(57)【要約】免疫抑制の療法と組み合わせた寛容原の投与により、哺乳動物宿主において抗原特異的免疫寛容性を誘導する。本方法は、任意選択により、寛容原の不在下で免疫抑制剤を投与する、先行する条件付け期間を含む。寛容化療法の後、宿主は抑制剤の投与を中止するが、寛容原に存在する免疫原性エピトープに対する特異的免疫寛容性を維持することができる。最適には、寛容原は、広範な寛容化細胞型においてインビボで低濃度での取り込みを可能にする高取り込み特性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物宿主をＴ細胞免疫抑制剤で維持する寛容化療法の間に、高取り込み部分を含む有効用量の寛容原を投与するステップを含み、
ここで、前記寛容化療法に続いて、前記Ｔ細胞免疫抑制剤の投与を止めた時に、前記哺乳動物宿主は前記寛容原に存在するエピトープに対して特異的に寛容であり、それ以外は実質的に正常な免疫系を含む、
哺乳動物宿主において抗原特異的免疫寛容性を誘導する方法。
【請求項２】
寛容化療法が、抗増殖性物質の投与をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主Ｔ細胞応答を抑制するのに十分な期間、前記寛容原の不在下で前記Ｔ細胞免疫抑制剤および前記抗増殖性物質の組み合わせを投与するステップを含む条件付け期間が、前記寛容化療法に先行する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞免疫抑制剤の初期用量を投与して、宿主血中の前記物質の谷レベルで抑制レベルを維持する請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記寛容化療法の間に、前記宿主がＴ細胞免疫抑制剤および抗増殖性物質の組み合わせにより少なくとも６週間維持される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞免疫抑制剤が、イムノフィリンである請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記イムノフィリンが、シクロスポリンＡである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
谷レベルが少なくとも約２００ｎｇ／ｍであるように、前記シクロスポリンＡの初期用量を投与する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
谷レベルが少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌであるように、前記シクロスポリンＡの初期用量を投与する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗増殖性物質が、ヌクレオチド類似物である請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド類似物が、６−メルカプトプリン薬である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記６−メルカプトプリン薬が、アザチオプリンである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗増殖性物質が、抗代謝薬である請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗代謝薬が、ジヒドロ葉酸リダクターゼまたはヌクレオチド代謝に関与するその他の酵素のインヒビターである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオチド代謝酵素が、ジヒドロ葉酸リダクターゼであり、そして前記インヒビターが、メトトレキセートまたはその類似物である請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記アザチオプリンが、１〜５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で少なくとも約２週間維持される請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも約６週の寛容化療法の間、有効用量の前記寛容原を少なくとも６回投与するステップを含む請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記寛容原の前記有効量が、正常治療用量の５０％未満である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記寛容原の前記有効量が、正常治療用量の１０％未満である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記寛容原が、高取り込みレセプターが前記哺乳動物宿主において広く発現されるポリペプチドである請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記寛容原が、マンノース６−ホスフェートを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記寛容原が、目的の抗原のマンノース６−ホスフェートコンジュゲートである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記寛容原が、治療用ポリペプチドである請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療用ポリペプチドが、抗体、凝固因子、酵素および成長因子からなる群から選択される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記寛容原が、自己抗原である請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
前記寛容原が、複数の自己抗原を含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記寛容原が、移植抗原を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記寛容原が、複数の移植抗原を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原に対する既往応答に関して前記哺乳動物宿主をモニター観察するステップと、前記抗原に対する免疫グロブリン力価の上昇時に、前記寛容化療法を繰り返すことにより前記抗原に対する寛容化を再誘導するステップとを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
高取り込み部分に結合したポリペプチド抗原と、
医薬上許容される賦形剤と
を含む寛容化組成物。
【請求項３１】
ペプチド抗原および医薬上許容される賦形剤を含む寛容化組成物と、
使用のための指示書と
を含むキット。
【請求項３２】
Ｔ細胞抗免疫抑制剤をさらに含む請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
抗増殖性物質をさらに含む請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記ペプチド抗原が、高取り込み部分にコンジュゲートしている請求項３１に記載のキット。
【請求項３５】
寛容原の抗原成分に対する免疫寛容性の予防的誘導におけるＴ細胞免疫抑制剤との組み合わせ治療に使用するための医薬品の製造のための、抗原および高取り込み部分を含む寛容原の使用。
【請求項３６】
組み合わせ治療が、抗増殖性物質をさらに含む請求項３５の使用。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞免疫抑制剤が、イムノフィリンである請求項３５の使用。
【請求項３８】
前記イムノフィリンが、シクロスポリンＡである請求項３７の使用。
【請求項３９】
前記シクロスポリンＡが、約０．５ｍｇから１０ｍｇの間の量で存在する請求項３８の使用。
【請求項４０】
前記抗増殖性物質が、ヌクレオチド類似物である請求項３６の使用。
【請求項４１】
前記ヌクレオチド類似物が、６−メルカプトプリン薬である請求項４０の使用。
【請求項４２】
前記６−メルカプトプリン薬が、アザチオプリンである請求項４１の使用。
【請求項４３】
前記抗増殖性物質が、抗代謝薬である請求項３６の使用。
【請求項４４】
前記抗代謝薬が、ジヒドロ葉酸リダクターゼのインヒビターまたはヌクレオチド代謝に関与するその他の酵素のインヒビターである請求項４３の使用。
【請求項４５】
前記ヌクレオチド代謝酵素が、ジヒドロ葉酸リダクターゼであり、そして前記インヒビターが、メトトレキセートまたはその類似物である請求項４３の使用。
【請求項４６】
前記アザチオプリンが、約０．５ｍｇ〜１０ｍｇを含む組成物に処方される請求項４２の使用。
【請求項４７】
前記寛容原が、高取り込みレセプターが前記哺乳動物宿主において広く発現されるポリペプチドである請求項３５の使用。
【請求項４８】
前記寛容原が、マンノース６−ホスフェートを含む請求項３５の使用。
【請求項４９】
前記寛容原が、目的の抗原のマンノース６−ホスフェートコンジュゲートである請求項３５の使用。
【請求項５０】
前記寛容原が、治療用ポリペプチドである請求項３５の使用。
【請求項５１】
前記治療用ポリペプチドが、抗体、凝固因子、酵素および成長因子からなる群から選択される請求項５０の使用。
【請求項５２】
前記治療用ポリペプチドが、第ＶＩＩＩ因子である請求項５０の使用。
【請求項５３】
前記第ＶＩＩＩ因子が、高取り込み部分にコンジュゲートしている請求項５２の使用。
【請求項５４】
前記高取り込み部分が、N結合炭水化物上の高親和性取り込みマーカーを含むイズロニダーゼである請求項５３の使用。
【請求項５５】
前記寛容原が、β細胞抗原を含む請求項３５の使用。
【請求項５６】
前記β細胞抗原が、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、ＩＡ２およびインスリンからなる群から選択される請求項５５の使用。
【請求項５７】
前記β細胞抗原が、ＧＡＤである請求項５６の使用。
【請求項５８】
前記ＧＡＤが、高取り込み部分にコンジュゲートしている請求項５７の使用。
【請求項５９】
前記高取り込み部分が、トランスフェリンレセプター、メラノトランスフェリンレセプターおよびマンノース６−ホスフェートレセプターからなる群から選択されるレセプターに結合するペプチドである請求項５８の使用。
【請求項６０】
前記高取り込み部分が、マンノース６−ホスフェートレセプターに結合しているペプチドである請求項５８の使用。
【請求項６１】
前記ペプチドが、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）である請求項６０の使用。
【請求項６２】
前記寛容原が、自己抗原である請求項３５に記載の使用。
【請求項６３】
前記寛容原が、複数の自己抗原を含む請求項６２に記載の使用。
【請求項６４】
前記寛容原が、移植抗原を含む請求項３５に記載の使用。
【請求項６５】
前記寛容原が、複数の移植抗原を含む請求項６４に記載の使用。
【請求項６６】
請求項３５〜６５のいずれかに記載の医薬品を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は哺乳動物において免疫寛容性を誘導するための方法および組成物を志向する。本方法は寛容化療法において免疫抑制剤と組み合わせた高取り込み寛容原の投与を含む。
【背景技術】
【０００２】
免疫寛容性は広範な臨床上重要な適用と高度に相関する。抗原特異的寛容性誘導は自己免疫疾患および移植片拒絶の処置または予防の主要な目標であり、これは現在非特異的免疫抑制治療により調節されているが、その結果感染率の上昇、癌および薬物に関連する病理に至る。免疫寛容性誘導のその他の適用にはアレルギーおよび喘息、骨髄移植並びにタンパク質基盤の治療などがある。
【０００３】
分子生物学の最初の実際的な適用の１つはその多くが治療活性を有している希少生物学的物質を大量に生成する能力である。しかしながらこれらの作用物質の投与中に患者は免疫応答を開始して、治療活性に結合および干渉する抗体の生成に至り、そして急性または慢性免疫学的反応を引き起こす可能性があることが解っている。タンパク質は複合抗原であり、そして多くの場合、患者は抗原に対して免疫学的に未経験であるので、この問題はタンパク質である治療薬に最も重要である。
【０００４】
この型の免疫応答は少なくとも数例の、例えば血友病Ａ（Ａｌｅｄｏｒｔ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔ．４７：２０８−２１７（１９９４））、真性糖尿病（Ｇｏｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ５５：１１６−１１８（１９８５））、アデノシン・デアミナーゼ欠損（Ｃｈａｆｆｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．８９：１６４３−１６５１（１９９３））、ゴーシェ病（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８２：１４０２−１４０９（１９９３））、およびポンペ病（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ、Ｇｅｎｅｔ．Ｍｅｄ．３：１３２−１３８（２００１））のような欠損障害を伴う患者において見出されている。血友病Ａでは、抗体は第ＶＩＩＩ因子機能を阻止できる活性化されたプロトロンビン複合体濃縮物での代替治療を必要とする。アデノシン・デアミナーゼ欠損では、ＰＥＧ修飾アデノシン・デアミナーゼに対する抗体が酵素のクリアランスを高め、そして効率を低下させる。ゴーシェ病では、ＩｇＧ１抗体の誘導は、注入中の補体活性化によるアナフィラキシー性反応に随伴される。ポンペ病では、組換えアルファ・グルコシダーゼでの代償療法の結果、処置された３人中２人の患者で抗体の誘導に至り、これは治療の効率低下を招く。
【０００５】
同様の免疫応答が遺伝子治療によるタンパク質治療薬の分配において見出されている。例えば、ベクターに随伴されるウイルスタンパク質は炎症を引き起こし、発現を短縮し、そしてベクターの反復投与を妨げ得る免疫応答の標的である（ＷｉｌｓｏｎおよびＫａｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：８８７−８８９（１９９５））。遺伝子治療実験においても治療用タンパク質に対する抗体応答が観察されており、そして長期間発現を妨げる全体的な免疫応答の一部である（Ｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ８８：３７７−３７９（１９９６））。一般化された免疫抑制、遮断および体液性から細胞性応答への免疫偏移を利用してこの問題に対処されているが、抗原に対する長期間持続的な寛容性を保証できそうにない。
【０００６】
寛容性を、その免疫応答がなければ正常である免疫系の設定において特異的抗原に対する免疫応答の不在として定義することができる。自己成分に対する特異的免疫学的寛容性のこの状態には中枢性および末梢性の双方の機構が関与している。中枢寛容性（負の選択）は、依然胸腺内に存在するが、強力な細胞内シグナル発生を受け取る未成熟Ｔ細胞の結果であり、それにより自己反応性細胞のクローン除去に至る。末梢性寛容性は、免疫系が末梢に存在する抗原に対して非反応性になるときに生じ、その場合胸腺と対照的にＴ細胞は機能的に成熟していると考えられる。末梢性寛容性は、抗原特異的サプレッサー細胞またはその他の活発な寛容性の手段の発達、クローン除去およびアネルギーなどの種々の機構の結果であると提示されている。寛容化抗原の認識後のアポトーシスの誘導により自己反応性細胞は物理学的に削除され得るか、削除されなければアネルギーになり得るか、または制御サイトカインまたは細胞により機能的に阻止され得る。近年多くのことが解ってきているが、インビボでの抗原暴露の結果を予測するのは依然困難であり、そして基本的なレベルでの寛容性の機構のさらなる解明が必要とされている。
