(57)【要約】本発明は、インビボで腫瘍関連抗原に対する強いＴｈ−１偏向細胞免疫応答を刺激する能力をもつ単数又は複数の該腫瘍関連抗原と組合せた脂質−核酸製剤を含む癌ワクチンを開示している。さらに、当該癌ワクチンは、動物の体内の腫瘍を治療する上での治療的効力を提供している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの腫瘍関連抗原と組合せた形で脂質核酸（ＬＮＡ）製剤を含む癌ワクチンにおいて、前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原が前記ＬＮＡ製剤と混合されているか又は会合させられており、前記ＬＮＡ製剤には、
ａ）  少なくとも１つのカチオン脂質を含む脂質成分、及び
ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸成分、
が含まれており、前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原に対するインビボでのＴｈ−１偏向免疫応答を刺激する能力をもつ、癌ワクチン。
【請求項２】
前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原が単一のエピトープを含んで成る、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原が同じ抗原からの複数のエピトープを含んで成る、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
複数の腫瘍関連抗原を含んで成る、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記腫瘍関連抗原が自己抗原を含んで成る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
前記腫瘍関連抗原が前記ＬＮＡ製剤と会合させられている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項７】
前記腫瘍関連抗原が前記ＬＮＡ製剤と混合されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項８】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含んで成る、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化シトシンを含んで成る、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
複数の腫瘍関連抗原と組合せた形で脂質核酸（ＬＮＡ）製剤を含むポリトープ癌ワクチンにおいて、前記複数の腫瘍関連抗原が前記ＬＮＡ製剤と会合させられており、前記ＬＮＡ製剤には、
ａ）  少なくとも１つのカチオン脂質を含む脂質成分、及び
ｂ）  少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド含む核酸成分、
が含まれており、前記腫瘍関連抗原に対するインビボでのＴｈ−１偏向免疫応答を誘発するべく前記ＣｐＧジヌクレオチドによるアジュバント免疫刺激と併せて抗原提示細胞まで前記複数の腫瘍関連抗原を同時送達する能力を有するワクチン。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＣＰＧジヌクレオチドがメチル化シトシンを含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記複数の腫瘍関連抗原のうちの少なくとも１つには１つの自己抗原が含まれている、該自己抗原に対する免疫寛容性を破る能力を有する請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記複数の腫瘍関連抗原には複数の腫瘍関連自己抗原が含まれている、該自己抗原に対する免疫寛容性に打ち勝つ能力を有する請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記複数の腫瘍関連抗原が複数の組織特異分化抗原を含んで成る、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
少なくとも１つの腫瘍関連抗原と組合せた形で脂質核酸（ＬＮＡ）製剤を含み、前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原が前記ＬＮＡ製剤と混合されているか又は会合させられており、前記ＬＮＡ製剤には、
ａ）  少なくとも１つのカチオン脂質を含む脂質成分及び
ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸成分、
が含まれており、前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原に対するインビボでのＴｈ−１偏向細胞免疫応答を刺激する能力をもつ、癌ワクチンを宿主に投与する段階を含む、腫瘍に対する増強された宿主免疫応答を刺激するための方法。
【請求項１６】
少なくとも１つの腫瘍関連抗原と組合せた形で脂質核酸（ＬＮＡ）製剤を含み、前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原が前記ＬＮＡ製剤と混合されているか又は会合させられており、前記ＬＮＡ製剤には、
ａ）  少なくとも１つのカチオン脂質を含む脂質成分及び
ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸成分、
が含まれている癌ワクチンを前記宿主に投与する段階を含んで成り、該投与段階が、哺乳動物宿主の体内での腫瘍細胞の成長を阻害するのに有効である、哺乳動物宿主の体内での腫瘍細胞の成長を阻害するための方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原が単一のエピトープを含んで成る、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原が同じ抗原からの複数のエピトープを含んで成る、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１９】
複数の腫瘍関連抗原を含んで成る、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍関連抗原が自己抗原を含んで成る、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍関連抗原が前記ＬＮＡ製剤と会合させられている、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍関連抗原が前記ＬＮＡ製剤と混合されている、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含んで成る、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化シトシンを含んで成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ワクチンがさらに少なくとも１つの微生物抗原を含んで成る、請求項１５〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの自己抗原と組合せた形で脂質核酸（ＬＮＡ）製剤を含み、前記少なくとも１つの自己抗原が前記ＬＮＡ製剤と混合されているか又は会合させられており、前記ＬＮＡ製剤には、
ａ）  少なくとも１つのカチオン脂質を含む脂質成分、及び
ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸成分、
が含まれている免疫刺激組成物を前記宿主に投与する段階を含んで成り、該投与段階が、免疫寛容性に打ち勝ち、インビボでの前記自己抗原に対するＴｈ−１偏向細胞免疫応答を刺激するのに有効である、自己抗原に対する宿主免疫応答を刺激するための方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの自己抗原と組合せた形で脂質核酸（ＬＮＡ）製剤を含み、前記少なくとも１つの自己抗原が前記ＬＮＡ製剤と混合されているか又は会合させられており、前記ＬＮＡ製剤には、
ａ）  少なくとも１つのカチオン脂質を含む脂質成分及び
ｂ）  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸成分、
が含まれている免疫刺激組成物を哺乳動物宿主に投与する段階を含んで成り、該投与段階が、インビボでの前記自己抗原に対するＴｈ−１偏向細胞免疫応答を刺激するのに有効である、インビボでの自己抗原に対する免疫応答に打ち勝つための方法。
【請求項２８】
前記自己免疫が組織特異分化抗原を含んで成る、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２９】
チロシナーゼ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ｍｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ｇｐ７５、ｇｐ１００、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロスターゼ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕから成るグループの中から前記自己免疫が選択されている、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの腫瘍関連抗原及び少なくとも１つの微生物抗原と組合せた形で脂質核酸（ＬＮＡ）製剤を含むポリトープ癌ワクチンにおいて、前記抗原が前記ＬＮＡ製剤と会合させられており、前記ＬＮＡ製剤には、
ａ）  少なくとも１つのカチオン脂質を含む脂質成分、及び
ｂ）  少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド含む核酸成分、
が含まれており、前記抗原に対するインビボでのＴｈ−１偏向免疫応答を誘発するべく前記ＣｐＧジヌクレオチドによるアジュバント免疫刺激と併せて抗原提示細胞まで前記少なくとも１つの腫瘍関連抗原及び前記少なくとも１つの微生物抗原を同時送達する能力を有するワクチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
技術分野
本発明は、腫瘍関連抗原に対する増強された免疫応答を刺激するため及びインビボでの腫瘍の成長を阻害するための方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、問題の単数又は複数の腫瘍抗原そして好ましくはかかる抗原の多数のエピトープと会合した状態で免疫刺激性脂質核酸製剤を含む改良型腫瘍ワクチン、及びかかる組成物の使用方法を提供している。
【０００２】
〔背景技術〕
免疫系は、有害な異常に対抗して身体を監視しながら広範な病原体に対して哺乳動物宿主を保護する細胞と組成物の並外れて複雑な組合せである。免疫系の１部門には、（ａ）骨髄由来のＢ−リンパ球、胸腺由来のＴリンパ球及びナチュラルキラー細胞といったようなリンパ球及び（ｂ）単球及びマクロファージの両方を含めた単核食細胞の両方を含む、免疫系機能を実施する細胞が関与している。リンパ球は、抗原決定基を特異的に認識し区別するその能力のため、主として特異的免疫応答と関連しており、一方単核食細胞は、微生物自体によって直接か又は抗原刺激されたＴリンパ球に応答して誘発されたサイトカインの産生及び分泌ならびに食作用を通した外来性微生物の一般的除去に関与することが最も多い。リンパ球性細胞及び単核食細胞の機能は、高いレベルで相互に関連しており、適正な免疫系の機能にとって不可欠である。
【０００３】
１つの重要なリンパ球性細胞のサブセットは、胸腺により処理されるという事実にその呼称が由来しているＴリンパ球である。Ｔリンパ球は、細胞死を誘発するための数多くのメカニズムをもつか又はその他の細胞を活性化させるように機能するさまざまなサイトカインを分泌することによって活性化する、細胞毒性を有し得る複合細胞群である。細胞毒性Ｔリンパ球（「ＣＴＬｓ」）は、特定の主要組織適合遺伝子錯体（ＭＨＣ）抗原に制限されることによって作用し、ＭＨＣの溝内のペプチドと会合した特定のＭＨＣ錯体に対する特異的親和性をもつ細胞表面Ｔ細胞レセプタを発現する。ＭＨＣが宿主にとって外来性であるか又は溝内のペプチドが外来性である場合、ＣＴＬはかかる細胞を攻撃しそれを殺すことになる。しかしながら、重要なことに、ＣＴＬは、溝内のペプチドが宿主にとって内因性である場合に細胞に対し通常作用しないような形で、胸腺発達中にスクリーニングされてきた。このことは、免疫寛容性と呼ばれ宿主を不利な自己免疫反応から保護するかかる自己抗原に対する免疫機能についての制限をもたらした。それは同様に、現在入手可能な癌免疫療法プロトコルにとっての主要な障害物をも提示している。
【０００４】
Ｂリンパ球とＴリンパ球の組合せは、合わさって癌細胞ならびに病原体に対する防御ワクチンを作り出すための根拠を成す、それぞれ体液性及び細胞性免疫応答の基礎である作用を確立する。体液性及び細胞性免疫応答は、各々、抗原からの刺激とそれに続くさまざまなサイトカインの分泌に応答してそのそれぞれの細胞型の活性化によって進行する。ナイーブＣＤ４＋Ｔヘルパ細胞に対する抗原性ペプチドの提示によって、細胞は、その機能及びサイトカイン発現プロフィールによって区別可能な２つの全く異なるヘルパ−細胞サブセット（Ｔｈ−１及びＴｈ−２）へと分化させられる。Mosman et al., Annu. Rev. Immunol., 7:145-173 (1989); Paul et al., Cell, 76:241-251 (1994); O’Garra, Immunity, 8:275-283 (1998)。
【０００５】
ＣＤ４＋Ｔｈ細胞によって分泌されたサイトカインの特異的パターンは（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＴＮＦ−αを含む）大部分が細胞性の１型応答又は（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を含む）主として体液性の２型応答に免疫応答を向けている。Glimcher and Murphy, Genes Dev., 14:1693-1711 (2000); Abbas et al., Nature, 383:787-793 (1996)。Ｔｈ−１サブセットは、ＣＴＬ及びＮＫ細胞の活性化を通した細胞媒介型の免疫性ならびに、ヒトにおいてはＩｇＧ及びＩｇＡマウスにおいてはＩｇＧ２ａへのＩｇＭからの免疫グロブリンクラススイッチングにより特徴づけされる体液性免疫性の両方を促進する。Ｔｈ−１応答は、遅延型過敏症及び自己免疫疾患にも結びつけることができる。Ｔｈ−２サブセットは体液性免疫性を誘発し、ヒトにおけるＩｇＧ１及びＩｇＥへのクラススイッチングを誘発する。Ｔｈ−１応答に結びつけられた抗体アイソタイプは一般に優れた中和及びオプソニン化作用能力を有するが、一方Ｔｈ−２応答に結びつけられた抗体アイソタイプは、一般にアレルギー性応答の方とより強い結びつきを有する。
【０００６】
癌と闘う手段としての免疫療法への期待は、長年にわたり十分成果を上げることのできなかった歴史をもつ。１世紀以上前に、細菌抽出物内に存在する毒素が、まず最初に、腫瘍特異免疫応答を刺激しようとして使用された。Coley, Am J. Med. Sci. 105:487-511 (1893)。その後、ＩＬ−２といったような免疫刺激性サイトカインと同様、corynebacterium paruum及びbacillus Calmette-Guerin (ＢＣＧ)といったような代替的な病原性材料が、癌療法のための免疫アジュバントとして取り組まれた。Lipton et al., J. Clin. Oncol. 9:1151-6 (1991); Marcinola et al., J. Clin. Oncol. 13:1110-22 (1995) いくつかの励みになる結果にもかかわらず、これらのさらに一般化された免疫刺激プロトコルは、究極的に、一部には、腫瘍に対して焦点をあてた免疫応答の欠如ならびにアジュバントの容量が高いことに付随する全身的毒性のせいで、不成功であることが立証された。
【０００７】
第１世代の癌ワクチンは、自己由来の又は同種異系の腫瘍から誘導された腫瘍細胞リゼイト又は照射済み全細胞調製物を用いて、感染症に適用される病原体不活性化／減衰アプローチと類似の要領で開発された：Moingeon, Vaccine 19:1305-1326 (2001)。臨床研究が予防療法としてのその潜在的有用性を立証したものの、立証された腫瘍の負荷に対する有効な細胞毒性応答は一般にこのアプローチに従っては得られなかった（同上）。より最近では、ヒトの腫瘍の分子特徴づけにおける進歩及び腫瘍生物学のより優れた理解により、腫瘍関連抗原つまりＴＡＡが固定されるに至った。同上。これらには、腫瘍細胞に独特の突然変異又は再配列を伴う遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚遺伝子、組織特異分化抗原、成長因子セレプタ、細胞表面炭水化物残渣、外来性ウイルスタンパク質及び数多くのその他の自己タンパク質が含まれる（同上及びTimmerman & Levy, Annu. Rev. Med. 50:507-29 (1993) を参照のこと）。これらの腫瘍関連抗原をターゲットとする癌ワクチンが現在設計されてきており人間でテストされてきている。前述のMoingeonを参照のこと。
【０００８】
例えば、ナイーブＴリンパ球に対するこれらの抗原の提示を増強しようとして、樹状細胞ワクチンが開発されてきた。前述のTimmerman and Levy参照。かかる樹状細胞−ペプチドワクチンは、転移性疾患における部分的又は場合によっては完全な軽快を誘発できるものの、ワクチン内に含まれた抗原に対する寛容性の誘発及びその後の急速な腫瘍の進行という逆説的な結果をもたらす可能性のある、このアプローチに伴う誤った抗原提示の危険性が残念なことに存在している。Bodey et al. Anticancer Res. 20:2665-2676 (2000)。その上、実際的な問題として、自己由来の樹状細胞を得ることは、時間がかかり、かつ困難であり得、結果として得られた腫瘍ペプチドパルスワクチンは、各々の患者について個別に調製されなくてはならない（同上）。
【０００９】
これらの先行技術の癌ワクチンの内部に含まれた抗原に対して導かれた一般的な免疫活性化が数多くのケースで実証されてきたが、腫痕負荷の削減は頻繁に観察されておらず、腫瘍の進行及び転移が通常は、場合によってはわずかに長くなった軽快時期の後に、続いて発生する（Bodey、前出）。これらの現行の免疫療法プロトコルの失敗の考えられる１つの要因は、全ての新生物的に形質転換された細胞が恒久的に受ける漸進的な脱分化にあり、これは、ワクチンによりターゲティングされている特異的腫瘍抗原の発現をダウンレギュレートするか又はその突然変異を結果としてもたらしうる（同上）。第１のケースでの腫瘍関連抗原の低い免疫原性、ＭＨＣ分子のダウンレギュレーション、適切な共同刺激性分子発現の欠如、阻害性サイトカインの分泌及び上述の誤まった抗原提示と結びついて、腫瘍のこの脱分化は、癌免疫療法が、抗癌療法のための実行可能な第４の様式としてのその期待を全うすることを妨げてきた（同上）。
【００１０】
必要なのは、腫瘍関連抗原の増強された提示を提供する癌ワクチンである。理想的には、かかるワクチンは、究極的に所望の抗原（単複）に対するより強い免疫応答を導く、ＡＰＣへの免疫刺激の同時送達と結び合わされたプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対し直接腫瘍関連抗原を提示する能力を有していなければならない。さらに、問題の抗原又は多数の個別の抗原のための複数の抗原エピトープを同時に提示する能力をもつワクチンが、広い免疫応答を確保し腫瘍による免疫回避の危険性を低下させるためにも好まれることになる。
【００１１】
当該技術分野における付加的な問題は、正常な組織ならびに癌組織によって内因的に発現された自己免疫に対し導かれる現行のワクチンプロトコルの一般的な不適切性に関するものである。Overwijk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2982-87 (1999)。上述のように、胸腺及び周囲における自己反応性Ｔ細胞の物理的又は機能的欠失によって作り出される中枢及び末梢の免疫寛容性は、これらは、わずかな数の機能的に損なわれたＴ細胞しか残さず、これまでのところ受入れがたい毒性が随伴する場合以外には適切に刺激されていなかった（同上）。かくして、同じく必要であるのは、過度の毒性なく、問題の抗原が自己抗原を表わしているケースにおいて免疫寛容性に打ち勝つ能力をもつ改良型の癌ワクチンである。
【００１２】
発明の要約
以上のニーズ及び目的に従って、本発明は、改良された癌ワクチン及び、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を刺激する上での、及び腫瘍の成長を阻害するためのそれらの使用方法を提供している。本書に記述されているワクチン及び方法は、脂質−核酸「ＬＮＡ」製剤を用いて問題の抗原と共に免疫刺激性核酸を組合わせた形で送達することを通して単数又は複数の標的抗原の単数又は複数のエピトープに対する増強されたＴｈ−１偏向細胞免疫応答を提供する。有意にも、本発明は、同時免疫刺激と組合わされた腫瘍関連抗原の多数のエピトープのプロフェッショナル抗原提示細胞に対する直接的なターゲッティングされた送達を可能にし、かくして、新生組織の脱分化及び／又は異常な抗原発現に起因する腫瘍の回避ならびに誤った抗原提示の危険性を低減させる。
【００１３】
１つの実施形態においては、本発明の癌ワクチンは、脂質混合物を含む脂質成分、好ましくはオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸成分を有する免疫刺激組成物を含んで成り、ここで核酸成分は、問題の腫瘍関連抗原からの単数又は複数のエピトープと組合せた状態で脂質成分によって封入されている。かかる抗原のエピトープ（単複）は、脂質核酸製剤と混合されているか又は会合されていてよく、最も好ましくは、例えばリポソーム粒子に付着されるか又はその中に封入されて、製剤と会合させられている。特に好ましいのは、或る種の癌に関与する病原体からの単数又は複数の微生物抗原をさらに内含しうる単数又は複数の腫瘍関連抗原からの複数の抗原エピトープを含んで成るポリトープワクチンである。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、本発明は、哺乳動物の体内で腫瘍関連抗原に対する増強されたＴｈ−１偏向免疫応答を刺激する方法において、ａ）少なくとも１つの脂質を含む脂質成分及び、ｂ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む核酸成分を含むＬＮＡ製剤を前記抗原からの少なくとも１つのエピトープと組合わせた形で含む免疫刺激組成物を有効量だけ哺乳動物に投与する段階を含んで成る方法を提供している。特に好ましい実施形態においては、ＬＮＡ製剤は少なくとも１つのエピトープと会合させられている。最も好ましい実施形態においては、ＬＮＡ製剤は、単数又は複数の問題の腫瘍関連抗原からの多数のエピトープと会合させられている。
【００１５】
１つの態様では、本発明を用いて得られる増強されたＴｈ−１偏向細胞免疫応答は、遊離ＣｐＧ  ＯＤＮの投与と比較して増大した数の抗原特異ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の誘発により特徴づけされる。好ましくは、天然のホスホジエステルバックボーンをもつオリゴヌクレオチドを含むＬＮＡ製剤を使用することで、抗原特異ＣＴＬ応答のさらに一層の改善が提供される。もう１つの態様においては、増強されたＴｈ−１偏向免疫応答は、例えば樹状細胞、ＣＤ８＋ＣＴＬなどからの例えばＩＦＮ−γを含む応答する免疫細胞からの増大したサイトカイン刺激によって特徴づけされる。
【００１６】
本発明で有利に用いられる腫瘍関連抗原は、一般に、腫瘍遺伝子、腫瘍抑制遺伝子及び腫瘍細胞に独特の突然変異又は再配列を伴うその他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚遺伝子産物（例えば腫瘍胎児抗原）、組織特異分化抗原、成長因子レセプタ、細胞表面炭水化物残渣、外来性ウイルスタンパク質及び数多くのその他の自己タンパク質の中から選択され得る。これらの腫瘍関連抗原は、本書で実証するように、本発明のワクチンがかかる自己免疫に対する免疫寛容性に打ち勝つ能力を有することから、自己抗原を内含しうる。
【００１７】
一変形形態においては、本発明は、単数又は複数の自己免疫と組合せた形で当該免疫刺激組成物を利用して腫瘍関連自己免疫に対する免疫寛容性に打ち勝つための方法を提供している。１実施形態において、該自己免疫は組織特異分化抗原を含む。特定の実施形態においては、自己免疫は、チロシナーゼ、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ｍｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロスターゼ、及びＨｅｒ２／ｎｅｕから成るグループの中から選択されている。
【００１８】
