(57)【要約】  本発明は多能性および生殖細胞系コンピテントな哺乳類胚性幹細胞の誘導、維持および生育のための新しい組成物を記載するものである。本発明の組成物は、１）白血病抑制因子（ＬＩＦ）の限定された量を発現する細胞系統のコンディショニングされた培地、２）哺乳類ＬＩＦでトランスフェクトされた細胞系統に由来するコンディショニングされた培地、および、３）組み換えウサギＬＩＦを添加した培地を含む組成物を指す。本発明は、好ましくは基質フリーの条件下、そして、添加ＬＩＦおよび／またはサイトカインまたは成長因子を用いることなく、成人ヒト幹細胞および／または成人早期プロジェニター細胞を誘導、維持および成育させるための新しい組成物を記載する。本発明の培地はこれまで多能性または生殖細胞系コンピテントな胚性幹細胞が得られなかった哺乳類のそのような細胞を対象として用いられ、その作成を意図している。本発明の培地は成人ヒト幹細胞および／または成人早期プロジェニター細胞を対象として用いられ、その作成を意図している。本発明はまた、新しいウサギＬＩＦ、および、ウサギＬＩＦをコードするヌクレオチドおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系における組み換えウサギＬＩＦの発現のための方法に関する。
2005512563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のコンディショニングされた培地を含む未分化の細胞として少なくとも１０継代の間の哺乳類の多能性胚性幹細胞の誘導、維持または生育のための組成物であって、前記組成物は白血病抑制因子（ＬＩＦ）０．５ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、組成物。
【請求項２】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）０．２ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）０．０２ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
組成物が霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌまたはウサギの群から選択される非ヒト哺乳類の幹細胞に適する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
組成物がげっ歯類の群から選択される非ヒト哺乳類の幹細胞に適する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
非ヒト哺乳類がクマネズミ種である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
非ヒト哺乳類がハツカネズミ種である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの群から選択される遺伝子的バックグラウンドを有する系統のいずれかのハツカネズミマウス系統である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
非ヒト哺乳類がＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するハツカネズミマウス系統の群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖの遺伝子的バックグラウンドまたはＣ５７ＢＬ／６Ｎの遺伝子的バックグラウンドを有するマウスである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
ＬＩＦがヒト、ネズミまたはウサギのＬＩＦである、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
細胞のコンディショニングされた培地を含む哺乳類の生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞の誘導、維持または生育のための組成物であって、前記組成物は白血病抑制因子（ＬＩＦ）２ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
ＬＩＦがヒト、ネズミまたはウサギのＬＩＦ等の哺乳類のＬＩＦである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）０．２ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１５】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）０．０２ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項１６】
組成物が霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウサギの群から選択される非ヒト哺乳類の胚性幹細胞に適することを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
組成物がげっ歯類である非ヒト哺乳類の胚性幹細胞に適することを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
非ヒト哺乳類がクマネズミ種である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
非ヒト哺乳類がハツカネズミ種である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの群から選択される遺伝子的バックグラウンドを有する系統のいずれかのハツカネズミ系統である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
非ヒト哺乳類がＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するハツカネズミ系統の群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖの遺伝子的バックグラウンドまたはＣ５７ＢＬ／６Ｎの遺伝子的バックグラウンドを有するハツカネズミである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
細胞のコンディショニングされた培地が不死化線維芽細胞株由来のものである、請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
細胞のコンディショニングされた培地がウサギＲａｂ９細胞株（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１４１４）由来のものである、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
ＬＩＦをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のコンディショニングされた培地を含む未分化の細胞として少なくとも１０継代の間の哺乳類の多能性胚性幹細胞の誘導、維持または生育のための組成物であって、前記組成物はウマ胎児血清、ヒツジ胎児血清、ヤギ胎児血清、新生仔哺乳類血清、成体哺乳類血清または血清代替物等のウシ胎児血清以外の血清を添加されていることを特徴とする、組成物。
【請求項２６】
非ヒト哺乳類が非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌまたはウサギの群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
非ヒト哺乳類がげっ歯類の群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
非ヒト哺乳類がクマネズミ種である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
非ヒト哺乳類がハツカネズミ種である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの群から選択される遺伝子的バックグラウンドを有する系統のいずれかのハツカネズミマウス系統である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
非ヒト哺乳類がＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するハツカネズミ系統の群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
ＬＩＦ遺伝子またはＬＩＦ変異体の遺伝子でトランスフェクトした細胞のコンディショニングされた培地を含有する、少なくとも１６継代の間の遺伝子的バックグラウンド１２９／ＳｖＥｖを有するマウス系統の肺細胞の誘導、維持または成育のための組成物であって、前記胚細胞は四倍体胚の凝集後に成体非ヒト哺乳類を与えることが可能であり、前記組成物はウマ胎児血清、ヒツジ胎児血清、ヤギ胎児血清、新生仔哺乳類血清、成体哺乳類血清または血清代替物等のウシ胎児血清以外の血清を添加されていることを特徴とする、組成物。
【請求項３３】
ＬＩＦ遺伝子またはＬＩＦ変異体の遺伝子でトランスフェクトした細胞のコンディショニングされた培地を含有する、非ヒト哺乳類の生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞の誘導、維持または生育のための組成物であって、前記組成物はウマ胎児血清、ヒツジ胎児血清、ヤギ胎児血清、新生仔哺乳類血清、成体哺乳類血清または血清代替物等のウシ胎児血清以外の血清を添加されていることを特徴とする、組成物。
【請求項３４】
非ヒト哺乳類が非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウサギの群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
非ヒト哺乳類がげっ歯類の群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３６】
非ヒト哺乳類がクマネズミ種である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
非ヒト哺乳類がハツカネズミ種である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの群から選択される遺伝子的バックグラウンドを有する系統のいずれかのハツカネズミマウス系統である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
非ヒト哺乳類がＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するハツカネズミ系統の群から選択される、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖの遺伝子的バックグラウンドまたはＣ５７ＢＬ／６Ｎの遺伝子的バックグラウンドを有するハツカネズミである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
トランスフェクトされる細胞が不死化線維芽細胞である、請求項２５〜４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
トランスフェクトされる細胞がウサギＲａｂ９細胞である、請求項２５〜４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４３】
細胞が非ヒト哺乳類ＬＩＦまたはＬＩＦ変異体をコードするＤＮＡでトランスフェクトされる、請求項２５〜４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４４】
細胞がウサギＬＩＦまたはウサギＬＩＦ変異体をコードするＤＮＡでトランスフェクトされる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ＬＩＦまたはＬＩＦ変異体をコードするトランスフェクトされたＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項４３または４４に記載の組成物。
【請求項４６】
細胞株が安定にトランスフェクトされる、請求項２５〜４５のいずれかに記載の組成物。
【請求項４７】
細胞株が受託番号ＬＭＢＰ５４７９ＣＢの下にＢＣＣＭに寄託されているＲａｂ９クローン＃１９である、請求項２５〜４６のいずれかに記載の組成物。
【請求項４８】
インターロイキン、オンコスタチン、毛様体神経栄養因子、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞成長因子およびカルジオトロピンの群から選択される化合物１種以上を添加された、前述の請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
Ｒａｂ９線維芽細胞株由来のコンディショニングされた培地を含有する、組成物。
【請求項５０】
ＬＩＦまたはＬＩＦ変異体をコードするＤＮＡでトランスフェクトされた細胞のコンディショニングされた培地を含有する組成物であって、トランスフェクトされる細胞が不死化線維芽細胞である、組成物。
【請求項５１】
ＤＮＡがウサギＬＩＦまたはウサギＬＩＦ変異体をコードする、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
ＬＩＦまたはＬＩＦ変異体をコードするトランスフェクトされたＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項５０または５１に記載の組成物。
【請求項５３】
細胞株が安定にトランスフェクトされる、請求項５０〜５２のいずれかに記載の組成物。
【請求項５４】
細胞株が受託番号ＬＭＢＰ５４７９ＣＢの下にＢＣＣＭに寄託されているＲａｂ９クローン＃１９である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５５】
請求項１〜１１または２５〜３２のいずれかの組成物中少なくとも１継代細胞を培養するステップを含む、非ヒト哺乳類由来の多能性胚性幹細胞を誘導、維持または生育させる方法。
【請求項５６】
請求項５５の方法により得られる、非ヒト哺乳類多能性胚性幹細胞。
【請求項５７】
請求項１２〜２４または３３〜４０の組成物中少なくとも１継代細胞を培養するステップを含む、非ヒト哺乳類由来の生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞を誘導、維持または生育させる方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法により得られる、非ヒト哺乳類生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞。
【請求項５９】
霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、および、１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するラットおよびマウス等のげっ歯類の群から選択される、非ヒト哺乳類由来の多能性胚性幹細胞。
【請求項６０】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するマウスの群から選択される、非ヒト哺乳類由来の多能性胚性幹細胞。
【請求項６１】
霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、および、１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するラットおよびマウス等のげっ歯類の群から選択される、非ヒト哺乳類由来の生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞。
【請求項６２】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するマウスの群から選択される、非ヒト哺乳類由来の生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞。
【請求項６３】
請求項１〜１１または２５〜３２のいずれかの組成物中少なくとも１継代胚性幹細胞を培養するステップを含む、胚性幹細胞からトランスジェニックな非ヒト哺乳類を作成する方法。
【請求項６４】
霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、および、１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するラットおよびマウス等のげっ歯類の群から選択される、トランスジェニック非ヒト哺乳類。
【請求項６５】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するマウスの群から選択される、トランスジェニック非ヒト哺乳類。
【請求項６６】
