(57)【要約】本発明は、過度のＴＨ２細胞分化を引き起こす２個の突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型遺伝子に関するものである。本発明は、該突然変異体を含有している生物学的構造、特に、該突然変異型遺伝子を含む非ヒトＬＡＴ遺伝子突然変異型動物、プラスミド、染色体ＤＮＡ、胚、及びそれらの適用に関するものである。本発明は、さらに、喘息及びアレルギーに対する処置のために有用な薬物のスクリーニング法に関するものである。また、本発明は、ＩｇＥ抗体を作製するための方法にも関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型ＬＡＴ遺伝子を有する非ヒト動物であって、該突然変異体ＬＡＴタンパク質が過度のＴＨ２細胞分化を引き起こすものである、非ヒト動物。
【請求項２】
突然変異体ＬＡＴタンパク質の配列が、野生型配列に相当し、かつマウスＬＡＴタンパク質におけるＹ１３６に相当するチロシンの単一突然変異を含有している、請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項３】
突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型ＬＡＴ遺伝子が、突然変異型遺伝子のエキソン７（配列番号２）を含む、請求項２記載の非ヒト動物。
【請求項４】
突然変異体ＬＡＴタンパク質の配列が、３個の遠位チロシン残基の複合突然変異を含有している、請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項５】
非ヒト動物が哺乳動物である、請求項１〜４のいずれか１項記載の非ヒト動物。
【請求項６】
動物が齧歯動物である、請求項５記載の非ヒト動物。
【請求項７】
齧歯動物がマウスである、請求項６記載の非ヒト動物。
【請求項８】
突然変異が、「チロシンに基づく」配列とタンパク質のＳＨ２ドメインとの会合を防止する残基によるチロシンの置換にある、請求項１〜７のいずれか１項記載の非ヒト動物。
【請求項９】
単一突然変異が、フェニルアラニン（Ｙ−Ｆ）、アスパラギン酸（Ｙ−Ｄ）又はグルタミン酸（Ｙ−Ｅ）によるチロシンの置換にある、請求項１〜７のいずれか１項記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
単一突然変異が、フェニルアラニンによるチロシンの置換（Ｙ−Ｆ）にある、請求項９記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
突然変異型ＬＡＴ遺伝子に関してホモ接合性であるか、又はＬＡＴ遺伝子のヌル対立遺伝子を保持している、請求項１〜１０のいずれか１項記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
突然変異型ＬＡＴ遺伝子を内因性ＬＡＴ遺伝子の制御領域の管理下に維持するため、該突然変異型ＬＡＴ遺伝子を標的指向化挿入によって動物ゲノムに組み込んでいる、請求項１〜１１のいずれか１項記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
突然変異型ＬＡＴ遺伝子を含有している請求項１〜１２のいずれか１項記載の非ヒト動物又はその子孫に由来する生殖細胞もしくは体細胞。
【請求項１４】
アレルギー、喘息、好酸球増加及び／又はＴＨ２細胞脱制御に関連した疾患のモデルとしての、請求項１〜１２のいずれか１項記載の動物の使用。
【請求項１５】
薬物を投与された請求項１〜１２のいずれか１項記載の動物を、薬物を投与されていない該動物と比較する工程を含むことを特徴とする、アレルギー、喘息及び／又はＴＨ２細胞脱制御に関連した疾患の処置のための薬物のスクリーニングの方法。
【請求項１６】
１）請求項１〜１２のいずれか１項記載の非ヒト動物に候補薬物を投与する工程；
２）アレルギー、喘息及び／又はＴＨ２細胞脱制御に関連した疾患の症状又は兆候に対する該薬物の効果を評価する工程；並びに
３）該症状又は兆候を軽減する薬物を選択する工程
を含むことを特徴とする、アレルギー、喘息及び／又はＴＨ２細胞脱制御に関連した疾患の処置のための薬物のスクリーニングの方法。
【請求項１７】
薬物の効果を、ＩｇＥレベル、ＩｇＧ１レベル、インターロイキンレベル（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−５及び／又はＩＬ−１３）並びに好酸球増加の群より選択されたパラメータを少なくとも１つ測定することにより評価し得る、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
薬物の効果を、ＩｇＥ及び／又はＩｇＧ１の血清レベルを測定することにより評価し得る、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
１）請求項１３記載の細胞を候補薬物に曝露する工程；
２）該細胞に対する該薬物の効果を評価する工程；及び
３）所望の効果を有する薬物を選択する工程
を含むことを特徴とする、アレルギー、喘息及び／又はＴＨ２細胞脱制御に関連した疾患の処置のための薬物をスクリーニングする方法。
【請求項２０】
１）請求項１〜１２のいずれか１項記載の非ヒト動物に候補薬物を投与する工程；並びに
２）該非ヒト動物におけるＴＨ２細胞の活性をモジュレートする薬物を選択する工程
を含むことを特徴とする、ＴＨ２細胞の活性を制御する薬物をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
（ｉ）請求項１６〜２０のいずれか１項記載のスクリーニング法を使用して、化合物を選択、同定、最適化又は特徴決定すること、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体又はビヒクルの中に該化合物又はその誘導体を調整すること、
を含むことを特徴とする、脱制御されたＴＨ２細胞活性に関連した疾患、特に喘息又はアレルギーを処置するための医薬組成物を作製する方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか１項記載の動物を含む、ヒトＩｇＥ抗体の大規模作製のためのバイオリアクター。
【請求項２３】
１）ヒト化ＩｇＥを発現する非ヒト動物を準備する工程；
２）該ヒト化ＩｇＥを発現する動物を、請求項１〜１２のいずれか１項記載の非ヒト動物と交配する工程；
３）子孫の動物をアレルゲンにより免疫感作する工程；
４）該アレルゲンに対して特異的なヒト化ＩｇＥを回収する工程
を含むことを特徴とする、ヒトＩｇＥ抗体の作製の方法。
【請求項２４】
工程４が、アレルゲンに対して特異的なヒト化ＩｇＥを産生するＢ細胞ハイブリドーマを作製する工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法によって得られたＢ細胞ハイブリドーマ。
【請求項２６】
野生型配列に相当し、かつチロシンＹ１３６の単一突然変異を含有している配列を有する突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする、突然変異型マウス遺伝子。
【請求項２７】
野生型配列に相当し、かつ３個の遠位チロシン残基の複合突然変異を含有している配列を有する突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型マウス遺伝子。
【請求項２８】
突然変異が、フェニルアラニン（Ｙ−Ｆ）、アスパラギン酸（Ｙ−Ｄ）又はグルタミン酸（Ｙ−Ｅ）によるチロシンの置換にある、請求項２６〜２７のいずれか１項記載のマウス遺伝子。
【請求項２９】
突然変異が、フェニルアラニンによるチロシンの置換（Ｙ−Ｆ）にある、請求項２８記載のマウス遺伝子。
【請求項３０】
配列が配列番号１に相当する、請求項２６記載のマウス遺伝子。
【請求項３１】
配列が、突然変異型遺伝子のエキソン７（配列番号２）を含有している、請求項３０記載のマウス遺伝子。
【請求項３２】
チロシンＹ１３２の単一突然変異又は３個の遠位チロシンＹ１７１、Ｙ１９１及びＹ２２６の複合突然変異を含有している突然変異体ＬＡＴタンパク質を含有している突然変異ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型ＬＡＴ遺伝子の検出を含むことを特徴とする、喘息、アレルギー、好酸球増加及び／又はＴＨ２細胞脱制御の診断法。
【請求項３３】
