(57)【要約】本発明は、抗原提示細胞と関連する、新規哺乳動物Ｃ型レクチンポリペプチドを提供する。樹状細胞Ｃ型レクチン（ＤＣＬ）と称する、以下の４つの新規遺伝子：ＤＣＬ１、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３およびＤＣＬ４、それととともに、スプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２、ｓｖＤＣＬ３およびｓｖＤＣＬ４、並びに本明細書においてＤＣＬ５と称するヒト相同体が発見された。本発明は、ＤＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、組換え発現ベクター、組換え発現ベクターでトランスフェクションした宿主細胞、本発明のポリペプチドを産生し、そして単離する方法、および多様なスクリーニングアッセイを提供する。多様な疾患を治療する療法組成物および方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜２４５および配列番号２のアミノ酸７７〜２４５からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでなる、配列番号２のアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）Ｃ型レクチンドメインを有する、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）免疫受容体チロシン依存性阻害性様モチーフ（ＩＴＩＭ）アミノ酸配列を有する、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）免疫原性である、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｈ）少なくとも２５のアミノ酸を含んでなり、そして（ａ）〜（ｇ）いずれかのアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有し、アミノ酸同一性パーセントが少なくとも８０％であり、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、アミノ酸配列；および
（ｉ）少なくとも２０のアミノ酸を含んでなり、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、およびＮ末端一部切除からなる群より選択される、少なくとも１つの修飾を有し、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
（ａ）配列番号１；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜７３８；および
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）の対立遺伝子変異体
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項２のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２および３いずれかのポリヌクレオチドに対応する、単離ゲノムポリヌクレオチド。
【請求項５】
長さ少なくとも１５のヌクレオチドを有し、中程度のストリンジェンシーの条件下で、請求項３のポリヌクレオチドの相補核酸にハイブリダイズし、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有するポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３の核酸のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列同一性を共有し、ヌクレオチド配列同一性パーセントが少なくとも８０％であり、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有するポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項２〜６いずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項８】
請求項２〜６いずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、形質転換宿主細胞。
【請求項９】
形質転換宿主細胞が、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、並びにヒト、サル（ｍｏｎｋｅｙ）、類人猿（ａｐｅ）およびげっ歯類などの哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項８の形質転換宿主細胞。
【請求項１０】
請求項２〜６いずれかのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で、形質転換宿主細胞を培養することを含んでなり、該形質転換宿主細胞が、請求項２〜６いずれかに記載の、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、前記方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドを精製することをさらに含んでなる、請求項１０の方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法によって産生されるポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１のポリペプチドに結合する、単離抗体。
【請求項１４】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１３の抗体。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１４の抗体。
【請求項１６】
抗体が、請求項１のポリペプチドの１以上のＤＣＬ活性をアゴナイズする、請求項１５の抗体。
【請求項１７】
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５のアミノ酸１〜２１５および配列番号５のアミノ酸４２〜２１５からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでなる、配列番号５のアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）Ｃ型レクチンドメインを有する、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）免疫原性である、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）少なくとも２５のアミノ酸を含んでなり、そして（ａ）〜（ｆ）いずれかのアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有し、アミノ酸同一性パーセントが少なくとも８０％であり、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、アミノ酸配列；および
（ｈ）少なくとも２０のアミノ酸を含んでなり、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端一部切除、およびＮ末端一部切除からなる群より選択される、少なくとも１つの修飾を有し、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１７のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
（ａ）配列番号２３；
（ｂ）配列番号２３のヌクレオチド１〜６４８；および
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）の対立遺伝子変異体
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１８のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１８および１９いずれかのポリヌクレオチドに対応する、単離ゲノムポリヌクレオチド。
【請求項２１】
長さ少なくとも１５のヌクレオチドを有し、中程度のストリンジェンシーの条件下で、請求項１９のポリヌクレオチドの相補核酸にハイブリダイズし、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有するポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項１９の核酸のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列同一性を共有し、ヌクレオチド配列同一性パーセントが少なくとも８０％であり、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有するポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１８〜２２いずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項１８〜２２いずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、形質転換宿主細胞。
【請求項２５】
形質転換宿主細胞が、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、並びにヒト、サル、類人猿およびげっ歯類などの哺乳動物細胞からなる群より選択される、請求項２４の形質転換宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１８〜２２いずれかのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で、形質転換宿主細胞を培養することを含んでなり、該形質転換宿主細胞が、請求項１８〜２２いずれかに記載の、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含んでなる、前記方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドを精製することをさらに含んでなる、請求項２６の方法。
【請求項２８】
請求項２７の方法によって産生されるポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１７のポリペプチドに結合する、単離抗体。
【請求項３０】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項２９の抗体。
【請求項３１】
モノクローナル抗体が、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である、請求項３０の抗体。
【請求項３２】
請求項１７のポリペプチドの、１以上のＤＣＬ活性をアゴナイズする、請求項３１の抗体。
【請求項３３】
ポリペプチドが、抗原結合、抗原インターナリゼーション、抗原プロセシングおよび抗原提示；抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性化、ＡＰＣ分化、ＡＰＣ成熟、ＡＰＣホーミングおよびＡＰＣ遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）；結合、および興奮性の方式または阻害性の方式いずれかでの細胞内シグナル伝達経路の調節を含む、細胞間相互作用；可溶性因子の分泌を通じた細胞外コミュニケーション；Ｃ型レクチン活性；炭水化物認識ドメイン活性；アスパルチルプロテアーゼ活性および免疫受容体チロシン依存性阻害性様モチーフ（ＩＴＩＭ）活性からなる群より選択される活性を有する、請求項１または１７のポリペプチド。
【請求項３４】
ＤＣＬポリペプチド活性を調節する化合物を同定する方法であって
（ａ）請求項１または請求項１７のポリペプチドと試験化合物を混合し；そして
（ｂ）試験化合物が、前記ポリペプチドのＤＣＬポリペプチド活性を改変するかどうかを決定する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項３５】
ＤＣＬポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定する方法であって
（ａ）請求項１または請求項１７のポリペプチドおよび前記ポリペプチドの結合パートナーと試験化合物を混合し；そして
（ｂ）試験化合物が、前記ポリペプチドの結合活性を阻害するかどうかを決定する
ことを含んでなる、前記方法。
【請求項３６】
ＤＣＬ活性を増加させる方法であって、請求項１および１７いずれかのポリペプチド、並びに前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される、少なくとも１つの化合物を提供することを含んでなる、前記方法。
【請求項３７】
アゴニストが、抗体、ペプチド、ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）またはペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）からなる群より選択される、請求項３６の方法。
【請求項３８】
１以上のＤＣＬ活性を減少させる方法であって、請求項１および１７いずれかのポリペプチドの少なくとも１つのアンタゴニストを提供することを含んでなる、前記方法。
【請求項３９】
アンタゴニストが、抗体、ペプチド、ペプチド擬似体、ミモトープまたはペプチボディからなる群より選択される、請求項３８の方法。
【請求項４０】
感染性疾患を治療する方法であって、請求項１および１７いずれか記載の１以上のポリペプチドを、感染性病原体由来の１以上の抗原とカップリングさせて投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４１】
感染性病原体に対する免疫反応を増大させる方法であって、請求項１および１７いずれか記載の１以上のポリペプチドを、感染性病原体由来の１以上の抗原とカップリングさせて投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４２】
癌を治療する方法であって、請求項１および１７いずれか記載の１以上のポリペプチドを、１以上の腫瘍抗原とカップリングさせて投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４３】
癌に対する免疫反応を増大させる方法であって、請求項１および１７いずれか記載の１以上のポリペプチドを、１以上の腫瘍抗原とカップリングさせて投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４４】
免疫系の細胞において、抗原特異的寛容を誘導する方法であって、請求項１および１７いずれか記載の１以上のポリペプチドを、自己免疫または炎症と関連する１以上の抗原とカップリングさせて投与することを含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づいて、米国仮出願第６０／３２８，０２６号、２００１年１０月９日提出の優先権を主張し、前記出願の開示は、本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、抗原提示細胞において発現される、新規Ｃ型レクチンファミリーメンバーを提供し、そして１つの特定の態様において、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）での刺激に反応して、樹状細胞上で上方制御されるＣ型レクチンを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
宿主防御系は、感染性病原体および傷害から宿主を保護する、自然免疫および適応免疫に頼る。自然免疫系には、補体、ナチュラルキラー細胞および食細胞などの、いくつかの免疫制御構成要素が含まれ、そして病原性傷害および／または組織傷害を迅速に認識する能力とともに、適応免疫系の細胞に多様なシグナルを送る能力によって特徴付けられる。自然免疫系の細胞は、病原体間で共有されるパターン、例えば細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、炭水化物、および二本鎖ウイルスＲＮＡを認識する、多様な受容体を用いる。適応免疫系、または体液性免疫および細胞仲介性免疫は、免疫グロブリンファミリーの遺伝子を再編成する能力によって特徴付けられ、これによって、非常に多様な抗原特異的クローンおよび免疫学的記憶が可能になる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、適応免疫系の細胞を指導し、そして制御するように働く。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）は、一次Ｔ細胞反応を誘導し、それによって、抗原特異的免疫反応を可能にし、そして免疫学的記憶を確立することが知られる唯一の細胞である点で、ユニークなＡＰＣである。ＤＣはプロフェッショナルＡＰＣであり、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の特に効率的な刺激因子である。ＤＣは、ミスマッチＭＨＣ、スーパー抗原（Ｂｈａｒｄｗａｊ，  Ｎ．ら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７８，  ６３３−６４２（１９９３））、感染性病原体由来のタンパク質（Ｉｎａｂａ，  Ｋ．ら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７８，  ４７９−４８８（１９９３））および腫瘍（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏ，  Ｊ．Ｉ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  １，  １２９７−１３０２（１９９５）；Ｈｓｕ，  Ｆ．Ｊ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  ２，  ５２−５８（１９９６））に対して、未刺激（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞をプライミングする能力を有する。ＤＣは、Ｔ細胞を活性化するのに非常に効率的であり、そして混合リンパ球反応において、１つのＤＣは、１００〜３，０００のＴ細胞を活性化することが可能である。研究者らは、いまだに、ＤＣのＴ細胞結合および活性化効率の基礎を特定できずにいるが、ＤＣのユニークな刺激特性は、部分的に、ＭＨＣ産物およびＭＨＣ−ペプチド複合体が、Ｂ細胞および単球などの他のＡＰＣよりも、ＤＣ上に１０〜１００倍多いという事実に起因する可能性がある（Ｉｎａｂａ，  Ｋ．ら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８６，  ６６５−６７２（１９９７））。さらに、成熟ＤＣのサブセットは、ＩＬ−１０の抑制効果に抵抗し、そして高レベルのＩＬ−１２を合成し、これが次に、ナチュラルキラー細胞の形の自然免疫、並びにＴ細胞およびＢ細胞による獲得免疫を増進する（Ｋｏｃｈ，  Ｆ．ら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １８４，  ７４１−７４７（１９３６））。さらに、ＤＣは、ＬＦＡ−３／ＣＤ５８、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４およびＢ７−２／ＣＤ８６などの、接着および同時刺激を増進する、Ｔ細胞上の受容体と相互作用する多くのアクセサリー分子を上方制御し、そして発現する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９２，  ２４５−２５２（１９９８））。
【０００５】
ＤＣは多くの組織に位置し、ここで、抗原を捕捉し、そしてプロセシングすることによって、歩哨（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）の役割を果たす。１つの形では、ＤＣの前駆体は骨髄から遊走し、そして血液中を循環して、体の特定の部位に移り、そこで成熟する。この輸送は、部分的に、ケモカイン受容体および接着分子の発現によって導かれる。ＤＣ輸送パターンおよび機能の間のこの関連から、発生および成熟中のＤＣのケモカイン反応性が調べられてきた。樹状細胞サブセットに対するケモカインの影響の概説に関しては、Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎ，  Ｊ．  Ｌｅｕｋ．  Ｂｉｏｌ．  ６６（２）：２５２−６２，  １９９９を参照されたい。一般的に、抗原および活性化シグナルへの曝露に際して、ＤＣが活性化され、そしてＤＣは、同時刺激分子および接着分子を上方制御し、そして組織を離れ、求心性リンパ管を介して、排出リンパ節のＴ細胞リッチ副皮質に向かって遊走する。活性化されたＤＣはその後、Ｔ細胞ホーミングおよび活性化に関与するケモカインおよびサイトカインを分泌し、そしてプロセシングした抗原をＴ細胞に提示する。例えば、ＤＣ特異的Ｃ型レクチンであるＤＣ−ＳＩＧＮは、血管リガンドＩＣＡＭ−２上にＤＣ−ＳＩＧＮ陽性細胞を束縛し、そして回転させるのを補助することが示されている。このプロセスは、血液からの流出の必要条件である可能性があり、そして、ＤＣ−ＳＩＧＮ：ＩＣＡＭ−２相互作用が、休止内皮および活性化内皮両方を横切る、ケモカインに誘導されるＤＣの遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を制御することが示されている（Ｔｅｕｎｉｓ，  Ｂ．Ｈ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  １：３５３−３５７，  ２０００）。さらに、ＤＣ−ＳＩＧＮは、休止Ｔ細胞上に発現されるＩＣＡＭ−３との一過性の接触を仲介し、そしてＩＣＡＭ−３への結合が、ＤＣおよびＴ細胞間の最初の接着を確立するのに重要な役割を果たし、そしてそれに続いて、他の接着分子との低アビディティー相互作用を促進して、生産的なＴ細胞受容体会合、その後、接着強化を可能にすることが立証されている（Ｔｅｕｎｉｓ，  Ｂ．Ｈ．ら，  Ｃｅｌｌ  １００：５７５−５８５，  ２０００）。
【０００６】
未成熟ＤＣは、抗原捕捉において、非常に効率的であり、そして、マクロピノサイトーシス；免疫複合体のインターナリゼーションのためのＣ型レクチン受容体またはＩ型（ＣＤ６４）およびＩＩ型（ＣＤ３２）Ｆｃγ受容体を介した、受容体仲介エンドサイトーシス、並びに微粒子の食作用などの、いくつかの経路を用いる。微粒子の食作用には、ＣＤ３６およびαＶβ３またはαＶβ５インテグリン（Ａｌｂｅｒｔ，  Ｍ．Ｌ．ら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８８：１３５９−６８，  １９９８；Ｒｕｂａｒｔｅｌｌｉ，  Ａ．ら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：１８９３−９００，  １９９７）、ウイルスおよび細菌とともに細胞内寄生虫（Ｍｏｌｌ，  Ｈ．ら，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，  １４：３８３−８７，  １９９３）を含む、アポトーシス細胞断片および壊死細胞断片が含まれる。ＤＣはまた、ペプチドが装填された熱ショックタンパク質ｇｐ９６およびＨｓｐ７０をインターナライズする能力も有する（Ａｒｎｏｌｄ−Ｓｃｈｉｌｄ，  Ｄ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２：３７５７−６０，  １９９９）。広く発現されているα２−マクログロブリン受容体であるＣＤ９１は、ｇｐ９６の受容体であることが示されている（Ｂｉｎｄｅｒ，  Ｊ．Ｒ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：１５１−５５，  ２０００）。特定のＤＣサブタイプにおいて、抗原の取り込みは、未成熟ＤＣが、表現型的変化および機能的変化を経て、最終的に抗原捕捉細胞から抗原提示細胞に完全に移行するように誘導する。
【０００７】
Ｃ型（Ｃａ2+依存性）レクチン受容体、例えばマンノース受容体（Ｈａｒｔ，  Ｄ．Ｎ．ら，  Ｂｌｏｏｄ  ９０：３２４５：８７，  １９９７）およびＤＥＣ−２０５（Ｊｉａｎｇ，  Ｗ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：１５１−５５，  １９９５）を介した、受容体仲介エンドサイトーシスの役割は、ＤＣ生物学の重要な興味の対象である。補体活性化経路を含むマンノース結合レクチン経路（ＭＢＬ）は、炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を介した炭水化物へのＭＢＬの結合によって仲介される。ＣＲＤ結合は、糖選択的およびカルシウム依存性である。ＭＢＬは、微生物表面上の炭水化物構造のアレイに結合し、該アレイは、次に、溶解性膜攻撃複合体を通じ、補体を介して直接殺すことによって、または生物の食作用を促進することによって、抗菌反応を仲介する。自己構造および非自己構造間を区別する能力は、ＣＲＤの特異性に、そしてＣＲＤの空間配置に存する。ＭＢＬ経路の概説に関しては、Ｇａｄｊｅｖａ，  Ｍ．ら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３：７４−７８，  ２００１を参照されたい。
【０００８】
いくつかのグループが、マクロファージおよびＤＣに特有の、いくつかの新規Ｃ型レクチンを同定してきており、これらは例えば、ネズミ・マクロファージ限定Ｃ型レクチン（ｍＭＣＬ）（Ｂａｌｃｈ，  Ｓ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：１８６５６−６４，  １９９８）；ランゲルハンス細胞特異的Ｃ型レクチン、ランゲリン（Ｖａｌｌａｄｅａｕ，  Ｊ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：７１−８１，  ２０００）；ネズミ腹腔マクロファージにおけるＮＦ−ＩＬ６の転写標的である、マクロファージ誘導性Ｃ型レクチン、ミンクル（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  Ｍ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：５０３９−４８，  １９９９）；ヒト樹状細胞免疫受容体で、マクロファージレクチンおよび肝アシアロ糖タンパク質受容体に相同性を持つ、ＩＩ型糖タンパク質であるＤＣＩＲ（Ｂａｔｅｓ，  Ｅ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：１９７３−８３，  １９９９およびＵＳＰＮ  ６，２７７，９５９）；並びに、Ｔ細胞同時刺激シグナルを搬送するのに関与すると考えられる、ネズミ・デクチン−１およびデクチン−２（ＤＣ関連Ｃ型レクチン；それぞれ、Ａｒｉｉｚｕｍｉ，  Ｋ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：２０１５７−１６７，  ２０００およびＡｒｉｉｚｕｍｉ，  Ｋ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：１１９５７−９６３，  ２０００）である。
【０００９】
現在まで、ＡＰＣおよび特にＤＣ生物学におけるＣ型レクチンの役割は、完全には理解されていない。例えば、Ｃ型レクチンは、ＡＰＣ／ＤＣ活性化、分化、成熟、遊走、抗原捕捉、抗原プロセシングおよび提示とともに、Ｔ細胞、Ｂ細胞および免疫系の他の細胞との相互作用に役割を果たす可能性がある。ＡＰＣ／ＤＣ生物学のこれらの側面を操作すると、炎症、腫瘍学、自己免疫、感染性疾患、移植、アジュバントおよびワクチンの分野で有用である可能性がある。本発明はこうした課題に取り組む。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
本発明は、ＡＰＣにおいて発現される、新規Ｃ型レクチンファミリーメンバーの発見に基づき、そして１つの特定の態様において、ＬＰＳでの刺激に反応して、ＤＣ上で上方制御されるＣ型レクチンの発見に基づく。
【００１１】
別の側面において、本発明は、本明細書において、樹状細胞Ｃ型レクチン（ＤＣＬ）と称する、ネズミ樹状細胞と会合する、新規哺乳動物Ｃ型レクチンポリペプチドを提供する。すなわち、ＤＣＬ１（配列番号２）、ＤＣＬ２（配列番号６）、ＤＣＬ３（配列番号１２）およびＤＣＬ４（配列番号２２）とともに、スプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２（配列番号１０）、ｓｖＤＣＬ３（配列番号１６）およびｓｖＤＣＬ４（配列番号２２）、並びに本明細書においてＤＣＬ５（配列番号２４）と称するヒト相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）である。本発明は、ＤＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＤＬＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明はさらに、ＤＣＬポリペプチドを単離する方法、および該組換え発現ベクターでトランスフェクションした宿主細胞を、Ｃ型レクチンポリペプチドを発現するのに適した条件下で培養し、そして発現されたレクチンポリペプチドを回収することによって、組換えＤＣＬポリペプチドを産生する方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明は：
（ａ）配列番号２、６、１０、１２、１６、１８、２２または２４のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜２４５および配列番号２のアミノ酸７７〜２４５からなる群より選択されるアミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、細胞外ドメインのすべてまたは一部を含んでなる、配列番号２のアミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｅ）Ｃ型レクチンドメインを有する、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｆ）免疫受容体チロシン依存性阻害性様モチーフ（ＩＴＩＭ）アミノ酸配列を有する、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｇ）免疫原性である、少なくとも２５の隣接するアミノ酸を含んでなる、（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列の断片；
（ｈ）少なくとも２５のアミノ酸を含んでなり、そして（ａ）〜（ｇ）いずれかのアミノ酸配列とアミノ酸同一性を共有し、アミノ酸同一性パーセントが：少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択され、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、アミノ酸配列；および
（ｉ）少なくとも２０のアミノ酸を含んでなり、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、およびＮ末端一部切除からなる群より選択される、少なくとも１つの修飾を有し、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有する、アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、該アミノ酸配列から本質的になる、またはより好ましくは該アミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明の他の側面は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸であり、好ましい態様は：
（ａ）配列番号１、５、９、１１、１５、１７、２１および２３；並びに
（ｂ）（ａ）の対立遺伝子変異体
からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、またはより好ましくは該ヌクレオチド配列を含んでなる、単離核酸である。
【００１４】
本発明はまた、本発明の核酸に対応する、単離ゲノム核酸も提供する。
本発明の他の側面は、本発明のポリペプチドをコードする単離核酸、および中程度のストリンジェンシーの条件下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする、好ましくは長さ少なくとも１５の隣接するヌクレオチドを有する、単離核酸である。本発明の好ましい態様において、こうした核酸は、Ｃ型レクチンポリペプチド活性を有するポリペプチドをコードするか、または本発明の核酸のヌクレオチド配列とヌクレオチド配列同一性を共有し、ヌクレオチド配列同一性パーセントが：少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９９％、および少なくとも９９．５％からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含んでなる。
【００１５】
本発明にさらに提供するのは、本発明の少なくとも１つの核酸を含んでなる、発現ベクターおよび組換え宿主細胞であり、そして好ましい組換え宿主細胞は、前記核酸が宿主細胞ゲノムに組み込まれているものである。
【００１６】
やはり提供するのは、本発明の核酸にコードされるポリペプチドを産生するための方法であって、前記ポリペプチドの発現を促進する条件下で、組換え宿主細胞を培養することを含んでなり、該組換え宿主細胞が、本発明の少なくとも１つの核酸を含んでなる、前記方法である。本発明の別の側面において、前記方法によって産生されるポリペプチドを提供する。
【００１７】
さらに、本発明の範囲内には、ＤＣＬポリペプチド、またはＤＣＬポリペプチドを発現する細胞を精製するかまたは分離する方法がある。こうした方法には、固相マトリックスに少なくとも１つの結合パートナーを結合させ、そしてＤＣＬポリペプチド（類）を含有する混合物またはＤＬＣポリペプチド（類）を発現する細胞の混合物を、ＤＣＬポリペプチド（類）が結合するものに接触させ、そしてその後、接触表面および溶液を分離することが含まれる。
【００１８】
本発明のさらなる側面には、以下にさらに詳細に記載するような、本発明のポリペプチドに結合する単離抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体等が含まれる。さらなる態様には、前記ポリペプチドのＤＣＬ活性をアゴナイズする、こうした抗体が含まれる。さらなる態様には、天然リガンド（類）へのＤＣＬポリペプチドの結合を阻害する（アンタゴナイズする）、こうした抗体が含まれる。
【００１９】
本発明はさらに、ＤＣＬポリペプチドの阻害剤を設計する方法であって、こうしたポリペプチドいずれかの三次元構造を決定し、基質の結合部位でありそうな部位の三次元構造を解析し、予測される反応性部位を組み込む分子を合成し、そして該分子のポリペプチド阻害活性を決定する工程を含んでなる、前記方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる側面において、ＤＣＬポリペプチド活性を改変する化合物を同定する方法であって
（ａ）本発明のポリペプチドと試験化合物を混合し；そして
（ｂ）試験化合物が、前記ポリペプチドのＤＣＬポリペプチド活性を改変するかどうかを決定する
ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２１】
本発明の別の側面において、ＤＣＬポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定する方法であって
（ａ）本発明のポリペプチドおよび前記ポリペプチドの結合パートナーと試験化合物を混合し；そして
（ｂ）試験化合物が、前記ポリペプチドの結合活性を阻害するかどうかを決定する
ことを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２２】
別の態様において、結合パートナーは、抗原であることが可能であり、また、オリゴ糖、多糖、炭水化物、糖タンパク質、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ糖脂質等であることが可能な天然リガンドであり；該天然リガンドは、細菌、ウイルス、真菌または原生動物ポリペプチドとともに細胞膜会合ポリペプチドからなる群より選択可能である。あるいは、結合パートナーは、ＤＣＬ活性に対してアゴニスト性またはアンタゴニスト性いずれかの抗体を含んでなることが可能である。また、結合パートナーは、ＤＣＬ天然リガンドの断片、誘導体、融合タンパク質またはペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）を含んでなることが可能である。
