(57)【要約】本発明は、哺乳動物幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法に関する。本発明の方法は、特定の細胞及び組織系統への、哺乳動物、特にヒトの幹細胞の分化及び成熟を調節及び制御するために用いることができる。本発明の方法は、特定の細胞及び組織系統への幹細胞又は前駆細胞集団の分化、特に分娩後の胎盤に由来する胚様幹細胞（embryonic-like stem cell）の分化をモジュレートするため、又は初期前駆細胞の顆粒球系統への分化のための、特定の小さな有機分子の使用に関する。最後に、本発明は、移植及び他の医療処置におけるそのような分化した幹細胞又は前駆細胞の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法であって、適切な条件下及びＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞又は前駆細胞を分化させるステップを含み、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、上記方法。
【請求項２】
前記幹細胞を造血細胞に分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、胚幹細胞、胎盤幹細胞、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群より選択されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＤＥ ＩＶ阻害剤がＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記分化が細胞培養物において行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分化が個体内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物の濃度が約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物のＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞の増殖又は分化をモジュレートする方法であって、増殖又は分化に適する条件下及びＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物の存在下で前記細胞を増殖又は分化させるステップを含み、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、上記方法。
【請求項１０】
前記前駆細胞がＣＤ３４＋前駆細胞及びＣＤ１３３＋前駆細胞からなる群より選択されるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記前駆細胞をＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−細胞に分化させる、請求項９に記載の方法。
前記化合物がＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記増殖又は分化が細胞培養物において行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記増殖又は分化が個体内で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記前駆細胞が前記個体に移植された細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物が、対照と比較して前記分化又は増殖に検出可能な差異を生じるのに十分な量で存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞が前記分化ステップの前に凍結保存し解凍したものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物被験体において前駆細胞集団を増殖させる方法であって、治療上有効な量のＣＤ３４＋前駆細胞とＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物とを前記哺乳動物被験体に投与するステップを含み、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、上記方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞を前記哺乳動物被験体中で分化させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞を、赤血球を実質的に含まない細胞調製物の形態で前記哺乳動物被験体に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞を、骨髄細胞、胎盤細胞、又は臍帯血細胞を含む細胞調製物の形態で前記哺乳動物被験体に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞を、担体と共に前記哺乳動物被験体に投与する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋前駆細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記前駆細胞が組み込まれている目的の遺伝物質を発現するものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物幹細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記幹細胞が、前記幹細胞の分化又は増殖をモジュレートするのに十分な時間にわたりＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物と接触させたものであり、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、上記医薬組成物。
【請求項２６】
前記幹細胞が、胚幹細胞、胎盤幹細胞、臍帯血幹細胞、末梢血幹細胞、及び骨髄幹細胞からなる群より選択されるものである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記化合物がＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記接触が細胞培養物において行われる、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記化合物の濃度が約０．００５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記分化が造血細胞への分化である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記造血細胞がＣＤ３４＋又はＣＤ３８＋造血細胞である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記造血細胞がＣＤ１１ｂ＋細胞である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
単離された臍帯血細胞と単離された白血球集団とを含む医薬組成物であって、前記白血球が、適切な条件下及びＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップであって、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない上記分化ステップと、それによって分化した前記白血球を単離するステップとを含む方法によって生成されるものである、上記医薬組成物。
【請求項３５】
前記化合物がイミド又はアミドである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記分化ステップが細胞培養物において行われる、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記化合物の濃度が約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記幹細胞がヒト幹細胞である、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記幹細胞が前駆細胞である、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記前駆細胞を特定の細胞系統にする（committed）、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記前駆細胞が造血前駆細胞である、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
培養されたＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、前記前駆細胞が、培養して最初の６日間以内に、前記前駆細胞の増殖及び分化を促進する条件下でＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物と接触させたものである、上記医薬組成物。
【請求項４３】
前記前駆細胞が培養して６日後に回収され凍結保存されたものである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３４−又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３４＋細胞である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記化合物がＳｅｌＣＩＤ（商標）である、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
哺乳動物幹細胞の移植方法であって、
（ａ）前記幹細胞とＰＤＥ ＩＶ阻害化合物とを接触させて、処理幹細胞を生成するステップであって、その接触が前記幹細胞の分化をモジュレートするのに十分である、上記ステップ、
（ｂ）前記処理幹細胞を個体に投与するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項４７】
ステップ（ｂ）が、前記処理幹細胞と併せて未処理細胞を投与することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記未処理細胞が、胚幹細胞、胎盤細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択されるものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記幹細胞が前記投与ステップの前に凍結保存し解凍されたものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
哺乳動物前駆細胞の移植方法であって、
（ａ）前記前駆細胞とＰＤＥ ＩＶ阻害化合物とを接触させて、処理前駆細胞を生成するステップであって、その接触が前記前駆細胞の分化をモジュレートするのに十分である、上記ステップ、
（ｂ）前記処理前駆細胞を個体に投与するステップ、
を含む、上記方法。
【請求項５１】
ステップ（ｂ）が、前記処理前駆細胞と併せて未処理細胞を投与することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記未処理細胞が、胚幹細胞、胎盤細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、及び骨髄細胞からなる群より選択されるものである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記幹細胞が前記投与の前に凍結保存し解凍されたものである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
ある症状に罹患している個体の治療方法であって、前記個体に、
（ａ）ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、ＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物、
（ｂ）前記化合物の存在下で分化させた幹細胞、及び
（ｃ）前記化合物の存在下で分化させた前駆細胞、
からなる群より選択される作用物質を投与するステップを含み、
前記作用物質が、前記症状を検出可能な程度に軽減又は改善するものである、上記方法。
【請求項５５】
前記症状が、炎症、心疾患、血管疾患、筋萎縮性側索硬化症、リソソーム蓄積症、及び糖尿病からなる群より選択されるものである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記作用物質が、幹細胞、及びポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではないＰＤＥ ＩＶ活性阻害化合物の両方を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
個体の治療方法であって、レシピエント哺乳動物被験体に治療上有効な量の白血球を投与するステップを含み、前記白血球が、適切な条件下及びＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物の存在下で幹細胞を分化させるステップであって、前記化合物が、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない、分化ステップを含む方法によって生成されるものである、上記方法。
【請求項５８】
前記幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記幹細胞を、灌流を行った分娩後胎盤において分化させる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記白血球を、赤血球を実質的に含まない細胞調製物の形態で前記個体に投与する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記白血球を、臍帯血細胞を含む細胞調製物の形態で前記個体に投与する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記白血球細胞を担体と共に前記個体に投与する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記白血球を投与して、レシピエント哺乳動物被験体の欠陥を治療又は修復する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記欠陥が造血細胞又は血球の増殖異常である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記造血細胞又は血球の増殖異常が好中球減少又は白血球減少である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記白血球を全身投与する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記白血球を静脈内投与する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記白血球が組み込まれている目的の遺伝物質を発現するものである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記白血球が同種異系である、請求項５７に記載の方法。
【請求項７０】
前記レシピエント哺乳動物被験体がヒトである、請求項５７に記載の方法。
【請求項７１】
医薬組成物の製造方法であって、
（ａ）ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞とＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物とを接触させるステップであって、前記前駆細胞を、その増殖及び分化を可能にする培養条件下で６日間培養するものである、接触ステップ、
（ｂ）培養して６日後に前記細胞を回収するステップ、
（ｃ）前記細胞を薬学的に許容される担体中に配置するステップ、
を含む方法。
【請求項７２】
前記接触ステップを培養初日に実施する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記接触ステップを、前記６日間の培養中に少なくとも２回実施する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記化合物がＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記前駆細胞が前記培養の前に他の血球から単離されたものである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記培地がさらにＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含有する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグが０．１μＭ〜１０．０μＭの濃度で存在する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグが１．０μＭの濃度で存在する、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞を前記回収ステップの後凍結保存する、請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
請求項７４の方法によって製造された医薬組成物。
【請求項８１】
ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞の分化をモジュレートする方法であって、
（ａ）分化が起こり得る条件下で前記前駆細胞の集団を準備するステップ、
（ｂ）前記前駆細胞と、ＰＤＥ ＩＶ阻害剤である化合物とを接触させるステップ、
（ｃ）分化に適した条件下で前記前駆細胞を分化させるステップ、
とを含み、前記化合物が、前記前駆細胞が分化する期間の少なくとも一時期の間にわたり前記前駆細胞と接触させて配置される、上記方法。
【請求項８２】
ステップ（ｂ）において、前記接触を培養第０日〜第６日の間の任意の時期に実施する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ステップ（ｂ）において、前記接触を前記前駆細胞の培養開始時に実施する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８４】
ステップ（ｂ）において、前記接触を前記前駆細胞を少なくとも２日間増殖させた後に実施する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８５】
ステップ（ｂ）において、前記接触を前記前駆細胞を少なくとも６日間増殖させた後に実施する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８６】
前記前駆細胞がＣＤ３４＋前駆細胞である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８７】
前記前駆細胞を、
対照と比較してＣＤ１１ｃの発現が低減、
対照と比較してＣＤ３８の発現が低減、
対照と比較してＣＤ８０の発現が低減、
対照と比較してＣＤ８６の発現が低減、
対照と比較してＣＤ１ａの発現が低減、
対照と比較してＣＤ１４の発現が低減、
対照と比較してＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔの発現が低減、
対照と比較してＨＬＡ−ＤＲの発現が低減、
対照と比較してＣＤ１５の発現が増大、
対照と比較してＣＤ３３の発現が増大、
対照と比較してＣＤ５４ｄｉｍの発現が増大、
対照と比較してＣＤ１３３の発現が増大、及び
上記マーカー特性のいずれかの組合せ、
からなる群より選択される細胞表面マーカー特性を示す細胞へと分化させ、
前記対照が、前記化合物の不在下で前記前駆細胞と同じ条件下で培養したＣＤ３４＋前駆細胞である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８８】
前記前駆細胞をＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−細胞へと分化させる、請求項８１に記載の方法。
【請求項８９】
前記ＰＤＥ ＩＶ阻害剤がＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグである、請求項８１に記載の方法。
【請求項９０】
ＣＤ３４＋前駆細胞から分化細胞を作製する方法であって、増殖及び分化を可能にする培地中で前記細胞を培養するステップ、前記前駆細胞とＳｅｌＣＩＤ（商標）若しくはそのプロドラッグとを接触させるステップを含む、上記方法。
【請求項９１】
前記接触ステップを前記培養の初日に実施する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記接触ステップを前記培養の最初の６日間に少なくとも２回実施する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記接触ステップを前記培養初日よりも早期に実施しない、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記分化細胞が、樹状細胞、顆粒球、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−細胞である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞がＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋前駆細胞である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
前記分化細胞を培養第６日に単離する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
前記分化細胞を培養第１２日に単離する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＣＤ３４＋細胞が前記培養ステップの前に他の血球から単離されたものである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
前記培地がさらにＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含有する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＳｅｌＣ１Ｄ（商標）又はそのプロドラッグが０．１μＭ〜１０．０μＭの濃度で存在する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグが１．０μＭの濃度で存在する、請求項８６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．導入
本発明は、哺乳動物幹細胞及び／又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法に関する。本発明の方法は、哺乳動物、特にヒト、幹細胞及び前駆細胞の分化及び成熟を、特定の細胞及び組織系統に調節及び制御するのに用いることができる。本発明の方法は、幹細胞集団の分化、特に分娩後の胎盤に由来する胚様幹細胞の分化を、特定の細胞及び組織系統にモジュレートするため、あるいは初期造血前駆細胞を、特定の分化経路、特に顆粒球分化経路にモジュレートするための、特定の有機小分子の使用に関する。本発明はまた、このような有機分子を使用して、ＣＤ３４＋、ＣＤ４５＋、及びＣＤ１３３＋前駆細胞などの、特定の前駆細胞系統の分化をモジュレートすることに関する。本発明はまた、前駆細胞の発達の時間的な態様、並びにそのような時間的な態様に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルに関する。本発明はさらに、予防及び治療方法におけるこのようなモジュレートされた細胞の使用に関するものであり、これには、かかる細胞及び／又は小さな有機化合物の医薬組成物における使用が含まれる。最後に、本発明は、移植及び他の医療処置におけるかかる分化細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
本願は、２００２年４月１２日出願の米国特許仮出願第６０／３７２，３４８号、２００２年５月３０日出願の同第６０／３８４，２５１号、２００２年１２月３１日出願の同第６０／４３７，３４８号、２００２年１２月３１日出願の同第６０／４３７，３５０号の優先権を主張するものであり、これら特許それぞれの全体を本明細書に援用する。
【０００３】
ヒトの幹細胞及び前駆細胞の同定、単離、及び生成には、かなりの関心が寄せられている。幹細胞は、様々な成熟細胞系統を生み出すことのできる全能性若しくは多能性前駆細胞であり、前駆細胞は、特定の細胞系統の細胞を生み出すことができる細胞である。このような能力は、臓器及び組織の発達に必要な、細胞の分化及び特殊化の基盤として働く。
【０００４】
最近、幹細胞及び前駆細胞の移植で成功が収められて、疾患を原因とする骨髄切除や、毒性の化学物質及び／若しくは放射線への暴露の後に、骨髄を再構築及び／又は補充するための新しい臨床手段がもたらされた。さらに、幹細胞を用いると、すべてではないにしても多くの組織を再増殖させ、生理学的及び解剖学的な機能性を回復させることができることを証明する証拠が存在する。幹細胞の、組織工学、遺伝子治療送達及び細胞治療学への応用も急速に進歩している。
【０００５】
数多くの種々の型の哺乳動物及び前駆幹細胞が特性決定されている。たとえば、胚幹細胞、胚生殖細胞、成体幹細胞若しくは単分化能幹細胞、又は前駆細胞が知られている。ある種の幹細胞は、単離及び特性決定がなされていないだけでなく、限られた程度まで分化を可能にする条件下での培養も行われていない。しかし、造血前駆細胞など、幹細胞や前駆細胞の分化を調節又は制御するのが困難であるという根本的な問題が残っている。目下、このような細胞の分化をモジュレートする現存する方法は、未完成であり、統制できないので、細胞は、望ましくない時期に望ましくない細胞型へと分化する。その上、細胞産物の収率は概して低い。
【０００６】
さらに、治療又は研究の目的に十分な数のヒト幹細胞を得ることが問題となる。成体組織中に正常に存在する幹細胞又は前駆細胞集団の単離は、一部には、血液又は組織中に見られる幹細胞又は前駆細胞の質が限られており、骨髄吸引液を得るのにかなりの不快が伴うために、技術的に困難であり、コスト高である。一般に、代替供給源から、治療及び研究目的に十分な量の幹細胞及び前駆細胞を回収することは、たとえば、ドナー被験体又は患者からの細胞又は組織の採取、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の培養及び／又は増殖、解剖などを含み、一般に労力を有する。特に幹細胞については、流産児を含む胚組織又は胎児組織からこうした細胞を調達することが、宗教的・倫理的な懸念を浮上させている。ヒトの胚及び胎児は、独立した生命であるという広く抱かれている信条が、医学的研究を含むすべての目的でのそのような供給源の使用に対する政府の規制を後押ししてきた。したがって、幹細胞の臨床での使用をさらに進歩させるために、胚組織又は胎児組織から調達した細胞を使わずに済む代替の供給源が求められている。しかし、幹細胞又は前駆細胞、特にヒトの幹細胞又は前駆細胞の、見込みのある代替供給源はほとんどなく、したがって、供給は限られている。
【０００７】
Ｈｕら（「Methods of isolation, cryopreservation, and therapeutic use of human aminiotic epithelial cells」と題された、２０００年１２月７日公開のＷＯ００／７３４２１号）は、分娩時に胎盤から得たヒト羊水上皮細胞を単離し、培養し、将来の使用に備えて凍結保存したこと、又は分化を誘導したことを開示している。Ｈｕらによれば、分娩後速やかに胎盤を採取し、羊水の膜を、たとえば切開によって漿膜から分離する。標準の細胞単離技術に従って、羊水の膜から羊水上皮細胞を単離する。開示された細胞は、様々な培地で培養し、培養中に増殖させ、凍結保存し、又は分化を誘導することができる。Ｈｕらは、羊水上皮細胞は、多分化能をもち（おそらくは多能性である）、角膜表面の上皮や膣上皮などの上皮組織へと分化し得ることを開示している。しかし、この方法の欠点は、かなり手間がかかり、幹細胞の収率が非常に低いことである。
【０００８】
現在利用可能な、細胞集団をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させる方法も、かなり労力を要する。たとえば、Ｅｍｅｒｓｏｎら（Emersonらの「Methods and compositions for the ex vivo replication of stem cells, for the optimization of hematopoietic progenitor cell cultures, and for increasing the metabolism; GM-CSF secretion and/or IL-6 secretion of human stromal cells」と題された、２００１年１２月４日出願の米国特許第６，３２６，１９８号）は、ヒト幹細胞画分をｅｘ  ｖｉｖｏで培養するための方法及び培地条件、並びに／又はヒト造血前駆細胞の最適化を開示している。開示された方法によれば、骨髄由来のヒト幹細胞又は前駆細胞を液体培地で培養し、培地を取り替えるが、好ましくは、約２４時間〜約４８時間毎に培養物１ｍｌあたり培地１ｍｌの速度で、連続的又は定期的に灌流を行う。代謝産物を除去し、生理的に許容される条件下で培養物を維持している間に添加した栄養素を消耗させる。
【０００９】
Ｋｒａｕｓら（Krausら、「Selective expansion of target cell populations」と題された、２００２年１月１５日出願の米国特許第６，３３８，９４２号）は、臍帯血又は末梢血からの出発細胞サンプルを増殖培地に導入し、標的細胞集団の細胞を分裂させ、増殖培地中の細胞を、予め決定された細胞集団（ＣＤ３４細胞など）に対して特異的な親和性のある結合分子（ＣＤ３４に対するモノクローナル抗体など）を含む選択成分と接触させて、増殖培地中の他の細胞から、予め決定された標的集団の細胞を選択することによって、予め決定された標的細胞集団を選択的に増殖させることができることを開示している。
【００１０】
Ｒｏｄｇｅｒｓら（「Method for promoting hematopoietic and mesenchymal cell proliferation and differentiation」と題された、２００２年１月１日出願の米国特許第６，３３５，１９５号）は、造血幹細胞及び間葉幹細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで培養する方法、並びに、単独又は他の増殖因子及びサイトカインと組み合わせたアンジオテオシノーゲン、アンジオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片及びその類似体、アンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片若しくはその類似体、又はＡＩＩＡＴ２２型受容体アゴニストの存在下で増殖させることによって、系統特異的な細胞の増殖及び分化を誘導する方法を開示している。幹細胞は、骨髄、末梢血、又は臍帯血由来である。しかし、この方法の欠点は、上で述べたように、幹細胞の増殖及び分化を誘導するためのｅｘ  ｖｉｖｏでの方法に時間がかかること、また幹細胞の収率も低くなることである。
【００１１】
幹細胞及び前駆細胞は、悪性腫瘍、先天的な代謝障害、異常血色素症、及び免疫不全を含む様々な疾患の治療に使用できる可能性を秘めている。臍帯血又は胎盤由来の幹細胞を用いる用途及び研究の一大領域は、そうした細胞を使用して、骨髄移植及び関連する他の移植用に少量の細胞を生成することである。しかし、これまで、ヒトＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞などの幹細胞又は前駆細胞をかなりの数で産生する方法は記載されていない。特に、大量の前駆細胞によって、前駆細胞を使用する治療方法が容易になるはずである。本明細書に開示する本発明の方法は、この要求に対処するものである。
【００１２】
ビタミンＡやレチノイン酸（ＲＡ）などのレチノイド類は、幹細胞の分化に影響を及ぼすことが知られている。たとえば、レチノイン酸は、異常化した（慢性骨髄性白血病）造血幹細胞の増殖を抑制し（Nadkarniら、1984年、Tumori第70巻:503〜505ページ）、前骨髄球性白血病細胞の分化を誘導し、潜在的自己再生能力を失わせる（Melchnerら、1985年、Blood第66巻(6):1469〜1472ページ）ことがわかっている。レチノイン酸は、胚幹細胞からのニューロンの分化を誘導し、中胚葉の自発的な分化を抑制することもわかっている（Slagerら、Dev. Genet.1993年、第14巻(3):212〜24ページ、Rayら、1997年、J. Biol. Chem.第272巻(30):18702〜18708ページ）。レチノイン酸はさらに、形質転換した生殖細胞前駆体（Damjanovら、1993年、Labor.Investig.第68巻(2):220〜232ページ）、胎盤細胞前駆体（Yanら、2001年、Devel.Biol.第235巻:422〜432ページ）、及び内皮細胞前駆体（Hatzopoulosら、1998年、Development第125巻:1457〜1468ページ)の分化を誘導することもわかっている。しかし、分化に対するレチノイン酸の作用は、幹細胞の分化を制御する調節可能な手段として使用できる程には、まだ完全に理解されていない。
【００１３】
造血幹細胞の分化に対する、アミノプテリンやアメトプテリン（メトトレキサート)などの葉酸類似体の作用が研究されている。葉酸類似体は、急性リンパ芽球性貧血及び他の血液増殖障害、並びに癌では化学療法剤として使用され、幹細胞のいくらかの集団を死滅させることによって、幹細胞の分化に影響を及ぼすことがわかっており（DeLoiaら、1998年、Human Reproduction第13巻(4):1063〜1069ページ)、したがって、大量の幹細胞の分化を調節するために患者に投与する有効な手段にはならないはずである。
【００１４】
幹細胞の造血系統では、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１などの数種のサイトカイン、並びにエリスロポエチン、Ｋｉｔリガンド、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなどのタンパク質が、幹細胞を特定の細胞型へと直接に分化させることがわかっているが（Dushnik-Levinsonら、1995年、Biol.Neonate第67巻:77〜83ページ）、しかし、このような過程は、十分に理解されておらず、幹細胞の分化を制御する調節可能な手段を実現するにはまだあまりに粗末で不正確なままである。
【００１５】
