(57)【要約】本発明は、その腫瘍酵素活性としてペクチン酸リアーゼ活性を示す親酵素に比較して変更を示すペクチン酸リアーゼ変異体；そのような酵素の生成方法；及び布、洗剤及びセルロース繊維加工産業へのそのような酵素の使用方法に関する。親酵素に比較して、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤において改良された安定性を示すことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペクチン酸リアーゼ活性（EC4, 2, 2, 2）を有し、そして次の位置番号：5,9, 11,26, 28,30, 31,37, 40,45, 46,47, 48,49, 50,51, 52,54, 61,64, 68,69, 70, 71,74, 75,76, 79,86, 87,91, 99,105, 106,107, 111,115, 116,118, 122,123, 134,136, 139, 140,141, 146,148, 156,158, 170,182, 185,186, 189,193, 194,196, 199,201, 202,204, 213,215, 218,224, 228,229, 234,235, 237,251, 256,257, 258,272, 277,286, 295,298, 301,302, 303,305, 307,308, 314,316, 323,324, 326,331, 332,333, 334,335, 336,337, 338,339, 340,341, 349,356, 357,363, 366,378, 381,384, 386,387, 389,390, 391,393 及び 397から成る群から選択された１又は複数の位置での変更を含んで成る、親酵素の変異体であって、ここで前記変更が独立して、
（ｉ）前記位置を支配するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を支配するアミノ酸の欠失、又は
（iii）前記位置を支配するアミノ酸の異なったアミノ酸による置換、
であり、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応し、そして前記親酵素が配列番号２で示されるペクチン酸リアーゼ又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも65％の同一性を有するペクチン酸リアーゼであることを特徴とする変異体。
【請求項２】
前記変異体が、親酵素に比較して、改良された洗剤安定性を有する請求項１記載の変異体。
【請求項３】
前記変更が置換である請求項１又は２記載の変異体。
【請求項４】
下記：
H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69*, L70*, K71*, K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N, K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V123I, S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A228I, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y, R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, I336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, I357V, N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S387A, V389I, I390N, I390T, S391N, A393V 及び K397Dから成る群から選択された１又は複数の置換を含んで成り、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応する請求項１〜３のいずれか１項記載の変異体。
【請求項５】
前記親ペクチン酸リアーゼが、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも約90％、さらにより好ましくは、少なくとも約95％及び最も好ましくは少なくとも約97％の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体。
【請求項６】
前記親ペクチン酸リパーゼが、配列番号１のポリヌクレオチド又はその相補的鎖と、中位の、より好ましくは高い緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる請求項１〜５のいずれか１項記載の変異体。
【請求項７】
前記変更が、ランダム又は特定部位の突然変異誘発により、又は配列番号２に対して少なくとも65％の同一性を有する、ペクチン酸アリーゼをコードする１又は複数のDNA配列のシャフリングにより導入される請求項１〜６のいずれか１項記載の変異体。
【請求項８】
前記親ペクチン酸リアーゼが、野生型ペクチン酸リアーゼである請求項１〜７のいずれか１項記載の変異体。
【請求項９】
前記親ペクチン酸リアーゼが、バチルス（Bacillus）ペクチン酸リアーゼである請求項１〜８のいずれか１項記載の変異体。
【請求項１０】
前記親ペクチン酸リアーゼが、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）DSM 14218株のプラスミドに存在するポリヌクレオチドによりコードされる請求項１〜９のいずれか１項記載の変異体。
【請求項１１】
前記変更の合計数が、13、好ましくは12、より好ましくは11、さらにより好ましくは10、さらにより好ましくは９、さらにより好ましくは８、さらにより好ましくは７、さらにより好ましくは６、さらにより好ましくは５、さらにより好ましくは４、さらにより好ましくは３、さらにより好ましくは２、及び最も好ましくは１である請求項１〜10のいずれか１項記載の変異体。
【請求項１２】
請求項１〜11のいずれか1項記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項12記載のポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクター。
【請求項１４】
請求項13記載の発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、細菌、好ましくはバチルス、より好ましくはバチルス・サブチリスである請求項14記載の微生物宿主細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、菌類又は酵母、好ましくは糸状菌、最も好ましくはアスペルギラス（Aspergillus）である請求項14記載の微生物宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜11のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体の生成方法であって、請求項14〜16のいずれか1項記載の微生物宿主細胞が、変異体の発現及び選択の助けとなる条件下で培養され、そして前記変異体が回収されることを含んで成る方法。
【請求項１８】
ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性の改良方法であって、次の位置番号：5,9, 11,26, 28,30, 31,37, 40,45, 46,47, 48,49, 50,51, 52,54, 61,64, 68,69, 70, 71,74, 75,76, 79,86, 87,91, 99,105, 106,107, 111,115, 116,118, 122,123, 134,136, 139, 140,141, 146,148, 156,158, 170,182, 185,186, 189,193, 194,196, 199,201, 202,204, 213,215, 218,224, 228,229, 234,235, 237,251, 256,257, 258,272, 277,286, 295,298, 301,302, 303,305, 307,308, 314,316, 323,324, 326,331, 332,333, 334,335, 336,337, 338,339, 340,341, 349,356, 357,363, 366,378, 381,384, 386,387, 389,390, 391,393 及び 397から成る群から選択された１又は複数の位置の変更を含んで成り、ここで前記変更が独立して、
（ｉ）前記位置を支配するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を支配するアミノ酸の欠失、又は
（iii）前記位置を支配するアミノ酸の異なったアミノ酸による置換、
であり、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応し、そして前記親酵素が配列番号２で示されるペクチン酸リアーゼ又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも65％の同一性を有するペクチン酸リアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記変更が置換である請求項18記載の方法。
【請求項２０】
下記：
H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69*, L70*, K71*, K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N, K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V123I, S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A228I, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y, R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, I336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, I357V, N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S387A, V389I, I390N, I390T, S391N, A393V 及び K397Dから成る群から選択された１又は複数の置換を含んで成り、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応する請求項18又は19記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜11のいずれか１項記載の変異体及び界面活性剤を含んで成る、洗剤又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い組成物。
【請求項２２】
さらに、セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、例えばマンナナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、リケナーゼ、アラビナナーゼ、もう１つのペクチン酸リアーゼ又はその混合物を含んで成る請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い洗剤への請求項１〜11のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体の使用。
【請求項２４】
布及びセルロース繊維の加工への請求項１〜11のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体の使用。
【請求項２５】
請求項１〜11のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体と細胞壁材料とを接触することを含んで成る酵素精錬方法。
【請求項２６】
請求項１〜11のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体と布とを接触することを含んで成る、布からの細胞壁材料の酵素的除去方法。
【請求項２７】
ペクチン酸リアーゼ活性（EC4.2.2.2）を有する、親酵素の変異体であって、前記酵素の全体的電荷がより陰性にされていることを特徴とする変異体。
【請求項２８】
ペクチン酸リアーゼ活性（EC4.2.2.2）を有する、親酵素の変異体であって、前記変異体の酸化不安定アミノ酸残基が置換されていることを特徴とする変異体。
【請求項２９】
ペクチン酸リアーゼ活性（EC4.2.2.2）を有する、親酵素の変異体であって、前記変異体のより柔軟なアミノ酸残基が低柔軟性アミノ酸残基により置換されていることを特徴とする変異体。
【請求項３０】
改良されたカルシウム消耗安定性を有する、ペクチン酸リアーゼ活性（EC4.2.2.2）を有する、親酵素の変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その腫瘍酵素活性としてペクチン酸リアーゼ活性を示す親酵素に比較して変更を示すペクチン酸リアーゼ変異体；そのような酵素の生成方法；及び布、洗剤及びセルロース繊維加工産業へのそのような酵素の使用方法に関する。親酵素に比較して、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤において改良された安定性を示すことができる。
【背景技術】
【０００２】
ペクチンポリマーは、植物細胞壁の重要な構成成分である。ペクチンは、交互に存在するホモガラクツロナン（平滑領域）及びラムノガラクツロナン（毛状領域）から構成される主鎖を有するヘテロ多糖である。平滑領域は、１，４−結合されたα−D−ガラクツロン酸の線状ポリマーである。ガラクツロン酸残基は、通常、非ランダム態様で、カルボキシル基上で種々の程度、メチル−エステル化され得、それにより、ポリガラクツロン酸のブロックは完全にメチル−エステル化される。
【０００３】
ペクチン酸分解酵素（ぺクチナーゼ）は、それらの選択的基質、すなわち高くメチル−エステル化されたペクチン又は低くメチル−エステル化されたペクチン及びポリガラクツロン酸（ペクチン酸塩）、及びそれらの反応機構、すなわちβ−排除又は加水分解に従って分類され得る。ぺクチナーゼは、主に内部−作用性であり、鎖内のランダム部位でポリマーを切断し、オリゴマーの混合物を付与するか、又はそれらは外部−作用性であり、ポリマーの一端から攻撃し、そしてモノマー又はダイマーを生成する。ペクチンの平滑領域に対して作用するいくつかのぺクチナーゼ活性は、酵素命名法（1992）により提供される酵素、例えばペクチン酸リアーゼ（EC4.2.2.2.）、ペクチンリアーゼ（4.2.2.10）、ポリガラクツロナーゼ（EC3.2.1.15）、エクソ−ポリガラクツロナーゼ（EC3.2.1.67）、エクソ−ポリガラクツロン酸リアーゼ（EC4.2.2.9）及びエクソ−ポリ−α−ガラクツロシダーゼ（EC3.2.1.82）の分類に包含する。
【０００４】
ペクチン酸リアーゼは、異なった細菌属、例えばエルウイニア（Erwinia）、シュードモナス（Pseudomonas）、キエブシエラ（Kiebsiella）及びキサントモナス（Xanthomonas）からクローン化されて来た。また、バチルス・サブチリス（Nasserなど. (1993) FEBS 335: 319-326）及びバチルスsp. YA-14 (Kimなど. (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 947-949) からのペクチン酸リアーゼのクローニングが記載されて来た。
ペクチン酸リアーゼは一般的に、アルカリpH最適性及び二価のカチオン（Ca2+が最も刺激的である）についての絶対的必要性により特徴づけられる。
例えば、洗剤又は布産業工程において適用される場合、親ペクチン酸リアーゼよりも改良された性能を示す。細胞壁分解酵素変異体、特にペクチン酸リアーゼ酵素変異体を供給することが本発明の目的である。
【発明の開示】
【０００５】
発明の要約：
本発明者は、細胞壁分解酵素、特にβ−ヘリックスを含む構造を有するペクチン酸リアーゼが、親酵素に比較して、中性又はアルカリ性pH範囲で改良された性能を有する酵素変異体をもたらすことを見出した。本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、洗剤組成物に使用される場合、改良された貯蔵安定性、すなわち洗剤に対する低い感受性を有する。
【０００６】
従って、第１の観点においては、本発明は、次の位置番号：5,9, 11,26, 28,30, 31,37, 40,45, 46,47, 48,49, 50,51, 52,54, 61,64, 68,69, 70, 71,74, 75,76, 79,86, 87,91, 99,105, 106,107, 111,115, 116,118, 122,123, 134,136, 139, 140,141, 146,148, 156,158, 170,182, 185,186, 189,193, 194,196, 199,201, 202,204, 213,215, 218,224, 228,229, 234,235, 237,251, 256,257, 258,272, 277,286, 295,298, 301,302, 303,305, 307,308, 314,316, 323,324, 326,331, 332,333, 334,335, 336,337, 338,339, 340,341, 349,356, 357,363, 366,378, 381,384, 386,387, 389,390, 391,393 及び 397から成る群から選択された１又は複数の位置での変更を含んで成るペクチン酸リアーゼ変異体に関し、ここで前記変更が独立して、
（ｉ）前記位置を支配するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を支配するアミノ酸の欠失、又は
（iii）前記位置を支配するアミノ酸の異なったアミノ酸による置換、
であり、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応し、そして前記親酵素が配列番号２で示されるペクチン酸リアーゼ又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも65％の同一性を有するペクチン酸リアーゼであることを特徴とする。
【０００７】
第２の観点においては、本発明は、ペクチン酸リアーゼ変異体をコードする核酸配列に関する。
本発明の第３の観点においては、発現ベクターが提供される。
本発明の第４の観点においては、上記発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細胞が提供される。
本発明の第５の観点においては、１又は複数のアミノ酸の変更を包含する、ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性を改良するための方法が提供される。
【０００８】
本発明の第６の観点においては、上記に開示されるような発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより、前記細胞は核酸配列によりコードされる変異体を発現し、そしてペクチン酸リアーゼ変異体を回収することを含んで成る、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の生成方法が提供される。
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、セルロース材料、特にセルロース含有繊維、糸、織布又は不織布の処理、及び布の浸水のために有用である。前記処理は、例えば糊抜き又は精錬段階における被服製造又は布製造のために容易な材料へのセルロース性材料の加工の間；又はそのような布又は被服の産業的又は家庭用洗濯の間に行われ得る。
【０００９】
従って、さらなる観点においては、本発明は、実質的な細胞壁分解活性を有するペクチン酸リアーゼ変異体を含んで成る洗剤組成物；及びセルロース−含有布、糸、織布又は不織布の処理、例えば洗浄のためへの本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の使用に関する。
さらに、本発明の追加の観点は、他の酵素と共に本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を含んで成る酵素組成物、及び本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を含んで成る、洗浄又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い用組成物に関する。
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、セルロース材料の調製における酵素精錬工程への使用のために、例えば続く染色作用における適切な応答のために非常に効果的である。
【００１０】
本発明のもう１つの観点は、ワイン及びジュースの加工に関する。酵素又は酵素調製物は、マッシュの抽出能力又は分解能力を改良するために、果物及び野菜からのマッシュの処理に使用され得る。
さらに、本発明の観点は、動物用飼料添加物としての適用である。大豆、ナタネ種子、ハウチワマメ、等からの植物材料を含む飼料に添加される場合、ペクチン酸リアーゼ変異体は、植物細胞壁材料のインビボ分解を有意に改良し、それにより、動物による植物栄養物の良好な利用性が達成される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
定義：
本発明をさらに詳細に論じる前、次の用語及び慣例が最初に定義されるであろう。
