(57)【要約】イソプレノイド生合成経路をコードするロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株から遺伝子を単離した。はじめに、ロドコッカス株から遺伝子および遺伝子産物を単離した。本発明の遺伝子および遺伝子産物は、多様な生物体におけるイソプレノイド化合物の産生について多様な方法で使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するイソプレノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子；
（ｂ）次のハイブリダイゼーション条件：０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される、下で（ａ）にハイブリダイズする、イソプレノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子；または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸分子、
からなる群より選択される単離された核酸分子。
【請求項２】
配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群より選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列表の配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも６４８アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項６】
配列表の配列番号４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７１％同一性を有する、少なくとも３８５アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項７】
配列表の配列番号６に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも２３２アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項８】
配列表の配列番号８に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも３１１アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項９】
配列表の配列番号１０に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも１５８アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１０】
配列表の配列番号１２に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも３４４アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列表の配列番号１４に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも３７８アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１２】
配列表の配列番号１６に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも３１４アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１３】
配列表の配列番号１８に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも５３０アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１４】
配列表の配列番号２０に記載の配列を有するポリペプチドと比較した場合、アラインメントのスミス−ウォーターマン法に基づいて、少なくとも７０％同一性を有する、少なくとも３７６アミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１５】
適切な調節配列に操作可能に連結された請求項１または５〜１４のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むキメラ遺伝子。
【請求項１６】
請求項１５に記載のキメラ遺伝子を含む形質転換された宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌、藻類、および緑色植物からなる群より選択される、請求項１６に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコックス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スピンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびクレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種からなる群より選択される、請求項１７に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞は、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ハエモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）からなる群より選択される、請求項１７に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞は、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ポテト、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、草の実作物、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草からなる群より選択される、請求項１７に記載の形質転換された宿主細胞。
【請求項２１】
（ａ）請求項１または５〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子でゲノムライブラリーをプロービングする工程；
（ｂ）請求項１または５〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含むゲノムフラグメントの配列を決定する工程、
を含み、
ここで、配列決定されたゲノムフラグメントは、イソプレノイド生合成酵素をコードする、イソプレノイド化合物生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項２２】
（ａ）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入物を増幅する工程；
を含み、
ここで、増幅された挿入物は、イソプレノイド生合成酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、イソプレノイド生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の方法の産物。
【請求項２４】
適切な増殖条件下にある形質転換された宿主細胞と、有効量の発酵性炭素基質とを接触させ、それによって、イソプレノイド化合物が産生される工程を含むイソプレノイド化合物の産生方法であって、前記形質転換された宿主細胞は、適切な調節配列の制御下で配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０をコードする核酸分子の組を含む方法。
【請求項２５】
形質転換された宿主細胞は細菌、酵母、糸状菌、藻類、および緑色植物からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
形質転換された宿主細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコックス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スピンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびクレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
形質転換された宿主細胞は、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ハエモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
形質転換された宿主細胞は、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ポテト、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、草の実作物、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
生物体において、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択される少なくとも１つのイソプレノイド遺伝子を過剰発現させ、前記生物体におけるイソプレノイド生合成が改変されるようにする工程を含む、生物体においてイソプレノイド生合成を調節する方法。
【請求項３０】
前記イソプレノイド遺伝子はマルチコピープラスミド上で過剰発現される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記イソプレノイド遺伝子は誘導または調節プロモーターに操作可能に連結される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記イソプレノイド遺伝子はアンチセンス方向で発現される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記イソプレノイド遺伝子はコーディング領域への外来ＤＮＡの挿入によって中断される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼでヌクレオチド配列の混合物を消化する工程であって、ここで、前記混合物は：
ａ）天然型イソプレノイド遺伝子；
ｂ）前記天然型イソプレノイド遺伝子にハイブリダイズするヌクレオチドフラグメントの第１の集団；
ｃ）前記天然型イソプレノイド遺伝子にハイブリダイズしないヌクレオチドフラグメントの第２の集団；
を含み、
ここで、制限フラグメントの混合物が生成される工程と；
（ｉｉ）前記制限フラグメントの混合物を変性させる工程と；
（ｉｉｉ）変性させた工程（ｉｉ）の前記制限フラグメントの混合物とポリメラーゼとをインキュベートする工程と；
（ｉｖ）工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返す工程であって、ここで、改変された生物活性を有するタンパク質をコードする変異したイソプレノイド遺伝子が産生される工程と、
を含む方法によって産生される、改変された生物活性を有するイソプレノイド酵素をコードする変異した遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学の分野に属する。より具体的には、本発明は、イソプレノイド化合物の微生物による産生に有用な酵素をコードする核酸フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレノイド類とは、共通の生合成起源、単一の代謝前駆体、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を有する天然産物の極めて大きくかつ多様な一群である。イソプレノイド類には、５炭素化合物であるＩＰＰから生合成で誘導されるすべての物質が含まれる［（非特許文献１）］。イソプレノイド類のあるものは、「テルペン類」または「テルペノイド類」とも呼ばれる。イソプレノイド類は、すべての生体生物体に見出される偏在性の化合物である。イソプレノイド類の周知のいくつかの例として、ここに若干列挙すると、ステロイド類（トリテルペン類）、カロテノイド類（テトラテルペン類）、およびスクアレンがる。
【０００３】
長年の間、ＩＰＰは、周知の酢酸／メバロン酸経路によって合成されるものとして受け入れられていた。しかし、最近の研究により、このメバロン酸依存性経路は、必ずしもすべての生体生物体において作動するとは限らないことが実証されている。メバロン酸に依存しない代替的ＩＰＰ生合成については、はじめに細菌において、後に緑藻および高等植物において特徴付けがなされた［（非特許文献２）；（非特許文献３）；（非特許文献４）；（非特許文献５）］。
【０００４】
メバロン酸非依存性イソプレノイド経路における多くの工程は公知である。例えば、初期の工程は、ピルビン酸およびＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸に関与し、５炭素化合物であるＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸を生じる。マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の合成を触媒するＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）をコードする遺伝子ｄｘｓが報告された［（非特許文献６）］。
【０００５】
次に、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸の異性化および還元によって２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸を生じる。異性化および還元プロセスに関与する酵素のうちの１つは、Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）である。マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）において、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸の形成を触媒するｄｘｒの遺伝子産物が報告されている［（非特許文献６）］。
【０００６】
２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸をイソペンテニル一リン酸に変換する工程についてはあまり特徴付けされていないが、いくつかの工程については既知である。２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸は、ＣＴＰ依存性反応において、注釈が付いていない（ｎｏｎ−ａｎｎｏｔａｔｅｄ）遺伝子ｙｇｂＰによりコードされる酵素によって４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに変換される。ＹｇｂＰタンパク質はマイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中に存在し、上記の反応を触媒することが報告されている［（非特許文献６）］。最近、ｙｇｂＰ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＤと改名された（スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）番号Ｑ４６８９３）［（非特許文献６）］。
【０００７】
４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールの２位の水酸基は、ｙｃｈＢ遺伝子によりコードされる酵素によって、ＡＴＰ依存性反応においてリン酸化することができる。ｙｃｈＢ遺伝子産物は、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールをリン酸化し、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸を生じる。Ｃｏｌｅら［（非特許文献６）］は、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）におけるＹｃｈＢタンパク質について報告している。最近、ｙｃｈＢ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＥと改名された（スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）番号Ｐ２４２０９）［（非特許文献６）］。
【０００８】
ｙｇｂＢ遺伝子産物は４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２−リン酸を２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸に変換する。［（非特許文献６）］は、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）におけるｙｇｂＢ遺伝子産物について報告した［（非特許文献６）］。２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸は、カロテノイド生合成経路においてさらにカロテノイド類に変換することができる。最近、ｙｇｂＢ遺伝子は、ｉｓｐ遺伝子クラスターの一部としてｉｓｐＦと改名された（スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）番号Ｐ３６６６３）。ＹｇｂＰ酵素によって触媒される反応は、ＣＴＰ依存性様式において行われる。イソペンテニル一リン酸およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）は、未だ特徴付けされていない一連の反応によって形成されるが、最近、ＬｙｔＢおよびＧｃｐＥによって仲介されることが提唱されている［（非特許文献７）；（非特許文献８）］。
【０００９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、ＩＰＰは、重要でないｉｄｉ遺伝子により特徴付けられる異性化反応によってジメチルアリル二リン酸に変換され得、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰは独立して産生されることを示唆する［（非特許文献８）］。多様な鎖長のプレニル二リン酸が形成を生じるイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の連続縮合を触媒する広範な酵素群が存在する。プレニルトランスフェラーゼの相同遺伝子は、それらのアミノ酸配列において高度に保存された領域を有する。それらはヘプタプレニルシンターゼ、ゲラニルゲラニル（Ｃ２０）二リン酸シンターゼ［（非特許文献６）］、ファルネシル（Ｃ１５）二リン酸シンターゼであり、様々な鎖長の５つのプレニル二リン酸の合成を触媒することができる。
【００１０】
Ｃ４０フィトエンの形成は、フィトエンシンターゼをコードするｃｒｔＢ遺伝子によって行われる。フィトエンは、２分子のＣ２０前駆体ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）の縮合によって形成される。フィトエンシンターゼは、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）より単離されている（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号Ｔ３６９６９）。
【００１１】
イソプレノイド生合成経路のさらに下流では、さらなる遺伝子がカロテノイドの合成に関与している。フィトエン不飽和化工程は、ｃｒｔＩ遺伝子によって行われ、リコペンの形成を生じる。フィトエンデヒドロゲナーゼ遺伝子ｃｒｔＩをコードする遺伝子は、ストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）より単離されている（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号Ｔ３６９６８）。
【００１２】
リコペンの環化は、ｃｒｔＹ／Ｌ遺伝子産物であるリコペンシクラーゼによって行われる。リコペンシクラーゼは、デイノコックス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）より単離されている［（非特許文献９）］。
【００１３】
イソプレノイドおよびカロテノイド合成に必要とされる多くの遺伝子が特徴付けされているが、ロドコッカス細菌のイソプレノイドおよび／またはカロテノイド経路に関与する遺伝子については、現存の文献には記載されていない。多くの有色ロドコッカス細菌が存在することから、カロテノイド色素を産生する能力はこれらの細菌に普及していることが示唆される。
【００１４】
【非特許文献１】
シュプールゲオン（Ｓｐｕｒｇｅｏｎ）およびポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｐｐ３−４６，Ａ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（１９８１）
【非特許文献２】
ホルバッハ（Ｈｏｒｂａｃｈ）ら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１１：１３５−１４０（１９９３）
【非特許文献３】
