(57)【要約】本発明は、遺伝子発現の全体的な変化の解明と既知の心臓毒に曝された組織又は細胞中の毒性マーカーの同定に基づいている。医薬スクリーニング及び毒性アッセイにおいて、遺伝子を毒性マーカーとして使うことができる。本発明は、マイクロアレイ及びその他の固相プローブと共に使用するように設計された、毒に誘導された差次的な発現によって特徴づけられる遺伝子のデータベースを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物の少なくとも１つの毒作用を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞試料の遺伝子発現プロファイルを作成すること、
（ｂ）当該遺伝子発現プロファイルを表５〜５Iのデータ又は情報の少なくとも一部を含むデータベースと比較すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記組織又は細胞試料から作成された前記遺伝子発現プロファイルが、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現レベルが、表５〜５Iの毒性平均及び／又は非毒性平均の値と比較される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現レベルが、比較の前に規格化される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記データベースが表５〜５Iのデータ又は情報の実質的にすべてである、請求項１に記載の方法
【請求項６】
化合物の少なくとも１つの毒作用を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表５〜５I中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、表５〜５I中の遺伝子の差次的発現が少なくとも１つの毒作用を示唆している、前記方法。
【請求項７】
化合物の毒作用の進行を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表５〜５I中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、表５〜５I中の遺伝子の差次的発現が毒作用の進行を示唆している、前記方法。
【請求項８】
化合物の心臓毒性を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞試料において、表５〜５I中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、表５〜５I中の遺伝子の差次的発現が、心臓毒性を示唆している、前記方法。
【請求項９】
毒性反応の発症又は進行を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）細胞を当該薬剤及び既知の毒に曝すこと、及び
（ｂ）表５〜５I中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出すること、
を含み、表５〜５I中の遺伝子の差次的発現が毒性を示唆している、前記方法。
【請求項１０】
細胞中で化合物が調節する細胞経路を予測する方法であって、
（ａ）当該化合物に曝された組織又は細胞において、表５〜５I中の２個又はそれ以上の遺伝子の発現レベルを検出することを含み、表５〜５I中の遺伝子の差次的発現が少なくとも1つの細胞経路の調節と関連している、前記方法。
【請求項１１】
少なくとも３個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも４個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも５個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも６個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも７個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも８個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも９個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１０個の遺伝子の発現レベルが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記作用が、心筋炎、不整脈、頻拍、心筋虚血、アンギナ、高血圧症、低血圧症、呼吸困難及び心臓性ショックからなる群から選択される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項２０】
前記心臓毒性が、心筋炎、不整脈、頻拍、心筋虚血、アンギナ、高血圧症、低血圧症、呼吸困難及び心臓性ショックからなる群から選択される少なくとも１つの心臓疾患の病理と関連している、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞経路が、シクロホスファミド、イホスファミド、ミノキシジル、ヒドララジン、ＢＩ−ＱＴ、クレンブテロール、イソプロテレノール、ノルエピネフリン及びエピネフリンからなる群から選択される毒によって調節される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
各プローブが表５〜５I中の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む、少なくとも２個のプローブのセット。
【請求項２３】
前記セットが少なくとも３個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項２２に記載のプローブのセット。
【請求項２４】
前記セットが少なくとも５個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項２２に記載のプローブのセット。
【請求項２５】
前記セットが少なくとも７個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項２２に記載のプローブのセット。
【請求項２６】
前記セットが少なくとも１０個の遺伝子にハイブリダイズするプローブを含む、請求項２２に記載のプローブのセット。
【請求項２７】
前記プローブが固体支持体に取り付けられている、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載のプローブのセット。
【請求項２８】
前記固体支持体が、膜、ガラス支持体及びシリコン支持体からなる群から選択される、請求項２７に記載のプローブセット。
【請求項２９】
各プローブが表５〜５I中の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含む、少なくとも２個のプローブを含む固体支持体。
【請求項３０】
前記固体支持体が、１平方センチメートル当たり、少なくとも１０個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項２９記載の固体支持体。
【請求項３１】
前記固体支持体が、１平方センチメートル当たり、少なくとも約１００個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項２９記載の固体支持体。
【請求項３２】
前記固体支持体が、１平方センチメートル当たり、少なくとも約１，０００個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項２９記載の固体支持体。
【請求項３３】
前記固体支持体が、１平方センチメートル当たり、少なくとも約１０，０００個の異なるオリゴヌクレオチドを分離した位置に含むアレイである、請求項２９記載の固体支持体。
【請求項３４】
コンピューターシステムであって、
（ａ）心臓毒に曝された組織又は細胞試料において、表５〜５I中の少なくとも２個の遺伝子を含む遺伝子セットの発現レベルを同定する情報を含むデータベース、及び
（ｂ）当該情報を見るためのユーザーインターフェース、
を備えた、前記コンピューターシステム。
【請求項３５】
前記データベースが、前記遺伝子の配列情報をさらに含む、請求項３４に記載のコンピューターシステム。
【請求項３６】
前記データベースが、心臓毒に曝される前の組織又は細胞試料における前記遺伝子セットの発現レベルを同定する情報をさらに含む、請求項３４に記載のコンピューターシステム。
【請求項３７】
前記データベースが、少なくとも第二の心臓毒に曝された組織又は細胞試料における前記遺伝子セットの発現レベルを同定する情報をさらに含む、請求項３４に記載のコンピューターシステム。
【請求項３８】
外部データベースからの記述的な情報を含む記録をさらに備えた、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のコンピューターシステムであって、当該情報は前記遺伝子を当該外部データベースの記録に関連させる、前記コンピューターシステム。
【請求項３９】
前記外部データベースがＧｅｎＢａｎｋである、請求項３８に記載のコンピューターシステム。
【請求項４０】
組織又は細胞試料における表５〜５I中の少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを同定する情報を提示するために、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のコンピューターシステムを用いる方法であって、
試験薬剤に曝された組織又は細胞試料における、表５〜５I中の少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを、データベース中の遺伝子の発現レベルと比較すること、
を含む方法。
【請求項４１】
少なくとも２個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも５個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１０個の遺伝子の発現レベルが比較される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
組織又は細胞試料における少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを、毒に曝されたときの発現レベルと比較して、表示するステップを更に含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記既知の毒が心臓毒である、請求項９に記載の方法。
【請求項４６】
前記心臓毒が、シクロホスファミド、イホスファミド、ミノキシジル、ヒドララジン、ＢＩ−ＱＴ、クレンブテロール、イソプロテレノール、ノルエピネフリン及びエピネフリンからなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
表５〜５I中の遺伝子のほとんどすべてが検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
表５〜５Iのいずれか１つのうちのすべての遺伝子が検出される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子の遺伝子発現情報と共にパッケージされた、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の少なくとも１個の固体支持体を含むキット。
【請求項５０】
前記遺伝子発現情報が、心臓毒に曝された組織又は細胞試料における遺伝子発現情報を含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
前記遺伝子発現情報が電子フォーマットである、請求項５０のキット。
【請求項５２】
前記化合物曝露がインビボ又はインビトロである、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記発現レベルが増幅アッセイ又はハイブリダイゼーションアッセイによって検出される、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記増幅アッセイが定量的又は半定量的ＰＣＲである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ハイブリダイゼーションアッセイが、ノーザンブロット、ドットブロット、スロットブロット、ヌクレアーゼ保護及びマイクロアレイアッセイからなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
表５〜５I中の遺伝子によってコードされるタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定する方法であって、
（ａ）当該タンパク質を当該薬剤に曝すこと、及び
（ｂ）当該タンパク質の少なくとも１つの活性をアッセイすること
を含む方法。
【請求項５７】
前記薬剤が前記タンパク質を発現している細胞に曝される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が既知の毒に曝される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記毒が前記タンパク質の発現を調節する、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、米国仮出願６０／３０３，８１９、６０／３０５，６２３、６０／３６９，３５１及び６０／３７７，６１１に基づき優先権を主張するものであり、これら全ては全体として関連付けにより本明細書に取り入れられる。本出願は、また、米国出願０９／９１７，８００、１０／０６０，０８７及び１０／１５２，３１９に関連があり、いずれもその全体として関連付けにより本明細書に取り入れられる。
【０００２】
（コンパクトディスクによる配列表提出）
本明細書と同時に提出されたコンパクトディスクの配列表はその全体として関連付けにより本明細書に取り入れられる。４部の配列表（４枚のコンパクトディスクのそれぞれに１部）が提供される。コピー１、コピー２及びコピー３は同一である。コピー１、コピー２及びコピー３はＣＲＦとも同一である。配列表の電子的複製物はそれぞれが２００２年６月１９日に作製され、ファイルサイズは１５２３ＫＢである。ファイル名は下記の通りである：コピー１−ｇｌ５０９０ｗｏ．ｔｘｔ；コピー２−ｇｌ５０９０ｗｏ．ｔｘｔ；コピー３−ｇｌ５０９０ｗｏ．ｔｘｔ；ＣＲＦ−ｇｌ５０９０ｗｏ．ｔｘｔ。
【発明の背景】
【０００３】