チロシンＹ１３２の単一突然変異又は３個の遠位チロシンＹ１７１、Ｙ１９１及びＹ２２６の複合突然変異を含有している突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型ＬＡＴ遺伝子の検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを含むことを特徴とする、喘息、アレルギー、好酸球増加及び／又はＴＨ２細胞脱制御の診断キット。
【請求項３４】
ヒト化ＩｇＥを発現する非ヒト動物と、請求項１〜１２のいずれか１項記載の非ヒト動物との交配により生じた非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過度のＴＨ２細胞分化を引き起こす２つの突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型遺伝子に関するものである。本発明は、該突然変異体を含有している生物学的構造物、特に、該突然変異型遺伝子を含む非ヒトＬＡＴ遺伝子突然変異型動物、細胞培養物、プラスミド、染色体ＤＮＡ、胚、及びそれらの適用に関するものである。本発明は、さらに、喘息、アレルギー及びＴＨ２細胞が関与している病理学的免疫応答に対する治療に有用な薬物のスクリーニング法に関するものである。本発明は、ＩｇＥ抗体を作製するための方法にも関するものである。
【０００２】
背景技術
病原における重要な事象は、ＩｇＥクラスの抗体の産生である。高γグロブリン血症Ｅは、免疫制御の欠損により生じる。より具体的には、Ｔリンパ球の異常が、多数の病理学的高ＩｇＥ状態において報告されており、それは、アトピー性アレルギー及び喘息を防止するであろう医薬化合物の開発を目標とした多くの調査の目的となっている。
【０００３】
ＴＣＲは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合したペプチド断片を認識し、この情報を、アダプタータンパク質を介してＴ細胞の内部へと中継する。これらのうちの１つ、アダプターＬＡＴ（Linker for Activation of T cells）は、細胞質セグメント内の複数個のチロシン残基を通して、シグナリング複合体の組み立てを統合している。ＴＣＲにより誘導されるリン酸化の際、これらのチロシン残基は、各々、それが動員するシグナリングタンパク質に関するある程度の専門化を示する。細胞系における研究は、チロシン１３６（Ｙ１３６）の突然変異が、ホスホリパーゼＣγ１（ＰＬＣ−γ１）の結合を選択的に排除し、Ｙ１７５、Ｙ１９５及びＹ２３５の同時突然変異が、下流アダプターＧａｄｓ及びＧｒｂ−２の結合の欠損をもたらすことを示した（Lin及びWeiss、2001;Samelsonら、1999;Zhangら、2000）。４ＹＦマウスと呼ばれる、ＬＡＴの４個の遠位チロシン残基のフェニルアラニンへの突然変異を呈するＬＡＴ「ノックイン」突然変異体マウスの研究は、マウスＴ細胞発達が完全に阻止されることを示した（Sommersら、2001）。従って、それらの胸腺細胞発達は、未熟なＣＤ４−ＣＤ８−段階で抑止され、成熟Ｔ細胞は存在しなかった。
【０００４】
本発明は、ＬＡＴが、ＣＤ４ヘルパーＴ（ＴＨ）細胞のＴＨ２細胞への分化に対して、予期せぬ驚くべき阻害機能を及ぼすという遺伝学的証拠を提供する。
【０００５】
単一ＬＡＴチロシンの突然変異（ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ）に関してホモ接合性のマウスは、大量のインターロイキン４、５、１０及び１３を慢性的に産生するポリクローナルＴＨ２細胞の早期で自然発生的な蓄積を示すマウスとなる。この過度のＴＨ２分化は、次に、組織好酸球増加、並びにＩｇＥ抗体及びＩｇＧ１抗体を分泌する多数の形質細胞の成熟を引き起こす（図１参照）。従って、既知の正のシグナリングに加え、ＬＡＴは、Ｔ細胞ホメオスタシスを管理する阻害性シグナルの確立にとっても不可欠であると考えられる。
【０００６】
３個の遠位ＬＡＴチロシンの複合突然変異（ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ）のためのマウスは、アルファ／ベータＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の発達を防止する。しかしながら、それは、γ／δＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の発達、及び末梢へのそれらの蓄積を可能にする（図９参照）。これらのポリクローナルγ／δＴ細胞は、慢性的に、大量のインターロイキン４、５、１０及び１３を産生する（即ち、それらは、過大なＴＨ２表現型を示す）。このγ／δＴ細胞の過度のＴＨ２型分化は、次に、ＩｇＥ抗体及びＩｇＧ１抗体を分泌する多数の形質細胞の成熟を引き起こす（図１０及び１１参照）。
【０００７】
発明の詳細な説明
本願において、ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ、ＬＡＴ  Ｙ１９５Ｆ及びＬＡＴ  Ｙ２３５Ｆとは、明示された突然変異自体をさし、ＬＡＴＹ１３６Ｆ、ＬＡＴＹ１７５Ｆ、ＬＡＴＹ１９５Ｆ及びＬＡＴＹ２３５Ｆとは、これらの突然変異に由来する突然変異体、マウス又は生成物をさす。
【０００８】
ＬＡＴタンパク質の４個の遠位チロシンのうちの１個又は３個のチロシンの突然変異（即ち、ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ、又はＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ）は、過度のＴＨ２免疫に関連した症状の発達を誘導することができる。この突然変異に関連した表現型の特徴は、以下の実施例に記載される。従って、本発明は、アレルギー及び／又は喘息、又はＴＨ２細胞の脱制御もしくは活性、より具体的にはＴＨ２細胞蓄積に関連したその他の疾患のモデルを提供する。該モデルの利点としては、モデル調製の迅速さ（数ヶ月ではなく、マウスモデルの場合、約３〜４週間）並びに過度の表現型（例えば、過度のＩｇＥ産生及び組織好酸球増加）が見出される。
【０００９】
マウスにおけるＬＡＴタンパク質の４個の遠位チロシン残基のうちの１個又は３個のチロシンの突然変異（即ち、ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ、又はＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ）によるこの表現型は、４個の突然変異が組み合わせられたマウス（ＬＡＴ  ４ＹＦマウス）の表現型を考慮すると、予測不可能であった。実際、ＬＡＴ  ４ＹＦマウスは、初期の分化阻止のために、胸腺細胞及びＴ細胞を完全に欠いている。従って、ＬＡＴ  ４ＹＦマウスは、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウス及びＬＡＴＹ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスに関して観察された表現型を暗示又は示唆し得ない。さらに、細胞系における以前の研究の結果は、いずれも、そのような表現型を示唆していない。さらに、細胞系研究において観察された突然変異Ｙ１３６Ｆと、突然変異Ｙ１７５Ｆ、Ｙ１９５Ｆ、及びＹ２３５Ｆとの異なる効果のため、複合突然変異Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆを有するマウスの予想される表現型を推測するために、突然変異Ｙ１３６Ｆを有するマウスにおいて得られた表現型を外挿することはできなかった。
【００１０】
