(57)【要約】本発明は、膜内のイオンチャネルおよびレセプターを研究するための装置および方法に関し、特に、コネキシンまたはインネキシンを用いて生体細胞のコレクション上で同時電気生理学的測定を実行するための装置および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気的測定機器（１）、電極（２）、コネキシンまたはイネキシン（４）を含有する膜（３）、および同様にコネキシンまたはイネキシン（６）を含有する膜体（５）を含有し、膜体上の電気信号を測定するための測定器具であって、膜体から離れて対向する膜側から膜体の内部までの電気的導通アクセス(conducting access)が、ギャップジャンクションチャネル（７）によって作られていることを特徴とする測定器具。
【請求項２】
生体の膜体上で電気信号を測定する方法であって、請求項１に記載の測定器具を用いることを特徴とする方法。
【請求項３】
測定される電気信号が、
（ｉ）      膜体の膜電位；
（ｉｉ）    膜全体に流れる電流；および／または
（ｉｉｉ）  膜の電気容量
である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
レセプターおよび／またはイオンチャネル（８）の特性に影響する有効物質を同定する方法であって、
（ｉ）      上記レセプターおよび／またはイオンチャネルを含有する少なくとも１の膜体（５）を少なくとも１の試験物質に接触させ；次いで、
（ｉｉ）    請求項１に記載の測定器具を用いて、少なくとも１の電気信号を膜体または複数の膜体上で測定する
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
膜体内へまたは膜体から物質を移動させる方法であって、前記物質がギャップジャンクションチャネルを通って膜体に進入するか、または膜体を退出し、前記物質の移動が濃度勾配、電圧差または圧力差によって駆動されることを特徴とする方法。
【請求項６】
膜が支持二重層として構成される請求項１に記載の測定器具。
【請求項７】
前記膜が脂質適合ポリマー中間膜を備えたシリカゲル基板上の支持二重層、すなわち、「束縛二重層」として構成される請求項６に記載の測定器具。
【請求項８】
物質の検出用のバイオセンサーとしての請求項１に記載の測定器具の使用。
【請求項９】
細胞培養中の生きている細胞の成長のための、前記細胞の電気的活性をモニターする設備を備えた基板としてのコネキシン−ドープ膜の使用。
【請求項１０】
膜が生きている細胞の形態であることを特徴とする請求項１に記載の測定器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜内のイオンチャネルおよびレセプターを研究するための装置および方法に関し、特に、コネキシンまたはインネキシンを用いて生体細胞のコレクション上で同時電気生理学的測定を実行するための装置および方法に関する。
に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．電気生理学的測定
イオンチャネルおよびレセプターの電気活性を研究するための様々な方法が当業者に知られている。
前世紀の５０年代、生体細胞の膜内のイオンチャネルおよびレセプターの活性を定量するための正確で信頼性のある方法として、電圧クランプ法が確立された［１、２］。この場合、研究すべき細胞を２つのマイクロ電極、すなわち、一気に引き延ばされ、塩溶液で満たされたガラスキャピラリーに接触させる。ひとつの電極は細胞内部の電位、すなわち、細胞膜を横断する電圧降下を測定する。もうひとつの電極は細胞膜と通過する電気的に調整された電流フローを発生させるために用いられる。電圧クランプ装置では、この電流フローを調整して、細胞膜全体で電位が一定になるようにする（それゆえ、「電圧クランプ」という）。それで、膜を通って流れる電流のサイズは、細胞膜内のレセプターによって直接的または間接的に活性化される細胞膜にあるイオンチャネルの活動に対する直接的であり非常に正確かつ適切な指標である。
あるいは、「電流クランプ」法において、電流をしばしばゼロの固定値に設定し、次いで任意に設定した膜電圧を測定する（無電流測定の場合には、たった一つのマイクロ電極しか必要ない）。そのため、電圧の値は細胞内にあるレセプターおよびチャネルの活性を反映するが、この装置は電圧クランプ法ほど情報量がなく、正確でもない。なぜならば、電流クランプ装置においてはレセプターの活性と実測電圧信号との関係は通常線形でなく、一方、電圧クランプ装置において、実測電流信号と開放イオンチャネルの数とは正比例するからである。
