(57)【要約】本発明は、コプリヌス（Coprinus）属の微生物に由来する微生物ペルオキシダーゼによるトルエン誘導体の選択的酸化方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コプリヌス（Coprinus）属の微生物から単離することができる微生物ペルオキシダーゼの存在下で式（II）のトルエンを過酸化水素で酸化することによる式（I）のアルデヒドの製造方法：
【化１】
2005504553.tif 000006
［式中、
Rは、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、F、Cl、Br、I、NO2、OHであり；
Nは、0、1、2である］。
【請求項２】
コプリヌスDSM 14525由来の微生物ペルオキシダーゼを使用する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
RがCH3である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
H2O2によりトルエンをベンズアルデヒドへと選択的に酸化させて、酸化トルエンのmol当たり0.4mol未満の安息香酸を生成することができる、コプリヌス由来の微生物ペルオキシダーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コプリヌス（Coprinus）属（ヒトヨタケ属）の微生物に由来する微生物ペルオキシダーゼによるトルエン誘導体の選択的酸化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
置換ベンズアルデヒドは、化学合成における有用な中間体である。これらのベンズアルデヒドの、対応する置換トルエンの酸化による化学的製造は、達成が困難である場合が多い。これは、そのメチル側鎖が酸化反応によってカルボキシル基にまで酸化されてしまうことが多く、アルデヒド基の段階でとどまらないためである。
【０００３】
さらに、微生物による酸化方法では、置換トルエンはほんの少ししか転換されないか、さもなくば酸化が安息香酸にまで進んでしまうため、そうした方法は工業的に使用できない場合が多い。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の目的は、基質を確実に高率で変換させ、かつ、置換安息香酸の量を最低限に抑える、微生物ペルオキシダーゼによる置換トルエンの選択的酸化方法を提供することである。
【０００５】
本発明者らは、この目的が、コプリヌス属の微生物から単離することができる微生物ペルオキシダーゼの存在下で式（II）のトルエンを過酸化水素で酸化することによって式（I）のアルデヒドを製造する方法により達成されることを見い出した。
【化１】
2005504553.tif 000002
【０００６】
［式中、
Rは、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、F、Cl、Br、I、NO2、OHであり；
Nは、0、1、2である。］
使用されるペルオキシダーゼは、様々な純度で用いることができる。ラッカーゼ活性が失われている部分精製ペルオキシダーゼ溶液が好ましい。
【０００７】
コプリヌス属DSM 14525（DSMに2001年9月25日付けで寄託済み）に由来するペルオキシダーゼは特に好ましく用いられる。
【０００８】
このペルオキシダーゼは、多数の溶媒中で使用可能である。少なくとも30％、好ましくは少なくとも50％の水を含む緩衝化溶液が好ましい。
【０００９】
酸化を引き起こす過酸化水素は、化学量論的量または化学量論的量よりも多い量で添加できる。過酸化水素を反応媒体に連続的に添加することが好ましい。
【００１０】
反応温度は、0〜50℃の広い範囲内で自由に選択できる。酵素的変換は、低温では大きく減速し、一方、高温では酵素が不活性化されてしまう可能性がある。したがって、最適な反応温度は10〜30℃であり、当業者であれば一連の実験により容易に設定することができる。
【００１１】
本発明の方法におけるメチル側鎖の酸化は、芳香族核上の他の置換基およびメチル鎖に対するそれらの位置に依存する。好ましい他の置換基Rは、メチル、イソプロピル、t-ブチル、ハロゲン、メトキシおよびニトロ基である。
【００１２】
メチル鎖に対する基Rの位置は、その基Rの性質よりもずっと重要であることは明らかである。本発明の方法においては、メチル鎖に対してオルトおよびパラにある置換基Rは、メタ位にあるものよりも好ましい。ニトロトルエンは、この例外である。o-ニトロベンズアルデヒドは、比較的低収率で得られたが、m-ニトロベンズアルデヒドの収率はp-ニトロベンズアルデヒドと同等であった。o-ニトロトルエンはまた、対応するアルコール誘導体も見られる唯一の基質である。他のいずれの基質の場合も、メチル鎖のアルコールへの酸化は見られなかった。
【００１３】
本発明はさらに、H2O2によりトルエンをベンズアルデヒドへと選択的に酸化させて、酸化トルエンのmol当たり0.4mol未満の安息香酸しか生成されないようにすることができる、コプリヌス由来の微生物ペルオキシダーゼに関する。
【００１４】
実施例1：
ペルオキシダーゼの調製
コプリヌスsp.DSM 14525を、20リットルの培地中（大豆粉）で発酵させた。菌糸体と大豆粉を遠心分離により除去した。得られた上清を限外濾過（流孔径0.16μm）により清澄化した。次に、濾液を、カットオフ10kDaの膜を用いた限外濾過により濃縮した。この濾液から、FPLCによりペルオキシダーゼを部分精製した。Q-セファロースでpH5およびpH7.3の2段階のクロマトグラフィーを行ったところ、活性が12倍に増大した（比活性はABTS（2,2’-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)を用いた場合7.6U/mgタンパク質であった）。この酵素調製物には、ラッカーゼ活性はなかった。
【００１５】
このペルオキシダーゼ調製物を、次の変換に使用した。
【００１６】
実施例2
ペルオキシダーゼによる酸化の概略的方法
アセトン（100mM）に溶解させた10μlの適当な出発化合物（置換トルエン）を、350μlの酒石酸緩衝液（200mM pH5）中に希釈した。4.5μlの過酸化水素（50mM）、45μlの水、および25μlのペルオキシダーゼ溶液（実施例1で調製し、30U/mlの活性を有するもの（すなわち、このペルオキシダーゼ溶液1mlは1分当たり30μmolのABTSを酸化する））を添加した。
【００１７】
反応混合物を室温でインキュベートした。4.5μlの過酸化水素（50mM）を10分置きに注射器で膜を通して添加した（全部で9回）。生体内変換の半減期において、さらに25μlのペルオキシダーゼ溶液を添加した。化合物の濃度を、HPLCにより、信頼できる標準物質との比較により確認した。得られた化合物の構造はGC-MSにより確認した。
【００１８】
表1に示す酸化は、実施例2に従って行った。
【表１】
2005504553.tif 000003
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2005504553.tif 000005
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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