(57)【要約】本発明は、単離されたＧＰＢＰ相互作用性９０及び１３０ｋＤａポリペプチド、それらの部分（ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド）、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する抗体、及びそれらの医薬組成物を提供する。本発明はまた、単離ＧＩＰ９０／１３０核酸配列、上記核酸配列を含む発現ベクター、及び上記発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本発明はさらに、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又は核酸配列を検出するための方法、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用、ｐｏｌ  κ７６とＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用又はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの凝集を阻害するための方法、及び自己免疫疾患又は癌を有する患者を治療するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸の少なくとも６個のアミノ酸を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号３６のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号４のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号６のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号８のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号１０のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号１２のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１９】
配列番号１４のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２０】
配列番号１６のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２１】
配列番号３２のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号３６のアミノ酸配列から成る、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号３４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項２４】
上記ポリペプチドが配列番号３４のアミノ酸配列から成る、請求項２３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号１８のアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸を含む単離ポリペプチド。
【請求項２６】
上記ポリペプチドが配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２７】
上記ポリペプチドが、配列番号１８のアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸から成る、請求項２５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２８】
上記ポリペプチドが配列番号１８のアミノ酸配列から成る、請求項２５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号２０のアミノ酸の少なくとも８個のアミノ酸から成る単離ポリペプチド。
【請求項３０】
上記ポリペプチドが配列番号２０のアミノ酸配列から成る、請求項２９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号２２のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項３２】
上記ポリペプチドが配列番号２２のアミノ酸配列から成る、請求項３１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号２４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項３４】
上記ポリペプチドが配列番号２４のアミノ酸配列から成る、請求項３３に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号２６のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項３６】
上記ポリペプチドが配列番号２６のアミノ酸配列から成る、請求項３５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号２８のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸を含む単離ポリペプチド。
【請求項３８】
上記ポリペプチドが配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３９】
上記ポリペプチドが、配列番号２８のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸から成る、請求項３７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４０】
上記ポリペプチドが配列番号２８のアミノ酸配列から成る、請求項３７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号３０のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸から成る単離ポリペプチド。
【請求項４２】
上記ポリペプチドが配列番号３０の配列から成る、請求項４１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号３８のアミノ酸配列から成る単離ポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２、及び配列番号３６から成る群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸配列のうちの１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体。
【請求項４５】
上記抗体が、配列番号２、配列番号４、配列番号１８、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２、及び配列番号３６から成る群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸配列のうちの１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに向けられる、請求項４４に記載の抗体。
【請求項４６】
配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、及び配列番号３５から成る群より選択される核酸配列に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含む単離核酸配列。
【請求項４７】
上記単離核酸配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、及び配列番号３５から成る群より選択される核酸配列を含む、請求項４６に記載の核酸配列。
【請求項４８】
上記単離核酸配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、及び配列番号３５から成る群より選択される核酸配列を含む、請求項４６に記載の単離核酸配列。
【請求項４９】
上記核酸が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２、及び配列番号３６から成る群より選択される１又はそれ以上の配列を含むアミノ酸配列をコードする、請求項４６に記載の単離核酸配列。
【請求項５０】
請求項１から４３のいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離核酸配列。
【請求項５１】
請求項４６から５０のいずれかに記載の単離核酸配列を含む組換え発現ベクター。
【請求項５２】
請求項５１に記載の組換え発現ベクターでトランスフェクトした組換え宿主細胞。
【請求項５３】
ａ）スクリーニングされるべきタンパク質試料を提供すること；
ｂ）スクリーニングされるべき上記タンパク質試料を、抗体−ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド複合体形成を促進する条件下で請求項４４又は４５に記載の抗体と接触させること；及び
ｃ）抗体−ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド複合体の存在が上記タンパク質試料におけるＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの存在を示す、抗体−ポリペプチド複合体の形成を検出すること
を含む、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドを検出するための方法。
【請求項５４】
上記検出が、免疫学的局在決定、免疫蛍光分析、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、及び核酸発現ライブラリーのスクリーニングから成る群より選択される方法を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
ａ）試料を、請求項３３から３７のいずれかに記載の核酸配列を含むプローブと、このプローブと試料中のＧＩＰ９０／１３０コード核酸との間の複合体の形成を促進する条件下で接触させること；及び
ｂ）上記プローブと上記試料中のＧＩＰ９０／１３０コード核酸の間の複合体の形成を検出すること
を含む、試料中のＧＩＰ９０／１３０コード核酸配列を検出するための方法。
【請求項５６】
細胞を、ＧＰＢＰとＧＩＰの間の相互作用を修飾するために、請求項１から４３のいずれかに記載のポリペプチドの有効量と接触させることを含む、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するための方法。
【請求項５７】
細胞を、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの凝集を修飾するために、請求項１から４３のいずれかに記載のポリペプチドの有効量と接触させることを含む、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの凝集を修飾するための方法。
【請求項５８】
細胞を、ＧＰＢＰとＧＩＰの間の相互作用を阻害するために、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する１又はそれ以上の抗体の有効量と接触させることを含む、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するための方法。
【請求項５９】
上記抗体が請求項４４又は４５に記載の１又はそれ以上の抗体を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
細胞を、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの凝集を修飾するために、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する１又はそれ以上の抗体の有効量と接触させることを含む、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの凝集を修飾するための方法。
【請求項６１】
上記抗体が請求項４４又は４５に記載の１又はそれ以上の抗体を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
細胞を、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド活性を修飾するために、請求項１から４３のいずれかに記載のポリペプチドの有効量と接触させることを含む、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド活性を修飾するための方法。
【請求項６３】
細胞を、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド活性を修飾するために、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する１又はそれ以上の抗体の有効量と接触させることを含む、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド活性を修飾するための方法。
【請求項６４】
上記抗体が請求項４４又は４５に記載の１又はそれ以上の抗体を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ａ）請求項１から４３のいずれかに記載の単離ポリペプチド；及び
ｂ）医薬適合性の担体
を含有する医薬組成物。
【請求項６６】
ａ）１又はそれ以上のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに特異的な抗体；及び
ｂ）医薬適合性の担体
を含有する医薬組成物。
【請求項６７】
ａ）請求項４４又は４５に記載の抗体；及び
ｂ）医薬適合性の担体
