(57)【要約】抗菌性組成物、および抗菌性組成物を家畜の水または飼料を通じて投与するための方法であって、抗菌性組成物は、リゾチーム、およびリゾチームと相乗効果的に作用する乾燥卵粉、アルブミン、金属イオン封鎖剤および／またはランチビオティックなどのさまざまな他の薬剤で作られる。組成物は、家畜の消化管内でウェルチ菌、大腸菌およびサルモネラ属の成長、およびそれらによって引起される疾患ならびに疫学的に重大な影響を抑えるために使用される。具体的には、抗菌性組成物および方法は、飼料を通じて家禽および／または豚に投与することのできる飼料の添加剤に関する。そのような添加剤の使用は家畜の消化管内に存在し得る他の腸の病原体も抑え得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
家畜の消化管内で腸の病原体の成長およびそれらに関連する疾患の発生を抑制するための方法であって、前記方法は抗菌性組成物を前記家畜に投与するステップを含み、前記抗菌性組成物は、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩と、
（ｂ）  抗菌性物質と、
（ｃ）  金属イオン封鎖剤とを含む、
方法。
【請求項２】
前記腸の病原体は、以下の族のバクテリア、すなわち、ウェルチ菌、大腸菌、ネズミチフス菌およびサルモネラムバンダカのメンバーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞壁溶解物質またはその塩はリゾチームである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗菌性物質は乾燥卵粉および／またはアルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記金属イオン封鎖剤は有機酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記金属イオン封鎖剤は金属キレートである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記金属イオン封鎖剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸またはキトサンから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物はランチビオティックをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ランチビオティックはナイシンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗菌性組成物は粉末化されたかまたは水溶液の形である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗菌性組成物は飼料の添加剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患は、壊死性腸炎、ウェルチ菌腸炎および下痢疾患を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗菌性組成物の比率は重量で２：５：３である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記乾燥卵粉は、前記家畜の消化管内でカビおよびウイルスなどの付加的な微生物の成長を抑制する、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記乾燥卵粉は、前記家畜の消化管内でプロテアーゼおよびリパーゼなどの付加的な酵素を抑制する、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗菌性組成物は、前記抗菌性組成物を前記家畜のための飲料水に混合することによって水性の形で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗菌性組成物は約１００から２００部／１０６の最終濃度を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗菌性組成物は飼料の添加剤として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗菌性組成物は約１００から２００部／１０６の最終濃度を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
家畜の消化管内で腸の病原体の成長およびそれらに関連する疾患の発生を抑制するための方法であって、前記方法は抗菌性組成物を前記家畜に投与するステップを含み、前記抗菌性組成物は、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩と、
（ｂ）  抗菌性物質と、
（ｃ）  金属イオン封鎖剤と、
（ｄ）  ランチビオティックとを含む、
方法。
【請求項２１】
前記細胞壁溶解物質またはその塩、前記抗菌性物質、前記金属イオン封鎖剤および前記ランチビオティックの比率は、重量で約５０：１５０：５０：２０である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
家畜の消化管内で腸の病原体の成長およびそれらに関連する疾患の発生を抑制するための抗菌性組成物であって、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩と、
（ｂ）  抗菌性物質と、
（ｃ）  金属イオン封鎖剤と、
（ｄ）  ランチビオティックとを含む、抗菌性組成物。
【請求項２３】
腸のバクテリア性の病原体は、以下の族のバクテリア、すなわち、ウェルチ菌、大腸菌、ネズミチフス菌およびサルモネラムバンダカのメンバーを含む、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【請求項２４】
