(57)【要約】核酸又はタンパク質を用いるナノスケール反応を準備するための方法を提示する。核酸は、反応チャンバ、代表的にはキャピラリーの内面で、飽和的だが可逆的に捕獲される。過剰な核酸が除去されて、反応は、キャピラリー内で直接実施される。タンパク質は反応チャンバ、代表的にはキャピラリーの修飾内面に特異的かつ飽和的に捕獲される。過剰なタンパク質が除去されて、反応は、キャピラリー内で直接実施される。本発明の方法を達成するためのデバイス、及び核酸又はタンパク質を含むハイスループット反応のための方法を利用するように有利に設計されたシステムも提供される。
2005525797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
規定量の核酸を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、当該方法が、
規定量の核酸を有するキャピラリー管に酵素反応混合物を導入することを含み、
上記反応混合物がオリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ及び１種以上のジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を含んでおり、
過剰量の核酸とカオトロピック剤を含む溶液をキャピラリー管の内面に核酸が内面に飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによって核酸が内面に直接飽和的に結合しており、過剰の核酸がキャピラリー管から除去されており、
規定量の核酸を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施すること
を含む方法。
【請求項２】
酵素反応混合物を１以上のサーマルサイクルに付す工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
過剰量の核酸を除去する工程の後に、キャピラリー管の内面を洗浄する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
キャピラリー管の内面を洗浄する工程の後に、キャピラリー管の内面を乾燥する工程をさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
酵素反応混合物を毛管現象によってキャピラリー管に導入する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
酵素反応を実施する工程の後に、反応生成物を排出する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
酵素反応を実施する工程の後に、未取込みのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を除去する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
反応生成物とゲル濾過媒体との接触によって、未取込みのｄｄＮＴＰを除去する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
酵素反応を実施する工程の後に、未取込みのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を不活性化する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
未取込みのｄｄＮＴＰが、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を用いて反応生成物を処理することによって不活性化される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
酵素反応混合物に含まれるジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が、Ａ単独、Ｃ単独、Ｇ単独、Ｔ単独、ＡとＣ、ＡとＧ、ＡとＴ、ＣとＧ、ＣとＴ、ＧとＴ、ＡとＣとＧ、ＡとＣとＴ、ＡとＧとＴ、ＣとＧとＴ及びＡとＣとＧとＴからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が蛍光発色団と連結している、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
蛍光発色団が塩基特異的である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
蛍光発色団が、フルオレセイン、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボキシローダミン及び５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン−６−Ｇ、テトラメチルローダミン及びローダミンＸからなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
蛍光発色団がエネルギー移動蛍光発色団である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
プライマーが核酸の複数の隣接ヌクレオチドに相補的であって、プライマーが核酸に存在する同定すべきヌクレオチドの直前で終わる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
プライマーが蛍光発色団と連結している、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
蛍光発色団が、フルオレセイン、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボキシローダミン及び５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン−６−Ｇ、テトラメチルローダミン及びローダミンＸからなる群から選択される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
蛍光発色団がエネルギー移動蛍光発色団である、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
酵素反応生成物を解析して、プライマーの３’末端に取込まれたｄｄＮＴＰを同定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
酵素反応生成物を解析して核酸に存在する塩基を同定する工程が、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、ＳＥＬＤＩ質量分析、蛍光発光検出、走査型共焦点レーザー誘導蛍光検出、蛍光偏光（ＦＰ）及び解析用マイクロチップ解析からなる群から選択される技術を用いて実施される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ｄｄＮＴＰと連結した蛍光発色団の発光スペクトルから、プライマーの３’末端に取込まれたｄｄＮＴＰを同定する工程をさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
プライマーの３’末端に取込まれたｄｄＮＴＰの同定によって、核酸に存在するヌクレオチドを同定する工程をさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸のヌクレオチドの同定によって、第二の核酸に存在するヌクレオチドを同定する工程をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ヌクレオチドの種類が、核酸における一塩基多型（ＳＮＰ）を規定する、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
