(57)【要約】細胞生存度および細胞膜透過性に関する他の特性についての情報を決定する方法を開示する。本方法は、電流の流れに対する細胞の影響を決定する段階と、既知の健康な細胞などの既知の標準にその影響を関連させる段階、それによって試験対象の細胞の生存度を推定する段階とを含む。試験対象の細胞を、周囲の化学物質、温度、pH、および圧力などの様々な環境条件に供して、細胞生存度および／または細胞透過性に対するそのような条件の影響を決定することができる。試験対象の細胞は、細胞懸濁液中、基板上で増殖中、インビトロにおける組織中、またはインビボにおける組織中にあってよい。本方法は実質的に即時的な結果を提供し、染料または他のマーカーの使用を含む必要がない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、細胞の生存度を判定する方法：
(a)導電性媒体に細胞を配置する段階であって、電流を遮断する材料の開口部を細胞が遮断する、段階、
(b)細胞に電圧を適用する段階、
(c)細胞を流れる電流を検出する段階、
(d)検出された細胞の電流を標準電流と比較して、細胞の生存度を判定する段階。
【請求項２】
(e)毎回異なる細胞を用いて段階(a)〜(d)を複数回反復する段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
細胞は、電流を遮断する材料の開口部に保持される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
複数の細胞を、電流を遮断する材料の開口部の導電性媒体に配置する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
以下の段階を含む、細胞の生存度を判定する方法：
(a)細胞群に電圧を適用する段階、
(b)細胞群の複数の異なる領域を流れる電流を検出する段階、および
(c)細胞群の異なる領域で検出された電流を比較して、異なる領域における細胞の生存度を推定する段階。
【請求項６】
細胞群が生物から抽出した組織である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
細胞群が生物に存在する組織である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含む、電気穿孔を検出する方法：
(a)細胞群に電圧を適用する段階、
(b)細胞群を流れる電流を検出する段階、および
(c)経時的に検出される電流を比較すると同時に、検出される電流が電気穿孔を表す変化を示すまで電圧を変化する段階。
【請求項９】
細胞群が生物から抽出した組織である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
細胞群が生物に存在する組織である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む方法：
(a)導電性媒体に細胞を配置する段階であって、電流を遮断する材料の開口部を細胞が遮断する、段階、
(b)細胞に電圧を適用する段階、
(c)細胞を流れる電流を検出して第1の信号を得る段階、
(d)細胞周囲の条件を変更する段階、
(e)細胞に(b)の電圧を再度適用する段階、
(f)細胞を流れる電流を検出して第2の信号を得る段階、
(g)第1の信号を第2の信号と比較し、細胞に対する変更した条件の影響を判定する段階。
【請求項１２】
変更される条件が、導電性媒体に化合物を添加することを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
変更される条件が、導電性媒体に生体物質を添加することを含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
生体物質が、タンパク質、ヌクレオチド配列、細菌、ウィルス、感染性プリオン、真菌、および多糖からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
変更した条件が、温度、圧力、pH、および放射線からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
化合物が、金属、金属合金、および金属塩からなる群より選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１７】
金属が重金属である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
重金属が、Cd、Hg、In、Tl、Sn、Pb、Te、およびBiからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
以下の段階を含む方法：
第1の地点と、生物細胞を含む導電性媒体によって第1の地点から分離されている第2の地点との間に、電荷の差を形成する段階、
第1の地点と第2の地点の間の第1の電気的パラメーターを測定する段階、
第1の電気的パラメーターの測定値を分析して、生物細胞の特性を判定する段階。
【請求項２０】
第1の電気的パラメーターが、電流、電圧、および電気インピーダンスからなる群より選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
生物細胞の膜に影響を与えるように第2の電気的パラメーターを調節する段階
をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
第2の電気的パラメーターが、電流、電圧、および電流と電圧との組み合わせからなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
特性が生物細胞の膜の完全性である、請求項19記載の方法。
【請求項２４】
生物細胞の特性が細胞膜透過性である、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
分析する段階が、得られた測定値を以前に得られた測定値と比較する段階を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２６】
以前に得られた測定値が、媒体中の生物細胞と実質的に同じである正常な生物細胞上で実施されたものである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
以前に得られた測定値が、媒体中の生物細胞と同一種類である障害を生じた生物細胞上で実施されたものである、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
細胞が、疾病、物理的外傷、化学的暴露、温度、および放射線からなる群より選択される様式で障害を生じている、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
以下のものを含む、細胞を試験する装置：
第1の電極、
第2の電極、
第1および第2の電極に電気的に接続している電源、
試験対象の試料を配置するための開口部を含む規定された経路を流れる電流を除いて、第1および第2の電極の間の電流の流れを遮断するための非伝導性材料を含む手段、ならびに
規定された経路を流れる電流を測定する手段。
【請求項３０】
開口部が、試験対象の生物細胞試料の寸法より小さい寸法を有する、請求項29記載の装置。
【請求項３１】
規定された経路を流れて測定された電流に基づいて電源を調節する手段
をさらに含む、請求項29記載の装置。
【請求項３２】
以下の段階を含む、細胞の生存度を検出する方法：
(a)細胞群に電圧を適用する段階、
(b)電気インピーダンス断層撮影法を用いて細胞群の複数の異なる領域を画像化する段階、および
(c)細胞群の複数の異なる領域の画像を比較し、異なる領域の細胞の生存度を推定する段階。
【請求項３３】
細胞群が生物から抽出した組織である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
細胞群が生物に存在する組織である、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
以下の段階を含む、電気穿孔を検出する方法：
(a)細胞群に電圧を適用する段階、
(b)電気インピーダンス断層撮影法を用いて細胞群を画像化すると同時に、電圧を経時的に変更する段階、および
(c)作製された画像を観察して、観察された画像の変化によって電気穿孔の発生を推定する段階。
【請求項３６】
細胞群が生物から抽出した組織である、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
細胞群が生物に存在する組織である、請求項35記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、細胞の生存度検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
生物学的研究において、生細胞と死んだ細胞を識別することは重要である。これは、細胞が細胞懸濁液中に存在する状況、細胞が基板上で増殖されている状況、細胞が生体から取り出された組織内に存在する状況、または細胞が生体内の組織内に存在する状況にとって重要である。例えば、生体外または生体内の細胞についてある種の操作を検討する前に、それらが生存しているかどうかを知ることは重要である。この操作は、機械的または電気的または化学的などの異なる種類のものであってもよい。例えば、懸濁液中の細胞または基板上の細胞または組織内にある細胞について薬物または化学物質を試験する場合には、試験前に細胞が生存していたかどうかを知ることは重要である。そうでないと、薬物または化学物質の影響を判定することができない。操作後は何度も細胞が生存しているかどうかを知ることが重要である。例えば、癌の化学的薬物治療後、その薬物が細胞を死滅させたかどうかを知ることは重要である。または、例えば、機械的傷害後、損傷を受けた細胞が生存しているかどうかを知ることは重要である。または、例えば、収束超音波、温熱療法、電気穿孔法、または冷凍外科術などのような方法による癌の加温治療後に、処置した細胞が生存しているかどうかを知ることは重要である。通常のアクシデントで、例えば、生体が低体温状態または低酸素状態に暴露された後に、細胞が生存しているかどうかを知ることは重要である。または、卒中後に、脳内の組織損傷の程度を知ることは重要である。
【０００３】
細胞の生存度を判定することができる方法には本質的に2種類ある。1つは、細胞の機能によるものであり、他方は細胞の特性によるものである。細胞の機能により生存度を試験する方法の一例は細胞の代謝を測定することによる。例えば、グルコースを処理する細胞の能力を陽子射出断層撮影(PET)測定法と共に使用する。細胞の特性により細胞の生存度を判定する最も一般的な方法の1つは、細胞膜の完全性を判定することによる。細胞膜は、細胞内環境を細胞外と分離するために進化した。細胞膜の機能は、細胞内成分の最適な機能に適合した細胞内環境を維持し、望ましくない化学物質を細胞の内部に流入させないことである。生細胞から死細胞を分離する主要な特徴の1つは、形質膜の物理的完全性の損失である(Darzynkiewicz, Z.、Li, X.およびGong, J. P. (1994)細胞生物学の方法(Methods in Cell Biology)  Academic Press, Inc.、New York；King, M. A. (2000) J. Immunol. Methods 243, 3-12.)。膜の完全性が失われると、そうでなければ細胞に流入しないと思われる化学物質が流入することができる。従って、完全な細胞の膜を透過することができない化学物質が細胞内部に存在するかどうかを試験する種々の生存度試験が設計されている。最も一般的なこのような化学物質は、細胞の内部に流入すると細胞の色を変えるトリパンブルーなどの比色染料およびヨウ化プロピジウムまたはYOYO-1(Molecular Probes OR)などの蛍光染料である(Horan, P. K.およびKapler, J. W. (1977) J. Immunol Methods 18, 309-316、Shapiro, H. M. (1995) 実用的なフローサイトメトリー(Practical Flow Cytometry)、Wiley, New York；Haugland, R. P. (1996) 蛍光プローブおよび研究用化学物質のハンドブック(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)、Molecular Probes, Inc.)。これらの化学物質は、懸濁液中の細胞(Rui, J.、Tatsunami, K. N.、Dahiya, R.、Rubinsky, B.、冷凍外科術におけるヒト乳癌に対する温度変化の影響(Effect of thermal variables on human breast cancer in cryosurgery) Breast Cancer Research and Treatment, 53 182-192, 1999)および生体から切除した組織内の細胞(Pham, L.、Rubinsky, B.、「不凍タンパク質を用いた乳房組織冷凍外科術(Breast tissue cryosurgery with antifreeze proteins)」HTD-362巻／BED-40巻、バイオテクノロジーにおける熱および物質伝達の進歩(Advances in Heat and Mass Transfer in Biotechnology)-ASME Press、171-175ページ、1998年)の細胞生存度を判定するために一般的に使用されている。しかし、細胞膜の完全性を測定することにより細胞の生存度を検出するこれらの比色または蛍光方法を使用することには、ある種の欠点がある。第一に、これら方法は、細胞懸濁液または組織に識別用の物質を添加するという第一の段階を必要とする。第二に、細胞が識別用の化学物質を組み込むのに一定の時間が必要である。第三に、細胞内部の識別用化学物質の存在は、顕微鏡またはフローサイトメトリー装置などの面倒な光学的検査装置の使用により判定しなければならない。これらの装置は、試験細胞との直接的相互作用を必要とする。第四に、色素排除に基づいたアッセイは生物学および臨床研究において広範に使用されているが、細胞死の動力学の検討に特に重要である即時的で定量的な細胞の生存度情報を与える能力がない。
【０００４】
本発明の目的は、上記の比色または蛍光染料の欠点を解消する方法で細胞膜の完全性を試験する細胞の生存度アッセイを提供することである。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
細胞の電気的特性の電気的測定を使用して細胞の生存度を試験する方法を開示する。本方法は、導電性媒体内の1つの細胞または複数の細胞の電気的特性を測定する段階を含む。本発明の一態様において、細胞は、好ましくは、電流が、本質的に細胞を通過することによって一方の電極から他方の電極に流動することだけができるように、電流を遮断する材料の開口部に配置される。細胞が適切に位置づけられた後、2つの電極の間に電位差を形成することによって電圧および電流を適用する。次いで、一方の電極から他方の電極に流動する電流または細胞の片側の1つの地点から細胞の別の側面の別の地点に流れる電流および関連する電圧を検出する。次いで、試験対象の細胞の生存度を判定するために、生存度が既知の細胞について先に読み取られた読み値などの標準値とそれらを比較する。例えば、標準値は、生存していることが既知の同一種類の細胞または類似の種類の細胞の電流の標準値であってもよい。検出された電流が同じまたは実質的に同じ場合には、試験対象の細胞も生存していることがわかる。標準値は電流に対する電圧の関係または細胞の電気インピーダンスであってもよい。電気的測定を適用し、検出し、次いで標準値と比較することができるように、新たな細胞を次々に適切な位置に配置して本方法を複数回反復することができる。または、細胞流または細胞の流れを、電流が流れて検出される開口部に誘導することができる。同じ過程を実施するために、電流を遮断する材料が周囲を囲む開口部に組織片の形態であってもよい複数の細胞を含むことも可能である。組織の異なる領域における細胞の生存度を判定するために、組織の異なる部分に電流を誘導することができる。
【０００６】
生存度について細胞を試験する方法論以外に、化合物または他の環境条件の変化の影響がある場合には、細胞に与える影響を判定するために本明細書に開示される方法論を使用することができる。従って、最初に対照環境において細胞を試験し、次いで化合物を添加または条件を変更し、やはり同じ電流を適用して細胞に対する新たに添加した化合物または変更した条件の影響を判定することによって細胞の生存度を試験するという同じ方法で、本方法を実施することができる。このような方法は、細胞の生存度に対するこれらの変更または化学物質の影響を判定するために化学物質または環境変化を試験する際に有用である。添加される化合物は、薬物または食品添加物または化学的環境が試験対象の細胞の生存度に影響を与えるかどうかを判定するために試験対象となる薬物、食品添加物、または環境由来の化学物質であってもよい。試験に使用される化合物は任意の化合物であってよく、薬物および食品添加物に限定されない。例えば、化合物は、金属、金属塩、金属合金、および特に水銀などの重金属などの、環境条件に影響を与えることが予想されうる任意の化合物であってよい。同様に、細胞の生存度に対する温度、圧力、pH、および放射線などの条件の影響を判定するために、これらを変更することができる。条件のいずれかまたは全てを個別または同時に変更することができる。放射線は、電磁放射線、光線、UV光、赤外線、または細胞の生存度に影響を与えることが予想されうる任意の種類の粒子もしくは波動放射線を含む任意の種類の放射線であってよい。数多くの細胞を試験し、条件の変更がない場合における細胞に対する電流の影響を判定するために条件を変更しないで再度試験する、対照を使用する通常の手法により、このような試験を実施することが望ましい場合がある。その後、実際の条件が細胞の生存度または細胞膜の透過性を変更しているものであり、適用した電流ではないという明確な理解を得ることができるように、化合物の添加などの条件が加えられる実際の実験の結果と比較するために、対照を使用することができる。
【０００７】
細胞膜を通過する物質の移動を正確にモニターすることを可能にする装置、システム、および特定の方法を開示する。細胞膜を通過する物質の移動をモニターすることによって得られる情報を直接適用して、細胞および／または細胞膜に関する情報を推定することができる。または、電流の適用を制御することなどによって細胞膜を通過する物質の移動を制御するために、モニターすることによって得られる情報を適用することができる。本発明の装置およびシステムは、荷電分子、特にイオン種に細胞膜を通過して移動させ、このような移動の発生を正確にモニターすることを可能にする。本発明の装置、システム、および方法を使用して電気穿孔法を実施する場合には、細胞膜を通過する荷電粒子の移動をモニターすることによって得られる情報を使用して、細胞膜を通過する物質伝達過程を制御する。具体的には、本システムを使用して細胞膜の電気インピーダンスの値および変化を求めると同時に、細胞の物質伝達特性を、電流を適用することによって変更する。従って、細胞膜を通過する荷電分子の移動を制御するために、電流の適用によって生じる電気インピーダンスの変化について得られる情報をリアルタイムで使用する。
