(57)【要約】  本発明は基板のウエル（チャンネルも含む）に充填する方法に関する。発明によると、ウエルが含まれる基板上においてウエルに一致しない位置に液体を塗布し、充填後のウエルをカバー手段で密封する。液体はカバー手段の前側とカバー手段で覆われていないウエルとの間の位置に塗布され、液体はカバー手段によってウエルに押し込まれる。
2005512026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウエルが含まれる基板上においてウエルに一致しない位置に液体を塗布し、充填後のウエルをカバー手段で密封する、ウエルに液体を充填する方法において、
ウエルに充填するため、基板上に使用されるカバー手段の前側に位置する第２の場所と前記カバー手段で覆われていないウエルとの間に位置する第１の場所に液体を塗布し、
カバー手段の前側を、塗布された液体とウエルの方向に移動させるとともに、ウエルに充填される液体をともに移動させ、
カバー手段の前側がウエルを通過した後、液体が充填されたウエルを密封するためにカバー手段を第３の固定位置まで導く
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
使用されるカバー手段の厚さは少なくとも０．５ｍｍ、好ましくは少なくとも０．８ｍｍ、最も好ましくは少なくとも１．２ｍｍとすることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
親水性の液体が使用される場合、基板の反対側となるカバー手段の前面付近は疎水性にし、またはその逆の場合は逆にすることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
基板に面する側を親水性とするカバー手段の一端部は疎水性部分を有する面とすることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
疎水性表面部分には疎水性ペーストが含まれることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも第３の位置においてカバー手段を少なくとも１ｋｇ／ｃｍ２の圧力で基板に押付けることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
基板にはウエル配列が含まれ、主方向成分がカバー手段の移動方向に直角となる溝を基板に設け、溝の上を移動するカバー手段によって液体が配列まで移される前に、前記溝に液体を導入することを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
カバー手段が第３の位置に達したときに、カバー手段付近の液体を除去することを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
除去は圧縮空気を使用して行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
カバー手段の基板に面する側とカバー手段の前側との角には少なくとも一部に丸みを付けたカバー手段を使用し、この丸みで切り取られた個所に接する液体は塗布される液体とウエルの方向に移動させ、ウエルに充填される液体とともに移動させることを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
単一基板上で第１のウエルに第１の液体を充填し第２のウエルに第２の液体を充填するため、第１の液体および第２の液体はそれぞれ重ならない第１の場所に塗布し、かつカバー手段には重ならない第１の場所の間に凹部が形成されることを特徴とする請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
単一基板上の第１のウエルには第１の液体を充填し第２のウエルには第２の液体を充填するため、第１の液体および第２の液体をそれぞれ重ならない第１の場所に塗布し、かつ、重ならない第１の場所の間でｉ）基板の上側およびｉｉ）カバー手段の下側から選択された少なくとも１方の手段には突起した障害物を設け、同一位置の他方の手段には障害物を収容できる相補的な溝を設けて、第１および第２のウエルに充填する際に障害物が溝に滑り込むように構成した請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
