(57)【要約】貪食細胞およびリンパ細胞集団に対する作用、ならびに特定の細胞におけるＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）抗体の活性を調節することによって改善する哺乳動物の疾患を予防および治療するための組成物および方法が提供される。さらに、所望の抗原に対する免疫グロブリンの改良された作製方法が記載されている。本発明は、貪食作用の制御および抗原に対するリンパ細胞集団の応答のメカニズムの発見に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
貪食作用および/または単球集団の増加によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を、治療的または予防的に処置するための組成物であって、治療的有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）、ＴＩＲＣ７のアクチベーター、または前記ＴＩＲＣ７もしくは前記アクチベーターをコードする核酸分子、および任意に、薬学的または化粧的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２】
貪食作用および/または単球集団の減少によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を、治療的または予防的に処置するための組成物であって、治療的有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニスト、または前記アンタゴニストをコードする核酸分子、および任意に、薬学的または化粧的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３】
ＴＩＲＣ７は、組換えＴＩＲＣ７、その機能的誘導体、または機能的に等価な物質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、刺激抗ＴＩＲＣ７抗体、ＴＩＲＣ７リガンド、またはＴＩＲＣ７を（過剰）発現する細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記アンタゴニストは、ＴＩＲＣ７とそのリガンドの相互作用をブロックする、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記アンタゴニストは、抗体、（ポリ）ペプチド、核酸分子、ＴＩＲＣ７遺伝子標的ベクター、小有機化合物、ＴＩＲＣ７リガンド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アプタマー、またはペプチドミメティクスである、またはそれを含む、請求項２または５に記載の組成物。
【請求項７】
前記アンタゴニストは、単球において発現するようにデザインされている、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記アンタゴニストは、
（ｉ）抗ＴＩＲＣ７抗体もしくは抗ＴＩＲＣ７リガンド抗体；または、
（ｉｉ）未刺激形態のＴＩＲＣ７もしくはそのリガンドを含む、
請求項２または５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記疾患は、皮膚疾患、免疫系疾患、炎症性疾患、呼吸器疾患、感染症、免疫系疾患、糖尿病、身体的創傷、歯周病および中枢神経系疾患からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記哺乳動物はヒトである、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
貪食作用および/または単球集団を増加させる方法であって、哺乳動物細胞を、有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）、ＴＩＲＣ７のアクチベーター、または前記ＴＩＲＣ７もしくは前記アクチベーターをコードする核酸分子に接触させることを含む方法。
【請求項１２】
（ａ）細胞、組織または臓器を被験体から取得すること；
（ｂ）前記細胞、組織または臓器に、ＴＩＲＣ７またはそのリガンドをコードし、かつin vivoで発現することが可能である核酸分子を導入すること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた前記細胞、組織または臓器を、同じ被験体または異なる被験体に再び導入すること、
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
貪食作用および/または単球集団を減少させる方法であって、哺乳動物細胞を、有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニストまたは前記アンタゴニストをコードする核酸分子に接触させることを含む方法。
【請求項１４】
貪食作用および/または単球集団の増加によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を、治療的または予防的に処置するための方法であって、前記哺乳動物に、治療的有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）、ＴＩＲＣ７のアクチベーター、または前記ＴＩＲＣ７もしくは前記アクチベーターをコードする核酸分子を投与することを含む方法。
【請求項１５】
貪食作用および/または単球集団の減少によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を、治療的または予防的に処置するための方法であって、前記哺乳動物に、治療的有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニストまたは前記アンタゴニストをコードする核酸分子を投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記アンタゴニストまたはアクチベーターは、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の作用物質である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物に、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物を投与するための製造物であって、組成物が作用可能に固着した固体送達媒体を含む製造物。
【請求項１８】
単球を標的とする、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）もしくはそのフラグメント、そのコード核酸配列もしくは制御核酸配列、または抗ＴＩＲＣ７抗体の、貪食作用および/または単球集団の増加または減少に関連する疾患の診断または治療的介入のための標的、または、そのような疾患の治療のための作用物質を同定または単離するためのスクリーニング方法の標的としての使用。
【請求項１９】
被験体において、貪食作用および/または単球集団の増加または減少に関連する疾患を診断するための方法であって、
ａ）被験体からのサンプルを、ＴＩＲＣ７転写活性についてアッセイすること；および
ｂ）健康な被験体と比較して、ＴＩＲＣ７転写活性の誘発または抑制によって特徴付けられる疾患の存在を測定すること、
を含む方法。
【請求項２０】
被験体において、貪食作用および/または単球集団の増加または減少に関連する疾患を診断する方法であって、
ａ）被験体からのサンプルを、ＴＩＲＣ７蛋白質の存在についてアッセイすること；および
ｂ）ＴＩＲＣ７蛋白質の異常な存在または欠如が疾患の存在を示す場合に、ＴＩＲＣ７蛋白質の存在によって疾患の存在を測定すること、
を含む方法。
【請求項２１】
前記細胞は単球である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２２】
貪食作用および/または単球集団の増加または減少を調節すること、または被験体において抗原に対するリンパ球応答を増加させることが可能な治療薬を同定または単離する方法であって、ＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／インヒビター、またはアゴニスト／アクチベーターをスクリーニングする方法を含む方法。
【請求項２３】
所望の抗原に特異的な免疫グロブリンまたはそのアナログを作製するための方法であって、
（ａ）免疫応答を刺激する条件下で、前記抗原またはその免疫原性部分を非ヒト動物に投与することによって、前記動物が前記抗原に特異的な免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生することを含み、前記非ヒト動物は、内因性Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ（ＴＩＲＣ７）またはＴＩＲＣ７活性をリンパ球中に産生することが実質的に可能でないことを特徴とし、および、
（ｂ）前記免疫グロブリンまたはアナログを回収すること
を含む方法。
【請求項２４】
所望の抗原に特異的な免疫グロブリンまたはそのアナログを作製するための方法であって、
（ａ）免疫応答を刺激する条件下で、前記抗原またはその免疫原性部分を非ヒト動物に投与することによって、前記動物が前記抗原に特異的な免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生することを含み、請求項２または５〜８のいずれか１項に記載の作用物質を投与することによって前記非ヒト動物の内因性Ｔ細胞免疫応答が阻害される方法。
【請求項２５】
前記抗原またはその免疫原性部分を、請求項２または５〜８のいずれか１項に記載の作用物質と併用して投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記動物からの前記ポリクローナル免疫グロブリンまたはアナログを回収することをさらに含む、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原によって免疫された前記動物からのＢ細胞を不死化すること、得られた不死化細胞を、前記抗原に特異的な前記免疫グロブリンの分泌についてスクリーニングすること、および、
（ｉ）前記不死化Ｂ細胞によって分泌された免疫グロブリンを回収すること；または、
（ｉｉ）少なくとも免疫グロブリンをコードする遺伝子を不死化Ｂ細胞から回収し、および任意に前記遺伝子を改変すること；
（ｉｉｉ）前記遺伝子またはその改変形態を発現させて、免疫グロブリンまたはアナログを産生させること；および
（ｉｖ）前記免疫グロブリンまたはアナログを回収すること、
をさらに含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
（ｉ）前記動物の一次Ｂ細胞からの免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収すること；
（ｉｉ）前記免疫グロブリンを発現する前記遺伝子のライブラリーを作製すること；
（ｉｉｉ）前記ライブラリーを、抗原に対する所望の親和性を持つ免疫グロブリンについてスクリーニングすること；
（ｉｖ）前記免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収すること；
（ｖ）前記遺伝子を発現させて、免疫グロブリンまたはアナログを産生させること；
（ｖｉ）前記免疫グロブリンまたはアナログを回収すること、
をさらに含む、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記所望の抗原は、遷移状態ミミックス；白血球マーカー；組織適合抗原；接着分子；インターロイキン；インターロイキンレセプター；ケモカイン、成長因子およびそれらのレセプター；インターフェロンレセプター;Ｉｇｓおよびそれらのレセプター；腫瘍抗原；アレルゲン；ウイルス蛋白質；トキシン；血液因子；酵素；ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、好酸球主要塩基性蛋白質またはカチオン性蛋白質、ｐＡＮＣＡ、アマドリ蛋白質、コラーゲンタイプＩＶ、糖化脂質、γ−インターフェロン、Ａ７、Ｐ−糖蛋白質、Ｆａｓ（ＡＦＯ−１）および酸化ＬＤＬ；ヒトＬＩ−６またはＩＬ−８、ヒトＴＮＦα、ヒトＣＤ４、ヒトＬ−セレクチン、ヒトｇｐ３９、ヒトＩｇＥ、ヒトαＶβ３、ヒトフィブリノシン（ＦｓＦ−１）、ヒトラミニン、ヒトＰＴＨｒＰ、および破傷風毒素Ｃ（ＴＴＣ）からなる群から選択される、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
免疫グロブリンを所望の抗原に分泌する、請求項２３〜２９のいずれか１項に規定されるの不死化Ｂ細胞。
【請求項３１】
リンパ球において、内因性のＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７(ＴＩＲＣ７)またはＴＩＲＣ７活性を産生させることが実質的に不可能であることを特徴とする、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３２】
免疫グロブリンまたはそのアナログを作製するための方法であって、
（ａ）請求項２６〜２８のいずれか１項に測定されるの前記免疫グロブリンまたはアナログをコードする遺伝子を含む細胞を、前記コード遺伝子が発現して前記免疫グロブリンまたはアナログ、または請求項３０に記載の不死化Ｂ細胞、または請求項３１に記載の非ヒト動物を産生する条件下で培養すること、および、
（ｂ）前記免疫グロブリンまたはアナログを回収すること、
を含む方法。
【請求項３３】
前記免疫グロブリンまたはアナログは、抗体またはそのアナログである、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ−フラグメント、二重特異性抗体、融合抗体、標識化抗体、またはこれらのいずれか１つのアナログを作製するステップをさらに含む、請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項２３〜３４のいずれか１項に記載の方法のステップ、および免疫グロブリン、そのアナログ、または抗体を、薬学的に許容される組成物中に製剤することを含む、薬学的組成物を作製する方法。
【請求項３６】
請求項２または５〜８のいずれか１項に規定される作用物質を含むワクチン。
【請求項３７】
請求項２または５〜８のいずれか１項に規定される作用物質の、アジュバントとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、貪食細胞およびリンパ細胞集団に対する影響、ならびにいくつかの細胞におけるＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）活性を調節することによって改善する哺乳動物の疾患の予防および治療に関する。本発明は、多くの組成物、方法および製造物に関し、皮膚および免疫系および中枢神経系の疾患など、相当範囲の疾患を取り扱う。さらに本発明は、所望の抗原に対する免疫グロブリンを作製するための改良された方法を提供する。本発明は、貪食作用の制御およびリンパ細胞集団の抗原に対する応答のメカニズムの発見に基づく。
【０００２】
背景技術
白血球細胞には３つの主なカテゴリー、顆粒球、単球およびリンパ球が存在する。顆粒球は全て、多数のリソソームおよび分泌小胞を含有しており、好中球、好酸球および好塩基球に細分される。単球は、侵入する微生物や異物ならびに損傷細胞および老化細胞を貪食および消化する組織マクロファージとなる。
【０００３】
貪食作用は、細胞の摂取プロセスであり、通常、粒状物質の単離または破壊である。脊椎動物において、それは各種の白血球および細網内皮細胞の特徴的な機能である。貪食作用は、微生物による感染に対する、および粘膜表面および組織の異物粒子や組織片による閉塞に対する重要な体の防御メカニズムである。貪食作用は、陥入部を介して細胞により流体を飲み込み、形質膜から離れて小胞を形成する飲作用とは異なる。本明細書において、用語「貪食作用」および「細胞摂取」は、交換可能に用いられる。種々の細胞における貪食作用のレベルは、重要な意味を持っている。これらの意味についての多くの例をここに述べる。
【０００４】
免疫関連および炎症性疾患。肺気腫の主な原因は、肺における異物（例えば、煙凝縮物）の蓄積である。この蓄積の後、貪食作用されようとする間に脱顆粒される好中球が補充される（Ravis、Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150 （1994）、5143-5146）。アレルギー性気管支肺アスペルギルス症などの免疫学的肺疾患は、気道粘膜の閉塞、好酸性肺炎および閉塞性細気管支炎を引き起こす。そのような疾患においては、好中球エラスターゼ切断された免疫グロブリンおよび消化されたＣ３ｂレセプターが、病原体の貪食作用を制限する（Greenberger、JAMA、Vol. 278、No. 22、1997）。貪食作用が損なわれている間、好中球エラスターゼの増加は、肺の持続性細菌感染と闘うのに有益である（Doring、Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150:6 Pt 2、（1994）、114-117）。
【０００５】
歯周病では、まず歯の土台にプラークがたまり、その後、歯ぐきのラインの下に日和見細菌が成長する。肺気腫における免疫応答と同様、感染部位に好中球が補充され、続いて貪食作用ができない間に脱顆粒が生じる（Travis、Am. J. Respir. Crit. Care Med. Vol. 150（1994）、5143- 5146）。歯周病患者からの多形核細胞（「ＰＭＮ」）によるオプソニン化を受けた黄色ブドウ球菌の接着率および摂取率は、健康な対照と比較して有意に減少している（MacFarlane、J. Periodontol 63（1992）、908-913）。
【０００６】