前記細胞壁溶解物質またはその塩はリゾチームである、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【請求項２５】
前記抗菌性物質は乾燥卵粉および／またはアルブミンである、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【請求項２６】
前記金属イオン封鎖剤は有機酸である、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【請求項２７】
前記金属イオン封鎖剤は金属キレートである、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【請求項２８】
前記金属イオン封鎖剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸またはキトサンから選択される、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【請求項２９】
前記ランチビオティックはナイシンである、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【請求項３０】
前記抗菌性組成物は粉末化されたかまたは水溶液の形である、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【請求項３１】
前記抗菌性組成物は飼料の添加剤である、請求項２２に記載の抗菌性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
この発明は、家畜の消化管内で微生物の成長を抑制するための組成物および方法に関し、特に、消化管内で病原性の微生物の成長を抑制するために水または飼料への添加剤として家畜に投与することのできる抗菌性組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
バクテリアは家畜にさまざまな腸の疾患を引起す。これら種類のバクテリアは一般的な種の病原性の腸のバクテリアに入る。腸の疾患を引起す１つのそのようなバクテリアはウェルチ菌であり、これは家禽に壊死性腸炎（「ＮＥ」）を、豚にウェルチ菌腸炎（「ＣＰＥ」）を引起す。もう１つの一般的な腸の病原体である大腸菌は、子豚の下痢疾患など、多くの種類の動物に疾患を引起す。毎年、ＮＥ、ＣＰＥおよび下痢疾患は、鳥ならびに豚の飼育業界に大きな財政的な損失を与えている。ウェルチ菌および大腸菌に加え、さまざまな血清型のサルモネラ属は、動物食品の消費を通じて人間に伝染し得る疾患を動物に引起す。
【０００３】
ＮＥおよびＣＰＥの症例は世界のほぼ全域で報告されており、家禽および豚の業界の存続性で大きな経済的な役割を果たしている。たとえば、ＮＥの感染による年間の国際的な損失は２０億米国ドルよりも多いと推定されている。
【０００４】
ＮＥは１９６１年当初、家畜の鳥類の疾患として説明されていた。ウェルチ菌は鳥類の消化管に自然に発生していることがわかっている。しかしながら、好ましい条件では、ウェルチ菌は素早く繁殖して毒素を放出し、これが下方の小腸の内層に大きな面積の壊死のひどい損傷を引起す。場合によっては、このバクテリアは盲腸および肝臓にも影響を及ぼし得る。ウェルチ菌の増殖に繋がる好ましい条件は、食事の危険因子、および疾患の素因として作用するコクシジウム症などの他の因子によって引起される腸のストレスによって誘発されることがある。ＮＥの古典的な形は大発生として起こる傾向があり、２週から５週の年齢の範囲の鳥に主に影響を及ぼし、食欲不振、鬱状態、逆立った羽毛、下痢および体重増加の減少の急性の経過によって特徴付けられ、これに突然の死が伴うことがある。治療しない群れの死亡率は１０％以上に到達し得る。同様に豚においても、ウェルチ菌Ａ型およびＣ型は、下痢、体重増加の減少、および時として急性の形で死を引起す。
【０００５】
下痢疾患としても知られるバクテリア性の下痢は、分娩管理の益々の強化、すなわち、大きな群れおよび早期の離乳に向けての傾向の結果として、家畜業界、特に豚において経済的に重要な疾患になっている。腸毒素産生性大腸菌によって引起される下痢疾患は、新生児期の豚に見られる最も一般的な腸の疾患である。疾患の始まりでは、大腸菌は小腸の上皮に付着することにより消化管内にコロニーを形成する。一旦、大腸菌がコロニーを形成すると、次にバクテリアは毒素を生成し、これが胃腸の障害を引起す。感染のプロセスは、新生児期および離乳後の両方の子豚で発生し得る。しかしながら、大腸菌の離乳後の感染は、成長速度の減少および死亡率の増加のため、豚の業界の経済的な損失の大きな原因である。離乳した豚の１．５％〜２％を殺傷する養豚場での離乳後の死亡率の最も一般的な原因の１つは、下痢疾患である。
【０００６】
バージニアマイシンおよびバシトラシンなどのさまざまな抗生物質が、ウェルチ菌および他の関連する疾患を管理ならびに防止するために使用されている。これら抗生物質は、それを飼料に添加することにより、さまざまな鳥類および豚に投与される。しかしながら
、飼料グレードの抗生物質に対する耐性の発生が続いているため、上述の疾患の予防および管理で後退が生じている。さらに、１９９９年７月、欧州共同体はバージニアマイシンおよびバシトラシンを含む飼料グレードの抗生物質の使用を禁止した。抗生物質の使用の負の影響、および環境ならびに人間の健康に対するその影響についての人々の意識が高まっているため、世界の残りの地域でも同様の動きが間もなく取られるだろう。家禽および豚で使用するための抗生物質の低減および排除に関連する最も重大な問題の１つは、あり得るＣＰＥおよび下痢疾患の発生の増加とともにＮＥの発生の増加である。さらに、動物業界の他の分野も、抗生物質の撤退後のさまざまな疾患の流行に脅威を受けるであろう。撤退は、動物食品として人間によって消費される食品の安全性の低下という結果にも繋がる。上述の理由のため、動物、特に鳥類および豚のＮＥ、ＣＰＥおよび下痢疾患などの胃腸疾患を防止またはその発生を低減するための費用効果の高い代替策が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
発明の概要