【０００７】
動物モデルにおいて、例えば自己免疫障害、例えば多発性硬化症（または実験的アレルギー性脳炎、ＥＡＥ）または糖尿病に関して、抗原特異的寛容性を誘導するために、および同種組織移植片の拒絶を防御するために多くの処置計画が開発されている。マウスおよびラットモデルにおいて開発された主要な方法には、可溶性抗原の高量投与、抗原の経口摂取または胸腺内注射などが含まれる。これらの方法の有効性は様々な程度でクローン除去、クローンアネルギー、抗原特異的Ｔ細胞による活発な抑制、および細胞性から体液性免疫応答への免疫偏移に依存する。
【０００８】
可溶性抗原の大量投与により、続く免疫学的誘発に対して非応答性が誘導されることは以前から解っているが、ＥＡＥの研究はまたこの研究法の困難を強調している。高用量が必要とされ、そして寛容性対免疫偏移が一貫しないことにより、可溶性抗原投与単独はたいていの遺伝子治療状況で非現実的なものになる。
【０００９】
非常に大量の抗原のマウスへの経口投与もまたタンパク質抗原に対する寛容性を誘導することが実証されている。しかしながら、極端な用量が必要とされ、そして結果は複雑である。特定の用量によりアネルギーが招かれることが見出されているが、その他の用量により、抗原特異的ＴＨ２型応答を特徴とする抗原特異的バイスタンダー抑制の形態が誘導される。加えて、経口抗原が免疫系を感作し、そしてさらに重篤な疾患を導き得る。
【００１０】
抗原または細胞の胸腺内注射は中枢免疫寛容性を誘導するための技術として広く開発されている。注射されそして胸腺内に存在する抗原は、１０日間までかかり得る過程においてＣＤ４+、ＣＤ８+Ｔ細胞のアポトーシスまたはアネルギーを引き起こすことができる。経口および可溶性抗原寛容性と同様に、寛容化効果は用量依存的である。低用量の抗原は感作するか、または部分的な保護のみを提供するが、高用量の抗原は寛容化する。胸腺内での抗原提示の文脈もまた重要である。抗原が宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示される場合、寛容性は最も効率よく誘導される。一度寛容化されると、動物内での抗原の持続的な存在が寛容性の維持に必要とされ、そして成熟Ｔ細胞の枯渇もまた必要とされるかもしれない。
【００１１】
寛容性誘導の１つの処置計画は、最適なＴ細胞活性化は抗原特異的シグナルおよび非抗原特異的シグナルの双方を必要とするという発見に基づいている。抗原提示の間にＴ細胞および抗原提示細胞の双方へのシグナル発生を伴う、種々の重要な双方向性同族相互作用を生じる。最もよく理解されている同時刺激シグナルはＴ細胞表面分子ＣＤ２８を介して提供される。ＣＤ２８は２つのリガンド、相同分子ＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）を有し；双方は活性化されたＡＰＣおよびいくつかのその他の細胞型で発現される。重大な注目を集め、そしてＴ細胞同時刺激において重要な別の経路はＣＤ４０およびそのリガンドであるＣＤ１５４により媒介される経路である。ＣＤ１５４は活性化されたＴ細胞、主にＣＤ４+Ｔ細胞において発現される。
【００１２】
過去数年において、種々の研究室によりＴ細胞同時刺激シグナルの遮断が長期間の同種移植片生存率を改善し、そして移植寛容性を誘導できることが示されている。これらの研究のほとんどは、ＣＤ８０およびＣＤ８６と競合的に結合するＣＴＬＡ−４およびヒトＩｇＧの融合タンパク質であるＣＴＬＡ４Ｉｇ、またはＣＤ１５４に対する遮断モノクローナル抗体のいずれかを用いている。同時刺激遮断は心臓、肝臓、島、腎臓、肺、および骨髄移植のマウスおよびラットモデルにおいて一部成功している。単一の物質単独、例えばＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＣＤ１５４抗体は長期間移植片生存率を改善できるが、これらの作用物質がそれ自体無期限の移植片生存を生み出す可能性はない；慢性拒絶の結果である後期同種移植片喪失が通常である。最も一般的には、供与体特異的リンパ球の移入またはＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ＣＤ１５４の組み合わせのいずれかが、寛容性を伴っても、伴わなくても長期間生存に必要とされる。さらに、非ヒト霊長類での結果はげっ歯類モデルほどに良好ではない。
【００１３】
寛容性を誘導するためにＣＴＬＡ４Ｉｇおよび／または抗ＣＤ４０抗体が用いられているネズミモデルでは、シクロスポリンの併用投与により寛容性の誘導が妨げられることが示されている。同時刺激シグナルを剥奪されているＴ細胞における寛容性の誘導は、シクロスポリンに感受性のあるＴＣＲシグナル発生事象に関与する活発な過程であると思われる。従って、シクロスポリンの存在下では、この手段によって寛容性を達成することができない。従って、これらの参考は、寛容性誘導計画においてシクロスポリンの使用から離れることを教示している。
【００１４】
移植後２日に投与されたＣＴＬＡ４Ｉｇおよび供与体特異的リンパ球の組み合わせを用いて心臓同種移植片寛容性をマウスにおいて誘導するプロトコールでは、移植時のＣＴＬＡ−４の遮断により寛容性誘導が妨げられ、そして早期拒絶に至る。従って、早期ＣＴＬＡ−４シグナルはいくつかのＴ細胞寛容原／阻止計画に許容され得る；これらのシグナルがなければ、免疫応答のスイッチを切ることが困難であることが判明するであろう。同様に、自己免疫疾患のネズミモデルでは、ＣＴＬＡ−４の遮断が疾病の期間および重篤度を悪化させる。ＣＴＬＡ４Ｉｇのような作用物質はＣＤ８０およびＣＤ８６のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４双方への結合を防御するので、これらは正のシグナル（ＣＤ２８を介する）を遮断する可能性および負のシグナル（ＣＴＬＡ−４を介する）を遮断する望ましくない能力の双方を有している。
【００１５】
これらの方法の全てにおいて、寛容性は誘導が不確かであり、ヒトにおいて達成されないか、または治療的もしくは臨床的に有用でないかのいずれかである。抗原に対する免疫応答を防御する方法が臨床上必要とされている。本発明はこの問題に対処する。
【発明の開示】
【００１６】
哺乳動物宿主において抗原特異的免疫寛容性を誘導する方法が提供される。目的の抗原に存在する実質的に全ての免疫原性エピトープを含む寛容原を、顕著な免疫抑制を提供するのに十分な用量のＴ細胞免疫抑制剤と組み合わせて一定時間をかけて哺乳動物宿主に投与する。処置計画はさらに抗増殖性物質の投与を含むことができる。本発明の１つの実施形態では、この寛容化療法は、寛容原の不在下でＴ細胞免疫抑制剤を投与する条件付け期間により先行される。寛容化療法の後、宿主の免疫抑制剤の投与を中止するが、寛容原に存在する免疫原性エピトープに対する特異的免疫寛容性を維持することができる。場合によっては寛容化療法が完了した後に寛容原の維持用量を投与する。
【００１７】
寛容原はいずれかの抗原、特に可溶性タンパク質抗原、例えば治療用タンパク質、移植抗原のカクテル等でよく、そして目的の抗原と同一でよいか、または寛容原特性が増強された、例えばノンプロフェッショナル抗原提示細胞により取り込みを増加させるために修飾された抗原の形態でよい。好ましくは、寛容原は高取り込み部分を含み、そして広く存在する高親和性レセプター、例えばマンノース６−ホスフェートレセプター等により効率よく取り込まれる。広く存在し、そして親和性が同等であるその他のレセプターもまた適している。適当な高取り込み能力のない抗原を、細胞型を寛容化することにより取り込みを可能にするこの機能を提供する部分を含有するように修飾することができる。
【００１８】
本発明の１つの実施形態では、宿主は目的の抗原に対して免疫学的に未経験であり、すなわち抗原に対して既存または記憶免疫応答がない。本発明の別の実施形態では、宿主を抗原に暴露した。後者の場合、既存の免疫応答の原因である免疫系の細胞を除去する必要があり得る。
【００１９】
本発明はさらに、寛容原の抗原成分に対する免疫寛容性の予防的誘導におけるＴ細胞免疫抑制剤との組み合わせ治療において使用する医薬品を製造するための抗原および高取り込み部分を含む寛容原の使用を企図する。
【００２０】
本発明の特定の態様では、免疫抑制剤の用量がＴ細胞を実質的に抑制するのに十分でなければならないことに留意すべきである。異なる対象において、および異なる条件下でＴ細胞抑制が同一の程度に至るように薬物の用量のバリエーションを組み合わせることができる。Ｔ細胞抑制のレベルを、Ｔ細胞が抗原刺激に応答して増殖しないレベルであるようにモニター観察する。Ｔ細胞増殖をモニター観察する方法は当業者に公知であり、そして本発明と組み合わせて用いることができる。
【００２１】
好ましい実施形態では、抗原／寛容原の用量範囲を０．００１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ／週の間にすることができる。さらに好ましくは、寛容原の用量範囲は０．０１ｍｇから１ｍｇ／ｋｇ、そしてさらに好ましくは０．００３ｍｇ／ｋｇ／週から０．１ｍｇ／ｋｇ／週の間である。好ましい実施形態では、抗原／寛容原の用量は週１回０．０５６ｍｇ／体重ｋｇである。
【００２２】
免疫抑制剤がＣｓＡであるこれらの好ましい実施形態では、血漿濃度が＞４００ｎｇ／ｍｌに達するようにＣｓＡを投与するが、３００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上を用いることもできる。好ましい用量範囲は１ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇの間でよく、最も好ましくは、ヒトにおける用量範囲は５から１５ｍｇ／ｋｇ／日の間でよい。このような１日用量を、全用量の２、３、４またはそれ以上の分画に分割することにより投与することができ、これを日中に間隔を空けて投与する。また別に、用量を１回の単回用量として投与することができる。
【００２３】
本発明の医薬品はさらにヌクレオチド類似物を含むことができる。類似物がアザチオプリンであるこれらの実施形態では、この作用物質の用量範囲は、毎日または隔日投与される１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日でよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
宿主を寛容化するのに十分な期間、寛容原を免疫抑制計画と組み合わせて投与することにより哺乳動物宿主において抗原特異的免疫寛容性を誘導する。免疫抑制はＴ細胞免疫抑制剤を投与することにより達成する。本方法はさらに抗増殖性物質の投与を含んでよい。本方法は場合によっては、寛容原の投与に先行して、寛容原不在下で免疫抑制剤を投与する条件付け期間を含んでよい。寛容化療法の後、宿主の免疫抑制剤の投与を中止するが、寛容原に存在する免疫原性エピトープに対する特異的免疫寛容性を維持することができる。寛容化療法が完了した後は寛容原の維持用量を投与することができる。
【００２５】
本発明の１つの実施形態では、宿主は目的の抗原に対して免疫学的に未経験であり、すなわち抗原に対して既存または記憶免疫応答がない。本発明の別の実施形態では、宿主を抗原に暴露しておく。後者の場合、既存免疫応答の原因である免疫系の細胞を除去する必要があり得る。本発明者は本発明の寛容化療法を用いて、所与の抗原に対する既存免疫応答を伴うイヌにおいて相対的寛容性を誘導するかまたは免疫グロブリン力価を低減させることができることを示した。
【００２６】
本方法は、タンパク質またはその他の免疫原性物質を未経験宿主に投与する積極的な寛容性の確立に有用である。例えば、予め宿主に存在しない治療用抗体、成長因子、酵素、およびその他のポリペプチドの投与により著明な免疫応答を引き起こすことができ、これは処置の有効性を低下させる。積極的な寛容性の確立によりこのような処置の長期間の有効性が増強される。移植前の寛容性の確立；および自己免疫疾患の処置における本発明の本方法の使用もまた見出されている。
【００２７】
例示的な研究では、本発明者は組換えヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ｒｈＩＤＵ）に対する臨床上有意な抗原特異的免疫応答を低減または防御するための方法を用いてイヌムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ  Ｉ）を処置することを実証した。本方法は、Ｔ細胞免疫抑制剤、例えばシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）および抗増殖性物質、例えばアザチオプリン（Ａｚａ）を低用量ｒｈＩＤＵの毎週の静脈内注入と組み合わせた初期３０から６０日処置計画を用いる。イヌにおけるｒｈＩＤＵの毎週の注入に対する典型的な強力なＩｇＧ応答は、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびアザチオプリン（Ａｚａ）を低用量ｒｈＩＤＵの毎週の静脈内注入を組み合わせた６０日処置計画を用いて大きく低減されるかまたは防御された。さらに具体的には、該計画を用いて、８匹のイヌはｒｈＩＤＵ（ＣｓＡ＋Ａｚａなしで６週間）の１２週毎週注入の後に抗体力価が２０倍低下し、６か月までのさらなるｒｈＩＤＵ注入およびｒｈＩＤＵ全治療用量で力価は増加しなかった（８匹の正常およびＭＰＳ  ＩイヌはＥＬＩＳＡにより平均抗体力価７．２ＯＤ単位／血清μｌを有し、８匹の対照イヌにおける１４９ＯＤ単位／μｌと比較した）。イヌは治療的高用量のイズロニダーゼに６か月まで力価を上昇させずに寛容化され（平均７．５ＯＤ／血清μｌ、ｎ＝６）、一方免疫応答性イヌはさらに２から３倍抗体力価を上昇させた（平均３６９ＯＤ／血清μｌ、ｎ＝２）。免疫応答性イヌの抗血清はインビトロでイズロニダーゼの細胞性取り込みを＞９５％まで阻止し、一方非応答性イヌの抗血清は阻止しなかった。データにより単純なプロトコールが、リソソーム酵素代償療法に対する臨床上有意な免疫応答を防御または低減させることができ、そしてその他の臨床上有意な抗原に対する免疫応答を低減させることができることが示唆される。
【００２８】
研究により、寛容化療法の成功を決定する重要な１つの因子は、ＣｓＡの血清レベルの谷の値が高いこと、好ましくは＞４００ｎｇ／ｍｌであることが実証された。加えて、寛容化抗原の研究により、高親和性、マンノース６−リン酸化（Ｍ６Ｐ）酵素（ｒｈＩＤＵ、アルファ・グルコシダーゼ）が寛容原として作用できるが、非リン酸化タンパク質卵白アルブミンは作用できないことが実証された。脱リン酸化されたｒｈＩＤＵが寛容状態を誘導できないので、高親和性Ｍ６Ｐメーカーが必須であるようである。全てのＴ細胞活性化がＣｓＡ＋Ａｚａにより抑制される条件下で寛容性を誘導するが、未成熟およびノンプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）がＭ６Ｐレセプターを介して抗原を効率よく担い、抗原応答性Ｔ細胞を不活性化するか、または制御Ｔ細胞を活性化してイヌにおいて寛容状態を誘導するモデルが提示される。これらの発見を利用するための方法および組成物を本明細書の以下でさらに詳細に論じる。
【００２９】
定義
本発明の方法を記載する前に、本発明は記載する特定の方法に限定されず、当然変化し得るものと理解すべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で用いる用語は特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、そして限定を意図するものではない。
【００３０】
値の範囲が提供される場合、その文脈が明確にそれ以外を指示しない場合、下限値の単位の１０分の１までで、その範囲の上限値から下限値の間で介在する各々の値、および記載された範囲内のいずれかその他の記載されたまたは介在する値は本発明の範囲内に包含されると理解される。これらのより小さな範囲の上限値および下限値を独立してこれらのより小さな範囲に含めることができ、記載された範囲内でいずれかの具体的な排除限界に供することができる。
