(57)【要約】本発明は、一般式Ｘ−（Ａ）n−Ｙを有する化合物の使用に関し、式中：ｎは６〜２０の間で変化し、；Ｘは、水素原子、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、またはＲaＳＯ2基を表し、Ｒaは、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール基であり、上記基は、置換されるか、または非置換であり、ｎが６に等しい場合は、Ｘが、Ｈと異なるという条件であり；Ａは、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）を有する基のどちらかを示し、式中、Ｒiは、水素原子、アミノ酸側鎖、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、またはヘテロアリール基であり、上記基は、置換されるか、または非置換であり、ｉは、１〜ｎの間の整数であり、；Ｙは、ＮＲbＲc基であり、ＲbおよびＲcは、上でＲaに与えたのと同じ意味を有する。上記化合物は、細菌性、真菌性、または細胞障害性疾患の、および特にアスペルギルス症およびカンジダ症などの真菌性感染症、および耐性細菌性感染症を治療するために意図された薬物の調製に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌性、真菌性、または細胞障害性疾患、および特にアスペルギルス症およびカンジダ症などの真菌性感染症、および耐性細菌性感染症を治療するために意図された薬物の調製のための、一般式：
Ｘ−（Ａ）n−Ｙ，  （Ｉ）
〔式中：
−ｎは、６〜２０の間で変化し、
−Ｘは、水素原子、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、ＲaＳＯ2、またはＲaＮＨＣＳ基を表し、
Ｒaは、フルオレセインまたは（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基、ＳＨ基、マレイミド基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
ｎが６に等しい場合は、Ｘが、Ｈと異なるという条件であり、
−Ａは、
【化１】
2005504122.tif 000028
のどちらかを表し、
＊Ｒiは、水素原子、アミノ酸側鎖、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、または（Ｃ１〜Ｃ１０）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、アミジン、ベンズアミジン、イミダゾール、アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
＊ｉは、１〜ｎを含む整数であり、
−Ｙは、ＮＲbＲc基であり、ＲbおよびＲcは、先にＲiに対して与えた意味を有する〕
の化合物の使用。
【請求項２】
一般式：
Ｘ−（Ａ）n−Ｙ，（Ｉ）
〔式中：
−ｎは、６〜２０の間で変化し、
−Ｘは、水素原子、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、ＲaＳＯ2、またはＲaＮＨＣＳ基を表し、
Ｒaは、フルオレセインまたは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基、ＳＨ基、マレイミド基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
ｎが６に等しい場合は、Ｘが、Ｈと異なるという条件であり、
−Ａは、
【化２】
2005504122.tif 000029
のどちらかを表し、
＊Ｒiは、水素原子、アミノ酸側鎖、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、または（Ｃ１〜Ｃ１０）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、アミジン、ベンズアミジン、イミダゾール、アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
＊ｉは、１〜ｎを含む整数であり、
−Ｙは、ＮＲbＲc基であり、ＲbおよびＲcは、先にＲiに対して与えた意味を有し、
以下の式：
【化３】
2005504122.tif 000030
2005504122.tif 000031
に相当する化合物を除外するという条件である〕の化合物。
【請求項３】
ｎが、６、７、８、または９に等しいことを特徴とし、そして以下の式：
【表１】
2005504122.tif 000032
〔式中：
−ＸおよびＹは、請求項２で記載したとおりであり、
−Ａ1は、請求項２で記載したＡ基に相当し、式中Ｒiは、フェニルアラニン側鎖に相当するベンジル基、チロシン側鎖に相当する４−ヒドロキシベンジル基またはトリプトファン側鎖に相当する（３−インドリル）メチル基のような、芳香族側鎖を表し、
−Ａ2は、請求項２で記載したＡ基に相当し、式中Ｒiは、リジン（−（ＣＨ2）4−ＮＨ2）、アルギニン（−（ＣＨ2）3ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）、もしくはオルニチン（−（ＣＨ2）3ＮＨ2）に相当する塩基鎖、または（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル基を表し、上記基は、非置換であるか、またはアミジン、ＮＨ2、グアニジノ基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
−Ａ3は、請求項２で記載したＡ基に相当し、式中Ｒiは、アラニン側鎖に相当するメチル型、バリン側鎖に相当するイソプロピル、ロイシン側鎖に相当するイソブチル、およびイソロイシン側鎖に相当するｓｅｃ−ブチルの疎水性側鎖を表す〕
に相当する、請求項２記載の化合物。
【請求項４】
以下の式：
【化４】
2005504122.tif 000033
2005504122.tif 000034
（式中、Ｚは、水素原子またはＯＨ基のどちらかを表す）
に相当する、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
少なくとも約１０％、好都合には約１０％〜約５０％のＲi置換基が、塩基特性のアミノ酸側鎖であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６】
塩基特性のアミノ酸側鎖が、第一級、第二級、または第三級アミン基、イミダゾール、グアニジン、アミジン、またはベンズアミジン基を含むことを特徴とする、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
以下の一般式：
Ｘ−（Ａ）n−Ｙ，  （Ｉ）
〔式中：
−ｎは、６〜２０の間で変化し、
−Ｘは、水素原子、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、ＲaＳＯ2、またはＲaＮＨＣＳ基を表し、
Ｒaは、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基、ＳＨ基、マレイミド基、フルオレセインから選択される１〜６の置換基によって置換され、
ｎが６に等しい場合は、Ｘが、Ｈと異なるという条件であり、
−Ａは、
【化５】
2005504122.tif 000035
のどちらかを表し、
＊Ｒiは、水素原子、アミノ酸側鎖、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、または（Ｃ１〜Ｃ１０）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、アミジン、ベンズアミジン、イミダゾール、アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
＊ｉは、１〜ｎを含む整数であり、
−Ｙは、ＮＲbＲc基であり、ＲbおよびＲcは、先にＲiに対して与えた意味を有する〕
に相当し、
以下の特徴：
−約４．９Å〜約５．３Åを含む、そして特に約５Åに等しい、右への標準ピッチを有し、
−ターン当たり２．４〜２．６の残基、特にターン当たり２．５の残基を含み、
−原子の中心から計算したその内径は、約３．８Å〜約４．６Åを含み、特に約４．２Åに等しく、
−ファンデルワールス表面から計算したその内径は、約１．４Å〜約１．８Åを含み、特に約１．６Åに等しいである、
らせん構造を所有する化合物。
【請求項８】
以下の式：
【化６】
2005504122.tif 000036
2005504122.tif 000037
に相当する、請求項７記載の化合物。
【請求項９】
請求項７記載の少なくとも１つの化合物および少なくとも１つの溶媒を含有する組成物であって、上記溶媒が、らせん形である上記化合物の分子および非らせん形である上記化合物の分子との間で配座平衡の場合に、部分的でさえ、上記化合物の分子にらせん形を与える特性を有し、特にアルコール、ピリジン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ミセルまたは脂質の存在下もしくは非存在下の水から選択され、そして好都合にはミセルの存在下もしくは非存在下の水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、またはこれらの溶媒の混合物から選択される組成物。
【請求項１０】
活性成分として、請求項２〜６のいずれか一項記載の化合物の少なくとも１つを、薬学的に許容されるベクターと併せて含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１１】
