(57)【要約】本発明は、例えば、宿主とウイルスの配列を含有するキメラ転写産物由来の宿主/ウイルス連結配列を回収することによる、ハイスループットプロウイルスタギング（ＨＰＴ）を用いた原癌遺伝子を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
原癌遺伝子を同定する方法であって：
プロウイルスを宿主のゲノムに挿入し、該ウイルスDNAと宿主との結合部位を形成させること；
宿主からmRNAを単離すること；
該ｍRNAからcDNAを調製すること；
該cDNAを増幅させて、上記結合部位の核酸配列を同定することにより、候補標的遺伝子を同定すること；
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
多重体細胞変異が蓄積する間に、複雑な生物学的進化の形質発現を示し、最終的には転移するのに十分な増殖自立性を獲得する。遺伝性の癌に関与すると疑われる対立遺伝子および後発的な要因がこの過程に影響するが、発癌は基本的には体細胞の進化（即ち、変異と増殖制御を徐々に失うことによる変異の自然淘汰）によって制御されている。これらの体細胞変異の標的である遺伝子は、変異型形質が優性か劣性かによって、それぞれ原癌遺伝子または癌抑制遺伝子として分類される。
【０００２】
複数の動物モデルでは、レトロウイルス感染が原癌遺伝子体細胞変異の大きな原因である。レトロウイルスは、以下の３つの必須なメカニズムにより癌を誘発させる：(i)宿主原癌遺伝子の導入（その後、ウイルス性癌遺伝子となる）、(ii)ウイルス遺伝子産物のトランス活性化効果、または(iii)組込み部位またはそのごく近傍での原癌遺伝子へのプロウイルスの組込みのシス活性化効果。後者の場合、感染した細胞だけが影響される。この現象は、プロウイルス挿入変異と呼ばれるものであり、詳細については後述する。
【０００３】
正常なレトロウイルスの生活環により、レトロウイルスゲノムのDNAコピー(プロウイルスと呼ばれる)は、宿主のゲノムに組込まれる。したがって、レトロウイルスは、必ず変異原である。新しく組込まれたプロウイルスは、２つのメカニズムのうちのいずれかによって、組込み部位またはその近傍にある遺伝子の発現にシスエレメントとして作用する。I型挿入変異は、プロウイルスの長い末端反復配列(LTR)中の制御配列(エンハンサーおよび/またはプロモーター)により近傍の遺伝子の転写をアップレギュレートする。これらの挿入変異は、典型的には標的組織は発現されない遺伝子に影響を与える。II型挿入変異は、オープンリーディングフレーム内に直接組込まれるか、終止コドンの上流にあるイントロン内に組込まれることによってコード領域の末端切断の原因となる。
【０００４】
プロウイルスの組込みは、ランダムである。したがって、全ての宿主遺伝子は、挿入変異の標的である。慢性的に感染した組織では、十分な数の細胞が新たなプロウイルス挿入を受け、ゲノム中の全ての遺伝子が変異する。まれに、１つの挿入変異が宿主原癌遺伝子を「活性化」し、その細胞に生体内での選択的な増殖における優位性を付与する。細胞が癌へと進むと、原癌遺伝子挿入変異が、腫瘍内でクローンが化学量論的に存在する。このような、「クローンとして組込まれた」プロウイルスは、ゲノム中に原癌遺伝子の存在部位に「タグ」を付与する。プロウイルスエンハンサーが組換え原癌遺伝子の調節不全に関与している場合、プロウイルスは、組込み部位から100kb以上離れていることもある(通常は、もっと近いところにある)。
【０００５】
クローンとして組込まれたプロウイルスと原癌遺伝子の比較的密接なこの関連性は、「プロウイルスタギング」という古典的な実験手法に基づいている。この手法では、挿入変異メカニズムによって作用する遅延性形質転換レトロウイルスを用いて原癌遺伝子を単離する。全体の理論は、以下の通りである：(i)未感染は発癌率が低い、(ii)感染動物は発癌率が高い、(iii)含まれるレトロウイルスは宿主導入された原癌遺伝子または病原性トランスアクティングウイルス性遺伝子を有していない、（iv）したがって、発癌率は、宿主原癌遺伝子のプロウイルス組込み作用の直接的な結果である、（v）プロウイルスの組込みがランダムであるため、まれに組込みにより選択的増殖優位性を有する宿主原癌遺伝子を「活性化」することがある、そして(vi)これらの現象は、腫瘍内でのクローンとしての化学量論的な新しいプロウイルスを生じさせる。