用語“野生型酵素”とは、自然に存在する微生物、例えば天然において見出される菌類又は細菌に対して内因性である酵素を示す。
用語“親酵素”とは、本明細書において使用される場合、修飾が本発明の酵素変異体を生成するために行われる酵素を意味する。親酵素は、天然源から単離された酵素、又は前もって修飾が、問題の酵素の特徴的活性を維持しながら、行われている酵素であり得る。本発明の親ペクチン酸リアーゼは、野生型ペクチン酸リアーゼであり得る。
【００１２】
用語“酵素変異体”とは、親酵素とはそのアミノ酸配列において異なった酵素を意味する。その差異は、親酵素に比較して、置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る。
用語“オルト体（ortholog）”（又は“種相同体”）とは、異なった種からの類似するポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する１つの種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
用語“パラ体（paralog）”とは、同じ種からの異なったポリペプチド又はタンパク質に対して相同性を有する所定の種から得られたポリペプチド又はタンパク質を示す。
【００１３】
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される対象ポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、線状又は環状DNA分子を示す。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を包含することができ、そして任意には、複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを含むことができる。
【００１４】
発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAに起因し、又は両要素を含むことができる。本発明の発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられるいずれかの発現ベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である。染色体外実存体として存在するベクター、たとえばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。
【００１５】
用語“組換え発現される”又は“組換え的に発現される”とは、ポリペプチド又はタンパク質の発現に関して本明細書において使用される場合、当業界における標準の定義に従って定義される。タンパク質の組換え的発現は一般的に、上記に記載されるような発現ベクターを用いることによって行われる。
【００１６】
用語“単離される”とは、ポリヌクレオチド分子に適用される場合、そのポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から除去されており、そして従って他の外来の又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノムクローンを含むそれらの分子である。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常関連する他の遺伝子を有さないが、しかし天然に存在する5’及び3’側の未翻訳領域、たとえばプロモーター及びターミネーターは含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（たとえば、Dynan and Tijan, Nature 319: 774-78, 1985を参照のこと）。用語“単離されたポリヌクレオチド”とは他方では、“クローン化されたポリヌクレオチド”とも称することができる。
【００１７】
タンパク質/ポリペプチドに適用される場合、用語“単離された”とは、タンパク質がその天然の環境以外の条件において見出されることを示す。好ましい形においては、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（すなわち“相同不純物”（下記参照のこと））を実質的に有さない。40％よりも高い純粋な形、より好ましくは60％よりも高い純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。さらにより好ましくは、SDS−PAGEにより決定される場合、高く精製された形、すなわち80％以上、より好ましくは95％以上、及びさらにより好ましくは99％以上の純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
【００１８】
用語“単離されたタンパク質/ポリペプチド”とは、他方では、“精製されたタンパク質/ポリペプチド”とも呼ばれ得る。
用語“相同不純物”とは、本発明のポリペプチドが最初に得られる相同細胞に起因するいずれかの不純物（たとえば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプチド）を意味する。
用語“〜から得られた”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドが特定源により、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味する。
【００１９】
用語“作用可能に連結される”とは、DNAセグメントを言及する場合、そのセグメントが、それらの意図された目的に関して機能するよう、たとえば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを意味する。
用語“ポリヌクレオチド”とは、5’から3’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーを示す。ポリヌクレオチドはRNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。
【００２０】
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、対照配列に比較して、相補的な塩基配列及び逆の配向を有するポリヌクレオチドを示す。たとえば、配列5’ ATGCACGGG 3’は、5’ CCCGTGCAT 3’に対して相補的である。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較して）。縮重コドンは、異なったヌクレオチドトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれ、Aspをコードする）。
【００２１】
用語“プロモーター”とは、RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’非コード領域に検出されるが、しかし必ずしもそうではない。
用語“分泌シグナル配列”とは、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通してそのより大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。大きなペプチドは、通常、分泌経路を通して、遷移の間、分泌ペプチドを除去するために分解される。
用語“ペクチン”は、高い程度又は低い程度にエステル化され得る、ペクチン酸、ポリガラクツロン酸及びペクチンを示す。
【００２２】
用語“ペクチナーゼ”とは、当業者において定義されるペクチナーゼ酵素を示し、ここでペクチナーゼはペクチン物質、主のポリ（１,４−α−D−ガラクツロニド）及びその誘導体のグリコシド連鎖を分解する酵素グループである（Sakai et al., Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties and applications, pp 213-294 in: Advances in Applied Microbiology vol : 39,1993を参照のこと）。
好ましくは、本発明のペクチナーゼは、トランス位脱離によりポリガラクツロン酸とも呼ばれるペクチンさんにおけるα−１,４−グリコシド連鎖のランダム分解を触媒するペクチナーゼ酵素、たとえばペクチン酸リアーゼとしても知られている、ポリ（１,４−α−D−ガラクツロニド）リアーゼとしても知られている、酵素種類ポリガラクツロン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）(PGL) であるペクチナーゼである。
【００２３】
用語“熱安定性”とは、熱の影響に対するタンパク質の安定性を意味する。すべての酵素タンパク質は、温度の上昇と共に不安定になり、そして結果的に分解し、個々の酵素は、タンパク質が安定し、そしてその酵素活性を保持する一定の温度範囲を有する。高められた熱安定性とは、酵素タンパク質がその酵素活性を保持し、そして/又は高められた温度で、より高い相対的活性を示すことができることを意味する。
【００２４】
用語“洗剤安定性”又は“貯蔵安定性”とは、洗剤、例えばアニオン性界面活性剤を含む配合物におけるタンパク質の安定性を意味する。アニオン性界面活性剤は、アニオン性基及び疎水性末端の組合せにより特徴づけられる。タンパク質に結合する場合、正に荷電された残基、例えばリシン又はアルギニン、及び疎水性領域は、たぶん相互作用点である。同様に、特に柔軟な領域の力学は、タンパク質の内部に通常、包含されるアミノ酸への接近性を開放する。それらの残基は典型的には、疎水性であり、そして従って、界面活性剤の末端に対して誘因性である。酵素と界面活性剤との間の化学反応は、確かに、酵素を不活性にする。従って、改良された洗剤−又は貯蔵安定性は、一定の洗剤濃度及び温度で、高い酵素活性が、一定の期間（高い残基活性）の後に維持されるであろうことを意味する。
【００２５】
従って、熱安定性及び洗剤安定性は、タンパク質又は酵素の２つの独立した特徴である。
改良された洗剤安定性を有する本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、例１に記載される分析方法にゆだねられる場合、親ペクチン酸リアーゼに比較して、少なくとも120％（好ましくは少なくとも140％、より好ましくは少なくとも160％、さらにより好ましくは少なくとも180％、さらにより好ましくは少なくとも200％、最も好ましくは少なくとも250％及び特に少なくとも300％）の残基活性を示すことができる。
【００２６】
タンパク質番号づけ：
本発明においては、細胞壁分解酵素、特にペクチン酸リアーゼ酵素におけるアミノ酸残基位置の特定の番号づけが使用される。例えば、既知のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列を整列することにより、そのアミノ酸配列が既知である場合、いずれかのペクチン酸リアーゼ酵素におけるいずれかのアミノ酸残基にアミノ酸位置番号を明白に割り当てることは可能である。
【００２７】
多くの他のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列と整列される、配列番号２で開示される、バチルス・サブチリスDSM14218株のプラスミドに存在するポリヌクレオチドによりコードされるペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に起因する番号づけシステムを用いて、ペクチン酸リアーゼ酵素におけるアミノ残基の位置を明白に示すことが可能である。
本発明に従って生成されるか又は企画される種々の細胞壁分解酵素変異体の記載においては、次の命名方法が容易さのために適合される：
【００２８】
置換：
[元のアミノ酸；位置；置換されたアミノ酸]
従って、位置72におけるイソロイシンによるセリンの置換は、S72Iとして示される。
複数突然変異は、追加の印（“＋”）による分離であり、例えばM169I＋F198Vは、それぞれ位置169及び198でのイソロイシン（I）によるメチオニン（M）の置換、及びバリン（V）によるフェニルアラニン（F）の置換の突然変異を表す。
【００２９】
欠失：
位置195におけるグリシンの欠失は、下記のように示されるであろう：
Gly195★  又は  G195★。
従って、１個よりも多くのアミノ酸残基の欠失、例えば位置195及び196におけるグリシン及びロイシンの欠失は、次のように示されるであろう：
Gly195★＋Leu196★  又は  G195★＋L196★。
【００３０】
挿入：
G195の後への追加のアミノ酸残基、例えばリシンの挿入は、次のように示され：
Gly195GlyLys  又は  G195GK；又は
１個よりも多くのアミノ酸残基、例えばLys及びAlaがG195の後に挿入される場合、これは次のように示されるであろう：
Gly195GlyLysAla  又は  G195GKA。
【００３１】
そのような場合、挿入されるアミノ酸残基は、挿入されるアミノ酸残基の前のアミノ酸残基の位置番号への小文字の付加により番号付けされる。従って、上記例においては、配列194〜196は、下記の通りである。
【００３２】
【表１】
2005525118.tif 000002
【００３３】
存在するアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基が挿入される場合、命名法における縮重が生じることは明白である。例えば、グリシンが上記例におけるグリシンの後に挿入される場合、これはG195GGにより示される。同じ実際的な変化は、同様に、
【００３４】
【表２】
2005525118.tif 000003
への変化について、A194AGとして示される。
【００３５】
そのような物質は当業者に明らかであり、そして従って、表示G195GG及びこのタイプの挿入いついての対応する表示は、そのような同様の縮重表示を包含することを意味する。
ペクチン酸リアーゼ番号づけにより言及されるすべての位置は、特にことわらない限り、上記の番号づけを言及し、そして配列番号２で開示される、バチルス・サブチリスDSM14218株のプラスミドに存在するポリヌクレオチドによりコードされるペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列に対して決定される。
【００３６】
発明の特定の記載：
本発明は、親ペクチン酸リアーゼ（EC4.2.2.2）の変異体に関する。前記変異体は、親酵素に比較して、改良された性質を有し、特に洗剤組成物における洗剤安定性又は貯蔵安定性が改良される。
親ペクチン酸リアーゼの性質の改良工程においては、本発明者は、親ポリペプチド主鎖における特定のアミノ酸の変更が酵素の洗剤安定性を有意に変更することを見出した。
【００３７】
ポリヌクレオチド：
本発明の好ましい態様においては、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の親酵素をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも中位の緊縮条件、好ましくは高い緊縮条件下で配列番号1のその対応するポリヌクレオチドの類似する大きさの領域、又はそれらに対して相補的な配列にハイブリダイズするであろう。
【００３８】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、製造される実際のアミノ酸置換に対応する適切な配列変更を有する、配列番号１の位置１〜1200に対応する十分な変異体配列、又は少なくとも約100個の長さの塩基対を有するその変異体副配列を含んで成るいずれかのプローブのいずれかを含んで成る変性された二本鎖DNAプローブに対して、少なくとも中位の緊縮条件（好ましくは、下記に詳細に記載されるような高い緊縮条件）下でハイブリダイズするであろう。
【００３９】
ヌクレオチドプローブと相同DNA又はRNA配列の間の、中位又は高い緊縮下でのハイブリダイゼーションを決定するための適切な実験条件は、５×SSC（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム、Sambrook など., 1989）において、ハイブリダイズするDNAフラグメント又はRNAを含むフィルターの10分間のプレソーキング、及び５×SSC、５×Denhardtの溶液（Sambrookなど., 1989）、0.5％SDS及び100μg/mlの変性され、音波処理されたサケ精子DNA（Sambrookなど., (1989）Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY)の溶液におけるフィルターのプレハイブリダイゼーション、続いて、10ng/mlの濃度のランダム−プライムされた（Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13）、32P−dCTP−ラベルされた（１×109cpm/μgよりも高い比活性）プローブを含む同じ溶液における約45℃で12時間のハイブリダイゼーションを包含する。
【００４０】
次に、フィルターは、２×SSC, 0.5％SDSにより、少なくとも60℃（中位の緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（中位/高い緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも70℃（高い緊縮性）、及びさらにより好ましくは少なくとも75℃（非常に高い緊縮性）で、30分間、2度洗浄される。
オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X−線フィルムを用いて検出される。
【００４１】
前で示されたように、本発明のペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。DNA及び単離するための方法は、当業界において良く知られている。興味ある遺伝子をコードするDNA及びRNAは、当業界において知られている方法により、Gene Banks 及びDNAライブラリーにおいてクローン化され得る。
次に、本発明のペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同定され、そして、たとえばハイブリダイゼーション又はPCRにより単離される。
【００４２】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の調製に使用される親ペクチン酸リアーゼの種相同体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明より提供される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。たとえば、DNAは、タンパク質を発現する細胞型から得られる染色体DNAを用いて、クローン化され得る。適切なDNA源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次にライブラリーが、陽性細胞系の染色体DNAから調製される。次に、本発明のペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNAが、種々の方法により、たとえば開示された配列の基づいて、完全な又は部分的DNA又は１又は複数の変性プローブによりプローブすることによって単離され得る。
【００４３】
DNAはまた、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）（Mullis, アメリカ特許第4,683,202号）を用いて、又は本明細書に開示される配列からの企画されたプライマーを用いてクローン化され得る。さらなる方法においては、DNAライブラリーが、宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され得、そして興味あるDNAの発現が、バチルス・サブチリス（IFO3134）からクローン化されたペクチン酸リアーゼに対して生ぜしめられた抗体（モノクローナル又はポリクローナル）により、又はペクチン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドに関連する活性試験により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノムクローンの単離に適用され得る。
【００４４】
バチルス・サブチリスDSM14218に存在するプラスミドをクローン化したDNA配列及び/又は本発明の類似DNA配列の部分をコードするポリペプチドは、ペクチン分解活性を有する酵素を生成する、細菌種バチルス・サブチリス、好ましくは菌株IFO3134、又は本明細書に記載されるような他の又は関連する生物からクローン化され得る。
他方では、類似配列は、バチルス・サブチリスDSM14218に存在するプラスミドから得られるDNA配列、たとえばその副配列に基づいて、及び/又は前記DNA配列によりコードされるペクチン酸リアーゼのもう1つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の導入のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列（すなわち本発明のペクチン分解酵素の変異体）を生ぜしめ得るヌクレオチド置換の導入により構成され得る。
【００４５】
ポリペプチド：
配列番号２のアミノ酸番号１〜399の配列は、IFO3134（Institute f or F ermentation, O saka, 17-85, J usohonmachi 2-chome, Yodagawa-ku, Osaka 532-8686, Japan）として寄託されているバチルス・サブチリス種からの野生型ペクチン酸リアーゼに対応する成熟ペクチン酸リアーゼ配列である。
【００４６】
本発明はまた、それぞれ配列番号２のポリペプチドに対して実質的に相同であるポリペプチドのペクチン酸リアーゼ変異体、及びそれらの種相同相（パラ体又はオルト体）を提供する。用語“実質的に相同である”とは、配列番号２に示される配列、又はそのオルト体又はパラ体に対して、70％、より好ましくは少なくとも85％、及びさらにより好ましくは少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために、本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、それぞれ配列番号２に示される配列、又はそのオルト体又はパラ体に対して、少なくとも95％及び最も好ましくは98％又はより以上に同一であろう。
