(57)【要約】  ライブラリ、特にディスプレイライブラリをスクリーニングするシステム、方法および装置を開示する。方法は、自動化することができ、または少なくとも部分的に機械化することができる。ディスプレイライブラリスクリーニングプロセスなどのライブラリスクリーニングプロセスのインターフェースとなるソフトウエアおよびデータベースも開示する。コンピュータシステムを使用して、様々な自動ステーションからのアッセイ結果および試料追跡を含む情報を保存し、管理し、作成することができる。このシステムは、プロジェクト管理、データ分析、および試料のタッキング（ｔａｃｋｉｎｇ）および監査のためのインターフェースを備えることができる。データベースは、ライブラリスクリーニング中に同定されるヒットを管理することができる。このデータベースは、プロジェクト、ライブラリ、スクリーンおよびヒットの表を含むリレーショナルデータベースとすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ライブラリ情報を管理する機械化された方法であって、
（ａ）個々のライブラリメンバと（ｂ）複数の前記個々のライブラリメンバの各々についてのアッセイ情報との関連性を含む情報を保存するステップと；
該保存された情報を評価して前記個々のライブラリメンバのサブセットを同定するステップと；
を含む方法。
【請求項２】
前記ライブラリメンバが、ディスプレイライブラリメンバを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記評価ステップが、前記保存された情報を選別して、関連するアッセイデータが判定基準を満たすディスプレイライブラリメンバのサブセットを同定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記選別ステップの前に、さらに、前記判定基準についての情報を含むクエリを受信するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ディスプレイライブラリメンバが、第１の選択において前記ライブラリから抽出されるメンバと、第２の選択においてライブラリから抽出されるメンバとを含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ディスプレイライブラリメンバが、それぞれ個々のディスプレイライブラリメンバのクローンの物理的位置によって同定される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイデータが、インビトロでの活性評価に関係する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記活性が結合活性である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ディスプレイライブラリメンバの各々が、１つまたは複数の第１のアレイの一義的なアドレスに保存される、請求項２に記載の方法であって、
保存されたライブラリメンバの順序または総数が、前記第１のアレイに保存された総数の順序とは異なるように、前記サブセットの各メンバを１つまたは複数の第２のアレイの一義的なアドレスに移すよう試料取扱い装置に命令するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
グラフィカルユーザインターフェースを含むディスプレイコンソールと；
実験装置と情報を送受信する通信インターフェースと；
方法を実行するように構成されたプロセッサと；
を備えるシステムであって、前記方法が、
ライブラリメンバアッセイデータを含む情報を前記通信インターフェースから受信するステップと；
（ａ）ライブラリメンバと（ｂ）前記ライブラリメンバアッセイデータとの関連性を含む情報を保存するステップと；
前記保存情報を評価してライブラリメンバのサブセットを同定するステップと；
前記ディスプレイコンソール上に前記評価の結果を表示するステップと；
を含んでなる、上記システム。
【請求項１１】
ライブラリメンバを選択する方法であって、
それぞれが多様なタンパク質成分をコードする核酸を含む複数のメンバを含むライブラリを用意するステップと；
前記ライブラリから１セットのメンバを選択するステップと；
前記１セットのメンバを評価して、前記セットのそれぞれ個々のメンバに対する機能パラメータを得るステップと；
前記セットのそれぞれ個々のメンバに対する前記機能パラメータについての情報を保存用コンピュータサーバに送信するステップと；
判定基準を満たす機能パラメータを特徴とする前記セットのサブセットを同定するために使用可能な機能判定基準を前記サーバに照会するステップと；
前記保存情報を選別して、関連する機能アッセイデータが前記判定基準を満たすライブラリメンバのサブセットを同定するステップと；
を含む、上記方法。
【請求項１２】
前記複数の各メンバが、さらに、前記それぞれのメンバの前記核酸によってコードされる前記多様なタンパク質成分を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ライブラリメンバの前記セットを選択するステップが、
前記ディスプレイライブラリメンバを標的と接触させるステップと；
前記標的に結合するメンバを前記標的に結合しない他のメンバから分離させるステップと；
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ライブラリメンバの前記セットを選択するステップが、
（ａ）前記ライブラリメンバを標的に接触させるステップと；
（ｂ）前記標的に結合するメンバを前記標的に結合しない他のメンバから分離させるステップと；
必要に応じて、（ｃ）前記標的に結合するメンバを増幅させるステップと；
の４サイクル未満を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記同定されたサブセットのメンバの前記多様なタンパク質成分に対応するタンパク質を産生するステップと；
前記タンパク質を医薬組成物として製剤するステップと；
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）所与の特性を有するポリペプチドを同定するためのスクリーンについての情報と、
（ｂ）ポリペプチドをそれぞれコードするディスプレイライブラリメンバの識別子と、
（ｃ）前記ディスプレイライブラリメンバの少なくとも一部に対する機能アッセイの結果と、
（ｄ）前記ディスプレイライブラリメンバの少なくとも一部に対する生体高分子配列と
を表すデータ；ならびに
（１）前記スクリーン情報と前記ディスプレイライブラリメンバ識別子、および（２）ディスプレイライブラリメンバ識別子と機能アッセイ結果を関係付ける関連性；
を含む、機械的にアクセス可能な媒体。
【請求項１７】
スクリーンについての前記情報が、標的、スクリーニング条件、およびライブラリのうち１つ以上ついての情報を含む、請求項１６に記載の媒体。
【請求項１８】
前記データが、さらに、１つまたは複数のスクリーンについての情報に関連する各プロジェクトについての情報を表す、請求項１６に記載の媒体。
【請求項１９】
前記プロジェクトの少なくとも一部の各々についての前記情報が、さらに、クライアントについての情報に関連する、請求項１８に記載の媒体。
【請求項２０】
クライアントおよび課金についての情報を表すデータをさらに含む、請求項１９に記載の媒体。
【請求項２１】
ディスプレイライブラリスクリーンによって選択されたディスプレイライブラリメンバの核酸配列を決定するように構成された核酸配列決定装置と、
前記選択されたディスプレイライブラリメンバの機能特性を評価するように構成されたアッセイ装置と、
サーバと
を備えるシステムであって、前記サーバが、
前記選択されたディスプレイライブラリメンバの各々の前記決定された核酸配列についての情報を前記核酸配列装置から受信し、前記選択されたディスプレイライブラリメンバの各々の前記評価された機能特性についての情報を前記アッセイ装置から受信するコミュニケーションインターフェースと、
前記ディスプレイライブラリスクリーンについての情報に関連する前記受信情報を保存するメモリと、
前記受信情報を選別して前記選択されたディスプレイライブラリメンバのサブセットを同定するプロセッサと
を備える、上記システム。
【請求項２２】
採取試料をマルチウェルプレートのウェル中に配置するように構成された試料採取装置をさらに備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記試料採取装置が、前記マルチウェルプレート上のマルチウェルプレート識別子を検出する検出器を備え、さらに
前記試料採取装置が、サーバに接続されて、前記検出されたマルチウェルプレート識別子についての情報を前記サーバと通信する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記システムが自動警告を発する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
（ｉ）複数の選択されたディスプレイライブラリメンバの各々の前記決定された核酸配列についての、前記核酸配列装置からの情報と、前記ディスプレイライブラリメンバの各々の前記評価された機能特性についての、前記アッセイ装置からの情報、ならびに
（ｉｉ）クエリを受信し、前記保存情報を選別して前記選択されたディスプレイライブラリメンバのサブセットを同定し、前記選択されたディスプレイライブラリメンバの前記サブセットについての情報を配信するように構成されたソフトウエア
を保存するサーバ、を備えるシステム。
【請求項２６】
１つまたは複数のライブラリスクリーンにおいて同定されたライブラリメンバの核酸配列についての情報を核酸配列決定装置から自動的に受信するステップと、
前記ライブラリメンバの機能についての情報をアッセイ装置から自動的に受信するステップと、
前記ライブラリメンバの識別子および前記ライブラリスクリーンの識別子に関連する前記受信情報を保存するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記ライブラリメンバがディスプレイライブラリのメンバである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アッセイ装置が、前記ライブラリメンバの試料を含むマルチウェルプレート上の試料識別子を検出し、
前記アッセイ装置から受信した前記情報が前記試料識別子についての情報を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ディスプレイライブラリメンバを評価する方法であって、
ディスプレイライブラリから選択されたディスプレイライブラリメンバに各々対応する複数の生物学的配列を表す情報を受信するステップと、
前記複数の各生物学的配列に対する前記情報を評価して、少なくとも複数の前記ディスプレイライブラリメンバに特徴的な配列がある場合にはその位置を決定するステップと、
前記特徴的配列が同定された各生物学的配列からの部分配列であって、前記特徴的配列の前記位置の関数として定義される前記部分配列に対する情報を保存または表示するステップと
を含む方法。
【請求項３０】
前記ディスプレイライブラリの各メンバが免疫グロブリン可変ドメインを含むタンパク質を表示し、
前記ディスプレイライブラリが、前記免疫グロブリン可変ドメインの少なくとも１０個の異なる配列変異体を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ディスプレイライブラリを評価する方法であって、
ディスプレイライブラリメンバをマルチウェルプレートの第１のセットに配置するステップであって、各ディスプレイライブラリメンバを前記第１のセットの前記マルチウェルプレートの１つの一義的なウェル中に採取するステップと、
各ディスプレイライブラリメンバを増幅するステップと、
各ディスプレイライブラリメンバの特性に関する評価を決定するステップと、
前記ディスプレイライブラリメンバの前記評価についての情報を保存するステップと、
前記情報を選別して前記ディスプレイライブラリメンバのサブセットを同定するステップと
を含む方法。
【請求項３２】
前記サブセットの各ディスプレイライブラリメンバをマルチウェルプレートの第２のセットに移すステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記採取前に、磁性粒子処理装置を用いて標的に結合する前記ディスプレイライブラリメンバを選択するステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ライブラリのスクリーニングに関連するイベントを管理する方法であって、
少なくともその一部がライブラリの第１のスクリーニングに関連するイベント識別子を含む保存情報にアクセスするステップと、
ライブラリの第２のスクリーニングに関係するイベントのイベント識別子に対する要求を受信するステップと、
前記保存情報中の前記イベント識別子中で一義的なイベント識別子を作製するステップと
を含み、前記第１および第２のスクリーニングがそれぞれ第１および第２の特性を有するタンパク質のライブラリスクリーンである、上記方法。
【請求項３５】
ライブラリスクリーニングのイベント情報を扱う方法であって、
ライブラリの第１のスクリーニングに関連する第１のイベントについての情報を第１のワークステーションから受信するステップと、
前記第１のスクリーニングに関連する第２のイベントについての情報を第２のワークステーションから受信するステップと、
前記第１のイベントについての前記情報と、前記第１のスクリーニングの指標または前記第１のスクリーニングに関連する他の情報に関連する前記第２のイベントについての前記情報とを保存するステップと
を含む、上記方法。
【請求項３６】
マルチウェルプレートを前記一義的なイベント識別子で標識するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記マルチウェルプレートを追跡するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記一義的なイベント識別子が、光学的に検出可能なコードとして標識される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ディスプレイライブラリプロジェクトを管理する機械化された方法であって、
プロジェクトのプロジェクト識別子を初期化するステップと、
ディスプレイライブラリメンバの第１のマルチウェル容器に対する前記プロジェクト識別子に関連する一義的な容器識別子を作成するステップと、
前記マルチウェル容器を前記一義的な容器識別子で標識するステップと、
個々のディスプレイライブラリメンバを前記マルチウェル容器のウェル中に自動的に配置するステップと
を含む、上記方法。
【請求項４０】
複合核酸ライブラリのメンバを評価する方法であって、
少なくとも２つのライブラリの複合体から抽出されるライブラリメンバの核酸配列についての情報を受信するステップであって、前記複合体の各ライブラリが、少なくとも１つの位置における異なる限定されたコドンセットを用いて構築されるステップと、
前記核酸配列についての前記情報を解析してコドンにするステップと、
前記少なくとも１つの位置における前記核酸配列の前記コドンに基づいて、前記複合体の前記ライブラリから親ライブラリを同定するステップと
を含む、上記方法。
【請求項４１】
複合核酸ライブラリを提供する方法であって、
核酸の第１のライブラリを構築するステップであって、前記第１のライブラリの各メンバが少なくとも１つの可変位置において限定されたコドンセットの１つを含むステップと、
核酸の第２のライブラリを構築するステップであって、前記第２のライブラリの各メンバが少なくとも１つの可変位置において限定されたコドンセットの１つを含むステップと、
前記第１および第２のライブラリのメンバをプールし、それによって複合核酸ライブラリを提供するステップと
を含む、上記方法。
【請求項４２】
前記第１のライブラリの核酸の前記限定されたコドンセットが、少なくとも１つの対応する可変位置において、前記第２のライブラリの核酸の前記限定されたコドンセットとは異なる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つの対応する定常位置における前記コドンの使用が、前記第１のライブラリと前記第２のライブラリの核酸間で異なる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ユーザが請求項１６に記載の媒体にアクセスし；ディスプレイライブラリメンバのサブセットを選択し、前記サブセットの各メンバについての情報を表示できるようにするユーザインターフェース。
【請求項４５】
前記ユーザが前記表示された情報を他のユーザに配信することをさらに可能にする、請求項４４に記載のユーザインターフェース。
【請求項４６】
ディスプレイライブラリをスクリーニングする方法であって、
それぞれが多様なタンパク質成分および前記多様なタンパク質成分をコードする核酸を含む複数のメンバを含むディスプレイライブラリを用意するステップと、
標的への結合と分離の１つまたは複数のサイクルを用いて前記ディスプレイライブラリから１セットのメンバを選択するステップと、
前記選択されたセットのメンバを請求項２１に記載のシステムを用いて処理するステップと
を含む、上記方法。
【請求項４７】
前記個々のディスプレイライブラリメンバが、異なる標的を用いたスクリーンにおいて同定される、請求項４４に記載のユーザインターフェース。
【請求項４８】
ディスプレイライブラリスクリーン、および前記スクリーンにおいて同定されたディスプレイライブラリメンバについての情報を保存し、
前記ディスプレイライブラリスクリーンのサブセットに対する前記保存情報にアクセスする権限を遠隔ユーザに認証し、
判定基準を満たすディスプレイライブラリメンバについての情報に対する前記遠隔ユーザからのクエリを受信し、
前記保存情報を選別して、前記ディスプレイライブラリスクリーンの前記サブセット中で同定され、前記判定基準を満たす選択されたライブラリメンバを同定し、
前記選択されたライブラリメンバについての情報を前記遠隔ユーザに送信する
ように構成されたサーバ。
【請求項４９】
前記スクリーンの各々がクライアントに関連し、
前記遠隔ユーザが前記クライアントとして確認された場合、前記遠隔ユーザが認証される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
請求項１に記載の方法をプロセッサに実行させる命令がコードされた機械可読媒体製品。
【請求項５１】
前記ライブラリメンバがディスプレイライブラリメンバを含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項５２】
前記ライブラリがディスプレイライブラリである、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１のスクリーニングに使用される前記ライブラリ、および前記第２のスクリーニングに使用される前記ライブラリがディスプレイライブラリである、請求項３４に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１および第２の特性が、それぞれ第１および第２の標的と相互作用する能力である、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［背景技術］
本発明は、ライブラリスクリーニングに関する。組換え技術によって、薬物療法、診断用薬（例えば、イメージングまたはバインディングアッセイ）、酵素およびアフィニティー分離用薬剤の開発に広く用途を有する合成ポリペプチドおよび天然ポリペプチドを発見することが可能になった。このような組換え技術のひとつは、多様な配列内容を含む核酸ライブラリの構築である。ライブラリは、他の活性の中でも、ハイブリダイゼーション、遺伝的相補性およびポリペプチド発現によってスクリーニングすることができる。発現ライブラリをスクリーニングする難題の１つは、多数の偽陽性を選別してスクリーニング基準を最も満たす真陽性を同定することである。
【０００２】
発現ライブラリの１類型は、発現されたポリペプチドが、分析用にアクセス可能であり、発現されたポリペプチドが、それらをコードするそれぞれの核酸に結び付けられたディスプレイライブラリである。ディスプレイライブラリ形式の一例は、繊維状バクテリオファージを使用するものである。ポリペプチドは、ファージのタンパク質外被に融合し、ポリペプチドをコードする核酸は、外被に封入された核酸中にある。別のディスプレイ形式は細胞を使用するものである。ポリペプチドは、細胞表面で発現され、それらをコードする核酸は、細胞内にある。ディスプレイライブラリの応用例は、特定の結合活性を有するライブラリメンバの同定である。
［発明の概要］
本発明は、ライブラリ、特にディスプレイライブラリをスクリーニングするシステム、方法および装置を提供する。この方法の多くは自動化され、または少なくとも部分的に機械化されている。本発明は、ディスプレイライブラリスクリーニングプロセスのインターフェースとなるソフトウエアおよびデータベースも提供する。本発明の特徴を、発現ライブラリ、化学ライブラリなどの他のライブラリに使用できることは言うまでもない。
【０００３】
ライブラリスクリーニングの情報管理
本発明は、様々な自動ステーションからのアッセイ結果および試料追跡を含めた情報を保存し、管理し、ある場合には作成するコンピュータシステムを提供する。このシステムは、プロジェクト管理、データ分析、ならびに試料追跡および監査用のインターフェースを備えることができる。
【０００４】
ディスプレイライブラリのスクリーニング中に同定されるヒットを管理するデータベースも提供する。このデータベースは、プロジェクト、ライブラリ、スクリーンおよびヒットの表を含むリレーショナルデータベースとすることができる。例えば、ヒットの表は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ファージバインディングの結果、細胞密度、ポリペプチド配列、ヌクレオチド配列および親ライブラリ（ｏｒｉｇｉｎａｔｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｙ）のレコードを含むことができる。
【０００５】
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）個々のライブラリメンバと（ｂ）複数の個々のライブラリメンバの各々についてのアッセイ情報との関連性（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を始めとする情報を保存するステップ；および保存情報を評価して個々のライブラリメンバのサブセットを同定するステップ；とを含む方法（例えば、機械化された方法）を特徴とする。評価ステップは、保存情報を選別してライブラリメンバのサブセットを同定するステップを含むことができる。ライブラリメンバは、ディスプレイライブラリメンバまたは別のライブラリ（例えば、発現ライブラリまたは化学ライブラリ）のメンバとすることができる。個々のライブラリメンバは、異なるタイプのライブラリメンバを含むこともできる。
【０００６】
アッセイ情報は、複数のライブラリメンバの各々に対する１つまたは複数の入力項目を含むことができる。この情報は、機能アッセイまたは構造アッセイのデータを含むことができる。情報は、例えば、ライブラリメンバに関連する特性の定性評価または定量評価の１つまたは複数の値を含むことができ、さらに、状態、例えば、「未評価」または「アッセイ失敗」までも含むことができる。一実施形態においては、アッセイ情報は、複数のアッセイの情報を含む。
【０００７】
この方法は、さらに、機能の判定基準を含むクエリ（例えば、ユーザ）を受信するステップを含むこともできる。評価ステップは、保存情報を選別して、関連するアッセイ情報（例えば、機能アッセイデータを含む情報）が判定基準を満たしているライブラリメンバを同定するステップを含むことができる。
【０００８】
別の例では、評価ステップは、アッセイデータが統計的に定義されたセットに準拠するライブラリメンバを同定するステップを含むことができる。統計的に定義されたセットは、平均、中央値、最頻数、標準偏差、最大または最小の関数とすることができる（例えば、ベストテンライブラリメンバの選択など）。
【０００９】
この方法は、さらに、（ａ）個々のライブラリメンバと生物学的配列情報の関連性を保存するステップを含むこともできる。評価ステップは、生物学的配列情報が基準配列または他のライブラリメンバの配列と所定の関係を示すサブセットを同定するステップを含むことができる。
【００１０】
一実施形態においては、ライブラリメンバは、合成の多様性、例えば、天然の多様性、合成の多様性、またはそれらの両方を含むライブラリから選択される。少なくとも一部のライブラリメンバを第１のライブラリから選択し、少なくとも一部の他のライブラリメンバを第２のライブラリから選択することができる。別の実施形態においては、少なくとも一部のライブラリメンバを複合ライブラリから選択する。
【００１１】
一実施形態においては、情報によって参照されるライブラリメンバは、それぞれのライブラリメンバのクローンの物理的位置によって、かつ／または生物学的配列情報によって同定される。
【００１２】
別の場合には、ディスプレイライブラリメンバは、第１の特性に対してライブラリから抽出されるメンバ、および第２の特性に対してライブラリから抽出されるメンバを含む。例えば、第１の選択は、第１の特性に対するものであり、第２の選択は、第１の特性とは異なる第２の特性に対するものである。別の例においては、選択は、同じ特性に対するものである。さらに別の例においては、第１の特性は第１の標的に対する結合性であり、第２の特性は第２の標的に対する結合性である。
【００１３】
アッセイ情報は、機能アッセイデータを含むことができる。機能アッセイデータは、バインディングアッセイのデータを含むことができ、機能の判定基準を、活性、例えば、結合活性または触媒活性とすることができる。例えば、判定基準は、最小活性レベル、または最大活性レベルなどのあらかじめ選択された値である。別の例においては、判定基準は、活性レベルの範囲である。一実施形態においては、判定基準は、親和性または特異性の関数である。
【００１４】
一実施形態においては、活性は結合活性である。結合活性は、親和性に比例する値として表される。別の実施形態においては、結合活性は、解離速度に比例する値として表される。結合活性は、標的への結合でも非標的への結合でもよい。活性の他の例としては、細胞アッセイにおける活性、酵素活性／触媒活性、および生物におけるインビボ活性がある。
【００１５】
アッセイ情報は、構造アッセイ情報、例えば、生物物理学的アッセイまたは構造アッセイについての情報（例えば、タンパク質の安定性または折り畳み）を含むこともできる。
機能アッセイデータは、１セットのライブラリメンバの各々に対して、第１の化合物に対する結合活性および第２の化合物に対する結合活性を含むことができる。例えば、第１の化合物は標的化合物であり、第２の化合物は非標的化合物である。
【００１６】
クエリは、クライアントシステムからサーバで受信することができる。同定されたライブラリメンバについての情報は、サーバからクライアントシステムに送られる。クエリは、ネットワークを介してクライアントシステムからサーバで受信することができる。保存情報の少なくとも一部は、装置、例えば、配列決定装置またはアッセイ装置から電子形式で受信することができる。情報は、ネットワーク（例えば、イントラネットまたはインターネット）経由で受信することができる。
【００１７】
この方法は、例えば、デジタル形式（例えば、電子、磁気または光学形式）で、装置から情報を受信するステップを含むことができる。情報は、保存前に受信することができる。例示的な装置としては、核酸配列決定装置、プレートスキャナ、液体取扱い装置などがある。
【００１８】
この方法は、さらに、同定されたディスプレイライブラリメンバについての情報を、例えば、テキスト、グラフ、ハイパーテキスト、またはそれらの組合せとしてユーザに表示するステップを含むこともできる。
【００１９】
この方法は、さらに、同定されたディスプレイライブラリメンバについての情報をクライアントシステムに送信するステップを含むこともできる。送信された情報は、例えば、カラー情報またはグラフィカル情報を含むように、例えば、書式設定される。書式設定は、ユーザ設定または選択によって決定することができる。
【００２０】
一実施形態においては、保存情報は、同じ標的への結合に対して抽出される少なくとも１０2、１０4または１０7のライブラリメンバ（例えば、ディスプレイライブラリメンバ）の情報を含むことができる。
【００２１】
選別を利用して、ライブラリメンバのサブセット、例えば、関連する機能アッセイデータが判定基準を満たすメンバを同定することができる。
この方法は、サブセットのメンバの各々に対応するクローンを操作するよう試料取扱い装置に命令を送るステップを含むことができる。例えば、クローンは、別個の格納域、または１つもしくは複数の共通の格納域に分配される。
【００２２】
この方法は、ヒットピッキングを含むこともできる。例えば、ディスプレイライブラリメンバの各々が、１つまたは複数の第１のアレイの一義的なアドレスで保存され、この方法は、さらに、保存されたライブラリメンバの順序または全アドレス数が、第１のアレイの順序または全アドレス数と異なるように、各サブセットのメンバ（または、サブセットの少なくとも一部もしくはすべてのメンバ）を１つまたは複数の第２のアレイのあらかじめ選択されたアドレスに移すように試料取扱い装置に命令を送るステップも含む。あらかじめ選択されたアドレスは、各移動されたメンバの一義的なアドレスとすることができる。アレイは、複数の試料担体、例えば、マルチウェルプレート、マイクロ流体チャネルを備える装置、または連続アレイとすることができる。命令を送るステップは、例えば、自動にすることができ、ユーザが開始することができ、またはユーザ選択によって起動させることができる。この方法は、サブセットの各ライブラリメンバを評価するよう装置に命令を送るステップを含むことができる。この方法は、さらに、サブセットの各ライブラリメンバの核酸の配列を決定する核酸配列装置に命令を送るステップを含むこともできる。この方法は、各サブセットのメンバに対する生物学的配列情報を用いて第２のライブラリを設計するステップを含むことができる。
【００２３】
この方法は、さらに、サブセットのメンバに対応するタンパク質を産生するステップを含むこともできる。この方法は、さらに、医薬組成物としてタンパク質を製剤するステップ、および必要に応じて、その医薬組成物を対象に投与するステップを含むこともできる。