ローマー（Ｒｏｈｍｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９５：５１７−５２４（１９９３）
【非特許文献４】
シュベンダー（Ｓｃｈｗｅｎｄｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１６：７３−８０（１９９６）
【非特許文献５】
アイゼンライヒ（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６４３１−６４３６（１９９６）
【非特許文献６】
コール（Ｃｏｌｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３９３：５３７−５４４，１９９８
【非特許文献７】
クニングハム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：５８４１−５８４８，２０００
【非特許文献８】
マックアティール（ＭｃＡｔｅｅｒ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：７４０３−７４０７，２０００
【非特許文献９】
ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：１５７１−１５７７（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従って、解決すべき問題は、イソプレノイドおよびカロテノイド産生に終局的に使用するために、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）におけるイソプレノイド生合成を担う配列を単離することである。本出願人らは、１０個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）株より核酸フラグメントを単離することによって、上記の問題を解決した。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本出願は、２００１年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／２８５，９１０号明細書に対し優先権を主張する。
【００１７】
それぞれイソプレノイド生合成経路の酵素をコードする１０個のオープンリーディングを、フレームロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株より同定および単離した。本発明の酵素は、組換え生物体におけるイソプレノイド類の産生に有用である。これらの化合物は、化学的に製造することは困難かつ高価であり、ヒトおよび動物の健康に有益である強力な抗酸化特性を有する。ロドコッカス株は、良好な産生宿主であり、該属の多くの種において見出されるこれらの化合物を産生する能力が本来備わっているため、カロテノイド類の産生に特に適している。
【００１８】
本発明は、
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するイソプレノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子；
（ｂ）次のハイブリダイゼーション条件：０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される、下で（ａ）にハイブリダイズする、イソプレノイド生合成酵素をコードする単離された核酸分子；または
（ａ）、もしくは（ｂ）に相補的である単離された核酸、
からなる群より選択される、単離された核酸分子を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、適切な調節配列に操作可能に連結された本核酸フラグメントを含むキメラ遺伝子ならびに本発明の核酸フラグメントおよびキメラ遺伝子によりコードされるポリペプチドを提供する。
【００２０】
本発明は、本核酸配列を含む形質転換された宿主をさらに提供し、ここで、宿主細胞は、細菌、酵母、糸状菌、藻類、および緑色植物からなる群より選択される。
【００２１】
もう１つの実施態様において、本発明は、
（ａ）本発明の単離された核酸配列のいずれか１つの核酸分子でゲノムライブラリーをプロービングする工程；
（ｂ）本発明の核酸配列のいずれか１つの核酸分子にハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定する工程；および
（ｃ）工程（ｂ）で同定されたクローンを含むゲノムフラグメントの配列を決定する工程、
を含み、
ここで、配列決定されたゲノムフラグメントは、イソプレノイド生合成酵素をコードする、イソプレノイド化合物生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供する。
【００２２】
同様に、本発明は、
（ａ）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する工程；および
（ｂ）工程（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、クローニングベクター中に存在する挿入物を増幅する工程；
を含み、
ここで、増幅された挿入物は、イソプレノイド生合成酵素をコードするアミノ酸配列の一部をコードする、イソプレノイド生合成酵素をコードする核酸分子を得る方法を提供する。
【００２３】
もう１つの実施態様において、本発明は、適切な増殖条件下にある形質転換された宿主細胞と、有効量の発酵性炭素基質とを接触させ、それによって、イソプレノイド化合物が産生される工程を含む、イソプレノイド化合物の産生方法であって、前記形質転換された宿主細胞は、適切な調節配列の制御下で配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８および２０をコードする核酸分子の組を含む、方法を提供する。
【００２４】
代替的実施態様において、本発明は、生物体において、配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９からなる群より選択される少なくとも１つのイソプレノイド遺伝子を過剰発現させ、該生物体におけるイソプレノイド生合成が改変されるようにする工程を含む、生物体においてイソプレノイド生合成を調節する方法を提供する。イソプレノイド生合成の調節は、マルチコピー上の遺伝子を発現させることによるか、関連遺伝子を調節もしくは誘導プロモーターに操作可能に連結させることによるか、アンチセンス発現によるかまたは経路の所定の遺伝子の選択的中断によって、達成することができる。
【００２５】
さらに、
（ｉ）制限エンドヌクレアーゼでヌクレオチド配列の混合物を消化する工程であって、ここで、前記混合物は：
ａ）本発明の天然型イソプレノイド遺伝子；
ｂ）前記天然型イソプレノイド遺伝子にハイブリダイズするヌクレオチドフラグメントの第１の集団；
ｃ）本発明の前記天然型イソプレノイド遺伝子にハイブリダイズしないヌクレオチドフラグメントの第２の集団；
を含み、
ここで、制限フラグメントの混合物が生成される工程と；
（ｉｉ）前記制限フラグメントの混合物を変性させる工程と；
（ｉｉｉ）変性させた工程（ｉｉ）の前記制限フラグメントの混合物とポリメラーゼとをインキュベートする工程と；
（ｉｖ）工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を繰り返す工程であって、ここで、改変された生物活性を有するタンパク質をコードする変異したイソプレノイド遺伝子が産生される工程と、
を含む方法によって産生される、改変された生物活性を有するイソプレノイド酵素をコードする変異した遺伝子が提供される。
【００２６】
本発明は、本出願の一部を形成する下記の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解することができる。
【００２７】
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則」）に従い、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則第２０８号および付属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用した記号および形式は、米国特許法施行規則第１．８２２に記載の規則に従う。
【００２８】
配列表の配列番号１は、ｄｘｓ遺伝子をコードするＯＲＦ１のヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列表の配列番号２は、ＯＲＦ１によってコードされるｄｘｓの推定されたアミノ酸配列である。
【００３０】
配列表の配列番号３は、ｄｘｒ遺伝子をコードするＯＲＦ２のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列表の配列番号４は、ＯＲＦ２によってコードされる推定されたアミノ酸配列である。
【００３２】
配列表の配列番号５は、ｙｇｂＰ（ｉｓｐＤ）遺伝子をコードするＯＲＦ３のヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列表の配列番号６は、ＯＲＦ３によってコードされるｙｇｂＰ（ｉｓｐＤ）遺伝子の推定されたアミノ酸配列である。
【００３４】
配列表の配列番号７は、ｙｃｈＢ（ｉｓｐＥ）遺伝子をコードするＯＲＦ４のヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列表の配列番号８は、ＯＲＦ４によってコードされるｙｃｈＢ（ｉｓｐＥ）遺伝子の推定されたアミノ酸配列である。
【００３６】
配列表の配列番号９は、ｙｇｂＢ（ｉｓｐＦ）遺伝子をコードするＯＲＦ５のヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列表の配列番号１０は、ＯＲＦ５によってコードされるｙｇｂＢ（ｉｓｐＦ）の推定されたアミノ酸配列である。
【００３８】
配列表の配列番号１１は、ｉｓｐＡ遺伝子をコードするＯＲＦ６のヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列表の配列番号１２は、ＯＲＦ６によってコードされるｉｓｐＡ遺伝子の推定されたアミノ酸配列である。
【００４０】
配列表の配列番号１３は、ｃｒｔＥ遺伝子をコードするＯＲＦ７のヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列表の配列番号１４は、ＯＲＦ７によってコードされるｃｒｔＥ遺伝子の推定されたアミノ酸配列である。
【００４２】
配列表の配列番号１５は、ｃｒｔＢ遺伝子をコードするＯＲＦ８のヌクレオチド配列である。
【００４３】
配列表の配列番号１６は、ＯＲＦ８によってコードされるｃｒｔＢ遺伝子の推定されたアミノ酸配列である。
【００４４】
配列表の配列番号１７は、ｃｒｔＩ遺伝子をコードするＯＲＦ９のヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列表の配列番号１８は、ＯＲＦ９によってコードされるｃｒｔＩ遺伝子の推定されたアミノ酸配列である。
【００４６】
配列表の配列番号１９は、ｃｒｔＬ遺伝子をコードするＯＲＦ１０のヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列表の配列番号２０は、ＯＲＦ１０によってコードされるｃｒｔＬ遺伝子の推定されたアミノ酸配列である。
【００４８】
配列表の配列番号２１〜３６はプライマーの配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明の遺伝子およびそれらの発現産物は、カロテノイド化合物を含む様々なイソプレノイド化合物を産生する能力を有する組換え生物体の作製に有用である。上記の酵素をコードする核酸フラグメントをロドコッカス・エリスロポリスの株より単離し、当業者に周知のＢＡＬＳＴおよびＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、ヌクレオチドおよびタンパク質配列を含有する公的データベースと比較することによって同定した。
【００５０】
本発明の遺伝子および遺伝子産物は、イソプレノイド化合物の増強または操作のための様々な様式に使用することができる。
【００５１】
微生物のイソプレノイド経路は、カロテノイド類、キノン類、スクアレン、およびビタミン類などの化合物の産生のための多種産生プラットホームとして天然に存在する。これらの天然産物は、鎖長で５炭素単位〜５５を超える炭素単位であることができる。カロテノイド化合物を化学的に作製することは極めて困難であるため、これらの化合物のための微生物によるイソプレノイド産生の一般的な実際的有用性が存在する（ネリス（Ｎｅｌｉｓ）およびリーンヒアー（Ｌｅｅｎｈｅｅｒ）、Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７０：１８１−１９１（１９９１））。ほとんどのカロテノイドは、濃厚な色を有し、天然色素または着色剤として検討することができる。さらに、多くのカロテノイドは、強力な抗酸化特性を有し、従って、これらの化合物が食物中に含まれることは健康によいと考えられる。周知の例として、β−カロテンおよびアスタキサンチンがある。
【００５２】
ロドコッカス・エリスロポリスの場合、カロテノイド類を産生する本来の能力が特に有用である。ロドコッカスの細胞は多くの溶媒に耐性であり、混合相プロセス開発での取り扱いが容易であるため、産生プラットホームとしてロドコッカス株を使用することは有利である。ロドコッカス株は、アクリルアミドなどの他の化学物質の商業生産のための産生宿主として、首尾よく使用されている。
【００５３】
本明細書に記載の遺伝子および遺伝子配列によって、健康に有益なカロテノイド類の産生を、ロドコッカス・エリスロポリスから誘導される単一細胞のタンパク質産物に直接組み入れることが可能である。飼料に所望の着色および健康有益性を付加することが公知であるカロテノイドが存在することから、この局面によって、これらの遺伝子が組み入れられるこのような株または任意の細菌株は、動物飼料にとってより所望な産生宿主となる。カロテノイド着色は、サケおよび小エビの価値に極めて重要であるため、これらの生物体の養殖は、本発明の特に有用なアプリケーションである。（Ｆ．シャヒディ（Ｆ．  Ｓｈａｈｉｄｉ）、Ｊ．Ａ．ブラウン（Ｊ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ）、Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ  ｐｉｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｅａｆｏｏｄ  ａｎｄ  ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３８（１）：１−６７（１９９８））
【００５４】
補助食品および食品添加物に加えて、該遺伝子は、色素、ステロイド類、風味付けおよび香料ならびに潜在的電気光学アプリケーションを有する化合物として有用な純生成物としてのカロテノイド類、およびそれらの誘導体、イソプレノイド、中間体およびそれらの誘導体の産生に有用である。
【００５５】
本開示では、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００５６】
「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと略称される。
【００５７】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと省略される。
【００５８】
本明細書において使用される「単離された核酸フラグメント」は、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、必要に応じて、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含む。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸フラグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントからなり得る。
【００５９】
用語「イソプレノイド」または「テルペノイド」は、カロテノイド類およびキサントフィル類などの１０炭素テルペノイド類およびそれらの誘導体を含むイソプレノイド経路から誘導される任意の分子を指す。
【００６０】
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２またはＡＮ１２という用語は、ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株を指し、交換可能に使用される。
【００６１】
ロドコッカス・エリスロポリスＡＴＣＣ４７０７２またはＡＴＣＣ４７０７２は、ロドコッカス・エリスロポリスＡＴＣＣ４７０７２株を指し、交換可能に使用される。
【００６２】
用語「Ｄｘｓ」は、ＯＲＦ１において表されるｄｘｓ遺伝子によってコードされる１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ酵素を指す。
【００６３】
用語「Ｄｘｒ」は、ＯＲＦ２において表されるｄｘｒ遺伝子によってコードされる１−デオキシキシルロース−５−リン酸レダクトイソメラーゼ酵素を指す。
【００６４】
用語「ＹｇｂＰ」または「ＩｓｐＤ」は、ＯＲＦ３において表されるｙｇｂＰまたはｉｓｐＤ遺伝子によってコードされる４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ酵素を指す。遺伝子ｙｇｂＰまたはｉｓｐＤの名称は、本出願において交換可能に使用される。遺伝子産物ＹｇｂＰまたはＩｓｐＤの名称は、本出願において交換可能に使用される。
【００６５】
用語「ＹｃｈＢ」または「ＩｓｐＥ」は、ＯＲＦ４において表されるｙｃｈＢまたはｉｓｐＥ遺伝子によってコードされるイソペンテニル一リン酸キナーゼ酵素を指す。遺伝子ｙｃｈＢまたはｉｓｐＥの名称は、本出願において交換可能に使用される。遺伝子産物ＹｃｈＢまたはＩｓｐＥの名称は、本出願において交換可能に使用される。
【００６６】
用語「ＹｇｂＢ」または「ＩｓｐＦ」は、ＯＲＦ５において表されるｙｇｂＢまたはｉｓｐＦ遺伝子によってコードされる２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ酵素を指す。遺伝子ｙｇｂＢまたはｉｓｐＦの名称は、本出願において交換可能に使用される。遺伝子産物ＹｇｂＢまたはＩｓｐＦの名称は、本出願において交換可能に使用される。
【００６７】
用語「ＩｓｐＡ」は、ＯＲＦ６において表されるｉｓｐＡ遺伝子によってコードされるプレニルトランスフェラーゼファミリーの１つとしてのゲラニルトランスフェラーゼまたはヘプタプレニル二リン酸シンターゼ酵素を指す。
【００６８】
用語「ＣｒｔＥ」は、ＯＲＦ７において表されるｃｒｔＥ遺伝子によってコードされるゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ酵素を指す。
【００６９】
用語「ＣｒｔＢ」は、ＯＲＦ８において表されるｃｒｔＢ遺伝子によってコードされるフィトエンシンターゼ酵素を指す。
【００７０】
用語「ＣｒｔＩ」は、ＯＲＦ９において表されるｃｒｔＩ遺伝子によってコードされるフィトエンデヒドロゲナーゼ酵素を指す。
【００７１】
用語「ＣｒｔＬ」は、ＯＲＦ１０において表されるｃｒｔＬ遺伝子によってコードされるリコペンシクラーゼ酵素を指す。
【００７２】
核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどのもう１つの核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．  Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）、特に、第１１章および該第１１章に掲載の表１１．１（全体が参考として本明細書に援用される）において例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシーな条件を調整して、遠い関係の生物体由来の相同配列などの中等度に類似のフラグメントから、近い関係の生物体由来の機能的酵素を複製する遺伝子などの、高度に類似のフラグメントをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄はストリンジェンシー条件を決定する。１組の好適な条件は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温、１５分間で開始し、次いで、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃、３０分間で反復し、次いで、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃、３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。より好適な組のストリンジェントな条件は、より高い温度を使用し、ここで洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の２回の３０分間の洗浄の温度を６０℃にまで上昇させたことを除いて、上記の洗浄と同一である。もう１つの好適な組の高度にストリンジェントな条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最後の２回の洗浄を使用する。さらにもう１つの組の好適なハイブリダイゼーション条件は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、続いて０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄されることを含む。
