(57)【要約】本発明は、PKCλと関連のある疾患および状態を診断する方法、このような疾患および状態を治療または予防するために用いうる化合物を同定するための方法、ならびにこのような疾患および状態の治療または予防のためにこれらの化合物を用いる方法を提供する。スクリーニング方法に用いうる動物モデル系も本発明において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験対象が、プロテインキナーゼCλと関連のある疾患もしくは状態を有するか否か、またはそれを発症するリスクがあるか否かを判定するための方法であって、被験対象がプロテインキナーゼCλをコードする遺伝子中に変異を有するか否かを判定するために、被験対象からの試料の核酸分子を分析することを含み、このような変異の存在によって、被験対象がプロテインキナーゼCλと関連のある疾患もしくは状態を有すること、またはそれを発症するリスクがあることが示される方法。
【請求項２】
被験対象が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
被験対象がヒトである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
疾患または状態が心臓の疾患もしくは状態または癌である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
疾患または状態が上皮-上皮細胞相互作用または上皮細胞極性と関連している、請求項1記載の方法。
【請求項６】
変異がプロテインキナーゼCλのカルボキシル末端の短縮をもたらす、請求項1記載の方法。
【請求項７】
変異が中核変異である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
プロテインキナーゼCλと関連のある疾患または状態の治療または予防に用いうる化合物を同定するための方法であって、プロテインキナーゼCλをコードする遺伝子中に変異を含み、かつプロテインキナーゼCλと関連のある疾患または状態に特徴的な表現型を有する生物を該化合物と接触させること、および該表現型に対する該化合物の影響を判定することを含み、該表現型の改善の検出によって該疾患または状態の治療または予防に用いうる化合物の同定が示される方法。
【請求項９】
プロテインキナーゼCλと関連のある疾患または状態が心疾患である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
生物がゼブラフィッシュである、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
変異がプロテインキナーゼCλのカルボキシル末端の短縮をもたらす、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
患者におけるプロテインキナーゼCλと関連のある疾患または状態の治療または予防の方法であって、請求項8記載の方法を用いて同定された化合物を患者に投与することを含む方法。
【請求項１３】
疾患または状態が心臓の疾患または状態である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
患者がプロテインキナーゼCλのカルボキシル末端の短縮をもたらす変異を有する、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
患者におけるプロテインキナーゼCλと関連のある疾患または状態の治療または予防の方法であって、機能性プロテインキナーゼCλタンパク質、または該タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを患者に投与することを含む方法。
【請求項１６】
患者におけるプロテインキナーゼCλと関連のある疾患または状態の治療または予防の方法であって、患者におけるプロテインキナーゼCλの活性または発現を変化させる化合物または分子を患者に投与することを含む方法。
【請求項１７】
実質的に純粋なゼブラフィッシュ・プロテインキナーゼCλポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号：2のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含む、請求項17記載のポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号：2のアミノ酸配列を含む、請求項17記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号：2の配列を含む実質的に純粋なポリペプチド、および、配列番号：2の配列と少なくとも95％同一な配列を含み、かつプロテインキナーゼCλ活性を有するそのバリアント。
【請求項２１】
ゼブラフィッシュ・プロテインキナーゼCλポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２２】
配列番号：2のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ配列を含むポリペプチドをコードする、請求項21記載の核酸分子。
【請求項２３】
配列番号：2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項21記載の核酸分子。
【請求項２４】
配列番号：1に示された配列の相補物と高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする単離された核酸分子であって、プロテインキナーゼCλ活性を有するタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２５】
請求項21記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２６】
請求項25記載のベクターを含む細胞。
【請求項２７】
プロテインキナーゼCλポリペプチドをコードする一方または両方の対立遺伝子にノックアウト変異を有する非ヒト動物。
【請求項２８】
請求項27記載の非ヒトノックアウト動物由来の細胞。
【請求項２９】
変異型プロテインキナーゼCλポリペプチドをコードする核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３０】
ゼブラフィッシュである、請求項29記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３１】
中核変異を含む、請求項29記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３２】
プロテインキナーゼCλポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項３３】
患者におけるプロテインキナーゼCλポリペプチドの活性を調節する方法であって、この活性を刺激または阻害するRNAを患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プロテインキナーゼCλと関連のある疾患および状態の診断および治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
器官が発生過程において全体的な構造およびパターンを獲得するプロセスは非常に複雑であり、一部が重複した多数の生化学経路がかかわっている可能性が高い。例えば、脊椎動物の心臓の場合、このプロセスにおいて認めうる最初の重要な段階は、心房および心室の成形を伴う、房（chamber）の形態形成である。機能的に異なるこの2つの収縮単位が適切な向きにあることが、生物の最初の心拍によって始まる、一方向性の血流のために必要である。適切に形成された房は、その後、さらなる心臓発生がその上に重なって起こるための基質となる。
【０００３】
近年、心房細胞および心室細胞が特徴的な運命を獲得する原因となる分子機構について多くのことがわかっている（Fishmanら、Development 124: 2099-2117, 1997；Srivastavaら、Nature 407：221-226、2000）。しかし、これらの房の高次構造を形作る発生的および分子的な段階の解明はいずれも困難であることが判明しており、この理由は一部には、細胞の運命の決定とは異なり、これらの段階は生きた生物体でなければ有意義な研究を行えないことによる。ゼブラフィッシュ、ダニオ レリオ（Danio rerio）は、発生の遺伝学的および生化学的な分析に用いるのに好都合な生物である。これは観察しやすい透明な胚を有しているために器官の機能を発生のごく早期から直接観察することができ、世代時間が短い上に、多産である。
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、ゼブラフィッシュのプロテインキナーゼCλ（PKCA）遺伝子における「中核（heart and soul：has）」変異と命名された変異、ならびにゼブラフィッシュにおける化学物質スクリーニングで同定された低分子であるコンセントラミド（concentramide）が心臓の異常な発育および発生を引き起こすという観察所見に基づく、診断方法、薬物スクリーニングの方法および治療方法を提供する。
【０００５】
第1の面において、本発明は、被験対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）が、PKCλと関連のある疾患もしくは状態（例えば、心臓の疾患または状態；以下も参照のこと）を有するか否か、またはそれを発症するリスクがあるか否かを判定するための方法を提供する。本方法は、被験対象がPKCλをコードする遺伝子中に変異（例えば、has変異；以下を参照）を有するか否かを判定するために、被験対象からの試料の核酸分子を分析することを含む。このような変異の存在により、被験対象がPKCλと関連のある疾患を有すること、または発症するリスクがあることが示される。本方法はまた、PKCλをコードする遺伝子に対して特異的な核酸分子プライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子の核酸分子増幅のために用いる段階も含みうる。これはさらに、PKCλをコードする被験対象由来の核酸分子のシークエンシングを行うことを含みうる。
【０００６】
第2の面において、本発明は、PKCλと関連のある疾患もしくは状態の治療もしくは予防のために用いうる化合物を同定するための方法、またはこのような方法に用いるための薬剤の調製に用いうる化合物を同定するための方法を提供する。本方法は、PKCλ遺伝子に変異（例えば、中核変異）を有し、かつこのような疾患または状態に特徴的な表現型を有する生物（例えば、ゼブラフィッシュ）を化合物と接触させること、および、表現型に対する化合物の影響を判定することを含む。表現型の改善が検出されることにより、その疾患または状態の治療または予防に用いうる化合物が同定されたことが示される。本方法の変法では、PKCλ遺伝子に変異（例えば、has変異）を有する生物、または有しない生物を、コンセントラミドの存在下で候補化合物と接触させる。
【０００７】
第3の面において、本発明は、患者（例えば、PKCλ遺伝子に変異（例えば、中核変異）を有する患者）におけるPKCλと関連のある疾患または状態を治療または予防する方法であって、上記の方法を用いて同定された化合物を患者に投与することを含む方法を提供する。このような疾患または状態の治療または予防におけるこのような化合物の使用、ならびにこのような治療または予防のための薬剤の調製におけるこれらの化合物の使用も本発明に含まれる。
【０００８】
第4の面において、本発明は、患者におけるPKCλと関連のある疾患または状態を治療または予防する、さらなる方法を提供する。本方法は、機能性PKCλタンパク質、またはこのタンパク質をコードする核酸分子（例えば、発現ベクター中にあるもの）を患者に投与することを含む。このような疾患または状態の治療または予防におけるこのようなタンパク質または核酸分子の使用、ならびにこのような治療または予防のための薬剤の調製におけるこれらのタンパク質または核酸分子の使用も本発明に含まれる。
【０００９】
第5の面において、本発明は、実質的に純粋なゼブラフィッシュPKCλポリペプチドを含む。このポリペプチドは、例えば、配列番号：2のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を含みうる、または本質的にそれからなりうる。本発明はまた、これらのポリペプチドの配列と少なくとも75％、85％、または95％同一な配列を含み、PKCλ活性を有するか別の点で本明細書の別の箇所で言及した疾患および状態に特徴的な、これらのポリペプチドのバリアントも含む。これらのポリペプチドの断片も本発明に含まれる。例えば、PKCλの種々のドメインの任意のものをさまざまな組み合わせで含む断片が含まれる。
【００１０】
第6の面において、本発明は、ゼブラフィッシュPKCλAポリペプチドをコードする配列を含む、単離された核酸分子（例えば、DNA分子）を提供する。この核酸分子は、配列番号：2のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ配列を含む、または本質的にはそれからなるポリペプチドをコードしうる。本発明はまた、高ストリンジェントな条件下で配列番号：1の相補物とハイブリダイズし、PKCλ活性を有するか別の点で本明細書の別の箇所で言及した疾患および状態に特徴的なポリペプチドをコードする、核酸分子も含む。
【００１１】
第7の面において、本発明は、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１２】
第8の面において、本発明は、上記のベクターを含む細胞を提供する。
【００１３】
第9の面において、本発明は、上記の核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物（例えば、ゼブラフィッシュまたはマウス）を提供する。
【００１４】
第10の面において、本発明は、PKCλポリペプチドをコードする一方または両方の対立遺伝子にノックアウト変異を有する非ヒト動物を提供する。
【００１５】
第11の面において、本発明は、上記の非ヒトノックアウト動物からの細胞を含む。
【００１６】
第12の面において、本発明は、変異型PKCλポリペプチド、例えば、中核変異を有するポリペプチドをコードする核酸分子をふくむ非ヒトトランスジェニック動物（例えば、ゼブラフィッシュ）を提供する。
【００１７】
第13の面において、本発明は、PKCλポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。
【００１８】
「ポリペプチド」または「ポリペプチド断片」とは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）の有無にかかわらず、天然または天然でないポリペプチドの全体または一部を構成する、2つまたはそれ以上（例えば、10、15、20、30、50、100、もしくは200個またはそれ以上）のアミノ酸の連鎖のことを意味する。「翻訳後修飾」とは、合成中または合成後のポリペプチドまたはポリペプチド断片への何らかの変化のことを意味する。翻訳後修飾は天然に生じさせることもでき（細胞内での合成中など）、人工的に作製することもできる（組換えまたは化学的手段などによる）。「タンパク質」は1つまたは複数のポリペプチドから構成されうる。
【００１９】
「プロテインキナーゼCλタンパク質」「プロテインキナーゼCλポリペプチド」「PKCλタンパク質」または「PKCλポリペプチド」とは、ヒト（配列番号：5）またはゼブラフィッシュ（配列番号：2）のPKCλポリペプチドの配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも45％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％および最も好ましくは少なくとも90％であるポリペプチドのことを意味する。PKCλ遺伝子配列のスプライスバリアントおよび変異を含むPKCλ遺伝子に由来するポリペプチド産物も、この定義に含まれる。本明細書の定義によるPKCλポリペプチドは心臓の発生、造形および機能に役割を果たす。これは、心疾患（以下も参照されたい）などの、PKCλと関連のある疾患および状態のマーカーとして用いることができる。