【０００６】
化学物質、放射線または自発性の異常による突然変異とは対照的に、原癌遺伝子挿入変異は、既知配列の適当なサイズの遺伝子マーカー(即ちプロウイルス)が変異部位に存在するという事実により、簡単に部位が特定される。クローン性に組込まれたプロウイルスを挟む宿主の配列は、種々の分子生物学的手法を用いて修復することができる。これらの配列が把握できれば、タグ付きの原癌遺伝子は特定できる。
【０００７】
プロウイルス組込み部位またはそのごく近傍に存在する一見してわかる証拠となる明確な生物学的基準が２つある。その１つは、2つ以上の独立した腫瘍において同じ遺伝子座にプロウイルスが存在するということである。これは、ランダムな組込みにより観察可能なクラスタリングが起こり、ゲノムが大きすぎることによる。何らかのクラスタリングが検出されると、生物学的選択（即ち、宿主原癌遺伝子の活性化に起因する腫瘍形質）の間接的証拠となる。２つめの基準は、１つだけの挿入変異をもつ腫瘍である。この場合、１つだけの挿入変異があれば、プロウイルスは原癌遺伝子座に存在する。これらの基準のいずれかに合致すれば、原癌遺伝子の遺伝子座が存在するという結果に達する。
【０００８】
プロウイルスタギングの概念は、プロウイルス挿入変異病因論を有する多くのレトロウイルス腫瘍モデルにおけるテストで20年間通用していた。生物学的な理論は、説得力があるものであり、実験結果は明確であるので、活性化遺伝子は発見時に機能的に原癌遺伝子として確認されたものとして主張できる。正式な確認は、典型的にはバイオアッセイ（細胞に基づく形質転換アッセイまたはトランスジェニックマウス）で使用するための全長cDNAの単離である。
【０００９】
トリおよび哺乳動物におけるプロウイルスタギングは、約50〜60個の原癌遺伝子の特定をもたらした(その多くは、それ以前は、他の技法で同定されていなかった新規の遺伝子であった)。挿入変異メカニズムにより癌を誘発する３つの哺乳動物レトロウイルスは、FeLV(ネコ白血病/リンパ腫)、MLV(マウスおよびラットの白血病/リンパ腫)、およびMMTV(マウス乳癌)である。
【００１０】
プロウイルスタギング法への絶大な期待にも関わらず、ラージスケールでの適用に順応するような設計ではなかった。あまりにも実験室レベル用であったため、既知の遺伝子を再度単離してしまうというリスクが多くの研究者に受け入れられない大きな問題点となっていた。結果として、このアプローチによる原癌遺伝子の発見は、未踏のままの部分が大きい。
【００１１】
この未踏部分を考え、本発明者らは、HPT法を設計し実行して、今までのプロウイルスタギング法の限界(これら全ては根本的には処理能力に関するものであった) を乗り越えた。本発明者らは、既知の遺伝子を再度単離するということはもはや問題ではないという域まで、プロウイルスタギングの処理能力を増大させることに成功した。事実、今やこれは、並行して回収される新規遺伝子の生物学的関連性を確認するのに役立つ「内在コントロール」として提供されるので、望ましい成果である。
【００１２】
機能的な癌遺伝子学的手法として、HPTは多くの利点を有する。第一に、原始的な方法(例えば、ディファレンシャルディスプレイ法など)より機能的なクローニング法である；回収された遺伝子は、発見時に機能的に確認されているということである。第二には、原癌遺伝子は臨床の材料から直接単離することができるので(細胞系、移植片または遺伝子転移により産生された材料より)生物学的な関連性が高いことである。第三には、自動化が簡単であり、このことは処理能力および発見に至るまでの時間において簡便な研究手法となる。
【００１３】
本発明は、ハイスループットプロウイルスタギング(HPT)と呼ばれる工程である。HPTにより、レトロウイルス誘導性腫瘍から原癌遺伝子の部分的cDNAを得られる。これらの部分的cDNAを用いて、簡便な方法で全長cDNAを発見することができる(本発明者らはこの最終ステップについては行っていない)。概念的な図を図１に示し、各工程のフローチャートを図２に示している。
【００１４】
