(57)【要約】体外量の対象の血液に含まれる単球の機能的樹状抗原提示細胞への分化を誘導するための方法が提供される。単球は、従来のフォトフェレーシス装置におけるプラスチックチャンネルなど、プラスチックチャンネルを通じる単球の流れの結果生じる活性化力によって樹状細胞へ分化するように誘導される。誘導された単球から生成される機能的樹状細胞はアポトーシスまたは不活性化疾患エフェクター因子と共にインキュベートされ、疾患エフェクター因子によって発現される少なくとも１つの病原体の提示を増強する。図１は、免疫療法治療における使用にも提供される疾患エフェクター因子とともにインキュベートされたかかる樹状細胞を含む一夜インキュベーション後の樹状抗原提示細胞およびアポトーシスＴ細胞組成物の生成を示す図である。
2005515781.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体外量の対象の血液から機能抗原提示樹状細胞を製造するための方法であって、該方法が、
（ａ）前記体外量の血液を血中に含まれる疾患エフェクター因子におけるアポトーシスを誘導する能力がある光活性化可能剤で処理するステップと、
（ｂ）前記体外量の血液を直径が約１ｍｍ以下であるプラスチックチャンネルを有するフォトフェレーシス（ｐｈｏｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）装置を通じて流すステップと、
（ｃ）前記フォトフェレーシス装置を通じて流れる前記体外量の血液を照射するステップと、
（ｄ）前記フォトフェレーシス装置における処理後に前記体外量の血液をインキュベートするステップと
を含んで成る方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）の前に前記方法が、
前記体外量の血液を白血球アフェレーシス（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）処理にかけることによって前記体外量の血液から白血球および単球を分離するステップをさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記光活性化可能剤がソラレンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
光活性化可能剤が８−ＭＯＰである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記疾患エフェクター因子が悪性Ｔ細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記疾患エフェクター因子が、前記体外量の血液中に含まれる充実性腫瘍からの癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
インキュベーションが、約６〜４８時間にわたって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
インキュベーションが、約１２〜２４時間にわたって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
体外量の対象の血液から機能抗原提示樹状細胞を製造するための方法であって、該方法が、
（ａ）前記体外量の血液に含まれる疾患エフェクター因子のアポトーシスを誘導するステップと、
（ｂ）前記体外量の血液を直径が約０．５ｍｍ〜約５ｍｍであるプラスチックチャンネルを通じて流すステップと、
（ｃ）前記プラスチックチャンネルの通過後に前記体外量の血液をインキュベートするステップと
を含んで成る方法。
【請求項１０】
前記体外量の血液をプラスチックチャンネルの中に流すステップが、直径が約１ｍｍ以下であるチャンネルを有するフォトフェレーシス装置で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記体外量の血液に含まれる疾患エフェクター因子のアポトーシスを誘導するステップが、
（ｄ）光活性化可能剤を前記体外量の血液に添加するステップと、
（ｅ）前記体外量の血液を紫外線で照射するステップと
から成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記光活性化可能剤が８−ＭＯＰである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記体外量の血液を白血球アフェレーシス装置で処理し、白血球濃縮液を調製するステップをさらに含んで成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
インキュベーションが、約６〜約４８時間にわたって行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
インキュベーションが、約１２〜約２４時間にわたって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
体外量の対象の血液から機能抗原提示樹状細胞を製造するための方法であって、該方法が、
（ａ）遊離Ｆｃセグメントを有するモノクローナル抗体で前記体外量の血液中の疾患エフェクター因子をコーティングするステップと、
（ｂ）前記体外量の血液を直径が約０．５ｍｍ〜約５ｍｍであるプラスチックチャンネルを通じて流すステップと、
（ｃ）前記プラスチックチャンネルの通過後に前記体外量の血液をインキュベートするステップと
を含んで成る方法。
【請求項１７】
前記疾患エフェクター因子が、前記体外量の対象の血液中に含まれる充実性腫瘍癌細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記体外量の血液中に含まれる前記疾患エフェクター因子のアポトーシスを誘導するステップをさらに含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患エフェクター因子が悪性Ｔ細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
インキュベーションが、約６〜約４８時間にわたって行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
インキュベーションが、約１２〜約２４時間にわたって行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
体外量の対象の血液から機能抗原提示樹状細胞を製造するための方法であって、該方法が、
（ａ）前記対象から単離された疾患エフェクター因子のアポトーシスを誘導するステップと、
（ｂ）前記体外量の血液を直径が約１ｍｍ以下であるプラスチックチャンネルを通じて流すステップと、
（ｃ）前記アポトーシス疾患エフェクター因子を前記体外量の血液と混合するステップと、
（ｄ）前記混合アポトーシス疾患エフェクター因子および処理血液をインキュベートするステップと
を含んで成る方法。
【請求項２３】
遊離Ｆｃセグメントを有するモノクローナル抗体で前記アポトーシス疾患エフェクター因子をコーティングするステップをさらに含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
インキュベーションが、約６〜約４８時間にわたって行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
インキュベーションが、約１２〜約２４時間にわたって行われる、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能樹状抗原提示細胞への単球の分化を誘導するためのインビボ方法に関し、より詳しくは、単球を処理し、インキュベートし、かかる分化を誘導するための体外方法に関する。本発明はさらに、これらの樹状細胞を含む免疫療法組成物を製造するための方法を提供する。具体的には、本発明は、アポトーシスまたは不活性化疾患エフェクター因子からのその表面抗原で発現する誘導単球由来の機能樹状細胞を含んで成る免疫療法組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