プロモーター配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列を含む酵母発現ベクターであって、前記ヌクレオチド配列がウサギＬＩＦまたはウサギＬＩＦに少なくとも９５％同一である変異体またはその機能的蛋白フラグメントをコードする、ベクター。
【請求項６７】
ヌクレオチド配列が図１［配列番号１］または図２［配列番号３］に示すウサギＬＩＦをコードする、請求項６６に記載のベクター。
【請求項６８】
コードされる蛋白配列が図１［配列番号２］または図２［配列番号４］に示すものであ
る、請求項６７に記載のベクター。
【請求項６９】
ヌクレオチド配列が分泌シグナルにインフレームに融合している、請求項６６〜６８のいずれかに記載のベクター。
【請求項７０】
ベクターがｐＰＩＣＺαであり、分泌シグナルがアルファ因子分泌シグナルである、請求項６９に記載のベクター。
【請求項７１】
請求項６６〜７０のいずれかのヌクレオチド配列で形質転換された、酵母細胞。
【請求項７２】
酵母細胞がＰｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ等のメチロ向性酵母である、請求項７１に記載の酵母細胞。
【請求項７３】
受託番号ＭＵＣＬ−４２９２５の下にＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されている、請求項７２に記載の酵母。
【請求項７４】
組み換えＤＮＡ技術操作法を用いて請求項７１〜７３のいずれかに記載の酵母細胞中でウサギＬＩＦまたはウサギＬＩＦに少なくとも９５％同一である変異体またはその機能的蛋白フラグメントを発現させる方法。
【請求項７５】
発現された蛋白がＰｉｃｈｉａの生育培地に分泌される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
ウサギＬＩＦまたはウサギＬＩＦに少なくとも９５％同一である変異体またはその機能的蛋白フラグメントを含有する組成物。
【請求項７７】
精製されたウサギＬＩＦまたはウサギＬＩＦに少なくとも９５％同一である変異体またはその機能的蛋白フラグメント。
【請求項７８】
精製されたウサギＬＩＦまたはウサギＬＩＦに少なくとも９５％同一である変異体またはその機能的蛋白フラグメントを含有する非ヒト胚性幹細胞の誘導、維持または生育のための組成物。
【請求項７９】
哺乳類成体幹細胞または早期のプロジェニター細胞の基質フリーの発現のための組成物であって、前記組成物が線維芽細胞系統のコンディショニングされた培地を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項８０】
成体幹細胞が造血幹細胞であり、成体早期プロジェニター細胞が造血前駆細胞である、請求項７９に記載の組成物。
【請求項８１】
組成物がサイトカインおよび／またはＬＩＦを強化されていないことをさらに特徴とする、請求項７９または８０に記載の組成物。
【請求項８２】
線維芽細胞株が不死化されている、請求項８１に記載の組成物。
【請求項８３】
不死化線維芽細胞株がＲａｂ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４１４）細胞株である、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
単離された哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞の基質フリーの増殖のための、請求項７９〜８３のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項８５】
成体幹細胞が造血幹細胞であり、成体早期プロジェニター細胞が造血前駆細胞である、請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
単離された造血幹細胞または造血前駆細胞がヒトＣＤ３４＋細胞である、請求項８５に記載の使用。
【請求項８７】
造血幹細胞または造血プリカーサー細胞が臍帯、胎盤血、末梢血および骨髄から選択される原料から単離される、請求項８５または８６のいずれかに記載の使用。
【請求項８８】
細胞の総量が少なくとも２５倍に増殖されている、請求項８５〜８７のいずれかに記載の使用。
【請求項８９】
ＣＤ３４＋細胞の量が少なくとも３倍に増殖されている、請求項８５〜８７のいずれかに記載の使用。
【請求項９０】
増殖された細胞が少なくとも１５日間培養されている、請求項８５〜８７のいずれかに記載の使用。
【請求項９１】
ＬＴＣ  ＩＣアッセイにおいて陽性反応を示す増殖された細胞の数が少なくとも１５倍増大する、請求項８５〜８７のいずれかに記載の使用。
【請求項９２】
ａ）哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞の原料を単離するステップと、
ｂ）請求項７９〜８３のいずれかに記載の組成物中、基質フリーの条件下、細胞を培養するステップとを含む、哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞を増殖するための方法。
【請求項９３】
成体幹細胞が造血幹細胞であり、成体早期プロジェニター細胞が造血前駆細胞である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
少なくとも２５倍の増殖が得られるまで培養のステップを行う、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
有核細胞の量が少なくとも１０倍に増殖されるまで培養のステップを行う、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
増殖細胞の集団中においてＣＤ３４＋細胞の量が少なくとも３倍増殖されている、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
増殖細胞の集団が少なくとも１５日間培養されている、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
ＬＴＣ  ＩＣアッセイにおいて陽性応答を示す増殖細胞の数が少なくとも１５倍増大する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９９】
増殖細胞が致死未満の放射線照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病性／重度複合免疫不全）マウスを再集団化できる、請求項９２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多能性および生殖細胞系コンピテントの胚性幹（ＥＳ）細胞の誘導、維持および成育のための新しい組成物およびその使用に関する。本発明はまた、組成物を用いて作成されたＥＳ細胞、および、生殖細胞系の伝達のため、および、遺伝子的に修飾された非ヒト動物の作成のためのこれらのＥＳ細胞株の使用にも関する。本発明は更に、成体幹細胞（ＡＳＣ）の誘導、維持および生育のための新しい組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞
ＥＳ細胞株は、特定の条件下では多継代に渡る培養物中に、即ち、その多能性を失うことなく通常の時間的間隔での新しい細胞培養皿への細胞の再プレート化において、維持することができる、胚盤胞段階の胚の内細胞塊（ＩＣＭ）から単離される細胞株である。それらは正常な核型を維持し、宿主胚盤胞内に再導入されると生殖細胞をコロニー化することができる。このような細胞株はＤＮＡでインビトロ形質転換することができ（下記参照）、そして染色体ＤＮＡ内への外来性ＤＮＡの組み換え（相同または非相同）について選択され、これにより所望の遺伝子の安定な取り込みを可能とする多くの多能性細胞を与える。しかしながら、今日まで、生殖細胞系の伝達、即ち次世代へのＥＳゲノムの伝達は、特定のマウス株のＥＳ細胞において達成されているのみである。
【０００３】
ネズミ胚性幹細胞は１９８１年に初めて単離された。それ以来、数個のＥＳ細胞株が樹立され、そしてそれらは現在では、マウスゲノム内へのターゲティング突然変異または他の遺伝子改変の導入のために広範に、そして、良好に使用されている。現在使用されている生殖細胞系コンピテントマウスＥＳ細胞株の大部分は１２９系統において得られており、そして、残りは数種の他の純系の系統内で得られている（Ｃ５７ＢＬ／６およびＣ５７ＢＬ／６との交配）。更にまたＥＳ細胞株は１２９系統内においても移植された胚盤胞の３０％において最も良好に得られており、約１０％の成功率は標準値に近いと考えられる。
【０００４】
キメラ動物を作成するための最も一般的に使用されている方法は宿主胚盤胞の分割腔内に約１０〜１５個の単離されたＥＳ細胞を注入し、そして、細胞を内細胞塊の細胞と混合することである。次に得られたキメラ胚盤胞をレシピエントに移して育成する。或いは極めて早期（８〜１６細胞期）の胚を用いた２倍体の凝集および４倍体の凝集をＥＳ細胞のための宿主として使用することができる。慨すれば、ＥＳ細胞を透明帯を有さない早期の段階の胚の間に「サンドイッチ」して一夜培養し、擬似母親内に移植する。この方法はキメラまたは完全にＥＳ細胞から誘導された仔のいずれかを与える条件下に行うことができる。
【０００５】
ＥＳ細胞の培養およびキメラの作成は技術的には数年間にわたり進歩しているが、ＥＳ細胞の多能性はなお数回の継代後には減少することが多いのに対し、完全なＥＳ細胞誘導の胎仔（４倍体凝集まで）は出生以後には顕著に低下した生存性を有すると考えられる。Ｎａｇｙ等の「早期継代胚性幹細胞からの完全細胞培養由来マウスの誘導」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９３；９０：８４２４−８は電子融合由来の４倍体胚を用いて早期の継代から誘導したＲ１ＥＳ細胞を使用することにより凝集体を形成し、そしてＥＳ細胞から完全に誘導されたマウスを得ている。しかしながら、１４継代よりも遅くに得られたＥＳ細胞からは如何なる動物も成体となるまで生存していないことから、ＲＩＥＳ細胞はインビトロで長時間培養されるとその全能性を失う。更にまた、早
期継代の細胞を用いた場合も、多くのＥＳ４倍体凝集体は予定発達よりも前に死滅している。移植された凝集体の僅か３．８％が帝王切開後に生存している。より遅い継代のＥＳ細胞を用いて生存性の高いＥＳマウスを得るという目標は達成されておらず、遺伝子的に修飾されたＥＳ細胞を用いたＥＳ細胞由来マウスの作成は可能とは考えられない。
【０００６】
４倍体凝集体を介して純系マウス系統のＥＳ細胞から生存性の高い仔を得ることは現在の技術では不可能であることが、最近、Ｅｇｇａｎ  Ｋ等の“Ｈｙｂｒｉｄ  ｖｉｇｏｒ，  ｆｅｔａｌ  ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ，  ａｎｄ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｅｍｂｒｙｏ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ”，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００１；９８：６２０９−１４において確認されている。遺伝子のヘテロ接合性が核クローニングまたは４倍体胚相補によりＥＳ細胞から誘導された仔の生後の生存性に影響する重要なパラメーターであることがわかっている。いずれの方法で純系のＥＳ細胞から誘導された仔動物も呼吸障害の表現型を示しながら周産期に死亡している。これとは対照的に、いずれの操作法によるＦ１ＥＳ細胞から誘導した仔動物の大多数（８０〜８５％）は成体時まで生存した。しかしながら他の試験において、ＥＳ細胞誘導マウスの出生後致死率と使用細胞系統との間には明確な相関はみとめられていない。出生後の死亡は異なる遺伝子的バックグラウンドを有するものも含めて全細胞株で起こっている。３４体の完全にＥＳ細胞誘導の新生仔（３％）が全細胞株からのＥＳを注入した１０３７検体の４倍体胚盤胞の移植後に得られている。１３匹のみのマウス（１％）が成体時まで成長した（Ａｍａｎｏ  Ｔ，  Ｋａｔｏ  Ｙ，  Ｔｓｕｎｏｄａ  Ｙ，  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔ−ｔｒｅａｔｅｄ  ａｎｄ  ｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ  ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ
ＥＳ−ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｉｃｅ，  Ｚｙｇｏｔｅ  ２００１；９：１５３−７）。
【０００７】
推定多能性ＥＳ細胞はマウス以外の多くの種、例えば、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ウシ、ミンク、ラット、霊長類、ヒト、ニワトリ、マーモセット、メダカフィッシュおよび人間から単離されている。僅か数例（ブタ、ニワトリ、メダカフィッシュ）においてのみ、これらの細胞株を胚盤胞に再導入してキメラが得られているが、いずれもいまだ生殖細胞への移行は行われていない。
【０００８】
移植前のウサギ胚盤胞から得た多能性ＥＳ細胞系統の単離がＧｒａｖｅｓ  ＫＨ，Ｍｏｒｅａｄｉｔｈ  ＲＷ，“Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｒａｂｂｉｔ  ｅｍｂｒｙｏｓ”，Ｍｏｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｄｅｖ  １９９３；３６：４２４−３３”により報告されている。これらのＥＳ株は全３種の生殖細胞層（インビトロの基準で多能性）を代表する分化した細胞型を与えることが分かっている。最近、Ｄｕｔｃｈ  Ｂｅｌｔｅｄ系統のこれらのＥＳ株もまたレシピエントのニュージーランドホワイトの胚盤胞に注入後に明確なコートカラーのキメラを作成できることが分かり、細胞がインビボの基準でも多能性であることが示された。しかしながら、生殖細胞系統への移行は達成されていない。他の実験によれば、キメラの形成の頻度が低いこと、および、生殖細胞系への移行がないことは、恐らくは大きい継代数によるＥＳ細胞株の多能性の消失が原因であると考えられる。
【０００９】
ＥＳ株は細胞の分化を防止する種々の因子を生産するフィーダー層の存在により未分化の状態で維持される。数種のサイトカイン、即ちＤＩＡ／ＬＩＦ（分化抑制活性／白血病抑制因子）、可溶性インターロイキン−６受容体と組み合わせたインターロイキン−６、インターロイキン−１１、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子およびカルジオトロピ
ンがこの作用に関与していることが分かっている。現在ではフィーダー細胞の非存在下、上記因子の存在下に少なくとも数継代培地中にＥＳ細胞を樹立維持できることが可能である。マウス以外の種において、ＥＳ細胞技術はなお開発中であり、マウス以外の如何なる種においても生殖細胞系の移行を報告する出版されたデータはない。
【００１０】
組み換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）は現在、インビトロの哺乳類胚由来の胚性幹（ＥＳ）細胞の単離のために用いられる培地に日常的に添加されている。この方法は１９８８年８月４日付けの優先権明細書ＡＵ１９８８ＰＩ０９６４４（５１−５３）に基づいたＵＳ５，１６６，０６５、ＥＰ０３８０６４６およびＷＯ９００１５４１において特許請求されている。組み換えネズミまたはヒトＬＩＦ蛋白は精製され、後に低下したクローン形成性を示す成熟マクロファージにおいてネズミ単球細胞株Ｍ１の分化を誘導する能力に基づいてｃＤＮＡクローニングされている。（組み換え）蛋白およびｃＤＮＡ（ネズミおよびヒトの変異体）は１９８７年４月２日付けのＡＵ１９８７ＰＩ１２０９の優先権に基づくＵＳ５，１８７，０７７（および２００１年７月１７日に発行されたＵＳ６，２６１，５４８までの数件のＣＩＰ出願）およびＥＰ２８５４４８においても特許請求されている。
【００１１】
