(57)【要約】ＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を開示する。これらの抗体は、hＴＮＦＳＦ１３ｂに対して高い親和性(例えば、ＫD＝１０-8Ｍ以下)、ＴＮＦＳＦ１３ｂ解離について遅いoff速度(例えば、Ｋoff＝１０-3 秒-1以下)を有し、ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性を in vitroおよび in vivoｄで中和する。本発明の抗体は、hＴＮＦＳＦ１３ｂ活性が原因である障害に悩まされているヒト患者におけるＴＮＦＳＦ１３ｂ活性の阻害についての態様において有用である。本発明の抗体をコードする核酸、その発現のためのベクターおよび宿主細胞も本発明に含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択される少なくとも３つのポリペプチドを含む、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体：
a.配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 
b.配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド;
c.配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド;
d.配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド;
e.配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および
f.配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド。
【請求項２】
以下からなる群から選択される少なくとも４つのポリペプチドを含む、請求項１記載の抗体：
a.配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 
b.配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド;
c.配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド;
d.配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド;
e.配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および
f.配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド。
【請求項３】
以下からなる群から選択される少なくとも５つのポリペプチドを含む、請求項１記載の抗体：
a.配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 
b.配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド;
c.配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド;
d.配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド;
e.配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および
f.配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド。
【請求項４】
以下のポリペプチドを含む、請求項１記載の抗体：
a.配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 
b.配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド;
c.配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド;
d.配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド;
e.配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および
f.配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２に示す軽鎖可変領域 (ＬＣＶＲ)またはポリペプチドまたは配列番号１０に示す重鎖可変領域 (ＨＣＶＲ) ポリペプチドを含む抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体。
【請求項６】
配列番号２に示すＬＣＶＲおよび配列番号１０に示すＨＣＶＲポリペプチドを含む請求項５記載の抗体。
【請求項７】
１×１０-8Ｍ以下のＫDでＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドから解離する、請求項１〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
１×１０-4 s-1以下のＫoffを有する、請求項１〜７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
１×１０-8Ｍ以下のＩＣ50を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
１×１０-9Ｍ以下ののＩＣ50を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１１】
１×１０-10Ｍ以下のＩＣ50を有する、請求項９記載の抗体。
【請求項１２】
１×１０-11Ｍ以下ののＩＣ50を有する、請求項１０記載の抗体。
【請求項１３】
以下の特性を有する抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体：
a.  ５×１０-4 s-1以下のＫoff速度定数;
b.  配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド；および 
c.  配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド。
【請求項１４】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、および ＩｇＤからなる群から選択される重鎖定常領域を含む請求項１〜１５のいずれかに記載の抗体。
【請求項１５】
重鎖定常領域がＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
重鎖定常領域がＩｇＧ４である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
ＩｇＧ４が、第２３１位のセリンについて置換されたプロリンを有する、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
κまたはλ軽鎖定常領域を含む請求項１〜１９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１９】
κ軽鎖定常領域を含む請求項２０に記載の抗体。
【請求項２０】
ＣＤＲが３以下保存的アミノ酸置換を有する、請求項１〜２１のいずれかに記載の抗体。
【請求項２１】
ＣＤＲが２以下の保存的アミノ酸置換を有する、請求項２２記載の抗体。
【請求項２２】
CDRが１個の保存的アミノ酸置換を有する、請求項２３記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号２に示すＬＣＶＲを含む軽鎖およびκ定常領域、および配列番号１０に示すＨＣＶＲポリペプチドを含む重鎖および第２３１位のセリンにプロリンへの置換を有するＩｇＧ４定常領域を含む抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体をコードする組換え発現 ベクター。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体を含有する医薬組成物。
【請求項２７】
製薬的に許容し得る担体をさらに含有する請求項２６記載の医薬組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体を投与することを含む、ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性が原因である免疫障害に悩まされている患者においてＴＮＦＳＦ１３ｂ活性を阻害する方法。
【請求項２９】
前記障害が、全身性 紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、若年型 慢性関節炎、Lyme 関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、感染性大腸炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、臓器移植拒絶、移植片対宿主病、サルコイドーシス、炎症性疾患、寄生性疾患、女性の不妊症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本病、シェーグレン症候群、悪性腫瘍、および癌からなる群から選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記障害が臓器移植拒絶または移植片対宿主病である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記障害が悪性腫瘍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が全身性 紅斑性狼瘡である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性が原因である免疫障害に悩まされている患者に投与するための医薬の製造のための、請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項３４】
前記障害が、全身性 紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、若年型 慢性関節炎、Lyme 関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、感染性大腸炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、臓器移植拒絶、移植片対宿主病、サルコイドーシス、炎症性疾患、寄生性疾患、女性の不妊症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本病、シェーグレン症候群、悪性腫瘍、および癌からなる群から選択される、請求項３３記載の使用。
【請求項３５】
前記障害が臓器移植拒絶または移植片対宿主病である、請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
前記障害が癌である、請求項３４記載の使用。
【請求項３７】
前記障害が全身性紅斑性狼瘡である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性が原因である障害に悩まされている患者に投与するための医薬の製造における、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシンおよび第１０５位のグルタミン酸を含む、ＴＮＦＳＦ１３ｂのエピトープが結合することによりＴＮＦＳＦ１３ｂ活性を中和する抗体の使用。
【請求項３９】
梱包材および該梱包材内に入れられた抗体を含んでなる製造品であって、該抗体が、ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性が原因である障害に悩まされているヒト患者の処置または予防のためにＴＮＦＳＦ１３ｂ活性を中和し、該梱包材が、該抗体がＴＮＦＳＦ１３ｂのエピトープに結合することにより中和することを示す添付文書を含み、該エピトープが第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシンおよび第１０５位のグルタミン酸を含む製造品。
【請求項４０】
抗体が請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体である、請求項３９記載の製造品。
【請求項４１】
抗体が配列番号２に示すＬＣＶＲポリペプチドまたは配列番号１０に示すＨＣＶＲポリペプチドを含む、請求項４０記載の製造品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
TNFファミリーのリガンドは、増殖、細胞毒性、抗ウイルス活性、免疫調節活性、およびいくつかの遺伝子の転写調節を含む多くの細胞内応答を誘導する最も大きなファミリーとして知られている。サイトカインやレセプターのＴＮＦファミリーは、大規模なＥＳＴ配列決定法の出現で、ここ２、３年で非常に大きな広がりを見せている。ＴＮＦＳＦ１３ｂは、the TNF Congress for BLyS, TALL-1, BAFF, THANK, neutrokine-α, and zTNF (for review see Locksley et al. Cell 2001 104:487)が採用している正式名称である。ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂ (hＴＮＦＳＦ１３ｂ)は、可溶性および膜結合タンパク質の存在を可能にするＮ末端 開裂部位を有する285アミノ酸 ＩＩ型膜結合タンパク質である。機能的には、ＴＮＦＳＦ１３ｂは、Ｂ細胞といくつかのＴ細胞の免疫応答を調節すると思われる。
【背景技術】
【０００２】
