(57)【要約】  本発明は、ＴＮＦ−アルファアンタゴニスト活性を有する新規タンパク質およびこれらのタンパク質をコードする核酸に関する。本発明はさらに、ＴＮＦ−アルファ関連障害の処置における新規タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＴＮＦ−アルファ配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質であって、該変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質が野生型ＴＮＦ−アルファと相互作用して、受容体のシグナル伝達を活性化できない混合三量体を形成するものである、非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項２】
該ＴＮＦ−アルファタンパク質が、野生型ＴＮＦ−アルファ配列と比較して２ないし５のアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項３】
該野生型ＴＮＦ−アルファ配列と比較した少なくとも１つの置換が、ラージドメイン、スモールドメイン、ＤＥループ、三量体接触面およびそれらの組合せから選択される群において為されている、請求項１に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項４】
少なくとも１つの置換が、該ラージドメインにおいて為されており、その位置が、２１、３０、３１、３２、３３、３５、６５、６６、６７、１１１、１１２、１１５、１４０、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７からなる群から選択される、請求項３に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項５】
少なくとも１つの置換が、該スモールドメインにおいて為されており、その位置が、７５および９７からなる群から選択される、請求項３または請求項４に記載の非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項６】
少なくとも１つの置換が、該ＤＥループにおいて為されており、その位置が、８４、８６、８７および９１からなる群から選択される、請求項３ないし請求項５のいずれかに記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項７】
少なくとも１つの置換が、該三量体接触面において為されており、その位置が、３４、９１および５７からなる群から選択される、請求項３ないし請求項６のいずれかに記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項８】
該ＴＮＦ−アルファタンパク質の置換位置が、２１、２３、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５７、６５、６６、６７、７５、８４、８６、８７、９１、９７、１１１、１１２、１１５、１４０、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７からなる群から選択される、請求項１に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項９】
２つの置換がある、請求項８に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項１０】
３つの置換がある、請求項８に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項１１】
該２つの置換が、５７、７５、８６、８７、９７、１１５、１４３、１４５および１４６からなる群から選択される、請求項９に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項１２】
該置換が、Ｑ２１Ｃ、Ｑ２１Ｒ、Ｅ２３Ｃ、Ｎ３４Ｅ、Ｖ９１Ｅ、Ｑ２１Ｒ、Ｎ３０Ｄ、Ｒ３１Ｃ、Ｒ３１Ｉ、Ｒ３１Ｄ、Ｒ３１Ｅ、Ｒ３２Ｄ、Ｒ３２Ｅ、Ｒ３２Ｓ、Ａ３３Ｅ、Ｎ３４Ｅ、Ｎ３４Ｖ、Ａ３５Ｓ、Ｄ４５Ｃ、Ｌ５７Ｆ、Ｌ５７Ｗ、Ｌ５７Ｙ、Ｋ６５Ｄ、Ｋ６５Ｅ、Ｋ６５Ｉ、Ｋ６５Ｍ、Ｋ６５Ｎ、Ｋ６５Ｑ、Ｋ６５Ｔ、Ｋ６５Ｓ、Ｋ６５Ｖ、Ｋ６５Ｗ、Ｇ６６Ｋ、Ｇ６６Ｑ、Ｑ６７Ｄ、Ｑ６７Ｋ、Ｑ６７Ｒ、Ｑ６７Ｓ、Ｑ６７Ｗ、Ｑ６７Ｙ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ７５Ｋ、Ｌ７５Ｑ、Ａ８４Ｖ、Ｓ８６Ｑ、Ｓ８６Ｒ、Ｙ８７Ｈ、Ｙ８７Ｒ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９７Ｒ、Ｉ９７Ｔ、Ａ１１１Ｒ、Ａ１１１Ｅ、Ｋ１１２Ｄ、Ｋ１１２Ｅ、Ｙ１１５Ｄ、Ｙ１１５Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｙ１１５Ｈ、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｋ、Ｙ１１５Ｌ、Ｙ１１５Ｍ、Ｙ１１５Ｎ、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｒ、Ｙ１１５Ｓ、Ｙ１１５Ｔ、Ｙ１１５Ｗ、Ｄ１４０Ｋ、Ｄ１４０Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｌ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｓ、Ｆ１４４Ｎ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｆ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｍ、Ａ１４５Ｎ、Ａ１４５Ｑ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｙ、Ｅ１４６Ｋ、Ｅ１４６Ｌ、Ｅ１４６Ｍ、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６Ｒ、Ｅ１４６ＳおよびＳ１４７Ｒからなる置換の群から選択される、請求項８に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項１３】
該置換が、Ｌ５７Ｆ、Ｌ５７ＷまたはＬ５７Ｙ、およびＬ８７Ｙ、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｔ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｒ、Ｅ１４６ＫおよびＥ１４６Ｒからなる群からのものを含む、請求項１１に記載の変異型タンパク質。
【請求項１４】
該置換が、Ｖ９１ＥおよびＮ３４Ｅを含む、請求項１１に記載の変異型タンパク質。
【請求項１５】
該置換が、さらにＹ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｔ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｒ、Ｅ１４６ＫおよびＥ１４６Ｒからなる群からの置換を含む、請求項１４に記載の変異型タンパク質。
【請求項１６】
該置換が、Ｖ９１Ｅ、Ｎ３４ＥおよびＡ１４５ＲまたはＡ１４５Ｅのいずれかを含む、請求項１５に記載の変異型タンパク質。
【請求項１７】
該置換が、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｍ、Ｙ１１５Ｔ、Ｅ１４３Ｎ、Ｅ１４３Ｑ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５ＫまたはＡ１４５Ｒの少なくとも２つを含む、請求項１１に記載の変異型タンパク質。
【請求項１８】
該置換が、Ｙ１１５ＩまたはＹ１１５Ｔ、およびＡ１４５ＥまたはＡ１４５Ｒのいずれかを含む、請求項１７に記載の変異型タンパク質。
【請求項１９】
該置換が、Ｙ１１５ＭまたはＹ１１５Ｑのいずれか、およびＬ５７Ｉ、Ｌ５７Ｗ、Ｌ５７Ｙ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ７５Ｑ、Ｓ８６Ｑ、Ｙ８７Ｈ、Ｙ８７Ｒ、Ｉ９７Ｒ、Ｉ９７Ｔ、Ｅ１４３Ｎ、Ｅ１４３Ｑ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５ＲまたはＥ１４６Ｋの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の変異型タンパク質。
【請求項２０】
該置換が、Ａ１４５Ｒ、およびＬ５７Ｆ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ７５Ｑ、Ｙ８７Ｈ、またはＩ９７Ｔの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の変異型タンパク質。
【請求項２１】
該置換がＡ１４５ＲおよびＹ８７Ｈを含む、請求項２０に記載の変異体。
【請求項２２】
該置換がＬ５７ＦおよびＡ１４５Ｅを含む、請求項１１に記載の変異型タンパク質。
【請求項２３】
該置換が、Ｋ６５ＤまたはＫ６５Ｅ、およびＤ１４３ＫまたはＤ１４３Ｒのいずれかを含む、請求項１１に記載の変異型タンパク質。
【請求項２４】
該置換が、Ｙ８７Ｈ、およびＬ７５ＥまたはＬ７５Ｋのいずれか、およびＹ１１５ＱまたはＡ１４５Ｒの少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の変異型タンパク質。
【請求項２５】
野生型ＴＮＦ−アルファ配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも単量体形態の非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質であって、該変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質が、受容体結合部位で受容体接触面と相互作用して、該受容体が受容体シグナル伝達を活性化できないようにするものである、非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項２６】
該ＴＮＦ−アルファタンパク質が単量体である、請求項２５に記載の変異型タンパク質。
【請求項２７】
該ＴＮＦ−アルファタンパク質が二量体である、請求項２５に記載の変異型タンパク質。
【請求項２８】
該ＴＮＦ−アルファタンパク質が、野生型ＴＮＦ−アルファ配列と比較して１ないし約２５のアミノ酸置換を有する、請求項２５に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項２９】
該ＴＮＦ−アルファタンパク質の置換位置が、６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、３３、３４、３６、５３、５４、５５、５７、５９、６１、６３、６９、７２、７３、７５、８２、８７、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０９、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５１、１５５、１５６および１５７からなる群から選択される、請求項２５に記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項３０】
該非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質が受容体結合部位を遮断するものである、請求項２５ないし請求項２９のいずれかに記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質。
【請求項３１】
該タンパク質がＰＥＧ化されている、請求項１ないし請求項３０のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項３２】
該タンパク質が、１０、２１、２３、２４、２５、２７、３１、４２、４４、４５、４６、８６、８７、８８、９０、１０７、１０８、１２８、１１０、１４０および１４５からなる群から選択される位置でＰＥＧ化されている、請求項３１に記載の変異型タンパク質。
【請求項３３】
該タンパク質が、２１、２３、３１および４５からなる群から選択される位置でＰＥＧ化されている、請求項３２に記載の変異型タンパク質。
【請求項３４】
該タンパク質がＮ末端でＰＥＧ化されている、請求項３３に記載の変異型タンパク質。
【請求項３５】
該ＰＥＧ化タンパク質が、受容体結合を乱すものである、請求項３１ないし請求項３４のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項３６】
Ｎ末端、Ｃ末端またはＮおよびＣ末端の両方からの約１ないし約５５のアミノ酸が欠失している、請求項１に記載の変異型タンパク質。
【請求項３７】
Ｎ末端の残基が、残基１０を超えて欠失している、請求項３６に記載の変異型タンパク質。
【請求項３８】
最初の４７のＮ末端アミノ酸が欠失している、請求項３７に記載の変異型タンパク質。
【請求項３９】
Ｃ末端のロイシンが欠失している、請求項３６に記載の変異型タンパク質。
【請求項４０】
該タンパク質が、環状に変更されているか、または環状化されている、請求項１ないし請求項３９のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項４１】
２つまたはそれ以上の修飾ドメインが、ジスルフィド結合を介して共有結合により連結されている、請求項１ないし請求項４０のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項４２】
２つまたはそれ以上の修飾ドメインが、化学的クロスリンクを介して共有結合により連結されている、請求項１ないし請求項４１のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項４３】
２つまたはそれ以上のＴＮＦ−アルファ変異型タンパク質が、リンカーペプチドを介して共有結合により連結されている、請求項１ないし請求項４２のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項４４】
該リンカーペプチドが、少なくとも１つの、かつ、約３０を超えないアミノ残基の配列のものである、請求項４３に記載の変異型タンパク質。
【請求項４５】
該リンカーペプチドが、少なくとも５つの、かつ、約２０を超えないアミノ残基の配列である、請求項４４に記載の変異型タンパク質。
【請求項４６】
該リンカーペプチドが、少なくとも１０の、かつ、約１５を超えないアミノ残基の配列である、請求項４５に記載の変異型タンパク質。
【請求項４７】
リンカーペプチドが、次のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒの、１つまたはそれ以上を含む、請求項４４ないし請求項４６のいずれかに記載の変異型タンパク質。
【請求項４８】
請求項１ないし請求項４７のいずれかに記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードする組換え核酸。
【請求項４９】
請求項４８に記載の組換え核酸を含む発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４８に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項５１】
請求項４９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
請求項５０に記載の宿主細胞を、該核酸の発現に適する条件で培養することを含む、非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質の産生方法。
【請求項５３】
該ＴＮＦ−アルファタンパク質を回収することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１ないし請求項４７のいずれかに記載の非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質および医薬担体を含む、医薬組成物。
【請求項５５】
処置を必要とする患者に、非天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質を投与することを含む、ＴＮＦ−アルファ関連障害の処置方法。
【請求項５６】
該ＴＮＦ−アルファ関連障害が自己免疫疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該ＴＮＦ−アルファ関連障害が脊椎関節炎である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
該ＴＮＦ−アルファ関連障害が炎症性腸疾患である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
該ＴＮＦ−アルファ関連障害が乾癬である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
該ＴＮＦ−アルファ関連障害が移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
該ＴＮＦ−アルファ関連障害が血液悪性腫瘍である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
該ＴＮＦ−アルファ関連障害が多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形性症候群（ＭＤＳ）または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
該症状がリウマチ性関節炎である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
該障害がクローン病である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
該障害が敗血症または敗血症ショックである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６６】
該障害が末梢神経損傷である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６７】
該障害が慢性狭窄性損傷（Chronic Constriction Injury）である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
該障害が脱髄性疾患である、請求項４６に記載の方法。
【請求項６９】
該障害がギランバレー症候群である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該障害が多発性硬化症である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
該障害が癌である、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２００１年１０月１５日に出願されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／９８１,２８９；２００１年８月３１日に出願されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／９４５,１５０；および２０００年３月２日に出願されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.６０／１８６,４２７の出願日の利益を主張する、２００１年３月２日に出願されたＵ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.０９／７９８,７８９の、一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＴＮＦ−アルファアンタゴニスト活性を有する新規タンパク質およびこれらのタンパク質をコードする核酸に関する。本発明はさらに、慢性関節リウマチなどの自己免疫症状、敗血症、およびクローン病などのＴＮＦ−アルファ関連障害、並びに末梢神経損傷および脱髄性障害の処置における新規タンパク質の使用に関する。
【０００３】
発明の背景
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−アルファ）は、活性化されたマクロファージおよびリンパ球により主に産生される多面発現性サイトカインであるが、内皮細胞や他の型の細胞でも発現される。ＴＮＦ−アルファは、炎症性、免疫性および病態生理的反応の主要な調節物質である（Grell, M., et al., (1995) Cell, 83: 793−802）。ＴＮＦには、２つの相違する形態が存在する。２６ｋＤａの膜発現型と、２６ｋＤａ型のタンパク質分解性開裂から誘導される可溶性の１７ｋＤａのサイトカインとである。可溶性ＴＮＦポリペプチドは、アミノ酸の長さが１５７であり、主要な生物学的に活性な分子である。
【０００４】
ＴＮＦ−アルファは、その生物学的作用を高親和性細胞表面受容体との相互作用で発揮する。２つの相違する膜ＴＮＦ−アルファ受容体がクローン化され、特徴解明されている。５５ｋＤａのものはｐ５５ＴＮＦ−Ｒと名付けられ、７５ｋＤａのものはｐ７５ＴＮＦ−Ｒと名付けられた（Corcoran, A.E et al., (1994) Eur. J. Biochem., 223: 831−840）。この２つのＴＮＦ受容体は、アミノ酸レベルで２８％の類似性を示す。これは細胞外ドメインに限られ、４つの反復するシステインに富むモチーフからなる。各モチーフは約４０のアミノ酸である。各モチーフは保存位置で４から６のシステインを含有する。デイホーフ（Dayhoff) 解析によると、各受容体の最初の３反復体に最も大きいサブユニット間の類似性がある。この特徴的な構造は、ＴＮＦ−Ｒ／神経成長因子受容体スーパーファミリーを含む他の受容体や細胞表面分子で多く共通している（Corcoran, A.E et al., (1994) Eur. J. Biochem., 223: 831−840）。
【０００５】
ＴＮＦシグナル伝達は、３価リガンドＴＮＦまたは橋かけモノクローナル抗体による受容体群集合で開始される（Vandevoorde, V., et al., (1997) J. Cell Biol., 137: 1627−1638)。ＴＮＦおよび構造的に関連するサイトカインであるリンホトキシン（ＬＴ）についての結晶学的試験によると、両サイトカインともホモ三量体として存在し、３つに折りたたまれた左右対称形の縁から縁にパッケージされたサブユニットを持つ。構造的に、ＴＮＦまたはＬＴのいずれも、それらの受容体の反復パターンを反映しない。各単量体は、円錐形であり、円錐の基底の反対側に２つの親水性ループを含有する。最近のｐ５５可溶性ＴＮＦ−Ｒ／ＬＴ複合体の結晶構造決定により、近接の単量体からのループが一緒になって、単量体間の溝を形成し、ＴＮＦ−Ｒがそれらの溝の中で結合するという仮説が確認された（Corcoran, A.E et al., (1994) Eur. J. Biochem., 223: 831−840）。
【０００６】
炎症、細胞免疫応答および多くの疾患の病態においてＴＮＦ−アルファが果たす重要な役割からして、ＴＮＦ−アルファのアンタゴニストの探索がなされた。ＴＮＦ−アルファシグナル伝達を妨害する可溶性ＴＮＦ受容体は、単離され、慢性関節リウマチの処置のために商標名 Enbrel（登録商標）で Immunex 社から販売されている。ランダム変異法を用いて、細胞毒活性の喪失の原因となるＴＮＦ−アルファの活性部位の同定がなされた（Van Ostade, X., et al., (1991) EMBO J. 10: 827−836)。ヒトｐ５５−ＴＮＦよりｐ７５−ＴＮＦに高い結合親和性を有するヒトＴＮＦ変異体も開示された（US 5,597,899 および Loetscher et al., J. Biol. Chem., 268(35) pp263050−26357 (1993)）。しかし、治療剤としての使用のためにさらに強力なＴＮＦ−アルファアンタゴニストの開発の必要性がなお存在している。
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＴＮＦ−アルファ関連障害の処置のためにＴＮＦ−アルファアンタゴニスト活性を有するタンパク質およびそれらのタンパク質をコードする核酸を提供することである。
【０００８】
発明の要旨
上記の目的に合致して、本発明は、野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質に比して少なくとも１つのアミノ酸変化を有するアミノ酸配列を含む非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質（例えば、天然に見出されないタンパク質）を提供する。
【０００９】
好ましい実施態様は、野生型ＴＮＦ−アルファと相互作用して、受容体シグナル伝達を活性化し得ない混合された三量体を形成する変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を利用する。好ましくは、野生型ＴＮＦ−アルファに比して１、２、３、４および５のアミノ酸変化を有する変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を使用する。好ましい実施態様において、その変化は、位置２１、２３、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５７、６５、６６、６７、７５、８４、８６、８７、９１、９７、１１１、１１２、１１５、１４０、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７でのアミノ酸残基より選ばれる。さらなる態様では、非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、Ｑ２１Ｃ、Ｑ２１Ｒ、Ｅ２３Ｃ、Ｎ３４Ｅ、Ｖ９１Ｅ、Ｑ２１Ｒ、Ｎ３０Ｄ、Ｒ３１Ｃ、Ｒ３１Ｉ、Ｒ３１Ｄ、Ｒ３１Ｅ、Ｒ３２Ｄ、Ｒ３２Ｅ、Ｒ３２Ｓ、Ａ３３Ｅ、Ｎ３４Ｅ、Ｎ３４Ｖ、Ａ３５Ｓ、Ｄ４５Ｃ、Ｌ５７Ｆ、Ｌ５７Ｗ、Ｌ５７Ｙ、Ｋ６５Ｄ、Ｋ６５Ｅ、Ｋ６５Ｉ、Ｋ６５Ｍ、Ｋ６５Ｎ、Ｋ６５Ｑ、Ｋ６５Ｔ、Ｋ６５Ｓ、Ｋ６５Ｖ、Ｋ６５Ｗ、Ｇ６６Ｋ、Ｇ６６Ｑ、Ｑ６７Ｄ、Ｑ６７Ｋ、Ｑ６７Ｒ、Ｑ６７Ｓ、Ｑ６７Ｗ、Ｑ６７Ｙ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ７５Ｋ、Ｌ７５Ｑ、Ａ８４Ｖ、Ｓ８６Ｑ、Ｓ８６Ｒ、Ｙ８７Ｈ、Ｙ８７Ｒ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９７Ｒ、Ｉ９７Ｔ、Ａ１１１Ｒ、Ａ１１１Ｅ、Ｋ１１２Ｄ、Ｋ１１２Ｅ、Ｙ１１５Ｄ、Ｙ１１５Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｙ１１５Ｈ、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｋ、Ｙ１１５Ｌ、Ｙ１１５Ｍ、Ｙ１１５Ｎ、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｒ、Ｙ１１５Ｓ、Ｙ１１５Ｔ、Ｙ１１５Ｗ、Ｄ１４０Ｋ、Ｄ１４０Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｌ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｓ、Ｆ１４４Ｎ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｆ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｍ、Ａ１４５Ｎ、Ａ１４５Ｑ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｙ、Ｅ１４６Ｋ、Ｅ１４６Ｌ、Ｅ１４６Ｍ、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６Ｒ、Ｅ１４６ＳおよびＳ１４７Ｒからなる群から選択される置換を有する。
【００１０】
他の好ましい実施態様では、置換は、別個に、または組み合わせて成され得る。いかなる組合せも可能である。好ましい実施態様は、各変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質において、少なくとも１つの、好ましくはそれ以上の位置を利用する。例えば、位置５７、７５、８６、８７、９７、１１５、１４３、１４５、および１４６での置換を組み合わせて二重変異体を形成し得る。加えて、三重点変異体を生成し得る。
【００１１】
別の実施態様では、単量体または二量体の形態の非天然産生ＴＮＦ−アルファ変異体が受容体接触面に結合し、野生型ＴＮＦ−アルファの結合を乱す。さらなる実施態様では、ＴＮＦ−アルファ分子は、例えば、ＰＥＧ化（PEGylation）またはグリコシル化により、化学的に修飾され得る。
他の態様では、ＮまたはＣ末端の一部が欠失され得る。
【００１２】
さらなる態様では、ＴＮＦ−アルファ分子は、環状に変更され得る。
さらなる態様では、天然産生ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−アルファ変異型タンパク質の２またはそれ以上の受容体相互作用ドメインは、リンカーペプチドまたは他の手段により共有結合的に連結される。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードする組換え核酸、発現ベクター、宿主細胞を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、非天然産生変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の生産方法を提供する。この方法は、本発明の宿主細胞を該核酸の発現に適する条件で培養することを含む。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質および医薬担体を含む医薬組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を患者に投与することを含む、ＴＮＦ−アルファ関連障害を処置する方法を提供する。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、ＴＮＦ−アルファ変異体についての設計戦略を示す。図１Ａは、ＴＮＦ受容体と野生型ＴＮＦ−アルファとの複合体を示す。図１Ｂは、変異ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ−Ｘ）と野生型ＴＮＦ−アルファとの混合された三量体を示す。灰色の丸形は受容体分子であり、白色の五角形は野生型ＴＮＦ−アルファであり、灰色の五角形は変異ＴＮＦ−アルファである。
【００１７】
図２は、野生型ＴＮＦ−ＴＮＦ−Ｒ三量体複合体の構造を示す。
図３は、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒ細胞外ドメインの構造を示す。黒色の領域はＴＮＦ−アルファとの接触に要する残基を表現する。
【００１８】
図４は、ＴＮＦ−Ｒを結合するのに関与するＴＮＦ−アルファ上の結合部位を示す。
図５は、ＴＮＦ−アルファ三量体の接触面を示す。
【００１９】
図６Ａは、変異体がつくられるテンプレート分子として使用されるヒスチジンタグ付き野生型ＴＮＦ−アルファ分子のヌクレオチド配列を示す。追加の６ヒスチジンは、開始コドンと最初のアミノ酸の間に位置し、それに下線を引く。
図６Ｂは、開始コドンと最初のアミノ酸の間の追加の６ヒスチジン（下線）を有する野生型ＴＮＦ−アルファのアミノ酸配列を示す。ＴＮＦ−アルファ変異体で変化しているアミノ酸を太字で示す。
【００２０】
図７は、ＴＮＦ−アルファ変異体における位置およびアミノ酸変化を示す。
図８は、ＴＮＦ−アルファ活性アッセイの結果を示す。試験した１１個のＴＮＦ−アルファ変異体の１つ、Ｅ１４６Ｋのみが、野生型ＴＮＦ−アルファと類似のアゴニスト活性を有すると判明した。
【００２１】
図９は、ＴＮＦ−アルファ変異体のアンタゴニスト活性を示す。示した結果は、対照の割合として標準化されていない未加工データである。この実験では、野生型ＴＮＦ−アルファを１０ｎｇ／ｍＬで使用した。変異型ＴＮＦ−アルファの濃度は、１ｎｇ／ｍＬないし５０μｇ／ｍＬの範囲であった。
図１０Ａおよび１０Ｂは、対照に対するアポトーシスの割合について標準化された、ＴＮＦ−アルファ変異体のアンタゴニスト活性を示す。
【００２２】
図１１は、ＴＮＦ−アルファタンパク質配列の変異パターンについての別の例である。蓋然性の表は位置２１、３０、３１、３２、３３、３５、６５、６６、６７、１１１、１１２、１１５、１４０、１４３、１４４、１４６、１４７のアミノ酸残基のみを表示する。各アミノ酸残基の表示位置での発生は、相対的な蓋然性で表す。例えば、位置２１で野生型アミノ酸はグルタミンであり、ＴＮＦ−アルファ変異体では、アルギニンがこの位置で好ましいアミノ酸である。
図１２Ａ−Ｆは、ＴＲＡＦタンパク質からの三量化ドメインを示す。
【００２３】
図１３は、完全長の遺伝子の合成およびＰＣＲによるすべての可能な変異を示す。完全長遺伝子（黒棒、段階１）に対応し、１以上の所望の変異を含む重複オリゴヌクレオチドを合成し、加熱し、アニーリングを行う。ＤＮＡポリメラーゼのアニーリングされたオリゴヌクレオチドへの添加でＤＮＡの５'から３'への合成がなされ（段階２）、より長いＤＮＡ断片をつくる（段階３）。加熱、アニーリング、ＤＮＡ合成を繰り返すと、いくつかの完全長分子を含む長いＤＮＡが産生する。これらのものを、完全長遺伝子の末端に対応するＰＣＲ使用プライマー（矢印で表示）の第２段階で選択できる。
【００２４】
図１４は、野生型遺伝子を用いて本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質のライブラリーを合成するのに、好ましい方法を示す。
【００２５】
図１５は、重複伸長法を示す。図１５Ａの最上段のテンプレートＤＮＡに、変異される領域（ブラックボックス）の場所および関連プライマー（矢印）の部位を示す。プライマーＲ１およびＲ２はプライマーのプールを表し、各々が異なる変異を含有する。本明細書に記述するように、所望により、異なる比率のプライマーを用いて行い得る。変異位置はハイブリダイゼーションをなすのに十分な相同性をもつ領域に挟まれている。この例において、３つの別個のＰＣＲ反応を段階１で行う。第１反応はテンプレートおよびオリゴＦ１とＲ１を含有し、第２反応はテンプレートおよびオリゴＦ２とＲ２を含有し、第３反応はテンプレートおよびオリゴＦ３とＲ３を含有する。反応産物を表示する。段階２において、段階１チューブ１および段階１チューブ２からの産物を得る。プライマーからの精製をした後、新たなＰＣＲ反応をＦ１およびＲ４とともに行う。ＰＣＲの変性相の間に、重なり領域のアニーリングがなされ、第２鎖が合成される。次いで産物を外部プライマーで増幅する。第３段階で、第２段階からの精製産物を、第３ＰＣＲ反応に段階１チューブ３およびプライマーＦ１およびＲ３とともに使用する。最終産物は完全長遺伝子に対応し、必要な変異を含有する。
