(57)【要約】本発明は、大腸癌または胃癌において差次的に発現する膜貫通タンパク質であるTMDCを提供する。また、このタンパク質、該タンパク質をコードするcDNA、および該タンパク質に特異的に結合する抗体類を種々の方法に用いて大腸癌または胃癌の進行または治療を診断、病期分類、または監視する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から選択された或るタンパク質をコードする或る単離されたcDNA。
（ａ）SEQ ID NO:1（配列番号１）のアミノ酸配列
（ｂ）SEQ ID NO:1の抗原エピトープ、および
（ｃ）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
以下から選択された或るポリヌクレオチドを有する或る単離されたcDNA。
（ａ）SEQ ID NO:2の核酸配列、またはSEQ ID NO:2の相補配列
（ｂ）SEQ ID NO:2の断片、またはその相補配列、および
（ｃ）SEQ ID NO:2の核酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する或るポリヌクレオチド、またはその相補配列
【請求項３】
SEQ ID NO:2の核酸配列を持つポリヌクレオチドを有する或る単離されたcDNA、または該cDNAの或る相補配列。
【請求項４】
請求項2のcDNAを有する或るプローブ。
【請求項５】
請求項2のcDNAで形質転換した或る細胞。
【請求項６】
請求項2に記載のcDNAと、或る標識成分とを有する組成物。
【請求項７】
請求項2のcDNAを有する或るアレイエレメント。
【請求項８】
請求項2のcDNAがその上に固定された或る基板。
【請求項９】
請求項2に記載のcDNAを有する或るベクター。
【請求項１０】
請求項9に記載のベクターを有する或る宿主細胞。
【請求項１１】
或るcDNAを用いてタンパク質を産生する方法であり、以下の過程を有する方法。
（ａ）請求項10の宿主細胞の培養を、タンパク質発現に適した条件で行う過程、および
（ｂ）該タンパク質を該宿主細胞培地から回収する過程
【請求項１２】
請求項3に記載のcDNAと、或る標識成分とを有する或る組成物。
【請求項１３】
或るcDNAを用いてサンプル中の或る核酸の発現を検出する方法であり、
（ａ）少なくとも１つのハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で請求項6の組成物と該サンプルの核酸群とをハイブリダイズする過程と、
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体形成を検出する過程とを含み、複合体形成が、前記サンプル中の該核酸の発現を標示することを特徴とする方法。
【請求項１４】
ハイブリダイゼーション前にサンプル中の該核酸を増幅する過程をも有する請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
組成物が或る基板に接着されることを特徴とする請求項13に記載の方法。
【請求項１６】
請求項13の方法であって、該サンプルが大腸または胃から得られる方法。
【請求項１７】
請求項13の方法であって、複合体形成が標準と比較され、大腸癌または胃癌の診断となる方法。
【請求項１８】
或るcDNAを用いて複数の分子または化合物をスクリーニングする方法であり、以下の過程を有する方法。
（ａ）特異結合を許容する条件下で、請求項2に記載のcDNAを複数の分子または化合物と混合する過程と、
（ｂ）特異結合を検出し、それにより該cDNAに特異結合する分子または化合物を同定する過程
【請求項１９】
請求項18の方法であって、該分子群ないし化合物群が、アンチセンス分子、人工染色体作成物、分岐核酸、DNA分子、エンハンサー、ペプチド核酸、ペプチド、タンパク質、リプレッサ、RNA分子、および転写因子から選択される方法。
【請求項２０】
或るcDNAを用いて或る分子または化合物の効力を算定する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）核酸群を有する或るサンプルを該分子または化合物で処理する過程
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項 2 のcDNAを有する該サンプルの核酸群をハイブリダイズする過程
（ｃ）複合体形成の量を判定する過程
（ｄ）前記処理されたサンプル中の複合体形成量を、或る処理されないサンプル中の複合体形成量と比較する過程であって、複合体形成における差が、該分子または化合物の効力を標示することを特徴とする過程
【請求項２１】
或るcDNAを用いて或る分子または化合物の毒性を算定する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）核酸群を有する或るサンプルを該分子または化合物で処理する過程
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した諸条件下で請求項 2 のcDNAを有する核酸群をハイブリダイズする過程
（ｃ）複合体形成の量を判定する過程
（ｄ）前記処理されたサンプル中の複合体形成量を、或る処理されないサンプル中の複合体形成量と比較する過程であって、複合体形成における差が、該分子または化合物の毒性を標示することを特徴とする過程
【請求項２２】
或る精製されたタンパク質であって以下から選択されるタンパク質。
（ａ）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列
（ｂ）SEQ ID NO:1の抗原エピトープ、および
（ｃ）SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する或るアミノ酸配列
【請求項２３】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を持つ、請求項22に記載の或る精製されたタンパク質。
【請求項２４】
請求項22に記載のタンパク質と、或る標識成分とを有する組成物。
【請求項２５】
請求項22に記載のタンパク質と、或る医薬用担体とを有する組成物。
【請求項２６】
請求項22のタンパク質がその上に固定された或る基板。
【請求項２７】
請求項22のタンパク質を有する或るアレイエレメント。
【請求項２８】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を持つタンパク質の発現をサンプル中に検出する方法であって、
（ａ）アッセイを行って或るサンプル中の請求項23のタンパク質の量を判定する過程と、
（ｂ）タンパク質の量を標準と比較し、それにより該サンプル中の該タンパク質の発現を検出する過程とを含む方法。
【請求項２９】
請求項28の方法であって、アッセイが、抗体アレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、蛍光活性化細胞選別、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびシンチレーション計数、ラジオイムノアッセイ、並びにウェスタン解析から選択される方法。
【請求項３０】
請求項28の方法であって、該サンプルが大腸または胃から得られる方法。
【請求項３１】
請求項28の方法であって、該タンパク質が標準と比較して差次的に発現し、大腸癌または胃癌の診断となる方法。
【請求項３２】
或るタンパク質を用いて複数の分子および化合物をスクリーニングし、少なくとも１つのリガンドを同定する方法であって、
（ａ）特異結合を許容する条件下で、請求項23に記載のタンパク質を複数の分子および化合物と混合する過程と、
（ｂ）特異結合を検出し、それにより該タンパク質に特異結合するリガンドを同定する過程を含む方法。
【請求項３３】
請求項32の方法であって、該分子群および化合物群が、アゴニスト、アンタゴニスト、二重特異性分子、DNA分子、小分子薬、イムノグロブリン、インヒビター、擬態物質、多重特異性分子、ペプチド、ペプチド核酸、薬品、タンパク質、およびRNA分子から選択される方法。
【請求項３４】
或るタンパク質を用いて、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を持つタンパク質に特異結合する抗体を同定する方法であって、
（ａ）特異結合を許容する条件下で、請求項23に記載のタンパク質と複数の抗体とを接触させる過程と、
（ｂ）或る抗体と該タンパク質との特異結合を検出し、それにより該タンパク質に特異結合する抗体を同定する過程を含む方法。
【請求項３５】
請求項34の方法であって、該複数の抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F(ab’)2 断片、Fv断片、および抗体-ペプチド融合タンパク質から選択される方法。
【請求項３６】
或るタンパク質を用いて或るポリクローナル抗体を調製および精製する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）抗体応答を誘発する条件下で、請求項22に記載のタンパク質を用いて或る動物を免疫する過程、
（ｂ）動物抗体を単離する過程、
（ｃ）該タンパク質を或る基板に接着する過程、
（ｄ）該タンパク質への特異結合を許容する条件下で、該基板と単離した抗体群とを接触させる過程、および
（ｅ）該抗体群を該タンパク質から解離させ、それにより、精製したポリクローナル抗体群を得る過程
【請求項３７】
或るタンパク質を用いて或るモノクローナル抗体を調製する方法であって、以下の過程を有する方法。
（ａ）抗体応答を誘発する条件下で、請求項22に記載のタンパク質を用いて或る動物を免疫する過程、
（ｂ）前記動物から、抗体を産出する細胞群を単離する過程、
（ｃ）不死化した細胞群と前記抗体産出細胞群とを培地内で融合し、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞群を形成する過程、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程、および
（ｅ）培地から、該タンパク質に特異結合するモノクローナル抗体を単離する過程
【請求項３８】
或るタンパク質を用いて癌を診断する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）アッセイを行って或るサンプル中の請求項23のタンパク質の発現を定量する過程、および
（ｂ）タンパク質の発現を標準と比較し、それにより癌を診断する過程
【請求項３９】
請求項38の方法であって、該サンプルが大腸および胃から得られる方法。
【請求項４０】
請求項38の方法であって、発現が大腸癌または胃癌の診断となる方法。
【請求項４１】
或る分子または化合物を、アゴニストとしての有効性について試験する方法であって、
（ａ）請求項23のタンパク質を有する或るサンプルを該分子または化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４２】
或る分子または化合物を、アンタゴニストとしての有効性について試験する方法であって、
（ａ）請求項23のタンパク質を有する或るサンプルを或る分子または化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおけるアンタゴニスト活性を検出する過程、とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４３】
或る単離された抗体であって、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を持つタンパク質に特異結合することを特徴とする抗体。
【請求項４４】
請求項36の方法で産生したポリクローナル抗体。
【請求項４５】
請求項37の方法で産生したモノクローナル抗体。
【請求項４６】
或る抗体を用いて或るサンプル中の或るタンパク質の発現を検出する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）抗体：タンパク質複合体群の形成を許容する条件下で、請求項43に記載の抗体と或るサンプルとを混合する過程、および
（ｂ）複合体形成を検出する過程であって、複合体形成が、前記サンプル中の該タンパク質の発現を標示することを特徴とする過程。
【請求項４７】
請求項46の方法であって、該サンプルが大腸、肝臓、肺、卵巣、および前立腺から得られる方法。
【請求項４８】
請求項46の方法であって、複合体形成が標準と比較され、大腸癌または胃癌の診断となる方法。
【請求項４９】
或る抗体を用いて或るタンパク質を免疫精製する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）請求項43に記載の抗体を或る基板に接着する過程
（ｂ）抗体：タンパク質複合体群の形成を許容する条件下で、該抗体を、タンパク質を有する或るサンプルに曝す過程
（ｃ）該タンパク質を該複合体から分離する過程、および
（ｄ）精製されたタンパク質を収集する過程
【請求項５０】
請求項43に記載の抗体と、或る標識成分とを有する組成物。
【請求項５１】
請求項50の組成物を有する或るキット。
【請求項５２】
請求項43の抗体を有する或るアレイエレメント。
【請求項５３】
請求項43の抗体がその上に固定された或る基板。
【請求項５４】
請求項43に記載の抗体と、或る医薬物質とを有する組成物。
【請求項５５】
該組成物が凍結乾燥されることを特徴とする、請求項54に記載の組成物。
【請求項５６】
或る組成物を用いて或る分子または化合物の効力を算定する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）タンパク質を有する或るサンプルを或る分子または化合物で処理する過程
（ｂ）複合体の形成に適した諸条件下で該サンプル中のタンパク質と請求項54の組成物とを接触させる過程
（ｃ）複合体形成の量を判定する過程、および
（ｄ）前記処理されたサンプル中の複合体形成量を、或る処理されないサンプル中の複合体形成量と比較する過程であって、複合体形成における差が、該分子または化合物の効力を標示することを特徴とする過程
【請求項５７】
或る組成物を用いて或る分子または化合物の毒性を算定する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）タンパク質を有する或るサンプルを或る分子または化合物で処理する過程
（ｂ）複合体形成に適した諸条件下で、該サンプル中のタンパク質と請求項54の組成物とを接触させる過程
（ｃ）複合体形成の量を判定する過程、および
（ｄ）前記処理されたサンプル中の複合体形成量を、或る処理されないサンプル中の複合体形成量と比較する過程であって、複合体形成における差が、該分子または化合物の毒性を標示することを特徴とする過程
【請求項５８】
大腸癌または胃癌の治療方法であって、治療介入を要する患者への請求項43の抗体の投与を含む治療方法。
【請求項５９】
大腸癌または胃癌の治療方法であって、治療介入を要する患者への請求項45の抗体の投与を含む治療方法。
【請求項６０】
大腸癌または胃癌の治療方法であって、治療介入を要する患者への請求項54の組成物の投与を含む治療方法。
【請求項６１】
或る薬剤を或る細胞に送達する方法であって、以下の過程を含む方法。
（ａ）該薬剤を、請求項33に記載の方法で同定した或る二重特異性分子に接着する過程
（ｂ）該二重特異性分子を治療介入を要する或る患者に投与する過程であって、該二重特異性分子がSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を持つタンパク質に特異結合し、それにより該薬剤を該細胞に送達することを特徴とする過程
【請求項６２】
請求項61の方法であって、該細胞が大腸の上皮細胞である方法。
【請求項６３】
請求項23のタンパク質に特異結合する或るアゴニスト。
【請求項６４】
請求項63に記載のアゴニストと、或る医薬用担体とを有する組成物。
【請求項６５】
請求項23のタンパク質に特異結合する或るアゴニスト。
【請求項６６】
請求項65に記載のアンタゴニストと、或る医薬用担体とを有する組成物。
【請求項６７】
請求項23のタンパク質に特異結合する或る薬剤。
【請求項６８】
請求項67に記載の薬剤と、或る医薬用担体とを有する組成物。
【請求項６９】
請求項23のタンパク質に特異結合する或る小分子薬。
【請求項７０】
請求項69に記載の小分子薬と、或る医薬用担体とを有する組成物。
【請求項７１】
18から30ヌクレオチドの長さのアンチセンス分子であってSEQ ID NO:2の核酸配列を持つ或るポリヌクレオチドの一部に、またはその相補配列に特異結合し、該アンチセンス分子が該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の発現を阻害するような分子。
【請求項７２】
該アンチセンス分子が少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合を有する、請求項71に記載のアンチセンス分子。
【請求項７３】
該修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項72に記載のアンチセンス分子。
【請求項７４】
該アンチセンス分子が少なくとも1つのヌクレオチド類似体を有する、請求項71に記載のアンチセンス分子。
【請求項７５】
該ヌクレオチド類似体が5-メチルシチジンである、請求項72に記載のアンチセンス分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌において差次的に発現する或る膜貫通タンパク質、それをコードするcDNA、及び該タンパク質に特異結合する或る抗体、並びに、それらを用いた大腸癌または胃癌の診断、病期分類、治療、或いは進行または治療のモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００２】
アレイ技術と定量PCRは、多数の関連遺伝子または無関係の遺伝子の発現プロファイルを探求する手段を提供する。発現プロファイルを試験するときは、アレイは次のような試験を行うプラットフォームを提供する。即ちどの遺伝子が組織特異的か、ハウスキーピング機能を行うか、シグナル伝達カスケードの一部であるか、又は、特定の遺伝的素因や、条件、疾患、または障害に、特異的に関連する遺伝子であるかの試験である。発現プロファイル作成の応用は特に、疾患の、診断、予後診断、および治療の向上に関する。例えば、種々のタイプの癌の患者からの組織に発現される配列群と量の双方を比較しうる。
【０００３】
癌と悪性腫瘍は継続的な細胞増殖と細胞死によって特徴付けられ、遺伝学と環境の両方に因果関係がある。癌マーカーは、癌への家族性素因の決定、また様々な癌の早期診断と予後において、非常に重要である。
【０００４】
膜貫通タンパク質（TM）、例えば細胞膜を横断するタンパク質は、或る病状の潜在的なマーカーであり治療標的でもある。例えば或る腫瘍細胞に関するならば、多くのTMタンパクは、細胞内の成長と分化を制御する信号伝達経路群に関する細胞表面受容体として作用する。したがって或る病態では、TMの活性または機能の変調は、疾患経過を妨害しうる。
【０００５】
大腸直腸癌は、米国で4番目に発生率の高い癌であり癌死の2番目に高い原因で毎年約13万人が新患となり5万5千人が死亡する。大腸癌と直腸癌は多くの環境危険因子を共有しており、両癌は、特有の遺伝的症候群を有する人々に見られる（大腸直腸癌の概説はPotter （1999; J Natl Cancer Institute 91:916-932）を参照）。大腸癌は男女におよそ等しい頻度で発生する唯一の癌である。また米国では大腸癌の診断5年後の生存率は約55％である（Ries他（1990） National Institutes of Health, DHHS Publ No. （NIH）90-2789）。
【０００６】
幾つかの分子経路が大腸癌の発生と関係があり、これらの経路いずれかの鍵遺伝子の発現は先天性または後天性突然変異或いは高メチル化により失われる可能性がある。発現における変化が大腸癌または大腸癌発生の素因の早期の指標となりうる遺伝子の同定が、特に必要とされている。これらのタンパク質はまた治療標的として利用され、癌の治療に有用な分子が同定されうる。
【０００７】
大腸癌の素因、発生および進行と関連のある多数の遺伝子が同定されてきた。例えば、ヒトの腫瘍ではDNAメチル化の異常パターンが一貫して発生することがよく知られている。特に大腸癌では、大腸癌に先行する前癌性ポリープ内など、腫瘍進行早期にこれらの変化が発生することが知られる。DNAメチル化を行う酵素であるDNAメチルトランスフェラーゼは、大腸癌または癌に先行する良性ポリープの患者の組織学的に正常な粘膜で著しく増加する。そしてこの増加は大腸腫瘍の進行中継続する（Wafik他（1991） Proc Natl Acad Sci 88:3470-3474）。
【０００８】
家族性大腸腺腫症（FAP）は大腸癌に先行するまれな常染色体優性症候群であり、大腸腺腫性ポリポーシス（APC）遺伝子の先天性突然変異によって起こる。APC遺伝子は、APC-β-カテニン-Tcf （T-細胞因子）経路の一部である。この経路の機能障害により、大腸上皮細胞の規則的な複製、接着、遊走が失われ、ポリープの成長につながる。遺伝性非腺腫性大腸癌（HNPCC）は別の先天性常染色体優性症候群であり、大腸癌の早期発症および他癌の発生の傾向により区別する。HNPCCは、DNAミスマッチ修復（MMR）経路の1つ以上の遺伝子の突然変異から発生する。２つのヒトMMR遺伝子MSH2およびMLH1の突然変異は、これまでに同定されたHNPCCファミリーの大部分に見出される。ほとんどすべての大腸癌は、エストロゲン受容体（ER）遺伝子が沈黙した細胞から発生する。ER遺伝子転写の沈黙は年齢に関係しており、ER遺伝子の高メチル化に関連する（Issa他（1994） Nature Genet 7:536-540）。培養した大腸癌細胞に外因性ER遺伝子を導入すると、著しく成長が抑制される。
【０００９】
大腸癌に関連し、また本病の発生と進行に関連する多数の遺伝的変容が存在することは明らかで、癌発生の早期指標を提供する可能性がある。これらの変容はモニター可能であり、おそらく治療で修正できる。
【００１０】
或る膜貫通タンパク質、それをコードするcDNA、および該タンパク質に特異結合する抗体の作成法の発見は、大腸癌または胃癌の、診断、病期分類、治療、或いは進行または治療のモニタリングに有用な組成物の提供により、当分野の要望を満たす。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、癌において差次的に発現する膜貫通タンパク質であるTMDC、それをコードするcDNA、および該タンパク質に特異結合する或る抗体の発見に基づく。これらの分子は、大腸癌または胃癌の、診断、病期分類、治療、或いは進行または治療のモニタリングに有用である。
【００１２】
本発明は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を持つ或るタンパク質をコードする或る核酸配列を有する或る単離されたcDNAを提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:2の核酸配列、SEQ ID NO:3-10から選択されたSEQ ID NO:2の或る断片、SEQ ID NO:12-16から選択されたSEQ ID NO:2の或る変異体、から選択された或る単離されたcDNAまたはその相補物（complement）を提供する。本発明は更に、該膜貫通タンパク質をコードするcDNAからなる或るプローブ、該膜貫通タンパク質をコードするcDNAで形質転換される或る細胞、該膜貫通タンパク質をコードするcDNAと或る標識成分とを有する或る組成物、該膜貫通タンパク質をコードするcDNAを有する或るアレイエレメント、及び、該膜貫通タンパク質をコードするcDNAがその上に固定される或る基板、を提供する。
【００１３】
