(57)【要約】本発明は、配列番号：１〜４３による核酸配列を有するデコイ−オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス−オリゴヌクレオチドと、薬剤としてのそれらの使用とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１〜３２または配列番号：３４〜４０の配列を示す核酸鎖を含むデコイ−オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
改変されたヌクレオチド間結合を示す請求項１記載のデコイ−オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：４１〜４３の配列を有する核酸分子。
【請求項４】
改変されたヌクレオチド間結合を示す請求項３記載の核酸分子
【請求項５】
薬剤としての請求項１または請求項２記載のデコイ−オリゴヌクレオチドおよび請求項３または請求項４記載の核酸分子。
【請求項６】
循環器系合併症、特に経皮的血管形成後の再狭窄および静脈バイパスの狭窄、移植の拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、外科的介入に関連する虚血／再注輸による障害、免疫学的過敏反応（Ｉ〜Ｖ型）、自己免疫疾患、特に糖尿病、多発性硬化症および関節リウマチ、あらゆる形態の急性、亜急性および慢性炎症性疾患、特に、関節の炎症性疾患、特に関節炎、呼吸器官の炎症性疾患、特に気管支喘息および慢性気管支炎、皮膚の炎症性疾患、特に乾癬および神経皮膚炎、並びに消化管の炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎およびクーロン病並びに敗血症性ショックを予防および／または治療するための薬剤としての請求項１または請求項２記載のデコイ−オリゴヌクレオチドおよび請求項３または請求項４記載の核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号：１〜４３の核酸配列を有するデコイ−オリゴヌクレオチド(decoy-oligonucleotide)およびアンチセンス−オリゴヌクレオチドと、薬剤としてのその使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
（病的遺伝子産物の作用様式により）病的遺伝子を同定し、これらの遺伝子の構造の病的変化（多形）をそれぞれ同定して、それらを疾患パターンに割り当てることはヒトゲノムの暗号翻訳の主要な目的である。従って、発現が強すぎる、弱すぎるまたは欠損している特定された数の遺伝子産物によって疾患が生じると認められる場合には、原因から決定されたほとんどの疾患の治療が達成されている。実際、通常１つの遺伝子欠損（単一遺伝子病）はある遺伝性疾患ではすでに知られているが（例えば、嚢胞性線維症）、他の疾患の状況（例えば、高血圧）はかなり複雑であることがわかっている。後者は、明らかに、１つではなく、所定の環境因子とのめぐり合わせで疾患を発症させることを罹患患者に運命づける多数の遺伝子欠損（多遺伝子性疾患）である。この制約にもかかわらず、１つまたは多数の遺伝子の発現に対する標的化した介在により、症状だけではなく、原因に基づいた治療の機会が提供される。
【０００３】
転写因子は、細胞核内の１つまたは多数の遺伝子のプロモーター領域に結合して、発現、すなわち、これらの遺伝子がコードするタンパク質の再生を調節するＤＮＡ結合タンパク質である。転写因子は、ヒト生体における発生および分化過程を制御する生理学的に重要な役割以外に、特に正しくない時点において遺伝子発現を活性化する場合には、疾患を誘発する高い可能性を有する。また、（おそらく同じ）転写因子が、保護機能を有する遺伝子を遮断することがあり、疾患を形成しやすい傾向に作用する。以下に記載する抗転写因子治療の原理は病的遺伝子を阻害し、一方保護遺伝子を活性化することを目的としている。
【０００４】
炎症は、障害性の刺激に対する生物およびその組織の防御反応であり、障害の改善または少なくとも障害を局所的に制限することおよび障害の原因（例えば、侵入した細菌または異物）を根絶することを目的としている。炎症の誘発因子は微生物（細菌、ウィルス、真菌または寄生虫）、異物（花粉、石綿またはケイ酸塩の結晶）、機械的障害による組織の破壊、化学的な毒および物理的な影響並びに生体由来の誘発因子（崩壊した腫瘍細胞、血管外に流出した血液、自己免疫反応）または生体内で関与している物質の結晶（尿酸、シュウ酸カルシウムおよびリン酸カルシウム、コレステロール）であることがある。
【０００５】
（組織内の）肥満細胞または血中の好塩基球という顆粒球の迅速な活性化は非常に強い急性炎症応答の始動の一例であり、即時型の免疫学的過敏反応（Ｉ型体液性アレルギー）と区別される。生物が抗原（または、過敏症の場合それぞれのアレルゲン）に接触していれば、すでに事前にＢリンパ球がこれに対する反応として感作されている。Ｂリンパ球は、事前に感作されているＣＤ４陽性２型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ２細胞）と協力して形質細胞に形質転換し、抗原に対するＩｇＥ型の抗体を産生しはじめる。この分化過程中、それぞれのリガンド（ＣＤ１５４）を発現するＴｈ２細胞によるＣＤ４０受容体を介するＢリンパ球の同時刺激は非常に重要である。抗原が負荷されたＩｇＥ抗体が肥満細胞のそれぞれの受容体（Ｆｃε型）に結合すると、これらは、炎症の異なる媒介物質、特にヒスタミン、インターロイキン８、ロイコトリエンおよび腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を放出し始める。その結果は、専門の炎症細胞、特に好酸球および好塩基球という顆粒球および単球、それだけでなくＴリンパ球が現場に引き寄せられる（走化性）。同時に、ヒスタミン依存性血管拡張および血管内壁を覆う内皮細胞の透過性の亢進が生じる。血管拡張により、血流速度が低下し、引き寄せられた白血球と内皮細胞との物理的接触の確立が促進される。サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）に暴露されることによってすでに活性化されているこれらの内皮細胞は、管腔表面のセレクチンの激しい発現を示し（例えば、Ｅ−セレクチン）、内皮細胞に沿った白血球の回転を生じ、それによってさらに別の接着分子（インテグリン、例えば、細胞接着分子−１［ＩＣＡＭ−１］または血管細胞接着分子−１［ＶＣＡＭ−１］が活性化される。白血球は血管壁に接着することができ（辺縁化）、ヒスタミンに関連する透過性の亢進（内皮細胞の結合の弛緩）により、血管外空間への遊走が促進される（漏出）。同時に、タンパク質に富む大量の流体（炎症性浸出液）が間質空間に達し、浮腫を形成する。組織圧の増加および炎症細胞によって産生されるさらに別の媒介物質によって周辺の神経終末が刺激され、組織の損傷を気づかせる疼痛を誘発する。
【０００６】
炎症部位に遊走してきた顆粒球およびマクロファージに再分化した単球は、それぞれ食作用および溶解によって炎症の原因物質を排除しようと試み、それによって周囲の組織も損傷する可能性のある、特にタンパク質分解酵素および酸素ラジカルの放出を誘発する。特に、マクロファージの活性化は、いろいろな意味で、急性期応答という点からみて生物全体が本来局所的である炎症応答によって冒されるということの原因になることがある（例えば、インターロイキン１βまたはインターロイキン６のようなさらに別のサイトカインの放出による）。急性期応答の代表的な特徴は、疲労、倦怠感および発熱、骨髄からの白血球放出の増加（白血球増多症）、急性期タンパク質の血中における検出（例えば、Ｃ−反応性タンパク質）、免疫系の刺激並びに代謝状態の変化による体重低下である。
【０００７】
炎症の原因を排除することができると、創傷治癒過程は破壊された組織の修復と同調する。これはせいぜい完全な再樹立にしかならないが（原状回復）、大きい病巣または結合組織（特にコラーゲン）の過剰な産生により、罹患組織に基づく重大な機能不全に関連する可能性のある瘢痕が形成される。原因がすぐに排除されないと（異物または創傷感染）、創傷治癒が遅延するだけでなく、同時に貪食細胞の移動および活動が増加し、組織の運命（壊死）は空洞（膿瘍）の形成に至る。結果は、ほとんどいつも、瘢痕化した組織の再構成であり、機能の損失を伴う。原因微生物から誘導される炎症を局所に限定しておくことができないと、炎症はリンパ系を介して生物全体に拡散する。結果は、致死的な結末（敗血症性ショック）を伴う敗血症である。
【０００８】
創傷治癒は、炎症および治癒過程が均衡している場合も妨害される。その結果は、線維化性（コラーゲンの過剰な合成）または肉芽腫性（炎症細胞の肉芽形成組織への組織化）である場合があり、それぞれ、罹患組織の連続的な破壊および機能抑制の増加を通常生じる慢性炎症である。
【０００９】
慢性的に悪化する場合があることが示されている一般的な炎症応答に加えて、基礎的な病因に関して共通の原因と別個の差を示す炎症性疾患がある。このような種類の２つの炎症性疾患は、臨床的関連性が大きいので本明細書においてさらに紙面をさいている、例えば、心臓手術介入後の合併症および免疫学的不適合である。
【００１０】