【００２６】
図１６は、本発明のライブラリーを作るためのＰＣＲ反応産物の連結反応を示す。この技法において、プライマーはまた、エンドヌクレアーゼ制限部位（ＲＥ）を含有し、平滑末端が５'突出または３'突出のいずれかである。段階１について別個の３ＰＣＲ反応を行う。第１反応はテンプレートおよびオリゴＦ１とＲ１を含有する。第２反応はテンプレートおよびオリゴＦ２とＲ２を含有する。反応産物を表示する。段階２において、段階１の産物を精製し、ついで適当な制限エンドヌクレアーゼで消化せしめる。段階２チューブ１と段階２チューブ２からの消化産物をＤＮＡリガーゼで連結する（段階３）。産物を、プライマーＦ１およびＲ４を用いて段階４で増幅する。全過程を繰り返す。即ち、増幅産物を消化せしめ、それを段階２チューブ３の消化産物に結合し、プライマーＦ１およびＲ３で最終産物を増幅する。２制限部位（ＲＥＴおよびＲＥ２）が異なっていると、段階１からのすべての３ＰＣＲ産物を１反応で結合することもできる。
【００２７】
図１７は、ＰＣＲ産物の平滑末端連結反応を示す。この技法において、Ｆ１やＲ１などのプライマーは重ならないで隣接している。さらに別個の３ＰＣＲ反応を行う。チューブ１およびチューブ２からの産物を連結し、外部プライマーＦ１およびＲ４で増幅する。この産物を段階１チューブ３からの産物と連結する。最終産物をプライマーＦ１およびＲ３で増幅する。
【００２８】
図１８は、野生型ＴＮＦ−アルファ分子の化学修飾部位の同定のアプローチを図解で例示するものである。
図１９Ａ−Ｄは、野生型ＴＮＦ−アルファおよび本発明のある種の変異体のＴＮＦＲ１結合アッセイの結果を示す。
【００２９】
図２０Ａは、本発明のＴＮＦ−アルファ変異体が予め野生型ＴＮＦ−アルファと交換されて、２９３Ｔ細胞においてＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢの活性化を低減させることを示すチャートである。図２０Ｂは、野生型ＴＮＦ−アルファとＡ１４５／Ｙ８７ＨＴＮＦ−アルファ変異体の交換が、ＨｅＬａ細胞においてＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢの核移行を阻害することを示す、ＨｅＬａ細胞におけるＮＦｋＢの免疫局在の写真である。図２０Ｃは、ＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈが、野生型ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢ作動性ルシフェラーゼレポーターの活性化を低減させることを示す。
【００３０】
図２１は、ＴＮＦ−アルファ変異体のアンタゴニスト活性を示すチャートである。
図２２Ａ−Ｃは、様々なＴＮＦによるカスパーゼ活性化の用量反応曲線である。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＴＮＦ−アルファアンタゴニスト活性を有する新規のタンパク質および核酸に関する。このタンパク質は、下記の特許等に記載のシステムを用いてつくる。ＷＯ９８／４７０８９および米国特許出願０９／０５８,４５９、０９／１２７,９２６、６０／１０４,６１２、６０／１５８,７００、０９／４１９,３５１、６０／１８１,６３０、６０／１８６,９０４、０９／４１９,３５１、０９／７８２,００４および０９／９２７,７９０、６０／３４７,７７２、および１０／２１８,１０２（これらを、出典明示により本明細書の一部とする）。一般的に、これらの出願は、非常に安定なタンパク質をつくることのできるような種々のコンピューター処理モデルシステムを開示している。この方法で、野生型ＴＮＦ−アルファのアンタゴニストとして作用するＴＮＦタンパク質の変異体を生成する。変異型ＴＮＦタンパク質を、野生型ＴＮＦ−アルファ、ｐ５５ＴＮＦ−Ｒタンパク質、ｐ７５ＴＮＦ−Ｒタンパク質から生成し得る。好ましい実施態様は変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を含む。
【００３２】
一般的に、一次変異配列ライブラリーの生成に使用できる様々なコンピューター処理方法がある。好ましい実施態様では、配列に基づく方法を使用する。あるいは、構造に基づく方法、例えば、下に詳述したＰＤＡ（登録商標）を使用する。配列の相対的エネルギーを評価するための正確さが高い他のモデルには、Warshel, Computer Modeling of Chemical Reactions in Enzymes and Solutions, Wiley & Sons, New York, (1991)、並びに２００２年８月１２日に出願された米国特許出願１０／２１８,１０２で同定される方法が含まれる。全て出典明示により本明細書の一部とする。
【００３３】
同様に、分子力学的計算は、変異体配列のスコアを個々に計算することおよび順位付けリストを編集することにより、配列をコンピューターに評価するために使用する。
【００３４】
好ましい実施態様では、残基対の力価をコンピュータースクリーニングにおいて、配列を評価するために使用する（Miyazawa et al., Macromolecules 18(3):534−552 (1985)、出典明示により本明細書の一部とする）。
【００３５】
好ましい実施態様では、配列プロファイルスコア（Bowie et al., Science 253(5016):164−70(1991)、出典明示により本明細書の一部とする）および／または力の平均の強さ（Hendlich et al.,J. Mol. Biol. 216(1): 167−180 (1990) 、出典明示により本明細書の一部とする）も配列を評価するために計算し得る。これらの方法は、配列と三次元タンパク質構造との間の釣り合いを評価し、そしてタンパク質の構造に対し適合性を調べる。配列を順位付けるために異なったスコア化関数を用い、配列空間の異なる領域をコンピューター評価でサンプル化する。
【００３６】
さらに、スコア化関数はタンパク質中で金属または補助因子の結合部位を作ると思われる配列を評価するのに使用し得る（Hellinga, Fold Des. 3(1): R１−8(1998)、出典明示により本明細書の一部とする）。同様に、スコア化関数はタンパク質中でジスルフィド結合を作ると思われる配列を評価するのにも使用し得る。これらの可能性は新しい構造的モチーフを導入するためのタンパク質構造を特異的に修正することを試みるものである。
【００３７】
好ましい実施態様では、配列および／または構造的配列プログラムは本発明の変異型ＴＮＦ−αタンパク質を生成するために使用する。当分野の技術では良く知られているように、数多くの配列を基本とする配列プログラムがある：例としては、Smith−Waterman検索、Needleman−Wunsch、DoubleAffine Smith−Waterman、フレーム検索、Gribskov/GCGプロファイル検索、Gribskov/GCGプロファイルスキャン、プロファイルフレームスキャン、Bucher帰納化プロファイル、Hidden Markov モデル、Hframe、Double Frame、Blast、Psi−Blast、Clustal、GeneWise 等である。
【００３８】
配列の供給源は幅広く変化でき、かつ、SCOP (Hubbard et al. Nucleic Acids Res 27(1):254−256. (1999))；PFAM (Bateman et al. Nucleic Acids Res 27(1):260−262. (1999))；VAST (Gibrat et al. Curr Opin Struct Biol 6(3):377−385. (1996))；CATH (Orengo et al. Structure 5(8):1093−1108. (1997)；PhD Predictor (http://www.embl−heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html)；Prosite (Hofmann et al. Nucleic Acids Res 27(1):215−219. (1999)；PIR (http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/protseqdb/)；GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；PDB (www.rcsb.org) および BIND (Bader et al. Nucleic Acids Res 29(1):242−245. (2001)を含むがこれらに限定されない、１つまたはそれ以上の既知データベースから配列を得ることを含む。
【００３９】
さらに、これらのデータベース由来の配列は、連続分析または遺伝子予測に付し得る；Wheeler et al. Nucleic Acids Res 28(1):10−14. (2000) および Burge and Karlin, J Mol Biol 268(1):78−94. (1997)。
【００４０】
当分野で知られているように、使用し得る配列アラインメント手法は数多くある。例えば、配列相同性に基くアラインメント法を、目標とする構造に関係する配列アラインメントを創出するのに使用する（Altschul et al.,J.Mol.Bio.215(3):403−410(1990)、Altschul et al., Nucleic Acids Res.25:3389−3402(1997)、両者とも出典明示により本明細書の一部とする)。これらの配列アラインメントを調べて、配列変化を決定する。これらの配列変化は、一組の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を明確にするために表に示す。
【００４１】
アラインメントに基く配列をいくつかの手法に使用する。例えば、当分野の技術で良く知られている様に、いくつかの関係するタンパク質を並び換え、そして、「可変性の」および「保存性の」残基を明確にする：即ち、ファミリーメンバー間で可変性の残基または同一性が存続する残基を明確にする。これらの結果は、下に概略を示すように確率表を作るために使用する。また、これらの配列変化を表にし、それから下記に明らかにするように二次的なライブラリーも明確にする。あるいは、許される配列変化は、コンピューター評価の間にそれぞれの部位での考えられるアミノ酸を明確にするため使用する。他の変化は、配列アラインメントで生じるアミノ酸に対するスコアを偏向せることであり、それによりコンピューター評価の間に見出される見込みを増加させるが、他のアミノ酸の考慮もなお残すものである。この偏向は、結果として目的とする変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質のライブラリーになるが、配列中に見出されていないアミノ酸を考慮から除外するものではない。さらに、いくつかの他のタイプの偏向を取り入れている。例えば、多様性を強化することである：即ち、「保存性」残基を選択し、変更して、タンパク質の多様性を強化し、サンプルを配列空間のより大きな部分とする。あるいは、ファミリーメンバー（即ち、低保存）間の変化しやすい部位を、アミノ酸の全てあるいはいくつかのサブセットを用いてランダマイズできる。アウトライアー残基、即ち部位的なアウトライアーまたは側鎖アウトライアーのいずれも除外し得る。
【００４２】
同様に、構造的に関係付けられたタンパク質の構造的なアラインメントは、配列アラインメントを作るために行う。例えば、VAST from the NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/Structure/VAST/vast.shtml); SSAP (Orengo and Taylor, Methods Enzymol 266(617−635 (1996)) SARF2 (Alexandrov, Protein Eng 9(9):727−732. (1996)) CE (Shindyalov and Bourne, Protein Eng 11(9):739−747. (1998)); (Orengo et al., Structure 5(8):1093−108 (1997); Dali (Holm et al., Nucleic Acid Res. 26(1):316−9 (1998)、全て出典明示により本明細書の一部とする、参照。これらの配列アラインメントは、観測された配列変化を決めるために調べる。ライブラリーは配列から二次構造を予測することにより、そして予測された二次構造と矛盾のない配列を選択することにより作成する。ヘリクッスコイル転移理論（Munoz and Serrano, Biopolymers 41:495,1997）、神経ネットワーク、局所的構造配列など（例えば、Selbig et al., Bioinformatics 15:1039−46, 1999を参照）のいくつかの二次構造予測法がある。
【００４３】
上で概略したように、他のコンピューター処理方法が配列プロファイル化を含め知られている。しかし、限定されるものではない。以下参照；[Bowie and Eisenberg, Science 253(5016): 164−70,(1991)]、回転異性体ライブラリー選択[Dahiyat and Mayo, Protein Sci. 5(5): 895−903(1996); Dahiyat and Mayo, Science 278(5335): 82−7(1997); Desjariais and Handel, Protein Science 4: 2006−2018 (1995); Harbury et al., Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(18): 8408−8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 19:244−255(1994);Hellinga and Richards, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 5803−5807(1994)］;およびポテンシャルあたりの残基 [Jones, Protein Science 3: 567−574, (1994)]; PROSA [Heindlich et al., J. Mol. Bio. 216:167−180(1990)]; THREADER [Jones et al., Nature 358:86−89(1992)]、そして Simons et al.により記述されいるような他の逆折り畳み法[Proteins, 34: 535−543, (1999)], Levitt and Gerstein [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:5913−5920,(1998)], Godzik and Skolnick[Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:12098−102, (1992)], Godzik et al.[J. Mol. Biol. 227:227−38, (1992)]、そして２つのプロファイル法 [Gribskov et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 4355−4358(1987), Fisher and Eisenberg, Protein Sci. 5: 947−955(1996), Rice and Eisenberg J. Mol. Biol. 267: 1026−1038(1997)]、これらは出典明示により本明細書の一部とする。
【００４４】
加えて、Koehl および Levitt により記述されているような他のコンピューター処理方法 (J. Mol. Biol. 293: 1161−1181(1999); J. Mol. Biol. 293: 1183−1193(1999); 出典明示により本明細書の一部とする）は、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーを作るのに使用する。それは実験的なスクリーニングに改良された性質と機能を使用するため、より小さい二次ライブラリーを作成するのに使用する。加えて、ＳＣＭＦに良く使われるＳＣＭＦのようなフォース・フィールド計算に基くコンピューター処理方法がある。以下参照：Delarue et al. Pac. Symp. Biocomput. 109−21(1997); Koehl et al. J. Mol. Biol. 239: 249−75(1994); Koehl et al., Nat. Struct. Biol. 2:163−70(1995); Koehl et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6: 222−6(1996); Koehl et al., J. Mol. Biol. 293: 1183−93(1999); Koehl et al., J. Mol. Biol. 293: 1161−81(1999);Lee J. Mol. Biol. 236:918−39(1994); Vasquez Biopolymers 36: 53−70(1995);出典明示により本明細書の一部とする。コンピューター処理方法において、配列の立体構造を最適化するのに、またはここで含まれる概略に示すような新たに最適化された配列を作成するのに使用される他のフォース・フィールド計算がある。しかし、限定されるものではない。以下参照；OPLS−AA [Jorgensen et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 1125−1136(1996); Jorgensen. W. L.; BOSS, Version 4.1;Yale University: New Haven, CT(1999)]; OPLS[Jorgensen et al., J.Am. Chem. Soc. 110: 1657ff(1988); Jorgensen et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 4768ff(1990)]; UNRES (United Residue Forcefield; Liwo et al., Protein Science 2:1697−1714(1993); Liwo et al., Protein Science 2:1715−1731(1993); Liwo et al., J. Comp. Chem. 18:849−873(1997); Liwo et al., J. Comp. Chem. 18:874−884(1997); Liwo et al. J. Comp. Chem. 19:259−276(1998);タンパク質構造予測のためのフォース・フィールド (Liwo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:5482−5485(1999)); ECEPP/3 [Liwo et al., J. Protein Chem. 13(4):375−80(1994)]; AMBER 1.1 force field (Weiner et al., J. Am. Chem. Soc. 106:765−784); AMBER 3.0 force field [U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82:755−759(1985)]; CHARMMおよびCHARMM22 (Brooks et al., J. Com. Chem. 4:187−217); cvff3.0 [Dauber−Osguthorpe et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 4:31−47(1988)]; cff91(Maple et al.,J. Comp. Chem. 15: 162−182)。また、DISCOVER (cvffおよびcff91)とAMBERフォース・フィールドは分子モデル化パッケージ、INSIGHT (Biosym/MSI, San Diego California)で使用されている。そして、HARMM は分子モデル化パッケージ、QUANTA (Biosym/MSI, San Diego California)で使用されている。これらの全てを出典明示により本明細書の一部とする。実際には、下に概略で示すように、これらのフォース・フィールド方法はＴＮＦ−アルファライブラリーを直接的に作成するために使用する；これらの方法は確率表を作成するのに使用し、そこから追加的なライブラリーを直接作成する。
【００４５】
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質のセットやライブラリーを作成するのに使用されるコンピューター処理方法は、Protein Design Automation（登録商標）（ＰＤＡ（登録商標））技術である。これは、米国特許出願６０／０６１,０９７、６０／０４３,４６４、６０／０５４,６７８、０９／１２７,９２６、６０／１０４,６１２、６０／１５８,７００、０９／４１９,３５１、６０／１８１６３０、６０／１８６,９０４、０９／４１９,３５１、０９／７８２,００４、０９／９２７,７９０、並びにＰＣＴＵＳ９８／０７２５４および１０／２１８,１０２に記述されている（出典明示により本明細書の一部とする）。
【００４６】
ＰＤＡ（登録商標）技術は、既知のタンパク質構造を出発点として使用する。最適化される残基を同定する。それは全体の配列あるいはそれのサブセットである。タンパク質の骨格と残っている側鎖からなる結果として得られる構造は、テンプレートと呼ばれる。それぞれの可変残基部位を場合によりコア残基、表面残基あるいは境界残基として分類し得る；それぞれの分類は部位に対し可能なアミノ酸残基のサブセットを限定する（例えば、コア残基は一般的に疎水性残基のセットから選択され、表面残基は一般的に親水性残基から選択され、そして境界残基はそのいずれかである）。それぞれのアミノ酸は、それぞれの側鎖が取り得る全ての構造の別々のセット、即ち回転異性体と呼ばれる、により表される。骨格に対し最適の配列に至るために、回転異性体の全ての可能な配列を評価しなければならない。それぞれの骨格部位は、その可能な回転異性体状態で、あるいはアミノ酸のサブセット、そして回転異性体のサブセットの中にそれぞれのアミノ酸により占められる。
【００４７】
相互作用する二セットをそれからそれぞれの回転異性体に対し全ての位置で計算する：回転異性体の側鎖と骨格の全てあるいは部分との相互作用（「シングル」エネルギー、回転異性体／テンプレートまたは回転異性体／骨格エネルギーとも呼ばれる）、回転異性体の側鎖と他の有り得る位置での別の可能な回転異性体との相互作用（「ダブル」エネルギー、回転異性体／回転異性体エネルギーとも呼ばれる）。これらの相互作用のそれぞれのエネルギーは、いくつかの変化するスコア化関数の使用を通して計算する。それはファンデルワールス力のエネルギー、水素結合のエネルギー、二次構造の性質のエネルギー、表面位置での溶媒和そして静電気的エネルギーである。このようにして、それぞれの回転異性体相互作用と骨格および他の回転異性体との相互作用の総エネルギーを計算し、マトリックス型にして保存する。
【００４８】
回転異性体セットの個々の性質は、試験される回転異性体配列の数の単純な計算を可能にする。位置あたり可能な回転異性体ｍ個を持つ長さｎの骨格はｍｎ個の可能な回転異性体配列を持つ。その数は配列長さとともに指数関数的に増加し、計算を一般的にもリアルタイムでも可能としない。従って、この組み合わせの検索の課題を解決するために、様々なアルゴリズムを採用し得る。例えば、「行き止まり排除法（Dead End Elimination）」（ＤＥＥ）計算を実施し得る。ＤＥＥ計算は、もし一番目の回転異性体の最も悪い総相互作用が二番目の回転異性体の最も良い総相互作用に比べなお良ければ、二番目の回転異性体は全体の最適解決の部分にはなりえないとの事実に基づく。全ての回転異性体のエネルギーは既に計算し終えているので、ＤＥＥのアプローチは試験する配列長さにわたる総和のみを必要とし、そして回転異性体を除外する。それは計算をかなりスピードアップさせる。ＤＥＥは回転異性体のペアまたは回転異性体の組み合わせを比較しながら再試行でき、それは結果として、全体の最適エネルギーを表す１つの配列を決定することになる。
【００４９】
いったん全体の解が見出されると、モンテカルロ検索をＤＥＥの解に基いて配列の順位付けリストまたはフィルターがけされた配列のセットを作成するために行う。ＤＥＥの解で開始し、ランダムな位置を他の回転異性体に変え、そして新しい配列を計算する。もし、新しい配列が受け入れられる基準になれば、それは他のジャンプの出発点として使用する。ジャンプの予め決められた数により、配列の順位付けたリストを作成する。モンテカルロ検索作業は、全体的に最小となる配列空間を探索するための、または配列空間における新しい局部的な最小距離を見つけ出すためのサンプリング技術である。下にさらに追加的に概略するように、使用される他のサンプリング技術、ボルツマンサンプリングを含め、遺伝的アルゴリズムと擬似的に試される強化技術がある。さらに、全てのサンプリング技術に対し可能なジャンプの種類を変える（例えば、ランダム残基へのランダムジャンプ、偏向のあるジャンプ（例えば、野生型へのまたは野生型から離れての）、偏向のある残基へのジャンプ（例えば、類似した残基へのまたは類似した残基から離れての）等）。同様に、全てのサンプリング技術に対し、サンプリングジャンプが受け入れられるかどうかの受入基準を変える。
【００５０】
米国特許出願０９／１２７,９２６（現在はＵＳ６,２６９,３１２）および１０／２１８,１０２に概略されるように、タンパク質骨格（α−炭素からβ−炭素のベクトル方向に沿って、窒素、カルボニル炭素、α−炭素そしてカルボニル酸素からなる（天然産生のタンパク質に対し））をコンピューター解析に先立ち変化させ、超二次構造パラメータと呼ばれるパラメータのセットを変え得る。
【００５１】
タンパク質の構造骨格を作成し（上で概略したように、変化を持たせて）そしてコンピューターに入力する場合、もし構造の中に含まれていなければ、判っている水素を加える（例えば、もし構造がＸ線結晶解析により作成されていると、水素を加える）。水素を追加した後、他の原子、結合角度および結合距離と同様、水素を緩和するため、構造のエネルギー最小化の計算を行う。好ましい実施態様では、静電気を持たないドライディングフォース・フィールドを最小にするため、原子の配位位置の共役勾配最小化 [Mayo et al., J. Phys. Chem. 94: 8897(1990)] をいくつかの段階で行うことにより実施する。一般的には、約１０から２５０段階が望ましく、約５０段階が最も望ましい。
【００５２】
タンパク質の骨格構造は、少なくとも１つの可変性の残基位置を含む。当分野で知られているように、タンパク質の残基またはアミノ酸は、一般的にタンパク質のＮ末端から開始して番号付けされている。Ｎ末端にメチオニンを持つタンパク質は、残基またはアミノ酸位置１にメチオニンを持っている。次の残基は２、３、４等とする。それぞれの位置で、野生型（即ち、天然産生の）タンパク質は少なくとも２０のアミノ酸の１つを持っており、回転異性体のいずれの番号でも同じである。「可変残基位置」はここではタンパク質のアミノ酸位置を意味し、そのアミノ酸位置は特殊な残基または回転異性体、一般的に野生型の残基または回転異性体として固定しないで設計する。
【００５３】
好ましい実施態様では、タンパク質の残基位置の全てが可変である。即ち、本発明の方法においては、あらゆるアミノ酸側鎖を変え得る。これはより小さなタンパク質に特に望ましいが、本方法は、より大きなタンパク質の設計も可能にする。このように設計されるタンパク質の長さに理論的な制限はないのに対し、実際上はコンピューター処理上の制限がある。
【００５４】
代わりの好ましい実施態様では、タンパク質の残基位置のいくつかのみを変え、残りの部分は「固定する」。即ち、それらを一組の立体配座の状態にして三次元構造で同定する。いくつかの実施態様で、固定された位置は元の立体配座状態を残している（それは使用される回転異性体ライブラリーの特異な回転異性体と相関するかしないかいずれかである）。あるいは、残基は非野生型残基として固定する；例えば、既知の位置指示変異誘発技術が、特殊な残基が望ましいことを示したとき（例えば、タンパク質分解の位置を除外するために、または酵素の基質特異性を変えるために）、その残基を特殊なアミノ酸として固定する。あるいは、本発明の方法を、下記するように変異を改めて評価するために使用する。代わりの好ましい実施態様では、固定された位置を「浮かせる」；その位置でのアミノ酸を固定するが、そのアミノ酸の異なる回転異性体を試験する。この実施態様では、可変残基は少なくとも１つ、または残基の総数の０.１％から９９.９％のいずれである。このように、例えば、少しの（あるいは１つの）残基または殆どの残基を、その中間にある全ての確率をもって、変えることができる。
【００５５】
好ましい実施態様では、固定できる残基は構造的にまたは生物学的に機能し得る残基を含むが、これらに限るものではない；生物学的に機能し得る残基は特異的に固定されなくてもよい。例えば、生物学的な活性に重要であると知られている残基、それは結合相手（配位子／受容体、抗原／抗体等）に対し結合部位を持つような残基、生物学的な機能に非常に重要であるリン酸化またはグルコシル化の部位、あるいは構造的に重要な残基、それはジスルフィド架橋のような部位、金属結合位置、重要な水素結合残基、プロリンまたはグリシンのような骨格立体配座に重要な残基、パッキング相互作用に重要な残基、これら全てを立体配座の中にまたは単一回転異性体として固定する、または「浮かせる」。
【００５６】
同様に、可変残基として選択され得る残基は、望ましくない生物学的特性、例えばタンパク質分解に対する感受性、二量体化や凝集化位置、免疫応答に導くグルコシル化部位、望まない結合活性、望まないアロステリック性、結合は保存されているが望ましくない酵素活性等の特性を与えるものであり得る。本発明では、下記に概略するように、可変性四量体化ドメイン残基のものである。
【００５７】
代わりの実施態様では、下記に説明するようにいくつかの場合、可変性位置は骨格のひずみを最小にするためグリシンにセットするが、それぞれ可変性位置を、コア、表面または境界残基位置として分類する。さらに、ここで概略するように、残基は分類される必要はなく、それらは使用され得るアミノ酸の可変かつ任意のセットとして選択できる。コア、表面および境界の位置のいずれの組み合わせも利用できる：コア、表面および境界残基；コアと表面残基；コアと境界残基、そして表面と境界残基、コア残基単独、表面残基単独、境界残基単独も同様である。
【００５８】
コア、表面または境界として残基位置の分類を、当分野で知られているいくつかの方法で行う。好ましい実施態様では、分類は側鎖を含め、そしてタンパク質モデル化の技術分野でうまく使われている主観的な評価に基いた分類と照らし合わせ、元のタンパク質骨格構造の視覚的走査を通して行う。あるいは、好ましい実施態様は、テンプレートＣα原子のみを用いて計算した溶媒が付き易い表面に比して、Ｃα−Ｃβベクトルの配向の評価を利用している。これは、米国特許出願６０／０６１,０９７、６０／０４３,４６４、６０／０５４,６７８、０９／１２７,９２６（現在は米国特許６,２６９,３１２）、６０／１０４,６１２、６０／１５８,７００、０９／４１９,３５１、６０／１８１６３０、６０／１８６,９０４、０９／４１９,３５１（現在は米国特許６,４０３,３１２）、０９／７８２,００４および２００１年８月１０日出願の０９／９２７,７９０、ＰＣＴＵＳ９８／０７２５４および１０／２１８,１０２に記述されている。あるいは、表面領域の計算ができる。
【００５９】
可変性位置をコア、表面または境界として分類し、アミノ酸側鎖のセットと回転異性体のセットをそれぞれの位置に割り付ける。即ち、プログラムがいずれか特定の位置で考えるアミノ酸側鎖の組を選択する。続いて、可能なアミノ酸側鎖を選択し、特定の位置での評価される回転異性体の組を決める。このように、コア残基をアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、トリプトファンおよびメチオニン（いくつかの実施態様では、ファンデルワールススコア化関数のαスケール因子が、下記のように低いとき、メチオニンはそのセットから除外される）からなる疎水性残基グループから一般的に選択する。そして、それぞれのコア位置に対する回転異性体は、これら８個のアミノ酸に対する回転異性体を含み得る（骨格非依存のライブラリーを使用する場合は全ての回転異性体、回転異性体依存の骨格を使用する場合はサブセット）。
【００６０】
同様に、表面位置をアラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる親水性残基の群から一般的に選択する。それぞれの表面位置に対する回転異性体はこれら１０個の残基を含む。最後に、境界位置はアラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンから一般的に選択する。それぞれの境界位置に対する回転異性体は、これら１７個の残基に対するあらゆる回転異性体を潜在的に含む（システイン、グリシンおよびプロリンは、使用できるが、使用しないと仮定している）。さらに、いくつかの好ましい実施態様では、１８個の天然産生アミノ酸（特に破壊的であると知られているシステインとプロリンを除く全て）のセットを使用する。
【００６１】
このように、当業者には判るように、残基位置を分類することは、計算回数を減少させるので、コンピューター処理上の利得がある。コア、境界および表面残基のセットが、上記のものから変更される状況があり得ることも、また留意すべきである；例えば、ある条件下では、１またはそれ以上のアミノ酸を許されるアミノ酸のセットに加えるか、または差し引く。例えば、二量化、三量化または多量化する、あるいはリガンド結合位置を持ついくつかのタンパク質は、疎水性表面残基を含有し得る、等。さらに、へリックスの「キャッピング」をさせないか、またはα−へリックス双極子と取り易い相互作用をさせない残基は、許される残基の組から差し引く。アミノ酸グループのこの修正は、残基ごとをベースとして行う。
【００６２】
好ましい実施態様では、プロリン、システインおよびグリシンを、可能なアミノ酸側鎖のリストに含めない。従って、これらの側鎖の回転異性体を使用しない。しかしながら、好ましい実施態様では、可変残基位置が０度より大きなφの角度、即ち、１）先行アミノ酸のカルボニル炭素；２）現在の残基の窒素原子；３）現在の残基のα炭素；４）現在の残基のカルボニル炭素で定義される二面角、を持つとき、位置をグリシンにセットし、骨格の歪みを最小にする。
【００６３】