遺伝子的に免疫不全の個人、後天性免疫抑制を有する個人（例えば、ＨＩＶ感染した個人）、または一時的に後天性免疫抑制を有する個人（例えば、臓器移植、異物インプラント、弁置換、または癌治療などの後）は、二次感染に苦しむことが多い。
【０００７】
糖尿病患者からの肺の多形核白血球は、健康な個人と比較して、細菌の摂取および死滅のレベルの双方において貪食作用活性が減少することがわかった（例えば、Musclow、Cytobios 65（1991）medline 15-24）。特に、免疫応答における糖尿病的な異常には、化学遊走性の低下、貪食作用の低下、および接着性の低下が含まれる（Grant-Theule、Periodontal Abstracts 44（1996）、No. 3）。これらの患者は感染に苦しむことが多い。
【０００８】
心血管系疾患。アテローム硬化性プラークの形成は、加齢によって、またはバルーン血管形成術後の再狭窄によって誘発される。アテローム硬化性病変は、コレステロールに富んだ粒子を含有しており、その多くは凝集し、マクロファージ貪食作用により制御されないで内在化する。この貪食プロセスは、ＬＤＬまたはスカベンジャーレセプターからは独立している。泡状細胞と呼ばれる脂質が充填されたマクロファージは、アテローム硬化性プラークのさらなる成長を導き得る（Hoff、European Heart Journal、II（Supp. E）（1990）、105-115； Robert、Annals New York Acad. of Sciences、673（1992）、331-341）。
【０００９】
中枢神経系疾患。アミロイドプラークコアの周辺に認められる小膠細胞は、ベータ/Ａ４アミロイドのプラーク原線維を含有していることがわかっている（El HachimiおよびFoncin、C. R. Acad. Sci. Paris、Sciences de la vie/Life sciences、317（1994）、445-451）。小膠細胞が老人斑コアを貪食し、取り除く能力は、星状膠細胞分泌型拡散性因子の存在下で抑制される。この因子は、老人斑の排除を阻害し、アルツハイマー病および他の神経病理学的な退行性プロセスを持続させることを可能にしている（DeWitt、Experimental Neurology 149（1998）、329-340）。好中球の貪食作用は、臨床的鬱状態の患者において減少することがわかった。恐怖症の患者は、貪食作用および細胞死滅能力が減少していた。神経学的疾患の治療に用いられるベンゾジアゼピン化合物は、貪食作用を減少させ、または阻害することがわかった（例えば、Covelli、Immunopharmacology and Immunotoxicology、11（1989）、701-714）。
【００１０】
皮膚疾患。皮膚疾患である真皮中央弾性線維症（mid-dermal elastosis）は、形態学的に正常な弾性組織の、貪食作用の結果として部分的に生じる皺および加齢の様相を臨床学的特徴とする（例えば、Fimiani、Arch. Dermatol. Res. 287（1995）、152-157）。多種の色素沈着疾患が多様な形状で存在する。これらは、遺伝したり（例えば、白斑）、後天的に発症したり（例えば、炎症後白質粃糠疹、特発性滴状メラニン減少症（idiophatic guttate hypomelanosis）、黒皮症）、および感染によって伝達し得る（例えば、癜風）。これらの疾患は、良性で自己制限的であることもあり（例えば、単離されたミルクコーヒー斑、光接触皮膚炎）、またはより深刻な基礎疾患の徴候であることもある（例えば、多発性ミルクコーヒー斑、悪性黒色表皮腫）（Hacker、Postgrad Med. 99（1996）、177-186）。尋常性座瘡は、多段階の疾患である。基礎的な座瘡病変は面皰である。好中球が面皰領域に補充される第２の炎症段階は、疾患の進行の根拠となる。面皰に関する殆ど全ての問題は、この炎症性段階から生じるものである。
【００１１】
さらに、リンパ球に２つの主なクラスがあり、双方とも免疫応答に関与する。Ｂリンパ球は抗体を産生し、一方、Ｔリンパ球はウイルスに感染した細胞を殺し、他の白血球細胞の活性を制御する。後者は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれ、マクロファージを活性化して摂取された微生物を破壊するＴＨ１細胞、およびＢ細胞を刺激して抗体を増殖させ分泌させるＴＨ２細胞の２種類が存在する。疾患の治療における貪食作用の重要性については既述した。さらに、種々の免疫特異性を持つ体抗体および抗体産生細胞の天然の免疫応答における役割は、治療的および診断的使用、特にモノクローナル抗体にとって望ましい。治療的および診断的使用を意図した抗体は、作製するのが問題であり、および/または労力がかかることがあり得る。なぜなら、全ての抗原が、好適な免疫原であって、例えば、モノクローナル抗体作製細胞を得ることができるというわけではないからである。免疫原応答性の非ヒトトランスジェニック動物、または共免疫賦活性分子として使用されるアジュバントによって、所望の抗原に対する抗体が都合よく産生できるようになるかもしれない。さらに、そのようなアジュバントは、人体における異物に対する免疫応答を高めるために、ワクチンにおいて使用してもよい。
【００１２】
したがって、細胞媒介性の免疫応答および抗体反応を制御節するための、代替的な改良された手段および方法が常に必要とされている。
【００１３】
発明の概要
本発明は、いくつかの哺乳動物の疾患を治療および予防するための組成物を提供する。
【００１４】
これらの組成物は、貪食作用およびリンパ細胞集団の抗原に対する応答を制御するためのメカニズムの発見に基づく。
【００１５】
第１の局面において、本発明は、貪食作用および/または単球集団の増加によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を、治療的または予防的に処置するための組成物であって、治療的有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）、ＴＩＲＣ７のアクチベーター、または前記ＴＩＲＣ７もしくは前記アクチベーターをコードする核酸分子、および任意に、薬学的または化粧的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００１６】
関連する局面において、本発明は、貪食作用および/または単球集団の減少によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を、治療的または予防的に処置するための組成物であって、治療的有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニスト、または前記アンタゴニストをコードする核酸分子、および任意に、薬学的または化粧的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００１７】
本発明はまた、貪食作用および/または単球集団すなわち数を増加させる方法であって、哺乳動物細胞を、有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）、ＴＩＲＣ７のアクチベーター、または前記ＴＩＲＣ７もしくは前記アクチベーターをコードする核酸分子に接触させることを含む方法、ならびに貪食作用および/または単球集団を減少させる方法であって、哺乳動物細胞を、有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニストまたは前記アンタゴニストをコードする核酸分子に接触させることを含む方法に関する。これらの方法は、貪食作用および/または単球集団の増加または減少によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を治療的または予防的に処置するために使用することができる。
【００１８】
本発明の方法によって治療することができる疾患は、「背景」の項目において十分に述べたように、皮膚疾患、免疫系疾患、炎症性疾患、呼吸器疾患、感染症、糖尿病、身体的創傷、歯周病および中枢神経系疾患を含む。
【００１９】
さらに、本発明は、哺乳動物に対して本発明の組成物を投与するための製造物であって、組成物が作用可能に固着した固体送達媒体を含む製造物に関する。
【００２０】
加えて、本発明は、単球を標的とする、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）もしくはそのフラグメント、そのコード核酸配列もしくは制御核酸配列、または抗ＴＩＲＣ７抗体の、貪食作用および/またはリンパ球応答、特に単球集団の増加または減少に関連する疾患の診断または治療的介入のための標的、または、そのような疾患の治療のための作用物質を同定または単離するためのスクリーニング方法の標的としての使用に関する。
【００２１】
本発明はまた、上記疾患のいずれか１つを診断するための方法であって、
ａ）被験体からのサンプルを、ＴＩＲＣ７転写活性についてアッセイすること；および
ｂ）健康な被験体と比較して、ＴＩＲＣ７転写活性の誘発または抑制によって特徴付けられる疾患の存在を測定することを含む、または
ａ）被験体からのサンプルを、ＴＩＲＣ７蛋白質の存在についてアッセイすること；および
ｂ）ＴＩＲＣ７蛋白質の異常な存在または欠如が疾患の存在を示す場合、ＴＩＲＣ７蛋白質の存在によって疾患の存在を測定することを含む方法に関する。
【００２２】
本発明はまた、貪食作用および/または単球集団の増加または減少を調節すること、または被験体において抗原に対するリンパ球応答を増加させることが可能な治療薬を同定または単離する方法であって、ＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／インヒビター、またはアゴニスト／アクチベーターをスクリーニングする方法を含む方法に関する。
【００２３】
第２の局面において、本発明は、所望の抗原に特異的な免疫グロブリンまたはそのアナログを作製するための方法であって、
（ａ）免疫応答を刺激する条件下で、前記抗原またはその免疫原性部分を非ヒト動物に投与することによって、前記動物が前記抗原に特異的な免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生することを含み、前記非ヒト動物は、内因性Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ（ＴＩＲＣ７）またはＴＩＲＣ７活性を産生することが実質的に可能でないことを特徴とし、および、
（ｂ）前記免疫グロブリンまたはアナログを回収することを含む方法に関する。
【００２４】
また、所望の抗原に結合する免疫グロブリンを分泌する、対応する不死化Ｂ細胞、それらのｃＤＮＡ、および上記ような、好ましくは抗体産生に使用するための対応する非ヒト動物にも関する。
【００２５】
第３の局面において、本発明は、所望の抗原に対する免疫応答を導き出すのに有用なワクチンであって、治療的有効量のＴ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニスト、または前記アンタゴニストをコードする核酸分子を含み、そして任意に、前記抗原またはその免疫原性部分をさらに含み、また任意に、薬学的に許容できる作用物質をさらに含むワクチンに関する。この局面において、ＴＩＲＣ７の前記アンタゴニストは、アジュバントとして使用することができる。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＴＩＲＣ７欠損マウスは、野生型同腹仔と比較して、in vitro およびin vivoでの異なる刺激に対するＴ細胞およびＢ細胞増殖応答の増加を示すという発見に基づく。ＣＤ６９およびＣＤ２５などのＴ細胞表面分子の発現は中等度の増加を示したが、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４では、ＴＩＲＣ７欠損細胞において野生型と比較してそれぞれ僅かに減少および増加することが認められた。注目すべきことに、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８およびＩＣＯＳなどの共刺激分子の発現は有意に減少したが、発現動力学における有意な変化は、それらの同腹仔と比較して、ＴＩＲＣ７欠損Ｔ細胞のＰＤ１およびＣＤ４０Ｌにおいて認められなかった。ＩＬ−４およびＬＰＳによる活性化の後、Ｂ細胞増殖ならびに免疫グロブリン発現は、ＴＩＲＣ７（−／−）マウス脾細胞において誘発された。ＴＩＲＣ７欠損休止Ｂ細胞において、ＣＤ８６の発現が増加したが、ＣＤ８０およびＣＤ４０の発現は変化しないままであった。単球画分は、数が減少し、貪食作用の不全および異常な細胞骨格構造を示していた。これらの結果から、ＴＩＲＣ７機能は、種々の抗原に対する免疫応答を制御するために必須であることが証明された。
【００２７】
ＴＩＲＣ７の発現および/または活性を調節することによって、これらの細胞的機能を特異的に増加および減少させるこの能力は、貪食作用および/または単球の増加または減少によって改善するであろう疾患を治療および予防することを可能とする。したがって、本発明は、貪食作用および/または単球集団の増加によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を治療的または予防的に処置するための組成物であって、治療的有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）、ＴＩＲＣ７のアクチベーター、または前記ＴＩＲＣ７もしくは前記アクチベーターをコードする核酸分子、および任意に薬学的または化粧的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００２８】
結局、本発明はまた、貪食作用および/または単球集団の減少によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を治療的または予防的に処置するための組成物であって、治療的有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニスト、または前記アンタゴニストをコードする核酸分子、および任意に薬学的または化粧的に許容される担体を含む組成物に関する。
【００２９】
本発明に関して使用される用語「ＴＩＲＣ７」は、Ｔ細胞の活性化および増殖のシグナルトランスダクションに関与し、好ましくは可溶型で、リンパ球混合培養におけるアロ活性化に応答して、または培養に外から加えられたマイトジェンに応答して、Ｔ細胞増殖を阻害または抑制することができる蛋白質を表す。In vitroで翻訳されたＴＩＲＣ７蛋白質は、リンパ球混合培養におけるアロ活性化に応答して、またはマイトジェンに応答してＴ細胞の増殖を用量依存的に効果的に抑制できることが判明した。ＴＩＲＣ７は、当業者に公知であり、前掲書、とりわけ、国際公開公報第W099/11782号、Utku、Immunity 9（1998）、509-518およびHeinemann、Genomics 57（1999）、398-406に記載されている。これらはまた、ＴＩＲＣ７のアミノ酸および核酸配列も開示している。
【００３０】
ＴＩＲＣ７発現および/または活性を特異的に増加または減少させる本組成物中の作用物質は、当該技術分野において公知のあらゆる種類であることができる。例としては、限定されるものではないが、有機分子、無機分子、ペプチド、蛋白質、炭水化物、核酸分子、脂質、およびそれらの組み合わせが含まれる。ＴＩＲＣ７アンチセンス核酸分子は、例えば、貪食作用を減少させるために用いることができる。ＴＩＲＣ７発現ベクターまたはＴＩＲＣ７リガンドは、例えば、貪食作用または単球集団を増加させるために用いることができる。
【００３１】
本発明によって、ＴＩＲＣ７活性を制御することによって、哺乳動物の細胞の貪食作用活性を増加または減少させるために使用し得る技法は、従来技術から導くことができる。例えば、本発明の代案としての国際公開公報第095/09011号においては、適切な細胞中に、ＦｃレセプターをコードするＤＮＡ分子を、前記ＤＮＡ分子が発現し、そして前記Ｆｃレセプターがそれにによって作製され、前記細胞の貪食作用活性がそれによって増加するように、導入することが提案されている。しかし本発明によっても同様に、ＤＮＡをコードするＴＩＲＣ７が用いられるであろう。本発明において改変して用いることができるその他のアプローチは、例えば、国際公開公報第W096/40199号および第W095/09002号に記載されている。
【００３２】
本明細書で用いられている用語「哺乳動物」は、Webster's Medical Desk Dictionary 407（1986）に定義されているところの哺乳類（Mammalia）のクラスに含まれる高等脊椎動物のすべてのメンバーを意味し、限定されるものではないが、ヒト、その他の霊長類、ブタ、イヌおよびげっ歯動物（免疫抑制されたマウスなど）が含まれる。本発明の好ましい態様においては、該哺乳動物はヒトである。
【００３３】
本組成物は、当該技術分野において公知のあらゆる形態を取ることができる。ある態様において、該組成物は、薬学的に許容される担体、ＴＩＲＣ７発現および/又は活性を特異的に変更する作用物質として機能する１以上の分離した薬学的化合物を含む。別の態様において、該組成物は、天然に存在する組成物または、薬学的または化粧的に許容できるとみなされる、その抽出物もしくは成分を含む。そのような天然に存在する組成物は、活性物質として機能するいくつかの成分を含み、薬学的または化粧的担体として機能する他の多くの物質を含む。該組成物は、人工的であっても、天然に存在するものであっても、それらの組み合わせであってもよい。さらに、該組成物は、例えば、液体（例えば、溶液、クリーム、ローション、ゲル、注射可能物）、固体（例えば、錠剤、カプセル、粉末、顆粒）、エアゾール、およびコーティングなど、当該技術分野において公知のあらゆる物理的形状とすることができる。
【００３４】