バルーンが先端についたカテーテルによる機械的な膨張（経皮的血管形成）および動脈硬化により狭窄した動脈の静脈バイパスによるバイパス術は、それぞれ、切迫した梗塞または臓器不全から保護するために、冠動脈および抹消の循環障害が認められる患者に対する優れた治療法となっている。しかし、機械的に膨張させ、（大半の症例において）金属製血管支持（ステント）で治療した動脈の再閉塞（再狭窄）率は、６ヶ月以内に２０〜５０％と受け入れがたいほど高くなっている。大動脈冠動脈および抹消静脈バイパスのそれぞれ５年後の５０〜７０％という再閉塞率は、特に手技に関するリスクのバックグラウンドおよび術後リスクそれぞれに対して治療した患者にとっては不満どころではない。おそらく、血管壁の損傷（この結果内皮細胞および平滑筋細胞が影響される）のために、血管形成術後の再狭窄は、特に早期段階において、専門の炎症細胞（特に、単球およびＴリンパ球）による血管壁の浸潤によって特に特徴づけられる顕著な炎症成分を示す。大動脈冠動脈および抹消静脈バイパス術における線維増殖性狭窄形成（内膜過形成）は、それぞれ、機械的および物理的病毒によって特に生じる炎症反応にも基づいていると思われる。手術介入または臓器移植に関連するいわゆる虚血／再注輸(refusion)による損傷は、内皮細胞と専門の炎症細胞（特に、顆粒球だけでなく単球およびＴ細胞）との相互作用並びに組織損傷性物質の放出（酸素ラジカル、サイトカイン）が極めて重要な作用をする炎症に基づいた組織損傷を伴うこともかなり前から知られている。
【００１１】
記載した心臓−血管合併症に関連して、特に血管壁の内皮細胞および平滑筋細胞に、炎症応答およびその後に生じる組織の適応的な再構成の程度を制限する助けとなる保護機序が存在することが重要である。例えば、内皮細胞におけるＮＯシンターゼによる一酸化窒素（ＮＯ）の合成はこれに属する。おそらく酸素ラジカルスーパーオキシドの内因性アンタゴニストの特徴を示すＮＯは、特に内皮細胞における前炎症性ケモカイン（例えば、単球走化性タンパク質、ＭＣＰ−１）および接着分子（例えば、ＩＣＡＭ−１）の発現、平滑筋細胞における成長因子の受容体の発現（例えば、エンドセリンＢ−受容体）の発現並びに白血球からの成長因子の放出を阻害する。その程度においては、（例えば、これらの細胞におけるＮＯシンターゼのサイトカイン誘導性の低下による）内細胞の機能的損傷としての機械的損傷が、記載した心臓−血管合併症の基礎となる、血管壁の炎症の過程およびその後に生じる線維増殖性再構成を妨げることを理解することは容易である。
【００１２】
血管形成術後の再狭窄を医薬的にチェックするこれまでの試みは全て、患者の大半に望ましい影響を達成していない。現在では、２つのローカルな治療原則が実施されている：すでに承認されている近接照射療法で、拡張した血管部分の短期放射能照射および臨床試験段階にある薬剤溶出ステントにより細胞の増殖をチェックする方法である。この方法は、増殖阻止医薬（細胞分裂停止剤および免疫抑制剤）が「含浸」されており、数週間にわたってそれらを徐々に放出するポリマーコーティングステントを含む。ほとんどの最近の臨床的検討は、どちらの治療方法も、初期には有望な結果が得られたにもかかわらず、重篤な問題（例えば、梗塞の危険に至るステント内血栓）から完全に逃れられないことを証明している。
【００１３】
すでに概説されている免疫学的Ｉ型不適合反応以外に、免疫調節において、それぞれ、原理上４つの他の形態のアレルギーおよび機能不全が存在する。Ｉ型反応自体、アレルギー化に達した後、原理的に２つの段階：すなわち、ＩｇＥ刺激された(IgE-spiked)肥満細胞からの血管に対して活性な炎症媒介物質の迅速な放出および再生と、誘引された好酸球および好中球顆粒球によって媒介される後期反応に分類されうる。完全なＩ型反応は、アレルゲンへの暴露に応じて局所的または全身的に生ずることがある。気道におけるアレルゲンは、典型的には粘膜浮腫および過敏反応（アレルギー性鼻症、枯草熱）並びに気管支痙攣（喘息）を伴う気道の反応を誘発するが、栄養素のアレルゲンは悪心、嘔吐および下痢のような消化管症状を誘発する。皮膚はアレルゲンに反応して、掻痒および蕁麻疹並びにアトピー性皮膚炎（神経皮膚炎）を伴う。アレルゲンが血流に直接接触する場合（例えば、血液製剤、医薬の注入）またはアレルゲンへの暴露が特に強い場合には、全身の即時型反応が生じ、致命的な血圧の低下（アナフィラキシーショック）を生ずる可能性がある。
【００１４】
II型反応の場合には、抗原的に活性な細胞（例えば、外来血液細胞）または細胞外タンパク質（例えば、生体内で天然に産生される細胞の表面の医薬によって誘導される変化）が主役となる。アレルギー化後、２回目の接触により、ＩｇＧ型およびＩｇＭ型のアレルゲン特異的抗体が産生され、アレルギー細胞に大量に結合する（オプソニン化）。これによって、補体系（膜攻撃複合体の形成）および特殊な亜集団のリンパ球である、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が活性化される。結果は、細胞溶解によるアレルゲン細胞の破壊である。自己抗体が、糸球体係蹄の基底膜などの、生体内で天然に産生される組織に結合すると同様の反応が誘発され、それによって切迫した腎不全を伴う迅速に進行する糸球体腎炎を誘発する。１型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１細胞、下記参照）以外に、活性化されたＮＫ細胞は、特にマクロファージの活性化によって炎症応答を激化するサイトカインである、インターフェロンγの主要な産生細胞である。
【００１５】
III型反応は、免疫複合体（抗原−抗体−複合体）が形成されて沈着し、その結果補体系および貪食細胞（顆粒球、マクロファージ）が活性化されることによって特徴づけられる。それらは血中を循環し、主に腎糸球体の毛細管だけでなく関節または皮膚に逐次沈着する。これによって誘発された炎症応答は、（免疫−複合体−）糸球体腎炎、関節痛および蕁麻疹を生ずることがある。免疫系が原因菌（例えば、連鎖球菌）を排除できないと、感染症は全身性III型反応を誘発することもある。代表的な局所的III型反応は、肺への抗原−抗体−複合体沈着症例（例えば、鳥飼育者肺）における免疫化または外因性アレルギー性肺胞炎後の皮膚のいわゆるアルサス反応である。全身性エリテマドーデスもIII型反応であるが、自己免疫疾患に関しては、自己抗体の形成による。
【００１６】
上記した過敏性反応とは異なり、IV型反応は液性ではなく、細胞性であり、通常数日経過するまで最大に達しない（遅延型の反応または遅延型過敏症）。誘発因子は、主にタンパク質、侵入した外来生物（細菌、ウィルス、真菌および寄生虫）、他の外来タンパク質（例えば、腹腔疾患症例のコムギ由来のグリアジン）並びにハプテン（医薬、金属［例えば、接触皮膚炎症例のニッケル］、化粧品および植物成分）である。移植臓器の主要な拒絶反応もIV型反応である。抗原は（組織）マクロファージによって貪食され、処理されて、未処理のＴヘルパー細胞（ＣＤ４−陽性）に提示される；Ｔヘルパー細胞のアレルギー化には数日かかる。２回目の接触時には、このような方法で感作されたＴヘルパー細胞はＴｈ１細胞に変化し、それによって、この信号伝達経路がマクロファージからのインターロイキン１２の放出を誘発するので、抗原提示細胞のＣＤ１５４−媒介性の同時刺激（これはＣＤ４０受容体を発現する）は重要な役割を果たす。インターロイキン１２は、Ｔヘルパー細胞の分化および増殖を開始させる。そのような役割のＴｈ１細胞はある種の増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）によって骨髄における単球の形成を励起し、ある種のケモカイン（例えば、ＭＩＦ）によってこれらを動員し、ＩＦＮγの放出によってそれらを活性化する。このような結果として生じた非常に強い炎症性応答は、生体内で通常産生される組織（例えば、結核）または移植された組織を大規模に破壊することがある。さらに、ＣＤ８−陽性細胞傷害性Ｔ細胞は移植拒絶反応に関与し（細胞溶解）、ＣＤ８−陽性細胞傷害性Ｔ細胞は標的（外来細胞表面）を認識し、従ってＣＤ４−陽性Ｔｈ１細胞のような先行する抗原提示によってのみ「武装する」ことができる。
【００１７】
IV型反応と同様の免疫調節不全は、例えば、関節リウマチまたは多発性硬化症（自己反応性Ｔｈ１細胞）および糖尿病（自己反応性細胞傷害性Ｔ細胞）の基礎となる。自己抗原（生体内で産生される；分子的模倣物）と交差反応する原因菌（例えば、連鎖球菌）のある種の抗原に対するＴ細胞は、細菌のスーパー抗原（ＴＢＣの原因因子）以外のこのような自己免疫疾患および相応の遺伝子的素因（ＭＨＣ−タンパク質、Ｔｈ１／Ｔｈ２−不均衡）において何らかの役割を果たすと思われる。一方、Ｖ型反応は、特にホルモン−（例えば、バセドウ病症例の甲状腺刺激ホルモン）または信号伝達物質受容体（例えば、重症筋無力症症例のアセチルコリン）の自己抗体を活性化または遮断することによって誘発することができる。
【００１８】
同種間骨髄移植（遺伝的に非同一個体間移植）経過中に約４０％のレシピエントに現れる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ:graft versus host disease）は、逆の意味であるが、移植拒絶反応に匹敵する。３ヶ月持続する急性期中に、幹細胞を注入されたドナーのＴ細胞は宿主生物を攻撃する。結果として生じると思われる重症の炎症応答は、主に皮膚、消化管および肝臓に発現する。
【００１９】
