(57)【要約】本発明は少なくとも１種の多機能性ホスホジエステラーゼ阻害薬（ＭＰＤＥＩ）及び少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、シロスタゾールとジピリダモールとを含む組成物及びそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のＭＰＤＥＩ又はその医薬的に許容出来る塩及び少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬又はその医薬的に許容できる塩を含む組成物。
【請求項２】
少なくとも１種のＭＰＤＥＩがシロスタゾールである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬がジピリダモール、プロペントフィリン（ｐｒｏｐｅｎｔｏｆｙｌｌｉｎｅ）、ジラゼプ（ｄｉｌａｚｅｐ）、ニトロベンジルチオイノシン、Ｓ−（４−ニトロベンジル）−６−チオグアノシン、Ｓ−（４−ニトロベンジル）−６−チオイノシン、ヨードヒドロキシ−ニトロベンジルチオイノシン、ミオフラジン、及びそれらのエステル類、アミド類及びプロドラッグ、及びそれらの医薬的に許容できる塩から選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
シロスタゾール及びジピリダモールを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
シロスタゾール及びジピリダモール又はそれらの塩から本質的になる組成物。
【請求項６】
組成物がシロスタゾールについて約０．３μＭ〜約１０μＭの血液濃度、及びジピリダモールについて約０．１μＭ〜約３μＭの血液濃度を生ずる、請求項４又は５の組成物。
【請求項７】
組成物がシロスタゾールについて約０．５μＭ〜約５μＭの血液濃度、及びジピリダモールについて１μＭ〜３μＭの血液濃度を生ずる、請求項４又は５の組成物。
【請求項８】
組成物がシロスタゾールについて約１μＭ〜３μＭの血液濃度及びジピリダモールについて１μＭ〜３μＭの血液濃度を生ずる、請求項４又は５の組成物。
【請求項９】
組成物が約０．１：１〜約１：０．０１の、血液中のシロスタゾール：ジピリダモールのモル比を生ずる、請求項４又は５の組成物。
【請求項１０】
組成物が約０．１６：１〜約１：０．２の、血液中のシロスタゾール：ジピリダモールのモル比を生ずる、請求項４又は５の組成物。
【請求項１１】
組成物が約０．３３：１〜約１：０．３３の、血液中のシロスタゾール：ジピリダモールのモル比を生ずる、請求項４又は５の組成物。
【請求項１２】
組成物が約１：０．７〜約１：３０のシロスタゾール：ジピリダモールの重量比を有する、請求項４又は５の組成物。
【請求項１３】
組成物が約１：１〜約１：１２のシロスタゾール：ジピリダモールの重量比を有する、請求項４又は５の組成物。
【請求項１４】
組成物が約１：１．２５〜約１：１２のシロスタゾール：ジピリダモールの重量比を有する、請求項４又は５の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項の組成物及び１種以上のその医薬的に許容できる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項の組成物の治療的に有効な量を患者に投与することからなる、前記患者においての
（ａ）ＰＡＯＤ又は卒中発作の治療；
（ｂ）血管拡張及び／又は血小板凝集の遮断の誘導；
（ｃ）冠状動脈再狭窄の治療；又は
（ｄ）平滑筋増殖の減少；
のための方法。
【請求項１７】
組成物が、シロスタゾールについて約２０ｍｇ／日〜約３００ｍｇ／日で、そしてジピリダモールについて約２００ｍｇ／日〜約６００ｍｇ／日で、投与される、請求項１６の方法。
【請求項１８】
組成物が、シロスタゾールについて約５０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日で、そしてジピリダモールについて約２００ｍｇ／日〜約６００ｍｇ／日で、投与される、請求項１６の方法。
【請求項１９】
組成物が、シロスタゾールについて約５０ｍｇ／日〜約１６０ｍｇ／日で、そしてジピリダモールについて約２００ｍｇ／日〜約６００ｍｇ／日で、投与される、請求項１６の方法。
【請求項２０】
組成物が、シロスタゾールについて約０．３μＭ〜約１０μＭの血液濃度、そしてジピリダモールについて約０．１μＭ〜約３μＭの血液濃度を生ずる、請求項１６の方法。
【請求項２１】
組成物が、シロスタゾールについて約０．５μＭ〜５μＭの血液濃度、そしてジピリダモールについて１μＭ〜３μＭの血液濃度、を生ずる、請求項１６の方法。
【請求項２２】
組成物が、シロスタゾールについて約１μＭ〜３μＭの血液濃度、そしてジピリダモールについて１μＭ〜３μＭの血液濃度を生ずる、請求項１６の方法。
【請求項２３】
組成物が、約０．１：１〜約１：０．０１の、血液中のシロスタゾール：ジピリダモールのモル比を生ずる、請求項１６の方法。
【請求項２４】
組成物が、約０．１６：１〜約１：０．２の、血液中のシロスタゾール：ジピリダモールのモル比を生ずる、請求項１６の方法。
【請求項２５】
組成物が、約０．３３：１〜約１：０．３３の、血液中のシロスタゾール：ジピリダモールのモル比を生ずる、請求項１６の方法。
【請求項２６】
方法が患者におけるＰＡＯＤ又は卒中発作の治療のためである、請求項１６の方法。
【請求項２７】
ＰＡＯＤが間欠性跛行である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
方法が患者における血管拡張及び／又は血小板凝集の遮断を誘導するためである、請求項１６の方法。
【請求項２９】
方法が、患者においての冠状動脈再狭窄の治療のためである、請求項１６の方法。
【請求項３０】
方法が、患者においての平滑筋増殖を減少させるためである、請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１種の多機能性ホスホジエステラーゼ阻害薬（ＭＰＤＥＩ）及び少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬を含む医薬組成物に関する。ＭＰＤＥＩは、最小で、ホスホジエステラーゼタイプＩＩＩ（ＰＤＥ３）及びアデノシン摂取の両方を阻害する薬剤（例えばシロスタゾール）である。本発明はまた、末梢動脈閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）に伴う手足虚血及び間欠性跛行（ＩＣ）を包含する種々の症状及び疾患の治療のために、卒中発作の予防及び治療のために、そして冠状動脈血栓症及び再狭窄の予防のために、該組成物を用いる方法に関する。本発明は、ＭＰＤＥＩ類、慣習的ＰＤＥ３阻害薬又はアデノシン摂取阻害薬のいずれかを単独で用いることで生ずる可能性がある副作用よりも少ない副作用を伴い、高められた治療的能力及び効能を達成するために該組成物を使用する方法を提供する。抗血小板効果及び血管拡張効果を高めるための、そしてＭＰＤＥＩ類及びＰＤＥ３阻害薬の潜在的強心副作用を回避するための本組成物の能力は、ＩＣ、卒中発作又は冠状動脈疾患及びうっ血性心不全（ＣＨＦ）を示す患者に、ＭＰＤＥＩ類（例えばシロスタゾール（ｃｉｌｏｓｔａｚｏｌ））の認容されている適応症及び用法を拡大する可能性を提供する。
【背景技術】
【０００２】
米国（ＵＳ）における高年齢患者の５％までもが、ＰＡＯＤに冒されており、そしてＰＡＯＤに冒されている患者は心臓及び脳血管原因から６倍増大した死の危険性を有する。ＩＣはしばしばＰＡＯＤの身体の無能力化症状である。患者は歩く時に、患った足において苦痛、痛み又は疲労感として様々に特徴づけられる不快感を典型的に示している。ＩＣの治療のためにＵＳにおいて２種だけの許可された医薬がある。ペントキシフィリンはこの２０年間市販されてきたが、しかしそれは周縁の効能しかない。シロスタゾール（プレタール（登録商標））（ｃｉｌｏｓｔａｚｏｌ（Ｐｌｅｔａｌ））（６−〔４−（１−シクロヘキシル−１Ｈ−テトラゾール−５イル）ブトキシ〕−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キノリノン）はＩＣの治療のために１９９９年に米国食品医薬局（ＦＤＡ）により承認された。偽薬−対照化試験において、シロスタゾールは偽薬及びペントキシフィリンと比較して、足踏み車上で最大歩行距離を有意義に改良した。
【０００３】
シロスタゾールは、サイクリックヌクレオチドＰＤＥ３阻害薬として長い間知られていた。サイクリックアデノシン一りん酸（ｃＡＭＰ）及びサイクリックグアノシン一りん酸（ｃＧＭＰ）のようなサイクリックヌクレオチドは心臓血管系内の多くの細胞応答を仲介することにおいて重要な役割を果たす。サイクリックヌクレオチドの細胞内水準は２つの群の酵素類のバランスのとれた活性により制御される。アデニル酸シクラーゼはｃＡＭＰの新しい合成を規制し、そしてグアニル酸シクラーゼはｃＧＭＰの新合成を規制する。反対に、それらの生化学的及び薬理学的プロフィールにおいて異なる、ＰＤＥの１１種の遺伝学的に異なるイソ形態はｃＡＭＰ及び／又はｃＧＭＰの分解を規制する。ＰＤＥ３イソ形態は、ｃＡＭＰに特に作用し、そして細胞内のｃＡＭＰの枯渇を生ずる。ＰＤＥ３は、心筋細胞、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）及び血小板を包含する多くの異なる細胞のタイプにおいて表れる。したがって、ＰＤＥ３は心収縮性、ＶＳＭＣ緊張力及び増殖、及び血小板活性それぞれに影響する。ＰＤＥ３の阻害は、細胞内ｃＡＭＰの選択的蓄積、及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）誘発作用における増大を生じさせる。それ故、上記細胞における減少したＰＤＥ３活性は増大した心収縮性、血管拡張、減少した細胞増殖、及び減少した血小板凝集を生じさせる。ＩＣ患者においてのシロスタゾールの有益な効果は、他の作用がまた役割を果たす可能性があるけれども、ＰＤＥ３阻害の血管拡張作用及び抗血小板凝集作用に大部分が起因していた。
【０００４】
ＰＤＥ３阻害薬は、一般に心臓に筋変力陽性作用及び周期変動性陽性作用（即ち、増大した収縮性及び心拍数）を発揮する。事実、ＰＤＥ３阻害薬は、ＣＨＦ患者において心拍出量を増大させ、そして肺うっ血を減少させることが示されている。例えば、基本型ＰＤＥ３阻害薬であるミルリノンは現在、ＣＨＦの急性治療のために臨床上使用されている。しかしながら、ＣＨＦ患者におけるミルリノンの慢性的使用は、（恐らくはｃＡＭＰ誘導心収縮性の過剰の増大に起因して（Ｐａｃｋｅｒ，１９９２（文献１２）：Ｔｈａｄａｎｉ及びＲｏｄｅｎ，１９９８（文献１６））、初期不整脈作用を伴っていた。シロスタゾールは、ＵＳにおけるＩＣ臨床試験において心臓血管死亡率を増大させることを示しておらず、そしてアジアの国々で安全な長期間使用が示されてきた（シロスタゾールのＮＤＡ，Ｏｔｓｕｋａ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（１９９７））。運動を制限されているＣＨＦは証拠排除基準にあったので、一般にＣＨＦ患者はＵＳにおけるシロスタゾールＩＣ試験に参加していなっかった。したがってＣＨＦを有する比較的に少ない患者（そして重症のＣＨＦを有する患者はなし）が、ＵＳにおける臨床試験に参加し、このグループの患者における死亡率に対しての医薬の影響は知られていない。それにもかかわらず、ミルリノンのようなＰＤＥ３阻害薬を用いての以前の臨床試験に基づいて、ＦＤＡは、何らかの重症のＣＨＦ患者において、シロスタゾールは使用してはいけないことを命令した。残念なことには、ＩＣを有する患者の人数は、ＣＨＦを有する患者と重複している可能性があり、その結果、ＰＤＥ３阻害薬の有益な効果は一般にこれらの患者に利用されることができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それ故、シロスタゾール及び他のＰＤＥ３Ｍ阻害薬の潜在的な心臓における副作用を排除するか、又は最少にし、それによりＩＣ及び心臓機能不全を示す患者に拡大される、シロスタゾール治療の有効性を可能にする新しい薬理学的方法を開発することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＰＤＥ３活性及びアデノシン摂取を阻害する医薬組成物を提供することによりこれらの必要性に向けられている。これらの医薬組成物は、少なくとも１種のＭＰＤＥＩ（例えばシロスタゾール）と、少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬（例えばジピリダモール）との組み合わせを包含する。本発明において、少なくとも１種のＭＰＤＥＩと、少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬との組み合わせは、ＰＤＥ３阻害の筋変力陽性作用を制限しながら、抗血小板作用及び血管拡張を増大させるように相乗的に働く。少なくとも１種のＭＰＤＥＩと少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬との組み合わせは、（ＩＣのような）ＰＡＯＤ、卒中発作、及び冠状動脈血栓症及び再狭窄を包含する種々の症状及び疾患の治療の治療のために、いずれかの薬剤の単独である場合よりも一層安全で且つ一層有効であるだろう。