本発明によれば、用語「アンタゴニスト/インヒビターおよびアゴニスト/アクチベーター」は、その酵素活性もしくは生物活性の変更を介して、または、例えば転写もしくは翻訳に影響を及ぼすことによる発現の調節を介して、ＴＩＲＣ７の活性を調節する化学物質を含む。場合によっては、アンタゴニスト/インヒビターまたはアゴニスト/アクチベーターはまた、基質またはリガンド結合分子であってもよい。
【００３５】
本明細書で用いられている「アクチベーター」という用語は、ＴＩＲＣ７が最初に活性化するのに必要な物質および単にその活性を強調する物質の双方を含む。
【００３６】
用語「インヒビター」は、ＴＩＲＣ７の活性を減少させる物質と、全く無にする物質の双方を含む。本明細書においては、ＴＩＲＣ７について複数の可能な活性が定義されている場合、インヒビターまたはアクチベーターは、ＴＩＲＣ７の活性のいくつかまたは全ての活性を調節しうる。ＴＩＲＣ７の活性を調節し、例えば、細胞ベースアッセイにおける応答を引き起こす「アンタゴニスト」または「アゴニスト」は、直接的または間接的に蛋白質の活性または活性ＴＩＲＣ７の量を変更する化合物を意味する。典型的に、アンタゴニストの効果は、Utku、Immunity 9（1998）、509-518に記載の抗ＴＩＲＣ７抗体のそれとほぼ同じである。アンタゴニストは、競合的ならびに非競合的アンタゴニストを含む。競合的アンタゴニスト（または競合的ブロッカー）は、アゴニストの結合に特異的な部位と相互作用するか、または接近する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニスト相互作用部位とは異なる部位と相互作用することによって、レセプターの機能と相互作用する。好ましくは、ＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／インヒビターおよびアゴニスト／アクチベーターは、ＴＩＲＣ７と直接的に相互作用する小さな化学物質である。したがって、ＴＩＲＣ７活性を阻害または刺激するために必要な化合物の分子量と、細胞に存在するまたは欠如しているＴＩＲＣ７の分子量との間に直接的関連があることが好ましい。
【００３７】
アクチベーターおよびインヒビターは、構造支援型コンピュータモデリングによって、例えば、アルファへリックスおよびアルファへリックス形成領域（「アルファ領域」）、ベータシートおよびベータシート形成領域（「ベータ領域」）、ターンおよびターン形成領域（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域、疎水性領域、アルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、柔軟性領域、表面形成領域、基質結合領域および高抗原性指数領域に基づいてデザインすることができる。そのような好ましい領域には、Garnier-Robsonアルファ領域、ベータ領域、ターン領域、およびコイル領域、Chou-Fasmanアルファ領域、ベータ領域、およびターン領域、Kyte-Doolittle親水性領域および疎水性領域、Eisenbergアルファおよびベータ両親媒性領域、Karplus-Schulz柔軟性領域、Emini表面形成領域、Jameson-Wolf高抗原性指数領域を含む。コンピュータ予測は、例えば、HGMP resource center Cambridge （Rice、1995）から得られるＧＣＧソフトウェアを用いて行うことができる。
【００３８】
ＴＩＲＣ７の前記アゴニスト／アクチベーターは、例えば、ＴＩＲＣ７ポリペプチド、ＴＩＲＣ７遺伝子、抗ＴＩＲＣ７抗体、ＴＩＲＣ７遺伝子の転写レギュレーターまたはリガンド結合分子、ＴＩＲＣ７リガンド、またはＴＩＲＣ７（過剰）発現細胞であることができる、またはそれらから導くことができる。好ましくは、前記ＴＩＲＣ７ポリペプチドは、組換えＴＩＲＣ７、その機能的誘導体、または機能的に等価な物質である。本発明の方法および使用に用いることができるＴＩＲＣ７をコードするＤＮＡ配列ならびに機能的誘導体および機能的に等価な物質は、従来技術に記載されている。上記引用文献参照。さらに、ＴＩＲＣ７のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Gene Bankデータベースから入手することができる。上記したように、組換え蛋白質の作製方法は、当業者に公知である。例えば、Sambrook、Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory （1989） N. Y.およびAusubel、Current Protocols in Molecular Biology、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、N. Y.（1989）、（1994）参照。
【００３９】
ＴＩＲＣ７アンタゴニストは、ペプチド、蛋白質、核酸、ＴＩＲＣ７遺伝子標的ベクター、抗体、小有機分子、ペプチドミミックス、アプタマー、またはＰＮＡであることができる（Milner、Nature Medicine 1（1995）、879-880；Hupp、Cell 83（1995）、237-245；Gibbs、Cell 79（1994）、193-198；Gold、Ann. Rev. Biochem. 64（1995）、736-797）。そのような化合物の調製および投与としては、当業者は、当該技術分野において公知の方法、例えば、上記したものを用いることができる。さらに、ＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／インヒビターおよびそれを得るための方法は、例えば、国際出願PCT/EP01/12485号に記載されている。
【００４０】
ＴＩＲＣ７コード遺伝子および/またはそれらの制御配列に特異的にハイブリダイズする核酸分子は、例えば、アンチセンスもしくは３重らせん効果によって、前記遺伝子の発現を抑制するために使用することができる。または、それらは、ＴＩＲＣ７をコードする遺伝子の（pre）−ｍＲＮＡを特異的に切断する適切なリボザイムを構築するために用いることができる（例えば、欧州特許B1 0 291 533号、欧州特許A1 0 321 201号、欧州特許A2 0 360 257号参照）。ＴＩＲＣ７をコードする核酸配列は、当該技術分野において公知である。例えば上掲文献参照。適切な標的部位および対応するリボザイムの選択は、例えば、Steinecke、Ribozymes、Methods in Cell Biology 50、Galbraithら、eds Academic Press、Inc.（1995）、449-460に記載されているように行うことができる。さらに、細胞内部において化合物が結合して、その結果、細胞成長および細胞死を遅滞させる、定義されたもしくは定義されていない標的ＲＮＡ分子に類似するＲＮＡフラグメントのような核酸分子を同定するための方法が、文献に記載されている。例えば、国際公開第WO 98/18947号およびそこに引用されている文献参照。これらの核酸分子は、薬学的に関心がもたれている未知の化合物を同定するため、および疾患の治療に用いるための未知のＲＮＡ標的を同定するために用いることができる。あるいは、例えば、該結合部位に類似するＲＮＡフラグメントの高次構造を合理的な薬物デザイン方法に採用して、公知のリガンドを改変し、それらをより強く標的に結合させることができる。１つのそのような方法は、薬物およびＲＮＡ高次構造を同定するのに有用な核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。さらに他の薬物デザイン方法は、例えば、国際公開公報ＷO95/35367号、米国特許A-5,322,933号に記載されている方法であり、そこには、ＲＮＡフラグメントの結晶構造が誘発され、コンピュータプログラムを用いて、抗生物質として機能し得る新規な結合用化合物をデザインすることが記載されている。
【００４１】
ＴＩＲＣ７コード遺伝子配列またはセンス核酸配列に相補的な核酸配列は、アンチセンス治療のために合成することができる。これらのセンスまたはアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホン酸などのＤＮＡの安定な誘導体、ＲＮＡ、2'-O-アルキルＲＮＡなどの安定なＲＮＡの誘導体、または他のＴＩＲＣ７アンチセンスオリゴヌクレオチドミメティクスであることができる。ＴＩＲＣ７アンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化またはアンチセンス配列を持つベクターからの発現によって細胞に導入することができる。ＴＩＲＣ７アンチセンス治療は、それがＴＩＲＣ７活性を減少させることが有益な疾患の治療に特に有用である。ＴＩＲＣ７遺伝子治療は、ＴＩＲＣ７を標的生物の細胞に導入するために用いることもできる。ＴＩＲＣ７遺伝子は、レシピエント宿主細胞の感染によるＴＩＲＣ７ ＤＮＡの転移を媒介するウイルスベクターにライゲーションすることができる。好適なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが含まれる。あるいは、ＴＩＲＣ７ ＤＮＡは、リガンド−ＤＮＡ複合体またはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、またはリポフェクション膜融合または直接的マイクロインジェクションを用いたレセプター媒介性標的ＤＮＡ転移を含む非ウイルス技法によって遺伝子治療をするために細胞に移すことができる。これらの処置およびその変形例は、ex vivo ならびにin vivoでのＴＩＲＣ７遺伝子治療に好適である。ＴＩＲＣ７遺伝子治療は、それがＴＩＲＣ７活性を増加させることが有益な疾患の治療に特に有用である。ＴＩＲＣ７遺伝子に適用することができる遺伝子治療の分子的方法論のためのプロトコルについては、Paul D. Robbins、Human press、Totawa NJ、1996により編集されたGene Therapy Protocolsに記載がある。
【００４２】
さらに、いわゆる「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）技法は、ＴＩＲＣ７をコードする遺伝子の発現を阻害するために使用することができる。例えば、ＰＮＡの相補形ならびに種々の一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡ核酸分子への結合は、例えば、熱変性およびBIAcore表面相互作用技法などを用いて体系的に検討することができる（Jensen、Biochemistry 36（1997）、5072-5077）。ＰＮＡの合成は、例えば、Koch、J. Pept. Res. 49 （1997）、80-88；Finn、Nucleic Acids Research 24 （1996）、3357-3363に記載されているような当該技術において公知の方法にしたがって行うことができる。さらに、ＴＩＲＣ７の構造的モチーフおよびそのレセプターまたはリガンドの、折り畳みシミュレーションおよびコンピュータ再デザインを上記のように行い、ＴＩＲＣ７の生物学的活性を阻害することが可能な薬物をデザインすることができる。
【００４３】
本発明においては、好ましくは、抗体を用いて、ＴＩＲＣ７、または抗体レセプターまたはその部分、すなわち、そのようなＴＩＲＣ７の特異的フラグメントまたはエピトープおよびリガンドを特異的に認識し、それによってＴＩＲＣ７またはＴＩＲＣ７リガンドを不活化することができる。これらの抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または合成抗体ならびにFab、Fv もしくはscFvフラグメントなどの抗体のフラグメントとすることができる。抗体またはそのフラグメントは、例えば、Harlow and Lane"Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor、1988または欧州特許B1 0 451 216号、およびそこに記載の引用文献に記載の方法を用いて取得することができる。例えば、BIAcoreシステムに用いられているような表面プラスモン共鳴を用いて、ＴＩＲＣ７またはそのリガンドのエピトープに結合するファージ抗体の結合効率を高めることができる（Schier、Human Antibodies Hybridomas 7（1996）、97-105；Malmborg、J. Immunol. Methods 183（1995）、7-13）。
【００４４】
ＴＩＲＣ７またはそのリガンドの生物学的活性を阻害することが可能な、ペプチド、蛋白質、核酸、抗体、小有機化合物、リガンド、ホルモン、ペプチドミメティクス、ＰＮＡなどを含む、本発明によって用いることができる推定上のインヒビターは、当該技術分野において公知の方法、例えば、欧州特許A-0 403 506号に記載の方法にしたがって同定することができる。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、アンタゴニストは核酸分子であり、単球において発現するようにデザインされる。
【００４６】
さらに好ましい態様において、アンタゴニストは、ＴＩＲＣ７とそのリガンドの相互作用をブロックする。好ましくは、前記アンタゴニストは、（ｉ）もしくは（ｉｉ）である、または（ｉ）もしくは（ｉｉ）を含む。
（ｉ）抗ＴＩＲＣ７抗体もしくは抗ＴＩＲＣ７リガンド抗体；
（ｉｉ）未刺激形態のＴＩＲＣ７もしくはそのリガンド。
【００４７】
本発明の薬学的組成物に関して使用される抗ＴＩＲＣ７抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体であることができる。しかし、またポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト抗体もしくはヒト化抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、またはＴＩＲＣ７ペプチドもしくはポリペプチドに特異的に結合するそれらのフラグメントも含む。また、二重特異的抗体、合成抗体、Fab、FvもしくはscFvフラグメントなどの抗体フラグメント、またはこれらのうちのいずれかの化学的に改変された誘導体をも含む。抗体を作製するための一般的な方法論は公知であり、例えば、KohlerおよびMilstein、Nature 256（1975）、494およびJ. G. R. Hurrel, ed.、"Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc.、Boco Raron、FL （1982）中の考察、ならびにL. T. Mimmsらによる教示、Virology 176（1990）、604-619に記載されている。また、下記も参照されたい。
【００４８】
インヒビターの基本構造のさらなるソースを採用することができ、それは、例えば、ＴＩＲＣ７ポリペプチドのミメティクアナログを含む。ＴＩＲＣ７ポリペプチドのミメティクアナログは、例えば、生物学的活性に必須であることが予期されるアミノ酸を、例えば、立体異性体、すなわち、Ｄ-アミノ酸で置換することによって作製することができる。例えば、Tsukida、J. Med. Chem. 40（1997）、3534-3541参照。さらに、ＴＩＲＣ７ポリペプチドは、天然のポリペプチドと同様に効率的に、リガンド、基質、結合パートナー、またはＴＩＲＣ７ポリペプチドのレセプターに結合する、またはそれらとして機能することができる合成的な化学的ペプチドミメティクスを同定するために使用することができる。例えば、Engleman、J. Clin. Invest. 99 （1997）、2284-2292参照。例えば、本発明の蛋白質の構造的モチーフの折り畳みシミュレーションおよびコンピュータ再設計は、適切なコンピュータプログラムを用いて行うことができる（Olszewski、Proteins 25 （1996）、286-299；Hoffinan、Comput. Appl. Biosci. 11（1995）、675-679）。蛋白質折り畳みのコンピュータモデリングは、詳細なペプチドおよび蛋白質モデルの高次構造的およびエネルギー分析に用いることができる（Monge、J. Mol. Biol. 247（1995）、995-1012；Renouf、Adv. Exp. Med. Biol. 376 （1995）、37-45）。特に、適切なコンピュータプログラムを用いて、相補的なペプチド配列のコンピュータ支援検索によって、ＴＩＲＣ７ポリペプチドとそのリガンドとの相互作用部位または他の相互作用蛋白質を同定することができる（Fassina、Immunomethods 5 （1994）、114-120）。蛋白質およびペプチドをデザインするためのさらに別の適切なコンピュータシステムが、従来技術に記載されている（例えば、Berry、Biochem. Soc. Trans. 22（1994）、1033-1036；Wodak、Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 （1987）、1-13；Pabo、Biochemistry 25（1986）、5987-5991）。ペプチドミメティクスコンビナトリアルライブラリーの作製方法および使用が従来技術に記載されている（例えば、Ostresh、Methods in Enzymology 267 （1996）、220-234およびDorner、Bioorg. Med. Chem. 4（1996）、709-715）。さらに、ＴＩＲＣ７蛋白質の３次元構造および/または結晶学的構造を、本発明の蛋白質の生物学的活性のミメティクスインヒビターのデザインのために用いることができる（Rose、Biochemistry 35（1996）、12933-12944；Rutenber、Bioorg. Med. Chem. 4 （1996）、1545-1558）。
【００４９】
例えば、ＴＩＲＣ７ポリペプチドに対する基質またはリガンドとして機能することができる小有機化合物のミメティクスをデザイン、合成および評価することが可能であることも、当業者には公知である。例えば、ハパロシン（hapalosin）のＤグルコースミメティクスは、細胞傷害性において多剤耐性支援関連蛋白質をアンタゴナイズする際のハパロシンと類似の効率を示したことが記載されている（Dinh、J. Med. Chem. 41（1998）、981-987参照）。
