(57)【要約】グループ・サインおよび薬剤サインを取り出し使用する方法が提供されており、本方法では、グループ・サインは複数の遺伝子からなり、それらの複数遺伝子の調整された発現は関連のある薬剤化合物のグループに特徴的且つ特異的であり；さらに本方法では、薬剤サインは複数の遺伝子からなり、それらの複数遺伝子の調整された発現は個々の薬剤化合物に特徴的且つ特異的である。本発明の方法は、以下の工程を包含する：ａ）  複数の発現データセットを提供すること；ｂ）差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；さらにｃ）前記複数被験化合物についてのグループ・サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、第２の複数の遺伝子を選択すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
関連のある活性を有する複数の化合物についてグループ・サインを作製する方法で、以下から構成される前記方法：
ａ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、ある化合物にある対象細胞を曝した結果生ずる第一の複数の遺伝子の発現応答からなる方法で、本方法では、前記複数発現データセットは、類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセット、および、被験化合物が有する生物学的活性を欠く複数のコントロール化合物の各々についての発現データセットからなる前記方法；
ｂ）  差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；さらに
ｃ）  前記複数被験化合物についてのグループ・サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、第２の複数の遺伝子を選択すること。
【請求項２】
ステップｂ）が、
ｉ）  複数の主成分を提供することを目的とした、主成分分析による発現データセットの等級化；
ｉｉ）  被験主成分を提供することを目的とした、複数の被験化合物を複数のコントロール化合物から最大限に区別する主成分の同定；さらに
ｉｉｉ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的とした、被験主成分をコントロール化合物から最大限に区別する遺伝子の同定からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記差別化遺伝子セットは、被験主成分内で最大の固有値を有する遺伝子を同定することにより選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記差別化メトリックは、Ｇｏｌｕｂの差別化メトリックを利用して同定された遺伝子セットの選択を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数遺伝子は、少なくとも１，０００個の遺伝子から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数遺伝子は、少なくとも４，０００個の遺伝子から成る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数遺伝子は、少なくとも１０，０００個の遺伝子から成る、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
コントロール化合物の数は、被験化合物の数より少ない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記差別化遺伝子セットは、発現増加遺伝子のみから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記差別化遺伝子セットは、被験主成分内で最大の固有値を有する発現増加遺伝子を同定することにより選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、
ｄ）  前記発現データセットをデータベースに保管すること、および
ｅ）．  ａ）からｄ）のステップを異なった被験化合物セットで繰り返すことから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、
ｄ）  複数のタンパク質を発現している対象細胞を各被験化合物に接触させること、およびｅ）  各化合物についてタンパク質応答データセットを提供することを目的として、前記接触の結果として生ずる各タンパク質の量を測定することから成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、
ｆ）  前記発現データセットおよび前記タンパク質応答データセットをデータベースに保管する；および
ｇ）．  ａ）からｆ）  のステップを異なった被験化合物セットで繰り返すことから成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記グループ・サインは、１個から５０個の遺伝子から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記グループ・サインは、１個から２５個の遺伝子から成る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記グループ・サインは、多くても３個の遺伝子から成る、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記グループ・サインは、少なくとも３個の遺伝子から成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記グループ・サインは、少なくとも５個の遺伝子から成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記グループ・サインは、少なくとも１０個の遺伝子から成る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記グループ・サインは、少なくとも１５個の遺伝子から成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
関連のある活性を有する複数の化合物についてグループ・サインを作製する方法で、以下から構成される前記方法：
ａ）  類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物、および、被験化合物が有する生物学的活性を欠く複数のコントロール化合物を提供すること；
ｂ）  各化合物を対象細胞と接触させること；
ｃ）  各化合物についての発現データセットを提供することを目的として、各対象細胞に対する第１の複数の遺伝子の発現応答を測定すること；
ｄ）  複数の主成分を提供することを目的として、主成分分析により発現データセットを等級化すること；
ｅ）  被験主成分を提供することを目的として、複数の被験化合物を複数のコントロール化合物と最大限に区別する主成分を同定する。
ｆ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的として、被験主成分をコントロール化合物と最大限に区別する遺伝子を決定する；さらに、
ｇ）  前記複数被験化合物についてグループ・サインを提供することを目標として、前記差別化遺伝子セットから第２の複数の遺伝子を選択すること。
【請求項２２】
前記化合物は、細胞と生体内で接触される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ある選択された薬剤化合物の活性を、関連のある活性を有する複数の化合物と区別することができる薬剤サインを作製する方法で、以下から成る前記方法；
ａ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、ある化合物にある対象細胞を曝した結果生ずる第一の複数の遺伝子の発現応答からなる方法で、前記複数発現データセットは、前記選択薬剤化合物についての発現データセット、および、類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセットからなる前記方法；
ｂ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現にもとづいて、選択薬剤化合物を複数の被験化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；さらに、
ｃ）  前記選択薬剤化合物についての薬剤サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、複数の遺伝子を選択すること。
【請求項２４】
ステップｂ）が、
ｉ）  複数の主成分を提供することを目的とした主成分分析による発現データセットの等級化；
ｉｉ）  被験主成分を提供することを目的とした、複数の被験化合物を複数のコントロール化合物から最大限に区別する主成分の同定；さらに
ｉｉｉ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的とした、被験主成分をコントロール化合物から最大限に区別する遺伝子の同定からなる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記差別化遺伝子セットは、被験主成分内で最大の固有値を有する遺伝子を同定することにより選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記差別化メトリックは、Ｇｏｌｕｂの差別化メトリックを利用して同定された遺伝子セットの選択を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬剤サインは、少なくとも３個の遺伝子から成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記薬剤サインは、少なくとも５個の遺伝子から成る、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記薬剤サインは、少なくとも１０個の遺伝子から成る、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤サインは、１個から５０個の遺伝子から成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤サインは、１個から２５個の遺伝子から成る、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤サインは、１個から３個の遺伝子から成る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬剤サインは、発現増加遺伝子のみから成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
ある選択された薬剤化合物の活性を関連した活性を有する複数の化合物から区別することができる薬剤サインを作製する方法で、以下から構成される前記方法：
ａ）  前記選択薬剤化合物、および、類似または同一の主要生物学的活性を有する複数の被験化合物を提供すること；
ｂ）  各化合物を対象細胞と接触させること；
ｃ）  各化合物についての発現データセットを提供することを目的として、各対象細胞に対する第１の複数の遺伝子の発現応答を測定すること；
ｄ）  複数の主成分を提供することを目的として、主成分分析により発現データセットを等級化すること；
ｅ）  差別化主成分を提供することを目的として、選択薬剤化合物を前記複数被験化合物から最大限に区別する主成分を同定する；
ｆ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的として、差別化主成分に最大限に寄与する遺伝子を同定する；さらに、
ｇ）  前記選択薬剤化合物について薬剤サインを提供することを目標として、前記差別化遺伝子セットから第２の複数の遺伝子を選択すること。
【請求項３５】
前記化合物は、細胞と生体内で接触される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
複数のグループ・サイン記録からなるグループ・サイン・データベースで、各グループ・サイン記録が、少なくとも１つの化合物の徴候および一組の遺伝子の徴候から成る前記グループ・サイン・データベースであって；
前記少なくとも１つの化合物の徴候では、グループ内の全化合物は、類似または同一の主要生物活性を示し；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、グループ記録に示された化合物の主要生物活性と類似または同一の主要生物活性を有するある化合物に曝された応答として調整され、前記組遺伝子は、前記グループ・サイン・データベース内の他の全グループから、前記グループを区別する。
【請求項３７】
前記複数のグループ・サイン記録が、少なくとも１０個のグループ・サイン記録からなる、請求項３６に記載のグループ・サイン・データベース。
【請求項３８】
前記複数のグループ・サイン記録が、少なくとも２５個のグループ・サイン記録からなる、請求項３７に記載のグループ・サイン・データベース。
【請求項３９】
各グループ・サイン記録についての前記組遺伝子は、少なくとも５個の遺伝子からなる、請求項３６に記載のグループ・サイン・データベース。
【請求項４０】
各グループ・サイン記録についての前記組遺伝子は、少なくとも１０個の遺伝子からなる、請求項３９に記載のグループ・サイン・データベース。
【請求項４１】
各グループ・サイン記録についての前記組遺伝子は、少なくとも１個から５０個の遺伝子からなる、請求項３６に記載のグループ・サイン・データベース。
【請求項４２】
各グループ・サイン記録についての前記組遺伝子は、少なくとも１個から２５個の遺伝子からなる、請求項４１に記載のグループ・サイン・データベース。
【請求項４３】
前記データベースがさらにストレス記録からなるグループ・サイン・データベースで；
各ストレス記録が、ストレスの徴候、および一組の遺伝子の徴候からなり；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、前記ストレスへの応答として調整され、さらに前記組遺伝子は、前記グループ・サイン・データベース内の他の全ストレスおよびグループから、前記ストレスを区別する、請求項３６に記載のグループ・サイン・データベース。
【請求項４４】
前記ストレスが、上昇温度、下降温度、加圧酸素、減圧酸素、加圧二酸化炭素、減圧二酸化炭素、飢餓、脱水、過密、断眠、痛み、感染、毒素への曝露、および断光からなる群から選択される、請求項４３に記載のグループ・サイン・データベース。
【請求項４５】
複数の薬剤サイン記録からなる薬剤サイン・データベースで、各グループ・サイン記録が、１つの化合物の徴候および一組の遺伝子の徴候から成る前記薬剤サイン・データベースであって；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、前記化合物に曝された応答として調整され、前記組遺伝子は、前記薬剤サイン・データベース内の他の全化合物から、前記化合物を区別する。
【請求項４６】
前記複数薬剤サイン記録は、少なくとも１０個の記録からなる、請求項４５に記載の薬剤サイン・データベース。
【請求項４７】
前記複数薬剤サイン記録は、少なくとも５０個の記録からなる、請求項４６に記載の薬剤サイン・データベース。
【請求項４８】
各薬剤サイン記録に対する前記組遺伝子は、少なくとも５個の遺伝子からなる、請求項４５に記載の薬剤サイン・データベース。
【請求項４９】
各薬剤サイン記録に対する前記組遺伝子は、少なくとも１０個の遺伝子からなる、請求項４８に記載の薬剤サイン・データベース。
【請求項５０】
各薬剤サイン記録に対する前記組遺伝子は、１個から５０個の遺伝子からなる、請求項４５に記載の薬剤サイン・データベース。
【請求項５１】
各薬剤サイン記録に対する前記組遺伝子は、１個から２５個の遺伝子からなる、請求項５０に記載の薬剤サイン・データベース。
【請求項５２】
薬剤候補の活性を測定する方法で、以下からなる前記方法；
ａ）  グループ・サイン・データベースを提供し、前記グループ・サイン・データベースは、複数のグループ・サイン記録、および一組の遺伝子の徴候からなり；
前記複数グループ・サイン記録では、各グループ・サイン記録は、少なくとも１つの化合物の徴候からなり、前記１つの化合物の徴候では、グループ内の全化合物は、類似または同一の主要生物活性を示し；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、グループ記録に示された化合物の主要生物活性と類似または同一の主要生物活性を有するある化合物に曝された応答として調整され、前記組遺伝子は、前記グループ・サイン・データベース内の他の全グループから、前記グループを区別し；
ｂ）  前記薬剤候補についての薬剤候補発現データセットを提供し、前記薬剤候補発現データセットは、対象細胞を前記薬剤候補に曝した応答として生ずる複数の遺伝子の発現応答からなり；
ｃ）  前記薬剤候補発現データセットを各グループ・サインと比較し；
ｄ）  前記薬剤候補発現データセットに最も類似したグループ・サインを選択し；さらに、
ｅ）  薬剤候補の活性を、最も類似しているグループ・サイン内の化合物が示す主要生物活性であると同定する。
【請求項５３】
薬剤候補発現データセットの各グループ・サインとの類似性は、Ｓ＝πｘＲｅｌＲｋｘという類似性スコアにより測定される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記薬剤候補発現データセットは、１個から２００個の遺伝子からなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記グループ・サイン・データベースは、さらに各化合物についてのバイオアッセイデータからなり、前記薬剤候補発現データセットは、さらに前記薬剤候補についてのバイオアッセイデータからなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
グループ・サイン試薬をデザインする方法で、
ａ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、対象細胞をある化合物に曝した結果生ずる第１の複数の遺伝子の発現応答からなり、ここでは、前記複数の発現データセットは、類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセット、および被験化合物が有する生物学的活性を欠く複数のコントロール化合物の各々についての発現データセットからなり；
ｂ）  差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；
ｃ）  前記複数被験化合物についてのグループ・サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、第２の複数の遺伝子を選択すること。さらに、
ｄ）  グループ・サイン・プローブ・セットを提供することを目的として、前記グループ・サイン中の前記第２複数遺伝子の１つまたはそれ以上の配列と特異的にハイブリダイズできる一組のポリヌクレオチド・プローブを提供すること
からなる、前記グループ・サイン試薬デザイン方法。
【請求項５７】
ステップｂ）が、
ｉ）  複数の主成分を提供することを目的とした、主成分分析による発現データセットの等級化；
ｉｉ）  被験主成分を提供することを目的とした、複数の被験化合物を複数のコントロール化合物から最大限に区別する主成分の同定；さらに
ｉｉｉ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的とした、被験主成分をコントロール化合物から最大限に区別する遺伝子の同定からなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記差別化遺伝子セットは、被験主成分内で最大の固有値を有する遺伝子を同定することにより選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記差別化メトリックは、Ｇｏｌｕｂの差別化メトリックを利用して同定された遺伝子セットの選択を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
さらに、関連性のない化合物についての異なった複数のグループ・サインを作製することを目的として、
ｅ）．  ａ）からｄ）のステップを異なった被験化合物セットで繰り返すことから成る、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
さらに
ｆ）  グループ・サイン・アレイを形成することを目的として、ある定義された位置の固相サポートに、前記グループ・サインを附帯することからなる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記グループ・サイン・アレイは、少なくとも１００個のグループ・サイン・プローブ・セットからなる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記グループ・サイン・アレイは、少なくとも５００個のグループ・サイン・プローブ・セットからなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記グループ・サイン・アレイは、少なくとも１，０００個のグループ・サイン・プローブ・セットからなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
請求項６１に従って作製されたグループ・サイン・アレイ。
【請求項６６】
適切な容器手段、請求項６５に記載のグループ・サイン・アレイ、およびキットを使用する指示書からなる、キット。
【請求項６７】
薬剤サイン試薬をデザインする方法で、
ａ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、対象細胞をある化合物に曝した結果生ずる複数の遺伝子の発現応答からなり、ここでは、前記複数の発現データセットは、前記選択薬剤化合物についての発現データセット、および類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセットからなり；
ｂ）  差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；
ｃ）  前記選択薬剤化合物についての薬剤サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、複数の遺伝子を選択すること。さらに、
ｄ）  薬剤サイン・プローブ・セットを形成することを目的として、前記薬剤サイン中の前記遺伝子の配列と特異的にハイブリダイズできる一組のポリヌクレオチド・プローブを提供すること
からなる、前記薬剤サイン試薬デザイン方法。
【請求項６８】
ステップｂ）が、
ｉ）  複数の主成分を提供することを目的とした、主成分分析による発現データセットの等級化；