【０００８】
細胞の生存度の判定はライフサイエンスにおいて重要な過程である。形質膜の物理的な完全性の損失は細胞死の主要な指標の1つである。従って、細胞の生存度は通常、比色または蛍光染料を用いた膜の完全性の検討によって判定される。細胞膜が高分子染料を排除する能力を失うと、イオンに対する透過性も変化するはずであり、細胞膜の電気的特性が変化する可能性があるということを本発明者らは思いついた。従って、細胞膜の電気的特性を評価することにより、膜の完全性が示される。本発明は、単細胞を通過して流れる電流を測定するために設計し、製造したチップを含む。細胞の生存度を検出する目的のために、死細胞と生細胞を識別するために典型的に使用される従来の蛍光染料アッセイに電気的測定を関連させた。ヒト前立腺癌細胞で実施し、生細胞を通過する電流が、膜が損傷されている細胞を通過する電流と実質的に異なることを示す例を本明細書に提供する。細胞溶解化合物である種々の濃度のTriton X100(商標)によって誘導される細胞障害の動力学的過程も本明細書に開示する。電気的測定による細胞膜の完全性の評価は、細胞の生存度を判定するための簡単で、定量的で、即時的な方法を提供し、基礎的な細胞死の検討および毒性検出のための細胞に基づいたバイオセンサーに非常に有用であろうことを、実験結果は示している。
【０００９】
本発明の一局面は、第1の地点と、生物細胞を含む導電性媒体によって第1の地点から分離されている第2の地点との間に電荷の差を形成する段階を含む方法である。次いで、第1および第2の地点の間の第1の電気パラメーターを測定する。次いで、第1の電気パラメーターの測定に基づいて第2の電気パラメーターを調節する。第1の電気パラメーターは、電流、電圧、および電気インピーダンスからなる群より選択されるものなどの任意のパラメーターであってよい。第2の電気パラメーターは、電流、電圧、または電流と電圧の組み合わせからなる群より選択されるものなどの（第1の電気パラメーターと同じまたは異なる）任意のパラメーターであってよい。
【００１０】
好ましい態様において、本方法は、導電性媒体に物質を配置する段階と、生物細胞内へ物質を移動させるために第2の電気パラメーターを調節する段階とをさらに含む。導電性媒体内に配置される物質は、薬学的に活性な化合物すなわち薬物、ヌクレオチド配列、蛍光染料、または望ましい方法で細胞に影響を与えるように特に設計されている結晶などの任意の物質であってよい。本方法によると、種々の条件は、2つの地点の間の電位が細胞を透過可能にするのに十分高くなるように調節される。しかし、2つの地点間の条件は、電気穿孔が可逆的であり、それが特に探求されている結果でない場合には細胞死を生じないように、さらに調節される。
【００１１】
本発明のさらに別の局面において、電気穿孔は物質を細胞内に移動させるまたは細胞から移動させる目的のために実施されるのではなく、むしろ細胞または細胞群を分析して、組織または組織を含む個体の情報または診断を与えるために実施される。本発明の方法によると、電位差は、第1の地点と、生物細胞を含む導電性媒体によって第1の地点から分離されている第2の地点の間に形成される。次いで、第1の地点と第2の地点の間の第1の電気パラメーターを測定する。次いで、細胞の特性、特に細胞膜の特性を求めるために、第1の電気パラメーターの測定値を分析する。第1の電気パラメーターは任意のパラメーターであってよく、好ましくは、電流、電圧、および電気インピーダンスからなる群より選択される。第2の電気パラメーターは、好ましくは、媒体に存在する細胞膜または細胞に影響を与えるように調節され、第2の電気パラメーターは任意のパラメーターであるが、好ましくは、電流、電圧、または両者の組み合わせから選択される。
【００１２】
本発明の別の局面は、好ましくは、第1の電極と、第2の電極と、後に電極に接続することができる電源とを含む装置である。装置が販売される場合には、選択的に電源(例えば、電池)が含まれる。本装置は、規定された経路を流れる電流以外の第1および第2の電極の間の電流の流れを遮断するための手段をさらに含む。さらに、本発明の装置は、規定された経路を流れる電流、電圧、または電気インピーダンスなどの電気パラメーターを測定するための手段と、測定された電気パラメーターに基づいて電源を調節するための手段とを含む。電流を遮断するための手段は、好ましくは、非伝導性材料を含み、規定された経路は、細胞がその規定された経路内に収まり、細胞を通過して電流が流れるが、好ましくは細胞の周囲に電流が流れないように、生物細胞の径より小さい径を各々が有する1つ以上の開口部を含む。
【００１３】
本発明の装置およびシステムは、望ましい結果を得るために多種多様の物質を生物細胞内に移動させるためまたは多種多様の物質を生物細胞から移動させるために本発明の方法において使用することができる。本プロセスは、個々の細胞、細胞群、細胞培養中または生物内の細胞、例えば、無脊椎動物および哺乳類を含む脊椎動物ならびに植物内の細胞について実施することができる。複数の細胞(例えば組織)について本プロセスを実施する場合には、組織を画像化し、画像に基づいて電流をリアルタイムで調節するプロセスを使用することができる。適用することができる画像形成技術は電気インピーダンス断層撮影法(EIT)である。この技術は、画像を形成するために生体または生物(例えばヒト)の生物電気的特性の差に基づいている。本発明の方法において、EIT画像は、本プロセスが単一の生物細胞に実施される場合に使用される測定段階と同じように使用することができる。本質的には、EIT技術は、電気穿孔によって生じる電流増加の影響を「見る」ことを可能にし、それによって細胞膜を透過性にするが、永久的には崩壊しない電流を正確に調節するために使用できる情報を提供する。
【００１４】
本発明の別の局面は、第1の地点と、組織を含む導電性媒体によって第1の地点から分離されている第2の地点との間に電流を送る段階を含む方法である。組織は脊椎動物または無脊椎動物などの生物内に存在してもよく、具体的には哺乳類およびヒトを含む。電流が送られると、組織の電気インピーダンスなどの電気パラメーターに基づいた組織の画像が形成される。ガイドとして画像を使用して、組織内の生物細胞を望ましい程度で電気穿孔するために電気パラメーターを調節する。電気穿孔は電気インピーダンスを変化させ、その変化は、形成される画像上に可視化することができる。調節する電気パラメーターは、電流、電圧、または両者の組み合わせなどの任意のパラメーターであってよい。好ましい態様において、物質は、組織に注入されるような導電性媒体内に配置され、電流の調節は、組織の生物細胞内に物質を移動させるように、画像に基づいて実施される。形成される画像は、好ましくは、再構成アルゴリズムを使用して既知の入力電流値と測定された入力電圧から形成されるインピーダンス画像である。インピーダンス画像は、既知の入力電圧値、測定された入力電流値、または既知の入力電圧値と測定された入力電流値の組み合わせから形成されうる。
【００１５】
導電性媒体に電流を形成する手段を含む本方法を実施するための装置は本発明の別の局面である。本装置は、さらに、画像を形成するために導電性媒体の第1の電気パラメーターを分析するための手段と、導電性媒体内の生物細胞を望ましい程度に電気穿孔するために画像に基づいて第2の電気パラメーターを調節するための手段とを含む。第1の電気パラメーターは、好ましくは、電気インピーダンスであり、第2の電気パラメーターは、好ましくは、電流、電圧、または両者の組み合わせから選択される。電流は、好ましくは、電気穿孔を実施する対象の組織領域付近に位置づけられた複数の電極によって形成される。
【００１６】
生物細胞の電気穿孔の発生および程度を、生物細胞または生物細胞を含む導電性媒体の電気インピーダンスの変化(この用語は、電圧に対する電流の比を意味するために本明細書において使用される)に相関させることができる。細胞膜が孔形成によりまたは細胞損傷もしくは他の様式の細胞膜の孔形成により透過性になると、生物細胞の電流対電圧比の増加が生じる。同様に、フロースルー電池の電極の間の領域に流体が生物細胞を引き寄せると、流動している伝導性流体の電流対電圧比の低下が生じる。従って、生物細胞または細胞が懸濁されている電解質溶液のインピーダンスをモニタリングすることによって、細胞膜の孔形成が発生する時点および孔形成による細胞膜透過性の相対的程度を検出することができる。次いで、所定の細胞が実際に電気穿孔を受けたことを確立するために、またはこのプロセスの電気パラメーター（例えば電圧の大きさ）の選択を支配することによって電気穿孔プロセスを制御するために、この情報を使用することができる。この発見はまた、細胞培養物、または脊椎動物、無脊椎動物、もしくは植物の多数の細胞を同時に電気穿孔する際にも有用である。具体的な態様は、ヒトを含む哺乳類に本発明を適用する。本プロセスは、実際の電気穿孔の発生の直接的な指標、および本プロセスに付される全細胞の平均の電気穿孔の程度を示す。この発見は、同じ理由により、生物組織(連続的な膜を有する生物細胞の塊)を電気穿孔する際にも同様に有用である。
【００１７】
本プロセスの利点は、電気穿孔の発生と程度を高いレベルで制御すること、および特定の個々の細胞または細胞塊に形成される透過性の発生および程度に関してさらに詳細に知ることができることを含む。本プロセスは、個々の細胞または連続した個々の細胞に適用されると、確実に個々の細胞は実際に透過性にされ、化学物質種の導入によって実際に変化される。本プロセスはまた、一部の細胞を破壊すると思われる電気的環境の変化を回避すると同時に、他にはあまり影響を与えないことによって、電気穿孔の効率を増加する能力も提供する。
【００１８】
本発明は、生物細胞を配置することができ、電流の流れを誘導して生物細胞を通過する流動路をイオンが流動するが、生物細胞からそれて流れる電流を実質的になくす障壁を備える電気的装置またはシステムの使用に関係する簡単な態様を記載することによって理解することができる。これらの態様のいくつかにおいて、本発明は、電流が実質的に不透過性である障壁によって分離されている2つの液体保持チャンバーを備える装置の使用に関係する。障壁は、生物細胞が開口部のところで止まると開口部に栓をするまたは開口部を閉じるように、生物細胞よりも小さい開口部を有する。電気穿孔法を実施するためには、好ましくは生物細胞に障害を加えることなく後に取り出せることができるように可逆的な様式で、機械的、化学的、および／または生物化学的手段によって生物細胞を開口部に固定する。生物細胞が開口部に固定されたら、2つのチャンバーおよび開口部に滞在する生物細胞に電圧を加える。このように、チャンバーの間の電流の通路は開口部を通る通路、従って生物細胞を通過する通路に限定される。電池内の電流対電圧の関係をモニターすることによって電気穿孔の発生を検出し、孔形成の程度を制御して、確実に電気穿孔を生じさせ、過剰な孔形成および細胞死を防ぐ。このように、ユーザーは、生物細胞膜の状態および生物細胞膜を通過するフラックスについて精度高く知ることができ、これを制御することができる。
【００１９】
別の一連の態様において、本発明は、化学物質種の生物細胞内へのまたは生物細胞からの拡散輸送に有用である。これらの態様において、細胞はやはり、障壁によって分離された2つのチャンバーに分割され、生物細胞は、細胞の周囲の液体が一方のチャンバーから他方のチャンバーへ実質的に通過しないように障壁の開口部に留められる。生物細胞内に導入される化学物質種の溶液をチャンバーの一方または両方に配置する。溶液中の化学物質種の濃度は細胞内の濃度と異なる(化学物質種を細胞内に導入することを狙いとするかまたは細胞から除去することを狙いとするかに応じて高いまたは低い)か、または一方のチャンバーの濃度は他方のチャンバーの濃度と異なる。
【００２０】
本発明を拡散輸送に適用する好ましい方法において、拡散輸送の駆動力が、チャンバーと生物細胞の内部との間ではなく2つのチャンバー自身の間であるように、2つのチャンバー内の溶液は濃度が異なる。拡散が進行するとき、周期的または連続的に2つのチャンバーの各々の濃度を知り、制御してモニターし、開口部の寸法を正確に知ることによって、ユーザーは、細胞に流入する化学物質種の速度および量を正確に観察し、制御することができる。拡散時間は、チャンバーのどちらかまたは両方の濃度の段階的な変化を与え、それによって濃度差を与えるまたは取り除くことによって制御することができる。特に関心のある用途は、化学物質種のこの種類の拡散輸送と先のパラグラフに記載されている制御式電気穿孔法の組み合わせである。
【００２１】
本発明は、電気穿孔技術に関連して有用である以外に、電気インピーダンスをモニターし、それによって細胞膜の完全性に関する情報を提供することによって、細胞または細胞群または細胞群を含む組織に関する有用な情報を提供することができる。具体的には、細胞膜を通過する荷電粒子の移動について測定を実施する。このような測定は、細胞膜を通過して拡散を行うのに必要な電流の量に関連する。得られる情報は直接分析しても、または同一組織の以前の測定値または疾患のある組織もしくは正常な組織で実施された測定値と比較して、それによって(同一組織の以前の測定値に基づいて)測定中の組織に生じた変化の量または測定中の組織と細胞膜が損傷されている(例えば、疾患細胞)組織または正常な細胞もしくは組織の間の変化の量を示すことができる。本方法は、電気穿孔法を実施するために使用されるものと同様に実施される。しかし、細胞周囲の媒体に物質を添加する必要はない。装置は2つの部分に分割されており、一方の側に陽極があり、障壁で分離されている他方の側に陰極があり、細胞および障壁の開口部を通過して荷電粒子を一方の電極から他方の電極に通過させるように細胞は障壁の開口部に位置づけられるという点において装置はほぼ同じである。障壁は、開口部を通過することを除いて荷電粒子の流動を妨害または完全になくす。電極間の電気インピーダンスを測定することにより、無傷の膜を有する細胞と障害のある膜を有する細胞を識別することができる。測定を正確に実施することによって、障害のある(例えば、疾患)細胞膜と比較した正常細胞膜の完全性に関する測定が可能になる。
【００２２】
本発明の種々の態様の各々は、2つ以上(すなわち、複数)の生物細胞に同時に使用しても、または本プロセス中に動物もしくは植物中に存在してもよい組織などの細胞の塊に使用してもよい。上記装置は、電流または拡散輸送が、全ての細胞を通過する流路に制限され、細胞の周囲への迂回を防止するように障壁を配置することによって2つ以上の生物細胞に使用するように適合することができる。本発明の概念のさらに別の適用は、流動中の液体に懸濁された生物細胞の電気穿孔である。電極を流路の一定の位置に配置し、電極間に電圧を与え、電極間を通過する電流をモニターする。電極の間の領域に流入する生物細胞は電流を低下し、インピーダンスはその領域に1つ以上の細胞が存在することを示し、選択的に電気穿孔を実施するのに十分に高い電圧の適用を開始する信号ともなる。
【００２３】
本発明の装置、システム、および方法のさらに別の用途は、哺乳類などの生物内に存在してもよい組織内に存在する生物細胞の電気穿孔である。電極を組織内の一定の位置に配置し、電極間に電圧を適用し、電極間を通過する電流をモニターする。電極の間の領域に存在する無傷の膜を有する生物細胞は電気インピーダンスを増加する。従って、電気インピーダンスの測定は、その領域に1つ以上の細胞が存在することを示す。電気穿孔は、測定されるインピーダンスの値を低下する。本プロセスを組織に実施する場合には、電気インピーダンスの測定値は、電極間に存在する細胞の統計学的な平均である。
【００２４】
本発明の電気穿孔方法は、膜を通過する電流の流れを可能にするように(好ましくはある程度)細胞膜が変化される場合に測定することが可能になる画像形成技術を使用して生物組織に実施することができる。好ましい画像形成技術は、画像形成対象の組織の生物電気的特性の差に関する情報によって形成される画像の変化を提供する電気インピーダンス断層撮影法(EIT)である。典型的なEIT画像は、生体内に電流を注入して生じる電圧を電極アレイにより測定することによって獲得される。次いで、再構成アルゴリズムを使用して既知の入力電流および測定された電圧データからインピーダンス画像が形成される。EITは実際に電気インピーダンスをマップ化するので、組織において本発明を実施するのに特に好適である。従って、電気穿孔を受け、結果として細胞の等価な電気インピーダンスが変化する組織領域はEITによって画像化される。この画像は、細胞膜を損傷することなく電気穿孔を生じるように電気パラメーター(例えば、電流の流れ)を調節するために使用する。
【００２５】
本アッセイは細胞の電気的特性の測定を扱う。本発明者らは、細胞膜は本質的に、細胞外溶液のイオンに対して不透過性であることに気づいた。従って、細胞膜が損傷し、識別できるような細胞外化学物質に対して透過性になると、イオンに対しても透過性になるはずである。イオンに対する細胞膜の透過性の変化は、膜の電気的特性、例えば、膜、従って細胞の電気インピーダンスの変化を示す。細胞膜および細胞の電気的特性の測定は、細胞膜の完全性および細胞の生存度の即時的な測定を与えうる。
【００２６】
化学物質または蛍光標識を使用することを上回る本発明の利点の1つは、イオンはあらゆる生物媒体に天然に存在し、添加する必要がないということである。
【００２７】
別の利点は、それらの存在および影響は瞬間的で、他の識別できる化学物質の場合のように一定期間のインキュベーションを必要としないことである。
【００２８】
さらに別の利点は、細胞の電気的特性の変化の測定には面倒な光学的手段を必要とせず、細胞から離れたところで実施できることである。
【００２９】
さらに別の利点は、電気的特性の測定は、細胞の完全性の瞬時の測定だけでなく、細胞膜損傷の大きさに関連する定量値を与えうることである。
【００３０】
本発明のさらに別の利点は、アッセイ過程中に細胞を観察して追加の情報を得ることができることである。
【００３１】
本発明のさらに別の局面は、本発明の方法を使用して細胞膜の透過性に関する具体的な情報を得ることができることである。
【００３２】
本発明の一局面は、導電性媒体に細胞を配置する段階であって、細胞が、電流を遮断する材料の開口部を遮断する段階を含む。次いで、電圧を細胞に適用し、細胞を通過する電流を検出して第1の信号を得る。次いで、細胞周囲の条件を変更し、電圧を再度細胞に適用し、電流を再度測定して第2の信号を得る。第1の信号を第2の信号と比較し、それによって細胞に対する変更した条件の影響を判定する。条件の変化は、導電性媒体に化合物を添加する段階を含んでもよい。さらに、生体物質などの物質を導電性媒体に添加してもよく、そのような物質としては、タンパク質、ヌクレオチド配列、細菌、ウィルス、感染性プリオン、真菌、および多糖などの物質が挙げられる。本質的に、細胞膜に対してその物質がどのような影響を及ぼすのか判定することが望まれるであろう任意の物質を添加することができる。