細胞又は生物体に対する、化合物、薬剤又は環境汚染物質の有毒な影響力を評価する方法の必要性により、生物学的モニターとして生物体を利用する手法の開発につながってきた。これらの系統の最も単純であり、そして最も便利なものは、酵母やバクテリアのような単細胞の微生物を利用することである。なぜなら、これらが最も簡単に維持され、そして操作されるからである。また、単細胞のスクリーニング系は、細胞に対する試験化合物の効果をモニターするために、たびたび表現型の簡単に検知できる変化を使用する。しかしながら、単細胞の生物は、それらがより高等な生物で見られる範囲、又はレベルで生体内変換を実行する能力を有しないので、複雑な多細胞の動物に対する多くの化合物の潜在的な効果を評価するための適当なモデルではない。
【０００４】
多細胞生物による化合物の生体内変換は、それらが曝される薬剤の全体的な毒性を決定する上での重要なファクターである。したがって、多細胞のスクリーニング系が、化合物の毒作用を検知するのに、好まれるか、又は要求される。しかしながら、毒性学スクリーニングツールとして多細胞生物を使用することは、酵母又はバクテリアの系で利用できるような、便利なスクリーニングメカニズム又はエンドポイントの欠如によって、かなり阻害されてきた。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の一部は、既知の毒（毒性物質）、特に、心臓毒、に曝された組織若しくは細胞における、曝されない組織若しくは細胞と比較しての遺伝子発現の全体的な変化の解明、ならびに毒に曝すことにより、発現量に差のある個々の遺伝子の同定に基づく。
【０００６】
様々な態様で、本発明は、化合物の少なくとも1つの毒作用を予測し、化合物の毒作用の進行を予測し、そして化合物の心臓毒性を予測する方法を含む。また、本発明は、毒性反応の発症又は進行を調節する薬剤を同定する方法をも含む。さらに、化合物が細胞で調節する細胞経路を予測する方法も、また提供される。本発明は、タンパク質活性を調節する薬剤を同定する方法を含む。
【０００７】
さらなる態様で、本発明は表１〜５I中の遺伝子に特異的にハイブリダイズする配列を含むプローブを提供する。また、以前に言及されたプローブのうちの少なくとも２つを含む固体支持体も提供される。また、本発明は、心臓毒に曝された組織又は細胞試料において表１〜５I中の遺伝子セットの発現レベルを同定する情報を含んでいるデータベースをもつコンピューターシステムをも含む。
【詳細な説明】
【０００８】
多くの生物学的機能は、転写（例えば、開始の制御、ＲＮＡ前駆体の供給、ＲＮＡプロセッシング等を通して）及び／又は翻訳制御を通して、様々な遺伝子の発現を変化させることによって達成される。例えば、細胞周期、細胞分化及び細胞死のような基本的生物学的プロセスは、遺伝子群の発現レベルにおける変化によって、しばしば特徴付けられる。
【０００９】
遺伝子発現の変化は、様々な化学物質、医薬、毒、薬剤及び汚染物質の生物又は細胞に対する影響とも関連する。このように、特定の遺伝子（例えば、癌遺伝子又は腫瘍サプレッサー）の発現レベルの変化は、特定の化合物に曝されたときの毒性の存在及び進行又はその他の細胞の応答の指標として役に立つであろう。
【００１０】
遺伝子発現の変化をモニターすることによって、医薬スクリーニング及び開発の間に、ある種の利点が提供されるであろう。しばしば、医薬はそれが細胞に対して持つ他の作用を無視して、主要な標的と相互作用する能力についてスクリーンされる。これらの細胞への作用は、動物個体において毒性を引き起こすかもしれず、可能性のある医薬の開発と臨床への使用を妨げる。
【００１１】
本発明者は、心臓への有害な影響を誘発する既知の心臓毒に曝された動物から、組織を調べて、これらの化合物によって誘発される遺伝子発現の全体的な変化及び遺伝子発現の個々の変化を確認した。遺伝子発現の全体的な変化は、発現プロフィル（一又は複数の遺伝子の発現レベル）の作成によって検出することができるが、試験化合物による毒性及び／又は毒性進行をモニターするのに用いることができる有用な毒性マーカーを提供する。また、これらのマーカーの一部は、様々な病気、若しくは生理的状態、病気の進行、医薬の効能及び薬物代謝をモニター又は検出するのに用いることができる。
【００１２】
毒性マーカーの同定
毒性の予測できる遺伝子発現の変化を評価及び同定するために、十分に特徴づけられた毒性を有する選択された化合物を使用した研究が本発明者らによって行われ、インビボ及びインビトロで曝されたときの変化した遺伝子発現が分類整理された。本研究では、シクロホスファミド、イホスファミド、ミノキシジル、ヒドララジン、ＢＩ−ＱＴ、クレンブテロール、イソプロテレノール、ノルエピネフリン及びエピネフリンが、既知の心臓毒として選択された。
【００１３】
シクロホスファミドは、アルキル化剤で、分裂中の細胞に対して非常に毒性であり、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに肺、胸部及び卵巣の癌腫を治療するために化学療法において一般的に使用されている（Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、１２３４頁、１２３７頁〜１２３９頁、Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６）。さらに、シクロホスファミドは、骨髄移植や以下の臓器移植における免疫抑制剤として使用されている。シクロホスファミドは、治療上有用であるが、心臓毒性、腎毒性及び出血性膀胱炎をも伴う。肝臓において一旦、シクロホスファミドは、チトクロームＰ４５０混合機能オキシダーゼ系によって水酸化される。その活性代謝物のホスホルアミドマスタード及びアクロレインによって、ＤＮＡが架橋され、増殖停止及び細胞死がもたらされる。アクロレインは、細胞内グルタチオンレベルを低下させることが、示されている（Ｄｏｒｒ  ａｎｄ  Ｌａｇｅｌ及びＬａｇｅｌ（１９９４）、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  ９３：１１７−１２８）。
【００１４】
シクロホスファミドの心臓毒性作用は、一部、解明されている。ある研究では、シクロホスファミド、チオテパ及びカルボプラスチンでの治療を受けていた転移性乳癌の１９人の女性の血漿レベルが分析された（Ａｙａｓｈら（１９９２）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １０：９９５−１０００）。その研究では、１９人の女性のうち６人が、中程度のうっ血性心不全を発症した。別の症例研究では、高用量のシクロホスファミドで治療を受けていた１０歳の少年が、心律動異常および難治性低血圧症を発症した（Ｔｓａｉら（１９９０）、Ａｍ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １２：４７２−４７６）。その少年は、移植後２３日で死亡した。
【００１５】
別の臨床試験では、投与されるシクロホスファミドの量と心臓毒性の発現との関係が試験された（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（１９８６）、Ｂｌｏｏｄ  ６８：１１１４−１１１８）。シクロホスファミドの用量が、１．５５ｇ／ｍ２／日以下であった時、患者３２人のうち１人だけが、シクロホスファミド心臓毒性と一致する症状を有した。しかし、用量が１．５５ｇ／ｍ２／日より多かった時には、患者５２人のうち１３人が、症候性であった。その高用量の患者のうち６人が、うっ血性心不全で死亡した。
【００１６】
関連した研究では、Ｂｒａｖｒｍａｎらが、骨髄移植患者に対するシクロホスファミドの一日一度、低用量での投与（８７＋／−１１ｍｇ／ｋｇ）の効果と、一日二回、高用量での治療（１７４＋／−３４ｍｇ／ｋｇ）の効果を比較した（Ｂｒａｖｅｒｍａｎら（１９９１），Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ９：１２１５−１２２３）。一週間以内に、高用量の患者の左心室質量指数が、増加した。臨床的心臓毒性を発現した患者５人のうち４人は、高用量グループであった。
【００１７】
イホスファミド（オキサザホスホリン）は、シクロホスファミドの類似体である。シクロホスファミドが、環外窒素上に２個のクロロエチル基を有するのに対し、イホスファミドは、一方のクロロエチル基を環窒素上に、そして他方を環外窒素上に含有する。イホスファミドは、ナイトロジェンマスタード型のアルキル化剤で、膀胱癌、子宮頸癌及び肺癌、ならびに肉腫及びリンパ腫を治療するために化学療法において一般的に使用されている。シクロホスファミドと同様、肝臓で水酸化されることにより活性化されるが、よりゆっくりと反応し、より多くの脱塩素化代謝物及びクロロアセトアルデヒドを生成する。シクロホスファミドの効能に見合うには、比較的高い用量のイホスファミドが必要である。
【００１８】
アルキル化剤は、ＤＮＡを架橋させることができ、その結果、増殖停止及び細胞死をもたらす。その治療的価値にもかかわらず、イホスファミドは、腎毒性（近位及び遠位尿細管に作用する）、尿毒性、静脈閉鎖病、骨髄抑制、肺線維症及び中枢神経系の毒性を伴う（Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、１２３４〜２３４０頁、Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６）。イホスファミドは、可逆性であることもある急性重症心不全及び悪性心室性不整脈も引き起こしうる。心臓性ショックによる死亡も報告されている（Ｃｅｃｉｌ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０版、Ｂｅｎｎｅｔｔら編、３３１頁、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。
【００１９】
進行性又は治療抵抗性リンパ腫又は癌腫の患者の研究は、高用量でのイホスファミド治療が、呼吸困難、頻拍、左心室収縮性低下及び悪性心室性不整脈を含む心臓病の様々な症状をもたらすことを示した（Ｑｕｅｚａｄｏら（１９９３）、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １１８：３１−３６；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９：１７１２−１７２２）。他の患者の研究では、イホスファミド誘導心臓毒は、無症候性であるが、心電図により検出可能であり、モニターすべきであると注意されている（Ｐａｉら（２０００）、Ｄｒｕｇ  Ｓａｆ  ２２：２６３−３０２）。
【００２０】
ミノキシジルは、高血圧症の治療に使用される降圧薬剤である。これは、血液がより容易に血管を通過できるように血管を弛緩させることにより作用し、その結果、血圧を低下させる。頭皮へのミノキシジルの塗布により、発毛を刺激することは、脱毛治療に効果的であることが、最近、示された。ミノキシジルは、肝臓スルホトランセフェラーゼにより代謝されると、活性分子ミノキシジルＮ−Ｏスルフェートに転化される（Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、７９６〜７９７頁、Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａら編、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６）。活性ミノキシジルホスフェートは、ＡＴＰ調節カリウムチャンネルを刺激し、その結果として、平滑筋の過分極及び弛緩をもたらす。ミノキシジルに関する初期の研究では、この薬の単回投薬後、左心室不全に罹患している患者は、心拍数のわずかな上昇、平均動脈圧の降下、全身血管抵抗の低下及び心係数のわずかな増加を示すことが明らかにされた（Ｆｒａｎｃｉｏｓａ及びＣｏｈｎ（１９８１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ６３：６５２−６５７）。
【００２１】
ミノキシジル治療に伴ういくつかの共通する副作用は、発毛の増加、体重増加及び急速又は不規則な心拍である。さらに深刻な副作用は、手、足又は顔のしびれ、胸痛、息切れ及び足又は下腿の腫脹である。体液貯留および心血管反射の危険性のため、ミノキシジルは、利尿薬及び交感神経遮断薬と同時に投与されることが多い。
【００２２】
ミノキシジルは、血圧の降下に有効であるが、心肥大を退行させることはない。それどころか、ミノキシジルは、正常血圧の動物に投与された時、心臓の拡張をもたらすことが示されている（Ｍｏｒａｖｅｃら（１９９４）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２６９：２９０−２９６）。Ｍｏｒａｖｅｃらは、ミノキシジルでの治療後に心筋肥大をは発症していたせ異常血圧のラットを試験した。この著者らは、ミノキシジル治療が、左心室、右心室及び心室中隔の拡張をもたらすことを見出した。
【００２３】
別のラット研究では、ミノキシジルにより誘導される心臓毒性の年齢依存性及び用量依存性が調べられた（Ｈｅｒｍａｎら（１９９６）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １１０：７１−８３）。年齢範囲３ヶ月から２年のラットに様々な量のミノキシジルが２日間にわたって投与された。その研究者らは、すべての用量レベルで間質性出血を観察したが、出血は、年齢の高い動物のほうがが頻繁であり、重症であった。２歳のラットには、細動脈の損傷及び石灰化からなる血管障害があった。
【００２４】
ヒドララジンは降圧薬であり、細動脈平滑筋の弛緩を生じさせる。そのような血管拡張は、心拍数及び心収縮性の増大、血漿レニン活性の増大、そして体液貯留をその後にもたらす、交感神経系の活発な刺激に関連する（Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第９版、７９４頁、Ｊ．Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６）。レニン活性の増大はアンギオテンシンIIの増大をもたらし、これは、その後、アルドステロンの刺激及びナトリウム再吸収を生じさせる。
【００２５】
ヒドララジンは、高い血圧（高血圧症）を治療するために、そして高い血圧に苦しんでいる妊婦（子癇前症及び子癇）を治療するために使用される。ヒドララジンに伴ういくつかの共通する副作用には、下痢、速い心拍、頭痛、食欲低下、及び悪心がある。ヒドララジンは、ヒドララジンの使用に伴うことがある軽い肺高血圧症を治療するために交感神経の活動を阻害する薬物と同時に使用されることが多い。
【００２６】
