(57)【要約】ウィーク・トランスファー・リガンドの存在下で生体分子とテクネチウムなどの放射性核種源を接触させるステップと、必要に応じて、混合物をサイズ排除ろ過プロセスに通過させるステップとを含む、生体分子を放射性標識する方法。さらに、このような新規組成物、特に化学療法剤に結合したラクトフェリンを含むキットおよび、そのための使用についてもクレームされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィーク・トランスファー・リガンドの存在下で生体分子と放射性核種源とを接触させるステップを含む、生体分子を放射性標識する方法。
【請求項２】
ウィーク・トランスファー・リガンドの結合定数が、０．０１〜１０００ｄｍ3  ｍｏｌ-1である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ウィーク・トランスファー・リガンドが、非キレート性で安定度定数が小さいウィーク・エクスチェンジ・リガンドである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ウィーク・トランスファー・リガンドが、チオ尿素、尿素およびアンモニアを含む群より選択される請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
放射性核種源が、99mＴｃ源である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
99mＴｃ源が、過テクネチウム酸イオン、すなわちＴｃＯ4-である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
放射性核種源が、57Ｃｏ、67Ｃｕ、67Ｇａ、90Ｙ、97Ｒｕ、169Ｙｂ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、203Ｐｂ、153Ｓｍおよび／または212Ｂｉを含む群より選択される請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
還元剤を用いて過テクネチウム酸イオン（ＴｃＯ4-）をＴｃ3+に変換する還元ステップをさらに含む請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
還元剤が、スズ(II)の塩化物、亜硝酸塩および／または亜硫酸塩などの塩を含む群から選択される、または還元剤が、アスコルビン酸／アスコルビン酸塩である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生体分子、放射性核種およびウィーク・トランスファー・リガンドを、ろ過システムに通過させるステップをさらに含む請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ろ過システムが、セントリコンフィルターを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）一端が開きかつもう一端が閉じ、実質的に横切るフィルターを有するチューブ内に反応混合物を導入するステップであって、該フィルターは、チューブの長手方向の壁に対して横切る位置に、フリットなどで固定されているステップと；
（ii）フィルターの上部表面上に、選択されたサイズの物質を収集するステップと；
（iii）最初に上部表面上に収集された物質がフィルターの下部表面上に位置するように、フィルターを反転するステップと；
（iv）フィルターの下部表面上の物質を洗い流して、チューブに該物質を収集するステップと、
を含む反転ろ過ステップまたは二回ろ過ステップをさらに含む請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ii）の前に、適切な装置で、約２０００〜５０００ｒｐｍの速度で混合物が遠心分離される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（iv）の後に、適切な装置で、約２０００〜５０００ｒｐｍの速度で遠心分離するステップをさらに含む請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
遠心分離の速度が、３０００〜４０００ｒｐｍである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
遠心分離の速度が、約３２００ｒｐｍである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）放射性標識生体分子をｐＨ５などの酸性条件に暴露するステップ；または
（ii）例えばジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）と混合することによって、放射性標識生体分子をキレート部に暴露するステップ、
のいずれかによって、結合が弱いあらゆる放射性核種を除去するステップをさらに含む請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
生体分子がジスルフィド結合を有し、ジスルフィド結合を二つのメルカプト結合に還元するために、放射性核種に暴露する前に、生体分子還元剤と一緒に生体分子のプレインキュベーションを行う請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
生体分子還元剤が、２−メルカプトエタノールである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生体分子と生体分子還元剤とのインキュベーションを６〜２４時間行う請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
生体分子還元剤の濃度が、２〜１００μＭの範囲である請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
生体分子、放射性核種源およびウィーク・トランスファー・リガンド、ならびに必要に応じて一組の取扱説明書を有するキット。
【請求項２３】
請求項１８〜２１のいずれかに記載の生体分子還元剤および／または請求項８もしくは９に記載の放射性核種還元剤をさらに有する請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法によって生産される放射性核種標識生成物。
【請求項２５】
放射性標識生体分子の生産における、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法の使用。
【請求項２６】
生体分子がホロ型である請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
化学療法剤に結合したテクネチウム標識鉄輸送タンパク質を有する生成物。
【請求項２８】
鉄輸送タンパク質がラクトフェリンである請求項２７に記載の生成物。
