(57)【要約】本発明は、チロシナーゼ（TYR）抗原、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP−1）抗原、及びチロシナーゼ関連タンパク質2（TRP−2）抗原の抗原性断片又はそれらの誘導体を含む新規トリハイブリッド黒色腫抗原、及びそれらをコードする核酸に関連する。本発明の新規トリハイブリッド黒色腫抗原は、ヒト新生物、例えば、癌腫、肉腫、白血病、及びリンパ腫などの悪性腫瘍、並びに異形成病変などの前癌病変の診断、治療及び予防において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシナーゼもしくはその断片、チロシナーゼ類縁タンパク質1(TRP−1)もしくはその断片、及びチロシナーゼ類縁タンパク質2(TRP−2)もしくはその断片を含んで成るトリハイブリッド黒色腫抗原をコードする、単離されたDNA。
【請求項２】
前記トリハイブリッド黒色腫抗原が、配列番号:7もしくはその断片、配列番号:9もしくはその断片、又は配列番号:11もしくはその断片を含んで成る、請求項1に記載の単離されたDNA。
【請求項３】
請求項1もしくは2に記載のDNAを含んで成る、クローニングもしくは発現ベクター。
【請求項４】
請求項3に記載のクローニング又は発現ベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項５】
チロシナーゼもしくはその断片、チロシナーゼ類縁タンパク質1(TRP−1)もしくはその断片、及びチロシナーゼ類縁タンパク質2(TRP−2)もしくはその断片を含んで成る、単離されたトリハイブリッド黒色腫抗原。
【請求項６】
前記トリハイブリッド黒色腫抗原が、配列番号:8もしくはその断片、配列番号:10もしくはその断片、又は配列番号:12もしくはその断片を含んで成る、請求項5に記載の単離されたトリハイブリッド黒色腫抗原。
【請求項７】
請求項1又は2に記載の単離されたDNA及び医薬的に許容できる担体を含んで成る組成物。
【請求項８】
請求項5又は6に記載の単離されたトリハイブリッド黒色腫抗原及び医薬的に許容できる担体を含んで成る組成物。
【請求項９】
トリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片及び医薬的に許容できる担体を含んで成る、動物においてメラノソーム活性を阻害する為の組成物。
【請求項１０】
トリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片及び医薬的に許容できる担体を含んで成る、動物において腫瘍増殖を阻害する為の組成物。
【請求項１１】
トリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片及び医薬的に許容できる担体を含んで成る、ワクチン化をする為の組成物。
【請求項１２】
前記トリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片が、チロシナーゼもしくはその断片、チロシナーゼ類縁タンパク質1(TRP−1)もしくはその断片、及びチロシナーゼ類縁タンパク質2(TRP−2)もしくはその断片を含んで成る、請求項7〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記トリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片が、配列番号:8もしくはその断片、配列番号:10もしくはその断片、又は配列番号:12もしくはその断片を含んで成る、請求項7〜12のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
有効な量のトリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片を動物に対して投与することを含んで成る、動物において黒色腫抗原に対する免疫反応を誘発する方法。
【請求項１５】
有効な量のトリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片を動物に対して投与することを含んで成る、動物において腫瘍を治療する方法。
【請求項１６】
有効な量のトリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片を動物に対して投与することを含んで成る、動物においてワクチン化をする方法。
【請求項１７】
前記トリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片が、チロシナーゼもしくはその断片、チロシナーゼ類縁タンパク質1(TRP−1)もしくはその断片、及びチロシナーゼ類縁タンパク質2(TRP−2)もしくはその断片を含んで成る、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
前記トリハイブリッド黒色腫抗原又はその断片が、配列番号:8もしくはその断片、配列番号:10もしくはその断片、又は配列番号:12もしくはその断片を含んで成る、請求項14〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、メラノソーム抗原を特異的に結合する抗体の生産を誘導する、請求項14〜18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法がIFNγの生産を誘導する、請求項14〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法がCD8T細胞の生産を誘導する、請求項14〜20のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、メラノソーム抗原に対して特異的な細胞傷害性リンパ球の生産を誘導する、請求項14〜21のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、動物における過剰なメラノソーム抗原活性に関連した症状を治療する為に用いられる、請求項14〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
前記症状が腫瘍である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記悪性腫瘍が、癌種、肉腫、白血病、又はリンパ腫である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が腫瘍の転移を予防する、請求項24〜26のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記症状が前癌病変である、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