推測された原因に応じて急性炎症性疾患を治療するために、通常非ステロイド消炎剤（ＮＳＡＩＤｓ:non-steroidal antiphlogistics、特にプロスタグランジンの合成阻止）および／または抗感染症剤（細菌、真菌または寄生虫の活力喪失剤）および抗ウィルス化学療法が、それぞれ使用され、条件付きであるが、局所適用の糖質コルチコイド（遺伝子発現の一般的な阻害剤）も使用される。重症または慢性再発性炎症性疾患の症例では、糖質コルチコイドまたは免疫抑制剤（Ｔ細胞活性化の阻害）またはメトトレキセートなどの細胞分裂停止剤が全身的に投与される。これはまた、臓器移植および骨髄移植にそれぞれ適用する。疑う余地のない治療効果にもかかわらず、記載した薬剤の全身投与は、特に永久的に使用される場合には、重症の副作用を誘発することがある。メトトレキセートを２年以上服用している患者の２５％以下は重症の肝硬変を発症している。特に慢性再発性炎症性疾患に使用されるさらに最近の有効な薬剤、：すなわち、サイトカイン自体およびその受容体それぞれに対する抗体、受容体の低分子量アンタゴニスト並びに遺伝子組換えにより作製された、サイトカインを捕獲する可溶性の受容体タンパク質はＴＮＦαの前炎症作用を遮断する。しかし、受容体タンパク質を用いた治療中には（特に結核）、高い発現頻度の感染性疾患の適応症の数は増加しており、約４０％の患者は治療に全く応答しないと思われる（無応答患者）。また、承認されているヒト化ＴＮＦα抗体についても、治療開始から２〜４年後の敗血症を含めた範囲の感染症の発現頻度に関する対応した警報がある。さらに両作用薬剤は、急性発現には禁忌である。また、喘息の治療に主に使用される受容体の低分子量アンタゴニストは、ロイコトリエンについて承認されており、従来の非ステロイド性消炎剤（ＮＳＡＩＤｓ）と比較して消化管副作用がかなり低い新しいグループの非ステロイド性消炎剤（ＮＳＡＩＤｓ）であるシクロオキシゲナーゼ−２の阻害剤も承認されている。さらに、臨床試験の異なる段階にある、白血球および内皮細胞の接着分子、Ｔヘルパー細胞のサイトカイン受容体またはＩｇＥ抗体にそれぞれ対する、一連のさらに別の−通常ヒト化されている−抗体またはアンチセンス−オリゴヌクレオチドに基づいた方法がある。グループとしての糖質コルチコイドおよび抗感染症剤を控えるために、記載した薬剤は、共通して、治療に関連する標的分子に特異的に向かう必要がある。
【発明の開示】
【００２０】
従って、本発明は、過剰な炎症性応答を予防または治療するため並びに罹患患者の罹病率および死亡率をこれに関連させて示すための物質を提供する問題に基づいている。
【００２１】
この問題は、特許請求の範囲によって規定される主題によって解決される。
【００２２】
本発明者らは、ヒト内皮細胞および平滑筋細胞並びに単球において、サイトカインによって媒介される前炎症遺伝子産物（ＣＤ４０、Ｅ−セレクチン、ＮＯシンターゼの誘導性アイソフォーム、インターロイキン１２［ｐ４０］、ＭＣＰ−１）の発現の増加に関与する転写因子を特徴づけた。それによって、培養内皮細胞を、ＩＦＮγを併用してＴＮＦαおよびＣＤ１５４のそれぞれにより刺激する場合に、転写因子核因子κＢ（ＮＦ−κＢ:nuclear factor κB）とシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ−１:signal transducer and activator of transcription-1）の間に相乗作用が存在することが示されると思われる。
【００２３】
ＩＦＮγ単独はヒト内皮細胞においてＣＤ４０の発現を増加することができたが、Ｅ−セレクチンまたはインターロイキン１２の一方ではできなかった。内皮細胞においてそれぞれ発現されにくく、非構成的に発現されるような２つの遺伝子産物の発現については、細胞をそれぞれＴＮＦα（Ｅ−セレクチン）およびＣＤ１５４（インターロイキン１２）で同時刺激することが必須である。さらに、内皮細胞および単球において、追加の転写因子、インターフェロン調節因子−１（ＩＲＦ−１:interferon regulatory factor-1）のデノボ発現がＣＤ４０のＩＦＮγによって媒介される発現の増加に必要であるが、Ｅ−セレクチンは必要ではない。これらの分析の範囲において、ＩＲＦ−１タンパク質発現は、両方のサイトカインの存在下と比較して、ＩＦＮγおよび特にＴＮＦαで細胞を単一刺激する場合にはかなり弱いことが示されると思われる。これによると、転写因子ＮＦ−κＢおよびＳＴＡＴ−１は、ＩＲＦ−１遺伝子の転写の場合にも相乗的に作用する(Ohmoriら、J.Biol.Chem.,(1997),272,14899)。
【００２４】
ＳＴＡＴ−１（GenBank寄託番号NM007315およびXM010893並びにhttp://transfac.gbf.de/cgi-bin/qt/getEntry.pl?t0149）は、少なくとも６メンバーを含む転写因子グループに属する。ＳＴＡＴ−１遺伝子の産物は細胞のほとんどによって構成的に発現されるが、通常細胞質において不活性なモノマータンパク質（９１ｋＤａ）として存在する。このｐ９１−サブユニットのチロシン−リン酸化およびこのようなｐ９１−サブユニット（ＳＴＡＴ−１αと呼ばれる）の２つのその後の結合（二量体化）により、活性な転写因子が細胞の核内に輸送されうる。ＳＴＡＴ−１βのｐ８４−サブユニットとのヘテロ−二量体化（同一遺伝子の異なってスプライシングされた産物）も可能である。構成的に存在するサブユニットのリン酸化は、刺激に応じて細胞質ヤヌスキナーゼにより生じる。従って、両方のヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ１およびＪａｋ２）はＩＦＮα（インターフェロン受容体に良好に動員される）によって刺激され、一方、ＳＴＡＴ−１を活性化するための（病態）生理学に関して最も重要な刺激、ＩＦＮγはＪａｋ２だけを刺激する。異なる増殖因子およびペプチドホルモン（例えば、アンジオテンシンII）もＳＴＡＴ−１を活性化し、内因性（増殖因子）受容体−チロシンキナーゼ以外に、有糸分裂−活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰ−キナーゼ）もこの段階においてなんらかの役割を果たす。ＳＴＡＴ−１αと異なり、ＳＴＡＴ−１βはトランス活性化作用、すなわち、遺伝子発現刺激作用がない。
【００２５】
ＳＴＡＴ−１は、白血球、内皮細胞および平滑筋細胞において前炎症性であると思われる一連の遺伝子産物の発現に関与し、それによって転写因子の活性化は、通常、ＩＦＮγ−依存的に生じる。例外は、特に、アンジオテンシンIIで刺激した血管平滑筋細胞におけるインターロイキン６のＳＴＡＴ−１依存的発現である(Schiefferら、Circ.Res.(2000),87,1195)。タンパク質は、ＳＴＡＴ−１も含めて、非常に異なる方法で活性が阻害されうる。従って、例えば、ＳＴＡＴ−１のＤＮＡとの相互作用を低下する、すなわち、トランス活性化作用を低下する抗−ＳＴＡＴ−１抗体および天然または合成物質を使用することができる。さらに、ＳＴＡＴ−１の活性化に至る、信号伝達経路（Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、受容体チロシン−キナーゼ、ＭＡＰキナーゼ）を阻害してもよい。ＳＴＡＴ−１の活性を特異的に阻害する好ましい方法は以下のようである：
１．デコイ−オリゴヌクレオチドによる活性化された転写因子の中和（抑制(squelching)）、
２．アンチセンス−オリゴヌクレオチドによるＳＴＡＴ−１タンパク質発現の阻害および
３．アンチセンス発現ベクターによるＳＴＡＴ−１タンパク質発現の阻害。
【００２６】
本明細書において使用する「デコイ−オリゴヌクレオチド」または「シス−エレメント−デコイ」という用語は、それぞれ、２本鎖ＤＮＡ−分子および２本鎖ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドをいう。両方のＤＮＡ−鎖は相補的な配列を示す。本発明では、シス−エレメント−デコイは、ゲノムの天然のＳＴＡＴ−１コア結合配列に一致するか、または実質的に同じであり、細胞内の転写因子ＳＴＡＴ−１が結合する配列を示す。従って。シス−エレメント−デコイは、ＳＴＡＴ−１の競合的阻害（良好な中和）のための分子として作用する。
【００２７】
本発明の一態様は、転写因子ＳＴＡＴ−１に配列特異的に結合することができ、以下の配列の１つを有するが、２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの一方の鎖だけが各々図示されており、相補鎖も含まれる２本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを提供することに関する：
5'-NTTNCBGDAAN-3'配列番号:1)、
5'-ATTACCGGAAG-3'(配列番号:3)、
5'-ATTCCGGTAAG-3'(配列番号:5)、
5'-ATTCCTGGAAG-3'(配列番号:7)、
5'-ATTCCTGTAAG-3'(配列番号:9)、
5'-GTTCCAGGAAC-3'(配列番号:11)、
5'-GTTCCCGGAAG-3'(配列番号:13)、
5'-GTTCCGGGAAC-3'(配列番号:15)、
5'-TGTGAATTACCGGAAGTGAGA-3'(配列番号:17)、
5'-TGTGAATTACCGGAAGTG-3'(配列番号:19)、
5'-AGTCAGTTCCAGGAACTGACT-3'(配列番号:21)、
5'-ATGTGAGTTCCCGGAAGTGAACT-3'(配列番号:23)、
5'-ACAGTTCCGGGAACTGTC-3'(配列番号:25)、
5'-GACAGTTCCGGGAACTGTC-3'(配列番号:27)、
5'-GTGTATTCCGGTAAGTGA-3'(配列番号:29)、
5'-TTATGTGAATTCCTGGAAGTG-3'(配列番号:31)、
5'-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3'(配列番号:33)、
5'-TGTGAATTCCTGTAAGTGAGA-3'(配列番号:35)、
5'-TGCATATTCCTGTAAGTG-3'(配列番号:37)、
5'-ATATTCCTGTAAGTG-3'(配列番号:39)。
【００２８】
