(57)【要約】本発明は、微生物由来の溶解細胞物質の粗清澄化および特に核酸を得る方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞溶解の結果として得られる溶解物を、通常の圧力と比較して低下または上昇した圧力に供することを特徴とする、微生物由来の細胞溶解物を粗清澄化する方法。
【請求項２】
微生物がグラム陽性またはグラム陰性細菌であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合物を取り巻く雰囲気の圧力が通常の圧力より２００から１０００ｍｂａｒ低い水準に調節されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
反応混合物を取り巻く雰囲気の圧力が通常の圧力より３００から８００ｍｂａｒ低い水準に調節されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
反応混合物を取り巻く雰囲気の圧力が通常の圧力より２００から５０００ｍｂａｒ高い水準に調節されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物を取り巻く雰囲気の圧力が通常の圧力より５００から２５００ｍｂａｒ高い水準に調節されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法によって得られたことを特徴とする、プラスミドＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の方法によって得られたことを特徴とする、ＲＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に細菌たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような微生物由来の溶解細胞物質の粗清澄化の方法に関する。
【０００２】
分子生物学的方法は、たとえば特に医薬品の製造といった範囲の分野でますます重要になっている。いわゆるプラスミドＤＮＡの回収では、可能な限りの最高純度のプラスミドＤＮＡを得ることに特に問題が起こる。たとえば調製スケールでプラスミドＤＮＡを製造するためには、いわゆる宿主細胞を用いてプラスミドを複製する必要がある。これらは通常、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異体のような、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌である。
【０００３】
この状況では、複製のために使用される微生物起源の、不要なゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、およびエンドトキシンを除去することに特に問題がある。上記の核酸は生物分子の同じ分類に属するため、それらはまたプラスミドＤＮＡの性質と同じ、ある物理化学的性質を有し、したがってプラスミドＤＮＡの分離または精製における主要な問題となる。
【０００４】
不要なまたは夾雑の核酸およびエンドトキシンの分離は分析スケールで克服できる問題である一方、調製スケールでは、同等の成功は現在まではそれより相当に高い費用でのみ達成されている。この種の精製の問題を解決する場合、大多数の例で技術者は、不純物の混入を裂けるため、可能な限り早い処理段階で不要な不純物を分離しようと苦心している。
【０００５】
微生物由来の細胞の溶解は、これらの微生物からのプラスミドＤＮＡの精製の単離の最初の段階である。溶解が実施された後は、通常は水酸化ナトリウムの存在下のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のような溶解緩衝液を用いて行われるが、細胞の各構成成分に加えて、ゲノムＤＮＡが膜結合タンパク質を介して結合している細胞壁の破片もまた反応溶液中に存在する。しかし、この結合は非常に弱く、それはこれらの結合を解除するには機械的な力で十分であることを意味する。このように水性上清中に放出されたゲノムＤＮＡは、その後、以降の精製段階でプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡからはもう容易に分離することができない。
【０００６】
細胞溶解物の製造においては、たとえば酢酸カリウム溶液を用いて、上記の塩基性溶解の結果として得られる溶液の中性化または酸性化の後の熟成過程中に綿状沈澱が形成される。これらの沈澱はドデシル硫酸カリウム（ＰＤＳ、ＳＤＳのカリウム塩）であり、細胞壁、細胞膜、およびその他の細胞構成成分を伴う、細胞壁結合タンパク質への添加およびその変性によって沈澱する。したがって、細胞壁に結合したゲノムＤＮＡもまたこれらの複合体に結合する。たとえば分析用のようなより小さい調製の場合には、ＰＤＳ−タンパク質−細胞壁複合体の分離は遠心分離によって達成することができ、それはまた同時にゲノムＤＮＡを実質的に除去する。
【０００７】
いわゆる「高処理量」用途またはより大きなスケールでの調製に関しては、遠心分離または濾過による上清からの綿状沈澱の分離は、上記の障害が原因で薦められないかまたは大きな問題を抱える。したがって、たとえばバッチでの遠心分離は非常に限られた程度でのより大規模な生産にしか用いることができず、一方、連続遠心分離はＰＤＳ沈澱から水系上清中に放出されたゲノムＤＮＡの含量を増大させる。
【０００８】
濾過の間、薄片を含む細菌溶解物をフィルターに負荷する際、詰まりおよびせん断の問題が生じる。この方法では、濾液中のゲノムＤＮＡの内容はまた、プラスミド相を深刻に汚染する。他の不利な点としては、フィルターの目詰まりが頻繁に生じる。