前記前癌病変が腺腫又は異形成病変である、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記トリハイブリッド黒色腫抗原がアジュバントとの組み合わせにおいて投与される、請求項14〜29のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記動物が哺乳動物である、請求項14〜30のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
前記動物がヒトである、請求項31に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト新生物の予防及び診断において有用である、チロシナーゼ（TYR）抗原、チロシナーゼ類縁タンパク質1（TRP−1）抗原、及びチロシナーゼ類縁タンパク質2（TRP−2）抗原の抗原性断片又はそれらの誘導体を含む、新規トリハイブリッド黒色腫抗原、及びそれらをコードする核酸に関連する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ガン細胞は、本質的に静的ではなく、絶え間なく変化している。免疫学的監視を逃れて増殖する為に、ガン細胞は、例えば以下のような多くの様々な機構を発達させてきた。それには、MHC分子発現の抑制（Ferroneら、Immunol.Today,16:pp.487〜494（1995）を参照のこと）;抗原プロセッシングの欠損（Kamarashevら、Int.J.Cancer,95:pp.23〜28（2001）を参照のこと）;免疫抑制サイトカインの分泌（Spellmanら、Surg Oncol.,5（5〜6）pp.237〜44（1996）を参照のこと）;及び腫瘍抗原発現の喪失(Ohmachtら、J.Cell Physiol.,182:pp.332〜338(2000)を参照のこと)などが挙げられる。
【０００３】
腫瘍抗原発現の喪失との関連で、近年、多くの黒色腫特異的抗原が同定されてきた。かかる抗原の主要な群であって、免疫系により認識される群は、チロシナーゼ、TRP−1(gp75とも命名された)、TRP−2、gp100及びMART−1／Melan−Aなどのメラニン細胞分化抗原からなる。これらの抗原は全てメラノソーム中に存在している。
【０００４】
チロシナーゼ、TRP−1、及びTRP−2はメラニン細胞分化抗原であり、メラニン細胞及び黒色腫細胞のメラノソーム中に局在して、メラニン合成に関与する。Kawakamiら、Immunol.Res.,16:pp.313〜339(1997);Kwakamiら、J.Immunother.,pp.237〜246(1998)を参照のこと。ヒトチロシナーゼは、529個のアミノ酸のメラノソーム膜タンパク質であり、チロシンヒドロキシラーゼ活性、DOPAオキシダーゼ活性及びDHI活性を有し、そしてそれはメラニン合成に関与する重要な酵素である。ヒトTRP−１は537個のアミノ酸からなり、そしてDHI−2カルボン酸オキシダーゼ活性を有する。ヒトTRP−2は、519個のアミノ酸のメラノソーム酵素でありDOPAクロムトートメラーゼ活性がある。これら抗原に対する抗体及びT細胞は黒色腫患者において同定されてきた。Houghtonら、Ann.N.Y.Acad.Sci.,690:pp.59〜68(1993);Brichardら.,J.Exp.Med.,178:pp.489〜495(1993);Kangら.,J.Immunol.,155:pp.1443〜1348(1995);Wangra.,Exp.,Med.,181:pp.799〜804(1995);Wangら.,J.Exp.Med.,184:pp.2207〜2216(1996)を参照のこと。しかしながら、ガンの状態においてこれらの分化抗原に対する寛容性がどのようにして破壊されるのかの理由は不明確なままである。
【０００５】
ガンワクチンの動物モデルにより、チロシンファミリーのタンパク質を用いることで黒色腫ワクチンの使用可能性が証明された。mTRP−1を発現する組換ヴァクチニアウィルス(vaccinia virus) (Overwijkら、Proc.Nat’lAcad.Sci.USA.,96:pp.2982〜2987(1999)を参照のこと)、もしくはhTRP−1をコードする裸のDNA(Weberら、Proc.J.Clin.Invest., 102: pp.1258〜1264(1998)を参照のこと)もしくは、mTRP−１を含む昆虫細胞(Naftgerら、Proc. Nat’lAcad.Sci.USA.,93:pp.14809〜14814(1996)を参照のこと)でワクチン化をされたマウスにより、TRP−1に対する寛容性を破壊する能力が証明され、そしてTRP−1特異的抗体及びCD4T細胞に依存する強い抗腫瘍活性の誘導が示された。TRP−2に対する免疫寛容性も、CD8T細胞の誘導の後に、ヒトTRP−2をコードする裸のDNAでも破壊された(Brownら、J.Exp.Med.,190:pp.1717〜1722(1999)を参照のこと)。
【０００６】
黒色腫の治療をする為に、チロシナーゼファミリーのタンパク質を標的とする多くの臨床的ワクチントライアルが行われている。黒色腫細胞はTRP−１、TRP−2又はチロシナーゼの発現を失うことができることが報告されてきた。Marinocolaら、Adv.Immunol.,74:pp.181〜273(2000)を参照のこと。しかし、黒色腫細胞が3つの抗原を同時に失う可能性は低いだろうし、従って、これら黒色腫抗原の3つ全てを含有するキメラタンパク質が非常に有用であろう。
【０００７】
ワクチンによる多くの方法は、規定のペプチドエピトープ、プラスミドDNA、及び組換えウィルスに基づいており、それらは様々な不都合を被る。ペプチドエピトープベースワクチンの為にはHLA結合エピトープ及びHLA型の各患者の同定が必要である。一般に、プラスミドDNAは弱い免疫原である。組換えウィルスにより、ワクチンの投与を制限する中和抗体が生じる。従って、組換えタンパク質ワクチンの使用はガンワクチンの為の魅力的な代替方法である。
【０００８】