【００２０】
「プロテインキナーゼCλ核酸分子」または「PKCλ核酸分子」とは、以上に定義した、PKCλタンパク質（例えば、ヒト（配列番号：4によりコードされる）またはゼブラフィッシュ（配列番号：1または3によりコードされる）PKCλタンパク質）、PKCλポリペプチドまたはその部分をコードする、ゲノムDNA、cDNAまたはRNA（例えば、mRNA）分子などの核酸分子のことを意味する。PKCλ核酸分子における変異は、例えば、PKCλ遺伝子中の任意の箇所への早期終止コドンの挿入を特徴とすることができる。例えば、コドンR515を終止コドンに変えること（CGAからTGAに）、またはコドンW519を終止コドンに変えること（TGGからTAGに）が可能である。このゼブラフィッシュ・プロテインキナーゼCλの変異（本明細書では以下、「中核変異」と称する）に加えて、本発明は、一部の例のみとして、短縮（truncation）を引き起こすヌル変異およびさらなる変異を含む、PKCλタンパク質の異常な産生または機能をもたらす任意の変異を含む。短縮は、タンパク質（またはその部分）のカルボキシル末端側の半分が産生されないような、カルボキシル末端の短縮でありうる。例えば、タンパク質のカルボキシル末端側の半分の少なくとも10、25、50、70、75、100、150、200、または250個のアミノ酸が欠失してもよい。
【００２１】
「同一性」という用語は、本明細書において、特定の核酸分子またはポリペプチドの配列と、同じ種類の参照分子の配列との関係を説明するために用いられる。例えば、あるポリペプチドまたは核酸分子が、それと整列化される参照分子と比較して、所定の位置で同じアミノ酸またはヌクレオチド残基を有する場合には、その位置で「同一性」があると言われる。核酸分子またはポリペプチドの参照分子との配列同一性の程度は一般に、配列解析ソフトウエアを、最適なアライメントを得るためのギャップの挿入といった、それに関して指定されたデフォルトパラメーターとともに用いて計測される（例えば、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）遺伝学コンピュータグループ（Genetics Computer Group）のSequence Analysis Software Package、BLAST、またはPILEUP／PRETTYBOXプログラム）。これらのソフトウエアプログラムは、種々の置換、欠失、およびその他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより、同一または類似の配列を対比する。保存的置換には一般に、以下の各群の内部での置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
【００２２】
核酸分子またはポリペプチドは、その全長にわたり、参照分子の配列に対する同一性が少なくとも51％、好ましくは少なくとも55％、60％、または65％であり、最も好ましくは75％、85％、90％、または95％である場合に、参照分子に対して「実質的に同一である」と言われる。ポリペプチドの場合、比較配列の長さは少なくともアミノ酸16個、好ましくは少なくともアミノ酸20個、より好ましくは少なくともアミノ酸25個であり、最も好ましくは少なくともアミノ酸35個である。核酸分子の場合、比較配列の長さは少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは少なくとも60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも75ヌクレオチドであり、最も好ましくは少なくとも110ヌクレオチドである。当然ながら、比較する長さは、最長で完全長を含む、任意の長さでありうる。
【００２３】
PKCλ核酸分子またはPKCλポリペプチドは、その生物活性またはそれが野生型であるか変異型であるかの決定を可能にする検査手順がそれに対して行われる場合に「分析される」または「分析」を受けるという。例えば、動物（例えば、ヒトまたはゼブラフィッシュ）のPKCλ遺伝子は、その動物のゲノムDNAをポリメラーゼ連鎖反応を用いて増幅した後に、増幅されたDNAが変異、例えば中核変異を含むか否かを、例えばヌクレオチド配列または制限断片の分析によって判定することによって分析しうる。
【００２４】
「プローブ」または「プライマー」とは、相補的配列を含む第2のDNAまたはRNA分子（「標的」）と塩基対合を行いうる、規定された配列を有する一本鎖のDNAまたはRNA分子のことを意味する。その結果生じるハイブリッドの安定性は、生じる塩基対合の程度に依存する。この安定性は、プローブと標的分子との相補性の程度、およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの程度などのパラメーターの影響を受ける。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの程度は、温度、塩濃度、有機分子（ホルムアミドなど）の濃度などのパラメーターによる影響を受け、当業者に周知の方法によって決定される。PKCλ核酸分子に対して特異的なプローブまたはプライマーは、ヒト（配列番号：4）またはゼブラフィッシュ（配列番号：1および3）のPKCλ遺伝子の配列に対して、好ましくは45％を上回る配列同一性を有し、より好ましくは少なくとも55〜75％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも75〜85％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも85〜99％配列同一性、最も好ましくは100％の配列同一性を有する。
【００２５】
プローブには、当業者に周知の方法により、検出可能な標識を放射性または非放射性に施すことができる。プローブは、核酸シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖立体構造多型（SSCP）分析、制限断片多型（RFLP）分析、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、インサイチューハイブリダイゼーション、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、および当業者に周知のその他の方法などの、核酸ハイブリダイゼーションを伴う方法のために用いうる。
【００２６】
分子、例えば、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、遺伝子またはその断片、cDNA分子、ポリペプチドまたは抗体は、試料におけるその存在を直接同定しうるような様式でそれが標識されていれば「検出可能な標識がなされている」と言える。分子の検出可能な標識のための方法は当技術分野で周知であり、これには放射性標識（例えば、３２Pまたは３５Sなどの同位体による）および非放射性標識（例えば、フルオレセインなどの蛍光性標識による）が非制限的に含まれる。
【００２７】
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然にそれに付随するタンパク質および有機分子から分離されたポリペプチド（またはその断片）のことを意味する。一般に、ポリペプチドは、天然にそれに付随するタンパク質および天然の有機分子を除いた割合が重量比で少なくとも60％であれば実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチドは、純度が重量比で少なくとも75％のPKCλポリペプチドであり、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％のPKCλポリペプチドである。実質的に純粋なPKCλポリペプチドは、例えば、天然の源からの抽出により、PKCλポリペプチドをコードする組換え核酸分子の発現により、または化学合成により、入手しうる。純度は任意の適した方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析によって測定しうる。
【００２８】
ポリペプチドは、天然の状態でそれに付随するタンパク質および有機分子から分離されていれば、天然に付随する成分から実質的に遊離している。このため、化学合成された、またはそれが天然に産生される細胞とは異なる細胞系で産生されたタンパク質は、天然に付随する成分から実質的に遊離している。したがって、実質的に純粋なポリペプチドには、真核生物生物に由来するものだけでなく、大腸菌、他の原核生物または他のこのような系で合成されたものも含まれる。
【００２９】
「単離された核酸分子」とは、それが天然に存在する環境から取り出された核酸分子のことを意味する。例えば、細胞のゲノム中にまたは遺伝子バンクの一部として存在する天然の核酸分子は単離されていないが、例えばクローニングイベント（増幅）などの結果として、ゲノムの残りの部分から分離された同じ分子は「単離」されている。一般に、単離された核酸分子は、天然のゲノム中で5'または3'末端で直接隣接している核酸領域（例えば、コード領域）から遊離している。このような単離された核酸分子はベクターまたは組成物の一部であってもよく、このようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、この場合も単離されていると考えられる。
【００３０】
抗体は、それがポリペプチド（例えば、PKCλ7ポリペプチド）を認識してそれと結合するが、そのポリペプチドを通常含む試料中、例えば生物試料中の他の分子（例えば、PKCλと関係のないポリペプチド）を実質的に認識せずに結合もしない場合には、そのポリペプチドと「特異的に結合する」と言われる。
【００３１】
「高ストリンジェンシー条件」とは、少なくとも100ヌクレオチド長、例えば200、350、または500ヌクレオチド長のDNAプローブを用いて、0.5M NaHPO４、pH 7.2、7％SDS、1mM EDTA、および1％BSA（第V画分）を含む温度65℃の緩衝液中での、または48％ホルムアミド、4.8×SSC、0.2M Tris-Cl、pH 7.6、1×デンハルト溶液、10％デキストラン硫酸、および0.1％SDSを含む温度42℃の緩衝液中で生じるハイブリダイゼーション（これらは高ストリンジェンシーのノーザンハイブリダイゼーションまたはサザンハイブリダイゼーションに関する一般的な条件である）に相当するハイブリダイゼーションを可能にする条件のことを意味する。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、高ストリンジェンシーPCR、DNAシークエンシング、一本鎖高次構造多型分析およびインサイチューハイブリダイゼーションなどの、分子生物学者によってルーチン的に行われるさまざまな技法の成否にも依拠する。ノーザンハイブリダイゼーションおよびサザンハイブリダイゼーションとは異なり、これらの技法は通常、比較的短いプローブ（例えば、PCRまたはシークエンシング用には通常16ヌクレオチドまたはそれより長いもの、インサイチューハイブリダイゼーション用には40ヌクレオチドまたはそれより長いもの）を用いて行われる。これらの技法に用いられる高ストリンジェンシー条件は分子生物学の当業者には周知であり、その例は、例えばAusubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley & Sons, New York, NY, 1998に記載されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【００３２】
「試料」とは、患者または被験対象から入手した生検用組織、羊水、細胞、血液、血清、尿、便または他の標本のことを意味する。試料は、PKCλ遺伝子における変異またはPKCλ遺伝子の発現レベルを検出するために、当技術分野で知られた方法によって分析することができる。例えば、患者試料に由来するPCR産物のシークエンシング、一本鎖高次構造多型（SSCP）分析または制限断片長多型（RFLP）分析はPKCλ遺伝子における変異の検出に用いうる；ELISAおよびその他のイムノアッセイはPKCλポリペプチドレベルの測定に用いうる；ならびに、PCRはPKCλ核酸分子レベルの測定に用いうる。
【００３３】
「プロテインキナーゼCλ関連疾患」「PKCλ関連疾患」「プロテインキナーゼCλ関連状態」または「PKCλ関連状態」とは、PKCλ核酸分子またはポリペプチドの生物活性を変化させる、PKCλ遺伝子の不適切に高いもしくは低い発現またはPKCλ遺伝子における変異（プロモーターなどの制御配列を含む）に起因する、疾患または状態のことを意味する。PKCλに関連のある疾患および状態は、出生前または出生後の時期にPKCλが発現される任意の組織に生じうる。PKCλに関連のある疾患および状態には、心臓または癌の疾患または状態が含まれうる（以下も参照のこと）。
【００３４】
本発明はいくつかの利点を提供する。例えば、本発明の診断方法を用いることで、患者における、心臓または癌の疾患といったPKCλに関連のある疾患または状態の可能性が高いことを検出し、それによって症状が起こり前に適切な介入を開始することが可能である。これは例えば、このような疾患または状態の高リスク群に属する患者に有用である。本発明の診断方法はまた、患者におけるこのような既存の疾患または状態の原因を明らかにし、治療への適切なアプローチを選択可能にすることも容易にする。さらに、本発明のスクリーニング方法を、これらの疾患または状態の治療または予防に用いうる化合物の同定に用いることもできる。本発明はまた、本発明の以前の唯一の治療法が、ドナー臓器の入手性および臓器拒絶反応の点で限界のある臓器移植であるような、疾患または状態（例えば、心不全または腎不全などの臓器不全）の治療に用いることもできる。
【００３５】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲によって明らかになると考えられる。
【００３６】
詳細な説明
本発明は、PKCλと関連のある疾患および状態、例えば心臓の疾患または状態（以下も参照）の診断、予防および治療のための方法、ならびにこのような疾患および状態の治療または予防に用いうる化合物を同定するためのスクリーニング方法を提供する。詳細には、本発明者らは、最初期の心臓を破壊する低分子コンセントラミドおよび遺伝子変異である中核（has）変異を同定した。これはいずれも心室を心房内部に形成させる。本発明者らは本明細書において、has遺伝子が異型プロテインキナーゼCであるプロテインキナーゼCλ（PKCλ）をコードすることを示す。has変異は広範囲の組織において上皮細胞間相互作用の破壊をもたらす。コンセントラミドは上皮細胞相互作用は破壊しないが、発生中の胚の心臓原基の収束を吻側側に移動させる。コンセントラミドおよびhasの作用に共通する点は、心臓原基の前端および後端の融合の順序が逆転することである。
【００３７】
このため、本発明の診断方法は、PKCλタンパク質をコードする遺伝子における変異の検出を含み、一方、化合物の同定方法は、PKCλをコードする遺伝子に変異を有する生物または適切な疾患および状態に関する他のモデルの表現型に影響を及ぼす化合物に関するスクリーニングを含む。この化合物同定法はまた、PKCλ変異（例えば、has変異）を有する生物または有しない生物を用いる、コンセントラミドの存在下における候補化合物のスクリーニングも含みうる。このようにして同定された化合物、ならびにPKCλ遺伝子およびタンパク質自体を、PKCλと関連のある疾患および状態の治療または予防のための方法に用いることができる。PKCλの機能を阻害することが見いだされた化合物、アンチセンス分子および抗体を、癌の予防または治療のために用いることもできる。
【００３８】
本発明はまた、上記のスクリーニング方法に用いうる動物モデル系（例えば、PKCλ遺伝子に変異（例えば、中核変異）を有するゼブラフィッシュ、またはこのような変異を有するマウス（または他の動物））、ならびにPKCλタンパク質およびこのタンパク質をコードする遺伝子も提供する。変異型ゼブラフィッシュPKCλタンパク質をコードする遺伝子（例えば、中核変異を有する遺伝子）およびこれらの遺伝子によってコードされるタンパク質も本発明に含まれる。これらのタンパク質（野生型または変異型）と特異的に結合する抗体も本発明に含まれる。