したがって、この発明の目的は、家畜、特に鳥類および豚の腸の病原性の感染の管理を支援するための改良された抗菌性組成物およびそれを投与するための方法を提供することである。
【０００８】
この発明の実施例によると、家畜の腸の病原体の成長を抑制するための新しい抗菌性組成物およびその抗菌性組成物を投与するための新しい方法が提供される。具体的には、抗菌性組成物は、ウェルチ菌、大腸菌およびサルモネラ属の成長を低減し、それらによって引起される疾患および疫学的な重大な影響を低減するため、ならびに上述の問題の少なくとも一部に対処するために抗菌性物質および金属封鎖剤と組合せてリゾチームを含む。
【０００９】
この発明の実施例による抗菌性組成物および方法は、動物の健康に影響を及ぼし、かつ体重増加の減少および死亡などの合併症に繋がり得る鳥類および豚の消化管内に存在し得るさまざまな種類のバクテリアを抑制する。具体的には、抗菌性組成物および方法は、豚にＣＰＥ、家禽にＮＥを引起すウェルチ菌の成長を抑えるために家畜に投与することのできる水または飼料の添加剤に関する。そのような水または飼料の添加剤の使用は、豚に下痢疾患を引起す大腸菌の成長も抑え、鳥類および豚の消化管に存在する他の腸の病原体を含め、ネズミチフス菌およびサルモネラムバンダカ（Salmonella Mbandaka）の成長も抑える。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この発明の実施例によると、家畜の消化管内で腸の病原体の成長ならびにそれらに関連する疾患の発生を抑制するための方法が提供され、この方法は家畜に抗菌性組成物を家畜に投与するステップを含み、この抗菌性組成物は、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩、
（ｂ）  抗菌性物質、および
（ｃ）  金属イオン封鎖剤を含む。
【００１１】
具体的な例では、細胞壁溶解物質またはその塩、抗菌性物質および金属イオン封鎖剤の比率は、重量で２：５：３である。
【００１２】
鳥類および豚の個体群では、目標とされる特定の腸の病原体は、以下の族のバクテリア、すなわち、ウェルチ菌、大腸菌、ネズミチフス菌およびサルモネラムバンダカのメンバーを含む。
【００１３】
別の具体的な例では、細胞壁溶解物質およびその塩はリゾチームであり得る。
【００１４】
別の具体的な例では、抗菌性物質は乾燥卵粉および／またはアルブミンであり得る。
【００１５】
さらに別の具体的な例では、金属イオン封鎖剤は有機酸および／または金属キレートであってもよく、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸またはキトサンから選択され得る。
【００１６】
別の具体的な例では、組成物はナイシン（nisin）であり得るランチビオティック（lantibiotic）をさらに含む。
【００１７】
別の具体的な例では、抗菌性組成物は粉末化されたかまたは水溶液の形である。
【００１８】
別の具体的な例では、抗菌性組成物は飼料の添加剤として投与される。
【００１９】
抗菌性組成物の投与は、壊死性腸炎、ウェルチ菌腸炎および下痢疾患の発生の抑制または治療のためのものである。
【００２０】
別の具体的な例では、乾燥卵粉は家畜の消化管内でカビおよびウイルスなどの付加的な微生物の成長を抑制し得る。さらに、乾燥卵粉は、家畜の消化管内でプロテアーゼおよびリパーゼなどの付加的な酵素も抑制し得る。
【００２１】
さらに別の具体的な例では、抗菌性組成物は、抗菌性組成物を家畜のための飲料水と混合することにより水溶液の形で投与することができ、抗菌性組成物は約１００から２００部／１０６の最終的な濃度を有し得る。
【００２２】
別の具体的な例では、抗菌性組成物は飼料の添加剤として投与することができ、抗菌性組成物は約１００から２００部／１０６の最終的な濃度を有し得る。
【００２３】
この発明の別の実施例によると、家畜の消化管内で腸の病原体の成長およびそれらに関連する疾患の発生を抑制するための方法が提供され、この方法は抗菌性組成物を家畜に投与するステップを含み、この抗菌性組成物は、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩、
（ｂ）  抗菌性物質、
（ｃ）  金属イオン封鎖剤、および
（ｄ）  ランチビオティックを含む。
【００２４】
具体的な例では、細胞壁溶解物質またはその塩、抗菌性物質、金属イオン封鎖剤およびランチビオティックの比率は、重量で約５０：１５０：５０：２０である。
【００２５】
この発明の別の実施例によると、家畜の消化管内で腸の病原体の成長およびそれらに関連する疾患の発生を抑制するための抗菌性組成物が提供され、この抗菌性組成物は、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩、
（ｂ）  抗菌性物質、
（ｃ）  金属イオン封鎖剤、および
（ｄ）  ランチビオティックを含む。
【００２６】
具体的な例では、目標とされる腸のバクテリア性の病原体は、以下の族のバクテリア、すなわち、ウェルチ菌、大腸菌、ネズミチフス菌およびサルモネラムバンダカのメンバーを含む。
【００２７】
別の具体的な例では、細胞壁溶解物質またはその塩はリゾチームであり得る。
【００２８】
別の具体的な例では、抗菌性物質は乾燥卵粉および／またはアルブミンであり得る。
【００２９】
別の具体的な例では、金属イオン封鎖剤は有機酸および／または金属キレートであってもよく、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸またはキトサンから選択され得る。
【００３０】
別の具体的な例では、ランチビオティックはナイシンであり得る。
【００３１】
別の具体的な例では、抗菌性組成物は粉末化されたかまたは水溶液の形であり得る。
【００３２】
別の具体的な例では、抗菌性組成物は飼料の添加剤であり得る。
【００３３】
この発明の別の局面および特徴は、添付の図面とともに以下のこの発明の実施例の説明を参照することにより当業者に明らかとなるであろう。
【００３４】
