(57)【要約】本発明は、商業的に有用な量の発現した蛋白質の製造のための哺乳動物細胞の成長用の化学的合成培地のための方法および組成物に関する。図（１）はグラフ表示により、本発明のＣＤＭ培地が４．５ｘ１０６個の細胞／ｍＬまでの高い細胞密度を７日目に維持できることを示す。
2005505240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養中の固定化哺乳動物細胞の成長に適する化学的合成培地（ＣＤＭ）であって、該培地が少なくとも１種もしくはそれ以上のメタバナジン酸アンモニウム、塩化カドミウム、硫酸カリウム第二クロム、クエン酸第二鉄、二酸化ゲルマニウム、モリブデン酸、塩もしくはアンモニウム塩、硫酸ニッケル、塩化ジルコニウムおよび／またはヒドロコルチゾン、或いはそれらのいずれかの適当な形態、塩、ハライド、水和物、溶液、懸濁液、乳化液、またはコロイドを含んでなる化学的合成培地。
【請求項２】
培養中の固定化哺乳動物細胞の成長に適する化学的合成培地における、該培地が少なくとも１種もしくはそれ以上のメタバナジン酸アンモニウム、塩化カドミウム、硫酸カリウム第二クロム、クエン酸第二鉄、二酸化ゲルマニウム、モリブデン酸、塩もしくはアンモニウム塩、硫酸ニッケル、塩化ジルコニウムおよび／またはヒドロコルチゾン、或いはそれらのいずれかの適当な形態、塩、ハライド、水和物、溶液、懸濁液、乳化液、またはコロイドを含んでなる改良。
【請求項３】
培養中の固定化哺乳動物細胞の成長に適する化学的合成培地であって、該培地が
を含んでなる、請求項１に記載の化学的合成培地。
【請求項４】
培養中の固定化哺乳動物細胞の成長に適する化学的合成培地であって、該培地が、３〜５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２〜０．４ｇ／Ｌの塩化カリウム、５〜７ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、３．５〜５．５ｇ／Ｌのグルコース（デキストロース）、０．０００００５〜０．００００２５ｇ／Ｌのビオチン、０．００２〜０．００４のアスコルビン酸、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのパントテン酸塩、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのコリン、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌの葉酸塩、０．００５〜０．０２ｇ／Ｌのイノシトール、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのナイアシンアミド、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのピリドキサール、０．０００２〜０．０００６ｇ／Ｌのリボフラビン、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのチアミン、０．０００００５〜０．００００２５ｇ／Ｌのシアノコバラミン、０．１〜０．４ｇ／Ｌのオキサロ酢酸、０．０１５〜０．０３５ｇ／Ｌのアラニン、０．０１〜０．０３５ｇ／Ｌのアスパラギン、０．０６〜０．１０ｇ／Ｌのアルギニン、０．０２〜０．０４ｇ／Ｌのアスパラギン酸塩、０．３〜０．５ｇ／Ｌのシステイン、０．０５〜０．２ｇ／Ｌのシスチン、０．８〜１．５ｇ／Ｌのグルタミン、０．０６〜０．０９ｇ／Ｌのグルタミン酸塩、０．０２〜０．０４ｇ／Ｌのグリシン、０．０３〜０．０５ｇ／Ｌのヒスチジン、０．０５〜０．２５ｇ／Ｌのイソロイシン、０．０５〜０．２５ｇ／Ｌのロイシン、０．０５〜０．２５ｇ／Ｌのリシン、０．０２〜０．０４ｇ／Ｌのメチオニン、０．０５５〜０．０７５のフェニルアラニン、０．０３〜０．０５ｇ／Ｌのプロリン、０．０３〜０．０５５ｇ／Ｌのセリン、０．０７〜０．１５ｇ／Ｌのスレオニン、０．００５〜０．０２５ｇ／Ｌのトリプトファン、０．０５〜０．１５ｇ／Ｌのチロシン、０．００００００５〜０．００００６０のバリン、セレン酸ナトリウム、０．０５〜０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．１５〜０．４５ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．０７５〜０．２ｇ／Ｌの燐酸ナトリウム、０．００００５〜０．００００９ｇ／Ｌの硝酸カリウム、０．０８〜０．２５ｇ／Ｌの塩化カルシウム、０．０５〜０．４ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、０．０５〜２ｇ／Ｌのインシュリン、２０〜８０ｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、１〜１００ｍｇ／Ｌのリノール酸、５〜２５ｇ／Ｌのエタノールアミン、１〜５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、１〜１０ｍｇ／ＬのＡＰＯトランスフェリンまたはクエン酸第二鉄、０．２〜２ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、０．３〜０．９ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１〜２ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸、２〜５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、１０〜２００ｍｇ／Ｌのキサンチン、１．５〜４．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含んでなる、請求項１に記載の化学的合成培地。
