(57)【要約】本発明は、出発組成物がアクリルアミド、架橋剤、ラジカル開始剤、反応性リンカー基を有する少なくとも１種のコモノマーおよび場合により可塑剤を包含するか、またはアクリルアミド、架橋剤、光開始剤、少なくとも１種の皮膜形成剤、反応性リンカー基を有する少なくとも１種のコモノマーおよび場合により可塑剤を包含する、ポリアクリルアミドをベースとするポリアクリルアミドをベースとする、ラジカル架橋したヒドロゲルからなるバイオセンサー用の親水性固定化層に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発組成物がアクリルアミド、架橋剤、ラジカル開始剤、反応性リンカー基を有する少なくとも１種のコモノマーおよび場合により可塑剤を包含する、ポリアクリルアミドをベースとするラジカル架橋したヒドロゲルからなるバイオセンサー用の親水性固定化層。
【請求項２】
出発組成物がアクリルアミド、架橋剤、光開始剤、少なくとも１種の皮膜形成剤、反応性リンカー基を有する少なくとも１種のコモノマーおよび場合により可塑剤を包含する、ポリアクリルアミドをベースとする光構造化ヒドロゲルからなる親水性固定化層。
【請求項３】
架橋剤がアクリル−および／またはメタクリル化合物である、請求項１または２記載の親水性固定化層。
【請求項４】
架橋剤がメチレンビス（メタ）アクリルアミドおよび／またはジメタクリル酸エステルである請求項３記載の親水性固定化層。
【請求項５】
反応性リンカー基を有するコモノマーがマレイン酸無水物および／またはグリシジル（メタ）アクリレートである、請求項１から４までのいずれか１項記載の親水性固定化層。
【請求項６】
可塑剤がモノエチレングリコール、ジエチレングリコールおよび／またはトリエチレングリコールである、請求項１から５までのいずれか１項記載の親水性固定化層。
【請求項７】
出発組成物が水と混合可能な極性溶剤中に存在する、請求項１から６までのいずれか１項記載の親水性固定化層。
【請求項８】
溶剤がジメチルホルムアミドである、請求項７記載の親水性固定化層。
【請求項９】
被膜形成剤がポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミドおよび／またはポリヒドロキシメタクリレートである、請求項２から８までのいずれか１項記載の親水性固定化層。
【請求項１０】
金属、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、プラスチックからなるトランスデューサー表面または担体表面上に、またはトポグラフィーを有する表面上に生成されている、請求項１から９までのいずれか１項記載の親水性固定化層。
【請求項１１】
化学的または生物学的認識分子の（共有）結合もしくは固定化によりバイオセンサー認識層を製造するための、請求項１から１０までのいずれか１項記載の固定化層の使用。
【請求項１２】
認識分子が捕獲オリゴヌクレオチドである、請求項１１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオセンサー用の固定化層、並びにバイオセンサー認識層の製造のための、特にいわゆるＤＮＡ−チップの製造のための、該固定化層の使用に関する。
【０００２】
近代的な生物学的分析技術並びに医学的診断法においては、生物学的認識システムが物理的トランスデューサーと結合しているバイオセンサーがますます使用されている。認識システムとは、いわゆる固定化層を介して担体（トランスデューサー）に結合している、生物学的認識分子、例えば抗体、酵素、核酸などである。トランスデューサーとしては、主に熱量的、圧電的、光学的および電気化学的原理を使用する。
【０００３】
認識システムまたは本来の固定化層は、多くの場合、それぞれトランスデューサーシステム上にほぼ二次元的な層（annaehrend zweidimensionalen Schichten）において固定される。認識分子の固定は共有結合により、親和性の相互作用により、更に親水性／疎水性相互作用によっても実施することができる。安定性の理由から、共有結合が有利であるが、例えばビオチン／アビジンのような安定な複合体の形成も十分に使用することができる。ほぼ二次元的な生物学的認識層の構築に関しての良好な概観は、I. Willner, E.Katz: "Redoxproteinschichten auf leitenden Traegern - Systeme fuer bioelektronische Anwendungen" Angew. Chem. 2000, 112, p1230-69中に記載されている。
【０００４】