【００５０】
組換えＴＩＲＣ７ポリヌクレオチド、アンチセンス分子およびポリヌクレオチドまたはアンチセンス分子を組み込んだベクターは、分子生物学の分野の当業者に公知の方法によって作製することができる。例えば、ベクターの選択は、所望の機能に依存するであろう。そして、ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子工学において従来から使用されてきた他のベクターが含まれる。当業者に公知の方法を用いて、種々のプラスミドおよびベクターを構築することができる。例えば、SambrookおよびAusubel、引用された上掲書に記載の技法を参照。あるいは、ポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞に送達するためにリポソームに組み込むことができる。特定のポリペプチドの発現が必要な場合、関連する配列を発現ベクターに転移することができる。典型的なクローニングベクターとしては、pBscpt sk、pGEM、pUC9、pBR322およびpGBT9が含まれる。典型的な発現ベクターとしては、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-l、pOP13CAT、pET、pGEX、pMALC、pPIC9、pBacが含まれる。
【００５１】
本発明の組成物に用いられる抗体、核酸分子、インヒビター、およびアクチベーターは、特に、ＴＩＲＣ７刺激が望ましい場合、天然のリガンドまたはＴＩＲＣ７蛋白質の結合パートナーに対する結合特異性と少なくとも実質的に同一の特異性を有することが好ましい。抗体またはインヒビターのＴＩＲＣ７蛋白質に対する結合親和性は、少なくとも１０５Ｍ−１、好ましくは１０７Ｍ−１より大きいとすることができ、ＴＩＲＣ７抑制が媒介される場合は、最大１０１０Ｍ−１とするのが有利である。
【００５２】
好ましい態様において、抑制抗体またはインヒビターは、少なくとも約１０−７Ｍ、好ましくは約１０−９Ｍ、最も好ましくは約１０−１１Ｍの親和性を有し；ＴＩＲＣ７刺激アクチベーターは、約１０−７Ｍ未満、好ましくは１０−６Ｍ未満、および最も好ましくは１０−５Ｍ程度の親和性を有する。
【００５３】
本発明を用いて治療または予防することができる疾患は、貪食作用または単球集団の増加または減少のいずれかによって改善（すなわち、疾患自身に対する陽性効果、および/またはその二次効果）することができるあらゆる疾患を含む。これらの疾患には、限定されるものではないが、免疫系疾患、糖尿病、炎症性疾患、中枢神経系の疾患、皮膚病、身体的創傷、歯周病および呼吸器疾患が含まれる。多くの疾患は、１つのカテゴリーの疾患のより多くの特徴を有している。そのような疾患は、例えば、皮膚疾患と免疫疾患の双方に分類され得る接着障害が含まれる。したがって、本明細書の記載によれば、特定のカテゴリーに属する疾患（例えば、皮膚疾患）は、少なくとも、該疾患がそのカテゴリーの特徴を持っていることを意味する。さらに、しかしながら、該疾患は、別のカテゴリーの特徴をさらに持っていてもよい。免疫細胞が細菌やウイルスのような異物を摂取する能力を増加させることによって、免疫応答を高めることが期待できるであろう。例えば、単核の貪食細胞は、慢性の微生物感染において不活性であり（Reiner、Immunol. Today 15 （1994）、37481）、それらを再活性化することによって疾患の治療が期待されるであろう。あるいは、免疫系の活性が高すぎる場合の疾患は、貪食作用を阻害することによって改善するであろう。
【００５４】
本発明において治療可能な免疫系および炎症性疾患の例としては、ＡＩＤＳ、化学療法によって引き起こされる免疫不全、喘息、毒性物質（例えば、アスベストまたは煙）被曝による傷害、インプラントおよび移植された組織の宿主拒絶、接着障害、中等度の感染（例えば、通常の風邪）、重篤な感染（例えば、髄膜炎または「キラー細菌」）、創傷（例えば、感染した創傷、糖尿病性創傷、急性および慢性創傷）、再狭窄、嚢胞性線維症、肺気腫、歯周病、おむつかぶれが含まれる。皮膚疾患には、望ましくない色素沈着、望ましくない色素脱失、乾癬、発疹および特定の身体的皮膚障害（例えば、皺）が含まれる。ある特定の例においては、白斑症患者は、メラニンを（リポソームを介して、またはそのままで）、明るいスポットを暗くするための貪食作用上昇物質と一緒に用いて治療される。あるいは、それらは、暗い部位を明るくするためのＴＩＲＣ７のアゴニストを用いて治療される。皮膚疾患に関連する１つの例において、白髪は、メラニン（そのまま、またはリポソーム送達性）および貪食作用上昇物質を、理想的には、シャンプーまたはクリーム中で用いて治療される。中枢神経系の疾患としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病や他の老人斑疾患（アミロイド原線維の貪食作用をアップレギュレートすることによって治療される）、鬱、恐怖症およびベンゾジアゼピン治療の二次効果の結果生じるその他の疾患が含まれる。
【００５５】
したがって、本発明は、貪食作用および/または単球集団を増加させる方法であって、哺乳動物細胞を、有効量の、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）、ＴＩＲＣ７のアクチベーター、または前記ＴＩＲＣ７もしくは前記アクチベーターをコードする核酸分子に接触させることを含む方法を提供する。この方法は、
（ａ）細胞、組織または臓器を被験体から取得すること；
（ｂ）前記細胞、組織または臓器に、ＴＩＲＣ７またはそのリガンドをコードし、かつ発現することが可能である核酸分子を、in vivo導入すること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）において得られた前記細胞、組織または臓器を、同じ被験体または異なる被験体に再び導入することを含んでもよい。
【００５６】
ＴＩＲＣ７およびＴＩＲＣ７をコードする核酸分子または対応するアクチベーターの部分は、単独もしくは組み合わせて、また任意に薬学的に許容できる担体または添加物と一緒に投与されることが本発明から予見できる。前記核酸分子は、細胞のゲノムに安定に組み込むことができ、または染色体外の形状に維持されることもできる。例えば、Calos、Trends Genet. 12（1996）、463-466参照。一方、従来技術に記載されているウイルスベクターは、特定の細胞、組織または臓器をトランスフェクトするために用いることができる。さらに、遺伝子治療において、ＴＩＲＣ７をコードする核酸分子を含む本発明の薬学的組成物を用いることができる。好適な遺伝子送達系には、リポソーム、レセプター媒介性送達システム、裸のＤＮＡおよび、ウイルスベクター、とりわけ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどが含まれる。遺伝子治療のための、体の特異的な部位への核酸分子の送達はまた、Williams（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 （1991）、2726-2729）に記載のような、微粒子銃送達系を用いて達成することもできる。
【００５７】
核酸分子で細胞をトランスフェクトする標準的な方法は、当業者に公知である（例えば、国際公開公報W094/29469号参照）。本明細書に記載の疾患の発生を予防もしくは減少させるための遺伝子治療は、ＴＩＲＣ７をコードする核酸分子を直接患者に投与することによって行うこともでき、または細胞を前記核酸分子でex vivoトランスフェクトし、そのトランスフェクトされた細胞を患者に注入することによって行うこともできる。さらに遺伝子の生殖細胞系列の細胞への転移に関する研究は、生殖生物学の分野において最も速く成長している研究である。治療的遺伝子を細胞に、ex-vivoまたはin-vivo技法で導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子転移の最も重要な応用である。in-vitroまたはin-vivo遺伝子治療に好適なベクターおよび方法は、文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、Giordano、Nature Medicine 2 （1996）、534-539; Schaper、Circ. Res. 79 （1996）、911-919; Anderson、Science 256（1992）、808-813; Isner、Lancet 348（1996）、370-374; Muhlhauser、Circ. Res. 77（1995）、1077-1086; Wang、Nature Medicine 2（1996）、714-716; 国際公開公報第094/29469号;第97/00957号または、Schaper、Current Opinion in Biotechnology 7（1996）、635-640、およびそこに引用されている他の引用参照。本発明の薬学的組成物に含まれる核酸分子は、直接的な導入、または前記核酸分子を細胞中に含有するリポソームまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介しての導入を行うためにデザインすることができる。前記細胞は、生殖系列細胞、胚芽細胞または卵細胞またはそれに由来する細胞であることが好ましい。
【００５８】
したがって、好ましい態様において、本発明において使用される薬学的組成物に含まれる核酸分子は、in vivoで細胞によって、例えば、前記核酸分子の直接的導入、または前記核酸分子を含有する対応するプラスミド、リポソーム中のプラスミドまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）の導入によってＴＩＲＣ７を発現するようにデザインされている。
【００５９】
さらに、本発明は、貪食作用および/または単球集団を減少させるための方法であって、有効量のＴ細胞免疫応答cＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニスト、または前記アンタゴニストをコードする核酸分子を哺乳動物細胞に接触させることを含む方法を提供する。上記を参照。
【００６０】
本発明はさらに、貪食作用および/または単球集団の増加によって改善する疾患に罹患した哺乳動物に関する治療および予防の方法であって、該哺乳動物に、治療的有効量のＴ細胞免疫応答cＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）、ＴＩＲＣ７のアクチベーターまたは前記ＴＩＲＣ７をコードする核酸分子または前記アクチベーターを投与することを含む方法を提供する。上記を参照。
【００６１】
さらに、本発明は、貪食作用および/または単球集団の減少によって改善する疾患に罹患した哺乳動物を治療および予防するための方法であって、該哺乳動物に、治療的有効量のＴ細胞免疫応答cＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）のアンタゴニストまたは前記アンタゴニストをコードする核酸分子を投与することを含む方法を提供する。
【００６２】
上記の方法に用いられる前記アンタゴニストまたはアクチベーターは、上記のあらゆる作用物質とすることができる。
【００６３】
本方法で治療される哺乳動物細胞は、好ましくはＴＩＲＣ７発現細胞であり、それは、限定されるものではないが、ケラチノサイト、線維芽細胞および「プロフェッショナル貪食細胞」（すなわち、主要な機能として貪食作用を有する細胞）を含む。プロフェッショナル貪食細胞は、例えば、好中球、マクロファージおよびマクロファージ様細胞（例えば、ランゲルハンス細胞およびクッパー細胞）。好ましい態様において、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【００６４】
本発明において、貪食作用およびＴＩＲＣ７発現が本組成物に応答して変更されなければならない「適切な細胞」は、治療または予防すべき疾患の性質に基づいて容易に決定される。例えば、もし治療すべき疾患が色素沈着の疾患であれば、ＴＩＲＣ７発現または活性が変更される必要がある適切な細胞は、ケラチノサイトである。
【００６５】
本方法は、疾患を予防ならびに治療することを指向している。本明細書で用いられるところの、疾患を「治療的に処置する」とは、疾患の進行を軽減すること、疾患の進行を止めること、疾患の二次的効果を止めること、さもなければ改善すること、疾患の進行を逆転させること、または好ましくは、疾患を治癒させることを意味する。本明細書で用いられているところの、疾患を「予防的に処置する」は、疾患または二次的効果の発生する可能性を減少させる、好ましくは失くすことを意味する。
【００６６】
本発明において、本組成物の投与は、アルコールおよびアミノ酸、親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）、ならびに接着剤および粘着付与剤（例えば、ポリイソブチレン、シリコンベースの接着剤、アクリレートおよびポリブテン）とすることができる。本発明の組成物のいくつか、特に、蛋白質またはアンチセンス核酸分子のような核酸分子またはＴＩＲＣ７発現ベクターを含む本発明の組成物の局所送達は、リポソームを用いて達成することができる。そのリポソームは、非イオン性であることが好ましい。ある例においては、それらは、（ａ）グリセロールジラウレート、（ｂ）コレステロール中に見出されるステロイド骨格を有する化合物、および（ｃ）炭素数約１２〜約１８の脂肪酸エーテルを含む。リポソームの構成化合物の比率は、約３７．５：１２．５：３３．３：１６．７である。グリセロールジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０ステアリルエーテル／ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルを含むリポソーム（「ＧＤＬ」リポソーム）が好ましい。ある態様において、リポソームは、組成物の総体積に基づいて、約１０ｍｇ／ｍｌ〜約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。比率は、約３７．５：１２．５：３３．３：１６．７であることが好ましい。リポソームを調製する方法は、Niemiec、Pharm. Res. 12（1995）、1184- 1188に記載されているように、当該技術分野において公知である。また、局所または経皮投与のためには、本組成物は、モイスチャライザー、化粧的アジュバント、抗酸化剤、脱色剤、チロシナーゼインヒビターおよびその他の色素脱失剤、アルファヒドロキシ酸、界面活性剤、発泡剤、調整剤（conditioners）、湿潤剤、芳香剤、粘度付与剤（viscosifiers）、緩衝剤、保存剤、日焼け止めなどの他の化合物と組み合わせることができる。本発明の組成物は、活性的な量の、例えば、トレチノイン、レチノール、トレチノインおよび/またはレチノールのエステルなどを含むレチノイドを含有することもできる。
【００６７】
経粘膜送達システムは、パッチ、錠剤、坐薬、ペッサリー、ゲルおよびクリームを含み、可溶化剤およびエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸）などの添加剤および他の賦形剤（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性ポリマー）を含有することができる。
【００６８】
注射可能薬物送達システムは、溶液、懸濁液、ゲル、小球体およびポリマー注射剤を含み、また、可溶性変更剤（例えば、エタノール、プロピレングリコールおよびスクロース）およびポリマー（例えば、ポリカプリラクトン（polycaprylactones）およびＰＬＧＡ）などの添加剤を含有することができる。中枢神経系送達システムには、例えば、血液脳関門を横断するための脂質結合誘導体（例えば、ＤＨＡ）が含まれる。移植可能システムとしては、ロッドおよびディスクを含み、また、ＰＬＧＡやポリカプリラクトン（polycaprylactones）などの添加剤を含有することができる。
【００６９】
経口送達システムは、錠剤およびカプセルを含む。これらはバインダー（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、その他のセルロース材料およびデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、デンプン、リン酸２カルシウムおよびセルロース材料）、崩壊剤（例えば、デンプンポリマーおよびセルロース材料）および潤滑剤（例えば、ステアリン酸およびタルク）などの添加剤を含有することができる。そのような送達システムはまた、例えば、歯磨き、マウスウォッシュ、ロゼンジおよびキャンディーも含む。
【００７０】
再構成可能送達システムのための溶液、懸濁液および粉末は、懸濁化剤（例えば、ガム、ザンタン、セルロース化合物および糖類）、湿潤剤（例えば、ソルビトール）、可溶化剤（例えば、エタノール、水、ＰＥＧおよびプロピレングリコール）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、Spans、Tweensおよびセチルピリジン）、保存剤および抗酸化剤（例えば、パラベン、ビタミンＥおよびＣ、アスコルビン酸および天然抽出物）、抗固化剤、コーティング剤およびキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）などの賦形剤を含む。水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、溶媒ベースの製剤および当業者に公知の水溶性ゲルなども本発明の組成物の送達のための賦形剤として使用することができる。
【００７１】