あるヒドララジン研究において、５つの心臓毒性化合物（イソプロテレノール、ヒドララジン、カフェイン、シクロホスファミド又はアドリアマイシン）が静脈内注射によりラットに与えられた（Ｋｅｍｉら（１９９６）、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ５８：６９９−７０２）。投薬後１時間及び４時間で、初期局所性心筋病変が組織検査により観察された。病変は、投薬後４時間、ヒドララジンで治療したラットにおいて観察された。前記病変は、乳頭筋を含む左心室壁の内部三分の一で見出された。
【００２７】
別の研究では、幼年及び成熟マウスに対するイソプロテレノール、ヒドララジン及びミノキシジルの効果が比較された（Ｈａｎｔｏｎら（１９９１）、Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｃｈｅｍ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１：２３１−２３４）。両方の時期のグループで心筋壊死が観察されたが、成熟ラットでのほうが重症であった。ヒドララジンで治療したラットには、低血圧症及び反射性頻拍も見られた。
【００２８】
ＢＩ−ＱＴは、イヌではＱＣ延長を、そしてラットでは肝臓の交代を誘導することが示されている。４週間にわたって、ＢＩ−ＱＴで治療したイヌは、鎮静、体重減少、肝重量の増加ならびにＡＳＴ、ＡＬＰ及びＢＵＮのわずかなレベル上昇を示した。３ヶ月の治療後、それらのイヌは、心血管作用の徴候を示した。
【００２９】
クレンブテロールは、β２アドレナリン作動性アゴニストで、喘息のための呼吸器作用薬として治療上使用することができる。これは、強力な筋肉蛋白同化及び脂肪分解作用も有する。米国では禁止されているが、筋肉の発育を増進するために運動家により不法に使用され続けている。多数の研究において、クレンブテロールで治療したラットは、心臓及び広背筋の肥大を発症した（Ｄｏｈｅｎｙら（１９９８）、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  １５：１３−２５；Ｍｕｒｐｈｙら（１９９９）、Ｐｒｏｃ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２２１：１８４−１８７；Ｐｅｔｒｏｕら（１９９５）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：II４８３−II４８９）。
【００３０】
ある研究では、治療レベルのクレンブテロールで治療した雌ウマが、運動をさせた雌ウマ及び対照グループの雌ウマと比較された（Ｓｌｅｅｐｅｒら（２００２）、Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｅｘｅｒｃ  ３４：６４３−６５０）。クレンブテロールで治療した雌ウマは、拡張期の終わりに有意に大きい左心室内径及び心室間中隔壁厚を示した。加えて、セルブテロールで治療した雌ウマは、大動脈破裂の機会を増すことになる可能性がある大動脈根径の有意な増大を有した。
【００３１】
別の研究において、研究者が、ヒトにおける急性クレンブテロール毒性の原因を報告した（Ｈｏｆｆｍａｎら（２００１）、Ｊ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３９：３３９−３４４）。２８歳の女性は、少量のクレンブテロールを摂取しており、その患者は、持続性洞性頻拍（sustained sinus tachycardia）、低カリウム血症、低リン酸塩血症及び低マグネシウム血症を発症した。
【００３２】
カテコールアミンは、副腎髄質及び交感神経系において合成される神経伝達物質である。エピネフリン、ノルエピネフリン及びイソプロテレノールは、カテコールアミン交感神経様作動アミンファミリーのメンバーである（Ｃａｓａｒｅｔｔ＆Ｄｏｕｌｌ’ｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｉｓｏｎｓ、第６版、６１８〜６１９頁、Ｃ．Ｄ．Ｋｌａａｓｓｅｎ編、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１）。それらは、アミンに結合している芳香族部分（カテコール）、又は窒素含有基を有することで化学的に類似している。
【００３３】
イソプロテレノールは、抗不整脈薬で、喘息、慢性気管支炎、肺気腫及び他の肺疾患の治療のために気管支拡張薬として治療上使用される。使用のいくつかの副作用には、心筋虚血、不整脈、アンギナ、高血圧症及び頻拍がある。β受容体アゴニストとして、イソプロテレノールは、直接的な陽性の変力作用及び変時作用（inotropic and chronotropic effects）を発揮する。抹消血管抵抗は、脈拍圧及び平均動脈圧とともに上昇する。しかし、心拍数は、平均動脈圧の低下により増大する。
【００３４】
ノルエピネフリンは、α及びβ受容体アゴニストで、ノルアドレナリンとしても知られている。これは、注意及び一般覚醒などの行動、ストレスならびに気分状態に関係する。β−１受容体に対して作用することにより、抹消血管抵抗、脈拍圧及び平均動脈圧の上昇をもたらす。平均動脈圧の上昇に起因して反射性徐脈が生じる。ノルエピネフリンの使用に伴ういくつかの禁忌には、心筋虚血、心室性期外収縮（ＰＶＣ）及び心室性頻拍がある。
【００３５】
エプネフリンは、強力なα及びβアドレナリン作動性アゴニストで、アナフィラキシーから生じる気管支収縮及び低血圧症、ならびにすべての形の心拍停止を治療するために使用される。エプネフリンの注射は、収縮期血圧の上昇、心室収縮性の増大及び心拍数の増加をもたらす。エプネフリンの使用に伴ういくつかの副作用には、心不整脈（特にＰＣＶ）、心室内頻拍、腎血管虚血、心筋酸素要求量の増加及び低カリウム血症がある。
【００３６】
毒性予測とモデリング
表１〜５Iに提供される遺伝子のポートフォリオ及びサブセットと同様に、遺伝子及び遺伝子発現情報を用いて、試験化合物又は未知化合物の心臓毒性を含む、少なくとも1つの毒作用を予測する。本明細書で使用する場合、少なくとも１つの毒作用には、限定はされないが、細胞又は生物の生理的状態の有害な変化が含まれる。その応答は、組織壊死、心筋炎、不整脈、頻拍、心筋虚血、アンギナ、高血圧症、低血圧症、呼吸困難及び心臓性ショックなどの特定の病理学的状態と関連するかもしれないが、そうあることを要求されない。したがって、毒作用は、分子及び細胞レベルでの効果を含む。本明細書で使用される、心臓毒性とは効果であり、そして組織壊死、心筋炎、不整脈、頻拍、心筋虚血、アンギナ、高血圧症、低血圧症、呼吸困難及び心臓性ショックを含むが、これらには限られていない。本明細書で使用する場合、遺伝子発現のプロファイルは、ある細胞サンプル又は細胞集団における少なくとも１つのｍＲＮＡ種の発現の定量的な又は定量的でない表現を有しており、ディファレンシャルディスプレイ、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション分析などの様々な方法により作られたプロファイルを含んでいる。
【００３７】
一般に、試験薬剤（又は化合物又は多重成分組成物）の毒性又は心臓毒性を予測するアッセイは、細胞集団を試験化合物に曝す工程と、表１〜５Iの遺伝子の１個又はそれ以上の相対的又は絶対的な遺伝子発現レベルをアッセイし又は測定する工程と、同定した発現レベルを前記表及びそこに開示されたデータベースに開示された発現レベルと比較する工程と、を含む。アッセイは、表１〜５Iから約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００個又はそれ以上の遺伝子発現レベルの測定を含むことができる。
【００３８】
本発明の方法では、試験薬剤、化合物又は組成物によって誘導される、１又は複数の遺伝子の発現レベルが約２倍、約１．５倍又は約１．０倍の係数の範囲内で変化するならば、本明細書に開示される表又はデータベースに見出されるレベルに匹敵する。いくつかのケースでは、薬剤が参照毒と同じ方向（例えば、アップ又はダウン）に、遺伝子の発現変化を誘発するならば、それらの発現レベルは匹敵する。
【００３９】
試験薬剤、化合物又は組成物に曝される細胞集団は、インビトロ又はインビボで曝されてもよい。例えば、培養又は新たに単離された心臓細胞（特に、ラット心臓細胞）は、標準的な実験室及び細胞培養条件の下でその薬剤に曝される。別のアッセイ様式では、インビボの曝露は、生きている動物（例えば、研究室ラット）に、その薬剤を投与することによって達成できる。
【００４０】
インビトロ及びインビボ系で毒性試験を設計及び実施するための手順は、周知であり、その主題に関しては多くの教科書に記載されている。例えば、Ｌｏｏｍｉｓら、Ｌｏｏｍｉｓ’ｓ  Ｅｓｓｅｎ  ｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ， ４版 （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６）、Ｅｃｈｏｂｉｃｈｏｎ，  Ｔｈｅ  ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９２）、Ｆｒａｚｉｅｒ編、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）などである。
【００４１】
インビトロ毒性試験では、２つのグループの試験生物が通常使用される。１つのグループは対照であり、他のグループは単一用量（急性毒性試験用）で、又は１つの投薬計画の用量で（遷延性又は慢性毒性試験用）、試験化合物を受ける。実験の継続期間を通して遺伝子発現のダイナミックスを観察することを望むのであれば、組織サンプリングのための動物除去が可能になるように、対照グループ及び化合物を受けているグループの両方ともが十分に大きくなければならない。いくつかのケースでは、本発明の方法で要求される組織の抽出において試験動物を犠牲にする必要があるからである。
【００４２】
毒性研究を計画するに際して、試験される化合物のために適切な試験生物を選ぶこと、投与経路、用量の範囲などについて広範囲な指針が文献で提供されている。水又は生理的食塩水（０．９％ＮａＣｌ水溶液）が、試験化合物のために選択される溶質である。というのは、これらの溶剤が様々な経路による投与を許容するからである。溶解性の限界のために、これが可能でないとき、トウモロコシ油のような植物油、又はプロピレングリコールのような有機溶剤が使用できる。
【００４３】
投与経路に関係なく、所与の用量を投与するのに要する容積は、使われる動物の大きさによって制限される。動物のグループ内又はグループ間で各用量の容積を均一に保つことが望ましい。ラット又はマウスを使用するとき、一般に経口経路で投与される容積は、動物のグラム当たり０．００５ｍＬを超えてはならない。水溶液又は生理的食塩水溶液が非経口的注入のために使われるときでも、そのような溶液は通常無害である考えられているが、許容される容積は制限される。マウスでの蒸留水の静脈ＬＤ５０は、マウスグラム当たり約０．０４４ｍＬであり、等張生生理食塩水のそれはマウスグラム当たり０．０６８ｍＬである。ある場合には、試験動物への投与経路は、治療目的のためのヒトへの該化合物の投与経路と同一、又はできるだけ似通っているべきである。
【００４４】
化合物が吸入によって投与されることになっているとき、試験空気を発生する特殊な手法が必要である。その方法は、通常、化合物を含む液のエーロゾル化又は噴霧化を含む。試験される薬剤が感知できる蒸気圧を持つ液であるならば、それは制御された温度条件下で空気を溶液に通すことによって投与できる。これらの条件下で、用量は単位時間当たりに吸入される空気の容積、溶液の温度及び関与する薬剤の蒸気圧から見積もられる。ガスは、ガス溜めからメーターで測られる。溶液の粒子が投与されることになっているとき、粒径が約２μｍより小さくなければ、粒子は肺で末端の肺胞嚢に達しない。吸入によって投与されるとき、様々な装置やチャンバーが、刺激物質又はその他の有毒なエンドポイントの効果を検出するための研究を実行するために利用できる。動物に薬剤を投与する好ましい方法は、挿管によるか又は飼料に薬剤を取り入れることによる、経口経路を通してのものである。
【００４５】
インビトロ又は細胞培養にて薬剤が細胞に曝されるとき、例えば、薬剤に曝される細胞集団は、その集団を２つ以上の同一のアリコートに分割することによって、２つ以上の副集団に分割され得る。本発明の方法の好適ないくつかの実施形態で、薬剤に曝される細胞は、心臓組織に由来する。例えば、培養された又は新たに単離されたラット心臓細胞を使うことができる。
【００４６】
本発明の方法は、一般に少なくとも１つの毒性反応を予測するのに使用でき、そして、実施例に記載されているように、化合物又は試験薬剤が組織壊死、心筋炎、不整脈、頻拍、心筋虚血、アンギナ、高血圧症、低血圧症、呼吸困難、心臓性ショック又は本明細書に記載された少なくとも１つの毒に関連する他の症状などの様々な特定の心臓症状を誘発するという見込みを予測するのに使用できる。また、本発明の方法を用いて、１つ又はそれ以上の個々の化合物に対する、毒性反応の類似性を決定できる。それに加えて、本発明の方法を用いて、既知の毒（表５〜５Iを参照）によって誘発されるプロファイルと比較しての、発現プロファイルの類似性のために、前記化合物又は試験薬剤によって影響、誘発又は調節される可能性のある細胞経路を予測するか、又は解明できる。
【００４７】
毒性マーカーの診断用途
上述のように、化合物に曝された組織若しくは細胞試料の生理的状態の予測又は同定のための診断マーカーとして、或いは化合物又は薬剤の毒作用を同定するか、予測するのに表１〜５Iに提供されたような遺伝子や遺伝子発現情報、又はそれらの発現情報を備える遺伝子のポートフォリオを使用することができる。例えば、末梢血液細胞の試料のような組織試料又は他の簡単に得ることができる若干の組織試料を上記の方法のいずれかによってアッセイでき、そして、表５〜５Iからの１又は複数の遺伝子の発現レベルが本明細書に記載される毒に曝された組織若しくは細胞で見出される発現レベルと比較できる。これらの方法は、細胞での生理的状態の診断をもたらし、毒への暴露を診断するために使用することができ、或いはある化合物（例えば、被験者が曝された新しいか未知の化合物又は薬剤）の潜在的な毒性を確認するために使用することができる。利用できる配列又は他の情報と同様に、発現データの比較は、研究者又は診断者が行ってもよいし、下記のようにコンピューターやデータベースの助けを借りてもなし得る。
【００４８】
別の様式では、試料（例えば、身体の組織若しくは体液試料）中、表５〜５Iの１又は複数の遺伝子のレベル、それがコードする１又は複数のタンパク質、又は該コードされたタンパク質によって生産されるいかなる代謝産物でも、モニター又は検出して、生物体の生理的状態を確認するか、診断することができる。そのような試料としては、尿、血液及び簡単に取得できる細胞（例えば、末梢リンパ球）を含む、いかなる組織又は液試料が挙げられる。
【００４９】
毒性進行をモニターするためのマーカーの使用
