(57)【要約】高感度かつ高速な分析物検出のための微粒子ベースの増幅（ＭＢＡ）について記載する。ＭＢＡは、この表面上の複数の位置に接着した複数の分析物結合分子と組み合わせて、微粒子（１０）の表面（１５）上の複数の位置に接着した複数の情報伝達分子（２０）を含むシグナル増幅微粒子（１０）の使用によって達成されるシグナル増幅に基づいている。続いて、それぞれの情報伝達分子はアクリジニウムなど、その分子に接着した複数のシグナル放出部分（２５および２８）を有する。これは分析物を含む複合体、シグナル増幅微粒子、および分離微粒子が形成されるように、その表面に接着した分析物結合分子も備える強磁性粒子などの分離微粒子と組み合わされる。
2005534006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を検出するための微粒子であって、
該微粒子と結合した第１の結合体化ドメインと、複数のシグナル放出部分と結合したシグナル結合ドメインとを含むシグナル分子を備えるシグナル増幅微粒子と、
該分析物と、該微粒子と結合した第２の結合体化ドメインとを結合する分析物結合ドメインを含む分析物結合分子と、
を備える微粒子。
【請求項２】
少なくとも１つの前記第１の結合体化ドメインおよび前記第２の結合体化ドメインが、前記シグナル増幅微粒子の表面の官能基に架橋結合される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３】
前記シグナル増幅微粒子の表面上の官能基に架橋結合された第１の接着部分を介して、前記第１の結合体化ドメインが前記シグナル増幅微粒子に結合され、該シグナル増幅微粒子の表面上の官能基に架橋結合された第２の接着部分を介して前記第２の結合体化ドメインが該シグナル増幅微粒子に結合される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項４】
前記第１の接着部分および前記第２の接着部分の少なくとも一方が、オリゴヌクレオチドから構成される、請求項３に記載の微粒子。
【請求項５】
前記第１の接着部分および第２の接着部分の各々が、オリゴヌクレオチドから構成される、請求項３に記載の微粒子。
【請求項６】
前記第１の接着部分および第２の接着部分の少なくとも一方が、第１のオリゴヌクレオチド配列から構成され、前記第１の結合体化ドメインおよび第２の結合体化ドメインの少なくとも一方は、それぞれ該第１のオリゴヌクレオチド配列に対して相補的な第２のヌクレオチド配列から構成される、請求項３に記載の微粒子。
【請求項７】
前記第１の接着部分が第１のオリゴヌクレオチド配列から構成され、前記第１の結合体化ドメインが該第１のオリゴヌクレオチド配列に対して相補的な第２のヌクレオチド配列から構成され、前記第２の接着部分は第３のオリゴヌクレオチド配列から構成され、さらに前記第２の結合体化ドメインは、該第３のオリゴヌクレオチド配列に対して相補的な第４のヌクレオチド配列から構成される、請求項３に記載の微粒子。
【請求項８】
前記第１のオリゴヌクレオチド配列が前記第３のオリゴヌクレオチド配列とは異なる、請求項７に記載の微粒子。
【請求項９】
前記第１のオリゴヌクレオチド配列が前記第３のオリゴヌクレオチド配列と同一である、請求項７の微粒子。
【請求項１０】
前記シグナル分子の前記シグナル結合ドメインが、ポリヌクレオチド、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、ポリヒスチジン、ポリアミノ糖類、スペルミン、スペルミジン、および複数のアミン側鎖官能基を有するポリペプチド類から成る群から選択されるポリマーから構成される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項１１】
前記シグナル分子がさらに前記第１の接着部分を結合する前記第１の結合体化ドメインを形成する第１の核酸配列から構成され、該第１の接着部分が該第１の核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列から構成される、請求項１０に記載の微粒子。
【請求項１２】
前記シグナル分子が、前記第１の接着部分を結合する前記第１の結合体化ドメインを形成する第１の核酸配列から構成され、該第１の接着部分が該第１の核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列から構成され、該シグナル分子が前記シグナル結合ドメインを形成する第２の核酸配列からさらに構成される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項１３】
前記シグナル分子の前記シグナル結合ドメインが、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｅ）、ポリグリコネート、および複数のカルボキシル側鎖官能基を有するポリペプチド類から成る群から選択されるポリマーから構成される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項１４】
前記シグナル分子が前記第１の接着部分を結合する前記第１の結合体化ドメインを形成する第１の核酸配列からさらに構成され、該第１の接着部分が該第１の核酸の配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列から構成される、請求項１３に記載の微粒子。
【請求項１５】
前記複数のシグナル放出部分が化学発光部分、リン光部分、エレクトロルミネッセント部分、および蛍光性部分から成る群から選択される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項１６】
前記複数のシグナル放出部分は第１の条件下ではシグナルを放出せず、該第１の条件とは異なる第２の条件下でシグナルを放出する、請求項１５に記載の微粒子。
【請求項１７】
前記第１の条件および第２の条件の少なくとも一方が、それぞれ他方の第２の条件および第１の条件に対して酸化状態である、請求項１６に記載の微粒子。
【請求項１８】
前記複数のシグナル放出部分がアクリジニウム残基から構成される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項１９】
前記シグナル結合ドメインが核酸配列から構成され、前記複数のシグナル放出部分が該シグナル結合ドメインの該核酸配列に結合したアクリジニウム残基から構成される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項２０】
前記複数のシグナル放出部分がフルオレセイン残基から構成される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項２１】
前記シグナル分子の前記シグナル結合ドメインが１シグナル分子当たり少なくとも１０個のシグナル放出部分と結合する、請求項１に記載の微粒子。
【請求項２２】
前記シグナル分子の前記シグナル結合ドメインが１シグナル分子当たり少なくとも５０個のシグナル放出部分と結合する、請求項１に記載の微粒子。
【請求項２３】
前記シグナル分子の前記シグナル結合ドメインが１シグナル分子当たり少なくとも１００個のシグナル放出部分と結合する請求項１に記載の微粒子。
【請求項２４】
前記シグナル分子の前記シグナル結合ドメインが１シグナル分子当たり少なくとも１５０個のシグナル放出部分と結合する請求項１に記載の微粒子。
【請求項２５】
前記分析物結合分子が分析物を結合する抗体を有し、前記分析物は抗原を備える、請求項１に記載の微粒子。
【請求項２６】
前記抗体がオリゴヌクレオチドと結合し、該オリゴヌクレオチドは前記第２の結合体化ドメインを形成する、請求項２５に記載の微粒子。
【請求項２７】
前記抗体がポリクローナル抗体から構成される、請求項２５に記載の微粒子。
【請求項２８】
前記抗体がモノクローナル抗体から構成される、請求項２５に記載の微粒子。
【請求項２９】
前記分析物結合分子が前記分析物を結合する抗原から構成され、該分析物は抗体から構成される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３０】
前記抗原がオリゴヌクレオチドと結合し、該オリゴヌクレオチドは第２の結合体化ドメインを形成する、請求項２９に記載の微粒子。
【請求項３１】
前記抗原がキャリア分子と結合体化し、該キャリア分子はオリゴヌクレオチドと結合し、該オリゴヌクレオチドは第２の結合体化ドメインを形成する、請求項２９に記載の微粒子。
【請求項３２】
前記分析物結合分子が前記分析物と結合する第１の核酸配列から構成され、該分析物は第１の核酸配列と相補的な標的核酸配列から構成される、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３３】
前記分析物結合分子が第２の核酸の配列でさらに構成され、該第２の核酸配列は第２の結合体化ドメインを形成する、請求項３２に記載の微粒子。
【請求項３４】
前記分析物結合分子に対する前記シグナル分子の比が、少なくとも３対１である、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３５】
前記分析物結合分子に対する前記シグナル分子の比が、少なくとも１０対１である、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３６】
前記微粒子の直径が約２マイクロメーター未満である、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３７】
前記微粒子の直径が約１マイクロメーター未満である、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３８】
前記微粒子の直径が約０．００１マイクロメーター〜約１．０マイクロメーターである、請求項１に記載の微粒子。
【請求項３９】
前記微粒子の直径が約０．０１〜０．５マイクロメーターである、請求項１に記載の微粒子。
【請求項４０】
分析物を検出するための微粒子であって、該微粒子は、
直径が約２μｍ未満の微粒子を含み、該微粒子は、
該微粒子に結合した複数のシグナル分子を含み、各シグナル分子は該微粒子に接着した第１のオリゴヌクレオチド接着部分を介して該微粒子と結合する第１のオリゴヌクレオチド結合体化ドメインを構成し、該シグナル分子は複数のアクリジニウム成分と結合した複数の官能基から構成されるシグナル結合ドメインをさらに含み、
該微粒子は、該微粒子に結合した複数の分析物結合分子を含み、各分析物結合分子は分析物を結合する分析物結合ドメインと、該微粒子に接着した第２のオリゴヌクレオチド接着部分を介してシグナル増幅微粒子と結合する第２のオリゴヌクレオチド結合体化ドメインとを含む、
微粒子。
【請求項４１】
分析物を検出するためのキットであって該キットは、
請求項１に記載の第１の微粒子、および
該第１の微粒子とは異なる物性を有する第２の微粒子を含み、該第２の微粒子は、第３の結合体化ドメインを有する第２の分析物結合分子と結合し、該第３の結合体化ドメインは、該第２の分析物結合分子と結合され、該第２の分析物結合分子は前記分析物を結合する第２の分析物結合ドメインを有する、
キット。
【請求項４２】
前記第３の結合体化ドメインが前記第２の微粒子の表面上の官能基に架橋結合される、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記第２の微粒子の表面上の官能基に架橋結合された第３の接着部分を介して前記第３の結合体化ドメインが該第２の微粒子に結合される、請求項４１に記載の微粒子。
【請求項４４】
前記第３の接着部分がオリゴヌクレオチド配列を有し、前記第３の結合体化ドメインは、該第３の接着部分の該ヌクレオチド配列と相補的なオリゴヌクレオチド配列から構成される、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記第１の微粒子が前記分析物の架橋結合により前記第２の微粒子と会合していない場合に、該第２の微粒子の物性により、該第１の微粒子から該第２の微粒子の分離が可能となる、請求項４１に記載のキット。
【請求項４６】
前記第２の微粒子の物性が前記第１の微粒子より大きなサイズを含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４７】
前記第２の微粒子の物性が強磁性特性を含み、前記第１の微粒子は非強磁性である、請求項４１に記載のキット。
【請求項４８】
前記第２の微粒子の物性が該第２の微粒子に結合した分子の蛍光を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４９】
前記第１の分析物結合ドメインが前記分析物の前記第２の分析物結合ドメインとは異なる領域と結合する、請求項４１に記載のキット。
【請求項５０】
前記第１および第２の分析物結合分子の少なくとも一方が抗原である、請求項１に記載のキット。
【請求項５１】
前記第１および第２の分析物結合分子の少なくとも一方が抗体である、請求項１に記載のキット。
【請求項５２】
前記第１および第２の分析物結合分子がそれぞれ抗体である、請求項２０に記載のキット。
【請求項５３】
前記第１および第２の分析物結合分子の少なくとも一方が核酸である、請求項１に記載のキット。
【請求項５４】
前記第１および第２の分析物結合ドメインの各々が核酸配列を備え、該第１の分析物結合ドメインが前記分析物上の第１の標的配列と相補的な第１の核酸配列から構成され、該第２の核酸配列が前記分析物結合分子上の第２の標的配列と相補的な第２の核酸配列から構成される、請求項１に記載のキット。
【請求項５５】
分析物を検出する方法であって、
請求項１に記載の第１の微粒子と前記分析物を含む試料とを接触させる工程；
前記第１の微粒子とは異なる物性を有する第２の微粒子と該試料とを接触させ、該第２の微粒子を該第２の微粒子と結合される第３の結合体化ドメインを有する第２の分析物結合分子と結合され、該第２の分析物結合分子は該分析物を結合する第２の分析物結合ドメインを有する工程；
該分析物とそれぞれ結合する該第１の微粒子と該第２の微粒子とから構成される結合した複合体を形成させるために、該試料を十分な時間でインキュベートする工程；
該複合体の中で結合していない該第１の微粒子を含む第２の分画から分離するよう、該結合した複合体を含む前記試料から第１の分画を分離する工程；
第１の分画を保持する工程；および
該第１の分画におけるシグナル放出部分から放出されたシグナル量を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項５６】