【００２４】
この方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。本発明は、この方法の１つまたは複数の機械化された態様を実施することができるシステム、およびプロセッサにこの方法を実施させる命令がその上にコードされた１つの機械可読媒体製品も特徴とする。
【００２５】
別の態様においては、本発明は、各メンバが多様なタンパク質成分および多様なタンパク質成分をコードする核酸を含む複数のメンバを含むライブラリを提供するステップと；ライブラリから１セットのメンバを選択するステップと；その１セットのメンバを評価してそのセットのそれぞれのメンバに対する機能パラメータを得るステップと；そのセットのそれぞれのメンバに対する機能パラメータについての情報を保存用コンピュータサーバに送信するステップと；判定基準を満たす機能パラメータによって特徴付けられるセットのサブセットを同定するために使用可能な機能判定基準によってサーバに照会するステップと；保存情報を選別して、関連する機能アッセイデータがその判定基準を満たすライブラリメンバのサブセットを同定するステップ；とを含む方法を特徴とする。サブセットは、単一のメンバまたは複数のメンバを含むことができる。ライブラリは、複数のメンバの一員ではないメンバを含むことができる。例えば、ライブラリは、例えば、アセンブリの欠陥のために多様なタンパク質成分を含まないいくつかのメンバを含むことができる。
【００２６】
１セットのディスプレイライブラリメンバを選択するステップは、ディスプレイライブラリメンバを標的に接触させるステップと；標的に結合しない他のメンバから標的に結合するメンバを分離させるステップとを含むことができる。一実施形態においては、標的は、分離ステップ中に固定される。
【００２７】
この方法は、さらに、同定されたサブセットのメンバの多様なタンパク質成分に対応するタンパク質を産生するステップを含むこともできる。この方法は、さらに、そのタンパク質を医薬組成物として製剤するステップ、および必要に応じて、その医薬組成物を対象に投与するステップを含むこともできる。
【００２８】
この方法は、さらに、同定されたサブセットのメンバの多様なタンパク質成分に対応するタンパク質の変異体をコードする核酸を産生するステップを含むこともできる。
別の態様においては、本発明は、（ａ）所与の特性を有するポリペプチドを同定する選択についての情報、（ｂ）各々がポリペプチドをコードする各ライブラリメンバの識別子、（ｃ）ライブラリメンバの少なくとも一部に対するアッセイ結果、および必要に応じて、（ｄ）ディスプレイライブラリメンバの少なくとも一部に対する生体高分子配列を表すデータ；ならびに（１）スクリーン情報とライブラリメンバ識別子、（２）ライブラリメンバ識別子と機能アッセイ結果（例えば、バインディングアッセイ結果、触媒アッセイ（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｓｓａｙ）結果または生物学的アッセイ結果）、および（３）ライブラリメンバ識別子と生体高分子配列の１つまたは複数に関係する関連性：を含む機械接続可能な媒体を特徴とする。このコードデータおよび関連性によって、例えば、アッセイ情報としきい値または生体高分子配列クエリに類似した配列とを比較して判定基準を満たすディスプレイライブラリメンバを同定することが可能になる。アッセイ情報は、機能アッセイについての情報、例えば、結合活性、細胞アッセイにおける活性、酵素／触媒活性、生物のインビボでの活性についての情報とすることができる。アッセイ情報は、生物物理学的アッセイまたは構造アッセイにおける活性についての情報（例えば、タンパク質の安定性または折り畳み）とすることができる。
【００２９】
選択についての情報は、標的、選択条件およびライブラリの１つまたは複数についての情報を含むことができる。
データは、さらに、１つまたは複数の選択についての情報に各々が関連する各プロジェクトについての情報を表すことができる。少なくとも一部のプロジェクトの各々についての情報のインスタンスを、さらに、クライアントについての情報のインスタンスと関連付けることができる。
【００３０】
生体高分子配列を表すデータは、核酸配列および／またはポリペプチド配列を表すデータを含むことができる。一実施形態においては、（例えば、少なくとも一部のベクターおよび／または不変配列の）生体高分子配列を表すデータが解析、例えば、トリミングされる。データは、変化した生体高分子配列を表すデータを用いて位置を示す情報を含むことができる。例えば、サブフィールドを使用して変化した位置についての情報を示すことができる。相互作用領域に対応する配列は、インデックスを付けることができ、または示すことができる。免疫グロブリン配列の場合、例えば、ＣＤＲもしくはＣＤＲコード領域、またはＦＲもしくはＦＲコード領域に対応する各配列を示すことができる。媒体は、さらに、生体高分子配列を表すデータについての質情報を含むこともできる。
【００３１】
媒体は、選択情報をスクリーンと関係付ける選択および関連性についての情報を表すデータを含むことができる。
媒体は、さらに、クライアントおよび課金についての情報を表すデータ、プロジェクトを表すデータのインスタンスと関連する情報のインスタンスを含むこともできる。
【００３２】
自動ワークフロー用システム
本発明は、様々な自動化ワークステーションと接続されたサーバも提供する。このサーバは、各ワークステーションから情報を受信することができる。情報は、試料追跡および実験データを含むことができる。いくつかの実施形態においては、サーバは、ワークステーションに命令を送信することができる。ワークステーションは、ヒットのマスタープレート、配列決定装置、ＥＬＩＳＡ装置などを操作するために使用されるロボット装置を備えることができる。システムは、試薬の使用をモニタすることもできる。
【００３３】
したがって、一態様においては、本発明は、（１）ライブラリスクリーン（例えば、ディスプレイライブラリまたは発現ライブラリ）によって選択されるライブラリメンバの核酸配列を決定するように構成された核酸配列決定装置、（２）選択されたライブラリメンバの機能特性を評価するように構成されたアッセイ装置、および（３）（ａ）選択されたライブラリメンバの各々の決定された核酸配列についての核酸配列装置からの情報、および選択されたライブラリメンバの各々に対して評価した機能特性についてのアッセイ装置からの情報を受信するコミュニケーションインターフェースと、（ｂ）ライブラリスクリーンについての情報と関連する受信情報を記憶するメモリと、（ｃ）受信した情報を選別して、選択ライブラリメンバのサブセットを同定するプロセッサとを備えるサーバを含むシステムを提供する。コミュニケーションインターフェースは、選択されたライブラリメンバの各々に対する別個の配列の読みについての情報を受信することができ、プロセッサは、１つの読みについての情報を別の読みについての情報と比較することができる。
【００３４】
システムは、さらに、（４）複数の試料担体、例えば、マイクロタイタープレートなどの複数のチャンバを有する容器を保存するようになされた保存装置を備えることもできる。システムは、試料採取装置、例えば、採取された試料を複数の試料担体のアドレス上に配置するように構成された装置を備えることもできる。試料採取装置は、複数の試料担体上の識別子を検出する検出器を備えることができる。試料採取装置は、サーバに接続されて、検出された識別子についての情報をサーバに通信することができる。
【００３５】
システムは、さらに、複数の試料担体を、例えば、試料採取装置から保存装置に、かつ／または試料採取装置からアッセイ装置に移動させるように構成された搬送装置を備えることもできる。
【００３６】
システムは、さらに、複数の試料担体を再配列させる試料取扱い装置を備えることもできる。プロセッサは、試料取扱い装置に命令を送るように構成することができる。
サーバプロセッサは、例えば自動的にまたはトリガーに応答してレポートを作成するようにすることができる。レポートは、アッセイ装置または核酸配列決定装置によって扱われるイベントについての情報を含むことができる。例えば、レポートは、決定された核酸配列の少なくとも１つを含む生体高分子配列のデータベースを検索した結果を含むことができる。また、レポートは、ユーザ定義形式で書式設定することができる。
【００３７】
サーバメモリは、複数のスクリーンによって選択されたディスプレイライブラリメンバに対する核酸配列情報を、各々のスクリーンについての情報と関連させて保存することができる。複数のスクリーンは、異なる標的化合物への結合に対するスクリーンを含むことができる。
【００３８】
一実施形態においては、システムは、例えば、ディスプレイライブラリスクリーンに対して予想される進行と実際の進行との偏差、複数のスクリーンからのディスプレイライブラリメンバに対する配列中の配列またはモチーフの過剰表現（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）、または予想される試薬不足の１つまたは複数によって引き起こされる自動警告を発する。
【００３９】
関係する実施形態においては、システムは、合成化合物ライブラリスクリーンについての情報を保存し、特定の化合物に対するブロック合成または合成経路を示す情報を含む。
別の態様においては、本発明は、（ｉ）複数の選択されたライブラリメンバ（例えば、ディスプレイライブラリメンバ）の各々の決定された核酸配列についての核酸配列装置からの情報、および選択されたライブラリメンバの各々の評価された機能特性についてのアッセイ装置からの情報、ならびに（ｉｉ）保存情報からの情報をクライアントシステムに配信するように構成されたソフトウエアを保存するサーバを含むシステムを特徴とする。一実施形態においては、ソフトウエアは、クエリを受信し、保存情報を選別して選択されたライブラリメンバのサブセットを同定し、選択されたライブラリメンバのサブセットについての情報を配信するようにも構成される。一実施形態においては、ソフトウエアは、実験装置からの情報を受信するようにも構成される。
【００４０】
別の態様においては、本発明は、１つまたは複数のライブラリスクリーンにおいて同定されたライブラリメンバの核酸配列についての情報を核酸配列決定装置から（例えば、自動的に）受信するステップと、ライブラリメンバの機能についての情報をアッセイ装置から（例えば、自動的に）受信するステップと、受信した情報をライブラリメンバの識別子およびライブラリスクリーンの識別子と関連させて保存するステップとを含む方法を特徴とする。ライブラリメンバは、ディスプレイライブラリのメンバとすることができる。
【００４１】
アッセイ装置は、ライブラリメンバの試料を含む複数の試料担体（例えば、マルチウェルプレート）上の試料識別子を検出することができ、アッセイ装置から受信された情報は、試料識別子についての情報を含む。試料識別子は、ライブラリメンバが抽出されるライブラリ選択または選択キャンペーンを示すことができる。
【００４２】
一実施形態においては、保存情報は、さらに、プロジェクト識別子と関連し、プロジェクト識別子は少なくとも別のライブラリスクリーンと関連する。この方法は、保存情報を選別して、判定基準を満たすライブラリメンバを同定するステップを含むことができる。
【００４３】
別の実施形態においては、この方法は、同定されたライブラリメンバについての情報を表す図形表示を作成するステップを含むことができる。
さらに別の実施形態においては、この方法は、同定されたライブラリメンバの少なくとも１つによってコードされるポリペプチド（またはペプチド）を医薬組成物として製剤するステップと、その医薬組成物を対象に投与するステップと、同定されたライブラリメンバの少なくとも１つによってコードされるポリペプチド（またはペプチド）を標識と結合させるステップと、標識ポリペプチドを対象に投与するステップと、同定されたライブラリメンバの少なくとも１つによってコードされるポリペプチド（またはペプチド）を固体支持体に結合させるステップの１つまたは複数を含むことができる。
【００４４】
別の態様においては、本発明は、核酸ライブラリ（例えば、ディスプレイライブラリなどの発現ライブラリ）から選択される核酸ライブラリメンバに対応する複数の生物学的配列を表す情報を受信するステップと、その複数の生物学的配列の各配列に対する情報を評価して特徴的配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｅａｔｕｒｅ）がある場合にはその場所を決定するステップであって、特徴的配列が核酸ライブラリメンバの少なくとも５、１０、２０、４０、６０、８０または９０％に特有であるステップと、特徴的配列が同定される各生物学的配列から、特徴的配列の位置の関数として定義される部分配列に対する情報を保存し、抽出し、または表示するステップとを含む方法を特徴とする。
【００４５】
一例においては、ライブラリの各メンバは、免疫グロブリン可変ドメインを含むタンパク質をコードし、ライブラリは、免疫グロブリン可変ドメインの少なくとも１０個の異なる配列変異体を含む。例えば、複数の特徴的配列は、以下の領域、すなわちシグナル配列、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４または定常ドメインの１つまたは複数に位置する特徴的配列を含むことができる。別の例においては、ライブラリの各メンバは、クニッツドメイン（Ｋｕｎｉｔｚ  ｄｏｍａｉｎ）を含むタンパク質をコードし、ディスプレイライブラリは、クニッツドメインの少なくとも１０個の異なる配列変異体を含む。さらに別の例においては、各ライブラリメンバは、５０、４０、３０または２０アミノ酸未満の変化領域を含むアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。変化領域は、少なくとも４、８、１２または１８の変化位置を含む。
【００４６】
一実施形態においては、この方法は、さらに、部分配列にはない配列をトリミングするステップ、または部分配列を抽出するステップを含むこともできる。
別の態様においては、本発明は、ライブラリメンバ（核酸ライブラリ、例えば、発現ライブラリメンバ、例えば、ディスプレイライブラリメンバ）を第１のセットの複数の試料担体に配置し、各ライブラリメンバが第１のセットの複数の試料担体の１つの一義的なアドレスで配置されるステップと、各ライブラリメンバを増幅させるステップと、特性（例えば、結合特性などの機能特性、またはライブラリメンバ核酸成分配列、ポリペプチド配列などの配列特性）に関して各ライブラリメンバの評価を決定するステップと、ライブラリメンバの評価についての情報を保存するステップと、その情報を選別して、ライブラリメンバのサブセットを同定するステップを含む方法を特徴とする。この方法は、さらに、サブセットの各ライブラリメンバ核酸成分の配列を決定するステップ、サブセットの各ライブラリメンバを第２のセットの複数の試料担体中に移すステップ、および／または配置ステップの前に、標的に結合するライブラリメンバを選択するステップを含むこともできる。磁性粒子処理装置を選択ステップに使用することができる。
【００４７】
さらに別の態様においては、本発明は、少なくともその一部がライブラリ（例えば、ディスプレイライブラリ、他の発現ライブラリなどの核酸ライブラリ）の第１のスクリーニングに関連するイベント識別子を含む保存情報にアクセスするステップと、ライブラリの第２のスクリーンに関係するイベントに対するイベント識別子への要求を受信するステップと、保存情報内のイベント識別子中で一義的であるイベント識別子を作成するステップとを含む方法を特徴とする。この方法は、さらに、作成されたイベント識別子、例えば、光学的に走査可能な識別子で複数の試料担体を標識するステップを含むこともできる。一例においては、第１および第２のスクリーニングは、異なるライブラリ、例えば、異なる標的に対するバインダを同定する異なるディスプレイライブラリのスクリーニングである。別の例においては、それらは同じライブラリ、例えば、異なる標的に対するバインダを同定する、例えば、同じディスプレイライブラリのスクリーンである。
【００４８】
別の態様においては、本発明は、ディスプレイライブラリの第１のスクリーニングに付随する第１のイベントについての情報を第１のワークステーションから受信するステップと、第１のスクリーニングに付随する第２のイベントについての情報を第２のワークステーションから受信するステップと、第１のイベントについての情報および第２のイベントについての情報を、第１のスクリーニングの指標または第１のスクリーニングに関連する別の情報に関連させて保存するステップとを含む。この方法は、さらに、複数の試料担体を一義的なイベント識別子で標識するステップを含むこともできる。一義的なイベント識別子は、例えば、プロジェクト識別子またはスクリーニング識別子の関数である。
【００４９】
標識された複数の試料担体は、例えば、バーコード、ドットコードなどのハイコントラスト画像標識によって光学的に同定可能である。
この方法は、さらに、複数の試料担体を追跡するステップを含むこともできる。例えば、ディスプレイライブラリの第２のスクリーニングに関連する第３のイベントについての情報を第１のワークステーションから受信することができる。第１および第２のスクリーニングは、無関係な標的に対するスクリーンとすることができる。
【００５０】
さらに別の態様においては、本発明は、プロジェクトに対するプロジェクト識別子を初期化するステップと、ライブラリメンバ（例えば、発現ライブラリメンバ、例えば、ディスプレイライブラリメンバ）の第１のマルチウェル容器に対するプロジェクト識別子に関連する一義的な容器識別子を作成するステップと、マルチウェル容器を一義的な容器識別子で標識するステップと、個々のライブラリメンバをマルチウェル容器のウェル中に（例えば、自動的に）配置するステップとを含む方法（例えば、機械化された方法、または部分的に機械化された方法）を特徴とする。この方法は、マルチウェル容器中の各ライブラリメンバを増幅させるステップ、または各ライブラリメンバの機能特性（例えば、結合特性または触媒特性）を評価するステップを含むことができる。
【００５１】
別の態様においては、本発明は、少なくとも１つの位置において異なる限定されたコドンセットを用いて構築される少なくとも２つのライブラリの複合体から抽出されるライブラリメンバの核酸配列についての情報を受信するステップと、核酸配列についての情報をコドンに分解するステップと、少なくとも１つの位置において核酸配列のコドンに基づいて複合体のライブラリから親ライブラリを同定するステップとを含む方法を特徴とする。
【００５２】
さらに別の態様においては、本発明は、少なくとも１つの可変位置において第１の限定されたコドンセットの１つを各メンバが含む第１の核酸ライブラリを構築するステップと、少なくとも１つの可変位置において第２の限定されたコドンセットの１つを各メンバが含む第２の核酸ライブラリを構築するステップと、第１および第２のライブラリのメンバをプールして複合ライブラリを形成させるステップとを含む方法を特徴とする。第１の限定セットは、少なくとも１つの対応する可変位置において第２の限定セットと異なり得る。例えば、第１の限定されたコドンセットは、所与の各アミノ酸に対して２つ未満のコドンを含むことができる。いくつかの実施形態においては、第１の限定されたコドンセットは、コドン表の一象限（ｑｕａｄｒａｎｔ）ではない１セットのコドンからなる。
【００５３】
構築ステップは、少なくとも部分的に無作為化された領域を含むオリゴヌクレオチドを合成するステップを含むことができる。この領域のヌクレオチドは、トリヌクレオチド混合物、例えば、限定されたトリヌクレオチドセットからトリヌクレオチドを添加することによって合成される。少なくとも１つの対応する定常位置におけるコドンの使用は、第１と第２のライブラリの核酸間で異なり得る。
【００５４】
この方法は、さらに、所与の機能特性を有するポリペプチドをコードするプールのメンバを同定するステップ、所与の機能特性を有するポリペプチドの配列を決定するステップ、またはその決定された配列から、ポリペプチドが第１もしくは第２のライブラリ（または、別のライブラリ、例えば、第３のライブラリ）に由来するかどうかを決定するステップを含むことができる。決定された配列は、核酸配列であってもよい。
【００５５】
実時間情報の送達
本発明は、ライブラリスクリーニング、例えば、契約ライブラリスクリーニングサービスのヒットおよびプロジェクト完了をモニタするために使用される情報管理システムも提供する。クライアントは、システムに接続し、ライブラリスクリーニングプロジェクトについての最新報告または特定の情報を受信する。情報送達システムは、上述したデータベースに接続することができる。例えば、本発明は、プロジェクト情報をクライアントにネットワークを介して送達する方法を特徴とする。この方法は、クライアントの接続要求を認証するステップと、多様なライブラリメンバに対する確認データを含む保存情報またはその選択された部分にアクセスするステップと、保存情報の評価を含む情報をネットワーク経由で送信するステップとを含むことができる。
【００５６】
本発明は、ライブラリメンバのサブセットをユーザが選択するのを可能にし、各サブセットのメンバについての情報を表示するユーザインターフェースも特徴とする。例えば、このインターフェースは、ライブラリメンバのサブセットの選択を決定するパラメータをユーザから受信する。インターフェースは、パラメータ、例えば、生体高分子配列属性もしくは生体高分子配列、または機能の判定基準をユーザに照会することができる。ライブラリメンバの選択されたサブセットは、生体高分子配列に対する配列類似性を有することができ、または生体高分子配列属性を有することができる。
【００５７】
インターフェースによって、（ａ）ライブラリスクリーニングについての情報、（ｂ）ライブラリメンバの識別子、（ｃ）ライブラリメンバの少なくとも一部に対する機能アッセイの結果、（ｄ）ライブラリメンバの少なくとも一部の生体高分子配列、ならびに（１）スクリーニング情報とライブラリメンバ識別子および（２）ライブラリメンバ識別子と機能アッセイ結果に関する関連性を表す保存データを含むデータベースにユーザが接続することが可能になる。ライブラリメンバは、例えば、ディスプレイライブラリメンバまたは発現ライブラリメンバとすることができる。ライブラリメンバは、異なる選択によって同定することができる。インターフェースによって、ユーザは、表示情報を他のユーザに配信することが可能になる。
【００５８】
別の態様においては、本発明は、プロセッサおよびメモリを備えるサーバを特徴とする。このプロセッサは、ディスプレイライブラリ選択キャンペーンおよびキャンペーンにおいて同定されたディスプレイライブラリメンバについての情報を保存し、その保存情報を選別して、ディスプレイライブラリ選択キャンペーンのサブセットにおいて同定され、かつ判定基準を満たす選択ライブラリメンバを同定し、遠隔ユーザに選択ライブラリメンバについての情報を送信するように構成されている。プロセッサは、判定基準を満たすディスプレイライブラリメンバについての情報に対する遠隔ユーザからのクエリを受信し、ディスプレイライブラリスクリーニングのサブセットの保存情報への接続許可に対して遠隔ユーザに認証を与えることもできる。スクリーニングの各々をクライアントと関連付けることができ、遠隔ユーザは、クライアントであると確認された場合、認証を受けることができる。
【００５９】
本明細書で使用する「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、区別なく使用される。両方の用語は、短鎖ペプチド、例えば、３〜２５アミノ酸のペプチドを包含することができると同時に、より長鎖のペプチドおよび多連鎖ポリペプチドも包含できることは言うまでもない。
【００６０】
本明細書に記載する新機軸の多数の態様が、一般に、ライブラリスクリーニング、例えば、ディスプレイライブラリ以外のライブラリのスクリーニング、例えば、発現ライブラリのスクリーニング、例えば、活性または細胞表現型に対するｃＤＮＡ発現ライブラリ、触媒核酸（ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に対する核アプタマー（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｐｔａｍｅｒ）ライブラリ、コンビナトリアルライブラリまたは薬物化合物ライブラリなどの化学ライブラリに適用可能である。
【００６１】
出版物、特許、および特許出願の引用を含めてすべての引用を、参照によりその全体を本明細書に援用する。本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記述において説明する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記述、図面および特許請求の範囲から明らかになるはずである。
［詳細な説明］
ディスプレイライブラリは、機械化された情報管理を含むプロセスを用いてスクリーニングされる。このプロセスの少なくとも一部の態様は自動化されている。本明細書に記載するプロセスおよび他のプロセスの技術的効果は、スクリーニングライブラリの処理量が増加し、ライブラリスクリーニングについての情報の迅速な接続および分析が可能になることである。例えば、このシステムは、異なる判定基準を有する複数のプロジェクトでスクリーニングされる１つまたは複数のディスプレイライブラリからのポリペプチドの同定を管理する。
【００６２】
図１および図２を参照すると、例示的なプロセス１０を使用して、ディスプレイライブラリがスクリーニングされる。プロセスからの情報は、リレーショナルデータベース６０のプロセス全体にわたって収集される。この情報は、いつでもアクセスし、または解析することができる。
【００６３】
プロセス１０は、例えば、ライブラリから検索される所望のポリペプチドを示す、いわゆる「プロジェクト」を初期化するステップ２０を含む。この情報は、プロジェクトの表１００に保存することができる。同様に、ライブラリについての情報を別の表１４０に保存する。次に、ディスプレイライブラリをスクリーニング３０して、そのような所望のポリペプチドの候補を同定する。候補についての機能情報１１０を与える高処理アッセイ４０を用いて、候補を個々に分析する。候補または候補のサブセットの配列を決定する５０。配列情報１２０は、候補の各々に対するレコードと関連付けられて保存される。
【００６４】
また、プロセス１０に付随するイベントを追跡し、監査して、やはりデータベース６０に保存されるイベント情報１３０が作成される。
図３を参照すると、プロセス１０は、例示的なシステム２００によって実行される。システム２００は、サーバ２０５、アッセイ装置２１０、試料取扱い装置２２０、および配列決定装置２３０を備える。サーバ２０５は、データベース６０の情報を保存する。サーバ２０５は、ディスプレイライブラリメンバの機能を示すデータを作成し、それをサーバ２０５に送信するアッセイ装置２１０に接続されている。サーバ２０５は、核酸配列装置２３０とも通信状態にある。装置２３０は、個々のライブラリメンバの配列データをサーバ２０５に送信する。また、サーバ２０５は、試料取扱い装置２２０とも通信状態にある。試料取扱い装置２２０およびアッセイ装置２１０は、試料取扱いに付随するイベントについての情報をサーバ２０５に送信する。システム２００が追加の装置を備えることができることは言うまでもない。
【００６５】
命令は、装置２１０、２２０、２３０のいずれにもサーバ２０５から送信することができる。このような命令によって、装置は、特定の候補に対して特定の方法を実行することができる。
【００６６】
また、装置２１０、２２０、２３０を、システム内で物理的に接続することもできる。例えば、試料取扱い装置２２０は、アッセイ用のマルチウェルプレートを準備することができる。９６または３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマルチウェルプレートは、本明細書で例として示すが、他の複数試料の担体（キャリア）をアッセイに使用することができる。複数の試料担体の別の例としては、複数のチャンバを有する担体、（試料が異なるアドレスで配置される）平面アレイ、「Ｔｈｅ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｈｉｐ」（Ｂｉｏｔｒｏｖｅ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、およびマイクロ流体チャネルを備える装置がある。アッセイが実施されると、マルチウェルプレートは、アッセイ装置２１０に自動的に移送されて読み取られる（下記「ロボット（Robotics）」参照）。
【００６７】
図４を参照すると、サーバ２０５を、ネットワーク、例えば、サーバ２０５をユーザシステム２４０および装置２１０、２２０、２３０と連結するイーサネット（登録商標）２４５に接続することができる。このネットワーク２３５によって、サーバ２０５は、装置と効率的に情報を交換することができ、ユーザは、ユーザシステム２４０のインターフェースを用いて情報にアクセスすることができる。サーバ２０５は、データベース情報６０を重複して保存するように構成されたハードディスクセットなどのデータ記憶装置２０６に接続することができる。
【００６８】
プロジェクト定義
データベース６０は、各プロジェクトについての情報を保存する。各プロジェクトは、例えば、ポリペプチド（例えば、意図した用途を満足させるポリペプチド）を同定する１つまたは複数のスクリーンである。したがって、複数のプロジェクトを同時に実行し管理することができ、以前のプロジェクト情報は、現在および将来のプロジェクトに情報を与えることができる。プロジェクトのデータベース表は、以下の項目を含むことができる。
【００６９】
（プロジェクト名）  プロジェクトは、オペレータによる参照に好都合な、レポート、試料などを標識する名前を有することができる。
（標的）  標的は、ディスプレイライブラリメンバを抽出するもとになる化合物である。意図した用途が結合を含む場合、所望のライブラリメンバは標的に結合する。標的を、結合以外の機能活性、または結合に加えて作用する活性に関する標的とすることができることは言うまでもない。
【００７０】
（意図した用途）  意図した用途の選択肢としては、治療、診断、酵素、または精製などがある。この項目は、あらかじめ定義されたリストを含むことができ、または、自由記載（例えば、可変長の自由記載）とすることができる。意図した用途についての以下の考察を参照されたい。
【００７１】