【請求項５】
請求項１に記載の化学的合成培地中で培養された哺乳動物細胞系統。
【請求項６】
請求項３に記載の細胞系統から発現した蛋白質。
【請求項７】
該蛋白質が治療用蛋白質または診断用蛋白質から選択される請求項４に記載の蛋白質。
【請求項８】
該蛋白質が免疫グロブリン、可溶性受容体、トランスメンブラン蛋白質、細胞質蛋白質、可溶性蛋白質、細胞外蛋白質、融合蛋白質、抗体融合蛋白質、またはそれらの断片もしくは部分から選択される請求項５に記載の蛋白質。
【請求項９】
該免疫グロブリンがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭから選択される請求項６に記載の蛋白質。
【請求項１０】
該ＩｇＧがＩｇＧ１、およびＩｇＧ２、およびＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される請求項７に記載の蛋白質。
【請求項１１】
該免疫グロブリン断片または部分がｆａｂ、ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖから選択される少なくとも１種である請求項６に記載の蛋白質。
【請求項１２】
該免疫グロブリンがげっ歯動物、ヒト、キメラ、ヒト化された、移植された、もしくは霊長類の免疫グロブリンまたはそれらの断片から選択される請求項６に記載の蛋白質。
【請求項１３】
請求項１に記載の化学的合成培地を含んでなる調合物。
【請求項１４】
請求項２に記載の化学的合成培地を含んでなる調合物。
【請求項１５】
請求項１に記載の化学的合成培地を含んでなる容器。
【請求項１６】
請求項２に記載の化学的合成培地を含んでなる容器。
【請求項１７】
化学的合成培地および少なくとも５種の塩化アルミニウム、メタバナジン酸アンモニウム、塩化バリウム、塩化カドミウム、塩化コバルト、硫酸カリウム第二クロム、硫酸第二銅、クエン酸第二鉄、二酸化ゲルマニウム、塩化マグネシウム、硫酸マンガン、モリブデン酸、塩もしくはアンモニウム塩、硝酸ニッケル、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化ルビジウム、塩化銀、弗化ナトリウム、硫酸亜鉛、および／またはヒドロコルチゾン、或いはそれらのいずれかの適当な形態、塩、ハライド、水和物、溶液、懸濁液、乳化液、またはコロイドを組み合わせて化学的合成培地を提供することを含んでなる、化学的合成培地を提供する方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により製造された化学的合成培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、引用することにより本発明の内容となる２００１年２月１５日に出願された米国仮出願第６０／２６８，８４９号に一部基づくものであり且つそれについて優先権を主張するものである。
【０００２】
バイオテクノロジー分野における本発明は、商業的に有用な量の発現した蛋白質の製造のための培養された哺乳動物細胞の成長のための化学的合成培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）を提供するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウシ血清が哺乳動物細胞培養において細胞成長および蛋白質製造を促進するために一般的に使用される。血清は高価であるため、例えばプリマトン（ｐｒｉｍａｔｏｎｅ）およびアルブミンのような未知組成（ｎｏｎ−ｄｅｆｉｎｅｄ）動物性原料が血清代替品として使用されていた。しかしながら、これらの未知組成動物性蛋白質の品質はバッチ毎に変動しそしてこれらの培地中で一貫した細胞成長を行うことは難しい。さらに、例えばプリオンおよびウイルスのような病原体はこれらの動物由来生成物の中に存在しうる潜在的感染剤として同定された（非特許文献１参照）。多くの規制が現在哺乳動物細胞内での血清または未知組成動物性蛋白質の使用に関するこれらの問題に課されている。
【０００４】
動物細胞の成長を維持するためには、種々の成分を培養培地中に含むことが必須である。例えば、グルタミンおよびグルコースは細胞成長を維持する基礎的エネルギー源である。これらの化合物の破壊がエネルギー発生経路、ＴＣＡサイクルおよびグリコール分解用の原料を与える。これらの経路の副生物は建築ブロックまたはバイオポリマー合成用の原料でもある（非特許文献２参照）。さらに、ビタミン、アミノ酸および成長因子もアポプトシスとして知られる自殺経路のカスケードを抑制することによりまたは細胞サイクルの進行を促進して細胞を複製可能にすることによる大量の細胞成長に必須である（非特許文献３参照）。
【０００５】
希元素も動物細胞の成長にとって重要である。希元素、例えば亜鉛、鉄、セレン、銅、モリブデン、およびマンガンなど、の添加が血清を含まない培地の過酷な条件下での動物細胞のクローニングおよび連続継代にとって重要であることが言及された（非特許文献４参照）。それにもかかわらず、動物細胞用の培地中での希元素の補充の重要性はあまり認識されていなかった（非特許文献５参照）。これは、血清または未知組成動物由来原料内に汚染不純物として希元素がすでに存在していたという前提によるかもしれない。
【０００６】
従って、細胞培養用の化学的合成培地および／または商業的に有用な量での異種蛋白質の製造を提供するための要望もある。
