＮＡ配列が、構築され得る。特定の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列が、利用され得る。選択されるＩＲＥＳ配列は、ウイルスパッケージング制限を妨害しないように十分短くあるべきである。従って、このような２シストロン性アプローチのために選択されるＩＲＥＳは、５００ヌクレオチド長以下であることが好ましく、２５０ヌクレオチド未満である。さらに、利用されるＩＲＥＳは、ピコルナウイルスエレメントと配列または構造の相同性を共有しないことが好ましい。好ましいＩＲＥＳエレメントとしては、哺乳動物ＢｉＰ  ＩＲＥＳおよびＣ型肝炎ＩＲＥＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
あるいは、外来性タンパク質は、新規の内部転写単位から発現され得、この転写単位は、開始部位およびポリアデニル化部位を有する。別の実施形態において、外来遺伝子は、天然で非分節型のマイナス鎖ウイルス遺伝子に挿入され得、その結果、これにより生じる発現タンパク質は、融合タンパク質である。
【００５８】
（組換えＲＮＡテンプレートを使用する異種遺伝子産物の発現）
上述のように調製された組換えテンプレートは、適切な宿主細胞において異種遺伝子産物を発現するためかまたは異種遺伝子産物を発現するキメラウイルスを作製するために、種々の方法にて使用され得る。１つの実施形態において、組換えテンプレートは、高レベルでの異種遺伝子産物の発現を指示し得る適切な宿主細胞を、トランスフェクトするために使用され得る。高レベルでの発現を提供する宿主細胞系としては、ＮＤＶで重感染された（ｓｕｐｅｒｉｎｆｅｃｔｅｄ）細胞株、ＮＤＶ機能を補完するように操作された細胞株などのような、ウイルス機能を提供する継続的細胞株が、挙げられる。
【００５９】
本発明の代替の実施形態において、組換えテンプレートは、異種遺伝子産物の発現を達成するためにウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する細胞株をトランスフェクトするために、使用され得る。この目的のために、ポリメラーゼタンパク質（例えば、Ｌタンパク質）を発現する、形質転換細胞株が、適切な宿主細胞として使用され得る。宿主細胞は、他のウイルス機能またはさらなる機能（例えば、ＮＰまたはＨＮ）を提供するように、同様に操作され得る。
【００６０】
別の実施形態において、ヘルパーウイルスが、異種遺伝子産物の発現を達成するために、細胞によって利用されるＲＮＡポリメラーゼタンパク質を、提供し得る。
【００６１】
なお別の好ましい実施形態において、細胞は、ＮＰウイルスタンパク質、Ｐウイルスタンパク質およびＬウイルスタンパク質をコードするベクターで、トランスフェクトされ得る。必要なウイルス核タンパク質（Ｎ）およびＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＬおよびＰ）は、異なった方法（Ｔ７応答性プラスミドを、Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスベクターに感染している細胞内へトランスフェクトすること、および補完細胞株におけるこれらのタンパク質の安定的な発現が挙げられる）によって、発現され得る。
【００６２】
（キメラマイナス鎖ＲＮＡウイルスの調製）
キメラウイルスを調製するため、マイナス鎖ウイルスゲノムおよび／または２つ以上の分節または２つ以上のＲＮＡにおけるプラスセンスまたはマイナスセンスにおいて外来タンパク質をコードする組換えマイナス鎖ウイルスＲＮＡが、細胞をトランスフェクトするために使用され得、この細胞は、複製およびレスキューのために必要な、ウイルスタンパク質ならびに機能を提供するか、または「親」ウイルスによってもまた感染される。代替のアプローチにおいて、２つ以上の分節においてゲノムウイルスＲＮＡまたはアンチゲノムウイルスＲＮＡをコードするプラスミド（野生型または改変型のどちらか）が、ウイルスポリメラーゼタンパク質（例えば、ＮＰ、ＰまたはＬ）をコードするプラスミドと共に宿主中に同時トランスフェクトされ得る。別の実施形態において、２つ以上の分節においてアンチゲノムウイルスＲＮＡをコードするプラスミドが、ウイルスポリメラーゼタンパク質Ｐおよびウイルスポリメラーゼタンパク質Ｌをコードするプラスミドと共に同時トランスフェクトされ得る。なぜなら、ＮＰポリメラーゼタンパク質は、例えばＮＤＶのアンチゲノムコピーによって転写される最初のタンパク質であり、トランスでＮＰポリメラーゼをさらに提供する必要はないからである。
【００６３】