この発明の実施例は、以下の好ましい実施例の説明および添付の図面を参照することにより明確に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
発明の説明
人間の食品におけるバクテリアの管理または抑制では、バクテリアの細胞壁を破壊するために細胞溶解物質を使用することが知られている。たとえば、一般にリゾチームとして知られる酵素（ＥＣ３．２．１．１７またはムラミターゼとしても知られる）は、乳汁、唾液および涙などの哺乳類の分泌物内に自然に発生する。業界では、リゾチームは、その豊富さのため鶏卵の卵白から抽出され、約３％のタンパク質を含む。リゾチームは、１４．６ｋＤａの単一ペプチドのタンパク質であり、ペプチドグリカン層でＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの間のβ（１−４）グリコシド結合を切断することによりバクテリアの細胞を溶解することができる。リゾチームは極度に高い等電点（＞１０）を有し、結果的に中性または酸性のｐＨで陽イオン性が高い。結果として、リゾチームは低いｐＨで比較的安定している。それは１℃から沸点近くの約１００℃の温度範囲でも活動的である。
【００３６】
リゾチームは、クロストリジウム種を含む或るグラム陽性バクテリアに対して効果的である。例として、リゾチームは、クロストリジウムチィロブチリカム（Clostridium tyrobutyricum）による、セミハードチーズの遅い発砲を引起す酪酸の腐敗を防止するために、２０年以上にわたってチーズ業界でバイオ保護剤として使用されている。この話題の検討には、「種に特有のRCR増幅によるチーズの遅い発酵の原因物質としてのクロストリジウムチィロブチリカムの識別」（“Identification of Clostridium tyrobutyricum as the causative agent of late blowing in cheese by species-specific RCR amplification”）, N Klijn, F F Nieuwenhof, J D Hoolwerf, C B van der Waals, and A H Weerkamp, Appl Environ Microbiol. 1995 August; 61(8):2919-2924を参照されたい。
【００３７】
この発明の実施例では、リゾチームを含む抗菌性組成物は、具体的には、抗菌性組成物を飼料を通じて家畜に投与することにより、家畜内で腸の病原性のバクテリアに関連する疾患を管理および予防するための抗菌剤として作用し得る。準備的な研究では、リゾチームは病原性バクテリアのウェルチ菌を抑えるのに効果的であることが示されている。図１は、ウェルチ菌に対するリゾチームについての最小発育阻止濃度（「ＭＩＣ」）プレート
から得られたデータを示す。ここでは、リゾチームは１００から２００ｐｐｍの間の投与量でウェルチ菌を抑える効力を示す。リゾチームは、他のバクテリアの成長とともにウェルチ菌の腸の病原性の影響を管理および予防するために、動物の飼料、特に鳥および豚の飼料にこの濃度で添加することができる。
【００３８】
現在では、抗生物質の使用は、効力を維持するために飼料のメートルトン（ＭＴＦ）当り、約３米国ドルから５米国ドルかかる。２００ｐｐｍでリゾチームを使用して等しい効力を維持するためには、約２０米国ドル／ＭＴＦかかるであろう。リゾチームの費用は動物を扱う全体の費用を増加させ得るが、リゾチームの使用は、従来の抗生物質の必要性を低減するかまたは排除するという利点を有するため、上述のように所与の個体群で生じ得る抗生物質の耐性に関する問題を克服することができる。
【００３９】
この発明の実施例では、リゾチームなどの細胞壁溶解物質、抗菌性物質、好ましくは乾燥卵粉／アルブミン、および金属イオン封鎖剤または金属キレート剤を含む抗菌組成物が、上述のバクテリアに関連する疾患の発生を低減するために家畜に投与される。準備的な研究では、乾燥卵粉およびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ二ナトリウム）、クエン酸またはキトサンなどの金属イオン封鎖剤／金属キレート剤をリゾチームに添加することによって、ウェルチ菌を抑えるための効力が増加することが示されている。これは、リゾチーム、乾燥卵粉および金属イオン封鎖剤／金属キレート剤の間の相乗効果によるものと思われる。リゾチーム、クエン酸およびアルブミンの間の相乗効果に関する実験データが図２に示される。図２は、終夜培養の１００倍希釈液を接種されたウェルチ菌のＭＩＣプレートを示す。この準備的な研究では、混合物（配合物１）は、リゾチーム、アルブミンおよびクエン酸を１：３：１の比率で含む。
【００４０】
図２は、上述の配合物１をＭＩＣプレート上で使用したときに約５０ｐｐｍでウェルチ菌を抑える効力があることを示している。なお、この準備的な研究で使用されたリゾチームの相対的な量は図１の準備的な研究で使用された濃度と比較して減少しているが、組成物の効力は増加した。リゾチームは、図２に示されるデータの生成に繋がった現在説明されている準備的な研究で使用される配合物１の断片のみを表わすことも重要な点である。
【００４１】
この発明のこの実施例の利点は、リゾチームと比較して、アルブミンおよびクエン酸の両方の費用が比較的低いことである。現在の価格では、配合物１は、ウェルチ菌を管理する際に効力を有するために５０ｐｐｍで約３米国ドル／ＭＴＦかかる。
【００４２】
金属イオン封鎖剤／金属キレート剤、すなわち、クエン酸は、大腸菌およびサルモネラ属などのグラム陰性病原体の成長を防止する手助けすることも示されている。配合物１を使用したさらに別の準備的な研究では、グラム陰性病原体に対する抗菌性の活動が増加したことがわかった。この理由は、金属イオン封鎖剤／金属キレート剤が酸化防止剤として働き、これらの条件でリゾチームと相乗作用的であるためだと考えられている。鳥および豚などの家畜の個々の消化管をより酸性に保つことによって、ウェルチ菌および他の病原体を抑える全体的な効果を増加することができる。
【００４３】