本発明の目的は、過度のＴＨ２細胞分化を引き起こす本発明の突然変異型ＬＡＴ遺伝子を有する非ヒト動物を提供することである。「遺伝子」とは、ＬＡＴタンパク質をコードするｃＤＮＡ又はゲノムの配列をさす。「本発明の突然変異型ＬＡＴ遺伝子」とは、野生型配列に相当し、かつマウスＬＡＴタンパク質におけるＹ１３６に相当する４個の遠位チロシンのうちの単一のチロシンの突然変異又は３個の遠位チロシン残基（マウスＬＡＴタンパク質におけるＹ１７５、Ｙ１９５及びＹ２３５に相当する）の複合突然変異を含有している配列を有する突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードするＬＡＴ遺伝子をさす。例えば、マウスＬＡＴタンパク質におけるＹ１３６に相当するチロシンは、ヒトＬＡＴタンパク質における残基Ｙ１３２である。第一の好ましい実施態様において、突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードするＬＡＴ遺伝子は、マウスＬＡＴタンパク質におけるＹ１３６に相当するチロシン残基の単一突然変異を含有している。第二の好ましい実施態様において、突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードするＬＡＴ遺伝子は、マウスＬＡＴタンパク質におけるＹ１７５、Ｙ１９５及びＹ２３５に相当する３個の遠位チロシンの複合突然変異を含有している。好ましくは、該非ヒト動物はマウスであり、該非ヒト動物は、野生型配列に相当し、かつ１３６位のチロシン残基の単一突然変異又は１７５位、１９５位及び２３５位の３個の遠位チロシン残基の複合突然変異を含有している配列を有する突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型遺伝子を有している。好ましくは、該突然変異は、「チロシンに基づく」配列とタンパク質のＳＨ２ドメインとの会合を防止する残基による置換にある。より好ましくは、該突然変異は、フェニルアラニン（Ｙ−Ｆ）、アスパラギン酸（Ｙ−Ｄ）又はグルタミン酸（Ｙ−Ｅ）によるチロシンの置換にある。さらに好ましくは、該突然変異は、チロシンのフェニルアラニン（Ｙ−Ｆ）による置換にある。好ましくは、本発明に係る該非ヒト動物は哺乳動物であり、特に、それらは齧歯動物である。より好ましくは、該齧歯動物はマウスである。好ましくは、該動物は、突然変異型ＬＡＴ遺伝子に関してホモ接合性であるか、又はＬＡＴ遺伝子のヌル対立遺伝子を保持している。好ましくは、該突然変異型ＬＡＴ遺伝子は、該突然変異型ＬＡＴ遺伝子を内因性ＬＡＴ遺伝子の制御領域の管理下に維持するため、標的指向化挿入によって動物ゲノムに組み込まれている。
【００１１】
「遠位」とは、タンパク質のＣ末端をさす。従って、遠位チロシン残基とは、タンパク質のＣ末端に位置するチロシン残基である。
【００１２】
特に、本発明は、本発明の突然変異型ＬＡＴ遺伝子を含有している該動物又はそれらの子孫に由来する生殖細胞及び体細胞にも関する。より具体的には、該動物の生殖細胞及び体細胞は、動物ゲノムへの又は該動物の先祖への染色体組み込みの結果として、本発明の突然変異型ＬＡＴ遺伝子を含有している。好ましくは、該突然変異型ＬＡＴ遺伝子は、該突然変異型ＬＡＴ遺伝子を内因性ＬＡＴ遺伝子の制御領域の管理下に維持するため、標的指向化挿入（相同的組換え）によって動物ゲノムに組み込まれている。
【００１３】
従って、本発明のさらなる目的は、その配列が、野生型配列に相当し、かつチロシンＹ１３６の単一突然変異又は１７５位、１９５位及び２３５位のチロシン残基の複合突然変異を含有している配列を有する突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型マウス遺伝子を提供することである。該突然変異は、「チロシンに基づく」配列とタンパク質のＳＨ２ドメインとの会合を防止する残基による置換にある。好ましくは、該チロシンの突然変異は、フェニルアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸による置換を引き起こす。より好ましくは、該チロシンの突然変異は、フェニルアラニンによる置換を引き起こす。好ましい実施態様において、突然変異型マウスＬＡＴＹ１３６Ｆタンパク質をコードする遺伝子の配列は、配列番号１に相当する。本発明は、さらに、突然変異型遺伝子のエキソン７（配列番号２）を含有している染色体ＤＮＡを含む。本発明は、該突然変異型マウス遺伝子を含有しているマウスに関係がある。
【００１４】
本発明は、本発明に係る突然変異型遺伝子に相当する配列を有している、ＤＮＡ又はその一部を含むプラスミドも包含する。好ましい実施態様において、本発明のプラスミドは、エキソン７のイントロン３’に導入された制限酵素分解部位を含有している。有利には、制限酵素分解部位は、ＢｇｌＩＩ制限部位である。
【００１５】
該プラスミドは、本発明に係る非ヒト動物の作製に有用である。
【００１６】
従って、本発明は、本発明のプラスミドが導入された非ヒト胚、及び本発明のプラスミドを使用した相同的組換えによって得られた非ヒト胚も包含する。好ましい実施態様において、非ヒト胚は、マウスに由来する胚性幹細胞である。有利には、ＥＳ細胞は、ＣＫ３５  １２９／ＳＶ  ＥＳ細胞である。
【００１７】
本発明は、チロシンＹ１３６の単一突然変異又は１７５位、１９５位及び２３５位のチロシン残基の複合突然変異を含有しているＬＡＴ突然変異体マウスタンパク質配列にも関係がある。該突然変異は、「チロシンに基づく」配列とタンパク質のＳＨ２ドメインとの会合を防止する残基による置換にある。好ましくは、該チロシンの突然変異は、フェニルアラニン、アスパラギン酸又はグルタミン酸による置換を引き起こす。より好ましくは、該チロシンの突然変異は、フェニルアラニンによる置換を引き起こす。一つの実施態様において、本発明は、エキソン７の突然変異型アミノ酸配列（配列番号３）を含有している突然変異型ＬＡＴタンパク質に関する。
【００１８】
ＬＡＴＹ１３６Ｆマウス及びＬＡＴＹ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスにおいて観察される増大し加速した病理学的事象の進行は、試験及び研究を容易に開始することを許容する。例えば、突然変異体ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスの表現型は、４週齢の時点で達成される。
【００１９】
本発明に係る突然変異体非ヒト動物は、様々な重要な適用において、特に：
−  過度のＩｇＥ産生及び組織好酸球増加を引き起こす分子メカニズムに対する薬物の影響を分析するため、そして
−  突然変異型ＬＡＴマウス（好ましくは、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウス又はＬＡＴＹ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウス）のヒト化の工程の前又は後の、既知の特異性を有するＩｇＥ抗体の専用の作製を可能にするバイオリアクターとして、有用である
【００２０】
従って、本発明は、本発明に係る動物を含む、アレルギー及び／又は喘息疾患のモデルを提供する。特に、本発明の動物は、好酸球増加及び／又はＴＨ２細胞脱制御、より具体的にはＴＨ２細胞蓄積のモデルとして使用され得る。
【００２１】
従って、本発明は、アレルギー及び／又は喘息疾患のモデルとしての、本発明に係る突然変異体非ヒト動物の使用に関する。本発明は、好酸球増加のモデルとしての、本発明に係る突然変異体非ヒト動物の使用にも関する。より一般的には、本発明は、ＴＨ２細胞脱制御のモデル、より具体的にはＴＨ２細胞蓄積のモデルとしての、本発明に係る突然変異体非ヒト動物の使用に関する。
【００２２】
人々の感受性が増加したため、喘息又はアレルギーのような健康問題は、より高頻度になっている。本発明に係る動物は、これらの領域における調査を支援するための適当なモデルである。
【００２３】
従って、本発明は、薬物を投与された本発明に係る動物を、薬物を投与されていない該動物と比較する工程を含む、アレルギー、喘息及び／又はＴＨ２細胞の脱制御もしくは活性に関連した疾患の処置のための薬物のスクリーニングの方法を提供する。
【００２４】
より具体的には、本発明は、
１）本発明に係る突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードするＬＡＴ遺伝子を有する非ヒト動物に候補薬物を投与する工程；
２）アレルギー、喘息及び／又はＴＨ２細胞の脱制御もしくは活性に関連した疾患の症状又は兆候に対する該薬物の効果を評価する工程；並びに
３）該症状又は兆候を軽減させる薬物を選択する工程、
を含む、アレルギー、喘息及び／又はＴＨ２細胞の脱制御もしくは活性に関連した疾患の処置のための薬物のスクリーニングの方法に関する。好ましい実施態様において、該スクリーニング法は、コントロール実験として、薬物を投与されていない非ヒト動物を使用する。他の好ましい実施態様において、該薬物の該効果は、ＩｇＥレベル、ＩｇＧ１レベル、インターロイキンレベル（好ましくは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−５及び／又はＩＬ−１３）並びに好酸球増加の群より選択されたパラメータを少なくとも１つ測定することにより評価され得る。より好ましくは、該薬物の該効果は、ＩｇＥ及び／又はＩｇＧ１の血清レベルを測定することにより評価され得る。
【００２５】
本発明は、
１）本発明に係る突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードするＬＡＴ遺伝子を有する細胞を候補薬物に曝露する工程；
