(57)【要約】サイトカインがＴＮＦα、ＴＮＦβ、又はＩＦＮγの場合、腫瘍標的指向部分（ＴＴＭ）はＣＤ１３リガンド以外のものであり、サイトカインがＩＬ１２の場合、ＴＴＭはフィブロネクチンに対する抗体以外のものであり、サイトカインがＴＮＦの場合、ＴＴＭはトランスフェリン受容体に対する抗体以外のものであり、サイトカインがＴＮＦ、ＩＦＮγ又はＩＬ２の場合、その抗体はＴＡＧ７２抗原に対する抗体以外のものであるという条件で、サイトカインとＴＴＭとの複合体。
2005525115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインと腫瘍標的指向部分（ＴＴＭ、tumor targeting moiety）との複合体であって、サイトカインがＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、又はＩＦＮ−γの場合、ＴＴＭはＣＤ１３リガンド以外のものであり；サイトカインがＩＬ−２又はＩＬ−１２の場合、ＴＴＭはフィブロネクチンに対する抗体以外のものであり；サイトカインがＴＮＦの場合、ＴＴＭはトランスフェリン受容体に対する抗体以外のものであり；サイトカインがＴＮＦ、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−２の場合、ＴＴＭはＴＡＧ７２抗原に対する抗体以外のものであり；サイトカインがＩＦＮの場合、ＴＴＭはαｖβ３インテグリンリガンド以外のものであり；サイトカインがＴＮＦの場合、ＴＴＭはフィブロネクチン以外のものである、サイトカインとＴＴＭとの複合体。
【請求項２】
前記サイトカインがＴＮＦ−α又はＴＮＦ−βの場合、ＴＴＭは腫瘍特異性抗体以外のものであるという条件をさらに加えた請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記複合体がビオチン化ＴＮＦではないという条件をさらに加えた請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
前記サイトカインが炎症性サイトカインである請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記サイトカインが化学療法用サイトカインである請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
前記サイトカインがＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、２、４、６、１２、１５、ＥＭＡＰＩＩ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ又はケモカインである請求項１〜５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
前記サイトカインがＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β又はＩＦＮ−γである請求項８に記載の複合体。
【請求項８】
前記ＴＴＭが腫瘍血管系標的指向部分（ＴＶＴＭ、tumor vasculature targeting moiety）である請求項１〜７のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
前記ＴＶＴＭが、腫瘍血管系の受容体、マーカー、又は腫瘍血管系を標的にするペプチドなどの他の細胞外成分の結合相手である請求項１０に記載の複合体。
【請求項１０】
前記ＴＴＭが、腫瘍の受容体、マーカー、又は他の細胞外成分の結合相手である請求項１〜９のいずれかに記載の複合体。
【請求項１１】
前記ＴＴＭが、抗体、又はリガンド、或いはその断片である請求項１〜１０のいずれかに記載の複合体。
【請求項１２】
前記ＴＴＭが、ＮＧＲ又はＲＧＤモチーフを含有するか、又はＨＩＶ−ｔａｔ、アネキシンＶ、オステオポンチン、フィブロネクチン、Ｉ型若しくはＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸塩、エフリンであるか、又は癌胎児性フィブロネクチンとの結合相手であるか；或いはその断片である請求項１〜１１のいずれかに記載の複合体。
【請求項１３】
前記ＴＴＭが、ＮＧＲモチーフを含有する請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記ＴＴＭが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状又は環状ＣＮＧＲＣである請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
前記ＴＴＭが、ＲＧＤモチーフを含有する請求項１２に記載の複合体。
【請求項１６】
前記ＴＴＭが、ＶＥＧＦＲ、ＩＣＡＭ１、２又は３、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ３１、ＣＤ１３、ＶＣＡＭ−１、セレクチン、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩ、ＡｃｔＲＩＢ、ＣＤ４４、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、ＦＧＦ−１、２、３又は４、ＩＬ−１Ｒ、ＥＰＨＲ、ＭＭＰ、ＮＧ２、テナシン、癌胎児性フィブロネクチン、ＰＤ−ＥＣＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ又はＰＳＭＡを標的とする請求項１〜１１のいずれかに記載の複合体。
【請求項１７】
表Ａに示される、請求項１〜１６のいずれかに記載の複合体。
【請求項１８】
前記複合体が、融合蛋白質の形態をとる請求項１〜１７のいずれかに記載の複合体。
【請求項１９】
前記複合体が、核酸の形態をとる請求項１〜１８のいずれかに記載の複合体。
【請求項２０】
請求項１９記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０記載の発現ベクターにより形質転換した宿主細胞。
【請求項２２】
前記複合体の発現をもたらす条件で、請求項２１記載の宿主細胞を培養することを含む複合体の調製法。
【請求項２３】
製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と共に請求項１〜２２のいずれかに記載の複合体を含む製薬組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、さらに他の抗腫瘍剤又は診断用腫瘍画像形成化合物を含む請求項２３に記載の製薬組成物。
【請求項２５】
前記抗腫瘍剤が、ドキソルビシン又はメルファランである請求項２４に記載の製薬組成物。
【請求項２６】
癌の治療又は診断用医薬品調製のための、請求項１〜１９のいずれかに規定の複合体の使用、又は請求項２３〜２５のいずれかに記載の製薬組成物の使用。
【請求項２７】
癌の治療又は診断を必要とする患者に、請求項１〜１９のいずれかに規定の複合体、又は請求項２３〜２５のいずれかに記載の製薬組成物を有効量投与することを含む癌の治療又は診断の方法。
【請求項２８】
ＴＮＦと第１のＴＴＭ又はそれをコードするポリヌクレオチドとの複合生成物の有効量、及びＩＦＮ−γと第２のＴＴＭ又はそれをコードするポリヌクレオチドの有効量を含む製薬組成物であって、前記第１のＴＴＭと前記第２のＴＴＭが異なる受容体に対して競合する製薬組成物。
【請求項２９】
製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と一緒になった請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１又は第２のＴＴＭが、ＣＤ１３受容体のリガンドである請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１又は第２のＴＴＭが、ＮＧＲモチーフを含有する請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記第１又は第２のＴＴＭが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状又は環状ＣＮＧＲＣである請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第１又は第２のＴＴＭが、αｖβ３受容体のリガンドである請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
前記第１又は第２のＴＴＭが、ＲＧＤモチーフを含有する請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記第１のＴＴＭがＣＤ１３受容体のリガンドであり、前記第２のＴＴＭがαｖβ３受容体のリガンドである請求項２８に記載の組成物。
【請求項３６】
前記第１のＴＴＭがαｖβ３受容体のリガンドであり、前記第２のＴＴＭがＣＤ１３受容体のリガンドである請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は製薬組成物及びその利用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍の増殖と大きさは、首尾よく免疫療法を行う上での主な制限要因となっている。腫瘍の容積を縮小させるために外科的、化学的及び放射線療法が便利に用いられているが、その成功は、腫瘍の局在化、その拡散及び治療に対する固有の抵抗性に依って変わってくる。患者生存率にいてある程度の改善はあるものの、これら従来療法は、依然として、顕著な欠点を示している。手術による容積縮小は原発巣腫瘍の塊を除去する上で非常に効率的となり得るが、汎発性転移性腫瘍での臨床利用は限られている。一方、化学療法は、抵抗性変異体を選別して、治療不能になる危険性を伴っている。さらに、化学療法は一般に患者に対して非常に毒性があり、強い免疫抑制効果を有する。これらの理由から、低毒性であり、汎発病巣の根絶に効率の高い異なる原理に基づいた癌治療への新規な手法の開発が必要である。
【０００３】
いくつかのサイトカイン類の抗腫瘍活性が記載されている。既にヒトの治療に用いられているサイトカイン類もある。例えば、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γなどのサイトカイン類は、腎臓転移癌、毛様細胞白血病、カポジ肉腫、黒色腫、骨髄腫などの種々のタイプの腫瘍を有する患者において陽性の抗腫瘍活性を示している。ＩＦＮβ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−）α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−１、４、６、１２、１５及びコロニー刺激因子（ＣＦＳ）類は、いくつかのタイプの腫瘍にある一定の抗腫瘍活性を示している。
【０００４】
一般に、サイトカイン類の治療上の利用は、それらの全身毒性によって強く制限されている。例えば、ＴＮＦは、最初いくつかの腫瘍の出血性壊死を誘導する能力、及び種々の腫瘍系に及ぼすインビトロ細胞毒作用に関して発見されたが、その後、過剰産生条件の場合は、ヒトの身体に危険な影響を与え得る強い前炎症性活性を有することが判った。
【０００５】
全身毒性は、ヒトに対してサイトカイン類の薬理学上有効量を用いる場合の基本的な問題であるので、それらの治療有効性を維持しつつ、このクラスの生物学的エフェクターの毒性作用を減少させることを目指した新規誘導体並びに治療法が現在評価中である。
【０００６】
いくつかの新規手法は以下のことに関する：
ａ）ＴＮＦを腫瘍内に送達し局在濃度を高めることのできる融合蛋白質の開発。例えば、ＴＮＦ及び腫瘍特異性抗体からなる融合蛋白質が産生されている；
ｂ）抗腫瘍活性を維持しつつ全身毒性の低下したＴＮＦ変異体の開発。このように１つの受容体だけを選択的に認識できる変異体が既に調製されている；
ｃ）ＴＮＦの抗腫瘍活性を損なうことなくその毒性作用をいくらか低下させることのできる抗ＴＮＦ抗体の利用。そのような抗体は文献にすでに記載されている；
ｄ）半減期のより長いＴＮＦ誘導体（例えば、ポリエチレングリコールと複合したＴＮＦ）の利用。
【０００７】
ＥＰ２５１４９４は、アビジン又はストレプトアビジンと複合した抗体並びに複合抗体と、ビオチンと複合した診断薬又は治療薬からなる化合物とを複合化できる試剤を含み、抗体によって認識された標的細胞上のビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して診断薬又は治療薬の局在化が可能になるように、連続的に又は適切に遅らせて投与される、診断薬又は治療薬投与のシステムを開示している。前記の診断薬又は治療薬は、金属キレート類、特に放射性核種のキレート類並びにシスプラチン、ドキソルビシンなどの低分子量の抗腫瘍剤を含む。
【０００８】
ＥＰ４９６０７４は、ビオチン化抗体、アビジン又はストレプトアビジン及びビオチン化診断薬又は治療薬の連続的投与を提供する方法を開示している。リシンのような細胞毒性試剤が一般的に挙げられるが、多くは放射標識化合物に関する適用が開示されている。
【０００９】
ＷＯ９５／１５９７９は、リガンド又は抗リガンドと複合した特定の標的分子を含む第１の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の投与に続いて抗リガンド又はリガンドに結合した毒性試剤からなる第２の複合体の投与に基づく、細胞標的上に毒性の高い試剤を局在化する方法を開示している。
【００１０】
ＷＯ９９／１３３２９は、ある分子とＮＧＲ受容体のリガンドとの複合体に基づき、前記分子に腫瘍新生血管を標的とさせる方法を開示している。可能な候補として多数の分子が示唆されているが、具体的に記載されているのはドキソルビシンだけである。免疫応答を誘導するサイトカイン媒介物としてのＮＧＲ受容体リガンドの利用は開示されていない。
【００１１】
ＷＯ０１／６１０１７で、当発明者は、驚くべきことに、ある一定のサイトカイン類の治療指数が著しく改善でき、アミノペプチダーゼ−Ｎ受容体（ＣＤ１３）のリガンドとのカップリングによりそれらの免疫療法特性を増強できることが判明したと記載している。ＣＤ１３は、１５０ｋＤａの膜貫通糖蛋白であり、様々な種における保存性が高い。これは正常細胞並びに骨髄腫瘍系、脈管形成内皮及びいくつかの表皮において発現する。ＣＤ１３受容体は、通常、「ＮＧＲ」受容体として同定され、そのペプチドリガンド類は、アミノ酸「ＮＧＲ」モチーフを共有している。
【００１２】
Ｈａｌｉｎ  Ｃら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２６４〜２６９頁は、フィブロネクチンの癌退治性ＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒト抗体断片に融合したＩＬ−１２からなる融合蛋白を開示している。Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ９９（５）：１６５９〜６５は、ＩＬ−２とＥＤ−Ｂに対する抗体との融合蛋白を開示している。
【００１３】
Ｃｏｒｔｉ  Ａら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：３８６６〜３８７２頁は、ビオチン化抗体及びアビジン又はストレプトアビジンによって腫瘍を予め標的とした後、ビオチン化ＴＮＦを遅延送達することを含む、ＴＮＦを腫瘍に誘導する間接的手法、すなわち「予備標的化」手法を開示している。
【００１４】
Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０２７〜１０３７頁は、抗トランスフェリン受容体ｍＡｂの重鎖部遺伝子とＴＮＦ−α遺伝子との融合によって構築された融合蛋白を開示している。Ｙａｎｇら（１９９５）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｏｄｏｍａｓ  ６：１２９〜１３６頁は、ＴＮＦのＮ末端を、結腸直腸、胃及び卵巣腺癌によって発現される腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原に対するｍＡｂのヒンジ部のＣ末端と融合することを開示している。Ｙａｎｇら（１９９５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．３２：８７３〜８８１頁は、ＴＡＧ７２抗原との一価Ｆｖ−ＴＮＦ融合蛋白の産生を開示している。本発明者らの知る限り、これらの複合体のインビボ活性についてのデータは報告されていない。
【００１５】
Ｘｉａｎｇら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  ８：３２７〜３３７頁は、ＴＡＧ７２及びＩＦＮ−γに向けられた単鎖Ｆｖの組み換え二官能性分子を開示しており；また、Ｘｉａｎｇら（１９９４）Ｉｍｍｕｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７２：２７５〜２８５頁は、ＴＡＧ７２及びＩＬ−２に向けられた単鎖Ｆｖの組み換え二官能性分子を開示している。
【特許文献１】ＥＰ２５１４９４
【特許文献２】ＥＰ４９６０７４
【特許文献３】ＷＯ９５／１５９７９
【特許文献４】ＷＯ９９／１３３２９
【特許文献５】ＷＯ０１／６１０１７
【特許文献６】米国特許第５，５３６，８１４号
【特許文献７】米国特許第４，５７８，０７９号
【特許文献８】米国特許第５，５４７，９３６号
【特許文献９】米国特許第４，９８８，６２１号
【特許文献１０】米国特許第４，８７９，２３７号
【特許文献１１】米国特許第５，１６９，９３０号
【特許文献１２】米国特許第５，４９８，６９４号
【特許文献１３】米国特許第５，７００，９０８号
【特許文献１４】ＷＯ９７／０８２０３
【特許文献１５】米国特許第５，６１２，３１１号
【特許文献１６】米国特許第５，６７２，５８５号
【特許文献１７】米国特許第５，１２０，８２９号
【特許文献１８】米国特許第５，５８７，４５６号
【特許文献１９】米国特許第５，６４８，３３０号
【特許文献２０】ＥＰ−Ａ−２３９４００
【特許文献２１】ＷＰＩ−９９−２１５１５８／１９９９１８
【特許文献２２】米国特許第５，０９１，１７６号
【特許文献２３】米国特許第５，２１４，１３１号
【特許文献２４】米国特許第５，２６４，２０９号
【特許文献２５】米国特許第５，５８０，８５３号
【特許文献２６】米国特許第５，８９１，４１８号
【特許文献２７】米国特許第５，８１１，５１２号
【非特許文献１】Ｈａｌｉｎ  Ｃら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２６４〜２６９頁
【非特許文献２】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａら、（２００２）Ｂｌｏｏｄ９９（５）：１６５９〜６５頁
【非特許文献３】Ｃｏｒｔｉ  Ａら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５８：３８６６〜３８７２頁
【非特許文献４】Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１０２７〜１０３７頁
【非特許文献５】Ｙａｎｇら（１９５５）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｏｄｏｍａｓ  ６：１２９〜１３６頁
【非特許文献６】Ｙａｎｇら（１９９５）ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．３２：８７３〜８８１頁
【非特許文献７】Ｘｉａｎｇら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ８：３２７〜３３７頁
【非特許文献８】Ｘｉａｎｇら（１９９４）Ｉｍｍｕｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ７２：２７５〜２８５頁