ヒト内皮細胞においてＳＴＡＴ−１に対する本発明のデコイ−オリゴヌクレオチドを使用すると、（ＩＦＮγによる単一刺激の場合も、ＩＦＮγとＴＮＦαの併用の場合も）サイトカインによって誘導されたＣＤ４０の発現は５０％を上回るほど顕著に阻害されるが、それぞれの対照オリゴヌクレオチドは阻害しない。細胞の刺激が、それぞれＩＦＮγおよびＴＮＦαおよびＣＤ１５４で生じる場合には、これは、それぞれ、Ｅ−セレクチンおよびＭＣＰ−１およびインターロイキン１２（ｐ４０）の発現にも当てはまる。これによると、ＳＴＡＴ−１活性がなくなると、ヒト内皮細胞において前炎症性遺伝子産物グループの発現はかなり有意に阻害される。そのようなものとして、内皮細胞−白血球−相互作用（Ｅ−セレクチン、ＭＣＰ−１）だけでなく、本治療方法の場合における炎症性疾患の範囲において抗原提示細胞（例えば、マクロファージおよびＢリンパ球）とＴリンパ球（ＣＤ４０、インターロイキン１２）の相互作用の有意な低下が示される。同様に、これは、ＴＨＰ−１−単球においてサイトカインによって誘導されるＩＲＦ−１−発現の示されている低下（それによって、ＩＲＦ−１−依存的遺伝子の下流の発現が低下する）およびヒト平滑筋細胞における、誘導性ＮＯシンターゼを含む記載されている遺伝子産物のサイトカインによって誘導される発現の示されている低下にも当てはまる。
【００２９】
従って、ＳＴＡＴ−１活性を特異的に阻害するための好ましい方法は、ＳＴＡＴ−１の結合部位を含有するシス−エレメントデコイまたはデコイ−オリゴヌクレオチドとも呼ばれる、本発明による２本鎖ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドを使用することである。細胞に広大な数の転写因子結合部位を、特にゲノムに存在するよりもはるかに多くの数で、外因的に供給すると、所定の転写因子の大半がそれぞれのシス−エレメント−デコイに特異的に結合し、内因性の標的結合部位に結合しない状況が生じる。内因性結合部位への転写因子の結合を阻害するこの方法は抑制(squelching)とも名づけられる。シス−エレメント−デコイを使用した転写因子の抑制(squelching)（または中和とも呼ばれる）は、細胞の増殖を阻害するのに適用され、成功している。これには、転写因子Ｅ２Ｆの特異的な転写因子結合部位を含有するＤＮＡ−断片が使用されている(Morishita ら、PNAS(1995)92,5855)。
【００３０】
転写因子ＳＴＡＴ−１の結合を防止するために使用される核酸の配列は、例えば、ＳＴＡＴ−１が通常細胞内に結合する配列である。ＳＴＡＴ−１は、配列5'-NNNSANTTCCGGGAANTGNSN-3'（ここで、表示は以下のようである：Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ、およびＳ＝ＣまたはＧ）を有するモチーフに特異的に結合する。下線をつけた塩基の正確なコンセンサスおよびこれらの塩基間の距離はＳＴＡＴ−１の効果的な結合に必須である。従って、本発明によるシス−エレメント−デコイは以下の１１マーコンセンサス−コア結合配列を示してもよい：5'-NTTNCBGDAAN-3'（配列番号：１）（ここで、表示は以下のようである：Ｂ＝Ｃ、ＧまたはＴ、Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ、およびＮ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）。さらに、シス−エレメント−デコイは１１マーコア結合配列より大きく、５’−末端および／または３’−末端が細長くてもよい。コア結合配列領域の準じた突然変異により、ＳＴＡＴ−１のデコイ−オリゴヌクレオチドへの結合は消失する。
【００３１】
シス−エレメント−デコイは２本鎖核酸であるので、本発明によるＤＮＡ−オリゴヌクレオチドはセンスすなわち順方向配列だけでなく、相補的アンチセンス−すなわち逆方向配列を含む。本発明による好ましいＤＮＡ−オリゴヌクレオチドは、配列番号：３〜配列番号：１６に含まれるように、ＳＴＡ−１の１１マーコア結合配列を示す。
【００３２】
しかし、シス−エレメント−デコイは上記配列とは異なる配列を示し、１１マーより長くてもよい。配列番号：１７〜配列番号：４０に含まれる配列が特に好ましい。これらのシス−エレメント−デコイは、ＳＴＡＴ−１各々に対して２つの結合部位を有する。
【００３３】
「２つの結合部位」という言及はセンス鎖およびアンチセンス鎖に関する。好ましい配列の本発明のリストは限定するものではない。多数の配列が、上記した条件の１１マーコンセンサスコア結合配列およびＳＴＡＴ−１に対する親和性を示す限り、それらはＳＴＡＴ−１の阻害剤として使用されうることは当業者に明らかである。
【００３４】
核酸配列のＳＴＡＴ−１への結合の親和性は電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ:electrophoretic mobility shift assay）を使用することによって評価することができる(Sambrookら、(1989),Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Krezeszら、(1999),FEBS Lett.453,191)。この試験システムは、本発明の方法に使用することが意図されている、または最適な鎖長の結合部位を決定することが意図されている核酸の品質管理に好適である。それはまた、ＳＴＡＴ−１が結合する他の配列の同定にも好適である。新たな結合部位の単離が意図されたＥＭＳＡについては、いくつかの交互のラウンドのＰＣＲ増幅およびＥＭＳＡによる選択に適用される、精製または組換えにより発現された形態のＳＴＡＴ−１が最も好適である(ThiesenおよびBach(1990),Nucleic Acids Res.18,3203)。
【００３５】
プロモーターもしくはエンハンサー領域にＳＴＡＴ−１結合部位を含むことが知られている遺伝子、または発現におけるＳＴＡＴ−１の重要性の機能的な証拠がすでに示されている遺伝子の場合には、本発明の方法による特異的な抑制(squelching)の標的となると推測される遺伝子は、ＣＤ４０−、Ｅ−セレクチン−、誘導性ＮＯシンターゼ−、インターロイキン１２（ｐ４０）およびＭＣＰ−１−遺伝子以外に、さらに別の前炎症遺伝子、例えば、ＩＦＮγ自身、サイトカインインターロイキン６、接着分子ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１（血小板内皮細胞接着分子:platelet endothelial cell adhesion molecule-1）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化により調節され、正常なＴ細胞から発現し、分泌されると推定される:regulated upon activation, normal T-cell expressed, presumed secreted、可溶性で、Ｔリンパ球によって分泌される）およびＶＣＡＭ−１、ケモカインインターロイキン８、ＩＰ−１０（インターフェロン−誘導性タンパク質−１０）およびＭｉｇ（ガンマ−インターフェロンによって誘導されるモノカイン:monokine induced by gamma-interferon）並びにＭＨＣ−タンパク質ＩおよびIIである。このように、これらの遺伝子の発現がＳＴＡＴ−１によって直接または間接的に（例えば、ＩＲＦ−１のＳＴＡ−１依存的発現を介して）調節されるかどうかは問題ではない。
【００３６】
本発明の方法は、遺伝子または遺伝子群、例えば、Ｅ−セレクチンが発現されないかまたはわずかしか発現されない方法で遺伝子または遺伝子群の転写を調節する。本発明の範囲における発現の低下または抑制は、転写率が、本発明の２本鎖ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して低いことを意味する。このような低下は、例えば、ノーザンブロット分析(Sambrookら、1989)またはＲＴ−ＰＣＲ(Sambrookら、1989)によって求めることができる。通常このような低下は少なくとも２倍であり、特に少なくとも５倍であり、特に少なくとも１０倍である。活性の損失は、例えば、ＳＴＡＴ−１が転写活性化因子として所定の遺伝子に作用すると達成されるので、活性化因子の抑制(squelching)により標的遺伝子が発現しない。
【００３７】
さらに、構成的に活性な転写因子または（細胞のそれぞれの刺激により）活性化された転写因子によって発現が遮断される場合にあっては、本発明の方法は、遺伝子発現の阻害の解除を促進する。この例は、転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質に対するシス−エレメント−デコイによる、ウサギ頚静脈の未処理の内皮細胞におけるプレプロエンドセリン−１遺伝子の発現の阻害の解除である(Lauthら、J.Mol.Med.(2000),78,441)。これは、その産物が（例えば、炎症性疾患に対する）保護作用を発揮する遺伝子の発現の阻害が解除されうることを意味する。従って、例えば、その産物ＮＯが内皮細胞において前炎症接着分子およびケモカインの発現の抑制に重大な作用をする、内皮アイソフォームのＮＯシンターゼはＩＦＮγによってダウンレギュレーションされる(Rosenkranz-Weissら、(1994),J.Clin.Invest.93,1875)。ＳＴＡＴ−１に対するシス−エレメント−デコイは、内皮ＮＯシンターゼ遺伝子のプロモーターの対応する結合部位へのＳＴＡＴ−１の結合を阻害することによって、この望ましくない作用を回復させることができる。
【００３８】