【０００７】
図面において、図１は、コラーゲン誘導血小板凝集に対してのアデノシン（１μＭ）及びシロスタゾール（１μＭ）の相乗効果を例示する。洗浄された血小板は矢印により示されるようにコラーゲン（１μｇ／ｍｌ）で活性化された。
図２は、洗浄された血小板における血小板凝集に対して、ジピリダモール（１、３及び１０μＭ）及びシロスタゾール（１０ｐＭ〜１００μＭ）の投与量依存性相乗効果を例示する。
【０００８】
図３は、アデノシン（１μＭ）及びシロスタゾール（３０ｎＭ及び１００ｎＭ）の存在下での、洗浄された血小板における血小板凝集に対するジピリダモール（１、３及び１０μＭ）の相乗効果を例示する。
図４は、アデノシン（１μＭ）及びジピリダモール（１、３及び１０μＭ）の存在下での洗浄された血小板における血小板凝集に対するシロスタゾール（３０ｎＭ及び１００ｎＭ）の相乗効果を例示する。
【０００９】
図５は、アデノシン（０．３μＭ及び１μＭ）の存在での、ＰＲＰの血小板における細胞内ｃＡＭＰ水準上昇に対するジピリダモール（３μＭ）及びシロスタゾール（３μＭ）の相乗効果を例示する。
図６は、アデノシン（１μＭ）の存在下又は不存在下での、アデノシンＡ２Ａ−発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における細胞内ｃＡＭＰ水準上昇に対する、ジピリダモール（０．５、１、５及び１０μＭ）及びシロスタゾール（１μＭ）の相乗効果を例示する。
【００１０】
図７は、アデノシン（１μＭ）の存在下又は不存在下での、アデノシンＡ２Ａ−発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における細胞内ｃＡＭＰ水準上昇に対する、ジピリダモール（０．５、１、５及び１０μＭ）及びシロスタゾール（３μＭ）の相乗効果を例示する。
図８は、洗浄されたヒト血小板及び赤血球中へのアデノシン摂取に対する、ミルリノンと比較してのシロスタゾールの阻害効果を例示する。
【００１１】
図９は、全血中の、ジピリダモール（１μＭ）の存在下又は不存在下での、コラーゲン（２μｇ／ｍｌ）刺激を用いての血漿中のアデノシン水準における増大を例示する。
図１０は、コラーゲンの０．５μｇ／ｍｌにより誘導された全血における血小板凝集に対するジピリダモール（０．１、０．３、１及び３μＭ）及びシロスタゾール（１０μＭ及び３０μＭ）の相乗効果を例示する。
【００１２】
図１１は、コラーゲンの０．１又は０．３μｇ／ｍｌにより誘導された全血の血小板凝集に対するジピリダモール（１μＭ及び３μＭ）及び低濃度のシロスタゾール（０．３、０．７、１及び３μＭ）の相乗効果を例示する。
図１２は、生体外全血の血小板凝集の阻止に対するジピリダモール（〜１μＭ）及びシロスタゾール（〜１μＭ）相乗効果を例示する。
【００１３】
図１３は、単離されたウサギのランゲンドルフ（Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ）心臓の心機能に対するシロスタゾール及びジピリダモールの効果を研究するために用いられた実験計画（プロトコル）を例示する。
図１４は、収縮（Ａ）、心拍数（Ｂ）及び冠状動脈流（Ｃ）に対しての、単独での、又は組み合わせでの、シロスタゾール（１、３及び１０μＭ）及びジピリダモール（０．３、１及び３μＭ）の効果を例示する。
【００１４】
図１５は、安静、（電気刺激を用いての）運動、大腿動脈を閉塞することによる虚血及び再灌流の間の腓腹筋の筋肉血流に対する低水準のシロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせの効果を試験するための試験計画（プロトコル）を例示する。
図１６は、シロスタゾール（１μＭ）と、ジピリダモール（１μＭ）との組み合わせを用いての処置が、非処置筋肉内におけるものと比較して、運動腓腹筋の筋肉における血流を有意義に増大させ、そして虚血期間後の血流回復を改良させたことを例示する。
【００１５】
発明の詳細な記載
本発明は、（ＩＣのような）ＰＡＯＤ、卒中発作、冠状動脈血栓症及び再狭窄のような症状のための、安全な且つ有効な医薬組成物に対する当業界の要求に向けられている。シロスタゾールはＩＣの治療のために市販されており、そして卒中発作（Ｇｏｔｏｈ、Ｔｏｈｇｉ、Ｈｉｒａｉ、Ｔｅｒａｓｈｉ、Ｆｕｋｕｕｃｈｉ、Ｏｔｏｍｏ、Ｓｈｉｎｏｈａｒａ、Ｉｔｏｈ、Ｍａｔｓｕｄａ、Ｓａｗａｄａ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｎｉｓｈｉｍａｒｕ及びＯｈａｓｈｉ，２０００（文献５））、冠状動脈経皮経管的冠状動脈血管形成術（ＰＴＣＡ）後の冠状動脈血栓症（Ｐａｒｋ、Ｌｅｅ、Ｋｉｍｕ、Ｌｅｅ、Ｐａｒｋ、Ｈｏｎｇ、Ｋｉｍ及びＰａｒｋ，１９９９（文献１３））、及び再狭窄（Ｔｓｕｃｈｉｋａｎｅ、Ｆｕｋｕｈａｒａ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、Ｋｉｒｉｎｏ、Ｙａｍａｓａｋｉ、Ｉｚｕｍｉ、Ｏｔｓｕｊｉ、Ｔａｔｅｙａｍａ、Ｓａｋｕｒａｉ及びＡｗａｔａ，１９９９（文献１７））の予防において有効であることが示されている。シロスタゾールは、ＰＤＥ３を阻害し、そして得られた抗血小板及び血管拡張作用は、その治療的作用に起因しているように思われる。しかしながら、ＰＤＥ３阻害の、可能性ある心臓副作用は重要な問題である。事実、ミルリノンを用いての以前の臨床上の経験の故、何らかの重症のＣＨＦにおいて、シロスタゾールは使用が禁止されている。
【００１６】
最近の研究は、シロスタゾールが、ミルリノンを用いては与えられない働きの予想外のメカニズムを有することを示している。事実シロスタゾールは、心室筋細胞、冠状動脈平滑筋細胞、内皮細胞、赤血球及び血小板を包含する種々の細胞中へのアデノシン摂取を阻害することを示している。シロスタゾールは、約５〜１０μＭのＩＣ５０でアデノシン摂取を阻害する。対照的にミルリノンは、１００μＭほども高い濃度で有意義な阻害作用を有しない（Ｌｉｕ、等，２０００（文献９））。ＰＤＥ３及びアデノシン摂取を阻害するその能力の故、本発明者はシテロスタゾールを１種のＭＰＤＥＩであると考える。
【００１７】
アデノシン摂取の阻害は、アデノシンが血管拡張及び血小板凝集の阻止を包含する広い範囲の生物学的効果を誘導するので有意義である。アデノシンはまた、心臓に対して陰性の筋変力作用及び変時性作用を発揮する。血管系及び血小板に対するアデノシンの作用はアデノシンＡ２  受容体の活性化により媒介される。アデノシンＡ２  受容体は、アデニル酸シクラーゼを刺激し、それによりｃＡＭＰの細胞内の濃度を増大するようにＧＳ  タンパク質を誘発する。心筋に対するアデノシンの周知の抗アドレナリン作用は、アデノシンＡ１  受容体の活性化により媒介される。アデノシンＡ１  受容体はアデニル酸シクラーゼを阻害し、それによりｃＡＭＰの細胞内濃度を減少させるようにＧｉ  タンパク質を誘発する（Ｄｏｂｓｏｎ及びＦｅｎｔｏｎ，１９９８（文献２）；Ｇｅｏｒｇｅ、等，１９９１（文献４）；Ｎａｒａｙａｎ、等，２０００（文献１１））。アデノシン摂取の阻害は、アデノシンの間質系及び循環系の水準を増大させる。細胞外アデノシンの増大はＰＤＥ３阻害の抗血小板作用を高め（Ｓｕｎ、等，２００１（文献１５））、ＰＤＥ３の血管拡張作用を高め、そしてＰＤＥ３阻害の陽性の筋変力作用を減少させる（Ｗａｎｇ、等，２００１（文献１８））好ましい結果を与える。ＰＤＥ３の阻害により生じた陽性の筋変力作用に対するアデノシンの強力な拮抗作用は、ミルリノンと比較してシロスタゾールによる心臓収縮性におけるより小さな増大の誘導により示され（Ｃｏｎｅ、等，１９９９（文献１））、そして単離されたウサギ心臓におけるシロスタゾールの強心作用を増大させるアデノシンＡ１  拮抗質の能力により示された（Ｗａｎｇ、Ｃｏｎｅ、Ｆｏｎｇ、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ、Ｋａｍｂａｙａｓｈｉ及びＬｉｕ，２００１（文献１８））。さらに、アデノシンは心臓保護の重要な局所媒体としての意味を持っており（Ｄｏｗｎｅｙ、等，１９９４（文献３））、そして骨格筋及び神経細胞における虚血及び再灌血流からの損傷を減少させることが示されていた（Ｗａｎｇ、等，１９９６（文献１９）；Ｗｈｅｔｚｅｌ、等，１９９７（文献２０））。全体として、アデノシンは、運動訓練によりもたらされる跛行距離における増大において役割を果たすことができ、そしてＩＣ関連症状に対して好ましい効果を発揮することができる（Ｌａｇｈｉ、等、１９９７（文献８）；Ｐａｓｉｎｉ、等、２０００（文献１４））。
【００１８】
アデノシン摂取の阻害のためのシロスタゾールの能力は、そのＰＤＥ３の阻害のための能力よりも、ひと桁以上低い（５〜１０μＭ対０．３２μＭ）（Ｌｉｕ、等，２０００（文献９））。陽性の筋変力作用を減少させ、且つ抗血小板凝集を増大させるのに十分である一方で、シロスタゾールにより生じた細胞外アデノシンの増大は、強力なアデノシン摂取阻害薬ジピリダモールにより生じるものと軽く匹敵している（ＩＣ５０１０ｎＭ）。それ故、ＩＣの治療におけるシロスタゾールの効力を増大させ、そしてシロスタゾールの潜在的な心臓副作用を減少させる１つの治療的方法は、このＭＰＤＥＩを少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬（例えばジピリダモール）と組み合わせることである。本出願人は、シロスタゾールと強力なアデノシン摂取阻害薬との組み合わせが、ＰＤＥ３阻害薬又はアデノシン摂取阻害薬の単独の相加的（添加）効果に起因する可能性がある効果よりも大きい抗血小板効果を生ずることを発見した。事実、その組み合わせは、異なるメカニズムの働きの寄与を確認する血小板機能の相乗的阻害を生じた。さらに、その組み合わせは、シロスタゾール単独での陽性の筋変力作用を減少させることが見い出された。さらに、低い水準のシロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせは、運動した腓腹筋の筋肉において血液流を増大させ、そして虚血の或る期間後に組織流回復を改良させる（それに対して、各々の医薬単独では血液流を有意義に変化させない）。したがって、得られた組み合わせは、血小板凝集及び血管収縮を包含する疾患のための安全な且つ有効な治療を提供する。これらの疾患は、（ＩＣのような）ＰＡＯＰ、卒中発作、及び冠状動脈血栓症を包含する。この組み合わせはまた、シロスタゾールによる平滑筋増殖の阻止により、冠状動脈再狭窄を治療するために用いられることができる。