炎症サイトカインの過剰産生に起因する敗血症性ショック症候群および他の疾患の研究は、疾患を有する宿主がしばしば、可溶性サイトカインを遊離することによりまたは高親和性の抗サイトカイン抗体を合成することにより高いサイトカインレベルに対抗することを示している（Slifka, M.K.,および Whitton, J.L., Clinical implications of dysregulated cytokine production, Journal of Molecular Medicine, 78(2):74-80 (2000)を参照)。そのような自然の応答を模擬する処置の方法は、サイトカインが介在する疾患を軽減するための実行可能な治療手段であると考えられる。このように、in vitro およびin vivoで標的とするサイトカインの活性に拮抗する能力が関与している、ＴＮＦＳＦ１３ｂ等の標的とするサイトカインに結合するヒト抗体の必要性が十分に認識されている。国際特許出願WO00/50597にはＴＮＦＳＦ１３ｂに対する抗体が一応開示されてはいるものの、そのような抗体の構造または特性は具体的に記載されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体、またはその抗原結合部分を提供する。本発明の抗体は、ＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドに対する高い親和性の結合、遅い解離速度、および in vitro および／またはin vivoでＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドに関連する活性の少なくとも１つを拮抗する能力によって特徴付けられる。
【０００４】
本発明はさらに、配列番号２に示すポリペプチド、配列番号４に示すポリペプチド、配列番号６に示すポリペプチド、配列番号８に示すポリペプチド、配列番号１０に示すポリペプチド、配列番号１２に示すポリペプチド、配列番号１４に示すポリペプチド、および配列番号１６に示すポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を提供する。
【０００５】
更なる態様では、本発明は、単離された抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を提供する。hＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドに結合するおよび表面 プラスモン共鳴によって測定される1×１０-4 s-1以下のＫoff速度定数を有するhＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドからの解離 1×１０-8Ｍ以下のＩＣ５０の中和分析において測定されるまたはＴＮＦＳＦ１３ｂ誘発の増殖を阻害する
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
好ましい態様では、本発明は、以下の特性を有する単離された抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体である：
a)  in vitro中和アッセイにおいて、1×１０-8Ｍ以下のＩＣ５０でもってＴＮＦＳＦ１３ｂ誘導性増殖を阻害する;
b)  配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３重鎖を有する；および
c)  配列番号８に記載のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３軽鎖を有する。
【０００７】
本発明はさらに、本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体の投与を含む、自己免疫疾患、例えば全身性紅斑性狼瘡, 慢性関節リウマチ、および／または新生物、を含むがこれに限定されない、Ｂ細胞およびいくつかのＴ細胞活性に関連する、急性または慢性疾患または状態を処置または予防する方法を提供する。
【０００８】
さらに別の態様では、本発明は、新規の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体をコードする配列、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体をコードするポリヌクレオチドを組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を含有する製剤および該ヒト化抗体の製造方法および使用を提供する。
【０００９】
抗体は、ジスルフィド結合により内部で連結した、２つの重鎖（Ｈ） (約50-70 ＫDa)および２つの軽鎖 (L) (約25 ＫDa)の４つのポリペプチドからなる免疫グロブリン分子である。軽鎖は、κおよびλに分類される。重鎖はγ、μ、δまたはεに分類され、その抗体のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよび ＩｇＥをそれぞれ規定する。各重鎖は、重鎖可変領域 (本明細書においてＨＣＶＲと略される)と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよび ＩｇＡについて３つのドメインCH1、CH2および CH3からなり、ＩｇＭおよび ＩｇＥについて４つのドメインCH1、CH2、CH3、CH4からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域 (本明細書においてＬＣＶＲと略される)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLからなる。ＨＣＶＲおよび ＬＣＶＲ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変領域と、その間に存在するフレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存性の高い領域とに分けられる。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、３つのCDRおよび４つのFRからなり、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ並んでいる：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。各ドメインに対するアミノ酸の配置は周知の慣例に従う[Kabat, et al, Sequence of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Healthおよび Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991); Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989)]。特定の抗原に結合する抗体の機能的特性はCDRによって決定される。
【００１０】
本明細書において、用語「抗体」は、モノクローナル抗体自体を意図するものである。モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体, Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2、または１本鎖のFV断片であってよい。好ましくは、用語「抗体」はヒト抗体を意味する。
【００１１】
用語「ヒト抗体」としては、ヒト生殖細胞系列 免疫グロブリン配列に対応する可変および 定常領域を有する抗体が挙げられる。ヒト抗体は、ヒトの治療において使用するための非ヒトにおよびキメラ抗体に対して、いくつかの、少なくとも３つの利点を有する。例えば、ヒト抗体のエフェクター部分は、ヒトの免疫系の他の部分と良好に相互作用する (例えば、補体依存性細胞傷害作用(CDC)によってまたは抗体依存性細胞傷害作用 (ADCC)によって標的細胞をより効率的に破壊する)。別の利点としては、ヒト抗体はヒト免疫系に外来物として認識されず、それゆえ注入されたそのような抗体などに対する抗体応答が、全体として外来の非ヒト抗体または特に外来のキメラ抗体に対するよりも弱い。さらには、注入されたヒト抗体は、ヒトの循環系において、ヒト抗体の半減期よりもはるかに短い半減期を有することが報告されている。注入されたヒト抗体は、天然のヒト抗体と本質的に同一の半減期を有し、投与量および投与頻度を低くすることができる。
【００１２】
用語「hＴＮＦＳＦ１３ｂ」は、国際特許出願WO98/18921および WO00/50597 (本明細書ではニュートロカイン（neutrokine）−αと称する）に記載されているリガンドの腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーのヒト形態を意味する。用語「hＴＮＦＳＦ１３ｂ」および「ＴＮＦＳＦ１３ｂ」は、標準的な組換え発現法によって調整することができるかまたは商業的に購入する(Research Diagnostics Inc. Catalog No. RDI-3113, rhuBAFF, Flanders, N.J.)、並びに合成により作製することができる形態を包含するものと意図する。
【００１３】
本発明の抗体について言及するとき、用語「生物学的特性」、「生物学的特徴」および用語「活性」は、本明細書において同じ意味で使われ、エピトープ親和性および特異性(例えば、hＴＮＦＳＦ１３ｂに結合する抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体)、標的となるポリペプチドの活性と拮抗する能力 (例えば、ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性)、抗体のin vivo安定性、および抗体の免疫原性特性、が挙げられるこれに限定されない。当分野において認識されている、抗体のその他の識別可能な生物学的特性または特徴としては、例えば、交差反応性 (即ち、標的となるポリペプチドの非ヒト相同体との、または一般的に他のタンパク質または組織との)、および哺乳類細胞におけるタンパク質の高い発現レベルを維持する能力が挙げられる。上記の特性または特徴は、ELISA,競合ELISA, 表面 プラスモン共鳴解析、in vitroおよび in vivo中和分析(例えば、実施例２）およびヒト、霊長類または必要であれば他の供給源に由来する組織片を用いた種々の免疫組織化学が挙げられるがこれに限定されない、当分野で認識されている技術を用いて、観察または測定することができる。抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体の具体的な活性および生物学的特性は、以下の実施例においてさらに詳述する。
【００１４】
用語「接触位置」としては、抗原が接触しているアミノ酸が占める、抗体の重鎖可変領域または軽鎖 可変領域のCDR1、CDR2またはCDR3におけるアミノ酸の位置が含まれる。CDRアミノ酸が抗原と接触するなら、そのアミノ酸は接触位置を占めるものと考えられる。
【００１５】
「保存的置換」または「保存的アミノ酸置換」は、天然の突然変異または人為的な変異のいずれかに由来するアミノ酸の置換を意味し、そのような置換によって生じた抗体が、本明細書に開示した抗体と実質的に同じ（または改善されたまたは所望であれば減少した）活性を有することを意味する。
【００１６】
本明細書において用いる用語「エピトープ」は、抗体が結合するタンパク質分子の領域を意味する。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原であるとき、抗体応答を惹起するタンパク質の部分として定義される（例えば、Geysen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983)を参照)。
【００１７】
本明細書において用いられる「結合する」は、一般的に、抗原のエピトープに対する抗体の相互作用を意味する。より具体的には、用語「結合する」は、抗原のエピトープに対する抗体の親和性を意味する。親和性はＫDによって測定される。
【００１８】
用語「阻害」または「阻害する」は、一般的に認識されている意味を包含し、疾患または状態の進行または重篤度を、中和する、予防する、阻止する、抑制する、遅らせる、止める、または逆転させることが含まれる。
【００１９】
抗ＴＮＦＳＦ１３ｂ 抗体に言及するときの用語「中和する」または「拮抗する」または「ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性を拮抗する抗体」は、そのＴＮＦＳＦ１３ｂに対する結合が、ＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドによって誘導される生物学的活性の阻害をもたらす、抗体または抗体断片を意味するものと意図する。ＴＮＦＳＦ１３ｂの生物学的活性の阻害は、ＴＮＦＳＦ１３ｂ誘導性増殖、ＴＮＦＳＦ１３ｂ誘導性免疫グロブリン分泌、Ｂ細胞 アポトーシスのＴＮＦＳＦ１３ｂ誘導性阻止,またはＴＮＦＳＦ１３ｂレセプター結合分析におけるレセプター結合の阻害がふくまれるがこれに限定されないin vitroまたはin vivo の指標の１またはそれ以上を測定することによって評価することができる。ＴＮＦＳＦ１３ｂ 生物学的活性の指標は、当分野において知られたいくつかの in vitroまたはin vivo分析の１つまたはそれ以上によって評価することができる（例えば、Moore, P.A., et al., Science, 285:260-263 (1999); Schneider, P., et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999); Shu, H., et al., J. Leuko. Biol., 65:680-683 (1999); Mukhopadhyay, A., et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999); Mackay, F. et al., J. Exp. Med., 190:1697-1710 (1999); Gross, J.A., et al., Nature, 404:995-999 (2000)；および 実施例２参照）。好ましくは、ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性を中和するまたは拮抗する能力は、実施例２に示したＢ細胞増殖の阻害によって評価する。
【００２０】
本明細書において用いる用語「Ｋoff」は、抗体／抗原複合体からの抗体の解離についてのoff速度定数を意味するものとして意図する。
【００２１】
本明細書において用いる用語「ＫD」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を意味する。本発明においては、ＫDを実施例４に記載のとおり測定した。
【００２２】