【請求項２９】
凍結乾燥体である、または追加的に／それに代えて適切な賦形剤、担体または希釈剤を有する請求項２７または２８に記載の生成物。
【請求項３０】
化学療法剤に結合したラクトフェリンもしくは放射性標識ラクトフェリンまたはテクネチウム標識ラクトフェリンを有する医薬組成物。
【請求項３１】
ガンを治療するための薬剤を製造するための、化学療法剤に結合したラクトフェリンもしくは放射性標識ラクトフェリンまたはテクネチウム標識ラクトフェリンの使用。
【請求項３２】
化学療法剤が、タキソール、シスプラチン、ブレオマイシン、金属イオンまたはダウノルビシンを含む群より選択される請求項２７〜３０のいずれかに記載の組成物、または請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
ラクトフェリンが、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法による放射性核種で標識されている請求項２７〜３０もしくは３２のいずれかに記載の組成物、または請求項３１に記載の使用。
【請求項３４】
テクネチウム標識ラクトフェリンを有する生成物を、腫瘍が疑われている、または腫瘍を有する患者に投与するステップと、体内の標識生成物を画像化するステップとを含む腫瘍の存在を診断する方法。
【請求項３５】
患者がヒトである請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
生成物が、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法によって生産される、またはその方法によって入手可能である請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
テクネチウム標識トランスフェリンまたはテクネチウム標識ラクトフェリンに結合した化学療法剤または遺伝子治療剤を含む治療上有効な量の組成物を投与するステップを含む、腫瘍を有する患者を治療する方法。
【請求項３８】
請求項３５または３６に記載の特徴をさらに含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
組成物を静脈内、筋肉内、皮下または経口にて単回または繰り返して投与する、または組成物を腫瘍部位に直接注入する請求項３７または３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性核種で、特に限定されるわけではないが、特にテクネチウムで生体分子を標識する方法、その方法を実施するための原料／成分を含むキット、新規組成物およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
患者または対象に特定の生体分子を投与した場合のその経路または位置を追跡または検出するための手段として、生体分子を放射性標識することが用いられてきた。このような放射性標識された生体分子であって、検出可能であり、標的器官またはその他の基質に正確に位置づけることができるものから放射される放射線レベルを低くすることは可能である。レニウム−１８６ｍ、特にテクネチウム−９９ｍなどの放射性核種は、生体分子の標識に有用である。というのは、これらは種々の生体分子と比較的安定した結合を形成することが知られているからである。量的な表現をすれば、テクネチウム（Ｔｃ）化合物は、現在用いられているなかで群を抜いて重要な放射性医薬品であり、８０％を超えると推定される市場占有率を有する。
【０００３】
放射線医療の目的に関して言えば、同位体99Ｔｃは、基底状態からの緩慢なβ−崩壊が重要なのではなく、不安定な核励起状態、すなわち診断上有用な６ヶ月の半減期を有し、専らγ−放射する99mＴｃとして重要である。この放射性同位体が放射線診断において人気が高い主な理由の一つは、容易に稼働できるテクネチウムの「リアクター」または「ジェネレーター」が利用しやすいことであり、これらの装置によって、正常な臨床環境に適した溶液を都合よく調製することが可能となる。
【０００４】
放射性標識化合物をろ過法を用いて調製することは、従来技術より知られている。しかしながら、生体分子を標識する現在の方法に付随する課題の一つに、溶液内に多数の異なるテクネチウム種が生成すること、それゆえに純度が不足することがある。テクネチウム化合物は特定の器官をインビボで標的化するために用いられるので、レシピエント／患者に導入する前に、その化合物を可能な限り純粋にすることが望ましい。
【０００５】
従来技術の方法に付随するさらなる課題は、標識の効率が高くないことである。このことは、高価な材料の相当な程度の浪費や調製時間の増加を導く。
【０００６】
インビボでの腫瘍画像化剤として期待できるテクネチウム標識トランスフェリンを用いることは、従来技術より知られている(Paik et al、J Radioanal Chem 1980;60:281-289)。この研究から、いくらかのＴｃ−ｓＴｆの腫瘍細胞への取り込み（注入量の０．３６％）は見られたが、その取り込みは非特異的な結合活性と比べて不十分であることが示された。注入後の血液に対する腫瘍の割合が小さいので、実際のところ、Ｔｃ標識トランスフェリンは適切な画像化剤とは思えない、と著者らは述べている。その結果、放射線医療分野で選抜された化合物は、テクネチウム標識トランスフェリンよりもむしろ125Ｉ、111Ｉｎおよび67Ｇａなどのその他の放射性核種で標識されたトランスフェリンであった。これらの標識の効率はより高く、したがって腫瘍の取り込みもより多い。
【０００７】
テクネチウム標識トランスフェリンの効率および安定性を改善し、そして結果として生じる腫瘍細胞への取り込みを改善することができる方法があれば、核医学および診断手法に直接的に有利な効果が提供されるだろう。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の一つの目的は、生体分子を放射性核種で標識する方法を提供することであり、これによって無関係な放射性核種材料の多くを都合よく除去し、標識効率の向上、およびこれまでの従来技術の方法で用いることができた放射性核種標識材料よりも純度の高い材料を導く。
【０００９】
最も広い態様において、本発明は、トランスファー・リガンドの存在下で生体分子と放射性核種源を接触させるステップと、必要に応じて、次に、放射性標識生体分子を選択的に収集するために、当該混合物をサイズ排除ろ過プロセスに通過させるステップとを含む、生体分子を放射性標識する方法を提供する。
【００１０】
本発明の第一の態様によると、ウィーク・トランスファー・リガンドの存在下で生体分子と放射性核種源を接触させるステップを含む、生体分子を放射性標識する方法が提供される。
【００１１】