【００４７】
％配列同一性は、従来の方法、すなわち当業者において知られているコンピュタープログラムパッケージプログラム、たとえば引用により本明細書に組込まれる、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453において開示されるようなGCGプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）に提供されるGAPにより決定される。GAPは、ポリペプチド配列比較のために次の設定を用いて使用される：3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延長ペナルティー。
【００４８】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、DNA配列比較に関して次の設定でのGAPを用いて類似する方法により決定される：5.0のGAP創造ペナルティー及び0.3のGAP延長ペナルティー。
【００４９】
親ペクチン酸リアーゼは好ましくは、微生物から、好ましくは細菌、古細菌又は菌類、特に細菌、例えばバチルス、好ましくはバチルス・サブチリス種及び整列された16S rDNA配列に基づいて、バチルス・サブチリスに対して少なくとも95％、より好ましくは少なくとも98％相同である高い関連性のバチルス種から成る群から選択され得る好アルカリ性バチルスに属する細菌から誘導される。本発明の親ペクチン酸リアーゼは、配列番号２のポリペプチド及びその種相同体（パラ体又はオルト体）に対して実質的に相同である。用語“実質的に相同である”とは、配列番号２で示される配列、又はオルト体又はパラ体に対して、70％、より好ましくは少なくとも85％及びさらにより好ましくは少なくとも90％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号２で示される配列、又はそのオルト体又はパラ体に対して、少なくとも95％及び最も好ましくは98％又はそれ以上、同一であろう。
【００５０】
実質的に相同の親タンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は好ましくは、保存性アミノ酸置換（表２を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に対して実質的に影響を与えない他の置換であるマイナーな性質のもの；典型的には、１〜約30個の少数のアミノ酸の欠失；および短いアミノ−又はカルボキシル−末端延長、たとえば、アミノ酸−末端メチオニン残基約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、たとえばポリ−ヒスチジン路、プロテインAの延長である（Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991）。一般的には、Fordなど., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991 (引用により本明細書に組込まれる)を参照のこと。親和性標識をコードするDNAは、商業的供給者（たとえば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。
【００５１】
しかしながら、上記変更が好ましくは，マイナーな性質のものであったとしても、そのような変更はまた、大きな性質のもの、例えば、エンド−グルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドへの、300個までのアミノ酸の大きなポリペプチドの融合、又は両アミノ−又はカルボキシル−末端延長としての融合でもあり得る。
【００５２】
【表３】
2005525118.tif 000004
【００５３】
20個の標準のアミノ酸の他に、非標準のアミノ酸（たとえば、４−ヒドロキシプロリン、６−N−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）は、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基により置換され得る。制限された数の非アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、アミノ酸残基により置換され得る。“不自然なアミノ酸”は、タンパク質合成の後、修飾され、そして/又は標準のアミノ酸の側鎖とは異なるそれらの側鎖に科学構造を有する。不自然なアミノ酸は、化学的に合成され得、又は好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３,３−ジメチルプロリンを包含する。
【００５４】
本発明のペクチン酸リアーゼポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあらゆる残基に導入され、そして得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、ペクチン分解活性）について試験される。また、Hilton など., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996を参照のこと。
【００５５】
酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得る。たとえば、de Vos など., Science 255: 306-312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの相同性の分析からも推定され得る。
【００５６】
複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え及び/又はシャフリング、続く適切なスクリーニング方法、たとえばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989), WO95/17413号又はWO95/22625号により開示される既知の方法を用いて、生成され、そして試験され得る。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数位置の同時ランダム化、又は組換え/異なった突然変異のシャフリング（WO95/17413号、WO95/22625号）、続いての機能的ポリペプチドについての選択、及び次に、個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドの配列決定のための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（たとえば、Lowman など., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号；Huse, WIPO Publication WO92/06204号）及び特定領域の突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46: 145, 1986; Ner など., DNA 7: 127, 1988）を包含する。
【００５７】
上記に開示されるような突然変異誘発/シャフリング方法は、宿主細胞においてクローン化され、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高い処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、そして近代装置を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける重要な個々のアミノ酸残基の急速な決定を可能にし、そして未知の構造体のポリペプチドに適用され得る。
上記で論じられた方法を用いて、当業者は、配列番号２の残基１〜399に対して実質的に相同であり、そして親タンパク質のペクチン酸リアーゼ活性を保持する種々のポリペプチドを同定し、そして/又は調製することができる。
【００５８】
しかしながら、同じ方法がまた、野生型タンパク質よりもより好都合な性質を有する本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を供給するためにも有用である。それらの方法を用いて、本発明者は、配列番号２の野生型ペクチン酸リアーゼが好都合には、改良された性質を有する変異体を調製するために置換され得る多くの位置を同定している。
【００５９】
本発明の好ましいペクチン酸リアーゼ変異体は、次の位置（配列番号２に関する番号づけ）の１又は複数の位置で置換される：5,9, 11,26, 28,30, 31,37, 40,45, 46,47, 48,49, 50,51, 52,54, 61,64, 68,69, 70, 71,74, 75,76, 79,86, 87,91, 99,105, 106,107, 111,115, 116,118, 122,123, 134,136, 139, 140,141, 146,148, 156,158, 170,182, 185,186, 189,193, 194,196, 199,201, 202,204, 213,215, 218,224, 228,229, 234,235, 237,251, 256,257, 258,272, 277,286, 295,298, 301,302, 303,305, 307,308, 314,316, 323,324, 326,331, 332,333, 334,335, 336,337, 338,339, 340,341, 349,356, 357,363, 366,378, 381,384, 386,387, 389,390, 391,393 及び 397。
【００６０】
本発明の好ましい変異体はさらに、酵素の全体の電荷がより負にされている変異体を包含する。そのような変異体においては、正に荷電されたアミノ酸が置換され、そして/又はその適用条件下で負に荷電されるアミノ酸が導入されている。
従って、好ましい変異体は、適用条件下で部分的に又は十分に正に荷電されるアミノ酸残基、すなわちHis, Lys又はArgを置換している。さらに、好ましい変異体は、適用条件下で負の電荷を有するアミノ酸、すなわちAsp, Glu及びTyrによりいずれかの残基を置換している。
【００６１】
特に好ましい変異体は、次の位置（配列番号２に関する番号づけ）：26,47, 54,59, 71,79, 87,90, 99,100, 115,118, 139,148, 213,218, 247,257, 263,265, 274,314, 317,334, 386 及び397の１又は複数の位置でのリシン残基が置換されているそれらの変異体である。
同様に、特に好ましい変異体は、次の位置（配列番号２に関する番号づけ）：38,110, 112,120, 155,206, 217,272, 279,282 及び 284の１又は複数の位置でのアルギニン残基が置換されているそれらの変異体である。
さらに、好ましい変異体はまた、次の位置（配列番号２に関する番号づけ）：5,31, 193,198, 221,222, 243,245, 269,270, 289,376 及び384の１又は複数の位置でのヒスチジン残基が置換されているそれらの変異体である。
【００６２】
好ましいペクチン酸リアーゼ変異体酵素は、Ca2+についての結合定数を変える、そしてそれにより、カルシウム−消耗安定性を改良するために修飾されている。本発明のペクチン酸リアーゼにおいては、３種のアミノ酸残基D184、D223及びD227が、一次カルシウム結合部位でのCa2+の結合調整する。この調整における第４のアミノ酸残基を補充することにより、Ca2+についての結合定数を変えることが可能である。一次カルシウム結合部位でのCa2+の存在は、触媒現象（触媒性残基のpKaを低めることにより）、基質の整列に影響を及ぼすか、又は酵素がヒドロラーゼ又はリアーゼとして機能するかどうかを決定することができる（Ca2+の存在は、リアーゼ活性のための必要条件である）。改良されたカルシウム−消耗安定性を有するそのような変異体は、置換Q182D及びQ182Eの１つを含んで成る。
【００６３】
好ましい変異体のさらなる例は、酸化不安定アミノ酸残基が置換されている改良された酸化安定性を有するそれらである。“酸化不安定性”とは、硫黄又はヒドロキシル基を保持するアミノ酸、例えばメチオニン、システイン、トレオニン、セリン及びチロシンを意味する。好ましい変異体は、次の位置（配列番号２に関する番号づけ）：64, 122, 199及び237の１又は複数の位置における酸化不安定性アミノ酸残基が置換されているそれらの変異体である。
【００６４】
好ましい変異体のさらなる例は、柔軟な残基におけるアミノ酸置換を保持するそれらであり、ここでより低い柔軟性のアミノ酸残基が導入されている。本発明においては、用語“柔軟性”とは、アミノ酸におけるC-α原子の可能性であるφ及びψ角度の数を言及する。ペプチド主鎖の柔軟性は、C−α原子に結合される原子の立体的妨害により制限される。一般的に、単にアミノ酸側鎖は、お互い１つの残基で異なり、従って、その側鎖のサイズ（フィン・デル・ワールス半径）がその柔軟性を決定する。グリシンは最小の側鎖、すなわち水素原子を有し；従ってグリシン残基はより柔軟性をもたらす。反対の情況がプロリンに関して適用され、ここで可能性あるコンホメーションは、大きな側鎖によってのみならず、また環構造により制限される。従って、プロリン残基は平均よりも低い柔軟性であり、そしてペプチドに対して剛性及び安定性を付与する。
【００６５】
そのような低い柔軟性の変異体は特に、グリシン残基が他の19の天然に存在するアミノ酸のいずれかにより置換されている変異体、又はいずれかのアミノ酸がプロリン残基により置換されている変異体を包含するが、但しそれらだけには制限されない。特に好ましい変異体においては、低い柔軟性のアミノ酸残基が次の領域（配列番号２に関する位置の番号づけ）の１又は複数の領域に導入される：26-31,45- 50,66-72, 81-89,90-106, 134-137,169-178, 210-217,253-262, 275-286,297-308, 328-343, 354-356,361-365, 368-372 及び 376-379。
【００６６】
本発明の好ましい態様においては、バチルス・サブチリス  ペクチン酸リアーゼ変異体は、次のものから成る群から選択された、少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基を含んで成る：H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69*, L70*, K71*, K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N, K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V123I, S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A228I, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y, R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, I336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, I357V, N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S387A, V389I, I390N, I390T, S391N, A393V 及び K397D。
【００６７】
単独で又は組合しての１又は複数のそれらの置換が、親酵素に比較して、ペクチン酸リアーゼ変異体の洗剤安定性を高めることが現在、企画される。
洗剤安定性を高める好ましい複数の置換は、次のものを包含する。
【００６８】
A228I+F251I, 
S134L+K257E, 
K115I+K213E, 
K139I+K213N, 
H5R+K257N+S302A, 
K99I+I196V, 
K115A+K118A, 
K115A+K118A+M122N, 
V141E+C199S+K213E, 
K115I+Q146H, 
K71E+K118E, 
T49P+N156S, 
【００６９】
K314N+S340P, 
V141E+I235V, 
G46D+K257N, 
S28T+S30F+K334E+N363S, 
D48E+L106Q+I140V+F215Y+K218E, 
H193Y+S256C+V389I+A393V, 
E9G+H31N+N50D+L106Q+A111E+T136S+V141L+F201L+N202K+F215Y+G286A+A381D+H384N, 
K213N+T258I, 
E9G+H31N+L106Q+D303S+A305P+T335S+H384N+S391N, 
E9G+H31N+D48E+L106Q+A111E+S301Y+D303S+A305P+T378S+ H384N+S391N, 
L45V+N50Y+N185H, 
N11Y+K87E+K99N, 
【００７０】
E9G+D48E+L106Q+S316F+A381D, 
S30P+K115I+K139I+Q146H+S337C, 
E9G+H31N+D48E+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N, 
H31N+T105A+L106Q+A111E+V141L+K218E+D303S+A305P+D326N+T335S+H384N+S391N, 
K26Q+K47N+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N, 
D48E+L106Q+I140V+F215Y+D303S+A305P+T378S+H384N+S391N, 
K213T+K218L+A305P, 
M64F+K213T+K218L+A305P, 
M64F+M122K+K118E+K213T+K218L+A305P, 
K139I+Q146H+K257N+S337C, 
M64F+Kl39I+Ql46H+S337C,
K139I+Q146H+K25N+S337C, 
D48P+M64F+T105P+K139I+Q146H+K213T+K218P+T258I+A305P+S331P+S337K。
【００７１】
タンパク質製造：
十分な長さのタンパク質、そのフラグメント及び融合タンパク質を包含する本発明のポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝子的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換され、又はトランスフェクトされ、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。細菌細胞、特に、グラム−陽性生物の培養された細胞が好ましい。
【００７２】
バチルス属からの次のグラム−陽性細胞が特に好ましい：バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lenntus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・スリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・アガラドハエレンス（Bacillus agaradhaerens）、又は特に、バチルス・サブチリス。
【００７３】
クローン化された分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は、次の文献に開示されている：Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel など. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987; 及びBacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim など., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C. (それらは引用により本明細書中に組込まれる)。
【００７４】
一般的に、本発明のペクチン酸リアーゼをコードするDNA配列は、一般的に発現プロモーター内に転写プロモーター及びターミネーターを含む、その発現のために必要とされる他の遺伝子要素に作用可能に連結される。前記ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むが、但し当業者は、一定のシステム内において、選択マーカーが別々のベクター上に供給され得、そして外因性DNAの複製が宿主ゲノムへの組み込みにより提供され得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び他の要素の選択は、当業者のレベル内の通常のことである。多くのそのような要素は、文献に記載されており、そして商業的供給者から入手できる。
【００７５】
宿主細胞の分泌経路中にポリペプチドを向けるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに提供される。分泌シグナル配列はポリペプチドの配列であり得、又は他の分泌されたタンパク質に起因し、又は新たに合成され得る。多くの適切な分泌シグナル配列が当業界において知られており、そして特に、バチルス宿主細胞における分泌のための適切な分泌シグナル配列のさらなる記載については、次の文献を参照のこと：Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim など., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.;及びCutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”, John Wiley and Sons, 1990。 分泌シグナル配列は、DNA配列に正しく読み取り枠を整合して連結される。