この発明の別の実施例では、リゾチーム、ＥＤＴＡ二ナトリウムおよび乾燥卵粉を含む抗菌性組成物は、バクテリアおよびバクテリアに関連する疾患の管理および抑制のために家畜、特に家禽および／または豚の飼料に添加され得る。さらに別の準備的な研究では、カナダのアボッツフォード B.C.の Canadian Inovatech Inc.からの配合物Inovapure（登録商標）PlusTM５３２が相乗作用的であり、ウェルチ菌を管理するのに成功していることが示されている。準備的な研究からの結果は、図３に示される。
【００４４】
この準備的な研究では、ウェルチ菌は０．１５％のＮａＣｌで補われたＬＢ培地に１０
5ＣＦＵ／ｍｌで接種された。１００ｐｐｍおよび２００ｐｐｍの両方のInovapure（登録商標）PlusTM５３２はともにウェルチ菌の成長を抑えるのに成功した。さらに、用量反応が、２００ｐｐｍの溶液がより好結果であったという事実によって証明された。
【００４５】
ＥＤＴＡ二ナトリウムを金属キレートとして使用する利点の１つは、それがカナダおよび米国の両方において動物の飼料での使用に承認されている成分であるという点である。さらに、ＥＤＴＡ自身は抗菌性の特性を有する。なぜなら、それが溶液中で陽イオンの利用可能性を制限するからである。溶液中で陽イオンの利用可能性を制限する際、陽イオンとのＥＤＴＡ複合体は、リポ多糖類などの膜の高分子間の塩橋として作用し、バクテリアの細胞膜を不安定にして溶解させる。
【００４６】
この発明のさらに別の実施例では、リゾチームおよびＥＤＴＡの相乗効果は、グラム陽性バクテリア、具体的には、黄色ブドウ球菌およびさまざまなグラム陰性バクテリアなどの他の種類の微生物でも観察された。リゾチームおよびＥＤＴＡは、或る種の真菌にも効果的であることが観察された。図４、図５および図６は、ネズミチフス菌、サルモネラムバンダカおよび大腸菌の臨床分離株に対するInovapure（登録商標）PlusTM５３２のＭＩＣを示す。
【００４７】
図４、図５および図６の生成に繋がった準備的な研究では、大腸菌、ネズミチフス菌およびサルモネラムバンダカのＭＩＣプレートは終夜培養の１０，０００倍の希釈液を接種された。図４は、Inovapure（登録商標）PlusTM５３２を用いて大腸菌を抑えるための効力は約１２５０ｐｐｍであり、サルモネラ属の培養はともに約２５００ｐｐｍで抑えられたことを示す。
【００４８】
リゾチームおよびＥＤＴＡの使用から得られた別の利点は、リゾチームおよびＥＤＴＡの両方が腸の病変を引起すホスホリパーゼＣ（またはウェルチ菌によって生成されるアルファ毒素）の酵素の活動性に直接的な抑制効果を有するとして知られている点であり、これはこの発明のこの実施例のさらなる利点である。
【００４９】
さまざまな卵の成分を含む乾燥卵粉の使用は、鶏卵の卵白の他の天然成分が有するとして示される付加的な利点を提供する。鶏卵の卵白の天然成分は、さまざまなバクテリア、イースト、カビおよびウイルス、ならびにプロテアーゼおよびリパーゼを抑えるのに効果的であることが示されている。さまざまな卵の抗菌薬の検討には、たとえば、「天然の食品の抗菌性システム」（“Natural Food Antimicrobial System”）, ed. A.S. Naidu, pp.211-226. New York: CRC Press, Inc. and Lineweaver, H., and C.W. Murray. 1947. 「オボムコイドを用いた卵白のトリプシン抑制体の識別」（“Identification of the trypsin inhibitor of egg white with ovomucoid.”） J. Biol. Chem. 171, 565-581を参照されたい。さらに、乾燥卵粉のタンパク質の相乗効果は、ウェルチ菌によって生成される毒素を抑える役割も果たす。乾燥卵のタンパク質に由来する免疫グロブリンＹ（ｌｇＹ）の効果を含むこれらさまざまな効果の検討には、たとえば、Erhard, M.H., Gobel, E.,
Lewan, B., Losch, U., Stangassinger, M., 1997. 「新生の子牛に所乳および卵粉を与えた後のウシ免疫グロブリンＧおよびニワトリ免疫グロブリンＹの系統的な利用可能性」（“Systematic availability of bovine immunoglobulin G and chicken immunoglobulin Y after feeding colostrum and egg powder to newborn calves.”） 「動物栄養学のアーカイブ」(“Archives of Animal Nutrition”）, 50(4), 369-380; Jin, I.Z., Baidoo, S.K., Marquardt, R.R. Frohlich, A.A., 1998. 「卵黄の抗体による腸毒素産生性大腸菌Ｋ８８の子牛の腸の粘液への付着の試験管内での抑制」（“In vitro inhibition of
adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88 to piglet intestinal mucus by egg-york antibodies”）. 「免疫学および医学的微生物学」（“Immunology and Medical Microbiology”）, 21, 313-321; Marquardt, R.R., 2000. 「特定のニワトリの卵の抗
体を与えることによる豚の腸の疾患の管理」（“Control of Intestinal diseases in pigs by feeding specific chicken egg antibodies”）. In: 「卵の栄養学および生物工学」（“Egg nutrition and biotechnology”）, Sim, J.S., Nakai, S., Guenter, W., (eds). CABI Publishing, 289-299; O'Farrelly, C., Branton, D., Wanke, C.A., 1992.