その後の研究により以前に精製された蛋白および／または生物学的活性とのＬＩＦの同一性が確認された。Ｈｏｚｕｍｉ等の１９８０〜１９８６年の研究により、マウス単球細胞株Ｍ１の分化を刺激し増殖を抑制する因子Ｄが精製均質化された（Ｔｏｍｉｄａ  Ｍ，Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ，Ｈｏｚｕｍｉ  Ｍ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  Ｍ１  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｏｒ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｌ９２９  ｃｅｌｌｓ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８４；２５９：１０９７８−８２）。その後因子ＤのｃＤＮＡはＬＩＦのものと同一であることが判明した（Ｌｏｗｅ  ＤＧ，Ｎｕｎｅｓ  Ｗ，Ｂｏｍｂａｒａ  Ｍ，ＭｃＣａｂｅ  Ｓ，Ｒａｎｇｅｓ  ＧＥ，Ｈｅｎｚｅｌ  Ｗ，Ｔｏｍｉｄａ  Ｍ，Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｙ，Ｈｏｚｕｍｉ  Ｍ，Ｇｏｅｄｄｅｌ  ＤＶ，Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，ＤＮＡ  １９８９；８：３５１−９）。ＥＳ細胞の培地中におけるＬＩＦの使用よりも前に、Ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞により分泌されるＤＩＡ（分化抑制活性）によりネズミ胚性幹細胞の分化の抑制に関する研究が行われている。その後、ＤＩＡとＬＩＦの同一性はｃＤＮＡおよび蛋白のレベルで確立された（Ｓｍｉｔｈ  ＡＧ，Ｈｅａｔｈ  ＪＫ，Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ  ＤＤ，Ｗｏｎｇ  ＧＣ，Ｍｏｒｅａｕ  Ｊ，Ｓｔａｈｌ  Ｍ，Ｒｏｇｅｒｓ  Ｄ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３６：６８８−９０；  Ｓｍｉｔｈ  ＡＧ，Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｊ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｍ，Ｒａｔｈｊｅｎ  ＰＤ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＤＩＡ／ＬＩＦ）ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｄｅｖｅｌ  Ｂｉｏｌ  １９９２；１５１：３３９−５１）。
【００１２】
過去１０年間の組み換えＤＮＡ技術の進歩は、ある遺伝子のプロモーターを他のコード配列に融合することによる、または、部位指向性突然変異誘発によるなどして如何なる可能な新規コンストラクトも作成できるという地点まで、遺伝子の単離と操作を大きく促進した。同様に胚の操作における進歩も、これらの新しい外来性遺伝子の内因性の染色体ＤＮＡへの移行によるトランスジェニック動物の作成を促進した。トランスジェニック動物は、接合体の前核内へのＤＮＡの注入による、宿主「胚」への（遺伝子操作された）多能性胚性幹（ＥＳ）細胞の導入による、そしてより最近では安定してトランスフェクトされ
たドナー体細胞を用いた摘出卵母細胞への核転移により、作成することができる。
【００１３】
現在の技術を勘案すれば、より長い継代後も多能性を保有し、生殖細胞コンピテントであるＥＳ細胞を提供する経済的組成物の必要性が存在している。更にまた、異なる遺伝子的バックグラウンドを有するトランスジェニックマウスの作成および他の非ヒトトランスジェニック哺乳類の作成も必要とされている。これらのトランスジェニック動物は同定された遺伝子の生物学的作用の研究のため、治療用の遺伝子産物の医薬品製造のため、「進歩した」家畜の作成のため等に有用である。
【００１４】
培養幹細胞の未分化の表現型の維持が困難なことは胚性幹細胞に限らない。種々の系統の成体幹細胞もまた種々の細胞型に分化するその能力を低下させる傾向にある。幹細胞の表現型の維持は造血幹細胞の場合に特に困難を伴う。
【００１５】
造血幹細胞（ＨＳＣと略記する）はそれ自体再生可能であり、種々の特化細胞に分化できる末梢血、臍帯血または骨髄から単離された細胞である。骨髄ＨＳＣは骨髄から移動することができる。ＨＳＣは有害または不必要な細胞が自己破壊する過程であるアポトーシスと呼ばれるプログラムされた細胞死を起こすことができる。骨髄細胞１００００〜１５０００個中約１個が幹細胞であると考えられている。血流中ではその比率は血球１０００００個当たり１個に低下する（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  Ｊｕｎ  ２００１，ＮＩＨ）。
【００１６】
過去３０年の間、骨髄および可動性末梢血に由来の造血プロジェニター／幹細胞の移植は疑問のない臨床的有用性を有する操作法であり、多くの悪性疾患、両性および異形成の血液学的疾患および遺伝病の標準的治療法であった（Ｄｕｐｏｎｔ  Ｂ．（１９９７），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．１５７，５−１２）。
【００１７】
造血移植片は、既存の疾患血球または腫瘍を破壊することを目的とした高用量の化学療法や放射線療法の結果、血液および免疫系の細胞を再生する血液、基質および免疫患者の能力を制限している治療法において特に良好に使用されている。提供された幹細胞を患者の静脈に注入し、移植片が良好であれば、提供された造血幹細胞はその数を増大させ、レシピエントの骨髄および造血機能を再生する。
【００１８】
自己由来の骨髄または末梢血幹細胞の役割の拡大にも関わらず、多くの適応症は、自己由来の幹細胞の移植後の悪性疾患を有する患者における移植片による悪性細胞の移行の潜在的危険性のため、および、入手可能なヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と同一の同胞物の数が制限されることが多いため、同種異型の移植を必要としている。同種異型の骨髄の移植の主な制約点は、適当な十分にＨＬＡマッチしたドナーが欠如していること、および、ＨＬＡの不一致に関わる移植片対宿主疾患の問題である。
【００１９】
臍帯血（ＵＣＢ）としても知られている胎盤血は多数のＨＳＣ、成人の骨髄に匹敵する頻度の骨髄様および赤血球様のプロジェニター、高比率の未熟コロニー形成細胞、低い感染伝播の危険性、および、高濃度のテロメラーゼを含んでいるということがわかったため、問題点の多くを回避できるようになると考えられる（Ｍａｙａｎｉ  Ｈ，Ｌａｎｓｄｏｒｐ  Ｐ，（１９９８），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１６，１５３−１６５）。ファンコーニ貧血患者において１９８８年に最初に行われた移植の成功（Ｇｌｕｃｋｍａｎ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１；１１７４−８）はヒトＵＣＢがＨＳＣの利用可能な代替入手源であることを証明し、世界規模の臍帯血液バンキングプログラムの開発を加速した（Ｓｉｒｃｈｉａ  Ｇ．ａｎｄ  Ｒｕｂｅｌｌａ  Ｐ．（１９９９），Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ，８４：７３８−７４７）。
【００２０】
臍帯血の最も重要な難点は平均的な献血分には平均で僅か１．５×１０9個の有核細胞しか含まれず、従来より実際には有核細胞（ＮＣ）の１０分の１が成人における骨髄移植片のために使用されていることである（Ｆａｓｏｕｌｉｏｔｉｓ  Ｓ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｎｋｅｒ  Ｊ．（１９９９），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｂｓｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．９：１３−２５）。医師等が数百万個超のＵＣＢ  ＨＳＣを抽出できることはまれであり、この量は、理想的にはキログラム体重（ｂｗ）当たり７〜１０百万個のＣＤ３４＋細胞を移植されなければならない成人の移植に用いるには少数過ぎるが、再注入されたＣＤ３４＋細胞の数と移植効率の間にはなお頻繁に不一致が存在するものの、小児の移植には十分である場合が多い。最近一部の研究者により５×１０4  ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞／ｋｇｂｗの閾値用量が提案されており、これ未満では３代の移植速度が顕著に低下し、予測不能となる（Ｈｅｎｏｎ  ＰＨ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ，１５，６２−６７）。この低いＮＣ数は臍帯血の広範な使用を潜在的に制限するものである。従って、幹細胞研究の主要な問題点は長期間移植可能なＨＳＣのインビトロの維持と増殖を促進するエクスビボの培養条件の開発である。このような培養系の確立は、遺伝子療法、腫瘍細胞パージ、および幹細胞移植等の数種の臨床用途における移植ＨＳＣの潜在的なエクスビボの操作および増殖のための条件である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
幹細胞がその幹細胞特性を失うことなく増殖できるように刺激されることが可能であり、これにより移植患者に対する単一のドナーから得た移植可能な細胞の用量を増量することができるような適当な実験室条件が望まれている。ＨＳＣの増殖は困難であり、研究者等は血液および免疫系の置換を超えたその用途の拡大において障害に直面している。第１にＨＳＣはインビトロで増殖（自己複製）および分化（他の細胞型に特化される）が不可能である（Ｌａｇａｓｓｅ  Ｅ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ＩＬ．，（２００１），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１４，４２５−４３６）。第２に、研究者等は真の幹細胞の同一性の正確な知識を未だ有していない。基質フリーの条件下における長期の再集団化細胞のエクスビボの増殖は再現可能な態様では未だ達成されていないが、造血幹細胞の増殖および分化を支配する機序を探求し続けることは関与するプロジェニターのみならずＨＳＣも増殖させる培養系の開発につながる（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ  Ｃ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，３１４−３１７。Ｌｅｗｉｓ  Ｉ等（（２００１），Ｂｌｏｏｄ  ９７，３４４１−３４４９）はサイトカインの組み合わせを用いたフィーダー細胞による非接触培養においてＨＵＣ由来ＣＤ３４＋細胞の増殖を示しており、そしてこれらの増殖した細胞が移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病性／重度複合免疫不全）マウスを再集団化できることを明らかにしている。Ｐｉａｃｉｂｅｌｌｏ等（１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ８９，２６４４−２６５３）によればＣＤ３４＋ＨＵＣ誘導細胞の数は急速に減少し、サイトカイン無添加では培養中３週間以内に死滅する。Ｐｉａｃｉｂｅｌｌｏ等（１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９３，１１，３７３６−３７４９）によればＣＤ３４１ＨＵＣ細胞は致死未満照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの再集団化により検討した場合、インビボの再集団化能力を失うことなく成長因子カクテル存在下で基質フリーの培養中１０週間まで増殖できた。即ち、成体幹細胞およびＨＳＣ等の早期プロジェニター細胞の増殖のための、成長因子存在下または非存在下の、新しい、または代替となる培地がなお望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は多能性および生殖細胞系コンピテントな哺乳類胚性幹細胞の誘導、維持および生育のための新しく優れた組成物、および、これらの組成物の使用に関する。
【００２３】
本発明の第１の特徴において、特定の細胞由来のコンディショニングされた培地を含む
多能性および生殖細胞系コンピテントなヒトまたは非ヒト哺乳類胚性幹細胞の誘導、維持または生育のための組成物が提供され、ここで組成物はイムノアッセイ、例えばヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）に対して作成されたマウスモノクローナル抗体クローン９８２４．１１等のウサギおよびヒトＬＩＦと交差反応する抗体を用いたＥＬＩＳＡにより調べた場合、ＬＩＦを２ｎｇ／ｍｌ未満含有する。好ましくはＬＩＦの濃度は１ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ未満、なお好ましくは０．２ｎｇ／ｍｌ未満、更に好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ未満、より更に好ましくは０．０５ｎｇ／ｍｌであり、そして最も好ましくは該試験で測定した場合ＬＩＦの濃度は０．０２ｎｇ／ｍｌ未満である。組成物は基本細胞培養用培地、例えば非必須アミノ酸、グルタミン、還元剤および胎児、新生児または成体の血清、例えばウシ胎児血清から選択される化合物１種以上を任意で添加した高グルコースＤＭＥＭを含有する培地を含む。培地のコンディショニングのために用いられる細胞はウサギ線維芽細胞細胞系統Ｒａｂ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４１４）等の不朽化線維芽細胞系統等の細胞である。
【００２４】
本発明の他の特徴においては、多能性および生殖細胞系コンピテントなヒトまたは非ヒト哺乳類胚性幹細胞の誘導、維持または生育のための組成物は、ＬＩＦをコードするヌクレオチドでトランスフェクトされた特定の細胞に由来するコンディショニングされた培地を含む組成物である。該ヌクレオチド配列は哺乳類ＬＩＦをコードし、好ましくはウサギＬＩＦをコードする。該ヌクレオシド配列はｃＤＮＡ配列であることができるが、好ましくは哺乳類ＬＩＦのゲノム配列である。トランスフェクトされた細胞株は、好ましくはＬＩＦコードヌクレオチド配列により安定にトランスフェクトされる。ＬＩＦをコードするヌクレオチド配列をトランスフェクトするために使用される細胞はいずれかの哺乳類細胞であることができるが、好ましくは線維芽細胞、より好ましくはウサギ線維芽細胞系統、そして最も好ましくはウサギＲａｂ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４１４）である。本発明で使用するトランスフェクト細胞はウサギＬＩＦをコードするゲノム配列で安定にトランスフェクトされるウサギＲａｂ９線維芽細胞である。このような細胞株は受託番号ＬＭＢＰ５４７９ＣＢの下にベルギー国のＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに寄託されている。組成物は基本細胞培養用培地、例えば、非必須アミノ酸、グルタミン、還元剤および新生児または成体の血清およびウシ胎児血清以外の胎児血清、例えばウマ胎児血清、ヤギ胎児血清、ヒツジ胎児血清から選択される化合物１種以上を任意で添加した高グルコースＤＭＥＭを含有する培地を含む。
【００２５】
本発明の第３の特徴において、多能性および生殖細胞系コンピテントなヒトまたは非ヒト哺乳類胚性幹細胞の誘導、維持または生育のための組成物は、特定の細胞に由来するコンディショニングされた培地を含む組成物であり、ここで組成物にはウサギＬＩＦ、ウサギＬＩＦに少なくとも９５％同一である変異体またはその機能的誘導体を添加する。該蛋白はメチロ向性コウボＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の蛋白の発現に適するコウボであり、ここで該蛋白をコードするヌクレオチド配列は場合によりコウボ発現系において使用するための最適化された配列を得るために任意に採用される。本発明に開示するウサギＬＩＦは受託番号ＭＵＣＬ−４９９２５の下にベルギー国のＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  に寄託されているＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ系統により生産される。
【００２６】
組成物は基本細胞培養用培地、例えば非必須アミノ酸、グルタミン、還元剤および胎児、新生児または成体の血清、例えばウシ胎児血清から選択される化合物の１つを任意で添加した高グルコースＤＭＥＭを含有する培地を含む。
【００２７】
本発明は非ヒト哺乳類、例えばマウス、特に１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ
、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／ＤＢＡ１ＬａｃＪ、ＣＤ１、ＢＡＬＢ／ｃ、ＭＲＬ、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣＢＡおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドの群から選択されるハツカネズミ系統のマルチ能性または多能性の胚性幹細胞の作成のためのこれらの組成物の使用を開示する。
【００２８】