これまで、幹細胞又は前駆細胞を分化させるのに、以下で論じるＰＤＥ ＩＶ阻害剤などの化合物を使用することは報告されていない。特に、この種の化合物を使用して、ＣＤ３４＋前駆細胞などの前駆細胞の分化を、樹状細胞系統から外してモジュレートすること、すなわち移植免疫寛容性の助長に有用となり得ることは実証されていない。同様に、そのような細胞を含有する医薬組成物を製造するために、本明細書に記載の化合物を使用して前駆細胞集団を増殖させることも報告されていない。そのような増殖させた前駆細胞の培養物は、移植片対宿主疾患を治療し、免疫寛容性を発現させるのに有用なはずである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
幹細胞及び前駆細胞の分化を制御すると、治療上有用な細胞集団が産生されるので、樹状細胞及び／又は顆粒球の産生を制御するために、ヒトＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞などの骨髄系樹状細胞系統又は初期前駆細胞の細胞分化を制御及び調節できることが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
３．発明の概要
本発明は、哺乳動物、特にヒトの幹細胞又は前駆細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。特に、本発明の方法を用いると、ヒト幹細胞の分化及び成熟を、特定の細胞及び組織系統に調節及び制御することができる。本発明は、ＰＤＥ ＩＶ阻害剤、特にＳｅｌＣＩＤ系（Ｃｅｌｇｅｎｅ）として知られている化合物のクラスを使用して、そのような調節及び制御を行うことを含む。本発明はさらに、そのような化合物を、特定の時期に前駆細胞に投与して、特定の様式にその分化をモジュレートすることを企図する。
【００１８】
本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の、間葉、造血、脂肪生成、肝臓形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋形成、軟骨形成、又は骨形成系統が含まれるがこれに限定されるものではない、特定の細胞系統への分化の調節を含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞の造血系統細胞への分化の調節を含む。
【００１９】
本発明は、単分化能細胞の特定の細胞型、たとえば間葉細胞、造血細胞、脂肪細胞、肝細胞、神経芽細胞、膠芽細胞、軟骨細胞、内皮細胞（ＥＣ）前駆体、筋細胞、軟骨細胞、又は骨芽細胞へのモジュレーションも含む。特定の実施形態では、本発明は、単分化能造血前駆細胞を、赤血球、血小板、又は好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、肥満細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、形質細胞などの白血球にモジュレートすることを含む。
【００２０】
別の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞の、造血系統、特にＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ４５＋造血系統の細胞への分化をモジュレートすること、並びにそのような細胞を含有する予防若しくは治療上有益な医薬組成物の製造方法に関する。別の具体的な実施形態では、本発明の方法は、初期前駆細胞の、樹状細胞系統若しくは顆粒球系統、内皮系統、又は心筋細胞系統の細胞への分化をモジュレートすることに関する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、前駆細胞の、造血系統、特に樹状細胞若しくは顆粒球系統、内皮系統、神経系統、又は心筋細胞系統への分化を調節する方法を提供する。具体的な実施形態では、前記前駆細胞は、ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞である。この調節は、培養中の前駆細胞を本発明の化合物と接触させて実施する。一実施形態では、前記化合物は、ＰＤＥ ＩＶ活性の阻害剤である。より具体的な実施形態では、前記化合物は、ＰＤＥ ＩＶ阻害剤である。より好ましくは、前記ＰＤＥ ＩＶ阻害剤は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）（以下の４．３節を参照のこと）である。
【００２２】
別の具体的な実施形態では、本発明の方法は、前駆細胞の樹状細胞への分化の抑制を含む。もう１つの具体的な実施形態では、本発明は、培養の最初の６日間、前駆細胞の分化をモジュレートして、その前駆細胞の増殖した培養物を作製する方法を提供する。別の実施形態では、本発明の方法は、初期前駆細胞の、顆粒球への発達の促進を含むが、これは、感染と闘うのに有用となり得る。顆粒球系統になる単分化能前駆細胞（ＣＤ１５＋細胞）を増加させると、癌の化学療法に最も一般的な用量制限的な毒性の表れである好中球減少及びそれに続く感染性の合併症を減じるのに使用できる可能性がある。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、樹状細胞の分化を抑制することができるが、これは、移植片対宿主疾患の影響を軽減するのに有用である。
【００２３】
本発明の化合物によってモジュレートされる本発明の前駆細胞は、移植（すなわち、造血系の再構成）に有用であり、正常な老化、心疾患、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病などの障害又は疾患の治療のために、代替細胞及び代替組織（膵臓、心臓、肝臓、腎臓、肝臓、脳、肺、膀胱、腸、筋肉の細胞など）の再生可能な供給源として再生医療で使用することができる。この細胞は、本発明の化合物の作用を媒介する細胞内の生化学経路の決定にも有用となる。このような細胞は、新薬及び毒素のスクリーニングを行って、たとえば、潜在的な抗癌薬の判定を行い、また出生の欠陥の原因を理解するなどにも有用であろう。
【００２４】
本発明の方法を使用すると、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制しながら、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成を増大させ、総コロニー形成単位生成を増強することができる。本発明の方法を使用すると、幹細胞、及びＣＤ３４＋前駆細胞などの前駆細胞の分化を調節することができるだけでなく、コロニー形成速度を刺激することもできるので、骨髄移植片生着の速度が向上して、造血幹細胞移植にかなりの利益がもたらされる。
【００２５】
本発明の方法によれば、臍帯血、胎盤、及び他の供給源から単離された幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、どんな哺乳動物幹細胞を使用することもできる。幹細胞は、任意の哺乳動物種、たとえばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サルなど、より好ましくはヒトから単離されたものでよい。幹細胞には、多能性細胞、すなわち完全な分化多様性を有し、自己再生可能であり、かつ組織内で休止若しくは静止状態に止まることのできる細胞が含まれるであろう。幹細胞には、多分化能細胞又は単分化能前駆細胞も含まれうる。好ましい一実施形態では、本発明は、満期胎盤内に存在し、又は満期胎盤によって後から産生される、生きた静止状態の多能性幹細胞である幹細胞を利用するが、すなわち、このような細胞は、出生及び胎盤の排出がうまく行われ、胎盤の瀉血及び灌流を行った後に回収することができ、その結果１０億個もの有核細胞が産生及び回収され、５千万〜１億個の多分化能幹細胞及び多能性幹細胞がもたらされる。この細胞は、本明細書では、ヒト胎盤幹細胞又は胚様幹細胞と呼ぶ。
【００２６】
本発明の具体的な一実施形態では、胚様幹細胞、ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞などの前駆細胞、多能性細胞、及び多分化能細胞が含まれるがこれに限定されるものではない細胞、たとえば骨髄又は灌流を行った分娩後胎盤に内在する細胞を本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。内因性細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることができる。別の実施形態では、内因性細胞は、胎盤及び培地から回収し、所望の細胞型又は系統への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。
【００２７】
本発明の別の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞を、臍帯血、末梢血、成体血などの他の供給源から得、本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。好ましい実施形態では、分化は、所望の系統又は細胞型への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。本発明の化合物は、添加による分化／培養培地、ｉｎ  ｓｉｔｕ産生、又は幹細胞若しくは前駆細胞と本発明の化合物との接触を可能にする他の任意の方法で使用する。
【００２８】
本発明の化合物を投与する時期は、ＣＤ３４＋前駆細胞の分化に対して甚大な影響を有することが発見されている。したがって、本発明の一実施形態では、培養初日の前駆細胞と本発明の化合物とを接触させることを含む方法によって、ＣＤ３４＋前駆細胞の樹状細胞への分化を遅延又は抑制する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを培養初日に接触させることを含む方法によって、ＣＤ１ａ＋細胞のＣＤ３４＋前駆細胞からの発達を低減又は阻止する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞を本発明の化合物の不在下で６日間培養した後に、前記前駆細胞と本発明の化合物とを接触させることによって、ＣＤ３４＋前駆細胞に由来するＣＤ１ａ＋細胞集団の存続を増進する。
【００２９】
本発明は、ヒトＣＤ３４＋細胞若しくはＣＤ１３３＋細胞などの初期前駆細胞の分化をモジュレートする方法であって、前駆細胞と１種又は複数の本発明の化合物とを、増殖期及び分化期中の様々な時期に接触させることを含む方法を包含する。従って、一実施形態では、本発明は、前駆細胞の分化をモジュレートする方法であって、前記細胞と１種又は複数の本発明の化合物とを培養初日のみ接触させることを含む方法を含む。別の実施形態では、培養初日と第１２日の間のいずれかの日に、前記細胞と単回用量の前記化合物とを接触させる。別の実施形態では、前記細胞と前記化合物とを、０〜１２日の間の異なる日に少なくとも２回接触させる。さらに別の実施形態では、前記細胞と１種又は複数の化合物とを、増殖期及び／又は分化期中の１日２回、１日１回、又は１日おきに１回接触させる。別の実施形態では、前記接触をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する。さらに別の実施形態では、前記接触を被験体においてｉｎ  ｖｉｖｏで実施する。より具体的な実施形態では、前記被験体は、ヒト、非ヒト哺乳動物、鳥、又は爬虫類である。
【００３０】
要するに、灌流を行った分娩後胎盤中で培養することのできる、内因性又は外因性の幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露することは、細胞を胎盤中で培養している間に行ってもよいし、あるいは好ましくは、細胞を胎盤から回収し、取り出した後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよい。
【００３１】
本発明は、ＰＤＥ ＩＶ阻害活性を有する化合物の、幹細胞及び／又は前駆細胞の発達のモジュレーターとしての使用を含む。具体的な実施形態では、この化合物は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎ）として知られているクラスの化合物などのＰＤＥ ＩＶ阻害剤である。
【００３２】
本発明はまた、疾患を治療又は予防するための、前処理した幹細胞又は前駆細胞の移植も含む。一実施形態では、本発明の化合物を、移植の必要のある患者にも、移植前、移植中、及び／又は移植後に投与する。
【００３３】
本発明はさらに、本発明の方法により生成される前駆細胞又は特定の細胞型の使用を含む。換言すれば、本発明は、造血前駆細胞を分化させて作製した白血球、顆粒球、又は樹状細胞の使用を含み、この場合には必ず、前駆細胞の前記分化が、本発明の化合物を使用してモジュレート又は調節されている。
【００３４】
他の実施形態では、本発明は、必要のある患者に本発明の幹細胞及び小分子化合物の両方を投与することによる、幹細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの制御又は調節を含む。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、培養の最初の６日間において前記前駆細胞の増殖及び分化を促進する条件下で、本発明の化合物、特にＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物と接触させておいたＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。具体的な実施形態では、医薬組成物は、培養してから６日後に回収し凍結保存しておいた細胞を含む。別の具体的な実施形態では、医薬組成物の細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３４−細胞又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３４＋細胞である。別の具体的な実施形態では、細胞と接触させる化合物は、本発明のＰＤＥ ＩＶ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、細胞と接触させる化合物は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）である。
【００３６】
別の実施形態では、本発明はまた、医薬組成物の製造方法であって、ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞とＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物とを接触させるステップであって、前記前駆細胞を、前記前駆細胞の増殖及び分化を可能にする培養条件下にて培地中で６日間培養するものである上記ステップ、培養して６日後に前記細胞を回収するステップ、前記細胞と薬学的に許容される担体を混合するステップを含む方法も提供する。この方法の具体的な実施形態では、前記接触ステップを培養初日に実施する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記接触ステップの前記６日間の培養中に少なくとも２回実施する。別の具体的な実施形態では、細胞と接触させる化合物は、本発明のＰＤＥ ＩＶ阻害剤である。別の具体的な実施形態では、細胞と接触させる化合物は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）である。この方法のさらに別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞は、前記培養の前に他の血液細胞から単離されたものである。この方法の別の具体的な実施形態では、前記培養培地がＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αをさらに含有する。この方法のより具体的な実施形態では、前記ＳｅｌＣＩＤ（商標）は、０．１μＭ〜１０．０μＭの濃度で存在する。この方法の別のより具体的な実施形態では、前記ＳｅｌＣＩＤ（商標）は、１．０μＭの濃度で存在する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記細胞を、前記回収ステップの後に凍結保存する。
【００３７】
本発明はさらに、哺乳動物被験体において前駆細胞集団を増殖させる方法であって、前記レシピエント哺乳動物被験体に、治療上有効な量のＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞と、１種又は複数のＳｅｌＣＩＤ（商標）を投与するステップを含む方法を提供する。この方法の具体的な実施形態では、前記前駆細胞を、レシピエント哺乳動物被験体中で分化させる。この方法の別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞を、赤血球を実質的に含まない細胞調製物の形態で前記被験体に投与する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞を、骨髄細胞、胎盤細胞、臍帯血細胞、又はＰＢＭＣを含む細胞調製物の形態でレシピエント哺乳動物被験体に投与する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞を、担体と共にレシピエント哺乳動物被験体に投与する。この方法の別の具体的な実施形態では、前記前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋前駆細胞である。この方法の別の具体的な実施形態では、前駆細胞は、組み込まれている目的の遺伝物質を発現するものである。
【００３８】
本発明は、上記方法によって産生される、医薬組成物として有用な細胞も提供する。
【００３９】
さらに他の実施形態では、本発明は、幹細胞又は前駆細胞、たとえばＣＤ３４＋前駆細胞を、凍結保存及び解凍後に順化させて（conditioning）、凍結保存及び凍結保存剤への暴露が幹細胞に及ぼす有害な影響を無効にする方法を含む。ある実施形態では、本発明は、幹細胞を、凍結保存及び解凍後に順化させて、凍結保存剤（たとえばＤＭＳＯ）への暴露が幹細胞の増殖及び遊走能力に及ぼす有害な影響を無効にする方法を提供する。
【００４０】
３．１．定義
本明細書では、用語「バイオリアクター」とは、細胞を増殖させ、生体材料を産生又は発現させ、細胞、組織、オルガノイド、ウイルス、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び微生物を増殖させ、又は培養するためのｅｘ  ｖｉｖｏ系を指す。
【００４１】
本明細書では、「ＤＣ細胞」とは、樹状細胞を指す。
【００４２】
本明細書では、「初期前駆細胞」とは、ＣＤ３４＋前駆細胞、ＣＤ１３３＋前駆細胞、又はこれらいずれかの哺乳動物、鳥類、若しくは爬虫類の等価物を意味する。
【００４３】
本明細書では、用語「胚幹細胞」とは、胚盤胞の内部細胞塊（たとえば、生後４〜５日のヒトの胚）に由来し、多能性である細胞を指す。
【００４４】
本明細書では、用語「胚様幹細胞（embryonic-like stem cell）」とは、胚盤胞の内部細胞塊由来ではない細胞を指す。本明細書では、「胚様幹細胞」を「胎盤幹細胞」と呼ぶこともある。胚様幹細胞は、多能性であることが好ましい。しかし、胎盤から得ることのできる幹細胞には、胚様幹細胞、多分化能細胞、単分化能前駆細胞が含まれる。本発明の方法においては、胎盤由来の胚様幹細胞は、残りの細胞を除去するのに十分な時間をかけてその瀉血及び灌流を行った後、分離した胎盤から回収することができる。胚様幹細胞は、いずれの哺乳動物に由来するものでもよいが、ヒトのものであることが好ましい。
【００４５】
本明細書では、用語「瀉血した」又は「瀉血」とは、胎盤に関して用いるとき、胎盤から実質的にすべての臍帯血を除去及び／又は排液することを指す。本発明においては、胎盤の瀉血は、たとえば、限定するものでないが、排液、重力による流出、マッサージ、圧搾、ポンピングなどによって実施することができる。好ましい実施形態では、胎盤の瀉血を助けるための、抗凝固剤などの薬剤を含有する又は含有しない流体を用い、胎盤の灌流、洗浄、又はフラッシングを行うことによって、さらに胎盤の瀉血を行ってもよい。
【００４６】
本明細書では、用語「灌流する」又は「灌流」とは、臓器又は組織に流体を注ぎ、又は流体を通過させる行為、好ましくは、臓器又は組織から残りの細胞、たとえば非付着細胞を除去するのに十分な力又は圧力をかけて臓器又は組織に液体を通す通過を指す。本明細書では、用語「灌流液」とは、臓器又は組織に通過させた後に回収した流体を指す。好ましい実施形態では、灌流液は、１種又は複数の抗凝固剤を含有する。
【００４７】
本明細書では、用語「内因性細胞」とは、「非外来」細胞、すなわち胎盤由来の「自己」若しくは自家細胞を指す。
【００４８】
本明細書では、用語「外因性細胞」とは、「外来」細胞、すなわち、異種細胞（すなわち、胎盤ドナー以外の供給源に由来する「非自己」細胞）又は胎盤以外の臓器若しくは組織に由来する自家細胞（すなわち、胎盤ドナーに由来する「自己」細胞）を指す。
【００４９】
本明細書では、「ＰＤＥ ＩＶ阻害剤」とは、以下の第４．３節で開示する化合物を指す。
【００５０】
本明細書では、用語「オルガノイド」とは、表面的な外観又は実際の構築物中に集まった、哺乳動物の身体、好ましくはヒトの身体の臓器又は腺としての、１種又は複数の細胞型の集合を指す。
【００５１】
本明細書では、用語「多分化能細胞（multipotent cell）」とは、哺乳動物身体の細胞型約２６０種のうちの任意のサブセットにも生育できる能力を有する細胞を指す。多能性細胞と異なり、多分化能細胞は、すべての細胞型を生成する能力をもたない。
【００５２】
本明細書では、用語「多能性細胞（pluripotent cell）」とは、完全な分化多様性、すなわち哺乳動物身体の細胞型約２６０種のいずれにも生育できる能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、自己再生することができ、組織内で休止若しくは静止状態に止まることができる。全能性細胞（たとえば、受精した二倍体卵細胞）と異なり、胚幹細胞は、通常は新しい胚盤胞を生成することができない。
【００５３】
本明細書では、用語「前駆細胞」とは、特定の型の細胞に分化することになっているか、又は特定の種類の組織を形成する細胞を指す。
【００５４】
本明細書では、用語「幹細胞」とは、無期限に再生して、組織及び臓器の特殊化した細胞を生成することのできる親細胞を指す。幹細胞は、発生に関して多能性又は多分化能である細胞である。幹細胞は、分裂して、２個の娘幹細胞、又は１個の娘細胞及び１個の前駆（「遷移」）細胞を産生することができ、次いで前駆細胞が増殖して、各組織の成熟した、完全に形作られた細胞になる。
【００５５】
本明細書では、用語「全能性細胞」とは、完全な胚（たとえば、胚盤胞）を生成することのできる細胞を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
４．発明の詳細な説明
本発明は、一部には、幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露すると、幹細胞若しくは前駆細胞の、特定の前駆細胞集団への分化、あるいは前駆細胞の、樹状細胞、顆粒球、内皮細胞、神経細胞などの特定の細胞型への分化を制御する調節可能な手段になるという予想外の知見に基づく。特に、幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露すると、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋、及びＣＤ１３３＋細胞を含む特定の造血細胞集団の分化及び増殖が調節可能になる。このような分化の調節は、細胞死のために収率がかなり損失したり、あるいは望ましくない細胞型又は細胞系統に分化したりすることなく実現されるが、換言すれば、本発明の化合物は、１種又は複数の細胞集団のアポトーシスを引き起こさない。さらに、造血前駆細胞を本発明の化合物に暴露すると、特定の細胞型の分化及び増殖が調節可能になる。
【００５７】
したがって、本発明は、ヒト幹細胞の分化、具体的にはＣＤ３４＋造血前駆細胞及びＣＤ１３３＋前駆細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。特に、本発明は、ＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する有機小分子を用いて、前駆細胞集団の分化を、特定の細胞及び組織系統にモジュレートする方法を提供する。さらに、本発明は、哺乳動物、鳥類、又は爬虫類に移植するための、ヒトＣＤ１３３＋又はＣＤ３４＋、特にＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞などの初期前駆細胞を増殖させる方法であって、造血前駆細胞をＰＤＥ  ＩＶの阻害剤又は拮抗剤に暴露するステップを含み、前記阻害剤又は拮抗剤が小分子である、上記方法を包含する。本発明は、脳、腎臓、腸管、及び筋肉の細胞を含むがこれに限定されるものではない、これら初期前駆細胞に由来する他の細胞型の製造方法も提供する。本発明の化合物は、ヒトＣＤ３４＋前駆細胞などの初期前駆細胞からの、樹状細胞への分化を抑制し、顆粒球への分化を促進する機能を有する。
【００５８】
本発明と共に使用することができる小分子化合物の例には、これに限定されるものではないが、ＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物が含まれうる。本発明の方法で使用しうる化合物を、第４．３節で詳細に述べる。特に好ましい実施形態では、その化合物は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ）である。
【００５９】
本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の、間葉、造血、脂肪生成、肝臓形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋形成、軟骨形成、又は骨形成系統が含まれるがこれに限定されるものではない特定の細胞系統への分化の調節を包含し、これは、前記幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物と共に、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、前記細胞が所望の細胞系統の細胞に分化するのに十分な時間にわたりインキュベートするステップを含む。具体的な実施形態では、幹細胞又は前駆細胞の、造血系統の細胞への分化をモジュレートする。特に、本発明の方法を使用すると、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ４５＋造血前駆細胞からの血球コロニーの生成を用量依存的にモジュレートすることができる。
【００６０】
本発明の方法は、ＣＤ３４＋前駆細胞の樹状細胞への分化の調節を含み、これは、前記前駆細胞を本発明の化合物と共に、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、前記細胞が所望の細胞系統の細胞に分化するのに十分な時間にわたりインキュベートするステップを含む。具体的な実施形態では、そのような前駆細胞の、樹状細胞系統の細胞への分化は、前記細胞とＰＤＥ ＩＶ阻害剤、特にＳｅｌＣＩＤ（商標）、又はその阻害剤若しくはＳｅｌＣＩＤ（商標）の類似体若しくはプロドラッグとを接触させることによってモジュレートされる。別の具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞の分化を、骨髄系統への分化を抑制し、顆粒球系統への分化を促進するようにモジュレートする。より具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞の、顆粒球系統の細胞への分化を、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを、前記前駆細胞を培養する初日に接触させるステップを含む方法によってモジュレートする。
【００６１】
本発明の方法においては、臍帯血から単離した幹細胞（「ＣＢ」細胞）、胎盤から単離した幹細胞、及び他の供給源から単離した幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではないいずれの哺乳動物幹細胞又は前駆細胞をも使用することができる。幹細胞には、多能性細胞、すなわち完全な分化多様性を有し、自己再生し、組織内で休止若しくは静止状態に止まることのできる細胞が含まれうる。幹細胞には、多分化能細胞又は単分化能前駆細胞も含まれうる。好ましい一実施形態では、本発明は、満期胎盤内に存在する、生きた静止状態の多能性幹細胞を使用するが、すなわち、このような細胞は、出生及び胎盤の排出がうまく行われ、瀉血及び灌流を行った後に回収することができ、その結果、多分化能幹細胞及び多能性幹細胞が回収される。
【００６２】
好ましい別の実施形態では、前駆細胞は、初期前駆細胞、特にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞である。ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞は、ヒト骨髄、胎盤、又は臍帯血由来であることが好ましい。他の哺乳動物に由来する、これら細胞の等価物を使用してもよい。たとえば、マウスでは、Ｓｃａ＋前駆細胞を本発明の方法に使用することができる。鳥類又は爬虫類に由来する等価な初期前駆細胞を使用してもよい。
【００６３】
本発明の特定の実施形態では、胚様幹細胞、前駆細胞、多能性細胞、及び多分化能細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、胎盤に内因性の細胞、又は灌流を行った分娩後胎盤によって産生された細胞を、分離し灌流が行われた胎盤中で培養する間に本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。灌流を行った分娩後胎盤中で増殖させた内因性細胞を回収してもよいし及び／又は灌流液、培地、若しくは胎盤細胞自体から生理活性分子を回収してもよい。
【００６４】
本発明の別の実施形態では、分娩後胎盤以外の供給源に由来する幹細胞又は前駆細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する間に本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。したがって、本発明は、哺乳動物幹細胞を特定の前駆細胞に分化させるための方法であって、前記幹細胞を、所望の分化に適する条件下及び／若しくは培地中で、かつ本発明の化合物の存在下で分化させるステップを含む方法を包含する。
【００６５】
さらに、本発明は、特定の前駆細胞集団の、特定の細胞型への分化をモジュレート又は調節するための方法であって、前記前駆細胞を、前記分化に適する条件下、かつ１種又は複数の本発明の化合物の存在下で分化させるステップを含む方法を包含する。あるいは、幹細胞又は前駆細胞を本発明の化合物に暴露し、その後適切な条件を使用して分化させることができる。適切な条件の例には、ヒト血清を添加した栄養培地調製物、及び増殖因子を添加したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）などの細胞培養基質が含まれる。
【００６６】
本発明の方法は、前駆細胞と本発明の化合物とを、培養中の増殖期又は分化期のいずれかの様々な時期に接触させることによって、異なる細胞集団を製造することができることを企図するものでもある。以下の第４．４節、詳細には第４．４．２節を参照されたい。
【００６７】
具体的な実施形態では、本発明は、造血前駆細胞の移植前の順化（conditioning）に関連して、小分子、特にＰＤＥ ＩＶ阻害剤、好ましくはＳｅｌＣＩＤ若しくはそのプロドラッグを用いて、造血をモジュレート又は調節する方法を提供する。
【００６８】
本発明は、造血前駆細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの順化に関連して、本発明の小分子を用いて、造血をモジュレート及び調節する方法も提供する。本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化の調節であって、幹細胞又は前駆細胞を化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートするステップと、その後分化した細胞を被験体に直接に移植するステップを含む、上記調節を包含する。
【００６９】
本発明はまた、必要とする患者に、本発明の幹細胞若しくは前駆細胞と化合物の両方を投与することによる、幹細胞又は前駆細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの制御又は調節を包含する。
【００７０】
本発明はさらに、疾患を治療又は予防するための、前処理幹細胞又は前駆細胞の移植を含む。一実施形態では、移植の必要のある患者に、移植前、移植中、及び／又は移植後に本発明の化合物を投与する。別の実施形態では、移植の必要のある患者に、未処理幹細胞又は前駆細胞、たとえば臍帯血細胞、成体血細胞、末梢血細胞、又は骨髄細胞を投与する。別の実施形態では、本発明の方法は、既に移植された幹細胞に対するモジュレート作用を誘発する目的で、順化させていない幹細胞又は前駆細胞のレシピエントである被験体に化合物を投与することを含む。
【００７１】
ある実施形態では、本発明は、骨髄移植であって、臍帯血（又は臍帯血から得た幹細胞）、末梢（すなわち生体）血（又は末梢血から得た幹細胞）を移植することを含み、前記臍帯血又は幹細胞が本発明の化合物で前処理したものである、上記骨髄移植を含む。さらに、本発明は、本発明の化合物の存在下で分化させた造血前駆細胞から生成された白血球の使用を含む。たとえば、造血前駆細胞を分化させて生成した白血球を、移植に使用したり、あるいは、移植に先立って臍帯血又は臍帯血幹細胞と混合することができる。
【００７２】
他の実施形態では、本発明は、骨髄移植であって、本発明の方法に従って得た、ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞などの初期前駆細胞の移植を含み、前記前駆細胞が本発明の化合物で前処理したものである、上記骨髄移植を含む。本発明の一実施形態では、前記樹状細胞の前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞である。さらに、本発明は、本発明の化合物の存在下で分化させたＣＤ３４＋前駆細胞から生成された細胞の使用を含む。たとえば、本発明の化合物を使用してＣＤ３４＋前駆細胞を分化させることによって生成されたＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋前駆細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞、顆粒球などを移植に使用することができる。本発明の化合物を使用してＣＤ１３３＋細胞から分化させた細胞も、本発明に含まれる。
【００７３】
本発明はさらに、凍結保存及び解凍後に幹細胞を順化させて、凍結保存及び凍結保存剤への暴露が幹細胞に及ぼす有害な影響を無効にする方法を含む。ある実施形態では、本発明は、凍結保存及び解凍後に幹細胞を順化させて、凍結保存剤（たとえばＤＭＳＯ）への暴露が幹細胞の増殖及び遊走能力に及ぼす有害な影響を無効にする方法を提供する。
【００７４】
４．１．幹細胞及びＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞の分化のモジュレーション
４．１．１．幹細胞