【００２３】
本発明はまた、ＤＣＬポリペプチド活性を増加させる方法であって、本発明のポリペプチドおよび前記ポリペプチドのアゴニストからなる群より選択される、少なくとも１つの化合物を提供することを含んでなる、前記方法も提供する。該方法のさらなる態様は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを投与することによって、患者において、前記活性を増加させることをさらに含んでなる。アゴニストは、抗体、単離ＤＣＬポリペプチド（類）またはその断片（類）、ＤＣＬペプチド（類）および／またはペプチド擬似体（類）を含んでなることが可能である。
【００２４】
ＤＣＬポリペプチド活性には、限定されるわけではないが、抗原結合、抗原インターナリゼーション、抗原プロセシングおよび抗原提示；抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性化、ＡＰＣ分化、ＡＰＣ成熟、ＡＰＣホーミングおよびＡＰＣ遊出（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）；結合、および興奮性の方式または阻害性の方式いずれかでの細胞内シグナル伝達経路の調節を含む、細胞間相互作用；自己分泌、傍分泌および／または内分泌様式で作用する、可溶性因子の分泌を通じた細胞外コミュニケーション；Ｃ型レクチン活性；炭水化物認識ドメイン活性；アスパルチルプロテアーゼ活性および免疫受容体チロシン依存性阻害性様モチーフ（ＩＴＩＭ）活性が含まれる。ＤＣＬポリペプチドを発現しているＡＰＣに結合可能な細胞の例には免疫系の細胞が含まれ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞とともにその前駆細胞が含まれる。
【００２５】
本発明にさらに提供されるのは、すぐ上に記載するような活性を１以上減少させる方法であって、本発明のポリペプチドの少なくとも１つのアンタゴニストを提供することを含んでなる、前記方法であり；該方法の好ましい態様は、本発明のポリペプチドの少なくとも１つのアンタゴニストを投与することによって、患者において、前記活性を減少させることを含んでなり、そしてさらに好ましい態様において、アンタゴニストは、前記ポリペプチドいずれかの活性を阻害する、抗体、単離ＤＣＬポリペプチドまたはその断片、ＤＣＬペプチドおよび／またはペプチド擬似体である。
【００２６】
他の側面において、本発明は、ＤＣＬ組成物を利用して、ＤＣＬ活性および／またはＤＣＬ関連細胞事象の潜在的なアゴニストおよび／またはアンタゴニストに関してスクリーニングするアッセイを提供する。さらに、そのアンタゴニストおよび／またはアゴニストの合理的設計において、ＤＣＬポリペプチド、ポリヌクレオチド、断片、変異体、突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）、融合タンパク質、抗体、結合タンパク質等を用いる方法もまた、本発明の側面である。
【００２７】
本発明はさらに、自己免疫障害、炎症、癌、移植関連状態、および感染性疾患を治療する方法であって、本発明のポリペプチド、並びに前記ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される、少なくとも１つの化合物を投与することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、哺乳動物細胞、および特にＤＣ細胞系譜の抗原提示細胞に関連するカルシウム依存性（Ｃ型）レクチンファミリーの新規メンバーを同定し、単離し、そして性質決定することに関する。本発明は、ネズミ樹状細胞上に発現され、本明細書において、ＤＣＬ１、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３およびＤＣＬ４と称する、Ｃ型レクチンドメインを有する新規ポリペプチドとともに、スプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２、ｓｖＤＣＬ３およびｓｖＤＣＬ４、並びに本明細書においてＤＣＬ５と称するヒト相同体を提供する。便宜上、ＤＣＬ１、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３、ＤＣＬ４およびＤＣＬ５（それとともにスプライシング変異体および相同体）を、しばしば、集合的にＤＣＬポリペプチドと称する。用語ＤＣＬを用いる場合、ＤＣＬ１、２、３、４および／または５とともに、スプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２、ｓｖＤＣＬ３およびｓｖＤＣＬ４の１以上を、単独でまたはいずれかの組み合わせで意味すると理解される。
【００２９】
本発明は、ＤＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＤＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを提供する。本発明はさらに、ＤＣＬポリペプチドを単離する方法、および組換え発現ベクターでトランスフェクションまたは形質転換した宿主細胞を、本発明のポリペプチドを発現するのに適した条件下で培養し、そして発現されたポリペプチドを回収することによって、組換えＤＣＬポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００３０】
本発明は、記載する特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種または属、構築物、および試薬には限定されないと理解されるものとし、これは、こうしたものが多様でありうるためである。また、本明細書において用いる専門用語は、特定の態様を記載する目的のみのものであり、そして本発明の範囲を限定することは意図されず、本発明の範囲は、付随する請求項によってのみ限定されるであろう。
【００３１】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すのに用いる分子（例えば核酸、プラスミド、またはウイルス）いずれかを指すのに用いられる。用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適したベクターを指し、そして挿入された異種核酸配列の発現を指示し、そして／または調節する核酸配列を含有する。発現には、限定されるわけではないが、転写、翻訳、およびイントロンが存在するならばＲＮＡスプライシングなどのプロセスが含まれる。
【００３２】
用語「機能可能であるように連結された」は、本明細書において、フランキング配列の配置を指し、こうして記載するフランキング配列は、その通常の機能を行うように構成されるかまたは組み立てられている。したがって、コード配列に機能可能であるように連結されたフランキング配列は、コード配列の複製、転写および／または翻訳を達成可能である可能性がある。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指示可能である場合、コード配列はプロモーター配列に機能可能であるように連結されている。フランキング配列は、正しく機能する限り、コード配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモーター配列およびコード配列の間に存在することが可能であり、そしてプロモーター配列はなお、コード配列に「機能可能であるように連結された」とみなされる。
【００３３】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されているか、または核酸配列で形質転換されることが可能であり、そしてその後、選択した目的の遺伝子を発現することが可能である細胞を指すように用いられる。該用語には、親細胞の子孫が含まれ、子孫は、選択した遺伝子が存在する限り、元来の親に対して、形態または遺伝子構成が同一であってもなくても、この用語に含まれる。
【００３４】
用語「ＤＣＬポリペプチド断片」は、配列番号２、６、１０、１２、１６、１８、２２および２４いずれかに示すようなポリペプチドのアミノ末端での一部切除（リーダー配列を含むかまたは含まない）、および／またはカルボキシル末端での一部切除を含んでなるポリペプチドを指す。用語「ＤＣＬポリペプチド断片」はまた、ＤＣＬポリペプチドオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、ＤＣＬポリペプチド誘導体、またはＤＣＬポリペプチド変異体のアミノ末端および／またはカルボキシ末端一部切除体も指し、あるいはＤＣＬポリペプチド対立遺伝子変異体またはＤＣＬポリペプチドスプライシング変異体にコードされるポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシル末端一部切除体も指す。ＤＣＬポリペプチド断片は、選択的ＲＮＡスプライシングから、またはｉｎ  ｖｉｖｏプロテアーゼ活性から生じる可能性もある。ＤＣＬポリペプチドの膜結合型もまた、本発明に意図される。好ましい態様において、一部切除および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００アミノ酸より多いアミノ酸を含んでなる。こうして産生したポリペプチド断片は、約２５の隣接アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸を含んでなるであろう。こうしたＤＣＬポリペプチド断片は、場合によって、アミノ末端メチオニン残基を含んでなることが可能である。こうした断片を用いて、例えばＤＣＬポリペプチドに対する抗体を生成可能であると認識されるであろう。
【００３５】
用語「ＤＣＬポリペプチドオルソログ」は、配列番号２または配列番号５いずれかに示すようなＤＣＬポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドを指す。例えば、マウスおよびヒトＤＣＬポリペプチドは、互いにオルソログとみなされる。
【００３６】
用語「ＤＣＬポリペプチド変異体」は、配列番号２または配列番号５いずれかに示すＤＣＬポリペプチドアミノ酸配列（リーダー配列を含むかまたは含まない）に比較した際、少なくとも１つのアミノ酸配列置換、欠失（内部欠失および／またはＤＣＬポリペプチド断片など）、および／または付加（内部付加および／またはＤＣＬ融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含んでなるＤＣＬポリペプチドを指す。変異体は、天然存在（例えば、ＤＣＬポリペプチド対立遺伝子変異体、ＤＣＬポリペプチドオルソログ、およびＤＣＬポリペプチドスプライシング変異体）であることが可能であるし、または人工的に構築可能である。こうしたＤＣＬポリペプチド変異体は、配列番号１または配列番号４いずれかに示すようなＤＮＡ配列にしたがって、多様であるＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製可能である。好ましい態様において、変異体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００アミノ酸より多いアミノ酸の置換、挿入、付加および／または欠失を有し、ここで、置換は保存的、または非保存的、あるいはその組み合わせいずれかであることが可能である。
【００３７】
用語「ＤＣＬポリペプチド変異体」は、ＤＣＬ１（配列番号２）、ＤＣＬ２（配列番号６）、ＤＣＬ３（配列番号１２）およびＤＣＬ４（配列番号２２）とともにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２（配列番号１０）、ｓｖＤＣＬ３（配列番号１６）およびｓｖＤＣＬ４（配列番号２２）、並びに本明細書においてＤＣＬ５（配列番号２４）と称するヒト相同体いずれかに示すようなポリペプチド；ＤＣＬポリペプチド断片；ＤＣＬポリペプチドオルソログ；または本明細書に定義されるように、化学的に修飾されているＤＣＬポリペプチド変異体を指す。用語「ＤＣＬポリペプチド変異体」はまた、本明細書に定義するように、化学的に修飾されている、ＤＣＬポリペプチド対立遺伝子変異体またはＤＣＬポリペプチドスプライシング変異体にコードされるポリペプチドも指す。
【００３８】
用語「成熟ＤＣＬポリペプチド」は、リーダー配列を欠くＤＣＬポリペプチドを指す。成熟ＤＣＬポリペプチドはまた、アミノ末端（リーダー配列を含むかまたは含まない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解プロセシング、より大きい前駆体からのより小さいポリペプチドの切断、Ｎ連結および／またはＯ連結グリコシル化等の他の修飾もまた含むことが可能である。典型的な成熟ＤＣＬポリペプチドは、ＤＣＬ１（配列番号２）、ＤＣＬ２（配列番号６）、ＤＣＬ３（配列番号１２）およびＤＣＬ４（配列番号２２）とともにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２（配列番号１０）、ｓｖＤＣＬ３（配列番号１６）およびｓｖＤＣＬ４（配列番号２２）、並びに本明細書においてＤＣＬ５（配列番号２４）と称するヒト相同体のアミノ酸配列に示される。
【００３９】
用語「ＤＣＬ融合ポリペプチド」は、ＤＣＬ１（配列番号２）、ＤＣＬ２（配列番号６）、ＤＣＬ３（配列番号１２）およびＤＣＬ４（配列番号２２）とともにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２（配列番号１０）、ｓｖＤＣＬ３（配列番号１６）およびｓｖＤＣＬ４（配列番号２２）、並びに本明細書においてＤＣＬ５（配列番号２４）と称するヒト相同体に示すようなポリペプチド、本明細書に定義するような、ＤＣＬポリペプチド断片、ＤＣＬポリペプチドオルソログ、ＤＣＬポリペプチド変異体、またはＤＣＬ誘導体のアミノ末端またはカルボキシル末端への、１以上のアミノ酸（異種タンパク質またはペプチドなど）の融合を指す。用語「ＤＣＬ融合ポリペプチド」はまた、本明細書に定義するような、ＤＣＬポリペプチド対立遺伝子変異体またはＤＣＬポリペプチドスプライシング変異体にコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端への１以上のアミノ酸の融合も指す。
【００４０】
用語「生物学的に活性であるＤＣＬポリペプチド」は、ＤＣＬ１（配列番号２）、ＤＣＬ２（配列番号６）、ＤＣＬ３（配列番号１２）、ＤＣＬ４（配列番号２２）およびＤＣＬ５（配列番号２４）とともにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２（配列番号１０）、ｓｖＤＣＬ３（配列番号１６）およびｓｖＤＣＬ４（配列番号２２）のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに特徴的な、少なくとも１つのＤＣＬ活性を有するＤＣＬポリペプチドを指す。ＤＣＬ活性の例には、限定されるわけではないが、抗原結合、抗原インターナリゼーション、抗原プロセシングおよび抗原提示；抗原提示細胞（ＡＰＣ）活性化、ＡＰＣ分化、ＡＰＣ成熟、ＡＰＣホーミングおよびＡＰＣ遊出；結合、および興奮性の方式または阻害性の方式いずれかでの細胞内シグナル伝達経路の調節を含む、細胞間相互作用；自己分泌、傍分泌および／または内分泌様式で作用する、可溶性因子の分泌を通じた細胞外コミュニケーション；Ｃ型レクチン活性；炭水化物認識ドメイン活性；アスパルチルプロテアーゼ活性および免疫受容体チロシン依存性阻害性様モチーフ（ＩＴＩＭ）活性が含まれる。ＤＣＬポリペプチドを発現しているＡＰＣに結合可能な細胞の例には免疫系の細胞が含まれ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞とともにその前駆細胞が含まれる。
【００４１】
さらに、ＤＣＬポリペプチドは、免疫原として活性である可能性があり；すなわち、ＤＣＬポリペプチドは、それに対して抗体を作製可能な、少なくとも１つのエピトープを含有する。
【００４２】
用語「天然存在」または「天然」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等の生物学的材料との関連で用いた場合、天然に見られ、そして人に操作されていない材料を指す。同様に「非天然存在」または「非天然」は、本明細書において、天然には見られないか、あるいは人によって構造的に修飾されているかまたは合成されている材料を指す。
【００４３】
用語「形質転換」は、本明細書において、細胞の遺伝的特性の変化を指し、そして細胞が新規ＤＮＡを含有するように修飾されている場合、該細胞は形質転換されている。例えば、細胞が天然状態から遺伝的に修飾されている場合、該細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることによって細胞のＤＮＡと組換え可能であるし、複製されることなくエピソーム要素として一過性に維持されることが可能であるし、またはプラスミドとして独立に複製されることが可能である。ＤＮＡが細胞の分裂とともに複製される場合、細胞は安定に形質転換されているとみなされる。
【００４４】
「ペプチボディ」は、Ｆｃドメインおよび少なくとも１つのペプチドを含んでなる分子を指す。こうしたペプチボディは、その多量体または二量体または断片であることが可能であり、そしてこれらを誘導体化することが可能である。ペプチボディは、ＷＯ  ００／２４７８２およびＷＯ  ０１／８３５２５にはるかに詳細に記載され、該文献は、本明細書に完全に援用される。ペプチドは、ＤＣＬ１（配列番号２）、ＤＣＬ２（配列番号６）、ＤＣＬ３（配列番号１２）およびＤＣＬ４（配列番号２２）とともにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２（配列番号１０）、ｓｖＤＣＬ３（配列番号１６）およびｓｖＤＣＬ４（配列番号２２）、並びに本明細書においてＤＣＬ５（配列番号２４）と称するヒト相同体のアミノ酸配列に由来することが可能である。
【００４５】
「ペプチド」は、本明細書において、１〜４０アミノ酸の分子を指す。別の態様は、５〜２０アミノ酸の分子を含んでなる。典型的なペプチドは、天然存在分子の細胞外ドメインの一部を含んでなるか、またはＤＣＬ１（配列番号２）、ＤＣＬ２（配列番号６）、ＤＣＬ３（配列番号１２）およびＤＣＬ４（配列番号２２）とともにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２（配列番号１０）、ｓｖＤＣＬ３（配列番号１６）およびｓｖＤＣＬ４（配列番号２２）、並びに本明細書においてＤＣＬ５（配列番号２４）と称するヒト相同体のランダム化配列を含んでなることが可能である。
【００４６】
ペプチド配列を指すのに用いられるような用語「ランダム化」は、完全にランダムな配列（例えばファージディスプレー法またはＲＮＡ−ペプチドスクリーニングによって選択されるもの）および天然存在分子の１以上の残基が、天然存在分子のその位で現れないアミノ酸残基と交換されている配列を指す。ペプチド配列を同定する典型的な方法には、ファージディスプレー、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ディスプレー、リボソームディスプレー、ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング、化学薬品スクリーニング等が含まれる。
【００４７】
用語「Ｆｃドメイン」は、天然ＦｃおよびＦｃ変異体分子および以下に定義するような配列を含む。Ｆｃ変異体および天然Ｆｃと同様、用語「Ｆｃドメイン」には、全抗体から消化されるか、または他の手段によって産生されるかいずれかの、単量体型または多量体型の分子が含まれる。
【００４８】
用語「天然Ｆｃ」は、単量体型または多量体型いずれかの、全抗体の消化から生じる非抗原結合断片の配列を含んでなる分子または配列を指す。天然Ｆｃの元来の免疫グロブリン供給源は、好ましくはヒト起源であり、そして免疫グロブリンのいずれであることも可能であるが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃは、共有結合（すなわちジスルフィド結合）および非共有結合によって、二量体型または多量体型に連結可能な、単量体ポリペプチドで構成される。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に応じて、１〜４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １０：４０７１−９を参照されたい）。用語「天然Ｆｃ」は、本明細書において、単量体型、二量体型、および多量体型の総称である。
【００４９】
用語「Ｆｃ変異体」は、天然Ｆｃから修飾されているが、なお、サルベージ受容体ＦｃＲｎの結合部位を含んでなる分子または配列を指す。国際出願ＷＯ  ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公開）およびＷＯ  ９６／３２４７８は、典型的なＦｃ変異体とともに、サルベージ受容体との相互作用を記載し、そして本明細書に完全に援用される。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化させた分子または配列を含んでなる。さらに、天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要でない構造的特徴または生物学的活性を提供するため、除去可能である部位を含んでなる。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択した宿主細胞との不適合性、（３）選択した宿主細胞における発現に際してのＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすか、またはこれらに関与する、１以上の天然Ｆｃ部位または残基を欠く、分子または配列を含んでなる。Ｆｃ変異体を以下にさらに詳細に記載する。
【００５０】
「ペプチド擬似体」は、ａ）代謝安定性、ｂ）優れた生物学的利用能、ｃ）高い受容体親和性および受容体選択性、並びにｄ）最少の副作用などの、プロトタイプ天然ペプチドより好ましい薬理学的特性を示すペプチド類似体である。ペプチド擬似体の設計およびペプチド擬似体の産生法が当該技術分野に知られる（例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，４０７，０５９および６，４２０，１１８を参照されたい）。ペプチド擬似体は、ＤＣＬ１〜５の細胞外ドメインの結合部位、並びにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２、ｓｖＤＣＬ３およびｓｖＤＣＬ４由来であることが可能である。別の態様において、ペプチド擬似体は、ＤＣＬ１〜５、並びにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２、ｓｖＤＣＬ３およびｓｖＤＣＬ４由来のペプチドと同一の三次元構造を有する非ペプチド化合物、あるいは上に列挙する分子由来のペプチドの一部が、同一の三次元構造を有する非ペプチド部分と交換されている化合物を含んでなる。
【００５１】
「ミモトープ」は、本明細書において、タンパク質上の結合部位を模倣するペプチド配列と定義される（Ｐａｒｔｉｄｏｓ，  ＣＤら，  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，  ２００２  ５：１５−２７を参照されたい）。ミモトープは、タンパク質のコンホメーションに依存する結合部位を模倣する能力を有することが可能である。これらのミモトープの配列は、連続する直鎖天然配列を同定しないか、または必ずしも天然存在タンパク質で生じない。ミモトープおよび産生法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，８７７，１５５およびＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，９９８，５７７に解説され、これらは本明細書に完全に援用される。
【００５２】
用語「酸性残基」は、酸性基を含んでなる側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な酸性残基にはＤおよびＥが含まれる。
用語「アミド残基」は、酸性基のアミド誘導体を含んでなる側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な残基にはＮおよびＱが含まれる。
【００５３】
用語「芳香族残基」は、芳香族基を含んでなる側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な芳香族残基にはＦ、Ｙ、およびＷが含まれる。
用語「塩基性残基」は、塩基性基を含んでなる側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な塩基性残基にはＨ、Ｋ、およびＲが含まれる。
【００５４】
用語「親水性残基」は、極性基を含んでなる側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な親水性残基にはＣ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、およびＱが含まれる。
用語「非官能性残基」は、酸性基、塩基性基、または芳香族基を欠く側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な非官能性アミノ酸残基にはＭ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌおよびノルロイシン（Ｎｌｅ）が含まれる。
【００５５】
用語「中性疎水性残基」は、塩基性基、酸性基、または極性基を欠く側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な中性疎水性アミノ酸残基にはＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、およびＦが含まれる。
【００５６】
用語「極性疎水性残基」は、極性基を含んでなる側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な極性疎水性アミノ酸残基にはＴ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、およびＮが含まれる。
【００５７】
用語「疎水性残基」には、塩基性基または酸性基を欠く側鎖を有するＤ型またはＬ型のアミノ酸残基を指す。典型的な疎水性アミノ酸残基にはＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｑ、およびＮが含まれる。
【００５８】
用語「被験者」は、本明細書において、哺乳動物を指す。例えば、本発明に意図される哺乳動物には、ヒト；霊長類；イヌ、ネコなどのすべての種類のペット；ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等の家畜動物；マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの一般的な実験動物；それとともに、動物園におけるような捕獲された動物または自由な野生動物が含まれる。本明細書全体を通じて、用語、宿主は、被験者と交換可能に用いられる。
【００５９】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに単数形を指示しない限り、複数の対象を含む。したがって例えば、「免疫（ａｎ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」には、複数のこうした免疫が含まれ、そして「細胞（ｔｈｅ  ｃｅｌｌ）」への言及には、１以上の細胞および当業者に知られるその同等物への言及が含まれるなどである。本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、明らかに異なって示されない限り、本発明が属する当該技術分野の一般的な当業者に、一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００６０】
本明細書において、樹状細胞またはＤＣは、リンパ組織または非リンパ組織に見られる、表現型的に、そして／または形態学的に類似の細胞種の多様な集団のメンバーいずれかを指す。ＤＣは、一種の「プロフェッショナル」抗原提示細胞であり、そしてＭＨＣ拘束Ｔ細胞を感作する高い能力を有する。細胞系譜および成熟段階に応じて、ＤＣは、機能、または表現型、特に細胞表面表現型によって、認識可能である。これらの細胞は、独特の形態、食作用能／エンドサイトーシス能、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現およびＴ細胞、特に未刺激Ｔ細胞に抗原を提示する能力によって特徴付けられる（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １８：７６７−８１１，  ２０００およびＵＳＰＮ  ６，２７４，３７８、前記文献は、こうした細胞の説明に関して、本明細書に援用される）。例示目的のみのため、本明細書に記載するＤＣは、ベール様の突起、および細胞表面マーカーＣＤ１ａ+、ＣＤ４+、ＣＤ８６+、またはＨＬＡ−ＤＲ+の発現によって特徴付け可能である。成熟ＤＣは、典型的にはＣＤ１１ｃ+であり、一方、ＤＣの前駆体には、表現型ＣＤ１１ｃ-、ＩＬ−３Ｒαlowを有するもの；およびＣＤ１１ｃ-ＩＬ−３Ｒαhighであるものが含まれる。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＧＭ−ＣＳＦで処理すると、ＣＤ１１ｂhigh、ＣＤ１１ｃhigh  ＤＣが優先的に拡大され、一方、Ｆｌｔ−３リガンドは、ＣＤ１１ｃ+  ＩＬ−３Ｒαlow  ＤＣおよびＣＤ１１ｃ-  ＩＬ−３Ｒαhigh  ＤＣ前駆細胞を拡大することが示されている。本発明のＣ型レクチンを発現するＤＣは、リンパ系系譜および／または骨髄系系譜の未成熟または成熟樹状細胞であることが可能である。機能的には、抗原提示の決定に関する、いかなる好適なアッセイによって、樹状細胞を同定することも可能である。こうしたアッセイには、試験抗原の提示によって、その後、Ｔ細胞増殖の決定、ＩＬ−２の放出などによって、抗原でプライミングされたＴ細胞または未刺激Ｔ細胞を刺激する能力を試験することが含まれる可能性がある。
【００６１】
Ｃ型レクチンは、本明細書において、炭水化物部分に対する親和性および炭水化物部分に結合する能力とともに、本明細書において「Ｃ型レクチン活性」と称する、当該技術分野に周知の他の特質を有するＣａ++依存性結合タンパク質のいずれかを指す。Ｗｅｉｓ，  Ｗ．Ｉ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １６３：１９−３４，  １９９８およびＦｅｉｚｉ，  Ｔ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，  １７３：７９−８８，  ２０００に概説されるように、Ｃ型レクチンにはまた、コレクチン、セレクチンおよび免疫系のＣ型レクチンスーパーファミリーも含まれる。
【００６２】
細菌抗原および炎症誘発性サイトカインなどの外部刺激に反応して、ＤＣ中で上方制御される遺伝子を同定すると、多様な種類の刺激に、免疫系がどのように反応するか解明するのに役立つ可能性がある。一般的に言って、ＤＣは、それぞれ、病原体、内因性炎症シグナルまたはＴ細胞フィードバックシグナルに相当する、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）およびＣｐＧ  ＤＮＡ、ＴＮＦ−αまたはＣＤ４０リガンドに反応して成熟する。細菌抗原にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはｉｎ  ｖｉｖｏで曝露された後、ＤＣは、２つのシグナル伝達経路の１つによって：ＤＣ生存を可能にするＥＲＫキナーゼ経路を介して、または最終的に高いＴ細胞刺激能およびＩＬ−１２放出を生じる、同時刺激分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現増加、ケモカインの放出および遊走によって特徴付けられる、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路を介して、成熟を経験する。細菌ＬＰＳは、自然免疫系に認識される主要な分子の１つである（Ｖｅｒｈａｓｓｅｌｔ，  Ｈ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：２９１９−２５，  １９９７）。ＬＰＳ複合体および可溶性ＬＰＳ結合タンパク質による膜会合ＣＤ１４の連結によって、ＴＮＦ分泌およびＩＬ−１分泌などの炎症誘発性シグナルが導かれ、これが局所ＡＰＣの代謝回転とともに、組織損傷部位での前駆細胞の補充を増加させる。また、トール様受容体２（ＴＬＲ２）は、ＬＰＳ結合タンパク質に依存し、そしてＣＤ１４に増進される反応において、ＬＰＳに活性化されるシグナル伝達受容体であることが示されてきている（Ｙａｎｇ，  Ｒ．Ｂ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９５：２８４−８８，  １９９８）。トール様受容体４（ＴＬＲ４）は、ＬＰＳ反応において、細胞内シグナル伝達を行い、ＮＦ−κＢ活性化を導き、そしてＴＬＲ４欠損マウスは、ＬＰＳに反応低下性である（Ｂｒｉｇｈｔｂｉｌｌ，  Ｈ．Ｄ．ら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７３２−３６，  １９９９）。さらに、ＴＬＲ２は、ペプチドグリカンおよびリポテイコ酸などの、グラム陽性菌の構成要素によって誘発される反応を仲介するが、ＴＬＲ４はこうした反応を仲介しない（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  Ａ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：１−５，  １９９９；Ｓｃｈｗａｎｄｅｒ，  Ｒ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：１７４０６−９，  １９９９）。他のトール様受容体には、細菌フラジェリンを認識し、そして該フラジェリンによって活性化されるトール様受容体５（ＴＬＲ５）（Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｆ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−７４５，  ２０００）、および低メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡモチーフを認識し、そして該モチーフによって活性化されるトール様受容体９（ＴＬＲ９）（Ｈｅｍｍｉ，  Ｈ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１０９９−１１０３，  ２００１）が含まれる。
【００６３】
異なる抗原性刺激が、免疫系全体に影響を及ぼす可能性がある、ＤＣ生物学に著しい影響を有する。一般的に言って、ＩＬ−１２産生骨髄性ＤＣは、Ｔｈ１反応をプライミングし、一方、インターフェロンαおよび／またはβを産生するリンパ系ＤＣは、Ｔｈ２反応をプライミングし、これは、活性化Ｔ細胞に産生されるＩＬ−４によって駆動される（Ｋａｌｉｎｓｋｙ，  Ｐ．ら，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２０：５６１−６７，  １９９９）。骨髄系ＤＣは、細菌、ウイルスおよびマイコプラズマなどの病原体に反応してＩＬ−１２を産生するが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、コレラ毒素またはＦａｓＬなどの他の成熟刺激に反応してＩＬ−１２を産生することはできない。ＩＬ−１２産生は、活性化された記憶Ｔ細胞上に高レベルで発現されるＣＤ４０Ｌによって、強力に誘導されることが可能である（Ｃｅｌｌａ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８４：７４７−５２，  １９９６）。しかし、ＬＰＳでの全身性刺激は、ＩＬ−１２産生の停滞を導く（Ｒｅｉｓ  ｅ  Ｓｏｕｓａ，  Ｃ．ら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：６３７−４７，  １９９９）。さらに、ＤＣ成熟の誘導中に、末梢組織に存在する多様なサイトカインもまた、ＩＬ−１２産生を調節する可能性がある。例えば、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４は、ＬＰＳまたはＣＤ４０Ｌに誘導されるＩＬ−１２産生を増進するが、一方、ＩＬ−１０は抑制性の効果を有し、そしてＴＧＦ−βもまた、ＬＰＳに対する反応を阻害するが、ＣＤ４０Ｌに対する反応を増大させることが示されてきている。
【００６４】