カバー手段には少なくとも２つの前側が含まれ、少なくとも１つの前側は移動方向に直角に基板の下側に設けた溝壁で形成され、単一基板上の第１のウエルには第１の液体を充填し第２のウエルには第２の液体を充填するため、第１の液体のウエルおよび第２の液体のウエルが次の第１の場所となるように第１の液体および第２の液体をそれぞれ重ならない第１の場所に塗布し、その後、第１のウエルおよび第２のウエルに充填するためにカバー手段を基板上に載置して引続き基板上を移動させることを特徴とする請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
基板およびカバー手段の両者にはこれらが接触する官能基と物理的または化学的に結合可能な官能基を備えることを特徴とする請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法に使用されるカバー手段。
【請求項１６】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法に使用される基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウエルに液体を充填する方法であって、液体はウエルが含まれる基板上でウエルと一致しない位置に塗布し、充填後にウエルはカバー手段で密封する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
この種の方法は、酵素やＤＮＡ分析試薬などの様々な分析試薬に使用される微細配列に充填するために知られている。ウエル内の液体の量が少ないために、蒸発の影響が比較的大きい。蒸発を防止するために、カバー手段をカバー片としてウエル上に載置する。
【０００３】
測定を行う前にいくつかの操作を実施しなければならず、例えばウエルに計量された量の液体を充填し、液体で充填されたウエルを覆い（空気泡が巻き込まれないように行うのが好ましい）、それから測定を開始する。基板の周りには光学的測定技術などの様々な測定技術のための場所がほとんどないので、上記の後者の操作には時間を要することが頻繁にあり、この理由のために装着の際に基板に充填させることがしばしば不可能となる。これに加えて多くの分析試薬にはウエルに液体を充填させると直ちに反応を開始するものがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、背景技術で述べた種類の方法において測定をより速く開始することが可能な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的ため発明による方法は次の特徴がある。
ウエルに充填するため、基板上に使用されるカバー手段の前側に位置する第２の場所と前記カバー手段で覆われていないウエルとの間に位置する第１の場所に液体を塗布し、
カバー手段の前側を塗布された液体とウエルの方向に移動させるとともに、ウエルに充填される液体をともに移動させ、
カバー手段の前側がウエルを通過した後、液体が充填されたウエルを密封するためにカバー手段を第３の固定位置まで導く。
【０００６】
驚くべきことに、ウエルに導入される液体を前方に押し進めて、迅速にウエルを充填、密封することが可能となる。これはすべて単一の操作で行われるので、発明による方法を（半）自動に任意に適用するのにも好都合である。本発明によると、試料の容積を正確にピペットで分注することなく、定量の分析試薬を試料に移すことが可能となる。発明によると、ウエルに充填してウエルを覆った後では、ウエルにはウエルの寸法で決まる正確に知りうる量の液体が含まれる。比較的小さい表面を有する比較的大きな容積の場合とは異なるが、蒸発は少なくなる。ウエルに充填された直後にはカバー手段で既に密封されているので、このため蒸発の影響も少なくなる。これはピペットや電子散布などによって試料液を個々のウエルに充填するものとは明らかに異なる。本願においては、ウエルはその形状には関係なく、基板内の任意のレセスであると解釈される。この定義には長細いウエルも含まれ、チャンネルと呼ばれることもある。本質的にはこの種のチャンネルは基板の面に平行に設けられる。  
【０００７】
使用されるカバー手段の厚さは少なくとも０．５ｍｍ、好ましくは少なくとも０．８ｍｍ、最も好ましくは少なくとも１．２ｍｍとする。  
このようなカバー手段によって確実に液体が効果的に前方に押し進められる。同時にカバー手段の剛性が厚みの増加とともに増加するので、カバー手段が基板に良好に付着する。
【０００８】
