(57)【要約】本発明は、概してβ−アミノ酸置換ペプチドを用いることによるＴ細胞機能的活性のモジュレーション方法およびその方法に有用な薬剤に関するものである。さらに具体的には、本発明は、β−アミノ酸置換ペプチドを用いることによるクラスＩ制限Ｔ細胞活性のモジュレーション方法およびそれに有用な薬剤に関するものである。本発明方法は、特に、最適以下のＴ細胞刺激を特徴とする状態、例えばウイルス感染および抗腫瘍免疫性、並びに異常な、望まれていない、または他の点で不適切なＴ細胞機能でもたらされる状態、例えば限定するわけではないが、移植拒絶または自己免疫状態の処置／予防において有用であり、さらに本発明は、Ｔ細胞機能的活性をモジュレーションし得る薬剤の同定、設計および／または修飾方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド特異的Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、Ｔ細胞をＭＨＣ−ペプチド複合体と接触させることを含む方法であり、ペプチドが少なくとも１個のβアミノ酸置換を含み、βアミノ酸置換により、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される方法。
【請求項２】
対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞がペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に投与することを含む方法であり、βアミノ酸置換により、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される方法。
【請求項３】
Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＭＨＣがＭＨＣ Ｉである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
ペプチドが２〜５０個のアミノ酸残基を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ペプチドが２〜４０個のアミノ酸残基を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが２〜３０個のアミノ酸残基を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ペプチドが２〜２０個のアミノ酸残基を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが２〜１５個のアミノ酸残基を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
応答がＴ細胞活性化である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
活性化がアゴナイズである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドが腫瘍由来ペプチドである、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍由来ペプチドが、ＮＹ−ＥＳＯ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥまたはＣＡＧＥから誘導される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドがウイルス由来ペプチドである、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスが、エプスタイン‐バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドが寛容原性エピトープである、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１６】
寛容原性エピトープが、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）から誘導される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
アミノ酸置換が、ペプチドのＭＨＣアンカー残基の置換である、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
応答が、病理学的Ｔ細胞のアネルギーまたは寛容性の誘導である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
応答がポリクローナルＴ細胞応答の誘導である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のアゴナイズ方法であって、アンタゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、上記状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法。
【請求項２１】
対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のアンタゴナイズ方法であって、アゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法。
【請求項２２】
対象における異常な、望まれていない、または他の点で不適切なペプチド特異的Ｔ細胞応答を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に投与することを含む方法であり、βアミノ酸置換により、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される方法。
【請求項２３】
Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＭＨＣがＭＨＣ Ｉである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ペプチドが２〜５０個のアミノ酸残基を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ペプチドが２〜４０個のアミノ酸残基を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ペプチドが２〜３０個のアミノ酸残基を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ペプチドが２〜２０個のアミノ酸残基を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
ペプチドが２〜１５個のアミノ酸残基を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
応答がＴ細胞活性化である、請求項２２〜２８記載の方法。
【請求項３０】
活性化がアゴナイズである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
状態が腫瘍であり、ペプチドが腫瘍由来ペプチドである、請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍由来ペプチドが、ＮＹ−ＥＳＯ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥまたはＣＡＧＥから誘導される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
状態がウイルス感染であり、ペプチドがウイルス由来ペプチドである、請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３４】
ウイルスが、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＩＶまたはＣＩＶである、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
状態が多発性硬化症であり、ペプチドが寛容原性ペプチドである、請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３６】
寛容原性エピトープがＭＢＰである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
応答が、病理学的Ｔ細胞のアネルギーまたは寛容性の誘導である、請求項２２〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
応答が、ポリクローナルＴ細胞応答の誘導である、請求項２２〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
対象における望まれていないペプチド特異的Ｔ細胞応答の発生を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、アゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法。
【請求項４０】
対象における不十分なペプチド特異的Ｔ細胞応答を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、アンタゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法。
【請求項４１】
状態が、自己免疫状態、移植またはアレルギー状態である、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
状態が新生物状態または感染症である、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
哺乳類におけるある状態、すなわち異常な、望まれていない、または他の点で不適切なＴ細胞応答を特徴とする状態を処置する医薬の製造におけるβアミノ酸置換ペプチドの使用であって、βアミノ酸置換により、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導されることを特徴とする使用。
【請求項４４】
１種またはそれ以上の医薬上許容される担体および／または希釈剤と一緒にβ−アミノ酸置換ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４５】
βアミノ酸置換ペプチド類似体の設計およびスクリーニング方法であって、位置スキャン方法においてβアミノ酸をαアミノ酸と合理的に置き換え、および所望の機能活性および改良された生物学的利用能を呈するペプチドを同定する手段を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してＴ細胞機能活性のモジュレーション方法およびそれに有用な薬剤に関するものである。さらに特定すれば、本発明は、クラスＩ制限Ｔ細胞活性のモジュレーション方法およびそれに有用な薬剤に関するものである。本発明方法は、特に、最適以下のＴ細胞刺激、例えばウイルス感染症および抗腫瘍免疫性でみられる刺激、並びに異常な、望まれていないまたは他の点で不適切なＴ細胞機能、例えば限定するわけではないが、移植拒絶または自己免疫状態を特徴とする状態の処置および／または予防において有用である。さらに本発明は、Ｔ細胞機能活性をモジュレーションし得る薬剤の同定、設計および／または修飾方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において著者により示された出版物のビブリオグラフィーの詳細については、明細書の最後にアルファベット順にまとめて記載している。
【０００３】
本明細書で先行技術についていう場合、それは、先行技術がオーストラリアにおける一般常識の一部を形成することを認容するか、または何らかの形で示唆するものではなく、またそういうものとしてとるべきではない。
【０００４】
クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子は、細胞内ペプチド抗原に選択的に結合し、細胞表面でそれらを細胞傷害性Ｔリンパ球に提示することにより免疫監視において決定的な役割を演じている。
【０００５】
ＭＨＣ分子に結合するペプチド抗原は、それらがＭＨＣクラスＩ分子であろうがまたはクラスII分子であろうが、まず無傷のタンパク質から遊離される。抗原がプロセッシングされる細胞内の区画は、それがＭＨＣクラスＩまたはクラスII分子と出会うか否かを決定する。普通、ＭＨＣクラスＩ分子は、通常細胞質に内在するか、またはそこに送達されたタンパク質からのペプチドと結合し、ＭＨＣクラスII分子は、細胞外環境から酸性小胞中へ内在化されたタンパク質から主として誘導されたペプチドと結合する。ペプチドは、プロテアソームとして知られている複合体により主として細胞の細胞質において、タンパク質加水分解により細胞で連続的に生成される。この結果、ＭＨＣクラスＩ分子に適切な広範囲のペプチド基質がもたらされる。一旦ペプチドが生成されると、それらはＭＨＣ分子と会合するために小胞体（ＥＲ）膜を通り抜けなければならない。
【０００６】
ＭＨＣクラスＩ分子は、単一重鎖と複合体を形成した、β−２ミクログロブリンとして知られている軽鎖により構成される。クラスＩ分子の構造は、細胞傷害性Ｔリンパ球への提示のために短いペプチドを捕獲するのに適合している。ＭＨＣクラスＩ分子は、３つの主要ドメイン、すなわちα１、α２およびα３ドメインにより構成される。α３ドメインの比較的保存された構造は、細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に存在するＣＤ８分子と相互作用する。最も外側のドメイン（α１およびα２）は、床部がβプリーツシートにより構成されたクレフト(裂け目)により分離された２本の長いαらせんを構成する。このクレフトは、ＭＨＣクラスＩ分子の抗原結合ポケットを形成し、構造多型性についての主要部位である（Yuan-Hua Ding、Brian M.Baker、David N.Garboczi、Four A6-TCR/Peptide/HLA-A2 Immunity、第１１巻、４５−５６、１９９９年７月）。このクレフトの多型性が、クレフトの床部および壁の静電気電荷および形状の変化をもたらし、その結果、個々のＭＨＣ対立遺伝子のペプチド結合特性に変化をもたらす。これがＭＨＣクラスＩ分子を内在性ペプチドの独特のレパートリーに結合させ得る。
【０００７】
細胞傷害性Ｔリンパ球は、標的細胞のＭＨＣ分子により提示されたタンパク質抗原のフラグメントをそれらのＴ細胞受容体を通して認識する。Ｔ細胞受容体は、αおよびβ鎖から成るヘテロ二量体である。両鎖とも、可変および定常ドメインを含む。可変ドメインは、ペプチド−ＭＨＣ複合体との接触をする表面で優位を占める相補性決定領域として知られているループを含む。細胞傷害性Ｔリンパ球は、少なくとも２つの異なる公知経路を介して標的細胞を殺す。すなわち、細胞溶解顆粒のエキソサイトーシスを伴う分泌経路、およびＣＴＬ表面のＦａｓリガンドが標的細胞のＦａｓ受容体と相互作用するＦａｓ経路。これら両機構は、独立して作動することにより、標的細胞の破壊に達するアポトーシスを誘導すると思われる。
【０００８】
膜結合ＴＣＲ複合体を通したシグナル送信は、Ｔ細胞レパートリーの発生および細胞免疫応答の開始に必要である。現在のところ、一旦Ｔ細胞受容体がそのリガンドにより結合されると、そのシグナル変換機構についてはほとんど知られていない。しかしながら、この機構が、チロシンキナーゼおよびシグナル変換に有利に働く他の潜在的エフェクター分子の活性化を必然的に伴うと考えられている。それにもかかわらず、シグナル機構の機能を特定すると主張する若干の競合モデルが依然として存在する。これについては、現在のところ、Ｔ細胞受容体−ペプチドＭＨＣ複合体相互作用の特性が結合の結果を決定するという強い意見がある。
【０００９】
細胞傷害性Ｔリンパ球活性化により、免疫系の非常に複雑な決定的成分が特定される。通常、個体の細胞傷害性リンパ球は、非自己ペプチド（例えばウイルス由来のペプチド）により活性化されるだけで、それにより、免疫応答が誘発される。上記ペプチドの同定および適切な送達は、抗ウイルスワクチンおよび抗腫瘍ワクチンを改良するためのワクチン設計の基礎をなすものである。ペプチドに基くワクチン成分の安定性を高め得ることは、上記ワクチンのペプチドおよびタンパク質に基く成分がインビボでは急速に分解されるため、非常に望ましいことである。
【００１０】
ある種の異常な状況では、個体の細胞傷害性Ｔリンパ球が自己抗原により活性化されるため、免疫系の正常な機能に欠陥が生じる。これによって、自己免疫と呼ばれる病的状態の発現が誘導される。明らかに、異常なＴ細胞機能の時として非常に深刻な場合もある結果、例えば自己免疫状態の発現を回避するためのＴ細胞機能モジュレーション手段の開発が要望されている。
【００１１】
最近では、βアミノ酸は、新規生物活性ペプチドの設計への可能性をもつ新規ペプチドミメティック手段として認められている。βアミノ酸は、それらがアミノ末端およびカルボキシル末端を含むという点でαアミノ酸と類似している。しかしながら、２個の炭素原子が、これらの官能末端を分離している。βアミノ酸は、アミノ酸鎖への有効な組込みが達成されることにより、例えば生物学的活性を呈するペプチドミメティクスを作製させ得ることが立証されている。現在までのところ、ペプチドミメティクスの状況におけるβアミノ酸の使用に向けた多くの研究が為されてきた。しかしながら、ＭＨＣ提示の状況で実施された非常に限定的な試験が、βアミノ酸ペプチド類似体の中にはＭＨＣクレフトに有効に結合し得るものもあることを立証したに過ぎない。さらに、これらの試験は、ペプチド構造の上記モジュレーションがＴ細胞機能に強い影響を及ぼすわけではないことを示唆している。
【００１２】
ワクチンとしてペプチドを使用した場合に困惑させられる結果の一つは、ワクチン接種後に急速な分解が起こることである。これは、肝臓および他の臓器における代謝から、そしてタンパク質加水分解により生じる。さらに、ペプチドワクチンのタンパク質加水分解は、クリプティックエピトープ、すなわち無駄またはなお悪い、まだ望まれていない免疫応答を誘発する目的免疫原のフラグメントの生成を誘導し得る。本発明に至る研究過程において、驚くべきことに、ＭＨＣクラスＩペプチドの状況においてαアミノ酸をβアミノ酸と置き換えることにより、事実、Ｔ細胞機能の高度に顕著なモジュレーションが誘導され得ることが決定された。特に、細胞傷害性Ｔ細胞応答のアゴニズムおよびアンタゴニズムが両方とも達成され得る。さらになお、細胞傷害性Ｔ細胞応答を分離してアゴナイズまたはアンタゴナイズするペプチドが、非修飾ペプチドと併用投与されると、非修飾ペプチドに関して変換応答（すなわち、それぞれアンタゴニズムまたはアゴニズム）の全般的アップレギュレーションをもたらすという完全に予想外の決定がみられた。これらの機能的および構造的関係を測定することにより、Ｔ細胞応答のモジュレーションを目的とする分子および方法の開発およびさらに特定すれば、異常な、望まれていないまたは他の点で不適切なＴ細胞機能を特徴とする状態の処置が容易になる。
【発明の開示】
【００１３】
特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈が他の解釈を要求しない場合、「含む」の語およびその語尾変化したもの、例えば「含み」および「含んでいる」は、明確に示された一完全体または一段階または完全体または段階の群の包含を意味するが、他の完全体または段階または完全体または段階の群を除外するわけではないものと理解すべきである。
【００１４】
本明細書で使用されている、「から誘導された」の語は、一特定完全体または完全体群が、特定された種に由来するが、必ずしも特定された供給源から直接得られるわけではないことを示すものとする。
【００１５】