本発明はさらに、本組成物を哺乳動物に投与するための製造物であって、組成物が作用可能（すなわち、送達可能）に固着した固体送達媒体を含む製造物を提供する。固体送達賦形剤は、それがもともと送達用賦形剤として使用することができるように意図されたものであろうとなかろうと、一時的または永久的に体に接触するようにデザインされたあらゆるデバイス(device)とすることができる。本製造物の例としては、限定されるものではないが、コーティングされた絆創膏または他の創傷治療用の創傷用包帯剤、コーティングされた組織の成長を予防または促進するための身体用インプラント（コートされた内部足場材料を有するインプラントを含む）、および再狭窄を予防するためのコーティングされたバルーンカテーテルおよびステントが含まれる。
【００７２】
加えて、本発明は、治療的、予防的または化粧的化合物を哺乳動物に投与するための方法であって、哺乳動物に対して（ａ）化合物、および（ｂ）化合物の摂取が望ましい場合、薬学的または化粧的担体、およびＴＩＲＣ７発現および/または活性を細胞における貪食作用を増加させるのに十分な量に特異的に調節する物質を含む、本発明の組成物を提供する。尚、該組成物は、化合物の投与の前にまたは同時に投与される。薬学的化合物は、例えば、ポリペプチド、蛋白質、または核酸分子であることができる。ある態様において、適切な細胞による貪食作用を介して摂取された後、薬学的化合物を放出する、顕微鏡的多孔性生物分解性ビーズを介して、薬学的化合物と組成物は一緒に投与される。
【００７３】
上記によれば、単球を標的とする、Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ７（ＴＩＲＣ７）もしくはそのフラグメント、そのコード核酸配列もしくは制御核酸配列、または抗ＴＩＲＣ７抗体の、貪食作用および/または単球集団の増加または減少に関連する疾患の診断または治療的介入のための標的、または、そのような疾患の治療のための作用物質を同定または単離するためのスクリーニング方法の標的としての使用に関する。
【００７４】
記述のＴＩＲＣ７ ＤＮＡ、ＴＩＲＣ７ ＲＮＡまたはＴＩＲＣ７蛋白質、またはＴＩＲＣ７活性のモジュレーター、すなわち、アクチベーター／アゴニストもしくはインヒビター／アンタゴニスト、またはその化学的誘導体などを含む薬学的に有用な組成物は、薬学的に許容される担体の混合などによる公知の方法にしたがって製剤することができる。そのような担体および製剤方法の例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに見出すことができる。効果的な投与に好適な薬学的に許容される組成物を形成するために、そのような組成物は、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはモジュレーターの有効量を含有するであろう。本発明の治療的または診断的組成物は、ＴＩＲＣ７に関連する活性の調節が指示されている疾患を治療または診断するのに十分な量が個体に投与される。有効量は、個人の状態、体重、性別および年齢などの種々の要因によって変わり得る。他の要因には、投与様式が含まれる。薬学的組成物は、個人に対して、冠内、腹腔内、皮下、静脈内、経皮、滑膜内、筋肉内または経口経路などの種々の経路で提供することができる。
【００７５】
用語「化学的誘導体」は、通常は基剤分子の一部ではない付加的な化学的部分を含有する分子を表す。そのような部分の例は、基剤分子の溶解性、半減期、吸収性などを向上させることができる。あるいは、該部分は、基剤分子の望ましくない副作用を減衰させ、または基剤分子の毒性を減少させることができる。そのような部分の例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesのような様々なテキストに記載されている。
【００７６】
本明細書に開示されているＴＩＲＣ７ ＤＮＡ、ＴＩＲＣ７ ＲＮＡまたはＴＩＲＣ７蛋白質、またはＴＩＲＣ７活性のモジュレーターは、単独で、潜在的なあらゆる毒性を最小限に抑えながらＴＩＲＣ７の、最適な活性化または阻害を得るための通常の試験によって定義された適切な投与量で用いることができる。さらに、他の物質の共投与または連続投与も望ましい。
【００７７】
治療的に有効な投与量は、症状または状態を改善する、蛋白質、抗体、核酸、アゴニスト、アクチベーター、アンタゴニストまたはインヒビターの量を言う。そのような化合物の治療的効果および毒性は、細胞培養液または実験動物において標準的な医薬的手順によって決定することができる。例えば、ＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％が死に至る用量）。治療的効果と毒性効果との間の用量比は、治療的指標であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。
【００７８】
更なる態様において、本発明は、被験体において、貪食作用および/または単球集団の増加または減少に関連する疾患を診断するための方法であって、
ａ）被験体からのサンプルを、ＴＩＲＣ７転写活性についてアッセイすること；および
ｂ）健康な被験体と比較して、ＴＩＲＣ７転写活性の誘発または抑制によって特徴付けられる疾患の存在を測定すること、
を含む方法に関する。
【００７９】
さらに別の態様において、本発明は、被験体において、貪食作用および/または単球集団の増加または減少に関連する疾患を診断する方法であって、
ａ）被験体からのサンプルを、ＴＩＲＣ７蛋白質の存在についてアッセイすること；および
ｂ）ＴＩＲＣ７蛋白質の異常な存在または欠如が疾患の存在を示す場合に、ＴＩＲＣ７蛋白質の存在によって疾患の存在を測定すること、
を含む方法に関する。
【００８０】
好ましくは、前記方法において、分析されるべき細胞は、単球である、または単球を含む。
【００８１】
これらの態様において、ＴＩＲＣ７ポリヌクレオチド、核酸分子、（ポリ）ペプチド、抗体またはリガンドは、検出可能な部分で標識されていることが好ましい。生物分子を標識するために、種々の手法が利用可能であり、それらは、本発明の範囲に属すると考えられる。そのような技法は、例えば、Tijssen、"Practice and theory of enzyme immuno assays"、Burden, RH and von Knippenburg（Eds）、Volume 15（1985）、"Basic methods in molecular biology" ; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier（1990）、Mayerら、（Eds） "Immunochemical methods in cell and molecular biology"Academic Press、London（1987）、またはseries"Methods in Enzymology"、Academic Press、Inc.に記載されている。当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法がある。通常用いられる標識は、とりわけ、蛍光色素（フルオロセイン、ローダミン、Texas Redなど）、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、放射性同位体（３２Ｐまたは１２５Ｉなど）、ビオチン、ジゴキシゲニン、コロイド金属、化学もしくは生物蛍光化合物（ジオキセタン、ルミノール、またはアクリジニウム）である。酵素またはビオチニル基の共有結合、ヨウ素化、リン酸化、ビオチニル化、ランダムプライミング、ニックトランスレーション、テーリング（末端トランスフェラーゼを使用）の共有結合ような標識化手順が当該技術分野において公知である。検出方法は、限定されるものではないが、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡、直接および関節酵素反応などを含む。
【００８２】
加えて、上記化合物などは、固相に付着されていてもよい。固相は、当業者に公知であり、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、コロイド金属粒子、ガラスおよび/またはシリコンチップおよび面、ニトロセルロースストリップ、膜、シート、動物赤血球、または赤血球ゴースト、デュアラサイト（duracytes）および反応トレイのウェルの壁、プラスチック管、またはその他の試験管を含むことができる。固相上のＴＩＲＣ７核酸、（ポリ）ペプチド、蛋白質、抗体などを固定する好適な方法は、限定されるものではないが、イオン性、疎水性、共有結合的相互作用などを含む。固相は、上で定義した領域を引き付け固定する能力を有する１以上のさらなるレセプターを保持することができる。このレセプターは、試薬それ自体または捕獲試薬に結合した荷電物質に対して逆に荷電した荷電物質を含むことができるか、または、該レセプターは、固相に固定化された（付着した）、かつ前記定義の試薬を固定することができる、あらゆる特異的な結合パートナーでもあり得る。
【００８３】
一般に使用される検出アッセイは放射性同位体または非放射性同位体方法を含むことができる。これらは、とりわけ、ＲＩＡ（放射性同位体アッセイ）およびＩＲＭＡ（免疫ラジオイムノメトリックアッセイ）、ＥＩＡ（酵素免疫アッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノアッセイ）、ＦＩＡ（蛍光免疫アッセイ）およびＣＬＩＡ（ケミルミネセント免疫アッセイ）を含む。当該分野で用いられる他の検出方法は、トレーサー分子を用いないものである。これらの方法の１つのプロトタイプは、少なくとも２つの粒子を架橋する、所与の分子の特性に基づく凝集アッセイである。
【００８４】
臨床および／または研究用検体中の（ポリ）ペプチド、ポリヌクレオチド等の診断および定量では、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、ＰＣＲアッセイまたはＤＮＡ酵素免疫アッセイ（Mantero etal.、Clinical Chemistry 37 （1991）、422-429）のような、前記した種々の免疫学的方法ならびに分子生物学的方法が開発されており、当該分野でよく知られている。ここにおいて、ＴＩＲＣ７核酸分子はＰＮＡ、アミド骨格結合を含む改変されたＤＮＡアナログも含むことができるのに注意すべきである。そのようなＰＮＡは、とりわけ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションのためのプローブとして有用である。
【００８５】
上記組成物は、ＴＩＲＣ７（ポリ）ペプチドをコードするｍＲＮＡの存在を検出することによって、ＴＩＲＣ７ヌクレオチドの発現を検出する方法であって、例えば、被験体の細胞からｍＲＮＡを得て、そのように得られたｍＲＮＡを、好適なハイブリダイゼーション条件下で、ＴＩＲＣ７ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸分子を含むプローブ／プライマーと接触させ、次いで、該プローブ／プライマーにハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を検出することを含む検出する方法に用いることができる。サンプル中の核酸分子の検出ができるさらなる診断方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸ハイブリダイゼーションと組み合わせたサザンブロッティング、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）または代表差分析（representative difference analysis）（ＲＤＡ）を含む。核酸分子の存在についてアッセイするこれらの方法は当該技術分野で知られており、過度の実験をせずに行うことができる。
【００８６】
また、本発明は、上記した方法のいずれか１つにおいて用いることができるキットに関する。前記キットは、抗ＴＩＲＣ７抗体またはＴＩＲＣ７アンチセンス核酸分子、またはその誘導体を含む。そのようなキットは、ＴＩＲＣ７ ＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡを検出するために、またはサンプル中のＴＩＲＣ７蛋白質またはペプチドフラグメントの存在を検出するために用いられる。そのような特徴付けは、限定されるものではないが、法医学分析、診断適用、および本発明の前記方法による疫学的研究を含めた種々の目的で有用である。組換えＴＩＲＣ７蛋白質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ＴＩＲＣ７の検出およびタイピングに適したキットの構成に適合するように調製される。そのようなキットは、典型的には、少なくとも１つの容器を密接な封じ込めにて保持するのに適した区画化キャリアを含む。該キャリアは、さらに、組換えＴＩＲＣ７蛋白質またはＴＩＲＣ７の検出に適した抗ＴＩＲＣ７抗体のような試薬を含むであろう。また、該キャリアは、標識抗原または酵素基質のような検出用の手段を含むこともできる。
【００８７】
さらに、本発明はまた、貪食作用および/または単球集団の増加または減少を調節すること、または被験体において抗原に対するリンパ球応答を増加させることが可能な治療薬を同定または単離する方法であって、ＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／インヒビターまたはアゴニスト／アクチベーターをスクリーニングする方法を含む、方法に関する。一般的に、ＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／インヒビターまたはアゴニスト／アクチベーターのスクリーニング方法は、国際公開公報W099/11782号および国際出願PCT/EPO1/12485号に記載されている。
【００８８】
好ましくは、上記診断方法、スクリーニング方法およびキットのいずれか１つを、最も好ましくは上記に記載のものを、貪食作用および/またはリンパ球活性に関連する疾患の検出またはスクリーニングに使用する。
【００８９】
さらに別の局面において、本発明は、所望の抗原に特異的な免疫グロブリンまたはそのアナログを作製するための方法であって、
（ａ）免疫応答を刺激する条件下で、前記抗原またはその免疫原性部分を非ヒト動物に投与することによって、前記動物が前記抗原に特異的な免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生することを含み、前記非ヒト動物は、内因性Ｔ細胞免疫応答ｃＤＮＡ（ＴＩＲＣ７）またはＴＩＲＣ７活性をリンパ球中に産生することが実質的に可能でないことを特徴とし、および、
（ｂ）前記免疫グロブリンまたはアナログを回収することを含む方法に関する。
【００９０】
本発明のこの局面は、Ｂ細胞増殖ならびに免疫グロブリン発現は、ＬＩ−４およびＬＰＳを用いた活性化後、ＴＩＲＣ７（-/-）マウス脾細胞において誘発されたという驚くべき所見に基づいている。実施例６および７を参照。したがって、ＴＩＲＣ７の活性が適切な細胞において、好ましくは少なくともＢ細胞において、例えば、ノックアウトもしくはアンチセンスアプローチによって実質的に減少した場合の非ヒト動物は、抗体産生のために用いるのに好都合である。一方、実施例においてＴＩＲＣ７（-/-）マウスで観察されたものと同じ効果を外因的にもたらすために、通常の免疫化プロセスには、ＴＩＲＣ７のアンタゴニスト／インヒビターを投与することが伴う。したがって、原理として、さらに、または代替的に、望ましい抗原で免疫化された非ヒト動物の細胞のすべてではないにしても、少なくともいくつかにおいて、ＴＩＲＣ７活性が実質的に減少するということを除き、モノクローナル抗体を作製するためのあらゆる公知の方法を使用することができる。好ましくは、ＴＩＲＣ７活性は、非ヒト動物の少なくともリンパ球、免疫化プロセスの少なくともいくつかの段階において、実質的に減少する。所望の抗体を作製するための第１のステップは、抗原の投与である。そのような投与の技法は、従来的であり、抗原自身の性質に依存する好適な免疫化プロトコルおよび製剤を含む。抗原に、その免疫原性を高める、および/またはアジュバントを含有する製剤を含む、および/または多数の注射を投与する、および/または免疫化の経路を変更するなどのために、担体を付与することが必要かもしれない。そのような技法は標準的であり、免疫特異性試薬が望まれる特定の抗原の特徴に依存して最適化されるであろう。In vivoで抗原に対して特異的な免疫応答を高めるための免疫化の方法を含むそのような方法は、当該技術において公知であり、例えば、Rudbach、Methods Mol. Biol. 45 （1995）、1-8およびDean、Methods Mol. Biol. 80（1998）、23-37に記載されている。本発明の方法はまた、上記改変を有する国際公開公報W096/33735号に記載のように、非ヒト抗体を作製する方法を含む。記述したように、ＴＩＲＣ７活性を減少させる効果は、ＴＩＲＣ７遺伝子を賦活化すること以外の手段によって達成してもよい。したがって、ある態様において、抗原またはその免疫原性部分は、非ヒト動物について、既に述べた態様に記載されているように、ＴＩＲＣ７アンタゴニストと結合した形態で投与することができる。
【００９１】
本明細書において用いられている「免疫特異性試薬」という用語は、免疫グロブリンおよびそれらのアナログを含む。「アナログ」という用語は、ここでは特殊の意味を持っている。それは、その免疫特異性を説明する免疫グロブリンを含有する部分を言う。特に、十分なフレームワーク（ＦＲ）の部分にあわせて、相補性決定領域（ＣＤＲ）が必要とされ、その結果、適切な３次元構造となる。当業者は、抗体の各可変ドメイン（重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬ）が、比較的保存された４つのフレームワーク領域すなわち「ＦＲ」に隣接している、相補性決定領域すなわち「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域を含むことを知っている。本発明の抗体の可変領域に含有されるＣＤＲは、例えば、Kabat、Sequences of Proteins of Immunological Interest（U. S. Department of Health and Human Services、第３版、1983、第４版、1987、第５版1990およびその更新されたもの）にしたがって決定することができる。抗体の典型的な免疫特異性アナログは、Ｆ（ａｂ”）２、Ｆａｂ’、およびＦａｂ領域を含む。例えば、適切な免疫特異性を有する一本鎖Ｆｖアナログを得るための、可変領域の改変された形態は公知である。そのようなＦｖ構築の考察は、例えば、Huston, Methods in Enzvmology 203（1991）、46-63に見出すことができる。多数の免疫特異性を有する抗体アナログの構築は、１つの抗体からの可変領域を第２の抗体の可変領域に結合することによっても可能である。