【００７３】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存して、塩基間にミスマッチの可能性が存在する。核酸にハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度（当業者に周知の変数）に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリダイズに対するＴｍの値は大きい。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに相当する）は、次の順で減少する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリダイズについては、Ｔｍを算出するための式が導入されている（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲、９．５０−９．５１を参照のこと）。より短い核酸、即ちオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上掲、１１．７−１１．８を参照のこと）。１つの実施態様において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、および最も好ましくは、長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、必要であれば、プローブの長さなどの因子に従って、温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができることを認識するであろう。
【００７４】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「本質的な部分」は、当業者により人的に、もしくはＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルトシュールＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照されたい）のようなアルゴリズムを使用するコンピュータに基づく配列比較および同定のツールを使用することによるかのいずれかにより、ポリペプチドまたは遺伝子を推定で同定するのに十分な程度のポリペプチドのアミノ酸または遺伝子のヌクレオチド配列を含む。一般に、あるポリペプチドまたは核酸配列を、既知のタンパク質または遺伝子に対して相同として推定で同定するためには、１０もしくはそれ以上の連続するアミノ酸または３０もしくはそれ以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、遺伝子の同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーもしくはバクテリオファージのプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列に依存する方法では、２０〜３０の連続するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。加えて、プライマーを含む特定の核酸フラグメントを得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲでの増幅プライマーとして使用することができる。従って、ヌクレオチド配列の「本質的な部分」は、該配列を含む核酸フラグメントを、特異的に同定および／または単離するのに十分な配列を含む。本明細書は、１種またはそれ以上の特定の微生物タンパク質をコードする部分的もしくは完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告されるような配列の恩恵を有する当業者は、今や、当業者に既知の目的上、開示される配列の全部もしくは本質的な部分を使用してよい。従って本発明は、付随する配列表で報告されるような完全な配列、ならびに上で規定されたようなそれらの配列の本質的部分を含む。
【００７５】
用語「相補的」は、相互にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、そしてシトシンはグアニンに相補的である。従って、本発明はまた、付随する配列表で報告されるような完全な配列、ならびにそれらの実質的に類似の核酸配列に相補的である単離された核酸フラグメントを含む。
【００７６】
当該分野において公知である用語「パーセント同一性」は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較することによって決定される。当該分野において、場合により「同一性」は、ペプチドまたはポリペプチド配列間の配列関係の程度をも意味し、そのような配列のストリング間の一致によって決定される。「同一異性」および「類似性」は、以下に記載される方法を含むがこれらに限定されない公知の方法によって容易に算出することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（レスクＡ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（スミスＤ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（グリフィンＡ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）、およびグリフィンＨ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（フォン・ヘインジＧ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）編）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（グリブスコフＭ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベルウクスＪ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編）  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ（１９９１）。同一性を決定するための好適な方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいてコード化される。配列のアラインメントおよびパーセント同一性の計算は、レーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）生物情報科学コンピュータ計算ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ））のメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施してもよい。配列の複数のアラインメントは、デフォルトのパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０）を用い、アラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施した。クラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）法を使用する対にしたアラインメントのためのデフォルトのパラメータは、Ｋタプル１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５およびダイアゴナルズ・セイブド＝５であった。
【００７７】
適切な核酸フラグメント（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一、好ましくは、少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告するアミノ酸配列に約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好適な核酸フラグメントは、本明細書において報告するアミノ酸配列に少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする。適切な核酸フラグメントは、上記の相同性を有するだけでなく、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドを典型的にコードする。
【００７８】
「コドンの縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝暗号中の性状を指す。従って、本発明は、配列表の配列番号に記載の本微生物ペプチドをコードするアミノ酸配列の全部または本質的な部分をコードするいかなる核酸フラグメントにも関する。当業者は、ある所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用における特定の宿主細胞により表される「コドンの偏り」を十分認識している。従って、ある宿主細胞中での改良された発現のための遺伝子を合成する場合、コドンの使用頻度が該宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくような遺伝子を設計することが望ましい。
【００７９】
「合成遺伝子」は、当業者に既知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド基礎単位から集成することが可能である。これらの基礎単位は連結およびアニーリングされて、その後に遺伝子全体を構築するように酵素的に集成される。ＤＮＡの配列に関するところの「化学的に合成される」は、成分ヌクレオチドがインビトロで集成されたことを意味する。ＤＮＡの人的な化学合成は、十分に確立された手順を使用して達成することができるか、または、多数の商業的に入手可能な機械の１つを使用して自動化学合成を実施することが可能である。従って、該遺伝子は、宿主細胞のコドンの偏りに反映するヌクレオチド配列の至適化に基づいた最適な遺伝子発現を適応させることが可能である。当業者は、コドンの使用を宿主に好まれるコドンに偏らせる場合に、成功裏の遺伝子発現の見込みを認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことが可能である。
【００８０】
「遺伝子」は、コーディング配列の前（５’非コーディング配列）および後（３’非コーディング配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「天然型遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含む天然型遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコーディング配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコーディング配列を含んでいてもよい。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある天然型遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。外来遺伝子は、非天然型生物体内に挿入された天然型遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換操作によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【００８１】
「コーディング配列」は特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００８２】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列に対し３’側に配置される。プロモーターはそっくりそのまま天然型遺伝子に由来してよいか、または、天然に見出される多様なプロモーター由来の多様なエレメントから構成されてよいか、または合成ＤＮＡセグメントさえ含むことができる。多様なプロモーターは、多様な組織もしくは細胞型において、または発生の多様な段階で、または多様な環境もしくは生理学的条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることが、当業者に理解される。大部分の時間で大部分の細胞型において遺伝子を発現させるプロモーターは普遍的に「構成プロモーター」と称される。大部分の場合で調節配列の正確な境界が完全に規定されていないため、多様な長さの核酸フラグメントが同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【００８３】
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に配置されるＤＮＡ配列を指し、かつ、ポリアデニル化認識配列、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を包含する。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【００８４】
「ＲＮＡ転写物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称されるか、またはそれは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりポリペプチドに翻訳される可能性があるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡに相補的でありかつこれに由来する二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを包含し、そして、従って細胞によりタンパク質に翻訳される可能性があるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部または一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；ＷＯ９９２８５０８）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特異的な遺伝子転写物のいずれかの部分、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、またはコーディング配列であることができる。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは翻訳されていないがしかし細胞の過程に対する影響をなお有する他のＲＮＡを指す。
【００８５】
用語「操作可能に連結している」は、一方の機能が他方により影響を受ける単一核酸フラグメント上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。例えば、プロモーターがコーディング配列の発現を影響することができる（すなわちコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコーディング配列に操作可能に連結されている。コーディング配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に操作可能に連結されることができる。
【００８６】
本明細書において使用される用語「発現」は、本発明の核酸フラグメントに由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。
【００８７】
「形質転換」は、遺伝的に安定に遺伝する核酸フラグメントの宿主生物体のゲノムへの伝達を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体を「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物体と称される。
【００８８】
用語「発酵可能な炭素基質」は、本発明の宿主生物体により代謝されることができる炭素源を指し、また特には、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および単炭素基質またはこれらの混合物からなる群から選択される炭素源である。
【００８９】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子フラグメントの形態である。そのようなエレメントは、任意の起源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的反復配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーターフラグメントおよび適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または組換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて外来宿主における遺伝子の発現の増強を可能にするエレメントを有する特定のベクターを指す。
【００９０】
用語「改変された生物活性」は、微生物のヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質に伴う活性を指し、該活性はアッセイ方法によって測定することができ、ここで、該方法は天然型微生物の配列に伴う活性よりも大きいかまたは小さい。「増強された生物活性」は、天然型配列に伴う活性よりも大きい改変された活性を指す。「低減された生物活性」は、天然型配列に伴う活性よりも小さい活性である。
【００９１】
用語「配列解析ソフトウェア」は、ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列の解析に有用なあらゆるコンピュータアルゴリズム、またはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販されていてもよく、また独立して開発してもよい。典型的な配列解析ソフトウェアとして、ＧＣＧプログラムソフトウェアパッケージ（ウィスコンシン・パッケージ・バージョン９．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））、ブラストＰ（ＢＬＡＳＴＰ）、ブラストＮ（ＢＬＡＳＴＮ）、ブラストＸ（ＢＬＡＳＴＸ）（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡスター（ＤＮＡＳＴＡＲ）（ＤＮＡスター社（ＤＮＡＳＴＡＲ，  Ｉｎｃ．）米国５３７１５ウィスコンシン州、Ｓ．パークセントマディソン１２２８（１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１５ＵＳＡ）、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み入れたフラスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、開催年１９９２、１１１−２０．編者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）．出版社：プレヌム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨークシュウ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））が挙げられるが、これらに限定されない。本出願に従い、配列解析ソフトウェアが解析のために使用される場合、解析結果は、他に特定しない限り参照したプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解される。本明細書において使用される「デフォルト値」は、最初に初期化した場合に本来ソフトウェアにロードされる任意の組の値、またはパラメータを意味する。
【００９２】
ここで使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．  Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ならびにＴ．Ｊ．シルハビー（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４）ならびにグリーン・パブリッシング・アソシエーション・アンド・ウィレイ−インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）から出版されたＦ．Ｍ．アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）により記載されている。
【００９３】
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株より、イソプレノイド経路に関与する遺伝子産物をコードする様々なヌクレオチド配列が単離されている。例えば、ＯＲＦ１〜５は、イソプレノイド経路（図１）の早期の酵素をコードし、すべてのイソプレノイド化合物の前駆体であるＩＰＰをもたらす。ＯＲＦ６および７は、それぞれＩｓｐＡおよびＣｒｔＥ酵素をコードし、ＩＰＰ前駆体の縮合による伸長に関与する。さらに、ＯＲＦ８〜１０は、カロテノイドの産生に特に関与する。