前記結合した複合体を含む前記第１の分画を洗浄し、該複合体中で結合する以外の手段で該第１の分画と会合している第１の微粒子の一部を除去し、続いて前記分離操作を繰り返す工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２の微粒子の物性が強磁性特性であり、前記分離操作は前記結合した複合体を磁石へ引き寄せる工程を包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記第２の微粒子の物性が蛍光特性であり、前記分離操作は蛍光標示式細胞分取器を介して前記結合した複合体を分離することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記第２の微粒子の物性が前記第１の微粒子より大きなサイズであり、前記分離操作は濾過または遠心分離の少なくとも１つによって前記結合した複合体を回収する工程を包含する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
インキュベーション時間が約１５分以下である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
インキュベーション時間が約１０分以下である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
インキュベーションの時間が約５分以下である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６３】
前記微粒子はさらにビヒクル分子を含み、前記シグナル分子および前記分析物結合分子が該ビヒクル分子に結合し、該ビヒクル分子は該微粒子に結合し、該ビヒクル分子は、該シグナル分子および該分析物結合分子それぞれの前記第１および第２の結合体化ドメインの両方を含むビヒクル分子接着部分を備える、請求項１に記載の微粒子。
【請求項６４】
前記第１のビヒクル分子接着部分が、前記微粒子に結合された第２の接着部分を含む相補的核酸配列を結合する核酸配列である、請求項６３に記載の微粒子。
【請求項６５】
前記ビヒクル分子がポリリジンから構成される、請求項６３に記載の微粒子。
【請求項６６】
前記シグナル分子の前記シグナル結合ドメインがポリリジンから構成される、請求項６５に記載の微粒子。
【請求項６７】
前記シグナル分子の前記第１の結合体化が、相補的なオリゴヌクレオチドを介して前記ポリリジンと結合されたオリゴヌクレオチドから構成される、請求項６３に記載の微粒子。
【請求項６８】
前記抗体がＨＩＶ抗原を結合する、請求項２５に記載の微粒子。
【請求項６９】
前記標的核酸配列がＨＩＶによってコード化された核酸配列である、請求項３２に記載の微粒子。
【請求項７０】
前記微粒子は、第２の分析物結合分子をさらに含み、前記第２の分析物結合分子はＨＩＶによってコード化された第２の核酸配列と相補的な第２の標的配列から構成され、前記第１の標的配列は該第１の標的配列とは異なっている、請求項６９に記載の微粒子。
【請求項７１】
前記第１および第２の標的配列の少なくとも１つはＨＩＶによってコード化された核酸配列である、請求項５４に記載のキット。
【請求項７２】
前記第１および第２の標的配列の各々はＨＩＶによってコード化された核酸配列であり、該第１および第２の標的配列が異なっている、請求項５４に記載のキット。
【請求項７３】
分析物を検出するための微粒子であって、
該微粒子に結合した第１の結合体化ドメインと情報伝達分子に結合したシグナル結合ドメインとを含むシグナル分子を含むシグナル増幅微粒子と；
該分析物と該微粒子に結合した第２の結合体化ドメインとを結合する分析物結合ドメインを含む分析物結合分子と、
を含む微粒子。
【請求項７４】
前記情報伝達分子が基質を生成物に変換する酵素を含む、請求項７３に記載の微粒子。
【請求項７５】
前記情報伝達分子がアクリジニウムを含み、かつ前記シグナル結合ドメインに複数のアクリジニウム部分が結合する、請求項７３に記載の微粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子、ならびに分析物の検出のためにこの微粒子を使用するキットおよび方法に関し、特に、複数のシグナル放出分子に接着し、およびこの分析物に結合させための分析物結合分子に接着した情報伝達微粒子に関する。本方法は、分析物の迅速で高感度な検出を促進する異なるタイプの分析物結合微粒子の組み合わせを含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
（本発明の背景）
細菌、抗原、抗体、受容体、配位子、および核酸などの生物学的分析物の検出は、多様な疾患および状態に関する診断検査法において中心的な役割を果たし、研究、法医学、およびリスクアセスメントの用途に重要である。このような方法では、一般に標的生物学的分析物と対応する分析物結合分子との間で、容易に検出することができる複合体を形成する特異的結合に頼っている。例えば、細菌では、特定のレシチン、あるいはその細菌上の表面抗原に特異的な抗体との結合によって検出される。可溶性抗原は、この抗原により生成した特異抗体との結合によって検出される。逆に、特異抗体はこれに対応する抗原（あるいは抗原結合体化物）への結合によって検出される。特定の細胞型を表す細胞表面の受容体は、その対応する配位子との結合によって検出される。逆に、配位子はこれに対応する受容体との結合によって検出される。核酸は、相補的核酸配列とハイブリッド形成されることにより検出される。これらの全ての検出方法の中核をなすのは、複合体を形成していない分子を区別可能であり、標的分析物と分析物結合分子との間で結合した複合体の形成を検出する能力である。一般に、結合した複合体は３つの基本技術の１つによって検出される。
【０００３】
第１の基本技術は、分析物と複合化した分析物結合分子の物理的状態が、一方の成分単独の場合に比べてどのように変化したのかに依存する。この技術の一般的な事例は抗体凝集であり、これにより抗体またはラテックス粒子などの粒子に結合した抗体は、架橋結合により相互に接続され、分析物の結合していない抗体と比較して、光を散乱させるのに十分なサイズの格子を形成する。凝集分析の一般的な形態は、マイクロタイタープレートの表面への抗体の接着、および分析物を有しラテックス粒子に結合した第２の抗体を有する試薬を含む試料とこの同じ抗体との接触に依存する。十分な期間のインキュベーション後、ラテックス粒子を有する光散乱格子は、マイクロタイタープレートの表面で形成される分析物と複合化し、格子のサイズは光散乱または吸収によって測定される。凝集分析および同様な物理的状態をベースとした方法の１つの短所は、複合体を確実に検出するために相対的に多量の分析物を必要とし、比較的感度が低いことである。
【０００４】
分析物複合体を検出するための第２の基本技術はＥＬＩＳＡ法であり、抗体への酵素の結合に依存する。酵素と結合した化学種は、一般に表面に固定化された分析物および別の抗体（または抗原）種とサンドイッチ複合体を形成する。未結合の酵素結合分子を除去するために表面に結合した複合体を洗浄した後、従来のスペクトロフォトメテリックまたはケモルミネッセントテクニックによって測定される生成物への基質の転換を検出するため、結合複合体を酵素基質とともにインキュベートする。ＥＬＩＳＡ法は、比較的高感度である利点を提供するが、最大感度を得るために比較的長時間の実施を要するという難点がある。一般的なＥＬＩＳＡ試験では、抗体抗原結合が平衡（１００％完了）に達するまでに数時間（一般に一晩）必要とするが、一方１０分間のインキュベーションではわずか約３％が完了するのみである。したがって、ＥＬＩＳＡ試験は、疾患における患者または供血者の迅速スクリーニングなど、短い時間枠においてその場で行う迅速試験には実際的ではない。ＥＬＩＳＡ試験では、さらに、結合した酵素の不安定性、比較的高価な基質、および実行するのに複数のステップを要することなどの別の短所があり、これらのすべては、ＥＬＩＳＡ試験の相対的な高コスト化を引き起している。
【０００５】
第３の基本的な分析物複合体検出技術は標識化であり、分析物と結合した後の分析物結合分子に接着した標識の検出に依存する。一般に、分析物試料は基質上に固定化され、標識された分析物結合分子とともにインキュベートされ、続いて未結合標識分子を除去するために洗浄される。標識化テクニックは、分析物結合分子が標的分析物核酸の相補的配列とハイブリッド形成される核酸プローブである核酸検出法と共に最も一般に使用されている。この点に関しては、例えば、放射性、蛍光性、化学発光性、およびエレクトロルミネッセント化学種をはじめとする多様な標識形式が利用されている。単純なフィルタ状膜から複雑な核酸チップアレイまで、種々の基質も使用されている。臨床分野では、最も一般に使用される核酸結合性試験は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、およびＨＢＶ）に関する血液スクリーニング、またはＨＩＶウイルス負荷試験を目的とするものである。ウイルス負荷試験は、抗ウイルス薬治療の有効性、または疾患進行をモニターする手段として、血漿中のウイルス濃度を測定するために使用される。核酸標識化テクニックは、特定サイズの標的分析物分子を同定するため、電気泳動法、または他のサイズ分離手法と共に頻繁に使用される。
【０００６】
特に核酸を検出することに関連した従来の標識化テクニックの主な問題点は、これらの方法が比較的複雑で、実施するのに熟練および訓練が必要なことである。別の問題点は、ＥＬＩＳＡ試験と同様に標識化試験では、標識体を検出するのに十分なレベルまでハイブリッド形成を実施するのに、比較的長い期間のインキュベーションを要することである。別の関連する問題点は、プローブのサイズ、およびハイブリッド形成のための水素結合領域を保護する必要があることにより、プローブに接着した標識の量が制限されることである。これにより検出の感度が制限され、標的分析物核酸を増幅するためにしばしばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの分析物増幅テクニックによって対処されることがある。ＰＣＲにより、信頼できるＰＣＲに必要とされる酵素、試薬およびプロトコルに関連したさらなるレベルの複雑さ（また変動性）が付加される。さらに別の問題点は、最も高感度のタイプの検出法では比較的高価な装置が必要であることである。これらの問題点は、臨床分野で要求されるような、診療時に迅速で安価なその場検出を必要とする用途では、従来の標識化テクニックの使用は事実上禁忌となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、感度、スピード、および分析物検出の簡易性を改善する組成物および方法、特にこのような組成物および方法のなかでも、および多様な分析物を検出するために容易に適用可能なものが当技術分野において求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本明細書に記載することは、スピード、感度、および分析物検出の簡易性を向上させ、多様なテクニックを適用可能な微粒子ベースの増幅（ＭＢＡ）と呼ばれる組成物および方法である。ＭＢＡにより、１ｍＬ反応液中で分析物に結合した３％ほどの分析物結合分子を１０〜２０分のプロトコルで検出することが可能である。ＭＢＡ技術をベースとする方法では、分析物への２種の微粒子、すなわちシグナル増幅微粒子および分離微粒子の結合、非複合型シグナル増幅微粒子からの２重に結合した微粒子複合体の分離、および１つの微粒子を形成する放出された光シグナルの検出の３つの基本的ステップを含む。労力と試薬におけるスピードおよびコストは、他の分析物検出テクニックより顕著に低い。
【０００９】
ＭＢＡは、シグナル増幅微粒子の使用により達成されたシグナル増幅に基づいており、この微粒子表面の複数の接着位置に接着した複数の情報伝達分子を含み、この表面の複数の位置に同様に接着した複数の分析物結合分子と組み合せを含む。
次に各々の情報伝達分子はそこに接着した複数のシグナル放出部分を有する。この方法では、シグナル増幅微粒子と分離微粒子とを組み合わせるが、分離微粒子がシグナル増幅微粒子から容易に分離されるように第１の微粒子とは異なる物性を有する。分離微粒子は、さらにこの表面に結合した分析物結合分子を有する。したがって、分析物を含む混合物、シグナル増幅微粒子、および分離微粒子は、このシグナル増幅微粒子が分析物と結合し、さらに分離微粒子とも結合する複合体を形成する。この複合体は、分析物が最初に分離微粒子と結合し第１の複合体を形成し、その後未結合の分析物から分離され、シグナル増幅微粒子と結合し最終複合体を形成する段階的方法で形成されてもよい。結合した複合体は、分離微粒子の分離特性に従って未結合シグナル増幅微粒子から容易に分離される。分離されると、複合体から直接検出されるシグナルは、この複合体中のシグナル増幅微粒子の量に相当し、したがってこれは試料中の分析物の量と一致する。分析物分子がそれぞれ複数のシグナル放出部分を備える複数の情報伝達分子を有するシグナル増幅微粒子と結合しているので、検出されたシグナルは、試料中の分析物分子の化学量論の量に対して大幅に増幅されている。
【００１０】
シグナル増幅微粒子上の情報伝達分子は高分子を含み、この微粒子と結合体化する領域（すなわち第１の結合体化ドメイン）、および複数のシグナル放出部分と結合する複数の官能基を含むシグナル結合ドメインを有する。ある実施形態において、情報伝達分子はオリゴヌクレオチドであって、第１の結合体化ドメインがシグナル増幅微粒子の表面上に相当する接着オリゴヌクレオチド成分と相補的な配列を有する。シグナル結合ドメインは、複数のアクリジニウム成分との結合に使用される複数の誘導体化アミン基を備えた配列を含む。様々な実施形態において、分析物結合分子は、抗体、抗原、受容体、配位子、あるいは核酸でもよい。分析物結合分子は分析物結合ドメインを有し、さらに微粒子の表面と結合体化するための領域（すなわち第２の結合体化ドメイン）を持つ。ある実施形態において、第２の結合体化ドメインは、シグナル増幅微粒子の表面の第２のオリゴヌクレオチド接着部分に対して相補的配列を有する結合体化されたオリゴヌクレオチドを含む。他の実施形態において、情報伝達分子および／または分析物結合分子は、直接架橋結合によってシグナル増幅微粒子と結合体化してもよい。
【００１１】
第１の分析物結合分子がシグナル増幅微粒子と結合体化されることと同様な方法で、分離微粒子は第２の分析物結合分子と結合体化されてもよい。したがって、第２の分析物結合分子は、分離微粒子の表面に存在する第３のオリゴヌクレオチド接着部分と相補的な配列を備えるオリゴヌクレオチド結合体化ドメイン（すなわち第３の結合体化ドメイン）を含んでもよい。第２および第３のオリゴヌクレオチド接着部分は同じ配列あるいは異なる配列を持っていてもよい。第２の分析物結合分子は、第１の分析物結合分子と同じか異なる種類でもよい。代わりに、第２の分析物結合分子は、直接架橋結合によって分離微粒子と結合体化されてもよい。