【００９２】
可変領域は、毒性、生物学的機能性、別の結合特異性などを提供することができる種々の追加物質に結合することもできる。本発明の方法によって作製される可変領域を含む部分は、一本鎖融合蛋白質、ペプチド結合を含む結合以外の共有結合の方法によって結合している分子、および凝集された分子を含む。更なる分子に、共有結合または非共有結合によって結合している可変領域を含むアナログの例としては、下記の非限定的なリストに記載のものが含まれる。Traunecker、Int. J. Cancer Surp.SuDP 7（1992）、51-52は、ＣＤ３を指向するＦｖ領域が可溶性ＣＤ４またはＯＶＣＡおよびＩＬ−７などの他のリガンドに結合している二重特異性試薬ジャヌシン（janusin）を記載している。同様に、本発明の方法によって作製された可変領域は、Ｆｖ分子に構築することができ、引用した記事に記載したもののような代替的なリガンドに結合することができる。Higgins、J. Infect Disease 166（1992）、198-202は、ＧＰ１２０のＶ３領域内の特異的な配列を指向した抗体に架橋結合したＯＫＴ３からなるヘテロ複合体抗体を記載している。本発明の方法によって作製された免疫グロブリン中に含有される少なくとも可変領域を用いて、そのようなヘテロ複合体抗体を構築することもできる。特異的な抗体のさらなる例は、Fanger、Cancer Treat. Res. 68（1993）、181-194およびFanger、Crit. Rev. Immunol. 12（1992）、101-124によって記載されている。従来の抗体を含む免疫毒素である複合体は当該技術において広く知られている。該毒素は、従来の結合技法によって抗体に結合することができる。または蛋白質毒素部分を含有する免疫毒素によって融合蛋白質として作製することができる。本発明のアナログは、そのような免疫毒素を得る、対応する方法に用いることができる。そのような免疫毒素は、Byers、Seminars Cell. Biol. 2（1991）、59-70およびFanger、Immunol. Today 12 （1991）51-54に記載されている。
【００９３】
尚、抗原が単一の形質導入機能を果たしている場合、本発明の免疫グロブリンおよびアナログのいくつかは、それらが免疫特異性を示す抗原に対してアゴニスト活性を有するだろう。したがって、例えば、細胞表面レセプターに対して免疫特異的な本発明の方法によって調製された抗体またはアナログのサブセットは、天然のリガンドによって誘発されたものに対応するレセプターを保持する細胞からの反応を誘発することが可能であろう。さらに、化学反応の遷移状態に類似する物質に対して免疫特異性を有する抗体またはアナログは、触媒活性を有するであろう。したがって、本発明の抗体およびアナログのサブセットは、触媒的抗体として機能するであろう。
【００９４】
当然、本発明の方法は、前記動物からの前記ポリクローナル免疫グロブリンまたはアナログを回収することをさらに含む。さらに、本発明の方法はさらに、前記抗原によって免疫された前記動物からのＢ細胞を不死化すること、得られた不死化細胞を、前記抗原に特異的な前記免疫グロブリンの分泌についてスクリーニングすること、および、
（ｉ）前記不死化Ｂ細胞によって分泌された免疫グロブリンを回収すること；または、
（ｉｉ）少なくとも免疫グロブリンをコードする遺伝子を不死化Ｂ細胞から回収し、および任意に前記遺伝子を改変すること；
（ｉｉｉ）前記遺伝子またはその改変形態を発現させて、免疫グロブリンまたはアナログを産生させること；および
（ｉｖ）前記免疫グロブリンまたはアナログを回収することを含んでもよい。
【００９５】
手短に言えば、本発明のトランスジェニック動物によって産生された免疫グロブリンをコードする遺伝子を検索することができる。そして、その可変領域をコードするヌクレオチド配列を公知の技法にしたがって操作し、上記したものなどの種々のアナログを提供することができる。加えて、可変領域を含有する免疫グロブリンそれ自体を標準的な結合技法を用いて改変し、免疫特異的な領域を保持する複合体を提供することができる。
【００９６】
したがって、免疫グロブリン「アナログ」は、それらの免疫特異性を保持する本発明の抗体の部分を含有する部分を言う。これらは十分な可変領域を持ち、望ましい特異性を提供することができる。
【００９７】
上記したように、本発明の方法の全ては、適切な抗原をトランスジェニック動物に投与することを含む。抗体自身の回収または作製は、種々の方法によって達成することができる。
【００９８】
第１に、最も直接的には、動物によって産生され、血流中に分泌されるポリクローナル抗体は、公知の技法を用いて回収することができる。精製形態のこれらの抗体は、もちろん、好ましくは、蛋白質Ａ、抗免疫グロブリンまたは抗原自身を用いたアフィニティクロマトグラフィーを含む、標準的な精製技法によって容易に調製することができる。いずれの場合にも、免疫化が成功したかどうかをモニターするために、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどのような標準的な技法を用いて血清中の抗原に対する抗体のレベルがモニターされる。
【００９９】
いくつかの応用において、抗体の可変領域のみが必要とされる。それは、ポリクローナル抗血清を好適な試薬で処理して、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ”）２部分を作製することによって得ることができる。そのようなフラグメントは、例えば、免疫グロブリンの免疫特異的部分を放射性同位体のような検出試薬に結合させることを含む免疫診断処置に用いるのに十分である。
【０１００】
あるいは、所望の特徴を有する免疫グロブリンおよびアナログは、本発明の方法において使用されるトランスジェニック動物由来の不死化Ｂ細胞から、または免疫化に応答したこれらの動物において再編成された遺伝子から作製することができる。したがって、動物から直接抗体を採取する代わりに、Ｂ細胞を、典型的には脾臓から、必要に応じて、周辺血液リンパ球またはリンパ節からも得ることができ、種々の技法、最も一般的には、Kohler and Milstein Nature 245（1975）、495に記載されているような方法を用いて不死化することができる。その後、得られたハイブリドーマ（またはそうでなければ、不死化Ｂ細胞）を、単一のコロニーとして培養し、所望の特異性の抗体分泌についてスクリーニングすることができる。適切なハイブリドーマを選択した後、再び従来の技法を用いて、所望の抗体を回収することができる。それらは、従来の方法を用いて、不死化Ｂ細胞を培養することによって、in vitro またはin vivoで多量に調製され、腹水を生成し得る。得られたモノクローナル抗体製剤の精製は、血清の場合ほど煩わしくない。なぜなら、各不死化コロニーが１種類のみの抗体を分泌するであろうからである。いずれにしても、培養培地において他の蛋白質から抗体を単離するための標準的な精製技法を採用することができる。
【０１０１】
動物由来の不死化Ｂ細胞の培養液から直接免疫グロブリンを取得する代わりに、続く発現および/または遺伝子操作のために、不死化細胞を、再編成された重鎖および軽鎖座のソースとして用いることができる。再編成された抗体遺伝子は、適切なmＲＮＡから逆転写してｃＤＮＡを作製することができる。必要に応じて、重鎖定常領域は、異なるアイソタイプの領域と交換したり、または全体的に削除することができる。可変領域は、一本鎖Ｆｖ領域をコードするように結合することができる。多数のＦｖ領域は、複数の標的またはキメラ重鎖および軽鎖の組み合わせに対して結合能力を付与するように結合することができる。一旦、遺伝子材料が取得できれば、所望の標的を結合するそれらの能力を維持するアナログの設計は直接的となる。
【０１０２】
一旦、適切な遺伝子材料を得、必要に応じて、アナログをコードするように改変すれば、最小限、重鎖および軽鎖の可変領域をコードするものを含むコード配列を、標準的な組換え宿主細胞にトランスフェクトすることが可能なベクター上に含有された発現系に挿入することができる。そのような宿主細胞としては、種々の細胞を使用することができるが、効率的にプロセシングするためには、哺乳動物細胞が好ましい。この目的のために有用な典型的な哺乳動物細胞系列としては、ＣＨＯ細胞、２９３細胞またはＮＳＯ細胞が含まれる。次に、改変された組換え宿主を培養することによって、抗体またはアナログの作製を、宿主細胞の成長およびコード配列の発現に適切な培養条件下で行う。次いで、抗体を培養液から回収する。発現系は、得られた抗体が培地に分泌されるように単一のペプチドを含むようにデザインされることが好ましいが、細胞内作製も可能である。
【０１０３】
アナログを作製するための改変形態の免疫グロブリン遺伝子の慎重なデザインに加えて、ファージディスプレイ技法を利用して、所望の抗原のための種々の親和性を持つ抗体のレパートリーを含有するライブラリーを提供することができる。そのようなレパートリーを作製するためには、免疫化された動物からのＢ細胞を不死化する必要がある。むしろ、一次Ｂ細胞(primary B cells)を直接ＤＮＡのソースとして使用することができる。Ｂ細胞から得た、例えば、脾臓由来の、ｃＤＮＡの混合物を用いて発現ライブラリー、例えば、E. coliにトランスフェクトされるファージディスプレイライブラリーを作製する。得られた細胞を所望の抗原に対する免疫応答性について試験する。そのようなライブラリーからの高親和性抗体の同定のための技法は、Griffiths、EMBO J. 13（1994）、3245-3260；Nissim、同書692-698およびGriffiths、同書12、725-734に記載されている。結局、抗原に対して所望の大きさの結合アフィニティーを生成するライブラリーからのクローンを同定し、そのような結合を担う生成物をコードするＤＮＡを回収し、標準的な組換え発現のために操作する。ファージディスプレイライブラリーを、既に操作したヌクレオチド配列を用いて構築し、類似の方法でスクリーニングしてもよい。一般的に、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡは独立して供給されるか、または、ファージライブラリー中に作製するためのＦｖアナログを形成するように結合される。次いで、ファージライブラリーを、抗原に対して高親和性を持つ抗体についてスクリーニングし、適切なクローンから遺伝子物質を回収した。
【０１０４】
更なるスクリーニングによって、単離されたオリジナルの抗体の親和性を増加させることができる。抗体の組換え作製または所望のアナログを形成するための改変を行うために上記の操作を採用することができる。
【０１０５】
抗体およびそれらのアナログを本発明の方法によって得ることができる多数の抗原が存在する。これらは限定されるものではないが、下記の非限定的なセットが含まれる。
白血球マーカー、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤｌｌａ、ｂ、ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７およびそのリガンド、ＣＤ２８およびそのリガンドＢ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７．３、ＣＤ２９およびそのリガンド、ＣＤ３０およびそのリガンド、ＣＤ４０およびそのリガンドｇｐ３９、ＣＤ４４、ＣＤ４５およびアイソフォーム、Ｃｄｗ５２（Campath抗原）、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＴＬＡ−４、ＬＦＡ−１およびＴＣＲ；
組織適合抗原、例えば、ＭＭＣクラスＩまたはＩＩ、ルイスＹ抗原、Ｓｌｅｘ、Ｓｌｅｙ、ＳｌｅａおよびＳｅｌｂ；
インテグリンを含む接着分子、例えば、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ａｍｐ３、およびｐｌ５０、９５；
セレクチン、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＰ−セレクチンおよびそれらのカウンターレセプターＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＬＦＡ−３；
インターロイキン、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；
インターロイキンレセプター、例えば、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−ＳＲ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１４ＲおよびＩＬ−１５Ｒなど；
ケモカイン、例えば、ＰＦ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰｌａ、ＭＣＰ１、ＩＰ１０、ＥＮＡ−７８、ＮＡＰ−２、Ｇｒｏａ、Ｇｒｏｗ、およびＩＬ−８；
成長因子、例えば、ＴＮＦアルファ、ＴＧＦベータ、ＴＳＨ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＰＴＨｒＰ、ＥＧＦファミリー、ＦＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、エンドセリン、フィブロシン（Fibrosin）（ＦｓＦ）、ラミニン、およびガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）; 
成長因子レセプター、例えば、ＴＮＦアルファＲ、ＲＧＦベータＲ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ／ＶＰＦＲ、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＴＨｒＰＲ、  ＰＤＧＦＲファミリー、ＥＰＯ−Ｒ、ＧＣＳＦ−Ｒおよび他の造血性レセプター；
インターフェロンレセプター、例えば、ＩＦＮａＲ、ＩＦＮＰＲ、およびＩＦＮｙＲ；
Ｉｇｓおよびそれらのレセプター、例えば、ＩＧＥ、ＦｃｅＲＩ、およびＦｃｅＲＩＩ；
腫瘍抗原、例えば、her2-neu、ムチン、ＣＥＡおよびエンドシアリン（endosialin）；
アレルゲン、例えば、ハウスダスト、ダニ抗原、lol pl（イネ科植物）抗原、およびウルシオール；
ウイルス蛋白質、例えば、ＣＭＶ糖蛋白質Ｂ、Ｈ、およびｇＣＩＩＩ、ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質、ＲＳＶエンベロープ糖蛋白質、ＨＳＶエンベロープ糖蛋白質、ＥＢＶエンベロープ糖蛋白質、ＶＺＶエンベロープ糖蛋白質、ＨＰＶエンベロープ糖蛋白質、肝炎ファミリー表面抗原；
トキシン、例えば、シュードモナスエンドトキシンおよびオステオポンチン／ウロポンチン（uropontin）、ヘビ毒、クモ毒およびハチ毒；
血液因子、例えば、補体Ｃ３ｂ、補体Ｃ５ａ、補体Ｃ５ｂ−９、Ｒｈファクター、フィブリノゲン、フィブリンおよびミエリン関連成長インヒビター；
酵素、例えば、コレステロールエステル転移蛋白質、膜結合マトリックスメタロプロテアーゼ、およびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）；ならびに
種々の抗原、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドGM2,LMP1, LMP2、好酸球主要塩基性蛋白質、PTHrp、好酸球カチオン性蛋白質、pANCA、アマドリ蛋白質、コラーゲンタイプＩＶ、糖化脂質、Ａ７、糖蛋白質およびＦａｓ（ＡＦＯ−１）および酸化−ＬＤＬ。
【０１０６】