１実施形態においては、ＬＮＡの核酸成分は、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んで成る。好ましくは、ＯＤＮは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含んで成る。特に好ましい実施形態においては、核酸配列は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。特定の１実施形態においては、核酸配列は、配列５′ＴＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ３′（ＯＤＮ１ｍ）を含む。１変形実施形態においては、核酸配列は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含んで成り、ここでＣｐＧジヌクレオチド内の少なくとも１つのシトシンはメチル化されている。さらなる１実施形態においては、配列内に存在するＣｐＧジヌクレオチド内の各シトシンがメチル化されている。もう１つの特定の実施形態においては、核酸配列は、配列５′ＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ３′（ＯＤＮ２ｍ）を含む。特に好ましい実施形態においては、ＯＤＮは、ＯＤＮ＃１、ＯＤＮ＃２、ＯＤＮ＃３、ＯＤＮ＃４、ＯＤＮ＃５、ＯＤＮ＃６、ＯＤＮ＃７、ＯＤＮ＃８及びＯＤＮ＃９から成るＯＤＮのグループの中から選択されている。
【００１９】
或る種の実施形態においては、核酸はホスホジエステルバックボーンから成る。その他の実施形態においては、核酸は、修飾されたリン酸塩バックボーンから成る。このような１つの実施形態においては、修飾されたリン酸塩バックボーンは、ホスホロチオエートバックボーンを含む。
【００２０】
１実施形態においては、ＬＮＡ製剤の脂質成分はカチオン脂質を含む。さらなる実施形態においては、カチオン脂質は、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＤＭＡ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＤＭＡ及びＤＯＤＡＰから成るカチオン脂質のグループの中から選択される。さらなる実施形態においては、ＬＮＡ製剤の脂質成分は、中性脂質を含む、さらなる１実施形態においては、中性脂質は、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィゴミエリン、コレステロール、セファリン、及びセレブロシドから成る中性脂質のグループの中から選択される。
【００２１】
その他の実施形態では、脂質粒子はさらに、脂質粒子の表面上に立体障壁脂質成分をさらに内含する。或る種の実施形態においては、立体障壁脂質成分は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＰＥ及びＰＥＧセラミドから成るグループの中から選択されている。１実施形態では、ＰＥＧセラミドは、ＰＥＧ−セラミドＣ−１４である。もう１つの実施形態では、ＰＥＧセラミドはＰＥＧ−セラミドＣ−２０である。好ましい実施形態においては、ＬＮＡ製剤の脂質成分は、ＤＳＰＣ、ＤＯＤＭＡ、Ｃｈｏｌ及びＰＥＧ−ＤＭＧを含み、ＤＳＰＣ対ＤＯＤＭＡ対Ｃｈｏｌ対ＰＥＧ−ＤＭＧの比は、約２０：２５：４５：１０モル／モルである。
【００２２】
１つの態様においては、本発明の組成物及び方法のＬＮＡ製剤の脂質成分と核酸成分の比は約０．０１〜０．２５ｗｔ／ｗｔである。もう１つの態様では、本発明の組成物及び方法のＬＮＡ製剤の脂質成分は、前記オリゴヌクレオチドを封入する脂質膜を含む。
【００２３】
さまざまな実施形態において、脂質−核酸製剤はさらに薬学的に受容可能な担体、緩衝液又は希釈剤を含む。
【００２４】
もう１つの態様では、本発明は、宿主の免疫系により腫瘍関連抗原に対する増強されたＴＨ−１偏向免疫応答を誘発するべく、腫瘍の成長を阻害するのに有効な有効量の上述の組成物のいずれかを投与する段階を含んで成る、哺乳動物宿主の体内で腫瘍の成長を阻害するための方法を提供している。好ましくは、該組成物の投与は、動物の免疫系内に存在する単数又は複数の樹状細胞を刺激する能力をもつ、１実施形態においては、腫瘍関連抗原は、本書で記述されている脂質−核酸製剤そしてより好ましくはリポソーム製品と会合させた状態で投与される。本書で記述されているように、好ましい実施形態においては、本発明は単数又は複数の腫瘍関連抗原からの複数のエピトープを含むポリトープワクチンを提供する。
【００２５】
発明の詳細な説明
細胞免疫応答特に細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）応答は、一般に抗腫瘍免疫性の主要なエフェクタとみなされている（Roth et al., Adu. Immunol. 57:281-351 (1994); Pardoll, Immunol. Today 14:310-316 (1993)）。細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞がこれまで近年の癌免疫療法プロトコルの大部分の焦点であったものの、そのＣＴＬ初回免疫のみならずそれ自体の場合によっては直接的な抗腫瘍エフェクタ機能に起因して、ＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞の有意性を同様に示す証拠が増々増えてきている（Toes et al., J. Exp. Med. 189:753-6 (1999)）。さらに、１型免疫応答を導き増幅するＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞の能力が、免疫原性の低い抗原そして特に自己免疫に対する適切な細胞免疫応答の誘発に必要である、ということが示唆されてきた（Overwijk et al., 前出）。
【００２６】
腫瘍関連抗原に対する強いＴｈ−１偏向細胞免疫応答を誘発する能力をもつ癌ワクチン及びプロトコルが有効な癌療法のために必要とされる（Moingen, 前出）。さらに、ＡＰＣ活性化を容易にする能力をもつ刺激性シグナルと共にプロフェッショナルＡＰＣに対する、特に樹状細胞に対する腫瘍関連抗原を同時提示することも又非常に重要である。本書で実証するように、本発明のワクチン組成物は、インビボで腫瘍関連抗原に対する強いＴｈ−１偏向免疫応答を刺激し、確立された腫瘍を含む癌組織の成長を劇的に阻害することができる。先行技術において記述された癌ワクチンとは異なり、本書に提供されている独特のワクチン製剤は、Ｔｈ−１偏向免疫刺激と併用してインビボで直接プロフェッショナルＡＰＣに対し多数の抗原決定基を同時に提示できるようにする。
【００２７】
本発明は、問題の少なくとも１つの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の少なくとも１つのエピトープと混合されるか又は会合された脂質−核酸（ＬＮＡ）製剤を提供する。好ましくは、ＬＮＡ製剤は、ポリトープ癌ワクチンを形成するべく単数又は複数のＴＡＡと混合又は会合させられる。より一層好ましくは、複数のこのようなエピトープがＬＮＡ製剤と会合させられる。好ましい実施形態では、核酸は、免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含んで成り、より好ましくは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。
【００２８】
当該組成物及び方法において特に興味の対象となるのは、免疫原性の低い又は非免疫原性の腫瘍であり、これは免疫応答を誘発するための適切な抗原刺激を提供することができないために特に難題である。これらのケースでは、例えば組織特異分化抗原といったような正常な組織及び癌組織の両方に共通の自己抗原がターゲティングされ得る。本発明のこの態様においては、抗原に対する免疫寛容性に打ち勝ち、かつ自己抗原を発現する細胞に対する自己反応性末梢Ｔ細胞応答を刺激する目的で、対象に対し、腫瘍関連自己免疫調製物を含む癌ワクチンが投与される。
【００２９】
当該療法で使用されうる腫瘍関連自己抗原には、チロシナーゼ、ｔｒｐ１、ｔｒｐ２、ｍｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、及びメラニン合成に関与するその他のタンパク質；前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異膜抗原（ＰＭＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロスターゼ、又はその他の前立腺特異遺伝子産物及びＨｅｒ２／ｎｅｕ又はその他の哺乳動物特異遺伝子産物が含まれるがこれらに制限されるわけではない。当該療法によって惹起される免疫応答のための標的として役立つ付加的な自己免疫は当業者にとって既知であり、既知の分布をもつ明確な抗原に対する免疫化を可能にし、より焦点がしぼられた免疫応答を提供するべく発現クローニングといったような当該技術分野において周知の方法によって同定可能である。
【００３０】
かくして、１実施形態においては、当該治療は、免疫寛容性に打ち勝つ及び自己抗原に対する有効かつ制御された細胞毒性応答を増加させるための方法を提供する。この免疫学的療法は、正常な組織の一部又は全部の喪失又は修正が、副作用として受容可能又さらには望ましいものでありさえする、メラノーマ、乳癌、こう丸癌、卵巣癌、前立腺癌などといった腫瘍の場合に特に用いられることになる。１変形実施形態においては、当該治療は、癌の発生に対する予防措置としてか又はその他の医学的理由で、選択された組織の抗原切除を増強させるか又はもたらすために使用することができる。選択的な組織切除の免疫学的方法は、より観血的な外科的方法に比べ多大な利点を提供する。
【００３１】
略語及び定義
以下の略語が本書で使用されている：ＲＢＣ、赤血球；ＤＤＡＢ、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム臭化物；ＤＯＤＡＣ、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム塩化物；ＤＯＰＥ、１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；ＤＯＳＰＡ、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−（２（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート；ＤＯＴＡＰ、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ）プロパンクロリド；ＤＯＴＭＡ、１，２−ジオレイルオキシ−３−（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノ）プロパンクロリド；ＯＳＤＡＣ、Ｎ−オレイル−Ｎ−ステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド；ＲＴ、室温；ＨＥＰＥＳ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；ＦＢＳ、ウシ胎仔血清；ＤＭＥＭ、ダルベッコ修正イーグル培地；ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ．ｓｕｂ．１４、１−０−（２’−（．オメガ−メトキシポリエチレングリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−ミリストイル−スフィンゴシン；ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ．ｓｕｂ．２０、１−０−（２’−（．オメガ．−メトキシポリエチレングリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−アラキドイル−スフィンゴシン；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；ＥＧＴＡ、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−四酢酸；ＳＦ−ＤＭＥＭ、無血清ＤＭＥＭ；ＮＰ４０、ノニルフェノキシポリエトキシエタノール、１，２ジオレイル−３ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）及びジステアロイルホスファジジルコリン（ＤＳＰＣ）。
【００３２】
本書で使用されている技術的及び科学的用語は、その他の定義づけのないかぎり、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解している意味合いを有している。本書では、当業者にとって既知のさまざまな方法論に対する参照指示が行なわれている。参照指示されているこのような既知の方法論について述べる刊行物及びその他の資料は、あたかも完全に記述されているかのごとくその全体が参考として本書に包含されている。組換え型ＤＮＡ技術の一般的原理を記述する標準的参考研究作業としては、以下のものが含まれる：
Sambrook, J., et al., 分子クローニング：実験室マニュアル第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N.Y. (1989); McPherson, M. J., Ed., 定方向突然変異：実践的アプローチ、IRL Press, Oxford (1991); Jones, J., アミノ酸及びペプチド合成、Oxford Science Publications, Oxford (1992); Austen, B.M.及びWestwood, O. M. R., タンパク質のターゲティング及び分泌、IRL Press, Oxford (1991)。本発明を実施する上で当業者にとって既知の適当なあらゆる材料及び／又は方法を利用することができる。しかしながら、好ましい材料及び／又は方法が記述されている。以下の記述及び例において参照指示されている材料、試薬などは、相反する指摘のないかぎり、商業的供給源から得ることができる。当業者ならば、本書の記述に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられている。本出願全体にわたり引用されている（参考文献、交付済み特許、公示済み特許出願及び同時係属出願を含めた）全ての参照指示の内容全てが本書中に明示的に参考として包含される。
【００３３】
本発明の方法において使用される免疫刺激性組成物は一般に、少なくとも１つの脂質成分及び少なくとも１つの治療剤を含みインビボで治療剤単独よりも大きい免疫刺激活性を有する脂質−治療剤（「ＬＴＡ」）製剤を意味する。本書で使用される「治療剤」又は「治療用化合物」又は「薬物」という語は、互換的に使用でき、対象の医学的治療において有益な効果を提供する。
【００３４】
本書で記述される好ましい実施形態においては、治療剤は少なくとも１つの核酸配列、より好ましくは少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも１つのオリゴデオキシヌクレオチド（「ＯＤＮ」を含む。好ましい実施形態においては、ＯＤＮは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドモチーフを含み、これはメチル化されていてもいなくてもよい。特に好ましい実施形態においては、ＯＤＮは、免疫刺激活性を有しかつ非メチル化形態では免疫刺激配列（「ＩＳＳ」）と呼ばれるメチル化核酸配列を含む。
【００３５】
本書で使用する「対象」又は「宿主」という語は、免疫系を有する雄又は雌の生体、好ましくは動物、より好ましくは脊椎動物、より一層好ましくは哺乳動物、さらに一層好ましくはげっ歯類、そして最も好ましくはヒトを意味する。対象のさらなる例としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ及びラットが含まれるがこれらに制限されるわけではない。本書で用いられる「患者」という語は、医学的身体条件（例えば疾病又は障害）のために治療を必要としている対象を意味する。
【００３６】
本書で使用される「インビボ」という語は、１つの生体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはげっ歯類そして最も好ましくはヒトの体内を意味する。
【００３７】
本書で使用される「免疫刺激」、「免疫刺激活性」又は「免疫応答を刺激する」ならびにその文法的等価物は、免疫応答を誘発する、増大させる、増強させる又は変調すること、又はその他の形で免疫応答に関し有益な効果を提供することを意味する。本書で使用される「免疫応答」は、細胞性及び体液性の両方の免疫応答を意味し、細胞性免疫応答が最も好ましい。一定の与えられた製剤及び核酸配列の免疫刺激活性は、本書に記述されているように適当なインビボ検定を用いて容易に決定することができる。
【００３８】
本書で使用される「標的抗原」という語は、それに対して免疫応答を導くか又は刺激させることのできる問題の抗原を意味する。自らに導かれた免疫応答を刺激するため本発明の組成物中で使用される標的抗原は、合成分子、天然発生分子又は単離分子又はそのフラグメントであり得、単一又は多重エピトープを含み得る。かくして本発明の組成物は、抗原の単一又は多重エピトープに向けられた免疫応答を刺激することができる。好ましい実施形態においては、標的抗原は、本発明の脂質粒子と会合させられている。抗原（又は標的抗原）に関して本書で使用される「〜と会合状態にある」、「〜と会合させられた」又はその文法的等価物は、もう１つの成分に付着した又はそれにより封入された抗原を意味する。本発明の脂質粒子又はリポソームに関しては、該抗原は、例えば、脂質粒子の内腔又はラメラ内空間内に封入されていてもよいし、又は脂質膜内に又は一部脂質膜内に配置又は付着されていてもよいし、又、脂質粒子に付着（例えば共有結合で又はイオンで）されていてもよい。抗原は、脂質粒子の内部に付着されていてよく、又より好ましくは抗原は脂質粒子の外側に付着されている。好ましい実施形態においては、抗原は、脂質粒子内に封入される。
【００３９】
本発明の組成物及び方法において有用な抗原の例としては、ペプチド又はタンパク質、細胞、細胞抽出物、多糖類、多糖類接合体、脂質、糖脂質、糖ペプチド及び炭水化物が含まれるがこれらに制限されるわけではない。１実施形態においては、抗原は、ペプチド又はタンパク質抗原の形をしている。もう１つの実施形態においては、抗原は、対象の体内での発現及びこの対象の免疫系に対する提示に適した形をしたペプチド又はタンパク質をコードする核酸である。好ましい実施形態においては、本発明の方法において使用される組成物は、哺乳動物内でその標的抗原に対する免疫応答を刺激するペプチド又はタンパク質標的抗原を含んで成る。好ましくは、標的抗原は、腫瘍関連抗原であり、一部のケースでは微生物抗原である。
【００４０】
本書で使用される「腫瘍関連抗原」というのは、腫瘍又は癌細胞と会合させられ、ＭＨＣ分子という状況下で抗原提示細胞の表面上で発現されたときに免疫応答を誘発する能力をもつ分子又は化合物（例えばタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物及び／又はＤＮＡ）である。腫瘍関連抗原は、自己抗原ならびに、癌と特異的に会合させられない可能性があるもののそれでも動物に対して投与された場合に癌に対する免疫応答を増強しかつ／又はその成長を低減させるその他の抗原を含む。より特定的な実施形態が本書で提供されている。
【００４１】
本書で使用される「微生物抗原」というのは、微生物の抗原であり、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫及び感染性真菌を内含するが、これらに制限されるわけではない。微生物抗原は、天然に発生する微生物抗原と同一か又はこれに類似し好ましくは（天然に発生する微生物抗原の由来源である）対応する微生物に特異的な免疫応答を誘発する、無傷の微生物及びその天然の分離株、フラグメント又は誘導体であり得る。好ましい実施形態においては、１つの化合物は、それが天然に発生する微生物抗原に対する免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を誘発する場合に、天然に発生する微生物抗原に類似している。天然に発生する微生物抗原に類似する化合物又は抗原は、当業者にとっては周知である。天然に発生する微生物抗原に類似する化合物の制限的意味のない一例は、多糖類抗原のペプチド擬似体である。より特定的な実施形態が本書で提供されている。
【００４２】
「抗原」という語は、さらに、上述のもののような既知の又は野生型の抗原のペプチド又はタンパク質類似体を包含するように意図されている。該類似体は、野生型抗原よりもさらに可溶性及び安定性の高いものであり得、同様にその免疫学的活性をより高くする突然変異又は修飾を含有し得る。本発明の組成及び方法においてさらに有用であるのは、対応抗原がそれぞれの腫瘍に対する免疫応答を誘発している、所望の抗原のアミノ酸配列を伴うアミノ酸配列相同体を有するペプチド又はタンパク質である。
【００４３】
本書で使用する「相同な」という語は、例えば２つの核酸分子（例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子）の間或いは２つのポリペプチド分子の間といったような、２つの重合体分子間のサブユニット配列の類似性を意味する。両方の分子内の１つのサブユニット位置が同じ単量体サブユニットにより占有されている場合、例えば２つのＤＮＡ分子の各々の中の１つの位置をアデニンが占めている場合には、それらはその位置において相同である。２つの配列の間の相同性は、整合する又は相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの化合物配列内の位置のうちの半数（例えば長さ１０サブユニットの重合体内の５つの位置）が相同である場合には、２つの配列は５０％相同であり、９０％の位置すなわち１０中９の位置が整合する又は相同である場合には、その２つの配列は９０％の相同性を共有する。一例を挙げると、ＤＮＡ配列５′−ＣＣＧＴＴＡ−３′及び５′−ＧＣＧＴＡＴ−３′は５０％の相同性を共有する。本書で使用されている「実質的に相同な」という語は、所望の核酸に対して約５０％、より好ましくは約７０％、さらに一層好ましくは約８０％そして最も好ましくは約９０％の相同性をもつＤＮＡ又はＲＮＡを意味している。所望の抗原コーディング配列に対して相同な遺伝子は、それらが所望の抗原のものと実質的に類似の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドをコードすることを条件として、本発明の中に含まれるとみなされるべきである。本文中でタンパク質及び／又はＤＮＡ配列が、同定済み配列に対するその相同性又は同一性百分率で定義されている場合、相同性百分率又は同一性百分率を計算するために用いられるアルゴリズムには以下のものが含まれる、Smith-Watermanアルゴリズム（J. F. Collins et al, Comput. Appl. Biosci., (1988) 4:67-72; J. F. Collins et al, 分子配列の比較及び配置 (M. J. Bishop et al, eds.) Practical Approach Series: Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII, IRL Press中、Oxford, England, UK (1987) 417）、及びthe BLAST and FASTAプログラム (E. G. Shpaer et al, 1996, Genomics, 38:179-191) これらの参考文献は本書に参考として内含されている。
【００４４】
本書に記述されている抗原の類似体は、保存的アミノ酸配列差異又は配列に影響を及ぼさない修飾又はその両方によって、天然に発生するタンパク質又はペプチドと異なっている可能性がある。例えば、タンパク質又はペプチドの一次配列を改変するものの通常はその機能を改変しない保存的アミノ酸変更を加えることができる。（通常は一次配列を改変しない）修飾としては、ポリペプチドのインビボ又はインビトロでの化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化が含まれる。同じく抗原として考慮されているのは、グリコシル化によって修飾されるタンパク質、例えば哺乳動物のグリコシル化又は脱グリコシル化酵素といったグリコシル化に影響を及ぼす酵素にポリペプチドを露呈することによってなどといった、その合成及び処理の間又はさらなる処理段階においてポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって作られたタンパク質である。同じく抗原として考慮されているのは、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホトレオニンといったリン酸化されたアミノ酸残基例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホトレオニンを有するアミノ酸配列である。同様に抗原として考慮されているのは、タンパク質分解に対するその耐性を改善するか又は溶解度特性を最適化する目的で通常の分子生物学的技術を用いて修飾されたポリペプチドである。かかるポリペプチドの類似体には、天然に発生するＬ−アミノ酸以外の残基を含有するもの、例えばＤ−アミノ酸又は天然に発生するものではない合成アミノ酸がある。
【００４５】