「単離された」抗体は、同定された、および分離されたおよび／またはその自然状態での成分から回収された抗体を意味する。自然状態での不純物は、その抗体の診断的または治療的使用を妨害し得る物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性のまたは非タンパク質性の溶質が挙げられる。一般的に、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって精製する。好ましい態様では、抗体は、(1) Lowry法による測定で、抗体重量の９５％以上、および最も好ましくは９９％以上の純度になるまで、および(2)クーマシーブルーまたは好ましくは銀染料を用いた還元的条件下または非還元的条件下でのSDS-PAGEで均一になるまで精製する。好ましくは、「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体である。(例えば、hＴＮＦＳＦ１３ｂと特異的に結合する単離された抗体は、hＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。
【００２３】
「核酸分子」としては、DNA分子およびRNA分子が挙げられる。核酸分子は、１本鎖または２本鎖であってよいが、好ましくは２本鎖のＤＮＡである。
【００２４】
hＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドに結合する抗体または抗体断片(例えば、ＨＣＶＲ, ＬＣＶＲ, CDR3)をコードする核酸に言及する際に本明細書において用いる用語「単離された核酸分子」としては、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、他の配列がヒトゲノムＤＮＡの核酸に自然に結合し得る、hＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド以外の抗原と結合する抗体または抗体断片をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸が挙げられる。即ち、例えば、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体のＨＣＶＲ領域をコードする本発明の単離された核酸は、hＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド以外の抗原が結合するＨＣＶＲ領域をコードする他の配列を含まない。
【００２５】
用語「ベクター」としては、そこへ結合した他の核酸を運ぶことが可能な核酸分子が挙げられる。ベクターの１つのタイプは、更なるＤＮＡ断片を連結しうる環状の２本鎖ＤＮＡループである「プラスミド」である。別のベクターのタイプは、更なるＤＮＡ断片をウイルスのゲノムに連結することができる、ウイルスベクターである。ある特定のベクター(例えば、細菌複製起源を有する細菌ベクター、および エピソーム哺乳類ベクター)は、そのベクターが導入された宿主細胞において自立的な複製が可能である。他のベクター (例えば、非エピソーム哺乳類ベクター)は、宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに取り込まれ、それにより宿主のゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能な様に結合している遺伝子の発現を指揮することが可能である。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」(または単純に「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、プラスミドの形態をとることが多い。プラスミドは最も一般的の用いられるベクターの形態であるので、本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」は同じ意味で用いる。しかしながら、本発明は、同等の機能を供するウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス)などの発現ベクターの他の形態を包含するものと意図する。
【００２６】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係で位置しているとき「作動可能なように連結」している。例えば、そのポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現するならば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡはポリペプチドのＤＮＡに作動可能な様に連結しており、その配列の転写に影響を及ぼすならばプロモーターまたはエンハンサーがコード配列に作動可能なように連結しており、または翻訳を促進するように位置しているならばリボソーム結合部位がコード配列に作動可能なように連結している。一般に「作動可能なように連結」とは、連結しているDNA配列が隣接していることを意味し、分泌リーダーの場合、隣接し且つリーディングフレームにあること意味する。但し、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は便利な制限部位でのライゲーションにより行なう。そのような部位が存在しない場合、慣用的な手法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。
【００２７】
抗体に言及するに際して用語「組換え」には、組換え法により調製された、発現させた、作出したまたは単離された抗体が含まれる。代表例としては、宿主細胞にトランスフェトした組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組換え物から単離された抗体、組合せヒト抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックな動物から単離された抗体(例えばマウス）(例えば、Taylor, L.D., et al., Nucl. Acids Res. 20:6287-6295,(1992)を参照）;またはヒト免疫グロブリン 遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングが関与する任意の手段によって調製、発現、作出または単離された抗体が挙げられる。そのような組換え ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列 免疫グロブリン配列に由来する可変および 定常領域を有する。
【００２８】
用語「組換え 宿主細胞」 (または単純に「宿主細胞」)には、そこに組換え 発現 ベクターが導入された細胞が含まれる。そのような用語は、特定の対象となる細胞だけでなくそのような細胞の子孫も意味するものと意図する。ある特定の修飾が、突然変異または環境の影響によって何世代かに何事もなく存在しているかもしれないので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でないかもしれない。しかし、本明細書において用いる「宿主細胞」の範囲には含まれる。
【００２９】
組換え ヒト抗体もまたin vitro 突然変異誘発の対象となりうる (あるいは、ヒトIg配列に関してトランスジェニックな動物を用いる場合には、in vivo 体細胞 突然変異誘発)、したがって組換え 抗体のＨＣＶＲおよび ＬＣＶＲ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列 ＨＣＶＲおよび ＬＣＶＲ 配列に関係のある配列に由来するが、in vivoでのヒト抗体 生殖細胞系列 レパートリーには自然には存在し得ない。
【００３０】
内因性の免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全レパートリーを生じる免疫により入手可能なトランスジェニック動物 (例えば、マウス)を用いることができる。そのような生殖細胞系列 mutant マウスにおけるヒト生殖細胞系列 免疫グロブリン 遺伝子配列系列のトランスフェクトは、抗原投与によりヒト抗体の産生をもたらすであろう (例えば、Jakobovits, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, (1993); Jakobovits, et al., Nature, 362:255-258, (1993; Bruggemann, et al., Year in Immun., 7:33 (1993); Nature 148:1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14:826 (1996); Gross, J.A., et al., Nature, 404:995-999 (2000)；および U.S. patents nos. 5,877,397, 5,874,299, 5,814,318, 5,789,650, 5,770,429, 5,661,016, 5,633,425, 5,625,126, 5,569,825,および 5,545,806 (それぞれ、本明細書の一部を構成する)参照)。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生させることができる (Hoogenboomおよび Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992); Marks, et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。Coleらおよび Boernerらの技術もまた、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用可能である(Cole, et al., monoclonal antibodies, and Cancer Therap, Alan R. Liss, p. 77 (1985)および Boerner, et al., J. Immunol., 147(l):86-95 (1991))。
【００３１】
「容器」とは、医薬品の保存、運送、調剤および／または取り扱いに適当な任意の貯蔵と密閉を意味する
【００３２】
「梱包材」とは、便利な投薬を可能にする消費者にとって便利な部品および／または配布、教育および／または投与を助ける補助的な部品を意味する。梱包材は、患者への抗体の投与を改良し、患者への教育的指導を少なくまたは改善し、改善された医薬品の経済性評価のための基盤を提供し、および／または流通の作業負担を限定しうる。また、梱包材には、紙製の梱包、収縮包装の梱包、シースルートップの梱包、試供品クーポン、教育用品、補助用品および／または搬送品が含まれるがこれに限定されない。
【００３３】
「添付文書」とは、医者、薬剤師および患者がその製品使用に関する情報を得た上での決断を可能にするために必要な、安全性および有効性のデータとともにその製品をそのようにして投与するかについて、および／または患者向けの教育的情報を記載している、その製品に添付する情報を意味する。
【００３４】
「患者」は、動物、好ましくは処置が必要なヒトを意味する。本発明に関して、処置を必要とする対象としては、全身性 紅斑性狼瘡、慢性関節リウマチ、若年型 慢性関節炎、Lyme 関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、感染性大腸炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患、サルコイドーシス、炎症性疾患、寄生性疾患、女性の不妊症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本病、シェーグレン症候群、、および 癌、特にＢ細胞またはＴ細胞 リンパ腫または骨髄腫が挙げられるがこれに限定されない、自己免疫疾患および炎症性疾患に悩まされているまたはその傾向がある動物が挙げられる。
【００３５】
以下に本発明の種々の態様をさらに詳細に記載する。
【００３６】
本発明は、生物活性なhＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドに特異的でを中和するヒトモノクローナル抗体に関する。さらに、それを追加投与したときに、ＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドに対して高い特異性を有し中和する重鎖および軽鎖アミノ酸配列を記載する。この高い特異性によって、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体および 同様の特異性を有するヒトモノクローナル抗体の、ＴＮＦＳＦ１３ｂが関連する疾患の免疫治療が可能になる。
【００３７】