【非特許文献１】
Ｂａｌｔｅｒ，Ｍ．  ２０００，  Ｋｏｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６
【非特許文献２】
Ｐｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｂｕｌｔｅｒ  １９９４
【非特許文献３】
Ｆｒａｎｅｋ  Ｆ．  １９９４、Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２，  Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  １９９６，  Ｍｕｈａｍｅｄ  Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ  １９９８
【非特許文献４】
Ｈａｍ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｅｈａｎ  （１９７９）
【非特許文献５】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  １９８９，  Ｍｅｒｔｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｔｗｉｎ  １９９１
【発明の要旨】
【０００７】
本発明は、化学的合成培地（ＣＤＦ）調合物および未知組成動物由来原料（例えば、プリマトン、アルブミンおよびエキシサイト（Ｅｘｃｙｔｅ）（ＴＭ）、並びに血清から由来する他の同様な原料または他の動物由来蛋白質もしくは生成物であるが、それらに限定されない）を使用しない化学的合成培地を与えるある種の化合物、アミノ酸、脂質、炭水化物、希元素および／またはビタミンを与える方法を提供する。本発明のそのような培地組成物および調合物は骨髄腫および細胞培養物の成長を可能にしてそのような細胞培養物中で発現する商業的に有用な量の所望する蛋白質を提供する。従って、本発明は特定の培地、調合物並びにそれらの製造方法および使用方法、並びにそれらから製造される蛋白質を提供する。本発明は、化学的に定義され、より良く蛋白質を製造し、商業的に適しており、費用効果的であり、および／またはその中で成長する細胞系統中で製造される蛋白質に関する規制問題を減ずるという一つもしくはそれ以上の利点を与える培地を提供する。
【詳細な記述】
【０００８】
本発明は、既知の培地を越える利点を与え且つ哺乳動物細胞培養された蛋白質の商業的製造用に使用できる化学的合成培地を与える培地調合物および方法を提供する。本発明は、新規成分を含んでなり、並びに、または場合によりここに記載されており且つ可能なように当該技術で既知のものと組み合わせた少なくとも１種の特定のアミノ酸、脂質、炭水化物、希元素、ビタミン、化合物および／または蛋白質を含んでなる化学的合成培地（ＣＤＭ）も提供する。
【０００９】
本発明は、動物由来または未知組成動物由来の成分（例えば、プリマトン、アルブミンおよびエキシサイト、並びに組み換え、合成もしくは精製形態の血清もしくは他の動物蛋白質であるが、それらに限定されない）を含有する培地に関連する一つもしくはそれ以上の問題を回避する。
【００１０】
従って、本発明の化学的合成培地（ＣＤＭ）組成物および調合物は骨髄腫および他の細胞培養物の成長を可能にして商業的に有用な量のそのような細胞培養物中で発現した所望する蛋白質を与える。本発明はそれ故、完全に定義されていない動物由来原料を含んでなる既知の培地または既知の化学的合成培地と比べて、化学的に定義されており、費用効果的でありそして規制問題を軽減させる特定の培地調合物を提供する。
【００１１】
本発明の培地は、動物由来蛋白質を用いない特定成分の代替を包含する。好ましい態様では、「化学的合成培地」（ＣＤＭ）と称する本発明の培地は特定成分、例えば限定されないが希元素およびビタミンを含んでなる。本発明の培地は、適切な高い細胞密度成長、改良された成長速度、規模拡大される改良された成長、改良された生存率、規模拡大される改良された生存率、改良された蛋白質収率、規模拡大される改良された蛋白質収率などのうちの少なくとも一つを含むがそれらに限定されない有用性および改良を与える。
【００１２】
本発明に従い使用できる適切な細胞系統は形質転換または固定化された哺乳動物細胞系統である。そのような細胞系統は骨髄腫細胞系統、例えばＳｐ２／０、ＮＳＯ、ＮＳＩ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ａｇ６５３、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ細胞（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ−１８５１）、ＣＯＳ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳＳ−７（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６１０、ＣＨＯ  ＤＸＢ−１１、ＣＨＯ  ＤＧ４４）、ＢＳＣ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）細胞系統、ＨｅｐＧ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３，２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ２７３など、または上記のものの細胞融合体を包含するそれらから由来する細胞、例えば蛋白質製造細胞、例えばＢ−細胞、抗体製造細胞、単離もしくはクローニングされた脾臓もしくはリンパ節細胞などを包含できる。好ましい細胞系統はＳｐ２／０から由来しそしてここに記載されているようにＣ４６３Ａと表示される。