ＤＣ生物学に対する、ＬＰＳなどの抗原性刺激の影響を決定すると、抗原結合および取り込み、抗原プロセシングおよび提示、抗原提示細胞の活性化、分化、成熟、ホーミングおよび遊出とともに、Ｔ細胞およびＢ細胞などの、免疫系の多様な細胞との細胞間相互作用を理解する手がかりが提供される可能性がある。この目的に向けて、ネズミＤＣ集団を、ＬＰＳおよびＩＦＮ−αなどの多様な剤で処理して、これらの剤に反応した、ＤＣ関連遺伝子の示差的発現を決定した。この種の解析を通じて、とりわけＣ型レクチンドメインを有するポリペプチドをコードする、樹状細胞Ｃ型レクチン１〜４（ＤＣＬ１〜４）と称される４つの新規ネズミ遺伝子とともに、そのスプライシング変異体を発見した。さらに、ＤＣＬ１〜４ポリペプチドの新規ヒト相同体を発見しており、そしてこれを、ＤＣＬ５と称する（ＤＣＬ１（配列番号２）、ＤＣＬ２（配列番号６）、ＤＣＬ３（配列番号１２）およびＤＣＬ４（配列番号２２）とともにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２（配列番号１０）、ｓｖＤＣＬ３（配列番号１６）およびｓｖＤＣＬ４（配列番号２２）、並びに本明細書においてＤＣＬ５（配列番号２４）と称するヒト相同体）。
【００６５】
骨髄（ＢＭ）細胞をＣ５７ＢＬ／１０マウスから単離し、そして本質的に実施例１に記載するような条件下で培養した。ＢＭ細胞をＦｌｔ３リガンド中で９日間培養した。以下の刺激／条件で、培養を４日間刺激した：（ａ）１０ｎｇ／ｍｌ組換えネズミＧＭ−ＣＳＦ、１０００Ｕ／ｍｌヒト；（ｂ）５００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−アルファ／Ｄ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）；（ｃ）１μｇ／ｍｌ大腸菌（０２１７：Ｂ８）由来ＬＰＳ（Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイト）および（ｄ）刺激なし。刺激への曝露４時間後、当該技術分野に周知の方法を用いて、細胞を溶解し、そしてＲＮＡを単離した。別個の組の実験において、ＤＣ数を増加させるため、採取する前に、マウスをＦｌｔ−３リガンド、またはＰＥＧ化ＧＭ−ＣＳＦで処理した。
【００６６】
標的ＲＮＡの調製およびマイクロアレイチップへのハイブリダイゼーションは、本質的に、本明細書に援用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サンタクララ）に記載されるように行った。簡潔には、１０μｇの総ＲＮＡをまず、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩTM逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードするプライマーを用いて、一本鎖ｃＤＮＡに変換して用いて、標的試料を調製した。その後、一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換した。Ｔ７プロモーターを用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびビオチン化ヌクレオチド三リン酸を含有する反応において、標識ｃＲＮＡ標的を生成した。精製後、平均の長さが５０〜２００塩基であるようにｃＲＮＡを化学的に断片化し、そして４５℃で一晩、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓTMにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズ後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ流体工学ステーション中でチップをプロセシングし、該ステーションでチップを洗浄し、ストレプトアビジン・フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）で染色し、ビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジンで探査し（ｐｒｏｂｅｄ）、そして最後に、第二回のＳＡＰＥを行った。
【００６７】
ＤＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、ネズミ樹状細胞上に発現されるカルシウム依存性レクチンファミリーの新規ポリペプチド、本明細書にＤＣＬ１、ＤＣＬ２、ＤＣＬ３およびＤＣＬ４と称するものとともにスプライシング変異体ｓｖＤＣＬ２、ｓｖＤＣＬ３およびｓｖＤＣＬ４、並びに本明細書においてＤＣＬ５と称するヒト相同体を提供する。こうしたタンパク質は、混入する内因性材料を実質的に含まず、そして場合によって、会合する天然パターングリコシル化を持たない。本発明の範囲内のＤＣＬポリペプチドの誘導体にはまた、生物学的活性を保持する、一次タンパク質の多様な構造型が含まれる。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基が存在するため、例えば、ＤＣＬタンパク質は、酸性塩または塩基性塩の形であることが可能であるし、あるいは中性型であることが可能である。個々のアミノ酸残基はまた、酸化または還元によっても修飾可能である。
【００６８】
遺伝子マイクロアレイ技術は、いくつかの異なる刺激条件下で得た、異なるマウス樹状細胞下位集団に渡る、示差的遺伝子発現を研究するツールを提供する。上述のように、ＬＰＳで刺激したＤＣ由来のハイブリダイゼーションシグナルを、ＩＦＮ−αで刺激したＤＣ由来のシグナルとともに、ＧＭ−ＣＳＦで刺激したＤＣ由来のシグナルと比較した。ＬＰＳによって上方制御されるが、ＩＦＮ−αまたはＧＭ−ＣＳＦによっては改変されない、遺伝子発現を同定した。同定したシグナルに対応する遺伝子配列の解析を行った。同定した、こうした遺伝子の１つは、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡ３８９９７７およびＮＣＢＩ  ＵｎｉｇｅｎｅエントリーＭＭ３４４３としてのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータに相当した。ＮＣＢＩ  Ｕｎｉｇｅｎｅサイトから、ＡＡ３８９９７７を含む９つのＧｅｎＢａｎｋ寄託番号が、この同じＵｎｉｇｅｎｅエントリーに対応すると列挙された。これら９つのエントリー由来の配列を合わせ、そしてＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、生じた「コンティグ」を公共のデータベースタンパク質配列に比較した。この比較から、コンティグは、「Ｃ型レクチン」と特徴付けられる分子に相同性を持つ、推定上のタンパク質をコードすることが明らかになった。
【００６９】
組み立てたＥＳＴコンティグをこれらの既知のＣ型レクチンと比較すると、このアセンブリーが不完全な（５’端を欠く）配列をコードすると予測されたため、この同じＥＳＴアセンブリーを、ＣｅｌｅｒａTM所有データベース内に含有されるマウスゲノム配列とのＢＬＡＳＴ比較で用いて、ゲノム対応物を得た。Ｃ型レクチンオープンリーディングフレームに対応する特定のコード領域に関して、候補マウスゲノム配列を検索すると、多数の遺伝子が、単一の巨大マウスゲノム断片（４００，０００ｂｐを越える）内に含有されることが明らかになった。さらなる解析によって、マウスには、９以上の近縁の遺伝子があることが示され、これらには、以下の４つの新規配列が含まれた：ＤＣＬ１（配列番号１、および対応するアミノ酸配列は配列番号２に提供する）、ＤＣＬ２（配列番号５、および対応するアミノ酸配列は配列番号６に提供する）、ＤＣＬ３（配列番号１１、および対応するアミノ酸配列は配列番号１２に提供する）およびＤＣＬ４（配列番号１７、および対応するアミノ酸配列は配列番号１８に提供する）。互いに染色体上で近接し、そして高い度合いの相同性を有することを考慮すると、これらの遺伝子は、遺伝子複製事象を通じて生じた可能性がある。
【００７０】
多数のファミリーメンバーの存在を予測するため、２つの既知のファミリーメンバー、デクチン２（Ａｒｉｉｚｕｍｉ，  Ｋ．ら、上記）およびｄｃｍｐ１とも称されるＤＣＩＲ（Ｂａｔｅｓ，  Ｅ．ら、上記）のアミノ酸配列を、ＧＣＧプログラムＴＦＡＳＴＡを用いて、ゲノムコンティグの６つのあり得る翻訳読み枠すべてで、比較することによって、ＤＣＬ１および関連配列に対応する配列をコードすることが決定されたマウスゲノムコンティグを調べた。反復ＴＦＡＳＴＡ解析および出力の手動検査によって、多数の関連遺伝子が存在することが明らかになった。この時点で、９つの異なる近縁マウス遺伝子があり、５つには対応するヒト遺伝子があると考えられた。ＴＦＡＳＴＡプログラム、マウスゲノム領域の配列マップおよび哺乳動物ＤＮＡにおけるエクソン／イントロン接合部の規範的（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）配列の理解を用いて、ＤＣＬ１〜５ポリペプチドに関して、オープンリーディングフレームおよびイントロン／エクソン境界を予測した。この配列情報を用いて、各遺伝子の５’および３’コード領域に特異的なユニークなオリゴヌクレオチド対を設計し、そして合成した。具体的には、配列番号３および４は、それぞれ、ＤＣＬ１のセンスおよびアンチセンス方向のＰＣＲプライマーであり（図１を参照されたい）；配列番号７および８は、それぞれ、ＤＣＬ２のセンスおよびアンチセンス方向のＰＣＲプライマーであり（図２を参照されたい）；配列番号１３および１４は、それぞれ、ＤＣＬ３のセンスおよびアンチセンス方向のＰＣＲプライマーであり（図３を参照されたい）；配列番号１９および２０は、それぞれ、ＤＣＬ４のセンスおよびアンチセンス方向のＰＣＲプライマーであり（図４を参照されたい）；そして配列番号２５および２６は、それぞれ、ＤＣＬ５のセンスおよびアンチセンス方向のＰＣＲプライマーである（図５を参照されたい）。これらのプライマー対を、ヒトおよびマウス組織特異的ｃＤＮＡの巨大コレクション（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）由来のテンプレートを含有するＰＣＲ混合物に添加し、そしてＰＣＲを行った。これらの反応から、予測される大きさのアンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を得た。これらの断片をゲル精製し、そしてＤＮＡ配列解析に提出して、この解析によって、５つの新規ＤＣＬ分子すべてに関して、決定したｃＤＮＡ配列が、予測される配列と同一であることが立証された。さらに、より小さいアンプリマーを配列決定し、そしてこれらが選択的スプライシング型、すなわちｓｖＤＣＬ２、ｓｖＤＣＬ３およびｓｖＤＣＬ４をコードすることを見出した。
【００７１】
以下の論議全体を通じて、定義されるモチーフおよび／またはポリペプチド領域および／またはサイン配列のアミノ酸指定はこれを含んだものである。当業者は、対立遺伝子変異体などの天然存在変異体は、これらの領域の番号付けにおいて多様であることが可能であり、そしてしたがって、コンピュータ解析から予測されるものとは異なる可能性があることを認識するであろう。したがって、領域またはモチーフの最初のアミノ酸指定および最後のアミノ酸指定は、割り当てられた番号付けとは１〜５アミノ酸異なる可能性がある。ＧＣＧプログラムＭＯＴＩＦＳ（タンパク質部位およびパターンのＰＲＯＳＩＴＥディクショナリー）を用いて、Ｃ型レクチンドメインおよび内部サインパターンを決定した。本明細書において、Ｎ連結グリコシル化部位をＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸いずれかである）と定義する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／の膜貫通隠れマルコフモデル（ＴＭＨＭＭ）予測ツールを用いて予測を行い、そしてタンパク質パターンのＰＲＯＳＩＴＥディクショナリーを用いるＧＣＧプログラムＭＯＴＩＦＳを用いて、Ｃ型レクチンおよびアスパルチルプロテアーゼドメインを予測した。例えば米国医学図書館ウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉを介して使用のために入手可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．０．９、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムなどの、配列比較の当業者に用いられる他のプログラムもまた、使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０の標準的なデフォルトパラメーター設定は、以下のインターネットサイト：ｓａｐｉｅｎｓ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔ／＃Ｆｅａｔｕｒｅｓに記載される。確立されたコンセンサス配列を用いて、免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を予測した。
【００７２】
ＤＣＬ１のｃＤＮＡ配列を配列番号１に提供し、そして該配列は、７３８ｂｐのポリヌクレオチドを含んでなり、図１に示すように、開始コドン、５つのエクソン／イントロン・スプライス接合部およびヌクレオチド７３６〜７３８の停止コドンを有する。ＤＣＬ１は、ネズミ染色体６にマッピングされている。全長ＤＣＬ１ポリペプチド配列（配列番号２）は、２４５アミノ酸オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなり、本質的にアミノ酸１〜５３に渡るアミノ末端細胞内領域、本質的にアミノ酸５４〜７６に渡る膜貫通領域、および本質的にアミノ酸７７〜２４５に渡る細胞外領域を有する。細胞外領域は、ほぼアミノ酸１０２〜１０４および１９５〜１９７に見られる、いくつかの推定されるＮ連結グリコシル化部位を有する。ＤＣＬ１は、ほぼアミノ酸２１１〜２３８に渡る代表的なサイン配列を有する、特徴的なＣ型レクチンドメイン、およびほぼアミノ酸５〜１０の免疫受容体チロシン依存性阻害性様モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する。可溶性ＤＣＬ１は、細胞外ドメイン（配列番号２の残基７７〜２４５）またはその断片を含んでなる。
【００７３】
ＤＣＬ２のｃＤＮＡ配列を配列番号５に提供し、そして該配列は、７１４ｂｐのポリヌクレオチドを含んでなり、図２に示すように、開始コドン、５つのエクソン／イントロン・スプライス接合部およびヌクレオチド７１２〜７１４の停止コドンを有する。ＤＣＬ２は、ネズミ染色体６にマッピングされている。全長ＤＣＬ２ポリペプチド配列（配列番号６）は、２３７アミノ酸ＯＲＦを含んでなり、本質的にアミノ酸１〜４４に渡るアミノ末端細胞内領域、本質的にアミノ酸４５〜６８に渡る膜貫通領域、および本質的にアミノ酸６９〜２３７に渡る細胞外領域を有する。細胞外領域は、ほぼアミノ酸８６〜８８、１３０〜１３２および１８８〜１９０に見られる、いくつかの推定されるＮ連結グリコシル化部位を有する。ＤＣＬ２はまた、ほぼアミノ酸１５７〜１６８に渡る、予測されるアスパルチル（または酸）プロテアーゼドメインとともに、ほぼアミノ酸２０４〜２３０に渡る代表的なサイン配列を有する、特徴的なＣ型レクチンドメインを有する。可溶性ＤＣＬ２は、細胞外ドメイン（配列番号６の残基６９〜２３７）またはその断片を含んでなる。
【００７４】
さらに、ＤＣＬ２は、ｓｖＤＣＬ２と称する一部切除スプライシング変異体アイソフォームを有し、該アイソフォームでは、エクソン３が欠失されている（ｃＤＮＡ配列を配列番号９に提供し、そして対応するアミノ酸配列を配列番号１０に提供する）。ｓｖＤＣＬ２  ｃＤＮＡ配列は、６１２ｂｐ断片を含んでなり、開始コドン、４つのエクソン／イントロン・スプライス接合部およびヌクレオチド６１０〜６１２の停止コドンを有する。全長ｓｖＤＣＬ２ポリペプチド配列は、２０３アミノ酸ＯＲＦを含んでなり、本質的にアミノ酸１〜４４に渡るアミノ末端細胞内領域、本質的にアミノ酸４５〜６７に渡る膜貫通領域、および本質的にアミノ酸６８〜２０３に渡る細胞外領域を有する。細胞外領域は、ほぼアミノ酸９６〜９８および１５４〜１５６に、いくつかの推定されるＮ連結グリコシル化部位を有する。ｓｖＤＣＬ２はまた、ほぼアミノ酸１２３〜１３４に渡る、予測されるアスパルチル（または酸）プロテアーゼドメインとともに、ほぼアミノ酸１７０〜１９６に渡る代表的なサイン配列を有する、特徴的なＣ型レクチンドメインを有する。可溶性ｓｖＤＣＬ２は、細胞外ドメイン（配列番号１０の残基６８〜２０３）またはその断片を含んでなる。
【００７５】
ＤＣＬ３のｃＤＮＡ配列を配列番号１１に提供し、そして該配列は、７１１ｂｐのポリヌクレオチドを含んでなり、図３に示すように、開始コドン、５つのエクソン／イントロン・スプライス接合部およびヌクレオチド７０９〜７１１の停止コドンを有する。ＤＣＬ３は、ネズミ染色体６にマッピングされている。全長ＤＣＬ３ポリペプチド配列（配列番号１２）は、２３６アミノ酸ＯＲＦを含んでなり、本質的にアミノ酸１〜４４に渡るアミノ末端細胞内領域、本質的にアミノ酸４５〜６９に渡る膜貫通領域、および本質的にアミノ酸７０〜２３６に渡る細胞外領域を有する。細胞外領域は、ほぼアミノ酸１２３〜１２５、１３０〜１３２、１６０〜１６２および１３６〜１３８に、いくつかの推定されるＮ連結グリコシル化部位を有する。ＤＣＬ３は、ほぼアミノ酸２４〜２２９に渡る代表的なサイン配列を有する、特徴的なＣ型レクチンドメインを有する。可溶性ＤＣＬ３は、細胞外ドメイン（配列番号１２の残基７０〜２３６）またはその断片を含んでなる。
【００７６】
ＤＣＬ３は、ｓｖＤＣＬ３と称する一部切除スプライシング変異体アイソフォームを有し、該アイソフォームでは、エクソン４およびエクソン５が欠失されている（ｃＤＮＡ配列を配列番号１５に提供し、そして対応する部分的アミノ酸配列を配列番号１６に提供する）。ｓｖＤＣＬ３  ｃＤＮＡ配列は、４４３ｂｐ断片を含んでなり、開始コドン、３つのエクソン／イントロン・スプライス接合部およびヌクレオチド３４９〜３５１などのいくつかの停止コドンを有する。予測されるｓｖＤＣＬ３ポリペプチド配列の１つのアイソフォームは、１１６アミノ酸ＯＲＦを含んでなり、本質的にアミノ酸１〜４５に渡るアミノ末端細胞内領域、本質的にアミノ酸４６〜６９に渡る膜貫通領域、および本質的にアミノ酸７０〜１１６に渡る細胞外領域を有する。細胞外領域は、アミノ酸９５〜９７のＮ連結グリコシル化部位、およびほぼアミノ酸５〜１０の免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフを有する。可溶性ｓｖＤＣＬ３は、細胞外ドメイン（配列番号１６の残基７０〜１１６）またはその断片を含んでなる。
【００７７】
ＤＣＬ４のｃＤＮＡ配列を配列番号１７に提供し、そして該配列は、６２７ｂｐのポリヌクレオチドを含んでなり、図４に示すように、開始コドン、５つのエクソン／イントロン・スプライス接合部およびヌクレオチド６２５〜６２７の停止コドンを有する。ＤＣＬ４は、ネズミ染色体６にマッピングされている。全長ＤＣＬ４ポリペプチド配列（配列番号１８）は、２０８アミノ酸ＯＲＦを含んでなり、本質的にアミノ酸１〜２０に渡るアミノ末端細胞内領域、本質的にアミノ酸２１〜４３に渡る膜貫通領域、および本質的にアミノ酸４４〜２０８に渡る細胞外領域を有する。細胞外領域は、ほぼアミノ酸１０２〜１０４に、推定されるＮ連結グリコシル化部位を有する。ＤＣＬ４はまた、ほぼアミノ酸１７６〜２０１に渡る代表的なサイン配列を有する、特徴的なＣ型レクチンドメインも有する。可溶性ＤＣＬ４は、細胞外ドメイン（配列番号１８の残基４４〜２０８）またはその断片を含んでなる。
【００７８】
ＤＣＬ４は、ｓｖＤＣＬ４と称する一部切除スプライシング変異体アイソフォームを有し、該アイソフォームでは、エクソン４が欠失されている（ｃＤＮＡ配列を配列番号２１に提供し、そして対応する部分的アミノ酸配列を配列番号２２に提供する）。ｓｖＤＣＬ４  ｃＤＮＡ配列は、４７２ｂｐ断片を含んでなり、開始コドン、４つのエクソン／イントロン・スプライス接合部およびヌクレオチド２８３〜２８５などのいくつかの停止コドンを有する。予測されるｓｖＤＣＬ４ポリペプチド配列の１つのアイソフォームは、９４アミノ酸ＯＲＦを含んでなり、本質的にアミノ酸１〜１９に渡るアミノ末端細胞内領域、本質的にアミノ酸２０〜４２に渡る膜貫通領域、および本質的にアミノ酸４２〜９４に渡る細胞外領域を有する。可溶性ｓｖＤＣＬ４は、細胞外ドメイン（配列番号１６の残基４２〜９４）またはその断片を含んでなる。
【００７９】
ＤＣＬポリペプチドに対するヒト相同体もまた発見し、そしてＤＣＬ５と称する。該ｃＤＮＡ配列を配列番号２３に提供し、決定したアミノ酸配列を配列番号２４に提供する。ＤＣＬ５ポリヌクレオチド配列は、６４８ｂｐのポリヌクレオチドを含んでなり、図５に示すように、開始コドン、５つのエクソン／イントロン・スプライス接合部およびヌクレオチド６４６〜６４８の停止コドンを有する。ＤＣＬ５は、ヒト染色体１２にマッピングされている。全長ＤＣＬ５ポリペプチド配列（配列番号２４）は、２１５アミノ酸ＯＲＦを含んでなり、本質的にアミノ酸１〜１９に渡るアミノ末端細胞内領域、本質的にアミノ酸２０〜４１に渡る膜貫通領域、および本質的にアミノ酸４２〜２１５に渡る細胞外領域を有する。細胞外領域は、ほぼアミノ酸４５〜４７、１０２〜１０４および１１１〜１１３に、いくつかの推定されるＮ連結グリコシル化部位を有する。ＤＣＬ５はまた、ほぼアミノ酸１８２〜２０７に渡る代表的なサイン配列を有する、特徴的なＣ型レクチンドメインも有する。可溶性ＤＣＬ５は、細胞外ドメイン（配列番号２４の残基４２〜２１５）またはその断片を含んでなる。
【００８０】
ＤＣＬ１〜５はカルシウム依存性レクチンファミリーのメンバーおよびＩＩ型膜タンパク質と特徴付けられる。ＤＣＬ１〜５は、マクロファージレクチンに相同性を持つＩＩ型糖タンパク質である樹状細胞免疫受容体（ＤＣＩＲ）、並びに特異的免疫の開始のため、個体発生および／またはＤＣのＡｇハンドリング潜在能力を指示するのに特定の役割を果たすと考えられる、肝アシアロ糖タンパク質受容体（Ｂａｔｅｓ，  Ｅ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：１９７３−８３，  １９９９）；Ｔ細胞結合に、そしてＴ細胞同時刺激シグナルを搬送するのに関与すると考えられるＤＣ会合Ｃ型レクチン（デクチン１および２）（それぞれ、Ａｒｉｉｚｕｍｉ，  Ｋ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：２０１５７−１６７，  ２０００およびＡｒｉｉｚｕｍｉ，  Ｋ．ら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５：１１９５７−９６３，  ２０００）；およびバーベック顆粒の形成を誘導するエンドサイトーシス受容体であると考えられるランゲルハンス細胞特異的Ｃ型レクチン（ランゲリン）（Ｖａｌｌａｄｅａｕ，  Ｊ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：７１−８１，  ２０００）などの他のＣ型レクチンファミリーメンバーと相同性を共有する。
【００８１】
カルボキシ末端に単一の炭水化物認識ドメインを持つＣ型レクチンドメインを有するＩＩ型タンパク質のファミリーメンバーには、肝アシアロ糖タンパク質受容体１および２、並びにオリゴ糖基に結合するマクロファージレクチンなどの細胞表面受容体が含まれ、そしてこれらは、リガンド・インターナリゼーションおよび抗原取り込みに関与する。したがって、ＤＣＬポリペプチドは、オリゴ糖基に結合する可能性があり、そしてリガンド・インターナリゼーションおよび抗原取り込みに関与する。さらに、ＤＣＬポリペプチドは、結合、および細胞内シグナル伝達経路の開始などの細胞間相互作用および細胞間コミュニケーションに関与する可能性がある。
【００８２】
新規ポリペプチドのいくつかが、プロテアーゼおよびレクチン機能の組み合わせを有するという知見はユニークである。アスパルチルプロテアーゼは、細胞内小胞中の活性と関与するとともに、細胞表面膜と関与する。
【００８３】
ＤＣＬ１およびＤＣＬ３はまた、少なくとも１つの免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）も有する。陽性シグナル伝達を仲介する多くの受容体は、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるチロシンホスファターゼリン酸化の部位を含有する細胞質テールを有する。陽性シグナル伝達の一般的な機械的経路は、受容体の細胞質ドメイン上および他のシグナル伝達分子上の部位をリン酸化するチロシンキナーゼの活性化を伴う。受容体がリン酸化され、シグナル伝達分子の結合部位が生成されると、これがシグナル伝達経路を開始し、そして細胞を活性化する。阻害性経路は、ＩＴＡＭ同様、チロシンキナーゼによってリン酸化される、免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する受容体を伴う。ＩＴＩＭモチーフを有する受容体は、活性化された受容体またはシグナル伝達分子からチロシンを除去することによって、シグナル伝達を遮断する、阻害性シグナル伝達に関与する（Ｒｅｎａｒｄら，  Ｉｍｍｕｎ  Ｒｅｖ  １５５：２０５−２２１，  １９９７）。ＩＴＩＭは、コンセンサス配列Ｉ／ＶｘＹｘｘＬ／Ｖ（配列番号２８）を有し、そして免疫系の多様なシグナル伝達タンパク質の細胞質部分に見られ、これらの多くがＩｇスーパーファミリーに属するか、またはＩＩ型二量体Ｃレクチンファミリーに属する（Ｒｅｎａｒｄら、１９９７、上記を参照されたい）。ＩＴＩＭを含有するタンパク質には、「キラー細胞Ｉｇ様受容体」または「ＫＩＲ」、および白血球Ｉｇ様受容体またはタンパク質の「ＬＩＲ」ファミリーのいくつかのメンバーが含まれる（Ｒｅｎａｒｄら、１９９７、上記；Ｃｏｓｍａｎら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：２７３−８２，  １９９７；Ｂｏｒｇｅｓら，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：５１９２−９６，  １９９７）。ＩＴＩＭによるシグナル伝達は、標的とされる細胞活性、例えば細胞表面タンパク質の発現を下方制御すると考えられる。Ｒｅｎａｒｄらは、複雑な細胞機能の制御は、ＩＴＩＭが仲介する阻害性シグナル伝達、および１６〜１８アミノ酸活性化モチーフ、または他のタンパク質に存在する「ＩＴＡＭ」配列による、同一機能の活性化の相互作用によって微調整されていると提唱する。ＣＤ２２およびＦｃγＲＩＩｂ１もまた、細胞質ドメインにＩＴＩＭを、そして細胞機能を下方制御するかまたは阻害する阻害性シグナルを送る機能も有する。これらの受容体が、ＩＴＩＭモチーフへの結合を介して、ＳＨＰ−１ホスファターゼに会合することが示されてきている。受容体によるＳＨＰ−１ホスファターゼの補充が、受容体の阻害性機能を制御する、細胞内シグナル伝達経路には、必要であるようである。重要なことに、単一の細胞内ＩＴＩＭモチーフを有するＩＩ型膜タンパク質である、Ｃ型レクチンもまた、報告されている。例えば、ＮＫ遺伝子複合体と称される領域中のヒト染色体１２ｐ１２〜ｐ１３上に位置する遺伝子には、ＮＫＧ２複合体およびＣＤ９４の産物が含まれ、これらは、ＭＨＣクラスＩ分子の認識に、そしてＮＫ細胞活性の制御に関与する。ＮＫＧ２Ａ／Ｂ−ＣＤ９４ヘテロ二量体による細胞機能の阻害は、ＮＫＧ２Ａ／Ｂ細胞内ドメインにＩＴＩＭが存在することと関連付けられる（Ｌａｚｅｔｉｃ，  Ｓ．Ｃ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７：４７４１，  １９９６；Ｈｏｕｃｈｉｎｓ，  Ｊ．Ｐ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：３６０３，  １９９７）。
【００８４】
したがって、ＩＴＩＭモチーフを有する他のＣ型レクチンファミリーメンバーとの類似によって、ＩＴＩＭモチーフを有する配列番号２、１２および１６に示すポリペプチドは、ＤＣＬポリペプチドが適切な受容体または天然リガンドと結合した際に、そのＩＴＩＭと、チロシンホスファターゼ（ＳＨＰ−１チロシンホスファターゼを含む）などの１以上のホスファターゼの相互作用を介して阻害性シグナルを搬送する。また、ＩＴＩＭを所持する免疫制御受容体との類似によって、ＤＣＬファミリーメンバーは、体液性免疫および細胞仲介免疫、ＭＨＣクラスＩ分子の認識、および免疫細胞活性の制御とともに炎症反応およびアレルギー反応の調節に、制御上の影響を有する。明らかに、相対するキナーゼおよびホスファターゼによって仲介される、免疫系活性化シグナルおよび阻害性シグナルは、免疫系の平衡を維持するのに非常に重要である。活性化シグナルが優勢である系は、自己免疫および炎症につながるであろう。阻害性シグナルが優勢である免疫系は、感染した細胞または癌細胞を攻撃する能力がより低い。したがって、ＤＣＬファミリーメンバーは、免疫系における平衡を維持するのに役割を果たす。
【００８５】
本発明内に含まれるのは、ＤＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。これらの核酸は、適切な供給源からのゲノムまたはｃＤＮＡ分子の単離を含む、いくつかの方法で同定可能である。核酸単離用のプローブまたはプライマーとして、あるいはデータベース検索用のクエリー配列として使用しようとする、本明細書に記載するアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、アミノ酸配列からの「逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」によって、またはコードＤＮＡ配列が同定されているポリペプチドとアミノ酸同一性を有する領域を同定することによって、得ることが可能である。周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して、１以上のＤＣＬポリペプチドまたは望ましい組み合わせのＤＣＬポリペプチド断片をコードするＤＮＡ配列を単離し、そして増幅することが可能である。ＤＮＡ断片の組み合わせの所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドを５’プライマーおよび３’プライマーとして使用する。該オリゴヌクレオチドはさらに、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有して、増幅したＤＮＡ断片の組み合わせを発現ベクターに挿入するのを容易にすることが可能である。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，  Ｗｕら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  サンディエゴ（１９８９），  ｐｐ．１８９−１９６；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｉｎｎｉｓら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９９０）に記載される。
【００８６】
本明細書において、ポリヌクレオチドまたは核酸分子には、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡおよびＲＮＡと共に対応する相補配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ、およびその組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子と共に、その断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸は、優先的にヒト供給源由来であるが、本発明は非ヒト種由来のものもまた含む。
【００８７】
「単離ポリヌクレオチド」は、天然存在供給源から単離されているポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチドが単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離されているポリヌクレオチドである。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドなど、テンプレートから酵素的に合成されたか、または化学的に合成されたポリヌクレオチドの場合、こうしたプロセスから生じるポリヌクレオチドは、単離ポリヌクレオチドと理解される。単離ポリヌクレオチド分子は、別個の断片の形の、またはより大きいポリヌクレオチド構築物の構成要素としての、ポリヌクレオチド分子もまた指すことが可能である。１つの好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、実質的に、内因性成分の混入を含まない。ポリヌクレオチド分子は、好ましくは、標準的生化学法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）に概略されるものなど）によって、少なくとも１度は、実質的に純粋な形で、そしてその構成要素ヌクレオチド配列の同定、操作および回収を可能にする量または濃度で単離されているＤＮＡまたはＲＮＡに由来している。こうした配列は、好ましくは、真核遺伝子に典型的には存在する内部非翻訳配列またはイントロンに中断されない、オープンリーディングフレームの形で提供され、そして／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの５’または３’に存在することが可能であり、ここでは該ＤＮＡは、コード領域の操作または発現に干渉しない。
【００８８】
本発明にはまた、中程度にストリンジェントな条件下、そしてより好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本明細書に記載するＤＣＬポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、ポリヌクレオチドも含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  およびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  第９章および第１１章；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９５，  Ａｕｓｕｂｅｌら監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ，  セクション２．１０および６．３−６．４）によって示されており、そして例えばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、一般の当業者によって容易に決定可能である。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５ｘＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６ｘＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または約４２℃のハイブリダイゼーション温度を伴う、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）、並びに約６０℃、０．５ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中の洗浄条件の使用を伴う。一般的に、高度にストリンジェントな条件は、上記のようなハイブリダイゼーション条件であるが、およそ６８℃、０．２ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液において、ＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４である）をＳＳＣ（１ｘＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりに使用することが可能である；洗浄はハイブリダイゼーション完了後、１５分間行う。当業者に知られるように、そして以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応および二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することによって、必要に応じて、所望の度合いのストリンジェンシーを達成するよう、洗浄温度および洗浄塩濃度を調整可能であることが理解される（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい）。核酸が、未知の配列の標的核酸にハイブリダイズする際、ハイブリッド長は、ハイブリダイズする核酸のものであると予測される。既知の配列の核酸がハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、核酸の配列を並列し、そして最適配列相補性の単数または複数の領域を同定することによって、決定可能である。長さ５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、該ハイブリッドの融解温度（Ｔm）より５〜１０℃低く、Ｔmは、以下の等式にしたがって決定する。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関しては、Ｔm（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋���塩基数）である。長さ１８塩基対を越えるハイブリッドに関しては、Ｔm（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ10［Ｎａ+］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ+］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１ｘＳＳＣの［Ｎａ+］＝０．１６５Ｍ）。より詳細に上に記載するように、好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸分子は各々、少なくとも１５ヌクレオチド（またはより好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）の長さを有するか、またはハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）の長さを有し、そして配列同一性が、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性が最大になるように並列させた際のハイブリダイズする核酸配列の比較によって決定される場合、ハイブリダイズする本発明の核酸と、少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。