を含有する医薬組成物。
【請求項６８】
自己免疫疾患を有する患者において１又はそれ以上のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの発現又は活性を修飾することを含む、自己免疫疾患を有する患者を治療するための方法。
【請求項６９】
腫瘍を有する患者において１又はそれ以上のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの発現又は活性を修飾することを含む、腫瘍を有する患者を治療するための方法。
【請求項７０】
細胞を、ｐｏｌ  κ７６とＧＩＰの間の相互作用を修飾するために、請求項１から４３のいずれかに記載のポリペプチドの有効量と接触させることを含む、ｐｏｌ  κ７６とＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するための方法。
【請求項７１】
細胞を、ｐｏｌ  κ７６とＧＩＰの間の相互作用を阻害するために、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する１又はそれ以上の抗体の有効量と接触させることを含む、ｐｏｌ  κ７６とＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するための方法。
【請求項７２】
上記抗体が請求項４４又は４５に記載の１又はそれ以上の抗体を含む、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、細胞生物学、タンパク質−タンパク質相互作用、自己免疫、癌、及び薬剤発見の一般的分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
グッドパスチャー抗原結合タンパク質（Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＰＢＰ）は、ランゲルハンス島（Ｉ型糖尿病）：中枢神経系の白質（多発性硬化症）；胆管（原発性胆汁性肝硬変）；副腎の皮質細胞（アジソン病）；横紋筋細胞（重症筋無力症）；精原細胞（男性不妊症）；小脳のプルキンエ細胞（腫瘍随伴性小脳変性症候群）；及び腸上皮細胞（悪性貧血、自己免疫性胃炎及び腸炎）などの、自己免疫応答の一般標的である組織及び細胞において選択的に発現される、８０−８９ｋＤａの分子量を有する、至る所に存在するプロテインキナーゼである。
【０００３】
ＧＰＢＰは、対応するプレｍＲＮＡのエクソン選択的スプライシングから生じる２つのアイソフォーム（ＧＰＢＰ及びＧＰＢＰΔ２６）として発現される。ＧＰＢＰはより活性な変異体であり、その発現は、ヒト肺胞及び糸球体基底膜（グッドパスチャー病）を含む一般的自己免疫応答の標的となる組織学的構造に、より一層限定される。ＧＰＢＰは、ヒトα３ＮＣ１ドメインがグッドパスチャー自己免疫応答を仲介する病原性自己抗体の標的であることからグッドパスチャー抗原とも称されるＩＶ型コラーゲンのヒトα３ＮＣ１ドメイン（α３（ＩＶ）ＮＣ１）に結合し、リン酸化する（国際公開公報第００／５０６０７号）。リン酸化は、少なくとも部分的にＧＰＢＰによって触媒され、配座異性化反応及びジスルフィド結合交換を含む過程である、凝集のためにα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインを活性化する（国際公開公報第０２／０６１４３０号）。
【０００４】
ＧＰＢＰΔ２６に比べてＧＰＢＰの高い発現は、ヒトα３（ＩＶ）ＮＣ１ドメインの耐容されない異常配座形態（「異常配座異性体」）の産生及びグッドパスチャー病を引き起こす、その後の自己抗体産生に結び付けられてきた（国際公開公報第０２／０６１４３０号）。このデータは、同様の病原性機構が、皮膚エリテマトーデス、天疱瘡、類天疱瘡及び扁平苔癬を含む他の自己免疫状態に関与すること、及び異常ＧＰＢＰ発現と自己免疫疾病は関連した過程であることを示唆している。さらに、ＧＰＢＰは癌細胞系では下方調節されていて（国際公開公報第００／５０６０７号）、このことは、ＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６を有する細胞機構は細胞分裂を低下させる又は細胞死を誘導するシグナル伝達経路にも関与していることを示唆する。これらの経路は、自己免疫疾病においては上方調節されて、特異的ＭＨＣハプロタイプを担う個体において変化した抗原提示を引き起こし、細胞形質転換の間は下方調節されて、腫瘍増殖における形質転換細胞の自己免疫性攻撃を予防しうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のすべてに基づき、この技術分野では、自己免疫疾患及び癌の治療において使用するための、ＧＰＢＰ活性を修飾する方法及び試薬を特定することの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
１つの局面では、本発明は、単離されたＧＰＢＰ相互作用性９０及び１３０ｋＤａポリペプチド、及びそれらの部分（ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド）、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する抗体、及びそれらの医薬組成物を提供する。さらなる局面では、本発明は、単離ＧＩＰ９０／１３０核酸配列、前記核酸配列を含む発現ベクター、及び前記発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を提供する。本発明はさらに、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又は核酸配列を検出するための方法、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの相互作用、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの凝集及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドを介した遺伝子転写を修飾するための方法、及び自己免疫疾患又は癌を有する患者を治療するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本明細書の中で、特に異なる記載がない限り、使用した手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙより（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編集（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐ．１０９−１２８、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編集、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、及び  ｔｈｅ  Ａｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などのいくつかの周知の参考文献のいずれかに見出しうる。
【０００８】
ここで使用するとき、「ＧＩＰ９０／１３０」及び「ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド」の語は、ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ、ＧＩＰ１３０ｂ、及びＧＩＰ１３０ｃを含むＧＰＢＰ相互作用性タンパク質のファミリー、それらから誘導されるアミノ酸配列を指し、それらのモノマー及びオリゴマーの両方を包含する。
【０００９】
ここで使用するとき、「ＧＩＰ９０」は、配列番号１０のアミノ酸配列から成る、ＧＩＰの９０ｋＤａ形態を指し、そのモノマー及びオリゴマーの両方を包含する。
【００１０】
ここで使用するとき、「ＧＩＰ１３０ａ」の語は、配列番号１２のアミノ酸配列から成る、ＧＩＰの１３０ｋＤａ形態の１つを指し、そのモノマー及びオリゴマーの両方を包含する。
【００１１】
ここで使用するとき、「ＧＩＰ１３０ｂ」の語は、配列番号１４のアミノ酸配列から成る、ＧＩＰの１３０ｋＤａ形態の１つを指し、そのモノマー及びオリゴマーの両方を包含する。
【００１２】
ここで使用するとき、「ＧＩＰ１３０ｃ」の語は、配列番号１６のアミノ酸配列から成る、ＧＩＰの１３０ｋＤａ形態の１つを指し、そのモノマー及びオリゴマーの両方を包含する。
【００１３】
ＧＩＰタンパク質に関して下記で使用するヌクレオチド及び残基の番号は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３２９０９２を指す。
【００１４】
ここで使用するとき、「ＤＯＣタンパク質」又は「ＤＯＣ１タンパク質」の語は、卵巣癌−１において下方調節されるタンパク質（ＤＯＣ１）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ  ０１４８９０）及びＤＯＣ１関連タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０２７８６０）を指す。ＤＯＣ１及びＤＯＣ１関連タンパク質は、ヌクレオチド及びアミノ酸レベルで相同領域においては同一であるので、同じ遺伝子から誘導される。
【００１５】
ここで使用するとき、「ＧＰＢＰ」の語は、国際公開公報第００／５０６０７号に開示されている、グッドパスチャー抗原結合タンパク質を指し、そのモノマー及びオリゴマーの両方を包含する。
【００１６】
ここで使用するとき、「ＧＰＢＰΔ２６」の語は、国際公開公報第００／５０６０７号に開示されている、２６個のアミノ酸残基を欠失したグッドパスチャー抗原結合タンパク質の選択的スプライシング産物を指し、そのモノマー及びオリゴマーの両方を包含する。
【００１７】
ここで使用するとき、ｐｏｌ  κは、国際公開公報第０２／４６３７８号に開示されているＰＯＬＫの一次タンパク質産物を意味する。
【００１８】
ここで使用するとき、ｐｏｌ  κ７６は、国際公開公報第０２／４６３７８号に開示されている、ＰＯＬＫの７６ｋＤａの選択的スプライシングアイソフォーム産物を意味する。
ここで使用するとき、「凝集」は、個々のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの自己凝集、及び２個又はそれ以上の異なるＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの凝集の両方を指す。
【００１９】
１つの局面では、本発明は単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ここでＧＩＰ９０／１３０とＧＰＢＰの間の相互作用にとって必須であることを明らかにする（下記で詳細に論じる）ユニークな１０アミノ酸ポリペプチド（ＳＹＲＲＩＬＧＱＬＬ）であり、ＤＯＣタンパク質中には存在しない、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも７、８、９又は１０個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも６、７、８、９又は１０個のアミノ酸から成る。これらのポリペプチドは、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０の間の相互作用を修飾するため、又はＧＰＢＰ−ＧＩＰ９０／１３０相互作用に干渉する抗体を惹起するために使用できる。
【００２０】
さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＤＯＣタンパク質中には存在しないＧＩＰ９０／１３０ａ／ｃのＮ末端領域であり（下記で詳細に論じる）、エクソンＩＩ−ＩＶ及びエクソンＶの一部によってコードされる（図３）、配列番号４のアミノ酸配列を含む及び／又は配列番号４のアミノ酸配列から成る。これらのポリペプチドは、それ故、例えば、ＧＩＰ９０／１３０とＤＯＣタンパク質を識別することができる、抗体などの試薬を開発するために有用である。このポリペプチドは、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０の間の相互作用に関与する配列（配列番号２を含む）を含み、それ故、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するために使用できる（又はこのポリペプチドに対する抗体が使用できる）。このポリペプチドはまた、ＧＩＰ９０／１３０凝集に関わる配列を含み、それ故、ＧＩＰ９０／１３０凝集を修飾するためにさらに使用できる（又はこのポリペプチドに対する抗体が使用できる）。このポリペプチドはまた、ＧＩＰ９０／１３０の転写活性に関わる配列を含み、それ故、そのポリペプチド又はそれから誘導される抗体は、特異的遺伝子発現を調節するためにさらに使用できる。
【００２１】
本発明のポリペプチドはまた、Ｉ−２０と称され、下記で詳細に論じる２６５アミノ酸ポリペプチドである、配列番号６のアミノ酸配列を含む及び／又は配列番号６のアミノ酸配列から成るポリペプチドを包含する。このポリペプチドは、完全長ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドよりも強力にＧＰＢＰ及びｐｏｌ  κ７６と相互作用し、完全長ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドよりも効率的に凝集する。さらに、Ｉ−２０は、完全長ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドと異なり、遺伝子転写を誘導しない。それ故、このポリペプチドは、例えば、（ａ）ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用；（ｂ）ｐｏｌ  κ７６とＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用；（ｃ）ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集；及び（ｄ）遺伝子転写の誘導などの、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの他の機能を修飾するために使用できる（又はこのポリペプチドに対する抗体が使用できる）。