【０００９】
本発明の目的は、したがって第一に、調製スケールで用いることのできる、プラスミドＤＮＡまたはＲＮＡを結果としてゲノムＤＮＡおよびエンドトキシンを実質的に含まない形で得ることのできる、プラスミドＤＮＡまたはＲＮＡを回収する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、先行技術で知られている不利益を避ける、可能な限り容易で実際的な方法を提供することである。
【００１１】
上記にまとめた目的は、生物材料（微生物）の細胞溶解を本質的に先行技術から知られている方法で実施することによって達成される。結果として得られる反応混合物は圧力変化、すなわち通常の圧力と比較して圧力の上昇または低下、好ましくは圧力低下に供される。
【００１２】
この段階の驚くべき利点は、本発明に記載の反応混合物を取り巻く雰囲気の圧力の変化によって、薄片が浮かぶかまたは沈み、その結果、空間的に高度に圧縮した綿状相を最終的に生じる。綿状相は液層上に安定し、液層から容易に完全に分離することができる。本発明に記載の提示された方法では、反応混合物を取り巻く雰囲気の圧力は好ましくは通常の圧力（通常条件下での大気圧）より２００から１０００ｍｂａｒ低い値に調節される。非常に好ましくは、圧力は３００から８００ｍｂａｒの範囲の水準に低下させられる。
【００１３】
大気圧より高い圧力、好ましくは２００から５０００ｍｂａｒまで、非常に好ましくは２００から２５００ｍｂａｒまでが選択される場合、同様の効果が達成される。この方法もまた綿状相の形成に繋がるが、この場合は綿状相は液体の上に浮かぶ代わりに沈む。
【００１４】
このように、要約すると、本発明に記載の操作方法は下記の効果を有する：
１．５０Ｌ以上の大容量についてさえ、相分離には数分および３０から１８０分しか要しない。
２．相分離の結果、空間的に高度に圧縮した綿状相を生じ、その結果として同時に産物を含む水相の容量比が増大する。
【００１５】
これらの驚くべき効果は下記の特長を有する：
１．ＰＤＳ薄片は以後の濾過または遠心分離段階中にせん断力に曝されない。
２．より多量が用いられる場合、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いたプラスミドＤＮＡの製造において、濾過ユニットが目詰まりしたり、後で目詰まりしたりすることがなく、より高い流速を選択することができるため、細胞溶解物の清澄化の処理時間は有意に減少する。収量は本発明に記載の方法を用いて約１０から３０%増加させることができる（綿状沈澱を含む相が、通常圧力条件下で調製することのできる対応する相と比較して有意に、より圧縮されているため）。
３．本発明に記載の方法を用いることによる、自動化高処理量用途、またはいわゆるベンチスケールでの用途において、本発明に従って実施することができる綿状相の水相からの予備的分離によって、時間のかかる遠心分離段階を省くことができるかまたは、濾過の速度を上げることができ、また、たとえばフィルターメンブレンの詰まりのリスクを有意に低下させることができる。この技術はまた、完全自動化高処理量用途への組み込みに適している。
４．本発明に従って達成することができる綿状沈澱の圧縮は、極めて低いせん断力を伴って実施され、したがって、前述の通り、ゲノムＤＮＡおよびエンドトキシンの細胞壁断片からの分離のリスクを最小化する。
【００１６】
本発明に記載の方法を用いてゲノムＤＮＡおよびエンドトキシンの混入が無視できるほど少量であるプラスミドＤＮＡまたはＲＮＡを得ることが可能であるため、特にこの最後の効果はとりわけ有益であることが明らかになっている。同様の有利な効果はこれまでは、先行技術からは、たとえば分離が沈降によって実施される方法についてしか知られていない；しかし、この方法での沈降による分離は非常に時間が掛かる手順を与え、相分離が不完全な場合には、不満足な結果に繋がり、また工業生産のために無限にスケールアップすることができないことは熟練者には明らかである。より大きな量を処理するためにはこの方法はしたがって、いずれにしろ本格的な代替法としては疑いなく除外される。
【００１７】
本発明に記載の方法のもう１つの長所は、以後の濾過段階中に、清澄化されていない細菌溶解物が用いられる場合よりもフィルターが目詰まりするのにかなり長くかかることである。
【００１８】
本発明に記載の微生物の細胞からのプラスミドＤＮＡおよびＲＮＡの回収を実施するために、開始材料は先行技術から知られているアルカリ溶解に供される。
【００１９】
溶解段階の結果得られた混合物の必要な中性化の後、通常圧（大気圧）より２００から１０００ｍｂａｒ低い圧力での減圧が適用される。３００から８００ｍｂａｒまでの範囲の値で圧力を低下させるのが特に好ましい。
【００２０】
別の実施例では、通常圧より好ましくは２００から５０００ｍｂａｒまでの範囲で高い、また非常に好ましくは２００から２５００ｍｂａｒまでの範囲で高い、通常圧より高い雰囲気圧力が選択される。
以下の実施例は本発明を説明することを意図する：
【実施例】
【００２１】
[実施例１]