ｉｉ）  被験主成分を提供することを目的とした、複数の被験化合物を複数のコントロール化合物から最大限に区別する主成分の同定；さらに
ｉｉｉ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的とした、被験主成分をコントロール化合物から最大限に区別する遺伝子の同定からなる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記差別化遺伝子セットは、被験主成分内で最大の固有値を有する遺伝子を同定することにより選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記差別化メトリックは、Ｇｏｌｕｂの差別化メトリックを利用して同定された遺伝子セットの選択を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
さらに、関連性のない化合物についての異なった複数の薬剤サインを作製することを目的として、
ｅ）．  ａ）からｄ）のステップを繰り返すことから成る、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
さらに
ｅ）  薬剤サイン・アレイを形成することを目的として、ある定義された位置の固相サポートに、前記薬剤サインを附帯することからなる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
前記薬剤サイン・アレイは、少なくとも１００個の薬剤サイン・プローブ・セットからなる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記薬剤サイン・アレイは、少なくとも５００個の薬剤サイン・プローブ・セットからなる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記薬剤サイン・アレイは、少なくとも１，０００個の薬剤サイン・プローブ・セットからなる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記薬剤サイン・アレイは、少なくとも１０，０００個の薬剤サイン・プローブ・セットからなる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
請求項７２に従って作製された薬剤サイン・アレイ。
【請求項７８】
適切な容器手段、請求項７７に記載の薬剤サイン・アレイ、およびキットを使用する指示書からなる、キット。
【請求項７９】
薬剤候補の活性を決定する方法で、以下からなる前記方法：
ａ）  グループ・サイン・アレイを提供し、前記グループ・サイン・アレイは、複数のグループ・サイン・プローブ・セットが添付されている固相サポートからなり、ここでは、各グループ・サイン・プローブ・セットは、各グループ・サインの遺伝子の配列に特異的にハイブリダイズできる一組のポリヌクレオチド・プローブからなり、ここでは、前記グループ・サインは、以下の手順によって得られることからなる：
ｉ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、対象細胞をある化合物に曝した結果生ずる複数の遺伝子の発現応答からなり、ここでは、前記複数発現データセットは、類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセット、および、被験化合物が有する生物学的活性を欠く複数のコントロール化合物各々についての発現データセットからなり；
ｉｉ）  差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；
ｉｉｉ）  前記複数被験化合物についてのグループ・サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、複数の遺伝子を選択すること；さらに
ｉｖ）  各グループ・サインについて、ｉ）からｉｉｉ）のステップを繰り返すこと；
ｂ）  対象細胞と前記薬剤候補を接触させること；
ｃ）  前記対象細胞から、ｍＲＮＡを抽出すること；
ｄ）  前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること；
ｅ）  前記ｃＤＮＡをグループ・サイン・アレイに接触させること；さらに、
ｆ）  どのグループ・サイン・プローブ・セットで、ｃＤＮＡとの結合が増加しているか否か調べること。
【請求項８０】
化合物ライブラリーをスクリーニングする方法で；
この方法では、ライブラリーは複数の薬剤候補からなり、複数の薬剤候補は以下からなる前記スクリーニング方法：
ａ）  請求項７９に記載されている方法に従って各薬剤候補の活性を判断すること；および
ｂ）  薬剤候補を選択し、前記薬剤候補では、グループ・サイン・プローブ・セットは、対象細胞が前記薬剤候補に接触させた結果ｃＤＮＡとの結合の増加が認められること。
【請求項８１】
フィブラート様活性を検出するポリヌクレオチド・プローブ・セットで、前記セットは、以下に列挙する遺伝子群から選ばれた遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドからなる：Ｒａｔ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５２，Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ＬＡ−ｏｍｅｇａ  （ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｍｅｇａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），Ｒａｔ  Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｋ２，Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ＬＡ−ｏｍｅｇａ（ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｍｅｇａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），Ｒａｔ  Ｃｙｐ４ａ  ｌｏｃｕｓ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  （ＩＶＡ３），Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ３−２−ｔｒａｎｓ−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，Ｒａｔ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｏｃｔａｎｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ  Ｗｉｓｔａｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＰＸＥＬ），Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ  β−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＦＡＢＰ），  Ｒａｔ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ４  （ＰＤＫ４），  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５，  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｖ３２２４，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ：  ｈｙｄｒｏｔａｓｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｍｐ２６ｐ  （Ｐｅｒｏｘｉｎ−１１），  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ２，４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ：  ｈｙｄｒｏｔａｓｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ，  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｂ  （Ｐｔｅ１ｂ）。
【請求項８２】
前記複数ポリヌクレオチドは、少なくとも３個の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる、請求項８１に記載のポリヌクレオチド・プローブ・セット。
【請求項８３】
前記複数ポリヌクレオチドは、少なくとも５個の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる、請求項８２に記載のポリヌクレオチド・プローブ・セット。
【請求項８４】
前記複数ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる、請求項８３に記載のポリヌクレオチド・プローブ・セット。
【請求項８５】
適切な容器手段、請求項８１に記載のポリヌクレオチド・プローブ・セット、およびキットを使用する指示書からなる、キット。
【請求項８６】
ゲムフィブロジル様活性を検出するポリヌクレオチド・プローブ・セットで、前記セットは、以下に列挙する遺伝子群から選ばれた遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドからなる：Ｒａｔ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｒａｔ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ７α−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，  Ｍｏｕｓｅ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，  Ｍｏｕｓｅ  Ｖａｎｉｎ−１，  Ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＫＳ），  Ｒａｔ  ２，３−ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ：ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｃｙｃｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，  ａｎｄ  Ｒａｔ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β−１０。
【請求項８７】
前記複数ポリヌクレオチドは、少なくとも３個の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる、請求項８６に記載のポリヌクレオチド・プローブ・セット。
【請求項８８】
前記複数ポリヌクレオチドは、少なくとも５個の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる、請求項８７に記載のポリヌクレオチド・プローブ・セット。
【請求項８９】
前記複数ポリヌクレオチドは、少なくとも１０個の遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる、請求項８８に記載のポリヌクレオチド・プローブ・セット。
【請求項９０】
適切な容器手段、請求項８６に記載のポリヌクレオチド・プローブ・セット、およびキットを使用する指示書からなる、キット。
【請求項９１】
フィブラート活性を有する薬剤候補のスクリーニング方法で、以下の手順からなる前記方法：
ａ）  対象細胞を薬剤候補と接触させること；
ｂ）  前記対象細胞から、ｍＲＮＡを抽出すること；
ｃ）  前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること；
ｄ）  前記ｃＤＮＡをフィブラート・サイン・プローブ・セットにハイブリダイズさせ、前記プローブ・セットは、フィブラート・サイン遺伝子に特異的にハイブリダイズできる複数のポリヌクレオチドからなり、ここでは、前記フィブラート・サイン遺伝子は、以下に列挙する遺伝子群から選ばれる：Ｒａｔ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５２，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ＬＡ−ｏｍｅｇａ  （ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｍｅｇａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），  Ｒａｔ  Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｋ２，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ＬＡ−ｏｍｅｇａ  （ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｍｅｇａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），  Ｒａｔ  Ｃｙｐ４ａ  ｌｏｃｕｓ，  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  （ＩＶＡ３），  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ３−２−ｔｒａｎｓ−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｏｃｔａｎｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ  Ｗｉｓｔａｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＰＸＥＬ），  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ  β−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＦＡＢＰ），  Ｒａｔ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ４  （ＰＤＫ４），  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５，  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｖ３２２４，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ：  ｈｙｄｒｏｔａｓｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｍｐ２６ｐ  （Ｐｅｒｏｘｉｎ−１１），  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ２，４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ：  ｈｙｄｒｏｔａｓｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ，  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｂ  （Ｐｔｅ１ｂ）；および、
ｅ）  前記対象細胞がフィブラート・サイン遺伝子の増加発現を呈しているかどうかを、判断すること。
【請求項９２】
データベース製品で；
コンピュータ読み出し可能媒体、および一組の遺伝子の徴候からなり；
前記媒体はそれ自体に、グループ・サイン・データベースを保存し、前記データベースは、複数のグループ・サイン記録からなり、ここでは、各グループ・サイン記録は、少なくとも１つの化合物の徴候からなり、ここでは、グループ内の全化合物は、類似または同一の主要生物活性を示し；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、グループ記録に示された化合物の主要生物活性と類似または同一の主要生物活性を有するある化合物に曝された結果調整され、前記組遺伝子は、前記グループ・サイン・データベース内の他の全グループから、前記グループを区別することからなる、前記データベース製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、仮出願（Ｕ．Ｓ．  Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）  Ｎｏ．  ６０／３６０，７２８（２００２．  ２．  ２８出願）に続くもので、それに関わる権利を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ゲノム科学、化学、およびドラッグ・ディスカバリーの分野に関する発明である。特に、本発明は、化合物を生体内における活性および遺伝子の効果にもとづいて体系化・分類する方法とシステム、さらに、生体内におけるある化合物の活性および副作用を予測する方法とシステムに関する発明である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
現在、いくつかの生物体については、遺伝子配列に関する情報を入手することができ、新たなデータが日々追加されている。しかしながら、現在までに配列が決定されているオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ，  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）のうち、機能が解明されている遺伝子と対応できている配列は、ごく一部に限られている。ほとんどのポリヌクレオチド配列の機能、すなわち、それらがコードするタンパク質の機能は解明されていない。現在、これらの遺伝子について、特に、ポリヌクレオチド・アレイという研究手段によって、特定の条件下で被験細胞（または、生物体）が産生するｍＲＮＡの定量が進んでいる。「化学ゲノム・アノテーション」とは、１つあるいはそれ以上の遺伝子がある化学物質に曝された場合、転写およびバイオアッセイの面でいかなる応答を示すかを調べ、遺伝子に作用する化合物の種類によって遺伝子の特定、意味づけをすることである。化学ゲノム・アノテーションの包括的なライブラリーがあれば、新薬開発において、ある特徴を有する化合物を想定し、その化合物のおおよその転写および生物分子プロフィールにもとづいて、リード化合物をデザインし、最適化することが可能であろう。さらに、化学ゲノム・アノテーションは、複数の遺伝子間の相互関係（たとえば、あるシグナル経路に属する複数の遺伝子間の関係やタンパク質−タンパク質間の相互作用など）の解明や、副作用の原因の究明などに応用することもできる。そして、ドラッグ・デザインに携わる研究者は、化学ゲノム・アノテーションの情報をもとに仮説を立て、それにもとづき実験計画を立てることができるであろう。
【０００４】
遺伝子データベースのモデルがいくつか開示されている。Ｓａｂａｔｉｎｉら（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，９６６，７１２）は、遺伝子データを保存、比較、分析するためのデータベースとシステムを、Ｍａｓｌｙｎら（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，９５３，７２７）は、遺伝子データを保存するリレーショナル・データベースを、Ｋｏｈｌｅｒら（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，５２３，２０８）は、ポリヌクレオチド配列とポリヌクレオチドがコードするタンパク質に予想される機能を比較するデータベースと方法を、Ｆｕｊｉｙａｍａら（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，７０６，４９８）は、類似の配列の遺伝子を探すデータベースと検索システムを、それぞれ開示している。
【０００５】
Ｓａｂｒｙら（ＷＯ００／７０５２８）は、ドラッグ・ディスカバリーにおいて細胞インフォマティクスのデータベースを使い化合物を分析する方法を開示している。そのシステム上で、細胞を操作したり、細胞を被験化合物に曝したりした状態を想定し、得られた結果をデータベース化する。Ｓａｂｒｙは、また、細胞・化合物間の相互作用のデスクリプターからなる「細胞の指紋」のデータベースの構築について述べている。このデータベースでは、、デスクリプターは、作用がわかっている化合物との相互作用を特徴付ける同定データ／表現形の変化の集まりであり、そのデスクリプターをもとに系統樹を作り、各デスクリプターについて統計的重要度を決定するというものである。新しい化合物のデスクリプターを系統樹と比較し、最もあり得る作用機序を予想することができる。
【０００６】
Ｗｉｎｓｌｏｗら（ＷＯ００／６５５２３）は、生物学的情報のデータベースからなり、それを使って、少なくとも１つの属性、ユーザー・インターフェイス、少なくとも１つの数式を少なくとも１つの階層的な記述から生み出す式作成エンジンと、細胞内部および細胞の動的挙動をモデル化する数式を生み出す計算エンジンを有するデータ構造を作るシステムを開示している。このシステムでは、私有および公共のデータベース内の遺伝子情報にアクセスし作表し、それらのデータを遺伝子産物の生物化学的・生物物理的役割に関する機能の情報と組み合わせ、この情報をもとに細胞内における遺伝的・生物化学的・生物物理的反応を予測・解明・分析することを意図している。
【０００７】
Ｇｏｕｌｄ−Ｒｏｔｈｂｅｒｇ（ＷＯ００／６３４３５）は，  肝毒性のある薬剤を同定する方法を開示している。トログリタゾン（医薬品第ＩＩＩ相試験で一部の患者に肝障害を起こすことが見つかった糖尿病治療薬）に反応を示す１つあるいはそれ以上の核酸配列を発現することができる細胞からなる被験細胞集団を、被験薬剤に曝し、核酸配列の発現を参照細胞集団と比較する。参照細胞集団の遺伝子の発現と比較し、被験細胞集団の核酸配列の発現が変化した場合、被験薬剤に肝毒性があることが示唆される。Ｇｏｕｌｄ−Ｒｏｔｈｂｅｒｇら（ＷＯ００／３７６８５）は、運動神経系に影響を及ぼさない精神活性薬を同定する方法を開示している。その方法では、ラットの脳線条体においてハロペリドールに対する反応の結果、転写が活性化される遺伝子を同定した。このような遺伝子を誘導しない化合物には、副作用がないとされている。
【０００８】