【００２２】
本発明のポリペプチドはまた、ＧＩＰ９０のＮ末端からＩ−２０の末端までから成り、エクソンＩＩ−ＩＶ及びＩ−２０コード配列の末端までのエクソンＶの部分によってコードされる、配列番号８のアミノ酸配列を含む及び／又は配列番号８のアミノ酸配列から成るポリペプチドを包含する。このポリペプチドは、（ａ）ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用；（ｂ）ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集；及び（ｃ）ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの転写活性に関与する配列を含み、それ故このポリペプチド又はそれから誘導される抗体は、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するため、ＧＩＰ９０／１３０凝集を修飾するため、及び遺伝子発現を調節するために使用できる。
【００２３】
本発明のポリペプチドはまた、配列番号１０（ＧＩＰ９０）、配列番号１２（ＧＩＰ１３０ａ）、配列番号１４（ＧＩＰ１３０ｂ）、又は配列番号１６（ＧＩＰ１３０ｃ）のアミノ酸配列を含む前記アミノ酸配列から成るポリペプチドを包含する。下記で詳細に述べる、これらの完全長ポリペプチドはＧＰＢＰと相互作用し、凝集することができる。これらのポリペプチドは、例えば、ＧＰＢＰ−ＧＩＰ９０／１３０相互作用を修飾するため、ＧＩＰ９０／１３０凝集を修飾するため、遺伝子発現を修飾するため、ならびにここで述べる他の目的のために使用できる。
【００２４】
さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＩＰ９０のＣ末端に存在し、ＤＯＣタンパク質、ＧＩＰ１３０ａ、ＧＩＰ１３０ｂ又はＧＩＰ１３０ｃ中には存在しない、ユニークな１５アミノ酸ポリペプチドである、配列番号１８のアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸を含み、それ故、例えば、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドファミリーの他の成員からＧＩＰ９０を識別するための、抗体などの試薬を生成するために使用できる。さらに、上記ポリペプチド又はその抗体は、ＧＩＰ９０の自己凝集を特異的に修飾するために使用できる。さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個のアミノ酸を含む又は前記アミノ酸から成る。
【００２５】
さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０の相互作用、及びまたＧＩＰ９０／１３０凝集にも関係付けられてきたＩ−２０内に存在する３０アミノ酸ポリペプチドである、配列番号２０のアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸から成る。さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のアミノ酸配列から成る。それ故、これらのポリペプチド又はこれらのポリペプチドに対する抗体は、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するために使用できる。さらに、このポリペプチドは、ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ、ＧＩＰ１３０ｂ、ＧＩＰ１３０ｃ及びＤＯＣ１タンパク質の各々に存在するので、これらのポリペプチド又はそれらに対する抗体は、一般にＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド及びＤＯＣ１タンパク質の凝集を修飾するために使用できる。ＤＯＣ１タンパク質が配列番号２０を含むという事実にもかかわらず、それらはＧＰＢＰとのツーハイブリッドアッセイにおいて相互作用せず（下記参照）、従って配列番号２０は、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＰＢＰの相互作用に関与するが、ＧＰＢＰの相互作用にとって十分ではない。
【００２６】
さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＩＰ１３０ａのＣ末端に存在するがＧＩＰ９０には存在せず、ＤＯＣ１には必ずしも全面的に存在するわけではない、ユニークな３８６アミノ酸ポリペプチドである、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか又は配列番号２２のアミノ酸配列から成り、ＧＩＰ１３０ｂ、ＧＩＰ１３０ｃ及びＤＯＣ１関連タンパク質からの変異体を包含し、それ故、例えば、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドファミリーの他の成員から、およびＤＯＣタンパク質から、ＧＩＰ１３０ａを識別するために、および抗体などの試薬を生成するために、使用できる。この領域は、ＧＩＰ９０／１３０−ＧＰＢＰ相互作用を修飾するため、又は同じ目的のための抗体などの試薬を生成するために使用できる、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０の相互作用を下方調節する配列を含む。
【００２７】
さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、Ｎ末端からＩ−２０の末端までを欠失したＧＩＰ１３０ａである、配列番号２４のアミノ酸配列を含む又は配列番号２４のアミノ酸配列から成る。このポリペプチドは、ＧＰＢＰ相互作用及び遺伝子発現の誘導に関わるＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの決定的に重要な領域を欠き、ＧＩＰ１３０ｂ／ｃのＣ末端と同様に、ＧＰＢＰとの相互作用を下方調節するアミノ酸配列を含む。それ故、上記ポリペプチド又はそれらに対する抗体は、例えば、ＧＰＢＰ−ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド相互作用を修飾するため又はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を修飾するために使用できる。
【００２８】
さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＩＰ１３０ａのＣ末端に存在し、ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ｂ、ＧＩＰ１３０ｃ及びＤＯＣタンパク質のいずれにも存在しない、ユニークな７アミノ酸ポリペプチドである、配列番号２６のアミノ酸配列を含む又は配列番号２６のアミノ酸配列から成る。それ故、これらのポリペプチドは、ＧＩＰ１３０ａに特異的であり、例えば、ＧＩＰ１３０ａ凝集を特異的に修飾するために使用できる、抗体などの試薬を生産するために使用できる。
【００２９】
もう１つの実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＰＢＰの間の相互作用に関与し、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集にとって必須であり、ＤＯＣタンパク質には存在しない、Ｉ−２０内のユニークな１０アミノ酸ポリペプチド（ＬＤＫＶＶＥＫＨＫＥ）である、配列番号２８のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、配列番号２８のアミノ酸配列の少なくとも７、８、９又は１０個のアミノ酸を含む又は前記アミノ酸から成る。これらのポリペプチド又はそれらに対して惹起される抗体は、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するため又はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を修飾するために使用できる。
【００３０】
もう１つの実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＰＢＰの間の相互作用に関与し、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集にとって必須であり、ＤＯＣタンパク質中に存在する、Ｉ−２０内の１０アミノ酸ポリペプチド（ＥＥＥＱＫＡＴＲＬＥ）である、配列番号３０のアミノ酸配列の少なくとも６個のアミノ酸から成る。さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、配列番号３０のアミノ酸配列の少なくとも７、８、９又は１０個のアミノ酸から成る。これらのポリペプチド又はそれらに対して惹起される抗体は、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するため又はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を修飾するために使用できる。さらに、このポリペプチドはＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ、ＧＩＰ１３０ｂ、ＧＩＰ１３０ｃ及びＤＯＣ１タンパク質の各々に存在するので、これらのポリペプチド又はそれらに対する抗体は、一般にＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド及びＤＯＣ１／ＤＯＣ１関連タンパク質の凝集を修飾するために使用できる。ＤＯＣ１タンパク質が配列番号２０を含むという事実にもかかわらず、それらはＧＰＢＰとのツーハイブリッドアッセイにおいて相互作用せず（下記参照）、従って配列番号２０は、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＰＢＰの相互作用に関与するが、ＧＰＢＰの相互作用にとって十分ではない。
【００３１】
もう１つの実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＰＢＰの間の相互作用及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集にとって必須の残基を含み、ＤＯＣタンパク質には存在しない、Ｉ−２０内のユニークな２０アミノ酸ポリペプチド（ＬＤＫＶＶＥＫＨＫＥＳＹＲＲＩＬＧＱＬＬ）である、配列番号３２のアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸を含む。さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個のアミノ酸を含む又は前記アミノ酸から成る。これらのポリペプチドは、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するため及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を修飾するために、又はＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾し、及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を修飾する抗体を惹起するために使用できる。
【００３２】
もう１つの実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、Ｉ−２０内に含まれ、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＰＢＰの間の相互作用及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集にとって必須である領域を含み、ＤＯＣタンパク質中に存在する、５０アミノ酸ポリペプチドである、配列番号３４のアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸から成る。さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０個のアミノ酸から成る。これらのポリペプチドは、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するため及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を修飾するために、又はＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾し、及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を修飾する抗体を惹起するために使用できる。さらに、このポリペプチドはＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ、ＧＩＰ１３０ｂ、ＧＩＰ１３０ｃ及びＤＯＣ１タンパク質の各々に存在するので、これらのポリペプチド又はそれらに対する抗体は、一般にＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド及びＤＯＣ１／ＤＯＣ１関連タンパク質の凝集を修飾するために使用できる。ＤＯＣ１タンパク質が配列番号２０を含むという事実にもかかわらず、それらはＧＰＢＰとのツーハイブリッドアッセイにおいて相互作用せず（下記参照）、従って配列番号２０は、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＰＢＰの相互作用に関与するが、ＧＰＢＰの相互作用にとって十分ではない。
【００３３】