本発明は更に、ヒトまたは非ヒトの哺乳類、例えばマウス、特に１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎ、ＤＢＡ１ＬａｃＪ、ＣＤ１、ＢＡＬＢ／ｃ、ＭＲＬ、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣＢＡおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドの群から選択されるハツカネズミ系統のマルチ能性または多能性の胚性幹細胞に関し、これらは本発明の組成物中それを少なくとも１継代培養することにより得られる、
本発明はまた、トランスジェニックな非ヒト哺乳類、例えばマウス、特に、１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎ、ＤＢＡ１ＬａｃＪ、ＣＤ１、ＢＡＬＢ／ｃ、ＭＲＬ、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣＢＡおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドの群から選択されるハツカネズミ系統に関し、これらは本発明の組成物中、少なくとも１継代、該動物の作成のために使用される胚性幹細胞を培養することにより得られる。
【００２９】
本発明は更に、本発明において開示される組成物、胚性幹細胞およびトランスジェニック動物の製造方法に関する、
本発明は胚性細胞およびトランスジェニック動物の作成のためのウサギ細胞系統によりコンディショニングされた培地の使用を開示し、これは他の非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ブタ、ヤギ、ウシ、ミンク、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、ハムスターおよびハツカネズミ以外のげっ歯類に適用される。
【００３０】
本発明はまた増殖した胚盤胞の３０％より多くについて胚性幹細胞株を得るための方法を開示する。
【００３１】
本発明はまた少なくとも１６継代の間培養されている胚性幹細胞を用いた凝集細胞を介して成体子孫を得るための方法を開示する。
【００３２】
本発明は特に多能性および生殖細胞系コンピテントな哺乳類胚性幹細胞の誘導、維持および生育のための新しい組成物に関する。組成物は基本細胞培養用培地、例えば、ＥＳ細胞の成育および自己更新のために必須な要素を分泌するウサギ細胞株Ｒａｂ９（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１４１４）またはその等価物等の安定した細胞株により予備コンディショニングされた、高グルコースＤＭＥＭ，非必須アミノ酸、グルタミン、還元剤およびウシ胎児血清またはその等価物を含有する培地を含む。ＬＩＦを少量含有するか全く含有しないこのコンディショニングされた培地がＥＳ細胞の自己更新を支援し、ＥＳ細胞の誘導を可能とすることが分かっている。形態学的および表面マーカー基準（アルカリホスファターゼの存在およびビメンチンおよびサイトケラチンの非存在）により確認される未分化の状態の維持は、ネズミＬＩＦまたはウサギＬＩＦを添加した標準的な細胞培養用培地を用いて観察されたものよりも優れていた。
【００３３】
この組成物に組み換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）、好ましくは本明細書に開示されたウサギＬＩＦ（Ｒａｂ−ＬＩＦ）、または市販のＬＩＦを任意に添加することができる。ペニシリン／ストレプトマイシン等の抗生物質およびインシュリンもまた組成物に含有させてよい。本発明はまたＥＳ細胞を未分化のインビトロ培養物として維持する新しいウサギＬＩＦ（Ｒａｂ−ＬＩＦ）およびＲａｂ−ＬＩＦをコードするヌクレオチドに関する。場
合によりインターロイキン、オンコスタチン、神経栄養因子、幹細胞因子および線維芽細胞成長因子等の他の成分もまたＥＳ培地に含めてよい。これらの因子の特定の例は、ヒトインターロイキン１１、ヒトオンコスタチンＭ、ヒト毛様体神経栄養因子、カルジオトロピン、インターロイキン６とその特異的受容体、および、ヒト幹細胞因子である。
【００３４】
本発明は更に生殖細胞系移行のため、および、遺伝子的に修飾された非ヒト動物の作成のためのこれらのＥＳ細胞系統の使用に関する。
【００３５】
本発明は更に始原生殖細胞の単離、維持および増殖のための本発明の新しい組成物の使用に関する。
【００３６】
本発明はまた哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞の基質フリーの増殖のための組成物に関する。その例は造血幹細胞および成体早期造血プロジェニター細胞である。ＡＳＣを培養するための組成物は線維芽細胞株のコンディショニングされた培地を含む。線維芽細胞系統は好ましくは不死化された細胞株、より好ましくはウサギ不死化線維芽細胞であり、最も好ましくはＲａｂ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４１４）細胞株である。ＡＳＣを培養するための組成物は、好ましくはサイトカインおよび／またはＬＩＦを含まない。
【００３７】
本発明はまたＡＳＣまたは早期プロジェニター細胞、例えばＨＳＣを増殖させるための組成物の使用に関する。これらのＨＳＣは例えば臍帯、胎盤血、末梢血および骨髄等の原料から単離されたＣＤ３４＋細胞である。組成物を用いれば細胞の総量が少なくとも２５倍増殖する。組成物を用いればＣＤ３４＋細胞の量が少なくとも３倍増殖する。組成物を用いればＬＴＣ  ＩＣアッセイで陽性応答を示す増殖細胞の数が少なくとも１５倍増大する。
【００３８】
本発明は更に、哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞の原料を単離し、ＡＳＣ培養のための本発明の組成物中で基質フリーの条件下に細胞を培養する工程を含む哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞を増殖するための方法に関する。この方法は造血幹細胞、造血前駆細胞に適用することができる。この方法は少なくとも２５倍のＡＳＣの増殖が得られるまで実施することができる。この方法は少なくとも１０倍有核細胞の量が増殖するまで実施することができる。この方法はＣＤ３４＋細胞の数が少なくとも３倍増殖するまで実施することができる。この方法は少なくとも１５日間実施することができる。この方法はＬＴＣ  ＩＣアッセイにおいて陽性応答を示す増殖細胞の数が少なくとも１５倍増大するまで実施することができる。この方法は致死未満の放射線照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病性／重度複合免疫不全）マウスを再集団化できる増殖ＨＳＣ細胞が得られるように実施することができる。
【００３９】
本発明はまた骨髄、胎児血液、臍帯血および末梢血由来の造血幹細胞の増殖のための安定な細胞株によりコンディショニングされた培地の使用に関する。組成物は基本細胞培養用培地、例えば、高グルコースＤＭＥＭ、非必須アミノ酸、グルタミン、還元剤およびウシ胎児血清またはその等価物を含有する培地を包含し、これは安定な細胞株、例えば、造血幹細胞の成長および自己更新のための必須要素を分泌するウサギ細胞株Ｒａｂ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４１４）またはその等価物により予備コンディショニングされる。
【００４０】
本発明は以下の図面を参照しながらこれより説明する。
【００４１】
［定義］
胚性幹（ＥＳと略記）細胞とは本明細書においては、胚盤胞期の胚の内細胞塊（ＩＣＭ）から単離された、または移植後の胚に由来する始原生殖細胞（始原または胚性の生殖細
胞）から誘導された細胞株である。ＥＳ細胞はその多能性を失うことなく多継代に渡り培養物中の特定の条件下に維持することができる。
【００４２】
多能性またはマルチ能性とは、本明細書においては、幹細胞は妊娠を支援する細胞および組織を含む細胞および組織の種々の型を生じさせることができるが生殖細胞株（精子細胞および卵子細胞）の細胞を生じさせることはできないことを意味する。
【００４３】
生殖細胞系統コンピテント、全能（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）または万能（ｏｍｎｉｐｏｔｅｎｔ）とは本明細書においては、幹細胞が生殖細胞株（精子細胞および卵子細胞）の細胞を含む細胞および組織の全ての型を生じさせることができることを意味する。
【００４４】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）とは、本明細書においては、胚盤胞の内細胞塊から誘導された未分化の胚性幹細胞の誘導、生育および維持を可能とするＧｅａｒｉｎｇ等（１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．６，３９９５−４００２）により最初にクローニングされ、配列決定された哺乳類蛋白を指す。これはまたＬＩＦのスプライシング変異体、および、アミノ酸１個以上が突然変異、挿入または欠失しているＬＩＦの変異体も指すが、ただし、変異体ＬＩＦは野生型ＬＩＦと少なくとも９５％同一であり、胚盤胞の内細胞塊から誘導された未分化の胚性幹細胞の誘導、生育および維持を可能とするものでなければならない。
【００４５】
ＬＩＦの機能的蛋白フラグメントとは本明細書においては、胚盤胞の内細胞塊から誘導された未分化の胚性幹細胞の誘導、生育および維持がなお可能であるＮまたはＣ末端の欠失を有するＬＩＦ蛋白を指す。
【００４６】
「サイトカインおよび／またはＬＩＦで強化されていない」とは、本明細書においては、ＡＳＣにおいて、細胞が維持または増殖されている組成物が添加されたサイトカインまたはＬＩＦにより強化されていないことを指す。添加または強化とは蛋白としてのサイトカインまたはＬＩＦの組成物への補給を意味する。これはまた、培地のコンディショニングのために使用される細胞の一過性または安定なトランスフェクションを介したこれらの化合物の強化を意味する。
【００４７】
「成体幹細胞」とは、本明細書においては、哺乳類、例えばげっ歯類（例えばマウスおよびラット）および霊長類、特にヒトから単離したマルチ能性の成体幹細胞に関する。成体幹細胞は非胚性の臓器または組織から誘導され、そして、中胚葉、外胚葉および内胚葉の起源の少なくとも１種の分化した細胞型を形成するように分化が誘導される能力を有する。成体幹細胞が単離される臓器または組織は例えば骨髄、臍帯血または胎盤である。成体幹細胞から得ることができる異なる型の細胞は、成体幹細胞の種類により変動し、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、骨髄基質、骨格筋、平滑筋、心筋、眼細胞、内皮細胞、表皮細胞、肝細胞、膵臓細胞、造血細胞、グリア細胞、ニューロンまたはオリゴ樹状細胞が挙げられる。
【００４８】
「成体早期プロジェニター細胞」とは本明細書においては、その起源である幹細胞のマーカーのうちの１個または数個を失っているが、なお多くの細胞継代数、ただしそれらの誘導源である幹細胞よりも少ない継代数において分化することができる操作された細胞を指す。
【００４９】
「造血幹細胞（ＨＳＣと略記）」とはそれ自体更新可能であり、種々の特化された細胞に分化できる末梢血、臍帯血または骨髄から単離された細胞である。ＨＳＣは赤血球系、好中球−マクロファージ、巨核球およびリンパ様造血細胞プールを再集団化できる。ＨＳＣはＣＤ３４、ｃ−ｋｉｔおよびｔｈｙ１を発現するが、ＣＤ３８は発現しない。
【００５０】
寄託細胞株
ウサギＬＩＦを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  Ｘ３３（ＲｂＬ）は受託番号ＭＵＣＬ４２９２５の下に２０００年７月５日にＴｈｒｏｍｂ−Ｘ（Ｌｅｏｐｏｌｄｓｔｒａａｔ
１，３０００  Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）Ｍｙｃｔｈｅｑｕｅ  ｄｅ  Ｉ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｃａｔｈｏｌｉｑｕｅ  ｄｅ  Ｌｏｕｖａｉｎ（ＭＵＣＬ）ＰｌａｃｅＣｒｏｉｘ  ｄｕ  Ｓｕｄ，Ｂ  １３４８  Ｌｏｕｖａｉｎ  ｌａ  Ｎｅｕｖｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍに寄託されている。
【００５１】
ウサギＬＩＦを発現するウサギ線維芽細胞株（Ｒａｂ９＃１９クローン）は受託番号ＬＭＢＰ５４７９ＣＢの下に２０００年４月７日にＴｈｒｏｍｂ−Ｘ（Ｌｅｏｐｏｌｄｓｔｒａａｔ  １，３０００  Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）によりＢｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ−Ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｌｌｅｃｔｉｅ（ＬＭＢＰ）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｇｅｎｔ，Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ  ３５，９０００  Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍに寄託されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
本発明はマウス系統において例示するとおり多能性および生殖細胞系コンピテントな哺乳類胚性幹（ＥＳ）細胞系統の誘導、維持および生育のための開示した組成物の使用に関する。これらの進歩した培養条件を用いることにより生殖細胞移行の潜在性が高い種々の遺伝子的バックグラウンドから安定なネズミＥＳ細胞を作成する。この手法はまた非ヒト哺乳類種（ウサギ、ブタ、ウシ等）にも適用でき、そして、非ネズミ種における機能獲得または機能損失を伴うターゲティングされたトランスジーンの基礎を形成できる。
【００５３】
組成物はＥＳ細胞の成育および自己更新のための必須要素を分泌する安定な細胞株により予備コンディショニングされた基本細胞培養用培地よりなる。これらの組成物には精製された組み換え白血病抑制因子（ＬＩＦ）を任意に、例えば少量添加することができる。
【００５４】
１つの実施形態において、基本細胞培養用培地は非必須アミノ酸、グルタミン、ベータメルカプトエタノールおよびウシ胎児血清を含有する高グルコースのダルベッコ変性イーグル培地ＤＭＥＭであり、安定な細胞株はウサギ線維芽細胞様細胞株Ｒａｂ９（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１４１４）である。ＬＩＦの任意の添加は好ましくはインビトロ培養物中に未分化の状態でＥＳ細胞を維持することを支援し、そしてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの最適化ｃＤＮＡ配列を発現することにより得られる新しく開示したウサギＬＩＦ（Ｒａｂ−ＬＩＦ）よりなるものを用いる。
【００５５】
細胞から培地に分泌されるＬＩＦは定量的な免疫検定法、例えば、ＬＩＦに対する抗体を用いた酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射線計測試験（ＩＲＭＡ）、蛍光イムノアッセイ、化学ルミネセントイムノアッセイ（ＣＬＩＡ）または電子化学ルミネセントイイムノアッセイ（ＥＣＬ）により測定することができる。本発明においては、ウサギＬＩＦに反応性を有するモノクローナル抗体、例えばヒトＬＩＦに対して作成したマウスモノクローナル抗体クローン９８２４．１１を用いたＥＬＩＳＡが好適な例である。このような試験法の例はＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＬＩＦイムノアッセイ（カタログ番号ＤＬＦ００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）である。
【００５６】
本発明の組成物は種々の量の付加的な成分を含有してよいが、それらの量は培地中で長時間未分化の状態にＥＳ細胞を維持するのに十分な量でなければならない。
【００５７】
本発明の組成物は例えばリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅの変性ダルベッコ培地、ＭｃＣｏｙ５Ａ培地、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０、培地１９９、ＭＣＤＢ培地、ＲＰＭＩ、グラスゴー最小必須培地イーグル（ＧＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２倍値、ハムＦ−１０栄養混合物、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ  Ｌ１５培地、ＣＭＲＬ培地、ＢＧｊｂ培地、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ＢｒｉｍｓｔｅｒＢＭＯＣ−３倍地、Ｗｉｌｌｉａｍ培地ＥおよびＭｃＣｏｙ培地またはこれらの応用物等の培地中の線維芽細胞様細胞株のコンディショニングされた培地を含む。組成物には更に、ベータメルカプトエタノールまたはジチオスレイトール等の還元剤を含有できる。