癌免疫療法における樹状細胞の使用は現在、重要な臨床的探求の分野である。樹状細胞は、反応性Ｔ細胞に対する抗原の発現においてきわめて有効であるが、しかし、樹状細胞は通常、血中単核白血球の１パーセント未満を構成している。したがって、樹状細胞の集団を拡大し、抗癌免疫を増大させる多くのインビトロ法が開発されている。増加した数の樹状細胞を腫瘍または他の病原細胞上の抗原に曝露することによって、抗原負荷樹状細胞の患者への再導入後、反応性Ｔ細胞に対するこれら抗原の提示が顕著に増強されうる。
【０００３】
例えば、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下に８日間の血液単核白血球の培養により多数の樹状細胞が生じる。次いで、これらの細胞は、Ｔ細胞に対する提示のために腫瘍由来ペプチド抗原で外部から負荷されうる。あるいは、樹状細胞を変換し、これらの抗原をそれ自身で産生および提示させることができる。Ｔ細胞を含む他の単核白血球を補強し、活性化するサイトカインを産生し、分泌するように変換された樹状細胞の集団の拡大は、抗腫瘍免疫応答を生成するさらにより有効な方法でありうる。
【０００４】
特定の一般的な腫瘍抗原および／または追加のサイトカインを産生するように培養樹状細胞を変換することは、手間と費用がかかる。さらに重要なことに、この方法は、個人の独自の癌に最も関係があるとみられるような複数の腫瘍抗原を産生し、提示することに失敗する可能性が高い。この問題を克服する幾つかの方法が提案されている。培養自己樹状細胞の腫瘍細胞とのハイブリダイゼーションにより、複数の未知の腫瘍抗原を処理し、提示する能力がある４倍体細胞が産生されうる。第２の方法案では、悪性細胞の表面からのクラスＩおよびクラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の酸溶離により、広範囲の腫瘍由来ペプチドが遊離される。次いで、これら遊離されたペプチドは、自己培養樹状細胞のＭＨＣ複合体上へ外部から負荷されうる。
【０００５】
従来のフォトフェレーシスは、特有の腫瘍抗原が未知である場合でも白血病性リンパ球に対して患者にワクチン接種する方法である。この方法では、悪性細胞が、クラスＩＭＨＣ結合腫瘍抗原の細胞表面ディスプレイを強化する光活性化８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）に曝露される。これら変性悪性リンパ球の元の患者への静脈内返還後、強力な抗腫瘍反応が患者の約２５％において発生し、悪性細胞集団の減少および時々長期間にわたる寛解につながることがある。自己樹状細胞を最初に組織培養中で成長させ、次いで８−ＭＯＰ処理腫瘍細胞と混合させるマウスにおける実験的試験は、従来のフォトフェレーシスの効果を増大させるように思われる。この実験プロトコルでは、腫瘍性マウスＴ細胞が８−ＭＯＰを用いるフォトフェレーシスおよび紫外線（ＵＶ）エネルギーへの曝露によってアポトーシスが付与される。この悪性リンパ球の化学変換後、自己培養樹状細胞がアポトーシスＴ細胞に添加され、この細胞混合物が攪拌とともに一夜インキュベートされ、Ｔ細胞と樹状細胞との接触を最大化する。アポトーシスＴ細胞／樹状細胞混合物は、生存腫瘍性２Ｂ４．１１細胞でチャレンジ（challenge）された試験マウスにおける有効な細胞ワクチンであることが判明している。
【０００６】
上述した実験プロトコルは、別の方法よりも明らかに有効かつ包括的であるが、数日間にわたる大規模なエクスビボ細胞操作を必要とする。したがって、１日で多数の機能樹状細胞を提供し、その細胞をアポトーシス腫瘍細胞に曝露しうるインビボ処置は、それによって抗腫瘍細胞ワクチンが調製されうる手段を大幅に簡素化することになる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、２つの異なる現象に基づき、すなわち機能樹状抗原提示細胞へのその分化を誘導する方法で単球を処理すること、および腫瘍細胞などの疾患エフェクター因子を処理し、それらにアポトーシスを付与し、またはそれらを不活性化することである。樹状抗原提示細胞を患者に戻す前に、疾患エフェクター因子に特有の疾患結合抗原の樹状細胞による処理および提示を最適化するのに十分な時間にわたってこれら処理集団を共にインキュベートすることによって、疾患結合抗原に対する臨床的に強化された免疫が達成される。
【０００８】
本明細書中で用いられる「疾患エフェクター因子」は、対象における病状の原因の中心となり、疾患結合抗原を発現する因子である。ある特定の状況では、これら疾患エフェクター因子は、血中に循環しており、それによって体外操作および処理が容易に可能となる病原細胞である。かかる病原細胞の例としては、悪性Ｔ細胞、悪性Ｂ細胞、自己免疫応答を仲介するＴ細胞およびＢ細胞、およびそれらの表面でウイルスまたは細菌ペプチドまたはタンパク質を発現するウイルスまたは細菌感染白血球が挙げられる。病原細胞を生じさせる典型的な疾患カテゴリーとしては、白血病、リンパ腫、自己免疫疾患、移植片対宿主病、および組織拒絶反応が挙げられる。これらの病状を仲介し、病原細胞由来である疾患結合抗原としては、ＭＨＣクラスＩ部位、ＭＨＣクラスＩＩ部位、またはＭＨＣ部位（すなわちシャペロン）へのおよび同部位からのペプチドの輸送に関係する熱ショックタンパク質に結合するペプチドが挙げられる。疾患結合抗原としては、感染白血球の表面で発現し、通常、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と関係しているウイルスまたは細菌ペプチドも挙げられる。
【０００９】
他の病原細胞としては、肺癌、結腸癌、脳腫瘍、腎癌、または皮膚癌など充実性腫瘍から外科的に切除された試料から単離されたものが挙げられる。これらの細胞は、懸濁液に入れられ、または組織培養中で増殖された後に血中白血球と類似の方法で体外的に操作されうる。あるいは、場合によっては、充実性腫瘍を有する患者の循環血液が、腫瘍から決裂し、循環に入った悪性細胞を含有しうることがわかっている。［クレフト（Ｋｒａｅｆｔ）ら、レアイベント・イメージングシステムを用いた血中および骨髄中の癌細胞の検出および分析（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒａｒｅ  ｅｖｅｎｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年（６）、ｐｐ．４３４−４４２。］これらの循環腫瘍細胞は、本発明の方法によってアポトーシスが付与され、本明細書中に記載され請求される方法によって形成される樹状細胞に提示されうる容易に利用可能な癌細胞源を提供しうる。
【００１０】
病原細胞に加えて、さらに本発明の範囲に含まれる疾患エフェクター因子としては、疾患結合抗原を発現する細菌、真菌、およびウイルスなどの微生物が挙げられる。ウイルスは「不完全」に加工されうること、すなわち、実際の感染因子として作用しうることなしに特徴的な病原抗原を産生し、かかる「不完全」ウイルスが本明細書中で用いられる「疾患エフェクター因子」なる用語の意味に含まれることを理解すべきである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、血中に含まれる単球の機能抗原提示樹状細胞への分化を誘導する患者の血液の体外量を処理するための方法を提供する。本発明の好ましい実施形態では、体外量の患者の血液は、従来のフォトフェレーシス装置を用いて処理され、樹状細胞への単球の分化を誘導する。特定の機序に限定されることは望ましくないが、発明者は、血中の単球がフォトフェレーシス装置におけるチャンネルのプラスチック表面に引きつけられ、かつ粘着し、それらはその後にチャンネルを通じた流体の流れからの剪断力によってプラスチック表面から放出されると考えている。したがって、単球がフォトフェレーシス装置を通過すると、それらはプラスチック表面への順次的な付着および同表面からの放出を受ける。これらのイベントの物理的力は、細胞膜を通じて活性化シグナルを送り、単球の機能樹状細胞への分化を誘導する。
【００１２】