組換えタンパク質ワクチンを使用することにはいくつかの利点、例えば、ワクチンが繰り返し投与できることなどの利点があり、それにより多種多様な免疫反応、例えば、抗体、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)(適切なアジュバントと共に)、及びCD4＋T細胞(腫瘍免疫を維持するのに重要である)の生産などを誘導できる。更に、タンパク質ワクチンは全ての有力な抗原のエピトープも含むことができる。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、チロシナーゼもしくはその断片、TRP−1もしくはその断片、又はTRP−2もしくはその断片を含んで成るトリハイブリッド黒色腫抗原、及びかかる抗原をコードする単離されたDNAに関する。本発明は、かかるトリハイブリッド黒色腫抗原及び単離されたDNAを含んで成る、メラノソーム活性又は腫瘍増殖を阻害する為の組成物にも関する。更に、本発明は、メラノソーム抗原に対する免疫反応を誘発する方法、腫瘍を治療する方法、又はかかるトリハイブリッド黒色腫抗原及び単離されたDNAを用いてワクチン化をする方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、チロシナーゼ抗原（米国特許第4,898,814号）、TRP−1抗原（WO91／14775号）及びTRP−2抗原（米国特許第5,831,086号）（それらの抗原性断片及び誘導体を含む）のトリハイブリッド黒色腫抗原に関連する。誘導体には、例えば、突然変異体又は対立遺伝子変異体である抗原が挙げられる。抗原はヒト抗原、更に広くは、哺乳類が起源の抗原であって良く、そしてトリハイブリッド黒色腫抗原の成分は様々な起源に由来して良い（例えば、様々な種に由来する相同抗原など）。更に、各成分（即ち、抗原又は抗原断片）は、複数の起源由来の配列を組み合わせたハイブリッドであって良い。本発明は、黒色腫に対する免疫を付与する為に、全ての単一抗原に由来して免疫を付与するよりも一層有効であるトリハイブリッド黒色腫抗原を提供する。
【００１１】
本明細書中で用いられる場合「抗原断片」とは、タンパク質又は遺伝子の任意の抗原セグメントを意味し、通常タンパク質断片の場合には少なくとも5又は6個のアミノ酸を有し、そして遺伝子の場合は少なくとも15〜18個のヌクレオチドを有する。従って、一般に、断片とはタンパク質のセグメント、又はそれをコードするヌクレオチド配列を網羅し、それにはB細胞エピトープ又はT細胞エピトープが1つ以上含まれる。
【００１２】
チロシナーゼ、TRP−1（gp75としても公知である）及びTRP−2は主に黒色腫細胞、正常なメラニン細胞、及び網膜細胞で発現する。これら3つのタンパク質は類縁の配列であり、40％超のアミノ酸配列の同一性及び50％超のアミノ酸配列の類似性を共有（対で）し、そしてN末端シグナルペプチド及び細胞内貯留及びエンドソーム／リソソーム経路に沿ってのメラノソームへの分配に関わるC末端の配列に共通性がある。更に、チロシナーゼファミリーのタンパク質のこれら3つのメンバーは、種間で非常によく保存されている。
【００１３】
本発明は更に、ヒトにおいてヒトタンパク質に対する寛容性を遮断する為に用いることができうるヒトチロシナーゼ、TRP−1、TRP−2の相同物に関連する。表1には、これらチロシナーゼファミリータンパク質3つのそれぞれに関するかかる相同物の例が2つ供されている。ヒトタンパク質に対する相同物の％同一性の値は、タンパク質の全長に渡り計算されている。本発明の用いることができうる相同物は、寛容性が遮断される種の対応するタンパク質に対して、60％以上の同一性を有する。好適な相同物は70％以上の同一性を有する。更に好適な相同物は80％以上の同一性を有する。不完全なアミノ酸配列がトリハイブリッド黒色腫抗原に組み込まれる場合、％同一性は組み込まれているタンパク質断片の長さに関してのみ計算されていることがわかっている。
【００１４】
ヒトチロシナーゼ、TRP−1／gp75及びTRP−2をコードするmRNAのヌクレオチド配列、並びにタンパク質それら自身の配列は、他の種からの相同配列であるので、GenBank（National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Bethesda, MD）から公に入手可能である。本明細書中に言及するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、表１中に示されるようにGenBank受け入れ番号に対応する。その中で示されている配列は、一例としての意味であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【表１】
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【００１５】
本発明の好適なトリハイブリッド黒色腫抗原は、チロシナーゼ、TRP−1及びTRP−2それぞれの可溶性部分を含んで成る。例えば、配列番号:7、配列番号:9、及び配列番号:11は、本発明の背景のトリハイブリッド黒色腫抗原をコードするDNA配列を提供する。トリハイブリッド黒色腫抗原の為の対応するタンパク質配列は、配列番号:8、配列番号:10及び配列番号:12中に開示されている。従って、ある実施態様では、トリハイブリッド黒色種抗原をコードする単離されたDNAは、配列番号:7もしくはその断片、配列番号:9もしくはその断片、又は配列番号:11もしくはその断片を含んで成り、そしてトリハイブリッド黒色腫抗原はそれ自身、配列番号:8もしくはその断片、配列番号:10もしくはその断片、又は配列番号:12もしくはその断片を含んで成る。
【００１６】
一層好適なトリハイブリッド黒色腫抗原の例は、約25アミノ酸残基〜約477アミノ酸残基のヒトTRP−1もしくはその相同物の配列、約24アミノ酸残基〜約472アミノ酸残基のヒトTRP−2もしくはその相同物の配列、及び約19アミノ酸残基〜約476アミノ酸残基のヒトチロシナーゼもしくはその相同物の配列を含んで成る。個々の断片は任意のオーダーで連結されて良く、そして前記トリハイブリッド黒色腫抗原は、グリシン残基（それにより断片が連結される）を更に含んで成る。
【００１７】
従って、特に好適なトリハイブリッド抗原は、アミノ酸残基数約25〜アミノ酸残基数約1392（グリシン結合を含む）の配列番号:8及びアミノ酸残基数約25〜アミノ酸残基数約1384（グリシン結合がない）の配列番号:12によって表される。タンパク質の免疫原性特性に変化を殆ど与えないであろう、トリハイブリッド黒色種抗原が含まれているタンパク質断片においてある程度の変化が可能でありうることは当業者により明らかであろう。
【００１８】
ヒトではない哺乳類タンパク質の、突然変異体、ハイブリッド型、断片、又は誘導体が用いられる場合、それらは、免疫原性が高まり、副作用が減少し、そして半減期が長くなるなどの所望の特性を有するようにそれらが選択されて良い。例えば、個々の抗原の断片は、公知もしくは仮想のB細胞エピトープもしくはT細胞エピトープの存在に基づき本発明のトリハイブリッド黒色腫抗原を組み込む為に選択されて良い。他の例としては、MHC分子に対する結合力が向上していることを示す突然変異体が選択されて良い。
【００１９】