いったん可能性のある回転異性体のグループをそれぞれの変化する残基に対し割り付けたら、米国特許出願０９／１２７,９２６（現在は米国特許６,２６９,３１２、並びにＰＣＴ ＵＳ９８／０７２５４および１０／２１８,１０２に概略されるように、結果を処理する。この処理段階は、最適化されたタンパク質配列を作成するために、回転異性体相互の、および回転異性体とタンパク質骨格との相互作用を解析することを必要とする。簡単述べると、その処理は、骨格そのものまたはタンパク質の回転異性体いずれかに対する回転異性体の相互作用エネルギーを計算するためにスコア化関数の使用をまず意味している。好ましいＰＤＡスコア化関数は、ファンデルワールス力スコア化関数、水素結合力スコア化関数、原子溶媒和スコア化関数、二次構造傾向スコア化関数および静電気的スコア化関数を含む。これらに限定されるものではない。さらに下に記述するように、α−へリックス双極子との好ましい相互作用のように、少なくとも１つのスコア化関数をそれぞれの位置をスコア付けるために使用する。なお、スコア化関数は位置の分類または他の考慮すべき事項により異なる。下に概略するように、計算に使用される全エネルギーは、一般的に式１で示されるような特定な位置で使用されるそれぞれのスコア化関数のエネルギー和である。
計算式１
Ｅtotal = ｎＥvdw + ｎＥas + ｎＥｈ−bonding + ｎＥss + ｎＥelec
【００６４】
式１において、全エネルギーは、ファンデルワールス力のエネルギー（Ｅvdw）、原子溶媒和のエネルギー（Ｅas）、水素結合のエネルギー(Ｅｈ−bonding)、二次構造のエネルギー(Ｅss)および静電気的相互作用のエネルギー(Ｅelec)の和である。項ｎは、その項が特定の位置に対して考慮されるものかどうかにより、０か１のいずれかである。
【００６５】
米国特許出願６０／０６１,０９７、６０／０４３,４６４、６０／０５４,６７８、０９／１２７,９２６（現在は米国特許６,２６９,３１２）、６０／１０４,６１２、６０／１５８,７００、６０／１８１,６３０、６０／１８６,９０４、６０／１９２,８５１、０９／４１８,７１９、０９／４１９,３５１（現在は米国特許６,４０３,３１２）、０９／７８２,００４、０９／９２７,７９０、ＰＣＴＵＳ９８／０７２５４、０９／８７７,６９５、１０／０７１,８５９、１０／１０１,４９９および１０／２１８,１０２に記述されているように、これらのスコア化関数のあらゆる組み合わせ、単独もしくは組み合わせで使用し得る。
【００６６】
いったん使用するスコア化関数をそれぞれの可変性位置に対して同定したら、コンピューター処理解析における好ましい最初の段階は、それぞれ可能な回転異性体またはアミノ酸と、タンパク質の全てまたは残りの一部との相互作用を測定することを含む。即ち、スコア化関数の１以上、骨格もしくはタンパク質の回転異性体またはアミノ酸が持つそれぞれの可変残基位置での可能な回転異性体またはアミノ酸の１以上により測定されるような、相互作用のエネルギーを計算する。好ましい実施態様では、それぞれの回転異性体またはアミノ酸と、タンパク質の残り部分全体、即ちテンプレート全体と他の回転異性体またはアミノ酸全て、との相互作用を見る。しかしながら、上で概略したように、タンパク質の部分、例えばより大きなタンパク質のドメインをモデル化することができるだけであり、従って、いくつかの場合では、タンパク質の全てが考慮される必要はない。タンパク質に関し、ここで使用する術語「部分」あるいは文法的な均等物は、そのタンパク質の断片を意味する。断片は６−１０個のアミノ酸残基から、全アミノ酸配列から１アミノ酸を引いたものまでのサイズであり得る。従って、核酸に関し、この中で使用する術語「部分」はその核酸の断片を意味する。この断片は１０個のヌクレオチドから、全体の核酸配列から１ヌクレオチドを引いたものまでのサイズである。
【００６７】
好ましい実施態様では、コンピューター処理の第一段階を、あらゆる位置でそれぞれの回転異性体またはアミノ酸に対し２組の相互作用を計算することにより行う：回転異性体側鎖またはアミノ酸とテンプレートまたは骨格との相互作用（「シングル」エネルギー）、そして回転異性体側鎖と他のあらゆる位置での他の可能な回転異性体またはアミノ酸全てとの相互作用（「ダブル」エネルギー）、その位置が変化しているのか浮いているのかである。この場合の骨格は固定されたいずれの残基の原子と同様、タンパク質の構造骨格の原子両方を含む。この中で、固定された残基をアミノ酸の特定の立体配座として定義する。
【００６８】
このように、「シングル」（回転異性体／テンプレート）エネルギーを、骨格とあらゆる可変残基位置であらゆる可能な回転異性体またはアミノ酸との相互作用に対し、スコア化関数のいくつかまたは全てを用いて計算する。水素結合スコア化関数のために、回転異性体またはアミノ酸のあらゆる水素結合原子と骨格のあらゆる水素結合原子を評価する。そして、ＥHBをあらゆる可変性位置で可能なそれぞれの回転異性体またはアミノ酸に対して計算する。同様に、ファンデルワールススコア化関数のために、回転異性体またはアミノ酸のあらゆる原子をテンプレートのあらゆる原子（一般的に骨格、それ自身の残基の原子を除いて）と比較する。そして、Ｅvdwをあらゆる可変残基位置でそれぞれの可能な回転異性体に対して計算する。さらに、一般的にファンデルワールスエネルギーは、もし原子が３個以下の結合で繋がっていれば、計算しない。原子溶媒和スコア化関数のために、回転異性体またはアミノ酸の表面をテンプレートの表面に対して測定する。そして、あらゆる可変残基位置でそれぞれの可能な回転異性体またはアミノ酸に対するＥasを計算する。二次構造傾向スコア化関数はシングルエネルギーと考えられており、全シングルエネルギーはＥｓｓの項に含んでいる。当業者には判るはずであろう、これらのエネルギー項の多くは、回転異性体またはアミノ酸とテンプレート位置の間の物理的距離に依存してゼロに近づくはずである；即ち、２つの部分構造が離れれば離れるほど低いエネルギーとなる。
【００６９】
「ダブル」エネルギー（例えば、回転異性体／回転異性体）の計算のために、それぞれ可能な回転異性体またはアミノ酸の相互作用エネルギーを他の可変残基位置全てであらゆる可能な回転異性体またはアミノ酸と比較する。こうして、「ダブル」エネルギーを、スコア化関数のいくつかまたは全てを使って、あらゆる可変残基位置であらゆる可能な回転異性体またはアミノ酸とあらゆる他の可変残基位置であらゆる可能な回転異性体またはアミノ酸との相互作用に対し計算する。水素結合スコア化関数のために、一番目の回転異性体またはアミノ酸のあらゆる水素結合原子とあらゆる可能な二番目の回転異性体またはアミノ酸のあらゆる水素結合原子を評価する。そして、ＥHBをいずれか２つの可変性位置のそれぞれ可能な回転異性体またはアミノ酸に対し計算する。同様に、ファンデルワールススコア化関数のために、一番目の回転異性体またはアミノ酸のあらゆる原子を、あらゆる可能な二番目の回転異性体またはアミノ酸のあらゆる原子と比較する。そして、Ｅvdwをあらゆる２つの可変残基位置でそれぞれ可能な回転異性体またはアミノ酸ペアに対して計算する。原子溶媒和スコア化関数のために、一番目の回転異性体またはアミノ酸の表面をあらゆる可能な二番目の回転異性体またはアミノ酸の表面に対して測定する。そして、あらゆる２つの可変残基位置でそれぞれ可能な回転異性体またはアミノ酸に対するＥasを計算する。二次構造傾向スコア化関数は、「シングル」エネルギーの一成分と考えられるので、「ダブル」エネルギーとして実行する必要はない。当業者には判るように、一番目の回転異性体と二番目の回転異性体の間の物理的距離に依存して、即ち２つの部分構造が離れれば離れるほどエネルギーは低くなり、これらダブルエネルギー項の多くはゼロに近づくはずである。
【００７０】
さらに、当業者には判るように、ＰＤＡ（登録商標）技術の計算に使用されるフォース・フィールドの多様性は以下のものを含め使用し得る。しかし、これに限るものではない。以下参照；Dreiding I and Dreiding II [Mayo et al, J. Phys. Chem. 94:8897(1990)], AMBER [Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc. 106: 765(1984), Weiner et al., J. Comp. Chem. 106: 230(1986)], MM2 [Allinger, J. Chem. Soc. 99: 8127(1977), Liljefors et al., J. Com. Chem. 8: 1051(1987)]; MMP2 [Sprague et al., J. Comp. Chem. 8: 581(1987)]; CHARMM [Brooks et al., J. Comp. Chem. 106:187(1983)]; GROMOS; MM3 [Allinger et al., J. Amer. Chem. Soc. 111: 8551(1989), OPLS−AA [Jorgensen et al., J. Am. Chem. Soc. 118: 11225−11236(1996); Jorgensen, W. L.; BOSS, Version 4.1; Yale University: New Haven, CT(1999)]; OPLS [Jorgensen et al., J. AM. Chem. Soc. 110:1657ff(1988); Jorgensen et al., J. Am. Chem. Soc. 112:4768ff(1990)]; UNRES (United Residue Forcefield; Liwo et al., Protein Science 2:1697−1714(1993); Liwo et al., Protein Science 2:1715−1731(1993); Liwo et al., J. Comp. Chem. 18: 849−873(1997); Liwo et al., J. Comp. Chem. 18: 874−884(1997); Liwo et al., J. Comp. Chrm. 19:259−276(1998); Forcefield for Protein Structure Prediction (Liwo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 96:5482−5485(1999)); ECEPP/3 [Liwo et al., J. Protein Chem. 13(4):375−80(1994)]; AMBER 1.1 フォースフィールド (Weiner et al., J. Am. Chem. Soc. 106:765−784); AMBER 3.0 フォースフィールド (U. C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 755−759); CHARMMおよびCHAMM22 (Brooks et al., J. Comp. Chem. 4: 187−217); cvff3.0 [Dauber−Osguthorpe et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, 4:31−47(1988); cff91 (Maple et al., J. Comp. Chem. 15:162−182); DISCOVER (cvff とcff91) および AMBER フォースフィールドは分子モデルパッケージINSIGHT (Biosym/MSI, San Diego California)に使用されている、および HARMM は分子モデルパッケージQUANTA(Biosym/MSI, San Diego California)に使用されている。これらの全ての文献は出典明示により本明細書の一部とする。
【００７１】
シングルスおよびダブルスエネルギーを計算しそして保存すると、コンピューター処理の次の段階を行う。米国特許出願０９／１２７,９２６（現在は米国特許６,２６９,３１２）、ＰＣＴＵＳ９８／０７２５４およびＵＳＳＮ１０／２１８,１０２に概略したように、好ましい実施態様は行き止まり排除法（ＤＥＥ）段階、モンテカルロ法を利用する。
【００７２】
ＰＤＡ（登録商標）技術は、概略すると、出力（例えば、一次ライブラリー）を変えるために変化させ得る、処理に使われる３成分；スコア化関数、フィルタリング技術およびサンプリング技術を有する。
【００７３】
好ましい実施態様では、スコア化関数を変える。好ましい実施態様では、上で概略したスコア化関数を種々の方法で偏らせ、または重み付けをする。例えば、対照配列または配列のファミリーから近づく方向または離れる方向への偏向を行う；例えば、野生型または相同残基に近づける偏向を使用する。同様に、そのタンパク質全体または断片を偏らせる：例えば、活性位置を野生型残基に近づける方向に偏らせ、または特定の望まれる物理的性質の方向に近づけるドメイン残基を偏向せしめる。さらに、エネルギーを増加させる方向へのまたは逆への偏向を生じさせる。付加的なスコア化関数偏向は、静電位傾斜または親水性傾斜を適用することに限定されないが、計算に基質または結合相手を加えること、または望ましい変化または親水性の方向に偏らせることを含む。
【００７４】
さらに、好ましい実施態様では、使用される種々の付加的なスコア化関数がある。付加的なスコア化関数は、歪み力に限定されないが、残基ペア力または残基エントロピー力を含む。その様な付加的なスコア化関数は単独で、または初めにスコア化された後ライブラリーを処理するために関数として使用され得る。ＭＨＣ（主要組織適合複合体）へのペプチドの結合についてのデータから導かれる種々の関数を、ＭＨＣに潜在的に結合し得る配列、即ち免疫原性配列を含むタンパク質を除外するためにライブラリーを再スコア化するのに使用する。例えば、米国特許出願６０／２１７,６６１；０９／９０３,３７８；１０／０３９,１７０；６０／３６０,８４３；６０／３８４,１９７；ＰＣＴ０１／２１,８２３；およびＰＣＴ０２／００１６５を参照。
【００７５】
好ましい実施態様では、ＤＥＥおよび同種技術を含む種々のフィルタリング技術を行う。しかし、これに限定されるものではない。付加的なフィルタリング技術は、限定されないが、最適な配列（Gordon and Mayo, Structure Fold. Des. 7: 1089−98, 1999) および網羅的な一覧の配列を見出すための枝分かれ−結合技術を含む。しかしながら、いくつかの技術は、フィルタリング技術なしで成され得ることに留意すべきである；例えば、サンプリング技術は、フィルタリングの非存在下で良好な配列を見いだすのに使用できる。
【００７６】
当業者にはわかるように、最適化された配列または配列のセットが作成されると、種々の配列空間サンプリング法を望ましいモンテカルロ法に加えて、またはモンテカルロ検索に代えて行う。即ち、配列または配列のセットが作成されると、望ましい方法を試験するために付加的な、関係付けられた配列の作成を可能にするサンプリング技術に利用する。
【００７７】
これらのサンプリング方法は、１以上の配列についてアミノ酸の置換、挿入、欠失、または組換えを含み得る。ここで概略するように、好ましい実施態様は、一連の偏向のある、組織的なまたはランダムなジャンプであるモンテカルロ検索を利用する。しかしながら、ボルツマンサンプリング、遺伝学的アルゴリズム技術そして模擬的に試されるアニール化を含めて、使用され得る他のサンプリング技術がある。さらに、全てのサンプリング技術に対し、許されたジャンプの種類を、ランダム残基に対するランダムジャンプに、偏向のあるジャンプに（例えば、野生型へ、または野生型から離れて）、偏向のある残基へのジャンプに（例えば、類似の残基へ、または類似の残基から離れて）変える。複数の残基位置を組み合わせる（２つの残基を常に一緒に変化させる、または決して一緒に変化させない）ジャンプ、残基の全体のセットが他の配列（例えば、組換え）に変わるジャンプがある。同様に、全てのサンプリング技術に対し、サンプリングジャンプが許されるかどうかの受入れ基準を変え、高温での広い探索および局所的最適に近い低温での狭い探索を可能にする。出典明示により本明細書の一部とする Metropolis et al., J. Chem Phys v21, pp 1087, 1953 参照。
【００７８】
さらに、発明の好ましい方法は、配列の順位付けまたはフィルターがけされたリストになることは注目すべきである；即ち、配列をいくつかの客観的な基準に基いて順位付けする。しかしながら、ここで概略するように、非順位付け配列のセットを作ることは可能である。例えば、順位付けしないで配列をリストする確率表（例えば、ＳＣＭＦ解析または配列技術を使用して）を作成することにより可能である。この中で概略するサンプリング技術はいずれの状況にも使用できる。
【００７９】
好ましい実施態様では、ボルツマンサンプリングを行う。当業者に判るように、ボルツマンサンプリングに対し温度基準を高い温度では幅広い検索が、または低い温度では局所的な最適化に近づく狭い検索ができるように変える (参照、例えば、Metropolis et al., J. Chem. Phys. 21:1087, 1953)。
【００８０】
好ましい実施態様では、サンプリング技術に遺伝学的アルゴリズムを利用する。例えば、Holland により記述されているようなアルゴリズム(Adaptation in Natural and Artifical Systems, 1975, Ann Arbor, U. Michigan Press)。遺伝的学アルゴリズム解析は、一般的に作成された配列を取り上げ、そして「遺伝子シャッフリング」に類似した方法で核酸組換え作業と同様に、コンピューター処理的に組換える。遺伝的学アルゴリズム解析の「ジャンプ」は、一般的に複数位置ジャンプである。そして、下に概略するように、関係付けられた複数ジャンプも行う。そのようなジャンプは、異なった交差位置で、そして１つ以上の組換えで同時に起こすことができ、２以上の配列の組換えを含むことができる。
【００８１】
さらに、欠失または挿入（ランダムまたは偏向）を行う。そして、下に概略するように、遺伝学的アルゴリズム解析を二次ライブラリーが作成された後に使用する。好ましい実施態様では、サンプリング技術を模擬的に試されるアニール化に利用する。たとえば、Kirkpatrick 他により記述されているようなアニール化 [Science, 220: 671−680(1983)]。模擬的に試されるアニール化は、温度を変えることにより良いまたは悪いジャンプを受け入れるためのカットオフを変える。即ち、カットオフの緊縮度は温度を変えることにより変化する。これは配列空間の新しい領域に対し、高い温度での幅広い検索ができ、詳細に領域を探索するために低い温度で狭い検索ができる。そして、下に概略したように、これらのサンプリング方法をＴＮＦ−アルファタンパク質の初めのセットから追加的セットを作成するため更なる処理に使用する。
【００８２】
本明細書で使用する場合、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−アルファタンパク質には、ＴＮＦ−アルファ（またはＴＮＦ−α）単量体または二量体が含まれる。
【００８３】
コンピューター処理は、最適化された変異型ＴＮＦタンパク質配列のセットを結果として出す。最適化変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質配列は、受容体親和性に重要な領域、例えばｐ５５やｐ７５（図２−４参照）において野生型ＴＮＦ−アルファ配列と一般的にかなり異なっている。好ましくは、最適化変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質配列は、開始または野生型の配列から、少なくとも約１、好ましくは３−５の変異アミノ酸を含む。
【００８４】
そして、最も広い意味で、本発明は、野生型ＴＮＦ−アルファのアンタゴニストである変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質に関する。ここでの「変異型ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−αタンパク質」は、少なくとも１つのアミノ酸が対応の野生型タンパク質と相違するように記述のコンピューター処理方法を用いて、設計されたＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−αタンパク質を意味する。
【００８５】
ここでの「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合的に結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む。タンパク質は、天然産生アミノ酸およびペプチド結合から、または一般的な合成の方法による合成ペプチド様構造、即ちペプトイドのような「類似体」[Simon et al., Proc. Natl. Acd. Sci. U.S.A. 89 (20:9367−71(1992)) から作成し得る。そして、この中で使用される「アミノ酸」または「ペプチド残基」は天然産生および合成の両方のアミノ酸を意味している。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびネオロイシンは本発明の目的に対しアミノ酸と考える。「アミノ酸」はまた、プロリンやヒドロキシプロリンのようなイミノ酸も含む。さらに、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の成分を表すいずれのアミノ酸も、同じアミノ酸であるが反対のキラリティーのものと置きかえることができる。従って、天然産生でＬ配置（化学物質の構造により、ＲまたはＳとも表され得る）にあるいずれのアミノ酸も、同一の化学構造タイプであるが、反対のキラリティーのアミノ酸と置きかえ得る。これは、一般的にＤ型アミノ酸と表されるが、さらにその組成および化学配置によって、Ｒ−またはＳ−と表される。そのような誘導体は、安定性を大きく増す性質を持ち、それに経口、静注,筋注、腹腔内注、局所、直腸、眼球内あるいは他の経路で投与された時、生体内でより長い半減期を持つ化合物の製剤化に有利である。好ましい実施態様で、アミノ酸は、ＳまたはＬ型の立体配座である。もし非天然型の側鎖を使用すると、非アミノ酸置換基を、例えば生体内での分解を防ぐためまたは遅らせるために使用し得る。非天然型アミノ酸を含むタンパク質を合成するか、ある場合には組換え的につくり得る (van Hest et al., FEBS Lett 428: (1−2)68−70 May 22 1998, ang et al., Abstr. Pap Am. Chem. S 218:U138−U138 Part 2 August 22, 1999、出典明示により本明細書の一部とする)。
【００８６】
芳香族アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−ナフチルアラニン、Ｄ−またはＬ−フェニルアラニン、フェニルグリシン、Ｄ−またはＬ−２−チエニルアラニン、Ｄ−またはＬ−１−,２−または３−４−ピレネイルアラニン、Ｄ−またはＬ−３−チエニルアラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン、Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン、Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン、Ｄ−ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−ｐ−メトキシビフェニルフェニルアラニン、Ｄ−またはＬ−２−インドール（アルキル）アラニンおよびｆＤ−またはＬ−アルキルアニリンである。ここでアルキルは、置換または非置換メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソペンチルである。これらはＣ１−Ｃ２０の非酸性アミノ酸である。
【００８７】
酸性アミノ酸を、負の電化を維持している間に非カルボオキシレートアミノ酸で置換し得る。そして、それの誘導体または類縁物、例えば(ホスホノ)アラニン、グリッシン、ロイシン、シオロイシン、トレオニン、セリン；または硫酸化(例えば、−ＳＯ３Ｈ)トレオニン、セリン、チロシンで置換し得る。
【００８８】
非天然水酸化アミノ酸を含む他の置換は、いずれかの天然アミノ酸と「アルキル」を組み合わせることにより作成し得る。この中で使用されている術語「アルキル」は、１ないし２４の炭素原子の分枝または非分枝の飽和炭化水素基に相当する。それらは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、シオプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラシシルおよびそれらに類似するものである。アルキルは窒素、酸素および硫黄の原子を持つヘテロアルキルを含む。この中で望ましいアルキル基は１ないし１２の炭素原子を持っている。塩基性アミノ酸を天然型アミノ酸のいずれかの位置でアルキル基と置換し得る。天然型のアミノ酸は、リシン、アルギニン、オルニチン、シトルリンまたは（グアニジノ）酢酸、または他の（グアニジノ）アルキル酢酸である。「アルキル」は上で定義している。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの場所にあるＣＮ部分を含む）もアスパルギンまたはグルタミンに置換する。そして、メチオニンスルフォキシドはメチオニンに置換する。そのようなペプチド誘導体の合成法は当分野の技術でよく知られている。
【００８９】
さらに、ＴＮＦ−アルファポリペプチドにあるアミド結合をケトンメチレン部分により置換し得る。そのような誘導体は、酵素による分解に対し安定性を増す性質を持つことが期待される。従って、経口、静注、筋注、腹腔内注、局所、直腸、眼球内あるいは他の経路で投与された時、生体内でより長い半減期を持つ化合物の製剤化に有利である。
【００９０】
本発明の変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドアミノ酸の付加的なアミノ酸修飾は、次ぎのものを含み得る：システニル残基をα−ハロアセテート（アミンに対応）、例えば 2−クロロ酢酸および／またはクロロアミドと反応させ、カルボキシメチルまたはカルボアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基を、同様ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−(５−イミダゾイル)プロピオン酸、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルキュリベンゾエート、ｐ−クロロメルキュリ−４−ニトロフェノール、クロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールとの反応により誘導化し得る。
【００９１】
ヒスチジル残基を、ジエチルプロカルボネートのような化合物と、例えば ｐＨ５.５−７.０で反応し誘導化し得る。なぜなら、この試薬はヒスチジル側鎖に対し比較的特殊であり、パラ−ブロモフェナクチルブロミドも使用し得る。；例えば、その反応は、好ましくは、０.１Ｍナトリウム・カルボジレート中ｐＨ６.０で実施する。
【００９２】
リジニルとアミノ末端残基を、酒石酸または他のカルボン酸無水物のような化合物と反応させ得る。これらの試薬を持つ誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を持つことが期待される。α−アミノを持つ残基を誘導化する他の適切な反応試薬には、イミドエステルのような化合物がある。例えば、メチルピコリニミデート；リン酸ピリドキサール；ピリドキサールクロロボロ無水物；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２,４−ペンタンジオン；グリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応である。
【００９３】
アルギニン残基を、既知の方法の段階に従い、１つあるいはいくつかの普通の反応試薬と反応させて修飾し得る。その試薬は、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオン、ニンヒドリンである。アルギニン残基の誘導体化は、反応がグアニジン官能基の高いpＫａのため、アルカリ条件中で行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リシン基並びにアルギニンのイプシロンアミノ基と反応し得る。
【００９４】
チロシル残基自体の特定の修飾は、よく知られている。それは、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタン、Ｎ−アセチルイミダゾールとの反応によりトシル残基にスペクトルラベルを導入するものである。そして、テトラニトロメタンはＯ−アセチルトシル部分と３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成するのに使用する。
【００９５】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）を、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジイミド（Ｒ'−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ'）と反応させ選択的に修飾し得る。さらに、アスパラチルおよびグルタミル残基を、アンモニウムイオンと反応させてアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換し得る。
【００９６】
アスパラギニルおよびグルタミニル残基を、対応するアスパラチルおよびグルタミル残基にしばしば脱アミド化し得る。あるいは、これらの残基を緩和な酸性条件下で脱アミド化する。これら残基のいずれの形も本発明の範囲に入る。
【００９７】
ＴＮＦ−アルファタンパク質は多くの生物体由来であり、哺乳動物由来のＴＮＦ−アルファタンパク質が特に好ましい。適切な哺乳動物は、げっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモット等）、霊長類、飼育動物（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ等）を含み、最も好ましくは、ヒト由来である（図６Ｂに示す配列）が、限定されるものではない。当業者に理解されるように、ヒト以外の哺乳動物由来のＴＮＦ−アルファタンパク質に基づくＴＮＦ−アルファタンパク質は、ヒトの疾患の動物モデルにおいて有用であり得る。
【００９８】
本発明のＴＮＦタンパク質は、野生型ＴＮＦ−アルファのアンタゴニストである。ここで、「野生型ＴＮＦ−アルファのアンタゴニスト」は、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質が、野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質による受容体シグナル伝達の活性化を阻害または有意に減少させることを意味する。好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質と相互作用し、変異型ＴＮＦ−アルファと野生型ＴＮＦ−アルファを含む複合体がＴＮＦ受容体、即ちｐ５５ＴＮＦ−Ｒやｐ７５ＴＮＦ−Ｒを活性化できないものである。
【００９９】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、野生型ＴＮＦ−アルファ６のアゴニストとして機能する変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質である。好ましくは、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は野生型ＴＮＦ−アルファと優先的に相互作用し、野生型ＴＮＦ−アルファとの混合三量体を形成する。これは受容体結合を起こさないし、および／またはＴＮＦ−アルファシグナル伝達を開始しない（図１Ａ）。
【０１００】
本明細書での混合された三量体は、野生型の単量体と変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質とが相互作用して三量体ＴＮＦ−アルファを形成することを意味する（図５）。混合された三量体は、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質と野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質が１：２または２：１で含有する。ある実施態様において、三量体は変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質のみから形成され得る（図１Ｂ）。
【０１０１】
本発明の変異型ＴＮＦ−アルファアンタゴニストタンパク質は、ＴＮＦ−ベータの拮抗作用に比してＴＮＦ−アルファ拮抗作用に高い特異性をもつ。追加の特徴は、改善された安定性、薬力学、野生型ＴＮＦ−アルファとの高い親和性を含む。野生型ＴＮＦ−アルファとの高い親和性をもつ変異体は、上記したようなＴＮＦ−アルファ拮抗作用を示す変異体から生成させることができる。
【０１０２】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファは野生型に比して生物学的活性の減少を示す。限定でないが、受容体との結合の減少、活性化の減少および／または細胞毒活性の消失を含む。ここで「細胞毒活性」は、細胞を選択的に殺すまたは阻害するＴＮＦ−アルファ変異体の活性を意味する。生物学的活性が野生型ＴＮＦ−アルファに比して５０％未満を示す変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質が好ましい。さらに好ましいのは、生物学的活性が２５％未満を示す変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質であり、一層さらに好ましいのは、生物学的活性が１５％未満を示す変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質であり、最も好ましいのは、生物学的活性が１０％未満を示す変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質である。適切な検定は、ＴＮＦ−アルファ細胞毒性アッセイ、ＤＮＡ結合検定；転写検定（レポータコンストラクト使用；Stavridi、前出）；腫瘍抑制検定（トランスフェクション検定とセルカウンティング使用；Stavridi、前出）；四量体化検定（ゲル電気泳動検定；Mateu、前出；サイズ排除クロマトグラフィー検定および放射ラベル化／免疫沈降法；Stavridi、前出）；そして安定性検定（円偏向二色性（ＣＤ）検定と平衡研究の使用を含む；Mateu、前出）；しかし、限定されるものではない。これらの全ては出典明示により本明細書の一部とする。
【０１０３】