【００１３】
例えばここに表示されているもののような細胞系統を、既知の技術を用いておよび／またはここに記載されている通りにして、本発明に従う化学的合成培地に適応させることができる。そのような方法は、使用する特定の細胞系統および培地調合物により、１−３０日間または数ヶ月間かかりうる。しかしながら、本発明の化学的合成培地中で成長させるための哺乳動物細胞の適応は予期せぬことに既知の既知組成または未知組成培地のものより有意に短い時間で起きることが見出された。
【００１４】
本発明の培地の少なくとも１種の調合物は予期せぬことに、（１）種々の哺乳動物細胞系統からの改良されたまたは大量の成長および蛋白質または抗体製造を維持すること、（２）蛋白質製造細胞系統に対する容易な適応、（３）存在する必要がなくそして包含されない既知成分、例えばウシ血清およびエキシサイト、と比べて費用効果的な培地成分、並びに／または（４）培地成分が少なくともより良く定義されており、動物由来蛋白質または他の生成物を含まず、且つ感染剤を含有しないかもしくは潜在的に含有しないため規制認可に関する良好な適合性のうちの少なくとも１種を含む既知の培地と比べた数種の利点の少なくとも一つを与えることが発見された。
【００１５】
例えば培養皿、培養板、培養瓶、懸濁培養、スピンフィルター懸濁培養、バイオリアクター、灌流タイプバイオリアクター、哺乳動物細胞発酵培養、またはいずれかの他の適当なタイプの細胞培養を包含するがそれらに限定されない細胞培養技術におけるこの培地の使用も本発明に含まれる。
【００１６】
本発明の培地調合物は、指定された緩衝液、塩、炭水化物、ビタミン、蛋白質、アミノ酸、脂質、希元素、鉱物などのうちの少なくとも１種をここに記載されている通りにして当該技術で既知であるものと組み合わせて含む。
【００１７】
培地は、好ましくは、未知組成蛋白質−または動物−由来成分を含まない既知の哺乳動物またはハイブリドーマ細胞培養成分の他に、少なくとも１種もしくはそれ以上のメタバナジン酸アンモニウム、塩化カドミウム、硫酸カリウム第二クロム（ｃｈｒｏｍｉｃ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、クエン酸第二鉄、二酸化ゲルマニウム、モリブデン酸、塩もしくはアンモニウム塩、硫酸ニッケル、塩化ジルコニウムおよび／またはヒドロコルチゾン、またはそれらのいずれかの適当な形態、塩、ハライド、水和物、溶液、懸濁液、乳化液もしくはコロイド、粉末などを含んでなる。好ましい態様では、培地は既知成分の他に、少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、もしくは９種の上記成分を含んでなる。
【００１８】
そのような緩衝液の非限定的な例は、ＭＯＰＳ、燐酸ナトリウム、燐酸カリウム、ＨＥＰＥＳ、および他の既知緩衝液のうちの少なくとも１種を包含する。そのような緩衝液中に含まれる塩は塩化ナトリウム、塩化カリウムなどを包含するがそれらに限定されない。非限定的例を、１種もしくはそれ以上の塩、含水、無水または他の塩形態として、以下の表に表示する。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
そのような炭水化物はグルコース（デキストロース）、フルクトース、マンノース、ガラクトース、およびいずれかの他の適当な単糖、二糖、多糖、重合体、炭水化物などを包含するが、それらに限定されない。量の非限定的例は１種もしくはそれ以上の炭水化物成分に関して０．００００００１〜１００ｇ／Ｌである。
【００２１】
そのようなビタミンおよび補因子は、ビオチン、アスコルビン酸、パントテン酸塩、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、タミン、シアノコバラミン、Ｌ−アスコルビン酸および塩、Ｄ−ビオチン、カルシフェロール、コリン、コカルボキシラーゼ、補酵素Ａ、２−デオキシアデノシン、２−デオキシグアノシン、２−デオキシシチジン、エルゴカルシフェロール、フラビンアデノシンジヌクレオチド、ＦＡＤ、葉酸、Ｄ−グルコロン酸、ラクトン、Ｄ−グルコロン酸、グルタチオン、ミオ−イノシトール（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、哺乳動物組み換えインシュリン、メナジオン、５’メチルシトシン、ナイアシンアミド、ＮＡＤＰ、ＮＡＤ、ニコチン酸、オキサロ酢酸、ｐ−アミノ安息香酸、Ｄ−パントテン酸、ピロキシダル、ピロキシジン、酢酸レチノール、リボフラビン、α−トコフェロール、チアミン、チミジン、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＣＭＰ、ＣＤＰ、ＣＴＰ、ＴＭＰ、ＴＤＰ、ＴＴＰ、ビタミンＢ１２などを適当な形態、例えば塩、酸、塩基などの形態で包含しうるが、それらに限定されない。
【００２２】
そのような蛋白質またはアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸塩、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、およびそれらの塩もしくは他の誘導体を包含するが、それらに限定されない。或いは、そのようなアミノ酸は、Ｌ−α−アミノ−ｎ−酪酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｄ−グルコサミン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、タウリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンなど、並びにそれらの塩、水和物、水素化物、酸、塩基などを包含するが、それらに限定されない。