多量のトリハイブリッド黒色腫抗原の生産は当業界で公知の方法によって達成できうる。例えば、多量のトリハイブリッド黒色腫抗原はin vitroで容易に合成されて良い。他の例としては、トリハイブリッド黒色腫抗原をコードする核酸は、適切なベクター及び当業界で公知の方法を用いることで細菌、昆虫、又は哺乳類細胞中にトランスフェクションされて良い。従って、本発明は、トリハイブリッド黒色腫抗原をコードするDNAを含んで成るクローニング又は発現ベクター及びかかるクローニング又は発現ベクターを含んで成る宿主細胞を網羅する。
【００２０】
ある細胞種類においてトリハイブリッド黒色腫抗原の発現が要求又は所望された場合、トリハイブリッド黒色腫抗原の第１タンパク質断片がシグナルペプチドによって先導されて良く、そのシグナルペプチドは、トリハイブリッド黒色腫抗原における第１タンパク質断片に由来するシグナルペプチドであって良い、又は起源が他のシグナルペプチドであって良い。例えば、トリハイブリッド黒色腫抗原が細胞の外部ミロー（mileau）へ分泌されることが望まれている場合に、分泌の為のシグナル配列シグナリングは有用である。分泌及びペプチド機能の総説は、例えば、Pugsley,Curr.Opin.Cell Biol.,2:pp.609〜619（1990）を参照のこと。分泌シグナル配列予測の為のアルゴリズム及びコンピューターインプリメンテーションが使用可能である。例えば、von Heijneら., Nucleic acid Res.,14:pp.4683〜4690（1986）;Neilsenら、Protein eng. 10:pp.1〜6を参照のこと。
【００２１】
細菌細胞中での発現については、細菌性シグナル配列が好適でありうる。またシグナル配列は、トリハイブリッド黒色腫抗原を封入体における細菌宿主中で発現するのに必ずしも必要ではない。例えば、本発明のトリハイブリッド黒色腫抗原は、アミノ酸残基数約25〜アミノ酸残基数約1392の配列番号:8によって示されたアミノ酸配列を含んで成ることができる。宿主細菌の性質に依存して、かかるトリハイブリッド黒色腫抗原がN末端メチオニン残基を有し発現されうる。このメチオニンはin vivoにおいて細菌細胞中で解裂される、あるいは完全なままであって良い。かかるトリハイブリッド黒色腫抗原は大腸菌（E.Coli）中で発現されて当業界で周知の方法によって封入体から獲得されて良い。
【００２２】
精製を補助する為に、本発明のトリハイブリッドタンパク質は、融合「標識」配列を有し発現されて良い。例えば、トリハイブリッド黒色腫抗原をコードするDNA配列は、N末端にHis標識配列を結合したトリハイブリッド黒色腫抗原の生産を担う発現ベクター中にクローニングされて良い。この標識により金属キレートクロマトグラフィーによる精製が可能になる。ある実施態様では、精製された後にトリハイブリッド黒色腫抗原からこのHis標識は解裂されて良い。また、親和性精製を司る為の標識配列が使用できうる。好適な実施態様では、トリハイブリッド黒色腫抗原はpET−28a(＋)により発現され、金属キレートクロマトグラフィーによって精製され、そしてHis標識は、トロンビン解裂部位での特異的タンパク質分解によって除去されて良い。
【００２３】
本発明は、ガン及び前ガンの治療、阻害、及び予防をする為に有効な免疫反応を誘導する為のワクチンとして特に有用な新規トリハイブリッド黒色腫抗原を提供する。黒色腫の患者において抗腫瘍免疫反応を誘導するトリハイブリッド黒色腫抗原が特に注目のものである。従って、本発明のトリハイブリッド黒色腫抗原は、様々な症状を予防する及び／又は臨床的に治療する為に投与されて良い。本発明の背景において、治療とは、根底にある症状の進行を阻害すること、減速させること、もしくは反転させること、症状の臨床症状を改善すること、又は症状の臨床症状の出現を予防することの全てを網羅することを意味している。
【００２４】
用語「黒色腫」には、限定ではないが、黒色腫、転移性悪性黒色腫、メラニン細胞又は斑母細胞に関連したメラニン細胞のどちらかに由来する黒色腫、黒色ガン、黒色上皮腫（melanoepithelioma）、黒肉腫、上皮内黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端性黒子性黒色腫、浸潤性黒色腫（invasive melanoma）並びに家族性異型分子及び黒色腫（FAM−M）症候群が含まれる。
【００２５】
トリハイブリッド黒色腫抗原を投与する為に適切な多くの方法が当業界で公知である。例えば、トリハイブリッド黒色腫抗原は可溶性形態において投与されて良い。他の例としては、トリハイブリッド黒色腫抗原を発現できる自己哺乳類細胞が投与されて良い。他の例としては、トリハイブリッド黒色腫抗原をその表層で発現できるウィルスが投与されて良い。更なる他の例としては、トリハイブリッド黒色腫抗原をコードする核酸を担持するウィルスが投与されて良い。一層更なる例として、トリハイブリッド黒色腫抗原をコードする裸のDNA又は他の核酸が投与されて良い。
【００２６】
トリハイブリッド黒色腫抗原は、単独で、アジュバントと組み合わせて、ヘルパー（キャリアー）ペプチド、タンパク質、脂質もしくはリポソームに連結して、又は精製された抗原提示細胞（APC）上及び免疫感作の為に用いられる抗原提示細胞上にパルス化することで投与されて良い。免疫感作及び他の治療方法において用いる為のアジュバントには、例えば、RIBI Detox（Ribi Immunochemical）、QS21、CRIS−21、ミョウバン、BCG及び不完全Freundのアジュバントなどが挙げられる。試験動物の為に、アジュバントには更に、完全Freundのアジュバント及び当業界で通常用いられる他のアジュバントが含まれる。トリハイブリッド黒色腫抗原は、熱ショック結合タンパク質と複合化されても良い。APCは一般に、細胞表層に遺伝子産物、クラスＩ又はクラスIIのいずれかの主要組織適合遺伝子複合体（MHC）を有する真核生物細胞である。本発明で用いることができうるAPCのいくつかの例には、DC、並びにマクロファージ、好ましくはMHCクラスII陽性マクロファージ単球、好ましくはMHCクラスII陽性マクロファージ単球、及びリンパ球が挙げられる。概して、米国特許第5,597,563号を参照のこと。かかる投与法は、新規ハイブリッド黒色腫抗原を投与する、前、同時に、その後に実施されて良いことが理解されるだろう。
【００２７】