ＳＮＰがヘテロ接合性ＳＮＰである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ＳＮＰがホモ接合性ＳＮＰである、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオチドの種類が、コンピューターデータ構造のデータとして記憶される、請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
コンピューターデータ構造がコンピューター読取可能な媒体で実現される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性である、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
核酸が、ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応で生成したＤＮＡ、逆転写反応で生成したＤＮＡ、真核生物細胞から単離したＤＮＡ、原核生物細胞から単離したＤＮＡ、古細菌細胞から単離したＤＮＡ、真菌細胞から単離したＤＮＡ、植物細胞から単離したＤＮＡ、ウイルスから単離したＤＮＡ、バクテリオファージから単離したＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、エピソームのＤＮＡ、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、真核生物細胞から単離したＲＮＡ、原核生物細胞から単離したＲＮＡ、古細菌細胞から単離したＲＮＡ、真菌細胞から単離したＲＮＡ、植物細胞から単離したＲＮＡ、ウイルスから単離したＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、細菌の凍結グリセロールストックから得た核酸、及び固体増殖培地で増殖した細菌コロニーから得た核酸からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３４】
核酸がＤＮＡであり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＤＮＡを調製する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３５】
ポリメラーゼ連鎖反応に用いる鋳型がゲノムＤＮＡである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
ＰＣＲでＤＮＡを調製する工程の後に、一本鎖Ｄｎａｓｅを用いて未取込みのＰＣＲプライマーを除去する工程をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
ＰＣＲでＤＮＡを調製する工程の後に、ホスファターゼを用いて未取込みのｄＮＴＰを除去する工程をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
ＰＣＲでＤＮＡを調製する工程の後に、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）及びエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いてＤＮＡを処理する工程をさらに含む、請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
過剰量のＤＮＡからキャピラリー管の内面にＤＮＡを直接飽和的に結合させ、過剰量を除去する工程の後に、キャピラリーの内面を洗浄することによって未取込みのＰＣＲプライマー及びｄＮＴＰを除去する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４０】
酵素反応が約１０〜５０００ナノリットルの反応体積で実施される、請求項１記載の方法。
【請求項４１】
キャピラリー管が、空間的アドレス可能な複数のキャピラリー管のアレイに存在する、請求項１記載の方法。
【請求項４２】
空間的アドレス可能な複数のキャピラリー管のアレイが、２個、４個、８個、１２個、１６個、２４個、３２個、４８個、６４個、９６個、１２８個、１９２個、２８８個、３８４個、４８０個、５７６個、６７２個、７６８個、８６４個、９６０個及び１５３６個のキャピラリーからなる群から選択される多数のキャピラリーを有するアレイである、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
請求項１記載の方法によって規定量の核酸を用いて生成した酵素反応生成物。
【請求項４４】
一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に有効な酵素反応に使用するため第一及び第二のサンプルから実質的に同じ量の核酸を得る方法であって、当該方法が、
第一のサンプル由来の核酸とカオトロピック剤を含む第一の溶液を第一のキャピラリー管の内面に核酸が内面に飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによって核酸を内面に直接飽和的に結合させる工程、及び
第二のサンプル由来の核酸とカオトロピック剤を含む第二の溶液を第二のキャピラリー管の内面に核酸が内面に飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによって核酸を内面に直接飽和的に結合させる工程、
を含んでおり、
第一及び第二のキャピラリー管の内面がそれぞれ実質的に同様の第一及び第二のサンプルの由来の核酸を飽和的に結合させることができ、かつ
核酸に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に有効な酵素反応に、第一又は第二のキャピラリー管のいずれか又は両方の核酸を用いること
を含む方法。
【請求項４５】
酵素反応が、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ遺伝子型決定（ＯＬＡ）反応、ミニシークエンシング反応、ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子型決定反応、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ反応、色素標識オリゴヌクレオチドライゲーション反応、パイロシークエンシング反応、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応及び一塩基伸長（ＳＢＥ）反応からなる群から選択される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
酵素反応が一塩基伸長反応である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
酵素反応生成物を解析する工程をさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
請求項４４記載の方法によって規定量の核酸を用いて生成した酵素反応生成物。
【請求項４９】
一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に有効な規定量の核酸を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、当該方法が、