フォトフェレーシス装置における処理後、機能樹状細胞はアポトーシス疾患エフェクター因子の存在下にインキュベートされ、樹状細胞による疾患エフェクター因子の貪食を可能にするともに、疾患エフェクター因子から対象の免疫系におけるＴ細胞への抗原の提示を可能にする。本発明の特に好ましい実施形態では、血液がフォトフェレーシス装置を通過し、単球の機能樹状細胞への分化を誘導すると、血中の疾患エフェクター因子は、光活性化可能物質で疾患エフェクター因子を処理し、フォトフェレーシス装置を通過すると血液を照射することによってアポトーシスが付与される。疾患エフェクター因子に単球が誘導されるアポトーシスを付与し、新しい樹状細胞を形成することによって、本発明の方法により結果として増加した数の抗原提示樹状細胞がもたらされ、これらは患者に再注入され、免疫療法反応を誘発しうる。
【００１３】
体外量の患者の血液がフォトフェレーシス装置で処理された後、組成物は約６〜約４８時間、最も好ましくは約１２〜約２４時間にわたってインキュベートされる。この期間中、樹状細胞はアポトーシス疾患エフェクター因子を貪食し、それらの表面で貪食細胞から抗原を提示し、ここで樹状細胞は患者の免疫系におけるＴ細胞によって認識され、それによって患者における疾患エフェクター因子に対する免疫応答を誘導する。
【００１４】
血中に含まれる悪性Ｔ細胞の治療において特に有効である本発明の別の実施形態では、血中の疾患エフェクター因子はモノクローナル抗体を用いてアポトーシスが付与される。このモノクローナル抗体は抗体の末端で遊離Ｆｃセグメントを含みうるが、これは樹状細胞の表面上で相補的受容体と結合しうる。抗体はこのようにしてアポトーシス疾患細胞と樹状細胞との間にブリッジを形成し、アポトーシス細胞が樹状細胞によって貪食され、処理される可能性を増大させる。あるいは、疾患エフェクター細胞は、他の方法によってアポトーシスが付与され、利用可能なＦｃ受容体とともにモノクローナル抗体でコーティングされ、機能樹状細胞によるアポトーシス疾患エフェクター因子の摂取および処理を増強する。また、決裂し、血中に循環している充実性腫瘍からの癌細胞など、非アポトーシス疾患エフェクター因子は、抗体でコーティングされ、機能樹状細胞による癌細胞の摂取を増強しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上記のとおり、単球分化は、患者の血液の体外量に含まれる単球を、従来のフォトフェレーシス装置のチャンネルの表面など、プラスチック表面上の単球の順次的な付着および放出の結果もたらされる物理的力に曝露することによって開始される。本発明の好ましい実施形態では、当業者に周知の種類の白血球アフェレーシス／フォトフェレーシス装置を用いる標準の白血球アフェレーシス実践に従い白血球濃縮物が調製される。白血球濃縮物には、単球、リンパ球、および一部の赤血球と血小板が含まれる。通常、２０億個までの白血球が白血球アフェレーシス中に収集される。単球が収集された総白血球集団の約２％〜約５０％を構成すると仮定すれば、約４０００万〜１０億個の単球が白血球濃縮物には存在する。
【００１６】
白血球アフェレーシスによる分離後、単球分化は複数のプラスチックチャンネルを有する装置を通じて血中細胞濃縮物を汲み上げることによって誘導される。プラスチックチャンネルは直径が約０．５ｍｍ〜５．０ｍｍであることが好ましい。チャンネルの直径が１ｍｍ以下である従来のフォトフェレーシス装置が用いられることが最も好ましい。フォトフェレーシス装置の狭いチャンネルの構造は、フォトフェレーシス装置の中を流れる血中細胞濃縮物が曝露されるプラスチックの表面積を最大化する。しかし、本発明はこの点に関し限定されず、プラスチックチャンネルを有する適切な装置を用いて単球分化を誘導することができる。
【００１７】
血中細胞濃縮物がフォトフェレーシス装置を用いて処理される本発明の好ましい実施形態では、単球分化は、それらがフォトフェレーシス装置におけるプラスチックチャンネルを通じて流れると直面する物理的力によって誘導される。本発明は特定の機序に限定されないが、発明者は、血中細胞濃縮物における単球がフォトフェレーシス装置のプラスチックチャンネル壁に引きつけられるとともに、単球がチャンネル壁に付着すると考えている。流体は、単球をプラスチックチャンネル壁から放出させる付着単球上に剪断力を与えるチャンネルを通じて流れる。したがって、単球がフォトフェレーシス装置を通過すると、プラスチックチャンネル壁への付着および同壁からの放出という幾つかのエピソードを受ける。これらの物理的力は単球の細胞膜を通じて活性化因子シグナルを送り、これにより単球の機能樹状細胞への分化の誘導がもたらされる。
【００１８】
この方法によって単球を誘導して樹状細胞を形成することは、免疫療法治療に幾つかの利点を提供する。樹状細胞のすべてはきわめて短時間内に単球から形成されるため、樹状細胞はすべてほぼ同じ年齢である。樹状細胞は、そのライフサイクルの早期の明確な期間中にアポトーシス細胞を貪食する。さらに、貪食アポトーシス細胞に存在する抗原は、後期の明確な期間中に樹状細胞の表面で処理され、発現する。比較的狭い年齢プロファイルで樹状細胞を作製することによって、本発明の方法は、アポトーシス疾患エフェクター因子を貪食し、その後に免疫療法治療に使用されるその疾患エフェクター因子から抗原を提示する増加した数の樹状細胞を提供する。
【００１９】
単球の分化を開始させる処理後、処理された血中細胞濃縮物は、アポトーシスまたは不活性化疾患エフェクター因子の存在下にインキュベーションのために隔絶される。インキュベーション期間は、アポトーシス疾患エフェクター因子に比較的接近している血液濃縮物における樹状細胞の形成および成熟を可能にし、それによってアポトーシス疾患因子が樹状細胞によって消費され、処理される可能性が増大する。以下で説明されるとおり、疾患細胞は、血液濃縮物がフォトフェレーシス装置を通過するとアポトーシスに誘導され、または疾患細胞はアポトーシスを誘導するように別々に処理され、フォトフェレーシス装置を通じた血液濃縮物の通過前後に血液濃縮物に添加されうる。フォトフェレーシスにおいて一般的であるように、標準の血液バッグを細胞のインキュベーションのために使用することができる。しかし、実質的な量の可塑剤をろ過することがなく、気体、特にＣＯ2およびＯ2の交換を可能にするのに十分に多孔性である種類の血液バッグを使用することが特に有利であることがわかっている。かかるバッグは、例えば、アミカス（Ａｍｉｃｕｓ）（商標）アフェレーシスキット（Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）の名称でバクスター  ヘルス  ケア社（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．）のフェンウォール（Ｆｅｎｗａｌｌ）事業部から入手可能である。種々の可塑剤を含まない血液バッグも米国特許第５，６８６，７６８号および同第５，１６７，６５７号に開示されており、その開示内容は本明細書中で参考によって援用される。
【００２０】
血中細胞濃縮物および疾患エフェクター細胞は、インキュベートされる細胞集団における機能抗原提示樹状細胞の数を最大限にするのに十分な時間にわたってインキュベートされる。通常、処理された血中細胞濃縮物および疾患エフェクター細胞は、約６〜約４８時間にわたってインキュベートされるが、好ましいインキュベーション時間は約１２〜約２４時間に及ぶ。上述した方法で単球を処理し、次いで処理された細胞集団をインキュベートすることによって、多数の機能抗原提示樹状細胞を得ることができる。インキュベート期間中に、血液バッグに緩衝培地のほか、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４など１つもしくはそれ以上のサイトカインを添加することが特に有利であることがわかっている。
【００２１】
例えば、疾患エフェクター因子が悪性Ｔ細胞である場合など、疾患エフェクター因子が対象の血中で循環している場合に特に有用である本発明の好ましい実施形態では、単球がフォトフェレーシス装置において直面する物理的力によって樹状細胞を形成するように誘導されるとフォトフェレーシス装置においてアポトーシスが疾患エフェクター因子に付与される。疾患エフェクター細胞におけるアポトーシスを誘導する能力がある光活性化可能剤が、フォトフェレーシス装置を通過する前に血中細胞濃縮物に添加され、血中細胞濃縮物はフォトフェレーシス装置を通過すると照射され、疾患細胞にアポトーシスを付与する。フォトフェレーシス装置における疾患細胞にアポトーシスを付与することによって、これらの細胞は、単球が分化して樹状細胞を形成しているため、直ちに貪食されるように利用可能になる。