「腸毒素産生性大腸菌の株で免疫を与えられた雌鳥からの卵黄免疫グロブリンの経口摂取は同じ株で攻撃されるウサギの下痢を予防する」（“Oral ingestion of egg yolk immunoglobulin from hens immunized with an enterotoxigenic Escherichia coli strain prevents diarrhea in rabbits challenged with the same strain”）. 「感染と免疫」（“Infection and Immunity”）, 60(7), 2593-2597. を参照されたい。
【００５０】
この発明の別の実施例では、ランチビオティックをさらに含む組成物は、家畜、特に鳥類および豚の個体群でグラム陽性バクテリアの成長および関連する疾患を抑制するように形成され得る。さらに別の準備的な研究では、ナイシンなどのランチビオティックをリゾチームに添加することによって、リゾチームとランチビオティックとの間の相乗効果によってウェルチ菌を抑える効力が増加することが示されている。
【００５１】
図７は、この準備的な研究中に得られたナイシンとリゾチームとの間の相乗効果に関連する実験データを示す。ウェルチ菌の分別阻止濃度（「ＦＩＣ」）プレートは、終夜培養の１００倍希釈液を接種された。なお、この準備的な研究ではリゾチームは約１２０ｐｐｍで効果的であった。準備的な研究におけるナイシンの量を３ｐｐｍに増加することによって、ウェルチ菌に対する殺菌効果を実現するために８ｐｐｍのみのリゾチームが必要であった。
【００５２】
この発明の別の実施例では、リゾチーム、乾燥卵粉および／またはアルブミン、金属イオン封鎖剤／金属キレート剤およびランチビオティックを含む抗菌性組成物は、家畜、特に鳥類および豚の個体群でバクテリアの成長およびバクテリアに関連する疾患を抑制するために家畜に投与することができる。好ましくは、組成物は、腸のバクテリアに関連する疾患を予防するために鳥類および／または豚の個体群の水または飼料に添加される。さらに別の準備的な研究では、ナイシンなどのランチビオティック、リゾチーム、アルブミンおよびクエン酸などの金属イオン封鎖剤／金属キレート剤を含む組成物は、リゾチーム、ナイシン、アルブミンおよびクエン酸の間の相乗効果によりウェルチ菌を抑えるための高い効力を有することがわかった。
【００５３】
図８は、準備的な研究から決定されたような、ナイシン、リゾチーム、クエン酸およびアルブミンの間の相乗効果に関連する実験データを示す。図８は、終夜培養の１００倍希釈液を接種されたウェルチ菌のＭＩＣプレートを示す。準備的な研究では、抗菌組成物の２つの配合物が使用された（配合物２および配合物３）。配合物２および配合物３は、それぞれ、３３：１７：５０：１５０および５０：２０：５０：１５０（Inovapure（登録商標）Plus）の比率でリゾチーム、ナイシン、クエン酸およびアルブミンを含んでいた。図８は、ウェルチ菌に対する配合物３の組合せの効果的な投薬量は約２０ｐｐｍであることを示す。ナイシンを添加することにより、効果的な投薬量は約５０ｐｐｍ（図２の配合物１に見られるように）から２０ｐｐｍに減少した。ここでも、混合物内のリゾチームの量は抗菌性組成物全体の一部分のみに相当する。
【００５４】
この発明のこの実施例の付加的な利点は、２０ｐｐｍでウェルチ菌を抑えることにより効力を維持するためのリゾチーム、ナイシン、クエン酸およびアルブミンの配合物の費用は、現在では、約１米国ドル／ＭＴＦ未満であるという点である。
【００５５】
より最近のケージ研究では、同種の群れのブロイラーの雛が使用された。研究では４００羽が使用され、それは２７日にわたって行なわれた。研究で使用された鳥はすべて、孵
化場で卵の状態で慣例の予防接種を受けた。準備的な研究中に、付随した薬物治療は使用されなかった。準備的な研究は無作為化された完全なブロック設計に基づいていた。処置当り、８つのケージが使用され、各ブロックで５つの処置が施された。
【００５６】
処置は次のようである。
【００５７】
１  薬物を添加されない、攻撃なし
２  薬物を添加されない、攻撃あり
３  InovapureTMPlus  ５０ｍｇ／ｋｇ
４  InovapureTMPlus  １００ｍｇ／ｋｇ
５  ＢＭＤ（バシトラシンメチレンジサリシレート）５０ｇ／ｔ
処置３および４での抗菌性組成物の混合物は、上述のInovapure（登録商標）Plusであった。
【００５８】
試験の５日目に、鳥はグループに分けられた。各グループについてのケージ当りの重量はできるだけ均一に保たれた。各グループの各鳥の付加的な重み付けは、準備的な研究の１４日目および２７日目に行なわれた。
【００５９】
試験中に死亡した鳥の死体は、研究者による検死による病変のスコアリングのために用いられた。検死の目的は、死亡または病的状態の最もあり得る原因を決定するためであった。腸の病変が認められた場合にはＮＥが死亡の原因であると診断された。
【００６０】
研究中に鳥に投与された飼料は、薬物を添加されないスターター（starter）およびグローワー（grower）の基礎飼料であった。飼料はスターター（０日目から１８日目）およびグローワー（１８日目から２７日目）と称された。これらのタイムラインは地元業界の規定飼料を表わすものと見なされる。さらに、鳥の飼料の消費量が監視された。
【００６１】