オリゴヌクレオチドは、通常、細胞のエンド−およびエキソヌクレアーゼ、特にＤＮＡａｓｅｓおよびＲＮａｓｅｓによって迅速に分解される。従って、高濃度のオリゴヌクレオチドが長い期間にわたって細胞内に維持されるように、ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドを改変して分解されないように安定化することができる。通常、このような安定化は１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合を導入することによって得ることができる。
【００３９】
安定化が成功しているＤＮＡ−オリゴヌクレオチドは、各ヌクレオチド間結合が必ずしも改変されているわけではない。好ましくは、シス−エレメント−デコイの両方のオリゴヌクレオチドのそれぞれの末端のヌクレオチド間結合が改変される。それによって、末端の６つのヌクレオチド間結合の末端から６、５、４、３、２または末端から１つ以上のヌクレオチド間結合が改変されうる。ヌクレオチド間結合のさらに別の異なる改変が核酸に挿入されてもよく、それによって出現した２本鎖ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドは、通常のＥＭＳＡ試験システムを使用してＳＴＡＴ−１に対する配列特異的結合についてアッセイすることができる。この試験システムによって、シス−エレメント−デコイの結合定数を求めることができるので、親和性が改変によって変更されたかどうかを判定することができる。十分な結合を示す改変されたシス−エレメント−デコイを選択することができ、十分な結合は、未改変の核酸の結合の少なくとも約５０％または少なくとも約７５％、特に好ましくは約１００％を意味する。
【００４０】
ヌクレオチド間結合が改変されており、十分な結合を示すシス−エレメント−デコイは、未改変のシス−エレメント−デコイより細胞内で安定であるかどうかを試験することができる。本発明によるシス−エレメント−デコイを「トランスフェクトした」細胞は、異なる経過時点において依然として利用可能なシス−エレメント−デコイの量についてアッセイすることができる。それによって好ましくは、蛍光染料（例えば、テキサスレッド）で標識したシス−エレメント−デコイまたは放射性標識した（例えば、32Ｐ）シス−エレメント−デコイは、それぞれ、後にデジタル蛍光顕微鏡およびオートラジオグラフィーまたはシンチグラフィーと共に使用される。改変が成功したシス−エレメント−デコイは、細胞内で未改変のシス−エレメント−デコイの半減期より長い、好ましくは少なくとも約４８時間、さらに好ましくは少なくとも約４日、最も好ましくは少なくとも約７日の半減期を有する。
【００４１】
改変された好適なヌクレオチド間結合はUhlmannおよびPeyman((1990)Chem.Rev.90,554)に要約されている。本発明による方法に使用することができる核酸の改変されたヌクレオチド間−リン酸残基および／または非リン−架橋は、例えば、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、リン酸−エステルを含むが、非−リンヌクレオチド間−類似物は、例えば、シロキサン−架橋、カルボネート−架橋、カルボキシメチルエステル−架橋、アセタミデート−架橋および／またはチオエーテル−架橋を含む。ホスホロチオエート−改変型ヌクレオチド間結合を使用する場合には、それらは、好ましくは、塩基シトシンとグアニンの間に位置してはいけない。その理由は、そうすることによりシス−エレメント−デコイの標的細胞が活性化されることがあるからである。
【００４２】
本発明のさらに別の実施態様は、核酸の半減期を延長する構造的特徴を核酸に挿入することによる核酸の安定化である。ヘアピン−およびベル−型ＤＮＡを有するこのような構造は米国特許第5,683,985号に開示されている。同時に、改変されたヌクレオチド間リン酸残基および／または非リン架橋を、上記構造と共に導入することができる。それによって得られた核酸構造は、上記の試験システムにおいて、結合および安定性についてアッセイすることができる。
【００４３】
コア結合配列は、シス−エレメント−デコイに存在してもよいし、ベクターに存在してもよい。好ましい実施態様において、ベクターはプラスミドベクターであり、特に常染色体が複製することができ、それによって導入された２本鎖核酸の安定性を増加させることができるプラスミドベクターである。
【００４４】
本発明のシス−エレメント−デコイは細胞に速やかに取り込まれる。十分な取り込みは、ＳＴＡＴ−１による制御下にある１つ以上の遺伝子の発現の調節によって特徴づけられる。本発明のシス−エレメント−デコイは、好ましくは、細胞との接触の約４時間後、さらに好ましくは約２時間後、約１時間後、約３０分後、最も好ましくは約１０分後に遺伝子または遺伝子群の転写を調節する。このような実験に使用される典型的な混合物は１０μｍｏｌ／ｌのシス−エレメント−デコイを含有する。
【００４５】
さらに、本発明は、薬剤を製造する際の本発明によるシス−エレメント−デコイの使用に関する。さらに、本発明は、循環器系合併症(cardio-vascular complication)（例えば、経皮的血管形成後の再狭窄(restenosis after percutaneous angioplasty)および静脈バイパスの狭窄）、移植の拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、外科的介入に関連する虚血／再注輸による障害、免疫学的過敏反応（Ｉ型〜Ｖ型）、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、多発性硬化症および関節リウマチ）並びに敗血症性ショックを含む全ての他の形態の急性、亜急性および慢性炎症性疾患、｛特に関節（例えば、関節炎）、呼吸器官（例えば、気管支喘息、慢性気管支炎）、皮膚（例えば、乾癬、神経皮膚炎(neurodermitis)）並びに消化管（例えば、潰瘍性大腸炎、クーロン病）のもの｝を予防および／または治療するための薬剤を製造する際の本発明のシス−エレメント−デコイの使用に関する。
【００４６】
さらに、本発明は、細胞、特に内皮細胞、上皮細胞、白血球、平滑筋細胞、ケラチン生成細胞または線維芽細胞における少なくとも１つの遺伝子の転写を調節するための方法であって、転写因子ＳＴＡＴ−１に配列特異的に結合することができる本発明による１つ以上の２本鎖核酸を含有する混合物を、上記細胞に接触させるステップを含む方法に関する。好ましい方法は、例えば、レシピエントの生体内に導入する前に、Ｔリンパ球を含有する骨髄ドナー検体を半ビボで処理することである。
【００４７】
さらに、本発明によるシス−エレメント−デコイは組成物が患者に投与されてもまたは本発明による方法に使用されてもよい。本発明によるシス−エレメント−デコイを含有する組成物（以下において、混合物と呼ぶ）を標的細胞（例えば、内皮細胞、上皮細胞、白血球、平滑筋細胞、ケラチン生成細胞または線維芽細胞）と接触させる。この接触の目的は、ＳＴＡＴ−１に結合するシス−エレメント−デコイを標的細胞（すなわち、ＳＴＡＴ−１依存的な方法で前炎症遺伝子産物を発現する細胞）内に移動させることである。従って、核酸の改変および／または膜の透過性を改善することが既知の添加剤または補助物質を本発明の範囲内で使用することができる(UhlmannおよびPeyman(1990),Chem.Rev.90,544)。
【００４８】
好ましい実施態様において、本発明による混合物は核酸と緩衝液だけを含有する。好適な濃度のシス−エレメント−デコイは少なくとも０．１〜１００μＭの範囲で存在し、好ましくは１０μＭの濃度で存在し、１種以上の好適な緩衝液を添加する。このような緩衝液の一例は、１４５ｍｍｏｌ／ｌのＮａ+、５ｍｍｏｌ／ｌのＫ+、１５６ｍｍｏｌ／ｌのＣｌ-、２ｍｍｏｌ／ｌのＣａ2+、１ｍｍｏｌ／ｌのＭｇ2+、１０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１０ｍｍｏｌ／ｌのＤ−グルコースを含有するリンガー液ｐＨ７．４である。
【００４９】
本発明のさらに別の実施態様において、混合物は少なくとも１つの添加剤および／または補助物質をさらに含有する。脂質、陽イオン脂質、ポリマー、リポソーム、ナノ粒子、核酸−アプタマー、ＤＮＡ結合型のペプチドおよびタンパク質または合成ペプチドＤＮＡ分子のような添加剤および／または補助物質が、（ｉ）例えば、細胞内への核酸の導入を増加するため、（ii）混合物を小グループの細胞にだけ標的化するため、（iii）細胞内での核酸の分解を阻止するため、（iv）使用前の核酸混合物の保存を容易にするために意図されている。ペプチドおよびタンパク質または合成ペプチドＤＮＡ分子の例は、例えば、抗体、抗体の断片、リガンド、接着分子であり、それらの全ては改変されていても、未改変であってもよい。
【００５０】
細胞内でシス−エレメント−デコイを安定化する添加剤は、例えば、陽イオンポリマー、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリエチレンイミンのような核酸凝縮物質である。
【００５１】
本発明の方法に使用される混合物は、主に、注射、カテーテル、坐剤、エアゾール（それぞれ経鼻および経口スプレー、吸入）、トロカール、発射体、プルロニック(pluronic)ゲル、薬剤の徐放性ポリマーまたは局所的アクセスを容易にする任意の他の手段によって局所的に適用される。本発明の方法に使用される混合物の半ビボにおける使用によっても局所的なアクセスが可能になる。
【００５２】