【００９４】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４）、開催年１９９２、１１１−２０．編者：スハイ，サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）．出版社：プレヌム（Ｐｌｅｎｕｍ）、ニューヨークシュウ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））を使用して、ｄｘｓヌクレオチド塩基および推定されたアミノ酸配列（ＯＲＦ１）を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、本明細書において報告する６４８アミノ酸長のアミノ酸配列に対し約７０％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なＤｘｓは、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なＤｘｓ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一であるＤｘｓ核酸フラグメントが最も好適である。
【００９５】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、Ｄｘｒ塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、３８５アミノ酸長（ＯＲＦ２）のアミノ酸レベルで７１％同一であることが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なＤｘｒは、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なＤｘｒ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一であるＤｘｒ核酸フラグメントが最も好適である。
【００９６】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、ＹｇｂＰ（ＩｓｐＤ）塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、２３２アミノ酸長（ＯＲＦ３）のアミノ酸レベルで約５３％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なＹｇｂＰ（ＩｓｐＤ）は、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なＹｇｂＰ（ＩｓｐＤ）核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一であるＹｇｂＰ（ＩｓｐＤ）核酸フラグメントが最も好適である。
【００９７】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、ＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、３１１アミノ酸長（ＯＲＦ４）のアミノ酸レベルで約６２％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）は、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一であるＹｃｈＢ（ＩｓｐＥ）核酸フラグメントが最も好適である。
【００９８】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、ＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、１５８アミノ酸長（ＯＲＦ５）のアミノ酸レベルで約５７％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）は、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一であるＹｇｂＢ（ＩｓｐＦ）核酸フラグメントが最も好適である。
【００９９】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、ＩｓｐＡ塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、３４４アミノ酸長（ＯＲＦ６）のアミノ酸レベルで約５７％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なＩｓｐＡは、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なＩｓｐＡ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一であるＩｓｐＡ核酸フラグメントが最も好適である。
【０１００】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、ＣｒｔＥ塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、３７８アミノ酸長（ＯＲＦ７）のアミノ酸レベルで約４１％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好適なＣｒｔＥは、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適なＣｒｔＥ核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一であるＣｒｔＥ核酸フラグメントが最も好適である。
【０１０１】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、ＣｒｔＢ塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、３１４アミノ酸長（ＯＲＦ８）のアミノ酸レベルで約４７％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する好適な核酸配列は、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適な核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。
【０１０２】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、ＣｒｔＩ塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、５３０アミノ酸長（ＯＲＦ９）のアミノ酸レベルで約４５％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する好適な核酸配列は、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適な核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。
【０１０３】
スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上掲）を使用して、ＣｒｔＬ塩基および推定されたアミノ酸配列を公的データベースと比較すると、最も類似する既知の配列は、３７６アミノ酸長（ＯＲＦ１０）のアミノ酸レベルで約３１％同一の遠位から範囲が及ぶことが示される。好適なアミノ酸フラグメントは本明細書に記載の配列に少なくとも約７０％〜８０％同一であり、ここで、８０％〜９０％同一がより好適である。本明細書において報告するアミノ酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する好適な核酸配列は、活性なタンパク質をコードする配列であり、本明細書において報告する核酸配列に少なくとも８０％同一である。より好適な核酸フラグメントは、本明細書に記載の配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告する核酸フラグメントに少なくとも９５％同一である核酸フラグメントが最も好適である。
【０１０４】
本発明の核酸フラグメントを使用して、同じまたは他の微生物種由来の同種タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存性プロトコルを使用する相同的遺伝子の単離は、当該分野において周知である。配列依存性プロトコルの例としては、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、タボルＳ．（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，１０７４（１９８５））またはストランド置換増幅（ＳＤＡ，ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９，３９２，（１９９２）］の多様な使用によって例示されるように、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０５】
例えば、本発明のタンパク質またはポリペプチドに類似のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、本核酸フラグメントのすべてまた一部を、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用し、当業者に周知の方法論を使用して任意の所望される細菌由来のライブラリーをスクリーニングすることによって、直接単離し得る。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当該分野において既知の方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））により設計および合成することができる。さらに、配列全体は、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、もしくは末端標識技術のような当業者に既知の方法によりＤＮＡプローブを、または利用可能なインビトロ転写系を使用してＲＮＡプローブを合成するのに直接使用することができる。加えて、本配列の一部または完全長を増幅するための特異的プライマーを、設計かつ使用することができる。生じる増幅産物は増幅反応の間に直接標識することができるか、または増幅反応後に標識することができ、そして適切なストリンジェンシーの条件下で、完全長のＤＮＡフラグメントを単離するためのプローブとして使用することができる。
【０１０６】
典型的に、ＰＣＲ型増幅技術において、プライマーは、異なる配列を有し、相互に相補的ではない。所望される試験条件に依存して、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ正確な複製を提供するために設計するべきである。ＰＣＲプライマーの設計方法は一般的であり、当該分野において周知である。（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびワレイス（Ｗａｌｌａｃｅ）、“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｋ．Ｅ．デイビス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）編、（１９８６）３３〜５０頁、ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、バージニア州、ヘルンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ，  Ｖｉｒｇｉｎｉａ）；ホワイトＢ．Ａ．（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．）（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙのリキリックＷ．（Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．）（１９９３）、第１５巻、３１〜３９ページ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ヒューマニアプレス社（Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニュージャージー州、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。
【０１０７】
一般に、本配列の２個の短いセグメントをポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで使用し、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同な遺伝子をコードするより長い核酸フラグメントを増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸フラグメントのライブラリー上で実施してもよく、ここで、一方のプライマーの配列は本核酸フラグメント由来であり、そして他方のプライマーの配列は、微生物の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の存在を利用する。
【０１０８】
あるいは、第２のプライマー配列はクローニングベクター由来の配列に基づいてよい。例えば、当業者は、ＰＣＲを使用して転写物の単一点と３’またはは５’末端との間の領域のコピーを増幅することにより、ｃＤＮＡを生じさせるＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８５：８９９８（１９８８））に従うことが可能である。本配列から３’および５’方向に配向されたプライマーを設計することが可能である。商業的に入手可能な３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を使用して、特異的な３’または５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（オオハラ（Ｏｈａｒａ）ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ８６：５６７３（１９８９）；ロー（Ｌｏｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：２１７（１９８９））。
【０１０９】
あるいは、本配列は、相同物の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として用いることもできる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本構成成分には、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子フラグメントを含有することが疑われるサンプル、および特異的ハイブリダイゼーション方法が含まれる。本発明のプローブは、典型的に、検出しようとする核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出しようとする核酸配列に「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは５塩基〜１万塩基に変動することができ、実施しようとする特定の試験に依存する。典型的に、約１５塩基〜約３０塩基のプローブの長さが適切である。プローブ分子のただ一部でも検出しようとする核酸配列に相補的である必要がある。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは不完全な相補的分子の間でも生じ、その結果、ハイブリダイズされた領域内の塩基の特定の画分は、適切な相補的塩基と対を形成しない。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション方法は良好に規定されている。典型的に、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなければならない。これには、適切な濃度および温度条件下、無機または有機塩の存在下でプローブとサンプルとを接触させることを要する。プローブおよびサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸との間に可能な任意のハイブリダイゼーションが生じ得るのに十分に長い時間だけ接触させなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度は、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的の濃度が高いほど、ハイブリダイゼーションのインキュベーションに必要な時間は短い。必要に応じて、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤は、室温で短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度かつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（バン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１）。適切なカオトロピック剤としては、特に、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムが挙げられる。典型的に、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望であれば、ハイブリダイゼーション混合物に典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）でホルムアミドを添加することができる。
【０１１１】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。典型的にこれらは、約２０〜６０％容量、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖホルムアルデヒド、約０．１５〜１Ｍ塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳなどの約０．０５〜０．１Ｍ緩衝液（約６〜９のｐＨ範囲）、ドデシル硫酸ナトリウムなどの約０．０５〜０．２％の界面活性剤、または０．５〜２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、フィコール（ＦＩＣＯＬＬ）（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．））（約３００〜５００キロダルトン）、ポリビリルピロリドン（約２５０〜５００キロダルトン）、および血清アルブミンを用いる。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識キャリア核酸、フラグメント化した核酸ＤＮＡ、例えばウシ胸腺もしくはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡおよび必要に応じて約０．５〜２％ｗｔ．／ｖｏｌ．グリシンが含まれる。また、ポリエチレングリコールなどの様々な極性水溶性または膨潤性薬剤、ポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどのアニオン性ポリマー、および硫酸デキストランなどのアニオン性多糖性ポリマーを含む排除体積剤などの他の添加物も含まれ得る。
【０１１２】
核酸ハイブリダイゼーションは、様々なアッセイ形式に適応可能である。最も適切な形式の１つはサンドイッチアッセイ形式である。サンドイッチアッセイは、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに特に適応可能である。サンドイッチ型アッセイの主な構成成分は固相支持体である。固相支持体は、標識されていない、配列の一方の部分に相補的である固定化された核酸プローブを吸着するかまたは共有結合している。
【０１１３】
本ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列の利用可能性は、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングを容易にする。本アミノ酸配列の部分を表す合成ペプチドを合成してもよい。これらのペプチドを使用して、該アミノ酸配列を含むペプチドもしくはタンパク質に対する特異性を有するポリクローナルまたはモノクローナルの抗体を産生するため動物を免疫することが可能である。その後、これらの抗体を使用して、目的の完全長ＤＮＡクローンを単離するためにＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることが可能である（レーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）（１９８４）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１；マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））。
【０１１４】
本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞、とりわけ微生物宿主の細胞中で製造することができる。組換え微生物宿主における発現は、様々な経路の中間体の発現；宿主においてこれまで可能でなかった新規産物の合成のための宿主における既存の経路の操作に有用であり得る。
【０１１５】