【００３１】
特記しない場合、本明細書で用いる全ての技術および科学的用語は本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書で記載するものに類似するかまたは等価であるいずれかの方法および材料を本発明の実施または試験において使用することもでき、好ましい方法および材料をここで記載する。関連して出版物が引用される方法および／または材料を開示および記載するために本明細書にて言及する全ての出版物は参照して本明細書に組み込む。
【００３２】
本明細書および添付の請求の範囲で用いるように、その文脈が明確にそれ以外を指示しない場合、単数形態「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数の対象物を含むことに留意しなければならない。
【００３３】
本明細書で論じた出版物は単に本出願の出願日に先行するその開示のために提供される。本発明は、先行発明によるこのような出版物に先行するために権利を与える許可として意図されることは決してない。さらに、出版物の提供された日付は実際の公開日とは異なる可能性があり、これは別個に確認される必要があろう。
【００３４】
抗原。本明細書で用いる抗原なる用語は哺乳動物宿主において免疫応答、特に体液性免疫応答、すなわち抗原特異的抗体の生成により特徴付けられる免疫応答を引き出すことができる分子を意味する。目的の抗原は治療用薬、例えばポリペプチドおよびそのフラグメント；自己抗原、例えば自己ポリペプチド；移植抗原；等である。抗原に応答して、種々のクラス、サブクラスおよびアイソタイプの抗体が生成される。
【００３５】
抗体により結合される抗原の部分はエピトープと称される。抗原、特に複合抗原、例えばポリペプチドは通常複数のエピトープを含む。抗原がタンパク質である場合、直鎖状エピトープは約５から２０個のアミノ酸の長さの範囲である。抗体は抗原の隣接していない残基により形成される高次構造の決定基を認識することもでき、そして従ってエピトープは結合のために存在する抗原の大きなフラグメント、例えばタンパク質ドメインまたは実質的に全てのタンパク質配列を必要とし得る。従って、アミノ酸長が数百個になり得る治療用タンパク質は多くの別個のエピトープを含むことができることは理解されよう。
【００３６】
「特異的」であると考えられる抗体結合の親和性のレベルは一部、抗体のクラスによって決定され、例えばＩｇＭクラスの抗原特異的抗体は、例えばＩｇＧクラスの抗体よりも親和性が低い。本明細書で用いるように、抗体相互作用を「特異的」であると考えるために、目的のエピトープに関する親和性は少なくとも約１０-7Ｍ、通常１０-8Ｍから１０-9Ｍになり、そして１０-11Ｍまでまたはそれ以上でよい。「特異性」なる用語はこのような高親和性結合を意味し、そして抗体がその他の分子に同様に結合できないか、またはエピトープに対する幾分わずかな交差反応性が宿主において存在し得ないことを意図するものではないことは当業者に理解されよう。
【００３７】
抗原特異的免疫寛容性。本発明の目的に関する寛容性は、それがなければ実質的に正常な免疫系の設定における、特異的抗原に対する免疫応答の不在である。寛容性は一般化された免疫抑制とは区別され、ここで免疫応答の全て、または全クラス、例えばＢ細胞媒介免疫応答が低下する。
【００３８】
治療用抗原特異的免疫寛容性は宿主において、目的の治療用分子、例えば治療用タンパク質を通常の有効用量で複数回投与することができる特定の状態を提供する。このような抗原特異的寛容性が不在の場合、治療用物質の通常用量の連続投与により、抗体の治療用物質との相互作用により効果が低減され、そして従って有効用量に必要な作用物質の量が増加する。本発明の方法に従って抗原特異的免疫寛容性が達成される場合、治療用物質の有効用量に必要な量は、連続投与後、約５倍を超えて増加することはなく、通常では連続投与後約２．５倍を超えず、そして初期用量以上に増加することはない。
【００３９】
また別に、または前記した有効性の利点と組み合わせて、免疫寛容状態により治療用タンパク質またはその他の薬物投与の安全性が高められる。薬物に対する免疫応答は、寛容性が不在である場合、特異的抗体の生成に基づくアナフィラキシーまたはアナフィラキシー性もしくは免疫複合反応を引き起こす。本発明の方法による寛容性の存在下で観察される免疫応答の低下または不在はまた、低下した抗体に媒介される不都合な事象に因るこのような薬物の投与の安全性低下を低減および制限する。
【００４０】
目的の抗原が自己抗原である場合、抗原特異的免疫寛容性の誘導は患者における自己免疫疾患の症状を低減させるのに十分であり、例えば患者は一般的な免疫抑制剤、例えばコルチコステロイドの不在下で、または存在量を減らして通常の活性を維持するように十分に改善され得る。
【００４１】
目的の抗原が１つまたはそれ以上の移植抗原である場合、抗原特異的免疫寛容性の誘導により、移植された器官が受体宿主において一般的な免疫抑制剤の不在下で、または存在量を減らして生存し、そして機能することが可能になる。
【００４２】
抗原特異的免疫寛容性を決定するためのまた別の方法は、治療用物質の連続投与後の宿主動物の血清中の抗原特異的抗体の存在を観察することである。非寛容宿主では、抗原、例えば治療用物質、自己抗原、移植抗原等に特異的な抗体の力価は、連続投与、すなわち暴露時に、桁違いに増加する。例えば治療用タンパク質の連続投与の約８週後に特異的抗体力価は約５０倍以上、しばしば１００倍以上に上昇でき、そして時間を経て１０００倍またはそれ以上ほどにも増加し得ることが本明細書で示されている。寛容宿主では、特異的抗体力価の上昇は対応する非寛容宿主の増加の１０％を超えず、そして増加の約５％を超えることはない。例えば特異的抗体力価の５０倍未満の増加は約８週から数か月までの期間観察できる。特定の作用物質に対して観察される増加の具体的なレベルは、作用物質の宿主への暴露前は作用物質の特性、作用物質を投与する様式、応答を測定する方法等に依存して変動する。患者血清中の特異的抗体の存在を決定するための方法、例えばＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等は当分野で周知であり、そして本明細書にて詳述する必要はない。
【００４３】
寛容性の別の態様は、それがなければ実質的に正常な免疫系の存在である。本発明の方法は一般的な免疫抑制を志向せず、そして寛容化療法の後、目的の抗原以外の抗原に対する免疫応答は実質的に正常であり、未処置対照と比較して通常約５倍を超えて低下せず、さらに通常的には、未処置対照と比較して約２倍を超えて低下せず、そして正常な応答と区別できないこともある。
【００４４】
本発明の方法から有利であり得る哺乳動物種には、イヌ；ネコ；ウマ；ウシ；ヒツジ等、および霊長類、特にヒトなどがある。動物モデル、特に小型哺乳動物、例えばネズミ、ウサギ等を実験研究用に使用することができる。目的の動物モデルには治療用タンパク質投与、自己免疫、移植片拒絶等のモデル用のものなどがある。
【００４５】
高取り込み部分を含む寛容原。寛容原は、寛容化療法の間に宿主に投与される目的の抗原の形態であり、抗原に存在する実質的に全てのエピトープを含み、そのエピトープを作用物質の１つまたはカクテルとして提供することができる。寛容原および抗原が同一であるが、修飾、処方等の存在において相違がある場合もある。寛容原を可溶性形態で、すなわち凝集物を実質的に含まず、そして無細胞形態で投与するが、目的の抗原は不溶性でなければならない。寛容原はまた免疫系との相互作用を増強するためのキャリアを含むこともでき、目的の抗原から誘導される複数のフラグメントを含むことができ；寛容原性を高める基に結合していてよく、目的のポリペプチド部分等を含む融合タンパク質でよい。
【００４６】
寛容原は高取り込み部分を含むか、またはそれに共有結合しているかのいずれかである。高取り込み部分は広く認識され、そしてノンプロフェッショナル抗原提示細胞上に存在するレセプターにより内在化されているポリペプチドである。抗原を提示する場合に寛容化する末梢および中枢細胞で広く発現され、そしてマクロファージ、樹状細胞またはその他のプロフェッショナル抗原提示細胞で独占的に発現されるわけではないレセプターを選択するのが好ましい。抗原を提示する場合に寛容化する細胞には、例えば肝臓類洞内皮細胞、皮質／髄質胸腺上皮細胞、および類似の細胞型などがある。
【００４７】
レセプターがリガンドに関して少なくとも約１０-6Ｍ、通常少なくとも約１０-7Ｍ、さらに通常的には少なくとも約１０-8Ｍ、および好ましくは少なくとも約１０-9ＭのＫuptakeを有するのが特に好ましく、ここでＫuptakeは細胞において最大取り込みの５０％を生じるリガンドの濃度を表す。目的のレセプターにはトランスフェリンレセプター、メラノトランスフェリンレセプター、マンノース６−ホスフェートレセプター、成長ホルモンレセプターなどがある。同族リガンドには、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ２）、トランスフェリン、成長ホルモン、インスリン、およびその結合フラグメント、特に多様な細胞型上で特異的および高親和性レセプターを有するポリペプチドなどがある。無作為ファージディスプレイ系に由来する１本鎖抗体および結合物質がレセプターに関して十分な親和性を有する場合、それらを使用することができる。リガンドおよびレセプター組み合わせのＫuptakeを決定するために、当分野で公知の方法（例えばα−Ｌ−イズロニダーゼのＫuptakeを決定するために用いるアッセイに関して、Ｋａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５（３）：２２５−２３２（１９９４）参照）を用いることができる。開示した方法はいずれかのリガンドおよびレセプター組み合わせに容易に適合される。このようなアッセイはまた外因性の高取り込み部分を含む寛容原の取り込みを確認するのにも有用である。
【００４８】
抗原がこのようなレセプターによって取り込まれるポリペプチドである場合、抗原および寛容原は同一でよい。目的の抗原がノンプロフェッショナル抗原提示細胞によりそれほど広く取り込まれないポリペプチドである場合、寛容原は抗原の修飾された形態でよく、例えば抗原および高取り込み部分（リガンド）、例えばマンノース６−ホスフェート、トランスフェリン等のコンジュゲートでよい。
【００４９】
また別に、寛容原はアミノ酸変化、例えば置換、欠失、付加等を含む抗原性ポリペプチドの修飾された形態でよく、これは高取り込みに関する配列を伴うポリペプチドを提供する。例えば、適当な翻訳後修飾を提供するために、グリコシル化モチーフ、例えばマンノース６−ホスフェートの付加のためのモチーフを付加または変化させることができる（Ｃａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（３２）：２３３４９−２３３５６（１９９２））。本発明の１つの実施形態では、寛容原は（ａ）目的の抗原の全てまたは一部；および（ｂ）高取り込み部分を有するタンパク質のフラグメント（ここでフラグメントは高取り込み特性を付与するのに十分である）；を含む融合タンパク質である。例えば翻訳後グリコシル化およびマンノース６−ホスフェートの付加のために必要なモチーフを含むα−Ｌ−イズロニダーゼのフラグメントを目的の抗原に融合させることができる。
【００５０】
化学基をポリペプチドに結合させる方法は当分野で周知である。結合に使用されることが見出されている化学基には当分野で公知であるように、カルバマート；アミド（アミン＋カルボン酸）；エステル（アルコール＋カルボン酸）チオエーテル（ハロアルカン＋スルフヒドリル；マレイミド＋スルフヒドリル）、シッフ塩基（アミン＋アルデヒド）、尿素（アミン＋イソシアナート）、チオ尿素（アミン＋イソチオシアナート）、スルホンアミド（アミン＋塩化スルホニル）、ジスルフィド；ヒドラゾン、脂質等がある。結合が物質の輸送後にサイトゾルで容易に分解されるべきである場合、エステルおよびジスルフィド結合が好ましい。説明用の物質には、アジドベンゾイル・ヒドラジド、Ｎ−［４−（ｐ−アジドサリチルアミノ）ブチル］−３’−［２’−ピリジルジチオ］プロピオンアミド）、ビス・スルホサクシンイミジル・スベラート、ジメチルアジピミダート、ジサクシンイミジルタートラート、Ｎ−γ−マレイミドブチリルオキシサクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホサクシンイミジル−４−アジドベンゾアート、Ｎ−サクシンイミジル［４−アジドフェニル］−１，３’−ジチオプロピオナート、Ｎ−サクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾアート、グルタルアルデヒド、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ；サクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート；３−（２−ピリジルジチオ）プロピン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）；Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセタミド）；または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、およびサクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、ＭＢＳの伸長鎖類似物などがある。これらの架橋剤のサクシンイミジル基は１級アミンと反応し、そしてチオール反応性マレイミドはシステイン残基のチオールと共有結合を形成する。
【００５１】
抑制剤
Ｔ細胞免疫抑制剤。Ｔ細胞免疫抑制剤は、通常その他の細胞、例えばＢ細胞、単球、骨髄造血前駆細胞等の増殖および活性の一般的な抑制を伴わずに、Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞の活性を阻止する化合物である。Ｔ細胞免疫抑制を検定する方法は当分野で周知であり、インビトロアッセイ、例えば抗原の存在下でのＴヘルパー細胞によるＩＬ−２の放出、抗原または刺激剤、例えばＣｏｎ  Ａの存在下での3ＨチミジンのＤＮＡへの取り込み、同種刺激細胞の存在下での51Ｃｒの放出等がある。インビボアッセイはＴ細胞の増殖、サイトカインの放出、活発に抑制されている間の移植片拒絶の不能性等の測定に依存し得る。
【００５２】
これらの目的のための、特定の目的の化合物の群は、カルシニュリンインヒビターとも称されるイムノフィリンであり、これはＴヘルパー細胞を阻止する。カルシニュリンはＣａ2+／カルモデュリン依存性Ｓ／Ｔタンパク質ホスファターゼ２Ｂであり、これはカルシウムシグナル発生経路において重要であることが報告されている。この酵素は６１ｋＤａのカルモデュリン結合触媒性サブユニット（カルシニュリンＡ）および小型（１９ｋＤａ）の制御サブユニット（カルシニュリンＢ）のヘテロ二量体である。免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、ラパマイシン、ＦＫ５０６等は、ＮＦ−ＡＴ（活性化Ｔ細胞の核因子）の核輸入に必要であるカルシニュリンを阻止する。以下で詳細に論じるように、寛容化の目的のためのＴ細胞免疫抑制剤の用量は一般的な免疫抑制に通常用いられる用量よりも高量でよい。
【００５３】