親水性の液体が使用される場合、基板の反対側となるカバー手段の前面付近は疎水性にし、またはその逆の場合は逆にするカバー手段を使用する実施形態が好ましい。
このことによって、液体の一部が前方に押し進められずにカバー手段の上面まで移動してくることが防止できる。使用されるカバー手段が薄い場合は、この実施形態は特に有効となる。
【０００９】
好ましい実施形態によると、基板に面する側を親水性とするカバー手段の一端部は疎水性部分を有する面にされる。滑り移動の前にウエルに最も近いこのような面の端部の影響によって、ウエルに充填するのに必要な（水性）液体は少なくて済む。
【００１０】
この面端部は、例えばシラン処理だけでなく、シリコングリースなどの疎水性ペースト
を塗布することによっても疎水性にすることができる。このようなグリースは水性液体に溶解せず、また蒸発防止にも寄与するという別の利点もある。さらに、カバー手段を基板上で容易に滑走させることになる。
【００１１】
ウエルに充填の際、または充填の後、試薬あるいは被検体が流れあるいは拡散によって１つのウエルから他のウエルに移るという別の問題がある。試薬がウエルから出ていかないように迅速にウエルに充填密封すると好都合である。少なくとも第３の位置においてカバー手段を少なくとも１ｋｇ／ｃｍ２の圧力で基板に押付けると有効である。  
【００１２】
これによって液体または試薬が流れおよび／または拡散によって移動することが少なくなる。また第１の位置から第３の位置に移動する間に、このような圧力を、しかも１５ｋｇ／ｃｍ２にもなる圧力を加えることが示される。これによって液体または試薬が流れおよび／または拡散で移動することが制限される。
【００１３】
カバー手段の基板に面する側とカバー手段の前側との角には少なくとも一部に丸みを付けたカバー手段を使用し、この丸みで切り取られた個所に接する液体は塗布される液体とウエルの方向に移動させ、ウエルに充填される液体とともに移動させることが好ましい。
【００１４】
このような丸み付けのために液体がともに運ばれて、ウエルへの充填が容易になる。このような丸み付けは液体がカバー手段の全高（厚さ）で接触するカバー手段においては特に適切である。基板に反対となる側と前側との間に形成される角は、この場合はほぼ直角、すなわち鋭角を形成にするのが好ましく、凝集力の影響のため液体が容易に通過することがない。
【００１５】
単一基板上で第１のウエルに第１の液体を充填し第２のウエルに第２の液体を充填するため、第１の液体および第２の液体はそれぞれ重ならない第１の場所に塗布し、かつカバー手段には重ならない第１の場所の間に凹部が形成されることが好ましい。
【００１６】
この代りに、またはこれに追加して、単一基板上の第１のウエルには第１の液体を充填し第２のウエルには第２の液体を充填するため、第１の液体および第２の液体をそれぞれ重ならない第１の場所に塗布し、かつ、重ならない第１の場所の間でｉ）基板の上側およびｉｉ）カバー手段の下側から選択された少なくとも１方の手段には突起した障害物を設け、同一位置の他方の手段には障害物を収容できる相補的な溝を設けて、第１および第２のウエルに充填する際に障害物が溝に滑り込むように構成される。
【００１７】
両方法とも基板のウエルに異なった液体が充填できる。
好ましい実施の形態によると、カバー手段には少なくとも２つの前側が含まれ、少なくとも１つの前側は移動方向に直角に基板の下側に設けた溝壁で形成され、単一基板上の第１のウエルには第１の液体を充填し第２のウエルには第２の液体を充填するため、第１の液体のウエルおよび第２の液体のウエルが次の第１の場所となるように第１の液体および第２の液体をそれぞれ重ならない第１の場所に塗布し、その後、第１のウエルおよび第２のウエルに充填するためにカバー手段を基板上に載置して引続き基板上を移動させる。
【００１８】
この方法で、互いにほぼ延長方向となるウエルには同時に異なった液体が充填可能となる。
カバー手段が第３の位置に移動した後でウエルを有効に密封するために、基板およびカバー手段の両者にはこれらが接触する官能基と物理的または化学的に結合可能な官能基を備えることが好ましい。
【００１９】
例えば、一方にはアミノ基を備え、他方にはエポキシ基を備えることができる。様々な官能基はたんぱく質や他の分子を表面に固定することに関する文献で簡単に見付けることができるので、当分野の通常の専門化にはこれ以上の説明は必要ない。
【００２０】