前記のように、免疫グロブリンまたはそのコードｃＤＮＡは、さらに改変してもよい。したがって、更なる態様において、本発明の方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、二重特異性抗体、融合抗体、標識抗体またはこれらのうちのいずれかのアナログを作製するステップのいずれかを含む。対応する方法は、当業者に公知であり、例えば、Harlow and Lane"Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor,1988.に記載されている。前記抗体の誘導体をファージディスプレイ技法によって取得する場合、BIAcoreシステムに採用されているような表面プラスモン共鳴を用いて、本明細書に記載の抗体のいずれかと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 （1996）、97-105; Malmborg、J. Immunol. Methods 183 （1995）、7-13）。キメラ抗体の作製は、例えば、国際公開公報W089/09622号に記載されている。ヒト化抗体の作製方法は、例えば、欧州特許A1 0 239 400号および国際公開公報W090/07861号に記載されている。本発明にしたがって使用することができる抗体のさらなる供給源は、いわゆる異種抗体である。マウス中のヒト抗体のような異種抗体を作製するための一般原理は、例えば、国際公開公報WO 91/10741号、WO 94/02602号、WO 96/34096号およびWO 96/33735号に記載されている。上記したように、本発明の抗体は、完全な形態の他に、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖の形態を含む種々の形態で存在することができる。例えば、国際公開公報WO88/09344号参照。本発明の抗体は、またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当該技術分野において公知の従来の技法を用いて、当該技術において公知の、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加および/または組換えおよび/または他の改変を単独もしくは組み合わせて用いて、さらに改変することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の根底にあるＤＮＡ配列にそのような改変を導入する方法は、当業者に公知である。例えば、Sambrook、 Molecular Cloning A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory （1989） N. Y. およびAusubel、Current Protocols in Molecular Biology、Green Publishing Associates and Wiley Interscience、N. Y.、（1994）参照。本発明の抗体の改変には、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化および炭水化物または脂質部分、共因子、などの付着を含む、側鎖改変、骨格改変、およびＮ末端およびＣ末端改変を含む１以上の構成アミノ酸における化学的および/または酵素的誘導体化が含まれる。同様に、本発明は、記載された抗体またはそのいくつかのフラグメントを、カルボキシ末端の免疫賦活性リガンドなどの異種分子に融合したアミノ末端に含む、キメラ蛋白質の製造を含む。対応する技術の詳細については国際公開公報WO00/30680を参照されたい。
【０１０７】
治療的用途としては、抗体は、薬学的に許容される投与形態で投与することができる。それらは、活性物質が所望の活性部位に到達することができるような、あらゆる手段で投与することができる。例えば、ボラスとして静脈投与によって、または時間をかけた点滴によって、筋肉内、皮下、関節内、滑膜内、経口、局所または吸入経路によって投与してもよい。抗体は一度に投与してもよいし、一連の治療として投与してもよい。非経口投与としては、抗体を溶液、懸濁液、エマルジョン、または凍結乾燥粉末を薬学的に許容される非経口賦形剤とともに製剤することができる。抗体が経口投与に適する場合、製剤は、例えば、デンプン、セルロース、シリカ、種々の糖類、炭酸マグネシウム、またはリン酸カルシウムのような好適な添加物を含有することができる。好適な賦形剤は、この分野の標準的な参考テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。
【０１０８】
疾患を予防または治療するための適切な投与量は、特定の抗体の薬物動力学的特徴、その投与形態および経路、レシピエントの年齢、体重および健康状態、治療される状態の種類および状態の重篤度および経過、治療回数、併用する治療および望まれる生理学的効果などの公知の因子に依存するであろう。
【０１０９】
さらに別の形態において、本発明は、上記のいずれかのようなＴＩＲＣ７アンタゴニスト／インヒビターを含むワクチンに関する。この態様は、ＴＩＲＣ７欠損マウスが、野生型同腹仔と比較して、in vitro およびin vivoで異なる刺激に対するＴおよびＢ細胞増殖応答が増加するという驚くべき所見に基づいている。実施例４〜７参照。特にタイプ１免疫応答が明白であった。したがって、本発明は、Moingeon、Vaccine 19（2001）、4363-4372に記載されているもののようなＴｈｌアジュバントの合理的デザインのための手段および方法を提供する。ワクチン成分としてのＴＩＲＣ７アンタゴニスト／インヒビターの製剤方法は、従来技術から導くことができる。例えば、Ragupathiら、in Vaccine 19 （2000）、530-537参照。この文献は、免疫学的アジュバント組成物の、抗体およびＴ細胞のＭＵＣ１−ＫＬＨとＧＤ３−ＫＬＨとの複合体でのワクチン化に対する反応への影響を記載している。したがって、同様に、ＴＩＲＣ７アンタゴニスト／インヒビターは、抗体および所望の抗原を含有するワクチンに対するＴ細胞の応答を論証するために用いることができる。これに関する別の実施例は、ブタのヘルペスウイルスワクチンに対する細胞の免疫応答を高めるためのインターロイキン１２を使用する。Zuckermann、Adv. Vet. Med. 41 (1999)、447-461参照。したがって、本発明は、アジュバントとしての上記ＴＩＲＣ７アンタゴニスト／インヒビターのいずれかの使用に関する。
【０１１０】
本発明は、以下に述べる実施例を参照してより理解されるであろう。しかし、それらは上記した請求の範囲により完全に記載している本発明を例示するにすぎず、限定するものでないことを当業者は理解するであろう。さらに、多くの書類を本明細書の本文において引用する。本明細書において引用した書類のそれぞれ（製造元の仕様書、説明書等を含む）は、本明細書において引用によって援用する；しかし、引用したいかなる書類も実際に本発明の先行技術であると認めているわけではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：ＴＩＲＣ７欠損マウスの作製
ＴＩＲＣ７の機能的重要性を特徴付けるために、相同標的遺伝子組換えによってＴＩＲＣ７座を破壊したマウスを作製した（Tivol、Immunity 3（1995）、541-547）。標的ベクターを構築し、それを用いて、ＴＩＲＣ７のエキソン２〜８をコードする配列を、ネオマイシン薬剤耐性遺伝子で置換した（図１Ａ）（Tivolら、1995）。標的遺伝子組換えは、Ｃ５７ブラックマウスにおいて、確立されているプロトコル（Capecchi、Science 244（1989）、1288-1292）にしたがって行った。株１２９マウス胚に由来するＥＳ細胞において、ＴＩＲＣ７のエキソン２〜８の２ｋｂのゲノムフラグメントを、ネオマイシン耐性遺伝子を含有するカセットを挿入することによって置換した。ＥＳ細胞のトランスフェクションと培養は、Foresterら（Cell 87（1996）、1037-1047）によって記載されているように行った。キメラのオスをＣ５７メスと交配させ、その子孫の遺伝子型を、サザンブロットに加えて、ネオマイシンカセット、エキソン９およびエキソン１１を検出するオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、尾のＤＮＡのＰＣＲによって確認した。破壊したＴＩＲＣ７遺伝子座にヘテロ接合の２種の動物の交雑雑種によって得られた子孫の遺伝子型同定は、ＴＩＲＣ７特異的プライマーを用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲによって示されるように行った（図１Ｂ）。ホモ接合突然変異子孫は、典型的なメンデルの頻度において産生された。ホモ接合子孫のＣＤ３陽性Ｔ細胞上のＴＩＲＣ７蛋白質欠如を、抗ＴＩＲＣ７抗体で染色し、続いてＦＡＣＳ分析することによって確認した（図１Ｃ）。ＴＩＲＣ７欠損マウスの表現型は、野生型同腹仔と比較して体重が有意に減少していることが証明された（図１Ｄ）。
【０１１２】
実施例２：ＴＩＲＣ７欠損マウスは、全ての単核細胞集団の減少を示す。
ＴＩＲＣ７発現の欠如が、リンパ器官内の細胞集団の発育に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ＴＩＲＣ７欠損およびＷＴ同腹仔から得た脾細胞の単細胞懸濁液のフローサイトメトリー分析を行った（図１Ｅ）。また、ＴＩＲＣ７蛋白質が欠如しているマウスにおいては、ＷＴマウスと比較して、単球の有意な減少が認められた（図１Ｆ）。
【０１１３】
無菌のワイヤーメッシュによって組織を粉砕し、５０ｍｍのフィルターを通過させることによって、マウス脾臓およびリンパ節からの単細胞の懸濁液を調製した。全ての処置は、１０％ウシ胎児血清（Biochom KG）、５ｍＭグルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（Gibco BRL）が補充されたＲＰＭＩ １６４０培地（Biochom KG）中で、無菌状態で行った。細胞を１００μｌのＰＢＳ中で４℃で３０分間染色し、その後分析を行う前に洗浄した。Waldropら（JCI 99（1997）、1739-1750）に記載のようにＦＡＣＳ分析を行った。細胞を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３ ｍＡｂおよび抗ＣＤ１９ ｍＡｂ、ＰＥ標識抗ＣＴＬＡ４、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ６２Ｌ、抗ＣＤｌｌａ、抗ＣＤ７１および抗ＣＤ８６モノクローナル抗体を含む蛍光色素複合抗体のパネルを用いて染色した。ＰｅｒＣＰ標識抗Ｂ２２０およびＡＰＣ標識抗ＣＤ４ ｍＡｂおよび抗ＣＤ８ ｍＡｂ抗体は、PharMingenから購入した。抗ＩＣＯＳ抗体は、Santa Cruz Biotechnologyから購入し、ロバＦ（ａｂ’）２抗ウサギならびにヤギＦ（ａｂ’）２抗マウス抗体は、Jackson Laboratoriesから購入した。分析は、FACScanフローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて行った。細胞は、Cell Questソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて分析した。
【０１１４】
実施例３：ＴＩＲＣ７欠損マウスの組織学的分析によって全ての免疫組織の萎縮が明らかになった。
図２Ａに示すように、ＴＩＲＣ７（-/-）マウスおよびＷＴ同腹仔から単離した脾臓の組織学的分析によれば、不均衡のＴおよびＢ細胞領域を持つ白脾髄の顕著な低形成が認められた。本質的にKarulinら、J. Immunol. 168（2002）、545-553に記載されている組織学的方法を用いた。ＷＴ同腹仔と比較して、ＴＩＲＣ７欠損マウスの脾臓においては、多くの大きなＰＡＬＳとＢ細胞が欠如した小さなＢリンパ性濾胞が観察された。にもかかわらず、ＴＩＲＣ７（-/-）脾臓のＢリンパ性濾胞では、胚中心数が増加していた。ＴＩＲＣ７（-/-）細胞の白脾髄低形成の後退に加えて、赤脾髄の形質細胞の過形成、顆粒球生成の向上と組み合わされたラッセル小体数の増加が明らかになった。これは、図１Ｆに示した、Ｇｒ−１陽性細胞画分数の増加の所見を支持するものである。図２Ｂに示したように、これらの所見は、ＴＩＲＣノックアウトマウスにおける形質細胞の過形成を証明する赤脾髄の免疫組織学的染色によって確認した。
【０１１５】
ＴＩＲＣ７（-/-）マウスおよびＷＴマウスから得た胸腺の組織学的分析によって、主に皮質における、異なるステージの萎縮が明らかになった。ＴＩＲＣ７（-/-）の胸腺細胞の崩壊およびアポトーシスは、ＷＴ同腹仔と比較して著明であった。ＴＩＲＣ７突然変異マウスリンパ球の皮質および傍皮質における、周辺リンパ節の構築的な構造は予備的に存在している。注目すべきことに、ＴＩＲＣ７欠損マウスの周辺リンパ節の傍皮質は、ＷＴ同腹仔とは対照的に、白脾髄での所見と同様に、アポトーシスのリンパ球の増加を示していた。
【０１１６】
実施例４：ＴＩＲＣ７の欠失によって、アロ抗原またはマイトゲンの存在下で、増殖性Ｔ細胞応答の有意な増加およびＴｈ１サイトカインの誘発が生じる。
特異的抗体を用いたＴＩＲＣ７シグナリングの調節は、ヒトＰＢＭＣのＴ細胞の増殖を阻害した（Utkuら、1998）。したがって、ＴＩＲＣ７欠損マウスが種々の抗原に対して応答し得るかどうかを評価した。ＷＴマウスおよび突然変異マウスからの脾臓（図３Ａ）およびリンパ節から単離した細胞でin vitroで、細胞増殖アッセイ（［３Ｈ］チミジン取り込みによって評価）を行った。Ｔ細胞増殖アッセイにおいては、リンパ球は、プレコーティングされたウェル内で１０μｇ/ｍｌの抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（PharMingen）によって、またはＰＨＡ（１μｇ/ｍｌまたは２μｇ/ｍｌ）（Sigma）を用いて、３７℃で４８時間９６ウェルプレート内で刺激した。培養物を０．５μＣｉ[３Ｈ]チミジン（ICN Biochemicals）でパルスし、１８時間のインキュベーション後、細胞を採取し、シンチレーションカウンターでチミジン取り込み（ｃｐｍ）を測定することによって、細胞増殖を調べた。図３Ａに示したように、ＴＩＲＣ７（-/-）マウスからの脾細胞では、ＷＴ脾細胞と比較して、抗ＣＤ３抗体のみ、または抗ＣＤ２８抗体との併用に対する増殖応答が有意に増加していた。同様に、ＰＨＡを用いた細胞の分裂促進活性の後、ＴＩＲＣ７（-/-）マウスから単離した細胞の増殖応答において用量依存的な増加が観察された。それは、野生型動物からの細胞で観察されたものをほぼ上回っていた（図３Ａのａおよびｂ）。２×１０６個/ｍｌのリンパ細胞懸濁液（脾臓またはリンパ節由来）を１．５μｇ/ｍｌのＰＨＡまたは１００ｎｇ/ｍｌのＬＰＳおよび１０ｎｇ/ｍｌの組換えＩＬ−４（PharMingen）を用いて、マイクロタイタープレート中で３７℃で４８時間インキュベートした。ＰＨＡ刺激された細胞の上清中でＩＦＮ−γおよびＩＬ−２サイトカインを測定した。サイトカインのレベルは、PharMingenから取得した捕獲、検出および標準的な抗体を用いて、ＥＬＩＳＡによって確認した。ＴＩＲＣ７（-/-）マウスからの脾細胞をＰＨＡ活性化した結果、野生型の同腹仔から単離した細胞のものと比較して、Ｔｈｌ特異性サイトカイン発現（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）の有意なアップレギュレーションが認められた（図３Ｂ）。
【０１１７】
実施例５：ＴＩＲＣ７欠失は、Ｔ細胞のいくつかの活性化分子および共刺激分子の発現に影響を及ぼす。
実施例２に記載のようにフローサイトメトリー分析を行った。リンパ球活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の発現分析により、ＴＩＲＣ７（-/-）マウスからの休止Ｔ細胞は、ＷＴ同腹仔からの対照Ｔ細胞と比較して、中等度の増加のみが示された（図４Ａ）。記憶Ｔ細胞集団および未処置Ｔ細胞集団の双方のマーカー分子を表すＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４の発現は、野生型の細胞と比較して、それぞれ僅かに減少および上昇することがわかった（図４Ａ）。ＣＤ１１ａ染色によって、ＴＩＲＣ７ノックアウトマウスからのＴ細胞におけるメモリー細胞集団が、野生型の同腹仔と比較して、有意に増加していることがわかった。休止Ｔ細胞は、ＣＤ１１ａがほぼ３倍高い集団であること（ノックアウトマウスで４．９％、野生型マウスで１．６％であった）、ならびに野生型Ｔ細胞集団（２８．６％）と比較して未処置のＴ細胞数が低い（１７．７％）ことがわかった（図４Ｂ）。図４Ｃ〜Ｄで証明したように、ＣＤ ４０Ｌ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＣＤ２８およびＩＣＯＳを含めて、ＴＩＲＣ７の欠失がＴ細胞上の共刺激分子に及ぼす影響を調べた。
【０１１８】
ＣＴＬＡ4分子は、その細胞表面発現と比較して、細胞内区画に高い濃度で存在することが記載されている。Alegre、J. Immunol. 157 （1996）、4762-4770参照。したがって、ＣＴＬＡ４発現分析は、ＦＡＣＳ分析として透過処理された、ならびに透過処理されていないリンパ球を用いて行った。ＣＴＬＡ４の細胞内および細胞表面を、Ｔ細胞の分裂促進的な活性化の４８時間後にＦＡＣＳ分析によって測定した。注目すべきことに、ＴＩＲＣ７（-/-）マウスからの活性化Ｔ細胞においては、ＣＴＬＡ４の最小限の細胞内ならびに細胞表面発現が測定可能であった（図４Ｃ、ａ〜ｃ）。対照的に、ＣＴＬＡ４発現は、ＷＴマウスにおいては影響がなく、４８時間の活性化後、アップレギュレートされた。ＷＴ同腹仔とは対照的に、ＴＩＲＣ７（-/-）細胞においては、ＣＤ２８およびＩＣＯＳ発現レベルは有意に減少した（図４Ｄ）。一方、ＴＩＲＣ７突然変異および野生型マウスからの、休止細胞Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞におけるＰＤ１およびＣＤ４０Ｌについては、発現において有意な変化は観察されなかった。
【０１１９】
複数の細胞表面分子が、クラスリンでコーティングされた賦形剤を介して、細胞表面に輸送されることが知られている。ＴＩＲＣ７の欠失が、クラスリンでコーティングされた賦形剤を介して、ＣＤ７１のような細胞表面に輸送されることが知られている分子に影響を及ぼすかどうかを調べるために、突然変異マウスおよびＷＴマウスからリンパ球を単離し、ＰＨＡで活性化した。ＣＤ７１の発現（図４Ｅ）をＦＡＣＳ分析によって測定した。ＴＩＲＣ７（-/-）細胞とＷＴマウスの間で、ＣＤ７１の発現の有意差は認められなかった。これらの結果は、ＴＩＲＣ７が、分子の、免疫応答に必須であることが知られている他のシグナリング経路を制御する異なるシグナルを輸送するかもしれないことを強く示唆するものである。
【０１２０】
実施例６：ＴＩＲＣ７が欠乏しているマウスは、in vivo で抗原に対してより感受性が高い。