本発明は、TMDCをコードするcDNAを有する或るベクター、該ベクターを有する或る宿主細胞、及び、該cDNAを用いて該タンパク質を作成する方法を提供し、本法では、該タンパク質をコードする該cDNAを有する該ベクターを有する該宿主細胞を発現に適した条件下で培養し、該タンパク質を該宿主細胞培地から回収する。本発明はまた、TMDCをコードするcDNAを有するベクターを有する或るトランスジェニックの細胞株または生物をも提供する。本発明は更に、該cDNA、その断片、変異体、または相補配列を有する組成物、基板、またはプローブを提供するが、これらは検出、スクリーニング、および精製の方法に使用できる。一態様では、プローブは一本鎖の相補的RNA分子またはDNA分子である。
【００１４】
本発明は、サンプル中の核酸の差次的発現を検出するためにcDNAを使用する方法を提供する。本法ではプローブを核酸にハイブリダイズし、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成して、ハイブリダイゼーション複合体形成を標準と比較する。比較はサンプル中のcDNAの差次的発現を示す。或る態様において検出方法は更にハイブリダイゼーション前にサンプルの核酸の増幅を含む。別の態様では、該cDNAの差次的発現を示す方法を用い、大腸癌または胃癌を診断する。
【００１５】
本発明は、或るcDNAを用いて或るライブラリまたは複数の分子あるいは化合物をスクリーニングし該cDNAに特異結合する少なくとも1つのリガンドを同定する方法を提供し、本法では該cDNAと該分子または化合物とを特異結合を許容する条件下で混合し、該cDNAへの特異結合を検出することにより該cDNAに特異結合するリガンドを同定する。一態様では、該分子群あるいは化合物群は、アンチセンス分子、人工染色体作成物、分岐核酸、DNA分子、エンハンサ、ペプチド、ペプチド核酸、タンパク質、RNA分子、リプレッサ、および転写因子から選択される。本発明はまた、或るcDNAを用いて該cDNAに特異結合するリガンドを精製する方法を提供し、本法では該cDNAを或る基板に接着し、該cDNAと或るサンプルとを特異結合を許容する条件下で接触させ、該リガンドを該cDNAから解離させることにより、精製したリガンドを得る。本発明は更に或る分子または化合物の効力または毒性を算定する方法を提供し、本法では、核酸群を有する或るサンプルを該分子または化合物で処理し、該核酸群と或るcDNAとをハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下でハイブリダイズし、複合体形成量を判定し、処理済みサンプル中の複合体形成量を無処理サンプル中の複合体形成量と比較し、複合体形成の差異が、該分子または化合物の効力または毒性を示す。
【００１６】
本発明は、以下からなる群から選択された或る精製されたタンパク質またはその一部を提供する。SEQ ID NO:1のアミノ酸配列、SEQ ID NO:1の抗原エピトープ、及び、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を持つSEQ ID NO:1の変異体。本発明はまた、該精製タンパク質と或る医薬用キャリアとを有する組成物、該タンパク質と或る標識成分とを有する組成物、該タンパク質が固定される基板、及び、該タンパク質を有する或るアレイエレメントを提供する。本発明は更に、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を持つタンパク質の発現をサンプル中に検出する方法を提供し、本法ではアッセイを行ってサンプル中の該タンパク質の量を判定し、タンパク質量を標準と比較することにより、該サンプル中の該タンパク質の発現を検出する。本発明は更に癌を診断する方法を提供し、本法では、アッセイを行ってサンプル中に発現するタンパク質の量を定量し、発現したタンパク質の量を標準と比較することにより、腫瘍性障害を診断する。一態様では、アッセイは、抗体アレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、蛍光活性化細胞選別、2D-PAGEおよびシンチレーション計数、タンパク質アレイ、ラジオイムノアッセイ、並びにウェスタン解析から選択される。第二の態様では、該サンプルが大腸および胃の組織から選択される。第三の態様では、癌は大腸癌または胃癌である。
【００１７】
本発明は、或るタンパク質を用いて或るライブラリまたは複数の分子あるいは化合物をスクリーニングし少なくとも1つのリガンドを同定する方法を提供し、本法では該タンパク質と該分子または化合物とを特異結合を許容する条件下で混合し、特異結合を検出することにより該タンパク質に特異結合するリガンドを同定する。一態様では、該分子群および化合物群が、アゴニスト、アンタゴニスト、二重特異性分子、DNA分子、小分子薬、イムノグロブリン、インヒビター、擬態物質、多重特異性分子、ペプチド、ペプチド核酸、医薬品、タンパク質、およびRNA分子から選択される。別の態様では、該リガンドを用いて腫瘍性障害患者を治療する。本発明はまた、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異結合する治療用抗体を提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異結合するアンタゴニストを提供する。本発明はまた、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異結合する小分子薬を提供する。本発明はまた、リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストとして有効であるか試験する方法を提供し、本法では、該タンパク質を有するサンプルを該分子または化合物に曝す過程と、サンプル中のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を検出する過程とを含む。
【００１８】
本発明は、或るタンパク質を用いて該タンパク質に特異結合する抗体を同定するため複数の抗体をスクリーニングする方法を提供し、本法では複数の抗体と該タンパク質とを抗体:タンパク質複合体を形成する条件下で接触させ、該抗体を該抗体:タンパク質複合体から解離させることにより、該タンパク質に特異結合する抗体を得る。一態様では、該抗体が、無傷イムノグロブリン分子、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性分子、多重特異性分子、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F（ab’）2 断片、Fv断片、および抗体-ペプチド融合タンパク質から選択される。本発明は、或るタンパク質に特異結合する精製された抗体群を提供する。
【００１９】
本発明はまた、或るタンパク質を用いて、該タンパク質に特異結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製および精製する方法を提供する。ポリクローナル抗体を調製する方法では、抗体応答を誘発する条件下で動物をタンパク質で免疫し、動物抗体を単離し、該タンパク質を或る基板に接着し、該基板と単離した抗体とを該タンパク質への特異結合を許容する条件下で接触させ、該抗体を該タンパク質から解離させることにより、精製したポリクローナル抗体を得る。モノクローナル抗体を調製する方法では、抗体応答を誘発する条件下で動物を或るタンパク質で免疫し、抗体産生細胞を動物から単離し、該抗体産生細胞と不死化細胞とを培地で融合してモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成し、該ハイブリドーマ細胞を培養し、モノクローナル抗体を培地から単離する。
【００２０】
本発明はまた、或る抗体を用いてサンプル中の或るタンパク質の発現を検出する方法を提供し、本法では該抗体とサンプルとを抗体:タンパク質複合体を形成する条件下で混合し、複合体形成を検出し、複合体形成はサンプル中の該タンパク質の発現を示す。一態様では、該サンプルが大腸または胃の組織から選択される。第二の態様では、複合体形成が標準と比較され、大腸癌または胃癌の診断となる。
【００２１】
本発明は、或るタンパク質の免疫精製方法を提供し、本法では或る抗体を或る基板に接着し、該抗体を、抗体:タンパク質複合体を形成する条件下で、タンパク質を有する或るサンプルに曝し、該タンパク質を該複合体から解離させ、精製したタンパク質を収集する。本発明はまた、該タンパク質に特異結合する或る抗体と或る標識成分または医薬品とを有する或る組成物、該組成物を有する或るキット、該抗体を有する或るアレイエレメント、該抗体が固定される或る基板を提供する。本発明は更に或る抗体を用いて或る分子または化合物の効力を算定する方法を提供し、本法では、タンパク質を有する或るサンプルを或る分子または化合物で処理し、該サンプル中のタンパク質と該抗体とを複合体が形成される条件下で接触させ、複合体形成量を判定し、処理済みサンプル中の複合体形成量を無処理サンプル中の複合体形成量と比較し、複合体形成の差異が、該分子または化合物の効力を示す。
【００２２】
本発明は大腸癌の或る治療法を提供し、本法は、治療介入を要する或る被検者に、該タンパク質に特異結合する或る治療用抗体、該タンパク質に特異結合する或る二重特異性分子、該タンパク質に特異結合する或る多重特異性分子、または、或る抗体と或る医薬品とを有する或る組成物を投与する。本発明はまた、或る医薬物質または治療物質を或る細胞に送達する方法を提供し、本法では、該医薬物質または治療物質を該タンパク質に特異結合する或る二重特異性分子と付着させ、治療介入を要する或る被検者に該二重特異性分子を投与し、該二重特異性分子が該医薬物質または治療物質を該細胞に送達する。一態様では、該細胞は大腸の上皮細胞である。
【００２３】
本発明は、該タンパク質に特異結合する或るアゴニストおよび、該アゴニストと或る医薬用キャリアとを有する或る組成物を提供する。本発明は又、該タンパク質に特異結合する或るアンタゴニストおよび、該アンタゴニストと或る医薬用キャリアとを有する或る組成物を提供する。本発明はまた、該タンパク質に特異結合する或る医薬品または小分子薬を提供する。
【００２４】
本発明は、18から30ヌクレオチドの長さのアンチセンス分子であってSEQ ID NO:2の核酸配列を持つ或るポリヌクレオチドの一部分に、またはその相補物に特異結合し、該アンチセンス分子が、該ポリヌクレオチドにコードされるタンパク質の発現を阻害するような分子を提供する。
【００２５】
本発明は又、少なくとも1つの修飾されたヌクレオシド間結合または少なくとも1つのヌクレオチド類似体を持つ或るアンチセンス分子を提供する。本発明はまた、該修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、また該修飾された核酸塩基が5-メチルシトシンである分子を提供する。
【００２６】
本発明は、内在性ポリヌクレオチドの発現を撹乱するために異種マーカー遺伝子を哺乳動物のゲノムDNAに挿入する方法を提供する。
さらに本発明は、哺乳動物モデル系を構築するためにcDNAを使用する方法を提供し、ここではSEQ ID NO:2-16から選択されたcDNAを持つベクターを作製し、ベクターをES細胞に形質転換し、形質転換したES細胞を選択し、形質転換したES細胞を哺乳動物胚盤胞に微量注入し、それによってキメラ胚盤胞を形成し、キメラ胚盤胞を偽妊娠メスに移植し、前記メスが生殖細胞系に該cDNAを持つキメラ子孫を産み、そしてホモ接合性哺乳動物モデル系を構築するため該キメラ哺乳動物を交配する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（本発明の記載について）
本発明が、説明した特定の装置、材料及び方法に限定されるものではないことを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施態様を説明する目的で用いたものであり、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【００２８】
請求の範囲および明細書中で用いる単数形の「或る」および「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もある。例えば「或る宿主細胞」と記されている場合には当業者に公知のそのような宿主細胞が複数あることもある。
【００２９】
本明細書中で用いる全ての技術用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００３０】
（定義）
「抗体」とは、無傷イムノグロブリン分子、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Fab断片、F（ab’）2 断片、Fv断片、および抗体-ペプチド融合タンパク質を指す。
【００３１】
「抗原決定基」は、抗原エピトープまたは免疫原エピトープを指し、これはオリゴペプチド、ペプチド、またはタンパク質の構造的特徴または領域であって該タンパク質に特異結合する抗体の形成を誘導するものを指す。生物活性は、免疫原性に必須ではない。
【００３２】
「アレイ」は、或る基板上の、少なくとも2つのcDNA、タンパク質、または抗体の、秩序ある配置を指す。少なくとも1つのcDNA、タンパク質、または抗体は対照または標準であり、他のcDNA、タンパク質、または抗体が、診断または治療上の関心事である。基板上の少なくとも2個、最大で約40,000のcDNA、タンパク質、または抗体の配置が、各々標識される複合体（各cDNAと少なくとも1個の核酸との間、各タンパク質と少なくとも1個のリガンドまたは抗体との間、または各抗体と該抗体が特異結合する少なくとも1個のタンパク質との間に形成される複合体）の、サイズと信号強度が個々に識別できるよう保証する。
【００３３】
「二重特異性分子」は2種の結合特異性を持ち、2種の分子、または或る分子の2箇所の部位に同時に結合できる。同様に、「多重特異性分子」は多数（３つ以上）の別の標的に結合でき、その１つは免疫細胞の表面の分子である。抗体は二重特異性分子または多重特異性分子として機能でき、また、これらの一部と成りうる。
【００３４】
「TMDC」は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して厳密または高度に相同な（>85％）膜貫通タンパク質であって、天然、合成、半合成或いは組換え体など任意の出所からの、任意の種（例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒト種）から得られる膜貫通タンパク質を指す。
【００３５】
配列表（Sequence Listing）のcDNAの「相補物」は、核酸分子であって、その全長にわたって完全に相補的であり、高ストリンジェンシー条件下で或る核酸分子とハイブリダイズする分子である。
【００３６】
「cDNA」とは、或る単離されたポリヌクレオチド、核酸分子、またはその何れかの断片であって、約400〜約12000ヌクレオチドを持つものを指す。cDNAは起源が組換えまたは合成のものがあり、一本鎖または二本鎖があり、コードおよび非コードの3’または5’配列を示すことがあり、また一般にイントロンを欠く。
【００３７】
用語「タンパク質をコードするcDNA」は、核酸であって、その配列が、公知の分析で同定される保存された領域、モチーフまたはドメインをコードする配列群と密にアラインするものを指す。この分析としては、BLAST （Basic Local Alignment Search Tool; Altschul （1993） J Mol Evol 36:290300; Altschul 他 （1990） J Mol Biol 215:403-410）およびBLAST2 （Altschul 他 （1997） Nucleic Acids Res 25:3389-3402）があり、これらは保存された領域内の同一性を提示する。Brenner 他 （1998; Proc Natl Acad Sci 95:6073-6078）はBLASTを分析して構造的相同体を配列同一性によって同定する性能について調べ、30%の同一性が少なくとも150の残基の配列アラインメントでの信頼できる閾値であり40%が少なくとも70の残基のアラインメントでの合理的閾値であることを発見した（Brenner, 6076ページ, 列2）。
【００３８】
「組成物」は、ポリヌクレオチドおよび標識成分を指しまた、精製したタンパク質と医薬用キャリアまたは異種成分、標識成分あるいは精製成分を指し、抗体と標識成分または医薬品、なども指す。
【００３９】
「誘導体」とは化学修飾されたcDNAあるいはタンパク質を指す。cDNAの誘導体化には、クエオシン（queosine）などの非従来型塩基の或いはヒポキサンチンなどの類似体の置換が含まれ得る。これらの置換は当分野で周知である。cDNAまたはタンパク質の誘導体化にはまた、アセチル基、アシル基、アルキル基、アミノ基、ホルミル基、またはモルホリノ基による水素の置換（例えば5-メチルシトシン）を含みうる。誘導体分子は天然分子の生物活性を保持するが、長い寿命または増強した活性を与えうる。
【００４０】
「差次的発現」とは、サンプル中の転写されたメッセンジャーRNAあるいは翻訳されたタンパク質の存在の有無や、量の少なくとも二倍の変化により検出される、増加または上方調節あるいは減少または下方調節発現を指す。
【００４１】
「障害（disorder）」は、病状、疾患、または症候群であって、そこでTMDCまたはTMDCをコードするmRNAが差次的に発現するものを指し、これには大腸癌および胃癌がある。
【００４２】
「発現プロファイル」は、或るサンプルでの遺伝子発現の表現である。核酸発現プロファイルを作成するには、シークエンシング、ハイブリダイゼーション、または増幅（定量PCR）の技術と、サンプルからのmRNAまたはcDNAを用いる。タンパク質発現プロファイルは、時間の遅延はあるが核酸発現プロファイルの鏡像をなし、これには抗体またはタンパク質アレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、蛍光活性化細胞選別、空間的固定たとえば2D-PAGE、および、ラジオイムノアッセイたとえば放射標識およびシンチレーションカウンタでの定量、並びにウェスタン解析を用いてサンプル中のタンパク質発現を検出しうる。核酸、タンパク質、または抗体は溶液でまたは基板に付着させて使用でき、その検出は公知の方法と標識成分に基づく。発現プロファイルを評価する方法にはまた、電子的ノーザン分析、「guilt-by-association」（連帯責任により有罪）法、および転写物イメージングがある。上記いずれかの方法で作成した発現プロファイルは、正常または患部組織を用いて作成した発現プロファイルと対比できる。注目すべきは、mRNAとタンパク質の発現の対応が、Zweiger （2001, Transducing the Genome. McGraw-Hill, San Francisco, CA）およびGlavas 他 （2001; T cell activation upregulates cyclic nucleotide phosphodiesterases 8A1 and 7A3, Proc Natl Acad Sci 98:6319-6342）などで述べられている。
【００４３】
「断片」とは長さが約50から約5000塩基対の連続したヌクレオチドの鎖を指す。断片は、関連する核酸分子を同定するためにPCRまたはハイブリダイゼーション技術で、またリガンドをスクリーニングするために結合アッセイで使用される可能性がある。このようなリガンドは、複製、転写または翻訳を調節する治療薬として有用である。
【００４４】
「Guilt-by-association」（GBA）法は、或る特定の疾患、調節経路、細胞内区画、細胞タイプ、組織タイプ、または種に関連するcDNAまたはタンパク質の同定を、既知のマーカーまたは治療薬との、高度に有意な共発現で行う方法である。
【００４５】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、１つの分子のプリン群が5’-A-G-T-C-3’塩基対と3’-T-C-A-G-5’のように相補分子のピリミジン群と水素結合する時、或るcDNAと或るサンプルの核酸の間で形成される。ハイブリダイゼーション条件、相補性の度合、およびヌクレオチド類似体の使用は、ハイブリダイゼーション反応の効率とストリンジェンシーに影響する。
【００４６】
配列に用いられる用語「同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上の配列間のヌクレオチドまたは残基の一致の定量化（通常、百分率）を指し、アルゴリズムは例えばSmith-Waterman alignment （SmithおよびWaterman （1981） J Mol Biol 147:195-197）, CLUSTALW （Thompson 他 （1994） Nucleic Acids Res 22:4673-4680）, またはBLAST2 （Altschul （1997, 前出）がある。BLAST2は、アラインメントを最適化するために配列の１つにギャップを挿入するまた配列をより有意に比較できる、標準化された再現性のある方法で使用される可能性がある。「類似性」には同じアルゴリズムを使うが、残基の保存的置換を考慮する。タンパク質では類似性が同一性を上回り、理由はバリンのロイシンまたはイソロイシンとの置換が、報告される百分率の計算でカウントされるからである。保存的とみなされる置換は当分野で公知である。
【００４７】
「単離された」または「精製された」は、いずれかの分子または化合物が、その自然環境から分離され、天然に会合する他の成分が約60％〜90％無いものを指す。
【００４８】
「標識成分」は、任意のレポーター分子、例えば放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、色原体、基板、補助因子、阻害因子、または磁気粒子であって、ポリヌクレオチド、タンパク質、または抗体に、付着または組込みできる分子を指す。可視の標識および色素としては、限定はされないが、アントシアニン、βグルクロニダーゼ、ビオチン、BIODIPY、クーマシーブルー、Cy3とCy5、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、FITC、金、緑色蛍光タンパク、リサミン（lissamine）、ルシフェラーゼ、フィコエリトリン、ローダミン、spyro red、銀、ストレプトアビジンなどがある。放射性マーカーには、水素、ヨウ素、リン、硫黄などの放射性形態が含まれる。
【００４９】
「リガンド」とは、或るポリヌクレオチドに或いは或るタンパク質のエピトープに特異結合する、任意の薬剤、分子または化合物を指す。そのようなリガンドはポリヌクレオチドまたはタンパク質の活性を安定化あるいは調節する。そしてミネラル、補助因子、核酸、タンパク質、糖質、脂肪、脂質など、無機および／または有機物質から構成されている可能性がある。
【００５０】
「オリゴヌクレオチド」とは、長さが約18から約60ヌクレオチドの一本鎖分子を指す。これはハイブリダイゼーションまたは増幅技術、或いは複製、転写または翻訳の調節で使用される可能性がある。等価な用語に、アンプリコン（単位複製配列）、アンプリマー、プライマー、およびオリゴマーがある。
【００５１】
「医薬品（pharmaceutical agent）」は抗体の場合もあり、アンチセンス分子、二重特異性分子、多重特異性分子、ペプチド、タンパク質、放射性核種、小分子薬、細胞特異的または細胞障害性の薬物たとえばアブリン、アクチノミオシンD、シスプラチン、crotin、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、メトトレキサート、リシン（ricin）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、または、これらエレメントの任意の併用でもありうる。
【００５２】