本発明は、ヒト幹細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調節を含み、これは、前記幹細胞を化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接に移植することを含むものである。他の実施形態では、本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ  ｖｉｖｏでの調節を含み、これは、順化させていない幹細胞のレシピエントである被験体に化合物を送達した後、その被験体に化合物を直接に投与することを含むものである。
【００７５】
本発明の方法によって得られる胚様幹細胞は、間葉、造血、脂肪生成、肝臓形成、神経形成、神経膠形成、軟骨形成、血管形成、筋形成、軟骨形成、又は骨形成系統が含まれるがこれに限定されるものではない特定の細胞系統への分化を誘導することができる。
【００７６】
ある実施形態では、移植及びｅｘ  ｖｉｖｏの治療プロトコルでの使用のために、本発明の方法に従って得た胚様幹細胞の分化を誘導する。ある実施形態では、本発明の方法によって得た胚様幹細胞を特定の細胞型に分化させ、さらに遺伝子の改変を行って、治療用の遺伝子産物を得る。具体的な実施形態では、本発明の方法によって得た胚様幹細胞を、有機小分子など、この細胞の分化を誘導する化合物と共にインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植する。好ましい実施形態では、幹細胞の分化を制御又は調節するのに使用する化合物は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない。
【００７７】
本発明において使用しうる幹細胞には、臍帯血（ＣＢ）細胞、胎盤細胞、胚幹（ＥＳ）細胞、胚様幹細胞、栄養芽幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、並びに多分化能、多能性、及び全能性細胞が含まれるがこれに限定されるものではない。
【００７８】
特に、本発明の方法は、幹細胞集団、さらには間葉幹細胞の、特定の組織系統への分化の調節を含む。たとえば、本発明の方法を用いると、特定の筋骨格の再生及び修復、血管新生；心筋や骨格筋など、特定の筋肉組織の再増殖、並びに脳、脊髄、肝臓、肺、腎臓、及び膵臓が含まれるがこれに限定されるものではない様々な臓器及び組織の血管再生の促進によって、多分化能幹細胞の、軟骨形成、血管形成、筋形成、及び骨形成系統の細胞への分化を調節することができる。本発明の方法を用いて、多分化能幹細胞の、脂肪生成、軟骨形成、骨形成、神経形成、又は肝臓形成系統の細胞への分化を調節することができる。
【００７９】
分化のモジュレートに使用する薬剤を、灌流を行った分娩後胎盤に導入して、胎盤中で培養されている細胞の分化を誘導することができる。あるいは、細胞を胎盤から回収又は取り出した後、この薬剤を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化をモジュレートすることができる。
【００８０】
本発明の方法は、前駆幹細胞の、造血系統の細胞への分化の調節を含み、これは、前駆幹細胞を、化合物と共に、その細胞が造血系統に分化するのに十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートすることを含むものである。特に、本発明の方法を使用すると、ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋、及びＣＤ４５＋造血前駆細胞からの血球コロニーの生成を、用量依存的にモジュレートすることができる（用量についての説明は、第４．７節を参照のこと）。
【００８１】
本発明の方法を使用して、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制し、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成を増大させ、総コロニー形成単位生成を増強することが好ましい。本発明の方法を使用すると、幹細胞の分化を調節することができるだけでなく、コロニー形成速度を刺激することもできるので、骨髄移植片の生着速度並びに白血球及び／又は血小板生成の回復が向上して、造血幹細胞移植にかなりの利益がもたらされる。
【００８２】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、たとえば、ニューロン前駆細胞又は神経芽細胞の、感覚ニューロン（たとえば、網膜細胞、嗅細胞、機械感覚ニューロン、化学受容性ニューロンなど）、運動ニューロン、皮質ニューロン、又は介在ニューロンなど、特定のニューロン細胞型への分化を調節することができる。他の実施形態では、本発明の方法を使用して、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、グリア細胞（ミエリンを産生する乏突起膠細胞）、及び（脳室系に沿って並ぶ）上衣細胞を含むがこれに限定されるものではない細胞型の分化を調節することができる。さらに他の実施形態では、本発明の方法を使用して、心臓のプルキンエ細胞、肝臓の胆管上皮細胞、膵臓の膵島β細胞、腎皮質若しくは腎髄質細胞、及び眼の網膜光受容体を含むがこれに限定されるものではない、臓器を構成する細胞の分化を調製することができる。
【００８３】
本発明の方法に従って得た幹細胞の分化状態の評価については、細胞表面マーカーの存在によって特定することができる。本発明の胚様幹細胞は、たとえば、細胞表面マーカーのＯＣＴ−４＋及びＡＢＣ−ｐｔによって識別することができる。さらに、本発明は、上述のように、胚様幹細胞で、ＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４、ＯＣＴ−４、及びＡＢＣ−ｐのマーカーを有するもの、又はＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４の細胞表面マーカーを欠損するものを含む。このような細胞表面マーカーは、当技術分野で周知の方法に従って、たとえばフローサイトメトリーの後に、洗浄し、抗細胞表面マーカー抗体で染色することによって常法どおりに決定する。たとえば、ＣＤ３４又はＣＤ３８の有無を判定するために、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、抗ＣＤ３４フィコエリトリン及び抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（ベクトンディッキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンヴュー）で二重染色することができる。
【００８４】
４．１．２．ＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋初期前駆細胞
本発明は、ヒトＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、幹細胞を化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植することを含む、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調節を含む。
【００８５】
本発明の方法によって得た前駆細胞は、ＣＤ３４＋前駆細胞では骨髄若しくは顆粒球系統、及びＣＤ１３３＋細胞では内皮若しくは神経細胞系統を含むがこれに限定されるものではない、特定の細胞系統に分化させることができる。ある実施形態では、移植及びｅｘ  ｖｉｖｏ治療プロトコルでの使用のために前駆細胞の分化を誘導する。ある実施形態では、前駆細胞の特定の細胞型への分化を誘導し、また前駆細胞に遺伝子改変を行って、治療用の遺伝子産物を得る。特定の実施形態では、前駆細胞を、有機小分子など、この細胞の分化を誘導する化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植する。好ましい実施形態では、幹細胞の分化を制御又は調節するのに使用する化合物は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない。別の好ましい実施形態では、前駆細胞をＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞に分化させる。
【００８６】
本発明の方法を使用して、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制し、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成を増大させ、総コロニー形成単位生成を増強することが好ましい。本発明の方法を使用すると、幹細胞の分化を調節することができるだけでなく、コロニー形成速度を刺激することもできるので、骨髄移植片の生着速度、並びに白血球及び／又は血小板生成の回復が向上して、造血幹細胞移植にかなりの利益がもたらされる。
【００８７】
他の実施形態では、本発明の方法を使用して、ＣＤ３４＋前駆細胞の、ＣＤ１ａ＋細胞、特にＣＤ８６＋ＣＤ１ａ＋細胞への分化を低減することができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、ＣＤ３４＋前駆細胞の、ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−細胞への分化を低減又は抑制することができる。ＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−細胞は、皮膚の樹状細胞又は単球／マクロファージの前駆細胞である。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、増殖性のＣＤ３４＋前駆細胞上での共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を低減することができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、増殖性ＣＤ３４＋前駆細胞の、ＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔ細胞への分化を低減し、ＣＤ５４ｄｉｍ細胞への分化を促進することができる。別の実施形態では、本発明の方法を使用して、内皮細胞の前駆細胞であるＣＤ１３３＋細胞数を増加させることができる。さらに別の実施形態では、本発明の方法を使用して、増殖性ＣＤ３４＋細胞の、ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１５＋細胞への分化を低減し、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１５−細胞への分化を増大させることができ、すなわち骨髄樹状細胞系統から顆粒球系統へと分化をシフトさせることができる。
【００８８】
本発明の方法に従って得た幹細胞の分化状態の評価については、細胞表面マーカーの存在によって特定することができる。本発明の前駆細胞は、たとえば、ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋細胞表面マーカーによって識別することができる。さらに、本発明は、上述のように、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、若しくはＣＤ５４ｄｉｍのうちの１種又は複数のマーカーを有するか、又はその発現が対照よりも増大を示す増殖性前駆細胞を含む。本発明はさらに、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ３８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔ、若しくはＣＤ１４のうちの１種又は複数のマーカーを欠損するか、又はその発現が対照よりも低減を示す増殖性前駆細胞を含む。好ましい実施形態では、本発明の増殖性前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−を示す。このような細胞表面マーカーは、当技術分野で周知の方法に従って、たとえば、洗浄し、抗細胞表面マーカー抗体で染色し、その後フローサイトメトリーを行うことによって常法どおりに決定する。たとえば、ＣＤ３４又はＣＤ３８の有無を判定するには、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで、抗ＣＤ３４フィコエリトリン及び抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（ベクトンディッキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンヴュー）で二重染色することができる。
【００８９】
ある実施形態では、分化した細胞の貪食能の特性決定ことによって、分化した細胞の特性決定を行うことができる。分化した、又は分化途中の細胞の貪食能は、たとえば、デキストランをＦＩＴＣで標識し、既知の方法によって取り込み量を測定して評価することができる。分化した、又は分化途中の細胞のＴ細胞刺激能は、抗原担持細胞を推定に基づきＴ細胞と混合し、Ｔ細胞の活性化レベルを測定するという混合白血球反応（ＭＬＲ）で評価することができる。
【００９０】
４．１．３．細胞の同定及び特性決定
ある実施形態では、示差的に発現される遺伝子の特性決定（たとえば、目的の未分化前駆細胞の遺伝子プール対その前駆細胞由来の分化した細胞の遺伝子プールの特性決定）によって、分化した細胞を同定することができる。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅法、転写に基づく増幅法（たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ））を使用すると、たとえばポリヌクレオチドマイクロアレイを使用して、異なる細胞集団の遺伝子発現のプロファイリングを行うことができる。示差的な遺伝子発現をプロファイリングする方法は、当技術分野で周知である（たとえば、Wielandら、Proc.Natl.Acad:Sci.USA第87巻:2720〜2724ページ(1990年)；Lisitsynら、Science第259巻:946〜951ページ(1993年)；Lisitsynら、Meth.Enzymology第254巻:291〜304ページ(1995年)；米国特許第５，４３６，１４２号；米国特許第５，５０１，９６４号；Lisitsynら、Nature Genetics第6巻:57〜63ページ(1994年)；Hubank及びSchatz、1994年、Nucleic Acids Research第22巻:5640〜5648ページ；Zengら、1994年、Nucleic Acids Research第22巻:4381〜4385ページ；米国特許第５，５２５，４７１号；「RNA amplification method」と題された、Linsleyら、２００１年８月７日発行の米国特許第６，２７１，００２号；「Processes for genetic manipulations using promoters」と題された、Van Gelderら、１９９８年２月１０日発行の米国特許第５，７１６，７８５号；Stofletら、1988年、Science第239巻:491〜494ページ、1988年；Sarkar及びSommer、1989年、Science第244巻:331〜334ページ；Mullisら、米国特許第４，６８３，１９５号；Malekら、米国特許第５，１３０，２３８号；Kacian及びFultz、米国特許第５，３９９，４９１号；Burgら、米国特許第５，４３７，９９０号；R. N Van Gelderら(1990年)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第87巻、1663ページ；D.J.Lockhartら、1996年、Nature Biotechnol.第14巻、1675ページ；Shannon、米国特許第６，１３２，９９７号；「Procedure for subtractive hybridization and difference analysis」と題された、Lindemannら、２００１年５月２２日公開の米国特許第６，２３５，５０３号を参照のこと）。
【００９１】
市販のキット、たとえば、遺伝子発現のプロファイリングにゲルに基づく手法を使用するｄｉｓｐｌａｙＰＲＯＦＩＬＥ（商標）シリーズのキット（Qbiogene、米国カリフォルニア州Carlsbad）を遺伝子プロファイリングに利用できる。このキットは、制限断片長示差的表示ＰＣＲ（ＲＦＤＤ−ＰＣＲ）を利用して、真核生物細胞の遺伝子発現パターンを比較するものである。ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用することもできるが、そうすると、サブトラクトされたライブラリー中で、示差的に発現されたクローンの同定が可能になる。ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎキットを用い、示差的に発現された遺伝子のプールを作製した後、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇキットを使用する。サブトラクトされたライブラリーに、テスター集団及びドライバー集団から直接に合成したプローブ、サブトラクトしたｃＤＮＡから作製したプローブ、及び逆サブトラクト（逆に実施した２回目のサブトラクト）したｃＤＮＡから作製したプローブをハイブリダイズさせる。テスタープローブにハイブリダイズするが、ドライバープローブにはハイブリダイズしないクローンが示差的に発現されるが、しかし、サブトラクトしたものでないプローブは、わずかなメッセージを検出するには感度が十分ではない。サブトラクトしたプローブは、示差的に発現されたｃＤＮＡに非常に富むが、偽陽性の結果を与えることもある。製造者（Clontech）の指示に従って、サブトラクトしたプローブとサブトラクトしたものでないプローブの両方を使用すると、示差的に発現された遺伝子が同定される。
【００９２】
別の実施形態では、Ｍｅｓｅｎ  Ｃｕｌｔ（商標）培地（Stem Cell Technologies,Inc.、カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）など、当技術分野で一般に知られているコロニー形成単位アッセイによって、分化した幹細胞又は前駆細胞の同定及び特性決定を行う。
【００９３】
幹細胞又は前駆細胞が、特定の細胞型に分化したかどうかの判定は、当技術分野で周知の方法によって、たとえば、フローサイトメトリー又は免疫細胞化学（たとえば、組織特異的又は細胞マーカー特異的な抗体を用いた染色）などの技術を使用して、形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することによって、あるいは光学若しくは共焦点顕微鏡法を使用して細胞の形態を調べることによって、あるいはＰＣＲや遺伝子発現プロファイリングなど、当技術分野で周知の技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって実施することができる。
【００９４】
４．２．幹細胞及び前駆細胞集団
本発明は、ヒト幹細胞の分化をモジュレートする方法を提供する。臍帯血から単離された幹細胞（ＣＢ細胞）、末梢血、成体血、骨髄、胎盤、間葉幹細胞、及び他の供給源から単離された幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、任意の哺乳動物幹細胞を本発明の方法の範囲内で使用することができる。好ましくない実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞、又は胎盤以外の供給源から単離された細胞である。
【００９５】
間葉幹細胞の供給源には、骨髄、胚卵黄嚢、胎盤、臍帯、胎児及び青年の皮膚、及び血液が含まれる。骨髄細胞は、たとえば、腸骨稜、大腿、脛骨、脊椎、肋骨、又は他の髄質の空間から得ることができる。
【００９６】
本発明の方法に従って使用することになる幹細胞には、多能性細胞、すなわち完全な分化多様性を有し、自己再生性であり、組織内で休止若しくは静止状態に止まることのできる細胞が含まれうる。幹細胞には、多分化能細胞、単分化能前駆細胞、及び線維芽細胞も含まれうる。好ましい一実施形態では、本発明は、瀉血及び灌流を行った満期胎盤から単離した、生きた静止状態の多能性幹細胞である幹細胞を利用する。
【００９７】
幹細胞集団は、商業的サービス、たとえば、LifeBank USA（米国ニュージャージー州Cedar Knolls）、ViaCord（米国マサチューセッツ州ボストン）、Cord Blood Registry（米国カリフォルニア州サンブルーノ）、及びCryocell（米国フロリダ州クリアウォーター）を通して入手した胎盤幹細胞からなっていてよい。
【００９８】
幹細胞集団は、「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００２年９月５日公開の米国特許出願公開第２００２０１２３１４１号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００３年２月１３日公開の米国特許出願公開第２００３００３２１７９号で開示されている方法に従って回収した胎盤幹細胞からなっていてもよい（両特許の全体を参照により本明細書に援用する）。
【００９９】
一実施形態では、臍帯血由来の幹細胞を使用してよい。胎盤から最初に回収した血液を臍帯血と呼ぶが、これは、主にＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋造血前駆細胞を含んでいる。分娩後灌流を行って最初の２４時間以内に、胎盤から高濃度のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を単離することができる。灌流を行って約２４時間後には、前述の細胞と共に、高濃度のＣＤ３４−ＣＤ３８−細胞を胎盤から単離することができる。単離され、灌流を行った本発明の胎盤は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−幹細胞及びＣＤ３４−ＣＤ３８＋幹細胞に富む大量の幹細胞の供給源となる。単離された胎盤に２４時間以上灌流を行ったものは、ＣＤ３４−及びＣＤ３８−幹細胞に富む大量の幹細胞の供給源となる。
【０１００】
本発明に従って使用する好ましい細胞は、瀉血及び灌流を行った胎盤に由来する胚様幹細胞、又は胎盤胚様幹細胞に由来する細胞である。本発明の胚様幹細胞は、フローサイトメトリー及び免疫細胞化学などの技術を使用して形態及び細胞表面マーカーの変化を測定し、またＰＣＲなどの技術を使用して遺伝子発現の変化を測定することによって特性決定することができる。本発明の一実施形態では、このような胚様幹細胞は、細胞表面マーカーＣＤ１０、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ９０、ＳＨ２、ＳＨ３、ＳＨ４、ＯＣＴ−４、及びＡＢＣ−ｐが存在すること、又は細胞表面マーカーＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４が存在しないことによって特性決定することができる。好ましい実施形態では、こうした胚様幹細胞は、細胞表面マーカーＯＣＴ−４及びＡＰＣ−ｐの存在によって特性決定することもできる。このような細胞表面マーカーは、当技術分野で周知の方法に従って、たとえば、フローサイトメトリーの後に、洗浄し、抗細胞表面マーカー抗体で染色することによって常法どおりに決定する。たとえば、ＣＤ３４又はＣＤ３８細胞の有無を判定するには、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次いで抗ＣＤ３４フィコエリトリン及び抗ＣＤ３８フルオレセインイソチオシアネート（ベクトンディッキンソン、米国カリフォルニア州マウンテンヴュー）で二重染色することができる。
【０１０１】
胎盤に由来する胚様幹細胞は、胚幹細胞の特徴を有するが、胚由来ではない。換言すれば、本発明は、灌流を行った分娩後胎盤から単離される未分化の幹細胞であるＯＣＴ−４＋及びＡＢＣ−ｐ＋細胞の使用を含む。この種の細胞は、ヒト胚幹細胞と同じく多様性（たとえば多能性）である。上述のように、灌流を行った胎盤から、異なる時期に、数種の異なる多能性若しくは多分化能幹細胞、たとえば、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、及びＣＤ３４−ＣＤ３８−造血細胞を単離することができる。本発明の方法においては、出産後のヒト胎盤を、胚様幹細胞の供給源として使用する。
【０１０２】
たとえば、胎盤は、アポトーシスを防止し、又は最小に抑えるために、子宮から排出された後できるだけ速く瀉血を行う。続いて、瀉血後できるだけ速やかに胎盤に灌流を行って、血液、残りの細胞、タンパク質、諸因子、及び臓器中に存在する他の物質を除去する。また、胎盤から壊死組織片を除去する。灌流は、通常、適切な灌流液を用いて少なくとも２時間〜２４時間以上続ける。幾例かの追加の実施形態では、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、及び２２時間にわたり胎盤の灌流を行う。換言すれば、本発明は、少なくとも一部には、十分な時間にわたり瀉血及び灌流を行うことによって、分娩後胎盤の細胞を活性化することができるという知見に基づく。したがって、胎盤は、胚様幹細胞の高品位で豊富な供給源として容易に使用でき、この胚様幹細胞を、薬物の発見、疾患の治療及び予防、特に移植手術又は移植療法、並びに単分化能細胞、組織、及びオルガノイドの生成を含む研究に使用することができる。「Method of Collecting Placental Stem Cells」と題された、２００１年１２月５日出願の同時係属出願第１０／００４，９４２号、及び「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００２年２月１３日出願の出願第１０／０７６，１８０号を参照されたい。これら両出願の全体を参照により本明細書に援用する。
【０１０３】
胚様幹細胞は、臍動脈及び臍静脈のどちらか又は両方を利用する灌流技術によって、排液処置した胎盤から抽出する。胎盤には、残った血液（たとえば、残った臍帯血）の瀉血及び回収によって排液処置を施すことが好ましい。次いで、排液処置した胎盤を、その中に実質組織及び血管外空間内に存在する残りの胚様幹細胞が補充されるｅｘ  ｖｉｖｏの自然のバイオリアクター環境が確立されるように処理する。胚様幹細胞は、排液処置された空の微小循環へと遊走し、本発明の方法により、そこで、好ましくは灌流によって回収容器に洗い流すことにより、その幹細胞を回収する。
【０１０４】
本発明の一部として特に企図するのは、ＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋前駆細胞が骨髄細胞、特に樹状細胞又は顆粒球になるのをモジュレートすることである。最近の報告では、そのような細胞が多能性であることが示されているので、本発明は、これらの前駆細胞の、脳、腎臓、腸管、肝臓、又は筋肉の細胞への発達をモジュレートすることも企図する。
【０１０５】
臍帯血から単離された幹細胞（ＣＢ細胞）、末梢血、成体血、骨髄、灌流を行った胎盤（「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、その全体が参照により本明細書に援用される２００３年２月１３日公開の米国特許出願公開第２００３００３２１７９号を参照のこと）を含む胎盤、間葉幹細胞、及び他の供給源から単離された幹細胞が含まれるがこれに限定されるものではない、任意の哺乳動物、鳥類、又は爬虫類のＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋幹細胞又は前駆細胞を、本発明の範囲内で使用することができる。好ましい実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞、又は骨髄から単離された細胞である。この種の細胞は、他の臓器又は組織から得ることもできるが、そのような供給源はそれほど好ましくない。
【０１０６】
一実施形態では、臍帯血又は分娩後胎盤由来の前駆細胞を使用することができる。上述のように、臍帯血は、主にＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋造血前駆細胞を含んでいる。分娩後灌流の最初の２４時間以内では、単離され、灌流を行った胎盤から、高濃度のＣＤ３４＋ＣＤ３８−造血前駆細胞を単離することができる。灌流を行って約２４時間後には、前述の細胞と共に、高濃度のＣＤ３４−ＣＤ３８−細胞を胎盤から単離することができる。別の実施形態では、商業的サービス、たとえば、LifeBank USA（米国ニュージャージー州Cedar Knolls）、ViaCord（米国マサチューセッツ州ボストン）、Cord Blood Registry（米国カリフォルニア州サンブルーノ）、及びCryocell（米国フロリダ州クリアウォーター）を通じて前駆細胞集団を入手してもよい。
【０１０７】
４．３．本発明の化合物
本発明で使用する化合物には、ラセミ体、立体異性体として純粋な、又は一方の立体異性体を多量に含む（stereomerically enriched）、選択的サイトカイン阻害薬、立体異性体又はエナンチオマーとして純粋な、選択的サイトカイン阻害活性を有する化合物、並びにその薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、多形体、及びプロドラッグが含まれる。本発明で使用する好ましい化合物は、既知のCelgene社製の選択的サイトカイン阻害薬（Selective Cytokine Inhibitory Drug；ＳｅｌＣＩＤ（商標））である。
【０１０８】
特に指摘しない限り、本明細書で使用する用語「ＳｅｌＣＩＤ（商標）」は、小分子薬物、たとえばペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ糖、又は他の高分子ではない有機小分子を含む。好ましい化合物は、ＴＮＦ−αの産生を阻害する。さらにまた、化合物は、ＬＰＳ誘導型ＩＬ１β及びＩＬ１２に対してわずかな阻害作用を有してもよい。本発明の化合物は、強力なＰＤＥ４阻害剤であることがより好ましい。ＰＤＥ４は、ヒトの骨髄及びリンパ系統細胞中に見られる主要なホスホジエステラーゼアイソザイムの１つである。この酵素は、偏在する二次メッセンジャーｃＡＭＰを分解し、その細胞内レベルを低く維持することによって、細胞活性の調節で非常に重要な役割を担っている。特定の理論に拘泥するものではないが、ＰＤＥ４活性を抑制すると、ｃＡＭＰレベルが増大し、ＬＰＳ誘導型サイトカインがモジュレートされるようになり、単球及びリンパ球中でのＴＮＦ−α産生の阻害がモジュレートされる。
【０１０９】
選択的サイトカイン阻害薬の具体的な例には、限定されるものではないが、米国特許第５，６０５，９１４号で開示されている環状イミド類、それぞれ米国特許第５，７２８，８４４号及び同第５，７２８，８４５号のシクロアルキルアミド類及びシクロアルキルニトリル類、米国特許第５，８０１，１９５号及び同第５，７３６，５７０号のアリールアミド類（たとえば、具体的にはＮ−ベンゾイル−３−アミノ−３−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−プロパンアミドである）、米国特許第５，７０３，０９８号で開示されているイミド／アミドエーテル類及びアルコール類（たとえば、３−フタルイミド−３−（３’，４’−ジメトキシフェニル）プロパン−１−オール）、米国特許第５，６５８，９４０号で開示されているスクシンイミド類及びマレイミド類（たとえば、３−（３’，４’，５’６’−ペトラヒドロフタルイミド）−３−（３’’，４’’−ジメトキシフェニル）プロピオン酸）メチル、ＷＯ９９／０６０４１号で開示されているイミド及びアミド置換アルカノヒドロキサム酸類、及び米国特許第６，０２０，３５８号で開示されている置換フェネチルスルホン類、並びに米国特許第６，０４６，２２１号に記載のＮ−ベンゾイル−３−アミノ−３−（３’，４’−ジメトキシフェニル）プロパンアミドなどのアリールアミド類が含まれる。本明細書で特定したそれぞれの特許及び特許出願は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【０１１０】
他の選択的サイトカイン阻害薬は、合成化学化合物のファミリーに属し、その具体例には、３−（１，３−ジオキソベンゾ−［ｆ］イソインドール−２−イル）−３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）プロピオンアミド及び３−（１，３−ジオキソ−４−アザイソインドール−２−イル）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−プロピオンアミドが含まれる。
【０１１１】
他の具体的な選択的サイトカイン阻害薬は、共に本明細書に援用する米国特許第５，６９８，５７９号及び第５，８７７，２００号で開示されている非ポリペプチド環状アミドのクラスに属する。代表的な環状アミドとしては、次式の化合物：
【化１】
2005522215.tif 000002
【０１１２】
［式中、
ｎは、１、２、又は３の値を有し、
Ｒ５は、非置換の、又はニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、１〜１０個の炭素原子からなるアルキル、１〜１０個の炭素原子からなるアルキル、及びハロからなる群よりそれぞれ独立して選択される１〜４個の置換基で置換された、ｏ−フェニレンであり、
Ｒ７は、（ｉ）フェニル、又はニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、１〜１０個の炭素原子からなるアルキル、１〜１０個の炭素原子からなるアルコキシ、及びハロからなる群よりそれぞれ他とは独立して選択される１若しくは複数の置換基で置換されたフェニル、（ｉｉ）非置換の、又はニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、１〜１０個の炭素原子からなるアルキル、１〜１０個の炭素原子からなるアルコキシ、及びハロからなる群より選択される１〜３個の置換基で置換された、ベンジル、（ｉｉｉ）ナフチル、並びに（ｉｖ）ベンジルオキシであり、
Ｒ１２は、−ＯＨ、１〜１２個の炭素原子からなるアルコキシ、又は次式：
【化２】
2005522215.tif 000003
【０１１３】
であり、
Ｒ８は、水素、又は１〜１０個の炭素原子からなるアルキルであり、
Ｒ９は、水素、１〜１０個の炭素原子からなるアルキル、−ＣＯＲ１０、又はＳＯ２Ｒ１０であり、ここでＲ１０は、水素、１〜１０個の炭素原子からなるアルキル、又はフェニルである。］
が挙げられる。
【０１１４】
このクラスの具体的な化合物には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：
３−フェニル−２−（１−オキソイソインドリン−２−イル）プロピオン酸；
３−フェニル−２−（１−オキソイソインドリン−２−イル）プロピオンアミド；
３−フェニル−３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）プロピオン酸；
３−フェニル−３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）プロピオンアミド；
３−（４−メトキシフェニル）−３−（１−オキソイソインドリン（oxisoindolin）−イル）プロピオン酸；
３−（４−メトキシフェニル）−３−（１−オキソイソインドリン−イル）プロピオンアミド；
３−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）プロピオン酸；
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−（１−オキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−イル）−プロピオンアミド；