【００１９】
ＩＣにおいてのその有益な効果に加えて、シロスタゾールは卒中発作の再発の予防において有効であることが示された（Ｇｏｔｏｈ、等，２０００（文献５））。ジピリダモールの単独で有効であるかどうかは知られていないけれども、アスピリンと組み合わせてのジピリダモールは、卒中発作の予防のためにＡｇｇｒｅｎｏｘＲ  （登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ製）として現在市販されている。ＡｇｇｒｅｎｏｘＲ  の有益な効果はジピリダモールとアスピリンとの相加的な抗血小板作用に起因している。種々の研究は、アスピリンのような他の抗血小板薬に優るシロスタゾールの利点を示した（Ｉｇａｗａ、等，１９９０（文献７）；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、等，１９９９（文献１０））。シロスタゾールとジピリダモールとは血小板凝集を相乗的に阻止するので、これらの２種の医薬の組み合わせは卒中発作の予防において少なくとも同じであるように有効であろう。
【００２０】
シロスタゾールは、冠状動脈ＰＴＣＡ後の血栓症の予防において首尾よく用いられて来た（Ｐａｒｋ、等，１９９９（文献１３））、そしてステントを用いての又はステントを用いることなしのＰＴＣＡ後の再狭窄の予防のために首尾よく用いられて来た（Ｔｓｕｃｈｉｋａｎｅ，等、１９９９（文献１７））。シロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせは、有害な心臓の副作用を減少させることにより、シロスタゾール単独よりも有効な且つ安全なものとして存在するであろう。
【００２１】
本発明の１つの態様において、本組成物は、血小板凝集の相乗的阻止を提供することができる量で、少なくとも１種のＭＰＤＥＩと少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬とを含む。本発明の他の態様は、細胞内ｃＡＭＰ水準の相乗的な上昇を提供することができる量で、少なくとも１種のＭＰＤＥＩ及び少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬を含む組成物を提供する。本発明はまた、ＰＤＥ３阻害薬又はアデノシン摂取阻害薬のいずれかの単独を用いた治療中に生ずる可能性があるよりも少ない副作用で、高められた治療的能力及び効力を達成させるために本組成物を用いて、（ＩＣのような）ＰＡＯＤ、卒中発作及び冠状動脈血栓症及び再狭窄を治療する方法を提供する。
【００２２】
本明細書において用いられるものとして“ＰＤＥ３阻害薬”とは、ＰＤＥタイプＩＩＩの活性を阻害するか又は選択的に減少できる薬剤を言う。本発明に従うＰＤＥ３阻害薬は、ＰＤＥ３を阻害する任意の既知の化合物であるか、又はその上に、ＰＤＥ３を阻害する発見された化合物であることができる。許容できるＰＤＥ３阻害薬は以下のものを包含する：ミルリノン及びアムリノンのようなビピリジン類；ピロキシモン（ｐｉｒｏｘｉｍｏｎｅ）及びエノキシモン（ｅｎｏｘｉｍｏｎｅ）のようなイミダゾロン類；イマゾダン（ｉｍａｚｏｄａｎ）及び５−メチル−イマゾダンのようなイミダゾリン類；インドリダン（ｉｎｄｏｌｉｄａｎ）及びＬＹ１８１５１２のようなジヒドロピリダジノン類；シロスタミド（ｃｉｌｏｓｔａｍｉｄｅ）、シロスタゾール（ｃｉｌｏｓｔａｚｏｌ）及びＯＰＣ３９１１のようなジヒドロキノリノン化合物；そしてアナグレリド（ａｎａｇｒｅｌｉｄｅ）、ベモラダン（ｂｅｍｏｒａｄａｎ）、イブジラスト（ｉｂｕｄｉｌａｓｔ）、イソマゾール（ｉｓｏｍａｚｏｌｅ）、リキサジノン（ｌｉｘａｚｉｎｏｎｅ）、モタピゾン（ｍｏｔａｐｉｚｏｎｅ）、オルプリノン（ｏｌｐｒｉｎｏｎｅ）、フタラジノール（ｐｈｔｈａｌａｚｉｎｏｌ）、ピモベンダン（ｐｉｍｏｂｅｎｄａｎ）、クアジノン（ｑｕａｚｉｎｏｎｅ）、シグアゾダン（ｓｉｇｕａｚｏｄａｎ）、及びトレキンシン（ｔｒｅｑｕｉｎｓｉｎ）のような他の化合物。
【００２３】
本明細書において用いられるものとして“ＭＰＤＥＩ”とは、ＰＤＥ３の活性を阻害するか又は選択的に減少することができ、そして細胞中へのアデノシン輸送を遮断するのに有効である薬剤を言う。本発明に従うＭＰＤＥＩはＰＤＥ３を阻害し、そしてアデノシンの摂取を減少させる任意の既知の多機能性ＰＤＥ阻害薬化合物であることができるか、又はその上に、発見されたそのＰＤＥ阻害薬であることができる。許容できるＭＰＤＥＩ類はシロスタゾール及びなお発見されるべき他のものを包含する。
【００２４】
本明細書において用いられるものとして“アデノシン摂取阻害薬”とは、細胞中へのアデノシン輸送を遮断するのに有効である任意の薬剤を言う。そのようなアデノシン摂取阻害薬は、アデノシン輸送を阻止することを示した既知の化合物、それらの類似体及び誘導体、ならびにその上になお確認される他のアデノシン摂取阻害薬を包含する。許容できるアデノシン摂取阻害薬は、以下のものを包含する：ジピリダモール；プロペントフィリン（ｐｒｏｐｅｎｔｏｆｙｌｌｉｎｅ）；ジラゼプ（ｄｉｌａｚｅｐ）；ニトロベンジルチオイノシン；Ｓ−（４−ニトロベンジル）−６−チオグアノシン；Ｓ−（４−ニトロベンジル）−６−チオイノシン；ヨードヒドロキシニトロベンジルチオイノシン；ミオフラジン；及びそれらのエステル類、アミド類及びプロドラッグ、及びそれらの医薬的に許容できる塩。
【００２５】
本発明は、少なくとも１種のＭＰＤＥＩと少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬との組み合わせ（即ち本医薬組成物）の医薬的に有効な量を投与することによる、（ＩＣのような）ＰＡＯＤ、卒中発作、冠状動脈血栓症、あるいは過剰の血小板凝集又は動脈閉塞、等から生ずるものとして特徴づけられる、他の症状及び疾患、そして平滑筋増殖から生ずる冠状動脈再狭窄の治療に関する。本明細書において用いられるものとして、医薬的に有効なとは、上に記載された症状又は疾患のいずれかの発生又は重症度の程度を減少させることができる薬剤の量を言う。当業者に知られているように、上記症状は、患った手足の不快感又は苦痛、壊疽、等を包含する。全体的に、医薬組成物の有効な投与量は、上記された症状及び疾患を予防するか、改善するか、又はさもなくば治療するために十分な量で、ＰＤＥ３活性の減少を起こさせ、そして血小板及び他の血液細胞、ならびに血管平滑筋細胞におけるアデノシン摂取の減少を起こさせるであろう。
【００２６】
当業者は、当業界に知られている技術を用いて本発明のＭＰＤＥＩ類及びアデノシン摂取阻害薬の個々の投与量を決定し、そして最適化することができるだろう。これらの技術は、例えばＧｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎのＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ第９版（１９９６）の第３頁〜第４１頁（この全体において参照することにより本明細書に組み入れる）に記載されている。投与量は確立された検量試験、慣用の投与−応答及び時間−応答研究、及び慣用の薬物動態学及び代謝研究の使用によって確認され且つ最適化されることができる。治療のための適当な投与量を決定するために必要な計算の追加の精密な推論は、当業者により日常的に行われ、そして不当な実験を行うことなしにこれらにより日常的に行われる仕事の一系列内に入る。例えば細胞培養検査及び動物研究から得られたデータは、患者において使用するための範囲の投与量を処方するのに用いられることができる。これらの投与量は、使用される薬剤投与型及び投与の経路に依存してこの範囲内で変化させることができる。本発明の方法において使用される任意の組成物について、治療的に有効な投与量は細胞培養検査から、始めに概算されることができる。
【００２７】
投与量は、細胞培養において決定されたように循環している血液血漿濃度範囲を達成させるために配合されることができる。１つの処方物として又は別々の処方物として２種以上の化合物が投与されるべきである場合、投与量（１又は複数）は、細胞培養において決定されたように、循環している血液血漿において２種以上の化合物の間のモル比範囲を達成させるように処方されることができる。例えば本発明の１つの態様において、シロスタゾール及びジピリダモールを含む組成物は、シロスタゾールについて約０．３μＭ〜約１０μＭの血液濃度を生成し、そしてジピリダモールについて約０．１μＭ〜約３μＭの血液濃度を生成する。他の態様において、シロスタゾール及びジピリダモールを含む組成物は、シロスタゾールについて０．５μＭ〜５μＭ又は１μＭ〜３μＭの血液濃度を生成し、そしてジピリダモールについて１μＭ〜３μＭの血液濃度を生成する。したがって、本発明の１つの態様において、シロスタゾール及びジピリダモールを含む組成物は、約０．１：１〜約１：０．０１の、血液中のシロスタゾール：ジピリダモールのモル比を生成する。本発明の他の態様においてシロスタゾール及びジピリダモールを含む組成物は約０．１６：１〜約１：０．２、又は約０．３３：１〜約１：０．３３の、血液中のシロスタゾール：ジピリダモールのモル比を生成する。
【００２８】
現在臨床的に利用できる処方物を用いて、これらの水準の血液濃度は、シロスタゾール（ＰｌｅｔａｌＲ  （プレタール、登録商標））について２０ｍｇ〜３００ｍｇの毎日の投与量に等価値であり、そしてジピリダモール（Ｐｅｒｓａｎｔｉｎｅ−ＲｅｔａｒｄＲ  （登録商標））について２００ｍｇ〜６００ｍｇの毎日の投与量に等価値である。他の態様において、血液濃度のこれらの水準は、シロスタゾールについて５０ｍｇ〜２００ｍｇ、又は５０ｍｇ〜１６０ｍｇの毎日の投与量に等価値であり、ジピリダモールについて２００ｍｇ〜６００ｍｇの毎日の投与量に等価値である。したがって、シロスタゾールとジピリダモールとを含む医薬調剤は約１：０．７〜約１：３０のシロスタゾール：ジピリダモールの重量比を有する。他の態様において、シロスタゾール及びジピリダモールを含む医薬調剤は、約１：１〜約１：１２、又は約１：１．２５〜約１：１２のシロスタゾール：ジピリダモールの重量比を有する。血液中の水準は、高速液体クロマトグラフィーにより、又は当業界に知られている他の方法により測定されることができる。
【００２９】
さらに、本発明の方法において投与されるべき個々のＭＰＤＥＩ類及びアデノシン摂取阻害薬の投与量は、例えば治療されるべき特定の症状及び疾患、投与の様式、そして治療されるべき患者の年齢、体重及び性別に依存して変化するだろう。事実個々の患者は、症状及び疾患の重症度において、広い変化を示す可能性があり、そして各々の医薬はその特有の治療特性を有するので、各々の患者のために使用される投与の正確な様式及び投与量は、開業医の判断に任せられる。
【００３０】
本明細書において用いられるものとして“患者”とは、上記の症状及び疾患に対しての治療を必要としている任意のヒト及びヒトでない動物を言い、又はヒト及びヒトでない動物を包含する、その治療が有益であり得る任意の患者を言う。治療されるべきそのようなヒトでない動物は、すべての家畜の、及び野性の脊椎動物、好ましくは、ハツカネズミ、ネズミ、ウサギ、魚、鳥、ハムスター、犬、猫、豚、羊、馬、牛、及びヒトでない哺乳動物を包含するが、しかしそれらに限定されない。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、１種以上の医薬的に許容できる担体又は賦形剤及び随意的に他の治療薬と一緒に活性成分（即ち、少なくとも１種のＭＰＤＥＩ又はその医薬的に許容できる塩と、少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬又はその医薬的に許容できる塩との組み合わせ）の処方物からなる。担体（１種又は複数種）は、組成物の他の成分と相容性である意味において許容できなければならなく、そして組成物の受容者に対して有害であってはならない。本組成物の個々の成分が一緒に、又は別々に投与される場合、それらは一般に医薬処方物として提供される。