上述のように、医薬、候補薬、毒、汚染物質などに最初に曝された後に見出されるような毒性進行をモニターするためのマーカーとして、表５〜５Iに提供される遺伝子や遺伝子発現情報を使用することもできる。例えば、組織試料又は細胞試料を上記の方法のいずれによってアッセイでき、そして、表５〜５Iの１又は複数の遺伝子の発現レベルが本明細書に記載される心臓毒に曝された組織若しくは細胞で見出される発現レベルと比較できる。利用できる配列又は他の情報と同様に、発現データの比較は、研究者又は診断者が行ってもよいし、下記のようにコンピューターやデータベースの助けを借りてもなし得る。
【００５０】
医薬スクリーニングのための毒性マーカーの使用
本発明によれば、表１〜５Iで同定された遺伝子を、マーカー又は薬標的として使用して、細胞又は組織試料に対する、候補薬、化学物質又は他の薬剤の効果を評価することができる。その発現や活性を調節する薬剤をスクリーニングするための薬標的として遺伝子を使用することもできる。様々な様式で、候補薬又は薬剤は、所定の１又は複数のマーカーの転写・発現を刺激する能力、或いは１又は複数のマーカーの転写・発現をダウンレギュレート又は妨げる能力をスクリーニングできる。本発明によれば、薬が誘発するマーカーの数を見て、そしてそれらを比較することによって、薬の効果の特異性を比較することもできる。より特異的な薬は、より少ない転写標的を有する。２つの薬のために同定されたマーカーの類似したセットは、効果の類似性を示すかもしれない。
【００５１】
表１〜５Iに定義するような１又は複数のマーカーの発現をモニターするためのアッセイは、本発明の核酸の発現レベル変化をモニターするのに利用可能ないかなる手段を利用してもよい。本明細書で使用する場合、細胞で核酸の発現をアップ又はダウンレギュレーションできるならば、薬剤は本発明の核酸の発現を調節するという。
【００５２】
１つのアッセイ様式で、表１〜５Iからの１個、２個若しくはそれ以上の遺伝子に対するプローブを含む遺伝子チップを使用して、処理又は曝露された細胞で、遺伝子発現の変化を直接モニター又は検出することができる。株化細胞、組織又は他の試料を試験薬剤（ある場合には既知の毒）にまずさらして、表１〜５Iの遺伝子のうちの１個若しくはそれ以上（又は、好ましくは２個若しくはそれ以上）の検出された発現レベルを、既知の毒単独に曝された同じ遺伝子の発現レベルと比較する。既知の１又は複数の毒の発現パターンを調節する化合物は、インビボで潜在的に有毒な生理作用を調節することが期待される。表１〜５中の遺伝子は、既知の心臓毒に曝されたとき、細胞で差次的に発現されるので、これらのアッセイにおいて特に適切な指標である。表１及び表２は、指定の毒に曝されて差次的に発現した遺伝子と、対応するＧｅｎｂａｎｋ受入番号と、を開示する。表３は、表１及び表２の差次的に発現した遺伝子のヒトホモログと、対応するＧｅｎｂａｎｋ受入番号と、を開示する。
【００５３】
別の様式では、表１〜５Iの遺伝子のオープンリーディングフレーム及び／又は転写調節領域間のリポーター遺伝子融合を含む株化細胞及びアッセイ可能な融合パートナーを調製する。多数のアッセイ可能な融合パートナーが知られており、容易に入手可能であるが、ホタルルシフェラーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含む（Ａｌａｍら、（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．1８８：２４５−２５４）。リポーター遺伝子融合を含む株化細胞を、適切な条件と時間で試験される薬剤に曝す。薬剤に曝された試料と対照試料との間のリポーター遺伝子の示差発現は、核酸の発現を調節する薬剤を同定する。
【００５４】
追加のアッセイ様式を用いて、表５〜５I中で同定された遺伝子の発現を調節する薬剤の能力をモニターできる。上述のように、例えば、ｍＲＮＡ発現は、本発明の核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって直接モニターできる。株化細胞を適切な条件と時間で、試験される薬剤にさらして、トータルＲＮＡ又はｍＲＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に開示されているもののような標準的な手順によって単離する。
【００５５】
もう一つのアッセイ様式では、本発明の遺伝子産物を生理的に発現する細胞又は株化細胞をまず同定する。そのように同定された細胞及び／又は株化細胞は、転写装置の調節の忠実度が適当な表面伝達機構及び／又は細胞質カスケードと薬剤の外因性接触に関して、維持されるように必要な細胞機構を含むと期待されるだろう。さらに、そのような細胞又は株化細胞は、表１〜５Iの遺伝子産物をコードする構造遺伝子の端を含んでいる操作可能な非翻訳性の５’−プロモーターが１つ以上の抗原性フラグメント又は他の検出可能なマーカーであり、これらは本発明の遺伝子産物に特有であり、さらに前記フラグメントは、該プロモーターの転写調節の下にあり、ポリペプチドとして発現される（その分子量が天然に存在するポリペプチドから区別できるか、又はさらに免疫学的に識別される若しくは他の検出可能なタグを含む）ものに融合されたものを含んでなる発現媒体（例えば、プラスミド又はウィルス性ベクター）構築体で形質導入又は形質転換できる。そのようなプロセスは、当該技術において周知である（上記のＳａｍｂｒｏｏｋらを参照）。
【００５６】
上記で概説したような細胞又は株化細胞を、それから、適切な条件下で薬剤と接触させる。例えば、その薬剤は薬学的に許容される賦形剤を含み、そして、生理的ｐＨでのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理的ｐＨでのイーグル緩衝塩類溶液（ＢＳＳ）、血清を含むＰＢＳ又はＢＳＳ、若しくはＰＢＳ又はＢＳＳ及び／又は血清を含む条件培地などの水性の生理的緩衝液に含まれる細胞と接触され、３７℃でインキュベートされる。前記条件は、当業者が必要と思えば調節することができる。細胞を前記薬剤に接触させるのに続いて、該細胞を粉砕して、細胞溶解液のポリペプチドを、ポリペプチド画分がプールされ、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降又はウエスタンブロット）によってさらに処理されることになっている抗体と接触させられるように分画する。薬剤と接触された試料から単離したタンパク質のプールを次いで対照試料（非曝露又は既知の毒への曝露）と比較するが―そこでは賦形剤のみが細胞と接触される、そして、その対照と比較して薬剤と接触された試料からの免疫学的に発生されたシグナルにおける増加又は減少を用いて、前記薬剤の有効性及び／又は毒作用を識別する。
【００５７】
蛋白質の活性又はレベルを調節する薬剤を同定するための毒性マーカーの使用
本発明の別の実施形態は、表１〜５Iの遺伝子によってコードされる１又は複数のタンパク質の少なくとも１つの活性を調節する薬剤を同定するための方法を提供する。そのような方法又はアッセイは、所望の活性をモニター又は検出するいかなる手段をも利用できる。
【００５８】
１つの様式では、曝されていない対照細胞集団と比較しての試験される薬剤に曝された細胞集団と既知の毒に曝された細胞集団との間のタンパク質の相対量（表１〜５I）をアッセイする。この様式の中で、特異的抗体のようなプローブを用いて、異なる細胞集団でのタンパク質の差次的な発現をモニターする。株化細胞又は細胞集団を、適切な条件と時間の下で、試験される薬剤に曝す。曝された株化細胞又は細胞集団、及び対照の曝されていない株化細胞又は細胞集団から細胞溶解液を調製する。この細胞溶解液は、それから、プローブ（例えば、特異的抗体）で分析される。
【００５９】
上記の方法でアッセイした薬剤を無作為に選ぶことができるか、又は合理的に選ぶか若しくは設計することができる。本明細書で使用する場合、薬剤が本発明のタンパク質単独で、又はその関連する基質、結合パートナーなどとの会合に関与する特異的配列を考慮することなく無作為に選ばれるとき、その薬剤は無作為に選ばれるという。無作為に選ばれた薬剤の例は、化学的なライブラリ若しくはペプチドのコンビナトリアルライブラリ、又は生物の成長ブロスの使用である。
【００６０】
本明細書で使用する場合、薬剤がその作用と関連して、標的部位の配列及び／又はその立体配座を考慮する無作為な基準ではなく選ばれるとき、その薬剤は合理的に選ばれるか、または設計される。薬剤は、これらの部位を構成するペプチド配列を利用することによって合理的に選ぶか、または設計することができる。例えば、合理的に選ばれたペプチド薬剤は、そのアミノ酸配列が機能コンセンサス部位と同一であるか、又はその誘導体でありえる。
【００６１】
本発明の薬剤は、例えば、ペプチド、小分子、ビタミン誘導体、同様に炭水化物でありえる。ドミナントネガティブなタンパク質、これらのタンパク質をコードするＤＮＡ、これらのタンパク質に対する抗体、これらのタンパク質のペプチドフラグメント、又はこれらのタンパク質の模擬体は、機能に影響を及ぼすために細胞に導入される。本明細書で使用する「模擬体」とは、親ペプチドと化学的に構造は異なるが、組織分布的に、そして、機能的に親ペプチドと類似な構造を提供するためのペプチド分子の１つの領域又はいくつかの領域の改変を指す（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）中、６５９−６６４頁を参照)。当業者は、本発明の薬剤の構造上の性質に関して、制限がないと容易に認識できる。
【００６２】
核酸アッセイ様式
前に議論したように、既知の心臓臓毒（表１〜５I）に曝されると、差次的に発現されると同定した遺伝子を様々な核酸検出アッセイで使用して、与えられた試料中、１又は複数の遺伝子の発現レベルを検出又は定量できる。表１〜５Iに記載した遺伝子は、その差次的な発現が細胞又は組織での毒性に関連する、１つ以上の追加の遺伝子と組合せても使用されるかもしれない。好ましい実施形態では、表５〜５中の遺伝子は、先願の関連出願である６０／３０３，８１９、６０／３０５，６２３、６０／３６９，３５１、６０／３７７，６１１、０９／９１７，８００、１０／０６０，０８７、及び１０/１５２，３１９に記載される遺伝子の１つ以上と組合せられるかもしれない。これら全ては、本出願の１頁で関連付けによって取り入れられる。
【００６３】
遺伝子発現を検出するいかなるアッセイ様式を使用してもよい。例えば、伝統的なノーザンブロッティング、ドットブロット又はスロットブロット、ヌクレアーゼ保護、プライマー指示された増幅、ＲＴ−ＰＣＲ、半定量的若しくは定量的ＰＣＲ、分枝鎖ＤＮＡ及びディファレンシャルディスプレイ法が、遺伝子発現レベルを検出するために使われるかもしれない。それらの方法は、本発明のいくつかの実施形態に有用である。より少ない数の遺伝子が検出される場合には、増幅に基づくアッセイが最も効率的であるかもしれない。しかしながら、本発明の方法及びアッセイは、多数の遺伝子の発現を検出するハイブリダイゼーションに基づく方法で、最も能率的に設計される。
【００６４】
いかなるハイブリダイゼーションアッセイ様式を用いてもよいが、これには溶液に基づくアッセイ様式及び固体支持体に基づくアッセイ様式が含まれる。本発明の差次的に発現された遺伝子用オリゴヌクレオチドプローブを含む固体支持体は、フィルター、ポリ塩化ビニルディシュ、粒子、ビーズ、微粒子又はシリコン若しくはガラス基盤チップ等であり得る。そのようなチップ、ウエハー及びハイブリダイゼーション法は、広く利用でき、例えばＢｅａｔｔｉｅ（ＷＯ  ９５／１１７５５）によって開示されたものである。
【００６５】
オリゴヌクレオチドが、直接的に又は間接的に、共有結合的に又は非共有結合的に、結合され得るいかなる固体の表面でも、使用することができる。好ましい固体支持体は、高密度アレイ又はＤＮＡチップである。これらは、アレイ上で予め決められた位置に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含む。予め決められた位置は、１分子以上のプローブを含んでもよいが、その予め決められた位置内の各分子は同一の配列を有する。そのような予め決められた位置は、特徴と呼ばれる。例えば、単一の固体支持体上に２、１０、１００、１，０００から１０，０００、１００，０００個まで、又は４００，０００個以上のこのような特徴があるかもしれない。固体支持体又はプローブが取り付けられる範囲は、約1平方センチメートル程度である。表５〜５Iの遺伝子に対応するプローブ、又は上記の関連出願からのプローブは、単一の又は複数の固体支持体に取り付けることができる。例えば、それらのプローブは、単一のチップ又は１つのチップセットを構成する複数のチップに取り付けることができる。
【００６６】
発現モニター用のオリゴヌクレオチドプローブアレイは、当該技術で知られているいかなる手法によっても製作し、かつ用いることができる（例えば、Ｌｏｃｋｈａｒｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９６）１４，１６７５−1６８０；ＭｃＧａｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ. ＵＳＡ（１９９６）９３, １３５５５−１３４６０）。そのようなプローブアレイは、表５〜５Iに記載した２個若しくはそれ以上の遺伝子に相補的であるか、又はハイブリダイズする少なくとも２個以上のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、そのようなアレイは、本明細書に記載される少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、７０、１００個若しくはそれ以上の遺伝子に相補的であるか、又はハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含んでもよい。好ましいアレイは、表１〜５Iに挙げられた遺伝子の全て又はほぼ全て、或いは個別的には、表５〜５Iの遺伝子セットを含む。好ましい実施形態では、単一の固体支持体基質（例えば、チップ）上に表１〜５Iのいずれか１個又は全て遺伝子のうち、すべて又はほぼすべての遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドを含むように、アレイが構築される。
【００６７】
表１〜５Iの発現マーカー遺伝子の配列は、公共のデータベースにある。表１は、配列の各々についてＧｅｎｂａｎｋ受入番号又はＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑＩＤ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を参照）ならびに本出願とともに出願した配列リスト中の対応する配列番号を提供する。表３は、表１及び表２に記載の遺伝子のヒトホモログのＬｏｃｕｓＬｉｎｋ及びＵｎｉｇｅｎｅの名称及び記述を提供する。本出願の出願日現在でのＧｅｎＢａｎｋ及び／又はＲｅｆＳｅｑ中の遺伝子の配列は、明示により本明細書にそれらの全体が関連付けにより取り入れられる、さらに関連する配列、例えば、異なる長さの同一遺伝子からの配列、該遺伝子の変異体配列、多型配列、ゲノム配列及び異なる種（適当な場合、ヒトに対応）からの関連配列も同様である。これらの配列は、本発明の方法に用いることができるか、或いは本発明のプローブ又はアレイを作製するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、以前から毒性反応に関連する遺伝子又はフラグメントに一致する表１〜５I中の遺伝子は、その表から除外してよい。