トリハイブリッド黒色腫抗原はDNAワクチンとして投与されて良い。DNAワクチンは、トリハイブリッド黒色腫抗原をコードする「裸の」DNAを含んで成ることができる。好ましくは、トリハイブリッド黒色腫抗原をコードするDNAは宿主細胞によって摂取され、そして発現されたペプチドが免疫系に対して有効に提示される。例えば、裸のDNAは腹腔内もしくは筋内に、もしくは脂質につながれて注射されて良い。好ましくは、トリハイブリッド黒色腫抗原を含んで成るワクチンは、筋肉又は皮膚に直接注射されてコードされた抗原と反応する細胞性及び液体性免疫の両方が生じる。例えばDNAワクチンの調製と使用の方法の為に、米国特許第5,813,016号、Gregerson,Natrwissenschften,88（12）:pp.504〜13（2001年12月）、及びWangら、Expert Opin.Biol.Ther.,1（2）:pp.277〜90（2001年3月）を参照のこと。ワクチンは、本発明のトリハイブリッド黒色腫抗原をコードするDNAを含んで成る生育不能（non−viable）DNAベクターを含んで成って良い。生育不能DNAベクターは調製が容易で投与が安全であるという利点を有する。本発明のトリハイブリッド黒色腫抗原をコードするDNA配列は、遺伝子銃を用いることで、ガン細胞に対して細胞反応を誘導する量で投与されて良い。かかる目的の為にはngの量が有用でありうる。
【００２８】
トリハイブリッド黒色腫抗原をコードするDNAは、細菌によって又は組換えウィルスの患者の宿主細胞への感染によっても発現されて良い。かかる細菌又はウィルスベクターは、免疫反応を高める共免疫刺激性分子(co−immunostimulatory molecule)を発現するように設計されても良い。共免疫刺激性分子には、例えば、IL−2、IL−6、IL−10、IL−12、及びγ−インターフェロン(INF−γ)が挙げられる。共免疫刺激性分子は、液体性免疫反応又は細胞傷害性免疫反応に有利に働くように選択されて良い。
【００２９】
本発明のトリハイブリッド黒色腫抗原をコードするDNAは、ヒト腫瘍抗原を認識できる遺伝子改変された免疫細胞を作製する為に用いられても良い。かかる遺伝子改変された免疫反応細胞は、例えば、転移性悪性黒色腫を有する選定の患者においてガンの退行に介在することにおいて特に有効でありうる。抗原提示細胞上に存在する腫瘍抗原ペプチドに対して、in vitroでヒトリンパ球が感作される技術は当業界で公知である。反復in vitro 刺激によって、細胞は、ヒト腫瘍抗原を認識して応答する為のはるかに優れた能力を伴い誘導されて良い。従って、本発明の腫瘍抗原による反復in vitro感作によって、リンパ球はその能力が高まり誘導されて良い。感作される細胞は、治療される対象者から獲得できうる又は起源が別のMHC適合細胞であって良い。治療される対象者にこれらの細胞を養子移入することによって、in vivoで腫瘍を退行させるのを仲介する効果が高まる。
【００３０】
トリハイブリッド黒色腫抗原は、１又は複数の様々な経路を介して投与されて良く、それには限定ではないが、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、鞘内、胸腔内、腎内、直腸、膣、局所、腫瘍内などが挙げられる。
【００３１】
投与は、経粘膜的又は経皮的手段によって行われて良い。経粘膜的又は経皮的な投与の為に、バリアー(barrier)へ浸透する為の適切な浸透剤が製剤中で用いられている。かかる浸透剤には、一般に当業界で公知の、例えば、経粘膜投与胆汁酸塩及びフシジン酸誘導体などが挙げられる。更に、浸透を促すのにデタージェントが用いられて良い。経粘膜投与は、例えば、鼻腔用スプレー又は座薬によって行われて良い。経口投与の為に、腫瘍抗原、ガンペプチド又はそれらの変形型は、カプセル、タブレット、及び強壮剤などの通常の経口投与形態へと処方される。
【００３２】
本発明のトリハイブリッド黒色腫抗原は、予防又は治療の目的の為に動物において用いられる場合、医薬的に許容できる担体を任意に含んで成る組成物の形態において投与されて良いものと解される。適切な医薬的に許容できる担体には、例えば、1又は複数の、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。医薬的に許容できる担体には更に、棚寿命を長くする又は結合タンパク質の効力を高める補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、防腐剤もしくは緩衝剤が少量含まれて良い。注射用の組成物は、当業界で周知のように、供給を迅速にし、動物に対して投与された後に活性成分の放出が持続又は遅延するように処方されて良い。
【００３３】
本発明の組成物は様々な形態にあって良い。これらの形態には、例えば、固体、半固体及び液体投与形態、例えば、タブレット、ピル、粉末、液体溶液、分散体又は懸濁、リポソーム、座薬、注射可能及び注入可能溶液などが挙げられる。好適な形態は、目的とされた投与方法及び治療用途に依存する。
【００３４】
本発明のかかる組成物は、医薬業界で周知の方法で調製されている。組成物の調製において、通常、活性成分は担体と混合される、又は担体によって希釈されるそして／もしくは、カプセル、小袋、紙、もしくは他の容器などの形態でありうる担体内に封入されるだろう。担体が、希釈剤として働く場合、それは、活性成分の為のビヒクル、賦形剤又は媒体として作用する固体状、半固体状、又は液体状の物質であって良い。従って、組成物は、タブレット、ロゼンジ、小袋、エリキシル剤、懸濁、エアロゾル(固体として又は液体媒体の)、軟膏（例えば、最大で10重量％の活性成分を含む）、ソフト及びハードゼラチンカプセル、座薬、注射液、懸濁、無菌包装粉末及び局所パッチとしての形態であって良い。
【００３５】
本発明の免疫原は、全ての適切な動物に対して投与されて良いことが明らかであろう。例えば、その動物とは、好適には、ウサギ、ラット又はマウスなどの哺乳動物である。動物がヒトであることが一層好ましい。
【００３６】
本発明のトリハイブリッド腫瘍抗原は、治療上有効な量で供給されるのが好ましい。好適には、その投与量とは、受容者においてガンを代わるがわる予防、阻害又は治療できるガン抗原特異的Bリンパ球及びTリンパ球のクローン拡大を開始する、刺激するそして／又は生じるのに有効な量である。
【００３７】
治療上有効な用量は、臨床試験を経て当業者によって決定されて良い。治療上有効な用量は、適切な動物モデルにおいて測定され、そして公知の技術を用いることでヒトに対して外挿されることによって決定されて良い。例えば、全身投与について、ラットの単位体重当り投与された化合物の量は、ヒトに対しても容易に当てはめることができる。
【００３８】
治療上有効な用量は、例えば、患者の体重及び症状などの因子、治療、阻害、予防されるべき黒色腫もしくは他のガンの種類などの因子、及び投与方法によって変化して良い。
【００３９】
ヒトの為のトリハイブリッド腫瘍抗原の用量は、約1pg／kg体重以上でありうる。約1ng／kg体重〜約100mg／kg体重の範囲が好適である。一層好ましくは、投与される量は約1□g／kg体重〜約1mg／kg体重以上である。
【００４０】
前記用量は1回以上投与され、そしてボーラス投与又は連続投与として提供されて良い。数週間〜数ヶ月に渡る期間での前記用量の多重投与が好ましい。多重投与が行われる場合、投与量及び処方は投与毎に同じであって良い又は異なって良い。
【００４１】