【００３２】
適当な処方物は、経口投与、経直腸投与、経鼻投与、（経皮、経頬、及び舌下投与を包含する）局所投与、膣内投与、（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内投与を包含する）非経口投与のために適している処方物を包含する。処方物は、例えば（１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ発行の）ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１８版：特に、パート８：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照）（この文献をその全体において参照することにより本明細書に組み入れる）のＧｅｎｎａｒｏ，等において記載された方法のような方法を用いて、調剤の業界において周知の任意の方法により調製されることができる。そのような方法は、活性成分を、１種以上の補助成分を構成する担体と一緒にする工程を包含する。そのような補助成分は、充てん剤、結合剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、着色料、香味料及び湿潤剤のような当業界に慣用の成分を包含する。
【００３３】
経口投与のために適当な処方物は、粉末又は顆粒として、あるいは溶液又は懸濁液として、各々が所定の量の活性成分を含有する丸薬、錠剤又はカプセルのような個々の単位として、提供されることができる。活性成分はまた、大丸薬又はペーストとして提供されることができ、あるいはリポソーム（人工小胞）内に含有されることができる。
経直腸投与のための処方物は、坐薬又は浣腸剤として、提供されることができる。
【００３４】
非経口投与のために、適当な処方物は水性及び非水性滅菌注射液を包含する。その処方物は、単位投与量又は多投与量容器、例えば密封された小瓶及びアンプル中に提供されることができ、そして使用の前に滅菌液体担体、例えば水の添加だけを必要とする凍結乾燥された状態で貯蔵されることができる。
【００３５】
経鼻的吸入により投与されるために適当な処方物は、計量された投与の加圧エーロゾル、ネブライザー、吹入器により発生されることができる微粉又は噴霧を包含する。
【００３６】
本発明はさらに、少なくとも１種のＭＰＤＥＩ（又はその医薬的に許容できる塩）と、少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬（又はその医薬的に許容できる塩）との組み合わせを、そのための１種以上の医薬的に許容できる担体と一緒にすることからなる医薬組成物の製造のための方法を提供する。
【実施例】
【００３７】
本発明は、如何なる方法であっても限定されることを意図しない、以下の諸例により例示される。
【００３８】
例  １
シロスタゾール及びジピリダモールはインピトロでのヒト洗浄血小板の凝集を阻止する
洗浄血小板の調製
１９Ｇ蝶形針を用いて２−注射器技術により（少なくとも１０日間医薬を受け入れていない）１０人の健康なボランティアから、末梢血液サンプルを収集した。血液を引き抜くための方法は、ヘルシンキ協定に従う規格条例委員会（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｃｏｍｍｉｔｅｅ）により認容された。９容量の血液は、１容量のくえん酸三ナトリウム（３．８％）を含有する注射器中に直接に集められた。室温で１５分間１５０ｘｇで遠心分離後に血小板に富む血漿（ＰＲＰ）を集めた。洗浄された血小板（ＷＰ）懸濁液は、Ｃｏｎｅ、等（Ｃｏｎｅ、等１９９９ａ（文献１））（この文献を参照することにより本明細書に組み入れる）において以前に記載されたようなクエン酸塩洗浄法によりクエン酸塩ＰＲＰから調製された。血小板は、最後に、ＴｙｒｏｄｅのＨＥＰＥＳ緩衝液（１３６．７ｍＭのＮａＣｌ、５．５ｍＭのデキストロース、２．６ｍＭのＫＣｌ、１３．８ｍＭのＮａＨＣＯ３  、１ｍＭのＭｇＣｌ２  、０．３６ｍＭのＮａＨ２  ＰＯ４  及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中に再懸濁された。血小板濃度は、３．８ｘ１０８  血小板／ｍｌに調節された。
【００３９】
試験化合物の記載
シロスタゾール（ＯＰＣ−１３０１３）：
ＰＤＥ３を選択的に阻害し、そしてｃＡＭＰ水準を上昇させることにより血小板凝集を防止するＭＰＤＥＩ（日本の徳島の大塚製薬株式会社により提供された：Ｌｏｔ＃Ｂ８Ｅ８８Ｍ）。
ジピリダモール：
血管及び血液細胞中へのアデノシンの摂取を遮断する抗血小板薬（カリフォルニア州、ラ・ホーヤのＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ製：Ｃａｔ＃３２２３２８，Ｌｏｔ＃Ｂ１１７５５）。
ＺＭ２４１３８５：
選択的アデノシンＡ２Ａ受容体遮断薬（ミズーリ州ボールウイン（Ｂａｌｌｗｉｎ）のＴｏｃｒｉｓ製、Ｃａｔ＃１０３６，Ｂａｔｃｈ＃２／１８０７４）。
【００４０】
洗浄された血小板の凝集の検出
凝集は、ＡＧ−１０凝集分析器（日本のＫｏｗａ製）を用いて光透過における変化により定量化された。洗浄された血小板は室温に維持され、その研究は血液収集後３時間内に行われた。シロスタゾールをＤＭＳＯに溶解し、そしてアデノシンを水中に溶解した。０．２％以下にＤＭＳＯの最終濃度を維持しながら、所望の操作濃度を得るために適当な希釈が行われた。血小板懸濁液（４００μｌ）をピペットでとって凝集キュベット中に入れ、そして１分間３７℃で１０００ｒｐｍでかき混ぜながらインキュベートした。医薬又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を次に加え（０．４μｌ）、そしてもう３分間インキュベートした。ジピリダモールとの相乗作用について試験するときに、医薬又はＤＭＳＯの添加後にジピリダモール（１、３及び１０μＭ）及び１μＭのアデノシンを１分間加え、その結果、ジピリダモール及びアデノシンについての全体的インキュベーション時間は２分間であった。次にその懸濁液を１〜２μｇ／ｍｌのコラーゲン（ペンシルベニア州、ＨａｖｅｒｔｏｗｎのＣｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ  Ｃｏｒｐ．製）で刺激した。記録された凝集の全体時間は１５分であった。（コラーゲン添加後の）最後の１１分の間の最大光透過値が対照凝集（ＤＭＳＯ＋エタノール＋アデノシン）のパーセンテージとして提供された。
【００４１】
シロスタゾール及びジピリダモールは洗浄された血小板の凝集を相乗的に阻止する
洗浄された血小板の凝集に対してのアデノシンとシロスタゾールとの相乗効果を研究するために、１μＭのアデノシンの存在下に、コラーゲンの量を各々個々提供者について滴定した。１μＭのアデノシンが凝集に対して作用を示さなかったコラーゲン（１〜５μｇ／ｍｌ）の最少濃度が用いられた。シロスタゾール（１μＭ）又はアデノシン（１μＭ）それ自体ではコラーゲン誘導血小板凝集に対してほとんど効果を有しなかった（図１ａ、図１ｂ、図１ｃ）。しかしながら、両方を組み合わせると血小板凝集を完全に阻止した（図１ｄ）。
【００４２】
ジピリダモール（１、３及び１０μＭ）と組み合わせてのシロスタゾールによる洗浄血小板のコラーゲン誘導凝集の濃度依存性阻止が、アデノシン（１μＭ）の存在下に行われた。図２おいて示されるように、シロスタゾールは血小板凝集を投与量依存的に阻止した。アデノシンを添加すると左に阻止曲線が移動した（図２）。計算されたＩＣ５０は、２．６６±０．４１μＭから０．３８±０．０５μＭに減少された（ｐ＜０．００１、二尾対スチューデントｔ−試験）。ジピリダモールは、投与量依存的に、アデノシンとのシロスタゾールの阻止曲線をさらに左に移動した。ＩＣ５０は、１μＭのジピリダモールの存在下に０．１７±０．０４μＭ（ｐ＜０．０５）に、３μＭのジピリダモールの存在下に０．１１±０．６６μＭ（ｐ＜０．０５）に、そして１０μＭのジピリダモールの存在下に０．０１±０．０１μＭ（ｐ＜０．００５）に移動した（表１）。そのデータは、ジピリダモールとシロスタゾールとの組み合わせが血小板凝集の阻止について、相加的効果よりもむしろ、相乗効果を発揮したことを示している。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
シロスタゾールとジピリダモールとの相乗効果は、５人の追加の提供者からの洗浄された血小板を用いて再確認されたが、しかしこのときは３０及び１００ｎＭのシロスタゾールに重点をおいて、再確認された。図３は、アデノシン（１μＭ）及びジピリダモール（１、３及び１０μＭ）の存在下に１及び３μＭのシロスタゾールが加えられたときに対照（医薬添加なし）と比較した血小板凝集の％阻止を示す。対照と比較して、ジピリダモール（１、３又は１０μＭ）又はシロスタゾール（３０又は１００ｎＭ）単独では、試験された濃度で洗浄された血小板凝集に有意義な阻止効果を有していなかった（図３及び４）。アデノシンの添加（１μＭ（この濃度でのアデノシン単独による効果は観察されなかった））は、ジピリダモールの効果を有意義に上昇させた（図３）。１００ｎＭのシロスタゾールの添加でさらに上昇が観察されたが、しかし３０ｎＭのシロスタゾールの添加では上昇が観察されなかった。
【００４５】
それ故、ジピリダモールとシロスタゾールとの２種の化合物間の相乗効果に起因して、アデノシンの存在下に、１μＭのジピリダモールと１００ｎＭのシロスタゾールとの組み合わせを用いて、血小板凝集に対する１０μＭのジピリダモールの阻止効果が達成された。図４は、１、３又は１０μＭのジピリダモールが１μＭのアデノシン及び３０又は１００ｎＭのシロスタゾールの存在下に加えられた場合に対照と比較した血小板凝集の％阻止を示す。１μＭのアデノシンとの３０又は１００ｎＭのシロスタゾールの組み合わせは、対照とは有意義な差を示したが、しかしそれらのいずれかの単独では有意義な差を示さなかった。両方のシロスタゾール濃度（３０及び１００ｎＭ）での、その組み合わせへのジピリダモールの添加は、すべての３つの濃度で阻止効果を有意義に上昇させた。
【００４６】
また、それらの２種の化合物間の相乗効果は、１００ｎＭのシロスタゾールと同等な効果が、アデノシンの存在下に３μＭのジピリダモールとの３０ｎＭのシロスタゾールの組み合わせにより達成させることができたことにおいて例示されることができる。予期されたように、アデノシン無しでのジピリダモールとのシロスタゾールの組み合わせは、洗浄された血小板の凝集に対して効果を有せず（データは示さず）、アデノシンがシロスタゾールとジピリダモールとの相乗効果の仲介者であることを示唆している。それ故、これらの実験はシロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせが血小板凝集を相乗的に阻止することを明らかに示した。このことは、高い濃度の各々の薬剤が単独で用いられて得られるのと同じ効能を達成させるために、組み合わせで各々の薬剤の非常に低い濃度の使用を可能にするだろう。以下に示されるように、その相乗効果は、細胞内ｃＡＭＰ水準の高められた上昇に起因しているものと信じられた。
【００４７】
例  ２
シロスタゾール及びジピリダモールは細胞内ｃＡＭＰの濃度を相乗的に増大させる
血小板におけるｃＡＭＰの測定