本明細書は、後記ビブリオグラフィーの後に示されているプログラムＰａｔｅｎｔＩｎバージョン３.１を用いて作製されたアミノ酸配列情報を含む。各アミノ酸配列は、配列リストにおいて番号表示＜２０１＞後に続く配列識別名（例、＜２０１＞１、＜２０１＞２など）により識別されている。配列の長さ、タイプ（タンパク質など）および各配列についての供給生物は、それぞれ番号表示欄＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞で提供された情報により示されている。明細書で示されたアミノ酸配列は、配列番号表示後に続く配列識別名（例、配列番号１、配列番号２など）により識別される。本明細書で示された配列識別名は、配列リストにおける番号表示欄＜４００＞、その後に続く配列識別名（例、＜４００＞１、＜４００＞２など）で提供された情報と対応している。すなわち、明細書で詳述されている配列番号１は、配列リストで＜４００＞１として示された配列と対応している。
【００１６】
本発明の一局面は、ペプチド特異的Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、Ｔ細胞をＭＨＣペプチド複合体と接触させることを含む方法であり、ペプチドが少なくとも１個のβアミノ酸置換を含み、βアミノ酸置換が、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導する方法に関するものである。
【００１７】
本発明の別の局面は、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＭＨＣ Ｉ−ペプチド複合体と接触させることを含む方法であり、ペプチドが少なくとも１個のβアミノ酸置換を含み、βアミノ酸置換が、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導する方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらに別の局面は、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化のモジュレーション方法であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＭＨＣ Ｉ−ペプチド複合体と接触させることを含む方法であり、ペプチドが少なくとも１個のβアミノ酸置換を含み、βアミノ酸置換が、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に対してＣＤ８＋Ｔ細胞活性化のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導する方法を提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の局面は、対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に投与することを含む方法であり、βアミノ酸置換が、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導する方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらに別の局面は、対象におけるペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ＭＨＣ Ｉ−ペプチド複合体の状況において細胞傷害性Ｔ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に投与することを含む方法であり、βアミノ酸置換が、ペプチドの非置換形態により誘導され得る細胞傷害性Ｔ細胞応答に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導する方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、ワクチン成分のタンパク質加水分解により生成されるクリプティックエピトープに向かう望まれていない免疫応答を阻止する方法であって、少なくとも１個のβアミノ酸を前駆体ペプチドへ置換することにより、上記タンパク質加水分解を阻止し、クリプティックエピトープの生成およびそれに続くＭＨＣ−ペプチド複合体の状況におけるＴ細胞へのそれらの提示を阻止することによる方法に関するものである。
【００２２】
本発明のさらに別の局面は、対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のアゴナイズ方法であって、アンタゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法を提供する。
【００２３】
さらに別の局面において、対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のアンタゴナイズ方法であって、アゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法が提供される。
【００２４】
本発明はまた、対象における異常な、望まれていない、または他の点で不適切なペプチド特異的Ｔ細胞応答を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に投与することを含む方法であり、βアミノ酸置換が、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導する方法に関するものである。
【００２５】
本発明の別の局面は、対象における望まれていないペプチド特異的Ｔ細胞応答の発生を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、アゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
さらに別の局面では、対象における不適切なペプチド特異的Ｔ細胞応答を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、アンタゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法が提供される。
【００２７】
さらに別の局面において、本発明は、哺乳類におけるある状態、すなわち異常な、望まれていない、または他の点で不適切なＴ細胞応答を特徴とする状態を処置する医薬の製造における前記βアミノ酸置換ペプチドの使用であって、βアミノ酸置換が、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導することを特徴とする使用に関するものである。
【００２８】
さらに別の局面において、本発明は、１種またはそれ以上の医薬上許容される担体および／または希釈剤と一緒に前記モジュレーション成分を含む医薬組成物に関するものである。上記成分は有効成分と称される。
【００２９】
さらに別の局面では、βアミノ酸置換ペプチド類似体の設計およびスクリーニング方法であって、位置スキャン方法においてβアミノ酸をαアミノ酸と合理的に置き換え、所望の機能活性および改良された生物学的利用能を呈するペプチドを同定する手段を提供する方法が開発された。本発明方法は、興味の対象であるペプチドを含む１個またはそれ以上のαアミノ酸の対応するβアミノ酸による逐次置換によるペプチド類似体集団の生成およびそこから誘導された類似体の機能的分析に基いている。従って、本発明は、このスクリーニング方法およびそこから誘導されるペプチドをも包含するものと理解すべきである。
【００３０】
本明細書全体を通して使用されているアミノ酸構造並びに１および３文字省略形を表１に記載する。
表１
【化１】
2005537325.tif 000002
【表１】
2005537325.tif 000003
【００３１】
図面の簡単な説明
図１は、Ｈ２−Ｋｂ特異的モノクローナル抗体Ｙ−３によるＲＭＡ−Ｓ細胞の染色をグラフで表したものである。データは、蛍光強度に対する細胞数として示されている。
【００３２】
図２は、ＣＤ８分子に特異的なモノクローナル抗ＣＤ８抗体によるＣＴＬクローンの染色をグラフで表したものである。データは、蛍光強度に対する細胞数として示されている。
【００３３】
図３は、Ｈ２−Ｋｂ特異的モノクローナル抗体Ｙ−３によるＩ−３細胞の染色をグラフで表したものである。データは、蛍光強度に対する細胞数として示されている。
【００３４】
図４は、増加量の外因性ＩＬ−２での３Ｈ−チミジン取込により測定された細胞増殖をグラフで表したものである。データは、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−２依存性を示す。
【００３５】
図５は、βＣ３−アミノ酸置換および親ペプチドによるＲＭＡ−Ｓに対するＫｂ安定化をグラフで表したものである。ペプチドのＮ−末端領域での置換により（ａ）Ｋｂ安定化は妨げられ、残りの中間およびＣ−末端における置換により（ｂ）均等の安定化またはその増加がもたらされた。示されたペプチドの系列希釈物を、冷却誘導ＲＭＡ−Ｓ細胞（２６℃）へパルスし、次いで３７℃でパルスした。表面でのＫｂの安定化を、モノクローナル抗体Ｙ−３を用いて検出し、フローサイトメトリーにより分析した。データは、ペプチド濃度に対する最大ＳＩＩＮＦＥＫＬ応答のパーセンテージとして示されている（対数目盛）。
【００３６】
図６は、抗体２５−Ｄ１.１６を用いた、βＣ３−アミノ酸置換および親ペプチドによるＲＭＡ−Ｓに対するＫｂ安定化をグラフで表したものである。β−アミノ酸の置換により、Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異抗体２５−Ｄ１.１６について親和力減少がもたらされた。データは、ペプチド濃度に対する最大野生型応答のパーセンテージとして示されている（対数目盛）。
【００３７】
図７は、各ＣＴＬクローンに対する親ＳＩＩＮＦＥＫＬの滴定のグラフを示す。予想通り、ＨＳＶ２.３対照は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを認識しなかった。データは、ペプチド濃度に対する放射能計数として示されている。
【００３８】
図８は、ＣＴＬクローンによる親ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびβＣ３−アミノ酸類似体の認識力のグラフを示す。Ｐ２での置換により、ＧＡ４.２以外の全クローンによる認識力は顕著に失われた。Ｐ６では、ベンジル側鎖保護基を含むβＣ３−Ｇｌｕは、完全にＣＴＬ認識力を破壊した。ペプチドをＩ−３細胞へパルスし、次いでＣＴＬと共培養した。次いで、上清を除去し、ＩＬ−２バイオアッセイに加えた。データは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ応答のパーセンテージとして示されている（対照クローン、ＨＳＶ２.３の場合、データは、ＳＳＩＥＦＡＲＬ応答のパーセンテージとして示されている）。
【００３９】
図９は、ＣＴＬクローンＧＡ４.２による親ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびβＣ３−アミノ酸類似体の認識力のグラフを示す。
【００４０】
図１０は、ＣＴＬクローン（ａ）ＧＡ４.２および（ｂ）Ｂ３.１を用いたアンタゴニスト検定のグラフを示す。β−類似体を、最適以下の濃度の親ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと併用投与する（断続線）。次いで、ＣＴＬと共培養したパルスＩ−３細胞の上清を、ＩＬ−２バイオアッセイで使用する。Ｐ１位での置換により、Ｂ３.１の強いアンタゴニズムおよびＧＡ４.２の弱いアンタゴニズムが誘発された。Ｐ２での置換により、両クローンで生じる超アゴニスト効果がもたらされた。両類似体は、非常に低濃度で応答を伝達したことから、ＴＣＲを通したシグナリングの改変には非常に低レベルの類似体ペプチドで充分であることが示された。
【００４１】
図１１は、マウス血清で２時間後に採取されたペプチドのパーセンテージを示す血清安定度検定のグラフを示す。Ｐ５およびＰ８が修飾されたペプチドは、最も安定した分子を生産した。
【００４２】
図１２は、波長２１４ｎｍでのＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターされた２時間後の親ＳＩＩＮＦＥＫＬ分解のグラフを示す。クロマトグラムは、親ペプチドのフラグメント化を示す。ＭＳ結果は、酵素分解についての開裂部位を示している。開裂は、＊の印を付した結合で行なわれる：Ｓ＊Ｉ＊Ｉ＊ＮＦ＊Ｅ＊ＫＬ。
【００４３】
図１３は、０、２および１２時間の時点におけるＰ５でのβ−Ｐｈｅを含むペプチドの分解のグラフを示す。ｔ＝０では、完全ペプチドが見られる。ｔ＝２時間では、完全ペプチドは減少し、他のフラグメントが見られる。ｔ＝１２では、完全ペプチドは消失し、フラグメントのみ残された。フラグメントのＭＳは、開裂が、親ペプチドの場合のようにはＰ５アミノ酸の後には起こらなかったことを示す。＊は、遮断された開裂部位：Ｓ＊Ｉ＊Ｉ＊ＮＦ＊Ｅ＊ＫＬを示す。
【００４４】
図１４は、０および２時間の時点におけるＰ３でのβ−Ｉｌｅを含むペプチドの分解のグラフを示す。ｔ＝０では、完全ペプチドが見られる。ｔ＝２時間では、完全ペプチドの大部分は消失し、３つの主要フラグメントを伴う。フラグメントのＭＳは、親ペプチドの開裂部位である、Ｐ２−Ｐ３結合に開裂が無いことを示した。＊は、遮断された開裂部位：Ｓ＊Ｉ＊Ｉ＊ＮＦ＊Ｅ＊ＫＬを示す。
【００４５】
図１５は、ＮＹ−ＥＳＯ１５７−１６５および１５７−１６７（１から採取）でのワクチン接種後における天然およびクリプティックＮＹ−ＥＳＯ決定基の提示の図を示す。
【００４６】
図１６において、Ａ）ＨＬＡ Ａ０２０１／ＥＳＯ１５７−１６５複合体が立方晶形態で結晶化している図を示し、Ｂ）ＥＳＯ１５７−１６５ペプチドの２.１オングストローム電子密度省略マップを示し、Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２抗原結合クレフトに結合したＥＳＯ１５７−１６５のカッタウェイ図を示し、露出されたＭｅｔ−４、Ｔｒｐ−５、Ｔｈｒ−７、Ｇｌｎ−８を強調している。
【００４７】
図１７は、インビボ初回免疫に従って実施されたクロム放出検定法を示す。
【００４８】
図１８は、ＣＴＬ−ラインの細胞内サイトカイン染色のグラフを示す。
【００４９】
図１９は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド立体配座の図を示す。
【００５０】
図２０は、ＳＩＩＮ−βＦ−ＥＫＬペプチド立体配座の図を示す。
【００５１】
図２１は、ＳＩＩＮＦＥＫ−βＬペプチド立体配座の図を示す。
【００５２】
発明の詳細な記載
本発明は、一つには、ＭＨＣ提示ペプチドのβ−アミノ酸置換により、非修飾ペプチドに関して誘導されるＴ細胞機能に対してＴ細胞機能のモジュレーションが誘導され得るという驚くべき測定結果に基いている。さらに、なお驚くべきことには、ＭＨＣ提示の状況において、それが相互作用するＴ細胞の機能を直接モジュレーションすることに加えて、β−アミノ酸置換ＭＨＣ提示ペプチドはまた、非修飾ペプチドと相互作用したＴ細胞集団の機能をモジュレーションすべく作用し得ることが測定された。従って、これらの測定結果により、Ｔ細胞応答のモジュレーション、さらに特定すれば、異常な、望まれていない、または他の点で不適切なＴ細胞応答を特徴とする状態の処置を目的とする分子および方法の開発が容易となる。
【００５３】
従って、本発明の一局面は、ペプチド特異的Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、ＭＨＣペプチド複合体をＴ細胞と接触させることを含み、ペプチドが少なくとも１個のβ−アミノ酸置換を含み、β−アミノ酸置換が、上記ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導する方法に関するものである。
【００５４】
上記で詳述した通り、本発明は、ペプチドに対するＴ細胞応答の定性的および／または定量的性質のモジュレーション方法であって、ペプチドを含むαアミノ酸の１個またはそれ以上を対応するβアミノ酸により置換することに基いた方法の開発に関するものである。この点については、本発明を、ＭＨＣ Ｉ提示ペプチドに対する細胞傷害性Ｔ細胞応答のモジュレーションに関して典型例により説明したが、これは本発明の範囲に対する限定を意図したわけではないものと理解すべきである。本明細書で詳述されている教義および原理は、あらゆるタイプのペプチド制限Ｔ細胞応答、例えばＭＨＣII制限ＣＤ４（Ｔヘルパー）細胞応答またはＭＨＣＩ制限ＣＤ８（Ｔ細胞傷害性）細胞応答に適用され得る。
【００５５】
従って、「Ｔ細胞」については、Ｔ細胞受容体を含むあらゆる細胞を包含するものと理解すべきである。この点について、Ｔ細胞受容体は、α、β、γまたはδ鎖のいずれか１個またはそれ以上を含み得る。本発明は、Ｔ細胞の特定機能またはサブクラスに限定されるわけではないが、好ましい実施態様において、主たるＴ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。
【００５６】
「ＭＨＣ」については、あらゆるＭＨＣ分子、例えばＭＨＣクラスＩ、IIおよび／またはＩＢ分子、並びにこれらの分子の全形態を包含するものと理解すべきである。本発明をいずれか一つの理論または作用方式に限定するわけではないが、主要組織適合遺伝子複合体は、ＭＨＣ分子をコード化する遺伝子のクラスター（例えば、ヒト染色体６またはマウス染色体１７における）である。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）に対して細胞質ゾルで生成されたペプチドを提示するタンパク質であり、ＭＨＣクラスII分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）に対して細胞小胞で分解されたペプチドを提示するタンパク質である。ＭＨＣは、幾つかの異なる遺伝子座の多数の対立遺伝子を発現する、ヒトゲノムにおける最も多型的な遺伝子クラスターの一つである。ＭＨＣは、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスIIおよびＭＨＣクラスＩＢ分子を含む。ＭＨＣクラスＩおよびクラスIIとは異なり、ＭＨＣクラスＩＢ分子は、限られたセットの抗原を提示すると考えられており、クラスＩおよびクラスII遺伝子が呈するのと同程度の多型性を呈することはない。
【００５７】
特有のＭＨＣ遺伝子対立遺伝子の発現から生じるＭＨＣ分子の様々な多型性形態を包含することに加えて、「ＭＨＣ」についてはまた、ＭＨＣの他の突然変異体および多型性形態、例えばＭＨＣ ｍＲＮＡの選択的スプライシングから生じるイソ型を全て包含するものと理解すべきである。さらに、本明細書では、ＭＨＣ分子の機能性誘導体、相同体、類似体、均等内容物およびミメティクスも全て包含されるものと理解すべきである。例えば、所定のワクチン戦略が外生的に導入された細胞集団（例えばインビトロで抗原と共にローディングされ、患者に再導入された細胞集団）によるペプチド提示を必然的に含み得るが、またその集団に、そのＭＨＣ分子レベルでの分子または化学的修飾を加えることにより、提示の改善が簡易化され得るかぎり、上記ＭＨＣ分子も本発明に包含される。別の例では、主たるＭＨＣ分子は、それが個体または処置されている個体とは異なる種から誘導されるという点でＭＨＣ相同体であり得る。この点については、Ｔ細胞活性化が、一般的にＴＣＲによる両ペプチド−ＭＨＣ認識の状況および宿主ＭＨＣ提示の状況で厳しく制限されるとみなされるが、変則的状態、例えば同種間または異種間移植に関連して生じる提示形態が同定されている。これらの状態では、免疫抑制の不存在下で生じる組織拒絶が、ドナーＭＨＣ ＩおよびIIの状況における受容体Ｔ細胞に対するドナーペプチドの提示に少なくとも部分的に起因し得ると考えられている。この現象についての基礎は完全に解明されてはいないが、ある程度の「漏出」が、宿主ＭＨＣ制限の状況で生じると思われるため、移植技術の点からは非常に関連性が高い。さらに、本発明はまた、ＭＨＣ分子の機能的特徴の少なくとも一つを呈する他の分子も全て包含するものと理解すべきである。上記分子には、例えば、ＭＨＣ機能的活性を呈する内生的発現分子または体内に導入され（例えば細胞のドナー集団を介して）、ＭＨＣ機能の少なくとも一つ、例えばＴ細胞へのペプチド提示能力を模倣する分子が含まれる。
【００５８】
好ましくは、主たるＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり、ＭＨＣ分子はＭＨＣ Ｉ分子である。
【００５９】