従来の電気生理学的電圧クランプ法および電流クランプ法の欠点は、それらが非常に大きな細胞、例えば、イカの神経突起、筋肉細胞またはカエル卵細胞にしか適さないことである。電気生理学的実験の対象となり得る全ての細胞（例えば、神経細胞、内分泌細胞、ある種の培養細胞）のうちほとんどが非常に小さくて、この方法には使用できない。もうひとつの欠点は、全ての電気生理学的測定と同様に、この方法は非常に複雑であり、経験のある技術者によって手動で行わなければならず、そのため、一日にわずかな実験しか行えず、工業的有効物質調査（「高スループットスクリーニング(high throughput screening)」またはＨＴＳ）が排除されてしまう。
【０００３】
細胞膜内のイオンチャネルの開閉メカニズムを研究するためのもう一つの公知な方法は、パッチクランプ法であり、それはネーアー(Neher)およびザクマン(Sakmann)によって７０年代半ばに開発された［３、４］。この方法は、電気生理学において以前制約のあった大型細胞への限定を解消した。電解質充填ガラスキャピラリーやピペットを挿入せず、その代わり、細胞膜上に慎重に置いて、わずかに吸引する。これは、通常、極度に高いインピーダンス、ピペット先端と細胞膜との間の電気的に密接な結合、いわゆるギガシールの原因となる。それは、小さな膜スポット、「パッチ」を細胞表面の残りの部分から隔絶し、それで、このパッチ内の個々のイオンチャネルを電気的に観察することを可能にした。この「パッチ」をさらに吸い出す、すなわち、電気的に除去することによって、細胞に損傷を与えたりさらには破壊したりせずに、細胞内部への高品位の電気的アクセスを生じ得る。
パッチクランプ法の欠点は、測定のための複雑な準備であり、経験のある電気生理学者でも一日に約２０測定しかできない。これは、現代の高スループット法の要求からするとかなり少ない。さらに、従来のパッチクランプ技術は相当な経験とかなりの手先の器用さを要求し、この理由により、自動化できる程度が限定される。
【０００４】
パッチクランプ法または別の匹敵する電気生理学的測定装置を自動化するか、並列化して、より高い測定スループットを可能とすることを意図する様々な研究グループと企業による仕事が知られている。これらのアプローチは次のように分類することができる：
【０００５】
（１）コンピュータ制御の下、複雑な手動操作ステップのいくつかまたは全てを機械で行うことによって、ガラスピペットを用いた以前のパッチクランプ法を自動化する。これらのアプローチのいくつかは将来性があり、実験者の負荷を軽減し、それゆえ、かなりの係数、例えば実行する測定数を１０倍も増大することができる。しかし、それらの全ては技術的に非常に困難であり費用がかかり、それらの達成可能なスループットは、依然として、ＨＴＳで必要な能力、好ましくは一日にあたり＞１０００００試験に届かない。
【０００６】
（２）パッチクランプピペットを平板すなわちミクロ構造基板に置き換えるコンセプトが開発された。例えば、これは、小さな穴が開けられた膜または薄膜であり得る［５、６、７］。その考えは、細胞がその穴に堆積し、パッチピペットの場合のギガシールのようなシールをそこに形成して、穴全体で細胞膜の同様の電気生理学的測定を可能とする。平板構成および基板中の複数の穴と平行に細胞を適用するという原理の可能性はＨＴＳ範囲まで測定スループットを増大させる。このタイプの様々なコンセプトが、異なる研究グループによって開発され、それらは、主に、基板が同時に試験物質等を輸送し、取り出すチャネルを含む複雑な構造の程度にまで、基板の材質の選択および穴の形状の複雑さを異にする。
【０００７】
これら全てのコンセプトに共通する局面は、それらが依然として実質的に解明されていないことである。いくつかの場合、細胞の堆積および封止が例示されているプロトタイプがある。それでも、パッチクランプ法に匹敵する品位でこのようにして電気生理学的開始が達成し得るか否かは疑問である。さらに、これらのコンセプトがＨＴＳ用に十分に自動化されまたは並列化し得るか否かは依然として全く不明である。
【０００８】
（３）一つの特別な技術がバイエル社(Bayer AG)によって開発され、それは現在ロイトリンゲンにあるＭＣＳによって市販されている［８、９］。ここでは、アフリカツメガエル卵母細胞が×９６マルチウェルプレートに保持され、自動的にｃＤＮＡが注入される。自動化電気生理学的電圧クランプ測定はこの装置でこれらの卵母細胞につき実施し得、これらの卵母細胞に発現されたレセプターまたはイオンチャネルは自動測定にとって利用し易い。したがって、測定スループットは約１０倍も増大する。しかし、この方法は、専らアフリカツメガエル卵母細胞のごとき大型細胞に制限され、大多数の標本を構成する小細胞には適さない。この装置の測定スループットは自動化パッチクランプ法と同程度であり、ＨＴＳに必要なスループットはこの方法では達成されない。アボット(Abbott)、アクソン(Axon)その他の企業もそのような方法の開発に取り組んでいる。
【０００９】