【００１２】
ある実施形態では、第１および第２の分析物結合分子が、抗原、特に細菌表面の抗原と結合する抗体である組成物を含む。他の実施形態では、第１および第２の分析物結合分子が、試料に存在する抗体、特別な実施形態ではＨＩＶ抗体と結合する抗原である組成物を含む。さらに他の実施形態では、第１および第２の分析物結合分子がそれぞれ、標的核酸分析物の第１および第２の標的配列と相補的である第１と第２配列とを有する核酸である組成物を含む。
【００１３】
ＭＢＡをベースとしたキットおよび方法も記載される。ある実施形態において、キットは、特別な抗体分析物結合分子および複数のアクリジニウム成分を含み接着した情報伝達オリゴヌクレオチド分子と結合体化したシグナル増幅微粒子を含んでいる。分離微粒子は、同じタイプの抗体分析物結合分子に結合体化された磁性粒子である。本方法は、シグナル増幅微粒子、分離微粒子、および分析物を含む混合物を形成し、第１および第２の分析物結合分子が分析物と結合するのに十分な時間でこの混合物をインキュベートし、この混合物を磁石を使用して分離微粒子を含む試料に分割し、分離された微粒子を洗浄し、接着したシグナル増幅微粒子から放射される光を生じる条件に洗浄された微粒子を曝し、さらに発光シグナルを検出する、ことにより分析物を検出するためのこのような組成物および／またはキットの使用を含んでいる。
【００１４】
本方法は、比較的安価な携帯用照度計を使用して１０〜２０分で行う分析に適している。高度なレベルの信頼度および感度を有し、分析を１５〜３０分以内に完了することができるので、照度計と組み合わせたこのような分子を利用する細菌検出システムは、少なくとも部分的に、病院などのポイントオブケア（ＰＯＣ）設定で使用するのに適している。したがって、例えば、輸血処置を行う直前に細菌汚染について血小板を検査することに使用してもよい。特定の実施形態において、設計感度（検出限界）は、５種の菌種において５０００細菌／ｍＬ以上である。一般的な手順では、結合反応に１０〜２０分、洗浄（リンス）に４〜５分、化学発光の反応に１分を要する。
【００１５】
本明細書に記載の組成物および方法を使用したスピード、感度、複雑性がないことにより、容易に自動化すること、および多数の試料を取り扱うのに適したこのような方法が生み出される。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
図１は、本発明の一局面によるＭＢＡに使用されたシグナル増幅微粒子１１の一般的な特徴を示す。シグナル増幅微小粒子１１は、図１Ａに示すようにコア微粒子２より組み立てられる。コア微粒子２は、複数の官能基２０を備え、第１の接着部分２５と第２の接着部分２８とが結合している表面１５を有する第１の微粒子１０を含んでいる。第１の接着部分２５と第２の接着部分２８は、一般に第１と第２の接着部分２５および２８上に存在する官能基を備えた第１の微粒子１０上の官能基２０を共有結合的に架橋することにより第１の微粒子１０と結合している。
【００１７】
図１Ｂは、シグナル増幅微粒子１１を形成するために組み立てられたコア微粒子２を示す。シグナル増幅微粒子１１は、第１の接着部分２５を介して第１の微粒子１０の表面に結合するシグナル分子３０を含む。このシグナル分子は、第１の接着部分２５と結合する結合体化ドメイン（すなわち第１の結合体化ドメイン３２）、および複数のシグナル放出部分３６と結合するシグナル結合ドメイン３４を含む。このシグナル増幅微粒子１１も第２の接着部分２８を介して分析物結合分子４０と結合している。この分析物結合分子４０は、第２の接着部分２８と結合する結合体化ドメイン（すなわち、第２の結合体化ドメイン３５）を含み、さらに分析物５０と結合する第１の分析物結合ドメイン４４を有する。後述でより詳細に述べるように、好ましい分析物結合分子４０としては、対応する分析物がそれぞれ抗体、抗原、基質、配位子、あるいは受容体である場合は、抗原、抗体、タンパク質、受容体および配位子があるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、第１の結合体化ドメイン３２および／または第２の結合体化ドメイン３５は、相補的な核酸配列間の水素結合などの非共有結合により、それぞれ第１および第２の接着部分２５および２８と結合している。他の実施形態において、第１の結合体化ドメイン３２および／または第２の結合体化ドメイン３５は、相当する結合体化ドメイン３２および３５上に官能基を備えた接着部分２５および２８上の官能基の化学的架橋結合により形成された共有結合によって、それぞれ第１および第２の接着部分２５および２８と結合している。ある実施形態において、第１の結合体化ドメイン３２および／または第２の結合体化ドメイン３５は、共有結合を介して直接微粒子に接着している。
【００１８】
シグナル分子３０は、第１の接着部分２５と結合体化することのできる分子構造を有する結合体化ドメイン３２を含むあらゆる高分子種でもよく、また複数のシグナル放出部分３６に結合体化することができる複数の官能基３３を含むシグナル結合ドメイン３４を有する。本明細書で言う「結合体化」とは、非共有結合性および共有結合を含む異なる分子種間のあらゆる化学的結合を意味する。一般的な実施形態では、結合体化ドメイン３２は水素結合によって接着部分と結合体化し、シグナル結合ドメイン３４は官能基３３を介する共有結合によってシグナル放出部分３６と結合体化する。情報伝達分子３０のシグナル結合ドメイン３４のための実例種は、ポリヌクレオチド、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン、ポリヒスチジン、ポリアミノ糖類、スペルミン、スペルミジン、および複数のアミン側鎖官能基を有するポリペプチドなどの複数のアミン基を含む高分子などがあるがこれに限るものではない。情報伝達分子３０のシグナル結合ドメイン３４のための他の実例種は、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔｅ）、ポリグリコネートおよび複数のカルボキシル側鎖官能基を有するポリペプチドなどのポリカルボン酸基を含む高分子などがあるがこれに限定されない。これらのタイプの官能基３３がほとんどのシグナル放出部分３６上に存在する最も一般的な官能基と結合するための架橋結合化学は公知の技術であるので、情報伝達分子３０のシグナル結合ドメイン３４にはポリアミンおよびポリカルボキシルを含む高分子が好ましい化学種である。しかしながら、シグナル放出部分３６に架橋結合することができる複数の官能基３３を有するあらゆる高分子が好ましい。
【００１９】
官能基で誘導体化されたヌクレオチドを含む規定された配列のオリゴヌクレオチド、すなわち官能基的に均質な化学種は、これらの官能基がシグナル放出部分３６と化学的架橋結合するための都合のよいビヒクルを提供するので、シグナル分子３０のシグナル結合ドメイン３４において好ましい。オリゴヌクレオチドは相補的配列のハイブリッド形成によって第１の接着部分２５と容易に結合体化することができるので、規定された配列のオリゴヌクレオチドもシグナル放射分子３０の結合体化ドメイン３２において好ましい。シグナル放出部分３０の複合した実施形態において、結合体化ドメイン３２はオリゴヌクレオチド配列を有していてもよく、一方シグナル結合ドメイン３４はポリリジンまたはポリグルタミン酸塩などの非ヌクレオチドポリマーを含んでいてもよい。非オリゴヌクレオチドポリマー上の官能基と共有結合的に架橋結合するオリゴヌクレオチドのための技術は公知である。したがって、結合体化ドメイン３２として機能する少なくとも１つの官能残基、およびシグナル結合ドメイン３４として機能する複数の官能基３３より構成される限りにおいて、シグナル分子３０は多様な化学種から形成されてもよい。
【００２０】
シグナル放出部分３６は、適切な機器により検出可能なシグナルを放出するあらゆる化学成分でもよい。代表的な実施形態では、シグナル放出部分は照度計によって容易に検知できる光を放射する。ある実施形態では、特定の化学的あるいは物理的条件にさらされる結果、例えば、化学発光などのシグナル放出部分３６の酸化／還元環境を変化させる試薬による化学反応の結果、あるいは蛍光およびリン光発光の場合のような放射エネルギーにより励起される結果、もしくはエレクトロルミネッセント発光の場合のような電気刺激の結果、シグナル放出部分３６は光を放射する。エレクトロルミネッセント材料としては、各々が本明細書に参考として援用される米国特許第６，３３３，１２２号、同第６，３２９，０８３号、同第６，２７７，５０３号、同第６，２７１，６２６号、同第６，１８０，２６７号、同第６，１４３，４３４号、同第５，７４７，１８３号および同第５，７０６，２２４号明細書に記載の材料などがあるがこれらに限定されない。化学発光シグナル放出部分３６の１つの例は、エステル成分で誘導体化された場合、シグナル放出部分３０のシグナル結合ドメイン３４上に存在するアミン類、特に一級アミンと容易に架橋結合することができるアクリジニウムである。過酸化水素、スーパーオキシドなどの酸化化学種の存在下で、アクリジニウムは照度計で検出可能な化学発光を起こす。シグナル放出部分３６のさらなる事例は、蛍光強度計（ｆｌｕｏｕｒｉｍｅｔｅｒ）内での励起により容易に検出可能な蛍光を発する蛍光性分子のフルオレセインである。フルオレセインをアミンおよびオリゴヌクレオチドに架橋結合する技術は公知である。他の実施形態において、シグナル放出部分は基質、そこではこの基質がシグナルを放出する生成物に変換されるが、と組み合わせて使用されるアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼなどの酵素でもよい。ある実施形態において、シグナル放出部分３６は、色シグナルの生成を促進する。
【００２１】
シグナル増幅微粒子１１の第１の微粒子１０は、以下に限定されないが、固形ビーズ、多孔性ビーズ、強磁性ビーズ、および類似物を含む任意の微粒子状の高分子構造で構成されていてもよい。そのようなビーズは、当技術分野では一般にナノ粒子、微粒子、ビーズ、または微小球と呼ばれている。ほとんどの実施形態において、シグナル増幅微粒子１１と共に使用される微粒子１０は、約２μｍ未満、さらに好ましくは約１μｍ未満の平均径を有する。代表的な実施形態において、微粒子１０は約０．００１μｍから約１．０μｍ、より一般には０．０１から０．５μｍの直径を有する。微粒子１０は分析物が検知される試料の種類と相溶性のある任意の物質で作られてもよい。ここに開示された任意の微粒子の実例材料は、スチレン系ポリマー、ケイ酸塩、シリカまたは炭素ベースのエーロゲルまたはキセロゲル、シリコーン、ラテックス、炭水化物、メタクリル酸塩、アクリルアミド、およびその類似物、もしくは必要なサイズの粒子を形成することができ、微粒子１０の表面上に複数の官能基２０を含むように誘導できるあらゆる物質、などがあるがこれに限定されない。溶液中の微粒子は、この微粒子が沈降せずに試料中に懸濁されるように試料と同等の密度を有するように、微粒子が物質容量に対して比較的大きな空隙容量を有することが好ましいが必須ではない。
【００２２】
一般に必須ではないが分析物結合分子４０よりも多くのシグナル分子３０が提供される割合で、シグナル分子３０および分析物結合分子４０が微粒子１０の表面と結合している。一般に、分析物結合分子４０に対するシグナル分子３０の比率は、少なくとも３対１、少なくとも５対１、さらに好ましくは少なくとも１０対１以上である。分析物結合分子４０に対するシグナル分子３０の比率の選択は、最終的には、与えられた試料タイプにおいて要求される感度の範囲内で検出可能とするために必要とするシグナル増幅に対する分析物５０における分析物結合分子４０の親和性によって決定される。一般に、分析物５０と分析物結合分子４０との間の親和性の増加に伴い、与えられた試料中で信頼性のある結合を提供するのに必要な分析物結合分子４０はより少なくてすむ。したがって、分析物結合分子４０に対するシグナル分子３０のより高い比率を使用することができる。所定の試料で分析物を検知するために与えられた時間において、分析物結合分子４０の量が十分な数の分析物分子５０と結合するには少なすぎるものの、分析物結合分子４０に対するシグナル分子３０の比率を経験的に規定された限界まで増加させることができる。分析物結合分子４０に対するシグナル分子３０の比率を経験的に決定するための１つのテクニックを実施例８で例示する。
【００２３】
シグナル分子３０および分析物結合分子４０を含むシグナル増幅微粒子１１は、本発明によるＭＢＡにおけるシグナル増幅の主要なビヒクルとして機能する。シグナル増幅は、部分的に微粒子１０が第１の接着部分２５を介してそれに対応する多数のシグナル分子３０と結合した多数の官能基２０を含むという事実から生じる。例えば、１グラムの１−２μｍ磁気ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウォリントン、ＰＡ）は、粒子表面に２４０μモルのアミン基、または１粒子当たり約３×１０９アミン基を含む。これらのアミンの０．０１％のみがシグナル分子３０と結合体化し、それぞれが１つのみのアクリジニウムシグナル放出部分３７を有している場合でも、一般の照度計は１つのシグナル増幅微粒子１１の存在を正確に検出できるであろう。それに応じて、１つの分析物結合分子４０のみがシグナル増幅微粒子１１に接着している場合は、この分析物結合分子４０は、シグナル増幅微粒子１１とも結合している３×１０１０のシグナル放出部分３６と関連しているはずである。したがって、シグナル増幅の最初のレベルは、シグナル増幅微粒子１１に接着した複数のシグナル分子３０によって提供される。対照的に、分析物結合分子４０のみ、従来の標識化テクニックを使用して少数のシグナル放出部分で標識できる。
【００２４】