従って、本発明は、さらに特定すれば、ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＭＨＣ Ｉペプチド複合体と接触させることを含み、ペプチドが少なくとも一つのβ−アミノ酸置換を含み、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対して、β−アミノ酸置換によりＣＤ８＋Ｔ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される方法を提供する。
【００６０】
「ペプチド」については、任意の数の連続および非連続アミノ酸を含み、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣ Ｉ分子により提示され得る分子を包含するものと理解すべきである。「提示された」とは、ペプチドがＭＨＣ分子および、より特定すればＭＨＣクレフトと相互作用し得ることを意味する。
【００６１】
ＭＨＣ分子は、そのクレフトをペプチドが占めており、本明細書では「ＭＨＣ−ペプチド複合体」と称する。この点について、そして後記の通り、ＭＨＣ−ペプチド相互作用は、適切な手段により、例えば細胞内プロセッシングおよびＭＨＣ分子との会合の結果として、または細胞表面発現ＭＨＣ分子へのペプチドの細胞外送達を介して行われ得る。好ましくは、ペプチドは、２〜５０アミノ酸、さらに好ましくは２〜４０アミノ酸、さらに好ましくは２〜３０アミノ酸、さらに好ましくは２〜２０アミノ酸そして最も好ましくは２〜１５アミノ酸の連続配列を含む。
【００６２】
この点に関して、「ペプチド特異的」Ｔ細胞応答については、ペプチド−ＭＨＣ複合体とのＴ細胞受容体相互作用の結果として誘導されるＴ細胞応答として理解すべきである。これは、例えば、Ｔ細胞活性化をＭＨＣ制限的に行わせるための必要条件を効果的に回避することによりＴ細胞刺激を達成する、ある種のマイトジェンまたは超抗原の作用の結果として生じ得る広範囲なポリクローナルＴ細胞刺激とは当然対照的である。しかしながら、本発明の「ペプチド特異的」Ｔ細胞応答は、ペプチドのＭＨＣ提示から生じる応答を包含すると理解すべきである。Ｔ細胞受容体レパートリーにより提供される免疫学的特異性故に、ペプチドは、所定のペプチドは、非常に少数のＴ細胞クローンにより特異的に認識される（適切なＭＨＣ提示状況において）と思われる。しかしながら、ある程度の交差反応性が発生するため、かかるペプチドの提示に応じて追加のＴ細胞クローンにも刺激を加え得る可能性がある。上記Ｔ細胞応答は（すなわち、それが強い、弱い、高特異的なまたは交差反応性応答のいずれであろうと）いかなる場合も、それがＴ細胞受容体へのペプチド−ＭＨＣ複合体の提示から生じたことから本発明状況における「ペプチド特異的」Ｔ細胞応答であると理解すべきである。事実、本発明のある種の実施態様では、本発明教示に従ってペプチドを修飾することにより、交差反応性から生じる、所定のＴ細胞クローンの弱い応答を強めることは充分目的となり得、その場合、興味の対象であるペプチドに応じて拡大され得るＴ細胞クローンの数を効果的に増加させるため、対象の全般的免疫応答が改善され得る。
【００６３】
Ｔ細胞「応答」については、Ｔ細部が遂行し得る機能のいずれか一つまたはそれ以上をさすものとして理解すべきである。例えば、主たる応答は、増殖、分化（例、Ｔ細胞からの記憶またはエフェクターＴ細胞の誘導）または他の細胞活性形態、例えばサイトカインの生産、細胞表面分子のアップレギュレーション、細胞溶解性顆粒の放出（例えば充分に活性化された細胞傷害性Ｔ細胞により起こり得る）または細胞内シグナリング事象であり得る。本発明は、この応答を「モジュレーションする」ことに関するものであり、それは、ペプチドの非修飾形態に応じて生じる応答の性質に対して、β−アミノ酸置換ペプチドに対する応答が、完全または部分的にアップレギュレーションされる（例、増強される、または高められる、本明細書ではＴ細胞応答の「アゴニズム」と称す）かまたはダウンレギュレーションされる（例、阻害または遅延される、本明細書ではＴ細胞応答の「アンタゴニズム」と称す）ことを意味する。従って、「アゴニズム」および「アンタゴニズム」については、２分子（例えばＴ細胞受容体およびペプチド−ＭＨＣ複合体）間で生じ得る物理的アゴニズムまたはアンタゴニズムを指すのではなく、究極的に発せられるＴ細胞応答の性質についていうものとする。しかしながら、これは、誘導される応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが、事実上、β−アミノ酸置換の結果としてのＴ細胞受容体およびＭＨＣ−ペプチド複合体間における物理的アゴニズムまたはアンタゴニズムの誘発または排除によるものではないと言っているわけではない。好ましくは、Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞活性化である。
【００６４】
従って、本発明は、好ましくはペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化のモジュレーション方法であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＭＨＣ Ｉ−ペプチド複合体と接触させることを含み、ペプチドが少なくとも一つのβ−アミノ酸置換を含み、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に対して、β−アミノ酸置換によりＣＤ８＋Ｔ細胞活性化のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される方法を提供する。
【００６５】
「誘導する」については、対象のモジュレーションの直接的または間接的誘導をさすものと理解すべきである。本明細書記載のβ−アミノ酸置換は、一般的に、ＭＨＣ−ペプチド複合体とのＴ細胞受容体相互作用から生じるシグナリングの性質および程度を直接モジュレーションすると考えられるが、環境によっては、対象のモジュレーションが間接的に行われ得る場合もあると理解すべきである。例えば、β−アミノ酸置換のある種の形態は、ＭＨＣクレフトにおけるペプチドの安定性のモジュレーションを誘発し得ることにより、Ｔ細胞応答におけるその役割の状況において、このペプチドを提示している細胞の機能的活性の一つまたはそれ以上に強い衝撃を与え得る。
【００６６】
ペプチドは、いかなる供給源からでも誘導され得る。例えば、それは、天然に存するか、組換え技法により製造されるかまたは合成的に再生されたポリペプチドまたはタンパク質から誘導され得、それらは細胞内での取込みまたは発現時、プロセッシングにかけられ、ＭＨＣクラスＩまたはクラスIIの状況においてそこから誘導されたペプチド成分が提示される。別法として、ペプチドは、大きな分子、例えばタンパク質またはポリペプチドから誘導されるのではなく、第一にペプチド形態をとるものであり得る。
【００６７】
ペプチドの例には、限定されるわけではないが、微生物（例えば細菌、ウイルス、真菌または寄生虫）のタンパク質成分から誘導されたペプチド、合成的に生成されるかまたは天然に存するタンパク質毒素、環境的タンパク質抗原または自己分子（例えば、自己免疫応答が指向するもの）がある。対象ペプチドは、免疫原性または非免疫原性であり得るものと理解すべきである。非免疫原性ペプチドに関して、本発明の目的の一つは、そのペプチドに向けられたＴＣＲを発現するＴ細胞の応答をアゴナイズすることにより免疫原性を有効に改良する手段を提供することであり、Ｔ細胞では、通常、そのペプチドの天然に存する形態に応答した免疫学的に顕著な活性化は行なわれない。
【００６８】
本発明方法に従って使用されるペプチドは、あらゆる適切な形態をとり得る。例えば、ペプチドは、様々な程度にグリコシル化または非グリコシル化、リン酸化または脱リン酸化され得、および／またはタンパク質と融合、連結、結合または他の形で会合した一連の他のタンパク質性または非タンパク質性分子、例えばアミノ酸、脂質、炭水化物または他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み得る。
【００６９】
本発明を何にせよ限定するわけではないが、天然に存するタンパク質（およびそこから誘導されるペプチド）は、アミノ酸が一般的にとる天然形態である、α−アミノ酸により構成される。本発明は、ペプチド配列を含むα−アミノ酸の１個またはそれ以上のβ−アミノ酸、好ましくは対応するβ−アミノ酸による置換に基いている。
【００７０】
好ましくは、ペプチドは、以下のものから誘導される：
（ｉ）腫瘍標的、例えばＮＹ−ＥＳＯ、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥまたはＣＡＧＥファミリー要員
（ii）ウイルス標的、例えばＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＩＶまたはＨＣＶ
（iii）寛容原性エピトープ、例えば多発性硬化症における抗原であるＭＢＰ。
【００７１】
本明細書で使用されている「アミノ酸」の語は、α−アミノ酸またはβ−アミノ酸をいい、Ｌ−またはＤ−異性体であり得る。アミノ酸は、天然に存する側鎖（上記表１参照）または非天然側鎖（下記表２参照）を有し得る。アミノ酸はまた、α位またはβ位が、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＲ１、−（ＣＨ２）ｎＲ２、−ＰＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｎヘテロシクリルまたは−（ＣＨ２）ｎアリールから選択される基［式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキルまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり、Ｒ２は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキル、−Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキルまたは−ＮＨＣ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２であり、ｎは０または１〜１０の整数であり、各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクリル基は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキル、−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ３アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＣＯＮＨ２または−ＣＯＮＨＣ１−Ｃ３アルキルから選択される１個またはそれ以上の基により置換され得る］によりさらに置換され得る。
【００７２】
本明細書で使用されている「α−アミノ酸」の語は、アミノ基およびカルボキシル基を有する化合物をいい、アミノ基およびカルボキシル基は、単一炭素原子、α−炭素原子により分離されている。α−アミノ酸は、天然または非天然Ｌ−アミノ酸およびそれらのＤ−異性体およびその誘導体、例えば官能基が適切な保護基により保護されている塩または誘導体を包含する。α−アミノ酸はまた、α位が−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＲ１、−（ＣＨ２）ｎＲ２、−ＰＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｎヘテロシクリルまたは−（ＣＨ２）ｎアリールから選択される基［式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキルまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり、Ｒ２は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキル、−Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキルまたは−ＮＨＣ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２であり、ｎは０または１〜１０の整数であり、各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクリル基は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキル、−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ３アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＣＯＮＨ２または−ＣＯＮＨＣ１−Ｃ３アルキルから選択される１個またはそれ以上の基により置換され得る］によりさらに置換され得る。
【００７３】
本明細書で使用されている「β−アミノ酸」の語は、カルボキシル末端およびアミノ末端を分離する２個の炭素原子があるという点でα−アミノ酸とは異なるアミノ酸をいう。それ自体特異的側鎖をもつβ−アミノ酸は、α（Ｃ２）炭素またはβ（Ｃ３）炭素のいずれかでのＲまたはＳ鏡像体として存在し得るため、所定の側鎖については合計４異性体の存在が可能となる。側鎖は、天然α−アミノ酸の場合と同一であり得るか（上記表１参照）、または非天然アミノ酸の側鎖であり得る（下記表２参照）。
【化２】
2005537325.tif 000004
【００７４】
さらに、β−アミノ酸は、Ｃ２およびＣ３炭素原子においてモノ、ジ、トリまたはテトラ置換を有し得る。モノ置換は、Ｃ２またはＣ３炭素原子におけるものであり得る。ジ置換はＣ２炭素原子のところに２置換基、Ｃ３炭素原子のところに２置換基またはＣ２およびＣ３炭素原子の各々に１置換基を含む。トリ置換は、Ｃ２炭素原子のところに２置換基およびＣ３炭素原子のところに１置換基またはＣ３炭素原子のところに２置換基およびＣ２炭素原子のところに１置換基を含む。テトラ置換は、Ｃ２炭素原子のところに２置換基およびＣ３炭素原子のところに２置換基を含む。適切な置換基には、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、−（ＣＨ２）ｎＣＯＲ１、−（ＣＨ２）ｎＲ２、−ＰＯ３Ｈ、−（ＣＨ２）ｎヘテロシクリルまたは−（ＣＨ２）ｎアリール［式中、Ｒ１は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキルまたは−Ｃ１−Ｃ３アルキルであり、Ｒ２は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキル、−Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、−Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキルまたは−ＮＨＣ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２であり、各アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールまたはヘテロシクリル基は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１−Ｃ３アルキル、−ＯＣ１−Ｃ３アルキル、−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ３アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−Ｃ３アルキル、−ＣＯＮＨ２または−ＣＯＮＨＣ１−Ｃ３アルキルから選択される１個またはそれ以上の基により置換され得る］がある。
【００７５】
他の適切なβ−アミノ酸には、立体配座的に束縛されたβ−アミノ酸がある。環状β−アミノ酸は、立体配座的に束縛されており、一般的に酵素分解をうけにくい。適切な環状β−アミノ酸には、限定されるわけではないが、シスおよびトランス２−アミノ−Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルキル−１−カルボン酸、２−アミノ−Ｃ３−Ｃ１０−シクロアルケニル−１−カルボン酸、２−アミノ−ノルボラン−１−カルボン酸があり、そして適切な立体配座的に束縛されたβ−アミノ酸のそれらの不飽和カルボン酸の例には、２−アミノシクロプロピルカルボン酸、２−アミノシクロブチルおよびシクロブテニルカルボン酸、２−アミノシクロペンチルおよびシクロペンテニルカルボン酸、２−アミノシクロヘキシルおよびシクロヘキセニルカルボン酸および２−アミノ−ノルボルナンカルボン酸およびトロパンアミノ酸およびそれらの誘導体があり、それらの幾つかを下記に示す。
【化３】
2005537325.tif 000005
【００７６】
β−アミノ酸の適切な誘導体は塩類を包含し、適切な保護基により保護された官能基を有し得る。
【００７７】
本明細書で使用されている「非天然アミノ酸」の語は、天然Ｌ−α−アミノ酸からは見出されない側鎖を有するアミノ酸をいう。非天然アミノ酸および誘導体の例は、限定はされないが、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸、６−アミノへキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用を含む。本発明で有用であり得る非天然アミノ酸のリストを表２に示す。
【００７８】
表２
【表２】
2005537325.tif 000006
【表３】
2005537325.tif 000007
【表４】
2005537325.tif 000008
【表５】
2005537325.tif 000009
【表６】
2005537325.tif 000010
【表７】
2005537325.tif 000011
【００７９】
本明細書で使用されている「アルキル」の語は、直鎖または分枝状炭化水素基をいう。適切なアルキル基には、限定されるわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルおよびデシルがある。例えば、Ｃ１−Ｃ３アルキルとは、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルをいう。
【００８０】
本明細書で使用されている「アルケニル」の語は、１個またはそれ以上の二重結合を含む直鎖または分枝状不飽和炭化水素基をいう。適切なアルケニル基には、限定するわけではないが、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニルおよびデセニルがある。
【００８１】
本明細書で使用されている「アルキニル」の語は、１個またはそれ以上の三重結合を含む直鎖または分枝状不飽和炭化水素基をいう。適切なアルキニル基には、限定するわけではないが、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニルおよびデシニルがある。
【００８２】
本明細書で使用されている「シクロアルキル」の語は、環状炭化水素基をいう。適切なシクロアルキル基には、限定するわけではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシルおよびシクロドデシルがある。
【００８３】
本明細書で使用されている「シクロアルケニル」の語は、環に少なくとも１個の二重結合を有する環状不飽和炭化水素基をいう。適切なシクロアルケニル基には、限定するわけではないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロノネニル、シクロデセニル、シクロウンデセニルおよびシクロドデセニルがある。
【００８４】
本明細書で使用されている「ヘテロシクリル」の語は、少なくとも１個の炭素原子がＮ、ＯまたはＳにより置換された５または６員環状炭化水素基をいう。所望により、ヘテロシクリル基は、フェニル環と縮合され得る。適切なヘテロシクリル基には、限定するわけではないが、ピロリジニル、ピペリジニル、ピロリル、チオフェニル、フラニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリジニル、キノリニル、イソキノリニル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、オキサジアゾリル、テトラゾリル、トリアゾリルおよびピリミジニルがある。