【００５８】
ＬＩＦをコードするＤＮＡでトランスフェクトしない細胞のコンディショニングされた培地を含有する組成物においては、培地には成体、新生仔または胎仔の血清を補給してよい。ＬＩＦをコードするＤＮＡでトランスフェクトした細胞のコンディショニングされた培地を含有する組成物においては、血清は成体または新生仔の哺乳類の血清または非ウシ胎児血清、例えばウマ、ヤギおよびヒツジの胎児血清であることができる。
【００５９】
本発明の組成物の好ましい例は線維芽細胞様細胞株のコンディショニングされた培地リットル当たり、ウシ胎児血清５０〜１２０ｍｌ、好ましくは８０ｍｌ、非必須アミノ酸１０〜２５ｍｌ、好ましくは１７ｍｌ、β−メルカプトエタノール２〜８μｌ、好ましくは５μｌ、インスリン０．５〜２．５ｍｌ、好ましくは１．２５ｍｌ、および、基本ＥＳ細胞培地８０〜１３０ｍｌを含有する。
【００６０】
好ましくは、基本ＥＳ細胞培地は、高グルコースＤＭＥＭ４００〜６００ｍｌ、好ましくは５００ｍｌ、ペニシリン／ストレプトマイシン０〜１５ｍｌ、好ましくは１３ｍｌ、非必須アミノ酸１０〜１５ｍｌ、好ましくは１３ｍｌ、グルタミン１０〜１５ｍｌ、好ましくは１３ｍｌ、β−メルカプトエタノール５〜１０μｌ、好ましくは６．３μｌ、ウシ胎児血清５０〜１００ｍｌ、好ましくは７０ｍｌ、中性、好ましくはｐＨ７．４よりなる。
【００６１】
本発明は更に、多能性および生殖細胞系コンピテントなＥＳ細胞を得るための哺乳類ＥＳ幹細胞を誘導し培養する方法に関し、その場合、哺乳類ＥＳ幹細胞の培養は少なくとも部分的には上記した本発明の組成物中で行う。このような方法は、ａ）胚盤胞期の胚の細胞を培養するステップと、ｂ）単離された内細胞塊を培養するステップと、ｃ）本発明の組成物中で周期的に内細胞塊を継代するステップとを含む。好ましくは、内細胞塊は少なくとも８回周期的に継代する。方法は更にトランスジェニック動物を作成するステップも含んでよい。
【００６２】
本発明の更に他の特徴によれば、本発明は生殖細胞株への移行の能力を有する胚性幹（ＥＳ）細胞株に関する。細胞株は、好ましくはネズミ細胞株であるが、他の動物の細胞株も使用できる。ネズミ細胞株の場合は、細胞株は１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｏｌａ、ＦＶＢ／Ｎ、ＤＢＡ１ＬａｃＪ、ＣＤ１、ＢＡＬＢ／ｃ、ＭＲＬ、Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣＢＡおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドの細胞または組織から誘導することができる。ネズミ細胞株は、好ましくは１１以上の継代の後に生殖細胞系統移行能力を有する。本発明の胚性幹（ＥＳ）細胞株は３次元のコロニー形成、アルカリホスファターゼ染色陽性、および、サイトケラチン１８およびビメンチンの染色陰性を１０継代以降に示すことを特徴とする。これらの胚性幹（ＥＳ）細胞株はキメラまたはＥＳ細胞誘導動物の作成において、相同または非相同組み換えによる遺伝子改変において、生殖細胞系統移行を
介した遺伝子改変による動物の作成において、キメラ動物の作成のため、レシピエントの胚盤胞または２倍体または４倍体の胚凝集体への胚盤胞注入または核転移の後のキメラ動物の作成のため、（新規）遺伝子の研究または単離のため、または、遺伝子の発現または過剰発現のために使用してよい。
【００６３】
本発明の組成物は種々のマウス系統の胚性幹細胞の表現型を維持する際に優れた特性を示す。本発明はまたこの新しい組成物の特性は胚性幹細胞以外の幹細胞にも適用されることを示す。
【００６４】
即ち本発明はＨＵＣ誘導ＣＤ３４＋細胞により例示されるとおり、成体幹細胞および早期プロジェニター細胞の維持および成育のための開示された組成物の使用に関する。
【００６５】
本発明の１つの実施形態において、成体幹細胞または成体早期プロジェニター細胞の培養を、基質フリー条件下、本発明の組成物中で維持増殖させ、これはフィーダー細胞と直接に接触させることなく、または、フィーダー細胞と間接的に接触させることなく行う（非接触培養）。本発明によるＡＳＣの増殖のための組成物は、線維芽細胞、好ましくは不死化線維芽細胞、更に好ましくはウサギ不死化線維芽細胞、例えばＲａｂ９細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４１４）によりコンディショニングする。本発明は、これらの組成物が、成体幹細胞または早期プロジェニター細胞、例えばＨＳＣまたは造血前駆細胞の増殖および維持のための基本ＥＳ培地よりも優れていることを示す。組成物は他のＬＩＦ（添加蛋白、または培地のコンディショニングのために使用されたトランスフェクト細胞により生産されるＬＩＦ）を含有することができる。しかしながら、好ましい実施形態においては成体幹細胞のための組成物は添加ＬＩＦを含有しない。一方ではＬＩＦが存在しないことはＡＳＣの増殖能力に影響しない。もう一方ではＬＩＦの存在はＨＳＣ等の細胞の骨髄細胞系への分化を刺激することが知られている。即ちＬＩＦが存在しないことは少なくともＨＳＣまたは早期造血プロジェニター細胞の未分化特性の維持に対しては正の作用を有する。
【００６６】
本発明のより好ましい実施形態においては、ＡＳＣの培養のための組成物は強化されず、即ち、サイトカインや成長因子を添加しない。例えばＨＳＣまたは造血前駆細胞を培養するために培地に典型的に添加されるサイトカインまたは成長因子は例えばＦｌｔ３リガンド、ＩＬ−６（インターロイキン）、可溶性ＩＬ−６受容体、Ｔｐｏ（トロンボポエチン）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、インターロイキン−７、インターロイキン８、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）（ＭＩＰ−１ａ）マクロファージ炎症性蛋白−１ａ、ＭＣＰ（単球化学誘引物質蛋白−１）（ＶＥＧＦ）血管内皮細胞成長因子である。本発明によれば、上記したもののようなサイトカインの添加は成体幹細胞または早期プロジェニター細胞、例えばＨＳＣまたは造血前駆細胞の増殖および維持のためには省略することができる。
【００６７】
即ち本発明の好ましい実施形態においては、ＨＳＣ等のＡＳＣを培養するための組成物はＬＩＦもサイトカインも添加しない組成物である。
【００６８】
本発明の１つの実施形態においては、本発明の組成物は、成体幹細胞および成体早期プロジェニター細胞の表現型の維持のために使用する。その一例として、ＨＵＣ（ヒト臍帯）誘導造血幹細胞の幹細胞特性を長期間維持することへの適用を記載する。
【００６９】
成体幹細胞および／または早期プロジェニター細胞、例えばＨＳＣまたは造血前駆細胞は、本発明によれば、単離後、培養物中少なくとも１５日間、好ましくは培養物中少なくとも３０日間、より好ましくは培養物中少なくとも６０日間、更に好ましくは培養物中少なくとも９０日間、特に好ましくは培養物中少なくとも１８０日間、継代される。
【００７０】
成体幹細胞および／または早期プロジェニター細胞、例えばＨＳＣまたは造血前駆細胞は、本発明によれば、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２５倍、より好ましくは少なくとも４０倍、更に好ましくは少なくとも１００倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍に増殖させる。
【００７１】
ＣＤ３４＋成体幹細胞および／または早期プロジェニター細胞、例えばＨＳＣまたは造血前駆細胞の量は、本発明によれば、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、更に好ましくは少なくとも２５０倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍に増殖させる。
【００７２】
増殖した成体幹細胞および／または早期プロジェニター細胞、例えばＨＳＣまたは造血前駆細胞の能力は、本発明によれば、骨髄様プロジェニターにまで拡大する能力を評価するＬＴＣ  ＩＣアッセイ等のアッセイにより調べた場合、少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１５倍、より好ましくは少なくとも５０倍、更に好ましくは少なくとも２５０倍、最も好ましくは少なくとも１０００倍に拡大される。
【００７３】
増殖したＡＳＣ、例えばＨＳＣは、少なくとも１５日間、好ましくは少なくとも２８日間、より好ましくは少なくとも６０日間、最も好ましくは少なくとも９０日間の培養の後、致死未満の放射線照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植される。
【００７４】
本発明に従って培養されるＨＳＣ細胞は順次継代して二次ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスとする。
【００７５】
本発明を以下の実施例により更に説明するがこれらは本発明を制限するものではない。本発明に基づき、いくつかの変更や改善が当業者には自明である。
【００７６】
［実施例］
実施例１：組み換えウサギ白血病抑制因子（Ｒａｂ−ＬＩＦ）の製造
上記参照した方法およびＥＳ細胞培地には任意でＬＩＦ、好ましくは組み換えＲａｂ−ＬＩＦを含有させることにより、ＥＳ細胞を未分化のまま維持し、生殖細胞系への移行を行う能力を維持することができる。図１において、Ｒａｂ−ＬＩＦのヌクレオチド配列をそのペプチド配列と共に示す。
【００７７】
Ｒａｂ−ＬＩＦは多くの方法、典型的には生物学者が使用できる多くの分子生物学のツール、即ち発現系により調製してよい。このような場合、Ｒａｂ−ＬＩＦ蛋白をコードするＤＮＡ分子は、発現カセットを創生するために転写プロモーターおよびターミネーターをコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結してよい。次にプロモーター、ターミネーターおよびＲａｂ−ＬＩＦコードＤＮＡを含むＤＮＡ分子をＲａｂ−ＬＩＦ蛋白の製造のために細胞に導入する。好ましくは、分泌シグナルをコードするＤＮＡが、活性Ｒａｂ−ＬＩＦが細胞から分泌されるような態様でＲａｂ−ＬＩＦコードＤＮＡに作動可能に連結する。
【００７８】
プロモーターは構成的、誘導性、または、組織特異的であってよく、その選択は典型的にはＲａｂ−ＬＩＦ蛋白の生産が望まれる細胞およびその条件により異なる。実施例１に記載するとおり、組み換えＲａｂ−ＬＩＦをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内で生産し、コウボアルファ因子分泌シグナルおよびアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターに作動可能に連結する。或いは、原核細胞またはより高度な真核細胞、例えば哺乳類細胞および昆虫細胞中で発現させるために適切なプロモーター、エンハンサーまたはターミネーター（総称して「制御配列」とする）にＲａｂ−ＬＩＦコードＤＮＡを作動可能
に連結してよい。
【００７９】
組み換えＲａｂ−ＬＩＦはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手したメチロ向性コウボＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系を用いて作成した。Ｒａｂ−ＬＩＦ遺伝子はウサギゲノムライブラリラムダＤＡＳＨＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
＃９４５９５０）から単離し、成熟Ｒａｂ−ＬＩＦ蛋白をコードするｃＤＮＡを、標準的操作法を用いてスプライス重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）により組み立てた。
【００８０】
連続して行うＰＣＲおよびＳＯＥ−ＰＣＲ反応においてＲａｂ−ＬＩＦｃＤＮＡを鋳型として用い、コドンの使用を変更することによりＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中の発現のために遺伝子を最適化した。このＲａｂ−ＬＩＦ最適化ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は図２に示すとおりである。
【００８１】
ＰＣＲ反応におけるプライマーはｐＰＩＣＺαベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中のアルファ因子分泌シグナルを有する成熟Ｒａｂ−ＬＩＦ配列の厳密なインフレームの融合を可能にするように設計した。これにより形質転換されたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの培養上澄みから組み換え蛋白を単離することができる。このプライマーはまた成熟Ｒａｂ−ＬＩＦコード配列の前面の余分なアラニンコドン（上記配列において下線）もまた導入し、アルファ因子分泌シグナルのＫｅｘ２プロセシングを促進する。ＬＹ−ＲＬＩＦ−ＰＤプライマーはＮｏｔＩ部位を含んでいる。生成物を精製し、ＸｈｏｌおよびＮｏｔＩで消化し、ベクターｐＰＩＣＺαの相当する部位にクローニングし、ｐＰＩＣＺα−ＲＬＩＦ１００を得た。このベクターにおいて、Ｒａｂ−ＬＩＦの発現は強力なアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）プロモーターにより指向される。
【００８２】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中の形質転換の前に、ベクターｐＰＩＣＺα−ＲＬＩＦ１００をＢｓｔＸ１で消化して５’ＡＯＸ１未翻訳配列内で切断することにより線状化することにより、ＡＯＸ１染色体遺伝子座内の発現モジュールの安定な組み込みを行う。コウボの操作は全て入手もとの推奨法に基づいて実施した。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ形質転換体Ｘ３３（ＲｂＬ）を最終的にＲａｂ−ＬＩＦコウボ発現株として選択し、Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓに受託番号ＭＵＣＬ４２９２５の元に寄託した。
【００８３】
上記した発現カセットは染色体内に安定に組み込まれる。Ｘ３３（ＲｂＬ）株は２０００年７月５日にＢＣＣＭに寄託されている。Ｐｉｃｈｉａ内の発現について最適化されたヌクレオチド配列は本発明の部分を構成する。
【００８４】
Ｒａｂ−ＬＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はこれまで報告されておらず、それは図１に示すとおりである。ヌクレオチド配列はＳａｎｇｅｒ等の標準的方法に従って決定した。
【００８５】
成熟蛋白のＲａｂ−ＬＩＦ核酸配列は手作業によりヒトＬＩＦ配列（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ
ａｌ．，１９８８，受託番号Ｍ６３４２０＆Ｊ０５４３６）およびマウスＬＩＦ配列（Ｇｅａｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，受託番号Ｍ６３４１９＆Ｊ０５４３５）と比較した。ヒトとウサギのＬＩＦの核酸配列の間には９０％の相同性が観察された。マウスとウサギのＬＩＦの核酸配列の間には７７％の相同性が観察された。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内の発現のために最適化されたｃＤＮＡの相当する相同性はマウスに対して６１％、ヒトＬＩＦに対して７０％であった。
【００８６】
実施例２：Ｒａｂ９で予備コンディショニングされたＥＳ細胞培養用培地の製造
本発明の１つの実施形態において、Ｒａｂ９線維芽細胞のコンフルエント単層培養によりコンディショニングされた基本ＥＳ細胞の培地を４日連続採取し、コンディショニングされた培地を合わせてＥＳ細胞培養に使用する。毎日１５ｃｍのペトリ皿に基本ＥＳ培地２５ｍｌを交換する。４日後、各１５ｃｍペトリ皿を１：４に分割する、分割後第１日に、培地を廃棄する。コンディショニングされた基本ＥＳ培地（４採取日の混合物から）の１リットルに対し、ウシ胎児血清８０ｍｌ、非必須アミノ酸１７ｍｌ、グルタミン２０ｍｌ、β−メルカプトエタノール６．３μｌ、インスリン１．２５ｍｌおよび基本培地８０ｍｌを添加し、ｐＨを７．４に合わせる。基本培地の組成はＤＭＥＭ高グルコース５００ｍｌ、ウシ胎児血清７０ｍｌ、ペニシリン／ストレプトマイシン１３ｍｌ、グルタミン１３ｍｌ、β−メルカプトエタノール６．３μｌおよび必須アミノ酸１３ｍｌとした。強化基本培地は更に４％（ｖ：ｖ）のウシ胎児血清を添加した基本培地とする。
【００８７】
他の実施形態においては、コンディショニングされた基本ＥＳ培地はローラーボトル、セルファクトリーまたはバイオリアクター等の標準的な操作法を用いてスケールアップすることができる。
【００８８】
実施例３：ネズミ胚性幹（ＥＳ）細胞の誘導および培養
１．マウス系統およびＥＳ細胞