しかし、ＳＴＡＴ−１活性の阻害は、上記方法においてタンパク質レベルで阻害されうるだけでなく、転写因子タンパク質の翻訳前または翻訳中に実施することもできる。阻害は、いわゆるアンチセンス−オリゴヌクレオチドによって実施することができる。アンチセンス−オリゴヌクレオチドは３つの異なるレベル、転写中（ｈｎＲＮＡ合成の防止）、ｈｎＲＮＡを処理（スプライシング）してｍＲＮＡを形成する間およびリボソームにおいてｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される間に標的遺伝子の合成を阻害することができる。アンチセンス−オリゴヌクレオチドによって遺伝子の発現を阻害する方法は最先端であり、当業者に周知である。本発明のさらに別の態様は、ＳＴＡＴ−１発現を特異的に阻害し、好ましくは、以下の配列の１つを有するアンチセンス−オリゴヌクレオチドである：
5'-TACCACTGAGACATCCTGCCAC-3'(配列番号:41)、
5'-AACATCATTGGCACGCAG-3'(配列番号:42)、
5'-GTGAACCTGCTCCAG-3'(配列番号:43)。
【００５３】
アンチセンス−オリゴヌクレオチドは１本鎖ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子または１本鎖ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子であってもよい。アンチセンス−オリゴヌクレオチドは、例えば、シス−エレメント−デコイについて上記されているように、１つ以上の改変されたヌクレオチド間結合をさらに示してもよい。ホスホチオエート改変ヌクレオチド間結合によって安定化されたアンチセンス−オリゴヌクレオチドの場合には、塩基シトシンとグアニンの間にホスホロチオエート改変ヌクレオチド間結合が挿入されないことを特に考慮すべきである。その理由は、これにより、特に免疫担当細胞（例えば、内皮細胞）がＩＦＮγにより同様に活性化されるので、望ましい治療効果が少なくとも一部損なわれると思われるからである。
【００５４】
アンチセンス−オリゴヌクレオチドは１本鎖核酸分子として投与されるだけでなく、ベクター内に含有してもよい。好ましい実施態様において、ベクターはプラスミドベクター、特に常染色体が複製することができ、それによって導入された１本鎖核酸の安定性を増加することができるプラスミドベクターである。
【００５５】
従って、本発明のさらに別の態様は、トランスフェクション後に標的細胞内で発現され、ＳＴＡＴ−１発現を特異的に阻害するアンチセンス発現ベクターである。それによって最先端技術による任意の入手可能な真核細胞発現ベクターを考慮することができる。好ましくは、例えば、２３５０ｂｐを含むＳＴＡＴ−遺伝子のセグメント（−１２１〜＋２２２９、GenBank寄託番号XM010893）が反対方向（３’→５’）にクローニングされているPromega社のｐＣＩプラスミド（カタログ番号E1731、GenBank寄託番号U47119）が考慮される。ＳＴＡＴ−１のこのセグメントには２つのＥｃｏＲＩ制限部位が隣接しており、ＸｈｏＩ制限部位を含有する。その発現はＣＭＶプロモーターの制御下にある。プラスミド全体（pCI/Stat1 ASと名づけられている）は６３６５ｂｐを含む。
【００５６】
ＳＴＡＴ−１タンパク質発現のアンチセンス−オリゴヌクレオチドに基づいた減弱は、デコイ−オリゴヌクレオチドと同じ程度、ヒト内皮細胞におけるサイトカイン誘導性ＣＤ４０−発現も阻害する。
【００５７】
さらに、本発明は、薬剤を製造するための、本発明によるアンチセンス−オリゴヌクレオチドの使用に関する。さらに本発明は、循環器系合併症（例えば、経皮的血管形成後の再狭窄および静脈バイパスの狭窄）、移植の拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、外科的介入に関連する虚血／再注輸による障害、免疫学的過敏反応（Ｉ型〜Ｖ型）、自己免疫疾患（例えば、糖尿病、多発性硬化症および関節リウマチ）並びに敗血症性ショックを含む全ての他の形態の急性、亜急性および慢性炎症性疾患｛特に関節（例えば、関節炎）、呼吸器官（例えば、気管支喘息、慢性気管支炎）、皮膚（例えば、乾癬、神経皮膚炎）並びに消化管（例えば、潰瘍性大腸炎、クーロン病）のもの｝を予防および／または治療するための薬剤を製造するための本発明によるアンチセンス−オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００５８】
本発明によるアンチセンス−オリゴヌクレオチドは組成物で使用され、患者に投与することもできる。組成物は、例えば、細胞内へのアンチセンス−オリゴヌクレオチド導入を容易にする、組成物を小グループの細胞にだけ標的化する、例えば、細胞内でのアンチセンス−オリゴヌクレオチドの分解を阻止する、または例えば、使用前のアンチセンス−オリゴヌクレオチドの保存を容易にする、安定化作用のある添加剤または補助物質から製造することができる。
【００５９】
以下の図面および実施例は、例示目的のためだけに示されており、あらゆる点において本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００６０】
１．細胞培養
ヒト内皮細胞は、ＨＥＰＥＳ−変法タイロード液中で１．６Ｕ／ｍｌのディスパーゼで３７℃において３０分間処理することにより、臍帯静脈から単離し、ゼラチンをコーティングした６ウェル組織培養皿（２ｍｇ／ｍｌゼラチンを０．１Ｍ  ＨＣｌに加えたもので室温において３０分間）で、２０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０Ｕ／ｍｌナイスタチン、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび５ｍＭ  ＴＥＳ、１μｇ／ｍｌヘパリン並びに４０μｇ／ｍｌ内皮増殖因子を含有するＭ１９９培地（Gibco Life Technologies、Karlsruheドイツ）中で培養した。ヒト内皮細胞は、典型的な敷石形態、von Willebrandt−因子（ｖＷＦ）の陽性の免疫染色およびＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）の蛍光定量的検出（ＦＡＣＳ）並びに平滑筋α−アクチンの陰性の免疫染色によって同定した(Krzeszら、(1999),FEBS Lett.453,191)。ヒト単球−細胞株ＴＨＰ−１(ATCC TIB 202)は、１０％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０Ｕ／ｍｌナイスタチンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地(Life Technologies)で培養した。ヒト平滑筋細胞は、外植−技術によって切開した胸腺静脈から単離し(Krzeszら、(1999),FEBS Lett.453,191)、ゼラチンをコーティングした６ウェル組織培養皿（上記参照）で、１５％ウシ胎仔血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０  Ｕ／ｍｌナイスタチンを含有する１．５ｍｌのデルベッコ変法イーグル培地で培養した。平滑筋細胞は、平滑筋α−アクチンの陽性の免疫染色で同定した。
【００６１】
２．ＲＴ−ＰＣＲ分析
内皮細胞の総ＲＮＡは、製造業者のプロトコールにより、Qiagen RNeasyキット（Qiagen、Hilden、ドイツ）で単離し、合計容量２０μｌにおいて３μｇのＲＮＡおよび２００ＵのSuperscript(商標)II逆転写酵素(Life Technologies)でｃＤＮＡ合成した。ｃＤＮＡ負荷量を調節するために、５μｌ（約７５ｎｇのｃＤＮＡ）の得られたｃＤＮＡ溶液および伸長因子１（ＥＦ−１:elongation factor-1）ＰＣＲのプライマー対(Gibco)を１ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ(Gibco)と共に総容量５０μｌで使用した。ＥＦ−１はＰＣＲの内部標準として作用した。０．１％臭化エチジウムを含有する１．５％アガロース−ゲルでＰＣＲ産物を分離し、以下のＰＣＲ分析におけるｃＤＮＡの容量を調節するために、ＣＣＤカメラシステムおよびScanalytics社（マサチューセッツ州ビレリカ、米国）のOne-Sdcanゲル分析ソフトウェアで濃度測定した。
【００６２】
ＰＣＲ反応は全て、Hybaid OmnE Thermocycler（ＡＷＧ、ハイデルベルグ、ドイツ）で各プライマー対について別個に実施した。臍帯由来のヒト内皮細胞のｃＤＮＡの個々のＰＣＲ条件は以下のようであった：ＣＤ４０（産物サイズ３８１ｂｐ、２５サイクル、アニーリング温度６０℃、（順方向プライマー）5'-CAGAGTTCACTGAAACGGAATGCC-3'(配列番号:44)、（逆方向プライマー）５'-TGCCTGCCTGTTGCACAACC-3'(配列番号:45)）、Ｅ−セレクチン（産物サイズ３０４ｂｐ、３３サイクル、アニーリング温度６０℃、（順方向プライマー）5'-AGCAAGGCATGATGTTAACC-3'(配列番号:46)、（逆方向プライマー）5'-GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3'(配列番号:47)）、ＥＦ−１（産物サイズ２２０ｂｐ、２２サイクル、アニーリング温度５５℃、（順方向プライマー）5'-TCTTAATCAGTGGTGGAAG-3'(配列番号:48)、（逆方向プライマー）5'-TTTGGTCAAGTTGTTTCC-3'(配列番号:49)）、ＩＬ−１２ｐ４０（産物サイズ２８１ｂｐ、３０サイクル、アニーリング温度６２℃、（順方向プライマー）5'-GTACTCCACATTCCTACTTCTC-3'(配列番号:50)、（逆方向プライマー）5'-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3'(配列番号:51)）、ｒｐ１３２（産物サイズ３６８ｂｐ、２０サイクル、アニーリング温度６０℃、（順方向プライマー）5'-GTTCATCCGGCACCAGTCAG-3'(配列番号:52)、（逆方向プライマー）5'-ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3'(配列番号:53)）、ＭＣＰ−１（産物サイズ３３０ｂｐ、２２サイクル、アニーリング温度６３℃、（順方向プライマー）5'-GCGGATCCCCTCCAGCATGAAAGTCTCT-3'(配列番号:54)、（逆方向プライマー）5'-ACGAATTCTTCTTGGGTTGTGGAGTGAG-3'(配列番号:55)）。