HPTはプロウイルスタギング法の古典的手法に由来する。プロウイルス挿入変異メカニズムにより癌を誘発するレトロウイルスにより誘発される腫瘍は特定のものである。レトロウイルスは、マウス乳癌ウイルス(MMTV)を含む。MMTV-誘導性腫瘍を用いて、HPT手法を実施した。
【００１５】
プロウイルス挿入変異により誘発される腫瘍では、クローン性化学量論的に存在する新規プロウイルスの組込みは、宿主原癌遺伝子の位置に目印をつける。このような組込みのほとんどは、転写領域の外側に起こる。しかし、一部は、転写される配列の領域内に起こる。HPTはこれらのキメラ転写産物から宿主/ウイルス結合配列を回収するよう設計されている。
【００１６】
汎用のアンカーを組込んだ改変/最適化されたアンカーPCR(A-PCR)を用いる。この工程で、5’LTR上流の宿主配列を増幅する。宿主/ウイルス連結部を含む転写産物が腫瘍に存在すれば、A-PCR法によってユニークな断片が増幅され、電気泳動により検出される。さらに、1種以上の共通な断片が、3’LTRの5’末端を含むレトロウイルス転写産物から産生される。
【００１７】
この手法を可能にした改良点は、cDNAを増幅前に4塩基認識の制限酵素で消化することである。これにより、(1)正確な5’末端を有し、かつ(2)確実かつ効率的に増幅されるのに十分に小さいという特徴を有する標的cDNAの集団ができる。さらに、可能な限り最大のレトロウイルス転写産物を産生する制限酵素を選択する（ゲルの最上部にくる）。これは、キメラ転写産物が、レトロウイルス転写産物の主要なものよりずっと低レベルで存在することから重要である。適切な制限酵素の選択により、シグナル対ノイズの比が最も好ましいゲル領域において大きな検出範囲が利用可能となる。さらに、増幅の際に、サイクル時間をより小さい産物に有利なように設定できる。
【００１８】
プロウイルスタギング法は約20年間用いられてきた。腫瘍DNAから回収される組込み部位に隣接する遺伝子を見つけるためのポジショナルクローニング法を新規遺伝子の同定に必要とするDNAに基づく検出方法である。これは実験室レベルの方法であり、最近になってPCR手法により改良された。にもかかわらず、組込みが既知配列内に起こらなければ、多くのさらなる作業なしには、それが作用する遺伝子を同定することは不可能である。
【００１９】
HPTの利点は、最初のPCRに基づくプロウイルスタギング法でRNAから原癌遺伝子を回収することである。RNAを用いるので、新規原癌遺伝子は直接同定される。腫瘍画分だけがキメラ転写産物を生成する挿入変異を有するが、手順はハイスループットととなるよう設計した。その結果、参考にならない多くのサンプルが問題とはならなかった。さらに、既知の原癌遺伝子を回収することは受け入れ難い労力の無駄ではない程に効率的であり、実際には、手法の確実性を確認するための内在コントロールとして役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、HPT法の概念的な図を示す。
【図２】図２は、HPT法の各工程のフローチャートである。
【図３】図３は、HPTスクリーニング法のデータの一例である。
【図４Ａ】図４Ａは、HPT法についての附属的説明である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、HPT法についての附属的説明（図４Ａの続き）である。
【図５】図５は、用語説明である。
【図６Ａ】図６Ａは、図３に示したデータから得られたCTTである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図３に示したデータから得られたCTT（図６Ａの続き）である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、図３に示したデータから得られたCTT（図６Ｂの続き）である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図３に示したデータから得られたCTT（図６Ｃの続き）である。
【図７】図７は、新規原癌遺伝子候補を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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