1つの態様では、本発明は、配列番号1-16 2、4、6、8、10、12、14、または16に示したアミノ酸配列の少なくとも1つを含み、ＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド エピトープに高い親和性で結合し、結合したＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドから１×１０-4 s-1以下の低いＫoff速度定数でもって解離し、ＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド活性を拮抗する能力を有する単離されたヒト抗体を提供する。1つの態様では、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド; 配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド; 配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および 配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む。別の態様では、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド; 配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド;配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および 配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。更なる態様では、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド; 配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド; 配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および 配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。別の態様では、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド; 配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド; 配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および 配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む。更なる態様では、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド; 配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド; 配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および 配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも５つのポリペプチドを含む。別の態様では、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、配列番号４に示すＬＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号６に示すＬＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド; 配列番号８に示すＬＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチド; 配列番号１２に示すＨＣＶＲのＣＤＲ１ポリペプチド; 配列番号１４に示すＨＣＶＲのＣＤＲ２ポリペプチド；および 配列番号１６に示すＨＣＶＲのＣＤＲ３ポリペプチドを含む。
【００３８】
より好ましくは、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、配列番号２に示す軽鎖可変領域 (ＬＣＶＲ)ポリペプチドまたは配列番号１０に示す重鎖 可変領域 (ＨＣＶＲ)ポリペプチドを含む。さらに好ましくは、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、配列番号２に示すＬＣＶＲポリペプチドおよび配列番号１０に示すＨＣＶＲポリペプチドを含む。
【００３９】
好ましい態様では、単離されたヒト抗体は、5×１０-5 s-1以下のＫoff速度定数でもって結合したＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドから解離し、中和アッセイにおいて1×１０-7Ｍ以下のＩＣ５０でＴＮＦＳＦ１３ｂ誘導性増殖を阻害する。さらに好ましい態様では、単離されたヒト抗体は、1×１０-5 s-1以下のＫoff速度定数で、結合したＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド エピトープから解離し、in vitro中和アッセイにおいて 1×１０-8Ｍ以下のＩＣ５０でもってＴＮＦＳＦ１３ｂ誘導性増殖を阻害する.さらに好ましい態様では、単離された抗ＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、5×１０-6 s-1以下のＫoff速度定数でもって結合したhＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドから解離し、in vitroアッセイにおいて1×１０-9Ｍ以下のＩＣ５０でもってＴＮＦＳＦ１３ｂ誘導性増殖を阻害する。上記の動力学および中和基準を満たす抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体の例としては、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 抗体が挙げられる。
【００４０】
本発明の最も好ましい抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体は、本明細書において ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４と称する。４Ａ５−３．１．１−Ｂ４は、それぞれ配列番号2および 配列番号10に示したＬＣＶＲ および ＨＣＶＲポリペプチド 配列を有する。４Ａ５−３．１．１−Ｂ４のＬＣＶＲおよび ＨＣＶＲをコードするポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号1および 配列番号9に示される。本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体の特性は、実施例に具体的に記載する。特に注目すべきは、ＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチドに対する高い親和性、遅い解離速度および４Ａ５−３．１．１−Ｂ４によって示されるＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド活性を拮抗する高い能力である。
【００４１】
抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体のＫoffは、実施例４に一般的に記載した表面 プラスモン共鳴によって測定することができる。一般的に、表面 プラスモン共鳴解析は、BIAcore system (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)を用いた表面 プラスモン共鳴 (SPR)により、リガンド (バイオセンサーマトリクスに固定された組換え ＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド)と分析対象 (溶液中の抗体)との間の実時間結合相互作用の測定値を解析する。SPR解析はまた、分析対象 (バイオセンサーマトリクス上の抗体)を固定化しリガンド (溶液中の組換え V ＴＮＦＳＦ１３ｂ)を存在させることによって行なうこともできる。
【００４２】
1つの態様では、本発明はさらに、本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を産生する細胞系列に関する。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞系列の単離は、当分野で周知の慣用的なスクリーニング技術を用いて行なうことができる。本明細書に記載しているように、本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を産生するハイブリドーマをATCCに寄託した（ATCC PTA-3674）。
【００４３】
細菌、酵母、バキュロウイルス、植物および哺乳動物発現系（並びにファージディスプレイ発現系）を含む多種多様の宿主発現系を用いて本発明の抗体を発現させることができる。適当な細菌発現 ベクターの例は、pUC119 (Sfi)である。他の抗体 発現系は、茂又当分野で知られており、本明細書において意図される。
【００４４】
本発明の抗体は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の宿主細胞における組換え 発現により調製することができる。抗体を組換えにより発現させるために、宿主細胞を、抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を有する１またはそれ以上の組換え 発現 ベクターでトランスフェクトして、その軽鎖および重鎖を宿主細胞のいて発現させる。好ましくは、組換え 抗体を、宿主細胞を培養している媒体中に分泌させ、抗体をその培地から回収する。標準的な 組換え DNA法を用いて抗体重鎖および軽鎖の遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え 発現 ベクターに組み込み、ベクターを宿主細胞に導入する。
【００４５】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離されたDNAは、完全長の 重鎖 遺伝子に変換することができる。ＨＣＶＲをコードするDNAを重鎖 定常領域(CH1, CH2,および CH3) をコードする別のDNA分子に作動可能なように連結させる。ヒト重鎖定常領域のＤＮＡ配列は、当分野で周知のであり(例えば、Kabat, E.A., et al. (1991) 配列 of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Healthおよび ヒトServices, NIH Publication No. 91-3242を参照)、および３つの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なPCR増幅によって得ることができる。Kabat (Kabat, et al, 配列 of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Healthおよび ヒトServices, NIH Publication No. 91-3242 (1991))に記載されているように、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１, ＩｇＧ２, ＩｇＧ３, ＩｇＧ４, ＩｇＡ, ＩｇＥ, ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域、およびそれらにおける任意のアロタイプ変異体であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１,またはＩｇＧ４定常領域である。
【００４６】
あるいは、抗体部分はFab断片, Fab’断片, F(ab’)2,または１本鎖FV断片であってよい。Fab断片 重鎖 遺伝子に関して、ＨＣＶＲをコードするDNAは、重鎖 CH1定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能な様に連結させることができる。
【００４７】
ＬＣＶＲ 領域 をコードする単離されたDNAは、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域 CLをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能な様に連結させることによって完全長の 軽鎖 遺伝子(並びにFab 軽鎖 遺伝子)に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子のＤＮＡ配列は当分野で周知であり３つの領域を包含するDNA断片は標準的な PCR増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。
【００４８】
scFV 遺伝子を作出するために、ＨＣＶＲおよび ＬＣＶＲをコードするＤＮＡ断片をフレキシブルばリンカー（例えば、アミノ酸配列 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser- Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (Gly4-Ser)3をコードするアミノ酸配列）をコードする別の断片に作動可能なように連結させて、ＨＣＶＲおよび ＬＣＶＲ 配列が、ＬＣＶＲおよび ＨＣＶＲ 領域がフレキシブルなリンカーによって連結した隣接した１本鎖のタンパク質として発現されるようにすることができる(例えば、Bird et al. Science 242:423-426 (1988); Huston, et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty, et al., Nature 348:552-554 (1990)を参照)。
【００４９】
本発明の抗体を発現させるために、上記のようにして得られた、部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、発現 ベクターに挿入して遺伝子が、転写および翻訳調節配列に作動可能なように連結させる。抗体遺伝子をベクターにライゲーションして、ベクター内の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図した機能がもたらされるようにする。発現 ベクターおよび 発現調節配列は用いる発現 宿主細胞に適合するように選択する。抗体 軽鎖 遺伝子および 抗体 重鎖 遺伝子は、別のベクターまたはより典型的には両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することができる。抗体遺伝子は、標準的な方法により発現ベクターに挿入する(例えば、抗体遺伝子断片およびベクターの相補的な制限部位のライゲーションまたは制限部位が存在しなければ平滑末端ライゲーション)。さらに、または別法として、組換え 発現 ベクターは宿主細胞からの抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングして、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結するようにできる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたはヘテロローガスなシグナルペプチド (即ち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であってよい。
【００５０】