【００３３】
本発明が従来技術に対して提供する利点には、細胞を個々に処理し、個々の細胞の必要性に処理条件を適合させることが挙げられる。電圧を適用する態様では、インピーダンスをモニターすることにより孔の有無をユーザーに知らせることができ、孔形成の進行および細胞死を生じる可能性のある非可逆的孔形成が生じたかどうかを示す。
【００３４】
障壁-開口部装置の利点は、開口部を通過する電流経路に電流を制限することによって、信号対雑音比の感度が高いことである。
【００３５】
よりさらに別の利点は、本装置および方法を自動化システムに組み込むことができることであり、それによって各細胞の状態が機械によってモニターされ、個々の細胞は開口部に留まり、モニターされた条件によって決定されたときに除去される。
【００３６】
本発明の一局面は、検出される電流の変化のリアルタイム測定に基づいて、システムに適用する電気パラメーター(例えば、電圧および／または電流)を調節することによって、生物細胞の電気穿孔をリアルタイムに制御する方法である。
【００３７】
本発明の一特徴は、1つの細胞、多数の細胞、生きている動物の組織または組織領域に電気穿孔を実施するために、普遍的な概念を適用できることである。
【００３８】
本発明の利点は、得られる電気穿孔の量に関連する電流の変化のリアルタイム測定に基づいて、適用される任意の所定の電気パラメーター(例えば、電流および／または電圧)を制御することによって、電気穿孔の正確な量を入手して細胞損傷を回避することができることである。
【００３９】
本発明の別の利点は、送達のためにウィルスベクターにヌクレオチド配列をパッケージングする必要なく、細胞にヌクレオチド配列をトランスフェクトでき、それによってこのようなベクターの細胞特異性を回避できることである。
【００４０】
さらに他の利点は、本プロセスは、技術的な専門知識の程度が比較的低くても比較的迅速に実施できることである。
【００４１】
さらに別の利点は、本プロセスは、免疫応答を生じずに細胞にトランスフェクトするために使用できることである。
【００４２】
さらに別の利点は、本プロセスは、DNAのサイズ(すなわち、DNA配列の鎖長)によって限定されず、細胞に導入されるDNAの量を制御できることである。
【００４３】
本発明の別の特徴は、EITなどの画像形成技術を使用して多量の細胞のインピーダンスの変化を検出できることである。
【００４４】
本発明の別の特徴は、組織領域のインピーダンスをマッピングするためにEITを使用し、それによって多量の細胞の細胞インピーダンスの変化を検出して任意の所定の電気パラメーター(例えば、電流および／または電圧)を調節して望ましい電気穿孔を得ることができることである。
【００４５】
本発明のこれらおよびさらに別の特徴、利点、ならびに目的は、以下の説明から、さらに理解される。
【００４６】
本発明の説明および具体的な態様
本発明の装置および細胞の生存度を検出する方法を含む方法について記載する前に、本発明は、記載される特定の方法および装置に限定されるわけではなく、当然のことながら、変更があってもよいことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定され、本明細書において使用する用語は、特定の態様だけを記載する目的のためのものであり、限定する意図のものではないことも理解されるべきである。
【００４７】
範囲のある値が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間にある、内容が明らかにそうでないことを記載していない限り、下限の単位の10分の1までの各介在値も具体的に開示されていることが理解される。記載されている範囲における任意の記載値または介在値と、記載されているその範囲における任意の他の記載値または介在値の間の、小さい範囲も各々本発明内に含まれる。このような小さい範囲の上限および下限は、独立にその範囲に含まれてもまたは含まれなくてもよく、どちらかの限界もしくは両方の限界が小さい範囲に含まれるまたはどちらの限界も小さい範囲に含まれない各範囲も本発明に含まれ、記載されている範囲の具体的に含まれない任意の限界に付される。記載されている範囲が限界の一方または両方を含む場合には、含まれるそのような限界の一方または両方を含まない範囲も本発明に含まれる。
【００４８】
特に規定しない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当技術分野の当業者に普通に理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書に記載されているものとほぼ同じまたは等価な任意の方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書において記載する。本明細書に記載されている全ての文献は、文献が関連して引用されている方法および／または材料を開示および記載するために参照として本明細書に組み入れられる。
【００４９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「a」、「an」および「the」は、内容がそうでないことを明確に記載していない限り、複数形を含むことに留意すべきである。従って、例えば、「生物細胞（a biological cell）」という言及は複数のこのような生物細胞を含み、「電極（an electrode）」という言及は1つ以上の電極および当業者に既知のその等価物等を含む。
【００５０】
本明細書に考察されている文献は本願の提出日以前の開示内容についてのみ提供されている。本明細書における何ものも、本発明が以前の発明に照らしてそのような文献より日時が前である資格がないと認めるものと解釈すべきものはない。さらに、提供されている文献の日付は実際の発表日と異なる可能性があり、個別に確認する必要がありうる。
【００５１】
生物学的検討において、生細胞と死細胞を識別することは重要である。死細胞を生細胞から分離する主要な特徴の1つは、形質膜の物理的完全性の損失である(Darzynkiewicz, Z.、Li, X.およびGong, J. P. (1994). 細胞生存度アッセイ：アポトーシスによる細胞死の識別(Assays of Cell Viability: Discrimination of Cells Dying by Apotosis)。細胞生物学の方法(Methods in Cell Biology) Academic Press, Inc.、ニューヨーク；King, M. A. (2000) 死細胞の検出とフローサイトメトリーによる細胞死の測定(Detection of deal cells and measurement of cell killing by flow cytometry) J. Immunol. Methods 243, 3-12.)。このために、細胞の生存度は通常、比色または蛍光染料を用いた膜の完全性の検討により判定される(Horan, P. K.およびKapler, J. W. (1977) 細胞毒性アッセイのための自動蛍光分析(Automated fluorescent analysis for cytotoxicity assays) J. Immunol. Methods 18, 309-316；Shapiro, H. M. (1995) 実用的なフローサイトメトリー(Practical Flow Cytometry) Wiley、ニューヨーク；Haugland, R. P. (1996) 蛍光プローブおよび調査用化学物質ハンドブック(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)、Molecular Probes, Inc.)。このような生存度アッセイには、トリパンブルーまたはヨウ化プロピジウムなどの種々の識別剤を細胞懸濁液に添加する必要があり、通常、顕微鏡またはフローサイトメトリー装置などの視覚的検査装置の使用を含む。色素排除に基づいたアッセイは、生物学および臨床研究において広範に使用されているが、細胞死の力学の検討において特に重要な即時的で定量的な細胞の生存度情報を生ずる能力がない。
【００５２】
本発明は、個々の細胞の生存度を即時的に測定する電気的測定を使用する方法および装置を提供する。従来の生存度方法は、一般に、種々の染料による細胞膜の完全性の検出に基づいている。本発明は、一部には、細胞膜が高分子染料に対して透過性である場合には、イオンも透過できるということを知ることに基づいている。従って、細胞膜を通過するイオン電流により、膜の物理的完全性、従って細胞の生存度が測定される。本発明の方法は、シリコンチップの無生物的な電気回路に生物細胞を組み入れるために微小開口スキームを使用するマイクロ電気機械的技術を使用することができる(Huang, Y.およびRubinsky, B. (2000). 微小電気穿孔：細胞の電気的透過化の効率と理解の改善(Micro-Electroporation: Improving the Efficiency and Understanding of Electrical Permeabilization of Cells). Biomedical Microdevices 2, 145-150；Huang, Y.およびRubinsky, B. (2001). 単細胞膜透過化用のマイクロ加工された電気穿孔チップ(Microfabricated Electroporation Chip for Single Cell Membrane Permeabilization). Sensors and Actuators: Physical 89, 242-249)。この技術により、個々の細胞と電気的に接続することができる。本発明者らは、この概念に基づいて、特に細胞膜の電気的特性を評価するためのマイクロ生存度チップを開発した。このチップにより、細胞の損傷を引き起こすことなく、低電位で単細胞を探索して、その細胞を通過する対応する電流の流れを測定することができる。チップは顕微鏡とも適合性であるので、従来の蛍光生存度アッセイを使用して死細胞と生細胞を識別することができる。異なるサイズの微小開口部を有する種々のチップを使用して、本発明者らは、ヒト前立腺癌細胞の生細胞および死細胞の膜の電気抵抗を測定し、比較した。本明細書に提供されている結果は、同じ励起条件下で、4μmおよび6μmの開口部サイズの生存度チップで得られた生細胞に関連する平均電気抵抗は、膜が損傷されている細胞の平均電気抵抗よりそれぞれ10.98倍および8.04倍高いことを示した。広範に使用されている細胞溶解試薬である膜界面活性剤Triton X100(商標)を導入することによって細胞死の力学を検討した。本発明者らはまた、異なる量のTriton試薬によって誘導される膜損傷をリアルタイム膜電流測定により定量化した。本明細書に提供されている実験所見は、膜の電気抵抗の測定は、細胞の生存度の判定だけでなく、細胞死の力学および毒性刺激に対する細胞の応答を検討するために使用できることを示している。この新規な単細胞レベルにおける生存度評価方法は、化学的または生物学的物質の添加を含まず単に電気的な測定を使用しているだけなので、簡単で正確な生存度判定装置および小型毒性検出細胞センサーを提供するために使用することができる。
【００５３】
定義
「電極」という用語は、任意の伝導性材料、好ましくは金属、最も好ましくは、その電極から別の電極への電流の流れを確立するために使用される非腐食性金属を意味することが意図されている。「導電性」は、いかなる呼称の電流、例えば、電流または電圧を伝達することを意味する。電極は種々の導電性材料から製造され、銅、金、白金、スチール、銀、塩化銀およびそれらの合金などの合金または純粋な金属であってもよい。さらに、電極は、超小型回路に関連して使用されるシリコン系材料などの導電性の非金属を含んでもよい。組織電気穿孔に使用される典型的な電極は、好ましくは、棒状、平らな平面状、または中空の針状の構造である。電極は、電流を連続的に送達するためまたはパルスを送達するために使用することができる。電極は用途特異性を高くすることができ、平行ステンレス鋼プレート、植え込み式ワイヤー、ニードルペアー、およびニードルアレイを含んでもよい。当業者は、本発明により電気穿孔が得られる望ましい結果に関連して特に有用な特異的な電極を設計する。
【００５４】
「組織」という用語は複数の細胞を意味する。細胞は同一種類であってもまたは数多くの異なる種類であってもよい。これらの細胞は、好ましくは、特定の機能を実施するために組織化されている。組織は生物および切除された組織内に存在する組織を含み、インビボまたはインビトロにおける状況を示しうる。さらに、組織は、植物および動物を含む任意の生物または遺伝子操作技術を使用して発生させた組織由来であってよく、従って人工的な起源由来であってもよい。一態様において、組織はヒトの別個の領域に存在する複数の細胞である。
【００５５】
「装置」および「電気穿孔装置」という用語は、本明細書に全体的に開示および記載されている任意の装置を述べるために、本発明において交換可能に使用される。本装置は、好ましくは、第1の電極および第2の電極を備え、第1および第2の電極は、電極にそれぞれ正電荷および負電荷を提供するように電源に接続されている。本装置はまた、好ましくは、1つ以上の特定の開口部を通過する以外は、2つの電極の間の電気の流れを遮断するための手段を備える。例えば、電流を遮断するための手段は、1つ以上の開口部を有する非伝導性材料であってもよく、開口部は生物細胞または生物細胞群を特に保持するように設計されている。それによって、電流は、開口部および細胞を通過して他方の電極方向に流れるはずである。本装置はまた、好ましくは、電極の間の電流の流れを測定するための手段を備える。測定するための手段は、ボルトメーター、アンプメーター、または任意の様式で電流の流れを測定することができる当業者に既知の任意の装置を備えてもよい。さらに、本装置は、好ましくは、電極間の電流量を調節するための手段を備える。それによって、電極の間に位置づけられた細胞を最適に電気穿孔するために、測定された流れに基づいて、電圧、電流、または電流の流れの他の望ましいパラメーターを特に調節することができる。「電気穿孔」という用語を使用する場合には、この装置は、薬物またはDNA配列などの化合物を細胞内に移動させるためにこの装置が使用されることを必ずしも意味しない。
【００５６】
「電源」、「電気源」等の用語は、電力、電流、または電圧を提供し、それによって電極間に電流の流れを形成する任意の手段を記載するために、本明細書において交換可能に使用される。本装置は、好ましくは、制御されたモードおよび振幅を提供することができ、一定のDC電流またはAC電流を提供することができ、パルス電圧または連続電圧を提供することができる。好ましい装置は、電圧、ランプ電圧、ランプ電流、または任意の他の組み合わせを指数関数的に減衰させることができる。例えば、電源は、マイクロプロセッサーと接続して使用される種類のチップと組み合わせて使用することができ、110ボルトの交流を提供する従来のウォールサーキット（wall circuit）に接続して高速電圧増幅を提供する。パルス形状は、LabViewプログラムで作動するToshibaラップトップなどのマイクロプロセッサー装置によって、電力増幅器に供給される出力を用いて形成することができる。多種多様の異なる市販の電源が望ましい機能を提供することができる。電気穿孔のために送達される電位は通常、組織に形成されるV/cm単位で規定される影響を受けた領域に発生する電圧勾配に関して引用される。範囲は、10 V/cm〜100,000 V/cmの範囲を含み、さらに好ましくは、100 V/cm〜10,000 V/cmの範囲を含む。しかし、範囲は増幅特異的であり、任意の望ましい用途のために範囲外に拡大されてもよい。電気パルスは、一般に、マイクロ秒からミリ秒の範囲である。しかし、望ましい結果に応じて、他のパルス範囲を使用してもよい。
【００５７】
発明の概説
本発明は、種々の構成、方法、および用途に渡り、本明細書の本部分は、ある種の特定の構成および方法を詳細に例示し、本発明の全体としての概念を明らかにする。
【００５８】
本発明の方法を実施するために多種多様の異なる装置およびシステムを使用することができる。装置は、第1の電圧を有する第1の電極と、第2の電圧を有する第2の電極を備えなければならない。さらに、本装置は、電極間の荷電粒子の流れを検出するための手段と、電極間の荷電粒子の流れの変化を検出することによって得られたデータに基づいて電極間の電流を変更するための手段とを備える。好ましくは、本装置は、さらに、第1の電極と第2の電極の間に位置づけられた1つ以上の生物細胞を通過して生じる流れを除いた、電極間の荷電粒子の流れを防ぐまたは実質的に低下する要素を含む。
【００５９】
媒体中に存在する細胞に任意の望ましい物質を移動させるために、その物質を媒体に添加することができる。さらに、本発明は、細胞内に導入する物質を媒体に加える処理段階を必ずしも含まない。本プロセスは、適用した電流に基づいて細胞膜に生じる変化を測定するためにだけに実施することができる。その情報は、媒体中に存在する細胞または細胞群に関する特性を測定するのに有用である可能性があり、具体的には、正常な細胞および疾患細胞の情報を比較するため、または以前に試験した細胞と現在試験中の細胞の差を判定するために使用することができる。
【００６０】
考察される第1の構成は、単一細胞の生物細胞を保持するための内部保持部材と、生物細胞を通過して流れる流路に電池内の電流の流れを制限する内部障壁とを備える電気穿孔電池である。電圧が適用されない場合には、本構成は拡散輸送のみのために使用され、電圧によって誘導される孔形成による助けを受けない。
【００６１】
障壁、および2つのチャンバーを備える態様においては2つのチャンバーの配置は、本発明にとって致命的ではなく、本発明の目的および利点を果たす限り多様に変更してもよい。しかし、生物細胞はサイズが顕微鏡的であるので、種々の形態の各々において、本発明を実施するために好ましい種類の装置は、全体としての構成および／またはチャンバーが、電子チップ製造に使用されるものなどのマイクロ加工技法によって製造される電子チップのサイズであるものである。液体を連続流動、間欠流動、またはユーザーの指示による流動で通過させるため、および生物細胞膜を通過する化学物質種の通過を厳密に制御するのに必要な濃度、圧力、および他の条件の変化を生じさせるために、チャンバーはフロースルーチャンバーとして構成されることがさらに好ましい。従って、本装置の製造の好ましい構成および方法は、層または小板が一体として接合されて流路を形成する適当な開口部を有する層または小板状の装置の形成を含むものである。
【００６２】
フロースルーチャンバーは、個々の細胞の連続流入および除去を可能にし、多数の細胞を連続して処理することができるという利点を提供する。フロースルーチャンバーはまた、溶質が枯渇した溶液の補給を可能にし、適宜濃度勾配を連続的に維持することができる。フロースルーチャンバーが果たすことができるさらに別の機能は、以下に記載する種々の目的に有用な機能である、圧力の増加および低下である。
【００６３】