【００３９】
本発明の診断方法、スクリーニング方法および治療的方法、ならびに本発明の動物モデル系、タンパク質および遺伝子については、本発明に従って診断および予防および治療しうるPKCλと関連のある疾患および状態の簡単な説明の後に、以下にさらに説明する。
【００４０】
PKCλと関連のある疾患または状態
PKCλ遺伝子またはタンパク質における異常を広範囲にわたる疾患または状態の任意のものと関連づけることができ、このため本発明の方法を用いて診断、予防または治療することができる。例えば、上に考察した通り、ゼブラフィッシュにおける中核変異は心臓の発育および発生の異常を特徴とする。したがって、PKCλ遺伝子またはその発現の異常の検出を、心臓の疾患もしくは状態を診断するため、またはその治療もしくは発生をモニタリングするための方法に用いることができる。さらに、上記のスクリーニング方法で同定された化合物、ならびにPKCλ核酸分子、タンパク質および抗体それ自体を、このような疾患または状態の予防または治療のための方法に用いることもできる。
【００４１】
本発明に従って診断、予防または治療を行いうる心臓の疾患または状態の具体的な例には、心臓奇形をもたらす先天的欠陥が含まれる。これらには、三尖弁の異常をもたらすエプスタイン奇形などの先天的欠陥のほかに、心臓、消化管臓器および脾臓などの特定臓器の非対称性配置に関する種々の異常を特徴とし、通常は発生期間中に生じる相同性欠陥（isomerism defect）が含まれる。
【００４２】
例えば、無脾症候群、イブマルク症候群および右房相同症としても知られる右側相同症連鎖（right isomerism sequence）では、心臓の右側構造が心臓の右側に重複して生じ、脾臓が欠失する。この状態は、房室中隔欠損（AVSD）などの極めて複雑かつ高度の心臓障害につながるおそれがある。これに対して、多脾症候群としても知られる左側相同症連鎖では、左側心臓構造が重複して生じるほか、多数の小さな脾臓が存在する場合がある。この状態は心臓障害のほかに、心拍徐脈をもたらす心ブロック、2つの房の上部間に孔が開いていることを特徴とする心房中隔欠損、およびAVSDにつながるおそれがある。どちらの種類の相同症でも、腸管の位置が正しくないために、腸の捻転または腸閉塞が起こる可能性がある。腎臓などの他の臓器に類似した障害が起こることもある。
【００４３】
本発明に従って診断、予防または治療を行いうる、PKCλに関連のあるその他の疾患および状態には、密着結合の異常を特徴とするものが含まれる。上に指摘した通り、本発明者らは、PKCλにおける異常（例えば、has変異によって引き起こされるもの）が、上皮細胞間相互作用の欠陥につながるおそれがあることを見いだした。これは密着結合の形成における異常に起因し、密着結合は身体の管腔（例えば、胃腸管、血液容器、気道および尿路）の内層をなす、またはある種の臓器（例えば、脳）を囲んで保護する、上皮細胞または内皮細胞のシートを構成する個々の細胞の間の空隙を密閉する上で決定的な役割を果たしている。これらの細胞シートは選択的透過障壁として作用し、これらの障壁の透過性がPKCλの欠陥などのために変化すると、当技術分野で周知の数多くの疾患または状態のいずれかを招くおそれがある。例えば、胃腸管内層の透過性の増大は、クローン病、急性胃腸炎および下痢を招くおそれがある。同じく、密着結合の欠損は、血液／脳関門または血液／網膜関門の決定的な機能を損なわせるおそれがある。さらにもう1つの例として、糖尿病患者における血管透過性の欠陥は糖尿病性網膜症などの状態を招くおそれがある。本発明に従って診断、予防または治療を行いうるそのほかの疾患および状態には、多嚢胞腎（例えば、常染色体優性多嚢胞腎）などの、上皮細胞の極性の異常に関連のあるものが含まれる。また、本発明者らはPKCλの異常が細胞増殖の制御の欠陥につながることを見いだしているため、癌におけるPKCλの役割も想定される。このため、PKCλ活性を修飾することが見いだされた化合物は、上皮細胞に由来する癌である癌腫（例えば、腎細胞癌）などの癌の予防および治療に用いることができる。
【００４４】
診断方法
PKCλタンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子によってコードされるポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対して特異的な抗体を、このタンパク質をコードする遺伝子における変異または不適切な発現を伴う疾患および状態の診断のため、またはモニタリングのための方法に用いることができる。
【００４５】
本発明の診断方法は、例えば、PKCλと関連のある疾患または状態を有する患者に対して、その原因を明らかにし、それによって適切な治療方針の選択を容易にするための取り組みの中で用いることができる。また、本診断方法を、このような疾患もしくは状態をまだ発症していないが発症するリスクのある患者、またはこのような疾患もしくは状態の発症初期にある患者に対して用いることもできる。また、本発明の診断方法を、例えば、PKCλタンパク質をコードする遺伝子における劣性変異の保有者である可能性のある親を同定するための、出生前遺伝学的スクリーニングに用いることもできる。本発明の方法は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、愛玩動物または家畜における、本明細書に記載した障害の診断（または治療）のために用いうる。
【００４６】
本発明の診断方法を用いて検出しうるPKCλにおける異常には、例えば、（i）異常なPKCλタンパク質の産生をもたらす変異を含むPKCλタンパク質をコードする遺伝子、（ii）異常なPKCλポリペプチドそれ自体（例えば、短縮型タンパク質）および（iii）このタンパク質の異常な量の産生をもたらすPKCλ遺伝子における変異、を特徴とするものが含まれる。このような異常の検出は、心臓に影響を及ぼすものといった、ヒトPKCλと関連のある疾患または状態の診断に用いることができる。PKCλ遺伝子における変異の例には中核変異があり、以下にこれについてさらに説明する。
【００４７】
PKCλ遺伝子における変異は対象の任意の組織において検出可能であり、それはこのタンパク質が発現されないものでもよい。これらのタンパク質が発現される組織の数および期間が限られていて、期間も限定的である可能性があるため、ならびにこの種の組織（例えば、心臓組織）の試料をアッセイのために採取することが望ましくない可能性があるために、血液または羊水試料といった、より容易に入手しうる他の種類の試料における変異遺伝子を検出することが好ましいと考えられる。
【００４８】
PKCλタンパク質をコードする遺伝子における変異の検出は、任意の標準的な診断技法を用いて行いうる。例えば、患者から入手した生物試料を、ミスマッチ検出アプローチを用いて、PKCλタンパク質をコードする核酸分子における1つまたは複数の変異（例えば、中核変異）に関して分析することができる。一般に、このアプローチは、患者試料からの核酸分子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅の後に、ハイブリダイゼーションの変化、異常な電気泳動ゲル移動、結合、もしくはミスマッチ結合タンパク質を介した切断の検出により、または直接的な核酸分子シークエンシングにより、変異（すなわち、ミスマッチ）を同定することを含む。PKCλタンパク質をコードする変異型遺伝子の検出を容易にするためにこれらの技法の任意のものを用いることができ、これらはそれぞれ当技術分野で周知である。例えば、これらの技法の例は、Oritaら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 2766-2770, 1989）およびSheffieldら（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86：232-236,1989）に記載されている。
【００４９】
上に指摘した通り、変異検出アッセイは、既存の疾患または状態の診断を容易にすることに加えて、PKCλ遺伝子における変異と関連のある疾患に対する素因を症状の発現前に診断する機会ももたらす。例えば、PKCλの正常な生物活性または発現を抑制する異常なPKCλタンパク質（またはその異常な量）をコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である患者は、このようなタンパク質と関連のある疾患の臨床症状を示さないことがあるが、それでもこの種の疾患を発症する確率は正常よりも高い。このような診断が得られれば、患者は有害な環境因子への曝露を最小限にとどめる対策を講じることができ、例えば頻回の身体的検査を通じて、医学的状態を注意深くモニタリングすることができる。上記の通り、この種の診断アプローチを、出生前スクリーニングにおける、PKCλタンパク質をコードする遺伝子における変異の検出に用いることもできる。
【００５０】
上に指摘したように、PKCλ遺伝子における変異を検出するための診断方法は、容易に入手しうる組織からのゲノムDNAを用いて行うことが好ましいが、このタンパク質をコードするmRNAまたはタンパク質自体を、それが発現される組織試料からアッセイすることもできる。患者由来のこのような組織試料における、PKCλをコードする遺伝子の発現レベルは、ノーザンブロット分析および定量的PCRを含む、当技術分野で周知のさまざまな標準的な技法のうち任意のものを用いて決定しうる（例えば、Ausubelら、前記；「PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification」、H.A. Ehrlich編、Stockton Press, NY；Yapら、Nucl. Acids. Res. 19: 4294, 1991を参照されたい）。
【００５１】
本発明のもう1つの診断アプローチにおいては、生物試料におけるPKCλタンパク質のレベルの検出またはモニタリングにイムノアッセイを用いる。PKCλタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、任意の標準的なイムノアッセイ形式（例えば、ELISA、ウエスタンブロットまたはRIA；例えば、Ausubelら、前記を参照）で、PKCλのポリペプチドレベルを測定しうる。これらのレベルを罹患していない個体からの試料におけるPKCλのレベルと比較することができる。例えば、本方法を用いてPKCλの産生の低下が検出されれば、PKCλタンパク質の生物活性が不十分であることが関係する状態にあること、またはそれに対する素因があることを示すと思われる。
【００５２】
免疫組織化学の技法を、患者試料中のPKCλタンパク質の検出のために用いることもできる。例えば、組織試料を患者から入手し、切片にして、抗PKCλ抗体および任意の標準的な検出システム（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素と結合させた二次抗体を含むもの）を用いて、PKCλの存在に関して染色することができる。このような技法に関する一般的な手引きは、例えば、Bancroftら、「Theory and Practice of Histological Techniques」、Churchill Livingstone, 1982およびAusubelら、前記に記載がある。
【００５３】
PKCλと関連のある疾患または状態の治療または予防のために用いうる分子の同定
以上に考察したように、PKCλをコードする遺伝子中の変異を、心臓の発育および発生の異常が生じる表現型をもたらすものとして同定することにより、PKCλと関連のある疾患または状態の治療または予防に用いうる分子（例えば、小型の有機分子または無機分子、抗体、ペプチドまたは核酸分子）の同定が容易にある。このような疾患または状態に対する候補化合物の効果を、例えば、ゼブラフィッシュ系を用いて調べることができる。上記の通り、ゼブラフィッシュ、ダニオ レリオは発生の遺伝学的な分析に用いるのに好都合な生物である。これは観察しやすい透明な胚を有しているために器官の機能を発生のごく早期から直接観察することができ、世代時間が短い上に多産である。以下でさらに考察するように、これらの方法に用いうる、中核変異などのPKCλ変異を有するゼブラフィッシュおよび他の動物も本発明に含まれる。
【００５４】
本発明のスクリーニング方法の1つの例では、PKCλタンパク質をコードする遺伝子中に変異を有するゼブラフィッシュ（例えば、中核変異を有するゼブラフィッシュ）を候補化合物と接触させ、心臓異常の発生に対する、または既存の異常などの状況に対する化合物の効果を、未処理の同一変異型対照と比較してモニタリングする。本方法の1つの変法では、ゼブラフィッシュ、PKCλ遺伝子に変異（例えば、has変異）のあるゼブラフィッシュまたは変異のないゼブラフィッシュを、コンセントラミドの存在下で候補化合物と接触させる。
【００５５】
化合物がゼブラフィッシュ系において所望の効果を有することが示された後には、それを、心疾患の他のモデル、例えば、PKCλをコードする遺伝子に変異を有するマウスまたは他の動物で試験することができる。または、このような動物モデル系における試験を、ゼブラフィッシュ試験を用いずに行うこともできる。本発明の化合物を癌の動物モデルで試験することもできる。
【００５６】
また、細胞培養系アッセイを、PKCλのレベルまたは生物活性を上昇または低下させる分子の同定に用いることもできる。1つのアプローチによれば、PKCλmRNAを発現する細胞の培地に候補分子を添加する。続いて、PKCλ生物活性を標準的な技法を用いて測定する。生物活性の測定には、PKCλのタンパク質および核酸分子のレベルの測定が含まれうる。
【００５７】
一般に、PKCλをコードする遺伝子における変異と関連のある疾患の予防または治療のための新規薬剤は、天然物の大規模ライブラリー、合成（または半合成）抽出物、および化学物質ライブラリーから、当技術分野で周知の方法を用いて同定しうる。薬剤の探索および開発の分野の当業者は、被験抽出物または化合物の厳密な源は本発明のスクリーニング方法にとって特に重要ではなく、デレプリケーション、すなわちPKCλに対する治療的活性がすでに知られた材料の複製物または反復物の除去を、可能な場合は常に行いうることを理解すると考えられる。
【００５８】
試験を行う候補化合物には、精製された（または実質的に精製された）分子、または化合物の混合物（例えば、細胞から得た抽出物または上清；Ausubelら、前記）の1つもしくは複数の成分が含まれ、このような化合物にはさらに、天然または人工的に導き出された化学物質、および既存の化合物の修飾物のいずれもが含まれる。例えば、候補化合物は、ポリペプチド、合成された有機分子または無機分子、天然の有機分子または無機分子、核酸分子、およびそれらの成分でありうる。
【００５９】
当業者は天然の候補化合物のさまざまな源を容易に入手しうる。例えば、天然の化合物を、細胞（植物、真菌、原核生物および動物を含む）抽出物、哺乳動物の血清、哺乳動物細胞を培養した増殖培地、タンパク質発現ライブラリーまたは発酵培地から見いだすことができる。さらに、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態にある天然化合物のライブラリーが、Biotics（Sussex, UK）、Xenova（Slough, UK）、Harbor Branch Oceanographic Institute（Ft. Pierce, FL）、およびPharmaMar, U.S.A.（Cambridge, MA）を含む、さまざまな供給元から販売されている。さらに、天然化合物のライブラリーを、必要に応じて、当技術分野で知られた方法に従って、例えば、標準的な抽出および分画によって作製することもできる。
【００６０】