２）該細胞に対する該薬物の効果を評価する工程；及び
３）所望の効果を有する薬物を選択する工程、
を含む、アレルギー、喘息及び／又はＴＨ２細胞の脱制御もしくは活性に関連した疾患の処置のための薬物をスクリーニングする方法も企図する。好ましい実施態様において、該薬物の該効果は、インターロイキン産生、より好ましくはＩＬ−４産生を測定することにより評価され得る。
【００２６】
本発明の別の目的は、
１）本発明に係る突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードするＬＡＴ遺伝子を有する非ヒト動物に候補薬物を投与する工程；及び
２）該非ヒト動物におけるＴＨ２細胞の活性をモジュレートする薬物を選択する工程、
を含む、ＴＨ２細胞の活性を制御する薬物をスクリーニングする方法にある。
【００２７】
スクリーニング法は、候補薬物を選択、同定、特徴決定及び／又は最適化するために使用され得る。候補薬物は、任意の起源、性質及び構造のものであり得る。それらの濃度は、当業者によって調整され得る。さらに、数個の薬物を並行に又は組み合わせて試験してもよい。
【００２８】
本発明の別の目的は、（ｉ）前記のようなスクリーニングアッセイを使用して、化合物を選択、同定、最適化又は特徴決定すること、及び（ｉｉ）医薬的に許容される担体又は媒体の中に該化合物又はその誘導体を用意すること、
を含む、脱制御されたＴＨ２細胞活性に関連した疾患、特に喘息又はアレルギーを治療するための医薬組成物を作製する方法である。
【００２９】
さらに別の適用において、本発明は、本発明に係る動物を含む、ヒトＩｇＥ抗体の大規模作製のためのバイオリアクターを提供する。実施例２に記載されるように、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウス及びＬＡＴＹ１７５Ｆ＋ＹＬ９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスは、実際、膨大な量のＩｇＥを産生することができる。突然変異体マウスによって産生されたＩｇＥは、脱感作のような適用のため、又は臨床的アッセイのキットのため有用である。
【００３０】
従って、本発明は、
１）ヒト化ＩｇＥを発現する非ヒト動物を用意する工程；
２）該ヒト化ＩｇＥを発現する動物を、本発明に係る突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードするＬＡＴ遺伝子を有する非ヒト動物と交配する工程；
３）子孫の動物をアレルゲンにより免疫感作する工程；
４）該アレルゲンに対して特異的なヒト化ＩｇＥを回収する工程、
を含む、ヒトＩｇＥ抗体の作製の方法に関係する。工程４は、該アレルゲンに対して特異的な該ヒト化ＩｇＥを産生するＢ細胞ハイブリドーマを作製する工程を含み得る。本発明は、該アレルゲンに対して特異的な該ヒト化ＩｇＥを産生する該Ｂ細胞ハイブリドーマに関する。
【００３１】
ヒト化ＩｇＥを発現する非ヒト動物は、ＩｇＥ遺伝子の定常エキソンに相当する遺伝子セグメントが、対応するヒト配列に置換される、従来のノックインによって入手され得る。
【００３２】
本発明は、ヒト化ＩｇＥを発現する動物を、本発明に係る突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードするＬＡＴ遺伝子を有する非ヒト動物と交配することにより生じる非ヒト動物に関する。
【００３３】
作製された該アレルゲンに対して特異的なヒト化ＩｇＥは、脱感作のため、そして患者に存在するアレルゲン、好ましくはアトピー性アレルゲンを特徴決定することを目標とした臨床的アッセイにおいて使用され得る。
【００３４】
本発明は、マウスＬＡＴタンパク質におけるＹ１３６に相当するチロシンの単一突然変異又は３個の遠位チロシン（マウスＬＡＴタンパク質におけるＹ１７５、Ｙ１９５及びＹ２３５に相当する）の複合突然変異を含有している突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型ＬＡＴ遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを企図する。そのようなプローブは、ＬＡＴ遺伝子内の突然変異の存在を検出するのに有用である。従って、本発明は、マウスＬＡＴ遺伝子における突然変異Ｙ１３６の存在をスクリーニングするためのプローブとして、配列番号４及び／又は配列番号５に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドを提供する。より具体的には、本発明は、チロシンＹ１３２の単一突然変異又はチロシン残基Ｙ１７１、Ｙ１９１及びＹ２２６の複合突然変異を含有している突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型ヒトＬＡＴ遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブに関する。そのようなプローブは、喘息、アレルギー、好酸球増加及び／又はＴＨ２細胞の脱制御もしくは活性に関連した疾患に関与している突然変異体ＬＡＴ遺伝子の検出に有用である。該プローブは、診断キットの一部であり得る。
【００３５】
従って、本発明は、チロシンＹ１３２の単一突然変異又は複合突然変異Ｙ１７１＋Ｙ１９１＋Ｙ２２６を含有している突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型ＬＡＴ遺伝子の検出を含む、喘息、アレルギー、好酸球増加及び／又はＴＨ２細胞脱制御、より具体的にはＴＨ２細胞蓄積の診断法に関する。さらに、本発明は、Ｙ１３２の単一突然変異又は複合突然変異Ｙ１７１＋Ｙ１９１＋Ｙ２２６を含有している突然変異体ＬＡＴタンパク質をコードする突然変異型ＬＡＴ遺伝子の検出のためのオリゴヌクレオチドプローブを含む、喘息、アレルギー、好酸球増加及び／又はＴＨ２細胞脱制御、より具体的にはＴＨ２細胞蓄積の診断キットに関する。
【００３６】
本発明のその他の特徴及び利点は、図１〜１１を参照しながら、以下の実施例に与えられる。
【００３７】
実施例
突然変異ＬＡＴＹ１３６
実施例１：突然変異体マウスの作製
ＬＡＴＹ１３６の重要性をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するため、本発明者らは、Ｙ１３６をフェニルアラニンにより置換する突然変異（Ｙ１３６Ｆ）を有するノックインマウスを作出した。
【００３８】
１．材料及び方法
マウス
マウスは、特定病原体除去動物設備で維持した。
【００３９】
ＬＡＴＹ１３６Ｆ突然変異
ＬＡＴゲノムクローンを、１２９／Ｏｌａファージライブラリーから単離した。ＬＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列及びエキソン−イントロン構造を確立した後、１３６位に見出され、エキソン７によってコードされるチロシン残基を、フェニルアラニンへと突然変異させた。突然変異誘発は、エキソン５の一部、エキソン６、７及び８を包含している１７１７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片に対して実施した。意図された突然変異に加え、ＬｏｘＰ隣接ｎｅｏｒ遺伝子を適合させ、ＬＡＴＹ１３６Ｆ突然変異体マウスの後の同定を容易にするため、新たなＢｇｌＩＩ制限酵素分解部位をエキソン７の３’のイントロンに導入した。最後に、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片の５’及び３’のそれぞれ１．７ｋｂ及び４．８ｋｂの相同配列を与えるため、ターゲティング構築物を伸長させた（図２参照）。ＣＫ３５  １２９／ＳＶ  ＥＳ細胞（Ｃ．Ｋｒｅｓｓら、１９９８）の電気穿孔及びＧ４１８における選択の後、サザンブロット分析によって相同的組換えに関してコロニーをスクリーニングした。５’単一コピープローブは、ＬＡＴゲノムクローンから単離された０．９ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ断片であった。ＢｇｌＩＩ消化ＤＮＡに対して試験したところ、５’プローブは、８．５ｋｂの野生型断片又は４．５ｋｂの組換え断片のいずれかにハイブリダイズした。３’側における相同的組換え事象は、長領域ＰＣＲによってスクリーニングした。相同的組換えＥＳクローンを、エキソン７に相当するゲノムセグメントを配列決定することにより、意図された突然変異の存在に関してさらにチェックした。最後に、ｎｅｏプローブを使用して、偶発的な非相同的組換え事象が、選択されたクローンに起こっていないことを保証した。