【００２３】
そのような希元素および鉱物は、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムなどの、塩（例えば、塩化物、ヨウ化物、臭化物、弗化物、ナトリウムもしくはカリウム塩、燐酸塩、塩など）、酸（例えば、酢酸塩、硫酸塩、硫化物、硝酸塩、窒化物、二酸化物など）、塩基（例えば、ＮａＯＨ、ＫＯＨなど）、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、燐酸ナトリウム、セレン、アルミニウム、メタバナジン酸アンモニウム、バリウム、カドミウム、塩化コバルト、硫酸カリウムクロム、硫酸第二銅、クエン酸第二鉄、二酸化ゲルマニウム、塩化リチウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、モリブデン酸、硝酸ニッケル、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化ルビジウム、塩化銀、弗化ナトリウム、塩化第一錫、珪酸ナトリウム、塩化錫、塩化チタン、硫酸亜鉛、オキシ塩化ジルコニウムなど、並びにそれらの塩を包含するが、それらに限定されない。
【００２４】
別の非限定的な例として、本発明のＣＤＭ培地の調合物は、３〜５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．２〜０．４ｇ／Ｌの塩化カリウム、５〜７ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、３．５〜５．５ｇ／Ｌのグルコース（デキストロ〜ス）、０．０００００５〜０．００００２５ｇ／Ｌのビオチン、０．００２〜０．００４のアスコルビン酸、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのパントテン酸塩、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのコリン、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌの葉酸塩、０．００５〜０．０２ｇ／Ｌのイノシトール、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのナイアシンアミド、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのピリドキサール、０．０００２〜０．０００６ｇ／Ｌのリボフラビン、０．００２〜０．００６ｇ／Ｌのチアミン、０．０００００５〜０．００００２５ｇ／Ｌのシアノコバラミン、０．１〜０．４ｇ／Ｌのオキサロ酢酸、０．０１５〜０．０３５ｇ／Ｌのアラニン、０．０１〜０．０３５ｇ／Ｌのアスパラギン、０．０６〜０．１０ｇ／Ｌのアルギニン、０．０２〜０．０４ｇ／Ｌのアスパラギン酸塩、０．３〜０．５ｇ／Ｌのシステイン、０．０５〜０．２ｇ／Ｌのシスチン、０．８〜１．５ｇ／Ｌのグルタミン、０．０６〜０．０９ｇ／Ｌのグルタミン酸塩、０．０２〜０．０４ｇ／Ｌのグリシン、０．０３〜０．０５ｇ／Ｌのヒスチジン、０．０５〜０．２５ｇ／Ｌのイソロイシン、０．０５〜０．２５ｇ／Ｌのロイシン、０．０５〜０．２５ｇ／Ｌのリシン、０．０２〜０．０４ｇ／Ｌのメチオニン、０．０５５〜０．０７５のフェニルアラニン、０．０３〜０．０５ｇ／Ｌのプロリン、０．０３〜０．０５５ｇ／Ｌのセリン、０．０７〜０．１５ｇ／Ｌのスレオニン、０．００５〜０．０２５ｇ／Ｌのトリプトファン、０．０５〜０．１５ｇ／Ｌのチロシン、０．００００００５〜０．００００６０のバリン、セレン酸ナトリウム、０．０５〜０．２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．１５〜０．４５ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．０７５〜０．２ｇ／Ｌの燐酸ナトリウム、０．００００５〜０．００００９ｇ／Ｌの硝酸カリウム、０．０８〜０．２５ｇ／Ｌの塩化カルシウム、０．０５〜０．４ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、０．０５〜２ｇ／Ｌのインシュリン、２０〜８０μｇ／Ｌのヒドロコルチゾン、１〜１００ｍｇ／Ｌのリノール酸、５〜２５μｇ／Ｌのエタノールアミン、１〜５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム、１〜１０ｍｇ／ＬのＡＰＯトランスフェリンまたはクエン酸第二鉄、０．２〜２ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、０．３〜０．９ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム、０．１〜２ｍｇ／Ｌのミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、２〜５ｍｇ／Ｌのヒポキサンチン、１０〜２００ｍｇ／Ｌのキサンチン、１．５〜４．５ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムを含んでなる。
【００２５】