慣用的に実施される様式でイムノフィリンを投与することができる。例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第７版、１２９９頁（１９８５）参照。例えばＣＳＡを、１２．５％  アルコールを伴う１００ｍｇ／ｍｌ経口用溶液として、そして静脈内投与用には３３％  アルコールおよびポリオキシエチル化ヒマシ油６５０ｍｇを伴う５０ｍｇ／ｍｌの溶液として提供することができる。静脈内投与する場合、ＣＳＡを生理食塩水または水中５％  デキストロース２０から１００ｍｇに対する５０ｍｇの希釈溶液として、数時間かける緩慢な注入により投与することができる。静脈内投与用量は典型的には経口用量の３分の１である。最も好ましくは、ＣＳＡを経口で、カプセルまたは錠剤形態のいずれかで投与する。活性化合物および適当な担体（１つまたはそれ以上の補助成分を含有できる）を会合させる工程を含むいずれか適当な製薬方法によりこのような処方を調製することができる。一般に、活性化合物を液体もしくは微細に分割された固体担体のいずれか、またはその双方を均一におよび十分に混合し、そして次に必要な場合、得られた混合物を成形することにより処方を調製できる。ＣＳＡの調製は米国特許第４，１１７，１１８号に開示されている。本発明の実施において使用することができるＣＳＡはＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（登録商標）の名前の下でＳａｎｄｏｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販により入手可能である。ＦＫ５０６はまたタクロリムスとしても公知であり、商品名ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）の下でＦｕｊｉｓａｗａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販により入手可能である。シロリムスとしても公知のラパマイシンは商品名ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）の下でＷｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｐｈａｒｍａｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．から市販により入手可能である。
【００５４】
抗増殖性物質。本発明の方法の目的のための抗増殖性物質は、細胞増殖を低下させる医薬的に活性な化合物である。免疫系の細胞はしばしば活発に分割するので、一般的な抗増殖性物質でさえ免疫抑制効果を有していることがよくある。多くのこのような抗増殖性薬物が当分野で公知であり、例えば化学療法において用いられるようなものがある。
【００５５】
目的の抗増殖性薬物には、代謝拮抗剤、例えばヌクレオチド類似物、例えばアザチオプリン、６−メルカプトプリン、チオグアニン、シタラビン等；その他の類似物、例えばメトトレキセート、ミコフェノール酸、すなわち６−（１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキシ−５−イソベンゾフラニル）−４−メチル−４−ヘキサン酸等がある。あまり好ましくはないが、アルキル化剤、例えばシクロホスファミド、クロラムブシル等もまた、例えば目的の抗原に対して既存の免疫応答がある場合に、免疫抑制性抗増殖性物質としての使用が見出されている。
【００５６】
本発明の１つの実施形態では、抗増殖性物質はアザチオプリン（ＡＺＡ）または６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）である。本明細書で用いる「６−メルカプトプリン薬」または「６−ＭＰ薬」なる用語は治療的有効性を有している活性な６−メルカプトプリン代謝物に代謝できるいずれかの薬物を意味する。本明細書で定義する例示的な６−メルカプトプリン薬には６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）およびアザチオプリン（ＡＺＡ）などがある。その他の６−ＭＰ薬には、例えば６−メチルメルカプトプリン・リボシドおよび６−ＴＧなどがある。６−ＴＧは高活性ＴＰＭＴを有する患者において特に有用な６−ＭＰ薬である。高活性ＴＰＭＴを呈する患者はより容易に６−ＭＰ薬、例えば６−ＭＰおよびＡＺＡを６−ＭＭＰに変換すると予測される。本明細書で用いる「６−チオグアニン」または「６−ＴＧ」なる用語は６−チオグアニンまたはその類似物を意味し、同一塩基構造を有する分子、例えば６−チオグアニン・リボヌクレオシド、６−チオグアニン・リボヌクレオチド一、二および三リン酸、６−チオグアニン・デオキシリボヌクレオシド並びに６−チオグアニン・デオキシリボヌクレオチド一、二および三リン酸が含まれる。「６−ＴＧ」なる用語はまた６−チオグアニン誘導体をも含み、６−ＴＧ塩基の構造が保存される限り、６−ＴＧの化学的修飾を含む。本明細書で用いる「６−メチル−メルカプトプリン」または「６−ＭＭＰ」なる用語は６−メチル−メルカプトプリンまたはその類似物を意味し、同一塩基構造を有する分子、例えば６−メチル−メルカプトプリン・リボヌクレオシド、６−メチル−メルカプトプリン・リボヌクレオチド一、二および三リン酸、６−メチル−メルカプトプリン・デオキシリボヌクレオシド並びに６−メチル−メルカプトプリン・デオキシリボヌクレオチド一、二および三リン酸などがある。「６−ＭＭＰ」なる用語はまた６−メチル−メルカプトプリンの誘導体をも含み、６−ＭＭＰ塩基の構造が保存される限り、６−ＭＭＰの化学的修飾を含む。
【００５７】
６−ＭＰ薬を懸濁液、溶液または油性もしくは水性溶剤中のエマルジョンとして分配することができ、そしてこのような製薬用物質、例えば懸濁剤、安定剤および／または分散剤を含有できる。適当な水性溶剤には生理学的食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、および一般的には「静脈内用溶液」と称される非経口薬物分配のためのその他の溶剤などがある。また別に、活性成分は、使用前に適当な溶剤、例えば滅菌パイロジェン不含水を用いる、滅菌固体の無菌単離により得られるか、または溶液から凍結乾燥された粉末形態でよい。
【００５８】
発明の方法
哺乳動物宿主において寛容原およびＴ細胞免疫抑制剤を同時に投与することにより、抗原特異的免疫寛容性を誘導し、これをさらに前記したような抗増殖性物質の投与と組み合わせることができる。これらの作用物質を別個にまたは一緒に、通常別個に処方することができる。共通の処置スケジュールの経過中に同一時点で、または異なる時点で宿主に導入する場合、作用物質は同時に投与されるといえる。後者の場合、望ましい効果を達成するために化合物を十分に接近した時間で投与する。典型的には、１つの作用物質がその他の作用物質のインビボでほぼ半減期以内に投与される場合、２つの作用物質は同時に投与されると考えられる。患者においていずれかの活性物質は、治療上有効になる十分な組み合わせレベルで存在すべきである。
【００５９】
寛容化療法は、任意選択により、条件付け期間に先行されることもあり、その条件付け期間の間に寛容原の不在下で、１つまたは複数の抑制剤を約１から３週間の期間投与する。条件付けのための期間は、寛容原の投与に先立って宿主におけるＴ細胞反応性を十分に抑制させる。条件付けのための期間は、宿主、抑制剤等に依存して変動し得る。期間を経験的に決定することができるか、または公開されている情報源から得ることができる。
【００６０】
寛容化療法は免疫寛容性を誘導するのに十分な期間Ｔ細胞免疫抑制剤を維持する必要がある。通常Ｔ細胞免疫抑制剤を少なくとも約３週間、通常少なくとも約５週間宿主に投与し、そして少なくとも約８週間またはそれ以上でよい。この期間に、抗増殖薬もまた、薬物に適当なスケジュールで、通常少なくとも隔日、毎日、１日２回またはそれ以上投与する。寛容化療法を長時間継続することができるが、通常患者を抑制剤で処置する期間免疫するのが望ましい。
【００６１】
本発明の重要な態様は、寛容化手順の初期段階で高用量のＴ細胞免疫抑制剤を維持することである。薬物動態では、血流中の薬物の濃度が投与後「ピーク」に到達し、そして次に血液レベルは次の用量の投与前に最低点、すなわち「谷」まで低下する。本発明の方法では、この期間に「谷」が非抑制レベルまで低下しないようにＴ細胞免疫抑制剤の治療レベルを維持することが重要である。所与の投与プロトコールに関する谷の値を決定するために、血流中の薬物濃度を定期的に測定することにより、これを経験的に決定することができる。所与の薬物濃度に関する免疫抑制のレベルを、以前に論じたように経験的に決定するか、または公開された値から得ることができる。薬物の濃度は、Ｔ細胞媒介免疫応答をインビボで開始または維持するのを防御するのに十分である。
【００６２】
高用量の薬物を投与することにより、または標準的な用量をさらに頻繁に投与することにより、薬物の抑制レベルを維持するための谷レベルの上昇を達成することができる。例えばヒトにおいて、シクロスポリンＡを用いて、谷血中レベルを約２００ｎｇ／ｍｌ以上、通常約３００ｎｇ／ｍｌ以上にするのが望ましく、そして約５００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上でよい。イヌ種で寛容性を誘導することが知られているレベルは谷で約４００ｎｇ／ｍｌであるが、その他の種における適当なレベルは宿主の投与される免疫抑制剤に対する感受性を考慮に入れる。特にヒトは、イヌよりもさらにシクロスポリンの影響に感受性がある。一般に、イヌに相対してヒトにおいて代謝速度が低下するために、ヒトに関する用量範囲はイヌよりも低くてよい。代謝速度の相違に基づいて、同一血漿レベルまたは同一の生理学的効果の程度を達成するために、ヒト用量は、イヌ用量のおよそ２分の１（約１０ｍｇ／ｋｇ／日から約１５ｍｇ／ｋｇ／日）でよいと予測される。必要なレベルはデノボ腎またはその他の移植片で用いるレベルに匹敵し（約８±３ｍｇ／ｋｇ／日）、そこで約３５０±１５０ｎｇ／ｍｌの谷レベルを達成できる（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５６版、Ｍｉｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．（Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ニュージャージー州）により出版。２３８１頁）。
【００６３】
例えば、Ｔ細胞免疫抑制剤の初期用量を免疫抑制のための標準的な用量の少なくとも約１２５％、標準的な用量の少なくとも約１５０％、または標準的な用量の少なくとも約２００％に等価またはそれ以上の用量にすることができる。別の実施形態では、用量を慣用される用量にし、さらに頻繁に、例えば１日１回の代わりに１日２回等で投与することができる。経口タクロリムスの慣用される用量は、０．２ｍｇ／ｋｇ／日である。シロリムスの慣用される用量は２ｍｇ／ｋｇ／日である。標準的な用量は具体的な薬物、投与方法、すなわち経口、静脈内等、および宿主に依存して変動する。
【００６４】
高用量期間の終わりに、Ｔ細胞免疫抑制剤の用量を、それを中止する寛容化療法の終わりまで漸減させる。例えば毎週または２週毎に半分にすることにより、いずれかの慣用されるプロトコールを用いることができる。
【００６５】
寛容原が、寛容化細胞により取り込まれ、処理され、そして細胞表面に提示されることが可能になり、そしてＴ細胞がこのような寛容化細胞と相互作用することが可能になるほど十分な時間、通常少なくとも約２週間、さらに通常的には少なくとも約３週間高用量を維持し、そして４週間またはそれ以上でよい。処置計画の６週から８週で、宿主の血清または血漿を検定するために、ＥＬＩＳＡのような方法を用いて抗体力価を測定することにより、用量レベルおよび時間間隔が十分であることを決定することができる。寛容でない宿主は免疫抑制剤の漸減の終わり近くまでに免疫応答を開始している。高用量が必要である期間は条件付け期間を含み、２週間の条件付け期間がある場合、次いで寛容化療法の開始直後に高用量を漸減させることができる。
【００６６】
抗増殖性物質が処置計画に含まれる場合、これは慣用される用量で投与されるが、Ｔ細胞免疫抑制剤は通常少なくとも約２週間、さらに通常的には少なくとも３週間を投与され、そして４週間またはそれ以上でよい。例えば、アザチオプリンの標準的な用量は約１から５ｍｇ／ｋｇ／日であり、処置計画が確立された後、上限で約３から５ｍｇ／ｋｇ／日を初期に用い、そして下限で約１から３ｍｇ／ｋｇ／日を用いる。また抗増殖性物質を隔週毎に投与できる。Ｔ細胞免疫抑制剤に関して前記したように、初期用量が必要な期間は条件付け期間を含み、２週間の条件付け期間がある場合、次いで寛容化療法の開始直後に高用量を漸減させることができる。通常いずれかの慣用されるプロトコールにより、寛容化療法の間中、用量を漸減させるのが好ましい。
【００６７】
寛容化期間中少なくとも２回、通常少なくとも約４回、寛容原を投与し、そして６回またはそれ以上投与することができる。条件付け期間がある場合、その間は寛容原を投与しない。抑制剤とは対照的に、寛容原はあまり頻繁に投与せず、例えば約４日後、約７日後、約１０日後等である。毎週投与が便利である。
【００６８】
寛容原の用量は、一般的に対応する抗原の治療用量よりも少なく、そして抗原の通常の治療用量ほどの量から、治療用量の約５％、治療用量の約１０％、治療用量の約５０％等ほどの量までの範囲でよい。寛容原がポリペプチドである場合、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ／週、通常少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ／週、さらに通常的には少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ／週；そして通常約１ｍｇ／ｋｇ／週を超えない用量を投与する。しかしながら具体的な用量は投与経路、作用物質の活性等に依存することは理解されよう。
【００６９】
寛容原の用量を徐々に上昇させて約３週後、通常約４週後に開始する正常な治療用量に到達させ、そして約６週または８週後でよい。寛容原および抗原が同一でない場合、寛容化療法の後、患者を抗原に転換させることができ、その変化は一定期間、２つの混合物を投与することを含むことができる。
【００７０】
寛容原をいずれか慣用される経路、通常静脈内に可溶性形態で投与する。さらに詳細には、適当な医薬的に許容される担体または希釈剤との組み合わせにより寛容原を処方することができ、そして固体、半固体、液体または気体形態の調製物、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、マイクロスフェアおよびエアロゾルに処方することができる。このように、経口、口腔内、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管支内等の投与などの種々の方法により化合物の投与を達成できる。
【００７１】
医薬用投与形態では、寛容原を医薬的に許容される塩の形態で投与することができる。これを医薬的に活性な化合物と適当に関連させて用いることもできる。以下の方法および賦形剤は単に例示的であり、そしていかなるようにも限定することはない。寛容原を水性または非水性溶媒、例えば植物油またはその他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコール中；そして望む場合慣用される添加剤、例えば可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤を伴って、溶解、懸濁、または乳化することにより、注射用調製物に処方することができる。
【００７２】
本明細書で用いる「単位投与形態」なる用語は、ヒトおよび動物対象に単一投与量として適した物理的に別個の単位を意味し、各単位は、医薬的に許容される希釈剤、担体または溶剤と関連させて、望ましい効果を生み出すのに十分な量に算出された予め決定された量の本発明の化合物を含有する。本発明の単位投与形態に関する明細は用いる特定の化合物および達成される効果、並びに宿主において各化合物に随伴される薬物動態に依存する。
【００７３】
医薬的に許容される賦形剤、例えば溶剤、アジュバント、担体または希釈剤は容易に公に利用可能である。さらに医薬的に許容される補助物質、例えばｐＨ調整および緩衝化剤、張度調整剤、安定剤、湿潤剤等は容易に公に利用可能である。
【００７４】