【非特許文献９】Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）
【非特許文献１０】Ａｕｓｕｂｅｌら著、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社
【非特許文献１１】Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  Ｈら（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２６３５０〜７頁
【非特許文献１２】Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  Ｘら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６〜９頁
【非特許文献１３】Ｈａｌｉｎら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２６４〜２６９頁
【非特許文献１４】Ｂｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ、２０００年、ＴｉｂＴｅｃｈ  １８：２４３〜２５１頁
【非特許文献１５】Ｈｒｕｂｙら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：２５９〜３４５頁（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．１９９２年）
【非特許文献１６】Ｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ、１９９２年、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３９：５３３〜３９頁
【非特許文献１７】Ｍｏｒｏ、１９９７年
【非特許文献１８】Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第２版、編集者Ｗａｄｅ  ＆  Ｗｅｌｌｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
【非特許文献１９】Ｃｏｆｆｉｎら、１９９７年、「ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、編集者
【非特許文献２０】ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ７５８〜７６３頁
【非特許文献２１】Ｃａｓｓｅｌら１９９３年Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２１：５８５〜５９１頁
【非特許文献２２】Ｂｒｅｇｎｉら１９９２年Ｂｌｏｏｄ８０：１４１８〜１４２２頁
【非特許文献２３】Ｌｕら１９９３年Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１７８：２０８９〜２０９６頁
【非特許文献２４】Ｍｏｒｏ、１９９７年＃２８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、癌の治療及び診断のためのさらなる、そして改善された製薬組成物及び方法の必要性は依然として存在している。
【００１７】
本発明者らは、サイトカイン類の標的誘導送達のコンセプトが広く適用でき、驚きべきことに化学療法薬の療法指数を増大させることを見出した。これら複合体が作用するために必要な多価相互作用（標的受容体、ＴＮＦ受容体）の複雑性により、ＣＤ１３とは異なる血管受容体が作用し得ることは明瞭ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の態様によれば、サイトカインがＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、又はＴＩＦＮ−γの場合、腫瘍標的指向部分（ＴＴＭ、tumor targeting moiety）はＣＤ１３リガンド以外のものであり；サイトカインがＩＬ−２又はＩＬ−１２の場合、ＴＴＭはフィブロネクチンに対する抗体以外のものであり；サイトカインがＴＮＦの場合、ＴＴＭはトランスフェリン受容体に対する抗体以外のものであり；サイトカインがＴＮＦ、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−２の場合、ＴＴＭはＴＡＧ７２抗原に対する抗体以外のものであり；サイトカインがＩＦＮの場合、ＴＴＭはαｖβ３インテグリンリガンド以外のものであり；サイトカインがＴＮＦの場合、ＴＴＭはフィブロネクチン以外のものであるという条件で、サイトカインとＴＴＭとの複合体を提供する。
【００１９】
他の実施形態において、前記複合体はビオチン化ＴＮＦではない。
【００２０】
サイトカインは炎症性サイトカインであることが好ましい。
【００２１】
好ましい一実施形態において、サイトカインは化学療法上のサイトカインである。
【００２２】
サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、２、４、６、１２、１５、ＥＭＡＰＩＩ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ又はケモカインであることが好ましい。
【００２３】
一実施形態において、サイトカインはＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β又はＩＦＮ−γである。
【００２４】
標的化合物は、腫瘍血管の内皮細胞表面上、若しくは内皮細胞と密に接触している、又は内皮細胞近辺にある細胞外マトリックス内のいずれかで発現できる。
【００２５】
一実施形態において、ＴＴＭは腫瘍血管系標的指向部分（ＴＶＴＭ、tumor vasculature targeting moiety）である。
【００２６】
他の一実施形態において、ＴＶＴＭは、腫瘍血管系受容体、マーカー又は他の細胞外成分の結合相手である。
【００２７】
他の一実施形態において、ＴＴＭは、腫瘍受容体、マーカー又は他の細胞外成分の結合相手である。
【００２８】
他の一実施形態において、ＴＴＭは、抗体又はリガンド又はその断片である。
【００２９】
一実施形態において、ＴＴＭは、ＮＧＲ又はＲＧＤモチーフを含有するか、又はＨＩＶ−ｔａｔ、アネキシンＶ、オステオポンチン、フィブロネクチン、Ｉ型又はＩＶ型コラーゲン、ヒアルロン酸塩、エフリンであるか、又は癌退治性フィブロネクチンとの結合相手であるか；又はその断片である。一実施形態において、ＴＴＭはＨＩＶ−ｔａｔ以外のものである。
【００３０】
好ましい一実施形態において、ＴＴＭはＮＧＲモチーフを含有する。
【００３１】
ＴＴＭは、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状又は環状ＣＮＧＲＣであることが好ましい。
【００３２】
他の好ましい実施形態において、ＴＴＭは、ＲＧＤモチーフを含有する。
【００３３】
一実施形態において、ＴＴＭは、ＶＥＧＦＲ、ＩＣＡＭ１、２又は３、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ３１，ＣＤ１３，ＶＣＡＭ−１、セレクチン、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩ、ＡｃｔＲＩＢ、ＣＤ４４、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、ＦＧＦ−１、２、３又は４、ＩＬ−１Ｒ、ＥＰＨＲ、ＭＭＰ、ＮＧ２、テナシン、癌退治性フィブロネクチン、ＰＤ−ＥＣＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ又はＰＳＭＡを標的とする。他の実施形態において、ＴＴＭは、ＶＥＧＦＲを標的としていない。
【００３４】
前記複合体は、融合蛋白の形態をとることが好ましい。
【００３５】
他の実施形態において、前記複合体は、核酸の形態をとることが好ましい。
【００３６】
本発明の他の態様により、本発明の核酸を含む発現ベクターが提供される。
【００３７】
本発明の他の態様により、本発明の発現ベクターによって形質転換した宿主細胞が提供される。
【００３８】
本発明の他の態様により、複合体の発現を提供する条件下で請求項の宿主細胞を培養することを含む複合体の調製法が提供される。
【００３９】
さらに本発明の他の態様により、本発明の複合体を、製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と共に含む製薬組成物が提供される。
【００４０】
好ましい一実施形態において、前記組成物はさらに他の抗腫瘍剤又は診断用腫瘍画像形成化合物を含む。
【００４１】
さらなる抗腫瘍剤はドキソルビシン又はメルファランであることが好ましい。
【００４２】
本発明のさらなる態様により、癌の治療又は診断のための薬剤を調製する目的で、本発明による複合体又は架橋組成物の利用法が提供される。
【００４３】
他には、本発明は、癌の治療又は診断を必要とする患者に、本発明による複合体又は架橋組成物の有効量を投与することを含む癌の治療又は診断の方法を提供する。
【００４４】
本発明で使用し得る好ましい標的指向部分及びサイトカイン類の組合せは下記の表Ａに示してある。
【００４５】
【表１】
2005525115.tif 000003
2005525115.tif 000004
2005525115.tif 000005
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2005525115.tif 000022
【００４６】
上記の表において、用語「Ａｂ」は抗体を表わし、抗体及びリガンドはそれらの断片を含むことが理解されよう。
【００４７】
特に好ましい実施形態において、前記複合体は、ＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β及びＮＧＲ含有ペプチド又はＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β及びＲＧＤ含有ペプチドを含む。好ましい実施形態において、前記複合体は、融合蛋白質の形態をとる。
【００４８】
本発明の他の態様において、ＴＮＦ及び第１のＴＴＭ又はそれをコードするポリヌクレオチドの複合生成物の有効量並びにＩＦＮ−γ及び第２のＴＴＭ又はそれをコードするポリヌクレオチドの有効量を含み、前記第１のＴＴＭ及び前記第２のＴＴＭが異なる受容体で競合する製薬組成物が提供される。
【００４９】
本発明のいくつかの主要な利点
化学療法剤は、固形腫瘍に到達するためには、腫瘍血管に入り、血管壁を通過し、最終的に間質を通って移動しなければならない。不均一な腫瘍灌流、血管透過性及び細胞密度並びに間質圧の増加が、腫瘍血管から離れた新生物細胞内への薬剤の浸透を制限し、その結果、化学療法の有効性を制限し得る決定的な障壁となり得る（１）。したがって、腫瘍内への薬剤浸透の改善を目指す方法には実験的及び臨床的に大きな関心が向けられている。
【００５０】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ）及び強力な抗腫瘍活性を有する炎症性サイトカインがこの目的に開発し得ることを示唆する証拠は増大している。例えば、孤立させた一肢の部位潅流にメルファラン又はドキソルビシンと共にＴＮＦを加えることにより、末端軟組織肉腫又は黒色腫を有する患者において、化学療法剤単独で得られる応答率よりも高い応答率が得られている（２〜６）。ＴＮＦに誘導された内皮バリア機能の変化、腫瘍間質圧の低下、化学療法剤の浸透増大及び腫瘍血管の損傷が、ＴＮＦと化学療法との共同作用の重要な機構であると考えられている（３、４、７〜１０）。遺憾ながら、ＴＮＦの全身投与は、毒性が高すぎて適用できず、その忍容最高用量（８〜１０μｇ／ｋｇ）は予想される有効用量より１０〜５０倍低い（１１、１２）。このため、ＴＮＦの全身投与は放棄され、このサイトカインの臨床利用は、局所部位治療に限定されている。それにもかかわらず、ＴＮＦ活性のいくつかの特徴、特に腫瘍関連血管に関する選択性及び化学療法剤との共同作用により、より広汎な療法適用への可能性に関する希望は続いて育まれてきた（１３）。
【００５１】
ＴＮＦの血管作用は、局所有効性の増大及び療法用量の全身投与を可能にする方法を目指す「血管標的」法の開発に根拠を与えている。本発明者らは最近、腫瘍血管に対するＴＮＦの標的送達が、この蛋白質とＣＮＧＲＣペプチドとのカップリング、腫瘍新生血管系を標的とするアミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）リガンドによって達成できることを示した（１４）。本研究において本発明者らは、他の複合体による血管標的化が化学療法剤の腫瘍内への浸透を増大し、それらの有効性を改善し得るかどうかを調べた。さらに本発明者らは、前記複合体による血管標的化が、薬剤浸透バリアを低下させ、癌細胞に到達する化学療法剤量を増加させ得るかどうかを調べる。
【００５２】
抗腫瘍エフェクターＴ細胞によって完全に消滅できる数まで腫瘍細胞を減少させるためには、化学療法とは違って、免疫抑制的ではないような腫瘍容積縮小法を考える必要がある。
【００５３】
この観点から、腫瘍細胞を消滅させるために、腫瘍血管標的化が最も有望な癌治療法の１つであるように思われる。腫瘍に誘導された血管内皮は、非形質転換細胞からなり、したがって、それらは、療法によって誘導される変異を受けない。このように、腫瘍血管内皮を標的とする治療は原理的には、抵抗性変異体の選択という危険に陥らずに、反復して投与し得る。第２に比較的少数の腫瘍血管を消滅させることによって、生長するために血液支持物に依存している多数の腫瘍細胞を消滅することが可能になると考えられる。
【００５４】
したがって、免疫抑制を引き起こすことなく腫瘍関連血管の機能を損なわない、新血管形成を中断させる生物学的療法は、免疫療法又は他の治療的介入の前に、腫瘍容積を縮小させる魅力的な方法であると考えられる。
【００５５】
腫瘍血管並びに免疫系に影響を及ぼし得る種々のサイトカイン類及び生物学的応答モデファイアーの中でも、ＴＮＦ−αが単独で、又はインターフェロンγや化学療法剤と組み合わせて、より強力なものの１つであることは明らかである。このサイトカインが動物腫瘍において、２４時間以内に大量の出血性壊死と腫瘍縮小を誘導できることは、発見時からよく認められている。ＴＮＦが孤立させた一肢の灌流により、インターフェロンγ及びメルファランと組み合わせて、高用量で部位投与された場合、患者における末端の転移性黒色腫の腫瘍の大血管系及び小血管系を撹乱することもできることが現在十分に確証されている。ＴＮＦは、内皮細胞の損傷、血小板凝集、血管内フィブリン沈着と凝集、そして結果として腫瘍循環の阻止といったカスケード事象を引き起こすことができる。注目すべきことは、腫瘍に近接している正常な血管は影響を受けずにいることから、ＴＮＦは正常組織の血管系を腫瘍の血管系から何らかの方法で識別できることが示唆される。したがって、魅力的な可能性の１つは、他の療法の介入前に腫瘍容積縮小を誘導するＴＮＦを開発することである。
【００５６】
従来の化学療法剤よりもＴＮＦによる腫瘍容積縮小の他の有利となり得る点は、それが免疫抑制剤ではなく、逆に免疫応答の重要な活性化剤であることである。実際ＴＮＦは、有効な免疫応答に寄与する他の機構と同様、抗原提示細胞を活性化することができ、次にその細胞が免疫応答の重要な媒介物となる。
【００５７】
遺憾ながら、抗癌剤としてのＴＮＦの臨床使用は用量制限的全身毒性と療法指数の低さのため、今まで局所部位治療に限定されていた。
【００５８】
可溶性で生物活性のＴＮＦは、ピコモル量の不活性な単量体サブユニットへと徐々に分離するホモ三量体蛋白質である（１）。生物活性は、三量体ＴＮＦと、５５〜６０ｋＤａ及び７５〜８０ｋＤａの２つの異なる細胞表面受容体各々（ｐ５５ＴＮＦＲ及びｐ７５ＴＮＦＲ）との相互作用の際及びその後の同型集合の際に誘導される（２）。ｐ５５ＴＮＦＲは、大部分のＴＮＦ作用を媒介し（３、（４、（５、（６、（７）、一方、ｐ７５ＴＮＦＲはその高い親和性（ｐ５５ＴＮＦＲに関してＫｄ＝０．１×１０−９Ｍから０．５×１０−９）により、ＴＮＦの局所濃度の増大及びｐ５５ＴＮＦＲに対するリガンド通過において重要な役割を演じていると考えられている（８、（９）。これらの支持的又は調節的作用の他に、ｐ７５ＴＮＦＲによる直接的シグナル伝達もまた、胸腺細胞、線維芽細胞及びナチュラルキラー細胞の増殖、ＧＭ−ＣＳＦの分泌などのいくつかの細胞応答（２、（１０、（１１）、並びにＴＮＦの内因性膜結合形態によって誘導された局所限定応答の決定にも寄与できる（１２）。
【００５９】
ＴＮＦの抗腫瘍有効性を証明するために実施された臨床試験により、ＴＮＦの治療上有効な高用量の投与には許容できない高レベルの全身毒性が伴い、その用量制限的毒性は通常、低血圧であることが示された。したがって、腫瘍患者に対し、ＴＮＦを全身的に投与する試みは本質的に中止された。それにもかかわらず、いくつかの動物モデルにおけるＴＮＦの著しい抗腫瘍活性により、ヒトにおけるＴＮＦの治療適用の可能性に関する希望は続いて育まれてきた。しかし、このことは、全身投与の際のＴＮＦ毒性を減少させるか、又は実際の治療標的−腫瘍に対し、相対的又は絶対的な選択性を有するＴＮＦを送達するための方法を見出す必要性を示唆した。
【００６０】
ヒトにおけるボーラスＴＮＦ（静脈内）の最高忍容用量は、２１８〜４１０μｇ／ｍ２であり（２８）、動物における有効用量より凡そ１０倍低い（２９）。マウスモデルのデータに基づき、ヒトにおける抗腫瘍効果を達成するには、少なくとも１０倍高い用量が必要であると考えられている。
【００６１】
ＴＮＦの全身毒性を回避しつつ、その抗腫瘍性活性を開発するために探究された１つの手法は、部位（ｒｅｇｉｏｎａｌ）又は局所（ｌｏｃａｌ）投与であった。例えば、ＴＮＦの局所投与は、カポジ肉腫、プラズマ細胞腫、卵巣腺癌及び肝臓内の種々の転移性腫瘍において有望な応答率を示している（３０、（３１）。部位投与に関しては、末端黒色腫及び肉腫を治療するための孤立一肢の灌流において、高用量のＴＮＦをメルファランと併用した際に、目覚しい結果が得られている。このプロトコルによって、出血性壊死を受けている腫瘍との完全応答率の９０〜１００％が達成できており３２）、この所見は、いくつかの実験動物腫瘍モデルにおける前臨床試験の所見と一致している。
【００６２】
これらの結果に励まされはするが、これらの方法の適用可能性は主に２つの理由から、依然として限定的であると思われる。第１に、局所部位療法を考えることのできる多くの場合、将来、他の確立された介入手段（例えば、手術、放射線療法）の利用もなされることが多いと考えられる。第２に、定義上悪性疾患は拡散する傾向があり、局所部位的療法が排除されるこの状況では、新たな治療法に対する医療的必要性が極めて深刻である。高体温孤立させた一肢の灌流における初期の臨床試験において、メルファラン及びインターフェロンγと併用したＴＮＦの４ｍｇ特定用量により高い応答率が得られた（３２）。他の研究では、インターフェロンγを除くことができること、また、ＴＮＦのさらに低い用量で十分に治療応答を誘導できることが示された（３３、（３４）。これらの治療もまた、毒性の危険性が避けられないため（３５）、この設定においても、毒性作用を減じるため、ＴＮＦ誘導体による血管標的化が代替法となり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
次に、本発明の種々の好ましい特徴及び実施形態を非限定例により説明する。
【００６４】
一般に本明細書に挙げられた技術は当業界でよく知られているが、特にＳａｍｂｒｏｏｋら著、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌら著、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９９）第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社（並びに分子生物学における現プロトコルの完全版）を参照とした。