（所望の結合条件）  所望の結合条件は、意図した用途に基づく。例えば、治療用途の場合、所望の結合条件を、生理学的強度のバッファーとすることができる。精製用途の場合、所望の結合条件を、前の精製ステップにおいて使用したバッファー条件とすることができる。
【００７２】
（所望の放出条件）  所望の放出条件も意図した用途に基づく。治療の場合、所望のポリペプチドが、生理学的条件下で有意な程度に分解しないように、放出条件を極めて厳格にすることができる。このような放出条件は、低ｐＨでも、高ｐＨでも、またはカオトロピックでもよい。精製用途の場合、所望の放出条件は、標的化合物によって限定されることがある。例えば、標的化合物は、変性されないか、精製中に所望のポリペプチドからの溶出によって撹乱される。
【００７３】
（特異性要求）  この項目は、候補ポリペプチドの所望の特異性を示すことができる。いくつかのプロジェクトでは、所望のポリペプチドは標的化合物に結合するが、密接に関係する化合物、非標的化合物には結合しない。標的化合物がポリペプチドである場合、関係する非標的化合物は、標的のアミノ酸配列ホモログ、標的の配座変異体（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）、タンパク質分解変異体またはグリコシル化変異体とすることができる。配座変異体の例は、プリオンタンパク質である。同様に、この項目は、触媒特異性（例えば、ある反応物を触媒するが、関係する非標的反応物を触媒しないという能力）を示すことができる。
【００７４】
（他の諸要件）  この項目は、候補ポリペプチドが満たさなければならない他の要件を示すテキストまたはパラメータを含むことができる。例えば、治療用途に関して、こうした要件は、抗原性、クリアランス速度、循環サイクルの半減期などである。酵素用途の場合、こうした要件は、ｋcat／Ｋmなどの動力学パラメータとすることができる。
【００７５】
（クライアント）  クライアントは、パーティの名前、例えば、オペレータにプロジェクトの実行を要求する会社または個人の名前とすることができる。この項目は、リレーショナルデータベース内のクライアント表中のクライアントレコードのポインタを含むこともできる。
【００７６】
（ユーザ）  この項目は、プロジェクトに関連する特定の個人に対して使用することができる。これらは、プロジェクトを行うパーティで技術的役割および／または管理上の役割を担う個人、および外部のクライアントの位置にある類似の個人を含むことができる。
【００７７】
（認証）  この項目は、プロジェクトに許可を与えるために使用することができる。例えば、許可は、情報にアクセスし、情報を入力（またはアップロード）し、かつ／またはプロジェクトに関連するイベントを実行することができるオペレータを制限するために使用することができる。例えば、クライアント個人は、所与のクライアントによって要求される特定のプロジェクトについての情報にアクセスする許可を得ることができるが、別のクライアントに関連する別のプロジェクト、または同じクライアントに関連する別のプロジェクトでさえも許可を得ることができない。
【００７８】
（優先度）  この項目は、他の保留中のプロジェクトに相対して優先度を割り当てるために使用することができる。優先度項目を変える権限は、特定の責任者に制限することができる。優先度項目を使用して、装置時間、計算時間（例えば、ＣＰＵ時間）および人的時間を割り当てることができる。
【００７９】
（マイルストン）  プロジェクトレコードは、プロジェクトのマイルストンについての情報を含むことができる。これらのマイルストンは、既定の進行が予測される将来の日付、または既定の進行が得られた過去の日付とすることができる。適切であれば、マイルストン項目は、別のデータベース表中のマイルストンイベント専用情報へのポインタを含むことができる。
【００８０】
他の追加項目を多数含めることができる。
選択
図５を参照すると、ディスプレイライブラリメンバを抽出する方法は、ディスプレイライブラリ３００を提供するステップ（例えば、調製するステップ）を含む。ディスプレイライブラリを作成する例示的な方法を以下（「ディスプレイライブラリ」）に示す。メンバは、例えば、ライブラリを標的リガンドに接触させ、標的リガンドに結合するメンバを同定することによってライブラリから選択３０４される。標的リガンドは、固体支持体上に固定することができ、または後で捕捉可能な溶液状態にすることができる。未結合または弱く結合したライブラリメンバは、支持体から洗い流される。次いで、結合したライブラリメンバが支持体から溶出する。他の方法も選択に使用できることは言うまでもない。例えば、Ｋｏｌｏｎｉｎ等（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：３０８〜３１３；ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４〜３６６；およびＰａｑｕａｌｉｎｉ等（２０００）「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」Ｉｎ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｅｄ．Ｂａｒｂａｓ等  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  ２２．１〜２２．２４に記載されたように、例えば、選択をインビボで実施して、標的組織または器官に結合するライブラリメンバを同定することができる。例えば、Ｗｉｄｅｒｓｔｅｎ等（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３２８：３８９〜４０４（遷移状態アナログに結合することによって）；Ｆｏｒｒｅｒ等（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ  ９：５１４〜５２０；Ｇａｏ等（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１７７７；およびＢａｃａ等（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１００６３に記載されたように、選択を使用して、酵素に対して選択を行うことができる。
【００８１】
いくつかの場合においては、非特異的結合および他の非理想的な諸特性は、１サイクルを超える選択を必要とする。追加の選択サイクルによって、候補ライブラリメンバの濃縮が進む。選択ステップ３１４を繰り返す必要がある場合、溶出したライブラリメンバを増幅３０６させ、次いで、標的リガンドに再度適用する。インプリメンテーションに応じて、異なるサイクル数の選択が、極めて多様なライブラリから候補ライブラリメンバのプールを同定するのに十分であり得る。例えば、１ラウンドまたは２ラウンドの選択が十分なこともある。１セットの選択サイクルを、選択キャンペーンと称する。
【００８２】
追加の選択ラウンドは、選択されたライブラリメンバのバイアスを増加させ、候補としての適合性とは無関係な理由のために他のメンバよりも希少なまたは損なわれたメンバを減少させる結果になり得る。例えば、いくつかのライブラリメンバが、宿主細胞中の複製に対して損なわれ得る。
【００８３】
図６を参照すると、選択の各々に対するパラメータが、データベース中の選択３６３の表に記録される。選択は、選択キャンペーン３６２の表中のエントリによって、特定の選択キャンペーンに関連付けられる。上述したように、選択キャンペーンは、プロジェクト３６１の表中の特定のプロジェクトに関連付けられる。
【００８４】
（選択）選択のレコードは、以下の項目を含むことができる：
（選択キャンペーン）  この項目は、選択が実施された選択キャンペーンを示す。
（ライブラリソース）  この項目は、ディスプレイライブラリメンバのソースを示す。このソースは、選択キャンペーンの第１の選択の場合のようにライブラリ試料、または選択キャンペーンの後続の選択の場合のように以前の選択の出力とすることができる。
【００８５】
（選択ラウンド）  この項目は、選択キャンペーン内の選択の位置を示す整数値である。例えば、「１」は、選択が第１の選択であることを示し、以下同様である。
（入力サイズ）  このパラメータは、標的に接触しているディスプレイライブラリメンバの数を示す。
【００８６】
（出力サイズ）  このパラメータは、標的から溶出するディスプレイライブラリメンバ数を示す。
（ＦＯＩ）  これは、選択キャンペーンによって回収される入力ディスプレイライブラリメンバのフラクションである。
【００８７】
（標的試料）  これは、標的試料の表に対する参照を含むことができる。例えば、標的化合物を、例えば、異なる日に、かつ／または異なるプロセスを用いて、複数のバッチで調製することができる。このような情報を追跡し、それを用いて、同定されたリガンドが特定の試料と相関するかどうかを決定することができる。
【００８８】
（選択キャンペーン）  選択キャンペーンのレコードは、以下の項目を含むことができる。
（プロジェクト）これは、選択キャンペーンが開始されたプロジェクトへのポインタである。
【００８９】
（ライブラリ）これは、使用されたディスプレイライブラリを記載するライブラリレコードへのポインタである。
選択キャンペーンに関連するすべての選択を確認するために、選択の表は、選択キャンペーンを指すすべてのエントリに対して照会される。各選択エントリは、選択キャンペーンプロセスにおけるその相対的な位置を示す指標（選択ランク）を含む。
【００９０】
プロジェクトを、１つを超える選択キャンペーンと関連付けることができる。
選択後、同定されたプールのメンバが個々に抽出される。ここで図５および図７を参照すると、ファージディスプレイライブラリの場合、例えば、プールを細菌細胞に感染させることができ、次いでそれを個々のコロニーまたはプラークが各感染イベントから形成されるような密度で平板培養３１６する。自動コロニー採取装置を用いて、個々のコロニーをマルチウェルプレート（例えば、９４または３６４ウェルプレート）のウェル中に採取３２０する。一般に、コロニーは、例えば同じ２つのプレートの対応するウェルに２回採取される。これらのプレートのうち１つが保管される。もう１つのプレートは、後続の分析のソースとして使用することができる。
【００９１】
自動採取によって、少なくとも１００、１０3、１０4、１０5（またはそれ以上）の選択ライブラリメンバを採取することが可能になる。次いで、これらのライブラリメンバの各々を、以下に示すように個々に分析することができる。
【００９２】
再度図６を参照すると、採取についての情報は、例えば、プレート３６６、各ウェル３６５および各ディスプレイライブラリメンバ３６４のそれぞれの相互参照レコードを用いてデータベース６０に保存される。
【００９３】
（マルチウェルプレート）  マルチウェルプレートのレコードは、以下を含むことができる。
（プレートＩＤ）  この項目は、自動的に作成されプレート上に標識される一義的なプレート識別子を記録する。下記「バーコード方式＆イベント監査」参照。
【００９４】
（プレートタイプ）  この項目は、プレートタイプ、例えば、カタログ番号および製造者を示す。
（プレートサイズ）  この項目は、プレート上のウェル数を示す。例えば、９６または３６４である。
【００９５】
（保存場所）  この項目は、プレートが物理的に保存される場所を示す。これは、冷凍機またはプレートホテル内の場所とすることができる。
（プロジェクト）  この項目は、プレートが作成されるプロジェクトを示す。
【００９６】
（日付）  この項目は、プレートがシステムに入れられた日付を示す。一般に、これは、ディスプレイライブラリメンバがプレートのウェル中に置かれた日付である。
（オペレータ）  この項目は、プレートをシステムに入れることを指示または指導した人を示す。
【００９７】
（ウェル）  ウェルのレコードは以下を含むことができる。
（プレートＩＤ）  この項目は、マルチウェルプレートのウェルに対するレコードへのポインタである。
【００９８】
（ウェルＸ座標）  この項目は、プレート上のウェルのｘ座標を示す。
（ウェルＹ座標）  この項目は、プレート上のウェルのｙ座標を示す。
（内容）  この項目は、プレート中に配置された試料を示す。これは、ディスプレイライブラリメンバのレコードへのポインタとすることができる。
【００９９】
（ライブラリメンバ）  ディスプレイライブラリメンバのレコードは以下を含むことができる。
（ファージＩＤ）  この項目は、データベース６０中のライブラリメンバを特定する一義的な識別子を含むことができる。
【０１００】
（選択キャンペーン）  この項目は、ライブラリメンバが抽出されるディスプレイライブラリ選択キャンペーンのエントリを参照するポインタを含む。
（プレートＩＤ）  この項目は、ライブラリメンバが保存されるマルチウェルプレートのエントリを参照するポインタを含む。
【０１０１】
（ウェルＩＤ）  この項目は、ライブラリメンバが保存されるウェルのエントリを参照するポインタを含む。
（抽出日）  この項目は、ライブラリメンバが抽出された日付を示す。
【０１０２】
（オペレータ）  この項目は、ライブラリメンバの抽出を監視するオペレータを示す。
（ＡＡ配列ＩＤ）  これは、ディスプレイライブラリメンバによってコードされるアミノ酸配列を示すストリングを含むレコードへのポインタである。
【０１０３】
（ＤＮＡ配列ＩＤ）  これは、ディスプレイライブラリメンバによってコードされる核酸配列を示すストリングを含むレコードへのポインタである。関係するレコードは、例えば、抗体のＣＤＲまたはフレームワークのフィンガープリントを提供することができる。
【０１０４】
（サブライブラリＩＤ）  複合ライブラリがスクリーニングされるインプリメンテーションにおいて、これは、ディスプレイライブラリメンバのソースであることが決定されたサブライブラリを記録するレコードへのポインタである。サブライブラリは、複合ライブラリの構成集団の１つである。
【０１０５】
（親ライブラリ）  これは、ライブラリメンバを同定するためにスクリーニングされたライブラリを記録するレコードへのポインタである。
（アッセイ結果）  この項目は、ディスプレイライブラリメンバに対する機能情報１１０の表中のアッセイ結果のレコードが利用可能であるかどうかを示すブール演算子を含むことができる。別のインプリメンテーションにおいては、この項目は、１つまたは複数のこのようなレコードへのポインタを含むことができ、または機能情報自体を含むことができる。
【０１０６】
ディスプレイライブラリメンバのレコードは、初期化することができ、項目のいくつかに対する情報が利用可能になる前に使用することができる。例えば、核酸およびアミノ酸配列情報は、ライブラリメンバが分析され配列決定が認められた後でのみレコードと関連付けることができる。
【０１０７】
アッセイ
図５および図７を参照すると、個々のライブラリメンバは、アッセイ３２４、一般にハイスループットアッセイを用いて分析される。アッセイによって、各ライブラリメンバに対して表示されるポリペプチド成分の機能情報１１０が決定される。ポリペプチド成分に対する機能情報は、ポリペプチド成分がライブラリビヒクル（例えば、バクテリオファージ）に付着するかそこから除去されるときに得ることができる。機能情報１１０は、データベース６０のアッセイ結果の表に記録される。表中の各エントリは、分析されるディスプレイライブラリメンバを指す項目、ならびにアッセイ結果、およびバックグラウンドレベルなどの他の関連する情報、および対照の結果を保存する別の項目を含む。
【０１０８】
機能情報１１０は、（例えば、特異性、動力学パラメータ、平衡パラメータ、結合力、親和性などに関係する情報を含めた）結合活性、触媒活性、構造特性または生化学特性（例えば、熱安定性、オリゴマー形成状態、溶解性など）、生理学的特性（例えば、腎クリアランス、毒性、標的組織特異性など）などの１つまたは複数に関係し得る。いくつかの実施形態においては、機能情報表の各レコード内の項目は、分析特性を示す。他の実施形態においては、機能情報は、例えば、異なる特性またはアッセイに対する複数の表を含む。
【０１０９】
ホモジナスアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ａｓｓａｙ）を含めて様々な可能なアッセイを以下に記述する。例えば、ＥＬＩＳＡを、結合についての機能情報を特定するアッセイとして使用することができる。ＥＬＩＳＡアッセイのデータベースレコードは、以下の情報を含むことができる。すなわち、標的試料（標的試料のレコードへのポインタ）、マルチウェルプレートタイプ、標的量（例えば、ｎｇ／ウェル）、遮断薬、遮断薬濃度、インキュベーション時間、インキュベーション温度、インキュベーション緩衝液組成、インキュベーションｐＨ、インキュベーション体積、洗浄緩衝液、洗浄回数、洗浄体積、洗浄時間、認識分子（「ＲＭ」、例えば、ディスプレイライブラリメンバの定常領域に対する抗体などの酵素結合プローブ）、ＲＭ／ウェル量、ＲＭ結合時間、ＲＭ結合温度、ＲＭ用洗浄緩衝液、ＲＭ洗浄体積、洗浄回数、現像液、現像液量、現像時間、および予想信号範囲である。
【０１１０】
機能情報アッセイも以下で考察する（例えば、「後処理」参照）
ヒットピッキング
いわゆる「ヒットピッキング」プロセス３３０は、所与の判定基準を満たす個々のライブラリメンバを同定する機能情報の分析を含む。例えば、機能情報は、各ライブラリメンバによってコードされるポリペプチドの標的結合能力に関係し得る。この場合、分析の判定基準を最小結合活性とすることができる。機能情報のデータベースは、選別されて判定基準を満たす個々のライブラリメンバが同定される。
【０１１１】
サーバは、ヒットピッキング用インターフェースを備えることができる。サーバは、判定基準タイプ、例えば、特定のアッセイまたは他の要求（例えば、特定の配列またはライブラリメンバ）をユーザに照会する。サーバは、機能情報データベースを選別して、スクリーン（またはプロジェクト）の判定基準を満たすライブラリメンバを同定する。（例えば、同定されたライブラリメンバの数、平均スコアまたは中間スコアを示す）各同定されたライブラリメンバの情報を表示することができ、またはその結果の要約を表示することができる。個々のライブラリメンバに対する結果の表示例を図８に示す。
【０１１２】
オペレータ／ユーザは、結果を承認することができ、あるいはより多くのメンバまたはより少ないメンバを選択するために判定基準を変えることができる。また、同定されたヒット数を、ブール検索用語を用いて（例えば、ＯＲ検索を用いて）増加させ、または（例えば、ＡＮＤを用いて）減少させることができる。これは、１つを超える機能アッセイを実施する場合には、特に有用になり得る。例えば、これは、（例えば、ＡＮＤ  ＮＯＴを用いて）標的に結合するが非標的には結合しないものを同定することができる。
【０１１３】
次いで、この情報が、最初に第２のセットのマルチウェルプレートに配列された３２５個の個々のクローンをマルチウェルプレートから移動させる試料取扱い装置に通信される（いわゆる「再配列」プロセス３２５）。第２のセットには選択されたライブラリメンバのみが含まれるので、第２のセットは、マルチウェルプレートの最初のセットよりもサイズが小さい。この小さいフットプリントによって、後の操作が都合よく容易なものになる。
【０１１４】
データベース６０への例示的なヒットピッキングインターフェース３８０を図８に示す。このインターフェースによって、ユーザは、タイトルバー３８６中のインターフェース上に示すことができる所与のプロジェクトに対するディスプレイライブラリメンバを手動で、または自動的に選択することができるようになる。インターフェースは、各ライブラリメンバの識別子（「抽出物」と標識されたカラムを参照）、その対応するアッセイ数値（「アッセイ値」と標識されたカラムを参照）およびグラフ書式設定３９６を表示する。利用可能であれば、各ライブラリメンバの配列またはその一部を示すことができる。アッセイの対照もグラフ化することができる。
【０１１５】
一態様では、ユーザは、判定基準を用いてライブラリメンバを選別することを選択する。この態様は、「判定基準を設定する」ボタン３８１を起動させ、判定基準を設定すべき特性を要求するクエリに応答することによって作動させることができる。一般に、この特性は、機能アッセイ結果の１つである。次に、グラフ表示３９６上でいわゆる「カットオフ」線３９４によって示すことができるしきい値がユーザに照会される。いくつかのインプリメンテーションにおいては、カットオフ線３９４自体は、ユーザがカーソル３９２を用いてしきい値を示すことによって位置決めすることができる。
【０１１６】
サーバ２０５は、ディスプレイライブラリメンバから判定基準を満たすメンバを選別する。チェックボックス３９０は、図８の例に示すように、アッセイ値が少なくとも０．２５である判定基準を満たすメンバに対して自動的に選択されるようにすることができる。本明細書では示さない別の例においては、インターフェースは、判定基準を満たすライブラリメンバのみを表示する。
【０１１７】
別の態様においては、ユーザは、例えば、マウスによって制御されるカーソル２９２を用いて、１つまたは複数のライブラリメンバを手動で選択することができる。選択は、チェックボックス３９０の１つを「チェックする」ことによって起動させることができる。ユーザは、判定基準または検索表現（例えば、ブール検索表現）に対して照会すべき選択肢を選択することもできる。
【０１１８】
さらに別の態様においては、ユーザは、チェックボックス３８２を選択することによってブール検索を用いてライブラリメンバを照会するように選定することができる。ユーザは、複数の検索語を入力して、ライブラリメンバ情報を選別する。次いで、インターフェースは、検索語に合致するライブラリメンバを列挙し、または示す。
【０１１９】
インターフェース３８０は、選択されたライブラリメンバのリストを満たす３８３、または取り除く３８４ための選択可能なボックスも含む。例えば、インターフェースは、整数のマルチウェルプレートを作成するために追加または除去しなければならない選択ライブラリメンバの数の指標を表示することができる。この機能によって、ユーザは、マルチウェルプレート上の利用可能なすべてのウェルを積極的に再配列に使用することができる。ユーザは、選択を完了すると、「ヒットを再配列させる」ボタン３８６を選択する。これによって、再配列命令を試料取扱い装置に自動的に送ることができる。
【０１２０】
インターフェースは、例えばヒストグラムの棒を使用して、ライブラリメンバをグループとして表示して、分析した候補間の機能分布を示すこともできる。この例では、ユーザは、例えばカットオフ線を移動させてヒストグラムを切り詰めることによって、特定の棒、または一連の棒を選択してさらに分析することができる。
【０１２１】
いくつかのインプリメンテーションにおいては、ヒットピッキングが必要でないことは言うまでもない。メンバが初期に採取された容器から、選択されたライブラリメンバを「必要に応じて」回収することができる。さらに別のインプリメンテーションにおいては、再配列は、各選択されたライブラリメンバを処理するステップを含む。例えば、各選択されたライブラリメンバの関連する挿入断片をサブクローニングし、または異なる核酸ベクターに挿入することができる。
【０１２２】
配列決定
図５および図７を参照すると、第２のセットの各ライブラリメンバの核酸配列が決定される３４０。例えば、ライブラリの不変領域にアニールされるプライマーを用いて各メンバをＰＣＲ増幅させることができる。配列決定された領域がライブラリメンバ間で変動する領域に対応するように、プライマーを配置する。これらの試料を増幅させ、ＰＣＲ配列決定反応によってその配列を決定する。
【０１２３】
これらの反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  ＡＢＩ３７００などのキャピラリー配列決定装置２３０で分析される。ＡＢＩ３７００は、ディスプレイライブラリメンバと各読みを関連付ける情報および配列決定反応に関する情報（例えば、使用プライマー）ともに、配列決定結果を、自動的にサーバ２０５に送信するようにプログラムすることができる。このような情報を、サーバ２０５に手動でアップロードし、またはディスクまたは他の関係する記憶媒体を用いて転送できることは言うまでもない。他の配列決定方法、例えば，「ハイブリダイゼーションによる配列決定法」（例えば、米国特許第５，２０２，２３１号、同５，６９５，９４０号、および同６，００７，９８７号参照）および他の核酸アレイに基づく配列決定法も使用することができる。
【０１２４】
品質管理のために、配列の各領域を２回以上読み取ることができる。例えば、相補鎖にアニールされるプライマーを使用して、所与のセグメントの順方向と逆方向の読みを得ることができる。複数の読みを、ＰＨＲＥＤおよびＰＨＲＡＰ（例えば、ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１７５〜１８５；ＥｗｉｎｇおよびＧｒｅｅｎ（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８：１８６〜１９４；およびＧｏｒｄｏｎ等（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．８：１９５〜２０２参照）などのベースコーリングソフトウエアを用いて解析して、配列決定された各ヌクレオチドに対する確信値（ｃｅｒｔａｉｎｔｙ  ｖａｌｕｅ）を得ることができる。
【０１２５】
サーバ２０５は、確信値を使用して核酸配列を検証する。確信値がプリセットしきい値外の場合、配列決定装置２３０に問題のディスプレイライブラリメンバを再配列させるように自動的に指示するステップ；例えば電子メールまたは警告メッセージボックスでオペレータに通知するステップ；および／またはさらに検証が必要な核酸配列レコードに印を付けるステップの１つまたは複数を実施する警告が起動される。
【０１２６】
特に確かめられた配列の場合、サーバ２０５は、関連する読み枠中の核酸を自動的に翻訳することができる。関連する読み枠は、ディスプレイライブラリ設計または推測によって示すことができる。データベース６０は、核酸配列の翻訳に使用されるいくつかの静的テーブルを含むことができる。これらのテーブルとしては以下のものなどがある。
【０１２７】
（アミノ酸リスト）：この表は、２０種類のアミノ酸名のカラムとそのコード識別子のカラムを有する。必要に応じて、この表は、３文字標準名称（例えば、「Ａｌａ」）、および単一文字標準名称（例えば、「Ａ」）の追加カラムを含むことができる。
【０１２８】
（コドン表）：この表は、６４個の全トリヌクレオチドをそれらがコードするアミノ酸または終止コドンと関連付ける。
サーバ２０５は、核酸配列をコドンに分解し、コードされるアミノ酸をコドン表で検索する。例えばアミノ酸表によって提供されるアミノ酸コードは、アミノ酸配列表中のアミノ酸配列レコードのストリングに追加される。当該ライブラリで適切であれば、サーバ２０５は、アミノ酸配列がライブラリ設計と一致することも検証する。例えば、アミノ酸は、定常領域（例えば、抗体ライブラリのフレームワーク領域およびシステインループライブラリのシステイン）中のテンプレートと合致する必要があり、可変領域中で許容される１セットのアミノ酸にも合致しなければならない。この検証は、例えば下記複合ライブラリで考察するように、核酸配列レベルでも実施できることは言うまでもない。
【０１２９】
いくつかのディスプレイライブラリは、多連鎖配列、例えば、２つのポリペプチド鎖を含むタンパク質を表示する。例えば、抗体Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖ポリペプチドを含む。両方の鎖の変異領域（ｖａｒｉａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の配列を決定することができ、または、いくつかのインプリメンテーションにおいては、ちょうど１本の鎖の配列を決定するだけで十分な場合もある。例えば、１本の鎖のみが変異領域を含む場合がある。
【０１３０】
ライブラリメンバの完全な変異領域配列を決定可能な一別法として、ライブラリメンバは、１つまたは複数の制限酵素で分解してフィンガープリントを取り、または単一のジデオキシヌクレオチドを用いて配列を決定してトラクト（ｔｒａｃｔ）、例えば、Ｔ−トラクトを生成することができる。いくつかのライブラリ、例えば、非翻訳核酸タグ配列を含むライブラリの場合、完全な変異領域ではなくタグなどの小領域の配列を決定するだけで十分な場合がある。ディスプレイライブラリメンバ候補をさらに精査した後、部分的に配列決定した、またはフィンガープリントを取ったライブラリメンバの配列を決定して、完全な変異領域、例えば、ＣＤＲなどの変化したドメイン全体またはセグメントの配列を決定することができる。
【０１３１】
ロボット工学
様々なロボット装置が自動化プロセスに使用される。これらは、マルチウェルプレート搬送システム、磁気ビーズ粒子処理装置、液体取扱い装置、コロニー採取装置などである。
【０１３２】
これらの装置は、注文仕様で製作することができ、またはＡｕｔｏｇｅｎ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  ＭＡ）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（ＵＳＡ）、Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ（Ｗｏｂｕｒｎ  ＭＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｔｏｎ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  ＵＫ）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ（Ｒｅｎｏ  ＮＶ）、Ｈｕｄｓｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ  ＮＪ）、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｗｅｌｌｓｅｌｅｙ  ＭＡ）、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍｅｒｉｄｅｎ  ＣＴ）、Ｔｅｃａｎ（Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などの商用ソースから購入することができる。
【０１３３】
これらの装置の各々は、それら自体の特殊なデータフォーマットを有していてもよく、標準形式のデータ（例えば、タブ区切りテキストなど）をエクスポートすることもできる。サーバ２０５は、これらのデータ書式設定を、処理可能かつデータベース中に保存可能な情報に分解するスクリプトまたは他のソフトウエアを含むことができる。サーバ２０５は、装置が判断可能なコマンドおよび他の信号を用いて各装置と通信するように構成することもできる。これらの特別設計のインターフェースを、常法に従って、装置製造者が提供する仕様から構築することができる。