ＥＳ細胞はとりわけ以下の市販マウス系統、即ち、１２９／ＳｖＥｖＴａｃｏｎｉｃ（Ｔａｃｏｎｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）；Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃｆＢｒ（Ｔａｃｏｎｉｃ）；ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃｆＢｒ（Ｔａｃｏｎｉｃ）；ＤＢＡ／２ＮＴａｃｆＢＲ（Ｔａｃｏｎｉｃ）；Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＴａｃ  ＮＴＶｆＢｅ（Ｔａｃｏｎｉｃ）；ＦＶＢ／ＮＴａｃｆＢＲ（Ｔａｃｏｉｃ）；Ｔａｃ：（ＳＷ）ｆＢＲ，Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ（Ｔａｃｏｎｉｃ）；１２９／ＳｖＪ（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）；Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ＜Ｂ−Ｍ３＞（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄ（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ，ＵＳＡ）；ＣＢＡ／ＣａＯｌａＨｓｄ（Ｈａｒｌａｎ）；ＤＢＡ／１ＯｌａＨｓｄ（Ｈａｒｌａｎ），ＤＢＡ１ＬａｃＪ，ＣＤ１，ＢＡＬＢ／ｃ，ＭＲＬ，Ｃ５７ＢＬ／６ｘＣＢＡから誘導することができる。
【００８９】
２．ネズミＥＳ細胞の誘導
ＥＳ細胞は３．５〜４．５日齢の胚盤胞期のネズミ胚から誘導視することができ、これは有糸分裂停止マウス胚性線維芽細胞フィーダー単層に被覆された９６穴ディッシュ上に個々に採取し、プレーティングすることができる。胚盤胞を単層に結合させ、毎日本発明のコンディショニングされたＥＳ細胞培地（実施例２参照）、ネズミＬＩＦまたはＲａｂ−ＬＩＦ添加または無添加の基本ＥＳ培地、または、内因性Ｒａｂ−ＬＩＦを分泌するＲａｂ９＃１９細胞株でコンディショニングされたＥＳ細胞培地を供給する。
【００９０】
培地中５〜６日の後、内細胞塊（ＩＣＭ）の発芽後成長物を選択的に（残存）栄養外胚葉から取り出し、マイトマイシン停止ネズミ線維芽細胞と共に９６穴ディッシュ上でトリプシン−ＥＤＴＡでトリプシン処理した後に再プレーティングする。その後ＥＳ細胞を徐々により大きい培養ディッシュにプレーティングする。ＥＳ細胞は本発明のコンディショニングされたＥＳ細胞培地を使用することにより２０継代より長く未分化のままで存続することができる。
【００９１】
線維芽細胞フィーダー層は交尾後１２．５日の妊娠マウスのネズミ胚から得ることができる。マウスを屠殺し、子宮を採取し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の入ったペトリ皿中に入れる。胚を子宮から摘出し全ての膜を除去する。胚をＰＢＳの入った新しいディッシュに移し、頭部および全ての内臓を除去し、死骸をＰＢＳで洗浄して血液を除去する。
次に死骸を、２インスリンシリンジを用いて粉砕して直径２〜３ｍｍの小片とし、トリプシン−ＥＤＴＡ／ＭＥＭ溶液（１０／９０Ｖ／Ｖ）中４℃で２時間インキュベートする。次に懸濁液を３７℃で１５分間インキュベートし、単細胞懸濁液を、５ｍｌピペットを用いて作成し、フィーダー培地２５ｍｌ中、１８０ｍｍのペトリ皿当たり５ｘ１０６個でプレーティングする。
【００９２】
フィーダー培地の組成は、ダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ）５００ｍｌ、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン１３ｍｌ、グルタミン１３ｍｌ、非必須アミノ酸１３ｍｌ、β−メルカプトエタノール２．３μｌとした。培地を２４時間後に交換し、破砕物を除去する。培養２〜３日の後、線維芽細胞はコンフルエントの単層となる。次にプレートをトリプシン処理し、ペトリ皿２枚に再度プレーティングし、コンフルエントに達したら、各プレートの細胞をバイアル２本中に凍結し、−８０℃で一夜保存し、翌日液体窒素中に移す。
【００９３】
３．ＥＳ細胞の培養
ＥＳ細胞をマイトマイシンで有糸分裂停止させたマウス胚性線維芽細胞上にサブコンフルエントとなるまで生育させる。培養ディッシュは空気中５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下３９℃で維持する。ＥＳ細胞は２〜３日おきに新しく調製したフィーダーディッシュ上に継代する。ＥＳ細胞には毎日コンディショニングされたＥＳ細胞培地を与える。
【００９４】
４．比較
本発明の１つの実施形態においては、胚盤胞はＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃｆＢｒ（Ｔａｃｏｎｉｃ）マウスの自然交配から得た。胚盤胞をａ）強化基本培地（下記参照）；ｂ）ネズミＬＩＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）添加強化基本培地；ｃ）Ｒａｂ−ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）添加強化基本培地；ｄ）Ｒａｂ−ＬＩＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）添加強化基本培地；ｅ）実施例２のＲａｂ９線維芽細胞上でコンディショニングした基本培地；またはｆ）Ｒａｂ９＃１９線維芽細胞株上でコンディショニングした基本培地とともに培養した。
【００９５】
基本培地の組成はＤＭＥＭ高グルコース５００ｍｌ、ウシ胎児血清７０ｍｌ、ペニシリン／ストレプトマイシン１３ｍｌ、グルタミン１３ｍｌ、β−メルカプトエタノール６．３μｌおよび非必須アミノ酸１３ｍｌとした。強化基本培地は更に４％（ｖ：ｖ）のウシ胎児血清を添加した基本培地とする。
【００９６】
Ｒａｂ９線維芽細胞でコンディショニングした基本培地を実施例２に記載するとおり得る。コンディショニングされた基本ＥＳ培地（４採取日の混合物から）の１リットルに対し、ウシ胎児血清８０ｍｌ、非必須アミノ酸１７ｍｌ、グルタミン２０ｍｌ、β−メルカプトエタノール６．３μｌ、インスリン１．２５ｍｌおよび基本培地８０ｍｌを添加し、ｐＨを７．４に合わせる。このコンディショニングされた培地はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）のヒトＬＩＦ用のＥＬＩＳＡで測定した場合に測定不能な濃度（２０ｐｇ／ｍｌ未満）のＲａｂ−ＬＩＦを含有する。
【００９７】
Ｒａｂ９＃１９線維芽細胞でコンディショニングされた基本培地を実施例２においてＲａｂ９に関して記載したとおり４連続日に収集する。コンディショニングされた基本ＥＳ培地（４採取日の混合物から）の１リットルに対し、ウシ胎児血清８０ｍｌ、非必須アミノ酸１７ｍｌ、グルタミン２０ｍｌ、β−メルカプトエタノール６．３μｌ、インスリン１．２５ｍｌおよび基本培地８０ｍｌを添加し、ｐＨを７．４に合わせる。Ｒａｂ９＃１９はウサギ白血病抑制因子遺伝子で安定にトランスフェクトされており、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）のヒトＬＩＦ用のＥＬＩＳＡで測定した場合にＲａｂ−ＬＩＦ３０ｎｇ／ｍｌ／日までを分泌するＲａｂ９線維芽細胞である。
【００９８】
胚盤胞をフィーダー層に結合させる。培地は毎日交換する。培養約１週間の後、ＩＣＭの発芽後成長物を栄養外胚葉から取り出し、トリプシン処理後、マイトマイシンＣ停止ネズミ線維芽細胞のフィーダー層で被覆された新しい９６穴ディッシュ上に移す。その後ＥＳ細胞を徐々により大きいフィーダー層を有する培養ディッシュに移す。５〜１０継代の後、樹立されたＥＳ細胞株の数を培養条件の各々について計数する。樹立されたＥＳ細胞系統の未分化性は、免疫化学染色法によりアルカリホスファターゼ存在下の存在について（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、または、ビメンチンおよびサイトカインの非存在について（ともにＤａｋｏ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）調べる。未分化細胞の９０％超に相当するＥＳ細胞株のみ培地中に維持される。
【００９９】
強化基本培地のみではＥＳ細胞の誘導は不可能である。ＩＣＭの発芽後成長物は第１継代の前またはその最中に急速に分化した（図３Ｅおよび図４Ｅ）。
【０１００】
【表１】
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【０１０１】
ネズミＬＩＦまたはＲａｂ−ＬＩＦのいずれかを強化基本培地に添加した場合ＥＳ細胞の誘導の効率は３継代後に約２５％まで増大した。ネズミまたはウサギのＬＩＦのいずれかを用いたＥＳ細胞分化の効率は同等であった。内因性または添加ＬＩＦの非存在下でＲａｂ９コンディショニング培地を用いた場合にはＥＳ細胞誘導の効率は約５０％まで増大した。基本培地を内因性Ｒａｂ−ＬＩＦを分泌するＲａｂ９＃１９細胞株でコンディショニングした場合にも同様のＥＳ細胞誘導の効率が観察された。
【０１０２】
胚盤胞をＲａｂ９またはＲａｂ９＃１９線維芽細胞でコンディショニングした基本培地中で培養した場合（図３Ｃおよび図３Ｄ）、内細胞塊の発芽後成長の促進が観察された。ネズミＬＩＦまたはＲａｂ−ＬＩＦを添加した強化基本培地中では、内細胞塊の部分的分化または栄養外胚葉細胞の発芽後成長が観察された（図３Ａおよび図３Ｂ参照）。
【０１０３】
１継代後には既に、異なる培地中のＥＳ細胞コロニーの形態には差が認められた。ネズ
ミまたはＲａｂ−ＬＩＦを添加した強化基本培地（図４ＡおよびＢ）はむしろ平坦なＥＳコロニーを生じさせたのに対し、Ｒａｂ９またはＲａｂ９＃１９線維芽細胞細胞上でコンディショニングされた基本培地の使用（図４Ａおよび図４Ｄ）は３次元のＥＳ細胞コロニーをもたらした。基本培地を使用した場合には全ての細胞が１継代後には分化した（図４Ａ）。上記した結果は培養３週後に得られた予備的結果であった。数例においては、ＥＳ細胞は３週目〜２ヶ月の間に得られた。累積頻度を表２に総括する。
【０１０４】
【表２】
2005512563.tif 000004
【０１０５】
表２においては、少なくとも１０継代に渡り未分化の状態を維持したＥＳ細胞のみを樹立されたＥＳ細胞株とみなした。
【０１０６】
ネズミＬＩＦ、１０ｎｇウサギＬＩＦまたは２０ｎｇＲａｂ−ＬＩＦのいずれかを強化栄養培地に添加した場合も、ＥＳ細胞の分化の効率はそれぞれ３４％、３８％および３６％であった。ネズミまたはウサギのＬＩＦのいずれかを用いたＥＳ細胞誘導の効率は同等であった。内因性または添加ＬＩＦの非存在下にＲａｂ９コンディショニング培地を用いた場合には、ＥＳ細胞誘導効率は５１％であった。内因性Ｒａｂ−ＬＩＦを分泌するＲａｂ９＃１９細胞株で基本培地をコンディショニングした場合、ＥＳ細胞誘導効率は６１％であった。これらの差（５１％ｖｓ６１％）は統計学的に有意ではなかった（カイ自乗分析、ｐ＝ＮＳ）。
【０１０７】
５．その他の実施形態
本発明の第２の実施形態において、胚盤胞をＦＶＢ／ＮｔａｃｆＢＲ（Ｔａｃｏｎｉｃ，  Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）マウスの自然交配およびＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＴａｃｆＢｒ（Ｔａｃｏｎｉｃ）の自然交配より得た。胚盤胞は実施例２に記載の通りＲａｂ９線維芽細胞上でコンディショニングした基本培地を用いて培養した。
【０１０８】
基本培地の組成はＤＭＥＭ高グルコース５００ｍｌ、ウシ胎児血清７０ｍｌ、ペニシリン／ストレプトマイシン１３ｍｌ、グルタミン１３ｍｌ、β−メルカプトエタノール６．３μｌおよび非必須アミノ酸１３ｍｌとした。強化基本培地は更に４％（ｖ：ｖ）のウシ
胎児血清を添加した基本培地とする。
【０１０９】
Ｒａｂ９線維芽細胞でコンディショニングした基本培地を実施例２に記載するとおり得る。コンディショニングされた基本ＥＳ培地（４採取日の混合物から）の１リットルに対し、ウシ胎児血清８０ｍｌ、非必須アミノ酸１７ｍｌ、グルタミン２０ｍｌ、β−メルカプトエタノール６．３μｌ、インスリン１．２５ｍｌおよび基礎培地８０ｍｌを添加し、ｐＨを７．４に合わせる。このコンディショニングされた培地は、ウサギＬＩＦと完全に交差反応するＲａｂ−ＬＩＦを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ，  ＵＳＡ）のヒトＬＩＦ用のＥＬＩＳＡで測定した場合に測定不能な濃度（２０ｐｇ／ｍｌ未満）で含有する。
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
胚盤胞をフィーダー層に結合させる。培地は毎日交換する。培養約１週間の後、ＩＣＭの発芽後成長物を栄養外胚葉から取り出し、トリプシン処理後、マイトマイシンＣ停止ネズミ線維芽細胞のフィーダー層で被覆された新しい９６穴ディッシュ上に移す。その後ＥＳ細胞を徐々により大きいフィーダー層を有する培養ディッシュに移す。培養２ヶ月後、樹立されたＥＳ細胞株の数を系統の各々について計数する。樹立されたＥＳ細胞株の未分化性は、免疫化学染色法によりアルカリホスファターゼ存在下の存在について（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、または、ビメンチンおよびサイトカインの非存在について（ともにＤａｋｏ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）調べる。少なくとも１０継代に渡り未分化状態で培地中維持できたＥＳ細胞のみ（未分化細胞が９０％超）樹立されたＥＳ細胞であるとみなした。
【０１１２】
Ｒａｂ９線維芽細胞でコンディショニングした基本培地はＦＶＢ／ＮならびにＢＡＬＢ／ｃ系統由来の胚性幹細胞の誘導を可能にする。２ヶ月培養の後、樹立された８ＥＳ細胞株をＦＶＢ／Ｎ系統について計数し、１５ＥＳ細胞株をＢＡＬＢ／ｃ系統について計数される。このことはそれぞれ４０％および４４％の全体的誘導効率を示す。
【０１１３】
実施例４：キメラおよびＥＳ細胞誘導動物の作成
宿主胚の生殖細胞系にコロニー化できるＥＳ細胞の能力は、これらのＥＳ細胞を宿主の胚盤胞に注入することにより、または、その桑実胚期の２倍体胚または４細胞期の４倍体胚との凝集させこれらのキメラ予備移植胚を擬似妊娠の擬似レシピエント内に定法に従って移植することにより試験できる。得られたキメラ仔をＥＳ細胞ゲノムの生殖細胞系への移行について試験交配させる。
【０１１４】
１．ＥＳ細胞クローンへの胚盤胞注入
Ｃ５８ＢＬ／６、ＦＶＢ／ＮおよびＢＡＬＢ／ｃマウス由来の樹立されたＥＳ細胞株がコロニー化して宿主胚の生殖細胞となる能力は、これらのＥＳ細胞系統を１０継代以降に
宿主胚盤胞に注入し、そして、これらのキメラ胚を擬似妊娠の擬似母親に定法により移植することにより試験した。％キメラ化（即ちＥＳ細胞ゲノムのキメラ仔への寄与度）を容易に推定するために、着色被毛を有するマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）のＥＳ細胞株をスイスウェブスターの胚盤胞に注入し、白色体毛を有するマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、ＦＶＢ／Ｎ）のＥＳ細胞株を黒色Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ胚盤胞とキメラ化した。次にＥＳ細胞ゲノムの生殖細胞系への移行について、ＥＳ細胞系統誘導被毛着色をＦ１仔において樹立するために高パーセントキメラをスイスウェブスターまたはＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスと適宜交配することにより試験した。
【０１１５】
胚盤胞注入はＭ２倍値をフレーバーラッシュすることにより過剰排卵メスの子宮から収集した３．５日齢の胚盤胞を用いて行った（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ，Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。過剰排卵は妊娠成熟メスの血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）７．５ＩＵを注射し、その後、４８時間の間隔を置いてヒト絨毛ゴナドトロピン（Ｐｒｅｇｎｙｌ  Ｏｒｇａｎｏｎ，Ｏｓｓ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）７．５ＩＵを注射することにより誘導した。収集した胚盤胞はＭ１６培地（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）中３９℃で空気中５％ＣＯ2雰囲気下に培養した。
【０１１６】
ＥＳ細胞株は２日間継代した後に露出ゼラチンディッシュ上にマイクロインジェクションした。マイクロインジェクションの日にこれらのディッシュを３９℃で約２分間０．２５％トリプシン／１ｍＭＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトリプシン処理した。新しいコンディショニングされた細胞培養培地を添加し、懸濁液をピペッティングして単細胞懸濁液を作成した。遠心分離（５分間１１００ｒｐｍ／分）の後、ＥＳ細胞を新しいコンディショニングされた培地中に再懸濁し、インキュベーター中３９℃に維持した。