ＮＨ−またはＯＨ−基を有するトランスデューサー−表面においては、生物学的機能担体、すなわち認識分子は、しばしば、いわゆるリンカー基を有するアルコキシシランにより、しかし塩化シアヌルまたはカルボジイミドを用いて固定化されている。金含有トランスデューサー表面にはチオアルキルで標識した認識分子を使用し、これはいわゆる硫黄−金−結合を介してトランスデューサー表面上に、いわゆる自己集合層の形で固定化される。トランスデューサー表面上への核酸の固定化のための興味深い試みは、光化学的に支持されるアフィメトリクッス（Affymetrix）の合成である（Light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis, S.P.A., Fodor 等、Science 251, 767-773(1991)）。
【０００５】
バイオセンサーの感度の上昇のために、並びにこのことにより得られる測定結果の再現性の最適化のために、生物学的認識分子のための三次元的な固定化層の使用は重要な意味を有するものである。Schleicher & Schuell GmbH社はFASTＴＭSlidesという商標でＤＮＡ−チップを提供している、このＤＮＡ−チップにおいては捕獲−オリゴス（Faenger-Oligos）が三次元的なニトロセルロース膜中に固定化されている（BioMolecular Screening, Catalog 2001, intern. Edit. Fa. Schleicher & Schuell）。
【０００６】
ＷＯ００／４３５３９はポリマーブラシの形のＤＮＡ−捕獲プローブの固定化により三次元的なＤＮＡ−認識層の構築を記載している。
【０００７】
Timofeev等は化学的に変性されたラジカル架橋ポリアクリルアミドを記載しており、これは例えば捕獲−オリゴスの固定化のために使用することができる（E.N. Timofeev等, Regioselectiv Immobilization of Short Oligonucleotides to Acrylic Copolymer Gels, Nucleic Acids Reasearch, 1966, Vol. 24, No. 16, 3142-3148）。ここでは、ヒドロゲル中の結合基としてアミノ基またはアルデヒド基を使用する。アルデヒド官能化もしくはアミノ官能化捕獲−オリゴスを、この結合基に還元反応条件下に共有結合により固定化することができる。しかしながら、このことはアミノ基およびアルデヒド基の間の、もしくは逆のこれらの基の本来の結合反応の他に、付加的な還元工程が還元剤の使用下に必須である。更に、Timofeev等により記載された架橋したポリアクリルアミドの化学的活性化のための方法は、同様にポリマーマトリックス中での付加的な反応工程を必要とする。
【０００８】
本発明の課題は、ヒドロゲルをベースとするバイオセンサーへの使用のための親水性固定化層の製造、並びに生物学的認識分子を共有結合することによる認識層の製造のための、そのような固定化層の使用である。
【０００９】
本発明は、この課題をラジカル架橋したまたは光構造化したヒドロゲルを固定化層として使用することにより解決する。そのようなヒドロゲルは本願出願人によるドイツ特許出願“ヒドロゲル層を製造するためのラジカル架橋性組成物（Radikalisch vernetzbare Zusammensetzung zur Erzeugung einer Hydrogelschicht）”もしくは“ヒドロゲル層を製造するための光構造化性組成物（Foto-strukturierbare Zusammensetzung zur Erzeugung einer Hydrogelschicht）”（出願番号は未公知である）中に記載されている。
【００１０】
本発明の対象は、こうして１つには、出発組成物がアクリルアミド、架橋剤、ラジカル開始剤、反応性リンカー基を有する少なくとも１種のコモノマーおよび場合により可塑剤並びにその他の添加物を包含する、ポリアクリルアミドをベースとするラジカル架橋したヒドロゲルからなるバイオセンサーのための親水性固定化層である。
【００１１】
更に、本発明の対象は、出発組成物がアクリルアミド、架橋剤、光開始剤、少なくとも１種の皮膜形成剤、反応性リンカー基を有する少なくとも１種のコモノマーおよび場合により可塑剤並びにその他の添加物を包含する、ポリアクリルアミドをベースとする光構造化ヒドロゲルからなる親水性固定化層である。
【００１２】
本発明によるシステムは、高いインテグレイション密度で三次元マトリックス中に生物学的認識分子を有するセンサアレイの構築を可能にする。
【００１３】
本発明による親水性固定化層の有利な実施形もしくは組成は、従属請求項３〜１０に記載されている。
【００１４】
この組成物は、関与するモノマーおよび開始剤の混和性を達成する、更なる成分を場合により添加されていてもよい。表面張力を低下させるためには、市販の添加物を使用することができる。
【００１５】
トランスデューサーシステム上への層形成および熱架橋もしくは光架橋または光重合または光構造化もしくは重合構造化の後に、水で膨潤性のヒドロゲルが得られ、この中にリンカー基を使用して分析または診断適用のための生物学的または化学的認識分子を結合し、その機能性を獲得することができる。従って、本発明の対象は、化学的または生物学的認識分子を（共有）結合もしくは固定化することによりバイオセンサー認識層を製造するための、固定化層の使用でもあり、この際認識分子は有利に捕獲−オリゴヌクレオチドである。