Ｔｈｏｒｐ（ＷＯ９９／０６８３９）は、コンビナトリアル・ケミカル・ライブラリをスクリーニングに使うタンパク質のデータベースを開示している。データベースは、標的タンパク質、参照タンパク質、化合物およびアッセイを関係づけている。タンパク質デスクリプターとしては、分子量、活性、疎水性などのほか、アプタマーとの結合パターンも含まれている。標的タンパク質が参照タンパク質に類似しているほど、検討中のコンビナトリアル・ライブラリは、最も類似する参照タンパク質に結合する化合物に加重値が与えられる。
【０００９】
Ｆｒｉｅｎｄら（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，２０３，９８７）は、遺伝子を相互制御遺伝子セット（ｇｅｎｅｓｅｔ）に分類して、アレイ・プロフィールを比較する方法を開示している。Ｆｒｉｅｎｄらは、ある薬剤に対する発現プルフィールを遺伝子セットに投影し、他の遺伝子セットと比較して、生物学的経路が薬剤の影響を受けるか否かを決定する実施例を開示した。また、別の実施例では、薬剤候補の投影プロファイルを既存の薬剤のプロフィールと比較し、開発中の薬剤が既存の薬剤にとって代わる可能性を調べた。
【００１０】
Ｔａｍａｙｏら（ＥＰ  １０３７１５８）は、自己組織化マップを用い、遺伝子の発現データを類似したセットにクラスタし、遺伝子・データを体系化する方法を開示している。この方法で、被験細胞をある化合物に曝した後、どのように遺伝子の発現が変化するかを知ることにより、薬剤の作用点を解明することができる。
【００１１】
Ｔｒｙｏｎら（ＷＯ０１／２５４７３）は、薬剤に対する発現プロフィールを構築する方法を開示している。この方法では、特定の薬剤や条件に反応すると思われる遺伝子を選び、薬剤の投与に対し、細胞培養における発現を調べる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、関連のある活性を有する複数の化合物についてグループ・サインを作製する方法で、以下から構成される前記方法に関する。
ａ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、ある化合物にある対象細胞を曝した結果生ずる第一の複数の遺伝子の発現応答からなる方法で、本方法では、前記複数発現データセットは、類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセット、および、被験化合物が有する生物学的活性を欠く複数のコントロール化合物の各々についての発現データセットからなる前記方法；
ｂ）  差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；さらに
ｃ）  前記複数被験化合物についてのグループ・サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、第２の複数の遺伝子を選択すること。
【００１３】
本発明は、また、関連のある活性を有する複数の化合物についてグループ・サインを作製する方法で、以下から構成される前記方法に関する。
ａ）  類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物、および、被験化合物が有する生物学的活性を欠く複数のコントロール化合物を提供すること；
ｂ）  各化合物を対象細胞と接触させること；
ｃ）  各化合物についての発現データセットを提供することを目的として、各対象細胞に対する第１の複数の遺伝子の発現応答を測定すること；
ｄ）  複数の主成分を提供することを目的として、主成分分析により発現データセットを等級化すること；
ｅ）  被験主成分を提供することを目的として、複数の被験化合物を複数のコントロール化合物と最大限に区別する主成分を同定する。
ｆ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的として、被験主成分をコントロール化合物と最大限に区別する遺伝子を決定する；さらに、
ｇ）  前記複数被験化合物についてグループ・サインを提供することを目標として、前記差別化遺伝子セットから第２の複数の遺伝子を選択すること。
【００１４】
本発明は、また、ある選択された薬剤化合物の活性を、関連のある活性を有する複数の化合物と区別することができる薬剤サインを作製する方法で、以下から成る前記方法に関する。
ａ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、ある化合物にある対象細胞を曝した結果生ずる第一の複数の遺伝子の発現応答からなる方法で、前記複数発現データセットは、前記選択薬剤化合物についての発現データセット、および、類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセットからなる前記方法；
ｂ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現にもとづいて、選択薬剤化合物を複数の被験化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；さらに、
ｃ）  前記選択薬剤化合物についての薬剤サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、複数の遺伝子を選択すること。
【００１５】
本発明は、ある選択された薬剤化合物の活性を関連した活性を有する複数の化合物から区別することができる薬剤サインを作製する方法で、以下から構成される前記方法に関する。
ａ）  前記選択薬剤化合物、および、類似または同一の主要生物学的活性を有する複数の被験化合物を提供すること；
ｂ）  各化合物を対象細胞と接触させること；
ｃ）  各化合物についての発現データセットを提供することを目的として、各対象細胞に対する第１の複数の遺伝子の発現応答を測定すること；
ｄ）  複数の主成分を提供することを目的として、主成分分析により発現データセットを等級化すること；
ｅ）  差別化主成分を提供することを目的として、選択薬剤化合物を前記複数被験化合物から最大限に区別する主成分を同定する；
ｆ）  差別化遺伝子セットを提供することを目的として、差別化主成分に最大限に寄与する遺伝子を同定する；さらに、
ｇ）  前記選択薬剤化合物について薬剤サインを提供することを目標として、前記差別化遺伝子セットから第２の複数の遺伝子を選択すること。
【００１６】
本発明は、また、複数のグループ・サイン記録からなるグループ・サイン・データベースで、各グループ・サイン記録が、少なくとも１つの化合物の徴候および一組の遺伝子の徴候から成る前記グループ・サイン・データベースであって；
前記少なくとも１つの化合物の徴候では、グループ内の全化合物は、類似または同一の主要生物活性を示し；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、グループ記録に示された化合物の主要生物活性と類似または同一の主要生物活性を有するある化合物に曝された応答として調整され、前記組遺伝子は、前記グループ・サイン・データベース内の他の全グループから、前記グループを区別する。
【００１７】
本発明は、また、複数の薬剤サイン記録からなる薬剤サイン・データベースで、各グループ・サイン記録が、１つの化合物の徴候および一組の遺伝子の徴候から成る前記薬剤サイン・データベースであって；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、前記化合物に曝された応答として調整され、前記組遺伝子は、前記薬剤サイン・データベース内の他の全化合物から、前記化合物を区別する。
【００１８】
本発明は、また、薬剤候補の活性を測定する方法で、以下からなる前記方法に関する。
ａ）  グループ・サイン・データベースを提供し、前記グループ・サイン・データベースは、複数のグループ・サイン記録、および一組の遺伝子の徴候からなり；
前記複数グループ・サイン記録では、各グループ・サイン記録は、少なくとも１つの化合物の徴候からなり、前記１つの化合物の徴候では、グループ内の全化合物は、類似または同一の主要生物活性を示し；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、グループ記録に示された化合物の主要生物活性と類似または同一の主要生物活性を有するある化合物に曝された応答として調整され、前記組遺伝子は、前記グループ・サイン・データベース内の他の全グループから、前記グループを区別し；
ｂ）  前記薬剤候補についての薬剤候補発現データセットを提供し、前記薬剤候補発現データセットは、対象細胞を前記薬剤候補に曝した応答として生ずる複数の遺伝子の発現応答からなり；
ｃ）  前記薬剤候補発現データセットを各グループ・サインと比較し；
ｄ）  前記薬剤候補発現データセットに最も類似したグループ・サインを選択し；さらに、
ｅ）  薬剤候補の活性を、最も類似しているグループ・サイン内の化合物が示す主要生物活性であると同定する。
【００１９】
本発明は、また、グループ・サイン試薬をデザインする方法で、
ａ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、対象細胞をある化合物に曝した結果生ずる第１の複数の遺伝子の発現応答からなり、ここでは、前記複数の発現データセットは、類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセット、および被験化合物が有する生物学的活性を欠く複数のコントロール化合物の各々についての発現データセットからなり；
ｂ）  差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；
ｃ）  前記複数被験化合物についてのグループ・サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、第２の複数の遺伝子を選択すること。さらに、
ｄ）  グループ・サイン・プローブ・セットを提供することを目的として、前記グループ・サイン中の前記第２複数遺伝子の１つまたはそれ以上の配列と特異的にハイブリダイズできる一組のポリヌクレオチド・プローブを提供すること
からなる、前記グループ・サイン試薬デザイン方法。
さらに、前記方法でデザインされたプローブ・セット、および、そのようなプローブ・セットを含むキットも含む。
【００２０】
本発明は、また、薬剤サイン試薬をデザインする方法で、
ａ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、対象細胞をある化合物に曝した結果生ずる複数の遺伝子の発現応答からなり、ここでは、前記複数の発現データセットは、前記選択薬剤化合物についての発現データセット、および類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセットからなり；
ｂ）  差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；
ｃ）  前記選択薬剤化合物についての薬剤サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、複数の遺伝子を選択すること。さらに、
ｄ）  薬剤サイン・プローブ・セットを形成することを目的として、前記薬剤サイン中の前記遺伝子の配列と特異的にハイブリダイズできる一組のポリヌクレオチド・プローブを提供すること
からなる、前記薬剤サイン試薬デザイン方法。
さらに、上記の方法でデザインされたプローブ・セット、および、そのようなプローブ・セットを含むキットも含む。
【００２１】
本発明は、また、薬剤候補の活性を決定する方法で、以下からなる前記方法：
ａ）  グループ・サイン・アレイを提供し、前記グループ・サイン・アレイは、複数のグループ・サイン・プローブ・セットが添付されている固相サポートからなり、ここでは、各グループ・サイン・プローブ・セットは、各グループ・サインの遺伝子の配列に特異的にハイブリダイズできる一組のポリヌクレオチド・プローブからなり、ここでは、前記グループ・サインは、以下の手順によって得られることからなる：
ｉ）  複数の発現データセットを提供し、各発現データセットは、対象細胞をある化合物に曝した結果生ずる複数の遺伝子の発現応答からなり、ここでは、前記複数発現データセットは、類似または同一の生物学的活性を有する複数の被験化合物の各々についての発現データセット、および、被験化合物が有する生物学的活性を欠く複数のコントロール化合物各々についての発現データセットからなり；
ｉｉ）  差別化された遺伝子セットを提供することを目的として、遺伝子発現に基づいて、複数の被験化合物をコントロール化合物と区別する差別化メトリックを作製すること；
ｉｉｉ）  前記複数被験化合物についてのグループ・サインを提供することを目的として、前記差別化遺伝子セットから、複数の遺伝子を選択すること；さらに
ｉｖ）  各グループ・サインについて、ｉ）  からｉｉｉ）  のステップを繰り返すこと；
ｂ）  対象細胞と前記薬剤候補を接触させること；
ｃ）  前記対象細胞から、ｍＲＮＡを抽出すること；
ｄ）  前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること；
ｅ）  前記ｃＤＮＡをグループ・サイン・アレイに接触させること；さらに、
ｆ）  どのグループ・サイン・プローブ・セットで、ｃＤＮＡとの結合が増加しているか否か調べること。
【００２２】
さらに、前記方法を化合物のライブラリーに適用し、薬剤候補を選ぶこと。その場合、グループ・サイン・プローブ・セットには、対象細胞と当該薬剤候補を接触させた結果ｃＤＮＡとの結合の増加が認められる。
【００２３】
本発明は、また、フィブラート様活性を検出するポリヌクレオチド・プローブ・セットで、前記セットは、以下に列挙する遺伝子群から選ばれた遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドからなる：Ｒａｔ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５２，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ＬＡ−ｏｍｅｇａ  （ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｍｅｇａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），  Ｒａｔ  Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｋ２，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ＬＡ−ｏｍｅｇａ  （ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｍｅｇａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），  Ｒａｔ  Ｃｙｐ４ａ  ｌｏｃｕｓ，  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  （ＩＶＡ３），  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ３−２−ｔｒａｎｓ−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｏｃｔａｎｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ  Ｗｉｓｔａｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＰＸＥＬ），  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ  β−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＦＡＢＰ），  Ｒａｔ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ４  （ＰＤＫ４），  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５，  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｖ３２２４，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ：  ｈｙｄｒｏｔａｓｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｍｐ２６ｐ  （Ｐｅｒｏｘｉｎ−１１），  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ２，４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ：  ｈｙｄｒｏｔａｓｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ，  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｂ  （Ｐｔｅ１ｂ）。
【００２４】
本発明は、また、ゲムフィブロジル様活性を検出するポリヌクレオチド・プローブ・セットで、前記セットは、以下に列挙する遺伝子群から選ばれた遺伝子に特異的にハイブリダイズすることができる複数のポリヌクレオチドからなる：Ｒａｔ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｒａｔ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ７α−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，  Ｍｏｕｓｅ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，  Ｍｏｕｓｅ  Ｖａｎｉｎ−１，  Ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＫＳ），  Ｒａｔ  ２，３−ｏｘｉｄｏｓｑｕａｌｅｎｅ：ｌａｎｏｓｔｅｒｏｌ  ｃｙｃｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，  ａｎｄ  Ｒａｔ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β−１０。
【００２５】
本発明は、また、フィブラート活性を有する薬剤候補のスクリーニング方法で、以下の手順からなる前記方法：
ａ）  対象細胞を薬剤候補と接触させること；
ｂ）  前記対象細胞から、ｍＲＮＡを抽出すること；
ｃ）  前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること；
ｄ）  前記ｃＤＮＡをフィブラート・サイン・プローブ・セットにハイブリダイズさせ、前記プローブ・セットは、フィブラート・サイン遺伝子に特異的にハイブリダイズできる複数のポリヌクレオチドからなり、ここでは、前記フィブラート・サイン遺伝子は、以下に列挙する遺伝子群から選ばれる：Ｒａｔ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５２，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ＬＡ−ｏｍｅｇａ  （ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｍｅｇａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），  Ｒａｔ  Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ｋ２，  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ＬＡ−ｏｍｅｇａ  （ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｍｅｇａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ），  Ｒａｔ  Ｃｙｐ４ａ  ｌｏｃｕｓ，  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  （ＩＶＡ３），  Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０，  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ３−２−ｔｒａｎｓ−ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ  ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  ｏｃｔａｎｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，  Ｒａｔ  Ｗｉｓｔａｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ  ｈｙｄｒａｔａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＰＸＥＬ），  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ３−ｋｅｔｏａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｌａｓｅ  β−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＦＡＢＰ），  Ｒａｔ  ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ４  （ＰＤＫ４），  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｂ５，  Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｖ３２２４，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ：  ｈｙｄｒｏｔａｓｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｍｐ２６ｐ  （Ｐｅｒｏｘｉｎ−１１），  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ，  Ｒａｔ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，  Ｒａｔ  ２，４−ｄｉｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，  Ｒａｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ−ＣｏＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ，  Ｒａｔ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｅｎｏｙｌ−ＣｏＡ：  ｈｙｄｒｏｔａｓｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｚｙｍｅ，  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｅ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｉｂ  （Ｐｔｅ１ｂ）；および、