ある実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の結合親和性に重要な少なくとも１つの性質が野生型ＴＮＦ−アルファの同じ性質に比して変わっている。特に、受容体親和性が変わった変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質が好ましい。特に望ましいのは、野生型ＴＮＦ−アルファに比してオリゴマー化に対する親和性が変わった変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質である。
【０１０４】
本発明は、変異型ＴＮＦ−アルファが野生型ＴＮＦ−アルファに優先的にオリゴマー化し、野生型ＴＮＦ−アルファ受容体、例えばｐ５５やｐ７５と実質的に相互作用しないような、変化した結合親和性を持つＴＮＦ−アルファタンパク質を提供する。「優先的に」は、変異型ＴＮＦ−アルファ単量体と野生型ＴＮＦ−アルファ単量体が等量与えられたときに、変異型と野生型との混合ＴＮＦ−アルファ三量体が少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも５０％、一層好ましくは少なくとも８０−９０％で得られることを意味する。換言すると、本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質が、野生型ＴＮＦ−アルファに比して野生型ＴＮＦ−アルファに大きい親和性をもつことが好ましい。「ＴＮＦ−アルファ受容体と実質的に相互作用しない」とは、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質がｐ５５またはｐ７５と結合し得ないで、この受容体を活性化またはＴＮＦシグナル伝達経路を開始しないことを意味する。好ましい実施態様では、少なくとも５０％の受容体活性化の減少が見られる。５０％、７６％、８０−９０％より大きいのが好ましい。
【０１０５】
上記したように、本発明は、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドをコードする変異型ＴＮＦ−アルファ核酸を提供する。変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドは、天然産生のＴＮＦポリペプチドの対応する同じ特性と比較して、少なくとも１つの異なる特性を有する。変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドの特性は、本発明のＰＤＡ分析の結果である。
【０１０６】
本明細書で使用されているポリペプチドについて「変化した性質」または文法的にその相当語句は、選択または見つけられ得るおよび天然のタンパク質の対応する性質と比較され得るポリペプチドの特性または寄与を意味する。これらの性質は、限定でないが、以下のものがある；細胞毒活性、酸化安定性、基質特異性、基質結合または触媒活性、温度安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解に対する抵抗性、動力学的会合（Ｋon）と解離(Ｋoff)速度、タンパク質の折り畳み、免疫応答を含むものとして、細胞表面に表現される能力、オリゴマー化する能力、シグナル伝達する能力、細胞増殖を刺激する能力、細胞増殖を阻止する能力、アポトーシスを引き起こす能力、リン酸化またはグルコシル化により修飾される能力、および病気を治療する能力。
【０１０７】
他に特定しない限り、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドの性質を天然型ＴＮＦタンパク質の性質と比較したとき、上にリストしたタンパク質のいずれにおいても実質的な変化が、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは２倍に増加または減少する。細胞毒活性は、野生型タンパク質に比して変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質により開始される細胞死が７５％以上になることで証明する。
【０１０８】
結合親和性の変化は、野生型ＴＮＦ受容体タンパク質または野生型ＴＮＦ−アルファに対して結合親和性が少なくとも５％以上増加または減少することで証明する。
【０１０９】
酸化安定性における変化を、種々の酸化条件にさらしたとき、野生型ＴＮＦ−アルファの活性と比較して変異型ＴＮＦ−アルファの活性が少なくとも約２０％、より望ましくは少なくとも５０％増加することにより証明する。酸化安定性は既知の手順により測定する。
【０１１０】
アルカリ安定性における変化を、増加または減少のｐＨ条件にさらしたとき、野生型ＴＮＦ−アルファの活性と比較して変異型ＴＮＦ−アルファの活性が半減期で少なくとも約５％以上大きく増加か減少（好ましくは増加）することにより証明する。一般的に、アルカリ安定性は既知の手順により測定する。
【０１１１】
温度安定性における変化を、比較的高い温度と中性ｐＨにさらした時、野生型ＴＮＦ−アルファの活性と比較して変異型ＴＮＦ−アルファの活性が半減期で少なくとも約５％、またはより大きく増加か減少（望ましくは増加）することにより証明する。一般的に、温度安定性は既知の手順により測定する。
【０１１２】
同様に、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、例えば、インビボおよびインビトロのアッセイにおいて、実験的に試験し、確認する。適するアッセイには、活性アッセイおよび結合アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、カスパーゼ活性を介するアポトーシスを検出するなどのＴＮＦ−アルファ活性アッセイは、野生型ＴＮＦ−アルファのアンタゴニストであるＴＮＦ−アルファ変異体の探索に使用できる。他のアッセイには、アクチノマイシン−Ｄ感受性細胞株において、ＴＮＦに誘導される細胞透過性の検出に Sytox グリーン核酸染料を使用することが含まれる。この染料は生きている細胞から排除されるが死んでいる細胞を透過するので、このアッセイも野生型ＴＮＦ−アルファのアゴニストであるＴＮＦ−アルファ変異体の検出に使用できる。ここで、「野生型ＴＮＦ−アルファのアゴニスト」は、野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質による受容体シグナル伝達の活性化を増強する変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を意味する。一般的に、野生型ＴＮＦ−アルファのアゴニストとして機能する変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、好ましくない。しかしながら、いくつかの実施態様では、野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質のアゴニストとして機能する変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は好ましい。ＮＦカッパＢアッセイの例は、実施例７に提示されている。
【０１１３】
好ましい実施態様では、天然産生のＴＮＦ−アルファおよびｐ５５やｐ７５などのＴＮＦ受容体タンパク質に対する変異型ＴＮＦ−アルファの結合親和性を、野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質に比して調べることを含む。適するアッセイには、例えば、動力学的定数と平衡結合定数の定量的比較が含まれるが、これらに限定されるものではない。動力学的会合速度(Ｋon)と解離速度（Ｋoff）、そして平衡結合定数(Ｋｄ)を、文献の標準手順に従い BIAcore社製装置により、表面プラズモン共鳴を使用して測定する [Pearce et al., Biochemistry 38:81−89(1999)]。再度、概略するように、変異型ＴＮＦ−アルファが野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質との混合三量体を優先的に形成し、野生型ＴＮＦ−アルファ受容体と実質的に相互作用しないことが好ましい。結合アッセイの例は、実施例６に記載されている。
【０１１４】
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の宿主動物における抗原性プロファイルは、宿主ＴＮＦ−アルファの抗原性プロファイルに対し類似しており、そして望ましくは同等である；即ち、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は免疫応答に対し宿主生物体（例えば、患者）を充分に刺激しない；即ち、いずれの免疫応答も臨床的には適切でなく、抗体によるアレルギー反応またはタンパクの中性化もない。即ち、好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦ−αタンパク質は、ＴＮＦ−アルファとは付加的または異なったエピトープを含んでいない。ここでの「エピトープ」または「決定基」は、抗原を生成するおよび／または結合するタンパク質の一部を意味する。そして、殆どの例において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質に対して、抗体の意味のある量は生成されない。一般的に、これは表面残基を変えることによっても、下に概略するように新しいグルコシル化が免疫応答を示すとき、グルコシル化が起こる表面にあるいずれのアミノ酸残基を付加しても達成されない。
【０１１５】
本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質および核酸は天然の野生型ＴＮＦ−アルファと区別できる。「天然産生」または「野生型」または文法的に相当な語句は、自然に見出されるアミノ酸配列または核酸を意味し、対立遺伝子の変化を含む；即ち、通常は計画的に修飾されないアミノ酸配列または核酸配列である。従って、「非天然産生」または「合成」または「組換え」または文法的に相当な語句は、天然には見出されないアミノ酸配列または核酸配列をここでは意味する；即ち、通常は計画的に修飾されるアミノ酸配列または核酸配列である。組換え核酸がつくられ、そして宿主細胞または生物体に再導入されると、それは非組換え的に転写すると理解される。即ち、インビトロ操作よりもむしろインビボで宿主細胞の細胞装置を使用して起こるだろう。しかしながら、そのような核酸は、一旦組換え的につくられると、その後非組換え的に転写されても、発明の目的にはなお組換え体と考えられる。天然のヒトＴＮＦ−アルファの代表的なアミノ酸と核酸配列を図６ＡおよびＢに示す。他の方法で述べない限り、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質と変異型ＴＮＦ−アルファ核酸の全ての位置番号付けは、これらの配列に基いている。即ち、当業者には判るであろうように、ＴＮＦ−アルファタンパク質と変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の配列を、下に概略するように、２つのタンパク質間の「同等な」位置を同定するのに、標準的なプログラムを使用して行うことができる。そして、本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質と核酸とは非天然産生である；即ち、それらは自然に存在しない。
【０１１６】
そして、好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、野生型ＴＮＦ−アルファ配列とは、残基の少なくとも１−５％異なるアミノ酸配列を持っている。即ち、本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、野生型ＴＮＦ−アルファアミノ酸配列と約９７−９９％以下で同じである。従って、タンパク質は、図６に示したアミノ酸配列に対しタンパク質配列の全てにわたる相同性が、好ましくは約９９％以下、より好ましくは約９８％以下、さらにより好ましくは約９７％以下、そして最も望ましくは９５％以下であるならば、「変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質」である。いくつかの実施態様では、相同性は約７５から８０％と同じ低さである。別の言い方をすれば、図６ＢのヒトＴＮＦ配列に基けば、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、少なくとも約２、３、４、５の異なる残基を持ち、ヒトＴＮＦ−アルファ配列と少なくとも約１つの残基を持っている。望ましい変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、１−３の異なる残基を持つ。
【０１１７】
本文における相同性は、配列類似性または同一性を意味し、同一性が望ましい。当分野の技術では良く知られているように、数多くの異なるプログラムは、タンパク質（または下に記述する核酸）が既知の配列に対し、同一のまたは類似の配列を持つかどうかを同定するために使用されている。配列同一性および／または類似性は、当分野の技術で知られている標準の技術を使用して決定される。それらは以下のものを含む。しかし、限定されるものではない。Smith & Waterman の局所配列同一性アルゴリズム、Adv. Appl. Math., 2:482(1981)、Needleman & Wunsch の配列同等性配列アルゴリズム、J. Mol. Biol., 48:443(1970)、Pearson & Lipman の類似性法のための検索、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444(1988)、これらのアルゴリズムの計算実施（GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA, Wisconsin Genetic Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI）、Devereux et al.,により記述されたBest Fit 配列プログラム、Nucl. Acid Res., 12:387−395(1984)、デフォルトセッティングを使用すること、または点検が望ましい。パーセント同一性が次のようなパラメータに基いてFast DB により計算される；ミスマッチペナルティー、1；ギャップペナルティー、1; ギャップサイズペナルティー、０.３３；ジョイニングペナルティー、３０、"Current Method in Sequence Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127−149(1988), Alan R. Liss, Inc.。
【０１１８】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは漸進的、ペア組み合わせ配列を使用して関係する配列から複数の配列アラインメントを創生する。それは配列を創生するために使用されるクラスター化の関係を示すツリーをプロットもできる。ＰＩＬＥＵＰはFeng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351−360 (1987) の斬新配列法の単純化を使用している;その方法は Higgins & Sharp CABIOS 5:151−153 (1989) により記述されたものに類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは３.００のデフォルトギャップ重み、０.１０のデフォルトギャップ長さ重みおよび重みづけられたエンドギャップを含む。
【０１１９】
有用なアルゴリズムの他の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。以下に記述されている；Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403−410,(1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389−3402 (1997); および Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873−5787 (1993)。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Altshul et al., Methods in Enzymology, 266:460−480 (1996); http://blast.wust/edu/blast/README.html] から得られた ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用する。その殆どをデフォルト値にセットする。調整可能なパラメータを次の値でセットする：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０.１２５、ワードスレショールド（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは動力学的値であり、興味ある配列を検索して行くのに特定の配列の組成と特定のデ−タベースの構成によりプログラムそれ自身で実行する；しかしながら、それらの値は感度を増すために調整する。
【０１２０】
さらに有用なアルゴリズムは、Altschul et al., Nucl. Acid Res., 25:3389−3402 に報告されているギャップドＢＬＡＳＴである。ギャップドＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２の置換スコアを使用する；スレショールドＴパラメータを９にセットする；拡張子をギャップさせないトリガーに対する二点ヒット法；κの電荷ギャップ長さ、１０+κの値段；Χuを１６にセット、そしてΧｇを検索段階のデータベースに対し４０にセットし、アルゴリズムの出力段階でに対し６７にセットする。ギャップ化された配列は、〜２２ビットに対応するスコアにより引き起こされる。
【０１２１】
パーセントアミノ酸配列同一性の値は、マッチする同一残基の数を、アラインメントを行った領域における「より長い」配列の総残基数で割って決定される。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中で実際の残基を最も多く有するものである（アラインメントスコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップを無視する）。
【０１２２】
同様にして、本発明で同定されるポリペプチドのコード配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」を、標的タンパク質のコード配列のヌクレオチド残基と同一な、候補配列中のヌクレオチド残基の割合として定義する。好ましい方法は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールをデフォルトパラメータに設定し、重複スパンおよび重複フラクションをそれぞれ１および０.１２５に設定して利用する。
【０１２３】
アラインメントは、アラインメントを行う配列中へのギャップ導入を含んでもよい。加えて、図６Ｂの配列より多いかまたは少ないアミノ酸を含有する配列については、ある実施態様では、配列同一性の割合は、アミノ酸総数に関する同一アミノ酸数に基づいて決定されると理解される。そして、例えば、図６に示したそれよりも短い配列の配列同等性は、以下で議論するように、１つの実施態様では、より短い配列にあるアミノ酸の番号を使用して決められる。パーセント同一性の計算においては、相対的重みは、挿入、欠失、置換その他のような種々の配列変化の表出には割り当てられない。
【０１２４】
ある実施態様では、同一性のみがプラスのスコアを与えられ（＋１）、ギャップを含むあらゆる形態の配列変化に「０」の値が割り当てられる。これにより、配列類似性計算について後述するような、重みをつけた目盛りまたはパラメータの必要性がなくなる。例えば、パーセントアミノ酸配列同一性は、マッチする同一残基の数を、アラインメントを行った領域における「より短い」配列の総残基数で割り、１００を掛けて算出される。「より長い」配列は、アラインメントを行った領域中で実際の残基を最も多く有するものである。
【０１２５】
従って、本発明の変異タンパク質は、図６Ｂに示すアミノ酸配列よりも、短くても長くてもよい。標的配列の部分または断片が、変異タンパク質の定義に包含される。本発明で使用する場合、「野生型ＴＮＦ−アルファ」は、自然の哺乳動物のタンパク質（好ましくはヒト）である。ＴＮＦ−アルファは、多型である。アミノ酸配列の例を図６Ｂに示す。従って、好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦタンパク質の定義に含まれるものは、表中に示された部分または配列の断片である。変異タンパク質の断片は、ａ）少なくとも１つの抗原エピトープを共有する；ｂ）少なくとも指示された相同性を有する；ｃ）そして好ましくは変異型ＴＮＦ−アルファの生物学的活性を示す場合、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質とみなされる。
【０１２６】
好ましい実施態様では、以下に詳しく概略するように、野生型ＴＮＦ−アルファと比較して、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、ここで概略するよりもさらに多くのアミノ酸変化を含む。そして、ここで概略するように、ここで描かれた変化のいずれをも、付加的な新しい変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を形成するために何らかの方法で組み合わせ得る。
【０１２７】
さらに、例えば、エピトープまたは精製タグの付加により、ここで概略するように他の融合配列等の付加により、図に描かれたものより長い変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を作成し得る。例えば、発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を、治療的タンパク質にまたはＦｃのような他のタンパク質に、または薬物動態的な目的のため血清アルブミンに融合させる。参照、例えば、米国特許５,７６６,８８３および５,８７６,９６９（出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１２８】
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、以下の位置から選択される残基を含む；２１、２３、３０、３１、３２、３３、３４、３５、５７、６５、６６、６７、７５、８４、８６、８７、９１、９７、１１１、１１２、１１５、１４０、１４３、１４４、１４５、１４６および１４７。
【０１２９】
コア、表面および境界残基に可変残基を含む変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質も、本発明に含まれる。
【０１３０】
ヒトＴＮＦ−アルファ残基を含む、各位置について好ましいアミノ酸を図７に示す。従って、例えば、位置１４３では、好ましいアミノ酸はＧｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、およびＬｙｓなどである。
【０１３１】
好ましい変化には、以下のものが含まれる：Ｑ２１Ｃ、Ｑ２１Ｒ、Ｅ２３Ｃ、Ｎ３４Ｅ、Ｖ９１Ｅ、Ｑ２１Ｒ、Ｎ３０Ｄ、Ｒ３１Ｃ、Ｒ３１Ｉ、Ｒ３１Ｄ、Ｒ３１Ｅ、Ｒ３２Ｄ、Ｒ３２Ｅ、Ｒ３２Ｓ、Ａ３３Ｅ、Ｎ３４Ｅ、Ｎ３４Ｖ、Ａ３５Ｓ、Ｄ４５Ｃ、Ｌ５７Ｆ、Ｌ５７Ｗ、Ｌ５７Ｙ、Ｋ６５Ｄ、Ｋ６５Ｅ、Ｋ６５Ｉ、Ｋ６５Ｍ、Ｋ６５Ｎ、Ｋ６５Ｑ、Ｋ６５Ｔ、Ｋ６５Ｓ、Ｋ６５Ｖ、Ｋ６５Ｗ、Ｇ６６Ｋ、Ｇ６６Ｑ、Ｑ６７Ｄ、Ｑ６７Ｋ、Ｑ６７Ｒ、Ｑ６７Ｓ、Ｑ６７Ｗ、Ｑ６７Ｙ、Ｌ７５Ｅ、Ｌ７５Ｋ、Ｌ７５Ｑ、Ａ８４Ｖ、Ｓ８６Ｑ、Ｓ８６Ｒ、Ｙ８７Ｈ、Ｙ８７Ｒ、Ｖ９１Ｅ、Ｉ９７Ｒ、Ｉ９７Ｔ、Ａ１１１Ｒ、Ａ１１１Ｅ、Ｋ１１２Ｄ、Ｋ１１２Ｅ、Ｙ１１５Ｄ、Ｙ１１５Ｅ、Ｙ１１５Ｆ、Ｙ１１５Ｈ、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｋ、Ｙ１１５Ｌ、Ｙ１１５Ｍ、Ｙ１１５Ｎ、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｒ、Ｙ１１５Ｓ、Ｙ１１５Ｔ、Ｙ１１５Ｗ、Ｄ１４０Ｋ、Ｄ１４０Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｌ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｓ、Ｆ１４４Ｎ、Ａ１４５Ｄ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｆ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５Ｍ、Ａ１４５Ｎ、Ａ１４５Ｑ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｔ、Ａ１４５Ｙ、Ｅ１４６Ｋ、Ｅ１４６Ｌ、Ｅ１４６Ｍ、Ｅ１４６Ｎ、Ｅ１４６Ｒ、Ｅ１４６ＳおよびＳ１４７Ｒ。
【０１３２】
これらは個々に、または組み合せて行い得る。いかなる組み合わせも可能である。しかしながら、上記の様に、好ましい実施態様では、各変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質において少なくとも１ないし５、好ましくはそれ以上の位置を利用する。
【０１３３】
本発明の目的のためには、修飾される野生型または天然産生ＴＮＦ−アルファ分子の領域を、ラージドメイン（Large Domain）(ＩＩとしても知られる）、スモールドメイン（Small Domain）(Ｉとしても知られる）、ＤＥループ、および三量体接触面からなる群から選択する。ラージドメイン、スモールドメインおよびＤＥループは、受容体相互作用ドメインである。修飾は、これらの領域の１つにおいて単独で、またはこれらの領域のいかなる組合せにおいても為し得る。
【０１３４】
ラージドメインで好ましい変異する位置には、以下のものが含まれる：２１、３０、３１、３２、３３、３５、６５、６６、６７、１１１、１１２、１１５、１４０、１４３、１４４、１４５、１４６および／または１４７（図１１）。スモールドメインについて、好ましい変異する位置は、７５および／または９７である。ＤＥループについては、好ましい修飾位置は、８４、８６、８７および／または９１である。三量体接触面は、好ましくは、３４および９１を含む二重変異並びに位置５７におけるものを有する
【０１３５】
好ましい実施態様では、多数の受容体相互作用および／または三量体化ドメインでの置換を組み合わせ得る。例には、ラージおよびスモールドメイン（例えば、Ａ１４５ＲおよびＩ９７Ｔ）、ラージドメインおよびＤＥループ（Ａ１４５ＲおよびＹ８７Ｈ）、およびラージドメインおよび三量体化ドメイン（Ａ１４５ＲおよびＬ５７Ｆ）でのアミノ酸の同時置換が含まれるが、これらに限定されるものではない。追加例には、例えば、Ｉ９７ＴおよびＹ８７Ｈ（スモールドメインおよびＤＥループ）などの、いかなる、そしてあらゆる組合せも含まれる。
【０１３６】
ことさらに、これらの変異体は、例えばＫ１１２Ｄ、Ｙ１１５Ｋ、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｔ、Ａ１４５ＥまたはＡ１４５Ｒなどの、単一点の変異の形態であり得る。これらの単一点の変異は、例えば、Ｙ１１５ＩとＡ１４５Ｅ、またはＹ１１５ＩとＡ１４５Ｒ、またはＹ１１５ＴとＡ１４５Ｒ、またはＹ１１５ＩとＡ１４５Ｅ；または任意の他の組合せのように、組み合わせ得る。
【０１３７】
好ましい二重点の変異位置には、５７、７５、８６、８７、９７、１１５、１４３、１４５および１４６が、任意の組合せで含まれる。
【０１３８】
さらに、二重点の変異は、Ｌ５７Ｆと、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｑ、Ｙ１１５Ｔ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｒ、Ｄ１４３Ｅ、Ａ１４５Ｅ、Ａ１４５Ｒ、Ｅ１４６ＫまたはＥ１４６Ｒの１つを含めて生成し得る。
【０１３９】
他の好ましい二重変異は、Ｙ１１５Ｑと、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５ＲまたはＥ１４６Ｋの少なくとも１つ；Ｙ１１５Ｍと、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｑ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５ＲまたはＥ１４６Ｋの少なくとも１つ；およびＬ５７Ｆと、Ａ１４５Ｅまたは１４６Ｒの少なくとも１つ；Ｋ６５Ｄと、Ｄ１４３ＫまたはＤ１４３Ｒのいずれか、Ｋ６５Ｅと、Ｄ１４３ＫまたはＤ１４３Ｒのいずれか、Ｙ１１５Ｑと、Ｌ７５Ｑ、Ｌ５７Ｗ、Ｌ５７Ｙ、Ｌ５７Ｆ、Ｉ９７Ｒ、Ｉ９７Ｔ、Ｓ８６Ｑ、Ｄ１４３Ｎ、Ｅ１４６Ｋ、Ａ１４５ＲおよびＩ９７Ｔのいずれか、Ａ１４５Ｒと、Ｙ８７ＲまたはＹ８７Ｈのいずれか；Ｎ３４ＥとＶ９１Ｅ；Ｌ７５ＥとＹ１１５Ｑ；Ｌ７５ＱとＹ１１５Ｑ；Ｌ７５ＥとＡ１４５Ｒ；並びにＬ７５ＱとＡ１４５Ｒである。
【０１４０】
さらに、三重点変異体を生成し得る。好ましい位置には、３４、７５、８７、９１、１１５、１４３、１４５および１４６が含まれる。三重点変異体の例には、Ｖ９１Ｅ、Ｎ３４Ｅと、Ｙ１１５Ｉ、Ｙ１１５Ｔ、Ｄ１４３Ｋ、Ｄ１４３Ｒ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｅ、Ｅ１４６ＫおよびＥ１４６Ｒの１つが含まれる。他の三重点変異体には、Ｌ７５ＥとＹ８７ＨおよびＹ１１５Ｑ、Ａ１４５Ｒの少なくとも１つ、また、Ｌ７５Ｋ、Ｙ８７ＨおよびＹ１１５Ｑが含まれる。より好ましくは、三重点変異体Ｖ９１Ｅ、Ｎ３４Ｅと、Ａ１４５ＲまたはＡ１４５Ｅのいずれかである。
【０１４１】
好適な実施態様では、本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質はヒトＴＮＦ−アルファのコンフォマー（conformer）である。本明細書で「コンフォマー」は、三次元構造のタンパク質骨格が実質的に同じであるが、アミノ酸側鎖に有意な差異を持つタンパク質を意味する。即ち、本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質はコンフォマーのセットを定義するが、このセットのタンパク質は全て同じ骨格構造を共有しているが少なくとも１−３−５％異なる配列を持つ。変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の三次元骨格構造は、ヒトＴＮＦ−アルファの三次元骨格構造に実質的に対応する。この文脈での「骨格」は非側鎖原子、即ち：窒素、カルボニルの炭素および酸素、α−炭素、および窒素およびα−炭素に付着している水素を意味する。タンパク質であるコンフォマーはヒトＴＮＦ−アルファ構造から２オングストロームＲＭＳＤ以内に骨格原子を持たなければならないと考えられ、１.５オングストロームＲＭＳＤ以内が好適であり、１オングストロームＲＭＳＤ以内が特に好適である。一般にこの距離は２つの方法で決定し得る。ある実施態様では、可能な各コンフォマーを結晶化させてその三次元構造を決定する。あるいは、前記方法はとても面倒なので、可能な各コンフォマーの配列をＰＤＡ（登録商標）技術プログラムに付してそれがコンフォマーであるかどうかを決定する。
【０１４２】
変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質はまた、変異型ＴＮＦ−アルファ核酸にコードされることによって同定し得る。核酸の場合、核酸配列の全般的相同性はアミノ酸の相同性と対応するが、遺伝子コードの縮重および様々な生物のコドン偏向を配慮する。従って核酸配列相同性はタンパク質配列のものよりも低いことも高いこともあり、低い相同性の方が好適である。
【０１４３】
好適な実施態様では、変異型ＴＮＦ−アルファ核酸は変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードする。当分野で認められるように、遺伝子コードの縮重のために非常に大きな数の核酸を作成できるが、その全てが本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードする。そこで特定のアミノ酸配列が同定されれば、当業者は変異型ＴＮＦ−アルファのアミノ酸配列を変更しない方法で１またはそれ以上のコドンの配列を単純に修正することによって、異なる核酸をいくつでも作成し得る。
【０１４４】
ある実施態様では、核酸相同性はハイブリッド形成研究によって決定する。そこで例えば図６Ａに示す核酸配列またはその相補鎖および変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードする配列に高い緊縮度（stringency）でハイブリッドを形成する核酸は、変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子と考えられる。
【０１４５】
高緊縮度条件は当技術分野で知られており、例えば、共に出典明示により本明細書の一部とするManiatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual., 2d Edition, 1989 および Short Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al.編を参照。緊縮度の条件は配列依存性であって条件によって異なる。長い配列は高温でハイブリッドを特異的に形成する。核酸のハイブリッド形成に関する詳細な指針は Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993) に見出される。一般に緊縮条件は特定の配列に対して所定のイオン強度およびｐＨにおける熱的融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択する。このＴｍは（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下で）標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリッドを形成する（標的配列が過剰に存在するので、このＴｍでの平衡時にはプローブの５０％が占拠される）温度である。緊縮度条件はナトリウムイオン約１.０Ｍ以下、典型的にはｐＨ７.０〜８.３で塩濃度がナトリウムイオン（または他の塩）約０.０１から約１.０Ｍであって、温度は短いプローブ（例えば１０から５０ヌクレオチド）に対しては低くとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば５０ヌクレオチド以上）に対しては低くとも約６０℃である。緊縮度条件はまたホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成し得る。