抗体鎖遺伝子配列に加え、本発明の組換え 発現 ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を調節する調節配列を有している。用語「調節配列」には、抗体鎖遺伝子プロモーターの転写または翻訳を調節する、エンハンサー、および他の発現調節エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。調節配列の選択を含め発現 ベクターの設計は、翻訳される宿主細胞の選択、目的とする細胞の発現のレベル等の要因に依存することは当業者に理解される。哺乳類宿主細胞 発現のための好ましい調節配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）(CMV プロモーター/エンハンサーなど)、シミアン・ウイルス 40 (SV40) (SV40 プロモーター/エンハンサー等), アデノウイルス, (例えばアデノウイルス主要後期プロモーター (AdMLP))および ポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー等の哺乳類細胞におけるタンパク質の高いレベルの発現を指揮するウイルスエレメントを含む。
【００５１】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本発明の組換え 発現 ベクターは更なる配列、例えば宿主細胞におけるベクターの転写を調節する配列 (例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子を有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の分泌を促進する。例えば、選択マーカー遺伝子は、そのベクターが導入された細胞において、G418, ハイグロマイシンまたはメトトレキセート等の薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー 遺伝子としては、ジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR) 遺伝子(使用メトトレキセート選択／増幅についてdhfr-宿主細胞に使用)およびneo 遺伝子配列（G418選択に使用）が挙げられる。
【００５２】
軽鎖および重鎖の発現に関し、重鎖および 軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な方法により宿主細胞にトランスフェクトする。種々の用語「トランスフェクション」は、外来ＤＮＡの原核または真核宿主細胞への導入のための、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどの一般的に用いられる多種多様の技術を包含するものとして意図する。原核宿主細胞または真核宿主細胞のいずれにおいても本発明の抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞、および特に哺乳類細胞は、原核細胞と比較して適切に折り畳まれ免疫学的活性な抗体を組み立てて分泌すると考えられるので、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。本発明の組換え 抗体を発現するための好ましい哺乳類 宿主細胞はとしては、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO細胞) (例えば、R.J. Kaufmanおよび P.A. Sharp, Mol. Biol., 159:601-621 (1982)に記載のDHFR 選択マーカーを使用する、Urlaubおよび Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220 (1980) に記載のdhfr-CHO細胞を含む)、NS0 骨髄腫細胞, COS細胞および SP2細胞が挙げられる。抗体 遺伝子配列をコードする組換え 発現 ベクターを哺乳類 宿主細胞に導入する場合、抗体は、宿主細胞をその抗体の宿主細胞における発現が可能な、または、より好ましくはその宿主細胞を培養している培地への抗体の分泌に十分な期間培養することによって産生させる。抗体は、標準的な精製法を用いて培地から回収することができる。
【００５３】
宿主細胞はさらに、scFV分子のFab断片等の、インタクトな抗体の一部を産生させるために使用することもできる。上記手法の変法も本発明尾範囲内であると理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれか (但し、両方ではない)をコードするＤＮＡによって宿主細胞をトランスフェクトすることが好ましいかもしれない。組換え DNA法はまた、hＴＮＦＳＦ１３ｂへの結合に必要のない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡのいくつかまたは全てを除去するために使用してもよい。
そのような切り取られたＤＮＡ分子から発現した分子もまた、本発明の抗体に含まれる。本発明の抗体の組換え 発現に好ましい１つの系では、抗体重鎖および抗体 軽鎖の両方をコードする組換え 発現 ベクターをリン酸カルシウム法によるトランスフェクションよりdhfr-CHO細胞に導入する。この組換え 発現 ベクター内では、抗体重鎖および 軽鎖 遺伝子が、エンハンサー/プロモーター調節エレメント (例えば、SV40, CMV, アデノウイルなどに由来する、CMV エンハンサー/AdMLP プロモーター調節エレメントまたはSV40 エンハンサー/AdMLP プロモーター調節エレメントなど)にそれぞれ作動可能なように連結し、遺伝子の高いレベルの転写を指揮する。組換え 発現 ベクターはまた、DHFR 遺伝子配列を有し、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択がメトトレキセート選択／増幅を用いて可能である。
【００５４】
選択された形質転換宿主細胞を培養して抗体重鎖および 軽鎖およびインタクトな抗体を発現させ、培地から回収する。標準的な分子生物学の技術を用いて組換え 発現 ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養して培地から抗体を回収する。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、ヒト免疫グロブリン 遺伝子配列についてトランスジェニックな動物(例えば、マウス）において発現させることができる (see 例えば、Taylor, L.D., et al. Nucl. Acids Res., 20:6287-6295(1992)参照)。植物細胞を修飾して、本発明の抗体または抗原結合部分を発現するトランスジェニック植物を作出することもできる。
【００５５】
上記に鑑みて、本発明の別の態様は、本発明の抗体および 抗体部分の組換え発現に使用することができる核酸、ベクター,および 宿主細胞、組成物に関する。好ましくは、本発明は、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４のCDRまたは４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の完全な重鎖および／または軽鎖 可変領域をコードする単離された核酸によって特徴付けられる。したがって、１つの態様では、本発明は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 重鎖 CDR3をコードする抗体 重鎖 可変領域をコードする単離された核酸によって特徴付けられる。好ましくは、抗体 重鎖 可変領域さらには４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 重鎖 CDR2をコードする核酸は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、抗体 重鎖 可変領域をコードする核酸は、さらに配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 重鎖 CDR1をコードする。さらにより好ましくは, 単離された核酸は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む10 (４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の完全な ＨＣＶＲ 領域)抗体 重鎖 可変領域をコードする。
【００５６】
他の態様では、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 軽鎖 CDR3をコードする抗体 軽鎖 可変領域をコードする単離された核酸によって特徴付けられる。好ましくは、抗体 軽鎖 可変領域をコードする核酸は、さらに配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 軽鎖 CDR1をコードする。さらにより好ましくは、単離された核酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む抗体 軽鎖 可変領域(４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の完全なＬＣＶＲ 領域)をコードする。
【００５７】
他の態様では、本発明は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 軽鎖 CDR3をコードする抗体 軽鎖 可変領域をコードする単離された核酸によって特徴付けられる。好ましくは、抗体 軽鎖 可変領域をコードする核酸はさらに配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 軽鎖 CDR1をコードする。さらにより好ましくは, 単離された核酸は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む抗体 軽鎖 可変領域 (４Ａ５−３．１．１−Ｂ４のＬＣＶＲ 領域) をコードする。
【００５８】
他の態様では、本発明は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖 CDR3 ドメイン(即ち、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ ＨＣＶＲ CDR3)をコードする単離された核酸を提供する。この核酸はCDR3 領域のみ、またはより好ましくは抗体 重鎖 可変領域全体 (ＨＣＶＲ)をコードすることができる。例えば、核酸は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含むCDR2 ドメイン (即ち、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ ＨＣＶＲ CDR2)および配列番号１２のアミノ酸配列を含むCDR1 ドメイン(即ち、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ ＨＣＶＲ CDR1) を有するＨＣＶＲをコードすることができる。
【００５９】
さらに別の態様では、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む抗体 軽鎖 可変領域 (即ち、the ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ ＬＣＶＲ)をコードする単離された核酸を提供する。好ましくは、核酸は、配列番号1のヌクレオチド配列を含むが、当業者は、遺伝コードの縮重により、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードすることができる他のヌクレオチド配列を想到しうる。核酸はＬＣＶＲのみまたはＬＣＶＲに作動可能なように連結した抗体 軽鎖定常領域をコードすることができる。一態様では、この核酸は組換え 発現 ベクター内のものである。
【００６０】
更なる態様では、本発明は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、抗体 重鎖 可変領域(即ち、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ ＨＣＶＲ)をコードする単離された核酸を提供する。好ましくは、この核酸は、配列番号９のヌクレオチド配列を含むが当業者は、遺伝コードの縮重により、配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードすることができる他のヌクレオチド配列を想到しうる。核酸は、ＨＣＶＲのみまたはＨＣＶＲに作動可能なように連結した重鎖定常領域をコードすることができる。例えば、核酸は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を含むことができる。一態様では、この核酸は組換え 発現 ベクター内のものである。
【００６１】
当業者は、抗体のアミノ酸配列の修飾によって、もとの抗体と比較して同等もしくはそれよりも優れた機能的特性を示す抗体を生じうることを認識する。本発明の抗体における変更は、自然の突然変異または人為的な、１またはそれ以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換、切取り、融合などを導入することができる。本発明は、さらに１またはそれ以上のアミノ酸置換を含むが、但し、その置換を有する抗体が、本明細書に開示した抗体と比較して実質的に同じ（または改善された、もしくはそれが望ましいならば減少した）活性を有する、本明細書に開示された抗体を包含する。好ましくは、本発明の CDRは、３以下の保存的置換を有する。好ましくは、本発明のCDRは、2以下の保存的置換を有する。好ましくは、本発明のCDRは１つの保存的置換を有する。当業者は、保存的アミノ酸置換を有する抗体を当分野で周知の様々な技術によって調製することができることを認識するであろう。例えば、PCRアッセンブリ, Kunkel (dut-ung-)および チオホスフェート (Amersham Sculptor kit) オリゴヌクレオチド-標的突然変異誘発を含め、数多くの突然変異誘発を用いることができる。目的とする保存的置換を、好ましい置換と共に表１に示す。
【表１】
2005517384.tif 000002
【００６２】
本発明はさらに、配列番号２に示すポリペプチド, 配列番号４に示すポリペプチド, 配列番号６に示すポリペプチド, 配列番号８に示すポリペプチド, 配列番号１０に示すポリペプチド, 配列番号１２に示すポリペプチド, 配列番号１４に示すポリペプチド；および 配列番号１６に示すポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む抗体をコードする組換え 発現 ベクターを提供する。
【００６３】