本明細書における「生体分子」への言及は、放射性核種と複合体を形成する能力を有するあらゆる生成物または物質の組成物を包含する。例えば、タンパク質、ポリペプチド、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体または抗体断片、アルブミン、薬物、サイトカイン、酵素、ホルモン、免疫調節物質、受容体タンパク質などの生体分子が、放射性核種と複合体を形成する独立したグループを有する。標識される生体分子が抗体断片の場合、抗体断片としては、特に限定されるわけではないが、腫瘍、感染性病変、微生物、寄生生物、心筋梗塞、血餅、アテローム斑、または正常な器官もしくは組織によって生産された抗原またはそれらに関連する抗原を含む抗原と結合することができる抗体断片であると理解されるべきである。「生体分子」という用語は、複数のユニットからなるタンパク質（すなわち、二以上の分子を含むタンパク質）への言及を包含し、あまり好ましくないが、複合化部分(complexing moiety)が付加されたことに由来する生物学的な生成物への言及を包含する。
【００１２】
その結果、放射性核種で標識する本発明の方法は、上記のあらゆる生体分子を放射性核種で標識することに有用である。
【００１３】
本明細書における「トランスファー・リガンド」への言及は、不要な副反応を起こさない程度には十分安定であるが、放射性標識生体分子に変換される程度には十分不安定である中間複合体を、放射性核種と一緒に形成するリガンドである。中間複合体の形成は、動力学的に有利な方向に働くのに対して、放射性標識生体分子の形成は熱力学的に有利な方向に働く。トランスファー・リガンドは酸素供与原子または窒素供与原子から形成されるのが一般的である。
【００１４】
ウィーク・トランスファー・リガンドは、安定性が低く、かつ非キレート性のリガンドであることが好ましい。
【００１５】
ウィーク・エクスチェンジ・リガンドの結合定数は、０．０１〜１０００ｄｍ3  ｍｏｌ-1が好ましい。
【００１６】
ウィーク・エクスチェンジ・リガンドは、安定度定数が小さいものが好ましい。
【００１７】
ウィーク・エクスチェンジ・リガンドとしては、チオ尿素、尿素またはアンモニアを含む群より選択されるものが好ましい。
【００１８】
反応混合物としては、溶液の状態のものが好ましい。
【００１９】
放射性核種源は99mＴｃ源であることが好ましく、源が過テクネチウム酸イオン、すなわちＴｃＯ4-であることがより好ましい。通常、過テクネチウム酸イオン源は、典型的には、調査／処理を行う場所で生成される液体として供給される。
【００２０】
その他の適切な放射性核種は、57Ｃｏ、67Ｃｕ、67Ｇａ、90Ｙ、97Ｒｕ、169Ｙｂ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、203Ｐｂ、153Ｓｍおよび／または212Ｂｉを含む群より選択することができる。
【００２１】
生体分子、放射性核種およびトランスファー・リガンドの混合物は、過テクネチウム酸イオン（ＴｃＯ4-）としてのＴｃをＴｃ3+に変換して、生体分子により簡単に結合しやすい形態にする機能を有する還元剤を用いる還元ステップをさらに含むことが好ましい。この点に関して、還元剤としては、還元ステップを実施する能力を有するあらゆる薬剤を含んでもよい。
【００２２】
還元剤としては、スズ（II）の塩化物、亜硝酸塩および／または亜硫酸塩などの塩を含む群より選択されるものが好ましい。別の好ましい還元剤は、アスコルビン酸／アスコルビン酸塩である。
【００２３】
反応混合物がチューブおよびろ過システムを通過するステップを含むサイズ排除ステップを含める場合、例えばセントリコン３０フィルターなどのセントリコン(Centricon)フィルターが好ましいが、これらに限定されるわけではない。このようなフィルターによって、３０，０００ダルトン未満の生体分子がそれを通過し、その一方、３０，０００ダルトンを超える生体分子をフィルター表面上に捕らえることが可能になる。選抜される生体分子に従ってフィルターのサイズを選択することは理解されるだろう。そして選択されるフィルターのサイズによって、本発明の範囲が制限されることはない。
【００２４】
この方法は二回ろ過ステップをさらに含むことが好ましい。これに関して、一端が閉じたチューブ内に混合物を導入し、そして混合物を、チューブの長手方向の壁に対して横切る(transverse)位置に、フリットなどで固定されているフィルターに通す。
【００２５】
その後に、またはそれと同時に、適切な装置で、例えば約２０００〜５０００ｒｐｍかそれ以上の速度で、より好ましくは３０００〜４０００ｒｐｍの速度で、最も好ましくは約３２００ｒｐｍの速度で、混合物の遠心分離を行うことが好ましい。一旦溶液がフィルターを通過して、選択されたサイズの生体分子が排除されると、すなわち小さなサイズの分子がフィルターを通過してチューブの底部に溶液状態で存在すると、次いで、それらは廃棄してもよい。選択された排除サイズよりも大きいサイズの生体分子は、フィルターの上部表面上に残存する。
【００２６】
次いで、フィルターの排除サイズよりも大きなサイズの生体分子を、通常はチューブの底部に洗い流してもよいように、フィルターを反転することが好ましい。
【００２７】
約２０００〜４０００ｒｐｍで、洗い流された放射性標識生体分子の遠心分離をさらに行うことが好ましい。チューブの底部にある放射性標識生体分子を収集するためには、２５００ｒｐｍで行うことが通常である。
【００２８】
二回ろ過プロセスとしては、
（ｉ）一端が開きかつもう一端が閉じ、横切るフィルターを有するチューブ内に反応混合物を導入するステップであって、このフィルターは、チューブの長手方向の壁に対して横切る位置に、フリットなどで適切に固定されているステップと；
（ii）このフィルターの上部表面上に、選択されたサイズの物質を収集するステップと；
（iii）最初に上部表面上に収集された物質がフィルターの下部表面上に位置するように、フィルターを反転するステップと；
（iv）フィルターの下部表面上の物質を洗い流して、チューブの閉じた端などにその物質を収集するステップと、
を含むことが好ましい。
【００２９】
本発明の方法によって、純度がより高い放射性標識、特にテクネチウム標識された生体分子が都合よく提供され、さらには異質な物質の量が低減されたテクネチウム標識ラクトフェリンおよび／またはトランスフェリンが提供される。生体分子をウィーク・エクスチェンジ・リガンド、通常はチオ尿素に結合させることによって、さらに必要に応じて続けてサイズ排除ろ過法を利用することによって、このことが達成される。
【００３０】
結合が弱いあらゆる放射性核種を除去するステップをさらに含む方法が好ましい。例えば、ｐＨ５などの酸性条件に暴露する酸ストリッピングによって、あるいは、特に限定されるわけではないが、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）と混合することによるキレート部(chelating moiety)と競合させることのいずれかよって、このことを達成してもよい。このやり方によって、強固に結合した放射性核種標識生体分子の濃度が都合よくさらに高まるだろう。