【００６３】
３．電気泳動移動シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
核抽出物および［32Ｐ］標識２本鎖コンセンサス−オリゴヌクレオチド（Santa Cruz Biotechnologie、ハイデルベルグ、ドイツ）の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、オートラジオグラフィーおよびスーパーシフト分析を、Krzeszら(1999),FEBS Lett.453,191に記載されているように実施した。以下の１本鎖配列（コア結合配列には下線をつけてある）を有する２本鎖ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドを使用した：SIE、5'-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTC-3'(配列番号:56)。種々のシス−エレメント−デコイによるサイトカイン刺激したＴＨＰ−１細胞（前単球ヒト細胞株）の核抽出物における内因性ＳＴＡＴ−１放出(extrusion)を分析するためには、３０：１の比（ＳＴＡＴ−１シス−エレメント−デコイ：［32Ｐ］標識ＳＩＥオリゴヌクレオチド（１１ｆｍｏｌ））をＥＭＳＡ結合方法に選択した。
【００６４】
４．デコイ−オリゴヌクレオチド技法
Krzeszら、(1999),FEBS Lett.453,191に記載されているように、相補的な１本鎖ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチド（Eurogentec社、ケルン、ドイツ）を用いて、２本鎖デコイ−オリゴヌクレオチドを作製した。培養ヒト内皮細胞は、１０μＭ濃度のそれぞれのデコイ−オリゴヌクレオチドと共に４時間事前インキュベーションした。これらは、ＥＭＳＡおよびＲＴ−ＰＣＲ分析に基づいて以前にすでに最適化されている条件であった。この後、デコイ−オリゴヌクレオチドを含有する培地を、通常どおり、新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチドの１本鎖配列は以下のようであった（下線つきの文字はホスホロチオエート結合塩基を示し、それらは各々５’−３’方向で示す）：
GATA-2, CACTTGATAACAGAAAGTGATAACTCT (配列番号:57)
NF-κB, AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC (配列番号:58);
STAT-1, CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG (配列番号:33);
STAT-1-19mut, GACAGTGCAGTGAACTGTC (配列番号:59);
STAT-1-25mut, CATGTTATGCAGACCGTAGTAAGTG (配列番号:60)。
【００６５】
５．アンチセンス−オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）技法
アンチセンス方法については、１００ｍｌのOPTI-MEM(登録商標)Ｉ培養培地に１５μｌのリポフェクチン（Gibco Life Technologie社、Karlsruhe、ドイツ）を添加し、室温（ＲＴ:room temperature）において４５分間インキュベーションした（溶液Ａ）。その後、アンチセンス−ＯＤＮ（Eurogentec社、ケルン、ドイツ）を、最終濃度０．５μＭまで１００μｌのOPTI-MEM(登録商標)Ｉ培養培地に添加した（溶液Ｂ）。溶液ＡおよびＢをプールした後、さらに１５分間インキュベーションした（ＲＴ）。実験開始時に、内皮細胞培養液の０．８ｍｌの従来の細胞培養培地（ヘパリンおよび内皮増殖因子を含有しない）を、リポフェクチン−アンチセンス−ＯＤＮ−複合体を含有するエッペンドルフチューブに添加し、内皮細胞培養液の細胞培養培地をアンチセンス−リポフェクチン培地と交換した。４時間後アンチセンス−リポフェクチン培地を除去し、新鮮な細胞培養培地（ヘパリンおよび内皮増殖因子を含有する）と交換した。ＳＴＡＴ−１−アンチセンス−ＯＤＮの配列は5'-T*A*CCA*C*T*G*A*G*A*C*A*T*CC*T*GCC*A*C-3'（*ホスホロチオエート改変塩基、配列番号：４１）。
【００６６】
６．ウェスタンブロット分析
臍帯由来のヒト内皮細胞および胸腺静脈由来の平滑筋細胞は、液体窒素中で凍結させ、３７℃において融解すること（サーモブロック(thermoblock)、Kleinfelden、ドイツ）を５回反復することによって破壊した。タンパク質抽出液は、Heckerら、(1994),Biochem J.299,247に記載されているように調製した。標準的なプロトコールに従って、２０〜３０μｇのタンパク質を、ＳＤＳの存在下において変性条件下において１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、BioTrace(商標)フッ化ポリビニリデン転移膜（Pall Corporation、Rosdorf、ドイツ）に移した。以下の一次抗体を免疫学的タンパク質検出に使用した：ＣＤ４０タンパク質（ポリクローナル、2000倍稀釈、Research Diagnostics Inc.ニュージャージー州フランダース、米国）、ＳＴＡＴ−１タンパク質（モノクローナル、5000倍稀釈、BD Transduction Laboratories、ハイデルベルグ、ドイツ）、ＩＲＦ−１タンパク質（ポリクローナル、2000倍稀釈、Santa Cruz Biotechnology、ハイデルベルグ、ドイツ）、ｉＮＯＳタンパク質（ポリクローナル、3000倍稀釈、BD Transduction Laboratories、ハイデルベルグ、ドイツ）。タンパク質バンドは、ペルオキシダーゼ−結合抗−ウサギ−ＩｇＧを添加することにより検出し、モノクローナル一次抗体を使用する場合には、化学発光方法（スーパーシグナル化学発光基質(SuperSignal Chemiluminescent Substrate)、Pierce Chemical、イリノイ州ロックフォード、米国）およびその後のオートラジオグラフィー（Hyperfilm(商標)MP、Amersham Pharmacia, Biotech、Buckinghamshire、英国）により、それぞれの抗−マウス−ＩｇＧ（3000倍、Sigma、Deisenhofen、ドイツ）によって検出した。βアクチンの等しいタンパク質バンドをモノクローナル一次抗体およびペルオキシダーゼ−結合抗−マウスＩｇＧ（共にSigma-Aldrich製、3000倍稀釈）で検出することによって、転移膜の「ストリッピング」（０．２Ｎ  ＮａＯＨで５分間、その後Ｈ2Ｏで１０分間洗浄を３回）により、等しいタンパク質量のローディングおよび転移が示された。
【００６７】
７．統計分析
そうでないことを示さない限り、図面および本文中のデータは全て、ｎ回の実験の平均値±ＳＥＭとして示す。統計学的評価は、対応のないデータについては、統計学的に有意であると考えられるｐ値＜０．０５を用いてスチューデントのｔ検定を実施した。
【００６８】
８．動物実験によるデコイ−オリゴヌクレオチドの影響の検出
８．１  マウス
本願において開発したデコイ−オリゴヌクレオチドに基づいた治療方法の有効性を検出するために、１群あたり８〜１０匹の動物を用いたマウスにおける動物実験に関連する概念検証試験を抗原誘導性関節炎の徴候について実施した（モデルはHenzgenら、Exp.Toxicol.Pathol.(1996),48,255を参照）。０．２５ｎｍｏｌのＳＴＡＴ−１−デコイ−オリゴヌクレオチド（配列番号：３３）を関節に１回適用すると（関節内注射）、関節の抗原誘導性膨潤（３５％）、炎症性応答の強度（７０％）、関節破壊（８０％）、総関節炎スコアー（７０％）および血清中の前炎症性サイトカイン濃度（例えば、インターロイキン６は８０％）を３〜１４日目においてかなり有意に低下した。一方、それぞれの対照オリゴヌクレオチドは治療作用を示さなかった。
【００６９】
さらに、動物に１回以上皮下注射することによって、関節炎誘発の１４日後に皮膚に誘発させた接触皮膚炎（IV型反応）もデコイ−オリゴヌクレオチド治療マウスではかなり有意に阻害された（３５％）ことは本発明の検討において注目すべきである。
【００７０】
８．２  モルモット
モルモット（Hartley、雄、体重３５０ｇ）に７日間の間に２回アレルギー化した後（１０％ＤＮＣＢの５０％アセトン／５０％オリーブオイル溶液５０μｌで１日目に一方の耳に、２日目に他方の耳に抗原投与し、７日目に２％ＤＮＣＢの９５％アセトン／５％オリーブオイル溶液１５μｌで頚部の皮膚に追加抗原投与した）、動物の剃毛した背中のそれぞれサイズが約１ｃｍ2の１箇所以上の領域に１３日目に２，４−ジニトロクロロベンゾール（ＤＮＣＢ、０．５％ＤＮＣＢの９５％アセトン／５％オリーブオイル溶液１０μｌ）を再度適用することによって接触皮膚炎を誘発し、２４時間後に肉眼的および組織学的に評価した。このような方法で誘発した接触皮膚炎は、表皮領域の浮腫および海綿状変化の顕著な形成、アポトーシス細胞の増加並びに白血球の広範囲の浸潤によって組織学的に（ギムザ染色）特徴づけられた（図８）。最後のＤＮＣＢ暴露の１時間前にＳＴＡＴ−１−デコイ−オリゴヌクレオチド（配列番号：１９）を皮内適用すると、記載した組織学的なパラメーターが明確に低下した、すなわち、全体的に炎症性応答の有意な低減を生じたが、突然変異型対照オリゴヌクレオチド（5'-TGTGGACCGTAGGAAGTG-3'、配列番号：６１）は生じなかった。