本発明のポリペプチドはまた、ＧＩＰ１３０ｂのＮ末端の最初の２４０アミノ酸から成り、ＤＯＣ１タンパク質中には存在せず、ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ及びＧＩＰ１３０ｃ内の対応する配列とは１６８位の１個のアミノ酸残基が異なる、配列番号３６のアミノ酸配列を含む及び／又は配列番号３６のアミノ酸配列から成るポリペプチドを包含する。このポリペプチドは、（ａ）ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用、（ｂ）ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集、及び（ｃ）ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの転写活性に関与する配列を含み、それ故このポリペプチド又はそれから誘導される抗体は、例えば、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの間の相互作用を修飾するため、ＧＩＰ９０／１３０凝集を修飾するため、及び遺伝子発現を調節するために使用できる。
【００３４】
さらなる実施形態では、単離ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＩＰ１３０ｂ／ｃのＣ末端及びＤＯＣ−１関連タンパク質中に存在するがＧＩＰ９０には存在せず、ＤＯＣ１には必ずしも全面的に存在するわけではない、ユニークな３８４アミノ酸ポリペプチドである、配列番号３８のアミノ酸配列から成り、ＧＩＰ１３０ａからの変異体を包含し、それ故、例えば、ＧＩＰ１３０ｂ／ｃ凝集を修飾するため、及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドファミリーの他の成員からＧＩＰ１３０ｂ／ｃ及びＤＯＣ１関連タンパク質を識別するための、抗体などの試薬を生成するために使用できる。
【００３５】
ここで使用するとき、「単離ポリペプチド」は、細胞から単離されたとき又は組換えＤＮＡ手法によって生産されたときは、他のタンパク質、細胞物質及び培地を実質的に含まないポリペプチドを指し、あるいは化学的に合成されたときは、化学的前駆物質又は他の化学物質を実質的に含まないポリペプチドを指す。従って、該タンパク質は天然ソースから精製するか又は化学合成することができ、あるいは組換えタンパク質は下記で開示する組換え宿主細胞から精製することができる。
【００３６】
固相、液相、又はペプチド縮合手法、又はそれらの何らかの組み合わせの周知の手法を使用して作製される合成ポリペプチドは、天然及び非天然アミノ酸を含みうる。ペプチド合成のために使用されるアミノ酸は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）の最初の固相手順の標準脱保護、中和、カップリング及び洗浄プロトコールによる標準Ｂｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂であるか、あるいはＣａｒｐｉｎｏとＨａｎ（１９７２、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３７：３４０３−３４０９）によって最初に記述された塩基不安定性Ｎα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸でありうる。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃＮα−アミノ保護アミノ酸のいずれも、Ｓｉｇｍａ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ又は当業者が熟知する他の化学会社から入手できる。さらに、該ポリペプチドは、当業者が熟知する他のＮα−保護基を用いて合成することができる。
【００３７】
固相ペプチド合成は、当業者が熟知する手法によって実施でき、例えば、ＳｔｅｗａｒｔとＹｏｕｎｇ，１９８４，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．；ＦｉｅｌｄｓとＮｏｂｌｅ，１９９０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４の中で、あるいは自動シンセサイザーを用いて提供されうる。本発明のポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸（インビボでＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性である）、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組合せ、及び特殊な特性を与えるための様々な「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、及びＮα−メチルアミノ酸等）を含みうる。合成アミノ酸は、リシンに対するオルニチン、フェニルアラニンに対するフルオロフェニルアラニン、及びロイシン又はイソロイシンに対するノルロイシンを包含する。
【００３８】
さらに、該ポリペプチドは、新規特性を備えたペプチドを作成するために、エステル結合などのペプチドミメティック結合を有しうる。例えば、還元ペプチド結合、すなわちＲ１−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２［式中、Ｒ１及びＲ２はアミノ酸残基又は配列である］を組み込んだペプチドが生成されうる。還元ペプチド結合はジペプチドサブユニットとして導入しうる。そのようなポリペプチドはプロテアーゼ活性に対して耐性となり、インビボで長い半減期を有する。
【００３９】
あるいは、該タンパク質は、下記で開示する組換え宿主細胞によって生産し、標準手法を用いて精製する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）参照）。該タンパク質は、それ故、原核生物又は真核生物ソースから精製することができる。さらなる様々な好ましい実施形態では、該タンパク質を細菌、酵母、又は哺乳類細胞から精製する。
【００４０】
該タンパク質は、エピトープタグ及び輸送シグナルなどの、タンパク質の精製を促進するために有用な付加的配列を含みうる。そのようなエピトープタグの例は、ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ｍｙｃ（９Ｅ１０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、６−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びＨＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含むが、これらに限定されない。そのような輸送シグナルの例は、核外移行シグナル、分泌シグナル、核局在化シグナル、及び細胞膜局在化シグナルを含むが、これらに限定されない。
【００４１】
もう１つの局面では、本発明は、ここで開示するＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する抗体を提供する。そのような抗体は、ＧＰＢＰ−ＧＩＰ９０／１３０号作用を修飾する、ＧＩＰ９０／１３０凝集を修飾する、及び／又はＧＩＰ９０／１３０を介した転写活性を修飾する上で、それらが認識するポリペプチドと同様に使用することができる。さらに、そのような抗体は、ここで論じるような、ＧＩＰ９０／１３０ファミリーの成員を識別するために使用できる。
【００４２】
１つの実施形態では、上記抗体は、配列番号２、配列番号４、配列番号１８、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２、及び配列番号３６から成る群より選択される１又はそれ以上のアミノ酸配列のポリペプチド中に存在するエピトープに向けられる。さらなる実施形態では、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６及び配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列に向けられる。
【００４３】
抗体は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に述べられているような、周知の方法によって作製できる。一例では、第一回免疫の前に免疫前血清を採集する。ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドのアミノ酸配列のペプチド部分を適切なアジュバント共に、免疫応答を誘発するのに十分な量と間隔で動物に注入する。抗体力価を測定するために規則正しい間隔で、好ましくは週に１回、動物から採血する。初回免疫後、動物にブースター注射を実施してもよく又は実施しなくてもよい。各々のブースター免疫後約７日目に、又は単回免疫後約１週間ごとに、動物から採血し、血清を収集して、アリコートを約−２０℃で保存する。その後、動物から収集した血清を、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドを含まない同じ発現系から作製した非抗原関連タンパク質が結合しているカラムを通すことによってＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対するポリクローナル抗体を精製することができる。
【００４４】
モノクローナル抗体は、動物から脾細胞を入手することによって生産できる（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７（１９７５）参照）。一例では、近交系マウスをＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又はその部分で免疫することによって対象とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製する。そのマウスを、免疫応答を誘発するのに十分な量と間隔でＩＰ又はＳＣ経路で免疫する。マウスは０日目に初回免疫を受け、約３週間から約３０週間休ませる。免疫したマウスに静脈内（ＩＶ）経路で１回又はそれ以上のブースター免疫を実施する。この技術分野で既知の標準手順によって免疫マウスから脾臓を切除することにより、抗体陽性マウスからリンパ球を得る。その脾リンパ球を、安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下で適切な融合パートナーと混合することによってハイブリドーマ細胞を生産する。抗体産生細胞と融合パートナー細胞をポリエチレングリコール中約３０％から約５０％の濃度で融合させる。融合ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）でのこの技術分野で既知の手順による増殖によって選択する。増殖陽性ウエルから上清液を収集し、固相放射線免疫測定法などの免疫測定法によって抗体産生に関してスクリーニングする。抗体陽性ウエルからのハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓより、ＫｒｕｓｅとＰａｔｅｒｓｏｎ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９７３の軟寒天手法などの手法によってクローン化する。
【００４５】
そのような抗体応答を生じさせるために、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又はその部分は、典型的には非経口投与用の医薬適合性の担体と共に製剤される。そのような許容されるアジュバントは、フロイント完全、フロイント不完全、ミョウバン沈殿物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍを含有する油中水型乳剤及びｔＲＮＡを含むが、これらに限定されない。該ポリペプチドの濃度及び賦形剤及び他の成分の選択を含む、そのような組成物の製剤法は当分野の技術範囲内である。
【００４６】
ここで使用する抗体の語は、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドと選択的に反応するその抗体フラグメントを包含することが意図されている。抗体は従来の手法を用いてフラグメントに切断することができ、それらのフラグメントは、全抗体に関して上述したのと同様にして有用性に関してスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することによって作製できる。生じたＦ（ａｂ’）２フラグメントを、ジスルフィド架橋を還元するように処理して、Ｆａｂ’フラグメントを作製することができる。
【００４７】
もう１つの局面では、本発明は、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。１つの実施形態では、該単離核酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２及び配列番号３６から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする配列を含む。さらなる実施形態では、該単離核酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６及び配列番号３８から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードする配列から成る。
【００４８】