単位用量当たり１０〜２０００mgの請求項２〜６のいずれか一項記載の化合物の少なくとも１つを含有することを特徴とする、請求項１０記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項８記載の化合物を、薬学的に許容されるベクターと併せて含むことを特徴とする、薬学的組成物。
【請求項１３】
薬学的ベクターとして請求項２〜８のいずれか一項記載の化合物の少なくとも１つを、薬学的活性成分と併せて含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１４】
薬学的ベクターとしての、請求項２〜８のいずれか一項記載の化合物の使用。
【請求項１５】
式ＧＰ−Ａ−Ｗ：
〔−ＧＰは、Ｆｍｏｃ、Ｔｅｏｃ、フタルイミド、Ａｌｌｏｃ、ＢＯＣ、およびＣｂｚから選択される保護基であり、
−Ａは、請求項２で記載したとおりであり、
−Ｗは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フェノール、ペンタフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジクロロ−６−ニトロフェノール、ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール、１−オキソ−２−ヒドロキシジヒドロベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、７−アザ−１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、４−アザ−１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾール（４−ＨＯＡｔ）、イミダゾール、テトラゾール、およびＷＡＮＧ樹脂から選択されるＷ−Ｈ基より生じ、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはｐ−ニトロフェノールである〕
の前−活性化モノマーからの、請求項２記載の式（Ｉ）の化合物の固相での調製のための方法であって、
以下の工程：
ａ）支持体のアミン官能基での上で定義したようなＧＰ−Ａ−Ｗの結合の工程であって、上記支持体の上記アミン官能基へのＡ−ＧＰ基のグラフトを可能にする工程、
ｂ）適切な条件下でのＧＰ基の開裂の工程、
ｃ）ｎ個のＡ基が上記支持体にグラフトされるまでの、工程ａ）およびｂ）の連続反復、
ｄ）Ｒaは請求項２で記載したとおりである、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、またはＲaＳＯ2基の導入の工程、
ｅ）請求項２に記載したように、樹脂の除去およびＹ基の放出を可能にする、適切な手段による支持体からの式（Ｉ）の化合物の開裂の工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
工程ａ）が、ＤＩＥＡ、コリジン、ＮＭＭ、またはルチジンのような第三級塩基の存在下もしくは非存在下にて、およびＨＯＢｔのような触媒の存在下もしくは非存在下にて実施され得ることを特徴とする、請求項１５記載の調製方法。
【請求項１７】
工程ａ）が、ＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＴＨＦ、またはＮ−メチルピロリドンのような溶媒中で実施され得ることを特徴とする、請求項１５記載の調製方法。
【請求項１８】
ＧＰ基が、Ｆｍｏｃ基であることを特徴とする、請求項１５記載の調製方法。
【請求項１９】
式ＧＰ−Ａ−Ｗ：
〔−ＧＰは、Ｆｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、ＢＯＣ、およびＣｂｚから選択される保護基であり、
−Ａは、請求項２で記載したとおりであり、
−Ｗは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フェノール、ペンタフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジクロロ−６−ニトロフェノール、ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール、１−オキソ−２−ヒドロキシジヒドロベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、７−アザ−１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、４−アザ−１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾール（４−ＨＯＡｔ）、イミダゾールおよびテトラゾールから選択されるＷ−Ｈ基より生じ、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはｐ−ニトロフェノールである〕
の前−活性化モノマーからの、請求項２記載の式（Ｉ）の化合物の液相での調製のための方法であって、
以下の工程：
ａ）Ｈ−Ａ−Ｙ誘導体のＡ基のアミン官能基への、上で記載したようなＧＰ−Ａ−Ｗの結合の工程、
ｂ）適切な条件下でのＧＰ基の開裂の工程、
ｃ）ｎ個のＡ基が、上記アミン官能基にグラフトされるまでの、工程ａ）およびｂ）の連続反復、
ｄ）Ｒaは、請求項２で記載したとおりである、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、またはＲaＳＯ2基の導入の工程、
ｅ）適切な手段による式（Ｉ）の化合物の開裂の工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
上で記載した化合物の１つまたは式（ＶＩＩｃ）もしくは（ＶＩＩｄ）の化合物の１つを、メタノール、エタノール、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、水のような溶媒と、または食塩リン酸緩衝液もしくは非食塩リン酸緩衝液のような生物学的緩衝液と、またはミセルもしくは脂質溶媒と接触させることによる、請求項７記載の化合物の調製のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な尿素オリゴマー、その調製方法、およびそれを含有する薬学的組成物に関する。
【０００２】
タンパク質の広範な機能多様性は、タンパク質の極めて高度な三次および／または四次構造に密接に関連付けられているが、それは基本的な基礎単位、すなわちらせん、シート、および屈曲の極めて小規模なセットに基づいており、これらの構造要素は、アミノ酸配列、すなわちタンパク質の一次構造によってそれ自体決定される。
【０００３】
近年、Ｓｅｅｂａｃｈ（Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｄ．；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７，２０１５）、Ｇｅｌｌｍａｎ（Ａｐｐｅｌａ，Ｄ．Ｈ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９７，１１８，１３０７１−１３０７２）、およびＨａｎｎｅｓｓｉａｎ（Ｈａｎｎｅｓｓｉａｎ，Ｓ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，８５６９−８５７０）の研究が、小型のオリゴ−βまたはγ−ペプチド（ω−ペプチド）、α−またはβ−アミノ酸のみの化合物は、溶液中および固相中で、タンパク質構造に類似したらせんまたはシート型の独自の安定および予測可能な二次構造を形成可能であることを明らかにした。Ｇｅｌｌｍａｎの文献（Ｇｅｌｌｍａｎ，Ｓ．Ｈ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９９８，３１，１７３−１８３）において、これらのオリゴペプチドは「フォルダマー」と呼ばれる。
【０００４】
これらのオリゴペプチドのタンパク質分解に対する耐性は、それらを新規な生物活性の発見のための、そしてタンパク質−タンパク質認識プロセスの妨害のための、医化学における良好および有望な候補にする。
【０００５】
現在までに、その骨格にアミド機能を含有しない鏡像的に純粋なオリゴマーの構造および生物特性に関して、非常にわずかなデータしか存在していない。
【０００６】
本発明の目的は、アミノ酸の側鎖を含み、上記分子の一次構造から独立した、すなわち側鎖から独立したらせん形構造を採ることが可能な、非ペプチド分子を提供することである。
【０００７】
本発明の目的は、らせん形配座を採ることが可能な、そして活性天然らせんを模倣することが可能な分子を提供することである。
【０００８】
本発明の目的は、その薬理学的特性が特にこれらのオリゴマーと細胞膜との相互作用による、薬物の調製のためのこれらの新規なオリゴマーの使用にも関する。
【０００９】
本発明は、細菌性、真菌性、または細胞障害性疾患の治療用の薬物の調製のための、一般式：
Ｘ−（Ａ）n−Ｙ，  （Ｉ）
〔式中：
−ｎは、６〜２０の間で変化し、
−Ｘは、水素原子、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、ＲaＳＯ2、またはＲaＮＨＣＳ基を表し、
Ｒaは、フルオレセインまたは（Ｃ１〜Ｃ１０アルキル）、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基、ＳＨ基、マレイミド基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
ｎが６に等しい場合は、Ｘが、Ｈと異なるという条件であり、
−Ａは、
【００１０】
【化７】
2005504122.tif 000002
【００１１】
のどちらかを表し、