規定量の核酸を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施することを含み、
過剰量の核酸とカオトロピック剤を含む溶液をキャピラリー管の内面に核酸が内面に飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによって核酸が内面に直接飽和的に結合しており、過剰の核酸がキャピラリー管から除去されており、
酵素反応が、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ遺伝子型決定（ＯＬＡ）反応、ミニシークエンシング反応、ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子型決定反応、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ反応、色素標識オリゴヌクレオチドライゲーション反応、パイロシークエンシング反応、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応及び一塩基伸長（ＳＢＥ）反応からなる群から選択される、方法。
【請求項５０】
酵素反応が一塩基伸長反応である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
酵素反応生成物を解析する工程をさらに含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
請求項４９記載の方法によって規定量の核酸を用いて生成した酵素反応生成物。
【請求項５３】
規定量の酵素を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、当該方法が、
規定量の酵素を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施することを含み、
過剰量の酵素を含む溶液をキャピラリー管の内面に酵素が内面に飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによって酵素が内面に直接飽和的に結合しており、過剰の酵素がキャピラリー管から除去されている方法。
【請求項５４】
規定量の酵素を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、当該方法が、
規定量の酵素を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施することを含み、
過剰量の酵素を含む溶液をキャピラリー管の修飾内面に酵素が修飾内面に特異的かつ飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによって酵素が内面に特異的かつ飽和的に結合しており、過剰の酵素がキャピラリー管から除去されている方法。
【請求項５５】
キャピラリーの内面の修飾がシラン処理で実施される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
キャピラリー管の修飾内面が官能基で修飾される、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
官能基がアミノ基、ピリジルジチオ基、ジスクシンイミジルスベレート基、オキシラン基、ストレプトアビジン分子及び界面活性ヒドロゲルからなる群から選択される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
結合した酵素が官能基に共有結合される、請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
結合した酵素が、官能基に非共有結合的に結合される、請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
複数の酵素がキャピラリーの修飾内面に均一に配向している、請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
過剰量のチオピリドンの添加によって、飽和的に結合した酵素を遊離する工程をさらに含む、請求項５４記載の方法。
【請求項６２】
酵素が、プロテアーゼ、配列特異的プロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、ペプシン、エンドプロテイナーゼ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＰｒｏ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、Ｖ８プロテアーゼ、グリコシダーゼ、βガラクトシダーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸モノオキシゲナーゼ、リガーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、メチラーゼ、ポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ酵素、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ＤＮＡジャイレース、トポイソメラーゼ、ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、Ｓ１エキソヌクレアーゼ、マング・ビーンヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ及びウレアーゼからなる群から選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項６３】
酵素反応を実施する工程の前に、キャピラリーを基質を含む溶液で満たす工程をさらに含む、請求項５４記載の方法。
【請求項６４】
キャピラリーを基質を含む溶液で満たす工程が、毛管現象によって実施される、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
溶液が約１００〜２０００ナノリットルの容積からなる、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
酵素反応が等温的に実施される、請求項５４記載の方法。
【請求項６７】
キャピラリーが空間的アドレス可能なアレイで存在する、請求項５４記載の方法。
【請求項６８】
酵素反応が１以上の追加の酵素反応と平行して実施される、請求項５４記載の方法。
【請求項６９】
酵素反応を実施する工程の後に、酵素反応生成物を解析する工程をさらに含む、請求項５４記載の方法。
【請求項７０】
酵素反応生成物を解析する工程が、質量分析、キャピラリー電気泳動、蛍光スキャンニング、及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）からなる群から選択される技術を用いて実施される、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
酵素反応生成物を解析する工程の前に、生成物を蛍光標識する工程をさらに含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
規定量のタンパク質を用いてキャピラリー管内でタンパク質に基づく反応を実施する方法であって、当該反応が、
規定量のタンパク質を用いてキャピラリー管内でタンパク質に基づく反応を実施することを含み、
過剰量のタンパク質を含む溶液をキャピラリー管の内面にタンパク質が内面に飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによってタンパク質が内面に飽和的に結合しており、過剰のタンパク質がキャピラリー管から除去されている方法。