人工的に導き出された候補化合物も当業者にとって入手は容易である。例えば糖質、脂質、ペプチドおよび核酸分子を基盤とする化合物を含む、任意のさまざまな化合物のランダム合成または定方向合成（例えば、半合成または全合成）を行うために、さまざまな方法を利用することができる。加えて、合成化合物ライブラリーが、Brandon Associates（Merrimack, NH）およびAldrich Chemicals（Milwaukee, WI.）から販売されている。合成化合物のライブラリーを、必要に応じて、当技術分野で知られた方法、例えば、標準的な抽出および分画によって作製することもできる。さらに、必要に応じて、任意のライブラリーまたは化合物を、標準的な化学的、物理的または生化学的方法を用いて容易に修飾することもできる。コンビナトリアル化学を含む、現在の合成化学の技法も用いうる（Schreiber, Bioorganic and Medicinal Chemistry 6：1172-1152,1998；Schreiber, Science 287: 1964-1969, 2000に総説がある）。
【００６１】
粗抽出物がPKCλ関連疾患の発症または存続に影響を及ぼすことが見いだされた場合には、観察された影響の原因となる化学成分を単離するために陽性リード抽出物のさらなる分画を行いうる。すなわち、抽出、分画および精製工程の目標は、所望の活性を有する、粗抽出物内部の化学的実体の入念な特徴分析および同定である。化合物の混合物における活性の検出のために本明細書に記載したものと同じアッセイを用いて、活性成分を精製し、これらの化合物の誘導体を試験することができる。このような不均質な抽出物の分画および精製の方法は当技術分野で周知である。必要に応じて、治療のために有用な作用物質であることが示された化合物を、当技術分野で知られた方法に従って化学的に修飾することができる。
【００６２】
一般に、PKCλの発現または活性を活性化することが見いだされた化合物は、異常な発育もしくは発生を特徴とするものまたは心不全といった心臓の疾患または状態（上記も参照のこと）の予防または治療に用いうる可能性がある。PKCλの発現または活性を修飾する、例えば阻止することが見いだされた化合物は、癌の予防または治療のために用いうる可能性がある。
【００６３】
動物モデル系
本発明はまた、上記のスクリーニング方法を行う際に用いるための動物モデル系も提供する。これらのモデル系の例には、PKCλ遺伝子に変異（例えば、中核変異）を有する、ゼブラフィッシュ、およびマウスなどの他の動物が含まれる。例えば、本発明に用いうるゼブラフィッシュモデルは、PKCλタンパク質産生の欠如、または短縮型（例えば、終止コドンの導入による）もしくは別の様式で変化したPKCλ遺伝子産物の産生をもたらす変異を含みうる。具体的な一例としては、中核変異を有するゼブラフィッシュを用いることができる（以下を参照）。
【００６４】
PKCλと関連のある疾患または状態の治療または予防
上記のスクリーニング方法を用いて同定された化合物は、心臓の疾患もしくは状態または癌を有する、または発症するリスクのある患者を治療するために用いうる。PKCλタンパク質をコードする核酸分子、ならびにこれらのタンパク質自体をこのような方法に用いることもできる。治療は短期間のみ必要なこともあり、何らかの形で患者の生涯にわたって必要なこともある。しかし、継続的な治療の必要性は、例えば上記の診断方法を用いて判定しうる。種々の治療法を検討する際には、このような治療法が、罹患した臓器またはその可能性のある臓器（例えば、心臓）を標的とすることが好ましいことを理解しておくべきである。このようなターゲティングは、標準的な方法を用いて実現しうる。
【００６５】
変異したPKCλ遺伝子に起因する疾患の治療または予防は、例えば、変異型PKCλタンパク質の機能を修飾することによって実現しうる。治療は、正常なPKCλタンパク質を適切な細胞に送達すること、正常または変異型PKCλタンパク質のレベルを改変すること、PKCλタンパク質をコードする変異型遺伝子をPKCλタンパク質をコードする正常遺伝子によって置換すること、またはPKCλタンパク質をコードする正常遺伝子を投与することによって実現しうる。また、PKCλタンパク質をコードする遺伝子における欠陥の影響を、PKCλタンパク質が関与する生理的経路（例えば、シグナル伝達経路）を改変することによって是正することも可能である。
【００６６】
変異型PKCλタンパク質をコードする遺伝子に関してヘテロ接合性である、またはこのような変異もしくは異常PKCλ発現に対する感受性が高い（このような変異または発現パターンがPKCλの発現または生物活性の変化をまだ引き起こしていない場合であっても）と診断された患者には、本明細書に記載した治療物質の任意のものを、疾患表現型の発現の前に投与することができる。特に、変異体の表現型に効果を及ぼすこと、またはPKCλタンパク質の発現を調節することが示された化合物は、疾患を有する可能性があるまたは実際に疾患を有すると診断された患者に対して、任意の標準的な投与量および投与経路によって投与することができる。
【００６７】
本発明による、上記のようにして同定された化合物、PKCλ遺伝子またはPKCλタンパク質の投与には、任意の適切な投与経路を用いうる。例えば、投与は、非経口的、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、血管内、嚢内、脊髄内、槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾルによる、坐薬による、または経口的でありうる。
【００６８】
本発明の治療的化合物は、薬学的に許容される希釈剤、担体または添加剤の中にある状態で、単位投薬式剤形として投与することができる。投与は患者が発症する前に開始することも後に開始することもできる。製剤を作製するための当技術分野で周知の方法は、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（第18版）、A. Gennaro編、1990, Mack Publishing Company, Easton, PAに記載されている。治療的製剤が溶液または懸濁液の形態にあってもよい。非経口的投与のための製剤は、例えば、添加剤、滅菌水または生理的食塩液；プロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール；植物由来の油；または水素化ナフタレンを含みうる。化合物の放出を制御するためには、生体適合性がある生分解性のラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体またはポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレングリコール共重合体を用いうる。有用な可能性のある他の非経口的送達システムには、エチレン-酢酸ビニル共重合体粒子、浸透ポンプ、植え込み型注入システムおよびリポソームが含まれる。経口投与のための製剤は、錠剤またはカプセル剤の形態であってよい。吸入用の製剤は、添加剤、例えばラクトースを含んでもよく、または例えば、ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸を含む水性溶液であってもよく、または点鼻薬の形態もしくはゲルとしての投与用の油性溶液であってもよい。または、鼻腔内製剤は粉末またはエアロゾルの形態であってよい。
【００６９】
変異型タンパク質を正常タンパク質によって置換するため、または十分量のPKCλもしくは正常PKCλを発現しない細胞に対してタンパク質を添加するためには、PKCλタンパク質が発現される細胞培養系（例えば、以下を参照のこと）から大量の純粋なPKCλタンパク質を入手することが必要と思われる。続いて、罹患組織へのタンパク質の送達を、適切なパッケージングシステムまたは投与システムを用いて行うことができる。
【００７０】
遺伝子治療は、PKCλ遺伝子の欠陥に起因する疾患を予防または改善するための、もう1つの治療的アプローチである。野生型PKCλタンパク質をコードする核酸分子を、正常PKCλタンパク質の生物活性が十分でない細胞（例えば、PKCλ遺伝子に変異（例えば、中核変異）を有する細胞）に送達することができる。この核酸分子は、細胞によって取り込まれ、有効なPKCλタンパク質の機能を得るのに十分なレベルのタンパク質が産生されうる形態として細胞に送達されなければならない。または、いくつかのPKCλ変異については、その遺伝子中に第2の変異を有する相同遺伝子の別のコピーを導入することによって結果として起こる疾患の進行を遅らせることもしくはPKCλタンパク質活性を調節すること、変異を改変すること、または負の影響を阻止するために別の遺伝子を用いることが可能と思われる。
【００７１】
体細胞遺伝子治療のためには形質導入ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）ベクターを用いることができ、これはそれらの感染ならびに安定的な組込みおよび発現の効率が高いためである（例えば、Cayouetteら、Human Gene Therapy 8: 423-430, 1997；Kidoら、Current Eye Research 15: 833-844, 1996；Bloomerら、Journal of Virology 71: 6641-6649, 1997；Naldiniら、Science 272: 263-267, 1996；およびMiyoshiら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 10319, 1997を参照されたい）。例えば、完全長PKCλ遺伝子またはその部分をレトロウイルスベクター中にクローニングし、その内因性プロモーターから、レトロウイルス末端反復配列から、または目的の標的細胞種に対して特異的なプロモーターからの発現を導くことができる。用いうる他のウイルスベクターには、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはエプスタイン-バーウイルスなどのヘルペスウイルスが含まれる（例えば、以下のもののベクターも参照されたい：Miller, Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman, Science 244: 1275-1281, 1989；Eglitisら、BioTechniques 6: 608-614, 1988；Tolstoshevら、Current Opinion in Biotechnology 1: 55-61, 1990；Sharp, The Lancet 337: 1277-1278, 1991；Cornettaら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36: 311-322, 1987；Anderson, Science 226：401-409,1984；Moen, Blood Cell 17: 407-416,1991；Millerら、Biotechnology 7: 980-990, 1989；Le Gal La Salleら、Science 259: 988-990, 1993；およびJohnson, Chest 107: 77S-83S, 1995）。レトロウイルスベクターは特に開発が進んでおり、臨床環境で用いられている（Rosenbergら、N. Engl. J. Med 323: 370, 1990；Andersonら、米国特許第5,399,346号）。
【００７２】
PKCλタンパク質がかわる疾患を被ることが予想される細胞への治療的DNAの導入のために、非ウイルス的アプローチを用いることもできる。例えば、PKCλの核酸分子またはアンチセンス核酸分子は、リポフェクションにより（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413, 1987；Onoら、Neuroscience Letters 17: 259, 1990；Brighamら、Am. J. Med. Sci. 298: 278, 1989；Staubingerら、Methods in Enzymology 101: 512, 1983）、アシアロオロソムコイド-ポリリジン結合により（Wuら、Journal of Biological Chemistry 263: 14621, 1988；Wuら、Journal of Biological Chemistry 264: 16985, 1989）、または手術条件下での微量注入により（Wolffら、Science 247: 1465, 1990）、細胞に導入することができる。
【００７３】
また、遺伝子導入を、インビトロでのトランスフェクションを伴う非ウイルス的手段を用いて実現することもできる。このような方法には、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、電気穿孔およびプロトプラスト融合の使用が含まれる。リポソームも細胞内へのDNAの送達に有益な可能性がある。患者の罹患組織中への正常遺伝子の移植を、正常PKCλタンパク質を培養可能な細胞種（例えば、自己または異種の初代細胞またはその子孫）にエクスビボで移入し、その後に細胞（またはその子孫）を標的組織に注入することによって行うこともできる。
【００７４】
遺伝子治療の方法に用いるためのPKCλcDNA発現は、任意の適したプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）、シミアンウイルス40（SV40）またはメタロチオネインプロモーター）から指令させ、任意の適切な哺乳動物調節因子によって調節することができる。例えば、必要に応じて、特定の細胞種における遺伝子発現を選好的に指令することが知られたエンハンサーを、PKCλ発現を指令するために用いることができる。用いられるエンハンサーには、組織特異的または細胞特異的エンハンサーとして特徴づけられるものが非制限的に含まれうる。または、PKCλのゲノムクローンを治療的構築物として用いる場合には（このようなクローンは、本明細書に記載するように、PKCλcDNAとのハイブリダイゼーションによって同定しうる）、調節を、コグネイト調節配列により、または必要に応じて、上記のプロモーターもしくは調節因子の任意のものを含む、異種の源に由来する調節配列によって媒介させることもできる。
【００７５】
アンチセンスに基づく戦略を行うための分子は、PKCλタンパク質の遺伝子機能を利用するために、治療薬の設計の基盤として、ならびに癌などのPKCλ関連疾患の治療のために用いうる。これらの戦略は、遺伝子発現の配列特異的な抑制（転写または翻訳を介する）を、ゲノムDNAまたはmRNAと相補的アンチセンス種との細胞内ハイブリダイゼーションによって実現しうるという原理に基づく。ハイブリッドRNA二重鎖の形成により、PKCλをコードする標的ゲノムDNA分子の転写、または標的PKCλmRNA分子のプロセシング、輸送、翻訳もしくは安定性が妨げられる。
【００７６】
アンチセンス戦略は、さまざまなアプローチによる送達が可能である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスRNAを、細胞内への取り込みが可能な形態として対象に直接投与すること（例えば、静脈内注射による）ができる。または、アンチセンスRNA（またはアンチセンスRNA断片）をコードするウイルスベクターまたはプラスミドベクターを、インビボまたはエクスビボで細胞に導入することもできる。アンチセンス効果は制御（センス）配列によって誘導しうる；しかし、表現型変化の程度には大きな幅がある。アンチセンス分子によって誘導される表現型効果は、タンパク質レベル、タンパク質活性測定および標的mRNAレベルなどの基準における変化に基づく。
【００７７】
PKCλ遺伝子治療を、野生型または変異型PKCλタンパク質の発現によって有害な影響を受けると予想される細胞に対するアンチセンスPKCλmRNAの直接投与によって行うこともできる。アンチセンスPKCλmRNAの作製および単離は任意の標準的な技法によって行いうるが、高効率プロモーター（例えば、T7プロモーター）の制御下にあるアンチセンスPKCλcDNAを用いるインビトロ転写によって作製することが最も容易である。細胞へのアンチセンスPKCλmRNAの投与は、上記の直接的な核酸分子の投与のための方法の任意のものによって行いうる。
【００７８】
遺伝子治療を用いてPKCλタンパク質機能を抑制するための1つの代替的な戦略は、抗PKCλタンパク質抗体または抗PKCλタンパク質抗体の部分の細胞内発現を伴う。例えば、PKCλタンパク質と特異的に結合してその生物活性を阻害するモノクローナル抗体をコードする遺伝子（または遺伝子断片）を、組織特異的な遺伝子調節配列の転写制御下におくことができる。