本遺伝子および核酸フラグメントの発現のための好適な異種宿主細胞は、菌類または細菌ファミリー内において広範に見出すことができ、広範な範囲の温度、ｐＨ値、および溶媒耐性で増殖する生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌のいずれかは、本発明の核酸フラグメントの発現に適切な宿主であろうと考えられる。細胞の供給材料にかかわらず、転写、翻訳およびタンパク質の生合成装置は同じであるため、細胞バイオマスの作製に使用される炭素供給材料にかかわらず、機能的遺伝子が発現される。大規模微生物増殖および機能的遺伝子発現は、広範な単純あるいは複雑な炭水化物、有機酸およびアルコール、メタンなどの飽和炭化水素または光合成もしくは化学合成独立栄養宿主の場合の二酸化炭素を利用することができる。しかし、機能的遺伝子は、窒素、リン、イオウ、酸素、炭素または小さな無機イオンを含む任意の微量栄養素の形態および量を含み得る特定の増殖条件によって、調節、抑制または低下させることができる。さらに、機能的遺伝子の調節は、培養物に添加され、典型的に栄養またはエネルギー源とはみなされない特定の調節分子の有無によって達成することができる。増殖速度もまた、遺伝子の発現において重要な調節因子である。宿主株の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの細菌、菌類もしくは酵母種、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｏｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、デイノコックス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スピンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロシヌス（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスチス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、ミクソコッカス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびクレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
異種遺伝子の高レベル発現を指令する調節配列を含有する微生物発現系および発現ベクターは当業者に周知である。これらのいずれをも使用して、本発明の配列の任意の遺伝子産物の産生のためのキメラ遺伝子を構築することができる。次いで、これらのキメラ遺伝子を、形質転換によって適切な微生物に導入し、高レベルの酵素発現を提供することができる。
【０１１７】
従って、例えば、適切なプロモーターの制御下の本細菌酵素をコードするキメラ遺伝子の導入は、イソプレノイド賛成の増加を実証することが予想される。天然の宿主細胞および異種宿主の両方において、本遺伝子を発現することが有用であることが考えられる。本発明の遺伝子を天然型宿主に導入すると、現存のイソプレノイド産生のレベルが上昇するであろう。さらに、本遺伝子を非天然型宿主細菌に導入してもよく、ここで、ロドコッカスに存在しないイソプレノイド化合物の産生を操作するという利点がある。
【０１１８】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該分野において周知である。典型的に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択マーカー、および自己複製または染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の制御を有する遺伝子の５’側領域および転写の終了を制御するＤＮＡフラグメントの３’側領域を含む。両方の制御領域が形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来することが最も好ましいが、そのような制御領域は、産生宿主として選択される特定種に生来である遺伝子に由来する必要はないことを理解すべきである。
【０１１９】
所望の宿主細胞において、本ＯＲＦの発現を推進するのに有用である、開始制御領域またはプロモーターは多数あり、かつ当業者に馴染みである。事実上、これらの遺伝子を駆動することができるいかなるプロモーターも本発明に適し、これらはＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）での発現に有用）；ならびにｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびにａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよびＢａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）での発現に有用な様々なファージプロモーターを包含するがこれらに制限されない。
【０１２０】
終了制御領域もまた、好適な宿主に天然型の様々な遺伝子由来であり得る。必要に応じて、終了部位は必要ではないが、しかし、含まれている場合が最も好ましい。
【０１２１】
本発明の配列に関する知識は、イソプレノイド生合成経路を有する任意の生物体、特にメタノトロフにおける前記経路を操作するのに有用である。遺伝子経路を操作する方法は一般的であり、当該分野において周知である。特定の経路において選択された遺伝子は、様々な方法でアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる。さらに、遺伝子中断および類似の技術によって、生物体における競合経路を消失または消化することができる。
【０１２２】
一旦、重要な遺伝子経路が同定され、配列が決定されると、特定の遺伝子をアップレギュレートし、経路の出力を増加することができる。例えば、標的化された遺伝子のさらなるコピーを、ｐＢＲ３２２などのマルチコピープラスミド上で宿主細胞に導入することができる。あるいは、標的遺伝子は、非天然型プロモーターの制御下にあるように修飾することができる。細胞周期の特定のポイントまたは発酵進行中に経路が作動することが所望される場合、調節または誘導プロモーターを使用して、標的遺伝子の天然型プロモーターを置き換えることができる。同様に、場合によって、生来または内因性のプロモーターを修飾して、遺伝子発現を増大させることができる。例えば、内因性プロモーターは、変異、欠失、および／または置換によって、インビトロで変更することができる（キメエック（Ｋｍｉｅｃ）米国特許第５，５６５，３５０号明細書；ザーリング（Ｚａｒｌｉｎｇ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８を参照のこと）。
【０１２３】
あるいは、標的経路またはエネルギーもしくは炭素の競合取り込み（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｓｉｎｋ）として役割を果たし得る競合経路において特定の遺伝子の発現を減少または消失する必要があることがある。この目的のための遺伝子をダウンレギュレーションする方法が探査されている。中断しようとする遺伝子の配列が既知である場合、遺伝子ダウンレギュレーションのための最も有効な方法の１つは、標的化された遺伝子中断であり、ここで、転写を中断するように外来ＤＮＡが構造遺伝子に挿入される。このことは、中断しようとする遺伝子の部分に高度な相同性を有する配列に隣接する挿入すべきＤＮＡ（しばしば、遺伝子マーカーである）を含む遺伝子カセットを作製することによって生じることができる。カセットを宿主細胞に導入することによって、細胞の天然型ＤＮＡ複製機構を介して外来ＤＮＡが構造遺伝子に挿入される。（例えば、ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４６１７−４６２２、バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら（１９９３）Ｇｅｎｅ１３６：２１１−２１３、グエルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２５１９−２５２４、およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２７０−２７７を参照のこと。）
【０１２４】
アンチセンス技術は、標的遺伝子の配列が既知である場合の遺伝子のダウンレギュレーションのもう１つの方法である。これを達成するために、所望の遺伝子由来の核酸セグメントをクローニングし、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに操作可能に連結する。次いで、この構築物を宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を産生させる。アンチセンスＲＮＡは、目的のタンパク質をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨害することによって、遺伝子の発現を阻害する。当業者であれば、特定の遺伝子の発現を減少するためにアンチセンス技術の使用が特に考慮されることを知っているであろう。例えば、アンチセンス遺伝子を適切なレベルで発現させるには、当業者に既知の異なる調節エレメントを利用して異なるキメラ遺伝子を使用することが必要であり得る。
【０１２５】
標的化された遺伝子中断およびアンチセンス技術は、配列が既知である遺伝子をダウンレギュレーションするための効果的な手段を提供するが、この他にも配列には基づかないそれほど特異的ではない方法論も開発されている。例えば、細胞をＵＶ放射に暴露させ、次いで、所望の表現型についてスクリーニングしてもよい。化学薬剤による変異誘発も変異を作製するのに有効であり、通常使用される物質には、ＨＮＯ２およびＮＨ２ＯＨなどの非複製ＤＮＡに影響を及ぼす化学物質、ならびにフレームシフト変異が顕著であるアクリジン色素などの複製中のＤＮＡに影響を及ぼす薬剤が含まれる。照射または化学薬剤を使用して変異を作製するための特定の方法については、当該分野において良好に記載されている。例えば、トーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）シナウエル・アソシエート社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．）またはデスパンデ・ムクンドＶ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）を参照のこと。
【０１２６】
遺伝子中断のためのもう１つの非特異的方法は、転位因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入するが、配列に基づいて後で回収され、挿入が生じた場所を決定することができる遺伝子エレメントである。インビボおよびインビトロ両方での転位方法が公知である。両方法ともトランスポザーゼ酵素と組み合わせた転位因子の使用を要する。転位因子またはトランスポゾンをトランスポザーゼの存在下で核酸フラグメントと接触させると、転位因子は核酸フラグメントに無作為に挿入する。中断された遺伝子は転位因子の配列に基づいて同定することができるため、該技術は無作為変異および遺伝子の単離に有用である。インビトロ転位のためのキットが市販されている（例えば、ザ・プライマー・アイランド・トランスポジション・キット（Ｔｈｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、パーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ニュージャージー州、ブランチブルグ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）より市販、酵母Ｔｙ１エレメントに基づく；ザ・ゲノム・プライミング・システム（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州、ベヴァリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）より市販；細菌トランスポゾンＴｎ７に基づく；およびザ・ＥＺ：：ＴＮトランスポゾン・インサーション・システムズ（ｔｈｅ  ＥＺ：：ＴＮ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、エピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より市販、Ｔｎ５細菌転位因子に基づく；を参照のこと）。
【０１２７】
本明細書に関連して、上記の方法のうちのいずれか１つによって、同定されたイソプレノイド経路の発現を変調することは有用であり得る。例えば、本発明は、色素およびより小さなイソプレノイド化合物の産生をもたらすテルペノイド経路の重要な酵素をコードする多くの遺伝子を提供する。単離される遺伝子として、ｄｘｓおよびｄｘｒ遺伝子、ｉｓｐＡ、Ｄ、Ｅ、およびＦ遺伝子、ｃｒｔＥ、Ｂ、ＩおよびＬ遺伝子が挙げら得る。特に、３炭素類（ピルビン酸およびＣ１アルデヒド基、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸）の初期濃度をアップグレードし、ｄｘｓ遺伝子によって仲介される５炭素化合物（Ｄ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸）を生じることは有用であり得る。あるいは、特定の非色素イソプレノイドを産生させることを所望する場合、経路の下流末端の様々な遺伝子を中断することを所望することができる。例えば、カロテノイド生合成経路の一部であるフィトエンデヒドロゲナーゼをコードすることが公知であるｃｒｔＩ遺伝子。より小さな上流のテルペノイドが経路の所望される産物である場合、遺伝子中断またはこの遺伝子のアンチセンス阻害を使用することを所望してもよい。
【０１２８】
本発明の遺伝子のイソプレノイド産物の商業的製造を所望する場合、様々な培養方法論を適用することができる。例えば、バッチまたは連続培養方法論の両方によって、組換え微生物宿主から過剰発現された特定の遺伝子産物の大規模製造を行うことができる。
【０１２９】
古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。従って、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体または複数の生物体を接種し、増殖および代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしばｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで一定に変化する。バッチ培養細胞は静的対数期を穏やかに通過して高対数増殖期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期に達する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、最終産物産生の大部分を担うかまたはいくつかの系において中間的である。定常または指数後期産生は他の系で得ることができる。
【０１３０】
標準的なバッチ系の１つのバリエーションは流加培養系である。流加培養プロセスも本発明に適切であり、培養の進行に伴って基質を徐々に増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を構成する。異化産物の提示が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することを所望する場合は、流加培養系は有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は困難であるため、ｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排気体分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該分野において一般的かつ周知であり、その例はトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）シナウエル・アソシエート社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ．）またはデスパンデ・ムクンドＶ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７，（１９９２）（本明細書において参考として援用される）に見出すことができる。
【０１３１】
本発明の遺伝子の産物の商業的製造は、連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、有益な産物、副産物または不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【０１３２】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を変調することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源などの制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、他のすべてのパラメータを中位にすることが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子は連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、従って、培地を取り出すことによって失われる細胞は培養物中の細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスの栄養および増殖因子を変調するための方法ならびに生成物の形成速度を最大にするための技術は、産業微生物学の分野において周知であり、様々な方法がＢｒｏｃｋ、上掲によって詳述されている。
【０１３３】
本発明の発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなければならない。適当な基質としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類、ラクトースまたはスクロースなどのオリゴ糖類、デンプンまたはセルロースなどの多糖類、またはこれらの混合物、ならびにチーズ乳漿浸透液（ｃｈｅｅｓｅ  ｗｈｅｙ  ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンステープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、テンサイモラス、およびオオムギモルトなどの再生可能な原料からの未精製混合物が挙げられるが、これらに限定はされない。さらに、炭素基質は、重要な生化学中間体への代謝返還が実証されている二酸化炭素、メタンまたはメタノールなどの単炭素基質であってもよい。炭素１個および２個の基質に加えて、メチロトロフィック生物体は、代謝活性のために、メチルアミン、グルコサミンおよび種々のアミノ酸などの多数の他の炭素含有化合物を利用することも知られている。例えば、メチロトロフィック酵母は、メチルアミンからの炭素をトレハロースまたはグリセロールの形成のために利用することが知られている（ベリヨン（Ｂｅｌｌｉｏｎ）ら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．，［国際シンポジウム（Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ）］，第７回（１９９３）、４１５−３２．編集者：ムレルＪ．コリン（Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ）；ケリー・ドンＰ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．）、発行者：インターセプト（Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ）、英国、アンドベル（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ））。同様に、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の様々な種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（スルター（Ｓｕｌｔｅｒ）ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３：４８５−４８９（１９９０））。従って、本発明で利用される炭素の供給源は多様な炭素含有基質を包含することができ、生物体の選択によってのみ制限される。
【０１３４】