１４日目、処置１のものを除くすべての鳥は、アイメリアアセルブリナ（E. acervulina）およびアイメリアマキシマ（E. maxima）の卵母細胞の混合された接種物を経口接種された。卵母細胞は、鳥の消化管および腸内のクロストリジウム属の増殖を刺激するように軽いコクシジウムの攻撃を提供した。１８日目から、処置１を除くすべての鳥は約１０8
ｃｆｕ／ｍｌのウェルチ菌の肉汁培地を経口的に胃管栄養で与えられた。次に、鳥は、１８日目、１９日目および２０日目の３日間、毎日新鮮な肉汁培地を投与された。
【００６２】
２２日目、各ケージから２羽が無作為に選択され、犠牲にされ、ＮＥの病変の存在が調べられた。病変が存在する場合、それらはスコアを付けられた。スコアリングは０から３の基準に基づき、０は正常であり、３は最も重症であった。２７日目、残りの鳥が犠牲にされ、病変がスコア付けされた。
【００６３】
以下の表はケージ研究からの結果を示す。
【００６４】
【表１】
2005539070.tif 000002
【００６５】
上述のケージ研究からいくつかの重要な所見を導くことができる。まず、抗菌性組成物を投与された鳥の死亡率が大きく減少した。さらに、処置３および４の両方で鳥の腸の病変の発達が大きく低減した。処置３および４の間に観察できるような試験の被験者で導き出される用量反応もあった。抗菌性組成物が投与された両方の処置で顕著な体重の増加も観察された。鳥に生じた体重の増加に加え、飼料変換率（ＦＣＲ）［平均飼料接種量／鳥の平均体重］が大きく減少した。上述のことから、抗菌性組成物は、抗生物質のＢＭＤのものに類似の抗菌性／成長促進効力を有する。
【００６６】
さらに別のフロアペン（floor pen）研究が行なわれ、Inovapure（登録商標）Plus５３２を含む抗菌性組成物が投与された。出願人は、ウェルチ菌Ａ型で攻撃されるフロアペン環境で育てられたブロイラーの鶏の行動に対する１００および２００ｐｐｍの飼料のInovapure（登録商標）Plus５３２の影響を評価するために準備的な研究を行なった。
【００６７】
実験のパラメータは上述のケージ研究と実質的に類似であった、このフロアペン研究は無作為化された完全なブロック設計で行なわれ、単一の群れの種類を使用し、標準的な予防接種が孵化場で卵の状態で投与され、鳥の規定飼料は実験の設計で処方されたもの以外には抗コクシジウムまたは抗生物質は含まなかった。研究は４１日にわたって行なわれた。
【００６８】
上述のように、抗菌性組成物は成長の全体にわたって連続して鳥に与えられた。抗菌性組成物は、０、１００、または２００ｐｐｍの含有率で完全な規定飼料と混合された。抗菌性組成物は、各トンに必要とされる全量を小麦などの主成分の５キログラムと混合し、手でよく混ぜることによって中間事前混合物にされた。次に、中間事前混合物は混合物全体に添加され、配合された。
【００６９】
鳥の腸内のクロストリジウム属の増殖を刺激するため、雛にコクシジウムの攻撃が投与された。
【００７０】
以下は準備的な研究から得られた結果である。
【００７１】
【表２】
2005539070.tif 000003
【００７２】
上の表１からわかるように、抗菌性組成物が試験被験者に与えられたところでは平均の合計死亡率が減少した。合計死亡率に基づいて組成物に関して導き出される用量反応があった。準備的な研究では、合計死亡率のある部分を占める大量のＮＥがあった。表２は、抗菌性組成物を投与することにより、ＮＥによって引起される死亡率が大きく低減されたことを示す。ここでも用量反応が観察された。
【００７３】
上述のことに加え、準備的な研究では鳥の飼料消費量および体重が注意深く監視され、これは表３に示されるデータに繋がった。表３は、抗菌性組成物が投与されたところでＦＣＲの減少があったことを示す。鳥のグローワーおよびフィニッシャー（finisher）の両方のクラスで体重増加に増加が見られた。
【００７４】
鳥類および豚の個体群の両方を含む家畜に抗菌性組成物を投与する方法は、飲料水または飼料を通じて経口経路で行なわれることが好ましい。水溶性の形で、たとえば、飲料水で抗菌性組成物を投与するため、組成物は粉末の形で生成され、次に約１００から２００ｐｐｍの最終濃度を実現するように飲料水に溶解され得る。最適に溶解するために、活性成分は容易に溶けるように選択されるべきである。飼料を通じた投与では、抗菌性組成物は、動物の基礎飼料のサブセットに添加されて、１から２％の濃度で事前混合物を形成することが好ましい。事前混合物は約１００から２００ｐｐｍで最終飼料に混合することができる。配合物は、スターター、グローワーおよびフィニシャーの飼料で使用される。
【００７５】
この発明の実施例は、この発明を実現する好ましい実施例の例示的なものに過ぎない、ここに開示される実施例に限定されず、形、部品の配置、ステップ、詳細および動作の順番の変更が可能であることを理解されたい。この発明は、請求項によって規定されるように、その範囲内のすべてのそのような変形例を含むことを意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ウェルチ菌に対するリゾチームの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を示す図である。
【図２】ウェルチ菌に対する５０対１００対５０の比率でリゾチーム、アルブミンおよびクエン酸を含む配合物のＭＩＣを示す図である。
【図３】１００および２００ｐｐｍの濃度での２：３：５の比率のリゾチーム、ＥＤＴＡ二ナトリウムおよび乾燥卵粉によるウェルチ菌の阻止を示す図である。
【図４】大腸菌に対するInovapure（登録商標）Plus５３２のＭＩＣを示す図である。