【００７９】
本発明に含まれるもう1つの治療的アプローチは、組換えPKCλポリペプチドの投与を、潜在的もしくは実際の疾患罹患組織の部位への直接的なもの（例えば、注入による）、または全身的なもの（例えば、任意の好都合な組換えタンパク質投与法による）のいずれかとして伴う。PKCλタンパク質の投与量は、個々の患者の身体の大きさおよび健康状態を含むさまざまな要因に依存するが、一般に、成人に対しては1日当たり0.1mg〜100mg（0.1mg、100mgを含む）を、薬学的に許容される任意の製剤中にある形で投与する。
【００８０】
PKCλ修飾性化合物、PKCλタンパク質またはPKCλ核酸の患者への投与を含む本明細書に記載の治療方法に加えて、本発明は、このような分子の存在下で臓器を培養する方法も提供する。特に、以上に指摘した通り、PKCλ変異は心臓の発育および発生の異常と関連している。このため、これらの分子の存在下での心臓組織の培養を、その発育および発生を促進するために用いることができる。この組織は、例えば、同種または異種ドナーから移植片用として調製されたものでもよく、合成性の組織または臓器でもよい。
【００８１】
PKCλタンパク質、ポリペプチドおよびポリペプチド断片の合成
分子生物学の当業者は、非常にさまざまな発現系を、組換えPKCλタンパク質の産生に用いうることを理解すると考えられる。以下にさらに考察するように、用いる宿主細胞の詳細は本発明にとって特に重要ではない。PKCλタンパク質は、原核生物宿主（例えば、大腸菌）でも真核生物宿主（例えば、出芽酵母（S. cerevisiae）、Sf9細胞などの昆虫細胞、またはCOS-1、NIH-3T3もしくはHeLa細胞などの哺乳動物細胞）でも産生させうる。これらの細胞は、例えば、American Type Culture Collection, Manassas, VAから販売されている（Ausubelら、前記も参照）。形質転換の方法発現媒体（例えば、発現ベクター）の選択は、選択する宿主系に依存すると考えられる。形質転換およびトランスフェクションの方法は、例えば、Ausubelら、前記に記載されており、発現媒体は、例えば、Pouwelsら、「Cloning Vectors: A Laboratory Manual」、1985, Supp. 1987に示されたものから選択しうる。本発明において用いうる発現系の具体的な例を、以下にさらに説明する。
【００８２】
タンパク質発現のためには、PKCλ遺伝子配列がプラスミドまたは他のベクター中に導入された真核生物または原核生物発現系を作製し、それを続いて生細胞の形質転換に用いるとよい。全オープンリーディングフレームを含む完全長PKCλcDNAが発現プラスミド中に正しい向きで挿入された構築物を、タンパク質発現のために用いうる。または、野生型または変異型PKCλ配列を含むPKCλ遺伝子配列の部分を挿入することもできる。原核生物および真核生物の発現系により、PKCλの種々の重要な機能ドメインを、必要に応じて、融合タンパク質として回復させ、続いて結合試験、構造試験および機能試験のため、ならびに抗体の作製のために用いることが可能になる。
【００８３】
典型的な発現ベクターは、ベクター中に挿入された核酸分子に対応する大量のmRNAの合成を指令するプロモーターを含む。それらはまた、宿主細胞内での自律複製を可能にする真核生物性または原核生物性の複製起点、通常であれば有害な薬剤に対する耐性を付与し、それによってベクターを含む細胞をその薬剤の存在下で選択することを可能にする配列、および合成されたmRNAが翻訳される効率を高める配列も含みうる。安定な長期持続性ベクターは、例えば、ウイルスの調節因子（例えば、エプスタインバーウイルスのゲノム由来のOriP配列）を用いることにより、自由に複製する実体として維持しうる。また、細胞のゲノムDNA中にベクターが組み込まれた細胞系を作製することもでき、このようにすることで、遺伝子産物を細胞内で連続的に産生させることができる。
【００８４】
大腸菌などの細菌における外来性分子の発現には、外来性核酸分子、例えばPKCλ核酸分子の、細菌発現ベクター中への挿入が必要である。このようなプラスミドベクターは、細菌内でのプラスミドの増殖のため、およびプラスミド内部に含まれる外来性DNAの発現のために必要ないくつかの因子を含む。プラスミドを保有する細菌のみの増殖は、プラスミドを保有する細菌が、通常であれば有害な薬剤の存在下で増殖することを可能にする、選択マーカーをコードする遺伝子をプラスミドに導入することによって達成しうる。プラスミドは、外来性DNAからの大量のmRNAの合成を指令しうる転写プロモーターも含む。このようなプロモーターは（必然的ではないものの）、適切な条件下（例えば、プロモーターを活性化する薬剤の存在下）での培養によって誘導すると転写を開始する誘導性プロモーターでありうる。プラスミドはまた、遺伝子をベクター内部に正しい向きで挿入することを容易にするためのポリリンカーも含むことが好ましい。
【００８５】
PKCλ遺伝子またはその断片、融合物もしくは変異型を含む適切な発現ベクターがひとたび構築されれば、例えば、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAEデキストランによるトランスフェクション、電気穿孔、微量注入、プロトプラスト融合またはリポソームを介したトランスフェクションなどの形質転換法を用いて、それを適切な宿主細胞内に導入することができる。本発明のベクターによるトランスフェクションが可能な宿主細胞には、大腸菌もしくは他の細菌、酵母、真菌、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルスベクターを発現のために用いる）、またはマウス、ヒトもしくは他の動物に由来する細胞が非制限的に含まれうる。哺乳動物細胞を、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルス発現系）を用いるPKCλタンパク質の発現に用いることもでき、これは例えば、Ausubelら、前記に記載されている。
【００８６】
クローニングされたDNAによってコードされるPKCλタンパク質、融合物、ポリペプチド断片もしくは変異体のインビトロ発現を、T7後期プロモーター発現系を用いて行うこともできる。この系は、バクテリオファージT7のDNAにコードされた酵素であるT7 RNAポリメラーゼの調節下での発現に依存している。T7 RNAポリメラーゼはT7後期プロモーターと呼ばれる特定の23塩基対プロモーター配列の箇所で転写を開始する。T7後期プロモーターのコピーはT7ゲノム上のいくつかの部位に位置するが、大腸菌染色体DNAに存在するものはない。その結果、T7に感染した大腸菌では、T7 RNAポリメラーゼはウイルス遺伝子の転写を触媒するが大腸菌遺伝子の転写は触媒しない。この発現系では、組換え大腸菌細胞を、T7 RNAポリメラーゼをコードする遺伝子をlacプロモーターに隣接して有するようにまず操作する。IPTGの存在下で、これらの細胞はT7ポリメラーゼ遺伝子を高い速度で転写し、T7 RNAポリメラーゼを大量に合成する。続いて、これらの細胞に対して、T7後期プロモータータンパク質のコピーを有するプラスミドベクターによる形質転換を行う。これらの形質転換された大腸菌細胞を含む培地にIPTGを添加すると、大量のT7 RNAポリメラーゼが産生される。続いて、ポリメラーゼがプラスミド発現ベクター上のT7後期プロモーターと結合し、挿入されたcDNAの高い速度での転写を触媒する。大腸菌細胞は発現ベクターのコピーを数多く含むため、クローニングされたcDNAに対応する大量のmRNAをこの系で産生させることができ、生じたタンパク質を放射標識することができる。
【００８７】
後期プロモーター、ならびにT3、T5、およびSP6などの近縁のバクテリオファージ由来の対応するRNAポリメラーゼを含むプラスミドベクターを、クローニングされたDNAからのタンパク質のインビトロ産生のために用いることもできる。大腸菌をmGPI-2などのM13ファージを用いた発現のために用いることもできる。さらに、ファージλ調節配列を含むベクター、または融合タンパク質、例えばマルトース結合タンパク質融合タンパク質もしくはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質の発現を導くベクターを、大腸菌における発現のために用いることもできる。
【００８８】
真核生物発現系は、発現されたタンパク質の適切な翻訳後修飾を得るために有用である。PKCλ遺伝子を含む真核生物発現プラスミドの真核生物宿主細胞への一時的トランスフェクションにより、トランスフェクトされた宿主細胞によるPKCλタンパク質の一過性産生が可能になる。PKCλタンパク質を、安定的にトランスフェクトされた真核生物（例えば、哺乳動物）細胞系によって産生させることもできる。哺乳動物細胞の安定的トランスフェクションのために適したさまざまなベクターが一般に公開されており（例えば、Pouwelsら、前記を参照）、このような細胞を含む系統を構築するための方法についても同様である（例えば、Ausubelら、前記を参照）。
【００８９】
1つの例においては、PKCλタンパク質、融合物、変異体またはポリペプチド断片をコードするcDNAを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子を含む発現ベクター中にクローニングする。宿主細胞染色体へのプラスミドの組込み、すなわち中核変異タンパク質をコードする遺伝子の組込みに関して、0.01〜300μMメトトレキサートを培地に含めることによって選択する（Ausubelら、前記）。この優性選択はほとんどの細胞種で行いうるう。組換えタンパク質の発現は、トランスフェクトされた遺伝子のDHFRを介した増幅によって増加させることができる。遺伝子増幅物を保有する細胞系を選択するための方法はAusubelら、前記に記載されている。これらの方法は一般に、含有するメトトレキサートの濃度を徐々に増加させながら培地中に長期的に培養することを含む。最もよく用いられるDHFR含有発現ベクターはpCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV(A)である（例えば、Ausubelら、前記に記載されている）。上記の宿主細胞、または好ましくはDHFR欠損CHO細胞系（例えば、CHO DHFR細胞、ATCCアクセッション番号CRL 9096）は、安定的にトランスフェクトされた細胞系またはDHFRを介した遺伝子増幅のDHFR選択のために最も好ましいものである。
【００９０】
もう1つの好ましい真核生物発現系は、例えば、Clontech社（Palo Alto, CA）から入手しうるベクターpBacPAK9を用いる、バキュロウイルス系である。必要に応じて、この系を、他のタンパク質発現法、例えば、Evanら（Molecular and Cellular Biology 5: 3610-3616, 1985）によって記載されたmycタグアプローチと組み合わせて用いることもできる。
【００９１】
ひとたび組換えタンパク質が発現されれば、細胞溶解に続いてアフィニティークロマトグラフィーなどのタンパク質精製法を行うことにより、それを発現細胞から単離することができる。この例では、本明細書に記載の方法によって作製しうる抗PKCλ抗体をカラムに結合させて、組換えPKCλを単離するために用いる。アフィニティークロマトグラフィーの前の、PKCλを保有する細胞の溶解および分画は、標準的な方法によって実施しうる（例えば、Ausubelら、前記を参照）。ひとたび単離した上で、組換えタンパク質を、必要に応じて、例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC；例えば、Fisher, 「Laboratory Techniques In Biochemistry and Molecular Biology」、WorkおよびBurdon編、Elsevier, 1980を参照）によってさらに精製することもできる。
【００９２】
本発明のポリペプチド、特に短いPKCλ断片ならびにPKCλのN末端およびC末端の比較的長い断片を、化学合成によって（例えば、「Solid Phase Peptide Synthesis」、第2版、1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, ILに記載された方法によって）作製することもできる。ポリペプチドの発現および精製のこれらの一般的な技法を、本明細書に記載するように、有用なPKCλ断片または類似体の作製および単離のために用いることもできる。
【００９３】
PKCλタンパク質断片
PKCλタンパク質の種々の部分を含むポリペプチド断片は、その生物活性にとって重要なPKCλのドメインを同定するのに有用である。本明細書に提供するヌクレオチド配列を用いて、このような断片を作製するための方法は当技術分野で周知である（例えば、Ausubelら、前記を参照）。例えば、PKCλタンパク質断片は、PKCλ核酸配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、所望のPKCλ核酸分子断片のPCR増幅を行うことによって作製しうる。オリゴヌクレオチドプライマーは、発現ベクター（例えば、哺乳動物発現ベクター、上記を参照）のクローニング部位への増幅断片の挿入を容易にする、一意的な制限酵素部位を含むことが好ましい。続いて、、発現ベクターを含む細胞内でのPKCλタンパク質断片の産生をもたらす、本明細書に記載したものなどの、当技術分野で知られたさまざまな技法の任意のものを用いる手法により、このベクターを細胞（例えば、哺乳動物細胞；上記を参照）に導入することができる。PKCλタンパク質断片（例えば、キメラ融合タンパク質）を、例えば下記の方法を用いて、PKCλタンパク質のさまざまな領域に対して特異的な抗体を産生させるために用いることもできる。
【００９４】
PKCλタンパク質抗体
ポリクローナル抗体を調製するためには、PKCλタンパク質、PKCλタンパク質の断片、またはPKCλタンパク質の規定された部分を含む融合タンパク質を、例えば、適したクローニング用媒体中に含まれる対応するDNA配列の発現により、細菌内で合成させる。融合タンパク質は、抗体を作製するための抗原の源として一般に用いられる。大腸菌用の発現系として広く用いられているものには、pURシリーズのベクターを用いるlacZ融合物、およびpATHベクターを用いるtrpE融合物の2つがある。タンパク質を精製し、担体タンパク質と結合させ、接種した動物における抗原応答を刺激するためにフロイントアジュバントと混合した上で、ウサギまたは他の実験動物に注入することができる。または、タンパク質を、PKCλを発現する培養細胞から単離することもできる。週2回の間隔で追加注射を行った後に、ウサギまたは他の実験動物から採血して血清を単離する。血清を直接用いることもでき、または、プロテインA-セファロース、抗原-セファロースおよび抗マウス-Igセファロースなどの試薬を用いるアフィニティークロマトグラフィーを含むさまざまな方法により、使用の前に精製することもできる。続いて血清を、PKCλタンパク質を同定するためのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画したPKCλ発現組織からタンパク質抽出物のプローブ検索を行うために用いることができる。または、タンパク質の抗原部分に対応する合成ペプチドを作製し、動物への接種に用いることもできる。
【００９５】
例えば、PKCλ特異抗体などの作製に用いるためのペプチドまたは完全長タンパク質を作製するためには、PKCλコード配列を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST；Smithら、Gene 67: 31-40, 1988）とのC末端またはN末端融合物として発現させることができる。融合タンパク質をグルタチオン-セファロースビーズで精製し、グルタチオンによって溶出させ、トロンビンまたは第Xa因子などのプロテアーゼによって切断した上で（人工的に導入した切断部位の箇所で）、ウサギの免疫処置が奏功するのに必要な程度まで精製することができる。初回免疫処置はフロイント完全アジュバントを用いて行い、その後の免疫処置はフロイント不完全アジュバントを用いて行いうる。抗体価は、GST-PKCλタンパク質のプロテアーゼ切断PKCλ断片を用いるウエスタンブロットおよび免疫沈降分析によって観測しうる。免疫血清はCNBr-セファロースに結合させたPKCλを用いてアフィニティー精製を行いうる。抗血清の特異性は関連のない一連のGST融合タンパク質を用いて決定しうる。