【００７６】
分泌シグナル配列は、通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の５’側に位置し、但しあるシグナル配列は興味のDNA配列の他の場所に位置することができる（たとえば、Welch など., アメリカ特許第5,037,743号；Holland など., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。形質転換された又はトランスフェクトされた宿主細胞は、栄養物、及び選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。定義された培地及び複合培地を包含する種々の適切な培地が、当業界において知られており、そして一般には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要な場合、成長因子のような成分を含むことができる。薬物選択、又は発現ベクター上に担持され、又は宿主細胞中に同時にトランスフェクトされた選択マーカーにより補充される必須栄養物における栄養不足により、増殖培地は、外因的に付加されたDNAを含む細胞を選択するであろう。
【００７７】
発酵は、他の必須栄養物と共に炭素及び窒素源を含む栄養培地における好気性条件下での菌株の培養により行われ得、ここで前記培地は知られている技術の原理に従って構成される。培地は複合富化培地又は最少培地であり得る。窒素源は、無機及び/又は有機性質の物であり得る。適切な無機窒素源は、硝酸塩及びアンモニウム塩である。有機窒素源の中で、非常に多くの窒素源が発酵において規則的に使用される。例としては、大豆ミール、カゼイン、トウモロコシ、トウモロコシ蒸留酒、酵母抽出物、尿及びアルブミンを列挙することができる。適切な炭素源は、炭水化物又は炭水化物含有材料である。好ましい栄養培地は、炭素源として高いか又は低い程度、エステル化される、ペクチン酸、ポリガラクツロン酸及び/又はペクチン、及び/又はペクチナーゼ生成のインデューサーを含む。他方では、培地は、ペクチンに富んでいる材料、たとえば大豆ミール、リンゴ果肉又はカンキツ類の皮を含む。
【００７８】
培養は好ましくは、アルカリpH値、たとえば少なくともpH8、又は少なくともpH9で行われ、これは、増殖培地の殺菌の後、適切な緩衝液、たとえば炭酸ナトリウム、又は炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムの混合物の添加により得られる。
【００７９】
タンパク質単離：
発現された組換えポリペプチドが分泌される場合、そのポリペプチドは増殖培地から精製され得る。好ましくは、発現宿主細胞は、ポリペプチドの精製の前、培地から除かれる（たとえば、遠心分離による）。
発現された組換えポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、宿主細胞は好ましくは、破壊され、そしてポリペプチドは、そのような精製技法の第１段階である水性“抽出物”中に開放される。好ましくは、発現宿主細胞は、細胞破壊の前、培地から除去される（たとえば遠心分離による）。
【００８０】
細胞破壊は、従来の技法たとえばリゾチーム消化により、又は細胞に高圧力を付与することにより行われ得る。そのような細胞破壊技法のさらなる説明のためには、Robert K. Scobes, Protein Purification, Second edition, Springer-Verlagを参照のこと。
発現された組換えポリペプチド（又はキメラポリペプチド）が分泌されても又はされなくても、それは、分別及び/又は従来の精製方法を用いて、精製され得る。
【００８１】
硫酸アンモニウム沈殿及び酸又はカオトロープ抽出が、サンプルの分別のために使用され得る。典型的な精製段階は、ヒドロキシアパタイト、サイズ排除、FPLC及び逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含する。適切なアニオン交換媒体は、誘導体化されたデキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ及び同様のものを含む。PEI, DEAE, QAE及びQ誘導体が好ましく、そしてDEA Fast-Flow セファロース（Pharmacia, Piscataway, NJ）が特に好ましい。
【００８２】
典型的なクロマトグラフィー媒体は、フェニル、ブチル、又はオクチル基により誘導体化されたそれらの媒体、たとえばフェニル−セファロース（Pharmacia）、Toyopearlブチル650（Toso Haas, Montgomeryville, PA）、オクチル−セファロース（Pharmacia）及び同様のもの；又はポリアクリル酸樹脂、たとえばAmberchrom CG71 (Toso Haas)及び同様のものを包含する。適切な固体支持体は、ガラスビーズ、シリカ基材のビーズ樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋されたアガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋されたポリアクリルアミド樹脂、及びそれらが使用される条件下で不溶性である同様のものを包含する。
【００８３】
それらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基及び/又は炭水化物成分によるタンパク質の結合を可能にする反応性基により変性され得。カップリング化学の例は、臭化シアン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、及びカルボジイミドカップリング化学のためのカルボキシル及びアミノ誘導体を包含する。それらの及び他の固体媒体が、良く知られており、そして当業界において広く使用されており、そして商業的供給者から入手できる。
【００８４】
特定方法の選択は、日常のことであり、そして選択された支持体の性質により一部決定される。たとえば、Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照のこと。
本発明のポリペプチド又はそのフラグメントはまた、化学合成を通して調製され得る。本発明のポリペプチドは、モノマー又はマルチマー；グリコシル化された又は非グリコシル化され；ペギル化され（pegylated）又は非ペギル化され得；そして最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでも又は含まなくても良い。
【００８５】
従って、さらなる観点においては、本発明はまた、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体を生成するための方法にも関し、ここで前記方法は、ペクチン酸リアーゼを生成することができる微生物を前記酵素の生成を可能にする条件下で培養し、そして培養物から酵素を回収することを含んで成る。培養は、従来の発酵技法、たとえばペクチン酸リアーゼ変異体の生成を誘発する増殖培地に対して十分な確保するために撹拌しながら、振盪フラスコ又は発酵器においての培養を用いて実施され得る。
【００８６】
増殖培地は、従来のN−源、たとえばペプトン、酵母抽出物又はカザミノ酸、低められた量の従来のC−源、たとえばデキストロース又はスクロース、及びインデューサー、たとえばペクチン酸又はペクチン、又は複合植物基質、たとえば穀類ふすま（たとえば小麦ふすま又は米穀）を含むことができる。回収は、従来の技法、たとえばバイオマス及び上清液の遠心分離又は濾過による分離、上清液の回収、又は興味ある酵素が細胞内に存在する場合、細胞の破壊、たぶん続いて、ヨーロッパ特許第0406314号に記載されるようなさらなる精製、又はWO97/15660号に記載のような結晶化により実施され得る。
【００８７】
さらにもう1つの観点においては、本発明は、上記に記載される性質を有し、そして相同不純物を有さず、そして従来の組換え技法を用いて生成される、単離されたペクチン酸リアーゼ変異体に関する。
【００８８】
方法及び使用：
ペクチン酸リアーゼ活性の定量化のためのマイクロタイターアッセイ：
ペクチン酸リアーゼは、トランス排除機構を通してポリガラクツロン酸を分解する。これは、それが、個々の基質分離のために二重C-C結合を脱離することを意味する。この結合は、235nmで吸収し、その波長での吸光度を測定することにより可溶性ポリガラクツロン酸に対するペクチン酸リアーゼ作用の直接的な検出を可能にする。
【００８９】
酵素サンプルが、５〜100ng/mlの濃度にアッセイ緩衝液（100mMのトリス−HCl、0.68mMのCaCl2、pH8.0）により希釈される。酵素サンプルが洗剤を含む場合、それは、洗剤に関して、少なくとも1000倍で希釈されるべきである。100μlの酵素緩衝希釈溶液が、100μlの基質（Sigmaからの１％（w/v）ポリガラクツロン酸、すなわちP−3850がアッセイ緩衝液において、少なくとも15分間、攪拌され、そして2300gで５分間、遠心分離され、そして上清液が使用される）と共に、加熱プレートにおいて混合され、そして加熱ブロック、好ましくはPCR機械又は及び加熱速度の装置において、40℃に10分間、加熱される。
【００９０】
100μlの酵素/基質溶液が、100μlの停止試薬（50mMのH3PO4）と共に、UV−透過性マイクロタイタープレートにおいて混合される。UVプレートが短時間及び軽く振盪され、そして235nmでの吸光度がマイクロタイター分光計（Molecular Devices, Spectara-MAX190）により測定される。吸光度読み取りは、添加される酵素を伴わないで行われた対照サンプルの吸光度を、すべての測定された値から控除することによりバックグラウンド吸光度について補正される。
配列番号２（IFO3134として寄託されたバチルス・サブチリス）のペクチン酸リアーゼの活性に基づく標準曲線は、反応混合物において2.5〜100ng/mlの間で直線であった：
【００９１】
【表４】
2005525118.tif 000005
他方では、ペクチン酸リアーゼの触媒活性が、粘度アッセイAPSUにより決定され得る。
【００９２】
粘度アッセイ、APSU：
APSU単位：APSU単位アッセイは、添加されるカルシウムを伴わないで、基質ポリガラクツロン酸を用いての粘度測定である。
ポリガラクツロン酸ナトリウムの５％w/v溶液（Sigma P-1879）を、0.1Mのグリシン緩衝液（pH10）に溶解する。その溶液４mlを、40℃で５分間プレインキュベートする。次に、酵素250μl（又は酵素希釈溶液）を添加し、この後、反応物を最大速度でミキサー上で10秒間、混合し、そして40℃又は他の温度で20分間インキュベートする。
【００９３】
粘度を、Sofraser, 45700 Villemandeur, France からのMIVI600を用いて測定する。粘度を、10秒後、mVとして測定する。APSU単位の計算のために、上記のような酵素標準希釈度を標準曲線を得るために使用した：
【００９４】
【表５】
2005525118.tif 000006
【００９５】
洗剤産業への使用：
さらなる観点においては、本発明は、本発明のペクチン酸リアーゼ変異体又はペクチン酸リアーゼ変異体調製物を含んで成る洗剤組成物、及び本発明のペクチン酸リアーゼ変異体又はペクチン酸リアーゼ変異体調製物を含む洗浄溶液により、機械洗浄の洗浄サイクルの間、布を処理することを含んで成る、布の機械処理のための方法に関する。
典型的には、本発明の洗剤組成物は、引用により本明細書に組込まれるWO97/01629号に記載されるように、従来の成分、例えば界面活性剤（アニオン性、非イオン性、両性イオン、両性）、ビルダー及び他の成分を含んで成る。
【００９６】
紡織及びセルロース繊維加工産業への使用：
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、繊維の生物調製のために、又は繊維の清浄のために、洗剤と組合して、他の炭水化物分解酵素（たとえば、ヘミセルラーゼ、例えばアラビナナーゼ、キシログルカナーゼ、マンナナーゼ及びペクチナーゼ）と組合して使用され得る。綿繊維は、ペクチンを含む一次細胞壁層及び主にセルラーゼを含む二次層から成る。綿調製又は綿精錬下で、一次細胞壁の部分が除去されるであろう。本発明は、一次細胞壁の除去により、綿精錬の間、又は残留ペクチン物質を除去し、そして紡繊の灰色化を防げるために綿の清浄の間の助けに関する。
【００９７】
本明細書においては、用語“セルロース材料”とは、繊維、縫われ及び縫われていない布、たとえば編物、織物、デニム、糸及びタオル（綿から製造される）、綿ブレンド、又は天然又は人工的セルロース系誘導物（たとえば、キシラン−含有セルロース繊維、たとえば木材パルプに起因する）、又はそれらのブレンドを意味する。ブレンドの例は、綿又はレーヨン/ビスコースと１又は複数の類似する材料、たとえば毛、合成繊維（たとえば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリ塩化ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、及びセルロース含有繊維（たとえば、レーヨン/ビスコース、ラミー、大麻、亜麻/リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、ライオセル（lyocell））のブレンドである。
【００９８】
本発明の調製物は、大麻、亜麻又はリネンからの繊維の前処理又は浸水のためにセルロース繊維加工産業において有用である。綿繊維に関して、紡織産業のためのセルロース材料の被服製造のために容易な材料への加工は、次のいくつかの段階を包含する：繊維の糸への紡糸；糸からの織物又は編物の構成、及び続く調製、染色及び最終操作。織物製品は、一連の縦糸間に横糸を織り込むことによって構成され；糸は２種の異なったタイプのものである。編物製品は、１本の連続した長さの糸から絡み合いのループの網状構造を形成することによって構成される。セルロース繊維はまた、不織布のためにも使用され得る。
【００９９】
調製工程は、染色操作における適切な応答のための紡織を提供する。調製に包含される副段階は次の工程である：
a. たとえばスターチのようなポリマーサイズ剤を用いてのサイズ剤除去（織布製品に関しては）；CMC又はPVAが、縦糸の速度を早めるために、織り込む前に添加され、この材料は、追加の加工の前に除去されるべきであり；
【０１００】
b. 精練；この目的は、綿繊維から非セルロース材料、特に表皮（主に、蜜蝋から成る）及び一次細胞壁（主に、ペクチン、タンパク質及びキシログリカンから成る）を除去することである。適切な蜜蝋の除去は、良好な染色を得るための目安である高い湿潤性を得るために必要である。一次細胞壁、特にペクチンの除去は、蜜蝋の除去を改良し、そしてより均等に染色を確実にする。されに、これは、漂白工程における白色度を改良する。精練に使用される主要化学物質は、70g/kg綿までの高濃縮及び80〜90℃の高温での水酸化ナトリウムであり；
【０１０１】
c. 漂白；通常、精練に続いて、十分に漂白された（白色）布を得、又は染料の明瞭な色相を確保するために、酸化剤として水酸化ナトリウムを用いての漂白が伴う。
精練/漂白工程を組みさわされた１つの段階がまた、産業において使用される。調製工程は布の状態においては、最も日常的に使用されるが、精練、漂白及び染色操作はまた、繊維又は糸段階で用いられ得る。
【０１０２】
加工手段は、バッチ又は連続的であり得、そして布は開放した一定幅又はロープ形で液体加工流により接触される。連続操作は一般的に、含浸機を使用し、それにより、布の重量当たりほぼ等しい重量の化学物質が布に適用され、続いて、化学反応が起こる、加熱された保圧チャンバーに適用される。次に、洗浄セクションが、次の加工段階のための布を用意する。バッチ加工は一般的に、１つの加工バッチにおいて行われ、それにより、布は、化学薬品浴において、その重量の約８〜15倍の薬品と接触せしめられる。一定反応の期間の後、化学薬品が排水され、布がすすがれ、そして次に、化学薬品が適用される。断続的パッド−バッチ加工は、含浸機を包含し、それにより、布の重量当たりほぼ等しい重量の化学薬品浴が布に適用され、続いて冷パッド−バッチの場合、１又は複数の日を要する保圧期間が伴う。
【０１０３】
織物は、編織布構成の一般的な形である。織り込み工程は、摩擦からそれを保護するために縦糸の“サイジング”を要する。スターチ、ポリビニルアルコール（PVA）、カルボキシメチルセルロース、蜜蝋及びアクリル酸結合剤が、利用性及び費用のために、使用される典型的なサイジング化学薬品の例である。サイズ剤は、織物を調製する最初の段階として、織り込み工程の後に除去されるべきである。ロープ又は開放した一定幅の形でのサイジングされた布は、デサイジング剤を含む処理液体と接触せしめられる。使用されるデサイジング剤は、除去されるべきサイズ剤の型に依存する。PVAサイズ剤に関しては、熱湯又は酸化剤工程がしばしば使用される。
【０１０４】
綿布のための最も通常のサイズ剤は、スターチに基づかれている。従って、最もしばしばには、織られた綿布は、熱湯、スターチを加水分解するための酵素α−アミラーゼ、及び湿潤剤又は界面活性剤の組み合わせによりデサイジングされる。セルロース材料は、デサイジングを行うために十分に長い“保持期間”、デサイジング化学薬品と共に静置される。保持期間は、加工レジメの型及び温度に依存し、そして15分〜２時間であり、多くの場合、数日である。典型的には、デサイジング化学薬品は、一般的に、約15℃〜約55℃の範囲である含浸機に適用される。
【０１０５】
次に布が、デサイジング剤の活性を高めるために、十分な熱、通常約55℃〜約100℃の熱を付与する装置、たとえば“J−ボックス”において維持される。化学薬品、たとえば除去されるサイジング剤が、保持期間の終結の後、布から洗浄される。高い白色度又は良好な湿潤性及び得られる染色性を確保するために、サイジング薬品及び他の適用される化学薬品は十分に除去されるべきである。一般に、効果的なサイジングは、次の調製工程、すなわち精練及び漂白に対して決定的に重要なものであると思われる。
【０１０６】
精練工程は、綿に天然において見出される多くの非セルロース化合物を除去する。天然の非セルロース不純物の他に、精練は、汚れ、土壌、及び製造工程で導入された残留する材料、たとえば紡糸、コーン形成又はスラッシング滑剤を除去することができる。精練工程は、水酸化ナトリウム、又は関連する苛性アルカリ化剤、たとえば炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、又はそれらの混合物を用いる。一般的な、アルカリ安定性界面活性剤が、疎水性化合物の溶解性を高めるために、及び/又は布上へのそれらの再付着化を妨げるために、工程に添加される。処理は、一般的に、精練剤のpH13〜14の強アルカリ性溶液を用いて、80℃〜100℃の高温で行われる。
【０１０７】
化学工程の非特異的性質のために、不純物のみならず、セルロース自体が攻撃され、強度又は他の所望する布の性質の損傷を導く。セルロース布の軟度は、残留する天然綿の蜜蝋の機能である。高温での強アルカリ精練工程の非特異的性質は、所望する天然綿滑剤と製造工程において導入される滑剤との間を区別することはできない。さらに、従来の精練工程は、それらの工程からの高アルカリ性流出液のために環境問題を引き起こす。精練段階は、漂白のための最適な応答のための布を調製する。不適切に精練された布は、続く漂白段階において高いレベルの漂白用化学薬品を必要とするであろう。漂白段階は、天然の綿色素を脱色し、そしてジンニング、カーディング又は精練の間、完全には除去されなかったいずれかの残留する天然の木性綿のごみ成分を除去する。今日使用するための主要工程は、アルカリ過酸化水素漂白である。多くの場合、特に、非常に高い白色度が必要とされない場合、漂白は精練と組み合わされ得る。
【０１０８】
下記例においては、精練段階が本発明のペクチン酸リアーゼ又はペクチン酸リアーゼ調製物、約50℃〜80℃の温度、及び約７〜11のpH（従って、苛性アルカリ剤を置換し又は補充する）を用いて行われ得ることが示されている。最適化された酵素工程は、高いペクチン除去性及び十分な湿潤性を確保する。
【０１０９】
植物材料の分解又は変性：
本発明の酵素調製物は好ましくは、本発明の酵素の高い植物細胞壁分解活性のために、植物細胞壁又は植物壁に起因するいずれかのペクチン含有材料の分解又は変性のための剤として使用される。
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、油に富んでいる植物材料からの油の、大豆からの同様の大豆油の、オリーブからのオリーブ油の、又はナタネ種子からのナタネ油の又はヒマワリからのヒマワリ油の抽出を改良するために、グルカナーゼ、ペクチナーゼ、および/又はヘミセルラーゼのような他の酵素と共に、又は単独で使用され得る。
【０１１０】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、植物細胞材料の成分の分解のために使用され得る。糖又はスターチに富んでいる植物材料の相当な商業的興味ある成分（たとえば、テンサイからスクロール、又はジャガイモからスターチ）及び商業的に興味が低い成分（たとえば、パルプ又は外皮画分）への分離が、特に興味あるものである。また、タンパク質に富んでいるか又は油に富んでいる収穫物の価値あるタンパク質及び油、及び不価値の外皮画分への分離が特に興味あるものである。分離工程は、当業界において知られている方法の使用により実施され得る。
【０１１１】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体はまた、収率を高めるために果実又は野菜ジュースの調製にも、及びたとえばワイン又はジュース製造からの種々の植物細胞壁−由来の材料又は廃棄材料、又は農業残留物、たとえば植物外皮、豆類の外皮、テンサイ果肉、オリーブ果肉、ジャガイモ果肉、及び同様のものの酵素加水分解にも使用され得る。
植物材料は、異なった種類の加工を改良し、カンキツ類からのペクチンの精製のような、ガラクタン以外の成分の精製又は抽出を促進し、供給価値を改良し、水結合能力を低め、廃水プラントにおける分解性を改良し、エンシレージへの植物材料の転換性を改良するために分解され得る。