黒色腫もしくは他のガンもしくは前ガン病変の治療の有効性は、当業界で公知の多くのパラメーター、例えば、限定ではないが、全身腫瘍組織量の減少、液体性免疫反応の増加、血清腫瘍マーカーの変化及び細胞傷害性もしくは細胞性免疫反応の増加によって測定されて良い。一層詳細な例として、抗体レベル及びCTLレベルが測定されて良い。治療の有効性を評価するのに用いられて良い更なる基準の例には、腫瘍応答に関する世界保健機構(WHO)標準基準が挙げられる。黒色腫の予防の有効性は、当業界で公知のパラメーター、例えば、限定ではないが、治療されていない集団に比べて治療された集団では発症率が低下したこと、などによって測定されて良い。かかる基準は当業界で公知の方法によって測定されて良い。
【００４２】
従って、本発明は、当業界で公知の、調査、診断、予防、又は治療方法の全ての為に、in vivoおよびin vitroで用いられて良い。
【００４３】
当然、本明細書中で開示された本発明の本質における変化は、当業者によりもたらされるものと解され、そしてかかる変化版は本発明の範囲内に含まれているものと解される。
【００４４】
本明細書中で述べられた全ての参考文献はその全体を組み込まれている。
【００４５】
実施例
下記の例は本発明を更に説明するが、いかなる場合にも本発明の範囲を制限する解釈をされるべきではない。汎用の方法、例えば、ベクター及びプラスミドの構築、かかるベクターへとポリペプチドをコードする遺伝子の挿入する、プラスミドを宿主細胞中に導入する、並びにその遺伝子及び遺伝子産物の発現及び測定をする方法の詳細な説明は、多くの刊行物、例えば、Sambrook,Jら、(1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Pressから得られる。
【００４６】
一般的な方法
細胞及び動物
マウス黒色腫細胞株B16BL6は、Isaiah Fidler博士(M.D.Anderson Cancer Center,Huston)の好意により提供された。B16BL6のTRP−1、TRP−2、及びチロシナーゼの発現はRT−PCR及びウェスタン解析によって測定された。EL4細胞株はAmerican Type Culture Collection（Manassas,VA）から入手した。C57BL／6及びMHCクラスＩ、もしくはMHCクラスII、もしくはFcRに欠陥があるC57BL／6をJackson Laboratory（Bar Harbor,ME）から購入した。10％熱不活性化ウシ胎児血清を有して抗生物質を伴わないPMRI1640（Gibco BRL,Gaithersburg,MD）中で全ての細胞株を維持された。そして日常的にマイコプラズマによるコンタミネーションについて検査された。それらは陰性であった。
【００４７】
全ての実験及び手順は、実験動物の使用に関するUnited States Department of Agriculture and Human Service及びNIHの方針に従って行われた。
【００４８】
hTRP−1、hTRP−2及びh−チロシナーゼを含むDNA断片の生成
キメラDNA断片を生成する為に、3対のプライマーが設計された。プライマー対１はhgp75を鋳型として使用し、プライマー対2はhTRP−2を鋳型として用い、そしてプライマー対3はh−チロシナーゼを鋳型として用いた。htyrF−1及びhytrF−2と命名された対１により、hgp75可溶性部分、4つのグリシンリンカー及びhTRP−2の5´部分を含むDNA断片が生成された。htyrF−1（配列番号:1）:
【化１】
2005506045.tif 000003
及びhtyrF−2（配列番号:2）:
【化２】
2005506045.tif 000004
htyr−3及びhtyr−4と命名された対2は、hgp75の3´部分、hTRP−2の可溶性部分、4つのグリシンリンカー、及びh−チロシナーゼの5´部分を網羅する。htyrF−3（配列番号:3）:
【化３】
2005506045.tif 000005
及びhtyrF−4（配列番号:4）
【化４】
2005506045.tif 000006
htyr−5及びhtyr−6と命名された対3により、h−チロシナーゼの3´部分、h−チロシナーゼの可溶性部分、及びストップコドンを含む断片がPCRでクローン化された。htyrF−5（配列番号:5）:
【化５】
2005506045.tif 000007
及び
htyr−6（配列番号:6）:
【化６】
2005506045.tif 000008
各PCR反応により1.4kbの断片(PCR産物1)がもたらされた。次いで、生成された3つのPCR産物は混合されて10サイクルのPCR反応に委ねられた(PCR産物2)。最後に、キメラDNAがプライマーhtyr−1及びhtyr−6により生じた(PCR産物3)。PCR産物3は約4.1kbであり、pET28a(＋)(Novogen,Madison,WI)中にクローニングされる前にEcoRＩ及びXhoＩで消化された。
【００４９】
組換えhTRP×3の発現及び精製
hTRP×3cDNAを含むpET28a（＋）で形質転換された大腸菌BL21(Novogen,Madison,WI)は、振とうフラスコ中37℃で0.6(A600nm)の細胞密度に増殖した。lacプロモーターが最終濃度1mMのIPTGの添加によって誘導され、そして細胞は更なる4時間に渡り37℃で増殖しつづけた。前記細胞は遠心によって収穫され、PBS中で再懸濁され、そして細胞破砕器(Constant Systems Ltd, Warwick, UK)で破砕された。組換え封入体を含んだ大腸菌ホモジネートの可溶性画分は遠心(10,000ｇ、4℃で30分)によって収穫された。そのペレットは、8Mの尿素、50mMのトリス、及び5mMのイミダゾールを含むpH8.0の溶液中に溶かされた。組換えhTRP×3は、Toyopearl His結合樹脂(TosoHaas,Montgomeryvill,PA)を取扱説明書に従い用いることで、アフィニティー精製された。組換えヒトTRP−1、TRP−2、チロシナーゼは同様の方法で発現及び精製された。
【００５０】
ウェスタンブロットは、組換えhTRP×3がhTRP−1、hTRP−2及びh−チロシナーゼに特異的な抗体によって認識されたのを確かめるのに行われた。精製されたhTRP×3タンパク質は12％SDS−PAGE上で泳動されてPVDF膜(Novex,San Diego,CA)へと移された。この膜は、5％乾燥脱脂粉乳(ブロッキングバッファー)中4℃で一晩ブロッキングされ、そして室温で1時間に渡り穏やかに振とうしながら、PBS-0.2％Tween20溶液中で1:500に希釈された個々の抗原に特異的なマウス血清で標識された。次いで、ブロットはPBS-0.2％Tween20溶液で洗浄され、そしてPBS-0.2％Tween20中で希釈(1:5000)されたペルオキシダーゼが連結したヤギ抗マウスIgG(Biosource,Camarillo,CA)と1時間に渡りインキュベートされた。上記のように十分にブロットは洗浄され、ELCウェスタンブロッティング試薬(Amersham Pharmcia Biotech,Little Chalfont,UK)により検出された。hTRP−1、hTRP−2及びh−チロシナーゼに特異的なマウス血清は各々のタンパク質で免疫感作されたマウスから生成された。