【００８９】
本発明の範囲内のＤＣＬタンパク質およびその相同体の他の誘導体には、Ｎ末端融合体またはＣ末端融合体として組換え体培養における合成によるなど、タンパク質またはその断片と他のタンパク質またはポリペプチドの共有結合コンジュゲートまたは凝集コンジュゲートが含まれる。例えば、コンジュゲート化されるペプチドは、翻訳と同時に、または翻訳後に、タンパク質をその合成部位から、細胞膜または細胞壁の内部または外部の機能部位に輸送するのを指示する、シグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（例えば酵母α因子リーダー）であることが可能である。
【００９０】
本発明は、ＤＣＬポリペプチドおよびそれらをコードする核酸の種相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）（オルソログとも呼ばれる）もまた、提供する。本明細書において、「種相同体」は、既定のポリペプチドまたは核酸のものと起源の異なる種であるが、当業者に決定されるように、既定のポリペプチドまたは核酸に有意な配列類似性を持つポリペプチドまたは核酸である。種相同体は、本明細書に提供するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから、適切なプローブまたはプライマーを作成し、そして所望の種由来の適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって、単離し、そして同定することが可能である。本発明はまた、ＤＣＬポリペプチドおよびそれをコードする核酸のアリル変異体；すなわち、アミノ酸またはヌクレオチド配列の相違が、遺伝子多型（集団内の個体間のアリル変動）に起因しうる、こうしたポリペプチドおよび核酸の天然存在代替型も含む。
【００９１】
タンパク質融合体は、ＤＣＬタンパク質および相同体の精製または同定を容易にするために付加するペプチド（例えばポリＨｉｓ）を含んでなることが可能である。本発明のタンパク質のアミノ酸配列もまた、Ｈｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４（１９８８）に記載されるものなどの同定ペプチドに連結することが可能である。こうした非常に抗原性のペプチドは、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合して、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にするエピトープを提供する。Ｈｏｐｐらの配列はまた、ウシ粘膜エンテロキナーゼに特異的に切断されるため、精製されたタンパク質からこのペプチドを除去することが可能である。こうしたペプチドでキャッピングした融合タンパク質はまた、大腸菌における細胞内分解にも耐性である可能性がある。融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域に連結されたＤＣＬタンパク質のアミノ酸配列をさらに含んでなる。典型的なＦｃ領域はヒトＩｇＧ１およびその機能可能な断片とともに、Ｆｃ突然変異タンパク質であり、これらはすべて当該技術分野に周知である。用いるＦｃ領域の部分に応じて、融合タンパク質は、鎖間ジスルフィド結合の形成を通じて、二量体として発現可能である。融合タンパク質を抗体の重鎖および軽鎖両方を用いて作製すると、４つものＤＣＬ領域を持つタンパク質オリゴマーを形成可能である。
【００９２】
さらに、融合ポリペプチドは、精製および同定を容易にするため付加するペプチドを含んでなることが可能である。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドであり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えポリペプチドの迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるネズミハイブリドーマは、米国特許第５，０１１，９１２号に記載されるように、特定の二価金属陽イオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞株は、寄託番号第ＨＢ９２５９号でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネティカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００９３】
別の態様において、ＤＣＬおよびその相同体は、さらに、オリゴマー化ジッパードメインを含んでなる。ジッパードメインは当該技術分野に周知であり、そして詳細に記載する必要はない。ロイシン・ジッパードメインの例は、酵母転写因子ＧＣＮ４に見られるものおよびラット肝臓に見られる熱安定性ＤＮＡ結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１，  １９８９）、優先的にヘテロ二量体を形成する核トランスフォーミングタンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎ（Ｏ’Ｓｈｅａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５；６４６，  １９８９；ＴｕｒｎｅｒおよびＴｊｉａｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８９，  １９８９）、並びにネズミプロトオンコジーンｃ−ｍｙｃの遺伝子産物（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９，  １９８８）に見られるものである。パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルスおよび多くのレトロウイルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合体形成性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）タンパク質もまた、ロイシン・ジッパードメインを所有する（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉｌｄ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：５４７，  １９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：３９４，  １９９１；ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏｓ，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ６：７０３，  １９９０）。
【００９４】
本発明はまた、上に前述するように、これらのポリペプチドの特定の断片またはドメインを含んでなる、ＤＣＬポリペプチドの可溶性型もまた提供する。可溶性ＤＣＬポリペプチドは、発現される細胞から分泌されることが可能であり、そして好ましくは、ＤＣＬポリペプチド活性を保持する。可溶性ＤＣＬポリペプチドにはさらに、少なくとも１つのＤＣＬポリペプチドを含んでなるオリゴマーまたは融合ポリペプチド、並びにＤＣＬポリペプチド活性を有するこれらのポリペプチドいずれかの断片が含まれる。分泌された可溶性ポリペプチドは、培地から、例えば遠心分離によって、所望のポリペプチドを発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞を分離し、そして所望のポリペプチドの存在に関して培地（上清）をアッセイすることによって、同定可能（そしてその非可溶性膜結合対応物から区別可能）である。培地中の所望のポリペプチドの存在は、該ポリペプチドが細胞から分泌され、そしてしたがって、該ポリペプチドの可溶性型であることを示す。ＤＣＬポリペプチドの可溶性型の使用は、多くの適用に好適である。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるため、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易になる。さらに、可溶性ポリペプチドは、一般的に、非経口投与に関して、そして多くの酵素的方法に関して、膜結合型より適している。
【００９５】
ＤＣＬポリペプチドの誘導体はまた、免疫原、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ中の試薬、またはアフィニティー精製法の結合剤としても使用可能である。こうした誘導体はまた、システインおよびリジン残基で、Ｍ−マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの架橋剤によって得ることも可能である。本発明のタンパク質はまた、臭化シアン活性化、ビスオキシラン活性化、カルボニルジイミダゾール活性化またはトシル活性化アガロース構造などの多様な不溶性支持体に反応性側鎖を通じて共有結合させるか、またはポリオレフィン表面に吸着させることによって（グルタルアルデヒド架橋を伴いまたは伴わず）、共有結合させることも可能である。支持体に結合したら、タンパク質を用いて、ＤＣＬ、またはＤＣＬタンパク質に構造および／または機能が類似である他のタンパク質に対して作製された抗体に（アッセイまたは精製の目的で）選択的に結合させることが可能である。
【００９６】
本発明は、結合する天然パターングリコシル化を含むまたは含まないＤＣＬポリペプチドもまた含む。酵母または哺乳動物発現系、例えばＣＯＳ−７細胞で発現させたタンパク質は、発現系に応じて、分子量およびグリコシル化パターンにおいて、天然分子と同様である可能性も、またはわずかに異なる可能性もある。大腸菌などの細菌における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの発現は、非グリコシル化分子を提供する。不活性化されたＮ−グリコシル化部位を有するＤＣＬタンパク質またはその相同体の機能する突然変異類似体（ａｎａｌｏｇ）は、オリゴヌクレオチド合成および連結によって、または部位特異的突然変異誘発技術によって、産生可能である。これらの類似体タンパク質は、酵母発現系を用いて、優れた収率で、均質な炭水化物減少型で産生可能である。真核タンパク質中のＮ−グルコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ａ1−Ｚ（式中Ａ1はＰｒｏ以外のアミノ酸であり、そしてＺはＳｅｒまたはＴｈｒである）によって特徴付けられる。この配列において、アスパラギンが炭水化物の共有結合のための側鎖アミノ基を提供する。こうした部位は、Ａｓｎまたは残基Ｚを別のアミノ酸で置換するか、ＡｓｎまたはＺを欠失させるか、あるいはＡ1およびＺ間に非Ｚアミノ酸を挿入するか、またはＡｓｎおよびＡ1間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入することによって、除去可能である。
【００９７】
ＤＣＬタンパク質誘導体はまた、天然ＤＣＬポリペプチドまたはそのサブユニットの突然変異によっても得ることが可能である。本明細書において、ＤＣＬ突然変異タンパク質は、ＤＣＬタンパク質に相同であるが、少なくとも１つまたは複数の欠失、挿入または置換のため、天然ＤＣＬと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ＤＣＬペプチドをコードするＤＮＡにおいて作成した突然変異いずれの影響も、突然変異ＤＣＬペプチドが、ＤＣＬに特異的に結合するタンパク質（例えば抗体または天然リガンド）に結合する能力を解析することによって、容易に決定可能である。さらに、ＤＣＬ類似体、突然変異タンパク質または誘導体の活性は、本明細書に記載するアッセイ法のいずれによっても決定可能である。同様の突然変異をＤＣＬの相同体において作製することが可能であり、そして同様の方式で試験することが可能である。
【００９８】
本発明のタンパク質の生物学的に同等な類似体は、例えば残基または配列の多様な置換体を作製するか、あるいは生物学的活性に不要な末端または内部残基または配列を欠失させることによって、構築可能である。例えばシステイン残基を欠失させるか、または他のアミノ酸と交換して、再生に際して、誤った分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することが可能である。突然変異誘発の他のアプローチは、隣接する二塩基性アミノ酸残基の修飾を伴い、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増進する。
【００９９】
例えば「保存的アミノ酸置換」は、その位で、アミノ酸残基の極性または荷電にほとんどまたはまったく影響がないように、非天然残基で天然アミノ酸残基を置換することを伴うことが可能である。さらに、ポリペプチド中のいかなる天然残基もまた、「アラニン・スキャニング突然変異誘発」に関して先に記載されているように（例えばアラニン・スキャニング突然変異誘発を論じる、ＭａｃＬｅｎｎａｎら，  １９９８，  Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｓｃａｎｄ．  Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら，  １９９８，  Ａｄｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３５：１−２４を参照されたい）、アラニンで置換することも可能である。
【０１００】
所望のアミノ酸置換は（保存的であってもまたは非保存的であっても）、こうした置換が所望であるときに、当業者によって決定可能である。例えばアミノ酸置換を用いて、ペプチド配列の重要な残基を同定可能であるし、あるいはペプチドまたはビヒクル−ペプチド分子の親和性（前述の式を参照されたい）を増加させるかまたは減少させることが可能である。典型的なアミノ酸置換を表１に示す。
【０１０１】
【表１−１】
2005505285.tif 000002
【０１０２】
【表１−２】
2005505285.tif 000003
【０１０３】
特定の態様において、保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりも、化学的ペプチド合成によって、典型的に取り込まれる、非天然存在アミノ酸残基もまた含む。
【０１０４】
上述のように、天然存在残基は、配列の修飾に有用である可能性がある、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類可能である。例えば、非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラス由来のメンバーと交換することを伴う可能性がある。こうした置換残基を、非ヒトオルソログと相同であるペプチドの領域に、または分子の非相同領域に導入することが可能である。さらに、鎖配向に影響を及ぼすため、ＰまたはＧを用いた修飾も行うことが可能である。
【０１０５】
こうした修飾を作製する際、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することが可能である。各アミノ酸には、疎水性および荷電特性に基づいて、ヒドロパシー指数が割り当てられてきており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１０６】
相互作用的な生物学的機能をタンパク質に与える際に、ヒドロパシーアミノ酸指数が重要であることが、当該技術分野において理解されている（Ｋｙｔｅら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５７：１０５−１３１（１９８２））。類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸を、特定のアミノ酸で置換して、そしてなお類似の生物学的活性を保持しうることが知られる。ヒドロパシー指数に基づいて変化を作製する際、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
【０１０７】
当該技術分野において、同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に行うことが可能であることもまた、理解されている。隣接するアミノ酸の親水性によって決定される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【０１０８】
以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化を作製する際、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することも可能である。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
【０１０９】
当業者は、周知の技術を用いて、前述の配列に示すようなポリペプチドの適切な変異体を決定することが可能であろう。活性を破壊することなく変化させることが可能な分子の適切な領域を同定するため、当業者は、活性に重要でないと考えられる領域を標的とすることが可能である。例えば、同一種由来のまたは他の種由来の類似の活性を持つ類似のポリペプチドが知られている場合、当業者は、ペプチドのアミノ酸配列を類似のペプチドに比較することが可能である。こうした比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を同定することが可能である。こうした類似のペプチドに比較して保存されていないペプチド領域における変化は、ペプチドの生物学的活性および／または構造に不都合な影響を与える可能性がより低いと認識されるであろう。当業者はまた、比較的保存されている領域であっても、活性を保持しながら、天然に存在する残基を、化学的に類似のアミノ酸で置換することが可能であることも知っているであろう（保存的アミノ酸残基置換）。したがって、生物学的活性または構造に重要である可能性がある領域であっても、生物学的活性を破壊することなく、またはペプチド構造に不都合に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供することが可能である。
【０１１０】
さらに、当業者は、活性または構造に重要な、類似のペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再検討することが可能である。こうした比較を考慮して、類似のペプチドにおける、活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、ペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測可能である。当業者は、ペプチドのこうした予測される重要なアミノ酸残基に対する、化学的に類似のアミノ酸置換を選ぶことが可能である。
【０１１１】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける構造に関連して、三次元構造およびアミノ酸配列を解析することも可能である。この情報を考慮して、当業者は、三次元構造に関して、ペプチドのアミノ酸残基の並列を予測することが可能である。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるため、当業者は、こうした残基に根本的な変化を与えないように、選択することが可能である。さらに、当業者は、所望のアミノ酸残基各々の位で、単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を生成することが可能である。その後、当業者に知られる活性アッセイを用いて、変異体をスクリーニングすることが可能である。こうしたデータを用いて、適切な変異体に関する情報を集めることが可能である。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、破壊された活性、望ましくなく減少した活性、または不適切な活性を生じることが発見された場合、こうした変化を持つ変異体は回避されるであろう。言い換えると、こうした日常的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、単独の、または他の突然変異と組み合わせた、さらなる置換を回避すべきである位のアミノ酸を容易に決定することが可能である。
【０１１２】
いくつかの科学的刊行物が二次構造の予測に充てられている。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ７（４）：４２２−４２７（１９９６）；Ｃｈｏｕら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら，  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕら，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．，  ２６：３６７−３８４（１９７９）を参照されたい。さらに、二次構造を予測するのを補助するコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％を越える配列同一性、または４０％を越える類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造的トポロジーを有する。近年、タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が大きくなり、二次構造の予測可能性が増進してきており、これには、ポリペプチド構造またはタンパク質構造内でのフォールディングの潜在的な数が含まれる。Ｈｏｌｍら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  ２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照されたい。既定のポリペプチドまたはタンパク質には、限定される数のフォールディングしかなく、そして決定的な数の構造が解明されたなら、構造予測は劇的に正確性を得るであろうことが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
【０１１３】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ４（１）：１５−９（１９９６））、「プロフィール解析」（Ｂｏｗｉｅら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍ．，  １８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８４（１３）：４３５５−８（１９８７））、および「進化連関（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ、上記およびＢｒｅｎｎｅｒ、上記を参照されたい）が含まれる。
【０１１４】
類似体ＤＣＬポリペプチドの発現のために構築されるヌクレオチド配列中の突然変異は、もちろん、コード配列の読み枠相を保存しなければならず、そして好ましくは、受容体ｍＲＮＡの翻訳に不都合な影響を与えるであろうループまたはヘアピンなどの二次ｍＲＮＡ構造を産生するようハイブリダイズ可能な相補領域を生成しないであろう。突然変異部位はあらかじめ決定されていることが可能であるが、突然変異自体の性質があらかじめ決定されている必要はない。例えば、既定の部位での突然変異体の最適な特性を選択するため、標的コドンでランダム突然変異誘発を行って、そして発現された突然変異ウイルスタンパク質を、所望の活性に関してスクリーニングすることが可能である。
【０１１５】
ＤＣＬタンパク質またはその相同体をコードするヌクレオチド配列中のすべての突然変異が、最終産物中で発現されるわけではなく、例えば、ヌクレオチド置換を作製して、発現を増進するか、主に、転写されるｍＲＮＡ中の二次構造ループを回避する（本明細書に援用されるＥＰＡ  ７５，４４４Ａを参照されたい）か、または選択される宿主により容易に翻訳されるコドン、例えば大腸菌発現のための周知の大腸菌優先コドンを提供することが可能である。
【０１１６】
天然配列の断片への連結を可能にする制限部位が隣接した、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の遺伝子座に突然変異を導入することが可能である。連結後、生じた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有する類似体をコードする。
【０１１７】
あるいは、オリゴヌクレオチドが指示する部位特異的突然変異誘発法を使用して、必要な置換、欠失、または挿入に応じて改変された特定のコドンを有する、改変された遺伝子を提供することが可能である。上述の改変を作製する典型的な方法がＷａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，  １９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，  １９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，  １２−１９）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８１）に開示されており；そして米国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号は、適切な技術を開示し、そして本明細書に援用される。
【０１１８】
本明細書に記載するＤＣＬポリペプチドおよび類似体は、薬剤組成物調製を含む、多くの用途を有するであろう。本発明のタンパク質はまた、例えば組織標本において、ＤＣＬポリペプチドを検出するのに用いられるキットを調製するのにも有用であろう。こうしたキットは、ＤＣＬポリペプチドとその天然リガンドの相互作用のアンタゴニストまたは擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃ）（例えば、それぞれ該相互作用を阻害するかまたは模倣する、ペプチドまたは小分子）に関してスクリーニングする際に必要であるように、こうした相互作用を検出するのに使用を見出すであろう。こうしたキットには多様なアッセイ形式が有用であり、これらには（限定されるわけではないが）、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、固相結合アッセイ（バイオセンサーを用いるものなど）、迅速形式アッセイおよびバイオアッセイが含まれる。
【０１１９】
組換えＤＣＬポリペプチドの発現
本発明のポリペプチドは、好ましくは、組換えＤＮＡ法により、ＤＣＬポリペプチドまたはその相同体をコードするＤＮＡ配列を、組換え発現ベクターに挿入して、そして発現を促進する条件下で、組換え微生物発現系においてＤＮＡ配列を発現させることによって、産生される。本発明に提供されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列をｃＤＮＡ断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから組み立てるか、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てて、組換え発現ベクターに挿入し、組換え転写単位で発現することが可能な合成遺伝子を提供することが可能である。
【０１２０】
組換え発現ベクターには、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子由来の適切な転写制御要素または翻訳制御要素に機能可能であるように連結された、ＤＣＬポリペプチド、相同体、または生物学的に同等な類似体をコードする合成またはｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片が含まれる。こうした制御要素には、以下に詳細に記載するような、転写プロモーター、転写を調節する所望によるオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写および翻訳の終結を調節する配列が含まれる。通常、複製起点によって与えられる、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに取り込むことが可能である。
【０１２１】
ＤＮＡ領域は、互いに機能的に関連する場合、機能可能であるように連結されている。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現される場合、該ポリペプチドのＤＮＡに機能可能であるように連結されており；プロモーターは、コード配列の転写を調節する場合、該配列に機能可能であるように連結されており；またはリボソーム結合部位は、翻訳を可能にするように配置されている場合、コード配列に機能可能であるように連結されている。一般的に、機能可能であるように連結された、は、連続しており、そして分泌リーダーの場合、連続していて、そして同じ読み枠にあることを意味する。微生物において発現しようとするＤＣＬポリペプチドまたは相同体をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を未成熟に終結させる可能性があるイントロンをまったく含有しないであろう。
【０１２２】
細菌使用のための有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子要素を含んでなる商業的に入手可能なプラスミド由来の選択可能マーカーおよび細菌複製起点を含んでなることが可能である。こうした商業的なベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、スウェーデン・ウプサラ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ、米国ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。これらのｐＢＲ３２２「主鎖」部分を適切なプロモーターおよび発現しようとする構造配列と組み合わせる。大腸菌は、典型的には、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される（Ｂｏｌｉｖａｒら，  Ｇｅｎｅ  ２：９５，  １９７７）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、そしてしたがって形質転換細胞を同定する単純な手段を提供する。
【０１２３】
組換え微生物発現ベクターに通常用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６１５，  １９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４，  １９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８：４０５７，  １９８０；およびＥＰＡ  ３６，７７６）およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ｐ．４１２，  １９８２）が含まれる。特に有用な細菌発現系は、ファージλＰLプロモーターおよびｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサーを使用する。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能な、λＰLプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベクターには、大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ  ３７０９２）に常住するプラスミドｐＨＵＢ２および大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ  ５３０８２）に常住するｐＰＬｃ２８が含まれる。
【０１２４】
酵母ベクターの適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：２０７３，  １９８０）または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．  ７：１４９，  １９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７：４９００，  １９７８）のプロモーターが含まれる。酵母発現に用いるのに適したベクターおよびプロモーターがＲ．  Ｈｉｔｚｅｍａｎら、ＥＰＡ−７３，６５７にさらに記載される。
【０１２５】
大腸菌における選択および複製のため、ｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子および複製起点）を、そしてグルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む酵母ＤＮＡ配列を用いて、好ましい酵母ベクターを組み立てることが可能である。ＡＤＨ２プロモーターは、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：２６７４，  １９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７２４，  １９８２）に記載されている。異種タンパク質の分泌を指示する酵母α−因子リーダーを、プロモーターおよび発現しようとする構造遺伝子の間に挿入することが可能である。例えば、Ｋｕｒｊａｎら，  Ｃｅｌｌ  ３０：９３３，  １９８２；およびＢｉｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：５３３０，  １９８４を参照されたい。リーダー配列を修飾して、その３’端近傍に、１以上の有用な制限部位を含有して、外来遺伝子へのリーダー配列の融合を容易にすることも可能である。
【０１２６】
脊椎動物細胞の形質転換に使用しようとする発現ベクター中の転写および翻訳調節配列は、ウイルス供給源より提供可能である。例えば、通常用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒト・サイトメガロウイルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０起点、初期および後期プロモーター部位、エンハンサー部位、スプライシング部位、およびポリアデニル化部位を用いて、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝要素を提供可能である。初期および後期プロモーターは、どちらもＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有する断片として容易にウイルスから得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３，  １９７８）。ＳＶ４０ウイルス複製起点部位に位置するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位からＢｇｌ  Ｉ部位に渡るおよそ２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片もまた使用可能である。さらに、ウイルスゲノムプロモーター、調節配列および／またはシグナル配列も、こうした調節配列が選択した宿主細胞に適合するならば、利用可能である。典型的なベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３：２８０，  １９８３）に開示するように構築可能である。
【０１２７】