【００４０】
突然変異体マウスの作製
突然変異体ＥＳ細胞をＢａｌｂ／ｃ胚盤胞に注射した。２個のＬＡＴＹ１３６Ｆ組換えＥＳ細胞クローンが、生殖系列伝達能を有することが見出された。２個の変異体マウス系列を、まず、ＬｏｘＰ隣接ネオマイシンカセットを排除するため、デリーター（Ｄｅｌｅｔｅｒ）マウス（Ｓｃｈｗｅｎｋ．Ｆら、１９９５）と交配し、ホモ接合性突然変異体マウスを作製するために交雑した。２個の独立に派生した突然変異体系列は、区別不能な表現型を示した。ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ突然変異が真に導入されていることを確認するため、突然変異型マウスの胸腺から逆転写及びＰＣＲ増幅によってＬＡＴ転写物をクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって意図された突然変異の存在を確認した。ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ突然変異の存在に関するマウスのスクリーニングを、以下のオリゴヌクレオチド対を使用したＰＣＲによって実施した：
ｃ：５’−ＧＴＧＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＧＧＧＴ−３’（配列番号４）；
ｄ：５’−ＧＡＣＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＧＡ−３’（配列番号５）。ｎｅｏｒの除去の後にＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ対立遺伝子に残った単一ＬｏｘＰ部位は、野生型ＬＡＴ対立遺伝子から増幅された５１０ｂｐ長の断片より１４０ｂｐ長い増幅ＰＣＲ産物を生じた。
【００４１】
２）突然変異体マウスの発達
ＬＡＴＹ１３６Ｆ突然変異に関してホモ接合性のマウス（以後、ＬＡＴＹ１３６Ｆと表記する）は、予想されたメンデルの頻度で誕生し、それらのＴ細胞は、野生型Ｔ細胞に類似したレベルのＬＡＴタンパク質を含有していた。出生時、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスは、正常サイズの末梢リンパ器官を示した。しかしながら、約３週目、突然変異体マウスの脾臓及びリンパ節は、野生型同腹仔と比べて肥大し始め、１５週齢までに、脾臓の細胞性は野生型マウスのそれのおよそ１０倍になった（図３Ａ〜Ｃ）。肺、肝臓及び腎臓における著しいリンパ球浸潤にも関わらず、ホモ接合体は、少なくとも１７週齢まで生存し、慢性の腸炎症又は腫瘍形成は観察されなかった。ＬＡＴＹ１３６Ｆ突然変異の効果は、ホモ接合性、又はＬＡＴ遺伝子のヌル対立遺伝子を保持しているマウスと、マウスを交配した後にのみ、検出可能であった。
【００４２】
実施例２：突然変異の効果：マウスにおける自然発生的な過度の２型Ｔヘルパー免疫
１．材料及び方法
ＣＤ４＋Ｔ細胞及び好酸球の精製
数匹のマウスに由来するリンパ節及び脾臓の細胞をプールし、ＣＤ４＋細胞を高勾配磁気細胞分離システムを使用して精製した（S.Miltenyiら、1990）。好酸球は、ＦＳＣｈｉｇｈ、ＨＳＡ＋及びＣＤ１１ｂ＋表現型に基づき、ＦＡＣＳｖａｎｔａｇｅ（登録商標）で分取した。
【００４３】
抗体及びフローサイトメトリー分析
染色前に、Ｆｃ受容体をブロッキングするため、氷上で少なくとも１０分間ポリクローナルのマウス及びラットのＩｇと共に細胞をプレインキュベートした。フローサイトメトリー分析は、以前に記載されたようにして実施した（M.Malissen、1995）。Ｒ＆Ｄより購入した抗ＣＣＲ３抗体以外、抗体は全てBD PharMingen製であった。
【００４４】
細胞内サイトカインに関する染色
細胞内サイトカイン染色前に、細胞（１．５×１０６個）を、２μＭの最終濃度のモネンシン（GolgiStop;BD PharMingen）の存在下で４時間培養した。次いで、細胞を直ちに氷上に置き、洗浄し、ＰＢＳ１×、１％ＦＣＳ、０．２０％アジ化ナトリウムに再懸濁させ、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ４抗体で染色した。細胞内サイトカイン染色のため、細胞を、まず、サイトフィックス／サイトパーム（cytofix/cytoperm）キット（BD PharMingen）を使用して固定した。その後、各細胞試料を等分し、それらを、（１）ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＩＦＮ−α抗体とＰＥコンジュゲート抗ＩＬ−２抗体との組み合わせ、（２）ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＩＬ−５抗体とＰＥコンジュゲート抗ＩＬ−４抗体との組み合わせ及び（３）蛍光色素をコンジュゲートしたアイソタイプ一致ネガティブコントロールＩｇの組み合わせ（BD PharMingen）により別々に染色した。最終洗浄の後、前方散乱及び側方散乱を使用して死細胞をゲートアウトした後、ＣＤ４＋細胞（１０４個）を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターで分析した。
【００４５】
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ
多重サイトカイン転写物分析のため、トリゾール（TRIzol）（GIBCO-BRL Life Technologies）を使用して、指定された細胞から全細胞ＲＮＡを単離し、ＭＣＫ−１ＲｉｂｏＱｕａｎｔ（登録商標）カスタムマウステンプレートセット（BD Pharmingen）を使用して、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイによって分析した。簡単に説明すると、３２Ｐ標識リボプローブを、ＲＮＡ  １０μgと混合し、５６℃で１２〜１６時間インキュベートし、次いでＲＮａｓｅ  ＡとＲＮａｓｅ  Ｔ１との混合物及びプロテイナーゼＫで処理した。ＲＮａｓｅプロテクト３２Ｐ標識ＲＮＡ断片を、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｆｕｊｉイメージングプレートシステムでバンドの強度を評価した。
【００４６】
血清中のアイソタイプ特異的免疫グロブリンレベルの決定
ポリクローナルのＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体及びＩｇＡ抗体、並びにκ及びλ軽鎖の力価を、アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡ（Southern Biotechnology）を使用して決定した。ＩｇＧ１及びＩｇＥの濃度を、試験サンプル希釈系列の値をアイソタイプコントロール標準と比較することにより決定した。
【００４７】
２．結果
サイトカインを作成する能力を測定したところ、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスに見出されるＣＤ４  Ｔ細胞の顕著な表現型が、明らかとなった。サイトカイン及びそれらの転写物の短い半減期のため、それらの分析は、一般的には、ＰＭＡ及びイオノマイシンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞の再刺激を必要とする。９個のサイトカインの転写物のレベルを検出するマルチプローブＲＮａｓｅプロテクションアッセイは、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスから新鮮に単離されたＣＤ４  Ｔ細胞が、ｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激なしですら、検出を可能にするために十分なＩＬ−４及びＩＬ−１０の転写物を含有していることを示した（図４Ａ）。ＰＭＡ／イオノマイシンによる活性化により、それらが含有しているＩＬ−４及びＩＬ−１０の転写物のレベルは、さらに増加し、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−αの転写物が容易に検出可能となった（図４Ｂ）。著しく対照的に、野生型ＣＤ４  Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞に関して予想されるＩＬ−２及びＩＦＮ−αの転写物のみを与えた。単細胞レベルのＩＬ−４産生の分析は、ＰＭＡ／イオノマイシンによる４時間の活性化の後、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスから単離されたＣＤ４  Ｔ細胞の８０％近くが、極めて高いレベルのＩＬ−４を発現することを示した（図４Ｃ）。これらのＣＤ４  Ｔ細胞がＴＣＲ刺激に対して抵抗性であったという所見と一致して、それらは、いずれも、ＴＣＲクロスリンキングに応答したＩＬ−４＋とは判定されなかった（図４Ｃ）。従って、ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆは、自然発生的に高頻度のＴＨ２細胞を発達させた。野生型ＣＤ４  Ｔ細胞の場合、そのような大きさのＴＨ２偏向は、ＩＬ−４の存在下での長期の抗原刺激の後にのみ達成される。