【００９６】
または、モノクローナルPKCλ抗体を、PKCλを発現する培養細胞から単離されたPKCλまたは組織から単離されたPKCλタンパク質を抗原として用いることによって作製することもできる。PKCλを含む細胞抽出物または組換えタンパク質抽出物は、例えば、フロイントアジュバントとともにマウスに注入しうる。注射から数日後に、マウス脾臓を摘出し、組織を解離させて、脾細胞をリン酸緩衝食塩水（PBS）中に懸濁化する。脾細胞は、リンパ球（その一部は適切な特異性を備えた抗体を産生すると考えられる）の供給源としての役割を果たす。続いて、これらを永久増殖性の骨髄腫パートナー細胞と融合させ、融合産物を、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（HAT）などの選択用薬剤の存在下で多数の組織培養ウェルへのプレーティングを行う。続いて、PKCλポリペプチド断片またはその変異体と結合しうる抗体を作製する細胞を含むものを同定するために、ウェルをELISAによってスクリーニングする。これらの細胞を続いて再プレーティングし、一定の増殖期間の後に、これらの細胞を含むウェルを、抗体産生細胞を同定するために再びスクリーニングする。90％を超えるウェルのが特異抗体の産生に関して陽性である単一クローンを含むようになるまで、複数回のクローニング手順を実施することができる。この手順により、抗体を産生するクローンの安定的な系統を樹立しうる。続いてこのモノクローナル抗体を、プロテインAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ならびにこれらの技法の変法および組み合わせにより、精製することができる。モノクローナル抗体がひとたび作製されれば、ウエスタンブロットまたは免疫沈降分析により、それらを特異的なPKCλ認識に関しても試験する（例えば、Kohlerら、Nature 256: 495, 1975；Kohlerら、European Journal of Immunology 6: 511, 1976；Kohlerら、European Journal of Immunology 6: 292, 1976；Hammerlingら、「Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridoma」、Elsevier, New York, NY, 1981；Ausubelら、前記を参照されたい）。
【００９７】
GST融合タンパク質に対する代替的または補助的な免疫原として、PKCλの比較的独特な親水性領域に対応するペプチドを作製し、導入したC末端リジンを介してキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）と結合させることができる。これらのペプチドのそれぞれに対する抗血清を、BSAと結合させたペプチド上で同様にアフィニティー精製し、ペプチド結合物を用いるELISAおよびウエスタンブロットにより、ならびに例えばGST融合タンパク質として発現させたPKCλを用いるウエスタンブロットおよび免疫沈降により、特異性を評価することができる。
【００９８】
本発明の抗体は、高度に保存された領域内には位置せず、しかもペプチド構造プログラム（Genetics Computer Group Sequence Analysis Package, Program Manual for the GCG Package, バージョン7, 1991）により、Jamesonら、CABIOS 4: 181, 1988のアルゴリズムを用いて得られるものなどの基準による分析によれば抗原性である可能性が高いように思われる、PKCλアミノ酸配列を用いて作製しうる。これらの断片を標準的な技法、例えばPCRによって作製し、pGEX発現ベクター中にクローニングすることができる。GST融合タンパク質は大腸菌内で発現させ、グルタチオン-アガロースアフィニティマトリックスを用いて精製することができる（Ausubelら、前記）。ウサギポリクローナル抗体を産生させ、非特異的であるかPKCλに対する低親和性結合を示す抗血清を最小限に抑えるためには、2種または3種の融合物を各タンパク質に関して作製し、各融合物を少なくとも2匹のウサギに注入する。抗血清は、好ましくは少なくとも3回の追加注射を含む、一連の注射によって産生される。
【００９９】
完全なモノクローナル性およびポリクローナル性の抗PKCλ抗体に加えて、本発明は、種々の遺伝的に操作された抗体、ヒト化抗体、ならびにF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、およびsFv断片を含む抗体断片も特徴とする。短縮型のモノクローナル抗体は、例えば、所望のモノクローナル抗体断片を適した宿主内で発現するプラスミドを作製する組換え方法によって作製しうる。抗体は当技術分野で知られた方法によってヒト化することができ、例えば、所望の結合特異性を備えたモノクローナル抗体の商業的なヒト化が可能である（Scotgene, Scotland；Oxford Molecular, Palo Alto, CA）。トランスジェニック動物で発現されるものなどの完全ヒト抗体も本発明に含まれる（Greenら、Nature Genetics 7: 13-21, 1994）。
【０１００】
Ladner（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）は、単一ポリペプチド鎖抗体を調製するための方法を記載している。Wardら、Nature 341: 544-546, 1989は、自ら「単一領域抗体」と命名した、高い抗原結合親和性を有する重鎖可変領域の調製について記載している。McCaffertyら、Nature 348: 552-554, 1990は、fdバクテリオファージの表面に完全な抗体V領域を提示することができ、このファージが抗原と特異的に結合し、ファージのごく一部（100万個中の1個）をアフィニティクロマトグラフィーによって単離しうることを示した。Bossら、米国特許第4,816,397号は、単一の宿主細胞において、免疫グロブリン、ならびに少なくとも重鎖および軽鎖の可変領域を含んでいて免疫的な機能を持つその断片を産生させるための種々の方法を記載している。Cabillyら、米国特許第4,816,567号は、キメラ型抗体を調製するための方法を記載している。
【０１０１】
PKCλ抗体の使用
PKCλに対する抗体は、以上に指摘したように、PKCλを検出するため、またはPKCλの生物活性を阻害するために用いうる。例えば、抗体または抗体の部分をコードする核酸分子を、PKCλの機能を阻害するために細胞内で発現させることができる。さらに、抗体を、診断または治療の用途のために放射性核種およびリポソームなどの化合物と結合させることもできる。本明細書に記載のPKCλポリペプチドの活性を阻害する抗体は、野生型または変異型PKCλ遺伝子の不適切な発現に起因する疾患の発症の予防または緩徐化においても有用な可能性がある。
【０１０２】
PKCλ遺伝子発現の検出
指摘した通り、上記の抗体はPKCλ遺伝子の発現のモニタリングのために用いうる。RNAのインサイチューハイブリダイゼーション法を用いて、PKCλ遺伝子の発現を検出することができる。RNAインサイチューハイブリダイゼーション法は、特異的に標識された核酸プローブと個体の細胞または組織における細胞RNAとのハイブリダイゼーションに依拠している。このため、RNAインサイチューハイブリダイゼーションは組織特異的および時間特異的な遺伝子発現を検討するための強力なアプローチである。本方法においては、オリゴヌクレオチド、クローニングされたDNA断片、またはPKCλ遺伝子の一意的な部分に対応するクローニングされたDNA断片のアンチセンスRNA転写物を、例えば、さまざまな発生段階にあるマウスなどの動物の組織における特異的mRNA種の検出に用いる。その他の遺伝子発現検出法も当業者に知られており、PKCλ遺伝子発現の検出に用いることができる。
【０１０３】
さらなるPKCλ遺伝子の同定
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーションなどの標準的な技法を用いて、他の種におけるPKCλ遺伝子相同体およびヒトにおけるPKCλ関連遺伝子をクローニングすることができる。PKCλ関連遺伝子および相同体は、ヒトPKCλプローブもしくはプライマーを用いる低ストリンジェンシーDNAハイブリダイゼーションまたは低ストリンジェンシーPCRを用いて容易に同定しうる。ヒトPKCλまたはヒトPKCλ関連アミノ酸配列をコードする縮重プライマーを、さらなるPKCλ関連遺伝子および相同体をRT-PCRによってクローニングするために用いることができる。
【０１０４】
トランスジェニック動物およびノックアウト動物の構築
PKCλ遺伝子の特徴分析により、PKCλノックアウト動物モデルを相同組換えによって開発することを可能にする情報が得られる。好ましくは、PKCλノックアウト動物は哺乳動物であり、最も好ましくはマウスである。同様に、PKCλ過剰産生の動物モデルは、1つまたは複数のPKCλ配列を、標準的なトランスジェニック手法に従って動物のゲノム中に組み込むことによって作製しうる。さらに、PKCλ変異（例えば、優性遺伝子変異）の影響を、変異型PKCλ導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスを用いて、または標準的な相同組換え法を用いてこのような変異を内因性PKCλ遺伝子に導入することにより、検討することができる。
【０１０５】
ノックアウトモデルの作出に用いうる置換型ターゲティングベクターは、例えば、129／Svなどのマウス系統（Stratagene Inc., LaJolla, CA）由来の同質遺伝子系統ゲノムクローンを用いて構築しうる。ターゲティングベクターを電気穿孔によって胚性幹（ES）細胞の適した派生系に導入し、著しい短縮型のPKCλ遺伝子を保有するES細胞系を作製することができる。キメラ性ファウンダーマウスを作製するために、標的細胞系をマウス胞胚期胚に注入する。ヘテロ接合性子孫の品種間交雑を行ってホモ接合性にすることができる。PKCλノックアウトマウスは、胚発生および疾患におけるPKCλの役割を研究するためのツールとなる。さらに、このようなマウスは、PKCλ依存的経路またはPKCλの作用を受ける経路がかかわる疾患または状態の改善のための治療的化合物のインビボでの試験のための手段ともなる。
【０１０６】
心臓の幹細胞に関するマーカーとしてのPKCλの使用
PKCλは発生過程において心臓を生じる細胞内で発現されるため、これは心臓の幹細胞のマーカーとして用いうる。例えば、PKCλは、このような幹細胞の同定、選別またはターゲティングのために用いることができる。例えば、候補細胞のプールを、心臓幹細胞の同定を容易にするためにPKCλ発現に関して分析し、この同定に基づいてそれをプールから単離することができる。単離された幹細胞は当業者に知られた多くの目的に用いうる。例えば、幹細胞は新たな臓器の作製に、臓器培養に、または損傷もしくは移植した臓器の強化のために用いることができる。
【０１０７】
実験結果
コンセントラミドは心臓パターン形成に関与する生物経路を特異的に調節する
最近、ゼブラフィッシュ胚は、発生過程を乱す低分子を同定するためのハイスループットスクリーニングに適することが示されている（Petersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 12965-12969, 2000）。このような1つのスクリーニングにおいて、本発明者らは発生中のゼブラフィッシュ胚を、大規模で多様な化学物質ライブラリー由来の低分子に対して曝露させた。心臓の全体的パターン形成に影響を及ぼす低分子を同定するために、透明な胚の目視検査を用いた。これらの低分子の1つは、当初はライブラリー番号32P6として同定された（Petersonら、前記）、本発明者らがコンセントラミドと称している、アクリルアミドを含むビアリール化合物である（図1A）。
【０１０８】
通常、受精24時間後（hpf）までに心管は正中線に集合し、心房が心室の前方に左向きに幾分ずれて位置し（図2A）、血流は最初は蠕動により、後には逐次的な房収縮により、心房端から心室端へと駆動される。30hpfまでには、房の境界は明瞭になり（図2B、両方の房を標識するために心臓ミオシン軽鎖2、cmlc2を使用）、図2C（心室特異的ミオシン重鎖および心房特異的抗体S46）に示されているように、異なる遺伝子を発現するようになる。
【０１０９】
コンセントラミドに曝露された胚は密な心臓を生じ、これは循環を持続することができない。図2Eおよび2Fに示されているように、これらの個体では、心房および心室はともに協調的な様式で形成され、拍動するように思われるが、心室は心房の中心部に形成される。その結果、心房および心室が2つの同心円をなしている心臓（内側の円は心室で構成され、外側の円は心房で構成される）が生じる。背側から見ると心臓は弓矢の的のように見え（図2D）、側面図からは、心室がキノコの軸を形成し、心房がキノコの傘のように心室を取り囲んで覆っている反対向きのキノコのように見える（図1B）。
【０１１０】
いくつかの観察所見から、コンセントラミドは、心臓パターン形成にとって重要な特定の分子経路に対する高度に特異的な調節因子であることが示唆される。コンセントラミドは極めて効力が強く、ED５０は約2nMである。さらに重要なことに、コンセントラミドは比較的高用量でも別の副作用を引き起こさないように思われる。コンセントラミドを6μMの濃度で用いると6nMの濃度で用いた場合と事実上同じ表現型を引き起こすことから、これは、観察しうる発生過程に影響を及ぼす他のタンパク質を調節するよりも少なくとも1,000倍強力に、特異的な分子標的を調節することが示唆される。心血管の発生に対するコンセントラミドの作用は全般的な細胞毒性の結果とは考えられない。コンセントラミド処理胚の発生は未処理同胞と比べて遅延せず、細胞死の増加も認められない。また、コンセントラミドは、酵母の増殖速度に対しても哺乳動物細胞におけるブロモデオキシウリジン取込みに対しても何ら影響を及ぼさない。コンセントラミドの効力、幅広い濃度範囲にわたるその表現型の再現性、およびそれが生じさせる表現型が稀であること（スクリーニングを行った2000種を上回る他の低分子の中で類似の表現型を生じさせたものは皆無であった）を考慮して、本発明者らは、コンセントラミドが、心臓パターン形成の原因となる生物経路の特異的な調節因子であると結論した。
【０１１１】
コンセントラミドの効果に関する時間枠
発生過程を研究する上で低分子が遺伝子変異よりも優れる点の1つは、低分子により、過程をはるかに高度な時間的制御下で調節することが可能になることである。低分子は発生期間中の任意の時点で加えたり洗い流したりすることができるが、遺伝子変異は一般に全発生過程を通じて存在する。低分子によって得られるこの時間的制御により、発生過程にとって決定的な時期の同定が容易になる。
【０１１２】
コンセントラミドが心臓パターン形成の決定を攪乱する発生段階を同定するために、本発明者らは発生中の胚の入った水にさまざまな時点でコンセントラミドを添加した。図1Cに示されているように、14hpfよりも前の時点で処理した胚は24hpf時に同心円状の房形態を示すが、17hpf後に処理した胚は24hpf時に野生型の心臓形態を示す。この実験をさらに厳密な時期評価の下で再び行ったところ、同心円状の房形態を誘導するにはコンセントラミドが14体節期（約15hpf）より前に存在しなければならないことが判明した。すなわち、14体節期の時点で起こる発生イベントが、心臓パターン形成にとって決定的であり、低分子コンセントラミドによる擾乱を受けるものである。
【０１１３】
中核変異体の表現型を模倣するコンセントラミド処理胚の心臓