イオンチャネルおよびレセプターの電気的測定の当業者に知られているもうひとつの技術は、合成脂質膜への結合である［１０］。これらの方法は６０〜７０年代の初期に開発され、高い実験経費と結果の低い再現性を特徴とし、そのため、現在では、工業的有効物質調査の代替ではない。しかしながら、適当な基質による合成脂質膜の安定化して、それを機械的により強力にし、より長く保存ができ、より再現性があるようにするためのより最近のアプローチは、興味深い［１１］。そのような安定化合成膜についての電気的測定の必要条件は、同時に膜の両側に良好な電気的アクセスを可能とする適当な基板の選択である。ここで用いられる基板はシリカゲルであり、例えば、所望により、膜の安定性および流動性を向上させるためにポリマー内層を付与してしてもよい［１２］。基板上の二重層も適当な鎖状分子で安定化し得る（「束縛二重層」）［１３］。
【００１０】
これらの方法はいまだにＨＴＳの代わりにはならない。なぜならば、特に、これらの合成膜への機能的レセプターまたはイオンチャネルの結合はいまだ再現性よく行えず、多くのタイプのより複雑な膜レセプターには基本的に不可能なようである。それにもかかわらず、電気的測定はいくつかの非常に単純な膜タンパク質（グラミシジン、アラメチシン、メリチン、ヘモリシン）［１０］、いくつかのカルシウムチャネルおよび特にコネキシン［１４］を持つそのような合成膜について行い得る。
【００１１】
２．コネキシン、コネクソンおよびギャップジャンクション
生存細胞間のコミュニケーションに特別な役割を演じる生体タンパク分子、いわゆるコネキシンが当業者に知られている。いまでは、約１５種の異なるコネキシンをそれらのアミノ酸配列に基づき単離し得る［１５、１６］。コネキシンは全ての脊椎動物に発生し、通常、略号、例えば、Ｃｘ２６と呼ばれる。ここに、この数字はコネキシンのクロマトグラフィックサイズをｋＤで示す。現在まで、約２６ｋＤと５６ｋＤの間の分子量を有するコネキシンが知られている。これの代りとして、二番目に一般的な命名法があり、それは構造的特徴を補助として、コネキシンを少なくとも３つのクラスａ、ｂおよびｃに分類し、次いで、個々のクラスで対応するコネキシンに番号を付ける。
【００１２】
細胞膜において、それぞれ６つのコネキシンが組み合わさってコネクソンを形成する。コネクソンは細胞膜を貫通する環状構造であり、基本的に非常に広い非特異的イオンチャネルすなわち水充填孔を形成することができる。しかし、これらの孔は、コネクソンが単一の健康細胞上に位置している限り、通常閉鎖されている。しかしながら、膜内に互いに匹敵するコネクソンを有する２つの細胞が接触するとき、ギャップジャンクションチャネル（電気的シナプスともいう）が対向する細胞の２つのコネクソンの間に形成され、細胞膜間の長さに広がる。通常、ギャップジャンクションチャネルは、接触して数分間で形成される。形成されたギャップジャンクションチャネルは通常１２個の同一または異なるコネキシン、すなわち、２つのコネキシンからなる構造である。このチャネルは、ときに直径が約１．５ないし２ｎｍの閉鎖可能な中央孔を有する。他の膜チャネルとの本質的な違いは、ギャップジャンクションチャネルは２つの隣接する細胞膜を通り、それゆえ、細胞内部と外部媒体との間の連結の代わりに、２つの細胞の内部媒体間の連結を形成することにある。
【００１３】
そして、ギャップジャンクションチャネルは無機イオンおよび約１０００ダルトンの分子量までの小さな水溶性分子に、ある細胞の細胞質から他の細胞の細胞質への直接通路を提供する。それゆえ、２つの細胞は機械的、電気的および代謝学的に全てにより連結される。ギャップジャンクションチャネルは上皮細胞−細胞連結に属し、実際に全ての上皮および多くの他の組織型において見出される。一般的に、複数のギャップジャンクションチャネルは、場の形態で組織される。そのため、これらの構造は正式にはギャップジャンクションと呼ばれる。
【００１４】
連結細胞のギャップジャンクションチャネルは通常開放されていて、コネキシンが引き延ばされている。もし、細胞に、例えば、怪我によって外部から大量のカルシウムが流入すれば、近辺の細胞との連結は、協同的にやってくるコネキシンによって破壊される。
【００１５】
コネキシンはコネキシンを含有する細胞、例えば、水晶体、心筋、平滑筋または上皮細胞から細胞膜を精製することによって、ならびに、細菌、酵母そのたの細胞中でのコネキシンの遺伝子工学的発現によって、入手可能である。コネキシンはマーカー、例えば、蛍光性タンパク質フラグメントに結合して、細胞膜内におけるそれらの存在を簡単な光学方法によって検出し得るようにすることも知られている［１７］。
【００１６】
コネクソンを合成膜または他の無細胞系に導入できる方法が当該分野で知られている［１４］。しばしば、これらのコネクソンおよびギャップジャンクションチャネルは、依然として、それらの天然環境と同じ特性、例えば、孔径、イオン選択性、電気的挙動を有している。膜が接触すると、合成膜に結合され２つのコネクソン間に、機能的ギャップジャンクションチャネルも形成されることが知られている［１８］。