第２のレベルの増幅は、シグナル増幅微粒子１１に接着したそれぞれのシグナル分子３０が複数のシグナル放出部分３６に結合するという事実から生じる。シグナル分子上のシグナル結合ドメイン３４は、情報伝達成分３６が結合体化する少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、あるいは少なくとも１００個の官能基３３を有する高分子が好ましい。したがって、複数のシグナル分子３０に結合したシグナル増幅微粒子１１の使用によるシグナルの増幅は、さらに各シグナル分子３０に結合した複数のシグナル放出部分３６が掛け合わされ、これにより少なくとも１０から１００倍のさらなる増幅が行われる。例えば、バックグラウンドシグナルを除去するために分析物非結合のシグナル増幅微粒子１１と区別して、分析物が結合したシグナル増幅微粒子１１のみが得られると仮定すると、各シグナル分子３０に結合した約５０個のアクリジニウム成分３６を有する０．５μｍシグナル増幅微粒子１１により、従来の照度計でも単一の分析物結合分子４０を介して微粒子１０に結合した一つの分析物分子５０を正確に検出することができる。本明細書の別な部分で記載されるように、分析物結合分子を有する第２の微粒子の使用によって、分析物結合シグナル増幅微粒子１１を分析物非結合のシグナル増幅微粒子１１から移動させることができる。
【００２５】
図２は、シグナル分子と同様に第１および第２の接着部分がオリゴヌクレオチドを有する場合のシグナル増幅微粒子１１の実施形態を示す。微粒子１０は、表面にアミン官能基２１を含むように誘導された０．１から０．５μｍのプラスチックビーズである。そのような微粒子は多様な製造元より市販されている。例えば、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フィッシャー、インディアナ州）では、アミノ、カルボキシル、水酸化、スルフヒドリル、ヒドラジド、アミド、クロロメチル、アルデヒド、エポキシ、およびトシル基をはじめとする、がこれに限定されない種々の官能基を被覆した多様なサイズの微小球形ビーズを供給し、さらに本明細書において参考として援用したＴｅｃｈＮｏｔｅ第２０５号に記載されるように、同様な官能基を共有結合的に結合体化する技術も提供している。第１の接着部分２６は、規定された核酸配列を備える適切な長さ（例えば３０塩基）の第１のオリゴヌクレオチドである。第２の接着部分２９は、規定された核酸配列を備えた長さの約３０塩基のオリゴヌクレオチド（すなわち、第２のオリゴヌクレオチド）である。当業者は、第１の２６、および第２の２９接着オリゴヌクレオチド成分の長さと配列は、相補的なオリゴヌクレオチドによる塩基対形成によって安定でかつ迅速に結合を提供するような任意の組成物であり得ることが分かるであろう。一般に、少なくとも５０℃、より一般には少なくとも７０℃の融解温度を提供するように長さと配列を選択する必要がある。第１および第２のオリゴヌクレオチド２６および２９の５’末端は、架橋結合試薬によって微粒子１０の表面でアミン官能基２１と架橋結合している。この目的に好ましい架橋結合試薬の１例は、ＢＳ３［ビス（スルホサクシンイミジル）スベリン酸］、ホモ二官能性ＮＨＳエステルである。
【００２６】
シグナル分子３０は長さ少なくとも５０、少なくとも１００、もしくは少なくとも２００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド３１（すなわち、第３のオリゴヌクレオチド）である。代表的な実施形態において、第３のオリゴヌクレオチド３１は長さ約２５０のヌクレオチドで、２つの領域を含んでいる。第１の領域は第３のオリゴヌクレオチド３１の５’または３’末端に位置する結合領域３２である。結合領域３２は、第１のオリゴヌクレオチド接着部分２６に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。第２の領域は、それぞれは複数の官能基３３を有し、第３のオリゴヌクレオチド中に残りのヌクレオチド残基を含むシグナル結合ドメイン３４である。好ましい架橋結合基３３の１例は、オリゴヌクレオチド合成中に導入することができる一般に使用される官能基である一級アミンである。第３のオリゴヌクレオチド３３の複数の架橋残基３３は、複数のアクリジニウムエステル分子３７に架橋結合され、第３のオリゴヌクレオチド３３のシグナル結合ドメイン３４のシグナル放出部分３６を形成する。オリゴヌクレオチド合成中に一級アミンをオリゴヌクレオチドへ組み込むための好ましい方法は、一級アミンを含むように修正されたヌクレオチドホスホアミディテスの使用、あるいはオリゴヌクレオチドに一級アミンを組み込むために設計された非ヌクレオチドホスホラミダイトの使用などがあるがこれに限定されない。これらのホスホラミダイトは、効率的にオリゴヌクレオチドへ組み込むことができ、市販品、例えば、一級アミン誘導体化ｄＴまたはｄＣホスホラミダイトにおけるＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（スターリング、バージニア州）、およびＵｎｉＬｉｎｋＴＭＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒと呼ばれる一級アミン誘導体化非ヌクレオチドホスホラミダイトにおけるＣｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）より容易に利用可能である。ホスホラミダイト中の一級アミン基は、通常オリゴヌクレオチド合成の間は保護され、オリゴヌクレオチド合成完了後に脱保護化され、これによって一級アミンが解放される。接着したアクリジニウムシグナル放出部分３７を備えたシグナル分子３１の調製後、シグナル分子３１は、結合体化ドメイン３２のヌクレオチドのオリゴヌクレオチド接着部分２６の相補的なヌクレオチドへのハイブリッド形成により、第１のオリゴヌクレオチド接着部分２６に結合体化される。
【００２７】
分析物結合分子４０は、第２のオリゴヌクレオチド接着部分２９に対する相補的オリゴヌクレオチドである第２の結合体化ドメイン３５を含んでいる。第２のオリゴヌクレオチド結合体化ドメイン３５は、通常の架橋結合を用いて分析物結合分子４０と結合体化する。第２のオリゴヌクレオチド結合体化ドメイン３５の分析物結合分子への架橋結合は、例えば、一般に、必須ではないがオリゴヌクレオチド結合体化ドメイン３５の３’または５’ヌクレオチド上で誘導体化された官能基を利用してもよい。これらの官能基としては、一般に抗体、受容体、および／またはポリペプチドを含む化学種などのタンパク質型分析物結合分子上に存在する、一級アミン、アミンなどの分析物結合分子４０の官能基と架橋結合するチオ基およびカルボン酸類、チオ基、カルボニル、カルボン酸、およびその類似物などがあるがこれに限定されない。
【００２８】
図１に示すコア微粒子組成物２は、任意の所望の特異性を備えた種々のシグナル増幅微粒子１１を組み立てるための都合のよいプラットフォームを提供する。図３Ａに示すように、第１のおよび第２の接着部分２６と２９の各々は、オリゴヌクレオチド接着部分である。コア微粒子組成物２は、規定されたオリゴヌクレオチド接着部分２６および２９の組み合わせにより作ることができる。同じ第１のオリゴヌクレオチド接着部分２６および同じ第２のオリゴヌクレオチド接着部分２９を有する単一バッチの微粒子１０を、オリゴヌクレオチド２６および２９は、同一の反応で微粒子１０の表面上で官能基２０と架橋結合する１つのステージで作ることができるので、このようなコア微粒子組成物２が都合よく作成される。この反応の中で使用されるオリゴヌクレオチド２６および２９のモル比は、微粒子１０に架橋するオリゴヌクレオチド２６および２９の比率を決定する。続いてコア微粒子組成物２は、別のステージで、第３のオリゴヌクレオチド３１シグナル分子の異なるバッチおよび／または分析物結合分子４０の異なるバッチと結合することができる。多様な実施形態において、第１の２６および第２の２９オリゴヌクレオチドの配列は同一でもよく、異なっていてもよいが、しかしながら、コアシグナル増幅微粒子２が多くの検出方法に寄与することが望ましいので、第１のオリゴヌクレオチド接着部分２６は、一般に第２のオリゴヌクレオチド接着部分２９と異なる配列を持っている。このように、ハイブリッド形成条件の再現性のあるセットは、別々にコントロールされたステップで、オリゴヌクレオチドシグナル分子３１および分析物結合分子４０を適切に結合体化することと定義することができる。したがって、非特異的シグナル増幅微粒子１１を共通バッチのオリゴヌクレオチドシグナル分子３１に結合体化したコア微粒子２を用いて最初に作ることができ、続いて別個のステップにおいて、特定のシグナル増幅微粒子１１が作成される。
【００２９】
図３Ｂおよび３Ｃは、コアシグナル増幅微粒子２を形成するための第１の２６および第２の２９オリゴヌクレオチドの微粒子への間接的結合体化に関する２つの別な方法を示す。両方法では、複数のオリゴヌクレオチドが共有結合で結合体化されている多数の官能基を備えたビヒクル分子２３（例えばポリリジン）がビヒクルとして機能する。ある実施形態において、図３Ｂに示すように、少なくとも３つの別個のオリゴヌクレオチドがビヒクル分子２３と結合する。オリゴヌクレオチド３９の一方は共有結合的に微粒子と結合体化し、オリゴヌクレオチド３８に対して相補的である。第１の２６および第２の２９のオリゴヌクレオチドは、同様にビヒクル分子２３に結合している。他の実施形態において、図３Ｃに示すように、十分な数のシグナル放射分子３７（例えばアクリジニウム）の直接結合を可能とするためビヒクル分子２３は十分な数の官能基を含む場合、第１のオリゴヌクレオチド２６の存在、およびそれに続くシグナル分子３０の接着は不要となる。これらの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド２９はビヒクル分子２３と結合している。
【００３０】
ある実施形態において、図３Ｄから３Ｇに示すように、シグナル放出分子３７（例えばアクリジニウム）は、それ自体はシグナルを放出しないが、適切な基質からのシグナル（例えば光または色）の生成を触媒するシグナル生成分子４３（例えばアルカリホスファターゼ）と置き換えられている。シグナル放出分子３７のための接着方法と平行して、シグナル増幅微粒子へのシグナル生成分子４３の接着も同様な手段によって達成することができる。シグナル生成分子４３は、直接（図３Ｅ）、またはオリゴヌクレオチドハイブリッド形成によって間接的（図３Ｄ）にビヒクル分子２３と結合体化することができる。これとは別に、シグナル生成分子４３は直接（図３Ｇ）、またはオリゴヌクレオチドハイブリッド形成によって間接的（図３Ｆ）にシグナル増幅微粒子と結合することができる。
【００３１】
シグナル増幅微粒子１１に対する分析物特異性を提供するために必要な全ての条件は、ハイブリッド形成により第２のオリゴヌクレオチド結合体化ドメイン３５に、特定の分析物結合分子４０を結合体化することである。図２に示す実施形態において、分析物結合分子はオリゴヌクレオチド結合体化ドメイン３５と架橋結合した抗体４１である。抗体４１の分析物結合ドメイン４４は、抗体分子の（複数の）可変領域を含む通常の抗原結合領域である。抗体４１が分析物特異性を提供するので、シグナル分子３０により組み立てられたコア微粒子２の１つのバッチは、種々の異なる抗体と共に使用し、様々な特異的なシグナル増幅微粒子１１を作成することができ、許容できるシグナル増幅微粒子１１の製造を保証するために必要なプロセス制御モニタリングの量が減少する。本明細書で使用の「抗体」という用語は、動物から得られたポリペプチドを認識するあらゆる抗原を含むか、またはその以外に、動物の免疫系の多様な成分をコード化するＤＮＡによってコード化された可変領域結合領域を有するアミノ酸配列を含んでいることが分かるであろう。これには、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体ファージディスプレイ配列、任意のクラスの免疫グロブリン、あるいはＴ細胞受容体、などが含まれるがこれに制限されない。この用語は、例えば、ＦａｂまたはＦａｂ１’あるいは任意の抗原結合領域の可変領域を含むキメラ融合分子をはじめとする機能性抗原結合断片も含まれる。
【００３２】
シグナル増幅微粒子１１は特定の分析物を検知するためのシステム中で使用される。シグナル増幅微粒子１１を使用する分析物検出システム５１の一実施形態を図４に示す。シグナル増幅微粒子１１を形成するために組み立てられた第１の微粒子１０に加えて、分析物検出システムは分離微粒子７３を形成するために組み立てられた第２の微粒子６０を含む。２つの粒子が分析物５０と架橋結合することにより複合体６５中で会合する場合を除いて、第２の微粒子６０は第１の微粒子１０とは異なる物理構造を有し、これにより分離微粒子７３からのシグナル増幅微粒子１１の迅速な分離が可能となる。なおこのケースでは、複合体６５も非複合型シグナル増幅微粒子１１から分離されている。非複合型シグナル増幅微粒子１１の分離が可能な物理構造の相違例としては、サイズ、密度、電気的、磁気的、あるいは開花的な特性などがあるがこれに限定されない。実施形態の一事例では、分離微粒子６０はシグナル増幅微粒子１１より大きい。別の実施形態において、分離微粒子６０が磁石を使用して非強磁性シグナル増幅微粒子１１から分離することができる強磁性ビーズを構成するように、分離微粒子６０は強磁性成分６２を含んでいる。別の実施形態において、分離微粒子６０は強磁性であり、かつシグナル増幅微粒子１１よりも大きい。別の実施形態において、粒子を蛍光に基づいて選別するように構成された開花活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳ）を使用して試料から選択的に除去することが可能なように、第２の微粒子６０を開花ラベルで標識してもよい。さらに別の実施形態では、分離成分は、分離粒子ではなくマイクロタイタープレートウェルなどの不動固相である。
【００３３】
代表的な実施形態では、第２の微粒子６０は、少なくとも約１？ｍ、一般的に約１〜１０？ｍ、最も一般的には約１〜５？ｍの直径を有する。本明細書で述べた微粒子１０および／または微粒子６０などのあらゆる微粒子は、ナノスフェアーまたは微小球と称してもよいが、必ずしも球状である必要はないことが分かる。実際、微粒子１０または６０は、不規則形状であってもよい。したがって、用語「直径」は、微粒子集団における最大寸法の平均長を表すことが分かる。分離微粒子７３が強磁性の第２の粒子６０を有する場合、分離微粒子７３を混合物から単離する、もしくはシグナル増幅微粒子１１が懸濁液中に遊離している間は磁石の使用によって容器の壁に保持させることができ、これにより、シグナル増幅微粒子１１が複合体６５内で分離微粒子７３と会合している場合を除いて、分離微粒子７３から分離して洗い出すことができる。
【００３４】