【００６５】
複合体
本発明は、遺伝子融合又は化学結合によって形成された少なくともサイトカインに結合した少なくとも１つの標的指向部分／ポリペプチドを含む分子である複合体に関する。「結合した」とは、第１の配列によって、第２の配列が標的細胞へと輸送されることが可能となるように、第１の配列と第２の配列とが結合していることを意味する。したがって、複合体は、輸送蛋白質をコードするＤＮＡ分子の遺伝子発現によるそのポリペプチド骨格を介して、輸送蛋白質がサイトカインと結合している融合蛋白質、直接合成された蛋白質及び予備形成した配列が架橋剤によって会合しているカップリング蛋白質を含む。この用語は、また、サイトカインと標的指向蛋白質との凝集体などの会合も含むものとしてここでは使用される。一実施形態によれば、該第２の配列は、ポリヌクレオチド配列を含み得る。この実施形態は蛋白質／核酸複合体として認め得る。
【００６６】
前記第２の配列は、第１の配列と同一種からのものであってよいが、天然状態とは異なった仕方で本発明の複合体に存在しているか、若しくは異なった種からのものとなり得る。
【００６７】
本発明の複合体は、輸送配列にカップリングしているペプチド配列に相当するエフェクター機能が発揮できるように、細胞に誘導することができる。
【００６８】
前記ペプチドは、サイトカインに直接、若しくは単独アミノ酸、アミノ酸配列又は６−アミノカプリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの有機残基であるスペーサーを介して間接的にカップリングできる。
【００６９】
前記ペプチドは、好ましくはサイトカインのＮ−末端に結合させて修飾サイトカインとその受容体との結合における妨害を最小にする。或いは、前記ペプチドは、分子上に天然に存在し得る、又は遺伝子工学法を用いて人工的に挿入したアミド又はカルボキシル結合アクセプターであるアミノ酸残基に結合できる。修飾サイトカインは、前記ペプチドをコードする５’隣接配列を含むｃＤＮＡを用いて調製することが好ましい。
【００７０】
好ましい実施形態により、ＴＮＦのアミノ末端がスペーサーＧ（グリシン）を介してＣＮＧＲＣペプチドと結合している、ＴＮＦとＣＮＧＲＣ配列との複合生成物が提供されている。
【００７１】
サイトカイン類
固形腫瘍化学療法の有効性にとって、新生物細胞内への薬剤浸透性は重要である。固形腫瘍内の癌細胞に到達するためには、化学療法剤は血管に入り、その血管壁を通過し、最終的には、間質を通って移動しなければならない。不均一な腫瘍灌流、血管透過性及び細胞密度並びに間質圧の増加が、新生物細胞内への薬剤の浸透を制限し、その結果、化学療法の有効性を制限し得る決定的な障壁となり得る。したがって、これらの要因に影響する作用を有するサイトカイン類が、本発明において有用である。本発明に使用し得るサイトカイン類の非限定的リストは、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、２、４、６、１２、１５、ＥＭＡＰＩＩ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ又はケモカインである。
【００７２】
ＴＮＦ
ＴＮＦは炎症性サイトカインであり、内皮バリア機能変化の誘導、腫瘍間質圧の低下及び化学療法剤浸透性の増大並びに腫瘍血管損傷の効果を有している。
【００７３】
腫瘍壊死分子の存在は、癌患者が細菌感染後、彼らの腫瘍の自然な後退を時々示したことが見られた時に先ず示唆された。引き続く１９６０年代の研究により、細菌産生物に応じて作成された宿主関連（又は内因性）媒介物が、前記の観察された効果の原因になっている可能性が示された。１９７５年に、細菌誘導循環因子がマウスの皮膚に移植された腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を有していることが示された。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）と名付けられたこの因子は、その後単離、クローン化され、免疫調節と炎症に関与する分子ファミリーのプロトタイプであることが判明した。ＴＮＦ及びＴＮＦスーパーファミリーの他のメンバーの受容体もまた、関連蛋白質のスーパーファミリーを構成している。
【００７４】
ＴＮＦ関連リガンド類は、通常、共通の特徴を多数有している。これら特徴の中には、全体的なアミノ酸（ａａ）配列相同性の程度の高さは含まれていない。神経増殖因子（ＮＧＦ）及びＴＮＦ−βを除いて、リガンド類はすべて、短い細胞質セグメント（１０〜８０のａａ残基）及び比較的長い細胞外部位（１４０〜２１５のａａ残基）を含有するタイプＩＩの膜貫通蛋白質（細胞外Ｃ−末端）として合成される。構造的には、ＴＮＦと関連していないＮＧＦは、ＴＮＦＲＳＦ低親和性ＮＧＦ受容体（ＬＮＧＦＲ）と結合する能力があるという理由だけで、このスーパーファミリーに含まれる。ＮＧＦは、古典的なシグナル配列ペプチドであり、分泌されている。ＴＮＦ−βは、やはり十分に分泌されているが、対照的にＩＩ型膜貫通蛋白質にはるかに多く関連した一次構造を有している。ＴＮＦ−βは、非機能的又は非有効的な膜貫通セグメントを有するＩＩ型蛋白質と考えることができよう。一般に、ＴＮＦＳＦのメンバーは、三量体構造を形成し、それらの単量体は、２つのシート構造に自身を配向させているβ類から成り立っている。これらの分子の三量体構造の結果、ＴＮＳＦ及びＴＮＦＲＳＦスーパーファミリーのリガンド類及び受容体類は、シグナル導入の間に「集合化」を受けることが示唆される。
【００７５】
ＴＮＦ−α：ヒトＴＮＦ−αは、２３３ａａの残基で、膜貫通蛋白質又は可溶性蛋白質のいずれかとして存在する非グリコシル化ポリペプチドである。２６ｋＤａ膜貫通蛋白質として発現された場合、ＴＮＦ−αは、２９ａａ残基の細胞質ドメイン、２８ａａ残基の膜貫通セグメント及び１７６ａａ残基の細胞外部位からなる。可溶性蛋白質は、８６ｋＤａのＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）を介した蛋白質分解の開裂事象により生成し、通常はホモ三量体として循環する１７ｋＤａ、１５７ａａ残基の分子を生成する。
【００７６】
ＴＮＦ−β／ＬＴα：他にリンフォトキシンα（ＬＴα）としても知られているＴＮＦ−βは、そのクローニングがＴＮＦ−αのクローニングと同時期であった分子である。ＴＮＦ−βは、１７１ａａ残基、２５ｋＤａグリコシル化ポリペプチドとして循環するが、１９４ａａ残基長のより大きな形態が見つかっている。ヒトＴＮＦ−βｃＤＮＡは、２０５ａａ残基（マウスでは２０２）のオープンリーディングフレームをコードし、恐らく分泌時に何らかのタイプの蛋白質加水分解処理が生じていると思われる。ＴＮＦ−αと同様、循環しているＴＮＦ−βは非共有結合三量体として存在しており、ＴＮＦ−αと同じ受容体に結合することが知られている。
【００７７】
一実施形態において、ＴＮＦは、ＴＮＦ受容体の１つと選択的に結合できるＴＮＦの変異体形態をとる（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ  Ｈら（１９９３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２６３５０〜７頁）；Ｖａｎ  Ｏｓｔａｄｅ  Ｘら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：２６６〜９頁）。
【００７８】
ＴＮＦの抗腫瘍活性を保持しつつ、その全身毒性の低下を目指すいくつかの手法が追求された。最終的な目標は前節における目標、すなわち治療指数の増大であるが、その根拠は著しく異なっている。単独の生物活性の一般的増大である前の場合、細胞毒性は最初、ＴＮＦの抗腫瘍活性のインビトロ関連を示すと考えられたが、今回はＴＮＦの生物学的プロフィルの選択的修飾によって、ある一部の活性は保存され、その他の活性は失われることになる。
【００７９】
この後者の根拠による研究は、２種のＴＮＦＲのうちの１種とだけ結合するＴＮＦ変異体を設計する可能性を大部分利用した。この方向における努力は、ヒトＴＮＦがマウスの２種のＴＮＦＲのうちの１種だけ（ｐ５５ＴＮＦＲ）と結合し、マウスｐ７５ＴＮＦＲとの相互作用は種特異的であるという所見によって開始された（２）。インビボ試験によってヒトＴＮＦの全身毒性は、正常マウスに投与した際のマウスＴＮＦの全身毒性より約５０倍低く、一方、抗腫瘍性活性は等しいということが示された（４４）。これらの所見は、ｐ７５ＴＮＦＲとの結合を維持したＴＮＦ変異体は天然のＴＮＦよりも、より好ましい治療指数を有し得ることを示唆した。実際、このような受容体選択的ＴＮＦ変異体がその後、部位配向変異誘発法によって得られた（４、（４５）。ｐ５５ＴＮＦＲ特異的変異体を用いた試験では、これが、インビボ抗腫瘍性活性に関しては、天然ＴＮＦと同様に有効であったが、他方、好中球及び内皮細胞（この２つの細胞型はＴＮＦ誘導全身毒性において重要な役割を演じていると考えられていた）に及ぼす活性は大きく低下したことが示された（６）。
【００８０】
これらの結果は、抗腫瘍療法におけるこれらの変異体の治療的利用の可能性の点で大いに励ましを与えるものではあったが、霊長類においても、ｐ５５ＴＮＦＲが全身毒性に重要な役割を演じており（４６）、その変異体に、ＩＬ−１、ＬＰＳなどのＴＮＦに対する感受性を高める薬剤が併用投与された場合、若しくは、この設定において最も重要なことだが、前に言及した、外から投与した物質に関して述べたのと同様な仕方で、ＴＮＦに対し生物を感作する腫瘍それ自体の存在下で（４７）毒性低下という点での利点が失われたという所見により、一旦高まった希望は大きく損なわれた。
【００８１】
上記に関し、本発明者らは、これら又は他のＴＮＦ変異体とαｖβ３リガンドとのカップリングにより、それらの治療指数の改善をもたらし得ることを教示する。
【００８２】
他の多くの炎症性サイトカイン類もまた、内皮血管透過性を高める性質を有しており、本発明がこのようなサイトカインの発現を増加させる薬剤と共にこのようなサイトカインへ適用できることが理解されるであろう。前炎症性サイトカイン類としても知られている炎症性サイトカイン類は５ｋＤａから７０ｋＤａの間の分子量を有する多数のポリペプチド及び糖蛋白質である。それらは、炎症応答に刺激的効果を有する。最も重要な炎症性サイトカイン類は、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８である。
【００８３】
炎症性サイトカイン類として分類されたいくつかのサイトカイン類の表を下記に示してある。
【００８４】
【表２】
2005525115.tif 000023
【００８５】
ＴＧＦβ：悪性転換増殖因子、ＬＩＦ：白血球阻害因子；ＯＳＭ：オンコスタチンＭ；ＣＮＴＦ：シリア線毛神経栄養因子；ＰＦ４：血小板因子４；ＰＢＰ：血小板塩基性蛋白質；ＮＡＰ２：好中球活性化蛋白質２；βＴＧ：βトロンボグロブリン；ＭＩＰ：マクロファージ炎症性蛋白質；ＭＣＰ：単球化学誘引蛋白質。
【００８６】
炎症応答のアップレギュレーションは、またＩＬ−１１、ＩＦＮα、ＩＦＮβ及び特にケモカインスーパーファミリーのメンバーによって行われる。いくつかの状況においてＴＧＦβは、好中球、Ｔリンパ球及び不活性単球に対する化学誘引効果を含め、多数の炎症性活性を有する。
【００８７】
ＩＬ−２
免疫及び炎症応答の媒介におけるＩＬ−２／ＩＬ−２Ｒ系の中心的役割のため、この系のモニタリングと操作が重要な診断的及び治療的意味を有していることは明らかである。ＩＬ−２は、腫瘍攻撃性のＬＡＫ及びＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）細胞の増殖及び活性を刺激する能力の点で、抗癌剤としての有望性を示している。しかし、ＩＬ−２毒性による問題に対してなお、懸念と利点調査がされている。本発明はこの問題を扱っている。
【００８８】
ＩＬ−１５
インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は、ＩＬ−２と多くの生物学的性質を共有しているが、アミノ酸配列の相同性を欠いている新規のサイトカインである。ＩＬ−１５は、元々マウスＴ細胞系、ＣＴＬＬ２に対するサル腎臓上皮細胞系（ＣＶＩ／ＥＢＮＡ）のマイトジェン活性に基づき、条件付けされた培地中に確認された。ＩＬ−１５はまた、Ｔ細胞増殖を刺激し、ＩＬ−Ｔと称された、ヒト成人Ｔ細胞白血病細胞系（Ｈｕｔ−１０２）によって産生されるサイトカインとして独立に発見された。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞及びＴＩＬ類の刺激剤としての活性に関して、ＩＬ−２は現在、癌及びウィルス感染の治療におけるその利用可能性を試験する臨床試験中である。ＩＬ−１５は同様な生物活性のため、同様の治療上の可能性を有しているはずである。
【００８９】
ケモカイン類
ケモカイン類は、リンパ球の輸送、補充及び再循環において機能する、多くは小型の分泌蛋白質のスーパーファミリーである。それらはまた、アレルギー応答、感染性及び自己免疫疾患、血管形成、炎症、腫瘍増殖及び血液形成発達などの多くの病理生理学的過程において重要な役割を演じている。この蛋白質の略８０パーセントが、成熟形態において、６６個から７８個のアミノ酸（ａａ）を有している。残りのものは、蛋白質コアの上流に生じるか、又は伸長したＣ末端セグメントの一部として、追加のａａを有して、より大型である。ケモカイン類はすべて、７つの膜貫通ドメインＧ蛋白結合受容体を介してシグナル伝達する。少なくとも１７種のケモカイン受容体が知られており、これらの受容体の多くはいくつかの異なったケモカインが同一の受容体を介してシグナル伝達できる無差別結合性を示す。
【００９０】
ケモカイン類は、保存されたａａ配列モチーフに基づきサブファミリーに分けられる。多くのファミリーメンバーは２つの分子内ジスルフィド結合を形成する少なくとも４個の保存されたシステイン残基を有している。サブファミリーは、最初の２つのシステイン残基の位置によって規定する：
・ＣＸＣケモカインとも称されるαサブファミリーは、最初の２つのシステイン残基を分けている１個のａａを有している。このグループは、最初のシステイン残基のすぐ前にあるｇｌｕ−ｌｅｕ−ａｒｇ（ＥＬＲ）ａａモチーフが存在するかしないかに基づいて、さらに小さく分けることができる。現在５種のＣＸＣ特異的受容体があり、それらはＣＸＣＲ１〜ＣＸＣＲ５と称されている。ＥＬＲ＋ケモカイン類は、ＣＸＣＲ２と結合し、一般に好中球化学誘引剤及び活性剤として作用する。ＥＬＲケモカイン類は、ＣＸＣＲ３〜ＣＸＣＲ５に結合し、主にリンパ球に対して作用する。本文執筆時に、科学文献にＣＸＣケモカイン類をコードする１４種の異なったヒト遺伝子が、場合によってはスプライシングにより与えられたさらなる多様性を有して報告された。
・ＣＣケモカイン類とも称されるβファミリーにおいては、最初の２つのシステインが介入ａａなしに互いに隣接している。現在、２４種のヒトβサブファミリーメンバーが識別されている。このグループの受容体は、ＣＣＲ１〜ＣＣＲ１１と称される。種々のＣＣファミリーメンバーの標的細胞としては、白血球の大抵の型が挙げられる。
・α及びβサブファミリーに入らないケモカイン相同性を有する２つの蛋白質が知られている。リンホタクチンは、第１と第３のシステインを欠いたγクラス（Ｃケモカイン）の単独メンバーである。リンホタクチン受容体は、ＸＣＲ１と称される。デルタクラス（ＣＸ３Ｃケモカイン）の唯一のメンバーであるフラクタルカインは、最初の２つのシステイン残基の間に３個の介入ａａを有している。この分子は、長いムチン様の柄に融合したＮ末端ケモカインドメインを有する膜貫通蛋白質であるという点で、ケモカイン類の中でも独特である。フラクタルカイン受容体は、ＣＸ３ＣＲ１として知られている。
【００９１】
ＶＥＧＦ
本発明はまた、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）にも適用できる。新血管形成は、先に存在する血管系から新たな血管が発達する過程である。それは、胚の発達、組織の正常な成長、傷の治癒、女性の生殖サイクル（すなわち、排卵、月経及び胚盤発達）における必須の役割並びに多くの疾患において主要な役割を演じている。特に関心が集中するのは癌に対してである。なぜなら、腫瘍は、新しい血液供給の発達がなければ、数ミリメートルの大きさ以上には増殖できないからである。また、新血管形成は腫瘍細胞転移の拡散と増殖にも必要である。
【００９２】
内皮にとって最も重要な増殖及び生存因子の１つがＶＥＧＦである。ＶＲＧＦは脈管形成と内皮細胞増殖を誘導し、脈管形成の調節に重要な役割を演じている。ＶＥＧＦは、４５ｋＤａのホモ二量体として分泌されるヘパリン結合性糖タンパクである。通常は、内皮細胞自身以外の大抵のタイプの細胞はＶＥＧＦを分泌する。最初に発見されたＶＥＧＦであるＶＥＧＦ−Ａは血管透過性を高めるため、それは血管透過性因子として知られていた。また、ＶＥＧＦは部分的には内皮細胞内の一酸化窒素シンターゼの刺激を介して血管拡張を引き起こす。ＶＥＧＦはまた、細胞移動を刺激し、アポトーシスを阻害することもできる。ＶＥＧＦ−Ａのいくつかのスプライシング変異体がある。主なものとしては、１２１、１６５、１８９、２０６アミノ酸（ａａ）が挙げられ、各々が特定のエキソン付加体を含む。
【００９３】
ＥＭＡＰＩＩ
内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ（ＥＭＡＰＩＩ）は、腫瘍血管発達における抗血管形成因子であるサイトカインであり、腫瘍の増殖を強力に阻害する。組み換えヒトＥＭＡＰＩＩは１６６個のアミノ酸残基を含有する１８．３ｋＤａの蛋白質である。ＥＭＡＰＩＩもまた、内皮血管透過性を高めることが判明している。
【００９４】
ＰＤＧＦ
血小板由来の増殖因子（ＰＤＧＦ）アンタゴニストが、一般的な固形腫瘍において広範囲の抗腫瘍剤の薬剤取り込みと治療効果を高め得ることも示唆されている。ＰＤＧＦは、３０ｋＤＡのサイトカインであり、創傷時に血小板により放出され、近隣の細胞が増殖して傷を修復することを促す。
【００９５】
ＰＤ−ＥＣＧＦ
その名称に示唆されるように、血小板由来の内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）は、最初は内皮細胞における有糸分裂を誘導する血小板の能力に基づいて、血小板から単離された。その関連蛋白質はグリオスタチンである。
【００９６】
標的指向部分
本発明者らは、腫瘍血管に対するサイトカイン標的化の方向付けによってサイトカイン類の治療指数を高めることができることを見出した。さらに、腫瘍細胞は、腫瘍血管系の内層の一部を形成し得ることが知られていることから、本発明は腫瘍細胞の血管系と同様、腫瘍細胞を直接標的にすることも包含する。任意の便利な腫瘍又は腫瘍血管系、特定の内皮細胞、標的指向部分が、本発明の複合体において使用できる、このような多くの標的指向部分が知られており、これら及び引き続いて利用可能な任意のものが本発明の範囲内に包含される。一実施形態において、標的指向部分は、腫瘍細胞によって発現した受容体のリガンドなどの結合相手又は腫瘍細胞に伴う細胞外マトリックスのマーカー又は成分に対する抗体などの結合相手である。より具体的には、標的指向部分は、腫瘍関連血管によって発現した受容体のリガンドなどの結合相手、又は血管形成脈管に伴う細胞外マトリックスの内皮マーカー又は成分に対する抗体などの結合相手である。用語の結合相手は、本発明では最も広い意味で用いられ、リガンドや抗体又はその結合断片などの天然、合成双方の結合ドメインを含む。したがって、前記結合相手は、受容体、細胞の細胞外成分のマーカーに結合できるＦａｂ、Ｆｖ、１本鎖Ｆｖ、ペプチド、又はペプチド模倣物、すなわちペプチド様分子などの抗体又はその断片となり得る。
【００９７】
以下のものは、前記複合体が標的化され得る好適な標的ドメイン及び受容体／マーカーの非限定例を表わす。
【００９８】
ＣＤ１３