【０１３４】
図９に、プロセス１０および図３に図式化したシステム２００のインプリメンテーション用の例示的な自動システム４００を示す。システム４００は、ステーション４２０、４３０、４４０間でマルチウェルプレートを移送する搬送装置４０５を備える。
【０１３５】
例えば、このシステムは、コロニー採取用のマルチウェルプレートを用意する液体取扱いステーション４２０を備えることができる。この準備システムでは、プレートウェルに無菌培地を充填する。次いで、プレートがロボットによってプレート採取装置４１０中に配置される。１回、２回（または３回以上）採取した後、１対のプレートを自動的にインキュベータ４２４に移送して増殖させる。その後、１対のうちの１つを保存装置、例えば、４℃、−２０℃または−８０℃の保存装置４２０に移す。もう一方をバインディング（結合）アッセイステーション４４０に移す。
【０１３６】
ＥＬＩＳＡアッセイの例では、アッセイステーション４４０は、ＥＬＩＳＡプレートを用意する自動液体取扱い装置４４２、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄する洗浄装置４４４、および結合を定量する検出器４４６を備える。
【０１３７】
アッセイ結果を解析し、ヒットを採取した後、保存されたプレートを用いて、採取したヒットを第２のマルチウェルプレート対に再配列させることができる。再配列は、自動液体取扱いステーション４２０に配置された再配列ロボット４２２によって実施することができる。再配列後、１対のプレートをインキュベータ４２４に移送して増殖させる。１対のうちの１つを保存装置４２６に自動的に移し、もう一方を搬送装置４０５によって配列決定セットアップステーション４３０に移す。
【０１３８】
配列決定セットアップステーション４３０は、例えばマルチウェルプレートを受けるように構成されたサーマルサイクラー４３４中で、ＰＣＲ配列決定反応用のマルチウェルプレートを用意する。プレートの各ウェルに、ディスプレイライブラリメンバを含む細胞試料（例えば、ディスプレイライブラリの場合のファージ感染細胞）を蒔く。ＰＣＲ増幅またはＤＮＡ調製および配列決定の後、試料をＡＢＩ３７００などの配列決定装置４３６に手動または自動で装填する。
【０１３９】
自動選択
再度図１を参照すると、スクリーニングプロセス３０は、手動で、または自動化された方法で実施することができる。自動選択の一例は磁性粒子を使用するものである。
【０１４０】
この場合、標的は、磁性粒子上（例えば下記の磁性粒子上）に固定される。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）の磁性粒子処理装置であるＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（商標）システムを使用して、標的に対してディスプレイライブラリメンバを選択することができる。ディスプレイライブラリを、管中の磁性粒子に接触させる。ビーズとライブラリを混合させる。次いで、使い捨ての外筒で覆われた磁気ピンが、磁性粒子を回収し、洗浄溶液を含む別の管にそれらを移送する。粒子を溶液と混合させる。このように、磁性粒子処理装置を使用して、磁性粒子を複数の管に連続移送して、非特異的にまたは弱く結合しているライブラリメンバを粒子から洗浄することができる。洗浄後、粒子を溶出緩衝液を含む管に移送して、特異的かつ／または強く結合しているライブラリメンバを粒子から取り除く。次いで、これらの溶出したライブラリメンバを個々に抽出して上述したように分析し、または追加の選択ラウンド用にプールする。
【０１４１】
選択を実施するために自動化を利用することによって、選択プロセスの再現性ならびに処理量が増す。
例示的な磁気応答粒子は、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）から入手可能なＤｙｎａｂｅａｄ（登録商標）である。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）は、均一サイズ（例えば、２μｍ、４．５μｍおよび５．０μｍ直径）の球状表面を有する。ビーズは、磁気材料としてガンマＦｅ2Ｏ3およびＦｅ3Ｏ4を含む。粒子は、超常磁性であり、磁場中で磁気特性を有するが磁場の外では残留磁気がない。様々な表面（例えば、カルボキシル化表面を有する親水性表面、およびトシル基によって活性化された疎水性表面）の粒子が利用可能である。粒子をＢＳＡ、またはカゼインなどの遮断薬でブロックして、標的以外の化合物が粒子に非特異的に結合およびカップリングするのを抑えることもできる。
【０１４２】
標的は、常磁性粒子に直接または間接的に付着する。常磁性粒子に連結された形の様々な標的分子を購入することができる。一例においては、標的は、反応性基（例えば、架橋剤（例えば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル）またはチオール）を含む粒子に化学的に結合する。
【０１４３】
別の例においては、標的を、特異的結合対のメンバを用いて粒子と連結させる。例えば、標的にビオチンを結合させることができる。次いで、その標的を、ストレプトアビジンで被覆された常磁性粒子に結合させる（例えば、Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙから入手可能なＭ−２７０およびＭ−２８０ストレプトアビジンＤｙｎａｐａｒｔｉｃｌｅｓ（登録商標））。一実施形態においては、標的に試料を接触させた後に、標的を常磁性粒子に付着させる。
【０１４４】
特異的結合対の別のクラスは、ペプチドエピトープおよびそれに特異的なモノクローナル抗体である（エピトープタグを用意する一般的な方法については、例えば、ＫｏｌｏｄｚｉｅｊおよびＹｏｕｎｇ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚ．１９４：５０８〜５１９を参照されたい）。例示的なエピトープタグとしては、ＨＡ（インフルエンザ血球凝集；Ｗｉｌｓｏｎ等（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）、ｍｙｃ（例えば、Ｍｙｃｌ−９Ｅ１０、Ｅｖａｎ等（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０〜３６１６）、ＶＳＶ−Ｇ、ＦＬＡＧ、および６−ヒスチジン（例えば、ドイツ特許第１９５０７  １６６号参照）がある。
【０１４５】
他の例示的な特異的結合対としては、細胞表面タンパク質とそれに結合するリガンド（例えば、抗体などのペプチドまたはポリペプチド）がある。細胞表面タンパク質は、特定の細胞タイプ、または特定の特性、挙動もしくは障害を有する細胞に特異的であり得る。例えば、細胞は癌細胞とすることができ、抗体は、低グリコシル化（ｈｙｐｏｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＭＵＣ１、メラノーマ分化抗原ｇｐ１００またはＣＥＡ１に特異的に結合することができる。
【０１４６】
インターフェース
データベース６０に保存された情報は、多くの方法でアクセスすることができる。再度図４を参照すると、データベース６０は、ネットワーク２４５経由で通信状態にあるユーザシステム２４０のインターフェースに接続することができる。例えば、ユーザシステム２４０は、サーバ２０５とＸＭＬまたはＨＴＭＬで通信するウェブブラウザを用いて、データベース６０に照会することができる。一例においては、インターフェースは、ユーザにいくつかの利用可能な選択肢を決定させる最上位メニューを含む。ユーザは、ディスプレイライブラリメンバを照会し、レポートを個別に設定し、システム２００またはプロジェクトを監査し、配列分析または他のバイオインフォマティクスツールを実行するなどの選択をすることができる。ユーザ選択によって、インターフェースは各特定の選択専用の子メニューを表示する。
【０１４７】
１つの子メニューによって、ユーザは、可能なクエリを選択することができる。１つのタイプのクエリによって、上述した図８のヒットピッキングインターフェースが作動する。別のタイプのクエリによって、ユーザはデータベース６０の任意の項目を用いて検索することができる。例えば、特定のプロジェクト（例えば、特定の日付前に開始されたプロジェクト）、特定のクライアント、特定の選択条件（例えば、特定の製造者からの磁性粒子を使用した選択）などを確認するために検索することができる。
【０１４８】
別の子メニューによって、ユーザは、電子レポートの様式を個別に設定することができる。この書式を、特定のクライアント、オペレータまたはプロジェクトと関連付けることができる。この様式によって、レポート書式設定パラメータ（例えば、１ページ当たりのヒット数、色の使用、グラフの使用など）が決定される。様式は、レポートのファイル形式（例えば、マイクロソフト（登録商標）エクセル、ワードまたはパワーポイントなどのマイクロソフト（登録商標）オフィスアプリケーション、ポストスクリプト、アドビ（登録商標）ポータブルドキュメントフォーマット（ＰＤＦ）、ＨＴＭＬ、ＸＭＬ、メタタグ付きテキスト、テキスト、タブ区切りテキスト、ビジュアルベーシック互換など）も指定することができる。ファイルは、暗号化することもプロテクト（例えば、独立に、読出し禁止または書込み禁止）をかけることもできる。サーバ２０５は、自動レポートの書式を設定するためにこの様式仕様にアクセスすることができる（下記参照）。この様式メニューは、検索後に、検索結果レポートを個別に設定するために検索メニューからアクセスすることもできる。
【０１４９】
この様式メニューを使用して、核酸配列および／またはアミノ酸配列の表示を個別に設定することもできる。配列の様式仕様を、特定のライブラリと関連付けることもできる。個別のパラメータは、ある種の色による特定位置の着色、またはある種の色による特定残基タイプの着色を含むことができる。アミノ酸配列の場合、例えば、疎水性残基を赤色で、親水性残基を青色で示すことができる。抗体配列表示の一例においては、フレームワークに対応する位置を青色、相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する位置を赤色とすることができる。さらに別の例においては、この様式によって、特定の位置、例えば、可変位置のみまたはＣＤＲ位置のみの表示が指定される。
【０１５０】
さらに別の子メニューによって、ユーザは、システムまたはプロジェクトを監査することができる。この選択肢が起動されると、サーバ２０５は、必要な監査のタイプおよび程度に関してユーザに照会する。例えば、システムの監査は、作動中の装置および作動中のプロジェクトを簡潔に列挙するテキスト表示またはレポートを含むことができる。他の詳細なレベルが利用可能なことは言うまでもない。別の例においては、システム監査は、グラフ表示され、装置がアイコン表示され、操作上の処理量に応じて色付けされる。
【０１５１】
プロジェクト監査は、現在の日付、将来の目標日付、および過去のマイルストンに関する時間線上に位置するアイコンを含むグラフとしても提供される。同じ監査を、テキストとして表形式で提示することもできる。
【０１５２】
さらに別の子メニューによって、ユーザは、下記に示すものなどのバイオインフォマティクスツールに接続することができる。
インターフェースの１タイプは、例えば、１つもしくは複数のプロジェクト、または１つもしくは複数のヒットリストから選択された一部またはすべてのディスプレイライブラリのリストを示す。インターフェースは、本明細書に記載する１つまたは複数の項目を任意の様式（例えば、ユーザ指定の様式）で示すことができる。例えば、インターフェースは、識別子、選択位置のアミノ酸およびアッセイ情報（例えば、バインディングアッセイ、酵素アッセイなどの機能アッセイ情報）を示すことができる。選択された特徴的配列は、例えば、下記入力配列情報を解析することによって確認することができる。
【０１５３】
インターフェースは、各表示されたライブラリメンバの配列分析、例えば、基準配列に対する類似性（例えば、同一性パーセントまたはスコア）、コンセンサス配列に対する類似性、疎水性（例えば、全体の疎水性または選択部位の疎水性）、親水性、ｐＩ、電荷、分子量、予想されるストークス半径、薬らしさ（ｄｒｕｇａｂｉｌｉｔｙ）などと関連するパラメータを示すこともできる。このようなパラメータおよびスコアは、例えば、式、例えば、実験式、任意の式または理論式によって決定することができる。
【０１５４】
インターフェース上に示された別のパラメータは、２つ以上の項目の関数とすることができる。例えば、パラメータの１つを特異性比（例えば、非標的（例えば、標的分子と相同であるが同一ではない分子）に対する結合活性で割った標的結合活性）とすることができる。
【０１５５】
バイオインフォマティクスおよび配列分析
様々なバイオインフォマティクスツールを手動または自動で使用して、ディスプレイライブラリスクリーニングプロセス１０によって同定された配列を解析することができる。このようなツールの例は、配列解析、配列検索、複数の配列アラインメント、および構造モデリングである。
【０１５６】
（配列解析）核酸配列決定装置によって決定された核酸配列データを解析することができる。解析は、いつでもあらゆるプロセッサ、例えば、配列装置に付属するプロセッサ、ネットワークコンピュータシステムなどによって実行することができる。一実施形態においては、解析は、配列生データの品質スコアを評価するステップ、ヌクレオチド（例えば、ディスプレイベクターまたは表示されたタンパク質中の不変位置にあるヌクレオチド）のパターンを同定するステップとを含む。いくつかの例においては、ヌクレオチドパターンは、特定のポリペプチドモチーフをコードするコドンのセットである。
【０１５７】
一実施形態においては、解析ルールは、天然の多様性（例えば、天然の免疫グロブリン可変ドメイン多様性）のプールを含むライブラリにおいて関連する特徴的配列を同定するように設計される。このようなルールは、タンパク質ファミリー中の既知のメンバを比較し、ライブラリ構築考慮事項、例えば、特定の変性プライマーまたは不変プライマーなどの使用を含めることによって確認することができる。天然の多様性を検索するルールは、一般に広く、特定の保存アミノ酸または特定のセットのアミノ酸をコードするすべてのコドンが関連する位置で同定される。
【０１５８】
別の実施形態においては、解析ルールは、合成ライブラリにおいて関連する特徴的配列を同定するように設計される。合成ライブラリは、（例えば、本明細書に記載するように）特定のヌクレオチド位置において程度の制御された変異を含むことができる。解析ルールは、ライブラリ設計に一致する特徴を同定するように「狭く」定義することができる。天然と合成の両方の多様性を含むいくつかのライブラリは、各関連する位置に対する両方のタイプのルールを含むことができる。
【０１５９】
核酸配列における特定の特徴を同定することによって、変動する領域または物理的相互作用に関与すると予想される領域（例えば、ＣＤＲ位置）を、自動的に捜し出し、ユーザに強調表示することが可能になる。また、不変領域をコードする核酸配列をデータから削除することができる。例えば、コード領域上流のベクター配列は廃棄される。
【０１６０】
１つのインプリメンテーションにおいては、削除された核酸配列が互いに比較され、複製を迅速に同定することができる。ライブラリメンバは、それらの配列同一性に基づいて各グループに分別することができる。例えば、特定の軽鎖配列を有する（例えば、免疫グロブリンライブラリからの）すべてのライブラリメンバを含むことができる第１のグループは、１つのグループを成す。グループメンバのすべてを同定することができ、または重鎖配列の変動を含むことができる。インターフェースは、グループ数および各グループのメンバ数を示すことができる。例えば配列同一性以外の他の判定基準を使用することができ、例えば、相同性、疎水性などに基づいてグループを形成することができる。ユーザは、スクリーニング結果をグループとして見ることができ、グループの個々のメンバを可視化するためにグループを選択することができる。
【０１６１】
一例においては、免疫グロブリン可変ドメインをコードするディスプレイライブラリメンバの核酸配列データを解析して、シグナル配列、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４および定常領域を配置する配列特徴を同定する。ＣＤＲは長さが様々であり得るので、多くの場合、これらの特徴の位置は重要である。天然の多様な免疫グロブリン可変ドメインにおいて同定することができる特徴の一例は、表３および４に示す特徴である。
【０１６２】
【表１】
2005512181.tif 000002
【０１６３】
【表２】
2005512181.tif 000003
【０１６４】
これらの特徴を同定する表３および４におけるルールは、ストリング比較用のＰＥＲＬ規則を用いて書かれている。記号＝．（ドット）意味＝スペース以外の任意の文字（任意のアミノ酸を示すために使用される、または（．、ｑ、ｓ、＊）によって表される終止コドンの一種。記号＝＋意味＝併用されたときの任意の長さ（例えば、．＋は、列中のスペース以外の文字の無限長を意味する）。記号＝［ｘ｜ｙ］意味＝アミノ酸パターンにおけるこの特定の位置は、ｘまたはｙであり得る。［ｘｕ｜ｙｕ］のように併用して使用することができ、ｘｕまたはｙｕと称する相互の後の２つのａａを意味する。［］の記号間のあらゆるものは、連続した複数のアミノ酸に一致する場合でも、ＰＥＲＬにおいては単一のエンティティと見なされる。例：［ｘｕ｜ｙｕ］｛４｝は、「ｘｕｙｕｘｕｙｕ」またはいくつかの他の組合せのように４回連続して現れるパターンｘｕまたはｙｕを意味する。記号＝｛ｘ｝意味＝先行するパターンが正確にｘ回（ｘは整数である）に一致する。例：ｘ｛５｝は、パターンに一致する連続５回のｘである。記号＝｛ｘ，ｙ｝意味＝どんなパターンが前に来ようと、ｘの最小およびｙの最大（ｘおよびｙは整数である）に一致する。例：ｘ｛１，２｝は、パターンに一致する少なくとも１つのｘおよび最高２つの連続したｘを意味する。ｘ｛ｌ，｝およびｘ｛，４｝などの組合せは、それぞれ少なくとも１つのｘ、および最高４個の連続したｘを意味する。
【０１６５】
いくつかの実施形態においては、解析に失敗した配列は標識されて、手動で再検討されるか、自動で再配列決定（ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）される。例えば、下記「自動情報管理」を参照されたい。
【０１６６】
（配列検索）インターフェースメニューは、配列決定されたライブラリメンバ候補の１つまたは複数を用いて核酸またはアミノ酸配列検索を実行する選択肢を提供することができる。ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８３：６３〜９８））、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９９４）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３〜４６８０）などの標準配列比較ルーチンを使用して比較することができる。例えば、比較は、ＧＣＧ（登録商標）ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ  ＰＡＣＫＡＧＥ（商標）プログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）によって提供されるモジュールを用いて実行することができる。インターフェースを用いてモジュールを実行することができ、配列を単に選択することによって分析を実行することができる。配列検索ルーチンは、以下のデータベースの１つまたは複数を検索することができる。
【０１６７】
非冗長核酸配列（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤから利用可能なＧｅｎＢａｎｋ提供）
−非冗長ポリペプチド配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋから）
−特許配列
−他の配列決定されたディスプレイライブラリメンバ（例えば、情報がすべての利用可能なプロジェクト、所与のプロジェクト、または１セットのプロジェクト用のサーバに保存された任意のディスプレイライブラリメンバ）のコレクションなど所有権のある配列。
【０１６８】
天然および他の利用可能な配列を検索することによって、活性に対して生物学的に関連のある共通の特徴を同定することができる。所有権のある配列を検索することによって、偽陽性を確認することが可能である。例えば、配列は、無関係な標的に対する選択キャンペーンにおいて同定される傾向にある。
【０１６９】
（複数の配列アラインメント）検索を使用して、ヒット（例えば、所与のプロジェクトに対するヒット）のコレクション内のモチーフを同定することもできる。所与の選択キャンペーンまたは所与のプロジェクトから抽出されるすべてのヒットの対ごとのアラインメントを再帰的に実行して、１つまたは複数の配列アラインメントを作成することができる。例えば、ＧＣＧ（登録商標）「パイルアップ」モジュールを使用して、このような配列すべての整列を試みることができる。
【０１７０】
ＰＨＹＬＩＰの系統学的ブートストラッピング技術などの系統学的技術を用いて、このようなアラインメントの強制を試みることも可能である（例えば、Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９８９）Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ  ５：１６４〜１６６およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡによって提供されるオンラインリソースを参照されたい）。
【０１７１】
この分析によって、リガンド間（特に少なくともしきい値の活性を有するリガンド間）で共通のモチーフを同定することができる。このようなモチーフの同定を使用して、モチーフの周囲の配列空間を高濃度にサンプリングするのに専用のより小さなディスプレイライブラリを設計することができる（下記参照）。
【０１７２】
外部および内部配列データベースの検索も、例えば、下記自動チェックのように自動化することができる。
（構造モデリング）このツールを使用して、ディスプレイライブラリメンバの３次元座標を設計することができる。このツールは、まず、多数の可能なモデリング技術の１つを用いてモデルを構築する。次いで、このツールによって、モデルがインターフェース上の２次元または３次元イメージにされ、ユーザに見えるようにする。
【０１７３】
モデリング技術は、相同モデリング、エネルギー極小化などの標準戦略に依拠することができる。コンピュータ支援の相同性に基づく構造予測方法は、周知であり、自動化でき、デスクトップＰＣを用いて局所的に、または、例えば、アプリケーションを走らせているサーバに接続することによって遠隔的に実行することができる。１つの例示的な相同モデリングスイートは、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ構造予測プラットフォームである（例えば、Ｇｕｅｘ等（１９９９）ＴｉＢＳ  ２４：３６４〜３６７、およびＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｇｅｎｅｖａ、ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄのＥＸＰＡＳＹから利用可能なオンラインリソースを参照されたい）。さほど自動化されていない他のより高度なアルゴリズムを使用することもできる。Ｌｕｄｉ（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＡｌａｄｄｉｎ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）などのいくつかの予測プラットフォームが市販されている。
【０１７４】
モデルは、標的リガンドまたは基質と合体させることもできる。例えば、ＥｗｉｎｇおよびＫｕｎｔｚ（１９９７）Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１８：１１７５〜１１８９を参照されたい。
【０１７５】
自動情報管理
サーバ２０５は、システム２００によって扱われる多数のプロジェクトおよび装置をモニタする自動チェックを、例えば、定期的に（例えば、毎晩、毎週など）実行することもできる。
【０１７６】
１セットの自動チェックによって、所与の間隔で装置使用効率が決定される。例えば、サーバは、各装置が最適に実行されているかどうかをイベントログから決定することができる。動作不能時間が増加すると、当該装置のオペレータまたはサービス技術者に、例えば電子メールで、自動警告を発することができる。
【０１７７】
別のセットの自動チェックによって、各ライブラリの性能が決定される。この分析は、複合ライブラリ、サブライブラリ、および個々のライブラリのレベルで実施することができる。このシステムは、ライブラリの各々から同定された候補数を決定することができ、これらの候補の成功率についての統計データを収集することができる。他の同様に設計されたライブラリよりも性能の劣るライブラリは注意を受ける。当該ライブラリのオペレータは、性能が最適以下である可能性を示す自動警告を受信することができる。
【０１７８】
同様に、サーバ２０５は、様々なプロジェクトに対して同じライブラリから得られる候補配列を比較することができる。無関係な標的化合物に対して抽出された候補において過度に見られる配列またはモチーフをサーバが同定した場合、これらの配列に、それらが出現するすべてのプロジェクトにおいて標識を付けることができる。この標識は、配列が偽陽性の恐れがあり、無関係な標的化合物に対する活性を点検すべきであることをオペレータに警告する。
【０１７９】
複合ライブラリの場合、サーバは、各サブライブラリが予想通りの性能を発揮しているかどうかを決定することができる。例えば、各サブライブラリから得られる候補数についての統計データがアップデートされ、設計パラメータと比較される。ライブラリ設計者は、統計データを点検し、新しい複合ライブラリ試料におけるサブライブラリの割合を変更し、新しいライブラリ構築物の品質を制御することができる。
【０１８０】
第３のセットの自動チェックは、プロジェクトの進行をモニタすることができる。サーバ２０５は、それまでの進行を初期に入力した予測マイルストンと比較することができる。サーバ２０５は、オペレータおよび責任者に遅延を自動的に警告する。サーバ２０５は、これまでの進行および装置効率についての情報に基づいて予測を修正することもできる。例えば、必要な保全または試薬不足のために、例えば、動作不能時間が検出された場合、予測が変更され、オペレータおよび責任者に通知される。
【０１８１】
第４のセットの自動チェックは、例えば、プロジェクト内、スクリーン内、またはデータベース全体における、配列決定されたディスプレイライブラリメンバの配列比較および／または複数の配列アラインメントを開始することができる。サーバ２０５は、これらのタスクを実行することができ、結果レポートをオペレータに自動的に送ることができる。これに加えて、またはこれとは別に、サーバ２０５は、結果を解析することができ、傾向および予想からの偏差を記録することができる。例えば、配列決定されたライブラリメンバすべての配列を、単一の複数の配列アラインメントに適合させることができる場合、これは、スクリーニングプロセスにバイアスが導入されたこと、または共通の分子インターフェースが作動していることをユーザに示している可能性がある。
【０１８２】
第５のセットの自動チェックは、サーバ２０５によって受信されたデータの品質を検証することができる。例えば、受信された各配列の読みを、品質パラメータ、例えば、ＰＨＲＥＤのパラメータによって検証することができる。別の例においては、アッセイプレートからスキャンされたデータを評価する。例えば、バックグラウンドおよび対照試料の値を、許容範囲と比較することができる。
【０１８３】
検査ルーチンが、標準以下のデータまたはいくつかの判定基準を満たすデータを同定するとき、システムは、試料取扱い装置にさらにデータを取得するように自動的に命令することができる。例えば、配列の品質が劣る場合、システムは、再配列決定の要求または命令を出すことができる。さらに、検査ルーチンは、例えば、品質が特定の領域において劣化する場合、配列決定反応用のプライマーおよびストランドを示すことができる。同様に、システムは、アッセイを再度実施する要求または命令を出すことができる。
【０１８４】
データ品質に偏向がある場合、システムは、装置またはユーザに接続して、実験室条件および試薬の不具合を改善することもできる。収集された情報を、データ品質と実験条件についての情報を関連させるデータベースに保存することができる。次いで、品質の劣るデータを受信したときに、問題を特定または示唆するように、システムを（例えば、ニューラルネット、ファジイ論理、または統計上の相関関係を用いて）トレーニングすることができる。例えば、特定の配列の読解が低活性ＤＮＡ配列決定酵素（すなわち、ポリメラーゼ）と相関する場合、システムは、ユーザまたは装置に、点検または新しい酵素のバッチを用意することを警告することができる。したがって、試薬、装置、試料および環境条件を、システムによって自動的にモニタすることができる。
【０１８５】
バーコード方式＆イベント監査
図１０を参照すると、各マルチウェルプレートは、一般に、最初に用意されたときに、一義的なプレート識別子が割り当てられる。この割り当てとしては、サーバ２０５に一義的な識別子を要求するステップ４５０が含まれる。サーバ２０５は、割り当てられたプレート識別子の表を検索し４５２、例えば、識別子の最高値を増すステップ４５４によって、例えば、次に割り当てるべき識別子を決定する。プロジェクト名またはプロジェクト番号を識別子の左側に連結させて参照を容易にすることができる。サーバは、割り当てられたプレート識別子の表中に要求に関連する情報を保存４５６し、一義的な識別子をプレート採取装置に返信４５８する。次いで、識別子は、マルチウェルプレート上にバーコードを用いて貼られることができる４６０。マルチウェルプレートは、対象とする各イベントに対して追跡４６２される。追跡は、各イベントの前後にバーコード標識を走査するステップを含むことができる。イベントのインスタンスがサーバに通信され、ログに記録４６４される。
【０１８６】