＊Ｒiは、水素原子、アミノ酸側鎖、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、または（Ｃ１〜Ｃ１０）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、アミジン、ベンズアミジン、イミダゾール、アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
＊ｉは、１〜ｎを含む整数であり、
−Ｙは、ＮＲbＲc基であり、ＲbおよびＲcは、先にＲiに対して与えた意味を有する〕
の化合物の使用に関する。
【００１２】
本発明は、一般式：
Ｘ−（Ａ）n−Ｙ，  （Ｉ）
〔式中：
−ｎは、６〜２０の間で変化し、
−Ｘは、水素原子、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、ＲaＳＯ2、またはＲaＮＨＣＳ基を表し、
Ｒaは、フルオレセインまたは（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基、ＳＨ基、マレイミド基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
ｎが６に等しい場合は、Ｘが、Ｈと異なるという条件であり、
−Ａは、
【００１３】
【化８】
2005504122.tif 000003
【００１４】
のどちらかを表し、
＊Ｒiは、水素原子、アミノ酸側鎖、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、または（Ｃ１〜Ｃ１０）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、アミジン、ベンズアミジン、イミダゾール、アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
＊ｉは、１〜ｎを含む整数であり、
−Ｙは、ＮＲbＲc基であり、ＲbおよびＲcは、先にＲiに対して与えた意味を有し、
以下の式：
【００１５】
【化９】
2005504122.tif 000004
【００１６】
に相当する化合物を除外するという条件である〕
の化合物にも関するものである。
【００１７】
「Ａは、
【００１８】
【化１０】
2005504122.tif 000005
【００１９】
のどちらかを表し」という表現は、（Ａ）n鎖中のＡ基が、ランダムな方法で、上で定義した基の１つであることを意味する。
【００２０】
本発明は、ｎが、６、７、８、または９に等しいことを特徴とし、そして以下の式：
【００２１】
【表２】
2005504122.tif 000006
【００２２】
〔式中：
−ＸおよびＹは、上で定義したとおりであり、
−Ａ1は、上で定義したＡ基に相当し、式中Ｒiは、フェニルアラニン側鎖に相当するベンジル基、チロシン側鎖に相当する４−ヒドロキシベンジル基、またはトリプトファン側鎖に相当する（３−インドリル）メチル基のような、芳香族側鎖を表し、
−Ａ2は、上で定義したＡ基に相当し、式中Ｒiは、リジン（−（ＣＨ2）4−ＮＨ2）、アルギニン（−（ＣＨ2）3ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）、もしくはオルニチン（−（ＣＨ2）3ＮＨ2）に相当する塩基鎖、または（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル基を表し、上記基は、非置換であるか、またはアミジン、ＮＨ2、グアニジノ基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
−Ａ3は、上で定義したＡ基に相当し、式中Ｒiは、アラニン側鎖の相当するメチル型、バリン側鎖に相当するイソプロピル、ロイシン側鎖に相当するイソブチルおよびイソロイシン側鎖に相当するｓｅｃ−ブチルの疎水性側鎖を表す〕
に相当する、上で定義した化合物に関する。
【００２３】
本発明による好都合な化合物は、以下の式：
【００２４】
【化１１】
2005504122.tif 000007
2005504122.tif 000008
2005504122.tif 000009
【００２５】
（式中、Ｚは、水素原子またはＯＨ基のどちらかを表す）
に相当する、上で定義した化合物である。
【００２６】
本発明は、少なくとも約１０％、好都合には約１０〜約５０％のＲi置換基が、塩基特性のアミノ酸側鎖であることを特徴とする、上で定義した化合物にも関する。
【００２７】
「塩基特性のアミノ酸側鎖」という表現は、Ｂｒｏｎｓｔｅｄ定義により、プロトンを受容する能力を持つ少なくとも１以上の基を含む鎖を指す。例えばこれらの基は、（第一級、第二級、もしくは第三級）アミン、アミド、アミジン、ベンズアミジン、グアニジン、イミダゾール、イミダゾリン、またはピリジンでありうる。
【００２８】
本発明の好都合な化合物は、塩基性のアミノ酸側鎖が、第一級、第二級、もしくは第三級アミン基、イミダゾール、グアニジン、アミジン、またはベンズアミジン基を含有することを特徴とする、上で定義した化合物である。
【００２９】
上述の側鎖を担持する分子は、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩型の負に帯電した鎖を除いてカチオン性であり、したがって負に帯電した微生物表面に静電気的に引き付けられる。グラム陰性細菌の場合、分子は、最初に、外部膜のリポ多糖類（ＬＰＳ）が豊富な壁と相互作用する。グラム陽性細菌の場合、テイコ酸ならびにタイクロン酸およびペプチドグリカン中のアミノ酸残基のカルボキシル基の存在により、表面が負に帯電している。細胞膜に達すると、カチオン性分子は、次に外部壁のリン脂質の負に帯電した末端と相互作用することができる（Ｔｏｓｓｉら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０００，５５，４−３０）。
【００３０】
本発明は、以下の一般式：
Ｘ−（Ａ）n−Ｙ，  （Ｉ）
〔式中：
−ｎは、６〜２０の間で変化し、
−Ｘは、水素原子、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、ＲaＳＯ2、またはＲaＮＨＣＳ基を表し、
Ｒaは、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、（Ｃ１〜Ｃ５）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基、ＳＨ基、マレイミド基、フルオレセインから選択される１〜６の置換基によって置換され、
ｎが６に等しい場合は、Ｘが、Ｈと異なるという条件であり、
−Ａは、
【００３１】
【化１２】
2005504122.tif 000010
【００３２】
のどちらかを表し、
＊Ｒiは、水素原子、アミノ酸側鎖、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ５〜Ｃ１２）アリール、（Ｃ５〜Ｃ１４）アラルキル、または（Ｃ１〜Ｃ１０）ヘテロアリール基であり、上記基は、非置換であるか、またはハロゲン原子、ＮＯ2、ＯＨ、アミジン、ベンズアミジン、イミダゾール、アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ＮＨ2、ＣＮ、トリハロメチル、（Ｃ１〜Ｃ４）アシルオキシ、（Ｃ１〜Ｃ４）ジアルキルアミノ、グアニジノ基から選択される１〜６の置換基によって置換され、
＊ｉは、１〜ｎを含む整数であり、
−Ｙは、ＮＲbＲc基であり、ＲbおよびＲcは、先にＲiに対して与えた意味を有する〕
に相当し、
以下の特徴：
−約４．９Å〜約５．３Åを含み、そして特に約５Åに等しい、右への標準ピッチを有し、
−ターン当たり２．４〜２．６の残基、特にターン当たり２．５の残基を含み、
−原子の中心から計算したその内径は、約３．８Å〜約４．６Åを含み、特に約４．２Åに等しく、
−ファンデルワールス表面から計算したその内径は、約１．４Å〜約１．８Åを含み、特に約１．６Åに等しいである、
らせん構造を所有する化合物に関する。
【００３３】
「残基」とは、上で定義したＡ基を指す。
【００３４】
「原子の中心から計算した内径」という表現は、核磁気共鳴によって得られたデータからモデル化された構造の標準部分において、らせんの軸がわかっていれば、正反対に位置する２個の原子間の直径を定義できることを示す。得られた距離は次に、原子の中心から測定される。
【００３５】
「ファンデルワールス表面から計算した内径」という表現は、構造の標準部分において、らせんの軸がわかっていれば、正反対に位置する２個の選択された原子間の直径を定義できることを示す。得られた距離は次に、選択された２個の原子のファンデルワールス半径から引いた、以前に計算された距離である。例として、以下の原子のファンデルワールス半径：水素原子では１．２Å。酸素原子では１．５Å。窒素原子では１．６Å。炭素原子では１．７Å。そして硫黄原子では１．８Å、を与えることができる。
【００３６】
本発明の化合物のらせん構造が一部は、ｉ残基のＣＯ基の酸素原子およびｉ＋３残基のＮＨ基ならびにｉ＋２残基のＮ′Ｈの水素原子２個それぞれとの間の水素結合２個から生じることに注目する。より明確にするために、ＣＨ2基およびＣＯ基の間に位置する窒素原子は、Ｎ′によって表される。
【００３７】
一方では、ｉ残基のＣＯ基の酸素原子およびｉ＋３残基のＮＨ基の水素原子との間の、他方ではｉ残基のＣＯ基の酸素原子およびｉ＋２残基のＮ′Ｈ基の水素原子との間の、これらの水素結合は、１２または１４の原子を持つ環の形成につながる。実際に、ｉ残基のＣＯ基およびｉ＋３残基のＮＨ基の水素原子の間の水素結合は１４原子環を閉じるが、一方ｉ残基のＣＯ基およびｉ＋２残基のＮ′Ｈ基の水素原子の間の水素結合は、１２原子環を閉じる。
【００３８】
メタノール中およびピリジン中でＮＭＲにより観測されたらせん構造を、円偏光二色性（ＣＤ）の特性信号と関連付けることが可能である。