【請求項７３】
規定量のタンパク質を用いてキャピラリー管内でタンパク質に基づく反応を実施する方法であって、当該方法が、
規定量のタンパク質を用いてキャピラリー管内でタンパク質に基づく反応を実施することを含み、
過剰量のタンパク質を含む溶液をキャピラリー管の修飾内面にタンパク質が修飾内面に特異的かつ飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによってタンパク質が内面に特異的かつ飽和的に結合しており、過剰のタンパク質がキャピラリー管から除去されている方法。
【請求項７４】
タンパク質が非触媒性タンパク質である、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
非触媒性タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、プロテインＧ、プロテインＡ及びストレプトアビジンからなる群から選択される、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
タンパク質に基づく反応が分子結合反応である、請求項７３記載の方法。
【請求項７７】
分子結合反応の基質がタンパク質、酵素、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂質及び他の化学物質からなる群から選択される、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
第一及び第二のサンプルから実質的に同じ量のタンパク質を獲得する方法であって、
第一のサンプル由来のタンパク質を含む溶液を第一のキャピラリー管の修飾内面にタンパク質が修飾内面に飽和的かつ特異的に結合するのに十分な時間接触させることによってタンパク質を修飾内面に直接飽和的かつ特異的に結合させる工程、及び
第二のサンプル由来のタンパク質を含む溶液を第二のキャピラリー管の修飾内面にタンパク質が修飾内面に飽和的かつ特異的に結合するのに十分な時間接触させることによってタンパク質を修飾内面に直接飽和的かつ特異的に結合させる工程
を含み、
第一及び第二のキャピラリー管の修飾内面がそれぞれ実質的に同様の第一及び第二のサンプルの由来のタンパク質を飽和的かつ特異的に結合させることができるものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に属し、核酸又はタンパク質を用いて小規模反応を調製・実施するための方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
合衆国連邦政府の資金援助を受けたヒューマンゲノムプロジェクトの当初の目的は、ヒトゲノムの１０倍の配列をカバーすることを２００５年までに完了することであった。進行速度の劇的な加速によって、既に部分的ドラフトが発表されている。しかし、この業績によって、迅速で安価なＤＮＡ配列決定の必要性が減ったわけではなく、核酸の迅速で安価な配列決定の必要性が喚起された。ドラフトのヒトゲノム配列の完成によって、プロテオームと総称されるゲノムにコードされたタンパク質の完全なコレクションを直接解析するための方法及び装置の必要性も喚起された。
【０００３】
ＤＮＡ配列の必要性を考慮すれば、細菌、植物及び動物を始めとする非ヒト生物体のゲノムを配列決定することの重要性は一段と増している。
【０００４】
より詳細には、分子病理学及び薬理ゲノム学の拡大中の分野では、個々の患者からの複数の遺伝子の再配列決定を必要とする。分子病理学は、特定の遺伝子における変異を特定することによって、ヒト疾患についての診断に、しばしば予後の設計に関する。薬理ゲノム学とは、全てのヒト集団に存在する対立遺伝子の相違が、薬物に対する個体の治療応答、及び副作用に対する感受性にどのように影響するかを理解するということをいう。
【０００５】
個々の患者由来の遺伝子を配列決定する必要性が増大しているので、配列決定能力に配慮する必要がある。十分に資金提供された学術的な研究施設及びゲノムの会社にしか存在しない大型の集中的な高処理能力のＤＮＡ配列決定設備から、ほとんどの病院及び診療所に設置できる小型で複雑でない中処理能力の遺伝子配列決定システムへのシフトが必要である。ＤＮＡ配列決定技術のためのこの市場におけるシフトは、試薬のコストを下げること、及びサンプル処理工程をできるだけ簡単でかつ継ぎ目がなくすることを重視する。
【０００６】
１９７０年代後半には、Ｓａｎｇｅｒらが、配列全体にわたってあらゆるヌクレオチドで共通の起点及びランダムターミネーションを用いる、ＤＮＡフラグメントのネスト化されたセットを生成するＤＮＡ配列決定解析のための、酵素的なチェーンターミネーション法を開発した。ＬＩｏｙｄ  Ｓｍｉｔｈ、Ｌｅｅ  Ｈｏｏｄ他が、配列決定反応における４つの蛍光標識を用いるようにＳａｎｇｅｒ法を改変し、これによって単一レーン分離が可能になった。これが結果として、最初の自動化ＤＮＡシーケンサーの作製であて、これには、分離のためにポリアクリルアミドのスラブゲルを用いた。さらに近年では、蛍光エネルギー移動色素を用いて、シグナルを２倍〜１０倍に増強する色素セットが作製され、光学的構成が単純化されている。
【０００７】
自動化蛍光キャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）ＤＮＡシーケンサーは、スラブゲルに代わる一般的な技術であると考えられる。キャピラリーゲル電気泳動は、配列決定生成物の分離を加速して、必要なサンプル容積を劇的に低下する能力を有する。９６チャネルのキャピラリー電気泳動装置であるＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から市販されており、レーザー誘導蛍光（ＬＩＦ）共焦点蛍光スキャナーを用いて、２時間のサイクル時間で９０分の泳動において、１キャピラリー当たり（Ｐｈｒｅｄ  ２０ウインドウ）平均で約６２５塩基まで検出する。共焦点空間フィルタリングによって、さらに高いシグナル対ノイズ比が得られる。なぜなら、周囲の物質からの過剰な反射及び蛍光が、光電子増倍管（ＰＭＴ）でシグナル検出の前に排除されるからである。従って、１つの配列決定バンド当たり、サブアトモルのレベルの感度が達成できる。共焦点画像化は、キャピラリー電気泳動を用いるマイクロチップ解析システムにおいても特に重要であるが、ここではガラス又はプラスチックのマイクロチップのバッククラウンド蛍光が溶融シリカキャピラリーのバックグラウンド蛍光よりもかなり高いかもしれない。キャピラリーアレイ電気泳動システムによって、ＤＮＡ解析のためのゲノムコミュニティーの最初の処理の要件の多くが解決される。しかし、低容積サンプル調製のための現行の方法は依然として、処理能力の向上及び費用の削減のための重大な障壁である。
【０００８】
蛍光ＤＮＡシークエンサーによってＤＮＡ配列決定の処理能力が向上したが、そのため処理能力の障害は配列決定から再度サンプル調製に移った。それに応じて、配列決定鋳型を調製するため、及びトランスポゾン促進ＤＮＡ配列決定のための迅速な方法が開発され、同様に遠心分離を省略する磁気ビーズ捕獲法が開発された。好熱性古細菌ＤＮＡポリメラーゼを、スクリーニングして忠実度を改善するように遺伝子操作して、高温での安定性を確保し、長さを伸長し、ジデオキシヌクレオチド及び蛍光アナログについての親和性を変えた。これらの改良によって、試薬の費用が低下し、サンプル調製が容易になり、データの正確度が向上し、読取り長さが長くなった。
【０００９】