【００８５】
本明細書で使用されている「アリール」の語は、Ｃ６−Ｃ１０芳香族炭化水素基をいい、例えばフェニルおよびナフチルがある。
【００８６】
また、式（Ｉ）の化合物は、不斉中心を有することから、複数の立体異性体形態で存在し得ることも認識されている。すなわち本発明は、１個またはそれ以上の不斉中心における実質的に純粋な異性体形態、例えば約９０％ｅｅより大、例えば約９５％または９７％ｅｅまたは９９％ｅｅより大である化合物、並びにそのラセミ混合物を含む混合物に関するものである。上記異性体は、天然に存し得るかまたは例えばキラル中間体を用いる不斉合成により、またはキラル分割により製造され得る。
【００８７】
上記で詳述した通り、本発明方法は、興味の対象であるいずれか１個またはそれ以上のアミノ酸のα形態を、そのアミノ酸の対応するβ形態により置換することに基いている。従って、「置換する」については、この置換事象を指すものと理解すべきである。しかしながら、所定のα−アミノ酸をその特定アミノ酸のβ形態により置換することは好ましいが、対象α−アミノ酸を、異なるアミノ酸（β−アミノ酸形態であろうとも）で同類置換することにより同じ機能的成果を達成することも可能であり得ると解釈すべきである。適切な同類置換の決定方法は、当業者には熟知されており、常用の手順によるものとして実施され得る。
【００８８】
典型的な同類アミノ酸置換には、限定するわけではないが、下記表３で詳述されているものがある。
【００８９】
表３
アミノ酸置換に適した残基
【表８】
2005537325.tif 000012
【００９０】
興味の対象であるペプチドを含むかなり多数のα−アミノ酸が、対応するβ−アミノ酸により置換され得る。僅か１アミノ酸から全対象アミノ酸まで置換され得るが、置換事象の数はこれらの数値間の中途に位置すると予測される。本発明で教示していることを手掛かりとして（本明細書に記載されている一連の試験用置換ペプチドの生成手段およびインビトロ試験方法の両方に関して）、当業者であれば、常用手順の事柄として、本発明目的の達成のために為す必要がある置換の性質を決定できるはずである。例えば、共通ＭＨＣ対立遺伝子の大部分は現時点で判明しており、ｘ線結晶学的分析の対象となっている。したがって、可能性のあるアンカー位置の同定およびその置換実施については常用手順により解明され得る。ＭＨＣ対立遺伝子の中には現在まだそれらの三次元構造について知られていないものもあるという程度であっても、興味の対象であるペプチドのＭＨＣアンカー位置をそれにもかかわらず同定する常用的方法がプール配列決定技術により提供される。プール配列決定法は、所定のＭＨＣ対立遺伝子と結合する若干のエピトープの配列解析を行うことにより、共通モチーフを同定し得るよく知られた技術である。所定のエピトープが結合するＭＨＣ分子の形態の測定については、エピトープが結合する特定ＭＨＣ制限分子、例えば特定ＨＬＡ制限分子を同定する当業者に公知の標準的方法がある。同様に、これらの方法は、三次元ＭＨＣ構造の知識に依存するものではない。Ｔ細胞応答性の分析については、当業者であれば、興味の対象である所定エピトープについての適切なＴ細胞クローンを生成するか、または別法として、エピトープが対象において免疫応答を発生させることが示された場合、細胞集団、例えば末梢血単核細胞を単離することにより、免疫細胞応答性、例えば細胞傷害性Ｔ細胞応答性を分析し得るはずである。この点について、卵アルブミンペプチド−ＭＨＣ Ｉモデルを用いて本発明を具体的に説明したが、これは本発明の広範な適用に制限を設ける意図は無いものと解釈すべきである。むしろ、本明細書で教示したことにより、ＭＨＣおよび特にＭＨＣ Ｉ提示ペプチドによりＴ細胞に提示され得るペプチドに関連した本発明の適用は容易になる。
【００９１】
本発明をいずれか一つの理論または作用方式に限定することなく、本発明者らは、所定ペプチドのＭＨＣアンカー残基の置換が、特に好ましい手Ｔ細胞応答モジュレーション段であることを測定した。この点について、ＭＨＣアンカー残基は直接Ｔ細胞受容体とは相互作用しないが、これらの残基をそれらのβアミノ酸対応物質により置換すると、ある程度の立体配座変化を誘発すると考えられており、次いでその変化がＴ細胞受容体関連シグナリングに強い影響を与えると考えられる。さらに、別の好ましい実施態様において、興味の対象である所定ペプチドで置換される対象残基は、溶媒露出残基と対応する。
【００９２】
しかしながら、本明細書で提供した教示内容および原理を考慮すると、本発明目的の達成に適切なペプチドの決定および設計手段は、常用手順の事柄であり、限定されるわけではないが、以下の検定法（ワクチン効力およびＴ細胞認識力を試験する）の適用を含む：
【００９３】
（ｉ）ＴｃＲ連結反応およびＴ細胞活性化のリードアウトとしてのＴ細胞クローンまたは細胞系、Ｔ細胞ハイブリドーマおよびサイトカイン生産の使用。脾臓またはリンパ節に関する免疫リンパ球についての類似検定法も存在する。サイトカイン生産、例えばＩＬ−１、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＭＩＰ、ＲＡＮＴＥＳは、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、共培養上清についてのＥＬＩＳＡ検定法、タンパク質マイクロアレイ、ＥＬＩＳｐｏｔ、またはバイオアッセイ、例えばＩＬ−２感受性細胞系ＣＴＬＬの使用により評価され得る。
【００９４】
（ii）リンパ球活性化はまた、放射性標識（例、３Ｈ−チミジン）または発色団、例えばＢｒｄＵの取込を用いた増殖により評価され得る。
【００９５】
（iii）インビボ活性およびリンパ球への抗原提示はまた、インビボＣＴＬ検定法または養子免疫伝達ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖（リヨン−パリッシュ分析）により測定され得る。
【００９６】
（iv）ヒト化応答（すなわち、例えばＨＬＡ Ａ２−制限応答）は、上記で列挙した検定法でＨＬＡトランスジェニックマウスを用いて、またはヒトＰＢＭＣのインビトロ刺激（例えばＡＰＣとして単核細胞由来樹状細胞を使用）により調べられ得る。
【００９７】
本発明のβ−アミノ酸ペプチドは、本明細書で描写または記載されているかまたは当業界で公知の方法を用いることにより製造され得る。特定ｂ−アミノ酸化合物を合成するのに、本明細書記載または当業界で公知の方法に僅かな修飾を加えることが必要とされ得ることは当然である。化合物の合成に適用可能な一般的合成手順は、標準参考文献、例えばComprehensive Organic Transformations, R. C. Larock, １９８９、ＶＣＨパブリッシャーズおよび Advanced Organic Chemistry, J. March, 第４版 (１９９２）、ワイリー・インターサイエンス、およびそこに記載された参考文献に記載されている。また、ある種の反応基は、それらを含むβ−アミノ酸またはペプチドを製造する合成過程中に保護および脱保護を必要とし得ることも認められる。
【００９８】
反応性官能基についての適切な保護および脱保護方法は、当業界では公知であり、例えばProtective Groups in Organic Synthesis, T. W. Green & P. Wutz, ジョン・ワイリー・アンド・サン、第３版, １９９９ および Amino Acid and Peptide Synthesis, John Jones, オックスフォード・サイエンス・パブリケーションズ、１９９２に記載されている。
【００９９】
Ｃ２にＲ側鎖基を有するβ−アミノ酸は、スキーム１に示された典型的な一般方法により製造され得る。適切な出発物質は、市販されているか、または当業界で公知の方法を用いて製造され得る。
【化４】
2005537325.tif 000013
【０１００】
Ｃ３にＲ側鎖基を有するβ−アミノ酸は、スキーム２に示された典型的な一般方法により製造され得る。適切な出発物質は、市販されているかまたは当業界で公知の方法を用いて製造され得る。
【化５】
2005537325.tif 000014
【０１０１】
別法として、Ｃ３にＲ側鎖を有するβ−アミノ酸は、アルンヅ‐エイスタート（Arndt‐Eistert）反応を用いたスキーム３に示された典型的な一般方法により製造され得る。適切な出発物質は、市販されており、例えばα−アミノ酸であるか、または当業界で公知の方法を用いて製造され得る。
【化６】
2005537325.tif 000015
【０１０２】
β−アミノ酸を含むペプチドは、公知液相ペプチド合成技術を用いて合成され得る。典型的固相合成をスキーム４に示す。
【化７】
2005537325.tif 000016
【０１０３】
また、本発明ペプチドには、β−アミノ酸置換に加えて、何らかの適切な理由のため、例えば限定されるわけではないが、ペプチドの溶解度を高めるか、またはタンパク質加水分解に対するその抵抗性を増強するため、所望によりいずれか１つまたはそれ以上の一般的修飾が加えられ得る。またペプチドに修飾を加えることにより、一つまたはそれ以上の天然対立遺伝子変化から生じる多型、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体が組込まれ得る。また、リポーター基を付加することにより、本発明によるペプチドの精製が容易になり、潜在的に溶解度が高めれられ得る。他の公知タイプの修飾には、特異的エンドプロテアーゼ開裂部位の挿入、官能基の付加、または疎水性残基のそれより低疎水性の残基による置換がある。上記で挙げた本発明によるペプチドに対する様々な修飾は、具体例として挙げているに過ぎず、対象ペプチドに関して実施され得る修飾が広範囲であることを示しているのに過ぎないものとする。この点について、例えば、「α−アミノ酸」については、それ自体、そのα−アミノ酸の非β−アミノ酸置換体および誘導体、例えば表１、２および３に詳述されている天然および非天然α−アミノ酸置換体および類似体を包含するものと理解すべきである。
【０１０４】
本発明をいずれか一つの理論または作用方式に限定するわけではないが、細胞傷害性Ｔ細胞は、標的細胞ＭＨＣクラスＩ分子により提示されたペプチド抗原をそれらのＴ細胞受容体を通して認識する。Ｔ細胞受容体／ペプチド−ＭＨＣ界面は、免疫シナプスの焦点である。一般にウイルスまたは腫瘍タンパク質から始まる抗原性シグナルにより、溶菌経路の活性化、サイトカイン生産、セリンエステラーゼ放出、カルシウム流入および細胞増殖が誘発され、最終的に感染／損傷細胞が除去される。Ｔ細胞受容体は、提示されたペプチドの非常に小さい部分を読み取るに過ぎない。卵アルブミンである、本明細書で例示されたペプチドの状況においては、Ａｓｎ−Ｐ４、Ｇｌｕ−Ｐ６およびＬｙｓ−Ｐ７での卵アルブミンペプチド組成は、置換に対して不安定であるため、修飾時にＴ細胞受容体シグナリングに劇的な変化がもたらされる。この点について、特定β−アミノ酸置換は、置換アミノ酸が溶媒露出されておろうと否と、Ｔ細胞応答の普遍的アゴニズムを誘導することが測定された。
【０１０５】
従って、本発明は、興味の対象であるペプチドに対するＴ細胞応答の性質のモジュレーション手段を提供する。これは、免疫治療およびペプチドワクチンの開発の状況において充分な可能性を提供するものであり、限定するわけではないが、以下の事項を可能にする修飾ペプチドの投与を含む：
【０１０６】
（ｉ）自然状態ではほとんどまたは全く免疫原性を呈しない、例えば腫瘍により発現される組織抗原から誘導されたペプチドエピトープの弱い免疫原性の抗原に対するＴ細胞応答をアップレギュレーションまたは他の点で増強する。
【０１０７】
（ii）免疫系の一般的機能を傷つけることなく高度に有効かつ特異的な形で病理学的Ｔ細胞のアネルギーまたは寛容性の誘発をまねく。かかる療法は、望まれていない免疫応答、例えば自己免疫性に関連した状態、移植拒絶およびアレルギーの処置における適用性を有する。これらの適用に関して、本発明の出現により、現行の免疫抑制療法に代わる実現性のある療法が提供される。
【０１０８】
（iii）提示性ＭＨＣ分子を安定させることによりアジュバント様特性を提供し、それによって細胞表面でのより長い提示が容易になる。これは、さらに強力で長く続く免疫学的効果を提供する。
【０１０９】
（iv）全α−アミノ酸含有ペプチドでのワクチン接種により誘導されるエレメントに対しそれらに代わるＴｃＲ ＶαおよびＶβエレメントを利用し得るポリクローナルＴ細胞応答を誘導する。これは、Ｔ細胞特異性が消耗され得、所定の特異性のＴ細胞が誘導困難であり得る慢性感染症において、または標的応答が寛容性誘導の対象であった自己抗原に向かっている状況において顕著な可能性を有しており、例えば多くの腫瘍抗原はこの自己抗原範ちゅうに属する。
【０１１０】
（ｖ）免疫化賦形剤中においてペプチドを安定させる。例えば、多くのペプチドは、不安定であることから、タンパク質加水分解および他の分解形態を被り易いため、例えば静脈手段を介した個体への投与用に処方するのは困難である。従って、本発明方法に従ってこれらのペプチドを安定させることにより、それらの生物学的利用能を高める手段が提供され、それによってこれらのペプチドワクチンはさらに有効なものとなる。
【０１１１】
従って、本発明のさらに別の局面は、対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に投与することを含む方法であり、βアミノ酸置換により、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される方法を提供する。
【０１１２】
さらに具体的には、本発明は、対象におけるペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答のモジュレーション方法であって、ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ＭＨＣ Ｉ−ペプチド複合体の状況において細胞傷害性Ｔ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に投与することを含む方法であり、βアミノ酸置換により、ペプチドの非置換形態により誘導され得る細胞傷害性Ｔ細胞応答に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される方法を提供する。
【０１１３】
好ましくは、上記Ｔ細胞応答はＴ細胞活性化である。
【０１１４】
処置または予防の対象は、一般的に哺乳類、例えば限定するわけではないが、ヒト、霊長類、家畜（例、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、ペット（例、イヌ、ネコ）、実験動物（例、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲された野生動物（例、キツネ、シカ）である。好ましくは、哺乳類はヒトまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳類はヒトである。
【０１１５】
さらに別の局面において、本発明者らは、驚くべきことに、単離されたＴ細胞クローンのＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムを誘導し得るペプチドが、ペプチドの非置換形態と一緒に投与されたとき、そして非置換ペプチド単独により事実上誘導され得る応答の程度に対して考慮した場合、事実上、反対の応答（すなわち、それぞれアンタゴニズムまたはアゴニズム）の増強を誘導し得ることを測定した。
【０１１６】
従って、本発明のさらに別の局面は、対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のアゴナイズ方法であって、アゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法を提供する。
【０１１７】
さらに別の局面において、対象におけるペプチド特異的Ｔ細胞応答のアンタゴナイズ方法であって、アゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法が提供される。
【０１１８】
「アンタゴニスト的」ペプチドについては、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対して単離されたＴ細胞のＴ細胞応答のアンタゴニズムを誘導するβ−アミノ酸置換ペプチドをいうものとして理解すべきである。「アゴニスト的」ペプチドについては、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対して単離されたＴ細胞のＴ細胞応答のアゴニズムを誘導するβ−アミノ酸置換ペプチドをいうものとして理解すべきである。本明細書で提供されている教示内容に照らすと、所定のβ−アミノ酸置換ペプチドが本発明のこれらの局面による使用に適切か否かを決定することは、当業者にとって常用手順の事柄である。例えば、単離Ｔ細胞クローンの状況における所定ペプチドのアンタゴニスト的またはアゴニスト的特性の常用手順による測定方法はよく知られている。さらに、ペプチドの置換および非置換の両形態の存在下におけるポリクローナルＴ細胞集団の総合累積応答の測定方法もまた、常用手順の事柄として実施され得、それによって、以前にはまだ報告されたことがないこの現象の誘導に基いた予防および治療方法の常用手順による設計手段が提供される。
【０１１９】
「併用投与される」については、同一または異なる経路による対象ペプチドの同一処方物または２種の異なる処方物での同時投与または同一または異なる経路によるそれらの連続投与を包含するものと理解すべきである。「連続投与」とは、２タイプの分子の投与間に秒、分、時間または日単位の時間差があることを意味する。これらの分子は、いかなる順序でも投与され得る。また、「併用投与」については、一ペプチドが既に対象に存在する場合における他方のペプチドの投与を包含するものと理解すべきである。例えば、本来個体に自然に存在するペプチドであるため、それ自体、投与される必要のない自己ペプチドである、天然自己ペプチドに対応するβ−アミノ酸置換ペプチドの投与が要求され得る。これは、例えば自己免疫疾患処置の状況において起こり得る。
【０１２０】
前記で詳述されている通り、本発明はまた、患者の治療および／または予防処置、例えば疾患状態または他の望まれていない状態の処置および／または予防における本発明方法の使用に及ぶものと理解すべきである。
【０１２１】
従って、本発明は、対象における異常な、望まれていない、または他の点で不適切なペプチド特異的Ｔ細胞応答を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に投与することを含む方法であり、βアミノ酸置換により、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される方法に関するものである。
【０１２２】
好ましくは、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞であり、ＭＨＣ−ペプチド複合体は、ＭＨＣ Ｉ−ペプチド複合体である。さらに好ましくは、Ｔ細胞応答はＴ細胞活性化である。
【０１２３】
「異常な、望まれていない、または他の点で不適切な」Ｔ細胞応答については、異常に不活発な応答、それが望まれていないという点で不適切である生理学的に正常な応答または異常に活発な応答を指すものと理解すべきである。前記で詳述した通り、Ｔ細胞応答の正しいレベルおよび性質の誘導に左右される多くの状態がある。例えば、アレルギー応答は、専門的には免疫学的に正常な応答であるにも拘わらず、この応答は無害の抗原の状況においては望まれていないかまたは不必要である。別の例では、自己抗原に指向したＴ細胞応答により、非常に望ましくない自己免疫状態が誘導される。さらに別の例では、非常に弱い免疫原性ペプチドに対して誘導されることもある非常に効率の悪いＴ細胞応答が、そのペプチドが高度病原性生物体または腫瘍から誘導される致命的な状態を誘発し得る。したがって、本発明方法は、上記状態に関連した広範な範囲を有する。
【０１２４】