【００３９】
円偏光二色性は、タンパク質またはＤＮＡなどの生体巨大分子の構造に関する情報の重要な供給源となる（Ｇ．Ｄ．Ｆａｓｍａｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｒ  Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９６）。円偏光二色性は、偏光ビームの左（Ｅｌ）に向くおよび右（Ｅｒ）に向く２つの構成要素を異なる方法で吸収する、光学活性分子の能力の波長の関数としての測定である。したがって光学活性は、試験した媒体の光学異方性に関連付けられる。光学活性吸収バンドが明示されているスペクトル領域における、差分吸収（円偏光二色性）および左ならびに右の偏光の透過速度の差（光学活性）との併用は、コットン効果と呼ばれる（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｃｒａｂｂｅ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｄｅ  ｌａ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｒｏｔａｔｏｉｒｅ  ｏｐｔｉｑｕｅ  ｅｔ  ｄｕ  ｄｉｃｒｏｉｓｍｅ  ｃｉｒｃｕｌａｉｒｅ  ｏｐｔｉｑｕｅ  ｅｎ  ｃｈｉｍｉｅ  ｏｒｇａｎｉｃ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｖｉｌｌａｒｓ，Ｐａｒｉｓ，１９６８）。
【００４０】
メタノール中では、メタノール中のヘプタマーおよびナノマーのらせん形（最大２０５nm）に恐らく相当する強いコットン効果が観測され、より短いオリゴマー：残基１がアシル化されないヘキサマーの信号の非存在（残基３との水素結合に関与することが可能なカルボニル基の不在）は、この波長ではほとんど信号を与えない。ヘプタマーの場合、温度の関数としての２０５nmにおける信号の試験は、後者が温度の上昇に対してあまり感受性ではないことを示し、二次構造が６０℃まで持続することと、アンフォールディング機構が非協調的である（負勾配を持つ直鎖が得られる）ことを示唆する。化合物を加熱することによって、構造は少しずつ不安定化され、分子の完全な変性は恐らく、多数の部分的に折り畳まれた中間体状態を経過する：このことは次に、非協調効果と呼ばれる。
【００４１】
トリフルオロエタノール中では特性信号は消えるが、これに対して水中では、２０５nmにおいて信号の一部が残り、このことはらせん構造が一部は水中に存在することを示唆している。
【００４２】
らせん状化合物を得るためには、最低６個の残基が必要であることも注目される。しかし、残基６個（ｎ＝６）の場合、らせん構造を安定化するためには、ＮＨ末端基をアシル基によって保護することが好都合または必要でさえある。
【００４３】
「らせん構造を所有する化合物」という用語は、らせん形構造が全体である化合物およびらせん形構造が一部である化合物の両方を示す。
【００４４】
部分らせん形構造は、分子の一部のみが、らせんの構造特徴を採用している場合、またはらせん形および他の配座状態の間に動的平衡が存在する場合のどちらかに定義される。これは、溶液中のＮＭＲまたは円偏光二色性を含む各種の技法によって観測できる。熱的試験によりらせんの安定性も測定できる。
【００４５】
本発明は、上で定義し、以下の式：
【００４６】
【化１３】
2005504122.tif 000011
2005504122.tif 000012
【００４７】
の１つに相当する化合物にも関する。
【００４８】
本発明は、上で定義した少なくとも１つの化合物および少なくとも１つの溶媒を含有する組成物にも関し、上記溶媒は、らせん形である上記化合物の分子および非らせん形である上記化合物の分子との間で配座平衡の場合に、部分的でさえ、上記化合物の分子にらせん形を与える特性を持ち、アルコール、ピリジン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ミセルまたは脂質の存在下もしくは非存在下の水から特に選択され、そしてミセルの存在下もしくは非存在下の水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、ジメチルスルホキシド、またはこれらの溶媒の任意の混合物から好都合に選択される。
【００４９】
ピリジンまたはメタノール中で構造は、極めて安定および明確である。水中では、円偏光二色性によって実施された測定は、２０５nmにおける信号がメタノール中よりも弱いため、らせん形構造は部分的でありうることを示唆している。しかし構造は、熱的試験によっても測定できる。
【００５０】
本発明は、式ＧＰ−Ａ−Ｗ：
〔−ＧＰは、Ｆｍｏｃ、Ｔｅｏｃ、フタルイミド、Ａｌｌｏｃ、ＢＯＣ、およびＣｂｚから選択される保護基であり、
−Ａは、上で定義したとおりであり、
−Ｗは、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド、フェノール、ペンタフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジクロロ−６−ニトロフェノール、ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール、１−オキソ−２−ヒドロキシジヒドロベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、７−アザ−１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、４−アザ−１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾール（４−ＨＯＡｔ）、イミダゾール、テトラゾール、およびＷＡＮＧ樹脂から選択されるＷ−Ｈ基より生じ、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはｐ−ニトロフェノールである〕
の前−活性化モノマーからの、上で定義した式（Ｉ）の化合物の固相での調製のための方法であって、
以下の工程：
ａ）支持体のアミン官能基での上で定義したようなＧＰ−Ａ−Ｗの結合の工程であって、上記支持体の上記アミン官能基への−Ａ−ＧＰ基のグラフト（graft）を可能にする段階、
ｂ）適切な条件下でのＧＰ基の開裂の工程、
ｃ）ｎ個のＡ基が、上記支持体にグラフトされるまでの、工程ａ）およびｂ）の連続反復、
ｄ）Ｒaは、上で定義したとおりである、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、またはＲaＳＯ2基の導入の工程、
ｅ）上で定義したように樹脂の除去およびＹ基の放出を可能にする、適切な手段による支持体からの式（Ｉ）の化合物の開裂の工程、
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００５１】
「前−活性化モノマー」とは、尿素またはカルバミン酸塩をそれぞれ生成するために、有機溶媒中の塩基の存在下もしくは非存在下に、一般に周囲温度において、第一級もしくは第二級アミンと反応することが可能なカルバミン酸またはカルボン酸誘導体を示す。
【００５２】
保護基：Ｆｍｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ａｌｌｏｃ、ＢＯＣ、およびＣｂｚ基は、それぞれフルオレニルメトキシカルボニル、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル、およびベンジルオキシカルボニル基に相当することを想起すべきである。
【００５３】
固相での上述の調製方法の結合工程は、有機溶媒（ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＮＭＰ）中で、前−活性化モノマーの溶液（樹脂の遊離アミンの量に対して１〜２０当量）をヒドロキシベンゾトリアゾールのような触媒の存在下または非存在下で、溶媒中の樹脂の懸濁液に添加することによって実施する。本工程に、有機塩基（ＤＩＥＡ、ＮＭＭ、ピリジン、Ｅｔ3Ｎ、コリジン、ルチジンなど）の添加が続けることも、続けないことも可能である。
【００５４】
開裂工程は、保護基ＧＰに応じて選択される。Ｆｍｏｃ基の場合、後者は、ＤＭＦ中ピペリジンの２０％溶液によって脱保護することができる。Ｔｅｏｃ基の場合、後者は、フッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液によって脱保護することができる。これらの技法は、標準であり、主に、Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉによる“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ”（Ｅｄｉｔｉｏｎｓ  Ｔｈｉｅｍｅ）に述べられている。
【００５５】
次にオリゴマーは、配列の最後の残基Ａまで、結合および開裂工程の反復によって伸長される。
【００５６】
最後のＧＰ基の脱保護の後、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、またはＲaＳＯ2基は、適切な場合、標準条件下での、樹脂のアミンと例えば塩化アシル（ＲaＣＯＣｌ）、混合無水物（ＲaＯＣＯＯＲa）、イソシアナート（ＲaＮＣＯ）、または塩化スルファニル（ＲaＳＯ2Ｃｌ）との反応によって導入することができる。
【００５７】
開裂工程は、ＴＦＡ／Ｈ2Ｏ／トリイソプロピルシラン混合物（９．５／２．５／２．５）のようなペプチド合成に使用される周知の混合物による、酸性溶媒中での樹脂の処理によって実施できる。
【００５８】