本構成における生物細胞の支持構造は、生物細胞を一定の位置に固定し、電流を通過させる任意の構成であってよい。最も便利な支持構造は障壁内の開口部である。開口部に生物細胞を固定することは、開口部を閉鎖、密封、または栓をする働きをし、それによって細胞を通過する電流、拡散輸送、またはその両方の流れを誘導し、細胞周囲への漏洩をなくすかまたは最小にする。これを実施するための便利な機械的な手段は、細胞を開口部に押し付ける方向で開口部に圧力差を与えることである。開口部の径は細胞の径より小さく、細胞は、装置に流入すると2つのチャンバーの一方に入り込む。細胞が滞在するチャンバーの圧力を増加することによって、または他方のチャンバーの圧力を低下することによって、細胞は開口部の方向に移動させられて、開口部を閉鎖する。手法が終了したら、2つのチャンバーの圧力を等しくすることによって、または細胞が導入されたチャンバーではない方のチャンバーの圧力が高くなるように差を逆にすることによって、細胞は容易に開口部から解放される。次いで、細胞が導入されたチャンバー内の液体の流動が開口部から細胞を除去し、開口部を別の細胞に露出する。
【００６４】
開口部を細胞で密封する別の方法は、細胞膜に結合する物質による障壁表面または開口部の周辺部のコーティングを使用することによる。生物細胞膜は負に荷電しているので、コーティングは、ポリリジン、ポリアルギニン、またはポリヒスチジンなどの正電荷を有する物質でありうる。生物細胞は、開口部の圧力差によって開口部に誘導され、コーティングによってその場所に保持される。手法が終了したら、細胞は、開口部の細胞側のチャンバー内の液体の流速を一瞬増加することによって、または開口部に逆の圧力差を与えて開口部から細胞を動かすことによって、コーティングから開放することができる。
【００６５】
開口部のサイズは本発明にとって致命的ではないが、ただし開口部は、制御可能で経済的に妥当な期間で、物質移動、電流の通過、またはその両方の望ましい程度を達成するために、十分な細胞膜の表面積を露出する。従って、最適なサイズは、処理または検討される特定の細胞によって異なる。概して、開口部は、好ましくは形状が円形またはほぼ円形であり、細胞のサイズに応じて、好ましくは、径が約1ミクロン〜約100ミクロンの範囲であり、さらに好ましくは約1ミクロン〜約50ミクロンの範囲であり、最も好ましくは約2ミクロン〜約20ミクロンの範囲である。孔が形成され、2つのチャンバーを分離する障壁は、好ましくは、水および溶質に対して不透過性であり、開口部に細胞を固定するのに十分な圧力差を保持する剛性誘電材料である。マイクロ加工技法によって製造される装置については、障壁の便利な材料は窒化ケイ素である。十分に同等に機能する他の材料は当業者には容易に明らかとなる。
【００６６】
本発明の好ましい態様のさらに別の特徴は、透明な材料で製造される装置の使用である。これにより、ユーザーは、細胞の内部ならびにマイクロ拡散およびマイクロ電気穿孔過程を、それらが生じるときに、顕微鏡によって観察することができる。
【００６７】
インビボにおける治療に使用される電気穿孔
本発明の電気穿孔技法は、治療を必要としている哺乳類およびヒトを含む生物を治療、分析、または診断することに関連して有用である。一般に、治療は、治療対象の組織領域に物質を連続的に注入することによって、または迅速な1回大量注入で、実施することができる。いつ望ましいレベルの電気穿孔が得られ、それによって治療中の組織の細胞に注入した物質を移動させられるかを判定するために、電極を組織に隣接して配置し、電流または電圧を適用し、連続的に測定する。
【００６８】
注入される薬学的に活性な化合物は、通常小分子と言われる従来の薬物であっても、またはタンパク質もしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列であってもよい。さらに、組織内に注入される組成物は、電気穿孔装置から電気パルスを適用する前、最中、または後に投与されてもよい。本プロセスの全体的な目標は、電気穿孔により孔を開口させることであり、それによって通常では細胞膜を透過しない化合物を細胞内に導入することである。例えば、ブレオマイシン、または種々の遺伝子構築物、および／またはプラスミドを、治療中の組織の細胞内に導入することができる。これは、治療対象の組織内の細胞に電位および電流を形成することによって実施され、電位は電気パルスとして発生される。パルスを形成するために、単一の電極でなく複数の電極を使用することが好ましい。
【００６９】
有用な電極設計の一例は、幅10 mmおよび厚さ0.6 mmの2つの平坦なスチール製の帯状物を含むものである。電極は、互いに約6〜7 mmの一定の距離で間隔をおいて配置される。2つめの電極設計は、20 mmの平坦なスチール製の正方形状物を2〜8つまでも含む。電極は、PS15電気パルス発生装置に接続される。パルスは、皮膚の平坦な面に電極を配置することによって、または皮膚腫瘍の周囲に電極を配置することによって、送達することができる。皮膚接触は、導電性ゲルまたは生理食塩液などの心電計の実施に関連して従来使用されている材料を使用することによって実施することができる。本手法を実施するためには、患者は1つまたは複数のパルスを受容する可能性があり、好ましくは複数のパルスを受容する。ヒト体内などの生物内の組織の電気穿孔を実施するため、すなわち皮膚の外側で電極を適用することなく電気穿孔を実施するために、異なる構成を設計することができる。このような構成は、複数のニードル電極を含むニードルアレイを含んでもよい。一例として、正および負の電極は各々、径0.5 mmで、BTX 820パルス発生装置に接続された長さ1 cmのステンレス鋼から構成される6つ以上の針を含んでもよい。電極は、電気穿孔による影響を受けさせる対象の細胞周囲の組織内に平行に挿入することができる。電極は、5 mm〜1 cmの範囲の種々の径の円形状に位置づけることができる。約1300 V/cmの範囲の電圧電極比を使用することができる。任意の数のパルスを送達することができるが、1秒間隔で100マイクロ秒のパルス幅を有する約6つのパルスを送達することによって本プロセスを開始することが好ましい。本方法は、細胞の内側に運ばれる物質を追跡するために染料および標識を使用することなく電気穿孔が生じているかどうかを判定することができるという点において、本発明は組織の電気穿孔に関連して特に望ましい。
【００７０】
図6Aおよび6Bに示すように、電流は細胞の周囲を流れる(図6A)か、または電気穿孔が生じた後は細胞を通過して流れることができる(図6B)。本発明のプロセスにより、図6aに示すものと図6bにおいて生じているものの間の遷移が生じている時点を判定することができ、さらに細胞膜に対する非可逆的な影響の発生を防止することができる。図8Aに示すように、電気穿孔は、細胞膜が損傷され、それによって細胞に対して非可逆的な影響を生じるほど大きい程度で実施することができる。一般に、これは望ましくない。しかし、電流の量を調節することによって、細胞膜に大きな損傷を生じることなく電気穿孔を実施することができ、それによって図8Bに示す可逆的な状況を得ることができる。
【００７１】
図6Aおよび6Bに示すように、細胞は電気インピーダンスを形成し、本発明は、その電気インピーダンスの程度を正確に測定し、電気穿孔に関して望ましい結果が得られるように電流を調節することに関する。しかし、組織内などの多数の細胞が関係する場合には、組織内の複数の細胞に対して電気穿孔を形成する際の電流の他の影響を測定するために他の機序を使用することが望ましい場合がある。電気インピーダンスは、電気が所定の物質を通過してどのように移動するかの測定値である。全ての物質は、電気的組成によって決定される異なる電気インピーダンスを有する。高い電気インピーダンスを持つ物質もあれば、低い電気インピーダンスを持つ物質もある。悪性(癌性)の乳房組織は、正常な組織または良性(非癌性)腫瘍と比較して電気インピーダンスがかなり低い(電気をかなり良く伝導する)。
【００７２】
インピーダンスは、回路の末端に電圧が加えられるとき、電気回路が電流の流れに抵抗する度合いの測定値である。OHMS単位で表されるインピーダンスは、末端間の電流に対する末端対に加えられる電圧の比である。直流(DC)回路では、インピーダンスは抵抗に相当する。交流(AC)回路では、インピーダンスは、抵抗、インダクタンス、および電気容量の関数である。インダクタおよびキャパシタは、電流の流れに対向する電圧を構築する。この反対の成分をリアクタンスといい、インピーダンスを規定するためには抵抗と組み合わせなければならない。インダクタンスによって形成される抵抗は交流の周波数に比例するが、電気容量によって形成されるリアクタンスは周波数と逆比例する。
【００７３】
上記の基本概念は本発明の基本的な局面に利用され、電気インピーダンス断層撮影(EIT)とも言われる電気インピーダンス画像形成を記載するのにも適用可能である。同じ技法を記載するために数多くの異なる用語を使用することがあることに注目すべきであり、それらには応用電位断層撮影(APT)が挙げられる。このような画像形成技術により、生物組織の電気特性の位置的な変化に基づいて画像を形成することが可能になる。APTおよびEITなどの技法は、組織に関連して本発明を実施するために利用できると思われる。応用電位断層撮影(APT)は、物理的な基礎として、生物材料の表面の2箇所の地点間に電流が適用されるときの、生物材料の表面の電位分布の測定に依拠する。他の研究者らはその技法を利用しており、それを電気インピーダンス画像形成、伝導性画像形成、電気インピーダンス断層撮影等と呼んだ。本明細書において、その技術をまとめて、EITすなわち電気インピーダンス断層撮影法と呼ぶ。従って、本開示の残りにおいて、その技術はEIT技術とだけ呼び、これの一例を以下の実施例3に示す。
【００７４】
当業者は、本開示を読んで、電流の変化を測定する異なる手段に想到するであろう。組織に本発明を実施するとき、これを測定する好ましい方法は、画像を形成するために、モニター中の試料の生物学的特性の差をモニターし分析する画像形成技術、具体的には電気インピーダンス断層撮影(EIT)を使用することである。EIT技術は、EIT画像を形成し、望ましい結果を得るためにその画像を使用して電流を調節することによって、本発明と関連して使用することができる。具体的には、EIT画像は、組織に電流を注入し、電極アレイによって得られた電圧を測定することによって形成される。これにより、再構成アルゴリズムを使用して、既知の電流入力および測定された入力電圧データからインピーダンス画像を形成することができる。EIT画像形成は電気インピーダンスのマップを提供するという点において、EIT技術の使用は、組織に適用される本発明に関連して特に望ましい。電気インピーダンスのマップにより、本質的にユーザーは、電気穿孔を開始すると可視化することができる。電気穿孔が開始すると、ユーザーは適用される電流の量を安定化することができ、それによって図8Aに示すような細胞に対する非可逆的な損傷を生じるような大量の電流を適用することを回避することができる。EIT技術により、電気穿孔を受けている可視化対象の組織領域は、モニター中の組織内の細胞の等価的電気インピーダンスの変化に基づいて可視化することができる。
【００７５】
図7は、組織71に本発明のプロセスを実施するために使用されるEITシステムの概念図を示す。電流源72は、信号発生装置73によって制御され、差動増幅器76および復調器77にいたる1対のコンピュータ制御式マルチプレクサ74および75により組織試料71に電流を誘導するために使用される。測定された信号は、後に画像を構成するための振幅および位相データを記録するためにオリジナルと比較される。制御用コンピュータ78は、典型的には、いずれの電極対が電流を注入するかを選択すると同時に、残った電極の電圧を読む。本発明に関連して使用することができるハードウェア構成には異なるものが数多く存在する。
【００７６】
図7に示すEITシステムは、全般的に、電流源および測定増幅器が単一なので、直列型システムと呼ばれる。種々の程度の並列(多数の電流源および電圧測定増幅器)が他のシステムにおいて使用されており、それによって電流注入システムの汎用性および速度が増加される。
【００７７】
再構成アルゴリズムは、生体内の関心対象の領域の外側表面で測定された電圧(注入された電流データ)および電極の幾何学的構成に関する情報を得るために使用され、組織71の領域内部の空間的な組織インピーダンス組織分布を表す画像を形成する。インピーダンス画像を形成するために使用することができる方法は数多く存在する。静止画像形成は絶対インピーダンス分布の産物である。Cook, R. D.ら、ACT3:高速、高精度電気インピーダンス断層撮影法(a high speed, high precision electrical impedance tomography). IEEE, Trans. Biomed. Eng. 41, 713-22(1994)。示差式画像形成方法は、2つのデータセット間の差に基づいた分布を形成した。Barber, D. C. Advances in Biomed Eng.(Benek in, W.、Thevenin, V.編)165-173(IOS Press, Amsterdam, 1995)。この種類の技法は、インピーダンス分布が1つのベースライン測定値からどのように変化したかの画像を提供する。多周波数インピーダンス画像形成法は、組織インピーダンスの周波数依存性を利用している。Groffiths, H. 電気インピーダンス断層撮影における位相測定の重要性(The importance of phase measurement in electrical impedance tomography). Physics in Medicine and Biology 32, 1435-44(1987)。準静的（quasi-static）画像は、ベースラインとして使用される低周波数画像を用いた上記の示差的技法を使用して形成することができる。従って、本システムにより、真の静止画像形成の困難さを伴うことなく、ある種の静止画像を作成することができる。
【００７８】
再構成、従って画像を提供するために、電流が組織内でどのように挙動するかの数学的モデルが使用される。一般に、EIT内の電流を支配するモデルは周知のポアソン方程式によって提供される。EIT画像再構成および多数の他の医学的画像形成技術に必要とされる種類の数学的分析は、境界値問題として既知の総括的なクラスに属する。境界値問題を解決する方法は異なるものが数多く存在する。しかし、これらの問題は全て分析的または数的反復技法に分類することができ、当業者は、本発明を実施するためにこれを適用することができる。
【００７９】
現在使用されている大多数の再構成アルゴリズムは、ポアソン方程式に反復的数的解決法を使用している。ほとんどの反復的数的アプローチは、組織内のインピーダンス分布を推測し、フォワード問題（forward problem）を反復的に解決し(インピーダンス分布を与える電圧および電流密度を見つける)、測定電圧および電流が算出されたものと一致するまでインピーダンス推定値を対応して調節することによって、境界値問題を解決しようとしている。フォワード問題は数的に解決されるはずであり、通常、有限要素または定差スキームを使用して実施される。FEMは、フォワード問題の非常に強力で一般的な解決方法であり、このために、多数の各種学問分野に渡る工学的解決を支配する傾向がある。
【００８０】
電場を適用しないで細胞膜を通過して物質を輸送するための、単一の生物細胞のための本発明による微小拡散装置の一例を図1に示す。本装置のこの構成要素は、下から上へ、アクリル基板11、2つの液体チャンバーの下方の横の境界を規定するために掘り込みがつけられた部分13を有する中間のシリコン層12(厚さ1ミクロン)、2つのチャンバーの障壁として働く窒化ケイ素層14、上方の液体チャンバー16の横の境界を規定するシリコンワッシャ15、およびガラスカバープレート17である。窒化ケイ素障壁の孔18は開口部として働き、細胞または組織などの連続細胞塊19は孔を覆っていることが示されている。流路はアクリル基板を通過して延在し、図に矢印で示すように、上方および下方のチャンバーを通過する液体の流入および流出流路として働く。
【００８１】
上方のチャンバー16内の圧力が下方のチャンバー13内の圧力より高い場合には、細胞は孔上の位置に保持され、2つのチャンバー内の液体を互いに分離する栓として働く。2つのチャンバー内の溶液の組成が細胞の内側の組成と異なる場合には、チャンバーと細胞の間で細胞膜を通過して物質移動が生じる。一方のチャンバー内の溶液の組成が他方の組成と異なる場合には、細胞を通過して一方のチャンバーから他方のチャンバーへの物質移動が生じる。2つのチャンバー内の溶液の組成を正確に制御することによって、細胞内の物質移動速度および方向を正確に制御することができる。開口部18の径は既知であるので、開口部を通過して生じる物質移動を正確に測定することができる。
【００８２】
本微小流動装置の数多くの用途が、容易に明らかになる。例えば、上方のチャンバー16に生理食塩液を充填し、下方のチャンバー13にグリセロールを充填することによって、グリセロールなどの冷凍保存剤を細胞に注入するために本装置を使用することができる。細胞膜を通過するグリセロールの物質移動係数が既知の細胞19を使用すると、細胞に流入するグリセロールの量を容易に算出することができ、冷凍保存に必要であることが既知の量を細胞に注入するための濃度および暴露時間を調節することができる。
【００８３】
単一の生物細胞のための本発明による微小電気穿孔装置の一例を図2に示す。本装置は、図1の微小拡散装置と構成がほぼ同じである。その構造的な構成要素は、下から上に、アクリル基板21、下方の液体チャンバー23の横の境界を規定するために掘り込みがつけられた部分を有する下方シリコン層22、2つのチャンバーの障壁として働く窒化ケイ素層24(厚さ1ミクロン)、上方の液体チャンバー26の横の境界を規定する上方シリコン層25、ならびにn+ポリシリコン層(厚さ5,000Å)27および窒化ケイ素層(厚さ1ミクロン)28からなるカバーである。窒化ケイ素障壁24の孔29は開口部として働き、細胞30(または細胞塊)が孔を覆う。流路は、アクリル基板を通過して延在し、図に矢印で示すように、上方および下方のチャンバーを通過する液体の流入路および流出路として働く。n+ポリシリコン(5,000Å)のさらに別の層31がアクリル基板21の上に存在し、この層は、上方チャンバー26の上のn+ポリシリコン層27と共に2つの電極として働く。各電極は電線によって、電極間に適用される電圧を制御し、両者の間を通過する電流を測定するプリント回路基板32に接続される。
【００８４】
図2に示す微小電気穿孔装置は、典型的には化学的蒸着、マスキング、エッチング、およびスパッタリングに関係する、従来のマイクロ加工技法によって製造することができる。本装置の操作は、図1の微小拡散装置の操作とほぼ同じである。装置を通過する生物細胞の移動は、上方のチャンバーを充填するために使用される液体に細胞を懸濁させることによって実施され、チャンバー間に圧力差を与えることによって細胞は1つずつ開口部に引き寄せられ、圧力差はまた、細胞が開口部に引き寄せられると細胞をその場所に保持する。このような圧力差を与える便利な方法は、上方のチャンバー内の大気圧を維持しつつ、下方のチャンバーにシリンジを取り付け、シリンジプランジャーを引くことによって下方のチャンバーの圧力を大気圧より低くすることである。細胞を損傷しないように圧力差を制限するように注意を払うべきである。