植物および藻類もイソプレノイド化合物を産生することが公知である。本発明の核酸フラグメントを使用して、微生物タンパク質を発現する能力を有するトランスジェニック植物を作製することができる。好適な植物宿主は、高産生レベルの本タンパク質を支持するあらゆる種類である。適切な緑色植物としては、ダイズ、アブラナ（ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、Ｂ．カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ））、ヒマワリ（ヘリナンタス・アヌス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ））、ワタ（ゴシピウム・ヒルスタム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、トウモロコシ、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、アルファルファ（メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ））、小麦（トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）種）、大麦（ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））、カラスムギ（アベナ・サティバＬ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ，Ｌ））、モロコシ（ソルガム・ビコロル（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ））、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アブラナ科の野菜（ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ポテト、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、草の実作物、テンサイ、サトウキビ、マメ、エンドウ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草が挙げられるが、これらに限定されない。藻類の種としては、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ハエモタコッカス（Ｈａｅｍｏｔａｃｏｃｃｕｓ）、およびドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｌｉｅｌａ）などの商業的に重要な宿主が挙げられるが、これらに限定されない。イソプレノイド化合物の過剰発現は、最初に、発生の所望の段階で所望の組織におけるある遺伝子の発現を指図することが可能なプロモーターにコーディング領域が操作可能に連結されている、本発明のキメラ遺伝子を構築することにより達成することができる。便宜的理由上、キメラ遺伝子は、同一の遺伝子由来のプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでよい。転写終止シグナルをコードする３’の非コーディング配列もまた提供することができる。本キメラ遺伝子は、遺伝子発現を助長するために、１個もしくはそれ以上のイントロンもまた含んでよい。
【０１３５】
コーディング領域の発現を含むことが可能ないかなるプロモーターおよびいかなるターミネーターのいかなる組み合わせも、キメラ遺伝子配列に使用することができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例として、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のプロモーターおよびターミネーターが挙げられる。使用することができる効率的な植物プロモーターの１つのタイプは、高レベル植物プロモーターである。本発明の遺伝子配列と操作可能に連結されているそのようなプロモーターは、本発明の遺伝子産物の発現を促進することが可能であるべきである。本発明において使用することができる高レベル植物プロモーターとしては、ダイズ由来の例のリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小さいサブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐ．  Ｇｅｎ．，１：４８３−４９８  １９８２）、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物の光誘導プロモーターであることが既知である（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．キャシュモア（Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、ニューヨークシュウ、プレヌム（Ｐｌｅｎｕｍ，ＮＹ）（１９８３）、２９〜３８頁；コルジＧ．（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．）ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５８：１３９９（１９８３）、およびダンスムイルＰ．（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ，Ｐ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【０１３６】
次いで、本キメラ遺伝子を含むプラスミドベクターを構築することができる。プラスミドベクターの選択は宿主植物を形質転換するのに使用されるであろう方法に依存する。当業者であれば、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、そして増殖させるためにプラスミドベクターに存在しなければならない遺伝子エレメントを十分に知っているであろう。また当業者であれば、多様な独立の形質転換事象が多様なレベルおよびパターンの発現をもたらすこと（ジョーンズら、（Ｊｏｎｅｓ）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１−２４１８（１９８５）；デアルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、そして従って、複数の事象が、所望の発現レベルおよびパターンを表す株を得るためにスクリーニングされなければならないことも認識するであろう。こうしたスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３，（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（クロックゼクＪ．（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．，６１８（１−２）（１９９３）１３３−１４５）、タンパク質発現のウェスタン分析、または表現型分析により成し遂げられ得る。
【０１３７】
アプリケーションによっては、本タンパク質を多様な細胞区画に向かわせることが有用である。従って、輸送配列（キーグストラ（Ｋｅｅｇｓｔｒａ）（１９８９）Ｃｅｌｌ５６：２４７−２５３）、シグナル配列もしくは小胞体局在化をコードする配列（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）または核局在化シグナル（ライクヘル（Ｒａｉｋｈｅｌ）（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２）のような適切な細胞内ターゲッティング配列が付加されおよび／または既に存在するターゲッティング配列を除去した酵素をコードするようにコーディング配列を改変することにより、上述されたキメラ遺伝子をさらに補うことができることが予見される。引用された参考文献はこれらのそれぞれの例を与えるが、該一覧は網羅的でなく、そして、本発明において有用なより多くのターゲッティングシグナルが将来発見されてもよい。
【０１３８】
本発明のヌクレオチドを使用して、増強されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を産生させることができると考えられる。改変されたまたは増強された活性を有する遺伝子産物を産生させるために、天然型遺伝子配列を変異するための様々な方法が公知であり、誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（１９９９年２月１５日）第２７巻、Ｎｏ．４、１０５６〜１０６２頁）；部位特異的変異誘発（クーブス（Ｃｏｏｍｂｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９８），２５９〜３１１，１ｐｌａｔｅ．編集者：アンゲレッチ・ルス・ホーグ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｒｕｔｈ  Ｈｏｇｕｅ．）発行者：  アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、カルフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および「遺伝子シャッフリング」（米国特許第５，６０５，７９３号明細書；米国特許第５，８１１，２３８号明細書；米国特許第５，８３０，７２１号明細書；および米国特許第５，８３７，４５８号明細書、これらは参考として本明細書に援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
実行が容易であり、変異誘発が高率であり、スクリーニングが容易であるため、遺伝子シャッフリングの方法は特に魅力がある。遺伝子シャッフリングのプロセスは、目的の遺伝子に類似するＤＮＡ領域または異なるＤＮＡ領域の両方のさらなる集団の存在下で、目的の遺伝子を、特定のサイズのフラグメントに制限エンドヌクレアーゼ切断することを要する。次いで、このプールのフラグメントを変性し、再アニールして、変異した遺伝子を作製する。次いで、改変した活性を対象に、変異した遺伝子をスクリーニングする。
【０１４０】
本発明の本微生物配列は、この方法によって、変異し、改変されたまたは増強された活性についてスクリーニングすることができる。配列は二本鎖であるべきであり、５０ｂｐ〜１０ｋｂの範囲の様々な長さであることができる。配列は、当該分野において周知である制限エンドヌクレアーゼを使用して、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲のフラグメントに無作為に消化することができる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）上掲）。本微生物配列に加えて、微生物配列のすべてまたは部分にハイブリダイズするフラグメントの集団を添加することができる。同様に、本配列にハイブリダイズしないフラグメントの集団を添加することもできる。典型的に、これらのさらなるフラグメント集団は、全核酸に比べて重量で約１０〜２０倍を超えて、添加される。一般に、このプロセスの後では、混合物中の異なる特異的核酸フラグメントの数は約１００〜約１０００である。無作為核酸の混合された集団は変性されて一本鎖核酸フラグメントを形成し、次いで、再アニーニングされる。他の一本鎖核酸フラグメントとの相同領域を有するそれらの一本鎖核酸フラグメントのみが再アニーリングする。加熱することによって、無作為核酸フラグメントを変性してもよい。当業者であれば、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を決定することができる。好ましくは、温度は８０℃〜１００℃である。核酸フラグメントは、再冷却することによって再アニーリングすることができる。好ましくは、温度は２０℃〜７５℃である。変性は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の添加によって加速することができる。適切な遠濃度は、０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲であることができる。次いで、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（即ち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の存在下で、アニーリングされた核酸フラグメントをインキュベートする。核酸ポリメラーゼは、当該分野において公知であるクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、Ｔａｑポリメラーゼまたは他の任意のＤＮＡポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼは、アニーリングの前、アリーニングと同時またはアニーリグ後に、無作為核酸フラグメントに添加することができる。ポリメラーゼ存在下での変性、変性およびインキュベーションのサイクルは、所望される回数だけ繰り返される。好ましくは、該サイクルは、２〜５０回、より好ましくは、配列は１０〜４０回繰り返される。得られる核酸は、約５０ｂｐ〜約１００ｋｂの範囲のより長い二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準的なクローニングおよび発現プロトコールによって、発現および改変された活性についてスクリーニングすることができる。（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）上掲）。
【０１４１】
さらに、ハイブリッドタンパク質は、遺伝子シャッフリング（エキソンシャッフリング）方法（ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら、ＰＮＡＳ，９４：１０６９−１０７３（１９９７））を使用して、機能的ドメインの融合によって集成させることができる。本遺伝子の機能的ドメインは、所望される触媒機能を有する新規の酵素を作製するために、他の遺伝子の機能的ドメインと組み合わせることができる。ＰＣＲ重複伸長方法を使用して、ハイブリッド酵素を構築し、当業者に周知の技術を使用して様々な発現ベクターにクローニングしてもよい。
【０１４２】
好適な実施態様の説明
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株を含有する本来の環境サンプルは、ごみ処理施設から入手した。１ｍｌの活性汚泥を１０ｍｌのＳ１２培地に直接接種した。アニリンを唯一の炭素およびエネルギー源として使用した。培養は、１００ｐｐｍのアニリンを２〜３日ごとに添加することによって、維持した。培養物を、１４日ごとに希釈（１：１００希釈）した。唯一の炭素およびエネルギー源としてアニリンを利用する細菌をさらに単離し、Ｓ１２寒天上で精製した。アニリン（５μｌ）は、各ペトリ皿の蓋の内側に配置した。
【０１４３】
ＡＮ１２株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の配列データベースで他の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列と比較した場合、ＡＮ１２株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、高Ｇ＋Ｃグラム陽性ロドコッカス属の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対し少なくとも９８％類似性であった。
【０１４４】
表１は、カロテノイド類合成のためのイソプレノイド経路に関与するロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株由来のゲノム配列決定によって同定された１０個の遺伝子についてまとめている。カロテノイド類合成のための生化学経路および遺伝子機能の推定的割当てを図１に示す。
【０１４５】
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株は、天然に着色されている。ＡＮ１２の色素を抽出し、ロドコッカス・エリスロポリスＡＴＣＣ４７０７２株のカロテノイド色素と比較した。両株の色素をアセトンに抽出し、窒素下で乾燥し、メタノールに再溶解した。両株由来の可溶性材料をＨＰＬＣで分析した。ＡＮ１２由来の色素は、ＨＰＬＣ分析において、ＡＴＣＣ４７０７２株由来のカロテノイド色素に類似のプロフィールを示した（図２）。ＡＴＣＣ４７０７２株の主な主要な色素の分子量は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析およびＬＣ−ＭＳによって５５０ダルトンであると決定された。
【０１４６】
ｄｘｓ遺伝子は、イソプレノイド合成におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルビン酸前駆体から１−デオキシキシルロース−５−リン酸の合成の第１段階を殖倍する１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする。ＡＮ１２由来の異なるＤＮＡ長の上流プロモーター領域を有するｄｘｓ遺伝子をマルチコピーシャトルベクターにクローニングし、ＡＴＣＣ４７０７２宿主にエレクトロポレートし、過剰発現させた場合、形質転換されたコロニーは、ベクターコントロールを有するコロニーよりも暗い外観を呈した。形質転換されたコロニーのカロテノイド産生を、分光光度計によりおよびＨＰＬＣを使用して評価した。形質転換されたコロニーにおいてカロテノイド産生の増加が観察された（表２）。
【０１４７】
本発明の遺伝子および遺伝子産物の活性は、相同組換えによって遺伝子が中断された場合のＡＴＣＣ４７０７２株におけるカロテノイド産生の消失を示す研究によって確認されている。標的化された遺伝子はｃｒｔＥおよびｃｒｔＩであった。ＡＴＣＣ４７０７２株由来のｃｒｔＥおよびｃｒｔＩ遺伝子の切断された部分を、ＰＣＲを使用して増幅した。ＰＣＲのためのプライマー配列はＡＮ１２の配列に基づいていた。ｃｒｔＥおよびｃｒｔＩ遺伝子の増幅されたフラグメントは、ＡＮ１２株由来のそれぞれの遺伝子に対してＤＮＡレベルで約９５％同一性を有した。最初に、ｃｒｔＥフラグメントおよびｃｒｔＩフラグメントをｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州、カールスバット（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングした。ＴＯＰＯクローンをＮｃｏＩで消化し、続いて、ｃｒｔＥまたはｃｒｔＩフラグメントをｐＢＲ３２８のＮｃｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物を配列決定によって確認し、ｃｒｔＥクローンについてはｐＤＣＱ１００およびｃｒｔＩクローンについてはｐＤＣＱ１０１と命名した。ｐＤＣＱ１００およびｐＤＣＱ１０１の約１μｇＤＮＡをエレクトロポレーションによりロドコッカスＡＴＣＣ４７０７２に導入し、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを有するＮＢＹＥプレート上にプレート化した。ｐＢＲ３２８ベクターは、ロドコッカスでは複製しない。３０℃で３〜４日間のインキュベーション後に得られたテトラサイクリン耐性形質転換体は、染色体組込みによって作製した。ＡＴＣＣ４７０７２の染色体に対する標的化されたｃｒｔＥまたはｃｒｔＩ遺伝子への組込みを、ＰＣＲによって確認した。テトラサイクリン耐性形質転換体から調製した染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用し、遺伝子特異的プライマーと対を形成するベクター特異的プライマーをＰＣＲのために使用した。予想されるサイズのＰＣＲフラグメントをテトラサイクリン耐性形質転換体から増幅したが、野生型ＡＴＣＣ４７０７２からはＰＣＲ産物は得られなかった。２つの遺伝子特異的プライマーを使用した場合、大きなベクターＤＮＡを挿入したため、テトラサイクリン耐性形質転換体ではＰＣＲフラグメントは得られなかった。ベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーにより得られたＰＣＲフラグメントを配列決定した。ベクターとｃｒｔＥまたはｃｒｔＩとの接合部の配列解析により、予想された部位で１回の交叉組換えが生じ、標的遺伝子ｃｒｔＥまたはｃｒｔＩを中断したことが確認された。
【０１４８】
ＡＴＣＣ４７０７２のＣｒｔＥおよびＣｒｔＩ中断変異の表現型について分析した。ＣｒｔＥまたはＣｒｔＩ中断変異体のコロニーは青白い色を呈していた。野生型株に存在する色素は、両変異体において消失したと思われた。変異体のカロテノイド類のＨＰＬＣ分析により、目視による検査結果を確認した。
【０１４９】
ＣｒｔＩ中断変異体は、４５０ｎｍでモニターした場合に野生型株において存在する２つのＨＰＬＣのピークを有していなかった。（表３）。これらの結果により、カロテノイド類生合成におけるＣｒｔＩタンパク質の役割が確認された。ＣｒｔＩ遺伝子のノックアウトにより、４５０ｎｍにおける２つのＨＰＬＣのピークによって表されるカロテノイド色素が認められなかった。ＣｒｔＩ中断変異体におけるフィトエン（無色）の蓄積により、ＢＬＡＳＴ検索によって示唆されるフィトエンデヒドロゲナーゼとしてのＣｒｔＩタンパク質の機能が確認される。
【０１５０】
ＣｒｔＥ中断変異体は、野生型に存在する２つのＨＰＬＣのピークもＣｒｔＩ中断変異体におけるフィトエンのピークも有していなかった。これらの結果によっても、カロテノイド類生合成におけるＣｒｔＥタンパク質の役割が確認された。ＣｒｔＥ中断変異体においてフィトエンの蓄積が認められなかったことは、該経路におけるフィトエン合成工程の前に作用するゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼとしてのＣｒｔＥタンパク質の機能と一致する。
【０１５１】