本発明による好都合な調製方法は、工程ａ）が、ＤＩＥＡ、コリジン、ＮＭＭ、またはルチジンのような第三級塩基の存在下もしくは非存在下にて、およびＨＯＢｔのような触媒の存在下もしくは非存在下にて実施され得るということを特徴とする、上で定義した調製方法である。
【００５９】
定義により、ＤＩＥＡは、ジイソプロピルエチルアミンを示し、ＮＭＭは、Ｎ−メチルモルホリンを示し、ＨＯＢｔは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを示す。
【００６０】
本発明は、工程ａ）が、ＤＭＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＴＨＦ、またはＮ−メチルピロリドンのような溶媒中で実施され得ることを特徴とする、上で定義した調製方法にも関する。
【００６１】
本発明による好都合な調製方法は、ＧＰ基がＦｍｏｃ基であることを特徴とする、上で定義した調製方法である。
【００６２】
本発明は、式ＧＰ−Ａ−Ｗ：
〔−ＧＰは、Ｆｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ、ＢＯＣ、およびＣｂｚから選択される保護基であり、
−Ａは、上で定義したとおりであり、
−Ｗは、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド、フェノール、ペンタフルオロフェノール、ペンタクロロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジクロロ−６−ニトロフェノール、ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアゾール、１−オキソ−２−ヒドロキシジヒドロベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、７−アザ−１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、４−アザ−１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾール（４−ＨＯＡｔ）、イミダゾールおよびテトラゾールから選択されるＷ−Ｈ基より生じ、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはｐ−ニトロフェノールである〕
の前−活性化モノマーから、上で定義した式（Ｉ）の化合物の液相中での調製方法であって、
以下の工程：
ａ）Ｈ−Ａ−Ｙ誘導体のＡ基のアミン官能基への、上で定義したようなＧＰ−Ａ−Ｗの結合の工程、
ｂ）適切な条件下でのＧＰ基の開裂の工程、
ｃ）ｎ個のＡ基が、上記アミノ官能基にグラフトされるまでの、工程ａ）およびｂ）の連続反復、
ｄ）Ｒaは、上で定義したとおりである、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、またはＲaＳＯ2基の導入の工程、
ｅ）適切な手段による式（Ｉ）の化合物の開裂の工程。
を含むことを特徴とする方法に関する。
【００６３】
液相での上述の調製工程の結合工程は、有機溶媒（ＤＭＦ、ＴＨＦ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＮＭＰ）中で、前−活性化モノマーの溶液（開始Ｈ−Ａ−Ｙ誘導体の第一級または第二級アミンの量に対して１〜１．５当量）を添加することによって実施する。本工程に、有機塩基（ＤＩＥＡ、ＮＭＭ、ピリジン、Ｅｔ3Ｎ、コリジン、ルチジンなど）の添加が続けることも、続けないことも可能である。本工程には、薄相クロマトグラフィーが続く。反応の終了時に炭酸水素ナトリウムの飽和溶液を、次に例えばジクロロメタンを添加する。有機相は、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液によって、次にＮａＣｌの飽和溶液によって洗浄する。有機相は場合により、酸性溶媒（１ＮのＨＣｌまたは１ＮのＫＨＳＯ4）中で洗浄することができる。有機相を回収し、ＭｇＳＯ4上で乾燥させ、予想される化合物を生成するために溶媒を蒸発させる。粗生成物が、不純物を含有している場合、適切な溶媒系を用いてシリカゲルによるクロマトグラフィーで精製することができる。
【００６４】
開裂工程は、保護基ＧＰの脱保護に相当する。ＢＯＣ基の場合、後者はＴＦＡによって脱保護することができる。Ｔｅｏｃ基の場合、後者はフッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液によって脱保護することができる。これらの技法は標準であり、主に、Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉによる“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ”（Ｅｄｉｔｉｏｎｓ  Ｔｈｉｅｍｅ）に述べられている。
【００６５】
次にオリゴマーは、配列の最後の残基Ａまで、結合および開裂工程の反復によって伸長される。
【００６６】
最後のＧＰ基の脱保護の後、ＲaＣＯ、ＲaＯＣＯ、ＲaＮＨＣＯ、またはＲaＳＯ2基は適切な場合、標準条件下での、脱保護されたアミンと例えば塩化アシル（ＲaＣＯＣｌ）、混合無水物（ＲaＯＣＯＯＲa）、イソシアナート（ＲaＮＣＯ）、または塩化スルファニル（ＲaＳＯ2Ｃｌ）との反応によって導入することができる。最終化合物は、シリカによるクロマトグラフィーによって精製できる（順相または逆相）。
【００６７】
本発明は、上で定義した化合物の１つあるいは式（ＶＩＩｃ）または（ＶＩＩｄ）の化合物の１つを、メタノール、エタノール、トリフルオロエタノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、水のような溶媒と、または食塩リン酸緩衝液もしくは非食塩リン酸緩衝液のような生物学的な緩衝液と、またはミセルもしくは脂質溶媒と接触させることによる、上で定義した化合物の調製のための方法にも関する。
【００６８】
式（ＶＩＩｃ）の化合物は、以下の式：
【００６９】
【化１４】
2005504122.tif 000013
【００７０】
に相当する、ＯＬ−７と呼ばれる化合物である。
【００７１】
式（ＶＩＩｄ）の化合物は、以下の式：
【００７２】
【化１５】
2005504122.tif 000014
【００７３】
に相当する化合物である。
【００７４】
本発明は、細菌性、真菌性、または細胞障害性疾患の、および特にアスペルギルスおよびカンジダのような真菌性感染症、および耐性細菌性感染症の治療用の薬物の調製のための、上で定義した化合物の使用に関する。
【００７５】
「細菌性疾患」とは、以下の細菌：
・Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（レジオネラ菌）、レジオネラ症に関連する細菌、
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｏ１５７：Ｈ７：１９８２年に発見され、通常、汚染された食物によって伝染するこの細菌は、溶血性および尿毒性症候群の罹患源である、
・Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ（ボレリア・ブルグドルフェリ）：１９８２年に米国で検出され、ライム病の原因であるとして同定されている、
・Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌）Ｏ１３９：伝染性コレラに関連する新しい菌株、
・Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｒｏｌｉ（ヘリコバクター・ピロリ）：胃腸潰瘍と関連する細菌、
に関連する新興感染症を意味する。
【００７６】
ますます広範囲の抗生剤に対して耐性になりつつある細菌に関連する感染症も示される。それゆえ多くの領域において、安価である第一の目的の抗生剤は、以下の細菌：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｄｅ（肺炎連鎖球菌）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｃｃａｌｉｓ（腸球菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｃａ（淋菌）、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ（肺炎球菌）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（赤痢菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ブドウ球菌毒素ショックに関連する）、およびＭｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（カタル球菌）、
に関連する感染症に対する有効性を失っている。
【００７７】
「真菌性疾患」とは、以下の病原性真菌：カンジダ症に関連するＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダ・アルビカンス）、アスペルギルス症に関連するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ（アスペルギルス・ニジュランス）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ（アスペルギルス・パラシティカス）、およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（アカパンカビ）、
によって引き起こされる感染症を示す。
【００７８】