【図５】ネズミチフス菌に対するInovapure（登録商標）Plus５３２のＭＩＣを示す図である。
【図６】サルモネラムバンダカに対するInovapure（登録商標）Plus５３２のＭＩＣを示す図である。
【図７】ウェルチ菌に対するリゾチームおよびナイシンの分別阻止濃度（ＦＩＣ）を示す図である。
【図８】ウェルチ菌に対するリゾチーム、ナイシン、クエン酸およびアルブミンの効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年12月3日(2004.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
家畜の消化管内で腸の病原体の成長を抑制するためおよび家畜の胃腸の感染の予防ならびに治療のための薬剤としての抗菌性組成物であって、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩と、
（ｂ）  乾燥卵粉およびアルブミンの少なくとも１つと、
（ｃ）  金属イオン封鎖剤とを含む、抗菌性組成物。
【請求項２】
前記腸の病原体は、以下の族のバクテリア、すなわち、ウェルチ菌、大腸菌、ネズミチフス菌およびサルモネラムバンダカのメンバーを含む、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項３】
前記細胞壁溶解物質またはその塩はリゾチームである、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項４】
前記抗菌性組成物は乾燥卵粉およびアルブミンの両方を含む、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項５】
前記金属イオン封鎖剤は有機酸である、請求項４に記載の抗菌性組成物。
【請求項６】
前記金属イオン封鎖剤は金属キレートである、請求項５に記載の抗菌性組成物。
【請求項７】
前記金属イオン封鎖剤は、（ａ）エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）；（ｂ）クエン酸；（ｃ）キトサンからなる群から選択される、請求項５に記載の抗菌性組成物。
【請求項８】
ランチビオティックをさらに含む、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項９】
前記ランチビオティックはナイシンである、請求項８に記載の抗菌性組成物。
【請求項１０】
前記細胞壁溶解物質またはその塩、前記乾燥卵粉およびアルブミンの少なくとも１つ、前記金属イオン封鎖剤、ならびに前記ランチビオティックの比率は、重量で５０：１５０：５０：２０である、請求項８に記載の抗菌性組成物。
【請求項１１】
前記抗菌性組成物は粉末化された形である、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項１２】
前記抗菌性組成物は水溶液の形である、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項１３】
前記抗菌性組成物は、前記抗菌性組成物を飲料水と混合して前記家畜に投与するために水溶性である、請求項１２に記載の抗菌性組成物。
【請求項１４】
前記抗菌性組成物は飼料の添加剤である、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項１５】
前記胃腸の感染は、壊死性腸炎、ウェルチ菌腸炎および下痢疾患を含む、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項１６】
前記細胞壁溶解物質またはその塩、前記乾燥卵粉およびアルブミンの少なくとも１つ、ならびに前記金属イオン封鎖剤の比率は、重量で２：５：３である、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項１７】
前記抗菌性組成物は乾燥卵粉を含み、前記乾燥卵粉は、前記家畜の消化管内で付加的な微生物を抑制することができる、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項１８】
前記付加的な微生物はカビおよびウイルスを含む、請求項１７に記載の抗菌性組成物。
【請求項１９】
前記抗菌性組成物は乾燥卵粉であり、前記乾燥卵粉は前記家畜の消化管内で付加的な酵素を抑制することができる、請求項１に記載の抗菌性組成物。
【請求項２０】
前記付加的な酵素はプロテアーゼおよびリパーゼを含む、請求項１９に記載の抗菌性組成物。
【請求項２１】
家畜の胃腸の感染の予防および治療で使用するための抗菌性組成物であって、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩と、
（ｂ）  乾燥卵粉およびアルブミンの少なくとも１つと、
（ｃ）  金属イオン封鎖剤と、
（ｄ）  ランチビオティックとを含む、抗菌性組成物。
【請求項２２】
家畜の消化管内で腸の病原体の成長を抑制するための抗菌性組成物であって、
（ａ）  細胞壁溶解物質またはその塩と、
（ｂ）  乾燥卵粉およびアルブミンの少なくとも１つと、
（ｃ）  金属イオン封鎖剤とを含み、
前記細胞壁溶解物質またはその塩、前記乾燥卵粉およびアルブミンの少なくとも１つ、ならびに前記金属イオン封鎖剤の比率は、重量で２：５：３である、抗菌性組成物。
【国際調査報告】
2005539070.tif 000012
2005539070.tif 000013
2005539070.tif 000014