本発明の抗原は、本書に列挙されている特定のプロセス例のいずれかの生成物に制限されるわけではない。実質的に全長のポリペプチドに加えて、本発明において有用な抗原には、ポリペプチドの免疫学的に活性なフラグメントが含まれる。例えば、抗原は、少なくとも１つのエピトープを含む完全な抗原であり得る。本書で使用されている「エピトープ」という語は、抗体のパラトープが結合し得る抗原上のあらゆる抗原決定基を意味している。エピトープ決定基は通常、例えばアミノ酸又は糖側鎖といったような分子の化学的に活性な表面群性体から成り、通常は特異的な３次元構造特性を有している。本発明の組成物及び方法の特に好ましい実施形態には、同じ標的抗原からの多数のエピトープ又は２つ以上の異なるＴＧＡからのエピトープ（すなわちポリトープワクチン）を含む組合せ抗原が含まれる。例えば、組合せ抗原は、ペプチド−ペプチド抗原、糖脂質−ペプチド抗原又は糖脂質−糖脂質抗原といったような同じ又は異なるタイプのものであり得る。
【００４６】
そのポリペプチド又は抗原又はエピトープは、ＴＧＡ及び／又は腫瘍に対する免疫応答を誘発する場合に「免疫学的に活性」である。本書で用いる「ワクチン」という語は、１つのＴＧＡに対して特異的な免疫応答を刺激する、そのＴＧＡを含む組成物を意味する。本書で使用する「癌ワクチン」という語は、抗原（単複）に対する特異的免疫応答を刺激する少なくとも１つの腫瘍関連抗原の少なくとも１つのエピトープを含む組成物を意味する。
【００４７】
本書で使用する「アジュバント」という語は、免疫応答を刺激するか又はその刺激を増強することのできるあらゆる物質を意味する。一部のアジュバントは、免疫系の細胞の活性化をひき起こすことができ、例えばアジュバントは免疫細胞にサイトカインを産生させ分泌させることができる。免疫系の細胞の活性化をひき起こすことのできるアジュバントの例としては、ＱＳ２１（ＨＰＬＣ分留で２１番目のピークにおいて溶出する糖脂質；Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, Mass.）といったようなＱ saponariaの木の樹皮から精製されたサポニン；ポリ（ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ重合体；Virus Research Institute, USA）；モノホスホリル脂質Ａ（ＰＭＬ；Ribi Immuno Chem Research, Inc., Hamilton, Mont.）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ribi）及びトレオニル−ムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ribi）といったようなリポ多糖類の誘導体；ＯＭ−１７４（ＬＰＡに関係するグルコースアミン二糖類；ＯＭ Pharma SA, Meyrin, スイス）；及びリーシュマニア伸長因子（精製済みリーシュマニアタンパク質；Corixa Corporation, Seatl, Wash）が含まれるがこれらに制限されるわけではない。従来のアジュバントは当該技術分野において周知であり、例えばリン酸又は水酸化アルミニウム塩（「ミョウバン」）が含まれる。
【００４８】
既知のアジュバントに比べて、本発明は、増強されたＴｈ−１偏向免疫応答を刺激するべく相乗的に作用する脂質及び核酸の組合せを含む改良型のアジュバントを提供している。好ましい実施形態では、本発明のこのような組成物は、核酸成分及び脂質成分を含んで成る。好ましくは、核酸成分は少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１つのＯＤＮ、そして最も好ましくは少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含む少なくとも１つのＯＤＮを含み、ここでシトシンはメチル化されていてもいなくてもよい。
【００４９】
好ましい実施形態においては、本発明の方法において使用される免疫刺激性組成物は、治療剤を封入する脂質膜を含む脂質成分を含んで成る。ここで使用する「リポソーム粒子」「リポソーム」、「脂質小胞」及び「リポソーム小胞」という語又はその文法的等価物は、互換的に使用可能であり、水性内部を取り囲むつまり封入する脂質含有膜を含む構造、粒子、錯体又は製剤を意味する。好ましい実施形態においては、リポソームは、例えば核酸といったような治療剤を取り囲むつまり封入する。リポソームは単数又は複数の脂質膜を有し得る。１つの脂質含有膜をもつリポソームは、ここでは「単一ラメラ」と呼ばれる。多数の脂質含有膜を有するリポソームはここでは「多重ラメラ」と呼ばれる。好ましい実施形態においては、リポソームは多層である。本書で用いられている「脂質２層」という語は、２層を有する脂質含有膜を意味する。
【００５０】
核酸
本発明の組成物の中で使用するのに適した核酸には例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡが含まれる。好ましくは、核酸はオリゴヌクレオチドであり、より好ましくはＯＤＮ、そして最も好ましくはＩＳＳ（「ＩＳＳ  ＯＤＮ」）及び少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含むＯＤＮである。
【００５１】
本書で用いられている「核酸」という語は、多数のヌクレオチド（すなわち、置換ピリミジン（例えばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））又は置換プリン（例えばアデニン（Ａ）又はグアニン（Ｇ））のいずれかである交換可能な有機塩基及びリン酸塩基にリンクされた糖（例えばリボース又はデオキシリボース）を含む分子）を意味している。核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。好ましくは、核酸は、オリゴリボヌクレオチドであり、より好ましくはＯＤＮである。核酸は同様にポリヌクレオシド、すなわちポリヌクレオチドからリン酸塩及びその他のあらゆる有機塩基含有重合体を差し引いたものであってもよい。本発明の免疫刺激性組成物は、核酸成分を含む。本書で本発明の組成物に関して用いられている「核酸成分」は、核酸を含む成分を意味している。
【００５２】
好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドは１本鎖であり、長さは５〜５０ヌクレオチド（「ｎｔ」）の範囲内にある。ただし、例えば５００〜５０，０００塩基対（「ｂｐ」）の範囲内の大きい２本鎖プラスミドＤＮＡを含む任意のオリゴヌクレオチドを使用することが可能である。
【００５３】
本発明の組成物及び方法において有用な核酸は、既知の供給源から得るか又は当該技術分野において周知の方法を用いて単離することのできるものである。核酸は、同じく当該技術分野において周知の組換え型又は合成方法によっても調製可能である。かかる核酸はこのとき脂質粒子内に封入され得、結果として得た組成物は、本書で記述されているように本発明の方法を用いて免疫刺激活性についてテストされ得る。
【００５４】
インビボでの使用のためには、核酸は（例えばエンド及びエキソヌクレアーゼを介した）分解に対する耐性を有している可能性がある。ステムループといったような二次的構造が、分解に対し核酸を安定化することができる。代替的には、核酸安定化は、リン酸塩バックボーン修飾を介して達成できる。好ましい安定化した核酸は少なくとも部分的ホスホロチオエート修飾型バックボーンを有している。ホスホロチオエートは、ホスホルアミデート又はＨ−ホスホネート化学反応を用いて自動化された技術を用いて合成可能である。例えば米国特許第４，４６９，８６３号に記述されている通りにアリール及びアルキルホスホネートを作ることができ、アルキルホスホトリエステル（ここで荷電酸素部分は米国特許第５，０２３，２４３号及び欧州特許第０９２，５７４号に記述されている通りにアルキル化されている）は、市販の試薬を用いて、自動化された固相合成によって調製可能である。その他のＤＮＡバックボーン修飾及び置換を作る方法が記述されてきた（Uhlmann及びPeyman, Chem. Rev. 90:544, 1990; Goodchild, Bioconjugate Chem. 1:165, 1990）。しかしながら、本書で記述されている通り、本発明の方法及び組成物は、対象の核酸に対するこのような修飾を内含する必要性を緩和する。
【００５５】
かくして、本発明の組成物及び方法に有用なオリゴヌクレオチドは、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及びそれらの互いの組合せ及び／又はホスホジエステルオリゴヌクレオチドとの組合せといったような修飾されたリン酸塩バックボーンを有することができる。さらに、その他の修飾されたオリゴヌクレオチドとしては、アルキル−ホスフェート及びアリール−ホスフェート（ここでは荷電ホスホン酸酸素がアルキル又はアリール基で置換されている）、荷電酸素部分がアルキル化されているアルキルホスホトリエステル及びホスホジエステルといったような非イオンＤＮＡ類似体といった非イオンＤＮＡ類似体がある。本書で実証されているように細胞免疫応答が望ましい場合にはＰＯＯＤＮが好まれ、一方体液性応答が望まれる場合には、ＲＳＯＤＮといったような修飾されたＯＤＮが好ましい可能性がある。
【００５６】
塩基、糖又はリンケージ部分に対するその他の数多くの化学的修飾も同様に有用であり得る。塩基は、メチル化されていてもいなくてもよい。好ましい実施形態においては、メチル又はヒドロキシメチル基が、少なくとも１つのシトシンの炭素−４位置（４−ｍＣ）又は炭素５位置（５−ｍＣ）に付着させられている。メチル化されたシトシンは、好ましくは、核酸配列内のＣｐＧモチーフ内部に位置づけされている。代替的又は付加的には、当該技術分野において記述されているように、糖部分をメチル基で修飾することができる。
【００５７】
本発明の組成物及び方法において有用な核酸配列は、アンチセンスオリゴヌクレオチドといったような患者／対象ｍＲＮＡに対し相補的であってもよいし、又は外来性又は非相補的であってもよい（例えばヌクレオチド配列は患者／対象ゲノムに対し特異的にハイブリッド形成しない）。ヌクレオチド配列は、発現され得かつ、結果としての発現産物はＲＮＡ及び／又はタンパク質でありうる。さらに、かかるヌクレオチド配列は適切なプロモータ及び発現要素にリンクされ得、発現ベクター内に含まれていてもよい。本発明の組成物及び方法において有用なヌクレオチド配列は、ヘヤピン二次構造（Yamamoto S. et al (1992) J. Immunol. 148:4072-4076）又はＣｐＧモチーフ又はその他の既知のＩＳＳフィーチャー（例えばMulti-Gドメイン、ＷＯ９６／１１２６６参照）を導く或る種のパリンドロームといったＩＳＳであり得る。本発明において使用するための好ましいＩＳＳは、特に好ましい実施形態ではメチル化されたシトシンを含んでいる少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含んで成る。
【００５８】
本発明の核酸は、当該技術分野において周知の数多くの手順のいずれかを用いて新たに合成可能である。例えば、ｂ−シアノエチルホスホルアミダイト方法（Beaucage and Caruthers, Tet. Let. 22:1859, 1981）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート方法（Garegg et al., Tet. Let. 27:4051-4054, 1986; Froehler et al., Nucl, Acid. Res. 14:5399-5407, 1986; Garegg et al., Tet. Let. 27:4055-4058, 1986, Gaffney et al., Tet. Let. 29:2619-2622, 1988）。これらの化学反応は、市販されているさまざまな自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置によって実施可能である。同様に、ＣｐＧジヌクレオチドをプラスミド内で大規模に産生させることもできる（Sambrook, T., et al., 分子クローニング：実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989を参照のこと）。かかるプラスミドは、同様に、ＤＮＡワクチンの場合に抗原コーディング遺伝子といったようなその他の発現すべき遺伝子をコードすることもできる。制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いたものといったような既知の記述を用いて、既存の核酸配列（例えばゲノミック又はｃＤＮＡ）からオリゴヌクレオチドを調製することができる。
【００５９】
インビボでの投与のためには、例えば脂質成分又は核酸成分などの組成物の成分を含め、本発明の組成物を、標的細胞（例えばＢ−細胞、単球細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ））の表面に対するより高い親和力及び／又は標的細胞による細胞摂取の増加を結果としてもたらす分子と結びつけることができる。組成物の成分を含め、本発明の組成物は、当該技術分野において周知である技術を用いて、所望の分子とイオン又は共有結合によって会合させることができる。例えばプロテインＡ、カルボジイミド及びＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）といったさまざまなカップリング又は架橋結合剤を使用することができる。
【００６０】
１つの生体内の核酸配列の免疫刺激活性を、単純な実験、例えば問題の配列をその他のアジュバント又はＩＳＳといったその他の免疫刺激剤と比較すること又は問題の配列の免疫刺激活性を検出又は測定すること、例えば免疫系成分の活性化又は宿主防御メカニズムの活性化を検出し測定することなどによって決定することができる。かかる検定は当該技術分野において周知である。同様に、当業者であれば、本書で記述されている及び／又は当該技術分野において既知である日常的な検定を用いて問題の特定の哺乳動物種にとって有用な最適なオリゴヌクレオチドを同定する方法がわかるであろう。
【００６１】
本発明の組成物及び方法において使用するのに適したＯＤＮの特定的核酸配列は、米国特許出願第６０／３７９，３４３号、米国特許出願第０９／６４９，５２７号、国際公開ＷＯ０２／０６９３６９、国際公開ＷＯ０１／１５７２６、米国特許第６，４０６，７０５号及びRaney et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 298:1185-1192 (2001)の中で記述されており、これは全て本書に参考として内含されている。ＯＤＮの配列例には、表１で示した核酸配列が含まれるがこれらに制限されるわけではない。本発明の組成物及び方法において有用なＯＤＮは、ホスホジエステル（「ＰＯ」）バックボーン又はホスホロチオエート（「ＰＳ」）バックボーンのいずれかを有することができる。本書で記述する通り、強いＴｈ−１偏向免疫応答を誘発するその能力のため、ＰＯＯＤＮが最も好ましい。もう１つの好ましい実施形態においては、ＯＤＮは、ＣｐＧモチーフ内に少なくとも１つのメチル化シトシン残基を含む。
【表１】
2005530761.tif 000002
【表２】
2005530761.tif 000003
注：ＯＤＮ１４は、１５量体オリゴヌクレオチドでありＯＤＮ１は、ＯＤＮ１を１６量体にする５′末端に付加されたチミジンを有する同じオリゴヌクレオチドである。ＯＤＮ１４とＯＤＮ１の間には生物活性の違いが全く検出されておらず、両方共類似の免疫刺激活性（Mui et al. 2001）を示す。
【００６２】
脂質及びその他の成分
送達ビヒクルとしてリポソームを調製する方法及び脂質製剤は、当該技術分野において既知であり、その開示が本書に参考として内含されている米国特許第６，４６５，４３９号、米国特許第６，３７９，６９８号、米国特許第６，３６５，６１１号及び米国特許第６，０９３，８１６号の中で記述されているものを含めたこのような製剤をいくつでも本書で有利に使用することができる。好ましい脂質製剤は、本書で記述されかつ例えば全て本書に参考として内含されている米国特許第５，７８５，９９２号、米国特許第６，２８７，５９１号、米国特許第６，２８７，５９１Ｂ１号、同時係属米国特許出願第６０／３７９，３４３号及び同時係属米国特許出願第０９／６４９，５２７号の中でより詳しく記述されている脂質粒子製剤である。
【００６３】
１つの好ましい実施形態においては、好ましい脂質製剤は、２０：２５：４５：１０モル／モルの比率を有するＤＳＰＣ、ＤＯＤＭＡ、Ｃｈｏｌ、及びＰＥＧ−ＤＭＧである。本書で使用されているように、脂質製剤中の各脂質のモル量は、脂質が列挙されているのと同じ順序で与えられている（例えば、ＤＳＰＣ対ＤＯＤＭＡ対Ｃｈｏｌ対ＰＥＧ−ＤＭＧの比率は２０ＤＳＰＣ：２５ＤＯＤＭＡ：４５Ｃｈｏｌ；１０ＰＥＧ−ＤＭＧ又は「２０：２５：４５：１０」である）。代替的実施形態においては、ＤＳＰＣをＰＯＰＣで置換し、ＤＯＤＭＡをＤＯＤＡＰで、そしてＰＥＧ−ＤＭＧをＰＥＧＣｅｒ１４又はＰＥＧＣｅｒ２０で置換することができる。
【００６４】
「脂質」という語は、脂肪酸エステルでありかつ水中で不溶性であるものの数多くの有機溶剤中では可溶であることを特徴とする有機化合物の一群を意味する。これらは通常、（１）脂肪及び油ならびにろうを内含する「単純な脂質」；（２）リン脂質及び糖脂質を内含する「化合物脂質」及び（３）脂質操作から誘導されたステロイド及び化合物といったような「誘導型脂質」という少なくとも３つのクラスに分割される。本発明では多種多様な脂質を使用することができ、そのうちのいくつかが以下で記述されている。
【００６５】
「荷電脂質」という語は、カチオン電荷又は負の電荷のいずれかを有するか又はネット中性荷電されていない両性イオンである脂質種を意味し、一般に、脂質が発見される溶液のｐＨを基準とする必要がある。
【００６６】
生理学的ｐＨにあるカチオン荷電脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−N，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）；３ｂ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）及びＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）があるがこれらに制限されるわけではない。さらに、本発明の中で使用できる数多くのカチオン脂質の商業的調製物が入手可能である。これらには、例えば、LipofectinTM（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ, Grand Island, New York, U.S.Aから市販されているＤＯＴＭＡ及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）を含むカチオンリポソーム）及びLipofectamineTM（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから市販されているＮ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）及びＤＯＰＥを含むカチオンリポソーム）が含まれる。
【００６７】
一部のカチオン荷電脂質は滴定可能である。すなわち、これらは生理学的ｐＨの又はそれに近いｐＫａを有し、本発明にとっては、弱酸性条件下で強いカチオン性を示しかつ生理学的ｐＨではわずかしか（又は全く）カチオン性を示さないという有意な帰結をもたらす。このようなカチオン荷電脂質としては、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＭＡ」）及び１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）、が含まれるがこれらに制限されるわけではない。ＤＭＤＭＡも同様に、有用な滴定可能なカチオン脂質である。
【００６８】
生理学的ｐＨにおけるアニオン荷電脂質としては、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ジホスファチジルグリセロール、ポリ（エチレングリコール）−ホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアリロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、脳ホスファチジルセリン、などが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００６９】
一部のアニオン荷電脂質は滴定可能である。すなわち、これらは生理学的ｐＨの又はそれに近いｐＫａを有し、本発明にとっては、弱酸性条件下で強いカチオン性を示しかつ生理学的ｐＨではわずかしか（又は全く）カチオン性を示さないという有意な帰結をもたらす。このようなアニオン荷電脂質は、本書で開示されている原理に基づいて当業者によって同定され得る。
【００７０】
「中性脂質」という語は、生理学的ｐＨで無荷電か又は中性両性イオン形態のいずれかで存在する一定数の脂質種のうちの任意のものを意味する。かかる脂質には、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールが含まれる。
【００７１】
本発明で使用されているいくつかの好ましい脂質製剤には、ＰＥＧ−脂質又はポリアミドオリゴマー−脂質（例えばＡＴＴＡ−脂質）及びその他の立体障壁又は「シース」−脂質、洗浄剤などといった凝集防止用化合物が含まれる。かかる脂質については、本書に参考として内含されている、ポリアミドオリゴマーに関する米国特許第４，３２０，１２１号、米国特許第５，８２０，８７３号、米国特許第５，８８５，６１３号、国際公開ＷＯ９８／５１２７８号及び米国特許出願第０９／２１８，９８８号に記述されている。これらの脂質及び洗浄剤化合物は、反対の電荷をもつ脂質及び治療剤を含有する製剤の沈殿及び凝集を防ぐ。これらの脂質は、同様にインビボでの循環寿命を改善するためにも利用でき（Klibanov et al (1990) ＦＥＢＳ Letters, 268 (1); 235-237参照）、又インビボで製剤外で急速に交換するべく選択される可能性もある（本書に参考として内含されている米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態では、交換可能な立体障壁脂質が利用される（全て本書に参考として内含される米国特許第５，８２０，８７３号、米国特許第５，８８５，６１３号及び米国特許出願第０９／０９４５４０号及び米国特許第６，３２０，０１７号に記述されている通り）。ＰＥＧ２０００−ＣｅｒＣ１４及びＡＴＴＡ８−ＣｅｒＣ１４といったような交換可能な立体障壁脂質が、対象／患者に対する投与時点で脂質粒子の外部単層から急速に交換する立体障壁脂質である。このような脂質の各々は、アシル鎖長、飽和、立体障壁部分のサイズ、膜組成及び血清組成などを含むさまざまな因子に応じて、特徴的な粒子外交換速度を有する。かかる脂質は粒子形成中の凝集を防ぐ上で有用であり、投与時点で粒子からの出発が加速されることから、以上で指摘した特許提出物の中で記述されているように、プログラミング可能な融合能及び粒子不安定化活性といった利点が得られる。
【００７３】
一部の脂質粒子製剤は、或る種の標的細胞又は標的組織におけるリポソームの局在化を促進するように設計されたターゲティング部分を利用することができる。ターゲティング部分を、処方中又は処方後（直接的接合、疎水性相互作用又はその他の形で）脂質粒子の外部２層と会合させることができる。これらの方法は、当該技術分野において周知である。さらに、一部の脂質粒子製剤は、ＰＥＡＡといった融合誘導重合体、ヘマグルテニン、その他のリポ−ペプチド（全て本書に参考として内含される米国特許第６，４１７，３２６号及び米国特許出願第０９／６７４，１９１号を参照のこと）及びインビボ及び／又は細胞内送達のために有用なその他の特長を利用することができる。
【００７４】
もう１つの好ましい実施形態においては、本発明の脂質成分は、スフィンゴマミエリン及びコレステロール（「スフィンゴゾーム」）を含んで成る。好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法の中で用いられる脂質粒子は、スフィンゴミエリン及びコレステロールから成り、酸性のリポソーム内ｐＨを有する。スフィンゴミエリン及びコレステロールを含む脂質粒子は、その他の製剤に比べていくつかの利点を有している。スフィンゴミエリン／コレステロールの組合せは、テストされたその他のリポソーム製剤に比べて、長い循環寿命を有し、酸性加水分解に対しはるかに安定しており、著しく優れた薬物保持特性をもち、腫瘍などの中へのより優れた負荷特性を有し、かつ著しく優れた抗腫瘍効能を示すリポソームを産生する。
【００７５】
好ましい実施形態においては、本発明のＬＮＡ製剤は、構造式Ｉのカチオン化合物及び以下の通りの（そして本書に参考として内含されている米国特許第５，７８５，９９２号の中で完全に記述されている）少なくとも１つの中性脂質を含んで成る。
【化１】
2005530761.tif 000004
【００７６】
構造式Ｉにおいては、Ｒ1及びＲ2は各々独立してＣ1〜Ｃ3；アルキルである。Ｙ及びＺはアルキルか又はアルケニル鎖であり、Ｙ及びＺが両方共−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−でないことを条件として、独立して以下の通りである：−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−、又は−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ−。ｎ＋ｍ及びｑ＋ｐの和が各々１０〜１４の整数であることを条件として、文字ｎ及びｑは、３〜７の整数を表わし、一方文字ｍ及びｐは、４〜９の整数を示す。記号Ｘ′は薬学的に受容可能なアニオンを表わす。上述の構造式においては、２重結合の方向性はシス又はトランスであり得るが、一般的にはシス異性体が好ましい。