ログは、イベント表とすることができる。各イベントは、イベントを追跡したプレート識別子と、イベント性質の表示（例えば，「ステーション１で用意」「ステーション２で接種」など）と、イベントの時間および位置についての情報との関連性を含む。記述的情報を、例えば、イベントコード表中で識別されたコードを用いてコード化することができる。
【０１８７】
プロセス全体４４０によって、マルチウェルプレートを容易かつ正確に標識することが可能になる。また、スクリーニングプロセス１０に関連するイベントはすべて追跡されるので、プロジェクトまたはシステム２００全体の状態を決定することが可能である。また、マルチウェルプレートがシステム２００内にある場合、その内容および履歴についての情報は、サーバ２０５を照会することによって容易に検索することができる。
【０１８８】
他のタイプのオブジェクト識別子を、例えば、バーコードの代わりに使用することができる。例えば、各プレートは、高周波（ＲＦ）タグ、ホログラムまたは電子チップなどあらゆるタイプの光学、磁気、電子、化学または物理的識別子を含むことができる。
【０１８９】
外部クライアント
図１１を参照すると、外部クライアント２６２は、ライブラリスクリーニングサービスプロバイダー２４２にプロジェクトを依頼する。データベース６０は、外部クライアント２６２に関連する個人が情報にアクセスできるように構成されている。アクセスは、１）外部クライアントにおいて認証された個人、２）依頼されたプロジェクト、ただし他人によって依頼されたプロジェクトではないプロジェクトに関連する情報、３）例えば検証および品質管理に対して、内部ユーザによって公開された情報に制限することができる。
【０１９０】
例えば、外部クライアント２６２のクライアントユーザシステム２６５にいる個人は、ファイアウォール２６１によってインターネット２５０に接続されたイントラネット２６０に接続することができる。インターネット２５０を使用して、スクリーニングサービスプロバイダー２４２の内部イーサネット（登録商標）２４５に接続されたサーバ２０５との通信がルーティングされる。イーサネット（登録商標）２４５は、同様に、ファイアウォール２４１によって保護されている。
【０１９１】
クライアントユーザシステム２６５は、標準ハイパーテキスト転送プロトコルを使用して、このネットワークを介してサーバ２０５と機密を保持しつつ通信することができる。個人を認証するために電子証明書とパスワードが交換される。認証された個人は、ウェブブラウザでメニューを見ることができる。このメニューによって、例えば、個人が、プロジェクト概要を見たり、イベント、スクリーニングヒットおよびアッセイ結果のレポートを要求および／または閲覧することが可能になり、スクリーニングサービスプロバイダー２４２内でユーザシステム２４０においてコンタクト（ｃｏｎｔａｃｔ）して通信することができる。レポートなどのいくつかの情報は、電子メールで、またはウェブブラウザに直接送ることができる。レポートは、マイクロソフト（登録商標）エクセル、ワードもしくはパワーポイントなどのマイクロソフト（登録商標）オフィスアプリケーション、またはポストスクリプト、またはアドビ（登録商標）ポータブルドキュメントフォーマット（ＰＤＦ）用に書式設定することができる。
【０１９２】
プロジェクト概要は、プロジェクトに関連するマイルストンの目標日付を表示する図示時間線、および実際の進行の指標を含むことができる。例えば、時間線は、「スクリーニングライブラリ」、「アッセイ１０，０００ヒット」、「配列決定ベスト２，０００」、「スクリーニングライブラリラウンド２」、「組換え産物」、「産物検証」、「送達」などのマイルストンを含むことができる。
【０１９３】
１つのインプリメンテーションにおいては、インターフェースによって、クライアントユーザシステム２６５のユーザが、スクリーニングサービスプロバイダー２４２、例えば、スクリーニングサービスプロバイダー２４２の責任者または管理者と通信することも可能になる。例えば、インターフェースは、テキストコメントまたは要求のエントリ用領域を含むことができる。別のインターフェースによって、図示またはテキストによる顧客満足指標を選択することが可能になり、またはクライアントユーザシステムからデータ、必須パラメータまたはアッセイ条件を入力することさえ可能になる。この情報の一部または全部を、例えば、ユーザ入力パラメータに従ってディスプレイライブラリメンバヒットのアッセイを構成するように自動的に処理することができる。
【０１９４】
いくつかのインプリメンテーションにおいては、サーバ２０５は、課金および他の会計情報を管理するように構成されたソフトウエアを含むことができる。例えば、クライアント表中の外部クライアント２６２用データベースレコードは、課金コード、請求料率および請求計画、ならびに会計担当者取引用の各項目を含むことができる。プロジェクトが開始されると、課金予定がクライアントエントリに入力される。プロジェクト中、ソフトウエアは、指定のマイルストンに達する時間を自動的に検出し、外部クライアント２６２に課金請求書を発行することができる。また、サーバ２０５を、企業間取り引き（ｂｕｓｉｎｅｓｓ−ｔｏ−ｂｕｓｉｎｅｓｓ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）と接続することもできる。企業間取り引きは、例えば、ＳＡＰ  ＡＧ（Ｗａｌｌｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。
【０１９５】
ソフトウエアは、各プロジェクトに対する消耗品、装置時間およびオペレータ時間も追跡することができる。この情報を、外部クライアント２６２に請求書を送るために、または原価管理および費用効果管理に使用することができる。
【０１９６】
サーバは、システム操作に関係した配信およびオーダを追跡することもできる。特に主要な候補が同定されたときに、これらをクーリエによって外部クライアント２６２に送ることができる。送達の追跡情報は、サーバによってオンラインで、例えば、クーリエオペレータによって作成される。ライブラリスクリーニングパーティ２４２によって作成される、例えば、酵素、マルチウェルプレート、および他の消耗品に対するさらなるオーダを、サーバ２０５で追跡して各プロジェクトに必要な材料を時間通りに確実に送達させることができる。
【０１９７】
ソフトウエアおよびデータベースのインプリメンテーション
システム２００のコンピュータを使用した態様は、デジタル電子回路、またはコンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウエア、またはそれらの組合せにおいて実施することができる。本発明の装置、例えば、サーバ２０５は、機械読取り可能な記憶装置で明白に具体化されるコンピュータプログラム製品において実行することができ、プログラム可能なプロセッサによって実行される。方法アクション（ｍｅｔｈｏｄ  ａｃｔｉｏｎ）はプログラム可能なプロセッサによって実行され、命令プログラムを実行して入力データを処理し、出力することによって本発明の機能を実施することができる。本発明は、データ記憶システム、少なくとも１つの入力装置、ならびに少なくとも１つの出力装置からデータおよび命令を受信し、それらにデータおよび命令を送信するように接続された少なくとも１つのプログラム可能なプロセッサを含むプログラム可能なシステム上で実行される１つまたは複数のコンピュータプログラムで有利に実行することができる。各コンピュータプログラムは、高度手順（ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｃｅｄｕａｌ）またはオブジェクト指向プログラミング言語、または所望であればアセンブリもしくは機械語で実施可能である。いずれの場合にも、言語はコンパイルされた言語またはインタープリタ型言語とすることができる。適切なプロセッサとしては、例として示すと、汎用マイクロプロセッサ、専用マイクロプロセッサなどがある。一般に、プロセッサは、読み出し専用メモリおよび／またはランダムアクセスメモリから命令およびデータを受信する。一般に、コンピュータは、データファイルを保存する１つまたは複数の大容量記憶装置を備える。このような装置には、内部ハードディスク、リムーバブルディスクなどの磁気ディスク、光磁気ディスク、光ディスクなどがある。コンピュータプログラム命令およびデータを明白に具体化するのに適切な記憶装置としては、例としてＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ素子などの半導体メモリ素子を含めた不揮発性メモリ、内部ハードディスク、リムーバブルディスクなどの磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ  ＲＯＭディスクなどのあらゆる形式がある。
【０１９８】
例えば、サーバ２０５を、複数のコンピュータ間に分散させることもできることは言うまでもない。
このようなタイプのコンピュータの一例を図１２に示す。この図は、本発明の装置または方法を実行または実施するのに適切なプログラム可能なプロセシングシステム５１０のブロック図である。システム５１０は、プロセッサ（ＣＰＵ）バス５２５によって接続されたプロセッサ５２０、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）５２１、プログラムメモリ５２２（例えば、フラッシュＲＯＭなどの書込み可能な読み出し専用メモリ（ＲＯＭ））、ハードドライブ制御装置５２３および入力／出力（Ｉ／Ｏ）制御装置５２４を備える。システム５１０は、例えばＲＯＭに、あらかじめプログラムすることができ、または別のソース（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭまたは別のコンピュータ）からプログラムを書き込むことによってプログラムする（およびプログラムを書き変える）ことができる。
【０１９９】
ハードドライブ制御装置５２３は、本発明を具体化するプログラムを含めた実行可能なコンピュータプログラム、および記憶を含めたデータを保存するのに適切なハードディスク５３０に接続されている。Ｉ／Ｏ制御装置５２４は、Ｉ／Ｏバス５２６によってＩ／Ｏインターフェース５２７に接続されている。Ｉ／Ｏインターフェース５２７は、シリアルリンク、ローカルエリアネットワーク、ワイアレスリンク、パラレルシンクなどの通信リンクを介して、アナログ形式またはデジタル形式のデータを送受信する。
【０２００】
非限定的な実行環境の一例は、ウィンドウズ（登録商標）ＮＴ４．０以上（マイクロソフト）またはソラリス２．６以上（Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）のオペレーティングシステムを作動させているコンピュータである。ブラウザは、マイクロソフトインターネットエクスプローラバージョン４．０以上、またはネットスケープナビゲータもしくはコミュニケータバージョン４．０以上とすることができる。データベース用コンピュータおよび管理サーバは、２５６ＭＢメモリを用いた４００ＭＨｚペンティアム（登録商標）ＩＩ（インテル）プロセッサまたは同等品を有するウィンドウズ（登録商標）ＮＴ４．０、および９ＧＢ  ＳＣＳＩドライブを備えることができる。あるいは、２５６ＭＢメモリを備えたソラリス２：６ウルトラ１０（４００Ｍｈｚ）および９ＧＢ  ＳＣＳＩドライブとすることができる。
【０２０１】
後処理
再度図５を参照すると、プロセス３００は、様々ないわゆる「後処理」方法を含むことができる。例えば、第１の機能アッセイ３２４の後に、この方法は、追加のアッセイを含むことができる。これらの追加アッセイは、初期のセットのアッセイと異なっていてもよく、またはそれらを繰り返してもよい。それらは、ヒットピッキング３３０前またはヒットピッキング後および／または配列決定３４０後に実施することができる。追加アッセイを用いて、以下の情報を得ることができる。
【０２０２】
−特異性、例えば、非標的分子に対する結合または非標的分子に対する触媒活性
−親和性：見掛けＫｄ、または触媒の動力学パラメータ
−結合部位または「エピトープ」（例えば、１つまたは数個のエピトープが標的化合物とは異なる競合化合物を使用して、ディスプレイライブラリメンバが結合するエピトープを同定することができる）
−安定性（例えば、ディスプレイライブラリメンバは、ポリペプチドの安定性を精査する様々な条件下で前処理またはアッセイすることができる。このような処理としては、例えば、カオトロープ、極度のｐＨおよび熱への暴露がある。
【０２０３】
−生物活性（例えば、増殖、分化、アポトーシス、細胞遊走、細胞接着などの細胞プロセスの調整能力）。
−生理学的な諸性質（例えば、腎クリアランス、毒性、標的組織特異性など）
高処理機能アッセイのいくつかの例としては、ＥＬＩＳＡ、ホモジナスアッセイ、およびタンパク質アレイへの結合がある。
【０２０４】
（ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法））  標的に対するライブラリメンバの結合相互作用は、ＥＬＩＳＡアッセイによって分析することができる。例えば、ライブラリメンバを、その底面が標的、例えば、限定量の標的で被覆されたマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄して、標的およびプレートに非特異的に結合している物質を除去する。次いで、ライブラリメンバを認識する抗体を用いてプレートを精査して、プレートに結合しているライブラリメンバの量を決定する。例えば、ディスプレイライブラリメンバの場合、抗体は、例えば、ファージディスプレイライブラリメンバ、主要ファージコートタンパク質に対して、すべてのディスプレイライブラリメンバ間で一定である領域を認識することができる。抗体は、適切な基質が提供されると比色産物（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔ）を産生するアルカリホスファターゼなどの酵素に結合する。いくつかの場合においては、産生される比色産物の量は、比色産物の吸収波長における光学濃度を測定する光学式読取り装置を用いて決定することができる。
【０２０５】
いくつかの後処理分析は、上で列挙した追加情報（例えば、特異性など）を収集するＥＬＩＳＡ法の変法を含むことができる。これらの分析では、ＥＬＩＳＡは、入力ディスプレイライブラリメンバ量、標的化合物量、競合化合物量、ｐＨ、イオン強度、温度、還元剤の有無、またはプロテアーゼの有無を変えるステップを含むことができる。
【０２０６】
ＥＬＩＳＡは、「動力学モード」でも実施することができる。このモードでは、セットアップ後すぐに、ＥＬＩＳＡ分析物は、未結合ディスプレイライブラリメンバを設定時間で溶液から除去する液体取扱いステーションに移送される。別のインプリメンテーションでは、競合量の標的化合物が設定時間添加される。競合標的化合物は、アッセイプレートへの結合が阻止され、飽和量で存在するので、解離したディスプレイライブラリメンバは、プレートに結合している標的化合物に再結合しない。このバインディングアッセイの結果、結合の解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）についての情報が提供される。
【０２０７】
（ホモジニアスアッセイ）標的との結合相互作用は、ホモジナスアッセイによっても分析することができ、すなわち、すべてのアッセイ成分が添加された後、追加の流体操作が不要である。一般に、ディスプレイライブラリメンバは、アッセイに必要な１つの標識を含むように改変され、標的化合物はもう一方の標識を含むように改変される。標識は、共有結合しても、非共有結合してもよい。例えば、標識を含む抗体を使用して、標識をファージディスプレイライブラリエンバに結合させることができる。
【０２０８】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）をホモジナスアッセイとして使用することができる（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚ他、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ他、米国特許第４，８６８，１０３号参照）。第１の分子（例えば、画分中で同定された分子）上のフルオロフォア標識は、第２の分子が第１の分子に近接して存在する場合、その放射する蛍光エネルギーが第２の分子（例えば、標的）上の蛍光標識によって吸収されるように選択される。第２の分子上の蛍光標識は、転移エネルギー（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｅｎｅｒｇｙ）を吸収すると蛍光を発する。標識間のエネルギー移動効率は、分子間距離に関係するので、分子間の空間的関係を評価することができる。分子間に結合が存在する状況においては、アッセイにおける「受容体」分子標識の蛍光発光は、最大になるはずである。ＦＲＥＴ結合イベントは、当分野で周知の標準的な蛍光定量検出手段（例えば、蛍光光度計）によって都合良く測定することができる。第１または第２の結合分子の量を滴定することによって、結合曲線を作成して平衡結合定数を推定することができる。別のホモジナスアッセイは、Ｂｉｏｓｉｇｎａｌ  Ｐａｃｋａｒｄ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ）から入手可能なＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）技術を使用する。レーザによって励起されると一重項酸素を生成するドナービーズを、バインディングアッセイの１メンバ、例えば、ディスプレイライブラリメンバに結合させる。ドナービーズから拡散する一重項酸素に接触すると発光する受容体ビーズが、バインディングアッセイのもう一方のメンバ、例えば、標的化合物に結合する。このシステムおよびＦＲＥＴは、近接アッセイの例である。
【０２０９】
（タンパク質アレイ）抽出された各ディスプレイライブラリメンバからのタンパク質を、固体支持体、例えば、ビーズまたはアレイ上に固定することができる。タンパク質アレイの場合、ポリペプチドの各々は、支持体上の一義的なアドレスに固定される。一般に、アドレスは２次元アドレスである。
【０２１０】
いくつかのインプリメンテーションにおいては、ディスプレイライブラリメンバ自体が増幅され、アレイ上に配置される。例えば、細胞またはファージを、アレイとして使用するフィルター上で直接増殖させることができる。他のインプリメンテーションにおいては、組換えタンパク質産生を使用して、少なくとも部分的に精製されたタンパク質試料が産生される。部分的に精製された（または純粋な）試料がアレイ上に配置される。
【０２１１】
タンパク質アレイを産生する方法は、例えば、Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ等（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９〜９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇ等（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３〜１１１；Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８、ｅ３、Ｉ〜ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０〜１７６３；国際公開第０１／４０８０３号および同９９／５１７７３号Ａ１に記載されている。アレイ用ポリペプチドは、例えば、市販の、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏ  ＳｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓからのロボット装置を用いて高速にスポッティングすることができる。アレイ基質は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば、表面改質ガラスとすることができる。例えば、アレイは、例えば、上記Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔに記載されたように抗体のアレイとすることができる。
【０２１２】
タンパク質アレイを、標識標的に接触させ、多様性ストランドライブラリ（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｓｔｒａｎｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）からの各固定化タンパク質に対する標的の結合度を決定することができる。アレイの各アドレスにおける結合度についての情報は、プロファイルとして、例えば、コンピュータデータベースに保存することができる。タンパク質アレイは、繰り返し産生することができ、例えば標的および非標的の結合プロファイルを比較するために使用することができる。したがって、タンパク質アレイを使用して、１つまたは複数の分子に関して所望の結合特性を有する多様性ストランドライブラリの個々のメンバを同定することができる。
【０２１３】
（組換え産生）上述したように、いくつかの後処理分析には、表示されたポリペプチドの部分的に精製された試料、または精製された試料が必要である。これらの分析では、組換えポリペプチド産生技術を使用して試料を調製することができる。
【０２１４】
例えば、サーバ２０５は、組換え産生用のディスプレイライブラリメンバ候補をオペレータが選択することができるインターフェースを備えることができる。上述したように、インターフェースは、ディスプレイライブラリメンバ候補を選択するために使用することができるチェックボックス、プルダウンメニューまたは検索クエリを含むことができる。ユーザ選択に基づいて、サーバ２０５は、試料取扱い装置に指示して、組換えポリペプチド産生用に選択されたディスプレイライブラリメンバを調製することができる。
【０２１５】
試料取扱い装置は、自動クローニングプロセスにおいて、選択されたライブラリメンバを処理することができる。例えば、この装置は、様々な操作（例えば、ＰＣＲ、他の増幅、プラスミド、または一本鎖核酸調製）を実行して各ライブラリメンバの関連表示ポリペプチドをコードする核酸を得て、その核酸を新しいベクターに挿入し、または組換え産生などの下流処理の新しい状況に置くことができる。自動クローニングを使用して、他の目的、例えば、配列決定、アーカイビング、トランスジェニック動物産生、遺伝子除去などのために、ライブラリメンバを再設定できることは言うまでもない。
【０２１６】
表示ポリペプチドが、ファージメンバコートタンパク質またはその断片に融合体として表示され、融合体をコードする核酸中に抑圧可能な終止コドンが含まれる場合、試料取扱い装置は、表示ポリペプチドをコードする核酸を非抑圧細菌菌株（ｎｏｎ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔｒａｉｎ）に移すことができる。これを実施するには、ライブラリ核酸のリクローニングまたは他の再設定は不要である。
【０２１７】
別の例においては、試料取扱い装置は、各選択されたディスプレイポリペプチドの変異領域をコードする核酸の増幅反応を構築することができる。これらの反応は、増幅条件、例えば、サーマルサイクラー中に移すことができる。次いで、増幅断片を単離し、発現ベクター、例えば、真核生物発現ベクター（例えば、哺乳動物、植物または真菌）または原核生物発現ベクターにクローン化することができる。
【０２１８】
さらに別の例においては、変異領域（または表示ポリペプチド全体）をコードする核酸を、末端組換え部位を含むプライマーを用いて増幅させる。このような部位は、増幅が不要であるディスプレイベクターにおいて設計することもできる。核酸は、組換え、例えば、インビボでの組換えまたはインビトロでの組換え（例えば、組換えクローニング）を用いて、発現ベクター中に挿入される。
【０２１９】
組換えクローニング方法は、例えば、米国特許第５，８８８，７３２号；Ｗａｌｈｏｕｔ等（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１１６；およびＬｉｕ等（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８（２４）：１３００〜９に記載されている。組換えクローニングは、特異的配列でＤＮＡを切断し、次いでその両末端を単一の協奏反応中に他の適合する配列と再結合させるある種の酵素の活性を利用する。組換え反応は、インビトロで起こすことができる。その後、反応混合物を、適切な細菌宿主菌株中に形質転換する。標的ベクターは、組換え部位間に位置し細菌に対して毒性のある遺伝子を、組換え中にその毒性遺伝子の切除が必要になるように含むことができる。したがって、適切な選択下にある細菌中に生存可能であるクローニング産物は、ほとんど所望の構築体だけである。実際には、所望の産物のクローニング効率は、９５〜１００％に迫る。この高い効率によって、自動的に、例えばロボットで、ほとんど監視することなくプロセスを実施することが可能になる。
【０２２０】
自動クローニング（例えば、サブクローニング）の後、クローニングされた選択ライブラリメンバを、高処理形式で検証することができ、または例えば検証なしでスクリーニングすることができる。
【０２２１】
いくつかのタイプの細胞は、選択されたライブラリメンバによってコードされるタンパク質の発現に適切な宿主細胞として働くことができる。Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇは、組換え（および非組換え）タンパク質を精製するいくつかの一般的な方法を提供している。この方法には、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ−サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、選択的沈殿、透析および疎水性相互作用クロマトグラフィがある。これらの方法は、例えば並行して選択されたライブラリメンバのタンパク質に対する精製戦略を考案するように適合させることができる。特に、ヘキサ−ヒスチジンタグおよびエピトープタグなどの精製ハンドル（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｈａｎｄｌｅ）を使用することができる。抗体および抗体断片の場合、タンパク質Ａ、ＬまたはＧなどの抗体結合タンパク質を使用することができる。
【０２２２】
合成産生。７０アミノ酸未満、より典型的には３０アミノ酸未満のポリペプチドの場合、ディスプレイライブラリスクリーンによって同定されたポリペプチドは、例えば、ｔ−ＢＯＣ／ＦＭＯＣを用いた合成によって合成することができる。サーバ２０５は、オペレータがペプチド合成用のディスプレイライブラリメンバを選択可能にするインターフェースを含むことができる。次いで、各選択されたメンバのアミノ酸配列を表すストリングは、自動ペプチド合成装置に（局所的にまたは遠隔で）送信される。次いで、合成装置は、ペプチドを産生し、バーコードで標識された容器、例えば、マルチウェルプレートのウェルまたは独立型容器にそれを配置する。これらの容器を、システムが追跡することもできる。必要に応じて、合成後、手動または自動の命令によってペプチドのＨＰＬＣ精製および質量分析検証が行われる。
【０２２３】
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））表示されたポリペプチドは、ＳＰＲによって標的への結合をアッセイすることができる。ＳＰＲまたは実時間生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）は、相互作用物質のいずれも標識することなく、生体特異的相互作用を実時間で検出する（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。ＢＩＡチップの結合表面における（結合イベントを示す）質量変化は、表面近くの光屈折率変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）をもたらす。屈折度の変化によって検出可能な信号が発生し、生物学的分子間の実時間反応の指標として測定される。ＳＰＲの使用方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８〜２３４５；Ｓｚａｂｏ等（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９〜７０５、およびＢＩＡＣｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から利用可能なオンラインリソースに記載されている。
【０２２４】
ＳＰＲからの情報を使用して、標的への生体分子の結合に対する平衡解離定数（Ｋd）、およびＫonおよびＫoffを含めた動力学パラメータを正確かつ定量的に測定することができる。このようなデータを使用して、様々な生体分子を比較することができる。例えば、ディスプレイライブラリから選択されたタンパク質を比較して、標的に対する親和性の高い個体、またはＫoffの遅い個体を同定することができる。生体分子が関係する場合、この情報を使用して、構造活性相関（ＳＡＲ）を解明することもできる。例えば、タンパク質がすべて単一の親抗体または１セットの既知の親抗体の突然変異体である場合、所与の位置において、特定の結合パラメータ、例えば、高い親和性および遅いＫoffと相関する変異アミノ酸を同定することができる。
【０２２５】
結合親和性を測定する別の方法としては、蛍光偏光（ＦＰ）（例えば、米国特許第５，８００，９８９号参照）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および結合滴定（例えば、蛍光エネルギー移動）などがある。
【０２２６】
（バイオアッセイ）  組換え産生された表示ポリペプチドの生物活性を分析することができる。一例においては、ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃエフェクタードメインに融合される。表示ポリペプチドは、それ自体免疫グロブリンの断片、例えば、単鎖免疫グロブリンまたはＦａｂ断片であってもよい。ただし、表示ポリペプチドは、免疫グロブリンの断片でなくてもよい。
【０２２７】
Ｆｃエフェクタードメインに融合したディスプレイライブラリメンバは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞性細胞傷害（ＣＤＣ）の２つのモードで細胞毒性を分析することができる。これらのアッセイは、当分野では日常的なものである。