アデノシン、シロスタゾール又はジピリダモールを単独で又は組み合わせて、まず、別々のポリプロピレン試験管中に等分して分けて入れた。対照として、ＤＭＳＯ及びエタノールを用いた。単独で又は組み合わせて、試験薬剤を、簡単な渦動によりＰＲＰと混合した。最終のサンプルの容積は２００μｌであり、そして各々の実験を２回ずつ行った。５分間３７℃でサンプルをインキュベートした後に氷冷過塩素酸（ＰＣＡ、１．２５Ｎ）の５０μｌを添加することにより反応を停止させた。いったん凍結及び解凍した後、混合物をＫＨＣＯ３  （１．２５Ｎ）の５０μｌで中和し、そして４℃で１５分間２０，０００ｘｇで遠心分離した。得られた上澄み液を収集し、そしてキットで提供された酢酸塩緩衝液で希釈した。ｃＡＭＰ濃度は、ｃＡＭＰ放射線免疫アッセイキット（マサチューセッツ州、ボストンのＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製のＮＥＫ−０３３）を用いて２回測定した。
【００４８】
ヒトアデノシンＡ２Ａ受容体を発現するＣＨＯ細胞の造成
トータルのＲＮＡを新しいヒト血小板から抽出し、５μｇをｃＤＮＡ中に逆転写し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型として用いた。アデノシンＡ２Ａ受容体についてのＫｏｚａｋ配列（ＣＣＣＡＣＣ）を有する特異的プライマーがテザインされ（前方プライマー：５’−ＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＴ−３’、逆プライマー：５’−ＴＣＡＧＧＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣ−３’）、そしてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（メリーランド州、ロックビル）により合成された。これらのプライマーを用いて、十分なコード領域が、ＰＣＲにより増幅され、そしてさらにクローニングベクター，ｐＣＲ２．１（カリフォルニア州、カールズバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に組み換えた。挿入するＤＮＡ配列が挿入前に確認された後に、哺乳動物発現ベクター，ｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入された。ルシフェラーゼの発現を駆動する、プロモーター領域におけるｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）を含有する発現ベクター（ｐＣＲＥ−Ｌｕｃ）がＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）から購入された。ルシフェラーゼ発現の水準は細胞内ｃＡＭＰの濃度を反映している。
【００４９】
アデノシンＡ２Ａ受容体がＧＳ  タンパク質にカップリングすることは知られている（Ｈｕｔｔｅｒｍａｎｎ、等，１９８４（文献６））。それ故、受容体の活性化は、発現水準がルシフェラーゼ活性アッセイにより測定されることができる、ルシフェラーゼ発現により反映されるだろう。アデノシンＡ２Ａ受容体を含有するベクターとのルシフェラーゼレポーターベクターの同時トランスフェクションは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中への燐酸カルシウム沈殿により行われた。安定なトランスフェクション剤（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）は、１２日間１．０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて選択された。機能性アデノシンＡ２Ａ受容体を過剰発現する（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）細胞クローンが、アデノシンの刺激下でのルシフェラーゼ発現により決定された。
【００５０】
ルシフェラーゼアッセイ
ｃＡＭＰ上昇について、アデノシンを有するか、又はアデノシン無しでの、シロスタゾールとジピリダモールとの相乗的な効果を試験するために、透明な底を有する白色壁９６−ウェルプレート（マサチューセッツ州、ケンブリッジのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔｅｒ  Ｃｏ．製）中への近合流（ｎｅａｒ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で、細胞を継代培養した。次の日に、０．５％のＦＣＳを補充したＦ１２Ｋ媒質を用いて細胞を一度洗浄し、次に３７℃で４時間１００μｌの培地のみ（基礎）又は培地＋試験薬剤を用いてインキュベートした。室温に平衡化後１００μｌの検出基剤（ウイスコンシン州、マジソンのＰｒｏｍｅｇａ製Ｂｒｉｇｈｔ−ＧｌｏＴＭ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム）が各々のウェルに加えられた。ルシフェラーゼ活性は、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ＰｈＬルミネセンス板読み取り機（メリーランド州、ニューウインザーのＩｍｍＴｅｃｈ製）を用いて５分後に測定された。１／２秒中に検出されたルミネセンスの値（任意単位）がルシフェラーゼ活性として採用された。
【００５１】
シロスタゾール及びジピリダモールはｃＡＭＰの細胞内水準を相乗的に上昇させる
細胞内ｃＡＭＰ濃度に対するジピリダモール及びシロスタゾールの効果がまずＰＲＰにおいて研究された。図５Ａ及び５Ｂにおいて示されるように、０．３又は１μＭのアデノシンの存在下に、シロスタゾール（３μＭ）と組み合わせてのジピリダモール（３μＭ）は、どちらかの単独と比較した場合に血小板内ｃＡＭＰ水準をさらに増大させた（二度アッセイのｎ＝２）。血小板中の低い基礎ｃＡＭＰ水準の故、本発明者は、ヒト血小板アデノシンＡ２Ａ受容体を過剰発現したＣＨＯ細胞においてルシフェラーゼアッセイを確立した。ルシフェラーゼ活性の量は細胞内のｃＡＭＰ水準を反映する。アデノシン摂取に対するジピリダモールの阻害効果は血小板及び赤血球において同様であった。
【００５２】
図６は、０．０３μＭのアデノシン及び／又は１μＭのシロスタゾールの存在下にルシフェラーゼ活性についてのジピリダモールの効果を示す。同様に、図７は、０．０３μＭアデノシン及び／又は３μＭのシロスタゾールの存在下にルシフェラーゼ活性に対するジピリダモールの効果を示す（少なくとも３つの独立した実験の三つ組における代表）。図６及び７において示されるように、１及び３μＭのシロスタゾールは、３μＭのシロスタゾールの場合においてはアデノシンの不存在においてさえ、ジピリダモールの存在下にルシフェラーゼ活性を相乗的に上昇させた。ジピリダモールは、０．５μＭ〜１０μＭの範囲で、約５μＭでのピークで、シロスタゾールの効果を投与量依存的に上昇させた。全体で、これらの研究は、シロスタゾール及びジピリダモールがｃＡＭＰの細胞内濃度を上昇させるために相乗的に働き、そしてそれらが、これらの薬剤が血小板凝集を相乗的に阻止する有望なメカニズムを提供することを証明している。
【００５３】
例  ３
シロスタゾールはアデノシンの摂取を阻害する
洗浄された血小板及び赤血球中へのアデノシン摂取についてのアッセイ
洗浄された赤血球（ｗＲＢＣ）は、次のとおりにして調製された。初期の遠心分離、そしてＰＲＰ及び軟膜の除去の後に、赤色小球部分の１００μｌを、カルシウム及びマグネシウムを含有する１２ｍｌのＰＢＳ中に希釈した。ＲＢＣを５分間１５０ｘｇで回転させた。ＰＢＳでもう一度洗浄後、その小球を１ｘ１０８  ＲＢＣ／ｍｌとして、ＰＢＳ中に再懸濁させた。アデノシン摂取実験は、以前に記載された方法に従って行われた（Ｌｉｕ、Ｆｏｎｇ、Ｃｏｎｅ、Ｗａｎｇ、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ、及びＫａｍｂａｙａｓｈｉ，２０００（文献９））。１００μｌのＷＰ又はｗＲＢＣを５分間３７℃で５０μｌのシロスタゾール又はミルリノンと共にインキュベートした。次に５０μｌの１μＣｉの〔  ３Ｈ〕−アデノシン（ニュージャージー州、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）、１μＭのアデノシン及び２５μＭのエリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）アデノシン（ＥＨＮＡ、最終濃度；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ製）を加え、次に２００μｌの油（フタル酸ジブチル：フタル酸ジオクチル＝１：１、Ａｌｄｒｉｃｈ製）を加え、次に１分間インイュベートした。２分間１６，０００ｘｇでの遠心分離により細胞を水相中で遊離のアデノシンから分離した。該油及び水の相を除去した後に、細胞小球の放射能を、β−液体シンチレーション計数管（フィンランド国、トゥルクのＬＫＢ製、１２０９  Ｒａｃｋｂｅｔａ）を用いて測定した。
【００５４】
シロスタゾールはアデノシン摂取を阻害する
洗浄された血小板及び洗浄された赤血球を用いて、〔  ３Ｈ〕アデノシン摂取実験を行ったので、その結果を図８に示す。シロスタゾールは、約７μＭ（ｎ＝３）のＩＣ５０で血小板及び赤血球の両方においてアデノシン摂取を阻害した。摂取阻害についてのシロスタゾール（５〜１０μＭ）の能力はウサギ心臓筋細胞、ヒト血管平滑筋、及び内皮細胞について以前に報告された値と同様である（Ｌｉｕ、Ｆｏｎｇ、Ｃｏｎｅ、Ｗａｎｇ、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ及びＫａｍｂａｙａｓｈｉ，２０００（文献９））。対照的に、ミルリノンは血小板及び赤血球によるアデノシン摂取に対して実質的に効果を有しなかった。機能性ヒトＡ２Ａ受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞を、アデノシン摂取を阻害することにおけるシロスタゾールの役割をさらに確認するために用いた。シロスタゾールは血小板及び赤血球に対してと同じ能力でこれらのＣＨＯ細胞中への〔  ３Ｈ〕アデノシン摂取を阻害したが、ミルリノンは効果を有しなかった（データは示さず）。
【００５５】
例  ４
シロスタゾール及びジピリダモールはインビトロでのヒト全血における血小板の凝集を阻止する
全血の調製
血液の１０ｍｌ当たり４μｌのヒルジン（２５０Ｕ／μｌ）を含有する注射器を用いて、２−注射器技術により１０人の健康なボランティア（少なくとも１０日間医薬を受け入れていない）から末梢血液サンプルを集めた。
【００５６】
全血血小板凝集の研究
血液サンプルを生理的食塩水で１：１に希釈し、１０００ｒｐｍのかき混ぜ速度でＣｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ全血血小板凝集計を用いて試験を行った。出発時に、かき混ぜ棒をプラスチックキュベット中に落下させ、次に１ｍｌの希釈全血を添加した。次に電極をキュベット中に入れ、そして機器に目盛り付けする一方で、サンプルを３７℃でインキュベートさせた。シロスタゾール及びＺＭ２４１３８５をＤＭＳＯに溶解して１００ｍＭのストック濃度とした。ジピリダモールをエタノール（ＥｔＯＨ）で希釈し１００ｍＭのストック濃度とした。１ｍｌの全血に加えたときに適当な試験用濃度のシロスタゾール（タンパク質へのシロスタゾールの結合性質の故、１０μＭ及び３０μＭ）、ジピリダモール（０．１、０．３、１又は３μＭ）及びＺＭ２４１３８５（０．１μＭ）が得られるように、さらに希釈を行った。医薬及びビヒクルは、ＤＭＳＯの最終濃度が０．２％を超えないように、１μｌ容積で加えられた。懸濁液を３分間インキュベートさせた後に、コラーゲンを加えた。
【００５７】
この研究において使用されたコラーゲン濃度は、予備スクリーニングにより測定されて、０．５μｇ／ｍｌであった。シロスタゾールとジピリダモールとの間の相乗作用を試験するために、ジピリダモール（１μｌストック）は、シロスタゾールの添加後１分に加えられた。これらの医薬の逆作用を調べるために、医薬添加の１分前に０．１μＭのＺＭ２４１３８５（１μｌ）を加えた。ＺＭ２４１３８５を合計４分間、シロスタゾール又はＤＭＳＯを３分間、そしてジピリダモールを２分間、インキュベートするように、医薬の添加後３分においてコラーゲンを加えた。