本発明は請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の方法に使用されるカバー手段、および、請求項１１ないし１４のいずれか１項に記載の方法に使用される基板にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明を実施の形態と図面を参照して説明する。
図１にウエル４からなる２つの配列２，３を設けた基板を示す。基板１には２つの溝５’、５’’も設け、この溝はウエル４と同様、エッチングによって基板１に都合よく設けられる。発明の１つの実施形態によると、溝５’、５’’はウエル４に液体Ａを導入するのに適したものである。それに代って、またはそれに追加して、直線状コーティング、例えば液体に対する親和力の大きい親水性コーティングを設ける別の実施形態によることも可能である。それに代って、液体に対する親和力の小さい２列のコーティングで境界を定めることができる。水性液体が塗布される場合には、例えばテフロンスプレイを使用することが可能である。これは、液体が塗布される場所を例えば矩形状の紙によって保護することによってごく簡単に実施することができる。液体Ａを塗布した後、基板上に位置するカバー手段６をウエルの方向に移動させる。図１においては配列２のウエル４は既に充填されている。
【００２２】
カバー手段６の基板に対向する面および基板１のカバー手段６に対向する面は完全に平滑であるので、カバー手段６は一旦基板上に置かれると基板１から等距離を保ち移動可能であり、試料液体Ａは溝５’、５’’からウエル４内に押し込まれる。その直後にウエル４をカバー手段６で密封する。余剰の液体Ａは空気銃を使用して吹き飛ばす（圧力はほぼ４−５バール）。その前に、好ましくは余剰の液体を除去する間に、必要に応じて、適宜２−３ｋｇ／ｃｍ２の圧力で押付ける。この余剰液体を除去することによって、カバー手段６と基板１の間にこの液体が表面張力で引き込まれて、その結果、カバー手段６と基板１の間に厚さを有する液体層が増加することとなる状態が回避される。押付け力を与えなくても、非常に薄い液体層の粘着力によって、測定時間が例えば５−２０分の間はカバー手段でウエル４の密封が保証される。測定を実施するために、ウエルに充填された液体Ａ中で溶解する試薬をウエルに含有させることができる。薄い液体層の存在によって、１つのウエルから隣接するウエルに（拡散により）交換される可能性のある試薬が最小限となる。最終的に、測定の間に蒸発する液体はこの記載方法によって有効に回避される。
【００２３】
また、カバー手段６と基板１は清浄（ダストのない）にし、また、水性液体Ａの場合には、基板１とカバー手段６が互いに対向する少なくともどちらかの面は親水性とするのが好ましい。それにもかかわらず、水性液体Ａの場合には、基板１に対向するカバー手段６側のウエル４に近い端部は好ましい実施形態にしたがって疎水性にする。このやり方で、比較的多くの液体試料Ａがウエル４の充填に必要となることが避けられる。簡単な実施形態によると、基板１に対向する側の端部はシリコングリースを使用して疎水性とする。使用するシリコングリースの量は最小限に保持する（すなわち、非常に薄いコーティングを塗布する）。溝５の使用は不可欠なものではなく、望ましくないことすらある。液体Ａはウエル４の方向に向くカバー手段６の前面の側に塗布するのが好ましい。このやり方で液体Ａを横方向に広げることが可能となる。前記前面の側は親水性とするのが好ましい。
【００２４】
基板１に関し移動しなければならないカバー手段６の速度は、含有される界面活性剤などの成分と同様に使用される材料や使用される液体Ａに依存する。それにもかかわらず、当分野の専門家は適切な速度を決定することができる。閉じ込められた空気を含むウエル４の比率が望ましいものよりも高いと、速度を減少するか、または角を丸めたり勾配を少なくしたウエルを使用する必要がある（充填がより簡単になる）。基板１およびカバー手段６は、ポリスチレン、ガラス、あるいは半導体業界で知られる技術を使用して処理できる材料など本質的に（液体Ａに対して）不活性な材料から製作できる。
【００２５】
カバー手段６の前端の基板側付近の角７には（点線で示すように）丸みを付けるのが好ましい。これで液体が効果的にウエル４に充填される。ウエルに充填する実用的な方法は次のように行う。
【００２６】
１）厚さ１ｍｍのパイレックスガラスを洗剤で処理して脱塩水ですすいで清浄にする。
２）パイレックスガラスを半導体基板上に載置する。半導体基板には親水性のＳｉＯ２層および好ましくはシリコン窒化物層を設ける。半導体基板に深さ５０μｍの４００ｘ４００μｍのウエルを設ける。