この分離微粒子７３は、第２の分析物結合分子７０を介して分析物５０と架橋結合する。第１の微粒子１０のような第２の微粒子６０は、その表面に複数の官能基６１（すなわち、第３の官能基）を有する。これらの官能基６１は、図４Ａに示すように第２の分析物結合分子７０と直接、あるいは図４Ｂに示すように第３の接着部分６５を介して間接的に結合体化していてもよい。ある実施形態において、第３の接着部分６５は、シグナル増幅微粒子１１の第１および第２のオリゴヌクレオチド接着部分２６および２９と類似する第３のオリゴヌクレオチド接着部分６６である。第２の分析物結合分子７０は、結合体化ドメイン７１（すなわち第３の結合体化ドメイン）と、第２の結合体化ドメイン３５に類似する第２の分析物結合ドメイン７４と、シグナル増幅微粒子１１に接着した第１の分析物結合分子４０の第１の分析物結合ドメイン４４とを有する。分離微粒子７３上の第２の分析物結合分子７０は、第１の分析物結合分子４０と同じタイプの分子でもよく、あるいは異なるタイプでもよい。例えば、一実施形態において、第１の４０および第２の７０分析物結合分子は抗原分析物５０で免疫化された動物より得られたポリクローナル抗体である。その他の実施形態において、第１の４０および第２の７０分析物結合分子は、異なるハイブリドーマ細胞系において発現したモノクローナル抗体でもよい。
【００３５】
第１の４０および第２の７０の分析物結合分子は分析物５０上の異なる特徴構造と結合し、複合体６５の形成において、複数の分離微粒子７３を備える複数のシグナル増幅微粒子１１との会合を促進することが好ましい。明確とする目的で、図４Ａに１つのみの分離微粒子７３と会合し、シグナル増幅微粒子１１を１つのみ有する複合体６５を示すが、しかしながら実際には、複合体６５が凝集した格子を実質的に形成するように、多数の分離微粒子７３と会合した多数のシグナル増幅微粒子１１が存在すると予想されることが分かる。複合体６５は、少なくとも１つの分析物分子５０、少なくとも１つのシグナル増幅微粒子１１、および少なくとも１つの分離微粒子７３を含んでいる。複合体６５の形成は、抗体と抗原との間、あるいは抗原を介しビーズと結合した抗体との間の凝集反応と同種である。分析物５０が細菌、ウイルス、あるいは高分子のような大きな種である場合、複数の分離微粒子７３および複数のシグナル増幅微粒子１１が単一の分析物５０と結合する可能性がある。そのような場合は、複合体６５を形成する際に、続いて複数のシグナル増幅微粒子１１が単一の分析物と会合するので、複合体６５の形成によりさらにいっそう検出感度が増幅される。複合体６５は、分離微粒子７３の分離特性により、非複合型シグナル増幅微粒子１１から容易に分離され、これにより、非複合型シグナル増幅微粒子１１からのバックグランドノイズが大幅に軽減される。
【００３６】
複合体６５は一般に、シグナル増幅微粒子１１よりもより急速に沈降するので、ある実施形態における遠心分離のようなテクニックによって、複合体６５を懸濁液から容易に分離することが可能である。さらに複合体６５の形成は、シグナル増幅微粒子１１あるいは分離微粒子７３単独のいずれよりも大きな構造を生み出すので、別の実施形態における濾過によって、シグナル増幅微粒子１１からの複合体６５を分離することが可能となる。さらに他の実施形態において、分離微粒子７３がマイクロタイタープレートの表面に接着することによって、凝集複合体６５がそのプレートの表面に接着していてもよい。遠心分離、濾過、あるいは粘着性の使用により、いくつかの適用において有用であるが、本明細書で提供する好ましい方法に比して付加的なステップが加わるが、これは微量な分析物の迅速で経済的な検出のためにＭＢＡを使用するように設計されている。
【００３７】
したがって、煩雑性のより少ない方法で複合体６５は非複合型シグナル増幅微粒子１１から分離されることが好ましい。上述のように、強磁性分離微粒子７３（すなわち磁気ビーズ）の使用により、分離微粒子６０と会合していないシグナル増幅微粒子１１を洗い出すことができる。分析物の存在下での情報伝達粒子１１および分離粒子７３のインキュベーションの後、磁石を使用して分離粒子７３を特定の位置（例えば試験管の側面）に引き寄せ、これにより分離粒子７３に結合しているものを除いて、分離粒子の大部分を保持しながら、全ての情報伝達粒子を反応混合物から除去することができる。試験管の近傍から磁石を除去すると、分離粒子が放出され、続いて適当な洗浄溶液で洗浄することができ、次に、洗浄廃液が除去されるように再度磁石で引き寄せる。１〜３回の洗浄の後、分離微粒子７３は保持され、またこれらのうちのいくつかは、複合体６５中の第１、４０、第２、７０の分析物結合分子における第１および第２の分析物結合ドメイン４４および７４による分析物への架橋結合を介してシグナル増幅微粒子１１と会合すると予想される。保持された複合体６５中の会合したシグナル増幅微粒子１１の量は、直接はじめから存在する分析物の量に相当すると予想される。
【００３８】
それに応じて、本発明の別な局面において、分離微粒子７３と組み合わせたシグナル増幅微粒子１１の使用に基づいた分析物を検出する方法を含んでいる。図５は一般にこのような方法の一実施形態を示す。この方法は、第１の分析物結合分子４０およびシグナル分子３０を含むシグナル増幅微粒子１１を備えた分析物５０を含む試料と接触することを含んでいる。この試料は、第２の分析物結合分子７０を含分離微粒子とも結合し、混合物を形成している。試料の分離微粒子７３およびシグナル増幅微粒子１１との接触は、図５Ａで一般化されるような１ステップ、または図５Ｂに要約されるような２ステップで行われてもよい。この混合物は、第１の分析物結合分子４０および第２の分析物結合分子７０が分析物と結合し、複合体６５を形成するために必要な十分な時間インキュベートされる。一般にこの混合物は２０分未満、１０分未満、あるいは５分未満の間インキュベートされる。複合体６５と結合していないシグナル増幅微粒子１１は、続いて分離微粒子７３の物性の相違を使用して、非結合シグナル増幅微粒子１１から複合体６５を分離することにより除去し、複合体６５を含む保持された分画を形成する。任意にまた好ましくは、この保持された分画を少なくとも１回洗浄し、複合体６５と非特異的に会合している可能性のある非結合シグナル増幅微粒子１１をさらに除去する。続いて保持された複合体を、複合体６５に保持されたシグナル増幅微粒子１１上の情報伝達成分３６から放出されるべきシグナルを発するような条件下に置く。複合体中の分析物の量に相当し、したがって試料中の分析物の量に相当する放出されたシグナル量を測定する。好ましい実施形態では、全ての方法は、３０分未満、２０分未満、あるいは１５分未満で実行される。
【００３９】
図６は、試料中の細菌の存在を検出する方法を実施するためのキットの実施形態を示す。本実施形態における分析物５０は、細菌５３であり、その表面に複数の抗原部位５４を有する。このシグナル増幅微粒子１１は、シグナル分子３１のシグナル結合ドメイン３４中のヌクレオチドと結合した複数のアクリジニウム成分３７で標識されたオリゴヌクレオチドシグナル分子３１を含んでいる。シグナル分子３１は、第１のオリゴヌクレオチド結合成分２６と第１の結合体化ドメイン３２との間の相補的塩基対形成によって、第１の微粒子１０の表面上の第１のオリゴヌクレオチド結合成分２６と結合体化される。細菌５３上の表面抗原５４に特異的なポリクローナル抗体４１は、第２のオリゴヌクレオチド接着部分２９と抗体４１に結合した相補的なオリゴヌクレオチドとの間の塩基対形成によって第１の微粒子１０と結合体化する。これは第２の結合体化ドメイン３５を含む。次に抗体４１は、第１の結合部位で細菌５３の表面の抗原５４と結合する。分離粒子７３は、強磁性分離微粒子６０に結合したポリクローナル抗体４１を含む。図４Ｂに示すような実施形態において、ポリクローナル抗体４１は第２の分析物結合分子７０であり、さらに第３の結合体化ドメインを形成する第三のオリゴヌクレオチド７１と結合体化し、この抗体は続いて、第３のオリゴヌクレオチド接着部分６６と第３のオリゴヌクレオチド７１との間の塩基対形成を介して微粒子６０と結合体化する。シグナル増幅微粒子１１を細菌５３を含む試料および分離微粒子７３と混合した後、複合体６５は上述のように磁気引力により分離し洗浄する。洗浄された複合体７８中のアクリジニウム成分から放射された光量を測定して検量線と比較し、試料中に存在する細菌５３の数を定量するか、もしくは定性分析において、ネガティブコントロールから放射された光量と比較する。
【００４０】
図７は分析物結合分子が抗原８１および８２である抗体分析物７９を検出するためにキットの実施形態を示す。抗原８１および８２は、それぞれシグナル増幅微粒子１１および分離微粒子７３の表面に結合体化する。一実施形態において、抗原８１および８２はＨＩＶ粒子の外皮タンパク質あるいはウイルスの可溶化液から単離されたウイルスタンパク質などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原である。抗原８１および８２の一方または両方は、図７のシグナル増幅微粒子１１に示すようにオリゴヌクレオチド接着部分２９と結合する結合体化ドメイン３５などの接着したオリゴヌクレオチド結合体化ドメインを介して微粒子に結合体化してもよい。あるいは、抗原８１および８２の一方または両方は、図７の分離微粒子７３に示すような少なくとも１つの微粒子と直接架橋結合してもよい。標的抗体７９は、試料中でシグナル増幅微粒子１１および分離微粒子７３の両者の上の抗原８１および８２に抗体７９が結合することによって検出される。本明細書で述べたように分離微粒子７３が分離される場合、分離微粒子７５に保持されたシグナル増幅微粒子１１の量を検量線と比較して、試料中の抗体８３の量が定量される。
【００４１】
一方、図７が抗原８１および８２が、ＨＩＶエンベロープタンパク質のような高分子構造である実施形態を示す場合は、当業者は従来技術を使用して任意の抗原決定基をシグナル増幅微粒子１１および分離微粒子７３に組み入れることができると評価するであろう。例えば、図８に示すように、抗原８１および８２の一方あるいは両方が小分子エピトープ、例えばペプチドまたは他のハプテンであり、この同一物は、鍵穴カサガイアントシアニン
、大腸菌毒素、卵白アルブミン、およびその他の類似物などの適切なキャリア分子８４と容易に結合できる。このような場合、キャリア分子８４は分析物結合分子４０および／または７０の成分になり、またキャリア分子８４は、キャリア分子８４の１つの領域で接着した結合体化ドメイン３５およびまたは７１を含み、架橋結合した抗原８１を有する。シグナル増幅微粒子１１および分離微粒子７３上で使用される抗原８１および８２は、同じ構造を持っていてもよく、あるいは異なる構造を有していてもよい。
【００４２】
多様な実施形態では、異なるタイプの分析物結合分子の組み合わせを利用してもよい。例えば図９に関して、シグナル増幅微粒子１１は、検出される標的抗体７９によって認識されたエピトープを含む抗原８１と結合体化する。一方、分離微粒子７３は一般的な拮抗種の抗体４２、例えば、全ヒトＩｇＧ分子と結合するウサギ抗ヒトＩｇＧと結合体化する。この例においては、分離微粒子７３は、分析物結合抗体４２を介して全ヒト化抗体７９と非特異的に結合するが、検出される唯一のシグナルは、シグナル増幅微粒子１１上に存在する抗原８１分析物結合分子とも特異的に結合している抗体７９の量によって決定されると予想される。
【００４３】
図１０は、分析物９０として核酸配列を検出するための実施形態を示す。この実施形態では、第１の分析物結合分子（４０）は、結合体化ドメイン９１が第２のオリゴヌクレオチド酸接着部分２９に対する相補的配列を含んでおり、分析物結合ドメイン９２は核酸分析物９０上で、第１の標的配列９４に対する相補的核酸配列を構成するげんこつ核酸配列８９である。第１の核酸配列８９は、結合体化ドメイン２９を介してシグナル増幅微粒子１１に結合され、また分析物結合ドメイン９２との相補的塩基対形成により、標的配列９４の標的核酸分析物９０と結合している。分離微粒子７３は、分離微粒子７３上の（第三の）オリゴヌクレオチド酸接着部分６６に対して相補的な結合体化ドメイン配列７１を有する第２の核酸配列９５を含む。第２の核酸配列９５は、標的核酸分析物９０上の第２の標的配列９８に対して相補的な核酸配列である第２の分析物結合ドメイン９７も含んでいる。ハイブリッド形成を促進する条件下で核酸分析物９０を含む試料と混合された場合、標的核酸９０の第１および第２の標的核酸配列９４および９８は、シグナル増幅微粒子１１および分離微粒子７３と結合し複合体６５を形成する。複合体６５中のシグナル量を検量線と比較し、試料中に存在する標的核酸分析物９０の量を定量する。図１０はシグナル増幅微粒子１１あるいは分離微粒子７３のいずれかのための一結合部位を表すことから、分析物分子上の１つ以上の結合部位を標的とすることが可能であり、また好ましいことが分かる。分析物結合分子８９および／または９５は必ずしもげんこつ核酸配列である必要はないことも分かる。この場合これらは単に分析物結合ドメインを含み、微粒子１０および／または分離微粒子６０に直接結合体化される。
【００４４】
上述の実施形態において、多様な接着部分２５、２８および６５は、主としてそれぞれオリゴヌクレオチド２６、２９および６６として示される。オリゴヌクレオチド接着部分を使用する汎用性は本明細書ですでに述べた。しかしながら、本発明はオリゴヌクレオチド接着部分の使用に限定してはいない。上述のように、ある実施形態において、シグナル分子３０および／または分析物結合分子４０および７０は、官能基２０および６１への直接結合体化により、もしくは微粒子１０あるいは６０に接着する介在化学成分（キャリア分子８４など）との結合体化を介して、それぞれの微粒子１０および／または６０に直接接着することができる。
【００４５】
図１１は直接化学的架橋結合を使用し、シグナル分子３０、および分析物結合分子４０および７０をシグナル増幅微粒子１１および分離微粒子７３に接着させる実施形態を示す。このような実施形態では、接着部分２５、２８および／または６５は、微粒子１０、および６０上の官能基２０または６１と、微粒子１０および／または６０が架橋結合する残基３２、３５および／または７２との間のリンカーで結合するＲ基置換基の結合に関する適切な化学用語で規定してもよい。このような場合、シグナル分子３０および／または分析物結合分子４０および７０の結合領域３５または７２は、結合部分を形成するこれらの分子上の残基のための相当する化学用語で規定される。したがって、官能基２０および６１、Ｒ基２５、２８、および６５、ならびに残基３２、３５および７２によって規定された結合連鎖は、それぞれの接着部分および結合領域も規定する。
【実施例】
【００４６】
（実施例１  微粒子ベースの増幅を用いた細菌分析）