Ｃ１２７ネズミ乳腺上皮細胞における哺乳動物受容体ｃＤＮＡの安定した高レベル発現に有用な系は、実質的にＣｏｓｍａｎら（Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：９３５，  １９８６）に記載されるように構築可能である。ＤＣＬポリヌクレオチドの発現に好ましい真核ベクターは、ｐＤＣ４０６（ＭｃＭａｈａｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）と称され、そして該ベクターには、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来の制御配列が含まれる。他の好ましいベクターには、ｐＤＣ４０６由来のｐＤＣ４０９およびｐＤＣ４１０が含まれる。ｐＤＣ４１０は、ＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする配列を用いて、ＥＢＶ複製起点を置換することによって、ｐＤＣ４０６から得た。ｐＤＣ４０９は、マルチクローニング部位の外のＢｇｌＩＩ制限部位が欠失され、マルチクローニング部位内のＢｇｌＩＩ部位が唯一のものとなっている点で、ｐＤＣ４０６と異なる。
【０１２８】
ｐＤＣ４０６およびｐＤＣ４０９などの、ＥＢＶ複製起点を含有する発現ベクターのエピソーム複製を可能にする、有用な細胞株は、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）である。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞株は、エプスタイン−バーウイルス核抗原１（ＥＢＮＡ−１）をコードする遺伝子でＣＶ−１細胞株をトランスフェクションすることによって得られたものであり、そしてヒトＣＭＶ極初期エンハンサー／プロモーターから駆動されてＥＢＮＡ−１を恒常的に発現する。
【０１２９】
宿主細胞
形質転換宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、そして本発明のタンパク質をコードする配列を含有する発現ベクターで形質転換されているかまたはトランスフェクションされている細胞である。形質転換宿主細胞は、所望のタンパク質（１以上のＤＣＬポリペプチドまたはその相同体）を発現することが可能であるが、本発明のＤＮＡをクローニングするかまたは増幅する目的のために形質転換されている宿主細胞は、タンパク質を発現する必要はない。発現されるタンパク質は、好ましくは、選択したＤＮＡに応じて、培養上清中に分泌されるであろうが、細胞膜に沈着していることも可能である。
【０１３０】
ウイルスタンパク質を発現するのに適した宿主細胞には、適切なプロモーターの調節下の、原核生物、真核生物、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物（ヒト、サル、類人猿、げっ歯類など）または他のより高次の真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種が含まれる。より高次の真核細胞には、以下に記載するような、哺乳動物起源の樹立細胞株が含まれる。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示するＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて、ウイルスタンパク質を産生するのに使用可能である。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主とともに使用するのに適したクローニングおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  エルゼビア，  ニューヨーク州，  １９８５）に記載されており、該文献の関連する開示が本明細書に援用される。
【０１３１】
徹底的なタンパク質分解プロセシングおよびジスルフィドプロセシングを必要としないＤＣＬまたは相同体の発現には、原核発現宿主が使用可能である。原核発現ベクターは、一般的に、１以上の表現型的に選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐性を与えるタンパク質または独立栄養必要条件を供給するタンパク質をコードする遺伝子、および宿主に認識されて、宿主内での増幅を確実にする複製起点を含んでなる。形質転換に適した原核宿主には、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な他の種が含まれるが、好みの問題として、他のものもまた、使用可能である。
【０１３２】
組換えＤＣＬポリペプチドはまた、酵母宿主、好ましくはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種由来、例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来などの酵母宿主において発現可能である。ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）などの他の属の酵母もまた使用可能である。酵母ベクターは、一般的に、２μ酵母プラスミド由来の複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、並びに選択遺伝子を含有するであろう。好ましくは、酵母ベクターには、酵母および大腸菌両方の形質転換を可能にする、複製起点および選択可能マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．セレビシエｔｒｐ１遺伝子が含まれ、該遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株の選択マーカー、および下流の構造配列の転写を誘導する、高発現される酵母遺伝子由来のプロモーターを提供する。酵母宿主細胞ゲノムにおいてｔｒｐ１破壊が存在すると、トリプトファンの非存在下、増殖によって、形質転換を検出するのに有効な環境が提供される。
【０１３３】
適切な酵母形質転換プロトコルが当業者に知られ；典型的な技術は、Ｈｉｎｎｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１９２９，  １９７８に記載され、０．６７％酵母窒素基剤、０．５％カザミノ酸，２％グルコース，１０μｇ／ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地中でＴｒｐ+形質転換体に関して選択する。ＡＤＨ２プロモーターを含んでなるベクターによって形質転換された宿主株は、８０μｇ／ｍｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを補った、１％酵母エキス、２％ペプトン、および１％グルコースからなるリッチ培地中で、発現のため、増殖させることが可能である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、培地からグルコースが枯渇したとき起こる。未精製酵母上清を、ろ過によって採取し、そしてさらなる精製前に４℃で保持する。
【０１３４】
また、本発明の単離核酸を、１以上の昆虫発現ベクター中の適切な調節配列に機能可能であるように連結し、そして昆虫発現系を使用することによって、本発明のポリペプチドを産生することも可能である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の材料および方法は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）のキット中で商業的に入手可能であるし、そしてこうした方法は、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  第１５５５号（１９８７）、並びにＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に記載されるように、当該技術分野に周知である。細胞不含翻訳系もまた、本明細書に開示する核酸構築物由来のＲＮＡを用いて、ポリペプチドを産生するのに使用可能である。
【０１３５】
多様な哺乳動物または昆虫細胞培養系を使用して、組換えタンパク質を発現することが可能である。昆虫細胞において、異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に概説される。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，  １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または血清不含培地で増殖するＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯなどのその派生物および関連細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら，  １９９８，  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３１）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＭｃＭａｈａｎら，  １９９１，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３などのヒト胎児腎臓細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が含まれる。場合によって、多様なシグナル伝達またはレポーターアッセイにおいて、ポリペプチドを使用するのが望ましい場合、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ  ３Ｔ３またはＳ４９などの哺乳動物細胞株を、ポリペプチドの発現に使用することが可能である。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、発現しようとする遺伝子に連結された適切なプロモーターおよびエンハンサー、および他の５’または３’フランキング非転写配列などの非転写要素、並びに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス・ドナー部位およびスプライス・アクセプター部位、および転写終結配列などの５’または３’非翻訳配列を含んでなることが可能である。
【０１３６】
ＤＣＬポリペプチドの精製
組換え合成の慣用法にしたがって、ポリペプチドを単離し、そして精製することもまた可能である。例えば、発現宿主の溶解物を調製することが可能であり、そしてＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて、溶解物を精製することが可能である。ほとんどの場合、用いる組成物は、産物の調製法およびその精製法に関連する混入物質に対して、所望の産物を、重量にして少なくとも２０％、より一般的には、重量にして少なくとも約７５％、好ましくは、重量にして少なくとも約９５％、そして療法目的には、通常、重量にして少なくとも約９９．５％含んでなるであろう。通常、割合は、総タンパク質に基づくであろう。
【０１３７】
精製ＤＣＬポリペプチド、変異体、相同体、または類似体は、適切な宿主／ベクター系を培養して、本発明のＤＮＡの組換え翻訳産物を発現させ、これをその後、培地または細胞抽出物から精製することによって調製される。例えば、組換えタンパク質を培地に分泌する系由来の上清は、まず、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過装置を用いて濃縮可能である。
【０１３８】
濃縮工程に続いて、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することが可能である。例えば、適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体に結合した対構造（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）タンパク質または抗体分子を含んでなることが可能である。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは支持体が使用可能である。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に一般的に使用される他の種類であることが可能である。あるいは、陽イオン交換工程が使用可能である。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含んでなる多様な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲルろ過クロマトグラフィーもまた、本発明のタンパク質を精製する手段を提供する。
【０１３９】
アフィニティークロマトグラフィーが、ＤＣＬポリペプチドおよびその変異体、相同体、または類似体の特に好ましい精製法である。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域を含んでなる融合タンパク質として発現されるＤＣＬポリペプチドは、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製可能である。さらに、オリゴマー化ジッパードメインを含んでなるＤＣＬタンパク質は、オリゴマー化ジッパードメインに特異的な抗体を含んでなる樹脂上で精製可能である。ＤＣＬタンパク質に対するモノクローナル抗体もまた、当該技術分野に周知の方法を利用することによって、アフィニティークロマトグラフィー精製において有用である可能性がある。炭水化物または糖タンパク質部分などのリガンドもまた、ＤＣＬのアフィニティー精製用のアフィニティーマトリックスを調製するのに使用可能である。
【０１４０】
最後に、疎水性逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）媒体、例えばペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲルを使用する、１以上のＲＰ−ＨＰＬＣ工程を使用して、ＤＣＬ組成物をさらに精製することが可能である。多様な組み合わせの前述の精製工程のいくつかまたはすべてを使用して、均質な組換えタンパク質を提供することもまた可能である。
【０１４１】
細菌培養中で産生された組換えタンパク質を、通常、細胞ペレットからまず抽出して、その後、１以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を続けることによって、単離する。最後に、最終精製工程のため、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することが可能である。組換えウイルスタンパク質の発現で使用する微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、いかなる好適な方法によって、破壊することも可能である。
【０１４２】
分泌タンパク質として本発明のタンパク質を発現する酵母の発酵は、精製を非常に単純化する。大規模発酵から生じる、分泌される組換えタンパク質は、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．  ２９６：１７１，  １９８４）に開示されるものと類似の方法によって精製可能である。この参考文献は、分取用ＨＰＬＣカラム上での組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ精製のための、２つの連続する逆相ＨＰＬＣ工程を記載する。
【０１４３】
組換え体培養において合成されるタンパク質は、本発明のタンパク質を培養から回収するのに採用される精製工程に応じる量および性質の、タンパク質を含む細胞構成要素の存在によって特徴付けられる。これらの構成要素は、通常、酵母、原核生物または非ヒトのより高次の真核起源のものであろうし、そして好ましくは、重量にして約１パーセント未満の桁の、無害な混入物質量で存在する。さらに、組換え細胞培養は、元来の種において、自然に見られるように、本発明のタンパク質と通常関連している可能性がある他のタンパク質を含まない、本発明のタンパク質の産生を可能にする。
【０１４４】
スクリーニングアッセイおよび方法
本発明は、ＤＣＬポリペプチドおよびＤＣＬ関連基質および／または結合パートナーの活性をアンタゴナイズするかまたはアゴナイズする分子（しばしば「試験化合物」と称される）に関するスクリーニング法を提供する。ＤＣＬポリペプチド活性には、限定されるわけではないが、抗原結合、インターナリゼーション、プロセシングおよび提示；ＡＰＣ活性化、分化、成熟、ホーミングおよび遊出；結合、および興奮性の方式または阻害性の方式いずれかでの細胞内シグナル伝達経路の調節を含む、細胞間相互作用、それらとともに自己分泌、傍分泌および／または内分泌様式で作用する因子の分泌を導く経路を通じた細胞外コミュニケーションが含まれる。ＤＣＬポリペプチドを発現するＡＰＣに結合可能な細胞の例には免疫系の細胞が含まれ、ＤＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞とともにこれらの前駆細胞が含まれる。
【０１４５】
結合パートナーは、本明細書において、オリゴ糖、多糖、炭水化物、糖タンパク質、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ糖脂質等であることが可能な天然リガンドを含んでなることが可能であり；好ましくは、天然リガンドは、細菌、ウイルス、真菌または原生動物ポリペプチドとともに、細胞膜会合ポリペプチドからなる群より選択される。結合パートナーはまた、ＤＣＬ活性に対してアゴニスト性またはアンタゴニスト性いずれかである抗体を含んでなることも可能である。また、結合パートナーは、ＤＣＬ天然リガンドの断片、誘導体、融合タンパク質またはペプチド擬似体を含んでなることが可能である。
【０１４６】
最も基本的な意味で、典型的なアッセイは、アゴニストまたはアンタゴニストの形であることが可能な、ＤＣＬポリペプチド活性を調節する試験化合物を同定する方法であって、試験化合物を１以上のＤＣＬポリペプチドと混合し、そして試験化合物が、前記ポリペプチドのＤＣＬポリペプチド活性を改変するかどうかを決定することを含んでなる前記方法を含んでなる。他の態様は、ＤＣＬポリペプチドの結合活性を阻害する化合物を同定する方法であって、試験化合物を１以上のＤＣＬポリペプチドおよび前記ポリペプチドの結合パートナーと混合し、そして試験化合物が、前記ポリペプチドの結合活性を阻害するかどうかを決定することを含んでなる前記方法を含んでなる。
【０１４７】
さらなる態様には、特筆される生物学的読み取り値、例えばＣ型レクチン活性の調節などを用いて、活性化合物に関してスクリーニングする方法が含まれる。本出願全体で用いられるように、調節する、は、活性を増加させるかまたは減少させるかいずれかを意味する。さらなる態様は、生物学的読み取り値として、アスパルチルプロテアーゼ活性の調節を用いることが可能である。そして、さらなる態様において、生物学的読み取り値には、ＩＴＩＭ活性（それとともに、ＩＴＡＭドメイン、およびＳＨＰ−１チロシンホスファターゼを含むチロシンホスファターゼなどの１以上のホスファターゼとの相互作用などの関連する経路）の調節が含まれる。
【０１４８】
本発明の方法を用いて、細胞、細胞不含調製物、化学薬品ライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、組換え抗体ライブラリー（または抗体サブユニットを含んでなるライブラリー）および天然産物混合物から、ＤＣＬシグナル伝達活性のアンタゴニストおよびアゴニストを同定することが可能である。アンタゴニストおよびアゴニストは、本発明のポリペプチドの天然のまたは修飾された基質、リガンド、酵素、受容体などであることが可能であるし、あるいはＤＣＬポリペプチドおよびその断片の１つの構造的模倣体または機能的模倣体であることが可能である。本発明の潜在的なアンタゴニストには、本発明のポリペプチドまたはその結合パートナーの結合部位に結合し、そして該部位を占め、その天然結合パートナーに結合するのに利用不能にして、そしてこうして正常な生物学的活性を防止する、小分子、ペプチドおよび抗体を含むことが可能である。潜在的なアゴニストには、本発明のポリペプチドまたはその結合パートナーに結合して、そして本発明のポリペプチドの結合によって引き起こされるのと同一かまたはそれより増進された生物学的効果を引き出す、小分子、ペプチドおよび抗体が含まれる。
【０１４９】
１つの側面において、本発明の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光分極、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動、シンチレーション近接アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光消光酵素基質、色素生産酵素基質および電気化学発光などの均質アッセイ形式を利用する。別の側面において、本発明の方法は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイなどの不均質アッセイ形式を利用する。本発明のさらに別の側面は、細胞に基づくアッセイ、例えばレポーター遺伝子を利用するものとともに、生物学的機能（単数または複数）に対するアンタゴニストまたはアゴニストの影響を解析する機能アッセイである。
【０１５０】
小分子アゴニストおよびアンタゴニストは、通常、１０Ｋ分子量未満であり、そして細胞浸透を増進し、分解に抵抗し、そしてその生理学的半減期を延長する、いくつかの物理化学的特性および薬理学的特性を所持することが可能である（Ｇｉｂｂｓ，  Ｊ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．７９（１９９４））。損なわれていない分子とともに、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2断片などの断片、それとともにそれに由来する組換え分子（ファージ上で発現される抗体、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖなどの一本鎖抗体および当該技術分野で知られる免疫グロブリン由来の他の分子を含む）を含む抗体を用いて、シグナル伝達カスケードの伝播を遮断することによって、本発明のポリペプチドに結合し、そして該ポリペプチドを阻害することが可能である。抗体がヒト化されていることが好ましく、そしてより好ましくは、抗体はヒトである。本発明の抗体は、多様な周知の方法のいずれかによって調製可能である。
【０１５１】
本明細書において、ＤＣＬアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関して試験しようとする、「試験化合物」とも称される、候補分子のさらなる例には、限定されるわけではないが、炭水化物、小分子（通常、有機分子またはペプチド）、タンパク質、および核酸分子（典型的には８〜３０核酸残基からなるオリゴヌクレオチド断片を含む）が含まれる。試験しようとするペプチドは、典型的には、５〜２５アミノ酸残基からなる。また、候補核酸分子は、アンチセンス核酸配列であることが可能であり、そして／またはリボザイム活性を所持することが可能である。ＤＣＬアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関してアッセイ可能な候補分子にはまた、限定されるわけではないが、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス）、Ａｒｑｕｌｅ（マサチューセッツ州ウォバーン）、Ｅｎｚｙｍｅｄ（アイオワ州アイオワシティー）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（英国コーンウォール州トレビレット）、ＭＤＳ  Ｐａｎｌａｂｓ（ワシントン州ボセル）、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ニュージャージー州プリンストン）、およびＴｒｅｇａ（カリフォルニア州サンディエゴ）などの会社から、しばしば大きいコンビナトリアルケミストリー化合物「ライブラリー」の一部として、商業的に入手可能なものなどの小有機分子が含まれることが可能である。天然産物、無機化学薬品、並びにタンパク質および毒素などの生物学的活性物質を含む化合物もまた、これらの方法を用いて、ＤＣＬ関連細胞事象を調節する能力に関して、アッセイすることが可能である。
【０１５２】
特異的スクリーニング法が当該技術分野に知られ、そして統合されたロボット系および化学的化合物／天然産物のコレクションを高処理スクリーニングに大規模に取り込んで、短時間で、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性に関して、多数の試験化合物を試験することが可能である。これらの方法には、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光分極、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動、シンチレーション近接アッセイ、レポーター遺伝子アッセイ、蛍光消光酵素基質、色素生産酵素基質および電気化学発光などの均質アッセイ形式とともに、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイなどの、より伝統的な不均質アッセイ形式が含まれる。均質アッセイが好ましい。本明細書にやはり含まれるのは、細胞に基づくアッセイ、例えばレポーター遺伝子を利用するアッセイとともに、生物学的機能（単数または複数）（例えば基質のリン酸化、サイトカインまたは増殖因子の分泌、細胞または組織の増殖および／または分化等）に対するアンタゴニストまたはアゴニストの影響を解析する機能アッセイである。
【０１５３】
さらに、スクリーニングアッセイの組み合わせを用いて、ＤＣＬの生物学的活性を制御する分子を発見することが可能である。ポリペプチドの生物学的活性を制御する分子は、該ペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして有用である可能性がある。多様なアッセイの組み合わせを用いる際、通常、高処理スクリーニングに受け入れられるアッセイを用いることによって、候補分子がポリペプチドに結合するかどうかをまず決定する。この方式で同定される結合候補分子をその後、生物学的アッセイに添加して、生物学的影響を決定する。結合し、そして生物学的活性にアゴニスト性またはアンタゴニスト性の影響を有する分子は、ポリペプチド（単数または複数）が関連付けられる疾患または状態を治療するかまたは防止するのに有用であろう。
【０１５４】
一般的に、アンタゴニストは、活性を少なくとも３０％阻害するであろうし；より好ましくは、アンタゴニストは、活性を少なくとも５０％阻害するであろうし、最も好ましくは、活性を少なくとも９０％阻害するであろう。同様に、アゴニストは、活性を少なくとも２０％増進するであろうし；より好ましくは、アゴニストは、活性を少なくとも３０％増進するであろうし、最も好ましくは、活性を少なくとも５０％増進するであろう。当業者は、それぞれ、異なるレベルのアゴニズムおよびアンタゴニズムを持つアゴニストおよび／またはアンタゴニストが異なる適用（すなわち異なる疾患状態の治療）に有用である可能性があることを認識するであろう。
【０１５５】
均質アッセイは、ロボット適用に非常に受け入れやすい、混合および読み取り形式のアッセイであり、一方、不均質アッセイは、ろ過、遠心分離または洗浄などの、より複雑な単位操作によって、結合した分析物から未結合のものを分離することが必要である。これらのアッセイを利用して、非常に多様な特異的生体分子相互作用（タンパク質−タンパク質、受容体−リガンド、酵素−基質などを含む）、および小有機分子によるその阻害を検出する。これらのアッセイ法および技術は当該技術分野に周知である（例えばＨｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｐ．  Ｄｅｖｌｉｎ（監修），  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ニューヨーク，  １９９７  ＩＳＢＮ：０−８２４７−００６７−８を参照されたい）。本発明のスクリーニングアッセイは、化学薬品ライブラリーの高処理スクリーニングに受け入れやすく、そして天然または合成の小分子薬剤候補、抗体、ペプチド、および他のアンタゴニストおよび／またはアゴニストの同定に適している。
【０１５６】
こうしたアッセイの１つは、２つの蛍光標識、エネルギーを供与する長命キレート標識および短命有機アクセプター間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ；例えばＨＴＲＦ（登録商標）、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、コネティカット州メリデン；ＬＡＮＣＥTM、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ．、フィンランド・トゥルク）である。エネルギー移動は、ＤＣＬおよび基質および／または結合パートナー間の分子相互作用を介して、２つの標識がごく近接した際に起こる。ＤＣＬおよび基質および／または結合パートナーの阻害を検出するＦＲＥＴアッセイにおいて、ユーロピウムキレートまたはクリプタート標識ＤＣＬまたは基質および／または結合パートナーがエネルギードナーとして働き、そして適切な結合パートナー（すなわちＤＣＬが標識されている場合は基質および／または結合パートナー、あるいは基質または結合パートナーが標識されている場合はＤＣＬ）に結合したストレプトアビジン標識アロフィコシアニン（ＡＰＣ）がエネルギーアクセプターとして働く。ＤＣＬが基質および／または結合パートナーに会合すると、ドナー分子およびアクセプター分子が近接して、そしてエネルギー移動が起こり、６６５ｎｍの蛍光シグナルが生じる。したがって、ＤＣＬおよび基質および／または結合パートナーの相互作用のアンタゴニストは、蛍光シグナルを阻害するであろうし、一方、この相互作用のアゴニストは、蛍光シグナルを増進するであろう。
【０１５７】
別の有用なアッセイは、生物発光共鳴エネルギー移動アッセイ、またはＢＲＥＴアッセイであり、実質的にＸｕら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：１５１（１９９９）に記載されるとおりのアッセイである。ＦＲＥＴアッセイ同様、ＢＲＥＴは、生物発光ドナーから蛍光アクセプタータンパク質へのエネルギー移動に基づく。しかし、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をアクセプター分子として用いて、励起光供給源の必要性を排除する。典型的なＢＲＥＴアッセイには、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、コネティカット州メリデンのＢＲＥＴおよびＢＲＥＴ2が含まれる。
【０１５８】
ＤＥＬＦＩＡ（登録商標）（解離化増進ランタニド蛍光免疫アッセイ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ．、フィンランド・トゥルク）は、ランタニドキレートの時間分解蛍光光度解析に基づく固相アッセイである（例えば米国特許第４，５６５，７９０号、１９８６年１月２１日発行を参照されたい）。この種のアッセイには、マイクロウェルプレートを第一のタンパク質（ＮＥＭＯまたはＣＹＬＤ）でコーティングする。結合パートナー（それぞれ、ＤＣＬまたはＤＣＬの基質および／または結合パートナー）をユーロピウムキレートまたはクリプタートにコンジュゲート化し、そしてプレートに添加する。適切なインキュベーション後、プレートを洗浄し、そして固相結合タンパク質からユーロピウムイオンを解離させる溶液を添加して、溶液に存在する、リガンドを伴う高い蛍光のキレートを形成し、その後、ＶＩＣＴＯＲ2 TM（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ．、フィンランド・トゥルク）プレート読み取り装置などの読み取り装置を用いてプレートを読み取り、６１５ｎｍの発光を検出する。
【０１５９】
本発明で有用である可能性がある別のアッセイは、ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州）に基づくアッセイである。このアッセイは、化合物が、タンパク質−タンパク質相互作用を阻害する能力を測定する。ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ（登録商標）を、第一のタンパク質（ＤＣＬまたはＤＣＬの基質および／または結合パートナーいずれか）でコーティングし、その後、洗浄して過剰なタンパク質を除去する。該アッセイには、試験しようとする化合物を、第二のタンパク質（プレートがＤＣＬでコーティングされている場合はＤＣＬの基質および／または結合パートナー、あるいはプレートがＤＣＬの基質または結合パートナーでコーティングされている場合はＤＣＬ）、およびＩ125標識した、第二のタンパク質に対する抗体とインキュベーションし、そしてプレートに添加する。適切なインキュベーションおよび洗浄後、シンチレーションカウンター（ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）カウンター；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ．、フィンランド・トゥルク）を用いて、放射能結合の量を測定する。
【０１６０】
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMアッセイ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、コネティカット州メリデン）。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTM技術は「増幅発光近接均質アッセイ」法であり、光増感剤（ドナービーズ）、または化学発光基および蛍光アクセプター分子（アクセプタービーズ）を含有する、ラテックス微小ビーズ（直径２５０ｎｍ）を利用する。６８０ｎｍのレーザー光で照射した際、ドナービーズ中の光増感剤は、周囲酸素を一重項状態酸素に変換する。励起した一重項状態酸素分子は、迅速に崩壊する前に、およそ２５０ｎｍ（１ビーズ直径）に散乱する。アクセプタービーズがドナービーズにごく近接している場合（すなわちＤＣＬおよびＤＣＬの基質および／または結合パートナーの相互作用による）、一重項状態酸素分子がアクセプタービーズ中の化学発光基と反応し、これが直ちに同じビーズの蛍光アクセプターにエネルギーを移動させる。これらの蛍光アクセプターは、発光波長を５２０〜６２０ｎｍにシフトさせ、検出可能なシグナルが生じる。こうして、ＤＣＬおよびＤＣＬの基質および／または結合パートナーの相互作用のアゴニストは、発光波長のシフトを阻害するであろうし、一方、この相互作用のアゴニストは、このシフトを増進するであろう。
【０１６１】
ＤＣＬファミリーのポリペプチドおよびその断片を用いて、結合パートナーを同定することが可能である。例えば、適切なアッセイいずれか、例えば慣用的な結合アッセイとともに酵母ツーハイブリッドシステムで、候補結合パートナーに結合する能力に関して、これらを試験することが可能である。例えば、ＤＣＬポリペプチドを検出可能試薬（例えば放射性核種、発色団、比色反応または蛍光定量反応を触媒する酵素等）で標識することが可能である。候補結合パートナーを発現している細胞と、標識したポリペプチドを接触させる。その後、細胞を洗浄して、未結合の標識したポリペプチドを除去し、そして標識の性質にしたがって選択した、適切な技術によって、細胞結合標識の存在を決定する。
【０１６２】