本発明の１つの実施形態において、本発明の組換え方法は、キメラマイナス鎖ＲＮＡウイルスを操作するために利用され得、この技術は、ウイルスポリメラーゼによる認識のためおよび成熟ビリオンを産生するために必要なシグナルをパッケージングするために不可欠な、マイナス鎖ウイルスＲＮＡの非コード領域を含む合成組換えウイルスＲＮＡの調製を含む。合成組換えプラスミドＤＮＡおよび合成組換えプラスミドＲＮＡは、以下で記載されるように、当該分野で公知の多数の技術によって感染性ウイルス粒子内で複製され、レスキューされ得る：米国特許第５，１６６，０５７号（１９９２年１１月２４日発行）；米国特許第５，８５４，０３７号（１９９８年１２月２９日発行）；欧州特許公開ＥＰ  ０７０２０８５Ａ１（１９９６年２月２０日公開）；米国特許出願第０９／１５２，８４５号；国際特許公開ＰＣＴ  ＷＯ  ９７／１２０３２（１９９７年４月３日公開）；ＷＯ  ９６／３４６２５（１９９６年１１月７日公開）；欧州特許公開ＥＰ−Ａ７８０４７５；ＷＯ  ９９／０２６５７（１９９９年１月２１日公開）；ＷＯ  ９８／５３０７８（１９９８年１１月２６日公開）；ＷＯ  ９８／０２５３０（１９９８年１月２２日公開）；ＷＯ  ９９／１５６７２（１９９９年４月１日公開）；ＷＯ  ９８／１３５０１（１９９８年４月２日公開）；ＷＯ  ９７／０６２７０（１９９７年２月２０日公開）；およびＥＰＯ  ７８０  ４７ＳＡ１（１９９７年６月２５日公開）、これら各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００６４】
マイナス鎖ＲＮＡウイルスをレスキューするために、逆遺伝学アプローチを適用するために使用され得る多くの異なったアプローチが存在する。第１に、組換えＲＮＡが、組換えＤＮＡテンプレートから合成され、そしてインビトロで精製ウイルスポリメラーゼ複合体を用いて再構築され、細胞をトランスフェクトするために使用され得る組換えリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成する。別のアプローチにおいて、ウイルスポリメラーゼタンパク質がインビトロまたはインビボのいずれかで合成ＲＮＡが転写される間存在する場合、より効率的なトランスフェクションが、達成される。このアプローチにより、合成ＲＮＡは、上記ポリメラーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡプラスミドとインビトロで同時転写されるか、またはポリメラーゼタンパク質存在下でインビボ（すなわち、上記ポリメラーゼタンパク質を一過的にまたは継続的に発現する細胞内）で転写される、ｃＤＮＡプラスミドから転写され得る。
【００６５】
代替の実施形態において、逆遺伝学技術と再分類（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）技術の組み合わせが、分節型ＲＮＡウイルスにおいて所望のエピトープを有する弱毒化ウイルスを操作するために使用され得る。例えば、弱毒化ウイルス（自然淘汰、突然変異または逆遺伝学技術によって産生される）および所望のワクチンエピトープを保有する株（自然淘汰、突然変異または逆遺伝学技術によって産生される）が、その分節型ゲノムの再分類を許容する宿主において同時感染され得る。次いで、弱毒化表現型および所望のエピトープの両方を示す再分類体（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）が、選択され得る。
【００６６】
再分類後、これらの新規ウイルスを単離し得、そしてこれらのゲノムを、ハイブリダイゼーション分析を介して同定し得る。本明細書中に記載されるさらなるアプローチにおいて、感染性キメラウイルスの産生は、ＮＤＶウイルスポリメラーゼタンパク質を発現する宿主細胞系において複製され得（例えば、ウイルス／宿主細胞発現系（ポリメラーゼタンパク質を発現するように操作された形質転換細胞株）において、など）、その結果、感染性キメラウイルスがレスキューされる。この例において、ヘルパーウイルスは利用される必要はない。なぜなら、この機能は発現されるウイルスポリメラーゼタンパク質によってもたらされるからである。
【００６７】
本発明に従って、当業者に公知の任意の技術を使用して、キメラウイルスの複製およびレスキューを達成し得る。１つのアプローチは、宿主細胞にトランスフェクションする前に、インビトロで複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルス機能を供給する工程を含む。このような実施形態において、ウイルスタンパク質は、野生型ウイルス形態、ヘルパーウイルス形態、精製ウイルスタンパク質形態または組換え発現されたウイルスタンパク質形態で、供給され得る。これらのウイルスタンパク質は、キメラウイルスをコードする合成ｃＤＮＡまたは合成ＲＮＡの転写前、転写中または転写後に供給され得る。この混合物全体を使用して、宿主細胞にトランスフェクションし得る。別のアプローチにおいて、複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルス機能は、キメラウイルスをコードする合成ｃＤＮＡまたは合成ＲＮＡの転写前または転写中に供給され得る。このような実施形態において、複製に必要とされるウイルスタンパク質およびウイルス機能は、野生型ウイルス形態、ヘルパーウイルス形態、ウイルス抽出物形態、またはウイルスタンパク質を発現する合成ｃＤＮＡ形態もしくは合成ＲＮＡ形態精製ウイルスタンパク質形態または組換え発現されたウイルスタンパク質形態で供給され、これらは感染またはトランスフェクションを介して宿主細胞中に導入される。この感染／トランスフェクションは、キメラウイルスをコードする合成ｃＤＮＡまたは合成ＲＮＡの導入前、またはその導入と同時に起こる。