【００７７】
もう１つの好ましい実施形態においては、カチオン化合物は構造式Ｉのものであり、ここでＲ1及びＲ2はメチルであり、Ｙ及びＺは各々独立して以下の通りである：−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2−又は−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ−。好ましい実施形態においては、Ｒ1及びＲ2はメチルであり、Ｙ及びＺは各々−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ及びｑは両方共７であり；ｍ及びｐは両方共５である。もう１つの好ましい実施形態においては、カチオン化合物はＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド）である。ＤＯＤＡＣは当該技術分野において既知であり、専ら洗浄剤及びシャンプー内の添加物として使用される化合物である。ＤＯＤＡは同様に、その他の洗浄剤を伴うリポソーム組成物中の補脂質としても使用される（Takahashi et al., ＧＢ２１４７２４３を参照のこと）。
【００７８】
本発明のＬＮＡ製剤中の中性脂質は、標準的に洗浄剤の中で使用される又はミセル又はリポソームの形成のために使用されるさまざまな中性脂質のうちのいずれでもあり得る。当該組成物中で有用である中性脂質の例としては、ジアシルホスファチジルクロリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン及びセレブロシドがあるが、これらに制限されるわけではない。好ましい実施形態においては、当該組成物は、ジアシルホスファチジルクロリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド又はスフィンゴミエリンである単数又は複数の中性脂質を内含することになる。これらの中性脂質内のアシル基は、好ましくは、Ｃ10〜Ｃ24炭素鎖をもつ脂肪酸から誘導されたアシル基である。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル又はオレオイルである。特に好ましい実施形態においては、中性脂質は、１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとなる。
【００７９】
アニオン、Ｘ-は、同様にして、さまざまな薬学的に受容可能なアニオンのうちのいずれかであり得る。これらのアニオンは、有機又は無機であり得、例えばＢｒ-、Ｃｌ-、Ｆ-、Ｉ-、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、硝酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、及び乳酸塩を含む。好ましい実施形態においては、Ｘ-はＣｌ-又はＡｃＯ-である。
【００８０】
本書で記述されているその他の成分に加えて、本発明の組成物は薬学的に受容可能な担体を含有することができる。薬学的に受容可能な担体は当該技術分野において周知である。担体の選択は、一部には投与されるべき特定の組成物によってならびにその組成物を投与するのに用いられる特定の方法によって決定される。好ましくは、薬学的担体は、水又は食塩水中に溶解した状態にある。
【００８１】
本発明の組成物においては、化合物対中性脂質の比は、約２５：７５（カチオン化合物：中性脂質）から約７５：２５（カチオン化合物：中性脂質）か又は約５０：５０までの範囲内にある。
【００８２】
本発明の組成物において使用されるカチオン化合物は、標準的合成反応を用いて当業者にとって既知の方法により調製され得る（Advanced Organic Chemistry、第４版、３月号、Wiley-Interscience, NY, N.Y. (1992)、本書に参考として内含）。例えば、ＯＳＤＡＣの合成は、まずアミンの還元性アルキル化を結果としてもたらす条件下でホルムアルデヒド及びシアノホウ素化水素ナトリウムでオレイルアミンを処理することによって実施可能である。このアプローチはジメチルオレイルアミンを提供し、これを次に臭化ステアリルでアルキル化して、対応するアンモニウム塩を形成させることができる。アニオン交換の結果、ＯＳＤＡＣが形成される。大量の余剰ジメチルアミンで臭化オレイルを処理することによりジメチルオレイルアミンを合成し、次に上述の通りにさらに誘導体化することもできる。
【００８３】
両方の脂肪酸鎖が不飽和であるカチオン化合物（すなわちＤＯＤＡＣ）については、以下の一般的手順を使用することができる。不飽和酸（すなわちオレイン酸）を、塩化オキサリル、塩化チオニル、ＲＣ１３又はＰＣ１５といったような試薬を用いてその対応する塩化アシルへと変換することができる。該塩化アシルを不飽和アミンすなわちオレイルアミン）で処理して対応するアミドを得ることができる。例えば、水素化アンモニウムリチウムでのアミドの還元により、両方のアルキル基が不飽和の長鎖アルキル基である２級アミンが得られる。次にこの２級アミンをヨウ化メチルといったようなハロゲン化アルキルで処理して、第４級アンモニウム化合物を得ることができる。次にアニオン交換を実施して、所望の薬学的に受容可能なアニオンをもつカチオン化合物を得ることができる。同様の要領でアルキルアミン前駆物質を合成することができる。例えば、充分余剰のメタノール溶液でハロゲン化アルキルを処理することで、精製後に所要のアミンが生成されることになる。代替的には、塩化オキサリルでの適切なカルボン酸の処理により生成された塩化アシルをアンモニアと反応させて、アミドを生成させることが可能である。ＬｉＡｌＨ4でアミドを還元させると、所要のアルキルアミンが得られることになる。
【００８４】
好ましい実施形態においては、本発明の薬学組成物は、ミセル又はリポソームとして製剤される。本発明のカチオン化合物及び中性脂質を含有するミセルは、当該技術分野において周知の方法によって調製可能である。当該組成物のミセル製剤に加えて、本発明は同様にリソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン−ポリオキシエチレン接合体、セラミド−ポリオキシエチレン接合体又はホスファチジン酸−ポリオキシエチレン接合体、といったようなその他の種を内含するミセル製剤をも提供している。
【００８５】
本発明の組成物において用いられるポリオキシエチレン接合体は、接合基（すなわちホスファチジン酸又はホスファチジルエタノールアミン）を適切に機能化されたポリオキシエチレン誘導体と組合わせることによって調製可能である。例えば、ホスファチジルエタノールアミンをオメガ−メトキシポリエチレングリコールコハク酸塩と組合わせて、ホスファチジルエタノールアミン−ポリオキシエチレン接合体を得ることができる（例えば本書に参考として内含されているParr. et al. Biochem. Biophys. Acta 1195:21-30 (1994) を参照のこと）。
【００８６】
本発明の組成物及び方法において使用するための中性脂質の選択は、一般に例えばリポソームのサイズ及び血流中のリポソームの安定性を考慮することによって導かれる。上述のように、リポソーム内の中性脂質成分は、２つのアシル基（すなわち、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジル−エタノールアミン）を有する脂質である。変動する鎖長及び飽和度のさまざまなアシル鎖長を有する脂質を入手可能であるか、又は周知の技術により単離又は合成することができる。一般に、脂質は飽和度が低くなればなるほど、特にフィルタ殺菌を目的としてリポソームを約０．３ミクロン未満のサイズにしなければならない場合、より容易にサイズ決定される。１群の実施形態においては、Ｃ14〜Ｃ22の範囲内の炭素鎖長のモノ又はジ不飽和脂肪酸が使用される。さらに、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。
【００８７】
本発明の組成物及び方法の中で有用であるリポソームは同様に、セリン及びイノシトールといったようなその他の頭部を伴うスフィンゴミエリン又はリン脂質から成っていてもよい。本発明において有用なさらなるその他のリポソームとしては、コレステロール、ジグリセリド、セラミド、ホスファチジルエタノールアミン−ポリオキシエチレン接合体、リン酸−ポリオキシエチレン接合体、又はポリエチレングリコール−セラミド接合体（例えば、ＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ１４又はＰＥＧ−Ｃｅｒ−Ｃ２０）が含まれることになる。リポソームをサイズ決定しフィルタ殺菌する上で用いられる方法について、以下で論述する。
【００８８】
リポソームを調製するさまざまな方法が当該技術分野において知られている（例えば全て本書に参考として内含されるSzoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)、米国特許第４，２３５，８７１、４，５０１，７２８、４，８３７，０２８号the text Liposomes, Maro J. Ostro, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1983、第１章及びHope, et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986) を参照のこと）。１つの既知の方法は、不均一なサイズの多重ラメラ小胞を生成する。この方法においては、小胞形成脂質は適切な有機溶剤又は溶剤系内で溶解され、真空又は不活性ガス下で乾燥させられて薄い脂質フィルムを形成する。所望の場合には、フィルムを、第３ブタノールといったような適切な溶剤中に再溶解させ、次に凍結乾燥させて、より容易に水和された粉末様の形態をしているさらに均質な脂質混合物を形成させることが可能である。薄いフィルムは緩衝水溶液で覆われ、標準的に１５〜６０分の時間にわたり、撹拌によって水和することができる。結果として得られた多重ラメラ小胞のサイズ分布は、より勢いのある撹拌条件下で脂質を水和させることによってか、又はデオキシコール酸塩といったような可溶化用洗浄剤を添加することによって、さらに小さいサイズへと移行させることができる。
【００８９】
リポソーム調製の後、所望のサイズ範囲及び比較的狭いリポソームサイズ分布を達成するように、リポソームをサイズ決定することができる。約０．２〜０．４ミクロンのサイズ範囲では、標準的には０．２２ミクロンのフィルタである従来のフィルタを通したろ過により、リポソーム懸濁液を殺菌させることができる。リポソームが約０．２〜０．４ミクロンまで縮小された場合、フィルタ殺菌方法を高処理量ベースで実施することができる。
【００９０】
リポソームを所望のサイズにサイズ決定するためにいくつかの技術を利用することができる。１つのサイズ決定方法は、本書に参考として内含されている米国特許第４，７３７，３２３号の中で記述されている。浴又はプローブ音波処理のいずれかによりリポソーム懸濁液を音波処理すると、サイズが約０．０５ミクロン未満の小さい単一ラメラ小胞まで徐々にサイズが縮小されることになる。均質化は、大きいリポソームをより小さいものへと分析するのにせん断エネルギーに依存しているもう１つの方法である。標準的な均質化手順においては、標準的には約０．１〜０．５ミクロンである選択されたリポソームサイズが見られるようになるまで標準的エマルジョンホモジナイザーを通して多重ラメラ小胞が再循環させられる。両方の方法において、粒度分布は、従来のレーザービーム粒度識別によって監視可能である。
【００９１】
小孔ポリカーボネート膜又は非対称セラミック膜を通してのリポソームの押出し加工も又、リポソームサイズを比較的明確なサイズ分布に縮小するための有効な方法である。標準的には、所望のリポソームサイズ分布が達成されるまで、単数又は複数回懸濁液を膜を通して循環させる。リポソームのサイズを漸進的に縮小させるため、連続的に孔が小さくなる膜を通してリポソームを押出し加工することができる。本発明で使用するためには、約０．０５ミクロンから約０．１５ミクロンのサイズをもつリポソームが好ましい。
【００９２】
さらに以下で記述する通り、本発明の組成物は、任意の既知の投与経路により、対象に投与することができる。ひとたび細胞により吸着された時点で、（前述した錯体を含めた）リポソームは、細胞の一部分による飲食作用を受け細胞膜と脂質を交換するか又は細胞と融合することができる。錯体の核酸成分の移送又は取込みは、これらの経路のうちのいずれか１つを介して起こり得る。特に、融合が起こった場合、リポソーム膜は細胞膜内に組込まれる可能性があり、リポソームの中味は細胞内流体と組合わさることができる。
【００９３】
以下で詳述されている通り、治療用化合物でもありうる付加的な成分を本発明の脂質粒子に添加して、それらを特定の細胞型にターゲティングすることが可能である。例えば腫瘍関連抗原といったような特定の細胞型上にのみ存在するエピトープに結合するその結合フラグメント又はモノクローナル抗体にリポソームを接合させて、全身的投与の後にリポソームをターゲティングする手段を得ることが可能である。代替的には、標的細胞型の表面レセプタを結合するリガンドは、同じくリポソームにも結合され得る。リポソームをターゲティングするためのその他の手段も同様に、本発明において利用可能である。
【００９４】
リポソームを含有する培地から遊離した治療剤を除去するのに必要でありうる分離段階の後、リポソーム懸濁液は、患者又は宿主細胞への投与のために薬学的に受容可能な担体中での所望の濃度にされる。本発明の組成物及び方法においては、数多くの薬学的に受容可能な担体を利用することができる。例えば水、緩衝水、０．４％の食塩水、０．３％のグリシンなどといったさまざまな水性担体を使用することができ、これらは、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンといったような、安定性増強のための糖タンパク質を内含し得る。一般に、薬学的に受容可能な担体として通常の緩衝食塩水（１３５〜１５０ｍＭのＮａＣｌ）が利用されることになるが、その他の適切な担体でも充分であろう。これらの組成物は、ろ過といったような従来のリポソーム殺菌技術によって殺菌され得る。組成物は、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの、ｐＨ調整及び緩衝剤、緊張性調整剤などといった、生理学的条件を近似するのに必要とされるような薬学的に受容可能な補助的物質を含有することができる。これらの組成物は、以上で言及された技術で殺菌されてもよいし、又は無菌条件下で生成されてもよい。結果として得られた水溶液は使用のために包装することもでき、又は無菌条件下でろ過し凍結乾燥させることもでき、凍結乾燥された調製物は、投与に先立ち無菌水溶液と組合せられる。
【００９５】
担体中のリポソームの濃度は変動しうる。好ましい実施形態においては、リポソーム濃度は約０．１〜２００ｍｇ／ｍｌである。当業者であれば、特定の患者についての又は異なるリポソーム成分での治療を最適化するためにこれらの濃度をいかに変動させるかを知っていることだろう。例えば、治療に付随する流体負荷を低下させるために、濃度を増大させることができる。
【００９６】
対称の細胞は通常、インビボ又はエクスビボ投与によって本発明の組成物に露呈される。本書で記述されている好ましい実施形態においては、本発明の組成物は、全身的に、例えば静脈内で投与され、筋内、皮下及び局所的投与も同じく考慮されている。
【００９７】
患者に対する多数の投与が考慮されている。治療の薬剤投与計画は、疾病及び患者の身体条件によって決定されることになる。当該技術分野において周知である免疫刺激性組成物（例えばワクチン）を含めた治療用化合物での標準的治療が、治療用化合物を含有するリポソームでの治療に対する指針として役立つかもしれない。治療の持続期間及び計画は、当業者にとって周知の方法によって変動され得るが、循環時間の延長及びリポソーム内漏出の減少は一般に、以前に用いられてきた投薬量を下方修正できるようにすることになる。本発明のリポソームの用量は、治療を受ける動物又は患者の臨床的条件及びサイズによって変動し得る。封入されていない場合の治療用化合物の標準的用量は、リポソーム封入された化合物の用量に対する指針として役立つ可能性がある。用量は標準的に、治療の間中一定であるが、場合によっては、用量が変動してもよい。本発明のリポソームの用量を変えるために使用できる標準的な生理学的パラメータは、治療中に評価することができる。
【００９８】
抗原
本発明の癌ワクチンはさらに、上述のＬＮＡ製剤と混合されるか又さらに好ましくは会合させられた少なくとも１つの腫瘍関連抗原を含んで成る。最も好ましくは、単数又は複数の腫瘍関連抗原からの複数のエピトープを含むポリトープワクチンが提供される。当該組成物及び方法の中で使用できる腫瘍関連抗原は、本来免疫原性又は非免疫原性又はわずかに免疫原性であり得る。本書で実証されているように、当該組成物はかかる抗原に対する免疫寛容性に打ち勝つ能力を有することから、腫瘍関連免疫寛容性でさえ、治療的効果のために当該ワクチンの中で有利に利用可能である。抗原の例としては、合成、組換え型、外来性又は相同抗原が含まれるがこれらに制限されるわけではない。又抗原材料としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物及びＤＮＡが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【００９９】
本発明において使用するのに適した腫瘍関連抗原には、単一の腫瘍タイプを表わしているか、複数のタイプの腫瘍の間で共有されている及び／又は正常な細胞に比べて腫瘍細胞中で過剰発現されているか又は排他的に発現されている可能性のある、突然変異を受けた分子及び受けていない分子の両方が含まれる。タンパク質及び糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質及びムチンの腫瘍特異的発現パターンも実証されてきた。Moingeon、前出。当該癌ワクチンで使用するための腫瘍関連抗原の例としては、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子及び腫瘍細胞に独特の突然変異又は再配置をもつその他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化された胚遺伝子産物、胎児腫瘍性抗原、組織特異的（ただし腫瘍特異的ではない）分化抗原、成長因子レセプタ、細胞表面炭水化物残渣、外来性ウイルスタンパク質及び数多くのその他のタンパク質が含まれる。
【０１００】
腫瘍関連抗原の特定の実施形態としては、例えばＲａｓｐ２１原癌遺伝子、腫瘍抑制ｐ５３及びＨＥＲ−２／ｎｅｕ及びＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、Ｃａｓｐａｓｅ８及びベータカテニンのタンパク質産物といったような突然変異を受けた抗原；ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２及びＫＳＡといった過剰発現された抗原；アルファフエトプロテイン（ＡＦＰ）といった胎児腫瘍性抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）；癌胎児抗原（ＣＥＡ）といった免疫寛容性及びＭａｒｌ／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１及びＴＲＰ２といったメラニン細胞分化抗原；ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１及びＰＳＭ−Ｐ２といった前立腺関連抗原；ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥといった再活性化された胚遺伝子産物及びＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２及びＳＣＰ１といったその他の癌精巣抗原；Ｍｕｃ−１及びＭｕｃ−２といったムチン；ＧＭ２、ＧＤ２及びＧＤ３といったガングリオシド及びルイス（ｙ）及びグロボ−Ｈといった中性糖脂質及び糖タンパク質；及びＴｎ、トンプソン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦ）及びｓＴｎといった糖タンパク質が含まれる。同様に本書に腫瘍関連抗原として含まれるのは、全細胞及び腫瘍細胞リゼイドならびにその免疫原性部分、ならびにＢ細胞リンパ腫に対し使用するためのＢリンパ球のモノクローナル増殖上で発現される免疫グロブリンイディオタイプである。
【０１０１】
腫瘍関連抗原及びそのそれぞれの腫瘍細胞標的には、例えば、癌腫に対する抗原としてのサイトケラチン、特にサイトケラチン８、１８及び１９が含まれる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胎児抗原（ＨＥＡ−１２５）、ヒト乳脂肪小球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−エピトープ４、１７−１Ａ、Ｃ２６及びＴ１６も同じく既知の癌腫抗原である。デスミン及び筋特異的アクチンが、筋原性肉腫の抗原である。胎盤アルカリホスファターゼ、ベータ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン及びアルファ−フェトプロテインは、栄養膜細胞及び胚細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異抗原は、結腸腺癌の癌胎児性抗原である前立腺癌の抗原である。ＨＭＢ−４５は、黒色腫の抗原である。子宮頸癌においては、有用な抗原は、ヒト乳頭腫ウイルスによってコードされ得る。クロマグラニン−Ａ及びシナプトフィシンは、神経内分泌及び神経外胚葉腫瘍の抗原である。特に有利であるのは、壊死部分を有する中実腫瘍塊を形成する攻撃的腫瘍である。かかる壊死細胞の溶解は、抗原提示細胞のための抗原の豊かな供給源であり、かくして当該療法は、従来の化学療法及び／又は放射線療法と併用して有利に使用できる。
【０１０２】
腫瘍関連抗原は、当該技術分野において周知の方法によって調製することができる。例えば、これらの抗原は、癌細胞の粗製抽出物を調製することによって（例えば、Cohen et al., Cancer Res., 54:1055 (1994) 中で記述されているように）、抗原を部分的に精製することによって、組換え技術によって又は既知の抗原の新たな合成によって、癌細胞から調製可能である。抗原は同様に、対象の体内での発現及び免疫化された対象の免疫系に対する提示に適した形態で抗原ペプチドをコードする核酸の形をしていてもよい。さらに抗原は、完全抗原であってよく、そうでなければ少なくとも１つのエピトープを含む完全抗原のフラグメントであってもよい。
【０１０３】
或る種の癌にかかりやすくするものとして知られている病原体から誘導された抗原も同様に、本発明の癌ワクチンの中に有利に内含させることができる。世界中の癌発生の１６％近くが、感染性病原体にその原因を帰することができると推定されており（Moingeon (前出)）、数多くの一般的悪性腫瘍が、特異的ウイルス遺伝子産物の発現により特徴づけられている。かくして、癌の発生に関与する病原体からの単数又は複数の抗原を内含させることが、宿主免疫応答を広くし癌ワクチンの予防的又は治療的効果を増強させる上で一助となる可能性がある。本書で提供されている癌ワクチンの中で使用するための特に有利な病原体としては、Ｂ型肝炎ウイルス（肝細胞癌）、Ｃ型肝炎ウイルス（肝癌）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）（バーキット型リンパ腫、鼻咽頭癌、免疫抑制された個体におけるＰＴＬＤ）、ＨＴＬＶ−１（成人Ｔ細胞白血病）、癌遺伝子ヒト乳頭腫ウイルス１６、１８、３３、４５型（成人子宮頸癌）及びピロリ菌（Ｂ細胞胃リンパ腫）が含まれる。哺乳動物そしてより特定的にはヒトにおける抗原として役立つ可能性のあるその他の医学的に適切な微生物は、その全内容が本書に参考として内含されているC.G.A. Thomas, Medicial Microbiology, Bailliere Tindall、イギリス、１９８３といった文献中で広く記述されている。
【０１０４】
上述のように、脂質製剤の抗原は、リポソーム又は脂質粒子を用いて封入、会合又は混合され得る。本発明の一部の実施形態においては、抗原は、リポソーム又は脂質粒子内に封入されている。その他の実施形態では、抗原はリポソーム又は脂質粒子に吸着されている。その他の態様においては、抗原は、リポソーム又は脂質粒子に共有結合により付着される。抗原をリポソーム又は脂質粒子に対し共有結合により付着させるために用いられる方法は、当業者にとっては既知の標準的方法である。
【０１０５】
その他の薬物成分