好ましい実施態様において、対象となる異常な、望まれていないまたは他の点で不適切なＴ細胞応答が不十分なＴ細胞応答である場合、好ましくは、上記β−アミノ酸置換ペプチドは、上記ペプチドの非置換形態により誘導され得る応答に対し、対象応答のアゴニズムを誘導する。別の例では、異常な、望まれていないまたは他の点で不適切なＴ細胞応答が異常に活発なＴ細胞応答またはいかなる程度にせよ応答の単なる発生である場合、上記β−アミノ酸置換ペプチドは、上記ペプチドの非置換形態により誘導され得る応答に対し、上記応答のアンタゴニズムを誘導する。
【０１２５】
本発明の別の局面は、対象における望まれていないペプチド特異的Ｔ細胞応答の発生を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、アゴニスト的ペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法を提供する。
【０１２６】
さらに別の局面では、対象における不十分なペプチド特異的Ｔ細胞応答を特徴とする状態の処置および／または予防方法であって、アンタゴニストペプチド、すなわち少なくとも１個のβアミノ酸置換を含むペプチドの有効量を、ペプチドの非置換形態と一緒に、ＭＨＣ−ペプチド複合体の状況においてＴ細胞にペプチドを提示するのに充分な時間および条件下で対象に併用投与することを含む方法が提供される。
【０１２７】
好ましくは、望まれていないＴ細胞応答を特徴とする上記状態は、自己免疫状態、移植またはアレルギー状態である。好ましくは、不十分なＴ細胞応答を特徴とする上記状態は、新生物状態または感染症である。
【０１２８】
「有効量」とは、少なくとも部分的に所望の応答の獲得、または処置されている特定状態の開始の遅延または進行阻害またはその開始または進行の全体としての停止に必要な量を意味する。有効量は、処置される個体の健康および身体状態、処置される個体の分類群、所望される保護の度合、組成物の処方、医学的状況の評価、および他の関連因子により変動する。有効量は、常用手順による試験を通して決定され得る比較的広い範囲内に入ると予測される。
【０１２９】
「処置」および「予防」については、その最も広い状況で考えるべきである。「処置」の語は、必ずしも対象が完全回復まで処置されることを意味しない。同様に、「予防」は、対象が結局は疾患状態に罹らないことを必ずしも意味しない。したがって、処置および予防は、特定状態の症状の改善または特定状態を発現する危険性の阻止またはさもなくば低減化を包含する。「予防」の語は、特定状態の重症度または開始を低減化するものとして見なされ得る。「処置」はまた、既存の状態の重症度を低減化し得る。
【０１３０】
さらに本発明は、治療の組合わせ、例えば所望の治療または予防成果を容易にし得る他のタンパク質または非タンパク質分子と一緒のモジュレーター薬剤の投与に関するものである。
【０１３１】
医薬組成物形態での前記本発明ペプチド［本明細書では集合的に「モジュレーター薬剤」と称す］の投与は、慣用的手段により実施され得る。医薬組成物のモジュレーター薬剤は、特定症例により異なる量で投与されたときに治療活性を呈すると予測される。変動は、例えば選択されたヒトまたは動物およびモジュレーター薬剤に左右される。広範囲の用量が適用可能であり得る。患者について考慮すると、例えば、約０.１ｍｇ〜約１ｍｇのモジュレーター薬剤が、１日に体重１キログラムにつき投与され得る。用量摂取法は、最適治療応答を提供するように調節され得る。例えば、幾つかの分割用量が毎日、週ごと、月ごとまたは他の適切な時間間隔で投与され得るか、または用量は、状況の緊急性により指示されたように比例的に低減化され得る。
【０１３２】
モジュレーター薬剤は、慣用的方法で、例えば経口、静脈内（水溶性である場合）、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮または坐剤経路または移植（例、徐放性分子を使用）により投与され得る。モジュレーター薬剤は、医薬上許容される非毒性塩類、例えば酸付加塩類または例えば亜鉛、鉄などとの金属錯体（本願の目的に適う塩類としてみなされる）の形態で投与され得る。上記酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。有効成分が錠剤形態で投与される場合、錠剤は、結合剤、例えばトラガカントゴム、コーンスターチまたはゼラチン、崩壊剤、例えばアルギン酸、および滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含み得る。
【０１３３】
投与経路には、限定されるわけではないが、気道、気管内、鼻咽頭、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、くも膜下腔、小脳内、鼻腔内、注入、経口、直腸、ＩＶドリップパッチ手段または移植によるものがある。好ましくは、上記投与経路は皮下または経口経路である。
【０１３４】
さらに別の局面では、本発明は、哺乳類におけるある状態、すなわち異常な、望まれていない、または他の点で不適切なＴ細胞応答を特徴とする状態を処置するための医薬の製造における上記β−アミノ酸置換ペプチドの使用に関するものであり、その場合、β−アミノ酸置換により、ペプチドの非置換形態により誘導され得るＴ細胞応答に対してＴ細胞応答のアゴニズムまたはアンタゴニズムが誘導される。
【０１３５】
好ましくは、Ｔ細胞応答は、細胞傷害性Ｔ細胞応答であり、ＭＨＣペプチド複合体は、ＭＨＣ−Ｉペプチド複合体である。さらに好ましくは、Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞活性化である。
【０１３６】
本発明方法は、インビトロおよびインビボの両方におけるＴ細胞機能のモジュレーションに関するものである。好ましい方法は、個体をインビボで処置することであるが、本発明方法はインビトロ環境で適用され得ることにより、例えば免疫原性の乏しいペプチドに指向したＴ細胞系の生成といった目的のためにバージンＴ細胞の活性化を誘導することが望ましい場合もあり得るものと理解すべきである。
【０１３７】
さらに別の局面において、本発明は、上記モジュレーター薬剤および１種またはそれ以上の医薬上許容される担体および／または希釈剤を含む医薬組成物に関するものである。上記薬剤を有効成分と称す。
【０１３８】
注射可能溶液用に適した医薬形態は、滅菌注射可能溶液または分散液の即座での製造用に滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を含むか、またはクリームまたは局所適用に適切な他形態であり得る。それは、製造および貯蔵条件下で安定していなくてはならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保護されなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散液媒質であり得る。適当な流動性は、例えばコーティング、例えばレシチンの使用、分散液の場合に要求される粒子サイズの維持および界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより遂行され得る。多くの場合、等張性成分、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むのが好ましい。注射可能組成物の長期間にわたる吸収は、吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物での使用により達成され得る。
【０１３９】
滅菌注射可能溶液は、適切な溶媒中に必要とされる量の活性化合物を上記で列挙した様々な他の成分と共に混ぜ込み、次いで必要に応じて濾過滅菌することにより製造される。一般的には、分散液は、基剤となる分散媒質および上記で列挙したものから必要とされる他成分を含む滅菌賦形剤中に様々な滅菌有効成分を混ぜ込むことにより製造される。滅菌注射可能溶液製造用滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、有効成分とその予め滅菌濾過した溶液からの追加の所望成分の粉末が得られる。
【０１４０】
有効成分が適切に保護されているとき、それらは、例えば不活性希釈剤または同化性可食担体により経口投与され得るか、またはそれは、硬または軟ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に圧縮され得るか、または食餌療法の食物へ直接混ぜ込まれ得る。経口治療投与については、活性化合物は、賦形剤と共に混ぜ込まれ、経口摂取用錠剤、舌下錠、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用され得る。上記組成物および調製物は、少なくとも１重量％の割合で活性化合物を含むべきである。組成物および調製物のパーセンテージは、勿論、変えられ得、好都合には単位重量の約５〜約８０％の割合であり得る。治療上有用な組成物中における活性化合物の量は、適切な用量が得られるように選択される。本発明による好ましい組成物または調製物は、経口用量単位形態が約０.１μｇ〜２０００ｍｇの活性化合物を含むように製造される。
【０１４１】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル剤などはまた、以下に列挙された成分を含み得る：結合剤、例えばアカシアゴム、コーンスターチまたはゼラチン、賦形剤、例えばリン酸二カルシウム、崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸など、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、および甘味料、例えばしょ糖、乳糖またはサッカリンが加えられ得、または香味料、例えばペパーミント、冬緑油またはチェリー香味料も加えられ得る。用量単位形態がカプセル剤であるとき、それは、上記タイプの物質に加えて、液体担体を含み得る。様々な他の物質が、コーティングとして、または用量単位の物理的形態を他の方法で修飾するために存在し得る。例えば、錠剤、丸薬またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方によりコーティングされ得る。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味料としてしょ糖、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素および香味料、例えばチェリーまたはオレンジ香味料を含み得る。勿論、用量単位形態の製造で使用される材料は全て、医薬上純粋で、使用量では実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物（複数も可）は、持続放出型調製物および処方物に混ぜ込まれ得る。
【０１４２】
医薬組成物はまた、遺伝的特徴をもつ分子、例えば標的細胞をトランスフェクションし得るベクターを含み得、その場合ベクターは、ペプチドの非置換形態をコード化する核酸分子を担持する。ベクターは、例えばウイルスベクターであり得る。
【０１４３】
また、本発明のペプチドそれ自体の投与に加えて、本発明はまた、タンパク質または非タンパク質分子、例えば一次または二次リンパ性器官へのペプチドのターゲッティングを助け得る分子と一緒の対象ペプチドの投与に関するものであることを理解すべきである。さらに、本発明方法はまた、ＭＨＣの状況で既に発現されたペプチドの投与、例えば既に抗原がローディングされたＭＨＣ発現細胞の投与に及ぶものと理解すべきである。
【０１４４】
さらに別の局面において、β−アミノ酸置換ペプチド類似体についての設計およびスクリーニング方法であって、位置スキャン方法におけるβ−アミノ酸のα−アミノ酸による合理的置換および所望の機能的活性および改善された生物学的利用能を呈するペプチドの同定の手段を提供する方法が開発された。対象方法は、興味の対象であるペプチドを含むα−アミノ酸の１個またはそれ以上の対応するβ−アミノ酸による連続置換によるペプチド類似体の集団の生成およびそこらか誘導される類似体の機能的分析に基いている。従って、本発明は、このスクリーニング方法およびそこから誘導されるペプチドに及ぶものと理解すべきである。
以下の非限定的図面および／実施例により本発明をさらに説明する。
【０１４５】
実施例１
β−アミノ酸置換ペプチドによるＭＨＣ クラスＩ結合およびＣＴＬ応答の修飾
方法および材料
細胞系
ＭＨＣクラスＩ Ｈ２−Ｋｂを発現するＲＭＡ−Ｓ細胞（Schumacher, N. M., M.-T. Heemels, J. J. Neefjes, W. M. Kast, C. J. Melief, M. H. L. Ploegh. 1990.  Direct binding of peptide to empty MHC class I molecules on intact cells and in vitro（無傷細胞およびインビトロでの中空ＭＨＣクラスＩ分子へのペプチドの直接結合）.  Cell ６２：５６３; Karre K., Ljunggren H. G., Piontek G.、および Kiessling R.  Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy（Ｈ−２欠損リンパ腫変異型の選択的拒絶は代替的免疫防御戦略を示唆する）.  Nature. １９８６年２月 ２０-２６;３１９(６０５５):６７５-８）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｌ−グルタミンおよび抗体（０.５ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８）を含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）培地で保った。これらの細胞のＴＡＰ（抗原プロセッシングに随伴する輸送体）分子における突然変異故に、これらの細胞は、３７℃の細胞表面で低レベルのＫｂ（正常の〜５％−１０％）を発現する。１９〜３３℃間の温度でのＲＭＡ−Ｓ細胞のインキュベーションにより、Ｋｂ（ＲＭＡ親細胞系において〜５０％存在）２０の表面発現が増幅される。これらの分子が、最適以下のペプチドリガンドにより結合されると、その結果として、これらの細胞を３７℃に戻したときには不安定である。事実、高親和力の外生ペプチドがＲＭＡ−Ｓ細胞に加えられたときのみ、Ｋｂ発現におけるこの増幅が観察される。この結果、これらの細胞により、Ｋｂ分子へのリガンド結合についての理想的な全細胞リポーター検定法となり、図１に示されているように、外生ペプチドは、フローサイトメトリーにより示されたように表面Ｋｂ染色の５０倍増加をもたらす。
【０１４６】
ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｋｂ−制限ＣＤ８＋ＣＴＬクローンＢ３.１、ＧＡ４.２（Nikolic-Zugic, J.,および Carbone F.R. （１９９０）The effect of mutations in the MHC Class I peptide binding groove on the cytotoxic T lymphocyte recognition of the Kb restricted ovalbumin determinant（Ｋｂ制限卵アルブミン決定基の細胞傷害性Ｔリンパ球認識に対するＭＨＣクラスＩペプチド結合溝における突然変異の効果）、Eur. J. Immunol. ２０：２４３１）、１４９.１３.１３, １４９.４２.１２ (Clark S. R., Barnden M., Kurts C., Carbone F.R., Miller J.F., Heath J.R.  Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection（卵アルブミン−特異的ＴＣＲトランスジェニックラインＯＴ−Ｉの特性確認：正および負の選択についてのＭＨＣエレメント）、Immunol Cell Biol. ２０００年４月；７８(２):１１０−７)、および単純疱疹ウイルス特異的クローンＨＳＶ２.３（Wallace, M. E., Keating, R., Heath, W R., Carbone, F. R. １９９９、The cytotoxic T-cell response to herpes simplex virus type 1 infection of C57BL/6 mice is almost entirely directed against a single immunodominant determinant（Ｃ５７ＢＬ／６マウスの単純疱疹ウイルス１型感染に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答は、ほぼ完全に単一免疫優性決定基に対して指向されている）、J Virol. ９月；７３(９)：７６１９−２６）が、上記要領で誘導および維持された。全Ｔ細胞ハイブリッドを、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質（０.７ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８）を含む市販のＤＭＥＭで成長させた。ＣＴＬクローンを認識検定で使用し、クローンＢ３.１およびＧＡ４.２をアンタゴニズム検定で使用した。Ｔ細胞機能および細胞表面表現型の検査を含め（ＣＤ８についてのフローサイトメトリー染色；図２参照）、Ｔハイブリッドについて使用前に充分に表現型分類を行った。
【０１４７】
ＭＨＣクラスＩ Ｈ２−Ｋｂを発現するＩ−３線維芽細胞（図３参照）を、ＤＭＥＭ−１０で成長させた。Ｉ−３細胞をＣＴＬ認識およびアンタゴニズム検定における標的細胞として用いた。
【０１４８】
インターロイキン２（ＩＬ−２）依存的細胞系、ＣＴＬＬ−２（Gillis, S., M. M. Ferm, W. Ou, K. A. Smith. １９７８、T cell growth factor: parameters of production and a quantitative microassay for activity（Ｔ細胞成長因子：生産のパラメーターおよび活性についての定量的マイクロアッセイ）、J. Immunol.１２０：２０２７）を、ＩＬ−２バイオアッセイで使用することにより、ペプチド類似体による刺激を受けたときのＣＴＬクローンによるＩＬ−２生産の相対量を測定した（Chang, H. C., A. Smolyar, R. Spoerl, T. Witte, Y. Yao, E. C. Goyarts, S. G. Nathenson, E. L. Reinherz. １９９７. Topology of T cell receptor-peptide/class I MHC interaction defined by charge reversal complementation and functional analysis（電荷逆転相補性および機能分析により特定されたＴ細胞受容体−ペプチド／クラスＩ ＭＨＣ相互作用のトポロジー）、J. Mol. Biol.２７１：２７８）。１００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−２を補ったＤＭＥＭ−１０において細胞を成長させ、培養培地においてＩＬ−２を除去後、ＣＴＬＬを外生ＩＬ−２に用量依存的に増殖させた（図４参照）。
【０１４９】
ペプチド
モナシュ・ユニバーシティー、ケミストリー・デパートメントにおいて、Dr. Patrick Perlmutterとの共同研究で保護β−アミノ酸を合成した。固相ペプチド合成法および標準ｆ−ｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）保護戦略を用いて、ペプチドを合成した（Karen Stewartによる）。合成および選択的脱保護後、完全な脱保護および樹脂からの開裂がトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて達成された。ペプチドの精製を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により達成し、精製されたペプチドを、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法、およびアジレント・テクノロジーズＬＣＤイオントラップ質量分析計を用いる後続のＭＳ／ＭＳ（デパートメント・オブ・マイクロバイオロジー・アンド・イミュノロジー、ユニバーシティー・オブ・メルボルン）により特性確認した。ＲＰ−ＨＰＬＣ精製および特にイオントラップＭＳに基いた実験のこの組合わせにより、各β−類似体の明白な構造的立体配座が得られる。ペプチドおよびそれらの相対分子質量および純度を表４に示す。