【００３１】
生体分子がジスルフィド結合を有する場合、放射性核種に暴露する前に、生体分子還元剤と一緒にプレインキュベーションを行うことが好ましい。生体分子還元剤はジスルフィド結合を二つのメルカプト結合に還元し、その結果、選抜された放射性核種に対する生体分子結合部位の接近が容易になる。２−メルカプトエタノールが適切な生体分子還元剤である。
【００３２】
プレインキュベーションステップが、生体分子還元剤と一緒に生体分子のインキュベーションを６〜２４時間行うステップを含むことが好ましい。
【００３３】
生体分子としてはホロ型のものが好ましい。
【００３４】
生体分子還元剤の濃度が、２〜１００μＭの範囲であることが好ましい。我々は、プレインキュベーションステップにおける生体分子還元剤の濃度を高めると、放射性核種に暴露した時の生体分子の標識の効率が上昇することを明らかにしている。
【００３５】
本発明のさらなる態様に従って、生体分子、放射性核種源およびウィーク・トランスファー・リガンド、ならびに必要に応じて一組の取扱説明書を含むキットが提供される。
【００３６】
キットが生体分子還元剤および／または放射性核種還元剤をさらに含むことが好ましい。
【００３７】
本発明のさらなる態様に従って、本発明の方法によって生産して入手可能となった放射性核種標識生成物、または本発明の方法によって生産された放射性核種標識生成物が提供される。本発明には、本発明の方法によって生産された生成物の特徴を有する放射性標識生成物が包含される。
【００３８】
本発明のさらなる態様によると、放射性標識生体分子の生産における、本発明の方法の使用が提供される。
【００３９】
本発明のさらなる態様によると、化学療法剤に結合した金属輸送タンパク質、好ましくは化学療法剤に結合したラクトフェリンなどの鉄輸送タンパク質を含む組成物が提供される。
【００４０】
ラクトフェリンとしては放射性標識されたものが好ましく、テクネチウムで放射性標識されたものがより好ましい。
【００４１】
好ましい組成物としては凍結乾燥体であってもよい。追加的にまたはそれに代えて適切な賦形剤、担体または希釈剤を含んでもよい。
【００４２】
本発明のさらなる態様によると、化学療法剤に結合したラクトフェリンまたは化学療法剤に結合した放射性標識ラクトフェリンを含む医薬が提供される。
【００４３】
放射性標識としては、テクネチウムが好ましい。
【００４４】
本発明の化学療法剤に結合したラクトフェリンを含む薬物複合物または組成物は、通常の、対応する薬物が有効となる目的にとって有効である。そして、特に利益を受ける所望の細胞に薬物を輸送するという、複合体に本来備わっている能力のために、この薬物複合物または組成物は優れた効果を有する。さらに、所定の生物学的反応を改変するために本発明の複合物／組成物を用いることができるので、薬物部分を伝統的な化学療法剤に制限して解釈するべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドでもよい。このようなタンパク質としては、例えば、腫瘍壊死因子などのタンパク質が挙げられ得る。本発明において用いられる薬物としては、細胞傷害性の薬物、特にガンの治療に用いられているものが好ましい。このような薬物としては、一般的に、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗剤、天然物およびこれらの類似体が挙げられる。細胞傷害性の薬物の好ましい部類としては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害剤およびチミジル酸シンターゼ阻害剤などの酵素阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡクリーバー、トポイソメラーゼ阻害剤、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性のヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジネン、ポドフィロトキシン、分化誘導因子、およびタキソールが挙げられる。これらの部類の中で特に有用な一員としては、例えば、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、レウロシン、レウロシデイン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タルリゾマイシン、ポドフィロトキシン、およびエトポシドまたはエトポシドホスファートなどのポドフィロトキシン誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、レチノイン酸タキソテール、酪酸、Ｎ8−アセチルスペルミジン、カンプトテシン、およびこれらの類似体ならびに金属イオンが挙げられる。
【００４５】
我々は、トランスフェリンまたはラクトフェリンなどの金属輸送タンパク質によって、代わりに使える一般的な、化学療法剤のための輸送タンパク質が提供されることを見出している。我々は、ラクトフェリンが腫瘍に特異的に取り込まれることを既に明らかにしている（PCT/GB01/03531）。我々は今、特に限定されるわけではないが、例えば、タキソール、シスプラチン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、そしてチタンなどの金属イオンといった化学療法剤に結合したトランスフェリンおよび／またはラクトフェリンが、これらの化学療法剤の腫瘍部位へのインビボでの取り込みを促進することを示す。
【００４６】
本発明のさらなる態様によると、ガンを治療するための、必要に応じて放射性標識されてもよい、化学療法剤に結合したトランスフェリンまたはラクトフェリンの使用が提供される。本発明によって、治療上有効な量の、化学療法剤に結合したトランスフェリンまたはラクトフェリンを、ガンの治療を必要とする患者に投与するステップを含む治療方法がさらに提供される。
【００４７】
本発明のさらなる態様によると、ガンを治療するための薬剤を製造するための、必要に応じて放射性標識されてもよい、化学療法剤に結合したトランスフェリンまたはラクトフェリンの使用が提供される。
【００４８】
化学療法剤に結合したラクトフェリンを放射性核種で標識してもよいことも理解されるだろう。放射性核種としてはテクネチウムが好ましく、そして上記のようにして、追加成分の化学療法剤でラクトフェリンを放射性標識することが好ましい。
【００４９】
本発明のさらなる態様によると、本発明の方法によって生産されるテクネチウム標識トランスフェリン生成物またはテクネチウム標識ラクトフェリン生成物を、腫瘍が疑われているかまたは腫瘍を有する患者に投与するステップと、体内での標識生成物の存在を画像化するステップとを含む、腫瘍の存在を診断する方法が提供される。
【００５０】
診断上の検査の前に、または検査の間にテクネチウム標識生成物を作製してもよいことは理解されるだろう。従って、実験室内または病院環境内のいずれかで生成物を作製すればよい。