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株において同定されるリコペンシクラーゼ（ＯＲＦ１０）は、植物およびシアノバクテリウムにおけるＣｒｔＬ型のリコペンシクラーゼに対して高い配列類似性を示した（表１）。トリアルキルアミン化合物、２−（４−メチルフェノキシ）−トリエチルアミン塩酸塩（ＭＰＴＡ）および２−（４−クロロフェニルチオ）−トリエチルアミン塩酸塩（ＣＰＴＡ）は、ＣｒｔＬ型のリコペンシクラーゼを特異的に阻害し、非光合成細菌のＣｒｔＹ型のリコペンシクラーゼは阻害しないことが明らかにされている（クニングハムＪｒ．（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｊｒ．）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７９４２，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９４、第６巻：１１０７）。ロドコッカス・エリスロポリス（ＡＴＣＣ４７０７２株）のカロテノイド産生に対するＭＰＴＡまたはＣＰＴＡの効果について調べた。４０μＭのＭＰＴＡまたはＣＰＴＡの存在下でリコペンを基質として使用することにより、カロテノイドの産生は有意に減少した。
【実施例】
【０１５２】
以下の実施例において本発明をさらに規定する。これらの実施例は本発明の好適な実施態様を示すと同時に例示のみの方法によって与えられることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的特徴を確かめることができ、そして本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に様々な変更および改変を加えて、さまざまな用途および条件に適応することができる。
【０１５３】
一般的方法
実施例で使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルックＪ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティスＴ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；コールド・スプリング・ハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）：コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）（１９８９）（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））ならびにＴ．Ｊ．シルハビー（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４）ならびにアウスベルＦ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（グリーン・パブリッシング・アソシエーション・エンド・ウィリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）より出版）（１９８７）により記載されている。
【０１５４】
細菌培養の維持または増殖に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．ムレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、オイゲンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーク（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、アメリカン・ソサイエティ・フォア・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）（１９９４））またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウエル・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９）に記載の通りに見ることができる。すべての試薬、制限酵素ならびに細菌細胞の増殖および維持のために使用した材料は、特に特定しない限りアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、ギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（メリーランド州、ガイセルブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））より入手した。
【０１５５】
略語の意味は次のようである：「ｈ」は時間（単数および複数）を意味し、「ｍｉｎ」は分（単数および複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数および複数）を意味し、「ｄ」は日（単数および複数）を意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
【０１５６】
実施例１
ＡＮ１２株の単離および特徴付け
実施例１は、唯一の炭素およびエネルギー源としてアニリン上で増殖し得ることに基づく、ロドコッカス・エリスロポリスのＡＮ１２株の単離について説明する。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の解析は、ＡＮ１２株が、ロドコッカス属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌に関連することを示した。
【０１５７】
アニリン上で増殖した細菌を、集積培養から単離した。集積培養は、１２５ｍｌスクリューキャプ付き三角フラスコ（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  ｆｌａｓｋ）中、１０ｍｌのＳ１２培地（１０ｍＭ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ３、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ２、および０．０００１％ＦｅＳＯ４）に１ｍｌの活性汚泥を接種することによって樹立した。活性汚泥は、ごみ処理施設から入手した。集積培養に、１００ｐｐｍのアニリンを培養培地に直接添加して補充し、２５℃、往復振盪でインキュベートした。集積培養は、１００ｐｐｍのアニリンを２〜３日ごとに添加することによって、維持した。培養物を、１４日ごとに、９．９ｍｌの培養物を同容量のＳ１２培地で置き換えることによって希釈した。集積培養のサンプルをＳ１２寒天上に拡げることによって、唯一の炭素およびエネルギー源としてアニリンを利用する細菌を単離した。アニリン（５μＬ）は、各ペトリ皿の蓋の内側に配置した。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、倒置して室温（約２５℃）でインキュベートした。次いで、代表的な細菌コロニーを、唯一の炭素およびエネルギー源としてアニリンを使用する能力について試験した。最初の単離に使用した本来のＳ１２寒天プレートから新たなＳ１２寒天プレートにコロニーを移し、各ペトリ皿の蓋の内側にアニリンを供給した。ペトリ皿をパラフィルムで密閉し、倒置して室温（約２５℃）でインキュベートした。
【０１５８】
各単離体の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲで増幅し、以下のように解析した。各単離体は、Ｒ２Ａ寒天（ディフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マサチューセッツ州ベットフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））上で増殖させた。培養プレート由来のいくつかのコロニーを１００μｌの水に懸濁した。混合物を凍結し、次いで融解した。市販のキットを使用して、製造者（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））の指示に従い、ＰＣＲにより、プライマーＨＫ１２（５’−ＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’）（配列表の配列番号２１）およびＨＫ１３（５’−ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’）（配列表の配列番号２２）で１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を増幅した。ＰＣＲは、パーキン・エルマー・ジーンアンプ・９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ９６００）で実施した。サンプルは、９４℃で５分間、インキュベートし、次いで９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間を３５回サイクル行った。増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、市販のキットを使用し、製造者（ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））の指示に従って精製し、自動化されたＡＢＩシークエンサー上で配列を決定した。配列決定反応は、プライマーＨＫ１２、ＨＫ１３、およびＨＫ１４（５’−ＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＹＭＧＣＧＧＴ−３’）（配列表の配列番号２３、ここで、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ）で開始した。類似配列について、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のＢＬＡＳＴ検索［アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）］に対する照会配列として、各単離体の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を使用した。
【０１５９】
ＡＮ１２株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を配列決定し、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）の配列データベースで他の１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列と比較した。ＡＮ１２株由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列は、ロドコッカス属に属する高Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対し約９８％類似であった。
【０１６０】
実施例２
配列決定および配列の作製のためのＡＮ１２ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡの調製
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株を、２５ｍＬのＮＢＹＥ培地（０．８％栄養ブロス、０．５％酵母エキス、０．０５％ツウィーン８０（Ｔｗｅｅｎ８０））中、３７℃で通気しながら対数増殖中期まで増殖させた。細菌細胞を、４，０００ｇ、４℃で３０分間、遠心分離した。細胞ペレットを１Ｍ  ＫＣｌを含有する２０ｍｌの５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３で１回洗浄し、次いで、２０ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５）で洗浄した。細胞ペレットを、５ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）に再懸濁し、リゾチームを２ｍｇ／ｍＬの最終濃度で添加した。懸濁液を３７℃で２時間インキュベートした。次いで、ドデシル硫酸ナトリウムを１％の最終濃度で添加し、プロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。懸濁液を５５℃で５時間インキュベートした。懸濁液が澄明になったところで、澄明な容怪物を等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。１７，０００ｇで２０分間の遠心分離後、水相を注意深く取り出し、新しい試験管に移した。２容量のエタノールを添加し、シールしたガラス製パスツールピペットでＤＮＡを穏やかに巻き取った。ＤＮＡを、７０％エタノールを含有する試験管にドリップし、次いで、空気乾燥した。空気乾燥後、ＲＮアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）（１００μｇ／ｍＬ）を有する４００μｌのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）にＤＮＡを再懸濁し、そして４℃で保管した。
【０１６１】
ライブラリーの構築
２００〜５００μｇの染色体ＤＮＡを、３００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  Ｎａ−ＥＤＴＡ、および３０％グリセロールの溶液に再懸濁し、アエロミスト・ダウンドラフト・ネブライザー（Ａｅｒｏｍｉｓｔ  Ｄｏｗｎｄｒａｆｔ  Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）チャンバ（ＩＢＩメディカルプロダクツ（ＩＢＩ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、イリノイ州シカゴ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ））中、１２ｐｓｉで６０秒間、せん断した。ＤＮＡを沈殿させ、再懸濁し、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベヴァリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））で処置した。０．８％のアガロースゲル電気泳動によるサイズ分画後、画分（２．０ｋｂ、または５．０ｋｂ）を切り出し、洗浄し、２段階連結反応手順を使用して、９９％を超える単一挿入物を有する高力価ライブラリーを生成した。
【０１６２】
配列決定
ショットガン配列決定ストラテジーアプローチを、全微生物ゲノムの配列決定に適応した（フレイシュマン・ロバート（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，Ｒｏｂｅｒｔ）ら、Ｗｈｏｌｅ−Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒａｎｄｏｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｒｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１９９５）。
【０１６３】
配列は、色素ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書；ＥＰ２７２００７）を使用して、ＡＢＩオートマチック（ＡＢＩ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ）シークエンサー上で作成した。配列の編集は、ＤＮＡスター（ＤＮＡＳｔａｒ）（ＤＮＡスター社（ＤＮＡ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）またはウィスコンシンＧＣＧ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＧＣＧ）（ウィスコンシン・パッケージ・バージョン９．０（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のいずれか、およびＣＯＮＳＥＤ（バージョン７．０）で実施した。すべての配列は、両方向で少なくとも２倍の範囲を表す。
【０１６４】
実施例３
ＡＮ１２株由来のイソプレノイド経路におけるＯＲＦの同定
ＯＲＦ１〜１０を、ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全部の非冗長（ｎｒ）ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、三次元構造ブルックヘイブンタンパク質データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）由来の配列、スイスプロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含む）中に含有される配列に対する類似性についてＢＬＡＳＴ（基礎局部整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）検索を実施することにより同定した。実施例２で得られた配列を、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なＤＮＡ配列に対する類似性について解析した。ＤＮＡ配列を全部の読み枠で翻訳し、そして、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（アルトシュルＳ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２）（１９９７）を使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なタンパク質配列に対する類似性について比較した。ＢＬＡＳＴ比較の結果を表１に示し、それらが最も類似性を有する配列についてまとめている。表１は、予想値において報告された値でＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づくデータを示す。予想値は、このサイズのデータベースの調査において全く偶然に予想される一致数を所定のスコアで特定し、一致の統計的有意性を推定する。
【０１６５】
【表１】
2005505249.tif 000002
【０１６６】
【表２】
2005505249.tif 000003
【０１６７】
表１は、カロテノイド類合成のためのイソプレノイド経路に関与するロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株由来のゲノム配列決定によって同定された１０個の遺伝子についてまとめている。カロテノイド類合成のための生化学経路および遺伝子機能の推定的割当てを図１に示す。
【０１６８】
ＯＲＦ３およびＯＲＦ５に対するＢＬＡＳＴ検索での最高のヒットは、マイコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来の仮想タンパク質として注釈を付した。これらの２つの仮想タンパク質をコードする遺伝子をマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の染色体において連結させた。ＯＲＦ３に対して相同性を有するタンパク質をコードする上流遺伝子Ｒｖ３５８２ｃを、後に４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチルエリスリトールシンターゼをコードするｙｇｂＰ（ｉｓｐＤ）の相同物として同定された（ローディヒ（Ｒｏｈｄｉｃｈ）ら、１９９９，ＰＮＡＳ９６：１１７５８）。ＯＲＦ５に相同性を有するタンパク質をコードする下流遺伝子Ｒｖ３５８１ｃは、後に２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼをコードするｙｇｂＢ（ｉｓｐＦ）の相同物として同定された（ヘルツ（Ｈｅｒｚ）ら、２０００，ＰＮＡＳ９７：２４８６）。ＯＲＦ３およびＯＲＦ５はまた、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）および枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｙｇｂＰおよびｙｇｂＢ相同物と同じ構成で、ロドコッカス株ＡＮ１２の染色体上において極付近に隣接している（ローディッヒ（Ｒｏｈｄｉｃｈ）ら、１９９９，ＰＮＡＳ９６：１１７５８）。他の２つの遺伝子ｃｒｔＥ（ＯＲＦ７）およびｃｒｔＩ（ＯＲＦ９）もＡＮ１２の染色体上に連結される。
【０１６９】
ＯＲＦ１０は、リコペン基質の末端にβ環基を付加するβリコペンシクラーゼに対する相同性を有した。機能的に極めて類似する２つのクラスのβリコペンシクラーゼ、シアノバクテリウムおよび植物由来のｃｒｔＬ型のシクラーゼ、ならびに他の細菌由来のｃｒｔＹ型のシクラーゼが存在する。機能的類似性にもかかわらず、これらの２つのクラスのシクラーゼは、共通する構造類似性が限られていた。ＯＲＦ１０はデイノコックス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）由来のリコペンシクラーゼに対し最も高い類似性を示した。ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株およびデイノコックス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）Ｒ１株由来のリコペンシクラーゼはすべて、細菌性のｃｒｔＹ型のリコペンシクラーゼよりも植物性のｃｒｔＬ−ｂ型のリコペンシクラーゼに対して高い相同性を示した。
【０１７０】
実施例４
ロドコッカス株によって産生されるカロテノイド色素