【０１５０】
表４．各ペプチドの配列、相対分子質量純度
【表９】
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【０１５１】
Ｈ２−Ｋｂ安定性検定
ＲＭＡ−Ｓ細胞を３７℃で〜１０６細胞／ｍｌの密度まで成長させ、次いで５％ＣＯ２により２６℃で２０時間維持した。細胞を洗浄し、再懸濁して、平底９６ウェルプレートの１ウェル（２００μｌ）につき１０５細胞の最終濃度にした。細胞をＰＢＳ中でのペプチド滴定でパルスし、２６℃で１時間、次いで３７℃でさらに２時間インキュベーションした。この２度目のインキュベーションにより、不安定なＫｂ−ペプチド複合体が細胞表面から除去された。洗浄後、細胞表面における適切な立体配座のＫｂ複合体を染色するモノクローナル抗体Ｙ３を用いてＨ２−Ｋｂの細胞表面発現が検出された（Jones, B., Jr C. A. Janeway.１９８１、Cooperative interaction of B lymphocytes with antigen-specific helper T lymphocytes is MHC restricted（抗原特異的ヘルパーＴリンパ球とＢリンパ球の協同作用はＭＨＣ制限される）、Nature、２９２：５４７）。追加洗浄後、ＦＡＣｓｃａｎ（ＢＤバイオサイエンシーズ、サンホセ、カリフォルニア）で実施されるフローサイトメトリー中にＦＩＴＣ−コンジュゲートヒツジ抗マウスＩｇ（アムラッド・メルボルン）によりＹ３結合Ｋｂ−ペプチド複合体が検出された。
【０１５２】
ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｈ２−Ｋｂ安定性検定
上記Ｋｂ安定性検定からの手順を、他のＨ２−Ｋｂペプチド組合わせではなく、ＳＩＩＮＦＥＫＬ／Ｈ２−Ｋｂ複合体に特異的に結合するモノクローナル抗体２５−Ｄ１−１６により反復した（Porgador, A., J. W. Yewdell, Y. Deng, J. R. Bennink, R. N. Germain. １９９７、Localization, quantitation, and in situ detection of specific peptide-MHC class I complexes using a monoclonal antibody（モノクローナル抗体を用いた特異的ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体の局在性、定量およびin situ検出）、Immunity、６：７１５）。
【０１５３】
Ｔ−ハイブリッド検定法
Ｉ−３細胞を７０％コンフルエントまで成長させ、次いで１ウェル（総容量１００μｌで）につき５×１０４細胞の密度で平底９６ウェルプレートへ平板培養し、３７℃で２０時間インキュベーションした。次いで、細胞を３７℃で１時間、ペプチド滴定でパルスした。１０６細胞／ｍｌまで成長させたＴ−ハイブリッドクローンを洗浄し、１ｍｌにつき１０６細胞の密度で再懸濁し、次いで１００μｌをパルスＩ−３細胞含有ウェルに移した。次いで、Ｔ−ハイブリッドクローンを２０〜２４時間共培養でインキュベーションした。共培養上清５０μｌを、各ウェルから採取し、ＣＴＬＬ−２ ＩＬ−２バイオアッセイに加えた。
【０１５４】
ＣＴＬＬ−２バイオアッセイ
ＣＴＬＬ−２細胞を１ｍｌにつき５×１０５細胞まで成長させ、次いで外生ＩＬ−２不含有培地中で３回洗浄した。次いで、細胞を、９６平底ウェルにおいて１ウェルにつき５０００細胞の濃度で最終体積１５０μｌとなるまで平板培養した。次に採取した共培養上清（５０μｌ）を平板培養ＣＴＬＬ−２細胞に加え、３７℃で１８〜２２時間（ＣＴＬＬ−２細胞死に関するＩＬ−２が全く加えられていない対照ウェルの視覚的観察結果に左右される）インキュベーションした。次いで、細胞を、６時間１ウェルにつき１μＣｉでの３Ｈ−チミジンによりパルスした。次いで細胞をガラスフィルターへ採取し、乾燥させた。一旦乾燥すると、シンチレーション液（パッカード・バイオサイエンシーズ、メルボルン）を加え、次いでトップカウント（TopCount）シンチレーション計数管（パッカード・バイオサイエンシーズ、メルボルン）で計数した。
【０１５５】
アンタゴニズム検定法
Ｉ−３接着抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、３７℃で一晩１ウェルにつき１０５細胞になるまで前平板培養した。ＡＰＣを１ｎＭのアゴニストＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（この濃度はＴハイブリドーマの５０％最大刺激を与えた、図９の結果参照）でパルスし、３７℃で１時間インキュベーションした。次いで、勾配濃度（１０−１３Ｍ〜１０−６Ｍ）のβ−類似体を加え、さらに１時間インキュベーションした。１０６細胞／ｍｌまで成長させたＴ−ハイブリッドクローンを洗浄し、１ウェル当たり１０５細胞の密度で再懸濁し、次いでパルスＩ−３細胞含有ウェルに移した。次いで、Ｔ−ハイブリッドクローンおよびＡＰＣを、２０〜２４時間共培養でインキュベーションした。共培養上清５０μｌを各ウェルから採取し、Ｔ−ハイブリッド検定法の場合と同様ＣＴＬＬ−２バイオアッセイに加えた。アンタゴニズムが、Ｔハイブリッドの半最大刺激をもたらすアゴニストペプチド濃度での基底レベルのＩＬ−２生産の減少として検出された。
【０１５６】
血清安定性検定
１ｍｇ／ｍｌペプチド含有のペプチド水溶液１０μｌを、１００μｌの２０％マウス血清（成熟雄ＢＬ６マウスから）に加え、３７℃で０分、２時間および１２時間インキュベーションした。各時点で、試料を採取し、４０μｌの１５％ＴＣＡ添加による沈降により、血清タンパク質を除去した。試料を４℃で３０分間貯蔵し、遠心分離にかけた。次いで上清を除去し、氷上で保った。各上清５０μｌを、水中０.１％のＴＦＡ（溶離液Ａ）および６０％水性アセトニトリル中０.０９％のＴＦＡ（溶離液Ｂ）および以下の勾配を用いたＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１５７】
勾配：
５分間０％Ｂ
３５分間６０％Ｂまでの直線勾配
【０１５８】
カラムは、３μＭ呼び粒子サイズおよび３００オングストロームの細孔サイズのファルマシアμＲＰＣオクタデシルシリカカラムであった。流速は２００μｌ／分であり、ＵＶ検出は２１４ｎｍ、２５４ｎｍおよび２８０ｎｍで使用された。値は、ペプチドピーク（２１４ｎｍ）の面積として与えられる。Ｔ＝０でのペプチド量を１００％として使用した。ペプチド消化物を分画し、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオントラップ質量分析法を用いて、ＳＩＩＮＦＥＫＬのフラグメント化パターンを特性確認し、β−アミノ酸類似体を選択した。
【０１５９】
実施例２
ＭＨＣ結合親和力に対するβＣ３−アミノ酸組込みの効果
Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるＣＴＬによるＳＩＩＮＦＥＫＬに対する応答は、ＭＨＣクラスＩ対立遺伝子Ｈ−２Ｋｂを通して専ら制限される（Porgador, A., J. W. Yewdell, Y. Deng, J. R. Bennink, R. N. Germain. １９９７、Localization, quantitation, and in situ detection of specific peptide-MHC class I complexes using a monoclonal antibody（モノクローナル抗体を用いた特異的ペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体の局在性、定量およびin situ検出）、Immunity、６：７１５）。Ｋｂ安定化に対してβＣ３−アミノ酸が有する効果を特性確認するため、単一βＣ３−アミノ酸置換を含むＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの突然変異体ペプチドを合成した（表４）。ＴＡＰ突然変異体細胞系ＲＭＡ−Ｓにおける表面Ｋｂへの結合についてペプチドを試験した。
【０１６０】
これらの細胞は、３７℃では低レベルのＫｂ（正常の〜５％−１０％）を発現するが１９、１９℃および３３℃間のインキュベーション温度では、表面Ｋｂの発現が増幅される（親ＲＭＡ細胞系の５０％まで）（Ljunggren, H. G., N. J. Stam, J. J. C. Oehlen, P. Neefjes, M. T. Hoeglund, J. Heemels, T. N. Bastin, A. Schumacher, K. Kaerre Townsend, H. L. Ploegh. １９９０、Empty MHC class I molecules come out in the cold（中空ＭＨＣクラスＩ分子が低温で出現する）、Nature、３４６：４７６）。Ｋｂ結合ペプチドにより安定化されていない場合、細胞を３７℃に戻したときにこれらの低温誘導分子は表面から迅速に除去される。ＲＭＡ−Ｓ細胞を一晩２６℃で培養し、Ｋｂ発現について試験し、次いで細胞を各ペプチドの系列希釈物でさらに１時間パルスした後、３７℃で２時間置いた。ペプチドのＮ−末端端部での置換により、Ｋｂ分子への結合親和力は減少した。しかしながら、中間およびＣ−末端端部での置換により、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに対して低温安定化Ｋｂ分子の同等または高い結合安定化が達成された。結果は、高度再現性があり、代表的なデータは図５に示されている。
【０１６１】
実施例３
露出残基に対するβＣ３−アミノ酸組込みの効果
モノクローナル抗体２５−Ｄ１.１６は、Ｋｂ分子と連係的にＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに特異的に結合する。ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドは、ＭＨＣクレフト内にほとんど隠れており、Ｐ４、Ｐ６およびＰ７にある残基の側鎖のみ複合体の表面から外へ向かっている。このペプチド結合配向は、まずＳＩＩＮＦＥＫＬのアラニン置換スキャン（Jameson S. C., Bevan M. J., Dissection of major histocompatibility complex (MHC) and T cell receptor contact residues in a Kb-restricted ovalbumin peptide and an assessment of the predictive power of MHC-binding motifs（Ｋｂ制限卵アルブミンペプチドにおける主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）およびＴ細胞受容体接触残基の解離およびＭＨＣ結合性モチーフの予測力の評価）、Eur J Immunol. １９９２年１０月；２２(１０):２６６３−７）により予測され、次いでＫｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ結晶構造により確認された（Fremont D. H., Stura E. A., Matsumura M., Peterson P. A.および Wilson I. A. Crystal structure of an H-2Kb-ovalbumin peptide complex reveals the interplay of primary and secondary anchor positions in the major histocompatibility complex binding groove（Ｈ−２Ｋｂ−卵アルブミンペプチド複合体の結晶構造は、主要組織適合遺伝子複合体結合性グルーブにおける一次および二次アンカー位置の相互作用を明らかにする）、Proc Natl Acad Sci U S A. １９９５年３月２８日；９２(７)：２４７９−８３）。ＳＩＩＮＦＥＫＬの残基Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＬｙｓ（それぞれＰ４、Ｐ６およびＰ７）は、ＣＴＬ認識に関与することが知られている。これらの露出残基の配向に対するＳＩＩＮＦＥＫＬへのβＣ３−アミノ酸組込みの衝撃を試験するため、ＲＭＡ−Ｓ安定化検定を抗体２５−Ｄ１.１６により反復した。２５−Ｄ１.１６認識における変化は、以前に改変されたＴＣＲ認識との相関関係が明らかにされていることから（Porgador et al.１９９７、前出）、この抗体がＴＣＲ様結合特異性を有することが示唆されている。
【０１６２】
ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドのいずれかの部分へβ−アミノ酸を置換することにより、溶媒露出残基の配向または組成の変化がもたらされた。置換に関して最も脆弱な位置は、Ｐ２およびＰ５であり、２５−Ｄ１.１６抗体による認識性を崩壊させた。Ｐ４およびＰ８での置換は最も影響が小さく、Ｐ１およびＰ３が置換されたペプチドは、ＳＩＩＮＦＥＫＬと同じ認識レベルに達するためには濃度の１００倍増加を必要とした。分析から得られた結果は高度再現性があり、代表的データは図６に示されている。
【０１６３】
実施例４
ＣＴＬ認識に対するβＣ３−アミノ酸組込みの効果
Ｈ２−Ｋｂ分子により制限され、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドに特異的なＣＴＬクローン（異なるＴＣＲ Ｖβ／Ｖαセグメントを発現する）を、様々なβＣ３−アミノ酸置換類似体の認識能力について試験した（表Ｘ）。各クローンについての親ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの滴定を完了させることにより、ＣＴＬ認識についての最適ペプチド濃度を測定した（図７）。Ｉ−３細胞を一晩培養し、次いで１時間１μＭの各βＣ３−アミノ酸類似体によりパルスした。ＣＴＬクローンを２０〜２４時間パルスしたＩ−３細胞との共培養状態で置いた。次いで、分泌されたＩＬ−２を含む共培養物からの上清を、ＩＬ−２依存的ＣＴＬＬ−２細胞に加える。次いで、ＣＴＴＬ−２増殖を、３Ｈ−チミジン取込により測定し、シンチレーション計数管で計数する。
【０１６４】
異なる位置における置換の効果の差異が観察された。Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ８が置換された類似体は、ＣＴＬ ＧＡ４.２から相当に認識されても影響は非常に小さく、Ｂ３.１では約５０％の認識および１４９.１３.１３では同３０％であった。ただし１４９.４２.１２による認識は、親ペプチドと比べるとほぼ存在していなかった。Ｐ２置換を伴う類似体の場合、ＧＡ４.２以外の全クローンによる認識が顕著に低い。Ｐ６（側鎖保護基をもつ残基）では、応答は全く観察されなかった。対照ＣＴＬクローンＨＳＶ２.３（単純疱疹ウイルス特異的クローン）で見られる応答は、主としてＳＳＩＥＦＡＲＬペプチドにより伝達され、予想通りこのペプチドは、Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限クローンにより認識されなかった。コンカナバリンＡを用いることにより、ＣＴＬ機能性の指標としてＣＴＬクローンにおける最大のＩＬ−２分泌を誘導した。
【０１６５】
ＣＴＬ認識に対するβＣ３−アミノ酸置換の効果は、Ｋｂに対するペプチドの安定性とある程度の相関関係を有していた。例えば、Ｐ２でのβＣ３−Ｉｌｅは、Ｋｂについての親和力が最低であり、全ＣＴＬクローンによる認識も最小であった。さらに、Ｐ５でのβＣ３−Ｐｈｅは、Ｋｂに対する最強の安定化効果を有し、同じくＣＴＬクローンに対して最も広範に及ぶ応答性を有していた。これらの結果は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの個々の位置におけるβＣ３−アミノ酸の置換が一般的にＣＴＬ認識を減少させることを示している。この効果は、置換の位置により異なるもので、Ｋｂ／ペプチド複合体の安定性と微妙な相関関係を示す。結果は再現性があり、典型的データを図８および９に示す。
【０１６６】
実施例５
Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＧＡ４.２およびＢ３.１ＣＴＬクローンのＴＣＲアンタゴニズム
アンタゴニスト検定を用いることにより、βＣ３−アミノ酸の組込みが、アゴニストペプチドの存在下であっても正常なシグナリングおよびＩＬ−２分泌を改変させ得るか否かを測定した。ＭＨＣ結合との競合からＴＣＲアンタゴニズムを区別するように設計された検定法でペプチド類似体を試験した。この検定法では、標的細胞を最適以下の用量のＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドにより前パルスした後、それらをβ−類似体およびＣＴＬとインキュベーションする。天然ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドの選択された最適以下濃度は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ滴定検定法（図７）に基いた１ｎＭであり、この濃度は、これらの共培養物において最大ＩＬ−２生産の５０％を誘導した。Ｉ−３細胞を、１ｎＭの親ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドによりパルスした。次いで、β−アミノ酸置換を滴定した。次いで、ＣＴＬクローンＧＡ４.２およびＢ３.１を、パルスしたＩ−３細胞との共培養状態に置き、インキュベーション後、この共培養物からの上清を除去し、ＣＴＬ認識検定法の場合と同様にＩＬ−２バイオアッセイ中に置いた。
【０１６７】
ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドへのβＣ３−アミノ酸の組込みにより、親ＳＩＩＮＦＥＫＬ応答を修飾し得る２種の類似体が生じた。Ｐ２のβ−Ｉｌｅを置換することにより、両クローンの相対ＩＬ−２分泌を増加させる類似体が生成した。先のＣＴＬ認識検定法では、Ｐ２におけるβ−Ｉｌｅの置換により、Ｂ３.１およびＧＡ４.２細胞の両方におけるＩＬ−２分泌が減少したが（図８、９）、しかしながらこのペプチドを親ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと併用投与すると、ＩＬ−２分泌はＳＩＩＮＦＥＫＬ基底応答より高く増強された（図１０）。逆に、第二類似体、Ｐ１におけるβ−Ｓｅｒは、Ｂ３.１の強いアンタゴニストであり、ＧＡ４.２の弱いアンタゴニストであった。先のＣＴＬ認識検定法において、β−Ｓｅｒペプチド類似体は、ＣＴＬクローンを比較的高い効率で刺激したが（図８）、親ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと併用投与されると、親ＳＩＩＮＦＥＫＬ応答の徹底したアンタゴニズムをもたらした。これら両類似体が両細胞系における応答を改変させたという事実は、β−類似体を用いることによるＴＣＲシグナリングの修飾は、モノクローナル的事象ではあり得ないことを立証している。親応答のこのアンタゴニズムは、両ＣＴＬクローンにおいて０.１ｐＭまでで誘発されることが観察された。結果は再現性があり、典型的データを図１０に示す。
【０１６８】
実施例６
マウス血清安定性に対するβＣ３−アミノ酸組込みの効果