【００６８】
特に望ましいアプローチにおいて、２つ以上のＲＮＡ分子またはＲＮＡセグメント由来の、天然で非分類型マイナス鎖のウイルスのための全てのウイルス遺伝子を発現するように操作された細胞は、所望の遺伝子型を含む、感染性組み換えウイルスまたは感染性キメラウイルスの産生を生じ得る；これらにより、選択系の必要性も任意のヘルパーウイルスの必要性も排除する。理論上、当業者は、６つのウイルス遺伝子のいずれか１つまたは６つのウイルス遺伝子のいずれか１つの一部を、外来配列で置き換え得る。しかし、この等価物の必要な部分は、欠損性ウイルスを増幅させる能力である（欠損性とは、通常のウイルス遺伝子産物が欠けているかまたは変更されるからである）。この問題を回避するための多くの可能性あるアプローチが存在する。１つのアプローチにおいて、変異型タンパク質を有するウイルスが、同じタンパク質の野生型ウイルスバージョンを構築的に発現するために構築された細胞株において増殖され得る。この方法によって、この細胞株はウイルスにおける変異を補完する。ウイルスタンパク質を発現するために作製されたこれらの細胞株を使用して、組換えウイルスにおける欠損を補完し得、そしてこれによって組換えウイルスを増殖させ得る。組換えウイルスを増殖させるための特定の天然の宿主範囲の系が利用可能であり得る。
【００６９】
あるいは、そして本発明の利点と同程度に、マイナス鎖のウイルスが、２つ以上のセグメントまたはＲＮＡ分子から調製されており、特にウイルスタンパク質の長さまたはサイズがウイルスのパッケージングを妨げない場合、外来配列が、必要なタンパク質に加えて、ウイルスタンパク質との融合タンパク質としてかまたはさらなるタンパク質として使用され得るかまたは発現され得る。
【００７０】
初期に定めたように、本明細書中に記載されるような、天然で非分類型マイナス鎖のウイルスのための分類型ベクターの使用は、従来のな非分類型ベクターの使用に勝る特定の利点を有する。第１に、このゲノムは２つ以上のセグメントに分割されるので、これらのセグメントの各々は野生型の非分類型ゲノムより小さくてもよい。より小さなＲＮＡセグメントは、より高い複製速度および転写速度を有すること、および外来配列をコードするより長い挿入部を適合させることが、予測される。従って、外来抗原を発現する分類型ベクターは、より融通がきき、そして非分類型ベクターより高レベルまで外来挿入部を発現する。第２に、天然で非分類型のウイルスゲノムの分節型はウイルスを減毒する可能性が大いにあり、動物またはヒトにおけるワクチンのための分類型ベクターの使用に対してさらなる安全性の尺度を加える。１つ以上の外来抗原、異種性タンパク質および／または免疫刺激性分子を発現する組換え分類型ベクターは、異なる疾患（ＡＩＤＳおよび癌を含む）に対して有効的なワクチンまたは治療剤として使用され得る。
【００７１】
（キメラウイルスを使用したワクチン処方物および治療処方物）
本発明は、本発明の操作されたマイナス鎖ＲＮＡウイルスを含むワクチン処方物および治療処方物を包含する。本発明は、ウイルス感染に対する保護を授けるため、または癌抗原に対する免疫応答を促進もしくは開始させるためにワクチン処方物において改変された、天然で非分類型マイナス鎖の組換えウイルスの使用を、包含する。なお別の実施形態において、本発明の天然で非分類型マイナス鎖の組換えウイルスは、種々の病原体のいずれかに対する保護性応答を誘導する外来エピトープを発現するためのビヒクルとして使用され得る。さらなる実施形態において、本発明の組換えウイルスは、異種性のポリペプチドまたは治療的タンパク質（オンコジーンまたは改変されたオンコジーン、リガンドまたはレセプター結合性タンパク質、および増殖因子または免疫刺激性分子が挙げられるが、これらに限定されない）を発現するためのビヒクルとして使用され得る。
【００７２】
本発明は、ヒトまたは動物に投与されるべきワクチン処方物または治療処方物を、包含する。特に、本発明は、家庭内動物（イヌおよびネコを含む）；野生動物（キツネおよびアライグマを含む）；家畜（ウシ、ウマおよびブタおよびヒツジおよびヤギを含む）；ならびに家禽（ニワトリおよびシチメンチョウを含む）に対して、投与されるべきワクチン処方物または治療処方物を、包含する。
【００７３】
本発明は、鳥類の疾患原因性因子（ＮＤＶ、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）、トリインフルエンザウイルスを含む）に対して有用であるワクチン処方物を包含する。
【００７４】
別の実施形態において、本発明は、家畜の疾患（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｄｅｓｅａｓｅ）原因性因子（狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、およびイヌジステンパーウイルスを含む）に対して有用であるワクチン処方物を包含する。なお別の実施形態において、本発明は、水泡性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、牛疫ウイルス、豚痘ウイルスに対して家畜を保護するために有用であり、そしてさらに狂犬病ウイルスに対して野生動物を保護するために有用である、ワクチン処方物を包含する。