もう１つの実施形態では、該単離核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、及び配列番号３５、から成る群より選択される核酸配列、それらの相補物、又はそれらの転写産物に高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする配列を含む。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ここでは核酸ハイブリッドが安定である条件を表わすために使用される。当業者に既知であるように、ハイブリッドの安定性はハイブリッドの融解温度（ＴＭ）に反映される。配列相同性が１％低下するごとにＴＭは約１℃から１．５℃低下する。一般に、ハイブリッドの安定性はナトリウムイオン濃度及び温度の関数である。典型的には、より低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーション反応を実施し、その後様々な、但しより高いストリンジェンシーの洗浄を行う。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーへの言及はそのような洗浄条件に関する。従って、ここで使用するとき、高ストリンジェンシーは、０．１％ＳＳＰＥ中６５℃で安定なハイブリッドを形成する上記核酸配列のハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す。これらの条件は様々な緩衝液と温度を使用して二重に実施しうること及びそれらが必ずしも厳密ではないことは了解される。デンハルト溶液及びＳＳＰＥ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，及びＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌより、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照）は、他の適切なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に、当業者に周知である。
【００４９】
もう１つの実施形態では、該単離核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号１７、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、及び配列番号３５、それらの相補物、又はそれらの転写産物から成る群より選択される１又はそれ以上の配列を含む。さらなる実施形態では、該単離核酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３１、及び配列番号３５、それらの相補物、又はそれらの転写産物から成る群より選択される１又はそれ以上の配列を含む。さらなる実施形態では、該単離核酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７、それらの相補物、又はそれらの転写産物から成る群より選択される１又はそれ以上の配列から成る。
【００５０】
ここで使用するとき、「単離核酸配列」は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ内でその核酸に天然で隣接する遺伝子配列（すなわちその核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ内で該単離核酸分子についての遺伝子に隣接して位置する遺伝子配列）を含まない核酸配列を指す。本発明に従った「単離」ＧＩＰ９０／１３０核酸配列は、しかしながら、異種プロモーター配列又は他のベクター配列などの、上述した配列に通常は隣接しない他のヌクレオチド配列に連結されていてもよい。本発明に従った核酸配列は宿主細胞をトランスフェクトするために使用される発現ベクターの位置でありうるので（下記参照）、該単離核酸配列は、「単離」されているとみなされるために他の細胞物質不含である必要はない。
【００５１】
これらの実施形態すべてにおいて、該単離核酸配列はＲＮＡ又はＤＮＡを含んでいてもよく、一本鎖又は二本鎖のいずれでもよい。そのような一本鎖配列は、開示されている配列、その相補物、又はその転写産物を含みうる。該単離配列は、ポリＡ配列、修飾コザック配列、及びエピトープタグ、核外移行シグナル、分泌シグナル、核局在化シグナル及び細胞膜局在化シグナルをコードする配列を含むがこれらに限定されない、コードされるタンパク質の発現及び／又は精製を促進するために有用な付加的配列をさらに含みうる。
【００５２】
もう１つの実施形態では、本発明は、プロモーターに作動可能に連結された、上述したような単離核酸を含む発現ベクターを提供する。好ましい実施形態では、上記プロモーターは異種である（すなわち、天然に生じるＧＩＰ９０／１３０プロモーターではない）。プロモーター及びＧＩＰ９０／１３０核酸配列は、そのプロモーターがＧＩＰ９０／１３０  ＤＮＡのＲＮＡへの発現を駆動することができるとき「作動可能に連結されて」いる。
【００５３】
ここで使用するとき、「ベクター」の語は、それが連結されているもう１つ別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。１つの種類のベクターは、その中に付加的なＤＮＡセグメントをクローニングしうる環状二本鎖ＤＮＡを指す、「プラスミド」である。もう１つの種類のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内にクローニングしうる、ウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸配列の発現を指令することができる。そのようなベクターをここでは「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と称する。本発明において、核酸配列の発現は、発現すべき核酸配列に本発明のプロモーター配列を作動可能に連結することによって指令される。一般に、組換えＤＮＡ手法において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。本明細書では、プラスミドは最も一般的に使用される形態のベクターであるので、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用されうる。しかし、本発明は等しい機能を果たす、ウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの他の形態の発現ベクターを包含することを意図する。
【００５４】
該ベクターはまた、付加的核酸配列のサブクローニングのためのポリリンカー及び転写産物の適切なポリアデニル化を生じさせるためのポリアデニル化シグナルなどの、付加的な配列を含みうる。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明を成功裏に実施する上で決定的に重要ではないと考えられ、ＳＶ４０及びウシ成長ホルモンポリＡ部位を含むがこれらに限定されない、何らかのそのような配列が使用できる。該ベクターは、メッセージレベルを高め、構築物から他の配列への読み過ごしを最小限に抑える役割を果たしうる、終結配列をさらに含みうる。最後に、発現ベクターは、典型的には、これらのベクターを担う細胞の選択を可能にする、しばしば抗生物質耐性遺伝子の形態の、選択マーカーを有する。
【００５５】
さらなる実施形態では、本発明は、ここで開示する発現ベクターが導入された組換え宿主細胞を提供する。ここで使用するとき、「宿主細胞」の語は、本発明の組換え発現ベクターなどの、本発明の核酸が導入された細胞を表わすことが意図されている。そのような細胞は原核細胞又は真核細胞でありうる。
【００５６】
「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」の語はここでは交換可能に使用される。そのような語が、特定対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫又は潜在的子孫も表わすことは了解されよう。突然変異又は環境的影響のためにある種の改変が連続する世代において起こりうるので、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一でないことがあるが、それでもやはりここで使用されるこの語の範囲内に包含される。
【００５７】
該宿主細胞は、本発明の１又はそれ以上の発現ベクターで一過性に又は安定にトランスフェクトすることができる。原核及び真核細胞への発現ベクターのそのようなトランスフェクションは、標準細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈法、電気穿孔、又はリポソームを介した、ＤＥＡＥデキストランを介した、ポリカチオンを介した又はウイルスを介したトランスフェクションを含むがこれらに限定されない、この技術分野で既知の何らかの手法によって実施できる。あるいは、該宿主細胞を、ＧＩＰ９０／１３０核酸を含む組換えウイルスベクターに感染させることができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。
【００５８】
さらなる局面では、本発明は、スクリーニングするタンパク質試料を提供すること；スクリーニングする上記タンパク質試料を１又はそれ以上のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する抗体と接触させること；及び抗体−ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド複合体の形成を検出することを含む、タンパク質試料においてＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの存在を検出するための方法を提供する。該抗体はポリクローナル又はモノクローナルでありうるが、モノクローナル抗体が好ましい。ここで使用するとき、「タンパク質試料」の語は、組織及びその部分、組織切片、無傷細胞、細胞抽出物、精製又は部分精製タンパク質試料、体液、及び核酸発現ライブラリーを含むがこれらに限定されない、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドを含む可能性のある何らかの試料を指す。従って、本発明のこの局面は、免疫局在化、免疫蛍光分析、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、及び核酸発現ライブラリースクリーニングを含むがこれらに限定されない標準手法によって（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）、これら様々なタンパク質試料におけるＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの存在を試験するために使用しうる。１つの実施形態では、上記手法はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの存在又は不在だけを判定しうる。あるいは、上記手法は定量的でありえ、試料中のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの相対的量についての情報を提供しうる。定量のためには、ＥＬＩＳＡが好ましい。
【００５９】
ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドに対する抗体又はそのフラグメントとの間の免疫複合体形成の検出は、標準検出手法によって実施することができる。例えば、標識抗体又は二次抗体を使用することによって免疫複合体の検出を行うことができる。標識の選択を含む、そのような方法は、当業者に既知である（ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、前出）。あるいは、ポリクローナル又はモノクローナル抗体を検出可能物質に結合することができる。「結合」の語は、検出可能物質が抗体に物理的に連結されていることを意味するために使用される。適切な検出可能物質は、様々な酵素、補欠分子のグループ、蛍光物質、発光物質及び放射性物質を含む。適切な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含む。適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリンを含む。発光物質の一例は、ルミノールを含む。適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈを含む。
【００６０】
そのような検出方法は、自己免疫状態を検出すること、細胞分裂の停止又は細胞死を特定すること、ＧＰＢＰ又は他のタンパク質とＧＩＰ９０／１３０の相互作用を検出すること、組織試料中のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの免疫局在化、ウエスタンブロット分析、及び関連タンパク質を見出すための発現ライブラリーのスクリーニングを含むがこれらに限定されない、様々な目的のために有用である。
【００６１】
さらにもう１つの局面では、本発明は、スクリーニングする核酸試料を提供すること、その試料を、本発明の単離核酸配列又はそのフラグメントから誘導した核酸プローブと接触させること、及び複合体形成を検出することを含む、試料中のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドをコードする核酸配列の存在を検出するための方法を提供する。
【００６２】
ここで使用するとき、「試料」の語は、組織及びその部分、組織切片、無傷細胞、細胞抽出物、精製又は部分精製核酸試料、ＤＮＡライブラリー、及び体液を含むがこれらに限定されない、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドをコードする核酸を含む可能性のある何らかの試料を指す。従って、本発明のこの局面は、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ＤＮＡライブラリースクリーニング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない標準手法によって、これら様々な試料においてＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ又はＤＮＡの存在を試験するために使用しうる（例えば、Ｓｍｂｒｏｏｋら、１９８９参照）。１つの実施形態では、上記手法は単に対象とする核酸の存在又は不在だけを判定しうる。あるいは、上記手法は定量的でありえ、試料中の対象核酸の相対的量についての情報を提供しうる。定量のためには、定量的ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲが好ましい。それ故、一例では、ＲＮＡを試料から単離し、ＧＩＰ９０／１３０  ＲＮＡからｃＤＮＡを作製するための適切な緩衝液と温度条件下で、逆転写酵素と共に、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドをコードする核酸配列から誘導したオリゴヌクレオチドと接触させる。次のそのｃＤＮＡを、ここで開示する適切な核酸配列から誘導したプライマー対を使用するＰＣＲに供する。好ましい実施形態では、上記プライマーはＧＩＰ９０／１３０のＲＮＡ発現産物の存在を検出するように設計され、試料中のＧＩＰ９０／１３０遺伝子発現の量を対照試料中のレベルと比較する。