本発明の一部の好ましい実施形態はさらに、例えば薬物又は生物活性作用物質といった付加的な治療剤を含む。これらの付加的な成分は、直接的に付加的な治療上の利点又は付加的な免疫刺激上の利点を提供し得る。本発明の組成物及び方法により多種多様の治療用化合物を送達することができる。治療用化合物の例としては、核酸、タンパク質、ペプチド、腫瘍溶解薬、抗感染薬、抗不安薬、向精神薬、免疫調整剤、イオノトロープ、ゲロニンといった毒素及び真核性タンパク質合成阻害物質などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。本発明のリポソーム内でのエントラップメントのための好ましい治療用化合物は、親油性カチオンであるものである。これらの中には、リポソームの脂質２層相へと分割できかくして膜形状でリポソームと会合できる親油性分子クラスの治療剤が入る。治療用化合物のさらなる例としては、プロスタグランジン、アンフォテリシンＢ、メトトレキセート、シスプラチン及び誘導体、プロゲステロン、テストステロン、エストラジオール、ドキソルビシン、エピルビシン、ベクロメタゾン及びエステル、ビタミンＥ、コルチゾン、デキサメタゾン及びエステル、吉草酸ベータメタゾン及びその他のステロイド、フッ素化キノリン抗細菌性シプロフロキシン及びその誘導体、及びアルカロイド及びその誘導体が含まれるがこれらに制限されるわけではない。アルカロイド誘導体の中には、スワインソニン及び例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、エトポシド、リン酸エトポシド及びテニポシドといったようなビンカアルカロイド及びその半合成誘導体の成員が入る。このグループのうち、ビンブラスチン及びビンクリスチン及びスワインソニンが特に好ましい。スワインソニン（Creaven及びMihich, Semin. Oncol. 4:147 (1977)）は、骨髄増殖を刺激する能力をもつ（White and Olden, Canser Common. 3:83 (1991)）。スワインソニンは同様にＩＬ−２、ＩＬ−２、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びインターフェロンを含めた多数のサイトカインの産生も刺激する（Newton, Cancer Commun. 1:373 (1989); Olden, J. Natl. Cancer Inst., 83:1149 (1991)）。さらに、スワインソニンは、伝えられるところによれば、Ｂ及びＴ−細胞の免疫性、インビボでの腫瘍細胞のナチュラルキラーＴ細胞及びマクロファージ誘発型破壊を誘発し、インターフェロンと組合わさった場合、インビボで結腸癌及び黒色腫癌に対する直接的抗腫瘍活性を有する（Dennis, Cancer Res., 50:1867 (1990); Olden, Pharm. Ther. 44:85 (1989); White and Olden, Antlcancer Res., 10:1515 (1990)）。本発明の組成物及び方法において有用であるその他のアルカロイドには、パラリタキセル（タキソール）及びその合成誘導体が含まれるが、これらに制限されるわけではない。付加的な薬物成分には、脂質粒子内に取込むことのできる当該技術分野において既知の任意の生物活性作用物質が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１０６】
これらの付加的な薬物成分は、本書に記述されている脂質粒子で封入されていても又その他の形でそれと会合させられてもよい。代替的には、本発明の組成物には、脂質核酸粒子と会合していない薬物又は生物活性作用物質が含まれ得る。かかる薬物又は生物活性作用物質が含まれ得る。かかる薬物又は生物活性作用物質は、別々の脂質担体内に入っていても、又同時投与されてもよい。
【０１０７】
組成物の製造
本発明の組成物の製造は、任意の技術によって達成され得るが、最も好ましいのは、本書に各々参考として内含されている以下の刊行物、特許及び出願において詳述されているエタノール透析又は洗浄剤透析方法である：米国特許第５，７０５，３８５号；米国特許第５，９７６，５６７号；米国特許出願第０９／１４０，４７６号；米国特許第５，９８１，５０１号；米国特許第６，２８７，５９１号；国際公開ＷＯ９６／４０９６４；及び国際公開ＷＯ９８／５１２７８。これらの製造方法は、脂質粒子、好ましくは脂質−核酸粒子内に封入された治療剤を含む免疫刺激性組成物の小規模及び大規模製造を提供する。該方法は同様に、優れた薬学的特性をもつこのような粒子をも生成する。
【０１０８】
本発明の癌ワクチンは、免疫応答が望まれている単数又は複数の腫瘍関連抗原を添加することによって調製され得る。抗原を取込む手段は、当該技術分野において周知であり、例えば以下のものが含まれる：１）処方プロセス中の抗原の受動的封入（例えば、ＯＤＮを含有する溶液に抗原を添加することができる）；２）本書に記述されたエタノールベースのプロトコルを用いて処方された、エタノール脂質混合物に対する糖脂質及びその他の抗原脂質の添加；３）脂質小胞内への挿入（例えば抗原−脂質ミセルと共に小胞をインキュベートすることにより、形成された脂質小胞内に抗原−脂質を添加することができる）；及び４）抗原を処方後に添加できる（例えばリンカー部分を伴う脂質が製剤された粒子内に内含されリンカーが処方後に活性化されて所望の抗原をカップリングするような、カップリング）。標準的カップリング及び架橋方法は、当該技術分野において周知である。代替的調製では、核酸を含有しない脂質粒子内に抗原が取込まれ、これらの粒子は、対象への投与に先立ち脂質−核酸粒子と混合される。
【０１０９】
本発明の方法において使用される組成物の特徴づけ
本発明の方法において使用される組成物の好ましい特徴は、以下の通りである。
【０１１０】
本発明の好ましい脂質−核酸粒子は、内部空間を充分に封入する脂質膜（一般にはリン脂質２層）の外部を含んでいる。本書では時として脂質膜小胞とも呼ばれているこれらの粒子は、平均直径５０〜２００ｎｍ、好ましくは６０〜１３０ｎｍの小さい粒子である。静脈内投与のために最も好ましいのは、９５％の粒子が平均の３０ｎｍ以内である比較的均等なサイズの粒子である。核酸及びその他の生物活性作用物質は、内部空間内に収納されるか又は、封入膜の内部表面と会合されている。最も好ましくは、ＬＮＡ粒子は、層の形に組織された脂質／ＤＮＡコアを封入する外部脂質２層から成る小胞の均質な集団を含んで成る。粒子１個あたりの層の数は、封入されたＤＮＡの量に正比例しており、標準的に好ましい組立て条件は、０．１〜０．１５（重量／重量）というＤＮＡ対脂質比をもつ粒子を生成する。
【０１１１】
本書で使用されている「完全に封入された」という語は、粒子内の核酸が、遊離ＤＮＡを著しく分解するはずのマクレアーゼ検定又は血清に対する露呈の後に、著しい分解を受けない、ということを表わしている。完全に封入された系においては、好ましくは粒子核酸の２５％未満が、通常遊離核酸の１００％を分解するはずの処理において分解し、より好ましくは１０％未満、そして最も好ましくは５％未満の粒子核酸が分解する。代替的には、完全封入をOlgreenTM検定によって決定することができる。完全に封入されたという語は同様に、粒子が血清安定であること、すなわちインビボ投与の時点でその成分部分へと急速に分解しないことを示唆している。
【０１１２】
本発明の組成物のこれらの特徴は、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTM）製剤といったような（カチオン錯体又はリポプレックスとしても知られている）脂質−核酸凝集物から本発明の好ましい粒子を区別している。これらの凝集物は一般に直径がはるかに大きく（＞２５０ｎｍ）、ヌクレアーゼ消化に完全に耐えるものではない。これらは一般にインビボ投与の時点で分解する。上述のような弱い抗原とのカチオン脂質−核酸凝集物を含む脂質−核酸製剤は、筋内、腹腔内及び髄腔内投与そしてより好ましくは鼻腔内投与といった局所的及び領域的適用のための適切なワクチンを提供することができる。
【０１１３】
本発明のリポソームは、広範囲の薬物：脂質比で製剤され得る。本書で使用する「薬物対脂質比」は、調製物の規定の体積内の治療用核酸の量（すなわち血液に対し露呈された時点で急速に分解されない封入された核酸の量）を同じ体積内の脂質の量で除したものを意味している。これは、モル／モルベースか又は重量／重量ベース又は重量／モルベースで決定され得る。薬物対脂質の比が、一定の与えられた用量の核酸と会合される脂質の用量を決定することができる。好ましい実施形態においては、本発明の組成物は約０．０１対０．２５（重量／重量）の範囲内の薬物：脂質比を有する。
【０１１４】
本発明の組成物及び方法の使用
本書で立証されているように、当該癌ワクチンは、腫瘍関連抗原に対する強いＴｈ−１偏向細胞免疫応答を刺激する能力をもち、確立された腫瘍の成長を阻害することができる。かくして、本書で記述されている癌ワクチンは、免疫寛容性を含め、腫瘍関連抗原に対するＴｈ−１偏向細胞免疫性を誘発する方法において使用することができる。同様に本書において提供されているのは、例えば分化抗原、前立腺特異抗原などを含めた腫瘍関連抗原に対する免疫寛容性に打ち勝つための方法である。
【０１１５】
これらの免疫応答は、免疫系の細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ＡＰＣ例えば樹状細胞又はマクロファージ、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞など）の活性化、増殖又は分化；マーカーのアップレギュレート又はダウンレギュレートされた発現；サイトカイン分泌；ＩｇＡ、ＩｇＭ又はＩｇＧ力価の刺激又は増加；イソ型クラススイッチング及び巨脾腫症（脾臓細胞充実度の増加を含む）を含めた（ただしこれらに制限されるわけではない）数多くのやり方で測定可能である。特にＴｈ−１偏向細胞媒介型免疫性の存在は、Ｔｈ−１サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２）及び抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの誘発によって直接決定可能である。Ｔｈ−１偏向細胞媒介型免疫性の存在は同様に、誘発される１型抗原特異抗体のイソ型（例えばマウスにおけるＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ１、ヒトにおけるＩｇＧ及びＩｇＡ）によって間接的にも表示される。かくして、Ｔｈ−１サイトカイン又はＣＴＬ又はＴｈ１様抗体が誘発された場合、Ｔｈ−１偏向免疫応答が本発明に従って誘発される。以上で論述した通り、Ｔｈ−１サイトカインにはＩＬ−１２及びＩＦＮ−γが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１１６】
好ましい実施形態においては、本発明の方法は、少なくとも１つの腫瘍関連抗原を含む癌ワクチンを有効量だけ対象に投与することによって、対象の体内で腫瘍細胞に対するＴｈ−１偏向細胞免疫応答を刺激する段階を含んで成る。好ましくは、ワクチンは、封入されたＯＤＮを含むＬＮＡ粒子を含んで成る。より好ましくは、抗原はＬＮＡ粒子と会合されており、最も好ましくは複数の抗原が利用される。Ｔｈ−１応答を誘発する代替的なアジュバントには、ＭＰＬ、ＭＤＰ、ＩＳＣＯＭＳ、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＳＢ−ＡＳ２が含まれるが、これらに制限されるわけではない。特に、本発明の組成物及び方法は、サイトカインを分泌するためのそれらの活性化と同時に、マクロファージ及び樹状細胞といったＡＰに腫瘍関連抗原を送達するために使用することができる。
【０１１７】
当該ワクチン製剤を用いて癌及び腫瘍細胞の成長を阻害するための方法ならびに対象の体内で抗腫瘍免疫性を誘発するのに有効な量で本発明のワクチン組成物を対象に対し投与することにより、或る種の癌を発生するリスクのある個体を免疫化するための予防的方法も提供されている。一部の実施形態においては、対象には同様に、上述のような少なくとも１つの非核酸アジュバントも投与される。本書で用いられている細胞媒介型免疫性という語は、抗原特異的Ｔ細胞反応が関与する免疫応答を意味している。
【０１１８】
適応症、投与及び投薬量
本発明の組成物及び方法は、免疫系刺激の必要があるあらゆる患者又は生体において使用するように指示されている。かかる必要性には、腫瘍学、炎症、関節炎及びリウマチ、免疫不全障害などといった大半の医学的分野が包含されるが、これらに制限されるわけではない。当業者は、本書中の開示に基づいて効力をテストするための適切な適応症を選択することができる。好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法を使用して以下の例で記述する新生組織形成といったような新生組織形成（病的であるか病的となる可能性のあるあらゆる新生細胞成長）を治療するために使用される。
【０１１９】
対象に対する本発明の組成物の投与は、インビボ又はエクスビボ方法を含めたあらゆる方法によって行なうことができる。インビボ方法は、局所的、領域的又は全身的適用を含み得る。好ましい実施形態においては、組成物は、粒子が患者の体内のＢ細胞、マクロファージ又は脾細胞にアクセスできかつ／又は粒子がリンパ球増殖を刺激できその結果前記患者の体内のＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮｇ及び／又はＩｇＭの分泌をもたらすような形で静脈内投与される。
【０１２０】
本発明のワクチン組成物は、既知のあらゆる投与経路により投与され得る。１つの実施形態においては、本発明の組成物は、静脈内注射を介して投与される。もう１つの実施形態においては、筋内又は皮下注射が利用され、このようにして、より大きいサイズの（１５０〜３００ｎｍ）脂質粒子を使用することができる。その結果、費用のかかる押出し段階に対する必要性は削減されるか又は無くなり、粒子は循環する必要がないため脂質成分の選択をより費用の安い材料に有利な方向へと偏向させることができる。例えば、ＣｈｏＩの量を削減でき、ＤＳＰＣをより剛性の低いもの（例えばＰＯＰＣ又はＤＭＰＣ）と置換でき、又ＰＥＧ−脂質をより費用の安いＰＥＧ−アシル鎖と置換することができる。さらにもう１つの実施形態においては、本発明の組成物は、例えば気管内点滴注入法又は鼻腔内吸入法により気道を介して投与される。
【０１２１】
当業者であれば、例えば補体活性化、凝結腎臓毒性、肝臓酵素検定などといった、可能な製剤毒性の同定方法がわかるであろう。
【０１２２】
組成物の薬学的調製では通常、送達方法を改善又は補助するために付加的な担体が用いられる。標準的には、本発明の組成物は、標準的な薬学的実践方法に従って選択された生理食塩水又はリン酸緩衝液といったような生理学的に受容可能な担体の中に入って投与される。その他の適切な担体としては、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどといった、安定性増強のための糖タンパク質を含めた水、０．９％の食塩水、０．３％のグリシンなどが含まれる。
【０１２３】
脂質−核酸製剤の投薬量は、所望の脂質投薬量、所望の核酸投薬量及び組成物の薬物対脂質比によって左右される。当業者であれば、本書で提供された情報に基づいて適切な投薬量を選択することができる。
【０１２４】
初回免疫、追加免疫及び免疫性の維持のための免疫療法又はワクチン接種プロトコルは、当該技術分野において周知であり、以下でさらに記述されている。特に、当業者であれば、本書で記述されている投薬量に基づいて、対象に、特に哺乳動物そしてより特定的にはヒトのための投薬量を計算する方法を知っているはずである。１つの動物からもう１つの動物（例えばマウスからヒト）へと投薬量を換算するための特定的換算係数は周知であり、例えば、本書に参考として内含されている食品医薬品局ウェブサイトwww.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm（腫瘍学ツールセクション内）において充分に記述されている。遊離核酸を有する既知の免疫刺激性組成物に比べて、本発明の免疫刺激性組成物及び方法は、インビボでの増強された免疫応答を刺激するのに少ない量の核酸を利用することができる。
【０１２５】
本発明の製剤中の核酸の量は一般に約０．００１〜６０ｍｇ／ｋｇ（一用量あたりのマウスの体重１ｋｇについての核酸ｍｇ）の間で変動することになる。
静脈内（i.v.）投与のための好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法は、約１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約５〜２０ｍｇ／ｋｇを利用する。皮下（s.c.）投与のための好ましい実施形態においては、本発明の組成物及び方法は約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１〜５ｍｇ／ｋｇ、通常は約３〜５ｍｇ／ｋｇを利用する。本発明の脂質粒子と会合された抗原の量は、好ましくは約０．０４〜４０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０４〜４ｍｇ／ｋｇである。上述のように、当業者であれば、以上で識別されている周知の換算係数及びさらなる実験的試験に基づいて、本書に記述された投薬量をかんがみ、その他の哺乳動物のための適切な投薬量を容易に決定することができると思われる。
【０１２６】
本発明の製剤は、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、相溶性担体、アジュバントそして任意にはその他の治療用成分を日常的に含有しうる薬学的に受容可能な溶液の形で投与可能である。
【０１２７】
治療において使用するためには、有効量の本発明の癌ワクチンを、適切な標的細胞による摂取を可能にするあらゆる様式により対象に対し投与することができる。ワクチン組成物の「投与」は、当業者にとって既知のあらゆる手段によって達成可能である。好ましい投与経路には、非経口注射（皮下、皮内、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内など）ならびに粘膜、鼻腔内、気管内、吸入及び直腸内、腔内又は経口、経皮（例えばパッチを介して）が含まれるが、これらに制限されるわけではない。注入は、ボーラスの形又は連続的輸液の形であってよい。
【０１２８】
例えば、本発明の免疫刺激性組成物は、筋内又は皮内注入又はその他の非経口手段又は表皮に対するバイオリスティック「遺伝子銃」適用により投与可能である。本発明の免疫刺激性組成物は、同様に、例えば吸入、局所施用、静脈内、経口、移植、直腸又は腔経由で投与することもできる。適切な液体又は固体薬学調製物形態は、例えば注入又は吸入用の水溶液又は食塩水溶液であり、エンコキレート（encochleate）され、微視的金粒子上にコーティングされ、噴霧される。薬物送達のための当該方法の簡単な再考については、本書に参考として内含されているLanger, Science 249; 1527-1533, 1990を参照のこと。
【０１２９】
薬学組成物は好ましくは、用量単位で調製され投与される。液体用量単位は、注射又はその他の非経口投与のためにはバイアル又はアンプルである。固体用量単位は、錠剤、カプセル及び座薬である。患者の治療のためには、化合物の活性、投与方法、免疫化の目的（すなわち予防か又は治療か）、障害の性質及び重症度、患者の年令及び体重に応じて、異なる用量が必要であり得る。一定の与えられた用量の投与は、一日の投与で個々の用量単位の形か或いは又複数のより小さい用量単位の形の両方で行なうことができる。特定の週間隔又は月間隔をとった多数回の用量投与が、抗原特異応答を促進するために普通のことである。
【０１３０】
適切な緩衝剤には、酢酸及び塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸及び塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸及び塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；及びリン酸及び塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が含まれる。適切な防腐剤には、塩化ベンズアルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）及びチメローザル（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が含まれる。
【０１３１】
好ましい実施形態においては、本発明の免疫刺激性組成物は、薬学的に受容可能な担体の中に任意に内含されている抗原とアジュバントの組合せを有効量含有している。本書で使用する「薬学的に受容可能な担体」という語は、ヒト又はその他の哺乳動物に対する投与に適した単数又は複数の相溶性ある固体又は液体充てん剤、希釈剤又は封入用物質を意味する。本書で使用する「担体」という語は、適用を容易にするため有効成分と組合わされる有機又は無機成分を意味する。本発明の免疫刺激性組成物の成分は同様に、本発明の化合物と、及び互いに、所望の薬学的有効性を実質的に損うことになる相互反応が全く無いような形で、混合され得る。
【０１３２】
非経口投与に適した組成物は、適切なことにレシピエントの血液と等張でありうる無菌の水性調製物を含んでいる。受容可能なビヒクル及び溶剤の中には、水、リンゲル溶液、リン酸緩衝溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに、無菌の固定油が、溶剤又は懸濁媒質として、適切に利用される。この目的で、合成モノ−オルジグリセリドを含め、あらゆる無刺激性の無機又は有機油を利用することができる。さらに、オレイン酸といった脂肪酸も、注射物質の調製において使用可能である。皮下、筋内、腹腔内、静脈内などの投与にとって適切な担体製剤は、Remington’s Pharmacentical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Paの中に見い出すことができる。
【０１３３】
本発明において有用なアジュバント又は抗原は、２つ以上のアジュバント又は抗原の混合物の形で送達可能である。混合物は、本書で記述されているＬＮＡ製剤に加えて複数のアジュバントで構成されていてよい。
【０１３４】
多様な投与経路が利用可能である。当然のことながら、選択される特定の様式は、選択された特定のアジュバント又は抗原、対象の年令及び全身的健康状態、治療中の特定の身体条件及び治療的効能に必要とされる投薬量によって左右されることになる。本発明の方法は、一般的に言って、医学的に受容可能であるあらゆる投与用式、つまり臨床的に受容不可能な不利な効果をひき起こすことなく有効なレベルの免疫応答を生み出すあらゆる様式を用いて実践することができる。
【０１３５】
組成物は、適切には、単一投薬量形態の体裁をとってよく、調剤術において周知の方法のいずれかによって調製され得る。全ての方法は、単数又は複数の補足的な成分を構成する担体と化合物を会合させる段階を内含している。一般に、組成物は、化合物を液体担体、細かく分割された固体担体又はその両方と均質にかつ密に会合させ、次に必要とあらば製品を整形することによって調製される。
【０１３６】
その他の送達系としては、時間放出、遅延放出又は持続放出型送達系が含まれ得る。かかる系は、対象及び医師にとっての不便さを増す化合物の反復的投与を回避することができる。数多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者にとって既知である。これらには、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシブチル酸及びポリ無水物が含まれる。上述の薬物を含有する重合体のマイクロカプセルは、例えば米国特許第５，０７５，１０９号の中で記述されている。送達系には同様に、コレステロールといったステロールを含む脂質、コレステロールエステル及び脂肪酸又はモノ−ジ及びトリ−グリセリドといった中性脂肪；ハイドロゲル放出系；シラステック系；ペプチドベース系；ワックスコーティング；従来の結合剤及び賦形剤を用いる圧縮錠；部分的に融合されたインプラントなども含まれる。特定の例としては、（ａ）本発明の作用物質が米国特許第４，４５２，７７５号、４，６７５，１８９号及び５，７３６，１５２号に記述されているものといったようなマトリクス内の一形態の中に含有されている侵食系、及び（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号、５，１３３，９７４号及び５，４０７，６８６号に記述されているような重合体から制御された速度で活性成分が浸透している拡散系が含まれる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系も使用でき、そのうちのいくつかは移植のために適合されている。
【０１３７】
ここで本発明のいくつかの特定の態様を見てみると、１つの態様は、当該ＬＮＡ製剤が、自己抗原を含めたインビボの腫瘍関連抗原に対する強いＴＨ−１偏向免疫応答を誘発する能力をもつという認識から発生したものである。かくして、本書に記述されている癌ワクチンは、現在利用可能なものに比べ低い毒性で、免疫寛容性に対する免疫寛容性に打ち勝つ能力を有する。
【０１３８】
実験
実験の詳細
マウス。雌のＢａｌｂ／ｃ又はＣ５７／ＢＬ６（「Ｂ６」）マウス（生後６〜８週）を、Harlan-Spraque Dawley (Indianapolis, IN) から購入した。全ての動物を、使用前に一週間隔離した。全ての研究は、Canadian Council on Animal Care（ＣＣＡＣ）及びInstitutional Animal Care and User Committee（ＩＡＣＵＣ）により設定された指針に従って行なわれた。
【０１３９】
ペプチド。ペプチドをCommonwealth Biotechnologiesから得、これはＨＰＬＣによって決定される通り９５％を上回る純度を有していた。
【０１４０】
オリゴヌクレオチド製剤。オリゴヌクレオチドはAvecia又はProligo又はTrilinkから得た。全てのＯＤＮを、無菌水中で再水和させ、無菌ＤＰＢＳ、ｐＨ７．２の中で適切な濃度まで希釈させた。
【０１４１】
ＬＮＡ製剤。ＬＮＡ製剤は、以下の通りに調製した。初期ＯＤＮ：脂質比は、０．２５ｗ／ｗであった。ホスホジエステル製剤については、ＯＤＮを溶解するために３００ｍＭのクエン酸緩衝液の代わりに２０ｍＭのクエン酸緩衝液を使用した。これを行なわなかった場合、結果として、封入効率は著しく減少する（すなわち最終〜３％）。
【０１４２】