【００８５】
図3Aおよび3Bは、本発明の範囲内の異なる装置および方法を図示する。本装置および方法は、導管または流路を通過して流動する生物細胞の流体懸濁液に関係し、細胞は電極対間の領域を通過する。図3Aの長手方向の断面は流路の壁41を示し、生物細胞42は流路の内腔を下方向に通過する(矢印の方向)。図3Bの横方向の断面は、流路は断面が矩形であることを示すが、他の断面の幾何学的構造を使用してもよい。電極43、44は、流路の向かうあう2つの壁のコーティングとして形成されている。電極は、電線によって、インピーダンスを測定して、電極に適用される電圧を制御するプリント回路基板45に接続される。生物細胞42は、2つの電極の間の領域を通過しているところが示されている。
【００８６】
流路の断面の面積は、本質的に流路の壁によって妨げられないで細胞を通過させられるほど大きいが、一度に電極間領域を1つの細胞しか通過することができない程度に小さい。また、細胞がその領域に流入すると、電極間に適用された電圧によりその領域を流れる電流の有意なまたは測定可能な低下を生じるように、各電極43、44は、生物細胞の径と長さがほぼ等しいかまたはわずかに長い。電極の間隔、すなわち電極間の距離についても、同じ考慮事項を同様に検討しなければならない。生物細胞は細胞内に導入される予定の化学物質種の溶液に懸濁され、流路に懸濁液を通過させる。懸濁液が流路を通過して流動すると電圧が電極間に適用され、電極間の電流(またはインピーダンス)がモニターされる。電流の有意な低下は、電極間領域に生物細胞が存在することを示す。細胞がこのように検出されると、細胞が電極間領域に存在する間に電気穿孔パルスを電極に適用することができ、インピーダンスをさらに観察して、電気穿孔の発生を検出することができる。溶液に溶解している化学物質種は、電気穿孔の結果として細胞内に流入する。
【００８７】
これらの構成および方法のバリエーションは、当業者に容易に明らかである。例えば、上記の障壁は、生物細胞と同じサイズの微小電極または生物細胞より小さい微小電極を使用することによって最小にすることもでき、または使用しなくてもよい。このような微小電極の例は、高精度（high-graduation）マイクロマニピュレータ(Narishige MWH-3、東京、日本製のものなど)と併用される炭素繊維微小電極(ProCFE、Axon Instruments、カリフォルニア州フォスターシティ、米国など)である。微小電極は、図2に示す電極の代わりに、または図3Aおよび3Bに示すものの代わりに使用することができる。
【００８８】
図12は、本発明のアッセイ装置50の概念的な斜視図である。装置50は、電気的相互接続53、電力源54、およびスイッチ55を備える下方の電極52および上方の電極51を含む。導電性媒体を含む上方のチャンバー56は、イオンを含有する水などの任意の材料であってよい。上方のチャンバー56は、上面が上方の電極51に接しており、底面が誘電膜57に接している。下方のチャンバー58は、下方の電極52の上方および誘電膜57の下方に位置づけられている。上方のチャンバー56と同様に、下方のチャンバー58は導電性媒体、例えばDPES溶液または生理食塩液を含有する。
【００８９】
誘電膜57は、上方の電極から下方の電極に電流を流させない材料を含む。しかし、誘電膜57は微小孔59を備える。微小孔は、好ましくは、孔59に配置された状態で示されている細胞60などの単一の細胞より径が小さい。スイッチ55が閉じられて回路が完成すると、電位が上方の電極51と下方の電極52の間に形成される。そして電流は一方の電極から他方の電極に流れることができるが、誘電膜57が存在するので、電流の流れは微小孔59を通過する流れに制限される。細胞60が孔59に位置づけられていると、電流は細胞60を通過して流れなければならない。電流検出装置である、アンプメーター装置61などのアンプメーターまたは電流を測定する他の手段を電極52に配置することができる。または、検出装置である任意の種類の電流検出手段61またはこのような装置のセンサーを、電流が検出されると思われる他の場所に配置することができる。
【００９０】
電流が検出されたら、電流のレベルを、測定中の細胞と実質的に同じ既知の生細胞について取った標準値などの標準と比較する。電流の流れが標準と実質的に同じである場合には、試験中の細胞は生存していることがわかる。しかし、電流の流れが標準と比較して実質的に大きい場合には、試験担当者は、試験中の細胞は生存していないと結論づけることができる。細胞60が試験されたら、別の細胞62に代えることができる。細胞を次々に連続的に読み、試験中の細胞の生存度を瞬時に判定するために、装置を通過する細胞の流れ63を形成することができる。
【００９１】
図13を参照すると、細胞60は透明な電極51を通して観察できることがわかる。さらに、微小孔59を見ることができる。当然のことながら、観察は、透明な電極51の上方に顕微鏡を位置づけることによって実施される。本発明の装置を使用して染料が細胞内に輸送されることを証明するために、蛍光染料を使用した。
【００９２】
図14は、図12に示す誘電膜57の3ミクロンの孔59を有する装置内に配置したDU-145細胞の電気的応答について実施した実験の電流対時間を示すグラフである。図14のグラフに示されるように、細胞のいくつかは生細胞と診断されたが、他の高い電流を有する細胞は死細胞として明らかに識別された。YOYO-1染料と呼ばれる染料を取り込んだ集団中の細胞の電気的応答を、染料を取り込まず、従って蛍光性でない同数の集団の細胞と比較した。染料を取り込むということは細胞膜が損傷されていたこと、従って細胞が死んでいたことを示す。比較は、高い電流が検出された死細胞と蛍光染料を有する細胞の相関関係を示した。
【００９３】
図15は、125ms以下の電気パルスの10ボルトが適用された図14のデータの棒グラフを示す。このパルスは、DU-145細胞の細胞膜の可逆的な電気穿孔を誘導することが以前に示されている。図14は、蛍光を発している3つの細胞、無傷の3つの細胞、および空の孔を流れる電流のデータを比較して示す。無傷である細胞を通過する電流は、YOYO-1染料の取り込みが膜の損傷を示す細胞を通過する電流より実質的に小さいことを結果は示している。従って、図14は、膜に損傷のある細胞および膜が無傷である細胞の電気的応答の定量的な測定値を示す。結果は、適用したパルスの終盤における死細胞、生細胞、および空の孔の平均電流を比較している。100 msにわたって適用した10ボルトの終盤において無傷の細胞(n=32)を通過する電流は9.19±0.19マイクロアンプであった。蛍光を発光している細胞(n=22)に同じパルスを適用すると、電流は14.39±1.9マイクロアンプであった。これは、無傷の細胞を通過する電流と有意差がある(p<0.0001)。
【００９４】
電流の差は、損傷された膜を有する死細胞を無傷の膜を有する生細胞と識別するための有用な指標であることをこれらの結果は示している。生化学的または生物学的アッセイとは異なり、電流測定は即時的なので、本発明の方法は即時的な生存度判定を提供する。図14にグラフで示す結果を図15において棒グラフにする。自然に死んだ細胞の平均的な内容と空の孔の電流(23.64±0.58マイクロアンプ)には大きな差があったことに注目すべきである。死細胞と空孔モードの電流比は0.61である。自然の原因により死んだ集団の細胞の損傷された膜は、ある程度完全性を維持していたことを、これらの結果は示している。従って、死んだ細胞の膜を通過するイオンの流れに対して若干の抵抗が存在する。
【００９５】
図16の結果は図14の結果とほぼ同じである。しかし、図16の結果は、微小電気機械的チップの同じ3マイクロメーターの孔を用いてND-1細胞で実施した実験の結果である。これらの実験の実験結果は、生細胞を通過する電流を、細胞膜に非可逆的な電気穿孔を誘導することによって意図的に殺した細胞を通過する電流と比較した。非可逆的な電気穿孔は、蛍光顕微鏡下で細胞が明るく蛍光を発光するまで、低振幅の電気インパルスを連続的に適用することによって得られた。図16は、100 msあたり10ボルトの電気パルスの適用中の、蛍光を発光している細胞、無傷の生細胞、および空の孔のチップ電流を示す。このパルスは、MD-1細胞において細胞膜の可逆的な電気穿孔を誘導することが以前に証明されている。同じ電気パルスが生細胞および異なる細胞を通過して非常に異なる電流を生じることは明白である。図16は、無傷の生細胞(n=40)および非可逆的に電気穿孔したND-1細胞(n=22)の、10ボルト100 msパルスの終盤の平均電流値を比較している。電流の有意な差(p<0.0001)である10.02±1.22マイクロアンプ対20.95±2.75マイクロアンプは、微小電気機械的チップの電流が生存度の直接的で実質的に即時的な試験として使用できる可能性があることを、ここでも証明している。生存しているND-1およびDU-145細胞を通過する電流は統計学的に同じであることを、データは示している。得られた結果を図16に示し、図17において棒グラフで示す。非可逆的に電気穿孔したND-1細胞の平均チップ電流は空の孔の電流に非常に近く(20.95マイクロアンプ対23.64マイクロアンプ)、自然に死んだDU-145細胞を通過する電流と比較して有意に大きい(20.95マイクロアンプ対14.39マイクロアンプ)ことに注目すべきである。細胞を通過する電流の大きさは細胞膜が経験する損傷の種類に関連することを、これらの結果は示している。非可逆的電気穿孔を経験したND-1細胞の高い電流は、非可逆的膜破壊による膜損傷の程度がDU-145細胞の自然の溶解による膜損傷の程度より大きいことを示していると考えられる。
【００９６】
図14〜17に示す結果により、同じ電気パルスでは、死んだ(膜が損傷している)細胞および生細胞を通過する電流には検出可能な差があることが、明白に示されている。これにより、細胞を通過する電流を測定することは、細胞膜の完全性を判定して細胞の生存度を推定する際に有用であることが示されている。この判定の精度は、細胞膜の完全性を検討するために染料を使用する生存度アッセイに匹敵する。しかし、電流測定は即時的であり、化学添加物質の添加を必要としない。一方、比色および蛍光測定は化学物質の添加を必要とし、即時的ではない。さらに、比色または蛍光染料は、損傷のある細胞膜の損傷の大きさに関する定量的な情報を生じない。本発明の方法は、死んだ細胞と生きている細胞の識別だけでなく、健康な生細胞と細胞膜が損傷した生細胞を識別するためにも使用することができる。
【００９７】
非可逆的電気穿孔によって膜が損傷されたND-1細胞の応答を自然に損傷されたDU-145細胞の応答と比較することによって、細胞損傷の機序および大きさも、電流応答の定量的分析によって識別可能であろうことが示される。
【００９８】
図12は、フロースルー特徴63を有する装置を構成できることを示している。この特徴を使用すると、装置を使用して大集団中の個々の細胞の生存度を検討することができる。さらに、本装置を使用して、生細胞を死細胞から分離することができ、または生きている健康な細胞膜を有する健康な生細胞を損傷のある細胞膜を有する生細胞から分離することができる。本装置は、化学物質、pH変化、温度、および圧力の変化を含む種々の条件に細胞を暴露するためにも使用できる可能性がある。これらの変化および条件が細胞膜にどのように影響を与え、細胞の生存度にどのように影響をあたえるかを判定するために、条件の変化を電流に関連させうる。細胞死に関与する細胞機序を含む、ある種の細胞に特異的な追加の情報を決定するために、これらの結果をさらに外挿することができる。従って、本発明のアッセイ方法および装置は、どの細胞が生きていてどの細胞が死んでいるかを判定するためだけでなく、どの周囲の環境条件が特定の種類の細胞に安全であるかを判定するために使用することができる。
【００９９】
以下の実験プロトコールを使用して実験を実施し、図14〜17に示すデータを得た。
【０１００】
実験プロトコール
微小電気穿孔チップ：本発明の検討に使用する微小電気機械的チップの設計および操作はいくつかの文献に記載されている[Huangら、Biomedical Microdevices, 18: 368-375(2000)；Huangら、Sensor and Actuators, A89: 242-249(2001)]。それは、細胞を通過する電流を収束し、細胞を通過する電流を測定し、顕微鏡下で細胞を観察する能力を組み合わせる。細胞はフロースルー構成において検討されても、または個々の細胞が連続的な検討のための電流の通路に維持されてもよい。
【０１０１】
細胞系統：ヒト前立腺癌(human prostate adenocarcinoma)細胞(ND-1細胞系統)[Narayan, P.およびR. Dahiya, ヒト原発性前立腺癌細胞系統(ND-1)の樹立(Establishment of a human primary prostatic adenocarcinoma cell line (ND-1)). J. Urol., 1992, 148: 1600-1604]およびヒト前立腺癌(human prostate carcinoma)細胞(DU145細胞系統)[Stoneら、Int. J. Cancer, 21: 274-281(1978)]を生存度試験に使用した。両細胞系統はサンフランシスコVA病院(カリフォルニア州サンフランシスコ)の好意によるものであった。全ての細胞系統は、75cm2の組織培養フラスコ(Corning)において5%CO2および95%空気の加湿大気下において37℃で維持した。両細胞系統に使用する培養培地は、10%(v/v)ウシ胎仔血清、20 mM HEPES、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100mg/ml)、および1%(v/v)L-グルタミンを添加したRPMI-1640(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)である。各実験について、集密化した単層の細胞をトリプシン処理(トリプシン0.05%、EDTA0.025%)(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)によって取り出して、使用のためにダルベッコのPBS(Sigma chemicals、ミズーリ州セントルイス)に再懸濁した。
【０１０２】
死んだ細胞株：膜貫通電流信号を細胞生存度と関連させるために、YOYO-1(Molecular Probes、オレゴン州)を使用して、死んだ細胞と生きている細胞を識別した。YOYO-1は、DNA/RNAに結合する膜不透過性蛍光核酸染料である。UV光線の励起下では、染料と核酸の複合体は強力な緑色の光線を発光する。健康な細胞膜は、YOYO-1分子が細胞内に流入するのを防止するので、染料分子は生きている細胞を染色しない。一方、死んだ細胞は膜の完全性を失っているので、YOYO-1染料はそのような細胞内に流入し、それらにUV光線下において緑色の蛍光を発光させることができる。従って、死細胞および生細胞は、顕微鏡下で蛍光を調査することによって識別することができる。すなわち、死細胞は緑色蛍光であり、生細胞は暗い。本発明者らの実験において使用した典型的なYOYO-1濃度は1μl/mlであった。YOYO-1の励起および発光スペクトルは、それぞれ491nmおよび509nmである。
【０１０３】
実験手法：YOYO-1染料を含有するDPBS溶液に細胞を移して懸濁させた。次いで、細胞懸濁液を微小電気穿孔チップの上方のチャンバーに注入した。顕微鏡(BX60、Olympus)で視覚的に補助して、細胞をチップの微小孔の方向に引き寄せ、チップの上方のチャンバーと下方のチャンバーの間に適切な圧力差を適用することによって孔に捕獲した。細胞が捕獲されたら、488nmフィルターを介してUV光線で励起して、それが生きている細胞または死んだ細胞であるかをチェックする。次いで、非可逆的膜破壊によって細胞を損傷しない電気パルスを、チップの2つの電極間に適用する。細胞膜を通過する対応する電流をTektronix TDS220デジタルオシロスコープで記録し、後の分析のためにコンピュータに転送する。
【０１０４】
実施例
以下の実施例は、どのように本発明を達成し使用するかについて、完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定する意図のものではなく、また以下の実験が実施される全ての実験もしくは唯一の実験であることを示すことを意図していない。使用した数値(例えば、量、温度等)に関して正確さを保証する努力が払われたが、いつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に示さない限り、部（part）は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏単位であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【０１０５】
実施例1
一連の実験は、流動および圧力制御装置と、上方のチャンバーと下方のチャンバー内に循環させる液体用圧力ゲージとを組み合わせた、図2に示す上記電気穿孔装置、可変DC電源、装置に電圧パルスを与えるためのパルス発生器および電力増幅器、パルスをモニターするためのデジタルオシロスコープ、蛍光顕微鏡、CCD(電荷結合素子)カメラ、ならびに画像処理および波形処理ソフトウェアを備えたコンピュータからなる、電気穿孔システムを使用して実施した。装置の両方のチャンバーに生理食塩液を充填し、細胞は上方のチャンバーに導入した。上方および下方のチャンバーの液体の動きはシリンジで制御した。上方のチャンバーの圧力は大気圧であったが、下方のチャンバーの圧力は、下方のチャンバーに接続したシリンジの筒部を引っ張ることによって大気圧より低くした。大きさが0〜120 Vの範囲で、時間が2マイクロ秒〜100ミリ秒の範囲の単一方形パルス（single square pulse）の電圧を適用した。上方および下方のチャンバーの電極間距離は900ミクロンであった。
【０１０６】
この実施例における試験は、典型的な径が20ミクロンのND-1ヒト前立腺癌細胞を使用して実施した。微小電気穿孔装置の開口部は、直径5ミクロンであった。矩形電圧パルスを60ミリ秒の時間で適用し、5ボルトの増分の10V〜60Vの範囲の種々の振幅のパルスを適用した。各パルスを用いて、開口部を通過する電流を測定した。細胞を用いて実験を実施し、ガラスビーズで栓をした開口部を用いて、および開口部を全く塞がない場合において、実験を反復した。各場合の結果は、マイクロアンペア単位の電流対ボルト単位のパルス振幅として表し、図4にプロットされている。図4では、上の曲線(データ点は×で示されている)は塞がれていない開口部を示し、下の曲線(データ点は星印で示されている)は開口部にガラスビーズが存在する場合に取ったデータを示し、真ん中の3つの曲線(白抜きの四角、白抜きで上向きの三角、および白抜きで逆さの三角)は開口部に3つの異なるND-1細胞が存在する場合に取ったデータを示す。