３−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）プロピオンアミド；
３−（３，４−ジエトキシフェニル）−３−（１−オキソイソインドリン−イル）プロピオン酸；
メチル３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）−３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）プロピオネート；
３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）−３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）プロピオン酸；
３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）−３−（３−プロポキシ−４−メトキシフェニル）プロピオン酸；
３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）−３−（３−ブトキシ−４−メトキシフェニル）プロピオン酸；
３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）−３−（３−プロポキシ−４−メトキシフェニル）プロピオンアミド；
３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）−３−（３−ブトキシ−４−メトキシフェニル）プロピオンアミド；
メチル３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）−３−（３−ブトキシ−４−メトキシフェニル）プロピオネート；及び
メチル３−（１−オキソイソインドリン−２−イル）−３−（３−プロポキシ−４−メトキシフェニル）プロピオネート。
【０１１５】
他の具体的な選択的サイトカイン阻害薬としては、参照により本明細書に援用するＷＯ９９／０６０４１号で開示されているイミド及びアミドで置換されたアルカノヒドロキサム酸が挙げられる。そのような化合物の例としては、限定されるものではないが、次式：
【化３】
2005522215.tif 000004
【０１１６】
［式中、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、互いに独立して、水素、低級アルキルであり、あるいはＲ１及びＲ２は、それぞれが結合する炭素原子と一緒に、非置換であるか、又はニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、１〜１０個の炭素原子からなるアルキル、１〜１０個の炭素原子からなるアルコキシ、及びハロからなる群よりそれぞれ独立して選択される１〜４個の置換基で置換された、ｏ−フェニレン、ｏ−ナフチレン、又はシクロヘキセン−１，２−ジイルであり、
Ｒ３は、ニトロ、シアノ、トリフルオロメチル、カルボエトキシ、カルボメトキシ、カルボプロポキシ、アセチル、カルバモイル、アセトキシ、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、１〜１０個の炭素原子からなるアルキル、１〜１０個の炭素原子からなるアルコキシ、１〜１０個の炭素原子からなるアルキルチオ、ベンジルオキシ、３〜６個の炭素原子からなるシクロアルコキシ、Ｃ４〜Ｃ６−シクロアルキリデンメチル、Ｃ３〜Ｃ１０−アルキリデンメチル、インダニルオキシ、及びハロからなる群より選択される１〜４個の置換基で置換されたフェニルであり、
Ｒ４は、水素、１〜６個の炭素原子からなるアルキル、フェニル、又はベンジルであり、
Ｒ４’は、水素、又は１〜６個の炭素原子からなるアルキルであり、
Ｒ５は、−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＯ−、−ＳＯ２−、−Ｓ−、又はＮＨＣＯ−であり、
ｎは、０、１、又は２の値を有する。］
並びに、プロトン化することのできる窒素原子を含有する前記化合物の酸付加塩が挙げられる。
【０１１７】
本発明で使用される別の具体的な選択的サイトカイン阻害薬には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：
３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−（１−オキソイソインドリニル）プロピオンアミド；
３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−メトキシ−３−（１−オキソイソインドリニル）プロピオンアミド；
Ｎ−ベンジルオキシ−３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−３−フタルイミドプロピオンアミド；
Ｎ−ベンジルオキシ−３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−３−（３−ニトロフタルイミド）プロピオンアミド；
Ｎ−ベンジルオキシ−３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−３−（１−オキソイソインドリニル）プロピオンアミド；
３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−フタルイミドプロピオンアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−フタルイミドプロピオンアミド；
３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−（３−ニトロフタルイミド）プロピオンアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−（１−オキソイソインドリニル）プロピオンアミド；
３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−（４−メチル−フタルイミド）プロピオンアミド；
３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−フタルイミドプロピオンアミド；
３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−（１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｆ］イソインドール−２−イル）プロピオンアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−３−｛３−（２−プロポキシ）−４−メトキシフェニル｝−３−フタルイミドプロピオンアミド；
３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−３−（３，６−ジフルオロフタルイミド）−Ｎ−ヒドロキシプロピオンアミド；
３−（４−アミノフタルイミド）−３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシプロピオンアミド；
３−（３−アミノフタルイミド）−３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシプロピオンアミド；
Ｎ−ヒドロキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−（１−オキソイソインドリニル）プロピオンアミド；
３−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−３−（１−オキソイソインドリニル）プロピオンアミド；及び
Ｎ−ベンジルオキシ−３−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−３−（３−ニトロフタルイミド）プロピオンアミド。
【０１１８】
本発明で使用する別の選択的サイトカイン阻害薬には、フェニル基がオキソイソインジン基で置換されている置換フェネチルスルホンが含まれる。そのような化合物の例としては、それに限定されるものではないが、本明細書に援用する米国特許第６，０２０，３５８号で開示されているものが挙げられ、それには、次式：
【化４】
2005522215.tif 000005
【０１１９】
［式中、
＊で示す炭素原子は、キラル中心となり、
Ｙは、Ｃ＝Ｏ、ＣＨ２、ＳＯ２、又はＣＨ２Ｃ＝Ｏであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４はそれぞれ、他とは独立して、水素、ハロ、１〜４個の炭素原子からなるアルキル、１〜４個の炭素原子からなるアルコキシ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、又はＮＲ８Ｒ９であり、あるいは、隣接する炭素原子上のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のいずれか２個が、記されているフェニレン環と一緒にナフチリデンとなり、
Ｒ５及びＲ６はそれぞれ、他とは独立して、水素、１〜４個の炭素原子からなるアルキル、１〜４個の炭素原子からなるアルコキシ、シアノ、又は最高で１８個の炭素原子からなるシクロアルコキシであり、
Ｒ７は、ヒドロキシ、１〜８個の炭素原子からなるアルキル、フェニル、ベンジル、又はＮＲ８’Ｒ９’であり、
Ｒ８及びＲ９はそれぞれ、他とは独立して、水素、１〜８個の炭素原子からなるアルキル、フェニル、又はベンジルであり、あるいはＲ８及びＲ９の一方が水素であり、他方が−ＣＯＲ１０又はＳＯ２Ｒ１０であり、あるいはＲ８とＲ９が一緒に、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、又はＣＨ２ＣＨ２Ｘ１ＣＨ２ＣＨ２−（ここで、Ｘ１は、−Ｏ−、−Ｓ−、又はＮＨ−である）となり、
Ｒ８’及びＲ９’はそれぞれ、他とは独立して、水素、１〜８個の炭素原子からなるアルキル、フェニル、又はベンジルであり、あるいはＲ８’及びＲ９’の一方が水素であり、他方が−ＣＯＲ１０’又はＳＯ２Ｒ１０’であり、あるいはＲ８’とＲ９’が一緒に、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、又はＣＨ２ＣＨ２Ｘ２ＣＨ２ＣＨ２−（ここで、Ｘ２は、−Ｏ−、−Ｓ−、又はＮＨ−である）となる。］
が含まれる。
【０１２０】
上記化合物は、便宜上フェネチルスルホン類と特定するが、Ｒ７がＮＲ８’Ｒ９’である場合には上記化合物にスルホンアミド類も含まれることを理解されたい。
【０１２１】
この種の化合物の具体的な群は、ＹがＣ＝Ｏ又はＣＨ２である化合物である。
【０１２２】
この種の化合物のさらに具体的な群は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４がそれぞれ、他とは独立して、水素、ハロ、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシ、又はＮＲ８Ｒ９（ここで、Ｒ８及びＲ９はそれぞれ、他とは独立して、水素又はメチルであり、あるいはＲ８及びＲ９の一方が水素であり、他方が−ＣＯＣＨ３である）である化合物である。
【０１２３】
特定の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの１個が−ＮＨ２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の残りが水素である化合物である。
【０１２４】
特定の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの１個が−ＮＨＣＯＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の残りが水素である化合物である。
【０１２５】
特定の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの１個が−Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の残りが水素である化合物である。
【０１２６】
この種の化合物のさらに好ましい群は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの１個がメチルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の残りが水素である化合物である。
【０１２７】
特定の化合物は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のうちの１個がフルオロであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の残りが水素である化合物である。
【０１２８】
特定の化合物は、Ｒ５及びＲ６がそれぞれ、他とは独立して、水素、メチル、エチル、プロピル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、シクロペントキシ、又はシクロヘキソキシである化合物である。
【０１２９】
特定の化合物は、Ｒ５がメトキシであり、Ｒ６がモノシクロアルコキシ、ポリシクロアルコキシ、及びベンゾシクロアルコキシである化合物である。
【０１３０】
特定の化合物は、Ｒ５がメトキシであり、Ｒ６がエトキシである化合物である。
【０１３１】
特定の化合物は、Ｒ７がヒドロキシ、メチル、エチル、フェニル、ベンジル、又はＮＲ８’Ｒ９’（ここで、Ｒ８’及びＲ９’はそれぞれ、他とは独立して、水素又はメチルである）である化合物である。
【０１３２】
特定の化合物は、Ｒ７がメチル、エチル、フェニル、ベンジル、又はＮＲ８’Ｒ９’（ここで、Ｒ８’及びＲ９’はそれぞれ、他とは独立して、水素又はメチルである）である化合物である。
【０１３３】
特定の化合物は、Ｒ７がメチルである化合物である。
【０１３４】
特定の化合物は、Ｒ７がＮＲ８’Ｒ９’（ここで、Ｒ８’及びＲ９’はそれぞれ、他とは独立して、水素又はメチルである）である化合物である。
【０１３５】
他の具体的な選択的サイトカイン阻害薬には、その全体が参照により本明細書に援用されるＧ．Ｍｕｌｌｅｒらの２００２年１２月３０日出願の米国特許仮出願第６０／４３６，９７５号に示されるフルオロアルコキシ置換１，３−ジヒドロ−イソインドリル化合物が含まれる。代表的なフルオロアルコキシ置換１，３−ジヒドロ−イソインドイル化合物としては、次式の化合物：
【化５】
2005522215.tif 000006
【０１３６】
［式中、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２−、又はＳＯ２であり、
Ｚは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、−（Ｃ０〜１−アルキル）−ＳＯ２−（Ｃ１〜４−アルキル）、−Ｃ１〜８−アルキル、−ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２（Ｏ）（Ｃ１〜８−アルキル）、又はＣＮであり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、−ＣＨＦ２、−Ｃ１〜８−アルキル、−Ｃ３〜１８−シクロアルキル、又は（Ｃ１〜１０−アルキル）（Ｃ３〜１８−シクロアルキル）であり、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方はＣＨＦ２であり、
Ｒ３は、−ＮＲ４Ｒ５、−アルキル、−ＯＨ、−Ｏ−アルキル、フェニル、ベンジル、置換フェニル、又は置換ベンジルであり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、−Ｈ、−Ｃ１〜８−アルキル、−ＯＨ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、
Ｒ６は、−Ｃ１〜８−アルキル、−アミノ（Ｃ１〜８−アルキル）、−フェニル、−ベンジル、又はアリールであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、それぞれ独立して、−Ｈ、−ハロゲン、−ニトロ、−ＮＨ２、−ＣＦ３、−Ｃ１〜６−アルキル、−（Ｃ０〜４−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−（Ｒ８）、（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ７Ｒ８）、（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｒ７Ｒ８）、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＯＲ８、（Ｃ０〜４−アルキル）イミダゾリル、（Ｃ０〜４−アルキル）−ピロリル、（Ｃ０〜４−アルキル）−オキサジアゾリル、又は（Ｃ０〜４−アルキル）−トリアゾリルであり、あるいはＸ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のうちの２個は、一緒に、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキル環を形成していてよく（たとえば、Ｘ１とＸ２、Ｘ２とＸ３、Ｘ３とＸ４、Ｘ１とＸ３、Ｘ２とＸ４、又はＸ１とＸ４が、芳香族であってもよい３員、４員、５員、６員若しくは７員環を形成し、それによってイソインドリル環と二環系を形成していてよい）、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜９−アルキル、Ｃ３〜６−シクロアルキル、（Ｃ１〜６−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、（Ｃ１〜６−アルキル）−Ｎ（Ｒ７Ｒ８）、（Ｃ１〜６−アルキル）−ＯＲ８、フェニル、ベンジル、又はアリールである。］
又は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、多形体、若しくはプロドラッグが挙げられる。
【０１３７】
好ましい化合物には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：
３−（４−アセチルアミノ−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）−プロピオン酸；
３−（４−アセチルアミノ−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロピオンアミド；
３−（４−アセチルアミノ−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）−プロピオンアミド；
３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）−３−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−プロピオン酸；
３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）−３−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド；
３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）−３−（７−ニトロ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−プロピオン酸メチルエステル；
３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）−３−（７−ニトロ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−プロピオン酸；
３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル−３−（７−ニトロ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロピオンアミド；
３−（７−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（３−シクロプロピルメトキシ−４−ジフルオロメトキシ−フェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロピオンアミド；
３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−３−（７−ニトロ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−プロピオン酸メチルエステル；
３−（７−アミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−プロピオン酸メチルエステル；
３−［７−（シクロプロパンカルボニル−アミノ）−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−プロピオン酸メチルエステル；
３−（７−アセチルアミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−プロピオン酸メチルエステル；
３−（７−アセチルアミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−プロピオン酸；
３−［７−（シクロプロパンカルボニル−アミノ）−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル］−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−プロピオン酸；
シクロプロパンカルボン酸｛２−［２−カルバモイル−１−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−エチル］−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝−アミド；
シクロプロパンカルボン酸｛２−［１−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−２−ジメチルカルバモイル−エチル］−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝−；
シクロプロパンカルボン酸｛２−［１−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−２−ヒドロキシカルバモイル−エチル］−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝−アミド；
３−（７−アセチルアミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−プロピオンアミド；
３−（７−アセチルアミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロピオンアミド；
３−（７−アセチルアミノ−１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド；
３−（４−アセチルアミノ−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−プロピオン酸；
３−（４−アセチルアミノ−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−プロピオンアミド；
３−（４−アセチルアミノ−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−プロピオンアミド；
３−（４−アセチルアミノ−１，３−ジオキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−３−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−Ｎ−ヒドロキシ−プロピオンアミド；
シクロプロパンカルボン酸｛２−［１−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−２−メタンスルホニル−エチル］−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝−アミド；
Ｎ−｛２−［１−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−２−メタンスルホニル−エチル］−１，３−ジオキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝−アセトアミド；及び
シクロプロパンカルボン酸｛２−［２−カルバモイル−１−（４−ジフルオロメトキシ−３−エトキシ−フェニル）−エチル］−７−クロロ−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝−アミド。
【０１３８】
他の選択的サイトカイン阻害薬としては、参照により本明細書に援用されるＧ．Ｍｕｌｌｅｒらの２００３年３月１２日出願の米国特許仮出願第６０／４５４，１５５号に示される７−アミド−置換イソインドリル化合物が挙げられる。
【０１３９】
代表的な７−アミノ−置換イソインドリル化合物としては、次式の化合物：
【化６】
2005522215.tif 000007
【０１４０】
［式中、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、又はＳＯ２であり、
ＸはＨであり、
Ｚは、（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ１〜４−アルキル、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＯＨ、（Ｃ１〜４−アルキル）−Ｏ（Ｃ１〜４−アルキル）、（Ｃ１〜４−アルキル）−ＳＯ２（Ｃ１〜４−アルキル）、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＳＯ（Ｃ１〜４−アルキル）、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＮＨ２、（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｎ（Ｃ１〜８−アルキル）２、（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｎ（Ｈ）（ＯＨ）、ＣＨ２ＮＳＯ２（Ｃ１〜４−アルキル）であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜８−アルキル、シクロアルキル、又は（Ｃ１〜４−アルキル）シクロアルキルであり、
Ｒ３は、ＮＲ４Ｒ５、ＯＨ、又はＯ−（Ｃ１〜８−アルキル）であり、
Ｒ４はＨであり、
Ｒ５は、−ＯＨ又はＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜８−アルキル、アミノ−（Ｃ１〜８−アルキル）、（Ｃ１〜８−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、Ｃ３〜６シクロアルキル、フェニル、ベンジル、又はアリールである。］
又は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、多形体、若しくはプロドラッグ、
あるいは次式の化合物：
【化７】
2005522215.tif 000008
【０１４１】
［式中、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、又はＳＯ２であり、
Ｘは、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＲ７Ｒ８、−ＮＯ２、又はＣＦ３であり、
Ｗは、
【化８】
2005522215.tif 000009
【０１４２】
であり、
Ｚは、（Ｃ０〜４アルキル）−ＳＯ２（Ｃ１〜４−アルキル）、−（Ｃ０〜４−アルキル）−ＣＮ、−（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｃ（Ｏ）Ｒ３、Ｃ１〜４−アルキル、（Ｃ０〜４−アルキル）ＯＨ、（Ｃ０〜４−アルキル）Ｏ（Ｃ１〜４−アルキル）、（Ｃ０〜４−アルキル）ＳＯ（Ｃ１〜４−アルキル）、（Ｃ０〜４−アルキル）ＮＨ２、（Ｃ０〜４アルキル）Ｎ（Ｃ１〜８−アルキル）２、（Ｃ０〜４−アルキル）Ｎ（Ｈ）（ＯＨ）、又は（Ｃ０〜４−アルキル）ＮＳＯ２（Ｃ１〜４−アルキル）であり、
Ｗは、−Ｃ３〜６−シクロアルキル、−（Ｃ１〜８−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、−（Ｃ０〜８−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）−ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ０〜８−アルキル）ＮＲ７Ｒ８、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＣＨＲ９−（Ｃ０〜４−アルキル）−ＮＲ７Ｒ８であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜８−アルキル、シクロアルキル、又は（Ｃ１〜４−アルキル）シクロアルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ１〜８−アルキル、ＮＲ４Ｒ５、ＯＨ、又はＯ−（Ｃ１〜８−アルキル）であり、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜８−アルキル、（Ｃ０〜８−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、ＯＨ、又はＯＣ（Ｏ）Ｒ６であり、
Ｒ６は、Ｃ１〜８−アルキル、（Ｃ０〜８−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、アミノ−（Ｃ１〜８−アルキル）、フェニル、ベンジル、又はアリールであり、
Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜８−アルキル、（Ｃ０〜８アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、フェニル、ベンジル、アリールであり、あるいは、これらを結合する原子と一緒に、３〜７員のヘテロシクロアルキル又はヘテロアリール環を形成していてもよく、
Ｒ９は、Ｃ１〜４−アルキル、（Ｃ０〜４−アルキル）アリール、（Ｃ０〜４−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、（Ｃ０〜４−アルキル）ヘテロシクルである。］
又は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、多形体、若しくはプロドラッグが挙げられる。
【０１４３】
さらに他の選択的サイトカイン阻害薬としては、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＧ．Ｍｕｌｌｅｒらの２００３年３月１２日出願の米国特許仮出願第６０／４５４，１４９号に示されるＮ−アルキル−ヒドロキサム酸−イソインドリル化合物が挙げられる。代表的なＮ−アルキル−ヒドロキサム酸−イソインドリル化合物には、次式の化合物：
【化９】
2005522215.tif 000010
【０１４４】
［式中、
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ２、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、又はＳＯ２であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１〜８−アルキル、ＣＦ２Ｈ、ＣＦ３、ＣＨ２ＣＨＦ２、シクロアルキル、又は（Ｃ１〜８アルキル）シクロアルキルであり、
Ｚ１は、Ｈ、Ｃ１〜６−アルキル、−ＮＨ２−ＮＲ３Ｒ４、又はＯＲ５であり、
Ｚ２は、Ｈ又はＣ（Ｏ）Ｒ５であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、ＮＯ２、ＯＲ３、ＣＦ３、Ｃ１〜６−アルキル、（Ｃ０〜４−アルキル）−（Ｃ３〜６−シクロアルキル）、（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｎ−（Ｒ８Ｒ９）、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＮＨＣ（Ｏ）−（Ｒ８）、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（Ｒ８）（Ｒ９）、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８Ｒ９）、（Ｃ０〜４−アルキル）−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ（Ｒ８）、（Ｃ０〜４−アルキル）−Ｏ−Ｒ８、（Ｃ０〜４−アルキル）−イミダゾリル、（Ｃ０〜４−アルキル）−ピロリル、（Ｃ０〜４−アルキル）−オキサジアゾリル、（Ｃ０〜４−アルキル）−トリアゾリル、又は（Ｃ０〜４−アルキル）−ヘテロシクルであり、
Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜６−アルキル、Ｏ−Ｃ１〜６−アルキル、フェニル、ベンジル、又はアリールであり、
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立して、Ｈ又はＣ１〜６−アルキルであり、
Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜９−アルキル、Ｃ３〜６−シクロアルキル、（Ｃ１〜６−アルキル）−（Ｃ３〜６シクロアルキル）、（Ｃ０〜６−アルキル）−Ｎ（Ｒ４Ｒ５）、（Ｃ１〜６−アルキル）−ＯＲ５、フェニル、ベンジル、アリール、ピペリジニル（piperidinyl）、ピペリジニル（piperizinyl）、ピロリジニル、モルホリノ、又はＣ３〜７−ヘテロシクロアルキルである。］
又は、その薬学的に許容される塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、多形体、若しくはプロドラッグが含まれる。
【０１４５】
具体的な選択的サイトカイン阻害薬には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：
２−［１−（−３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチル−スルホニルエチル］イソインドリン−１−オン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノスルホニル）エチル］イソインドリン−１−オン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチル−スルホニルエチル］イソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチル−スルホニルエチル］−５−ニトロ−イソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチル−スルホニルエチル］−４−ニトロイソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］−４−アミノイソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］−５−メチルイソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］−５−アセトアミドイソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］−４−ジメチルアミノイソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］−５−ジメチルアミノイソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］ベンゾ［ｅ］イソインドリン−１，３−ジオン；