【００２２】
本発明のこの実施形態では、フォトフェレーシスの前に白血球濃縮物に食塩水を添加し、赤血球濃度を体積で約２％まで希釈し、それによって標的疾患細胞への活性化放射線のより有効な浸透を可能にする。白血球アフェレーシスおよびフォトフェレーシスのために対象から多量の血液を得る前に光活性化可能剤を対象に投与することができる。あるいは、または追加的に、通常、光活性化可能剤を白血球アフェレーシス／フォトフェレーシス装置につながるチューブに注射することによって、体外血流に直接、添加することができる。いつおよびいかにして特定の薬剤が投与されるかにかかわらず、疾患細胞は、薬剤が疾患細胞における細胞成分と反応するのに十分な時間にわたって光活性化可能剤に曝露されなければならない。
【００２３】
本発明において使用されうる典型的な光活性化可能剤は、ソラレン類、ポルフィリン類、ピレン類、フタロシアニン、レチノイド誘導体、光活性化コルチゾン、光活性化可能色素、およびポルフィリン分子に結合されているモノクローナル抗体である。本発明はこの点に関して限定されず、当業者に周知の適切な光活性化可能剤を使用することができる。
【００２４】
ソラレン類は、フォトフェレーシス処置における使用に好ましいクラスの光活性化可能剤である。ソラレン類は消化トラックから容易に吸収され、経口投与後１〜４時間で血中および他の組織中でピークレベルに達し、これらの薬剤はほぼ完全に２４時間以内に排出される。したがって、ソラレン類は、対象の血液の体外量を得る前の経口投与に特に適している。ソラレン分子は照射への曝露前に不活性であり、照射後の励起状態に一時的に活性化される。好ましいソラレン類としては、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）、４’アミノメチル−４，５’，８トリメチル−ソラレン（ＡＭＴ）、５−メトキシソラレン（５−ＭＯＰ）、およびトリメチル−ソラレン（ＴＭＰ）が挙げられる。８−ＭＯＰは、本発明の方法との使用に最も好ましい光活性化可能剤であり、このソラレンの経口投与の状態は、米国特許第５，１４７，２８９号に記載されており、その開示内容は本明細書中で参考によって援用される。
【００２５】
フォトフェレーシスの照射段階は、血中細胞濃縮物がフォトフェレーシス装置を通過すると実施される。好ましい曝露装置としては、対向する照射源間に配置された約１ｍｍの直径を有する透明のプラスチックチャンネルが挙げられる。再び好ましい実施形態を参照すると、血中細胞濃縮物がプラスチックチャンネルを通過すると、疾患細胞は約０．５ｍｍ超の血液によって照射源から決して分離されない。疾患細胞をこのように照射源に接近して維持することは、活性化放射線への疾患細胞の十分な曝露の確保において特に有効であることが判明している。８−ＭＯＰなどのソラレンが光活性化可能剤として用いられる場合、照射源が活性化放射線として紫外線Ａ放射線（ＵＶＡ）を放射する。ソラレンを活性化するには、処理された疾患細胞は通常、約１５〜約１５０分間にわたって約１〜２ジュール／ｃｍ2のＵＶＡに曝露される。
【００２６】
上述した方法の１つの実施形態の応用例は、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）と呼ばれる特定の種類の癌の治療について図２〜１０に示されている。図２〜１０は個々の細胞の処理を示すが、実際には、対象の血液は以下に記載される複数の種々の細胞を含有し、複数の細胞は同時に処理されることを理解すべきである。図２を参考にすると、プラスチックチャンネル１０は多量の対象の血液、または対象の血液が最初に白血球アフェレーシスによって処理されている場合は血中細胞濃縮物を含有する。血液は血中単球１２および悪性ＣＴＣＬ細胞１４を含有する。悪性ＣＴＣＬ細胞は、複数のアミノ酸１８を含むクラス１結合ペプチド抗原１６を示す。対象の血液はプラスチックチャンネルを通じて汲み上げられ、単球の樹状細胞への分化を誘導する。
【００２７】
図３に示されているとおり、対象の血液がプラスチックチャンネルを通じて汲み上げられると、単球１２はプラスチックチャンネル１０の壁１５に付着する。図４に示されているとおり、単球を流れ過ぎる流体によって剪断力が付着単球上に与えられ、単球１２は壁１５から除去される。単球がプラスチックチャンネルを通じて流れると、それらはチャンネル壁から付着および除去の幾つかのエピソードを受けることがある。単球が直面する力の結果、単球を分化させ、図５に示されている未成熟樹状細胞２０を形成する活性化信号が送信される。
【００２８】
上述したとおり、特に好ましい実施形態では、プラスチックチャンネルは従来のフォトフェレーシス装置の一部である。これにより、血液がプラスチックチャンネルを通過すると、悪性ＣＴＣＬ細胞にはアポトーシスが付与される。対象の血液は、８−ＭＯＰなど光活性化可能剤でチャンネル通過前に処理される。図６に示されているとおり、処理されたＣＴＣＬ細胞１４がフォトフェレーシス装置（図示せず）のプラスチックチャンネル１０を通過すると、紫外線光２２がフォトフェレーシス装置の透明なプラスチックチャンネル壁１５を通じて伝達される。紫外線光２２は光活性化可能剤を活性化し、それによって悪性ＣＴＣＬ細胞１４のアポトーシスを誘導する。
【００２９】
血液がフォトフェレーシス装置を通過した後、対象の血液はインキュベートされ、樹状細胞の成熟およびアポトーシスＣＴＣＬ細胞の貪食を可能にする。図７に示されているとおり、樹状細胞２０はインキュベート期間中にアポトーシスＣＴＣＬ細胞１４を摂取する。樹状細胞は、インキュベート期間中に継続して成熟すると、アポトーシス悪性ＣＴＣＬ細胞を処理する。図８に示されているとおり、インキュベーション期間の終わりに、樹状細胞が悪性ＣＴＣＬ細胞を消化した後、結合クラス１ペプチド抗原１６が樹状細胞２０の表面に提示される。インキュベーション期間の後、抗原提示樹状細胞を含有する組成物は免疫療法のために対象へ再注入される。
【００３０】
対象の血流中への再注入後の抗原提示樹状細胞を示す図８および図９を参照すると、樹状細胞２２はその表面で悪性ＣＴＣＬ細胞からクラス１ペプチド抗原の受容体部位２６を有する健常Ｔ細胞２４へクラス１ペプチド抗原１６を提示する。図９に示されているとおり、健常Ｔ細胞２４が樹状細胞からクラス１ペプチド抗原を受け取ると、健常Ｔ細胞は活性化し、同じクラス１ペプチド抗原を示す悪性Ｔ細胞を認識し、攻撃するＴ細胞クローンの形成を誘導する。その結果、図１０に示されているとおり、対象の免疫系の健常Ｔ細胞クローン２４は悪性ＣＴＣＬ細胞クローンによって示されたクラス１ペプチド抗原を認識し、クラス１ペプチド抗原を示す対象における悪性ＣＴＣＬ細胞クローン２８を攻撃し、殺傷するように誘発される。
【００３１】
上述の説明はＣＴＣＬを処理するための方法に言及しているが、本発明はこの点に関して限定されないことを理解されるべきであり、この方法を用いて他の種類の癌または疾患を治療することができる。また、本明細書中でさらに説明されるとおり、この方法は、プラスチックチャンネルを有する任意の種類の装置を用いて実行し、単球分化を誘導することができる。さらに、癌細胞または他の疾患エフェクター因子は、当業者に周知の方法によってアポトーシスが付与され、本発明の方法によって形成される樹状細胞とともにインキュベートされうる。
【００３２】
上述したとおり、単球が樹状細胞への分化が誘導されるのと同時にフォトフェレーシス装置における疾患細胞のアポトーシスを誘導することによって、樹状細胞は疾患細胞を貪食し、免疫療法治療における使用のための疾患細胞から抗原を提示する可能性が高い。本発明のこの実施形態は、例えば、疾患細胞が悪性Ｔ細胞である場合など、疾患エフェクター因子が対象の血中に存在する場合に特に有用である。本発明のこの実施形態は、疾患細胞が充実性腫瘍からの細胞である場合にも使用することができる。少なくとも場合によっては、充実性腫瘍からの細胞が決裂し、血中に循環することが示されている。このような場合には、単球が樹状細胞への分化を受けるのと同時にフォトフェレーシス装置における腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが好ましいとみられる。