ワクチン接種。注射１回につき１００ｍｌのワクチンをＢ６マウスに皮下で接種した。薬剤投与計画はｑ７ｄ×２又はｑ４ｄ×４のいずれかであり、個々の図の凡例の中で指示されている。ＣＦＡ混合物は非常に粘性が高く、より大きいゲージの注射器で投与しなくてはならなかった。体液性研究のためには、初回免疫（０日目）と追加免疫（１４日目）の戦略を用い、テール・ニッキングによりさまざまな時点で血液標本を収集した。
【０１４３】
効力研究。研究全体を通して、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ又はＥＬ−４胸腺腫細胞系統を使用した。腫瘍研究のためには、１％のＦＣＳを含有するＰＢＳ５０ｍｌ中で２．５×１０６のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を皮下注射した。腫瘍の寸法を反復的に垂直測定し、以下の式を用いて、腫瘍測定を行なった：
体積（ｍｍ3）＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）ｐ／６
【０１４４】
Ｂ１６／ＢＬ６マウス黒色腫モデルを用いて、ＴＲＰ−２及びｇｐ１００研究を実施した。標準的には、２〜３回の注射のため毎週動物にワクチンを接種し、その後、最終ワクチン接種から１〜２日後にＢ１６細胞を投与した。Ｂ−１６の注射の後１４〜１８日目の間に動物を屠殺し、肺を取り出し、立体顕微鏡を用いて転移を計数した。
【０１４５】
フローサイトメトリ分析。ＭＨＣ四量体（Beckman Cotulter）又は二量体×試薬（Pharringen）のいずれかを用いてさまざまな時点で、ワクチン接種を受けたマウスの体内で抗原特異的Ｔ細胞を決定した。問題の細胞集団を同定し、望まれない集団を捨てるべく、ＣＤ８ａ、Ｂ２２０及びＣＤ４に対する抗原を用いた。脾臓及びリンパ節の単細胞懸濁液を、「免疫学における現行のプロトコル」の中で概略説明されたプロトコルに従って調製した。抗体染色を、４℃に保った９６ウェルの平板内で１×１０６の細胞について行なった。１×１０6細胞につき、一般に０．２ｍｇの各々の抗体を使用した。
【０１４６】
例１
遊離又は封入オリゴヌクレオチドに対する露呈による全血球内の白血球のインビトロ対インビボ活性化
インビボでの免疫刺激を予測するためのインビトロ検定の有効性を実証するために、図１及び２には、ＣＤ６９の発現の比較が示されている。ＣＤ６９は、ＮＫ細胞、Ｂ細胞及び単球の活性化を数量化する細胞活性化マーカーである。ＣＤ６９のＮＫ細胞上での発現は、Ｔｈ−１免疫応答を誘発する上で重要であるＩＦＮ−γの産生及び細胞活性化を表わしている。インビトロ及びインビボで遊離及び封入ＯＤＮ１及び２を、そのＣＤ６９発現能力についてテストした。インビトロで０．１ｍｇ／ｍｌのＯＤＮ２及び１０ｍｇ／ｍｌのＯＤＮ１という用量を用い、インビボで１０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ２及び２０ｍｇ／ｋｇのＯＤＮ１を用いた。各オリゴヌクレオチドを２０：４５：２５：１０の比でＰＯＰＣ：ＣＨＯＬ；ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ  ＤＭＧから成る脂質粒子内に封入した。
【０１４７】
図１は、遊離オリゴヌクレオチド及び封入オリゴヌクレオチド、特定的にはＯＤＮ１及び２でマウス全血を処理することからの、活性化マーカーＣＤ６９を担持する白血球のインビトロ刺激を例示している。マウス全血を遊離オリゴヌクレオチドでインビトロで処理した場合、処理から１５時間後に使用された遊離オリゴヌクレオチドの量に従ってＣＤ６９陽性Ｂ細胞、単球そして或る程度まではＮＫ細胞の量の用量応答性の増加が存在した。このインビトロ検定においては、遊離ＯＤＮ２は遊離ＯＤＮ１に比べてはるかに大きいＣＤ６９の刺激をひき起こした。しかしながら、これらの同じオリゴヌクレオチドを脂質小胞内に封入した場合、これらの同じ細胞型上でのＣＤ６９産生のインビトロ刺激は、削減されるか又は完全に根絶された。
【０１４８】
しかしながら同じオリゴヌクレオチドをインビボでテストした場合、驚くべき結果が得られた。図２は、封入又は遊離オリゴヌクレオチドの注入によるＩＣＲマウスのインビボ治療がインビトロで得られたものと反対の結果を生成する、ということを例示している。この図は明らかに、インビボにおいて脂質封入されたオリゴヌクレオチドが、注射から１６及び２４時間後に同じ細胞系統上でＣＤ６９マーカーを刺激する上で遊離オリゴヌクレオチドよりもさらに有効であったということを実証している。これらの結果は、オリゴヌクレオチドがインビボで免疫刺激性となるか否かを決定するのにインビトロデータでは充分でないことを示している。その上。図１及び２は、オリゴヌクレオチドがインビボで有効であるか否かを決定する上で、脂質封入が重要な因子であるということを示唆している。インビボ結果は、封入されたＯＤＮ１及びＯＤＮ２が両方共、ＮＫ細胞上でＣＤ６９の産生を刺激することができたということを示しており、一方、インビトロ結果は、ＯＤＮ１及び２の脂質封入が、実際、ＮＫ細胞上のＣＤ６９の刺激を対照レベル以下に低減させたということを示していた。
【０１４９】
以上のインビボ結果は、インビボでＣＤ６９担持細胞を刺激することによって測定されるように脂質小胞内に封入されているのでないかぎり、遊離オリゴヌクレオチドが必ずしも免疫刺激性をもたないということを示している。これは、遊離ＯＤＮによってインビトロでＣＤ６９の刺激が観察された場合でも言えることである。さらに、これらの結果は、封入オリゴヌクレオチドが、インビトロで有効であることが示されていない場合でも、インビボで有効でありうるということを表わしている。
【０１５０】
例２
メチル化オリゴヌクレオチドでのインビボ樹状細胞活性化
以上の背景の節で論述した通り、先行技術は、メチル化されたＣｐＧオリゴヌクレオチドが、インビトロ又はインビボのいずれで測定されたにせよ、免疫応答を刺激する上で有効でないか又は非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドに比べて有効性が低い、ということを教示している。米国特許第６，４２９，１９９号は、メチル化オリゴヌクレオチドが、ＮＫ細胞又はヒトＢ細胞上のＣＤ４０の発現を増強させず、又、Ｔｈ−１応答における体液性及び細胞性免疫性に関与する主要な抗原提示細胞である樹状細胞の存続の改善を全く示さなかったということを開示している。さらに、開示されたメチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、インビトロでの樹状細胞の存続、分化、活性化又は成熟を改善させる上で不活性であった。同様にして、ＷＯ０２／０６９３６９で開示されたインビトロＰＢＭＣの結果は、樹状細胞上でのメチル化オリゴヌクレオチドのいかなる活性も実証しなかった。
【０１５１】
これとは対照的に、本発明は、メチル化オリゴヌクレオチドが非メチル化オリゴヌクレオチドに比べて樹状細胞の増殖を誘発する上で少なくとも同じ位有効であり標準的にはより有効である、ということを示している。非メチル化ＯＤＮ１の対応物は、単一ＣｐＧジヌクレオチド配列のシトシン残基がメチル化された場合に作られたものであり、ＯＤＮ１ｍと呼ばれる。
【０１５２】
メチル化オリゴヌクレオチドが樹状細胞を刺激する能力をもつことを実証するために、ＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍの各々を、２０：４５：２５：１０の比でＰＯＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧＤＭＧを含む脂質小胞内に封入させた。この実験の結果は図３に示されている。
【０１５３】
図３は、樹状細胞を活性化する封入されたＯＤＮ１ｍの能力を明確に示している。さらに、脂質小胞内に封入された時点で、メチル化ＯＤＮ１ｍは、インビボで樹状細胞の活性化を刺激する上でその非メチル化対応物ＯＤＮ１よりもさらに活性であった。樹状細胞の活性化は、ＩＦＮ−γ分泌細胞の百分率によって測定された。これらの細胞は、細胞型を表示するために抗体で標識づけされ、樹状細胞マーカーを有するものだけがこの測定に含み入れられた。
【０１５４】
脂質封入された非メチル化及びメチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドの投与の結果としての樹状細胞の膨張を実証する目的で、樹状細胞集団の活性化及び膨張について、血液、脾臓及びリンパ節からの細胞を分析した。ＩＣＲマウスを２０ｍｇ／ｋｇの用量で、封入オリゴヌクレオチドの一回の静脈内注射で免疫化させ、対照ＩＣＲマウスにＰＢＳを注射した。脾臓、血液及びリンパ節の各々についての細胞を、図４及び５に示されているようにさまざまな時点で単離させ、樹状細胞の膨張及び活性化の量を、樹状細胞マーカーＣＤ１１Ｃ及びＤＥＣ２０５の使用を通して測定した。これらのマーカーの各々は、樹状細胞に特異的であるが、これらは異なる細胞亜集団を表わし得る。図４及び５の各々において、対照は１００％に等しいものとしてプロットされ、各々のバックボーン立体配置についてのＯＤＮ１ｍの効果はその対照の百分率としてプロットされた。図４Ａは、図版の各々の中で、対照に対して測定した場合に、メチル化ＯＤＮ１ｍが脾細胞及び全血細胞内でＣＤ１１Ｃ陽性樹状細胞の膨張を刺激したものの、リンパ系組織内では刺激しなかったということを例示している。ＯＤＮ１ｍについてのＰＯ及びＰＳバックボーンは両方共、樹状細胞の膨張を示した。図４Ｂは、各図版内で、対照に対して測定した場合に、メチル化ＯＤＮ１ｍが同様に脾臓細胞及びリンパ系組織内でＤＥＣ２０５陽性樹状細胞の膨張を刺激したものの、全血細胞内では刺激しなかったということを示している。
【０１５５】
図５は同様に、樹状細胞の活性化を実証している。標本を収集した時点で、細胞はまず第１に、細胞活性化を表示するＣＤ８６及び樹状細胞マーカーＣＤ１１Ｃ及びＤＥＣ２０５の同時発現についてフローサイトメトリにより分析された。活性化された樹状細胞の百分率を１００％に等しいＰＢＳ対照に対しプロットした。図５では、各図版は、メチル化ＯＤＮ１ｍが、オリゴヌクレオチドが脂質封入された時点でＣＤ１１Ｃ陽性樹状細胞上でのＣＤ８６の発現を誘発したということを示している。図５の図版ではＤＥＣ２０５陽性樹状細胞を測定した場合の類似の結果が示されている。
【０１５６】
従って図４及び図５内のデータは、メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドが樹状細胞の存続、分化、活性化又は成熟を改善する上で不活性であることを教示する米国特許第６，４２９，１９９号内の記述に異議を唱えるものである。
【０１５７】
例３
血漿サイトカインレベルに対するＰＳ及びＰＯバックボーン立体配置の効果
上述のように、非脂質封入オリゴヌクレオチドでは、バックボーンは従来、ヌクレアーゼによる分子の分解を低減させるべく修飾されている。ただし、封入時点で、かかる修飾は分解を防ぐためにもはや必要とされない。脂質封入により誘発されるサイトカイン刺激に対する異なるリン酸バックボーンの効果を立証するため、ＰＯ及びＰＳの両方のバックボーンを有するオリゴヌクレオチドをマウスに注射し、一連の時点（図６及び７Ｂに示されているような）及び図７Ａに示されているようなスライド式投薬量スケール全体にわたって、サイトカイン刺激を測定した。この実験においては、ＩＣＲマウスに静脈内で２０ｍｇＯＤＮ／ｋｇ用量の遊離ＰＯ  ＯＤＮ１、封入ＰＯ−ＯＤＮ１及び封入ＰＳ−ＯＤＮ１を注射した。Ｔｈ−１及びＴｈ−２の両方に共通のサイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γ）及びＭＣＰ−１（マクロファージケモカイン）を投与後２４時間にわたって測定した。サイトカイン刺激は一般に、ＭＣＰ−１内のケモカイン応答と同様に、細胞免疫応答を表わしている。オリゴヌクレオチドは、２０：４５：２５：１０の比でＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧ−ＣＥＲ１４から成る脂質粒子内に封入された。
【０１５８】
図６は、遊離ＰＯ−ＯＤＮ１のインビボ投与がＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ又はＭＣＰ−１の刺激に対しいかなる効果ももたず、これはオリゴヌクレオチドがおそらくヌクレアーゼにより分解されたということを表わしている、ということを示している。当該技術分野においては、ヌクレアーゼ分解を回避するために遊離オリゴヌクレオチドを投与した時点でＰＳバックボーンが必要とされるということは周知である。これとは対照的に、脂質封入ＰＯ及びＰＳ  ＯＤＮ１のインビボ投与は、これらのサイトカイン及びケモカインの各々の産生を刺激した。しかしながら、図６は、ＰＯ−ＯＤＮが、サイトカイン及びケモカイン産生を誘発する上でより有効であることを表わしている。
【０１５９】
図７Ａは、スライド式投薬量スケール上で測定された場合に、遊離ＯＤＮ１４に比較して封入ＰＯ又はＰＳ  ＯＤＮ１４のいずれかでのＩＣＲマウスの治療によってＩＬ−１２の誘発が増大したことを例示している。この図は、ＩＬ−１２の誘発の増加によって証明されるように脂質封入がサイトカイン刺激の有効性を増大させること及びＰＯ−ＯＤＮがＰＳ−ＯＤＮよりもサイトカイン応答を誘発する上でより有効であることを表わす図６から引き出された結論を裏づけている。実際、同じ用量で、ただし封入された形で投与した場合、２．５倍のピーク血漿ＩＬ−１２増加が、ＩＬ−６（１０００倍）及びＩＦＮ−γ（２０倍）といったその他のサイトカインにおけるさらに一層劇的な増大と合わせて観察されている。図７Ａは同様に、脂質粒子が無い状態で投与された遊離オリゴヌクレオチドと比べて封入された場合にサイトカイン応答を容易にするのに必要とされるオリゴヌクレオチドの用量が少ないということをも実証している。
【０１６０】
ＰＯ−ＯＤＮ及びＰＳ−ＯＤＮ内の差を解明するために、図７Ｂは、ＰＳ及びＰＯ  バックボーン立体配置に特異的な、経時的なＩＦＮ−γ−サイトカイン刺激の差異を例示している。封入ＰＯ  ＯＤＮ１４での治療は、ＩＦＮ−ガンマの強い早期誘発を刺激し、一方封入ＰＳ  ＯＤＮ１４での治療はＩＦＮ−ガンマのさらに小さいもののなおも有効な誘発を刺激する。その上、図７Ｂは、何日間かの期間にわたり、ＰＳ−ＯＤＮでの刺激時点で第２の大きなＩＦＮ−γピークが起こり、これは、免疫系が封入ＰＳ−ＯＤＮでの治療によって初回免疫を受けて、場合によっては治療の後のＮＫ細胞の膨張を通してＩＬ−１２産生に対しより有効な形で応答した、ということを表わしている可能性がある、ということを示している。
【０１６１】
図２２は同様に、さらに例４で論述するように、同じオリゴヌクレオチドのＰＯバージョンと比べて、ＰＳ−ＯＤＮについて図７Ｂで見られた晩期ＩＦＮ−γピークを実証している。
【０１６２】
本発明に従った脂質封入の１つの重要な特長は、先行技術では有効なインビボ活性のためにＰＳバックボーンが必要とされているのに対して、免疫応答を刺激するために天然のＰＯバックボーンをもつオリゴヌクレオチドを使用することができるという発見事実にある。有効なインビボ活性のためにはＰＳバックボーンが必要とされる。以下の例７に示されているように、封入ＰＯオリゴヌクレオチドは、特にオリゴヌクレオチドがメチル化されている場合に、抗腫瘍効力を評価した時、ＰＳオリゴヌクレオチドよりもさらに有効であり得る。
【０１６３】
例４
ＰＳ及びＰＯバックボーンを有するＣｐＧ  ＯＤＮの免疫刺激特性の評価
特にＰＯ及びＰＳバックボーンを有するＯＤＮと結びつけられた応答のレベルを区別するとき、さらなる態様は、評価対象の応答のタイプの分析、より特定的に言うとその応答が体液性応答が細胞性応答かということにある。バックボーンの効果を査定するために、体液性免疫応答の成熟を開始させ誘発する（すなわちイソ型スイッチングを容易にする）ＰＳ−ＯＤＮ及びＰＯ−ＯＤＮの能力を見るべく１つの実験を行なった。封入ＰＯ−ＯＤＮ及びＰＳ−ＯＤＮの投与によって惹起された体液性免疫応答の規模及び動態を比較した。ＰＯ−ＯＤＮ及びＰＳ−ＯＤＮの各々を、０日目と１４日目にｑ１４×２の初回免疫−追加免疫設定で一回１００μｇの用量にて皮下投与し、３５日目に６週で査定した。対象マウスは、ＯＶＡ−ＰＢＳ及びＯＶＡ−ミョウバンを用いて同じ用量で免疫化した。２０：４５：２５：１０の比のＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ−ＤＭＧから成る脂質粒子内にオリゴヌクレオチドを封入した。
【０１６４】
ＰＯ及びＰＳ  ＯＤＮの両方が体液性免疫応答を誘発できるものの、その応答の性質は異なるという結論を下すことができる。図８及び図９は、吸光度に関するさまざまなオリゴヌクレオチド及び対照についての６週間後のＩｇＭ及びＩｇＧ応答の規模を例示している。図に明確に実証されているように、ＰＳ−ＯＤＮ１及びＰＳ−ＯＤＮ２の各々が弱いＩｇＭ応答を生成したのに対し、ＰＯ−ＯＤＮ２は強いＩｇＭ応答を生成した。換言すると、生成されたＩｇＧ応答はＰＯバックボーンを有する同じオリゴヌクレオチドに比べてテストされたＰＳ−ＯＤＮの各々について一貫してより優れたものであった。このことは、ＰＳ−ＯＤＮがより優れたＩｇＧ応答を生成するということを示唆している。これらのデータは、ＰＯ及びＰＳ  ＯＤＮの両方が体液性免疫応答を開始することができるものの、ＰＯ応答は、イソ型スイッチングの欠如及びＩｇＭイソ型の優勢によって表わされているように成熟していない、ということを示す。一方、ＰＳ−ＯＤＮは、体液性免疫応答を開始しかつＩｇＧイソ型抗体の優勢性へのイソ型スイッチングによって表わされるような応答の成熟を誘発することができる。
【０１６５】
この現象は、ＰＯ  ＯＤＮ対ＰＳ  ＯＤＮにより誘発されたサイトカインプロフィールに関連づけすることができる。図７Ｂ及び２２は、封入ＰＯオリゴヌクレオチドによっては生成されない強いＩＦＮ−γピークを治療から６日後に生成したということを例示している。ＩＦＮ−γといったサイトカインが、さまざまなＩｇＧイソ型に対する優先的なイソ型スイッチングを結果としてもたらすことが報告されてきた。従って、大きいＰＳ−ＯＤＮ−誘発型晩期ＩＦＮ−γピークは、ＩｇＭからＩｇＧイソ型へのイソ型スイッチングを誘発することができ、一方ＰＯ−ＯＤＮ治療されたマウスにおけるかかるピークの欠如の結果として、イソ型スイッチングは全く無くなる可能性がある。ＰＯ−ＯＤＮでのこの晩期ＩＦＮ−γピークの低下の根拠は明らかでないが、結果は、封入されたＰＯオリゴヌクレオチドが、ＮＫ又はＴ細胞内でのＩＦＮ−γ発現を促進するのに必要とされるＩＬ−１２の発現を阻害するＩ型インターフェロンの先行誘発をひき起こすものの、ＰＳオリゴヌクレオチドはこれをひき起こさない、ということを示唆している可能性がある。
【０１６６】
同様にして、図６は、以前に論述したようなＴｈ−１応答を導くサイトカインの産生を刺激するためにオリゴヌクレオチドの封入が重要であることだけでなく、ＰＳオリゴヌクレオチドよりも封入オリゴヌクレオチドを用いた場合にさらに多くのサイトカインが産生されることをも示している。このことは、インビボでのオリゴヌクレオチドの分解を防止するためにはＰＯオリゴヌクレオチドよりもＰＳバックボーンが好まれるということを一般に示す先行技術で教示されている通りの遊離オリゴヌクレオチドの投与と好対照を成す。
【０１６７】
例５
サイトカイン誘発、四量体分析及び細胞毒性検定（ＣＴＬ）によって測定される、オリゴヌクレオチドでの治療に対するインビボ 免疫応答
皮下免疫化に対する免疫応答を監視するため、抗原特異細胞免疫応答をＭＨＣクラスＩ−四量体分析、細胞毒性検定及びサイトカイン放出検定を用いて監視し、一方、血漿抗体レベルを測定することによって体液性免疫応答を監視した。それぞれＣ５７Ｂ１／６及びＢａｌｂ／Ｃマウスにおいて、細胞性及び体液性応答を査定した（１グループにつき動物５匹）。細胞応答の分析のため、２０μｇの抗原と組合わせた１００μｇのオリゴヌクレオチドという用量で０日目、７日目及び１４日目にｑ７ｄ×３の投与計画にて３回の注射によりマウスを皮下免疫化した。２１日目に、脾臓、肝臓、リンパ節及び血液組織を収集した。固体組織を機械的に解離させ、単核細胞を収集するために細胞を処理した。体液性応答の分析のため、０日目及び１４日目にｑ１４ｄ×２で２回動物を免疫化し、免疫グロブリンレベルについての血漿分析のため３５日目に血液を収集した。この一連の実験において、２０：４５：２５：１０の比のＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ−ＤＭＧ又はＰＯＰＣ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ−ＤＭＧのいずれかから成る脂質粒子の中にオリゴヌクレオチドを封入した。全ての比較は、同じ脂質粒子で行なった。
【０１６８】
ＭＨＣクラスＩ錯体という状況下で標的抗原を担持する標的細胞の認識及び溶解を可能にするため、適切なＴ細胞レセプタを有するＣＤ８ｔｖｅ、細胞毒性Ｔリンパ球を検出するように、ＭＨＣ−四量体分析を設計する。免疫化された動物からの単離した脾細胞を、免疫優性ＯＶＡＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと錯化されたＰＥ−標識付け済みＭＨＣクラス１四量体（Ｈ2Ｋｂ）ならびにＦＩＴＣ標識付け済み抗ＣＤ８及びＣｙ−クロム標識付け済み抗ＴＣＲ抗体で染色し、フローサイトメトリ分析に付した。ＭＨＣクラスＩ分子という状況下でＯＶＡを特異的に認識しそれに結合する能力をもつ細胞の数について、ＣＤ８ｔｖ、ＴＣＲｔｖｅＴリンパ球を査定した。
【０１６９】
細胞毒性検定のために、４時間の51クロム放出検定を用いて、免疫化された動物由来の脾細胞の標的細胞を抗原特異的に認識し溶解させる能力を査定した。標的細胞を、51クロムで標識づけし、免疫エフェクタ細胞によって溶解された標的から上清中に放出された放射性核種の量によって、細胞毒性の量を決定した。免疫化された動物由来の単離された脾細胞を、ＯＶＡでパルス処理した同系抗原提示細胞でのインビトロ再刺激の直後又はそれから５日後に、ＥＬ４非ＯＶＡ発現細胞に比べてＥＧ．７、ＯＶＡ発現標的細胞を特異的に溶解するそれらの能力についてテストした。
【０１７０】
サイトカイン放出検定の目的は、特異的抗原での刺激に応答してサイトカイン、特定的にはＩＦＮ−γを産生し分泌するように活性化されている抗原特異的免疫エフェクタ細胞を検出することにある。細胞を、免疫化された動物の脾臓、肝臓、血液及びリンパ節から単離し、サイトカイン分泌検定（Miltenyl Biotec）を用いて分析した。細胞を一晩、ＯＶＡパルス処理された自系抗原提示細胞で刺激し、キャッチ剤（免疫細胞及びＩＦＮ−γの表面上のＣＤ４５エピトープを認識する２重特異性抗体）で標識付けした。抗原刺激を認識しそれに応答する能力をもつあらゆる細胞がサイトカインを合成し分泌し、このサイトカインは次に細胞に結合したキャッチ試薬によって捕捉され、結果としてその表面上にＩＦＮ−γ結合されたマーカーをもたらした。その後、細胞を、ＩＦＮ−γに対する蛍光標識づけされた抗体及びさまざまな表現型マーカーで標識づけし、フローサイトメトリで分析して、ＩＦＮ−γを分泌するように活性化された特異的細胞型の検出を可能にした。
【０１７１】
体液性応答の分析は、免疫化されたマウスの血漿中の抗原特異的ＩｇＧレベルを決定するように設計された。心臓穿刺により血液を収集し、血漿を収集するために遠心分離した。合計ＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａサブクラスの力価を測定するため、終点希釈ＥＬＩ自己抗原方法を用いて抗原特異的免疫グロブリン産生を測定した。プールされた血漿の標本を連続希釈し、ＯＶＡコーティングした平板内に固定して、希釈した標本中でＯＶＡ特異的抗体を捕捉した。その後、ＯＶＡ特異的抗体をホースラディッシュペルオキシダーゼ接合ウサギ抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ａ抗体及びＴＭＢ基質で検出した。ＥＬＩ自己抗原平板読取り装置上で４５０ｎｍで比色反応の吸光度を測定し、０．０５というカットオフ値で、実験未使用の動物のものよりも２倍大きい吸光度値を結果としてもたらした血漿の最高希釈度として終点希釈力価を定義づけした。これを用いて、セロコンバーション及び応答の規模を評価すると共に、Ｔｈ応答型を評価した。
【０１７２】
図１０及び１１の各々は、その非メチル化対応物ＯＤＮ１のものに対するＯＤＮ１ｍの正規化を例示している。これらの図中の棒は各々、メチル化されたＯＤＮでの治療を受けた１つの動物グループ（１グループにつき５匹の動物）及び各々のオリゴヌクレオチドが同一の脂質粒子内に封入された脂質である非メチル化対応物で治療された第２のグループ。直接的比較を表わしている。非メチル化集団についての結果は、各グループについて１００％と等価にセットされ、この１００％の標準に対してメチル化されたグループを測定した。２００％に対する等価性を示す棒上で、これはカットオフ値であり、実際には２００％のラインは２００％以上の値を表わしている。
【０１７３】
図１０は、以上で記述されたサイトカイン放出検定の結果を示している。この図は、一連のスクリーニング全体にわたり、メチル化及び非メチル化の両方の脂質封入オリゴヌクレオチドの各々が免疫応答を示したものの、メチル化ＯＤＮを非メチル化ＯＤＮに比べた時点で、それぞれ図１０Ａ、Ｂ及びＣ内のサイトカイン分泌により示されているように、メチル化オリゴヌクレオチドが樹状細胞、ＮＫ細胞及びＣＤ+Ｔ細胞の増殖を刺激する上で非メチル化ＯＤＮと同じ位又は往々にしてそれ以上に優れていた、ということを例示している。
【０１７４】