本発明の方法に適した抗原には多くの治療用活性物質、特に免疫学的に活性でよいポリペプチド、成長因子、ホルモン、凝固因子、代謝酵素等などがある。目的の治療用タンパク質の実例には、血液凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子；アルファグルコシダーゼ；イズロニダーゼ、治療用抗体、例えばヘルセプチン；ＤＮアーゼ；ヒト成長因子；インスリン；等がある。
【００７５】
目的の抗原が自己抗原である場合、または宿主が予め治療用物質に暴露されている場合、患者に存在する成熟免疫細胞のいくつかまたは全てを除去する必要があるかもしれない。このような方法は当分野で公知であり、例えば強力な免疫抑制剤、例えばシクロホスファミド、抗胸腺細胞グロブリン、全身照射（ＴＢＩ）等を利用することができる。
【００７６】
寛容化のための目的の自己抗原には以下のものが含まれる。寛容原は自己抗原の１つまたはカクテルを含むことができる。多発性硬化症には、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）；ミエリン乏突起膠細胞タンパク質（ＭＯＧ）；サイクリック・ヌクレオチド・ホスホジエステラーゼ（ＣＭＰアーゼ）；ミエリン随伴糖タンパク質（ＭＡＧ）、およびミエリン随伴乏突起膠細胞塩基性タンパク質（ＭＢＯＰ）；アルファ−Ｂ−クリスタリン（熱ショックタンパク質）；ＯＳＰ（乏突起膠細胞特異的タンパク質）；シトルリン修飾ＭＢＰ（６アルギニンがシトルリンに脱イミノ化されているＭＢＰのＣ８アイソフォーム）等。
【００７７】
リウマチ性関節炎の自己抗原には、ＩＩ型コラーゲン；ｈｎＲＮＰ；Ａ２／ＲＡ３３；Ｓａ；フィラグリン；ケラチン；シトルリン；ｇｐ３９などの軟骨タンパク質；Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＩＸ、ＸＩ型コラーゲン；ＨＳＰ−６５／６０；ＩｇＭ（リウマトイド因子）；ＲＮＡポリメラーゼ；ｈｎＲＮＰ−Ｂ１；ｈｎＲＮＰ−Ｄ；カルジオリピン；アルドラーゼＡ；シトルリン修飾フィラグリンおよびフィブリンなどがある。
【００７８】
ヒトインスリン依存性真性糖尿病の自己抗原にはチロシン・ホスファターゼＩＡ−２；ＩＡ−２β；６５ｋＤａおよび６７ｋＤａの双方の形態のグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）；カルボキシペプチダーゼＨ；インスリン；プロインスリン；熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）；グリマ３８；ランゲルハンス島細胞抗原６９ｋＤａ（ＩＣＡ６９）；ｐ５２；２個のガングリオシド抗原（ＧＴ３およびＧＭ２−１）；およびランゲルハンス島細胞グルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２）などがある。
【００７９】
重症筋無力症の自己抗原は、アセチルコリンレセプター内のエピトープを含むことができる。尋常性天疱瘡で標的化される自己抗原は、デスモグレイン−３を含むことができる。シェーグレン症候群抗原は、ＳＳＡ（Ｒｏ）；ＳＳＢ（Ｌａ）；およびフォドリンを含むことができる。尋常性天疱瘡において優勢な自己抗原は、デスモグレイン−３を含むことができる。
【００８０】
肺、心臓、肝臓、腎臓、膵臓およびその他の器官並びに組織などの組織移植の免疫拒絶は、移植された器官に対して向けられた応答により媒介される。同種移植された器官は、移植片受体のアミノ酸配列と比較した場合、そのアミノ酸配列の変動を有するタンパク質を含有する。移植された器官のアミノ酸配列は移植片受体のアミノ酸配列と異なるので、これらはしばしば受体において移植された器官に対する免疫応答を引き出す。移植された器官の拒絶は、主要な合併症および組織移植の限界であり、そして受体における移植された器官の不全を引き起こす可能性がある。拒絶の結果である慢性炎症はしばしば移植された器官の機能不全を導く。
【００８１】
意図される移植片受体のための寛容原は、１つまたはそれ以上の主要組織適合性抗原、例えばＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ等を含むことができ、このような抗原のカクテルを含むことができ、ここで抗原は受体および供与体の間で対合しないものを含む。これらは細胞表面タンパク質であるので、投与される形態は可溶性形態、すなわち膜貫通ドメインでトランケートされているものでよい。
【００８２】
必ずしも必要ではないが、抑制剤の中止後、寛容性を増強するために、寛容原の維持用量を提供することができ、この場合維持用量は、週あたり０．０５６ｍｇ／ｋｇに等価かもしくはそれ以下の用量、またはその用量の１／１０もしくはそれ以下、または月１回もしくは数か月毎に１回もしくはそれ以下ほどの低頻度で、または用量および頻度の双方で提供される。寛容原が抗原と異なっている場合、維持相が必要であれば、寛容原を維持相で使用する。
【００８３】
本発明の方法で利用する作用物質をキットで提供することができ、そのキットはさらに使用のための指示書を含むことができる。このようなキットは通常宿主への投与に適した用量および形態の寛容原を含む。キットはさらに投与に適した形態のＴ細胞免疫抑制剤を含み、そしてさらに作用物質の血中レベルをモニター観察するための、および／またはＴ細胞活性の抑制を測定するためのアッセイ試薬を含むことができる。投与に適した形態の抗増殖性物質もまた含むことができる。
【００８４】
キットはまた寛容原性組成物を作製するために、抗原、特にポリペプチド抗原の高取り込み部分への結合をも提供する。例えば、前記で記載したように、糖およびポリペプチドの連結に適したリンカーにいずれか結合したマンノース６−ホスフェート基のような部分を提供することができる。高取り込み部分を非結合形態で、適当なリンカーおよび使用のための指示書と組み合わせて提供することもできる。
［実施例］
【００８５】
以下の実施例は、本発明の作製および使用の仕方の完全な開示および記載を当業者に提供するために示すものであって、本発明者が彼らの発明と見なす範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が全てまたは実施した実験のみであることを提示することを意図するものでもない。使用した数字（例えば量、温度等）に関して正確さを確実にするために努力しているが、いくつかの実験誤差および逸脱を考慮に入れるべきである。特記しない場合、部は重量による部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、そして圧力は大気圧またはほぼ大気圧である。
【実施例１】
【００８６】
実験
正常およびＭＰＳ  Ｉのイヌにおけるヒトα−Ｌ−イズロニダーゼに対する寛容性の誘導
ムコ多糖症Ｉはα−Ｌ−イズロニダーゼ遺伝子の変異により引き起こされる遺伝的症状であり、酵素イズロニダーゼの欠損に至る。この欠損は、粗大化顔貌、巨大舌、巨大肝臓および脾臓、呼吸器障害、心臓障害、関節硬直、並びに骨疾患進行性の多重システムリソソーム貯蔵障害に至る。該疾患は通常１０歳代または２０歳代で患者の死亡に至る。
【００８７】
欠損酵素イズロニダーゼは、ヘパリンおよび硫酸デルマタンの末端イズロニド残基を切断するリソソームヒドロラーゼである。該酵素は、組換え細胞において作製され、そしてその細胞への取り込みに重要である翻訳後に付着した炭水化物上で、マンノース６−ホスフェートマーカーで生成される。酵素代償療法は酵素の組換え形態が静脈内投与され、組織に分配され、そしてマンノース６−ホスフェートレセプターを介して細胞に取り込まれる処置の方法を提示している。該療法は、イヌおよび極最近ではヒトにおいて研究されている（Ｋａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ  ３４４：１８２（２００１））。
【００８８】
組換えヒトα−Ｌ−イズロニダーゼの正常またはＭＰＳ  Ｉイヌへの投与により酵素に対する強力な免疫応答が誘導される（Ｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９１：１２９３７−１２９４１（１９９４）；Ｋａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５８：１５６−１６７（１９９６））、これはヒトＭＰＳ  Ｉ患者において観察されたものを擬似している。これらの応答は酵素治療の有効性に干渉し得る。寛容性を誘導する方法を研究するために、活性な免疫応答を防御し、そして寛容性の誘導を可能にするために設計された種々の条件下で正常なイヌに異種性ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼタンパク質を投与した。研究によりシクロスポリンおよびアザチオプリンの適当な用量、続く組換えヒトα−Ｌ−イズロニダーゼの毎週投与、そして免疫抑制剤の漸次的除去により、毎週の酵素投与の少なくとも６か月で持続する酵素に対する寛容性を誘導できることが実証される。胸腺内注射または抗Ｔ細胞モノクローナル抗体を加えた、または加えないシクロスポリンの低頻度用量は寛容性の誘導に影響を与えない。Ａｚａを用いないで正確な用量のＣｓＡ単独では寛容性を誘導しなかった。
【００８９】
寛容化療法は、図１に示すスケジュールで、寛容原注入と一緒にＣｓＡ＋Ａｚａ処置（ＣｓＡ用量２５ｍｇ／ｋｇ／日で）を利用した。指示したさらなる処置、例えば胸腺内注射およびモノクローナル抗体は作動しなかった、または寛容性誘導を増強しなかった処置の実例として示している。これらの無効な療法は、本発明による抗原に対して最適に寛容化されたこれらのイヌの応答との対比を提供するために実施例に含めている。
【００９０】
胸腺内注射またはモノクローナル抗体を用いるが、ＣｓＡ用量２５ｍｇ／ｋｇ／日ではない非寛容性誘導計画に関しては、イヌは４日に胸腺内注射を受ける。最下段のＩＴ＋イヌに関する計画図式（図１）では、イヌは０から４日にＣｓＡ＋Ａｚａを受け、そして次に胸腺内注射（ＩＴ注射、すなわちＩＴＩ）を受ける。モノクローナル抗体が示されている場合、それをＩＴ注射の前の日に与える。実施する正確な投与量は実験に依存する。非寛容性実験では、Ａｚａと交互の日に隔日にＣｓＡ  ２５ｍｇ／ｋｇをイヌに投与する。寛容化実験では、Ａｚａと交互の日に毎日にＣｓＡをイヌに投与する。いずれかの場合に、投与する用量は記載する順で半分にした。寛容化療法を受けたイヌに関しては、最上段の計画図式は処置の経過を記載している。イヌＰＡにはＣｓＡ単独を投与し、注入を始める４日前に始め、そして上の寛容性誘導計画に従って漸減させた。
【００９１】
材料および方法
動物。正常およびＭＰＳ  ＩのイヌをＨａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡのＭＰＳ  Ｉイヌ・コロニーから入手した。イヌは、ビーグルとプロットハウントの雑種であり、体重は平均１２から２０ｋｇである。これらの実験用にイヌは２年齢以下であり、そして少なくとも４月齢であった。
【００９２】
イヌＢＩ、ＢＥ、ＢＣ、ＢＯ、ＪＡ、ＪＯ、ＭＥ、ＭＡ、ＭＯ、およびＰＡは正常またはＭＰＳ  Ｉイヌ・コロニーからのキャリアのイヌであり、そして従ってＭＰＳ  Ｉを患っておらず、そして寛容性を誘導しない一連の異なる療法を受けた。ＣｓＡ＋Ａｚａは療法の一部である場合、ＣｓＡを隔日に投与した。ＢＩにはリン酸塩緩衝食塩水胸腺内注射（ＩＴＩ）を投与し、ＢＥおよびＢＣにはイズロニダーゼＩＴＩを注射し、ＢＯにはＣｓＡ（ｑｏｄ）＋Ａｚａ＋ＩＴＩを投与し、ＪＡ、ＪＯ、ＭＥ、ＭＥおよびＭＯにはＣｓＡ＋Ａｚａ、ＩＴＩおよび成熟Ｔ細胞を枯渇させる種々のモノクローナル抗体を投与した。ＰＡにはＣｓＡ１日用量を投与したが、寛容性になったイヌとは異なり、このイヌにはＡｚａを投与しなかった。
【００９３】
イヌＲＨ、ＲＩおよびＲＯは正常またはＭＰＳ  Ｉイヌ・コロニーからのキャリアのイヌであり、寛容性を誘導する最低のＣｓＡ＋Ａｚａ療法を受け、そしてＲＨおよびＲＩの場合は胸腺内注射をも受けた。ＣｓＡは毎日投与された。
【００９４】
イヌＲＵはＭＰＳ  Ｉ罹患したイヌであり、寛容化療法を受けず、そして対照として提供された。イヌＰＥ、ＳＡおよびＮＩはＭＰＳ  Ｉ罹患したイヌであり、ＣｓＡ＋Ａｚａの寛容性誘導計画を受けた。
【００９５】
モノクローナル抗体。一連のモノクローナル抗体はＰｅｔｅｒ  Ｍｏｏｒｅ（ＵＣ  Ｄａｖｉｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｈｏｏｌ）から入手され、そしてイヌＴ細胞レセプター（抗ＴＣＲ）、イヌＣＤ３抗原（抗ＣＤ３；ＩｇＧ２ｂ）およびＴｈｙ−１イヌ等価物（抗Ｔｈｙ１；ＩｇＧ１）に特異的であった。ハイブリドーマを低血清含有培地中で増殖させ、そしてプロテインＡクロマトグラフィーにより抗体を精製することにより抗ＴＣＲ抗体を調製した。契約研究所（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）にてハイブリドーマＣＡ１７．６Ｂ３およびＣＡ１．４Ｇ８を用いるマウスにおける腹水の生成並びにプロテインＡクロマトグラフィーにより抗ＣＤ３および抗Ｔｈｙ１抗体を調製した。利用する場合、ＩＴＩの直前に２または３用量でモノクローナル抗体を投与した。
【００９６】
免疫抑制剤。シクロスポリン（ＮｅｏｒａｌまたはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ）およびアザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）を地元の薬局から入手した。双方の薬物は実験で記載した用量および頻度で経口的に投与した。試験した２つの処置計画を直ぐ以下に示す。
【００９７】
寛容性を誘導する、ＣｓＡ毎日投与を伴う免疫抑制剤処置：
ＣｓＡ  Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）２５ｍｇ／ｋｇ／日  １日２回  経口
Ａｚａ  Ｉｍｕｒａｎ（登録商標）５ｍｇ／ｋｇ／日  隔日  経口
ＣｓＡ＋Ａｚａ  ０から３２日は全量投与、３３から４６日は１／２用量、そして４７から６０日は１／４用量、そして次に終了する。
副作用に関して動物をモニター観察する。
ＣｓＡピークおよび谷レベルをモニター観察し、そして循環中の目標谷レベル４００から５００ｎｇ／ｍｌを維持するように用量を調整する。
【００９８】
寛容性を誘導しない、隔日のＣｓＡ投与を伴う免疫抑制剤処置計画：
ＣｓＡ  Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）２５ｍｇ／ｋｇ／隔日  １日２回  経口
Ａｚａ  Ｉｍｕｒａｎ（登録商標）５ｍｇ／ｋｇ／日  ＣｓＡとは別の日に隔日
ＣｓＡ＋Ａｚａ  ０から１８日は全量投与、１９から３２日は１／２用量、３３から４６日は１／４用量、そして４７から６０日は１／８用量、そして次に終了する。
副作用に関して動物をモニター観察する。
ＣｓＡピークおよび谷レベルをモニター観察し、そして循環中の谷レベル１００から２００ｎｇ／ｍｌ。
【００９９】
胸腺内注射。一般的な麻酔の間、３インチ切開を第３肋間の左側に行った。胸腔に到達するまで全ての筋層を通って切開を続けた。肋骨セパレーターを用い、そして胸腺を肺の下で血管が通った浅裂の器官として直接観察した。シリンジおよび２５Ｇ針を用いて酵素溶液を胸腺に注射した。針を抜くときの酵素の漏れを防御しようとして胸腺に針を挿入する場合に「ジグザグ」パターンが作られた。エバンスブルー色素により可視化した酵素溶液のいずれかの漏れに関して胸腺を視覚的に検査した。外科的手術部位を閉じ、そして胸腔に挿入したフォーリーカテーテルを通して真空吸引を用いて呼吸機能回復させた。全ての切開部位に抗生物質を適用し、そして外科的手術に続いて、必要な場合短期間の抗生物質および疼痛管理投薬を行った。
【０１００】
注射溶液、全量１．５ｍｌ：１２．１ｍｇ／ｍｌ  イズロニダーゼ（３×１０6単位／ｍｌ）１ｍｇ／ｋｇ。酸性ＰＢＳ中（最終溶液およそ６％  ＰＥＧ、０．３ｍｇ／ｍｌ  エバンス）４０％  ＰＥＧ＋２ｍｇ／ｍｌ  エバンスブルー色素で１．５ｍｌにする。
【０１０１】