脊椎動物は、機能的に同じ分類の膜タンパク質を有していることも知られおり、それらはイネキシンとして知られている［１９］。しかしながら、それらで形成されたチャネルは２０００ダルトンまでの分子量の分子を通過させてしまうかなり大きな孔を有している。
ギャップジャンクションと同じ特性を有する連結が植物の細胞間でも同様に発生し、それらは、細胞間連結と呼ばれている。それらも近隣の細胞の中間細胞壁に広がり、同様に、細胞から細胞への限定数のイオンや小分子を通過させる。しかしながら、生体動物組織内のチャネルとは対象的に、細胞間連結は形質膜によって制限される。
【００１７】
【非特許文献１】Hodgkin, A.L., A.F. Huxley and B. Katz (1949). Ionic currents underlying activity in the giant axon of the squid. Arch. Sci. Physiol. 3, 129-150.
【非特許文献２】Hodgkin, A.L., A.F. Huxley and B. Katz (1949). Measurements of current-voltage relations in the membrane of the giant axon of Loligo. J. Physiol. (London) 117,500-544
【非特許文献３】Neher E. and B.Sakmann (1975) Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature 260, 779-802
【非特許文献４】Hamill, O.P., A. Marty, E. Neher, B. Sakmann and F.J. Sigworth (1981). Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pfluigers Archiv 391, 85-100
【非特許文献５】Sigworth, FJ and Klemic, KG (2002) Patch clamp on a chip. Biophys. J.82, 2831-2832
【非特許文献６】Fertig, N., Blick, R.H. and Behrends, J.C. (2002) Whole Cell Patch Clamp Recording Performed on a Planar Glass Chip. Biophys. J. 82, 3056-62
【非特許文献７】Rosat, J.-P., Brueggemann, A. and Schmidt, C. (2002) Patch-clamp on a chip-a reality. Analytica 2002 pp. 4-10
【非特許文献８】Schulz R, S. Bertrand, K. Chamaon, K.H. Smalla, E.D. Gundelfinger and D. Bertrand (2000) Neuronal nicotinic acetylcholine receptors from Drosophila: Two different types of a subunits coassemble within the same receptor complex. J. Neurochem. 74, 2537-2546
【非特許文献９】Decker K. und C. Methfessel (2002) Automatisierte elektrophysiologische Wirkstoffsuche. Laborpraxis/LabFuture, pp. 72-79
【非特許文献１０】Hanke, W. (1985) Reconstitution of Ion Channels. CRC Critical Reviews Biochemistry 19, 1-44
【非特許文献１１】Sackmann E. and Tanaka M. (2000) Supported Membranes on soft polymer cushions: fabrication, characterization and applications TIBTECH 18, 58-64
【非特許文献１２】Loidl-Stahlhofen, A., Schmitt, J., Noeller, J., Hartmann, T., Brodowsky, H., Schmitt, W. and Keldenich, J. (2001) Solid-Supported Biomolecules on Modified Silica Surfaces-A Tool for Fast Physicochemical Characterization and High-Throughput Screening. Advanced Materials 13, 1829-1834