【００４８】
４週齢より高齢のＬＡＴＹ１３６Ｆマウスに由来する胸腺細胞及びリンパ節細胞の光散乱分析は、齢一致野生型マウスにはほとんど存在しない独特の細胞集団を明らかにし、中間の前方散乱及び高度の側方散乱の両方を示した（図５Ａ、５Ｂ、６Ａ）。数個の基準に基づき、これらの細胞は、好酸球と同定された（図６）。通常、野生型胸腺には極少数の好酸球が存在しており、ＬＡＴＹ１３６Ｆ胸腺におけるそれらの増大は、主としてＬＡＴＹ１３６Ｆ分子の内在性の発現により生じたのかもしれない。しかしながら、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスから精製された好酸球中にはＬＡＴ転写物は検出不可であり、このことは、それらが示す胸腺及びリンパ節の好酸球増加が、これらの突然変異体マウスに存在する異常なＣＤ４細胞によるＩＬ−５の産生により生じたものであることを意味している。
【００４９】
６週齢ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスの二次リンパ器官は、野生型カウンターパートより７〜１０倍多くのＢ細胞を含有していた。従って、若齢ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスにおいて発達した脾腫及び全身性リンパ節腫脹は、主に、Ｔ及びＢ細胞系統に属する細胞によるのかもしれない。６週齢野生型同腹仔の脾臓及びリンパ節に見出された成熟Ｂ細胞の９０％超が、休止表現型を有していた（図７Ａ）。著しく対照的に、齢一致ＬＡＴＹ１３６Ｆ同腹仔の肥大した二次リンパ器官に見出されたＢ細胞の２５％のみが、休止表現型を示した。残りのＢ細胞のうち、２５％が、過剰に活性化された表現型を示し、５０％が、抗体産生細胞に典型的な表現型を発現した。これらの後者の細胞の存在と一致して、血清中のＩｇＧ１濃度は、野生型マウスと比較しておよそ２００倍に上昇し、ＩｇＥのそれは、２５００〜１００００倍に上昇した（図７Ｃ）。対照的に、その他のＩｇアイソタイプのレベルは、野生型血清のそれと有意に異なっていなかった（図７Ｂ）。ポリクローナル高γグロブリン血症Ｇ１及びＥを支持して、κ及びλ軽鎖の濃度は、両方とも、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスの血清において著しく増強されていた（図７Ｂ）。注目すべきことに、ＩｇＥ抗体及びＩｇＧ１抗体の濃度は、早くも５週齢でプラトーに達し（図７Ｃ）、その値は、ＮＦＡＴｃ２及びＮＦＡＴｃ３転写調節因子を欠いたマウスに関して以前に報告されたＩｇＥ及びＩｇＧ１の非常に多い量を越えていた。Ｂ細胞はＬＡＴタンパク質を発現しないため、そしてＩｇＥ及びＩｇＧ１へのアイソタイプ切り替えが、ＩＬ−４及びＩＬ−１３の存在に対して高度に依存性であることを考慮すると、ＬＡＴＹ１３６Ｆマウスに認められたＩｇＥ及びＩｇＧ１の過剰産生は、異常に高頻度のＴＨ２エフェクターの存在による二次的なものである。
【００５０】
実施例３：ＩｇＥの作製
ＩｇＥ遺伝子の定常エキソンに相当する遺伝子セグメントが、対応するヒト配列に置換される、従来のノックイン戦略によって、ヒト化ＩｇＥを発現するマウスを開発した。ヒト化ＩｇＥ遺伝子座を有するマウスを、ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆマウスと交配した。免疫感作の後、特異的なヒトＩｇＥを産生するＢ細胞ハイブリドーマを作製し、生じた特異的なヒトＩｇＥを、患者に存在するアトピー性アレルゲンを特徴決定することを目標とした臨床的アッセイにおける「標準」として使用した。
【００５１】
実施例４：薬物のスクリーニング
突然変異体マウス及びコントロールマウスを、多様な薬物又は原型化合物により処理した。それらの効果を、以下のような様々なパラメータを測定することによりｉｎ  ｖｉｖｏで分析した：
・  ＴＨ２細胞分化
・  ＴＨ２型サイトカインの産生
・  好酸球増加
・  高γグロブリン血症Ｇ１及びＥ
・  突然変異ＬＡＴＹ１７５＋Ｙ１９５＋Ｙ２３５
【００５２】
実施例５：突然変異体マウスの作製
３個のカルボキシ末端チロシン（ＬＡＴ  Ｙ１７５、ＬＡＴ  Ｙ１９５及びＬＡＴ  Ｙ２３５）の重要性をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するため、本発明者らは、これらの３個のチロシンを、フェニルアラニンに置換する突然変異（ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ）を有するノックインマウスを作製した。
【００５３】
１．材料及び方法
マウス
マウスは、特定病原体除去動物設備において維持した。
【００５４】
ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ突然変異
ＬＡＴゲノムクローンを、１２９／Ｏｌａファージライブラリーより単離した。ＬＡＴ遺伝子（ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース；登録番号：ＡＪ４３８４３５）のヌクレオチド配列及びエキソン−イントロン構造を確立した後、１７５位、１９５位及び２３５位に見い出され、エキソン９、１０、１１によってコードされるチロシン残基を、フェニルアラニンへと突然変異させた。突然変異誘発は、エキソン９、１０、１１（チロシン１７５（エキソン９）、１９５（エキソン１０）、２３５（エキソン１１）をコードしている）、及びエキソン１２の一部（ＬＡＴの３’非翻訳領域に相当する）を包含する８１５ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片に対して実施した。各エキソンを独立に突然変異させ、後のクローニング工程を容易にするため、新たな制限部位を導入した。新たなＥｃｏＲＩ部位をＮｃｏＩ部位の５’ 側に導入し、ＢａｍＨＩ部位及びＣｌａＩ部位をエキソン９と１０の間に導入し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位をエキソン１０と１１の間に導入し、ＢｇｌＩＩ部位、ＸｈｏＩ部位及びＮｏｔＩ部位を元のＢａｍＨＩ部位の代わりにエキソン１１の３’側に導入した。Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を用いたＰＣＲ反応を実施し、ＰＣＲ産物を精製し、エキソン９についてはＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで、エキソン１０についてはＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで、エキソン１１についてはＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩで切断した。これらの３個の断片を、ｐＢＳ−ＫＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内に組み立てた。生じたプラスミドを使用して、５’ホモロジーアームを提供する３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩゲノム断片及び３’ホモロジーアームを提供する４．３ｋｂびＳａｌＩゲノム断片をクローニングした。最後に、エキソン９と１０の間に挿入されたＢａｍＨＩ部位及びＣｌａＩ部位を使用して、ｌｏｘＰ隣接ｎｅｏｒ遺伝子を導入した。ＣＫ３５  １２９／ＳＶ胚性幹（ＥＳ）細胞の電気穿孔及びＧ４１８における選択の後、ＬＡＴゲノムクローンから単離された１．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片からなる３’単一コピープローブを使用したサザンブロット分析によって、相同的組換えに関してコロニーをスクリーニングした。ＢａｍＨＩ消化ゲノムＤＮＡで試験したところ、３’プローブは、７．０ｋｂの野生型断片又は９．１ｋｂの組換え断片のいずれかにハイブリダイズした。真の組換え事象の存在を、以下のプライマー対を使用したＰＣＲによってチェックした（図８に図示）：