【００７１】
本発明の以下の図面によってさらに詳細に解明される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】対応するシス−エレメント−デコイ（配列番号：３３）による転写因子ＳＴＡＴ−１の中和による培養中のヒト内皮細胞におけるＣＤ４０（ａ、ｃ、ｄおよびｅ）、Ｅ−セレクチンおよびＭＣＰ−１（ａ）のサイトカインによって刺激された発現の阻害並びにインターロイキン１２ｐ４０−発現のＣＤ４０−リガンド−誘導の阻害（ｂ）を示す。（ａ）ＳＴＡＴ−１（配列番号：３３）またはＮＦ−κＢシス−エレメント−デコイ（１０μＭ）と共に４時間事前インキュベーションし、その後１００Ｕ／ｍｌの腫瘍壊死因子αおよび１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンγと共に９時間インキュベーションした内皮細胞におけるＥ−セレクチン、ＭＣＰ−１およびＣＤ４０  ｍＲＮＡ発現の代表的なＲＴ−ＰＣＲ分析である（また、デンシトメトリー分析（「強度」）は刺激した対照に対する割合（％）で示し、内部標準ＥＦ−１を基準とする）。（ｂ）ＳＴＡＴ−１シス−エレメント−デコイ（１０μＭ、配列番号：３３）と共に４時間事前インキュベーションし、その後約６７００００Ｐ３ｘＴＢ．Ａ７−細胞／ｍｌ（これらのマウス骨髄腫細胞はヒトＣＤ４０−リガンドＣＤ１５４を安定して発現する）および１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンγと共に１２時間インキュベーションした内皮細胞におけるインターロイキン１２ｐ４０のｍＲＮＡ発現の代表的なＲＴ−ＰＣＲ分析である（また、デンシトメトリー分析（「強度」）は刺激した対照に対する割合（％）で示し、内部標準ｒｐ１３２を基準とする）。（ｃ）ＳＴＡＴ−１シス−エレメント−デコイ（配列番号：３３）またはそれぞれの対照オリゴヌクレオチド（ＳＴＡＴ−１−２５ｍｕｔ）と共に４時間事前インキュベーションし（濃度１０μＭ）、その後１００Ｕ／ｍｌの腫瘍壊死因子αおよび１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンγと共に９時間インキュベーションした内皮細胞におけるＣＤ４０  ｍＲＮＡ発現の代表的なＲＴ−ＰＣＲ分析である（また、デンシトメトリー分析（「強度」）は刺激した対照に対する割合（％）で示し、内部標準ＥＦ−１を基準とする）。（ｄ）培養中の内皮細胞のサイトカインによって刺激されたＣＤ４０  ｍＲＮＡ発現に対してＳＴＡＴ−１シス−エレメント−デコイ（配列番号：３３）が与える影響について実施した５つの独立した実験の統計学的な要約である（*ｐ＜０．０５対刺激した対照細胞）。（ｅ）２４時間後に培養中の内皮細胞のサイトカインによって刺激されたＣＤ４０タンパク質発現に対してＳＴＡＴ−１シス−エレメント−デコイ（配列番号：３３）が与える影響のデンシトメトリー分析以外の代表的なウェスタンブロット分析である（「強度」は刺激した対照に対する割合（％）で示し、内部標準βアクチンを基準とする）。比較結果はさらに別の実験で得た。
【図２】転写因子ＳＴＡＴ−１の発現のアンチセンス−オリゴヌクレオチドに基づいたダウンレギュレーションによるヒト培養内皮細胞におけるサイトカイン誘導性のＣＤ４０遺伝子発現の阻害を示す。（ａ）それぞれ、休止状態並びに細胞を１００Ｕ／ｍｌ腫瘍壊死因子αおよび１０００Ｕ／ｍｌインターフェロンγと共に１４時間インキュベーションした後のＣＤ４０およびＳＴＡＴ−１タンパク質の発現である。図の左のパネルは、異なるバッチの細胞を用いた２〜４の実験の統計学的な要約であり、図の左のパネルは、刺激しなかった対照に対する割合（％）で示し、内部標準βアクチンを基準としたデンシトメトリー分析（「強度」）以外に、代表的なウェスタンブロット分析を各々示す（*ｐ＜０．０５対刺激しなかった対照細胞）。（ｂ）ＳＴＡＴ−１アンチセンス−オリゴヌクレオチド（１μＭ、配列番号：３３）を用いた２４時間の事前処理により刺激した内皮細胞におけるＣＤ４０およびＳＴＡＴ−１タンパク質発現の比較阻害である。２つの実験の要約（図の左のパネル、*ｐ＜０．０５対刺激した対照細胞）および代表的なウェスタンブロット（図の右のパネル）である。
【図３】それぞれのシス−エレメント−デコイ（配列番号：３３）による転写因子ＳＴＡＴ−１の中和による単球細胞株ＴＨＰ−１における転写因子ＩＲＦ−１の発現の阻害（ａ）および培養中のヒト平滑筋細胞におけるＮＯシンターゼの誘導性アイソフォームの阻害（ｂ）を示す。（ａ）刺激した対照に対する割合（％）で示し、内部標準βアクチンを基準としたデンシトメトリー分析（「強度」）以外に、代表的なウェスタンブロット分析を示す。培養中のＴＨＰ−１細胞は、シス−エレメント−デコイ（１０μＭ）と共に４時間事前インキュベーションし、その後１００Ｕ／ｍｌの腫瘍壊死因子αおよび１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンγと共に３時間インキュベーションした。（ｂ）図の左のパネル：ＳＴＡＴ−１（配列番号：３３）、ＮＦ−κＢまたはＧＡＴＡ−２シス−エレメント−デコイ（１０μＭ）と共に４時間事前インキュベーションし、その後１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンγ、６０Ｕ／ｍｌのインターロイキン１β、１００Ｕ／ｍｌの腫瘍壊死因子αおよび１μｇ／ｍｌの細菌のリポ多糖と共に９時間インキュベーションした異なるバッチの培養ヒト平滑筋細胞を用いた３つの実験の統計学的な要約である。ＮＯシンターゼの誘導性アイソフォームのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析（*ｐ＜０．０５対刺激した対照細胞＝１００％）。図の右のパネル：異なるバッチの細胞を用いた３つの実験の統計学的要約と、それぞれ、ＳＴＡＴ−１（配列番号：３３）およびＮＦ−κＢシス−エレメント−デコイと共に事前インキュベーションすることによって（２０時間の暴露後の）ＮＯシンターゼタンパク質のサイトカインによって刺激された発現の阻害の代表的なウェスタンブロット分析である（*ｐ＜０．０５対刺激した対照細胞＝１００％）。
【図４】異なるシス−エレメント−デコイ（配列番号：１７、２５、２９、３１、３３、３５、３７、３９並びに突然変異型対照オリゴヌクレオチドＳＴＡＴ−１−１９ｍｕｔおよびＳＴＡＴ−１−２５ｍｕｔ）による単球細胞株ＴＨＰ１の細胞核抽出液における内因性ＳＴＡＴ−１の中和を示す。培養ＴＨＰ−１細胞は、１００Ｕ／ｍｌの腫瘍壊死因子αおよび１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンγと共に３時間インキュベーションし、その後核抽出液の調製のために使用した。細胞の核抽出液は、［32Ｐ］標識した２本鎖ＳＩＥオリゴヌクレオチド（Santa Cruz Biotochnologie、ハイデルベルグ、ドイツ）並びにそれぞれのシス−エレメント−デコイおよび対照オリゴヌクレオチドと共に室温において２０分間それぞれ同時インキュベーションし、その後電気泳動移動シフト分析に付した。
【図５】胸腺静脈のヒト平滑筋細胞におけるＥ−セレクチンおよびＭＣＰ−１  ｍＲＮＡの発現に対する選択したＳＴＡＴ−１シス−エレメント−デコイ（配列番号：１７、３１、３５、３７）の影響を示す。培養細胞（継代２代）は、それぞれのシス−エレメント−デコイ（１０μＭ）と共に４時間事前インキュベーションし、その後１００Ｕ／ｍｌの腫瘍壊死因子αおよび１０００Ｕ／ｍｌインターフェロンγと共に９時間インキュベーションした。代表的なＲＴ−ＰＣＲ分析、比較結果はさらに別の実験で得た。
【図６】ＳＴＡＴ−１アンチセンス−発現ベクターｐＣＩ／Ｓｔａｔ１  ＡＳの遺伝子マップに関する構造を略図で示す。
【図７】異なるシス−エレメント−デコイ（配列番号：１７、１９、２７、３３および３９）によるヒト培養内皮細胞におけるＳＴＡＴ−１の中和の結果を示す。デンシトメトリー分析（「強度」）以外に代表的なＥＭＳＡ分析を示す。培養中の内皮細胞はデコイ−オリゴヌクレオチド（１０μｍｏｌ／ｌ）と共に４時間インキュベーションし、その後１００Ｕ／ｍｌの腫瘍壊死因子αおよび１０００Ｕ／ｍｌのインターフェロンγで３０分間刺激した。ＥＭＳＡ分析には、刺激した細胞の核抽出液および［32Ｐ］標識した２本鎖ＳＩＥ−オリゴヌクレオチド（Santa Cruz Biotochnologie、ハイデルベルグ、ドイツ）を使用した。
【図８】雄モルモットのＤＮＣＧ−誘導性接触皮膚炎に対するＳＴＡＴ−１デコイ−オリゴヌクレオチド（ＳＴＡＴ−１ｃｏｎｓ、１０ｎｎｍｏｌ、配列番号：１９）の影響の組織学的分析を示すが、突然変異型対照オリゴヌクレオチド（ＳＴＡＴ−１ｍｕｔ、１０ｎｍｏｌ、配列番号：６１）の影響は示していない（オリジナル×４００、検討した合計１７匹のモルモットの典型的な結果）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005505283.tif 000062
【国際調査報告】
2005505283.tif 000063
2005505283.tif 000064
2005505283.tif 000065
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