【００６８】
上述のように、表１〜５Iに開示されたＧｅｎｂａｎｋ受入番号又はＮＣＢＩのＲｅｆＳｅｑＩＤの配列に加えて、天然に起こっている変異体又は多型の配列のような配列を本発明の方法及び組成で使用してもよい。例えば、表１〜５Iに開示された遺伝子の様々な対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ）体又は相同体の発現レベルをアッセイできる。本明細書に開示された遺伝子の全ての天然に起こっている対立形質（ａｌｌｅｌｉｃ）変異体を含む表１〜５Iに挙げられた遺伝子の機能活性を有意に変えない、いかなるそして全てのヌクレオチド変異を、本発明の方法に用いて、本発明の組成（例えば、アレイ）を作ることができる。
【００６９】
上記の遺伝子の配列に基づくプローブは、一般に利用できるいかなる方法によっても調製できる。組織若しくは細胞試料をスクリーニング又はアッセイするためのオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、適当な、相補的遺伝子又は転写物のみに特異的にハイブリダイズするのに十分な長さである。典型的には、オリゴヌクレオチドプローブが、長さで少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０又は２５個のヌクレオチドである。ある場合には、少なくとも３０、４０又は５０個のヌクレオチドのより長いプローブが望ましいこともある。
【００７０】
本明細書で使用する場合、表１〜５Iに記載された遺伝子の１個若しくはそれ以上に相補的であるオリゴヌクレオチド配列とは、ストリンジェントな条件下、該遺伝子のヌクレオチド配列、それらがコードするＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ、又はｃＲＮＡなどのＲＮＡの増幅型の少なくとも一部にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。そのようなハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは典型的には、該遺伝子にヌクレオチドレベルで、少なくとも約７５％の配列一致性、好ましくは約８０％又は８５％の配列一致性、さらに好ましくは該遺伝子に約９０％又は９５％以上の配列一致性を示すことになる。
【００７１】
「実質的に結合する」とは、プローブ核酸と標的核酸間の相補的なハイブリダイゼーションを指し、標的ポリヌクレオチド配列の望ましい検出を達成するためにハイブリダイゼーション培地の厳密性を減らすことによって、適応することができる重要でないミスマッチを包含する。
【００７２】
「バックグランド」又は「バックグランドシグナル強度」という用語は、ラベルされた標的核酸とオリゴヌクレオチドアレイの成分（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、対照プローブ、アレイ基質等）との間で、非特異的な結合、又はその他の相互作用から生じるハイブリダイゼーションシグナルを指す。バックグランドシグナルは、また、アレイ成分自身の内部蛍光によって生じるかもしれない。単一のバックグランドシグナルは、全アレイのために計算することができる、或いは、異なるバックグランドシグナルを各標的核酸のために計算してもよい。好ましい実施形態では、バックグランドはアレイ中のプローブの最も低い５％〜１０％に対する平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算されるか、或いは、異なるバックグランドシグナルを各標的遺伝子のため計算する場合、各遺伝子のプローブの最も低い５％〜１０％に対する平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算される。当然ながら、当業者は、特定の遺伝子へのプローブが、よくハイブリダイズして、標的配列に特異的に結合しているようにみえる場合は、それらをバックグランドシグナル計算に使用してはならないと理解するであろう。あるいは、試料中に見出されるいかなる配列にも相補的でないプローブ（例えば、反対のセンスの核酸に指向されているプローブ、又は、試料が哺乳類の核酸であるとき、バクテリア遺伝子のような試料中に見出されない遺伝子に指向されているプローブ）へのハイブリダイゼーションによって生成される平均ハイブリダイゼーションシグナル強度として計算してもよい。また、バックグランドは、全くプローブを欠くアレイの領域によって生じる平均シグナル強度として計算されることもできる。
【００７３】
「特異的にハイブリダイズしている」又は「特異的にハイブリダイズする」という表現は、配列が複雑な混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡ又はＲＮＡに存在するとき、ストリンジェントな条件下、特定の１又は複数の核酸配列に実質的に又はそれらだけに、ある分子が結合、二本鎖形成（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）又はハイブリダイズすることを指す。
【００７４】
本発明のアッセイ及び方法は、入手可能な形態を利用して、同時に少なくとも約１００個、好ましくは約１，０００個、より好ましくは約１０，０００個、最も好ましくは約１，０００，０００個の異なる核酸ハイブリダイゼーションを選別できる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「プローブ」は、１種類以上の化学結合を通して、通常は相補的な塩基対形成を通して、通常は水素結合形成を通して、相補配列の標的核酸に結合することができる核酸として定義される。本明細書で使用する場合、プローブは天然型の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、Ｃ又はＴ）又は修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン等）を含む。加えて、それがハイブリダイゼーションを妨げない限り、プローブ中の塩基は、ホスホジエステル結合以外の結合でつながれていてもよい。したがって、プローブは、構成塩基がホスホジエステル結合ではなくペプチド結合でつながれているペプチド核酸であってもよい。
【００７６】
「完全なマッチプローブ」という用語は、特定の標的配列に、完全に相補的である配列を持つプローブを指す。試験プローブは、典型的には、標的配列の部分（部分配列（サブシークエンス））に対して完全に相補的である。完全なマッチ（ＰＭ）プローブは、「試験プローブ」、「標準化対照」プローブ、発現レベル対照プローブなどであり得る。しかしながら、完全なマッチ対照又は完全なマッチプローブは、「ミスマッチ対照」又は「ミスマッチプローブ」から区別される。
【００７７】
「ミスマッチ対照」又は「ミスマッチプローブ」という用語は、その配列が特定の標的配列に完全には相補的でないように故意に選ばれるプローブを指す。高密度アレイ中の各ミスマッチ（ＭＭ）対照に対して、同じ特定の標的配列に、完全に相補的である対応する完全なマッチ（ＰＭ）プローブが典型的には存在する。そのミスマッチは、１つ以上の塩基を含むかもしれない。
【００７８】
ミスマッチは、ミスマッチプローブでどこにでも存在していてもよいが、末端ミスマッチはより望ましくない。なぜなら、末端ミスマッチは標的配列のハイブリダイゼーションを防ぎそうにないからである。特に好ましい実施形態では、試験ハイブリダイゼーション条件下、そのミスマッチが標的配列との二本鎖を最も不安定にしそうな、プローブの中央又はその近くにミスマッチは位置する。
【００７９】
「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列へは実体のないハイブリダイゼーションだけか、又は違いが確認される程度に他の配列にハイブリダイズする条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列に依存しており、異なる状況において異なることになる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般的には、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度とｐＨにおける特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選ばれる。
【００８０】
典型的には、ストリンジェントな条件は、その塩濃度がｐＨ７．０〜８．３において少なくとも０．０１〜１．０ＭのＮａ＋イオン濃度（又は他の塩）であり、そして、温度が短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）用には少なくとも約３０℃であるものであろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成することもできる。
【００８１】
「配列同一性のパーセント」又は「配列同一性」は、比較ウィンドウ又はスパンにわたって、２つの最適に整列した配列又は部分配列を比較することによって決定されるが、そこで比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分が、該２つの配列の最適な整列のための基準配列（それは、付加又は欠失を含まない）と比較して、随意に付加若しくは欠失（すなわち、ギャプ）を含むかもしれない。同一のサブユニット（例えば、核酸塩基又はアミノ酸残基）が両方の配列で起こる位置の数を決定しマッチした位置の数をだし、マッチした位置の数を比較ウィンドウ中にある位置の全数で割り、そしてその結果に１００を乗じて配列同一性のパーセントを出すことにより、前記パーセントを計算する。ＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラム（下記参照）使用して計算したとき、配列同一性パーセントは、デフォルトギップの加重値を用いて計算する。
【００８２】
プローブ設計
配列設計の莫大な数が本発明の実施に適切であることを当業者は理解するであろう。高密度アレイは、興味ある配列に特異的にハイブリダイズする数多くの試験プローブを典型的に含む。プローブは、表中及び付随する代表的な配列表で同定されている遺伝子のいかなる領域から作製してもよい。その表中の遺伝子参照がＥＳＴである例では、その配列から、又は配列データベース（例えば、本明細書に記載されたもの）のどれかで入手可能であろう対応する全長転写物の他の領域から、プローブは設計されてもよい。与えられた１又は複数の遺伝子のためのプローブを作製する方法については、ＷＯ９９／３２６６０を参照。それに加えて、利用できるソフトウェアならなんでも用いて特定のプローブ配列を作成することができるが、これは例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ、オリンパス光学工業株式会社及びＢｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手可能なソフトウェアを含む。好ましい実施形態では、そのアレイはまた、１個若しくはそれ以上の対照プローブを含む。
【００８３】
本発明の高密度アレイチップは、「試験プローブ」を含む。その試験プローブは、長さで約５〜約５００個、又は約７〜約５０個のヌクレオチド、より好ましくは約１０〜約４０個のヌクレオチド、そして、最も好ましくは約１５〜約３５個のヌクレオチドの範囲にあるオリゴヌクレオチドであってもよい。他の特に好ましい実施形態では、プローブが長さで２０個又は２５個のヌクレオチドである。好ましいもう一つの実施形態では、試験プローブは、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ配列（例えば、ｃＤＮＡ断片）である。ＤＮＡ配列は、自然源から単離されるかクローンされるか、或いは天然の核酸を鋳型に使用して増幅される。これらのプローブは、その発現を検出するように設計した遺伝子の特定の部分配列に相補的な配列を有する。このように、前記試験プローブは、それが検出するはずである標的核酸に、特異的にハイブリダイズすることができる。
【００８４】
興味ある標的核酸を結合する試験プローブに加えて、高密度アレイは、数多くの対照プローブを含むことができる。その対照プローブは、ここで１）標準化対照、２）発現レベル対照、そして３）ミスマッチ対照と呼ばれる３つのカテゴリーに分類されるかもしれない。
【００８５】
標準化対照は、ラベルされた参照オリゴヌクレオチドに、又はスクリーンされる核酸試料に加えられた他の核酸配列に相補的であるオリゴヌクレオチド、又は他の核酸プローブである。ハイブリダイゼーション後、標準化対照から得られるシグナルは、ハイブリダイゼーション条件の変化、ラベル強度、「読み」効率及び完全ハイブリダイゼーションのシグナルをアレイ間で変化させる他の因子、のための対照を提供する。好ましい実施形態において、アレイ中全ての他のプローブから読まれるシグナル（例えば、蛍光強度）は、対照プローブからのシグナル（例えば蛍光強度）によって割られ、かくして、測定を標準化している。
【００８６】
実質的に、いかなるプローブでも、標準対照として役に立つかもしれない。しかしながら、ハイブリダイゼーション効率は、塩基組成及びプローブ長さとともに変化すると認められている。好ましい標準化プローブは、アレイに存在する他のプローブの平均長を反映するように選ばれるが、それらはある範囲の長さをカバーするように選ばれることができる。標準化対照も、また、アレイ中の他のプローブの（平均）塩基組成を反映するように選ばれ得るが、好ましい実施形態では、１個か、数個のみのプローブを使用し、それらはよくハイブリダイズし（すなわち、二次構造をとらない）、そしていかなる標的特異的プローブにもマッチしないように選択される。
【００８７】
発現レベル対照は、生物学的試料中の恒常的に発現した遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブである。実質的に、恒常的に発現した遺伝子はどれも、発現レベル対照に対して適当な標的を提供する。典型的には、発現レベル対照プローブは、アクチン遺伝子、トランスフェリンレセプター遺伝子、ＧＡＰＤＨ遺伝子などを含むがこれらに限らない、恒常的に発現した「ハウスキーピング遺伝子」の部分配列に相補的な配列を有する。