真菌性疾患は、病原性真菌、特に不完全菌類族の菌類によって、特にモニリアまたは肉座菌族の菌類またはｓｐｈａｅｒｉａｌｅｓ（スフェリアーレ）目の菌類によっても引き起こされる疾患を含む。
【００７９】
「細胞障害性疾患」とは、特に癌、および特に消化系（肝臓、腸、食道、膵臓など）、泌尿生殖器系（子宮、前立腺、腎臓、膀胱など）、内分泌腺、目、皮膚、乳房、骨、神経系、胸郭（肺など）の腫瘍を示す。
【００８０】
本発明は、薬学的に許容されるベクターと併せて、上で定義した化合物の少なくとも１つを活性成分として含むことを特徴とする、薬学的組成物に関する。
【００８１】
本発明による好都合な薬学的組成物は、単位用量当たり上で定義した化合物の１つの１０〜２０００mgを含有することを特徴とする、上述の薬学的組成物である。
【００８２】
本発明による薬学的組成物は、経口、非経口、直腸または局所経路によって投与することができる。
【００８３】
経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸薬、粉末（特にゼラチンカプセルもしくはカシェ剤）、または顆粒を使用できる。これらの組成物において、本発明による活性成分は、澱粉、セルロース、サッカロース、ラクトース、またはシリカのような１以上の不活性希釈剤と混合される。これらの組成物は、他の物質、例えば１以上のステアリン酸マグネシウムまたはタルクのような潤滑剤、着色剤、コーティング（糖コーティング）、またはワニスも含むことができる。
【００８４】
経口投与用の液体組成物として、水、エタノール、グリセロール、植物油、またはパラフィン油のような不活性希釈剤を含有する、薬学的に許容される溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、およびエリキシルを使用できる。これらの組成物は、他の物質、例えば湿潤生成物、甘味料、増粘剤、着香料、または安定剤も含む。
【００８５】
非経口投与用の滅菌組成物は好ましくは、水性または非水性溶液、懸濁液、またはエマルジョンでもよい。溶媒またはビヒクルとして、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、特にオリーブ油、適切な有機エステルを使用することができる。これらの組成物はアジュバント、特に湿潤剤、等張剤、乳化剤、分散剤、および安定剤も含有することができる。滅菌は、異なった方法、例えば無菌濾過によって、滅菌剤の組成物中への含有によって、照射によって、または加熱によって行うことができる。それらは、注射用滅菌溶媒中に使用時に溶解することができる、滅菌固体組成物の形で調製することもできる。
【００８６】
直腸投与用の組成物は、活性成分に加えて、ココアバター、半合成グリセリド、またはポリエチレングリコールのような賦形剤を含有する座薬もしくは直腸カプセルである。
【００８７】
局所投与用の滅菌組成物は、例えば、クリーム、軟膏、ローション、洗眼剤、うがい剤、点鼻剤、またはエアロゾルでもよい。
【００８８】
好ましい投与方法は、非経口経路および経口経路である。
【００８９】
薬理学的用量は、治療の求められる効果および持続時間によって変わり；それらは一般に、０．００１mg／kg／日〜１００mg／kg／日、および好ましくは１〜２０mg／kg／日を含む。
【００９０】
これらの量は、１回以上の用量で投与することができる。
【００９１】
本発明による好都合な薬学的組成物は、薬学的に許容されるベクターと併せて、ＯＬ−９と呼ばれる、上で定義した化合物を含むことを特徴とする薬学的組成物である。
【００９２】
別の実施態様により、本発明は、薬学的活性物質と併せて、本発明による少なくとも１つの化合物を薬学的ベクターとして含むことを特徴とする薬学的組成物にも関する。
【００９３】
本発明は、本発明による化合物の薬学的ベクターとしての使用にも関する。
【００９４】
「薬学的ベクター」とは、組合わせることにおいて見出される生体膜または外被、特に細胞膜、核膜、または皮膚への、物質の通過を促進する、本発明による化合物を示す。
【００９５】
本発明のあるオリゴマーは、インビトロおよびインビボで膜と相互作用して、哺乳類細胞中に透過する能力を持つ。この特性がそれらを、組織、特に皮膚、細胞膜を通じた、またはこれらの細胞の核も通じた、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドのような、治療対象の分子の透過を促進するための有用な化合物にする。この特性は、対象のペプチドの生物学的利用能を上昇させることを可能にするために有用である。ペプチドは、共有結合的な方法でその輸送体と併用するか、または単に後者と混合することができる。共有結合の場合、潜在的に加水分解性の化学結合、特にエステル、オキシム、またはアミド結合または還元可能である化学結合、特にジスルフィドブリッジが好ましい。輸送体が、その機能を確保する能力は、ある数の塩基性残基、好ましくはアミン、グアニジノ、またはベンズアミド基の存在に関連付けられる。輸送体の機能を確保する残基の好都合な数は、ｎ＝４〜１０である。塩基性残基の数は、好都合には、４０％〜１００％を含む。
【００９６】
実際に、従来技術より、最小数の連続アルギニン残基を持つペプチド（オリゴ−Ａｒｇ）は、細胞内に内部化させることが可能であり、選択した分子にペプチドまたは活性成分を輸送する役割を果たすことができる（Ｐ．Ａ．Ｗｅｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０００  Ｎｏｖ  ２１；９７（２４）：１３００３−８）。分子の輸送能力は、ペプチド配列中のアルギニンの相対位置に依存しうることが示されている（Ｊ．ＲｏｔｈｂａｒｄらＪ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００２  Ａｕｇ  １５；４５（１７）：３６１２−８）。らせん形構造の場合、それゆえ両親媒性らせんとなる、らせんの同じ面へのアルギニンの配置が、輸送特性を向上させうることが示されている（Ａ．Ｈｏら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１  Ｊａｎ  １５；６１（２）：４７４−７）。本発明の好都合な化合物の設計は、本発明に述べたらせん形構造の知識によって理論的に説明することが可能であり、らせん軸の垂直面におけるその投影は、化合物の両親媒特性を描出するために使用できる。本発明で述べるらせん形構造２．５に基づく両親媒性らせん設計の例を、以下に提案する。Ａ2およびＡ3基は、上で定義したとおりであり、Ａ2は、優先的にグアニジン、ベンズアミジン、またはアミド基を含み、Ｐｉは、配列中の残基の位置を示す。
【００９７】
【表３】
2005504122.tif 000015
【００９８】
上で定義した以下の配列：
【００９９】
【表４】
2005504122.tif 000016
【０１００】
は、細胞内部化に使用することができる。
【０１０１】
Ｘ基の選択は、重要であり、好都合には、
１）細胞に透過する分子（活性成分、ペプチド、オリゴヌクレオチド）への続いての連結（結合）を可能にする官能性、
または
２）Ｘ基は、以下の残基のアミンと、ＦＩＴＣ（フロオレセインイソチオシアナート、Ｆｌｕｋａによる市販製品Ｒｅｆ．４６９５０）との反応生成物でもありうる。本誘導体は、試験したオリゴマーが、細胞内部化特性を持つことを証明するために有用である、
を含む。
【０１０２】
４つの例を以下に示す。
選択１）チオールまたは核イミド基を含む別の分子自体への固着（anchoring）を可能にするチオール基：
【０１０３】
【化１６】
2005504122.tif 000017
【０１０４】
選択２）細胞内部化試験のためのフルオレセイン官能基：
【０１０５】
【化１７】
2005504122.tif 000018
【実施例】
【０１０６】
本発明の化合物、特にＯＬ−９およびＯＬ−７の調製
本発明のオリゴマーおよび特にＯＬ−９およびＯＬ−７は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ａｒｇ（ＰＭＣ）、またはＡｒｇ（Ｐｂｆ）の側鎖を担持するカルバミン酸スクシンイミジル１より５０μｍｏｌのスケールで、市販のＲｉｎｋアミド樹脂（４−（２′，４′−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミド−４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂）から固相中で合成した（Ｇｕｉｃｈａｒｄら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４１，１５５３−１５５７に従って調製）。
【０１０７】
【化１８】
2005504122.tif 000019
【０１０８】
ＤＭＦ２ml中の所望のカルバミン酸塩１（４当量）を、ＤＭＦ（２ml）中の上述の樹脂の懸濁液に添加し、続いてＮ−メチルモルホリン（１当量）を添加した。反応は、９０分間行わせ、樹脂の濾過後に再開させた。次にＦｍｏｃ基を、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンを用いた処理によって開裂させた。樹脂の洗浄および濾過の技法は、Ｆｍｏｃ基の脱保護と同様に、固相のペプチド合成で一般に使用されるものである。操作全体（Ｆｍｏｃの結合および脱保護）は、樹脂の開裂（ＴＦＡ、水／トリイソプロピルシラン：Ｆｍｏｃ方法での固相のペプチド合成で使用される標準開裂）後に、純度がそれぞれ６５％および３２％（ＨＰＬＣによって決定）の粗生成物ＯＬ−７およびＯＬ−９を生成するために、配列中の次の残基の側鎖を保有するカルバミン酸塩１を用いて、複数回再開した。純生成物は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって、およびＨＰＬＣによって特性を明らかにした。
【０１０９】
結果
ＯＬ−７：