中核（has）変異は、本発明者らの大規模遺伝子スクリーニングで同定された変異である。ホモ接合性has変異型胚の心臓は小さい。本発明者らは今回、has変異型胚の心臓では、コンセントラミド処理胚のものと同じように、心室組織が心房内にあることを見いだした（図2Gおよび2H）。それらは心房に続いて心室が半径方向の逐次的な収縮を示す。しかし、has変異型胚には、網膜、腎臓、消化管および脳を含む多くの組織の欠陥も認められる。これらの欠陥はコンセントラミド処理胚には存在しない。コンセントラミド処理胚の脳は異常な発生を起こすが、胚を9〜14hpfの間に処理するとこの脳の欠陥は生じずに同心円状の房表現型が保たれる（図1C）。すなわち、コンセントラミド処理胚およびhas変異型胚の心臓表現型は非常に類似しているが、コンセントラミド処理胚の方が他の箇所での発生的欠陥は少ないように思われ、コンセントラミド処理の時期を調節することによって表現型の心臓特異性をさらに高めることができる。
【０１１４】
異型PKCλをコードする中核変異
has胚およびコンセントラミド処理胚由来の心臓の間に表現型類似性があることから、本発明者らはhas遺伝子のクローニングによって心臓パターン形成の過程に関する分子的洞察が得られる可能性があると考えた。さらに、hasのクローニングにより、hasおよびコンセントラミドが心臓パターン形成に及ぼす機序が類似しているか異なるかを本発明者らが明らかにできるとも考えられた。本発明者らは、マーカーz8451およびz11023によって挟まれた約1.1cMの区域に対してゼブラフィッシュSSRマーカー（Michelmoreら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 9828-9832,1991；Knapikら、Nat. Genet. 18: 338-343, 1998；Shimodaら、Genomics 58: 219-232, 1999）、およびAFLP（Vosら、Nucleic Acids Res. 23: 4407-4414, 1995）を用いる連鎖解析により、hasのマッピングを行った（図3A）。これらを用いてYACおよびBACを用いるウォーキング法を開始し、末端クローニング、精緻化マッピングおよび最終的なシークエンシングを進めた。変異の候補として同定された遺伝子をインサイチュー解析によってアッセイし、cDNA多型に関しては野生型および変異型RNAプールのRT-PCRによってアッセイした。BACの内部に含まれていた遺伝子を表1に示している。遺伝子の指定はBLASTXアライメントに基づく。
【０１１５】
（表１）中核変異区域内に同定された候補遺伝子
2005504533.tif 000002
【０１１６】
野生型胚および変異型胚からのPKCλのシークエンシングにより、本発明者らは両方のhas対立遺伝子がPKCλコード配列中に変異を有すると結論づけた。m567アレルにおける変異はアミノ酸518の後に早期終止コドンを生じさせ、m129アレルにおける変異はアミノ酸514の後に早期終止コドンを生じさせる（図3A）。本発明者らは、BAC 23c14のショットガンシークエンシング法により、ゼブラフィッシュPKCλ遺伝子の完全なゲノム構造を決定した。これは18個のエクソンを含み、約45kbに及ぶ。本発明者らはPKCλmRNAが広範囲にわたる組織中で発現されることを見いだした。
【０１１７】
PKCλのC末端短縮は、短縮型タンパク質が変異型胚のウエスタンブロット分析によって検出されていることから、このタンパク質を不安定化しないように思われる（図3B）。しかし、PKCαまたはPKCβのC末端短縮がこれらの近縁のキナーゼの触媒活性を失活させることからみて、短縮によってPKCλ機能に不可欠なドメインが消失する可能性があると予想される（Riedelら、J. Cell. Biochem. 52: 320-329, 1993；Riedelら、Mol. Cell. Biol. 13: 4728-4735, 1993）。PKCλ変異の表現型における役割を確かめるために、本発明者らはPKCλ翻訳開始部位に対して相補的なアンチセンスモルホリノオリゴマーを注入した。これらの注入により、変異の表現型が完全に再現された。注入した胚は肉眼的な形態のレベルでは遺伝子変異体と区別不能であり（図3C）、このことから遺伝子機能を失わせるにはC末端70アミノ酸の喪失で十分であるとの概念が裏づけられた。
【０１１８】
PKG2変異の影響を受けるが、コンセントラミド処理による影響は受けない上皮の完全性
PKCλはキナーゼの大規模なPKCファミリーに属し、PKCζとともに「異型」PKCとして分類される（Mellorら、Biochem. J. 332: 281-292, 1998）。C.エレガンス（C. elegans）におけるPKCλのオルソログと推定されるPKC-3は、Par3およびPar6とともに一細胞胚の前極に局在する（Tabuseら、前記；Hungら、Development 126: 127-135, 1999）。PKC-3は胚極性の確立に必要であり、PKC-3の不活性化はPar遺伝子の誤った局在化および対称性の初回細胞分裂をもたらす。ショウジョウバエには異型PKCが一種しかなく（DaPKC）、これもPar3様タンパク質と会合し（Bazooka）、細胞極性の制御と関連づけられている（Wordarzら、前記）。DaPKC変異体は、上皮積層化の乱れ、不規則な細胞形状および上皮細胞極性の喪失を示し、これらは細胞接着の欠陥に起因すると考えられている。脊椎動物細胞において、PKCλおよびPKCζはいずれも上皮密着結合部に局在し、Par3様タンパク質（ASIP）と会合する（Jobertyら、Nat. Cell Biol. 2: 531-539, 2000；Suzukiら、J. Cell Biol. 152: 1183-1196, 2001；Linら、Nat. Cell Biol. 2: 540-547, 2000；Izumiら、J. Cell Biol. 143: 95-106, 1998）。このため、本発明者らは、has変異およびコンセントラミド処理が上皮パターン形成および密着結合を擾乱させるか否かについて、網膜および腎臓を対象として検討した。
【０１１９】
神経網膜は基底面上の水晶体および頂端面上の第2の上皮シート（網膜色素上皮、RPE）と境界を接した上皮シートから生じる（Schmittら、J. Comp. Neurol. 344: 532-542, 1994）。細胞分化の前に、神経上皮細胞の核は上皮の頂端面と基底面との間を移動する。M期の間には、細胞核は頂端面に局在し、近傍のRPEに近接する（Sauer、J. Comp. Neurol. 62: 377-405, 1935）。約30hpfの時点から、これらの神経上皮細胞は細胞周期からの逸脱を開始し、7種類の細胞種のいずれか1つに分化する（Altshulerら、「Specification of Cell Type in the Vertebrate Retina」、「Development of the Visual System」中、Lamら（編）、MIT Press, Cambridge, MA 37-58, 1991；Dowling、「The Retina」、Belknap Press, Cambridge, MA, 1987）。続いて、それぞれの細胞種は網膜内の特定の層に移動し、高度に組織化された層状パターンを生じる（図4A参照）。
【０１２０】
has変異は神経網膜の積層化の障害およびRPEの斑状喪失を引き起こす（図4E）。これらの障害は、oko meduzy（ome）およびmosaic eyes（moe）という変異を有するゼブラフィッシュにおいて以前に指摘されたものに類似している（Jensenら、Development 128: 95-105、2001；Malickiら、Development 126: 1235-1246, 1999）。has変異体における層破壊の重症度はRPEの不連続性の位置および程度と相関し、このことからRPE上皮障害が神経網膜の障害を引き起こす、または悪化させることが示唆される。これは、正常RPEが積層化にとって重要であるという知見（Raymondら、Curr. Biol. 5: 1286-1295, 1995；Vollmerら、Neurosci. Lett. 48: 191-196, 1984）、および、has変異体の網膜上皮は、有糸分裂核の大半が神経上皮の頂端面に正しく局在するという点で、適切な頂底極性の少なくとも1つの属性を示すという事実（図4B、4Dおよび4F；has胚のM期核の89％は頂端面に局在し、これに対して野生型胚は97％が局在する）と一致すると考えられる。本発明者らは、密着結合のマーカーとして、内在性密着結合タンパク質である免疫反応性密着帯（ZO-1）を検討し、その局在が異常であることを見いだした（図4Gおよび4H）。このため、RPE細胞間の接着の消失が、has変異体における網膜パターン形成の異常の原因である可能性がある。注目すべきことに、コンセントラミド処理胚の網膜は細胞極性（図4D）、RPE連続性および積層化（図4C）の障害を示さない。
【０１２１】
発生中の腎臓は、高度の極性を有する上皮細胞から構成されるもう1つの構造である。本発明者らは、野生型胚、has胚およびコンセントラミド処理胚の腎臓における頂端部タンパク質および側底部タンパク質の分布を調べた。網膜の場合と同じく、has腎臓における細胞極性はほとんど保存されているように思われた（図5A〜5C）。しかし、has腎臓は上皮細胞の形状の点で不規則性を示す上に細胞間の間隙が時折認められ、これは上皮細胞接着の障害と一致する。コンセントラミドに曝露させた胚では、これらの障害を観察されなかった。
【０１２２】
has胚とコンセントラミド処理胚との間の違いが網膜および腎臓における上皮シートの完全性にあるとすれば、コンセントラミドがhas変異と同じ機序、すなわちPKCλの不活性化を介して働いている可能性は低いと思われる。この点をさらに検討するために、本発明者らはC.エレガンス胚の初期発生に対するコンセントラミドの影響を調べた。C.エレガンスでは、RNA干渉（RNAi）を介したPKCλオルソログPKC-3の不活性化により、Parタンパク質の極性局在の喪失および第1の細胞分裂時の非対称性の喪失が生じる（Tabuseら、前記）。高濃度のコンセントラミドで処理した胚はPar2の後極への適切な局在を保ち、正常な非対称性の初回細胞分裂を行う（図5Dおよび5E）。処理胚はサイトカインの異常を示し、発生を完了することができず、このことから非対称性障害のないことは化合物の侵入に伴う問題には起因しないことが示唆される。すなわち、コンセントラミド処理胚およびPKCλ不活性化はどちらも類似した心臓パターン形成表現型をもたらすが、コンセントラミドはゼブラフィッシュPKCλもそのセンチュウオルソログも不活性化しないように思われる。
【０１２３】
APパターン形成に関与するコンセントラミドの分子標的
コンセントラミドの分子標的がPKCλのようには上皮シートの連続性に影響を及ぼさないとすれば、それが心臓パターン形成に影響を及ぼすと考えられるのはどのような種類の過程によるであろうか。コンセントラミドによる処理は、前後（AP）軸に沿ったいくつかの解剖学的構造の相対的位置に影響を及ぼすように思われる。例えば、眼内および中脳／後脳境界部のPax2.1発現細胞の間の距離は、コンセントラミド処理胚では短くなる（図6A〜6C）。おそらくさらに重要なこととして、コンセントラミド処理胚では18体節期の時点で心臓原基の心臓ミオシン軽鎖2（cmlc2）発現細胞が吻側に推移している（図6D）。cmlc2発現領域の前縁と胚の前端との間の距離は、野生型胚（3.1+/-0.2任意単位、n＝8）の方がコンセントラミド処理胚（2.2+/-0.3任意単位、n＝12）よりも約40パーセント長い。has変異体における心臓原基の位置（3.1+/-0.3任意単位、n＝12）に関して野生型の位置との有意差はない。このため、コンセントラミドの分子標的はAPパターン形成に役割を果たすように思われる。
【０１２４】
いずれも心臓原基の融合順序に影響を及ぼすPKCλおよびコンセントラミドの標的
PKCλおよびコンセントラミドの分子標的は異なる細胞機序を介して作用するように思われるが、いずれの変調も心臓のパターン形成に極めて類似した変化をもたらす。このように類似した心臓パターン形成障害を可能にする2つの機序の共通性を特定するために、本発明者らは生物過程を変調させうる低分子による時間的制御を利用した。上記のように、本発明者らは、心室の心房内形成を引き起こすためには胚を14体節期またはその前にコンセントラミドで処理する必要があることを明らかにした。この観察所見から、本発明者らは、決定的な心臓パターン形成過程が14体節期の少し後に開始されること、ならびにこの過程の擾乱がhas胚およびコンセントラミド処理胚の両方で観察される同心円状の房表現型をもたらすことを結論づけた。これにより、本発明者らが、has胚とコンセントラミド処理胚との共通性に関する探索の対象をこの決定的な期間に絞ることが可能になった。
【０１２５】
原始心管の生成は、両側の心臓原基シートの正中線での融合によって行われる。ゼブラフィッシュではこの融合によってまず単一の正中線錐体が生じ、その基部は卵黄上にある（Fishmanら、前記；Yelonら、Dev. Biol. 214: 23-37, 1999）。その後、錐体は傾き、A-P方向となって前心室端が後方になるが、後には卵黄の再吸収に伴って前方に動かされる。
【０１２６】
本発明者らは、正中線錐体の生成が通常は錐体周囲で均一には起こらずに後方から前方へと進行し、後方領域は16体節期の時点で融合し、前方は18体節期で融合することを見いだした。この段階はコンセントラミドおよびhas変異の両方による擾乱を受ける。has変異型胚およびコンセントラミド処理胚のいずれにおいても、後端は融合できない（図7A〜7C）。原基の前端が通常融合を開始する18体節期になっても、has胚およびコンセントラミド処理胚における後端は隔たったままである（図7D〜7F）。最終的に、has胚およびコンセントラミド処理胚で後端が融合するのは、同心円状の房を伴う心臓が出現する直前である。したがって、心臓領域の前端および後端の融合順序を調節する決定的なパターン形成の決定は16体節期前後で起こる。この過程は、PKCλの不活性化またはコンセントラミド標的の変調のいずれによっても阻止しうる。
【０１２７】
すなわち、以上をまとめると、本発明者らは、低分子および変異を用いた擾乱により、心臓形成における重要な段階を特定した。この段階は、原始心管がちょうど融合する際の2つの心臓房の正しい整列化を含む。低分子コンセントラミドおよびhas変異という2種類の擾乱はいずれも、心室が心房の内部に形成されるという過去に記載されていなかった房の整列化異常を誘発する。このことは、心筋細胞の運命の確定はほとんど成されているが、房構造の高次構成が破壊されていることを意味する。
【０１２８】
実験方法
低分子処理
ゼブラフィッシュは以前の記載の通りに28.5℃で飼育した（Westerfield,「The Zebrafish Book, Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)」、Univ. of Oregon Press, Eugene 1995）。別に特記する場合を除き、胚の処理は、原腸胚形成の前にコンセントラミドを34μM貯蔵溶液（DMSO中）から最終濃度34nMとして水に添加することによって行った。。
【０１２９】
ホールマウントインサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学
ジゴキシゲニン標識アンチセンスRNAプローブを、cmlc2（Yelonら、前記）、vmhc（Yelonら、前記）およびpax2.1（Kraussら、Development 113: 1193-1206, 1991）に対するインビトロ転写によって作製した。インサイチューハイブリダイゼーションは以前の記載の通りに行った（Oxtobyら、Nucleic Acids Res. 21: 1087-1095, 1993）。ホールマウント免疫組織化学に関しては、胚を4％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝食塩水中）（S46および3G8）または80％メタノール、20％ジメチルスルホキシド（α-ZO-1）中で固定し、-20℃のアセトン中に30分間おいて透過化を行い（3G8）、5％ウシ胎仔血清でブロックした上で、抗体S46、3G8（Vizeら、Dev. Biol. 171: 531-540, 1995）またはα-ZO-1とともにインキュベートした。S46および3G8に対しては抗マウス-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物を二次抗体として用い、α-ZO-1染色の場合はAlexa 488標識抗マウス二次抗体を用いた。