【０１１２】
本発明の酵素調製物により、加工された果物又は野菜のコンシステンシー及び外観を調節することが可能である。コンシステンシー及び外観は、加工のために使用される酵素の実際の組み合わせ；すなわち本発明のペクチン酸リアーゼが組み合わされる酵素の特異性の生成物であることが示されている。たとえばリンゴ、ナシ、又はベリーからの透明なジュース；たとえばリンゴ、ナシ、ベリー、柑橘類又はトマトからの曇り安定性ジュース；及びたとえばニンジン及びトマトからのピューレの製造が、例として包含される。
【０１１３】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、植物細胞壁由来の材料の粘度を改良するために使用され得る。たとえば、前記ペクチン酸リアーゼ変異体は、ガラクタンを含む供給物の粘度を低めるために、及び粘性ガラクタン含有材料の加工を促進するために使用され得る。粘度の低下は、ガラクタン含有植物材料を、本発明の酵素調製物により、ガラクタン含有材料の十分な又は部分的分解のために適切な条件下で処理することによって得られる。
【０１１４】
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、たとえば植物繊維からのペクチン物質の除去のために他の酵素と組合して使用され得る。この除去は、たとえば紡織繊維又は他のセルロース材料の製造において必須である。このためには、植物繊維材料は、適切な量の本発明のペクチン分解酵素により、植物繊維材料に関連するペクチン物質の十分な又は部分的分解を得るための適切な条件下で処理される。
【０１１５】
動物飼料添加剤：
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体は、動物飼料の改良のために使用され得、そしてインビトロ（飼料の成分を変性することによって）又はインビボのいずれかで、それらの効果を付与することができる。ペクチン酸リアーゼ変異体は特に、多量のアラビノガラクタン又はガラクタンを含む動物供給組成物、たとえば大豆、ナタネ種子、ルピナス、等からの植物材料を含む飼料への添加のために適合化される。飼料に添加される場合、ペクチン酸リアーゼ変異体は、植物細胞壁材料のインビボ分解を有意に改良し、それにより、動物による植物材料の良好な利用性が達成される。
【０１１６】
それにより、動物の成長速度及び/又は飼料転換比（すなわち、体重の上昇に対する摂取された飼料の重量）が改良される。たとえば、摂取できるガラクタンが、β−ガラクトシダーゼと組合して、ペクチン酸リアーゼにより、動物により摂取でき、そして従って、飼料の利用できるエネルギーに寄与するガラクトース又はガラクトオリゴマーに分解される。また、ガラクタンの分解によりペクチン酸リアーゼが、非炭水化物飼料構成成分、たとえばタンパク質、脂肪及び鉱物の消化能力及び摂取を改良することができる。
さらなる記載のために、PCT/DK96/00443号及びそこにおける実施例が言及される。
【０１１７】
ワイン及びジュース加工：
本発明の酵素又は酵素調製物は、野菜又は果物ジュース、特にリンゴ又はナシジュースにおける脱ペクチン化及び粘度低下のために使用され得る。これは、果物又は野菜ジュースを、本発明の酵素調製物により、果物又は野菜ジュースに含まれるペクチン−含有材料を分解するのに効果的な量で処理することによって達成され得る。
酵素又は酵素調製物、マッシュ（飼料）の抽出性又は分解性を改良するために果物及び野菜からのマッシュの処理に使用され得る。たとえば、酵素調製物は、ジュース製造のためにリンゴ及びナシからのマッシュの処理に、及びワイン製造のためにブドウのマッシュ処理に使用され得る。
改良された洗剤安定性を有するペクチン酸リアーゼ変異体の適用性は、その変異体が界面活性剤を含んで成る環境下で使用される場合いつでも適切である。
【０１１８】
洗剤の開示及び例：
界面活性剤系：
本発明の洗浄又は洗剤組成物は界面活性剤系を含んで成り、ここで前記界面活性剤は、非イオン性、及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性、及び/又は両性及び/又は両性イオン性、及び/又は半極性界面活性剤から選択され得る。
界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。
【０１１９】
界面活性剤は好ましくは、組成物に存在する酵素ハイブリッド及び酵素成分と適合できるよう配合される。液体又はゲル組成物においては、界面活性剤は最も好ましくは、それが、それらの組成物における酵素ハイブリッド又は酵素の安定性を促進するか又は少なくとも分解しないような態様で配合される。
本発明への使用のための好ましい界面活性剤系は、本明細書に記載される１又は複数の非イオン性及び/又はアニオン性界面活性剤を界面活性剤として含んで成る。
【０１２０】
アルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブチレンオキシド縮合物が、本発明の界面活性剤系の非イオン界面活性剤としての使用のために適切であり、そしてポリエチレンオキシド縮合物が好ましい。それらの化合物は、直鎖又は枝分かれ鎖形状において、約６〜約14個の炭素原子、好ましくは約８〜約14個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルキルフェノールと酸化アルキレンとの縮合生成物を包含する。好ましい態様においては、酸化エチレンは、アルキルフェノール１モル当たり、約２〜約25モル、より好ましくは約３〜約15モルに等しい量で存在する。このタイプの市販の非イオン性界面活性剤は、GAF Corporationにより市販されているIgepalTM CO-630 ; 及びRohm & Haas Companyにより市販されているTritonTM X-45, X-114, X-100, 及びX-102を包含する。それらの界面活性剤は、通常、アルキルフェノールアルコキシレート（例えば、アルキルフェノールエトキシレート）として言及される。
【０１２１】
約１〜約25モルの酸化エチレンと第一及び第二脂肪族アルコールとの結合生成物は、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために適切である。脂肪族アルコールのアルキル鎖は、直鎖又は枝分かれ鎖の第一又は第二アルコールであり、そして一般的には、約８〜約22個の炭素原子を含む。アルコール１モル当たり約２〜約10モルの酸化エチレンと、約８〜約20個の炭素原子、より好ましくは約10〜約18個の炭素原子を含むアルキル基を有するアルコールとの縮合生成物が好ましい。アルコール１モル当たり、約２〜約７モルの酸化エチレン及び最も好ましくは、２〜５モルの酸化エチレンが、前記縮合生成物に存在する。
【０１２２】
このタイプの市販の非イオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する：TergitolTM 15-S-9 (９モルの酸化エチレンとC11-C15線状アルコールとの縮合生成物)、TergitolTM 24-L-6NMW (狭い分子量分布を有する、６モルの酸化エチレンとC12-C14第一アルコールとの縮合生成物) (両者ともUnion Carbide Corporationにより市販されている)；NeodolTM 45-9 (９モルの酸化エチレンとC14-C15線状アルコールとの縮合生成物)、NeodolTM 23-3 (3.0モルの酸化エチレンとC12-C13線状アルコールとの縮合生成物)、NeodolTM 45-7 (７モルの酸化エチレンとC14-C15線状アルコールとの縮合生成物)、NeodolTM 45-5 (５モルの酸化エチレンとC14-C15線状アルコールとの縮合生成物) (Shell Chemical Company により市販されている)；KyroTM EOB (９モルの酸化エチレンとC13-C15アルコールとの縮合生成物) (The Procter & Gamble Company により市販されている)；及びGenapol LA050（５モルの酸化エチレンとC12-C14アルコールとの縮合生成物）（Hoechstにより市販されている）。それらの生成物におけるHLBの好ましい範囲は８〜11、及び最も好ましくは８〜10である。
【０１２３】
また、約６〜約30個の炭素原子、好ましくは約10〜約16個の炭素原子を含む疎水性基を有する、アメリカ特許第4,565,647号に開示されるアルキル多糖類、及び約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最も好ましくは約1.3〜約2.7のサッカリド単位を含む親水性基を有する多糖、例えばポリグリコシドが、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤として有用である。５〜６個の炭素原子を含むいずれかの還元サッカリドが使用され得、例えばグルコース、ガラクトース、及びガラクトシル成分がグルコシル成分により置換され得る（任意には、疎水性基が２−,３−,４−,等の位置で結合され、従って、グルコシド又はガラクトシドとは対照的に、グルコース又はガラクトースが得られる）。サッカリド間結合は、例えば、追加のサッカリド単位の１つの位置と先に存在するサッカリド単位上の２−,３−,４−及び/又は６−位置との間で存在することができる。
【０１２４】
好ましいアルキルポリグリコシドは、下記式：
R2O (CnH2nO)t (グリコシル)x
［式中、R2は、アルキル、アルキルフェニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルフェニル、及びそれらの混合物（ここで、アルキル基は約10〜約18、好ましくは約12〜約14個の炭素原子を含む）から成る群から選択され；ｎは、２又は３、好ましくは２であり；ｔは０〜約10、好ましくは０であり；そしてxは約1.3〜約10、好ましくは約1.3〜約３、最も好ましくは約1.3〜約2.7である］を有する。グリコシルは好ましくは、グルコースに由来する。それらの化合物を調製するためには、アルコール又はアルキルポリエトキシアルコールが最初に形成され、そして次に、グルコース、又はグルコース源と反応せしめられ、グルコースが形成される（1−位置での結合）。次に、追加のグリコシル単位が、それらの１−位置と、先に存在するグルコシル単位２−,３−,４−,及び/又は６−位置、好ましくは、優力的には２−位置との間に結合され得る。
【０１２５】
酸化プロピレンとプロピレングリコールとの縮合により形成される疎水性基と酸化エチレンとの縮合生成物がまた、本発明の追加の非イオン性界面活性剤系としての使用のために適切である。それらの化合物の疎水性部分は、好ましくは、約1500〜約1800の分子量を有し、そして水不溶性を示すであろう。この疎水性部分へのポリオキシエチレン成分の付加は、全体として分子の水溶性を高める傾向があり、そして生成物の液体特性は、ポリオキシエチレン含有率が縮合生成物の合計重量の約50％であり、約40モルまでの酸化エチレンとの縮合に対応する点まで維持される。このタイプの化合物の例は、BASFにより市販されている一定のPluronicTM 界面活性剤を包含する。
【０１２６】
酸化プロピレン及びエチレンジアミンの反応に起因する生成物と酸化エチレンとの縮合生成物はまた、本発明の非イオン性界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のためにも適切である。それらの生成物の疎水性成分は、エチレンジアミン及び過剰の酸化プロピレンの反応生成物から成り、そして一般的には、約2500〜約3000の分子量を有する。この疎水性成分は、縮合生成物が約40〜約80重量％のポリオキシエチレンを含み、そして約5,000〜約11,000の分子量を有する程度まで、酸化エチレンにより縮合される。このタイプの非イオン性界面活性剤の例は、BASFから市販されているTetronicTM 化合物を包含する。
【０１２７】
アルキルフェノールのポリ酸化エチレン縮合物、すなわち約１〜約25モルの酸化エチレン、アルキル多糖類及びそれらの混合物と第一及び第二脂肪族アルコールとの縮合生成物は、本発明の界面活性剤系の非イオン性界面活性剤としての使用のために好ましい。３〜15個のエトキシ基を有するG9-C14アルキルフェノールエトキシレート、及び２〜10個のエトキシ基を有するC8-C18アルコールエトキシレート（好ましくは、C10平均）、及びそれらの混合物が最も好ましい。下記式：
【０１２８】
【化１】
2005525118.tif 000007
【０１２９】
［式中、R1はHであり、又はR1はC1-4ヒドロカルビル、２−ヒドロキシエチル、２−ヒドロキシプロピル又はそれらの混合物であり、R2はC5-31ヒドロカルビルであり、そしてZは線状ヒドロカルビル鎖に直接的に結合される少なくとも３個のヒドロキシルを有するそのヒドロカルビル鎖を有するポリヒドロキシヒドロカルビルである］
で表されるポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活性剤、又はそのアルコキシル化された誘導体が、非常に好ましい非イオン性界面活性剤である。好ましくは、R1はメチルであり、R2は直鎖のC11-15又はC16-18アルキル、又はアルケニル鎖、例えばヤシアルキル又はそれらの混合物であり、そしてZは還元糖、例えばグルコース、フルクトース、マルトース又はラクトースから還元アミノ化反応において誘導される。
【０１３０】
非常に好ましいアニオン性界面活性剤は、アルキルアルコキシル化されたスルフェート界面活性剤を包含する。その例は、式RO(A)mSO3M [式、Rは置換されていないC10-C20アルキル又はC10-C24アルキル成分を有するヒドロキシアルキル基、好ましくはC12-C20アルキル又はハロ−キシアルキル、より好ましくはC12-C18アルキル又はヒドロキシアルキルであり、Aはエトキシ又はプロポキシ単位であり、ｍはゼロよりも大きく、典型的に約0.5〜約６、より好ましくは約0.5〜約３であり、そしてMはH, 又は例えば、金属カチオンであり得るカチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、等）、アンモニウム、又は置換されたアンモニウムカチオンである。アルキルエトキシル化されたスルフェート及びアルキルプロポキシル化されたスルフェートが本明細書において企画される。
【０１３１】
置換されたアンモニウムカチオンの特定の例は、メチル−、ジメチル−、トリメチル−アンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペルジニウムカチオン、及びアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、それらの混合物から誘導されたそれらのもの、及び同様のものを包含する。典型的な界面活性剤は、C12-C18アルキルポリエトキシレート（1.0）スルフェート（C12-C18E(1.0), C12-C18アルキルポリエトキシレート（2.25）スルフェート（C12-C18(2.25)M）及びC12-C18アルキルポリエトキシレート（3.0）スルフェート（C12-C18E(3.0)M）、C12-C18アルキルポリエトキシレート（4.0）スルフェート（C12-C18E(4.0)M）(ここで、Mは便利には、ナトリウム及びカリウムから選択される)である。
【０１３２】
使用される適切なアニオン性界面活性剤は、“The Journal of the American Oil Chemists Society”52(1973), pp.323-329に従って、気体SO3によりスルホン化されたC8-C20カルボン酸（すなわち、脂肪酸）の線状エステルを含むアルキルエステルスルホネート界面活性剤である。適切な出発材料は、牛脂、ヤシ油、等から誘導されるような天然の脂肪物質を包含する。
特に、洗濯用途のための好ましくはアルキルエステルスルホネート界面活性剤は、下記式：
【０１３３】
【化２】
2005525118.tif 000008
【０１３４】
［式中、R3はC8-C20ヒドロカルビル、好ましくはアルキル又はそれらの組み合わせであり、R4はC1-C6ヒドロカルビル、好ましくはアルキル、又はそれらの組み合わせであり、そしてMはアルキルエステルスルホネートと共に水溶性塩を形成するカチオンである］
で表される構造を有するアルキルエステルスルホネート界面活性剤を含んで成る。適切な塩形成カチオンは、金属、例えばナトリウム、カリウム及びリチウム、及び置換された又は置換されていないアンモニウムカチオン、例えばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンを包含する。好ましくは、R3はC10-C16アルキルであり、そしてR4はメチル、エチル又はイソプロピルである。R3がC10-C16アルキルであるメチルエステルスルホネートが特に好ましい。
【０１３５】
他の適切なアニオン性界面活性剤は、式ROSO3M［式中、Rは好ましくは、C20-C24ヒドロカルビル、好ましくはC10-C20アルキル成分を有するアルキル又はヒドロキシアルキル、より好ましくはC12-C18アルキル又はヒドロキシアルキルであり、そしてMは、H、又はカチオン、例えばアルカリ金属カチオン（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム）、又はアンモニウム、又は置換されたアンモニウム（例えば、メチル−、ジメチル−及びトリメチルアンモニウムカチオン、及び第四アンモニウムカチオン、例えばテトラメチル−アンモニウム及びジメチルピペリジニウム、及びアルキルアミン、例えばエチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン及びそれらの混合物から誘導された第四アンモニウムカチオン、及び同様のもの）である］で表される水溶性塩又は酸であるアルキルスルフェート界面活性剤を包含する。典型的には、C12-C16のアルキル鎖は、低い洗浄温度（例えば、約50度以上）のために好ましい。
【０１３６】
洗浄目的のために有用な他のアニオン性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物にも含まれ得る。それらは、次のものを包含する：石鹸の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、及び置換されたアンモニウム塩、例えばモノ−、ジ−及びトリエタノール塩）、C8-C22第一又は第二アルカンスルホネート、C8-C24オレフィンスルホネート、イギリス特許第1,082,179号明細書に記載されるような、アルカリ土類金属クエン酸塩の熱分解された生成物のスルホン化により調製されたスルホン化さえたポリカルボン酸、C8-C24アルキルポリグリコールエーテルスルホネート（10モルまでの酸化エチレンを含む）、アルキルグリセロールスルホネート、脂肪アシルグリセロールスルホネート、脂肪オレイルグリセロールスルホネート、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホネート、パラフィンスルホネート、アルキルホスホネート、イセチオネート、例えばアシルイセチオネート、N−アシルタウレート、アルキルスクシナメート及びスルホスクシネート、スルホスクシネートのモノエステル（特に、飽和及び不飽和C12-C18モノエステル）及びスルホスクシネートのジエステル（特に、飽和及び不飽和C6-C12ジエステル）、アシルサルコシネート、アルキル多糖類のスルフェート、例えばアルキルポリグルコシドのスルフェート（非イオン性の硫酸化されていない化合物は下記に記載される）、枝分かれ鎖の第一アルキルスルフェート、及びアルキルポリエトキシカルボキシレート、例えば式RO(CH2CH2O)k-CH2COO-M+［式中、RはC8-C22アルキルであり、ｋは１〜10の整数であり、そしてMは可溶性塩形成カチオンである］で表されるそれらのもの。樹脂酸及び水素化された樹脂酸、例えばロジン、水素化されたロジン、及びタル油に存在するか又はその油から誘導された樹脂酸及び水素化された樹脂酸がまた適切である。
【０１３７】
アルキルベンゼンスルホネートが非常に好ましい。線状（直鎖）アルキルベンゼンスルホネート（LAS）（ここで、アルキル基は好ましくは、10〜18個の炭素原子を含む）が特に好ましい。
さらなる例は、“Surface Active Agents and Detergents”（Vol. I and II by Schwartz, Perry and Berch）に記載される。種々のそのような界面活性剤はまた、一般的に、アメリカ特許第3,929,678号（第23頁左欄、第58行〜第29頁左欄、第23行；引用により本明細書に組み込まれる）にも開示される。
【０１３８】
本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、約１〜約40重量％、好ましくは約３〜約20重量％のそのようなアニオン性界面活性剤を含んで成る。
本発明は洗濯洗剤組成物はまた、カチオン性、両性、両性イオン及び半極性界面活性剤、並びに本明細書においてすでに記載されたもの以外の非イオン性及び/又はアニオン界面活性剤を含むことができる。
【０１３９】
本発明の洗濯洗剤組成物への使用のために適切なカチオン性洗剤海面活性剤は、１つの長鎖ヒドロカルビル基を有すそれらのものである。そのようなカチオン性界面活性剤の例は、次のものを包含する：アンモニウム海面活性剤、例えばアルキルトリメチルアンモニウムハロゲン化物、及び下記式：
［R2(OR3)y］ [R4(OR3)y]2R5N+X-
［式中、R2は、アルキル又はアルキル鎖に約８〜約18個の炭素原子を有するアルキルベンジル基であり；個々のR3は、-CH2CH2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2CH2(CH2OH)-, -CH2CH2CH2-及びそれらの混合物から成る群から選択され；個々のR4は、C1-C4アルキル、C1-C4ヒドロキシアルキル、２つのR4基を連結することによって形成されるベンジル環構造体、及び-CH2CHOHCHOHCOR6CHOHCH2OH（ここで、R6は、約1000以下の分子量を有するいずれかのヘキソース又はヘキソースポリマー、及びｙが０でない場合、水素である）から成る群から選択され；R5は、R4と同じであるか、又はアルキル鎖であり、ここで炭素原子の合計数、又はR2＋R5がが約18よりも大きくなく；個々のｙは０〜約10であり、そしてｙ値の合計０〜約15であり；そしてXがいずれかの適合できるアニオンである］を有するそれらの海面活性剤。