【非特許文献１３】Raguse, B., Braach-Maksvytis, V.,Cornell, B. A., King, L. G., Osman, P. D. J., Pace, R. J. and Wieczorek, L.(1998). Tethered Lipid Bilayer Membranes: Formation, and Ionic Reservoir Characterization. Langmuir 14, 648-659
【非特許文献１４】Mazet, J. L., Jarry, Th., Gros, D. and Mazet F. (1992) Voltage Dependence of liver gap-junction channels reconstituted into liposomes and incorporated into planar bilayers. European Journal of Biochemistry 210,249-256
【非特許文献１５】Austin, C. D. (1993) The Connexins: A Family of Gap Junction Proteins. Einstein Quarterly Journal of Biology and Medicine 10,133-142
【非特許文献１６】Goodenough, D. A., J. A. Goliger, and D. L. Paul (1996) Connexins, Connexons, and intercellular communication. Annu. Rev. Biochem. 65: 475-502
【非特許文献１７】Jordan K., Solan J. L., Dominguez M., Sia M., Hand A., Lampe P. and Laird D. W. (1999) Trafficking, Assembly, and Function of a Connexin43-Green Fluorescent Protein Chimera in Live Mammalian Cells. Molecular Biology of the Cell 10, 2033-3050
【非特許文献１８】Brewer, G. J. (1991) Reconstitution of lens channels between two membranes. Chapter 19 in: Biophysics of Gap Junction Channels, Editor: C. Peracchia, CRC Press Boca Raton, Ann Arbor, Boston.
【非特許文献１９】Phelan, P. (2000) Gap Junction Communication in Invertebrates: The Innexin Gene Family. Current Topics in Membranes 49,389-422
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、膜体、好ましくは生体膜体の電気的測定を実施するための方法および装置に関する。これらの電気的測定は、状態および膜統合生体分子の挙動について、ならびに予想されるエフェクター分子に対する応答について結論を導き出すことを可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の装置は、少なくとも、電気的測定機器（１）、１または好ましくは２つの電極（２）および膜（３）、それらに結合されたイネキシン、コネキシンまたはコネクソンと同一または同様の特性を有する生体分子（４）を含有する。好ましくは、イネキシン、コネキシンまたはコネクソンは膜に融合される。この場合、同じ型のイネキシン、コネキシンまたはコネクソン、異なる型のイネキシン、コネキシンまたはコネクソンをそれぞれ膜に融合させることができる。
【００２０】
膜の各側に、好ましくは緩衝作用を有する電解液が存在する。生きている細胞の生存に必要な特性を有する液体は好ましくは膜の一方の側に用いる。これらは、例えば、適当な濃度および組成の塩、生理適合ｐＨ、および好まくは栄養素および／または適当な酸素濃度を含む。
【００２１】
これらの電極は、好ましくは、膜の各側になるように配置する。結合生体分子を持つ膜は、好ましくは、開口イオンチャネルの不存在下で高電気抵抗を有するように構成される。
【００２２】