本発明の培地を提供するために変更できる既知の血清を含まないハイブリドーマ培地は、例えばシグマ／アルドリッヒ（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）製品番号Ｓ２７７２、Ｓ２８９７およびＳ８２８４（ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）を包含するがそれらに限定されず、同様な既知の血清を含まない培地はメリーランド州、ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ）およびカンサス州、レネキサのＪＲＨバイオサイエンセス（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ｗｗｗ．ｊｒｈｂｉｏ．ｃｏｍ）からのものを包含する。例えば、既知の血清を含まないハイブリドーマ細胞培養物は、他の血清を含まない哺乳動物細胞培養成分の他に，ＨＥＰＥＳまたはＭＯＰＳ、炭酸水素ナトリウム、Ｌ−グルタミン、コレステロール、インシュリン、ＢＳＡ、トランスフェリンまたはクエン酸第二鉄を含むことができる。例えば、引用することにより本発明の内容となるＳＩＧＭＡ  ｃａｔａｌｏｇ，  １９９８，  ｐｐ１７７６−１７７７，１６７７−１７０４，１７１５−１７５５，１７９５−１８４７を参照のこと。本発明のＣＤＭを与えるために変更できる既知の血清を含まない培地の非限定的例は下記のシグマ培地製品番号Ｓ２７７２、Ｓ２８９７およびＳ８２８４を包含するが、それらに限定されない。
【００２６】
【表２】
2005505240.tif 000004
【００２７】
例えば、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５３：２８８−１９３  （１９６５）；  Ｍｙｏｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２５：４７７−４８０  （１９８９）を参照のこと。
【００２８】
より好ましくは、培地は、さらに、緩衝液、塩、炭水化物、アミノ酸、脂質、ビタミン、補因子などよりなる群から選択される少なくとも１種を適当な形態で含んでなる。本発明に従い変更できる適する培地は、以上で挙げられたシグマ、ライフ・テクノロジーズまたはＪＲＨバイオサイエンセスにより提供されるような、アイスコフ変更培地（Ｉｓｏｃｏｖｅ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍｅｄｉａ）、ダルベッコ変更イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ−１２培地（Ｈａｍ‘ｓ  Ｆ−１２  ｍｅｄｉａ）の１種もしくはそれ以上または組み合わせを包含しうる。非限定的例は以下のものを包含するが、それらに限定されない：
【００２９】
【表３】
2005505240.tif 000005
【００３０】
例えば、Ｉｓｃｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １４７：９２３−９３３  （１９７８）；  Ｉｓｃｏｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １２６：１２１−１２６（１９８０）を参照のこと。
【００３１】
【表４】
2005505240.tif 000006
【００３２】
例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８：３９６−３９７  （１９５９）；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｄ．，  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．，  Ｖｏｇｔ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ，Ｒ．（１９６０）．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：１８５−１９６  （１９６０）；  Ｍｏｒｔｏｎ，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ６：８９  （１９７０）；  Ｒｕｔｚｋｙ  ａｎｄ  Ｐｕｍｐｅｒ，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ９：４６８  （１９７４）を参照のこと。
【００３３】
【表５】
2005505240.tif 000007
【００３４】
例えば、Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ，  Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １０２：２５５−２７０（１９８０）を参照のこと。
【００３５】
哺乳動物細胞発現に適しているかまたは所望する蛋白質を細胞培養において本発明に従う培地を用いて使用することができる。そのような蛋白質の非限定的例は治療用または診断用蛋白質、例えば真核細胞または原核細胞蛋白質を包含するが、それらに限定されない。好ましい蛋白質はサイトカイン類、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、可溶性受容体、インターロイキン類、成長因子などを包含するが、それらに限定されない。
引用文献