【００５８】
刺激後に、許容度（幅、ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）は、データ提供のために用いられた最大許容度で、１１分間観察された。より低濃度のシロスタゾールがまた、全血中の血小板凝集を阻止するためにジピリダモールと相乗作用することができるかどうかを試験するために、より低い能力の凝集を生ずるが患者における症状に一層関連しているやや低い濃度のコラーゲン（０．１又は０．３μｇ／ｍｌ）で、本発明者は血小板を刺激した。シロスタゾール（０．３、０．７、１及び３μＭ）とジピリダモール（１及び３μＭ）との異なる組み合わせを調べた。データは、全く阻止が存在しない検出値のパーセントとして表される。
【００５９】
血漿におけるアデノシン濃度の測定
血液を採取し、そして組み換えヒトヒルジン（１００Ｕ／ｍｌ）と混合した。血小板凝集のための同じ方法がコラーゲン（２μｇ／ｍｌ）を用いてのこれらの血小板を刺激するために用いられた。５分間インキュベーションの後に、５００μｌのＷＢを、５００μｌの氷冷食塩水と迅速に混合した。細胞を、４℃で４分間２０，０００ｘｇで回転させた。上澄み液（６００μｌ）を３００μｌのＰＣＡ（２．５Ｎ）とまず混合し、次に３００μｌのＫＨＣＯ３  （２．５Ｍ）で中和した。最後に、４℃で１５分間２０，０００ｘｇで混合物を遠心分離した。Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ３μ  Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ  ｘ  ４．６ｍｍ）及び２０ｍＭのＫＨ２  ＰＯ４  中の５％から２０％までのメタノールの勾配を用いての逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０）を用いて上澄み液中のアデノシン濃度を測定した。２５８ｎｍでの吸光度変化を有するダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒ  ９９６）を用いてアデノシンを検出し、そして持続期間及びピーク高さを既知の外部標準と比較することにより定量化した。定量化は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ３２Ｃｌｉｅｎｔ／Ｓｅｒｖｅｒソフトウエアを用いて行った。
【００６０】
多量のアデノシンは血小板活性化中に全血において生成される
ＨＰＬＣを用いて、全血の細胞外媒体中のアデノシン濃度を、２μｇ／ｍｌコラーゲンを用いての刺激後５分に測定した。図９において示されるように、恐らく活性化血小板からの放出ＡＴＰ及びＡＤＰの分解に起因して、コラーゲン刺激後に全血中多量のアデノシン（基礎２４０±５３ｎＭに比較して、３１５２±４２８ｎＭ、ｎ＝５）を生成した。ジピリダモール（１μＭ）の存在下に、血小板凝集は影響されなかったが、しかしアデノシン水準は５９１６±６４１ｎＭ（ｎ＝３）にさらに有意義に増大した。
【００６１】
シロスタゾール及びジピリダモールは全血中の血小板凝集を相乗的に阻止する
上に観察されるように、多量のアデノシンが血小板活性化中に生成され得るので、このアッセイに何らかの外因性のアデノシンを添加する必要がない。全血において、実験は、シロスタゾール（１０又は３０μＭ）又はジピリダモール（０．１、０．３、１又は３μＭ）単独では血小板凝集に対して有意義な効果を有しなかった（図１０）ことを示した。しかしながら、１０μＭのシロスタゾールと３μＭのジピリダモールとの組み合わせは、血小板凝集を有意義に阻止した（１０μＭのシロスタゾール単独についての９８．９±２．０％及び３μＭのジピリダモール単独についての９７．９±０．７％から、７４．８±６．２％へ、ｎ＝８、ｐ＜０．００５；図１０Ａ）。明らかな証拠は、低い濃度でさえ、ジピリダモールとの３０μＭのシロスタゾールの組み合わせを用いて見られた（ｎ＝５〜１４、図１０Ｂ）。その相乗効果は、シロスタゾール及びジピリダモールの両方について、投与量依存性であった。さらに、ＺＭ２４１３８５（０．１μＭ）、選択的アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗質の存在下に、ジピリダモールとシロスタゾールとの相乗効果はシロスタゾール単独（ｎ＝８）の基本水準にまで逆戻りし、相乗効果は血漿中のアデノシンの蓄積により仲介されたことを示唆している。
【００６２】
全血凝集がコラーゲンの０．１又は０．３μｇ／ｍｌにより誘導された場合、シロスタゾール（０．３μＭ〜３μＭ）とジピリダモール（１又は３μＭ）との組み合わせが血小板凝集を有意義に阻止した（図１１）ことを本発明者は観察した。例えば、０．７μＭのシロスタゾールと３μＭのジピリダモールとの組み合わせは、５７±１１％だけ血小板凝集を阻止し、そして１μＭのシロスタゾールと３μＭのジピリダモールとの組み合わせは７２±１１％（ｐ＜０．００１）だけ血小板凝集を阻止した。これらの濃度でのシロスタゾール又はジピリダモール単独では何ら有意義な阻止を生じなかった。
【００６３】
例  ５
シロスタゾール及びジピリダモールは体外でのヒト全血における血小板凝集を相乗的に阻止する
臨床的研究の計画
血小板凝集の阻止についてのシロスタゾールとジピリダモールとの相乗効果が健康なボランティアにおける臨床的に関連する投与量で観察されることができるかどうかを試験するために１期間、オープンラベル（ｏｐｅｎ  ｌａｂｅｌ）、連続的、クロスオーバー（ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）研究が計画された。６人の被検者が、研究の１日目において、シロスタゾール（ＰｌｅｔａｌＲ  （プレタール、登録商標））の１つの１００ｍｇ錠剤を受容した。研究の４日目において、被検者はジピリダモールの１つの２００ｍｇの錠剤を受容した。研究の６日目において、これらの被検者はシロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせを受容した。
【００６４】
全血血小板凝集
投与前、投与後２時間及び投与後４時間に、分別蒸留されたヘパリンの１０Ｕ／ｍｌを含有する注射器に５ｍｌの血液を引き入れた。次に、血液サンプルを生理食塩水で希釈し、１０００ｒｐｍのかき混ぜ速度でＣｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ全血血小板凝集計を用いて血小板凝集を測定した。血小板凝集はコラーゲン（０．３μｇ／ｍｌの最終濃度；ドイツ国ミュンヘンのＮｙｃｏｍｅｄ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ製）の添加により誘導された。パーセンテージ凝集が各々の時間点で記録された。医薬治療の効果を比較するために、２時間及び４時間での凝集が、投与前の値に対するパーセンテージとして基準に合わせられる。
【００６５】
シロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせは生体外全血血小板凝集を相乗的に阻止する
１００ｍｇの１回投与後２時間及び４時間でのシロスタゾールの血液濃度は約２μＭである。以前の薬物動態学的データに基づいて、２００ｍｇの１回投与後２時間及び４時間でのジピリダモールの血液濃度はまた、２μＭの範囲ある。血小板凝集計製造業者の指針に従って、食塩水との血液の１：１希釈の要件が存在するので、生体外血小板凝集アッセイにおける有効な医薬濃度はシロスタゾールについて１μＭであり、そしてジピリダモールについて１μＭであると推定される。予期されるように、これらの濃度で、シロスタゾール単独でも、又はジピリダモール単独でも、血小板凝集を阻止しなかった（図１２）。しかしながら、被検者がシロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせを用いて処置された後４時間で血小板凝集は４５％阻止された（前投与に対してｐ＜０．００１）。これらの結果は例４において記載されたインビトロ全血凝集研究において得られたデータに非常に類似している。
【００６６】
例  ６
ジピリダモールは心臓機能に対するシロスタゾールの潜在的に有害な作用に対抗する
外科的調製
この研究は、ワシントンＤＣのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌにより１９９６年に発行された“Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  Ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ”に従って行われ、そしてＯｔｓｕｋａ  Ｍａｒｙｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ委員会ＬＬＣにより許可された。２〜２．５ｋｇの重さを有する雄のウサギ（ニュージランドホワイト）を、耳の縁の静脈中への静脈内ペントバルビタール（３０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔した。気管切開を行い、そしてその動物に挿管した。通気はＨａｒｖａｒｄ小動物ベンチレーターを介して１００％Ｏ２  を補充した室内空気を用いた。呼吸速度は生理学的範囲での動脈血ＰＯ２  、ＰＣＯ２  及びｐＨを維持するように調節された。加熱用毛布を用いて体温を３８℃近くに維持した。胸の中央線での切開により心臓を露出させ、心臓の基部での切開により迅速に切り取り、そして氷冷されたＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ重炭酸塩緩衝液に入れた。次に心臓を動脈根によりＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置に取り付け、そして７５ｍｍＨｇの一定の圧力で再循環していないＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液で灌流した。
【００６７】
その灌流液に９５％Ｏ２  と５％ＣＯ２  とのガス混合物を用いて泡立て、生理的ｐＨ（７．３５〜７．４５）を維持するように泡立て速度を調節した。灌流液温度は緩衝液の液溜めをとり囲む循環水ジャケットにより３８℃に維持された。心臓はまた、中にそれを吊り下げている水ジャケット付きハウジングを介して、３８℃に維持された。ジャケットの開かれた頂部は、湿度及び温度を維持するために、一片のパラフィンでカバーされた。動脈根の右側の周りの肺動脈は、冠動脈流出液を収集するために、そしてメスシリンダーを用いての冠動脈流速測定のためにカニューレ挿入された。圧力変換器にカテーテルを介して接続された、食塩水を満たしたラテックスバルーンは左心室中に挿入され、そして０〜５ｍｍＨｇの拡張終期圧力を生ずるように膨らまされた。左心室圧力、その第１誘導（ｄｐ／ｄｔ）及び心拍数を記録するために圧力変換器をＧｒａｓｓ  Ｃｈａｒｔレコーダーに接続した。１５分の平衡期間の終わりに８５ｍｍＨｇ未満の圧力を発現する左心室を有する心臓は研究に包含されなかった。
【００６８】
心臓機能測定
測定された心臓機能インデックスは、ＬＶＤＰ（左心室発現圧力）、ｄｐ／ｄｔｍａｘ  （ＬＶＤＰの第１誘導の最大値）、心拍数及び冠動脈流であった。実験計画（プロトコル）を図１３に示す。１５分平衡後、心臓を５分間シロスタゾールで処置し、次にシロスタゾールとジピリダモールとで５分間処置した。医薬不存在灌流の１０分後に、心臓をジピリダモールで５分間処置した。心臓機能についての測定を各々５分の医薬処置の終わりに行った。医薬処置の効果は、各々の医薬処置の前の値と各々の医薬処置の後の値のパーセント変化として表される：
基準線からの％変化＝〔（医薬処置後の値  −  医薬処置前の値）／医薬
処置前の値〕  ｘ  １００