【０１０７】
上の曲線は、開口部を通過する電流の流れに障壁がない場合には、電圧が上昇すると、電流が実質的に安定して増加することを示している。下の曲線も、電圧が上昇すると実質的に安定な上昇を示すが、はるかに低い程度である。下の曲線に示す電流の値は、装置を通過する漂遊電流を示す。開口部にND-1細胞が存在する場合に取ったデータの曲線は、低い電圧では、電流は、開口部がガラスビーズで閉じられている場合に得られるものに値が近いが、高電圧では、電流は、開口部が閉ざされていない場合に得られるレベルに上昇することを示す。遷移（transition）は、電流が流れることができる孔が細胞膜に形成されたこと、すなわち電気穿孔の発生を示す、鋭い上昇である。3つの細胞全てにおいて、遷移は、30V〜40Vの電圧において発生した。3つの細胞のうち2つでは(白抜きの四角および白抜きの上向きの三角)、電気穿孔の発生は本質的に同じ電圧において起こったが、3番目(逆さの三角)では、発生は、他の2つより約5V低い電圧において起こった。これは、個々の細胞についてプロセスを制御して最適な結果を得るための値を示している。
【０１０８】
図4に示すデータが形成された後、振幅値の高い方からパルスを再度適用すると、得られた曲線はヒステリシスを示した。すなわち、振幅を低くしていく場合に得られた曲線は、振幅を大きくしていく場合に得られた曲線より電圧が高かった。これは、これらの実験における電気穿孔は非可逆的であることを示した。
【０１０９】
実施例2
実施例1に使用したものと同じ微小電気穿孔システムを使用して、典型的な細胞の径が20ミクロンであるラット肝細胞(ATCC#CRL-1439)で一連の試験を実施し、微小電気穿孔装置は径が4ミクロンの開口部を有した。ここでも同様に、時間60ミリ秒で、10V〜37.5Vの振幅の範囲で、10V〜30Vの部分は5Vの増分、30V〜37.5Vの部分は2.5Vの増分で、矩形電圧パルスを使用した。実験は、ある例では振幅を増加することのみによって実施し、他の例では、可逆性を評価するために最初に振幅を増加して、次いで振幅を低下することによって実施した。結果は、図5A、5B、5C、および5Dに示すグラフにプロットしてある。各場合において、上の曲線(データ点は円で示されている)は、開口部に細胞もガラスビーズも存在しない場合に取ったデータであり、下の曲線(データ点は四角によって示されている)は開口部にガラスビーズがある場合に取ったデータであり、真ん中の曲線(データ点は三角で示されている)は開口部に肝細胞がある場合に取ったデータであり、4つの図の各々に異なる肝細胞を使用している。
【０１１０】
図5Aでは、振幅は増加し、低下しておらず、電気穿孔閾値電圧は25V〜30Vの間であることを示した。図5Bおよび5Cでは、振幅は最初に増加し、次いで低下して、2つの真ん中の曲線を形成した。上昇曲線および下降曲線は区別されていないが、それらは各図において実質的に同一であり、これら2つの場合の各々における細胞膜は各電圧パルス後に再密封されること、従って孔形成が可逆的であることを示している。図5Dによって表される試験では、適用される電圧が37.5Vを超えると細胞が崩壊したが、これは図に示されていない。同じ種類の細胞が図5A、5B、5C、および5Dの各々において使用されたという事実にもかかわらず、全て20V〜35Vの範囲内であったが、電気穿孔閾値電圧は個々の細胞間で異なったことに注目することは重要である。個々の細胞に対する手法の適合は、このように電流をモニターして電気穿孔閾値が生じる時点を確認することによって容易に実施される。次いで、細胞を破壊しないで、細胞の望ましい処理を実施するために、最適な暴露時間、電圧、周囲の液体中の組成の変化、およびシステムの他のパラメーターを選択することができる。
【０１１１】
本明細書に記載する方法は、生物細胞の電気穿孔特性の基本的な調査を実施するための実験室における有用なツールであり、フロースルー様式で大量の細胞を処理するための産業における有用なツールである。個々の細胞を流れる電流を観察し記録することが可能になることによって、電圧パルスの振幅および時間を制御して最適な結果を得ることができる。また、本発明を実施する際に使用するための本明細書に記載され示されている装置は、透明で、顕微鏡のステージ上に載せるのに好適なサイズの部品を用いて構成することができる。これにより、電流測定を細胞内の視覚的な観察および蛍光測定に関連させることができる。本装置を使用して、細胞が開口部に留まる時点および孔形成が細胞膜に達成される時点を電流の測定により電気的に検出することができる。大規模の産業用用途では、本明細書に記載する種類の電気穿孔装置を多数、平行に配置することができる。各細胞について、細胞が開口部に捕獲されたことを示す電気的情報(電流の急激な低下など)を使用して、一連の電気穿孔を開始する信号を発生することができ、電気穿孔の完了を示すさらに別の電気的情報(電流の急激な上昇など)は、(例えば、圧力差をなくすか、または圧力差を逆にすることによって)細胞を解放し、次の細胞を開口部の方向に流動させる信号を発生する。
【０１１２】
物質を細胞内に移動させるまたは細胞から移動させるために本発明の装置およびシステムを使用する以外に、本発明のシステムおよび装置は、診断または分析モードに使用することができる。これは、媒体中に配置された1つの細胞または複数の細胞の電気インピーダンスを測定し、測定した電気インピーダンス情報を使用することによって実施される。細胞膜の完全性に関する情報を推定して分析に供することができる。この情報を、同じ種類の正常な細胞または疾患細胞について以前に得られた情報と比較して、診断情報を得ることもできる。例えば、無傷の膜を有する細胞の電気インピーダンスは、損傷のある膜を有する同じ細胞のインピーダンスよりはるかに大きい。従って、本プロセスは分析的に、細胞膜の構造的完全性に関する情報を提供することができる。診断的には、本方法は、細胞膜の相対的な構造的完全性に関する情報を提供することができる。
【０１１３】
実施例3
電気穿孔を受けた領域の電気インピーダンスマッピング
EITが組織の電気穿孔をモニターする能力を例示するために、本発明者らはこの問題の数学的シミュレーションを解決した。
【０１１４】
電気穿孔画像形成シミュレーションに必要なデータを提供するために、先ず2-D微細メッシュFEMモデル(約1600の交点、約3100の要素)を使用して疑似組織ファントムを作成した。図9に示すファントムは円形の画像形成ドメインからなるものであった(周辺部に等しい間隔で配置された可変数の作用点電極を有する筋肉の半径20mm、電気固有抵抗500 ohm・cm)。この画像形成領域内において、任意の形状の単一の電気穿孔領域を異なる電気固有抵抗で規定した。対向電極電流注入パターンを使用して、N(N-1)/2(ここでNは電極の数である)回独立に電圧を測定した。MATLABの偏微分方程式ツールボックス(The Mathworks Inc.)から入手可能な適応メッシュ生成およびFEM解法アルゴリズムを使用してモデルを解いた。所定の幾何学的構成の例示的なメッシュを図9に示す。ファントムモジュールにより再構成アルゴリズムに利用できる情報は、実験の電気穿孔部分を実施中に利用できるデータ、すなわち組織周囲の異なる電極の電流および電圧を示す。このデータから、本発明者らは、モデルに入力した組織の元の画像を再構成する試みを実施した。(問題を簡単にするために、EITに典型的なAC電流の代わりにDC注入電流を使用したことに注目するべきである。AC導出および実装は本明細書に示すものの単純な延長である)。8-電極EITシステムの疑似データ取得段階中のファントムにおける電圧および電流分布の典型的な例を、図10に図示する。
【０１１５】
ファントムから得られるデータを、画像を作成するために、1つは有限要素法を使用し、もう1つは境界要素法を使用する、2つのEIT画像形成アルゴリズムに入力した。アルゴリズムは、画像を作成するための標準的なニュートンラフソン技法を使用している。図11は、2つの異なる電気インピーダンスを用いた円形ドメインの画像を、有限要素法および境界要素法を用いて再構成した元のファントムの画像と比較している。
【０１１６】
電気インピーダンス断層撮影法は、組織内の電気穿孔領域を画像化するために使用することができる。その理由は、EITは組織の電気インピーダンスマップから組織の画像を作成し、電気穿孔はインピーダンスの変化を生じるからである。組織電気穿孔画像形成のための電極は、電気穿孔プロセスそのものに使用されるものと異なっても同じであってもよい。
【０１１７】
実施例4
膜透過性の変化の電気的検出
細胞電気穿孔に関する本発明者らの研究の一部として、本発明者らは、可逆的および非可逆的電気穿孔中の細胞の電気的特性を検討した。可逆的電気穿孔では、細胞は電気穿孔過程によって損傷されず、膜は再度閉じる。非可逆的電気穿孔では、細胞膜が損傷されて閉じない。本発明者らがND-1細胞を使用して微小電気穿孔チップにおいて細胞を通過する電流を測定した実験セットにおいて、本発明者らは図8Aおよび8Bに図示される結果を得た。図8Aおよび8Bにおいて、細胞を三角形の形状の電気パルスに暴露することによって結果を得た(上の曲線)。細胞を通過して流れる電流は図8Aおよび8Bの下の曲線に示す。図8Aは、非可逆的に電気穿孔した細胞であり、図8Bは可逆的に電気穿孔した細胞である。可逆的に電気穿孔した細胞において電圧を低下すると、電圧上昇段階中と同じ値を保持したことが容易に確認できる。しかし、非可逆的な例では、損傷を受けた膜を有する細胞を通過する電流は、無傷の細胞より電流が高かった。このことにより、細胞を通過する電流は全体的に、膜の透過性の変化に関する指標を提供することができ、特に電気穿孔中だけでなく種々の状況下にある細胞膜の完全性の指標を提供することができるという結論が得られる。例えば、細胞の生存度は、損傷のある膜を透過するトリパンブルーまたは蛍光染料を用いて測定されることが多い。これらの結果は、損傷のある膜を有する細胞を検出する別の方法は、細胞の電流-電圧関係を測定することであろうことを示している。同様に、イオノフォアなどの細胞膜に孔を誘導する化合物が存在する。電流-電圧を測定すること(細胞膜のインピーダンス関係もこれらの化学物質によって膜が損傷されたかどうかを検出することができる)。電気的測定は、迅速な情報を提供するので、細胞膜損傷を検出するための化学的手段を上回る利点を有すると思われる。細胞膜、特に損傷のある細胞膜の透過性の変化を検出するために考えられる方法は、電気穿孔プロセスについて記載した電気穿孔チップを使用することである。損傷の測定は、図8aおよび8bに図示するように、無傷の細胞のインピーダンスと損傷のある細胞のインピーダンスの差であると思われる。組織において、本明細書に記載する電気穿孔を検出するための方法と同様に損傷のある膜を有する細胞を検出することが可能であると思われる。
【０１１８】
実施例5
組織の非生存領域の電気インピーダンスマッピング
EITが組織の細胞および非生存細胞の生存度をモニターする能力を示すために、本発明者らはこの問題の数学的シミュレーションを解いた。
【０１１９】
非生存組織の画像形成シミュレーションに必要なデータを提供するために、まず2-D微細メッシュFEMモデル(約1600の交点、約3100の要素)を使用して疑似組織ファントムを作成することができる。図9に示すファントムは円形の画像形成ドメインからなるものであった(周辺部に等しい間隔で配置された可変数の作用点電極を有する筋肉の半径20mm、電気固有抵抗500 ohm・cm。この画像形成領域内において、任意の形状の単一の非生存組織領域を異なる電気固有抵抗で規定することができる。対向電極電流注入パターンを使用して、N(N-1)/2(ここで、Nは電極の数である)回独立に電圧を測定した。MATLABの偏微分方程式ツールボックス(The Mathworks Inc.)から入手可能な適応メッシュ生成およびFEM解法アルゴリズムを使用してモデルを解くことができる。所定の幾何学的構成の例示的なメッシュを図9に示す。ファントムモジュールにより再構成アルゴリズムに利用できる情報は、実験のEIT再構成部分を実施中に利用できると思われるデータ、すなわち組織周囲の異なる電極の電流および電圧を示す。このデータから、モデルに入力した組織の元の画像を再構成することができる。(問題を簡単にするために、EITに典型的なAC電流の代わりにDC注入電流を使用されうることに注目するべきである。AC導出および実装は本明細書に提供するものの単純な延長である)。8-電極EITシステムの疑似データ取得段階中のファントムにおける電圧および電流分布の典型的な例を、図10に図示する。
【０１２０】
ファントムから得られるデータを、画像を作成するために、1つは有限要素法を使用し、もう1つは境界要素法を使用する、2つのEIT画像形成アルゴリズムに入力することができる。アルゴリズムは、画像を作成するための標準的なニュートンラフソン技法を使用している。図11は、2つの異なる電気インピーダンスを用いた円形ドメインの画像を、有限要素法および境界要素法を用いて再構成した元のファントムの画像を比較している。
【０１２１】
電気インピーダンス断層撮影法は、組織内の非生存領域を画像化するために使用することができる。その理由は、EITは組織の電気インピーダンスマップから組織の画像を作成し、細胞死はインピーダンスの変化を生じるからである。
【０１２２】
実施例6
ヒト前立腺癌細胞の生存度を分析するためのシリコンチップ
マイクロデバイスの無生物回路に単一の細胞を組み入れることによって細胞膜の電気的特性を分析する原理は、これまでにいくつかの文献に記載されている(Huang, Y.およびRubinsky, B. (2000). 微小電気穿孔：効率の改善と細胞の電気透過化の理解(Micro-Electroporation: Improving the Efficiency and Understanding of Electrical Permeabilization of Cells). Biomedical Microdevices 2, 145-150；Huang, Y.およびRubinsky, B. (2001).単一細胞の膜透過化のためのマイクロ加工された電気穿孔チップ(Microfabricated Electroporation Chip for Single Cell Membrane Permeabilization). Sensors and Actuators: Physical 89, 242-249)。n+ポリシリコン電極の使用は、特にDCおよび低周波数分析について電極-電解質界面における複雑な電気化学的挙動のために、細胞膜の電気的特性の正確な特徴づけを妨害することを本発明者らは見出した。従って、本発明の設計は銀／塩化銀電極を使用している。Ag/AgCl電極は、高安定性、低DCオフセット、および非分極性のために、低DC励起電位において細胞膜の正確で直接的な電気的特徴づけが可能になる。図18は、改良を加えた装置の断面の略図を示す。本装置は、マイクロ加工したシリコンチップ、2つのAg/AgCl環状電極(in vivo Metric、カリフォルニア州)、およびアクリル基板からなる。1cm×1cm×0.5mmシリコンチップは、微小孔を1つだけ有する0.5mm×0.5mm×1μmの透明な窒化ケイ素膜を備え、孔は本発明者らの実験に使用する細胞より小さい。シリコンチップ、電極、および基板は、一体として、薄い誘電膜によって分離される2つのチャンバーを形成する。実験中、チャンバーの各々に導電性媒体を充填し、上方および下方の電極に与える電圧により異なる電位に維持する。誘電膜の微小孔は2つの電極の唯一の電気的接続を提供するので、孔を塞ぐ任意の細胞は電流の通過を効果的に遮断する。従って、チップを流れる電流は、設計上、細胞を通過して流れなければならない。これにより、細胞膜の電気的特性をリアルタイムで定量的に評価するために、特定の励起電圧下にある細胞を通過する電流を正確に測定することができる。
【０１２３】
シリコンチップは、標準的なシリコンマイクロ加工技法を使用して製造される。先ず、低圧化学蒸着(LPCVD)を使用して、4インチの両面研磨型<100>p-タイプウェハに厚さ1μmの低応力窒化ケイ素薄膜をコーティングする。標準的なリソグラフィープロセスを使用して、3μm〜6μmの径を有する微小孔を形成し、窒化物膜(Lam Research、カリフォルニア州)を介してプラズマエッチングし、次に窒化ケイ素層の背面をエッチングして、KOHエッチングウィンドウを形成する。正確な背面の整合は、Carl Zeiss KS Aligner接触リソグラファーを用いて実施する。その後、ウェハをバルクシリコン全体を介してKOH溶液(80℃における重量比KOH:H2O=1:2)中でエッチングして、面積約0.5mm×0.5mmの窒化ケイ素膜を形成する。その後、2000オングストロームの二酸化シリコン層を、KOHエッチングによって露出したバルクシリコンの上面に熱的に成長させて、電気的絶縁層として使用する。ダイシング後、個々のシリコンチップを汎用エポキシでAg/AgCl電極に接着し、次いでアクリル基板の上面に取り付ける。密閉された底部のチャンバーへの流体的な接近は、基板の2つの流体ポートを介して可能になる。
【０１２４】
細胞系統
ヒト前立腺癌細胞(DU-145細胞系統)(Bashford, C. L.、孔形成トキシン：細胞表面への接着と防御(Pore-forming toxins: attach and defence at the cell surface). Cell. Biol. Mol. Lett. 6: 2A, 328-333, 2001)を生存度試験に使用した。細胞系統は、75cm2の組織培養フラスコ(Corning)で5%CO2および95%空気の加湿雰囲気下で37℃において維持する。両細胞系統に使用する培養培地は、10%(v/v)ウシ胎仔血清、20 mM HEPES、ペニシリン(100単位/ml)、ストレプトマイシン(100mg/ml)、および1%(v/v)L-グルタミンを添加したRPMI-1640(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)である。各実験について、集密化した単層の細胞をトリプシン処理(トリプシン0.05%、EDTA0.025%)(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)によって取り出して、使用のためにダルベッコのPBS(Sigma chemicals、ミズーリ州セントルイス)に再懸濁した。
【０１２５】
死細胞染色
膜貫通電流信号を細胞生存度と関連させるために、YOYO-1(Molecular Probes, オレゴン州)を使用して、死細胞と生細胞を識別した。YOYO-1は、DNA/RNAに結合する膜不透過性蛍光核酸染料である。UV光線の励起下では、染料と核酸の複合体は強力な緑色光を発光する。健康な細胞膜は、YOYO-1分子が細胞内に流入するのを防止するので、染料分子は生きている細胞を染色しない。一方、死んだ細胞は膜の完全性を失っているので、YOYO-1染料はそのような細胞内に流入し、それらにUV光線下において緑色の蛍光を発光させることができる。従って、死んだ細胞および生きている細胞は、顕微鏡下で蛍光を調査することによって識別することができる。すなわち、死んだ細胞は緑色蛍光であり、生きている細胞は暗い。本発明者らの実験において使用した典型的なYOYO-1濃度は、1μl/mlであった。YOYO-1の励起および発光スペクトルは、それぞれ491nmおよび509nmである。