結合アッセイ法の１つの例は以下のとおりである。候補結合パートナーｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターを構築する。１０ｃｍ2プレート中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞をこの組換え発現ベクターでトランスフェクションする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）は、ＣＭＶ極初期エンハンサー／プロモーターから駆動されるＥＢＶ核抗原１を恒常的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は、ＭｃＭａｈａｎら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１）に記載されるように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であった。トランスフェクション細胞を２４時間培養し、そして各プレート中の細胞をその後、２４ウェルプレートに分ける。さらに４８時間培養した後、トランスフェクション細胞（約４ｘ１０4細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。ＢＭ−ＮＦＤＭは５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳が添加されている結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２を含有するＲＰＭＩ１６４０）である。該細胞をその後、多様な濃度の、例えば上述のように作成した可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドと、３７℃で１時間インキュベーションする。細胞をその後、洗浄し、そして結合培地中で、125Ｉマウス抗ヒトＩｇＧの一定の飽和濃度で、穏やかに攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションする。徹底した洗浄の後、トリプシン処理を介して細胞を遊離させる。上に使用するマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そしてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。抗体は標準的クロラミン−Ｔ法を用いて放射ヨウ素標識される。該抗体は、細胞に結合しているいかなるポリペプチド／ＦｃポリペプチドのＦｃ部分にも結合するであろう。すべてのアッセイにおいて、125Ｉ抗体の非特異的結合をＦｃ融合ポリペプチド／Ｆｃの非存在下でアッセイするとともに、Ｆｃ融合ポリペプチドおよび２００倍のモル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体の存在下でもアッセイする。細胞結合125Ｉ−抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ  Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンターで定量化する。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：６６０，  １９４９）はＭｉｃｒｏｖａｘコンピューター上で実行されるＲＳ／１（ＢＢＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、マサチューセッツ州ボストン）上で生み出される。結合はまた、高処理スクリーニング法に適した方法を用いても検出可能であり、これらの方法は例えばシンチレーション近接アッセイ（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄら，  １９８５，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：８６７２−８６７６）、均質時間分解蛍光法（Ｐａｒｋら，  １９９９，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９：９４−１０４）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法（Ｃｌｅｇｇ  ＲＭ，  １９９５，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：１０３−１１０）、または、例えばＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（スウェーデン・ウプサラ）に供給されるものなどのバイオセンサーを用いて、結合さ���たポリペプチドを潜在的な結合パートナーに曝露した際の表面プラズモン共鳴のいかなる変化も測定する方法である。
【０１６３】
試験化合物に関するスクリーニングに、酵母ツーハイブリッドまたは「相互作用捕捉」アッセイを用いることが可能である。ＤＣＬポリペプチドが別のポリペプチドに結合するか、または結合する可能性がある場合、ＤＣＬポリペプチドをコードする核酸もまた、相互作用捕捉アッセイ（例えばＧｙｕｒｉｓら，  Ｃｅｌｌ  ７５：７９１−８０３（１９９３）に記載するものなど）に使用して、結合が生じる他のポリペプチドをコードする核酸を同定するか、または結合相互作用の阻害剤を同定するのに使用可能である。これらの結合相互作用に関与するポリペプチドもまた、結合相互作用のペプチドまたは小分子阻害剤またはアゴニストに関してスクリーニングするのに使用可能である。
【０１６４】
適切な結合アッセイの別の種類は、競合的結合アッセイである。例えば、変異体の候補結合パートナーへの結合に関して、天然ポリペプチドと競合する能力をアッセイすることによって、変異体の生物学的活性を決定可能である。競合的結合アッセイは慣用的方法論によって実行可能である。競合的結合アッセイに使用可能な試薬には、放射標識ＤＣＬ、および細胞表面にＤＣＬ（内因性または組換え体）を発現している、損なわれていない細胞が含まれる。例えば、放射標識可溶性ＤＣＬ断片を用いて、細胞表面受容体への結合に関して、可溶性ＤＣＬ変異体と競合させることが可能である。損なわれていない細胞の代わりに、Ｆｃ部分とポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ（固相上）の相互作用を通じて固相に結合させた、可溶性結合パートナー／Ｆｃ融合ポリペプチドを使用可能である。ポリペプチドＡおよびポリペプチドＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なものが含まれる。
【０１６５】
試験化合物に関してスクリーニングするのに、細胞増殖、細胞死、細胞分化および細胞接着アッセイもまた使用可能である。本発明のＤＣＬポリペプチド、その断片および／または誘導体は、サイトカイン、細胞増殖（誘導または阻害いずれか）、または細胞分化（誘導または阻害いずれか）活性を示す可能性があり、あるいは特定の細胞集団において、他のサイトカイン、ケモカインまたは他の可溶性因子の産生を誘導することが可能である。現在までに発見されている多くのポリペプチド因子は、１以上の因子に依存する細胞増殖アッセイにおいて、こうした活性を示しており、そしてしたがって、これらのアッセイは、細胞刺激活性の好適な確認として働く。本発明のＤＣＬのアゴニストおよび／またはアンタゴニストの活性は、限定なしに、３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（プレＢ  Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫを含む細胞株に関する、日常的な因子に依存するいくつかの細胞増殖アッセイのいずれか１つによって立証される。本発明のＤＣＬポリペプチドの活性は、他の手段の中で、以下の方法によって測定可能である：
脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖に関するアッセイには、限定なしに：ＫｒｕｉｓｂｅｅｋおよびＳｈｅｖａｃｈ，  １９９４，  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｖｏｌ１  ｐｐ．３．１２．１−３．１２．１４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント；およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ，  １９９４，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｖｏｌ  １  ｐｐ．６．８．１−６．８．８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロントに記載されるものが含まれる。
【０１６６】
細胞移動および接着に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第６．１２章，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ．  ６．１２．１−６．１２．２８）；Ｔａｕｂら  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９５：１３７０−１３７６，  １９９５；Ｌｉｎｄら  ＡＰＭＩＳ  １０３：１４０−１４６，  １９９５；Ｍｕｌｌｅｒら  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２５：１７４４−１７４８；Ｇｒｕｂｅｒら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：５８６０−５８６７，  １９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５３：１７６２−１７６８，  １９９４に記載されるものが含まれる。
【０１６７】
受容体−リガンド活性に関するアッセイには、限定なしに：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎら監修，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第７．２８章，  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｓｔａｔｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ７．２８．１−７．２８．２２）、Ｔａｋａｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：６８６４−６８６８，  １９８７；Ｂｉｅｒｅｒら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６８：１１４５−１１５６，  １９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６９：１４９−１６０，  １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：５９−６８，  １９９４；Ｓｔｉｔｔら，  Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０，  １９９５に記載されるものが含まれる。
【０１６８】
本発明の方法を用いて、ＤＣＬ依存性細胞反応を仲介する１以上のタンパク質をコードする１以上のｍＲＮＡ分子の機能的発現を阻害するアンチセンス分子に関して、スクリーニングすることが可能である。アンチセンス核酸分子は、転写に関して通常の方向に比較して反転しており、そしてしたがって宿主細胞内で発現される標的ｍＲＮＡ分子に相補的であるＲＮＡ転写物を発現する（すなわちアンチセンス核酸分子のＲＮＡ転写物は、ワトソン・クリック塩基対形成を通じて、標的ｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能である）。標的タンパク質の発現に干渉することが可能であるならば、いくつかの異なる方法で、アンチセンス核酸分子を構築可能である。スクリーニングしようとする典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、長さ３０〜４０ヌクレオチドである。アンチセンス核酸分子は、一般的に、標的遺伝子と実質的に同一（しかしアンチセンス方向である）であろう。最少同一性は、典型的には約６５％より大きいであろうが、同一性がより高いと、内因性配列発現の抑制がより有効である可能性がある。約８０％より高い、実質的により高い同一性が好ましいが、約９５％から絶対的な同一性が最も好ましいであろう。
【０１６９】
候補核酸分子は、リボザイム活性を所持することが可能である。したがって、本発明の方法を用いて、ＣＤ４０依存性細胞反応を仲介する１以上のタンパク質をコードする１以上のｍＲＮＡ分子の機能的発現を阻害するリボザイム分子に関して、スクリーニングすることが可能である。リボザイムは触媒性ＲＮＡ分子であり、リボザイムの配列に完全にまたは部分的に相同である配列を有する核酸分子を切断することが可能である。標的ＲＮＡと特異的に対形成し、そして特定の位置でホスホジエステル主鎖を切断して、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活性化するＲＮＡリボザイムをコードする、リボザイム導入遺伝子を設計することが可能である。この切断を行う際、リボザイム自体は改変されず、そしてしたがって再利用され、そして他の分子を切断することが可能である。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を含むと、ＲＮＡ切断活性が与えられ、それによって、アンチセンス構築物の活性が増加する。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計および使用がＨａｓｅｌｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：５８５，  １９８８；米国特許第５，６４６，０２３号もまた参照されたい）に記載され、これらの刊行物はどちらも本明細書に援用される。Ｔａｂｌｅｒら（Ｇｅｎｅ  １０８：１７５，  １９９１）は、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイム技術の利点を単一の構築物中で組み合わせることによって、触媒性ＲＮＡの構築を非常に単純化した。リボザイム触媒作用には、相同性のより小さい領域しか必要とされず、したがって、切断部位が保存されているならば、大きな遺伝子ファミリーの異なるメンバーの抑制を促進することが可能である。
【０１７０】
合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、生物学的に活性である目的のポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子、例えば阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト等の構造的類似体を産生することである。これらの例いずれかを用いて、活性化合物の、より活性であるかまたは安定な型である薬剤、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏでＤＣＬ活性化合物の機能を増進するかまたは該機能に干渉する薬剤を形作ることが可能である（Ｈｏｄｇｓｏｎ  Ｊ（１９９１）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１９−２１）。１つのアプローチにおいて、Ｘ線結晶学によって、核磁気共鳴によって、またはコンピューター相同性モデリングによって、あるいは最も典型的には、これらのアプローチの組み合わせによって、目的の活性化合物の三次元構造を決定する。分子の構造を解明し、そして分子の活性部位（単数または複数）を決定するため、活性化合物の形状および荷電両方を確定しなければならない。より頻繁でないが、相同ポリペプチドの構造に基づいてモデリングすることによって、ポリペプチドの構造に関する有用な情報が得られる可能性がある。どちらの場合も、適切な構造情報を用いて、類似のＤＣＬ様分子を設計するか、有効な阻害剤を同定するか、あるいはＤＣＬポリペプチドまたはＤＣＬ会合基質および／または結合パートナーに結合する小分子を同定する。合理的薬剤設計の有用な例には、Ｂｒａｘｔｏｎ  ＳおよびＷｅｌｌｓ  ＪＡ（１９９２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：７７９６−７８０１）に示すように、改善された活性または安定性を有する分子、あるいはＡｔｈａｕｄａ  ＳＢら（１９９３  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１３：７４２−７４６）に示すように、天然ペプチドの阻害剤、アゴニスト、またはアンタゴニストとして作用する分子が含まれる。アゴニストおよび／またはアンタゴニスト設計、並びにアゴニスト／アンタゴニスト−ＤＣＬポリペプチド相互作用研究を補助するための、分子モデリングソフトウェア系における、ＤＣＬポリペプチド構造情報の使用もまた、本発明に含まれる。本発明の特定の方法は、基質のありうる結合部位に関して、ＤＣＬポリペプチドの三次元構造を解析し、予測される反応部位を取り込んだ新規分子を合成し、そして本明細書にさらに記載するように、新規分子をアッセイすることを含んでなる。
【０１７１】
本明細書にさらに記載するような、機能アッセイによって選択される、標的特異的抗体を単離し、そしてその後、結晶構造を解析することもまた可能である。このアプローチによって、原則として、続く薬剤設計の基礎とすることが可能なファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を得る。機能する薬理学的活性抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ）を生成することによって、ポリペプチド結晶学を完全に回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗ｉｄの結合部位は、元来の抗原の類似体であると予測されるであろう。次いで、抗ｉｄを用いて、化学的または生物学的に産生したペプチドのバンクからペプチドを同定し、そして単離することが可能である。その後、単離ペプチドは、ファーマコアとして働くであろう。
【０１７２】
本発明の精製ＤＣＬポリペプチド（ポリペプチドおよびその断片、突然変異タンパク質、変異体、オリゴマー、融合タンパク質、および他の型を含む）は、多様なアッセイで有用である。例えば、本発明のＤＣＬ分子を用いて、ＤＣＬポリペプチドの結合パートナーが同定可能であり、この結合パートナーをまた用いて、細胞間コミュニケーション、細胞刺激、または免疫細胞活性を調節可能である。あるいは、これらを用いて、細胞間コミュニケーション、細胞刺激経路、または免疫細胞活性を調節する、非結合パートナー分子または物質を同定可能である。
【０１７３】
療法適用
本明細書に提供する方法は、患者にＤＣＬポリペプチドおよび／またはそのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを投与し、それによって、次に特定の条件において役割を果たす、抗原提示細胞上のＤＣＬタンパク質に仲介される生物学的反応を調節することを含んでなる。特定の条件において役割を果たす可能性があるＤＣＬポリペプチド活性には、限定されるわけではないが、抗原結合、インターナリゼーション、プロセシングおよび提示；ＡＰＣ活性化、分化、成熟、ホーミングおよび遊出；結合、および興奮性の方式または阻害性の方式いずれかでの細胞内シグナル伝達経路の調節を含む、細胞間相互作用、それらとともに、自己分泌、傍分泌および／または内分泌様式で作用する因子の分泌を導く経路を通じた細胞外コミュニケーションが含まれる。ＤＣＬポリペプチドを発現しているＡＰＣに結合可能な細胞の例には免疫系の細胞が含まれ、ＤＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞とともにその前駆細胞が含まれる。
【０１７４】
治療には、障害の少なくとも１つの症状の軽減、または疾患重症度の減少などを含む。アンタゴニストは、発展しうる療法剤の構成要素となるために、完全な「治癒」を達成する必要はなく、あるいは疾患のすべての症状または徴候を根絶する必要はない。適切な分野で認識されるように、療法剤として使用される薬剤は、既定の疾患状態の重症度を減少させることが可能であるが、有用な療法剤であるとみなされるために、疾患のすべての徴候を根絶する必要はない。
【０１７５】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、感染性病原体と関連する疾患状態を治療するか、または予防するとともに、感染性病原体に対する免疫反応を増大させることが可能である。１つの態様において、ＤＣＬポリペプチドを発現するＡＰＣ、好ましくはＤＣに、細菌抗原および／またはウイルス抗原をターゲティングする。本発明は、ＡＰＣに細菌抗原および／またはウイルス抗原をターゲティングする組成物を提供する。例えば、１以上のＤＣＬポリペプチドアゴニストを、１以上の細菌抗原またはウイルス抗原に結合させるか、あるいは化学的に連結するか、またはカップリングして、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで、または確立されたｅｘ  ｖｉｖｏ法によって、ＤＣＬポリペプチドを発現しているＡＰＣにおいて、抗原取り込みおよび抗原提示を促進するために、こうした治療が必要な患者に投与する。ＤＣＬアゴニストの例には、例えば、抗ＤＣＬ抗体、またはその誘導体、ＤＣＬ天然リガンド、またはその誘導体およびペプチド擬似体とともに、抗天然リガンド抗体に対して向けられる抗イディオタイプ抗体が含まれる。
【０１７６】
本発明はまた、感染性病原体に関連する疾患状態を治療するかまたは予防するとともに、感染性病原体に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の細菌抗原またはウイルス抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなる前記方法も提供する。
【０１７７】
別の態様において、本発明は、感染性病原体に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の細菌抗原またはウイルス抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなり、ここでＤＣＬポリペプチドがまた、末梢リンパ節に位置するＴ細胞およびＢ細胞への抗原提示のため、末梢リンパ節までの輸送も容易にする、前記方法を提供する。さらなる態様において、ＤＣＬアゴニストを用いて、ＡＰＣ輸送パターンを、排出リンパ節、脾臓等への優先的な輸送など、選択した特定の臓器への輸送に改変することが可能である。
【０１７８】
さらに別の態様において、本発明は、感染性病原体に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の細菌抗原またはウイルス抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなり、ここでＤＣＬポリペプチドがまた、Ｔ細胞への抗原提示のため、末梢リンパ節までの輸送も容易にし、そしてＤＣＬポリペプチドがまた、Ｔ細胞に結合し、そして該細胞を同時刺激するのも容易にする、前記方法を提供する。
【０１７９】
感染性ウイルスの例には：レトロウイルス科（例えばヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称される；および他の単離体、例えばＨＩＶ−ＬＰ））； ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒト・コクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えばデング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）；コロナウイルス科（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えばハンタンウイルス、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ  ｖｉｒｕｓ）、フレボウイルスおよびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ  ｖｉｒｕｓ））；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（大部分のアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘・帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えばアフリカ・ブタ熱ウイルス）；並びに未分類のウイルス（例えば海綿状脳症の病因学的作用因子、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの不全付随体と考えられる）、非Ａ非Ｂ肝炎の病原体（クラス１＝体内感染；クラス２＝非経口感染（すなわちＣ型肝炎））；ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、並びにアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ））が含まれる。
【０１８０】
感染性細菌の例には：ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ライム病ボレリア（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリア属種（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ）（ヒト型結核菌（Ｍ．  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥型結核菌（Ｍ．  ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシ（Ｍ．  ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドネ（Ｍ．  ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、単球症リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ビリダンス群）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ウシ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌属（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム属種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウエルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、フランベジア・トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）が含まれる。
【０１８１】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、真菌感染または寄生虫侵襲に関連する疾患状態を治療し、それとともに、これらの障害に対する免疫反応を増大させることが可能である。1つの態様において、ＤＣＬポリペプチドを発現しているＡＰＣ、好ましくはＤＣに、真菌抗原または寄生虫抗原をターゲティングする。したがって、本発明は、ＡＰＣに真菌抗原または寄生虫抗原をターゲティングする組成物を提供する。１以上のＤＣＬポリペプチドアゴニストを、１以上の真菌抗原または寄生虫抗原に結合させるか、あるいは化学的に連結するか、またはカップリングして、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで、または確立されたｅｘ  ｖｉｖｏ法によって、ＤＣＬポリペプチドを発現しているＡＰＣにおいて、抗原取り込みおよび抗原提示を促進するために、こうした治療が必要な患者に投与する。ＤＣＬアゴニストの例には、例えば、抗ＤＣＬ抗体、またはその誘導体、ＤＣＬ天然リガンド、またはその誘導体およびペプチド擬似体、並びに抗天然リガンド抗体に対して向けられる抗イディオタイプ抗体が含まれる。
【０１８２】
本発明はまた、真菌感染または寄生虫侵襲に関連する疾患状態を治療するとともに、真菌感染または寄生虫侵襲に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の真菌抗原または寄生虫抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなる前記方法も提供する。
【０１８３】
別の態様において、本発明は、真菌感染または寄生虫侵襲に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の真菌抗原または寄生虫抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなり、ここでＤＣＬポリペプチドがまた、末梢リンパ節に位置するＴ細胞およびＢ細胞への抗原提示のため、末梢リンパ節までの輸送も容易にする、前記方法を提供する。
【０１８４】
さらに別の態様において、本発明は、真菌感染または寄生虫侵襲に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の真菌抗原または寄生虫抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなり、ここでＤＣＬポリペプチドがまた、Ｔ細胞への抗原提示のため、末梢リンパ節までの輸送も容易にし、そしてＤＣＬポリペプチドがまた、Ｔ細胞に結合し、そして該細胞を同時刺激するのも容易にする、前記方法を提供する。
【０１８５】
感染性生物の例には、限定されるわけではないが、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、皮膚ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、トラコーマ・クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、鵞口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）等が含まれることが可能である。感染性生物の例には、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が含まれる。
【０１８６】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、多様な血液学的障害および腫瘍学的障害に関連する疾患状態を治療するとともに、これらの障害に対する免疫反応を増大させることが可能である。１つの態様において、ＤＣＬポリペプチドを発現しているＡＰＣ、好ましくはＤＣに、腫瘍抗原をターゲティングする。したがって、本発明は、ＡＰＣに腫瘍抗原をターゲティングする組成物を提供する。１以上のＤＣＬポリペプチドアゴニストを、１以上の腫瘍抗原に結合させるか、あるいは化学的に連結するか、またはカップリングして、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで、または確立されたｅｘ  ｖｉｖｏ法によって、ＤＣＬポリペプチドを発現しているＡＰＣにおいて、抗原取り込みおよび抗原提示を促進するために、こうした治療が必要な患者に投与する。ＤＣＬアゴニストの例には、例えば、抗ＤＣＬ抗体、またはその誘導体、ＤＣＬ天然リガンド、またはその誘導体およびペプチド擬似体、並びに抗天然リガンド抗体に対して向けられる抗イディオタイプ抗体が含まれる。
【０１８７】
本発明はまた、癌、血液学的障害および腫瘍学的障害に関連する疾患状態を治療するとともに、血液学的障害および腫瘍学的障害に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の腫瘍抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなる前記方法も提供する。
【０１８８】
別の態様において、本発明は、血液学的障害および腫瘍学的障害に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の細菌抗原またはウイルス抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなり、ここでＤＣＬポリペプチドがまた、末梢リンパ節に位置するＴ細胞およびＢ細胞への抗原提示のため、末梢リンパ節までの輸送も容易にする、前記方法を提供する。
【０１８９】
さらに別の態様において、本発明は、血液学的障害および腫瘍学的障害に対する免疫反応を増大させる方法であって、１以上の細菌抗原またはウイルス抗原に結合させるか、あるいは化学的にカップリングするかまたは連結した、１以上のＤＣＬアゴニストを、こうした治療が必要な患者に投与することを含んでなり、ここでＤＣＬポリペプチドがまた、Ｔ細胞への抗原提示のため、末梢リンパ節までの輸送も容易にし、そしてＤＣＬポリペプチドがまた、Ｔ細胞に結合し、そして該細胞を同時刺激するのも容易にする、前記方法を提供する。
【０１９０】
腫瘍抗原は、当該技術分野に周知であり、例えばＭｉｎｅｖ，  Ｂ．ら，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  Ｖｏｌ．８１，  Ｎｏ．２，  ｐｐ．１２１−１３９，  １９９９に記載されるものがあり、そしてまた、以下の例に関連する腫瘍抗原を含むことも可能である。腫瘍抗原は、単離された、すなわち部分的に精製された細胞会合型または融合タンパク質のある型であることが可能である。
【０１９１】
血液学的障害および腫瘍学的障害の例には、急性骨髄性白血病、エプスタイン−バーウイルス陽性上咽頭癌、神経膠腫、結腸癌、胃癌、前立腺癌、腎細胞癌、子宮頚癌および卵巣癌、肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）が含まれ、癌関連悪液質、疲労、無力症、悪液質の傍腫瘍性症候群および高カルシウム血症が含まれる。さらに、肉腫、骨肉種、並びに腺癌（例えば乳癌）などの癌腫を含む固形腫瘍；メラノサイト母斑、放射状および垂直増殖相黒色腫を含む、黒色新生物；脂漏性角化症、光線角化症、基底細胞癌および扁平上皮癌を含む扁平細胞新生物が含まれる。さらに、急性骨髄性白血病、慢性または急性リンパ芽球性白血病および毛様細胞白血病を含む白血病を治療可能である。多発性骨髄腫を含む、浸潤性転移能力を持つ他の悪性腫瘍を、本発明の化合物、組成物および併用療法で治療することが可能である。さらに、本発明を用いて、慢性疾患の貧血、ファンコニーの再生不良性貧血を含む再生不良性貧血；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；脊髄異形成症候群（不応性貧血、環状鉄芽球を伴う不応性貧血、過剰な芽球を伴う不応性貧血、急性転化を来たした過剰な芽球を伴う不応性貧血を含む）；骨髄線維症／骨髄化生；および鎌状赤血球血管閉塞発症を含む、貧血および血液学的障害を治療することが可能である。
【０１９２】
多様なリンパ増殖性障害もまた、治療可能であり、これらの障害には、自己免疫リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、慢性リンパ芽球白血病、毛様細胞白血病、慢性リンパ性白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、外套細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、エプスタイン−バーウイルス陽性Ｔ細胞リンパ腫、細網肉腫、ホジキン病、びまん性攻撃的リンパ腫、急性リンパ性白血病、Ｔガンマリンパ増殖性疾患、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（すなわち菌状息肉症）およびセザリー症候群が含まれる。
【０１９３】
移植に関連する障害、例えば移植片対宿主病、並びに心臓、肝臓、肺、皮膚、腎臓または他の臓器移植を含む、固形臓器移植から生じる合併症を、開示するＤＣＬポリペプチドで治療可能である。ＤＣＬポリペプチドを投与して、例えば皮膚移殖を促進し、そして／または人工的な皮膚移殖片の分化を抑制するとともに、肺移植後の閉塞性細気管支炎発症を予防するかまたは阻害することが可能である。
【０１９４】
本発明はまた、自己免疫および炎症に関連する障害および症状を治療する組成物および方法も提供する。この例には、関節炎、糖尿病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、溶血性貧血とともに、当該技術分野に周知の疾患および状態が含まれる。１つの態様において、ＤＣＬポリペプチド、そのアゴニストおよび／またはアンタゴニストを、自己免疫または炎症に関連する１以上の抗原と組み合わせて用いて、それによって、抗原特異的Ｔ細胞寛容を誘導する。
【０１９５】
ＤＣＬ薬剤組成物の投与
本発明は、有効量のタンパク質（ＤＣＬポリペプチド、その類似体、断片、誘導体、融合タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニスト）並びに適切な希釈剤およびキャリアーを含んでなる薬剤組成物とともに、これらの薬剤組成物を用いて、上述の多様な疾患を治療するかまたは予防する方法、あるいはこれらの疾患に対する免疫反応を増大させる方法を提供する。可溶性サイトカイン受容体またはサイトカイン、あるいは他の免疫制御分子と組み合わせた、ＤＣＬまたは相同体の使用もまた、意図される。さらに、可溶性ＤＣＬまたは相同体をコードするＤＮＡもまた有用であろう；当該技術分野に知られる方法いずれかによって、移植しようとする組織または臓器を、該ＤＮＡでトランスフェクションすることが可能である。
【０１９６】
療法的使用のため、徴候に適した方法で治療するため、精製タンパク質を患者、好ましくはヒトに投与する。したがって、例えば免疫機能を制御するために投与されるＤＣＬタンパク質組成物は、多量（ｂｏｌｕｓ）注射、連続注入、移植物からの徐放、または他の適切な技術によって投与可能である。典型的には、療法剤は、生理学的に許容しうるキャリアー、賦形剤または希釈剤と組み合わせて、精製ＤＣＬを含んでなる組成物の形で投与されるであろう。こうしたキャリアーは、使用する投薬量および濃度で、レシピエントに毒性でない。
【０１９７】