【００７５】
逆遺伝学アプローチによって調製された弱毒化ウイルスは、本明細書中に記載されるワクチン処方物および薬学的処方物において使用され得る。逆遺伝学技術はまた、ワクチン産生のために重要な他のウイルス遺伝子に対して、さらなる変異を操作するために使用され得る。すなわち、有用なワクチン株改変体のエピトープが弱毒化ウイルス内に操作され得る。あるいは、完全な外来エピトープ（他のウイルス性病原体または他の非ウイルス性病原体由来の抗原を含む）が、弱毒化ウイルス中に操作され得る。例えば、非関連性ウイルスの抗原（ＨＩＶ（ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）寄生生物抗原（例えば、マラリア）、細菌性抗原もしくは真菌性抗原、または腫瘍抗原）などが、弱毒化ウイルス中に操作され得る。あるいは、インビボでのウイルスの親和性を変更するエピトープが、本発明の弱毒化キメラウイルス中に操作され得る。
【００７６】
実際に、任意の異種性遺伝子配列が、ワクチンにおける使用のために、本発明のキメラウイルス中に構築され得る。好ましくは、種々の病原体、または中和化抗体を結合する種々の抗原のいずれかに対する保護免疫応答を誘導するエピトープが、キメラウイルスによって、またはキメラウイルスの一部として、発現され得る。例えば、本発明のキメラウイルス中に構築され得る異種性遺伝子配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：インフルエンザ糖タンパク質（特に、ヘマグルチニンＨ５、Ｈ７、マレック病ウイルスエピトープ）；伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のエピトープ、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）のエピトープ、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）のエピトープ、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＶ）のエピトープ、トリ白血病ウイルスのエピトープ（ＡＬＶ）、細網内皮症ウイルス（ＲＶ）のエピトープ、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）のエピトープ、狂犬病ウイルスのエピトープ、ネコ白血病ウイルスのエピトープ、イヌジステンパーウイルスのエピトープ、水泡性口内炎ウイルスのエピトープ、牛疫ウイルスのエピトープ、および豚痘ウイルスのエピトープ（Ｆｉｅｌｄｓら（編）、２００１、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、その全体が本明細書中で参考として援用される）。
【００７７】
なお別の実施形態において、キメラウイルス中に操作され得る異種性遺伝子配列としては、免疫増強活性を有するタンパク質をコードする配列が挙げられる。免疫増強タンパク質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：サイトカイン、インターフェロン１型、γインターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−１２。
【００７８】
さらに、本発明のキメラウイルス中にワクチンにおける使用のために構築され得る異種性遺伝子配列としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来、好ましくは１型または２型由来の配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、抗原の要素であり得る免疫原性ＨＩＶ由来ペプチドが、キメラＮＤＶ中に構築され得、これは次いで、脊椎動物の免疫応答を導き出すために使用され得る。このようなＨＩＶ由来ペプチドとしては以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：ｅｎｖ遺伝子由来配列（すなわち、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０および／もしくはｇｐ４１の全部またはその一部をコードする配列）、ｐｏｌ遺伝子（すなわち、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼおよび／もしくはインテグラーゼの全部またはその一部をコードする配列）、ｇａｇ遺伝子（すなわち、ｐ７、ｐ６、ｐ５５、ｐ１７／１８、ｐ２４／２５の全部またはその一部をコードする配列）、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、ｖｐｒ、ならびに／あるいはｖｐｘ。
【００７９】