【００５１】
酵素免疫測定法(ELISA)
間接ELISAは、抗体反応を検出する為に開発された。精製されたヒトタンパク質抗原(50μlPBSバッファー中50ng)が96ウェルImmunolon−2プレート(Dynex Technologies, Chantilly,VA)の各ウェルに添加されて4℃で一晩インキュベートされた。プレートはPBS-0.2％Tween20で2度洗われ、そして室温で2時間に渡りブロッキングバッファー(5％無脂肪乳含有PBS)中でインキュベートされた。PBS-0.2％Tween20中で様々な濃度に希釈されたマウス血清がプレートに添加されて室温で2時間に渡りインキュベートされた。ウェルは上記のように3度洗われ、そしてPBS-0.2％Tween20中で1:5000希釈にされたペルオキシダーゼが連結したヤギ抗マウスIgG(Biosource, Camarillo,CA)が添加され、そして1時間に渡り室温でインキュベートされた。次いで、ウェルは3度洗浄されてペルオキシダーゼ基質TMB(KLP, Gaithersburg, MD)が添加された。450nmでの吸光度はカイネティックミクロプレートリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)で読まれた。
【００５２】
INFγ放出アッセイ
脾臓細胞(4×105)は、最後に免疫感作した一週間後に収穫され、そして10％ウシ胎児血清を伴う総体積2mlのRPMI1640中で10mg／mlの組換えタンパク質と24ウェルプレートにおいて72時間に渡り培養された。上清は収穫されそしてELISAキット(Research Diagnostics Inc. , Flanders, NJ)を用いてIFNγについての試験をされた。
【００５３】
ELISPOTアッセイ
ELISPOTアッセイを行う為に、ワクチン化された各々のマウスから単離された新鮮な1×104個の脾臓細胞が20IU／ml のIL−2とともに96ウェルプレートの各ウェルに添加された。細胞は、B16又はコントロールEL4細胞と共に37℃で24時間に渡りインキュベートされた。培養後、プレートは洗浄され、しかる後に5mg／mlのビオチン化IFNγ抗体(クローンXMG1.2、PharMingen)と50mlのPBS中4℃で一晩インキュベートされた。洗浄を6度した後、50mlのPBS中1.25mg／mlのアビジン−アルカラインフォスファターゼ(Sigma, St. Louis, MO)が添加されて室温で2時間に渡りインキュベートされた。洗浄後、50mlの5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム溶液(Boehringer Mannheim, Indianapolis,IN)を添加して室温で1時間に渡りインキュベートすることによってスポットが明らかにされた。このスポットは解剖顕微鏡を用いることで計測された。
【００５４】
免疫感作及び腫瘍保護アッセイ
100μgの精製されたhTRP×3は、100□lの完全Freund´sアジュバント(CFA)中で各注射ごとに乳化された。C57BL／6マウスは10日おきに5度腹腔内にワクチン化され、そして免疫追加の1週間後に採血された。様々なアジュバントを比較する為に、皮内へのhTRP×3／BCG又はhTRP×3／GMCSFで免疫感作されたマウスもいた。特に断らない限り、全ての結果は、hTRP×3／CFAでワクチン化されたマウスによるものであった。黒色腫保護アッセイの為に、マウスは尻尾の血管を介して静脈内に5×104のB16BL6細胞を最後の免疫感作の10日後に注射された。B16黒色腫チャレンジの20日後、マウスは犠牲にされて肺が除去された。解剖顕微鏡の下で、表層肺転移が記録されて計測された。表層肺転移の統計的解析が学生t検定を用いて行われた。
【実施例】
【００５５】
実施例1
この例では、トリハイブリッド黒色腫抗原である、組換えhTRP×3タンパク質の構築及び生産を示す。
【００５６】
キメラhTRP×3分子を生成する為に、先に示すようにPCRプライマー対を用いてヒトTRP−1、TRP−2、及びチロシナーゼをコードするDNA断片を作製した(図1)。各PCRにより1.4kbの断片を生じた(PCR産物1)。次いで、生じた3つのPCR断片を混合して10サイクルのPCR反応に委ねた(PCR産物2)。最後に、PCR産物2をプライマー、htyr−1及びhtyr−6で増幅した(PCR産物3)。PCR産物3は約4.1kbであり、そしてpET28(Novogen、細菌発現ベクター)中にクローニングする前にEcoRI及びXhoIで消化された。最終産物を配列決定によって確認した。クローン化されたトリハイブリッドヌクレオチド配列のコーディング配列を標準法によって決定して配列番号:7に示した。翻訳産物のアミノ酸配列を配列番号:8に示した。
【００５７】
ヒトhTRP×3遺伝子をコードするプラスミドを含むBL21大腸菌細胞を誘導することにより、不溶性形態の155kDa融合タンパク質の発現がもたらされた（図2A）。細胞溶解物に由来する上清画分(即ち、可溶性タンパク質)は、可溶性形態のhTRPタンパク質が殆どないことを示した。誘導中、細胞増殖の阻害は観察されず、これはヒトhTPR×3が融合タンパク質で発現された場合、毒性ではなかったことを示す。細胞がもし37℃で誘導されたなら封入体が形成されることにより、発現したタンパク質のレベルを増加できただろう。発現したTPR1タンパク質のレベルは約5mg／Lであった。発現したhTPR×3タンパク質は、TPR−1もしくはTPR−2もしくはチロシナーゼに対して特異的な抗血清を用いることでウェスタン解析によって確認された(図2B)。
【００５８】
実施例2
この例では、トリハイブリッド黒色腫抗原である、hTRP×3タンパク質による免疫感作に続いて液体性免疫反応が誘導されたことを示す。
【００５９】
hTRP×3タンパク質によるタンパク質免疫感作をマウス10匹／集団に対して行った。最後の免疫追加の1週間後、血清試料を、精製された個々の抗原に対して反応するそれらの能力についてELISAプレート上で試験した(図3A)。免疫感作されたマウスの大部分（27／30）は、各タンパク質及びhTPR×3に対する抗体反応性を高めた。
【００６０】