【０１２６】
細胞溶解試薬
危険な物質によって誘導される細胞死の力学的経過を検討するために、細胞を異なる用量のTriton X100(Sigma、ミズーリ州)で処理する。Triton X100は、細胞を溶解するために生化学用途において通常使用されている、穏やかな非イオン性で非変性性の界面活性剤である。Triton X100は膜タンパク質を溶解し、細胞膜に2価陽イオン感受性の孔を形成し、高分子および細胞タンパク質を漏洩させて、最後には壊死による細胞死を生じる(Weaver, J. C. (1993). 電気穿孔：細胞および組織を操作するための一般現象(Electroporation: A general phenomenon for manipulating cells and tissues). J. Cellular Biochemistry, 51, 426-435)。本発明者らの実験では、10%、1%、および0.1%(容量／容量)の濃度のTriton X100をPBSと事前に混合し、細胞懸濁液が充填されている上方のチャンバーに導入する。実際のTriton濃度は、細胞懸濁液および調製したTriton溶液の容量から求める。例えば、9μLの細胞懸濁液と1μLの1%Triton溶液では、実際のTriton濃度は0.1%である。
【０１２７】
実験システムおよび手法
生存度評価システムを図19に略図で図示する。本システムは、マイクロ加工された装置、蛍光顕微鏡(BX60、Olympus)、CCDカメラ、データ取得カード(National Instruments、テキサス州)、コンピュータ、ならびにCellScanコントローラおよびソフトウェア(Bioelectronic Micro Systems、カリフォルニア州)からなる。CellScanコントローラは、1mV〜1Vの正確な連続励起電圧を発生し、0.1nA〜10μAの電流をノイズレベル20pA未満で測定することができる。本システムはまた、微小孔に細胞を保持する吸引圧をモニターするために0.05kPaの分解能の圧力測定手段を有する。実験では、生存度装置の底部のチャンバーにシリンジを使用してPBSを充填する。次いで、5μL〜10μLの細胞懸濁液をピペッターを用いて装置の上方のチャンバーに導入する。DU-145細胞を用いる実験は、集密化した細胞の単層をトリプシン処理することにより得られた細胞集団を使用する。この細胞集団は生細胞と死細胞の通常の混合物である。YOYO-1染料は、細胞溶液と事前に混合しても、実験中に添加してもよい。顕微鏡(BX60、Olympus)により視覚的に補助して、細胞をチップの微小孔方向に引っ張り、孔に捕獲する。細胞捕獲のための吸引圧力は、排液管系を取り付け、シリンジをゆっくり引くことによって形成する。本発明者らの実験において使用する典型的な吸引圧は、-1KPa〜-3KPaである。この圧力範囲は、細胞膜に機械的な損傷を誘導することなく細胞膜と微小孔の端部の妥当な密閉を確実にする。細胞が捕獲された後、連続またはパルス励起電圧で細胞を調べ、10ms〜100msに調節可能なサンプリング間隔で対応する膜電流を記録する。励起信号の大きさは大きすぎないことに注目すべきであり、そうでないと電気穿孔による膜抵抗の摂動を誘導する(5、10)。典型的な電圧50mVを本発明者らの実験において使用し、本発明者らの対照検討では、この励起下での細胞は、蛍光検査および膜抵抗測定により測定したとき、10分以上経過しても膜損傷を受けないと思われる。
【０１２８】
細胞膜の電流測定と細胞の生存度との相関は、細胞の生存度を判定するための確立されている方法であるYOYO-1核酸染色による蛍光検査により実施する。YOYO-1は、生細胞を透過しない膜不透過性核酸染料であるので、膜が損傷されている死細胞だけがUV励起下で蛍光となる。本発明者らの実験では、YOYO-1染料は、細胞懸濁液に事前に混合しても、または励起パルスの適用後に添加してもよい。本発明者らは、1μL/mLのYOYO-1溶液を添加する前および後の細胞膜の抵抗測定値を比較したところ、注目に値する差は観察されず、この膜不透過性染料は細胞膜の伝導性の摂動を誘導しないことを証明している。
【０１２９】
毒素に対する細胞の力学的な応答は、低励起電圧で捕獲した細胞を連続的に調べることによってモニターする。種々の用量のTriton X100試薬を特定の時点に上方のチャンバーに添加する。次いで、細胞膜の抵抗を正確に記録することによって、毒素によって誘導される細胞死の力学的経過をリアルタイムで定量的に検討することができる。
【０１３０】
改善を加えた上記の装置の回路モデルは、比較的単純である。0.5mm×0.5mm×1μmの窒化ケイ素膜は、算出値16pFの純粋なコンデンサとして作用する。装置の上方および下方のチャンバーに生理食塩液(ρ=66.7Ω-cm)を充填すると、2つの電極間の主な電気抵抗は厚さ1μmの膜のマイクロメーターサイズの孔で生じ、数百KΩである。Ag/AgCl電極はほぼ非分極性なので、Ag/AgCl電極と電解質界面は純粋な抵抗器として簡単にモデル化することができる。両方のチャンバー内の生理食塩液と同様に、主な微小孔抵抗と比較して無視できるので、界面抵抗器の正確な測定は実施していない。プラズマエッチングした微小孔の実際の径は、3μm、4μm、および6μmの設計サイズに対応する、3.35±0.28μm、4.24±0.22μm、および6.11±0.12μmであり、測定したチップ抵抗の平均値は、それぞれ330KΩ、216KΩ、および110KΩである。チップ抵抗は、本発明者らの対照実験において数十分にわたる20 mV〜1Vの励起電圧下で、すぐれた一貫性と安定性を示す。チップの固有RC定数は、上記の値に基づいてマイクロ秒程度であるので、チップの電流測定の力学的応答は非常に迅速であり、細胞膜の特性の一時的な摂動を測定するのに理想的である。
【０１３１】
実験中、平均径が約20μmである個々の細胞は吸引圧力下において微小孔の方向に引っ張られ、2つの電極間の電流の通路を効果的に遮断する。こうして、捕獲された細胞によって生じる電気抵抗を、容易に測定することができる。図20は、細胞-孔組み合わせの等価回路を図示する。DC励起下では、細胞抵抗の大半は、回路においてRmpおよびRmtと示されている脂質膜によって生じ、微小孔および細胞膜の残りの部分の等価抵抗によってそれぞれ規定される膜パッチの抵抗を示す。膜パッチは、膜表面全体の非常にわずかな部分、例えば6μmの孔の装置では約2.25%、4μmの孔の装置では1%を構成するので、RmpはRmtよりはるかに大きく、従って細胞の全抵抗RcellはRmpで近似することができる。それは、膜コンダクタンスの主要な起源であるイオンチャネルの個々の抵抗および密度に基づいて推定されており、細胞膜の抵抗は、細胞の種類および状態に応じて1MΩ・μm2〜100GΩ・μm2となりうる。これにより、Rcellは、4μmの孔の装置では80KΩ〜8GΩであることが推定される。Rsは、表面タンパク質およびフィルムの粗さのために細胞膜と窒化ケイ素フィルムの間の密封が不完全であることによるシャント抵抗を示す。図20に示すように、RsはRcellと並列であるので、密封抵抗の存在は細胞膜の抵抗測定の分解能を低下し、細胞抵抗の測定可能な範囲を制限することがある。捕獲された細胞各々の密封抵抗の正確な測定を実施することは不可能であるので、良好な機械的接触を確実にして一貫した密封を得るために一定のバックサイド圧力を細胞ごとに維持することが重要である。細胞に機械的な損傷を誘導しないと思われる-1Kpaの吸引圧力は、細胞をその場所に保持するために使用され、数MΩの範囲の密封抵抗が測定される。吸引圧力をさらに増加しても実験観察からは密封にほとんど改善が得られなかったことに注目すべきであり、これは、細胞表面タンパク質と窒化ケイ素膜の間のミクロスケールの機械的および電気的相互作用が密封抵抗において支配的になることを示唆している。本発明者らの検討では実施されていないが、細胞および装置表面への特殊な処理を用いてギガ-Ωの密封抵抗を実施することが可能である(Borkholder, D. A.,微小電極を使用する細胞に基づいたバイオセンサー (Cell based biosensors using microelectrodes)、博士論文、スタンフォード大学、1998年)。RcellおよびRsは本発明者らのケースでは同じオーダーであるので、測定結果からそれらを分離することは不可能である。従って、R*cell=Rcell//Rsは、微小孔に捕獲された個々の細胞によって生じる全細胞抵抗と呼ばれ、簡単にするために以下では細胞抵抗と呼ぶ。
【０１３２】
電気測定による単一細胞の生存度評価
上記の方法を使用して、本発明者らは、生きているDU-145細胞および膜に損傷のあるDU-145細胞の抵抗を測定した。本発明者らは、細胞の一部は生存しており、残りは生存していない、通常の細胞集団の細胞を検討した。本実験において、本発明者らは、YOYO-1染料を取り込んだ集団の細胞(細胞膜の損傷を示す)の電気的応答を、蛍光のない同数の集団の細胞と比較した。図21は、4μmの微小孔装置を使用して、50mV  100ms励起パルス下における生細胞および膜が損傷している細胞の典型的な電流読み値を示す。図21は、蛍光を発光している細胞、膜が無傷の生細胞、および空の孔を通過する電流を比較する。膜が無傷であった細胞を通過する電流は、YOYO-1染料の取り込みが損傷のある膜を示す細胞を通過する電流よりも小さいことが明白である。言い換えると、生細胞の無傷の膜は、死細胞よりもはるかに大きい電気抵抗を示す。死細胞および生細胞の電流の修正時間（settling time）は2ms未満であることに注目することも有用であり、非常に小さい電気容量効果を示している。これは、細胞膜特性の迅速な一時的摂動を測定するのに特に重要である。
【０１３３】
図22は、膜に損傷のある細胞および膜が無傷の細胞の電気抵抗の定量的な比較を提供する。両細胞は、4μmおよび6μmの微小孔装置を使用して、-1KPaの吸引圧力下で微小孔に捕獲され、50mV 100msの励起パルスに付される。ベースラインを確立するために、細胞が微小孔を遮断していない場合にも抵抗測定値を取った。4μmの微小孔装置では、空の孔の抵抗は0.223±0.012MΩであり、無傷の細胞(n=26)が存在する場合には、チップの抵抗は4.213±1.960MΩであった。しかし、同じパルスを蛍光を発光する細胞(n=36)に適用すると、測定される抵抗は0.578±0.076MΩであった。6μmの微小孔装置では、空の孔、死細胞(n=28)、および生細胞(n=24)のチップ抵抗は、それぞれ0.108±0.008MΩ、0.270±0.070MΩ、および1.414±0.568MΩであった。チップの抵抗は主に、直列の2つの部分、微小孔抵抗Rholeおよび総細胞抵抗R*cellからなるので、細胞の抵抗は、単純に、測定されたチップ抵抗から微小孔抵抗を引くことによって算出される。従って、4μmの微小孔装置で得られた死細胞の平均抵抗は0.355±0.088MΩであり、3.900±1.972MΩであった生細胞の抵抗と有意に異なる(p<0.0001)。同様に、6μmの微小孔装置は、膜損傷のある細胞の抵抗が0.162±0.078MΩであり、これと比較して、無傷の細胞の抵抗は1.306±0.576MΩであり、やはり死細胞および生細胞の電気抵抗の有意な差(p<0.0001)を示している。
【０１３４】
これらの結果は、単一細胞の電気抵抗の測定は、膜が損傷している死細胞を膜の完全性が十分に保存されている生細胞と識別する直接的で即時的な方法でありうることを示している。
【０１３５】
Triton X100毒性試薬に対する力学的細胞応答
細胞膜の完全性をリアルタイムで測定する能力を用いて、本発明者らは、生物学において広範に使用されている細胞溶解試薬であるTriton X100によって誘導される細胞損傷の力学的経過を検討した。本発明者らの検討において、種々の用量のTriton X100を添加することによる細胞死を証明するために、蛍光染料YOYO-1を死細胞マーカーとして使用した。図22は、1%Triton X100溶液を添加する前後のDU-145細胞の明視野および蛍光画像を示す。6μmの微小孔装置を検討に使用した。画像は、20X対物レンズを使用してOlympus BX60顕微鏡を使用して取得し、SONY CCDカメラで記録し、画像キャプチャーカードを介してパーソナルコンピュータに転送した。本発明者らの画像キャプチャー装置の感度は限られているので、そのままの蛍光画像は印刷するには適しておらず、妥当なコントラストを形成するように調節し(図22Bおよび図22B')、結果をさらによりよく示すために反転処理した画像も提供してある(図22Cおよび図22C')。図22A、B、およびCは、細胞溶解化合物を添加する前に取った画像であり、画像には3種の細胞が存在することがわかり、1つの標的細胞は-1KPaのバックサイド圧力下において微小孔を塞いでおり、その隣は死んだ細胞であり、基準として下方左に別の生細胞が存在する。膜不透過性染料YOYO-1は健康な細胞には流入できないので、死細胞だけが蛍光画像において見られる(図22Bおよび図22C)。図22A'、B'、およびC'は、チップの上方のチャンバーに1%Triton X100を添加してから1分後に取ったものである。画像視野の全細胞集団が蛍光となることが、顕微鏡下で明らかに観察でき(図22B'および図22C')、これはTriton X100は細胞を損傷させ、細胞はYOYO-1分子を排除できなくなったことを示している。Tritonで損傷を加えた細胞の蛍光強度は、自然に死んだ細胞の蛍光強度より実質的に弱いことに注目すべきであり、これは、YOYO-1染料がDNA/RNAに結合するのを妨害するか、または染料-核酸化合物の発光効率を低下する可能性のある、TritonX100とYOYO-1染料または核酸との生化学的相互作用と思われるものの結果であると考えられる。
【０１３６】
種々の用量のTriton X100に対する個々の細胞の力学的応答を図23に示す。先ず、-1KPaの吸引圧力下で6μmの微小孔装置に個々の細胞を導入した。次いで、50mVの連続探索電圧をAg/AgCl電極に適用し、これらの検討では50msの試料間隔で対応する細胞抵抗を記録した。図23Aは、長期の探索時間にわたって実施した細胞抵抗の対照検討を示す。細胞抵抗は500秒間の連続励起電位下でほぼ一定値を維持したことがわかり、これは50mVの探索電位は細胞膜を物理的に損傷しないことを示した。図23Bは、細胞溶解用途のために提案されている濃度である(Triton X100製品情報、Sigma)1% Triton X100の添加に対する生きているDU-145細胞の膜応答を示す。細胞の最初のチップ抵抗は約1MΩであり、t=30秒の時点で、10%Triton X100溶液の1μLを、9μLの細胞懸濁液が充填されている上方のチャンバーに導入すると、実際のTriton X100濃度は1%になった。毒性試薬を添加してから大体5秒以内に、チップ抵抗は260KΩに低下した。これは十分に、死細胞について既に確立されている抵抗の範囲内である。従って、標的細胞の死は、1%Triton X100試薬の添加後5秒以内に生じたと結論づけることができる。図23Cは、t=30秒の時点で0.1% Triton X100に暴露した別のDU-145細胞で得られた。この場合には、細胞抵抗の突然の変化が毒性試薬導入後約30秒経過時に生じた。膜抵抗が死細胞の抵抗より約250KΩ大きいとき、細胞膜はある程度の完全性を維持しているようであった。この準安定状態は約60秒継続し、この時点で細胞抵抗は死細胞の平均抵抗値に徐々に低下し始めた。これはその標的細胞の最終的な死を示す。このパターンの下降応答は低用量のTritonX100を用いた本発明者らの実験において繰り返し観察され、外部刺激によって誘導される細胞死は有害な試薬の用量に依存することを示した。比較として、同じ装置を使用してTriton X100に対する死細胞の応答も検討した。典型的な抵抗測定を図23Dに示し、これは、t=30秒の時点における1% Triton X100の暴露による死細胞の膜の摂動を示している。死んだ細胞の抵抗がゆっくりではあるが目に見えるほど低下しているのは、おそらくTriton X100による膜タンパク質の溶解が継続していることにより、損傷のある細胞膜にさらに損傷が加えられていることを表している。
【０１３７】
最後の注目点として、細胞膜は、Triton X100溶液の添加直後に抵抗の増加を短時間経験していることが図23Bおよび図23Cから明らかである。本発明者らの対照検討により、細胞が存在しない場合は、容量／容量濃度で5%以下のTriton X100の導入はチップ抵抗に影響を与えないことが示されたので、一時的な抵抗の増加が常に見られることは、細胞膜を物理的な損傷から保護する細胞の活動に関連するに違いない(Bashford, C. L.、孔形成毒素：細胞表面への付着と防御(Pore-forming toxins: attach and defence at the cell durface). Cell. Biol. Mol. Lett. 6: 2A, 328-333, 2001)。
【０１３８】
実施例6は、単一細胞の膜電気特性の高分解能のリアルタイム評価のためのマイクロ加工装置を使用している。本発明者らは、この装置を使用して、死(膜が損傷されている)細胞および生細胞の電気抵抗は有意に異なることを見出した。これは、個々の細胞の膜抵抗の評価は、単一細胞レベルで細胞膜の完全性および細胞の生存度を判定するための、即時的・定量的で正確な測定を提供することを示しており、生物学において通常使用される従来の蛍光または比色染料アッセイを上回る多数の利点を提供する。膜損傷試薬Triton X100を細胞に導入し、次いで微小装置を用いて細胞の抵抗を連続的に評価することによって、外部刺激に対する細胞応答も検討した。リアルタイムの膜抵抗分析は、種々の濃度のTriton溶液によって誘導される細胞死の力学的経過についての定量的な情報を明らかにすることに成功しており、このことは、細胞死および薬物などの外部刺激に対する細胞応答の力学の検討だけでなく、単一の生物細胞を使用する高感度で即時的な毒素の検出のために、この新規技術が有用であることを示している。
【０１３９】
実施例7-序文
細胞の生存度を示すための電気インピーダンス断層撮影法
多くの医学的用途において、インビボにおいて生細胞と死細胞を識別することは重要である。例えば、癌治療、機械的傷害、または低体温もしくは低酸素への暴露後に、標的細胞または損傷を受けた細胞が生きているかどうかを知ることは必須である。細胞の生存度を識別することは、卒中後のような状況において脳の損傷を評価する場合にも重要である。脳の活動を測定する方法は現在利用可能となりつつある。しかし、脳の組織評価を除いて、インビボにおいて細胞の生存度を正確に評価する技術、またはある種の低侵襲性外科手技の成功もしくは事故の重症度を定量化する手段はほとんどない。本発明を使用すると、組織中の細胞の生存度を細胞の電気インピーダンスを測定することにより判定することができる。これは、検出のツールとして電気インピーダンス断層撮影法を使用することによって実施することができる。