【００８８】
標的遺伝子に対するプローブ、発現レベル対照、又は標準化対照に対して、ミスマッチ対照が提供される。ミスマッチ対照は、１個以上のミスマッチ塩基の存在を除いて、対応する試験プローブ又は対照プローブと同一なオリゴヌクレオチドプローブ又は他の核酸プローブである。ミスマッチ塩基とは、そのプローブがさもなければ特異的にハイブリダイズするであろう標的配列中の対応する塩基に相補的でないように、選ばれる塩基である。適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、ストリンジェントな条件）、試験プローブ又は対照プローブがその標的配列にハイブリダイズすると期待されるが、ミスマッチプローブはハイブリダイズしないであろう（又は、かなり少ない程度でしかハイブリダイズしないであろう）ように、１個以上のミスマッチが選択される。好ましいミスマッチプローブは、中央ミスマッチを含む。このように、例えばプローブが２０ｍｅｒである場合、対応するミスマッチプローブは、６位から１４位（中央ミスマッチ）のどの位置でも単一の塩基ミスマッチ（例えば、Ｇ、Ｃ又はＴをＡのかわりとする）を除いて、同一の配列を持つことになる。
【００８９】
かくして、ミスマッチプローブは、試料中でそのプローブが指示する標的以外の核酸に非特異的に結合するか、又はクロスハイブリダイゼーションするための対照を提供する。例えば、標的が存在するならば、完全なマッチプローブはミスマッチプローブより絶えず明るいはずである。それに加えて、全ての中央ミスマッチが存在するならば、ミスマッチプローブを使用して、変異（例えば、添付の表１〜５Iの遺伝子の変異）を検出することができる。完全なマッチプローブとミスマッチプローブとの間の強度の違いは、ハイブリダイズした材料の濃度の良い尺度を提供する。
【００９０】
核酸試料
細胞又は組織試料は、インビトロ又はインビボで試験薬剤に曝される。培養細胞又は組織が使用されるとき、適当な哺乳動物の細胞抽出物（例えば、肝臓細胞及び抽出物）を、試験薬剤と共に加え、毒性を示すのに生体内変換を要するかもしれない薬剤を評価してもよい。
【００９１】
本発明によってアッセイされる遺伝子は、典型的にはｍＲＮＡ又は逆転写されたｍＲＮＡの形態である。その遺伝子は、クローン化されてもよいし、されなくてもよい。その遺伝子は、増幅されてもよいし、増幅されず、ｃＲＮＡが生産されなくてもよい。クローニング及び／又は増幅は、集団内での遺伝子の表現にバイアスをかけるようには見えない。しかし、いくつかのアッセイでは、より少ないプロセッシングステップで使用できるので、材料としてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを用いることが好ましいかもしれない。
【００９２】
当業者にとって明らかであるように、本発明の方法及びアッセイにおいて使われる核酸試料は、いかなる利用可能な方法又はプロセスによって調製されてもよい。トータルｍＲＮＡを単離する方法は、当業者に周知である。例えば、核酸の単離と精製の方法は、「生化学と分子生物学における研究室手法（第２４巻）  核酸プローブとのハイブリダイゼーション：理論と核酸プローブ、Ｐ．  Ｔｉｊｓｓｅｎ、編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）」の第３章に詳しく記載されている。そのような試料は、ＲＮＡ試料を含むが、興味ある細胞若しくは組織から単離されるｍＲＮＡ試料から合成されるｃＤＮＡをも含む。また、そのような試料は、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、及びその増幅されたＤＮＡ（ｃＲＮＡ）から転写されるＲＮＡをも含む。当業者は、ホモジネートが使われる前に、ホモジネートに存在するＲＮＡ分解酵素を阻害又は破壊することが、望ましいと認めるだろう。
【００９３】
生物学的試料は、どんな生物並びにインビトロで育てられた細胞（例えば、株化細胞及び組織培養細胞）からのいかなる生体組織、液体又は細胞のものでもよい。しばしば、その試料は、化合物、薬剤、医薬、医薬組成物、潜在的な環境汚染物質又は他の組成物に曝された組織又は細胞試料である。ある様式では、試料は、患者に由来する試料である「臨床試料」であるだろう。典型的な臨床試料には、痰、血液、血液細胞（例えば、白血球）、組織若しくは細針バイオプシーの試料、尿、腹膜液や胸水、或いはそれらからの細胞が含まれるが、これらには限定されない。生物学的試料は、組織学的目的で取られた凍結切片又はホルマリン固定切片のような、組織の切片をも含むかもしれない。
【００９４】
高密度アレイの作成
合成のステップの最小数で、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを作成する方法は、知られている。オリゴヌクレオチド類似体のアレイは、様々な方法で単一又は複数の固体基質上に合成することができ、これらは限定はされないが、光指向された化学的カップリング及び機械的に指向されたカップリングを含む（Ｐｉｒｒｕｎｇ（米国特許第５，１４３，８５４号）を参照）。
【００９５】
手短に言えば、ガラス表面上でのオリゴヌクレオチドアレイの光指向されたコンビナトリアル合成は、自動化されたホスホラミダイト化学とチップマスキング手法を用いて進む。１つの特定的実施において、ガラス表面を、官能基（例えば、光反応性保護基によってブロックされている水酸基又はアミン基）を有するシラン試薬で誘導体化する。光リソグラフ性マスクを通しての光分解を使用して、導入する５’光保護されたヌクレオシドホスホラミダイトと化学反応する準備ができている官能基を選択的に露出する。そのホスホラミダイトは、照射された（かくして、光反応性ブロック基の除去によって曝される）部位のみと反応する。このように、ホスホラミダイトは前のステップで選択的に曝されるそれらの領域にのみ付加する。所望の配列アレイが固体表面上に合成されるまで、これらのステップが繰り返される。アレイ上の異なる位置での異なるオリゴヌクレオチド類似体のコンビナトリアル合成は、合成の間の照射パターンとカップリング試薬の添加の順序によって決定される。
【００９６】
前述のことに加えて、単一基質上でオリゴヌクレオチドのアレイを生成するために使用できる追加の方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０９６６８号とＷＯ０１／２３６１４号に記載されている。高密度核酸アレイは、予め調製した、又は天然の核酸を予め決められた位置に置くことによって組み立てることもできる。合成又は天然の核酸は、光指向ターゲティング及びオリゴヌクレオチド指向ターゲティングによって、基質の特定位置に置かれる。別の実施形態は、区域から区域に移動し、核酸を特定スポットに置くディスペンサーを使用する。
【００９７】
ハイブリダイゼーション
核酸ハイブリダイゼーションは、相補的な塩基対形成を通してプローブとその相補的な標的とが安定した混成二本鎖を形成することができる条件下、プローブと標的核酸とを接触させることを単に含む。ＷＯ９９／３２６６０を参照。混成二本鎖を形成しない核酸は、その後、洗い流されて、ハイブリダイズした核酸が検出されるのにまかせる（典型的には、付着した検出可能なラベルの検出を通して）。核酸を含んだ緩衝液の温度を上昇させるか、又はその塩濃度を減少させることによって、核酸が変性すると一般に認められている。低いストリンジェンシー条件下では（例えば、低温及び／又は高塩濃度）、アニールした配列が完全に相補的でない場合でも、混成二本鎖（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡ）が形成される。このように、ハイブリダイゼーションの特異性は、低いストリンジェンシーで減少する。逆に、より高いストリンジェンシー（例えば、より高温及び／又は低塩濃度）では、うまくゆくハイブリダイゼーションは、より少ないミスマッチしか許容しない。ハイブリダイゼーション条件を選択して、いかなる程度のストリンジェンシーをも提供できると当業者は認識するであろう。
【００９８】
好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションを確実にするために低いストリンジェンシー（この場合、３７℃で６×ＳＳＰＥＴ（０．００５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００））で、ハイブリダイゼーションを実行し、それから、ミスマッチした混成二本鎖を除去するためにより高いストリンジェンシー（例えば、３７℃で１×ＳＳＰＥＴ）で、続く洗浄を実行する。続く洗浄はハイブリダイゼーション特異性の要求されるレベルが得られるまで、ストリンジェンシーをより高くしながら（例えば、３７℃から５０℃で０．２５×ＳＳＰＥＴまで低く落として）実行されるかもしれない。ストリンジェンシーは、ホルムアミドのような薬剤の添加によっても増加することができる。存在することがありえる様々な対照（例えば、発現レベル対照、標準化対照、ミスマッチ対照など）へのハイブリダイゼーションと試験プローブへのハイブリダイゼーションを比較することによって、ハイブリダイゼーション特異性を評価できる。
【００９９】
一般に、ハイブリダイゼーション特異性（ストリンジェンシー）とシグナル強度の間にはトレードオフがある。このように、好ましい実施形態では、一貫した結果を生む、そして、バックグランド強度のおよそ１０％を超えるシグナル強度を与える最も高いストリンジェンシーで、洗浄を実行する。このように、好ましい実施形態では、ハイブリダイズしたアレイは、継続してより高いストリンジェンシー溶液で洗浄され、各洗浄の間に読み取られる。このようにでてきたデータセットの解析により、それ以上ではハイブリダイゼーションパターンが認めうるほどに変化せず、適切なシグナルを興味ある特定のオリゴヌクレオチドプローブのために適切なシグナルを提供する洗浄ストリンジェンシーが明らかとなる。
【０１００】
シグナル検出
ハイブリダイズした核酸は、試料核酸に付けられた１つ以上のラベルを検出することによって典型的に検出される。ラベルは、当業者に周知である数多い手段のいずれによって取り込まれてもよい。ＷＯ９９／３２６６０を参照。
【０１０１】
データベース
本発明には、配列情報（例えば、表１〜５Iの遺伝子）と同様に、様々な標準的毒に曝された組織又は細胞からの遺伝子発現情報（例えば、本明細書に記載のもの、表５〜５Iを参照）を含んでいる関連あるデータベースが含まれる。データベースは、与えられた配列又は組織試料に関連する情報をも含んでもよいが、これは例えば、配列情報と関連する遺伝子についての記載的な情報（表１及び２を参照）や組織試料の臨床状態又はその試料が由来する動物に関する記載的な情報である。データベースは、例えば配列データベースと遺伝子発現データベースというような異なる部分を含むようになっているかもしれない。そのようなデータベースの配置と構築のための方法及びそのようなデータベースがセーブされるコンピュータ読み取り可能な媒体は、広く利用できる。例えば、その全体が関連付けにより本明細書に取り入れられている、米国特許５，９５３，７２７号を参照されたい。
【０１０２】
本発明のデータベースは、外部のデータベースとリンクされていてもよいが、これらは例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ．ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＫＥＧＧ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／ｋｅｇｇ）、ＳＰＡＤ（ｗｗｗ．ｇｒｔ．ｋｙｕｓｈｕ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｐａｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＨＵＧＯ（ｗｗｗ．ｇｅｎｅ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｈｕｇｏ）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ．ｓｐｒｏｔ）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃｎｐｓｉｔ１．ｈｔｍｌ）、ＯＭＩＭ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ）及びＧＤＢ（ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ）である。好ましい実施形態では、表１〜５Iに記載されているように、外部データベースはＧｅｎＢａｎｋ及び国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって維持されているそれに関連するデータベースである。
【０１０３】
配列情報、遺伝子発現情報及びデータベース中のその他の情報又は入力として提供された他の情報の間の必要な比較を実行するためには、適当なコンピュータープラットフォーム、ユーザーインターフェースなどを用いてもよい。例えば、多数のコンピューターワークステーションが様々な製造業者から入手可能であり、そのようなものは、シリコングラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ）から入手可能ものを有する。クライアント／サーバー環境、データベースサーバー及びネットワークも、本発明のデータベースのために広く利用できて、適当なプラットホームである。
【０１０４】
本発明のデータベースを用いて、とりわけ、与えられた遺伝子が発現する細胞の型又は組織をユーザーが決定することが可能な電子ノーザンを生成し、そして特定の組織又は細胞中の与えられた遺伝子の存在量及び発現レベルを決定することが可能となる。
【０１０５】
組織又は細胞において表５〜５Iの遺伝子の１個若しくはそれ以上からなる遺伝子セットの発現レベルを同定する情報であって、試験薬剤に曝された細胞又は組織中で表５〜５I中の少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを、データベース中のその遺伝子の発現レベルと比較するステップを含む、ものを提供するために、本発明のデータベースを用いることができる。そのような方法を用いて、前記試験薬剤に曝された組織又は細胞試料から、表５〜５Iの１又は複数の遺伝子の発現レベルを、標準毒又は心臓毒（例えば、本明細書に記載されたもの）に曝された対照組織試料又は細胞試料で見出される発現レベルと比較することによって、与えられた化合物の毒性ポテンシャルを予測するために、そのような方法を用いることができる。そのような方法は、また、下記のように薬又は薬剤スクリーニングアッセイでも使われるかもしれない。