驚くべきことに、アミノペプチダーゼ−Ｎ受容体（ＣＤ１３）のリガンドとのカップリングによって、ある一定のサイトカイン類の治療指数が著しく改善でき、その免疫療法特性が増強できることが判明した。ＣＤ１３は、様々な種において保存性の高い１５０ｋＤａの膜貫通糖蛋白質である。それは正常な細胞並びに骨髄腫瘍系、血管形成内皮及びいくつかの上皮において発現する。ＣＤ１３受容体は、通常、そのペプチドリガンドがアミノ酸の「ＮＧＲ」モチーフを共有している「ＮＧＲ」受容体として同定される。前記リガンドはＮＧＲモチーフを含む、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ又はシクロＣＮＧＲＣなどの直鎖又は環状ペプチドであることが好ましく、ペプチドＣＮＧＲＣであることがより好ましい。さらに詳細は、参照として本明細書に組み込まれている本発明者らのＷＯ０１／６１０１７に見ることができる。
【００９９】
ＴＮＦ受容体
ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーと同様に、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバーもまた共通の特徴を多く共有している。特に、ＴＮＦＲＳＦの分子はすべて、それらの細胞外ドメインに１つから６つのリガンド結合、４０ａａ残基のシステインの多いモチーフを含有するＩ型（Ｎ末端細胞外）膜貫通糖蛋白質である。また、機能性ＴＮＦＲＳＦのメンバーは、通常、システイン内ジスルフィド結合によって安定化している三量体又は多量体の複合体である。ＴＮＦＳＦの多くのメンバーと違って、ＴＮＦＲＳＦのメンバーは、膜結合形態と可溶性形態の双方において存在する。最後に、前記スーパーファミリーメンバーの細胞質ドメインにおけるａａ配列の相同性は２５％を超えないが、多くの受容体が様々な細胞にアポトーシスのシグナルを導入することができ、共通の機能を示唆している。
【０１００】
ＣＤ４０：ＣＤ４０は、Ｂ細胞の増殖と分化に関連することが最も多い５０ｋＤａ、２７７ａａ残基の膜貫通糖蛋白質である。様々なタイプの細胞に発現したヒトＣＤ４０ｃＤＮＡは、２０ａａ残基のシグナル配列、１７３ａａ残基の細胞外部位、２２ａａ残基の膜貫通セグメント、及び６２ａａ残基の細胞質ドメインをコードする。細胞外部位に、４つのシステインの多いモチーフがあり、それにセリンとトレオニンの多いジャクスタ膜近傍配列が伴っている。ＣＤ４０を発現することが知られている細胞としては、内皮細胞が挙げられる。
【０１０１】
ＴＮＦＲＩ／ｐ５５／ＣＤ１２０ａ：ＴＮＦＲＩは、核のある哺乳動物細胞の事実上すべてで明らかに発現する５５ｋＤａ、４５５ａａ残基の膜貫通糖蛋白質である。前記分子は、１９０ａａ残基の細胞外部位、２５ａａ残基の膜貫通セグメント、及び２２０ａａ残基の細胞質ドメインを有する。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの双方が、ＴＮＦＲＩと結合する。ＴＮＦＲＩを発現することが知られている細胞の中に内皮細胞がある。
【０１０２】
ＴＮＦＲＩＩ／ｐ７５／ＣＤ１２０ｂ：ＴＮＦＲＩＩは、元々ヒト肺線維芽細胞ライブラリーから単離された７５ｋＤａ、４６１ａａ残基の膜貫通糖蛋白質である。この受容体は、２４０ａａ残基の細胞外部位、２７ａａ残基の膜貫通セグメント、及び１７３ａａ残基の細胞質ドメインからなる。明らかに、ＴＲＲＥ（ＴＮＦ受容体遊離酵素）と呼ばれるメタロプロティナーゼによる蛋白加水分解開裂から生じるＴＮＦＲＩＩの可溶性形態が同定されている。その脱離過程は、可溶性ＴＮＦＲＩのそれとは独立していると思われる。ＴＮＦＲＩＩを発現することが知られている細胞の中に内皮細胞がある。
【０１０３】
ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ：ＯＸ４０Ｌの受容体であるＯＸ４０は、炎症部位においてＣＤ４＋Ｔ細胞の生存（及び恐らく免疫応答の延長）を促進すると思われる、発現の限定されているＴ細胞活性化マーカーである。ＯＸ４０Ｌの発現もまた限定されている。現在、活性化されたＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞及び血管内皮細胞のみがこの因子を発現すると報告されている。ヒトのリガンドは、２１ａａ残基の細胞質ドメイン、２３ａａ残基の膜貫通セグメント、及び１３９ａａ残基の細胞外部位からなる３２ｋＤａ、１８３ａａ残基のグリコシル化ポリペプチドである。
【０１０４】
ＶＥＧＦ受容体ファミリー
ＶＥＧＦ受容体ファミリーには３つの受容体がある。それらは、複数のＩｇＧ様細胞外ドメイン及びチロシンキナーゼ活性という共通の性質を有している。ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１、Ｆｌｔ−１としても知られる）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ又はＦｌｋ−１としても知られる）及びＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｋ−４としても知られる）の酵素ドメインは、挿入配列によって分けられている。内皮細胞は、その他のＶＥＧＦ受容体であるニューロピリン−１とニューロピリン−２も発現する。ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ１とＶＥＧＦＲ２並びにニューロピリン−１とニューロピリン−２に結合する。ＰＩＧＦとＶＥＧＦ−ＢはＶＥＧＦＲ１とニューロピリン−１に結合する。ＶＥＧＦ−ＣとＶＥＧＦ−Ｄとは、ＶＥＧＦＲ３とＶＥＧＦＲ２に結合する。ＨＩＶ−ｔａｔとそれに由来するペプチドもまた、ＶＥＧＦＲを標的にすることが判っている。
【０１０５】
ＰＤＧＦ受容体
ＰＤＧＦ受容体は、多くの一般的な固形腫瘍における間質画分に発現する。ラット結腸癌モデルにおいて間質に発現したＰＤＧＦ受容体を阻害すると、腫瘍間質液圧が低下し、腫瘍の毛細管輸送が増加する。
【０１０６】
ＰＳＭＡ
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）もまた、優れた腫瘍内皮マーカーであり、ＰＳＭＡ抗体を生成できる。
【０１０７】
細胞接着分子（ＣＡＭ類）
細胞接着分子（ＣＡＭ類）は、細胞、通常は、白血球を互いに、内皮細胞に、又は細胞外マトリックスに結合することに関与している細胞表面蛋白質である。創傷や感染に応じて産生された特定のシグナルが、ある一定のこれら接着分子の発現と活性化を制御する。次にこれらＣＡＭ類の、それらの受容体／リガンドに対する結合によって開始された相互作用や応答が、これら損傷に対する生体防衛の一系列を構成する炎症反応及び免疫反応の媒介において重要な役割を演じる。今までに特定されたＣＡＭ類の多くは、３つの一般的な蛋白質ファミリーに分けられる。すなわち、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、インテグリンファミリー又はセレクチンファミリーである。
【０１０８】
細胞表面分子のセレクチンファミリーのメンバーであるＬ−セレクチンは、ＮＨ２−末端レクチンＣ型ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、２つの相補的制御ドメイン、１５アミノ酸残基のスペーサー、膜貫通配列及び短い細胞質ドメインからなる。
【０１０９】
内皮細胞上にＬ−セレクチンに対する３種のリガンドが同定されているが、すべてがＯ−グリコシル化ムチン又はムチン様ドメインを含有している。第１のリガンド、ＧｌｙＣＡＭ−１は、ほとんど末梢及び腸間膜のリンパ節高内皮細静脈においてのみ発現する。第２のＬ−セレクチンリガンドは、元はｓｇｐ９０と呼ばれていたが、今ではＣＤ３４であることが示されている。多能性幹細胞の精製のための表面マーカーとしてしばしば用いられるこの唾液ムチン様糖蛋白質は非リンパ組織の広範囲において並びに末梢リンパ節の毛細血管に血管発現を示す。Ｌ−セレクチンに対する第３のリガンドは、粘膜リンパ節高内皮細静脈に見られるムチン様糖蛋白質であるＭａｄＣＡＭ１である。
【０１１０】
細胞表面分子のセレクチンファミリーのメンバーであるＰ−セレクチンは、ＮＨ２−末端レクチンＣ型ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、９つの相補的制御ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインからなる。
【０１１１】
四糖類のシアリルＬｅｗｉｓｘ（ｓＬｅｘ）は、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン双方のリガンドとして同定されているが、Ｐ、Ｅ、及びＬ−セレクチンはすべて適切な条件下でｓＬｅｘ及びｓＬｅａに結合できる。Ｐ−セレクチンはまた、マウス骨髄細胞上に存在する１６０ｋＤａの糖蛋白質及び骨髄細胞、血液好中球、単球、リンパ球上の糖蛋白質であって、Ｐ−セレクチン糖蛋白リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）と称され、Ｅ−セレクチンとも結合できるリガンドに選択的に結合することが報告されている。Ｐ−セレクチン媒介の白血球のローリングは、ＰＳＬＧ−１に特異的な単クローン抗体によって完全に阻害することができ、Ｐ−セレクチンがインビトロの条件下では様々な糖蛋白質と結合できるとはいえ、生理学的に重要な結合はより限定されている可能性が示唆される。Ｐ−セレクチンが骨髄細胞並びにＢ細胞及びＴ細胞の亜群の接着に関与して内皮を活性化することを示す様々な証拠がある。
【０１１２】
ＩｇスーパーファミリーＣＡＭ類
ＩｇスーパーファミリーＣＡＭ類は、カルシウム非依存性膜貫通糖蛋白質である。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーとしては、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ類）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）、血小板−内皮−細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１）及び神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）が挙げられる。各ＩｇスーパーファミリーＣＡＭは、いくつかのＩｇ様鎖内ジスルフィド結合したループを含有する細胞外ドメインと、保存されたシテイン残基、膜貫通ドメイン、細胞骨格と相互作用する細胞内ドメインを有している。典型的には、それらは、インテグリン類又は他のＩｇスーパーファミリーＣＡＭ類と結合する。ニューロンのＣＡＭ類は、ニューロンのパターン形成に関係していた。内皮ＣＡＭ類は免疫応答及び炎症に重要な役割を演じている。
【０１１３】
より詳述すると、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１、ＣＤ１０６、又はＩＮＣＡＭ−１１０）、血小板内皮細胞接着分子（ＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１）及び細胞間接着分子１、２、３（ＩＣＡＭ−１、２、３）は、白血球接続組織／内皮細胞相互作用に決定的に関与している５つの機能関連ＣＡＭ／ＩｇＳＦ分子である。主に内皮細胞上に発現したこれらの分子は一般に、血管壁を越えた白血球の移動を調節し、血管形成時の上皮発達のための付着点を提供し、すべて本発明における標的に好適である。
【０１１４】
ヒトＣＤ３１は、細胞接着分子（ＣＡＭ）又はＩｇＳＦ１のＣ２様亜群に属する１３０ｋＤａのＩ型（細胞外Ｎ末端）膜貫通糖蛋白質である。成熟分子は、長さが７１１アミノ酸（ａａ）残基であって５７４ａａ残基の細胞外部位、１９ａａ残基の膜貫通セグメント、及び１１８ａａ残基の細胞質尾部を含有する。細胞外部位には、９つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位があり、８０ｋＤａの予想分子量を有して、これらの部位の多くは占有されているようである。細胞外部位の最も顕著な特徴は、ＩｇＳＦのＣ２ドメインと類似した６つのＩｇ相同性単位の存在である。数に変化はあっても、これらのモジュールの存在は、すべてのＩｇＳＦ接着分子（ＩＣＡＭ−１、２、３及びＶＣＡＭ−１）の共通の特徴である。
【０１１５】
インテグリン類
インインテグリン類は、α及びβサブユニットの非共有結合したヘテロ二量体である。現在までに、１６αサブユニットと８βサブユニットが同定されている。これらは、様々な仕方で結合して、種々のタイプのインテグリン受容体を形成することができる。いくつかのインテグリンに関するリガンドには、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン類及びラミニンなどの細胞外接着マトリックス（ＥＣＭ）蛋白質がある。多くのインテグリン類は、フィブロネクチンや他の接着蛋白質に存在している、それらが結合するアミノ酸配列、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）を認識する。ＲＧＤ配列を含有するペプチド及び蛋白質断片をＲＧＤ認識インテグリンの活性を調節するために使用できる。したがって、本発明は、標的指向部分として、インテグリンに認識されるペプチドを使用できる。これらのペプチドは従来「ＲＧＤ含有ペプチド」として知られている。これらのペプチドは、インテグリンに結合するペプチドモチーフとして同定されたものを含む。これらのモチーフはアミノ酸配列：ＤＧＲ、ＮＧＲ及びＣＲＧＤＣを含む。前記ペプチドモチーフは線状でも環状でもよい。このようなモチーフは、ＲＧＤペプチドの記載に関連して参照として本明細書に組み込まれている以下の特許に、より詳細に記載されている：米国特許第５，５３６，８１４号は、シクラサイズ化ＣＲＧＤＣＬ、ＣＲＧＤＣＡ及びＧＡＣＲＧＤＣＬＧＡを記載している。米国特許第４，５７８，０７９号は、ＸとＹがアミノ酸である式Ｘ−ＲＧＤ−Ｔ／Ｃ−Ｙの合成ペプチドに関する。米国特許第５，５４７，９３６号は、Ｘがアミノ酸となり得る配列Ｘ−ＲＧＤ−ＸＸを含むペプチドを記載している。米国特許第４，９８８，６２１号は、多数のＲＧＤを含むペプチドを記載している。米国特許第４，８７９，２３７号は、Ｙがアミノ酸であるＲＧＤ−Ｙの一般的ペプチド及びペプチドＧ−ＲＧＤ−ＡＰを記載している。米国特許第５，１６９，９３０号は、αｖβ１インテグリンに結合するペプチドＲＧＤＳＰＫを記載している。米国特許第５，４９８，６９４号及び米国特許第５，７００，９０８号は、配列ＲＤＧを含有しているが、厳密に言えばＲＧＤ含有ペプチドではないβ３インテグリンサブユニットの細胞質ドメインに関する。ＷＯ９７／０８２０３は、構造的模倣体又はＲＧＤ結合部位である環状ペプチドを記載している。米国特許第５，６１２，３１１号は、Ｃ−Ｃ結合か、若しくはペニシルアミン又はメカプトプロピオン酸類縁体などの他の基を介して環化され得る１５個のＲＧＤ含有ペプチドを記載している。米国特許第５，６７２，５８５号は、ＲＧＤ含有ペプチドを包含する一般式を記載している。好ましいペプチド群は、ＲＧＤのアスパラギン酸残基がＯ−メトキシチロシン誘導体へと誘導化されるものである。米国特許第５，１２０，８２９号は、ＲＧＤ細胞接着促進結合部位及び疎水性接着ドメインを記載している。米国特許第５，５８７，４５６号には、Ｄ体が記載されている。米国特許第５，６４８，３３０号は、ＧＰＩｉｂ／ＩＩＩａに高親和性を有する環状ＲＧＤ含有ペプチドを記載している。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態において、標的指向部分は、αｖβ３又はαｖβ５インテグリンに対するリガンドである。
【０１１７】
細胞毒性化学療法剤を腫瘍に送達するためのαｖβ３リガンドの利用法は以前報告されている（ＷＰＩ  ９９−２１５１５８／１９９９１８）。しかし、これらの特許出願においては、化学療法剤又は毒素、又は抗血管形成化合物などの毒性化合物を腫瘍血管に送達するという考え方であった。
【０１１８】
これとはまったく対照的に、ＴＮＦは、阻害剤又は毒性化合物ではなくて、内皮細胞及び免疫細胞の機能の活性化剤である。例えば、ＴＮＦは、前血管形成分子であって、抗血管形成分子ではないと考えられる。さらに、ＴＮＦは、いくつかの腫瘍細胞系に対するその細胞毒性に関して発見されたにもかかわらず、ＴＮＦは、防御的機構が遮断（例えば、転写／翻訳阻害剤）されていなければ培養液中の細胞を死滅させることはめったにあり得ないことがよく知られている。
【０１１９】
したがって、ＴＮＦの抗腫瘍性活性は、種々の細胞に及ぼす活性化作用に基づいており、腫瘍細胞又は内皮細胞に対して直接的な細胞毒性作用を向けることはないか又はほとんどないように思われる。ＴＮＦは本明細書において、古典的な細胞毒性化合物としてではなく、生物学的応答調節剤として考えるべきである。
【０１２０】
このように、単に特許ＷＰＩ  ９９−２１５１５８／１９９９１８に基づくと、αｖβ３に送達されたＴＮＦの治療的特性は明瞭ではない。
【０１２１】
ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧモチーフを含有する分子は、マウス並びにヒトの活性化血管を標的にすると予想される（７２）。したがって、本発明者らがマウスにおいてネズミ類の対応物で観察したように、患者においてヒトＲＧＤ−ＴＮＦは、ヒトＴＮＦよりも、より優れた抗腫瘍活性が得られることが予想できる。
【０１２２】
ヒトにおけるボーラスＴＮＦ（静脈内）の最高忍容用量は、２１８〜４１０μ／ｍ２であり（２８）、動物における有効量（２９）の約１０倍低い。マウスモデルのデータに基づくと、ヒトにおける抗腫瘍効果を達成するためには１０〜５０倍高い用量が必要であると考えられている（３５）。孤立一肢の温熱灌流に関する最初の臨床試験では、メルファロン及びインターフェロンγと併用したＴＮＦの特定の４ｍｇ用量を用いて高応答率が得られた（３２）。他の研究では、インターフェロンγを省けること、そして、治療応答の誘導にはさらに低用量のＴＮＦで十分となり得ることが示された（３３、（３４）。これらの治療でも毒性の危険性は免れないため（３５）、少なくともこの設定において、毒性作用を低減するために、ＲＧＤ−ＴＮＦの利用が代替法になり得る。
【０１２３】
さらに、ＲＧＤ−ＴＮＦｃＤＮＡがＴＮＦ遺伝子の代わりに遺伝子治療目的に利用し得る一方、その治療指数を高めるためビオチン化ＲＧＤ−ＴＮＦが、原理的にビオチン化抗体及びアビジンによる腫瘍予備標的化と組み合わせて適用し得ると考えられる。
【０１２４】
アクチビン
ＡｃｔＲＩＩを発現することが知られている細胞としては、内皮細胞が挙げられる。ＡｃｔＲＩＩＢの発現は、ＡｃｔＲＩＩの発現と類似しており、やはり内皮細胞において見られる。ＡｃｔＲＩを発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。ＡｃｔＲＩＢもまた内皮細胞において確認された。
【０１２５】
アンジオゲニン
アンジオゲニン（ＡＮＧ）は、新血管増殖を誘導する能力に関して名付けられた１４ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。
【０１２６】
アネキシンＶ
アネキシンＶは、血管抗凝集活性を有する蛋白質のカルシウム及びリン脂質結合ファミリーのメンバーである。アネキシンＶには種々の同義語がある。すなわち、胎盤蛋白４（ＰＰ４）、胎盤抗凝集蛋白Ｉ（ＰＡＰＩ）、カルホビンジンＩ（ＣＰＢ−Ｉ）、カルシウム依存リン脂質結合蛋白３３（ＣａＢＰ３３）、血管抗凝集蛋白α（ＶＡＣａ）、アンコリンＣＩＩ、リポコルチンＶ、エンドネキシンＩＩ、及びトロンボプラスチン阻害剤である、アネキシンＶに対する結合部位の数は腫瘍細胞では６〜２４×１０６／細胞、そして内皮細胞では、８．８×１０６／細胞と報告されている。
【０１２７】
ＣＤ４４
白血球接着事象に明らかに関与している他の分子はＣＤ４４であり、これは造血細胞及び非造血細胞の双方に偏在して発現する分子である。ＣＤ４４は、場合によっては、スプライシングされた形態（その多くは活性が異なる）を生成させる能力が顕著である。腫瘍細胞が増殖と転移によって首尾よく発達するために用いる方法のいくつかにおいて、ＣＤ４４がその性質を変化させて、ある役割を演じているという推測が、この顕著な柔軟性から導かれた。ＣＤ４４は、８０〜２５０ｋＤａのＩ型（細胞外Ｎ末端）膜貫通糖蛋白質である。ＣＤ４４を発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。