ここに引用された全ての文献または特許は、それらが本発明の時点での最新技術を示すためおよび／または本発明の説明および可能性を与えるため、引用することにより本発明の内容となる。文献は科学もしくは特許文献または全ての記録された、電子もしくは印刷された形式を包含するいずれかの媒体形式で入手できる他の情報をさす。下記の参考文献は引用することにより本発明の内容となる：Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  ＮＹ  （１９８７−１９９９）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）；  Ｃｏｌｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹ  （１９９４−１９９８）；  Ｃｏｌｌｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹ，  ＮＹ  （１９９７−１９９９）。
【実施例】
【００３６】
実施例１：適応した細胞系統を用いる本発明の化学的合成培地中での蛋白質の製造
Ｃ１６８Ｏと称する骨髄腫細胞系統を製造するＩｇＧ蛋白質は、例えばエキシサイト（Ｅｘｃｙｔｅ）などのような充分に定義または同定されていない動物蛋白質由来調合物を含有する既知の血清を含まない培地の培地成分が必要であるために、ＩｇＧの商業的製造のためまたは適切な規制認可のためには完全には適していない。このエキシサイト依存性は、既知組成脂質または他の成分を加えることにより軽減することができなかった。しかしながら、エキシサイトを除去しそして希元素／ビタミン類を補充する場合には、Ｃ１６８Ｏの大量の成長が得られた。プリマトン、アルブミンおよびエキシサイトを含まないが希元素およびビタミン類が補充されたこの培地をここでは「ＣＤＭ」と称する。ＣＤＭ培地中でのＣ１６８Ｏの半バッチ培養は、ＣＤＭ培地が高い細胞密度成長および高いＩｇＧ生産の両方を維持できたことを示した。
【００３７】
Ｃ４６３Ａと称する別の骨髄腫細胞系統は種々の商業用の化学的合成培地の中で成長可能である。しかしながら、この成長はＩｇＧの商業的製造または適切な規制認可には完全には適していなかった。Ｃ４６３ＡはＳｐ２／０から由来しそして将来商業用に適する細胞系統を開発するためのトランスフェクション宿主として使用することができる。半バッチ培養では、本発明のＣＤＭ培地のＣ４６３Ａの細胞密度は一般的に、他の試験した化学的合成培地中の１ｍｌ当たり３００万〜４００万と比べて、１ｍｌ当たり６００万〜７００万に達した。生存率は全ての試験した培地の中で同様である（８０％〜９０％）。明らかに、ＣＤＭは他の化学的合成培地より高い密度で細胞成長を維持する能力を有する。
【００３８】
化学的合成培地中でＳｐ２／０細胞から由来する細胞系統を適応させることは冗長な工程である。それを得るために一般的には数ヶ月ないし１年かかる。ＣＤＭ培地が使用される場合には、適応時間の長さは他の化学的合成培地よりはるかに短かったことに我々は注目した。ある場合には、ＣＤＭ培地を得るために、これまでの実験からの数ヶ月と比べて数週間しかかからなかった。
【００３９】
要約すると、我々はウシ血清および未知組成動物由来原料の不存在下での骨髄腫細胞の成長にとって希元素およびビタミンが必須であることを見出した。既知組成調合物は適当な血清を含まない培地系に対する希元素およびビタミン類の添加に基づき製造された。この調合物は数種の利点を与える：１．種々の骨髄腫および他の細胞系統の大量の成長およびＩｇＧまたは他の蛋白質製造を維持すること、２．哺乳動物細胞、例えば、Ｓｐ２／０−由来ＩｇＧまたは蛋白質製造細胞系統、への容易な適応、３．例えばウシ血清およびエキシサイトのような高価な成分が含まれないため費用効果的であること、並びに４．潜在的感染剤が含まれないため規制に沿いやすいこと。
【００４０】
灌流タイプバイオリアクターまたは他のタイプの細胞培養中でのこの培地の使用は本発明に従い可能である。
ＣＤＭ培地の調合物
本発明のＣＤＭ培地の調合物は以下の通りにして、例えば表Ａ−Ｂのようにして、提供される。表Ａ１は培地を製造するために加えられる成分を示す。表Ａ２−Ａ３およびＢ１−Ｂ４は表Ａ１で使用された追加調合物に関する成分のリストを示す。これらの成分は、個別成分として、または販売元から、例えばシグマ（米国、ミズーリ州、セントルイス）、アルドリッヒ（米国、ミズーリ州、セントルイス）、ＪＲＨバイオサイエンセス（米国、カンサス州、レネキサ）などから発注可能な注文調合物として、入手できる。
【００４１】
【表６】
2005505240.tif 000008
【００４２】
製造指示：上記の順序で成分を加える。水酸化ナトリウムは同じに日に製造すべきである。
註：ｐＨ調節前に、ｐＨ＝６．７−６．８であった。液体貯蔵溶液の密度は水と同じである（ｐ−１ｇ／ｍｌ）である。従って、容量または重量は選択的に使用することができる。
Ｓ１  ｐＨ：  ７．３−７．６
Ｓ１  Ｏｓｍ：  ３０５−３６８
【００４３】
【表７】
2005505240.tif 000009
【００４４】
【表８】
2005505240.tif 000010
【００４５】
表Ａ１に従い、成分ＣＨ−２，Ａ部（１８．８ｇｍ／Ｌ、表Ａ２）およびＢ部（１０ｍｌ／Ｌ（１００Ｘ）、表Ａ３）を加え、引き続きＮａＨＣＯ３（３．０２ｇ／Ｌ）、ウシＡＰＯトランスフェリンまたはクエン酸第二鉄（５ｍｇ／Ｌ）、プルロニックＦ６８（０．８ｇ／Ｌ）、ＮａＯＨ（０．７ｇ／Ｌ）、エタノールアミン（１０μｌ／Ｌ）、グルタミン（０．２９ｇ／Ｌ）、ミコフェノール酸（０．５ｍｇ／Ｌ）、ヒポキサンチン（２．５ｍｇ／Ｌ）、キサンチン（５０ｍｇ／Ｌ）、ヒドロコルチゾン（２０μｇ／Ｌ）、ビタミン（１００Ｘ、１０ｍｌ／Ｌ、表Ｂ１）、希少鉱物１（１０００Ｘ、０．３３−１．０ｍｌ／Ｌ、表Ｂ２）、希少鉱物２（１０００Ｘ、０．３３−１．０ｍｌ／Ｌ、表Ｂ３）、希少鉱物３（１０００Ｘ、０．３３−１．０ｍｌ／Ｌ、表Ｂ４）を加えることにより、ＣＤＭ培地を製造する。本発明のＣＤＭ培地のこの例では、希元素の操作濃度は０．３３−１．００Ｘであり、そしてビタミンに関しては１Ｘである。