【０１１７】
胚盤胞の注入は着色被毛を有するマウス系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）のＥＳ細胞１５〜２０個をアルビノスイスウェブスターマウスの宿主胚盤胞に注入するか、または、白色被毛を有するマウス（ＦＶＢ／Ｎ、ＢＡＬＢ／Ｃ）のＥＳ細胞を黒色Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの宿主胚盤胞に注入することにより行った。注入後、胚盤胞を２．５妊娠日齢の迷走神経切除雄マウスとあらかじめ交配させた擬似妊娠スイスウェブスター雌に再移植（各子宮角に７〜８胚盤胞）した。
【０１１８】
１１種のＣ５７ＢＬ／６ＮＥＳ細胞株をスイスウェブスター胚盤胞に注入した。各Ｃ５７ＢＬ／６ＮＥＳ細胞株はスイスウェブスターマウスの胚盤胞への胚盤胞注入後にキメラ仔を出生することができた。全てのＣ５７ＢＬ／６ＮＥＳ細胞株は高パーセントキメラをスイスウェブスターマウスと交配させた後に生殖細胞系への移行を示しており、そして、生殖細胞系への移行の能力に関する他の試験を実施する。９ＦＶＢ／Ｎおよび７ＢＡＬＢ／ｃＥＳ細胞株をＣ５７ＢＬ／６Ｎ胚盤胞に注入した。ＦＶＢ／Ｎ並びにＢＡＬＢ／ｃ系統に由来するこれらのＥＳ細胞株のそれぞれについて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの胚盤胞への注入の後に、キメラ仔が出生した。５ＦＶＢ／ＮＥＳ細胞株および５ＢＡＬＢ／ｃＥＳ細胞株が生殖細胞系への移行の能力を示している。生殖細胞系への移行の能力に関する他の試験を実施する。
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
２．ＥＳ細胞クローンの２倍体凝集
２倍体凝集方法は以下の通り実施することができる。スイスウェブスター（アルビノ被毛着色）雌を妊娠成熟雌血清ゴナドトロピン、次いで４４〜４８時間後に５単位のヒト絨毛ゴナドトロピンを用いて過剰排卵させる。過剰排卵し、交配させたスイスウェブスターマウスの卵管を交尾２．５日後に洗浄し、最新の８細胞期の２倍体胚を収集する。試験した全てのＥＳ細胞株は着色被毛を有するマウス系統から誘導することによりキメラ仔の同定をようにする。
【０１２３】
これらの８細胞期の２倍体胚の透明帯を酸Ｔｈｙｒｏｄｅバッファで処理することにより除去する。透明帯非含有の胚を洗浄し、Ｍ１６培地に入れる。１個の８細胞期の２倍体とＥＳ細胞集塊との間で凝集を行う。胚盤胞期までＭ１６微小液滴中で凝集物を培養した後、２．５妊娠日齢の擬似妊娠スイスウェブスター雌の子宮角に再移植する。
【０１２４】
キメラ仔はＥＳ細胞の寄与により発生した暗色（非アルビノ）の存在により同定する。キメラ化のパーセント（ＥＳ細胞から生じた新生仔の比率）は白色被毛（アルビノスイス
ウェブスター胚から生じる）と比較した場合の暗色被毛（ＥＳ細胞から生じる）のパーセントを判断することにより目視で同定する。
【０１２５】
３．ＥＳ細胞クローンの４倍体凝集体
完全にＥＳ細胞に由来する胚は４倍体の宿主胚とのＥＳ細胞の凝集を介して発生させることができる。２細胞胚を電気的に融合させ、その後４細胞の４倍体胚としてＥＳ細胞と凝集させることにより、キメラ胚を形成し、そして擬似妊娠のレシピエントに移植する。ＥＳ細胞は（ほぼ）排他的に胚および４倍体の細胞から胚外膜のものへの発達に寄与する。
【０１２６】
ＥＳ細胞と４倍体細胞を識別するために、宿主胚（凝集用に使用）を、ＬａｃＺを遍在的に全発達と成体期を通じて発現するＲＯＳＡ２６系統から誘導する。過剰排卵させ交配させたＲＯＳＡ２６マウスの卵管をヒト絨毛ゴナドトロピン処理３６時間後に洗浄して最新の２細胞期の胚を収集する。
【０１２７】
実施例６：臍帯血由来造血幹細胞のエクスビボ増殖
１．臍帯血（ＵＣＢ）の収集
インフォームドコンセントを得た後、ＵＣＢバンキングに用いられる標準的操作法に従って臨月出産のヒトＵＣＢをＨｏｓｐｉｔａｌ  Ｇａｓｔｈｕｉｓｂｅｒｇ（Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）において収集した。操作では、出産胎盤の臍帯静脈内にクエン酸塩リン酸塩デキストロースアデニン（ＣＰＤ−Ａ）抗凝固剤（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ
Ｃａｒｅ  Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）３５ｍｌの入った標準４５０ｍｌ血液ドナーセットの１６ゲージ針を挿入し、ＵＣＢを重力により血液バッグ中に導入する。全ての場合において、血液試料は採取後２４時間以内に処理した。各採血ごとに、少量を取りおき、通常の血液学的分析（Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ  ３５００  Ｓｙｓｔｅｍ，Ａｂｂｏｔｔ）および造血プロジェニターの免疫表現型タイピングに付した。
【０１２８】
２．単核細胞（ＭＮＣ）の単離およびＣＤ３４＋細胞の精製
単核細胞（ＭＮＣ）はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で軟膜をｖ／ｖ希釈し、３０ｍｌ分をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）１０ｍｌ上に積層することにより単離した。これらの試料を２０分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。この時点で赤血球枯渇している白血球リッチな界面細胞を収集し、洗浄し、そして、製造元の指示書に従ってＭＡＣＳ  ＣＤ３４プロジェニター細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いてＣＤ３４＋を免疫磁気的に増量強化した。慨すれば、ＭＮＣを洗浄しＣａ２＋非含有Ｍｇ２＋非含有の０．５％ＢＳＡおよび２ｍＭＥＤＴＡを添加したダルベッコＰＢＳ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。次に細胞をブロッキング試薬の存在下、ＭＡＣＳミクロビーズに結合した抗ＣＤ３４抗体と共にインキュベートした。標識された細胞を、３０ｍｍナイロンメッシュを通して濾過し、次に強磁場においた高勾配磁気分離カラムを用いて分離した。磁気的に保持された細胞を溶出し、その純度をフローサイトメトリーで９５％超まで測定した。
【０１２９】
３．基質フィーダー
ネズミ胎児肝細胞株ＡＦＴＯ２４（Ｄｒ．Ｔｈｅｕｎｉｓｓｅｎより寄贈）を２０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１５０μＭ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ、Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｌａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中３３℃で維持した。細胞を１５０ｃｍ２のフラスコおよび０．１％ゼラチン（Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ
Ｍｅｄｉａ，Ｌａｖａｌｅｔｅ，ＮＪ）を予備コートした６穴および９６穴のプレート
（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，ＮＪ）中でサブ培養し；コンフルエントまで生育させ、３７℃５％ＣＯ２で移動させ、生育を停止させた。
【０１３０】
４．造血幹細胞の培養
慨すれば、１０5個の強化ＵＣＢＣＤ３４＋細胞を６穴プレート中に播種し、３０日間、下記の通り培養した。
１）ウサギ線維芽細胞様細胞株Ｒａｂ９（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４１４）によりコンディショニングされた培地中基質細胞非存在下の露出ディッシュ上、
２）ウサギ線維芽細胞様細胞株Ｒａｂ９＃１９（Ｒａｂ９＃１９はゲノムウサギＬＩＦ遺伝子で安定にトランスフェクトされているウサギ線維芽細胞細株Ｒａｂ９である）によりコンディショニングされた培地中基質細胞非存在下の露出ディッシュ上、
３）ウサギ線維芽細胞様細胞株Ｒａｂ９＃１９（ＬＭＢＰ５４７９ＣＢ）によりコンディショニングされた培地中基質細胞非存在下の露出ディッシュ上、
４）インスリン添加強化基本培地中基質細胞非存在下の露出ディッシュ上、
５）２０ｎｇ／ｍｌヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ３／Ｆｌｋ２）、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−６組み換え体（ｒｈＩＬ−６）、２００ｎｇ／ｍｌヒト組み換えＩＬ−６受容体可溶性型（ｒｈＩＬ−６  ｓＲ）、２０ｎｇ／ｍｌヒトトロンボポエチン（Ｔｐｏ）を添加したインスリンを添加した強化基本培地中基質細胞非存在下の露出ディッシュ上。
【０１３１】
サイトカイン（ヒトＦｌｔ３リガンド（ｒｈＦｌｔ３／Ｆｌｋ２）、ヒトＩＬ−６組み換え体（ｒｈＩＬ−６）、ヒト組み換えＩＬ−６受容体可溶性型（ｒｈＩＬ−６  ｓＲ）、ヒトトロンボポエチン（Ｔｐｏ）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｙｓ，ＭＮより入手した。１週間に２回、細胞に新しい適切な培地を与えた。第５０日まで５日おきに、細胞の一部を採取し、細胞数の評価、表現型の分析およびインビトロアッセイ（ＬＴＣ−ＩＣ）に付した。トリパンブルー排除法を用いて増殖培養物の全生存細胞含量を求めた。最初は１０5個の強化ＵＣＢＣＤ３４＋細胞を６穴プレートに播種し、３０日間培養した。
【０１３２】
細胞増殖の結果は表６および図５に示すとおりである。３０日後、基質細胞非存在下露出ディッシュ上でＲａｂ９細胞によりコンディショニングされた培地中で培養した場合、総細胞数は２５倍に増大していた。基質細胞非存在下露出ディッシュ上でＲａｂ９＃１９細胞によりコンディショニングされた培地中で培養した場合、増殖ファクターは４３であった。
【０１３３】
サイトカインカクテル添加または無添加のインスリン添加強化基本培地中で基質細胞非存在下露出ディッシュ上のＣＤ３４＋細胞は全て、培養１５日後には分化しており、全てその造血細胞表現型は消失していた。
【０１３４】
【表７】
2005512563.tif 000009
【０１３５】
表６および図５によれば、ＨＳＣおよびＨＳＰは、ＥＳ細胞の単離および維持に使用される基本培地と比較した場合Ｒａｂ９およびＲａｂ９＃１９コンディショニングサイトカイン非含有培地中では有意に良く生育した。ＬＩＦの存在は細胞の増殖に対して有益な作用を有している（Ｒａｂ９とＲａｂ９＃１９を比較）。
【０１３６】
５．蛍光−活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）
ＣＤ３４＋細胞をまず上記した通り単離し、次に、室温で１５〜２０分間、ＣＤ３４−ＦＩＴＣコンジュゲート抗体（クローン５８１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＣＤ３８−ＰＥ−コンジュゲート抗体（クローンＨＩＴ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で標識した。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次に、４８８ｎｍアルゴンレーザーを装着したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）上で分析した。ＦＩＴＣおよびＰＥとコンジュゲートしたアイソタイプのマッチした対照群を用いて分析ゲートを設定した。培養中、試料を５日間隔で採取し、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞を計数した。
【０１３７】
表７および図６は３０日間の培養の後、ＣＤ３４＋細胞の数は基質細胞非存在下露出ディッシュ上のＲａｂ９細胞によりコンディショニングされた培地中では約３倍に増加していた。同様の増加が基質細胞非存在下露出ディッシュ上のＲａｂ９＃１９細胞によりコンディショニングされた培地中で細胞を培養した場合にも観察された。
【０１３８】
サイトカインカクテルの存在下または非存在下でインスリンを添加した強化基本培地中、基質細胞非存在下の露出ディッシュ上のＣＤ３４＋およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の数はそれらの増殖能力が極めて弱かったため、計数することができなかった。フローサイトメトリー分析に用いるのに十分な細胞が得られなかった。
【０１３９】
【表８】
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【０１４０】
６．ＬＴＣ−ＩＣアッセイ
インビトロの原始細胞の存在頻度をアッセイするために最も頻繁に使用されている方法は長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイである。ＬＴＣ−ＩＣは基質中の原始造血細胞の焦点、即ち、「コブルストーン領域」を形成する。このような領域は限界希釈法により造血支援性基質上の培養５週間後に大部分が骨髄様細胞を生成する原始プロジェニターを定量する。ＬＴＣ−ＩＣはＣＤ３８の異種性発現を伴ってＣＤ３４＋画分に検出されている。これらのアッセイはプロジェニターの自己更新性、多継代能力または移植の化膿性を評価するものではない（Ｄｅ  Ｗｙｎｔｅｒ  Ｅ．，Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ  Ｒ．Ｅ．（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｇｕｌ．Ｈｏｍｅｏｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ，１５：２３−７）。
【０１４１】
増殖培養物から得られるＣＤ３４＋細胞をＡＦＴＯ２４コーティング９６穴プレート上に１１連で６段階の限界希釈によりプレーティングした。培地の組成は１２．５％ＦＢＳ、１２．５％ウマ血清（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、１０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、２マイクロモルのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）および１０-6マイクロモルのヒドロコルチゾンを添加したＩｓｃｏｖｅｓ変性ダルベッコ培地（ＩＭＥＭ）とした。培養は培地の半量を毎週交換しながら５週間継続した。次に培地を除去し、１．１２％メチルセルロース、ＩＭＤＭ、３０％ＦＢＳ、３Ｕ／ｍｌエリスロポエチン、５０ｎｇ／ｍｌｒｈ幹細胞因子、１０ｎｇ／ｍｌｒｈＧＭ−ＣＳＦ、１０ｎｇ／ｍｌｒｈＩＬ−３、１０-4Ｍメルカプトエタノールよりなるクローン形成性メチルセルロース培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）  ＧＦＨ４４３４、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と交換した。
【０１４２】
このメチルセルロース培地中２週間培養後、造血コロニーの有無についてウェルを評価し、それぞれ陽性または陰性と評点した。次にＬＴＣ−ＩＣの頻度をポアソンの統計分析に従って計算した。
【０１４３】
培養１５日の後、ＬＴＣ−ＩＣの数は、基質細胞非存在下および添加サイトカインの非存在下の露出ディッシュ上のＲａｂ９細胞によりコンディショニングされた培地中で培養した場合、１８倍に増大していた。基質細胞非存在下および添加サイトカインの非存在下の露出ディッシュ上のＲａｂ９＃１９細胞によりコンディショニングされた培地中で培養
した場合、増殖ファクターは僅か３．８であった。コンディショニングされた培地中にＬＩＦが存在しないことは長期のＬＴＣ−ＩＣの増殖に対して有益な作用を有している。
【０１４４】
インスリン添加、サイトカインカクテル含有または非含有の強化基本培地中に基質細胞非存在下の露出ディッシュ上の培養については、これらの培養条件下における十分な細胞の入手容易性の観点から、ＬＴＣ−ＩＣは分析しなかった。
【０１４５】
【表９】
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【０１４６】
表８および図７に示す結果は増殖細胞の分化能力に対するＬＩＦの影響を明らかに示している。Ｒａｂ９培地中にＬＩＦが存在しないことは、骨髄系継代における細胞の分化能力を劇的に温存する。結果はまた、ＥＳ細胞の誘導および維持のための優れた能力を有する新しいＲａｂ９培地が造血幹細胞および幹細胞前駆体の生育の促進およびの未分化状態の維持において優れた性能を有することを示している。
【０１４７】