【００５１】
本発明のさらなる態様によると、本発明の方法によって生産されるテクネチウム標識トランスフェリン生成物もしくはテクネチウム標識ラクトフェリン生成物に結合した化学療法剤または遺伝子治療剤を含む治療上有効な量の組成物を投与するステップを含む、腫瘍を有する患者を治療する方法が提供される。
【００５２】
適切な投与計画の終わりまで、組成物を繰り返して投与することが好ましく、静脈内、筋肉内、皮下もしくは経口にて組成物を投与してもよく、または組成物を腫瘍部位に直接注入しても、もしくは適切とみなされるその他のあらゆる経路によって腫瘍部位に注入してもよい。
【００５３】
治療の前に、または治療時に組成物を調製することが好ましい。
【００５４】
添付の図面のみを参照しつつ、例示を目的として、本発明を説明したい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
［材料と方法］
一つの例において、タンパク質（濃度は下記を参照すること）を過テクネチウム酸イオン（約２．３ｎＭ）、１ｍＭのチオ尿素および７．５μＭのＳｎＣｌ2と一緒に、ｐＨ７．０で０．５〜２時間のインキュベーションを行うことによって、タンパク質を標識した。インキュベーションの後、フィッシャー・サイエンティフィック(Fisher Scientific)社から購入できるセントリコン３０フィルターなどのサイズ排除フィルターにその溶液を通し、３２００ｒｐｍでの遠心分離を行う。次いで、約２．５ｍＬのｐＨ７のＰＢＳ溶液でサンプルを洗浄する。遠心分離装置内でこのフィルターを裏返して反転させ、次いでフィルター上の残留物を洗い流す。このタンパク質を、２５００ｒｐｍでの遠心分離によって回収する。
【００５６】
［ＲＴ１１２の細胞培養］
成長が速いヒト膀胱ガン細胞系のＲＴ１１２に関して、結合と取り込みの研究を行った。５％の仔ウシ血清、１０，０００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを追加したダルベッコ変法イーグル培地で、この細胞系を維持した。７５ｃｍ2の組織培養用フラスコ内で細胞を維持した。そして２５ｃｍ2のフラスコ内で実験する前に、４日間の継代培養（１：２０）を行った。この細胞は、それぞれの実験時においてコンフルエントであった。
【００５７】
［ＭＣＦ７の細胞培養］
乳腺腫瘍細胞系のＭＣＦ７に関して、取り込みの研究を行った。１０％の仔ウシ血清、１０，０００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを追加したダルベッコ変法イーグル培地で、この細胞系を維持した。７５ｃｍ2の組織培養用フラスコ内で細胞を維持した。そして２５ｃｍ2のフラスコ内で実験する前に、４日間の継代培養（１：２０）を行った。この細胞は、それぞれの実験時においてコンフルエントであった。
【００５８】
［トランスフェリンの予備的還元と放射性標識］
凍結乾燥ヒト血清トランスフェリン（シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)社、プール、英国）を１０ｍｍｏｌ  ｄｍ-3のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、そして２８０ｎｍでの吸光度を測定することによってｓＴｆの濃度を求めた。この波長におけるｓＴｆ（血清トランスフェリン）の吸光係数は９３，０００ｄｍ3  ｍｏｌ-1  ｃｍ-1である。
【００５９】
予備的還元：標識の前に、必要な濃度のトランスフェリンを２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）と一緒に、全体積が０．２ｍＬにて、２０℃で２５分間インキュベーションすることによって、２−ＭＥを用いるトランスフェリンの還元を行った。
【００６０】
［放射性標識］
放射性標識のためのすべての溶液を１０ｍｍｏｌ  ｄｍ-3のＰＢＳで作製した。１ｍＬのガラス製サンプルバイアルに次のものを添加した。チオ尿素の２５μＬの２．８×１０-7ｍｏｌ  ｄｍ-3溶液（最終濃度は１．５ｍｍｏｌ  ｄｍ-1）、ＳｎＣｌ2の２５μＬの１０-10ｍｏｌ  ｄｍ-3溶液（最終濃度は８×１０-7ｍｏｌ  ｄｍ-1）、99mＴｃジェネレーターから得た５０μＬの過テクネチウム酸イオン（２５０ＭＢｑ  ｍＬ-1）および２５μＬのトランスフェリン。用いたトランスフェリンの濃度を変化させて、標識の効率に与えるｓＴｆの濃度の影響を調べた。予備的還元を行ったｓＴｆと行わなかったｓＴｆを用いる細胞取り込み実験のために、それぞれ最終濃度が２．５×１０-6ｍｏｌ  ｄｍ-1および２．５×１０-7ｍｏｌ  ｄｍ-1のものを用いた。溶液を混合し、そして３７℃で６０分間のインキュベーションを行った。その後に０．８５ｍＬのＰＢＳを添加し、そして溶液を３７℃でさらに１５分間放置した。次いで、標識溶液をセントリコンＹＤ３０フィルター（フィッシャー・サイエンティフィック社、英国）に添加した。このフィルターの分画分子量は３０ｋＤａである。１ｍＬのＰＢＳと０．５０ｍＬのＰＢＳとでタンパク質を洗浄し、次いで１ｍＬのＭｅｄｉｕｍ１９９（全体を通してＨＥＰＥＳ改変されたものを用いた）内に回収した。両方のろ液の、２５μＬのサンプルおよび回収されたタンパク質について、９０〜１８０ｋｅＶの領域を用いるガンマ線測定装置にて計測した。
【００６１】
セントリコンフィルターから回収された活性と、オリジナルの過テクネチウム酸イオン溶液から作製した標準に基づく放射性標識溶液にて用いられた全活性とを比較することによって、標識の効率を求めた。生理食塩水を溶離液とするシリカゲル上での薄層クロマトグラフィーを用いて、過テクネチウム酸イオンの還元が生じたことを確認した。
【００６２】
［細胞取り込み］
99mＴｃ−ｓＴｒ取り込み：３×５ｍＬのＰＢＳでＲＴ１１２細胞を洗浄した。フィルターから回収されたトランスフェリン（「放射性標識」を参照すること）を５０ｍＬのＭｅｄｉｕｍ１９９に添加し、そしてフラスコあたり４ｍＬの細胞を添加した。３７℃でインキュベーションを行った。インキュベーションの後、ＰＢＳで細胞を５回洗浄した。次いで、１ｍＬのトリプシンを添加して３７℃で１０分間のインキュベーションを行うことによって、トリプシン処理を行った。いくつかの実験において、３０００ｇで５分間、細胞の遠心分離を行うことによって、表面に結合した活性から内部に取り込まれた活性を分離した。上清（外部に結合したもの）と、１ｍＬの０．５ｍｏｌ  ｄｍ-3のＮａＯＨを添加した後のペレット（内部に取り込まれたもの）を計測した。
【００６３】
［ｓＴｒによる99mＴｃ−ｓＴｒの置換］