β−アミノ酸はタンパク質分解に抵抗性を示すため、マウス血清中におけるペプチドの分解をモニターすることにより、タンパク質分解に対する安定性についてのペプチド修飾の影響を試験した。分解速度検定、次いでペプチド定量化のための対応するピーク領域を用いた逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による分析を実施した。親ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドは迅速に分解され、２時間後に採取されたペプチドは５％に過ぎなかった。βＣ３−類似体については、分解の量は置換の位置により大きく異なった。Ｐ３およびＰ４に置換を伴うペプチドについての安定化は制限されており、それぞれ８％および７％の収率であった（図１１）。Ｐ１が置換されている場合、初回ピークの１０％が回収された。しかしながら、Ｐ２、Ｐ５およびＰ８での置換により、タンパク質分解的切断に対する顕著な抵抗性が形成された。Ｐ５でのβ−ＰｈｅおよびＰ８でのβ−Ｌｅｕについては、２時間後初回ピークが２５％を越える割合で回収された。
【０１６９】
ＨＰＬＣ分析から、分解されたβ−Ｉｌｅ（Ｐ３）およびβ−Ｐｈｅ（Ｐ５）ペプチドのフラグメントが時間経過に伴いある程度蓄積しているのが観察された（図１２〜１４）。質量分析法およびＭＳ／ＭＳは、これらのペプチドフラグメントおよび親ＳＩＩＮＦＥＫＬフラグメントで実施された。結果をまとめると、血清タンパク質分解からの開裂点が明らかにされ、また、β−アミノ酸の組込みにより、置換位置での開裂が停止されることが示された。典型的結果は、図１２、１３および１４に示されている。
【０１７０】
実施例７
ＮＹ−ＥＳＯ−１
ＮＹ−ＥＳＯ−１、癌精巣抗原は、正常成人体組織ではなく、黒色腫、胸部、肺および膀胱癌を含む多くの異なるタイプの腫瘍で発現される。種々の癌によるその広範な発現に加えて、それはまた、患者において液性および細胞性の両免疫応答を誘発する高い免疫原性を示す。臨床的証拠は、ＮＹ−ＥＳＯ決定基に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球が悪性疾患を安定化させ、転移を根絶し得ることから、ＮＹ−ＥＳＯが理想的な腫瘍ワクチン成分となり得ることを示している。ＮＹ−ＥＳＯ決定基によるペプチドワクチン接種は非常に有望ではあったが、これらの試験は、途中でペプチド免疫化および腫瘍を殺す強いＣＴＬの誘発の度重なる失敗に随伴する安定性および生物学的利用能の問題を強調することになった。
【０１７１】
癌患者およびワクチン受容者におけるＮＹ−ＥＳＯに対する応答
ＮＹ−ＥＳＯは、病気が進行した癌患者において高い免疫原性を示し、患者における細胞性および液性応答は両方とも明白である。クラスＩおよびクラスII制限決定基は両方とも同定されており、ＮＹ−ＥＳＯまたはそれから誘導されるペプチドは有用なワクチン成分となっている。さらに、ＮＹ−ＥＳＯに対するＨＬＡ−Ａ２−制限応答は、特に充分に特性確認されており、抗原の１５５〜１６７領域に集中する。この領域からのペプチドは、現在ラドウィグ・インスティテュート・オブ・キャンサー・リサーチ（ＬＩＣＲ）での臨床試験で使用されている。現在までのところ、ＮＹ−ＥＳＯペプチドによるワクチン接種は、総じて腫瘍反応性の乏しい抗ペプチドＴＣＤ８を誘発している。これは、乏しい抗原利用能、ペプチド抗原のＮ−末端の開裂による不自然なＨＬＡ−Ａ２リガンド（すなわちクリプティックエピトープ）の生成およびＣｙｓおよびＭｅｔ残基の存在により起こり得るペプチドの酸化的分解に随伴していると思われる。ＮＹ−ＥＳＯタンパク質の重複領域からの３ペプチド（１５５−１６３ ＱＬＳＬＬＭＷＩＴ（配列番号９）、１５７−１６５ ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１０）、および１５７−１６７ ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番号１１））は、以前に黒色腫患者からの腫瘍反応性ＴＣＤ８により認識されるＨＬＡ−Ａ＊０２０１−制限決定基として報告されている。ＨＬＡ−Ａ２への結合性が乏しいにも拘わらず、腫瘍反応性ＴＣＤ８クローンは、主としてＥＳＯ１５７−１６７決定基を認識する。ＮＹ−ＥＳＯペプチドの免疫原性は、最初に癌患者の試験接種で評価され、その際コレラのペプチドの混合物がＮＹ−ＥＳＯ＋腫瘍のある患者に皮内投与された。ＥＳＯ１５７−１６７に対する激しいＣＤ８＋Ｔ細胞応答が観察され、ＥＳＯ１５７−１６５に対する反応性は後発で低レベルであると思われた。またＮＹ−ＥＳＯペプチド接種に対するＴＣＤ８応答を、ＨＬＡ−Ａ２／ペプチド４量体分析により調べたところ、アミノペプチダーゼ活性から生じたクリプティック決定基を含む幾つかの異なる重複エピトープに対して指向した異種応答が示された（図１５）。クリプティックＥＳＯ１５９−１６７決定基も同様であったが、これは腫瘍細胞により自然に提示されるとは思われない。また、正確なＥＳＯ１５７−１６５決定基を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球のみ、ＮＹ−ＥＳＯ＋腫瘍細胞における内在的にプロセッシングされた決定基を認識する。すなわち、ＥＳＯ１５７−１６５免疫性のみ高親和力抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球を生じさせると思われる。この短いペプチドが臨床的に関連したエピトープを構成するという観察結果はその重要性を強調している。
【０１７２】
ＮＹ−ＥＳＯ決定基の以前の修飾法による、強い腫瘍反応性細胞傷害性Ｔリンパ球の誘発の失敗
Ｃ末端Ｃｙｓ残基がさらなる慣用的アンカー残基により置換されたＥＳＯ１５７−１６５の類似体、すなわちＩ９、Ｌ９およびＶ９類似体が生成された。これらの類似体はＨＬＡ−Ａ２により有効に結合し、天然ＥＳＯ１５７−１６５ペプチドに対して産生した細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されるが、それらは高品質の抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球をインビボでは誘導しない。事実上、Ｃ−末端におけるＣｙｓの存在は、腫瘍細胞において内在的にプロセッシングされたＮＹ−ＥＳＯ決定基を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球産生にとっては重大なものである。このアミノ酸の存在は、両方とも免疫原としてのペプチド抗原の効力を低下させる酸化的損傷および２量体化に起因した処方物に伴う問題を誘発する。Ｃｙｓ残基および特に反応性チオールの正確な役割は、ＨＬＡ−Ａ２と複合体化したこのペプチドの最近解明された高解像能構造で可視化されており（次項参照）、アンカー相互作用、抗原結合クレフト立体配座に対するその影響および可能性のあるＴｃＲ相互作用をもたらす際におけるチオールの役割が特定されている。さらに、自然プロセッシングおよび提示されたＮＹ−ＥＳＯ決定基の生化学的性質は依然不明瞭であり、交差反応性細胞傷害性Ｔリンパ球の反応性パターンにより探索されたに過ぎない。腫瘍細胞系の表面および専門的ＡＰＣに存在する自然プロセッシングされたＮＹ−ＥＳＯ決定基の同一性が研究されている。
【０１７３】
ＮＹ−ＥＳＯペプチド接種で見られたように、タンパク質分解は、ペプチド免疫原が抗原提示細胞へ送達され得る際の正確さに影響し得、その結果、意図された免疫応答をより無益な反応性に向かって逸脱させ得るクリプティックエピトープの提示が誘導され得る。プロテアーゼ抵抗性および安定性をペプチドに基いたエピトープへ適切な送達体と連係的に遺伝子操作で組込む技法は、ワクチン設計における打開策を示すもので、ＡＰＣによる抗原性決定基の正確な提示を可能にする。ペプチドおよび有機化学、構造生物学およびそれに続く免疫応答の試験を組合わせる統合的方法は、エピトープに基いた免疫治療の合理的設計を可能にする。抗原性決定基の正確な送達は、抗腫瘍および抗ウイルス免疫性の誘導を意図した接種並びに自己免疫を改善または移植拒絶を遮断するための接種に直接関連した特性である。
【０１７４】
実験的設計
（１）ＮＹ−ＥＳＯから誘導されたペプチド決定基の提示を調べ、抗腫瘍免疫性に直接関連した新たなＨＬＡ−制限決定基を同定する。
【０１７５】
（２）接種試験に直接関連したＨＬＡ−Ａ２−ＮＹ−ＥＳＯペプチド複合体の高解像能構造を決定し、それらの構造とそれらの抗腫瘍活性誘導能力との相関関係を明らかにする。
【０１７６】
（３）ＮＹ−ＥＳＯペプチド−ＨＬＡ−Ａ２と複合体化した抗腫瘍ＴｃＲの構造を調べることにより、抗腫瘍免疫性を誘発する認識プロセスの重要なエレメントを特定する。
【０１７７】
（４）抗原性決定基の正確な提示を可能にする、本発明に基いた、プロテアーゼ抵抗性および安定性が改善された腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯに基く新規ペプチドミメティクスを設計する。
【０１７８】
（５）癌患者およびワクチン受容者並びにＨＬＡトランスジェニックマウスからの細胞系を用いたＮＹ−ＥＳＯに基くペプチドミメティクスの免疫原性試験を実施する。
【０１７９】
これらの試験では、多対立遺伝子により制限される自然プロセッシングされたＮＹ−ＥＳＯ決定基の生化学的性質を同定し、外生ペプチド抗原のプロセッシング必要条件を調べる。
【０１８０】
プロテアーゼ抵抗性および安定性ＮＹ−ＥＳＯ類似体の生成は、高い臨床的意義を有する。これらの設計にとって重要なのは、類似体設計用の構造的鋳型を形成することから、ＨＬＡ−ＥＳＯペプチド複合体の高解像能構造の生成（現在では常用的手順である）である。
【０１８１】
ＨＬＡ−Ａ２により制限されるＮＹ−ＥＳＯエピトープの高解像能構造
２.１オングストローム解像能までＥＳＯ１５７−１６５（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）に複合体化したＨＬＡ−Ａ２の構造が解明された（図１６）。ペプチドリガンドについての電子密度は明白であり、Ｍｅｔ−４、Ｔｒｐ−５、Ｔｈｒ−７およびＧｌｎ−８の溶媒接近性を明らかに示しており、これらの残基がＴｃＲ認識において鍵となる役割を演じることを示している。Ｃｙｓ−８残基は隠れており、疎水性Ｆポケットとの固定的相互作用に関与している。これは、チオールが結合にとって重大ではないことを示すが、この構造をＡ９、Ｖ９またはＩ／Ｌ９類似体と比較すると、抗原結合クレフト立体配座のモジュレーションにおいてチオールが演じる役割が当然明らかにされる。
【０１８２】
腫瘍細胞および専門的ＡＰＣにより提示されたＮＹ−ＥＳＯ決定基の同定
腫瘍細胞および専門的ＡＰＣにおいてプロセッシングされ、ＮＹ−ＥＳＯから提示されたペプチド決定基の正常な内在性アレイを調べる。接種後、腫瘍細胞により自然に提示されるＮＹ−ＥＳＯ決定基（残基１５７〜１６７、１５５〜１６３、１５７〜１６５にまたがる）およびペプチド接種の結果として提示されるに過ぎないクリプティック決定基（１５８〜１６７および１５９〜１６７）は、抗ペプチド細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導する。腫瘍細胞により自然に提示されるそれらのペプチド、特にＥＳＯ１５７−１６５決定基のみ臨床的に有用である。
【０１８３】
（ｉ）ＮＹ−ＥＳＯからの内在的にプロセッシングされたＨＬＡ−２結合ペプチドリガンドの単離
ＭＨＣクラスＩおよびクラスII結合ペプチドリガンドの単離方法は、大規模細胞培養（５×１０９〜１０１０細胞）、固定化特異的ｍＡｂを用いたデタージェント可溶化ＭＨＣ−複合体の単離、酸中における複合体の溶離、および限外濾過による解離したペプチドリガンドからのＭＨＣタンパク質の除去を含む。単離されたペプチドを、多次元逆相ＨＰＬＣにより分離し、フラクションを生物学的活性について分析（例、細胞傷害性Ｔリンパ球検定）し、個々のペプチドを質量分析法により同定する。ＨＬＡ型ヒトＮＹ−ＥＳＯ＋腫瘍細胞系からのペプチド溶離は、充分に確立された手順を使用する。質量（またはＭＳ／ＭＳフラグメント化）およびクロマトグラフィー保持時間により同定され得る既知ＨＬＡ−Ａ２−制限エピトープを、腫瘍細胞およびＡＰＣにおけるそれらの自然な提示について検索し、確認する。さらに、これらのフラクションの同一性を、細胞傷害性Ｔリンパ球系、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）または患者からのＰＢＭＣを用いて、常用的な細胞崩壊およびサイトカインに基く検定法を用いることにより機能的スクリーニングにかける。特異的ｍＡｂ ＢＢ７−２を用いてＨＬＡ−Ａ２−複合体を精製し、次いで、Ａ２−枯渇物質をさらなる精製ラウンドにかけて、他のクラスＩ（例、Ｂｗ４およびＢｗ６決定基に特異的なｍＡｂを有する）またはクラスII対立遺伝子（例、ｍＡｂ Ｌ２４３（ＤＲ）、ＳＰＶＬ３（ＤＱ）またはＢ.７２１（ＤＰ））について濃厚化する。これらの対立遺伝子からの溶離液を、ＨＬＡ−Ａ２−誘導物質に次ぐ優先事項として調べるが、新たな臨床的に有用な決定基が当然もたらされる。
【０１８４】
（ii）樹状細胞によるＮＹ−ＥＳＯ決定基のプロセッシング
これは、プールしていた個々の試料から調製された樹状細胞（１０〜２０軟層調製物は、約１０９の樹状細胞を生じる）またはＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスから調製された骨髄樹状細胞の抗原またはペプチド供給後に類似ラインに沿って進行する。樹状細胞を様々なＮＹ−ＥＳＯペプチドまたは組換えＥＳＯによりパルスする。組換えＥＳＯを用いた予備実験は、２０μｇ／ｍｌ負荷量２〜５×１０６の樹状細胞が特異的Ｔ細胞培養物を刺激し得ることを立証した。これを拡大することにより、ペプチド溶離に充分な物質が提供される。ＥＲ−被ターゲッティングＥＳＯ１５７−１６７を発現する構築物は、ＲＰ−ＨＰＬＣフラクションの溶離およびＴ細胞スクリーニングにより測定したところによるとＥＳＯ１５７−１６５およびＥＳＯ１５９−１６７を生成した。これらのフラクションをＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより調べることにより、これらのペプチドの同一性を確認する。Ｃｙｓ−９またはＭｅｔ−４修飾は、ペプチドの酸化的修飾の可能性があることから、特に興味深いのはこれらの修飾の試験であり、インビトロ検定前の還元剤によるペプチド／抗原提示細胞の処置は、細胞傷害性Ｔリンパ球認識における１０倍までの改善を示していた。さらに、樹状細胞のペプチドローディングの際の条件により、クリプティックＮＹ−ＥＳＯ決定基（すなわち、ＥＳＯ１５８−１６７およびＥＳＯ１５９−１６７）の提示が誘発される。この方法を用いて、これらのペプチドの類似体を、臨床的に直接関連性のあるＥＳＯ１５７−１６５およびＥＳＯ１５７−１６７決定基の生成能力について調べる。
【０１８５】
ＨＬＡ−Ａ２により制限されるＮＹ−ＥＳＯエピトープの高解像能構造および腫瘍細胞のＴ細胞認識の分子基礎
ＮＹ−ＥＳＯペプチド（１５７〜１６７、１５９〜１６７および１５５〜１６３）並びにＥＳＯ１５７−１６５のＣ末端Ｃｙｓ残基がより適切なＡ２アンカー残基ＩｌｅまたはＶａｌへと突然変異誘発されている以前に報告された高親和力類似体を伴うＨＬＡ−Ａ２の高解像能構造を解明する。ペプチドの固定におけるこのＣｙｓ残基の役割、長いクリプティックペプチドのクレフトにおけるペプチド結合域（register）の変化およびクレフト立体配座に対するそれらの影響は、類似体の設計にとって重要である。ＨＬＡ−Ａ２−ＥＳＯ１５７−１６７および他の自然プロセッシング決定基と抗腫瘍ＴｃＲの共複合体を調べる。これらの試験は、どのアミノ酸側鎖が重要な腫瘍認識エレメントを構成するかを確認し、模倣的設計の微調整を可能にする。
【０１８６】
自然提示ＮＹ−ＥＳＯ決定基に基いたペプチドミメティクスの構造誘導設計
ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープについて示されたものと類似したβ−アミノ酸スキャンを、ＥＳＯ１５７−１６５およびＥＳＯ１５７−１６７について実施する。タンパク質分解安定性、免疫現性決定基の生成および抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球−交差反応性に対するβ−アミノ酸置換の影響を調べる。Ｎ−末端トリミングに随伴するクリプティックエピトープの遊離を伴わないＥＳＯ１５７−１６５の提示を達成する。すぐ使える状態になっていれば他のエピトープも試験され得る。酸化感受性ＭｅｔおよびＣｙｓ残基の修飾を調べる。Ｃｙｓ残基をアイソスターＬ−アミノ酪酸（Ａｂｕ）またはＳｅｒと置換することによりＣ−末端修飾類似体を設計する。この構造は、この残基の合理的置換によりＭＨＣ−ペプチド複合体の忠実度を確実なものにさせ得、腫瘍細胞のＴｃＲ認識にとって重要なエレメントが維持される。
【０１８７】
ペプチドミメティクスの免疫原性試験
最初にヒト細胞傷害性Ｔリンパ球クローンおよび系、腫瘍浸潤性リンパ球またはＮＹ−ＥＳＯ＋腫瘍をもつ患者からのＰＢＭＣを用いることにより、ＮＹ−ＥＳＯ類似体の免疫原性の評価を実施する。基準は、腫瘍細胞およびＡＰＣへパルスされた類似体（例、Ｔ２、自己ＰＢＭＣ）の交差認識である。ＨＨＤ（Ｈ−２クラスＩノックアウトバックグラウンドでのＨＬＡ−Ａ２.１トランスジェニック）マウスは、ヒト免疫性の最良の予備臨床モデルを代表するため、免疫試験においてこれらのマウスを用いることにより、有望な類似体を免疫原性について試験する。ＨＨＤマウスをＮＹ−ＥＳＯおよび類似体ペプチドにより免疫化し、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を生じさせるそれらの有効性を、細胞傷害性、ＥＬＩＳＰＯＴ検定法および細胞内ＩＦＮ−γ検定法によりモニターする。同じく、ペプチド特異的ＨＬＡ−４量体を、これらの培養物から生成されたＣＤ８＋特異的リンパ球の評価およびそれらの活性化状態の表現型特性確認に用いる。ペプチド類似体に向かって誘導されたＴ細胞を、それらのＮＹ−ＥＳＯ陽性腫瘍細胞系の溶解能力について試験する。送達方法および免疫原の組成は両方とも、抗ペプチド細胞傷害性Ｔリンパ球の親和力および究極的にはそれらの抗腫瘍反応性に影響を及ぼす。さらに、保護的抗腫瘍免疫性を誘導するため、ＮＹ−ＥＳＯおよび他の腫瘍抗原からの多数の決定基を使用することが必要な場合もある。
【０１８８】
実施例８
方法および技術
可溶性クラスＩ ＨＬＡ−ペプチド複合体の製造
エシェリキア・コリ（E.coli）においてＭＨＣ重鎖（ｈｃ）の先端切除形態（アミノ酸残基１〜２７６）および完全長β２−ミクログロブリン（β２ｍ）を発現させることにより、特異的ペプチドリガンドを含む可溶性クラスＩヘテロ２量体を製造し、我々が他の箇所AP19で詳述した要領で各タンパク質を封入体から精製する。再び折りたたまれた複合体をゲル濾過クロマトグラフィーおよびアニオン交換クロマトグラフィーにより結晶学試験に適切な高純度レベルになるまで精製する。
【０１８９】
結晶化
タンパク質結晶化のハンギング・ドロップ法を一般的には使用するが、他の方法、例えばシッティング・ドロップおよび透析ボタン法も必要ならば利用可能である。ハンギング・ドロップ法では、マルチウェル組織培養プレートを、カバーグラスで被覆し、そこで０.７ｍｌの沈澱剤溶液全体にドロップ（等量の貯蔵溶液と混合したタンパク質溶液２〜１０μｌを含有）を懸濁および沈澱させる。沈澱剤としてポリエチレングリコールを用いることによりほとんどのＨＬＡ対立遺伝子は結晶化され、公表された条件をこれらのスクリーンについての出発点として使用する。一旦結晶が得られると、初回結晶化条件の微調整、ミクロおよびマクロ播種法を用いて、結晶のサイズおよび品質を高める。
【０１９０】
ＴｃＲ ｃＤＮＡの単離および発現プラスミドの構築
トリゾール（ライフ・テクノロジーズ）によりＡ２−ＮＹ−ＥＳＯ−制限抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球からＲＮＡを調製し、逆転写する。ＴｃＲαまたはβ鎖をコード化するＤＮＡを、特異的５'および３'プライマーの組合わせを用いたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により得、ｐＥＴ−３０発現ベクター（ノヴァゲン）へクローン化する。各ＤＮＡフラグメントからの予測された翻訳生成物は、先導配列を欠いており、鎖間ジスルフィド結合を通常形成する各αまたはβ鎖定常域システインの直前に翻訳は終結される。Ｃβ領域の１８６位にある不対システインをコード化するコドンを変えて、位置指定突然変異導入によりアラニンをコード化する。
【０１９１】
Ｘ線結晶学