タンパク質の「翻訳後修飾」には、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、蛋白分解性切断及びその他が含まれ得る。これらのプロセスは、合成或いは生化学的に生じ得る。生化学的修飾は、細胞の位置、細胞型、pH、酵素環境などによって異なることとなる。
【００５３】
「プローブ」とは、サンプル中の少なくとも1つの核酸にハイブリダイズするcDNAを指す。標的が一本鎖である場合、プローブは相補的一本鎖である。プローブは、サザン法、ノーザン法、in situ、ドットブロット法、アレイなどの技術を含め、ハイブリダイゼーション反応で、またはスクリーニングアッセイで使用するために、レポーター分子で標識化できる。
【００５４】
「タンパク質」とは、ポリペプチドあるいはその任意の部分を指す。或るタンパク質の「一部/部分」とは、ある長さのアミノ酸配列であって、該タンパク質の、少なくとも1つの生物活性、PFAMまたはPRINTS分析で同定される或るドメイン、または、PROTEANプログラム（DNASTAR, Madison WI）のKyte-Doolittleアルゴリズムで同定される或る抗原決定基を保持する配列を指す。「オリゴペプチド」は、抗体を産生する融合タンパク質の一部として使用される、約５残基から約１５残基までのアミノ酸配列である。
【００５５】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられ、核酸、タンパク質、及び抗体を有するものがある。サンプルは、体液たとえば腹水、血液、脳脊髄液、リンパ、精液、唾液、尿などや、細胞製剤の可溶分画、または、その中で細胞が成長した培地のアリコットや、細胞から単離または抽出した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜や、溶液中に存在するまたは基板に結合したゲノムDNA、RNA、cDNAや、細胞、組織、組織生検、組織プリント、口腔粘膜細胞、皮膚、毛髪、毛包などを有し得る。
【００５６】
「特異結合」は、二分子間の正確な相互作用であって、それらの構造、特にそれらの分子側基に依存する作用をさす。例えば、調節タンパク質のDNA分子主溝への挿入（インターカレーション）、あるいは、タンパク質のエピトープとアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体との間の結合がある。
【００５７】
「基板」は、任意の剛性あるいは半剛性の支持物であってポリヌクレオチド、タンパク質、または抗体が結合するものを指し、磁気または非磁気ビーズ、毛細管または他のチューブ、チップ、ファイバー、フィルタ、ゲル、膜、プレート、ポリマー、スライド、ウェハ、および微小粒子であって種々の表面形状たとえばチャネル、カラム、ピン、細孔、トレンチ、およびウェルなどを持つものが含まれる。
【００５８】
「転写イメージ（transcript image: TI）」は、特定の組織内、特定時の、遺伝子転写活性のプロファイルである。TIは或るESTデータベースのcDNAライブラリ群の中で発現されるポリヌクレオチド群の相対的存在度のアセスメントを提示し、これは米国特許第5,840,484号に記載され、参照により開示に含まれる。
【００５９】
「変異体」は、分子であって、或るタンパク質または其れをコードするポリヌクレオチド群の、認識されるバリエーションをいう。スプライス変異体はBLASTスコアにより決定でき、スコアは少なくとも100、最も好ましいのは少なくとも400である。対立遺伝子変異体はcDNAに対して高一致率を有し、100塩基に付き約３塩基が異なりうる。「１塩基多型」（SNP）とは、置換、挿入または欠失による、単一塩基での変異を指す。変異は保存的（プリンからプリン）あるいは非保存的な（プリンからピリミジン）可能性があり、コード化されたアミノ酸またはその２次、３次、４次構造の変異となる可能性もならない可能性もある。
【００６０】
（発明）
本発明は、癌において差次的に発現する膜貫通タンパク質、該タンパク質をコードする或るcDNA、および該タンパク質に特異結合する或る抗体の発見に基づく。該タンパク質、またはその各部分、該cDNA、またはその断片群、および該抗体を、直接に、または組成物として用いて、大腸癌または胃癌を診断、病期分類、治療、或いは其の進行または治療をモニターできる。
【００６１】
本発明のTMDCをコードする核酸は初め、或る大腸腫瘍ライブラリ（COLNTUTO3）からのIncyte Clone 1929823の中に、或るヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列アラインメント用コンピュータ検索を用いて同定された。SEQ ID NO:2の由来は以下のオーバーラップおよび/または伸長した核酸配列群（SEQ ID NO:3-10）およびその関連cDNAライブラリ群Incyte Clone 1929823H1、1929823T6、および1341151F6 （COLNTUTO3）、7703595H1 （UTRETUE01）、8146316H1 （MIXDTME01）、3274531H1、ショットガン配列であるSCCA02331V1およびSCCA04417V、並びに、ゲノム配列g2951946_010 （SEQ ID NO:11）である。
【００６２】
一実施態様において本発明はSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を持つ或るタンパク質を含み、これは図（Figure）1Aから1Hに示す。TMDCは760アミノ酸の長さであり、7つの潜在的N-グリコシル化部位をアミノ酸残基N16、N77、N221、N264、N342、N350、およびN567に持つ。TMDCは、1つの潜在的サイクリックAMP/サイクリックGMP依存タンパク質キナーゼ燐酸化部位をT237に、11ヶ所の潜在的カゼインキナーゼ燐酸化部位をS46、S48、S75、S97、T115、T129、S174、T241、S474、S634およびS752に、６つの潜在的タンパク質キナーゼC燐酸化部位をS59、T115、T148、T188、S640およびS749に、また1つの潜在的チロシンキナーゼ燐酸化部位をY536に持つ。HMMR分析では、以下の9つの膜貫通ドメインがある。TM-1, アミノ酸残基210-230; TM-2, アミノ酸残基281-299; TM-3, アミノ酸残基372-392; TM-4, アミノ酸残基447-467; TM-5, アミノ酸残基487-507; TM-6, アミノ酸残基540-562; TM-7, アミノ酸残基586-610; TM-8, アミノ酸残基654-672; およびTM-9, アミノ酸残基956-974である。SEQ ID NO:1の有用な抗原エピトープ群は、ほぼアミノ酸残基S110〜ほぼR150、ほぼF230〜ほぼG270、ほぼV330〜ほぼF370、および、ほぼC420〜ほぼI450に及ぶ。膜貫通タンパク質腫瘍抗原に特異結合する抗体は、癌、特に大腸癌または胃癌を同定する診断アッセイに有用である。
【００６３】
図2はTMDCの疎水性プロットであり、種々の膜貫通領域を疎水性領域（プロットのY軸上の負の値）として示す。
【００６４】
図3は、種々の正常な成体組織をTMDC発現につきTAQMAN解析で分析した結果である。最も顕著なTMDC発現は精巣、脂肪組織、乳房、十二指腸、および結腸に見られ、TMDCが比較的限局的な正常組織分布を持つことを示す。しかし精巣での高発現は、内部対照であるβ2ミクログロブリンでの、正常より高い発現に関連した。
【００６５】
表（Table）1は、LIFESEQ Goldデータベース（Incyte Genomics）内のcDNAライブラリ群のノーザン分析による、組織カテゴリ群でのTMDCの発現を示す。結果は、消化系でのTMDCの最高の存在量（Abundance：見られた転写物の総数）を示す。上記の表1と図3の結果に見られる差異は、おそらく、LIFESEQデータベースのcDNAライブラリ群における胎児組織と患部組織の高出現率を反映する。
【００６６】
また表2は、消化系の内、TMDCを過剰発現するcDNAライブラリ群（転写物/ライブラリの比が1より大きい群）が患部組織であり、大腸腫瘍、FAP、炎症性の腸、および胃の腫瘍を含むことを示す。特に注目すべきは大腸腫瘍（COLNTUT03）を同じドナーからの正常大腸組織（COLNNOT16）（TMDC発現は検出不能であった）と比べた場合のTMDCの過剰発現と、胃の腫瘍であるSTOMTUP02での過剰発現でありSTOMTUP02はTMDCを発現する消化組織の内で最高の存在量を示した。
【００６７】
図4は、QPCR分析（Applied Biosystems）を用いて正常大腸組織と比較した、大腸癌組織サンプル群でのTMDC発現を示す。結果は、試験した9の内8サンプルの大腸腫瘍でのTMDCの発現の増加を示す。結果は、癌組織と正常組織とで少なくとも1.2倍の発現差が見られたときに、有意とした。
【００６８】
図5は同様に、QPCR分析を用いて非腫瘍化大腸細胞株LS123と比較した、種々のヒト大腸腫瘍細胞株でのTMDC発現を示す。TMDCは、試験した8の内6の大腸腫瘍細胞株、LS174、HCT116、Caco2、HT29、COLO205およびSW620で過剰発現する。
【００６９】
表3は、マイクロアレイ分析で、大腸癌組織群と正常大腸組織とでのTMDCの発現を比較した結果である。結果は、試験した14の内2名の患者でのTMDCの発現の増加を示す。差次的発現（列1）は、癌組織と正常組織とで少なくとも1.5倍の発現差が見られたときに、有意とした。図3のQPCRで分析したサンプル群と表1とを比較した相対発現値の差の部分的原因は、おそらく、マイクロアレイ分析に比してのQPCR分析の感度とダイナミックレンジの大きさである。
【００７０】
TMDCをコードするcDNAの哺乳類変異体群の同定には、BLAST2で初期値パラメータ群とZOOSEQデータベース群（Incyte Genomics）を用いた。これらの好適な変異体は、以下の表で示されるように約84%から90%の同一性を有する。列1は変異体cDNAのSEQ IDvar、列2は変異体cDNAのクローン番号、列3は種、列4はヒトcDNAとの一致率、列5は変異体cDNAのヒトcDNAへのアラインメントである。
2005505267.tif 000002
【００７１】
遺伝暗号の縮重により、TMDCをコードする多数のcDNAが作り出され、中には、既知のいかなる天然遺伝子のcDNAとも極小の類似性しか持たない配列もあることは、当業者には理解されよう。従って本発明は、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るような、ありとあらゆる可能性のあるcDNA変異を企図する。これらの組合せは、天然TMDCをコードするポリヌクレオチドに適用される標準的なトリプレット遺伝暗号を基に作られる。また、このような全ての変異が明確に開示されていると考慮されたい。
【００７２】
SEQ ID NO:2-16のcDNAは、SEQ ID NO:2とサンプル中の関連分子の中で同定、区別するための、ハイブリダイゼーション、増幅、およびスクリーニング技術で使用可能である。哺乳類cDNAであるSEQ ID NO:12-16を用いてトランスジェニックの細胞株または生物を産生できるが、これらはヒトの大腸癌または胃癌のモデル系であり、それらについて治療処置の毒性と有効性を試験できる。本発明の、cDNA、タンパク質、抗体、並びに、cDNAとタンパク質とを用いて同定される分子および化合物を使用して、毒性研究、臨床試験、および被検者/患者治療プロファイルを、実施またモニターすることが可能である。
【００７３】
本発明の性質決定と使用
cDNAライブラリ
ここに開示する或る特定の実施態様では、mRNAを当業者に周知の方法を使用して哺乳動物の細胞と組織から単離し、cDNAライブラリを準備するために使用する。Incyte cDNA群を、「実施例」のように準備した哺乳類cDNAライブラリ群から単離した。コンセンサス配列は1つのクローンインサート中に在るか化学的にアセンブリされ、これはIncyte cDNA群ならびに伸長配列および/またはショットガン配列など、シークエンスした断片群からの電子アセンブリに基づく。コンピュータープログラム例えばPHRAP （P Green, University of Washington, Seattle WA）およびAUTOASSEMBLERアプリケーション（ABI）を用いて配列アセンブリし、これらは実施例5に記載する。5’および3’配列の検証後、TMDCをコードするIncyteクローン1929823F6を、研究開発用試薬に指定した。
【００７４】
シークエンシング
核酸をシークエンシングする方法は当該分野で周知であり、本発明の何れの実施態様も、核酸シークエンシング法を用いて実行可能である。これらの方法に用いる酵素は例えばDNAポリメラーゼIのクレノウ断片、SEQUENASE, Taq DNAポリメラーゼ、および熱安定性T7 DNA ポリメラーゼ（Amersham Biosciences （APB）, Piscataway NJ）、または、ポリメラーゼ群と校正エキソヌクレアーゼ群（Invitrogen, Carlsbad CA）の併用がある。配列の準備はMICROLAB 2200システム（Hamilton, Reno NV）およびDNA ENGINEサーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）およびABI CATALYST 3700サーマルサイクラー（Applied Biosystems）などの装置を、シークエンシングはPRISM 3700, 377または373 DNAシークエンシングシステム（ABI）、或いはMEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（APB）を用いて自動化する。
【００７５】
配列表に在るcDNA群の核酸配列の準備にはこうした自動化法を用い、この配列群には時折、シークエンスエラーとNで示す未同定ヌクレオチドとを含みうるが、これはcDNAをシークエンスした時点での最新技術を反映する。ベクター、リンカーおよびポリ（A）配列をマスクするには、BLASTと、動的プログラミングと、隣接ジヌクレオチド分析（dinucleotide nearest neighbor analysis）とに基づく、アルゴリズムとプログラムとを用いた。N群とSNP群を検証するには、cDNAを再シークエンスするか、該N群またはSNP、が起きるエリアにオーバーラップする多数の配列を比較するアルゴリズムを用いうる。この両技術は当業者に周知であり使用もされる。配列の分析には種々のアルゴリズムを使用でき、それらはAusubel他（1997; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7） およびMeyers （1995; Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ）に記載がある。
【００７６】
ショットガン・シークエンシングを、当該の特定クローン化インサートの配列を完成するために使用することもできる。ショットガン・ストラテジーには、無作為に元来のインサートを多様なサイズのセグメントに切断すること、これらの断片をベクターにクローニングすることが含まれる。これらの断片は、元来のインサートの配列全体がわかるまで、オーバーラップする末端を使用してシークエンスされ再アセンブリされる。ショットガン・シークエンシング法は当分野で公知であり、本法は、当該のcDNAに隣接する代表的領域群から選択される、熱安定性DNAポリメラーゼ、易熱性DNAポリメラーゼ、およびプライマーを使用する。不完全アセンブリした配列の同一性の点検には種々のアルゴリズムまたはプログラム例えばCONSED （Gordon （1998） Genome Res 8:195-202）を用い、これらは当該分野で公知である。コンタミネートする配列たとえばベクターまたはキメラ配列は除去でき、欠失した配列は復旧可能で、アセンブリした完全な配列を完成できる。
【００７７】
核酸配列の伸長
本発明の配列群の伸長には、種々のPCRベースの、当分野で既知の方法を利用できる。例えばXL-PCR kit （ABI）、入れ子プライマー群、およびcDNAまたはゲノムDNAライブラリを用いて核酸配列を伸長できる。全てのPCRベースの方法では、ソフトウェア、例えばOLIGOプライマー分析ソフトウェア（Molecular Biology Insights, Cascade CO）を用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含量が約50％以上、温度約55℃〜約68℃で標的分子にアニーリングするように、プライマー群を設計し得る。配列を伸長して調節エレメント群を回収する際は、cDNAでなくゲノムライブラリ群を用いる。
【００７８】
ハイブリダイゼーション
cDNAとその断片は、様々な目的のハイブリダイゼーション技術において使用することが可能である。プローブの設計または誘導は、固有領域（例えば５’調節領域）から、また、非保存領域（すなわち、該タンパク質の保存触媒ドメインをコードするヌクレオチド群の5’または3’）から可能で、プローブは、TMDCをコードする天然分子、対立遺伝子変異体、または近縁分子を同定するプロトコルに用い得る。プローブはDNAまたはRNAの場合があり、一本鎖の場合があり、核酸配列SEQ ID NOs:2-9の何れかに対して少なくとも50％の配列同一性を持つ。ハイブリダイゼーションプローブを産生するには、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化（エンドラベリング）、または、レポーター分子の存在下のPCR増幅を用い得る。cDNAまたはその断片を有するベクターを用いてmRNAプローブをin vitroで産生でき、このためには或るRNAポリメラーゼと標識したヌクレオチド群を付加する。これらの手順には、APBが提供するようなキットを用い得る。
【００７９】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、プローブのG+C含量、塩濃度、および温度により決定する。特にストリンジェンシーは、塩の濃度の減少あるいはハイブリダイゼーション温度の上昇により増強することができる。ハイブリダイゼーションは、5xSSCに1%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で60℃などのバッファーでの低ストリンジェンシーで実施することができ、そこでは、いくらかのミスマッチを有する核酸配列間でハイブリダイゼーション複合体の形成を可能にする。より高いストリンジェンシーでは、続いて45℃（中間ストリンジェンシー）または68℃（高ストリンジェンシー）で、0.1% SDSを有する0.2xSSCなどのバッファーで洗浄を実施する。高ストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は核酸が完全に相補的な場合のみ安定を保持するであろう。数種の膜系ハイブリダイゼーションでは、約35％〜約50％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に添加し、ハイブリダイゼーションが成される温度を低下できる。背景信号を低減するには、界面活性剤たとえばSarkosylまたはTRITON X-100 （Sigma-Aldrich）、およびブロッキング剤たとえば変性サケ精子DNAを用い得る。構成成分の選択とハイブリダイゼーションの条件とは当業者には公知である。またAusubel （前出）およびSambrook他（1989） Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに概説されている。
【００８０】
アレイを当該分野で周知の方法を用いて調製また分析することができる。オリゴヌクレオチドまたはcDNAは、同時に多数の遺伝子の発現レベルをモニターするために、または遺伝変異体、突然変異及び一塩基多型を同定するために、ハイブリダイゼーションプローブあるいは標的として使用され得る。アレイを用いることで、遺伝子機能を決定し、症状、疾患または障害の遺伝的根拠を理解し、症状、疾患または障害を診断し、治療薬を開発し活性をモニターすることができる（例えば米国特許第5,474,796号; Schena他（1996） Proc Natl Acad Sci 93:10614-10619; Heller他（1997） Proc Natl Acad Sci 94:2150-2155; 米国特許第5,605,662号参照）。
【００８１】
ハイブリダイゼーションプローブはまた、天然のゲノム配列をマッピングするのにも有用である。ハイブリダイゼーションプローブは、特定の染色体、染色体の特定領域、または人工染色体作成物にハイブリダイズされうる。こうした作成物としては、ヒト人工染色体、酵母人工染色体、細菌人工染色体、細菌P1作成物、または、単一染色体から作製したライブラリ群のcDNAがある。
【００８２】
QPCR
QPCR法は核酸分子の定量法であり、PCR増幅時に発生する蛍光信号の検出に基づく（Gibson 他（1996） Genome Res 6:995-1001; Heid 他（1996） Genome Res 6:986-994）。増幅に用いる装置は例えばPRISM 7700検出システム（ABI）であり、これは96穴サーマルサイクラーがレーザーおよび電荷結合素子（CCD）光学系に接続される。QPCRを行うには、PCR反応を、二重標識したプローブの存在下で行う。プローブは標準の順行と逆行のPCRプライマー間でアニールするよう設計され、5’末端で蛍光原性レポーター色素（たとえば6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM））によって、また3’末端でクエンチャー分子（たとえば6-カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA））によって標識される。プローブが無傷な内は、3’クエンチャーが、5’レポーターによる蛍光を消す。しかし各プライマー伸長周期の間、アニール済プローブは、Taqポリメラーゼの内在性の5’→3’ヌクレアーゼ活性の結果、分解する（Holland 他（1991） Proc Natl Acad Sci 88:7276-7280）。この分解はレポーターをクエンチャーから分離し、蛍光は数秒ごとにCCDで検出される。核酸の開始コピー数が高いほど、早期に蛍光の増加が見られる。サイクル閾値（CT ）はPCR産物が一定の検出閾値を超えるサイクル数であり、機器のソフトウェアが判定する。CT は鋳型のコピー数に逆比例するので、サンプル中の核酸分子の相対または絶対的初濃度の計算に用い得る。2種の分子の相対濃度を計算するには、各々のCT 値を判定して行える（比較CT 法）。或いは核酸分子の絶対濃度を計算するには、既知濃度の或るハウスキーピング分子を用いて標準曲線を作成して行える。CT 値を計算し、標準曲線を準備し、開始コピー数を判定する過程には、SEQUENCE DETECTOR 1.7ソフトウェア（ABI）を用いる。
【００８３】
発現
TMDCをコードする多数のcDNAの何れか1つをベクターにクローン化でき、該タンパク質または其の各部分を宿主細胞内で発現するために用い得る。核酸配列は、新規な制限酵素部位の作製、グリコシル化パターンの改変、コドン選択性の変更のために、DNAシャッフリング（USPN 5,830,721）、部位特異的変異誘発などの方法により操作することが可能であり、これにより、特定宿主における発現の増大、スプライス変異体の生成、半減期の延長などがなされる。発現ベクターは、特定の宿主での効率のために選択された多様な出所からの、転写及び翻訳調節エレメント（プロモータ、エンハンサ、特定の開始シグナル、ポリアデニル化された3’ 配列）を持つことが可能である。ベクター、cDNA、調節エレメントは、当分野で公知でありSambrook （前出4、8、16、17章）に記載されている、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及び/またはin vivo遺伝的組換え技術を利用して結合する。