他の異種性配列は、以下に由来し得る：Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；Ａ型肝炎ウイルス表面抗原またはＣ型肝炎ウイルス表面抗原、エプスタインバーウイルスの糖タンパク質；ヒトパピローマウイルスの糖タンパク質；呼吸器多核体ウイルスの糖タンパク質、パラインフルエンザウイルスの糖タンパク質、センダイウイルスの糖タンパク質、シミアンウイルス５の糖タンパク質、または耳下腺炎ウイルスの糖タンパク質；インフルエンザウイルスの糖タンパク質；ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、ｇＤ、ｇＥ）；ポリオウイルスのＶＰ１；細菌および寄生生物のような非ウイルス性病原体（２〜３であるが挙げられる）の抗原決定基。別の実施形態において、免疫グロブリンの全部またはその一部が、発現されえる。例えば、このようなエピトープを模倣する、抗イデオタイプ免疫グロブリンの可変領域が、本発明のキメラウイルス中に構築され得る。
【００８０】
他の異種性配列は腫瘍抗原に由来し得、そして得られたキメラウイルスは、インビボで腫瘍進行を導く腫瘍細胞に対して免疫応答を形成するために、使用され得る。これらのワクチンは、腫瘍の処置のために、他の治療レジメンと組み合わせて使用され得る（化学療法、放射線療法、外科手術、骨髄移植などを含むが、これらに限定されない）。本発明に従って、組換えウイルスが、以下の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現するように操作され得る：Ｔ細胞によって認識されるヒト腫瘍抗原（ＲｏｂｂｉｎｓおよびＫａｗａｋａｍｉ、１９９６、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６２８−６３６、その全体が本明細書中で参考として援用される）、メラノサイト系統タンパク質（ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、チロシナーゼが挙げられる）；腫瘍特異的に広範に共有される抗原、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−１、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ、ｐ１５；腫瘍特異的変異抗原、β−カテニン、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４；乳癌、卵巣癌、脊髄癌および膵臓癌に対する非黒色腫瘍抗原、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウイルス−Ｅ６、ヒトパピローマウイルス−Ｅ７、ＭＵＣ−１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
組換えウイルスの生ワクチンまたは組換えウイルスの不活性化ワクチンのいずれかが処方され得る。生ワクチンが好ましくあり得る。なぜなら、宿主中での増幅が、天然の感染において起こるものと同種および同規模の長期化刺激を導き、従って、実質的な長期持続性の免疫を授けるからである。このような組換えウイルスの生ワクチン処方物の産生は、細胞培養物中またはニワトリ胚の尿膜中でのウイルスの増殖、その後の精製を包含する従来の方法を使用して達成され得る。さらに、ＮＤＶはヒトにおいて非病原性であることが実証されているので、このウイルスは生ワクチンとしての使用に高度に適合される。
【００８２】
このことに関連して、ワクチン目的のために遺伝子操作されたマイナス鎖ウイルス（ベクター）を使用することは、これらの株における減毒特性の存在を所望し得る。トランスフェクションのために使用されるテンプレート中への適切な変異（例えば、欠如）の導入は、新規ウイルスに減毒特性を提供し得る。例えば、温度感受性または低温適合性に関連する特定のミスセンス変異は、欠如変異中に作製され得る。これらの変異は、低温感受性変異体または温度感受性変異体に関連した点変異よりも安定であるはずであり、そして復帰頻度は極端に低いはずである。
【００８３】
あるいは、「自殺」特性を有するキメラウイルスが、構築され得る。このようなウイルスは、宿主内での１回または２〜３回のみの複製を経る。ワクチンとして使用される場合、この組換えウイルスは、限定された複製サイクルを経、そして十分なレベルの免疫応答を誘導するが、ヒト宿主中でさらには進行せず、そして疾患を引き起こさない。１つ以上のウイルス遺伝子を欠いている組換えウイルスまたは変異化ウイルス遺伝子を有する組換えウイルスは、継続的な回数の複製を受けることが出来ない。欠損性ウイルスは、このような遺伝子を恒常的に発現する細胞株において産生され得る。必須の遺伝子を欠いているウイルスは、これらの細胞株中で複製されるが、ヒト宿主に投与される場合、１回の複製を完了することが出来ない。このような調製物は、この不完全なサイクル中で、十分多くの遺伝子を転写しそして翻訳して、免疫応答を誘導し得る。あるいは、より多量の株が投与され得、その結果、これらの調製物は、不活性化（殺傷済み）ウイルスワクチンとして使用される。不活性化ワクチンのために、異種性遺伝子産物がウイルスの成分として発現され、その結果この遺伝子産物がビリオンと会合されることが、好ましい。このような調製物の利点は、これらがネイティブなタンパク質を含んでおり、そして殺傷済みウイルスワクチンの製造において使用されるホルマリンまたは他の薬剤を用いた処置による不活性化を受けないからである。