これは、プロテイン・クリスタログラフィー・ユニット、モナシュ・ユニバーシティー、デパートメント・オブ・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジーで実施される。学内Ｘ線測定は全て、Ｘ線供給源としてヘリウムパージＯＳＭＩＣ集束ミラーを備えたリカグ・ＲＵ−３ＨＢＲ回転陽極発生器を用いて為される。Ｒ−ＡＸＩＳ ＩＶ＋＋検出装置を用いてデータを集める。オックスフォード凍結システムによる逆フィージオメトリーを用いて、データ収集前に結晶を常用手順により瞬間凍結（１００Ｋの温度に）させることにより、Ｘ線誘導放射線損傷の影響を低減化する。さらに、研究室からは、より強いＸ線が利用可能である合衆国のシンクロトロン施設への訪問を頻繁に行う。ＨＫＬプログラム総合ソフトウェアを用いることにより、三次元回折データを処理および解析し、ＳＣＡＬＥＰＡＣＫを用いてスケーリングする。さらに、精密化、モデルビルディング（構築）および解析段階を実施するためのグラフィック・ワークステーションの総合ソフトウェアがある。
【０１９２】
構造決定および精密化
分子置換により構造を解明し、ソフトウェアパッケージ「Ｏ」内のツールを用いてモデルビルディングを実施する。最終モデルを得るためには、モデルビルディングおよび精密化の反復ラウンドが要求される。精密化は、ＣＮＳまたはＣＣＰ４総合ソフトウェア内のプログラムを用いて続行される。精密化の進行は、自由Ｒ値によりモニターされる。一般的規則として、モデルの精密化時にはバルク溶媒補正が適用される。Ｂ因子精密化（全般的に、グループ化されたＢ因子または個々のＢ因子）の選択は、構造の解像能により異なる。例えばＰＲＯＣＨＥＣＫ、ＯＯＰＳ、３Ｄ−ＰＲＯＦＩＬＥおよびＷＨＡＴＣＨＥＣＫなどのプログラムにより、構造の有効性を試験する（Dodson et al.（１９９８）概説）。構造を表示および分析するのに多数のソフトウェアパッケージが利用可能である（ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ、ＲＩＢＢＯＮＳ、Ｍｉｄａｓ Ｐｌｕｓ、ＰＲＯＭＯＴＩＦ、ＣＣＰ４内のプログラム）。
【０１９３】
ＨＬＡ結合の評価
ＴＡＰ−欠損ＡＰＣ、例えばＴ２およびトランスフェクタントにおける立体配座決定基の安定化に基いたエピトープ安定化検定法を用い、並びに組換えＨＬＡ、β２−マイクログロブリンおよびペプチドのマイクロアセンブリー検定法を用い、溶離ペプチドの質量分析法またはリードアウトとして立体配座感受性ｍＡｂを用いる捕獲ＥＬＩＳＡを用いてＨＬＡ結合を調べる。
【０１９４】
インビトロおよびインビボにおけるＣＤ８エピトープの評価
インビトロ試験について、ヒト細胞系は、ＮＹ−ＥＳＯペプチドを接種された患者およびＬＩＣＲの様々な支部の同僚により以前に発表されたクローンからのものを使用し、５１Ｃｒ−放出細胞溶解実験および細胞内ＩＦＮ−γ染色実験を用いることによりこの試験で生成された様々な類似体の認識力について試験する。
【０１９５】
インビボ試験については、ＨＨＤ（Ｈ−２クラスＩノックアウトバックグラウンドでのＨＬＡ−Ａ２.１トランスジェニック）マウス（ＬＩＣＲで入手可能）は、ヒト免疫性の最良の予備臨床モデルを代表するため、これらのマウスを免疫化試験で使用する。ＨＨＤマウスをＮＹ−ＥＳＯおよび類似体ペプチド（適切なＴヘルパーエピトープの添加により最初にＩＦＡで処方された）により免疫化し、細胞傷害性Ｔリンパ球応答を生じさせるそれらの有効性を、細胞傷害性、ＥＬＩＳＰＯＴ検定法および細胞内ＩＦＮ−γ検定法によりモニターする。同じく、ペプチド特異的ＨＬＡ−４量体を、これらの培養物から生成されたＣＤ８＋特異的リンパ球の評価およびそれらの活性化状態の表現型特性確認に用いる。ペプチド類似体に向かって誘導されたＴ細胞を、細胞溶解検定法においてそれらのＮＹ−ＥＳＯ陽性腫瘍細胞系の溶解能力について試験する。
【０１９６】
実施例９
クロム放出検定法
結果は、標準クロム放出検定法（図１７）および細胞内サイトカイン染色検定法（図１８）に示されている。
【０１９７】
７日前に完全フロイントアジュバント中の１００μｇのＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＳＩＩＮβＦＥＫＬまたはＳＩＩＮＦＥＫβＬで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスからエフェクター細胞を入手した。トリス緩衝塩化アンモニウムでの処理により、脾臓細胞から赤血球を枯渇させ、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスからの照射したＳＩＩＮＦＥＫＬパルス脾臓細胞を用いて抗原特異的Ｔ細胞にインビトロで１３日間再刺激を加えた。
【０１９８】
ＣＴＬ検定法で使用した標的細胞は、ＥＬ４（Ｈ−２ｂ）胸腺腫細胞またはＥＧ−７（天然ＳＩＩＮＦＥＫＬ決定基の生理学的提示を容易にする卵アルブミン抗原でトランスフェクションしたＥＬ４）であった。２００μＣｉの５１Ｃｒ（アマシャム）を含むＲＰＭＩ中５％のＦＣＳｖ／ｖ２００μＬに再懸濁することにより細胞を標識し、３７℃で２時間インキュベーションした。３回細胞を洗浄後、ＲＰＭＩにより濃度を１０５細胞／ｍＬに調節し、細胞を１００μＬアリコートで９６ウェルＵ底ＴＣプレートに分配した。エフェクター細胞の１００μＬアリコートの系列希釈物をトリプリケイトで加えた。３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベーション後、各ウェルの上清２５μＬを、ルーマプレート（パッカード）に採取し、γ計数管（パッカード・トップカウントＮＸＴ）により５１Ｃｒについて検定した。培地のみとインキュベーションされた標的細胞を含むウェルにおいて自然放出されたｃｐｍを引くことにより、各エフェクターでの特異的５１Ｃｒ放出：標的比を計算した。次いで、これらの値を、標的細胞を１％トリトンＸ−１００中でインキュベーションしたウェルからの試料において放出された５１Ｃｒを表すｃｐｍのパーセンテージとして表した（全放出可能ｃｐｍ）。自然放出の範囲は全放出可能ｃｐｍの１〜１０％であった。データは、トリプリケイト培養物から得られた値の平均として示されている。
【０１９９】
ペプチド構造
エシェリキア・コリ（Escherichia coli）のＢＬ２１（ＲＩＬ）株を用いて報告された要領［Garboczi, D.N., Madden, D.R. & Wiley, D.C.  Five viral peptide-HLA-A2 co-crystals.  Simultaneous space group determination and X-ray data collection（５ウイルスペプチド−ＨＬＡ−Ａ２共結晶、同時空間群測定およびＸ線データ収集）、J Mol Biol 239, ５８１−７(１９９４)］で、組換えＨ−２Ｋｂ分子をエシェリキア・コリ（E.coli）から封入体として発現させた。先導配列、貫膜領域および細胞溶解テイル（成熟タンパク質配列のアミノ酸１〜２７６）の除去により、クラスＩ重鎖を修飾した。この領域をコード化するｃＤＮＡを、細菌性発現ベクターｐＥＴへライゲーションし、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）のＢＬ２１（ＲＩＬ）株へ形質転換した。０.６のＡ６００で、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により培養物を１２時間誘導し、細菌を５０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ８.０、１％トリトンＸ−１００、１％のデオキシコール酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＤＴＴに溶解した。５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０.５％トリトンＸ−１００、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８.０で洗浄し、また５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＮａＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８.０で洗浄後、封入体を遠心分離により分離し、次いで、プロテアーゼ阻害剤１μｇ／ｍｌペプスタチンＡおよび２００μＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む２５ｍＭのＭＥＳ、８Ｍ尿素、１０ｍＭのＮａＥＤＴＡ、ｐＨ６.０に可溶化した。組換えタンパク質（６０ｍｇＫｂ重鎖および２０ｍｇのβ２ｍ）を、４℃の０.１Ｍのトリス、２ｍＭのＥＤＴＡ、４００ｍＭのＬ−アルギニン−ＨＣｌ、０.５ｍＭの酸化グルタチオン、５ｍＭの還元グルタチオンｐＨ８.０中、２４時間にわたって３Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび１０ｍＭのＮａＥＤＴＡ、ｐＨ４.２の存在下３０ｍｇのペプチド（ＳＩＩＮβＦＥＫＬおよびＳＩＩＮＦＥＫβＬ）により再フォールディング（折りたたみ）した。再フォールディング後、６〜８０００ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（スペクトラム、カリフォルニア、米国）を用いて、タンパク質を一晩ミリ（Milli）Ｑに対して透析した。ＤＥ５２カラム（ホワットマン、メイドストーン、ケント、英国）でのイオン交換によりタンパク質を濃縮し、それに続いてスーパーデックス７５ｐｇゲル濾過カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ウプサラ、スウェーデン）でのサイズ排除およびＭｏｎｏＱ ＨＲ５／５カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）での最終的イオン交換により精製した。定量的分析は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたＢＳＡタンパク質標準との比較に基いていた。結晶化試験で使用するためタンパク質を３ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０２００】
結晶化試験は全て、２４ウェル組織培養プレートを用いるハンギング・ドロップ蒸気拡散技術を用いて実施された。等量の３ｍｇ／ｍｌＫｂ−ペプチド複合体を貯蔵緩衝液（０.１Ｍのカコジル酸ナトリウム、０.２Ｍの酢酸カルシウム、１４％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００）と混合することにより、結晶を成長させ、室温で１６％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ４０００条件中において成長させた結晶から顕微播種した。各ウェルは、１ｍｌの貯蔵緩衝液を含んでいた。結晶は、単位格子サイズａ＝６６.３１オングストローム、ｂ＝８９.４６オングストローム、ｃ＝８９.２６オングストローム、β＝１１１.４６°の空間群Ｐ２１に属している。逆フィー・ジオメトリーを用いて２.０オングストロームデータセットを集め、処理し、プログラムのＨＫＬ総合ソフトウェアを用いてスケーリングした。構造を精密化し、明白な分子置換ソリューションを得た。結合ベータペプチドについての電子密度は非常に明確であった（図１９〜２１）。
【０２０１】
細胞内サイトカイン染色
１．ＡＰＣを、１００μｌ／ウェルの最終容量において要求された密度で平板培養した。
２．エフェクター細胞についてもクロム放出の場合と同様に実施した。
３．Ｔ細胞を、丸底９６−ウェルプレートにおいて、１ウェルにつき１００ｍｌ（２×１０５／ウェル）で、ＲＦ−１０培地に再懸濁した。
４．ブレフェルジンＡを各ウェルに加えて最終５〜１０ｍｇ／ｍｌとした。
５．さらに３〜４時間インキュベーションすることにより、活性化特異的Ｔ細胞におけるＥＲにｇＩＦＮ／ＩＬ−２を蓄積させた。
６．全細胞を採取し、３０〜６０分間氷上で抗ＣＤ８ａにより染色した。
７．Ｒ.Ｔ.で〜２０分間、細胞をＰＢＳ中１％のパラホルムアルデヒドにより固定した。
８．細胞を０.１％サポニン溶液で洗浄した。
９．暗所で１５分間インキュベーションした。
１０．細胞を遠心分離により沈降させ、０.５％サポニン洗浄液に再懸濁した。
１１．氷上で６０分間０.１〜０.５％サポニン含有ＰＢＳ（最終濃度、カルビオケム、＃５５８２５５）中１：１００の希釈率でｇＩＦＮまたはＩＬ−２について細胞内染色
１２．無傷細胞集団中、ＣＤ８＋細胞でのゲーティングによりＦＡＣＳ分析を２色について実施した。
【０２０２】
当業者であれば、本明細書に記載された発明に対し、具体的に記載したもの以外の変形および修飾が加えられることは容易に理解できるはずである。本発明は、それら全ての変形および修飾も包含するものと理解すべきである。本発明はまた、この明細書で個々に、または集合的に言及または指示された段階、特徴、組成物および化合物を全て、また上記段階または特徴のいずれか２つまたはそれ以上のあらゆる組合わせも全て包含する。
【０２０３】
ビブリオグラフィー：
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【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】図１は、Ｈ２−Ｋｂ特異的モノクローナル抗体Ｙ−３によるＲＭＡ−Ｓ細胞の染色をグラフで表したものである。データは、蛍光強度に対する細胞数として示されている。
【図２】図２は、ＣＤ８分子に特異的なモノクローナル抗ＣＤ８抗体によるＣＴＬクローンの染色をグラフで表したものである。データは、蛍光強度に対する細胞数として示されている。
【図３】図３は、Ｈ２−Ｋｂ特異的モノクローナル抗体Ｙ−３によるＩ−３細胞の染色をグラフで表したものである。データは、蛍光強度に対する細胞数として示されている。
【図４】図４は、増加量の外因性ＩＬ−２での３Ｈ−チミジン取込により測定された細胞増殖をグラフで表したものである。データは、ＣＴＬＬ−２細胞のＩＬ−２依存性を示す。
【図５】図５は、βＣ３−アミノ酸置換および親ペプチドによるＲＭＡ−Ｓに対するＫｂ安定化をグラフで表したものである。ペプチドのＮ−末端領域での置換により（ａ）Ｋｂ安定化は妨げられ、残りの中間およびＣ−末端における置換により（ｂ）均等の安定化またはその増加がもたらされた。示されたペプチドの系列希釈物を、冷却誘導ＲＭＡ−Ｓ細胞（２６℃）へパルスし、次いで３７℃でパルスした。表面でのＫｂの安定化を、モノクローナル抗体Ｙ−３を用いて検出し、フローサイトメトリーにより分析した。データは、ペプチド濃度に対する最大ＳＩＩＮＦＥＫＬ応答のパーセンテージとして示されている（対数目盛）。
【図６】図６は、抗体２５−Ｄ１.１６を用いた、βＣ３−アミノ酸置換および親ペプチドによるＲＭＡ−Ｓに対するＫｂ安定化をグラフで表したものである。β−アミノ酸の置換により、Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異抗体２５−Ｄ１.１６について親和力減少がもたらされた。データは、ペプチド濃度に対する最大野生型応答のパーセンテージとして示されている（対数目盛）。
【図７】図７は、各ＣＴＬクローンに対する親ＳＩＩＮＦＥＫＬの滴定のグラフを示す。予想通り、ＨＳＶ２.３対照は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを認識しなかった。データは、ペプチド濃度に対する放射能計数として示されている。
【図８】図８は、ＣＴＬクローンによる親ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびβＣ３−アミノ酸類似体の認識力のグラフを示す。Ｐ２での置換により、ＧＡ４.２以外の全クローンによる認識力は顕著に失われた。Ｐ６では、ベンジル側鎖保護基を含むβＣ３−Ｇｌｕは、完全にＣＴＬ認識力を破壊した。ペプチドをＩ−３細胞へパルスし、次いでＣＴＬと共培養した。次いで、上清を除去し、ＩＬ−２バイオアッセイに加えた。データは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ応答のパーセンテージとして示されている（対照クローン、ＨＳＶ２.３の場合、データは、ＳＳＩＥＦＡＲＬ応答のパーセンテージとして示されている）。
【図９】図９は、ＣＴＬクローンＧＡ４.２による親ＳＩＩＮＦＥＫＬおよびβＣ３−アミノ酸類似体の認識力のグラフを示す。
【図１０】図１０は、ＣＴＬクローン（ａ）ＧＡ４.２および（ｂ）Ｂ３.１を用いたアンタゴニスト検定のグラフを示す。β−類似体を、最適以下の濃度の親ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドと併用投与する（断続線）。次いで、ＣＴＬと共培養したパルスＩ−３細胞の上清を、ＩＬ−２バイオアッセイで使用する。Ｐ１位での置換により、Ｂ３.１の強いアンタゴニズムおよびＧＡ４.２の弱いアンタゴニズムが誘発された。Ｐ２での置換により、両クローンで生じる超アゴニスト効果がもたらされた。両類似体は、非常に低濃度で応答を伝達したことから、ＴＣＲを通したシグナリングの改変には非常に低レベルの類似体ペプチドで充分であることが示された。
【図１１】図１１は、マウス血清で２時間後に採取されたペプチドのパーセンテージを示す血清安定度検定のグラフを示す。Ｐ５およびＰ８が修飾されたペプチドは、最も安定した分子を生産した。
【図１２】図１２は、波長２１４ｎｍでのＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターされた２時間後の親ＳＩＩＮＦＥＫＬ分解のグラフを示す。クロマトグラムは、親ペプチドのフラグメント化を示す。ＭＳ結果は、酵素分解についての開裂部位を示している。開裂は、＊の印を付した結合で行なわれる：Ｓ＊Ｉ＊Ｉ＊ＮＦ＊Ｅ＊ＫＬ。
【図１３】図１３は、０、２および１２時間の時点におけるＰ５でのβ−Ｐｈｅを含むペプチドの分解のグラフを示す。ｔ＝０では、完全ペプチドが見られる。ｔ＝２時間では、完全ペプチドは減少し、他のフラグメントが見られる。ｔ＝１２では、完全ペプチドは消失し、フラグメントのみ残された。フラグメントのＭＳは、開裂が、親ペプチドの場合のようにはＰ５アミノ酸の後には起こらなかったことを示す。＊は、遮断された開裂部位：Ｓ＊Ｉ＊Ｉ＊ＮＦ＊Ｅ＊ＫＬを示す。
【図１４】図１４は、０および２時間の時点におけるＰ３でのβ−Ｉｌｅを含むペプチドの分解のグラフを示す。ｔ＝０では、完全ペプチドが見られる。ｔ＝２時間では、完全ペプチドの大部分は消失し、３つの主要フラグメントを伴う。フラグメントのＭＳは、親ペプチドの開裂部位である、Ｐ２−Ｐ３結合に開裂が無いことを示した。＊は、遮断された開裂部位：Ｓ＊Ｉ＊Ｉ＊ＮＦ＊Ｅ＊ＫＬを示す。
【図１５】図１５は、ＮＹ−ＥＳＯ１５７−１６５および１５７−１６７（１から採取）でのワクチン接種後における天然およびクリプティックＮＹ−ＥＳＯ決定基の提示の図を示す。
【図１６】図１６において、Ａ）ＨＬＡ Ａ０２０１／ＥＳＯ１５７−１６５複合体が立方晶形態で結晶化している図を示し、Ｂ）ＥＳＯ１５７−１６５ペプチドの２.１オングストローム電子密度省略マップを示し、Ｃ）ＨＬＡ−Ａ２抗原結合クレフトに結合したＥＳＯ１５７−１６５のカッタウェイ図を示し、露出されたＭｅｔ−４、Ｔｒｐ−５、Ｔｈｒ−７、Ｇｌｎ−８を強調している。
【図１７】図１７は、インビボ初回免疫に従って実施されたクロム放出検定法を示す。
【図１８】図１８は、ＣＴＬ−ラインの細胞内サイトカイン染色のグラフを示す。
【図１９】図１９は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド立体配座の図を示す。
【図２０】図２０は、ＳＩＩＮ−βＦ−ＥＫＬペプチド立体配座の図を示す。
【図２１】図２１は、ＳＩＩＮＦＥＫ−βＬペプチド立体配座の図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2005537325.tif 000037
【図２１】
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【国際調査報告】
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