−ＨＰＬＣ保持時間：１４．５８分（Ａ：Ｈ2Ｏ中の０．１％ＴＦＡ；Ｂ：ＣＨ3ＣＨ中の０．０８％ＴＦＡ、２０分に渡る５〜６５％Ｂ）（ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸）。
−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：１０５１．５［Ｍ＋Ｈ］+
【０１１０】
ＯＬ−９：
−ＨＰＬＣ保持時間：１５．２分（Ａ：Ｈ2Ｏ中の０．１％ＴＦＡ；Ｂ：ＣＨ3ＣＮ中の０．０８％ＴＦＡ、２０分に渡る５〜６５％Ｂ）（ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸）。
−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）：１３９３．１［Ｍ＋Ｈ］+
【０１１１】
固相で合成した２つのオリゴマーＯＬ−７およびＯＬ−９の配座研究は、最初にピリジン−ｄ5（ピリジン中では、ＮＨプロトンの信号はクロロホルムまたはメタノール中よりも良好に分散され、その信号の属性が助長される）中で、次に重水素化メタノールＣＤ3ＯＨ中で、一次元および二次元核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって実施した。
【０１１２】
共鳴の属性は、配列の決定と同様に、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ、およびＲＯＥＳＹ実験によって実施した。
【０１１３】
定義により、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ（二量子フィルターによる相関分光法）、ＴＯＣＳＹ（全相関分光法）、およびＲＯＥＳＹ（回転フレームオーバーハウザー効果分光法）が、標準分光技法であることが想起される。
【０１１４】
二次構造の決定のために重要なデータのある量は、一次元スペクトルおよびＣＯＳＹ実験から抽出した。
【０１１５】
以下の表１および２は、化合物ＯＬ−７（図１および２を参照）の残基１〜７の、および化合物ＯＬ−９の残基１〜９のＮＨおよびＮ′Ｈ基のプロトンについて計算された温度係数（ｐｐｂ．Ｋ-1における）を示す。
【０１１６】
【表５】
2005504122.tif 000020
【０１１７】
【表６】
2005504122.tif 000021
【０１１８】
これらの数値は、線形回帰によって得た直線の傾きを計算することによって、温度の関数として、化学シフト曲線より規定される。
【０１１９】
これらの温度係数は、ｐｐｂ．Ｋ-1で表され、δΔ／δＴで示される。
【０１２０】
これらの２つの分子の温度係数の測定（ＯＬ−７については約１００℃まで加熱）は、ＯＬ−７の残基４−７およびＯＬ−９の４−９のＮＨプロトンが、溶媒とあまり接近性でなく、そして水素結合によって潜在的に連結されている（ノナマーでは−Δδ／ΔＴ＜２．５）（一般に、温度係数が５を超える２つのＮ末端残基を除く）ことを示唆する。中央の残基のＮ′Ｈプロトンは、更に負の温度係数を持つ（オリゴマーＯＬ−７の場合、残基３−７では３．５＜−Δδ／ΔＴ＜３．８）；したがってそれらは恐らく、溶媒により接近性であり、それゆえ、各尿素官能基内の相当するＮＨそれぞれよりも、水素結合に関与していない。
【０１２１】
その上、結合定数Ｊ（ＮＨ，βＣＨ）は、高く（２つのＮ末端残基を除く、定数は、約９〜１０Ｈｚである）、そして温度変化に対してあまり感受性でない（以下の表３および４を参照）。
【０１２２】
表３  温度の関数としての、ＯＬ−７の残基２〜７のＨｚにおける結合定数3Ｊ（ＮＨ，βＣＨ）の変動の研究
【０１２３】
【表７】
2005504122.tif 000022
【０１２４】
表４  温度の関数としての、ＯＬ−９の残基２〜９のＨｚにおける結合定数3Ｊ（ＮＨ，βＣＨ）の変動の研究
【０１２５】
【表８】
2005504122.tif 000023
【０１２６】
更に、αＣの２つのジェミナルプロトンは、化学シフトに著しい相違を持つ（中央残基３〜６では１．３＜Δδ＜１．６ｐｐｍおよび残基２ならびに７ではΔδ＝１．０−１．１ｐｐｍ）。αＣが持つ２つの各ジアステレオトピックプロトンの明確および識別可能な空間配置を反映するこの相違は、温度範囲を通じて一定のままである。
【０１２７】
オリゴマーＯＬ−７の場合、３３２Ｋにおける残基３の定数3Ｊ（αＣＨ2，Ｎ′Ｈ）および3Ｊ（βＣＨ，αＣＨ2）の定数の値の注意深い調査によって（以下の表５を参照）、干渉からの非免除性が最も低いαＣＨプロトンが、Ｎ′Ｈとの高い結合定数（１０Ｈｚ）およびβＣＨとの低い結合定数（２．５Ｈｚ）を持つことを明らかにし、このことは、このプロトンがＮ′Ｈに対して実際的にアンチペリプラナー（antiperiplanar）配置にあり、βＣＨに対して向斜していることを示す。
【０１２８】
表５  化合物ＯＬ−７の残基３のプロトンの化学シフトおよび結合定数
【０１２９】
【表９】
2005504122.tif 000024
【０１３０】
続いて、ＣＯＳＹスペクトルで大きな結合定数3Ｊ（αＣＨ2，Ｎ′Ｈ）を持つαＣＨプロトンが、αＣＨＳｉプロトンであることを前提として、立体特異属性を実施した。これらのデータは、オリゴマーＯＬ−７およびＯＬ−９が、溶液中で明確な、安定二次構造を取ることを示す。
【０１３１】
二次構造について更に正確な情報を得るために、混合時間３００ｍｓでＲＯＥＳＹスペクトルを記録した。ＯＬ−７およびＯＬ−９について、特に強いβＣＨｉ／Ｎ′Ｈｉ＋2との多数のＮＯＥ残基間相関ｉ／（ｉ＋２）が、ピリジン中で、しかしメタノール中でも観測可能であり、βＣＨｉ／Ｎ′Ｈｉ＋2相関が、配列を通じて反復される（以下の表６を参照）。
【０１３２】
ＮＯＥ相関は、２つのプロトンの間の「オーバーハウザー」効果の測定に相当することが想起される（Ｋ．Ｗｕｔｈｒｉｃｈ、ＮＭＲ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ，１９８６，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）。
【０１３３】
表６  ３３２Ｋにおけるピリジン−ｄ5中でのＯＬ−７の残基間ＮＯＥ
【０１３４】
【表１０】
2005504122.tif 000025
【０１３５】
配列を通じたＮＯＥ相関のこのような反復は、γ−ペプチドの場合で既に提案された２．５−（ｐ）型らせんと一致している。２．５−（ｐ）型らせんは、ターン当たり２．５の残基を含む右巻きらせん（Ｐ）であることを想起すべきである。
【０１３６】
ピリジン中で記録されたスペクトル中で同定されたＮＯＥは、ピークの量の関数として、距離のカテゴリーによって分類した。これらの距離の制約および結合定数3Ｊに由来する骨格のあるねじれ角に関連する情報に基づいて、Ｄｉｄｉｅｒ  Ｒｏｇｎａｎグループとの共同研究（ＵＭＲ  ＣＮＲＳ−ＵＬＰ  ７０８１，Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ）において、シミュレートされたアニーリングによる分子モデル化および分子力学による研究をヘプタマーＯＬ−７で実施した。この研究は、このオリゴマーのらせん構造および得られた構造の安定性を確認した。
【０１３７】
それは約５オングストロームのピッチおよびらせんのターン当たり約２．５の残基数を所有する右巻きらせんである。らせんは、ｉ残基のＣ＝Ｏおよびそれぞれ残基ｉ＋２およびｉ＋３にそれぞれ相当する同じ尿素官能基の２つのＮＨ（Ｎ′ＨおよびＮＨ）との間の分子内水素結合のネットワークにより、配列を通じて安定化される。水素結合Ｃ＝Ｏｉ-----ＮＨｉ＋3（１４原子を持つ偽環を閉じる）は統計的に、水素結合Ｃ＝Ｏｉ-----Ｎ′Ｈｉ＋2（１２原子を持つ偽環を閉じる）よりも多く存在する。
【０１３８】
本溶媒中での構造を確認するメタノール中のＮＭＲ研究に基づいて、円偏光二色性（ＣＤ）研究は、メタノール中で、しかし水およびトリフルオロエタノール中でも実施した（図３を参照）。本研究は、メタノール中でのヘプタマーおよびノナマーのらせん状形の信号特性（２０５nmにて最大）およびより短いオリゴマーの信号の欠如を明らかにした（図４を参照）：ヘキサマーは、この波長において本質的に信号を生成しない。それゆえ、メタノール中のらせんの形成には、最低７の尿素結合が必要であることが結論付けられる。
【０１３９】
オリゴマーＯＬ−９の場合、温度の関数としての２０５nmにおける信号の研究は、これが温度の上昇に対してあまり感受性でないことを示し、二次構造が、６０℃まで持続すること、そしてアンフォールディング機構が、非協調的である（負の勾配の直線が、得られる）ことを示唆している。水中では、信号の一部が、２０５nmに残るため、トリフルオロエタノール中では、特性信号は、消失する。
【０１４０】
二次らせん構造に特徴的な２０５nmにおける強い信号の存在は、変化した配列の尿素オリゴマー中の二次構造の存在を迅速に同定するために、円偏光二色性が好都合に使用できることを示唆する。
【０１４１】
溶血性試験
試験の原理：
細菌の膜に作用する化合物は、哺乳類細胞の膜を潜在的に阻害することができる。赤血球は、脆化した膜の孔を通じて放出されるヘモグロビンの量を測定することによって膜透過の度合が容易に評価され、そしてその濃度が、４５０nmにおける光学密度に正比例する真核細胞のモデルとして役立つ。
【０１４２】
試験の使用：
赤血球は、新鮮に採取したサル血液（マカク）から調製した。ヘパリン添加血液を遠心分離し、そして冷ＰＢＳによって３回洗浄し、そしてＰＢＳ中に１０％（体積／体積）にて再懸濁させた。試験する生成物の水溶液１０μlを、赤血球懸濁液９０μlに添加した。赤血球を３７℃にて１時間インキュベートした。溶血度に依存して多少赤い上澄を回収するために、懸濁液を遠心分離した。上澄中に放出されたヘモグロビンの濃度を４５０nmにおける光学密度によって測定した。負の対照では、赤血球を生成物の非存在下でインキュベートし、そして懸濁液１ml当たり塩化セチルピリジニウム１００μgによって、０．１００％溶血のＯＤが得られることを示した。溶血度は、試験した生成物の各種濃度について、正の対照に関して評価した。