【０１２８】
ＣＤ４４に対しオステオポンチン、フィブロネクチン、Ｉ型及びＩＶ型コラーゲン及びヒアルロン酸塩などの複数のリガンドがある。フィブロネクチンとの結合は硫酸コンドロイチンを発現し、エクソンＶ８〜Ｖ１１に局在化した硫酸コンドロイチン付着部位を有するＣＤ４４変異体に限られていることが報告されている。ヒアルロン酸塩の結合は、事実上すべてのＣＤ４４イソ体で可能であることが示唆されている。主な結合部位の１つは、エクソン２に集中し、リジン残基とアルギニン残基を含むことが示唆されている。ヒアルロン酸塩結合のためには、知られているヒアルロン酸塩結合モチーフの単独発現以外の因子も必要であると思われる。ヒアルロン酸結合の成功は、発現エクソン、特有の細胞質尾部、グリコシル化パターン及び細胞の活性化状態の組合せによって助長される。このように、そのヒアルロン酸塩結合機能に関しては、各ＣＤ４４発現細胞内に、多くの「潜在的」融通性が存在する。
【０１２９】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）
「線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）」という名称は、このサイトカインファミリーの限定的な表現である。ＦＧＦ類の機能は、細胞増殖に限定されていない。いくつかのＦＧＦ類は、確かに線維芽細胞の増殖を誘導するが、元々のＦＧＦ分子（ＦＧＦ−２又はＦＧＦ塩基）は、内皮細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、メラニン細胞、並びに他の細胞の増殖も誘導することが現在知られている。それはまた、脂肪細胞の分化を促進し、マクロファージ及び線維芽細胞ＩＬ−６の産生を誘導し、星状細胞の移動を刺激し、ニューロンの生存を延長化することができる。現在までのところ、ＦＧＦスーパーファミリーは、２３のメンバーからなり、それらはすべて、６個の散在した同一アミノ酸を含有する１２０アミノ酸（ａａ）の保存コア部位を含有する。
【０１３０】
ＦＧＦ−１：ヒトＦＧＦ−１（ＦＧＦ酸、ＦＧＦａ、ＦＣＧＦ、及びＨＢＧＦ−１としても知られている）は、３つの胚芽層すべての様々な細胞によって発現される１７〜１８ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。結合分子はＦＧＦ受容体のいずれかとなり得る。ＦＧＦ−１を発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。
【０１３１】
ＦＧＦ−２：ＦＧＦ塩基、ＨＢＧＦ−２及びＥＤＧＦとしても知られているヒトＦＧＦ−２は、細胞内活性と細胞外活性の双方を示す１８ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。分泌後、ＦＧＦ−２は、細胞表面のＨＳ又はマトリックスのグリコサミノグリカン上のいずれかに隔離される。ＦＧＦ−２は単量体として分泌されるが、細胞表面のＨＳは、後に二量体化してＦＧＦ受容体を活性化できる非共有の左右配置において、単量体のＦＧＦ−２を二量体化すると思われる。ＦＧＦ−２を発現することが知られている細胞としては、血管内皮細胞が挙げられる。
【０１３２】
ＦＧＦ−３：ヒトＦＧＦ−３は、ｉｎｔ−２遺伝子産物である［すなわち、レトロウィルス挿入後に偶然活性化された遺伝子（ｉｎｔ−２／ＦＧＦ−３）を含有するマウス染色体７上の部位である部位−２の組み込みに由来］。この分子は、多数のペプチドモチーフを含有する２８〜３２ｋＤａの２２２ａａ糖蛋白質として合成される。ＦＧＦ−３を発現すると報告された細胞は、発生細胞と腫瘍とに限られている。ＦＧＦ−３を発現することが知られている腫瘍としては、乳癌及び結腸癌細胞が挙げられる。
【０１３３】
ＦＧＦ−４：ヒトＦＧＦ−４は、発生調節遺伝子産物である２２ｋＤａ、１７６ａａ糖蛋白質である。この分子は、大型の定義不適切な３０ａａシグナル配列の他に２つのヘパリン結合性モチーフ（５１〜５５ａａ及び１４０〜１４３ａａに）を含有する２０６ａａの前駆体として合成される。ヘパリン結合性部位は、ＦＧＦ−４の活性に直接関連する。すなわち、ヘパリン／ヘパランがＦＧＦ−４の能力を調節して、ＦＧＦＲ１とＦＧＦＲ２を活性化する。ＦＧＦ−４を発現することが知られている細胞としては、抗腫瘍細胞と胎芽細胞の双方が挙げられる。ヒト胃がんにおける同定によって、替わりの名称の１つ（／ｈｓｔ−１／ｈｓｔ）が生まれ、一方、カポジ肉腫における単離が、他の名称（Ｋ−ＦＧＦ）を生む根拠となっている。
【０１３４】
ＩＬ−１Ｒ
ＩＬ−１は、特定の受容体に結合することによりその作用を発揮する。２つの異なるＩＬ−１受容体結合性蛋白質に加え、非結合性シグナル伝達付属蛋白質が同定されている。各々が３つの細胞外免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメインを有しているこから、ＩＶ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーになっている。２つの受容体結合蛋白質は、それぞれＩ型ＩＬ−１受容体（ＩＬ１ＲＩ）、ＩＩ型ＩＬ−１受容体（ＩＬ１ＲＩＩ）と称される。ヒト（ＩＬ１ＲＩ）は、内皮細胞から単離された５５２ａａ、８０ｋＤａの膜貫通糖蛋白質である。
【０１３５】
ＲＴＫ
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の新規のファミリーであるＥｐｈ受容体とそれらのリガンドであるエフリン類は、血管の組立て、血管形成、腫瘍形成及び転移に関与していることが判っている。クラスＡのＥｐｈ受容体とそれらのリガンド類が、腫瘍及び関連血管系において増加することも判っている。
【０１３６】
ＭＭＰ
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）類は、腫瘍の増殖、血管形成、浸潤及び転移に関与していた。それらを腫瘍マーカーとして利用することも示唆されている。
【０１３７】
ＮＧ２
ＮＧ２は、最初、未成熟神経細胞によって発現した細胞表面分子として同定された大型の膜構成硫酸コンドロイチンプロテオグリカンである。その後、ＮＧ２は、多種多様な未成熟細胞並びに悪性度の高いいくつかのタイプの腫瘍によって発現することが判った。ＮＧ２は、腫瘍血管系における標的分子として示唆されている。特に、コラゲナーゼ１（Ｃ１）は新たに形成された微小血管に存在する主なマトリックスメタロプロテイナーゼであり、新生血管形成のマーカーとして役立つ。
【０１３８】
癌退治性フィブロネクチン
フィブロネクチン（Ｆｎ−ｆ）の癌退治性断片の発現が血管形成時に増加することも判っており、腫瘍血管形成のマーカーとして示唆されている。一実施形態において、ＴＴＭは、フィブロネクチンの癌退治性ＥＤ−Ｂドメインに対する抗体又はその断片である。このような抗体及びＩＬ−１２との複合体の調製は、Ｈａｌｉｎら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２６４〜２６９頁に記載されている。
【０１３９】
テネイシン
テネイシンは、脳腫瘍、乳癌及び黒色腫などの悪性腫瘍に見られるマトリックス糖蛋白質である。その発現は悪性であるが、十分には分化されていない腫瘍であり、腫瘍血管との関連があることから悪性腫瘍生物学、血管形成の双方を理解する上で重要な標的となっているだけでなく、癌の治療標的又はマーカーでもある。
【０１４０】
標的指向部分は、腫瘍細胞又は腫瘍血管系表面分子に結合することができるポリペプチドであることが好ましい。上記に挙げたものと同様、知られている、又は利用可能となった他のこのような表面分子もまた、第１の配列によって標的化できる。
【０１４１】
表面分子に結合する分子を同定するために従来の蛋白質結合アッセイが適用できることは理解されるであろう。また、表面分子に結合する配列を開発するための構造に基づいた薬剤デザインが適用できることも理解されよう。
【０１４２】
標的分子を同定するために、合成化合物に対する上記のような高スループットスクリーニングも使用できる。
【０１４３】
本発明は、標的に結合できる中和性抗体が標的との結合に関して試験化合物と特異的に競合する競合的薬剤スクリーニングアッセイの使用も考慮している。
【０１４４】
結合相手（ＢＰ）
標的指向部分は、一般に１個または複数の結合ドメインを含むか又はそれで構成されている表面分子に対して、結合相手（ＢＰ）の形態をとる。
【０１４５】
リガンド
本発明の標的指向部分はリガンドの形態をとることができる。前記リガンドは、天然又は合成となり得る。用語「リガンド」は、また化学的に修飾されたリガンドも言う。ＢＰの１つ以上の結合ドメインは、例えば、受容体に対する天然リガンドからなってもよく、その天然リガンドは、前記受容体に結合親和性を保持している接着分子、又は増殖因子受容体リガンド（例えば、表面増殖因子）又は天然リガンドの断片となり得る。
【０１４６】
合成リガンドとしては、デザイナーリガンド類が挙げられる。本明細書で用いられる用語「デザイナーリガンド類」とは、受容体の形状と対比される三次元的形状に基づいて受容体と結合しやすい試剤を言う。
【０１４７】
抗体
或いは、結合ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）可変部位の重鎖配列及び軽鎖配列に由来してもよい。このような可変部位は、天然ヒト抗体又はげっし動物の抗体などの他の種からの抗体に由来し得る。或いは、前記可変部位は、ヒト化抗体などの設計抗体、若しくは免疫化又は非免疫化動物又は変異誘発ファージディスプレイライブラリーからのファージディスプレイライブラリーに由来し得る。第２の代替として前記可変部位は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来し得る。前記ＢＰは、多量体得るため、又は結合ドメイン間のスペーサーとして作用するための他の配列、若しくはＩｇヒンジ配列又は新規スペーサーなどのＢＰをコードする遺伝子内で制限部位の挿入から生じた配列及び設計リンカー配列を含有し得る。
【０１４８】
前記ＢＰは、１つ以上の免疫グロブリン可変部位に加えて、Ｉｇ重鎖不変部位の全部又は一部を含むことができ、したがって、天然Ｉｇの全体、設計Ｉｇ、又は設計Ｉｇ様分子、一本鎖Ｉｇ又は一本鎖Ｉｇ様分子を含むことができる。或いは、若しくはそれに加えて、前記ＢＰは、トキシンなど他の蛋白質からの１つ以上のドメインを含有できる。
【０１４９】
本明細書に用いられる「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなる蛋白質を言う。抗体は、完全な免疫グロブリン、又は種々のペプチダーゼ類による消化によって産生した十分に特定された断片などの多数の断片として存在し得る。種々の抗体断片が完全な抗体の消化に関して規定しているが、抗体断片が化学的に、又は組み替えＤＮＡの方法論を利用して、新規に合成できることを当業者は理解するであろう。したがって、本明細書において抗体という用語は、完全抗体の修飾によって産生した、又は組み替えＤＮＡの方法論を利用して、新規に合成された抗体断片も含む。用語「抗体」の使用に包含された抗体断片としては、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ完全体、及びＦｄ断片が挙げられる。
【０１５０】
本発明はまた、単クローン抗体又は多クローン抗体を表面蛋白質に提供する。したがって、本発明のポリペプチドに対する単クローン抗体又は多クローン抗体を産生する方法をさらに提供する。
【０１５１】
多クローン抗体が望まれる場合は、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を、エピトープ（類）を担持する免疫原生ポリペプチドによって免疫化する。免疫化した動物の血清を採取し、知られた操作によって処理する。エピソープに対する多クローン抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合は、この多クローン抗体を免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。多クローン抗血清の産生と加工の技術は、当業界に知られている。このような抗体が製造できるように、本発明は、動物又はヒトにおける免疫原として使用するための、他のポリペプチドに対して部分抗原化した本発明のポリペプチド又はその断片も提供する。
【０１５２】
ポリペプチド内の細胞表面結合性エピトープに向けられた単クローン抗体もまた、当業者により容易に製造できる。ハイブリドーマにより単クローン抗体を製造する一般的方法論はよく知られている。永続性の抗体産生細胞系は、細胞融合及び腫瘍遺伝子ＤＮＡによるＢリンパ球の直接的形質転換又はＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスによるトランスフェクションなどの他の方法によっても創製できる。エピトープ類に対して産生された単クローン抗体の一群を種々の性質、すなわちイソタイプやエピトープ親和性に関してスクリーニングできる。
【０１５３】
代替法としては、例えば、多様な相補性決定部位（ＣＤＲ類）を有する膜の表面に、ファージがｓｃＦｖ断片を発現するファージディスプレイライブラリーのスクリーニングが挙げられる。この方法は当業者によく知られている。
【０１５４】
本発明の目的のため、用語「抗体」は、反する特記がされない限り、標的抗原に対する結合活性を保持する完全抗体の断片を含む。上記のように、このような断片としては、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２断片並びに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。さらに、前記抗体とその断片は、例えば、ＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されたヒト化抗体となり得る。
【０１５５】
スクリーニング
一態様において、本発明は腫瘍又は腫瘍血管系細胞表面分子に結合することできる試剤をスクリーニングする方法に関するものであって、この方法は、前記細胞表面分子と試剤とを接触させ、前記試剤が、前記細胞表面分子と結合するかどうかを決定することを含む。
【０１５６】
本明細書に用いられている用語「試剤」としては、限定はしないが、天然又は非天然の任意の好適な供給源から得ることのできる若しくはそれらにより産生できる試験化合物などの化合物が挙げられる。前記試剤は、設計されるか、又はペプチド類並びに小型の有機分子などの他の化合物、特に新規の主要化合物を含み得る化合物のライブラリーから入手できる。例えば、前記試剤は、細菌、真菌、又は動物（特に哺乳動物）細胞又は組織から製造される天然物質、生物高分子又は抽出物、有機又は無機分子、合成試験化合物、半合成試験化合物、構造的又は機能的模倣物、ペプチド、ペプチド模倣物、試験化合物の誘導体、完全蛋白質から開裂したペプチド又は合成的に（例えば、ペプチド合成器を用いてなど）又は組み換え法により、又はそれらの組合せにより合成されたペプチド類、組み換え試験化合物、天然又は非天然試験化合物、融合蛋白質又はその等価物及び変異体、それらの誘導体又は組合せとなり得る。
【０１５７】
前記試剤は、アミノ酸配列又はその化学的誘導体となり得る。前記物質は、有機化合物又は他の化学物質となり得る。前記試剤はさらにヌクレオシド配列でもよく、それはセンス配列でもアンチセンス配列でもよい。
【０１５８】
蛋白質
用語の「蛋白質」は、一本鎖ポリペプチド分子、並びに個々の構成ポリペプチドが共有結合的手段又は非共有結合的手段によって結合している複数のポリペプチド複合体を含む。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸長さ、典型的には５、１０、又は２０個のアミノ酸長さのペプチドを含む。
【０１５９】
ポリペプチド相同体
本発明に用いられるポリペプチド配列は特定の配列又はその断片に限定されず、任意の供給源から入手される相同配列、例えば、関連ウィルス／細菌蛋白質、細胞相同体及び合成ペプチド類並びにそれらの変異体又は誘導体も含むことは理解されよう。本発明のポリペプチド配列は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされているポリペプチドも含む。
【０１６０】
ポリペプチド変異体、誘導体及び断片
本発明のアミノ酸配列に関連する用語「変異体」又は「誘導体」は、好ましくは、標的活性、好ましくは配列表に示されたポリペプチドの少なくとも２５％から５０％の前記活性、より好ましくは実質的に同一の前記活性を有するアミノ酸配列を結果として提供する配列からの、又はその配列への、１個（又はそれ以上）のアミノ酸の置換、変化、修飾、交換、削除又は添加を含む。
【０１６１】
このように、本発明における使用のために配列は修飾できる。典型的には、配列の活性を維持する修飾がなされる。例えば、一実施形態において、アミノ酸置換は修飾された配列が少なくとも２５％から５０％の前記活性、又は実質的に同一の活性を保持するという条件で１、２、又は３から１０、２０、又は３０の置換を行うことができる。しかし、代わりの実施形態において、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列への修飾は、前記ポリペプチドの生物活性を意図的に低下させるために行うことができる。例えば、標的分子に結合する能力は残しているが、機能的エフェクタードメインを欠いている端を切り取ったポリペプチドが有用なことがある。
【０１６２】
一般に、配列表に示された相当する部位に比して変異体又は誘導体のアミノ酸残基の、好ましくは、２０％、１０％又は５％未満を変更する。
【０１６３】
アミノ酸置換は、例えば、治療に投与されるポリペプチドの血漿半減期を増加させるために、非天然類縁体の使用を含んでもよい（治療に使用されるペプチド誘導体の産生に関するさらなる詳細については下記を参照）。
【０１６４】
保存的変換は、例えば、下表によって行うことができる。２段目の同一ブロック、好ましくは３段目の同一行のアミノ酸は互いに置換してもよい。
【０１６５】
【表３】
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【０１６６】
本発明のポリペプチドは、上記ペプチド類の断片及び配列断片を含むその変異体も含む。好ましい断片としては、エピトームを含むものが挙げられる。好適な断片は少なくとも５、例えば１０、１２、１５又は２０個のアミノ酸長である。それらは、また２００、１００又は５０個のアミノ酸長となり得る。蛋白質並びにその対立変異体及び種変異体のポリペプチド断片は保存置換を含めて１つ以上の（例えば、２、３、５又は１０の）置換、削除又は挿入を含有し得る。置換、削除及び／又は挿入が、例えば、組み換え技術によって行われた場合、配列表に示されたアミノ酸残基の２０％、１０％又は５％未満を変更することが好ましい。
【０１６７】
本発明の蛋白質は、典型的には、例えば、下記のような組み換え法によって作製される。しかしながら、それらは、固相合成などの当業界によく知られた技術を用いた合成法によっても作製できる。ペプチド類を化学合成する種々の技術は、Ｂｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ、２０００年、ＴｉｂＴｅｃｈ  １８：２４３〜２５１頁により調査されており、詳細は、本明細書に含まれた文献に記載されている。
【０１６８】
調製
ＣＤ１３Ｌ−ＩＦＮ複合体の調製法はＷＯ０１／６１０１７に記載されている。例えば、インターフェロンγは、遺伝子工学又は化学合成によってＣＮＧＲＣペプチドと融合できる。インターフェロンγの二量体構造があるとして、Ｎ末端又はＣ末端で２つのＣＮＧＲＣ部分を有する複合体が、多価高結合力相互作用をもたらすために望ましい。