細菌調製：カナマイシン耐性遺伝子を保持する大腸菌の実験菌株Ｍ１５をＬＢプレート上で培養し、これを使用して２５μｇカナマイシン／ｍＬを含む成体ウシ血清４ｍＬを接種した。この細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３０℃で２０〜２４時間増殖させる。２ｍＬの培養液を使用しカナマイシンを含むウシ血清３００ｍＬを接種する。この細胞を振盪（２５０ｒｐｍ）させながら３０℃で一晩（約１５時間）増殖させる。培養液の約４０ｍＬを取り出し、１０ｍＬグリセリンを加え、標準とポジティブコントロールの調製に使用するためにこの混合物を１ｍＬ部分にアリコートする。１：５００および１：１０００に希釈された試料の２０μＬを２５μｇＫａｎ／ｍＬを補充した寒天培地にプレーティングし、続いて３７℃で一晩増殖させ、コロニー数をカウントし、グリセリンストック中で細菌濃度を計算することにより細菌力価が得られる。
【００４７】
この３００ｍＬからの残りの細胞は、５分間６０００×ｇの遠心分離によって回収され、１０ｍＬＰＢＳ中に懸濁される。懸濁された細胞を２５０ｍＬＰＢＳに希釈し、遠心分離によって回収し、２５０ｍＬＰＢＳ中の懸濁し続いて再び遠心分離することにより洗浄される。最終的に１０ｍＬＰＢＳ中で懸濁される。その後、細胞懸濁液は、間欠的振盪を行いながら９０℃で９０分間インキュベーションすることにより不活性化される。インキュベートされた懸濁液の５０μｌをＫａｎ−ＬＢプレート培地上で培養し、生きている細菌が残っていないことを確認する。
【００４８】
ポリクローナル抗体製造。不活性化された細菌細胞に対するポリクローナル抗体は、当業者において既知の種々の方法のいずれかを用いて、ウサギあるいは他の動物の免疫化によって得られる。工業規模で抗体を得るために、一つのリソースとして、抗体製造に特化したＰｒｏＳｃｉ社（ポーウェイ、カリフォルニア州）などの営利事業を利用してもよい。不活性化された細菌と共に一般に使用される免疫化プロトコルとしては、完全フロインドアジュバントは細菌成分を含むので、一般には不完全フロイントアジュバントを使用して約１０８の細菌細胞によりウサギを免疫化することが含まれる。ウサギは２週間間隔で２回増強させ、このウサギをブリードさせ分離した血球からの血清を回収することにより抗血清を回収する。
【００４９】
抗体のアフィニティー精製。細菌は親和性基質としてポリクローナル抗体のアフィニティー精製に使用される。３グラムのグルコースを含む１．０リットルのウシ血清培地中で後期対数期まで、細菌を培養する。細胞を６０００ｘｇ、５分間の遠心分離によって収集し、続いてＰＢＳ２５０ｍＬ中に懸濁する。細胞を収集するための遠心分離後、細胞ペレットを溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸塩、０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ２．４）２５０ｍＬ中に懸濁する。細胞をペレット化し、ＰＢＳ２５０ｍＬで洗浄する。さらに、細菌細胞を１０ｍＬＰＢＳ中で完全に懸濁する。
【００５０】
抗血清（２０〜４０ｍＬ）をはじめに１０×ＰＢＳを使用して１ｘＰＢＳに調節し、１ｘＰＢＳを用いて約１〜２ｍｇタンパク質／ｍＬに希釈し、続いて細菌細胞と混合する。穏やかに撹拌しながら室温で３０〜４０分間インキュベートする。この混合液をＰＢＳで２５０ｍＬに希釈する。細胞をペレット化し、ＰＢＳ２５０ｍＬで２回洗浄し、続いて３０ｍＬの溶出緩衝液の中に懸濁する。室温で１０分間インキュベーションした後、細胞をペレット化する。上清を回収する。細胞を再度溶出緩衝液２０ｍＬ中に懸濁し、室温で１０分間インキュベーションし、ペレット化する。上清を回収する。上清を併合し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０とともに２〜４ＬのＰＢＳに対して２〜８℃で一晩透析した。この溶液を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、限外濾過を使用して２〜５ｍｇタンパク質／ｍＬまで濃縮する。精製抗体のＩｇＧ分画をタンパク質Ａカラムまたはヤギ抗ウサギＩｇＧカラムを使用してさらに精製してもよい。
【００５１】
抗体価の測定。手順は同じだが抗体製剤を得るために使用する試料が異なっている場合もある検定の品質管理および再現性を考えると、抗体製剤の力価を測定するには一般的な定量方法が好ましい。ここで、力価とは、以下の分析において、バックグランドを越えて検出可能なシグナルを与える抗体濃度（あるいは希釈度）と定義される。以下は、１プロトコル例を示す。
【００５２】
２０００の熱不活化細菌を１．０ｍＬ容量の６セットの結合緩衝液（１０％ウシ血清を含むＰＢＳ）のそれぞれに打ち込む。細菌を含まない２セットの１．０ｍＬ結合緩衝液をネガティブコントロールとして使用する。細菌を含む試験管に、それぞれ以下の量の抗体を加える。１０μＬ（１：１００最終希釈液）、５μＬ（１：２００最終希釈液）、２．５μＬ（１：４００）、１：１０希釈の１２．５μＬ（１：８００最終希釈液）、１：１０希釈の６．２５μＬ（１：１６００最終希釈液）、および１：１０希釈の３．１２μＬ（１：３２００最終希釈液）。穏やかに撹拌しながら、室温で２０分間インキュベートする。遠心分離（微量遠心管中で６，０００ｒｐｍ、５分）および懸濁によってＰＢＳを用い４回洗浄する。最終的に細菌（および対照群）を１．０ｍＬ結合緩衝液中に懸濁する。
【００５３】
ペルオキシダーゼと結合体化されたヤギ抗ウサギ抗体５μＬ（あるいは製造者によって指図された量）を加える。穏やかに攪拌しながら２５分間室温でインキュベートする。遠心分離（微量遠心管中で６，０００ｒｐｍ、５分）および懸濁によってＰＢＳを用いて４回洗浄すること。ＴＭＢ法により結合したペルオキシダーゼ活性を測定する。簡潔に述べると、ｐＨ６．０の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液９９ｍＬ中に希釈されている１ｍＬＤＭＳＯに１０ｍｇＴＭＢ（シグマ、１２８８５）を溶解する。使用する直前に、３３μＬの過酸化水素（３０％Ｗ／Ｗ）をこの溶液に加える。得られた溶液１５０μＬを各ウェルに加え、続いて遮光下で１５〜３０分間インキュベーションを行う。２Ｍ硫酸５０μＬを加え反応を停止させる。分光光度計を使用してネガティブコントロールをバックグランドとして４５０ｎｍにおける吸収を測定する。データをプロットする。力価は図１５で示される直線と抗体希釈を表すＸ軸との間の交点である。
【００５４】
（実施例２  オリゴヌクレオチド：配列、合成、および連結反応）
オリゴヌクレオチドのデザイン：図１２は４つのオリゴヌクレオチド、Ａ−Ｄを示す。それらの配列は、接着オリゴヌクレオチド成分２６および２９におけるランダムに生成された配列に基づく。この実施例においては、オリゴヌクレオチドＡは、第１のオリゴヌクレオチド接着部分２６を表し、ｄＡ（４０）すなわち４０個のデオキシアデノシン残基を有する。オリゴヌクレオチドＡは情報伝達分子３０の結合体化ドメイン３２を形成するオリゴヌクレオチドＣの３’末端と相補的であり、この３’末端は４０個のデオキシチミジン残基を有する。この実施例においては、オリゴヌクレオチドＢは第２のオリゴヌクレオチド接着部分２９を表し、ｄＧ（３０）すなわち３０個のデオキシグアノシン残基を有する。オリゴヌクレオチドＢは、ｄＣ（３０）すなわち分析物結合分子４０として寄与する抗体４１と結合する結合体化ドメイン３５を形成する３０個のデオキシシチジン残基を有するオリゴヌクレオチドＤに対して相補的である。各オリゴヌクレオチド対の相補的な領域は、７０℃の融解温度を有している。従来のオリゴヌクレオチドシンセサイザで全てのオリゴヌクレオチドが合成される。
【００５５】
オリゴヌクレオチドＣは１９０塩基の長さであり、デオキシチミジンを有する３’末端の４０個の残基に加えて、さらにシグナル結合ドメイン３４のための１５０個の残基を含んでいる。オリゴヌクレオチド合成技術により長いオリゴヌクレオチドの高効率合成が可能な場合、単一のオリゴヌクレオチドとして１９０塩基のオリゴヌクレオチドＣ配列全体を合成してもよい。それ以外では、オリゴヌクレオチドＣは、例えば４０個のデオキシチミジン残基の全てを含んでいるＣ１を備えた４つのより小さな前駆体オリゴヌクレオチド９７（オリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ４）として合成される。続いて図１２Ｂに示すように、４つの前駆体オリゴヌクレオチドが連結される。オリゴヌクレオチドＣを合成するために、シグナル結合ドメインオリゴヌクレオチド（Ｃ２−Ｃ４）の５’末端および結合体化ドメインオリゴヌクレオチド（Ｃ１）がＡＴＰの存在下で最初にＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより処理される。１２塩基長のヒドロキシ末端骨格オリゴヌクレオチド９９によりオリゴヌクレオチドを整列させることにより、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりオリゴヌクレオチドＣ１−Ｃ４が互いに連結される。骨格オリゴヌクレオチド９９は、近接するオリゴヌクレオチドのリンカー、すなわちそれぞれｄＡ（６）ｄ（ＣＴ）（３）、ｄ（ＣＴ）（３）：ｄＣ（６）、およびｄＣ（６）ｄＴ（６）に固有の３’および５’末端と相補的である。オリゴヌクレオチドＣ２〜Ｃ４の中央部分（シグナル結合ドメイン）は、一級アミンなどの官能基で誘導体化されたデオキシヌクレオシド残基を含む。代わりに、官能基を含む非ヌクレオチド化合物のオリゴヌクレオチド合成中の取り込みによってシグナル結合ドメインに官能基を導入することができる。デオキシヌクレオシドまたは非ヌクレオシド化合物を誘導化した官能基のホスホラミダイトは、化学合成の間に効率的にオリゴヌクレオチドに取り込むことができる。これらのホスホラミダイトは、市販ソース、例えば、一級アミン誘導体化ｄＴホスホラミダイトにおけるＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃ（スターリング、バージニア州）、ＵｎｉＬｉｎｋＴＭＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒと呼ばれる一級アミン誘導体化非ヌクレオシドホスホラミダイトにおけるＣｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）から容易に入手可能である。
【００５６】
連結後、反応混合物を６５℃で１５分間加熱し、骨格オリゴヌクレオチドを分離する。この骨格オリゴヌクレオチドおよび非連結のオリゴヌクレオチドＣ１−Ｃ４は、比較的小さく（４０〜５０塩基未満）、このため適切なゲル濾過カラムにより、連結生成物（１９０塩基）から容易に除去される。ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動および続いて例えば銀染色を行うことにより、連結生成物の量および質を検査する。
【００５７】
しかしながら、オリゴヌクレオチドＣの長さ、および各オリゴヌクレオチドＣ分子上の一級アミンなどの官能基数は、分析のための特定の要件（例えば、感度および直線性の範囲など）に依存して変化してもよいことが分かる。アクリジニウムなどのシグナル分子に結合体化された後でもオリゴヌクレオチドが水溶性を維持するように、誘導体化された官能基数がオリゴヌクレオチドＣの総塩基数の半分を超過しないことが好ましい。いくつかの実施形態において、７０未満、６０未満、あるいは５０塩基未満を有するオリゴヌクレオチドＣは、それぞれ２０未満、１５未満のあるいは１０未満の官能基を含むが、依然分析に十分な感度を提供する。このような場合、オリゴヌクレオチドＣはハイブリッド形成領域３２およびシグナル結合ドメイン３４の両方を含む単一のオリゴヌクレオチドでもよい。
【００５８】
（実施例３  アクリジニウムエステルのオリゴヌクレオチドＣへの結合体化）
アクリジニウムはその高い量子収量のために診断分析において長年使用されており、その効率的な検出が可能となり、このため分析の感度を向上させる。アクリジニウムは容易に市販品を入手可能である。しかしながら、アミンを含む情報伝達領域に結合体化されるためにそれを活性化しなければならない。一般に使用される１つの方法は、アクリジニウム分子にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステルを導入することである。アクリジニウムエステルを製造する１つの合成手法は、参考として本明細書に援用されているＷｅｅｋら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２９、１４７４）１９８３、により開発され、いくつかの診断薬の製造業者によって使用された。例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ポートランド、オレゴン州）などのいくつかのベンダーは、アクリジニウムエステルのためのカスタム合成サービスを提供している。
【００５９】
アクリジニウムシスクシンイミジルエステルは一級アミンと反応性があるので、上述のようにオリゴヌクレオチドに導入された一級アミンによりオリゴヌクレオチドＣのシグナル結合ドメイン３４にアクリジニウムを結合体化することが可能である。水ベースの溶液内でのＮＨＳエステルの加水分解を避けるため、またこのためアクリジニウムのオリゴＣへの結合体化効率を改善するため、反応はオリゴヌクレオチドおよびアクリジニウムエステルの両者と相溶性のある有機溶剤（例えばジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）で行うことが好ましい。
【００６０】
１０μモルのアクリジニウムエステル（約５ｍｇ）をＤＭＳＯ１ｍＬに溶かし、続いて０．５ｍＬＤＭＳＯに溶解させた０．１μモルのオリゴヌクレオチドＣに加える。このオリゴ中の一級アミンに対するアクリジウムａｃｒｉｄｉｕｍのモル比は１０対１である。穏やかに振盪しながら、遮光下でこの混合物を４〜５時間インキュベートする。１００μＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５を添加後、未反応のアクリジニウムエステルを中和するため、この混合物を同じ条件下で３０分間インキュベートする。得られた溶液をセファデックスＧ−２５カラムに導入し、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．２で溶出させた。０．５ｍＬ分画として溶離液を採取し、ＯＤ２６０でモニターした。ピーク分画を採取し、互いに混合し、−７０℃で保存した。
【００６１】
比活性を評価するために、１０μＬのオリゴヌクレオチドを０．１Ｍ酢酸Ｎａ、ｐＨ５．２で１．０ｍＬに希釈する。０．５ｍＬを取り、ＯＤ２６０吸光度を測定する。これはオリゴヌクレオチド濃度を計算するために使用される。１００μＬを取り、系列稀釈液、例えば、１０２〜１０１２倍希釈液を作成する。各希釈について５０μＬを取り、ＲＬＵを２回測定する。平均ＲＬＵを希釈比に対して回帰分析を行う。これは５０μＬのオリジナル溶液におけるＲＬＵを評価するために使用することができ、続いて比活性、例えばＲＬＵ／ｐｍｏｌｅｓオリゴＣを測定するために利用できる。