【００１６】
基本的に、ヒドロゲル層（固定化層）の製造のための出発組成物は全ての近代的な被覆技術で好適な担体上に担持することができる。しかしながら、スピン−コーチング並びにディスペンシング（Dispensieren）を適用することが有利である。
【００１７】
製造すべきヒドロゲル層の親水性、架橋密度、膨潤性等の特性は使用した出発物質の種類、その相互の比および層形成の最終的な種類により広い範囲で変化させることができる。
【００１８】
ヒドロゲルマトリックスは使用する生物学的認識分子に、特に架橋密度に関して適合させることができる。架橋密度は使用した架橋剤分子、例えばアクリル化合物および／またはメタクリル化合物、特にメチレンビス（メタ）アクリルアミドおよび／またはジメタクリル酸エステル、例えばテトラエチレングリコールジメタクリレートの種類および濃度により調節される。
【００１９】
ヒドロゲル混合物は特別な適用目的のために有利な被覆法にも適合させることができる。
【００２０】
スピン−コーチングのためには、一方ではポリマー膜形成剤、例えばポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミドおよび／またはポリヒドロキシメタクリレートの適用を挙げることができる。他方では、高沸点溶剤、例えばエチレングリコール、をヒドロゲル混合物のために使用することができ、これはスピン−コーチングの際に完全に蒸発せずにこうして層中に可塑剤として残留する。こうして、残留溶剤含量は架橋の前にプリベーク工程により更に減少させ、こうして特に重合収率もしくは生じる層厚を調節することができる。場合により、付加的に可塑剤系、例えばジエチレングリコールおよび／またはトリエチレングリコールを添加することもできる。
【００２１】
ディスペンシングによる被膜形成においては、溶液のヒドロゲル混合物をトランスデューサーの寸法により数マイクロメーターからナノリットルまでの大きさの液滴において、担持することができる。このディスペンシングのためにはディスペンシングカニューレの先端での液滴の十分な存続期間を示すために、高沸点溶剤を使用する。こうして液滴の配量および沈着を再現性可能にする。他方では、沈着した液滴からの溶剤の十分に迅速な蒸発を可能にするために、溶剤の沸点は高すぎてはならない。場合により、ここでは残留溶剤の含量を調節するために熱処理工程が必要である。ヒドロゲル混合物のディスペンシングのためにジメチルホルムアミドおよび／またはエチレングリコールの使用が有利である。
【実施例】
【００２２】
ヒドロゲル混合物を、金属、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、プラスチックからなるトランスデューサー表面または担体表面上に層またはスポットの形状で担持することができる。種々の材料からなるトポグラフィーを有する表面、例えば窒化ケイ素上のインターデジタル電極アレーも不動態化層で被覆される。面の被覆はマイクロチャネルまたはナノチューブの内側表面の被覆も含む。被覆されるべき表面は、場合によっては接着助剤で被覆されていてもよい。
【００２３】
ヒドロゲル層の重合および架橋は熱−開始またはＵＶ−開始によりおこなわれる。ＵＶ−開始においては、ヒドロゲル層の構造化をマスクを介しての接触または近接照射により実施することもできる。ここではヒドロゲル層はネガ型レジストとして働く。照射された領域は重合し、架橋する。暗くした領域では反応は生じない。ここに存在するヒドロゲル混合物は現像の際に再び基板から除かれる。ポリマー膜形成剤または可塑剤のような補助成分を、抽出により架橋したヒドロゲル層から除去することができる。場合によっては、この工程を本来の装備工程と同時に実施することができる。
【００２４】
生物学的または化学的認識システムを有利に水溶液、水性緩衝溶液または水と極性溶剤との混合物から、固定化層上に担持することができる。この担持は滴下またはスポッティング／ディスペンシングにより実施する。ナノチューブまたはマイクロカニューレ中で、生物学的または化学的に認識可能な分子を含有する溶液を架橋したヒドロゲル層にもたらすことは、液体系自体を搬送することによっても実施することができる。測定位置への所定の担持は、有利には保護環により周囲を囲まれている架橋したヒドロゲル点を使用する。
【００２５】
架橋したヒドロゲル中に存在するリンカー基と適合する結合基を有している生物学的または化学的認識分子の共有結合のためには、その反応性により熱処理工程を必要とすることがある。結合反応の間、ヒドロゲル層の完全な乾燥を阻止するためには、空調室中で作業することができる。特に、アミノアルキルがリンカー基エポキシドおよびマレイン酸無水物への結合のために好適である。
【国際調査報告】
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