配列決定のコミュニティーはまた、ＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）反応物、及びＤＮＡ配列決定反応物を調製するためのより高処理能力の方法を開発した。サンプルの調製は、ますます多重的になり、９６ウェル及び３８４ウェルのマイクロプレート、マルチチャネルピペッター、並びに実験室のロボット様ワークステーションを用いて自動化された。一般に、これらのワークステーションは、技術者の実施する操作を模倣しており、約１マイクロリットルの最小作業容積を有するが、さらに小容積を操作するには独立したマルチチャネルピペッターが用いられている。
【００１０】
キャピラリーシステムでのＤＮＡショットガン配列決定のための代表的なフルスケールのサンプル調製方法は、ファージプラーク又は細菌のコロニーを溶解して、サブクローニングされたＤＮＡを単離することから開始する。同じ条件下で、サブクローニングされたＤＮＡインサートをＰＣＲ増幅してそのサンプルにおける濃度を指数関数的に増大することが所望され得る。次に、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）及びエビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を添加して、サイクルシークエンシングを妨害するプライマー及び過剰ｄＮＴＰｓを除去する酵素クリーンアップ反応を実施する。ＥｘｏＩを用いて、一本鎖プライマーを二本鎖生成物を消化することなくｄＮＭＰｓに分解する。ＳＡＰは、ｄＮＴＰｓをｄＮＰｓに変換し、ｄＮＴＰ濃度をＰＣＲ反応に用いられる２００μＭから、蛍光配列決定で用いるための０．１μＭ未満まで低下させる。この反応を３７℃で実施し、次いで６５℃まで加熱してＥｘｏＩ及びＳＡＰを不可逆的に変性する。
【００１１】
ＰＣＲ増幅は、サイクルシークエンシングには過剰の鋳型ＤＮＡを生成することができるので、ＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理したＰＣＲサンプルは、サイクルシークエンシングの前に５倍に希釈することができる。これによって夾雑物の濃度を、キャピラリー電気泳動解析を妨害する可能性が低い範囲に低下させる。サイクルシークエンシング試薬を加えて、代表的には蛍光標識した色素プライマー又はターミネーターとともに反応物をサーマルサイクリングして、標識フラグメントの直線的増幅を駆動する。最後に、サイクリング後、このサンプルを、代表的にはエタノール沈殿又はスピン濾過によって事後処理し、ホルムアミド、別の変性剤又は水の中に再懸濁して、サンプルをキャピラリー電気泳動システム中に電気運動学的に注入する。
【００１２】
この作業の流れによってＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）システムの能力の劇的な改善が得られ、同様の作業の流れは現在、同様に他のキャピラリー電気泳動システムのための選り抜きの方法でもあると考えられる。ヒトゲノムのランダムなサブクローンの単一のプラーク及びコロニー由来の実際のサンプル、又は発現配列タグ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇｓ）（ＥＳＴｓ）を用いて、この作業の流れは直線状ポリアクリルアミドを分離マトリックスとして用いて２００塩基対を超えるサンプルの成功率を約６０％から８５〜９０％まで改善し、平均読取り長さを約４００から６００塩基を上回るまで改善した。さらに、この方法は、完全に健全であることが証明されている。
【００１３】
上記のサンプル調製方法は、全体を通じて大きく増大したが、試薬の費用は依然として配列決定の費用の主な要素である。キャピラリー電気泳動はサブアトモルのサンプルしか必要としないが、現在のサンプルはピコモル範囲で調製される。従って反応体積の減少によって、ＤＮＡ配列決定の費用は減少して、解析に十分な材料さえ得られる。しかし反応体積の実質的な減少は、サンプル及び試薬を操作しかつ反応させるために満足な方法が開発され得る場合にのみ達成できる。理想的には、このような方法は、多数のサンプルを一回で生成するように自動化されて構成される。さらに、キャピラリー電気泳動並びに分離及び解析の検出器のような、さらなる成分と連動することができるモジュールとしてこのような方法を組み込むことが所望される。
【００１４】
サンプル調製の自動化を補助するために幾つかのデバイスが設計されている。例えば、米国特許第５７２０９２３号は、１ｍｍ程度の小さい直径を有する管内でわずかなサイクリング反応が生じるシステムを記載している。この管を実質的に、サーマルブロックによって生成されたサーマルサイクルに付して、所望の反応を達成する。少量のサンプルを取込み、その各々がこのサンプルと組み合わせられない液体によって管内で分離されることによって、一本の管内で多数のサンプルを処理することができる。液体はポンプによって管を通って移動する。これらの機能は、この管を自動的に浄化するシステムに組み込まれ、サンプル含有ウェルを有するサンプルトレイを動かして、この管を、このサンプルトレイ中のウェルと接触させる。
【００１５】
米国特許第５７８５９２６号は、小容積のサンプルを移動するためのシステムを開示する。このシステムでは、１以上のキャピラリー管を用いて、少量のサンプルを移動する。コンピューター制御のモーターに接続された精密線形アクチュエータは、空圧ピストンとして作用して、この管を用いて液体をアリコートにし、分配する。このサンプル量を、キャピラリーセグメント内の液体の存在を検出する光学センサーによってモニターする。このシステムは、貯蔵される液体を含有する液体ステーション、及び輸送キャピラリーを位置決めするための位置決めデバイスを備える。
【００１６】
米国特許第５８９７８４２号は、サーマルサイクリングを用いる自動サンプル調製のためのシステムを開示する。このシステムでは、反応混合物はキャピラリー管にポンピングされる。この管の一端は、連結されたポンプからの圧力を用いて封止されるが、もう一端は、障壁にこの管を押圧することによって封止される。このポンプはまたこの管内の液体を動かすように働く。一端この末端が封止されれば、この管はサーマルサイクルに付される。このシステムでは、ロボット的な移動デバイスによって、ポンプがこの管内に反応混合物の成分をロードするサンプル調製ステーションと、サーマルサイクリングステーションとの間で、この管が動かされる。
【００１７】
上記で考察したこのシステムでは、まず、サンプル、例えば配列決定用のＤＮＡ鋳型、及び試薬を一緒に混合して、その後にこの混合物を反応チャンバに導入する必要がある。この中間混合工程には必然的に、さらなる試薬及びサンプルの取り扱い工程が必要であり、これによって浪費が生じる。例えば、別々のマイクロピペットを用いてサンプル及び試薬を混合チャンバ中に分散する場合、少量のサンプル及び試薬を、各々のピペット中に保持し、反応混合物を混合チャンバ中に保持する。高処理能力のシステムでは、この浪費、並びに新しいか又は適切に浄化したピペット及び混合チャンバの費用が急激にかさむ。浪費の程度はしばしば、高濃度液の少ない容積を分配する際の不正確性を補償するためのストラテジーとして、反応成分を低濃度で含む比較的大容積の液体を分配する必要性のせいで悪化する。通常、反応混合物を形成した後、解析に必要なのは少量だけであり、その残滓は破棄される。
【００１８】
従って、反応の実施に必要な試薬とサンプルとを最初に混合する必要がなく、解析すべき生物学的サンプルを、反応チャンバ中に導入することができる方法が、必要である。
【００１９】