２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］−４−メトキシイソインドリン−１，３−ジオン；
１−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル−アミン；
２−［１−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］イソインドリン−１，３−ジオン；及び
２−［１−（３−シクロペンチルオキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］−４−ジメチルアミノイソインドリン−１，３−ジオン。
【０１４６】
他の選択的サイトカイン阻害薬としては、共に２００２年３月２０日出願のＧ．Ｍｕｌｌｅｒらの米国特許仮出願第６０／３６６，５１５号及び同第６０／３６６，５１６号、並びに共に２００３年１月７日出願のＧ．Ｍｕｌｌｅｒらの米国特許仮出願第６０／４３８，４５０号及び同第６０／４３８，４４８号で開示されているエナンチオマーとして純粋な化合物が挙げられる（これらの特許をすべて参照により本明細書に援用する）。好ましい化合物には、２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシフェニル）−２−メチルスルホニルエチル］−４−アセチルアミノイソインドリン−１，３−ジオンのエナンチオマー、及び３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−（１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−プロピオンアミドのエナンチオマーが含まれる。
【０１４７】
本発明で使用する好ましい選択的サイトカイン阻害薬は、３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−（１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−プロピオンアミド、及びシクロプロパンカルボン酸｛２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシ−フェニル）−２−メタンスルホニル−エチル］−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝−アミドであり、これらはＣｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎから入手可能である。３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−３−（１−オキソ−１，３−ジヒドロ−イソインドール−２−イル）−プロピオンアミドは、次の化学構造を有する：
【化１０】
2005522215.tif 000011
【０１４８】
シクロプロパンカルボン酸｛２−［１−（３−エトキシ−４−メトキシ−フェニル）−２−メタンスルホニル−エチル］−３−オキソ−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−イソインドール−４−イル｝−アミドは、次の化学構造を有する：
【化１１】
2005522215.tif 000012
【０１４９】
本発明の化合物には、これに限定されるものではないが、ＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物、例えばシロマスト（ｃｉｌｏｍａｓｔ）、テオフィリン、ザルダベリン（ｚａｒｄａｖｅｒｉｎｅ）、ロリプラム、ペントキシフィリン、エノキシモン、イソインドール−イミド、フェネチルスルホン、アルカノヒドロキサム酸、非ポリペプチド環状アミド、オキソイソインドール、イソインドリン、インダゾール、ヘテロ置換ピリジン、ジフェニルピリジン、アリールチオフェン、アリールフラン、インデン、三置換フェニル、フタラジノン、ベンゼンスルホンアミド、四環式化合物など、並びにその塩、溶媒和物、異性体、多形体、プロドラッグ、水和物、又は誘導体も含まれる。一実施形態では、化合物は、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、ホルモン、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、又は核酸ではない。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明の化合物は、次の構造（Ｉ）：
【化１２】
2005522215.tif 000013
【０１５１】
［式中、
Ｙは、Ｎ又はＮ−オキシドを表し、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、及びハロＣ１〜６アルキルから選択され、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ及びＣ１〜６アルキルから選択され、あるいは同じ炭素原子に結合したＲ３及びＲ４は、一緒にカルボニル酸素原子を表し、あるいは異なる炭素原子に結合したＲ３及びＲ４は、これらが介在する原子が加わって結合する炭素原子と組み合わせて、飽和５員、６員若しくは７員炭素環を表し、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、ハロＣ１〜６アルキル、及びＣＮからなる群より選択されるメンバーを表し、
ｎは、０〜６の整数を表し、
Ａｒ１は、チエニル、チアゾリル、ピリジル、フェニル、及びナフチルからなる群より選択され、前記Ａｒ１は、ハロ、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜７アルキルチオ、ＣＮ、
Ｃ１〜６アルキル、ヒドロキシＣ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１〜６アルキル、ＮＨ（ＳＯ２Ｍｅ）、Ｎ（ＳＯ２Ｍｅ）２、ＳＯ２Ｍｅ、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＣ１〜６アルキル、ＳＯ２Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２ＮＯ２、Ｃ２〜６アルケニル、
Ｃ１〜６アルキル、及びＮＨ２からなる群より選択される１〜３個のメンバーによって置換されていてもよく、
Ａｒ１が、２個又は３個の置換基を有するフェニル又はナフチル基を表す場合には、２個のそのような置換基を組み合わせてみなしてよく、５員若しくは６員の縮合ラクトン環を表す。］
を有する化合物（その異性体、プロドラッグ、並びに薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体を含む）である。
【０１５２】
この実施形態はさらに、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，３１６，４７２号に示される化合物などを含む。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明の化合物は、次の構造（ＩＩ）：
【化１３】
2005522215.tif 000014
【０１５４】
［式中、
Ｒ１及びＲ２は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル又はＣ３〜Ｃ１０シクロアルキルを表し、
Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｃ１〜４アルキル、シクロアルキル、１個の二重結合を有するＣ２〜Ｃ４アルキレン、１個の三重結合を有するＣ２〜Ｃ４アルキレン、（ＣＨ２）ｎＣＯ（ＣＨ２）ｍＣＨ３、（ＣＨ２）ｐＣＮ、（ＣＨ２）ｐＣＯ２−Ｍｅを表し、あるいはこれらが結合する窒素原子と一緒に３〜１０員の環を形成し、
ｎ及びｍは、０〜３であり、
ｐは、１〜３である。］
を有する化合物（その異性体、プロドラッグ、及び薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体を含む）である。
【０１５５】
この実施形態はさらに、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，１６２，８３０号に示される化合物などを含む。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明の化合物は、次の構造（ＩＩＩ）：
【化１４】
2005522215.tif 000015
【０１５７】
［式中、
Ｒ１は、各場合にそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、低級アルコキシ、ヒドロキシ、低級アルキル、低級アルキルメルカプト、低級アルキルスルホニル、低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、アミノ、ニトロ、ニトリル、低級アルキルカルボキシレート、−ＣＯ２Ｈ、及びスルホンアミドからなる群より選択され、
Ｒ２は、水素及び低級アルキルからなる群より選択され、
Ｒ３は、水素、低級アルキル、ヒドロキシ、及びアミノからなる群より選択され、
Ｒ４は、−ＣＯＭ及びＣＨ２ＯＨからなる群より選択され、ここでＭは、
ヒドロキシ、置換低級アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、Ｎ−モルホリノ、ヒドロキシアルキルアミノ、ポリヒドロキシアミノ、ジアルキルアミノアルキルアミノ、アミノアルキルアミノ、及びＯＭｅ基（Ｍｅはカチオン）からなる群より選択され、
Ｒ５は、アルキルスルホニルであり、
ｎは、０〜４の整数である。］
を有する化合物（その異性体、プロドラッグ、及び薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体を含む）である。
【０１５８】
この実施形態はさらに、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，１７７，４７１号で開示されている化合物を含む。
【０１５９】
別の実施形態では、本発明の化合物は、次の構造（ＩＶ）：
【化１５】
2005522215.tif 000016
【０１６０】
［式中、
Ｒ０は、水素、ハロゲン、又はＣ１〜６アルキルを表し、
Ｒ１は、水素；フェニル、ハロゲン、−ＣＯ２Ｒａ、−ＮＲａ、Ｒｂ、Ｃ３〜６−シクロアルキル、フェニル、及び、ピリジル、モルホリニル、ピペラジニル、ピロリジニル、ピペリジニルからなる群より選択され、１若しくは複数のＣ１〜６アルキルによって置換されていてもよく、Ｒ１がＣ１〜６アルキルを介して結合している窒素原子に結合していてもよい５員若しくは６員の複素環から選択される１若しくは複数の置換基によって置換されていてもよいＣ１〜６アルキルからなる群より選択され、
Ｒ２は、−ＯＲａ、−ＮＲａ、Ｒｂ、ハロゲン、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、及びニトロから選択される１若しくは複数の置換基によって置換されていてもよいフェニルからなる群より選択され、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素又はＣ１〜６アルキルを表す。］
を有する化合物（その異性体、プロドラッグ、及び薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体を含む）である。
【０１６１】
この実施形態はさらに、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，２１８，４００号に示される化合物などを含む。
【０１６２】
別の実施形態では、本発明の化合物は、次の構造（Ｖ）：
【化１６】
2005522215.tif 000017
【０１６３】
［式中、
Ｘは、Ｓ又はＯであり、
Ａｒ１は、最高で２個の置換基によって置換されていてもよいフェニル、ピリジニル、又はフリルから選択される芳香環であり、各置換基は、それぞれ独立して、
−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ｃ１〜３アルキル、若しくはＣＮによって置換されていてもよいＣ１〜６アルキル；Ｃ１〜６アルコキシ；−ＯＨによって置換されていてもよいＣ１〜３アルキルチオ、Ｃ１〜３アルキルスルホニル、Ｃ１〜３フルオロアルキル；ハロ、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、又はＣＯ２Ｃ１〜３アルキルであり、
Ｒ２は、水素又はＣ１〜３アルキルであり、
Ｒ３は、最高で２個の置換基によって置換されていてもよいフェニル、ピリジニル、キノリニル、又はフリルであり、各置換基は、それぞれ独立して、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３フルオロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシ、Ｃ１〜３フルオロアルコキシ、Ｃ１〜３アルキルチオ、ハロ、又はＯＨである。］
を有する化合物（その異性体、プロドラッグ、及び薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体を含む）である。
【０１６４】
この実施形態はさらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０３４，０８９号及び米国特許第６，０２０，３３９号に示される化合物などを含む。
【０１６５】
別の実施形態では、本発明の化合物は、次の構造（ＶＩ）：
2005522215.tif 000018
【０１６６】
［式中、
Ｙは、ハロゲン、アルキル、又はＸＲａ基であり、
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｐ−、又はＮ（Ｒｂ）−であり、ここでｐは０又は１若しくは２の整数であり、
Ｌは、−ＸＲ、−Ｃ（Ｒ１１）Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、又は（ＣＨＲ１１）ｎＣＨ（Ｒ１）（Ｒ２）であり、ここでｎは０又は整数１であり、
Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立して、水素、又は置換されていてもよいアルキル基であり、
Ｒは、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、シクロアルキル、又はシクロアルケニル基であり、
Ｒ１及びＲ２はそれぞれ、同じでも異なるものでもよく、水素、フッ素、−ＣＮ、−ＮＯ２、又は置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルキルチオ、−ＣＯ２Ｒ８、−ＣＯＮＲ９Ｒ１０、若しくはＣＳＮＲ９Ｒ１０基であり、あるいはＲ１及びＲ２は、これらが結合する炭素原子と一緒に置換されていてもよいシクロアルキル又はシクロアルケニル基を形成し、
Ｒ３は、水素、フッ素、ヒドロキシ、又は置換されていてもよい直鎖状若しくは分枝状アルキル基であり、
Ｒ４は、水素、−（ＣＨ２）ｔＡｒ、又は（ＣＨ２）ｔ−Ａｒ−（Ｌ１）ｎ−Ａｒ１であり、ここでｔは０又は整数１、２若しくは３であり、
Ｒ５は、−（ＣＨ２）ｔＡｒ又は（ＣＨ２）ｔ−Ａｒ−（Ｌ１）ｎ−Ａｒ’であり、
Ｒ６は、水素、フッ素、又は置換されていてもよいアルキル基であり、
Ｒ７は、水素、フッ素、置換されていてもよい直鎖状若しくは分枝状アルキル基、−ＯＲｃであり、ここでＲｃは、水素又は置換されていてもよいアルキル若しくはアルケニル基、又はホルミル、アルコキシアルキル、アルカノイル、カルボキサミド、若しくはチオカルボキサミド基であり、
Ｒ８、Ｒ９、及びＲ１０は、それぞれ独立して、水素、又は置換されていてもよいアルキル、アラルキル、若しくはアリール基であり、
Ｒ１１は、水素、フッ素、又はメチル基である。］
を有する化合物（その異性体、プロドラッグ、及び薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体を含む）である。
【０１６７】
この実施形態はさらに、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７９８，３７３号に示される化合物などを含む。
【０１６８】
好ましい実施形態では、化合物は、次の構造（ＶＩＩ）：
【化１８】
2005522215.tif 000019
【０１６９】
の化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、多形体、エナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ体、若しくは立体異性体の混合物である。
【０１７０】
別の好ましい実施形態では、化合物は、次の構造（ＶＩＩＩ）：
【化１９】
2005522215.tif 000020
【０１７１】
の化合物（その異性体、塩、多形体、溶媒和物、水和物、プロドラッグ、及び薬学的に許容される塩を含む）である。
【０１７２】
これら化合物のあるものは、Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎの市販品として入手することができる。上記化合物の他のものは、その全体が参照により援用される上で引用した特許で開示されているものを含む、当技術分野で公知の方法によって生成することができる。
【０１７３】
本発明の方法で有用なＰＤＥ ＩＶ阻害剤の別の例には、ＧＢ２  ０６３  ２４９Ａ、ＥＰ０  ６０７  ４３９Ａ１、米国特許第６，３３３，３５４号、米国特許第６，３００，３３５号、米国特許第６，１６６，０４１号、米国特許第６，０６９，１５６号、米国特許第６，０１１，０６０号、米国特許第５，８９１，８９６号、米国特許第５，８４９，７７０号、米国特許第５，７１０，１７０号、米国特許第４，１０１，５４８号、米国特許第４，００１，２３８号、米国特許第４，００１，２３７号、米国特許第３，９２０，６３６号、米国特許第４，０６０，６１５号、ＷＯ９７／０３９８５号、ＥＰ０  ６０７  ４３９Ａ１、米国特許第４，１０１，５４８号、米国特許第４，００１，２３８号、米国特許第４，００１，２３７号、米国特許第３，９２０，６３６号、米国特許第４，０６０，６１５号、ＷＯ９７／０３９８５号、ＥＰ０  ３９５  ３２８、米国特許第４，２０９，６２３号、ＥＰ０  ３９５  ３２８、米国特許第４，２０９，６２３号、米国特許第５，３５４，５７１号、ＥＰ０  ４２８  ２６８Ａ２、米国特許第５，３５４，５７１号、ＥＰ０  ４２８  ２６８Ａ２、８０７，８２６、米国特許第３，０３１，４５０号、米国特許第３，３２２，７５５号、米国特許第５，４０１，７７４号、８０７，８２６、米国特許第３，０３１，４５０号、米国特許第３，３２２，７５５号、米国特許第５，４０１，７７４号、米国特許第５，１４７，８７５号、ＰＣＴ  ＷＯ９３／１２０９５号、米国特許第５，１４７，８７５号、ＰＣＴ  ＷＯ９３／１２０９５号、米国特許第４，８８５，３０１号、ＷＯ９３／０７１４９号、ＥＰ０  ３４９  ２３９Ａ２、ＥＰ０  ３５２  ９６０Ａ２、ＥＰ０  ５２６  ００４Ａ１、ＥＰ０  ４６３  ７５６Ａ１、米国特許第４，８８５，３０１号、ＷＯ９３／０７１４９号、ＥＰ０  ３４９  ２３９Ａ２、ＥＰ０  ３５２  ９６０Ａ２、ＥＰ０  ５２６  ００４Ａ１、ＥＰ０  ４６３  ７５６Ａ１、ＥＰ０  ６０７  ４３９Ａ１、ＥＰ０  ６０７  ４３９Ａ１、ＷＯ９４／０５６６１号、ＥＰ０  ３５１  ０５８、米国特許第４，１６２，３１６号、ＥＰ０  ３４７  １４６、米国特許第４，０４７，４０４号、米国特許第５，６１４，５３０号、米国特許第５，４８８，０５５号、ＷＯ９７／０３９８５号、ＷＯ９７／０３６７５号、ＷＯ９５／１９９７８号、米国特許第４，８８０，８１０号、ＷＯ９８／０８８４８号、米国特許第５，４３９，８９５号、米国特許第５，６１４，６２７号、ＰＣＴ  ＵＳ９４／０１７２８号、ＷＯ９８／１６５２１号、ＥＰ０  ７２２  ９４３Ａ１、ＥＰ０  ７２２  ９３７Ａ１、ＥＰ０  ７２２  ９４４Ａ１、ＷＯ９８／１７６６８号、ＷＯ９７／２４３３４号、ＷＯ９７／２４３３４号、ＷＯ９７／２４３３４号、ＷＯ９７／２４３３４号、ＷＯ９７／２４３３４号、ＷＯ９８／０６７２２号、ＰＣＴ／ＪＰ９７／０３５９２号、ＷＯ９８／２３５９７号、ＷＯ９４／２９２７７号、ＷＯ９８／１４４４８号、ＷＯ９７／０３０７０号、ＷＯ９８／３８１６８号、ＷＯ９６／３２３７９号、及びＰＣＴ／ＧＢ９８／０３７１２号で開示されているものが含まれ、これら特許はすべて、参照により本明細書に援用する。
【０１７４】
本発明の一部として企図される化合物の多くは、当技術分野で公知の標準の分割又は不斉合成を利用して、上で詳細に述べた化合物の光学活性のあるエナンチオマーの一方が多量に存在するものとすることができる。たとえば、Shealyら、Chem.Indus.1030(1965年)、及びCasiniら、Farmaco Ed.Sci.第19巻:563ページ(1964年)を参照されたい。
【０１７５】
本発明はまた、その化合物の生理的に許容される非毒性の酸付加塩に関する。そのような塩には、当技術分野で公知の有機及び無機の酸又は塩基から誘導されたものが含まれる。そのような酸には、塩化水素酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ソルビン酸、アコニット酸、サリチル酸、フタル酸、エンボール酸(embolic acid)、エナント酸などが含まれる。
【０１７６】
性質が酸性である本発明の化合物は、薬学的に許容される様々な塩基と塩を形成することができる。そうした本発明の酸性化合物の薬学的に許容される塩基付加塩の調製に使用できる塩基は、非毒性の塩基付加塩、すなわち、それに限定されるものではないが、アルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩、特にカルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など、薬理学的に許容されるカチオンを含有する塩を形成するものである。適切な有機塩基には、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルマイン（meglumaine)（Ｎ−メチルグルカミン）、リジン、及びプロカインが含まれるがこれに限定されるものではない。
【０１７７】
本発明の化合物のＰＤＥ ＩＶ阻害能は、当技術分野で周知の方法、たとえば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，３１６，４７２号；米国特許第６，２０４，２７５号；Featherstone R.L.ら(2000年)の「Comparison of phosphodiesterase inhibitors of differing isoenzyme selectivity added to St. Thomas' hospital cardioplegic solution used for hypothermic preservation of rat lungs」、Am.J.Respir Crit.Care Med.第162巻:850〜6ページ；及びBrackeen M.F.ら(1995年)の「Design and synthesis of conformationally constrained analogues of 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl) imidazolidin-2-one(Ro 20-1724) as potent inhibitors of cAMP-specific phosphodiesterase」、J.Med.Chem.第38巻:4848〜54ページで開示されているアッセイを使用してアッセイすることができる。
【０１７８】
本発明の化合物は、市販品を購入してもよいし、又は本明細書で開示する特許若しくは公開特許に記載の方法に従って調製することもできる。さらに、既知の分割剤又はキラルカラム、並びに他の標準の有機合成化学技術を使用して、光学的に純粋な組成物の不斉合成又は分割を行うことができる。
【０１７９】
４．４．幹細胞の培養方法
本発明のある実施形態では、胚幹細胞、胚様幹細胞、前駆細胞、多能性細胞、全能性細胞、多分化能細胞、灌流を行った分娩後胎盤に内因性の細胞、臍帯血細胞、末梢血若しくは成体血由来の幹細胞若しくは前駆細胞、又は骨髄細胞を含むがこれに限定されるものではない幹細胞又は前駆細胞を、本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。これらの細胞は、当技術分野で周知の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させてもよいし、あるいは、灌流を行った分娩後胎盤中で増殖させてもよい。
【０１８０】
ある実施形態では、灌流を行った分娩後胎盤に内因性の細胞を胎盤及び培地から回収し、所望の細胞型又は細胞系統への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することができる。「Post-Partum Mammalian Placenta, Its Use and Placental Stem Cells Therefrom」と題された、２００３年２月１３日公開の米国特許出願公開第２００３００３２１７９号を参照のこと（この特許の全体を本明細書に援用する）。
【０１８１】
本発明の別の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞は、灌流を行った分娩後胎盤から得るのではなく、臍帯血、骨髄、末梢血、成体血などの他の供給源から単離し、本発明の化合物に暴露し、分化を誘導する。好ましい実施形態では、分化は、所望の系統又は細胞型への分化を誘導するのに適する条件下で、そうするのに十分な時間にわたりｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。本発明の化合物は、添加による分化／培養培地、ｉｎ  ｓｉｔｕ産生、又は幹細胞若しくは前駆細胞と本発明の化合物との接触を可能にする他の任意の方法で使用する。
【０１８２】
別の実施形態では、培養された幹細胞、たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又は灌流を行った分娩後胎盤中で培養された幹細胞を、たとえば、エリスロポエチン、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、ケモカイン、インターロイキン、リガンドを含む組換え型ヒト造血増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、インターロイキン、及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、又は他の増殖因子の投与によって刺激して、培養中に増殖させる。
【０１８３】
培養した細胞は、回収及び／又は単離した後、Ｍｅｓｅｎ  Ｃｕｌｔ（商標）培地（stem cell Technologies, Inc.、カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー）など、当技術分野で一般に公知のコロニー形成単位アッセイによって同定し、特性決定することができる。
【０１８４】
幹細胞又は前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養方法は、当技術分野で周知であり、たとえば、Thomsonら、1998年、Science第282巻:1145〜47ページ（胚幹細胞）；Hirashimaら、1999年、Blood第93巻(4):1253〜63ページ、及びHatzopoulosら、1998年、Development第125巻:1457〜1468ページ（内皮細胞前駆体）；Slagerら、1993年、Dev.Genet.第14巻(3):212〜24ページ（ニューロン又は筋肉前駆細胞）；Genbachevら、1995年、Reprod.Toxicol.第9巻(3):245〜55ページ（細胞栄養芽層、すなわち胎盤上皮細胞の前駆細胞）；Nadkarniら、1984年、Tumori第70巻:503〜505ページ、Melchnerら、1985年、Blood第66巻(6):1469〜1472ページ、２０００年５月１８日公開の国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／２７９９９号、Himoriら、1984年、Intl.J.Cell Cloning第2巻:254〜262ページ、及びDouayら、1995年、Bone Marrow Transplantation第15巻:769〜775ページ（造血前駆細胞）；Shamblottら、1998年、Proc. Natl. Acad. Sci.USA第95巻:13726〜31ページ（始原生殖細胞）；Yanら、2001年、Devel.Biol.第235巻:422〜432ページ（栄養芽幹細胞）を参照されたい。このような方法は、前駆細胞の培養が、細胞を所定の時期に本発明の化合物と共に培養して、所望の分化した細胞集団を産生させるステップを含むという条件で、本発明の方法での使用に容易に適合させることができる。
【０１８５】
４．４．１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの幹細胞培養
本発明の方法は、幹細胞又は前駆細胞の分化のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの調節を含み、これは、前記細胞を、本発明の有機小分子など、前記細胞の所望の特定の細胞系統の細胞への分化を誘導する化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植することを含むものである。好ましい実施形態では、細胞の造血細胞系統への分化を誘導する。
【０１８６】
ある実施形態では、培養した目的の幹細胞を、濃度０．１μｇ／ｍｌ、０．２μ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、５μｇ若しくは１０μｇ／ｍｌの本発明の化合物にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露する。目的の細胞を、約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度のＰＤＥ ＩＶ阻害剤、又は約０．００５μｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度のＳｅｌＣＩＤ（商標）（Ｃｅｌｇｅｎｅ社、米国ニュージャージー州Ｗａｒｒｅｎ）に暴露することが好ましい（第４．７節「医薬組成物」の項も参照のこと）。
【０１８７】
ある実施形態では、灌流液に栄養素、ホルモン、ビタミン、増殖因子、又はこれらの任意の組合せを導入することによって、胚様幹細胞を胎盤バイオリアクター中で増殖させる。増殖灌流液若しくは培地に血清及び他の増殖因子を加えてもよい。増殖因子は、通常はタンパク質であり、増殖因子には、サイトカイン、リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、ケモカイン、及びインターロイキンが含まれるがこれに限定されるものではない。使用しうる他の増殖因子には、リガンドを含む組換え型ヒト造血増殖因子、幹細胞因子、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、白血病阻害因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、胎盤由来増殖因子、及び上皮細胞増殖因子が含まれる。
【０１８８】
灌流液に導入された増殖因子は、未分化の胚様幹細胞、単分化能前駆細胞、又は分化した細胞（たとえば、分化した造血細胞）の増殖を刺激することができる。増殖因子は、免疫グロブリン、ホルモン、酵素、又は先述の増殖因子が含まれるがこれに限定されるものではない成体材料及び生理活性分子の産生を刺激することができる。培養する胎盤には、定期的に「供給」を行って、使用済みの培地を除去し、放出される細胞を減らし、新鮮な培地を加える。培養する胎盤は、混入の可能性を減らすために無菌条件下で貯蔵し、断続的かつ定期的に圧力をかけ続けて、胎盤の細胞に栄養素が十分に供給される条件下にする必要がある。胎盤の灌流及び培養は、効率と処理能力の拡大を考えて、どちらも自動化及びコンピューター管理ができることを理解されたい。
【０１８９】
４．４．２．前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
本発明の方法は、前駆細胞、特にＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋前駆細胞の発達の調節及びモジュレーションを含む。本発明の一実施形態では、前駆細胞の造血細胞系統への分化を誘導する。具体的な実施形態では、その系統は顆粒球系統である。別の実施形態では、ＣＤ１３３＋細胞を、内皮細胞、脳細胞、腎臓細胞、肝細胞、又は腸管細胞に分化するよう誘導する。
【０１９０】
前駆細胞は、上述のように標準の方法によって培養することができる。さらに、前駆細胞の培養は、前駆細胞を、種々の細胞系統に分化させるように、培養中の種々の時点又は期間での細胞の接触を含んでもよい。
【０１９１】
従って、ＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞を培養する一方法では、細胞を第０日に、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ−αを含有する培地に播き、６日間培養する。第６日に、細胞をＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含有する培地に再度播種し、さらに６日間培養を続ける。この方法によって、樹状細胞が産生される。この方法の別の形態では、細胞を、最初にＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含有する培地に播き、次いで第６日に単球調整培地に切り替える（Ｓｔｅｉｎｍａｎら、国際公開ＷＯ９７／２９１８２号を参照のこと）。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋前駆細胞の集団を生成させるには、第０日に前駆細胞を本発明の化合物と接触させて配置し、第６日にＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞を回収する。
【０１９２】