ｅ）  前記対象細胞がフィブラート・サイン遺伝子の増加発現を呈しているかどうかを、判断すること。
【００２６】
本発明は、また、データベース製品で；
コンピュータ読み出し可能媒体、および一組の遺伝子の徴候からなり；
前記媒体はそれ自体に、グループ・サイン・データベースを保存し、前記データベースは、複数のグループ・サイン記録からなり、ここでは、各グループ・サイン記録は、少なくとも１つの化合物の徴候からなり、ここでは、グループ内の全化合物は、類似または同一の主要生物活性を示し；
前記組遺伝子の徴候では、前記遺伝子の発現は、グループ記録に示された化合物の主要生物活性と類似または同一の主要生物活性を有するある化合物に曝された結果調整され、前記組遺伝子は、前記グループ・サイン・データベース内の他の全グループから、前記グループを区別することからなる、前記データベース製品。
【００２７】
詳細な説明
定義
「被験化合物」とは、通常、被験細胞を曝す化合物で、データ収集の対象である化合物を意味する。特に、被験化合物は、低分子量の有機分子で、特に、薬剤、および／または、有望な薬学的リード化合物であるが、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド、（表現型において）異型な遺伝子、プラスミド、ポリヌクレオチド類似体、ペプチド類似体、脂質、炭水化物、ウイルス、ファージ、寄生体などであってもよい。
【００２８】
「コントロール化合物」とは、被験化合物と生物活性を共有しない化合物で、本発明におけるグループ・サインおよび薬剤サインの作製にあたって、活性（被験）化合物と不活性（コントロール）化合物を比較する際に使用する化合物を意味する。特に、一般的なコントロール化合物には、これに限定されるわけではないが、被験化合物とは適用が異なるが治療薬、ビーイクル、既知の毒素、既知の不活性化合物などがある。
【００２９】
「生物学的活性」とは、ここでは、被験化合物が生物系に作用を及ぼす能力を意味する、たとえば、酵素の効果を調整する、レセプターを阻害する、レセプターを刺激する、１つまたはそれ以上の遺伝子の発現を変化させるなどである。生体内で生物体に、または、生体外で細胞やタンパク質に、被験化合物が類似の、または、同一の効果を及ぼす場合、被験化合物は、類似の、または、同一の生物学的活性を有している。たとえば、フェノフィブラート、クロフィブラート、およびゲムフィブロジルは、いずれも高リポタンパク血症に処方されるという点で、類似の生物学的活性を有している。また、アスピリン、イブプロフェン、および、ナプロキセンは、いずれも非ステロイド性抗炎症剤として知られており、同様の生物学的活性を有している別の例である。「主要生物活性」および「主要生物学的活性」とは、化合物の最も顕著な効果、あるいは、化合物に最も期待される効果を意味する。たとえば、ＡＣＥ阻害剤の主要生物活性は、二次的生物活性や副作用にかかわらず、アンギオテンシン変換酵素の阻害（とそれに伴う血圧低下）である。
【００３０】
「対象細胞」とは、生物学的細胞、あるいは、被験化合物に反応することができる生物系のモデルを意味し、特に、生きている動物、真核細胞、組織標本、または、原核生物である。
【００３１】
「発現応答」とは、被験化合物やコントロール化合物の投与（または、他の被験条件やコントロール条件）に対する遺伝子の発現レベルの変化（の有無）を意味する。発現レベルは、たとえば、プロテオミックな技法で遺伝子がコードするタンパク質を定量し、直接測ることができる。ウエスタン・ブロット法やエライザ（ＥＬＳＡ）法を含むがこれらに限定されない様々な方法でタンパク質を定量することができる。また、発現レベルは、ｍＲＮＡ転写の変化を測定するなど、遺伝子の活性を定量できる手段によって測ることもできる。発現応答は、データを正規化するために加重値を与えるかあるいはスケーリングを行うことができ、発現（または、転写）の増減を絶対値、相対的な変化（たとえば、パーセント変化）、閾値を越える変化の程度などで表現することもできる。
【００３２】
「発現データセット」とは、ここでは、被験化合物またはコントロール化合物の投与の影響を受ける特定の遺伝子、および、それに伴う発現の変化を示すデータを意味する。特に、発現データセットは、サブセットの複数の遺伝子、好ましくは、最も顕著な発現応答の変化を示すサブセットの複数の遺伝子から成っている。
【００３３】
「差別化メトリック」とは、被験化合物に対する発現データとコントロール化合物に対する発現データを区別する方法、または、アルゴリズムを意味する。この方法では、ＰＣＡのアウトプットから遺伝子の固有値にもとづいて遺伝子を選択する（被験化合物とコントロール化合物を区別する主要成分軸を選択する）ことができる。また、たとえば、Ｇｏｌｕｂの差別化メトリック、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定などを用い、被験化合物とコントロール化合物を最も的確に区別する１つの遺伝子、または、複数の遺伝子の組み合わせを決定する数学的分析であってもよい。
【００３４】
「ＰＣＡ」および「主成分分析」とは、いくつかの相関性のある変数を、主成分と呼ばれるいくつかの相関性のない（独立した）変数に変換する数学的方法を意味する。第１成分は、データ内の最大可能分散を占め、それに続く各成分は残りの最大可能分散を占める。「ＰＣＡ」には、ここでは、また、カーネルＰＣＡなどの主成分分析の変法も含む。
【００３５】
「グループ・サイン」とは、ここでは、１つのグループ識別子、および、１つ、または、それ以上の遺伝子識別子からなるデータ構造を意味する。グループ識別子は、類似の活性をもつ化合物のファミリー（たとえば、フィブラート系）、あるいは、活性自体（たとえば、ＰＰＡＲα阻害）を指す。これは、グループの単に「名前」であることが多い。グループ識別子は、さらに、化合物が属するグループの特徴でもある。遺伝子識別子は、あるグループに所属している化合物に曝されることにより、どの発現頻度が調整（増加、あるいは、減少）されているか、および、どの発現頻度が特徴的であるかを指す。そのグループに特徴的な変化が認められれば、遺伝子の発現の変化から、投与化合物が――他のグループに属しているとか、化合物に活性が全くないとかではなく――その特定のグループに所属していると決定することができる。遺伝子識別子は、配列、名前、受け入れ番号への照会、ＤＮＡアレイにおけるクローンまたは位置への照会などで、表現することができる。遺伝子識別子は、さらに、発現の変化の方向および程度（絶対値または相対値）で表現することもできる。たとえば、遺伝子識別子は、発現が少なくとも１０％減少するという要件、あるいは、発現が１００％から５００％の範囲で増加するという要件を含むことができる。遺伝子識別子には、さらに、時間的な制限を含むことができる。たとえば、あるグループ・サインは、遺伝子「Ｘ」の発現が、少なくとも２５０％、投与後８時間以内に、あるいは、４時間から１６時間の間に、増加するという要件を含むことができる。グループ・サインは、遺伝子の数の限定はないが、通常、５０個までの様々な特異性――さらに特異性を細分化することができる――の遺伝子識別子からなる。好ましくは、グループサインは、５０個以下の遺伝子からなる。さらに好ましくは、グループサインは、２５個以下の遺伝子からなる。また、グループ・サインは、好ましくは、少なくとも３個の遺伝子からなり、さらに好ましくは、少なくとも５個の遺伝子からなり、よりさらに好ましくは、少なくとも１０個の遺伝子からなり、最も好ましくは、少なくとも１５個の遺伝子からなる。場合によっては、グループサインは、３個またはそれ以下であってもよい。たとえば、あるグループの最も特異的なサインは２０個の遺伝子識別子からなることができ、このサインは、１つあるいはそれ以上の遺伝子識別子を省略することから作製される同様な（もしくは、やや低い）特異性をもつ複数のサブ・サインをもつことができる。グループ・サインは、さらに、たとえば、標準アッセイのパネルに対するあるグループの化合物に認められる生物活性を示すバイオアッセイ・データからなることもできる。バイオアッセイ・データは、ゲノム実験に先立って、あるグループに所属すると思われる化合物を同定するのに使うことができる。特に、薬剤になる可能性のある化合物をスクリーニングするのに役立つ。生物活性データは、特に、構造が異なるが、類似のゲノム発現パターンを誘導する化合物を差別化するのに有用である。データ構造は、物理的または電子的に保存することができる。たとえば、コンピュータ読み取り可能媒体に、データベースとして保存すること���できる。または、データ構造の全体あるいは一部をもとに、各グループ・サインについて特異的な別個のプローブとなる領域を有するポリヌクレオチド・プローブ・アレイのように、アレイに具現化することができる。
【００３６】
「グループ・サイン・データベース」とは、複数のグループ・サインからなるデータの集まりを意味する。データ・セット、および、同時派生する属性を保存するフォーマット（表計算ソフト、リレーショナル・データベース、次元データベースなど）が多数ある。表計算ソフトが最も一般的で、たとえば、マイクロソフト社製エクセル（登録商標）やコーレル社製Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｏ（登録商標）などがある。このフォーマットでは、データ・ポイントとそれに関連した属性は、表内のそれぞれの行に入力することで、関係づけられる。リレーショナル・データベースは、一般に、関係代数で定義される演算をサポートしている。そのようなデータベースは、一般に、データベースに含まれているデータの行と列からなる表で構成されている。各表には１つあるいは列の組からなる主キーがあり、その値によって表の中の行が特定される。さらに、リレーショナル・データベースの表には、１つあるいは行の組からなる外部キーがある場合があり、その値は別の表の主キーの値と一致する。一般に、リレーショナル・データベースは、データベース内の関係を決める関係代数である一連の演算（たとえば、選択、結び、結合）をサポートしている。好ましいリレーショナル・データベースには、これに限定されるわけではないが、オラクル（登録商標）（Ｏｒａｃｌｅ  Ｉｎｃ．，  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｓｈｏｒｅｓ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）やサイベース（登録商標）（Ｓｙｂａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）のデータベースがある。
【００３７】
「薬剤サイン」とは、ここでは、グループ・サインに類似するが、１つの化合物（または、同一化合物の塩やエステルのような、基本的には同一といえる複数の化合物）に特異的であるデータ構造を意味する。選択された化合物を、同様な活性を有する他の化合物と区別する目的で、薬剤サインの遺伝子識別子が選ばれる。すなわち、薬剤サインは、あるグループサイン内の複数の化合物を区別し、かつ、特定の薬剤と他の関係のない化合物を区別する。
【００３８】
「遺伝子発現プロフィール」とは、選択された発現条件（たとえば、標準化合物または被験化合物の存在下での培養）に対し、複数の遺伝子の発現レベルを何らかの形で表現することを意味する。遺伝子発現プロフィールは、各遺伝子について転写されたｍＲＮＡの絶対量――たとえば、被験細胞の転写ｍＲＮＡとコントロール細胞の転写ｍＲＮＡの比として――で表すことができる。ここでは、「標準」遺伝子発現プロフィールとは、すでに第１データベースにすでにあるプロフィール（たとえば、既知の活性を有する薬剤などの標準化合物と被験細胞を培養し得られたプルフィール）を意味する。一方、「被験」遺伝子発現プロフィールとは、研究対象条件下で得られたプロフィールを意味する。「調整」とは、あらかじめ定められた標準（たとえば、特定の条件下、特定の相で、選択した組織または細胞で認められる発現のレベル）と比較して、測定可能な程度の発現レベルの変動（誘導、または、抑制）を意味する。
【００３９】
「相関関係情報」とは、ここでは、一組の結果に関する情報を意味する。たとえば、あるプロフィール結果の相関関係情報は、以下のようなリストからなることができる。類似のプロフィール（複数の同じ遺伝子が同程度に調整されるプロフィール、あるいは、関係のある遺伝子が同程度に調整されるプロフィール）のリスト、類似のプロフィールをもたらす化合物のリスト、前述のプロフィールで変化した遺伝子のリスト、複数の同じ遺伝子が同様な機構で調整される疾患、および／または、障害のリストなど。化合物関連の照会用の相関関係情報は、以下のような化合物のリストからなることができる：類似の物理化学的性質をもった化合物、類似の構造をもった化合物、類似の生物学的活性をもった化合物、類似の発現アレイ・プロフィールを示す化合物など。遺伝子またはタンパク質関連の照会用の相関関係情報は、以下のような遺伝子またはタンパク質のリストからなることができる：類似の配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸のレベルで）を有する遺伝子またはタンパク質、類似の既知の機能または活性を有する遺伝子またはタンパク質、同一の化合物によって調整や制御を受ける遺伝子またはタンパク質、同一の代謝経路またはシグナル経路に属する遺伝子またはタンパク質など。一般に、相関関係情報は、様々なデータから対応物を引き出す過程において、ユーザーが遺伝子および／またはタンパク質の機能、化合物の有用性などに関する新たな仮説を立てるのに役立つ。製品に関する相関関係情報は、ユーザーがそのような仮説を試験するのに必要な製品の決定、購入に役立つ。
【００４０】
「類似」とは、ここでは、あらかじめ設定された閾値内にある定量値間の差異の程度を意味する。たとえば、２つの遺伝子の配列がある閾値――たとえば、２０％――以上に相同であれば、それらの２つの遺伝子を「類似」とみなすことができる。ヌクレオチド配列の類似性を評価するいくつかの方法やシステムが入手可能である（たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）。また、上記Ｍａｓｌｙｎら、および、Ｆｕｊｉｙａｍａら（本明細書に参考文献として組み入れられている）を参照されたい。２つのプロフィールの類似性は、種々の異なった形で定義することができる。たとえば、影響を受ける遺伝子の数、各遺伝子の影響を受ける程度などである。類似性を測る方法、すなわち、類似性を数値化する方法が、いくつか身近に存在している。たとえば、たとえば、類似性を測るある一つの方法は、閾値以上に誘導（または、抑制）された各遺伝子に注目し、両プロフイールがその遺伝子の誘導（または、抑制）を示す各遺伝子のスコアを上げるものである。本発明では、各遺伝子について、データセット内の他の全ての実験と比較し、実験プロフィール内の遺伝子が達成した制御のレベルに注目する類似性スコアを使っている。ある遺伝子について、他の全てのプロフィールと比較して、その実験プロフィールにおける制御レベルをランク付けすることができる（Ｒｋｘ）。相対ランクは、そのランクをプロフィールの全数で割ることによって求める（ＲｅｌＲｋｘ  ＝  Ｒｋｘ  ／  ｎ、ｎ  ＝  プロフィールの数）。次に、類似性スコアは、プロフィール中の全遺伝子の相対ランクの積、すなわち、Ｓ  ＝  ΠｘＲｅｌｋｘと定義することができる。Ｓの値が小さい場合は、実験プロフィールが複数の遺伝子に関する参照プロフィールにマッチし、各遺伝子の制御の幅が大きいことを意味する。被験プロフィールとサインの間の類似性は、種々のメトリックによって決定することができる。好ましくは、Ｓ  ＝  ΠｘＲｅｌｋｘと定義するメトリックである。また、データセットの残りと比較して、参照プロフイールと実験プロフイールがマッチするのがどれほど珍しいかを測るので、類似性スコアは、「特異性スコア」とも呼ばれる。また、他の統計学的方法を使ってもよい。
【００４１】
「ハイパーリンク」とは、ここでは、現在既に表示されている情報に追加される、および／または、関係する情報を、たとえば、ハイパーリンクをクリックすることによりアクティベートされた時に、提供できる表示イメージまたはテキストのフィーチャを意味する。ＨＴＭＬ  ＨＲＥＦが、本発明の範囲におけるハイパーリンクの一例である。たとえば、本発明のデータベースに照会し、ある化合物によって誘導される、または、抑制される遺伝子のリストなどのアウトプットを得る場合、アウトプットされたリストの遺伝子の１つあるいはそれ以上を、ハイパーリンクで関連情報とつなげることができる。関連情報とは、たとえば、その遺伝子に関する追加の情報、同様な方法で遺伝子の誘導に影響を与える化合物のリスト、遺伝子生産物の活性を測定するバイオアッセイのリスト、それらの関連情報に関係のある製品の情報などである。
【００４２】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」とは、ここでは、ヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）である重合体を意味し、その長さに限定はない。この用語は、分子の基本構造に限って言及している。したがって、この用語は、三重、二重、一重らせんＤＮＡ、および三重、二重、一重らせんＲＮＡに対しても使うことができる。また、ポリヌクレオチド修飾体――たとえば、メチル化体、キャップ構造体――にも、非修飾体にも使うことができる。さらに、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、以下の物質に対しても使うことができる：ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−  またはＣ−グリコシドである他のポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格をもつ他の重合体――たとえば、ポリアミド重合体（例：ペプチド核酸（ＰＮＡ））、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ重合体（Ｎｅｕｇｅｎｅとしてｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，  Ｏｒｅｇ．，  ＵＳＡより市販されている）、および、ＤＮＡやＲＮＡに見られるような塩基対および塩基の重なりが可能な配置をとる核酸塩基からなる他の合成配列特異的核酸重合体。
【００４３】
「プローブ」または「オリゴヌクレオチド・プローブ」とは、上に定義されているように、ポリヌクレオチドで、標的核酸分析物に存在する核酸配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を含むポリヌクレオチドからなる構造を意味する。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／または、ＲＮＡ、および／または、合成ヌクレオチド類似体であってよい。数十から数百塩基長のプローブを、オリゴヌクレオチド合成器を使い、人工的に合成することができる。また、種々のＤＮＡクローニング法で得ることもできる。プローブは、１本鎖でも２本鎖でもよい。プローブは、特定の遺伝子配列や断片の検出、同定、単離に利用できる。本発明で利用されているプローブはいずれも、たとえば、エライザ（ＥＬＳＡ）法、ＥＭＩＴ法、酵素的組織化学的アッセイ、および、蛍光、放射性、発光、スピン標識などの検出システムで検出することができるように、レポーター分子で標識を付け得ることが熟慮された。重要な点は、プローブには、被検出標的配列に対し少なくとも部分的に相補的な核酸配列鎖を含んでいなければならず、プローブは、その存在が視覚により認知することができるように標識されていなければならないということである。
【００４４】
「ハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーション」とは、ワトソン−クリック塩基対により二重らせん構造を形成することができる十分に相補的なヌクレオチド間で２本鎖を形成することを意味する。配列が必ずしも完全に相補的でなくても、安定にハイブリダイズすることができるという利点がある。さらに、２本のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、実験条件に左右される。たとえば、温度および／または塩濃度により、ハイブリダイズした２本鎖が安定して存在するために必要な塩基対相補性の割合が異なる。ハイブリダイズしやすい条件は、２本鎖が安定して存在するためにより高い相補性が必要な条件と比較し、「ストリンジェンシー」が低いと表現される。多くの場合、安定なハイブリッドは、４つあるいはそれ以上のヌクレオチドからなるループを無視した場合、相補的でない塩基が約１０％以下の場合に形成される。したがって、ここでは、「ハイブリダイズすることができる」とは、適切なアッセイ条件下で、「相補的な」相手と安定な２本鎖を形成することができるオリゴヌクレオチドを意味する。通常、そのためには、約９０％またはそれ以上の相補性が要求される。
【００４５】
「アレイ」、「ポリヌクレオチド・アレイ」、「マイクロアレイ」、および「プローブ・アレイ」は、いずれも、ある配列のポリヌクレオチドを特異的に結合することができる分子が結合あるいは置かれている表面を意味する。一般的に、そのような分子は、被検出ポリヌクレオチドに対し相補的な配列を有し、かつ、検出しようとしているポリヌクレオチドにハイブリダイズできるポリヌクレオチドである。
【００４６】
一般的な方法
本発明の方法は、化学ゲノム発現データおよびバイオアッセイ・データを使い、化合物の生物学的活性を特徴づけ、予測する方法である。本発明の方法は、発現データを有意味にクラスタし、一般的に遺伝子発現実験から結果として生ずる膨大なデータから関連する情報を引き出す方法を提供する。
【００４７】
本発明は、実験条件に応答して採取された化学ゲノム発現データに基づいており、好ましくは、化合物または生物活性のある物質に接触させることによって採取された化学ゲノム発現データに基づいている。適切な化合物には、既知の薬剤、毒性があることが既知であるあるいは疑われる毒素や汚染物質、タンパク質、染料・香料、栄養剤、漢方薬、環境サンプルなどがある。他の有用な実験条件には、病原体（ウイルス、細菌、菌類、寄生体など）、環境ストレス（飢餓、低酸素、温度など）などがある。現在のところ、種々の化合物、および／または、実験条件を同時に分析するのが好ましい。これは、特に、多くの化合物、および／または、多くの条件が、活性や薬物効果により関連付けられているからである。この実験条件は、遺伝子をもつ細胞、好ましくは哺乳動物の細胞に適用される。真核細胞は、生体外でも、生体内でも、試験することができる。適切な真核細胞には、これに限定されるわけではないが、ヒト、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ブタ、ヤギなどがある。現在のところ、複数の異なる組織タイプ（たとえば、肝臓、腎臓、骨髄、脾臓など）から取り出された哺乳動物の細胞について実験するのが好ましい。対象細胞を、複数の実験条件（たとえば、ある化合物の複数の異なる濃度）に曝し、時間を追って経過を観察するのが好ましい。