【０２２８】
分化および増殖に対する多数の細胞培養アッセイが当分野で知られている。いくつかの例は以下のとおりである。
胚性幹細胞分化の（なかでも胚分化血球新生に影響を及ぼすタンパク質を同定する）アッセイとしては、例えば、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ等（１９９５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１４１〜１５１；Ｋｅｌｌｅｒ等（１９９３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：４７３〜４８６；ＭｃＣｌａｎａｈａｎ等（１９９３）Ｂｌｏｏｄ  ８１：２９０３〜２９１５に記載のものがある。
【０２２９】
リンパ球生存／アポトーシスの（なかでもスーパー抗原誘導後のアポトーシスを阻止するタンパク質、およびリンパ球ホメオスタシスを調節するタンパク質を同定する）アッセイとしては、例えば、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ等、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １３：７９５〜８０８、１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａ等、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ７：６５９〜６７０、１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：１９４５〜１９５１、１９９３；Ｉｔｏｈ等、Ｃｅｌｌ  ６６：２３３  ２４３、１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４５：４０３７  ４０４５、１９９０；Ｚａｍａｉ等、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １４：８９１〜８９７、１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａ等、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：６３９〜６４８、１９９２に記載のものがある。
【０２３０】
Ｔ細胞拘束（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）および成長の初期ステップに影響を及ぼすタンパク質のアッセイとしては、Ａｎｔｉｃａ等、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１１１〜１１７、１９９４；Ｆｉｎｅ等、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：１１１〜１２２、１９９４；Ｇａｌｙ等、Ｂｌｏｏｄ  ８５：２７７０〜２７７８、１９９５；Ｔｏｋｉ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７５４８〜７５５１、１９９１に記載のものなどがあるが、これらだけに限定されない。
【０２３１】
（なかでもナイーブＴ細胞を活性化させる樹状細胞によって発現されるタンパク質を同定する）樹状細胞依存アッセイとしては、Ｇｕｅｒｙ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：５３６〜５４４、１９９５；Ｉｎａｂａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７３：５４９〜５５９、１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５４：５０７１〜５０７９、１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８２：２５５〜２６０、１９９５；Ｎａｉｒ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７：４０６２〜４０６９、１９９３；Ｈｕａｎｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１〜９６５、１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６９：１２５５〜１２６４、１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９４：７９７〜８０７、１９９４；およびＩｎａｂａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７２：６３１〜６４０、１９９０に記載のものなどがあるが、これらだけに限定されない。
【０２３２】
Ｔ細胞または胸腺細胞増殖のアッセイとしては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｐｕｂ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、−Ｔｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ３．１−３．１９；第７章、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｔａｋａｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４  ３５００、１９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１７０６  １７１２、１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ等、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３：３２７〜３４１、１９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉ，等、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７７８〜３７８３、１９９２；Ｂｏｗｍａｎ等、Ｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１７５６〜１７６１、１９９４に記載のものなどがあるが、これらだけに限定されない。
【０２３３】
ひ臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖のアッセイとしては、Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ａ．Ｍ．およびＳｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎ編  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．３．１２．１〜３．１２．１４、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４；およびＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ｇａｍｍａ．、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、Ｃｏｌｉｇａｎ編  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．８．１〜６．８．８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９４に記載のものなどがあるが、これらだけに限定されない。
【０２３４】
造血およびリンパ球産生細胞の増殖および分化のアッセイとしては、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ４、Ｂｏｔｔｏｍｌｙ，Ｋ．、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．Ｓ．およびＬｉｐｓｋｙ，Ｐ．Ｅ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．３．１〜６．３．１２、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；ｄｅＶｒｉｅｓ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１２０５  １２１１、１９９１；Ｍｏｒｅａｕ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６９０〜６９２、１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２９３１〜２９３８、１９８３；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６、Ｎｏｒｄａｎ、Ｒ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊ．Ｅ．ｅ．ａ．Ｃｏｌｉｇａｎ編  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．６．１  ６．６．５、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１；Ｓｍｉｔｈ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｅｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１８５７〜１８６１、１９８６；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１１、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｆ．、Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ，Ｊ．、Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．およびＴｕｒｎｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎ編  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．１５．１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ．１９９１に記載のものなどがあるが、これらだけに限定されない。
【０２３５】
抗原に対するＴ細胞クローン反応の（なかでもＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用ならびにＴ細胞効果に直接的な影響を及ぼすタンパク質を、増殖およびサイトカイン産生を測定することによって同定する）アッセイとしては、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ、Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ、Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ、Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ、Ｗ  Ｓｔｒｏｂｅｒ編、Ｐｕｈ．Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；第６章、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ；第７章、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎｓ）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６０９１〜６０９５、１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１１：４０５〜４１１、１９８１；Ｔａｋａｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３４９４〜３５００、１９８６；Ｔａｋａｉ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：５０８〜５１２、１９８８に記載のものなどがあるが、これらだけに限定されない。
【０２３６】
例えば、他のアッセイによって、内皮細胞挙動、神経細胞成長、神経細胞遊走、精子形成、卵形成、アポトーシス、内分泌信号、グルコース代謝、アミノ酸代謝、コレステロール代謝、赤血球生成、血小板生成などに関する生物活性を決定することができる。
【０２３７】
（インビボでのアッセイ）ディスプレイライブラリによって同定されたタンパク質は、インビボでのアッセイにおいて、例えば、タンパク質を発現するファージディスプレイメンバ、または（例えば、ファージから単離された）タンパク質自体を、生物、例えば、無脊椎動物（例えば、線虫、ショウジョウバエ）または脊椎動物（例えば、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ヤギ、霊長類、ヒトなどの哺乳動物）に投与することによって評価することもできる。生物は、特定の疾患モデル、例えば、ヒト腫瘍を異種移植したヌードマウスとすることもできる。生物の１つまたは複数のパラメータをモニタすることができる。パラメータについての情報は、データベースに入力することができる。例示的なパラメータとしては、生命徴候、疾患に対する抵抗力、ストレスに対する抵抗力、活性、導入されたタンパク質の腎クリアランス、導入タンパク質の循環レベル、導入タンパク質の局在化などがある。
【０２３８】
関係する実施形態においては、タンパク質は、生物において異種核酸を用いて発現される。例えば、異種核酸をコードする核酸を、導入遺伝子またはＤＮＡワクチンとして導入することができる。
【０２３９】
これらの方法を使用して、ライブラリから選択された１つまたは複数のタンパク質の毒性、効力および特異性についてのデータを収集することができる。これらのデータは、選択されたライブラリメンバについての他の情報に関連する（例えば、参照される）レコードに保存することができる。これらのデータを使用してタンパク質の構造活性相関を導き出すことができる。
【０２４０】
ディスプレイライブラリ
ディスプレイライブラリは、エンティティのコレクションである。各エンティティは、入手可能な多様なポリペプチド成分、およびポリペプチド成分をコードするまたは同定する回収可能な成分を含む。ポリペプチド成分は任意の鎖長とすることができ、例えば、３アミノ酸から３００アミノ酸を超える鎖長とすることができる。表示には様々な形式を使用することができる。
【０２４１】
（ファージディスプレイ）１つの形式では、ウイルス、特にバクテリオファージが使用される。この形式は、「ファージディスプレイ」と称する。変更が加えられたポリペプチド成分が、一般に、バクテリオファージコートタンパク質またはそのドメインに共有結合する。結合は、核酸によってコードされた翻訳融合（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ）によって生成され、変更が加えられたポリペプチドと不変バクテリオファージコートタンパク質またはそのドメインが結合する。結合は、可とう性のペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、または終止コドンが抑圧された結果組み込まれたアミノ酸を含むこともできる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５〜１３１７；国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９１／１７２７１号；国際公開第９２／２０７９１号；国際公開第９２／１５６７９号；国際公開第９３／０１２８８号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／０９６９０号；国際公開第９０／０２８０９号；国際公開第９４／０５７８１号；国際公開第００／７００２３号；Ｆｕｃｈｓ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０〜１３７２；Ｈａｙ等（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１〜８５；Ｈｕｓｅ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５〜７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ等（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９〜８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８；Ｇｒａｍ等（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６〜３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ等（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３〜１３７７；Ｒｅｂａｒ等（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：１２９〜４９；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３〜４１３７；およびＢａｒｂａｓ等（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８〜７９８２に記載されている。多連鎖タンパク質、例えば、Ｆａｂｓを表示することも可能である（下記参照）。また、変更が加えられたポリペプチド成分は、非共有相互作用（例えば、ｆｏｓ−ｊｕｎ二量体化）または非ペプチド共有結合（例えば、ジスルフィド結合）によって付着させることができる。
【０２４２】
ファージディスプレイシステムは、繊維状ファージ（ファージｆｌ、ｆｄ、およびＭ１３）ならびに他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージおよびラムダファージ；例えば、Ｓａｎｔｉｎｉ（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２：１２５〜１３５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等（１９９６）Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ６：１〜６；Ｈｏｕｓｈｍａｎｄ等（１９９９）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６８：３６３〜３７０参照）用に開発された。繊維状ファージディスプレイシステムは、一般に、遺伝子ＩＩＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩＩタンパク質などの少数のコートタンパク質、主要なコートタンパク質への融合を使用するが、遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、遺伝子ＩＸタンパク質、またはそれらのドメインなどの他のコートタンパク質への融合も使用することができる（例えば、国際公開第００／７１６９４号参照）。好ましい実施形態においては、融合は、遺伝子ＩＩＩタンパク質のドメイン、例えば、アンカードメインまたは「スタンプ」に対するものである（遺伝子ＩＩＩタンパク質アンカードメインの記述については、例えば、米国特許第５，６５８，７２７号を参照されたい）。
【０２４３】
ペプチド成分の結合価を制御することもできる。完全なファージゲノムへのペプチド成分をコードする配列のクローニングは、遺伝子ＩＩＩタンパク質のすべての複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）がペプチド成分に融合するので、複数の変異体表示をもたらす。結合価を減少させるために、ファージミド系を利用することができる。この系においては、遺伝子ＩＩＩに融合したペプチド成分をコードする核酸は、一般に７００ヌクレオチド未満の長さのプラスミド上で提供される。このプラスミドは、ファージ複製開始点を含み、プラスミドを含む細菌細胞がヘルパーファージ、例えば、Ｍ１３Ｋ０１に感染すると、バクテリオファージ粒子中に組み込まれる。ヘルパーファージは、ファージ複製および構築に必要な遺伝子ＩＩＩおよび他のファージ遺伝子の完全なコピーを提供する。ヘルパーファージは、欠陥のある開始点を有するので、ヘルパーファージゲノムは野生型開始点のプラスミドほど効率良くファージ粒子中に組み込まれない。
【０２４４】
ペプチド成分を表示するバクテリオファージは、標準ファージ準備方法、例えば増殖培地からのＰＥＧ沈殿を用いて増殖させ収集することができる。
個々のディスプレイファージを選択した後、選択されたファージを用いて細胞を感染させることによって、選択されたペプチド成分をコードする核酸。個々のコロニーまたはプラークを採取し、核酸を単離し、配列を決定することができる。
【０２４５】
（細胞ベースの表示）  さらに別の形式においては、ライブラリは細胞ディスプレイライブラリである。タンパク質は、細胞、例えば、真核生物細胞または原核生物細胞の表面に表示される。例示的な原核細胞としては、大腸菌細胞、枯草菌細胞、胞子などがある（例えば、Ｌｕ等（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３６６参照）。例示的な真核細胞としては、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、ＨａｎｓｅｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）がある。酵母表面ディスプレイは、例えば、ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３〜５５７に記載されている。
【０２４６】
一実施形態においては、変更が加えられた核酸配列がベクターにクローン化されて酵母表示される。クローニングによって、変更が加えられた配列と、ドメイン（または完全）酵母細胞表面タンパク質、例えば、Ｆｌｏ  １、ａ−凝集素、α−凝集素、またはそれらから誘導される断片、例えば、Ａｇａ２ｐ、Ａｇａ１ｐとが結合する。これらのタンパク質ドメインは、多様な核酸配列によってコードされるポリペプチドを、ＧＰＩ−アンカー（例えばａ−凝集素、α−凝集素またはそれらから誘導される断片、例えば、Ａｇａ２ｐ、Ａｇａ１ｐ）、膜貫通ドメイン（例えば、Ｆｌｏ  １）によって固定することができる。ベクターは、細胞表面で２つのポリペプチド鎖を発現するように構成することができ、その鎖の１本は酵母細胞表面タンパク質に連結されている。例えば、２つの鎖を免疫グロブリン鎖とすることができる。
【０２４７】
（ペプチド−核酸融合）  別の形式は、ペプチド−核酸融合を利用する。ポリペプチド−核酸融合は、例えば、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７〜１２３０２、および米国特許第６，２０７，４４６号に記載されているように、共有結合したピューロマイシン基を含むｍＲＮＡのインビトロでの翻訳によって生成させることができる。次いで、このｍＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、ポリペプチドに架橋させることができる。
【０２４８】
（リボソームディスプレイ）  ＲＮＡおよびそのＲＮＡによってコードされるポリペプチドは、ＲＮＡを翻訳中であり、まだ付着している発生期のポリペプチドを有するリボソームを安定化させることによって物理的に結合させることができる。一般に、高濃度の二価のＭｇ2+と低温が使用される。例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ等（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２；Ｈａｎｅｓ等（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７〜９２；Ｈａｎｅｓ等（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４０４〜３０．およびＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ等（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１（１〜２）：１１９〜３５を参照されたい。
【０２４９】
（他のディスプレイ形式）  さらに別のディスプレイ形式は、ポリペプチド成分が、ポリペプチドを識別する非核酸タグに付着している非生物学的なディスプレイである。例えば、タグは、ポリペプチドを表示するビーズに付着した化学タグ、または高周波タグとすることができる（例えば、米国特許第５，８７４，２１４号参照）。
【０２５０】
ディスプレイ技術を用いて、標的の特異的リガンド、例えば、抗体リガンド、特定のエピトープを得ることができる。これは、例えば、特定のエピトープを欠く、またはエピトープ内で、例えば、アラニンが突然変異した競合非標的分子を用いて実施することができる。このような非標的分子は、下記ネガティブセレクション操作において、ディスプレイライブラリを標的に結合させるときの競合分子として、または例えば、標的に特異的でない解離ディスプレイライブラリメンバを洗浄溶液中で捕捉するプレ溶出剤（ｐｒｅ−ｅｌｕｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）として使用することができる。
【０２５１】
抗体
一実施形態においては、ディスプレイライブラリがスクリーニングされて免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片が同定される。「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインを意味する。「免疫グロブリンスーパーファミリードメイン」とは、免疫グロブリンドメインに関係する３次元構造を有するが、非免疫グロブリン分子に由来するドメインを意味する。免疫グロブリンドメインおよび免疫グロブリンスーパーファミリードメインは、一般に、約７個のβ−ストランドで形成される２つのβ−シートと保存ジスルフィド結合（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｂｏｎｄ）を含む（例えば、Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ  １９８８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１〜４０５参照）。Ｉｇスーパーファミリードメインのドメインを含むタンパク質としては、Ｔ細胞受容体、ＣＤ４、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）などがある。
【０２５２】
免疫グロブリン足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の一実施形態は、抗体、特に抗体の抗原結合性フラグメントである。本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子またはその抗原結合部分を意味する。典型的な抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記する）、および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記する）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存的な「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称する領域とともに散在する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称する超可変領域にさらに細分することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．等（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．等（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７参照）。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で整列した３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。
【０２５３】
免疫グロブリンドメインのディスプレイライブラリにおいては、これらの領域の各々は、例えば、合成または天然の多様性とともに変わり得る。変異は、免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の１つまたは複数の領域に導入することができ、このような重鎖および軽鎖のどちらかまたは両方の領域を可変ドメインと称する。一実施形態においては、変異は、所与の可変ドメインの３つのＣＤＲすべてに導入される。別の好ましい実施形態においては、変異は、例えば、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に導入される。あらゆる組合せが可能である。
【０２５４】
抗体は、軽鎖または重鎖の一部として定常領域を含むこともできる。軽鎖は、ＣＯＯＨ末端のカッパまたはラムダ定常領域遺伝子を含むことができる。重鎖は、例えば、ガンマ定常領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４；約３３０アミノ酸をコードする）を含むことができる。
【０２５５】