【００８４】
本発明のこの局面の別の実施形態において、不活性化ワクチン処方物は、キメラウイルスを「殺傷する」ための従来技術を使用して、調製され得る。不活性化ワクチンは、それらの感染性が破壊されているという意味において、「死んで」いる。理想的には、ウイルスの感染性は、その免疫原性に影響を与えることなく破壊される。不活性化ワクチンを調製するために、キメラウイルスは細胞培養物中またはニワトリ尿膜中で増殖され得、成帯（ｚｏｎａｌ）超遠心分離によって精製され得、ホルムアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンによって不活性化され得、そしてプールされ得る。得られたワクチンは、通常、筋肉内に接種される。
【００８５】
不活性化ウイルスは、免疫学的応答を増強するために、適切なアジュバントと共に処方され得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）；表面活性化物質（例えば、リゾレチシン（ｌｙｓｏｒｅｃｉｔｈｉｎ）、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン；ペプチド；油エマルジョン；ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧおよびコリネバクテリウムパルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ））。
【００８６】
上記のワクチン処方物を導入するために、多くの方法が使用され得る。これらの方法としては、経口経路、皮内経路、筋肉内経路、腹膜内経路、静脈内経路、皮下経路、および鼻腔内経路が挙げられるが、これらに限定されない。キメラウイルスワクチンが設計された病原体の天然の感染経路を介して、キメラウイルスワクチン処方物を導入することが、好ましくあり得る。
【実施例】
【００８７】
（実施例：１つより多くのＲＮＡセグメント由来の非分類型マイナス鎖の組換えウイルスの発現およびパッケージング）
ワクチン接種は、種々の疾患を予防または処置するための、強力な手段である。有効なワクチンは、ヒトおよび動物において、種々の感染性因子に対して開発されているが、ワクチンが利用可能でない多くの微生物病原体（ＨＩＶを含む）が存在する。本実施例は、種々の病原体ならびに癌に対して有効なワクチンの開発のために重要であり得る、新規のマイナス鎖ＲＮＡウイルスベクターに関する。この実施例において、天然で非分類型のマイナス鎖ウイルスが、２つ以上のセグメントからか、または２つ以上のＲＮＡ分子もしくはウイルスＲＮＰＳから、組換え的に調製される。
【００８８】
天然で非分類型マイナス鎖のウイルスであるＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の１例として、本明細書に記載されるＮＤＶベクターは、ヒトおよび動物において、外来抗原に対して強力なＢ細胞応答およびＴ細胞応答を誘導する。例えば、ＨＩＶ−１感染に対する保護ワクチンは、保存的なＨＩＶ−１エピトープに対して、高レベルの細胞性免疫応答およびホルモン性免疫応答を誘導するはずである。ＨＩＶ−１抗原を発現する、安全且つ高度に免疫原性のベクターの同定は、ＡＩＤＳワクチンの開発に向けて、重要な工程である。本発明者らは、マイナス鎖の組換えウイルス（ＮＤＶを含む）が、このような目的に理想的なベクターを代表すると考える。
【００８９】
さらに、ウイルスのウイルスゲノム構造が、その安全性プロフィールおよびコードする潜在能を増大させるために改変されている。ＮＤＶは、天然で非分類型のＲＮＡウイルスである。以下に記載される方法は、遺伝子構成に大きな変更を有する、天然で非分類型のＲＮＡウイルスベクター（ＮＤＶベクターを含む）の構築を可能にする。これらのベクターは、分類型ＲＮＡゲノムを含む組換えＮＤＶの使用に基づく。
【００９０】
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、モノネガウイルス種のうち、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属に属する、マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。このウイルスは、鳥類の病原体であり、そして鳥において異なるレベルの毒性によって特徴付けられたいくつかのＮＤＶ株が、単離されている。毒性（速現性）株のＮＤＶは、家禽において高度に病原性の疾患を引き起こす。しかし、無発症性（メソジェニックおよびレントジェニック）株のＮＤＶは、穏やかまたは無症候性の感染を引き起こし、そしてこれらは通常、ニューカッスル病に対して、家禽における生ワクチンとして使用される。ヒトは、ＮＤＶに対する通常の宿主ではないが、このウイルスはヒトに投与されており、そして安全であることが見出されている。
【００９１】