【００４８】
化学ゲノム応答は、いかなる利用可能な方法によっても得ることができる。たとえば、レポーター細胞のパネルを用いることにより、各細胞グループがレポーター遺伝子を有し、異なった選択制御領域に作用可能に結合する。または、レポーター遺伝子を欠いた、主要な組織分離株、細胞または細胞系統を用い、複数の遺伝子の発現を直接調べることもできる。
【００４９】
直接検出方法には、ｍＲＮＡをオリゴヌクレオチドまたはそれより長いＤＮＡ断片（たとえば、ｃＤＮＡ）またはクローン化遺伝子ＤＮＡの断片と（溶液内あるいは固相上で）直接ハイブリダイズする方法、ｃＤＮＡの検出後に逆転写する方法、ノーザン・ブロット法などがある。
【００５０】
ここで発現レベルの測定に使うプライマーおよびプローブは、遺伝子配列から取り出し、標準的な手法で簡単に合成することができる。たとえば、固相合成法とホスホアミダイト法を用いて合成できる（本明細書中の参考文献Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，４５８，０６６およびＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，４１５，７３２に開示されている。また、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４８：２２２３−２３１１および  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．  １３  （Ａｐｒ．  １，  １９８７））。その他の化学合成法には、たとえば、ホスホトリエステル法（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９７９）  ６８：９０）、ホスホジエステル法（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９７９）  ６８：１０９）がある。ポリ（Ａ）またはポリ（Ｃ）、あるいは、他の非相補的なヌクレオチド延長部分は、これらと同じ方法を使って、プローブ内に組み込むことができる。ヘキサエチレンオキシド延長部分は、本分野で知られている方法で導入することができる（Ｃｌｏａｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１３：６３２４−６３２６；Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，９１４，２１０  ｔｏ  Ｌｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｄｕｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：６３５３−６３５９；およびＨｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｔｅｔ．  Ｌｅｔｔ．  ２７：４７０５−４７０８）。
【００５１】
プライマーおよびプローブの長さは異なってよいが、プローブ配列は、プライマー配列より融解温度が低くなるように、選ばれる。したがって、プライマー配列はプローブ配列より一般的に長い。一般的に、プライマー配列は、好ましくは、１０個から７５個までのヌクレオチドからなり、さらに一般的には、２０個から４５個までのヌクレオチドからなる。一般的なプローブ配列は、１５個から４０個、１８個から３０個などのように、１０個から５０個までのヌクレオチドからなり、上記の範囲のどの長さでもよい。
【００５２】
固相担体を使う場合、オリゴヌクレオチドのプローブは、固相担体に様々な方法で結合させることができる。たとえば、固相担体プローブの３’末端または５’末端ヌクレオチドを固相担体に結合させることによって結合させることができる。さらに好ましくは、プローブは、固相担体に、プローブと固相担体の間に隔たりを設ける働きをするリンカーによって結合させる。リンカーの長さは、通常、少なくとも原子１５個から３０個であり、さらに好ましくは、少なくとも原子１５個から５０個である。リンカーに必要な長さは、固相担体の種類によって異なる。たとえば、架橋の程度の高いポリスチレンを固相担体に使う場合、リンカーの長さは原子６個で十分である。
【００５３】
固相担体にオリゴヌクレオチド・プローブを結合させるのに使われる多種多様なリンカーが、本分野では知られている。リンカーは、標的配列が固相担体に結合されているプローブとハイブリダイズするのを著しく妨げない化合物で作製することができる。リンカーは、自動合成システムで、簡単にリンカー［誤：プローブの誤りか？］上に付加することができるホモポリマーのオリゴヌクレオチドで作製することができる。または、機能性ポリエチレングリコールのような重合体をリンカーとして使うことができる。そのような重合体は、ホモポリマーのオリゴヌクレオチドより好ましい。なぜなら、標的オリゴヌクレオチドにプローブがハイブリダイズするのを、著しく妨げないからである。ポリエチレングリコールが、特に好ましい。
【００５４】
塩基性条件下、高温で、塩基の保護基を除去する際に、固相担体、リンカー、および、プローブ間の遺伝子連鎖が切断されないことが、好ましい。好ましい遺伝子連鎖の例として、カルバミン酸またはアミドの遺伝子連鎖があげられる。オリゴヌクレオチド・プローブを固定する固相担体の好ましい例として、細孔性ガラス、ガラス製プレート、ポリスチレン、アビジンがコートされたポリスチレン製ビーズ、セルロース、ナイロン、アクリルアミド・ゲル、および、活性デキストランがあげられる。
【００５５】
さらに、プローブに、検出のための標識を共役させることができる。ここでは、「標識」および「検出標識」とは、検出に役立つ分子を意味する。たとえば、これに限定されるわけではないが、放射性同位体、蛍光剤、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素共同因子、酵素阻害剤、発色団［二回出てくる；原典の誤りか］、染料、金属イオン、金属コロイド溶液、リガンド（たとえば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、または、ハプテンなど）などがあげられる。「蛍光剤」とは、検出範囲で蛍光を発することができる物質または物質の一部を意味する。標識の付加を許容する反応官能のあるオリゴヌクレオチドを作製する手段がいくつか知られている。たとえば、アビジンを介して、放射性、蛍光、化学発光、酵素、高電子密度の標識を加えることができるように、プローブをビオチニル化する方法がいくつかある（フェリチン−アビジン−ビオチン標識について開示しているＢｒｏｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９７８）  ５：３６３−３８４、および、アミノアルキルホスホロアミド・リンカーを介するオリゴヌクレオチドの５’末端のビオチニル化について開示しているＣｈｏｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９８５）  １３：１５２９−１５４１などを参照のこと）。また、蛍光剤や他の化合物（イソチオシアナート、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドなどのアミノ反応基によって誘導された化合物）で簡単に標識できるアミノ基により誘導されたオリゴヌクレオチドの合成方法などもいくつか利用できる（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  （１９８７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：３１３１−３１３９、  Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：６４５５−６４６７、および、  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，６０５，７３５、および、  Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．などを参照のこと）。また、チオール特異的標識と反応できるスルフヒドリル基により誘導されたオリゴヌクレオチドを合成する方法も利用できる（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，７５７，１４１  ｔｏ  Ｆｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：４４８５−４５０２、および、  Ｓｐｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １５：４８３７−４８４８などを参照のこと）。Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９８８）  １６９：１−２５には、ＤＮＡ断片を標識する方法が包括的に解説されている。
【００５６】
プローブは、蛍光分子とプローブの非連結反応末端を結合させることにより、蛍光標識することができる。適当な蛍光標識の選択にあたっては、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  （１９８７）  １５５：２６０−３０１；Ｋａｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９９１）  １９：４９５５−４９６２、および、  Ｈａｕｇｌａｎｄ  （１９８９）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｅｕｇｅｎｅ，  Ｏｒｅｇ．）が参考になる。好ましい蛍光標識には、フルオレセインおよびその誘導体がある（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，３１８，８４６、  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  （１９８９）  １０：１５１−１６４、および、  ６−ＦＡＭ，  ＪＯＥ，  ＴＡＭＲＡ，  ＲＯＸ，  ＨＥＸ−１，  ＨＥＸ−２，  ＺＯＥ，  ＴＥＴ−１  またはＮＡＮ−２などに開示されている）。
【００５７】
さらに、プローブを、下記のような方法で、アクリジニウムエステル  （ＡＥ，  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）で標識することができる。現行の技術では、プローブ内のいかなる位置においても、ＡＥ標識を設置することができる。Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ”  ｉｎ  Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｉｎｇ，  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，  Ｋｒｉｃｋａ  Ｌ．  Ｊ．  （ｅｄ）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．、  Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  ”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  （ＨＰＡ）  ｔｏ  ＰＣＲ”  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  Ｍａｓｓ．、および、  Ｗｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  （１９８３）  ２９：１４７４−１４７９；Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  （１９８８）  ３４：２０８７−２０９０などを参照せよ。。一個のＡＥ分子を、プローブ内のいかなる位置においてもＡＥ標識を設置することができる非ヌクレオチド系リンカー腕ケミストリーを用いて、プローブに直接結合させることができ、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，５８５，４８１  および  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ  ５，１８５，４３９  を参照せよ。
【００５８】
現在のところ、遺伝子応答は、ヌクレオチド・アレイを用いて測定するのが望ましい。ヌクレオチド・アレイには、たとえば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）プローブ・アレイ  （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ），  ＣｏｄｅＬｉｎｋTM  Ｂｉｏａｒｒａｙ  （Ｍｏｔｏｒｏｌａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ，  Ｉｌｌ．，  ＵＳＡ）  などがある。組織や細胞の標本を調べるポリヌクレオチドのプローブは、適切で相補的な遺伝子または転写物のみに特異的にハイブリダイズする十分な長さであることが好ましい。好ましくは、本法に用いるポリヌクレオチド・プローブは、少なくとも、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または、２５個のヌクレオチドからなる。時には、少なくとも、３０、４０、または、５０個のヌクレオチドからなるより長いプローブが好ましい場合もある。アレイを用いて測定する遺伝子は、生物体に存在する全遺伝子、または、期待する分解能および／または信頼度で、化合物に起因する遺伝子発現の調整を示すことができる十分な大きさのあるサブセットから構成されていてもよい。さらに、本発明の本法は、このために必要な遺伝子の充分なサブセットのサイズを決定するのにも有用である。
【００５９】
標的増幅法（たとえば、Ｔａｑｍａ（登録商標）ポリメラーゼを用いるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅法、および、他の酵素的方法）、および／または、シグナル増幅法（たとえば、高度標識プローブ、色素産生酵素などを用いる方法）を用い、複数の遺伝子の発現を測定することができる。転写反応を応用した核酸増幅法（ＴＭＡ，ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法の詳細は、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，３９９，４９１に記述されており、本明細書の参照文献として組み入れられている。一般的なアッセイの一例では、単離核酸サンプルを、濃縮緩衝液（緩衝剤、塩、マグネシウム、３リン酸ヌクレオチド、プライマー、ジチオトレイトール、および、スぺルミジンを含む）と混合する。反応液は、任意で、約１００°Ｃで、約２分間インキュベートし、二次構造を変性させる。室温に冷却後、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、および、ＲＮアーゼＨを加え、混合液を３７°Ｃで、２時間から４時間、インキュベートする。その後、反応を以下の手順で測定する：生成物を変性させ、プローブ溶液を加え、６０°Ｃで２０分間インキュベートし、ハイブリダイズしていないプローブを選択的に加水分解する溶液を加え、反応液を６０°Ｃで６分間加温し、発光計で残存する化学発光を定量する。
【００６０】
ＴＭＡ法では、生物学的サンプル内に存在する極めて少量の標的核酸配列を同定することができる。そのような配列は、直接法では検出が困難または不可能である場合がある。特に、ＴＭＡ法は、標的配列のＲＮＡのコピーを１０億個以上提供することができる等温自己触媒核酸標的増幅法である。本アッセイを定性に使い、生物学的サンプル内の標的配列の有無を正確に検出することができる。さらに、本アッセイを定量法として使い、累乗数が複数になる濃度範囲にわたり、標的配列の量を定量することができる。ＴＭＡ法を用い、温度、イオン強度およびｐＨなどの反応条件を繰り返し操作することなく、標的核酸配列の複数のコピーを自己触媒的に合成することもできる。
【００６１】
一般的なＴＭＡ法の手順を以下に示す：（ａ）  実験に用いる生物学的サンプルから、ＲＮＡを含む核酸を単離する。次に、（ｂ）  以下を反応液に混合する。（ｉ）  単離核酸、（ｉｉ）  第１オリゴヌクレオチド・プライマー（ＲＮＡの標的配列（たとえば、（＋）鎖）が存在する場合に、ＲＮＡの標的配列と複合するために、ＲＮＡの標的配列の３’末端部分に十分相補的な複合体形成配列をもつ）、および、第２オリゴヌクレオチド・プライマー（相補配列（たとえば、（−）鎖）の標的配列の３’末端部分に十分相補的な複合体形成配列をもち、さらに、第１オリゴヌクレオチドが一個のプロモーターを含む、複合体形成配列から５’の距離にある配列からなる）、（ｉｉｉ）  逆転写酵素、またはＲＮＡおよびＤＡＮ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）  ＲＮＡ−ＤＮＡ複合体のＲＮＡ鎖を選択的に分解する酵素（たとえば、ＲＮアーゼＨ）、および、（ｖ）  プローモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼ。
【００６２】
反応液の成分の混合は、段階的に行ってもよいし、一度に行ってもよい。反応混合物は、ＤＮＡプライミング、核酸（３リン酸リボヌクレオチド、および、３リン酸デオキシリボヌクレオチドを含む）の合成条件を含め、オリゴペプチド−標的配列ハイブリッドが形成される条件下で、標的配列の複数のコピーを得るに十分な時間をかけて、インキュベートする。反応は、反応成分（たとえば、成分酵素）の安定性を保つのに適した条件で有利に進み、増幅反応の過程でに反応条件の変更や操作を必要としない。したがって、反応は、実質的には、等温下、一定のイオン強度およびｐＨで、進行することができる。この反応は、第１ＤＮＡ延長反応のため生じるＲＮＡ−ＤＮＡ複合体を分離する変性のステップを必要としないので便利である。
【００６３】
好ましいＤＮＡポリメラーゼには、逆転写酵素があり、その例としては、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，  Ｉｎｃ．などから入手可能）、および、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから入手可能）などがある。
【００６４】
プライマーに組み込むのに好ましいプロモーターおよびプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識する核酸配列（自然界で発生する配列、合成配列、制限消化の産物である配列のいずれか）である。ＲＮＡポリメラーゼは、その配列を認識し、結合し、ＲＮＡ転写物が産生される転写反応を開始しする。。任意に、当該配列には、ＲＮＡポリメラーゼが実際に認識する部分を越えて延長しているヌクレオチド塩基配列を、任意に含むことができ、このヌクレオチド塩基配列は、分解プロセスあるいは増強された転写効率に対し、付加的な安定性あるいは感受性を与えるものである。。有用なプロモーターの例として、特定のバクテリオファージのポリメラーゼが認識するプロモーター（たとえば、バクテリオファージＴ３、Ｔ７またはＳＰ６由来のプロモーター）、または、大腸菌由来のプロモーターがあげられる。これらのＲＮＡポリメラーゼは、通常の販路を通じて（たとえば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  および  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）容易に入手できる。
【００６５】
本法に使用するのに適切な逆転写酵素には、ＡＭＶ逆転写酵素などのＲＮアーゼＨ活性を有するものがある。しかしながら、ＡＭＶ逆転写酵素を使う場合であっても、大腸菌ＲＮアーゼＨなどの外在性ＲＮアーゼＨを添加するのが好ましい。ＲＮアーゼＨは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから容易に入手できる。
【００６６】
これらの方法で得たＲＮＡ転写物を鋳型として使い、上記の機序で、標的配列のコピーをさらに作製することができる。当該システムは自己触媒的に働き、増幅は、温度、ｐＨ、イオン強度などの反応条件を繰り返し変更させたり変化させる必要なしに、自己触媒的に進行する。
【００６７】
すでに述べたように、上記のプライマーおよびプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）にもとづく方法で使い、複数の遺伝子の発現レベルを測定することができる。ＰＣＲ法は、核酸分子または核酸分子の混合物に含まれる希望の核酸配列を増幅する方法である。ＰＣＲ法では、一対のプライマーを過剰に用い、標的核酸と相補的な鎖にハイブリダイズする。プライマーは、標的核酸を鋳型とし、ポリメラーゼによって、それぞれ延長される。延長生成物が、もともとの標的鎖から分離した後は、それ自体が標的配列になる。次に、新しいプライマーが、ハイブリダイズし、ポリメラーゼによって延長される。このサイクルが繰り返され、標的配列分子の数が幾何学的に増加する。サンプル中の標的核酸を増幅するＰＣＲ法は、本分野ではよく知られており、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  １９９０）、  Ｔａｙｌｏｒ  （１９９１）  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：  ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，  ｉｎ  ＰＣＲ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ、  Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３、および、  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，６８３，１９５、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ  ４，６８３，２０２  およびＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ  ４，８８９，８１８などに記載されており、本明細書に参考文献としてあげられている。
【００６８】