【０１４０】
非常に好ましいカチオン性界面活性剤は、下記式：
R1R2R3R4N+X-（ｉ）
［式、C6-C16アルキルであり、個々のR2, R3, 及びR4は独立して、C1-C4アルキル、C1-C4ヒドロキシアルキル、ベンジル及び-(C2H40)XH（ここで、Xは２〜５の値である）であり、Xはアニオンである］
で表される本発明の組成物において有用な水溶性第四アンモニウム化合物である。多くとも１つのR2, R3又はR4がベンジルであるべきである。
【０１４１】
R1のための好ましいアルキル鎖長は、特に、アルキル基がヤシ脂肪に由来する鎖長の混合物、又はオレフィン増成又はOXOアルコール合成により合成的に誘導される場合、C12-C15である。
R2R3及びR4のための好ましい基は、メチル及びヒドロキシエチル基であり、そしてアニオンXは、ハロゲン化合物、メトスルフェ−ト、アセテート及びホスフェートイオンから選択され得る。
【０１４２】
本明細書において使用するための式（ｉ）の適切な第四アンモニウム化合物の例は、次のものである：ヤシトリメチルアンモニウム塩化合物又は臭化物；ヤシメチルジヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；デシルトリエチルアンモニウム塩化物；デシルジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；C12-C15ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；ヤシジメチルヒドロキシエチルアンモニウム塩化物又は臭化物；ミリスチルトリメチルスルフェート；ラウリルジメチルベンジルアンモニウム塩化物又は臭化物；ラウリルジメチル (エテノキシ)4アンモニウム塩化物又は臭化物；コリンエステル［式（ｉ）（式中、R1は、下記式：
【０１４３】
【化３】
2005525118.tif 000009
【０１４４】
であり、そしてR2R3R4はメチルである）で表される化合物］；ジアルキルイミダゾリン［式（ｉ）の化合物］。
本明細書において有用な他のカチオン性界面活性剤は、アメリカ特許第4,228,044号及びヨーロッパ特許第000224号に記載される。
本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約25重量％、好ましくは１〜約８重量％のそのようなカチオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１４５】
両性界面活性剤はまた、本発明の洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二又は第三アミンの脂肪族誘導体、又は複素環式第二及び第三アミンの脂肪族誘導体として広く記載され得、ここで前記脂肪族基は直鎖又は枝分かれ鎖であり得る。脂肪族置換基の１つは少なくとも約８個の炭素原子、典型的には、約８〜約18個の炭素原子を含み、そして少なくとも1つは、アニオン性水溶性基、例えばカルボキシ、スルホネート又はスルフェートを含む。例えば、両性界面活性剤については、アメリカ特許第3,929,678号（第19頁左欄、第18〜35行）を参照のこと。
【０１４６】
本明細書において包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性界面活性剤を含んで成る。
両性イオン性界面活性剤はまた、洗濯洗剤組成物への使用のためにも適切である。それらの界面活性剤は、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミンの誘導体、又は第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第三スルホニウム化合物の誘導体として広く記載され得る。例えば、両性イオン性界面活性剤については、アメリカ特許第3,929,678号（第19頁左欄、第38行〜第22頁右欄、第48行）を参照のこと。
本明細書において包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような両性イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１４７】
半−極性非イオン性界面活性剤は、約10〜約18個の炭素原子の1つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された2つの成分を含む水溶性アミン酸化物；約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭酸原子を含むアルキル基及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された２つの成分を含む水溶性ホスフィン酸化物；及び約10〜約18個の炭素原子の１つのアルキル成分及び約１〜約３個の炭酸原子のアルキル及びヒドロキシアルキル基から成る群から選択された１つの成分を含む水溶性スルホキシドを含む、特定カテゴリーの非イオン性界面活性剤である。
【０１４８】
半−極性非イオン性洗剤界面活性剤は、下記式：
【化４】
2005525118.tif 000010
【０１４９】
［式中、R3は、約８〜約22個の炭素原子を含む、アルキル、ヒドロキシアルキル又はアルキルフェニル基、又はそれらの混合物であり；R4は、約２〜約３個の炭素原子を含むアルキレン又はヒドロキシアルキレン基、又はそれらの混合物であり；Xは０〜約３であり；そして個々のR5は、約１〜約３個の炭素原子を含むアルキル又はヒドロキシアルキル基、又は約１〜約３個の酸化エチレン基を含むポリ酸化エチレンである］で表される酸化アミン界面活性剤を含む。R5基は、環構造を形成するために、例えば酸素又は窒素原子を通して、お互い結合され得る。
【０１５０】
それらのアミンの界面活性剤は特に、C10-C18アルキルジメチルアミン酸化物及びC8-C12アルコキシエチルジヒドロキシエチルアミン酸化合物を含む。
本明細書に包含される場合、本発明の洗濯洗剤組成物は、典型的には、0.2〜約15重量％、好ましくは約１〜約10重量％のそのような半−極性非イオン性界面活性剤を含んで成る。
【０１５１】
ビルダー系：
本発明の組成物はさらに、ビルダー系を含むことができる。次のいずれかの従来のビルダー系が、本発明への使用のために適切である：アルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレート及び脂肪酸、材料、例えばエチレンジアミンテトラアセテート、金属イオン封鎖剤、例えばアミノポリホスホネ−ト、特にエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸及びジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸。明らかな環境の理由のためにほとんど好ましくはないけれども、ホスフェートビルダーもまた、本発明において使用され得る。
【０１５２】
適切なビルダーは、無機イオン交換材料、通常、無機水和化されたアルミノシリケート材料、より特定には、水和化された合成ゼオライト、例えば水和化されたゼオライトA，X, B, HS又はMAPであり得る。
もう１つの適切な無機ビルダー材料は、積層されたシリケート、例えばSKS-6(Hoechst)である。SKS−６は、珪酸ナトリウムから成る積層された結晶性シリケート（Na2Si2O5）である。
【０１５３】
1つのカルボキシ基を含む適切なポリカルボキシレートは、ベルギー特許第831， 368号、第821、368号及び第821、370号に開示されるように、乳酸、グリコール酸及びそれらのエーテル誘導体を包含する。2つのカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、琥珀酸、マロン酸、（エチレンジオキシ）ニ酢酸、マレイン酸、ジグリコール酸、酒石酸、タルト酸及びフマル酸の水溶性塩、及びドイツ特許第2,446,686号及び第2,446,487号、及びアメリカ特許第3,935,257号に記載されるエーテルカルボキシレート、及びベルギー特許第840,623号に記載されルスルフィニルカルボキシレートを包含する。3個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、特に水溶性シトレート、アコニトレート及びトラコネート、及びスクシネート誘導体、例えばイギリス特許第1,379,241号に記載さえるカルボキシメチルオキシスクシネート、オランダ特許出願第7205873号に記載されるラクトオキシスクシネート、及びイギリス特許第1,387,447号に記載されるオキシポリカルボキシレート材料、例えば２−オキサ−１，１，３−プロパントリカルボキシレートを包含する。
【０１５４】
４個のカルボキシ基を含むポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,261,829号に開示されるオキシジスクシネート、スルホ置換基を含む１，１，３，３−プロパンテトラカルボキシレート、例えばイギリス特許第1,398,421号及び第1,398,422号及びアメリカ特許第3,936,448号に開示されるスルホスクシネート誘導体、及びイギリス特許第1,082,179号に記載されるスルホン化され、熱分解されたシトレートを包含し、そしてホスホン置換基を含むポリカルボキシレートはイギリス特許第1,439,000号に開示される。
【０１５５】
脂環式及び複素環式ポリカルボキシレートは、次のものを包含する：シクロペンタン−シス、シス、シス−テトラカルボキシレート、シクロペンタジエニドペンタカルボキシレート、２，３，４，５−テトラヒドロ−フラン−シス，シス，シス−テトラカルボキシレート、２，５−テトラヒドロ−フラン−シス−ジスカルボキシレート、２，２，５，５−テトラヒドロフラン−テトラカルボキシレート、１，２，３，４，５，６−ヘキサン−ヘキサカルボキシレート、及び多価アルコール、例えばソルビトール、マンニトール及びキシリトールのカルボキシメチル誘導体。芳香族ポリカルボキシレートは、イギリス特許第1,425,343号に開示される、メリット酸、ピロメリット酸及びフタル酸誘導体を包含する。
【０１５６】
上記のうち、好ましいポリカルボキシレートは、分子当たり３個までのカルボキシ基を含むヒドロキシカルボキシレート、より特定には、シトレートである。
本発明の組成物への使用のための好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばゼオライトA，又は積層されたシリケート（SKS-6），及び水溶性カルボキシレートキレート剤、例えばクエン酸の混合物を包含する。
【０１５７】
本発明の洗剤組成物への包含のための適切なキレ−ト化剤は、エチレンジアミン−N，N’−ニ琥珀酸（EDDS），そのアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム又は置換されたアンモニウム塩、又はそれらの混合物である。好ましいEDDS化合物は、遊離酸形及びそのナトリウム又はマグネシウム塩である。EDDSのそのような好ましいナトリウム塩の例は、Na2EDDS及びNa4EDDSを包含する。EDDSのそのような好ましいマグネシウム塩の例は、MgEDDS及びMg2EDDSを包含する。マグネシウム塩は、本発明の組成物への包含のために最も好ましいものである。
【０１５８】
好ましいビルダー系は、水不溶性アルミノシリケートビルダー、例えばビオライトA，及び水溶性カルボキシレートキレート化剤、例えばクエン酸の混合物を包含する。
粒質組成物への使用のためのビルダー系の一部を形成することができる他のビルダー材料は、無機材料、例えばアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素塩、珪酸塩、及び有機材料、例えば有機ホスホネート、アミノポリアルキレンホスホネート及びアミノポリカルボキシレートを包含する。
【０１５９】
他の適切な水溶性有機塩は、ホモー又はコ−ポリマー酸又はそれらの塩であり、ここで前記ポリカルボン酸は２個よりも多くない炭素原子によりお互い分離された少なくとも２つのカルボキシ基を含んで成る。
このタイプのポリマーは、GB-A-1,596,756号に開示される。そのような塩の例は、MW2000〜5000のポリアクレレート、及び無水マレイン酸とのそれらのコポリマーであり、そのようなコポリマーは、20,000〜70,000、特に約40,000の分子量を有する。
洗浄ビルダー塩は通常、組成物の５〜80重量％の量で含まれる。液体洗剤のためのビルダーの好ましいレベルは、５〜30％である。
【０１６０】
酵素：
好ましい洗剤組成物は、本発明のペクチン酸リパーゼ調製物の他に、清浄性能及び/又は布保護特性を提供する他の酵素を含んで成る。本発明によれば、追加の酵素は、酸化−及びカルシウム−消耗安定性を改良するために変性され得る。
そのような酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ（例えば、ラッカーゼ）、ヘミセルラーゼ、例えばマンナナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、エステラーゼ、リケナーゼ、アラビナナーゼ及び他のペクチン酸リアーゼを包含する。
【０１６１】
プロテアーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないずれかのプロテアーゼが使用され得る。適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルスに由来するそれらのもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168（WO89/06279号に記載される）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びWO89/06270号に記載されるフサリウムプロテアーゼである。
【０１６２】
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、Novo Nordisk A/S(Denmark)によるAlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, 及びEsperaseTM, Genencor InternationalによるMaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, 及びPurafect OxPTM, 及びSolvar EnzymesによるOpticlean及びOptimaseを包含する。プロテアーゼ酵素は、組成物中、0.00001〜2重量％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで、本発明の組成物中に、導入され得る。
【０１６３】
リパーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないずれかのリパーゼが使用され得る。適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変更体が包含される。
【０１６４】
有用なリパーゼの例は、例えばEP258068号及びEP305216号に記載されるようなヒューミコラ・ラヌキノサ（Humicola lanuginose）リパーゼ、EP238023号に記載されるようなリゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ、EP214761号に記載されるようなカンジダ（Candida）リパーゼ、例えばC.アンタルシチカ（C.antarctica）リパーゼ、例えばC. アンタルシチカA又はB、EP218272号に記載されるようなP.アルカリゲネス（P. alcaligenes）及びP. シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcal: genes）リパーゼ、EP331376号に記載されるようなP. セパシア（P. Cepacia）リパーゼ、GB1, 372,034号に開示されるようなP. スツゼリ（P. stutzeri）リパーゼ、P. フルオレセンス（P. fluorescens）リパーゼ、バチルス（Bacillus）リパーゼ、例えばB. サブチリスリパーゼ（Dartoisなど., (1993), Biochemica et Biophysica acta 1131, 253-260）、B. ステアロサーモフィラス（B.stearothermophilus）リパーゼ（JP64/744992号）及びB. プミラス（B. pumilus）リパーゼ（WO91/16422号）を包含する。
【０１６５】
さらに、多くのクローン化されたリパーゼ、例えばペニシリウム・カメムベルチ（Penicillium camembertii）リパーゼ（Yamaguchiなど.,(1991）、Gene 103, 61-67), ゲオトリカム・カンジダム（Geotricum candium）リパーゼ（Schimada, Y. など., (1989), J. Biochem. 106,383-388）及び種々のリゾバス（Rhizopus）リパーゼ、例えばR. デレマル（R. delemar）リパーゼ（Hass, M. J.など., (1991), Gene 109, 117-113）, R. ニベウス（R. niveus）リパーゼ（Kugimiya）など., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 718-719) 及びR. オリザエ（R. oryzae）リパーゼが有用である。
【０１６６】
他のタイプの脂質分解酵素、例えばクチナーゼ、例えばWO88/09367号に記載されるようなシュドモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）に由来のクチナーゼ、又はWO90/09446号に記載されるようなフサリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）に由来のクチナーゼがまた有用である。
特に適切なリパーゼは、リパーゼ、例えばM1 LipaseTM, Luma fastTM 及び Lipo- matTM (Genencor), LipolaseTM及び Lipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S), 及び Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.)である。
リパーゼは通常、組成物中、0.00001〜2重量％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで、本発明の組成物中に、導入され得る。
【０１６７】
アミラーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないずれかのアミラーゼ（α及び/又はβ）が使用され得る。適切なアミラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。アミラーゼは、例えばGB1,296,839号に詳細に記載される、B. リケニホルミス（B. licheniformis）の特定株から得られたα−アミラーゼを包含する。市販のアミラーゼは、DuramylTM, TermamylTM, FungamylTM 及び BANTM (Novo Nordisk A/Sから入手できる) 及び RapidaseTM, Maxamyl PTM, PurastarTM 及び Purastar OxAmTM (Genencorから入手できる)である。さらに、SP707（Tsukamoto, A. など, 1 988. B iochem. B iophys. R es. C ommun. 1 51 : 25）又はK38（Kao  Carp. EP1022334号）に対して70％以上の相同性を有するアミラーゼが適切である。
【０１６８】
アミラーゼは通常、組成物中、0.00001〜2重量％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで、本発明の組成物中に、導入され得る。
【０１６９】
セルラーゼ：アルカリ溶液への使用のために適切ないずれかのアミラーゼ（α及び/又はβ）が使用され得る。適切なアミラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、アメリカ特許第4,435,307号に開示されており、これは、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）から生成された菌類セルラーゼを開示する。特に適切なセルラーゼは、色彩保護利点を有するセルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許出願第0495257号に記載されるセルラーゼである。
【０１７０】
市販のセルラーゼは、ヒューミコラ・インソレンスにより生成されるCelluzymeTM (Novo Nordisk A/S), 及び KAC-500 (B) TM (Kao Corporation)を包含する。
セルラーゼは通常、組成物中、0.00001〜2重量％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで、本発明の組成物中に、導入され得る。
【０１７１】
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ：ペルオキシダーゼ酵素は、過酸化水素又はその源（例えば、過炭酸塩、過硼酸塩又は過硫酸塩）と組合して使用される。オキシダーゼ酵素は、酵素と組合して使用される。両タイプの酵素は、“溶液漂白”のために、すなわちWO94/12621号及びWO95/01426号に記載されるように、布が洗液、好ましくは増強剤において一緒に洗浄される場合、染色された布からもう１つの布への紡織染料の移行を妨げるために使用される。適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらを包含する。化学的に又は遺伝子的に修飾された変異体が包含される。