四量体及びＣＴＬ分析の結果は、図１１Ａ〜Ｃに示されている。これらの図は再び、免疫応答を刺激するメチル化及び非メチル化の両方のＯＤＮの能力を例示している。しかしながら、図１１Ａ及びＢはさらに、それぞれ四量体及びＣＴＬ分析の各々において、メチル化又は非メチル化封入ＯＤＮで治療された動物の一連のスクリーニング全体にわたり、メチル化オリゴヌクレオチドが非メチル化ＯＤＮに比べ細胞毒性Ｔリンパ球及び四量体リンパ球細胞の増殖を刺激する上で一貫してより優れていたということを実証している。さらに、図１１Ｃは全体的平均が図１１Ｂに示されている、代表的な四量体研究からのデータを例示している。ＯＤＮ５、ＯＤＮ５ｍ、ＯＤＮ７及びＯＤＮ７ｍの各々が、上述のプロトコルに従ってテストされた。図１１Ｃでは、脂質封入されたＯＤＮ５ｍ及びＯＤＮ７ｍがその脂質封入された非メチル化対応物と比べてより多くの抗原特異的ＣＤ８Ｔ−細胞を誘発するということが、明確に示されている。
【０１７５】
図１０及び１１の各々から、メチル化−ＯＤＮ１ｍでの免疫化の結果もたらされた免疫刺激が、その非メチル化オリゴヌクレオチド対応物での同じ治療と一貫して少なくとも等価であり往々にしてそれ以上である、ということが示されている。このことは次の例においてさらに実証されている。
【０１７６】
例６
ＥＧ７−ＯＶＡ腫瘍モデルにおけるメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの予防的抗腫瘍効力の比較
本書で提供されている癌ワクチンは、インビボで抗原及び腫瘍に対する免疫応答を刺激するべく腫瘍関連抗原と併せて脂質−核酸製剤を内含している。鶏卵アルブミン（オボアルブミン：ＯＶＡ）が、広く研究されているモデル抗原系である。抗原決定基がマッピングされてきており、体液性及び細胞媒介型免疫応答の両方を監視するための試薬及びモデルが存在する。さらに、ＯＶＡ遺伝子を含有する細胞系統が確立され特徴づけされており、又、ワクチン接種後に抗腫瘍免疫応答を評価するために日常的に使用されてきた。特定的に言うと、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡは、異種腫瘍関連抗原としてＯＶＡたんぱく質を発現するように工学処理されたマウス胸腺腫細胞系統であり、インビボで悪性細胞を特異的に攻撃するべく宿主の免疫系を誘発するのに必要とされる因子を調査するための受容されたモデルである。有効な抗腫瘍免疫反応を増加させるためには、活気あるＴｈ１サイトカイン応答及び抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の誘発が不可欠であると考えられている。
【０１７７】
皮下免疫化によって誘発される抗腫瘍効力を、予防的免疫化モデルにおいてＣ５７ＢＩ／６（１グループにつき動物５匹）の体内で査定した。１００μｇのオリゴヌクレオチド及び２０μｇのＯＶＡ抗原用量で０．７及び１４日目にｑ７ｄ×３の投与計画にて３回の注射によりマウスを皮下免疫化した。その後、２１日目に２．５×１０6のＥＧ．７Ｏｖａ発現腫瘍細胞を皮下注射することによって動物を攻撃誘発した。腫瘍の成長及び体重の増加を監視するべく、週３回マウスを監視した。対照マウスには、上述のものと同じ計画に基づきＰＢＳ又はＨＢＳのうちの１つと２０μｇのＯＶＡ抗原を注射した。各々２５：４５：２０：１０の比のＰＯＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４又はＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４の脂質組成を有する脂質粒子内にオリゴヌクレオチドを封入した。メチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの全ての比較は、同じ脂質粒子を用いて行なわれた。これらの効力実験からの結果が、図１２〜１５、１８〜２１及び２５〜２８内で詳述されている。各々の図の０日目は、各動物が腫瘍で攻撃誘発された日である。
【０１７８】
図１２は、動物が遊離ＯＤＮで免疫化された時点での効力の傾向を例示している。示された結果は、先行技術と一貫している、すなわち、動物に遊離オリゴヌクレオチドが投与された場合、メチル化オリゴヌクレオチドは腫瘍の成長を低減させる上で非メチル化オリゴヌクレオチドよりも低い治療的効力を有している。特定的に言うと、ヌクレアーゼ分解を回避するべくＰＳバックボーンを有する遊離メチル化ＯＤＮ１及びＯＤＮ２は、そのメチル化対応物ＯＤＮ１ｍ及びＯＤＮ２ｍに比べ腫瘍の成長のさらに大幅な減少を示した。これは、特にメチル化オリゴヌクレオチドの腫瘍成長速度がＰＢＳ緩衝液のみで治療された対照動物の速度に近づいた、腫瘍の接種から約２５日後に最も当てはまることであった。
【０１７９】
図１３〜１５は、オリゴヌクレオチドの封入が、特にオリゴヌクレオチドが天然のホスホジエステル（ＰＯ）バックボーンを含有する場合に非メチル化オリゴヌクレオチドに比べメチル化されたオリゴヌクレオチドの同等の又はそれ以上の治療的効力を提供するということを例示している。図１３は、腫瘍の移植後、ＰＳバックボーンを有するメチル化封入ＯＤＮ１ｍでの治療が非メチル化ＯＤＮ１と比べて治療的効力が等しいものであったということを示している。これとは対照的に、図１４は、移植から３２日後に非メチル化バージョンがその効力を失なったのに対してメチル化バージョンで治療的効力が最大であった、ＰＯバックボーンを有する対応する封入メチル化ＯＤＮ１ｍ及び未メルチ化ＯＤＮ１オリゴヌクレオチドでの効力を示している。図１５は、非メチル化ＯＤＮ２及びそのメチル化対応物ＯＤＮ２ｍが、事実上腫瘍の成長を低減させる上で同一の効力を有していたことを示している。従って、或る種の実施形態においては、メチル化オリゴヌクレオチドは、ＰＳバックボーンと共に立体配置された場合に、非メチル化対応物と少なくとも同じ位効力がある。
【０１８０】
図１８、１９、２０、及び２１の各々は、さらに、上述の効力データについて、推敲している。図１８は、メチル化ＰＳ−ＯＤＮ１ｍの脂質封入が、長時間にわたり腫瘍の成長を低減させる上でＰＳ−ＯＤＮ１の封入よりもさらに有効であった治療上の利点を提供した、ということを示している。この有効性は、図１９に描かれた２つの異なる研究におけるＰＳ−ＯＤＮ１での治療に比べた、封入ＰＳ−ＯＤＮ１ｍで治療されたマウスのより優れた生存率によって、さらに裏づけされた。図１９Ａは、一連の時点において腫瘍が存在しない動物の百分率を例示し、１９Ｂは、これらの同じ時点における研究内に残っている動物の数を例示している。図１９Ｂに明確に示されているように、ＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍで治療された研究内に残っている動物の数は、基本的に研究全体を通して同一であった。しかしながら図１９Ａは、非メチル化ＯＤＮ１で治療されたものに比べた、メチル化ＯＤＮ１ｍで治療された場合の腫瘍を含まない動物のより大きい百分率を明確に例示している。
【０１８１】
同様にして、図２０は、経時的な２つのオリゴヌクレオチドで治療されたマウス体内の腫瘍の体積を例示し、図２１は、経時的に存続している動物の百分率を例示している。図２０は、封入された非メチル化対応物ＯＤＮ１に比べた、封入メチル化ＯＤＮ１ｍで動物を治療した場合の効力の改善を示している。これに対応して、図２１は、非メチル化ＯＤＮ１での治療との関係におけるメチル化ＯＤＮ１ｍで治療したマウスの生存率の増大を示している。
【０１８２】
異なる免疫化プロトコルを用いて、同じ腫瘍モデルについてさらなる効力研究を行なった。この研究においては、皮下免疫化によって誘発された抗腫瘍効力が、予防的免疫化モデル内でＣ５７ＢＩ／６（１グループにつき動物５匹）において査定された。１００μｇのオリゴヌクレオチド及び２０μｇのＯＶＡ抗原という用量で０及び７日目にｑ７ｄ×２の投与計画にて２回の注射によりマウスを皮下免疫化した。その後、２１日目に５×１０5のＥＧ．７Ｏｖａ発現腫瘍細胞を皮下注射することによって動物を攻撃誘発した。腫瘍の成長及び体重の増加を監視するべく、週３回マウスを監視した。対照マウスには、上述のものと同じ計画に基づきＰＢＳを注射した。各々２５：４５：２０：１０の比のＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４の脂質組成を有する脂質粒子内に図２４（ｂ）内のオリゴヌクレオチドを封入した。メチル化及び非メチル化オリゴの全ての比較は、同じ脂質粒子を用いて行なわれた。これらの効力実験からの結果が、図２４内で詳述されている。図の０日目は、各動物が腫瘍で攻撃誘発された日である。
【０１８３】
図２４は、このケースではその表面に付着されることにより脂質粒子と会合させられていたＥ−Ｇ７ＯＶＡ腫瘍抗原と併せた、メチル化されたＰＳ−ＯＤＮ１ｍ、各々メチル化されていない脂質封入型ＰＳ−ＯＤＮ１、ＰＳ−ＯＤＮ２を用いた実験的腫瘍Ｅ−Ｇ７の治療の一例を示している。図２４Ａは、オリゴヌクレオチドが免疫刺激性脂質粒子の不在下で投与された場合に、メチル化ＰＳ−ＯＤＮ１ｍは腫瘍成長に対しほとんど効果を及ぼさなかったということを示している。対応する非メチル化オリゴヌクレオチドＰＳ−ＯＤＮ１は、腫瘍体積を低減させる上で有効であったが、一方非メチル化オリゴヌクレオチドＰＳ−ＯＤＮ２は部分的に有効であった。図２４Ｂは、脂質粒子内のオリゴヌクレオチドの封入が非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ２の有効性をＯＤＮ１に類似するレベルまで増大させたことだけでなく、封入されたメチル化オリゴヌクレオチドＰＳ−ＯＤＮ１ｍが、封入非メチル化オリゴヌクレオチドのいずれか以上に有効であったということをも示している。
【０１８４】
図２５〜２８はさらに、オリゴヌクレオチドの封入が非メチル化オリゴヌクレオチドに比べ封入メチル化オリゴヌクレオチドについて同等か又はそれ以上の治療的効力を提供するということを例示している。図２５は、メチル化ＰＳ−ＯＤＮ５ｍの脂質封入が、経時的に腫瘍の成長を低減させる上で等価の非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ５の封入よりもさらに有効な治療上の利点を提供した、ということを例示している。該有効性は、図２６に示されているような、非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ５での治療と比べた封入メチル化ＰＳ−ＯＤＮ５ｍで治療されたマウスのより優れた生存率によって裏づけされた。図２７は、遊離非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ７がいくつかの抗腫瘍利点を提供するのに対して、非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ７及びＰＯ−ＯＤＮ７ならびに遊離メチル化ＰＳ−ＯＤＮ７及びＰＯ−ＯＤＮ７が腫瘍の成長を低減させる上で比較的無効であったということを例示している。しかしながら、メチル化ＰＯ−ＯＤＮ７ｍの脂質封入は、腫瘍の成長を誘発する上で有効な治療上の利点を提供した。同様にして、これらの傾向は、これらの同じＯＤＮでの治療を受けたマウスの生存率に関して、図２８の中でも例示されている。
【０１８５】
例７
Ｂ−１６メラノーマ腫瘍モデルにおけるメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの治療的抗腫瘍効力の比較
治療的免疫化モデル内でＣ５７ＢＩ／６（グループあたり動物８匹）において、静脈内尾部免疫化によって誘発された抗腫瘍効力を査定した。０日目に３．０×１０5のＥＧ．７Ｂ１６／ＢＬ６マウス黒色腫発現腫瘍細胞を皮下注射して、動物を攻撃誘発した。腫瘍の成長及び体重増加を査定するべく隔日でマウスを監視した。対照マウスには、以上に記述したものと同じ計画でＨＢＳを注射した。各々２５：４５：２０：１０の比でＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４の脂質組成を有する脂質粒子内に、オリゴヌクレオチドを封入した。この効力実験からの結果は、図１６及び１７に詳しく記されている。各図上の０日目は、各動物が腫瘍での攻撃誘発を受けた日である。
【０１８６】
図１６は、その非メチル化対応物ＰＳ−ＯＰＮ１に比べた、Ｂ１６のメラノーマ腫瘍の接種を受けた動物に対しメチル化ＰＳ−ＯＤＮ１ｍを投与することのもつ治療的効力を例示している。脂質粒子内へのＰＳ−ＯＤＮ１ｍの封入は、腫瘍体積を減少させる上でのその効力を、少なくとも封入非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ１のものまで増大させた。
【０１８７】
図１７は、２２日目における各マウスの体内の腫瘍の平均重量を例示している。遊離メチル化ＰＳ−ＯＤＮ１ｍで治療されたマウスの体内の平均腫瘍サイズは、緩衝液対照で治療したマウスの場合とほぼ同じであったが、一方遊離非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ１で治療されたマウスは腫瘍の成長の低減を示した。これとは対照的に、マウスを脂質粒子内に封入されたメチル化ＰＳ−ＯＤＮ１で治療した場合、腫瘍の減少量は、脂質封入された非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ１で得られたものとほぼ同等であった。従って、メチル化オリゴヌクレオチドの脂質封入は、たとえ遊離メチル化オリゴヌクレオチドがほとんど又は全く効力を示さなくても、インビボで腫瘍を治療する上で効力を生み出すことができる。
【０１８８】
例８
封入オリゴヌクレオチドで治療された場合の血液クリアランスレベル
有効な免疫刺激における１つの重要な側面は、特異的抗原に対する抗体応答を発生させる免疫系の能力である。かかる応答を開始させるための脂質封入オリゴヌクレオチドと会合させられた抗原の能力の最初の実証の１つが、図２３に示されたデータによって例示されている。
【０１８９】
ＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍの各々を、２つの異なる脂質粒子内に封入した。脂質１（Ｌ１）はＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ２０であり、脂質２（Ｌ２）は、ＰＥＧＣｅｒ２０の代りにＰＥＧＣｅｒ１４を有するという点以外同じものである。リポソーム内でのＰＥＧＣｅｒ２０の半減期は、ＰＥＧＣｅｒ１４のものよりもはるかに長いことがわかっており、かくして、ＰＥＧＣｅｒ２０は、より長時間脂質粒子と共にとどまっている。マウスは、０日目から始めて、４回の静脈内（i.v.）尾部注射を受け、３週間の間一週に一回投薬された。毎週注射から１時間後に血液を収集し、封入ＯＤＮの存在について分析した。
【０１９０】
図２３は、それぞれメチル化又は非メチル化オリゴヌクレオチド、ＯＤＮ１ｍ及びＯＤＮ１のいずれかと組合せた異なるＰＥＧ−セラミド立体コーティング（それぞれＰＥＧ−セラミド−Ｃ−２０及びＰＥＧ−セラミドＣ−１４）を各々伴うＬ１及びＬ２という異なる脂質組成物についての、マウス体内の血液からのクリアランスに対する効果を例示している。注射１の後、結果は、組成の如何に関わらず血液標本からの封入ＯＤＮの両方について、延長された循環／緩慢なクリアランスを示している。しかしながら、注射２、３、及び４の各々について、結果は、長寿命のＰＥＧＣｅｒ２０を含有するＬ１リポソーム（Ｌ１−ＯＤＮ１及びＬ１−ＯＤＮ１ｍ）が、より短かい循環／急速なクリアランスを有しており、一方短寿命のＰＥＧ−セラミドＣ−１４がＰＥＧＣｅｒ２０脂質を含有する脂質粒子で封入されたものよりも長い循環／緩慢なクリアランスを有していた、ということを示している。
【０１９１】
本書で記述されたデータは、次の２つの特定的なポイントを実証している。すなわち（１）抗原特異的抗体の誘発；及び（２）非メチル化及びメチル化オリゴヌクレオチドの相対的免疫刺激性能力。抗原特異的抗体の誘発に関しては、最初の注射は、ＰＥＧ−セラミド立体障壁脂質のＰＥＧ部分に対し向けられた抗体の誘発を結果としてもたらした。注射された動物の血漿中のこれらの抗体の存在は、ＰＥＧＣｅｒ２０を伴うＬ１リポソームの場合に見られた通り注射２、３及び４の後のＰＥＧを含むリポソームのオプソニン作用及びその後の循環からの急速なクリアランスを結果としてもたらした。しかしながら循環内でＰＥＧがそこから非常に急速に解離したＰＥＧＣｅｒ１４を伴うＬ２リポソームといったようなＰＥＧ無しのリポソームの注射を受けた動物は、オプソニン作用を受けず、かくして比較的長い循環時間を有していた。非メチル化オリゴヌクレオチド対メチル化オリゴヌクレオチドの相対的免疫刺激潜在力に関しては、非メチル化オリゴヌクレオチド又は対応するメチル化形態のいずれかを含有するリポソームは類似の速度でクリアランスされ、かくして、両方共が抗原特異的抗体を誘発できるということを示した。
例９
腫瘍関連抗原としての単一エピトープＯＶＡペプチドと全長ＯＶＡタンパク質の抗腫瘍効力の比較
アジュバントとしてと同時に癌ワクチン製剤のベースとしてもＬＮＡを用いて、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡでのトランスフェクションを受けた細胞系統に対するＯＶＡワクチン接種の予防的及び治療的効力及び細胞媒介免疫応答を評価するために、全長ＯＶＡ及び免疫優性細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）ペプチドエピトープ（ＯＶＡ257-264）を使用した。この実験のためのＬＮＡ製剤を、２５：４５：２０：１０の割当量でＤＳＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＡＰ：ＰＥＧＣｅｒ１４を用いて調製した。
【０１９２】
１．ＶＡ及びＯＶＡ257-264ペプチドの予防的効力
Ｃ５７／ＢＬ６マウスの体内に皮下（ＳＣ）移植されたマウス胸腺腫細胞系統Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡに対するＯＶＡ及びＯＶＡ257-264の抗腫瘍活性を検査した。５０ｍｇの全タンパク質での週一回のワクチン接種（合計２回の注射）の後、抗腫瘍活性が観察されたが、ＯＶＡ257-264（ｐＯＶＡ）又はアシル化ＯＶＡ257-284ペプチド（ｍＯＶＡ）を用いた場合いかなる抗腫瘍活性も観察されなかった（図２９）。タンパク質又はペプチド単独で観察された活性を考えると、この用量及び計画は、ＯＶＡ及び／又はＯＶＡ257-264に対する免疫応答を高めるように設計されたアジュバントを評価するための有用なモデルを表わしている。
【０１９３】
アジュバントとしてＬＮＡ製剤を検討するため、予防的Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡモデル内のワクチン接種及び効力に対する次の３つの変数の影響を評価した：すなわち（１）遊離ＯＤＮ１対封入ＯＤＮ１の活性、（２）ホスホジエステル（ＰＯ）対ホスホロチオエート（ＰＳ）ＯＤＮ、及び（３）全長ＯＶＡタンパク質対単一エピトープペプチドＯＶＡ257-264（図３０Ａ及びＢ）。この研究セットにおいて、遊離及び封入ＯＤＮ１は単に抗原と混合され、首筋近くで皮下（ＳＣ）投与された。
【０１９４】
これらの研究から、以下の３つの基本的な結論を下すことができる：すなわち（１）ＯＤＮ１の封入は、ＯＶＡ又はペプチドフラグメントのいずれかを用いた予防的ワクチン接種の後、抗原特異的効力の増大を結果としてもたらした；（２）ＰＳ  ＯＤＮ１は、ＯＶＡ及びペプチドのためのアジュバント活性を提供し、ＰＯ  ＯＤＮ１は、封入されたとき著しい活性を提供した；及び（３）ＯＶＡ257-284と比べＯＶＡタンパク質について劇的に改善された免疫応答及び効力が観察された。封入ＰＳ又はＰＯ  ＯＤＮ１で治療されＯＶＡタンパク質と混合されたグループの中の全ての動物は、未治療の動物を安楽死させなくてはならなくなった時点で腫瘍の兆候を全く示さなかった。全長ＯＶＡで治療された動物について観察された活性の改善は、同様に、完全タンパク質内に存在する多数のエピトープを認識する内因性ＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞の存在の結果である。これらのエピトープは、より広い免疫応答を刺激し、従って免疫回避の防止を助ける。
【０１９５】
２．ＬＮＡ会合ＯＶＡ257-264ペプチドの予防的効力
抗原−ＬＮＡ混合物の免疫応答及び効力を高めるために、予め形成されたＬＮＡの２層の中に、ペプチドＮ末端にステアロール基を含有する修飾されたペプチドを取込んだ。これは、洗浄剤（ＯＧＰ）又はＤＭＳＯのいずれかの中の少量の濃縮ペプチド溶液の添加とそれに続く透析によって達成された。ＤＭＳＯが用いられた場合、ペプチド−ＬＮＡ製剤内のＤＭＳＯの最終的濃度は、透析の前には１０％未満であった。
【０１９６】
ＯＤＮ３０（ＰＯ）を含有するＬＮＡを用いて、ペプチド取込みの影響を検討した。取込まれたペプチドを含有する粒子又は単純にペプチドと混合された粒子を、前述の研究で行なわれた通り２週間Ｂ６マウスに対し皮下（ＳＣ）投与した。修飾された又は未修飾のペプチドのいずれか単独での投与は、このモデルにおいて効力に対する予防的効果を全く有していなかった（図３１）。ペプチドと会合した粒子の投与が治療対象動物体内の腫瘍の成長の阻害に対し著しい効果を示したのに対して、ＬＮＡと混合されたペプチドの投与は、予防的効果を示した。一部の動物（２／５）は、可視的腫瘍を全く有しておらず、一方その他の動物は、その腫瘍質量が著しく減少していた。
【０１９７】
興味深いことに、免疫優性ＯＶＡペプチドが単純にＬＮＡ製剤と混合された場合、ワクチンはさほど有効でないが、ペプチドをＬＮＡペプチドと会合させた場合、全タンパク質について見られたものと同等の保護が観察される。その上、カップリングされた癌ワクチンは、非腫瘍担持マウスの中で抗原特異的Ｔ細胞を誘発し、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ−リンパ球の数は、予防的抗腫瘍ワクチンモデル内で見られる効力と正の相関関係をもつ（データ示さず）。
【０１９８】
３．ＬＮＡ会合されたＯＶＡタンパク質の予防的効力
ＬＮＡに対するＯＶＡタンパク質の化学的リンケージの影響を検討するために実験を拡大した。ＬＮＡとの単純な混合に比べて、ＯＶＡがＬＮＡにカップリングされたグループについてＥ．Ｇ７−ＯＶＡモデル内に改善が見られた（図３２）。両方のグループ共、強い抗腫瘍活性を示した。ＬＮＡと混合したＯＶＡタンパク質は、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡモデルにおいて強い活性を示した。
【０１９９】
４．ＯＶＡワクチン接種の治療的効果
現在、臨床的目標は、確立した癌の進行を減速させることのできる治療的宿主免疫応答を生成することにある。Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡモデル内の治療的効果に対するワクチン接種の効果を評価するために、Ｂ６マウスにＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞を移植し、次にひとたび腫瘍が−２５０ｍｍ3に達した時点でｑ４ｄ×４計画でＯＶＡ、ＯＶＡ＋ＯＤＮ１又はＯＶＡ＋ＬＮＡ／ＯＤＮ１でマウスを治療した。アジュバントとして遊離ＯＤＮ１を使用して、腫瘍の成長の遅延が観察されたが、ＯＶＡ単独については腫瘍成長のいかなる遅延も見られなかった（図３３）。ＬＮＡ／ＯＤＮ１と混合したＯＶＡの投与は、結果として腫瘍の退行とそれに続く安定化期間をもたらした。最初の退行と遅延した成長は、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬの存在を示唆している。しかしながら、疾病の再発は、エフェクタ細胞のこの集団が腫瘍の負荷を完全に無くすることができなかったことを示唆しており、１）より強い初期免疫応答のためのＬＮＡ製剤に対する腫瘍関連抗原のカップリング及び２）より広い免疫応答を誘発するための癌ワクチン両方におけるポリトープのアプローチの重要性を指摘している。
【０２００】
５．その他のアジュバントに対する効力比較
それに対して新しいアジュバントの大部分が測定される広く使用されている国際的に受容された規格は、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）である。ＣＦＡは、殺されたマイコバクテリウムを含む粘性の高い油中水エマルジョンである。ＣＦＡは実際には、体液性及び細胞媒介型の両方の応答を刺激し、Ｔｈ１応答に最も類似したサイトカインプロフィールを有するが、応答が広範であるという性質をもつことから、一部のＴｈ２活性をも結果としてもたらす。その強力な活性にも関わらず、ＣＦＡは、痛み、熱、膿瘍形成、局所的炎症応答、肉芽腫形成、そして或る種の例では自己免疫の誘発を含めた、人間におけるその使用を妨げる重大な副作用を有している。
【０２０１】
複数の研究において、ＯＶＡ及びＬＮＡ／ＯＤＮ１で予防的に治療されたマウスは最も極立った応答を示し、数多くのマウスにおいて多大な腫瘍退化と場合によって腫瘍が再度成長するまでの成長の遅延が見られた（図３４）。ＣＦＡ及びＯＶＡでの治療を受けた動物は、ＬＮＡ＋ＯＶＡと遊離ＯＤＮ１＋ＯＶＡの間の中間応答を示した。ＣＦＡで治療した動物は、標準的に非常に小さい腫瘍しかない又は全く腫瘍のない複数の動物とはるかに大きい腫瘍をもつ複数の動物を含んでいた。これは恐らく、ＣＦＡ混合物の粘性が高いものであることに起因している。同様にＬＮＡで皮下治療された動物は、局所的炎症の兆候を全く示さず、一方ＣＦＡで治療されたマウスの事実上、全てが精力的な局所的炎症応答及び肉芽腫形成を発生した。
【０２０２】
６．ＯＤＮ  配列
Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡモデルにおいて、ＩＳＳ及び非ＩＳＳ  ＯＤＮのさまざまな遊離及び封入バージョン（表１に記された配列及び同定）を評価した（図３６）。大部分のＯＤＮは、ＣｐＧ六量体（ＯＤＮ５）及びＯＤＮ１のメチル化バージョン（ＯＤＮ１ｍ）を含めた封入形態での効力を示した（図３５）。最も強い応答は、ＯＤＮ５（六量体）、ＯＤＮ１ｍ、ＯＤＮ２９（活性ＣｐＧ及び４Ｇ要素を保持するＯＤＮ１の非アンチセンスバージョン）及びＯＤＮ１のＬＮＡ形態について観察された。空の脂質粒子は完全に不活性であった。