ＮＤＶゲノムの分子構成は、他のパラインフルエンザウイルスの分子構成と同様である。マイナス鎖のＲＮＡウイルスゲノムは、３’末端に１つのリーダー配列を含み、その後順番に６つの転写ユニットを含む：３’―ＮＰ−Ｐ／Ｖ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’。ゲノムの末端での配列は、ウイルス性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって、ＲＮＡの転写および複製に関与する。さらに、内在性のジャンクション（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）は、遺伝子末端シグナル、ポリアデニル化シグナルおよび遺伝子開始シグナルを含む。
【００９２】
ＮＤＶゲノムの遺伝子操作を可能とする逆遺伝学系が、記載されている（Ｐｅｅｔｅｒｓ  ＢＰら（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：５００１−５００９；Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｇｅｒ  Ａら（１９９９）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：２９８７−２９９５；Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｓら（２０００）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７８：１６８−１８２；Ｎａｋａｙａ  Ｔら（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：１１８６８−１１８７３）。しかし、これらの方法は、１つのプラスミドまたは１つのＲＮＰから、マイナス鎖ウイルス（これらの場合、ＮＤＶ）の天然で非分類型ゲノムを産生することに基づき、そしてＮＤＶゲノムの基本的な非分類型性質を変更させることも、変更を利用することも、記載されていない。
【００９３】
本発明者らは、図１に例示する、分類型ゲノムを含む、天然で非分類型マイナス鎖の組換えＲＮＡウイルス（ＮＤＶを含む）のレスキューを可能にする方法を、開発した。この方法は、２つ以上のセグメントに分割したＮＤＶアンチゲノムを発現するプラスミドを、ＮＤＶのＮＰタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質を発現するプラスミドと一緒にトランスフェクションすることに基づく。
【００９４】
この方法において、２つの生物学的に活性なウイルスリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）が、トランスフェクトされた細胞の内側で形成される。ＲＮＰのうちの１つは、ＮＤＶの６つの機能性転写ユニットのサブセット（すなわち、ウイルスタンパク質のＮＰ、Ｐ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬのサブセット）を含む。第２のＲＮＰは、第１のＲＮＰ中に存在しない機能転写ユニットを含む。ＲＮＰを再構築するために、必要とされるウイルス性核タンパク質（Ｎ）およびＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＬおよびＰ）は、異なる方法（Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスベクターで感染された細胞中にＴ７応答性プラスミドをトランスフェクションし、そして補完細胞株においてこれらのタンパク質を安定に発現させる工程を含む）によって、発現され得る。２つのウイルス性ＲＮＡセグメントは、Ｔ７応答性プラスミドまたは裸の（ｎａｋｅｄ）ＲＮＡをトランスフェクションすることによって、発現される。この２つのセグメントは、マイナス方向またはプラス方向で発現され得る。両方のＲＮＡは、３’末端および５’末端に位置するＮＤＶ特異的プロモーターに挟まれる。細胞内で組み合わされるＲＮＰが、ウイルス性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されそして複製されて、感染性ウイルスの形成を導く。両方のＲＮＰは、感染性のために必要とされる。なぜなら、この２つを含むウイルスのみが、ウイルス産生に必要とされる全ての機能性遺伝子をコードするからである。
【００９５】
図１に例示される方法は、ＮＤＶに対してのみでなく、他の全てのモノネガウイルス科に対しても適用され得る。さらに、マイナス鎖ウイルスの６つの転写ユニットを２つより多くのセグメントに分割することによって、３つ以上のＲＮＡセグメントを有する組換えウイルスが、産生され得る。
【００９６】
ＮＤＶウイルスに対する分類型ＲＮＡ分子への１つのアプローチの例が、図２に例示される。図２は、野生型ＮＤＶの非分類型ゲノムの模式図、および本発明に従う分節型ＮＤＶベクターのゲノムの１例の模式図を示す。ＮＰタンパク質、Ｐ／Ｖタンパク質、Ｍタンパク質およびＬタンパク質ならびにマーカー遺伝子ＧＦＰは、１つのＲＮＰからコードされる。Ｆタンパク質およびＨＮタンパク質ならびにβ−ｇａｌは、第２のＲＮＰまたはＲＮＡセグメントからコードされる。各々のＲＮＰにおける異なるマーカー遺伝子の存在は、ＮＤＶ粒子中でのＲＮＡ、発現レベルおよびパッケージング効率の相対的検定を可能にする。