本発明の化合物、特にＳｅｌＣＩＤ（商標）を加える時期は、ＣＤ３４＋細胞の特定の細胞系統への分化の経路、並びにＣＤ１３３＋細胞の分化に対してかなりの影響を有することが予想される。標準の条件下で培養されたＣＤ３４＋前駆細胞は、骨髄発達経路若しくは系統をたどり、すなわち最初に播種してから（すなわち最初の培養後）１２日以内に樹状細胞になる。しかし、本発明の化合物を、培養の最初の６日間の間のいくつかの時期のうちの１時期に加えると、この経路が実質的に変更される。たとえば、ＣＤ３４＋細胞、特に骨髄由来のＣＤ３４＋を、培養初日に本発明の化合物、特にＳｅｌＣＩＤ（商標）に暴露した場合、培養第６日に、本発明の化合物に暴露していない（すなわち、ＤＭＳＯに暴露した）対照と比較して、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数が増加し、ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞数が減少することが証拠となるが、骨髄系統への分化が抑制されるはずである。さらに、本発明の化合物に暴露すると、ＣＤ８０やＣＤ８６など、樹状細胞系統の細胞によって発現される表面マーカーを発現する細胞の発達が抑制されるはずである。培養初日、又は培養初日から３日後までの任意の時期に本発明の化合物と接触させると、ＣＤ３４＋前駆細胞の発達がそのようにモジュレートされるはずである。ＣＤ３４＋細胞数の増加は、本発明の化合物を、第０日と第６日の間に複数回、たとえば第０日及び第２日、第０日及び第４日、第３日及び第６日、又は第２日、第４日、及び第６日に投与した場合に増強することになる。
【０１９３】
本発明の特に有用な態様は、本発明の化合物をＣＤ３４＋前駆細胞の培養初日に加え、第１２日まで暴露し続けると、独特な組合せの細胞表面マーカー、すなわちＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−を発現する独特な前駆細胞が発達する。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−細胞集団は、分化の中間段階を表す。この集団は、急速に発達する造血系統細胞、たとえば顆粒球細胞の集団を必要とする患者に容易に移植することのできる増殖可能な前駆細胞集団として有用である。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞を、増殖期（約６日間）の間に標準培地（すなわち、ＳｅｌＣＩＤ（商標）などのＰＤＥ ＩＶ阻害剤に暴露していないもの）に播き、培養し、次いで、同じ培地、又はＳｅｌＣＩＤ（商標）若しくはそのプロドラッグなどを含有する同様の培地に切り替えて、第１２日まで培養を続ける。この実施形態では、分化途中の細胞は、通常、対照と比べてＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ１４の発現の減少を示すが、ＣＤ１ａ＋細胞集団の持続性は増大することになる。このような分化途中の細胞は、樹状細胞になるのを妨げられない。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、増殖期（播種後第１〜６日）中にＳｅｌＣＩＤ（商標）又は本発明の別の化合物で少なくとも３日間連続で処理する。さらに別の実施形態では、ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋前駆細胞を、播種後の最初の６日間中にＳｅｌＣＩＤ（商標）又は他の本発明の化合物で２回以上処理する。このように複数回処理すると、ＣＤ３４＋又はＣＤ１３３＋集団の両方の増殖が増大する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）又は本発明の別の化合物で複数回処理すると、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１５−系統から逸れ、ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１５＋系統に向かう、すなわち骨髄樹状細胞系統から逸れ、顆粒球系統に向かう、ＣＤ３４＋前駆細胞の分化のシフトが生じる（図６Ｂ）。
【０１９４】
培養の第０日からの前駆細胞の処理、特に第０日〜第６日の間の複数回投与によっても、ＣＤ１３３＋前駆細胞数の増加、特にＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋前駆細胞集団の増大がもたらされる。ＣＤ１３３＋細胞は、ＣＤ３４＋サブセットと同様に増殖し、多系統分化能を保持することができるので、ＣＤ１３３は、ＣＤ３４の単離に代わる造血系マーカーである（Kobariら、J.Hematother.Stem Cell Res.第10巻(2):273〜81ページ(2001年)を参照のこと）。ＣＤ１３３＋は、ヒト胎児脳組織由来のＣＤ３４−細胞中に存在し、新生児マウスに注射したとき、強力な移植片生着、増殖、遊走、及び神経分化を示したことが報告されている（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.19:97(26):14720〜5ページ(2000年)を参照のこと）。ＣＤ１３３＋造血幹細胞は、前駆細胞活性が高まっており、クローン原性は拡大され、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスでの移植片生着が高かったことが示されている。
【０１９５】
上記のことにもかかわらず、本発明の化合物を培養して３日後の増殖性ＣＤ３４＋前駆細胞（すなわち、最初の培養の後３〜６日の間の任意の時期のもの）と接触させておくとき、すでに細胞表面マーカーＣＤ１ａの発現を開始している増殖性前駆細胞では、このマーカーの発現の持続性がＤＭＳＯ処理した対照よりも実質的に増大している。この持続性の増大に毒性が伴わないことは注目に値する。換言すれば、ＳｅｌＣＩＤ（商標）など、ＰＤＥ ＩＶ阻害剤による処理は、他の細胞集団のアポトーシスを引き起こさない。最終的な効果は、現存する免疫能力の維持及び新たな免疫能力の発達である。
【０１９６】
したがって、本発明の方法の一実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを、培養第０日（すなわち、培養初日）に接触させて、ＣＤ３４＋細胞の樹状細胞への分化をモジュレート（すなわち、抑制）する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを、培養第０日（すなわち、培養初日）に接触させて、ＣＤ３４＋細胞の顆粒球細胞への分化を増強する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを、培養の最初の３日間中に接触させて、ＣＤ３４＋細胞のＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞集団への分化を増強する。別の実施形態では、前駆細胞と本発明の化合物とを、培養第０日〜第６日に複数回接触させて、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋集団を増強するか、又は増大させる。別の実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞と本発明の化合物とを培養第６日に接触させて、ＣＤ１ａ＋細胞集団の持続性を増強するか、又は増大させるが、前記ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ１ａ表面マーカーを示す細胞に分化し、前記培養は、最高で６日間の前記化合物との接触を含まない。
【０１９７】
上記実施形態では、ＳｅｌＣＩＤ（商標）又は同類の化合物を投与する対象を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの前駆細胞だけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ、たとえばそうした細胞を移植又は移植片生着した患者などの前駆細胞に変更してもよいことは理解されよう。
【０１９８】
本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの幹細胞又は前駆細胞の分化の調節を含み、これは、前記細胞を、本発明の有機小分子など、それを特定の所望の細胞系統への分化を誘導する化合物と共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートした後、分化した細胞を被験体に直接移植することを含むものである。好ましい実施形態では、細胞を造血細胞系統へ分化を誘導する。別の実施形態では、ＣＤ１３３＋細胞を、内皮細胞、脳細胞、腎細胞、肝細胞、又は腸管細胞へ分化を誘導する。
【０１９９】
本明細書に記載の方法は、哺乳動物、好ましくはヒト由来のＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞を用いる用途を企図してはいるが、鳥類又は爬虫類の前駆細胞を用いる用途も企図していることに留意されたい。しかし、本発明の化合物は、前駆細胞が由来する種に応じて効力が様々である可能性がある。したがって、特に投与する化合物の濃度に関して、培養方法の若干の変更も企図する。たとえば、マウス由来の前駆細胞は、本発明の化合物、たとえばＳｅｌＣＥＤ（商標）に対する感受性が低く、ヒト由来の前駆細胞を用いて１μＭで得られる効果を実現するのに、より高い濃度を必要とするはずである。当業者ならば、このような最適化が慣用の手順であることがわかるはずである。
【０２００】
４．５．幹細胞及び前駆細胞の遺伝子操作
本発明の別の実施形態では、たとえば、アデノウイルス若しくはレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用して、あるいはリポソーム又は化学物質を媒介とするＤＮＡ取り込みなどの機械的手段を使用して、本発明の化合物に暴露する前に又はその後に、本発明の方法に従って分化させる幹細胞又は前駆細胞の遺伝子改変を行う。具体的な実施形態では、ＣＤ３４＋前駆細胞に遺伝子改変を行い、次いでそれを本発明の化合物で処理するが、より具体的な実施形態では、前記化合物は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）又はその類似体である。別の実施形態では、前記細胞を本発明の化合物で処理し、次いで遺伝子改変を行う。
【０２０１】
当技術分野で周知の方法、たとえば、トランスフェクション、形質転換、形質導入、エレクトロポレーション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、リソソーム融合、合成カチオン脂質、遺伝子銃若しくはＤＮＡベクター輸送体の使用によって、導入遺伝子が、娘細胞、たとえば胚様幹細胞が分裂して生成した娘胚様幹細胞若しくは前駆細胞に伝達されるように、導入遺伝子を含むベクターを目的の細胞に導入することができる。哺乳動物細胞に形質転換又はトランスフェクションを施すための様々な技術については、Keownら、1990年、Methods Enzymol.第185巻:527〜37ページ;Sambrookら、2001年、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、米国ニューヨーク、を参照されたい。
【０２０２】
好ましいことに、導入遺伝子は、細胞の核膜、又は他に存在する細胞若しくは遺伝子の構造物に対して破壊性でない限り、任意の技術を使用して導入しうる。ある実施形態では、導入遺伝子をマイクロインジェクションによって核の遺伝物質に挿入する。細胞及び細胞の構造物へのマイクロインジェクションは、当技術分野で一般に公知であり、実施されている。
【０２０３】
胎盤中で培養した細胞など、培養した哺乳動物細胞に安定なトランスフェクションを行うために、ほんの少ない細胞画分のゲノムに外来ＤＮＡを組み込む。組込みの効率は、使用するベクター及びトランスフェクション法に応じて変わる。遺伝子組込み体を同定し選択するために、一般に、目的の遺伝子配列と共に、（たとえば、抗生物質耐性の）選択可能なマーカーをコードする遺伝子を宿主胚様幹細胞に導入する。好ましい選択可能なマーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、メトトレキサートなどの薬物耐性を付与するものが含まれる。導入された核酸によって安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物による選択によって同定することができる（たとえば、選択可能なマーカー遺伝子が組み込まれている細胞が生き残り、他の細胞が死滅する）。このような方法は、哺乳動物細胞（たとえば、胚様幹細胞）中での相同組換えを、被験体又は患者に組換え細胞を導入又は移植する前に行う方法に特に有用である。
【０２０４】
形質転換された、胚様細胞などの宿主幹細胞、又はＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞などの前駆細胞を選択するために、いくつかの選択系を使用することができる。特に、ベクターは、特定の検出可能若しくは選択可能なマーカーを含んでいてよい。他の選択方法には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら、1977年、Cell第11巻:223ページ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska及びSzybalski、1962年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第48巻:2026ページ）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら、1980年、Cell第22巻:817ページ）など、遺伝子をそれぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、又はａｐｒｔ−細胞中で使用することができる別のマーカーの選択が含まれるがこれに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質耐性も、次の遺伝子、すなわち、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら、1980年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第77巻:3567ページ；O'Hareら、1981年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第78巻:1527ページ）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan及びBerg、1981年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA第78巻:2072ページ）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapinら、1981年、J.Mol.Biol.第150巻:1ページ）；及びヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerreら、1984年、Gene第30巻:147ページ）での選択に基づいて使用することができる。
【０２０５】
導入遺伝子は、好ましくはランダム組込みによって目的の細胞のゲノムに組み込むことができる。他の実施形態では、導入遺伝子は、部位特異的方法、たとえノックイン」又は「ノックアウト」）によって組み込むことができる（Ｃｈａｐｐｅｌの米国特許第５，２７２，０７１号及び１９９１年５月１６日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９１／０６６６７号；１９９５年１１月７日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，４６４，７６４号；１９９７年５月６日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，６２７，０５９号；１９９６年１月３０日発行のＣａｐｅｃｃｈｉらの米国特許第５，４８７，９９２号）。
【０２０６】
相同組換えによって標的化された遺伝子改変を有する細胞を作製する方法は、当技術分野で公知である。構築物は、所望の遺伝子改変のなされた少なくとも一部の目的の遺伝子を含み、標的座に対する相同領域、すなわち、宿主ゲノム中の、標的化遺伝子の内因性コピーを含む。ランダム組込み用のＤＮＡ構築物は、相同組換えに使用されるものとは対照的に、組換えを媒介するために相同領域を含む必要がない。標的化構築物又はランダム構築物中にマーカーを含めると、導入遺伝子の挿入についてポジティブ及びネガティブ選択を行うことができる。
【０２０７】
相同組換え細胞、たとえば、相同組換え胚様幹細胞、内因性胎盤細胞、又は胎盤中で培養した外因性細胞を作出するために、目的の遺伝子の５’及び３’末端に、標的細胞のゲノムに内在する遺伝子配列に隣接させて、ベクターによって保持される目的の遺伝子と標的細胞のゲノム中の内因性遺伝子との間で相同組換えが起こるのを可能にする相同組換えベクターを調製する。追加のフランキング核酸配列は、標的細胞のゲノム中の内因性遺伝子との相同組換えがうまく行われるのに十分な長さの配列である。通常、（５’及び３’末端の両方の）フランキングＤＮＡは数キロベースがベクターに含められる。相同組換えベクターを構築する方法、並びに組換え幹細胞から相同組換え動物を構築する方法は、当技術分野で一般に公知である（たとえば、Thomas及びCapecchi、1987年、Cell第51巻:503ページ;Bradley、1991年、Curr.Opin.Bio/Technol.第2巻:823〜29ページ；及びＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１３５４号、ＷＯ９１／０１１４０号、及びＷＯ９３／０４１６９号を参照のこと）。
【０２０８】
具体的な実施形態では、Bonadioらの方法(「Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells」と題された、１９９９年８月２４日発行の米国特許第５，９４２，４９６号；及び「Methods and compositions for stimulating bone cells」と題された、１９９５年８月２４日公開のＰＣＴ  ＷＯ９５／２２６１１号）を使用して、幹細胞、前駆細胞、又は胎盤中で培養した外因性細胞、たとえば骨前駆細胞などの目的の細胞に核酸を導入する。
【０２０９】
４．６．分化用に順化させた幹細胞及び前駆細胞の使用
４．６．１．一般の用途
本発明の幹細胞、並びにＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋前駆細胞は、移植及びｅｘ  ｖｉｖｏ治療プロトコルでの使用のために分化を誘導することができる。一実施形態では、幹細胞集団を特定の細胞型に分化させ、遺伝子改変を行って、治療用遺伝子産物を提供する。別の実施形態では、前駆細胞集団を初期前駆細胞に増殖させ、遺伝子改変を行って、治療用遺伝子産物を提供する。別の実施形態では、前駆細胞集団を顆粒球などの特定の細胞型に分化させ、遺伝子改変を行って、治療用遺伝子産物を提供する。
【０２１０】
本発明の化合物は、疾患及び／又は臨床的な骨髄切除のために生じる好中球減少及び白血球減少の逆転など、移植の主目的が、骨髄白血球細胞産生を回復させることである臨床状況でも有用性がある。化合物は、疾患、既知の様々な治療による副作用、又は骨髄切除のために起こる初期前駆細胞又は顆粒球の産生の回復においても有用である。本発明の化合物は、骨髄の抑制を伴わない赤血球産生の抑制が好ましい場合にも有用である。
【０２１１】
ある実施形態では、本発明の化合物で処理しておいた幹細胞を、臍帯血又は末梢血由来の幹細胞などの未処理細胞と共に、その必要のある患者に投与する。他の実施形態では、本発明の化合物で処理しておいたＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋細胞を、臍帯血又は末梢血由来の幹細胞などの未処置細胞と共に、その必要のある患者に投与する。一実施形態では、培養初日から本発明の化合物で処理したＣＤ３４＋前駆細胞を、未処理細胞と共にその必要のある患者に投与する。より具体的な実施形態では、移植される前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞である。
【０２１２】
本発明の方法によって分化をモジュレートした幹細胞、たとえば胚様幹細胞若しくは造血幹細胞、又は前駆細胞は、注射可能なように製剤化することができる（その全体が参照により本明細書に援用されるＰＣＴ  ＷＯ９６／３９１０１号を参照のこと）。別の実施形態では、本発明の方法に従って分化をモジュレートした細胞及び組織は、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第５，７０９，８５４号、同第５，５１６，５３２号、又は同第５，６５４，３８１号に記載されているように、重合性若しくは架橋ヒドロゲルを使用して製剤化することができる。
【０２１３】
胚様幹細胞は、前駆細胞が通常使用されうる治療又は研究プロトコルで、特定のクラスの前駆細胞（たとえば、軟骨細胞、肝細胞、造血細胞、膵臓実質細胞、神経芽細胞、筋前駆細胞など）の代わりに使用することができる。
【０２１４】
４．６．２．組織の交換又は増強
本発明の方法に従って分化をモジュレートした本発明の幹細胞、特に胚様幹細胞及び前駆細胞は、幹細胞や前駆細胞集団など、所望の細胞集団の移植又は注入に関する広範な種類の治療プロトコルに使用することができる。この幹細胞又は前駆細胞を使用して、既存の組織を交換若しくは増強し、新規若しくは代替の組織を導入し、又は成体組織若しくは構造を接合することができる。
【０２１５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法に従って分化をモジュレートした胎盤由来胚様幹細胞などの幹細胞、又は造血前駆細胞などの前駆細胞は、適合又は非適合のＨＬＡ型を含む自己及び同種異系の造血移植片として使用しうる。胚様幹細胞の同種異系造血移植片としての使用によって、好ましくは共に参照により本明細書に援用される１９９８年９月１日発行の米国特許第５，８００，５３９号及び１９９８年９月１５日発行の米国特許第５，８０６，５２９号に記載のものなど、宿主に処置を施して、ドナー細胞に対する免疫拒絶を低減しうる。
【０２１６】
たとえば、本発明の方法に従って分化をモジュレートした胚様幹細胞を、治療用移植プロトコルで使用して、例えば、肝臓、膵臓、腎臓、肺、神経系、筋肉系、骨、骨髄、胸腺、脾臓、粘膜組織、性腺、又は毛髪の幹細胞又は前駆細胞を増強又は交換することができる。同様に、本発明の方法に従って分化をモジュレートした造血前駆細胞は、骨髄若しくは内皮前駆細胞の代わりに使用することができる。
【０２１７】
本発明の方法に従って分化をモジュレートした幹細胞、たとえば胚様幹細胞は、軟骨、腱、又は靭帯の増強、修復又は交換に使用することができる。たとえば、ある実施形態では、人工器官（たとえば、股関節部人工器官）を、本発明の胚様幹細胞から増殖させた代替軟骨組織構築物でコーティングする。他の実施形態では、胚様幹細胞から増殖させた軟骨組織構築物を用いて関節（たとえば、膝）を再構築する。軟骨組織構築物は、異なる種類の関節の主要な再建手術で用いることもできる（プロトコルについては、たとえば、Resnick,D.及びNiwayama, G.ら、1988年、「Diagnosis of Bone and Joint Disorders」、第2版、W.B.Saunders Co.を参照のこと）。
【０２１８】
本発明の方法に従って処理した幹細胞及び前駆細胞を使用して、疾患のために生じた組織及び臓器の損傷を修復することができる。そのような実施形態では、患者に胚様幹細胞を投与して、疾患のために損傷を受けた組織又は臓器を再生又は回復させる、たとえば、化学療法又は放射線療法の後に免疫系を増強し、心筋梗塞の後に心臓組織を修復することができる。幹細胞及び／又は前駆細胞を、本発明の方法に従い、本発明のＰＤＥ ＩＶ阻害剤で処理し、あるいは本発明のＰＤＥ ＩＶ阻害剤と共に投与して、その必要のある個体に移植すると、肝臓、膵臓、又は心臓組織を修復及び／又は交換することができる。
【０２１９】
本発明の方法に従って処理した幹細胞及び前駆細胞はまた、骨髄移植で骨髄細胞を増強又は交換するために使用することができる。ヒトの自己及び同種異系骨髄移植は、現在白血病やリンパ腫などの疾患、及び生命を脅かす他の障害の治療法として利用されている。しかし、このような手法の欠点は、細胞が確実に移植に足りるようにするために、大量のドナー骨髄を取り出さなければならないことである。
【０２２０】
本発明の方法に従って回収した胚様幹細胞は、大規模な骨髄供与の必要を低減し得る幹細胞及び前駆細胞をもたらすことができる。また、本発明の方法によれば、小規模な骨髄供与を実現し、次いで、胎盤中で培養し、増殖させて幹細胞及び前駆細胞の数を増やした後に、レシピエントに注入又は移植することもできるはずである。
【０２２１】
ある実施形態では、本発明の方法を使用して得た多数の胚様幹細胞及び／又は前駆細胞が、大規模な骨髄供与の必要を低減するはずである。骨髄移植での移植片生着には、患者の体重１キログラムあたりおよそ１×１０８〜２×１０８個の骨髄単核細胞（すなわち、７０ｋｇのドナーでは約７０ｍｌの骨髄）を注入しなければならない。７０ｍｌを得るために、供与の過程では、過剰な供与とかなりの血液損失が必要となる。特定の実施形態では、小規模骨髄供与（たとえば、７〜１０ｍｌ）からの細胞は、たとえば胎盤バイオリアクター中で増殖して増やした後、レシピエントに注入できるはずである。本発明の方法に従って分化をモジュレートした幹細胞、及び前駆細胞、特にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞は、大規模骨髄供与の必要を低減し、又は排除し得る幹細胞及び／又は前駆細胞をもたらすことができる。
【０２２２】
具体的な実施形態では、胎盤から単離した胚様幹細胞を、自己若しくは異種性酵素による代償療法に使用して、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ファブリー病、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー症候群などのリソソーム蓄積症、並びに他のガングリオシド蓄積症、ムコ多糖症、及び糖原病が含まれるがこれに限定されるものではない、特定の疾患又は症状を治療することができる。
【０２２３】
他の実施形態では、細胞を遺伝子治療において自己若しくは異種導入遺伝子のキャリアーとして使用して、先天的な代謝障害、例えば副腎白質ジストロトフィー、嚢胞性線維症、糖原蓄積病、甲状腺機能低下症、鎌状赤血球貧血、ピアソン症候群、ポンペ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、及びテイ−サックス病、ポルフィリン症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ムコ多糖蓄積症、慢性肉芽腫症、及びチロシン血症を矯正し、あるいは癌、腫瘍、又は他の病理学的状態を治療することができる。
【０２２４】
他の実施形態では、角膜上皮欠損の治療、軟骨の修復、顔面削皮術、粘膜、鼓膜、腸の内層（intestinal linings）、神経構造（たとえば、網膜、基底膜の聴覚ニューロン、嗅覚上皮の嗅覚ニューロン）、皮膚外傷についての火傷及び創傷の修復、頭皮（毛髪）移植を含むがこれに限定されるものではない自己若しくは異種組織の再生若しくは代償療法若しくはプロトコルにおいて、又は他の損傷若しくは患部臓器若しくは組織の再構築のために、細胞を使用することができる。
【０２２５】
さらに、血流中を循環する幹細胞及び前駆細胞は、通常は少数である。別の実施形態では、血漿交換、すなわち、血液を採取し、１種又は複数の成分を選択的に除去し、血液の残りをドナーに再注入する手順によって、そうした外因性幹細胞又は外因性前駆細胞を回収する。血漿交換によって回収された外因性細胞を、本発明の方法によって増殖させ、それにより骨髄供与の必要が完全になくなる。
【０２２６】
別の実施形態では、本発明の方法による造血前駆細胞の増殖を、化学療法の補足治療として使用する。癌細胞を標的にして破壊するのに使用される大部分の化学療法剤は、すべての増殖性細胞、すなわち細胞分裂の途中の細胞を死滅させることによって作用する。骨髄は、体内で最も活発に増殖する組織の１つであるので、造血幹細胞は、化学療法剤によってしばしば損傷を受け、又は破壊され、その結果、血球産生が縮小し、又は停止する。化学療法は、一定間隔で終了し、患者の造血系が、化学療法の再開前に血球量を補充しなければならない。以前に静止状態にあった幹細胞が増殖し、白血球数が化学療法を再開してよい（同時にまた骨髄幹細胞が破壊される）許容レベルに増加するのには、１ヶ月以上かかるであろう。
【０２２７】
白血球は、化学療法の治療の合間に再生するが、しかし、癌が増殖する時間もあり、さらに自然選択のために化学療法薬に対する耐性が高くなるかもしれない。したがって、化学療法の期間が長くなり、治療間隔が短くなるほど、癌を首尾よく死滅させられる見込みが高くなる。化学療法処置間の時間短縮のために、本発明の方法に従って分化させた胚様幹細胞又は前駆細胞を患者に導入できると考えられる。このような処置は、患者が少ない血球数を示すはずの時間を短縮し、したがって化学療法処置をより早期に再開することが可能となりうる。
【０２２８】
別の実施形態では、ヒト胎盤幹細胞を使用して、慢性肉芽腫症などの遺伝病を治療又は予防することができる。
【０２２９】
４．６．３．炎症の改善
本発明の方法に従って分化をモジュレートした幹細胞及び前駆細胞は、一般の抗炎症剤として使用することができる。本発明者らは、たとえば臍帯血由来の幹細胞及び前駆細胞が、患者に移植したとき、炎症性の応答を低減し、又は実質的に消失させることを見出した。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、炎症性の応答を伴う患者、又は炎症性の応答を発症すると考えられる患者に、１種又は複数の本発明の化合物によって分化をモジュレートした幹細胞又は前駆細胞を投与することを含む。具体的な実施形態では、幹細胞は胚様幹細胞であり、前駆細胞は造血幹細胞、特にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞である。
【０２３０】
本発明者らは、個体を本発明の化合物、すなわちＳｅｌＣＩＤで処置すると、炎症性の応答をモジュレートし、改善させ又は軽減する細胞の発達及び分化が刺激されることも見出した。したがって、本発明の別の実施形態は、炎症性の応答を伴う個体、又は炎症性の応答を発症すると考えられる個体の治療方法であって、前記個体に、１種又は複数の有効量の本発明の化合物を投与することを含む方法を含む。別の実施形態では、この方法は、幹細胞又は前駆細胞と本発明の化合物とを、前記個体に投与する前に接触させ、次いで治療上有効な量の前記細胞を前記個体に投与することを含む。さらに別の実施形態では、そのように処理した細胞を、１種又は複数の本発明の化合物と同時に、前記個体に治療上有効な量で投与することができる。
【０２３１】
他の実施形態では、本発明の化合物及び／又は細胞と組み合わせて他の化合物を投与して、炎症を軽減することができる。たとえば、そのような追加の化合物は、プレドニソンなどのステロイド類を含んもよいし、又はｃｏｘ−１／ｃｏｘ−２阻害剤、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェン、アセトアミノフェン、ｃｏｘ−１特異的阻害剤、若しくはこれら化合物のいずれかの誘導体など、非ステロイド系抗炎症剤のいずれかを含んでもよい。このような追加の抗炎症剤は、静脈内、局所、皮内又は吸入などの任意の標準の経路によって送達することができ、また本発明の化合物及び／若しくは細胞と同時に送達してもよいし、又は別の時間に送達してもよい。
【０２３２】
上記方法を使用して、炎症に関連し、炎症によって生じ、又は炎症の結果として生じるいずれの疾患又は状態を治療してもよい。たとえば、不慮の損傷などの外傷によって生じる炎症の治療にこの方法を使用することができる。この方法は、外科手順、特に、天然組織の移植片、合成の血管移植片、心臓弁、血管形成術など、血管関連の外科手順によって引き起こされる炎症、又はそれに随伴する損傷の治療にも使用してよい。この方法を使用して、狭窄又は再狭窄を予防することもできる。上記方法は、心臓病、アテローム性動脈硬化症、アレルギー若しくは過敏症、免疫障害、自己免疫疾患（関節炎など）、感染による炎症などの疾患又は症状を含むがこれに限定されるものではない、任意の疾患又は症状の結果として生じる炎症の治療にも使用することができる。すでに存在する炎症性症状の治療に加えて、炎症の発生が低減されるように、本発明の細胞及び／又は化合物を、予防目的で個体に投与してもよい。これは、術後の炎症性応答の軽減によって、個体が好結果を収め、入院時間及び作業不能期間を短縮させる可能性を高める術前療法の形として特に有用である。
【０２３３】
上記治療の抗炎症作用の有効性は、視診、ＭＲＩ若しくはＣＡＴ走査、全身若しくは局所の温度測定など、任意の既知の方法によってモニターすることができる。Ｃ反応性タンパク質として知られているタンパク質は、炎症のマーカーであるので、個体中、特に以前に炎症を起こしたことのある区域中のＣ反応性タンパク質量が減少するかどうかを分析して、上記治療方法の有効性をモニターすることができる。
【０２３４】
４．６．４．樹状細胞及び顆粒球細胞集団の産生
本発明の化合物を投与すると、特に、幹細胞及び／又は前駆細胞の分化を、樹状細胞発達系路でなく顆粒球発達経路に沿ってモジュレートすることができる。同様に、本発明の細胞をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでモジュレートして、増殖した樹状細胞若しくは顆粒球集団を提供することができる。
【０２３５】
樹状細胞は、免疫療法のための試薬として使用することができる。たとえば、樹状細胞をＴリンパ球及びタンパク質抗原とｉｎ  ｖｉｔｒｏで共培養し、それによりＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで抗原特異的に活性化することができる。次いで、活性化したＴ細胞を自家投与して、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗原特異的免疫応答を起こす（ＷＯ９７／２４４３８号）。別の例では、Ｔリンパ球と、組換え構築物由来の抗原タンパク質を直接に発現する樹状細胞とを接触させて、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化することができる。活性化したＴ細胞は、自家注入に使用することができる（ＷＯ９７／２９１８３号）。
【０２３６】
特定のペプチド又はタンパク質断片によって活性化されたＴ細胞は、そのペプチド又は断片の供給源であったタンパク質、細胞若しくは生物体に対する免疫感作剤になる。たとえば、樹状細胞に、腫瘍特異的なペプチドを負荷することができる。ＤＣによってＴ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化して前立腺癌を治療するという特定の適用例が、米国特許第５，７８８，９６３号に記載され、特許請求の範囲に記載されている。Ｍａｙｏｒｄｏｍｏらは、合成腫瘍ペプチドを提示させた骨髄由来樹状細胞が、防御及び治療となる抗腫瘍免疫を惹起することを実証している（Nature Medicine第1巻:1297〜1302ページ(1995年)；J.Exp.Med、第183巻:1357〜1365ページ(1996年)）。米国特許第５，６９８，６７９号は、樹状細胞を含む標的の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に抗原ペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで送達する免疫グロブリン融合タンパク質を記載している。この同じ手法を、ウイルス、細菌、又は寄生生物由来のペプチド又は抗原で使用すると、ウイルス、細菌、又は寄生生物のワクチンを創出することができる。
【０２３７】