６８ｇの冷凍ｐＵＣ１９バイオマスをガラス製ビーカー内で１リットルの標準的な市販の再懸濁緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ１緩衝液）中で溶解し、振とうして均一化する。次いで１リットルの標準的な市販の細胞溶解緩衝液を加え（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ２緩衝液）、バイオマスを細胞溶解に供する。細胞溶解過程はまた、たとえば振とうによって補助される。この段階のためのインキュベート時間は少なくとも５分間である。このように得られた溶解物を、清澄化用の適当な大きさの反応容器に移し（容量約５リットル）、１リットルの氷冷した標準的な市販の中性化緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ３緩衝液）と混合する。次いで約３分間にわたって約５００ｍｂａｒの軽い減圧を反応容器に適用する。固体成分が直ちに浮上するのが観察される。下相の清澄化した溶解物は固体成分を含まず（目視検査による）、そして分離してさらに処理することができる。
【００２２】
[実施例２]
１ｇの冷凍ｐＱ７３バイオマスを１５ｍｌの標準的な市販の再懸濁緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ１緩衝液）中で溶解し再懸濁する。次いで１５ｍｌの標準的な市販の細胞溶解緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ２緩衝液）を加え、バイオマスを細胞溶解に供し、氷上で約５分間インキュベートする。結果として得られる溶解物を１５ｍｌの氷冷した標準的な市販の中性化緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ３緩衝液）と混合して振とうする。反応容器をデシケーターに入れ、０．７ｂａｒの減圧に約７分間曝露する。ここでも、固体成分が直ちに浮上するのが観察される。
【００２３】
[実施例３]
プラスミドｐＱ８１で形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の２００リットルの発酵物から採取した１００ｇのバイオマスを、５００ｍｌの標準的な市販の再懸濁緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ１緩衝液）中で溶解し、磁気攪拌棒を用いて再懸濁し、１０００ｍｌの再懸濁緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ１緩衝液）と５リットルフラスコ中で混合する。次いで１．５リットルの細胞溶解緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ２緩衝液）を加え、数回倒立することによって懸濁液を混合する。それを次いで、細菌が溶解する間、１０分間室温にてインキュベートする。インキュベート後、氷冷した標準的な市販の中性化緩衝液（キアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ３緩衝液）を１．５リットル４〜８℃にて加え、再び倒立することによって混合し、するとすぐドデシル硫酸カリウム沈澱（ＰＤＳ沈澱）が沈澱する。
【００２４】
このように生成した細胞溶解物（１０ｘ４．５リットル）を注意深く５０リットルの清澄化フラスコに傾斜法で入れる。次いでフラスコの内圧を雰囲気圧６００ｍｂａｒ（通常圧より４００ｍｂａｒ下に相当）へ下げる。減圧はすべての薄片が表面へ浮かぶまで維持する。この処理は約５〜１０分間を要する。次いで減圧を解除し、清澄な細胞溶解物を清澄化フラスコから底部から、上部で凝集しているＰＤＳ相が下の取り出し栓に達するまで出す。このように得られた液相は、目視検査によると視認可能な薄片を含まない。
【００２５】
[実施例４]
１リットルのＬＢミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）培地に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＤＨ５αＲＣＢを接種し、約１２時間、温度３７℃にて振とう機内でインキュベートする。次いで細菌を遠心分離する。このように得られた沈澱を、７５ｍｌの標準的な市販のＲＮａｓｅを含まない再懸濁緩衝液（たとえばキアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）のＰ１緩衝液）に再懸濁し、７５ｍｌの標準的な市販の細胞溶解緩衝液（たとえばキアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）のＰ２緩衝液）を加え、注意深く振とうして混合する。細菌の溶解後、調製物を７５ｍｌの標準的な市販の中性化緩衝液（たとえばキアゲン（Ｍｅｓｓｒｓ．ＱＩＡＧＥＮ，Ｄ−４０７２４Ｈｉｌｄｅｎ）製Ｐ３緩衝液）を用いて中性化する。反応混合物は正常圧より７００ｍｂａｒ低い圧に２分間曝露する。細胞残渣は直ちに分離され、液体の表面上に密な栓を形成する。
【００２６】
たとえばＲＮＡをマトリクスに結合し、結合したＲＮＡを適当な洗浄緩衝液で洗浄し、次いで溶出しその後溶出液からイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈澱させることを含むカラムクロマトグラフィーによる、その後の精製によって、総収量７２０μｇの良質のＲＮＡとしてＲＮＡが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は本発明に記載の処理の前（図１Ａ）および減圧後（図１Ｂ）の５０ｍＬスケールの反応混合物を示す。
【図２】図２は、図１と同様の、減圧前（図２Ａ）および本発明に記載の処理を実施した後（図２Ｂ）の、５０ｍＬスケールの実施例３に記載の溶解混合物を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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