本発明の装置は、膜体の電気的測定を実施するための本発明の方法に用いることができる。その目的のために、その膜がイネキシン、コネキシンまたはコネクソンと同一また同様の特性を有する生体分子をさらに含有する生体の膜体（５）が選択される。好ましくは、イネキシン、コネキシンまたはコネクソンは膜体の膜に融合される。
【００２３】
生きた細胞が本発明について特に好ましい膜体である。これらの細胞は好ましくはコネキシンまたはイネキシンを発現する。通常コネキシンまたはイネキシンを発現しない細胞を、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他の形態の適当な配列を移入することによって、または、他の方法で元から存在するコネキシンまたはイネキシンを結合することによって、遺伝学的に修飾して、所望のコネキシンまたはイネキシンを細胞膜に結合させ、好ましくは、他の細胞のコネキシンまたはイネキシンと全く同じようにそこで機能するようにさせることができる。適当な移入を好ましく選択する。研究されるレセプターまたはイオンチャネルのコネキシンおよび／またはイネキシンの発現が蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）の発現と連結されれば、蛍光分光分析によって適当な細胞を予め選択することが可能である。用いる細胞がすでにコネキシンを有していれば、もし適当であれば、これらを直接用いることができる。しかし、別の型のコネキシンを用いるつもりならば、細胞膜への内在コネキシンの結合は、適当なオリゴヌクレオチド（Ｃｘアンチセンスヌクレオチド）を添加によって一時的に抑制される。
【００２４】
膜（３）に、および膜体（５）に結合された生体分子の特別の特性のため、膜体は今や膜上ギャップジャンクション（７）上に好ましく堆積する。次いで形成されるこれらのギャップジャンクションは、膜体から離れた膜側から堆積膜体への電気的導通を構築する。
機能的ギャップジャンクションの検出は、電気的測定（二重電圧クランプ）または低分子量の染料（例えば、ルシファーイエロー）の移動の光学的観察により実施することができる。後者は、画像加工法により細胞全体の連結を評価することを可能にする。
【００２５】
本発明の膜体は、好ましくは、他の膜融合生体分子（８）（標的）を含有し、その特性は本発明の方法により研究し得る。これらの標的は、好ましくは、イオンチャネルまたはレセプターまたは他の生体分子であり、それは直接的または間接的に膜全体の電荷移動に影響する。
堆積膜体の膜全体の電荷移動および／または電位差は、今や、好ましく誘導され、２つの電極により定量され得る。
【００２６】
本発明の特に好ましい方法は、研究すべき膜融合生体分子（標的）上で物質が力を発揮する効果を調べることを含む。このように、モジュレータ（すなわち、標的のインヒビターおよびアクチベーター、ならびに当該標的の発現に影響するその他の物質）を同定することが可能である。
本発明は、本発明の方法によって同定された有効物質ならびにそれらの製造方法にも関する。
【００２７】
本発明の文脈において、「電気信号」とは、対象の系における、電荷、すなわち、電子、プロトンまたはイオンの分布に関連する物理量である。本発明の装置によって記録することができる電気信号の例は、電流強度、電気容量、または電位差、ならびに電荷およびこれらのパラメータの変動、例えば、作動電位である。
【００２８】
本発明の文脈において、「膜体」とは、液体で満たされ、かつ、膜で包まれた嵩のあるエレメントである。本発明の膜体は好ましくは生体の膜体、例えば、生きている細胞である。これは、分解（一次培養）によって生きている組織から単離された細胞を含む。それは、確立された細胞系統、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞ならびに過渡的にトランスフィクスされた(transfixed)細胞すなわち一次細胞として培養で維持されている細胞も含む。本発明の文脈において、生体の膜体とは、より人工的に作製された膜体であり、そこでは、例えば、脂質二重層が制限量の水性媒体を内包している（ベシクル）。したがって、これらの膜体は、好ましくは、少なくとも１の生体成分、例えば、脂質二重層に結合されたポリペプチド、膜融合酵素、イオンチャネルまたはＧ−タンパク質連結レセプターを含有する。本発明の文脈において生体の膜体は、細菌細胞、真菌細胞その他の単細胞または多細胞微生物の細胞も含であろう。本発明の文脈において生体の膜体は、例えば、周囲の細胞壁または類似の構造を除去することによって得られた真菌細胞または植物細胞の原形質でもある。本発明の文脈において生体の膜体は、さらに、生きている微生物の膜から切断または精製によって作製された膜体、例えば、シナプトソームであるか、または合成脂質ベシクルを有するそのような標本を精製することによって得られた膜体でもある。
【００２９】