通常、こうしたタンパク質組成物の調製は、本発明のタンパク質を、緩衝剤、アスコルビン酸などの酸化防止剤、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオンおよび他の安定化剤、並びに賦形剤と合わせることを含む。中性緩衝生理食塩水または同種血清アルブミンと混合した生理食塩水は、適切な希釈剤の典型である。好ましくは、産物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えばスクロース）を用いた凍結乾燥物として配合される。適切な投薬量を試験で決定可能である。投与量および投与頻度は、もちろん、治療する徴候の性質および重症度、望ましい反応、患者の状態などの要因に応じるであろう。
【０１９８】
適切なアゴニストには、上述のものおよびその変異体に加えて、ペプチド、小有機分子、ペプチド擬似体、抗体等が含まれる。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体；損なわれていない抗体または一部切除抗体、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ；異種抗体；同種抗体；同系抗体；またはその修飾型、例えばヒト化抗体、キメラ抗体などであることが可能である。
【０１９９】
多くの場合、アゴニストはポリペプチド、抗体またはその断片などであろうが、比較的高い特異性および親和性を提供する他の分子もまた、使用可能である。コンビナトリアルライブラリーは、必要な結合特性を有するオリゴペプチド以外の化合物を提供する。
【０２００】
候補剤は、多くの化学的種類を含むが、典型的には、これらは有機分子、好ましくは５０ダルトンより多く、そして２，５００ダルトン未満である分子量を有する小有機化合物である。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでなり、そして典型的には、少なくとも１つの、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの官能化学基を含む。候補剤はしばしば、上述の官能基の１以上の代わりに環状炭素または複素環構造および／または芳香族または多環芳香族構造を含んでなる。候補剤はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造的類似体または組み合わせを含む生体分子間にも見られる。
【０２０１】
候補剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む、非常に多様な供給源から得られる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現を含む、非常に多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および指定合成には、多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形の天然化合物ライブラリーが入手可能であるか、または容易に産生される。さらに、天然または合成的に産生したライブラリーおよび化合物が、慣用的な化学的手段、物理的手段および生化学的手段を通じて、容易に修飾される。既知の薬理学的剤を、指定またはランダム化学的修飾、例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に供して、構造的類似体を産生することが可能である。
【０２０２】
ＤＣＬポリペプチドおよび核酸の診断使用および他の使用
本発明が提供するＤＣＬポリペプチドをコードする核酸は、多くの診断または他の有用な目的に使用可能である。本発明の核酸は、解析、性質決定または療法使用のために組換えポリペプチドを発現するため；対応するポリペプチドを（恒常的に、あるいは組織分化もしくは発生の特定の時期に、または疾患状態において）優先的に発現する組織のマーカーとして；染色体を同定するかまたは関連する遺伝子位をマッピングするための染色体マーカーまたはタグとして（標識した場合）；潜在的な遺伝子障害を同定するために患者における内因性ＤＮＡ配列と比較するために；ハイブリダイズしそしてしたがって新規関連ＤＮＡ配列を発見するためのプローブとして；遺伝子フィンガープリンティングのためのＰＣＲプライマーを導くための情報供給源として；他の新規核酸を発見する過程において、既知の配列を「取り去る（ｓｕｂｔｒａｃｔ−ｏｕｔ）」ためのプローブとして；発現パターンの検査を含む、「遺伝子チップ」または他の支持体に付着するオリゴマーを選択し、そして作成するため；ＤＮＡ免疫技術を用いて、抗ポリペプチド抗体を作成するため；抗ＤＮＡ抗体を作成するかまたは別の免疫反応を誘発するための抗原として、そして遺伝子治療のために使用可能である。ＤＣＬポリペプチドおよび断片化ポリペプチドの使用には、限定されるわけではないが、以下が含まれる：ポリペプチドの精製およびその活性の測定；搬送剤；療法および研究試薬；分子量マーカーおよび等電点電気泳動マーカー；ペプチド断片化の対照；未知のポリペプチドの同定；および抗体の調製。これらの使用に適したいずれかのまたはすべての核酸は、製品として商品化するため、試薬等級またはキット形式に発展させることが可能である。上に列挙する使用を実行する方法は、当該技術分野に周知である。こうした方法を開示する参考文献には、限定なしに、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｅ．Ｆ．  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ監修，  １９８９、および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ．  Ｋｉｍｍｅｌ監修，  １９８７が含まれる。
【０２０３】
プローブおよびプライマー。開示するＤＣＬ核酸、およびその断片の組み合わせの使用の中に、プローブまたはプライマーとしての断片の使用がある。こうした断片は、一般的に、ＤＮＡ配列の少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドを含んでなる。他の態様において、ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ配列の少なくとも３０、または少なくとも６０の隣接するヌクレオチドを含んでなる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を与える基本的なパラメーターおよび適切な条件を考案するための手引きは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に示され、そして本明細書に詳細に上述している。遺伝暗号の知識を、上に示すアミノ酸配列と組み合わせて用い、縮重オリゴヌクレオチドの組を調製することが可能である。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、プライマーとして有用であり、それによってＤＮＡ断片を単離して、そして増幅する。特定の態様において、ヒト遺伝子または非ヒト遺伝子ライブラリー用のプローブとして、縮重プライマーを使用することが可能である。こうしたライブラリーには、限定されるわけではないが、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー、およびエレクトロニックＥＳＴ（発現配列タグ）またはＤＮＡライブラリーさえ含まれるであろう。
【０２０４】
診断法および遺伝子治療。当業者は、ＤＣＬポリペプチドをコードする核酸、および開示する断片、並びにこれらの核酸の組み合わせを用い、周知の技術を用いて、これらのポリペプチドに対応する遺伝子と関連する異常を解析することが可能である。これによって、このマーカーが再編成されているかまたは欠失している状態を識別することが可能になる。さらに、本発明の核酸またはその断片を位置マーカーとして用いて、未知の位置の他の遺伝子をマッピングすることが可能である。本発明の核酸に相当する遺伝子の不全または不十分な量によって（直接または間接的に）仲介されるいかなる障害に対する治療を開発するのにも、該ＤＮＡが使用可能である。天然ヌクレオチド配列の本明細書の開示により、不全遺伝子の検出、および正常遺伝子でのその置換が可能になる。不全遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイにおいて、そして本明細書に開示する天然ヌクレオチド配列と、この遺伝子に不全を宿すると推測されるヒト由来の遺伝子のものとを比較することによって、検出可能である。
【０２０５】
結合パートナーに関してスクリーニングする方法。本発明のポリペプチドを、各々、結合パートナーに関してスクリーニングするかまたは結合パートナーを同定する方法における試薬として用いることが可能である。例えば、ＤＣＬポリペプチドを固体支持物質に付着させることが可能であり、そしてアフィニティークロマトグラフィーに類似の方式で、その結合パートナーに結合することが可能である。特定の態様において、慣用法によってポリペプチドを固体支持体に付着させる。一例として、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基と反応するであろう官能基を含有するクロマトグラフィーカラムが入手可能である（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）。代替法において、ポリペプチド／Ｆｃポリペプチド（上に論じるようなもの）を、Ｆｃ部分との相互作用を通じて、プロテインＡまたはプロテインＧ含有クロマトグラフィーカラムに付着させる。ＤＣＬポリペプチドはまた、ＤＣＬ結合パートナーを発現する細胞を同定するのにも使用を見出す。精製ＤＣＬポリペプチドを、カラムクロマトグラフィーマトリックスなどの固相または類似の適切な支持体に結合させる。例えば、磁気微小球体を該ポリペプチドでコーティングし、そして磁場を通じてインキュベーション容器中に保持してもよい。潜在的な結合パートナー発現細胞を含有する細胞混合物の懸濁物または単離細胞の細胞溶解物を、ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。細胞表面上に結合パートナーを発現している細胞を固定ポリペプチドに結合させ、そして、未結合細胞を洗い流す。別の形式において、細胞溶解物由来の細胞内結合パートナーまたはＤＣＬ基質をＤＣＬポリペプチドに結合させ、そして未結合タンパク質を除去する。あるいは、検出可能部分にＤＣＬポリペプチドをコンジュゲート化し、その後、結合パートナー発現に関して試験しようとする細胞とインキュベーションしてもよい。インキュベーション後、未結合標識物質を除去し、そして細胞上の検出可能部分の存在または非存在を測定する。さらなる代替法において、結合パートナーを発現していると推測される細胞混合物または細胞溶解物を、ビオチン化ポリペプチドとインキュベーションする。インキュベーション時間は、十分な結合を確実にするため、典型的には少なくとも連続１時間である。その後、アビジンでコーティングしたビーズを充填したカラムに、生じた混合物を通過させ、それによってアビジンに対するビオチンの高い親和性が、ビーズへの所望の細胞または結合パートナーの結合を提供する。アビジンでコーティングしたビーズの使用法は知られている（Ｂｅｒｅｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０Ｄ：２３９，  １９８６を参照されたい）。非結合成分を除去する洗浄、および結合細胞または結合パートナーの遊離は、慣用法を用いて行う。ある場合では、結合パートナーに関してスクリーニングするかまたは結合パートナーを同定する上述の方法を用いるかまたは修飾して、こうした結合パートナー分子または該分子を発現している細胞を単離するかまたは精製することもまた、可能である。
【０２０６】
キャリアーおよび搬送剤。該ポリペプチドはまた、付着する剤を、同定された結合パートナーを所持している細胞に搬送するためのキャリアーとしての使用も見出す。したがって、該ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、診断用剤または療法剤をこうした細胞（あるいは、細胞表面上に結合パートナーを発現することが見出された、他の細胞種）に搬送するのに使用可能である。ポリペプチドに付着可能な検出可能（診断用）剤および療法剤には、限定されるわけではないが、毒素、他の細胞傷害性剤、薬剤、放射性核種、発色団、比色反応または蛍光定量反応を触媒する酵素等が、意図する適用にしたがって選択される特定の剤と共に含まれる。毒素の中には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ、リボソーム不活性化ポリペプチド、トリコセセンなどのマイコトキシン、並びにそれらの誘導体および断片（例えば一本鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定されるわけではないが、123Ｉ、131Ｉ、99mＴｃ、111Ｉｎ、および76Ｂｒが含まれる。療法使用に適した放射性核種の例は、131Ｉ、211Ａｔ、77Ｂｒ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、212Ｐｂ、212Ｂｉ、109Ｐｄ、64Ｃｕ、および67Ｃｕである。こうした剤は、いかなる適切な慣用法によって、ポリペプチドに付着させることも可能である。ポリペプチドは、例えば、所望の剤上の官能基と反応し、共有結合を形成することが可能である、アミノ酸側鎖上の官能基を含んでなる。あるいは、ポリペプチドまたは剤を誘導体化して、所望の反応性官能基を生成するか、または付着させることが可能である。誘導体化には、多様な分子をポリペプチドに付着させるのに利用可能である、二官能性カップリング試薬（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州ロックフォード）の１つの付着を伴うことが可能である。ポリペプチドを放射標識するいくつかの技術が知られる。例えば、適切な二官能キレート剤を用いることによって、放射性核種金属をポリペプチドに付着させることが可能である。ポリペプチドおよび適切な診断用剤または療法剤を含んでなるコンジュゲート（好ましくは共有結合したもの）をこうして調製する。該コンジュゲートを、特定の適用に適した量で投与するか、または別の方式で使用する。
【０２０７】
ＤＣＬポリペプチドに対する抗体
本発明のポリペプチドと免疫反応性である抗体を本明細書に提供する。こうした抗体は、抗体の抗原結合部位を介して（非特異的結合と対照的に）、ポリペプチドに特異的に結合する。本発明において、特異的に結合する抗体は、ＤＣＬポリペプチド、相同体、および変異体を特異的に認識して、そしてこれらの分子と結合するが、他の分子とは結合しないであろうものである。１つの好ましい態様において、抗体は、本発明のポリペプチドに特異的であり、そして他のポリペプチドとは交差反応しない。この方式で、上述のようなＤＣＬポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド等を、それと免疫反応性である抗体を産生する際の「免疫原」として使用することが可能である。
【０２０８】
より具体的には、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含有する。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖でもまたは高次構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）（断続的）でもどちらであることも可能である。エピトープは、当該技術分野に知られるいかなる方法によっても同定可能である。したがって、本発明の１つの側面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。こうしたエピトープは、以下により詳細に記載するように、抗体、特にモノクローナル抗体を作成するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチド由来のエピトープは、アッセイにおいて研究試薬として、そしてポリクローナル血清または培養ハイブリドーマの上清などの物質から、特異的に結合する抗体を精製するために、使用可能である。こうしたエピトープまたはその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的または酵素的切断、あるいは組換えＤＮＡ技術の使用など、当該技術分野に周知の技術を用いて、産生することが可能である。
【０２０９】
本発明のポリペプチドのエピトープによって誘発可能な抗体に関しては、エピトープが単離されていてもまたはポリペプチドの一部のままであっても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体のどちらをも慣用的技術によって調製可能である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｋｅｎｎｅｔら（監修），  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９８０）；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（米国特許第４，３７６，１１０号）；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，  １９８４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３：３００１−３００５；Ｃｏｌｅら，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）；およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ．  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．７７−９６）を参照されたい。本発明のポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書に意図される。こうしたハイブリドーマは、慣用的技術によって産生しそして同定することが可能である。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは高力価でｍＡｂが産生されるため、これが現在好ましい産生法である。こうしたハイブリドーマ細胞株を産生するための１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫し；免疫した動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し；そして該ポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することを含んでなる。抗体産生のため、１以上の以下：ＤＣＬポリペプチド、ＤＣＬポリペプチドの断片、ＤＣＬポリペプチドの機能的同等物、またはＤＣＬポリペプチドの突然変異体型を注射することによって、多様な宿主動物を免疫することが可能である。こうした宿主動物には、限定されるわけではないが、ウサギ、モルモット、マウス、およびラットが含まれる。宿主種に応じて、多様なアジュバントを用いて、免疫学的反応を増加させることが可能であり、こうしたアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））および坐瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。モノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。こうしたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであることも可能である。
【０２１０】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｔａｋｅｄａら，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４：４５２−４５４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，  １９８４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，  １９８４，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６４３−６４６；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２６８−２７０）を用いることが可能である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、ブタｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである。本発明のモノクローナル抗体にはまた、ネズミモノクローナル抗体のヒト化型も含まれる。こうしたヒト化抗体は、既知の技術によって調製可能であり、そして抗体をヒトに投与した際、減少した免疫原性という利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常領域を含んでなる。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を欠く）を含んでなることが可能である。キメラおよびさらなる操作モノクローナル抗体の産生法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，  １９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９，  １９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９３４，  １９８９）、並びにＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９，  Ｃａｎ，  １９９３）に記載されるものが含まれる。抗体をヒト化するのに有用な技術はまた、米国特許第６，０５４，２９７号に論じられる。トランスジェニック的に抗体を生成する方法は、ＧＢ  ２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および第５，５４５，８０６号、並びに関連特許に見出すことが可能である。好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒトのものであるかまたはヒト化されており；こうしたヒト抗体またはヒト化抗体を生成する技術もまた周知であり、そして例えばＭｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ（ニュージャージー州プリンストン）およびＡｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州ファーモント）から商業的に入手可能である。別の好ましい態様において、ヒト抗体可変ドメインのファージディスプレーライブラリーをスクリーニングすることによって、ヒトで使用するための完全なヒト抗体を産生する（Ｖａｕｇｈａｎら，  １９９８，  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６（６）：５３５−５３９；および米国特許第５，９６９，１０８号）。
【０２１１】
特異的エピトープを認識する抗原結合抗体断片は、既知の技術によって生成可能である。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが：抗体分子のペプシン消化によって産生可能なＦ（ａｂ’）2断片および（ａｂ’）2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し（Ｈｕｓｅら，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速でそして容易な同定を可能にしうる。一本鎖抗体の産生に関して記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎら，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；およびＷａｒｄら，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６）を適応させ、ＤＣＬ遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生することもまた可能である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を連結して一本鎖ポリペプチドを生じることによって形成する。こうした一本鎖抗体はまた、細胞内でも有用である（すなわち細胞内発現抗体として）可能性があり、例えば、Ｍａｒａｓｃｏら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２２３−２３８，  １９９９）に記載されるように、ＨＩＶ感染の遺伝子治療に有用である可能性がある。さらに、その後、当業者に周知の技術を用いて、ＤＣＬポリペプチドに対する抗体を利用して、ＤＣＬポリペプチドを「模倣」し、そしてＤＣＬポリペプチドの結合パートナーに結合することが可能な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能である（例えばＧｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，  １９９３，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７（８）：２４２９−２４３８を参照されたい）。
【０２１２】
本発明のポリペプチドと免疫反応性である抗体には、二重特異性抗体（すなわち第一の抗原結合ドメインを介して本発明のポリペプチドと免疫反応性であり、そしてまた、第二の抗原結合ドメインを介して異なるポリペプチドとも免疫反応性である抗体）が含まれる。多様な二重特異性抗体が調製されており、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方で有用であることが見出されている（例えば米国特許第５，８０７，７０６号；並びにＣａｏおよびＳｕｒｅｓｈ，  １９９８，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ９：６３５−６４４を参照されたい）。二重特異性抗体を調製する多くの方法が当該技術分野に知られ、２つの異なるハイブリドーマを融合させることによって形成する、クワドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）、およびハイブリドーマをリンパ球と融合させることによって形成する、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）などのハイブリッド−ハイブリドーマの使用が含まれる（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，  １９８３，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５４０；米国特許第４，４７４，８９３号；および米国特許第６，１０６，８３３号）。米国特許第６，０６０，２８５号は、二重特異性抗体を産生する方法を開示し、該方法においては少なくとも、第一の特異性を有する抗体の軽鎖および重鎖可変部の遺伝子を、第二の特異性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞にトランスフェクションする。抗体断片の化学的カップリングもまた、２つの異なる抗原に対する特異性を有する抗原結合分子を調製するのに用いられてきている（Ｂｒｅｎｎａｎら，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３；Ｇｌｅｎｎｉｅら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９８７，  １３９：２３６７−２３７５；および米国特許第６，０１０，９０２号）。二重特異性抗体はまた、例えばＫｏｓｔｅｌｎｙら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−４５５３；１９９２）に記載されるように、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質（優先的にヘテロ二量体を形成する）由来のロイシンジッパー部分を用いることによって、組換え手段を介して産生可能である。米国特許第５，５８２，９９６号は、二重特異性抗体の産生において、ヘテロ二量体形成を促進する、相補的相互作用ドメイン（例えばロイシンジッパー部分または他の錠および鍵相互作用ドメイン構造）の使用を開示する。米国特許第５，９５９，０８３号に記載されるように、抗体のＦ（ａｂ’）２断片の重鎖をコードするＤＮＡと、第二のＦ（ａｂ’）２分子の重鎖（ＣＨ１ドメインがＣＨ３ドメインで交換されているもの）をコードするＤＮＡ、または抗体の一本鎖ＦＶ断片をコードするＤＮＡいずれかを融合させることによって、四価二重特異性分子が調製可能である。哺乳動物細胞において、対応する軽鎖の遺伝子とともに、生じた融合遺伝子を発現させると、選択した抗原に対する特異性を有する四価二重特異性分子が生じる。二重特異性抗体はまた、米国特許第５，８０７，７０６号に記載されるように産生可能である。一般的に、該方法は、第一のポリペプチドの接触面に隆起を導入し（小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖と交換することによって構築する）、そして第二のポリペプチドの接触面に、対応する空洞を導入する（大きいアミノ酸側鎖を、より小さいものと交換することによって調製する）ことを伴う。さらに、２つの可変ドメインを共有結合することによって一本鎖可変断片（ｓＦｖ）が調製されてきており；生じた抗体断片は、２つの可変ドメイン間の柔軟なリンカーの長さに応じて、二量体または三量体を形成することが可能である（Ｋｏｒｔｔら，  １９９７，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：４２３−４３３）。
【０２１３】
こうした抗体を同定可能なスクリーニング法が周知であり、そして例えば免疫アフィニティークロマトグラフィーを伴う可能性がある。抗体は、アゴニスト（すなわちリガンド模倣）特性に関してスクリーニング可能である。こうした抗体は、細胞表面ＤＣＬへの結合に際して、ＤＣＬ結合パートナーが細胞表面ＤＣＬに結合した際に誘導される生物学的影響と類似の生物学的影響（例えば生物学的シグナルの伝達）を誘導する。アゴニスト抗体を用いて、ＤＣＬが仲介する細胞刺激経路または細胞間コミュニケーションを誘導可能である。２つの別個のアッセイを用いたスクリーニングによって、または二重特異性抗体が、第一の抗原および第二の抗原（後者は検出可能部分にカップリングされている）間の架橋として働くアッセイを用いたスクリーニングによって、二重特異性抗体を同定可能である。
【０２１４】
ＤＣＬの結合パートナーへの本発明のＤＣＬポリペプチドの結合を遮断可能な抗体を用いて、こうした結合から生じるＤＣＬが仲介する細胞間コミュニケーションまたは細胞刺激を阻害可能である。こうした遮断抗体は、ＤＣＬの、ＤＣＬ結合パートナーを発現している特定の細胞への結合を阻害する能力に関して、抗体を試験することによるなど、いかなる適切なアッセイ法を用いて同定することも可能である。あるいは、遮断抗体は、標的細胞への可溶性ＤＣＬの結合から生じる生物学的影響を阻害する能力に関するアッセイにおいて、同定可能である。例えば、抗体は、ＤＣＬ結合パートナーが仲介する細胞刺激経路を阻害する能力に関して、アッセイ可能である。こうした抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法で使用可能であるし、またはｉｎ  ｖｉｖｏで投与して、抗体を生成した実体によって仲介される生物学的活性を阻害することが可能である。このように、細胞表面結合パートナー受容体とＤＣＬの相互作用によって（直接または間接的に）引き起こされるかまたは悪化される障害を治療することが可能である。療法は、ＤＣＬ結合パートナーが仲介する生物学的活性を阻害するのに有効な量の遮断抗体を、哺乳動物にｉｎ  ｖｉｖｏ投与することを伴う。一般的に、こうした療法の使用には、モノクローナル抗体が好ましい。１つの態様において、抗原結合抗体断片を使用する。ＤＣＬに対して向けられる抗体、および生理学的に許容しうる希釈剤、賦形剤、またはキャリアーを含んでなる組成物を、本明細書に提供する。ＤＣＬポリペプチドを含有する組成物に関して、こうした組成物の適切な構成要素を以下に記載する。
【０２１５】
本明細書にやはり提供するのは、抗体に付着した検出可能（例えば診断用）または療法剤を含んでなるコンジュゲートである。こうした剤の例を上述する。該コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法またはｉｎ  ｖｉｖｏ法に使用を見出す。本発明の抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかの、本発明のポリペプチドまたは断片の存在を検出するアッセイにおいても使用可能である。抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、本発明のポリペプチドまたは断片を精製する際にも使用可能である。
【０２１６】
実施例
本発明をどのように行い、そして用いるかの完全な開示および説明を一般の当業者に提供するため、以下の実施例を提案し、そして該実施例は、本発明とみなされる範囲を限定することを意図しない。用いる数値（例えば量、温度、濃度など）が正確であるのを確実にする努力を行ったが、いくつかの実験の誤差および偏差は、許容されなければならない。別に示さない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均分子量であり、温度はセ氏であり、そして圧は大気圧であるかまたは大気圧に近い。
【０２１７】
（実施例１）
骨髄由来ネズミＤＣの生成およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  ＣｈｉｐTMマイクロアレイ実験用の標識標的の調製
マウス：
メスＣ５７ＢＬ／１０マウス（８〜１２週齢）をＴａｃｏｎｉｃ（ニューヨーク州ジャーマンタウン）から得た。すべてのマウスは特定病原体未感染条件下で飼育された。
【０２１８】
細胞調製物：
２％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ゲイザースバーグ）を補ったリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２ｍｌで、大腿骨を勢いよく洗浄する（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）ことによって、骨髄（ＢＭ）細胞を単離した。ＢＭ細胞を一度遠心分離し、そしてその後、Ｔｒｉｓ−塩化アンモニウム中に３７℃で２分間再懸濁して、赤血球を溶解した。細胞を再び遠心分離して、そしてその後、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、１ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸ナトリウム、２．５ｍｍｏｌ／Ｈｅｐｅｓ緩衝液  ｐＨ７．４、ビタミン類、５．５ｘ１０-5ｍｏｌ／ｌ  ２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−グルタミン（ＰＳＧ）、および１０％ＦＢＳを補ったマッコイの培地からなる培地（ＣＭ）中に再懸濁した（すべての培地試薬はＧｉｂｃｏから得た）。
【０２１９】
ＤＣ培養物：
１ｘ１０6／ｍｌ、６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ／Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州アクトン）中、２００ｎｇ／ｍｌ（１８０単位／ｍｌ）ヒトＦｌｔ−３Ｌ（Ａｍｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を含有するＣＭ中で、ＢＭ細胞を９日間培養した。空気中に５％ＣＯ2を含有する加湿雰囲気中、３７℃で培養をインキュベーションした。勢いよくピペッティングし、そして非接着細胞を除去し、その後、各ウェルを室温で、Ｃａ++またはＭｇ++を含まないＰＢＳで２回洗浄して、ゆるく接着した細胞を取り除き、これを非接着分画とともにプールすることによって、培養からＤＣを採取した。
【０２２０】