【００２７】
３）毛管作用によって水０．１ないし０．２μｌをパイレックスカバーガラスと基板の間に導く。この程度の最小量の液体の存在によってパイレックスカバーガラスは吸着で基板に付着する。これは取り去ることは難しいが、滑らせることは可能である。
【００２８】
４）試料液体（１μｌ）をパイレックスカバーガラスから離れたウエル列の前方にピペットで分注する。
５）パイレックスカバーガラスを試料液体およびウエルのある方向に２−６ｃｍ／ｓの速度で押し進める。
【００２９】
６）カバーガラスを基板上に２−３ｋｇ／ｃｍ２の圧力で押付けて余剰の試料液体は空気銃を使用して吹き飛ばす（圧力４バール）。
７）カバーガラスを有する基板を対物レンズの下方向にあるＸ−Ｙ−Ｚテーブル上のスライド物体保持装置に載置する。
【００３０】
実験では、４００ｘ４００ｘ５０μｍの５×５配列ウエル（総容積０．２μｌ）に０．５μｌだけ液体を充填した。
実験（ウエルを酵素で塗布した呈色反応）が示すところによると、基板に対するカバー手段の移動方向に対する横方向のキャリーオーバは最小であった。移動方向における隣り合うウエル間にはキャリーオーバがいくつか検出された。
【００３１】
本発明による方法によると、エタノールなどの揮発性溶剤をウエルに充填するのに適することが示された。これで、発明による方法が結合化学および潜在的な危険反応に適用でき、小規模で実施できて安全となる。
【００３２】
当分野の通常の専門家には、発明の範囲から逸脱することなく本方法は多くの方法に展開可能であることは明白である。例えば、ウエルが比較的深い特別の場合には、真直ぐでないカバー手段６、例えば鋸歯状あるいは溝付きのものを使用すると有利であり、鋸歯状あるいは溝付きのレセスは液体を吸収して、レセスを有するカバー手段６がウエル上に押付けられる。配列２に充填させる場合は、レセスの位置はウエル４の中心にほぼ一致するように選択する。要望によっては、異なる試料液体が同時に分析できるように、異なるレセスに異なる試料液体を含ませることが可能である。
【００３３】
シリコングリースなどの疎水性ペーストの密封層を一定の再現可能な方法で塗布するために、余剰ペーストの方向に基板上を移動している間に少なくとも１箇所で基板と接触する展張装置を使用することができる。展張装置は基板と展張装置の間に狭い溝を残し、この狭い溝（および展張装置が移動する角度）で層の厚さが決定される。展張装置には基板の側部に固定された案内部材を選択的に備えることもできる。
【００３４】
図２ａに様々なウエル４を設けた基板１を示す。カバー手段６には溝８が設けられ、各溝には様々な液体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄを前方に押し出す前壁９が含まれる。カバー手段６が第３の位置にあるとき、ウエル４は密封される。ウエル４には様々な試薬Ｗ，Ｘ，Ｙ，Ｚが含まれる。
【００３５】
図３に、異なる液体Ａ，Ｂ，Ｃが充填されるウエル４’、４’’、４’’’で構成された３つの配列２，３、９の上面図が示される。カバー手段の移動の間に、液体がカバー手段の前縁に沿って広がり互いに接触することを防止するためにレセス１０が設けられるので、液体は実質的には異なるカバー手段９に支配されることになる。
【００３６】
液体の塗布および液体の移動は供給装置やアクチュエータによって自動化するのが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１ａ】本発明によるカバー手段を有する基板の側面を示す。
【図１ｂ】本発明によるカバー手段と基板の上面を示す。
【図２ａ】異なるウエルに異なる液体を塗布する本発明によるカバー手段を有する基板の側断面を示す（充填前）。
【図２ｂ】異なるウエルに異なる液体を塗布する本発明によるカバー手段を有する基板の側断面を示す（充填後）。
【図３】本発明によるカバー手段を有する基板の上面を示す。
【図１ａ】
2005512026.tif 000003
【図１ｂ】
2005512026.tif 000004
【図２ａ】
2005512026.tif 000005
【図２Ｂ】
2005512026.tif 000006
【図３】
2005512026.tif 000007
【国際調査報告】
2005512026.tif 000008
2005512026.tif 000009
2005512026.tif 000010