本発明の文脈において、「電気的測定機器」とは、電気信号を記録し、光学的に定量することを可能にする装置である。
「膜電位」とは、膜の反対側との間の電位差である。
【００３０】
本発明の文脈において、「有効物質」とは、生体分子の活性に影響する物質である。本発明の文脈において、好ましい有効物質は、個々の生体分子または生体分子群の活性に特異的に影響するものである。特に好ましい有効物質はレセプターおよび／またはイオンチャネルの活性に影響するものである。
【００３１】
支持二重層は、その一方の側が適当な固体状、多孔質、またはゲル様物質に接触しているかまたはすぐ隣接している膜である。このことは、遊離状態膜と比較して、それらが機械的により強く、より荷重をかけられるようにする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、以下の項目に関する。
１．電気的測定機器（１）、電極（２）、コネキシンまたはイネキシン（４）を含有する膜（３）、および同様にコネキシンまたはイネキシン（６）を含有する膜体（５）を含有し、膜体上の電気信号を測定するための測定器具であって、膜体から離れて対向する膜側から膜体の内部までの電気的導通アクセス(conducting access)が、ギャップジャンクションチャネル（７）によって作られていることを特徴とする測定器具。
２．生体の膜体上の電気信号を測定する方法であって、項目１に記載の測定器具を用いることを特徴とする方法。
３．測定される電気信号が、
（ｉ）      膜体の膜電位；
（ｉｉ）    膜全体に流れる電流；および／または
（ｉｉｉ）  膜の電気容量
である項目２に記載の方法。
４．レセプターおよび／またはイオンチャネル（８）の特性に影響する有効物質を同定する方法であって、
（ｉ）      上記レセプターおよび／またはイオンチャネルを含有する少なくとも１の膜体（５）を少なくとも１の試験物質に接触させ；次いで、
（ｉｉ）    項目１に記載の測定器具を用いて、少なくとも１の電気信号を膜体または複数の膜体上で測定する
ことを特徴とする方法。
５．膜体内へまたは膜体から物質を移動させる方法であって、前記物質がギャップジャンクションチャネルを通って膜体に進入するか、または膜体を退出することを特徴とする方法。この場合、移動すべき物質は、本発明の器具の膜を通る電気的電位勾配、濃度勾配または圧力勾配に沿う。
６．膜が支持二重層として構成される項目１に記載の測定器具。
７．前記膜が脂質適合ポリマー中間膜を備えたシリカゲル基板上の支持二重層、すなわち、「束縛二重層」として構成される項目６に記載の測定器具。
８．キャピラリーの末端を覆う膜を備えた項目１に記載の測定器具。
９．物質の検出用のバイオセンサーとしての項目１に記載の測定器具の使用。
１０．細胞培養中の生きている細胞の成長のための、前記細胞の電気的活性をモニターする設備を備えた基板としてのコネキシン−ドープ膜の使用。
１１．膜が生きている細胞の形態であることを特徴とする項目１に記載の測定器具。
【実施例】
【００３３】
本発明の装置および方法を以下の代表的な具体例でさらに例示する。これらの代表的な具体例は単に本発明の好ましい型であって、本発明の特定事項を制限する意図は全くない。
【００３４】
実施例１
膜体上で電気信号を測定するための測定器具を図１に示す。それは、小チャンバー、例えば、マイクロ滴定プレートの底部に電極（例えば、金電極）を含む。電気的に緊密な合成膜（３）を電極の上方にはめ込み、膜と電極との間の中間スペースにはイオン貯蔵庫としての電解溶液を入れる。測定器具は第２の電極も有し、それは合成膜の上方に配置する。機能的半チャネル（コネクソン）を合成膜に結合して、それらが膜内を自由に拡散し得るようにし、それらの通常の細胞外ドメインは膜の上方（トランス）にある。意図する目的に合わせて適当なコネキシン型を用いる。所望により、コネクソンは１を超えるコネキシン（異種コネキシン）で構成することができる。研究する有効物質を添加していないときに最低電気信号を測定し、有効物質と研究するイオンチャネルおよび／またはレセプター（８）との間に相互作用があるとき、観察信号において最大の増大が発生する。
【００３５】
測定を行うために、上記の合成膜をすでに含有するチャンバーに、適当な細胞の懸濁物を添加する。これらの細胞（５）は、細胞内に少なくとも１の研究するイオンチャネルまたはレセプター（８）ならびに測定器具の合成膜（４）内に半チャネルを備えた機能的ギャップジャンクションを適宜形成する半チャネル（６）を有する。
【００３６】