【００３３】
本発明の別の実施形態では、対象の血液における疾患エフェクター因子は、疾患細胞の表面に選択的に結合するモノクローナル抗体でコーティングされる。結合モノクローナル抗体は、タンパク質鎖の末端で遊離Ｆｃセグメントを含む長鎖タンパク質である。ドーダプカー（Ｄｈｏｄａｐｋｅｒ）ら［抗腫瘍モノクローナル抗体は細胞抗原の交差浸透および樹状細胞による骨髄腫特異的キラーＴ細胞の生成を増強する（Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｒｏｓｓ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｅｌｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２年（１９５）、ｐｐ．１２５−１３３］に記載されているとおり、モノクローナル抗体は疾患細胞に付着し、遊離Ｆｃセグメントは、樹状細胞の表面上の相補的受容体に引きつけられ、かつこれと結合する。モノクローナル抗体上のＦｃセグメントと樹状細胞上の相補的受容体とのこの結合は、アポトーシス疾患エフェクター細胞とのブリッジを実質的に形成し、それによって樹状細胞によるアポトーシス疾患エフェクター細胞の摂取の可能性および速度を増大させる。抗体は、ＣＤ８抗腫瘍免疫応答を刺激する抗原において頂点に達する経路に摂取癌抗原を方向づけるようにも思われる。疾患エフェクター因子は、モノクローナル抗体でコーティングされる前にアポトーシスが付与されることが好ましい。しかし、本発明はこの点に関して限定されず、モノクローナル抗体を用いて、非アポトーシス疾患エフェクター因子の摂取および処理を増強することができる。
【００３４】
本発明の方法は、例えば、癌細胞を得る侵襲的な処置の必要なしに充実性腫瘍を有する対象の免疫療法治療に使用することができる。場合によっては、充実性腫瘍を有する患者の循環血液は、腫瘍から決裂し、循環に入った癌細胞を含有しうる［クレフト（Ｋｒａｅｆｔ）ら、レアイベント・イメージングシステムを用いた血中および骨髄中の癌細胞の検出および分析（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒａｒｅ  ｅｖｅｎｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年（６）、ｐｐ．４３４−４４２］。これらの循環する癌細胞は、細胞１００万個当たり癌細胞１０〜１００個ほどの比較的低いレベルで循環血中に存在しうる。特定の種類の癌細胞と反応し、白血球と反応することがない抗体を血液に添加し、癌細胞と結合させることができる。特定の種類の癌細胞に特有であり、かつこれらに結合するかかる抗体は、当業者に公知である。抗体タンパク質鎖の末端での遊離セグメントは、樹状細胞上の相補的受容体部位に優先的に結合する。したがって、癌細部に結合した抗体は、癌細胞を樹状細胞に優先的に方向づけ、それによって樹状細胞による癌細胞の摂取を増強することができる。この処置により、抗体は血中に存在する癌細胞を樹状細胞に方向づけるように作用するため、治療前に患者から癌細胞を除去する必要を除去しうる。癌細胞は、抗体でコーティングする前にアポトーシスが付与されることが好ましいが、本発明はこの点に関して限定されず、非アポトーシス癌細胞を使用することができる。
【００３５】
皮膚Ｔ細胞性リンパ腫の場合、悪性Ｔ細胞をモノクローナル抗体でコーティングすることによりＴ細胞のアポトーシスが誘導され、樹状細胞による瀕死のＴ細胞の摂取が増大し、かつ樹状細胞によるＴ細胞抗原の処理速度が増大する。モノクローナル抗体は、癌細胞または病原Ｔリンパ球およびＢリンパ球などの（自己免疫疾患、臓器移植拒絶反応、および幹細胞移植後の移植片対宿主病など）他の種類の病原細胞と使用し、樹状細胞による癌細胞の摂取および処理を増大させることができる。例えば、乳癌、結腸癌、および前立腺癌に対する抗体が利用可能であり、これらを用いて関連癌細胞をコーティングすることもできる。癌細胞は、当業者に周知の方法によってアポトーシスが付与されうるとともに、アポトーシス癌細胞は遊離Ｆｃフラグメントを有する抗体でコーティングされうる。遊離Ｆｃフラグメントは樹状細胞上の相補的受容体に結合し、それによって樹状細胞とアポトーシス疾患エフェクター因子との間のブリッジを形成するとともに、疾患細胞と樹状細胞との間のブリッジを形成し、樹状細胞によるアポトーシス疾患細胞の摂取および処理を増強する。
【００３６】
疾患エフェクター因子は、フォトフェレーシス装置を通じる血液の通過前に、アポトーシスに誘導され、かつ抗体でコーティングされ、単球の樹状細胞への分化を誘導することが好ましい。あるいは、対象の血中に含まれる疾患エフェクター因子は、フォトフェレーシス装置を通じる血液の通過後およびインキュベーション前にアポトーシスに誘導され、かつ抗体でコーティングされうる。必要に応じて、疾患エフェクター因子は、フォトフェレーシス装置を通過し、インキュベーション前に処理血液に添加される血中細胞濃縮物から別々に処理されうる。
【００３７】
処理前に白血球アフェレーシスによって体外量の患者の血液から単球を分離することが絶対に必要というわけではないことを理解すべきである。血中に含まれる単球が、プラスチックチャンネルを通じる流れによって与えられる物理的力に十分に曝露され、その後のインキュベーション後に樹状細胞への分化を開始する限り、単球集団の分離は必要ではない。
【００３８】
本発明による単球分化の誘導により、７日間もしくはそれ以上にわたるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４などサイトカインの存在下の白血球の費用と手間のかかる培養によって得られる樹状細胞の数と同等またはそれを超える数の樹状細胞が提供される。本発明によって生成される多数の機能樹状細胞は、選択された疾患結合抗原を提示する迅速な手段を提供し、それによって効率的な免疫療法に貢献する。特定の免疫応答を誘い出すように選択され、例えば、腫瘍、病原非悪性細胞、または細菌、ウイルス、および真菌などの微生物由来の抗原調製物をインキュベーション中に血液バッグに直接添加することができる。これらの微生物は、８−ＭＯＰまたは他の薬剤への前曝露によって不活性化されうることが好ましい。８−ＭＯＰは、細菌および真菌におけるアポトーシスを引き起こし、ウイルスを不活性化しうることが知られている。成熟樹状細胞を血液バッグの範囲内でかかる抗原調製物と密着させることにより、多数の抗原負荷樹状細胞が得られる。抗原負荷樹状細胞は、その細胞を対象へ再注入することによって、または周知の方法に従い、皮下、皮内、または筋内注射など、細胞を投与して免疫応答を誘い出すことによって免疫原として使用することができる。以下に説明されるとおり、疾患結合抗原を発現する能力がある単球および疾患エフェクター因子を処理し、共インキュベートすることによって抗原負荷樹状細胞を生成することも可能である。
【００３９】
本発明の別の態様では、単球を機能樹状細胞へ分化するように誘導しうるとともに、疾患エフェクター因子はアポトーシスが付与され、もしくは不活性化され、または使用される血液もしくは血中細胞濃縮物から別々に処理し、樹状細胞を形成することができる。上述したとおり、かかる疾患エフェクター因子は、細菌、真菌、完全および不完全ウイルス、および個人独自の組織または移植組織を攻撃する悪性細胞のクローンまたは非悪性Ｔ細胞またはＢ細胞のクローンを含む細胞の病原クローン集団などの微生物を含む。これらの因子は、大部分の他の細胞から区別されることを可能にするその表面上に特有の抗原を有するため、免疫応答がその特有の抗原に対して理想的に発現されうる。次いで、これらの免疫応答は、疾患エフェクター因子集団を抑制または除去しうる。反応性免疫系に対する関連抗原を有効に導入する能力がある樹状抗原提示細胞の生成により、本発明はかかる疾患制御免疫応答の可能性を実質的に増強する。
【００４０】
本発明のこの態様の要となるのは、上述したとおり生成された、増加した数の抗原提示樹状細胞の、特有の抗原を有するアポトーシス病原細胞もしくは不活性化または不完全微生物のクローンとの共培養である。病原細胞、細菌、および真菌の場合、光活性化剤への曝露に加えて、アポトーシスを誘導する他の手段が適用可能でありうる。