【０１６９】
同様の方法を用いて、ＣＮＧＲＣ−ＴＮＦと組み合わせて用いるＧＲＧＤＣ−ＩＦＮ−γ複合体を調製することが可能である。
【０１７０】
αｖβ３−Ｌ−ＴＮＦと腫瘍細胞又は腫瘍関連血管を標的とする抗体又は抗体断片との複合体を調製し、このＴＮＦ誘導体の腫瘍への方向付けをさらに高めることは、当業者にとって容易であると思われる。例えば、ａｖｂ３Ｌ−ＴＮＦは、腫瘍関連抗原又は他の腫瘍血管形成マーカー類に対する抗体、例えば、マトリックスのメタロプロテイアーゼ類（５７）及び血管内皮増殖因子（５８）と、或いは抗テネイシン抗体や抗フィブロネクチンＥＤＢドメインなどの細胞外マトリックスの成分に対する抗体とカップリングすることができると考えられる。
【０１７１】
ａｖｂ３Ｌ−ＴＮＦ複合体は、多くの方法で調製できると考えられる。例えば、ａｖｂ３Ｌは、好ましくはヒト起源の、又はヒト化骨格を有する抗体又はその断片である。本発明の好ましい実施形態において、ａｖｂ３Ｌはペプチドである。例えば、ａｖｂ３に結合するペプチドの１つがファージペプチドライブラリーを用いて最近発見された。このペプチドは、配列ＣＲＧＤＣの存在によって特徴づけられる。ペプチド類又は抗体類は、よく知られた組み換えＤＮＡ技術を用いて、又は化学的複合によってＴＮＦとカップリングできる。これらの分子もまた間接的複合によって調製できると考えられる：例えば、それらは、非共有架橋剤として四価アビジンを用いてビオチン化及びカップリングの双方ができる。
【０１７２】
治療用ペプチド類
本発明のペプチド類は、患者に対し、治療用に投与し得る。例えば、免疫原生を低下させるため、患者体内での循環半減期を増加させるため、生物学的利用能を高めるため、及び／又は有効性及び／又は特異性を高めるために、単に天然アミノ酸からなるのではなく、修飾したペプチドを用いることが好ましい。
【０１７３】
治療適用に、ペプチドを修飾するための多くの方法が用いられてきた。１つの方法は、ペプチド又は蛋白質を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）などの様々なポリマー類に結合させることである。例えば、米国特許第５，０９１，１７６号、米国特許第５，２１４，１３１号、米国特許第５，２６４，２０９号を参照されたい。
【０１７４】
天然アミノ酸とＤ−アミノ酸及びＮ−メチルアミノ酸などの様々な未コード化アミノ酸又は修飾アミノ酸との交換もまた、ペプチド修飾に使用できる。
【０１７５】
他の方法は、３−（２ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル、６−［３−（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノン酸スクシンイミジル及び６−［３−（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノン酸スルホスクシンイミジルなどの二官能性架橋剤を使用することである（米国特許第５，５８０，８５３号を参照）。
【０１７６】
本発明のペプチドのコンホメーションが束縛されている誘導体を用いることが望ましい。コンホメーションの束縛は、安定性及びペプチドがとる三次元形状の好ましいコンホメーションに関連している。コンホメーションの束縛としては、ペプチド内の１つの残基のコンホメーション移動性制限などの局所束縛、いくつかの二次構造単位を形成し得る残基群のコンホメーション移動性制限などの部位束縛、及びペプチド構造全体などの全体的束縛が挙げられる。
【０１７７】
ペプチドの活性コンホメーションは、環化などの共有的修飾により、又はγラクタムの組み込み、又は他のタイプの架橋により安定化し得る。例えば、相互作用部位の両側にＬ−γラクタム部分を創製するために、側鎖を骨格に環化できる。一般的には、Ｈｒｕｂｙら、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：２５９〜３４５頁（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．１９９２年）を参照されたい。また、環化は、例えばシステイン架橋の形成、各々の末端アミノ酸のアミノ基と末端カルボキシル基とのカップリング、若しくはＬｙｓ残基又は関連相同体のアミノ基とＡｓｐ、Ｇｌｕ又は関連相同体のカルボキシル基とのカップリングによっても達成できる。ヨード酢酸無水物を用いてポリペプチドのαアミノ酸とリジン残基のεアミノ基とのカップリングも行われる。Ｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ、１９９２年、Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３９：５３３〜３９頁を参照されたい。
【０１７８】
米国特許第５，８９１，４１８号に記載された他の方法は、ペプチド構造に金属イオン錯体骨格を含めることである。典型的には、好ましい金属ペプチド骨格は、所与の錯体金属イオンの配位球に必要な特定の配位基の必要数に基づく。一般に有用であることが証明し得る多くの金属イオンは４から６の配位数を有する。ペプチド鎖中の配位基の種類としては、アミン、アミド、イミダゾール、又はグアニジン官能基の窒素原子；チオール類又はジスルフィド類の硫黄原子；及びヒドロキシ、フェノール、カルボニル、又はカルボキシ官能基の酸素が挙げられる。また、ペプチド鎖又は個々のアミノ酸は、例えば、オキシム、ヒドラジノ、スルフヒドリル、ホスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペリジノ、又はモルホリノなどの配位基を含むように化学的に変化させることができる。ペプチド構築物は線状又は環状となり得るが、典型的には線状構築物が好ましい。小型の線状ペプチドの一例は、主鎖に４個の窒素（Ｎ４錯体化システム）を有し、配位数４を有する金属イオンと錯体化し得る、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである。
【０１７９】
治療用ペプチドの性質を改善するさらなる方法は、非ペプチドのペプチド模倣物の使用である。ペプチドの正確な構造を明らかにするために様々な有用な方法が使用し得る。これらの方法としては、アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶学、質量分析、核磁気共鳴分析、コンピュータ支援分子モデリング、ペプチドマッピング及びこれらの組合せが挙げられる。ペプチドの構造分析は一般に、ペプチドのアミノ酸配列、並びにその原子成分の三次元配置を含む膨大なデータを提供する。この情報から、治療活性にとって必要な化学的機能性を有するが、より安定な、例えば、生物学的分解に対し、より感受性の低い非ペプチドのペプチド模倣物を設計できる。この方法の一例は、米国特許第５，８１１，５１２号に提供されている。
【０１８０】
本発明の治療用ペプチドを化学合成する方法は、上記の文献に記載されており、又、Ｂｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ、２０００年、ＴｉｂＴｅｃｈ１８：２４３〜２５１によっても調べられ、その中に含まれる文献に詳述されている。
【０１８１】
二官能性誘導体
本発明のさらなる態様は、腫瘍抗原又は他の腫瘍血管形成マーカー類、例えばα−インテグリン類、メタロプロテイアーゼ類又は血管増殖因子或いは抗テネイシン抗体又は抗フィブロネクチンＥＤＢドメインなどの細胞マトリックスの成分に向けられた抗体又はその断片に対してＴＴＭで修飾されたサイトカイン類が抗体又はその断片と複合している二官能性誘導体によって提供される。胃線癌及び卵巣線癌によって発現する腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原に対するＴＮＦとｍＡｂのヒンジ部との間の融合蛋白質の調製が最近報告された。
【０１８２】
本発明のさらなる態様は、ビオチン／アビジン系による腫瘍前標準化によって提供される。この方法によると、三次複合体が腫瘍の抗原性部位に種々の段階で得られるが、それは以下のものによって形成される：１）ビオチン化ｍＡｂ、２）アビジン（又はストレプトアビジン）及び３）ＴＴＭ及びビオチンで修飾された二価サイトカイン。免疫複合体による従来の標的化に比して予備標的化法は、標的に向かう活性分子の比率を実際に増加させ、活性分子を遊離し、したがって治療毒性を低下させることができることを多数の論文が証明した。この方法は、通常のＴＮＦが不活性の条件下、インビトロ細胞毒性を誘導し、腫瘍細胞増殖を低下させる能力のあるビオチン化ＴＮＦによって良好な結果を生じた。予備標的化法はまた、腫瘍抗原と修飾サイトカインに同時に結合する二重特異性抗体を用いて、二段階操作で実施できる。癌胎児性抗原及びＴＮＦに対して方向付けられた二重特異性抗体の利用は最近、ＴＮＦ腫瘍予備標的化の手段として記載された。
【０１８３】
腫瘍予備標的化は、最近開発された他の方法である。予備標的化は、「２ステップ」法又は「３ステップ」法によって、種々多様なクラスの化合物を用いて実施できる（５９）。腫瘍の放射免疫シンチグラフィに適用されたアビジン−ビオチン系に基づいた一特定例が、この原理の説明に役立てることができる。この場合、腫瘍関連抗原に特異的なビオチン化ｍＡｂが先ず投与される（「標的」分子、第１ステップ）。この１日後にアビジン又はストレプトアビジンを投与し（「追跡」分子、第２ステップ）、四価の高分子がビオチン化ｍＡｂを複合体化し、過剰の循環分子の迅速な除去を促進する。さらに１日後、放射核標識化したビオチン（「エフェクター」分子、第３ステップ）を投与する。これは、「標的指向」高分子と「追跡」高分子の双方が循環から効率よく除かれた時期に当たる。このことにより、エフェクターが迅速に拡散して腫瘍に局在化すること、並びに過剰の循環遊離分子を迅速に排出することが可能となる。相当長い期間循環し、そのために放射免疫シンチグラフィにおける背景及び放射免疫療法における毒性の副作用を増大させる直接標識化ｍＡｂとは明らかに対照的である。予備標的化法は、免疫複合体による従来の標的化に較べて実際に標的対血液非を大きく改善でき、治療の毒性を低下できることが、いくつかの報告で示されている（６０、（６１、（６２、（６３）。
【０１８４】
ビオチン化ＴＮＦによる予備標的化法の腫瘍治療への適用は、ビオチン−アビジン相互作用の親和性（１０−１５Ｍ）がＴＮＦ−ＴＮＦＲ相互作用のそれに較べて著しく高いことから、特に興味深いと考えられている。これにより、予備標的化細胞に対するビオチン化ＴＮＦの効率的、優先的な結合が、ＴＮＦＲ発現細胞を超えて可能となり、腫瘍部位における持続を延長化すると予想された。この根拠に基づきビオチン化ＴＮＦを標的化するための３ステップｍＡｂ／アビジン系の利用が最近記載された［Ｍｏｒｏ、１９９７年］。特定のｔｕｍを創製するためにＴｈｙ１．１対立遺伝子によりトランスフェクションしたマウスＲＭＡリンパ腫細胞、Ｇａｓｐａｒｒｉら７１）。ビオチン化ａｖｂ３Ｌ−ＴＮＦの治療指数をさらに挙げるために、同様の方法が開発できるであろう。
【０１８５】
ａｖｂ３Ｌ−ＴＮＦ予備標的法は、必ずしも「３ステップ」法に限定されない。文献に記載された「２ステップ」法の例は、１つのアームが腫瘍抗原に特異的であり、他方がＴＮＦに特異的な二重特異性抗体の利用に基づいている。特に、ＴＮＦを腫瘍へと標的化するために癌胎児性抗原とＴＮＦに方向づけられた二重特異性抗体の利用が最近記載された（６４）。
【０１８６】
さらなる実施形態により、本発明は、抗体又はその断片が、腫瘍細胞に発現した抗原又は他の腫瘍支質成分、例えば、テネイシンやフィブロネクチンＥＤＢドメインに対して方向付けされている、種々のＴＮＦサブユニット上でＴＴＭと抗体、又はその断片双方に複合したサイトカイン（直接的に、又はビオチンアビジン架橋を介して間接的に）を含む。このことにより、修飾サイトカインの腫瘍方向付け特性のさらなる改善と三量体−単量体−三量体遷移によって、腫瘍ミクロ環境内での修飾サイトカインの緩やかな放出をもたらす。例えば、ＴＮＦ複合体の修飾サブユニットは、標的複合体から脱会合し、非修飾三量体ＴＮＦ分子を形成するために再会合し、次に腫瘍ミクロ環境内に拡散する。生物活性ＴＮＦの遊離は、標的化後２４〜４８時間以内に生じることが示されている。
【０１８７】
リポソームの形態でのサイトカイン類の調製は、その生物活性を向上させることができる。事実、ＴＮＦアミノ基のアシル化が、インビトロで生物活性の損失なしにその疎水性増大を誘導することが認められている。さらに脂質に結合したＴＮＦはインビトロの細胞毒性、免疫調節作用に影響を与えず、インビボで毒性を低下させたことが報告されている。
【０１８８】
αｖβ３Ｌ−ＴＮＦのリポソーム内カプセル化は、量的な点でその生物学的プロフィルを改善させる他の方法となり得る。ＴＮＦのいくつかのアミノ基のアシル化によってインビトロの生物活性の損失なしで、その疎水性の増大が導かれたという所見によってこの方法の実行可能性が示唆された。この知見は、ＴＮＦを容易に脂質ベシクルに組入れるために利用されている。このような脂質結合ＴＮＦは、腫瘍細胞に対するインビトロ細胞毒性及び免疫調節作用は変わらずに保持している一方、インビボでの毒性作用はより少ないことが報告されている（４８、（４９）。
【０１８９】
ポリエチレングリコールによるαｖβ３Ｌ−ＴＮＦの誘導体化（ＰＥＧ化）は、その半減期を延長させるための好ましい選択であると考えられる。
【０１９０】
多くの例で、インビボでのＴＮＦの測定半減期は天然よりも明らかとなり得る。したがって、このパラメータは投与用量への依存性が高いことが認められており、ＴＮＦの投与量増加時に半減期の不釣合いな延長化が見られた（５０）。この減少の説明の１つとしては、低用量時、ＴＮＦは可溶性の循環ＴＮＦＲによって効率よく結合している（５１）。このような可溶性ＴＮＦＲはＴＮＦで全身的治療を受けた患者の血清中に急速に増加し（５２）、表面結合受容体からの蛋白質加水分解開裂によって高まる。ＴＮＦは循環ＴＮＦＲと結合して、ＴＮＦ濃度測定のために一般に用いられるアッセイの多くで検出を免れ得る。すべての可溶性ＴＮＦＲ、すなわち基礎的並びにＴＮＦ誘導双方ともが飽和となる閾値以上になって、測定は未結合の循環ＴＮＦの検出を開始するために、より正確に、ＴＮＦの効果的なインビボ半減期を反映する。
【０１９１】
ＴＮＦのＰＥＧ化は、ＴＮＦＲのこの捕捉効果を除去することが期待できないことは明らかであり、したがって、ＴＮＦの半減期延長を目指す、より一般的には投与されるＴＮＦの用量減少を目指すすべての方法は、インビボでのＴＮＦ濃度が、活性であるためには、可溶性循環ＴＮＦＲの結合能力を超える必要があるという事実を扱わなければならない。しかし、この問題を処理するための１つの可能性は、ＣＤ１３Ｌ−ＴＮＦの変異を誘発し、天然のＴＮＦ受容体と相互作用するその能力を低下させ、したがって、より高用量の投与を可能にすることである。
【０１９２】
併用法
全身投与されたＴＮＦに関してより良好な治療指数を達成するために追求されてきたごく初期の手法の１つは、ＴＮＦを他の試剤と併用することであった。治療プロトコルがＴＮＦのより低用量投与を可能にし、抗腫瘍活性を保持したまま、全身毒性作用をより少なくするという結果が望まれていた。この根拠は、不確定性が高い。なぜならば、このようなプロトコルにより、毒性の点でも相乗効果が生じることとなり、したがって、治療指数はＴＮＦ単独で見られるものと同じになるという考えを除外できなかったからである。事実、このような併用療法のプロトコルをヒトで試験した全例で後者の状況が事実であることが証明されている。
【０１９３】
最も集中的に研究されたこれらの手法のうちの１つは、ＴＮＦとＩＦＮ−γの併用である（３６，３７）。特にこれらのサイトカインの内皮細胞における相乗作用のためである。第２の手法は化学療法との併用である。
【０１９４】
ＴＮＦと相乗作用をすると説明された化合物のいくつかとＴＮＦとを併用するプロトコルがいくつかの実験的腫瘍モデルにおいて試験された。遺憾ながら、この療法は全身毒性の増加を伴った。
【０１９５】
腫瘍血管へＴＮＦを標的化して送達する手法は、ＴＮＦの治療指数を上げるために最近追求されてきたものである。ＷＯ０１／６１０１７は、腫瘍血管に発現した膜プレオテアーゼ（ｐｒｅｏｔｅａｓｅ）であるアミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）のリガンドとＴＮＦとのカップリングにより調製した、治療指数の向上したＴＮＦ誘導体を記載している。このサイトカインは、非常に複雑な様式でＣＤ１３及びＴＮＦ受容体と相互作用し、低用量で腫瘍内皮細胞を選択的に活性化する。内皮細胞上でのＴＮＦとＩＦＮ−γの相乗効果を仮定すれば、ＣＤ１３リガンドに複合した双方のサイトカインによって内皮細胞を標的化することが当を得ている。しかし、これらの修飾サイトカインが内皮細胞上の同じ受容体（ＣＤ１３）に対して競合し、標的性と活性の損失を導くことが予想できる。ＷＯ０１／６１０１７は、このサイトカインとＣＤ１３リガンド類、例えば、ＮＧＲ−ＴＮＦやＮＧＲ−ＩＦＮ−γとの複合体の調製法を教示している。双方がＣＤ１３リガンド（ＣＮＧＲＣ）に複合したＴＮＦとＩＦＮ−γの投与に基づいて本発明者らの実験室で行われた実験は、事実これらの修飾サイトカインを動物モデルに注射するとそれらの活性は単独で投与された時よりも低く、それらが同じ標的受容体に対して競合しているためと推測される。
【０１９６】
これらのサイトカイン類は、例えば、ＴＮＦをＣＤ１３とは異なる腫瘍血管受容体に標的化し、ＩＦＮ−γにＣＤ１３を標的とさせる（例えば、それをＣＮＧＲＣペプチドにカップリングすることにより）、又はその逆によって、結合における交差干渉なしに、血管を標的とさせることができることを本発明者らは見出した。
【０１９７】
本発明の好ましい実施形態において、ＴＮＦは、ＣＲＧＤＣモチーフを含有するペプチドなどのαｖβ３のリガンドとカップリングする。したがって、本発明の好ましい実施形態の１つで、ａｖｂ３Ｌ−ＩＦＮ−γ誘導体とＣＤ１３リガンド−ＴＮＦとの併用が提供される。他の好ましい実施形態において、ａｖｂ３Ｌ−ＴＮＦ誘導体とＣＤ１３リガンド−ＩＦＮ−γとの併用が提供される。
【０１９８】
ポリヌクレオチド類
本発明に使用するポリヌクレオチド類は、本発明のポリペプチド複合体をコードする核酸配列を含む。遺伝コードの縮重の結果、多数の異なったポリヌクレオチドが同じポリペプチドをコードできることは当業者に理解されるであろう。さらに、本発明のポリペプチドを発現すべきいずれか特定の宿主生物のコドン使用を反映させるために、本発明のポリヌクレオチド類にコードされたポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチド置換を、当業者が慣例的方法を用いて実施できることを理解すべきである。
【０１９９】
本発明のポリヌクレオチド類はＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。それらは、一本鎖、又は二本鎖となり得る。また、それらは、中に合成又は修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドでもよい。オリゴヌクレオチド類に対する多数の異なったタイプの修飾が当業界に知られている。これらには、ホスホン酸メチル骨格やホスホロチオアート骨格、分子の３’及び／又は５’末端におけるアクリジン鎖又はポリリジン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的のため、本明細書に記載されたポリヌクレオチドは当業界で利用できる方法によって修飾できることを理解すべきである。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性を高める、又は寿命を延ばすために実施できる。
【０２００】
ヌクレオチドベクター類