酵素注入。高度に精製された形態の組換えイズロニダーゼを調製し、そして約１ナノモル濃度（Ｋuptake）の酵素濃度でフルラー線維芽細胞への最大取り込みの５０％の高取り込み能力および３．３ナノモル濃度未満の取り込み特異性を有することが実証されている。寛容原注入に関しては、１ｍｇ／ｍｌ  イヌアルブミン、および１０ｍＭ  ＮａＰＯ4を含む食塩水の５０ｍｌ注入液中α−Ｌ−イズロニダーゼ  １４，０００単位／ｋｇ／週を２時間かけて静脈内投与した（１時間目で３，０００単位／ｋｇ／時間、２時間目で１１，０００単位／ｋｇ／時間）。アナフィラキシー反応に関して動物をモニター観察した。２５０，０００単位はタンパク質１ｍｇに等しい。
【０１０２】
結果
実験計画の基本的な概要を図１に示す。イヌの全コホートを免疫抑制剤で前処置し、続いて予定されている場合はＩＴ注射を行い、そして次に２週後の初めにイズロニダーゼの一連の毎週誘発を行った。イヌはその他の処置（胸腺内注射、モノクローナル抗体）を伴うかもしくは伴わない隔日のＣｓＡ（前記の処置計画参照）を用いる非寛容性誘導処置、またはその他の処置を伴うかもしくは伴わないＣｓＡ毎日投与を用いる寛容性誘導処置のいずれかを受けた。１匹のイヌ、ＰＡには毎日ＣｓＡを投与したがＡｚａは投与しなかった。
【０１０３】
第１の酵素誘発の１８日前に等しい０日に、イヌに免疫抑制剤を始めた。予定されている場合、ＩＴＩの直前にイヌに静脈内注入によりモノクローナル抗体（２から５ｍｇ）を投与した。予定されている場合、イヌは４日に１ｍｇ／ｋｇでイズロニダーゼの胸腺内注射を受けた。２週間後、ヒト組換えイズロニダーゼ１４，０００単位／ｋｇ（０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週）の毎週の静脈内注入からなるイズロニダーゼ酵素注入の毎週スケジュールをイヌに始めた。示した材料および方法にて記載したように、ＣｓＡおよびＡｚａの用量を２週毎に半分にした。
【０１０４】
酵素誘発の６から８週後、ＩＴ注射を伴うかまたは伴わないＣｓＡ（毎日）＋Ａｚａの最適プロトコールを受けたイヌ（図２の中抜きの記号）はイズロニダーゼに対して寛容性であり、一方その他の処置計画を受けたイヌはＬＥＩＳＡにより評価されるように強力な免疫応答を有した（図２の塗りつぶした記号）。イズロニダーゼ寛容イヌＲＯは、イズロニダーゼに対して有意なＥＬＩＳＡ力価の誘導を伴わず、６か月間、毎週の酵素誘発を継続した。
【０１０５】
非寛容および寛容イヌにおけるイズロニダーゼに対する抗体力価を表１に示す。少なくとも１２週を完了したイヌのみを表に含める；非寛容イヌＢＥ、ＢＩ、ＢＣおよびＢＯは７週で既に２１から７４  ＯＤ／血清μｌの力価を有し、中止した。非寛容イヌでは、基底値０．８から、平均誘導レベル１４４．６  ＥＬＩＳＡ  ＯＤ／血清μｌまで１８１倍誘導された。寛容イヌでは基底での初期値０．４からイズロニダーゼでの処置後５．２まで、１３倍力価が増加した。非寛容のイヌでは、寛容のイヌよりもイズロニダーゼに対する抗体の誘導が〜２８倍高かった。１匹のイヌ、ＮＩは寛容群の中で最高の力価、１３．８を有した。このイヌは複数回にわたってＣｓＡ用量を吐き出し、これは寛容性の不完全な誘導の原因である可能性があり、そしてさらにＣｓＡ投与の重要な特性を支持する。ＰＡは好ましいＣｓＡの毎日投与を受けたが、Ａｚａを投与されず、そして寛容化しなかった。２匹の寛容性の正常なイヌ、ＲＨおよびＲＩもまた胸腺内注射を受けたが、ＲＯで示される寛容性ほど注射を必要としなかった。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
表１では、６匹の寛容イヌおよび７匹の非寛容イヌに関するイズロニダーゼに対する抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定されるように、ＯＤ単位／希釈していない血清μｌとして示す。実施例１に記載するように、イヌは薬物またはその他の処置を受け、そしてイズロニダーゼを投与された。全てのイヌは０．０５６ｍｇ／ｋｇ／日の組換えヒトイズロニダーゼ静脈内誘発を受けた。処置前ＥＬＩＳＡ値は、イズロニダーゼでの第１の抗原誘発の前の血清抗体レベルを表す。処置後ＥＬＩＳＡ値は、酵素誘発の１２週での、または少なくとも測定した時点での（ＭＥ、ＭＡ、ＭＯは１１週で；ＰＡは９週で）血清抗体レベルを表す。寛容イヌに関する平均処置後抗体力価（５．２  ＯＤ／μｌ）は非寛容イヌの力価（１４４．６  ＯＤ／μｌ）の１／２５である。
【０１０８】
６週の終わりまでにイヌは全ての免疫抑制剤を中止したという事実に関わらず、寛容イヌでイズロニダーゼに対する応答が大きく低下した。寛容イヌでの力価は数か月間低下したままであり、そして毎週注入の６か月間、ＲＯおよびＳＡで力価を研究した（図２）。別の抗原、卵白アルブミンに対する寛容性をマンノースＮ末端結合オリゴ糖で誘導する試みは成功しなかった。このデータにより、高取り込みおよび広範に存在するマンノース６−ホスフェートレセプターが必要であるか、またはマンノースレセプター媒介の取り込みが、寛容原が寛容性を誘導するのに成功するのに十分ではないことが示唆される。
【０１０９】
治療用タンパク質に対する寛容性の誘導がイヌで達成された。ＣｓＡおよびＡｚａの最適処置計画で処置したイヌで、少なくとも４から６か月持続する、イズロニダーゼ酵素の毎週注入に対する免疫応答の劇的な低下が示された。寛容性はその他の試薬または手順、例えばモノクローナル抗体または胸腺内注射に依存しなかった。寛容状態は免疫抑制剤の不在下で少なくとも６か月間維持される。
【０１１０】
寛容イヌとその他のイヌとの間の重要な相違は、ＣｓＡの毎日の使用であった。しかしながら、イヌＰＡはＣｓＡ単独を毎日使用したが寛容化しなかったので、ＣｓＡ単独はイヌでは十分ではなかった。免疫抑制剤単独はイヌにおいて寛容性を誘導できず、そして免疫抑制剤の保護的な補填の下での抗原注入の使用が寛容性プロトコールの重要な部分である。酵素が寛容化抗原として提示される可能性があるが、活性化されるＴ細胞は薬物により制止される。
【０１１１】
処置のその他の部分が寛容性を誘導する機会を改善することが意図されたが、効果はなかった。寛容原性であることがわかっている部位で抗原を提示するために胸腺内注射を設計したが、これは効果がなく、そして何かあるとすれば、早期に免疫応答を導いた。このモデルにおいて、このような末梢提示および寛容化がより有効であると思われる。
【０１１２】
Ｔ細胞マーカーに対するモノクローナル抗体もまた寛容性に寄与しなかった。パイロット実験で示されたように、これらのモノクローナル抗体は循環から成熟Ｔ細胞を９０％ほども枯渇させることが意図されたが、その使用を加えることはなく、そして寛容性には必要でなかった。
【０１１３】
宿主イヌは重要な因子を有したが、実際にはヒトイズロニダーゼに対する寛容性を、内因性イズロニダーゼを有する正常なイヌ、および内因性イズロニダーゼを有していないＭＰＳ  Ｉに罹患したイヌにおいて誘導した。
【実施例２】
【０１１４】
ＭＰＳ  Ｉに罹患したイヌにおける治療用イズロニダーゼに対する寛容性の誘導および治療用高用量注入の間の寛容性の維持
寛容性の誘導は、臨床で有用な治療用タンパク質に対する臨床上有意な免疫応答を防御しなければならない。イズロニダーゼを用いる酵素代償療法を受けているＭＰＳ  Ｉイヌは、酵素のクリアランスを遅延させるか、または安定性を変化させ、酵素の取り込みを妨げ、そして酵素療法の有効性を制限する可能性のある高力価抗体に応答する。同一の現象はその他の動物モデルにおいても報告された。
【０１１５】
未経験のＭＰＳ  Ｉイヌがイズロニダーゼに対して寛容化され、そして続いて週基盤で高用量治療レベルの酵素を投与されることができるかどうかを研究するために、一連の４匹のＭＰＳ  Ｉ罹患イヌを寛容化するか（３匹のイヌ）または対照として保持した（１匹のイヌ）。１２週後、寛容イヌに毎週漸増用量のイズロニダーゼを投与し、そして最終的に少なくとも６週間、治療用量の酵素を投与し、有意な免疫応答は伴わなかった。非寛容の対照イヌは、以前に観察されたように酵素に対して速やかに力価を上昇させ、そしてアナフィラキシー反応のために１６週で注入を終了した。
【０１１６】
方法および材料
動物。ＭＰＳ  ＩイヌをＨａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡのＭＰＳ  Ｉイヌ・コロニーから入手した。イヌはビーグルとプロットハウントの雑種であり、体重は平均１２から２０ｋｇである。これらの実験用にイヌは２年齢以下であり、そして少なくとも４月齢であった。
【０１１７】
免疫抑制剤。シクロスポリン（ＮｅｏｒａｌまたはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ）およびアザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）を地元の薬局から入手した。双方の薬物は実験で記載した用量および頻度で経口的に投与した。試験した処置計画を直ぐ以下に示す。
【０１１８】
寛容性を誘導する、ＣｓＡ毎日投与を伴う免疫抑制剤処置計画：この処置計画は実施例１に記載したとおりであった。
【０１１９】
酵素注入。高度に精製された形態の組換えイズロニダーゼを調製し、そして約１ナノモル濃度（Ｋuptake）の酵素濃度でフルラー線維芽細胞への最大取り込みの５０％の高取り込み能力および３．３ナノモル濃度未満の取り込み特異性を有することが実証されている。１ｍｇ／ｍｌ  イヌアルブミン、および１０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ５．８）を含む食塩水の５０ｍｌ注入液中α−Ｌ−イズロニダーゼ  １４，０００単位／ｋｇ／週、または用量を漸増させる高用量をイヌに投与した。２時間かけて静脈内投与した（１時間目で３，０００単位／ｋｇ／時間、２時間目で１１，０００単位／ｋｇ／時間、または２時間目には用量に依存してさらに高速で）。アナフィラキシー反応に関して動物をモニター観察した。
【０１２０】
結果
３匹のＭＰＳ  Ｉイヌでは寛容性が誘導されたが、対照ＭＰＳ  Ｉイヌでは誘導されなかった。毎週の酵素注入を開始する前にＣｓＡ＋Ａｚａの１８日を含む寛容化療法を用いて３匹のＭＰＳ  Ｉイヌが寛容化された。１匹のＭＰＳ  Ｉイヌは対照として提示され、そして寛容化療法を受けなかった。４匹のイヌは１から１２週でイズロニダーゼ０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週の静脈内注入を受けた。ＥＬＩＳＡにより測定される、３匹の寛容ＭＰＳ  Ｉイヌ（図３；中抜きの記号）および１匹の非寛容ＭＰＳ  Ｉイヌ（図３；塗りつぶした記号）のイズロニダーゼに対する抗体力価を示す。持続的な抗原誘発を伴う低抗体レベル（＜２０  ＯＤ）は寛容性を示す。寛容化薬物処置計画（ＣｓＡ＋Ａｚａ）を酵素誘発の７週で終え、そしてその点を超える低抗体レベルは寛容性が誘導されたことを示している。
【０１２１】
寛容ＭＰＳ  Ｉイヌは全治療用量の酵素療法に寛容である。４匹のＭＰＳ  Ｉイヌに、段階的に増加したイズロニダーゼ用量を３週間かけて、酵素誘発の１５週で０．５００ｍｇ／ｋｇ／週の治療用量まで投与した。これは先行のＭＰＳ  Ｉイヌの治療試験で使用したのと同一量であり、そしてヒトＭＰＳ  Ｉ酵素療法において使用される（Ｋａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．前出（２００１））。寛容イヌの抗体レベルは１５週で＜２０  ＯＤ単位のままであり、漸増用量の抗原に応答した、１５週で＞５００  ＯＤ単位の対照ＲＵ抗体レベルと比較した。比較のために、予めこの用量の酵素（０．５ｍｇ／ｋｇ／週）で処置した２匹のＭＰＳ  Ｉイヌは酵素治療の１４週までで１８００および２０００力価を有した。
【０１２２】
１６週で、非寛容イヌＲＵは注入の間に重篤な臨床アナフィラキシー反応を有し、そして処置を終えた。寛容イヌは注入の間にアナフィラキシー反応を呈さなかった。
【０１２３】
抗原イズロニダーゼを完全に欠損するＭＰＳ  Ｉイヌ、イヌまたはヒトを、再現性よくヒトイズロニダーゼタンパク質に対して寛容化することができる。これらの寛容イヌには有意な免疫応答なく酵素の全治療用量を投与することができる。この結果により、誘導された寛容性は堅調で、そして治療用タンパク質投与の間に予測されるレベルを含む、抗原に対する高レベルの暴露からイヌを保護することができることが示される。
【実施例３】
【０１２４】
アルファ・グルコシダーゼに対する寛容性の誘導
毎日ＣｓＡ＋Ａｚａ、続いて免疫抑制剤を漸減させながら寛容化抗原の注入の処置計画を用いる、正常およびＭＰＳ  Ｉイヌにおけるイズロニダーゼ注入に対する寛容性の誘導を実証した。高親和性取り込み特性を有する別の酵素に対して寛容性を誘導することができることを実証するために、組換えヒトアルファ・グルコシダーゼを調製し、そして寛容化療法を用いて研究した。２匹の正常なイヌを、１匹は寛容化療法を用いて、そして１匹は対照として研究した。グルコシダーゼでの毎週の注入を開始し、そして３週までに対照のイヌは免疫力価を上昇させた。５週までに、対照のイヌは力価が１００倍高く、そして処置したイヌは力価が有意でなかった。データにより、その他の抗原を用いて寛容化療法が成功し得ることが示される。
【０１２５】
方法および材料
動物。ＭＰＳ  ＩイヌをＨａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡのＭＰＳ  Ｉイヌ・コロニーから入手した。イヌはビーグルとプロットハウントの雑種であり、体重は平均１２から２０ｋｇである。これらの実験用にイヌは１年齢以下であり、そして少なくとも４月齢であった。
【０１２６】
免疫抑制剤。シクロスポリン（ＮｅｏｒａｌまたはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ）およびアザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）を地元の薬局から入手した。双方の薬物は実験で記載した用量および頻度で経口的に投与した。試験した処置計画を直ぐ以下に示す。
【０１２７】
寛容性を誘導する、ＣｓＡ毎日投与を伴う免疫抑制剤処置計画：
ＣｓＡ  Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）２５ｍｇ／ｋｇ／日  １日２回  経口
Ａｚａ  Ｉｍｕｒａｎ（登録商標）５ｍｇ／ｋｇ／日  隔日  経口
最初の酵素注入の各々２週後に全薬物に関して用量を半分にする。
副作用に関して動物をモニター観察する。
ＣｓＡピークおよび谷レベルをモニター観察し、そして循環中の最適目標谷レベル４００から５００ｎｇ／ｍｌを維持する。
【０１２８】
酵素注入。高度に精製された形態の組換えアルファ・グルコシダーゼを調製し、そして約１ナノモル濃度（Ｋuptake）の酵素濃度で線維芽細胞への最大取り込みの５０％の高取り込み能力および３．３ナノモル濃度未満の取り込み特異性を有することが実証されている。食塩水および１０ｍＭ  ＮａＰＯ4（ｐＨ５．８）の５０ｍｌ注入液中アルファ・グルコシダーゼ  ０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週で注入を行った。注入液を２時間かけて静脈内投与した（１時間目で全用量の２１％；２時間目で酵素の残り）。アナフィラキシー反応に関して動物をモニター観察した
【０１２９】
結果
対照イヌＳＴは薬物処置を受けず、そして毎週の静脈内注入によりアルファ・グルコシダーゼの投与を開始した。３週までに、有意な力価が検出され、そして４週までに力価は１００  ＯＤ／血清μｌ以上まで上昇した。続いて、力価は１００から２００単位／血清μｌの範囲になった。対照的に、イヌＳＣはＣｓＡ＋Ａｚａ処置計画を受け、そして１２週間の注入の間にいずれかの免疫応答がある場合、最低であった。これは免疫抑制剤を投与しなかった７から１２週を含む。
【０１３０】
毎週基盤の寛容化抗原の注入を伴うＣｓＡ＋Ａｚａの処置計画はその他の抗原に対する寛容性を誘導することができる。結果により、免疫寛容性の完全な状態の誘導における処置計画および寛容化抗原プロトコールの広範な利用性が実証される。特に、アルファ・グルコシダーゼに対する免疫応答はポンペ病患者における酵素代償療法の利用性を阻止または制限することが報告されている。この結果により、この治療用タンパク質に対する免疫応答の防御における寛容化療法の利用性が実証される。