これらの反応に関わる抗体のサブタイプを特定する為に、ELISAプレート上で抗体サブタイピングを行った(図3B)。手早く、免疫プレートを組換えhTRP×3で免疫プレートを覆い、そして免疫感作されたマウス由来の血清とインキュベートした。結合した抗体をマウス免疫グロブリンIgG1 IgG2a IgG2b IgG3 及びIgMに対して特異的な第2抗体によって特定した。hTRP×3に対する抗体は、IgGサブクラス;主にIgG1及びIgG2a (IgG2a ／IgG1 ＝0.56)であった。これはTh1及びTh2反応が誘導されたことを示唆した。
【００６１】
実施例3
この例では、トリハイブリッド黒色腫抗原である、hTRP×3タンパク質による免疫感作でT細胞性免疫反応が誘導されたことを示す。
【００６２】
マウスにおいて個々の抗原に対して特異的なT細胞が誘導されたかを特定する為に、hTRP×3で免疫感作されたマウス由来の脾臓をhTRP−1、hTRP−2、及びチロシナーゼタンパク質とそれぞれインキュベートした。T細胞によって上清中に放出されたIFNγを標準IFNγキットによって測定した。
【００６３】
hTRP×3で免疫感作したマウス由来の脾臓は、抗原による刺激の後、コントロールのマウスに比較してより多くの量のIFNγを有意に放出することが発見された(hTRP−1、hTRP−2、及びh−チロシナーゼ刺激により、INFγの放出は、それぞれ8、4及び4倍増加した)。血清コントロールマウス由来の脾臓も、個々の抗原で刺激された場合IFNγを放出し、これらの組換えタンパク質は、in vitroでいくつかのT細胞の活性化を誘導できるということを示唆する。
【００６４】
B16黒色腫細胞は、全てのチロシンファミリーのメンバー及びMHCクラスＩ分子を発現する。hTRP×3に特異的なT細胞も同系B16細胞と反応すべきである。これを確認する為に、ELISPOTアッセイを行った。ワクチン化されたマウス各集団由来の様々な濃度の単離された新鮮な脾臓細胞を手早くELISPOTプレートのウェルに対して添加した。細胞をB16細胞又はEL4コントロール細胞とインキュベートした。放出されたIFNγをマウスIFNγに対するmAbによってELISPOTプレート上で捕らえた。
【００６５】
図5に示すように、hTRP×3で免疫感作されたマウス由来の脾臓は、B16細胞刺激によってINFγを放出する。B16細胞はMHCクラスII分子を発現しなかったので、CD8T細胞がこれらIFNγスポットに対して応答性であった可能性が非常に高い。
【００６６】
実施例4
この例では、トリハイブリッド黒色腫抗原であるhTRP×3タンパク質による免疫感作は、哺乳動物における腫瘍の治療に非常に有用であったことを示す。
【００６７】
hTRP×3の、黒色腫に対する自己免疫性の作用をin vivoで特定する為に、同系マウスモデルを用いた。最後の免疫追加の10日後、免疫感作されたC57BL／6マウスに、C57BL／6マウス由来の黒色腫を突然誘発するB16BL黒色腫細胞を静脈(I.V.)注射した。
【００６８】
組換えhTRP×3で免疫感作されたマウスは、B16BL16黒色腫の肺転移から有意に保護された(図6A)。コントロールマウスと比べて、hTRP×3タンパク質で免疫感作されたマウスは、肺結節が80％少なく(p＝0.001)肺転移が有意により少なかった。
【００６９】
抗腫瘍活性の機構を特定する為に、腫瘍保護を、MHCクラスＩ、クラスII、及びFcRノックアウトマウスにおけるhTRP×3免疫感作の後評価した(図6B)。MHCクラスＩを欠損しているマウスは腫瘍保護を欠いた。マウスにおいてMHCクラスII分子の欠損は抗腫瘍活性に影響を及ぼさず、hTRP×3介在抗腫瘍活性においてCD8細胞が重要な役割を果たしうることを示唆する。
【００７０】
hTRP×3免疫感作を更に様々なアジュバントを用いて試験した。BCG及びGM−CSFは、Th1誘導アジュバントであるとして報告されている(Disisら、Blood,88(1)pp.202〜10;Kumarら、Immunology,97(3):pp.515〜21(1999年6月)を参照のこと)。hTRP×3／BCGによるワクチン化をされたマウスは、hTRP×3／CFAで免疫感作されたマウスと類似して黒色腫チャレンジから保護された。hTRP×3／GM−CSFによるワクチン化をされたマウスは腫瘍チャレンジから保護されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ヒトTRP−1、TRP−2、及びチロシナーゼを含む、トリハイブリッド黒色種抗原hTRP×3の構築体を示している。トリハイブリッド黒色種抗原DNA断片をプライマーにより生成し、そして生成された断片を混合し、そして10サイクルのPCRで融合させた。最終キメラDNAはプライマーhtyrF−1(配列番号:1)及びhtyrF−6(配列番号:6)により生じ、そして細菌発現ベクターpET28a(＋)中にクローン化された。
【図２】組換えトリハイブリッド黒色種抗原であるhTRP×3タンパク質の、SDS−PAGE及びウェスタンブロッティングによる精製及び特性決定を示している。図2Aおいて、SDS−PAGEゲルはhTRP×3タンパク質の発現及び精製を示し、そして図2Bおいて、精製されたhTRP×3タンパク質は、ヒトTRP−1、TRP−2、及びチロシナーゼに対して特異的な抗体によって認識されていることをウェスタンブロットが示している。
【図３】トリハイブリッド黒色種抗原であるhTRP×3で免疫感作された後の、マウスにおける抗体反応をグラフに示している。図3Aおいて、グラフはhTRP×3タンパク質による免疫感作でTRP−１、TRP−2、並びにチロシナーゼ及びhTRP×3に対する抗体が誘導されたことを示している。図3Bにおいては、グラフはhTRP×3タンパク質に対して特異的な抗体のイソ型を示す。
【図４】トリハイブリッド黒色種抗原であるhTRP×3でマウスを免疫感作することより、TRP−1、TRP−2、及びチロシナーゼに対して特異的なIFNγ放出T細胞の生産がもたらされたことをグラフに示している。
【図５】トリハイブリッド黒色種抗原であるhTRP×3タンパク質での免疫感作の後の、T細胞免疫反応の誘導を示す。図5Aでは、ELISPOTブロットがIFNγ生産T細胞の誘導を示し、そして図5Bでは、このIFN−γ生産T細胞誘導がグラフに示されている。
【図６】トリハイブリッド黒色種抗原であるhTRP×3タンパク質での免疫感作は、哺乳動物における腫瘍の治療に有用であったことを示している。図6Aにおいて、免疫感作後の肺表層転移の数が図示されている。図6Bでは、MHCクラスＩノックアウトマウス、MHCクラスIIノックアウトマウス、及びFcRγノックアウトマウスの免疫感作後の肺表層転移の数がグラフに示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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