樹状細胞は、様々な免疫障害の治療における治療介入のための標的でもある。たとえば、樹状細胞は、ＡＩＤＳの病原性及び病態生理において重要な役割を果たす（たとえば、ＨＩＶウイルスの貯蔵器として働く）ことが示唆されている。Zoeteweijら、J.Biomed.Sci.第5巻(4):253〜259ページ(1998年)；Grouardら、Curr.Opin.Immunol.第9巻(4):563〜567ページ(1997年)；Weissmanら、Clin.Microbiol.Rev.第10巻(2):358〜367ページ(1997年)を参照されたい。ＤＣのＨＩＶ感染を無効にする薬剤の薬剤候補をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングする方法が、米国特許第５，６２７，０２５号に記載されている。別の例では、樹状細胞を操作して、レシピエント中でドナー組織又は臓器に対するＴ細胞の無応答性を誘導することができる（米国特許第６，３７５，９５０号を参照のこと）。
【０２３８】
顆粒球は、感染、たとえば細菌による新生児敗血症、癌患者における好中球減少に随伴する感染、及び骨髄移植を受けている患者の潜在的な感染を治療又は予防する際に顆粒球輸血に使用することができる。顆粒球は、アレルギーの予防又は治療にも使用することができる。たとえば、ＩｇＥを媒介とする炎症に関与する顆粒球（すなわち、その一部がアレルゲンに特異的である、ＩｇＥ抗体で覆われた顆粒球）を失活させ、アレルゲンに対してすでに確立している免疫応答の症状を軽減するために使用することができる（米国特許第６，３８３，４８９号を参照のこと）。
【０２３９】
したがって、本発明の一実施形態では、個体に治療上有効な量の本発明の化合物を投与することを含み、前記量が、前記個体に内因性のＣＤ３４＋細胞から複数の顆粒球を産生させるのに十分なものである方法によって、前記個体中の顆粒球集団を本発明の前駆細胞から増殖させる。別の実施形態では、個体にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞集団を投与することを含み、ここで前記細胞が、本発明の化合物と少なくとも３日間接触させたものであって、前記個体にその細胞集団を投与する方法によって、前記個体内で顆粒球集団を増殖させる。別の実施形態では、個体にＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞集団と本発明の化合物を投与すること含み、前記本発明の化合物の用量が、複数の前記細胞集団を顆粒球へと分化させるのに十分なものである方法によって、前記個体中で顆粒球集団を増殖させる。上記実施形態の具体的な実施形態では、前記ＣＤ３４＋前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋細胞である。
【０２４０】
４．６．５．他の疾患及び症状の治療
本発明の分化した幹細胞及び前駆細胞、又は本発明の化合物は、単独又は組み合わせて、他の様々な疾患又は症状の治療又は予防にも使用することができる。ある実施形態では、たとえば、その疾患又は障害には、血管若しくは心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、再生不良性貧血、脊髄形成異常、心筋梗塞、発作障害、多発性硬化症、卒中、低血圧、心停止、虚血、炎症、加齢による認知機能の喪失、放射線による損傷、脳性麻痺、神経変性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、リー病、ＡＩＤＳ痴呆、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、虚血性腎疾患、脳若しくは脊髄の外傷、心肺バイパス、緑内障、網膜の虚血、網膜の外傷；リソソーム蓄積症、例えばテイ−サックス病、ニーマン−ピック病、ファブリー病、ゴーシェ病、ハンター病、ハーラー症候群など、並びに他のガングリオシド蓄積症、ムコ多糖症、及び糖原病リソソーム蓄積症；先天的な代謝障害、副腎白質ジストロトフィー、嚢胞性線維症、糖原蓄積病、甲状腺機能低下症、鎌状赤血球貧血、ピアソン症候群、ポンペ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、メープルシロップ尿症、ホモシスチン尿症、ムコ多糖蓄積症、慢性肉芽腫症、及びチロシン血症、テイ−サックス病、癌、腫瘍、又は他の病理学的若しくは腫瘍性の状態が含まれるがこれに限定されるものではない。
【０２４１】
他の実施形態では、本発明の細胞（たとえば、本発明の化合物に暴露してあるもの）は、外傷、特に炎症を伴う外傷によるあらゆる種類の傷害の治療に使用することができる。そのような外傷に関連した状態の例には、脳、脊髄、若しくはＣＮＳの周囲組織の傷害を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害、末梢神経系（ＰＮＳ）の傷害、又は他の任意の身体部分の傷害が含まれる。このような外傷は、事故によって引き起こされたものであっても、手術や血管形成術などの医学的手順の正常又は異常な結果であってもよい。外傷は、血管の破裂又は閉塞、たとえば卒中又は静脈炎に関連していてもよい。具体的な実施形態では、角膜上皮欠損の治療、軟骨の修復、顔面削皮術、粘膜、鼓膜、腸の内層、神経構造（たとえば、網膜、基底膜の聴覚ニューロン、嗅覚上皮の嗅覚ニューロン）、外傷による皮膚損傷についての火傷及び創傷の修復を含むがこれに限定されるものではない、自己又は異種組織の再生若しくは代償療法若しくはプロトコルにおいて、又は損傷若しくは疾患のある他の臓器若しくは組織の再構築のために、上記細胞を使用することができる。
【０２４２】
具体的な実施形態では、疾患又は障害は、再生不良性貧血、脊髄形成異常、白血病、骨髄障害、又は造血の疾患若しくは障害である。別の具体的な実施形態では、被験体はヒトである。
【０２４３】
４．７．医薬組成物
本発明は、単回及び／又は複数回用量の１種又は複数の本発明の化合物を含み、前記の単回用量又は複数回用量は、順化させた又は順化させていないヒトＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞の移植前又はその後に、個体に単回投与又は複数回投与すると有効であり、そうした幹細胞及び／又は前駆細胞の、特定の細胞型、たとえば造血系統の細胞、特に骨髄系統の細胞への分化を抑制し、モジュレートし、かつ／又は調節するのに十分な効果を発揮する医薬組成物を含む。これに関連して、他の場合と同様に本発明でも、「個体」とは、化合物又は細胞を投与する任意の個体、たとえば哺乳動物、鳥類、又は爬虫類を意味する。
【０２４４】
したがって、具体的な実施形態では、本発明の化合物の、前記の単回用量又は複数回用量を個体に投与すると、内因性のＣＤ３４＋前駆細胞の樹状細胞への分化がモジュレートされる。より具体的な実施形態では、その単回用量又は複数回用量は、前記単回用量又は複数回用量を投与した前記個体中の顆粒球細胞数を増加させる。別のより具体的な実施形態では、その単回用量又は複数回用量は、前記の単回用量又は複数回用量を投与した哺乳動物中のＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋若しくはＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３−前駆細胞数を増加させる。
【０２４５】
他の実施形態では、目的のＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞を、その必要のあるヒト被験体又は患者に移植する。移植した後、本発明の化合物をヒト被験体又は患者に投与して、移植された目的の細胞の分化をｉｎ  ｖｉｖｏでモジュレートする。具体的な実施形態では、そのような細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで顆粒球に分化させる。さらに他の実施形態では、ヒト被験体又は患者の中にある目的の前駆細胞又は幹細胞の分化を、本発明の化合物を投与してｉｎ  ｓｉｔｕでモジュレートする。
【０２４６】
さらに別の実施形態では、本発明は、単離された臍帯血幹細胞又は前駆細胞集団を、本発明の方法に従ってＰＤＥ ＩＶ活性を阻害する化合物に暴露して分化させた造血前駆細胞で増強したものを含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の化合物と接触させた幹細胞又は前駆細胞を添加した臍帯血を含む医薬組成物を提供するが、具体的な実施形態では、前記幹細胞又は前駆細胞は、前記化合物によって分化させたものである。
【０２４７】
さらに別の実施形態では、本発明は、１種又は複数の本発明のＰＤＥ ＩＶ阻害剤と、本発明の幹細胞及び／若しくは前駆細胞の両方を含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、幹細胞及び／又は前駆細胞の分化が、異なる発達／分化経路に沿ってモジュレートされるように、投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２日前に調製することができる。
【０２４８】
さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、幹細胞又は前駆細胞のみを含んでいてもよく、ここで前記細胞は、本明細書で開示する方法に従って分化させたものである。したがって、本発明は、複数の幹細胞及び／又は前駆細胞を含み、ここで前記の複数の幹細胞及び／又は前駆細胞が、前記細胞の分化をモジュレートするのに十分な濃度の本発明の１種又は複数のＰＤＥ ＩＶ阻害剤と、そうするのに十分な期間にわたり接触させたものである、医薬組成物を提供する。
【０２４９】
したがって、本発明の医薬組成物は、個体に投与される本発明の化合物；本発明の化合物と組み合わせて別々に個体に投与される本発明の細胞；及び前記個体に投与される、本発明の化合物と接触させた本発明の細胞を含む。
【０２５０】
本発明は、治療上有効な量の本発明の化合物又は組成物を、哺乳動物、好ましくはヒト被験体に投与して、被験体に移植された又は被験体内に存在するＣＤ３４＋若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞の増殖及び／又は分化のモジュレーションを実現することによる、疾患又は障害の治療及び予防方法を提供する。一実施形態では、本発明は、ＣＤ３４＋及びＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞の分化を、哺乳動物内で顆粒球細胞数が増加するようにモジュレートする方法を提供する。別の実施形態では、本発明の化合物を哺乳動物、好ましくはヒトに投与して、ＣＤ３４＋及び／若しくはＣＤ１３３＋前駆細胞又は幹細胞から派生し得る任意の細胞系統をモジュレートすることができる。用語「哺乳動物」は、本明細書では、任意の哺乳動物を含む。哺乳動物は、そのような治療又は予防を必要としていることが好ましい。哺乳動物の例には、好ましくは、限定されるものではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルなどが含まれ、より好ましくはヒトである。
【０２５１】
本発明の化合物の投与は、全身投与又は局所投与のいずれでもよい。ほとんどの場合、哺乳動物に投与すると、本発明の化合物が全身に放出されることになる（すなわち、血流にのる）。投与方法には、経口、頬側、舌下、直腸などの経腸経路；経皮や皮内などの局所投与；及び非経口投与が含まれる。適切な非経口経路には、皮下針若しくはカテーテルによる注射、たとえば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、動脈内、脳室内、くも膜下腔内、眼内、及び前眼房内（intracameral）注射、並びに腟内、直腸、若しくは経鼻投与などの非注射経路が含まれる。本発明の化合物及び組成物は、経口投与することが好ましい。特定の実施形態では、１種又は複数の本発明の化合物を、治療する必要のある区域に局所投与することが望ましい。これは、たとえば、術中の局所注入、たとえば術後の創傷包帯剤と合わせての局所への塗布、注射、カテーテル、坐剤、又は植込錠によって実施することができ、前記の植込錠は、シアラスティック膜などの膜や繊維を含む多孔質、非多孔質、又はゼラチン質の材料のものでありうる。
【０２５２】
本発明の化合物は、典型的な送達系だけでなく、標準的でない送達系、たとえば、リポソーム中への封入、微小粒子、マイクロカプセル、カプセルなどによっても投与することができる。たとえば、本発明の化合物及び組成物を、小胞、特にリポソームに入れて送達することができる（Langer、1990年、Science第249巻:1527〜1533ページ；Treatら、「Liposomes」、出典:Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-Berestein及びFidler編、Liss、米国ニューヨーク、353〜365ページ(1989年)；Lopez-Berestein、同書、317〜327ページ；並びに同書全般を参照のこと）。別の例では、本発明の化合物及び組成物を、徐放系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Langer、前掲書；Sefton、1987年、CRC Crit.Ref Biomed.Eng.第14巻:201ページ；Buchwaldら、1980年、Surgery第88巻:507ページ、Saudekら、1989年、N.Engl.J Med.第3巻:574ページを参照のこと）。別の例では、高分子材料を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release）、Langer及びWise編、CRC Press.、米国フロリダ州Boca Raton(1974年)；「Controlled Drag Bioavailability, Drug Product Design and Performance」、Smolen及びBall編、Wiley、ニューヨーク(1984年)；Ranger及びPeppas、1983年、J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.第23巻:61ページ；並びにLevyら、1985年、Science第228巻:190ページ；Duringら、1989年、Ann.Neurol.第25巻:351ページ；Howardら、1989年、J.Neurosurg.第71巻:105ページを参照のこと)。さらに別の例では、徐放系を治療する標的区域、たとえば肝臓の付近に配置することができ、したがって、全身用量のほんの一部しか必要とならない（たとえば、Goodsonの「Medical Applications of Controlled Release」、前掲書、第2巻、115〜138ページ(1984年)を参照のこと）。Langerによる総説(1990年、Science第249巻:1527〜1533ページ)で論じられている他の徐放系を使用することもできる。本発明の化合物は、組成物として投与するとき、哺乳動物への投与に適した剤形になるよう、薬学的に許容される適量のビヒクル又は担体を配合する。用語「薬学的に許容される」とは、哺乳動物、特にヒトでの使用が、連邦政府又は州政府の規制機関に認可され、あるいは米国薬局方、又は一般に認められている他の薬局方に記載されていることを意味する。用語「ビヒクル」とは、哺乳動物に投与するために本発明の化合物に配合する希釈剤、佐剤、賦形剤、又は担体を指す。このような薬学的に許容されるビヒクルは、水や油などの液体、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの、石油系、動物性、植物性、又は合成の油でありうる。薬剤用ビヒクルは、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などでよい。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤、及び着色剤を使用してよい。哺乳動物に投与するとき、本発明の化合物及び組成物、並びに薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤、又は希釈剤は、無菌であることが好ましい。本発明の化合物を静脈内投与するとき、水、生理食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液などの水性媒質が好ましいビヒクルである。
【０２５３】
本発明の化合物及び組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、ペレット、トローチ剤、粉剤、顆粒剤、シロップ剤、エリキシル剤、溶剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、若しくはその持効放出性製剤の剤形、又は哺乳動物への投与に適する他の任意の剤形を取ることができる。好ましい実施形態では、本発明の化合物及び組成物を、常套の手順に従って、ヒトへの経口若しくは静脈内投与に適合させた投与用医薬組成物として製剤化する。一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは、硬質ゼラチンカプセルである。適切な薬剤用ビヒクル及びその配合方法の例は、参照により本明細書に組み込まれる「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Alfonso R. Gennaro編、Mack Publishing Co.米国ペンシルヴェニア州Easton、第19版、1995年、Chapters 86、87、88、91、及び92章に記載されている。
【０２５４】
経口送達用に製剤化された本発明の化合物及び組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤の剤形、又は任意の圧縮剤形であることが好ましい。さらに、錠剤又は丸剤の形である場合、化合物及び組成物をコーティングして、消化管での崩壊及び吸収を遅らせ、それによってより長い期間にわたり持効性作用をもたらすことができる。浸透圧により活性が生じる推進化合物を覆う選択的に透過性のある膜も、経口投与用の本発明の化合物及び組成物に適する。その後者の基盤（platform）では、カプセルを覆う環境からの流体が推進化合物によって吸収され、化合物が膨張して、開口部を通して薬品又は薬品組成物を放出する。このような送達基盤は、即時放出製剤の鋭利なプロフィールとは対照的に、本質的にゼロ次の送達プロフィールをもたらし得る。モノステアリン酸グリセロールやステアリン酸グリセロールなどの時間遅延材料を使用してもよい。経口組成物は、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、ケイ酸ナトリウム、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロースなど、標準のビヒクル、賦形剤、及び希釈剤を含んでよく、その製剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などの滑沢剤；湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤；メチル及びプロピルヒドロキシ安息香酸塩などの保存剤をさらに含んでよい。そうしたビヒクルは、医薬級であることが好ましい。経口投与される本発明の化合物及び組成物は、薬剤として味のよい製剤にするために、任意選択で、フルクトース、アスパルテーム、サッカリンなどの１種又は複数の甘味剤；ペパーミント、冬緑油、チェリーなどの１種又は複数の着香剤；あるいは１種又は複数の着色剤を含んでいてもよい。
【０２５５】
特定の障害又は症状を治療するための治療上有効な投与計画は、その性質及び重症度に応じて変わり、医療従事者の判断に従って、標準の臨床上の技量によって決定することができる。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイを使用して、最適投与量の確認に役立ててもよい。当然、治療上有効な用量を構成する本発明の化合物の量も、投与経路に応じて変わる。一般に、経口投与に適する投与量は、１日当たり、体重１キログラムあたり本発明の化合物約０．００１ミリグラム〜約２０ミリグラム、好ましくは約０．７ミリグラム〜約６ミリグラム、より好ましくは約１．５ミリグラム〜約４．５ミリグラムの範囲である。好ましい実施形態では、哺乳動物、好ましくはヒトに、本発明の化合物を１日当たり約０．０１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、より好ましくは１日約０．１ｍｇ〜約３００ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約２５０ｍｇを、単回用量又は分割用量で経口投与する。本明細書に記載の投与量は、総投与量を指し、すなわち、本発明の化合物を２種以上投与する場合、好ましい投与量は、投与する本発明の化合物の総量に対応する。経口用組成物は、本発明の化合物を１０重量％〜９５重量％含有していることが好ましい。好ましい単位経口投与剤形には、丸剤、錠剤、及びカプセル剤が含まれ、カプセル剤がより好ましい。通常、このような投与剤形単位は、本発明の化合物を約０．０１ｍｇ、０．１ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、又は５００ｍｇ含有し、好ましくは剤形単位あたり化合物を約５ｍｇ〜約２００ｍｇ含有する。
【０２５６】
別の実施形態では、本発明の化合物及び組成物は、（たとえば、筋肉内、くも膜下腔内、静脈内、及び動脈内経路によって）非経口的に投与、好ましくは静脈内投与することができる。通常、静脈内投与用の本発明の化合物及び組成物は、水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液など、等張性の無菌水性ビヒクルの溶液である。必要に応じて、組成物は、安定剤も含んでよい。静脈内投与用の組成物は、場合により、注射部位の痛みを和らげるために、リグノカインなどの局所麻酔剤を含んでよい。静脈内投与では、本発明の化合物及び組成物を、アンプル又はサシェットなどの、有効薬剤の量を表示してある密閉容器に入れた、凍結乾燥した無菌の乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給することができる。次いで、静脈内投与の前に、そのような粉末又は濃縮物を適切な水性媒質で希釈する。投与前に希釈するために、無菌の水、生理食塩水、又は他の適切な水性媒質のアンプルを、粉末又は濃縮物に添えて提供することができる。あるいは、組成物を、すぐに投与できる混合済みの形態にして供給することもできる。本発明の化合物又は組成物を静脈内注入によって投与しようとする場合では、たとえば、化合物又は組成物を、医薬級の無菌の水、生理食塩水、又は他の適切な媒質を含む注入瓶に分注することができる。
【０２５７】
カカオ脂、変性植物油などの従来型の担体、及び他の脂肪基剤から製剤化した坐剤を使用して、直腸投与を行うことができる。坐剤は、周知の処方を使用して周知の方法によって製剤化することができ、たとえば、参照により本明細書に援用される「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、Alfonso R. Gennaro編、Mack Publishing Co.米国ペンシルヴェニア州Easton、第19版、1995年、1591〜1597ページを参照されたい。
【０２５８】
局所投与剤形を製剤化し、投与するには、ローション剤、クリーム剤、軟膏などの周知の経皮及び皮内送達媒質、並びにパッチなどの経皮送達デバイスを使用することができる（参照により本明細書に援用されるGhosh,T.K.、Pfister,W.R.、Yum,S.I.「Transdermal and Topical Drug Delivery Systems」、Interpharm Press,Inc.、249〜297ページ）。たとえば、貯蔵型のパッチ設計は、接着剤で覆われた背面フィルムと、半透膜によって皮膚と隔てられる、本発明の化合物又は組成物を含む貯蔵区画とを含むことができる（たとえば、参照により本明細書に援用される米国特許第４，６１５，６９９号）。接着剤で覆われた背面層は、貯蔵区画の境界周囲に広がって、皮膚と共に中心位での密閉を実現し、貯蔵区画を皮膚に隣接させて保持する。
【０２５９】
本発明は、１種又は複数の本発明の化合物を充填した１種又は複数の容器を含む薬剤パック又はキットも提供する。場合により、そのような容器に、医薬品又は生物製剤の製造、使用、又は販売を取り締まる政府機関によって規定された、その機関によってヒトへの投与向けに製造、使用又は販売することが認可されたことを表す通知を添えることができる。一実施形態では、キットは、１種以上の本発明の化合物を含む。別の実施形態では、キットは、本発明の化合物と、別の生物学的活性を有する薬剤とを含む。
【０２６０】
本発明の化合物は、ヒトに使用する前に、所望の治療又は予防活性があるかどうか、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでアッセイすることが好ましい。たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、本発明の特定の一化合物を投与するのと、本発明の化合物を併用投与するのではどちらが好ましいかを判定することができる。本発明の化合物及び組成物が有効かつ安全であることを、動物モデル系を使用して実証してもよい。他の方法は、当業者に公知であり、本発明の範囲内にある。
【０２６１】
４．８．本発明の方法を使用するアッセイ
上述の方法、すなわち、ＳｅｌＣＩＤがＣＤ３４＋細胞などの初期前駆細胞の分化に及ぼす作用についての試験は、目的のどんな化合物にも適用できるが、分化に対するその作用がわかっていることが望ましい。試験は、いくつかの手段で実施することができる。
【０２６２】
一実施形態では、単にＳｅｌＣＩＤ又は他の本発明の化合物に替えて、その化合物を使用することができる。そこで、前駆細胞の、単分化能細胞及び／又は完全に分化した細胞への増殖及び／又は分化を可能にする条件下で、ＣＤ３４＋前駆細胞及び／又はＣＤ１３３＋前駆細胞を、様々な濃度の目的の化合物と接触させることができる。本明細書で開示する培養方法、特に第４．４節で開示した培養方法を使用することができる。目的の化合物の作用は、それがある場合には、前駆細胞から分化する細胞集団の変化を評価して決定し、その変化は、表現型の変化によってモニターすることもできるが、細胞表面マーカーが存在するか否かを判定して評価することが好ましい。本発明の方法のように、目的の化合物を、最初の培養からの任意の時期に１回で投与して、最終的に分化した細胞を得ることができる。あるいは、目的の化合物を、増殖期、分化期、又はその両方の期間中に複数回で投与してもよい。増殖／分化途中にある前駆細胞の表現型の特徴の変化は、ＤＭＳＯ処理細胞などの対照細胞培養物と比較することが好ましい。これに限定されるものではないが、増殖速度のモジュレーション、分化速度のモジュレーション、前駆細胞の特定の単分化能前駆細胞への分化のモジュレーション、特定の細胞型への分化の阻止、及び特定の細胞型への分化の増強など、増殖又は分化に対する作用があれば、特に関心を引くものになる。
【０２６３】
別の実施形態では、培養、増殖、及び分化は上記のように行われるが、目的の化合物をＳｅｌＣＩＤ（商標）などのＰＤＥ ＩＶ阻害剤と共に前駆細胞と接触させる。この方式では、複数の化合物の可能性ある相乗効果（相乗作用）を判定することができる。単独では増殖又は分化に対して全く又は僅かしか効果をもたないが、ＳｅｌＣＩＤ（商標）又はそのプロドラッグと併用すると有意な作用をもつ化合物があれば、特に関心を引くものになる。別の実施形態では、通常は前駆細胞の増殖及び分化を可能にする上記のような培養条件下で、任意の目的の化合物２種を前駆細胞と接触させることができる。そこで、前駆細胞を２種の目的の化合物と接触させる実験が、前駆細胞を前記化合物それぞれの一方のみと接触させる対照、前駆細胞をＳｅｌＣＩＤ（商標）などのＰＤＥ ＩＶ阻害剤と接触させる対照、並びに細胞を化合物と接触させないか、又はＤＭＳＯと接触させる対照を含むことが好ましい。投与量及び投与するタイミングの変形形態は、同じく上記及び第４．４節に記載のとおりである。
【実施例】
【０２６４】
５．１．実施例１：ＣＤ３４＋前駆細胞の分化に対するＰＤＥ ＩＶ阻害剤の作用
ＣＤ３４＋（造血前駆細胞）細胞の分化とコロニー形成単位（ＣＦＵ）の生成にＰＤＥ ＩＶ阻害剤が及ぼす作用を判定するために次のアッセイを利用する。重要なことには、このアッセイから、ＰＤＥ ＩＶ阻害剤が赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制する一方で、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成と総コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｔｏｔａｌ）の産生促進との両方を増強する能力を有することが実証される。したがって、本発明の方法は、幹細胞の分化の調節に使用でき、コロニー形成速度の促進にも使用でき、骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復とを促進することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。
【０２６５】
２０％ウシ胎仔血清及びサイトカイン類（ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びｋｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加したＩＭＤＭ培地で１ウェルあたり１０００細胞の密度となるように臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞を９６ウェル培養ディッシュ内で培養する。細胞を１つ以上のＰＤＥ ＩＶ阻害剤又はＤＭＳＯ（対照化合物）に暴露し、６日間培養する。２０％ウシ胎仔血清及びサイトカイン類（ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びｋｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加したＩＭＤＭ培地で１ウェルあたり１０００細胞の密度で臍帯血ＣＤ３４＋細胞を９６ウェル培養ディッシュに播種する。培養後、細胞を染色して蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）で分取する。染色した細胞４００μＬを回収し、１％でウシ胎仔血清を溶解したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して１．０ｍｌとする。細胞を計数して幹細胞の分化のモジュレーションの作用を判定する。結果は、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成抑制、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成の増強、並びに総コロニー形成単位の産生促進を示すであろう。したがって、本発明の方法は幹細胞の分化の調節に使用でき、特異的コロニー形成速度の促進にも使用でき、目的とする移植片が生着可能な系列に始原幹細胞の分化を方向づけることで骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復とを促進することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。
【０２６６】
５．２．実施例２：ヒト臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞の分化に対するＰＤＥ ＩＶ阻害剤の作用
本実施例では、臍帯血（ＣＢ）単核細胞の増殖とＣＤ３４＋（造血前駆）細胞への分化に対するＰＤＥ ＩＶ阻害剤の作用を検討する。臍帯血単核細胞は造血前駆（ＣＤ３４＋）細胞の小集団を含む混合細胞集団である。このＣＤ３４＋細胞の小集団のサブセットには（総ＣＢ単核細胞のおよそ１％の）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞集団及びそれより小さな（総ＣＢ単核細胞の１％未満の）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団が含まれる。重要なことには、陽性対照及び陰性対照と比較して、ＰＤＥ ＩＶ阻害剤はＣＤ３４＋細胞のアップレギュレーション（分化の増強）と、造血幹細胞又は前駆細胞の分化の阻害又は速度低下とを引き起こすであろう。
【０２６７】
５．２．１．材料と方法
ＣＢのＣＤ３４＋細胞はサイトカイン類（ＩＬ３、Ｇ−ＣＳＦ及びＫｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加した２０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ（ウシ胎仔血清／Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地）を用い２４ウェルプレート内で４×１０４細胞／ｍｌで培養を開始する。ＰＤＥ ＩＶ阻害剤を種々の濃度で培養液に加える。同容量のＤＭＳＯを対照として用いる。何も化合物を加えない陰性対照も用いる。細胞を加湿培養器内で５％ＣＯ２の気相下で３７℃にて７日間培養する。次に細胞をそれぞれのウェルから回収する。
【０２６８】
ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）１７００（Ａｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で計数することで各ウェルの総細胞数を測定し、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１１ｂ及びＧｌｙ−Ａの発現をＦＡＣＳ（蛍光励起セルソーティング）染色で分析する。
【０２６９】
５．３．実施例３：ヒト臍帯血ＭＮＣ細胞に対するＰＤＥ ＩＶ阻害剤の作用
標準法で凍結保存し解凍した臍帯血ＭＮＣを標準Ｆｉｃｏｌｌ分離法で単離し、サイトカイン類（ＩＬ６、ＫＬ及びＧ−ＣＳＦ、各１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭに０．５×１０６細胞／ｍｌとして２４ウェルプレート内で培養する（三連で行う）。実験群は無添加（サイトカインのみ）、ＤＭＳＯ（１．７ｕｌ）、及びＤＭＳＯに溶かした種々の濃度のＰＤＥ ＩＶ阻害剤である。１週間培養後に培養した細胞を回収し、ＦＡＣＳ染色で分析する。
【０２７０】
５．４．実施例４：単球産生に対するＰＤＥ ＩＶ阻害剤の作用
サイトカイン類（ＩＬ−３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＬ及びＥｐｏ）を添加した２０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ培地中に４×１０４細胞／ｍｌで精製したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（９０％を超えるＣＤ３４＋）を加湿した５％ＣＯ２培養器内で３７℃で１４日間培養する。実験群は、（ｉ）ＤＭＳＯと化学化合物無添加（「なし」）、（ｉｉ）ＤＭＳＯ単独、並びに（ｉｉｉ）ＤＭＳＯに溶かしたＰＤＥ ＩＶ阻害剤、の群からなる。細胞のアリコートを回収し、ＣＤ３４−ＰＥ結合モノクローナル抗体及びＣＤ１４−ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体で染色する。
【０２７１】
５．５．実施例５：臍帯血及び胎盤由来の移植された有核細胞に対するＰＤＥ ＩＶ阻害剤の作用
本実験はＰＤＥ ＩＶ阻害剤による前処理が、移植された胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）の生存を増強することを実証する。