米国特許第５８４６７２７号は、アフィニティーキャプチャー（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｃａｐｔｕｒｅ）法を開示しているが、ここでは鋳型ＤＮＡが、サーマルサイクリングのために反応チャンバとして働くガラスキャピラリーの内側に固定される。このキャピラリーは、最初に、このキャピラリーの内面にビオチン分子を固定することによって、続いてこのビオチンに強固に結合するアビジン又はストレプトアビジンを用いたカラムの充填によって調製される。配列決定される鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲでビオチン部分に共有結合され、次いでこのキャピラリーの内側のアビジンに付される。これによって、ビオチン−アビジン−ビオチン結合を通じたキャピラリー壁への鋳型の固定が得られる。未結合の鋳型を洗い流した後、配列決定試薬を添加してキャピラリーの内容物をサーマルサイクリングに供して、配列決定反応を起動させる。この方式では、キャピラリーをローディングする前に、鋳型ＤＮＡを配列決定試薬と混合することは不必要である。
【００２０】
しかし、記載されたとおりの方法では、ビオチンがＰＣＲで鋳型ＤＮＡに連結される必要があり、配列決定反応の前でさえ反応を設定して実行する必要がある。この必須の予備段階によって、配列データを獲得するのに伴う時間及び費用がかさむ。さらに、ＤＮＡの固定は事実上不可逆的である。なぜなら、ビオチン−アビジン結合は、かなり強力であるため、これはアビジンを変性する試薬を用いてしか破壊できないが、この処理は反応における任意の他のタンパク質性分も変性するからである。結果として、鋳型ＤＮＡは、キャピラリーの内面に結合したままでなければならない。ＤＮＡは、溶液中で遊離していないため、反応成分が壁に拡散し、ここで反応成分がＤＮＡと相互作用し得るためにはさらに時間が必要である。さらに、キャピラリーをリサイクルすることが所望される場合、アビジンの変性を介して鋳型ＤＮＡを除去して、キャピラリー中でアビジンの洗浄及び次いで再充填をする必要があり、この全てが時間及び試薬の費用がかさむ。
【００２１】
従って、サンプル中の全ての分子にアフィニティーキャプチャー（捕獲）部分を結合させる必要がなく、最初のサンプル試薬混合工程なしに、反応チャンバ中に分子を導入するための方法であって、ここで鋳型の固定が可逆的である方法が、当技術分野で依然として必要である。この方法では、試薬の費用は最小限であって、処理速度は最大である。
【００２２】
キャピラリーアレイ電気泳動システム及びキャピラリー電気泳動マイクロチップ解析システムは、サブアトモルのＤＮＡ配列決定反応生成物を検出することができる。この非凡な感度によって、配列決定反応における理想的な量の鋳型ＤＮＡからの逸脱について、スラブゲルと比べて、許容度の低下が犠牲になる。例えば、配列決定反応における鋳型ＤＮＡが小さすぎる場合、蛍光標識されたプライマー伸長生成物の収率は乏しい。これによって、反応生成物をレーザーでスキャンする場合、シグナル強度が弱くなる。これによって、スペクトル分離を適切に実施することからクロマトグラムを解析するソフトウェアが妨げられ、その結果平均の配列読取り長さより短くなる；この反応を、繰り返さなければならないか、又は配列情報が失われる。
【００２３】
多すぎる鋳型ＤＮＡによって、キャピラリーの過剰ローディングに起因して、同様の問題が生じる。十分な収率の蛍光標識された反応生成物が存在するが、鋳型が過剰である場合、これは、電気運動学的注入の間のキャピラリーへの進入について、配列決定生成物と競合する。大型の鋳型ＤＮＡ分子の存在は、キャピラリー電流の全体的な減少又は突発的な低下を生じ得、これが種々の方法でそれ自体を明らかにし得る。過剰ローディングによって、弱いシグナル強度、クロマトグラムにおける解釈可能な蛍光強度ピークの後期の出現、及び反応生成物の劣った解像度が生じ得る。なぜなら蛍光発光が広範かつ拡散性であるからである。これらの効果の全てによって、短い読取り及び低い配列決定データの質がもたらされる。
【００２４】
過剰重複の問題は代表的には、配列決定反応物を希釈するか、又は配列決定反応物中に導入された鋳型ＤＮＡの量を注意深く滴定することによって解決される。これらの解決法の両方とも原則的に簡単であり、前者はこの反応の解析の繰り返しを必要とし、後者は、高処理能力システムで従来の手段を用いて実行することが困難である。これらの手段は、サンプル中のＤＮＡに結合する蛍光色素の量を検出して、標準濃度曲線と比較する工程、又はＤＮＡ濃度の絶対的な指標に変換することができる２６０ｎｍの波長で紫外光の吸収を測定する工程を含む。従って、当技術分野では、配列決定反応のための鋳型ＤＮＡの量を滴定して、高処理能力キャピラリー電気泳動システムを用いて解析するための方法が依然として必要であり、ここでは費用の最小化及び速度の最大化が重要である。
【００２５】
極めてパラレルな様式で小規模サーマルサイクリング反応を実施し得る自動化システムがさらに必要である。このシステムによって、試薬の消費が最小であるサイクリング反応の迅速な調製が可能になる。反応に必要な試薬の量を減少すること、及び反応に必要な時間を短縮することの組み合わせによって、サイクリング反応の調製の全体的な費用が大きく減少する。
【００２６】
プロテオミクスに関して、プロテオームの解析には、大きいタンパク質コレクションの分離、数量化及び同定が必要である。
【００２７】
代表的には、このような解析は、異なる技術、例えば２−Ｄ電気泳動分離、その後の酵素消化、並びにマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（２Ｄ  ＰＡＧＥ−ＭＡＬＤＩ／ＭＳ）、又はエレクトロスプレーイオン化質量分析（２Ｄ  ＰＡＧＥ−ＥＳＩ／ＭＳ）による同定の組み合わせによって達成される。別の共通の方法は、ＬＣ／ＬＣ−ＭＳ／ＭＳであり、すなわちタンパク質を消化し、強力な陽イオン交換液体クロマトグラフィー及び逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＬＣ）によって分離し、次いでタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）によって同定する。現在の制限としては、タンパク質分解性の消化の前の大規模なサンプル調製の必要性、分析物の損失、及び低タンパク質濃度での低い反応効率が挙げられる。
【００２８】
代替としては、単一の誘導レーザー脱離プローブを用いて、部分的精製及び質量スペクトル同定の両方を可能にする方法及び装置が開発されている。例えば、米国特許第６２２５０４７号、同第６１２４１３７号、同第５７１９０６０号を参照のこと。しかし、このような方法は、専門的な装備、及び質量分析計に対する習熟を要する。
【００２９】
従って、極めて類似の方式で小規模プロテオーム反応を実施することが可能な自動化システムが当技術分野において継続して必要である。このシステムによって、試薬の消費が最小である、酵素反応の迅速な調製が可能になるはずである。反応に必要な試薬の量を減少すること、及び反応に必要な時間を短縮することの組み合わせによって、プロテオーム反応の調製の全体的費用が大きく減少するが、極めてパラレルなシステムは処理能力を改善する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
従って、本発明の特定の実施形態は、以下の番号を付けた項目に示される。
【００３１】
１．小規模反応を実施するためのシステムであって、このシステムは以下を備える：キャピラリーカセットであって、基板及びこの基板を通って延びる複数のキャピラリーを有し、このキャピラリーの各々は、この基板の両側に第一及び第二の開口端を有する、キャピラリーカセットと；このキャピラリーの両端を一時的に封止し得るように、配向されかつ空間を隔てられた一対のメンブレンと；このキャピラリーカセット及びこのメンブレンを保持するのに十分な能力の内部チャンバを有するサーマルサイクラーと；ある位置にこのキャピラリーカセットを接触させかつ動かすように配置された自動移動デバイスであって、このキャピラリーの末端がこの一対のメンブレンによって封止されてもよく、このメンブレンで封止された末端を有するこのキャピラリーカセットが、このサーマルサイクラーの内部チャンバ内に配置されてもよい自動移動デバイス。