本発明はさらに、抗体 重鎖および抗体 軽鎖の両方をコードする組換え 発現 ベクターを提供する。例えば、一態様では、本発明は、以下をコードする組換え 発現 ベクターを提供する：
a)配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体 重鎖；および 
b)配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体 軽鎖
。
【００６４】
発現したら、全抗体、それらの２量体、個々の軽鎖および重鎖,または本発明の他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換、アフィニティー、逆相、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等の、標準的な方法に従って精製することができる。医薬としての用途には、少なくとも約90〜95％均一な実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、98〜99％以上均一であるのが最も好ましい。部分的または所望の均一性にまで精製したら、本明細書に記載するようにポリペプチドを治療または予防に用いることができる。
【００６５】
本発明の抗体は、患者への投与に適した医薬組成物にすることができる。典型的には、医薬組成物は、本発明の抗体または抗体部分および製薬的に許容し得る希釈剤, 担体,および／または賦形剤を含有する。投与用の医薬組成物は選択された投与様式に適するように設計し、製薬的に許容し得る 希釈剤, 担体,および／または賦形剤、例えば分散剤、緩衝剤、界面活性剤、保存剤、溶解剤、等張剤、安定化剤などを適当に用いる。
【００６６】
本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を含有する医薬組成物は、標準的な投与方法を用いて、静脈内、腹腔内、皮下、肺、筋肉内、鼻内、舌下または座剤投与により、全身性 紅斑性狼瘡等の症状または病状に関連した自己免疫の危険性があるかまたは示す哺乳類に投与することができる。本発明の抗体は、非経口投与に適した医薬組成物に含有させることができる。静脈内または腹腔内または皮下注射による末梢への全身性送達が好ましい。そのような注射に適当なビークルが明らかである。さらに、鼻内用エアロゾルまたは座剤により粘膜を介して投与を行なうことができる。そのような様式に適当な製剤は周知であり、典型的には粘膜の通過を促進する界面活性剤を含む。
【００６７】
医薬組成物は、典型的に無菌であり、製造および保存状態では安定でなければならない。したがって、医薬組成物は、製剤を調製したのち滅菌濾過するか、そでなければ微生物許容状態（microbiologically acceptable）とすることができる。静脈内注入のための典型的な組成物は２５０ｍL程度の滅菌リンゲル液等の液量であり、抗体の濃度は1〜100 mg／ｍL以上である。本発明の治療剤は、保存のために全体を凍結するかまたは凍結乾燥することができる。使用するまえに適当な滅菌担体中に再構成することができる。凍結乾燥および再構成は抗体活性の損失の程度が変化する(例えば、慣用的な免疫グロブリンについて、ＩｇＭ 抗体はＩｇＧ 抗体よりも活性の損失は大きくなる傾向がある)。用量を調整して補う必要がある。製剤のpHは、抗体の安定性(化学的および物理的)のバランスを考慮して選択し、投与する患者の苦痛とならないようにする。一般的に、６〜８のpHが許容範囲である。
【００６８】
ＴＮＦＳＦ１３ｂは、免疫および炎症因子が関与する様々な疾患に関連する病状において重要な役割を担っている。したがって、本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を含有する医薬組成物は、ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性が原因である障害、例えば自己免疫疾患および炎症性疾患を含む免疫疾患、を処置するために用いることができる。好ましい疾患としては、全身性 紅斑性狼瘡, 慢性関節リウマチ, 若年型 慢性関節炎, Lyme 関節炎, クローン病, 潰瘍性大腸炎, 感染性大腸炎, 喘息, アレルギー性疾患, 乾癬, 移植片対宿主病, 臓器移植拒絶, 臓器移植に伴う急性または慢性免疫疾患, サルコイドーシス, 炎症性疾患, 寄生性疾患, 女性の不妊症, 自己免疫性血小板減少症, 自己免疫性甲状腺疾患, 橋本病, シェーグレン症候群,および癌、特にＢ細胞またはＴ細胞リンパ腫または骨髄腫が挙げられるがこれに限定されない。
【００６９】
より好ましくは、本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体および／または抗体断片を含有する医薬組成物は全身性 紅斑性狼瘡を処置するために用いる。
【００７０】
ＴＮＦＳＦ１３ｂ活性が原因である上記障害の少なくとも１つの処置のための医薬の製造における本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体の使用もまた意図する。
【００７１】
ある特定の状況では、本発明の本発明の抗体を、自己免疫および／または炎症性疾患の処置において有用な１またはそれ以上の更なる治療剤とともに製剤化するおよび／または投与する。そのような組合せ治療は投与する治療剤を低い用量で有利に利用することができ、種々の治療に伴う可能性のある毒性または問題を回避することができる。本発明の抗体を組合せ治療の一部として用いる場合、その抗体を単独で患者に投与するときよりも低い用量の抗体が望ましいかもしれないということを当業者は認識するであろう(例えば、治療を組合わせて用いることにより相乗的な治療効果を達成し得、所望の治療効果を達成するためのより少ない抗体の用量の使用が可能になる）。本発明の医薬組成物は、本発明の抗体の「治療上有効な量」または「製薬的に有効な量」を含有しうる。「治療上有効な量」は、用量および必要な期間での、所望の治療結果を達成するために有効な量を意味する。
【００７２】
抗体の治療上有効な量は、疾患の状態、その人の性別および体重および、抗体または抗体部分がその人において所望の応答を示す能力などの因子に従って変更してもよい。治療上有効な量はまた、その抗体または抗体部分が、毒性または有害な作用より治療上有益な効果が上回るような量である。「予防的に有効な量」は、用量および必要な期間での、所望の予防結果を達成するために有効な量を意味する。典型的に、予防的用量は、疾患の前または疾患の早期の段階で用いるので、好ましくは、予防的に有効な量は、治療上有効な量よりも少ない量であろう。
【００７３】
投与計画は最適な所望の応答をもたらすように調整することができる(例えば、治療的または予防的応答)。例えば、単一のボーラスを投与する、数回に分けた用量を所定の時間にわたって投与する、または用量を治療状況の要件に応じて増減することができる。
【００７４】
hＴＮＦＳＦ１３ｂに結合する能力によって、本発明の抗体は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または免疫組織化学等の慣用的なイムノアッセイを用いてＴＮＦＳＦ１３ｂポリペプチド (例えば、血清または血漿などの生物学的試料）を検出するために用いることができる。本発明は、生物学的試料中のＴＮＦＳＦ１３ｂの検出方法であって、生物学的試料を本発明の抗体または抗体の一部と接触させ、hＴＮＦＳＦ１３ｂに結合した抗体 (または抗体の部分)または結合しなかった抗体 (または抗体の一部)のいずれかを検出し、それによって生物学的試料中のhＴＮＦＳＦ１３ｂを検出することを含む方法を提供する。抗体は、結合したまたは結合しなかった抗体の検出を容易にする検出可能な適当な物質で直接または間接的に標識する。適当な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質および 放射性物質が挙げられる。適当な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適当な補欠分子団の例としてはストレプタビジン/ビオチンおよび アビジン/ビオチン、適当な蛍光物質としてはアンベリフェロン, フルオレセイン, フルオレセイン イソチオシアネート, ローダミン, ジクロロトリアジニルアミン フルオレセイン、塩化ダンシル または フィコエリトリン、発光物質の例としてはルミノール、および適当な放射性物質の例としては125I, 131I, 35S,または3Hが挙げられる。
【００７５】
抗体の標識に代わり、検出可能な物質で標識したＴＮＦＳＦ１３ｂ標準および標識していない抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を利用して、競合イムノアッセイにより生物学的液体におけるＴＮＦＳＦ１３ｂを分析することができる。この分析では、生物学的試料, 標識したＴＮＦＳＦ１３ｂ 標準および抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体を混合して、標識していない抗体に結合した標識したＴＮＦＳＦ１３ｂ 標準の量を測定する。生物学的試料中のＴＮＦＳＦ１３ｂの量は、抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体に結合した標識したＴＮＦＳＦ１３ｂ 標準の量に反比例する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、ＴＮＦＳＦ１３ｂのエピトープの結合によりＴＮＦＳＦ１３ｂ活性を中和する抗体の使用を提供する。このエピトープは、実施例１０に記載にしたがて同定した。例えばｈＴＮＦＳＦ１３ｂの可溶性部分は以下で示される。
【表２】
2005517384.tif 000003
【００７７】
新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第６９位のトレオニン、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシン、第１０５位のグルタミン酸、第１０６位のトレオニン、第１０７位のロイシン、第１０９位のアスパラギンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。別の態様では、新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第６９位のトレオニン、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシン、第１０５位のグルタミン酸、第１０６位のトレオニン、第１０７位のロイシン、第１０９位のアスパラギンからなる群から選択される少なくとも２つのアミノ酸を含む。別の態様では、新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第６９位のトレオニン、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシン、第１０５位のグルタミン酸、第１０６位のトレオニン、第１０７位のロイシン、第１０９位のアスパラギンからなる群から選択される少なくとも３つのアミノ酸を含む。別の態様では、新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第６９位のトレオニン、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシン、第１０５位のグルタミン酸、第１０６位のトレオニン、第１０７位のロイシン、第１０９位のアスパラギンからなる群から選択される少なくとも４つのアミノ酸を含む。
【００７８】
別の態様では、新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第１０５位のグルタミン酸と、第６９位のトレオニン、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。別の態様では、新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第１０６位のトレオニンと、第６９位のトレオニン、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。別の態様では、新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第１０７位のロイシンと、第６９位のトレオニン、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。別の態様では、新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第１０９位のアスパラギンと、第６９位のトレオニン、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。
【００７９】
さらに別の態様では、新規の抗ｈＴＮＦＳＦ１３ｂヒト抗体の結合に関与するｈＴＮＦＳＦ１３ｂアミノ酸は、第７１位のリジン、第７２位のトレオニン、第７３位のチロシンおよび第１０５位のグルタミン酸を含む。
【００８０】
以下の実施例は説明を意図するものであり本発明の限定を意図するものでない。
実施例１：抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒトモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体は、Medarex のHuMAb-MouseTM technology を用い、マウスを可溶性hＴＮＦＳＦ１３ｂ (アミノ酸 133〜285、RDI, Flanders, NJより購入)で免疫することにより作製した。HCo7および HCo12の両マウスを用いた。マウスをRIBI, Freund’s 完全アジュバントまたはFreund’s 不完全アジュバント中、１５〜５０ｇの可溶性hＴＮＦＳＦ１３ｂで免疫した。hＴＮＦＳＦ１３ｂに対して血清抗体力価を生じた８匹のマウスに、PBS 中１０μgのhＴＮＦＳＦ１３ｂを静脈内注射した。３日後に各マウスから脾臓を取り出し、Zola (Zola, H. モノクローナル抗体: A Manual of Techniques. CRC Press, Boca Raton, FL. (1987))に記載の方法に従って骨髄腫細胞と融合した。
【００８１】
ハイブリドーマをhＴＮＦＳＦ１３ｂに対する結合について試験し、それらがヒト免疫グロブリン重鎖および 軽鎖を発現することを確認した。hＴＮＦＳＦ１３ｂに結合する抗体はELISAにより以下のように検出した。
【００８２】