【００６９】
統計的分析
データは平均±ＳＥＭとして提供される。有意性（ｐ＜０．０５）を検出するために、対のｔ−試験が用いられた（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ２．０，カリフォルニア州サンラファエルのＪａｎｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【００７０】
ジピリダモールは心筋収縮能及び心拍数におけるシロスタゾール誘導化増大に対抗する
前の研究は、シロスタゾールが１μＭより下の濃度で心臓機能に最少の影響を有することを明らかにした。ジピリダモールが０．３〜１μＭの濃度で非常に強力な且つ有効なアデノシン摂取阻害薬であることがまた示されている。それ故、これらの実験は１、３及び１０μＭのシロスタゾール濃度、及び０．３、１及び３μＭのジピリダモール濃度を用いて行われた。
【００７１】
予期されるように、０．３、１又は３μＭでのジピリダモール単独では心臓機能に重大な作用は有しなかった。しかしながら、３又は１０μＭでのシロスタゾールは、心筋収縮能、心拍数及び冠動脈流を重大に増大させた。０．３、１又は３μＭでのジピリダモールは、心筋収縮能のシロスタゾール誘導化増大を有意義に減少させ（図１４Ａ）、そして心拍数のシロスタゾール誘導化増大を有意義に減少させた（図１４Ｂ）。１及び３μＭでのジピリダモールはまた、冠動脈流におけるシロスタゾール（１０μＭ）誘導化増大を増強させた（図１４Ｃ）。結論において、これらの研究は、ジピリダモールが心臓機能に対するシロスタゾールの潜在的に有害な作用に対抗することができることを示唆している。
【００７２】
例  ７
低水準のシロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせは運動中の腓腹筋における血液流を増大させ、そして虚血後の血液流回復を改良する
この例は、シロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせの投与が、運動した骨格筋への血液供給を増大させ、そして生体内における虚血の或る期間後の血液流回復を改良することを示す。以下に記載されるように、ウサギの後足が、医薬注入、運動を模擬するための足の刺激、及び血流測定のために準備された。
【００７３】
外科的調整
２．５〜３．５ｋｇの重さを有する雄のウサギ（ニュージランドホワイト）を、耳の縁の静脈中への静脈内ペントバルビタール（３０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔した。気管切開を行い、そしてその動物に挿管した。通気はＨａｒｖａｒｄ小動物ベンチレーターを介して１００％Ｏ２  を補充した室内空気を用いた。加熱用毛布を用いて体温を３８℃近くに維持した。追加の麻酔及び医薬投与のために、頸静脈にカニューレ挿入した。左心室圧（ＬＶＰ）測定及び蛍光微小球の注入のために、ルーメン（４Ｆ）を有するＭｉｌｌａｒ圧力変換器を左頸動脈に挿入し、そして左心室に進行させた。
【００７４】
動脈血圧測定のために右頸動脈にカニューレ挿入した。両方の後足の大腿動脈を、鼡径靱帯から後膝に延びた中間の大腿においての縦方向皮膚切開により露出させた。動脈クランプを用いて動脈閉塞を実現させ、そしてクランプの取り外しにより再灌血流を行った。筋肉収縮を刺激するために左後足の坐骨神経上に一対の電極を置き、そしてＧｒａｓｓ  ＳＤ９刺激器に接続した。１Ｈｚで超最大１０Ｖの８ミリ秒平方パルスを用いて刺激を生じさせた。後足を大腿に関して９０°度に配置させた。反対側の後足は対照として供し、刺激されなかった。
【００７５】
局所血液流測定
“蛍光微小球を用いて器官灌流を測定するための手引き書”（ワシントン州、シアトルのワシントン大学の蛍光微小球供給源センター）に従って、蛍光微小球を用いて血液流を測定した。青−緑、黄−緑、オレンジ、赤及び真紅色での蛍光標識化ポリスチレン微小球（１５μｍ直径）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ユージーン）から購入した。体重のｋｇ当たり５０万の各々の着色した微小球を、２０秒間カテーテルを通して左心室中に注入した。同時に、微小球の注入の前の３０秒で出発して２分間２．５ｍｌ／分で右頸動脈から血液サンプルを抜き取った。終わりに、ペントバルピタールナトリウムの致死量（１００ｍｇ／ｋｇ）を用いてウサギを安楽死させた。左心室自由壁、腎臓、両方の後足の腓腹筋から組織サンプル（各々約１ｇの片）を取った。サンプルを秤量し、チューブに入れ、そして消化及び蛍光強度測定のために処理した。蛍光は、蛍光分光光度計（ニュージャージー州、エジソンのＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｓ．Ａ．，Ｉｎｃ．製Ｆｌｕｏｍａｘ−２）を用いて測定された。局所血液流は標準の基準流動技術により計算され、そしてｍｌ／分／１００ｇとして表された。
【００７６】
実験計画（プロトコル）
実験の時間行程を図１５に示す。外科調整後６０分に動物を４つのグループに分け、そしてビヒクル（対照）か、又はシロスタゾール（０．２２５ｍｇ／ｋｇの塊で，次に０．０１７５ｍｇ／ｋｇ／分で静脈内に）とジピリダモール（２０μｇ／ｋｇ／分で静脈内に）との組み合わせ（Ｃｉｌ＋Ｄｉｐ）のいずれかを受容させた。医薬注入計画（プロトコル）を前もって決定し、そして約１μＭのシロスタゾール及び約１μＭのジピリダモールの血液濃度を生成した。外科手術後６０分にビヒクル又は医薬組み合わせの注射を開始した。２０分後、実験の残りを通じて左後足の腓腹筋を刺激した。刺激後２０分（図１５における４０分時間点）に、虚血を誘導するために２０分間左大腿動脈をしっかりと締め、そして再灌血流を可能にするために締めを解いた。局所血液流を、青−緑、黄−緑、オレンジ、赤及び真紅色蛍光微小球の、０、２０、４０、６０及び８０分での注射により測定した。
【００７７】
統計
データは平均±ＳＥＭとして提供される。ｐ＜０．０５は統計的有意性の水準（Ｓｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ２．０、カリフォルニア州、サンラファエルのＪａｎｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）として採用された。データは繰り返しての測定を用いての、ｔｗｏ−ｗａｙ（分散量としてグループ及び時間）ＡＮＯＶＡ（分散量の分析）、次に事後のＳｔｕｃｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ試験により分析された。
【００７８】
低水準のシロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせは運動した筋肉における血液流を増大させ、そして虚血後の流れ回復を改良する
シロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせの投与は、活動していない腓腹筋の血液流を有意義に変化させなかった。刺激は両方のグループにおいての腓腹筋への血液流を有意義に増大させたが、組み合わせ医薬で処置された筋肉における血液流は、ビヒクル処置された筋肉における血液流と比較して有意義に高かった（ビヒクル処置された筋肉における３５±７ｍｌ／分／１００ｇから、組み合わせ医薬処置された筋肉における５６±１１ｍｌ／分／１００ｇへ、ｐ＜０．０５）（図１６）。組み合わせ医薬処置された筋肉はまた、左大腿動脈の完全な結紮の２０分後に、有意義に高い血液流を有した（ビヒクル処置された筋肉における２９±６ｍｌ／分／１００ｇに対して、５１±９ｍｌ／分／１００ｇ、ｐ＜０．０５）。その結果は、シロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせが運動骨格筋への血液供給を増大させ、そして虚血の期間後の血液流回復を改良させることを示唆している。
【００７９】
上記諸例は、アデノシン摂取阻害薬がＰＤＥ３阻害薬の陽性の筋変力作用及び変時性作用を減少させることができることを示している。さらにそれらの例は、アデノシン摂取阻害薬とのＭＰＤＥＩの組み合わせが血小板凝集の相乗的減少を生じ、かくして心臓収縮能に有害に影響することなしに、いずれかの薬剤を単独で用いるよりも一層低い濃度で使用されることができることを示している。該諸例はまた、単独で用いた場合に筋肉血液流を増大させることが期待されない、低い水準のＭＰＤＥＩとアデノシン摂取阻害薬との組み合わせが、運動した筋肉において血液流を有意義に増大させ、そして或る期間の虚血後の血液流回復を改良することを示している。例えば、０．３〜１０μＭの範囲の血液濃度を有するシロスタゾールと、０．１〜１０μＭの範囲の血液濃度を有するジピリダモールとの組み合わせは、血小板凝集の最適なプロフィール及び無視できる心臓副作用を生ずる。したがって、シロスタゾールとジピリダモールとのような、少なくとも１種のＭＰＤＥＩと少なくとも１種のアデノシン摂取阻害薬との組み合わせは、改良された効能で、しかしより低い心臓副作用で、ＩＣ及び卒中発作のような症状のための治療を提供することができる。
【００８０】
本明細書は、本明細書に引用された諸文献（これらの全てを、それらの全体において参照することにより本明細書に組み入れる）の技術を見て、最も完全に理解される。本明細書内の態様は、本発明の態様の例示を提供し、そして本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。当業者は、多くの他の態様が本特許請求の範囲の発明により包含されることを認識し、そして本明細書及び諸例は例としてのみ考えられることを当業者は認識し、本発明の真の範囲及び精神は特許請求の範囲により示される。
【００８１】
文献リスト
（１）  Ｃｏｎｅ  Ｊ．、Ｗａｎｇ  Ｓ、Ｔａｎｄｏｎ  Ｎ、Ｆｏｎｇ  Ｍ、Ｓｕｎ  Ｂ、Ｓａｋｕｒａｉ  Ｋ、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  Ｍ、Ｋａｍｂａｙａｓｈｉ  Ｊ及びＬｉｕ  Ｙ（１９９９）：“細胞内ｃＡＭＰ水準、並びに血小板及び心臓細胞における細胞機能についてのシロスタゾール及びミルリノンの効果の比較”：Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３４：第４９７〜第５０４頁；
（２）  Ｄｏｂｓｏｎ  ＪＧＪ及びＦｅｎｔｏｎ  ＲＡ（１９９８）：マサチューセッツ州ボストンのＫｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ発行（Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ  Ｇ、Ｄｏｂｓｏｎ  ＪＧＪ、Ｌｉａｎｇ  ＢＴ及び，Ｌｉｎｄｅｎ  Ｊ、監修）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｕｒｉｎｅｓ第２１頁〜第３９頁における、“アデノシンの心臓生理学”；
（３）  Ｄｏｗｎｅｙ  ＪＭ、Ｃｏｈｅｎ  ＭＶ、Ｙｔｒｅｈｕｓ  Ｋ及びＬｉｕ  Ｙ（１９９４）：ニューヨークのＡｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，Ｖｏｌ  ７２３、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｎｊｕｒｙ（Ｄａｓ  ＤＫ監修）第８２頁〜第９８頁における“虚血前調整における細胞のメカニズム：アデノシン及びプロテインキナーゼＣの役割”；
【００８２】
（４）  Ｇｅｏｒｇｅ  ＥＥ、Ｒｏｍａｎｏ  ＦＤ、及びＤｏｂｓｏｎ  ＪＧ，Ｊｒ．（１９９１）：“アデノシン及びアセチルコリンはねずみ筋細胞のイソプロテレノール誘導タンパク質燐酸化を減少させる”：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ２３：第７４９頁〜第７６４頁；