【００４６】
【表９】
2005505240.tif 000011
【００４７】
【表１０】
2005505240.tif 000012
【００４８】
【表１１】
2005505240.tif 000013
【００４９】
【表１２】
2005505240.tif 000014
【００５０】
この実験では、商業用の化学的合成培地であるギブコ／ライフ・テクノロジー（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からのＣＤ−ハイブリドーマを対照培地として使用した。半バッチ成長プロフィル（実験３日後に７５％培地交換が毎日行われた）を開始してＣＤＭ培地に対する種々の添加剤の効果を測定した。この比較用には、５日目のデータを使用した。
【００５１】
【表１３】
2005505240.tif 000015
【００５２】
他の試験した化学的合成培地と比べてＣＤＭ培地は最良に作用する。
【００５３】
別の半バッチ成長プロフィル実験を開始して他の商業用の化学的合成培地に対してＣＤＭ培地中でのＣ４６３Ａの成長性能を比較した。３日目およびその後の培地交換は表１で言及されたものと同様である。
【００５４】
表ＩＩは、半バッチ実験の５日目に集められた結果を示す。ＣＤＭ培養物はグループの中で最高の生存密度および合計密度に達した。ＣＤＭ培地中のＣ４６３Ａ生存率も８２％で４種の培養の中で最高であった。この実験の結果は、ＣＤＭ培地がＣ４６３Ａ成長を最も良く維持することを示している。
【００５５】
【表１４】
2005505240.tif 000016
【００５６】
ＣＤＭ培地はレミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）製造細胞系統であるＣ１６８Ｏの高い細胞密度成長およびＩｇＧ製造を維持する。
【００５７】
ＣＤＭ培地が我々の新しい宿主細胞系統中で細胞を促進させることが測定されたら、攪拌機中の半バッチ実験をＣ１６８Ｊから由来するレミケード製造細胞系統であるＣ１６８Ｏに対して開始した（例えば、参照）。図Ａは、ＣＤＭが７日目に４．５ｘ１０６個の細胞／ｍＬまでの高い細胞密度を維持できることを示す。図Ｂでは、ＣＤＭ培地に関する比生産量は１６ｕｇ／１０６個の細胞／日である。図Ｃは４〜５ｘ１０６個の細胞／ｍＬの間の高い細胞密度では、ＩｇＧ生産量は６０ｕｇ／ｍＬより上に達したことを示している。ＣＤＭ攪拌培養の生存率は図Ｄに示されているように実験全体を通して７５％より高いままであった。
ＣＤＭ培地中の急速適応
これまで、化学的合成培地に対する骨髄腫細胞系統の適応は難しくそして完了させるために１年間までかかることがある。ＣＤＭ培地を用いると、適応期間は数週間に短縮された。以下で、表ＩＩＩは約４−５週間の短い期間内でＣＤＭ培地に適用された別のＩｇＧ−製造細胞系統であるＣ３８０Ｃを示す。ＣＤＭ培地中のＣ３８０Ｃ維持安定後に、生存率は９０％より高く保たれそして倍加時間は３０−３５時間内のままであった。ＣＤＭ中のＣ３８０Ｃの比生産量および過剰成長ＩｇＧ力価はＩＭＤＭｗ／５％ＦＢＳ培地の中で成長した場合より高い。
【００５８】
【表１５】
2005505240.tif 000017
【００５９】
参考文献
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本発明を以上の記述および実施例に特に記載されたもの以外でも実施できることは明らかであろう。本発明の多くの改変は上記の教示に照らして可能であり、従ってそれらは添付された特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、グラフ表示により本発明のＣＤＭ培地が７日目に４．５ｘ１０６個の細胞／ｍＬまでの高い細胞密度を維持できることを示す。
【図２】図２は、グラフ表示によりＣＤＭ培養物に関する比生産量が１６μｇ／ｍＬであることを示す。
【図３】図３は、４−５ｘ１０６個の細胞／ｍＬの間の細胞密度において６０μｇ／ｍＬより高い値に達したことを示す。
【図４】図４は、グラフ表示によりＣＤＭ攪拌培養物の生存率が実験全体にわたり７５％より高いままであったことを示す。
【００６１】
図１−４には、プリマトン、アルブミンを含まないＳＦＭ８中のＣ１６８Ｏおよび比較用の対照としてのＳＦＭ８中のＣ１６８Ｊのデータが含まれる。
【図１】
2005505240.tif 000018
【図２】
2005505240.tif 000019
【図３】
2005505240.tif 000020
【図４】
2005505240.tif 000021
【国際公開パンフレット】
2005505240.tif 000022
2005505240.tif 000023
2005505240.tif 000024
2005505240.tif 000025
2005505240.tif 000026
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2005505240.tif 000049
2005505240.tif 000050
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505240.tif 000051
【国際調査報告】
2005505240.tif 000052