【０１０６】
キット
本発明は、異なる組合せで、高密度のオリゴヌクレオチドアレイ、アレイと使用する試薬、表の遺伝子によってコードされるタンパク質試薬、シグナル検出とアレイ−プロセッシング機器、遺伝子発現データベース及び上記の解析・データベース管理ソフトウェアを組合せたキットをさらに含む。例えば、前記キットを用いて、試験化合物の毒性反応を予測し、モデリングし、心臓疾患の状態の進行をモニターし、新しい薬標的としての見込みを示す遺伝子を同定し、そして上記で議論したように既知及び新しく設計された薬をスクリーニングすることができる。
【０１０７】
キットとパッケージされるデータベースは、ヒト又は実験動物の遺伝子及び遺伝子断片（表１〜５Iの遺伝子に対応する）からの発現パターンの編集体である。特に、データベースソフトウェアとパッケージされた情報―コンピュータ読み取り可能な媒体にセーブされたデータベースも含む―には、試験薬剤によって誘導される表１〜５Iの遺伝子の発現レベルを表５〜５Iに提示される発現レベルと比較することによって、試験薬剤の毒性を予測するために使用することができる、表１〜５Iの発現結果が含まれる。別の様式では、データベースとソフトウェア情報は、例えば、ウェブサイトのようにアドレスがキットとパッケージされた、遠隔電子フォーマットで提供されるかもしれない。
【０１０８】
マイクロアレイと使用するように設計されたデータベースとソフトウェアは、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１９９９年９月８日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／２０４４９、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄａｔａ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、２０００年６月２８日出願のＰＣＴ／IＢ００／００８６４で、及びＢａｌａｂａｎらの米国特許第６,２２９，９１１号（少数又は多数のマイクロアレイから収集され、表にインデックスされたように保存されている情報を管理するためのコンピューターで実行される方法）及び第６,１８５，５６１号（遺伝子発現レベルデータを集め、追加の特性を加え、そしてそのデータをフォーマットし直して様々な質問に対する答えを出すデータマイニング能力を有する、コンピュータベースの方法）で議論されている。Ｃｈｅｅらの米国特許第５，９７４，１６４号には、参照配列にハイブリダイズする野生型及び変異型配列間のプローブ蛍光強度の差異に基づいて、核酸配列中の変異を同定するためのソフトウェアベースの方法が開示されている。
【０１０９】
キットは、製薬業界で使用されるが、そこでは医薬開発に関連する高いコストのために早期の医薬試験への要求が強いが、バイオインフォマティクス、特に遺伝子発現情報がまだ欠落している。これらのキットは、細胞培養や実験動物を使用する伝統的な新薬スクリーニングに伴うコスト、時間及びリスクを低減するであろう。予めグループ分けされた患者集団、薬理ゲノミクス試験の大規模な医薬スクリーニングの結果も、またより大きい効能とより少ない副作用を備える薬を選ぶために応用できる。そのような大規模試験を実施するための施設を持たない規模の小さいバイオテクノロジー会社及び研究機関によっても前記キットは、使用されるであろう。
【０１１０】
さらに説明することなく、当業者は前の記載と以下の例示的な実施例を使って、本発明の化合物を作りそして利用することができ、請求項に記載の方法を実施できると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好適な実施形態を特定的に指摘するものであり、開示の残りをいかようにも制限するもとは解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：  毒性マーカーの同定
心臓毒であるシクロホスファミド、イホスファミド、ミノキシジル、ヒドララジン、ＢＩ−ＱＴ、クレンブテロール、イソプロテレノール、ノルエピネフリン及びエピネフリンならびに対照組成物を、当該技術分野で以前に記載され、そして上記で議論した優先権出願に記載されているような投与希釈剤、プロトコルや投与計画を用いて、様々な時間点において、雄性ＳＤ系ラットに投与した。下記チャートに各化合物の低用量及び高用量を示す。
心臓毒               低容量（ｍｇ／ｋｇ）       高用量（ｍｇ／ｋｇ）
シクロホスファミド             ２０                     ２００
イホスファミド                ５                      １００
ミノキシジル             １２ｍｇ／Ｌ             １２０ｍｇ／Ｌ
ヒドララジン              ２．５                       ２５  
ＢＩ−ＱＴ                  １０                       ５０      
クレングテロール              ０．４                        ４                    イソプロテレノール          ０．０５                    ０．５
ノルエピネフリン            ０．０５                    ０．５
エピネフリン                ０．１                        １    
投与後、投与された動物を観察し、そして、組織を以下に記載したように収集した。
【０１１２】
動物の観察
１．臨床観察  毎日２回、死亡率と瀕死性をチェックする。ケージ側面観察（皮膚と毛、目と粘膜、呼吸系、循環器系、自律神経系及び中枢神経系、体性運動パターン及び行動パターン）。震え、痙攣、唾液分泌、下痢、傾眠、昏睡又は異常な行動や外見を含む、毒性の可能性のある兆候が起こったときに、発症の時間、程度及び持続時間も含めて記録した。
２．身体検査  ランダム化の前、最初の処置前に、そして犠牲（屠殺）の前に。
３．体重  ランダム化の前、最初の処置前に、そして犠牲の前に。
【０１１３】
臨床病理
１．頻度  死体解剖の前に。
２．動物の数  全ての生き残っている動物。
３．出血手順  ７０％ＣＯ２／３０％Ｏ２麻酔下にあるあいだに、眼窩洞に穴を開けて血液を得た。
４．血液試料の採取  血液学パラメーターの評価のために、約０．５ｍＬの血液をＥＤＴＡチューブに集めた。臨床化学分析のために、約１ｍＬの血液を血清セパレーターチューブに集めた。試験化合物／代謝産物を概算するために、約２００μＬの血漿を取得して、−８０℃で凍結した。追加の２ｍＬの血液を１５ｍＬ円錐状ポリプロピレン・バイアルに収集して、直ちに３ｍＬのＴｒｉｚｏｌを加えた。内容物を直ぐにボルテックス及び繰り返し逆さまにして混合した。それらチューブを液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。
【０１１４】
終結手順
終結犠牲
最初の投与から、約３、６、２４、４８、１４４、１６８、１９２、３３６及び／又は３６０時間後に、ラットを計量し、身体検査して、断頭によって犠牲にし、失血させた。犠牲の約５分以内に動物を死体解剖した。頭蓋帽を開くのに使用した骨切断機を除いては、別々の滅菌した、使い捨ての機器を各々の動物のために使用した。その骨切断機は、動物と動物の間に殺菌剤溶液に浸した。
【０１１５】
委員会に認証された病理学者に承認された手順に従って、各動物の死体解剖を実施した。
【０１１６】
終結犠牲まで生き残っていない動物は、死体解剖（もし瀕死であるなら、二酸化炭素仮死状態による安楽死に続いて）することなく捨てられた。瀕死又は死んでいるのが見つかった動物については、死のおおよその時間を記録した。
【０１１７】
死後手順
新しくそして滅菌した使い捨て機器を使用して組織を収集した。組織又はバイアルを取り扱うときは、手袋をいつでも着用した。全ての組織は、動物の死のおよそ5分以内に回収して、凍結した。肝臓切片及び腎臓は、動物の死のおよそ３〜５分以内に凍結した。安楽死の時間、肝臓切片及び腎臓の凍結の暫定的な時間点、及び死体解剖完了の時を記録した。組織を約−８０℃で保存するか、又は１０％中性緩衝ホルマリンに保存した。
【０１１８】
組織収集及びプロセッシング
肝臓
１．内側右葉（液体窒素で瞬時に凍結し、そして−８０℃で保存した）。
２．内側左葉（１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）に保存し、全体の及び顕微鏡での病理検査のために評価した）。
３．外側左葉（液体窒素で瞬時に凍結し、そして−８０℃で保存した）。
【０１１９】
心臓
２つの心房の部分及び２つの心室の部分を含んでいる矢状横断面（sagittal cross section）を１０％ＮＢＦに保存した。残っている心臓を液体窒素で凍結して、−８０℃で保存した。
【０１２０】
腎臓（両方）
１．左：  半分に切開した。半分を１０％ＮＢＦに保存して、そして残っている半分を液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。
２．右：  半分に切開した。半分を１０％ＮＢＦに保存して、そして残っている半分を液体窒素中で凍結して、−８０℃で保存した。
【０１２１】
精巣（両方）
各精巣の矢状横断面を１０％ＮＢＦに保存した。残っている精巣を液体窒素中、一緒に凍結して、−８０℃で保存した。
【０１２２】
脳（全部）
大脳半球及び間脳の横断面を１０％ＮＢＦに保存し、そして脳の残りを液体窒素中で凍結して−８０℃で保存した。
【０１２３】
マイクロアレイ試料の調製は、アフィメトリックス  ジーンチップ発現解析マニュアル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍａｎｕａｌ）に記載されているプロトコルに従って、小さい修正で実施した。凍結した組織は、Ｓｐｅｘ  Ｃｅｒｔｉｐｒｅｐ  ６８００  Ｆｒｅｅｚｅｒ  Ｍｉｌｌを使用して、粉末へすりつぶした。トータルＲＮＡは、製造業者のプロトコルを利用してＴｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で抽出した。各試料用のトータルＲＮＡ収率は、３００ｍｇの組織重量あたり２００〜５００μｇであった。Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡ  Ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを単離し、エタノール沈殿を行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して、ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを生成させた。第１鎖ｃＤＮＡ合成をＴ７―（ｄＴ２４）オリゴヌクレオチドでプライムした。そのｃＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽出して、終濃度１μｇ／ｍＬにエタノール沈殿した。２μｇのｃＤＮＡからＡｍｂｉｏｎ’ｓ  Ｔ７  ＭｅｇａＳｃｒｉｐｔ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してｃＲＮＡを合成した。
【０１２４】
ｃＲＮＡをビオチンラベルするために、ヌクレオチドＢｉｏ―１１−ＣＴＰとＢｉｏ１６―ＵＴＰ（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を反応液に加えた。６時間３７℃のインキュベーションに続いて、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って、ラベルされたｃＲＮＡから不純物を取り除いた。ｃＲＮＡを９４℃で３５分間、断片化した（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．１、５００ｍＭ  酢酸カリウム、１５０ｍＭ  酢酸マグネシウムからなるフラグメンテーション緩衝液）。アフィメトリックスプロトコルに従って、５５μｇの断片化したｃＲＮＡを、４５℃のハイブリダイゼーション・オーブン中で、６０ｒｐｍで２４時間にわたってセットしたアフィメトリックスラットアレイ上にハイブリダイズさせた。チップを洗浄して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｓｔａｔｉｏｎ中、ストレプトアビジンフィコエリトリン（ＳＡＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）で染色した。染色を増幅するために、抗ストレプトアビジン  ビオチン化抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）染色ステップを間に挟んで、ＳＡＰＥ溶液を２回加えた。プローブアレイへのハイブリダイゼーションは、蛍光測定スキャンニング（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ）によって検出した。データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）バージョン２．０及びＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｇ（ＥＤＭＴ）ソフトウェア（バージョン１．０）、Ｇｅｎｅ  ＬｏｇｉｃのＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）２０００ソフトウェア及びＳ−Ｐｌｕｓ（商標）ソフトウェアを使用して解析した。
【０１２５】
表１及び表２には、示された毒に曝されたときに差次的に発現するそのような遺伝子及びそれらの対応するＧｅｎｂａｎｋ受入番号及び配列識別番号、遺伝子が機能する代謝経路の正体、知られている場合には遺伝子名、並びにＵｎｉｇｅｎｅクラスター名が開示される。モデルコードは、各遺伝子が識別することができる様々な毒性状態、及び各遺伝子に関連する個々の毒のタイプを表す。コードは表４に定義される。ＧＬＧＣ  ＩＤはジーン・ロジック内部の識別番号である。
【０１２６】
表３には、示された毒に曝されたときに差次的に発現する表１及び表２におけるそのような遺伝子のヒトホモログである遺伝子が開示される。対応するＧｅｎｂａｎｋ受入番号及び配列識別番号、知られている場合には遺伝子名、そしてヒトホモログのＵｎｉｇｅｎｅクラスター名が示される。
【０１２７】
表４は、表１、表２、表３及び表５で使用される比較コードを定義する。
【０１２８】