プレートを、ＰＢＳ中５μg／ｍL hＴＮＦＳＦ１３ｂ（50μL）で一晩４℃にてコーティングした。プレートを空にし、100μLPBS＋0.05％ Tween 20 (PBST)＋5％ 鶏血清で１時間室温でブロッキングした。PBSTで３回洗浄した後、プレートを乾燥させ、100μLの希釈した二次試薬 (HRP-HuＩｇＧFc, Jackson カタログ番号109-036-098またはHRP-HuKappa, Bethyl カタログ番号A80-115P; 1:5000 （ブロッキング緩衝液中）)を各ウェルに加えた。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを上記と同様に３回洗浄した。各プレートあたり、１０ｍLのクエン酸リン酸緩衝液（pH 4.0）、８０μLのABTS、８μLのH2O2 を用いて展開した。室温で３０分〜１時間インキュベーションした後、プレートの吸光度をA415-A490で読み取った。hＴＮＦＳＦ１３ｂに対する結合を示し、huＩｇＧ 重鎖および ヒトκ軽鎖であったハイブリドーマをサブクローニングのために選択した。
【００８３】
サブクローニングしたハイブリドーマの培地を、Amicon S3Y30 UF メンブレンを用いてAmicon ProFlux M12タンジェンシャル濾過システムで濃縮した。濃縮した培地をプロテインＡセファロースカラム(5〜20ｍLカラム)に流速5 ml/分で通した。吸光度がベースラインに戻るまでカラムを緩衝液Ａ(PBS, pH 7.4)で洗浄し、結合したポリペプチドを50 mMクエン酸（pH 3.2）で溶出した。画分を1M Tris, pH 8.0ですばやく中和した。次いで、カラムをSDS-PAGEにより解析した。抗体を含有する画分をプールし超遠心ユニット (Millipore, 分子量カット10 ＫDa)を用いて濃縮した。
【００８４】
実施例２:抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体の機能的活性
本発明の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体の中和活性をマウスIl-1 依存Ｂ細胞系列T1165.17を用いて測定した。細胞を分析培地 (10％ FBS、１ｍMピルビン酸ナトリウム、5×１０-5 M 2-メルカプトエタノールおよびペニシリン、ストレプトマイシンおよびフンギゾンを含有するRPMI1640)で３回洗浄したIL-1を除去した。細胞を、2.5ｎg／ｍL 可溶性huＴＮＦＳＦ１３ｂを含有する分析培地中で100,000細胞／ｍLに再懸濁し、5000細胞 細胞／ウェルになるよう96ウェルプレートにプレーティングし、5％ CO2中、３７℃でインキュベーションした。ELISA陽性のハイブリドーマの上清を１：４に希釈した。４８時間後、２０μLのPromega CellTiter 96 Aqueous One Solution (Madison, WI) を加え、プレートを5％ CO2 中37℃にて５時間インキュベーションした。吸光度をA490で読取り、増殖を測定した。ハイブリドーマ 上清の１つの中和活性の例として、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４を図１に示した。対照として、抗体をIL-1刺激細胞に加えた。hＴＮＦＳＦ１３ｂ刺激増殖のみでIL-1刺激増殖の阻害は見られなかった。
【００８５】
中和 抗体を、抗ＩｇＭ刺激に応答してＴＮＦＳＦ１３ｂ 増幅一次ヒトＢ細胞増殖を阻害する能力について試験した。一次ヒトＢ細胞を、MACSマグネティック単離システム(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用い、CD19ポジティブ選択を用いてｈト血液から単離した。10％ FCSを含む完全 RPMI (完全 RPMIは、10 mM L-グルタミン, 100 U／ｍLペニシリン, 100μg／ｍLストレプトマイシン, 1 mM ピルビン酸ナトリウム、0.1 mM 非必須アミノ酸および 1×１０-5 M β−メルカプトエタノールを含有するRPMI1640である)中のＢ細胞を96ウェル プレートのウェルに、各ウェルにつき2×１０5 細胞で加えた。ウェルのいくつかをＰＢＳ中の10μg／ｍLの抗ヒトＩｇＭ (BD PharMingen, Clone G20-127) で４℃で一晩コーティングし、PBSで４回洗浄した後、使用した。いくつかの細胞を、中和抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ 抗体 (2.5 μg／ｍL)の存在下または非存在下で、可溶性hＴＮＦＳＦ１３ｂ (25ｎg／ｍL)で刺激した。図２は、hＴＮＦＳＦ１３ｂの刺激作用を中和する４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の能力を示す。
【００８６】
実施例３：モノクローナル抗体の特徴付け
すべての中和 抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ 抗体は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４のいずれかであった。これらを変性状態のhＴＮＦＳＦ１３ｂに結合する能力について解析した。即ち、 hＴＮＦＳＦ１３ｂをSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースにブロッティングした。ウェスタンブロットではすべての中和 抗体がhＴＮＦＳＦ１３ｂに結合しなかったが、非中和抗体のいくつかは結合することが可能であった。
【００８７】
BIACoreシステムを用いた実験を行なって、非中和抗体および中和抗体がhＴＮＦＳＦ１３ｂの同じ部位に結合するかどうかを調べた。まず、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４をチップにコーティングした後、hＴＮＦＳＦ１３ｂ次いで飽和量の非中和抗体を注入した。飽和が達成したら、高濃度の４Ａ５−３．１．１−Ｂ４をチップに加えた。非中和モノクローナル抗体のうちの１１個が４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の同じ部位で競合することができなかった。１個の非中和ハイブリドーマが４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の結合を約４５％ブロックすることができ、これが４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ エピトープに近いエピトープを有することが示された。
【００８８】
同じ実験計画を用いて、中和 mAb, ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４が, could compete for the same binding site as one of the receptors for hＴＮＦＳＦ１３ｂに対するレセプターの１つ, TACIと同じ結合部位について競合することができることがわかった。これらの実験は、hＴＮＦＳＦ１３ｂ上でTACI-Fcおよび ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４が同じまたは重複したエピトープを有することを強く示唆している。
【００８９】
抗体溶液をCo+2をロードしたIMAC樹脂に通すことにより、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４を固相に固定した。結合させた後、樹脂を希過酸化溶液とインキュベーションすることによりコバルトを+3に酸化した。樹脂を洗浄した後、天然のhＴＮＦＳＦ１３ｂおよび修飾したhＴＮＦＳＦ１３ｂを(還元／アルキル化によりまたは末端変性により)カラムに通した。洗浄したのち、結合したタンパク質を酸性溶液で溶出し、溶出したタンパク質をMALDI MSで解析した。４Ａ５−３．１．１−Ｂ４は天然組換え hＴＮＦＳＦ１３ｂに結合したが、化学的にまたは熱により修飾された hＴＮＦＳＦ１３ｂには結合しなかった。したがって、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４は、可溶性hＴＮＦＳＦ１３ｂの立体構造依存のエピトープを認識していると考えられる。
【００９０】
組換え 可溶性hＴＮＦＳＦ１３ｂ (RDI)を４Ａ５−３．１．１−Ｂ４または抗ＴＮＦＳＦ１３ｂ ウサギポリクローナル抗体 (MoBiTec, Marco Island、FL; hＴＮＦＳＦ１３ｂのアミノ酸 254〜269に対する)と氷上で２時間インキュベーションし、タンパク質混合物をＰＢＳで平衡化したサイズ排除HPLC (２個のタンデムTosoHaas TSK-GEL G3000PW カラム)に0.25 ml/分の流速で流した。タンパク質をPBSで溶出した。対照として、抗体溶液およびhＴＮＦＳＦ１３ｂの溶液を別々に分析した。ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂは、ＴＮＦＳＦ１３ｂ分子の３量体に対応する位置でサイズ排除カラムから溶出した。３量体hＴＮＦＳＦ１３ｂの溶出は４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の存在下でより早いタイムポイントにシフトしたが、抗ＴＮＦＳＦ１３ｂポリクローナル抗体の不在下ではシフトせず、３量体hＴＮＦＳＦ１３ｂの４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 抗体への結合を示した。このデータは、中和 mAb ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４がhＴＮＦＳＦ１３ｂ上の立体配置依存のエピトープに結合し、hＴＮＦＳＦ１３ｂが３量体(生物学的に活性な状態)として存在しているときにのみエピトープが存在しうることを示している。
【００９１】
実施例４： BIAcoreによるモノクローナル抗体の親和性測定
hＴＮＦＳＦ１３ｂに対する種々の抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体の親和性をBIAcore 2000システムを用いて測定した。このシステムは、デキストランバイオセンサーマトリクス内で相互作用している分子のタンパク質濃度の変化を検出するために表面 プラスモン共鳴の光学特性を利用するものである。特記しないかぎり、物質はBIAcore AB (Upsala, Sweden)から入手した。測定はすべて２５℃で行なった。試料をHBS-EP緩衝液(150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005％ (w/v)界面活性剤P-20,および 10 mM HEPES, pH 7.4) 中に溶解した。アミンカップリングキットを用いてヤギ抗マウスＩｇＧ (Fc 特異的; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) をＣＭ５センサーチップのフローセル１に固定した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ (Fc 特異的；Jackson Immunoresearch)を、同じくアミンカップリングキットを用いてフローセル２に固定した。両抗体は、それぞれ700応答ユニットに達するよう固定化した。
【００９２】
組換え hＴＮＦＳＦ１３ｂ (Research Diagnostics, Inc., Flanders, NJ)の結合を、複数の解析サイクルを用いて評価した。各サイクルは、30μL／分の流速で行い、以下のステップからなる：２０μg／ｍLの４Ａ５−３．１．１−Ｂ４を１５０μL注入、250μLのhＴＮＦＳＦ１３ｂ (50 nMで開始し、各サイクルにつき２倍希釈)の注入、次いで１５分間の解離、および10 mM グリシンHCl（pH 1.5）９０μLを用いて再生。
【００９３】
各サイクルの会合および解離速度を、BIAevaluationソフトウエアにおいてLangmuir 1:1 結合モデルを用いて評価した。hＴＮＦＳＦ１３ｂに対する４Ａ５−３．１．１−Ｂ４のＫDは、38 pMであると求められた。
【００９４】
実施例５：重鎖および 軽鎖抗原結合領域のクローニングおよび配列決定
以下のプロトコルを用いて、中和ヒトmAb ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の重鎖および 軽鎖の可変領域をクローニングし配列を決定した。
キットに添付しているMicro-Fast Track プロトコル(Invitrogen)を用いて、2×１０6 ハイブリドーマ細胞からmRNAを調製した。cDNA サイクルキット(Invitrogen)を用い、mRNAのアリコートを１４０００ｒｐｍで３０分間４℃にて回転させた後、ペレットを70％エタノールで洗浄することにより、mRNA の200μLのエタノール沈殿からcDNAを調製した。風乾したペレットを11.5μLの滅菌水に再懸濁し、cDNAをキットの説明書にしたがって調製した。場合により、２回目のcDNA合成を省略したが、cDNAはフェノ/クロロホルム抽出ステップおよびエタノール沈殿を用いて清浄した。PCRで使用するため、cDNAペレットを３０μLのＴＥ中で再懸濁した。
【００９５】
定常領域の３’プライマーと対で、重鎖および軽鎖の可変領域の５’末端で変性プライマーを用いてＰＣＲ反応をセットした。各５０μLの反応溶液につき、ｃＤＮＡ１μLを用いた。PfuIでの使用に向けて反応をセットし、２０サイクル行なった。ＰＣＲ産物を各反応ごとに５μLを１％ アガロースゲル上を泳動させてチェックした。陽性の反応をZero Blunt TOPO PCRクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローニングした。陽性クローンのミニプレップを配列決定し、生産的な遺伝子の再配列のために解析した。独立したＰＣＲ反応の結果および複数のクローンの配列解析により以下に示す配列が明らかになった。
ヒト抗体 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 軽鎖 配列 (CDRを太字で示す) 
【表３】
2005517384.tif 000004
ヒト抗体 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 重鎖 配列 (CDRを太字で示し、シグナル配列を斜体で示す).