【００３２】
２．受容基板上のある位置上にキャピラリーカセットのキャピラリーからの液体を分配するディスペンサーをさらに備え、ここでこの自動移動デバイスは、このキャピラリーカセットのキャピラリー内に含まれた液体が、この基板上に分配されるように、このディスペンサー及び受容基板に対してこのキャピラリーカセットを動かすことができる、項目１記載のシステム。
【００３３】
３．ディスペンサーが遠心分離機である、項目２記載のシステム。
【００３４】
４．ディスペンサーが空気置換式ディスペンサーである、項目２記載のシステム。
【００３５】
５．自動移動デバイスが、ディスペンサーに対してキャピラリーカセットを移動することができるように配置された解析段階をさらに備え、その結果、この段階の際に配置された基板上にキャピラリーカセットの内容物を分配することができる、項目２記載のシステム。
【００３６】
６．基板がサンプル調製マイクロチップであり、自動化移動デバイスが、複数のサンプル調製マイクロチップサンプル受容ウェル中に直接キャピラリーカセットを分配するように配置されている、項目５記載のシステム。
【００３７】
７．基板が、キャピラリーのアレイであり、自動移動デバイスが、キャピラリーカセットをキャピラリー中に分配するように分散されている、項目５記載のシステム。
【００３８】
８．基板がマルチウェルプレートである、項目２記載のシステム。
【００３９】
９．キャピラリーが１０〜１０００ｎＬの内容積を有する、項目１記載のシステム。
【００４０】
１０．さらにキャピラリーカセット洗浄ステーションを備え、ここで自動移動デバイスが洗浄ステーションと接触するようにキャピラリーカセットを移動することが可能で、この洗浄ステーションは、このキャピラリーカセットがこの洗浄ステーション内に位置する場合、このキャピラリーカセットのキャピラリーを通じて洗浄液を導く、項目１記載のシステム。
【００４１】
１１．洗浄ステーションが、洗浄液タンク、及びこの洗浄液タンクの上の位置に動かすことができる上部洗浄マニフォールフドを有し、ここで洗浄液は、このキャピラリーカセットがこの洗浄ステーションに挿入される場合、この洗浄液タンクに導入されて、この洗浄マニフォールド中への吸引によって引き出される、項目１０記載のシステム。
【００４２】
１２．洗浄液はさらに、各々が洗浄液を含有する複数の洗浄液ボトル、及び選択バルブであって、このボトルの１つから洗浄液の選択をして、この洗浄液タンクを満たすことを可能にする選択バルブを備える、項目１１記載のシステム。
【００４３】
１３．このシステムの構成要素に電気的指示を伝達するようにプログラムされ得る電気的制御装置をさらに備える、項目１記載のシステム。
【００４４】
１４．一対のメンブレンが、サーマルサイクリングデバイスの内部チャンバの対向する側に固定される、項目１記載のシステム。
【００４５】
１５．自動移動デバイスがマイクロプレートを接触させかつ移動し得る位置にマイクロプレートを分配する複数のマイクロプレートホルダーマガジンをさらに備える、項目１記載のシステム。
【００４６】
１６．メンブレンが、キャピラリーの末端を一時的に封止するようにスプリングバイアスで保持された変形可能なメンブレンである、項目１記載のシステム。
【００４７】
１７．ナノスケール反応調製物のためのシステムであって、このシステムは以下を備える：キャピラリーカセットであって、基板及びこの基板を通って延びる複数のキャピラリーを有し、このキャピラリーの各々は、１０ｎｌと約１μＬとの間の内容積を有し、このキャピラリーの各々はこの基板の両側に第一及び第二の開口端を有し、この基板の一方の側の基板を通じて延びるキャピラリーの長さはマイクロプレートウェルの深さよりも短くなるように適合されている、キャピラリーカセットと；複数のウェルを有するマルチウェルプレートであって、そこへこのキャピラリーカセットのキャピラリーが挿入され得る、マルチウェルプレートと；ディスペンサーであって、このキャピラリーカセットのキャピラリー内に含まれた液体を、このキャピラリーがこのディスペンサーに移動される場合に、このマルチウェルプレートのウェルに分配するディスペンサーと；自動移動ロボットであって、キャピラリーカセット、マルチウェルプレート及びこのマルチウェルプレートのウェル内に挿入されたキャピラリーカセットのキャピラリーを有するマルチウェルプレートからなる群から選択される物品を担持する移動ヘッドを有する自動移動ロボットと；一対の対向するメンブレン表面であって、このキャピラリーの末端がこの末端にこのメンブレンを押圧することによって一時的に封止され得る、メンブレン表面と；このメンブレンがこのキャピラリーカセットのキャピラリーの末端を封止しているとき、このキャピラリーカセット及びこのメンブレンを保持するのに十分な容量の内部チャンバを有するサーマルサイクラーであって、このサーマルサイクラーは自動移動ロボットがこのサーマルサイクラー内の内部チャンバ中にキャピラリーカセットを入れることができるように配置されており、このメンブレンがこの内部チャンバ内のこのキャピラリーカセットのキャピラリーの末端を封止し得る、サーマルサイクラー。
【００４８】
１８．ディスペンサーが電気運動的な注入器である、項目１７記載のシステム。
【００４９】
１９．ディスペンサーが遠心分離機である、項目１７記載のシステム。
【００５０】
２０．ディスペンサーが空気置換式ヘッドである、項目１７記載のシステム。
【００５１】
２１．ディスペンサーが、解析段階に配置された解析基板上にキャピラリーからの液体を分配するように配置されている、項目１７記載のシステム。
【００５２】
２２．キャピラリーカセット洗浄ステーションをさらに備え、自動移動デバイスは、キャピラリーカセットをこの洗浄ステーションと接触するように移動することが可能で、この洗浄ステーションは、このキャピラリーカセットがこの洗浄ステーション内に位置するとき、このキャピラリーカセットのキャピラリーの内部を通して洗浄液を導く、項目１７記載のシステム。
【００５３】
２３．洗浄ステーションが、下部洗浄液タンク、及び上部洗浄マニフォールフドを有し、ここで洗浄液は、このキャピラリーカセットがこの洗浄ステーションに挿入される場合、この洗浄液タンクに導入されて、この洗浄マニフォールド中への吸引によって引き出される、項目２２記載のシステム。
【００５４】
２４．洗浄ステーションがさらに、複数の洗浄液ボトルと、選択バルブであって、この洗浄液タンクを満たす洗浄液の選択のためにこのボトルと液体連絡している選択バルブとを備える、項目２３記載のシステム。
【００５５】
２５．さらに電気的制御を備え、この制御が電気的指示を伝達してこのシステムのプログラムされた操作を発揮する、項目１７記載のシステム。
【００５６】
２６．ナノスケール反応物を調製するためのシステムであって、このシステムは以下を備える：両端を有する完全に連結した細長いサブマイクロリットル容積の反応容器を有する基板と；この反応容器内に含まれる反応混合物と；この反応容器のこの両端を一時的に封止するように配置された一対のメンブレンと；このメンブレンによって封止された細長い反応チャンバに連結したこの基板を受容するのに十分な寸法の内部チャンバを有するサーマルサイクラー。
【００５７】
２７．基板が基板を通じて延びるキャピラリーを有し、このキャピラリーが反応チャンバとして作用する、項目２６記載のシステム。
【００５８】
２８．この細長い反応容器が、この基板の厚みを通過する、項目２６記載のシステム。
【００５９】