【００８４】
種々の宿主系を、発現ベクターで形質転換可能である。これらには、限定するものではないが組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母発現ベクターで形質転換させた酵母や、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換させた昆虫細胞系や、ウイルス性および/または細菌性エレメントを有する発現ベクターで形質転換させた植物細胞系がある（前出Ausubel、ユニット16）。哺乳動物細胞系においては、アデノウイルス転写/翻訳複合体を利用し得る。配列をウイルスのゲノムのE1あるいはE3領域にライゲーションさせた後に、この感染性ウイルスが、宿主細胞を形質転換しそこで該タンパク質を発現するために用いられる。ラウス肉腫ウイルスエンハンサーあるいは、SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いて、タンパク質を高レベル発現させることもできる。
【００８５】
核酸配列の慣例的なクローニング、サブクローニング、および増殖には、多機能のpBLUESCRIPTベクター（Stratagene, La Jolla CA）またはpSPORT1プラスミド（Invitrogen）を用いることができる。或る核酸配列をこれらベクターのマルチクローニング部位に導入するとlacZ遺伝子が撹乱され、形質転換された細菌のための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子欠失の生成にも有用であろう。
【００８６】
組換えタンパク質の長期産生のために、同じ或いは別のベクターの上の選択可能マーカーまたは可視マーカー遺伝子と共に、ベクターは安定的に細胞株に形質転換されうる。形質転換後、細胞は強化培地で約1〜2日間増殖させ、次に選択培地に移す。選択可能マーカーや、代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性の遺伝子は関連する選択剤への耐性を与え、導入された配列の発現に成功するような細胞の成長及び回収が可能となる。選択培地上の生存にあるいは可視マーカーの発現により同定された耐性クローンは、培養技術を用いて増殖可能である。可視マーカーはまた、導入された遺伝子により発現したタンパク質の量を推定するためにも用いられる。所望のcDNAを有する宿主細胞の検証は、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーションあるいはPCR増幅に基づく。
【００８７】
宿主細胞は、所望の形で組換えタンパク質を修飾する能力について、選択され得る。そのような修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化及びその他がある。「プレプロ」形を切断する翻訳後プロセシングを利用して、タンパク質のターゲティング、折りたたみ、および／または活性を特定することも可能である。翻訳後の活性のための、特定の細胞機構および特徴的な機序を持つ、種々の宿主細胞を、組換えタンパク質の妥当な修飾およびプロセシングを確実にするように選択し得る。
【００８８】
細胞培地からのタンパク質の回収
精製を容易にするためベクターに組み込まれる異種成分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、6xHis、FLAG、MYC及びその他がある。GSTと6-Hisを精製するには、それぞれ固定化グルタチオンおよび金属キレート樹脂など、親和性マトリクスを用いる。FLAGおよびMYCを精製するには、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いる。精製後の分離を容易にするために、タンパク質と異種成分の間に位置するベクターに、タンパク質分解切断部位をコードする配列を含めることもできる。組換えタンパク質の発現および精製方法は、Ausubel（前出、ユニット16）に記載されている。
【００８９】
タンパク質の同定
高速液体クロマトグラフィと質量分析（MS）を用いてタンパク質の迅速な同定を可能にする数種の技術が開発されている。タンパク質を有するサンプルを発端に、本法では、1） タンパク質を二次元ゲル電気泳動（2-DE）で分離し、2） 選択したタンパク質をゲルから切除しプロテアーゼで消化して一組のペプチドを産生し、3） ペプチドを質量分析してペプチドイオン質量とスペクトルパターン情報を引き出す。MS情報を用いてタンパク質を同定するには、この情報をタンパク質データベースの情報と比較する（Shevenko 他（1996） Proc Natl Acad Sci 93:14440-14445）。蛋白質の2DEでの分離には、等電点分離法（IEF）を1次元目、その後SDS-PAGEを2次元目に用いる。IEFでは、固定したpH勾配ストリップが、分離の再現性と分解能の増進に有用である。別の技術を用いて、極めて塩基性、疎水性、または高分子量のタンパク質の分解能を改善しうる。分離したタンパク質の検出には、MSに適合する染色液または色素たとえば銀染色、クーマシーブルー、またはspyro red （Molecular Probes, Eugene OR）を利用できる。ゲルはPVDF膜にブロットしてウェスタン分析でき、光学スキャンにSTORMスキャナー（APB）を用いて、コンピュータで読み取れる出力を産出可能で、それをパターン認識ソフトウェア（例えばMELANIE （GeneBio, Geneva, Switzerland））で分析する。本ソフトウェアは個々のスポットを注釈するが、これは、一意の識別子を割当て、各々のX、Y座標、分子量、等電点、および信号強度を計算して行う。当該の個々のスポット（例えば差次的に発現したタンパク質を示すスポット）が切除され、部位特異的プロテアーゼ（例えばトリプシンまたはキモトリプシン）の単独または併用で蛋白分解消化され、一組の小ペプチド、好適には1〜2 kDaの範囲のものが産生される。消化の前にサンプルを還元剤およびアルキル化剤で処理でき、消化後にペプチドを液体クロマトグラフィまたはキャピラリー電気泳動で分離し、MSで分析する。
【００９０】
MSはサンプルの各成分をガス状イオンに変換し、イオンを質量電荷比に基づき分離し、相対存在度を判定する。ペプチドマスフィンガープリント分析では、MALDI-TOF （Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）, ESI （Electrospray Ionization、エレクトロスプレーイオン化質量分析）, およびTOF-TOF （Time of Flight/Time of Flight）装置を用いて、一組の高精度なペプチド質量を判定する。分析プログラム例えばTURBOSEQUESTソフトウェア（Finnigan, San Jose CA）を用いてMSデータを、既知または予測したタンパク質に由来する理論的MSデータのデータベースと比較する。最少で3ペプチド質量の一致を用いて、信頼できるタンパク同定を行う。更なる情報が同定に必要であれば、タンデムMSを用いて個々のペプチドの情報を引き出せる。タンデムMSでは、第1ステージのMSで個々のペプチド質量を判定する。次に、選択したペプチドイオンを断片化するため衝突誘起解離（CID）などの技術を用い、一連のイオンを産生する。結果の断片化イオン群を第２ラウンドのMSで分析し、それらのスペクトルパターンを用いてアミノ酸配列の短いストレッチを判定できる（Dancik 他（1999） J Comput Biol 6:327-342）。
【００９１】
該タンパク質がデータベースにあれば、ペプチド質量と断片化データの組合せは、該タンパク質の算出されたMWおよびpIと共に、通常、明白な同定を産生することとなる。一致が見られない場合、タンパク配列を得るには、当該分野で公知の直接化学シークエンシング法を用い得る（Creighton （1984） Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY参照）。
【００９２】
ペプチドの化学合成
タンパク質または其の各部分を産生するには、組換え法に限らず当該分野で公知の化学法も用いうる。固相ペプチド合成はバッチ式または連続フロープロセスで実行でき、これは逐次的に、αアミノ保護および側鎖保護したアミノ酸残基を不溶性ポリマー支持体に、或るリンカー基を介して付加する。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカー基を、サポートレジンを形成するためスチレン-ジビニルベンゼン共重合体に付着する。これらアミノ酸残基は、酸不安定Boc（t-ブチルオキシカルボニル）または塩基不安定Fmoc（9-フルオレニルメトキシカルボニル）でN-α保護される。保護アミノ酸のカルボキシル基はリンカー基のアミンに結合させ、この残基を固相サポートレジンにアンカーする。トリフルオロ酢酸またはピペリジンが、それぞれBocまたはFmocの場合に保護基を除去するために用いられる。各付加的アミノ酸を、カップリング剤か前もって活性化されたアミノ酸誘導体を用いてアンカー済み残基に付加し、次いでレジンを洗浄する。全長ペプチドを、逐次脱保護、誘導体化アミノ酸の結合、ジクロロメタンまた/あるいはN, N-ジメチルホルムアミドでの洗浄により合成する。前記ペプチドを、ペプチド酸またはアミドを産生するためにペプチドカルボキシ末端とリンカー基の間で切断する（Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook, San Diego CAS1-S20ページ）。自動合成はまた、431Aペプチドシンセサイザ（ABI）等の装置で成し得る。タンパク質或いはその部分は、分取用高速液体クロマトグラフを用いて精製可能である。またその組成はアミノ酸分析かシークエンシングにより確認することができる（Creighton （1984） Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY）。
【００９３】
抗体
抗体すなわちイムノグロブリン（Ig）は免疫応答の成分であり、Ｂ細胞の表面で発現されるか、または、Ｂ細胞によって分泌されて血液循環に入る。プロトタイプの抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの同じポリペプチド重鎖（Ｈ鎖）と２つの同じポリペプチド軽鎖（Ｌ鎖）からなる四量体であり、外来抗原に結合し中和する。抗体はＨ鎖に基づいてIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMに分類される。最も一般的なクラスであるIgGは四量体であるが、他のクラスのものは基本構造の変異体か、または多量体である。
【００９４】
抗体は、其の2つの機能ドメインについて記述される。抗原認識を媒介するのは抗体のFab（抗原結合フラグメント）領域であり、エフェクター機能を媒介するのはFc（結晶可能フラグメント）領域である。抗体の抗原への結合は、抗原の、食作用白血球たとえばマクロファージおよび好中球による破壊を誘起する。これらの細胞は表面Fc受容体を発現し、これが抗体のFc領域に特異結合し、食細胞に抗体結合抗原を破壊させる。Fc受容体は1回膜貫通糖タンパクで約350アミノ酸を持ち、細胞外部分は通常、２または３のIgドメインを持つ（Sears他 （1990） J Immunol 144:371-378）。
【００９５】
抗体の調製とスクリーニング
種々の宿主たとえばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ラマ、ラクダ、ヒト細胞株などが、抗原決定基の注入によって免疫化され得る。アジュバント例えばフロイント、ミネラルゲル、および界面活性物質（例えばリゾレシチン）、プルロニックポリオール（pluronic polyols）、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシアニン（KLH; Sigma-Aldrich）、ジニトロフェノールなどを用いて免疫応答を増進しうる。ヒトでは、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が応答を増進する。抗原決定基は、オリゴペプチド、ペプチド、またはタンパク質でありうる。抗原決定基の量が免疫化を反復するものであれば、高親和性の特異的ポリクローナル抗体を得ることができる（Klinman および Press （1975） Transplant Rev 24:41-83）。内因性タンパク質の一部分に同一な約5〜約15のアミノ酸を持ちうるオリゴペプチドをKLHなどのタンパク質と融合し、該キメラ分子への抗体を産生しうる。
【００９６】
モノクローナル抗体は、培地内の連続継代性細胞株によって抗体を産生する任意の技術を用いて調製することが可能である。この技術としては、ハイブリドーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法、およびEBVハイブリドーマ法がある（Kohler 他 （1975） Nature 256:495-497; Kozbor 他 （1985） J Immunol Methods 81:31-42; Cote 他 （1983） Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030; およびCole 他（1984） Mol Cell Biol 62:109-120）。
【００９７】
キメラ抗体を作製するには、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの技術が、好適な抗原特異性および生物活性を備える分子を得るために用いられる（Morrison他（1984） Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger 他（1984） Nature 312:604-608; およびTakeda他（1985） Nature 314:452-454）。別法では、抗体産生のために記載された技術を適用し、当分野で既知の方法を用いて、特異的一本鎖抗体を産生しうる。関連した特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体群を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton （1991） Proc Natl Acad Sci 88:10134-10137）。或る抗原決定基に対する特異結合部位を持つ抗体断片をも産生し得る。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF（ab’）2 断片と、F（ab’）2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定できる（Huse他（1989） Science 246:1275-1281）。
【００９８】
抗体類の産生はまた、リンパ球集団における産生の誘導によって、或いは非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリ類またはパネル類のスクリーニングによっても行え、これはOrlandi他（1989; Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）またはWinter 他（1991; Nature 349:293-299）に開示がある。タンパク質をファージミドまたはBリンパ球イムノグロブリンのライブラリのスクリーニングアッセイに用いて、所望の特異性を有する抗体を同定し得る。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる、イムノアッセイまたは競合結合に関する数々のプロトコルは、当該分野で公知である。
【００９９】
抗体特異性
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、或るタンパク質に対する特定抗体の親和性を算定しうる。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でタンパク-抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多様な抗原決定基に対する親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。モノクローナル抗体は特定の抗原決定基に特異的で、モノクローナル抗体の或る製剤について判定したKaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が約１０９〜１０１２L/molの高親和性抗体製剤は、蛋白-抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに通常用いる。Ka値が約１０６〜１０７L/molの低親和性抗体製剤は、該タンパク質が抗体から最終的に（好ましくは活性型で）解離する必要がある免疫精製（immunopurification）および類似の処理に用いるのが好ましい（Catty （1988） Antibodies, Volume I: A Practical Approach, IRL Press, Washington DC; Liddell および Cryer （1991） A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY）。
【０１００】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価および結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような製剤の品質および適合性を決定することができる。例えば、約5〜10mg/mlの特異抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、蛋白-抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いる。抗体作製や、抗体の特異性、力価、および結合力の評価の手順、並びに、様々な適用例における抗体の品質と使用に対する指針については、Catty（前出）およびAusubel （前出） 11.1-11.31ページに記載がある。
【０１０１】
細胞の形質転換アッセイ
細胞の癌化、すなわち正常な細胞の癌細胞への転換は、高度に複雑で遺伝的に多様な過程である。しかし、この過程に伴う、細胞生理の数種の変容は、in vitroの細胞ベースのシステムまたはin vivoの動物モデルを用いてアッセイできる。既知の変容としては、成長シグナルに関する獲得性の自足性、成長阻害シグナルへの不感性、無制限の複製能、アポトーシスの回避、持続する血管形成、および細胞浸潤ならびに転移がある（HanahanおよびWeinberg （2000） Cell 100:57-70参照）。こうしたアッセイを用いて例えば、細胞内のTMDCなどの遺伝子の過剰発現の、細胞癌化への効果をアセスできる。
【０１０２】
（診断）
TMDC、それをコードするcDNA、またはTMDCに特異結合する或る抗体と、以下の少なくとも1つのアッセイを用いて検出するTMDCの差次的発現を用いて、大腸癌または胃癌を診断できる。
【０１０３】
アッセイのための分子の標識化
多岐にわたるレポーター分子及び結合技術が当業者に知られており、様々な核酸アッセイ、アミノ酸アッセイおよび抗体アッセイにこれらの技術を用い得る。標識した分子の合成を成すのに用いるキットとしては、Promega （Madison WI）またはAPBが供給するような、標識したヌクレオチド例えば32P-dCTP （APB）、Cy3-dCTPまたはCy5-dCTP （Qiagen-Operon, Alameda CA）、或いはアミノ酸たとえば35S-メチオニン（APB）の組み込み用キットがある。ヌクレオチドとアミノ酸を直接に標識するには、種々の物質たとえば蛍光剤、化学発光剤、色原体などを用い、BIODIPYまたはFITC （Molecular Probes）等の試薬を用いた、分子内に在る、アミン、チオール、および他の基への化学接合によって行う。
【０１０４】
核酸アッセイ
cDNA、断片群、オリゴヌクレオチド、相補RNA、およびペプチド核酸（PNA）を用いて、差次的な遺伝子発現を検出および定量し、障害を診断できる。同様に、TMDCに特異結合する抗体を用いて、該タンパク質を定量し得る。こうした差次的発現を伴う障害としては、大腸癌または胃癌がある。診断アッセイは、差次的遺伝子発現を検出するために患者の生物学的サンプル中の遺伝子発現を標準サンプルと比較する、ハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用い得る。この比較のための定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０１０５】
発現プロファイル
発現プロファイルには複数のcDNAまたはタンパク質の発現を有し、この測定には、サンプルを有する標準アッセイを用いる。本発明のcDNA、タンパク質、または抗体を用いてアレイ上のエレメントとし、発現プロファイルを作成できる。一実施態様では、該アレイを用いて、疾患を診断、またはその進行を監視する。
【０１０６】
例えば、cDNAあるいはプローブは標準的な方法で標識化し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で患者の生物学的サンプルに加える。インキュベーション期間後、サンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体と関連する標識（またはシグナル）の量を定量して標準値と比較する。患者サンプル中の複合体形成が正常または疾患の標準に比して変容すれば、差次的発現は障害の存在を示す。
【０１０７】
差次的発現を確立する標準を提供するために、正常と疾患の発現プロファイルを確立する。これは、ハイブリダイゼーション発生に好適な条件下で、cDNAと、動物或いはヒトの何れかの正常な被検者から取ったサンプルを混合することにより達成される。精製された配列を既知量用いて行った実験から得た値を正常な対象から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーション複合体を定量することができる。このようにして得た標準値は、特定の症状、疾患または障害と診断された患者からのサンプルから得た値と比較することができる。標準値から特定の障害に伴う値への偏差を用いて、その障害を診断または病期分類する。
【０１０８】
遺伝子発現のパターンでの変化を分析することにより、疾患を早期に、患者に症状が出る前に診断できる。本発明を用いて予後診断を策定し、治療レジメンを設計できる。本発明はまた、治療の有効性のモニタリングに利用できる。既知の副作用を持つ治療については、該アレイを用いて治療レジメンを改善する。治療成功の指標となる、遺伝子発現パターンでの変化を起こす用量が確立される。望ましくない副作用の発症を伴う発現パターンは回避される。この手法は、患者が不十分な改善または副作用を示すのを待って治療のコースを変更するよりも、高感度かつ迅速でありうる。
【０１０９】
別の実施態様では、ヒト疾患を模倣する動物モデルを用いて、特定の病状、疾患、または障害、或いは、該病状、疾患または障害の治療に伴う発現プロファイルを特徴づけできる。新規の治療レジメンをこれらの動物モデルで試験でき、これにはアレイを用い、発現プロファイルを確立した後、長期間フォローする。またアレイを動物モデルから採取した細胞培地または組織と共に用いて多数の候補薬物分子を迅速にスクリーニングでき、これは既知の治療薬の発現に似た発現プロファイルを産出する分子を探すもので、同じ発現プロファイルを持つ分子がおそらく似た治療効果を持つことを見込む。このように、本発明は、薬物の分子作用の機序を迅速に判定する手段を提供する。
【０１１０】