本発明のポリヌクレオチドは、複製可能な組み換えベクター内へ組み込むことができる。前記ベクターは、適合性宿主細胞内の核酸を複製するために使用できる。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクター内に導入し、そのベクターを適合性宿主細胞内へ導入し、そのベクターの複製をもたらす条件下で宿主細胞を増殖させることによって、本発明のポリヌクレオチド類を製造する方法を提供する。このベクターは宿主細胞から回収できる。好適な宿主細胞としては、大腸菌などの細菌、酵母、哺乳動物細胞系及び他の真菌細胞系、例えば昆虫Ｓｆ９細胞が挙げられる。
【０２０１】
ベクター内の本発明ポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することのできる制御配列に作動可能に結合していること、すなわち、ベクターは発現ベクターであることが好ましい。用語の「作動可能に結合している」とは、前記の構成要素が、意図するように機能できる関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に結合している」調節配列は、コード配列の発現が制御配列に適合する条件下で達成されるような方法で結合している。
【０２０２】
制御配列により支配される転写レベルが転写モジュレーターに対してより良く応答するように、制御配列は、例えば、さらなる転写調節要素の付加により修飾できる。
【０２０３】
本発明の蛋白質を発現するために、本発明のベクター類は、下記の好適な宿主細胞内へ形質転換又はトランスフェクションをすることができる。この方法は、上記の発現ベクターによって形質転換した宿主細胞を、蛋白質をコードするコード配列をベクターにより発現する条件下で培養すること、及び場合によっては、発現した蛋白質を回収することを含む。
【０２０４】
前記ベクターは、例えば複製源、場合によっては前記ポリヌクレオチド発現のためのプロモーター、及び場合によっては、前記プロモーターの調節因子を備えたプラスミド、又はウィルスベクターとなり得る。前記ベクターは１種又は複数の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリン抵抗性遺伝子、又は哺乳動物ベクターでのネオマイシン抵抗性遺伝子を含有できる。ベクターは、例えば宿主細胞のトランスフェクション又は形質転換のために利用できる。
【０２０５】
本発明の蛋白質をコードする配列に、作動可能に結合している制御配列は、プロモーター類／エンハンサー類及び他の発現調節シグナル類を含む。これらの制御配列は、宿主細胞に適合するように選択でき、この宿主細胞の中で利用されるように発現ベクターが設計される。用語「プロモーター」は当業界でよく知られており、サイズと複雑さにおいて、最小のプロモーターから上流の要素及びエンハンサー類などのプロモーターまでの範囲の核酸部位を包含する。
【０２０６】
原核プロモーター及び他の真核細胞において機能的プロモーターが使用できるが、典型的には、プロモーターは哺乳動物において機能的なプロモーターから選択される。プロモーターは典型的には、ウィルス又は真核遺伝子のプロモーター配列から誘導される。例えば、発現を生じさせる細胞のゲノムから誘導されるプロモーターとなり得る。真核プロモーターに関しては、それらは、遍在的に（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンのプロモーターなど）、或いは組織特異的に（ピルビン酸キナーゼ遺伝子のプロモーターなど）機能するプロモーターであってもよい。ある一定の細胞に特異的な組織特異性プロモーターも使用できる。それらはまた、特定の刺激に応答するプロモーター、例えばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターとなり得る。ウィルスプロモーター、例えばモロニーネズミ白血球ウィルスの長端末反復（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、又はヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターもまた使用できる。
【０２０７】
非相同遺伝子の発現レベルを細胞の寿命の間、調節できるようにプロモーターを誘導できることも有利となり得る。誘導できるとは、プロモーターを用いて得られた発現レベルが調節できることを意味する。
【０２０８】
また、これらのプロモーターはいずれも、さらなる調節配列、例えば、エンハンサー配列の付加により修飾できる。上記の２種以上の異なったプロモーターからの配列要素を含むキメラプロモーターも使用できる。
【０２０９】
宿主細胞
ベクター／ポリヌクレオチドを複製し、及び／又は本発明のポリヌクレオチドによってコードされた本発明の蛋白質を発現させるために、本発明のベクター及びポリヌクレオチドを宿主細胞に導入できる。本発明の蛋白質は宿主細胞として原核細胞を用いて産生できるが、真核細胞、例えば酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞、特に哺乳動物の細胞を用いることが好ましい。
【０２１０】
本発明のベクター／ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換、及び電気穿孔法などの当業界に知られた種々の方法を用いて、好適な宿主細胞内へ導入できる。本発明のベクター／ポリヌクレオチドを動物に投与する場合、いくつかの方法、例えば、レトロウィルス、単純ヘルペスウィルス及びアデノウィルスなどの組み換えウィルスベクターによる感染、核酸の直接注入及び微粒子銃法形質転換が当業界に知られている。
【０２１１】
蛋白質の発現及び精製
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本発明の蛋白質を発現させるために使用できる。宿主細胞は、本発明の蛋白質が発現できる好適な条件下で培養できる。本発明の蛋白質の発現は、継続的に産生されるように構成的であるか、又は誘導的で、発現の開始に刺激を必要としてもよい。誘導発現の場合、例えば、培養培地に誘導物質、例えばデキサメタゾン又はＩＰＴＧの添加により、必要な時に開始できる。
【０２１２】
本発明の蛋白質は、酵素的、化学的及び／又は浸透圧的な溶解並びに当業界に知られた種々の方法によって宿主細胞から抽出できる。
【０２１３】
投与
本発明の蛋白質は、本発明の組成物を産生するために、種々の成分と組み合わせることが好ましい。前記組成物は、製薬組成物（ヒト用又は動物用でもよい）を産生するために、製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせることが好ましい。好適な担体及び希釈剤として、等張塩類溶液、例えばリン酸緩衝塩類液が挙げられる。賦形剤についての詳細は、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第２版、編集者Ｗａｄｅ  ＆  Ｗｅｌｌｅｒ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎに見ることができる。本発明の組成物は、直接注射により投与できる。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口又は経皮投与のために製剤化できる。
【０２１４】
前記複合体は、典型的には、約１ｍｇから約１０ｍｇの用量で投与できる。
【０２１５】
前記組成物は、毎日の、週ごとの、又は月ごとの投与が所望の１日用量を提供するように製剤化できる。前記組成物は、２、４、６、８、１０又は１２時間ごとなど、より少ない回数で投与されるように便利に製剤化し得ることは理解されるであろう。
【０２１６】
ポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド／ベクターは裸の核酸構築体として直接投与できるが、好ましくはさらに、宿主細胞ゲノムに対し相同なフランキング配列を含む。
【０２１７】
哺乳動物細胞による裸の核酸構築体の取り込みは、いくつかの知られたトランスフェクション法、例えばトランスフェクション剤の使用などの方法によって増加する。これらの試剤の例としては、カチオン性試剤（例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン）及びリポフェクタント類（例えば、リポフェクタム（商標）及びトランスフェクタム（商標））が挙げられる。組成物を産生するために、典型的には核酸構築体をトランスフェクション剤と混合する。
【０２１８】
製薬組成物を製造するために、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを製薬上許容できる担体又は希釈剤と組み合わせることが好ましい。好適な担体及び希釈剤として、等張塩類溶液、例えばリン酸緩衝塩類液が挙げられる。前記組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内又は経皮投与のために製剤化できる。
【０２１９】
熟練した実務医であれば具体的な患者及び状態のための最適な投与経路及び用法用量を容易に決定できるであろうから、前記の投与経路及び用法用量は、単なる指針として意図している。
【０２２０】
ウィルスベクター
好ましい実施形態において、前記複合体は、ウィルスベクター、より好ましくはレトロウィルスベクターを用いて投与される。
【０２２１】
レトロウィルス
本発明に使用するレトロウィルスベクターは、任意の好適なレトロウィルスから誘導され得るか、又は誘導可能となり得る。多数の種々のレトロウィルスが同定されている。例としては、ネズミ白血病ウィルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウィルス、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）、ウマ伝染性貧血症ウィルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、フジナミ肉腫ウィルス（ＦｕＳＶ）、モロニーネズミ白血病ウィルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲネズミ骨肉腫ウィルス（ＦＢＲＭＳＶ）、モロニーネズミ肉腫ウィルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンネズミ白血病ウィルス（Ａ−ＭＬＶ）、鳥類骨髄球腫症ウィルス−２９（ＭＣ２９）及び鳥類赤芽球腫症ウィルス（ＡＥＶ）が挙げられる。レトロウィルスのより詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら、１９９７年、「ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、編集者：ＪＭ  Ｃｏｆｆｉｎ、ＳＭ  Ｈｕｇｈｅｓ、ＨＥ  Ｖａｒｍｕｓ  ７５８〜７６３頁に見ることができる。
【０２２２】
いくつかのレトロウィルスのゲノム構造の詳細を当業界で見ることができる。例えば、ＨＩＶとＭｏ−ＭＬＶの詳細は、ＮＣＢＩジーンバンクから見られる（ゲノムアクセッション番号は、それぞれＡＦ０３３８１９及びＡＦ０３３８１１）。
【０２２３】
レトロウィルスは、大きく２つの種類、すなわち「単純」と「複雑」に分けることができる。レトロウィルスはさらに７つの群に分けることができる。これらの群のうち５つの群は、腫瘍形成可能性を有するレトロウィルスである。残りの２つの群は、レンチウィルスとスプーマウィルスである。これらのレトロウィルスの調査がＣｏｆｆｉｎら、１９９７年（同書）に示されている。
【０２２４】
レンチウィルスの群は、さらに「霊長目」と「非霊長目」に分けることができる。霊長目レンチウィルスの例としては、ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因であるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）及びサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）が挙げられる。非霊長目レンチウィルス群としては、プロトタイプの「スローウィルス」であるビスナ／マエディウィルス（ＶＭＶ）並びに関連のヤギ関節炎−脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血症ウィルス（ＥＩＡＶ）、又、最近記載されたネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）及びウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）が挙げられる。
【０２２５】
本発明は、ヌクレオチド配列の形態で複合体を、造血幹細胞（ＨＳＣ）へ送達するためのベクターの使用にも関連する。
【０２２６】
遺伝子移入は、１種又は複数のヌクレオチド配列及びそれらの発現を制御する配列から作成された発現カセットをＨＳＣ類などの標的細胞へ送達することを含む。これは、カセットが実験室内で細胞に移入され、次に修飾された細胞が受容者に投与される手順でエクスビボで実施できる。或いは、遺伝子移入は、発現カセットが個体内の細胞に直接移入される手順でインビボで実施できる。両方とも、その移入過程は、適切な細胞内部位へのカセット移入を助けるベクターによって通常補助される。
【０２２７】
骨髄は、形質導入のための伝統的なＨＳＣ源であったが、最近の研究により、末梢血幹細胞又は臍帯血細胞が等しく良好な、又はより良好な標的細胞となり得ることが示唆された（Ｃａｓｓｅｌら１９９３年Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２１：５８５〜５９１頁；Ｂｒｅｇｎｉら１９９２年Ｂｌｏｏｄ８０：１４１８〜１４２２頁；Ｌｕら１９９３年Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１７８：２０８９〜２０９６頁）。
【０２２８】
さらなる抗癌剤
本発明の複合体は、１種又は複数の細胞毒性剤などの１種又は複数の他の活性剤と併用できる。したがって、本発明の一態様では、本法は、細胞毒性剤などの他の有効製薬成分を、前記複合体との組合せ剤形で、又は別の剤形で投与することをさらに含む。このような別の細胞毒性剤の剤形としては、経口固体、経口溶液、シロップ、エリキシル、注射用、経皮、経粘膜又は他の剤形を挙げることができる。前記複合体及び他の有効な製薬成分は、１つの剤形に組み合わせるか、或いは、一緒に又は順に使用できる別々の剤形で供給することもできる。
【０２２９】
本発明に使用できる細胞毒性剤の例としては、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、ズスルファン、ロムスチン、カルムスチン、クロルメチン（ムスチン）、エストラムチン、トレオスルファン、チオテパ、ミトブロニトルなどのアルキル化剤；ドキソルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン（ミトザントロン）、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、及びマイトマイシンなどの細胞毒性抗生物質；ミトトレキサート、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、クラドリビン、ゲムシタビン、フルオロウラシル、ラルチトレキセド、メルカプトプリン、テガフール、及びチオグアニンなどの抗代謝剤；ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなどのビンカアルカロイド類及びエトポシド；アムサクリン、アルトレタミン、クリサンタスパーゼ、ダカルバジン、及びテモゾロミドなどの他の腫瘍用薬剤、ヒドロキシカルバミド（ヒドロキシ尿素）、ペントスタチン、白金化合物のカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチンなど、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、ラゾキサン、タキサン類のドセタキセル、パクリタキセルなど、トポイソメラーゼＩ阻害剤のイリノテカン、トポテカンなど、トラスツズマブ及びトレチノインが挙げられる。
【０２３０】
好ましい実施形態において、さらなる細胞毒性剤は、ドキソルビシン又はメルファランである。
【０２３１】
本発明の複合体は、診断目的の化合物に対する腫瘍細胞及び腫瘍血管の透過性を利用するためにも使用できる。例えば、前記複合体は、放射免疫シンチグラフィ又は腫瘍の放射線療法において、腫瘍による放射標識抗体又は放射標識ホルモン（腫瘍画像形成化合物）の取り込みを増加させるために利用できる。
【０２３２】
本発明を以下の非限定的な実施例と図を参照してさらに説明する。
【実施例１】
【０２３３】
ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦの調製
ネズミ組み換えＴＮＦ及びＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−ＴＮＦ（ＲＧＤ−ＴＮＦ）を大腸菌における細胞質ｃＤＮＡ発現によって産生した。ネズミＭｅｔ−ＴＮＦ１−１５６をコードするｃＤＮＡ（６６）を、３’及び５’プライマーとして
５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧ−３’及び
５’−ＴＧＣＣＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣ−３’を用いて、リポ多糖で刺激したネズミＲＡＷ−２６４．７単球マクロファージ細胞から単離されたｍＲＮＡ上に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって調製した。
【０２３４】
増幅した断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ビバリー）によって消化し、前もって同じ酵素で消化したｐＥＴ−１１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マジソン）（ｐＴＮＦ）中にクローニングした。
【０２３５】
ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−ＴＮＦ１−１５６をコードｃＤＮＡを、５’プライマーとして５’−ＴＧＣＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＧＣＴＴＧＣＧＡＣＴＧＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣ３’及び上記の３’プライマーを用いて、ｐＴＮＦ上でＰＣＲによって増幅した。
【０２３６】