【００４１】
例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）モチーフによる合成ペプチドを患者の血液、切除された充実性腫瘍、またはその組織培養株から単離された病原細胞の細胞懸濁液に添加しうる。ＲＧＤは、おそらくプロ−カスパーゼ−３の自己処理および活性化を誘発することによって、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導することがわかっている（Ｎａｔｕｒｅ、１９９９年、第３９７巻、ｐｐ．５３４〜５３９）。同様に、アポトーシスは、Ｆａｓ受容体を有する細胞において、この受容体に対する抗体で刺激することによって誘導されうるが、このようにして、細胞の内部にシグナルを送り、通常、Ｆａｓリガンドによるのと同じ方法で、プログラム細胞死を開始させる。また、アポトーシスは、病原細胞を熱または寒冷ショック、一部のウイルス感染（すなわち、インフルエンザウイルス）、細菌毒素、およびＸ線またはガンマ線照射にかけることによって誘導されうる。あるいは、インフルエンザウイルスなど一部の感染性因子はアポトーシスを引き起こしうるとともに、これらを用いて病原細胞の細胞懸濁液におけるこの目的を達成することもできうる。
【００４２】
したがって、これらの方法は、光活性化８−ＭＯＰによるアポトーシスの誘導ほど通常好ましくないが、誘導された樹状抗原提示細胞とそれらの共培養および免疫化のために患者にそれらを戻す前に、病原細胞集団におけるアポトーシスまたは不活性化を開始させる目的を達成しうる。もちろん、ウイルスは細胞ではなく、それらはその用語が一般に理解され、当業者によって用いられているようにアポトーシスを受けることがありえないことを理解すべきである。しかし、ウイルスは、８−ＭＯＰおよび他の光活性化剤への曝露によって不活性化し、したがって、このようにして、誘導された樹状抗原提示細胞との共培養の前に処理しうることが知られている。
【００４３】
発明のプロトコルおよび適用の臨床結果
本発明の適用の例を、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫を治療するための強化療法に特に関連して説明する。しかし、本発明はこの特定の適用に限定されず、かつ本発明を使用して、その独自の表面抗原によって区別可能な疾患エフェクター因子を成分として含む任意の病状を治療しうることを理解すべきである。かかる病状の数、成分エフェクター因子、および疾患結合抗原は上述されている。
【００４４】
皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、異常Ｔ細胞の単一クローンの膨大な拡大によって引き起こされる免疫疾患である。これらの悪性細胞は、クローン特異的または腫瘍特異的細胞表面抗原によって区別され、少なくともその１セットは、クローン特異的Ｔ細胞受容体のクローン特異的タンパク質成分由来である。細胞毒性Ｔ細胞応答は、これらのクローン特異的抗原に対して選択的に生成されうる。過去１０年の間に、フォトフェレーシスは進行性ＣＴＣＬに対する標準の免疫療法になり、少なくとも部分的に、かかる抗ＣＴＣＬ免疫応答を生成することによって機能している。フォトフェレーシスを用いる標準のＣＴＣＬ治療では、白血球および単球が体外量の対象の血液から白血球アフェレーシスによって分離される。単球および白血球は、生物学的に不活性な８−ＭＯＰが活性化され、悪性リンパ球におけるＤＮＡおよび細胞質タンパク質に共有結合する、上述した種類の紫外線Ａ曝露装置を通じて循環される。これは、薬剤がわずか数百万分の１秒間活性であり、それによって曝露領域における細胞のみを化学的に変化させ、全身の副作用の少なさを説明するため、きわめて特異的な療法である。フォトフェレーシスは、全身の免疫抑制を引き起こすことなく、曝露された白血球の免疫原性の増大を提供する。したがって、処理された細胞を対象に戻すことにより、「ワクチン接種」効果がもたらされ、大部分の反応性対象において、化学的に変化され、再導入された白血球に対する持続的な免疫応答を得ることができる。悪性Ｔ細胞の身体負荷量の５％未満の変化および返還は有意義な抗腫瘍反応を誘導しうるが、一部の対象においては、１５年を超える継続する完全寛解をもたらした。ＣＴＣＬの治療にフォトフェレーシスを適用する方法は、米国特許第５，１１４，７２１号および同第４８３８，８５２号、ならびに公開ＰＣＴ出願国際公開第９７／３４４７２号パンフレットおよび国際公開第９４／１１０１６号パンフレットにおいて開示されており、その開示内容は本明細書中で参考によって援用される。
【００４５】
フォトフェレーシスのＣＴＣＬへの適用により達成された臨床結果は、２つの主な理由で治療の基礎をなす機序への探求を助長した。第１に、それらの悪性細胞に対してフォトフェレーシスが患者にワクチン接種する機序がよりよく理解されうる場合は、方法を精巧にし、その有効性を強化することが可能であろう。例えば、進行性ＣＴＣＬ患者の２５％のみがフォトフェレーシスに対する主要な持続的反応を有している。これらの陽性反応は顕著であり、その頻度は従来の化学療法によって得られる頻度を超えるが、処置の有効性を増大させることが望ましいであろう。第２に、機序がよりよく理解されうる場合は、修正された療法を他の種類の悪性腫瘍および疾患過程に拡大適用することも可能であろう。この適用は、フォトフェレーシスに応じた樹状抗原提示細胞の役割の新しい理解に基づくとともに、より詳しくは、この役割を強化する方法に基づく。実験系における、および形質転換ヒト細胞系による試験により４系列の証拠が得られた。第１に、処理はＣＤ８Ｔ細胞を刺激し、Ｔ細胞の病原クローンの活性を抑制する。第２に、これらのＣＤ８細胞は、少なくとも病原Ｔ細胞の単一クローンのみが認められるＣＴＣＬにおいて、腫瘍細胞表面としてのクラスＩＭＨＣ複合体との関連で腫瘍特異的ペプチド抗原を認識する。第３に、ヒトリンパ芽球の光活性化８−ＭＯＰへの曝露は、クラスＩ複合体のディスプレイを３倍にし、一夜インキュベーション後にピークに達する。最後に、処理は、リンパ球におけるアポトーシスおよびそれらの食作用性単核細胞による摂取も引き起こす。
【００４６】
複数の系列の臨床的および実験的証拠により、異常Ｔ細胞集団を選択的に抑制する能力がある強力なＣＤ８反応の誘導と関係がある「ワクチン接種」現象が確認された。ＣＴＣＬの場合、少なくとも抗癌ＣＤ８Ｔ細胞の一部は、悪性細胞のＴ細胞受容体タンパク質由来の腫瘍特異的ペプチドを選択的にターゲティングした。ＣＤ８Ｔ細胞のＴ細胞受容体は、クラスＩＭＨＣとの関連で抗原性ペプチドを認識するため、これら複合体のディスプレイに対する８−ＭＯＰの影響への注目が焦点となった。最近、８−ＭＯＰが、曝露後最大約２２時間、形質転換ヒトリンパ球の細胞表面でクラスＩＭＨＣのディスプレイを３倍にし、この作用が細胞質タンパク質の劣化、およびＴＡＰ細孔を通じた小胞体上の生成ペプチドフラグメントの輸送に依存することが報告されている。この作用は、薬剤の他の主な分子標的、ＤＮＡのピリミジン塩基ではなく、細胞基質タンパク質の芳香族アミノ酸への８−ＭＯＰの結合によって開始されると思われる。
【００４７】
本発明は、免疫応答が関連抗原を含有する弱免疫原性複合体に対して発生される場合、かかる反応は複合体が抗原提示細胞上で最大化されている場合に最大化しうるという仮定に基づく。従来のフォトフェレーシスでは、Ｔ細胞は、アポトーシスがベースラインよりもわずかにやや上昇し、クラスＩ複合体もやや増強している時点で対象に直ちに戻される。本発明の方法では、処理された白血球は一夜、通常、約６〜４８時間にわたってインキュベートされる。予想外の所見は、処理された細胞の一夜インキュベーションは、アポトーシスＴ細胞によるクラスＩ複合体の発現を増強するだけではなく、単球の機能樹状細胞への成熟を最大化したことである。したがって、これら２つの現象の収斂により、インキュベーション段階は、多数のアポトーシス悪性細胞をアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞のフラグメントを摂取する能力がある増大した数の機能樹状細胞と同格にもたらす単純な手段となった。以前、フォトフェレーシスバッグにおける単核細胞はすでにアポトーシスＴ細胞を貪食し始めているが、これらの単核細胞は樹状細胞の特性を有さないことが示されている。通常、抗原提示細胞は、クラスＩＩＭＨＣ経路を通じて取込まれた抗原を処理し、これが通常、クラスＩＭＨＣとの関連でのみ抗原を「見る」所望のＣＤ８細胞毒性細胞ではなくＣＤ４Ｔ細胞の発現を刺激する。しかし、最近、樹状細胞はクラスＩＭＨＣ系を通じてアポトーシス細胞由来の抗原を処理し、提示する特殊な能力を有することが報告されていることに注目することが重要である。