特に、ＰＣＲ法は、比較的短いオリゴヌクレオチド・プライマーを使い、このオリゴヌクレオチド・プライマーは、増幅される標的ヌクレオチド配列を側面に配置し、その結果、プライマーは、その３’末端同士が向かい合わせになり、各プライマーがもうひとつのプライマーに向かって延長するような、方向に置かれる。。。ポリヌクレオチドのサンプルを抽出、好ましくは熱で、変性させ後、モル過剰量で存在する第１および第２プライマーとハイブリダイズさせる。４種類のデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ−−ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ  および  ｄＴＴＰ）の存在下、プライマー延長産物を生成することができる酵素のようないかなるプライマー依存性ポリヌクレオチド重合剤および鋳型依存性ポリヌクレオチド重合剤（たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ，  高度好温菌であるＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  （Ｔａｑ）から単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマーなどのソースから入手可能）、高度好熱菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  （Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  桿菌（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、  あるいは、超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ  （”Ｖｅｎｔ”  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））を用い、重合の触媒作用が進められる。これにより、２個の「長い産物」が生じる。この長い産物はそれぞれ、その５’末端に、元の鎖の新合成相補配列に共有結合しているプライマーを有し’ている。、。次に、反応混合物を、再度、重合条件に戻し（たとえば、温度を下げる、変性剤を不活性化する、あるいは、ポリメラーゼを追加するなどにより）、２回目のサイクルを開始する。２回目のサイクルでは、２本の元の鎖、１回目のサイクルで得た２個の長い産物、元の鎖から複製された２個の長い産物、および、当該の長い産物から複製された２個の「短い産物」が得られる。この短い産物は、それぞれの末端にプライマーを有する標的配列がある。その後のサイクル毎に、長い産物が２個づつ産出され、短い産物の数は、その前のサイクルの終わりに存在していた長い産物と短い産物の数に等しくなる。こうして、標的配列を有する短い産物の数は、サイクル毎に、幾何級数的に増加する。市販のサーマルサイクラー（たとえば、パーキンエルマー）を使って、ＰＣＲ法を行うのが好ましい。
【００６９】
ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、上記のＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法をおこなうことにより、ＲＮＡを増幅してよい。または、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，３２２，７７０に記載されているように、双方のステップに一種類の酵素を用ることもできる。または、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．  Ａｐｐ．  ４：８０−８４に記載されているように、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後、非対称性ギャップのリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）法を用いることもできる。
【００７０】
また、ＴａｑＭａｎTM  アッセイ  （パーキンエルマー）として知られる蛍光５’ヌクレアーゼアッセイは、核酸標的を検出する強力かつ万能なＰＣＲ系の検出方法である。従って、ＴａｑＭａｎTM  分析で、プライマーおよびプローブを用いることができる。分析は、蛍光シグナルの発生をモニターすることにより、熱サイクルと連携して行う。本アッセイ・システムは、ゲル電気泳動分析の必要性がなく、標的コピーの数を定量することができる。定量データを出すことができる。
【００７１】
蛍光５’ヌクレアーゼアッセイには、たとえば、蛍光レポーター染料とクエンチャーの双方で標識した内部のオリゴヌクレオチド・プローブを消化することを目的として、外在性の５’ヌクレアーゼ活性を有しているＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄTM  ＤＮＡ  ポリメラーゼを用い、簡便に行うことができる（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９９１）  ８８：７２７６−７２８０、および、  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （１９９３）  ２１：３７６１−３７６６を参照のこと）。アッセイ結果は、蛍光プローブが消化されると同時に、増幅サイクル中に発生する蛍光量の変化を測定することにより、検出する。その結果、蛍光レポーター染料とクエンチャー間の共役が解かれ、標的ＤＮＡの増幅に比例する蛍光シグナルにおける増加を引き起こすことになる。蛍光シグナルは、。ＴａｑＭａｎTM  ａｓｓａｙ、このアッセイで使用する試薬および条件の詳細なる説明については、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．  （１９９１）  ８８：７２７６−７２８０、  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，５３８，８４８、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，７２３，５９１、および、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，８７６，９３０などに記載されており、本明細書に参考文献としてあげられている。
【００７２】
増幅産物は、液体中あるいは固相担体を用い、検出することができる。本法では、ＴａｑＭａｎTM  プローブは、希望のＰＣＲ産物内の標的配列とハイブリダイズするようにデザインされている。ＴａｑＭａｎTM  プローブの５’末端には、蛍光レポーター染料が含まれている。当該プローブの３’末端は、プローブの延長を防ぐためブロックされており、５’蛍光体の蛍光を抑制する染料が含まれている。その後の増幅過程で、５’エキソヌクレアーゼ活性のあるポリメラーゼが反応に存在すれば、５’蛍光標識は切断される。５’蛍光体の除去により、検出可能な蛍光量の増加に結果として繋がる。特に、レポーター分子の蛍光を抑制できるほどクエンチャー分子がレポーター分子に十分近接するハイブリダイズしていない状態では、プローブが少なくとも１本鎖コンフォメーションに存在するように、オリゴヌクレオチド・プローブは構築されている。さらに、オリゴヌクレオチド・プローブは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしている状態では、クエンチャー分子がレポーター分子の蛍光を抑制するほどレポーター分子に近接した位置に置かれていないように、少なくとも１つのコンフォメーションに存在する。このようなハイブリダイズした時のコンフォメーションおよびハイブリダイズしていない時のコンフォメーションを採用することにより、プローブがハイブリダイズした時とハイブリダイズしない時では、プローブ上のレポーター分子とクエンチャー分子が、異なる蛍光シグナル強度を示す。その結果、レポーター分子、クエンチャー分子または両分子の蛍光強度の変化をもとにプローブがハイブリダイズしているか、ハイブリダイズしていないかを知ることができる。さらに、プローブがハイブリダイズしていない時に、クエンチャー分子がレポーター分子を抑制するようにプローブをデザインすることができるので、プローブがハイブリダイズしている時または消化された時以外は、レポーター分子が限られた蛍光しか発しないようにプローブをデザインすることができる。
【００７３】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法は、核酸を増幅し、発現レベルを検出する別の方法である。ＬＣＲ法では、２つ（第１と第２）の主要プローブと２つ（第３と第４）の二次プローブから成るプローブを対で用い、これらはすべて標的に対してモル過剰量で使う。第１プローブは、標的鎖の第一のセグメントにハイブリダイズし、第２プローブは、標的鎖の第二のセグメントにハイブリダイズする。第１部分と第２部分は、当該プローブがおおよそ５’  リン酸塩−３’  ヒドロキシル  （５’  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−３’  ｈｙｄｒｏｘｙｌ）の関係で互いに隣接するように、接在している。したがって、リガーゼは、２つのプローブを共有結合あるいは連結反応し、結合融合産物を生成する。さらに、第３（二次）プローブは第１プローブの一部に、第４（二次）プローブは第２プローブの一部に、類似の隣接様式でハイブリダイズすることができる。標的が最初は２本鎖の場合、二次プローブもまず標的の相補配列にハイブリダイズする。いったん主要プローブの共有結合した鎖が標的鎖から離れると、それはは第３と第４のプローブとハイブリダイズし、共有結合して相補的な二次連結反応産物を作る。ハイブリダイゼーションと連結反応を繰り返すことにより、標的配列を増幅することができる。この手法は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ３２０，３０８  （１９８９年６月１６日発行）および  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ４３９，１８２  （１９９１年７月３１日発行）などに記述されている。
【００７４】
遺伝子の発現レベルを検出する好ましい方法として、標的配列に特異的なオリゴヌクレオチド・プローブを使う方法がある。このプローブは、ハイブリダイゼーション保護アッセイ法（ＨＰＡ）に使うことができる。この実施例では、プローブを、強力な化学発光分子であるアクリジニウムエステル  （ＡＥ）で簡便に標識している。１個のＡＥ分子は、プローブ内のいかなる位置にでも標識を置くことを許容する非ヌクレオチド系のリンカー腕ケミストリーを介して、プローブに直接結合する。アルカリ性過酸化水素との反応ではじまり、発生した励起状態のＮ−メチルアクリドンが、次に光子を放出して基底状態に変化するので、化学発光現象が生じる。さらに、ＡＥによってエステルの加水分解が起き、非化学発光性のカルボン酸メチルアクリジニウムが生成する。
【００７５】
ＡＥ分子が核酸プローブに共有結合している場合、加水分解は弱アルカリ性下で急速に進む。ＡＥ標識プローブが標的核酸に完全に相補的な場合、ＡＥ加水分解の速度は大幅に減少する。したがって、ＡＥ標識プローブは、ハイブリダイズしているものもハイブリダイズしていないものも、物理的に分離する必要なしに、溶液中で、直接検出することができる。
【００７６】
ＨＰＡ法は、通常、以下のステップで行う。（ａ）  ＡＥ標識プローブを、約１５分から３０分かけて、溶液中で標的核酸とハイブリダイズさせる。次に、弱アルカリ性溶液を加え、ハイブリダイズしていないプローブに共役しているＡＥを加水分解する。この反応は約５分から１０分要する。残存するハイブリッドに関連しているＡＥを存在する標的の量として検出する。このステップには、約２秒から５秒を要する。好ましくは、微分法を用いた加水分解を、ハイブリダイゼーションのステップと同じ温度（通常５０°Ｃから７０°Ｃ）で行う。または、第２の微分法を用いた加水分解を室温で行うこともできる。この場合、高いｐＨ（たとえば、１０から１１の範囲）を使うことができ、ハイブリダイズしているＡＥ標識プローブとハイブリダイズしていないＡＥ標識プローブの加水分解速度の差が増加する。ＨＰＡ法は、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ  ６，００４，７４５、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ  ５，９４８，８９９、および、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ  ５，２８３，１７４などに詳しく記載されており、本明細書に参考文献としてあげられている。
【００７７】
また、核酸配列に基づいた増幅法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）も、複数の遺伝子の発現の測定に本発明で使うことができる。本法は、プロモーター主導の酵素反応で、特異的核酸を生体内で、連続的、均質、等温の下、増幅することを誘導し、核酸のＲＮＡのコピーを提供する方法である。ＮＡＳＢＡ法を行うために必要な試薬には、５’末端にプロモーターを有する第１ＤＮＡプライマー、第２ＤＮＡプライマー、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＮＴＰおよび  ｄＮＴＰがある。ＮＡＳＢＡ法を用いると、１本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは、２本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡから、大量の１本鎖ＲＮＡを生成することができる。ＲＮＡを増幅する場合、ｓｓＲＮＡが鋳型として働き、ＲＮＡポリメラーゼ認識部位を有する第１プライマーの伸長によって、第１ＤＮＡ鎖が合成される。続いて、このＤＮＡ鎖が、鋳型として働き、第２プライマーの伸長によって、第２の相補的なＤＮＡ鎖が合成される。それが、２本鎖活性ＲＮＡポリメラーゼ・プロモーター部位になる。第２ＤＮＡ鎖が鋳型として働き、ＲＮＡポリメラーゼによって、第１の鋳型であるｓｓＲＮＡを大量に合成する。ＮＡＳＢＡ法は、本分野ではよく知られており、Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８、  Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：９１−９２、  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  ３２９，８２２、  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９１／０２８１４、および、  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ６，０６３，６０３、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，５５４，５１７、および、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．５，４０９，８１８などに記載されており、本明細書に参考文献としてあげられている。
【００７８】
その他に知られている増幅および検出方法で利用できる方法には、これに限定されるわけではないが、Ｑ−β増幅法（Ｑ−ｂｅｔａ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、鎖置換型増幅法（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）  （Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４２：９−１３、および、  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ６８４，３１５）、および、転写反応を応用した核酸増幅法（ｔａｒｇｅｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）  （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＷＯ  ９３／２２４６１）がある。
【００７９】
上記の方法の多くは、プローブもしくはプライマーと標的核酸の間の相補性に頼るものである。ｓｓＤＮＡ分子がハイブリッドを形成するには、２本の鎖の塩基配列が必ずしも完全に相補的である必要はない。よくマッチしていないハイブリッド（すなわち、２本の鎖の間で相補塩基と対になり水素結合を形成できるヌクレオチド部分が限られている）は、低温で形成することができるが、温度が上がる（または、塩濃度が下がる）と不良ハイブリッド内の相補塩基対領域が離れてしまう。なぜなら、新しい環境下では、２本の鎖を一緒にしておくための充分な総水素結合形成が全複合体分子内に存在しないからである。ハイブリッド複合体を自然のままに保つためには、相補的な塩基対の割合を上げることが必要とされる状況を作り出すように、温度、および／または、塩濃度を漸次変化させてよい。最終的には、完全なハイブリッドだけが複合体として存在することができるという一組の条件が達せられる。このストリンジェンシーのレベルを超えると、完全に相補的な２本鎖でも分離する。ＤＮＡの混合物中のｄｓＤＮＡの各非反復性断片のストリンジェンシー条件は、それぞれの断片内で、その非反復性塩基対構成に依存している。ハイブリッドが持続するために、ハイブリダイゼーション条件が求める完全塩基対構成の程度は、、「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」と呼ばれる。ストリンジェンシーの低い条件とは、ミスマッチ塩基がある程度存在する複合体分子を形成することを許容する条件である。ストリンジェンシーの高い条件とは、ほとんど完全に塩基対がマッチした複合体分子のみが安定に存在することを許容する条件である。ストリンジェンシー条件の操作が、配列特異性アッセイを最適化する上で重要である。本方法は、完全に塩基対マッチした複合体を必要としないということの価値が認められる。
【００８０】
とりわけ、上記の増幅にもとづく方法は、いったんプライマーまたはプローブが十分延長、および／または、連結反応した後、標的配列から分離させる（たとえば、反応混合液を融解温度まで加熱し、相補的な核酸鎖を分離させる）。こうして、標的配列に相補的な配列を形成する。続いて新しい増幅サイクルをはじめ、全ての２本鎖を分離することにより、さらに標的配列の数を増幅させる。そうすることにより、プライマーまたはプローブをそれぞれの標的とハイブリダイズさせ、延長、および／または、連結反応させ、再分離させる。増幅サイクルで作った相補配列は、プライマー延長の鋳型としての役割、あるいは２つのプローブのギャップを埋め、標的配列の数をさらに増やすという役割を果たすこともできる。一般的に、反応サイクルの数は、２０回から１００回、さらに一般的には、２５回から５０回である。このようにして、標的配列およびその相補配列の複数のコピーを産出する。このように、プライマーは、増幅条件下でそれが存在する場合に、標的配列の増幅を開始する。
【００８１】
２本鎖ＤＮＡの「融解温度」（「Ｔｍ」）とは、  加熱や塩基対間の水素結合の解離（たとえば、酸、アルカリなどによる）によって、ＤＮＡのへリックス構造の半分が失われる温度と定義されている。ＤＮＡ分子のＴｍは、その長さおよびその塩基構成によって決まる。ＧＣ塩基対の多いＤＮＡ分子は、ＡＴ塩基対の多いＤＮＡ分子より、Ｔｍが高い。分離されたＤＮＡの相補的な２本鎖は、温度がＴｍ以下に下がると、自然に２再連結あるいはアニールし、本鎖を形成する。核酸のハイブリダイゼーションは、Ｔｍより約２５°Ｃ低い温度で最も効率がよい。Ｔｍは、次の関係式から予想することができる：Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（ＧＣ）％  （Ｍａｒｍｕｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：１０９−１１８）。
【００８２】
さらに、本発明の別の局面では、上記の方法を２つまたはそれ以上行う。たとえば、最初の検査が、検出を目的とした核酸の増幅を行うために転写反応を応用した核酸増幅法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ法）を用いた場合は、続いて、別の核酸検査（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ；ＮＡＴ法）アッセイ（たとえば、本明細書に記載のＰＣＲ増幅法、ＲＴ  ＰＣＲ法などを用いて）を行う。明らかに、本書で説明されているアッセイのデザインには、大幅な変更が許され、種々のフォーマットが本分野では知られている。上に説明されている方法は手引きのためだけであって、本分野に精通している者なら、本分野で知られている手法を用い、上記のプロトコールを容易に変更することができる。
【００８３】
増幅後および増幅しない状態での検出は、種々の異質または同質の検出フォーマットを用いて実行することができる。たとえば、異質の検出フォーマットは、Ｓｎｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，２７３，８８２、  Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，１２４，２４６、  Ｕｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，１８５，２４３、および、  Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，５８１，３３３に開示されており、本明細書に参考文献としてすべて組み入れられている。たとえば、同質の検出フォーマットは、Ｃａｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，５８２，９８９、および、  Ｇｅｌｆａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，２１０，０１５に開示されており、本明細書に参考文献としてすべて組み入れられている。また、複数のプローブをハイブリダイゼーション・アッセイに用い、標的シグナルの感度と増幅を向上させることも、熟慮されており、また本発明の範囲内である。これに関しては、Ｃａｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，５８２，９８９、および、  Ｇｅｌｆａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，２１０，０１５などに記載されており参照せよ。これらは、本明細書に参考文献としてすべてあげられている。
【００８４】