本明細書で使用する抗体の「抗原結合性フラグメント」（または単に「抗体部分」または「断片」）という用語は、標的に特異的に結合する能力を保持する完全長抗体の１つまたは複数の断片を意味する。抗原結合性フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ'）2断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ等、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）であるが、これらだけに限定されない。また、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、組換え方法を用いて、合成リンカーによって連結することができる。合成リンカーによって、ＶＬとＶＨを、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ等（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎ等（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３参照）として調製することが可能になる。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性フラグメント」という用語に包含される。
【０２５６】
必要であれば、本明細書に記載するディスプレイライブラリスクリーニング方法は、１つの形式から他の形式（例えば、ＦａｂからＩｇ、またはｓｃＦｖからＦａｂなど）への抗原結合ドメインの（例えば、ロボット駆動の核酸操作によって）自動的な移動を含むことができる。
【０２５７】
ペプチドおよび足場ドメイン変異
一実施形態においては、本明細書に記載する核酸変異方法を使用して、ペプチド、例えば、標的に特異的に結合するペプチドリガンドをコードする核酸を変異させ、または、一般に、任意のタンパク質様ドメイン、例えば、標的に結合するドメイン、または標的への結合に関与するドメインをコードする核酸を変異させる。ペプチドリガンドまたは他の標的結合リガンドは、例えば下記のディスプレイライブラリを用いて同定される。
【０２５８】
（合成ペプチド）  結合リガンドは、独立に標的分子に結合する３２アミノ酸以下の合成ペプチドを含むことができる。いくつかの合成ペプチドは、１つまたは複数のジスルフィド結合を含むことができる。他の合成ペプチド、いわゆる「リニアペプチド」には、システインがない。合成ペプチドは、溶液状態でほとんどまたはまったく構造を持たなくても（例えば、非構造（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ））、不均一構造でも（例えば、選択的配座（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）または「ゆるく構造化された」）、あるいは（例えば、協同的に折り畳まれた）単一の未変性構造であってもよい。いくつかの合成ペプチドは、標的分子に結合すると特定の構造をとる。いくつかの例示的な合成ペプチドは、少なくともジスルフィド結合と、例えば、約４〜１２非システイン残基のループとを有するいわゆる「環式ペプチド」である。多くの例示的なペプチドは、２８、２４、２０または１８アミノ酸より短い。
【０２５９】
分子標的に独立に結合するペプチド配列を、ディスプレイライブラリまたはペプチドのアレイから選択することができる。同定後、このようなペプチドを合成または組換え手段によって産生させることができる。これらの配列は、より長鎖の配列に組み込む（例えば、挿入、追加または付加）ことができる。
【０２６０】
例示的なファージディスプレイは、Ｍ１３ファージ表面に短く多様な外因性ペプチドを表示する。ペプチドディスプレイライブラリは、システイン残基（またはその補体）のコドンが隣接する４〜３０個の変更が加えられたコドン位置、例えば、４、５、６、７、８、１０、１１または１２個の変更が加えられたコドンのセグメントを有するように設計された合成オリゴヌクレオチドから合成することができる。システイン対は、安定なジスルフィド結合を形成し、環式ディスプレイペプチドを生成すると考えられる。オリゴヌクレオチドは、表示に適切な形式にクローン化することができ、例えば、変更が加えられたペプチドは、ファージ表面のタンパク質ＩＩＩのアミノ末端に表示される。例えば、１２アミノ酸長配列において４アミノ酸のループを作製するために、ライブラリは、変更が加えられた３つのコドン位置、システインをコードするコドン、変更が加えられた４つのコドン位置、システインをコードするコドン、および変更が加えられた３つのコドン位置を含むテンプレート配列を用いて構築される。変更が加えられたコドン位置は、システイン以外の任意のアミノ酸をコードするコドンを含むことができる。このような変異は、核酸合成用トリヌクレオチドサブユニットを用いて生じさせることができる。パターン形成および変異の程度を正確に制御して、例えば、他のサイズおよび組成のループを生成させることもできる。システインをすべて取り除き、リニアペプチドを調製することができる。例えば、Ｌｉｎ２０ライブラリは、単一のリニアペプチドを２０アミノ酸テンプレートで表示するように構築された。テンプレート中の各位置におけるアミノ酸は、システイン（Ｃｙｓ）以外の任意のアミノ酸が許容されるように変更された。
【０２６１】
Ｋａｙ等、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９６）および米国特許第５，２２３，４０９号で考察された技術は、選択された親テンプレートに対応するバインダ候補のライブラリを調製するのに有用である。上述したライブラリは、このような技術に従って調製され、例えば、上述したように、特定の分子標的に結合するペプチドをスクリーニングすることができる。
【０２６２】
１つまたは複数のペプチドが選択された後、１つまたは複数のペプチド（またはその補体）をコードするテンプレート核酸を調製することができる。これらのペプチドは、オリゴヌクレオチドのサブセットのみが結合する条件下で、多様なセットのオリゴヌクレオチド、例えば、最初のライブラリを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって、制御された方法で変更を加えることができる。これらのハイブリダイゼーション条件は、テンプレート核酸に対していくつかの類似性を有する配列をコードするアニーリングオリゴヌクレオチドに有利であり、その結果、最初に選択されたペプチドから少なくとも一部のコドンが保持される。アニールされたオリゴヌクレオチドを組み込む多様な核酸が、ペプチドの第２のディスプレイライブラリを調製するために合成される。いくつかのインプリメンテーションにおいては（例えば、１２アミノ酸未満のペプチドの場合）、これらのオリゴヌクレオチドを伸長させる必要は必ずしもなく、単にそれらを不変配列（例えば、アンカータンパク質）をコードする核酸に連結するだけでよい。すなわち、これらのインプリメンテーションにおいては、テンプレートストランドを複製する必要はない。例えば、オリゴヌクレオチド混合物は、オリゴヌクレオチドテンプレートハイブリッドを変性し、多様性の区域に接する相補領域を基にして直接クローン化することによって回収され、または保持されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲ後に回収される。あるいは、突然変異体ストランドは、先に記述されたクンケルの突然変異誘発手順によって回収される。
【０２６３】
このような突然変異誘発手順の利点は、個々のクローンの特徴的配列を明らかにする必要がなく、選択された集団の遺伝的な複雑さを理解することさえなしに、選択された集団のコレクション全体の突然変異を起こすことができる点にある。したがって、１つの用途においては、コンセンサス配列をあらかじめ同定する必要はない。この手法によって、第１のラウンドの選択／スクリーニング／分析後に定義される特定のコンセンサスに従わず、初期に選択された集団においては稀なクローンの親和性選択が可能になり、頻度およびコンセンサスを頻繁に考慮し、このようなクローンを除去してさらに分析または成熟させることができる。このハイブリダイゼーションによる突然変異誘発戦略を複数のラウンドに適用し、ストリンジェンシーを増加させながら実行すると（例えば、それによって導入される突然変異の数を徐々に減少させる高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および、例えば、抗原に対する結合を選択するときに洗浄のストリンジェンシーを徐々に増加させる高ストリンジェンシー選択の１つまたは複数）、初期のペプチドまたはタンパク質配列が繰り返し成熟することが予想される。配列空間を集中して利用することが特に有用であり得る。
【０２６４】
（他の例示的な足場）  血清アルブミンおよび特定の標的に結合するタンパク質を産生するように変化させることができる他の例示的な足場としては、細胞外ドメイン（例えば、フィブロネクチンタイプＩＩＩリピート、ＥＧＦリピート、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣタンパク質）；プロテアーゼ阻害剤（例えば、クニッツドメイン、エコチン（ｅｃｏｔｉｎ）、ＢＰＴＩなど）；ＴＰＲリピート；トリフォイル（ｔｒｉｆｏｉｌ）構造；ジンクフィンガードメイン；ＤＮＡ結合タンパク質；特に単量体ＤＮＡ結合タンパク質；ＲＮＡ結合タンパク質；酵素、例えば、（不活化プロテアーゼを含めた）プロテアーゼ、ＲＮアーゼ；シャペロン、例えば、チオレドキシン、および熱ショックタンパク質；ならびに細胞内シグナル伝達ドメイン（ＳＨ２およびＳＨ３ドメインなど）および抗体（例えば、Ｆａｂ断片、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦＶ）、単一のドメイン抗体、ラクダ抗体、およびラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体）；Ｔ細胞受容体およびＭＨＣタンパク質などがある。
【０２６５】
多くの実施形態においては、足場は、５０アミノ酸長未満である。小さな足場ドメインの例は、クニッツドメイン（約５８アミノ酸、３個のジスルフィド結合）、Ｃｕｃｕｒｂｉｄａ  ｍａｘｉｍａトリプシン阻害ドメイン（約３１アミノ酸、３個のジスルフィド結合）、グアニリンに関係するドメイン（約１４アミノ酸、２個のジスルフィド結合）、グラム陰性菌由来の耐熱性エンテロトキシンＩＡに関係するドメイン（約１８アミノ酸、３個のジスルフィド結合）、ＥＧＦドメイン（約５０アミノ酸、３個のジスルフィド結合）、クリングルドメイン（約６０アミノ酸、３個のジスルフィド結合）、真菌の炭水化物結合ドメイン（約３５アミノ酸、２個のジスルフィド結合）、エンドセリンドメイン（約１８アミノ酸、２個のジスルフィド結合）、ジンクフィンガードメイン（ジスルフィド結合なし、キレート亜鉛原子）、および連鎖球菌Ｇ  ＩｇＧ結合ドメイン（約３５アミノ酸、ジスルフィド結合なし）である。
【０２６６】
米国５，２２３，４０９は、いくつかのいわゆる「ミニタンパク質」、例えば、（変異体ＧＩ、ＧＩＩおよびＭＩを含めた）α−コノトキシン、ミュー−（ＧＩＩＩＡ、ＧＩＩＩＢ、ＧＩＩＩＣ）またはオメガ−（ＧＶＩＡ、ＧＶＩＢ、ＧＶＩＣ、ＧＶＩＩＡ、ＧＶＩＩＢ、ＭＶＩＩＡ、ＭＶＩＩＢなど）コノトキシンをモデルにしたミニタンパク質も記載している。米国６，４２３，４９８は、変更が加えられたクニッツドメインの例示的なライブラリ、およびこのようなライブラリを構築する方法を記載している。
【０２６７】
上述したように、ペプチドおよび免疫グロブリンドメインの場合、特定の性質に対するドメインを選択した後に、それ（および必要に応じて他のそのようなドメイン）をコードするテンプレート核酸を調製し、次いで、多様なオリゴヌクレオチド、例えば、合成オリゴヌクレオチドまたは天然源由来のオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって変更を加えることができる。ハイブリダイゼーション条件は、テンプレート核酸に対していくつかの類似性を有する配列をコードするアニーリングオリゴヌクレオチドに有利なように制御され、その結果、最初に選択されたペプチドから少なくとも一部のコドンが保持される。次いで、第２のディスプレイライブラリを調製し、スクリーニングすることができる。
【０２６８】
足場ドメインを評価する適切な判定基準としては、（１）アミノ酸配列、（２）いくつかの相同ドメイン配列、（３）３次元構造、および／または（４）一連のｐＨ、温度、塩分、有機溶媒、酸化剤濃度にわたる安定性データなどがある。一実施形態においては、足場ドメインは、小さく安定なタンパク質ドメイン、例えば、１００、７０、５０、４０または３０アミノ酸未満のタンパク質である。このドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合を含むことができ、または金属（例えば、亜鉛）をキレート化することができる。
【０２６９】
多様性
ディスプレイライブラリは、表示されたポリペプチド中の１つまたは複数の位置における変異を含む。所与の位置における変異は、合成されたものでも天然のものでもよい。いくつかのライブラリの場合、合成と天然の多様性が含まれる。
【０２７０】
（合成の多様性）  ライブラリは、人工的に合成された配列から生じる多様な核酸配列の領域を含むことができる。一般に、これらは、各所与の位置のヌクレオチド分布を含む縮重オリゴヌクレオチド集団から形成される。所与の配列は、分布に関して無作為に含まれる。合成多様性の縮重源の一例は、ＮＮＮを含むオリゴヌクレオチドである。ここで、Ｎは、同じ比率の任意の４つのヌクレオチドである。
【０２７１】
合成の多様性は、さらに制限することもでき、例えば、所与のトリヌクレオチドにおける核酸配列中のコドン数をＮＮＮよりも小さな分布に限定することができる。例えば、このような分布は、４つ未満のヌクレオチドを用いて、コドンのいくつかの位置において構築することができる。また、トリヌクレオチド付加技術を使用して、その分布をさらに制限することができる。
【０２７２】
いわゆる「トリヌクレオチド付加技術」は、例えば、Ｖｉｒｎｅｋａｓ等（１９９４）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：５６００〜７に記載されている。オリゴヌクレオチドは、固相支持体上で、１回に１つのコドン（すなわち、トリヌクレオチド）が合成される。支持体は、多数のオリゴヌクレオチドが並行して合成されるような多数の合成官能基を含む。支持体は、まず、第１の位置に対するコドンセットの混合物を含有する溶液に曝される。このユニットは保護されており、さらなるユニットは添加されない。第１の混合物を含有する溶液が洗い流され、固体支持体が脱保護される。したがって、第２の位置に対する１セットのコドンを含有する第２の混合物を添加して第１のユニットに付着させることができる。このプロセスは繰り返されて順次複数のコドンが構築される。トリヌクレオチド付加技術によって、所与の位置においていくつかのアミノ酸をコードできる核酸を合成することが可能になる。これらのアミノ酸の出現率は、混合物中のコドンの割合によって調節することができる。また、所与の位置におけるアミノ酸の選択は、単一ヌクレオチドの混合物が合成中に添加される場合のように、コドン表の象現に制限されない。
【０２７３】
（天然の多様性）  ライブラリは、異なる天然配列から生じる（または、それに基づいて合成される）多様な核酸配列の領域を含むことができる。
ディスプレイライブラリ中に含めることができる天然の多様性の一例は、免疫細胞中に存在する配列多様性である。この多様性には、抗体、ＭＨＣ複合体およびＴ細胞受容体の変異が含まれる。免疫細胞のいくつかの例は、Ｂ細胞およびＴ細胞である。免疫細胞は、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダまたはげっ歯類から得ることができる。一例においては、細胞は、特定の性質に対して選択される。例えば、Ｔ細胞のＣＤ４+およびＣＤ８-を選択することができる。様々な成熟段階にあるＢ細胞を選択することができる。別の例においては、Ｂ細胞は未処理である。
【０２７４】
一実施形態においては、蛍光活性化細胞選別を使用して、表面結合ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＧ分子を発現するＢ細胞が選別される。また、異なるアイソタイプのＩｇＧを発現するＢ細胞を単離することができる。別の好ましい実施形態においては、ＢまたはＴ細胞がインビトロで培養される。細胞は、例えば、支持細胞とともに培養することによって、あるいはＣＤ４０、ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ２０に対する抗体、酢酸ミリスチン酸ホルボール、細菌リポ多糖、コンカナバリンＡ、植物性赤血球凝集素、またはポークウィード分裂促進因子などの分裂促進因子もしくは他の調節試薬を添加することによって、インビトロで刺激することができる。
【０２７５】
さらに別の実施形態においては、細胞は、免疫障害、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、リウマチ様関節炎、血管炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、または抗リン脂質症候群に罹った対象から単離される。対象は、ヒトまたは動物、例えば、ヒト疾患動物モデル、または類似の障害を有する動物とすることができる。さらに別の実施形態においては、細胞は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物から単離される。
【０２７６】
好ましい一実施形態においては、細胞は、体細胞超変異のプログラムを起動させる。細胞は、例えば、抗免疫グロブリン、抗ＣＤ４０および抗ＣＤ３８抗体を用いて処理することによって、免疫グロブリン遺伝子の体細胞突然変異を誘発するように刺激することができる（例えば、Ｂｅｒｇｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒ等（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２２２８参照）。別の実施形態においては、細胞は未処理である。
【０２７７】
核酸は、これらの免疫細胞から調製され、タンパク質表示形式に処理される。
別のタイプの天然多様性は、異なる生物種間の配列の多様性である。例えば、多様な核酸配列を、土壌などの環境試料から増幅させることができる。
【０２７８】
複合ライブラリ
複合ディスプレイライブラリは、本明細書では「成分ライブラリ」または「サブライブラリ」と称する別々に構築されたディスプレイライブラリをプールすることによって構築される。成分ライブラリは、天然または合成多様性を含むことができる。複合ライブラリから抽出されるメンバは、成分ライブラリの１つから生じるものとして識別することができる。この識別は、２つの方法のうちの１つまたは両方において、ライブラリメンバの核酸配列中にコードすることができる。
【０２７９】
第１の方法の場合、成分ライブラリについての情報は、成分ライブラリメンバ間の定常領域中にコードされる。他の成分ライブラリ中の対応する位置は、異なるように設計される。定常領域は、定常なアミノ酸のコドンとすることができる。定常アミノ酸をコードする核酸位置においては、各成分ライブラリに対して単一のコドンが使用される。任意の成分ライブラリ中の定常位置におけるコドン使用の組合せは、成分ライブラリを他の成分ライブラリから区別するように設計される。成分ライブラリを識別するために定常領域のみが使用されるインプリメンテーションにおいては、使用されるコドンの組合せによって、成分ライブラリが一義的に識別されるべきである。
【０２８０】
表１に、システインであるように制約されている２つの定常位置における核酸配列を示す。システインは、２つのコドンＴＧＴまたはＴＧＣのうちの１つによってコードすることができる。これら２つのシステイン位置は、４つの成分ライブラリを区別するのに十分である。
【０２８１】
【表３】
2005512181.tif 000004
【０２８２】
第２の方法においては、成分ライブラリ内で変わる位置は、元になる成分ライブラリを示す情報を与えるように設計される。各位置が変動する場合、特定のアミノ酸に対するサブコドンセットのみが許容される。
【０２８３】
その位置に出現し得るあらゆるアミノ酸に対して１つのコドンのみが許容されることが理想的である。上述したトリヌクレオチド付加技術を使用して、所与の位置においてコードされるアミノ酸間の変動を依然として許容しつつ、その位置において利用可能なコドンを制限することができる。
【０２８４】
表２に、ライブラリ中で変動する位置においてコドンがどのように制約されるかの例を示す。第１の位置においては、コードされるアミノ酸配列は、（ＡＡＴまたはＡＡＣによってコードされる）Ａｓｎと（ＣＡＡまたはＣＡＧによってコードされる）Ｇｌｎの間で変わることができる。第２の位置においては、コードされるアミノ酸配列は、（ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＴによってコードされ、他の３つのコドンは本明細書では使用されない）Ａｒｇと（ＡＡＡまたはＡＡＧによってコードされる）Ｌｙｓの間で変わることができる。
【０２８５】
【表４】
2005512181.tif 000005
【０２８６】
表２に示すように、ライブラリメンバは、ライブラリ＃１、２、３および４を含む複合ライブラリから選択される。第１の位置にＡＡＣを含み、第２の位置にＡＧＡを含むこの複合ライブラリからのライブラリメンバは、必ずライブラリ＃３から生じる。
【０２８７】
別の例においては、割り当ては不明瞭であるが、それでも、もとになり得る成分ライブラリの数は減少する。このような割り当ては、依然として有用である。この例においては、複合ライブラリは、成分ライブラリ＃５、６、７、８、９および１０から構築される。第１および第２の位置にＡＡＣおよびＡＧＡを有するこの複合ライブラリからのライブラリメンバは、必ずライブラリ＃８から生じる。しかし、第１および第２の位置にＡＡＣおよびＡＡＡを有するライブラリメンバは、ライブラリ＃８または＃１０のどちらからでも生じることができる。
【０２８８】
複合ライブラリの成分ライブラリを識別する一目的は品質管理である。複合ライブラリからのディスプレイライブラリメンバを解析し、配列を決定した後、各ライブラリメンバが由来する成分ライブラリが決定される。次いで、同定された有用なディスプレイライブラリメンバの数を、各成分ライブラリに対して数えることができる。また、挿入および欠失の頻度を各成分ライブラリに対して推定することができる。これらの統計を使用して、最適以下の成分ライブラリを同定することができる。このようなライブラリは、その後の複合ライブラリのプーリングからは除外することができる。
【０２８９】
成熟ライブラリ
一実施形態においては、ディスプレイライブラリ技術は、反復モードで使用される。第１のディスプレイライブラリを使用して、標的に対する１つまたは複数のリガンドを同定することができる。次いで、これらの同定されたリガンドを突然変異させて、第２のディスプレイライブラリを形成させる。次いで、より親和性の高いリガンドを、例えば、より高いストリンジェンシー、またはより競合的な結合および洗浄条件を用いることによって、第２のライブラリから選択する。
【０２９０】
多数の技術を使用して、同定されたリガンドを突然変異させることができる。これらの技術には、エラープローンＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ）（Ｌｅｕｎｇ等（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１〜１５）、組換え、無作為切断を使用したＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９〜３９１；「核酸シャッフリング」と称する）、ＲＡＣＨＩＴＴ（商標）（Ｃｏｃｏ等（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、部位特異的突然変異誘発（Ｚｏｏｌｅｒ等（１９８７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：６４８７〜６５０４）、カセット突然変異誘発（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４〜５８６）、縮重オリゴヌクレオチドの組み込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３２４５）などがある。
【０２９１】
例えば、同定されたリガンドが抗体である場合、突然変異誘発は、重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域を対象にすることができる。また、突然変異誘発は、ＣＤＲに近いまたは隣接するフレームワーク領域を対象にすることができる。同様に、同定されたリガンドが酵素である場合、突然変異誘発は、活性部位の近傍を対象にすることができる。
【０２９２】
ネガティブセレクション
本明細書に記載するディスプレイライブラリスクリーニング方法は、非標的分子に結合するディスプレイライブラリメンバを除去する選択ステップを含むこともできる。このいわゆる「ネガティブセレクション」を使用して、標的分子と、関係するが異なる非標的分子とを識別するディスプレイライブラリメンバを同定することができる。ポリペプチド標的および核酸標的の場合、非標的分子と標的分子は、互いに少なくとも３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。これらは、認識のためのエピトープである小領域のみが異なり得る。非標的分子と標的分子は同一であり得るが、異なるコンホメーション、オリゴマー形成状態または修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾；核酸のメチル化または塩基付加）を有し得る。一実施形態においては、標的は少なくとも２つのポリペプチドの複合体であり、非標的は非複合状態の成分ポリペプチドである。説明のための一例では、標的がフィブリンであり、非標的はフィブリノゲンである。フィブリンは、フィブリノゲンの処理された形態であり、フィブリノゲンにはないエピトープを含むメッシュ構造を形成するが、フィブリンのアミノ酸はすべてフィブリノゲン配列中に存在する。さらに別の実施形態においては、非標的は、標的分子の選択中に存在する定常領域、例えば、ペプチドタグ、精製ハンドル、または付着成分である。
【０２９３】
別の例においては、非標的分子と標的分子は、少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％または８０％互いに異なる。
ディスプレイライブラリまたはそのプールを、まず、非標的分子に接触させる。非標的に結合しない試料のメンバを収集し、その後の標的分子への結合の選択に使用することができ、またはその後のネガティブセレクションにさえ使用することができる。この手順によって、標的に結合するが、非標的には結合しないディスプレイライブラリメンバの識別が促進される。
【０２９４】
解離速度選択
遅い解離速度は、高い親和性、特にポリペプチドとそれらの標的の相互作用に関する高い親和性を予測するものであるので、固定標的との結合相互作用に対して選択された動力学的解離速度によって生体分子を単離する方法を使用することができる。解離速度選択は、ディスプレイライブラリのメンバを標的に結合させるステップと、非特異的に結合したメンバおよび弱く結合したメンバの標的を洗浄するステップとを含む。次いで、固定標的を飽和量の遊離標的、すなわち、固定されていない標的の複製を含む溶出溶液と接触させる。遊離標的は、固定標的分子から解離するディスプレイライブラリメンバに結合する。再結合は、遊離標的の飽和量よりも粒子に付着した標的の濃度を極めて低濃度にすることによって効果的に防止される。
【０２９５】
溶出溶液は規則的な間隔で収集される。より遅く溶出するディスプレイライブラリメンバは、初期に溶出するメンバよりも解離速度が遅い可能性が高い。また、標的から溶出しないディスプレイライブラリメンバを回収することも可能である。例えば、標的が支持体に結合している場合、標的自体を支持体から分離させることができる。別の例においては、ディスプレイライブラリメンバまたはその核酸成分は、支持体から直接回収される。
【０２９６】
本明細書に記載する自動選択装置、例えば、磁性粒子処理装置を、解離速度選択用にプログラムすることができる。例えば、標的を磁性粒子上に固定し、溶出溶液を含む管に、早期に解離するライブラリメンバを遅く解離するメンバから分離させる間隔で移動させる。
【０２９７】
標的
一般に、任意の分子種を標的として使用することができる。標的は、小分子（例えば、有機小分子または無機小分子）、ポリペプチド、核酸、細胞などとすることができる。例として、標的のいくつかの例および構成を示す。以下に列挙するもの以外の標的、または以下に列挙するもの以外の諸特性を有する標的も使用できることは言うまでもない。
【０２９８】
標的の一つの分類としてポリペプチドが挙げられる。このような標的の例は、小ペプチド（例えば、約３〜３０アミノ酸長）、単一ポリペプチド鎖、多量体ポリペプチド（例えば、タンパク質複合体）などである。
【０２９９】
ポリペプチド標的は、例えば、グリコシル化、リン酸化、ユビキチン化、メチル化、切断、ジスルフィド結合などの修飾をすることができる。好ましくは、ポリペプチドは、特異的コンホメーション、例えば、未変性状態または変性状態をとる。一実施形態においては、ポリペプチドは、１つを超える特異的コンホメーションを有する。例えば、プリオンは、１つを超えるコンホメーションをとることができる。未変性コンホメーションと病的コンホメーションのどちらも望ましい標的となり得る。例えば、未変性コンホメーションを安定化させる試薬、あるいは病的コンホメーションを同定し、または標的にする試薬を単離することができる。
【０３００】
しかし、いくつかの例においては、ポリペプチドは特定の構造をとらず、例えば、ランダムコイルコンホメーションをとり、または単一の安定なコンホメーションを欠いている。非構造ポリペプチドに結合する試薬を使用して、ポリペプチドを、例えば、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で変性されるときに同定することができ、または、例えば予備精製プロセスにおいて、ポリペプチドの非構造アイソフォームを分離させて正確に折り畳まれたアイソフォームを得ることができる。