【００４８】
本発明に基づく増強されたフォトフェレーシスプロトコルは、進行性ＣＴＣＬに罹患した対象４例を含むパイロット試験において有望な臨床結果を提供した。しかし、試験の臨床結果を論じる前に、本発明の実施形態を説明する治療プロトコルを以下の実施例に記載する。
【実施例】
【００４９】
フォトフェレーシスプロトコル
フォトフェレーシスプロトコルである第１のステップは、ＦＤＡ（米国食品衛生局）によって現在認可されているプロトコルと実質的に同じである。対象は、経口８−ＭＯＰ（０．６ｍｇ／ｋｇ）または静注８−ＭＯＰを直接、フォトフェレーシス装置に受け、薬剤の５０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度を得る。次に、血液を白血球アフェレーシスにかけ、軟膜を得、次いで、約１〜２ジュール／ｃｍ2の紫外線Ａエネルギー（３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）を送出する連続閉回路紫外線Ａ曝露装置の中を通過させる。このようにして、約１〜１００分子の８−ＭＯＰが各百万塩基対のＤＮＡに共有結合するように誘導される。ほぼ同等量の８−ＭＯＰが細胞質タンパク質の芳香族アミノ酸に共有結合するように誘導される。総量約２５０ｃｃを含んで成る処理された白血球分画は、食塩水５００ｃｃと混合され、次いで、フォトフェレーシス処置には一般的である標準の血液バッグ中で隔絶される。フォトフェレーシス後、処理された画分は次の新しいインキュベーション段階プロトコルにかけられる。
【００５０】
インキュベーション段階プロトコル
８−ＭＯＰによる紫外線Ａ活性化後のフォトフェレーシス後試料の収集後、処理された細胞集団を以下のとおりインキュベートする。
１．チューブの熱シールおよびキットへの末端接続部でチューブを切断することによってアフェレーシスキット（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）フェンウォール（Ｆｅｎｗａｌｌ）４Ｒ  ２３−１２）から２個のアミカス（Ａｍｉｃｕｓ）血小板貯蔵バッグ（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）フェンウォール（Ｆｅｎｗａｌｌ）ＰＬ  ２４１０）を除去する。
２．鋭いカテーテルをフェレーシスバッグ（スパイク）の中へ挿入し、それによって、チャーター  メディカル（Ｃｈａｒｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ）３脚トランスファーセット（＃０３−２２０−０２）で開封し、チューブをクランプする。２個のアミカスバッグを同じトランスファーセットの他の穴あけピンでスパイクし、それによって細胞懸濁液の移動用通路を確立する。
３．フェレーシスバッグを第ＩＶ（４）極に掛け、クランプを開き、フェレーシスの１／２を重力によって各アミカスバッグの中へ流れ出るようにし、次いで、チューブをクランプする。
４．スパイクを除去し、サンプリング部位カプラーで置き換える。
５．各アミカスバッグを別々のフェンウォール遠心分離バッグおよび遠心分離担体に配置する。
６．１０分間、１０００ｒｐｍ、２３℃で遠心分離し、各バッグの底でペレットとして濃縮し、可塑剤の痕跡を含有する大きな画分の血漿を除去させる。
７．遠心分離後、トランスファーパック上のチューブに付着した針をアミカスバッグの片方のサンプリングカプラーに挿入する。
８．アミカスバッグを血漿抽出器に注意深く配置し、細胞ペレットの再懸濁を回避する。抽出器を閉鎖し、ゆっくり抽出器を前方へ傾けることによって血漿をトランスファーバッグの中へ絞り出す。約５０ｃｃがトランスファーバッグの中へ流れ出た場合、かつ／またはペレットが再懸濁し始めた場合、抽出器を垂直な位置に戻し、針を除去する。
９．バッグの内容物を静かに攪拌することによって再混合し、注意深くバッグ壁に付着した接着細胞を再懸濁する。
１０．ヘペス緩衝液（Ｈｅｐｅｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）を含む無色のＲＰＭＩ  １６４０培地１００ｃｃを含有する５００ｃｃのビンをバクスター（Ｂａｘｔｅｒ）ベント式メディケーションセットでスパイクし、チューブをクランプする。付属の針を第１のアミカスバッグ上のサンプリングカプラーポートの中へ挿入する。ビンを第ＩＶ（４）極へ掛け、チューブを開放し、培地をバッグの中へ流れ出させる。
１１．チューブをクランプし、針を除去し、メディケーションセットを廃棄する。静かに反転させることによってバッグを混合し、アーベル（Ａｂｅｌ）を下にした棚上の３７０℃のインキュベーターに一夜、バッグを配置する。
１２．第２のバッグでステップ８〜１２を繰り返す。
１３．６〜２４時間のインキュベーション後、インキュベーターからバッグ１個を取出し、攪拌および反転によって静かに混合し、すべての接着細胞が再懸濁されていることをよく確認する。血液６０ｃｃを注射器に取出す。微生物学検査のために１つを好気血液培養ビンに、１つを嫌気血液培養ビンに注入する。血液学検査に送られる総白血球数（ＷＢＣ）および白血球分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）のためにラベンダートップチューブ（ｌａｖｅｎｄｅｒ  ｔｏｐ  ｔｕｂｅ）に注入する。
１４．第２のアミカスバッグを再懸濁し、両方のバッグを個別の遠心分離バッグおよび遠心分離機に配置する。
１５．ステップ８〜１０に記載されているとおり上清液を取出し、移動する。
１６．十分に混合した血液を患者に戻す。
【００５１】
図１は、上記のフォトフェレーシスおよびインキュベーションのプロトコルによる処理後の樹状抗原提示細胞とアポトーシスＴ細胞の生成を示す合成グラフである。図１に示されているとおり、処理前血液は、ほとんど検出できない数の樹状細胞を含み、確認するためにαＶβ５またはＣＤ１１ｃマーカーのいずれかを用いた。約２２時間のインキュベーション後、これらマーカーのいずれも多数の成熟樹状細胞を示した。同様に、前処理血液は、ほとんどアポトーシスＴ細胞を含まなかった。わずか一夜のインキュベーション後に、ＣＤ３マーカーによるＴ細胞およびＡＰＯ２マーカーによるアポトーシス細胞の同時確認によって示されているとおり、アポトーシスＴ細胞は顕著に明らかとなった。
【００５２】
グラフの右端の４番目の一連の棒は、紫外線への曝露なしに、物理的摂動およびインキュベーションのみによる単球の成熟樹状細胞への分化を示す。分化は、白血球アフェレーシスによって体外量の血液から単球およびＴ細胞を単離することによって開始された。単離された単球およびＴ細胞は、フォトフェレーシスにかけられなかったが、白血球アフェレーシスと関連した遠心力にのみ曝露された。次いで、単離細胞集団を上記のインキュベーションプロトコルに従い約２２時間にわたってインキュベートされた。図１に示されているとおり、白血球アフェレーシス中にかけられる物理的力は、一夜インキュベーションとともに、αＶβ５マーカーおよびＣＤ１１ｃマーカーによって確認されるとおり、単球の機能樹状細胞への発達を効率良く引き起こした。Ｔ細胞の顕著なアポトーシスは確認されず、８−ＭＯＰによる処理の後、ＵＶへの曝露、または上述した一部の他の処理形態が、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するために必要であることを示した。
【００５３】