【０１４６】
別の一実施態様では当技術分野で知られているように緊縮度がさらに低いハイブリッド形成条件、例えば中庸なまたは低い緊縮度を使用する。Maniatis et al.（前出）、Ausubel et al.（前出）および Tijssen（前出）を参照。
【０１４７】
本発明による変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質および核酸は組換え体である。本明細書に使用する「核酸」はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか、またはデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの双方を含む分子を示す。この核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびセンスおよびアンチセンス核酸を含むオリゴヌクレオチドを包含する。このような核酸はまた生理学的環境下におけるその分子の安定性および半減期を改善するためにリボース−リン酸骨格に修飾を含み得る。
【０１４８】
この核酸は２本鎖または１本鎖であるか、または２本鎖の部分と１本鎖の部分との双方を含み得る。当分野で認められるように１本鎖（「ワトソン（Watson）」）の描写は他の鎖（「クリック（Crick）」）の配列を決定する；従って、図６に示す配列はその配列の相補鎖も含む。本明細書における「組換え核酸」の用語は、一般的に、核酸をエンドヌクレアーゼによって操作して、天然には通常見出されない形状で、当初にインビトロで形成した核酸を意味する。そこで分離した直線状の変異型ＴＮＦ−アルファ核酸、または正常には結合していないＤＮＡ分子に連結することによって試験管内で形成された発現ベクターは、共にこの発明の目的には組換え体であると考えられる。一旦組換え核酸が作成され宿主細胞または生物に再導入されたら、それは非組換え的に、即ち、インビトロの操作ではなく宿主細胞のインビボの細胞機構を使用して複製すると理解される；しかしながら、そのような核酸は一旦組換え的に産生されれば、以後は非組換え的に複製しても、本発明のためにはなお組換え体と考えられる。
【０１４９】
同様にして「組換えタンパク質」は組換え技術を使用して、即ち前記組換え核酸の発現によって作成したタンパク質である。組換えタンパク質は、天然産生タンパク質と少なくとも１種以上の特性によって区別される。例えばそのタンパク質は野生型宿主内では正常に混合しているタンパク質および化合物のいくつかまたは全部から離されて分離または精製されて実質的に純粋になっていることもある。例えば、分離されたタンパク質は天然の状態では通常に混合している物質の少なくともいくつかを伴っておらず、所与の試料中の全タンパク質の好ましくは少なくとも約０.５重量％、さらに好ましくは少なくとも５重量％を構成する。実質的に純粋なタンパク質は全タンパク質の少なくとも約７５重量％、好適には少なくとも約８０％、殊に好適には少なくとも約９０％を含む。この定義には変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の様々な生物または宿主細胞の生物１種からの生産を含む。あるいはタンパク質を増大した濃度レベルで作成するように誘導可能なプロモーターまたは高発現プロモーターを使用することによって、そのタンパク質は通常見られるよりも有意に高い濃度で作成できる。さらにその上、本明細書に略述する全変異型ＴＮＦ−アルファ配列はアミノ酸の置換、挿入および欠失を含むので正常には天然には見出せない型である；この中では以下に説明するように置換が最も好適である。
【０１５０】
本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の定義には本明細書に略述し、各図に記載する変異型ＴＮＦ−アルファ配列のアミノ酸配列変異体も含む。即ちこの変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質はヒトＴＮＦ−アルファと比較して可変位置が追加されていてもよい。この変異体は、置換変異体、挿入変異体または欠失変異体の３群の１以上に属する。これらの変異体は通常変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードするＤＮＡにあるヌクレオチドをカセット変異誘発またはＰＣＲ変異誘発またはその他の当技術分野でよく知られている技術を用いる位置特異的変異誘発を行ってその変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後にそのＤＮＡを前記に略述したようにして組換え細胞培養で発現することによって製造する。しかしながら約１００〜１５０残基を有する変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質断片は確立された技術を使用して試験管内合成によって作成し得る。アミノ酸配列変異体は予め決定しておいた変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質アミノ酸配列の天然産生対立遺伝子または種間変化の範囲から離れて設定した特徴である変異体の性質によって特徴付けられる。この変異体は典型的には天然産生類似体と定性的に同じ生物学的活性を示すが、この変異体はまた以下に詳細に記述するように修正された特徴を有するようにも選択できる。
【０１５１】
変異型アミノ酸配列を導入するための部位または領域は予め決定しておくが、変異それ自体を決定しておく必要はない。例えば所定の部位における変異の効率を最適化するために、標的コドンまたは標的領域に無作為変異誘発を行い、発現された変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を所望する活性の最適な組合せについて検索してもよい。知られている配列を持つＤＮＡ内の所定の位置における置換変異を行うための技術はよく知られており、例えばＭ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発がある。変異体の検索は変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質活性についての各検定法を用いて行う。
【０１５２】
アミノ酸置換は典型的には単一な残基のものである；挿入は通常は約１個から約２０個までのオーダーのアミノ酸であるが、かなり長い挿入も許容される。欠失は約１個から約２０個までの範囲の残基にわたるが、場合によってはさらに大きなものであり得る。
【０１５３】
置換、欠失、挿入またはその組合せを使用して最終的誘導体に到達してもよい。一般にこのような変化はアミノ酸少数に行って分子の変化を小さくする。しかしながら場合によってはさらに大きな変化にも耐えられる。変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の特性に小さな変化を起させることを望むとき、置換は一般に次の図表に従って行う。
図表１
【表１】
2005512521.tif 000002
【０１５４】
機能もしくは免疫学的同一性における実質的な変化は、図表Ｉに示されたものより保存性の低い置換を選択することによって行う。例えば、より大きく影響する置換を行うことができる：それらは、変化する区域のポリペプチドバックボーンの構造、例えばα−ヘリックス構造もしくはβ−シート構造；標的位置の分子の電荷もしくは疎水性；または側鎖の大きさである。一般的にポリペプチドの性質に最も大きな変化を生じると期待される置換は（ａ）親水性残基、例えばセリルもしくはスレオニルを、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルに（もしくは、により）変える、（ｂ）システインもしくはプロリンを他のいずれかの残基に（もしくは、により）変える、（ｃ）正電荷を持つ側鎖、例えばリシル、アルギニル、もしくはヒスチジルを、負電荷を持つ側鎖、例えばグルタミル、アスパルチルに（もしくは、により）変える、（ｄ）嵩高い側鎖を持つ残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を持たない残基、例えばグリシンに（もしくは、により）変える、置換である。
【０１５５】
変異体は典型的には元来の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質と定性的に同じ生物学的活性を発揮し、同じ免疫応答を誘起する。必要に応じて変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の特性を修飾するような変異体もまた選択する。これに代えて、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の生物学的活性が変わるように変異体を設計することができる。例えば、グリコシル化位置を変えたりもしくは除去したりすることができる。同様に、生物学的機能も変えることができる；例えば、ある場合にはより強力なもしくはより弱いＴＮＦ−アルファ活性を持つことが望ましいであろう。
【０１５６】
好ましい実施態様において、本発明は、溶性ｐ５５変異型ＴＮＦタンパク質および核酸を含む。この実施態様において、溶性ｐ５５変異型ＴＮＦタンパクは、受容体シグナル伝達に対するアンタゴニストとして働く。「受容体シグナル伝達に対するアンタゴニストとして働く」とは、溶性ｐ５５変異型ＴＮＦタンパク質が野生型ＴＮＦ−アルファに優先的に相互作用し、ＴＮＦ−アルファ受容体活性化シグナル伝達を遮断または顕著に減少せしめることを意味する。
【０１５７】
このように、上記のコンピューター処理の結果を用いて、１セットの最適な変異体ｐ５５タンパク質配列を生成させ得る。最適な変異体ｐ５５タンパク質配列は、一般的に野生型ｐ５５配列と少なくとも約１つの変異体アミノ酸が異なっている。
【０１５８】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦｐ５５タンパク質を、ヒトＴＮＦ受容体結合因子（ＴＲＡＦ）三量体化ドメインに融合せしめる（図１２）。好ましい実施態様において、最適な変異型ＴＮＦｐ５５受容体のＣ末端がＴＲＡＦ三量体化ドメインに融合する。ＴＲＡＦタンパク質からＴＮＦＲ分子への三量体化ドメインの融合が三量体化を誘導し、ＴＮＦ−アルファに対する高い親和性をもたらし、かくして単量体可溶性ＴＮＦＲよりも強力なＴＮＦ−アルファ阻害剤を創生する。この三量体化ドメインを用いると、いかなるタンパク質の三量体化を誘導できる。それには、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体（ｐ５５およびｐ７５）およびＮＧＦ受容体を含むＴＮＦ受容体ファミリーの他のメンバー、ＣＤ２７、ＣＤ３０、Ｃｄ４０、ｆａｓ抗原を含む。三量体コイル化コイルを形成することが知られている他のペプチドも使用できる。これはｐＩＩを含む（Harbury, Kim and Alber, 1994)。
【０１５９】
ＴＮＦ−アルファに焦点を絞って述べたが、当業者にわかるような実施態様および定義を溶性ｐ５５変異型ＴＮＦタンパク質に適用できる。
【０１６０】
本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質および核酸は多数の方法で作成できる。個々の核酸およびタンパク質を技術上公知の、また以下に略述する方法で作成できる。あるいは、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質のライブラリーを試験用に作成できる。
【０１６１】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質のセットまたはライブラリーを、確率分布表から作製する。本明細書に概説するように、ＰＤＡ（登録商標）技術計算、配列アラインメント、ＳＣＭＦ計算といったようなフォース・フィールド（force field）計算の使用を包含する、確率分布表を作製する様々な方法がある。さらに、確率分布は、ライブラリーで観察される変異頻度の尺度として、各位置についての情報エントロピースコアの作製に使用することができる。
【０１６２】
この実施態様において、リスト中の可変位置の各々にある各アミノ酸残基の頻度を同定する。頻度は限界設定することができ、ここで、カットオフより低い変異体頻度はゼロと定める。このカットオフは、好ましくは１％、２％、５％、１０％、２０％であり、１０％が特に好ましい。次いでこれらの頻度を変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーに組み入れる。即ち、上記のように、これらの可変位置を集め、可能な組合せを全て作製するが、但し、ライブラリーを「満たす」アミノ酸残基は頻度を基準にして利用する。従って、頻度を基準としないライブラリーでは、５個の可能な残基を有する可変位置は、第一の可能な残基を伴う可変位置を含むタンパク質の２０％、第二について２０％等を有する。しかしながら、頻度に基づくライブラリーでは、１０％、１５％、２５％、３０％、２０％の頻度をそれぞれ持つ５個の可能な残基を有する可変位置は、第一の可能な残基を伴う可変位置を含むタンパク質の１０％、第二の残基では当該タンパク質の１５％、第三では２５％等を有する。当業者は理解できるであろうが、実際の頻度はそのタンパク質を実際に生成させるために用いられる方法に依存し、例えば、当該タンパク質を合成する場合は、正確な頻度が得られるかも知れない。しかしながら、下に概説するように、頻度に基づくプライマー系を使用する場合、各位置での実際の頻度は下記のように変動する。
【０１６３】
当業者に理解されるように、そして本明細書に概説するように、確率分布表は様々な方法で作製することができる。本明細書に記載の方法に加えて、自己整合的平均フィールド（ＳＣＭＦ）法を、確率表の直接作製に使用することができる。ＳＣＭＦは、回転異性体相互作用の平均フィールド描写を使用してエネルギーを計算する、決定論的なコンピューター上の方法である。この方法で作製された確率表は、本明細書に記載のライブラリーの創設に使用することができる。ＳＣＭＦは３種類の方法で使用することができる：アミノ酸および各アミノ酸についての回転異性体の頻度を各位置で列挙する；確率をＳＣＭＦから直接決定する（Delarue et al., Pac. Symp. Biocomput. 109−21(1997)、出典明示により本明細書の一部とする）。さらに、高度可変位置および非可変位置を同定することができる。これとは別に、別の方法を用いて、配列間隙の探索中にどの配列が跳躍するかを決定する；ＳＣＭＦを用いてその配列についての精確なエネルギーを取得する；次にこのエネルギーを用いてそれを順位付け、順位順の配列リストを創る（モンテカルロ配列リストに類似する）。次いで各位置でのアミノ酸頻度を示す確率表をこのリストから計算することができる（Koehl et al., J. Mol. Biol. 239:249(1994)；Koehl et al., Nat. Struc. Biol. 2:163(1995)；Koehl et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 6:222(1996)；Koehl et al., J. Mol. Bio. 293:1183(1999)；Koehl et al., J. Mol. Biol. 293:1161(1999)；Lee J. Mol. Biol. 236:918(1994)； Vasquez Biopolymers 36:53−70 (1995)；これらは全て出典明示により本明細書の一部とする。同様の方法には、OPLS−AA (Jorgensen et al., J. Am. Chem. Soc. (1996), v 118, 11225−11236; Jorgensen, W.L.; BOSS, 4.1版; Yale University: New Haven, CT (1999)); OPLS (Jorgensen et al., J. Am. Chem. Soc. (1988),  v 110, 1657ff; Jorgensen et al., J Am. Chem. Soc. (1990), v 112, 4768ff); UNRES (United Residue Forcefield; Liwo et al., Protein Science (1993), v 2, 1697−1714; Liwo et al., Protein Science (1993), v 2, 1715−1731; Liwo et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, 849−873; Liwo et al., J. Comp. Chem. (1997), v 18, 874−884; Liwo et al., J. Comp. Chem. (1998), v 19, 259−276; タンパク質構造の予想のためのフォース・フィールド(Liwo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), v 96, 5482−5485); ECEPP/3 (Liwo et al., J Protein Chem 1994. 5 ;13(4):375−80); AMBER１.１フォース・フィールド (Weiner et al., J. Am Chem. Soc. v106, 765−784); AMBER ３.０フォース・フィールド (U.C. Singh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82:755−759); CHARMMおよびCHARMM22 (Brooks et al., J. Comp. Chem. v4, 187−217); cvff3.0 (Dauber−Osguthorpe et al.,(1988) Proteins: Structure, Function and Genetics, v4, 31−47); cff91 (Maple et al., J. Comp. Chem. v15, 162−182)が包含され; さらに、DISCOVER (cvffおよびcff91)およびAMBER forcefield が INSIGHT分子モデリングパッケージ(Biosym/MSI、サンディエゴ、カリフォルニア) で使用され、HARMMがQUANTA分子モデリングパッケージ(Biosym/MSI、サンディエゴ、カリフォルニア)で使用される。
【０１６４】
加えて、本明細書で概説するように、確率分布表生成の好ましい方法は配列アラインメントプログラムの使用を介するものである。加えて、確率表は配列アラインメントおよびコンピューター処理によるアプローチの組合せで得られる。例えば、相同配列のアラインメントで見出されたアミノ酸をコンピューター処理の結果に付加できる。好ましくは、確率表に一致する野生型アミノ酸を、もしそれがコンピューター処理で見出されない場合に付加できる。
【０１６５】
別の実施態様では、ＴＮＦ−アルファ変異体は、上記のコンピューター処理技法を使用して設計される。この別の実施態様では、非天然産生ＴＮＦ−アルファ単量体または二量体の変異体が生成され、受容体に結合する。より好ましくは、これらの変異体は、受容体に好適に結合し、天然産生ＴＮＦ−アルファ分子が受容体に結合するのを競合的に阻害する。二量体の変異体は、受容体接触面に実質的に結合するのでより好ましい。
【０１６６】
これらの変異体の好ましい例は、以下の位置：６、７、８、９、１０、１１、１３、１５、３３、３４、３６、５３、５４、５５、５７、５９、６１、６３、６９、７２、７３、７５、８２、８７、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０６、１０７、１０９、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５１、１５５、１５６および１５７で修飾されたもの、およびこれらの位置の任意の、そして全ての組合せである。
【０１６７】
理解されるように、可変位置および／または可変位置の残基を再結合することにより創生された変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーは、順位付けまたはフィルターがけされたリストには無いかも知れない。いくつかの実施態様では、このリスト全体を作製し試験することができる。これとは別に、好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーは、順位付けまたはフィルターがけされたリストの形態でもある。これは、実験的に作製するにはライブラリーの大きさが依然として大きすぎる等といったいくつかの理由のため、または予想目的のために行う。これはいくつかの方法で実施できる。１つの実施態様では、ライブラリーのメンバーを順位付けるためのＰＤＡ（登録商標）技術のスコア付け機能を用いてこのライブラリーを順位付ける。別法として、統計学的方法を使用することもできる。例えば、ライブラリーを頻度スコアによって順位付けることができる；即ち、高頻度残基の殆どを含むタンパク質をより高い順位とする等である。これは、各可変位置での頻度を加える、または掛けて数字によるスコアを作製することによって行うことができる。同様にして、ライブラリー相違位置に重みを付け、次いでタンパク質をスコア付けすることができる；例えば、ある残基を含むものを随意に順位付けることができる。
【０１６８】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーの異なるタンパク質メンバーを化学合成することができる。これは、設計されたタンパク質が短い、好ましくは１５０アミノ酸長未満、より好ましくは１００アミノ酸未満、そして特に好ましくは５０アミノ酸未満である場合にとりわけ有用であるが、当分野で知られるように、より長いタンパク質もまた化学的または酵素的に作製できる。例えば、Wilken et al., Curr.Opin.Biotechnol. 9:412−26(1998)を参照（出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１６９】
好ましい実施態様において、特に、より長いタンパク質または大きな試料が望まれるタンパク質のためには、このライブラリー配列を使用して、当該メンバーの配列をコードしているＤＮＡのような核酸を作り出し、次いでこれを宿主細胞中にクローニングし、発現し、所望により検定できる。従って、各メンバータンパク質配列をコードしている核酸、特にＤＮＡを作製することができる。これはよく知られる方法を用いて実施する。コドン、適切な発現ベクターおよび適切な宿主細胞の選択は、いくつかの因子に応じて変わり、必要に応じて容易に最適化できる。
【０１７０】
好ましい実施態様において、図１３−１７に概略を示したように、プールされたオリゴヌクレオチドを用いた複数のＰＣＲ反応を実施する。この実施態様では、全長遺伝子に対応する部分重複オリゴヌクレオチドを合成する。また、これらのオリゴヌクレオチドは各可変位置にある異なるアミノ酸の全て、またはサブセットを表し得る。
【０１７１】
好ましい実施態様において、これらのオリゴヌクレオチドを等しい割合でプールし、複数のＰＣＲ反応を実施して、当該ライブラリーにより定義される変異の組み合わせを含む全長配列を作製する。加えて、これは、誤りがちなＰＣＲ法を用いて行うことができる。
【０１７２】
好ましい実施態様において、異なるオリゴヌクレオチドを確率分布表に対応する相対量で添加する。従って、多数のＰＣＲ反応は、変異の所望の組み合わせを所望の比率で有する全長配列をつくる。
【０１７３】
必要とされるオリゴヌクレオチドの総数は、変異を受ける位置の数およびこれらの位置で考えられる変異の数の関数である：
（定常位置のためのオリゴの数）＋Ｍ１＋Ｍ２＋Ｍ３＋Ｍｎ＝（必要なオリゴの総数）
［式中、Ｍｎは、配列中の位置ｎにおいて考えられる変異の数である］
【０１７４】
好ましい実施態様では、各重複オリゴヌクレオチドは、変異させようとする位置を１つだけ含む；別の実施態様では、変異位置が互いに近接しすぎてこのことを不可能にし、各オリゴヌクレオチド当たり複数の変異を使用して可能性のある全ての組換えを完成させる。即ち、各オリゴは、変異させようとする単一位置か、または変異させようとする１以上の位置のコドンを含有できる。変異させようとする複数位置は、オリゴの長さが非実用的になるのを防ぐために、配列内で近接していなければならない。あるオリゴヌクレオチド上の複数の変異位置に対して、特定の変異の組合せをコードしているオリゴヌクレオチドを包含または排除することにより、該組合せをそのライブラリー中で包含または排除できる。例えば、本明細書で考察するように、可変位置間に相関関係があり得る；即ち、位置Ｘがある特定の残基の場合には、位置Ｙはある特定の残基でなければならない（または、あってはならない）。可変位置のこれらのセットは、本明細書においては時々「クラスター」と呼称される。クラスターが互いに近接した残基を含み、従って１個のヌクレオチドプライマー上に存在できるときには、クラスターは「良好な」相関に設定し、ライブラリーの有効性を減少させ得る悪い組合せを除去できる。しかしながら、クラスターの残基が配列中で離れていて、従って合成のための別のオリゴヌクレオチド上に存在するであろう場合には、残基を「良好な」相関に設定するか、または可変残基として完全に排除するのが望ましい。
【０１７５】
別の実施態様では、クラスター変異がもっぱら一緒に現れるように、ライブラリーをいくつかの段階で創出する。この方法、即ち、変異クラスターを同定し、それを同じオリゴヌクレオチド上に置くか、またはライブラリーから除去するか、またはクラスターを保存しながらいくつかの段階でライブラリーを生成させることにより、実験的ライブラリーが、適正に折畳まれたタンパク質にかなり富むようにできる。クラスターの同定は、例えば、既知のパターン認識法の使用、変異発生頻度の比較、または実験的に生成させる配列のエネルギー解析（例えば、もし相互作用エネルギーが高ければ、位置は相関している）の使用などの多数の方法で実行することができる。これらの相関は、位置相関（例えば、位置１および２が常に一緒に変化するか、または決して一緒に変化しない）でも、配列相関（例えば、位置１に残基Ａがあれば、常に位置２に残基Ｂがある）でもよい。Pattern discovery in Biomolecular Data: Tools, Techniques, and Applications; edited by Jason T.L. Wang, Bruce A. Shapiro, Dennis Shasha. New York: Oxford University, 1999; Andrews, Harry C. Introduction to mathematical techniques in pattern recognition; New York, Wiley-lnterscience [1972]; Applications of Pattern Recognition; Editor, K.S. Fu. Boca Raton, Fla. CRC Press, 1982; Genetic Algorithms for Pattern Recognition; edited by Sankar K. Pal, Paul P. Wang. Boca Raton: CRC Press, c1996; Pandya, Abhijit S., Pattern recognition with neural networks in C++ / Abhijit S. Pandya, Robert B. Macy. Boca Raton, Fla.: CRC Press, 1996; Handbook of pattern recognition & computer vision / edited by C.H. Chen, L.F. Pau, P.S.P. Wang. 2nd ed. Singapore; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999; Friedman, Introduction to Pattern Recognition: Statistical, Structural, Neural, and Fuzzy Logic Approaches; River Edge, N.J.: World Scientific, c1999, Series title: Series in machine perception and artificial intelligence; vol. 32; を参照（全て出典明示により本明細書の一部とする）。さらに、コンセンサスモチーフの探索に使用するプログラムもまた同様に使用できる。
【０１７６】
加えて、相関およびシャフリングは、オリゴヌクレオチドの設計を改変することにより、即ち、オリゴヌクレオチド（プライマー）をどこで開始および停止するか（例えばどこで配列を「切断」するか）を定めることにより、固定または最適化することができる。オリゴの開始および停止部位は、単一のオリゴヌクレオチド中に現れるクラスターの数を最大にするように設定でき、それにより、ライブラリーをより高いスコアの配列に富ませる。様々なオリゴヌクレオチドの開始および停止部位のオプションをコンピューター処理でモデル化し、単一のオリゴ上に表されるクラスターの数に従って、または予測された配列ライブラリーに合致する、生じた配列の割合に従ってランク付けまたはフィルターがけを行うことができる。
【０１７７】
必要となるオリゴヌクレオチドの総数は、複数の変異可能位置が単一のオリゴヌクレオチドによりコードされるとき、増加する。アニールリングした領域は一定のままのもの、即ち、参考配列の配列を有するものである。
【０１７８】
長さが異なるタンパク質を発現するライブラリーを創出するために、コドンを挿入または欠失したオリゴヌクレオチドを使用できる。特に、挿入または欠失のためのコンピューター処理配列スクリーニングにより、長さが異なるタンパク質を定義する二次ライブラリーを得ることができ、それらのタンパク質は、プールした様々な長さのオリゴヌクレオチドのライブラリーにより発現させ得る。
【０１７９】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーは、このファミリー（例えば、一組の変異体）をシャフリングすることによって実施する；即ち、最上級の配列（順位順のリストを使用する場合）の何らかの組を、誤りがちなＰＣＲを使用して、または使用せずにシャフリングすることができる。この文脈における「シャフリング」とは、一般に無作為なやり方での、関連配列の組換えを意味する。これは、米国特許５,８３０,７２１、５,８１１,２３８、５,６０５,７９３、５,８３７,４５８およびＰＣＴ/ＵＳ/１９２５６ に定義されかつ例示されている「シャフリング」を包含し、これらは全て出典明示によりその全体を本明細書の一部とする。この配列の組は、人工的な組、例えば確率表由来のもの（例えば、ＳＣＭＦを使用して作製されたもの）またはモンテカルロの組であってもよい。同様に、「ファミリー」は、最上級の１０および最下級の１０配列、最上級の１００配列等であってよい。これもまた誤りがちなＰＣＲを用いて行うことができる。
【０１８０】
従って、好ましい実施態様では、本明細書に記載のコンピューター処理法を用いてインシリコ（in silico）シャフリングを行うことができる。即ち、２つのライブラリーまたは２つの配列から開始して、配列の無作為組換えを作製し、評価することができる。
【０１８１】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーを作製するために、誤りがちなＰＣＲを行う。米国特許５,６０５,７９３、５,８１１,２３８、５,８３０,７２１ を参照（これらは全て出典明示により本明細書の一部とする）。これは、ライブラリーの最適配列もしくは最上級メンバー、またはその他の何らかの人工的組もしくはファミリーについて実施することができる。この実施態様では、一次ライブラリーのコンピュータースクリーニングで見出された最適配列のための遺伝子を合成することができる。次いで、そのライブラリーの可変位置にある変異をコードしているオリゴヌクレオチドの存在下に、最適配列の遺伝子上で誤りがちなＰＣＲを実施する。オリゴヌクレオチドの付加は、該ライブラリー中に変異を組み込むのに好都合な偏向を産むであろう。これとは別に、ある変異のための唯一のオリゴヌクレオチドを、該ライブラリーを偏向させるために使用できる。
【０１８２】
好ましい実施態様において、誤りがちなＰＣＲによる遺伝子シャフリングを、偏向オリゴヌクレオチドの存在下に、最適配列の遺伝子上で実施し、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリー中に見出される変異の比率を反映するＤＮＡ配列ライブラリーを作り出すことができる。偏向オリゴヌクレオチドの選択は様々な方法で行われる；これらは、その頻度の偏向に基づいて選択、即ち、高頻度変異位置をコードしているオリゴヌクレオチドを使用することができ；これとは別に、最も変化し易い位置を含むオリゴヌクレオチドを使用して多様性を増大させることもできる；二次ライブラリーを順位付ける場合、いくつかの最上級スコアの位置を使用して偏向オリゴヌクレオチドを作製することができ；無作為な位置を選択することができ；最上級スコアをいくつかと最下級スコアをいくつか選択することができる等である。重要なことは、好ましい可変位置および配列に基づく新たな配列を作製することである。
【０１８３】
好ましい実施態様において、図面に模式的に示すように、野生型遺伝子またはその他の遺伝子を用いるＰＣＲを使用することができる。この実施態様では、開始遺伝子を使用する；一般にこの遺伝子は、通常、野生型遺伝子であるが、これが必要である訳ではない。いくつかの場合には、これは、包括的最適化配列をコードしている遺伝子、または当該リストのその他の配列、または、例えば異なる生物由来の相同性配列をアラインメントすることで得られるコンセンサス配列であってよい。この実施態様では、変異位置に対応し、ライブラリー中の異なるアミノ酸を含むオリゴヌクレオチドを使用する。当分野で知られるように、末端にＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを行う。これには２つの利点がある。第一に、一般にこれは、より少ないオリゴヌクレオチドを必要とし、かつより少ない誤りがもたらされる。第二に、野生型遺伝子を使用する場合、合成する必要が無いという点で、実験上の有利性がある。
【０１８４】
さらに、図１３−１７に例示するように、使用できるその他いくつかの技術がある。好ましい実施態様において、ＰＣＲ産物の結合反応を実施する。
【０１８５】