【０３０１】
いくつかの例示的なポリペプチド標的としては、細胞表面タンパク質（例えば、グリコシル化表面タンパク質または低グリコシル化変異体）、癌関連タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、神経伝達物質、細胞表面受容体（例えば，細胞表面受容体キナーゼ、７回膜貫通型受容体、ウイルス受容体および補助受容体、細胞外マトリックス結合タンパク質、または（例えば、哺乳動物の癌細胞または病原体の）細胞表面タンパク質などがある。いくつかの実施形態においては、ポリペプチドは、疾患、例えば、癌と関連する。
【０３０２】
より具体的な例としては、インテグリン、カドヘリン、セレクション、Ｎ−ＣＡＭ、Ｅ−ＣＡＭ、Ｕ−ＣＡＭ、Ｉ−ＣＡＭなどの細胞接着分子または「ＣＡＭ」）；プロテアーゼ、例えば、サブチリシン、トリプシン、キモトリプシン；ウロキナーゼ、またはヒト組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノゲンアクチベータ；ボンベシン；第ＩＸ因子、トロンビン；ＣＤ−４；ＣＤ−１９；ＣＤ２０；血小板由来成長因子；インシュリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；神経成長因子；繊維芽細胞成長因子（例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インシュリン様成長因子結合タンパク質；エリスロポイエチン；トロンボポイエチン；ムチン；ヒト血清アルブミン；成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）；プロインシュリン、インシュリンＡ鎖インシュリンＢ鎖；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；チロキシン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；心房性ナトリウムペプチドＡ、ＢまたはＣ；黄体形成ホルモン；グルカゴン；第ＶＩＩＩ因子；造血成長因子；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）；エンケファリナーゼ；ミュラー管抑制物質；性腺刺激ホルモン関連ペプチド；組織因子タンパク質；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；ホルモン受容体または成長因子受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、β、γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４など；崩壊促進因子；免疫グロブリン（定常または可変ドメイン）；および上記ポリペプチドのいずれかの断片がある。いくつかの実施形態においては、標的は、疾患、例えば、癌と関連する。
【０３０３】
標的ポリペプチドは、好ましくは可溶性である。例えば、可溶性ドメインまたはタンパク質断片を使用することができる。この選択肢は、特に、細胞表面受容体、レトロウイルス表面タンパク質などの膜貫通タンパク質に結合する分子を同定するのに有用である。
【０３０４】
別のクラスの標的としては、細胞、例えば、固定細胞または生細胞が含まれる。細胞は、常磁性粒子に共有結合した抗体、または（例えば、別の抗体によって）間接的に結合した抗体に結合することができる。例えば、ビオチン化ウサギ抗マウスＩｇ抗体は、ストレプトアビジン常磁性ビーズに結合し、当該細胞表面タンパク質に特異的なマウス抗体はウサギ抗体に結合する。
【０３０５】
一実施形態においては、細胞は、組換え細胞、例えば、異種遺伝子を発現する異種核酸、あるいは内因性遺伝子の発現を妨害しまたは変える異種核酸を形質転換した細胞である。この異種核酸は、誘導性または構成性プロモーターの制御下に置くことができる。好ましい実施形態においては、異種核酸は、細胞表面タンパク質（例えば、当該細胞表面タンパク質）をコードする。プラスミドは、例えば、形質転換細胞を磁気応答粒子に結合させるのに使用されるマーカータンパク質を発現することもできる。
【０３０６】
別の実施形態においては、細胞は、対象（例えば、患者、例えば、癌患者）から単離される初代培養細胞である。さらに別の実施形態においては、細胞は、形質転換細胞、例えば、細胞増殖障害、例えば、新生物障害の哺乳動物細胞である。さらに別の実施形態においては、細胞は、病原細胞、例えば、病原細菌、病原真菌、または病原原生生物（例えば、変形体細胞）などの微生物、または多細胞の病原体に由来する細胞である。標的は、細胞、例えば、癌細胞、造血細胞などとすることもできる。
【０３０７】
さらに別の実施形態においては、細胞は、（例えば、薬物または遺伝子改変を用いて）処理されている。例えば、この処理によって、エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、エキソサイトーシスおよび／または細胞分泌の速度を変えることができる。この処理は、異種プロモーター−対象遺伝子構築体の薬物または誘導物質とすることもできる。この処理は、細胞挙動、形態などに変化をもたらし得る。処理によって細胞から解離する分子、または処理したときに細胞に付随する分子を収集し分析する。
【０３０８】
別の実施形態においては、標的は、組織または器官である。ディスプレイライブラリは、（例えば、Ｋｏｌｏｎｉｎ等（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：３０８〜３１３に記載されているように）この組織または器官にインビトロまたはインビボで結合するメンバをスクリーニングすることができる。
【０３０９】
追加の例示的な標的には、核酸（例えば、調節領域中の部位、コード領域中の部位などの二本鎖、一本鎖、および部分二本鎖ＤＮＡ、三次構造、例えば、Ｇ−カルテットまたはテロメア）；ＲＮＡ（例えば、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、例えば、ＲＮＡｉ、リボザイム）；またはそれらの組合せなどがある。例えば、ある部位を含む二本鎖核酸を使用して、その部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを同定することができる。そのＤＮＡ結合ドメインを細胞中で使用して、その部位に作動可能に結合した遺伝子を調節することができる。例えば、本明細書に記載する方法を使用して、標的核酸への結合についてジンクフィンガーポリペプチドのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｒｅｂａｒ等（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：１２９〜４９を参照されたい。ジンクフィンガーポリペプチドのファージディスプレイライブラリの記載に関して入手可能な抄録はない。
【０３１０】
さらに例示的な標的としては、有機分子が含まれる。一実施形態においては、有機分子は遷移状態アナログであり、それを使用してそのアナログの構造に類似した遷移状態構造を安定化させる触媒を選択することができる。別の実施形態においては、有機分子は、触媒反応の結果として触媒に共有結合する自殺基質である。
【０３１１】
標的は、薬物（例えば、化学反応、バイオリアクター、培地、乳または細胞抽出物からの薬物の精製を改善するためにリガンドが必要とする薬物）とすることができる。薬物は、ペプチド、例えば、ポリペプチドまたは非ペプチド機能を含むことができる。
【０３１２】
他の標的は、生物工学的用途に関連し、例えば、研究室で有用な分子を生成させることに関連し得る。例えば、ストレプトアビジン、緑色蛍光タンパク質または核酸ポリメラーゼを標的とすることができる。
【０３１３】
いくつかの実施形態においては、１つを超える種を標的として使用する。例えば、試料は複数の標的に曝される。
治療用途
本明細書に記載するスクリーニング方法を使用して、治療上の諸特性を有するタンパク質を同定することができる。このタンパク質は、例えば、症状に関する治療、予防、一般的な改善に使用することができる。薬剤として許容される担体とともにこのタンパク質を製剤して医薬組成物を提供することができる。
【０３１４】
別の態様においては、本発明は、本明細書に記載する方法を用いて標的分子に結合することが確認された標的特異的リガンド、例えば、抗体分子、他のポリペプチドまたはペプチドを含み、薬剤として許容される担体とともに製剤された組成物を提供する。医薬組成物は、インビボでの画像化用標識リガンドならびに治療用組成物を包含する。
【０３１５】
本明細書で使用する「薬剤として許容される担体」としては、生理学的に適合する任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などがある。担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に適切であることが好ましい。投与経路によって、活性化合物、すなわち、タンパク質リガンドは、酸および化合物を不活化する恐れがある他の天然条件の作用から同化合物を保護する材料で被覆することができる。
【０３１６】
「薬剤として許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性効果を何らもたらさない塩を意味する（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．等（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９参照）。このような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩がある。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒無機酸から誘導されるもの、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸、芳香族スルホン酸などの無毒有機酸から誘導されるものなどがある。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属から誘導されるもの、ならびにＮ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒有機アミンから誘導されるものなどがある。
【０３１７】
本発明の組成物は様々な形態をとることができる。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射溶液および注入溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソーム、坐剤などの液体、半固体、固体剤形などがある。好ましい形態は、意図する投与形式および治療用途による。典型的な好ましい組成物は、ヒトに抗体を投与するのに使用されるものと類似の組成物などの注射溶液または注入溶液の形態をしている。好ましい投与形式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態においては、標的特異的リガンドは、静脈内注入または注射によって投与される。例えば、治療用途の場合、標的特異的リガンドは、静脈内注入によって３０、２０、１０、５または１ｍｇ／ｍｉｎ未満の速度で約１〜１００ｍｇ／ｍ2または７〜２５ｍｇ／ｍ2の用量になるまで投与することができる。投与の経路および／または形式は、所望の結果に応じて変わる。ある実施形態においては、活性化合物は、移植錠、マイクロカプセル送達システムを含めた制御放出製剤などの、迅速放出に対して化合物を保護する担体とともに調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。このような製剤を調製する多数の方法が特許化され、または一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８を参照されたい。
【０３１８】
ある実施形態においては、リガンドを、例えば、不活性の希釈剤または同化可食担体とともに経口投与することができる。医薬組成物は、当分野で既知の医療器具を用いて投与することができる。
【０３１９】
診断用途
本明細書に記載するスクリーニング方法によって同定されたタンパク質を使用して、それらが結合する標的化合物を検出することができ、例えば、インビトロ（例えば、組織、生検、例えば、癌組織などの生物学的試料）またはインビボ（例えば、対象におけるインビボでの画像化）での標的の存在を検出することができる。以下は、標的特異的リガンドの単なる例示的使用である。これらには、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳ分析および選別、光学顕微鏡法、タンパク質アレイ、インビボでの画像化などがある。こういった用途は、１つの標的特異的リガンドについて行うことができ、また、多数のリガンドについて高処理モードで行うことができる。
【０３２０】
標的特異的リガンドは、例えば、蛍光団および発色団標識タンパク質リガンドを用いて標識することができる。抗体および他のタンパク質は、最高約３１０ｎｍの波長の光を吸収するので、蛍光性成分は、３１０ｎｍを超える、好ましくは４００ｎｍを超える波長を実質的に吸収するように選択すべきである。様々な適切な蛍光剤および発色団が、Ｓｔｒｙｅｒ（１９６８）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１６２：５２６およびＢｒａｎｄ，Ｌ．等（１９７２）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４１：８４３〜８６８に記載されている。タンパク質リガンドは、米国特許第３，９４０，４７５号、同４，２８９，７４７号、および同４，３７６，１１０号に記載されているものなどの従来手順によって、蛍光性発色団基を用いて標識することができる。上述したいくつかの所望の諸特性を有する蛍光剤の１グループはキサンテン色素であり、フルオレセインおよびローダミンが含まれる。別のグループの蛍光性化合物は、ナフチルアミンである。蛍光団または発色団で標識された後、タンパク質リガンドを使用して、試料中の標的分子の存在または局在を、例えば、蛍光顕微鏡法（共焦点またはデコンボリューション顕微鏡法など）を用いて検出することができる。
【０３２１】
（組織学的分析）  免疫組織化学を、本明細書に記載する方法によって同定された標的特異的リガンドを使用して実施することができる。このリガンドは標識されており、組織学的試料、例えば、顕微鏡スライド上の固定された組織切片に接触させられる。インキュベーションして結合させた後、試料を洗浄して未結合抗体を除去する。次いで試料を、例えば、顕微鏡法によって分析して、リガンドが試料に結合したかどうかを確認する。
【０３２２】
（タンパク質アレイ）  本明細書に記載する方法によって同定された標的特異的リガンドをタンパク質アレイ上に固定することができる。タンパク質アレイを、診断ツールとして使用して、例えば、医学試料（単離細胞、血液、血清、生検など）をスクリーニングすることができる。ポリペプチドアレイを産生する方法は、例えば、Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ等（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９〜９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇ等（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３〜１１１；Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８、ｅ３、Ｉ〜ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０〜１７６３；国際公開第０１／４０８０３および国際公開第９９／５１７７３号Ａ１に記載されている。例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓまたはＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓから市販されている例えばロボット装置を使用して、アレイ用ポリペプチドを高速でスポッティングすることができる。アレイ基質は、例えば、ニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば、表面改質ガラスとすることができる。アレイは、多孔質マトリックス、例えば、アクリルアミド、アガロースまたは別のポリマーを含むこともできる。
【０３２３】
（インビボでの画像化）  さらに別の実施形態においては、本明細書の方法によって同定された標的特異的リガンドを、検出可能マーカーに結合させ、対象に投与し、標的の発現組織または細胞に結合した検出可能マーカーを検出することによって画像化する。例えば、対象を、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段によって画像化する。
【０３２４】
本発明による画像診断に有用な標識の例は、131Ｉ、111Ｉｎ、123Ｉ、99mＴｃ、32Ｐ、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃおよび188Ｒｈなどの放射能標識、フルオレセイン、ローダミンなどの蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、陽電子放射断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナによって検出可能な陽電子放射同位体、ルシフェリンなどの化学発光体、およびパーオキシダーゼ、ホスファターゼなどの酵素マーカーである。短距離検出プローブによって検出可能な同位体などの短距離放射線放出体を使用することもできる。タンパク質リガンドを、既知の技術を使用してこのような試薬で標識することができる。例えば、抗体の放射能標識に関係する技術に対してはＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、およびＤ．Ｃｏｌｃｈｅｒ等（１９８６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２〜８１６を参照されたい。ＮＭＲ信号は、造影剤によって増強させることができる。このような造影剤の例は、（主にＴ１を変える）いくつかの磁性剤常磁性剤、および（主にＴ２応答を変える）強磁性または超常磁性剤である。標的特異的リガンドは、ＮＭＲ活性19Ｆ原子を含む表示基（ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）で標識することもできる。標的結合の許容時間後、全身ＭＲＩをＰｙｋｅｔｔ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、２４６：７８〜８８に記載されたものの１つなどの装置を用いて実施して、癌組織の位置を特定し画像化する。
【０３２５】
精製用途
本明細書に記載するスクリーニング方法によって同定されたタンパク質を使用して、標的化合物を精製することができる。一実施形態においては、精製は、例えば、タンパク質医薬品または他の医薬品を精製する製造スケールである。本明細書の方法によって同定された標的特異的リガンドを支持体に結合させ、アフィニティークロマトグラフィにおける親和性試薬として使用することができる。Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇは、組換えおよび非組換えタンパク質をアフィニティークロマトグラフィによって精製するいくつかの方法を提供している。カスタマイズした標的特異的リガンドを使用することによって、親和性タグの必要がなくなり、かつ／または密接に関係したアイソフォームを極めて特異的に分離することが可能になる。例えば、米国６，３２６，１５５参照。
【０３２６】
追加の例示的なライブラリ
この開示の態様を実行することができる他のタイプのライブラリとしては、タンパク質発現ライブラリ（例えば、細胞表現型、細胞内発現に対する例えばｃＤＮＡライブラリ）、二重ハイブリッドライブラリ、タンパク質アレイ、核アプタマー、コンビナトリアルライブラリまたは薬物化合物ライブラリなどの化学ライブラリなどがある。
【０３２７】
（一般の核酸ライブラリ）  本明細書に記載するライブラリ構築方法は、分子生物学、生化学、古典的遺伝学、および組換え遺伝学の分野における通常の技術の使用を含むことができる。本発明における一般的な使用方法を開示する基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ等編、１９９４））などがある。
【０３２８】
ｃＤＮＡライブラリを作製するために、好適なＲＮＡが豊富なソースを選択することができる。次いで、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、組換えベクターに連結させ、組換え宿主に貫通させて（ｔｒａｎｓｆｉｘ）増殖させ、スクリーニングし、クローニングする。ｃＤＮＡライブラリを作製しスクリーニングする方法は周知である（例えば、Ｇｕｂｌｅｒ＆Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｇｅｎｅ  ２５：２６３〜２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、同上；Ａｕｓｕｂｅｌ等、同上参照）。ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする例示的な方法としては、米国５，８６６，０９８および同５，６５４，１５０がある。
【０３２９】
ゲノムライブラリーの場合、組織からＤＮＡを抽出し、機械的せん断または酵素による消化のいずれかによって約１２〜２０ｋｂ断片を得る。次いで、それらの断片を勾配遠心分離によって不要なサイズのものから分離させ、真核生物プラスミドベクター、酵母人工染色体、Ｐ１またはバクテリオファージラムダベクター中で構築する。ファージベクターをインビトロでパッケージにする。
【０３３０】
（二重ハイブリッド）  二重ハイブリッドアッセイまたは三重ハイブリッドアッセイを使用して、タンパク質ライブラリをスクリーニングし、相互作用タンパク質（またはＲＮＡタンパク質相互作用）を同定することができる。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ等（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａ等（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ等（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ等（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３〜１６９６；およびＢｒｅｎｔ  国際公開第９４／１０３００号を参照されたい。二重ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合と活性化ドメインからなるほとんどの転写因子のモジュラー特性（ｍｏｄｕｌａｒ  ｎａｔｕｒｅ）に基づいている。手短に述べると、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築体を利用する。１つの構築体においては、目的タンパク質をコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合させる。もう一方の構築体においては、同定されていないタンパク質（「獲物（ｐｒｅｙ）」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリからのＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性ドメインをードする遺伝子に融合させる。「餌」と「獲物」タンパク質がインビボで相互作用して複合体を形成し得る場合、ＤＮＡ結合ドメインと転写因子活性ドメインが近接する。この近接によって、転写因子に反応する転写調節部位に作動可能に結合されたレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現は検出することができ、機能転写因子を含む細胞コロニーを単離し、使用して、目的タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得ることができる。
【０３３１】
（核酸アプタマー）  核酸アプタマーライブラリは、多様な核酸配列のプールであり、そこから、核酸分子自体によって付与される結合特性または触媒特性に対して核酸が選択される。核酸配列のＤＮＡおよびＲＮＡの無作為なプールを、人工リガンドおよび触媒の豊富なソースとして使用することができる（例えば、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８；および（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０；ならびにＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５および（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：７３９；米国特許第５，９１０，４０８号参照）。このような人工核酸を、アプタマーと称する。一般に、合成オリゴヌクレオチドを使用して、無作為な核酸配列のプールが構築される。これらの配列は、プライマー結合部位として役立ち得る定常領域またはタグを含むことができる。プールは、意図するリガンドまたは遷移状態アナログであり得る標的に曝される。標的に結合するプール中の核酸が選択され、次いで、核酸増幅後にプールされてその後選択されるか、ベクター中にクローン化される。ベクター中にクローン化される核酸アプタマーは、宿主細胞に形質転換され、平板培養される。次いで、個々のクローンを、上述した方法を用いて処理することができる。個々の各クローン中の核酸の複製を、適切なプライマーを用いてクローン核酸を増幅させることによって回収することができ、必要であれば、それを一本鎖にすることができる。
【０３３２】
（他の化学ライブラリ）  コンビナトリアル化学ライブラリの例は、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７〜４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎ等、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４〜８８（１９９１）参照）；ペプトイド（例えば、国際公開第９１／１９７３５）；ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号）；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、ジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９〜６９１３（１９９３））；オリゴカーバメイト（Ｃｈｏ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））；炭水化物ライブラリ（例えば、Ｌｉａｎｇ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５２０〜１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号参照）；および他の有機小分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ  Ｃ＆ＥＮ、Ｊａｎ  １８、３３頁（１９９３）；イソプレノイド、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルフォリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン、５，２８８，５１４など参照）であるが、これらだけに限定されない。
【０３３３】
本発明をその詳細な説明とともに記述してきたが、先の記述は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によって定義されることを理解されたい。例えば、本発明の態様を、核酸発現ライブラリ（例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリ）、核酸アプタマーライブラリ、コンビナトリアル化学ライブラリ、および合成ペプチドライブラリを用いたインプリメンテーションに適用することができる。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０３３４】
【図１】ディスプレイライブラリをスクリーニングする例示的なプロセスのフローチャートである。
【図２】ディスプレイライブラリスクリーンについての情報を保存する例示的なデータベースの概略図である。
【図３】ディスプレイライブラリをスクリーニングする例示的なシステムの概略図である。
【図４】ディスプレイライブラリをスクリーニングする例示的なネットワークの概略図である。
【図５】ディスプレイライブラリをスクリーニングする例示的なプロセスのフローチャートである。
【図６】ディスプレイライブラリスクリーンについての情報を保存する例示的なデータベースの概略図である。
【図７】ディスプレイライブラリをスクリーニングする例示的なプロセスの概略図である。
【図８】ヒットピッキングの例示的なインターフェースを示す図である。
【図９】ディスプレイライブラリのスクリーニングをする例示的な自動システムの概略図である。
【図１０】マルチウェルプレートおよび関連するイベントを追跡する例示的なプロセスのフローチャートである。
【図１１】ディスプレイライブラリをスクリーニングする例示的な外部クライアント用ネットワークの概略図である。
【図１２】例示的なサーバシステムの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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