グラフのＹ軸は、１立方センチメートル当りの機能樹状細胞の数を示す。２２時間にわたりインキュベートされた総量は２５０ｃｃであったため、ＣＤ１１ｃマーカーによって３番目の一連の棒によって示されているとおり、３２５０万個の樹状細胞（１３０，０００×２５０）が生成された。このレベルの成熟を有する樹状細胞はアポトーシス細胞を貪食し、かかる細胞由来の抗原を効率的に提示する。単球もアポトーシス細胞またはかかる細胞のフラグメントを摂取するが、単球は、アポトーシス細胞からＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞へ処理される抗原物質を効率的に提示することができない。ＣＤ８Ｔ細胞は、抗原提示細胞の表面でクラスＩＭＨＣと関係がある抗原のみを認識する。単球は、ＣＤ８Ｔ細胞が認識することができないクラスＩＩＭＨＣ分子に関連して摂取細胞由来の抗原を主に提示する。他方、樹状細胞は、ひとつには、それらがαＶβ５インテグリンを含むという理由で、アポトーシス細胞の消化由来の抗原を提示し、ＣＤ８細胞毒性Ｔ細胞が認識することができるクラスＩＭＨＣ分子と関連した処理抗原を示すことによって、ＣＤ８Ｔ細胞を「交差刺激（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｅ）」する特殊な能力を有する。これは、機能樹状細胞が、腫瘍免疫の刺激、またはそれらを引き起こす異常Ｔ細胞を攻撃することによって望ましくない免疫学的過程の抑制においてきわめて有用である主な理由である。
【００５４】
図１に示されているグラフは、混合細胞集団の最適なインキュベーション時間を決定する有効な手段をさらに示す。使用される特定のマーカーにより樹状細胞およびアポトーシスＴ細胞の数が同時に定量化が可能であるため、アポトーシス細胞と新たに形成された樹状細胞の最適な組合せがもたらされるインキュベーション時間を容易に決定することができる。これは、インキュベーションを終了させ、インキュベートされた細胞を対象へ再注入する時機を確立する決定因子を制御することである。
【００５５】
既述のとおり、約１２〜約４８時間のインキュベーション時間により最大数の樹状細胞がもたらされる。アポトーシスＴ細胞は、約６〜約４０時間で最大化する。したがって、約６〜約２４時間のインキュベーションが、アポトーシスＴ細胞と樹状細胞の最も有利な組合せを提供する。この持続時間のインキュベート期間の後、アポトーシス細胞の数は最大であり、多数の機能樹状細胞もインキュベーションバッグ中に存在する。したがって、病原性抗原を発現する能力がある最大数のアポトーシス細胞が存在し、それらの抗原を処理し、提示する能力がある多数の機能樹状細胞も存在する。疾患エフェクター因子が外来源由来であり、かつインキュベーションバッグに添加される場合、アポトーシス細胞の数を最大限にするために必要とされるインキュベーション期間は明らかに要因ではない。かかる場合には、誘導される樹状細胞の数を最大化するために必要とされる時間は、共インキュベーションの持続時間を決定する要因である。
【００５６】
併用治療および共インキュベーションの臨床効果
本発明によって開示された治療方法は、その疾患が進行性であると同時に標準のフォトフェレーシスで治療されていたＣＴＣＬの対象４例を含むパイロット試験で試験されている。パイロット試験における患者４例は、３つの基準に基づき大きなＣＴＣＬ集団から注意深く選択された。すなわち（１）従来のフォトフェレーシスの継続にかかわらず全身腫瘍組織量の増加、（２）血中で定量化されうる悪性クローン、および（３）低い絶対血中ＣＤ８レベル。対象の３例における白血病細胞は、そのクローンＴ細胞受容体表現型がフルオレセイン標識抗ファミリーＶ  Ｔ細胞受容体モノクローナル抗体（Ｖ  ｍＡｂ）を用いて認識可能であったため、正常Ｔ細胞と容易に区別することができた。５％を超える値は、悪性クローンの拡大を示す。第４の患者のＣＴＣＬ細胞のクローンＴ細胞受容体は、現在利用可能なＶ  ｍＡｂに結合することはないが、ＣＤ４／ＣＤ８比により同患者の白血性集団の定量化も可能である。従来のフォトフェレーシスに対する患者４例の不応答は、臨床的応答者は通常、無傷ＣＤ８コンパートメントを必要とするため、同患者のＣＤ８Ｔ細胞欠乏を反映していると思われる。したがって、これらの患者は新しい治療方法にとって重要な課題を示す。試験集団は小さかったが、この不良予後患者群における疾患進行の逆転を定量化することは容易であった。
【００５７】
上記のプロトコルによる治療後、患者４例のそれぞれは、１２か月のプロトコルにわたって絶対的循環悪性プールの減少を示した。完全な血液学的寛解はだれも経験しなかったが、血中ＣＴＣＬ細胞の以前の急速な増加は好転した。免疫系がそのＣＴＣＬによって損なわれている個人において一般的な症候性感染、およびこの疾患に対する療法には直面しなかった。全身腫瘍組織量および臨床応答の測定は、臨床的に最も重篤な皮膚病変の生検における浸潤性Ｔ細胞の数の血中測定および定量化に重点を置いた。患者４例中３例における皮膚病変の重篤度および分布が緩和したことに注目することが重要である。患者１例において、難治性掻痒と関連した長期にわたる最大の全身性剥脱性紅皮症が低悪性度のほとんど無症候性紅皮症に一変し、他の患者２例はほぼ完全な皮膚の寛解を示した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
この研究で試験されたフォトフェレーシス／インキュベーションプロトコルは、従来のフォトフェレーシスと同様、これらの対象において副作用は直面されなかったため、安全であると思われる。さらに、反応性免疫系に対するこれらの抗原を提示する能力がある機能樹状細胞とともに関連免疫抗原を有する悪性アポトーシス細胞を結びつけるプロトコルの能力は、ＣＴＣＬの治療の域を越えた免疫療法の可能性を提供する。例えば、最近報告された無作為化対照臨床試験において、従来の免疫抑制剤とフォトフェレーシスの組合せは、心臓移植レシピエントが直面する拒絶反応エピソードの数の減少において有効であることを示した。予備的に、それぞれの試験では、関節リウマチおよび乾癬性関節炎、紅斑性狼瘡、強皮症、および（同種骨髄移植後の）移植片対宿主病など一部の自己免疫疾患における従来のフォトフェレーシスの有効性も示した。多数の樹状細胞のインビボ源を提供する本発明の能力は、これらの療法を強化するであろう。プロトコルの修正は、懸濁したアポトーシス充実性腫瘍細胞、アポトーシス感染微生物、もしくは不活性化または不完全ウイルスを含む誘導された単球由来の樹状細胞の共培養も可能にしうる。
【００５９】
したがって、上記のとおり、本発明の一部の態様がＣＴＣＬに対する強化療法に関連して説明されているが、本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく広範囲な免疫疾患に適用可能であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】８−ＭＯＰおよび紫外線Ａエネルギーに曝露された血液の一夜インキュベーション後の樹状抗原提示細胞およびアポトーシスＴ細胞の生成を示す図である。
【図２】クラス１結合ペプチド抗原および血中単球とともにＣＴＣＬ細胞を示す対象の血液を含有するプラスチックチャンネルを示す断面図である。
【図３】プラスチックチャンネルの壁に付着した血中単球を示す対象の血液を含有するプラスチックチャンネルを示す断面図である。
【図４】チャンネルの壁に部分的に付着した血中単球を示す対象の血液を含有するプラスチックチャンネルを示す断面図である。
【図５】本発明の方法による血中単球の分化によって生成された樹状細胞を示す図である。
【図６】ＣＴＣＬアポトーシスを付与するように照射されているクラス１結合ペプチド抗原とともにＣＴＣＬ細胞を示すプラスチックチャンネルの断面図である。
【図７】樹状細胞によって貪食されている過程におけるアポトーシスＣＴＣＬ細胞を示す図である。
【図８】Ｔ細胞に対するクラス１結合ペプチド抗原を提示する対象の血流中へ再注入された樹状細胞を示す図である。
【図９】Ｔ細胞上の相補的受容体によって受け入れられる樹状細胞の表面上に提示されたクラス１結合ペプチド抗原を示す図である。
【図１０】クラス１結合ペプチド抗原を表示するＣＴＣＬ細胞を攻撃する活性化Ｔ細胞のクローンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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