【実施例４】
【０１３１】
寛容性の誘導はＣｓＡ用量に依存する
寛容性プロトコールの開発に関する初期の研究では胸腺注射、免疫抑制剤および成熟Ｔ細胞を枯渇させるモノクローナル抗体の組み合わせに注目された。寛容化抗原発現（胸腺内注射）、成熟抗原特異的Ｔ細胞応答の抑制（ＣｓＡ＋Ａｚａ）および抗原に応答できる成熟Ｔ細胞の枯渇の完全な組み合わせが活性化免疫応答を遮断し、そして抗原暴露を受け入れる免疫系を調製するために必要であると考えられた。この研究の開発中に、イヌＪＨはＩＴＩおよびＣｓＡ＋Ａｚａのみを受けたが寛容になった。このイヌのさらなる分析により、このイヌのＣｓＡ代謝によりＣｓＡの血清レベルが実質的に高くなったことが実証された。この知見が、免疫抑制剤および寛容原のみで寛容性の導入に至るさらなる実験を可能にする中心的な結果になった。
【０１３２】
方法および材料
動物。正常およびＭＰＳ  ＩイヌをＨａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡのＭＰＳ  Ｉイヌ・コロニーから入手した。イヌはビーグルとプロットハウントの雑種であり、体重は平均１２から２０ｋｇである。これらの実験用にイヌは２年齢以下であり、そして少なくとも４月齢であった。
【０１３３】
モノクローナル抗体。一連のモノクローナル抗体はＰｅｔｅｒ  Ｍｏｏｒｅ（ＵＣ  Ｄａｖｉｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｈｏｏｌ）から入手され、そしてイヌＴ細胞レセプター（抗ＴＣＲ）、イヌＣＤ３抗原（抗ＣＤ３；ＩｇＧ２ｂ）およびＴｈｙ−１イヌ等価物（抗Ｔｈｙ１；ＩｇＧ１）に特異的であった。ハイブリドーマを低血清含有培地中で成長させ、そしてプロテインＡクロマトグラフィーにより抗体を精製することにより抗ＴＣＲ抗体を調製した。契約研究所（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）にてハイブリドーマＣＡ１７．６Ｂ３およびＣＡ１．４Ｇ８を用いるマウスにおける腹水の生成並びにプロテインＡ精製により抗ＣＤ３および抗Ｔｈｙ１抗体を調製した。利用する場合、ＩＴＩの直前に２または３用量でモノクローナル抗体を投与した。
【０１３４】
免疫抑制剤。シクロスポリン（ＮｅｏｒａｌまたはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ）およびアザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）を地元の薬局から入手した。双方の薬物は実験で記載した用量および頻度で経口的に投与した。寛容性が誘導され、そして因子であることが見出されなかったかどうかの因子として、ＮｅｏｒａｌまたはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅの使用を評価した。
【０１３５】
寛容性を誘導しない、隔日のＣｓＡ投与を伴う免疫抑制剤処置計画：
ＣｓＡ  Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）２５ｍｇ／ｋｇ／隔日  １日２回  経口
Ａｚａ  Ｉｍｕｒａｎ（登録商標）５ｍｇ／ｋｇ／日  ＣｓＡとは別の日に隔日
ＣｓＡ＋Ａｚａ  ０から１８日は全量投与、１９から３２日は１／２用量、３３から４６日は１／４用量、そして４７から６０日は１／８用量、そして次に終了する。
副作用に関して動物をモニター観察する。
ＣｓＡピークおよび谷レベルをモニター観察し、そして循環中の谷レベル１００から２００ｎｇ／ｍｌ。
【０１３６】
胸腺内注射。一般的な麻酔の間、３インチ切開を第３肋間の左側に行った。胸腔に到達するまで全ての筋層を通って切開を続けた。肋骨セパレーターを用い、そして胸腺を肺の下で血管が通った浅裂の器官として直接観察した。シリンジおよび２５Ｇ針を用いて酵素溶液を胸腺に注射した。針を抜くときの酵素の漏れを防御しようとして胸腺に針を挿入する場合に「ジグザグ」パターンが作られた。エバンスブルー色素により可視化した酵素溶液のいずれかの漏れに関して胸腺を視覚的に検査した。外科的手術部位を閉じ、そして胸腔に挿入したフォーリーカテーテルを通して真空吸引を用いて呼吸機能回復させた。全ての切開部位に抗生物質を適用し、そして外科的手術に続いて、必要な場合短期間の抗生物質および疼痛管理投薬を行った。
【０１３７】
注射溶液、全量１．５ｍｌ：１２．１ｍｇ／ｍｌ  イズロニダーゼ（３×１０6単位／ｍｌ）１ｍｇ／ｋｇ。酸性ＰＢＳ中（最終溶液およそ６％  ＰＥＧ、０．３ｍｇ／ｍｌ  エバンス）４０％  ＰＥＧ＋２ｍｇ／ｍｌ  エバンスブルー色素で１．５ｍｌにする。
酵素注入。１ｍｇ／ｍｌ  イヌアルブミン、および１０ｍＭ  ＮａＰＯ4を含む食塩水の５０ｍｌ注入液中α−Ｌ−イズロニダーゼ  １４，０００単位／ｋｇ／週を２時間かけて静脈内投与した（１時間目で３，０００単位／ｋｇ／時間、２時間目で１１，０００単位／ｋｇ／時間）。アナフィラキシー反応に関して動物をモニター観察した。
【０１３８】
結果
初期の寛容性実験は隔日の間隔でのＣｓＡ投与を含めた。これらの初期の実験は、ＩＴＩ、免疫抑制剤および／またはＴ細胞を枯渇させるモノクローナル抗体が寛容性の誘導に必要であるかどうかを確立しようとした。図５はＩＴＩおよび薬物を用いるいくつかの初期のイヌの実験の結果を示す。
【０１３９】
ＢＩはＰＢＳのみのＩＴＩを受けた対照イヌであり、そしてＢＥおよびＢＣはイズロニダーゼのＩＴＩで処置された２匹のイヌであった。７週までの力価が２０を超えたので、３匹で寛容のものはなかった。ＢＯはＩＴＩに加えて隔日にＣｓＡ＋Ａｚａを受け、そして７週までに力価が４２で寛容でなかった。ＪＡおよびＪＯは同一の処置計画を受けたが、加えて、Ｔ細胞を枯渇させることにより寛容性を誘導することが可能になるかどうかを決定するために、ＩＴＩに先行して抗ＴＣＲモノクローナル抗体を注入した。双方のイヌは免疫応答を上昇させ、そして１２週までに力価は１４８および１３５に至った。不思議なことに、対照イヌＪＨは、以前にＢＯで行わなかったＣｓＡ＋ＡｚａおよびＩＴＩプロトコールを有したが、免疫応答を上昇させなかった。寛容性は１週で１５．１のピークに到達し、そしてその後１８週で７．１まで減少するイズロニダーゼに対する穏やかな力価の期間を含んだ。
【０１４０】
日常のＣｓＡレベルの評価はこの結果を説明するパターンを示した。隔日のＣｓＡを伴ったたいていのイヌは６０から１９０ｎｇ／ｍｌの谷レベルを有したが、１匹のイヌ（ＪＯ）は３４２に達した（表２）。これらのイヌで寛容のものはなかった。ＪＨは少なくとも２００ｎｇ／ｍｌまでその他のイヌを超える５７０のレベルを有した。ケージおよび薬物投与記録の見直しに基づいて、イヌは正確な処置計画を受け、そしてさらにレベルは高くなった。
【０１４１】
ＪＨはＣｓＡ＋ＡｚａおよびＩＴＩの処置計画を用いてイズロニダーゼ注入に対して寛容化した。不思議なことに、このイヌはその血清中のＣｓａレベルが非常に高く、これはＣｓＡのレベルが重要な因子であることを示唆した。この実験の後、ＣｓＡ投与に関するさらなる研究により、ＣｓＡ毎日投与は４００ｎｇ／ｍｌを超える谷レベルを維持し、そしてこれは隔日のＡｚａ投与で寛容性を誘導するのに十分であった。
【０１４２】
【表２】
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【０１４３】
表２では、寛容および非寛容イヌに関するシクロスポリン血中谷レベルをｎｇ／血液ｍｌとして示す。少なくとも４回のシクロスポリン連続投与の後、シクロスポリンレベルを測定した。ＰＡは初回イズロニダーゼ誘発の４日前に開始する毎日シクロスポリン単独処置を受け、そしてイズロニダーゼに対して寛容化された。全てのその他のイヌは最初のイズロニダーゼ静脈内誘発の１８日前（ＩＴＩの４日前）に開始する免疫抑制剤を投与された。全てのイヌは０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週の組換えヒトイズロニダーゼ静脈内誘発を受けた。イズロニダーゼに対する寛容性の成功は一貫して４００から７００ｎｇ／ｍｌのシクロスポリン谷レベルに随伴された。４００ｎｇ／ｍｌ未満のシクロスポリン谷レベルを有するイヌはイズロニダーゼに対して寛容化されなかった。（ＣｓＡ＝シクロスポリン；Ａｚａ＝アザチオプリン；ＩＴＩ＝イズロニダーゼの胸腺内注射；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体）。
【０１４４】
表２は、寛容化療法におけるＣｓＡ投与の役割を裏付ける、その他の寛容化されたイヌからのさらなるデータを示す。表の最上段の区域の非寛容イヌはＣｓＡ  ２５ｍｇ／ｋｇを隔日に投与され、そしてその他の処置を伴うかまたは伴わない薬物処置された６匹のイヌは６０から１９０ｎｇ／ｍｌのＣｓＡ谷レベルを有し、ＪＯの一例は３４２ｎｇ／ｍｌであった。少なくとも４用量の薬物が処置計画中に与えられた後にこれらのレベルになる。非寛容イヌの平均ＣｓＡレベルは１４８ｎｇ／ｍｌである。第３の区域では、寛容イヌは４４０から６８０、平均５４５ｎｇ／ｍｌのＣｓＡ谷レベルを有し、３倍以上高かった。ＪＨは表の第２の区域で示す５７０ｎｇ／ｍｌのレベルを有したが、そのイヌの投与は隔日のみであり、レベルは十分に高く、そしてそのイヌは寛容になった。対照的に表の第４の区域で示すＰＡは４９０の適切なＣｓＡレベルを有したが、Ａｚａは同様でなく、そして寛容にならなかった。これらのデータにより寛容性プロトコールでは適切なＣｓＡ効果が重要であることが実証される。
【実施例５】
【０１４５】
寛容性の誘導は慢性寛容原刺激がなくても長期持続性である
寛容原投与がなくても寛容状態が長期持続性である場合、寛容原による寛容性の誘導は特に有用である。寛容状態の安定性に取り組むために、寛容および非寛容のイヌを種々の時間間隔で保持し、そして次にイズロニダーゼ注入で再誘発した。データは少なくとも６か月間、寛容動物が持続性の寛容原または抗原暴露がなくても、イズロニダーゼ注入に対して寛容を維持することを示している。
【０１４６】
方法および材料
記載した各イヌに関して（同一の頭文字を使用した）前記の実施例で記載するように寛容性を誘導した。ＪＯはその他のイヌと異なって、隔日にＣｓＡを投与して寛容化されたイヌであった。このイヌは最初完全な寛容性を有さなかったが、抗体応答は控えめであった。その他の寛容イヌはその他の実施例で記載した研究に基づいて十分に寛容であった。イズロニダーゼは同一の前記したのと同一の高取り込みイズロニダーゼであった。週基盤で３から６用量の静脈内投与した酵素０．５８ｍｇ／ｋｇでイヌを誘発した。
【０１４７】
結果および論考
図６では、寛容および非寛容であったイヌの力価を、寛容原または治療用注入を行わない期間に充てたギャップと共に示す。最低５週から最大６か月の寛容原の中断は寛容イヌの応答を変化させず、イヌは寛容のままで、そして有意な免疫応答を上昇させなかった。非寛容イヌＲＵは４．５か月の中断の後酵素の２用量の投与後に抗体力価の＞２０倍の誘導を示した。イヌＪＨは、再誘導の３週で最も寛容であったイヌの応答を超えるある程度の応答を示したが、感作された非寛容イヌＲＵの応答には達しなかった。ＪＨはまた元来の誘発を行われた場合にさらに有意な応答性を有し、そして最適処置計画で寛容化されたイヌほど寛容ではなかった。そのイヌの元来の力価パターンもまたプラトーを示し、そして継続的な注入で低下し、それをこの症例で研究する。
【０１４８】
これらのデータにより、本発明の方法および組成物により誘導された寛容性は長期持続性であり、そして臨床上有用であることが実証される。
【実施例６】
【０１４９】
ヒトにおける寛容性の誘導
材料および方法
患者。ムコ多糖症Ｉの患者を処置のために選択する。ベースラインおよび６、１２、２６、および５２週に詳細な臨床試験、腹部および脳の核磁気共鳴映像法、心エコー検査法、可動域測定、睡眠ポリグラフ計、臨床検査評価、白血球α−Ｌ−イズロニダーゼ活性の測定、並びに尿グリコサミノグリカン排泄により患者を評価する。
【０１５０】
免疫抑制剤。シクロスポリン（ＮｅｏｒａｌまたはＳａｎｄｉｍｍｕｎｅ）およびアザチオプリン（Ｉｍｕｒａｎ）を商業用供給源から入手した。双方の薬物を以下のような用量および頻度で経口的に投与した。ＣｓＡ  Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）１２．５ｍｇ／ｋｇ／毎日  １日２回  経口投与；Ａｚａ  Ｉｍｕｒａｎ（登録商標）５ｍｇ／ｋｇ／日  隔日で２週間の条件付け期間の間、経口投与。次いで寛容原の存在下さらに２週間薬物をその用量で投与する。最初の寛容原の注入の各２週間後、全ての薬物の用量を半分にする。副作用、並びにＣｓＡピークおよび谷レベルに関して患者をモニター観察する。
【０１５１】
寛容原。組換えα−Ｌ−イズロニダーゼをチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞においてバイオリアクターおよび標準的なカラムクロマトグラフィーを用いて生成し、そして安全性および純度に関して詳しく分析する。α−Ｌ−イズロニダーゼの活性をＳｈｕｌｌら（前出）の方法に従って、またはその結果がＳＩ単位で報告されているアッセイ（Ｋａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．前出（２００１））を用いて測定する。後者のアッセイを用いる場合、ｋｇあたり１２５，０００単位の用量のα−Ｌ−イズロニダーゼはｋｇあたり１００ＳＩ単位に等しい。尿グリコサミノグリカン排泄をＢｊｏｒｎｓｓｏｎの方法の適用に従って測定する。α−Ｌ−イズロニダーゼに対する抗体に関する酵素結合免疫吸着アッセイはＳｈｕｌｌらの方法の変法を用い、そして標準的な方法に従ってウェスタン・ブロッティングを実施する。
【０１５２】
１４，０００単位（０．１％  ヒト血清アルブミン含有生理食塩水で希釈）の用量で、毎週分配する静脈内注入により寛容原を投与する。２週間の条件付け期間の完了後に第１回目の投与を行い、そしてその後は毎週投与する。患者には予めジフェンヒドラミンを投薬する（体重ｋｇあたり０．５から１．２５ｍｇ）。
【０１５３】
寛容性の誘導の後、条件付け期間の開始後通常６から８週で、用量を週１回ｋｇあたり１２５，０００単位（０．５８ｍｇ）まで増加させ；率は最初の１時間はｋｇあたり３０００単位であり、そして続く各２時間はｋｇあたり６１，０００単位である。
【実施例７】
【０１５４】
免疫寛容化療法はＩｇＧに加えてその他の免疫グロブリンの誘導を防御する
非寛容イヌで観察されるＩｇＧ応答に比較して、イズロニダーゼに対する全ＩｇＧ応答の低下により明らかであるように、イヌの寛容化療法はＩｇＧの誘導を防御する。本実施例は、ＩｇＧの誘導の防御に加えて、その他の免疫グロブリンサブタイプの誘導を寛容化療法が防御することを示すさらなる証拠を提供する。寛容（イヌＰＥおよびＳＡ）または、寛容化療法を受けなかったイヌ対照（イヌＲＵおよびＵＭ）のいずれかであるイヌの免疫血清の分析を、イズロニダーゼに対するＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ抗体の存在に関して研究した。
【０１５５】
これらの測定のデータを図７Ａから７Ｄに示す。これらのデータは、寛容イヌがこれらのその他のサブタイプにおける力価の有意な増加（＞３倍）を有さず、そして非寛容イヌがいくつかの症例で〜１０倍の有意なＩｇＡまたはＩｇＥ応答を有したことを示す。ＩｇＡまたはＩｇＥ力価はＩｇＧに相対して高くはないが、これらの力価は有意であり、そして非寛容イヌでは陽性であった。データにより、寛容化療法はまた、その他のＩｇサブタイプが体液性応答に及ぼす広範な影響に一致して誘導されることを防御することを示している。
【実施例８】
【０１５６】
既存の免疫応答を有する動物における寛容性の誘導