ｆ：５’−ＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＡＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧ−３’；（配列番号６）及び
ｇ：５’−ＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＣＧＣ−３’（配列番号７）。このＰＣＲは、組換えＥＳクローンにおいてのみ８．６ｋｂのバンドを与えた。エキソン９、１０及び１１に相当するゲノムセグメントを配列決定することにより、意図された突然変異の存在に関して、相同的組換えＥＳクローンをさらにチェックした。最後に、ｎｅｏプローブを使用して、偶発的な非相同的組換え事象が、選択されたクローンにおいて起こっていないことを確かめた。
【００５５】
突然変異体マウスの作製
突然変異体ＥＳ細胞をＢａｌｂ／ｃ胚盤胞に注射した。２個のＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ組換えＥＳ細胞クローンが、生殖系列伝達能を有することが見出された。２個の突然変異体マウス系列を、まず、ＬｏｘＰ隣接ネオマイシンカセットを排除するため、デリーター（Deleter）マウス（Schwenk.Fら、1995）と交配し、ホモ接合性突然変異体マウスを作製するために交雑した。２個の独立に派生した突然変異体系列は、区別不能な表現型を示した。ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ突然変異が真に導入されたことを確認するため、突然変異型マウスの胸腺から逆転写及びＰＣＲ増幅によってＬＡＴ転写物をクローニングし、ＤＮＡ配列分析によって意図された突然変異の存在を確認した。ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ突然変異の存在に関するマウスのスクリーニングを、以下のオリゴヌクレオチド対を使用したＰＣＲによって実施した：
ｄ：５’−ＧＧＡＧＡＣＴＴＡＧＡＴＧＴＣＴＧＡＧＣＣＧ−３’（配列番号８）、及び
ｅ：５’−ＧＡＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＴＧ−３’（配列番号９）（Ｗｔ  ２３８ｂｐ、突然変異体４３５ｂｐ）。ｎｅｏｒの欠失の後にＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ対立遺伝子に残った単一ＬｏｘＰ部位は、野生型ＬＡＴ対立遺伝子から増幅された５１０ｂｐ長の断片より１４０ｂｐ長い増幅ＰＣＲ産物を生じた。
【００５６】
２）突然変異マウスの発達
ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ突然変異に関してホモ接合性のマウス（以後、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆと表記する）は、予想されたメンデルの頻度で誕生し、それらのＴ細胞は、野生型Ｔ細胞に類似したレベルのＬＡＴタンパク質を含有していた。出生時、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスは、正常サイズの末梢リンパ器官を示した。しかしながら、約３ヶ月目、突然変異体マウスの脾臓及びリンパ節は、野生型同腹仔と比べて肥大し始め、３ヶ月齢までに、脾臓の細胞性は野生型マウスのそれのおよそ５倍になった。ホモ接合体は、少なくとも５ヶ月齢まで生存し、慢性の腸炎症又は腫瘍形成は観察されなかった。ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ突然変異の効果は、ホモ接合性、又はＬＡＴ遺伝子のヌル対立遺伝子を保持しているマウスと、マウスを交配した後にのみ、検出可能であった。
【００５７】
実施例６：突然変異の効果：マウスにおいてγ／δＴ細胞のサブセットが拡大し、自然発生的な過度の２型Ｔヘルパー免疫を獲得する
１．材料及び方法
γ／δＴ細胞及び好酸球の精製
数匹のマウスに由来する脾細胞をプールし、γ／δＴ細胞を高勾配磁気細胞分離系を使用して精製した（S.Miltenyiら、1990）。
【００５８】
抗体及びフローサイトメトリー分析
染色前に、Ｆｃ受容体をブロッキングするため、氷上で少なくとも１０分間ポリクローナルのマウス及びラットのＩｇと共に細胞をプレインキュベートした。フローサイトメトリー分析は、以前に記載されたようにして実施した（M.Malissen、1995）。抗体は全てBD PharMingen製であった。
【００５９】
細胞内サイトカインに関する染色
細胞内サイトカイン染色の前に、細胞（１．５×１０６個）を、２μＭの最終濃度のモネンシン（GolgiStop;BD PharMingen）の存在下で４時間培養した。次いで、細胞を直ちに氷上に置き、洗浄し、ＰＢＳ１×、１％ＦＣＳ、０．２０％アジ化ナトリウムに再懸濁させ、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ５抗体で染色した。細胞内サイトカイン染色のため、細胞を、まず、サイトフィックス／サイトパームキット（BD PharMingen）を使用して固定した。その後、各細胞試料を等分し、それらを、（１）ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＩＦＮ−  抗体とＰＥコンジュゲート抗ＩＬ−２抗体との組み合わせ、（２）ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＩＬ−５抗体とＰＥコンジュゲート抗ＩＬ−４抗体との組み合わせ及び（３）蛍光色素をコンジュゲートしたアイソタイプ一致ネガティブコントロールＩｇの組み合わせ（BD PharMingen）により別々に染色した。最終洗浄の後、前方散乱及び側方散乱を使用して死細胞を排除した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターでＣＤ５＋細胞（１０４個）を分析した。
【００６０】
ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ
多重サイトカイン転写物分析のため、トリゾール（TRIzol）（GIBCO-BRL Life Technologies）を使用して、指定された細胞から全細胞ＲＮＡを単離し、ＭＣＫ−１ＲｉｂｏＱｕａｎｔ（登録商標）カスタムマウステンプレートセット（BD Pharmingen）を使用して、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイによって分析した。簡単に説明すると、３２Ｐ標識リボプローブを、ＲＮＡ  １０μgと混合し、５６℃で１２〜１６時間インキュベートし、次いでＲＮａｓｅｓ  ＡとＲＮａｓｅｓ  Ｔ１との混合物及びプロテイナーゼＫで処理した。ＲＮａｓｅプロテクト３２Ｐ標識ＲＮＡ断片を、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、Ｆｕｊｉイメージングプレートシステムでバンドの強度を評価した。
【００６１】
血清中のアイソタイプ特異的免疫グロブリンレベルの決定
ポリクローナルのＩｇＭ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体及びＩｇＡ抗体、並びに  及び  軽鎖の力価を、アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡ（Southern Biotechnology）を使用して決定した。ＩｇＧ１及びＩｇＥの濃度を、試験サンプル希釈系列の値をアイソタイプコントロール標準と比較することにより決定した。
【００６２】
２．結果