【０１７２】
ペルオキシダーゼ及び/又はオキシダーゼは通常、組成物中、0.00001〜2重量％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで、本発明の組成物中に、導入され得る。
【０１７３】
ペクチン酸リアーゼ：ペクチン酸リアーゼは、異なった細菌属、例えばエルウィニア（Erwinia）、シュドモナス（Pseudamonas）、クレブシエラ（Klebsiella）及びキサントモナス（Xanthomonas）からクローン化されて来た。バチルス・サブチリス（Nasserなど., (1993) FEBS 335: 319-326）及びバチルスsp-YA-14（Kimなど., (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58: 947-949）からのペクチン酸リアーゼのクローニングが記載されている。
ペクチン酸リアーゼは一般的に、アルカリpH最適性、及び二価のカチオン（Ca2+が最も刺激的である）についての絶対的必要性により特徴づけられる。
【０１７４】
上記酵素の混合物、特にプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ及び/又はセルラーゼの混合物が本明細書に包含される。
ペクチン酸リアーゼは通常、組成物中、0.00001〜2重量％の酵素タンパク質のレベルで、好ましくは0.0001〜１重量％の酵素タンパク質のレベルで、より好ましくは0.001〜0.5重量％の酵素タンパク質のレベルで、さらにより好ましくは0.01〜0.2重量％の酵素タンパク質のレベルで、本発明の組成物中に、導入され得る。
【０１７５】
漂白剤：本発明の洗剤組成物に含まれ得る追加の任意の洗剤成分は、漂白剤、例えばPB1，PB4, 及び400〜800μの粒子サイズを有するペルカルボネートを包含する。それらの漂白剤成分は、１又は複数の酸素漂白剤、及び選択される漂白剤に依存して、１又は複数の漂白活性化剤を含むことができる。存在する場合、酸素漂白化合物は典型的には、約１％〜約25％のレベルで存在するであろう。一般的に、漂白化合物は、非液体配合物、例えば粒状洗剤において任意の添加される成分である。
【０１７６】
本発明に使用するための漂白剤成分は、洗剤組成物のために有用な漂白剤、例えば酸素漂白剤、及び当業界において知られている他のもののいずれかであり得る。
本発明のための適切な漂白剤は、活性化された又は活性化されていない漂白剤であり得る。
【０１７７】
使用され得る酸素漂白剤の１つのカテゴリーは、過カルボン酸漂白剤及びその塩を包含する。この種類の剤の適切な例は、マグネシウムモノペルオキシフタレート・６水和物、すなわちメタ−クロロ過安息香酸、４−ノニルアミノ−４−オキソペルオキシ酪酸及びジペルオキシドデカンジオール酸を包含する。そのような漂白剤は、アメリカ特許第4,483,781号、アメリカ特許第740,446号、ヨーロッパ特許第0133354号及びアメリカ特許第4,412,934号に開示される。非常に好ましい漂白剤はまた、アメリカ特許第4,634,551号に記載されるように、６−ノニルアミノ−６−オキソペルオキシカプロン酸も包含する。
【０１７８】
使用され得るもう１つのカテゴリーの漂白剤は、ハロゲン漂白剤を包含する。次亜ハロゲン化合物漂白剤の例は、トリクロロイソシアヌル酸、及びナトリウム及びカリウムジクロロイソシアヌレ−ト、及びN−クロロ及びN−ブロモアルカンスルホンアミドを包含する。そのような材料は通常、最終生成物の0.5〜10重量％、好ましくは１〜５重量％で添加される。
【０１７９】
次の過酸化水素離型剤が、漂白活性化剤と一緒に使用され得る：テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS;アメリカ特許第4,412,934号に記載される）、３，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート（ISONOBS；ヨーロッパ特許第120591号に記載される）又はペンタアセチルグルコース（PAG）、ここでそれらは、活性漂白種として過酸を形成するために過加水分解され、改良された漂白効果がもたらされる。さらに、次の漂白活性剤が非常に適切である：C8（6−オクタアミド−カプロイル）オキシベンゼン−スルホネート、C9（6−ノナンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート及びC10（６−デカンアミドカプロイル）オキシベンゼンスルホネート又はそれらの混合物。または適切な活性化因子は、アシル化されたシトレートエステル、例えばヨーロッパ特許出願第91870207.7号に開示されるようなものである。
【０１８０】
本発明の清浄組成物への使用のための漂白活性化剤及び過酸漂白化合物を含んで成る漂白系及び過オキシ酸を含む有用な漂白剤が、USSN出願08/136,626号に記載される。
過酸化水素はまた、洗浄及び/又はすすぎ工程の開始又はその間、過酸化水素を発生できる酵素系（すなわち、酵素及びそのための基質）を添加することによって存在することができる。そのような酵素系は、ヨーロッパ特許出願0537381号に開示される。
【０１８１】
酸素漂白剤以外の漂白剤もまた、当業界において知られており、そして本発明において使用され得る。特に興味ある１つのタイプの非酸素漂白剤は、光活性化された漂白剤、例えばスルホン化された亜鉛及び/又はアルミニウムフタロシアニンを包含する。それらの材料は、洗浄工程の間、支持体上に沈着され得る。日中の光下で乾燥するために布を吊り下げることによって、酸素の存在下で光による照射に基づいて、スルホン化された亜鉛フタロシアニンが活性化され、そして従って、支持体が漂白される。好ましい亜鉛フタロシアニン及び光活性化された漂白工程は、アメリカ特許第4,033,718号に記載されている。典型的には、洗剤組成物は、約0.025〜約1.25重量％のスルホン化された亜鉛フタロシアニンを含むであろう。
【０１８２】
漂白剤はまた、マンガン触媒を含むことができる。このマンガン触媒は、“Efficient mangamese catalysts for low-Temperature bleaching”、Nature 369 1994, pp.637-639に記載される化合物の１つであり得る。
【０１８３】
石鹸の泡抑制剤：もう１つの任意の成分は、シリコーン及びシリカ−シリコーン混合物により例示される石鹸の泡抑制剤である。シリコーンは一般的に、アルキル化されたポリシロキサン材料により表され得るが、ところがシリカは通常、細かく分割された形で使用され、シリカエーロゲル及びキセロゲル、及び種々のタイプの疎水性シリカにより例示される。それらの材料は粒質物として導入され得、ここで石鹸の泡抑制剤は好都合には、水溶性又は水分散性、実質的には非界面活性剤不透明過性キャリヤーに開放できるように導入される。他方では、石鹸の泡抑制剤は、液体キャリヤーに溶解され又は分散され、そして１又は複数の他の成分上に噴霧することによって適用され得る。
【０１８４】
好ましいシリコーン石鹸の泡抑制剤はアメリカ特許第3,933,672号に開示される。他の特に有用な石鹸の泡抑制剤は、ドイツ特許出願（DTOS）第2,646,126号に記載される自己乳化性シリコーン石鹸の泡抑制剤である。そのような化合物の例は、シロキサン−グリコールポリマーである、DOW Corningから市販されているDC−544である。特に好ましい石鹸の泡抑制剤は、シリコーン油及び２−アルキル−アルケノールの混合物を含んで成る石鹸の泡抑制剤系である。適切な２−アルキル−アルカノールは、商標名Isofol 12Rとして市販されている２−ブチル−オクタノールである。
【０１８５】
そのような石鹸の泡抑制剤系は、ヨーロッパ特許出願第0593841号に記載されている。
特に好ましいシリコーン石鹸の泡抑制剤は、ヨーロッパ特許出願第92201649.8号に記載されている。前記組成物は、ヒュームド非孔性シリカ、例えばAerosilRと組合して、シリコーン/シリカ混合物を含んで成る。
上記石鹸の泡抑制剤は通常、組成物の0.001〜２重量％、好ましくは0.01〜１重量％のレベルで使用される。
【０１８６】
他の成分：洗剤組成物に使用される他の成分、例えば土壌−沈殿防止剤、土壌−開放剤、蛍光増白剤、研磨剤、殺菌剤、曇り抑制剤、着色剤、及び/又は封入された又は封入されていない香料が使用され得る。
特に適切な封入材料は、イギリス特許第1,464,616号に記載されるような、多糖及びポリヒドロキシ化合物のマトリックスから成る水溶性カプセルである。
【０１８７】
他の適切な水溶性封入材料は、アメリカ特許第3,455,838号に記載されるような、置換ジカルボン酸のゲル化されていないスターチ酸エステルに由来するデキストリンを含んで成る。それらの酸−エステルデキストリンは、好ましくは、モチ状トウモロコシ、モチ状モロコシ、サゴ、タピオカ及びジャガイモのようなスターチから調製される。前記封入材料の適切な例は、National Starchにより製造されるN−Lokを包含する。N-Lok封入材料は、変性されたトウモロコシスターチ及びグルコースから成る。スターチは、一官能価置換された基、例えばオクテニル無水琥珀酸を添加することによって変性される。
【０１８８】
本発明において適切な再付着防止剤及び土壌沈殿防止剤は、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース、及びホモ−又はコ−ポリマーポリカルボン酸又はそれらの塩を包含する。このタイプのポリマーは、ビルダーとして前に言及された、ポリアクリレート及び無水マレイン酸−アクリル酸コポリマー、及びエチレン、メチルビニルエーテル又はメタクリル酸と無水マレイン酸とのコポリマー（前記無水マレイン酸は、コポリマーの少なくとも20％モル％を構成する）を包含する。それらの材料は通常、組成物の0.5〜10重量％より好ましくは0.75〜８重量％、最も好ましくは１〜６重量％のレベルで使用される。
【０１８９】
好ましい蛍光増白剤は、特徴的にはアニオン性であり、それらの例としては、次のものを列挙することができる：二ナトリウム４，４’−ビス−（２−ジエタノールアミノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート；ニナトリウム４，４’−ビス−（２−モルホリノ−４−アニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ−スチルベン−２：２’−ジスルホネート；二ナトリウム４，４’−ビス−（２，４−ジアニリノ−s−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２：２’−ジスルホネート；一ナトリウム４’，４”−ビス−（２，４−ジアニリノ−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２−スルホネート；二ナトリウム４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（N−メチル−N−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２,２’−ジスルホネ−ト；二ナトリウム４，４’−ビス−（４−フェニル−２，１，３−トリアゾール−２−イル）スチルベン−２，２’−ジスルホネ−ト；二ナトリウム４，４’−ビス−（２−アニリノ−４−（１−メチル−２−ヒドロキシエチルアミノ）−ｓ−トリアジン−６−イルアミノ）スチルベン−２，２’−ジスルホネート；ナトリウム−２−（スチルビル−４”−（ナフト−１’, ２’：４，５）−１，２，３−トリアゾール−２”−スルホネート；４，４’−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニル。
【０１９０】
他の有用なポリマー材料は、ポリエチレングリコール、特に1,000〜10,000の分子量、より特定には2,000〜8,000の分子量及び最も特定には、約4,000の分子量のものである。それらは、0.20〜５重量％、より好ましくは0.25〜2.5重量％のレベルで使用される。それらのポリマー及び前記のホモ−又はコ−ポリマー性ポリカルボキシレート塩は、白色度の維持、布への灰の付着、及び遷移金属不純物の存在下での、粘土、タンパク質性及び酸化性土壌に対して清浄性能を改良するために価値あるものである。
【０１９１】
本発明の組成物において有用な土壌開放剤は従来、種々の割合でのエチレングリコール及び/又はプロピレングリコール単位とテレフタル酸とのコポリマー又はターポリマーである。そのようなポリマーの例は、アメリカ特許第4,116,885号及び第4,711,730号、及びヨーロッパ特許第0272033号に開示される。ヨーロッパ特許第0272033号による特に好ましいポリマーは、下記式：
(CH3(PEG)43)0.75(POH)0.25[(T-PO)2.8(T-PEG)0.4]T(POH)0.25((PEG)43CH3)0.75
［式中、PEGは-(OC2H4)O-であり、POは（OC3H6O）であり、そしてTは（pOOC6H4CO）である］を有する。
【０１９２】
ジメチルテレフタレート、ジメチルスルホイソフタレート、エチレングリコール及び１，２−プロパンジオールのランダムコポリコーのごとき変性されたポリエステルがまた、非常に有用であり、ここで末端基は、第１に、スルホルベンゾエート及び第２に、エチレングリコール及び/又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成る。目的は、“主に”、スルホベンゾエート基により両端でキャップされたポリマーを得ることであり、本明細書においては、本明細書における前記コポリマーのほとんどは、スルホベンゾエート基によりキャップされるであろう。しかしながら、いくつかのコポリマーは十分にはキャップされず、そして従って、それらの末端基はエチレングリコール及び/又は１，２−プロパンジオールのモノエステルから成り、従って、第２に、そのような種から成ることができる。
【０１９３】
本明細書における選択されたポリエステルは、約46重量％のジメチルテレフタル酸、約16重量％の１，２−プロパンジオール、約10重量％のエチレングリコール、約13重量％のジメチルスルホ安息香酸及び約15重量％のスルホイソフタル酸を含み、そして約3,000の分子量を有する。ポリエステル及びそれらの調製方法は、ヨーロッパ特許第311342号に記載されている。
【０１９４】
軟化剤：布軟化剤もまた、本発明に従って、洗濯洗剤組成物中に導入され得る。それらの剤は、無機又は有機型のものであり得る。無機軟化剤は、GB-A-１ 400898号及びアメリカ特許第5,019,292号に開示されるスメクタイトクレー（smectite clays）により例示される。有機布軟化剤は、GB-A1 514276号及びヨーロッパ特許第0011340号に開示されるように水不溶性第三アミンを含み、そしてモノC12-C14第四アンモニウム塩とのそれらの組み合わせがEP-B-0026528号に開示されており、そして前記剤は、ヨーロッパ特許第0242919号に開示されるように２つの長鎖アミドを含む。布軟化システムの他の有用な有機成分は、ヨーロッパ特許第0299575号及び第0313146号に開示されるように高分子量ポリ酸化エチレン材料を含む。
【０１９５】
スメクタイトクレーのレベルは通常、５〜15重量％、より好ましくは８〜12重量％の範囲であり、そして前記材料は配合物の残りに混合された乾燥成分として添加される。有機布軟化剤、例えば水不溶性第三アミン又は２つの長鎖アミド材料は、0.5〜５重量％、通常１〜３重量％のレベルで導入され、そして高分子量ポリ酸化エチレン材料及び水溶性カチオン性材料は、0.1〜２重量％、通常0.15〜1.5重量％のレベルで添加される。それらの材料は通常、組成物の噴霧乾燥された部分に添加されるが、但し多くの場合、それは乾燥混合された粒質物としてそれらを添加し、又は組成物の他の固体成分上に溶融された液体としてそれらを噴霧することがより便利であり得る。
【０１９６】
ポリマー染料−移行阻害剤：本発明の洗剤組成物はまた、0.001〜10重量％、好ましくは0.01〜2重量％、より好ましくは0.05〜1重量％のポリマー染料−移行阻害剤を含んで成る。前記ポリマー染料−移行阻害剤は通常、染色された布からそれにより洗浄された布上への染料の移行を阻害するために洗剤組成物に組込まれる。それらのポリマーは、染料が洗浄において他の製品に結合するようになる機会を有する前、染色された布から洗浄される不安定染料を複合体化するか又は吸収する能力を有する。
【０１９７】
特に適切なポリマー染料−移行阻害剤は、ポリアミンN−オキシドポリマー、N−ビニル−ピロリドン及びN−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はそれらの混合物である。
そのようなポリマーの添加はまた、本発明の酵素の性能を高める。
本発明の洗剤組成物は、液体、ペースト、ゲル、棒状又は顆粒形で存在することができる。
【０１９８】
非−ダスチング粒質物は、アメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号（両者共Novo Industri A/Sによる）に開示のようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。蝋被覆材料の例は、1000〜20,000の平均モル重量を有するポリ（酸化エチレン）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50の酸化エチレン単位を有する、エトキシル化されたノニルフェノール；12〜20個の炭素原子を有するアルコールを有し、そして15〜80の酸化エチレン単位を有する、エトキシ化された脂肪アルコール；脂肪アルコール、脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。流動層技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。
【０１９９】
本発明の顆粒組成物はまた、“圧縮形”でも存在することができ、すなわちそれらは従来の顆粒洗剤よりも比較的高い密度、すなわち550〜950g/lを有し；そのような場合、本発明の顆粒洗剤組成物は、従来の顆粒洗剤に比較して、低い量の“無機充填剤塩”を含み；典型的な充填剤塩は硫酸及び塩酸のアルカリ土類金属塩、典型的には硫酸ナトリウムであり；“圧縮”洗剤は典型的には、10％以下の充填剤塩を含んで成る。本発明の液体組成物はまた、“濃縮された形”でも存在することができ、そのような場合、本発明の液体洗剤組成物は、従来の液体洗剤に比較して、低い量の水を含むであろう。典型的には、濃縮された液体洗剤の水含有率は、30重量％以下、より好ましくは20重量％以下、より好ましくは10重量％以下で洗剤組成物に存在する。
【０２００】
本発明の組成物は、例えば手動及び機械用洗濯洗剤組成物、例えば染色された布の前処理への使用のために適切な洗濯用添加剤組成物、すすぎ添加用布ソフトナー組成物、及び一般的な家庭用硬質表面清浄操作及び皿洗い操作への使用のための組成物として配合され得る。
次の例は、本発明の組成物を例示するためであって、本発明の範囲を制限するものではない。
【０２０１】
洗剤組成物においては、簡略された成分同定は次の意味を有する：
LAS：ナトリウム線状C12アルキルベンゼンスルホネート；
TAS：ナトリウム牛脂アルキルスルフェート；
XYAS：ナトリウムC1X−C1Yアルキルスルフェート；
SS：２−ブチルオクタン酸の第二石鹸界面活性剤；
25EY：平均Yモルの酸化エチレンにより縮合されたC12−C15主要線状第１アルコール；
45EY：平均Yモルの酸化エチレンにより縮合されたC14−C15主要線状第１アルコール：
XYEZS：モル当たり平均Zモルの酸化エチレンにより縮合されたC1X−C1Yナトリウムアルカリスルフェ−ト；
非イオン性：平均3.8の程度のエトキシル化及び平均4.5の程度のプロポキシル化を有する、商標Plurafax LF404としてBASF GmbHから市販されている、C13−C15の混合されたエトキシル化/プロポキシル化脂肪アルコール；
【０２０２】
CFAA：C12−C14のアルキルN−メチルグルカミド；
TFAA：C16−C18のアルキルN−メチルグルカミド；
珪酸塩：非晶性珪酸ナトリウム（SiO2：Na2Oの比＝2.0）；
NaSKS−６：δ−Na2Si2O5の結晶性積層珪酸塩；
炭酸塩：非晶性炭酸ナトリウム；
リン酸塩：トリポリリン酸ナトリウム；
MA/AA：約80,000の分子量を有する１：４のマレイン酸：アクリル酸のコポリマー；
ポリアクリレート：BASF GmbHにより商品名PA30として市販されている、平均8,000の分子量を有するポリアクリレートホモポリマー；
ゼオライトA：１〜20μmの主粒子サイズを有する、Na12(AlO2SiO2)12・27H2Oの水和化されたアルミノ珪酸ナトリウム；
【０２０３】
クエン酸塩：クエン酸三ナトリウム・２水和物；
クエン酸：クエン酸；
過硼酸塩：実験式NaBO2・H2Oを有する非晶性過硼酸ナトリウム・１水和物漂白剤；
PB4：非晶性過硼酸ナトリウム・４水和物；
過炭酸塩：実験式2Na2CO3・3H2Oを有する非晶性過炭酸ナトリウム漂白剤；
TAED：テトラ−アセチルエチレンジアミン；
CMC：ナトリウムカルボキシルメチルセルロース；
DETPMP：Monsantoにより商品名Dequest2060として市販されているジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）；
【０２０４】
PVP：ポリビニルピロリドンポリマー；
EDDS：アトリウム塩の形でのエチレンジアミン−N, N’−二琥珀酸［S, S］異性体；
石鹸の泡抑制剤：25％パラフィンワックス、融点50℃、17％疎水性シリカ；58％パラフィン油；
粒質形での石鹸の泡抑制剤：12%シリコーン/シリカ、18%ステアリルアルコール、70%粒質形での澱粉；
硫酸塩：非晶性硫酸ナトリウム；
HMWPEO：高分子量ポリ酸化エチレン；
TAE25：牛脂アルコールエトキシレート（25）。
【０２０５】
洗剤例I：