【００６２】
（実施例４  オリゴヌクレオチド接着部分のシグナル増幅微粒子および分離微粒子への結合体化）
様々なベンダーが磁気ビーズおよび本発明に適するその他の形態の微小球を提供している。Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（フィッシャー、インディアナ州）は、強磁性成分を含む、または含まないアミン官能基で被覆されたビーズをはじめとする多様なサイズおよび物質の種々の小球形ビーズを提供している。分離微粒子７３のために１．０μｍの磁気ビーズが使用され、シグナル増幅微粒子１１に１μｍビーズが使用される。これらのサイズにより、１つあるいは２つの磁気ビーズ、および１つあるいは２つのアクリジニウム標識シグナル増幅微粒子１１との、細菌などの適切な分析物の結合が可能となる。
【００６３】
５’末端に一級アミンを含むオリゴヌクレオチド接着部分２６および２９（ＡおよびＢ）の両者は、シグナル増幅微粒子１１に結合体化される。ここで、第３のオリゴヌクレオチド接着部分６６を分離微粒子７３を含む磁気ビーズへ結合体化することと同様に、オリゴヌクレオチド接着部分２６および２９をシグナル増幅微粒子１１に結合体化するのに適する方法について述べる。参考として本明細書に援用されている、このプロトコルはベンダーのプロトコル（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ウォリントン、ペンシルバニア州）を適合させたものである。カルボキシル基（約２４０μモル／ｇ）で誘導体化された２００ｍｇの微粒子を、限外濾過または遠心分離を使用して試薬用の水で２回洗浄する。２ｍＬ未満の水中に微粒子を懸濁させる。使用の直前に、３８４ｍｇのカルボジイミド［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）―カルボジイミド塩酸塩、ＥＤＣ］を１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ  ７．５）２０ｍＬに溶解する。オリゴヌクレオチドＡおよびＢそれぞれ１．８μモルおよび０．２μモルをＥＤＣ溶液に加え、２分間激しく攪拌し、オリゴヌクレオチドが完全に溶解されていることを確認する。得られたオリゴヌクレオチド／ＥＤＣ溶液を直ちに上述のように調製した微粒子溶液に加える。室温で１６〜２４時間、回転攪拌する。オリゴヌクレオチドが結合体化された微粒子を水に４０ｍＬで３回洗浄し、続いて１ｘＰＢＳ、５％グリセリン、１％ヌクレアーゼなしのＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．５％プロクリン５０００を含む貯蔵緩衝液１０ｍＬ中に懸濁させる。３０分ごとに激しく振盪しながら得られた溶液を６８℃で４時間インキュベートする。さらに室温で１６〜２４時間回転させ、貯蔵緩衝液を補充し、次に４８℃で貯蔵する。上清のＯＤ２６０測定によりオリゴヌクレオチド結合体化効率を評価する。
【００６４】
（実施例５  オリゴヌクレオチドの抗体への結合体化）
図１２を参照して、５’末端にアミン基を有するオリゴヌクレオチドＤは抗体４１と共有結合的に結合体化され、分析物結合分子の結合体化ドメインを形成する。抗体にオリゴヌクレオチドＤを結合体化するための好ましい方法は、異種２官能性架橋剤の使用を介することである。本明細書に実例として参照したこのような架橋剤の１つは、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸エステル（スルホ−ＳＭＣＣ）であり、スペーサアームと結合したＮＨＳエステルおよびマレイミド基より構成される。したがって、この架橋剤は共有結合的に一級アミンおよび別の分子のチオ基（スルフヒドリル）と相互作用することができ、これにより２つの分子を架橋させる。オリゴヌクレオチドＤがその末端で一級アミンを含んでいる場合、このオリゴヌクレオチドは、最初にモル比１：５の架橋剤に対するオリゴヌクレオチド比（あるいは経験的に決定された比率）で、スルホ−ＳＭＣＣで室温でＰＢＳ緩衝液中３０〜６０分間インキュベーションすることが好ましい。続いて、反応溶液を脱塩カラムに通して未反応の架橋剤を除去する。得られたオリゴヌクレオチドは、還元剤（例えば２-メルカプトエチルアミン）を使用して、または化学修飾剤（例えばＮ−スクシイミジル−Ｓアセチルチオアセテート）を介して導入でき、経験的に決定する必要がある２：１のモル配給で抗体を含む遊離のスルフヒドリルとともにＰＢＳ緩衝液中で４℃一晩インキュベートする。ゲル濾過クロマトグラフィあるいは遠心分離を使用する限外濾過により、得られたオリゴヌクレオチド結合体化抗体を非結合体化のオリゴヌクレオチドから分離する。これらの分離テクニックは当業者において公知である。
【００６５】
（実施例６  磁気ビーズへの抗体の直接結合体化）
この変更では、抗体は第三のオリゴヌクレオチド接着部分６６を介さずに、直接化学架橋結合により、分離微粒子７３（および／またはシグナル増幅微粒子１１）に接着している。このプロトコルは参考として本明細書に援用されている、ベンダーのプロトコル（ピアス、ロックフォード、イリノイ州）を適用している。五十（５０）ｍｇのアミン−誘導体化磁気ビーズ（２４０ｎモルアミン／ｍｇ）をＰＢＳ１ｍＬで３回洗浄する。続いて、このビーズを親和性精製ポリクローナル抗体（５ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬが添加されたＰＢＳ１ｍＬ中に懸濁する。穏やかに撹拌しながら混合した後、新たに調製した５ｍＭＢＳ３０．５ｍＬを加える。室温で６０分間穏やかに攪拌しながら混合物をインキュベーションする。１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）５０μＬを加え、さらに１０分間インキュベーションを継続し反応を停止させる。磁気分離と洗浄により、微粒子結合体を非結合の抗体から分離する。２８０ｎｍにおけるビーズの吸収を測定することにより、結合体化効率を評価する。
【００６６】
（実施例７  アクリジニウム標識オリゴヌクレオチドおよび抗体の微粒子への接着）
それぞれ、微粒子に共有結合で結合体化されているオリゴヌクレオチドＡ２６およびＢ２９へのハイブリッド形成により、アクリジニウム標識オリゴヌクレオチドＣおよびオリゴヌクレオチドＤ標識抗体４０の両者を微粒子に接着させる。ハイブリッド形成を行なうために、下記成分を４２℃で５分間あらかじめ加温する。：実施例４で述べた貯蔵緩衝液５ｍＬ中でオリゴヌクレオチドＡおよびＢを被覆した微粒子２００ｍｇ、２．０μモルのアクリジニウム標識オリゴヌクレオチドＣ（５ｍＬ）、２２．５ｍｇのオリゴヌクレオチドＤ結合体化抗体（５ｍＬ）、および１５ｍＬの２×ハイブリッド形成緩衝液（４０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１．０Ｍ  ＮａＣｌ）。これらの成分を互いに混合し、あらかじめ４２℃２時間加温したハイブリッド形成オーブン中でインキュベートする。続いて、この混合物を室温遮光下で約５時間、回転させながらインキュベートする。微粒子を回収し、遠心分離または限外濾過を使用してＰＢＳで４回洗浄し、１０９粒子／ｍＬの濃度で貯蔵緩衝液中に懸濁させた。
【００６７】
ソラレンなどのＵＶ誘導架橋結合剤を使用して、ハイブリッド化二本鎖ＤＮＡをさらに安定化させることが可能である。
【００６８】
（実施例８  プレート試料中の細菌を検出するためのキット構成材料）
検出のための構成材料および成分を以下の表にリストする：
（表１）
【００６９】
【表１】
2005534006.tif 000003
（実施例９  細菌検出キットにおける反応条件の最適化）
本明細書に述べた分析法はサンドイッチフォーマットであり、図６に示すものと同じポリクローナル抗体を介して細菌を磁気ビーズおよびアクリジニウム標識微粒子の両者と結合させる分析方法である。
【００７０】
（ｉ）感度（検出限界）を向上させるために、磁気ビーズと微粒子の濃度を高くし、および／またはインキュベーション時間を長くし、検出に適した十分な量の複合体６５の形成を可能とする必要がある。この分析は迅速試験を意図しているので、インキュベーション時間は２０分未満が好ましい。この分析では１０、１５あるいは２０分のインキュベーションを使用して評価している。他の変動要因はサンプル体積と調製であり、一貫して検出することができる（すなわち時間の９５％）単位ｍＬ当たりの一般細菌数として定義される検出限界に影響を及ぼす可能性がある。しかしながら、この分析におけるもう１つの設計目標は、わずかな試料調製、または試料調製なしに行うことをはじめ可能な限り簡易に行うことである。結果として本実施例では、貯蔵媒質から直接採取される１．０ｍＬの血小板をベースとする。最適化の目的で、５０００細菌／ｍＬ（すなわちポジティブコントロール）でスパイクさせたヒト血漿を最適化試料として使用する。実施例１に抗体と細菌の調製について記載した。
【００７１】
インキュベーション時間（１０分）およびそれ以上の調製なしの１.０ｍＬ陽性試料を用いて、シグナル増幅微粒子と分離微粒子上に結合体化する抗体の濃度、試験手順におけるこれらの２つの結合体化比をはじめに評価する。２つの結合体の比率の測定は、カットオフ比に対して最も高いシグナルを与える比率を識別することである。最初の試験で使用した２つの結合体の組み合わせを表２に示す
（表２  結合体の濃度に関する最適化）
【００７２】
【表２−１】
2005534006.tif 000004
【００７３】
【表２−２】
2005534006.tif 000005
【００７４】
【表２−３】
2005534006.tif 000006
カットオフ比に対するシグナル（Ｓ／ＣＯ）は、与えられた条件におけるポジティブコントロールのＲＬＵを、同じ条件下のネガティブコントロールＲＬＵで割り算を行い得られた値である。粒子数は結合体化プロセス後の回収率が８５％であると仮定するベンダーによって提供された分析証明書の情報に従って測定した。
【００７５】
（ｉｉ）最初の最適化プロトコル。以下のプロトコルを表２に示すように結合体化最適化のために使用するものとする。
（ａ）補給材料：磁石、反応チューブ（シンチレーションカウンタ用７５×１２ｍｍのガラス管あるいは他の同様なサイズの透明チューブ）、および実施例８の表１に示すようなキット構成材料。
（ｂ）２０本の反応チューブをとり、それらに表２に示す番号のラベルを貼る。指示された量の磁気ビーズ結合体およびアクリジニウム結合体を添加する（表２を参照）。
（ｃ）ポジティブコントロール１．０ｍＬを反応１０ｐ〜２０ｐに加え、ネガティブコントロール１．０ｍＬを反応１ｎ−９ｎへ加える。混合し、ロテーター中で穏やかに攪拌しながら室温で１０分間インキュベートする。
（ｄ）これらの管用に設計された磁気棒の近くにこの管を置く。２分間または管壁にすべての磁気ビーズが接着するまで待つ。
（ｅ）反応チューブ中で全ての溶液をデカントする。この管の口に１枚のキムワイプペーパーまたは他の吸収紙を当てて溶液の最後の液滴を除去する。
（ｆ）磁気棒上でこの管を保持させている間、洗浄緩衝液５ｍＬを加え、さらにステップｄおよびｅを繰り返す。このステップをもう１回繰り返す。
（ｇ）照度計により結果を読み取る。表２にＲＬＵを記録する。
（ｈ）各々の結合体化についてＳ／ＣＯを計算する。
【００７６】
この手順により２つの結合体の最適な（またはほぼ最適な）組み合わせが可能となる。同様のプロトコルを使用して、シグナル増幅微粒子上の情報伝達分子に対する抗体を最適化する。この手順では、グループ内でシグナル増幅微粒子に対する分離微粒子の比率は固定されているが、情報伝達分子結合体に結合体化する抗体の比は各グループ内で変化する。試験結果の再現性を確認するため２回以上この実験を繰り返す必要があると考えられる。
【００７７】
２つのインジェクタを備えたルミノメータがこの分析に適する。
【００７８】
（ｉｉｉ）結合体化濃度（任意）における一層の最適化。各々の結合体について３種の結合体化濃度レベルがあるが、これらは１０倍異なる。「最適な」濃度をさらに最適化することが可能であると考えられる。この組み合わせのいずれも最適ではないという指摘は、１種以上の結合体化濃度の組み合わせが同様に高いＳ／ＣＯを与えるということである。この場合、ピークのまわりの結合体化濃度はさらに最適化されている。
【００７９】
（ｉｖ）試料量および調製の最適化（任意）。いずれの結合体の組み合わせで適度に高いＳ／ＣＯがない（例えば＜２．０）場合、細菌濃度が極めて低いことが示唆される。細菌の濃度を「増加させる」ために、微量遠心管中で試料（１．０ｍＬ）を６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細菌をペレット化する。上清０．９ｍＬを除去し、残りの溶液に細胞ペレットを懸濁する。このステップにより、およそ１０倍濃度を増加させることができ、検出限界の項目に有意差が現れる。しかしながら、このステップによりこの手順は約５分長くなるものの、インキュベーション時間は１０分未満に減少される。当然ながら、遠心分離ステップが試料調製に含まれる場合は、１ｍＬを越える試料を使用することが可能である。
【００８０】
（ｖ）インキュベーション時間の最適化。与えられた試験では、インキュベーション時間は、少なくとも１５分あるいは２０分まで５分毎に漸増させるか、もしくは最長のインキュベーション時間とする。一般に、インキュベーション時間を増加させると、分析物結合分子の親和定数によって決定されるが、システムが平衡に達する時点まで分析物の結合が増加する。
【００８１】
（ｖｉ）バックグランドＲＬＵ（ネガティブコントロール）の最適化。シグナル分子は直接シグナル増幅微粒子に結合体化されるので、バックグランドＲＬＵは非常に低いと予想され、これは容易に洗い出すことができる。しかしながら、このプロトコルの２つの「洗浄」ステップは実際には「水洗」ステップであるため、未結合の微粒子を完全に除去されない可能性があり、このため高いバックグランドが生じる。バックグランドが高いと考えられる場合（例えば、アクリジニウム標識微粒子なしでＲＬＵの数倍）、洗浄ステップの回数を増加させる。この変更によりこの手順はさらに５分の時間が追加される。一方、バックグランドがアクリジニウム標識微粒子なしで対照群のＲＬＵと同様であった場合、「水洗」ステップにより非結合微粒子の除去が有効であることが示唆される。それぞれ手順において、水洗ステップの省略により３〜４分節約される。１回の洗浄ステップのみを利用する手順が好ましい。
【００８２】