好ましい実施態様において、様々な追加段階を変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーに対して実施することができる；例えば、さらなるコンピューター処理が発生し得、異なる変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーを再結合でき、または異なるライブラリーからのカットオフを併用できる。好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーをコンピューターによって再操作して、さらなる変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーを作製することができる（時には本明細書中で「三次ライブラリー」と称する）。例えば、任意の変異型ＴＮＦ−アルファライブラリー配列を、第一ライブラリー中の変化した位置のいくつかまたは全てを凍結または固定することにより、２巡目のＰＤＡ用に選択できる。別法として、最後の確率分布表に見られる変化のみを許容する。別法として、確率表の緊縮度を、包含のカットオフを増大または低下させることにより、変化させることができる。同様にして、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーを第一巡の後に実験的に再結合できる；例えば、第一スクリーニング由来の最良の遺伝子（群）を選択し、遺伝子の組み立てを再度実施できる（下に概説する技術、複数のＰＣＲ、誤りがちなＰＣＲ、シャフリング、等）。別法として、１以上の良好な遺伝子（群）由来の断片を、いくつかの位置で確率を変化させる。このことは、コンピューターによる実験的なスクリーニングの１巡目に見出される配列間隙の領域についての探索を偏向させる。
【０１８６】
好ましい実施態様において、異なる変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーを合わせることにより三次ライブラリーを作製できる。例えば、第一の変異型ＴＮＦ−アルファライブラリー由来の確率分布表を作製し、本明細書に概説するようにコンピューター処理により、または実験的に再結合できる。ＰＤＡ（登録商標）変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーを配列アラインメント変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーと合し、そして再結合（これもまたコンピューター処理により、または実験的に）するか、または各々由来のカットオフを合わせるだけで、新たな三次ライブラリーを作製できる。いくつかのライブラリー由来の最上級配列を再結合できる。ライブラリーの最上部由来の配列を該ライブラリーの最下部由来の配列と合わせて、試料の配列間隙をより広くするか、または、該ライブラリーの最上部から遠い配列のみを合することができる。あるタンパク質の異なる部分を分析した変異型ＴＮＦ−アルファライブラリーを合わせて、このタンパク質の合わせた部分を処理する三次ライブラリーとすることができる。
【０１８７】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファライブラリー中の相関を用いて三次ライブラリーを作製できる。即ち、第一の可変位置の残基を、第二の可変位置の残基と相関させることができる（または、さらなる位置の残基と、同様に相関させる）。例えば、第一の残基がＸであるならば、第二の残基はＹでなければならないといったように、２個の可変位置を立体的または静電的に相互作用させることができる。これは、正または負の相関であってよい。
【０１８８】
変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードしている本発明にかかる核酸を使用して、様々な発現ベクターを作製する。この発現ベクターは、自己複製する染色体外ベクター、または宿主ゲノム中に組み込まれるベクターであってよい。一般に、これらの発現ベクターは、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードしている核酸に機能し得るように連結した、転写および翻訳調節核酸を包含する。「制御配列」という語は、特定の宿主生物中の機能し得るように連結したコード化配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物にとって好適な制御配列は、例えばプロモーター、所望によりオペレーター配列、およびリボソーム結合位置を包含する。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【０１８９】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれたとき、「機能し得るように連結して」いる。例えば、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、これがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのためのＤＮＡに機能し得るように連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、これがコード化配列の転写に影響を及ぼすならば、その配列に機能し得るように連結している；または、リボソーム結合位置は、これが翻訳を促進するように配置されているならば、コード化配列に機能し得るように連結している。
【０１９０】
好ましい実施態様において、内因性分泌配列が天然産生タンパク質または変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の低レベル分泌を導く場合、この天然産生分泌リーダー配列を置換することが望ましい。この実施態様では、関連のない分泌リーダー配列が変異型ＴＮＦ−アルファコード化核酸に機能し得るように連結し、タンパク質分泌の増加を導いている。従って、ＴＮＦ−アルファの分泌およびその分泌配列と比較したとき、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の分泌増強をもたらす任意の分泌リーダー配列が望ましい。タンパク質の分泌を導く好適な分泌リーダー配列は当分野で知られている。
【０１９１】
別の好ましい実施態様において、天然産生タンパク質の分泌リーダー配列またはタンパク質を当分野で既知の技術によって除去し、その後発現させると、組換えタンパク質の細胞内蓄積がもたらされる。
【０１９２】
一般に、「機能し得るように連結」とは、連結しているＤＮＡ配列が連続しており、そして、分泌リーダーの場合には、連続しかつ読み取り枠にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要がない。連結は、都合の良い制限部位での結合反応によって達成する。かかる部位が存在しない場合、常套技術に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。融合タンパク質の発現に用いられる宿主細胞には、転写および翻訳の調節核酸が一般に適当である；例えば、Bacillusでの融合タンパク質の発現には、Bacillus由来の転写および翻訳調節核酸配列を好ましく使用する。多くのタイプの適当な発現ベクター、および適当な制御配列が、様々な宿主細胞のために当分野で知られている。
【０１９３】
一般に、転写および翻訳の制御配列には、プロモーター配列、リボソーム結合位置、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、並びにエンハンサーまたはアクチべーター配列が包含されるが、これらに限定される訳ではない。好ましい実施態様において、制御配列は、プロモーター並びに転写開始および停止配列を包含する。
【０１９４】
プロモーター配列は、構成的または誘導的プロモーターのいずれかをコードしている。プロモーターは天然産生プロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかとすることができる。２以上のプロモーターの要素を合しているハイブリッドプロモーターもまた当分野で知られており、かつ本発明において有用である。好ましい実施態様において、プロモーターは、とりわけＴｅｔ調節エレメントと組み合わせて、細胞、特に哺乳動物細胞での高度発現を可能にする強力なプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターである。
【０１９５】
加えて、発現ベクターはさらなるエレメントを含んでいてよい。例えば、発現ベクターは２つの複製系を持っており、従ってこれを２つの生物、例えば発現のための哺乳動物または昆虫細胞内で、そしてクローニングおよび増幅のための原核生物宿主内で維持できる。さらに、発現ベクターを組み込むため、この発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに対し相同性な少なくとも１個の配列、および、好ましくは該発現コンストラクトに隣接する２個の相同性配列を含んでいる。この組み込みベクターは、ベクター内への包含に適する相同性配列を選択することにより、宿主細胞内の特異的な座をめざすことができる。組み込みベクターのコンストラクトは当分野でよく知られている。
【０１９６】
加えて、好ましい実施態様において、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択マーカーを含んでいる。選択遺伝子は当分野でよく知られており、使用する宿主細胞によって変わる。
【０１９７】
好ましい発現ベクター系は、ＰＣＴ/ＵＳ９７/０１０１９およびＰＣＴ/ＵＳ９７/０１０４８に一般的な記載のあるレトロウイルスベクター系であり、これらは共に出典明示により本明細書の一部とする。好ましい実施態様において、発現ベクターは上記の構成成分および変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードしている遺伝子を含んでいる。当業者は理解できるであろうが、全ての組み合わせが可能であり、従って、本明細書で用いるように、レトロウイルスであってもそうでなくてもよい１以上のベクターより成る構成成分の組み合わせを、本明細書中では「ベクター組成物」と称する。
【０１９８】
変異型ＴＮＦ−アルファ核酸は、単独でまたは発現ベクターと組み合わせて細胞内に導入する。本明細書中、「導入する」または文法上の等価表現は、当該核酸が、その核酸のその後の発現にとって好適な方法で細胞に入ることを意味する。導入の方法は、下に論ずるような標的となる細胞タイプによってほぼ規定される。方法の例は、ＣaＰＯ4沈殿、リポソーム融合、リポフェクチン（登録商標）、電気穿孔、ウイルス感染等を包含する。変異型ＴＮＦ−アルファ核酸は、宿主細胞のゲノム中に安定に統合され（例えば下に概説するレトロウイルス導入によって）、または、細胞質中に一時的にまたは安定に存在することができる（即ち、常套的なプラスミドの使用により、標準的制御配列、選択マーカーの利用により、等）。
【０１９９】
本発明にかかる変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードしている核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の発現を誘導または惹起するのに適当な条件下で培養することによって産生させる。変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の発現にとって適当な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変わり、通常の実験によって当業者により容易に確認できるであろう。例えば、発現ベクター中の構成的プロモーターは、宿主細胞の生長および増殖の最適化を必要とし、また、誘導的プロモーターの使用は、誘導のための適当な生長条件を必要とする。さらに、いくつかの実施態様においては、収穫のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で用いられるバキュロウイルス系は溶解性ウイルスであり、従って収穫時期の選択が、生成物の収量にとって決定的となり得る。
【０２００】
適当な宿主細胞は、酵母、細菌、古細菌、真菌、並びに昆虫、および哺乳動物細胞を包含する動物細胞を包含する。特に興味深いものは、Drosophila melangaster細胞、Saccharomyces cerevisiaeおよびその他の酵母類、E. coli、Bacillus subtilis、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Neurospora、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Pichia Pastoris等である。
【０２０１】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を哺乳動物細胞で発現する。哺乳動物発現系もまた当分野で知られており、レトロウイルス系を包含する。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、そして融合タンパク質のコード化配列の、mＲＮＡへの下流（３'）転写を開始させることのできる、任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード化配列の５'末端に近接して位置する転写開始領域、および、この転写開始位置の上流に位置する２５−３０塩基対を使用するＴＡＴＡボックスを有する。このＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに、正しい位置でのＲＮＡ合成の開始を指令すると思われる。哺乳動物プロモーターはさらに、典型的にはＴＡＴＡボックスの上流１００ないし２００塩基対以内に位置する上流プロモーター要素（エンハンサー要素）を含むであろう。上流プロモーター要素は、転写が開始される速度を決定し、いずれの方向にも作用することができる。哺乳動物ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、かつ広範な宿主範囲を有するため、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターは哺乳動物プロモーターとして特に有用である。例として、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーターが挙げられる。
【０２０２】
典型的には、哺乳動物細胞により認識される転写終結およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３'に位置する調節領域であり、従って、プロモーター要素と共にコード化配列に隣接している。成熟ｍＲＮＡの３'末端を、位置特異的翻訳後開裂およびポリアデニル化によって形成させる。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例は、ＳＶ４０から誘導されるものを包含する。
【０２０３】
哺乳動物宿主に外因性核酸を導入する方法は、その他の宿主と同様当分野でよく知られており、使用される宿主細胞によって変わる。方法には、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ウイルス感染、リポソーム内へのポリヌクレオチドのカプセル化、および核内へのＤＮＡの直接的マイクロ注入が挙げられる。本明細書に概説するように、特に好ましい方法は、ＰＣＴＵＳ９７／０１０１９（出典明示により本明細書の一部とする）に概説されるレトロウイルス感染を利用するものである。
【０２０４】
当業者には理解できるであろうが、本発明に使用される哺乳動物細胞の型は極めて多様である。基本的に任意の哺乳動物細胞を使用することができ、マウス、ラット、霊長類およびヒトの細胞が特に好ましいが、当業者には理解できるように、偽タイピングによる系の修飾により、全ての真核細胞、好ましくは高等真核生物を使用することができる。以下により詳細に記載するように、細胞が生物学的活性ペプチドの存在下で選択可能な表現型を表すよう、スクリーニングが設定されるであろう。以下により詳細に記載するように、細胞内にあるペプチドが存在する結果として変化した表現型を表す細胞を選択できるよう、適切なスクリーニングを設定できる限り、多岐にわたる疾病状態に関わる細胞型がとりわけ有用である。
【０２０５】
従って、好適な細胞型は、全ての型の腫瘍細胞（特に黒色腫、骨髄性白血病、肺、乳房、卵巣、大腸、腎臓、前立腺、膵臓および精巣の癌腫）、心筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、リンパ球（Ｔ細胞およびＢ細胞）、肥満細胞、好酸球、血管内膜細胞、肝細胞、単核白血球を包含する白血球、幹細胞、例えば造血、神経、皮膚、肺、腎臓、肝臓および筋細胞幹細胞（分化および退化因子のスクリーニングに使用するため）、破骨細胞、軟骨細胞およびその他の結合組織細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、肝臓細胞、腎臓細胞、および脂肪細胞を包含するが、これらに限定される訳ではない。好適な細胞はさらに、Jurkat Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ、Ｃｏｓ等を包含する既知の研究用細胞を包含するが、これらに限定されない。ＡＴＣＣセルラインカタログ(出典明示により本明細書の一部とする）を参照。
【０２０６】
１つの実施態様において、細胞は、さらに遺伝学的に操作してよく、即ち、変異型ＴＮＦ−アルファ核酸以外の外因性核酸を含んでいてよい。
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を細菌系で発現させる。細菌発現系は当分野でよく知られている。
【０２０７】
好適な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合でき、かつ変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質のコード化配列の、ｍＲＮＡへの下流（３'）転写を開始することができる任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、コード化配列の５'末端の近傍に通常位置する転写開始領域を持っている。この転写開始領域は、典型的にはＲＮＡポリメラーゼ結合位置および転写開始位置を含んでいる。代謝経路酵素をコードしている配列は、とりわけ有用なプロモーター配列を提供する。例として、ガラクトース、乳糖およびマルトースといった糖代謝酵素から誘導されるプロモーター配列、並びにトリプトファンのような生合成酵素から誘導される配列が挙げられる。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた使用でき、当分野で知られている。加えて、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である；例えば、ｔａｃプロモーターはｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し転写を開始させる能力を有する非細菌起源の天然産生プロモーターを包含する。
【０２０８】
機能的なプロモーター配列に加えて、有効なリボソーム結合位置が望ましい。E.coli においては、このリボソーム結合位置は Shine−Dalgarno（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドンと、この開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列を含んでいる。発現ベクターはさらに、細菌において変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の分泌をさせるシグナルペプチド配列を含んでいる。シグナル配列は、典型的には、当分野でよく知られているように、タンパク質の、細胞からの分泌を指令する疎水性アミノ酸から成るシグナルペプチドをコードしている。タンパク質は、生長培地中に分泌される（グラム陽性細菌）か、または、細胞の外膜と内膜の間に位置するペリプラズム間隙中に分泌される（グラム陰性細菌）。細菌での発現のためには、通常、変異型ＴＮＦ−アルファコード化核酸と機能し得るように連結している細菌分泌リーダー配列が好ましい。
【０２０９】
細菌発現ベクターはさらに、形質転換された細菌菌株の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含んでいる。好適な選択遺伝子は、細菌を、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンといった薬物に対して耐性とする遺伝子を包含する。選択マーカーはまた、生合成遺伝子、例えばヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路中の生合成遺伝子を包含する。
【０２１０】
これらの構成成分を組み立てて発現ベクターとする。細菌のための発現ベクターは当分野でよく知られており、なかでもBacillus subtilis、E.coli、Streptococcus cremoris、Streptococcus lividansのためのベクターを包含する。
【０２１１】
細菌発現ベクターは、当分野でよく知られる技術、例えば塩化カルシウム処理、電気穿孔等を用いて細菌宿主細胞中に導入する。
【０２１２】
ある実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を昆虫細胞で産生する。昆虫細胞の形質転換用発現ベクター、特にバキュロウイルスに基づく発現ベクターは当分野でよく知られている。
【０２１３】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を酵母細胞でつくる。酵母発現系は当分野でよく知られており、Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans および C. maltosa、Hansenula polymorpha、Kluyveromyces fragilis および K. lactis、Pichia guillerimondii および P. pastoris、Schizosaccharomyces pombe、およびYarrowia lipolytica のための発現ベクターを包含する。酵母での発現のための好ましいプロモーター配列は、誘導的ＧＡＬ１,１０プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセラートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、および酸ホスファターゼ遺伝子由来のプロモーターを包含する。酵母選択マーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＡＬＧ７（ツニカマイシンに対する耐性を付与する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８に対する耐性を付与する）、およびＣＵＰ１遺伝子（酵母を銅イオンの存在下で生長させる）を包含する。
【０２１４】
好ましい実施態様では、修飾したＴＮＦ変異体を、少なくとも１つのさらなるＴＮＦ変異体とリンカーを介して共有結合させ、修飾ドメインのドミナント・ネガティブ作用を改善する。修飾した受容体ドメインを一緒に共有結合的に連結させるのに、数々の戦略を使用し得る。これらには、２つのドメインのＮ−とＣ−末端の間のポリペプチド連結などのリンカー、単量体間のジスルフィド結合を介する連結、化学的クロスリンク試薬を介する連結が含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、Ｎ−および／またはＣ−末端の一部を欠失させ、リンカーを介して残りの断片を連結するか、または断片を直接連結することにより、Ｎ−およびＣ−末端を共有結合的につなげる。
【０２１５】
「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」、「つなぎ配列」またはこれらの文法的均等物は、本発明において、２個の分子を接続し、しばしば２個の分子を好ましい配置に置くのに役立つ、分子または分子群（単量体またはポリマーなど）を意味する。本実施態様のある態様では、リンカーはペプチド結合である。２個のポリペプチド鎖を接続する場合、適切なリンカーの選択は、様々なパラメータによる。例えば、２個のポリペプチド鎖の性質（例えば、それらが自然に多量体化するのか否か（例えば、二量体を形成するのか否か））、もし３次元構造決定からわかるのであれば、接続されるＮ末端とＣ末端の間の距離、および／またはタンパク質分解および酸化に対するリンカーの安定性などである。さらに、リンカーは、柔軟性を与えるアミノ酸残基を含有し得る。従って、リンカーペプチドは、殆どが以下のアミノ酸残基を含む：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＴｈｒ。これらの連結したＴＮＦ−アルファタンパク質は、不自然な流体力学的特性を有し（即ち、それらは構成的な二量体を形成する）、従って、他の天然産生ＴＮＦ−アルファタンパク質と効率的に相互作用し、ドミナント・ネガティブの異種三量体を形成する。
【０２１６】
リンカーペプチドは、２個のＴＮＦ変異体単量体を、これらがＴＮＦ受容体のアンタゴニストとして所望の活性を保持するように相互に正しい配置をとるような方法で連結するのに適切な長さを有するべきである。この目的のために適する長さは、少なくとも１、かつ３０を超えないアミノ酸残基を含む。好ましくは、リンカーは約１ないし３０アミノ酸長であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８１９および２０アミノ酸長のリンカーが好ましい。出典明示により全体を本明細書の一部とするＷＯ０１／２５２７７も参照されたい。
【０２１７】
さらに、リンカーペプチドに含めるために選択されるアミノ酸残基は、ポリペプチドの活性を有意に妨害しない特性を示すべきである。従って、リンカーペプチドは、全体として、ポリペプチドの活性と相反する電荷を示すべきではなく、または内部の折り畳みを妨害するべきではなく、または単量体の１またはそれ以上のアミノ酸残基と、受容体単量体ドメインの結合を重大に妨げる結合または他の相互作用を形成すべきではない。
【０２１８】
当業者に理解されるように、有用なリンカーには、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎを含む。ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、およびシェーカー型カリウムチャネルのつなぎなどの他の柔軟なリンカー、および多数の様々な他の柔軟なリンカーが含まれる。グリシン−セリンポリマーが好ましい。これらのアミノ酸の両方は、比較的構造化されておらず、従って成分間の自然のつなぎとして役立ち得るからである。第２に、セリンは親水性であり、従って球状グリシン鎖であり得るものを可溶化することができる。第３に、類似の鎖が、一本鎖抗体などの組換えタンパク質のサブユニットをつなぐのに効果的であると示された。
【０２１９】
適するリンカーは、２個のポリペプチド鎖間のギャップを架橋できる天然産生のモチーフについての既知の３次元構造データベースを検索することによっても同定し得る。適するリンカーを得る他の方法は、ランダムな突然変異誘発を通して単純なリンカー（例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）を最適化することによる。あるいは、一度適するポリペプチドリンカーを定めたら、ＰＤＦ（登録商標）技術の適用により、連結されるドメインとより最適に相互作用するアミノ酸を選択し、さらなるリンカーポリペプチドを創生できる。本発明で使用し得る他のタイプのリンカーには、人工ポリペプチドリンカーおよびインテインが含まれる。他の好ましい実施態様では、２個の受容体単量体を単量体間接触部位で連結するために、ジスルフィド結合を設計する。この実施態様のある態様では、２個の受容体を＜５オングストロームの距離で連結する。加えて、本発明の変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドは、所望により、例えば発現を増大するか、またはタンパク質を安定化するために、他のタンパク質にさらに融合し得る。
【０２２０】
ある実施態様において、本発明にかかる変異型ＴＮＦ−アルファ核酸、タンパク質および抗体は、その骨格以外の標識を用いて標識する。本明細書において「標識する」とは、ある化合物が、その化合物の検出を可能にするために結合させた少なくとも１つの元素、アイソトープまたは化学化合物を有することを意味する。一般に、標識は３つのクラスに分類される：ａ）アイソトープ標識、これは放射性または重アイソトープであってよい；ｂ）免疫標識、これは抗体または抗原であってよい；そしてｃ）着色または蛍光色素、標識はいかなる位置で化合物に組み込んでもよい。
【０２２１】
いったん製造されると、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は共有結合により修飾することができる。従って当該タンパク質の共有結合的および非共有結合的修飾は、本発明の範囲内にある。このような修飾は、標的とされる該ポリペプチドのアミノ酸残基を、選択された側鎖または末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることにより、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチド中に導入することができる。
【０２２２】
共有結合による修飾の１つの型は、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドの標的アミノ酸残基を、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドの選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを包含する。例えば、後により詳細に記載するように、抗変異型ＴＮＦ−アルファ抗体を精製するまたはスクリーニングする検定の方法で使用するための、水不溶性支持体マトリックスまたは表面に、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を架橋するには、二官能性試薬による誘導体化が有用である。一般的に使用される架橋試薬は、例えば１,１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、ジスクシンイミジルエステル類、例えば３,３'−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）を包含するホモ二官能性イミドエステル類、二官能性マレイミド類、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１,８−オクタン並びにメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミダートのような試薬を包含する。
【０２２３】
その他の修飾には、それぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への、グルタミニルおよびアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化［T.E.Creighton、タンパク質：構造および分子の性質、W.H.Freeman & Co.、サンフランシスコ、79−86(1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を包含する。
【０２２４】
本発明の範囲内に包含される変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドの他のタイプの共有結合的修飾は、該ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含むものである。「天然グルコシル化パターンの変更」とは、本発明の目的のために、天然配列変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドに見出される１以上の炭水化物部分を除去し、および／または天然配列変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドに存在しない１以上のグリコシル化位置を付加することを意味する。
【０２２５】
変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドへのグリコシル化位置の付加は、そのアミノ酸配列を変化させることによって達成できる。この変更は、例えば、天然配列変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドに対して１以上のセリンまたはトレオニン残基を付加、または置換することによってなす事ができる（Ｏ−結合グリコシル化位置に対し）。変異型ＴＮＦ−アルファアミノ酸配列は所望により、特に、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドをコードしているＤＮＡを、前もって選択した塩基位置で、所望アミノ酸に翻訳されるようなコドンを生成するように変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を介して変化させることができる。
【０２２６】
変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドへのＮ−連結グリコシル化部位の付加は、そのアミノ酸配列を変化させることにより達成し得る。変化は、例えば、自然の配列または変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドに１またはそれ以上のアスパラギン残基を付加または置換することにより、為し得る。修飾は、例えば、Ｎ−Ｘ−Ｙ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Ｙは好ましくはスレオニン、セリンまたはシステインである）を含むがこれらに限定されるわけではない、正準のＮ−連結グリコシル化部位の導入により為し得る。変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドに炭水化物部分の数を増やす他の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。かかる方法は、当分野で、例えば１９８７年９月１１日発行のＷＯ８７／０５３３０および Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306 (1981) に記載されている。
【０２２７】
変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドに存在する炭水化物部分の除去は、化学的に、酵素的に、またはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異誘発的置換により達成し得る。化学的脱グリコシル化技法は当分野で知られており、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) および Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチドの炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987) に記載のように、様々なエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成できる。