【０１４０】
細胞の生存度を判定する方法は、機能によるものまたは特性によるものの2つがある。生存度は、陽子射出断層撮影法(PET)を用いて、例えば細胞の代謝機能であるグルコースを処理する能力を測定することによって、細胞機能により試験することができる。細胞の特性を使用して生存度を判定する最も一般的な方法の1つは、生細胞を死細胞から分離する主な識別特徴である細胞膜の完全性を判定することによるものである。膜の完全性が失われると、そうでなければ細胞内に流入しない化学物質が流入できるようになる。従って、懸濁液中の細胞および切除した組織中の細胞についての生存度試験は、無傷の細胞の膜を通常は透過できない化学物質が細胞の内部に存在するかどうかを試験するために設計されている。細胞内部に入ると細胞の色を変えるトリパンブルーなどの比色染料およびヨウ化プロピジウムまたはYOYO-1(Molecular Probes オレゴン州)などの蛍光染料が、最も一般的である。
【０１４１】
細胞膜は、高分子が細胞に流入するのを防止する以外に、イオン輸送障壁としても機能し、低周波数の電流が細胞に入るのを防止する。従って、膜が損傷されていると、イオンは比色染料と同様に細胞を通過することができる。結果として、細胞膜損傷により現される細胞壊死によって、バルク組織の導電性の測定可能な増加が生ずるはずである。組織内では、細胞の生存度は、バイオインピーダンス技法を使用してこの変化により判定することができる。
【０１４２】
電気インピーダンス断層撮影法(EIT)は、生物電気的特性の差を使用して、生体または器官内部の空間的な組織インピーダンスの分布を示す画像を作成する、バイオインピーダンス技法である。一般に、電極を生体の周囲に配置し、電極対を介して生体に微弱電流パターンを注入すると同時に、続いて生じる電位を残りの電極で測定する。再構成アルゴリズムは、これら電圧測定値、電流対情報、および電極の幾何学的構成をインプットとして採用する。再構成アルゴリズムは一般に、画像形成領域を数多くのインピーダンス画素に分割する、画素に基づくアプローチである。ポアソン方程式の逆解法は通常非線形であるので、アルゴリズムは数値的方法を使用して解を繰り返し見つける。最初の推定後、通常均一な伝導性で、システムが目的関数の何らかの解に収束して画像を生じるまで、各画素のインピーダンスを調節する。EITは、生体または器官内部の空間的な組織インピーダンス分布を示す画像を作成し、本発明は、電気インピーダンス断層撮影法を用いて、細胞死の結果としての組織電気インピーダンスの変化を使用して画像を作成する。
【０１４３】
電気的特性は、特定用途として冷凍外科術を使用して生きている組織と死んだ組織を識別することが不可欠である状況において使用される。冷凍外科術は、標的組織に接触する凍結剤によって冷却された針様の外科用プローブで、組織を冷凍することによって組織を破壊する外科的手技である。凍結病変の程度をリアルタイムでモニターする画像形成技法の出現により、現在では、画像形成してモニターしながら実施される冷凍外科術が、前立腺癌および肝臓癌を治療する際に使用されている。しかし、無差別的な冷凍処理は必ずしも組織を破壊しないことが見出された。むしろ、組織破壊は、冷凍処理中に適用される熱パラメーターの関数である。従って、冷凍処理の程度は、一連の画像形成技法を用いて良好にモニターできるが、冷凍外科術の効果的な適用は、冷凍処理の程度は組織破壊の程度に必ずしも対応しないという事実によって依然阻止されている。本発明は、確実に損傷させる熱的条件および細胞が生存する熱的条件で冷凍した組織の電気的特徴を実験的に比較している。次いで、実験データをEITモデルに組み入れ、冷凍処理によって破壊された組織と冷凍処理を生き抜いた組織との間の電気インピーダンスの変化を使用して、冷凍外科術によって処理した組織の電気インピーダンス断層撮影画像を形成することができるかどうかを判定する。
【０１４４】
実施例7
組織破壊を生じる熱パラメーターおよび組織が冷凍処理を生き抜く熱パラメーターを用いた冷凍処理後の組織の電気的特性の変化を評価するために、実験手法を実施した。実験は、動物を麻酔後数分以内に切除したSpraque-Dawleyラットの新鮮な肝臓組織を用いて実施した。切除後、ラット肝臓を厚さ2 mmの切片に切断し、液体窒素または-20℃の空気中で冷凍し、次いで37℃の生理食塩液中で急速に融解した。ラット肝臓の導電性を、以下の3つの状況について測定した：切除後、液体窒素(-190℃)を使用した冷凍後、-20℃の空気でゆっくり冷凍した後。図25は、組織に挿入した熱電対で測定したときの、後の2つの場合の冷却速度を示す。これらの特定の熱パラメーターは、冷凍(液体窒素)によって完全な組織破壊または冷凍した肝細胞の90%より多くの細胞の生存(-20℃の空気)を生じるという理由から選択した。肝臓組織は、比較的均質で、従って巨視的に比較的等方性であり、組織に対する電極の配向性に関する問題がないという理由から選択した。各実験条件について5回の実験を実施した。電気測定実験は全て体温(37℃)において実施し、30秒間記録した。組織は、使用時まで0.9%水溶液中で保存した。
【０１４５】
固有抵抗の測定は、径12mmの2つの電極(In vivo Metric、カリフォルニア州ヒールズバーグ)の間の2.0cm2の円形の断面の非伝導性チャンバーに、切除した組織を配置して実施した。接触抵抗を最小にするために、表面積が大きい銀／塩化銀電極を正弦波入力と共に使用した。1kHzの電流を一方の電極から、試料を通過して他方の電極に注入した。組織を通過する電流の量は、最後の電極とアースとの間に位置する1kOhmの抵抗器の電圧の低下を測定することによって求めた。
【０１４６】
正弦波波形は、関数発生器から発生し、Raytheon(864107-4)25V電源によって電力を供給される、デュアルオペアンプ(dual-op-amp, JFET TLO82CP)電圧-電流変換器(VCC)を使用して変換した。システムはNational Instruments PCI-1200データ取得カードで制御し、National Instruments LabVIEW 6.1取得ソフトウェアを使用してコード化した。数値モデルは、MATLABの偏微分方程式ツールボックス(The Math Works Inc.、マサチューセッツ州ナティック)を使用して解いた。データ取得およびコンピュータ処理は、Intel 800-MHzプロセッサおよび256MBのRAMを備えるCompaq Presario PCで実施した。
【０１４７】
3つの状況の各々の後の組織の構造的完全性を検討するために、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用して試料を調製し、顕微鏡スライド(PSI Berkeley、カルフォルニア州)にのせた。図26は、切除直後の組織切片を示す。図26Aは、200倍において、肝細胞の優れた保存性と細胞質溶解がないことを示す。細胞質の境界と類洞がはっきりと見える。図26Bは、400倍において、核の内部構造も良好に保存されていることを示している。
【０１４８】
図27は、-4.7℃に冷凍した後に続いて融解した組織の、組織学的切片を示す。200倍の拡大では、細胞質の一部は早期溶解を示し、類洞の一部ははっきりとは見えないことがわかる。しかし、形態は全体的に新鮮な試料とほぼ同じであり、核は良好に保存されている。
【０１４９】
図28は、液体窒素を使用して冷却した後に続いて融解した組織の組織学的切片を示し、処理によって組織が重度に損傷されたことを示す。図28Aは、200倍の拡大では、脈管構造は認識可能であるが、肝細胞の細胞質の境界は全て消失していることを示す。類洞および内皮細胞は見えず、細胞質の融解は非常に激しく生じている。図28Bは、400倍の拡大において、核および内部構造のほとんどは見えなかったことを示している。
【０１５０】
この実験は、肝臓の固有抵抗が、標準化された値の1(0.068)から、液体窒素で冷却した試料については0.363(0.026)に低下し、-4.7℃に冷凍した試料については1.096(0.0628)に変化することを示す(ここで、括弧内の数字はサンプルサイズ5の標準偏差である)。損傷を誘導しない熱的条件で凍結した肝臓は電気的特性を保持したが、細胞壊死を誘導する条件で凍結した肝臓は電気インピーダンスの有意な低下を経験したことが明らかである。これらの結果は、切除直後の組織と0℃をわずかに下回る温度で凍結した組織との間ではほとんど差を示さないが、切除直後の組織と液体窒素を使用して凍結した組織との間には顕著な損傷を示す組織学的評価と一致している。この結果はまた、細胞膜損傷のある細胞膜はイオン電流を阻止しないので、細胞膜損傷は電気インピーダンスの低下を生じるという仮定を確認するものである。
【０１５１】
数値的方法と結果
電気インピーダンス断層撮影法が組織の生存度を検出する可能性を示す最初の段階として、本発明者らは、各々が損傷のある組織の小切片を含有する径6cmの肝臓組織を示す二次元画像形成シミュレーションを作成した。肝臓は、外科手法中、電気的に絶縁性の半剛性電極アレイ固定具に一時的に配置されるとする。従って、シミュレーションの表面にはゼロのフラックス境界条件を与え、電極配置の不確定性エラーは考慮しなかった。
【０１５２】
本発明者らのシミュレーションでは、モデルの周囲に32の電極を等しい間隔で配置した。1mAの電流を対向電極対を介して注入すると同時に(「プロジェクション（projection）」)、残りの対向対の電圧差を記録する(「対向-対向」データ収集アルゴリズムとして知られる)。各電流プロジェクションについて、結果の電圧は、伝導性マップのインピーダンス分布を使用して、微細メッシュ有限要素システムにおいてポアソン方程式を解くことによって得た。その後に続く電圧測定値の収集は、独立の電圧測定値のベクトルを生じ、そのベクトルの長さは、十分に規定された行列逆数（matrix inverse）を存在させるための最大数の独立変数(本発明者らの場合には、464インピーダンス画素)を規定する。次いで、再構成アルゴリズムを使用して、既知の電流インプット、電極の幾何学的構成、および測定された電圧データから画像を作成する。
【０１５３】
本発明者らは、すぐれた収束特性のために、改良型Newton-Raphson(NR)再構成アルゴリズムを使用した。この方法は、シミュレーションされたファントムの全電圧測定値と再構成アルゴリズムの内部モデルの測定値との間の差を示す目的関数を繰り返し最小にする試みをする。悪状況を克服するためにマクワルト規則化を使用する感度行列法を使用してヤコビアン行列を算出した。
【０１５４】
再構成アルゴリズムの内部モデルは、366個の三角形要素の内側画像形成領域と、制限つきの一定の固有抵抗を有する外側リングとを有する有限要素メッシュを含んだ。これらのパラメーターについて、このアルゴリズムの収束基準は、典型的には、約5分かけて約20回の反復後に満たされた。
【０１５５】
損傷のない画像領域内に、冷凍により損傷した組織の4つの異なる分布をシュミレーションするために、4つの異なる導電性マップを作成した。予備的な評価により、非可逆的な電気穿孔と比較して冷凍外科術の導電性の摂動は小さいことが示された。従って、控えめな推定として、シミュレーションは、健康な組織については1.0ρoOhm cmおよび損傷のある組織については0.363ρoOhm cmの、冷凍外科術実験結果の組織の固有抵抗を組み入れた。
【０１５６】
図29Aおよび29Bはそれぞれ、第1の状況の導電性マップおよび作成された画像を示す。この例では、損傷のある組織は径2cmの円形で、組織の中心に位置する。図30Aは、組織の右上方に位置する1.5cm×2.0cmの損傷組織の楕円形の小片である、第2の状況の導電性マップを示す。図30Bは作成された画像を示す。図31Aは、組織の左下部分に位置する径1.5cmの損傷組織の円形の小片である、第3の状況の導電性マップを示す。図31Bは作成された画像を示す。図32Aは、先の2つの例の重ね合わせである、組織の内側に2箇所の損傷領域を含有する導電性マップである。図32Bは作成された画像を示す。4つの場合全てにおいて、再構成アルゴリズムは、損傷組織のサイズおよび位置を示す画像を作成し、電気穿孔によって損傷された組織を画像形成するためにEITを使用できることを示す。
【０１５７】
この実施例7は、特殊な用途である冷凍外科術を使用して、インビボにおいて健康な組織と損傷のある組織を識別することが不可欠である状況において電気測定を使用することができるかどうかを検討したものである。細胞膜の完全性は、エクスビボおよびインビトロ用途のための細胞の生存度を検出する最も一般的に使用されている方法の1つである。細胞膜の完全性の損失は組織のバルクとしての生物電気学的特性も変化させるので、EITは、インビボにおける生存度検出のための画像形成技法に安価で柔軟な補助手段を提供することができる。本発明者らの実験データおよびシミュレーションした導電性の分布から、本発明者らは、冷凍外科術によって損傷された組織の空間的分布を示す二次元EIT画像を作成した。大きめの血管の現実的不均質性、患者間変動、画像の質に対するノイズの影響、3D領域の非平面の電流、および電極の非線形挙動を含む複雑さは、後期段階において対処されうる。これらの問題は、再構成アルゴリズムをさらに改良し、厳密な実験を実施することにより解決可能になる。本検討の結果は、EITは、冷凍外科手技、非可逆的電気穿孔後の損傷組織、および全般的にインビボ用途のための組織の生存度を画像化するために使用できることを示している。
【０１５８】
本発明は、具体的な態様を参照して記載されているが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更を加えることができ、等価物と交換することができることが、当業者によって理解される。また、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス段階、または段階を、本発明の目的、精神、および範囲に適合するために多数の改良を加えることができる。このような改良は全て、本明細書に添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】電気穿孔を実施するために電流の補助を使用しないで生物細胞に化学物質種を注入するための、本発明を実施する際に有用な微小拡散装置の断面図である。
【図２】生物細胞に孔形成を実施するための、および選択的に電気穿孔の補助を使用して細胞に化学物質種を注入するための、本発明を実施する際に有用な装置の断面図である。本装置はまた、細胞の生存度の変化による膜の透過性の変化を検出するために、細胞を通過する電流を測定するために全般的に有用である。
【図３】図3Aは、生物細胞の移動懸濁液のために設計された、本発明による電気穿孔装置の長手方向の断面図である。図3Bは、図3Aに示す装置の横方向の断面図である。
【図４】図2の構造とほぼ同じ構造の微小電気穿孔装置を使用して実施した一連の電気穿孔実験における電流対電圧のプロットである。
【図５】図2と同様の微小電気穿孔装置を使用して実施した別の一連の電気穿孔実験における電流対電圧のプロットである。
【図６】図6Aは電気穿孔前の細胞周囲の電流を示し、図6Bは電気穿孔後（電気穿孔中）の細胞を通過する電流を示す。
【図７】本発明に使用するための典型的な電気インピーダンス断層撮影(EIT)システムを示す。
【図８】図8Aは非可逆的電気穿孔による細胞を通過する電流の画像であり、図8Bは可逆的電気穿孔による細胞を通過する電流の画像である。
【図９】電極(色の濃い点)で境界を示された円形領域の組織を示す有限要素メッシュの概略的なグラフ図である---ドメインは2つの異なるインピーダンスを有する。
【図１０】典型的な電極構成、測定される電気変化、および異なる電気インピーダンスが含まれる円形のドメインの等電位線を略図で示す。
【図１１】実際の画像を上部左側に示し、示差的なインピーダンスマッピングを示すインピーダンスマッピングを下部右側に示す。
【図１２】本発明の細胞の生存度検出装置の概念的な斜視図である。
【図１３】本発明の装置においてアッセイされる細胞の実際の写真である。
【図１４】アッセイされる生細胞、死細胞、および細胞が存在していない装置の電流対時間のグラフである。
【図１５】図14に示すデータを代表する棒グラフである。
【図１６】生細胞、死細胞、および細胞が存在していない装置の電流対時間のグラフである。
【図１７】図16に示すデータを代表する棒グラフである。
【図１８】銀／塩化銀電極を備えた微小装置の概略的な断面図である。
【図１９】単細胞の電気的特性を評価するためのシステム構成の略図である。
【図２０】細胞-孔組み合わせの等価的電気回路モデルを略図で示す。
【図２１】50 mV 100ms励起パルス下において、a)細胞が孔に存在しない、b)膜が損傷されている細胞が存在する、c)生細胞が存在する、4μmの微小孔装置の典型的な電流測定値を示すグラフである。
【図２２】4μmおよび6μmの微小孔装置を使用した、細胞が存在しない孔、死細胞、および生細胞の電気抵抗の比較を示すグラフである。
【図２３】1%v/v膜損傷試薬Triton X100によって誘導される細胞損傷の視覚的検討の画像を示す。画像は、蛍光付属装置を備えるOlympus BX60顕微鏡で得た。図23Aは、1% Triton X100溶液を添加する前の6μm微小孔装置に存在する細胞の明視野画像である。図23Bは、対応する蛍光画像である。図23Cは、蛍光画像を反転した画像であり、蛍光強度を示す。図23A'は、1% Triton X100試薬を導入60秒後の細胞の明視野画像である。図23B'は、損傷した細胞の対応する蛍光画像である。図23C'は、反転した蛍光画像であり、標的および基準細胞の細胞損傷を示す。
【図２４】細胞の抵抗のリアルタイム記録による毒性試薬に対する単細胞の力学的応答のグラフを示す。図24Aは、500秒にわたる50 mVの調査用の連続電圧下における生細胞の対照抵抗測定検討である。図24Bは、30秒経過時において添加した1% Triton X100に対する生細胞の抵抗応答であり、生細胞および死細胞の抵抗の変化が図に示されている。図24Cは、30秒経過時において添加した0.1% Triton X100に対する生細胞の抵抗応答である。図24Dは、30秒経過時において添加した1% Triton X100に対する死細胞の抵抗応答である。
【図２５】凍結した肝細胞の時間対温度のグラフである。
【図２６】図26Aおよび26Bは、それぞれ200倍および400倍における肝細胞の画像である。
【図２７】徐々に凍結したラット肝臓組織の画像である。
【図２８】図28Aおよび28Bは、それぞれ200倍および400倍におけるラット肝臓組織の画像である。
【図２９】図29Aおよび29Bは導電性マップである。
【図３０】図30Aおよび30Bは導電性マップである。
【図３１】図31Aおよび31Bは導電性マップである。
【図３２】図32Aおよび32Bは導電性マップである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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