ロドコッカス・エリスロポリスＡＴＣＣ４７０７２およびＡＮ１２株は天然に着色されている。ピンク色の２つの株は、これらの２つの株におけるカロテノイド色素の産生を示す。ＡＴＣＣ４７０７２およびＡＮ１２におけるカロテノイド色素を抽出し、ＨＰＬＣにより分析した。それぞれのロドコッカス株について、ＮＢＹＥ（０．８％栄養ブロス＋０．５％酵母エキス）中１００ｍｌの細胞培養液を２６℃で１晩、浸透しながら定常期まで増殖させた。細胞を４０００ｇで１５分間遠心分離し、細胞ペレットを１０ｍｌのアセトンに再懸濁した。室温で一定に浸透することにより、アセトン中にカロテノイド類を抽出した。１時間後、細胞を、上記と同じ条件で遠心分離し、上清を回収した。抽出を再度繰り返し、両抽出物の上清を合わせて、窒素下で乾燥した。乾燥材料を０．５ｍｌのメタノールに再溶解し、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）マイクロ遠心管５４１５Ｃ中、１６，０００ｇで２分間の遠心分離より、不溶性材料を取り出した。０．１ｍｌのサンプルをＨＰＬＣのために使用した。
【０１７１】
ベックマン・ゴールド・ノイビー・ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｏｌｄ  Ｎｏｕｖｅａｕ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を有するベックマンシ・ステム・ゴールド（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｏｌｄ）（登録商標）ＨＰＬＣ（メリーランド州コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ））を研究のために使用した。０．１ｍｌの粗アセトン抽出物を、対応する保護カラムを有する１２５×４ｍｍＲＰ８（５μｍ粒子）カラム（ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）、カリフォルニア州サンフェルナンド（Ｓａｎ  Ｆｅｒｎａｎｄｏ，ＣＡ））に充填した。流速は１ｍｌ／分であった。溶媒プログラムは：０〜１１．５分４０％水／６０％メタノール、１１．５〜２０分１００％メタノール、２０〜３０分４０％水／６０％メタノールである。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）フォトダイオードアレイ検出器（モデル１６８）によりスペクトルデータを回収した。
【０１７２】
ＨＰＬＣ分析により、ロドコッカスＡＴＣＣ４７０７２およびＡＮ１２株は、極めて類似するプロフィールのカロテノイド色素を示した（図２）。それらは、４５０ｎｍでモニターした場合、両方とも１４．６分の溶出時間の主要ＨＰＬＣピークを有した。主要ピークの吸収極大は４６５ｎｍである。小さなピークも両株において１５．６分の溶出時間で存在した。小さなピークの吸収極大は４３５ｎｍ、４５８ｎｍ、および４８６ｎｍである。これらのデータは、これらの２つのロドコッカス株に類似または同一のカロテノイド類が存在することを示す。これらの２つの株における主要および小さなカロテノイド類の分子量も決定した。カロテノイド類を細胞ペレットからメタノールに抽出し、メタノール中５％ＫＯＨで、１晩、室温でけん化した。けん化後、大部分のカロテノイド類をヘキサン中に抽出した。最初に、抽出されたサンプルをシリカゲルカラムに通過させ、中性脂肪から分離した。カラム（１．５ｃｍ×２０ｃｍ）にシリカゲル６０（粒子サイズ０．０４０〜０．０６３ｍｍ、ＥＭサイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、ニュージャージー州ギブスタウン（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ））を充填し、ヘキサンで洗浄した。カロテノイド類のサンプルを充填し、９５％ヘキサン＋５％アセトンで洗浄し、８０％ヘキサン＋２０％アセトンで溶出させた。溶出したカロテノイド類を、移動相として８０％アセトニトリル＋２０％アセトンにより逆相Ｃ１８薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（Ｊ．Ｔ．ベイカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、ニュージャージー州フィリプスバーグ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ））上でさらに分離した。主要なカロテノイドバンド（Ｒｆ０．５）を切り出し、アセトンで溶出した。精製された主要カロテノイドピークのＡＴＣＣ４７０７２の分子量（ＭＷ）は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより５５０ダルトンと決定された。これは、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）を有するＬＣ−ＭＳによって確認したところ、プロトン化化合物のＭＷが５５１ダルトンであることが明らかにされた。ＬＣ／ＭＳによっても、ＡＴＣＣ４７０７２の小さなピークのカロテノイドの分子量が５３６ダルトン（プロトン化の形態では５３７ダルトン）であることが示された。ＡＮ１２由来のカロテノイド類の質量分析では、ＡＮ１２の主要ピークのカロテノイドの分子量（５５０ダルトン）および小さなピークのカロテノイドの分子量（５３６ダルトン）は、ＡＴＣＣ４７０７２のそれらと同一であることが明らかにされた。ＨＰＬＣの結果、スペクトル分析および分子量決定に基づいて、ＡＮ１２およびＡＴＣＣ４７０７２より産生されるカロテノイド類は同一であり、カロテノイド類の産生に関与する遺伝子は相同的であると思われる。カロテノイド類の構造についてはまだ決定されていない。
【０１７３】
実施例５
ｄｘｓのマルチコピー発現によるカロテノイド産生の上昇
ｄｘｓ遺伝子は、イソプレノイド経路におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸およびピルビン酸前駆体から１−デオキシキシルロース−５−リン酸の合成の第１工程を触媒する１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコードする。マルチコピーシャトルベクター上でＡＮ１２由来の推定ｄｘｓ遺伝子を発現させ、カロテノイド類産生に対するｄｘｓ発現の影響について決定することを試みた。天然型プロモーターを有するｄｘｓ遺伝子を、ＰＣＲによってロドコッカスＡＮ１２株から増幅した。異なる長さを有するｄｘｓの天然型プロモーター領域を含むように、２つの上流プライマー、Ｎｅｗｄｘｓ５’プライマー：５’−ＡＴＴ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＴＣＧ  ＣＣ−３’（配列表の配列番号２４）およびＮｅｗ２ｄｘｓ５’プライマー：５’−ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＴＣＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＴＡＣ  ＣＡ−３’（配列表の配列番号２５）を設計した。下流プライマー、Ｎｅｗｄｘｓ３’プライマー：５’−ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＴＴ−３（配列表の配列番号２６）は、ｄｘｓ遺伝子の下線を付した終止コドンを含んだ。Ｎｅｗｄｘｓ５’＋Ｎｅｗｄｘｓ３’を使用するＡＮ１２全ＤＮＡのＰＣＲ増幅により、全長ＡＮ１２ｄｘｓコーディング領域、および約５００ｂｐの即時上流領域（ｎｔ．番号５００〜番号３０１９）を含んだ２５１９ｂｐのサイズの１つの産物を生じた。Ｎｅｗ２ｄｘｓ５’＋Ｎｅｗｄｘｓ３’プライマー対を使用する場合、ＰＣＲ産物のサイズは２９８５ｂｐであり、完全なＡＮ１２ｄｘｓ遺伝子および約１ｋｂ上流領域（ｎｔ．番号３４〜番号３０１９）を含む。製造者（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））の指示に従い、最初に、両ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯクローニングベクターにクローニングした。得られるクローンをスクリーニングし、配列決定した。確認されたプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、各プラスミド由来のｄｘｓ遺伝子および上流領域を含有する２．５ｋｂおよび３．０ｋｂのフラグメントをクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素で処置し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−ロドコッカスシャトルプラスミドｐＲｈＢＲ１７１（ＣＬ１７０９）の独特なＳｓｐＩ部位にクローニングした。得られる構築物ｐＤＣＱ２２（クローン番号４および番号７）ならびにｐＤＣＱ２３（クローン番号１０および番号１１）を、テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ選択でロドコッカス・エリスロポリスＡＴＣＣ４７０７２へエレクトロポレートした。ロドコッカス形質転換体の色素は、ベクターコントロールに比べて暗い色を呈した。各ロドコッカス株のカロテノイド産生を定量するために、１ｍｌの新鮮培養細胞を、０．０５％ツウィーン８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）および１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを有する２００ｍｌの新鮮ＬＢ培地に添加し、３０℃で３日間、定常期まで増殖させた。４０００ｇで１５分間、遠心分離により細胞をペレット化し、各細胞ペレットについて湿重量を測定した。細胞ペレットから、１０ｍｌのアセトンに１晩で振盪しながらカロテノイド類を抽出し、ＡＴＣＣ４７０７２の主要なカロテノイドの吸収極大（４６５ｎｍ）において分光光度��で定量した。産生されたカロテノイド類の量を示す吸収を、細胞ペースト重量または細胞密度（ＯＤ６００）に基づいて、各株において正規化した。いずれかの方法で算出されたカロテノイド類の産生は、より短いプロモーター領域を有するｄｘｓ遺伝子を含有するｐＤＣＱ２２を有するＡＴＣＣ４７０７２では約１．６倍の増加を示した。より長いプロモーター領域でｄｘｓを発現させた場合、カロテノイドの産生はより多く増加（２．２倍）した。１ｋｂ上流のＤＮＡは、発現の増強のためのプロモーターおよびいくつかのエレメントを含有すると思われる。ＨＰＬＣ分析によっても、ｄｘｓ発現株において野生型株と同じカロテノイドが産生されたことを確認した。
【０１７４】
【表３】
2005505249.tif 000004
【０１７５】
実施例６
カロテノイド生合成について表１に列挙したいくつかの遺伝子の機能を確認するために、相同組換えによってｃｒｔＥおよびｃｒｔＩの遺伝子中断を行った。例としてｃｒｔＩを使用して、標的化された遺伝子中断のスキームを図３に示す。ＡＮ１２のｃｒｔＥおよびｃｒｔＩ配列に基づいて設計されたＰＣＲプライマーを使用して、ＡＴＣＣ４７０７２由来のｃｒｔＥおよびｃｒｔＩの内部フラグメントを増幅した。プライマーＡＮ１２＿Ｅ＿Ｆ（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧＡＡＧＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＧ−３’）（配列表の配列番号２７）およびＡＮ１２＿Ｅ＿Ｒ（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＡＧＡＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＧＴＴ−３’）（配列表の配列番号２８）は、Ｎ末端で１７９ｂｐの切断およびＣ末端で１６０ｂｐの切断を伴う８０１ｂｐのｃｒｔＥを増幅した。プライマーＡＮ１２＿Ｉ＿Ｆ（５’−ＴＴＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＣＧＴＣＧＡＡＧＡＣＧＣＴＣＴＴＧ−３’）（配列表の配列番号２９）およびＡＮ１２＿Ｉ＿Ｒ（５’−ＴＴＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＧＧＡＴ−３’）（配列表の配列番号３０）は、Ｎ末端で２２１ｂｐの切断およびＣ末端で４６２ｂｐの切断を伴う９１０ｂｐのｃｒｔＩを増幅した。ＡＴＣＣ４７０７２より増幅されたｃｒｔＥおよびｃｒｔＩフラグメントを配列決定によって確認したところ、ＡＮ１２のｃｒｔＥおよびｃｒｔＩに対しＤＮＡレベルで約９５％同一であることが明らかにされた。ｃｒｔＥフラグメントおよびｃｒｔＩフラグメントは、最初に、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））にクローニングした。次いで、ＴＯＰＯクローンをＮｃｏＩ（プライマー配列において下線を付した制限部位）で消化し、続いて、ｃｒｔＥまたはｃｒｔＩフラグメントをｐＢＲ３２８のＮｃｏＩ部位にクローニングした。得られた構築物を配列決定によって確認し、ｃｒｔＥクローンについてはｐＤＣＱ１００およびｃｒｔＩクローンについてはｐＤＣＱ１０１と命名した。ｐＤＣＱ１００およびｐＤＣＱ１０１の約１μｇＤＮＡをエレクトロポレーションによりロドコッカスＡＴＣＣ４７０７２に導入し、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリンを有するＮＢＹＥプレート上にプレート化した。ｐＢＲ３２８ベクターは、ロドコッカスでは複製しない。３０℃で３〜４日間のインキュベーション後に得られたテトラサイクリン耐性形質転換体は、染色体組込みによって作製した。ＡＴＣＣ４７０７２の染色体に対する標的化されたｃｒｔＥまたはｃｒｔＩ遺伝子への組込みを、ＰＣＲによって確認した。ベクター特異的プライマーＰＢＲ３（５’−ＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＴＧ−３’）（配列表の配列番号３１）およびＰＢＲ５（５’−ＧＣＣＡＡＴＡＴＧＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’）（配列表の配列番号３２）は、テトラサイクリン耐性形質転換体から調製した染色体ＤＮＡをテンプレートとして使用し、遺伝子特異的プライマー（ｐＤＣＱ１００またはｐＤＣＱ１０１の挿入物の外側）Ｅ＿ＯＰ５（５’−ＡＴＣＣＧＡＣＣＴＣＡＣＴＣＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧ−３’）（配列表の配列番号３３）およびＥ＿ＯＰ��（５’−ＧＧＴＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＴ−３’）（配列表の配列番号３４）またはＩ＿ＯＰ５（５’−ＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＧＣＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＡＣ−３’）（配列表の配列番号３５）およびＩ＿ＯＰ３（５’−ＡＴＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＧＴＣＧＧＴＴＡＣＧ−３’）（配列表の配列番号３６）と対を形成するベクター特異的プライマーをＰＣＲのために使用した。予想されるサイズのＰＣＲフラグメントをテトラサイクリン耐性形質転換体から増幅したが、野生型ＡＴＣＣ４７０７２からはＰＣＲ産物は得られなかった。２つの遺伝子特異的プライマーを使用した場合、大きなベクターＤＮＡを挿入したため、テトラサイクリン耐性形質転換体ではＰＣＲフラグメントは得られなかった。ベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーにより得られたＰＣＲフラグメントを配列決定した。ベクターとｃｒｔＥまたはｃｒｔＩとの接合部の配列解析により、予想された部位で１回の交叉組換えが生じ、標的遺伝子ｃｒｔＥまたはｃｒｔＩを中断したことが確認された。
【０１７６】
次に、ＡＴＣＣ４７０７２のＣｒｔＥおよびＣｒｔＩ中断変異の表現型について分析した。ＣｒｔＥまたはＣｒｔＩ中断変異体のコロニーは青白い色を呈していた。野生型株に存在する色素は、両変異体において消失したと思われた。変異体のカロテノイド類のＨＰＬＣ分析により、目視による検査結果を確認した。ＨＰＬＣ分析は、実施例４に記載の通りに実施した。ＣｒｔＩ中断変異体は、４５０ｎｍでモニターした場合に野生型株において存在する２つのＨＰＬＣのピークを有していなかった。それは、２８６ｎｍでモニターした場合に１５．８分の溶出時間でＨＰＬＣのピークを示した。このピークの吸収極大は２７６ｎｍ、２８６ｎｍ、２９７ｎｍであり、フィトエンの吸収極大と同一である。このピークは野生型の株には存在しなかった。これらの結果により、カロテノイド類生合成におけるＣｒｔＩタンパク質の役割が確認された。ＣｒｔＩ遺伝子のノックアウトにより、４５０ｎｍにおける２つのＨＰＬＣのピークによって表されるカロテノイド色素が認められなかった。ＣｒｔＩ変異体におけるフィトエン（無色）の蓄積により、ＢＬＡＳＴ検索によって示唆されるフィトエンデヒドロゲナーゼとしてのＣｒｔＩの機能が確認される。ＣｒｔＥ変異体は、野生型に存在する２つのＨＰＬＣのピークもＣｒｔＩ変異体におけるフィトエンのピークも有していなかった。これらの結果によっても、カロテノイド類生合成におけるＣｒｔＥの役割が確認された。ＣｒｔＥ変異体においてフィトエンの蓄積が認められなかったことは、該経路におけるフィトエン合成工程の前に作用するゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼとしてのＣｒｔＥの機能と一致する。
【０１７７】
【表４】
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【０１７８】
実施例７
ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株において同定されるリコペンシクラーゼは、植物およびシアノバクテリウムにおけるＣｒｔＬ型のリコペンシクラーゼに対して高い配列類似性を示したため、ロドコッカスのリコペンシクラーゼもまたＣｒｔＬ型のリコペンシクラーゼに機能的に関連するかどうかを調べることにした。トリアルキルアミン化合物、２−（４−メチルフェノキシ）−トリエチルアミン塩酸塩（ＭＰＴＡ）および２−（４−クロロフェニルチオ）−トリエチルアミン塩酸塩（ＣＰＴＡ）は、ＣｒｔＬ型のリコペンシクラーゼを特異的に阻害し、非光合成細菌のＣｒｔＹ型のリコペンシクラーゼは阻害しないことが明らかにされている（クニングハムＪｒ．（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｊｒ．）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｃｏｐｅｎｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ  ＰＣＣ７９４２，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９４、第６巻：１１０７）。ロドコッカス・エリスロポリスのカロテノイド産生に対するＭＰＴＡまたはＣＰＴＡの効果について調べた。４０μＭのＣＰＴＡまたはＭＰＴＡ阻害剤を伴うかまたは伴わない０．０５％ツウィーン８０（Ｔｗｅｅｎ−８０）を有する２００ｍｌのＬＢ培地に１晩培養したＡＴＣＣ４７０７２細胞の１ｍｌを添加し、３０℃で浸透しながら２４時間培養した。細胞を４０００ｇで１５分間遠心分離し、細胞ペレットを１０ｍｌのアセトンに再懸濁した。一定に振盪しながら、室温で１時間、カロテノイド類をアセトン中に抽出し、続いて、細胞破砕物を４０００ｇで１５分間遠心分離した。抽出を１回繰り返し、両抽出物の上清を合わせて、窒素下で乾燥した。乾燥材料を１ｍｌのメタノールに再溶解し、マイクロ遠心管中、１６，０００ｇで２分間の遠心分離より、不溶性材料を取り出した。実施例４に記載のように、０．１ｍｌのサンプルをＨＰＬＣのために使用した。結果を表４にまとめて示す。
【０１７９】
阻害剤が何ら存在しない場合、ロドコッカスＡＴＣＣ４７０７２は、実施例４に記載のように同じカロテノイド類を産生した。４０μＭのＣＰＴＡまたはＭＰＴＡが存在する場合、４４３、４６９、５００ｎｍの吸収スペクトルとして主要なピークが１５．３分で出現した。シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））製の認証されたリコペン標準物は、同じ条件下で類似の特性を示した（４４３、４６９、５００ｎｍのピークスペクトルで１５．３分に溶出した）。これらのことから、リコペンは、ロドコッカスのシクラーゼの基質であり、ロドコッカスリコペンシクラーゼは、光合成細菌および植物におけるＣｒｔＬ型のシクラーゼに特異的な阻害剤によって阻害され得ることが確認された。４０μＭのＣＰＴＡが存在する場合、阻害は９５％と予想され、少量（全カロテノイドの５％）の野生型の主要なカロテノイドがなお観察された。４０μＭのＭＰＴＡが存在する場合、阻害は８２％と予想され、全カロテノイドのうち１８％は野生型の主要なカロテノイドであった。
【０１８０】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１】イソプレノイド経路およびＡＮ１２において同定されたイソプレノイド遺伝子の推定機能を示す。
【図２】ロドコッカス・エリスロポリスＡＮ１２株およびＡＴＣＣ４７０７２由来のカロテノイド色素のＨＰＬＣ分析を示す。
【図３】例としてｃｒｔＩ遺伝子使用した相同組換えによる標的化された遺伝子中断を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505249.tif 000097
2005505249.tif 000098
【国際調査報告】
2005505249.tif 000099
2005505249.tif 000100
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