このようなアッセイを、動物実験または臨床試験における特定の治療処置レジメンの効果を評価するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。症状の存在を一旦確定して治療プロトコルを開始すると、診断アッセイを定期的に繰り返して、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを判定し得る。経時的なアッセイから得られた結果を用いて、数日から数年の期間にわたる治療の効力を示し得る。
【０１１１】
タンパク質アッセイ
特異的ポリクローナル抗体または特異的モノクローナル抗体を用いてタンパク質発現の尺度としての複合体形成の検出及び計測を行うための免疫学的方法は、当分野で既知である。このような技術の例としては、抗体アレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、蛍光活性化細胞選別、2D-PAGEとシンチレーション計数、蛋白アレイ、ラジオイムノアッセイ、およびウェスタン分析がある。こうしたイムノアッセイには通常、タンパク質と其の特異抗体との複合体形成の測定を含む。これらのアッセイと其の精製した標識化標準に対する定量化とは当分野で公知である（前出のAusubel、unit 10.1-10.6）。２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体群を用いた２部位モノクローナル系イムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合試験を用いることもできる（Pound （1998） Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ）。
【０１１２】
これらの方法はまた、差次的なタンパク発現を示す疾患の診断に有用である。正常或いは標準的なタンパク発現の値は、複合体形成に適した条件下で、正常な哺乳動物またはヒト被検者から採取した体液または細胞抽出物と或るタンパク質に対する特異抗体とを混合することによって確定する。正常組織および患部組織での標準複合体形成値は、種々の方法、多くは測光法で確定する。次に、被験サンプルで発現する複合体形成を標準値と比較する。正常標準から、また罹患標準への偏差は疾患の診断または予後のためのパラメータを提供し、罹患標準からまた正常標準への偏差は治療効力の評価に用い得る。
【０１１３】
最近、抗体アレイによって、組換え抗体の高処理スクリーニングの技術の開発が可能となった。こうした方法ではロボットを用いて抗体遺伝子含有細菌を採取および格子配列し、フィルタ系ELISAを用いて抗体断片を発現するクローンをスクリーニングし同定する。液体ハンドリングが排除されクローンはマスターストックから配列されるので、同じ抗体を何度もスポットでき、複数の抗原に対して同時にスクリーニングできる。抗体アレイは、差次的に発現するタンパク質の同定で有用性が高い（de Wildt他（2000） Nature Biotechnol 18:989-94参照）。
【０１１４】
（治療）
TMDC （SEQ ID NO:1）および他の膜貫通タンパク質の領域の間には、化学的及び構造的類似性、特に膜貫通ドメインが存在する。また、差次的発現は、大腸癌および胃癌と高度に関連する。TMDCは明らかに大腸癌または胃癌で役割を果たす。
【０１１５】
一実施態様では、該タンパク質の発現または活性の低下を望む場合、抗体、アンタゴニスト、インヒビター、医薬品、または、これら分子の1つ以上を有する組成を、こうした治療を要する被検者に送達しうる。こうした送達は当該分野で公知の各法で行え、該タンパク質に特異結合する抗体による送達もありうる。治療用には、モノクローナル抗体を用いて活性部位を遮断し、二量体形成を阻害し、アポトーシスを誘起するなどする。
【０１１６】
別の実施態様では、該タンパク質の発現または活性の増加を望む場合、該タンパク質、アゴニスト、エンハンサ、医薬品、または、これら分子の1つ以上を有する組成を、こうした治療を要する被検者に送達しうる。こうした送達は当該分野で公知の各法で行え、該タンパク質を特異的に標的とする抗体による医薬品の送達もありうる。
【０１１７】
任意のcDNA、相補分子、または其の断片、タンパク質または其の各部分、これらの核酸分子を送達または該タンパク質を発現するベクター、治療抗体、及び、該cDNAまたはタンパク質に結合するリガンドを、別の治療薬と併用投与できる。併用療法で用いる治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従って選択し得る。治療薬の併用により、各薬剤の、より低い用量で、特定の障害の治療に影響する相乗効果をもたらし得る。
【０１１８】
核酸を用いる遺伝子発現の修飾
TMDCをコードする遺伝子のコントロール領域、5’、3’、または他の調節領域に相補的またはアンチセンスの分子（DNA、RNA、またはPNA）を設計して遺伝子発現をモディフィケーションし得る。転写開始を阻害するように設計されたオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に阻害は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合を阻害する三重らせん塩基対合を用いて達成することができる（Gee他In: HuberおよびCarr （1994） Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing, Mt. Kisco NY, 163-177ページ）。相補分子はまた、mRNAとリボソームの間の結合を阻止することによって翻訳を遮断するように設計することができる。或いは、ライブラリまたは複数のcDNAを、調節性非翻訳配列に特異結合するものを同定するためにスクリーニングすることが可能である。
【０１１９】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションとその後のGUA、GUU、GUC等の部位でのヌクレオチド鎖切断に関与している。一度それらの部位を同定すると、同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴につき評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションをテストすることによって行うことができる。
【０１２０】
本発明の相補的な核酸及びリボザイムは、in vitroまたはin vivoで組換え発現によりあるいは固相フォスフォアミダイト化学合成を使用して調製することが可能である。さらに、分子の5’末端、3’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を付加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）または2’ O-メチルを使用したりすることにより、細胞内の安定性を高め半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。修飾はPNAの産出に固有のものであり、他の核酸分子に拡張することができる。非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）を含めるか、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンをアセチル−、メチル−、チオ基で修飾すると、分子は内因性エンドヌクレアーゼへの耐性を増す。
【０１２１】
cDNA治療
本発明のcDNA群を遺伝子治療に用い得る。cDNAはex vivoで標的細胞たとえば骨髄の細胞に送達できる。安定した組込みと転写および／または翻訳を確認したら、骨髄を被検者に再導入できる。該cDNAがコードするタンパク質の発現は、正常配列の突然変異、内因性標的タンパクの減少または喪失、或いは、内因性または突然変異タンパクの過剰発現を伴う障害を修正しうる。或いはcDNAをin vivoで、ベクター例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、および細菌プラスミドを用いて送達できる。非ウイルス性遺伝子送達法としては、カチオン性リポソーム、ポリリジン抱合体、人工ウイルスエンベロープ、および、DNAの直接注入がある（Anderson （1998） Nature 392:25-30; Dachs他（1997） Oncol Res 9:313-325; Chu他（1998） J Mol Med 76（3-4）:184-192; Weiss他（1999） Cell Mol Life Sci 55（3）:334-358; Agrawal （1996） Antisense Therapeutics, Humana Press, Totowa NJ; およびAugust他（1997） Gene Therapy （Advances in Pharmacology, Vol. 40）, Academic Press, San Diego CA）。
【０１２２】
モノクローナル抗体治療
抗体、特に、特定のタンパク質、酵素、または受容体に特異結合し其の過剰発現を阻止するモノクローナル抗体が現在、治療に使われている。初めて広く受容された治療抗体は、HERCEPTIN （Trastuzumab, Genentech, S. San Francisco CA）およびGLEEVEC （メシル酸イマチニブ, Novartis Pharmaceuticals, East Hanover NJ）である。HERCEPTINはヒト化抗体であり、HER2陽性転移性乳癌の治療で承認された。これは、過剰発現したHER2タンパクに結合し機能をブロックするよう設計される。GLEEVECの適応は、フィラデルフィア染色体陽性（Ph+）慢性骨髄性白血病（CML）の芽球クリーゼ（急性転化期）または慢性期でインターフェロンα治療無効後の患者の治療である。GLEEVECの第二の適応は、KIT （CD117）陽性で切除不能および/または転移性の悪性胃腸間質腫瘍の患者の治療である。他のモノクローナル抗体群は臨床試験の種々の段階にあり、適応は例えば前立腺癌、リンパ腫、黒色腫、肺炎球菌感染、リウマチ様関節炎、乾癬、全身性エリテマトーデスなどがある。
【０１２３】
スクリーニング及び精製アッセイ
TMDCをコードするcDNAを用いて、或るライブラリまたは複数の分子あるいは化合物の特異結合親和性をスクリーニングできる。ライブラリは、アンチセンス分子、人工染色体作成物、分岐核酸分子、DNA分子、ペプチド、ペプチド核酸、タンパク質（たとえば転写因子、エンハンサまたはリプレッサ）、RNA分子、リボザイム、および他のリガンドであり、内因性遺伝子の、活性、複製、転写、または翻訳を制御するものでありうる。アッセイには、或るポリヌクレオチドと、或るライブラリまたは複数の分子あるいは化合物を、特異結合を許容する条件下で混合する過程と、特異結合を検出して該cDNAに特異結合する少なくとも1つの分子を同定する過程がある。
【０１２４】
一実施態様において、本発明のcDNAを複数の精製された分子または化合物と共にインキュベートすることが可能であり、ゲル遅延測定法（USPN 6,010,849）または網状赤血球溶解物転写アッセイ等の当分野で公知の方法によって結合活性を判定することが可能である。別の実施態様において、cDNAは生検および/または培養の細胞と組織からの核抽出物と共にインキュベートすることが可能である。cDNAと核抽出物の分子あるいは化合物の間の特異結合は、最初ゲルシフト法により決定される。そして後にその分子または化合物を回収して、それに対する抗体を作製することによって確認することが可能である。これらの抗体がアッセイに加えられる時、ゲル遅延アッセイにスーパーシフトが起きる。
【０１２５】
別の実施態様では、cDNAは、当分野で公知であるアフィニティークロマトグラフィー法を用いて分子あるいは化合物を精製するために使用される。一実施態様では、cDNAは重合樹脂またはゲル上の臭化シアン基と化学反応させる。次にサンプルを通し、cDNAと反応あるいは結合させる。cDNAに結合する分子または化合物は、流動媒体の塩の濃度の上昇によりcDNAから放出され、収集されうる。
【０１２６】
更なる実施態様では、該タンパク質あるいはその一部分を、サンプルからのリガンドを精製するために用いうる。タンパク質を用いてリガンドを精製する方法では、タンパク質とサンプルを、特異結合できる条件で混合し、タンパク質とリガンドの特異結合を検出し、結合タンパクを回収し、カオトロピック剤を用いてタンパク質を精製リガンドから分離することになる。
【０１２７】
或る好適な実施態様では、TMDCを用いて、複数の分子または化合物を、種々のスクリーニングアッセイの何れかでスクリーニングできる。そのようなスクリーニングで用いるタンパク質の部分は、溶液中で遊離しているか、非生物基板または生物基板に固定され（例えば細胞表面上に保持される）、あるいは細胞内に位置しうる。例えば１つの方法では、生存可能または固定された原核宿主細胞で、その細胞表面にペプチドを発現し位置させている組換え核酸で安定的に形質転換される細胞を、スクリーニングアッセイで使用することが可能である。細胞を複数のリガンドあるいはリガンドのライブラリに対してスクリーニングする。そして発現したタンパク質とリガンドの間で結合の特異性または複合体の形成を測定することが可能である。スクリーニングする分子または化合物の種類に応じ、アッセイを用いて、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、DNA分子、小分子薬、イムノグロブリン、インヒビター、擬態物質、ペプチド、ペプチド核酸、タンパク質、およびRNA分子、または任意の他のリガンドであって、該タンパク質に特異結合するものを同定できる。
【０１２８】
一態様で本発明は米国特許第5,876,946号に記載されるような、極めて小さなアッセイ容量と極めて少量の試験化合物を用いる或る高処理スクリーニング法を企図し、この特許は参照により開示に含まれる。この方法は、特異結合によって多数の分子と化合物をスクリーニングするために用いられる。別の様態において本発明は、タンパク質に特異結合可能な中和抗体が該タンパク質に結合可能な試験化合物と競合する、競合薬スクリーニングアッセイの使用も企図する。スクリーニングによって同定した分子または化合物を用いて、哺乳類モデル系で、その毒性または治療可能性を評価できる。
【０１２９】
医薬組成物
医薬組成物を処方し、そうした治療を要する被検者に投与して、治療効果を果たすことができる。そうした組成物には、即効性タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、二重特異性分子、小分子薬、イムノグロブリン、インヒビター、擬態物質、多重特異性分子、ペプチド、ペプチド核酸、医薬品、タンパク質、およびRNA分子を含む。組成物の製造には、従来の手段たとえば混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化（levigating）、乳化、カプセル化、封入（entrapping）、または凍結乾燥を行う。該組成物は酸たとえば塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸で形成した塩として、または凍結乾燥粉末として提供され、これは無菌バッファー例えば食塩水、デキストロース、または水と併用されうる。これらの組成物には、活性化合物のプロセシングを促進する補助剤または賦形剤を含みうる。
【０１３０】
補助剤および賦形剤としては、コーティング、充填剤、または結合剤があり、これには糖たとえばラクトース、スクロース、マンニトール、グリセロール、またはソルビトールや、トウモロコシ、小麦、米、またはジャガイモの澱粉や、タンパク質たとえばアルブミン、ゼラチン、コラーゲンや、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムの形のセルロースや、アラビアゴムとトラガカントなどゴムや、潤滑剤たとえばステアリン酸マグネシウムまたは滑石や、崩壊剤または可溶化剤たとえば寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウムまたは架橋ポリビニルピロリドンや、安定剤たとえばカルボポル（carbopol）ゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタンや、染料または色素があり、これらは産物を同定し活性化合物の含量、または用量を特徴付けるため添加する。
【０１３１】
これらの組成物は、任意の数の経路によって投与でき、経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０１３２】
投与の経路と用量が剤形を決めることとなる。例えば経口投与には錠剤、丸剤、糖衣、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、または懸濁液を用い、非経口投与は水性で生理適合バッファー例えばハンクス液、リンゲル液、または緩衝生理食塩水で処方されうる。注射用懸濁液は、水性で粘稠添加物たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウムまたはデキストランを含有して粘稠度を増した液や、油性で親油性溶媒たとえば胡麻油または合成脂肪酸エステルたとえばオレイン酸エチルまたはトリグリセリド、あるいはリポソームを有する液でありうる。当該分野で公知の浸透剤は、局所または鼻内投与に用いる。
【０１３３】
毒性および治療有効性
治療有効量とは、症候または病状を寛解させる活性成分量を言う。任意の化合物に対して、細胞培養アッセイに正常および腫瘍性の細胞を用いて、或いは、動物モデルで、治療有効量を推定できる。治療有効性、毒性、濃度範囲、および投与経路を決定するには、実験動物を用いた標準の製薬手順を用い得る。
【０１３４】
治療指数は治療効果と毒性効果の用量比、LD50（集団の５０％の致死量）/ED50（集団の５０％の治療有効量）であり、大きな治療指数が好ましい。投与量は循環濃度の範囲内で、ED50を含み毒性はわずかまたは無く、組成、送達法、患者の感受性、および投与の経路によって変動する。正確な投与量は、治療が必要な被検者に関する要素を考慮して、実務医が決定することになる。
【０１３５】
用法および用量は調整され、目的は治療効果を維持する活性成分の提供である。調整の要素としては、病態の重症度、患者の全身健康状態、患者の年齢、体重及び性別（ジェンダー）、食事、投与の時間及び頻度、併用薬、反応感受性及び治療に対する許容度/応答等がある。長時間作用性の医薬組成物は、特定組成物の半減期及びクリアランス速度によって3〜4日毎に1度、毎週、或いは隔週の間隔で投与し得る。
【０１３６】
通常の投与量は、投与経路によるが0.1μgから最大で総用量約1gまで変動しうる。特定組成物の用量は、別の媒介物、薬物、またはホルモンと併用して患者に投与する際は、低くなりうる。特定の用量決定および送達法に関する指針は、医薬文献に示される。製剤および投与の技術の詳細は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing, Easton PA）の最新版にも見られる。
【０１３７】
モデル系
動物モデルは生物検定として用い得る。そこではヒトに類似の表現型応答を示し、また暴露条件が人体暴露と関連する。哺乳類は最も一般的なモデルであり、大抵の感染因子、癌、薬物、及び毒性の試験は齧歯類たとえばラットやマウスで行うが、理由は、低コスト、可用性、寿命、妊娠期間、子孫の数、及び豊富な参照文献である。近交系また非近交系齧歯類は、目的遺伝子の過小発現と過剰発現の生理的結果の研究、および疾患の診断と治療のための方法開発のための便利なモデルを提供する。特定の遺伝子を過剰に発現する哺乳動物近交系（例えば乳汁内に分泌）は、その遺伝子により発現するタンパク質の便利な源泉となり得る。
【０１３８】
毒性研究
毒性研究は、生物系への薬剤影響の研究である。大多数の毒性研究は、ラットまたはマウスで実施される。ラットまたはマウスでの、生理、行動、恒常性プロセス、および致死性での定性または定量的変化の観察を用いて毒性プロファイルが作成され、該薬剤に曝露後のヒトの健康への影響がアセスされる。
【０１３９】
遺伝毒性研究により、内因性、自然発生および誘導された遺伝子突然変異の率への薬剤の影響の同定と分析がなされる。遺伝毒性薬剤は、核酸との相互作用を促進する共通の化学的特性また物理的特性を通常は有する。また染色体異常が子孫に伝達された時最も有害である。毒性研究により、受胎前に親に、妊娠中に母親にあるいは発達中の生物のいずれかに投与された場合子孫の組織中の構造的または機能的異常の頻度が増大する薬剤を同定することが可能である。マウスまたはラットは、これらの試験で最も頻繁に使用される。なぜなら生殖周期が短いので統計上の必要にかなう多数の生物の繁殖を可能にするからである。
【０１４０】
急性毒性試験は、薬剤の症候学または致死率を決定するために被験動物に薬剤を１回投与することに基づいている。３回の試験が実施される。すなわち、1）初回の用量範囲探索試験、2）有効量の範囲を狭める試験、3）用量反応曲線を確定するための最終試験、である。
【０１４１】
亜慢性毒性試験は、薬剤の反復投与に基づく。ラットとイヌはこれらの研究で一般的に用いられ、異なる科の種からのデータを提供する。発癌を除いて、３−４ヶ月の間、高用量濃度で薬剤を毎日投与することにより、成獣における毒性の多くの形態を明らかにできることに関して相当の証拠がある。
【０１４２】
慢性毒性試験の期間は1年以上であり、これを用いて、長期投与が毒性、催奇形性、または発癌を誘発するかどうか試験する。ラットで研究が実行される時は、最少で３つの試験群に加え１つの対照群が用いられる。実験の開始時および定期的に動物が試験され、モニターされる。
【０１４３】
遺伝子組換え動物モデル
当該の遺伝子を過剰発現あるいは過小発現する遺伝子組換え齧歯類は近親交配され、ヒト疾患のモデル化、または治療薬や毒剤の試験のために用いられ得る（米国特許第5,175,383号、第5,767,337号等を参照）。場合によっては、導入された遺伝子は胎児の発育中または出生後の発育中の特定の時間に特定の組織のタイプで活性化され得る。導入遺伝子の発現は、試験的薬物治療への取り組み前中後に遺伝子組換え動物の、表現型、組織特異的mRNA発現、または血清と組織タンパク質レベルの分析によってモニターされる。
【０１４４】
胚性幹細胞
齧歯類の胚から単離した胚性幹細胞（ES）は、胚組織を形成する能力を保持する。ES細胞はキャリアの胚内に置かれる時、正常な発育を再開して、生きて生まれた動物の組織に寄与する。ES細胞は実験的ノックアウトおよびノックイン齧歯類系の生成に用いられる好適な細胞である。マウスES細胞たとえばマウス129/SvJ細胞株は早期マウス胚に由来し、当該分野で公知の培養条件で成長する。トランスジェニック系の産生に用いるベクターは疾患遺伝子候補と標識遺伝子を有し、後者は導入した疾患遺伝子の存在を同定するよう働く。ベクターは当分野で公知の方法でES細胞に形質転換する。そして形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス系等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。これらの胚盤胞を偽妊娠メスに外科的移植し、得られるキメラ子孫の遺伝子型を決定し、これらを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。
【０１４５】
ヒト胚盤胞由来のES細胞は、in vitro で少なくとも８つの別々の細胞系統に分化するよう操作することが可能である。これらの系統はin vitroで様々な細胞のタイプと組織の分化を研究するのに用いられ、例えば神経細胞、造血系統及び心筋細胞に分化する内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む。