ＲＴ１１２細胞の９個のフラスコを、Ｍｅｄｉｕｍ１９９中の７×１０-12ｍｏｌ  ｍＬ-1の濃度の99mＴｃ標識ｓＴｒと一緒に６０分間インキュベーションした。次いで、ＰＢＳで５回洗浄した。上記のようにして、３個のフラスコから、結合して内部に取り込まれた99mＴｃの活性を細胞内で求めた。残りのフラスコを３個の組にして、Ｍｅｄｉｕｍ１９９および８×１０-9ｍｏｌ  ｍＬ-1の非標識ホロｓＴｒの中で１０分間および３０分間のインキュベーションを行い、トランスフェリン受容体に特異的に結合する標識ｓＴｒを置換した。次いで、培地中とまだ細胞内に存在する99mＴｃ活性を求めた。
【００６４】
［タンパク質含有量］
キット（シグマ−アルドリッチ社、プール、英国）を用いるビシンコニン酸法によって、タンパク質含有量を求めた。最初に、０．５ｍｏｌ  ｄｍ-3のＮａＯＨを用いて一晩かけて細胞を溶解させた。０．１ｍｏｌ  ｄｍ-3より高い濃度のＮａＯＨはタンパク質アッセイに干渉するので、次いで、２ｍｏｌ  ｄｍ-3のＨＣｌを用いてその溶液を中和した。
【００６５】
［放射性標識］
異なる標識条件下での、ｓＴｒに結合した99mＴｃのパーセントを表１に示す。予備的還元されていないタンパク質および還元されたタンパク質の両方に関して、ｓＴｒの濃度に従って標識の効率が高まることを見出した。タンパク質を還元するためのｓＴｒに対する２−ＭＥの比率として２００を用いた後者の場合において、３０μｍｏｌ  ｄｍ-3のｓＴｒ（最高濃度を用いた）を用いると５８％の収率が達成され、そして３μｍｏｌ  ｄｍ-3の濃度を用いると約６％であった。ｓＴｒに対する２−ＭＥの比率がより小さくなると、標識生成物の収率もより小さくなる結果となった。放射性標識が形成される際に１ｍｍｏｌ  ｄｍ-3のＤＴＰＡが含まれていると、ほとんど標識が起こらない結果となった。
【００６６】
テクネチウムで標識されたｓＴｒの、予備的還元を伴ったものおよび伴わなかったものの安定性について、表２に示す。予備的還元が伴わなければ、ｓＴｒに結合した99mＴｃは不安定であり、Ｍｅｄｉｕｍ１９９中で６０分間のインキュベーションを行っている間に、約５０％の標識が喪失した。これとは対照的に、３７℃のＭｅｄｉｕｍ１９９中で２１時間経過した後でさえ、99mＴｃの８３％が、予備的還元された99mＴｃ標識ｓＴｒとなお複合化していた。
【００６７】
［細胞取り込み；99mＴｃ−ｓＴｒ取り込み］
３×５ｍＬのＰＢＳでＭＣＦ７細胞を洗浄した。フィルターから回収されたトランスフェリン（「放射性標識」を参照すること）を、３７ｋＢｑ／ｍＬの活性を与えるようにＭｅｄｉｕｍ１９９に添加し、そしてフラスコあたり４ｍＬの細胞を添加した。３７℃でインキュベーションを行った。インキュベーションの後、ＰＢＳで細胞を５回洗浄した。次いで、１ｍＬのトリプシンを添加して３７℃で１０分間のインキュベーションを行うことによって、トリプシン処理を行った。次いで、０．１ｍＬの５．５ｍｏｌ  ｄｍ-3のＮａＯＨを添加して細胞を溶解し、懸濁液について計測した。
【００６８】
［組織分布の研究］
英国内務省の動物実験に関するガイドラインに基づいて、すべての動物実験を実施した。異なる時期に、次の実験を２回行った。それぞれの重量が約２０ｇの３匹の胸腺欠損ヌードマウスの左わき腹に、ＭＣＦ７細胞を移植した。第一の実験（グループ１）においては、画像化の時点で腫瘍が約２ｍｍのサイズに増殖していた。第二の実験（グループ２）においては、画像化の時点で約１ｃｍのサイズに増殖していた。それぞれの動物は、尾の血管を介して１０ＭＢｚの99mＴｃ複合体を受け入れた。注入されたのと同じ体積の標準も用意した。
【００６９】
（職人による）動物専用のγ−カメラを用いて、注入直後と注入から２４時間後までの異なる時点での動物を画像化した。全身、胸部、肝臓、腫瘍および腫瘍とは反対側の区域に関しての領域に設置した。次いで、研究の終了時に解剖を行って、複合体の生体での分布を求めた。サンプルを標準と同様に計測した。
【実施例１】
【００７０】
使用前に、３５μＭの２−メルカプトエタノールと一緒に４℃で一晩アポラクトフェリン（ａＬｆ）のプレインキュベーションを行った。次いで、７％の効率で標識された１．６μＭのタンパク質を用いて標識した。標識タンパク質を繰り返し洗浄した。そして、ＰＢＳ中で６０分間のインキュベーションを行った後でも９２％の標識がなお結合していることを見出した。結果を表３に示す。
【実施例２】
【００７１】
使用前に、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）と一緒に、４℃で一晩アポトランスフェリン（ａＴｆ）のプレインキュベーションを行った。８％、２５％および６０％の標識の効率をそれぞれ与える２．６μＭ、１２μＭおよび２６μＭのように濃度を変えて、２−メルカプトエタノールを用いた。２−ＭＥが最も低い濃度では、標識の効率は７％および８．５％という結果を繰り返した。洗浄し、３７℃のＰＢＳ中で９０分間のインキュベーションを行った後、最も高い９７％という標識濃度のａＴｆがなおタンパク質上に残存していた。結果を表３に示す。
【実施例３】
【００７２】
ＤＴＰＡは、キレート部の従来技術の典型例であり、種々の金属と一緒に安定したキレートを形成する。ＤＴＰＡが存在する場合での２時間のインキュベーションの後で脱落した、ａＴｆ上の標識の量はおよそ１０％まで、すなわち９７％から８７％であり、このことは、弱く結合した放射性核種は生体分子から離れることを示す。
【００７３】
酸性条件でａＴｆのインキュベーションを行った結果も、放射性核種の結合量が減少したというものであった。ｐＨ５で２時間のインキュベーションを行った後での、タンパク質上の標識の量はおよそ２３％まで、すなわち９７％から７５％であり、表４を参照すること。
【実施例４】
【００７４】
腫瘍細胞は難なく放射性核種標識トランスフェリンおよび放射性核種標識ラクトフェリンを取り込み、そして結合する。図１〜４は、腫瘍細胞内でのＴｃ−９９ｍ標識トランスフェリンおよびＴｃ−９９ｍ標識ラクトフェリンの結合と取り込みを説明する図である。図１は、Ｔｃ−９９ｍ標識ラクトフェリンの乳腺腫瘍細胞内への取り込みを時間に対してプロットした図であり、取り込みが迅速であり時間に応じて増加していることが示されている。図２は、Ｔｃ−９９ｍ標識トランスフェリンの膀胱腫瘍細胞内への取り込みを時間に対してプロットした図である。トランスフェリンは低親和性部位上で標識されている、すなわちＴｃはタンパク質の全体に結合している。このプロットから、約４０分後にプラトーに達するという迅速な取り込みが示される。図４は、同様のプロットを示す図ではあるが、この場合にはトランスフェリンは高親和性部位上のみで標識されている。図３に関して言えば、ラクトフェリンまたはトランスフェリンが存在しない場合、およびトランスフェリンまたはラクトフェリンのいずれかが存在する場合の、膀胱腫瘍細胞におけるＴｃの取り込みの棒グラフが示されている。両方のタンパク質が腫瘍細胞内へのＴｃの取り込みを促進することが分かるだろう。
【実施例５】
【００７５】
標識ｓＴｒが存在する場合でインキュベーションを行ったＲＴ１１２細胞による、99mＴｃの経時的な取り込みを、図２に示す。予備的還元を伴っていない標識ｓＴｒ（図２）および予備的還元を伴った標識ｓＴｒ（図４）の両方が、取り込みの初速度が速いことを示しており、約２０〜３０分後にプラトーに達した後は、感知できる程の99mＴｃの取り込みの増加は見られなかった。