表５〜表５Iには、行われた比較のそれぞれに対する統計概要が開示される。これらの表はそれぞれが、予測遺伝子のセットを含み、未知の化合物、すなわち、試験されていない化合物の心臓毒性を予測するためのモデルをもたらす。それぞれの遺伝子は、そのジーン・ロジック識別番号によって識別され、表１及び表２における遺伝子名及び代表的な配列番号に対して相互参照することができる。毒性群における試料（特定の毒に曝されたことによる影響を受けた試料）と非毒性群における試料（その同じ特定の毒に曝されたことによる影響を受けなかった試料）との間における遺伝子発現レベルのそれぞれの比較のために、毒性平均（毒性群試料について）は、アッセイされている様々なチップパラメーターについて規格化されたときの平均シグナル強度である。非毒性平均は、特定の毒の高用量で処置された動物とは異なる動物から得られたサンプルにおける、アッセイされている様々なチップパラメーターについて規格化されたときの平均シグナル強度を表す。これらの動物は、低用量の特定のトキシンで、又はビークル単独で、又は異なる毒で処置された。毒性群における試料は、表５〜５Iの表題部に示された時点で屠殺された動物から得られ、一方、非毒性群における試料は、実験におけるすべての時点で屠殺された動物から得られた。個々の遺伝子について、非毒性平均と比較した場合の毒性平均の増大は、トキシンに曝されたときのアップレギュレーションを示している。逆に、非毒性平均と比較した場合の毒性平均の低下はダウンレギュレーションを示している。
【０１２９】
平均値は、対応する試料全体で平均化された特定の遺伝子に対する平均差（ＡｖｅＤｉｆｆ）値から導かれる。個々の平均差値はそれぞれが、特定のフラグメントについて覆われる多数のプローブ対から得られる強度情報を積分することによって計算される。規格化により、所与の実験（チップ）に対するそれぞれの発現強度が全体的な調整係数（ｓｃａｌｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）で乗ぜられる。この規格化の意図は、チップ間の個々の遺伝子の比較を可能にすることである。調整係数は下記のように計算される：
１．実験における規格化されていない発現値のすべてから、最大値側の２％及び最小値側の２％の値を除く。すなわち、実験により、１０，０００個の実験値が得られた場合、それらの値を順に並べ、最小値側の２００個及び最大値側の２００個を除く。
２．残った値の平均値に等しい調整平均を計算する。
３．調整係数ＳＦ＝１００／（調整平均）を計算する。
【０１３０】
ここで使用される１００の値は、使用された基準標的の値である。ＡｖｅＤｉｆｆ値のいくつかは、核酸ハイブリダイゼーション実験に含まれる一般的なノイズのために負になることがある。多くの結論を、ＧｅｎｅＣｈｉｐプラットフォームでの負の値に対応して下すことができるが、個々のフラグメントについて負の値の背後にある意味を評価することは困難である。本発明者らの観測結果は、負の値が予測遺伝子セット内において何度も観測されるが、これらの値は測定が行われたすべての試料にわたって非常に再現的である実際の生物学的現象を反映することを示している。この理由のために、負の値を示すそのような遺伝子が予測セットに含められる。遺伝子発現測定の他のプラットフォームにより、対応する遺伝子について負の数字が解消され得ることに留意しなければならない。しかし、そのような遺伝子のそれぞれの予測能はプラットフォーム中に広がるはずである。それぞれの平均値には、平均値に対する標準偏差が伴う。表に開示されるような線形判別分析スコア（判別スコア）により、サンプルが毒性であるか否かを予測する各遺伝子の能力が評価される。判別スコアは、下記の工程によって計算される：
判別スコアの計算
Ｘｉは、非毒試料、ｉ＝１・・・ｎにわたる、与えられた遺伝子のＡｖｅＤｉｆｆ値を表わすとする；
Ｙｉは、毒試料、ｉ＝１・・・ｔにわたる、与えられた遺伝子のＡｖｅＤｉｆｆ値を表わすとする；
前記計算を次のように進める：
１．ＸｉとＹｉに対する平均値と標準偏差を計算して、そして、これらをｍＸ、ｍＹ、ｓＸ、ｓＹと表示する；
２．全てのＸｉとＹｉに対して、関数ｆ（ｚ）＝（（１／ｓＹ）＊ｅｘｐ（−．５＊（（ｚ−ｍＹ）ｓＹ）２））／（（（１／ｓＹ）＊ｅｘｐ（−．５＊（（ｚ−ｍＹ）／ｓＹ）２））＋（（１／ｓＸ）＊ｅｘｐ（−．５＊（（ｚ−ｍＸ）／ｓＸ）２）））の数値を求める；
３．正しい予測数（例えば、Ｐ）は、ｆ（Ｙi）＞．５であるＹiの数にｆ（Ｘi）＜．５であるＸiの数を足した数である；
４．判別式スコアは、それからＰ／（ｎ＋ｔ）である。
【０１３１】
線形判別分析は、試料を分類するのに、各遺伝子の個々の測定値と遺伝子の全組合せの計算された測定値の両方を使用する。各遺伝子については、加重値（weight）は毒性グループと非毒性グループの平均と標準偏差から導かれる。あらゆる遺伝子に加重値が乗ぜられ、そして、これらの値の合計が集合的な判別スコアをもたらす。この判別スコアは、それから毒性グループと非毒性グループの集合的中心（collective centroids）に対して比較される。これらの中心は、それぞれ毒性と非毒性全ての試料の平均値である。したがって、各遺伝子は、全体的な予測に貢献する。この貢献は、その遺伝子に対する毒性と非毒性試料の間の相対的な間隔が大きいならば、大きい正値又は負値であり、相対的な間隔が小さいならば、小さい数値である加重値に依存している。各未知試料の判別スコアと中心値を使用して、その未知試料がどのグループに属しているかについて、０と１の間の確率を計算することができる。
【０１３２】
実施例２：  一般的な毒性モデル作製
主成分分析（ＰＣＡ）を用いてそれぞれの研究を個々に調べることにより、毒性応答群及び毒性非応答群へのグループ分けのために試料を選択して、どの処置が観測可能な応答を有するかを決定した。それらの毒性応答状態及び毒性非応答状態の信頼度が明らかにされた群のみが、一般的な毒性モデルを組み立てる際に含められた（表５〜５I）。
【０１３３】
線形判別モデルが、毒性試料及び非毒性試料を記述するために作製された。トップ判別遺伝子及び／又はＥＳＴが、分散の等分散的処理及び異分散的処理ならびに遺伝子間の相互情報の包含又は排除とともにそれぞれの遺伝子寄与を計算することによって毒性を明らかにするために使用された。データベース内の試料の予測は、真の陽性が８０％越え、偽陽性率は５％未満であった。遺伝子及び／又はＥＳＴの組合わせは、個々の遺伝子よりも良好な予測能を一般にもたらすこと、そして使用される遺伝子及び／又はＥＳＴが多いほど、予測能が良好であることが明らかにされた。好ましい実施形態には、５０個以上の遺伝子が含まれるが、遺伝子及び／又はＥＳＴの多くの対形成又はより多くの組合わせが個々の遺伝子よりも良好に機能し得る。選択されたリスト（表５〜５I）からの２つ以上の遺伝子の組合わせはすべてが、毒性を予測するために使用され得る。これらの組合わせは、集団的、区別的、又は無作為なアプローチでの対形成によって選択することができる。さらに、今までのところ明らかにされていない遺伝子及び／又はＥＳＴを、予測能を増大させるために、本明細書に記載される遺伝子及び／又はＥＳＴの１つ１つと組合わせることができ、あるいは本明細書に記載される遺伝子及び／又はＥＳＴの組合わせと組み合わせることができる。しかし、本明細書に記載される遺伝子及び／又はＥＳＴは、任意のそのような明らかにされていない組合わせの予測能の大部分に寄与していると考えられる。
【０１３４】
上記方法に対する他の様々な変化により、十分な予測能が提供され得る。これらには、集団的、区別的、又は無作為なアプローチによる構成成分の選択的包含、あるいは集団的、区別的、又は無作為なアプローチで構成成分を負荷し、組合わせることの抜き出しが含まれる。また、サンプルの分類を決定するためのロジスティック回帰における複合変数の使用もまた、線形判別分析、ニューラルネットワークもしくはベイジアン（Ｂａｙｅｓｉａｎ）ネットワーク、又は類別的もしくは連続的な従属変数及び独立変数に基づく回帰及び分類の他の形態を用いて達成することができる。
【０１３５】
実施例３：  モデリング方法
上記のモデリング方法は、遺伝子の発現を組合せて、試料毒性を予測する、広いアプローチを提供する。単純な投票方法（ｖｏｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）で加重値を提供しないことも、集団的、区別的、又は無作為なアプローチを用いる監督又は監督されない方法で加重値を決定することもできる。遺伝子の全て又は選ばれた組合わせを、分類のための未知試料と、順序づけた、集団的又は区別的に、監督又は監督されていないクラスタリングアルゴリズムと組合わせることができる。未知試料を分類するために相関行列のどんな形でも用いることができる。グループ分布と判別スコアの広がり単独で、当業者に個別遺伝子の判別能力を超えうる正確さをもって上記のモデルタイプの全てを作成することを可能にする十分な情報を提供できる。個別に又はデータタイプを変換した後に組合わせて用いることができる方法のいくつかの例には、以下のものが含まれるが、これらには限定されない。すなわち、判別分析、多重判別分析、ロジスティック回帰、多重回帰分析、線形回帰分析、共同解析、正準相関、階層的なクラスタ解析、ｋ−ｍｅａｎクラスター解析、自己編成マップ、多次元尺度解析、構造方程式モデリング、サポートベクトルマシン決定境界、ファクター解析、ニューラルネットワーク、ベイシアン分類及びリサンプリング方法である。
【０１３６】
実施例４：  個々の化合物マーカー
遺伝子発現により示されるような特定の化合物が誘導する毒性の作用のメカニズムは、他のすべての化合物の誘導される毒性のメカニズムと異なるだろう。従って、データベースにおいて、特定の化合物モードと他のすべての化合物により示された毒性の他のすべてのモードとを分ける毒性マーカーを同定した。これらのマーカーを各々の心臓毒性について同定した。１つのモデルにおいて個々の判別スコアに基づく上位１０、２５、５０、１００個の遺伝子を使用して、遺伝子の組合わせが個々の遺伝子に比べてより良い予測を提供することを確実にした。上記で説明したように、どのような順序で、或いは順序づけて、集団的、区別的、又は無作為なアプローチによって、選択されるとき、このリストからの２個若しくはそれ以上の遺伝子の全組合わせは、潜在的に個々の遺伝子に比べてより良い予測を提供することができた。それに加えて、これらの遺伝子を他の遺伝子と組合わせることは、より良い予測能力を提供することができたが、この予測能力の大部分は、本明細書にリストされた遺伝子から来るだろう。
【０１３７】
それらがここで表示された個々の化合物において、又はデータから獲得できる個々の毒性化合物の投与量グループ分けと個々の時間との組合わせに基づく、一般的な毒性学モデルの項で言及されるいかなるモデリング方法において、正を記録する場合、試料は毒性があるとみなされる。１個若しくはそれ以上の遺伝子及び１つ若しくはそれ以上の試料用量と時間点を備えるほとんどの論理的なグループ化は、個々の遺伝子と比べて、一般的な毒性、又は既知の毒への類似性のより良い予測を出すはずである。
【０１３８】
本発明は、上記の実施例に関連して詳述されてきたが、本発明の精神から逸脱することなく、様々な改変をなし得ることが理解される。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲のみによって限定される。本出願で言及された全ての引用特許、特許出願及び刊行物は、それらの全体が関連付けによって本明細書に取り入れられる。
【０１３９】
【表１−１】
2005517400.tif 000002
【０１４０】
【表１−２】
2005517400.tif 000003
【０１４１】
【表１−３】
2005517400.tif 000004
【０１４２】
【表１−４】
2005517400.tif 000005
【０１４３】
【表１−５】
2005517400.tif 000006
【０１４４】
【表１−６】
2005517400.tif 000007
【０１４５】
【表１−７】
2005517400.tif 000008
【０１４６】
【表１−８】
2005517400.tif 000009
【０１４７】
【表１−９】
2005517400.tif 000010
【０１４８】
【表１−１０】
2005517400.tif 000011
【０１４９】
【表１−１１】
2005517400.tif 000012
【０１５０】
【表１−１２】
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【０１５１】
【表１−１３】
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【０１５２】
【表１−１４】
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【０１５３】
【表１−１５】
2005517400.tif 000016
【０１５４】
【表１−１６】
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【０１５５】
【表１−１７】
2005517400.tif 000018
【０１５６】
【表１−１８】
2005517400.tif 000019
【０１５７】
【表１−１９】
2005517400.tif 000020
【０１５８】
【表１−２０】
2005517400.tif 000021
【０１５９】
【表１−２１】
2005517400.tif 000022
【０１６０】
【表１−２２】
2005517400.tif 000023
【０１６１】
【表１−２３】
2005517400.tif 000024
【０１６２】
【表１−２４】
2005517400.tif 000025
【０１６３】
【表１−２５】
2005517400.tif 000026
【０１６４】
【表１−２６】
2005517400.tif 000027
【０１６５】
【表１−２７】
2005517400.tif 000028
【０１６６】
【表１−２８】
2005517400.tif 000029
【０１６７】
【表１−２９】
2005517400.tif 000030
【０１６８】
【表１−３０】
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【表５Ｇ−２】
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【表５Ｈ−１】
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【表５Ｈ−２】
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【表５Ｉ−１】
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【０２７５】
【表５Ｉ−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2005517400.tif 000139
2005517400.tif 000140