【０１４６】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、遺伝子の或る領域を酵素的に修飾し、非哺乳類遺伝子たとえばネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi （1989）Science 244:1288-1292）などを含める。修飾された遺伝子は、培養したES細胞に形質転換され、相同組換えにより内因性ゲノムに組み込まれる。挿入された配列は、内因性遺伝子の転写と翻訳を撹乱する。形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、その胞胚を偽妊娠メスに移植する。遺伝子組換え子孫は、哺乳動物遺伝子の機能的コピーを欠くホモ接合性近交系を得るために交雑される。一例では、哺乳動物遺伝子はヒト遺伝子である。
【０１４７】
ノックイン分析
ES細胞を用いて、ヒト疾患の「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物モデル（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子の或る領域を動物ES細胞に注入し、注入したヒト配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系を試験し、医薬品を用いて処理し、類似のヒト病態の治療に関する情報を得る。これらの方法は、幾つかのヒト疾患をモデル化するために用いられてきた。
【０１４８】
ヒト以外の霊長類モデル
動物実験の分野では、生理学、遺伝学、化学、薬理学、統計学等の基礎科学のデータと方法論を扱う。これらのデータは、ヒトの健康に関連している可能性がある、ヒト以外の霊長類での治療薬の影響評価に最も重要である。ワクチンと薬物の評価においてサルがヒトの代用に用いられる。またサルの反応は類似条件下の人体暴露と関連する。このような調査では、カニクイザルとアカゲザル（それぞれMacaca fascicularisとMacaca mulatta）、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）が最も一般的に用いられるヒト以外の霊長類（NHP）である。NHPの群体の発達と維持には多額の費用がかかるため、齧歯類のモデルで初期の調査と毒性研究が通常は実施される。薬物嗜癖などの行動測定を利用する研究では、NHPが第一選択の実験動物である。またNHPと個々のヒトは多くの薬物と毒素に差次的感受性を示し、或る範囲の表現型、これら物質の「高代謝群」から「低代謝群」に分類できる。
【０１４９】
別の実施態様では、該タンパク質をコードするcDNA群を、今後開発される分子生物学技術であり、現在知られているcDNA群の性質（限定はされないが、例えばトリプレット暗号、特異的な塩基対相互作用等）に依存する任意の新技術に用い得る。
【実施例】
【０１５０】
１  cDNAライブラリの作製
COLNTUTO3ライブラリは62才の白人男性のS状結腸切除および永久的人工肛門形成時にS状結腸から得た結腸腫瘍組織から単離したRNAを用いて作製した。病理はグレード2の腺癌を示し、これは筋層に浸潤していた。
【０１５１】
POLYTRONホモジナイザー（Brinkmann Instruments, Westbury NJ）を使用して、凍結組織をホモジナイズしグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した。可溶化液を、L8-70M超遠心機（Beckman Coulter, Fullerton CA）でSW28ローターを使用して5.7Mの塩化セシウムクッション上で18時間、25,000 rpm、周囲温度で遠心分離した。RNA抽出には酸性フェノール（pH 4.7）を用い、沈殿には0.3 M酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノールを用い、再懸濁をRNAseフリー水で行い、DNAse処理を37℃で行った。酸性フェノール（pH 4.7）抽出と酢酸ナトリウムおよびエタノールでの沈殿を繰り返した。mRNAをOLIGOTEXキット（Qiagen, Chatsworth CA）で単離して、cDNAライブラリの作製のために用いた。
【０１５２】
mRNAの処理はSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）の推奨プロトコルに従い、これはmRNAのポリ（A）尾部で第1鎖cDNA合成を始めるよう設計されたNotIプライマー−アダプタを有する。二本鎖cDNAを平滑末端化し、EcoRIアダプタに連結し、NotI （New England Biolabs, Beverly MA）で消化した。cDNAをSEPHAROSE CL4Bカラム（APB）上で分画して、そのうち400bpを超えるcDNAはpINCY プラスミド（Incyte Genomics）に連結させた。プラスミドpINCYを次に、DH5αコンピテント細胞群（Life Technologies）に形質転換した。
【０１５３】
２  cDNAの単離、調製、およびシークエンシング
プラスミドの、宿主細胞からの回収は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、あるいは細胞溶解によって行った。プラスミドを精製する方法は、MagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、Qiagen社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus Plasmid、QIAWELL 8 Ultra Plasmid 精製システム、REAL PREP 96プラスミド精製キットの中から少なくとも１つを用いた。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで４℃で保管した。
【０１５４】
別法では高処理フォーマットで直接結合PCRを用い、宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao （1994） Anal Biochem 216:1-14）。宿主細胞の溶解および熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルをプロセスして384穴プレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）およびFLUOROSKAN II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０１５５】
シークエンス反応は、標準的方法あるいは高処理装置、例えばCATALYST 800 （ABI）サーマルサイクラーまたはDNA ENGINEサーマルサイクラー（MJ Research）を、HYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、APB社が提供する試薬、またはシークエンシングキット、例えばPRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit （ABI）の試薬を用いて準備した。cDNAシークエンス反応の電気泳動分離と、標識したポリヌクレオチドの検出とには、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（APB）か、PRISM 373または377シークエンシングシステム（ABI）を、標準プロトコルとベースコーリングソフトウェアと共に用いた。cDNA配列内のリーディングフレームの同定には、標準の方法を用いた（Ausubel前出、ユニット7.7）。
【０１５６】
３  cDNAの伸長
cDNAクローンとオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて、cDNAを伸長した。一方のプライマーは既知断片の5’伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知断片の3’伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計にはプライマー分析ソフトウェアを用い、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含量が約50％以上、温度約68℃〜約72℃で標的配列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じないようにヌクレオチドを伸長した。
【０１５７】
選択したcDNAライブラリ群を鋳型として用い、配列を伸長した。２回以上の伸長を行った場合には、付加的プライマーあるいはプライマーのネステッドセットを設計した。好適なライブラリ群のサイズを選択してより大きなcDNA群を含むようにし、遺伝子群の5’または上流領域を持つ配列を多く有するようにランダムプライムした。ゲノムライブラリ群は、５’プロモータ結合領域に伸長する調節エレメントを得るために用い得る。
【０１５８】
高忠実度の増幅を、米国特許第5,932,451号で開示されたような方法を利用したPCR法によって得た。PCR法はDNA ENGINEサーマルサイクラー（MJ Research）を用いて96穴プレート内で実施した。反応混合液は、鋳型DNAを有し、また、200 nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と（NH4）2SO4とβメルカプトエタノールとを含有する反応バッファーと、Taq DNAポリメラーゼ（APB）と、ELONGASE酵素（Invitrogen）と、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）とを含有する。プライマー対であるPCI AとPCI B （Incyte Genomics）とに対し、以下のパラメータで増幅した。各サイクルのパラメータは、1: 94℃で3分; 2: 94℃で15秒; 3: 60℃で1分;  4: 68℃で2分;  5:  2, 3, および4を反復20回;  6: 68℃で5分; および7: 4℃で保存である。別法では、プライマーの組、T7とSK+（Stratagene）に対して以下のパラメータで増幅を行った。1: 94℃で3分;  2: 94℃で15秒;  3: 57℃で1分;  4: 68℃で2分;  5: 2, 3, および4を反復20回;  6: 68℃で5分; および7: 4℃で保存。
【０１５９】
各ウェルのDNA濃度は、100μlのPICOGREEN定量試薬（0.25％試薬を１×TE中（v/v）; Molecular Probes）および0.5μlの希釈していないPCR産物を不透明な蛍光光度計プレート（Corning Life Sciences, Acton MA）の各ウェルに分配し、DNAが試薬と結合できるようにして判定した。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II（Labsystems Oy, Helsinki Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコット5〜10μlを1％アガロースミニゲル上の電気泳動によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０１６０】
伸長したクローンは、脱塩及び濃縮して384穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（APB）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチド配列を低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAGARACE酵素（Promega）で消化した。伸長したクローンをT4DNAリガーゼ（New England Biolabs）を用いてpUC18ベクター（APB）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位オーバーハングを満たし、大腸菌コンピテント細胞に形質移入した。形質転換した細胞群の選択を抗生物質含有培地で行い、それぞれのコロニーを採取しLB/2×カルベニシリン液体培地の384穴プレートに37℃で一晩培養した。
【０１６１】
細胞を溶解し、プライマー、Taq DNAポリメラーゼ（APB）及びPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を用いて以下の手順でDNAを増幅した。1: 94℃で3分;  2: 94℃で15秒;  3: 60℃で1分;  4: 72℃で2分;  5: 2, 3, および4を反復29回;  6: 72℃で5分; および7: 4℃で保存。上記したようにPICOGREEN定量試薬（Molecular Probes）でDNAを定量化した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（DMSO; 1:2, v/v）で希釈し、DYENAMICエネルギー移動シークエンシングプライマー、およびDYENAMIC DIRECTサイクル シークエンシングキット（APB）またはPRISM BIGDYEターミネーターサイクル シークエンシングキット（ABI）を用いてシークエンシングした。
【０１６２】
４  cDNAクローンとその推定タンパク質の相同性検索
配列表のcDNA、またはその推定アミノ酸配列を用いて、GenBank、SwissProt、BLOCKSなどのデータベースに問合せした。過去に同定されまたアノテーションが付けられた配列あるいはドメインを含むこれらのデータベースをBLASTかBLAST2を用いて検索してアラインメントを生成し、またどの配列が厳密に一致するか、または相同体かを決定した。アラインメントは原核生物（細菌）または真核生物（動物、真菌あるいは植物）起源の配列へ行った。別法として、SmithとSmith （1992, Protein Engineering 5:35-51）で説明されているようなアルゴリズムを用いて、一次配列パターンと二次構造ギャップペナルティを扱うことが可能であった。本願に開示するすべての配列は少なくとも49ヌクレオチドの長さを有し、不要な塩基は12％に過ぎない（A、C、GまたはTでなくNが記録されている）。
【０１６３】
KarlinとAltschul （1993; Proc Natl Acad Sci 90:5873-5877）で詳述されているように、問合せ配列とデータベース配列の間のBLAST一致を統計的に評価して、ヌクレオチドで10-25、ペプチドで10-14 の閾値を満たす時のみ報告させた。相同性の評価はまた、以下のように計算した積スコアで行った。BLASTでの％ヌクレオチドまたはアミノ酸同一性[問合せ配列と参照配列の間]に％最大可能BLASTスコア[問合せ配列と参照配列の長さに基づく]を乗じ、次に100で除す。ラボで用いるハイブリッド形成手順に比し、厳密な一致のストリンジェンシーは、下限である約40（不要な塩基による1-2%の誤差あり）から、100％一致の約70までに設定した。
【０１６４】
BLASTソフトウェア一式（NCBI, Bethesda MD）には様々な配列分析プログラムが含まれ、これにはヌクレオチド配列をアラインメントするのに用いる「blastn」と、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の直接ペアワイズ比較に用いるBLAST2がある。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば以下のとおりである。Matrix: BLOSUM62; Reward for match: 1; Penalty for mismatch: -2; Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties; Gap x drop-off: 50; Expect: 10; Word Size: 11; およびFilter: on。同一性は配列全体の長さについて測定する。Brenner （前出）はBLASTが配列同一性によって構造相同体を同定する能力を分析し、30%の同一性が150残基以上の配列アラインメントでの信頼できる閾値であり、40%が70残基以上のアラインメントの閾値であると発見した。
【０１６５】
本願のcDNA群を、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics）で見られるアセンブリされたコンセンサス配列あるいは鋳型と比較した。cDNA、伸長、全長およびショットガン・シークエンシングプロジェクトのコンポーネント配列をPHRED分析にかけ、質スコアを割り当てた。質スコアが許容できるすべての配列を多様な予備処理経路と編集経路にかけ、低品質の3’末端、ベクターとリンカー配列、ポリAテイル、Alu反復、ミトコンドリア及びリボゾーム配列、細菌汚染配列を除去した。編集した配列は少なくとも長さが50 bpとし、情報に乏しい配列と、ジヌクレオチド反復、Alu反復などの反復エレメントを「N」に置換あるいはマスクした。
【０１６６】
編集した配列はアセンブリ処理にかけられ、配列が遺伝子ビン（gene bins）に割り当てられた。各配列は１つのビンにのみ所属でき、各ビンの配列群をアセンブリして鋳型を作製した。BLASTとCROSSMATCHを用いて、新たにシークエンスしたコンポーネント群を既存のビンに加えた。ビンに加えるには、前記のコンポーネント配列は150以上のBLAST質スコアと少なくとも82％の局所同一性のアラインメントを有することとした。PHRAPを用いて、各ビンの配列をアセンブリした。DEEP PHRAPを用いて、オーバーラップコンポーネント配列を幾つか有するビンをアセンブリした。コンポーネント配列の数と配向に基づいて、各鋳型の配向を決定した。
【０１６７】
ビンを互いに比較して、少なくとも82%の局所類似性を有するビンを結合し再アセンブリした。95%未満の局所同一性である鋳型を有するビンは分割した。STITCHER/EXON MAPPERアルゴリズムによって鋳型を分析にかけ、スプライス変異体、選択的スプライシングされたエキソン、スプライス接合部や、組織の各タイプや病態全体での選択的スプライシングされた遺伝子の差次的発現などの、存在の確率を決定した。アセンブリ処理を周期的に繰り返した。そしてBLASTを用いてGBpriなどのGenBankデータベースに対して鋳型にアノテーションを付けた。厳密な一致の定義は95%の局所同一性が200塩基対に及ぶものから100%の局所同一性が100塩基対に及ぶものとし、相同性一致はE値（すなわち確率スコア）が≦1 x 10-8とした。鋳型はまた、フレームシフトFASTxをGENPEPTに対してかけ、相同性一致の定義はE値が≦1 x 10-8とした。鋳型の分析とアセンブリについては、1999年3月25日に出願の米国特許出願第09/276,534号に記載がある。
【０１６８】
アセンブリ後、鋳型をBLAST, motif, 及び他の機能解析にかけ、タンパク質の各ヒエラルキーに分類したが、其の方法は、共に1997年3月6日に出願の米国特許出願第08/812,290号および08/811,758号; 1997年10月9日に出願の米国特許出願第08/947,845号; および1998年3月4日に出願の米国特許出願第09/034,807号に記載の方法を用いた。次に鋳型の分析のため、各鋳型の翻訳を全部で3の順行リーディングフレームで行い、各翻訳の検索を隠れマルコフモデル系蛋白ファミリー群およびドメイン群のPFAMデータベースに対しHMMERソフトウェアパッケージ（Washington University School of Medicine, St. Louis MO）を用いて行った。MACDNASIS PROソフトウェア（Hitachi Software Engineering）とLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いてcDNAを更に分析した。そして公共のデータベース、例えばGenBankのげっ歯類、哺乳類、脊椎動物、原核生物、真核生物のデータベースと、SwissProt、BLOCKS、PRINTS、PFAMそしてPrositeに問い合わせた。
【０１６９】
５  ノーザン分析、転写イメージング、および「Guilt-By-Association」法
ノーザン分析
ノーザン分析は遺伝子の転写物の存在の検出に用いる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与する。本技術は下記の実施例７とAusubel（前出、ユニット4.1-4.9）に記載されている。
【０１７０】
類似の、BLASTを応用したコンピュータ技術を用いて、GenBankまたはLIFESEQデータベース（Incyte Genomics）などのヌクレオチドデータベースにおいて、同一または関連分子を検索する。ノーザン分析は、幾つかの膜系ハイブリダイゼーションよりも高速である。更に、任意の特定の一致を厳密なあるいは相同的なものとして分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を修正できる。検索の基本は積スコアであり、上記の実施例４に記載した。
【０１７１】
ノーザン分析の結果の報告は、TMDCをコードする転写物がそこで生じるライブラリ群のリストとして成される。存在量とパーセント存在度も報告される。存在量は直接に、特定転写物が或るcDNAライブラリ内で示された回数を反映し、パーセント存在度は、存在量を、該cDNAライブラリで試験した配列の総数で除した数である。
【０１７２】
転写イメージング
転写イメージ（transcript image）作成にはLIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics）を用いた。本プロセスにより全cDNAライブラリで発現されるポリヌクレオチド群の相対的存在度のアセスメントができ、これは米国特許第5,840,484号に記載され、参照により開示に含まれる。LIFESEQデータベースの全ての配列とcDNAライブラリは、系、臓器/組織および細胞タイプで分類される。カテゴリは、心血管系、結合組織、消化器系、胎児構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性、および尿路がある。転写イメージングの判定基準は、カテゴリ、ライブラリ当りのcDNA数、ライブラリの説明、疾患適応、サンプルの臨床的意義等から選ぶ。
【０１７３】
各カテゴリにつき、そこで該配列が発現されたライブラリの数がカウントされ、そのカテゴリのライブラリの総数に対して示された。各ライブラリにつき、cDNA数がカウントされ、該ライブラリ内の総cDNA数に対して示された。転写イメージによっては、全ての濃縮した、ノーマライズした、またはサブトラクトしたライブラリ（高いコピー数の配列を持つ）を除去した後にプロセシングでき、また全ての混合組織またはプールした組織（複数の組織タイプまたは複数被検者の組織を持つという意味で非特異的と見なされる）を分析から除外できる。処理済および無処理の細胞株および/または胎児組織のデータも、臨床的意義が強調される際に除外できる。逆に胎児組織を強調でき、これは遺伝性障害の解明または、特定の成体幹細胞または胚性幹細胞を組織または器官（例えば心臓、腎臓、神経または膵臓）へ分化させる際に行い、これを補助するため臨床サンプルを分析から除外することとなる。転写イメージはまた、他の方法たとえばハイブリッド形成、「guilt-by-association」法、およびアレイ技術からのデータの補助に用い得る。
【０１７４】
「Guilt-By-Association」法
GBA法は、或る特定の疾患プロセス、細胞内区画、細胞タイプ、組織タイプ、または種に関連する複数のcDNAライブラリで発現されるcDNA群を同定する。未知の機能を持つcDNAの発現パターンが、充分に考証された機能を持つ遺伝子群の発現パターンと比較され、指定した共発現確率閾値に合うか判定される。この比較を通じて、高度に有意な共発現確率を既知の遺伝子群に対して持つcDNAのサブセットを同定する。