【０２７２】
胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）はヒトのドナーから得る。ＰＬＮＣ及びＵＣＢＮＣは胎盤及び臍帯から得る。
【０２７３】
細胞を１０μｇ／ｍｌのＰＤＥ ＩＶ阻害剤と共に２％ヒトＣＢ血清を添加したＤＭＥＭで２４時間培養することで前処理する。次に、細胞を洗浄し、自己血漿に再懸濁して、標準法にしたがって致死照射（９００ｃＧｙ）により骨髄破壊を生じたレシピエント成体ＳＪＬ／Ｌマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内投与する。このような放射線照射で照射後５０日以内に９０％以上が死亡する（Endeら、2001年、Life Sciences第69巻(13)、1531〜1539ページ;ChenとEnde、2000年、J. Med.第31巻、21〜30ページ;Endeら、2000年、Life Sci.第67巻(1)、53〜9ページ;EndeとChen、2000年、Am. J. Clin. Pathol.第114巻、89ページ）。
【０２７４】
５．６．実施例６：ＣＤ３４＋前駆細胞の分化に対するＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用
本実施例では、ＣＤ３４＋（造血前駆）細胞の分化及びコロニー形成単位（ＣＦＵ）の生成にＳｅｌＣＩＤ（商標）が及ぼす作用を分析する。重要なことに、結果は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）を使用して、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成と総コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｔｏｔａｌ）の産生促進の両方を増強する一方で、赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制することができることを実証している。
【０２７５】
したがって、本発明の方法は幹細胞の分化の調節に使用でき、コロニー形成速度の促進にも使用でき、骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復とを改善することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。
【０２７６】
２０％ウシ胎仔血清及びサイトカイン類（ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びｋｉｔリガンド（ＫＬ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加したＩＭＤＭ培地で１ウェルあたり１０００細胞の密度で臍帯血ＣＤ３４＋造血前駆細胞を９６ウェル培養ディッシュに入れる。細胞をＳｅｌＣＩＤ（商標）又はＤＭＳＯ（対照化合物）に暴露し、６日間培養する。２０％ウシ胎仔血清及びサイトカイン類（ＩＬ−３、Ｇ−ＣＳＦ及びｋｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加したＩＭＤＭ培地で１ウェルあたり１０００細胞の密度で臍帯血ＣＤ３４＋細胞を９６ウェル培養ディッシュに入れる。培養後、細胞を染色して蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）で分取する。染色した細胞４００μＬを回収し、１％でウシ胎仔血清を溶かしたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して１．０ｍｌとする。細胞を計数して幹細胞の分化のモジュレーション作用を判定する。
【０２７７】
本発明の化合物は造血前駆幹細胞の系列への分化の方向づけのモジュレーションに有効である。したがって、ＳｅｌＣＩＤ（商標）を使用して、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成と総コロニー形成単位の産生促進の両方を増強する一方で、赤血球又は赤血球産生コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制することができる。したがって、本発明の方法は、幹細胞の分化の調節に使用でき、特異的コロニー形成速度の促進にも使用でき、目的とする移植片が生着可能な系列へ始原幹細胞の分化を方向づけることで骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復とを改善することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。
【０２７８】
５．７．実施例７：ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞の増殖と分化に対するＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用
本実施例では、臍帯血（ＣＢ）単核細胞の増殖とＣＤ３４＋（造血前駆）細胞への分化に対するＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用を検討する。臍帯血単核細胞は造血前駆（ＣＤ３４＋）細胞の小集団を含む混合細胞集団である。このＣＤ３４＋細胞の小集団サブセットには（総ＣＢ単核細胞のおよそ１％の）ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞集団及びそれより小さな（総ＣＢ単核細胞の１％未満の）ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団が含まれる。ＳｅｌＣＩＤ（商標）は陽性対照及び陰性対照と比較してＣＤ３４＋細胞のアップレギュレーション（分化の増強）を引き起こし、造血幹細胞又は前駆細胞の分化をおそらく阻害する又は減速しうる。
【０２７９】
５．７．１．材料と方法
サイトカイン類（１Ｌ３、ＧＣＳＦ及びＫｉｔリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社））を添加した２０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ（ウシ胎仔血清／Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地）を用い、４×１０４細胞／ｍｌとなるように２４ウェルプレート内でＣＢのＣＤ３４＋細胞の培養を開始する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）を異なる３濃度、すなわち５μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び０．３μｇ／ｍｌとなるように培養液に加える。同容量のＤＭＳＯを対照として用いる。化合物を何も加えない陰性対照も用いる。細胞を加湿培養器内で５％ＣＯ２の気相下で３７℃にて７日間培養する。次に、それぞれのウェルから細胞を回収する。
【０２８０】
各ウェルの総細胞数をＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）１７００（Ａｂｏｔｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で計数して測定し、ＣＸＣＲ４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ１１ｂ及びＧｌｙ−Ａの発現をＦＡＣＳ（蛍光励起セルソーティング）染色で分析する。
【０２８１】
２人の異なるドナーからのＣＢ細胞（ＣＢ２２７６及びＣＢ２４１７）を別々に培養、アッセイ、分析する。
【０２８２】
５．７．２．結果と考察
サイトカインで刺激されたＣＤ３４＋細胞の増殖に及ぼすＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用を試験する。陰性対照と比較した場合に、ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＩＬ−３、Ｋｉｔリガンド（ＫＬ）及びＧ−ＣＳＦの存在下で培養したＣＤ３４＋細胞の増殖に有意な影響を及ぼさない。しかし、ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＤＭＳＯ対照に比べて多数の細胞の回収を誘導することが予想される。
【０２８３】
細胞の分化の発現に及ぼすＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用を表面タンパク質であるＣＸＣＲ４及びＣＤ３４のＦＡＣＳ分析により分析する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＣＸＣＲ４の発現に阻害作用を示すことが予想される。
【０２８４】
表面タンパク質ＣＤ３４＋に関しては、ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＣＤ３４＋細胞のアップレギュレーション（増殖の増大）を引き起こすと予想される。ＳｅｌＣＩＤ（商標）で処理した細胞では、大部分のＣＤ３４＋細胞及びＣＤ３４−細胞はＣＤ３８−で、対照細胞及びＤＭＳＯ処理細胞集団は主にＣＤ３８＋であろう。これは、ＳｅｌＣＩＤ（商標）を使用して、白血球及び血小板形成コロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）の生成と総コロニー形成単位の産生促進の両方を増強する一方で、赤血球又は赤血球形成コロニー（ＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ）の生成を特異的に抑制することができることを示している。したがって、本発明の方法は幹細胞の分化の調節に使用でき、コロニー形成速度の促進にも使用でき、骨髄移植片生着速度と白血球及び／又は血小板産生の回復を改善することによって造血幹細胞移植に顕著な利益をもたらす。
【０２８５】
細胞の分化の発現に及ぼすＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用をＣＤ３４＋３８−細胞に対比したＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞又はＣＤ１１ｂ＋細胞の表面タンパク質のＦＡＣＳ分析によって分析する。免疫蛍光の平均（ＭＩＦ）で測定されるように、ＳｅｌＣＩＤ（商標）処理細胞においてＣＤ１１ｂの発現レベルが減少していることはＣＤ１１ｂの発現が抑制されていることを示す。したがって、ＳｅｌＣＩＤ（商標）存在下で培養する場合にはＣＤ１１ｂ＋細胞はあまり分化していない状態である。
【０２８６】
５．８．実施例８：ヒト臍帯血ＭＮＣ細胞に及ぼすＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用
前実施例ではＳｅｌＣＩＤ（商標）は臍帯血ＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を有意にダウンレギュレートし、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団を増加させると予想されている。本実施例ではＳｅｌＣＩＤ（商標）が臍帯血単核細胞（ＭＮＣ）に対して同様の活性を有することを示す。
【０２８７】
標準法を用いて凍結保存し解凍した臍帯血ＭＮＣを標準Ｆｉｃｏｌｌ分離法で単離し、サイトカイン類（ＩＬ６、ＫＬ及びＧ−ＣＳＦ、各１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭに０．５×１０６細胞／ｍｌで２４ウェルプレート内で培養する（三連で行う）。実験群は、なし（サイトカインのみ）、ＤＭＳＯ（１．７μｌ）、及びＳｅｌＣＩＤ（商標）（ＤＭＳＯ１．７μｌ中に５．０μｇ）である。１週間培養後に培養細胞を回収し、ＦＡＣＳ染色で分析する。
【０２８８】
ＤＭＳＯ又はＳｅｌＣＩＤ（商標）を加えて培養したＭＮＣの総細胞数は対照群（「なし」、サイトカインのみ）よりも少ないと予想される。ＭＩＤ  １を添加して培養した細胞培養物は他の全ての群よりも高い割合のＣＤ３４＋細胞を示すはずであり、総ＣＤ３４＋細胞数は全ての群で同様のはずである。ＳｅｌＣＩＤ（商標）処理細胞においてはＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数が有意に高いであろう。このことは当該化合物で精製ＣＤ３４＋細胞を処理したときの結果と一致する。ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞はＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞よりも移植後に高い効率で生着して増殖するあまり分化していない造血前駆細胞であることが十分に受け入れられている（Daoら、1998年、Blood第91巻(4)、1243〜55ページ;Huangら、1994年、Blood第83巻(6)、1515〜26ページ）。
【０２８９】
培養したＳｅｌＣＩＤ（商標）処理細胞では大部分のＣＸＣＲ４＋細胞はＣＤ４５陰性である。この細胞集団はＳｅｌＣＩＤ（商標）処理細胞では有意に高い。
【０２９０】
この結果は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）が凍結保存、解凍及び／又は凍結保護剤の暴露によって幹細胞が受ける有害作用を無効にするための幹細胞の順化（conditioning）に有用であることを示している。この結果は、ＣＤ３４＋及びＣＤ１４＋細胞の増殖能を促進するＳｅｌＣＩＤ（商標）を用いた処理によって、ＤＭＳＯによるＣＤ３４＋及びＣＤ１４＋細胞の産生の抑制を無効にすることができることもさらに示している。
【０２９１】
５．９．実施例９：単球の産生に対するＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用
サイトカイン類（ＩＬ３、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＬ及びＥｐｏ）を添加した２０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ培地中に４×１０４細胞／ｍｌで、（ＣＤ３４＋細胞が９０％を超える）精製ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞を加湿５％ＣＯ２培養器内で３７℃で１４日間培養する。実験群は、（ｉ）ＤＭＳＯと化学化合物無添加（「なし」）、（ｉｉ）ＤＭＳＯ単独、（ｉｉｉ）ＤＭＳＯに溶かしたＳｅｌＣＩＤ（商標）、の群からなる。細胞のアリコートを回収しＣＤ３４−ＰＥ結合モノクローナル抗体及びＣＤ１４−ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体で染色する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）処理群は対照群よりも有意に高割合のＣＤ３４＋細胞を示すと予想される。さらに、ＣＤ１４＋細胞数の急激な減少が証明するように、単球の産生が減少する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）処理群も同様にＤＭＳＯに暴露することから、ＤＭＳＯにより阻害される単球の産生はＳｅｌＣＩＤ（商標）処理により妨害されると推論できる。
【０２９２】
５．１０．実施例１０：臍帯血と胎盤に由来する移植された有核細胞に対するＳｅｌＣＩＤ（商標）の前処理の作用
本実験は、ＳｅｌＣＩＤ（商標）の前処理が移植された胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）の生存を増大させることを実証する。
【０２９３】
胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）をヒトのドナーから得る。ＰＬＮＣ及びＵＣＢＮＣを胎盤及び臍帯から得る。
【０２９４】
細胞を１０ｇ／ｍｌのＳｅｌＣＩＤ（商標）と共に２％ヒトＣＢ血清を添加したＤＭＥＭ中で２４時間培養することで前処理する。次に、細胞を洗浄し、自己血漿中に再懸濁して、標準法にしたがった致死照射（９００ｃＧｙ）により骨髄破壊を生じたレシピエント成体ＳＪＬ／Ｌマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に静脈内投与する。このような放射線照射で照射後５０日以内に９０％以上が死亡する（Endeら、2001年、Life Sciences第69巻(13)、1531〜1539ページ;Chen及びEnde、2000年、J. Med.、第31巻、21〜30ページ;Endeら、2000年、Life Sci.第67巻(1)、53〜9ページ;Ende及びChen、2000年、Am. J. Clin. Pathol.第114巻、89ページ）。
【０２９５】
ＳｅｌＣＩＤ（商標）による前処理は、移植された胎盤有核細胞（ＰＬＮＣ）、臍帯血有核細胞（ＵＣＢＮＣ）及び骨髄細胞（ＢＭＮＣ）の生存を増大させる。
【０２９６】
５．１１．実施例１１：ＣＤ３４＋前駆細胞の分化のモジュレーション
骨髄及び臍帯血ＣＤ３４＋前駆細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから入手し、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でＢＩＴ９５０００（StemCell Technologies）を加えたＩｓｃｏｖｅのＭＤＭで６日間培養し、次にＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でさらに６日間培養する。
【０２９７】
細胞表面表現型の分析：第６日及び第１２日にＦＩＴＣ結合ｍＡｂ及びＰＥ結合ｍＡｂを用いて細胞を二重染色（４℃、３０分間）する。使用する抗体としてＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからＣＤ３４（ＰＥ）、ＣＤ３８（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３３（ＦＩＴＣ）、ＣＤ１ａ（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８６（ＰＥ）、ＣＤ１４（ＰＥ）、ＣＤ８３（ＰＥ）、ＣＤ５４（ＰＥ）、ＣＤ１１ｂ（ＰＥ）、ＣＤ１１ｃ（ＰＥ）、ＨＬＡ−ＤＲ（ＰＥ）、ＣＤ１５（ＦＩＴＣ）を、ＭｉｌｔｅｎｙｉからＣＤ１３３（ＰＥ）を入手する。１００００事象（Ｃｏｕｌｔｅｒ）の獲得後にＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータで蛍光分析を行う。
【０２９８】
アポトーシスの検出：ヨウ化プロピジウムと組み合わせてアネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎアポトーシス検出キットＩ）を使い製造業者の指示に従ってホスファチジルセリンの露出を測定する。
【０２９９】
食作用：細胞のエンドサイトーシス活性をＦＩＴＣ−デキストランの取込みを測定することで分析する。細胞を完全培地で１ｍｇ／ｍｌのデキストラン−ＦＩＴＣ（シグマ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、陰性対照では４℃で１時間インキュベートする。
【０３００】
Ｔ細胞増殖アッセイ：１３日間培養後にＣＤ３４＋由来ＤＣ細胞を回収しマイトマイシンＣ（５０μｇ／ｍｌ、シグマ）で処理してから、健康なボランティアの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製した同種成人ＣＤ３＋Ｔ細胞用の刺激細胞として使用する。ＣＤ３＋Ｔ応答細胞を５×１０４細胞／ウェルの濃度で使用する。化学発光検出用の９６ウェル透明平底組織培養プレートにＴ細胞を入れ、刺激細胞を段階濃度で加える。１０％の熱不活性化ＦＢＳ、グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地で培養する。６日間培養後、細胞の増殖をＢｒｄＵ化学発光アッセイ（ロシュ、ナトリー、ニュージャージー州）で製造業者の指示に従って測定する。三連の培養から得られる平均±ＳＤとして結果を表す。
【０３０１】
ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＣＤ３４＋前駆細胞からのＤＣの発達を有意に改変しうる。ＤＣの生成に及ぼすＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用を検討するためにＣＤ３４＋前駆細胞をＳｅｌＣＩＤ（商標）（１μＭ）の存在下又は不在下で増殖成熟期（第１〜１２日）の１２日間、又は成熟期（第６〜１２日）の６日間培養する。第１〜１２日におけるＳｅｌＣＩＤ（商標）の添加はＤＣの表現型の獲得を阻害し、さらに重要なことにはＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞集団を増大し、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞へのＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の正常な分化を改変すると予想される。しかし、ＳｅｌＣＩＤ（商標）で処理されたＣＤ３４＋細胞はＣＤ３３骨髄系細胞マーカーを獲得すると予想され、これらの細胞は第６日にＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ３３＋表現型を示すであろう。ＳｅｌＣＩＤ（商標）は第６日にＣＤ１ａ＋細胞の生成をほぼ完全に抑制し、特に二重陽性ＣＤ８６＋ＣＤ１ａ＋細胞の生成を抑制しうる。この二重陽性細胞集団は表皮ランゲルハンスＤＣの前駆細胞と考えられる。ＳｅｌＣＩＤ（商標）は表皮ＤＣと単球／マクロファージとの両方を生じることができるＣＤ１４＋ＣＤ１ａ−細胞の生成も減少させることができる。初期前駆細胞集団（ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞）の増加及び骨髄系ＤＣ前駆細胞（ＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞）の遮断はおそらく用量依存性であり、１μＭのＳｅｌＣＩＤ（商標）で最大に達する。この作用は可逆的であり、ＣＤ３４の分化経路の妨害はＣＤ３４＋前駆細胞をＳｅｌＣＩＤ（商標）と共に少なくとも３日間培養する場合にのみ観察される。
【０３０２】
第０〜６日のＳｅｌＣＩＤ（商標）の複数回投与はＣＤ３４＋細胞集団の増加を増強するであろう。
【０３０３】
ＳｅｌＣＩＤ（商標）の存在下で培養したＣＤ３４＋前駆細胞も第１２日に共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８０）の発現の減少を示す。ＣＤ５４接着分子はＣＤ５４ｂｒｉｇｈｔ細胞集団の発現の減少とＣＤ５４ｄｉｍ細胞集団の発現の増加と共に改変される。ＳｅｌＣＩＤ（商標）で処理したＣＤ３４＋前駆細胞ではＨＬＡ−ＤＲ分子の発現は減少している。
【０３０４】
第０〜６日に無処理の培養を行った後、１種以上のＳｅｌＣＩＤ（商標）を第６日に添加する場合、そしてＣＤ１ａ＋細胞集団がすでに生成していた場合には、ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＣＤ１ａ＋細胞集団の存続を増大する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）で処理した培養物は第１２日にＤＭＳＯ対照よりも多数のＣＤ１ａ＋前駆細胞を含んでいる。第６日におけるＣＤ３４＋分化細胞へのＳｅｌＣＩＤ（商標）の添加によってＣＤ１４＋前駆細胞の生成と共刺激分子（ＣＤ８６、ＣＤ８０）の発現とがかなり減少する。
【０３０５】
ＳｅｌＣＩＤ（商標）は顆粒球の分化を促進する：ＤＣの生成の遮断に伴って異なった骨髄系分化経路に変わるかどうかを調べるには、ＣＤ１５顆粒球マーカーの発現をモニターしてもよい。ＳｅｌＣＩＤ（商標）の存在下で培養したＣＤ３４＋前駆細胞では細胞表面のＣＤ１５分子の発現は増大する。ＤＣの分化を駆動するサイトカイン混合液の存在下では、ＳｅｌＣＩＤ（商標）を添加すると、前駆細胞の増殖／成熟はさらに顆粒球様の表現型へと転換する。骨髄系細胞の分化のひずみは、ランゲルハンス細胞及び間質ＤＣの前駆細胞である骨髄系ＤＣ前駆細胞が発現するＣＤ１１ｃと、顆粒球前駆細胞が発現するＣＤ１５という二つのマーカーの発現をモニターすることによって検討できる。ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１５−細胞集団の減少はＣＤ１１ｃ−Ｃｄ１５＋顆粒球集団が付随して増加することと関係する。興味深いことに、ＳｅｌＣＩＤ（商標）の複数回投与は顆粒球系列へのシフトを増大させる。
【０３０６】
ＤＣ生成の遮断はＤＣ前駆細胞の特異的死滅により媒介されない：ＤＣ前駆細胞の減少が特異的死滅によって媒介されるかを調べるために、ＣＤ３４＋前駆細胞をＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で６日間培養する。第６日にＣＤ１ａ＋ＣＤ１４−細胞及びＣＤ１ａ−ＣＤ１４＋細胞（ＤＣ前駆細胞）を磁気セルソーティング（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で単離する。精製した細胞集団をＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でＳｅｌＣＩＤ（商標）（１μＭ）を添加して又は添加しないでさらに２日間培養する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）処理によるアネキシンＶ＋−ＰＩ−（アポトーシス初期）細胞集団及びアネキシンＶ＋−ＰＩ＋（アポトーシス後期）細胞集団のレベルに有意な増加はない。
【０３０７】
ＣＤ３４＋前駆細胞から生成したＤＣの機能的活性は変化する：サイトカイン類を添加し、ＳｅｌＣＩＤ（商標）を添加して又は添加しないで培養したＣＤ３４＋前駆細胞から得られる細胞の食作用能を第１２日におけるデキストラン−ＦＩＴＣのマンノース受容体媒介型エンドサイトーシスによってアッセイする。１つ以上のＳｅｌＣＩＤ（商標）を第１〜１２日に添加した場合、ＤＭＳＯ対照に比べ食作用能が大きく減少する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）を第６〜１２日に添加した場合には、食作用能はＤＭＳＯ対照細胞と同等となる。
【０３０８】
サイトカインを添加して、ＳｅｌＣＩＤ（商標）を添加して又は添加しないで培養したＣＤ３４＋細胞の抗原提示能（ＡＰＣ）を第１２日における混合白血球反応（ＭＬＲ）でのＣＤ３＋同種Ｔ細胞の増殖誘導能を測定することで評価する。ＳｅｌＣＩＤ（商標）を第１〜１２日に添加した場合、ＣＤ３４＋細胞はＤＭＳＯ対照と比べてＴ細胞の増殖刺激能の減少を示す。対照的に、第６〜１２日に１つ以上のＳｅｌＣＩＤ（商標）を添加した場合にはＴ細胞の増殖刺激能はＤＭＳＯ対照細胞と同等となる。
【０３０９】
ＳｅｌＣＩＤ（商標）は樹状細胞へのＣＤ３４＋前駆細胞の分化を顕著に減弱することができる。その結果、ＳｅｌＣＩＤ（商標）で処理された細胞は低い食作用能とＡＰＣ能の低減を示すであろう。ＳｅｌＣＩＤ（商標）は初期造血前駆細胞であるＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞も増加させるであろう。それらの初期造血前駆細胞はＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスモデルにおいてより良く移植片を生着させ再増殖することが示された（Tamakiら、2002年、J.  Neurosci. Res.第69巻(6)、976〜86ページ）。さらにＳｅｌＣＩＤ（商標）は、サイトカイン圧が樹状細胞の分化に好適である場合にも、骨髄系細胞の分化を顆粒球系列にシフトすることによってＣＤ３４＋細胞の分化を別の方向へ向ける。加えて、ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＣＤ３４＋細胞に毒性作用を有さず、細胞の増殖能を損なわないことが分かっている。こういうＤＣの機能のモジュレーションと顆粒球への分化の促進は、様々な癌、免疫疾患及び感染症の治療のために、そして臓器移植及び再生医療において顕著な治療の有用性を有し得る。
【０３１０】
５．１２．実施例１２：ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＣＤ１３３＋前駆細胞の分化をモジュレートする
ＳｅｌＣＩＤ（商標）の複数回投与はＣＤ３４＋細胞集団の増大を増強することに加えて、ＣＤ３４ｂｒｉｇｈｔ造血前駆細胞と初期のＣＤ３４−小集団の一部が通常は発現するＣＤ１３３の発現も増大させる。ＳｅｌＣＩＤ（商標）は、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋初期造血細胞と多量に存在させる（濃縮する）ことによって、幹細胞移植後の造血細胞の回復に臨床的意義を有するはずである。加えて、ＣＤ１３３＋幹細胞も内皮系列を生じ、創傷治癒の点で貢献することができる。ＳｅｌＣＩＤ（商標）の複数回投与はランゲルハンスＤＣ前駆細胞の生成の遮断を悪化させない。
【０３１１】
５．１３．実施例１３：骨髄（ＢＭ）Ｓｃａ＋造血前駆細胞からのマウス樹状細胞の生成
近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから入手する。造血Ｓｃａ＋Ｌｉｎ−前駆細胞をＳｐｉｎＳｅｐマウス前駆細胞濃縮用カクテル（StemCell Technologies）を用いて濃縮し、マウス増殖因子であるＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦの存在下で、ＢＴＩ９５０００（StemCell Technologies）を含むＩｓｃｏｖｅのＭＤＭで９日間培養し、Ｓｃａ＋細胞とＤＣ前駆細胞表現型の増殖を促進する。次に、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下でさらに３日間培養して細胞を未成熟ＤＣ表現型に推進する。濃縮したＳｃａ＋Ｌｉｎ−細胞を第０日からＤＭＳＯ（０．１％）、１０μＭのＳｅｌＣＩＤ（商標）又は１０μＭのオールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）（ＩＣＮ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）の存在下で培養する。第０日及び第９日に細胞に化合物を加える。
【０３１２】
マウス細胞表面表現型の分析：第９日及び第１２日にＦＩＴＣ結合ｍＡｂ及びＰＥ結合ｍＡＢを用いてマウス細胞を二重染色のために処理する（室温で１４分間）。使用する抗体としてＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからＳｃａ（ＰＥ）、ＣＤ１１ｂ（ＦＩＴＣ）、Ｇｒ−１（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８６（ＰＥ）、ＣＤ１４（ＰＥ）、ＣＤ８０（ＰＥ）、Ｉ−Ａｂ（ＰＥ）、ＣＤ４０（ＰＥ）を、ＭｉｌｔｅｎｙｉからＣＤ３２．１／１６．１（ＦＩＴＣ）を入手する。１００００事象の獲得後にＦＡＣＳｃａｎフローサイトメータ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）で蛍光分析を行う。
【０３１３】
ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＳｃａ＋前駆細胞からのマウスＤＣの発達を改変することができる。第９日に細胞は、樹状／骨髄系細胞マーカーであるＣＤ３２／１６（Ｆｃレセプター）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８０の細胞表面での高い発現と、Ｉ−Ａｂ及びＣＤ８６の低い発現と、ＣＤ１４及びＧｒ−１としての系列マーカーの発現の欠如とを有するＤＣ前駆細胞表現型を示すであろう。ＳｅｌＣＩＤ（商標）は第９日までに細胞表面マーカーの発現に有意な作用を示さないが、ＡＴＲＡはＣＤ８０、Ｉ−Ａｂ及びＳｃａ＋の発現の顕著なダウンレギュレーションを示すであろう（データは示さない）。しかし、第１２日までにＳｅｌＣＩＤ（商標）はＣＤ８６及び鮮明なＩ−Ａｂの発現のダウンレギュレーションと、ＣＤ１１ｂの発現のアップレギュレーションとを示す可能性がある。ＡＴＲＡはＳｅｌＣＩＤ（商標）と類似するがさらに顕著な作用を示す。加えて、ＳｅｌＣＩＤ（商標）はＣＤ４０及びＣＤ８０の発現に作用を示さないが、ＡＴＲＡはこれらの分子の顕著なダウンレギュレーションを示す。
【０３１４】
ＳｅｌＣＩＤｓ（商標）はＣＤ８６及びＭＨＣＩＩの発現をダウンレギュレーションすることにより未成熟ＤＣへのＤＣ前駆細胞の分化を阻害する。この化合物の作用はヒトの造血前駆細胞で観察される作用と同じくらい顕著であるとは予期されない。ＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用は、マウスにおける催奇形物質であるＡＴＲＡの作用に比べずっと弱い。
【０３１５】
５．１４．実施例１４：ＳｅｌＣＩＤ以外の化合物に対する分化アッセイの適用
上述した方法、すなわちＣＤ３４＋細胞のような初期前駆細胞の分化にＳｅｌＣＩＤが及ぼす作用の試験は、分化に及ぼす作用を知ることが望まれる関心のあるどのような化合物にも適用できる。このアッセイを他の化合物に拡大する例として、対照（ＤＭＳＯ処理）細胞と比べたときのＤＣ系列へのＣＤ３４＋細胞の分化に及ぼす、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）及びアスピリンの作用をＳｅｌＣＩＤ（商標）の作用と比較した。細胞の増殖及び分化に及ぼす作用が既知であること、一部の癌の治療に応用されていること、及び催奇形性作用が知られていることからレチノイン酸を検討する。逆に、免疫調節性をもたない一般に使用されている抗炎症剤であることからアスピリンの作用を検討する。ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αの存在下で化合物を添加して又は添加しないで６日間培養したＣＤ３４＋前駆細胞の第６日における結果を得ることができる。
【０３１６】
文献では他の薬剤が細胞の分化をモジュレートすることが示されている。例えば、最近の論文はコルチコステロイドによるＣＤ３４＋前駆細胞からのＤＣの生成のモジュレーションを報告している。細胞プロフィールはＣＤ１ａ＋細胞集団の増加とＣＤ１４＋細胞集団の減少を伴い、ＳｅｌＣＩＤ（商標）とは異なっている。
【０３１７】
本発明は本明細書に記載する特定の実施態様によりその範囲が限定されることはない。むしろ、上記の説明から本明細書で記載する改変のほかに本発明の様々な改変が当業者に明らかであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲の範囲内に入るものとする。
【０３１８】
６．参考文献
本明細書において引用した全ての参考文献は、各刊行物、特許又は特許出願が全ての目的でその全体が参照によって組み入れられることが特にまた個々に示されているかのごとく同程度に、全ての目的で、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０３１９】
いかなる刊行物の引用も本出願以前に公表されているものであり、本発明が先行技術に照らしてそのような刊行物に先行する資格を与えられないという承認として解釈されるべきではない。
【国際調査報告】
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