【実施例６】
【００７６】
99mＴｃ標識ｓＴｒと一緒に６０分間のインキュベーションを行ったＲＴ１１２細胞を洗浄して、結合しなかった99mＴｃ−ｓＴｒを取り除いた。次いでこの結合しなかった99mＴｃ−ｓＴｒを、１０００倍過剰の、99mＴｃに関連する活性のほとんどを失った冷ｓＴｒ中でインキュベーションすると、１０分間まで培地中の活性の上昇が同時に生じた（図５）。
【実施例７】
【００７７】
６０分間の細胞のインキュベーションによって結合し内部に取り込まれた活性についての、予備的還元を行ったアポｓＴｒとホロｓＴｒとの比較を図６に示す。アポｓＴｒについての標識の効率（２９％）およびホロｓＴｒについての標識の効率（３６％）は類似しているが、結合した99mＴｃ活性（それぞれ４２，７７４±１２２８および１１０４８１±３２９８）と内部に取り込まれた99mＴｃ活性（それぞれ２５２４０±８３８および７５，９９０±４５９４）の両方は共にアポタンパク質よりもホロタンパク質の方が係数でほぼ３ほど大きい。
【実施例８】
【００７８】
ＲＴ１１２ヒト膀胱細胞と同様に、複合体と一緒にインキュベーションを行うと、ＭＣＦ７腫瘍細胞による99mＴｃの取り込みが最初の３０分間で急速に上昇した。次いでプラトーに到達し、その後は１６０分（最後）の時点まで、さらなる取り込みは明白ではなかった（図７）。
【実施例９】
【００７９】
細胞を、複合体および２００倍過剰のｈＴｆと一緒にインキュベーションすると、99mＴｃの取り込みが、放射性標識複合体のみと一緒にインキュベーションした細胞のそれの１２％未満にまで低下するという結果になった（図８）。このことは、トランスフェリン受容体を介してほとんどの活性が細胞に入ることを示唆している。図８は、ｈＴｆと同一の条件下で標識されたマウスＴｆの、ＭＣＦ７細胞による取り込みを示す図でもある。前者の取り込みは後者の約４０％であり、このことは、マウスＴｆはヒトトランスフェリン受容体に対していくらかの親和性を有することを示す。
【実施例１０】
【００８０】
図９は、99mＴｃ−ｈＴｆ複合体を投与してからの異なる時点における、１匹のマウス中での放射能の生体での分布を示す図である。示されている対象領域での取り込み−ｃｐｍ％／崩壊が補正された注入量、として表される−は、動物の両方のグループで類似であった。グループ１からのこのデータを図１０に示す。最初の５分間は、肝臓および肺／心臓領域において高い活性が見られ、後者は血液の活性を反映している。より後の時点では、これらの領域における活性は減少している。腫瘍領域の活性は注入量の約１％であり、そして研究期間中はその程度を維持したのに対して、腫瘍とは反対側の領域における活性は、注入された活性の約１．５％から０．５％に減少した。腫瘍／血液の比率は、２１時間後の時点で２．４に上昇していた。マウスの第二のグループについてのデータは、類似の傾向を示した。
【実施例１１】
【００８１】
図１１は、注入から２４時間後のマウスの二つのグループからの解剖データを示す図であり、ｃｐｍ％／注入量で表されている。二つのグループの正常な組織における活性の分布は極めてよく似ているにもかかわらず、腫瘍による複合体の取り込みは、第二のグループよりも第一のグループの方がより高いように思われる。小さな腫瘍による腫瘍の取り込みの標準偏差が大きいので、このことは統計的に有意ではない。第一のグループおよび第二のグループにおける腫瘍／血液の比率の平均値は、それぞれ２．７および１．７５である。
【００８２】
コロイドの形成について調べるために、放射性標識生成物を１００ｋＤａのフィルターに通した。すべての活性がフィルターを通過したことが分かった。
【００８３】
本発明は、２−メルカプトエタノールで前処理を行い、そしてチオ尿素をエクスチェンジ・リガンドとして用いることによって高い親和性部位上で標識されたヒト血清トランスフェリンを、次いでろ過法に付すことにより非結合テクネチウムを取り除くことによって、純度が高まった標識分子が提供されることを示した。
【００８４】
我々は、標識の効率を決定するために完全な定量方法を用いてきた。この方法には、放射性標識混合物をろ過したセントリコンＹＤ３０フィルターを十分に洗浄した表面上に保持された活性と、オリジナルの標識方法を用いた活性とを比較する必要があった。わずかに３０μｍｏｌ  ｄｍ-3という濃度のトランスフェリンを用いて、５８％という標識収率を達成した。２−ＭＥを用いて、類似の標識の効率を得、アルブミン（６２％）およびＩｇＭ（５５％）を還元した。標識トランスフェリンの比活性は２，１５０ＴＢｑ  ｍｏｌ-1であった。これは、１ｍｍｏｌ  ｄｍ-3の濃度のポリペプチドをテクネチウムで標識した研究で生じた比活性の２，０００ＴＢｑ  ｍｏｌ-1に匹敵した。
【００８５】
ｓＴｆ分子は、１６のシステイン残基から形成される合計で８のジスルフィド架橋を有する。２−ＭＥなどの強力な還元剤による前処理によって、ジスルフィド架橋が切断されるのかもしれない。その結果、99mＴｃが結合できる二つの還元されたスルフィド部位が生じる。高い標識収率を達成するためには、２−ＭＥ：トランスフェリンの比率を約２００にする必要があった。２−ＭＥの濃度を約８ｍｍｏｌ  ｄｍ-3とする限り、約２０の比率を用いれば、それでもなお標識が実現できた。興味深いことに、０．８ｍｍｏｌ  ｄｍ-3の２−ＭＥは、低い親和性部位を含む全ての標識を完全に取り除いた。
【００８６】
我々の細胞研究から、99mＴｃの取り込みの初速度は速く、そして約２０分後にプラトーに到達することが示された。非常に良く似た時間−取り込み曲線が、ヒト組織球性リンパ腫細胞による125Ｉおよび18Ｆで標識されたｓＴｆの取り込みについて見出された。この取り込みの挙動は、予備的還元ステップが、その受容体に結合するｓＴｆの能力を減少させたことはないことを示している。この曲線は、ｓＴｆが飽和に達するまでの迅速な結合と内部への活性の取り込みに相当する。
【００８７】
６０分間に亘る、ＲＴ１１２細胞による99mＴｃ標識ホロｓＴｆの結合と取り込みが、アポｓＴｆによるそれよりも多いことが見出された。しかしながら、アポｓＴｆに対するｓＴｆ受容体の親和性は、ホロｓＴｆのそれと類似し、そしてそれらの発現もよく似ているので、細胞は、アポｓＴｆをホロｓＴｆよりも迅速に再利用するのかもしれないということがあり得る。というのは、前者には鉄がなく、そのために細胞の役には立たないからである。この結果は、あらゆる目的の画像化に関して、好ましくはホロ型が用いられるべきであることを示している。
【００８８】
本研究において、我々は、タンパク質を予備的還元することなく、Ｆｅ3+結合部位においてｓＴｆを標識することも試みている。これらの標識条件下で、Ｍｅｄｉｕｍ１９９中で５０％の標識が２時間後には喪失した。ｓＴｒからの99mＴｃの喪失速度は、ｐＨ５においてより急激となった。59Ｆｅ活性の絶え間のない上昇が生じるＦｅ3+結合部位において、ｓＴｆがＦｅで標識されたこととは対照的に、ｓＴｆによる結合部位の飽和が生じた後でも、99mＴｃが経時的に蓄積されることは明白ではなかったことが、細胞取り込みの研究で示された。