サイトカインを産生する能力を測定したところ、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスに見出されるＣＤ９０．２＋、ＣＤ５＋γ／δＴ細胞の顕著な表現型（図９参照）が明らかとなった。サイトカイン及びそれらの転写物の短い半減期のため、それらの分析は、一般的には、ＰＭＡ及びイオノマイシンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴ細胞の再刺激を必要とする。９個のサイトカインの転写物のレベルを検出するマルチプローブＲＮａｓｅプロテクションアッセイは、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスから新鮮に単離されたγ／δＴ細胞が、大量のＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３の転写物を含有していることを示した（図１０）。この属性は、ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆマウスの末梢に存在するアルファ／ベータＴ細胞でなされた観察を彷彿とさせる。著しく対照的に、野生型ＣＤ４  Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞に関して予想されるＩＬ−２及びＩＦＮ−γの転写物のみを与えた。単細胞レベルのＩＬ−４産生の分析は、ＰＭＡ／イオノマイシンによる４時間の活性化の後、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスから単離されたＣＤ４  Ｔ細胞が、極めて高レベルのＩＬ−４を発現することを示した。従って、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスは、高頻度のＴｈ２表現型を有するγ／δ細胞を自発的に発達させた。野生型ＣＤ４  Ｔ細胞の場合、そのような大きさのＴＨ２偏向は、ＩＬ−４の存在下での長期の抗原刺激の後にのみ達成される。
【００６３】
３ヶ月齢のＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスの脾臓は、野生型カウンターパートより５〜１０倍多くのＢ細胞を含有していた。従って、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスにおいて発達した脾腫は、主に、Ｔ及びＢ細胞系統に属する細胞によるのかもしれない。３ヶ月齢野生型同腹仔の脾臓及びリンパ節に見出された成熟Ｂ細胞の９０％超が、休止表現型を有していた（図１１Ａ）。著しく対照的に、齢一致ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ同腹仔の肥大した二次リンパ器官に見出されたＢ細胞の１６％のみが、休止表現型を示した。残りのＢ細胞のうち、２１％が、過剰に活性化された表現型を示し、６３％が、抗体産生細胞に典型的な表現型を発現した。これらの後者の細胞の存在と一致して、血清中のＩｇＧ１濃度は、野生型マウスと比較しておよそ１００倍に上昇し、ＩｇＥのそれは、５００〜５０００倍に上昇した（図１１）。対照的に、その他のＩｇアイソタイプのレベルは、野生型血清のそれと有意に異なっていなかった。成熟Ｂ細胞はＬＡＴタンパク質を発現しないため、そしてＩｇＥ及びＩｇＧ１へのアイソタイプ切り替えが、ＩＬ−４及びＩＬ−１３の存在に対して高度に依存性であることを考慮すると、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスに認められたＩｇＥ及びＩｇＧ１の過剰産生は、異常に高頻度のＴＨ２サイトカイン産生γ／δＴ細胞の存在による二次的なものである。
【００６４】
実施例７：ＩｇＥの作製
ＩｇＥ遺伝子の定常エキソンに相当する遺伝子セグメントが、対応するヒト配列に置換される従来のノックイン戦略によって、ヒト化ＩｇＥを発現するマウスを開発した。ヒト化ＩｇＥ遺伝子座を有するマウスを、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスと交配した。免疫感作の後、特異的なヒトＩｇＥを産生するＢ細胞ハイブリドーマを作製し、生じた特異的なヒトＩｇＥを、患者に存在するアトピー性アレルゲンを特徴決定することを目標とした臨床的アッセイにおける「標準」として使用した。
【００６５】
実施例８：薬物のスクリーニング
突然変異体マウス及びコントロールマウスを、多様な薬物又は原型化合物により処理した。それらの効果を、以下のような様々なパラメータを測定することによりｉｎ  ｖｉｖｏで分析した：
・  ＴＨ２細胞分化
・  ＴＨ２型サイトカインの産生
・  高γグロブリン血症Ｇ１及びＥ
【００６６】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】突然変異体マウスの免疫系の発達を開示する図である。
【図２】ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆノックイン戦略を例示している。（１）：野生型ＬＡＴ遺伝子の部分的な制限地図。（２）：ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ突然変異の導入に使用されたターゲティングベクター。（３）：相同的組換え後の標的対立遺伝子の構造。（４）：Ｃｒｅ媒介組換えを介したｎｅｏｒ遺伝子の除去の後の標的対立遺伝子の最終構造。
【図３Ａ】マウスにおけるリンパ器官：胸腺（Ａ）の異常な成長を例示する。
【図３Ｂ】マウスにおけるリンパ器官：脾臓（Ｂ）の異常な成長を例示する。
【図３Ｃ】マウスにおけるリンパ器官：リンパ節（Ｃ）の異常な成長を例示する。
【図４Ａ】ＬＡＴＹ１３６Ｆ末梢リンパ器官から新鮮に単離されたＣＤ４  Ｔ細胞における構成性２型サイトカイン産生に関する。
【図４Ｂ】ＬＡＴＹ１３６Ｆ末梢リンパ器官から新鮮に単離されたＣＤ４  Ｔ細胞における構成性２型サイトカイン産生に関する。
【図４Ｃ】ＬＡＴＹ１３６Ｆ末梢リンパ器官から新鮮に単離されたＣＤ４  Ｔ細胞における構成性２型サイトカイン産生に関する。
【図５Ａ】野生型マウス及びＬＡＴＹ１３６Ｆマウスに由来するＴ細胞の表現型分析に関する。
【図５Ｂ】野生型マウス及びＬＡＴＹ１３６Ｆマウスに由来するＴ細胞の表現型分析に関する。
【図６Ａ】６週齢ＬＡＴＹ１３６Ｆリンパ器官における好酸球増加を例示する。Ａ：パネルＢに記載された分析及びパネルＣのソーティングした細胞の写真のため選択されたゲートを示すドットプロットパネル。
【図６Ｂ】６週齢ＬＡＴＹ１３６Ｆリンパ器官における好酸球増加を例示する。Ｂ：好中球を特徴付ける抗体により標識されたゲートされた細胞の単色ヒストグラム。
【図６Ｃ】６週齢ＬＡＴＹ１３６Ｆリンパ器官における好酸球増加を例示する。Ｃ：ソーティングした細胞のヘマトキシリン及びエオシンによる染色。
【図７Ａ】Ｂリンパ球の活性亢進：非免疫感作ＬＡＴＹ１３６ＦマウスにおけるＩｇＥ抗体及びＩｇＧ１抗体の高血清レベルを例示している。
【図７Ｂ】Ｂリンパ球の活性亢進：非免疫感作ＬＡＴＹ１３６ＦマウスにおけるＩｇＥ抗体及びＩｇＧ１抗体の高血清レベルを例示している。
【図７Ｃ】Ｂリンパ球の活性亢進：非免疫感作ＬＡＴＹ１３６ＦマウスにおけるＩｇＥ抗体及びＩｇＧ１抗体の高血清レベルを例示している。
【図８】ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆノックイン戦略を例示している。（１）：野生型ＬＡＴ遺伝子の部分的な制限地図。（２）：ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ、Ｙ１９５Ｆ及びＹ２３５Ｆ突然変異の導入に使用されたターゲティングベクター。（３）：相同的組換え後の標的対立遺伝子の構造。（４）：Ｃｒｅ媒介組換えを介したｎｅｏｒ遺伝子の除去の後の標的対立遺伝子の最終構造。
【図９】アルファ／ベータＴ細胞の非存在下でのみ、ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ突然変異体において多数発達したγ／δＴ細胞の表現型分析に関する。
【図１０】ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆ突然変異マウスに存在するγ／δＴ細胞によって自然発生的に産生されるＴＨ２型サイトカイン（レーン３）を例示し、ＬＡＴ  Ｙ１３６Ｆ突然変異体において発達したアルファ／ベータＴ細胞によって自然発生的に産生されるＴＨ２型サイトカイン（レーン１）と比較している。
【図１１】Ｂリンパ球の活性亢進、及び非免疫感作ＬＡＴ  Ｙ１７５Ｆ＋Ｙ１９５Ｆ＋Ｙ２３５Ｆマウスの血清中に自然発生的に見出される大量のＩｇＥ及びＩｇＧ１を例示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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