【０１７５】
該cDNAの起源はヒトcDNAライブラリ群であり、これは任意の細胞または細胞株、組織、または器官に由来し、種々の配列タイプから選択でき配列としては、限定はされないが、発現配列タグ（ESTs）、アセンブリしたポリヌクレオチド、全長遺伝子コード領域、プロモータ、イントロン、エンハンサ、5’非翻訳領域、および3’非翻訳領域がある。統計的に有意な分析結果を得るために、少なくとも5つのcDNAライブラリで該cDNAを発現する必要がある。配列を分析するcDNAライブラリの数の範囲は、少ないもので500から10,000以上でありうる。
【０１７６】
統計的に有意な共発現パターンを示すcDNAを同定する方法は以下のとおりである。最初に、或るcDNAライブラリ内の或る遺伝子の存在あるいは不存在を定義する。或る遺伝子に対応する少なくとも１つの、その配列の断片が、或るライブラリから採取した或るサンプルに検出される時、該遺伝子はそのライブラリに存在する。そして対応する断片がサンプル中で検出されない時、該遺伝子はそのライブラリに存在しない。
【０１７７】
２番目に、確率法を用いて共発現の有意性を評価して、共発現の偶然による確率を測定する。確率法はフィッシャーの正確確率検定、カイ2乗検定またはカッパ検定であり得る。これらの検定と適用例は当該分野で公知であり、標準的な統計学のテキストで見出すことができる （Agresti （1990） Categorical Data Analysis, John Wiley & Sons, New York NY; Rice （1988） Mathematical Statistics and Data Analysis, Duxbury Press, Pacific Grove CA）。ボンフェローニ補正（前出のRice、384ページ）も、１つの遺伝子の統計結果を多数の他の遺伝子に対して補正するために、確率法の１つと併用して適用できる。或る好適な実施態様では、偶然による確率をフィッシャーの正確確率検定により測定する。また偶然による確率の閾値を好ましくは0.001未満に設定する。
【０１７８】
2つの遺伝子の共発現の確率を推計するこの方法の前提は、ライブラリ群が独立しており同様にサンプルされることである。しかし実際の状況では、選択したcDNAライブラリは完全には独立していない。理由は以下である。1）複数ライブラリを単一の対象または組織から得ることができる。そして2）様々な数のcDNAを、通常の範囲は5000〜10000で、各ライブラリからシークエンスできるからである。更に、フィッシャーの正確共発現確率を、各遺伝子に対し、少なくとも5つのライブラリで出現する他のすべての遺伝子ごとに計算するので、複数の統計試験のためのボンフェローニ検定を用いた（Walker 他（1999; Genome Res 9:1198-203; 特に参照により開示に含まれる）。
【０１７９】
６  染色体マッピング
スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、配列表に存在する任意のcDNAが過去にマッピングされたかを判定した。TMDCをコードするcDNAの何れかの断片がマップされていれば、全ての関連する調節配列とコード配列を同じ場所に割り当てる。遺伝地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。cM単位（ヒトDNAの１メガベースにほぼ等しい）での或る間隔の地図上の位置を、染色体短腕（p-arm）の末端に対して測定する。
【０１８０】
７  ハイブリッド形成および増幅の技術ならびに分析
組織サンプルの調製
正常および癌組織のサンプルは、下表のドナー識別番号で記載する。列１はドナーID、列２はドナーの年齢/性別、列３は障害の説明、列４は腫瘍の分類、列５は出所を示す。
2005505267.tif 000003
*略語:CA=癌、U=不明、NA=入手不可
【０１８１】
図3で、ノーマライズした第1鎖合成、cDNA標本は正常なヒトの心臓、全脳、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、卵巣、小腸、末梢血白血球、および大腸の組織からの標本であり、Clontechから得た。更なるcDNA標本はヒト成人の正常な甲状腺、下垂体、および副腎組織の標本であり、Clinomics Bioscience （Pittsfield MA）から得た。
【０１８２】
図5に示す大腸直腸腺癌細胞株群はATCCから得た株であり、供給者の規格に従って培養した。細胞株は、LS123、LS174T、HCT116、CaCo2、HT29、SW480、Colo205、T84、およびSW620である。
【０１８３】
基板上でのcDNAの固定
下記の方法の１つによってcDNAを基板に付ける。ゲル電気泳動法によりcDNAの混合物を分画し、キャピラリー転写（capillary transfer）によりナイロン膜に転写する。別法として、cDNAを個々にベクターに連結し、細菌宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次に下記の方法の１つによってcDNAを基板に配置する。第一法では、個々のクローンを有する細菌細胞をロボットで採取し、ナイロン膜に配置する。膜を選択剤（用いるベクターに依存してカルベニシリン、カナマイシン、アンピシリンまたはクロラムフェニコール）を含むLB寒天に置き、37℃で16時間インキュベートする。寒天から膜を取り除き、コロニー側を上にして、10% SDS、変性溶液（1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH ）、中和溶液（1.5 M NaCl, 1 M Tris, pH 8.0）、2xSSC（2回）に各10分、継続的に膜を移す。次に膜をSTRATALINKER UVクロスリンク機（Stratagene）でUV照射する。
【０１８４】
第2法では、インサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマー群を用いて、cDNAを３０サイクルのPCRで細菌ベクターから増幅する。PCR増幅は1〜2 ngの開始濃度の核酸を5μgより大きい最終量まで増加する。長さ約400 bpから約5000 bpまで増幅した核酸を、SEPHACRYL-400ビーズ（APB）を用いて精製する。手であるいはドット/スロットブロット法マニホールドと吸引装置を用いて精製核酸をナイロン膜に置く。そして上述した変性、中和、およびUV照射により固定する。米国特許第5,807,522号に記載の方法を用いて、精製核酸をロボットで配置し、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning Life Sciences）を洗浄するため0.1％のSDSおよびアセトン中で超音波をかけ、4％フッ化水素酸（VWR Scientific Products, West Chester PA）中でエッチングし、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma Aldrich）を用いてコーティングし、そして110℃のオーブンで硬化させることにより、ポリマーコートされたスライドを準備する。スライドは処理の間および処理後に充分に蒸留水で洗浄する。核酸をスライド上に置き、次にSTRATALINKER UVクロスリンク機（Stratagene）を用いてアレイをUV照射に暴露することにより固定する。アレイを次に室温において０.２％SDSで洗浄し、蒸留水中で３回すすぐ。非特異結合部位をブロックするためリン酸緩衝食塩水（PBS; Tropix, Bedford MA）中に0.2％カゼイン、60℃で30分間アレイをインキュベートした後、前記のように0.2％SDS中で洗浄し蒸留水中ですすぐ。
【０１８５】
膜ハイブリダイゼーションのプローブ調製
配列表のcDNA群に由来するハイブリダイゼーションプローブを使用して、膜系ハイブリダイゼーションでcDNA、mRNAまたはゲノムDNAをスクリーニングする。プローブを調製するため、cDNAを45 μl TEバッファー中40〜50 ngの濃度に希釈し、5分間100℃に加熱して変性させ、短時間遠心分離する。次に変性したcDNAをREDIPRIMEチューブ（APB）に加え、青色が均一に分布するまで穏やかに混合して、次に短時間遠心分離する。5μlの[32P]dCTPを管に加え、内容物を37℃で10分インキュベートする。5 μl の0.2M EDTAを加えて標識化反応を停止する。そしてPROBEQUANT G-50マイクロカラム（APB）を用いてプローブを、組み込まれていないヌクレオチドから精製する。精製したプローブを5分間100℃に加熱し、2分間氷上で急冷して、以下に記載した膜系ハイブリダイゼーションで使用する。
【０１８６】
QPCR用のプローブ調製
QPCR用プローブをABI社のプロトコルに従い調製した。
【０１８７】
ポリマーコートされたスライドでのハイブリダイゼーションのプローブ調製
次の方法を使用して、図3に示すマイクロアレイ分析のプローブの調製を行った。サンプル群から単離したmRNAに由来するハイブリダイゼーションプローブを使用して、アレイベースのハイブリダイゼーションで配列表のcDNAをスクリーニングする。GEMbrightキット（Incyte Genomics）を用い、9 μl TE バッファーで200 ngの濃度にmRNAを希釈し、5 μl 5x バッファー、1 μl 0.1 MのDTT、3 μl Cy3またはCy5の標識ミックス、1 μl RNアーゼ阻害剤、1 μl逆転写酵素、5 μl 1x 酵母対照mRNAを加えてプローブを調製する。非コード酵母ゲノムDNAからin vitro 転写により酵母対照mRNA群を合成する（W. Lei, 未発表）。定量用対照として、0.002 ng、0.02 ng、0.2 ngおよび2 ngでの対照mRNAの1セットを、対サンプルmRNA比がそれぞれ1:100,000、1:10,000、1:1000、1:100 （w/w）で逆転写反応混液に希釈する。mRNA差次的発現パターンを調べるため、対照mRNAの第2セットを1:3, 3:1, 1:10, 10:1, 1:25および25:1 （w/w）の比で逆転写反応混液に希釈する。反応混液を混合し、37℃で2時間インキュベートする。次に反応混液を20分間、85℃でインキュベートする。そして2つの連続するCHROMA SPIN+TE 30カラム（Clontech, Palo Alto CA）を用いてプローブを精製する。精製したプローブのエタノール沈殿を、プローブをDEPC処理水中で90 μlに希釈し、2 μl 1mg/mlグリコーゲン、60 μl 5 M酢酸ナトリウム、300 μl 100% エタノールを加えて行う。プローブを20分間、20,800xgで遠心分離する。そしてペレットを12 μlの再懸濁バッファーで再懸濁し、5分間65℃に加熱してから、充分に混合する。プローブを加熱し、前記のように混合して、氷上に保管する。以下に述べるように、プローブを高密度アレイベースのハイブリダイゼーションにおいて使用する。
【０１８８】
in situハイブリダイゼーション
in situハイブリッド形成を用いて、切片組織での膜貫通タンパク質の発現を判定した。ジゴキシゲニンプロトコルで、新鮮な凍結切片（10ミクロン厚）をフリーザーから移し、直ちに浸漬を4％パラホルムアルデヒドで10分行い、PBSですすぎ、アセチル化を0.1 M TEA, pH 8.0に0.25% （v/v）無水酢酸で行う。組織を5×SSCに平衡させた後、プレハイブリダイゼーションをハイブリッド形成バッファー（50％ホルムアミド、5×SSC、1×デンハート液、10％デキストラン硫酸、および1 mg/mlニシン精子DNA）で行う。
【０１８９】
ジゴキシゲニン標識したTMDC特異的RNAプローブである、SEQ ID NO:2のcDNAから選択したセンスおよびアンチセンスのヌクレオチドの産生は以下のようにした。1） pINCYプラスミドであってSEQ ID NO:2のほぼヌクレオチド1068からほぼヌクレオチド2324に及ぶSEQ ID NO:2の或る断片（1519 bp）を有するプラスミドの直線化をEcoRi （アンチセンス）またはNot1 （センスプローブ）で行い、2） in vitro 転写にはT7 （アンチセンス）またはSP6 （センス） RNAポリメラーゼを用い、3） 加水分解して平均の長さを350 bpにした。約500 ng/mlのRNAプローブを用いて一晩のハイブリッド形成を、65℃、ハイブリッド形成バッファーで行った。ハイブリッド形成後、切片のすすぎを30分間2×SSC、室温で、1時間2×SSC、65℃で、また1時間0.1×SSC、65℃で行った。切片をPBSで平衡化し、ブロッキングを30分10% DIGキットブロッカー（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis IN）を含むPBSで行った後、インキュベートを一晩4℃、1:500抗-DIG-AP中で行った。翌日、切片をPBSですすぎ、平衡化を検出バッファー（0.1 M Tris, 0.1 M NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9.5）で行った後、インキュベートを検出バッファーに0.175 mg/ml NBTおよび0.35 mg/ml BCIPで行った。反応は、TE, pH 8で終了した。組織切片の対比染色に1μg/ml DAPIを用い、VECTASHIELD （Vector Laboratory, Burlingame CA）にマウントした。
【０１９０】
膜系ハイブリダイゼーション
1% Sarkosylと1x高リン酸バッファー（0.5 M NaCl, 0.1 M Na2HPO4, 5 mM EDTA, pH 7）を含むハイブリダイゼーション溶液で、55℃で2時間、膜をプレハイブリダイズする。15 mlの新鮮なハイブリダイゼーション溶液中で希釈されたプローブを次に膜に加える。膜をプローブと55℃で16時間ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、1mM Tris （pH 8.0）, 1% Sarkosylで15分間25℃で膜を洗浄し、さらに1mM Tris （pH 8.0）で、各回15分間、25℃で4回洗浄する。ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、XOMAT-ARフィルム （Eastman Kodak, Rochester NY）を膜に一晩70℃で暴露し、現像し、視覚で検討する。
【０１９１】
ポリマー被覆スライドベースのハイブリダイゼーション
次の方法を、表3に示すマイクロアレイ分析で用いた。プローブを5分間65℃に加熱してから、5415C微量遠心機（Eppendorf Scientific, Westbury NY）で5分間、9400 rpmで遠心分離する。そして18μlをアレイ表面に等分し、カバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チャンバーに移す。チャンバー内を湿度100％に保つため、140μlの5×SSCをチャンバーの１コーナーに加える。このアレイを含むチャンバーを、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイを1xSSC, 0.1% SDS中45℃で10分間洗浄し、次に0.1xSSC中45℃で10分間の洗浄を３回繰り返した後に、乾燥させる。
【０１９２】
ハイブリダイゼーション反応を絶対的または差次的ハイブリダイゼーションフォーマットで実施する。絶対ハイブリダイゼーションフォーマットでは、1つのサンプルのプローブをアレイエレメントにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション複合体形成後にシグナルを検出する。シグナル強度は、サンプル中のプローブmRNAレベルと相関する。差次的ハイブリダイゼーションフォーマットでは、2つの生物サンプルでの遺伝子のセットの差次的発現を分析する。2つのサンプルのプローブを調製して、異なる標識成分で標識化する。2つの標識されたプローブの混合物をアレイエレメントにハイブリダイズし、2つの異なる標識からの発光を個々に検出可能な条件下で２つの異なるシグナルを調べる。両方の生物サンプルから由来した同数のプローブにハイブリダイズされるアレイ上エレメントは、特有の複合蛍光を出す（Shalon WO95/35505）。
【０１９３】
ハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには４８８nm、Cy5の励起のためには６３２nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザー（Coherent, Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。励起レーザー光の焦点をアレイ上に置くため、20×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Melville NY）を用いる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のX-Yステージに置き、20μmの解像度の対物レンズを通してラスタースキャンする。差次的ハイブリダイゼーションフォーマットでは、レーザーにより２つのフルオロフォアを順に励起する。発光された光は波長に基づき分割され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。アレイと光電子増倍管の間に位置するフィルタ群を用いて、シグナルを分離する。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では５６５nm、Cy5では６５０nmである。プローブ混合液に加えた酵母対照mRNAによって生み出されるシグナル強度を用いてスキャンの感度を較正する。アレイ上の或る特定の位置には或る相補DNA配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズ種の重量比1：100,000と相関するようにする。
【０１９４】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールした１２ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化したデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラースケールへのリニア20色変換を用いて、シグナル強度がマッピングされたイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起及び測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）について補正する。グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルが次に統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLSプログラム（Incyte Genomics）である。
【０１９５】
QPCR分析
QPCRでは、cDNAの合成は、1μgの総RNAを含む25μl反応液から行い、これには100単位のM-MLV逆転写酵素（Ambion, Austin TX）、0.5 mM dNTPs （Epicentre, Madison WI）、および40 ng/mlのランダムへキサマー（Fisher Scientific, Chicago IL）を有した。反応液は25℃で10分間、42℃で50分間、次に70℃で15分間インキュベートし、500μlに希釈し、30℃で保管した。または、正常な組織をClontech （Palo Alto CA）およびClinomicsから購入した。PCRプライマーおよびプローブ（5’ 6-FAM標識、3’ TAMRA）の設計にPRIMER EXPRESS 1.5ソフトウェア（ABI）を用い、Biosearch Technologies （Novato CA）またはABIで合成した。
【０１９６】
QPCR反応にはPRISM 7700検出システム（ABI）を用い、これは25μlの総量に5μl cDNA鋳型、1x TAQMAN UNIVERSAL PCRマスターミックス（ABI）、100 nMの各PCRプライマー、200 nMのプローブ、また1x VIC標識β-2ミクログロブリン内在性コントロール（ABI）を有した。反応のインキュベートは50℃で2分、95℃で10分の後、40サイクルのインキュベートを95℃で15秒、また60℃で1分、行った。発光の測定をサイクルごとに行い、結果の分析にはSEQUENCE DETECTOR 1.7ソフトウェア（ABI）を用い、標準と比較したmRNAの倍単位の差、すなわち相対濃度の計算に、比較CT 法（ABI User Bulletin #2）を用いた。QPCRを用いて、図3、4、および5のデータを得た。
【０１９７】
８  相補的分子
cDNAに相補的なアンチセンス分子であって約5 bpから約5000 bpの長さの分子を用いて、遺伝子発現を検出あるいは阻害する。検出については、実施例７に記載されている。プロモータ結合を妨げることにより転写を阻害するためには、相補的分子を、最も固有な5’ 配列に結合し、オープンリーディングフレームの開始コドンの5’ UTR上流のヌクレオチド群を含むよう設計する。相補的分子としてはゲノム配列（エンハンサーまたはイントロン等）を含み、これは、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために充分に開く二重らせんの能力に影響を及ぼす三重らせん塩基対形成に用いられる。翻訳を阻害するためには、相補的分子の設計は、リボソームが該タンパク質をコードするmRNAに結合するのを防ぐようにする。
【０１９８】
相補的分子を発現ベクターに置いて、効力を試験するため、一過性或いは短期治療向けに器官、腫瘍、滑膜腔また脈管系に、もしくは長期或いは安定した遺伝子治療向けに幹細胞、接合子または他の生殖系統に、細胞株を形質転換するために用いる。非複製ベクターで一過性発現は１ヶ月以上続く、また形質転換/発現系でベクター複製を誘導するエレメントが用いられる場合は３ヶ月以上続く。
相補的分子をコードするベクターを有する分裂する細胞の安定的な形質転換によって、遺伝子導入細胞株、組織または生命体を産生する（米国特許第4,736,866号）。安定した組込みを可能にする充分な量のベクターを同化および複製する細胞も、タンパク質をコードするcDNAの活性を損なうまたは完全に除去するための充分な相補的分子を生成する。
【０１９９】
９  特異抗体の産生
TMDCのアミノ酸配列の分析にLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用い、免疫原性の高い領域を決定する。適切なオリゴペプチドを合成し、KLH （Sigma-Aldrich）に抱合する。
【０２００】
完全フロイントアジュバント中でオリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化し、結果の抗血清の抗ペプチド活性試験を標準ELISA法で行う。抗血清はまた、TMDCの特異的認識について試験する。TMDCで陽性に反応した抗血清の親和性精製をカラムで行い、このカラムはビーズ化アガロース樹脂を含有し、その樹脂に該合成オリゴペプチドを抱合しておく。カラムを平衡化するには12 mLのIMMUNOPURE Gentle Bindingバッファー（Pierce Chemical, Rockford IL）を用いる。３mLのウサギ抗血清を１mLの結合バッファーと混合し、カラムの上層に加える。カラムの上下にキャップし、抗血清が結合するよう穏やかな振盪を室温で30分行う。カラムを30分間、沈殿させ、自然流下で排液し、16 mL結合バッファ（バッファを4 x 4 mL添加）で洗浄する。抗体の溶出は1 ml分画でIMMUNOPURE Gentle Elutionバッファ（Pierce）を用い、吸光度を280 nmで判定する。ピーク分画をプールし、50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, および10%グリセロールで透析する。透析後、精製された抗体の濃度判定にBCAアッセイ（Pierce）を用い、アリコット化し、凍結する。