ある特定のシステムにおける複数の候補化合物、および／または、複数のシステムにおけるある候補化合物を迅速に評価するプロトコールが開発されている。候補化合物を評価するそのようなプロトコールは、ハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ＨＴＳ）法と呼ばれている。一つの典型的なプロトコールでは、候補化合物をマルチウエル・クラスター・プレート（たとえば、９６ウエル、または、３８４、８６４、１５３６ウエル・プレートなどそれより高フォーマットなプレート）に分注する。化合物の効果を、その化合物が試験されている試験システム上で評価する。この手法の「スループット」、すなわち、スクリーニングされ得る候補化合物の数と候補化合物のスクリーニングの対象となり得るシステムの数の組み合わせは、多くの要因によって限定される。それらの要因を、これに限定されるわけではないが、以下にあげる：ウエル毎に１つのアッセイしか行えない；候補化合物の効果をモニターするのに従来の染料分子を使う際、複数の染料を使う場合は、複数の励起源を必要とする；さらに、ウエルのサイズが小さくなる（たとえば、１５３６ウエルは総アッセイ量で約５μｌを受け付ける）ほど、各成分をウエルに均等に分注するのがむずかしくなり、各アッセイから発生するシグナル量が、アッセイの量に釣り合って、顕著に減少する。
【００８５】
１５３６ウエルは、１つの９６ウエルプレート・フォーマットを１６個のアッセイに単に物理的に分けたものにすぎない。１つの９６ウエルプレートの単一のウェルに、１６個のアッセイを多重系にする方が望ましい。これによって、ウエルに試薬を分注するのが容易になり、また、ウエル毎のシグナル・アウトプットが高まるであろう。さらに、１つのウエルで複数のアッセイを行うことで、複数の標的システムに影響を及ぼす候補化合物の可能性を同時に決定することができる。ＨＴＳ法を使えば、１つの候補化合物についてスクリーニングを行い、１回のアッセイで、プロテアーゼ阻害、炎症抑制、抗ぜんそくなどの活性の有無を調べることができる。
【００８６】
本発明のまた別の実施例には、多重系の検出試薬として蛍光標識を使うＨＴＳアッセイが提供されている。当該ＨＴＳアッセイは、ある候補化合物の種々の濃度の存在下で行う。候補化合物のアッセイ・システムに対する効果の証拠として、蛍光放出量をモニターする。たとえば、標識の付けられたリガンドあるいは受容体を用いた、これら［標識の付けられたリガンドあるいは受容体］のビーズ結合受容体あるいはリガンドへの結合をモニターするための蛍光度数は、ビーズの蛍光放出を測定する柔軟なフォーマットとして使うことができる。ビーズと関連付けられた蛍光放出量は、候補化合物の濃度（すなわち、候補化合物のシステムに対する効果）の関数である。さらに、多色シンチラントを使い、放射性標識リガンド（または放射性標識受容体）と標識受容体（または標識リガンド）への結合を検出することもできる。シンチラントの減少は、候補化合物がリガンドと受容体間の対の結合を阻害した結果の一つであろう。このようにして、ＨＴＳ法を用いて、非常に多くの遺伝子を評価し、発現データセットを作製することができる。
【００８７】
アレイ実験に由来しようとあるいは他の方法に由来しようとも、取得されたデータは、通常、遺伝子発現の量または程度、および、遺伝子発現が顕著に増加または減少されたかどうかで表される。たとえば、アレイに由来するデータを正規化することを目的として（体系的なエラーを調節する目的として、物理的アレイの異なる領域のポイントに由来するデータを比較しすること）、データは１つまたはそれ以上の操作に曝されてよい。たとえば、コントロール・レベルに対する実験発現レベルなど、データは比の形で表されることが多い。この場合、コントロール・レベルは、同一遺伝子について未処理の発現レベル、歴史的非処理レベル、多くの遺伝子についてプールされた発現レベルなどであってよい。各データ・ポイントは、化合物（またはコントロール）、検出されたｍＲＮＡに対応する遺伝子またはポリヌクレオチド配列、および、発現レベルと関係がある。さらに、各データ・ポイントは、たとえば、時間、温度、対象動物の種類、対象動物の性別、対象動物の年齢、それ以外の対象動物に対する処理（絶食、ストレス、過去または現在の他の化合物の投与の有無、屠殺時間と方法など）、データが取り出された組織または細胞系、アレイのタイプとシリアル・ナンバー、実験日、実験依頼者などの他の実験条件からなることができる。
【００８８】
数百またはそれ以上の遺伝子から得たデータセットを調べる場合、現在のところ、実験中に発現レベルにおいて最大の可変性を呈する遺伝子を選ぶのが好ましい。我々の研究では、ほとんどの化合物では、高度の応答（たとえば、５倍またはそれ以上の発現レベルの増加）を示すのはわずかの遺伝子に限られ、それ以下ではあるが実質的な応答を呈したのは約１００個から５００個の遺伝子であった。ほとんどの遺伝子には顕著な応答は認められず、情報を失うことなく、残りの分析から除外することができる。観察された遺伝子レベルの可変性は、各遺伝子の利用可能な「ダイナミックレンジ」に調整することができる。たとえば、仮に遺伝子Ａの発現レベルの最大変化がわずか２倍で、遺伝子Ｂの発現レベルの最大変化が３０倍だとすると、２における遺伝子Ａは、４における遺伝子Ｂより、相対的な応答が強いと予測できるであろう。したがって、可能な可変性（たとえば、全実験について、歴史的に観察された最大可変性）に対する観察されたｖの比（たとえば、標準偏差）にもとづいて遺伝子を選ぶことができる。現在のところ、可変性によって遺伝子を等級化し、残りの分析では、最も可変性の大きい遺伝子を２００個選ぶのが好ましい。
【００８９】
ゲノム発現実験では、二次元の表またはマトリックスの形でデータを表すのが一般的である。これらの二次元の表またはマトリックスでは、各遺伝子は行に割り当てられ、各列は実験または実験条件に対応する。それとは対照的に、本発明の方法では、行に各化合物を行変数として割り当て、列に各遺伝子を割り当てる。次に、データ・レコードは、化合物でクラスタし、したがって、類似の遺伝子発現調整にもとづいて全化合物がグループ化される。こうすることで、使用した化合物の存在に最も影響される遺伝子を直接同定することができる。
【００９０】
現在のところ、様々な関連のある化合物（被験群）を、数個の実験群には関連のない化合物（対抗措置）と共に選択し、たとえば、投与後の複数の時間経過などの様々な実験条件下で、観察および分析を行うのが好ましい。被験群の化合物は、類似の作用機序を有するという理由で関連がある（または、同一の経路により作用する）のが、好ましい。グループ・サインを開発するためには、現在のところ、複数の異なる実験条件下で（たとえば、各化合物が複数の時間経過において検査されるなど）、被験群について少なくとも２つの化合物を選ぶのが、好ましい。被験群に含まれてよい被験化合物の最大数は、一般的に、入手できる関連のある化合物の数により制限されるが、好ましくは、いかなる場合も、多くても２００個である。対抗措置群化合物の数は、好ましくは、少なくとも２個、さらに好ましくは、少なくとも１０個で、好ましくは、多くても２００個、さらに好ましくは、１００個以下、最も好ましくは、５０個以下である。好ましくは、対抗措置群は、被験群に属する関連のある化合物の数より多い関連のある化合物群を含まないように、選択される。
【００９１】
化合物を試験し、得られたデータを上記のように処理する。続いて、好ましくは、主成分分析（ＰＣＡ）で分析し、分離されるクラスターを形成する処理（実験）のセットを決定する。いったん、どの処理が分離されるクラスタを形成するかを確立できれば、観察された化合物の効果に対し、どの遺伝子または遺伝子のグループが最も影響を及ぼすかを決定することができる。この目的を達成するいくつかの方法を以下に述べる。被験群に選ばれた化合物が活性で関連している場合、ＰＣＡ分析では、そのデータ・ポイントは特徴的なクラスターを形成するであろう。これらのデータ・ポイントは、対抗措置群（選ばれた化合物によって、１つまたはそれ以上のクラスタを形成することもあれば、形成しないこともある）に属するデータ・ポイントとは別個である。被験群は、１つのＰＣＡ軸に対し一般的に支配的であり、対抗措置群のほとんどまたは全部のデータ・ポイントは、その軸に沿って低い値を示す。次に、対応するＰＣＡ軸をなす遺伝子に関する固有値を調べ、どの遺伝子が被験群によって最も調整されているかを決定することができる。この遺伝子グループからプールが得られ、ここからグループ・サインを決定する。当該グループ・サインは、グループの活性（被験グループの化合物が示す共通の生物学的活性）を他の活性と区別することができる一組の遺伝子からなる。たとえば、下記の実施例１のフィブラートについて得られたグループ・サインは、フィブラート活性を有する化合物（クロフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブジルなど）を他の活性を有する化合物（エストロゲン様化合物、フェノールなど）と区別することができる。被験グループの活性に対応するＰＣＡ軸に含まれる遺伝子が、固有値によって選別、ランク付けされる場合（すなわち、主成分に対するそれらの寄与の順に）、リストの上位にランクされた遺伝子でグループ・サインが構成される。グループ・サインには、上位の遺伝子を全部含む必要はないが、少なくとも上位３個、好ましくは、上位１０個のうち少なくとも５個をさらに含み、さらに好ましくは、上位２０個のうち少なくとも１０個を含むべきである。
【００９２】
あるいはまた、グループ・サインは、どの遺伝子が実験群を対抗処置群から最もよく区別するかを判断する差別化の計算を行うことにより、定義され得る。例えば、Ｔ．  Ｒ．  Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９９）  ２８６（５４３９）：５３１−３７により公表されている差別化メトリックを用いることができ、そのメトリックでは差別化は以下に示すように、算出される。
【００９３】
ｍｅａｎ１−ｍｅａｎ２／（ｓｔｄｅｖ１＋ｓｔｄｅｖ２）  
式中、ｍｅａｎ１  およびｓｔｄｅｖ１は、平均発現レベルおよび遺伝子「１」の発現レベルの標準偏差値を表している。この計算により、一般的に非常に類似した（必ずしも同一ではないが）組のグループ・サインの遺伝子が産出される。現在は、改正された形式のＧｏｌｕｂメトリックを用いることが好ましく、そのメトリックでは差別化は以下に示すように、算出される。
【００９４】
Ｍｅａｎ１−ｍｅａｎ２／（ｓｔｄｅｖ１＋ｓｔｄｅｖ２＋０．０１）  
上記メトリックが好ましいのは、分母の標準偏差値（ｓｔｄｅｖ）項がゼロかあるいはゼロに近い場合の誤差を避けるためである。これは、少数の実験を行って群を定義する場合に、偶然によく起こる。この問題は、データが品質管理メトリックによりフィルター処理され、率が１にリセットされる（Ｌｏｇ  ｒａｔｉｏ＝０）場合に、悪化する。分母に加えられた０．０１という小さい値は、直線率を使う場合には、変更され得（率のｌｏｇ１０が現在は好ましいとされている）る。
【００９５】
希望により、グループ・サインは、発現パターンがそれに沿って広がっているＰＣＡ軸の反対側の両端にある二つあるいはそれ以上の化合物の発現パターンを比較することにより（たとえば、既知の生物活性の程度が高い化合物、および同一の生物活性を有するが、その程度が低い化合物を選択することにより）、さらに改良され得る。次に、これら二つの選択された化合物間で変異がないかどうか遺伝子（グループ・サインの一部として選択されるために分類済み）が比較される場合、当該グループの化合物の生物活性と最も密接な相関関係にある遺伝子を同定することが可能である。
【００９６】
ＰＣＡを用いて原型データを検査し、体系的誤差が存在するか否かを判断することは、時に有用である。例えば、データが実験日、研究室技術者などによって、クラスタしている場合、このデータのさらなる分析が一般的に必要である。全ての処置をサブグループに分ける（例えば、ＰＣＡ軸に沿って）体系的かたよりが起こり得るが、これは付加的な真の効果の検出および視覚化を排除しないことに留意すべきである。実験を３次元に集め、さらに複数の同時に起こる効果を視覚化するＰＣＡのこの能力は、体系的かたよりが含まれていても、２Ｄ階層的クラスタ分割（単一の次元が実験をクラスタするために用いられていて、その他の次元が遺伝子をクラスタするために用いられている）のようなその他の方法と比べて、きわだった利点である。
【００９７】
実験処理とサインの間の類似性は、多様な方法で定量化され得る。例えば、発現増加する遺伝子Ａ、Ｂ、およびＣから成るサインにおいて、実験の遺伝子Ａの誘導レベルが１％に達し（あるいは１％を越える）、遺伝子Ｂの発現レベルが３％に達し（あるいは３％を越える）、遺伝子Ｃの発現レベルが１２％に達する場合（あるいは１２％を越える）、特異性は０．０１Ｘ０．０３Ｘ０．１２＝０．００００３６と算出される。遺伝子がその発現レベルをより頻繁に（例えば、それぞれ４％、６％、および１５％の頻度で）現した場合は、結果のスコアはより低くなる（０．０４Ｘ０．０５Ｘ０．１５＝０．０００３）。その理由は、遺伝子発現レベルの特殊性、特色の程度が低くなるからである。あらゆる長さにおけるサインについてのこの計算を一般化すると、Ｓ＝πｘＲｅＲｋｘが得られ、式中ＲｅＲｋｘは先に定義されたように相対ランクである。このスコアは、それぞれの遺伝子の寄与を比較考察することにより、さらに精錬され得る。当該サインにおいて低いランクに位置づけられている遺伝子は、高いランクに位置づけられている遺伝子に比べ、重要性が低く、特殊性が低い。このように、加重特異性は、それぞれの遺伝子の確率を、そのサイン内のランクかあるいはまたそのランクの複数累乗あるいは高位累乗により、徐すことにより、算出され得る。遺伝子Ｘの誘導レベルが実験の１％に達し、遺伝子Ｙの誘導レベルが実験の３％に達し、遺伝子Ｚの誘導レベルが実験の１２％に達した発現が増加する遺伝子Ｘ、Ｙ、およびＺから成るある所与のサインが与えられると、単純付加的特異性［？？？］は、０．０１０＋０．０３０＋０．１２０＝０．１６０となる。各項が遺伝子ランクで除された加重特異性では、特異性は（０．０１０／１）＋（０．０３０／２）＋（０．１２０／３）＝０．０６５と算出される。第一遺伝子の予測レベルが低い（確率が高い）サインでは、高いスコアを有する（特異性のレベルが低いことをあらわしている）。例えば、遺伝子Ｘ、Ｙ、およびＺの確率を逆にした場合は、同じ特異性が（０．１２０／１）＋（０．０３０／２）＋（０．０１０／３）＝０．１３８と算出される。特異性のスコアは、遺伝子ランクへの依存性を増すことにより（例えば、遺伝子ランクの２乗または３乗を除数として用いることにより）、さらに重く加重値を与えられ得る。このように、ＸＹＺサインは、ランクの２乗を用いて、（０．０１０／１）＋（０．０３０／４）＋（０．１２０／９）＝０．０３０８と算出され、またランクの３乗を用いて、（０．０１０／１）＋（０．０３０／８）＋（０．１２０／２７）＝０．０１８２と算出される。再度、特異性のスコアに関する結果を、確率を逆にして比較すると（それぞれ、０．１２８６  および０．１２４１）、スコアの差が、加重値とともに増加するのがわかる。ＸＹＺと逆にしたＸＹＺ間の特異性スコアの差は、ランクにより加重した場合は０．０７２３、ランクの２乗により加重した場合は０．０９７８、ランクの３乗により加重した場合は０．１０５９。また、その代わりに、その他の加重要因を用いることも可能である。その例には、非整数累乗されたランク（例えば、２．１、２．５、４．２など）、ランクのロガリズム、任意に��択された１組の定数（例えば、除数として、最初の５つの  遺伝子については１、２、４、８、および１０を用い、それ以降の遺伝子については、１５を用いる）、などがある。平方根（＝１／２）のような、累乗＜１を用いることが可能である。これは、ランクの加重を減少させる効果を持つ。そうすることにより、長いサインに対し、加重を許容する。
【００９８】
グループ・サインは、特に、化合物の多様な酵素および結合タンパク質への影響に関するバイオアッセイ情報を組み合わせた場合に、実験群の化合物、さらにその延長として化合物に対する反応に最も関係している遺伝子および／またはそれらの化合物により誘発される生物学的影響により最も影響を受ける遺伝子調節経路を特定する上で有用である。
【００９９】
グループ・サインはまた、遺伝子発現パターンに基づいて、新しい化合物を分類あるいは特徴づける上で、有用であり、さらにそれに伴って開発の治療的に使えそうな活性を予測する上で、有用である。ある化合物に反応する数千の遺伝子の発現パターンを、多数の他の化合物に反応する数千の遺伝子の発現パターンと比較するのは、非常に大量の計算を要する作業である。しかしながら、治療用化合物の各クラスから一つあるいはそれ以上のサインを有する、グループ・サインのデータベースを編纂することが可能であり（例えば、フィブレート系サイン、ＡＣＥ阻害剤サイン、カスパーゼ阻害剤サインなど）、このデータベースでは各サインは、例えば、１０から２０の発現パターンしか含む必要がない。編纂されたデータベースは、遺伝子発現パターンの完全なデータベースに比べ、はるかに小さく、迅速に検索可能である。データベース内のいかなるグループ・サインを構成するためにも選択されなかった遺伝子は、全く調査される必要がない。
【０１００】
さらに、グループ・サインは、（ポリヌクレオチドアレー内であっても溶液相内であっても）あるプローブ・セットおよびその他の検出試薬に直接「具現化」され得る。例えば、基質は、複数のグループを与えられることが可能で、グループは、特異的なグループ・サイン内に存在する配列と特異的に結合することができるポリヌクレオチド配列を含んでいる。このように、あるグループ・サイン・チップは、フィブレート系グループ・サインに特異的なプローブを含む第一の領域、フェニル酢酸（例えば、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン）グループ・サインに特異的なプローブを含む第二の領域などを有することができる。各グループ・サインのプローブは、互いに重ならないように、または重なり合うとすればその程度が最小限にとどまるように、選択されるのが好ましい。あるいはまた、二つまたはそれ以上のグループ・サインが共通の遺伝子セットを含む場合は、当該チップは、この共通のセットに対応するプローブを二つのサインの間に含むように（例えば、サイン１は領域１と共通領域Ｘを構成し、サイン２は領域２と共通領域Ｘを構成するように）配列され得る。当該チップに存在するグループ・サインは、治療薬のサインと毒性の特異的機序のサインの双方を含み得る。このように、ｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡは、対象細胞に被験化合物を曝し、標識し、グループ・サイン・チップに直接使うことができる。被験化合物の活性および毒性は（存在する場合は）、この後、どのグループ・サインが結合を呈示するかを決定することにより、直接特定される。
【０１０１】
上記の試験を行うためのプライマー、プローブ、結合プローブ固体担体さらにその他の検出試薬を含む、先に説明されたアッセイ試薬は、添付文書およびその他の必要な試薬付きのキットとして提供され得る。キットには、通常、別々の容器に、プライマーとプローブの組み合わせ（固体基質にすでに結合されているかあるいはプライマーとプローブが別になっていてこれらを固体基質に結合するための試薬が付いている）、コントロール製剤（陽性および／または陰性）、標識された試薬（標識がシグナルを直接発生しない場合には、アッセイ・フォーマットに同一のシグナル発生試薬｛例えば、酵素基質｝が必要となる）が含まれている。試験実行指示書（例えば、書面、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）は、キットに含まれている。キットにはまた、使用されるアッセイによって、その他の包装された試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）が含まれている。上記のような、標準アッセイは、これらのキットを用いて行うことができる。
【０１０２】
個々の化合物を試験し、（対象細胞がそれらの化合物に対して特徴的な反応を呈することができる限り）同一グループ内の化合物を区別することができる特異的な薬剤サインを提供することができる。グループ・サインが由来する遺伝子の分類リストのグループ内で、ある選択された化合物をそれ以外の化合物と区別する遺伝子を選択し、対象細胞が選択された化合物に特徴的に反応する薬剤サインを得ることができる。薬剤サインは、選択された化合物に特有な毒性と副作用、さらに予想される相乗効果を特定するのに、有用である。すなわち、薬剤サインは、なぜある化合物の活性レベルが高かったり低かったりするのか、および／またはなぜある化合物がある特別な患者（患者の状態）に対しては、より良い治療選択肢なのかを説明あるいは判断するのに利用される。
【０１０３】
フェノフィブラート（ｆｅｎｏｆｉｂｒａｔｅ）、クロフィブラート（ｃｌｏｆｉｂｒａｔｅ）、およびゲムフィブロジル（ｇｅｍｆｉｂｒｏｚｉｌ）は、高リポタンパク過剰血症の治療に一般的に処方されるフィブリン酸誘導体である。
【０１０４】
【化１】
2005518793.tif 000002
フィブラート・グループのグループ・サインを決定した。このサインは、発現プロフィールを構成し、そのプロフィール内では、下記に記した遺伝子セットにおいて発現が著しく増加している。
【０１０５】
フィブラート系グループ・サイン
【０１０６】
【表１】
2005518793.tif 000003
このフィブラート系グループ・サインには、上にリストされている遺伝子のうち少なくとも３つが含まれており、好ましくはリストされている最初の５つの遺伝子のうち少なくとも３つ、さらに好ましくは、リストされている最初の１０の遺伝子のうち少なくとも５つ、よりさらに好ましくは、リストされている最初の１０の遺伝子のうち少なくとも７つを含む少なくとも１５の遺伝子、あるいはそれらと同等の遺伝子が含まれている。このグループ・サインは、好ましくは、多くても２５個の遺伝子、さらに好ましくは、２０個から２５個の遺伝子しか含まれていない。希望により、このグループ・サインは、時間と投与量の変化を含めることにより、さらに改良され得る。例えば、所与の投与量のフィブラート系化合物は、一つの遺伝子の発現を１２時間で、また別の遺伝子の発現を４８時間で、最大限に刺激する。こうして改良すれば、より正確なグループ・サインを得ることできる。
【０１０７】
このフィブラート系グループ・サインは、フィブラート系化合物と類似したあるいは同一の生物活性（すなわち、ＰＰＡＲα作用）を有するその他の化合物の同定に使用できる。例えば、一連の被験化合物は、多様な濃度で、ラットの肝臓の単離組織に投与され得る。投与後多様な経過時間にて、当該肝臓細胞を検査し、どの遺伝子の発現が増加したかを調べる。例えば、総ｍＲＮＡ  を、逆転写し、ｃＤＮＡを得、このｃＤＮＡは、例えば固体表面に結合しているような、一セットのポリヌクレオチド・プローブと共にハイブリダイゼーションさせることが可能である。このプローブのセットには、フィブラート系グループ・サインに対応するポリヌクレオチド配列を含むようにプローブを選ぶ。このように、強力なシグナル（選択されたフィブラート系グループ・サインに強力に合致するシグナル）を発生するいかなる被験化合物も、ＰＰＡＲα作用を有するものとして同定される。
【０１０８】
このフィブラート系グループ・サインは、フィブラート系薬剤検索用プローブ・セットと試薬、さらにＰＰＡＲα作用がある可能性のある化合物スクリーニング用プローブ・セットと試薬をデザインするために、さらに利用され得る。フィブラート系グループ・サイン・プローブは、多様な類似した（あるいは異なった）活性を検出するようにデザインされた広範なグループ・サイン・プローブの一部を使って得ることができる。例えば、フィブラート系グループ・サインだけから選択された２０個のポリヌクレオチド・プローブから成るキットが提供され得る。あるいはまた、そのようなプローブ・セットに、その他のグループ・サインから選択した一つまたはそれ以上のプローブ・セットを加えたキットが提供され得る。さらに、これらのプローブ・セットは、コントロールあるいはその他の条件（例えば、毒性）を検出するための別のプローブを含んでもよい。