（ｖｉｉ）交互の成分形成。キットはシグナル増幅微粒子１１と分離微粒子７３とを含む単一成分を有するように単純化してもよい。そのような処方の生存度は、そのような処方の長期安定性に依存するが、これはそのようなキットを作成し、ポジティブコントロールによる結果と比較検証することにより評価される。
【００８３】
（ｖｉｉｉ）再現性試験−カットオフを設定し、検出限界を把握する。一度、この分析が最大Ｓ／ＣＯのために最適化されると、再現性試験を行なうことによりその分析の変動性を評価し、陽性（または陰性）Ｓ／ＣＯ値を設定するためのデータ、および検出限界を把握するためのデータが得られる。
【００８４】
（ｉｘ）プロトコル。５日以上の各日に１セットの試験運転を行うが、連続日である必要はない。毎日、血小板のバッグが得られる。プレートを使用する平板培養のためにその一部を取り出し、細菌汚染が認められないことを確認する。陰性試料として５０ｍＬを除去する。さらに５ｘ１５ｍＬ（６０ｍＬ）を除去し、５本の無菌管に移す。これらに、それぞれ１０００、２０００、４０００、６０００、および８０００／ｍＬの最終細菌濃度で、ポジティブコントロール細菌をスパイクする。それぞれ各々の日の陰性と陽性の試料について、４０および１０の複製物を試験する。「試験」回数を増加させるために、これらの複製物を各日のいくつかのミニ試験に分割してもよい。例えば、１つの試験では８つの陰性試料複製物と各陽性試料について２つの複製物の試験を行う。このような場合、各日に５つのミニ試験が行われる。各試験でＲＬＵ値が得られる。この試験が完了すると、陰性試料について２００例、および各陽性試料につき５０例の試験結果が存在する。
【００８５】
（ｘ）ネガティブコントロールにおける標準偏差（標準偏差）およびＲＬＵ値の平均をネガティブコントロールの２００例の試験結果（ＲＬＵ値）から計算する。陰性（あるいは陽性）におけるカットオフＲＬＵは、要求された特異性によって設定される。例えば、カットオフＲＬＵを平均値をこえる３ＳＤに設定すると、９９％の特異性が達成される。このカットオフＲＬＵは、試料のＲＬＵを割り算するための分母として使用され、試料のＳ／ＣＯ（カットオフ比に対するシグナル）を生成する。したがって、Ｓ／ＣＯが１．０以上である場合、試料は陽性と考えられる。
【００８６】
（ｘｉ）検出限界（分析感度）の評価。一度、陽性のためのＳ／ＣＯが設定される（例えば＝１．０）と、細菌含有試料が陽性であるかどうかを判定することができ、これにより、各細菌濃度レベルで得られる陽性結果の割合を計算することができる。続いて、本明細書に参考として援用したＦｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ｊ．（１９７１）（プロビット解析、第三版、ロンドン：ケンブリッジ大学出版局）により記載された「プロビットモデリング」統計学的方法を用いて、各細菌濃度における陽性割合から検出限界を評価する。プロビット解析のためのソフトウエアプログラムはＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社（ケアリー、ノースカロライナ州）からの入手可能である。図１４に示すように、検出限界は、試料を試験することが可能な時間の９５％が陽性であるような細菌レベルとして決定される。
【００８７】
（ｘｉｉ）血小板の中で成長する細菌の検出。新たに調製された血小板の１単位を５０００の細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｍ１５）でスパイクする。他の細菌株が血小板の中で成長しないようにするために、カナマイシンを２５μｇ／ｍＬの終濃度で加える。血小板４ｍＬを約１２時間ごとに除去し、１ｍＬを平板培養に使用して細菌濃度を測定する。一方、２ｍＬを最適化されたプロトコルに従った複製物の試験のために使用する。この試験により、シミュレートされた条件下での細菌成長のための分析性能が評価される。
【００８８】
（実施例１０  微粒子ベースの増幅を使用するＨＩＶ−１ウイルス負荷試験）
図１０に示すように、本発明は核酸の定性的あるいは量的検出に適用することができる。この実施例では、試料中のＨＩＶ−１ウイルスの定量的検出、例えばウイルス濃度定量のための１つの方法について述べる。
【００８９】
オリゴヌクレオチドの配列選択および合成。この分析では、少なくとも１対、少なくとも二対、少なくとも３対、あるいは少なくとも４対のオリゴヌクレオチドが必要であり、その全体または一部がＨＩＶ−１配列の高度な保存領域と相補的である。保存配列を選択する方法は、当業者において公知である。１つの対の２つのオリゴヌクレオチドが好ましいが、ウィルスゲノムの同じ領域と相補的（しかし別個の配列）である必要はない。１つの対における一方のオリゴヌクレオチドは分離微粒子７３と結合体化するが、もう一方のオリゴヌクレオチドはシグナル増幅微粒子１１と結合する。これらのオリゴヌクレトチドの結合体化は、図３Ａに示すように直接、もしくは図３Ｂおよび３Ｃに示すように第三の分子による間接的な結合体化が可能である。
【００９０】
４対のオリゴヌクレオチドを備えたデザインでは、分離微粒子７３およびシグナル増幅微粒子１１は、各々４つのオリゴヌクレオチドで結合体化される。このオリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも４０℃、少なくとも５０℃、あるいは少なくとも６０℃の融点を備えたＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを提供するように、十分な長さが必要である。このオリゴヌクレオチドは、３’または５’末端で誘導体化された官能基（例えば一級アミン）により合成される。図１０に示すように、シグナル増幅微粒子１１は、２つの追加のオリゴヌクレオチド、すなわちシグナル分子３１および第１の接着オリゴヌクレオチド２６を含み、後者はシグナル分子３１の結合領域３２と相補的である。シグナル分子３１および第１の接着オリゴヌクレオチド２６の調製は、実施例２および３に記載した。
【００９１】
微粒子へのオリゴヌクレオチドの接着。オリゴヌクレオチドは微粒子１０および６０に接着し、それぞれシグナル増幅微粒子１１および分離微粒子７３を形成する。オリゴヌクレオチドを微粒子に接着させる１つの方法は、実施例４で述べており、ＨＩＶ−１分析システムの製造のために使用することができる。ウィルスゲノムと相補的である第１の接着オリゴヌクレオチド２６のウイルス特異性オリゴヌクレオチドに対するモル比は、経験的に決定すべきであるが、例えば１：４のモル比で始めることができる。等モルのウイルス特異性オリゴヌクレオチドは、微粒子１０および６０の両者への接着において好ましい。一度、ウイルス特異性オリゴヌクレオチド（複数）が微粒子６０に結合体化されると、この微粒子は官能基分離微粒子７３となり、１０９粒子／ｍＬで貯蔵緩衝液の中に懸濁される。
【００９２】
官能基シグナル増幅微粒子１１の組立には、通常実施例７で述べたように、ハイブリッド形成を介したシグナル分子３１の接着が必要である。具体的には、下記成分をあらかじめ４２℃で５分間加温する。：オリゴヌクレオチドＣ（５ｍＬ）で被覆した二百（２００）ｍｇの微粒子、２．０μモルのアクリジニウム標識オリゴヌクレオチドＣ（５ｍＬ）、および２×ハイブリッド形成緩衝液（４０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１．０Ｍ  ＮａＣｌ）１０ｍＬ。続いて、これらの成分を互いに混合し、あらかじめ４２℃で２時間加温したハイブリッド形成オーブン中でインキュベートする。次に、この混合物を回転させながら、室温遮光下で約５時間インキュベートする。この微粒子を遠心分離または限外濾過を使用して回収し、ＰＢＳで４回洗浄し、１０９粒子／ｍＬで貯蔵緩衝液中に懸濁する。
【００９３】
試料調製。臨床試料は、ヘパリンおよびＥＤＴＡなどの抗凝血薬を使用するＨＩＶ−１ウイルス負荷試験における個人より採取したヒト血漿であることが好ましい。低速遠心分離（例えば３０００ｇ、１０分）により赤血球、白血球、および類似物を除去した後、得られた血漿をウイルス負荷試験に使用する。最初に試料中のリボ核酸（ＲＮＡ）が血漿から抽出されることが好ましい。臨床試料からＲＮＡを抽出する方法は、当業者において公知である。ＲＮＡ抽出溶液の市販の供給源（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）が利用可能である。このＲＮＡ抽出物は、１００μＬのＴＢ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で懸濁させることができる。
【００９４】
試験プロトコル。２×ハイブリッド形成緩衝液３００μＬ、分離微粒子１００μＬ、およびシグナル増幅微粒子１００μＬをＲＮＡ試料（１００μＬ）に加える。穏やかに攪拌しながら４２℃で３時間インキュベートする。反応溶液を１２×７５ｍｍ試験管に移し、続いてこれを磁石の近く置く。分離微粒子が試験管壁に接着した後（およそ２〜３分）、水溶液を除去する。ＰＢＳ緩衝液の２ｍＬで微粒子を４回洗浄する。１００μＬのＰＢＳ緩衝液中に微粒子を懸濁する。０．１ＮＨＣｌ中１％ヒドロペルオキシド３００μＬ、および０．４ＮＮａＯＨ１００μＬを添加した後、光の出力を測定する。試料中のウイルスＲＮＡ濃度を、あらかじめ測定され、または同時に測定された比例曲線を使用して定量する。
【００９５】
分析の最適化。最適化する必要のある分析条件としては、分離微粒子およびシグナル増幅粒子の量、シグナル増幅微粒子上のアクリジニウム標識強度、ハイブリッド形成条件（例えば、塩濃度、期間および温度）、および洗浄サイクル数などがあるが、これに限定されない。分離およびシグナル増幅微粒子の相対量を最適化する１つの方法は、実施例９に記載され、ＨＩＶウイルス負荷分析の適用可能である。強度最適化により、分析においてより広い直線範囲が得られるため、定量分析ではアクリジニウム標識強度を最適化する必要がある。それに応じて、所望の直線範囲（例えば１００〜５０，０００のＨＩＶ−１ＲＮＡコピー／ｍＬ）が達成されるように、直線性試験において最適なアクリジニウム標識強度が決定される。最適なハイブリッド形成条件は、最短時間で十分なハイブリッド形成を可能とするものである。洗浄サイクルの最適の回数は、最も低いバックグランドが得られる最小回数である。
【００９６】
検量線の確立。定量分析においては、検量線は通常必須ではないが、ＨＩＶ−１ウイルスＲＮＡの既知の濃度を増加させた、例えば０〜５０，０００コピー／ｍＬ、一連の試料を検査することにより試験ごとに確認する。得られたＲＬＵ出力はウイルス濃度に対して回帰分析を行い、比例曲線を生成させる。この比例曲線を使用して、試料中のＨＩＶ−１ＲＮＡ濃度を計算する。
【００９７】
その他の代わりの方法は、特定の試験のためではなく、様々な状況（例えば、異なる研究室および試薬ロット）下で多数の標準試料の試験を行うことにより分析のための検量線を確立する必要がある。試験に固有の変動を管理するため、各試験にごとに、既知濃度のＨＩＶ−１ＲＮＡを有する少数の較正物質（例えば３つ）で試験を行い、その試験の検量線を較正してもよい。
【００９８】
分析性能の判定。分析性能を表すいくつかのキーパラメーターを特徴づけられる。これらには、直線範囲（定量限界の上限と下限）、直線性、および精度などがあるがこれに限定されない。直線性および精度を評価する方法は、ＮＣＣＬＳ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）の指針書に記載されているように、当業者において公知であり、この分析を評価するために使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、本発明の一局面によるシグナル増幅微粒子を示す。図１Ａは、シグナル増幅微粒子のコアを示し、また、図１Ｂは、完全なシグナル増幅微粒子の実施形態を示す。
【図２】図２は、本発明によるシグナル増幅微粒子の一実施形態を示す。
【図３】図３Ａは、本発明のシグナル増幅微粒子の局面を示す。図３Ｂは、本発明のシグナル増幅微粒子の別の局面を示す。図３Ｃは、本発明のシグナル増幅微粒子の別の局面をさらに示す。図３Ｄから３Ｇは、シグナル放出分子をそれ自身はシグナルを放出しないが、シグナルの形成を触媒するシグナル生成分子（例えばアルカリホスファターゼ）と入れ換えた場合の本発明のシグナル増幅微粒子の局面を示す。図３Ｄから３Ｇは、シグナル生成分子を微粒子に接着させる多様な手段を示す。
【図４】図４は、本発明の別の局面によるシグナル増幅微粒子および分離微粒子を使用するキット示す。図４Ａは、分離微粒子の一実施形態によるキットを示し、また図４Ｂは、微粒子の別の実施形態を示す。
【図５Ａ】図５は、本発明の別の局面による方法を示す流れ図である。図５Ａは、１ステップ複合体形成方法に関する１つの手順を示す。
【図５Ｂ】図５は、本発明の別の局面による方法を示す流れ図である。図５Ｂは、２ステップ複合体形成方法に関する代わりの手順を示す。
【図６】図６は、本発明によって細菌分析物を検出することを示す。
【図７】図７は、本発明によって抗体分析物を検出するための一実施形態を示す。
【図８】図８は、本発明によって抗体分析物を検出するための別の実施形態を示す。
【図９】図９は、本発明によって抗体分析物を検出するための別の実施形態をさらに示す。
【図１０】図１０は、本発明によって核酸分析物を検出することを示す。
【図１１】図１１は、本発明のシグナル増幅微粒子および分離微粒子の別の実施形態を示す。
【図１２Ａ】図１２は、本発明によってシグナル増幅微粒子を組み立てに使用されるオリゴヌクレオチドを示す。図１２Ａはある実施形態で使用されるオリゴヌクレオチドＡ〜Ｄを示す。
【図１２Ｂ】図１２は、本発明によってシグナル増幅微粒子を組み立てに使用されるオリゴヌクレオチドを示す。図１２Ｂはある実施形態においてシグナル分子として使用されるオリゴヌクレオチドＣの組み合わせを示す。
【図１３】図１３は、陰性試料複製物の試験結果の予期される分散パターンを示す。カットオフＲＬＵ値は、平均値および標準偏差（ＳＤ）によって設定することができる。ここで、カットオフＲＬＵは、平均値をこえる３ＳＤに設定される。
【図１４】図１４は、本発明によって細菌を検出するために必要な感度の測定を示す。
【図１５】図１５は、抗体価の測定のための１つの方法を示す。
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【図２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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