【０２０１】
１０  抗体を用いた免疫精製
天然あるいは組換えタンパク質を精製するには、タンパク質に特異結合する抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィで行う。イムノアフィニティーカラムは、CNBr-活性化SEPHAROSE樹脂（APB）に抗体を共有結合させることにより形成する。該タンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、該タンパク質が優先的に吸光できるよう洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液でカラムを洗浄する。結合後、そのタンパク質を、抗体とタンパク質との結合を切るために、pH2〜3のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンを用いてカラムから溶出させ、精製されたタンパク質を収集する。
【０２０２】
１１  ウェスタン分析
電気泳動およびブロッティング
タンパク質を有するサンプルを2 xローディングバッファに混合し、95℃まで3〜5分間、加熱し、4〜12% NUPAGE Bis-Trisプレキャストゲル（Invitrogen）にロードする。注記がない限り、等量の総タンパク質を各ウェルにロードする。ゲルの電気泳動は1 x MESまたはMOPS泳動バッファ（Invitrogen）中、200 Vで約45分、Xcell II泳動槽（Invitrogen）で、RAINBOWマーカー（APB）が分離し色素先端がゲルの底面に近づくまで行う。ゲルと支持体を泳動槽から取って1×転写バッファー（Invitrogen）（10%メタノール含む）中に数分間、浸漬し、PVDF膜を100%メタノールに数秒間、浸漬してこれを活性化する。膜、ゲル、および支持体をTRANSBLOT SD転写装置（Biorad, Hercules CA）に置き、定電流350 mAを90分、印加する。
【０２０３】
抗体とのコンジュゲーションおよび可視化
タンパク質を膜に転写後、膜のブロックは、5% （w/v）脱脂粉乳を含む1 xリン酸緩衝食塩水（PBS）に0.1% Tween 20界面活性剤（ブロッキングバッファー）中、回転振盪機で、少なくとも1時間室温、または4℃で一晩行う。ブロック後、バッファーを取り出し、ブロッキングバッファー内の一次抗体10 mlを加え、インキュベートを回転振盪機で1時間室温、または一晩4℃で行う。膜の洗浄を3回、各10分PBS-Tween （PBST）で行い、二次抗体を西洋わさびペルオキシダーゼにコンジュゲートしたものを、10 mlブロッキングバッファー中1:3000に希釈して加える。膜と溶液の振盪を30分、室温で行い、次に洗浄を3回、各10分PBSTで行う。
【０２０４】
洗浄溶液を慎重に除去し、膜をECL+化学発光検出システム（APB）で加湿して、約5分インキュベートする。膜を、タンパク質側を下に、BIOMAX Mフィルム（Eastman Kodak）に置き、約30秒、現像する。
【０２０５】
１２  抗体アレイ
タンパク質間相互作用
タンパク質の酵母２ハイブリッド系分析に替えて、抗体アレイを用いてタンパク質間の相互作用とリン酸化を試験できる。種々のタンパク質リガンドを、当該分野で公知の方法で膜に固定する。このアレイのインキュベートを細胞溶解物の存在下で、タンパク質：抗体複合体が形成されるまで行う。当該のタンパク質を同定するため、膜を、当該のタンパク質に特異的な抗体に曝す。または、当該のタンパク質をジゴキシゲニン（DIG）で標識し、膜に曝した後、膜を抗DIG抗体に曝すと、当該のタンパク質が複合体を形成する箇所が示される。当該のタンパク質と相互作用するタンパク質の同一性は、膜の上の目的タンパク質の位置で判定する。
【０２０６】
プロテオームプロファイル
抗体アレイはまた、組換え抗体の高処理スクリーニングに用いうる。抗体遺伝子群を有する細菌をロボットで採取し、格子状、高密度（最大18342の別々の二重スポットしたクローン群）でフィルタに置く。最大15の抗原を一度に用いてクローンをスクリーニングし、結合抗体断片を発現するクローンを同定する。これらの抗体アレイはまた、サンプル中で差次的発現するタンパク質の同定に用い得る（de Wildt, 前出）。
【０２０７】
１３  cDNAまたはタンパク質と特異結合する分子のスクリーニング
cDNAまたは其の断片、或いはタンパク質または其の各部分の標識化を、各々32P-dCTP, Cy3-dCTPまたはCy5-dCTP （APB）で、或いはBIODIPYまたはFITC （Molecular Probes）で行う。前もって或る基板上に配置した候補分子または化合物のライブラリ群を、標識したcDNAまたはタンパク質の存在下でインキュベートする。核酸配列かアミノ酸配列のための条件下でインキュベート後、基板を洗浄し、標識を保持する基板上の、特異結合か複合体形成を示す任意の位置をアッセイし、リガンドを同定する。異なる濃度の核酸またはタンパク質を用いて得たデ-タを使用して、標識された核酸かタンパク質と、結合した分子との親和性を計算する。
【０２０８】
１４  2ハイブリッドスクリーン
酵母２ハイブリッドシステムであるMATCHMAKER LexAツーハイブリッドシステム（Clontech Laboratories）を用いて、本発明のタンパク質に結合するペプチドをスクリーニングする。該タンパク質をコードする或るcDNAを、pLexAベクターのマルチクローニング部位に挿入し、ライゲーションして、大腸菌に形質転換する。mRNAから調製したcDNAをpB42ADベクターのマルチクローニング部位に挿入し、ライゲーションし、大腸菌に形質転換してcDNAライブラリを作製する。pLexAプラスミドとpB42AD-cDNAライブラリ作製物を大腸菌から単離し、比率2:1で、ポリエチレングリコール/リチウムアセテートプロトコルを用いて、形質転換受容性をもつ酵母EGY48[p8op-lacZ]細胞に同時形質転換する。形質転換した酵母細胞を、ヒスチジン（-His）、トリプトファン（-Trp）、ウラシル（-Ura）を含まない合成ドロップアウト（SD）培地で平板培養し、30℃でインキュベートしてコロニーを成長させカウントする。コロニーを最小容積1x TE （pH 7.5）でプールし、2%ガラクトース（Gal）, 1% ラフィノース（Raf）および80 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-d-ガラクトピラノシド（X-Gal）を補ったSD/-His/-Leu/-Trp/-Ura培地で再プレーティングする。次いで青色コロニーの成長を検査する。発現したタンパク質とcDNA融合タンパク質との相互作用はEGY48内のLEU2レポーター遺伝子の発現を活性化し、ロイシン（-Leu）を含まない培地でコロニー成長を起こす。相互作用は又、X-Galで成長したコロニーに青色を産生する、p8op-lacZレポーター構築物からのβガラクトシダーゼの発現を活性化する。
【０２０９】
発現したタンパク質とcDNA融合タンパク質との陽性の相互作用は、個々の陽性コロニーを単離し30℃で1から2日間SD/-Trp/-Ura液体培地で成育することにより検証する。培地のサンプルをSD/-Trp/-Ura培地に蒔き、コロニーが出現するまで30℃でインキュベートする。サンプルをSD/-Trp/-UraとSD/-His/-Trp/-Uraのプレートにレプリカプレーティングする。ヒスチジンを含まない培地では成育せずヒスチジンを含むSD培地で成育するコロニーは、pLexAプラスミドを失っている。ヒスチジン要求コロニーをSD/Gal/Raf/X-Gal/-Trp/-Uraで成育する。そして白色コロニーを単離し増殖する。該タンパク質と物理的に相互作用する或るタンパク質をコードする或るcDNAを有するpB42AD-cDNAプラスミドを、酵母細胞から単離し特徴付ける。
【０２１０】
１５  細胞の形質転換アッセイ
軟寒天でのコロニー形成アッセイ
形質転換した細胞の足場非依存性増殖能の測定を、細胞が軟寒天（0.35％）中にコロニーを形成する能力で行う。アッセイは12穴の培養プレートで行い、各ウェルを、固形0.7% Noble寒天（Fisher Scientific, Atlanta GA）を用い細胞増殖培地でコートする。3.5%寒天溶液含有PBSを調製し、高圧滅菌し、マイクロ波をかけ、液状を保つため55℃のウォーターバスで振盪する。寒天の希釈を1:5で0.7%まで、適切な細胞増殖培地で行い、0.5 mlの希釈寒天をプレートの各ウェルに加える。培養プレートを室温に約15分、すなわち寒天が凝固するまで保つ。
【０２１１】
トリプシン処理した細胞の希釈を200〜4000細胞/mlまで増殖培地で行い、0.25 mlの希釈細胞を2 mlの温和な0.35%寒天と混ぜる。希釈した細胞を培養プレートのウェルに加え、二つ組のウェルを各細胞濃度について準備する。プレートを冷ますため約30分、室温に置いた後、37℃のインキュベータに移す。1〜2週間のインキュベート後、コロニーのカウントを倒立位相差顕微鏡で行う。コロニー形成効率の判定を、百分率の形成コロニー/総培養細胞数として行う。
【０２１２】
アポトーシス/生存アッセイ
形質転換した細胞がアポトーシス（プログラム細胞死）を回避し延命する能力の測定は、或るアッセイで、培養細胞のアポトーシスまたは延命をFACS分析で二重染色法にAnnexin Vとヨウ化プロピジウム（PI）を用いて判定して行える。Annexin Vはアポトーシス細胞用マーカーとして働き、これはアポトーシスの細胞表面マーカーであるホスファチジルセリンへの結合による。PIとの対比染色により、Annexin V陽性でPI陰性のアポトーシス細胞と、Annexin VおよびPIに陽性の壊死細胞を区別できる。アポトーシスの測定は培養0〜24時間で行い、細胞生存の測定は培養24〜96時間で行う。
【０２１３】
或いは、分泌タンパク質たとえばHUPAPによるアポトーシス/細胞生存への直接効果の測定を、培養したヒト血管内皮細胞（HMVEC）で、HMVEC細胞をHUPAPで処理して、または、細胞を、HUPAPをコードするcDNAを有する組換えアデノウイルスに感染させて行える。HMVEC細胞のアポトーシス/生存は、上記のように測定する。
【０２１４】
組織浸潤および転移のアッセイ
癌化した腫瘍細胞による細胞遊走と組織浸潤の判定には、BICOAT Angiogenesisシステム（BD Biosciences, Franklin Lakes NJ）を、製造者の記載のように用いる。アッセイは、BD FALCONマルチウェル インサートプレートに、再構成BD MATRIGEL基底膜マトリクスで均一に被覆した8 μm孔径のBD FLUOROBLOKポリエチレンテレフタレート膜を入れ、無処理マルチウェル レシーバープレートに挿入して行う。本システムは細胞の、膜を通じた受動拡散への障壁をもたらすが、浸潤癌細胞による能動遊走を許容する。細胞を適切な培地に入れ、インキュベートをチャンバーの上部で好適な時間おこなった後、膜の下側に現れる細胞を定量する。膜は490〜700nmの光の透過を防ぐので、膜を横断する細胞の検出を、細胞数に比例する蛍光で行う。
【０２１５】
本明細書で言及した全ての特許及び刊行物は、参照により開示に含まれる。本発明の範囲および趣旨から逸脱しない限りでの、記載した本発明の方法およびシステムの、種々の修正および変更は、当業者には自明であろう。本発明について記載するにあたり特定の好適実施態様に関連して説明を行ったが、請求される本発明が、そのような特定の実施態様に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載した本発明の実施方法の様々な変更は、特許請求の範囲内にあることを意図するものである。
【０２１６】
（表の簡単な説明）
表（Table）1は、LIFESEQ Goldデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）を使用して作製したTMDCのノーザン分析を示す。列１は組織カテゴリ、列２は組織カテゴリのクローンの数、列３は少なくとも１つの転写物が見られたライブラリの数と該カテゴリのライブラリの総数、列４は転写物の絶対存在量（転写物の数）、列５は転写物の存在％を示す。
【０２１７】
表2はTMDCのノーザン分析を示すが、これは消化系組織であって転写物が過剰発現する、すなわち存在量（Abundance）が1より大きい転写物が何れか１つのcDNAライブラリ内で見られる組織での分析である。列１はライブラリID（訳注：次列はcDNA数）、列２はライブラリの説明、列３は絶対存在量（転写物/ライブラリの数）、列４は転写物の存在％を示す。
【０２１８】
表3は正常な大腸組織と比較した、大腸癌を有する患者の組織でのTMDCの差次的発現を示し、これはマイクロアレイ分析で判定した。列1は腫瘍サンプルと正常な組織の間の差次的発現（DE）を示す。結果は腫瘍/正常発現の比という形で表現する。列2（P1説明）は、緑色蛍光色素Cy3で標識した微視的正常サンプルの、組織と患者供与者（Dn）を示す。列3（P2説明）は、赤色蛍光色素Cy5で標識した病変サンプル（大腸腫瘍または大腸ポリープ）の組織と患者供与者（Dn）を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１−Ａ】図は膜貫通タンパク質腫瘍抗原（TMDC、SEQ ID NO:1）を示し、これはcDNA （SEQ ID NO:2）によってコードされる。アラインメントはMACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１−Ｂ】図は膜貫通タンパク質腫瘍抗原（TMDC、SEQ ID NO:1）を示し、これはcDNA （SEQ ID NO:2）によってコードされる。アラインメントはMACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１−Ｃ】図は膜貫通タンパク質腫瘍抗原（TMDC、SEQ ID NO:1）を示し、これはcDNA （SEQ ID NO:2）によってコードされる。アラインメントはMACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１−Ｄ】図は膜貫通タンパク質腫瘍抗原（TMDC、SEQ ID NO:1）を示し、これはcDNA （SEQ ID NO:2）によってコードされる。アラインメントはMACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１−Ｅ】図は膜貫通タンパク質腫瘍抗原（TMDC、SEQ ID NO:1）を示し、これはcDNA （SEQ ID NO:2）によってコードされる。アラインメントはMACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１−Ｆ】図は膜貫通タンパク質腫瘍抗原（TMDC、SEQ ID NO:1）を示し、これはcDNA （SEQ ID NO:2）によってコードされる。アラインメントはMACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１−Ｇ】図は膜貫通タンパク質腫瘍抗原（TMDC、SEQ ID NO:1）を示し、これはcDNA （SEQ ID NO:2）によってコードされる。アラインメントはMACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）を用いて作成した。
【図１−Ｈ】図は膜貫通タンパク質腫瘍抗原（TMDC、SEQ ID NO:1）を示し、これはcDNA （SEQ ID NO:2）によってコードされる。アラインメントはMACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）を用いて作成した。
【図２】図2は、TMDCの疎水性プロットを示す。負のY軸が疎水性を示し、X軸はアミノ酸残基番号の位置/数である。プロット作成にはMACDNASIS PROソフトウェアを用いた。
【図３】図3は多様な正常な成体組織でのTMDCの発現を示す。X軸は組織のタイプ、Y軸は正常な大腸組織に見られる発現（100%に設定）に比較したTMDCの発現を示す。QPCR分析はTAQMANプロトコル（Applied Biosystems （ABI）, Foster City CA）によって実施した。組織はClinomics （Pittsfield MA） およびClontech （Palo Alto CA）から得た。分析に用いたオリゴヌクレオチドプローブは、SEQ ID NO:2のほぼヌクレオチド1899からほぼヌクレオチド1966に及ぶ。
【図４】図4は、QPCR（ABI）でドナーをマッチさせた正常な大腸組織と比較した、大腸癌患者の組織内のTMDCの差次的発現を示す。X軸は患者ID（ドナーID）、Y軸は正常な大腸組織に見られる発現（100%に設定）に比較したTMDCの発現を示す。腫瘍サンプルは黒で表示され、正常な組織は白で表示される。分析に用いたオリゴヌクレオチドプローブは、SEQ ID NO:2のほぼヌクレオチド1899からほぼヌクレオチド1966に及ぶ。
【図５】図5は、QPCR（ABI）を用いて或る非腫瘍化大腸細胞株（LS123）及び正常な大腸組織に見られる発現（100％に設定）と比較した、種々の大腸腫瘍細胞株内のTMDCの差次的発現を示す。細胞株はATCC （Manassas VA）から得た。分析に用いたオリゴヌクレオチドプローブは、SEQ ID NO:2のほぼヌクレオチド1899からほぼヌクレオチド1966に及ぶ。
【図６】図6は、正常な大腸組織でのTMDCをコードする転写物の発現を示す。薄切片はDAPI染色し、そのin situハイブリダイズに用いたセンスまたはアンチセンスRNAプローブはSEQ ID NO:2の或る断片から作製し、断片はSEQ ID NO:2のほぼヌクレオチド1068からほぼヌクレオチド2324に及ぶ。
【図７】図7は、或る大腸絨毛腺癌での、TMDCをコードする転写物の発現を示す。薄切片はDAPI染色し、そのin situハイブリダイズに用いたアンチセンスRNAプローブはSEQ ID NO:2の或る断片から作製し、断片はSEQ ID NO:2のほぼヌクレオチド1068からほぼヌクレオチド2324に及ぶ。
【０２２０】
【表１】2005505267.tif 000004
【０２２１】
【表２】2005505267.tif 000005
【０２２２】
【表３】2005505267.tif 000006
【図１−Ａ】
2005505267.tif 000007
【図１−Ｂ】
2005505267.tif 000008
【図１−Ｃ】
2005505267.tif 000009
【図１−Ｄ】
2005505267.tif 000010
【図１−Ｅ】
2005505267.tif 000011
【図１−Ｆ】
2005505267.tif 000012
【図１−Ｇ】
2005505267.tif 000013
【図１−Ｈ】
2005505267.tif 000014
【図２】
2005505267.tif 000015
【図３】
2005505267.tif 000016
【図４】
2005505267.tif 000017
【図５】
2005505267.tif 000018
【図６】
2005505267.tif 000019
【図７】
2005505267.tif 000020
【国際公開パンフレット】
2005505267.tif 000021
2005505267.tif 000022
2005505267.tif 000023
2005505267.tif 000024
2005505267.tif 000025
2005505267.tif 000026
2005505267.tif 000027
2005505267.tif 000028
2005505267.tif 000029
2005505267.tif 000030
2005505267.tif 000031
2005505267.tif 000032
2005505267.tif 000033
2005505267.tif 000034
2005505267.tif 000035
2005505267.tif 000036
2005505267.tif 000037
2005505267.tif 000038
2005505267.tif 000039
2005505267.tif 000040
2005505267.tif 000041
2005505267.tif 000042
2005505267.tif 000043
2005505267.tif 000044
2005505267.tif 000045
2005505267.tif 000046
2005505267.tif 000047
2005505267.tif 000048
2005505267.tif 000049
2005505267.tif 000050
2005505267.tif 000051
2005505267.tif 000052
2005505267.tif 000053
2005505267.tif 000054
2005505267.tif 000055
2005505267.tif 000056
2005505267.tif 000057
2005505267.tif 000058
2005505267.tif 000059
2005505267.tif 000060
2005505267.tif 000061
2005505267.tif 000062
2005505267.tif 000063
2005505267.tif 000064
2005505267.tif 000065
2005505267.tif 000066
2005505267.tif 000067
2005505267.tif 000068
2005505267.tif 000069
2005505267.tif 000070
2005505267.tif 000071
2005505267.tif 000072
2005505267.tif 000073
2005505267.tif 000074
2005505267.tif 000075
2005505267.tif 000076
2005505267.tif 000077
2005505267.tif 000078
2005505267.tif 000079
2005505267.tif 000080
2005505267.tif 000081
2005505267.tif 000082
2005505267.tif 000083
2005505267.tif 000084
2005505267.tif 000085
2005505267.tif 000086
2005505267.tif 000087
2005505267.tif 000088
2005505267.tif 000089
2005505267.tif 000090
2005505267.tif 000091
2005505267.tif 000092
2005505267.tif 000093
2005505267.tif 000094
2005505267.tif 000095
2005505267.tif 000096
2005505267.tif 000097
2005505267.tif 000098
2005505267.tif 000099
2005505267.tif 000100
2005505267.tif 000101
2005505267.tif 000102
2005505267.tif 000103
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505267.tif 000104
【国際調査報告】
2005505267.tif 000105
2005505267.tif 000106