合成膜内の半チャネルは、それらが位置するところに細胞がない限り、最初は閉じている。膜を通して電圧を負荷することによってこれを確実にする。細胞が合成膜と接するようになったとき、合成膜内の半チャネルと細胞膜との間でも接触が起こり、ギャップジャンクションが形成される。それは、近隣の細胞間で形成されるさらなるギャップジャンクションにとって、または、他の細胞を介して間接的にのみイオン貯蔵庫への導通を作る多くの細胞にとって完全に適している。しかしながら、これは、本発明に用いられるこの器具に対して障害ではない。実際に、それは、測定器具の感度をさらに向上させる実測信号の増幅をもたらす。
【００３７】
半チャネルとして閉鎖する、すなわち、細胞膜を通る低い電位差（例えば、２０ｍＶ未満）にてのみ半チャネルとして開き、より高い電位差にて閉じるような電圧挙動を示すコネクソンがこの測定器具に特に適している。
【００３８】
期待される有効物質の添加または負荷電気信号による刺激が、次いで、細胞膜内のイオンチャネルまたはレセプターの状態に変化を生じ、それが、細胞の膜電位に変化をもたらすならば、これは、直接的または間接的に合成膜下のイオン貯蔵庫への導通を作るそれらの細胞に対するイオン流をもたらす。このイオン流を測定する。典型的な電気生理学測定、例えば、パッチクランプ測定の当業者に知られているもののごとき電気的測定機器が、これにはふさわしい。
【００３９】
測定結果として、電流信号がかく得られ、それは、結合されたギャップジャンクションを介するイオン貯蔵庫への導通を有するそれら全ての細胞の細胞膜を通る全累積電流フローに対応する。
【００４０】
この代わりとして、これら同一の細胞膜内のイオンチャネルまたはレセプターの挙動を再現よく反映する電圧信号を得るように電圧を測定することもできる。それゆえ、記載した測定器具は、イオンチャネルおよびレセプターの電気的挙動を直接的にまたは間接的に、高精度かつ良好な時間分解能で明らかにし、また、例えば、既知のまたは期待される有効物質により開始される挙動の変化を正確に検出し評価するのに適している。この測定器具の時間分解能は、天然の機能においてサブミリ秒範囲の時間分解能を有するギャップジャンクションの電気特性によって決定される。
【００４１】
実施例２：総膜表面積の測定
基板に適用された細胞がギャップジャンクションを形成することによってイオン貯蔵庫との電気的連結を獲得する目的の最初の構成の発生は、同様に、電気的測定によってモニターし得る。特に、当業者に知られている適当な電気的測定法によって、膜およびギャップジャンクションを介してそれと連結している膜体の電気容量を測定することが可能である。この方法は、系の総膜面積を調べ、そして、ギャップジャンクションを介して膜と連結している堆積細胞数を定量する。この信号を用いて、この器具に対する試験物質の効果を決定することもできる。特に、堆積膜体におけるエキソサイトーシスの発生がこのようにして確かめられる。
代わりとして、適当な染料をイオン貯蔵庫または細胞に付加することによって、イオン貯蔵庫との導通にすでに参入している細胞の数を光学的に検出する。ギャップジャンクション通って拡散し得る定分子量の染料、例えば、ルシファーイエローがこれにふさわしい。
【００４２】
実施例３：並列化方法
実施例１に記載のレイアウトを変更して、複数または相当数の記載されたチャンバーを互いに隣り合わせて配置する。例えば、マイクロ滴定プレートの各チャンバーが実施例１の測定器具を構成するようにする。個々の測定チャンバーを連続的に、まとめて、または同時に読み出す。なかでも、ＭＥＡ（多重電極アレイ）技術から知られているような多重チャネル増幅システムまたは高エネルギー物理学における検出器をこれに用いることができる。
用いるマイクロ滴定プレートは、例えば、９個、３８４個、１５３６個またはいずれかの個数のチャンバーを持つものである。かくして、測定器具は、ＨＴＳシステムおよび有効物質調査ですでに確立されている設置に機械的および位置的に適合するように、実際の有効物質調査につき、本発明の技術的使用に対する障害がないように、好ましく構成される。そのため、計量し分注するための現行の道具を引き続き用いることができる。単に、マイクロ滴定プレートから電気信号を読み出すことができる適当なリーディングヘッドを検出装置に取り付けるだけである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】電気的測定機器（１）、電極（２）、コネキシンまたはインネキシン（４）を含有する膜（３）、膜体（５）、ギャップジャンクションチャネル（７）および標的（８）を備えた、本発明による典型的な測定器具を示す概略図。
【符号の説明】
【００４４】
１  電気的測定機器
２  電極
３  膜
４  コネキシンまたはインネキシン
５  膜体
６  コネキシンまたはインネキシン
７  ギャップジャンクションチャネル
８  標的
【図１】
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【国際調査報告】
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