【００９７】
天然で非分類型マイナス鎖のＲＮＡウイルスに対する分類型ベクター（ＮＤＶベクターを含む）の使用は、従来の天然で非分類型マイナス鎖ウイルスのベクターの使用（すなわち、全てのウイルスタンパク質をコードする１つのセグメントまたは１つのＲＮＡが、組換え系において利用される場合）に勝る、いくつかの利点を有することが期待される。第１に、ゲノムが２つ以上のセグメントに分割されるので、これらのセグメントの各々は、野生型の非分類型ゲノムより小さくあり得る。より小さなＲＮＡセグメントは、より高い複製速度および転写速度を有すること、これによってより効率的に組換えウイルスを産生することが、予測される（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ  Ｄ．（１９７６）Ｃｅｌｌ  ８：５４７−５５５）。さらに、ＲＮＡセグメントのより小さなサイズに起因して、これらは、外来配列をコードするより長い挿入に適合する。従って、外来抗原を発現する、分類型ベクターは、天然で非分類型マイナス鎖のウイルスについてより融通が利き、そしてこのようなウイルスに対する非分類型ベクターより高レベルまで、外来の挿入物を発現する。さらに、天然で非分類型ウイルス（ＮＤＶを含む）のゲノムのセグメント形成は、大いにウイルスを減毒しそうであり、動物またはヒトに対するワクチンにおいて、このような分類型ベクターの使用に対するさらなる安全性の尺度を付加する（Ｆｌａｎａｇａｎ  ＥＢら（２００１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：６１０７−６１１４）。１つ以上の外来抗原、異種性タンパク質および／または免疫刺激分子を発現する、天然で非分類型マイナス鎖のウイルスに対する組換え分類型ベクターは、異なる疾患（ＡＩＤＳおよび癌を含む）に対する有効なワクチンまたは治療剤として、使用され得る。
【００９８】
本発明は、本発明の個々の局面の単なる例示として意図されるように、記載される特定の実施形態によって、範囲を限定されるべきではなく、そして機能的に等価である任意の構築物、ウイルスまたは酵素は、本発明の範囲内にある。実際に、本明細書中に示されそして記載される改変に加え、本発明の種々の改変が、先の記載および添付の図面から、当業者に明らかである。このような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に帰することが意図される。
【００９９】
本明細書中に挙げられる全ての参考文献は、あらゆる目的のために、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】マイナス鎖天然非分節型ウイルスの分節型ウイルス組換え体の産生。ＮＤＶの系は、実施例において記載される通りである。２個の生物学的に活性なリボ核タンパク質（ＲＮＰ）が、トランスフェクトされた細胞の内側に産生される。ＲＮＰの１つは、ＮＤＶの６個の機能的転写単位を含む。第２のＲＮＰは、第１のＲＮＰには存在しない機能的転写単位を含む。ＲＮＰを再構築するため、必須のウイルス核タンパク質（Ｎ）およびＲＮＡポリメラーゼタンパク質（ＬおよびＰ）が、異なった方法により発現され得る。これらの方法としては、Ｔ７応答性プラスミドを、Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスベクターで感染させた細胞内にトランスフェクトする工程、および細胞株の補完におけるこれらのタンパク質の安定的な発現を包含する方法が挙げられる。この２個のウイルスＲＮＡセグメントは、Ｔ７応答性プラスミドまたは裸の（ｎａｋｅｄ）ＲＮＡをトランスフェクトすることにより、発現される。この２個のセグメントは、マイナス極性またはプラス極性で発現され得る。両ＲＮＡは、その３’端および５’端に位置するＮＤＶ特異的プロモーターに隣接される。細胞内で集合するＲＮＰは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによって転写され、複製され、ウイルス感染を導く。両ＲＮＰは、感染性に必須である。何故なら、２つを含むウイルスのみが、ウイルス産生に必須の全ての機能的遺伝子をコードするためである。
【図２】野生型ＮＤＶ非分節型ゲノムおよび本発明に従って分節型されたＮＤＶベクターのゲノムの例の図。Ｎタンパク質、Ｐタンパク質／Ｖタンパク質、Ｍタンパク質およびＬタンパク質は、１つのＲＮＰからコードされ、そしてＦタンパク質およびＨＮタンパク質は、第２のＲＮＰまたは第２のＲＮＡセグメントからコードされる。ＧＦＰおよびβ−ｇａｌについてのー遺伝子もまた、第１および第２のＲＮＰに、それぞれコードされ、ＲＮＡ、発現レベルおよびＮＤＶ粒子におけるパッケージングの効率の相対評価を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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