【００８９】
変性剤による前処理を行わず、Ｆｅ3+結合部位への明白な結合がない場合、99mＴｃは低親和性結合部位と結びつくことになるだろう。この方法で標識したｓＴｆによって、高親和性部位上で標識されたｓＴに対する同様の時間−活性曲線が作製されたにもかかわらず、少なくとも５０％の活性が血液内へ喪失することは、インビボでの使用の価値を下げるような高いバックグラウンドが生じる結果になるかもしれない。
【００９０】
異種移植されたマウスにおける複合体のインビボおよび生体での分布に関して言えば、複合体を投与して２４時間後に殺したマウスからの解剖データから、小さい腫瘍および大きな腫瘍についての平均の取り込みがそれぞれ６％ＩＤ／ｇ、１．７％ＩＤ／ｇであることが示された。この結果は、腫瘍における取り込みはわずかに０．３６％であることが分かったというPaik et alのデータとは際立って対照的である。我々の研究から、本発明の方法によって調製されるテクネチウム標識トランスフェリンが画像化剤に適していることが示される。さらに、我々は、標識の効率が低いかまたは未だに製造されていないために、現在では好ましくない候補であるその他の生体分子の標識の効率を改善することに、本発明の方法を適用できると考えている。
【００９１】
インビボの結果から、マウスの血液系とヒト腫瘍の血管系との間の不適合性の程度のせいで、直径が１または２ｍｍを超えて成長すると、異種移植片は非常に壊死しやすくなる傾向があることが示された。より小さな腫瘍に付随する活性がより強くなることは、より小さな腫瘍における壊死の割合がより小さいことをおそらく反映している。
【００９２】
血液／腫瘍の取り込み活性の比率は、小さな腫瘍および大きな腫瘍についてそれぞれ２．７および１．７５であった。これらの血液／腫瘍の比率は、他者が放射性標識した、腫瘍上で過剰発現するその他のタイプの受容体と結合する分子によって得られた比率と類似している。
【００９３】
トランスフェリン受容体を標的化することの一つの利点は、その過剰発現が、すべてのではないとしてもほとんどの腫瘍の特徴であるということである。その他のトレーサーと同じく、我々の結果は、腎臓および肝臓での取り込みが多いことを示している。
【００９４】
トランスフェリン複合体の取り込みが肝臓で多いということを説明するメカニズムは、肝細胞上でトランスフェリン受容体が存在し、それによってトランスフェリンが血液の循環から取り除かれることが一因かもしれない。
【００９５】
本研究のインビボおよびエクスビボでの発見から、99mＴｃトランスフェリン複合体が画像化剤として有用かもしれないことが示される。抗ヒトトランスフェリンを投与して血液のバックグラウンドレベルを下げることによって、腫瘍／血液の比率の改善が達成できるかもしれない。
【００９６】
要約すれば、高い比活性と優れた安定性のために、２−ＭＥで前処理を行いエクスチェンジ・リガンドとしてチオ尿素を用いることによって、ｓＴｆを99mＴｃで標識し、そしてタンパク質と複合化しなかった99mＴｃを、ろ過ステップにて除去した。インビトロおよびインビボの両方の腫瘍細胞による複合体の取り込みは、その他の放射性核種で共有結合により標識されたｓＴｆの取り込みに類似している。
【００９７】
【表１】
2005517042.tif 000002
【００９８】
【表２】
2005517042.tif 000003
【００９９】
【表３】
2005517042.tif 000004
【０１００】
【表４】
2005517042.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ＭＣＦ７乳腺腫瘍細胞によるＴｃ−９９ｍ標識ラクトフェリンの結合と取り込みを示す図である。
【図２】ＲＴ１１２膀胱ガン細胞によるＴｃ−９９ｍ標識アポトランスフェリンの結合と取り込みを示す図である。
【図３】標識溶液と一緒に、そしてトランスフェリンを伴っておよび伴わずにインキュベーションを行ったＲＴ１１２膀胱ガン細胞によるＴｃ−９９ｍの取り込みを示す図である。
【図４】高親和性部位上で標識されたａＴｆと一緒にインキュベーションを行ったＲＴ１１２膀胱ガン細胞におけるＴｃ−９９ｍの結合、取り込みおよび全活性を示す図である。
【図５】高親和性部位上で標識されたｓＴｆの存在下で６０分間のインキュベーションを行い、次いでさらに非標識ｓＴｆと一緒に１０分間および３０分間のインキュベーションを行ったＲＴ１１２による、99mＴｃの取り込みを示す図である。（外部に結合したもの（黒一色）；内部に取り込まれたもの（白色）；取り込みの合計（横線）；培地中の活性（点））。（結果：３組についての平均±標準偏差）。
【図６】高親和性部位上で標識されたアポｓＴｆまたはホロｓＴｆの存在下で６０分間のインキュベーションを行ったＲＴ１１２による、99mＴｃの取り込み（外部に結合したもの（黒一色）および内部に取り込まれたもの（白色））を示す図である。（結果：３組についての平均±標準偏差）。
【図７】99mＴｃトランスフェリン複合体と一緒にＭＣＦ７細胞のインキュベーションの様々な時点での、細胞に関連する99mＴｃの活性。
【図８】２００倍高い濃度の非複合化トランスフェリンがない場合およびある場合、または99mＴｃマウストランスフェリン複合体がある場合での、99mＴｃヒトトランスフェリン複合体と一緒にインキュベーションを行ったＭＣＦ７細胞による、細胞に関連する99mＴｃの活性。
【図９】99mＴｃトランスフェリンの投与後の異なる時点における、異種移植されたマウスからの全身イメージ。
【図１０】肝臓、肺および心臓、腫瘍に亘る領域ならびに腫瘍とは反対側の領域についての放射能の分布。データを、注入された活性（最初の時点におけるすべての体の活性）の％として、物質の崩壊を補正して表す。
【図１１】99mＴｃトランスフェリンを投与して２４時間後に解剖した器官、血液および腫瘍における活性の生体での分布。
【図１】
2005517042.tif 000006
【図２】
2005517042.tif 000007
【図３】
2005517042.tif 000008
【図４】
2005517042.tif 000009
【図５】
2005517042.tif 000010
【図６】
2005517042.tif 000011
【図７】
2005517042.tif 000012
【図８】
2005517042.tif 000013
【図９】
2005517042.tif 000014
【図１０】
2005517042.tif 000015
【図１１】
2005517042.tif 000016
【国際調査報告】
2005517042.tif 000017
2005517042.tif 000018
2005517042.tif 000019
2005517042.tif 000020
2005517042.tif 000021