【０２２８】
このような誘導された部分は、溶解性、吸収性、および血液脳関門の透過性、生物学的半減期などを改善し得る。このような変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドの部分または修飾は、あるいは、タンパク質の起こりえる望まない副作用などを除去または軽減し得る。そのような効果を媒介できる部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1980) に開示されている。
【０２２９】
変異型ＴＮＦ−アルファの他のタイプの共有結合的修飾は、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドを、米国特許４,６４０,８３５；４,４９６,６８９；４,３０１,１４４；４,６７０,４１７；４,７９１,１９２または４,１７９,３３７に記載の方法で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなどの様々な非タンパク質性ポリマーの１つに連結させることを含む。これらの非タンパク質性ポリマーは、変異型ＴＮＦ−アルファの、受容体結合を乱す能力および／またはインビボの安定性を高めるためにも使用し得る。
【０２３０】
他の好ましい実施態様では、（ａ）特性解析用の標識部位を導入するため、および（ｂ）ＰＥＧ化部位を導入するために、システインを変異体または野生型ＴＮＦ−アルファ中に設計する。例えば、使用し得る標識は、当分野で周知であり、ビオチン、タグおよび蛍光標識（例えばフルオレセイン）を含むがこれらに限定されるものではない。これらの標識は、また当分野で周知のように、様々なアッセイにおいて特性解析を達成するために使用し得る。当分野で周知のように、ＰＥＧ化を達成するために様々なカップリング化学を使用し得る。例には、リジン基およびＮ末端を含むがこれらに限定されるものではない一級アミンでの修飾を可能にする Shearwater および Enzon の技術が含まれるが、これらに限定されるものではない。両方とも出典明示により本明細書の一部とする、Kinstler et al, Advanced Drug Deliveries Reviews, 54, 477−485 (2002) および MJ Roberts et al, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 459−476 (2002)を参照されたい。
【０２３１】
修飾に最適な部位は、目視検査、構造分析、配列分析および分子シミュレーションを含む様々な基準を使用して選択できる。例えば、図１８に示すように、個々の残基の分画到達性（表面 ａａ）を分析し、単量体構造を乱さない突然変異部位を同定する。次いで、単量体の各側鎖から他のサブユニットへの最小距離（最小距離）を算出し、化学修飾が三量体化を乱さないことを確実にする。受容体結合の混乱が生じてもよく、そして本発明のＴＮＦ変異体の活性に有利であり得ることが可能である。
【０２３２】
好ましい実施態様では、本発明のＴＮＦ−アルファ変異体の最適化学修飾部位には、以下が含まれるがこれらに限定されるものではない：
【表２】
2005512521.tif 000003
【０２３３】
より好ましい実施態様では、最適化学修飾部位は、単独または任意の組合せで、２１、２３、３１および４５である。
【０２３４】
別の好ましい実施態様では、ＴＮＦ−アルファ分子が正しく折り畳まれることを可能とするままで、野生型ＴＮＦ−アルファ単量体のＮまたはＣ末端のいずれかの部分を欠失させる。加えて、これらの修飾されたＴＮＦ−アルファタンパク質は、受容体結合能を欠き、場合により他の野生型ＴＮＦ−アルファ分子または修飾されたＴＮＦ−アルファタンパク質と相互作用して上記のように三量体を形成する。ことさらに、ＮもしくはＣ末端、または両方からの、約１ないし約５５アミノ酸の除去または欠失が好ましい。より好ましい実施態様には、残基１０を超えるＮ末端の欠失が含まれ、最初の４７のＮ末端アミノ酸の欠失がより好ましい。Ｃ末端のロイシンの欠失は、これに代わる実施態様である。
【０２３５】
他の好ましい実施態様では、野生型ＴＮＦ−アルファまたは本発明により生成される変異体は、環状に変更される。全ての天然のタンパク質は、Ｎ末端で開始しＣ末端で終了するアミノ酸配列を有する。ＮおよびＣ末端は、つながれて、環状化または環状に変更されたＴＮＦ−アルファタンパク質を創生し得、一方、野生型タンパク質と比較して生物学的特性を保持または改善する（例えば、高められた安定性および活性など）。ＴＮＦ−アルファタンパク質の場合、通常タンパク質の一次構造の内側にあるアミノ酸位置でＮおよびＣ末端の新規セットを創生し、本来のＮおよびＣ末端は、長さ０ないし３０のアミノ酸からなるペプチドリンカーを介してつながれる（リンカー設計を合わせるために、本来の末端の近くに位置するいくつかのアミノ酸を除去する場合もある）。好ましい実施態様では、新規ＮおよびＣ末端は、ループやターンなどの不規則的な二次構造エレメント中に位置し、新規タンパク質の安定性および活性が本来のタンパク質のものと類似するようにする。環状に変更されたＴＮＦ−アルファタンパク質は、さらにＰＥＧ化またはグリコシル化し得る。さらに好ましい実施態様では、ＰＤＡ（登録商標）技術は、ＴＮＦ−アルファ変異体を、特に環状変更により創生される領域において、さらに最適化するために使用し得る。これらには、新規ＮおよびＣ末端、並びに本来の末端およびリンカーペプチドが含まれる。
【０２３６】
タンパク質を変更するために、様々な技法を使用し得る。US 5,981,200; Maki K, Iwakura M., Seikagaku. 2001 Jan; 73(1): 42−6; Pan T., Methods Enzymol. 2000; 317:313−30; Heinemann U, Hahn M., Prog Biophys Mol Biol. 1995; 64(2−3): 121−43; Harris ME, Pace NR, Mol Biol Rep. 1995−96; 22(2−3):115−23; Pan T, Uhlenbeck OC., 1993 Mar 30; 125(2): 111−4; Nardulli AM, Shapiro DJ. 1993 Winter; 3(4):247−55, EP 1098257 A2; WO 02/22149; WO 01/51629; WO 99/51632;  Hennecke, et al., 1999,  J. Mol. Biol., 286, 1197−1215; Goldenberg et al J. Mol. Biol 165, 407−413 (1983); Luger et al, Science, 243, 206−210 (1989); および Zhang et al., Protein Sci 5, 1290−1300 (1996)を参照されたい。全て出典明示により本明細書の一部とする。
【０２３７】
加えて、タンパク質が末端を含有しない、完全に環状のＴＮＦ−アルファを生成し得る。これは、インテイン技術を利用して達成される。このように、ペプチドは環状化でき、特にインテインは環状化を達成するために利用され得る。
【０２３８】
本発明にかかる変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドは、さらに、別の非定型のポリペプチドまたはアミノ酸配列と融合した変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドを含むキメラ分子を形成させる方法で修飾することができる。ある実施態様において、かかるキメラ分子は、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドと、抗標識抗体が選択的に結合するエピトープを提供する、標識ポリペプチドとの融合物を含む。このエピトープ標識は一般に、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に位置する。このようなエピトープ標識された形態の変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドの存在は、この標識ポリペプチドに対する抗体を用いて検出できる。また、エピトープ標識の提供は、この変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドを、抗標識抗体またはエピトープ標識に結合する他の型の親和マトリックスを使用する親和精製によって容易に精製できるようにする。これに代わる実施態様では、このキメラ分子は、変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定領域との融合物を含むことができる。二価形態のキメラ分子の場合、このような融合物はＩgＧ分子のＦc領域に対するものである。
【０２３９】
様々な標識ポリペプチドおよびそれらの各抗体が当分野でよく知られている。例として、ポリ−ヒスチジン（ポリｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）標識；ｆｌｕＨＡ標識ポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Field et al., Mol.Cell.Biol.8:2159−2165(1988)]；ｃ−ｍｙｃ標識およびこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Evan et al., Molecular and Cellular Biology、5:3610−3616(1985)]；および単純ヘルペスウイルス糖蛋白Ｄ（ｇＤ）標識およびその抗体［Paborsky et al., Protein Engineering、3(6):547−553(1990)]。その他の標識ポリペプチドには、Ｆｌａｇ−ペプチド［Hopp et al., BioTechnology 6:1204−1210(1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin et al., Science 255:192−194(1992)]；チューブリンエピトープペプチド［Skinnere et al., J.Biol.Chem. 266:15163−15166(1991)]；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド標識［Lutz−Freyermuth et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87:6393−6397(1990)］が包含される。
【０２４０】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、発現後に精製または単離する。変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、試料中に他のいかなる成分が存在するかに応じて、当業者に知られる様々な方法で単離または精製することができる。標準的精製法には、イオン交換、疎水性、親和、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを包含する、電気泳動、分子的、免疫学的およびクロマトグラフィー的技術、並びにクロマトフォーカシングを挙げ得る。例えば、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は標準的抗ライブラリー抗体カラムを用いて精製できる。タンパク質濃縮に関連した限外濾過およびダイアフィルトレーション技術もまた有用である。好適な精製技術の一般的指針については、Scopes, R.; 蛋白精製、Springer−Verlag、NY(1982) を参照。必要な精製の程度は変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の用途に応じて変る。いくつかの例では精製は必要ないであろう。
【０２４１】
いったん製造されたならば、本発明に係る変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質および核酸は、数々の適用に用途がある。好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質は、ＴＮＦ−アルファ関連疾患を処置するために患者に投与する。
【０２４２】
本明細書中における「ＴＮＦ−α関連疾患」または「ＴＮＦ−アルファ応答性疾患」または「症状」とは、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を含む医薬組成物の投与により改善できる疾患を意味する。限定でないが、炎症性および免疫性障害を含む。好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファは、免疫調節疾患の病理において多面的役割を有する主要なエフェクターおよび調節サイトカインである。
【０２４３】
好ましい実施態様では、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を使用して、脊椎関節炎（spondyloarthritis）、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、敗血症および敗血症ショック、クローン病、乾癬、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、並びに、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形性症候群（ＭＤＳ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの血液悪性腫瘍、癌、および腫瘍に関連する炎症、末梢神経損傷または脱髄性疾患を処置する。例えば、Tsimberidou et al., Expert Rev Anticancer Ther 2002 Jun; 2(3): 277−86 を参照されたい。
【０２４４】
炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）は、一般的に２つの疾患に適用される用語である。即ち、潰瘍性大腸炎およびクローン病である。潰瘍性大腸炎は、大腸のみを冒し、非常に重篤な場合を除き腸粘膜に限定される、原因不明の慢性炎症性疾患である。疾患の経過は継続的または再発性、軽症または重篤であり得る。これは、急性の重篤な疾患または慢性の間断のない疾患に必要とされ得る、全体的人工肛門形成術により治癒可能である。
【０２４５】
クローン病もまた、原因不明の慢性炎症性疾患であるが、潰瘍性大腸炎と異なり、腸のいかなる部分をも冒し得る。病変は表在的に始まるが、炎症過程は腸壁を通り流入領域リンパ節まで広がる。潰瘍性大腸炎と同様に、疾患の経過は継続的または再発性、軽症または重篤であり得るが、潰瘍性大腸炎と異なり、腸の関与切片の切除術により治癒できない。クローン病の患者の殆どは時々手術に来るが、後に再発するのが一般的であり、継続的医療処置が通常である。
【０２４６】
レミケード（Remicade；登録商標；インフリキシマブ（inflixmab））は、市販のクローン病処置剤である。レミケード（登録商標）は、ＴＮＦ−アルファに結合するキメラモノクローナル抗体である。本発明のＴＮＦ−アルファ変異体も、ＩＢＤまたはクローン病に関連する症状の処置に使用し得る。
【０２４７】
「敗血症」は、本明細書において、グラム陽性菌またはグラム陰性菌感染に起因する疾患を意味すると定義される。後者は主に菌体内毒素であるリポ多糖類（ＬＰＳ）による。これは少なくとも６種の主要なグラム陰性菌により誘導され、これらは、緑濃菌、大腸菌、プロテウス属、クレブシエラ属、エンテロバクター属およびセラチア属である。
【０２４８】
敗血症ショックは、肺炎球菌および連鎖球菌などによるグラム陽性菌感染、または大腸菌、クレブシエラ−エンテロバクター属、シュードモナス属およびセラチア属などによるグラム陰性菌感染に関連し得る症状である。グラム陰性の生物の場合、ショック症候群は、血流への細菌自体の浸入によるのではなく、菌体内毒素、即ち生物の細胞壁のＬＰＳ部分の、循環への放出に関連する。敗血症ショックは、不適切な組織潅流および循環の不全により特徴付けられ、組織への不十分な酸素供給、低血圧、頻脈、頻呼吸、発熱および乏尿を導く。敗血症ショックは、細菌性生成物、原則的にＬＰＳが、細胞膜および凝固の成分、補体、線維素溶解成分、ブラジキニンおよび凝固を活性化する免疫系、損傷細胞と反応し、特に微小血管系で血流を変えることにより起こる。微生物は、頻繁に古典的補体経路を活性化し、菌体内毒素は代替的経路を活性化する。
【０２４９】
本発明のＴＮＦ−アルファ変異体は、野生型ＴＮＦ−アルファに誘導される細胞毒性作用に効果的に拮抗し、ＴＮＦの成熟型ＴＮＦ分子（例えば、ＴＮＦの三量体形態）への変換を妨害する。従って、ＴＮＦ変異体の投与は、敗血症または敗血症ショックの効果を改良するか、または除去し、敗血症または敗血症ショックに関連する経路を阻害する。投与は、治療的または予防的であり得る。
【０２５０】
本発明のＴＮＦ−アルファ変異体は、細胞をベースとするアッセイおよび末梢神経損傷および軸索の脱髄／変性の動物モデルにおいて野生型ＴＮＦ−アルファに誘導される細胞毒性作用に効果的に拮抗し、損傷または脱髄性発作の炎症性成分を低減させる。このことは、神経病理および行動の後遺症に決定的に貢献し、有痛性の神経障害に影響する。
【０２５１】
重篤な神経損傷は、ＴＡＣＥ、即ちＴＮＦ−アルファ−変換酵素を含むマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性化を誘導し、ワーラー神経変性（Wallerian nerve degeneration）を導く現象のカスケードの早い時点でＴＮＦ−アルファタンパク質のレベルを高める結果となり、疼痛の感覚を増大させる（痛覚過敏）。本発明のＴＮＦ−アルファ変異体は、末梢からのマクロファージの補充を低減させる意図で、再ミエリン化に負の影響を与えずに、これらの高まったレベルのＴＮＦ−アルファの活性に末梢神経損傷部位で拮抗する。従って、これらのＴＮＦ−アルファ変異体を用いる局所的ＴＮＦ誘導性炎症の低減は、末梢神経損傷における炎症性脱髄および軸索変性、並びにしばしばかかる末梢神経損傷から生じる神経障害性疼痛状態の特徴である慢性痛覚過敏の処置における治療戦略を意味する。
【０２５２】
外来性ＴＮＦ−アルファの神経内投与は、脱髄および軸索変性と共に、末梢神経の裏打ち（神経内膜）の中で炎症性血管変化をもたらす（Redford et al 1995）。神経切断後、ＴＮＦ陽性マクロファージは、変性している繊維中に見いだされ、軸索切断後のミエリン分解に関与すると考えられる（Stoll et al 1993）。さらに、末梢神経グリア（シュワン細胞）および内皮細胞は、神経障害部位で異常な量のＴＮＦ−アルファを産生し（Wagner et al 1996）、抗ＴＮＦ−アルファ抗体の腹膜内適用は、炎症性脱髄の程度を有意に低減させる。これらは、神経脱髄および変性におけるＴＮＦ−アルファの病原性の役割を強く含意する（Stoll et al., 1993）。従って、本発明のＴＮＦ−アルファ変異体の有効量の投与は、これらの末梢神経損傷または脱髄症状の処置に使用し得る。好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の治療上有効な用量を、治療を必要とする患者に投与する。本明細書中、「治療上有効な用量」とは、それが投与される目的の効果を生み出す用量を意味する。正確な用量は治療目的に依存し、既知の技術を用いて当業者が確認できるであろう。好ましい実施態様においては、約５μｇ／ｋｇの用量を用いて静脈内または皮下のいずれかに投与する。当分野で知られるように、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の分解、全身対局所デリバリー、および新たなプロテアーゼ合成の速度、並びに年齢、体重、一般健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用および状態の重篤度についての調節が必要となり得、これらは当業者によって常套的実験を用いて確認できるであろう。
【０２５３】
本発明の目的のための「患者」とは、ヒトおよびその他の動物の両者、特に哺乳動物、および生物を包含する。従って、この方法は、ヒトの治療および獣医学的適用の両者に適用可能である。好ましい実施態様において患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施態様では、患者はヒトである。
【０２５４】
本発明において「処置」という語は、疾病または異常に対する治療的処置、並びに予防的または抑制的方法の包含を意味する。従って、例えば疾病の発症前に変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をうまく投与するならば、その疾病の「処置」がもたらされる。別の例としては、疾病の症状と対抗するため、その疾病の臨床症状発現後に変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をうまく投与することは、その疾病の「処置」を含む。「処置」とはさらに、疾病を根絶するため、その疾病の出現後に変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を投与することをも包含する。臨床症状の緩和の可能性および恐らくは疾病の軽減を伴う、発症後および臨床症状発現後の好首尾の投与は、該疾病の「処置」を含む。
【０２５５】
「処置を必要とする」ものとは、既にその疾病または異常を有する哺乳動物、およびその疾病または異常に罹り易い哺乳動物を包含し、その疾病または異常を防止すべき哺乳動物を包含する。
【０２５６】
別の実施態様においては、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質、変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子、または変異型ＴＮＦ−アルファ抗体の治療上有効な用量を、不適当なＴＮＦ−アルファの発現を含む疾病を有する患者に投与する。本発明の範囲内にある「不適当なＴＮＦ−アルファの発現を含む疾病」とは、ＴＮＦ−アルファの存在量の変化による、またはＴＮＦ−アルファ変異体の存在に起因する、異常なＴＮＦ−アルファを特徴とする疾病または異常の包含を意味する。過剰は、分子レベルでの過剰発現、作用位置での延長されたもしくは蓄積された出現、または正常状態に比したＴＮＦ−アルファの活性の増強を包含する(但しこれらに限定されない)いかなる原因にも起因し得る。この定義にはＴＮＦ−アルファの低下を特徴とする疾病または異常が包含される。この低下は、分子レベルでの低下発現、作用位置での短縮されたまたは低下した出現、ＴＮＦ−アルファの変異型、または正常状態に比したＴＮＦ−アルファの活性の減少を包含する(但しこれらに限定されない)いかなる原因にも起因し得る。ＴＮＦ−アルファの正常な発現、出現、または活性に比較した、このようなＴＮＦ−アルファの過剰または低下は、本明細書に記載し引用した検定に従って(但しこれらに限定されない)測定することができる。
【０２５７】
好ましくは無菌水溶液の形態での、本発明に係る変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の投与は、経口、皮下、静脈内、経鼻、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、腟内、直腸内、または眼内を包含する（但しこれらに限定されない）様々な方法で実施することができる。いくつかの例では、例えば創傷、炎症、または多発性硬化症の治療の際に、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を溶液またはスプレーとして直接適用することができる。導入の様式に応じてこの医薬組成物は様々な方法で製剤化できる。治療上活性な変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の製剤内濃度は、約０.１から１００重量％まで変わり得る。別の好ましい実施態様においては、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の濃度は０.００３ないし１.０モルの範囲であり、体重１キログラム当たり０.０３、０.０５、０.１、０.２、０.３ミリモルの用量が好ましい。
【０２５８】
本発明にかかる医薬組成物は、患者への投与に好適な形態で変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を含む。好ましい実施態様において、この医薬組成物は、薬学上許容し得る塩として存在するといったような、水溶性の形態であり、これは酸および塩基付加塩の包含を意味する。「薬学上許容し得る酸付加塩」とは、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等、および有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、琥珀酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、サリチル酸等を用いて製造された、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、かつ生物学的またはその他の意味で有害でない塩を指す。「薬学上許容し得る塩基付加塩」とは、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等といったような無機塩基から誘導されるものを包含する。アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が特に好ましい。薬学上許容し得る有機非毒性塩基から誘導される塩は、第一、第二、および第三アミン、天然産生置換アミンを包含する置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、およびエタノールアミンの塩を包含する。
【０２５９】
この医薬組成物は以下のものの１以上を含み得る：担体タンパク質、例えば血清アルブミン；緩衝剤、例えばＮaＯＡc；増量剤、例えば微結晶性セルロース、乳糖、トウモロコシおよびその他の澱粉；結合剤；甘味料およびその他の香料；着色剤；並びにポリエチレングリコール。添加剤は当分野でよく知られており、様々な製剤に使用されている。
【０２６０】
さらなる実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質はミセル製剤に添加されており；米国特許第５,８３３,９４８を参照（出典明示によりその全体を本明細書の一部とする）。
医薬組成物の組み合わせを投与することができる。さらに、該組成物は他の治療薬と組み合わせて投与することができる。
【０２６１】
本明細書に提供される１つの実施態様において、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を包含する(但しこれらに限定されない)抗体を、当分野で知られる方法を用いて変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質に対して作製する。好ましい実施態様において、これらの抗変異型ＴＮＦ−アルファ抗体を免疫療法に使用する。従って、免疫療法の方法を提供する。「免疫療法」とは、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質に対して作製された抗体による、ＴＮＦ−アルファ関連疾患の治療を意味する。本明細書中使用する免疫療法とは、受動的または能動的であってよい。本明細書中定義する受動免疫療法は、レシピエント（患者）への抗体の受動的移動である。能動免疫は、レシピエント（患者）における抗体および／またはＴ細胞反応の誘導である。免疫反応の誘導は、レシピエントに、抗体が作製される変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質抗原を提供した結果であってよい。当業者に理解できるように、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質抗原は、これに対する抗体がレシピエント内部に作製されることが望まれる変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドを注射することによって、または、レシピエントに、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質抗原を発現することのできる変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質コード化核酸を、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質抗原の発現のための条件下で接触させることによって、提供できる。
【０２６２】
別の好ましい実施態様において、治療用化合物を抗体、好ましくは抗変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質抗体とコンジュゲートさせる。この治療用化合物は細胞毒性物質であってよい。この方法では、腫瘍組織または細胞を細胞毒性物質の標的とすることが、罹患細胞の数の減少をもたらし、それにより癌、および変異型ＴＮＦ−アルファ関連疾患に伴う症状を低減させる。細胞毒性物質は多数かつ多岐にわたり、細胞毒性薬物または毒素またはかかる毒素の活性断片を包含するが、これらに限定されない。好適な毒素およびそれらの対応断片は、ジフテリアＡ鎖、エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン、エノマイシン等を包含する。細胞毒性物質はさらに、細胞周期タンパク質に対して作製された抗体にラジオアイソトープをコンジュゲートさせることにより、または、抗体に共有結合させたキレート剤に放射性核種を結合させることによって製造される放射性化学物質を包含する。
【０２６３】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質を治療物質として投与でき、上に概説したように製剤化することができる。同様に、変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子（全長配列、部分配列、または変異型ＴＮＦ−アルファコード化領域の制御配列を包含する）は、当分野で知られるように、遺伝子治療適用において投与することができる。これらの変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子は、当業者には理解できるであろうが、遺伝子治療（即ち、ゲノムへの組み込みのため）としてまたはアンチセンス組成物としてのアンチセンス適用を包含することができる。
【０２６４】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードしている核酸は、遺伝子治療に使用することもできる。遺伝子治療適用では、例えば欠陥遺伝子の置換のため、治療上有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために、細胞内に遺伝子を導入する。「遺伝子治療」は、１回の治療によって永続的効果が達成される常套的遺伝子治療と、治療上有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を含む遺伝子治療剤の投与の両者を包含する。ある遺伝子の発現をインビボで遮断するための治療用物質として、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡを使用することができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入することができ、細胞膜による取り込みが限定されているため細胞内濃度が低いにも拘わらず、それらがインヒビターとして働くということが既に示されている[Zamecnik et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 83:4143−4146 (1986)]。このオリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステル基を非荷電基に置換することにより、それらの取り込みを増強するよう修飾することができる。
【０２６５】
生存細胞に核酸を導入するために利用できる様々な技術がある。この技術は、核酸を、培養細胞にインビトロで移行させるのか、または意図する宿主の細胞にインビボで移行させるのかによって異なる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移行させるのに好適な技術は、リポソーム、電気穿孔、マイクロ注入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等の使用を包含する。現在好ましいインビボ遺伝子移動技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターによるトランスフェクションおよびウイルス外殻タンパク質−リポソーム仲介トランスフェクションを包含する［Dzau et al., Trends in Biotechnology 11:205−210(1993)]。いくつかの状況では、核酸供給源に、標的細胞を標的とする物質、例えば細胞表面膜タンパク質または標的細胞に対し特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等を供給することが望ましい。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的化のために、そして／または、例えば特定の細胞型に対し親和性のカプシドタンパク質またはその断片、周期においてインターナリゼーションを受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を増大させるタンパク質、の取り込みを促進するために使用できる。レセプター仲介エンドサイトーシスの技術は、例えば Wu et al., J. Biol. chem.. 262:4429−4432 (1987)；および Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87:3410−3414 (1990) に記載されている。遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールの総説については Anderson et al., Science 256:808−813(1992)を参照。