遅延型過敏（ＤＴＨ）は、Ｔ細胞応答およびＴｈ−１サイトカインによって特徴的に媒介される。ＴＩＲＣ７の標的化は、これらのサイトカインの発現に影響を及ぼすことがわかっている。Utku、Immunity. 9（1998）、509-518参照。したがって、炎症および白血球補充の媒介におけるＴＩＲＣ７欠損の機能的影響を、in vivo での免疫応答の間にＤＴＨ反応によって調べた。マウスを、皮内注射によって免疫化の７日後、卵白アルブミンに感作し、８日目にマウスを攻撃し、足蹠の腫脹を測定した。卵白アルブミン（Sigma）に対するＤＴＨ反応を、Current Protocols in Immunologyに既述されているように足蹠の腫脹で評価した。簡潔に述べれば、フロイントの完全アジュバント（Sigma）に乳化させた５０μｌの５％（w/v）卵白アルブミン（ova）を、マウスの尾の基底部に注射して感作した。最初の免疫化から８日後、３０μｌの２％（w/v）ovaのＰＢＳ溶液をマウスの左の平面足蹠に攻撃し、３０μｌのＰＢＳのみで右の平面足蹠に攻撃した。両足蹠について、足蹠の厚さ（腫脹および紅斑）を測定し、ova注射した足蹠とPBS注射した足蹠の厚さの差として、ＤＴＨ反応の大きさを測定した。足蹠の腫脹は、攻撃の４８時間後がピークであった。それは、ＴＩＲＣ７ノックアウトマウスにおいて、野生型の同腹仔において観察されるものより有意に高かった（図５Ａ）。予見したように、Ｔｈ−１サイトカインのアッセイから、ＷＴ同腹仔と比較して、ovaで攻撃した後、４８時間マイトゲンで刺激したＴＩＲＣ７欠損マウス脾細胞のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２のレベルがさらに高いことが明らかになった。腫脹足蹠から得た皮膚の組織学的分析の結果、ＷＴ動物において、リンパ球の単核浸潤などの、予測された炎症の徴候が確認された。それは、図５Ｂに示すようにＴＩＲＣ７欠損マウスにおいて増加していた。
【０１２１】
実施例７：  ＴＩＲＣ７の欠失の結果、Ｂ細胞活性化および免疫グロブリンレベルが上昇する。
Ｂ細胞活性化におけるＴＩＲＣ７（-/-）の役割をさらに特徴付けるために、抗ＣＤ４０抗体のみ、またはＬＰＳとＩＬ−４との組み合わせを含む種々のＢ細胞刺激で４８時間インキュベーションした後、脾細胞のin vitroでの細胞増殖を測定した。Ｂ細胞増殖アッセイでは、リンパ球（２×１０６個/ｍｌ）を１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−４および、０．５μｇ/ｍｌの抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（Pharmingen）または０．２μｇ/ｍｌのＬＰＳ（Sigma）で４８時間刺激した。細胞を２μＣｉ[３Ｈ]チミジンでパルスし、１６時間後、細胞増殖を測定した。７日経過した培養物の上清中のＩｇＭおよびＩｇＧのレベルを、PharMingenから取得した捕獲、検出および標準的な抗体を用いて、ＥＬＩＳＡによって測定した。実施例２および４を参照。図６Ａに示されているように、ＴＩＲＣ７（-/-）脾細胞においては、ＷＴとは対照的に、全てのＢ細胞刺激の４８時間活性化した後、実質的に高いレベルの増殖が認められた。これは、ＷＴと比較してＩｇＭおよびＩｇＧ１の作製のレベルが増加したことに伴うものであった（図６Ｂ）。血液は、マウスの眼窩後神経叢から得た。ＩｇＭ、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡおよびＩｇＥの血清濃度を、PharMingenから取得した捕獲、検出および標準的な抗体を用いて、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＷＴと比較した突然変異マウスの血清中の免疫グロブリンレベル（Ｉｇ）をＥＬＩＳＡによって測定したところ、全ての免疫グロブリンサブクラスのレベルが上昇することがわかった。これは、突然変異マウスにおける顕著なＢ細胞活性化を支持するものである（図６Ｃ）。
【０１２２】
Ｂ細胞の共刺激分子の発現を分析するために、脾細胞をＬＰＳおよびＩＬ−４の存在下および非存在下でインキュベートし、ＣＤ８０およびＣＤ８６の表面発現をフローサイトメトリーによって検出した。図６Ｄに示されているように、ＷＴ同腹仔と比較して、ＣＤ８６は、ノックアウトマウスの休止Ｂ細胞においてアップレギュレートしたが、ノックアウトＢ細胞において、ＣＤ８０発現において、有意な変化は認められなかった。このことは、ＴＩＲＣ７がＢ細胞における明確なシグナリング経路を制御することを示している。
【０１２３】
実施例８：  マクロファージによって、ＴＩＲＣ７欠損マウスにおいて形態学的および機能的欠点が明らかになった。
図７Ａに示されているように、ＬＰＳおよびＩＬ−４での刺激の４８時間後、ＴＩＲＣ（-/-）腹膜マクロファージでは、野生型（ＷＴ）と比較して、増殖細胞（ＫＯ）の有意な減少が観察された。腹腔をＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し、マクロファージの数をNeubauer血球計数器を用いて測定した。１０％ウシ胎児血清、１ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびストレプトマイシン−ペニシリンが補充されたＲＰＭＩ１６４０培地中１×１０６個の細胞を、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）および組換えＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間刺激した。増殖細胞数を顕微鏡で定量化した。ＦＡＣＳによる貪食作用の分析によって、マクロファージおよび顆粒球の全体のパーセンテージが減少することが明らかになり、野生型との比較によるＴＩＲＣ７欠損細胞における貪食細胞を示している。ＴＩＲＣ７の欠損が、貪食作用能を減少させ得る細胞骨格に影響を与えるかどうかを分析するために、細胞骨格分子に対する複数の特異的抗体を用いてＴＩＲＣ７（-/-）マクロファージの共焦顕微鏡分析を行った。腹腔のマクロファージを３７℃で１時間、ポリ−Ｌ−リジン（１：１０、Sigma）で前処理したスライド上にコーティングし、２０分後４℃で４％ＰＦＡを用いて固定した。細胞を５％ミルクで室温で１時間ブロックし、室温で１０分間、ＰＢＳ/トリトン（１００ｘ、０．５％）で透過処理した。抗アクチン（１：５０、Santa Cruz）、抗チューブリン１：５０、Santa Cruz）および抗ビンキュリン（１：５０、Santa Cruz）ウサギポリクローナル抗体、またはＩｇＧウサギ対照抗体（１：５０、Santa Cruz）を用いて染色を行い、４℃で一晩インキュベートした。二次抗体、ｃｙ３標識抗ウサギ抗体（１：２５０、Dianova）を室温で１時間インキュベートした。Pascal ５共焦点顕微鏡を用いて染色を分析した。図７Ｂに示されているように、ＴＩＲＣ７欠損マクロファージは、試験した全ての細胞骨格蛋白質（アクチン、チューブリンおよびビンキュリン）で発現の欠損を示している。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ＴＩＲＣ７欠損マウスの作製（Ａ）胚幹細胞における標的遺伝子組換え。ＴＩＲＣ７遺伝子のエキソン２〜８を置換したネオマイシン耐性遺伝子を含有するベクターコンストラクトを用いた相同組換えによってＴＩＲＣ７欠損マウス作製した。（Ｂ）野生型（＋／＋）、ヘテロ接合型（＋／−）およびホモ接合型（（−／−））マウスからのゲノムＤＮＡの、分裂ＴＩＲＣ７遺伝子座についてのＰＣＲ分析。ＰＣＲプライマーを、欠失のある野生型配列、ネオマイシン耐性カセットおよび非欠失３’領域内に配置した。ＰＣＲによって、１．４ｋｂのフラグメント（野生型対立遺伝子）および１．２ｋｂフラグメント（ＴＩＲＣ７置換型対立遺伝子）がそれぞれ明らかになった。（Ｃ）ＴＩＲＣ７（−／−）リンパ球におけるＴＩＲＣ７発現の欠如。交差反応しているヒト抗ＴＩＲＣ７抗体を用いたマウスリンパ球のフローサイトメトリー分析から、野生型の同腹仔と比較して、ヘテロ接合型（＋／−）ではＴＩＲＣ７発現の有意な減少が、そしてＴＩＲＣ７欠損マウス（（−／−））ではＴＩＲＣ７発現の欠如が示された。（Ｄ）１４日目のＴＩＲＣ７欠損マウス（右）は、野生型の同腹仔（左）の体重の約３０％であることがわかった。（Ｅ）ＴＩＲＣ７欠損マウスおよび野生型（ＷＴ）マウスから単離した脾細胞をフローサイトメトリーで分析して、抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ、抗ＣＤ４ ＰｅｒＣＰ、および抗ＣＤ８ＡＰＣ、抗Ｂ２２０ ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ１９ ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ１４複合ｍＡｂｓを用いてリンパ球亜集団数を証明した。ＷＴ細胞と比較して、ＴＩＲＣ７が欠乏している細胞においては、休止Ｔ細胞およびＢ細胞集団のすべて、ならびに単球の有意な減少が認められた。Ｔ細胞数が減少しているにもかかわらず、ＣＤ４／ＣＤ８比には有意な変化が認められなかった。単球の分析としては、ＣＤ１４陽性細胞上にゲートを設定し、ＷＴ（１８８細胞）およびＴＩＲＣ７（−／−）（１００細胞）の単球集団の細胞数を、側方散乱対ＣＤ１４のドットプロットで示した。
【図２】ＴＩＲＣ（−／−）マウスの組織学的分析。（Ａ）ＴＩＲＣ７（−／−）およびＷＴ脾臓をヘマトキシリンおよびエオシンを用いて組織学的染色を行ったところ、ＷＴ同腹仔と比較して、ＴＩＲＣ７（−／−）（ＫＯ）脾臓の白脾髄の著しい低形成が認められた。さらに、ＷＴマウスと比較して、ＴＩＲＣ７（−／−）ノックアウトマウスでは、多数の大きなＰＡＬＳとＢ細胞が欠如した小さなＢリンパ性濾胞が認められら。（Ｂ）ＴＩＲＣ７（−／−）およびＷＴ脾臓の免疫染色では、ＷＴ脾臓と比較して、ＴＩＲＣ７欠損マウス（ＫＯ）では赤脾髄内に形質細胞の有意な過形成が明らかにされた。
【図３】ＴＩＲＣ７欠損マウスからのＴ細胞応答性亢進。（Ａ）ＴＩＲＣ７ノックアウトマウス（ＫＯ）および野生型（ＷＴ）マウスから単離した脾細胞において［３Ｈ］チミジンを用いて増殖を測定した。抗ＣＤ３ ｍＡｂのみ、または抗ＣＤ２８ ｍＡｂ（ａ）もしくはＰＨＡ（ｂ）との異なる濃度での組み合わせを用いて、４８時間、細胞を活性化した。野生型（ＷＴｏ）およびＴＩＲＣ７欠損マウス（ＫＯｏ）の未刺激Ｔ細胞は対照とした。野生型細胞ＴＩＲＣ７欠損細胞は、活性化刺激（ＫＯｓｔ）に応答して反応性亢進を示した。（Ｂ）脾細胞を単離し、未刺激のままにするか（ＷＴｏ、ＫＯｏ）またはＰＨＡで４８時間活性化し（ＷＴｓ；ＫＯｓｔ）、４８時間後培養上清を集めた。野生型マウスおよびＴＩＲＣ７（−／−）マウスからの脾細胞の上清中のＩＬ−２およびＩＦＮ−γサイトカイン産生をＥＬＩＳＡによって確認した。その結果は、３つの異なる野生型およびＴＩＲＣ７欠損動物をそれぞれ表している。ＴＩＲＣ７欠損細胞のすべてにおいてサイトカインレベルが有意に上昇していた。
【図４】ＴＩＲＣ７欠損マウスおよび野生型マウスから単離した休止Ｔ細胞での活性化マーカーの発現プロファイルの分析。（Ａ）野生型（＋／＋）およびＴＩＲＣ７欠損（（−／−））マウスから単離したＴリンパ球において、ＣＤ６９およびＣＤ２５ならびにＣＤ６２ＬおよびＣＤ４４の発現を、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびＰＥ標識抗体を用いたフローサイトメトリー分析によってそれぞれ確認した。それぞれのマーカー分子に対して陽性の細胞の割合を、各プロットの右上の象限に示す。抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ ｍＡｂを用いてＣＤ４陽性細胞上にゲートを設定した。（Ｂ）ＣＤ１１ａ発現の確認は、ＴＩＲＣ７ノックアウトマウス（−／−）およびＷＴ（＋／＋）マウスから単離した休止および活性化Ｔリンパ球で、ＦＩＴＣ−複合抗ＣＤ３ ｍＡｂおよびＰＥ複合ＣＤｌｌａ ｍＡｂを用いて、ＦＡＣＳによって行った。未処置および記憶細胞集団の割合は、各プロットの右上象限にボックスで示している。（Ｃ）ＴＩＲＣ７（−／−）マウスおよび野生型マウスから単離した脾細胞中のＣＴＬＡ−４発現をＦＡＣＳによって分析した。Ｔ細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３ ｍＡｂとＰＥ標識マウス抗ＣＴＬＡ−４ ｍＡｂとの組み合わせを用いて染色した。抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ ｍＡｂを用いてＣＤ４陽性細胞上にゲートを設定した。未刺激細胞の表面上でのＣＴＬＡ−４発現を示す（ａ）。４８時間のＰＨＡ活性化後、野生型の同腹仔（＋／＋）と比較して、ＴＩＲＣ７欠損マウス（−／−）の上昇は最小限にすぎない（ｂ）。また、野生型の同腹仔と比較すると、ＴＩＲＣ７欠損マウスにおいては、細胞内ＣＴＬＡ−４発現は不十分である（ｃ）。（Ｄ）野生型（＋／＋）およびＴＩＲＣ７欠損（−／−）マウスから単離した脾細胞を、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ標識ｍＡｂおよび抗ＣＤ２８−ＰＥ標識ｍＡｂを用いて染色することによってＣＤ２８の発現を確認した。ＩＣＯＳ Ａｂを用いてＩＣＯＳ染色を行った後、二次ヤギ抗マウスＰＥ標識Ａｂで染色を行った。（Ｅ）ＣＤ７１の発現を、ＣＤ４上にゲートを設定したフローサイトメトリー分析によって、野生型（＋／＋）およびＴＩＲＣ７欠損（−／−）マウスから単離した脾細胞において確認し、４８時間ＰＨＡで活性化後、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ標識ｍＡｂおよび抗ＣＤ７１−ＰＥ標識ｍＡｂで染色した。ＣＤ７１に対して陽性の細胞の割合を各プロットの右上の事象に示している。
【図５】ＴＩＲＣ７欠損マウスの抗原に対するin vivoでのＴ細胞の応答。（Ａ）抗原（卵白アルブミン（ovalbumin））に対する遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を、卵白アルブミンでの再攻撃の４８時間後、ＷＴおよびＴＩＲＣ７（−／−）マウスの足蹠の厚さを測定することによって、評価した。ova注入とＰＢＳ注入対照動物との間の足蹠の腫脹の差の率を評価した。ＴＩＲＣ７（−／−）マウスでは、ＷＴと比較して、左右の足蹠に有意な腫脹が認められた。（Ｂ）野生型マウス（ＷＴ）から得た足蹠皮膚の組織学的状態は、予測された中等度の実質細胞リンパ球の皮膚への浸潤が示された（ｄ）が、ＴＩＲＣ７（−／−）マウス（ＫＯ）は、網状層の重篤な血管周囲および実質細胞浸潤を示した。ＤＴＨ反応の二回目の抗原攻撃の４８時間後、切片を単離し、ヘマトキシリンおよびエオシン（（ｅ）表皮）で染色した。倍率１００ｘで示している。
【図６】ＴＩＲＣ（−／−）マウスにおけるＢ細胞活性化の上昇。（Ａ）種々の刺激、すなわち、抗体ＣＤ４０抗体のみおよびＬＰＳとＩＬ−４の組み合わせでインキュベート後、Ｂ細胞の増殖は、チミジン組み込みアッセイによれば、それぞれＷＴの同腹仔（ＷＴｓｔ）と比較して、非常に高レベルのＴＩＲＣ（−／−）Ｂ細胞（ＫＯｓｔ）応答を示していた（ＷＴｏおよびＫＯｏｈは対照としての未刺激の集団を示す）。（Ｂ）ＷＴマウスおよびＴＩＲＣ７欠損マウスから単離した抗ＣＤ４０刺激脾細胞の培養上清の免疫グロブリン濃度は、刺激したＷＴ（ＷＴｓｔ）または未刺激対照（ＷＴｏ、ＫＯｏ）と比較して、ＴＩＲＣ７（−／−）Ｂ細胞（ＫＯｓｔ）によって分泌されたＩｇＭおよびＩｇＧの有意に高いレベルを示している。上清のＩｇ濃度を刺激の７日目にＥＬＩＳＡによって測定した。（Ｃ）ＥＬＩＳＡによって、野生型およびＴＩＲＣ（−／−）マウス（▲）の血清中の種々のＩｇＧレベルを測定することによって、Ｂ細胞の活性化状態を調べた。野生型（△）およびＴＩＲＣ７欠損の３つの異なる動物からの結果は、ＴＩＲＣ７（−／−）マウスにおいて調べた免疫グロブリンの全てのレベルの上昇をそれぞれ示している。（Ｄ）Ｂ細胞での共刺激分子ＣＤ８６の発現を、ＬＰＳ／ＩＬ−４のin vitro刺激の２４時間後、ＦＡＣＳによって分析した。抗Ｂ２２０ ＰｅｒＣＰ、および抗ＣＤ８６ ＰＥ複合ｍＡｂで染色を行ったところ、ＣＤ８６がＴＩＲＣ７（−／−）欠損マウスからの細胞表面上の休止状態において既にアップレギュレーションしていることがわかる。矢印は、ボックス中の活性化されたＢ細胞の高ＣＤ８６集団の割合の確立を示す。
【図７】ＴＩＲＣ７欠損マウスにおいてマクロファージは、広範囲の形態学的および機能的欠陥を明らかにした。（Ａ）ＴＩＲＣ７（−／−）および野生型マウスの腹腔から単離したマクロファージは、刺激されないままにしておくか、あるいはＬＰＳおよびＩＬ−４で４８時間刺激した。ＴＩＲＣ７欠損マウスでは、刺激されない細胞集団からわかるように、マクロファージの数は有意に少なかった。刺激後、ＴＩＲＣ７（−／−）マクロファージは、ＷＴの同腹仔と比較して、異なる形態の増殖マクロファージを示していた。（Ｂ）ＴＩＲＣ７（−／−）および野生型マウス（＋／＋）から得たマクロファージにおけるチューブリン（ａ）、ビンキュリン（ｂ）およびアルファアクチン（ｃ）などの骨格蛋白質の免疫染色を示す共焦点顕微鏡画像から、ＴＩＲＣ７欠損細胞（−／−）におけるこれら全ての蛋白質の発現が減少していることが示された。
【図１Ａ−Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2005531500.tif 000008
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
2005531500.tif 000013
【図５Ａ】
2005531500.tif 000014
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2005531500.tif 000016
【図６Ｂ】
2005531500.tif 000017
【図６Ｃ】
2005531500.tif 000018
【図６Ｄ】
2005531500.tif 000019
【図７Ａ−１】
2005531500.tif 000020
【図７Ａ−２】
2005531500.tif 000021
【図７Ｂ】
2005531500.tif 000022
【国際調査報告】
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2005531500.tif 000024
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