【０１４３】
結果：
溶血性試験の結果を図５のグラフにまとめる。
【０１４４】
濃度１mg／mlの濃度では、ＯＬ−９は、溶血１０％に達するのに対して、同じ側鎖を持つ対照ＬおよびＤペプチドは、それぞれ同じ濃度にて、約５０％および６０％超の溶血に達することに注目する。したがって、天然ペプチドは、真核細胞にとって比較的毒性であるのに対し、抗菌活性を示したオリゴマーＯＬ−９は、用量約１mg／mlにおいて、真核細胞に対してごくわずかに毒性であるか、または毒性でないことが結論付けられる。
【０１４５】
抗菌および／または抗真菌活性の評価試験：
試験の原理：
試験した化合物はすべて、ポリ尿素クラスの一部を形成し、化学経路によって実験室にて得た。細菌および真菌の成長阻害の試験は、液体試験にて実施した。各分子の特異的活性は、ＭＩＣと呼ばれる、細菌および／または真菌の増殖に対する最小阻害濃度によって表される。ＭＩＣは、各化合物に特異的な値であり、試験した生物に応じて変化する。ＭＩＣ値は、一連の試験にて試験した化合物の２ｘ２希釈による対数級数に従うことに注目すべきである。試験した分子は、塩の形で行い、それは水溶性で微生物の培地とした。
【０１４６】
試験の使用：
試験を実施する場合、９６ウェルプレートを使用した。各ウェルは、最終濃度１ｍＯＤを有するために、ＰＢ培地（Ｐｏｏｒ  Ｂｒｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ）中で希釈された細菌の懸濁液９０μlを含有していた。１mg／ml〜２μg／mlの範囲の濃度の滅菌水中の１０μlの溶液中の化合物を試験に添加した。プレートを２９℃にて２４時間攪拌下で設置した。細菌の成長は、培地の濁度を測定することおよび５９５nmにおけるＯＤを測定することによって測定した。ＭＩＣの値は、細菌の無増殖が記録される場合（ＯＤ＝０）の、試験物質の濃度に相当する。
【０１４７】
抗真菌試験は、培地としての１／２ＰＤＢ（ジャガイモデキストロース培養液、Ｄｉｆｃｏ）および培地１ml当たり１０，０００胞子を用いて、同様の方法で実施した。真菌の場合、繊維状真菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（アスペルギルス・フミガーツス）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（アカパンカビ））の菌糸体の形成を評価するために、倒立顕微鏡下での光学対照が必要であった。２９℃にて４８時間の培養の後、ＣＭＣを決定し、ＣＭＣは菌糸体の形成が観測されない場合の濃度に相当する。
【０１４８】
内部対照を使用した。これらは標準防腐剤の塩化セチルピリジニウムおよび臭化デクアリニウムを包含していた（Ｍｅｒｃｋ  ｉｎｄｅｘ）。
【０１４９】
結果：
オリゴマー９（ＯＬ−９）
分子量（＋３ＴＦＡ）＝１７３２．８２ｇ・ｍｏｌ-1
【０１５０】
Ｌペプチド（対照）
分子量（＋３ＴＦＡ）＝１４７２．４４ｇ・ｍｏｌ-1
【０１５１】
【表１１】
2005504122.tif 000026
【０１５２】
一連の試験において試験した化合物の濃度は、培養液１００μg／ml〜０．２μg／mlで変化する。１０〜５０μg／mlの値を含む活性は、低いと見なされる。０．１〜１０μgの活性を備えた化合物は、市販の抗生剤と同じ桁の活性を持つ。試験した化合物のうちの最良は、幅広い活性スペクトルをとともに活性３μg／mlを持つ。
【０１５３】
本試験より、オリゴマーＯＬ−９が、抗菌活性の幅広いスペクトル（Ｅ  Ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｌｏａｃａｅ（サルモネラ・クロアカ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌））を持つこと、そして非天然型オリゴマーのこの族および酸素化類似体（オリゴカルバミン酸）は、新規な抗生剤の開発のための対象候補となることが明らかになる。
【０１５４】
オリゴマーの内部化能力の評価試験
オリゴ尿素をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２）に溶解させ、その濃度を４９０nmにおけるフルオレセインの吸収によって決定した。サンプルの秤量、それに続く既知量のＰＢＳ緩衝液へのその溶解は、輸送体の濃度を正確に規定することができた。ＵＶ分光法により決定した濃度は、手動で測定した量に一致した。すべての細胞内部化測定に、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中のウシ胎仔血清１０μl中で培養したＴ  Ｊｕｒｋａｔ細胞株を用いた。微量滴定プレートのウェル中の総体積２００μl中の３ｘ１０5個の細胞に、可変量のオリゴマーを添加し、そして２３℃で３分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、細胞を単離して、冷ＰＢＳで３回洗浄し、次に０．１％ヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳ中で再懸濁させた。次に細胞を蛍光フローサイトメトリー（Ｆａｘｓｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって解析し、ヨウ化プロピジウムによって染色された細胞を分析から除外した。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】温度（Ｋでの）の関数として、オリゴマーＯＬ−７のＮＨプロトンの化学シフトの変化を表す。  本発明によるオリゴマーの残基の式が、想起されるべきである：  −ＮＨ−ＣＨＲi−ＣＨ2−Ｎ′Ｈ−ＣＯ−  黒四角の付いた曲線は、残基２（Ａｌａ）のプロトンに相当する；黒三角の付いた曲線は、残基３（Ｖａｌ）のプロトンに相当する；黒丸の付いた曲線は、残基４（Ｔｙｒ）のプロトンに相当する；白四角の付いた曲線は、残基５（Ａｌａ）のプロトンに相当する；白三角の付いた曲線は、残基６（Ｖａｌ）のプロトンに相当する；白丸の付いた曲線は、残基７（Ｔｙｒ）のプロトンに相当する。
【図２】温度（Ｋでの）の関数として、オリゴマーＯＬ−７のＮ′Ｈプロトンの化学シフトの変化を表す。灰色丸の付いた曲線は、残基１（Ｔｙｒ）のプロトンに相当する；黒四角の付いた曲線は、残基２（Ａｌａ）のプロトンに相当する；黒三角の付いた曲線は、残基３（Ｖａｌ）のプロトンに相当する；黒丸の付いた曲線は、残基４（Ｔｙｒ）のプロトンに相当する；白四角の付いた曲線は、残基５（Ａｌａ）のプロトンに相当する；白三角の付いた曲線は、残基６（Ｖａｌ）のプロトンに相当する；白丸の付いた曲線は、残基７（Ｔｙｒ）のプロトンに相当する。  図１および２の各曲線について、線形回帰を実施した。これらの線形回帰は、直線の傾きを得ることを可能にし、温度係数に相当する（表１および２を参照）。これらの値は、溶媒に対するプロトンの接近性および水素結合におけるその関与に関する情報を与える。この図の絶対値（特に４以下）が低くなればなるほど、プロトンが溶媒により接近しやすくなり、水素結合により関与することができる。したがってこれらの測定値によって、オリゴマーの中央のプロトンが、末端のプロトンよりも水素結合により関与することを確認することが可能となる。
【図３】各種の溶媒、すなわちメタノール、水、およびトリフルオロエタノールにおける化合物ＯＬ−７の円偏光二色性による研究を表す。この図の曲線は、θをnmでの波長の関数として示す。  θは、モル楕円率であり、°．cm2．dmol-1で表される。  θは、正または負であることが可能であり、その値は、オリゴマーの二次構造に関連付けられる。この現象（コットン効果）は、ペプチドおよび他の種類の非天然性オリゴマーについて非常によく知られている。  黒三角の付いた曲線は、メタノール中で研究を行った化合物ＯＬ−７に相当する；黒丸の付いた曲線は、トリフルオロエタノール中で研究を行った化合物ＯＬ−７に相当し、黒四角の付いた曲線は、水中で研究を行った化合物ＯＬ−７に相当する。
【図４】メタノール中での化合物ＯＬ−６（ヘキサマー）、ＯＬ−７およびＯＬ−９の円偏光二色性による研究を表す。  化合物ＯＬ−６は、以下の式：
【化１９】2005504122.tif 000027
に相当する。
この図の曲線は、nmでの波長の関数としてθ（°．cm2．dmol-1のモル楕円率）を表す。
黒丸の付いた曲線は、化合物ＯＬ−６に相当する；黒四角の付いた曲線は、化合物ＯＬ−７に相当する；黒三角の付いた曲線は、化合物ＯＬ−９に相当する。
【図５】本発明による化合物ＯＬ−９に実施した溶血性試験の結果を表す。  このグラフは、試験を行った化合物のμg／mlでの濃度の関数としての光学密度を表す。  白三角の付いた曲線は、塩化セチルピリジニウムに相当する（この化合物は内部対照として役立つ）；黒四角の付いた曲線は、対照Ｄペプチドに相当する；黒三角の付いた曲線は、対照Ｌペプチドに相当し、黒丸の付いた曲線は、化合物ＯＬ−９に相当する。  対照Ｄペプチドは、以下の配列：  Ｈ−ＤＴｙｒ−ＤＬｙｓ−ＤＬｅｕ−ＤＶａｌ−ＤＰｈｅ−ＤＬｙｓ−ＤＡｌａ−ＤＶａｌ−ＤＴｙｒ−ＮＨ2によって表される。  対照Ｌペプチドは、以下の配列：  Ｈ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＮＨ2によって表される。
【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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