【０２６６】
好ましい実施態様において、変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子は、単一の遺伝子または変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子の組み合わせのいずれかのＤＮＡワクチンとして投与する。裸のＤＮＡワクチンは一般に当分野で知られている。Brower、Nature Biotechnology、16:1304−1305(1998)。ＤＮＡワクチンとしての遺伝子の使用方法は当業者によく知られており、変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子または変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子の一部を、発現のためのプロモーターの調節下に、治療を必要とする患者に入れることを包含する。
【０２６７】
ＤＮＡワクチンに使用される変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子は、全長変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質をコードしていてよいが、より好ましくは、変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質から誘導されるペプチドを含む変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質の一部をコードしている。好ましい実施態様において、患者を、変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子から誘導される多数のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチンで免疫する。同様に、本明細書に定義する多数の変異型ＴＮＦ−アルファ遺伝子またはその一部で患者を免疫することも可能である。理論により拘束されることなく、このＤＮＡワクチンによりコードされているポリペプチドの発現、細胞毒性T細胞、ヘルパーＴ細胞および抗体が誘導され、これらはＴＮＦ−アルファタンパク質を発現する細胞を認識し、かつこれを破壊または排除する。
【０２６８】
好ましい実施態様において、このＤＮＡワクチンは、該ＤＮＡワクチンと共にアジュバント分子をコードしている遺伝子を包含する。かかるアジュバント分子は、該ＤＮＡワクチンによりコードされている変異型ＴＮＦ−アルファポリペプチドに対する免疫原性反応を増大させるサイトカインを包含する。さらなるまたはこれに代わるアジュバントが当業者に知られており、本発明における用途が見いだせる。
【０２６９】
特許、特許出願（仮、実用新案およびＰＣＴ）および出版物を含む、本明細書に引用されている文献は全て出典明示によりその全体を本明細書の一部とする。
【０２７０】
実施例１
ＴＮＦ−アルファライブラリーの発現、精製およびＴＮＦ−アルファ変異体の活性アッセイについてのプロトコール
方法：
１）終夜培養調製物
９６ウェルＰＣＲプレート中の形質転換能 Tuner(DE3)pLyS 細胞を、１μlのＴＮＦ−アルファライブラリーＤＮＡで形質転換し、３４ｍg／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを有するＬＢ寒天プレートに広げた。３７℃で終夜成長させた後、コロニーを各プレートから、９６深ウェルブロックに３４ｍg／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍg／ｍｌのアンピシリンを有する１.５ｍｌのＣＧ培地に採取した。ブロックを２５０ｒｐｍ、３７℃で終夜攪拌した。
【０２７１】
２）発現
コロニーをプレートから、２４ウェルブロック中の５ｍｌのＣＧ培地（３４ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン）に採取し、ＯＤ６００ ０.６になるまで３７℃、２５０ｒｐｍで成長させ、その時点で各ウェルに１ｍＭ濃度までＩＰＴＧを加えた。培養物をさらに４時間成長させた。
【０２７２】
３）分解
２４ウェルブロックを３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットを７００μlの分解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に再懸濁した。−８０℃で２０分間冷凍し、３７℃で２回解凍した後に、ＭgＣl2を１０ｍＭまで、ＤＮaseを７５ｍｇ／ｍｌまで加えた。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。
【０２７３】
４）ＮｉＮＴＡカラム精製
自然状態のQiagen Ni NTA スピンカラム精製プロトコールに従って精製を行った。精製されたタンパク質を１ＸＰＢＳに対して１時間４℃で４回透析した。Millipore マルチスクリーンＧＶフィルタープレートを使用して、透析されたタンパク質をフィルター滅菌し、後の滅菌哺乳動物細胞培養物へのタンパク質添加を可能とした。
【０２７４】
５）定量
精製されたタンパク質をＳＤＳ ＰＡＧＥで定量し、コーマシー染色およびKodak（登録商標）デジタル・イメージ密度測定を行った。
【０２７５】
６）ＴＮＦ−アルファ活性アッセイ
変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質サンプルの活性を、Vybrant Assay Kit および Caspase Assay Kit を用いて試験した。Syntox Green 核酸染色液を用いて、アクチノマイシンＤ感受性細胞系におけるＴＮＦ誘導細胞透過性を検出した。細胞の核酸と結合すると、染色は大きい蛍光の高まりを示し、これを測定する。この染色は生きている細胞から排除されるが、傷ついた膜を有する細胞を貫通する。
【０２７６】
カスパーゼアッセイは蛍光測定アッセイであり、細胞におけるアポトーシスとネクローシスとを識別できる。アポトーシスを誘導するように処理された細胞から細胞抽出物を作成した。これらの抽出物に、蛍光結合カスパーゼ基質（ＤＥＶＤ−Ｒ１１０）ペプチドを添加した。活性化されたカスパーゼ酵素は、ＤＥＶＤ−Ｒ１１０ペプチドを切断し、Ｒ１１０の蛍光の増大をもたらす。従って、Ｒ１１０の蛍光は、カスパーゼ活性の直接的測定であり、それはアポトーシスの直接的測定である。
【０２７７】
Ａ）材料
細胞系：ＡＴＣＣからのＷＥＨＩ Ｖａｒ−１３細胞系
培地：１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ完全培地
Vybrant TNF Kit：Cat # V−23100 ; Molecular Probe
キットは、SYTOXグリーン核酸染色液（５００ｍＭ溶液）およびアクチノマイシンＤ（１ｍｇ／ｍＬ）を含む。
Caspase Assay Kit：Cat # 3 005 372; Roche
キットは、基質原液（５００μＭ）およびインキュベーション緩衝液を含む。
ＴＮＦ−アルファ標準原液：R & D からのｈＴＮＦ−アルファの１０μｇ／ｍＬの原液
未知のサンプル：社内ＴＮＦ−アルファライブラリー・サンプル
９６ウェルプレート：１ｍＬ深ウェルおよび２５０ｍウェル
マイクロプレート・リーダー
【０２７８】
Ｂ）方法
２.５x１０５細胞／ｍＬのＷＥＨＩ１６４−１３Ｖａｒ細胞を、完全ＲＰＭＩ培地中に、アッセイ２４時間前に播く（Sytoxアッセイについて１００μＬ／ウェル、Caspaseアッセイについて５０μＬ／ウェル）。
実験当日に、下記のようにアッセイ培地を調製する：
１）Sytoxアッセイ用のアッセイ培地（１Ｘ）：濃縮 Sytox Green 染色液および濃縮アクチノマイシンＤ液を５００倍にＲＰＭＩ中に希釈し、最終濃度を１０ｍＭ Sytoxおよび２ｍｇ／ｍＬアクチノマイシンＤとし、アッセイ培地を調製する。
１０ｍＬ完全ＲＰＭＩ培地
２０ｍＬ SYTOX Green
２０ｍＬアクチノマイシンＤ
【０２７９】
２）Caspase Assay 用のアッセイ培地の作成（１Ｘ）
１０ｍＬ完全ＲＰＭＩ培地
２０μＬアクチノマイシンＤ（最終濃度２ｍｇ／ｍＬ）
【０２８０】
３）サンプル用のアッセイ培地の作成：Sytox Assay（２Ｘ）
１４ｍＬ完全ＲＰＭＩ培地
５６ｍＬ SYTOXグリーン核酸染色液
５６ｍＬアクチノマイシンＤ
【０２８１】
４）アッセイ培地の作成：(２Ｘ)：サンプル用：Caspase アッセイ
１４ｍＬ完全ＲＰＭＩ培地
５６ｍＬアクチノマイシンＤ
５）標準曲線稀釈の準備および実施
ＴＮＦ−アルファ標準保存液：１０ｍｇ／ｍＬ
１μｇ／ｍＬまで稀釈：１０μＬ保存液＋９０μＬアッセイ培地
【０２８２】
【表３】
2005512521.tif 000004
【０２８３】
未知のサンプルについて：(ゲルにより定量）：ＴＮＦ−アルファライブラリー：
以下のように、全サンプルを同じ開始濃度（５００ｎｇ／ｍＬ）に標準化：
そのまま（ニート（Neat））：５００ｎｇ／ｍＬ：１００ｍＬ
５００ｎｇの１：１０＝５０ｎｇ／ｍＬ：２０ｍＬニート＋１８０ｍＬ ＲＰＭＩ
５０ｎｇ／ｍＬの１：１０＝５ｎｇ／ｍＬ：５０ｎｇ／ｍＬの２０ｍＬ＋１８０ｍＬ ＲＰＭＩ
５ｎｇ／ｍＬの１：１０＝０.５ｎｇ／ｍＬ：０.５ｎｇ／ｍＬの２０ｍＬ＋１８０ｍＬ ＲＰＭＩ
【０２８４】
６）Sytox アッセイ用：別個の稀釈プレートに、６０ｍＬの各稀釈サンプルを６０ｍＬの２Ｘ Sytox アッセイ培地に加える。１００ｍＬの稀釈サンプルを１００μＬ培地に培養した細胞に移す。３７℃で６時間インキュベートする。蛍光に適したフィルター（４８５ｎｍ励起フィルターおよび５３０ｎｍ放出フィルター）をもつ蛍光マイクロプレート・リーダーを用いて、プレートを読む。
【０２８５】
７）Caspaseアッセイ用：別個の稀釈プレートに、３５ｍＬ各稀釈サンプルを３５ｍＬの２Ｘ Caspaseアッセイ培地に加える。５０ｍＬの稀釈サンプルを５０ｍＬ培地に培養した細胞に移す。３７℃で４時間インキュベートする。４時間後にCaspase基質を加える（１００μＬ／ウェル）[前稀釈基質 １:１０］。さらに２時間３７℃でインキュベートする。読む（蛍光）。
【０２８６】
Ｃ）データ分析
蛍光シグナルはアポトーシス細胞の数に直接比例する。ＴＮＦ−アルファ標準濃度に対して蛍光をプロットし、標準曲線を作成する。標準曲線上での最高点（５ｎｇ／ｍＬ）から得られた蛍光を、未知のサンプルから得られた蛍光と比較し、サンプルの活性％を決定する。
【０２８７】
４パラメータ適合プログラムを用いてデータを解析し、ＴＮＦについて５０％有効濃度(ＥＣ５０）を決定する。未知サンプルの活性％＝（未知サンプルの蛍光／５ｎｇ／ｍＬ標準点の蛍光）ｘ１００
【０２８８】
実施例２
野生型ＴＮＦ−アルファタンパク質のアゴニストを探索するためのＴＮＦ−アルファ活性アッセイ
Ａ）材料と方法：
１）ＴＮＦアッセイ用に細胞を播く：ＷＥＨＩを２.５ｘ１０５細胞／ｍｌ（９６ウェルプレート中、５０μｌ／ウェル）で播く。
２）アッセイ培地を下記のように調製する：
ａ）１Ｘアッセイ培地：
１０ｍｌ完全ＲＰＭＩ培地
２０μｌアクチノマイシンＤ
ｂ）２Ｘアッセイ培地：
７ｍｌ完全ＲＰＭＩ培地
２８μｌアクチノマイシンＤ
【０２８９】
３）生物活性アッセイ用に、ＴＮＦ−アルファ標準を希釈する：下記のように、２つの標準曲線を２部必要とする：
社内ＴＮＦ−アルファ（lot #143−112) 原液：１.１
４０μｇ／ｍＬに希釈：３６μｌ原液＋９６４μｌアッセイ培地
【表４】
2005512521.tif 000005
【０２９０】
４）ＴＮＦ−アルファライブラリー由来の未知サンプルの処理:
以下のように希釈することにより、全サンプルを同じ開始濃度（２００,０００ｎｇ／ｍｌ）に標準化する:
そのまま（ニート）：２００,０００ｎｇ／ｍｌ：２００μｌ
２００,０００ｎｇ／ｍｌの１：１０＝２０,０００ｎｇ／ｍｌ：２０μｌのニート＋１８０μｌのＲＰＭＩ
２０,０００ｎｇ／ｍｌの１：１０＝２０００ｎｇ／ｍｌ：２０μｌの１：１０＋１８０μｌＲＰＭＩ
２０００ｎｇ／ｍｌの１：１０＝２００ｎｇ／ｍｌ：２０μｌの１：１００＋１８０μｌＲＰＭＩ
２００ｎｇ／ｍｌの１：１０＝２０ｎｇ／ｍｌ：２０μｌの１：１００＋１８０μｌＲＰＭＩ
【０２９１】
Caspase アッセイ用の別個の希釈プレート上で：
１５０μｌの各希釈サンプルを１５０μｌの２Ｘカスパーゼアッセイ培地に添加する。
全希釈サンプルおよび標準曲線を３７℃で終夜インキュベートする。翌朝、５０μｌの希釈サンプルをＣＭと共に細胞に移す。４時間後、基質を調製し、１００μｌの基質を細胞に添加する。基質と２時間インキュベートした後、蛍光を読む。
Ｂ）結果：
結果を図８にまとめる。
【０２９２】
実施例３
ＴＮＦ−アルファアンタゴニスト活性
Ａ）材料と方法:
１）アッセイ用に細胞を播く：２.５ｘ１０５細胞／ｍｌでＷＥＨＩを播く（５０μｌ／ウェル）
２）アッセイ培地を調製する：
１Ｘ Assay Medium
４０ｍｌ完全ＲＰＭＩ培地
８０μｌアクチノマイシンＤ（最終濃度２μｇ／ｍｌ）
３）ＴＮＦ−アルファ変異体のアンタゴニスト活性
４）アッセイ培地＋野生型ＴＮＦ−アルファの調製
野生型ＴＮＦ−アルファは１.１ｍｇ／ｍｌである
１μｇ／ｍｌ：１：１０００；１ｍｌのＲＰＭＩ中、１μｌの原液
２０ｎｇ／ｍｌ：１μｇ／ｍｌの１：５０；４０ｍｌのアッセイ培地中、８００μｌ
【０２９３】
５）ＴＮＦ−アルファ変異体の希釈は、以下のように行った：
【表５】
2005512521.tif 000006
【０２９４】
５）阻害アッセイ用の希釈：
１Ｘアッセイ培地にＴＮＦ受容体（ＴＮＦ Ｒ）を希釈するための原液：
原液は１００μｇ／ｍｌである
２０μｇ／ｍｌ用：１：５希釈：６０μｌの１００μｇ／ｍｌ原液＋２４０μｌの野生型ＴＮＦ−アルファを有する１Ｘアッセイ培地
【０２９５】
以下に示すように、２０ｎｇ／ｍｌの野生型ＴＮＦ−アルファを含有するＴＮＦ Ｒアッセイ培地（細胞上で最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を希釈する：
【表６】
2005512521.tif 000007
【０２９６】
上記希釈は全て、細胞に添加する１６時間前に行った。その後、１２０μｌの各希釈サンプルを４℃でインキュベートし、１２０μｌの各サンプルを３７℃でインキュベートした。翌朝、５０μｌの各サンプルを細胞に添加した。細胞を３７℃で４時間インキュベートした。４時間のインキュベーション後、１００μｌのカスパーゼ基質を各ウェルに添加し、続いて３７℃で２時間インキュベートした。蛍光を読む。
結果を図９および１０に示す。
【０２９７】
実施例４
組合せたＴＮＦ−アルファ変異体のＴＮＦ−アルファアンタゴニスト活性
Ａ）材料と方法
１）アッセイ用に細胞を播く：ＷＥＨＩ１６４−１３Ｖａｒ細胞を、７.５ｘ１０５細胞／ｍｌで播き（５０μｌ／ウェル）、３７℃で終夜インキュベートする。
２）アッセイ培地を調製する：（１０Ｘ、細胞上の最終濃度は１０ｎｇ／ｍＬになる）
７ｍｌ完全ＲＰＭＩ
５ｕＬの３１０ｕｇ／ｍＬ野生型ｈｉｓ−ＴＮＦ[Lot#263−56]
１４０ｕＬ １ｍｇ／ｍＬアクチノマイシンＤ
３）ＴＮＦ−アルファ変異体の希釈は、以下のように行った：
実験開始３日前にこれらのサンプルを混合する。
【表７】
2005512521.tif 000008
【０２９８】
全ての希釈を行った後、ＷＴｈｉｓＴＮＦａを含有する１０Ｘアッセイ培地６８.４（ＴＮＦ Ｒには３４.２）ｕＬを、各希釈ウェルに添加した。次いで、９６ウェルを３日間インキュベーター内に置いた。５０ｕｌの各サンプルをＷＥＨＩ１６４−１３Ｖａｒ細胞に４時間添加した。インキュベーションが完了したら、１００ｕｌのカスパーゼ基質を添加した。１.５時間インキュベートした。Ｒ１１０標準をＲＰＭＩ中で１：１００に希釈し、８点の１／２希釈を続けることにより、Ｒ１１０曲線も調製した。１００ｕｌの各希釈を、細胞なしのプレートに添加した。これらの希釈は細胞に基質を添加する直前に行った。１００ｕｌの基質もＲ１１０曲線希釈に添加した。３７℃での１.５時間のインキュベーションが完了したら、４８４／５３５ｎｍ波長で Wallac 蛍光計を使用して全サンプルを読んだ。
結果を図２１に示す。
【０２９９】
実施例５
多数のＴＮＦ−アルファ変異体の固定平衡スクリーニング
ＴＮＦ−アルファ変異体の１：１０固定平衡比を調製した：
５０ｕＬの反応中、０.０１ｍｇ／ｍＬ野生型ｈｉｓ−ＴＮＦ[lot#263−56]を０.１ｍｇ／ｍＬ変異型ＴＮＦ−アルファと共にリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）中で混合した。
【表８】
2005512521.tif 000009
【０３００】
この混合物を調製し、３７℃で３ないし４日間インキュベートする。
アッセイ用に細胞を播く：ヒトＵ９３７細胞を、１ｘ１０６細胞／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）で播き、３７℃で終夜インキュベートする。
【０３０１】
２）Caspase アッセイ:
完全ＲＰＭＩ培地を温め、２ｕｇ／ｍＬアクチノマイシンＤを添加した。各５０ｕＬの反応全部を、アクチノマイシンＤを添加したＲＰＭＩ培地４５０ｕＬと混合した。この混合物を１：１に１１回希釈し、固定平衡用の用量曲線を生成させた。５０ｕＬの希釈混合物を細胞に４部適用した。細胞をＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦ−アルファ変異体固定平衡中で１.５時間インキュベートした。インキュベーションが完了したら、１００ｕｌのカスパーゼ基質を添加した。１.５時間インキュベートした。Ｒ１１０標準をＲＰＭＩ中で１：１００に希釈し、８点の１／２希釈を続けることにより、Ｒ１１０曲線も調製した。１００ｕｌの各希釈を、細胞なしのプレートに添加し、これらの希釈は細胞に基質を添加する直前に行った。１００ｕｌの基質もＲ１１０曲線希釈に添加した。３７℃での１.５時間のインキュベーションが完了したら、４８４／５３５ｎｍ波長で Wallac 蛍光計を使用して全サンプルを読んだ。
結果を図２２Ａ−Ｃに示す。
【０３０２】
実施例６
結合アッセイ
２０モル濃度過剰のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンをタンパク質サンプルに添加し、サンプルを氷上で２時間インキュベートすることにより、ＴＮＦａのビオチン化を実施した。過剰のビオチンをサンプルから透析により除去した。カップリング率は、１ないし４の範囲にあった。ビオチン化ＴＮＦａのタンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Pierce）により測定した。マイクロタイタープレートのウェルを２.５ｍｇ／ｍｌ濃度の抗ＦＬＡＧ抗体で被覆し、３％ＢＳＡにより終夜４℃でブロックした。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質ＴＮＦＲ１受容体をＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、抗ＦＬＡＧ被覆マイクロタイタープレートのウェルに添加し、プレートを２時間室温でインキュベートした。０−１ｍｇ／ｍＬの濃度範囲にあるビオチン化ＴＮＦａタンパク質を４部で抗−ＦＬＡＧ−ＴＮＦＲ１−被覆ウェルに添加し、総結合を表した。非特異的結合は、０−１μｇ／ｍｌの濃度範囲にあるビオチン化ＴＮＦアルファタンパク質を、抗ＦＬＡＧ抗体のみで被覆したウェルに４部で添加することにより測定した。終夜＋４℃で結合を生じさせ、平衡を確実にした。アルカリホスファターゼ結合ニュートラアビジン（neutravidin）(Pierce）をＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中１：１０,０００希釈でウェルに添加し、３０分間室温でインキュベートした。ＣＳＰＤｓｔａｒ基質（Applied Biosystems, Foster City, CA）を添加した際の発光を検出し、測定した（Wallac VICTOR, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA)。総結合から非特異的結合を差し引くことにより、ＴＮＦａの特異的結合を算出した。データを結合方程式ｙ＝（ＢＬｍａｘ＊ｘ）／（Ｋｄ＋ｘ）にフィットさせた。結合アッセイの結果を図１９Ａ−Ｄに示す。全変異体は、受容体結合の低下を示した。
【０３０３】
実施例７
７Ａ.  ＴＮＦ−アルファ変異体は野生型ＴＮＦ−アルファと交換し、ＮＦｋＢの活性化を低下させる
試験したＴＮＦ−アルファ変異体は、Ａ１４５Ｒ、二重変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈおよび三重変異体Ｅ１４６Ｋ／Ｖ９１Ｅ／Ｎ３４Ｅであった。Ｈｉｓ−タグ付きＴＮＦ−アルファを、１０倍過剰（１：１０）の様々な変異体と共に、３日間３７℃で予めインキュベートした。野生型ＴＮＦ−アルファ単独および予め交換したＴＮＦ−アルファ変異体の異種三量体を、２９３Ｔ細胞においてＮＦｋＢ作動性ルシフェラーゼレポーター（pNFkB−luc, Clontech）を活性化する能力について試験した。２９３Ｔ細胞を１.２ｘ１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。Fugene 形質転換試薬を製造者のプロトコール（Roche）に従って使用し、ｐＮＦｋＢ−ｌｕｃ（ＮＦ−ｋＢ依存性ルシフェラーゼレポーター）またはｐＴａｌ（対照：ルシフェラーゼ遺伝子を作動させる基底プロモーターであるが、ＮＦｋＢ結合エレメントを含まない）で細胞を形質転換した。形質転換の１２時間後、細胞を最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ野生型ＴＮＦ−アルファまたは予め交換した１０ｎｇ／ｍｌ：ＴＮＦ／１００ｎｇ／ｍｌ変異体の混合物で処理した。処理の１２時間後、Steady−Glo Luciferase Assay System (Promega) を製造者のプロトコールに従って使用し、９６ウェルプレート中の細胞をルシフェラーゼアッセイ用に加工した。各ウェルからの発光を、Packard TopCount NXT (Packard Bioscience) 発光カウンターを使用して測定した。処理したサンプルを４部で試験し、各処理につき、標準偏差を含む棒の値として発光の平均値をプロットした。結果を図２０Ａに示す。グラフは、本発明のＴＮＦ−アルファ変異体は、野生型ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢ活性化を低下させるのに有効であったことを示す。ＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈは、ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢ活性化を低下させるのに最も有効であった。
【０３０４】
７Ｂ.  ＨｅＬａ細胞におけるＮＦｋＢの免疫局在
ＨｅＬａ細胞を、１２ｍｍ滅菌カバースリップ（Fisherbrand）上に、１.５ｘ１０５細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレート中で播種し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。翌日、細胞を様々な濃度のｈｉｓタグ付き野生型ＴＮＦ−アルファ、Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ変異体単独、またはｈｉｓ−タグ付きＴＮＦ−アルファおよび１０倍過剰のＡ１４５／Ｙ８７Ｈ変異体（３日間、３７℃で予め交換した）により、３７℃、５％ＣＯ２で処理した。３０分間のインキュベーション後、６ウェルプレート中でカバースリップに接着した細胞を、ＰＢＳで短く洗浄し、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで１０分間固定した。次いで、細胞を免疫細胞化学用に加工する前に、細胞をＰＢＳでさらに５回洗浄するか、または最後のＰＢＳ洗浄液中で終夜維持した。カバースリップ上に固定した細胞を、０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで処理した。緩衝液を吸引し、カバースリップ毎に５０ｕｌの０.１％ＢＳＡ／０.１％ＴＸ−１００／ＰＢＳを用いて、加湿チャンバー内で１５分間、３７℃でカバースリップ上の細胞をブロックした。ブロック用試薬を除去し、ＮＦ−ｋＢのｐ６５サブユニット（pAb C−20, Santa Cruz Bioscience）に対する一次抗体と置き換えた。１時間、３７℃でインキュベートした後、抗体を除去し、カバースリップを５回ＰＢＳで洗浄した。ブロック緩衝液に希釈（１：１００）した５０ｕｌのＦＩＴＣ結合二次抗体（Jackson Immuno laboratories）を各カバースリップに添加し（Jackson Immunolaboratories）、カバースリップを遮光加湿チャンバー内でさらに１時間インキュベートし、二次抗体をＰＢＳによる５回の洗浄で除去した。カバースリップを蒸留水で短くすすぎ、遮光チャンバー内で空気乾燥させ、Anti−fade (Molecular Probes）を使用してスライドにマウントした。Cool SNAP−Pro CCD カメラ (Media Cybernetics）と組み合わせた Nikon Eclipse TS100 顕微鏡でＦＩＴＣフィルターおよび４０ｘ対物レンズを使用して、抗体に反応した細胞のデジタル画像を捉え、Image Pro Plus ソフトウェア (Media Cybernetics）を使用して操作した。
【０３０５】
図２０Ｂは、ＨｅＬａ細胞におけるＮＦｋＢの免疫局在の写真を示す。これは、ＨｅＬａ細胞において、野生型ＴＮＦ−アルファとＡ１４５／Ｙ８７Ｈ ＴＮＦ−アルファ変異体の交換が、ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢの核移行を阻害することを示す。ＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ単独は、野生型ＴＮＦ−アルファと異なり、ＮＦｋＢの核移行を誘導しない。さらに、過剰の変異体（１０倍過剰のＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ）と異種三量体を形成するように交換（３日間、３７℃）された野生型ＴＮＦ−アルファは、そのＮＦｋＢの核移行を誘導する能力を喪失する。このデータは、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるこの変異体の効果と適合する。
【０３０６】
７Ｃ.  ＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈは、ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢ作動性ルシフェラーゼレポーターの活性化を低減させる
Ｈｉｓ−タグ付き野生型ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５／Ｙ８７Ｈおよび交換した野生型ＴＮＦ−アルファ：Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ異種三量体（１０倍過剰のＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈと、３７℃で１日交換した）を、上記実施例７Ａの通りに、ＮＦｋＢルシフェラーゼレポーターアッセイで試験した。実験は、各ＴＮＦ−アルファ濃度で１０倍過剰のＴＮＦ−アルファ変異体（Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ）と共に、より広い範囲の最終ＴＮＦ−アルファ濃度および増大する用量（０.７８、１.５６、３.１３、６.２５、１２.５、２５ｎｇ／ｍｌ）を使用したことを除き、実施例７Ａの通りに実行した。
【０３０７】
野生型ＴＮＦ−アルファ：Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ異種三量体は、活性化レベルを有意に低下させた。これは、野生型ＴＮＦ−アルファに対するＴＮＦ−アルファＡ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈ変異体の阻害効果を示す。図２０Ｃの下の点線が示すように、野生型ＴＮＦ−アルファと異なり、ＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５／Ｙ８７Ｈ単独は、ＮＦｋＢ活性化に対して有意なアゴニスト的効果を有さない。図２０Ｃの灰色の実線が示すように、ＮＦｋＢ結合エレメントなしのレポーターは、ＴＮＦ−アルファに応答しないので、野生型ＴＮＦ−アルファに誘導される活性化は、ＮＦｋＢ活性化依存性である。
【０３０８】
特定の実施態様を例示説明のために記載したが、添付の特許請求の範囲に記載された発明を逸脱することなく、詳細について多数の変形を為し得ることが、当業者に理解される。
【図面の簡単な説明】
【０３０９】
【図１】図１Ａは、ＴＮＦ受容体と野生型ＴＮＦ−アルファとの複合体を示す。図１Ｂは、変異ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ−Ｘ）と野生型ＴＮＦ−アルファとの混合された三量体を示す。
【図２】野生型ＴＮＦ−ＴＮＦ−Ｒ三量体複合体の構造を示す。
【図３】ｐ５５ＴＮＦ−Ｒ細胞外ドメインの構造を示す。
【図４】ＴＮＦ−Ｒを結合するのに関与するＴＮＦ−アルファ上の結合部位を示す。
【図５】ＴＮＦ−アルファ三量体の接触面を示す。
【図６Ａ】変異体がつくられるテンプレート分子として使用されるヒスチジンタグ付き野生型ＴＮＦ−アルファ分子のヌクレオチド配列を示す。
【図６Ｂ】開始コドンと最初のアミノ酸の間の追加の６ヒスチジン（下線）を有する野生型ＴＮＦ−アルファのアミノ酸配列を示す。
【図７】ＴＮＦ−アルファ変異体における位置およびアミノ酸変化を示す。
【図８】ＴＮＦ−アルファ活性アッセイの結果を示す。
【図９】ＴＮＦ−アルファ変異体のアンタゴニスト活性を示す。
【図１０Ａ】対照に対するアポトーシスの割合について標準化された、ＴＮＦ−アルファ変異体のアンタゴニスト活性を示す。
【図１０Ｂ】対照に対するアポトーシスの割合について標準化された、ＴＮＦ−アルファ変異体のアンタゴニスト活性を示す。
【図１１】ＴＮＦ−アルファタンパク質配列の変異パターンについての別の例である。
【図１２】ＴＲＡＦタンパク質からの三量化ドメインを示す。
【図１３】完全長の遺伝子の合成およびＰＣＲによるすべての可能な変異を示す。
【図１４】野生型遺伝子を用いて本発明の変異型ＴＮＦ−アルファタンパク質のライブラリーを合成するのに、好ましい方法を示す。
【図１５】重複伸長法を示す。
【図１６】本発明のライブラリーを作るためのＰＣＲ反応産物の連結反応を示す。
【図１７】ＰＣＲ産物の平滑末端連結反応を示す。
【図１８】野生型ＴＮＦ−アルファ分子の化学修飾部位の同定のアプローチを図解で例示する。
【図１９Ａ】野生型ＴＮＦ−アルファおよび本発明のある種の変異体のＴＮＦＲ１結合アッセイの結果を示す。
【図１９Ｂ】野生型ＴＮＦ−アルファおよび本発明のある種の変異体のＴＮＦＲ１結合アッセイの結果を示す。
【図１９Ｃ】野生型ＴＮＦ−アルファおよび本発明のある種の変異体のＴＮＦＲ１結合アッセイの結果を示す。
【図１９Ｄ】野生型ＴＮＦ−アルファおよび本発明のある種の変異体のＴＮＦＲ１結合アッセイの結果を示す。
【図２０Ａ】本発明のＴＮＦ−アルファ変異体が予め野生型ＴＮＦ−アルファと交換されて、２９３Ｔ細胞においてＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢの活性化を低減させることを示すチャートである。
【図２０Ｂ】野生型ＴＮＦ−アルファとＡ１４５／Ｙ８７ＨＴＮＦ−アルファ変異体の交換が、ＨｅＬａ細胞においてＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢの核移行を阻害することを示す、ＨｅＬａ細胞におけるＮＦｋＢの免疫局在の写真である。
【図２０Ｃ】ＴＮＦ−アルファ変異体Ａ１４５Ｒ／Ｙ８７Ｈが、野生型ＴＮＦ−アルファに誘導されるＮＦｋＢ作動性ルシフェラーゼレポーターの活性化を低減させることを示す。
【図２１】ＴＮＦ−アルファ変異体のアンタゴニスト活性を示すチャートである。
【図２２Ａ】様々なＴＮＦによるカスパーゼ活性化の用量反応曲線である。
【図２２Ｂ】様々なＴＮＦによるカスパーゼ活性化の用量反応曲線である。
【図２２Ｃ】様々なＴＮＦによるカスパーゼ活性化の用量反応曲線である。
【図１】
2005512521.tif 000010
【図２】
2005512521.tif 000011
【図３】
2005512521.tif 000012
【図４】
2005512521.tif 000013
【図５】
2005512521.tif 000014
【図６Ａ】
2005512521.tif 000015
【図６Ｂ】
2005512521.tif 000016
【図７】
2005512521.tif 000017
【図８】
2005512521.tif 000018
【図９】
2005512521.tif 000019
【図１０Ａ】
2005512521.tif 000020
【図１０Ｂ】
2005512521.tif 000021
【図１１】
2005512521.tif 000022
【図１２Ａ】
2005512521.tif 000023
【図１２Ｂ】
2005512521.tif 000024
【図１２Ｃ】
2005512521.tif 000025
【図１２Ｄ】
2005512521.tif 000026
【図１２Ｅ】
2005512521.tif 000027
【図１２Ｆ】
2005512521.tif 000028
【図１３】
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【図１４】
2005512521.tif 000030
【図１５】
2005512521.tif 000031
【図１６】
2005512521.tif 000032
【図１７】
2005512521.tif 000033
【図１８】
2005512521.tif 000034
【図１９Ａ】
2005512521.tif 000035
【図１９Ｂ】
2005512521.tif 000036
【図１９Ｃ】
2005512521.tif 000037
【図１９Ｄ】
2005512521.tif 000038
【図２０Ａ】
2005512521.tif 000039
【図２０Ｂ】
2005512521.tif 000040
【図２０Ｃ】
2005512521.tif 000041
【図２１】
2005512521.tif 000042
【図２２Ａ】
2005512521.tif 000043
【図２２Ｂ】
2005512521.tif 000044
【図２２Ｃ】
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