宿主において、適切な増殖因子をあらかじめ投与することを通じて、機能的に成熟した樹状細胞の総数を増加させうることが当該技術分野において周知であり、該増殖因子は、１以上のＦｌｔ３−Ｌ；ＧＭ−ＣＳＦ；Ｇ−ＣＳＦ；ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４；ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３などであることが可能である。例えばＦｌｔ３−Ｌ（Ａｍｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、ワシントン州シアトル）が機能的に成熟した多数の樹状細胞の生成を、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ両方で刺激することが見出されてきている（米国出願第０８／５３９，１４２号、１９９５年１０月４日提出）。Ｆｌｔ３−Ｌは、どちらも本明細書に援用されるＥＰ  ０６２７４８７  Ａ２およびＷＯ  ９４／２８３９１に記載されるポリペプチドの種類を指す。他の有用なサイトカインには、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；各々本明細書に援用される、米国特許第５，１０８，９１０号、および第５，２２９，４９６号に記載される）が含まれる。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質（すなわちＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３のＣ末端からＮ末端融合体）が使用可能である。こうした融合タンパク質は当該技術分野に周知であり、そして各々本明細書に援用される米国特許第５，１９９，９４２号；第５，１０８，９１０号および第５，０７３，６２７号に記載される。当該技術分野に知られ、そして実行されるように、搬送の多様な経路および措置が使用可能である。例えば、剤がＦｌｔ３−Ｌである場合、Ｆｌｔ３−Ｌを毎日投与することが可能であり、この場合、用量は、約１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より一般的には、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与は局所部位である、例えば皮下投与であることが可能であり、または全身である、例えば腹腔内投与、静脈内投与などであることが可能である。
【０２２１】
Ｆｌｔ３−Ｌ誘導ＤＣを１０日間培養した。第１０日に、培養を以下の刺激／条件で、４時間刺激した：（ａ）１０ｎｇ／ｍｌ組換えネズミＧＭ−ＣＳＦ、１０００Ｕ／ｍｌヒト；（ｂ）５００Ｕ／ｍｌ  ＩＦＮ−Ａ／Ｄ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）；（ｃ）１μｇ／ｍｌ大腸菌（０２１７：Ｂ８）由来ＬＰＳ（Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイト）および（ｄ）刺激なし。
【０２２２】
ＲＮＡ単離：
４時間の刺激後、細胞を直ちにＴｒｉｚｏｌTM（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で溶解し、そして製造者の推奨にしたがってＲＮＡを単離した。単離したＲＮＡをＱｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）のＲＮｅａｓｙTMキットを用いて、さらに単離した。
【０２２３】
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘTMアレイへのハイブリダイゼーション用の標識ＲＮＡ標的の調製：
本質的に、本明細書に援用されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃｏｒｐ．、カリフォルニア州サンタクララ）に記載されるように、標的ＲＮＡの調製およびマイクロアレイチップへのハイブリダイゼーションを行った。簡潔には、１０μｇの総ＲＮＡを用いて、これをまず、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩTM逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびバクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードするプライマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡに変換して、標的試料を調製した。その後、一本鎖ｃＤＮＡを二本鎖ｃＤＮＡに変換した。Ｔ７プロモーターを用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびビオチン化ヌクレオチド三リン酸を含有する反応において、標識ｃＲＮＡ標的を生成した。精製後、ｃＲＮＡを化学的に断片化して平均５０〜２００塩基の長さにし、そしてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップに、４５℃で一晩ハイブリダイズさせた。このｃＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｅ  ＣｈｉｐTMアレイ上に合成された短いＤＮＡプローブに相補的である。ハイブリダイゼーション後、チップをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ流体工学ステーション中でプロセシングした。チップを洗浄し、ストレプトアビジン・フィコエリトリン（ＳＡＰＥ）で染色し、その後、ビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジンで染色し、そして最後に、第二回のＳＡＰＥを行った。
【０２２４】
（実施例２）
抗体調製
以下の実施例は、ＤＣＬポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を調製する方法を例示する。米国特許第４，４１１，９９３号に記載されるものなどの他の慣用技術が使用可能である。免疫原調製、アジュバントおよび免疫プロトコルの選択は、当該技術分野に周知の方法であり、そして例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｄ（監修），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８８）に見出すことが可能である。こうした抗体を生成するのに使用可能な適切な免疫原には、限定されるわけではないが、精製ＤＣＬポリペプチド、その免疫原性断片、および高レベルのＤＣＬポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する細胞が含まれる。例えばＰａｒｄｏｌｌおよびＢｅｃｋｅｒｌｅｇによってＩｍｍｕｎｉｔｙ  ３：１６５，  １９９５に概説されるように、１以上のＤＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡもまた、免疫原として使用可能である。
【０２２５】
げっ歯類（例えばＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＬｅｗｉｓラット）をアジュバント（完全または不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、またはＲｉｂｉアジュバントＲ７００（Ｒｉｂｉ、モンタナ州ハミルトン）などの別のアジュバントなど）中で乳化したＤＣＬポリペプチド免疫原で免疫し、そして１０〜１００マイクログラムの範囲の量を、皮下注射または腹腔内注射する。ＤＮＡを皮内投与（Ｒａｚら，  １９９４，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：９５１９）または筋内投与（Ｗａｎｇら，  １９９３，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：４１５６）することが可能であり；ＤＮＡに基づく抗原には、生理食塩水が適切な希釈剤であることが見出されている。１０日〜３週間後、免疫した動物をさらなる免疫原で追加免疫し、そしてその後、毎週、隔週（ｂｉ−ｗｅｅｋｌｙ）、または３週ごとの免疫スケジュールで、定期的に追加免疫する。
【０２２６】
後眼窩出血または尾先端切除によって、血清試料を定期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、免疫沈降、またはＤＣＬポリペプチド結合パートナーへのＤＣＬポリペプチドの結合の阻害のＦＡＣＳ解析などの他の適切なアッセイによって、ＤＣＬポリペプチド抗体に関して試験する。適切な抗体力価を検出した後、陽性動物に、生理食塩水中のＤＣＬポリペプチドを最後に一度、静脈内注射する。３〜４日後、動物を屠殺し、そして脾臓細胞を採取し、そして該脾臓細胞をネズミ骨髄腫細胞株、例えばＮＳ１または好ましくはＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）に融合させる。これらの細胞融合によってハイブリドーマ細胞が生成され、これを、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、および脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）選択培地中、マルチマイクロタイタープレートに蒔く。
【０２２７】
ハイブリドーマ細胞を、Ｅｎｇｖａｌｌら（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．  ８：８７１，  １９７１）および米国特許第４，７０３，００４号に開示される技術の適応によって、精製したＤＣＬポリペプチドに対する反応性に関して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることが可能である。好ましいスクリーニング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎｎら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４４：４２１２，  １９９０）に記載される抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を、同系げっ歯類に腹腔内注射して、高濃度の（例えば１ミリリットルあたり、１ミリグラムより多い）抗ＤＣＬポリペプチドモノクローナル抗体を含有する腹水を産生することが可能である。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、多様な技術によって、フラスコまたはローラーボトル中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させることが可能である。モノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿によって、続いてゲル排除クロマトグラフィーによって、精製可能である。あるいは、プロテインＡまたはプロテインＧに対する抗体の結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーもまた使用可能であり、ＤＣＬポリペプチドへの結合に基づくアフィニティークロマトグラフィーも使用可能である。
【０２２８】
（実施例３）
ＤＣＬ核酸発現のアンチセンス阻害
本発明にしたがって、オリゴヌクレオチド設計の基礎として、配列番号１、５、９、１１、１５、１７、２１および２３のヌクレオチド配列を用い、ＤＣＬ  ｍＲＮＡ分子の異なる領域を標的とする、一連のオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドの長さがおよそ１０、１２、１５、１８、またはより好ましくは２０ヌクレオチド残基であるように、そして少なくとも３７℃の予測されるハイブリダイゼーション温度を有するように、オリゴヌクレオチドを選択する。好ましくは、いくつかがｍＲＮＡ分子の５’領域にハイブリダイズし、他のものがコード領域にハイブリダイズし、そしてなお他のものがｍＲＮＡ分子の３’領域にハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドを選択する。ＧｒａｙおよびＣｌａｒｋ（米国特許第５，８５６，１０３号および第６，１８３，９６６号）に記載されるような方法を用いて、標的配列と最も安定なハイブリッド構造を形成するオリゴヌクレオチドを選択することが可能であり、これは、こうしたオリゴヌクレオチドがアンチセンス阻害剤として使用するのに望ましいためである。
【０２２９】
オリゴヌクレオチドは、全体でホスホロチオエート主鎖（ヌクレオシド間連結）を持つオリゴデオキシヌクレオチドであることが可能であるし、または多様な異なる種類のヌクレオシド間連結を有することが可能である。一般的に、多様な化学的修飾オリゴヌクレオチドの調製法、精製法、および使用法が、米国特許第５，９４８，６８０号に記載される。特別な例として、オリゴヌクレオチド合成に、以下の種類のヌクレオシド・ホスホロアミダイトが使用可能である：デオキシおよび２’−アルコキシアミダイト；２’−フルオロデオキシアデノシンアミダイト、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、および２’−フルオロデオキシシチジンなどの２’−フルオロアミダイト；２，２’−アンヒドロ［１−（ベータ−Ｄ−アラビノ−フラノシル）−５−メチルウリジン］、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシ−エチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン、３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン、２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン、Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン、およびＮ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジ−メトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイトなどの２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト；２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ2−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ］エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニル−シリル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルマドクスイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシ−エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、および５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロ−アミダイト］などの２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト；並びにＮ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニル−カルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソ−プロピルホスホロアミダイト］などの２’―（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト。
【０２３０】
修飾オリゴヌクレオシドもまた、オリゴヌクレオチド合成に使用可能であり、これらは例えば、ＭＭＩ連結オリゴヌクレオシドとも呼ばれるメチレンメチルイミノ連結オリゴヌクレオシド；ＭＤＨ連結オリゴヌクレオシドとも呼ばれるメチレン−ジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシド；アミド−３連結オリゴヌクレオシドとも呼ばれるメチレン−カルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシド；およびアミド−４連結オリゴヌクレオシドとも呼ばれるメチレン−アミノカルボニル連結オリゴヌクレオチドとともに、米国特許第５，３７８，８２５号、第５，３８６，０２３号、第５，４８９，６７７号、第５，６０２，２４０号、および第５，６１０，２８９号に記載されるように調製される、例えば交互のＭＭＩおよびＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ連結を有する、混合主鎖化合物である。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオシドもまた使用可能であり、そしてこれらは米国特許第５，２６４，５６２号および第５，２６４，５６４号に記載されるように調製され；そしてエチレンオキシド連結オリゴヌクレオシドもまた使用可能であり、そしてこれらは米国特許第５，２２３，６１８号に記載されるように調製される。ペプチド核酸（ＰＮＡ）を上述のオリゴヌクレオチドと同じ方式で使用可能であり、そしてこれらは、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９６，  ４，  ５−２３；並びに米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７００，９２２号、および第５，７１９，２６２号において言及される多様な方法のいずれかにしたがって調製される。
【０２３１】
本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なる種類であることが可能である。これらには、連結されるヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、連結されるヌクレオシドの５’および３’「ウィング」セグメントの間に位置する第一の型、並びに「ギャップ」セグメントが、オリゴマー化合物の３’末端または５’末端のいずれかに位置する第二の「オープン端」型が含まれる。第一の型のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において「ギャップマー」またはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二の型のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野において、「ヘミマー」または「ウィングマー」としても知られる。キメラオリゴヌクレオチドの異なる種類のいくつかの例は：すべて米国特許第５，９４８，６８０号にしたがって調製可能な、［２’−Ｏ−Ｍｅ］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−Ｍｅ］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、および［２’−Ｏ−（２−メトキシ−エチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシホスホロ−チオエート］−−［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌクレオチドである。１つの好ましい態様において、４ヌクレオチドの「ウィング」が両端（５’および３’方向）に隣接する、１０の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域で構成される、長さ１８ヌクレオチドのキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）を利用する。ウィングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成される。ヌクレオシド間（主鎖）連結は、オリゴヌクレオチド全体で、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２’−ＭＯＥウィング中のシチジン残基は５−メチルシチジンである。他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシド、および混合キメラオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，６２３，０６５号にしたがって合成される。
【０２３２】
オリゴヌクレオチドは、好ましくは、自動化合成装置上、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミダイト化学を介して合成される。試料の希釈およびＵＶ吸収分光によって、各ウェル中のオリゴヌクレオチド濃度を評価する。キャピラリー電気泳動によって、個々の産物が全長で完全であることを評価し、そしてエレクトロスプレー質量分析を利用した、化合物の質量分析によって、塩基および主鎖組成を確認する。
【０２３３】
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の影響は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、多様な細胞種のいずれで試験することも可能である。これは、例えば、ＰＣＲまたはノーザンブロット解析を用いて、日常的に決定可能である。供給者に推奨されるように、細胞を１０継代まで日常的に維持する。細胞が８０％〜９０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到達したら、細胞をオリゴヌクレオチドで処理する。９６ウェルプレートで増殖させた細胞に関しては、ウェルを２００マイクロリットルのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１血清減少培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で１回洗浄し、そしてその後、３．７５ｇ／ｍｌ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および最終濃度１５０ｎＭの所望のオリゴヌクレオチドを含有する１３０マイクロリットルのＯＰＴＩＭＥＭ−１で処理する。処理４時間後、培地を新鮮な培地に交換する。オリゴヌクレオチド処理１６時間後、細胞を採取する。好ましくは、いくつかの異なるオリゴヌクレオチドの効果を同時に試験すべきであり、この場合、最大の度合いの標的核酸発現阻害を生じるオリゴヌクレオチドを同定するため、オリゴヌクレオチドは標的核酸分子の異なる部分にハイブリダイズする。
【０２３４】
当該技術分野に知られる多様な方法で、ＤＣＬ核酸発現のアンチセンス調節をアッセイすることが可能である。例えば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲによって、ＤＣＬ  ｍＲＮＡレベルを定量化することが可能である。現在、リアルタイム定量的ＰＣＲが好ましい。総細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡに対して、ＲＮＡ解析を行うことが可能である。ＲＮＡ単離法およびノーザンブロット解析法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １，  ｐｐ．４．１．１−４．２．９および４．５．１−４．５．３，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９６に解説される。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティーから入手可能であり、そして製造者の指示にしたがって用いる、商業的に入手可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システムを用いて好適に達成可能である。この蛍光検出システムは、ＰＣＲ産物の高処理定量化を可能にする。ＰＣＲが完了した後に増幅産物を定量化する標準的ＰＣＲと対照的に、リアルタイム定量的ＰＣＲでは、集積すると同時に産物を定量化する。順方向および逆方向ＰＣＲプライマーの間に特異的にアニーリングし、そして２つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に含むことによって、これを達成する。レポーター色素（例えばＪＯＥまたはＦＡＭ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ、またはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティーから得る）をプローブの５’端に付着させ、そして消光剤色素（例えばＴＡＭＲＡ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ、またはＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティーから得る）をプローブの３’端に付着させる。プローブおよび色素が損なわれていなければ、レポーター色素の発光は、３’消光剤色素が近接することによって消光される。増幅中、標的配列にプローブがアニーリングして基質が生成され、該基質はＴａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって切断可能である。ＰＣＲ増幅周期の伸長期中、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断によって、プローブの残りから（そしてしたがって消光剤部分から）レポーター色素が放出され、そして配列特異的蛍光シグナルが生成される。各周期で、さらなるレポーター色素分子が各々のプローブから切断され、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出系に内蔵されたレーザー・オプティクスによって、定期的な間隔（６秒間間隔）で蛍光強度を監視する。各アッセイにおいて、未処理対照試料由来のｍＲＮＡの一連の希釈を含有する一連の平行反応によって標準曲線を生成し、これを用いて、試験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の阻害パーセントを定量化する。定量的ＰＣＲ解析の他の方法もまた、当該技術分野に知られる。免疫沈降、ウェスタンブロット解析（イムノブロッティング）、ＥＬＩＳＡ、または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）などの当該技術分野に周知の多様な方法で、ＤＣＬタンパク質レベルを定量化可能である。ＤＣＬポリペプチドに対して向けられる抗体は、本明細書に記載するような慣用的な抗体生成法を介して調製可能である。免疫沈降法、ウェスタンブロット（イムノブロット）解析、および酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が当該技術分野で標準的である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  ｐｐ．１０．１６．１−１０．１６．１１，  １０．８．１−１０．８−２１，  および１１．２．１−１１．２．２２，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９１を参照されたい）。
【０２３５】
本明細書に引用するすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が具体的にそして個別に本明細書に援用されると示されるかのように、本明細書に援用される。
【０２３６】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例示によってある程度詳細に記載されているが、本発明の解説に照らして、付随する請求項の精神または範囲から逸脱することなく、特定の変化および修飾を行うことが可能であることが、一般の当業者には容易に理解可能であろう。
【０２３７】
配列識別名
配列番号１はＤＣＬ１の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号２はＤＣＬ１の全長ＯＲＦアミノ酸配列である。
【０２３８】
配列番号３はＤＣＬ１をクローニングするためのセンス方向ＰＣＲプライマーである。
配列番号４はＤＣＬ１をクローニングするためのアンチセンス方向ＰＣＲプライマーである。
【０２３９】
配列番号５はＤＣＬ２の全長ｃＤＮＡ配列である。
配列番号６はＤＣＬ２の全長ＯＲＦアミノ酸配列である。
配列番号７はＤＣＬ２をクローニングするためのセンス方向ＰＣＲプライマーである。
【０２４０】
配列番号８はＤＣＬ２をクローニングするためのアンチセンス方向ＰＣＲプライマーである。
配列番号９は、ＤＣＬ２の選択的スプライシング変異体のｃＤＮＡ配列である（エクソン３が欠失）。
【０２４１】
配列番号１０は、ＤＣＬ２の選択的スプライシング変異体のアミノ酸配列である（エクソン３が欠失）。
配列番号１１はＤＣＬ３の全長ｃＤＮＡ配列である。
【０２４２】
配列番号１２はＤＣＬ３の全長ＯＲＦアミノ酸配列である。
配列番号１３はＤＣＬ３をクローニングするためのセンス方向ＰＣＲプライマーである。
【０２４３】
配列番号１４はＤＣＬ３をクローニングするためのアンチセンス方向ＰＣＲプライマーである。
配列番号１５は、ＤＣＬ３の選択的スプライシング変異体のｃＤＮＡ配列である（エクソン４および５が欠失）。
【０２４４】
配列番号１６は、ＤＣＬ３の選択的スプライシング変異体のアミノ酸配列である（エクソン４および５が欠失）。
配列番号１７はＤＣＬ４の全長ｃＤＮＡ配列である。
【０２４５】
配列番号１８はＤＣＬ４の全長ＯＲＦアミノ酸配列である。
配列番号１９はＤＣＬ４をクローニングするためのセンス方向ＰＣＲプライマーである。
【０２４６】
配列番号２０はＤＣＬ４をクローニングするためのアンチセンス方向ＰＣＲプライマーである。
配列番号２１は、ＤＣＬ４の選択的スプライシング変異体のｃＤＮＡ配列である（エクソン４が欠失）。
【０２４７】
配列番号２２は、ＤＣＬ４の選択的スプライシング変異体のアミノ酸配列である（エクソン４が欠失）。
配列番号２３はＤＣＬ５の全長ｃＤＮＡ配列である。
【０２４８】
配列番号２４はＤＣＬ５の全長ＯＲＦアミノ酸配列である。
配列番号２５はＤＣＬ５をクローニングするためのセンス方向ＰＣＲプライマーである。
【０２４９】
配列番号２６はＤＣＬ５をクローニングするためのアンチセンス方向ＰＣＲプライマーである。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１】図１は、ＤＣＬ１のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。ポリヌクレオチド配列中の‖記号は、エクソン／イントロン接合部を示し（イントロンは示していない）、そして下線領域は、ＰＣＲ反応で用いるオリゴヌクレオチドプライマーの位置を示す。ポリペプチド配列において、イタリックタイプは、予測される膜貫通ドメインを示し；囲んだ配列は、予測されるアスパルチル（または酸）プロテアーゼドメインを示し；太字のイタリックタイプは、ＩＴＩＭモチーフを示し；下線領域はＣ型レクチンドメインを示し、そして太字タイプは、推定上のＮ連結グリコシル化部位を示す。
【図２】図２は、ＤＣＬ２のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。図１に関して記載したのと同じ注釈を図２でもまた使用する。
【図３】図３は、ＤＣＬ３のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。図１に関して記載した注釈を図３でもまた使用する。
【図４】図４は、ＤＣＬ４のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。図１に関して記載した注釈を図４でもまた使用する。
【図５】図５は、ＤＣＬ５のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を示す。図１に関して記載した注釈を図５でもまた使用する。
【国際公開パンフレット】
2005505285.tif 000004
2005505285.tif 000005
2005505285.tif 000006
2005505285.tif 000007
2005505285.tif 000008
2005505285.tif 000009
2005505285.tif 000010
2005505285.tif 000011
2005505285.tif 000012
2005505285.tif 000013
2005505285.tif 000014
2005505285.tif 000015
2005505285.tif 000016
2005505285.tif 000017
2005505285.tif 000018
2005505285.tif 000019
2005505285.tif 000020
2005505285.tif 000021
2005505285.tif 000022
2005505285.tif 000023
2005505285.tif 000024
2005505285.tif 000025
2005505285.tif 000026
2005505285.tif 000027
2005505285.tif 000028
2005505285.tif 000029
2005505285.tif 000030
2005505285.tif 000031
2005505285.tif 000032
2005505285.tif 000033
2005505285.tif 000034
2005505285.tif 000035
2005505285.tif 000036
2005505285.tif 000037
2005505285.tif 000038
2005505285.tif 000039
2005505285.tif 000040
2005505285.tif 000041
2005505285.tif 000042
2005505285.tif 000043
2005505285.tif 000044
2005505285.tif 000045
2005505285.tif 000046
2005505285.tif 000047
2005505285.tif 000048
2005505285.tif 000049
2005505285.tif 000050
2005505285.tif 000051
2005505285.tif 000052
2005505285.tif 000053
2005505285.tif 000054
2005505285.tif 000055
2005505285.tif 000056
2005505285.tif 000057
2005505285.tif 000058
2005505285.tif 000059
2005505285.tif 000060
2005505285.tif 000061
2005505285.tif 000062
2005505285.tif 000063
2005505285.tif 000064
2005505285.tif 000065
2005505285.tif 000066
2005505285.tif 000067
2005505285.tif 000068
2005505285.tif 000069
2005505285.tif 000070
2005505285.tif 000071
2005505285.tif 000072
2005505285.tif 000073
2005505285.tif 000074
2005505285.tif 000075
2005505285.tif 000076
2005505285.tif 000077
2005505285.tif 000078
2005505285.tif 000079
2005505285.tif 000080
2005505285.tif 000081
2005505285.tif 000082
2005505285.tif 000083
2005505285.tif 000084
2005505285.tif 000085
2005505285.tif 000086
2005505285.tif 000087
2005505285.tif 000088
2005505285.tif 000089
2005505285.tif 000090
2005505285.tif 000091
2005505285.tif 000092
2005505285.tif 000093
2005505285.tif 000094
2005505285.tif 000095
2005505285.tif 000096
2005505285.tif 000097
2005505285.tif 000098
2005505285.tif 000099
2005505285.tif 000100
2005505285.tif 000101
2005505285.tif 000102
2005505285.tif 000103
2005505285.tif 000104
2005505285.tif 000105
2005505285.tif 000106
2005505285.tif 000107
2005505285.tif 000108
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505285.tif 000109
【国際調査報告】
2005505285.tif 000110
2005505285.tif 000111
2005505285.tif 000112