【０１０９】
ゲムフィブロジルについて、特徴的な薬剤サインが得られた。この薬剤サインは、ゲムフィブロジルをその他のフィブラート系化合物と区別することができる。このサインは、ゲムフィブロジルに対して、発現が増加した上位の１０個の差別化遺伝子から取り出された。
【０１１０】
【表２】
2005518793.tif 000004
ゲムフィブロジルをその他のフィブラート系化合物と区別する遺伝子を選択することにより、当該サインから「フィブラート系活性」を実質的に差し引いた。この残りのサインは、フィブラート系活性以外の活性を示しているわけで、この場合は既知の副作用と相関関係を持つサインであることが判明した。すなわち、ゲムフィブロジルは、高リポタンパク過剰血症患者において、ＬＤＬ  （低密度リポタンパク質）レベルの上昇を誘発するとして知られている。
【０１１１】
一般的に一つあるいはそれ以上のマイクロ・プロセッサから成る多様なコンピュータ・システムは、本発明の方法により得られた情報を、保管、検索、および分析するために利用され得る。このようなコンピュータ・システムは、データ保管の一形式を有する単独コンピュータと同程度に簡潔であり得る（すなわち、コンピュータ読み取り可能の媒体で、その例としては、フロッピー（登録商標）・ディスク、ハード・ドライブ、ＺＩＰ（登録商標）ドライブのような取り外し可能ディスク記憶装置、ＣＤ−ＲＯＭ  およびＤＶＤのような光学媒体、磁気タイプ、ソリッドステートメモリ、磁気バブルメモリなどがある）。あるいはまた、このようなコンピュータ・システムは、例えば、ネットワーク・サーバを通して連結された２台あるいはそれ以上のコンピュータから成るネットワークを含め得る。このネットワークは、イントラネット、インターネット接続、またはその双方を含み得る。本発明の一実施例では、コンピュータ読み出し可能な媒体付きの単独コンピュータが提供されており、この媒体は、グループ・サイン・データベースを含み、さらに前記グループ・サイン・データベースは、一つまたはそれ以上のグループ・サイン記録を含む。このようなコンピュータ・システムは、好ましくは、システムが実験から得られた遺伝子発現および／またはバイオアッセイ・データをグループ・サイン・データベースの内容と比較することができるようにするプロセッサおよびソフトウェアをさらに含む。本発明のまた別の実施例では、単独コンピュータが提供されており、このコンピュータは、グループ・サインデータベースを含むコンピュータ読み出し可能な媒体（データベース・サーバー）と、さらに他のコンピュータが接続可能なネットワーク接続（ユーザー・システム）を装備している。好ましくは、このユーザー・システムは、プロセッサおよびソフトウェアを伴って提供されている。これらのプロセッサおよびソフトウェアの目的は、一つのあるいはそれ以上の実験から得られた遺伝子発現および／またはバイオアッセイ・データを受け取りまた保管すること、またデータベース検索を公式化し、ネットワーク上で転送し、あるいはデータベース・サーバーかまたはユーザー・システムで実行するためである。このようなコンピュータ・システムは、Ｇｅｎｂａｎｋ  およびＤｒｕｇＭａｔｒｉｘ  （Ｉｃｏｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）などの別のデータベースにさらに連結され得る。
【実施例】
【０１１２】
以下の実施例は、技術常識のある当業者のためのガイドとして提供されている。これらの実施例の何ものも、発明を制限することを意図するものではない。別途特定されない限り、全ての試薬は製造者の指示に従って使用される。
【０１１３】
実施例  １
（フィブラート系薬剤サイン）
Ａ）  データ収集  
週令４から６週のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）  ＢＲ  株  （ＶＡＦ  プラス）ラットに、標準げっ歯類飼料で飼育し、水道水は不断に与えた。実験動物の飼育・実験は、Ｓｅｑｕａｎｉ  Ｌｔｄ．  （Ｌｅｄｂｕｒｙ，  Ｈｅｒｅｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ）にて、行われた。
【０１１４】
全ての化合物が、オス二匹およびメス二匹のラットから成る群に、それぞれの投与量と時間を以って、投与された。安息香酸エストラジオール、ビスフェノールＡ（「ＢＰＡ」）、オクチルフェノール（「ＯＰ」）はピーナツ・オイル中で皮下投与し、クロフィブラート、フェノフィブラート、ゲムフィブロジルおよびフタル酸ジ−２−エチルヘキシル（ＤＥＨＰ）は、１％  ＮａＣＭＣを用いてチューブにより経口投与した。投与量は、それぞれの化合物につき、最大耐性量（ＭＴＤ）、７０％  ＭＴＤ、５０％  ＭＴＤ、および１０％  ＭＴＤであった。全ての最大耐性量は、文献あるいは経験に基づき、決定された。使用されたＭＴＤ量は、以下の通りである。安息香酸エストラジオール＝２  ｍｇ／ｋｇ；ＢＰＡ  ＝１５０  ｍｇ／ｋｇ；ＯＰ＝４５０  ｍｇ／ｋｇ；クロフィブラート＝２５０  ｍｇ／ｋｇ；フェノフィブラート＝１，０００  ｍｇ／ｋｇ；ゲムフィブロジル＝３００  ｍｇ／ｋｇ；ＤＥＨＰ＝１，０００  ｍｇ／ｋｇ。組織は、初回の投与から３時間、２４時間、あるいは７２時間後に採取した。３時間および２４時間経過観察では、動物に時間ゼロで投与し、３時間および２４時間でそれぞれ安楽死させた。７２時間経過観察では、動物に０時間、２４時間、および４８時間で投与し、７２時間で安楽死させた。組織を採取し、ドライアイスで冷凍後、−８０℃で保存した。
【０１１５】
肝臓組織の均質化、ｍＲＮＡ  の抽出、およびプローブの標識方法は、Ｈ．  Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  （２００１）  ２９（８）：Ｅ４１−１（本明細書に参考文献としてあげられている）の説明に従った。Ｊ．  Ｌ．  ＤｅＲｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９７）  ２７８（５３３８）：６８０−８６（本明細書に参考文献としてあげられている）に従い、各サンプルはハイブリダイズし、Ｒａｔ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ＬｉｆｅＡｒｒａｙｓ  （Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を実施した。コントロールｍＲＮＡ  は、年齢および株が一致した無処置動物（雄４０匹、メス４０匹）から得られた肝臓から取り出した。６８０のマイクロアレイは全て、ＧＥＭ  Ｔｏｏｌｓ（登録商標）を用いて、双方のチャンネル間で平均総シグナル強度正常化を行った後、同時に分析した。遺伝子による調節の程度は、正常化された率のｌｏｇ２として表した。欠けている値をｌｏｇ２  ｒａｔｉｏｓ＝０で置き換えた。
【０１１６】
６８０の全実験から、最大の変化を示す２００の遺伝子を、クローン率の標準偏差値（下記の表１にリストされている）により求めた。これらの遺伝子は、主成分分析（ＰＣＡ）の変数として、ＳｐｏｔｆｉｒｅＴＭ  ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅＴＭ  ６．３を用いて選択した。最も重要な遺伝子は、各ＰＣＡ次元の固有値を分類することにより同定した。
【０１１７】
【表３−１】
2005518793.tif 000005
【０１１８】
【表３−２】
2005518793.tif 000006
【０１１９】
【表３−３】
2005518793.tif 000007
【０１２０】
【表３−４】
2005518793.tif 000008
【０１２１】
【表３−５】
2005518793.tif 000009
【０１２２】
【表３−６】
2005518793.tif 000010
【０１２３】
【表３−７】
2005518793.tif 000011
全ての化合物について分子薬理学アッセイを、ＭＤＳ−Ｐｈａｒｍａサービス・カタログから選択された１３０種類の異なったアッセイを用いて実施した。アッセイのパネルは、薬剤作用および薬剤毒性の重要な部位を含むように選択した。予備試験において、３０  μＭで?５０％の部分的阻害作用を呈した化合物については、さらに、８点３倍濃縮滴定法を用いて、３０  μＭから１／２−ｌｏｇ間隔で、滴定し、ＩＣ５０値を求めた。
【０１２４】
（Ｂ）  分析  
図３に、バイオアッセイの実験結果を示す。阻害作用が＜５０％の化合物の測定値は、０とした。ゲムフィブロジル、クロフィブラート、およびＤＥＨＰ  は、行った１２３のアッセイで、全く作用を示さなかった。対照的に、ＯＰ  は、１２３のアッセイのうち１６のアッセイで、相互作用を示した。フェノフィブラートは、エストロゲン受容体および部位−２ナトリウムチャンネルとわずかに、また約６００  ｎＭのＫｄｓを有する５ＨＴ２ａおよび  ５ＨＴ２ｃと強力に相互作用した。この結果により、更なる研究に値するフェノフィブラートの新規の作用機序および適用が示唆された。
【０１２５】
被験群とコントロール群間で、発現レベルにおける最大の差を示している２００の遺伝子を選択し、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。化合物（遺伝子ではなくて）は、ＰＣＡ  により分類およびクラスタされ、図１に示すような３Ｄ描写で表された。この結果から、発現パターンがいくつかの差別化されたグループにクラスタするということが示唆される。フェノフィブラートおよびその他のペルオキシソーム増殖剤化合物（例えばＤＥＨＰ  ）は、一つのグループにクラスタするが、安息香酸エストラジオールおよびＢＰＡ  （双方とも純粋なエストロゲン受容体アゴニスト）およびビーイクル・コントロール群は、第二のグループにクラスタする。ＯＰは、ＰＸＲに対しても活性を示す作用の弱いエストロゲン受容体（「ＥＲ」）作用薬であるが、独特の位置におり、その他の化合物から分離されている。当該グループのそれぞれの化合物が、実験動物の性別により、さらに分かれている。
【０１２６】
３つのＰＣＡ成分を調べ、どの遺伝子がそれぞれの成分に寄与しているかを判断した。その結果を、表４に示す。この表には第一の主成分に寄与を与える遺伝子が、各主成分への寄与と共に、リストされている。第一のＰＣＡ  成分は、ペルオキシソーム増殖剤ＰＰＡＲα作用薬（フィブラートおよびＤＥＨＰ）の効果が優勢で、主として脂肪酸β酸化遺伝子の発現と関連している。ある種の遺伝子（特に、４−１２  Ｘ−染色体特異的転写遺伝子およびある種の性ステロイド代謝遺伝子）の発現に対する性別の影響は、第二の主成分で優勢である。第三の成分は、ＯＰ  （ＰＸＲ／ＥＲ  作用薬）の効果が優勢で、細胞外および血液タンパク遺伝子と関連しており、ストレス反応である可能性が示唆された。ＥＲ選択的作用薬（安息香酸エストラジオールおよびＢＰＡ  ）およびビーイクルは、分解できなかった。
【０１２７】
【表４】
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ＰＰＡＲα作用薬を一つの成分に、エストラジオールおよびＢＰＡを別の成分に、さらにＯＰを第三の成分に分離すると、肝臓に発現されているいくつかの受容体に対するこれらの化合物の活性との相関関係が見えてくる。ＤＥＨＰ  およびフィブラート系化合物は、ＰＰＡＲαを強く刺激し、肝臓において毒性を示すには、ＰＰＡＲαの存在が必要である（Ｊ．  Ｃ．  Ｃｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  （２０００）  ４０：４９１−５１８；Ｊ．  Ｍ．  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．  （１９９８）  ２６（２）：２４０−４６；Ｓ．  Ａ．  Ｋｌｉｅｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９９）  ２８４（５４１５）：７５７−６０）。これらの活性は、ＰＣＡのＰＰＡＲα作用薬のクラスタリングと相関関係にある。エストラジオールは、１０−１１  Ｍに近いＥＤ５０でエストロゲン受容体を刺激するが（Ｈ．  Ｍａｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  （２０００）  １４（３）：４２１−２８）、一方、ＢＰＡ、ＤＥＨＰおよびノニルフェノール（ＯＰの同族体）は、約１μＭ  のＥＣ５０  で、エストロゲン受容体を刺激する。ＤＥＨＰおよびノニルフェノールは、約０．５μＭ  のＥＣ５０で、ＰＸＲ  受容体を刺激するが、一方、エストラジオールおよびＢＰＡ  は、ＰＸＲ受容体に対して完全に不活性である（上記Ｈ．  Ｍａｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．）。ＥＲ  活性化合物（エストラジオールおよびＢＰＡ  ）は、ビーイクル・コントロールと共にクラスタした。その理由はおそらく、肝臓が微弱なエストロゲン反応を示すからであろう。ＰＸＲ受容体に作用したＤＥＨＰがＯＰと同じ遺伝子を誘引しなかったので、この違いから一つあるいは複数のその他の受容体に対する活性が予想される。ＯＰが他の受容体に作用する可能性は、上記の分子薬理学アッセイで、複数の活性が認められたことから示唆される（上記Ｈ．  Ｍａｓｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．も参照せよ）。
【０１２８】
どの遺伝子がＰＰＡＲα作用薬（「ＰＰ」）をＥＲおよびＥＲ／ＰＸＲ  化合物  （「非」）から区別するのに役立っているかをよりよく理解するために、Ｔ．  Ｒ．  Ｇｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９９）  ２８６（５４３９）：５３１−３７により開発された差別化メトリックを用いて、データが分析された。これらの計算により、ＰＰセットを非セットから独自に区別する多くの遺伝子が同定された。ＰＰを差別化する上位１００個の遺伝子のうち、３５個の遺伝子が、脂肪酸β酸化（ＦＡＢＯ）経路に属する遺伝子として容易に同定され、２５個の遺伝子が、新規の遺伝子であった。これらの新規の遺伝子のいくつかあるいは全てがまたＦＡＢＯ経路に属する遺伝子であるが、今まではそのことが判明していなかったのであろう。下記の表５は、上位２５個の遺伝子の差別化の値を表しており、これら２５個の遺伝子は、フェノフィブラート対ビーイクル（オスにおいて）、クロフィブラート対溶剤（オスにおいて）、および（比較のため）非フィブラート系オクチルフェノール対溶剤（オスにおいて）の組み合わせで比較したところ、差別化の程度がフィブレート化合物について高いことがわかった。この表では、負の値は発現増加を表しており、正の値は発現減少を表している。フェノフィブラートとクロフィブラートが密接な相関関係にあり、主として発現増加の程度において異なっていること、さらに双方ともオクチルフェノールとは実質的に非相関関係にあることが、この表から明確である。このことにより、本発明の方法によって、異なった生物学的活性を遺伝子発現パターンに基づいて区別できること、さらに本発明の方法によって、関連遺伝子を同定することができることが実証された。さらに、このことにより、本発明の方法によって、今まで未知であった活性を有する遺伝子（例えば、「命名されていないタンパク生成物」）を見出し、既知の活性を有する遺伝子と共に分類することができることがわかった。
【０１２９】
【表５−１】
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【０１３０】
【表５−２】
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【０１３１】
【表５−３】
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ＰＣＡおよび差別化計算により、強力に重なり合う遺伝子セットが同定された。ＰＣＡにより同定された上位１５個の遺伝子のうち１４個は、差別化計算でも上位１００個の遺伝子として同定された。二つの方法を用いてその他の薬剤とＰＰＡＲα作用薬とを差別化することにより、結果についての交差検定をすることができ、その結果、ＰＰＡＲ作用薬はＦＡＢＯ経路により薬剤活性を示すことが示唆された。
【０１３２】
あるグループ・サインが、ＰＰＡＲα化合物を非ＰＰＡＲα化合物とを差別化する上で上位２０個の遺伝子を同定することにより取り出され、さらにこのグループから、ＰＰＡＲα化合物グループの全構成化合物に対し最も一貫して反応した遺伝子が選択された。フィブレート系サイン（フェノフィブラート対ビーイクルで決定された）については、上位１０個の遺伝子［原典に誤りあり］では発現の増加が著しく、上位２０個の遺伝子でもやはり発現の増加が明らかであった。本質的には、当該グループ・サインからほんのわずかの遺伝子を選択するだけで、ＰＰＡＲα化合物の一般的活性をその他の化合物の活性から、充分に区別することができた。当該グループ・サインから選択した別の遺伝子をさらに加えれば、信頼度が高まる。例えば、４つフェノフィブラート実験を４つのビーイクル／コントロール実験から区別するサインは、本質的にフェノフィブラート実験のすべてを非フェノフィブラート化合物およびコントロール化合物から区別することができ、さらにフィブラート化合物の大部分についても同様に正確に分類した。
【０１３３】
各ＰＰＡＲα化合物について、ある薬剤に関する全ての処置と全てのその他の処置を差別化するサインを取り出すことにより、各薬剤のサインが得られた。このように、各薬剤のサインは、治療用化合物の同一クラスに属する化合物間における活性の差異を強調し、予想される副作用および／または相乗作用を同定することができる。例えば、ゲムフィブロジルの投与により、その他のＰＰＡＲαアゴニストによっては誘導されなかった１３個の遺伝子が誘導された。これらの１３個の遺伝子のうち８個の遺伝子が、コレステロールおよび脂肪酸の生合成に関与している。このことは、既知の臨床禁忌と相関関係がある。フィブレート系化合物は、主として肝臓内の脂肪酸化の速度を高めること（上記のＦＡＢＯ経路遺伝子の発現増加により促進するメカニズム）により、高リポタンパク過剰血症の治療に使われている。多くの患者、特に高トリグリセライド血症を患う患者において、ゲムフィブロジル（その他のフィブレート系化合物ではなく）の投与によって、ＬＤＬ  レベルの上昇が認められる。脂肪酸の生産が高まると、ＶＬＤＬおよびＩＬＤＬのレベルが高まり、次いでＬＤＬ  レベルも高まる。ゲムフィブロジルが脂肪酸／コレステロール生合成遺伝子の発現を高めるという観察により、ゲムフィブロジルの逆説的な臨床効果を分子的に説明できるであろう。
【０１３４】
個々の化合物および実験を選択する目的で薬剤サインの能力を検定する目的で、フェノフィブラート系薬剤サインを形成した。当該薬剤サインは、４つのフェノフィブラート実験を４つのコントロール／溶剤実験と比較することにより計算し、その計算結果から６７７個のその他の実験（化合物、投与量、および時間経過の組み合わせが、１個の実験を構成する）を分類した。次に、分類リストをグラフ化した（図３）。このグラフでは、各フェノフィブラート実験に１．０を、フェノフィブラート実験以外の各フィブラート実験に０．５を、各非フィブラート・コントロール実験０をに割り当てた。このグラフにより、この最小のフェノフィブラート薬剤サインは、大部分のフェノフィブラート実験をリストの上位に、大部分のフィブラート実験を上位付近（フェノフィブラート実験より低いが）に、さらに、全コントロール実験をフェノフィブラートより下位に（および、大部分のフィブラート実験より下位に）正しく選択していることが、わかる。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、主成分分析アウトプットの投影図である。ＰＣＡ１に沿ったフィブラート系化合物のクラスタ、ＰＣＡ２に沿った対象動物の雌雄の分離、さらに、ＰＣＡ３沿ったオクチルフェノールとの区別が、示されている。［００２７］  図１Ａおよび図１Ｂは、同一のデータを回転させた図である。
【図２】図２は、フェノフィブラート薬剤サインの特異性を図解するグラフである。薬剤サインは、４つのフェノフィブラート実験と４つのコントロール／ビーイクル実験間の比較に基づき、その後それを他の６６７の実験を選別するのに用いた。類似性スコアＳ  ＝  ΠｘＲｅｌｋｘにより、選別を行った。次に、各フェノフィブラート実験に１．０を、フェノフィブラート以外の各フィブラートに０．５を、および、非フィブラート各コントロールに０を割り当て、選別されたリストをグラフにした。この最小のフェノフィブラート薬剤サインは、大部分のフェノフィブラート実験をリストの上位に、大部分のフィブラート実験を上位付近（フェノフィブラートより低いが）に、さらに、全コントロール実験をフェノフィブラートより下位に（および、大部分のフィブラート実験より下位に）正しく選別していることが、グラフに示されている。
【図３】図３は、７種の核受容体作用薬（ｚ軸の前から後ろに：エストラジオール、ビスフェノールＡ、クロフィブラート、ビス（２−エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）、フェノフィブラート、ゲムフィブジル、および、オクチルフェノール）について行ったバイオアッセイの結果をグラフにしたものである。バイオアッセイは、１２３個のアッセイのパネルから選択し、当該バイオアッセイは、選択した化合物のどれかが活性を示した場合に、行った。この結果選ばれた２６個のアッセイを以下に列挙する：（ｘ軸）：アセチルコリンエステラーゼ（ａ）、アデノシンＡ２Ａ（ｂ）、アデノシンＡ３（ｃ）、アドレナリン作動薬・１Ｄ（ｄ）、アドレナリン作動薬・２Ｂ（ｅ）、アドレナリン作動薬・２Ｃ（ｆ）、アドレナリン作動薬β３（ｇ）、ノルエピネフリン輸送体（ｈ）、Ｌ型カルシウムチャンネル（ｉ）、シクロオキシゲナーゼＣＯＸ−２（ｊ）、ドーパミン輸送体（ｋ）、エストロゲン受容体（ｌ）、グルココルチコイド受容体（ｍ）、リポキシゲナーゼ１５−ＬＯ（ｎ）、ムスカリン受容体Ｍ１（ｏ）、ムスカリン受容体Ｍ２（ｐ）、ムスカリン受容体Ｍ３（ｑ）、Ｓ／Ｔキナーゼｐ３８・（ｒ）、ＹキナーゼＥＧＦ受容体（ｓ）、セロトニン５−ＨＴ２Ａ（ｔ）、セロトニン５−ＨＴ２Ｃ（ｕ）、セロトニン輸送体（ｖ）、ナトリウム・チャンネル（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ−ｓｉｔｅ  ２）（ｗ）、タキキニンＮＫ２（ｘ）、テストステロン受容体（ｙ）、トロンボキサンシンセターゼ（ｚ）。活性は、１／ＩＣ５０（ｙ軸）で示し、＜  ５０  ％  阻害はいずれも値０とみなした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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