増幅した断片を上記のとおり消化し、ｐＥＴ−１１ｂでクローニングしＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）の形質転換に用いた。ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦの発現は、イソプロピル−□−Ｄ−チオガラクトシドにより、ｐＥＴ１１ｂ製造元の使用説明書に従って誘導した。２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中での細菌超音波処理により可溶性ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦを２リットルの培養液から回収し、続いて遠心分離（１５０００×ｇ、２０分、４℃）した。両方の抽出液を硫酸アンモニウム（飽和の２５％）と混合し、４℃で１時間おいてから、さらに上記のとおり遠心分離した。次に、上澄み液液中の硫酸アンモニウムを飽和の６５％にし、４℃で２４時間おいて、さらに遠心分離した。各ペレットを２００ｍｌの１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解し、フェニル−セファロース６ファストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）上の疎水性相互作用クロマトグラフィー（勾配溶出、緩衝液Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１Ｍ硫酸アンモニウム含有；緩衝液Ｂ：２０％グリセロール、５％メタノール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）によって精製した。ＴＮＦ免疫反応性物質含有分画（ウェスタンブロッティングによる）をプールし、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析し、ＤＥＡＥ−セファロースファストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）上のイオン交換クロマトグラフィー（勾配溶出、緩衝液Ａ：２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０；緩衝液Ｂ：１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０）により、さらに精製した。ＴＮＦ免疫反応性物質含有分画をプールし、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ−３００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）上のゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、予備平衡化した後、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３（ＰＢＳ）で溶出した。４００００〜５００００Ｍｒ生成物に相当する分画をプールし、小分けし、−２０℃で凍結保存した。クロマトグラフィーのステップで用いられた溶液はすべて、滅菌したエンドトキシンを含まない水（Ｓａｌｆ、イタリー国ベルガモ）で調製した。
【０２３７】
精製したＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦの分子量は、（６５）に記載された電気スプレー質量分析で測定した。蛋白質含量は市販の蛋白質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）により測定した。
【０２３８】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロット分析を１２．５％又は１５％のポリアクリルアミドゲルを用い、標準的操作により実施した。
【０２３９】
ＴＮＦの非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、単量体ＴＮＦに対して予想どおり１７〜１８ｋＤａの単一バンドを示した。それとは異なり、ＲＧＤ−ＴＮＦの非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析は、単量体、二量体、三量体に相当するような１８、３６及び５０ｋＤａの異なった免疫反応形態を示した。還元性条件下で多くの５０及び３６ｋＤａバンドは１８ｋＤａ形態に変換し、鎖間ジスルフィド架橋を有するＲＧＤ−ＴＮＦの存在を示した。１８ｋＤａバンドは物質全体の約１／２を占めた。これらの電気泳動パターンは、ＲＧＤ−ＴＮＦが正確な鎖内ジスルフィド（１０〜２０％）を有する３つの単量体サブユニットによってなる三量体と１つ以上の鎖間ジスルフィドを有する三量体が残りのほとんどである混合物であったことを示唆している。
【０２４０】
ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦ単量体の分子質量は、電気スプレー質量分析により、それぞれ１７３８６．１±２．０Ｄａ及び１８３９２．８Ｄａであった。これらの値は、Ｍｅｔ−ＴＮＦ１−１５６（１７３８６．７Ｄａ）及びＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ−ＴＮＦ１−１５６（１８３９２．９Ｄａ）に対して予想された質量に非常によく対応している。
【実施例２】
【０２４１】
ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦのインビトロ細胞毒活性
ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦの生物活性を（６７）に記載されたとおり、Ｌ−Ｍマウスの線維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１．２）に基づき標準的細胞溶解アッセイによって予想した。ＲＭＡ−Ｔ細胞上のＴＮＦとＮＧＲ−ＴＮＦの細胞溶解活性を３０ｎｇ／ｍｌアクチノマイシンＤの存在下で試験した（６８）。各試料を３段階の希釈で２回ずつ分析した。その結果を３種の独立アッセイ２回ずつの平均±ＳＤとして表わしている。
【０２４２】
ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦのインビトロ細胞毒活性は、Ｌ−Ｍ細胞による標準的細胞溶解アッセイにより、それぞれ（１．２±０．１４）×１０８単位／ｍｇと（１．７±１）×１０８単位／ｍｇであった。これらの結果は、ＲＧＤ−ＴＮＦ分子のＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ部分は折りたたみ、オリゴマー化及びＴＮＦ受容体に対する結合を妨げないことを示している。
【０２４３】
先行研究で、本発明者らは、ＲＭＡ−Ｔ細胞が３０ｎｇ／ｍｌアクチノマイシンＤの存在下、ＴＮＦによって死滅され得るが、他方、転写阻害剤の不在下で、これらの細胞は培養７日後でも、ＴＮＦに対して抵抗性であることを示した（６８）。アクチノマイシンＤの存在下、ＲＭＡ−Ｔ細胞上のＲＧＤ−ＴＮＦのインビトロ細胞毒性は、ＴＮＦ（１．２±０．１４）×１０８単位／ｍｇを標準として用いて測定すると（１．６＋１．３）×１０８単位／ｍｇであった。
【実施例３】
【０２４４】
ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦの治療活性及び毒性の特定
Ｃ５７ＢＬ／６起源のローシャーウィルス誘導ＲＭＡリンパ腫（６９）を、ＲＰＭＩ１６４０、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、２ｍＭゲルタミン、及び５０μＭ２−メルカプトエタノール中、インビトロで維持した。ＲＭＡ−Ｔは、Ｔｈｙ１．１対立遺伝子をコードする構築体によるトランスフェクションにより、ＲＭＡ細胞系から誘導し、Ｍｏｒｏ、１９９７年＃２８に記載されたとおり培養した。Ｔ／ＳＡマウス乳腺線癌細胞を、（）に記載されたとおり培養した。
【０２４５】
動物モデルに対するインビボ研究は、Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理委員会により承認され、規定されたガイドラインに従って実施された。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イタリー国カルコ）（１６〜１８ｇ）を５×１０４ＲＭＡ−Ｔ又はＴＳＡ生細胞の各々で、左腹皮下注射により誘発した。腫瘍移植１０〜１２日後、エンドトキシンのない０．９％塩化ナトリウムで希釈した２５０μｌのＴＮＦ又はＲＧＤ−ＴＮＦ溶液により、マウスを腹腔内注射で処理した。予備実験により、ＴＮＦ及びＲＧＤ−ＴＮＦ溶液に、担体としてヒト血清アルブミンを添加しても、抗腫瘍活性は変化しなかったことが示された。各実験とも一群につき５匹のマウスで実施した。腫瘍の移植は、カリパスで腫瘍サイズを測定することにより毎日モニターした。腫瘍面積はｒ１×ｒ２πの計算により予想し、一方、腫瘍容積はｒ１×ｒ２×ｒ３×４／３πの計算により予想した。式中ｒ１とｒ２は、縦半径と横半径であり、ｒ３は正常皮膚の表面から突出している腫瘍の厚みである。腫瘍直径が１．０〜１．３ｃｍになる前にマウスを殺処理した。腫瘍サイズは、平均±ＳＥ（一群につきマウス５〜１０匹）として示し、ｔ−検定によって比較した。
【０２４６】
Ｃ５７ＢＬ６マウスにおいてＲＭＡ−Ｔリンパ腫とＴ／ＳＡモデルを用いてＲＧＤ−ＴＮＦの抗腫瘍活性と毒性をＴＮＦのそれらと比較した。
【０２４７】
確立した皮下注射ＲＭＡ−Ｔ腫瘍を有するマウスにＴＮＦを投与すると、２４時間後、腫瘍中央部分に腫瘍の大きさの減少と出血性壊死が生じ、その後２、３日間、有意な増殖遅延があった（７１）。ＴＮＦによる単独処理は、ＬＤ５０に近い用量であっても、この腫瘍の完全な後退を誘導せず、壊死部位周辺に残っている生細胞は、処理２、３日後に増殖を再開する。実験の第１のセットで本発明者らは、ＴＮＦ又はＲＧＤ−ＴＮＦの種々の用量（腹腔内注射）のマウス生存率に及ぼす効果を調べた。マウスの過剰な苦痛を避けるため、その腫瘍直径が１〜１．３ｃｍ以上になったら、殺処理した。処理３日後、ＴＮＦとＲＧＤ−ＴＮＦの致死率は異なっており（ＬＤ５０が、それぞれ６μｇと１２μｇ）、一方、それらの抗腫瘍活性は、著しく異なっていた（表１）。例えば、１μｇのＲＧＤ−ＴＮＦは２μｇのＴＮＦよりも、より効果的に腫瘍の増殖を遅延化した。興味深いことに、１６μｇのＲＧＤ−ＴＮＦにより数匹のマウスは治癒したが、一方、ＴＮＦで治癒したマウスはまったくいなかった。治癒したマウスは、ＲＭＡ−Ｔ細胞又は野生型ＲＭＡ細胞のいずれかの腫瘍形成用量によるさらなる誘発を拒絶し、ＲＧＤ−ＴＮＦによる単独治療が、防御免疫を誘導できたことを示唆した。例えば、この条件下でのＲＧＤ−ＴＮＦの有効性／毒性比の計算値はＴＮＦのそれの４倍以上である。ＲＧＤ−ＴＮＦ製剤における正確なジスルフィド架橋を有する形態が約１０〜２０％であることを考慮すると、ＲＧＤ−ＴＮＦの治療指数は、ＴＮＦのそれの２０％〜４０％高い計算となり得る。
【０２４８】
さらにＲＧＤ−ＴＮＦは、ＴＮＦよりも効果的に防御免疫応答を誘導し得る。
【０２４９】
ＲＭＡ−Ｔ細胞は、αｖインテグリンを発現せず（抗αｖ抗体を用いたＦＡＣＳにより）、一方、内皮細胞はこのインテグリンを発現できるため、この結果は、作用機構が腫瘍細胞、例えば内皮細胞ではなく、標的細胞に基づいていることを示唆している。
【０２５０】
【表Ｉ】
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【０２５１】
上記明細書に挙げたすべての刊行物は参照として本明細書内に組入れてある。本発明の記載された方法とシステムの種々の修飾と変更は、本発明の範囲と精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明を、特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、請求された本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定すべきでないことを理解すべきである。実際、本発明の実施に関して前記の方法の分子生物学又は関連分野の業者に明らかな種々の修飾は、以下の請求項の範囲内に入ることが意図されている。
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】Ｔ／ＳＡマウス乳腺線癌モデルにおけるＮＧＲ−ＩＦＮと併用したＴＮＦ及びＲＧＤ−ＴＮＦの治療活性及び毒性活性の特定を例示しており、より詳しく言うと、それは、ＮＧＲ−ｍＩＦＮ−γと併用投与したＲＧＤ−ｍＴＮＦの抗腫瘍活性が、ＮＧＲ−ｍＩＦＮ−γと併用投与したｍＴＮＦの抗腫瘍活性又は単回投与したＮＧＲ−ｍＩＦＮ−γの抗腫瘍活性よりも強力であることを示しており、これらの結果は、腫瘍血管系上の異なった受容体へのＴＮＦとＩＦＮ−γの標的誘導送達は相乗効果を生み出すことができることを示す図である。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年3月23日(2005.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカインがＴＮＦα、ＴＮＦβ、又はＩＦＮγの場合、腫瘍標的指向部分（ＴＴＭ、tumor targeting moiety）はＣＤ１３リガンド以外のものであり；サイトカインがＩＬ２又はＩＬ１２の場合、ＴＴＭはフィブロネクチンに対する抗体以外のものであり；サイトカインがＴＮＦの場合、ＴＴＭはトランスフェリン受容体に対する抗体以外のものであり；サイトカインがＴＮＦ、ＩＦＮγ又はＩＬ２の場合、ＴＴＭはＴＡＧ７２抗原に対する抗体以外のものであり；サイトカインがＩＦＮの場合、ＴＴＭはαｖβ３インテグリンリガンド以外のものであり；サイトカインがＴＮＦの場合、ＴＴＭはフィブロネクチン以外のものであるという条件で、サイトカインとＴＴＭとの複合体。
【請求項２】
サイトカインがＴＮＦα又はＴＮＦβの場合、ＴＴＭは腫瘍特異性抗体以外のものであるという条件をさらに加えた請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記複合体がビオチン化ＴＮＦではないという条件をさらに加えた請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
サイトカインが炎症性サイトカインである請求項１から３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
サイトカインが化学療法用サイトカインである請求項１から４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
サイトカインがＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ１、２、４、６、１２、１５、ＥＭＡＰＩＩ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＰＤＧＦ、ＰＤ−ＥＣＧＦ又はケモカインである請求項１から５のいずれかに記載の複合体。
【請求項７】
サイトカインがＴＮＦα、ＴＮＦβ又はＩＦＮγである請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
ＴＴＭが腫瘍血管系標的指向部分（ＴＶＴＭ、tumor vasculature targeting moiety）である請求項１から７のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
ＴＶＴＭが、腫瘍血管系の受容体、マーカー、又は腫瘍血管系を標的にするペプチドなどの他の細胞外成分の結合相手である請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
ＴＴＭが、腫瘍の受容体、マーカー、又は他の細胞外成分の結合相手である請求項１から９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
ＴＴＭが、抗体、又はリガンド、或いはその断片である請求項１から１０のいずれかに記載の複合体。
【請求項１２】
ＴＴＭが、ＮＧＲ又はＲＧＤモチーフを含有するか、又はＨＩＶ−ｔａｔ、アネキシンＶ、オステオポンチン、フィブロネクチン、コラーゲンＩ型若しくはＩＶ型、ヒアルロン酸塩、エフリンであるか、又は腫瘍胎児性フィブロネクチンとの結合相手であるか；或いはその断片である請求項１から１１のいずれかに記載の複合体。
【請求項１３】
ＴＴＭが、ＮＧＲモチーフを含有する請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
ＴＴＭが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状又は環状ＣＮＧＲＣである請求項１３に記載の複合体。
【請求項１５】
ＴＴＭが、ＲＧＤモチーフを含有する請求項１２に記載の複合体。
【請求項１６】
ＴＴＭが、ＶＥＧＦＲ、ＩＣＡＭ１、２又は３、ＰＥＣＡＭ−１、ＣＤ３１，ＣＤ１３，ＶＣＡＭ−１、セレクチン、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＡｃｔＲＩ、ＡｃｔＲＩＢ、ＣＤ４４、アミノペプチダーゼＡ、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、αｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、ＦＧＦ−１、２、３又は４、ＩＬ１Ｒ、ＥＰＨＲ、ＭＭＰ、ＮＧ２、テナシン、腫瘍胎児性フィブロネクチン、ＰＤ−ＥＣＧＦＲ、ＴＮＦＲ、ＰＤＧＦＲ又はＰＳＭＡを標的とする請求項１から１１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
表Ａに載っている請求項１から１６のいずれかに記載の複合体。
【請求項１８】
前記複合体が、融合蛋白質の形態をとる請求項１から１７のいずれかに記載の複合体。
【請求項１９】
前記複合体が、核酸の形態をとる請求項１から１８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現ベクターにより形質転換した宿主細胞。
【請求項２２】
前記複合体の発現をもたらす条件で、請求項２１に記載の宿主細胞を培養することを含む複合体の調製法。
【請求項２３】
製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と共に請求項１から２２のいずれかに記載の複合体を含む製薬組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、さらに他の抗腫瘍剤又は診断用腫瘍画像形成化合物を含む請求項２３に記載の製薬組成物。
【請求項２５】
前記抗腫瘍剤が、さらにドキソルビシン又はメルファランである請求項２４に記載の製薬組成物。
【請求項２６】
癌の治療又は診断用医薬品調製のための請求項１から１９のいずれか一項に規定した複合体の使用又は請求項２３から２５のいずれか一項に記載の製薬組成物の使用。
【請求項２７】
癌の治療又は診断を必要とする患者に、請求項１から１９のいずれか一項に規定した複合体、又は請求項２３から２５のいずれか一項に記載の製薬組成物を有効量投与することを含む癌の治療又は診断の方法。
【請求項２８】
ＴＮＦと第１のＴＴＭ又はそれをコードするポリヌクレオチドとの複合生成物の有効量、並びにＩＦＮγと第２のＴＴＭ又はそれをコードするポリヌクレオチドの有効量を含む製薬組成物であって、前記第１のＴＴＭと前記第２のＴＴＭが異なる受容体に対して競合する製薬組成物。
【請求項２９】
製薬上許容できる担体、希釈剤又は賦形剤と一緒になった請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記第１又は第２のＴＴＭが、ＣＤ１３受容体のリガンドである請求項２８又は２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記第１又は第２のＴＴＭが、ＮＧＲモチーフを含有する請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記第１又は第２のＴＴＭが、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状又は環状ＣＮＧＲＣである請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記第１又は第２のＴＴＭが、αｖβ３受容体のリガンドである請求項２８又は２９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記第１又は第２のＴＴＭが、ＲＧＤモチーフを含有する請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記第１のＴＴＭがＣＤ１３受容体のリガンドであり、前記第２のＴＴＭがαｖβ３受容体のリガンドである請求項２８又は２９に記載の組成物。
【請求項３６】
前記第１のＴＴＭがαｖβ３受容体のリガンドであり、前記第２のＴＴＭがＣＤ１３受容体のリガンドである請求項２８又は２９に記載の組成物。
【国際調査報告】
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