実施例８：再集団化ＨＳＣに関するインビボのアッセイ
ＨＳＣの特性は自己亢進性、多継代分化能力、および、骨髄剥離された宿主を再集団化することである。長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）等のアッセイは培養物長期間の後の骨髄様プロジェニターを生成する細胞の能力を測定する。しかしながら、これらのアッセイは自己更新性、多継代能力またはプロジェニターの移植能力を測定するものではない。ヒトＨＳＣの移植能力の評価にはなお移植モデルを必要とする。いくつかの外因性のモデルが開発されており、例えばヒト化重度複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、非肥満糖尿病性（ＮＯＤ）−ＳＣＩＤマウス、ベージュヌードＸｉｄ（ＢＮＸ）マウスおよび前免疫胎児ヒツジ（例えばＬｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），Ｂｌｏｏｄ  ９７，３４４１−３４４９）への移植が挙げられる。
【０１４８】
ＮＯＤ−ＳＣＩＤレシピエント。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの交配コロニーではマウスを特定の病原体非含有の条件において飼育し、酸性の水およびオートクレーブされた飼料を与えた。水１００ｍｌ当たりトリメトプリム６０ｍｇおよびスルファメトキサゾール３００ｍｇ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪ）を毎週２回与えた。６〜８週齢において、Ｍａｒｋ１セシウム照射器により３００〜３２５ｃＧｙを５７ｃＧｙ／分でマウスに照射した。尾静脈注射によるＵＣＢ細胞の移植は照射後２４時間に行った。細胞の用量は第０日（即ち未培養時）には２５〜１５０×１０3個のＣＤ３４１細胞、または、第７、１４または２８日には培養細胞と同数のプロジェニーとした。移植後６週間に頚部切断によりマウスを屠殺した。大腿骨および脛骨をＩＭＤＭ２０％ＦＣＳで洗浄することにより骨髄（ＢＭ）を得た。次に移植動物の細胞を二次移植実験または延長
表現型のいずれかに用いた。２％を超えるヒトＣＤ４５１細胞がネズミ骨髄に存在していた場合、２大腿骨および２脛骨の細胞を個々の二次マウスレシピエントに移植した。ドナー細胞の移植の評価はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはピペリジンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）にコンジュゲートしたヒト特異的全白血球抗原ＣＤ４５（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の検出により行った。３色表現型タイピングは抗ヒトＣＤ４５ＰｅｒＣＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、抗マウスＣＤ４５ＦＩＴＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および抗ヒトＣＤ３フィコエリスリン（ＰＥ）、ＣＤ１４ＰＥ、ＣＤ１９ＰＥ、ＣＤ３３ＰＥまたはＣＤ３４ＰＥ（全てＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で細胞を染色することにより行った。適切なアイソタイプのコントロールを用いた。ＳＲＣとして定義されるマウス中のヒト細胞の移植の頻度は限界希釈法により計算した。マウスには漸増数の細胞を注入し、移植は０．５％ヒトＣＤ４５１細胞より高値の検出により定義した。ＳＲＣ頻度はポアソンの統計分析により計算した。
【０１４９】
胎児ヒツジレシピエント。培養細胞をＲａｂ９コンディショニング培地に懸濁した。５０（Ｘ群）〜１００（Ｉ群）の３×１０3の未培養ＣＤ３４１細胞または７（ＸＩ群およびＩＩ群）または１４（ＸＩＩ群およびＩＩＩ群）日間培養した細胞の同数の細胞のプロジェニーを羊水バブリング法を用いて前免疫（妊娠５７日〜６２日）胎児ヒツジレシピエントに注入した。一部の実験では供試動物を移植後６０日に屠殺し、ヒト細胞についてＢＭを分析した。ＢＭはまた二次レシピエントへの移植のためのＣＤ４５１細胞の原料として使用した。
【０１５０】
或いは、動物を出生させ、移植後６ヶ月にＢＭを検査した。二次移植のために、ヒトＣＤ４５１細胞をパニングにより移植後６０日にＩ、ＩＩおよびＩＩＩ群の一次レシピエントのＢＭから単離した。各群２匹より得たＣＤ４５１細胞をプールし、ＣＤ３４１細胞含量について分析し、３匹の二次胎児レシピエント（Ｉ群、ＩＶ群、ＩＩ群、Ｖ群、ＩＩＩ群、ＶＩ群）に注射した。移植後６０日に供試動物を屠殺し、ヒト細胞の存在についてＢＭ細胞を分析した。これらの二次レシピエントの骨髄を三次レシピエントに移植されるＣＤ４５１細胞の原料とした。全レシピエントを移植後６０日に屠殺し、ヒト細胞の存在についてＢＭ細胞を分析した。ドナー細胞の移植の評価のために、ヒト細胞を移植した胎児および新生仔のヒツジからのＢＭ  ＭＮＣ中のヒト細胞の存在をフローサイトメトリーで分析した。慨すれば、混在赤色細胞の低張性細胞溶解によりＢＭからＭＮＣを単離した。ヒトＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４５に対して特異的な抗体およびグリコホリンＡ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）をＦＩＴＣまたはＰＥのいずれかとコンジュゲートした。各試料において、５〜３×１０5個の細胞を標識し、各抗原の増殖を該当する非結合アイソタイプマッチの対照群と比較した。０．２％以上の発現濃度が検出できた。更に、ＢＭ  ＭＮＣをエリスロポエチン（２ＩＵ／ｍｌ）、ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍｌ）を添加したメチルセルロース（０．４〜２、３×１０5個／ｍｌ）中で培養し、ヒトＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−Ｍｉｘを計数した。
【０１５１】
これらのインビボのアッセイは本発明の新しい組成物中において培養した場合のＨＳＣの長期移植能力を示す証拠である。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】ウサギＬＩＦ（Ｒａｂ−ＬＩＦ）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列［配列番号１］およびそのペプチド配列［配列番号２］を示す。
【図２】Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓの発現のために最適化されたウサギＬＩＦｃＤＮＡのヌクレオチド［配列番号３］およびアミノ酸［配列番号４］の配列番を示す。
【図３】Ａ）ネズミＬＩＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）含有強化基本培地；Ｂ）Ｒａｂ−ＬＩＦ（１０〜２０ｎｇ／ｍｌ）含有強化基本培地；Ｃ）Ｒａｂ９線維芽細胞上でコンディショニングされた基本培地；Ｄ）Ｒａｂ９＃１９線維芽細胞系統上でコンディショニングされた基本培地；Ｅ）強化基本培地中で培養されたＣ５７ＢＬ６／Ｎマウス由来の結合胚盤胞の初期発芽後成長（継代０）を示す。
【図４】Ａ）ネズミＬＩＦ（１０００ＩＵ／ｍｌ）含有強化基本培地；Ｂ）Ｒａｂ−ＬＩＦ含有強化基本培地；Ｃ）Ｒａｂ９線維芽細胞上でコンディショニングされた基本培地；Ｄ）Ｒａｂ９＃１９線維芽細胞株上でコンディショニングされた基本培地；Ｅ）強化基本培地中１継代後のＥＳ細胞コロニーの形態を示す。
【図５】種々の培地中におけるＨＵＣ誘導ＣＤ３４＋細胞の増殖有核細胞の生育（初期集団の増殖ファクターとして表示）を示し、凡例は、実線と方形：Ｒａｂ９＃１９細胞でコンディショニングされた培地；実線と三角：Ｒａｂ９細胞でコンディショニングされた培地；実線と円：基本ＥＳ培地；破線と円：サイトカイン含有基本ＥＳ培地である。
【図６】種々の培地中のＨＵＣ誘導ＣＤ３４陽性細胞の培養物中のＣＤ３４＋細胞の増殖（初期ＣＤ３４＋陽性細胞の増殖ファクターとして表示）。凡例は、実線と方形：Ｒａｂ９＃１９細胞でコンディショニングされた培地；実線と三角：Ｒａｂ９細胞でコンディショニングされた培地。
【図７】種々の培地中のＨＵＣ誘導ＣＤ３４陽性細胞の培養物中のＬＴＣ−ＩＣ陽性細胞の増殖（初期ＬＴＣ−ＩＣ陽性細胞の増殖ファクターとして表示）。凡例は、実線と方形：Ｒａｂ９＃１９細胞でコンディショニングされた培地；実線と三角：Ｒａｂ９細胞でコンディショニングされた培地。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年6月2日(2004.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化の細胞として少なくとも１０継代の間の、または、哺乳類成体幹細胞および早期プロジェニター細胞の基質フリー増殖のための、哺乳類の多能性胚性肝細胞の誘導、維持または生育のための組成物であって、それが線維芽細胞株のコンディショニングされた培地を含むこと、および、それが白血病抑制因子（ＬＩＦ）０．１ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、組成物。
【請求項２】
成体幹細胞が造血幹細胞であり、成体早期プロジェニター細胞が造血前駆細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記多能性胚性幹細胞が哺乳類の生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）０．０５ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）０．０２ｎｇ／ｍｌ未満を含有することを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
組成物が霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌまたはウサギの群から選択される非ヒト哺乳類の幹細胞に適する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
組成物がげっ歯類の群から選択される非ヒト哺乳類の幹細胞に適する、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
非ヒト哺乳類がクマネズミ種である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
非ヒト哺乳類がハツカネズミ種である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの群から選択される遺伝子的バックグラウンドを有する系統のいずれかのハツカネズミ系統である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
非ヒト哺乳類がＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するハツカネズミ系統の群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
非ヒト哺乳類が１２９／ＳｖＥｖの遺伝子的バックグラウンドまたはＣ５７ＢＬ／６Ｎの遺伝子的バックグラウンドを有するマウスである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
細胞のコンディショニングされた培地が不死化線維芽細胞株由来のものである、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
細胞のコンディショニングされた培地がウサギＲａｂ９細胞株（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１４１４）由来のものである、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
哺乳類の多能性胚性幹細胞の誘導、維持または生育に適しており、そして、インターロイキン、オンコスタチン、毛様体神経栄養因子、幹細胞因子、塩基性線維芽細胞成長因子およびカルジオトロピンの群から選択される化合物１種以上を添加された、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
組成物がサイトカインを強化されていないことを更に特徴とする、哺乳類成体幹細胞および早期プロジェニター細胞の基質フリーの増殖のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかの組成物中少なくとも１継代細胞を培養するステップを含む、哺乳類または増殖中の哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞に由来する多能性胚性幹細胞を誘導、維持または生育させる方法。
【請求項１８】
前記幹細胞が非ヒト多能性胚性幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記幹細胞が生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギおよびげっ歯類の群から選択される非ヒト哺乳類に由来する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞がＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＨＰＲＴ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ、ＣＢＡ／ＣａＯｌａ、１２９／ＳｖＪ、ＤＢＡ／２Ｎ、ＤＢＡ／１Ｏｌａ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａ、ＦＶＢ／Ｎおよびスイスウェブスターの遺伝子的バックグラウンドを有するマウスに由来する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１８の方法により得ることのできる生殖細胞系コンピテント胚性幹細胞であって、前記細胞が霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギおよびラットの群から選択される非ヒト哺乳類に由来する、細胞。
【請求項２３】
請求項３〜１６のいずれかの組成物中少なくとも１継代胚性幹細胞を培養するステップを含む、胚性幹細胞からトランスジェニックな非ヒト哺乳類を作成する方法。
【請求項２４】
単離された哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞の基質フリーの増殖のための、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
成体幹細胞が造血幹細胞であり、成体早期プロジェニター細胞が造血前駆細胞である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
単離された造血幹細胞または造血前駆細胞がヒトＣＤ３４＋細胞である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
造血幹細胞または造血前駆細胞が臍帯、胎盤血、末梢血および骨髄から選択される原料から単離される、請求項２５または２６のいずれかに記載の使用。
【請求項２８】
前記幹細胞が哺乳類成体幹細胞または早期プロジェニター細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
成体幹細胞が造血幹細胞であり、成体早期プロジェニター細胞が造血前駆細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも２５倍の増殖が得られるまで培養のステップを行う、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
有核細胞の量が少なくとも１０倍に増殖されるまで培養のステップを行う、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
増殖細胞の集団中においてＣＤ３４＋細胞の量が少なくとも３倍増殖されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
増殖細胞の集団が少なくとも１５日間培養されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ＬＴＣ  ＩＣアッセイにおいて陽性応答を示す増殖細胞の数が少なくとも１５倍増大する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
増殖細胞が致死未満の放射線照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病性／重度複合免疫不全）マウスを再集団化できる、請求項２８に記載の方法。
【国際調査報告】
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