【００６３】
ＧＩＰ９０／１３０核酸配列を検出するにあたって、プローブ、対象核酸又はプローブと対象核酸の間の複合体を標識するために、そのすべてがこの技術分野において周知である、酵素、化学発光、あるいはアビジン又はビオチン標識手法を含むがこれらに限定されない、標準標識手法が使用できる。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら、１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）参照）。
【００６４】
そのような核酸検出の方法は、自己免疫状態を検出すること、細胞分裂の停止又は細胞死を特定すること、ＧＩＰ９０／１３０核酸配列を発現する細胞を特定すること、ＧＩＰ９０／１３０遺伝子発現のためのインサイチューハイブリダイゼーション、ノーザン及びサザンブロット分析、及びＤＮＡライブラリーのスクリーニングを含むがこれらに限定されない、様々な目的のために有用である。
【００６５】
上述したように、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、細胞分裂を減損する又は細胞死を引き起こす細胞シグナル伝達経路に関与する可能性が高く、それらシグナル伝達は自己免疫疾病においては上方調節され、腫瘍増殖の場合は自己免疫の攻撃を防ぐために癌細胞において下方調節されると思われる。それ故、ここで開示する検出方法は、そのような細胞死に関連するプロセスを受ける細胞を検出するために使用できる。
【００６６】
さらに、本発明は、ＧＩＰ９０／１３０  ＲＮＡ又はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの発現又は活性を上昇させること又は低下させることなどによって、それらの発現又は活性を修飾することを含む、自己免疫疾患又は癌を治療するための方法を提供する。ＧＩＰ９０／１３０  ＲＮＡ又はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの発現又は活性を修飾することは、ＧＩＰ９０／１３０抗体、ここで開示するもののようなＧＩＰ９０／１３０の提示相互作用性モチーフを示すポリペプチドなどのＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド発現又は活性の特異的誘導物質又は阻害因子を使用すること、ここで開示するＧＩＰ９０／１３０核酸配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又は二本鎖ＲＮＡの設計に基づくアンチセンス又はＲＮＡ干渉療法、１又はそれ以上のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドを発現する宿主細胞を用いた細胞療法、又はこの技術分野で既知の他の手法を使用することによって実施できる。ここで使用するとき、「発現又は活性の修飾」は、ＲＮＡ又はタンパク質産物のいずれかの発現又は活性を修飾することを指す。
【００６７】
例えば、ＧＩＰ９０／１３０遺伝子が腫瘍抑制遺伝子であること、異常に高い細胞死プロセスが特定自己免疫疾病の基礎であること（国際公開公報第００／５０６０７号）、及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの凝集物が自己免疫応答の一般的標的である多くのヒト組織で発現されることが判っているので、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又は本発明の核酸の投与、特にＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集及び／又は他の細胞成分との相互作用についての基本的相互作用モチーフを示すもの、例えばＧＰＢＰなどの投与は、疾病に影響を及ぼし、それ故自己免疫についての治療薬として働く。あるいは、腫瘍細胞はＧＰＢＰ又はＧＩＰ９０／１３０をほとんど又は全く発現せず、それ故単独又はＧＰＢＰとの組合せでの、本発明のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又は核酸配列の投与、特に完全長ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ、ＧＩＰ１３０ｂ、及び／又はＧＩＰ１３０ｃの投与は、癌の患者において治療的恩恵を提供すると期待される。
【００６８】
特定の作用機構に限定されるわけではないが、癌患者における治療的利益は、ＧＩＰ９０／１３０とＧＰＢＰなどの他の細胞成分との相互作用及び／又はＧＩＰ９０／１３０凝集を促進することによって引き出され、一方自己免疫患者に対する治療的利益は、これらの相互作用及び／又は凝集を阻害することによって導かれると考えられる。
【００６９】
もう１つの局面では、本発明は、細胞を、ＧＩＰ９０／１３０活性を修飾するために本発明の１又はそれ以上のポリペプチド、抗体、核酸、又はそれらの医薬組成物の有効量と接触させることを含む、ＧＩＰ９０／１３０活性を修飾するための方法を提供する。そのような細胞接触はインビトロ又はインビボで実施することができ、「修飾すること」は、転写促進活性を含むＧＩＰ９０／１３０活性を上昇させること又は低下させることの両方を包含する。
【００７０】
もう１つの局面では、本発明は、細胞を、ＧＰＢＰ活性を修飾するために本発明の１又はそれ以上のポリペプチド、抗体、核酸、又はそれらの医薬組成物の有効量と接触させることを含む、ＧＰＢＰ活性を修飾するための方法を提供する。そのような細胞接触はインビトロ又はインビボで実施することができ、「修飾すること」は、ＧＰＢＰ活性を上昇させること又は低下させることの両方を包含する。例えば、高いＧＰＢＰ活性は自己免疫と結びつき、それ故本発明のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又は抗体の投与（あるいは本発明のＧＩＰ９０／１３０核酸配列又はそのベクターの投与による遺伝子治療）は、ＧＰＢＰ−ＧＩＰ９０／１３０相互作用に影響を及ぼし、自己免疫疾患を有する患者において治療的恩恵を提供すると期待できる。あるいは、腫瘍細胞はＧＰＢＰをほとんど又は全く発現せず、それ故ＧＰＢＰと組み合わせた、本発明のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの同時投与、特に完全長ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ、ＧＩＰ１３０ｂ、及び／又はＧＩＰ１３０ｃの同時投与は、癌の患者において治療的恩恵を提供すると期待される。
【００７１】
もう１つの局面では、本発明は、細胞を、ｐｏｌ  κ７６活性を修飾するために本発明の１又はそれ以上のポリペプチド、抗体、核酸、又はそれらの医薬組成物の有効量と接触させることを含む、ｐｏｌ  κ７６ポリペプチド活性を修飾するための方法を提供する。そのような細胞接触はインビトロ又はインビボで実施することができ、「修飾すること」は、ｐｏｌ  κ７６活性を上昇させること又は低下させることの両方を包含する。例えば、高いｐｏｌ  κ７６活性は自己免疫と結びつき（国際公開公報第０２／４６３７８号）、それ故本発明のＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又は抗体の投与（あるいは本発明のＧＩＰ９０／１３０核酸配列又はそのベクターの投与による遺伝子治療）は、ｐｏｌ  κ７６−ＧＩＰ９０／１３０相互作用に影響を及ぼし、自己免疫疾患を有する患者において治療的恩恵を提供すると期待される。
【００７２】
本発明の治療法を実施する場合、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又はそれに対する抗体の量又は用量範囲は、一般に約０．０１μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重までの間、好ましくは約０．１０μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重まで、より好ましくは約１μｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲である。
【００７３】
さらなる局面では、本発明は、本発明の治療方法の１つ又はそれ以上を実施するためにＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド、それに対する抗体及びここで開示する核酸の有効量、及び医薬適合性の担体を含有する、医薬組成物を提供する。ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド又はそれに対する抗体は、滅菌などの従来の製薬操作に供しうる及び／又は防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等のような従来の佐剤を含有しうる。
【００７４】
投与のために、該ポリペプチドは通常、指示される投与経路に適切な１又はそれ以上の佐剤と組み合わせる。該化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸ナトリウム及びカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、及び／又はポリビニルアルコールと混合して、慣例的な投与のための錠剤化又はカプセル化しうる。あるいは、本発明の化合物は、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド溶液、エタノール、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム、及び／又は様々な緩衝液中に溶解しうる。他の佐剤及び投与様式は製薬技術分野において周知である。担体又は希釈剤は、単独であるいはろう又はこの技術分野で周知の他の物質と共に、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの放出遅延性物質を含みうる。
【００７５】
該ポリペプチド又はその医薬組成物は、従来の医薬適合性の担体、佐剤及び賦形剤を含有する投与単位製剤として経口的、非経口的、吸入スプレーによって、経直腸的、又は局所的経路を含む、何らかの適切な経路によって投与しうる。ここで使用する非経口的の語は、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内、腱内、髄腔内、頭蓋内、胸腔内、持続注入手法又は腹腔内を含む。好ましい実施形態では、該ポリペプチドを静脈内又は皮下経路で投与する。
【００７６】
該ポリペプチドは、固体形態（顆粒、粉末又は坐薬を含む）又は液体形態（例えば溶液、懸濁液又は乳剤）で作製しうる。本発明のポリペプチドは様々な溶液中で適用しうる。本発明に従って使用するための適切な溶液は、無菌であり、十分な量のポリペプチドを溶解し、意図される適用のために有害ではない。
【００７７】
本発明は、例示のみを目的とし、付属の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない下記の実施例を参照して、よりよく理解される。
【実施例】
【００７８】
ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの特定及び特徴指摘
ＧＰＢＰ相互作用性タンパク質についてのいくつかのヒトｃＤＮＡライブラリー検索に基づき、酵母ツーハイブリッドスクリーニングを実施した。このスクリーニングは完全長ＧＰＢＰをバイトとして用いて実施し、ベクターｐＧＢＴ９にクローニングしてＧＡＬ４結合ドメイン融合タンパク質を生成した。生じた構築物で酵母ＨＦ７ｃ細胞を形質転換して、安定にトランスフェクトされた細胞系を得、それをその後種々のｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。使用したのは：ヒト骨格筋（ｐＧＡＤ１０ベクター）、ヒト腎臓（ｐＧＡＤ１０）、ヒト膵臓（ｐＧＡＤ１０）、ヒト脳（ｐＡＣＴ２）及びＨｅｌａ（ｐＧＡＤＧＨ）ｃＤＮＡライブラリー（すべてＣｌｏｎｔｅｃｈより）であった。供給者の指示に従って形質転換を実施し、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール  ２０ｍＭを含有するＴｒｐ、Ｌｅｕ及びＨｉｓ欠損培地で平板培養した。製造者の推奨に従って相互作用を評価した。特に、β−ガラクトシダーゼ活性は、リフトコロニーアッセイについてはＸ−ＧＡＬ（０．７５ｍｇ／ｍｌ）で、及びイン・ソルーション（ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）定量についてはオルト−ニトロフェニルβ−Ｄガラクトピラノシド（０．６６ｍｇ／ｍｌ）で検定した。
【００７９】
ヒト骨格筋ライブラリーから、２６５残基のポリペプチド、Ｉ−２０（配列番号６）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む８００ｂｐ  ｃＤＮＡ（「Ｉ−２０  ｃＤＮＡ」）を単離した。このＯＲＦの一部は、そのコードするｍＲＮＡが卵巣癌細胞系では認められないが、正常卵巣細胞系では豊富に発現されるポリペプチド、ＤＯＣ１（卵巣癌において下方調節される、ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  １）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５５７０５）（Ｍｏｋら、Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．５２（２）：２４７−２５２（１９９４））をコードするＯＲＦと一致した。この理由から、ＤＯＣ−１遺伝子は腫瘍抑制遺伝子とみなされる。