本発明の粒状布清浄組成物を次の通りに調製することができる：
【表６】
2005525118.tif 000011
【０２０６】
洗剤例II：
本発明の圧縮粒状布清浄組成物（密度800g/l）を次の通りに調製することができる：
【表７】
2005525118.tif 000012
【０２０７】
洗剤例III：
着色された布の洗濯において特に有用である本発明の粒状布清浄組成物を次の通りに調製した：
【表８】
2005525118.tif 000013
【０２０８】
洗剤例IV：
“洗浄を通して軟化する"能力を付与する本発明の粒状布清浄組成物を次の通りに調製した：
【表９】
2005525118.tif 000014
【０２０９】
洗剤例V：
本発明の重質液体布清浄組成物を次の通りにして調製することができる：
【表１０】
2005525118.tif 000015
【０２１０】
例１．液体洗剤におけるペクチン酸リアーゼの安定性の測定：
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の洗剤安定性を、下記に記載される酵素−洗剤混合物のインキュベーションの後、変異体の活性を測定することにより評価する。
残留活性アッセイ：
30μlの酵素溶液（培養物上清液又は精製された酵素）を、２本のサンプル管において、1mlの典型的なヨーロッパ又はUS重質液体洗剤と共に混合する。１本の管を氷上で貯蔵し、そして他の管を40℃で90分間、インキュベートする。対照として、30μlの水を１mlの洗剤と共に混合し、そして氷上でインキュベートする。インキュベーションの後、9mlの氷−冷却された水をサンプルに添加し、これを激しく混合し、そしてさらなる分析まで、氷上で貯蔵する。
【０２１１】
酵素活性を、まず50μlの酵素−洗剤混合物と5mlのアッセイ緩衝液（100mMのトリス−HCl、0.68mMのCaCl2、pH8.0）と共に混合し、次に、この溶液75μlを、75μlの新しく調製された基質溶液（アッセイ緩衝液中、１％のポリガラクツロン酸）と共に混合し、そして40℃で10分間インキュベートすることにより、測定する。次に、100μlの前記インキュベーション混合物を、UV−透過性マイクロタイタープレートにおける100μlの停止−緩衝液（40mMのH3PO4）中に添加し、そして235nmでの吸光度を分光計により測定する。水−洗剤サンプルを用いて、分光計をゼロにする。
【０２１２】
残留活性を、氷上に貯蔵されたサンプルにおける活性に対して、40℃で90分間インキュベートされたサンプルにおける活性（A235吸光度）として計算する：
残留活性（RA）＝吸光度[40℃でインキュベートされたサンプル]/吸光度[0℃でインキュベートされたアンプル]×100
【０２１３】
従って、残留活性は、酵素の洗剤安定性に等しい。表１１〜表１５は、典型的なヨーロッパ重質液体洗剤においてインキュベートされた、配列番号２のペクチン酸リアーゼの多くの置換の改良された残留活性を列挙する。置換の大部分は、配列番号２で示されるような親ペクチン酸リアーゼに比較して、洗剤安定性の50％以上の改良性を生ぜしめる。同様に、表１６に列挙される配列番号２のペクチン酸リアーゼの置換は、典型的なUS重質液体洗剤においてインキュベートされる場合、酵素の安定性を有意に改良する。
【０２１４】
【表１１】
2005525118.tif 000016
【表１２】
2005525118.tif 000017
【表１３】
2005525118.tif 000018
【表１４】
2005525118.tif 000019
【表１５】
2005525118.tif 000020
【０２１５】
【表１６】
2005525118.tif 000021
【０２１６】
例２．延長されたインキュベーションの後、液体洗剤におけるペクチン酸リアーゼの安定性：
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の洗剤安定性を、下記に記載される酵素−洗剤混合物のインキュベーションの後、変異体の活性を測定することにより評価する。
【０２１７】
残留活性アッセイ：
30μlの酵素溶液（培養物上清液又は精製された酵素）を、２本のサンプル管において、1mlの典型的なヨーロッパ重質液体洗剤と共に混合する。１本の管を氷上で貯蔵し、そして他の管を40℃で18〜24時間、インキュベートする。対照として、30μlの水を１mlの洗剤と共に混合し、そして氷上でインキュベートする。インキュベーションの後、9mlの氷−冷却された水をサンプルに添加し、これを激しく混合し、そしてさらなる分析まで、氷上で貯蔵する。
【０２１８】
酵素活性を、まず50μlの酵素−洗剤混合物と5mlのアッセイ緩衝液（100mMのトリス−HCl、0.68mMのCaCl2、pH8.0）と共に混合し、次に、この溶液75μlを、75μlの新しく調製された基質溶液（アッセイ緩衝液中、１％のポリガラクツロン酸）と共に混合し、そして40℃で10分間インキュベートすることにより、測定する。次に、100μlの前記インキュベーション混合物を、UV−透過性マイクロタイタープレートにおける100μlの停止−緩衝液（40mMのH3PO4）中に添加し、そして235nmでの吸光度を分光計により測定する。水−洗剤サンプルを用いて、分光計をゼロにする。
【０２１９】
残留活性を、氷上に貯蔵されたサンプルにおける活性に対して、40℃で90分間インキュベートされたサンプルにおける活性（A235吸光度）として計算する：
残留活性（RA）＝吸光度[40℃でインキュベートされたサンプル]/吸光度[0℃でインキュベートされたアンプル]×100
従って、残留活性は、酵素の洗剤安定性に等しい。表１７は、典型的なヨーロッパ重質液体洗剤において18時間インキュベートされた、配列番号２のペクチン酸リアーゼの多くの置換の改良された残留活性を列挙する。同様に、表１８は、ヨーロッパ重質液体洗剤における18時間のインキュベーションの後に測定される、高められた残留活性を生ぜしめる。
【０２２０】
【表１７】
2005525118.tif 000022
【０２２１】
【表１８】
2005525118.tif 000023
【０２２２】
例３．ペクチン酸リアーゼ野生型及び変異体に対するDSC：
本発明のペクチン酸リアーゼ変異体の熱安定性を、示差走査熱量計（DSC）により測定した。この実験を、緩衝液（洗剤に対するものとして）において行った。精製された酵素サンプルを、10kDaの切断されたSlide−A−Lyzers (Pierce, USA) 中、SLの20mMのHEPES緩衝液、0.68mMのCaCl2、pH8.0に対して２度、透析し、そしてYM 10kDa Centricon Cells (Amicon)においてBiofuge Stratos (Kendro, Germany) を用いて、2,400gの遠心分離により約10mg/mlに濃縮した。DSCを、５〜110℃で1℃/分のグラジエントを用いて、MCS4100（Calorimetry Sciences Corporation, USA）において行い、そしてデータを、CpCalc 2.1ソフトウェア（Applied Thermodynamics, UsA）により分析した。
【０２２３】
【表１９】
2005525118.tif 000024
すべての変異体は、親CLAIMSに比較して、熱的に安定されていることが示されている。
【配列表】
2005525118000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月20日(2005.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペクチン酸リアーゼ活性（EC4, 2, 2, 2）を有し、そして次の位置番号：5,9, 11,26, 28,30, 31,37, 40,45, 46,47, 48,49, 50,51, 52,54, 61,64, 68,69, 70, 71,74, 75,76, 79,86, 87,91, 99,105, 106,107, 111,115, 116,118, 122,123, 134,136, 139, 140,141, 146,148, 156,158, 170,182, 185,186, 189,193, 194,196, 199,201, 202,204, 213,215, 218,224, 228,229, 234,235, 237,251, 256,257, 258,272, 277,286, 295,298, 301,302, 303,305, 307,308, 314,316, 323,324, 326,331, 332,333, 334,335, 336,337, 338,339, 340,341, 349,356, 357,363, 366,378, 381,384, 386,387, 389,390, 391,393 及び 397から成る群から選択された１又は複数の位置での変更を含んで成る、親酵素に比較して改良された洗剤安定性を有する親酵素の変異体であって、ここで前記変更が独立して、
（ｉ）前記位置を支配するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を支配するアミノ酸の欠失、又は
（iii）前記位置を支配するアミノ酸の異なったアミノ酸による置換、
であり、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応し、そして前記親酵素が配列番号２で示されるペクチン酸リアーゼ又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも65％の同一性を有するペクチン酸リアーゼであることを特徴とする変異体。
【請求項２】
前記変更が置換である請求項１記載の変異体。
【請求項３】
下記：
H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69*, L70*, K71*, K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N, K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V123I, S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A228I, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y, R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, I336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, I357V, N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S387A, V389I, I390N, I390T, S391N, A393V 及び K397Dから成る群から選択された１又は複数の置換を含んで成り、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応する請求項１又は２記載の変異体。
【請求項４】
前記親ペクチン酸リアーゼが、配列番号２のアミノ酸配列に対して、少なくとも約70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも約90％、さらにより好ましくは、少なくとも約95％及び最も好ましくは少なくとも約97％の程度の同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項１〜３のいずれか１項記載の変異体。
【請求項５】
前記親ペクチン酸リパーゼが、配列番号１のポリヌクレオチド又はその相補的鎖と、中位の、より好ましくは高い緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体。
【請求項６】
前記変更が、ランダム又は特定部位の突然変異誘発により、又は配列番号２に対して少なくとも65％の同一性を有する、ペクチン酸アリーゼをコードする１又は複数のDNA配列のシャフリングにより導入される請求項１〜５のいずれか１項記載の変異体。
【請求項７】
前記親ペクチン酸リアーゼが、野生型ペクチン酸リアーゼである請求項１〜６のいずれか１項記載の変異体。
【請求項８】
前記親ペクチン酸リアーゼが、バチルス（Bacillus）ペクチン酸リアーゼである請求項１〜７のいずれか１項記載の変異体。
【請求項９】
前記親ペクチン酸リアーゼが、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）DSM 14218株のプラスミドに存在するポリヌクレオチドによりコードされる請求項１〜８のいずれか１項記載の変異体。
【請求項１０】
前記変更の合計数が、13、好ましくは12、より好ましくは11、さらにより好ましくは10、さらにより好ましくは９、さらにより好ましくは８、さらにより好ましくは７、さらにより好ましくは６、さらにより好ましくは５、さらにより好ましくは４、さらにより好ましくは３、さらにより好ましくは２、及び最も好ましくは１である請求項１〜９のいずれか１項記載の変異体。
【請求項１１】
請求項１〜10のいずれか1項記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項11記載のポリヌクレオチドを含んで成る発現ベクター。
【請求項１３】
請求項12記載の発現ベクターにより形質転換された微生物宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、細菌、好ましくはバチルス、より好ましくはバチルス・サブチリスである請求項13記載の微生物宿主細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、菌類又は酵母、好ましくは糸状菌、最も好ましくはアスペルギラス（Aspergillus）である請求項13記載の微生物宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜10のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体の生成方法であって、請求項13〜15のいずれか1項記載の微生物宿主細胞が、変異体の発現及び選択の助けとなる条件下で培養され、そして前記変異体が回収されることを含んで成る方法。
【請求項１７】
ペクチン酸リアーゼの洗剤安定性の改良方法であって、次の位置番号：5,9, 11,26, 28,30, 31,37, 40,45, 46,47, 48,49, 50,51, 52,54, 61,64, 68,69, 70, 71,74, 75,76, 79,86, 87,91, 99,105, 106,107, 111,115, 116,118, 122,123, 134,136, 139, 140,141, 146,148, 156,158, 170,182, 185,186, 189,193, 194,196, 199,201, 202,204, 213,215, 218,224, 228,229, 234,235, 237,251, 256,257, 258,272, 277,286, 295,298, 301,302, 303,305, 307,308, 314,316, 323,324, 326,331, 332,333, 334,335, 336,337, 338,339, 340,341, 349,356, 357,363, 366,378, 381,384, 386,387, 389,390, 391,393 及び 397から成る群から選択された１又は複数の位置の変更を含んで成り、ここで前記変更が独立して、
（ｉ）前記位置を支配するアミノ酸の下流へのアミノ酸の挿入、
（ii）前記位置を支配するアミノ酸の欠失、又は
（iii）前記位置を支配するアミノ酸の異なったアミノ酸による置換、
であり、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応し、そして前記親酵素が配列番号２で示されるペクチン酸リアーゼ又は配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも65％の同一性を有するペクチン酸リアーゼであることを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記変更が置換である請求項17記載の方法。
【請求項１９】
下記：
H5R, E9G, N11Y, K26Q, S28T, S30F, S30P, S30T, H31N, N37D, Q40E, L45V, G46D, K47N, K47R, D48E, D48P, T49P, N50D, N50L, N50Y, N51Y, T52M, K54V, T61A, M64F, D68*, N69*, L70*, K71*, K71E, G74D, L75A, L75P, N76D, K79A, D86N, K87A, K87E, A91E, K99I, K99N, K99R, T105A, T105P, L106Q, E107K, A111E, K115A, K115I, K115N, K115Q, N116D, K118A, K118E, M122E, M122K, M122N, M122Q, V123I, S134L, T136S, K139E, K139F, K139I, K139M, K139N, K139S, I140V, V141G, V141E, V141L, V141N, Q146F, Q146H, Q146I, Q146V, K148E, K148Q, N156S, E158N, D170N, Q182D, Q182E, N185H, N186H, N189D, H193Y, I194V, I196V, C199N, C199S, F201L, N202K, G204R, K213E, K213N, K213T, F215Y, K218E, K218L, K218P, G224S, A228I, S229T, Y234H, I235V, M237I, F251I, S256C, K257E, K257N, T258I, L286Y, R272C, R272H, R272Y, V277D, G286A, Y295H, S298N, S301Y, S302A, D303S, A305P, S307R, Y308S, K314N, S316F, N323M, V324A, D326N, S331P, S331T, A332P, A333E, K334E, T335S, T335R, I336S, S337C, S337K, S337L, S337R, V338E, V338Y, F339I, S340A, S340K, S340N, S340P, S340Q, G341S, G349R, Q356H, I357V, N363S, S366N, T378G, T378S, A381D, H384N, K386P, K386R, S387A, V389I, I390N, I390T, S391N, A393V 及び K397Dから成る群から選択された１又は複数の置換を含んで成り、そして個々の位置が配列番号２のアミノ酸配列を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列の位置に対応する請求項17又は18記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜10のいずれか１項記載の変異体及び界面活性剤を含んで成る、洗剤又は洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い組成物。
【請求項２１】
さらに、セルラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、オキシドレダクターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、ヘミセルラーゼ、例えばマンナナーゼ、キシラナーゼ、ガラクタナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、リケナーゼ、アラビナナーゼ、もう１つのペクチン酸リアーゼ又はその混合物を含んで成る請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
洗剤組成物、好ましくは洗濯又は皿洗い洗剤への請求項１〜10のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体の使用。
【請求項２３】
布及びセルロース繊維の加工への請求項１〜10のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体の使用。
【請求項２４】
請求項１〜10のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体と細胞壁材料とを接触することを含んで成る酵素精錬方法。
【請求項２５】
請求項１〜10のいずれか１項記載のペクチン酸リアーゼ変異体と布とを接触することを含んで成る、布からの細胞壁材料の酵素的除去方法。
【請求項２６】
ペクチン酸リアーゼ活性（EC4.2.2.2）を有する、親酵素に比較して改良された洗剤安定性を有する親酵素の変異体であって、前記酵素の全体的電荷がより陰性にされていることを特徴とする変異体。
【請求項２７】
ペクチン酸リアーゼ活性（EC4.2.2.2）を有する、親酵素に比較して改良された洗剤安定性を有する親酵素の変異体であって、前記変異体の酸化不安定アミノ酸残基が置換されていることを特徴とする変異体。
【請求項２８】
ペクチン酸リアーゼ活性（EC4.2.2.2）を有する、親酵素に比較して改良された洗剤安定性を有する親酵素の変異体であって、前記変異体のより柔軟なアミノ酸残基が低柔軟性アミノ酸残基により置換されていることを特徴とする変異体。
【請求項２９】
改良されたカルシウム消耗安定性を有する、ペクチン酸リアーゼ活性（EC4.2.2.2）を
有する、親酵素に比較して改良された洗剤安定性を有する親酵素の変異体。
【国際調査報告】
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2005525118.tif 000027
2005525118.tif 000028
2005525118.tif 000029