例１０
腫瘍関連自己抗原としてのＴＲＰ−２の予防的抗腫瘍効力
チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）２は、ヒト及びマウスの両方の黒色腫の進行に関与していた黒色腫分化抗原である。かくして、ＴＲＰ−２が、癌ワクチンのための見込みある標的として提案されてきた。ＴＲＰ−２（ＴＲＰ181-188）の免疫優性ＭＨＣクラスＩ（Ｈ2−Ｋｂ制限された）ペプチドエピトープは最近同定され、抗Ｂ１６ＣＴＬにより認識されることが示された。Bloom et al. 1997。その後、このペプチドは、マウス体内のＢ１６肺転移を阻害するように設計された複数のワクチン接種研究において使用されてきた。ＴＲＰ−２タンパク質に対する天然の免疫寛容性を克服するためにワクチンは宿主免疫系を誘発しなければならないことから、内因性自己抗原として、ＴＲＰ−２モデルは、異種Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍よりも優れた効力試験を表わすものである。
【０２０３】
ＴＲＰ−２ペプチドは、さまざまなアジュバント製剤と混合され、毎週（×３）皮下（ＳＣ）投与され、その後Ｂ１６細胞が静脈内（ＩＶ）投与され、これは攻撃的に肺に播種して数多くの微小転移を形成した。ＴＲＰ−２ペプチドは単独で、このモデル内でいかなる活性も示さなかった（平均転移数＝８２；未治療の動物に匹敵。図示せず）（図３７）。ＣＦＡは、均衡のとれたＴｈ１／Ｔｈ２であり、Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ研究と一貫した穏やかな応答（平均＝４５）を提供した。Ｑｕｉｌ−Ａ（強いＣＴＬ活性プロモータとして指摘されたサポニンアジュバント系統群の一員）は強い応答を誘発した。
【０２０４】
ＴＲＰ−２ペプチドと混合した遊離ＯＤＮ１は、実際ＣＦＡよりもさらに有効であった（平均＝３７）。しかしながら、その他のモデルでの前述の研究（Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ、サイトカイン研究）の場合と同様、封入はこのＯＤＮの活性を著しく増大させ（平均＝６）、本発明に従ってＣｐＧ  ＯＤＮを封入することにより得られる相乗効果を実証した。興味深いことに、ＯＤＮ３の封入された形態（ＯＤＮ１についての非ＣｐＧ  ＯＤＮ対照配列）も同様に、多大な活性を示し（平均２３）、一方このＯＤＮの遊離形態は予想通り完全に不活性であった（平均＝８３）。この結果は我々のその他の発見事実（ＰＥＧ応答、ＮＫ細胞応答）のいくつかと一貫しており、非ＣｐＧ  ＯＤＮが、ＬＮＡ中に封入された時点で有意な免疫学的及び治療的効果を及ぼすことができるということを指摘している。その上、予防的Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデル内で以上で得たデータに基づき、ＬＮＡ製剤とＴＲＰ−２ペプチドといったような腫瘍関連抗原を会合させることが、転移の成長を阻害する上でさらに一層有効となるものと予想される。
【０２０５】
例１１
多数の腫瘍関連抗原と共にポリトープアプローチを用いたＣＴＬ応答の誘発
単一のエピトープベースのアプローチは、ＭＨＣ制限されたＣＴＬ応答がわずか１つの抗原に対してのみ発生されられるという欠点を有する。さらに、数多くの癌抗原は、以上で例示されているＴＲＰ−２といったような突然変異を受けていない分化抗原であり、従って、宿主体内の自己反応性Ｔ細胞は、胸腺教育中に大部分が欠失させられる。ポリトープアプローチにより、多くの抗原を同時に標的づけすることができ、かかる自己抗原に対する抗腫瘍ＣＴＬ応答のスペクトルが増大するはずである。多数の抗原に特異的でかつ多数のＭＨＣ対立遺伝子により制限されたＣＴＬ応答は、異なる悪性腫瘍における腫瘍抗原及びＭＨＣ対立遺伝子の可変的発現を考えると、より広い免疫反応性にとって明らかに望ましいものとなるだろう。特定の悪性腫瘍と会合させられた多数の抗原を標的づけすることにより、抗原ダウンレギュレーション又はエピトープ突然変異による腫瘍エスケープの可能性は最小限におさえられる。
【０２０６】
多数の抗原及びＭＨＣ対立遺伝子の標的づけは、合成ペプチドエピトープの数多くの組換え抗原混合物を使用することによって達成できる。これらの多重エピトープに対する免疫応答を改善するため、複数のアジュバントが検定中である。この実験では、２つのマウス黒色腫抗原ＴＲＰ２（Ｈ2Ｋｂ、ＶＹＤＦＦＶＷＬ）及びＧｐ１００（Ｈ2Ｄｂ、ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ）と組合わせてＰＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＯＤＭＡ：ＰＥＧ−ＤＭＧ（２５：４５：２０：１０モル比）を用いて、封入ＰＳ−ＯＤＮ１ｍが利用される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、封入ＰＳ−ＯＤＮ１ｍの存在下で各々の抗原のいずれか又は両方を３回注射した。正の対照として、我々は、ＣＴＬ応答を誘発する上で潜在力をもつものとして知られている樹状細胞を用いた。多数のエピトープを含むＢ１６リゼイトを同じく、多重エピトープ免疫性を誘発する能力についてＯＤＮ１ｍ又はＤＣのいずれかで検定した。抗原特異的に腫瘍細胞に対する細胞毒性を媒介するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力によって、免疫応答を査定した。
【０２０７】
結果、封入ＯＤＮ１ｍと合わせて注射した時点で、ＣＴＬ応答が両方の抗原に対して発生した（図３８）。ＰＳ−ＯＤＮ１ｍは、一緒に送達された両方の抗原に対するＣＴＬ応答を生成する上でＤＣと同じ位優れていた（図３９）。ＰＳ−ＯＤＮ１ｍとのＢ１６リゼイトの注射は、Ｂ１６リゼイトと共にインキュベートしたＤＣの注射よりもさらにＣＴＬを誘発する上で潜在力を有していた（図４０）。
【０２０８】
例１２
体液性免疫応答の誘発
１．タンパク質抗原と混合されたＬＮＡに対する体液性応答
単一の静脈内投与の後の単独のＬＮＡ／ＯＤＮ１によって誘発されたサイトカインプロフィールは、マウス抗体イソ型ＩｇＧ２ａの刺激によって特徴づけされるＴｈ１偏向を表わしている。これは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）といったようなタンパク質抗原と混合されマウスに皮下投与された時点で見られる。ＮＣ成分がＣｐＧモチーフを内含しない場合、強いＩｇＧ１応答がなおも観察されるが、ＣｐＧ含有粒子は、ＩｇＧ２ａイソ型のより高い力価を生成するように免疫系を導く（図４１）。
【０２０９】
２．抗原をＬＮＡと会合させることで体液体応答は増強される
その他の粒状アジュバントに比べた本書に記述されているワクチンの利点は、疎水性アンカーを用いて腫瘍及び疾病関連抗原を予め形成されたＬＮＡ粒子に直接リンクすることができるという点にある。ＡＰＣに同時に送達されるような形で抗原及びアジュバントがカップリングされた時点で、免疫応答の性質の多大な増強を実現することができる。例えば、マウス免疫系を活性化するべく最適化されたＩＳＳを含むＬＮＡがオボアルブミン（ＯＶＡ）タンパク質とカップリングされた場合、それは、ＬＮＡとＯＶＡが単純に混合された場合に見られるレベルよりも又は標準的ベンチマークアジュバントと比べて、１０倍大きいマウス体内の合計ＯＶＡ特異的ＩｇＧの力価を誘発する（図４２）。現在、非ヒト利用分野のための市販の最も活性なアジュバント組合せは、その高いＩｇＧ力価の生成及び早期セロコンバージョンで有名なImmuno Easy（ＣｐＧオリゴと混合したミョウバン）である。しかしながら、当該データは、ＬＮＡ−ＯＶＡ粒子が、単一の注射から２週間後に生成されたＯＶＡ特異的ＩｇＧのレベルにおいてImmuno Easyならびにその他の数多くのアジュバントより著しく効率のよいものであることを実証している。
【０２１０】
例１３
代替的ＬＮＡ脂質製剤
この例は、ＡＬ−１及びＰＥＧ−セラミドと共に処方された粒子に比べた、ＤＯＤＭＡ及びＰＥＧ−ジアシルグリセロールと共に処方されたＬＮＡ粒子の薬物動態（ＰＫ）及びサイトカイン産生を例示している。
【０２１１】
ＬＮＡ粒子は、カチオン脂質ＡＬ−１（又はＤＯＤＡＰ）及び立体障壁脂質ＰＥＧ−セラミド（Classic ＬＮＡ）から処方可能である。代替的には、カチオン脂質ＤＯＤＭＡ及び立体障壁脂質ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（再処方されたＬＮＡ）といったその他の脂質を使用することもできる。脂質組成のこれらの変更によってＰＫが影響されないことを実証するために、ＡＬ−１及びＰＥＧ−セラミドと共に処方されたＬＮＡ粒子の２４時間にわたる循環からのクリアランスを、ＤＯＤＭＡ及びＰＥＧ−ジアシルグリセロールと共に処方されたものと比較した（データ示さず）。１０ｍｇのＯＤＮ／ｋｇという用量で3Ｈ−ＣＨＥ−標識づけされたＬＮＡ粒子をマウスに静脈内注射し、さまざまな時点で血液を収集した。循環中に残っている放射線標識づけされたＬＮＡ粒子の量を液体シンチレーション分光法によって決定し、血液アリコートあたりの放射能の量を、体重、注射される製剤の量及び血液量に基づいて調整した。
【０２１２】
上述のように、カチオン脂質ＤＯＤＭＡ及び立体障壁脂質ＰＥＧ−ジアシルグリセロールといったようなその他の脂質成分を使用することが可能である。これらの粒子によって誘発されたサイトカイン分泌が脂質組成中のこれらの変更によって影響されないことを実証するために、ＡＬ−１及びＰＥＧ−セラミドと共に処方されたＬＮＡ粒子による４時間後のサイトカインＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＭＣＰ−１の誘発を、ＤＯＤＭＡ及びＰＥＧ−ジアシルグリセロールと共に処方されたものと比較した（データ図示せず）。マウスに、２０ｍｇのＯＤＮ／ｋｇの用量で、４時間目に静脈内注射し、血液を収集した。遠心分離によって血漿を収集し、市販のＥＬＩ自己抗原キットを用いたＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＭＣＰ−１の血漿濃度の決定に先立ち−２０℃で冷凍した。
【０２１３】
提供された例は、本発明の或る種の実施形態を例示している。しかしながらより一般的な意味では、本発明は、組成物そしてかかる組成物を用いて（ヒトを含めた）哺乳動物の対象に対して治療上の利点を提供するための方法を包含している。本発明の組成物は、脂質膜小胞の形をしており、核酸が前記小胞内に完全に封入されている。特定の抗原に対する応答の刺激が望まれる場合、組成物は、例えば小胞の外部表面に対する化学的カップリング、疎水性結合又はイオン結合、或いは小胞内部での封入を介して、抗原を小胞と会合させることもできる。
【０２１４】
好ましい組成物は、ＮＣが組成物の４重量％以上を構成しているものである。
【０２１５】
本発明の組成物中の核酸は、適切には、治療対象の哺乳動物のゲノムと相補的でないそして哺乳動物の核酸との相補的塩対合相互作用によって左右されないメカニズムを通して免疫刺激を提供する核酸であり得る。かかる核酸は、往々にしてＣｐＧモチーフ又は、免疫刺激パリンドロームといったような免疫刺激配列を含有することになる。
【０２１６】
本発明の組成物中で使用される核酸は、実験未使用の哺乳動物に対し遊離形態で投与された場合に免疫応答を誘発しないか又は実験未使用の哺乳動物に対し遊離形態で投与された場合にヌクレオチドの免疫刺激配列に対する免疫応答を抑制する核酸であり得る。
【０２１７】
核酸は、排他的にホスホジエステルインターヌクレオチドリンケージを有することができるか又は、修飾されたインターヌクレオチドリンケージと組合せて複数のホスホジエステルインタヌクレオチドを…する要領で、修飾され得る。核酸は同時に、排他的に修飾されたリンケージを又は複数の修飾されたリンケージを含有することもできる。例えば核酸は、排他的に、ホスホロチオエートインターヌクレオチドリンケージ又は複数のホスホロチオエートインターヌクレオチドリンケージを含有していてよい。
【０２１８】
組成物を処方する上で用いられるカチオン脂質は適切にはＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＣ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ及びＤＯＧＳの中から選択されている。さらに、脂質製剤は好ましくは、ＰＥＧ−脂質、ＰＡＯ−脂質又はガングリオシドといったような凝集防止化合物を内含している。
【０２１９】
抗原に加えて又は抗原に代って、本発明の組成物は、ドキソルビシンといったような同時封入された細胞毒性作用物質を内含することができる。脂質膜小胞は核酸及び細胞毒性作用物質の両方を完全に封入する。このタイプの組成物は、本発明のさらなる１態様である方法によって調製可能である。この方法においては、治療用組成物は、エタノール中で脂質を調製し；脂質を水性緩衝液中でオリゴヌクレオチドと混合させ；小胞の内部空間内に細胞毒性作用物質が活発に蓄積するような形で、オリゴヌクレオチドが装てんされた脂質小胞を細胞毒性作用物質に露呈することによって調製される。
【０２２０】
本発明の組成物は、薬剤の製造においてカチオン脂質を含む脂質製剤内に完全に封入されている核酸を含む脂質−核酸粒子を使用することを通して、人間を含む哺乳動物に対し治療上の利点を提供するため、さまざまな方法において使用可能である。かくして、組成物は、哺乳動物の体内で免疫応答を誘発するために、哺乳動物の体内でＣＴＬ又はＢ細胞を活性化するため又は、新生組織形成を治療するために、カチオン脂質を含む脂質製剤の中に完全に封入された核酸を含む脂質−核酸粒子を調製する段階及び哺乳動物に対し該脂質−核酸粒子を投与する段階を含む方法により使用することができる。
【０２２１】
組成物中に抗原が含まれている場合には、本発明は、中に完全に封入された核酸を含む脂質膜小胞及び小胞の外表面と会合され免疫応答が望まれている抗原を含む粒子を調製する段階及び治療すべき哺乳動物の対象に対し粒子を投与する段階を含んで成る、抗原に対する免疫応答の誘発方法を提供している。
【０２２２】
以上の例で実証されているように、本発明に従った組成物内での脂質担体の利用は、免疫系の所望の刺激を達成するのに必要とされるオリゴヌクレオチドの量の実質的な削減を可能にする。一部のケースでは、これは、遊離形態で見かけの活性を全く有していなかったオリゴヌクレオチドが、脂質封入形態で提供された場合に免疫応答を刺激するのに有用であるという事実の中に反映されている。その他のケースにおいては、これは、より低いＯＤＮ投薬量で同じ応答レベルを達成するのに必要なＯＤＮの量という事実に反映されている。かくして、哺乳動物における免疫応答を刺激するために有効量のオリゴヌクレオチドを利用する方法を実践するにあたり、本発明は、脂質小胞内にオリゴヌクレオチドを完全に封入すること及び哺乳動物の対象に対し前記有効量のオリゴヌクレオチドの２０％未満を投与しかくして前記哺乳動物の対象の体内に所望の免疫応答を得ることを含めた改良を提供する。
【０２２３】
本書に記述したデータは、完全さ及び一貫性を期して提供されている本発明の或る種の実施例を用いてインビボでの免疫刺激活性及び治療上の効力を実証しているものの、本発明はこれらの実施例に制限されるものでないということが理解される。当業者であれば、本書に提供されている教示と一貫した本発明のその他の特定的実施形態を作り出し使用することが容易にできるものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】全血を遊離オリゴヌクレオチドで処理することの結果としてもたらされる活性化マーカーＣＤ６９を担持する白血球のインビトロ刺激を例示している。マウス全血が、本書でＯＤＮ１と呼んでいる遊離オリゴヌクレオチド又はＯＤＮ２と呼ばれるオリゴヌクレオチドのいずれかで、インビトロで処理された。
【０２２５】
【図２】封入又は遊離ＯＤＮ１及びＯＤＮ２オリゴヌクレオチドを注入することによるマウスのインビボ治療が、インビトロで得られたものに反する結果を生じることを例示している。
【０２２６】
【図３】脂質小胞内に封入された場合に、メチル化されたＯＤＮ１ｍがインビボでの樹状細胞の活性化を刺激する上で非メチル化対応物ＯＤＮ１よりも活性が高かったことを示している。
【０２２７】
【図４Ａ】メチル化ＯＤＮ１ｍ及び非メチル化ＯＤＮ１の両方が、膵臓及び全血内のＣＤ１１Ｃ陽性細胞の膨張を刺激したことを示している。
【０２２８】
【図４Ｂ】ＯＤＮ１及びＯＤＮ１ｍの両方が、膵臓、全血及びリンパ節内でＤＥＣ２０５陽性細胞の膨張を刺激することを示している。
【０２２９】
【図５】いずれかのＯＤＮが脂質封入された場合に、ＣＤ８６発現を刺激する上でメチル化ＯＤＮ１ｍが非メチル化対応物ＯＤＮ１よりもさらに活性であったことを示している。
【０２３０】
【図６】遊離オリゴヌクレオチドのインビボ投与が、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ又はＭＣＰ−１の刺激に対していかなる影響も及ぼさないことを示している。これとは対照的に、脂質封入オリゴヌクレオチドのインビボ投与は、これらのサイトカインの各々の産生を刺激した。
【０２３１】
【図７Ａ】オリゴヌクレオチド調剤スケール上で測定された遊離オリゴヌクレオチドＯＤＮ１と比較して封入ＰＯ又はＰＳオリゴヌクレオチドＯＤＮ１のいずれかでのマウスの治療によりＩＬ−１２の誘発が増大したことを例示している。
【０２３２】
【図７Ｂ】封入ＰＳオリゴヌクレオチドが比較的少ないがなおも有効なＩＦＮ−ガンマ誘発を刺激する一方で、封入ＰＯオリゴヌクレオチドがＩＦＮ−ガンマの強い早期誘発を刺激することを示している。
【０２３３】
【図８】遊離ＰＳ又はＰＯオリゴヌクレオチドの投与時点でのＴｈ−１の応答を表わすＩｇＭ力価の比較を示している。
【０２３４】
【図９】メチル化オリゴヌクレオチドを含めた、遊離ＰＳ又はＰＯオリゴヌクレオチドの投与時点でのＴｈ−２応答を表わすＩｇＧ産生の比較を示す。
【０２３５】
【図１０】メチル化又は非メチル化脂質封入オリゴヌクレオチドで治療された動物の一連のスクリーニング全体にわたって、メチル化オリゴヌクレオチドが、樹状細胞、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激する上で非メチル化オリゴヌクレオチドとほぼ同じであるか又はそれよりも優れているということを示している。
【０２３６】
【図１１】Ａ及びＢは、メチル化又は非メチル化脂質封入オリゴヌクレオチドで治療された動物の一連のスクリーニング全体にわたって、メチル化オリゴヌクレオチドが、細胞毒性Ｔリンパ球及びＡｇ特異的リンパ球の増殖を刺激する上で非メチル化オリゴヌクレオチドよりも優れているということを示している。１１Ｃは、図１１Ａ及び１１Ｂ内で記述された全体的スクリーニングに内含された代表的四量体研究からのデータを例示している。
【０２３７】
【図１２】遊離オリゴヌクレオチドとして動物に投与された場合に、腫瘍の成長を低減する上でメチル化バージョンの治療的効能がメチル化ヌクレオチドよりも低いことを示している。
【０２３８】
【図１３】特にオリゴヌクレオチドがホスホチオエート（ＰＳ）バックボーンを含有する場合に、オリゴヌクレオチドの封入により、遊離ＯＤＮに比べてメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの効能が改善されるということを例示している。
【０２３９】
【図１４】オリゴヌクレオチドが天然のホスホジエステル（ＰＯ）バックボーンを含有する場合に、オリゴヌクレオチドの封入により、遊離ＯＤＮに比べてメチル化及び非メチル化オリゴヌクレオチドの効能が改善されるということを示している。
【０２４０】
【図１５】脂質封入ＰＳオリゴヌクレオチドＯＤＮ２及びＯＤＮ２ｍが各々治療上の効能を呈することを示している。
【０２４１】
【図１６】Ｂ１６メラノーマ腫瘍の接種を受けた動物に対しメチル化ＯＤＮ１ｍを投与することのアジュバント効果及び治療上の効能を例示している。脂質粒子内へのＯＤＮ１ｍの封入により、腫瘍の体積を低減させる上でのその効能は増大した。
【０２４２】
【図１７】Ｂ１６メラノーマの接種を受けその後２０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドの投与で治療された一連のマウスについて、封入された遊離オリゴヌクレオチドＯＤＮ１及びＯ遺伝子１ｍの平均腫瘍のサイズを示している。
【０２４３】
【図１８】封入されたメチル化ＯＤＮ１ｍ及び非メチル化対応物ＯＤＮ１でマウスが治療された場合の腫瘍体積の減少を示している。
【０２４４】
【図１９】２つの異なる研究における非メチル化ＯＤＮ１での治療に比べた封入されたメチル化ＯＤＮ１ｍでの治療を受けたマウスの生存率を示している。
【０２４５】
【図２０】メチル化ＯＤＮ１ｍ及び非メチル化対応物ＯＤＮ１が脂質粒子内に封入された場合の腫瘍体積に関する効能を例示している。
【０２４６】
【図２１】非メチル化封入ＯＤＮ１での治療との関係における封入メチル化ＯＤＮ１ｍでの治療を受けたマウスの生存率を示す。
【０２４７】
【図２２】治療から６日後の封入ＰＯオリゴヌクレオチドによって生成されないＩＦＮ−ガンマピークを、封入ＰＳオリゴヌクレオチドＯＤＮ１及びＯＤＮ２が生成したことを例示している。
【０２４８】
【図２３】異なるＰＥＧセラミド立体コーティングを有する脂質粒子内に封入されたマウスのメチル化又は非メチル化オリゴヌクレオチド内の血液クリアランスに対する効果を示している。
【０２４９】
【図２４】腫瘍を有する動物に対して組成物を投与することにより腫瘍を治療する上でのメチル化又はメチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチドを封入するリポソーム粒子の治療上の効能を例示している。
【０２５０】
【図２５】メチル化ＰＳ−ＯＤＮ５ｍの脂質封入が、経時的に腫瘍の成長を低減させるにあたり同等の非メチル化ＰＳ−ＯＤＮ５の封入よりもさらに有効な治療上の利点を提供したということを例示している。
【０２５１】
【図２６】非メチル化封入及び遊離ＯＤＮ５での治療との関係における遊離及び封入メチル化ＯＤＮ５ｍでの治療を受けたマウスの生存率を示す。
【０２５２】
【図２７】遊離非メチル化及びメチル化ＰＳ及びＰＯＯＤＮ２７及び封入ＰＯ−ＯＤＮ７ｍで治療された場合の腫瘍体積に関する効能を例示している。
【０２５３】
【図２８】封入ＰＯ−ＯＤＮ７ｍでの治療に比べた遊離メチル化及び非メチル化ＰＳ及びＰＯＯＤＮ７での治療を受けたマウスの生存率を示す。
【０２５４】
【図２９】予防的療法の後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍内のＯＶＡ及びＯＶＡ２５７−２６４の抗腫瘍活性を例示する。
【０２５５】
【図３０Ａ】遊離及び封入ホスホロチオエート及びホスホジエステルＯＤＮ１での予防的ワクチン接種の後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍内の抗腫瘍活性を例示する。
【図３０Ｂ】遊離及び封入ホスホロチオエート及びホスホジエステルＯＤＮ１での予防的ワクチン接種の後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍内の抗腫瘍活性を例示する。
【０２５６】
【図３１】は、腫瘍関連抗原モデルとして単一エピトープＯＶＡペプチドを用いたＰＯＯＤＮを含有するＬＮＡでの予防的療法の後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍内の抗腫瘍活性に対する抗原会合の影響を例示している。
【０２５７】
【図３２】腫瘍関連抗原モデルとして全長ＯＶＡタンパク質を用いたＰＯＯＤＮを含有するＬＮＡでの予防的療法の後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍内の抗腫瘍活性に対する抗原会合の影響を例示している。
【０２５８】
【図３３】腫瘍関連抗原モデルとして全長ＯＶＡタンパク質を用いた予防的療法の後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡタンパク質内の抗タンパク質活性を例示している。
【０２５９】
【図３４】さまざまなアジュバントでの予防的ワクチン接種の後のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍内の抗腫瘍活性を例示する。
【０２６０】
【図３５】遊離ＯＤＮを用いたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデル内の効能に対するＯＤＮの影響を例示する。
【０２６１】
【図３６】封入ＯＤＮを用いたＥ．Ｇ７−ＯＶＡ腫瘍モデル内の効能に対するＯＤＮの影響を例示する。
【０２６２】
【図３７】癌免疫療法の自己免疫モデル内の封入ＩＳＳＯＤＮの抗腫瘍活性を例示している。
【０２６３】
【図３８】封入ＯＤＮ１ｍを用いた多重エピトープ癌ワクチンでの免疫化の後のＢ１６細胞標的に対するＣＴＬ応答を示す。
【０２６４】
【図３９】ペプチドパルス樹状細胞を用いた多重エピトープ癌ワクチンでの免疫化の後のＢ１６細胞標的に対するＣＴＬ応答を示す。
【０２６５】
【図４０】封入ＯＤＮ１ｍ又は樹状細胞と組合せた状態での腫瘍細胞リゼイトでの免疫化の後のＢ１６細胞標的に対するＣＴＬ応答を示す。
【０２６６】
【図４１】ＢＳＡと同時投与された封入ＯＤＮのアジュバント効果を例示している。
【０２６７】
【図４２】その他の従来のアジュバントと比較した封入ＯＤＮの免疫刺激効果を例示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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