（５）  Ｇｏｔｏｈ  Ｆ、Ｔｏｈｇｉ  Ｈ、Ｈｉｒａｉ  Ｓ、Ｔｅｒａｓｈｉ  Ａ、Ｆｕｋｕｕｃｈｉ  Ｙ、Ｏｔｏｍｏ  Ｅ、Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｙ、Ｉｔｏｈ  Ｅ、Ｍａｔｓｕｄａ  Ｔ、Ｓａｗａｄａ  Ｔ、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔ、Ｎｉｓｈｉｍａｒｕ  Ｋ、及びＯｈａｓｈｉ  Ｙ、（２０００）：“シロスタゾール卒中発作防止研究：大脳血栓の二次防止のための偽薬対照化二重盲試験”：Ｊ．Ｓｔｒｏｋｅ  ａｎｄ  Ｃａｌｅｂｒｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．９：第１４７頁〜第１５７頁；
（６）  Ｈｕｔｔｅｍａｎｎ  Ｅ、Ｕｋｅｎａ  Ｄ、Ｌｅｎｓｃｈｏｗ  Ｖ、及びＳｃｈｗａｂｅ  Ｕ（１９８４）：“ヒト血小板におけるＲａアデノシン受容体．アデニル酸シクラーゼ活性に関連しての５’−Ｎ−エチルカルボキシアミド〔３Ｈ〕アデノシン結合による特徴づけ”：Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３２５：第２２６頁〜第２３３頁；
【００８３】
（７）  Ｉｇａｗａ  Ｔ、Ｔａｎｉ  Ｔ、Ｃｈｉｊｉｗａ  Ｔ、Ｓｈｉｒａｇｉｋｕ  Ｔ、Ｓｈｉｍｉｄｚｕ  Ｓ、Ｋａｗａｍｕｒａ  Ｋ、Ｋａｔｏ  Ｓ、Ｕｎｅｍｉ  Ｆ、及びＫｉｍｕｒａ  Ｙ（１９９０）：“血管内皮細胞を用いてのシロスタゾールの抗血小板凝集活性の強化”：Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ  ５７：第６１７頁〜第６２３頁；
（８）  Ｌａｇｈｉ  ＰＦ、Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＰＬ、Ａｃｃｉａｖａｔｔｉ  Ａ、Ｐｅｔｒｉ  Ｓ、ｄｅＬａｌｌａ  Ａ、Ｃａｔｉ  Ｇ、Ｃｏｌａｆａｔｉ  Ｍ及びＤｉＰｅｒｒｉ  Ｔ（１９９７）：“虚血の薬理学的前調整”：Ｃｌｉｎ  Ｈｅｍｏｒｈｅｏｌ．Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃ．１７：第７３頁〜第８４頁；
（９）  Ｌｉｕ  Ｙ、Ｆｏｎｇ  Ｍ、Ｃｏｎｅ  Ｊ、Ｗａｎｇ  Ｓ、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  Ｍ及びＫａｍｂａｙａｓｈｉ  Ｊ（２０００）、“間欠性跛行を治療するための薬剤であるシロスタゾールによる、アデノシン摂取の阻害及び介在性アデノシンの虚血誘導増大の増強”：Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３６：第３５１頁〜第３６０頁；
【００８４】
（１０）  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｙ、Ｍａｒｕｋａｗａ  Ｋ、Ｏｋｕｍｕｒａ  Ｈ、Ａｄａｃｈｉ  Ｔ、Ｔａｎｉ  Ｔ及びＫｉｍｕｒａ  Ｙ（１９９９）：“インビトロにおける抗血小板医薬の比較研究：トロンビン誘導血小板応答に対するｃＡＭＰ上昇用薬及びＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬の顕著な効果”：Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ  ９５：第１９頁〜第２９頁；
（１１）  Ｎａｒａｙａｎ  Ｐ、Ｍｅｎｔｚｅｒ  ＲＭ，Ｊｒ．及びＬａｓｌｅｙ  ＲＤ（２０００）：“ホスファターゼ阻害薬カンタリジンはネズミ心臓筋細胞におけるアデノシンＡ（１）受容体抗アドレナリン作用を遮断する”：Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７８、第Ｈ１頁〜第Ｈ７頁；
（１２）  Ｐａｃｋｅｒ  Ｍ（１９９２）：“慢性心不全の治療”：Ｌａｎｃｅｔ  ３４０：第９２頁〜第９５頁；
（１３）  Ｐａｒｋ  ＳＷ、Ｌｅｅ  ＣＷ、Ｋｉｍ  ＨＳ、Ｌｅｅ  ＨＪ、Ｐａｒｋ  ＨＫ、Ｈｏｎｇ  ＭＫ、Ｋｉｍ  ＪＪ及びＰａｒｋ  ＳＪ（１９９９）：“ステント移植後のチクロピジン治療に対するシロスタゾールの比較：Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ  ８４：第５１１頁〜第５１４頁；
【００８５】
（１４）  Ｐａｓｉｎｉ  ＦＬ、Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＰＬ及びＰｅｒｒｉ  ＴＤ（２０００）：“アデノシン及び下部足の慢性虚血”：Ｖａｓｃ．Ｍｅｄ．５：第２４３頁〜第２５０頁；
（１５）  Ｓｕｎ  Ｂ．、Ｌｅ  Ｓ．、Ｆｏｎｇ  Ｍ．、Ｇｕｅｒｔｉｎ  Ｍ．、Ｌｉｕ  Ｙ．、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  Ｍ．、Ｋａｍｂａｙａｓｈｉ  Ｊ．及びＴａｎｄｏｎ  Ｎ．：“抗血小板活性におけるアデノシンとシロスタゾールとの間の相互関係”：Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  Ｓｕｐｐｌ．２００１；
（１６）  Ｔｈａｄａｎｉ  Ｕ及びＲｏｄｅｎ  ＤＭ（１９９８）：ＦＤＡパネルレポート：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７（１９９８年１月）第２２９５頁〜第２２９６頁；
【００８６】
（１７）  Ｔｓｕｃｈｉｋａｎｅ  Ｅ、Ｆｕｋｕｈａｒａ  Ａ、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｔ、Ｋｉｒｉｎｏ  Ｍ、Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｋ、Ｉｚｕｍｉ  Ｍ、Ｏｔｓｕｊｉ  Ｓ、Ｔａｔｅｙａｍａ  Ｈ、Ｓａｋｕｒａｉ  Ｍ及びＡｗａｔａ  Ｎ（１９９９）：“経皮冠状動脈バルーン血管形成後の再狭窄に対するシロスタゾールの衝撃”：Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：第２１頁〜第２６頁；
（１８）  Ｗａｎｇ  Ｓ、Ｃｏｎｅ  Ｊ、Ｆｏｎｇ  Ｍ、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  Ｍ、Ｋａｍｂａｙａｓｈｉ  Ｊ及びＬｉｕ  Ｙ（２００１）：“間欠性跛行を治療するための薬剤である、シロスタゾールによる心臓機能に対するアデノシン摂取の阻害とホスホジエステラーゼタイプ３との間の相互関係”：Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ３８：第７７５頁〜第７８３頁；
【００８７】
（１９）  Ｗａｎｇ  ＷＺ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｇ、Ｍａｌｄｏｎａｄｏ  Ｃ及びＢａｒｋｅｒ  Ｊ（１９９６）：“骨格筋における虚血予備調整による血管痙攣及び毛細血管血液流非再開の減少”：Ｍｉｃｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  １７、第３２４頁〜第３２９頁；
（２０）  Ｗｈｅｔｚｅｌ  ＴＰ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＴＲ、ＳｈａｒｍａｎＲＢ及びＣａｒｌｓｅｎ  ＲＣ（１９９７）：“止血帯虚血後の骨格筋の回復に対する虚血前再調整の効果”：Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ  １００：第１７６７頁〜第１７７５頁。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】コラーゲン誘導血小板凝集に対してのアデノシン（１μＭ）及びシロスタゾール（１μＭ）の相乗効果を例示する。
【図２】洗浄された血小板における血小板凝集に対して、ジピリダモール（１、３及び１０μＭ）及びシロスタゾール（１０ｐＭ〜１００μＭ）の投与量依存性相乗効果を例示する。
【図３】アデノシン（１μＭ）及びシロスタゾール（３０ｎＭ及び１００ｎＭ）の存在下での、洗浄された血小板における血小板凝集に対するジピリダモール（１、３及び１０μＭ）の相乗効果を例示する。
【図４】アデノシン（１μＭ）及びジピリダモール（１、３及び１０μＭ）の存在下での洗浄された血小板における血小板凝集に対するシロスタゾール（３０ｎＭ及び１００ｎＭ）の相乗効果を例示する。
【図５】アデノシン（０．３μＭ及び１μＭ）の存在での、ＰＲＰの血小板における細胞内ｃＡＭＰ水準上昇に対するジピリダモール（３μＭ）及びシロスタゾール（３μＭ）の相乗効果を例示する。
【図６】アデノシン（１μＭ）の存在下又は不存在下での、アデノシンＡ２Ａ−発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における細胞内ｃＡＭＰ水準上昇に対する、ジピリダモール（０．５、１、５及び１０μＭ）及びシロスタゾール（１μＭ）の相乗効果を例示する。
【図７】アデノシン（１μＭ）の存在下又は不存在下での、アデノシンＡ２Ａ−発現チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における細胞内ｃＡＭＰ水準上昇に対する、ジピリダモール（０．５、１、５及び１０μＭ）及びシロスタゾール（３μＭ）の相乗効果を例示する。
【図８】洗浄されたヒト血小板及び赤血球中へのアデノシン摂取に対する、ミルリノンと比較してのシロスタゾールの阻害効果を例示する。
【図９】全血中の、ジピリダモール（１μＭ）の存在下又は不存在下での、コラーゲン（２μｇ／ｍｌ）刺激を用いての血漿中のアデノシン水準における増大を例示する。
【図１０】コラーゲンの０．５μｇ／ｍｌにより誘導された全血における血小板凝集に対するジピリダモール（０．１、０．３、１及び３μＭ）及びシロスタゾール（１０μＭ及び３０μＭ）の相乗効果を例示する。
【図１１】コラーゲンの０．１又は０．３μｇ／ｍｌにより誘導された全血の血小板凝集に対するジピリダモール（１μＭ及び３μＭ）及び低濃度のシロスタゾール（０．３、０．７、１及び３μＭ）の相乗効果を例示する。
【図１２】生体外全血の血小板凝集の阻止に対するジピリダモール（〜１μＭ）及びシロスタゾール（〜１μＭ）相乗効果を例示する。
【図１３】単離されたウサギのランゲンドルフ（Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ）心臓の心機能に対するシロスタゾール及びジピリダモールの効果を研究するために用いられた実験計画（プロトコル）を例示する。
【図１４】収縮（Ａ）、心拍数（Ｂ）及び冠状動脈流（Ｃ）に対しての、単独での、又は組み合わせでの、シロスタゾール（１、３及び１０μＭ）及びジピリダモール（０．３、１及び３μＭ）の効果を例示する。
【図１５】安静、（電気刺激を用いての）運動、大腿動脈を閉塞することによる虚血及び再灌流の間の腓腹筋の筋肉血流に対する低水準のシロスタゾールとジピリダモールとの組み合わせの効果を試験するための試験計画（プロトコル）を例示する。
【図１６】シロスタゾール（１μＭ）と、ジピリダモール（１μＭ）との組み合わせを用いての処置が、非処置筋肉内におけるものと比較して、運動腓腹筋の筋肉における血流を有意義に増大させ、そして虚血期間後の血流回復を改良させたことを例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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