【００８０】
Ｉ−２０  ｃＤＮＡを使用して、正常ヒト組織及びいくつかのヒト癌細胞系においてＩ−２０をコードするｍＲＮＡの発現レベルを測定するために多組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をプローブした。膜を３２Ｐ−α−ｄＣＴＰ標識Ｉ−２０  ｃＤＮＡ（配列番号５）とハイブリダイズさせ、特定ｍＲＮＡ種をオートラジオグラフィーによって特定した。９、４．４、４及び３Ｋｂの４つのｍＲＮＡ種を特定した。９、４．４及び３Ｋｂの種は骨格筋においてより豊富であり、４Ｋｂ種は骨格筋、膵臓及び肺において同様の発現を示し、心臓組織でより高い発現を示した。極微量の９、４．４及び３Ｋｂ種を含む心臓を除いて、試験した残りの組織は主として４Ｋｂ  ｍＲＮＡ種を発現した。ＤＯＣ１についてのこれまでの試験から予想されたように、Ｉ−２０  ｃＤＮＡは試験した個々のヒト癌細胞系からのいずれのｍＲＮＡ種とも有意にハイブリダイズせず（ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＭＴＮヒト癌細胞系ブロット）、それ故Ｉ−２０が腫瘍抑制遺伝子によってコードされることを確認した。
【００８１】
Ｉ−２０  ＯＲＦは終結コドンを含まず、ＤＯＣ１について想定されるＯＲＦを超えて５’側に伸長しているので、骨格筋においてＩ−２０がより大きなタンパク質の部分配列である可能性を探索した。対応するｃＤＮＡライブラリーをＩ−２０  ｃＤＮＡでプローブすることにより、全体で、ＧＰＢＰ相互作用性タンパク質９０ｋＤａ（ＧＰＢＰ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０ｋＤａについての、ＧＩＰ９０（配列番号１０）と称される９０ｋＤａの予測７６４アミノ酸ポリペプチドをコードするＯＲＦを含む、４つの重複ｃＤＮＡクローンを単離し、ヌクレオチド配列決定によって特性付けた。提起した重複ＯＲＦを含む同じライブラリーから誘導した連続するＰＣＲフラグメントを単離し、ヌクレオチド配列決定することにより、ＧＩＰ９０  ｍＲＮＡの存在を確認した。ＧＩＰ９０のより著明な構造特徴は、１つはＮ末端領域にあり、もう１つはＣ末端領域にある、２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）の存在、及び２つのロイシンジッパーを含むその配列の大部分にわたる高度に予測可能なコイルドコイルの形成である。
【００８２】
ＧＩＰ９０のｃＤＮＡヌクレオチド配列（「ＧＩＰ９０  ｃＤＮＡ」）（配列番号９）を使用して、ヒトゲノムに対するＢＬＡＳＴ検索を実施し、ＧＩＰ９０  ｃＤＮＡが染色体３番（３ｑ１２）に対応することを認めた（エクソンＩについてゲノムＤＮＡアクセッション番号ＮＴ＿０３０６３４及び残りのエクソンについてＮＴ＿０３３０５０）。合計６個のエクソンを含む、ＧＩＰ９０ゲノム配列についてのエクソン／イントロン構造を決定した（図１）。ＧＩＰ９０遺伝子のエクソンＩ−ＩＶは、５’側の翻訳不能配列を含み、ＤＯＣ１及びＤＯＣ１関連タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ２７８６０）には存在しない２４０残基のＮ末端セグメントの最初の２０１残基をコードする。エクソンＶは、ＤＯＣタンパク質には存在しない残りの３９残基ならびにＧＩＰ９９０の付加的な５２４残基をコードし、エクソンＶＩは３’側翻訳不能配列を含む。
【００８３】
ＧＩＰ９０  ｃＤＮＡとＧＩＰ９０ゲノム配列の比較は、ＧＩＰ９０ゲノムＤＮＡには存在しない、ＧＩＰ９０  ｃＤＮＡ内の２７２０位のアデニン（Ａ）（Ａ２７２０）の存在を明らかにし、ＧＩＰ９０  ｃＤＮＡがｃＤＮＡ人為産物であるか、あるいはＤＮＡ多型又はｍＲＮＡエディティングに由来する天然ｍＲＮＡ種のいずれかであることを示唆する。突然変異性人為産物は、２個以上のｃＤＮＡ分子種で認められる可能性が低い独特の事象である。我々は、２つの異なる逆転写事象を示す、少なくとも２個の異なるＧＩＰ９０  ｃＤＮＡフラグメントにおいてＡ２７２０を特定し、エクソンＩからの正プライマーとエクソンＶＩからの逆プライマーを使用したヒト筋ライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からの全ｃＤＮＡに関するＰＣＲ及びその後の直接塩基配列決定は、生じたｃＤＮＡが固有のＡ２７２０を含むことを明らかにした。相同ヌクレオチドがＤＯＣ１コード配列においてまた認められたが、ＤＯＣ１関連タンパク質コード配列では認められなかった。これらの結果は、ＧＩＰ９０  ｃＤＮＡ内のＡ２７２０が人為産物ではないことを示している。
【００８４】
ＧＩＰ９０  ｃＤＮＡの由来をさらに分析するために、２つの独立したヒト骨格筋組織試料におけるＧＩＰ９０の発現をＲＴ−ＰＣＲによって検討した。我々は、これらの試料からＧＩＰ９０  ｍＲＮＡを増幅することができなかった。これに対し、我々がＧＩＰ１３０ａ（配列番号１２）と命名した１３０ｋＤａポリペプチド（１１３５残基）をコードする関連ｍＲＮＡ種である、連続ｃＤＮＡフラグメント（配列番号１１）を単離し、特性付けた。ＧＩＰ１３０ａはＧＩＰ９０ゲノム配列（すなわちＡ２７２０なし）の忠実な転写と翻訳から生じ、ＧＩＰ９０ゲノム配列からのＧＩＰ９０コードｍＲＮＡの産生はｍＲＮＡ多様化についての特異的機構によることを示唆した。
【００８５】
ＤＯＣ１／ＧＩＰ９０／１３０ファミリーのｍＲＮＡ多様化機構をさらに探索するため、ＤＯＣ１／ＤＯＣ１関連タンパク質、ＧＩＰ９０及びＧＩＰ１３０ａをコードするヌクレオチド配列を比較した。いくつかのヌクレオチドの相違が特定された、すなわち：（１）ＤＯＣ−１及びＤＯＣ１関連ｍＲＮＡはエクソンＩ−ＩＶを欠く；（２）ＤＯＣ１  ｍＲＮＡはエクソンＶ内に４２ｂｐ及び１８ｂｐのヌクレオチド欠失を示し、ＤＯＣ１及びＤＯＣ１関連ｍＲＮＡの両方が、ＧＩＰ９０／１３０ａ内のイントロン配列に対応するこのエクソンの３’末端に付加的な２７６ｂｐを含む；（３）ＤＯＣ−１及びＤＯＣ１関連ｍＲＮＡはどちらもエクソンＶＩを持たない。
【００８６】
それ故、エクソンＶＩの発現はＧＩＰ９０／１３０ａ  ｍＲＮＡの発現に結びついており、ＤＯＣ−１及びＤＯＣ１関連ｍＲＮＡはイントロン延長エクソンＶによって独占的にコードされているようである。次に、ヒト骨格筋及びヒト２９３細胞からのｍＲＮＡのＰＣＲによってエクソンＩ−ＩＶを含むＤＯＣ−１  ｍＲＮＡの存在を評価した。どちらもエクソンＩ−Ｖ配列及びＤＯＣ−１独占的エクソンＶを含み、１６８位のアミノ酸変化（Ｈ１６８／Ｒ１６８）を導く、９７５位の１個のヌクレオチドが互いに異なる（Ａ／Ｇ）、２つの異なるｃＤＮＡ（配列番号１３及び１５）を入手した。これは、我々がそれぞれＧＩＰ１３０ｂ（配列番号１４）及びＧＩＰ１３０ｃ（配列番号１６）と命名した２つの異なる１１３３残基長のポリペプチド（１３０ｋＤａ）を生じる。ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＤＯＣ１ポリペプチドファミリーのアミノ酸配列の比較を図３に示す。
【００８７】
ラットフィラミンＡ相互作用性タンパク質（ＦＩＬＩＰ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＣ００８５１）及び仮説的（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）ヒトＫＩＡＡ１２７５タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ８６５８９）のアミノ酸配列は、ＧＩＰ９０／１３０及びＤＯＣタンパク質と高度に相同である（約５０％）。これは、これらの遺伝子が関連すること、及びＦＩＬＩＰ、ＫＩＡＡ１２７５及びＧＩＰ９０／１３０が生物学的機能を共有する可能性が高いことを示唆する。それ故、ＦＩＬＩＰは皮質ニューロンの細胞遊走を減弱することがわかっているので（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２年７月；４（７）：４９５−５０１）、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、少なくとも一部には、細胞遊走を減弱することによって腫瘍抑制作用を及ぼすと仮定することが妥当である。
【００８８】
上記データは、ＤＯＣ−１／ＧＩＰ９０／１３０  ｍＲＮＡファミリーが、対応する遺伝子（ＧＩＰ９０ゲノム配列）の発現に作用する複雑な多様化機構から生じることを示している。このように、我々は、Ｒ１６８又はＨ１６８の存在はＧＩＰ９０ゲノム配列多型の結果であることを見出した。ＧＩＰ９０／１３０ａの特徴であるエクソンＶの存在（エクソンＶａ）は、エクソンＶＩの発現に結びついており、１個のイントロンの２つの５’側スプライス部位の選択的使用が選択的３’側末端エクソンのスプライシングによって調整される、複雑な選択的エクソンスプライシングである。それ故、より短いエクソンＶ（エクソンＶａ）を生成するためにより上流の５’側スプライス部位が使用されるときは、３’側末端エクソン（エクソンＶＩ）がスプライシングされ、より大きなエクソンＶ（エクソンＶｂ）を生じるより下流の５’側スプライス部位が使用されるときは、３’側末端エクソン（エクソンＶＩ）はスプライシングされない。Ａ２７２０に関しては、我々はまだ、その存在の原因となる特異的多様化機構を決定する段階の途中にある。ＤＯＣ−１／ＧＩＰ９０／１３０ファミリーについての遺伝子のエクソン／イントロン構造を図１に示しており、ＧＩＰファミリーについてのｍＲＮＡ及びタンパク質構造に関するより詳細な特徴の一覧を図２に示している。最後に、おそらく同様の遺伝子多様化機構がＤＯＣ１におけるＣ２７０８の欠失の原因であり、長いエクソン内での異常な選択的スプライシング（これまでに他の遺伝子について述べた）がＤＯＣ１  ｍＲＮＡにおいて認められた４２ｂｐ及び１８ｂｐの欠失を説明すると思われる。
【００８９】
ＧＩＰ９０におけるＲ１６８の存在は、推定上の二部構成（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳシグナル及びＰＫＡリン酸化についてのコンセンサスを生じ、一方Ａ２７２０の存在は、ＧＩＰ９０をコードするＯＲＦ内のフレームシフトを引き起こし、それが第二の核局在化シグナルと未熟終結コドンの出現をもたらす。後者は、ＧＩＰ１３０タンパク質内に存在するＣ末端領域の合計３８６残基を除去する。これらの残基は、いくつかの推定上のＯ−グリコシル化部位を含む予測可能なコイルドコイルを持たないドメインに一致すると思われる（図２）。
【００９０】
ＧＩＰ９０／１３０相互作用の特徴
酵母ツーハイブリッドシステムを使用して、ＧＩＰ９０／１３０の４つの成員が、Ｉ−２０（配列番号６）よりは限られた度合であるが、ＧＰＢＰと相互作用することを見出した。ＧＩＰ９０はＧＰＢＰと最も強い相互作用を示し、個々のＧＩＰ１３０タンパク質は、ＧＩＰ９０よりは低い度合であるが、ＧＰＢＰと同様に相互作用した。これらのデータは、ＧＩＰ９０には存在しない、ＧＩＰ１３０タンパク質のＣ末端残基、及びまたＩ−２０には存在しないＧＩＰ９０のＣ末端残基を、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの相互作用の負の調節に関係付ける。ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ｂ及びＧＩＰ１３０ｃのＮ末端の２４０残基の欠失はＧＰＢＰと相互作用しない分子種を生じ、Ｎ末端領域がＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの相互作用に関与する残基を含むことを示唆する。これらの所見すべてが、このＮ末端領域の大部分（残基８６−２４０）を含み、阻害性Ｃ末端領域を持たないＩ−２０（配列番号６）が、ツーハイブリッドシステムにおいてＧＰＢＰと最も強い相互作用を示すという所見を説明する。付加的なＩ−２０欠失突然変異体の生産及び特異的ツーハイブリッド試験におけるそれらの使用は、ＧＰＢＰ相互作用にとって必須であるＩ−２０の２つの特異的領域の特定ならびに相互作用に関与するが必須ではない他の残基の特定を可能にした（図４）。
【００９１】
ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて自己凝集し、及び相互に凝集する。このことは、ＧＰＢＰ（国際公開公報第００／５０６０７号）と同様に、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは凝集してホモ及びヘテロオリゴマーを形成することを示す。ＧＩＰ９０／１３０完全長ポリペプチドの間で、自己凝集する能力に関して有意差は認められなかった。ＧＩＰ１３０ｂ／ｃからのＮ末端２４０残基の欠失は、より効率的に凝集し、ＧＰＢＰと相互作用しないＤＯＣ１関連タンパク質を生じる。欠失した残基はＩ−２０自己凝集についてのモチーフを含むので、欠失領域は、ＧＩＰ９０／１３０凝集にとって決定的に重要であるが、ＤＯＣ／ＤＯＣ１関連タンパク質凝集にとっては重要でない残基を含むこと、及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＤＯＣ１ポリペプチドは異なる方法で凝集することが考えられる。Ｎ末端２４０残基はまた、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドの相互作用に必須の残基も含むので、これはさらに、ＧＰＢＰ相互作用はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を負に調節するが、ＤＯＣ凝集は調節しないことを示唆する。一貫して、Ｉ−２０欠失突然変異体を用いたツーハイブリッドアッセイは、ＧＰＢＰとＧＩＰ９０／１３０の相互作用にとっての必須配列とＩ−２０凝集にとっての必須配列が広汎に重複することを示し（図４）、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドへのＧＰＢＰの結合はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を妨げるが、ＤＯＣ凝集は妨げないことを強く示唆する。従って、我々は酵母スリーハイブリッドシステムにより、ＧＰＢＰ発現はＩ−２０及びＧＩＰ９０の両方の凝集を減弱すること、及びＩ−２０及びＧＩＰ９０はＧＰＢＰ凝集を効率的に減弱することを認めた。