【表４】
2005517384.tif 000005
【００９６】
実施例６：抗hＴＮＦＳＦ１３ｂ ヒト抗体と非ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂとの種交差反応性
中和 mAbsの種交差反応性を調べるために、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４を補足抗体および検出抗体の両方として用いるELISAをセットした。ヒト組換え ＴＮＦＳＦ１３ｂを標準曲線として用いた。ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂは、hＴＮＦＳＦ１３ｂを発現するベクターでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の培地上清、培養したヒト単球またはヒト血清または血漿の上清において検出できた。マウスＴＮＦＳＦ１３ｂを発現するＣＨＯ細胞からの上清をELISAにおいて反応性について試験したが、陰性であった。４Ａ５−３．１．１−Ｂ４もまたマウスＴＮＦＳＦ１３ｂを沈殿させることはできなかったが、ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂは沈殿させることができた。このことは、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４がマウスＴＮＦＳＦ１３ｂを認識できないことを示している。
【００９７】
実施例７：重鎖 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４のアミノ酸配列
以下は、ＨＣＶＲおよびＩｇＧ４定常領域を含む重鎖 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 抗体のアミノ酸配列である。ヒトＩｇＧ４定常領域は、第231位にセリンを有する。しかし、この第231位の位置は、セリンから、最適な内部ジスルフィド結合を得るためにヒンジ領域の構造変化を引き起こすプロリンに置換した。これにより、半抗体（half antibody）の生成が減少する。半抗体は、１つの重鎖と１つの軽鎖から形成する。
【表５】
2005517384.tif 000006
【００９８】
さらに、第237位でのフェニルアラニンからアラニンの置換および第238位でのロイシンからアラニンまたはグルタミン酸への置換によって抗体のエフェクター機能が減少し得る。
【００９９】
実施例８：重鎖 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４のアミノ酸配列
以下は、ＨＣＶＲおよびＩｇＧ１定常領域を有する重鎖 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 抗体のアミノ酸配列である。
【表６】
2005517384.tif 000007
【０１００】
実施例９： 軽鎖 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４のアミノ酸配列
以下は、ＬＣＶＲおよびκ定常領域を含む軽鎖 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４ 抗体のアミノ酸配列である。
【表７】
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【０１０１】
実施例１０：４Ａ５−３．１．１−Ｂ４のエピトープの同定
４Ａ５−３．１．１−Ｂ４が結合しヒトＴＮＦＳＦ１３ｂを中和するエピトープを決定した。ヒトおよびマウスＴＮＦＳＦ１３ｂ配列を以下に示すとおり並べた。
【表８】
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【０１０２】
ＴＮＦファミリーのいくつかのメンバーの既知の結晶構造に基づいて、ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂについてのホモロジーモデルを作成した。４Ａ５−３．１．１−Ｂ４は、ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂを中和するがマウスＴＮＦＳＦ１３ｂは中和しないので、マウスＴＮＦＳＦ１３ｂとヒトＴＮＦＳＦ１３ｂとの間で異なる露出残基は、４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の潜在的な結合部位である。
【０１０３】
３つの潜在的なエピトープを同定した：1) K71、T72、Y73、E105；2) Q26、S29、L139、D140；および3) L53、K55、E56、Kl19。アミノ酸配列をヒトからマウスへ変化させることにより突然変異誘発を行ないキメラ分子を作製した。キメラＡは、L139R、D140Nであり、キメラＢはK71P、T72I、Y73Fであり、キメラＣはK71P、T72I、Y73F、E105Kであり、キメラＤはL53V、K55R、E56Qであり；キメラＥはE105Kであった。
【０１０４】
実施例２に記載の増殖分析を用いて、機能的活性および４Ａ５−３．１．１−Ｂ４による中和について全てのキメラを試験した。各キメラおよび両ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂとマウスＴＮＦＳＦ１３ｂ親分子について293の一過性トランスフェクションから得た上清を用いて最初の分析を行なった。全てのキメラは同様の増殖を誘導し、作製したキメラが機能的であることを示した。６μg／ｍLの４Ａ５−３．１．１−Ｂ４を用いた場合、ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂおよびキメラＡ、Ｂ、ＤおよびＥについて１００％の中和が観察された。マウスＴＮＦＳＦ１３ｂまたはキメラＣについては中和が観察されなかった。キメラＡＢＣについて精製ＴＮＦＳＦ１３ｂ突然変異体を製造し、11ｎg／ｍLの各親ＴＮＦＳＦ１３ｂまたはキメラＴＮＦＳＦ１３ｂおよび1μg／ｍLの４Ａ５−３．１．１−Ｂ４を用いて分析を繰り返した。結果は、ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂおよびキメラＡについて１００％の中和を示し、キメラＢについては８８％の中和を示し、マウスＴＮＦＳＦ１３ｂまたはキメラＣについて中和は観察されなかった。
【０１０５】
実施例１１： ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４を用いたin vivo試験
Hogan, B. et al. (1986) Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, NYに記載の確立された技術にFox and Solter (Mol. Cell. Biol. 8: 5470,1988による修飾を加えた方法を用い、可溶性ヒトＴＮＦＳＦ１３ｂを過剰発現するトランスジェニックマウスを作製する。簡潔に言えば、ｈＴＮＦＳＦ１３ｂ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、FVB/N株の新たに受精した１細胞期胚(接合体)の雄性前核にマイクロインジェクションする。胚を試験管内で一晩培養し、２細胞期胚まで発達させる。次いで、２細胞期胚を偽妊娠ＣＤ−１マウスの卵管に移植して出産まで生育させる。新生仔マウスの導入遺伝子の存在を試験するために、各マウスから足指を切断してプロテアーゼＫで消化して核酸を遊離させる。足指の抽出物の試料をPCR解析に付して、導入遺伝子を有するマウスを同定する。
【０１０６】
ｈＴＮＦＳＦ１３ｂ トランスジェニックマウスは、末梢Ｂ細胞の劇的な増加を有し、一般に、同齢、同性別の同腹子の約３倍である。同様に、末梢Ｔ細胞が若干増加する。ｈＴＮＦＳＦ１３ｂ トランスジェニックマウスを４Ａ５−３．１．１−Ｂ４で処置してｈＴＮＦＳＦ１３ｂの中和がＢ細胞数の減少をもたらし、正常レベルに戻すかどうかについて調べた。１５週齢で、ｈＴＮＦＳＦ１３ｂマウスに２５μg の４Ａ５−３．１．１−Ｂ４またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを週に２回を３週間皮下注射した。最後の注射から４日後に、マウスを屠殺して脾臓を取り出して解析した。フローサイトメトリーおよび白血球細胞絶対数を用いて、各脾臓について、Ｂ細胞についてはCD19＋細胞の百分率を測定することにより、Ｔ細胞についてはCD3＋細胞の百分率を測定することにより、Ｂ細胞およびＴ細胞数を計数した。ｈＴＮＦＳＦ１３ｂトランスジェニックマウスへの４Ａ５−３．１．１−Ｂ４の in vivo 投与がＴ細胞およびＢ細胞を正常な数（平均＋標準偏差）に戻すことができることが示す結果を以下に示す。
【表９】
2005517384.tif 000010
【０１０７】
本発明の配列：
配列番号１：軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列
【表１０】
2005517384.tif 000011
配列番号２：軽鎖可変領域をコードするアミノ酸配列
【表１１】
2005517384.tif 000012
配列番号３：軽鎖ＣＤＲ１をコードするポリヌクレオチド配列
【表１２】
2005517384.tif 000013
配列番号４：軽鎖ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
【表１３】
2005517384.tif 000014
配列番号５：軽鎖ＣＤＲ２をコードするポリヌクレオチド配列
【表１４】
2005517384.tif 000015
配列番号６：軽鎖ＣＤＲ２をコードするアミノ酸配列
【表１５】
2005517384.tif 000016
配列番号７：軽鎖ＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチド配列
【表１６】
2005517384.tif 000017
配列番号８：軽鎖ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
【表１７】
2005517384.tif 000018
配列番号９：重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列
【表１８】
2005517384.tif 000019
配列番号１０：重鎖可変領域をコードするアミノ酸配列
【表１９】
2005517384.tif 000020
配列番号１１：重鎖ＣＤＲ１をコードするポリヌクレオチド配列
【表２０】
2005517384.tif 000021
配列番号１２：重鎖ＣＤＲ１をコードするアミノ酸配列
【表２１】
2005517384.tif 000022
配列番号１３：重鎖ＣＤＲ２をコードするポリヌクレオチド配列
【表２２】
2005517384.tif 000023
配列番号１４：重鎖ＣＤＲ２をコードするアミノ酸配列
【表２３】
2005517384.tif 000024
配列番号１５：重鎖ＣＤＲ３をコードするポリヌクレオチド配列
【表２４】
2005517384.tif 000025
配列番号１６：重鎖ＣＤＲ３をコードするアミノ酸配列
【表２５】
2005517384.tif 000026
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】ヒト抗体 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４による、T1165.17細胞のhＴＮＦＳＦ１３ｂおよび IL-1誘発増殖の阻害を示すグラフ。
【図２】抗ＩｇＭで刺激した一次ヒトＢ細胞における、ヒト抗体 ４Ａ５−３．１．１−Ｂ４によるhＴＮＦＳＦ１３ｂ誘発増殖の中和を示すグラフ。
【配列表】
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2005517384.tif 000029
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【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年1月20日(2005.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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