本発明の別の態様では、発明者は既存の免疫応答を低減または排除することが可能であることを実証した。本実施例はイヌＮｉｔｒｏから作製されたデータを論考する。Ｎｉｔｒｏは元来寛容化されているが、ほぼ６か月の抗原暴露からの中断期間の後に、再暴露が著明な既往反応を誘導し、力価は４００＋に達した。抗原に対する暴露を行わない数週間の後、イヌを寛容化療法に置き、そして低用量（０．０５６ｍｇ）のイズロニダーゼの毎日注入を与えた。力価は最初ＣｓＡ＋Ａｚａ処置計画の投与中に典型的な既往反応で１００以上まで上昇し、そして次に２０以下まで速やかに低下した（図１８参照）。処置計画により応答は低減され、そして酵素に対する免疫応答は、以前に０．５ｍｇ／ｋｇ／週の注入での＞４００レベルと比較して相対的に控えめであった。これらのデータにより、動物が寛容原組成物中の抗原に対する免疫応答を既に有している場合でさえ、寛容原に対する寛容性を低減させることができることが実証される。
【実施例９】
【０１５７】
抗原における高親和性取り込み残基の存在が抗原を寛容原としてさらに有効にする
寛容原における高親和性部分の影響を前記の実施例１で論考したが、これはマンノース６−ホスフェートのような部分が抗原の寛容化能力を増大させるのに有用であろうということを示した。寛容原組成物のこの態様をさらに研究し、そしてその結果を本実施例および図９にて報告する。イズロニダーゼは通常マンノース６−ホスフェートを含み、そしてこの高取り込み部分はマンノース６−ホスフェートレセプターを介して標的細胞によるイズロニダーゼの取り込みを促進する。
【０１５８】
本実施例では、組換えイズロニダーゼをビーズに結合した酸ホスファターゼと共にインキュベートすることにより脱リン酸化した。フルラー線維芽細胞における有効な取り込みの欠如およびあまりに低くて算出できなかったＫuptakeにより実証されるように酵素は脱リン酸化に成功した。前記で論じた、イズロニダーゼを用いて行った寛容化実験に類似する寛容化療法において脱リン酸イズロニダーゼを使用した。データを図９に示す。この研究により、脱リン酸イズロニダーゼで寛容化されたイヌを寛容化することができないことが示され、これは再度、高取り込み親和性が寛容性に必要であることを示唆している。
【実施例１０】
【０１５９】
第ＶＩＩＩ因子に対する寛容性を誘導する方法
血友病Ａの処置は有効量の第ＶＩＩＩ因子を血友病患者に分配する能力に依存する。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子治療に対する抗体またはインヒビターが血友病Ａ疾患の患者において重大な問題になり得る。第ＶＩＩＩ因子に対する抗体インヒビターを発達させた血友病患者は第ＶＩＩＩ因子治療を無効にする制御不能な出血を経験することがある。実施例１から９は、宿主を寛容原に対して寛容化するのに十分な期間の免疫抑制の処置計画と組み合わせた、寛容原としてα−Ｌ−イズロニダーゼまたはアルファ・グルコシダーゼの抗原特異的免疫寛容性投与を誘導するための方法および組成物を記載する。本実施例は第ＶＩＩＩ因子に対する免疫寛容性を誘導することを志向する。本実施例は第ＶＩＩＩ因子に対するインヒビターの形成を防御し、そして逆転させるために用いるプロトコールを提供する。
【０１６０】
寛容原性第ＶＩＩＩ因子の調製：。タンパク質を高取り込みタンパク質に結合させることにより、寛容原性第ＶＩＩＩ因子を作製する。最も単純な研究法では、そのN結合炭水化物上に高親和性取り込みマーカーを含有するリソソーム酵素、イズロニダーゼを用いて第ＶＩＩＩ因子タンパク質を結合させる。ヘテロ二機能性架橋剤（例えばＳＢＤＢ）を用いてタンパク質を結合させる。最適には、架橋は１：１の比率で生じ、そして架橋されたタンパク質は精製されている。
【０１６１】
血友病患者の寛容化。４００ｎｇ／ｍｌ以上の血中レベルを達成するために分割された１２．５ｍｇ／ｋｇ／日になると予測される用量のシクロスポリンＡを患者に投与する。ヒト患者に適当であるアザチオプリンもまた２から５ｍｇ／ｋｇで隔日に患者に投与する。薬物の１８日後、毎週基盤で注入液中寛容原０．６ｍｇ／ｋｇを患者に投与する。３２日後、ＣｓＡおよびＡｚａを半分の用量サイズに切断し、そして４６日後、薬物を１／４に切断する。６０日にＣｓＡ＋Ａｚａを終了し、そして毎週の注入を継続した。免疫応答のモニター観察により、あるとすれば、寛容性のない先行の応答の２０％倍未満である穏やかな応答のみが示される。患者は正常な第ＶＩＩＩ因子注入を受け、そして寛容原を終了する。必要な場合、周期的にさらなる寛容原を投与して寛容状態を維持することができる。
【実施例１１】
【０１６２】
糖尿病におけるβ細胞抗原に対する寛容性
β細胞抗原、例えばグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に対する抗体および細胞性免疫応答は膵臓のβ細胞の破壊および糖尿病の発症の原因となる。これらの抗原に対する寛容性の誘導はＩ型糖尿病の症状の危険にあるか、または発症している患者における糖尿病の進行および発症を防御するための重要な方法を提供する。ＧＡＤは１つの重要な抗原であるが、その他の抗原、例えばＩＡ２およびインスリンをこの方法で研究することもできる。
【０１６３】
寛容原性ＧＡＤの調製。ＧＡＤの寛容原性形態を高取り込みペプチド部分との融合により作製することができる。ヒトＧＡＤの遺伝子は高取り込みペプチド、例えばマンノース６−ホスフェートレセプターに結合することが知られているＩＧＦ２に関する遺伝子とフレーム内で結合している。このような融合により双方のタンパク質が正確な構造で、および正確な抗原性および形態を伴って作製されることが可能になる。
【０１６４】
Ｉ型糖尿病患者の寛容化。疾患の経過の初期にあり、そしていくつかのβ細胞機能を保持している、新たに発症した糖尿病患者を用いるのが好ましい。４００ｎｇ／ｍｌ以上の血中レベルを達成するために分割された１２．５ｍｇ／ｋｇ／日になると予測される用量のシクロスポリンＡを患者に投与する。ヒト患者に適したようにアザチオプリンもまた２から５ｍｇ／ｋｇで隔日に患者に投与する。薬物の１８日後、毎週基盤で注入液中寛容原０．０６ｍｇ／ｋｇを患者に投与する。３２日後、ＣｓＡおよびＡｚａを半分の用量サイズに切断し、そして４６日後、薬物を１／４に切断する。６０日にＣｓＡ＋Ａｚａを終了し、そして毎週の注入を継続した。次いで寛容原用量を各週０．６ｍｇ／ｋｇまで増加させることができる。免疫応答のモニター観察により、あるとすれば、寛容性のない先行の応答の２０％倍未満である穏やかな応答のみが示される可能性がある。患者は正常化されたグルコース寛容性を有し、そして寛容原を終了する。必要な場合、患者の臨床状態により決定される間隔で、さらなる寛容原を投与して寛容状態を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】寛容化療法の図式に示す。寛容化療法の一般的な実例は示したスケジュールでの寛容原の注入と一緒に、ＣｓＡ＋Ａｚａ処置（ＣｓＡ用量２５ｍｇ／ｋｇ／日で）のみを必要とする。指示されたさらなる処置、例えば胸腺内注射およびモノクローナル抗体は、作用しないか、または寛容性導入に重要でなかった処置の実例として示される。本発明による抗原に対して最適に寛容化されたこれらのイヌの応答との対比を提供するために、これらの有効でない計画を実施例に含めている。  一般的な寛容化療法では、イヌにＣｓＡ（２５ｍｇ／ｋｇ／日）毎日＋Ａｚａ隔日を図の最下段の時間軸上で示すように０から１８日まで投与する。前記の時間軸上の上向きの矢印により示すように毎週のイズロニダーゼ酵素注入を１８日に開始する。次いでイヌは寛容原０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週の毎週の注入を受けた。その後２週間隔でＣｓＡ＋Ａｚａ用量を半分にし、そして最終的には最終の２週間の区間で初期用量から４分の１になる。次いで全部で６０日の後、薬物ＣｓＡ＋Ａｚａを終了し、そして寛容原注入を毎週基盤で継続した。  非寛容性誘導計画では、イヌに胸腺内注射またはモノクローナル抗体および２５ｍｇ／ｋｇ用量のＣｓＡおよび５ｍｇ／ｋｇ用量のＡｚａを隔日に投与した（すなわち各薬物を１日おきに）。予定されている場合、４日にイヌは胸腺内注射を受ける。最上段のＩＴ＋薬物のプロトコールの図式では、イヌは０から４日間ＣｓＡ＋Ａｚａを受け、そして次に胸腺内注入（ＩＴ注射。すなわちＩＴＩ）を受ける。モノクローナル抗体が指示されている場合、ＩＴ注射の前日までにそれらを投与する。実施する正確な投与量は実験に依存する。隔日に投与するＣｓＡおよびＡｚａの投与量はイヌに注入した最初の日である１８日には半分にした。イヌに毎週基盤で酵素０．５６ｍｇ／ｋｇの投与を開始した。続く２週間、イヌにＣｓＡおよびＡｚａを初期用量の１／２で隔日に投与した。その後、再度薬物を半分にして初期用量の１／４にし、そしてさらに２週後、それを半分にして初期用量の１／８にした。初期用量の１／８で２週間後、薬物を終了し、そしてイヌに酵素の毎週の注入を持続して行った。
【図２】組換えヒトイズロニダーゼ（ｒｈＩＤＵ）の注入の間のＣｓＡ毎日、およびＡｚａ隔日での寛容性の誘導。図では、６匹の寛容（中抜きの記号）および１１匹の非寛容（塗りつぶした記号）イヌに由来するイズロニダーゼに対する抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定されるようにＯＤ単位／希釈していない血清μｌとして示し、酵素注入の週に対してプロットする。イズロニダーゼ注入の前１８日に開始する、実施例１に記載するような寛容化療法をイヌに受けさせた。１週に開始して、０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週  イズロニダーゼのｒｈ−Ｉｄｕ毎週静脈内注入でイヌに注入する。持続的なイズロニダーゼ誘発での低抗体レベル（イズロニダーゼＥＬＩＳＡに関して＜２０）は最適寛容化療法を受けているイヌにおける寛容性を示し、並びに５０を超え、そして５００までの力価は活発な免疫応答を示している。ＣｓＡ＋Ａｚａ薬物処置計画は酵素誘発の７週で終わり、そしてその点を越える低抗体応答は、寛容性が持続的な免疫抑制に依存しないことを示している。
【図３】イズロニダーゼ欠損ＭＰＳ  Ｉイヌにおける寛容性の誘導の成功および続く酵素の治療的高レベルに対する寛容性。３匹のＭＰＳ  Ｉイヌを、寛容化療法を用いて寛容化し、そして１匹のＭＰＳ  Ｉイヌを対照として供し、そして寛容化療法を受けさせなかった。３匹の寛容ＭＰＳ  Ｉイヌ（中抜きの記号）および１匹の非寛容（塗りつぶした記号）ＭＰＳ  Ｉイヌにおけるイズロニダーゼに対する抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定されるようにＯＤ単位／希釈していない血清μｌで示し、酵素誘発の週に対してプロットする。実施例２に記載するような寛容化薬物処置計画を寛容イヌに受けさせた；非寛容対照には薬物処置を行わなかった。持続的に抗原誘発した低抗体レベル（＜２０  ＯＤ）は寛容性を示す。寛容化薬物処置計画を酵素誘発の７週で終わり、そしてその点を越える低抗体レベルは、寛容性が誘導されたことを示している。４匹のイヌに１から１２週で０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週の静脈内イズロニダーゼ注入を行った。続いて、イヌにイズロニダーゼの段階的漸増用量を３週間にわたり、酵素誘発の１５週で０．５００ｍｇ／ｋｇ／週の治療的用量まで投与した。寛容イヌの抗体レベルは１５週で＜２０  ＯＤ単位のままであり、漸増用量のイズロニダーゼ抗原に対して応答した１５週で＞５００  ＯＤ単位の対照ＲＵ抗体レベルと比較した。１６週で、非寛容イヌＲＵは注入中に深刻な臨床アナフィラキシー反応を有し、処置を終えた。寛容イヌは注入中にアナフィラキシーを呈さなかった。
【図４】ポンペ病を処置するために開発された第２のリソソーム酵素であるｒｈＧＡＡに対する抗原特異的寛容性の誘導の成功。１匹の寛容（ＳＣ、中抜きの記号）および１匹の非寛容（ＳＴ、塗りつぶした記号）イヌに関するｒｈ−アルファ・グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）に対する抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定されるようにＯＤ単位／希釈していない血清μｌとして酵素誘発の週に対して示す。実施例３に記載するような寛容化薬物処置計画を寛容イヌに受けさせた。１週に０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週のｒｈＧＡＡの毎週の静脈内注入でイヌを寛容化する。シクロスポリンおよびアザチオプリン（ＣｓＡ（毎日）＋Ａｚａ）を継続し、そして次に酵素誘発の７週でイヌの薬物投与を終えるまで、用量を２週毎に半分にする。非寛容対照には薬物処置を行わなかった。寛容化薬物処置計画を酵素誘発の７週で終わり、そしてその点を越える低抗体レベルは、持続的な免疫抑制の不在下で維持される寛容性が誘導されたことを示している。２匹のイヌは１から１２週で０．０５６ｍｇ／ｋｇ／週の静脈内ｒｈＧＡＡ注入を受けた。寛容イヌの抗体レベルは最高点で＜５  ＯＤ単位のままであり、最高点で＜１５０  ＯＤ単位の非寛容対照抗体レベルと比較した。結果により、治療用であることが暗示される免疫原酵素のさらなる高取り込みで寛容化療法が成功し得ることが確認される。
【図５】６匹の非寛容イヌのデータを寛容になった１匹のイヌ（ＪＨ）と比較して示す。非寛容イヌは５０を超えるＥＬＩＳＡ力価を有し、そしていくつかの例では２００ＯＤ  単位／μｌ／血清を超えた。対照的にＪＨはイズロニダーゼ注入の１８週にわたって２０ＯＤ  単位／μｌ／血清未満の抗体力価を有した。ＪＨは５００ｎｇ／ｍｌ以上のシクロスポリン血中レベルにより区別されたが、その他のイヌは血中４００ｎｇ／ｍｌ未満であり、しばしば２００ｎｇ／ｍｌ未満であった。
【図６】抗原特異的寛容性は長期持続的である。図は寛容化された（ＪＯ、ＲＯ）および寛容化されなかった（ＲＵ）イヌの抗体力価を経時的に示す。第１の区域では、寛容化の間および後の力価を示す。ＲＵは高力価であったが、その他のイヌの力価は低い。５週、４．５か月、６か月または２．５年の時間のギャップの後、イヌをイズロニダーゼで再誘発した。寛容イヌ（ＰＥ、ＲＯ）は寛容原注入の５週から６か月の中断の後でさえイズロニダーゼに対して免疫応答を示さなかった。非寛容イヌＲＵは４．５か月の中断後、たった２用量の酵素誘発の後にさえも＞２０倍の抗原に対する応答を示した。元来の寛容イヌＪＨは２．５年の中断の後に部分的な応答を示す。データにより、誘導された寛容状態の長期持続的効果が示される。
【図７】寛容化療法はＩｇＧに加えてその他のＩｇサブタイプの誘導を防御する。図７Ａおよび７Ｂはイズロニダーゼの注入の前および１２週後の非寛容対照イヌのＥＬＩＳＡ力価を示す。図７Ｃおよび７Ｄはイズロニダーゼの注入の前および１２週後の寛容対照イヌのＥＬＩＳＡ力価を示す。
【図８】寛容化療法を用いて既存の免疫応答を有するイヌにおける処置計画で相対的な寛容性を誘導するか、またはＩｇ力価を低減させることができる。Ｎｉｔｒｏは６か月の抗原暴露の中断が可能であった。この期間の後の抗原に対する再暴露時に、ＩｇＧ力価は最初、ＣｓＡ＋Ａｚａ処置計画の投与中に典型的な既往応答で１００以上に上昇し、そして次に速やかに２０以下に下がった。組み合わせ寛容化療法を用いる寛容性の再誘導により免疫応答が低減された。
【図９】イズロニダーゼの高取り込み部分（マンノース６−ホスフェート基）がイズロニダーゼでの免疫寛容性に必要であることを確認する。Ｍ６Ｐ高取り込み部分が抗原に対する寛容性の誘導を補助することを示すために、組換えイズロニダーゼをビーズに結合させた酸ホスファターゼと共にインキュベートすることにより脱リン酸化した。脱リン酸化されたイズロニダーゼ酵素をイヌに対する寛容化療法（ＣｓＡ＋Ａｚａ）に適用した。研究により、脱リン酸イズロニダーゼで処置されたイヌはイズロニダーゼに対して寛容化されないことが示され、それにより高取り込み親和性（マンノース６−ホスフェート部分）が寛容性に必要であることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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