【００９２】
特異的プライマーとＰＣＲを使用し、その後生じたｃＤＮＡをｐＧＢＴ９及びｐＧＡＤ４２４ベクターにクローニングすることによって欠失突然変異体を得た。リフトコロニーアッセイ手順により、ｐＧＢＴ９をＧＡＬ４結合ドメインベクターとし、ｐＧＡＤ４２４をＧＡＬ４活性化ドメインベクターとして、ＳＦＹ５２６又はＨＦ７ｃサッカロマイセス・セレビシエ菌株においてアッセイを実施した。簡単に述べると、酵母細胞を結合ドメイン及び活性化ドメインベクターの両方の構築物で同時形質転換し、その同時形質転換体をトリプトファン及びロイシン欠損培地で選択した。３０℃で５日間インキュベートした後、コロニーをＸ−Ｇａｌ基質（０．７５ｍｇ／ｍｌ）でβ−ガラクトシダーゼの発現に関して試験した。アッセイで発現された青色の強度が相互作用の相対的強度についての情報を提供した。ＨＦ７ｃ菌株に関してアッセイを実施したとき、リフトコロニーアッセイ手順によって及びヒスチジン、トリプトファン及びロイシン欠損培地での増殖によって相互作用を評価した。酵母スリーハイブリッドシステムに関しては、ツーハイブリッドシステムの通常のＧＡＬ４結合及び活性化ドメイン融合タンパク質とは別に第三のタンパク質の条件的発現を可能にするｐＢＲＩＤＧＥベクターを使用した。この場合、ＧＰＢＰ又はＩ−２０又はＧＩＰ９０の発現は、メチオニン不在下で活性なＭｅｔ２５プロモーターによって駆動された。これらの実験では、形質転換ＳＦＹ５２６細胞をトリプトファン、ロイシン及びメチオニン欠損培地で平板培養し、３０℃で５日間おいた後、コロニーリフトアッセイに供した。菌株ＨＦ７ｃの場合は、上記平板で増殖したコロニーを、さらにヒスチジンを欠損する培地に線条接種した。
【００９３】
ヒト細胞におけるこれらの分子相互作用の存在可能性を確立する試みとして、ＧＩＰ９０とＧＰＢＰの相互作用を、２９３細胞を使用した哺乳類ツーハイブリッドシステムにおいて評価した。ベクターｐＭ及びｐＲＫ５−ＧＡＬ４ＢＤをＧＡＬ４結合ドメインベクターとし、ｐＶＰ１６を活性化ドメインベクターとして、ＣＬＯＮＴＥＣＨ哺乳類ツーハイブリッドキットを使用した。適切な構築物とレポーターベクターを使用してリン酸カルシウム法によって２９３細胞をトランスフェクトし、相互作用を、製造者に指示に従って、ＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）によって判定した。
【００９４】
最後に、酵母ツーハイブリッドシステムを使用して、ｐｏｌ  κ／ｐｏｌ  κ７６とＧＰＢＰ／ＧＰＢＰΔ２６の相互作用を検討し、全く陽性結果を得なかった。しかし、ｐｏｌ  κ又はｐｏｌ  κ７６とＩ−２０の間の相互作用を試みたとき、ｐｏｌ  κ７６に関しては陽性の結果を得たが、ｐｏｌ  κでは陽性結果が得られなかった。Ｉ−２０とｐｏｌ  κ７６の陽性相互作用は、ＧＩＰ９０がＧＰＢＰとｐｏｌ  κ７６の間の生物学的ブリッジであること、及びこれら３つのタンパク質は自己免疫疾病において調節解除される特異的戦略におけるパートナーであることを示唆する。
【００９５】
これらのデータから、我々は次のように結論した：（１）ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドはＤＯＣ／ＤＯＣ１関連ポリペプチドとは異なる様式で凝集する；（２）ＧＰＢＰはＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドと相互作用し、この相互作用はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集を妨げる；（３）ＧＰＢＰはＤＯＣ／ＤＯＣ１関連タンパク質と相互作用せず、それ故ＧＰＢＰはＤＯＣ／ＤＯＣ１関連タンパク質凝集に影響を及ぼさないと予想される；（４）Ｉ−２０はＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドとＧＰＢＰの相互作用及びＧＩＰ９０／１３０凝集に関与する必須のアミノ酸配列を含む；（５）ＧＩＰ１３０種のＣ末端ドメインはそれらのＧＰＢＰとの相互作用に負の影響を及ぼす；及び（６）ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドは、ＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドのＧＰＢＰとの相互作用及びＧＩＰ９０／１３０ポリペプチド凝集の両方を負に調節する、Ｉ−２０には存在しない配列を含む。
【００９６】
ＧＩＰ９０／１３０のさらなる特性指摘
ＧＰＢＰはプロテインキナーゼであるので、精製酵母組換え対応物（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）を使用することにより、インビトロでＧＩＰ９０をリン酸化するＧＰＢＰの能力を評価した。ＧＩＰ９０を、Ｎ末端位置のＦＬＡＧタグ及びＣ末端位置の６ヒスチジン尾部と共にｐＨＩＬ−Ｄ２ベクターにインフレームでクローニングした。ピキア・パストリス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において発現させ、８Ｍ尿素を含有する破砕用緩衝液を使用し、ポリヒスチジン尾部を利用してアフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で精製し、トリス緩衝食塩水に対する透析によって緩衝液を除去した。その精製タンパク質を適切な反応緩衝液中で酵母組換えＧＰＢＰと共にインキュベートし、３０℃で１２時間標識した。リン酸化混合物を、ＦＬＡＧ特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）及びオートラジオグラフィーを用いてウエスタンブロットによって分析した。［γ３２Ｐ］ＡＴＰの存在下での精製ＧＩＰ９０とＧＰＢＰのインキュベーションはＧＰＢＰへの３２Ｐの組込みを生じさせ、それ故、ＧＰＢＰがＧＩＰ９０と相互作用し、それをリン酸化することを確認した。
【００９７】
ＧＩＰ９０／１３０タンパク質の顕著な構造的特徴は、（１）その存在が１個のヌクレオチド置換又は付加によって調節されると思われる（上記参照）、２つの核局在化配列（ＮＬＳ）の存在；及び（２）２つのロイシンジッパーを含む多数の予測可能なコイルドコイルモチーフの存在である。それ故我々は、ＧＩＰ９０／１３０とＤＯＣ１関連タンパク質がレポーター遺伝子の異種プロモーターからの転写を誘導する能力を検定した。これは、ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ、ＧＩＰ１３０ｂ又はＤＯＣ１関連タンパク質のいずれかを高レベル発現ｐＡＳ２−１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内のＧＡＬ４転写因子の結合ドメインに融合し、ＧＡＬ４結合部位を有するプロモーターの制御下にあるＬａｃＺレポーター遺伝子を担うＳＦＹ５２６酵母細胞を形質転換することによって実施した。形質転換体を３０℃で５日間、トリプトファン欠損培地において選択し、コロニーリフトアッセイを実施した。β−ガラクトシダーゼ活性の出現によって評価したとき、ＧＩＰ９０、ＧＩＰ１３０ａ及びＧＩＰ１３０ｂ融合ポリペプチドはＬａｃＺの発現を効率的に誘導したが、ＤＯＣ１関連タンパク質融合ポリペプチドはＬａｃＺの発現を誘導しなかった。
【００９８】
我々はまた、細菌においてＧＩＰ９０を発現させ、対応する組換えタンパク質を使用して、それぞれＧＩＰタンパク質に特異的なポリクローナル及びモノクローナル抗体を得るためにウサギとマウスを免疫した。ＧＩＰ９０を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼｃＤＮＡによりインフレームで、ｐＧＥＸベクターにクローニングした。生じた構築物を使用して、ＤＨ５α細胞を形質転換し、ＩＰＴＧでＧＳＴ−ＧＩＰ９０融合タンパク質の発現を誘導して、グルタチオンアフィニティーカラムでさらに精製した。それぞれポリクローナル及びモノクローナル抗体を得るために、ＧＳＴ−ＧＩＰ９０精製タンパク質を使用してウサギとマウスの両方を免疫した。特異的ＲＴ−ＰＣＲアプローチによって測定したとき、エクソンＶＩは２９３細胞では発現されないと思われるので、これらの抗体を使用して、おそらく内因性ＧＩＰ１３０ｂ又はＧＩＰ１３０ｃである、組換えＧＩＰ１３０と同じ運動性を示す２９３細胞内の天然タンパク質を特定した。モノクローナル抗体の１つ（Ｍａｂ３）はＧＩＰ９０のＮ末端２４０残基内に位置付けられ、Ｍａｂ８はその次の５０９残基内に（すなわち残基２４１−７５０の間に）位置付けられる。
【００９９】
組換えＧＩＰ９０を一過性に発現するＣＯＳ−７細胞についての間接免疫蛍光検査法により、ＧＩＰ９０を核内で発現する細胞、細胞質ゾルでＧＩＰ９０を発現する細胞、及び核と細胞質の両方でＧＩＰ９０を発現する細胞を特定した。これらの細胞が組換えＧＩＰ９０とＧＰＢＰを同時発現したとき、二重間接免疫蛍光検査法は細胞質ゾルにおける２つのタンパク質の発現を明らかにし、また一部の細胞では、核内でもＧＩＰ９０が検出された。核におけるＧＩＰ９０とＧＰＢＰの同時発現は認めなかった。最後に、共焦点顕微鏡とＮＩＨ３Ｔ３又は２９３細胞を使用して、ＧＩＰ９０の核局在化及びＧＩＰ９０／ＧＰＢＰの細胞質ゾル同時局在化を確認した。非トランスフェクション細胞を抗ＧＩＰ抗体及び適切な二次抗体と共にインキュベートしたとき有意の蛍光が検出されなかったので、これらの細胞は検出可能なレベルのＧＩＰ９０／１３０ポリペプチドを発現しない。免疫蛍光検査及び共焦点顕微鏡検査のために、ＧＩＰ９０  ｃＤＮＡをｐＲＫ５哺乳類発現ベクターにクローニングし、この構築物を単独で使用するか、あるいはＤＥＡＥ−デキストラン又はリン酸カルシウム手法を用いてｐＣＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしたＧＰＢＰでコトランスフェクションした。３７℃で２４時間のインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い、メタノール又はメタノール：アセトンで固定して、ＰＢＳ中３％ＢＳＡで遮断し、マウス抗ＧＩＰ９０モノクローナル抗体及びウサギ抗ＧＰＢＰポリクローナル抗体のプールと共にインキュベートした。ＦＩＴＣ複合抗マウスＩｇＧ及びＴＲＩＴＣ複合抗ウサギＩｇＧ抗体をそれぞれ二次抗体として使用した。
【０１００】
最後に、パラフィン包埋ヒト組織に関する免疫組織化学試験を実施し、ＧＩＰタンパク質が、ＧＰＢＰも同時に発現する多くの細胞及び構造に局在することを見出した。免疫組織化学試験は、ＡＢＣペルオキシダーゼ法を使用して、ヒト多組織対照スライド（Ｂｉｏｍｅｄａ，Ｄａｋｏ）で実施した。ＧＩＰタンパク質はヒト組織において広く発現されるが、一部の部位でより豊富に発現される。平滑筋細胞、特に血管の平滑筋細胞では、散在性細胞質パターンで、強い染色が認められる。肺胞上皮細胞の細胞質染色と共に、基底膜部位に関連することを示唆する線形パターンで、肺胞間中隔における強い発現が存在する。腎臓は、細管の上皮細胞、特に遠位尿細管の上皮細胞において、及び糸球体間質細胞及び糸球体の有足突起においても発現を示す。膵臓では、内分泌性ランゲルハンス島の細胞において染色が存在する。副腎では、皮質細胞が髄質細胞よりも高い発現を示す。肝臓では、肝細胞がＧＩＰ９０／１３０の発現を示し、この発現は胆管の上皮細胞におけるよりも高い。中枢神経系の白質は原線維パターンで散在性染色を示し、一部の神経細胞体でも存在が認められる。ＧＩＰ９０／１３０の発現はまた、前立腺、乳房、気管支及び腸の上皮細胞、心筋層の横紋筋細胞、下垂体の分泌細胞、及び精巣の精原細胞及びライディヒ細胞においても明らかである。
【０１０１】
ＧＩＰ９０／１３０の発現は、ランゲルハンス島（Ｉ型糖尿病）、中枢神経系の白質（多発性硬化症）、胆管（原発性胆汁性肝硬変）、副腎の皮質（アジソン病）、肺胞間中隔（グッドパスチャー症候群）、及び精原細胞（男性不妊症）などの自己免疫応答によって標的される組織における染色を伴って、ＧＰＢＰについてこれまでに記述されているもの（国際公開公報第００／５０７６０７号）と極めて類似する。
【０１０２】
上記の証拠は、ＧＩＰ９０／１３０が、転写因子活性を示し、ＧＰＢＰと相互作用してＧＰＢＰによってリン酸化される、腫瘍抑制遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーであることを示唆する。自己免疫疾患及び癌におけるＧＰＢＰの役割を考慮すると、ＧＩＰ９０／１３０はこれらの疾患における可能性ある治療薬又は治療標的である。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、２００２年５月２０日にヒトゲノム国立生物工学情報センター（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＮＣＢＩ）に対するＢＬＡＳＴ検索によって決定されたＧＩＰ９０ゲノムＤＮＡのエクソン−イントロン構造の一覧図である。
【図２】図２は、様々なＧＩＰ９０／１３０  ｍＲＮＡとポリペプチド種の間の相違の表示である。
【図３−１】図３−１は、完全長ＧＩＰ９０／１３０及びＤＯＣ１及びＤＯＣ１関連タンパク質の配列アラインメントである。
【図３−２】図３−２は、完全長ＧＩＰ９０／１３０及びＤＯＣ１及びＤＯＣ１関連タンパク質の配列アラインメントである。
【図３−３】図３−３は、完全長ＧＩＰ９０／１３０及びＤＯＣ１及びＤＯＣ１関連タンパク質の配列アラインメントである。
【図４】図４は、Ｉ−２０のアミノ酸配列である。太字の残基は、ＧＩＰ９０／１３０とＧＰＢＰの間の相互作用にとって必須と特定されたものである；小文字は、ＧＩＰ９０／１３０とＧＰＢＰの間の相互作用に関与するが必須ではないと特定された他の残基である；下線はＧＩＰ９０／１３０凝集に関わる残基である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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