【０１３０】
組織学
固定した胚を脱水し、プラスチック（JB-4、Polysciences, Inc.）中に包埋した上で2〜7μm厚の切片とした。網膜切片はヘマトキシリン-エオジンまたはdapiによって染色した。
【０１３１】
hasのクローニング
胚を表現型分析に基づいて変異型と野生型のプールに分けた。DNA単離用緩衝液（DNA単離用緩衝液：10mM Tris-HCl、pH 8.3；50mM KCl；0.3％Tween-20；0.3％Nonidet P40；0.5mg／mlプロテイナーゼK）中にて50℃で一晩インキュベートすることにより、ゲノムDNAを個々の胚から単離した。PCR操作の前に試料を98℃に10分間加熱することによってプロテイナーゼKを失活させた。PCR反応は以前の記載の通りに希釈したゲノムDNAを用いて行った（Knapikら、Development 123: 451-460, 1996）。
【０１３２】
RT-PCR分析用のcDNAを作製するために（SMART RACE cDNA増幅kit、Clontech）、RNAを野生型胚および変異型胚のプールから単離した（RNeasyカラム、Qiagen）。続いて断片をPCRII-TOPO（Invitrogen）中にサブクローニングした。PCRプライマーをPKCλに関するEST（fc69h04、GenBankアクセッション番号AI883774）からの配列およびゲノム配列（Genome Systems, BACクローンアドレス23c14）に基づいて設計し、PKCλの全コード領域および3'UTRのシークエンシングに用いた。
【０１３３】
ゲノムクローンは、連鎖マーカーz11023およびz8451に関するプライマーのセットを用いたBAC（Genome Systems）およびYAC（Research Genetics）ライブラリーからのDNAプールのPCR分析によって単離した。YAC末端配列は以前の記載の通りに決定した（Zhongら、Genomics 48: 136-138, 1998）。BAC末端はSP6およびT7プライマーを用いて直接シークエンシングを行い、BAC 53c17、89i15および152p21はAluI部分消化断片のショットガンクローニングによってpBluescript中にサブクローニングした。BACの完全シークエンシングのために、ハイドロシェア（hydroshear）を用いて2〜3kb長の断片を作製した。続いてこれらの断片のpGEM5（Promega）への平滑末端連結を行い、AB13700を用いて約5倍のカバー率でシークエンシングを行った。配列のアセンブルにはPhred／Phrap／Consedプログラムを用いた（Gordonら、Genome Res. 8: 195-202, 1998；Ewingら、Genome Res. 8：186-194,1998；Ewingら、Genome Res. 8: 175-185, 1998）。
【０１３４】
ウエスタンブロット
25個の胚の群を0.5％Triton X100リン酸緩衝食塩水溶液中で溶解させた。溶解物を遠心処理によって清澄化し、10％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。ウエスタンブロットはPKCλウサギポリクローナル抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）を用いて行った。
【０１３５】
モルホリノ注入
配列
2005504533.tif 000003
（GeneTools, LLC）のアンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドを、1×Danieau緩衝液（5mM Hepes pH 7.6、58mM NaCl、0.7mM KCl、0.6mM Ca(NO３)２、0.4mM MgSO４）中に濃度100μMとして溶解した。この溶液または1×Danieau緩衝液の1nLをそれぞれの1〜4細胞胚に注入した後に胚を28.5℃で発生させた。
【０１３６】
C.エレガンスの発生
C.エレガンス株KK871（par-2::GFP）は25℃で飼育した。各試料について、10〜15匹の成虫を34Mコンセントラミド、0.25％ジメチルスルホキシドを含む80μLのM9培地中に30〜60分間浸漬した。続いて虫体をメスで切開し、カバーグラスを用いて胚を2％アガロースパッド上にマウントした。胚を25℃で発生させた後に生きた状態で写真を撮影した。
【０１３７】
その他の態様
本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、それぞれが参照として組み込まれるように個別に示されている場合と同程度に、それらの全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
本発明をその詳細な態様に関して説明してきたが、これにはさらなる改変が可能であって、本出願が本発明の属する技術分野の範囲内にある周知または習慣的な実践からの本開示のそのような逸脱を含む、本発明の原理に一般に準拠する発明のあらゆる変更、用途または適応をカバーすることを意図していて、上記の本明細書における本質的な特徴に対して適用され、添付した請求の範囲に従うことが理解される必要がある。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１Ａ】心臓のパターン形成を変化させる低分子であるコンセントラミドの構造の概略図である。
【図１Ｂ】コンセントラミドで処理した受精後30hpfの生きた胚の、キノコ状の心臓の側面図である。心房はAで、心室はVで示されている。
【図１Ｃ】コンセントラミドの有効性の経時的推移に関する概略図である。黒のバーはコンセントラミドを含む水中に胚の群を浸漬した発生上の期間を示す。「x」は、表記した期間中の処理が、野生型の脳または心臓の表現型を変化させたことを示す。「o」は野生型表現型が観察されたことを示す。青および淡紅色のボックスはそれぞれ、脳および心臓の表現型の発生にとって決定的な期間を表す。
【図２】has変異型胚からの心臓が、コンセントラミド処理胚からの心臓の表現型を模倣することを示している。インサイチューハイブリダイゼーションを野生型胚（図2A〜2C）、コンセントラミド処理胚（図2D〜2F）およびhas胚（図2G〜2I）で行った。心臓ミオシン軽鎖2（cmlc2）の発現パターンを24hpf（図2A、2D、および2G）および30hpf（図2B、2E、および2H）の胚に関して示している。心房（A）および心室（V）の相対的位置は、心室特異的ミオシン重鎖（vmhc）とのインサイチューハイブリダイゼーションによって心室を青く前染色した後に心房特異抗体S46（図2C、2F、および2I）で心房を褐色に染色した、7μm厚の矢状切片によって確認した。図2A、2Dおよび2Gは背側から見た像であり、上が前方にあたる。他のすべてのフレームは側面図であり、左が前方にあたる。
【図３Ａ】has区域のマップをゼブラフィッシュPKCλ遺伝子のゲノム構造とともに示している。YACクローンおよびBAGクローンは「y」および「b」で始まるアドレスによって示されている。BAGクローン23c14のシークエンシングにより、has遺伝子の全ゲノム構造を決定した。リスト化されたBACの部分配列から、その領域の予備的な転写マップを決定した（表1参照）。ゼブラフィッシュのPKCλ遺伝子は、縦線によって表された18個のエクソンを含む。m129対立遺伝子およびm567対立遺伝子に付随する変異は星印で示されている。
【図３Ｂ】野生型胚（WT）、has変異型胚（m567-/-）、およびhas変異型胚（m567+/+および+/-）の子孫からのタンパク質抽出物の抗PKCλウエスタンブロットである。
【図３】図3C〜3Eは、PKCλ発現のアンチセンス破壊により、has変異の表現型が模倣されることを示している。野生型胚（3C）、has胚（3D）、およびPKCλアンチセンスモルホリノオリゴマーを注入した野生型胚（3E）の写真を受精2日後に生きた状態で撮影した。
【図４】PKCλが網膜における積層化、細胞極性および上皮細胞間相互作用に必要なことを示している。野生型胚（図4A〜4B）、コンセントラミド処理胚（図4C〜4D）およびhas胚（図4E〜4F）胚の5μm厚横断切片を、ヘマトキシリン-エオジンにより受精5日後に（図4A、4C、および4E）またはdapiにより30hpfに（図4B、4D、および4F）染色した。矢尻印は有糸分裂核を示す。野生型胚（図4G）またはhas胚（図4H）胚を5μm厚横断切片の作製後に抗ZO-1抗体で染色することにより、網膜における密着帯-1の局在が示されている。
【図５】ゼブラフィッシュ腎臓およびC.エレガンス胚の極性に対するPKCλ不活性化およびコンセントラミド処理の影響を示している。腎臓先端マーカー（3G8）を野生型胚（図5A）、コンセントラミド処理胚（図5B）およびhas胚（図5G）の腎臓の染色に用いた。原腎管の2μm厚横断切片が示されている。図5Dおよび5E、par2：GFP融合タンパク質を安定的に発現するC.エレガンスKK871株を34μMコンセントラミドで処理し、室温で発生させた。ノマルスキ（図5D）および蛍光（図5E）顕微鏡検査を用いて、分裂の非対称性および1回目の細胞分裂後のpar2：GFPの局在を観察した。左が後方にあたる。
【図６】コンセントラミド処理による前後方向のパターン形成の変化を示している。図6A〜6C、インサイチューハイブリダイゼーションを用いて、未処理（図6A）およびコンセントラミド処理（図6B）18体節胚におけるPax2.1発現を示した。発現パターンを未処理胚については青色に、コンセントラミド処理胚については赤色に疑似着色している。図6Cは図6Aおよび6Bの像を重ねて示している。矢尻印は中脳-後脳境界および耳板におけるPax2.1発現を示している。図6A〜6Cは側面から見た像であり、左が前方にあたる。図6D、ゼブラフィッシュ胚のcmlc2インサイチュー染色によって定められた心臓原基の前縁と吻側端部との間の距離を、18体節期の野生型胚（WT）、コンセントラミド処理胚（conc.）およびhas胚で測定した。エラーバーは標準誤差を表す。
【図７】前方および後方の心臓原基の融合の順序を示している。16体節期（図7A〜7C）および18体節期（図7D〜7F）におけるcmlc2発現を背側から見た像。発現パターンを野生型胚（図7Aおよび図7D）、コンセントラミド処理胚（図7Bおよび図7E）およびhas胚（図7Cおよび7F）について示している。上が前方にあたる。
【図８】ゼブラフィッシュ心臓における房パターン形成のモデルの概略図である。通常、両側の心臓原基が収束してまず後端が融合し、続いて前端が融合して円錐体を形成する。続いて円錐体が回転して心房前駆体は前方を向き、心室前駆体は伸長した心管内で後方を向く。コンセントラミド処理胚およびhas変異型胚では、心臓原基末端の融合の順序が逆転し、前端から後端の順になる。円錐体の回転が阻止されて心管の形成が妨げられ、同心円状の房表現型が生じる。予定心房前駆細胞を赤で示し、心室前駆細胞を青で示している。図は背側から見た像であり、上が前方にあたる。
【図１】
2005504533.tif 000004
【図２】
2005504533.tif 000005
【図３】
2005504533.tif 000006
【図４】
2005504533.tif 000007
【図５】
2005504533.tif 000008
【図６】
2005504533.tif 000009
【図７】
2005504533.tif 000010
【図８】
2005504533.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2005504533.tif 000012
2005504533.tif 000013
2005504533.tif 000014
2005504533.tif 000015
2005504533.tif 000016
2005504533.tif 000017
2005504533.tif 000018
2005504533.tif 000019
2005504533.tif 000020
2005504533.tif 000021
2005504533.tif 000022
2005504533.tif 000023
2005504533.tif 000024
2005504533.tif 000025
2005504533.tif 000026
2005504533.tif 000027
2005504533.tif 000028
2005504533.tif 000029
2005504533.tif 000030
2005504533.tif 000031
2005504533.tif 000032
2005504533.tif 000033
2005504533.tif 000034
2005504533.tif 000035
2005504533.tif 000036
2005504533.tif 000037
2005504533.tif 000038
2005504533.tif 000039
2005504533.tif 000040
2005504533.tif 000041
2005504533.tif 000042
2005504533.tif 000043
2005504533.tif 000044
2005504533.tif 000045
2005504533.tif 000046
2005504533.tif 000047
2005504533.tif 000048
2005504533.tif 000049
2005504533.tif 000050
2005504533.tif 000051
2005504533.tif 000052
2005504533.tif 000053
2005504533.tif 000054
2005504533.tif 000055
2005504533.tif 000056
2005504533.tif 000057
2005504533.tif 000058
2005504533.tif 000059
2005504533.tif 000060
2005504533.tif 000061
2005504533.tif 000062
2005504533.tif 000063
2005504533.tif 000064
2005504533.tif 000065
2005504533.tif 000066
2005504533.tif 000067
2005504533.tif 000068
2005504533.tif 000069
2005504533.tif 000070
2005504533.tif 000071
2005504533.tif 000072
2005504533.tif 000073
2005504533.tif 000074
2005504533.tif 000075
2005504533.tif 000076
2005504533.tif 000077
2005504533.tif 000078
2005504533.tif 000079
2005504533.tif 000080
2005504533.tif 000081
2005504533.tif 000082
2005504533.tif 000083
2005504533.tif 000084
2005504533.tif 000085
2005504533.tif 000086
2005504533.tif 000087
2005504533.tif 000088
2005504533.tif 000089
2005504533.tif 000090
2005504533.tif 000091
2005504533.tif 000092
2005504533.tif 000093
2005504533.tif 000094
2005504533.tif 000095
2005504533.tif 000096
2005504533.tif 000097
2005504533.tif 000098
2005504533.tif 000099
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005504533.tif 000100
【国際調査報告】
2005504533.tif 000101
2005504533.tif 000102
2005504533.tif 000103