２９．サーマルサイクラーが、連続的循環によって加熱された空気を循環し、内部チャンバが、この連続循環の一部である、項目２６記載のシステム。
【００６０】
３０．連続循環が、内部通路の一部をブロックする工程、及び加熱された空気を通気して、これによってこの加熱された空気の急速な温度調節を可能にする工程によって通気することが可能である、項目２９記載のシステム。
【００６１】
３１．内部チャンバが、内部チャンバの対向する表面に装着されたメンブレンを備える、項目３０記載のシステム。
【００６２】
３２．メンブレンの１以上が、反応容器の末端にメンブレンの封止力を提供するスプリングバイアスでこの内部チャンバ内に装着される、項目３１記載のシステム。
【００６３】
３３．反応容器を分配するための手段をさらに備える、項目２６記載のシステム。
【００６４】
３４．反応混合物を形成するための試薬を合わせるための手段、及びこの反応混合物を用いて反応容器を充填するための手段をさらに備える、項目２６記載のシステム。
【００６５】
３５．反応容器を保持しかつ洗浄し得る洗浄ステーションをさらに備える、項目２６記載のシステム。
【００６６】
３６．ナノスケールのサーマルサイクリング反応混合物を調製するための方法であって、この工程は以下を含む：化合物を合わせて反応混合物を形成する工程；この反応混合物を基板上に配置された複数の反応容器内に導入する工程であって、各々の反応容器は、１マイクロリットル未満の内容積を有しかつ、第一及び第二の開口端を有する工程；反応容器末端の第一及び第二のセットに１対の対向するメンブレンを押圧することによって反応容器の末端を一時的に封止する工程；この封止された反応容器を温度サイクルに付して、この反応混合物中での反応を達成する工程；並びにこの反応容器を基板上に分配する工程。
【００６７】
３７．反応混合物を形成するために化合物を合わせる工程が、以下の工程：キャピラリーカセットの複数のキャピラリーの１つの末端を第一の液体反応成分と接触するように配置し、ここでこのキャピラリーが毛管現象によって充填することによって第一の液体反応成分の量を定量する工程；第一の液体反応成分を基板の上の別々の位置に分配する工程；キャピラリーカセットのキャピラリーの１つの末端を反応試薬と接触するように配置し、ここでこのキャピラリーが毛管現象によって充填することによって第二の液体反応成分の量を定量する工程；並びに第二の液体反応成分を別々の位置に分配して、これによってこの第一及び第二の液体反応成分を合わせて反応混合物を形成する工程、を含む項目３６記載の方法。
【００６８】
３８．複数の反応容器内に反応混合物を導入する工程が、キャピラリーカセットを提供する工程、及びこのキャピラリーカセットのキャピラリーの１つの開口端をこの反応混合物と接触して浸させ、これによってこのキャピラリーが毛管現象によって充填する工程によって達成される、項目３７記載の方法。
【００６９】
３９．化合物を合わせて反応混合物を形成する工程が、以下の工程：反応容器の内面に生体高分子サンプルを固定する工程；キャピラリーカセットのキャピラリーの１つの末端を反応試薬と接触するように配置し、ここで、このキャピラリーが毛管現象によって充填することによって、このキャピラリーカセットのキャピラリー内への反応試薬の量を定量して、これによってこの反応試薬及びこの固定された生体高分子を合わせて反応混合物を形成する工程、を含む項目３６記載の方法。
【００７０】
４０．生体高分子が核酸である、項目３９記載の方法。
【００７１】
４１．化合物を合わせて反応混合物を形成する工程が、以下の工程：乾燥された反応試薬の層を用いて複数の表面位置をコーティングする工程；及び反応試薬の固体層を溶解するのに十分な容積の溶液中に核酸サンプルを各表面位置に添加して、これによって反応混合物を形成する工程、を含む項目３６記載の方法。
【００７２】
４２．化合物を合わせて反応混合物を形成する工程が、以下の工程：キャピラリーカセット内の各々のキャピラリーの内面を、乾燥された反応試薬の層を用いてコーティングする工程；及びキャピラリーカセットのキャピラリーの１つの末端を溶液中の核酸サンプルと接触するように配置し、ここで、このキャピラリーが毛管現象によって充填することによって、このキャピラリーカセットのキャピラリー内への溶液中の核酸サンプルの量を定量して、これによってこの溶液は反応試薬の層を溶解させて反応混合物を形成することを可能にする工程、を含む項目３６記載の方法。
【００７３】
４３．基板上に反応容器を分配する工程が、遠心分離機中の反応容器と連結してこの基板を配置する工程；この反応容器の１つの開口端の半径方向遠位端に基板を配置する工程；及び遠心力を加えて、これによってこの反応容器内に含まれる液体反応混合物をこの基板上に分配させる工程；によって達成される、項目３６記載の方法。
【００７４】
４４．基板上に反応容器を分配する工程が、空気置換を用いて基板上にこの反応容器の内容物を配置すること；によって達成される、項目３６記載の方法。
【００７５】
４５．第一及び第二のセットの反応容器末端に一対の対向するメンブレンを押圧することによってこの反応容器の末端を一時的に封止する工程が、サーマルサイクラーの内部チャンバ内にこの反応容器を配置する工程であって、ここでこの反応容器はこのサーマルサイクラー内に包含される場合、この内部チャンバの対向する内面に対する変形可能なメンブレンは、この反応容器の各々の末端上の反応容器末端を一時的に封止する工程、によって達成される、項目３６記載の方法。
【００７６】
４６．反応を達成するためにサーマルサイクルに封止された反応を付す工程が、導管を通じて反応容器を通過する加熱された空気の循環によって達成され、この導管はこの温度サイクルの間の急速な温度変化を達成するようにこの導管の外部に急速な空気の通気を可能にする、項目３６記載の方法。
【００７７】
４７．温度サイクルに反応混合物を付すためのサーマルサイクリングデバイスであって、このデバイスは、連続する内部サーキット通路を含むハウジングであって、このハウジングはこのハウジングの内面に対する接近を可能にするように一時的に開口することが可能なセクションを有するハウジングと；内部サーキット通路において１つの方向に空気の流れを導くようにこのサーキット通路内に配置されたブロワーと；加熱エレメントであって、この通路内を循環する空気がこの加熱エレメントを通過するように、この内部サーキット通路に配置された加熱エレメントと；このサンプル保持区画内で対向する方向に配置された２つのメンブレンを有するサンプル保持区画であって、このメンブレンが、サンプル保持区画に挿入された容器の両端に付勢され得る、サンプル保持区画と；加熱された循環する空気を急速に排気するように開口することができる通気孔ハウジングと；この通気孔が加熱された循環する空気を排気するとき、この内部サーキット通路内に空気を引き出すための空気取込みハウジングと；を備えるサーマルサイクリングデバイス。
【００７８】
４８．サンプル保持区画に近位に内部通路内に配置された温度モニタリングデバイスをさらに備える、項目４７記載のサーマルサイクリングデバイス。
【００７９】
４９．ブロワーとサンプル保持区画との間の内部通路に配置された１以上の空気ディフューザーを備え、このディフューザーは内部通路において循環する空気の温度を均一にさせる、項目４７記載のサーマルサイクリングデバイス。
【００８０】
５０．サンプル保持区画内の１以上のメンブレンが、スプリング付勢される、項目４７記載のサーマルサイクリングデバイス。
【００８１】
５１．内部サーキット通路の表面に固定された断熱材をさらに備える、項目４７記載のサーマルサイクリングデバイス。
【００８２】
５２．このサーマルサイクリングデバイスの構成要素に指示を伝達する電気的制御装置をさらに備える、項目４７記載のサーマルサイクリングデバイス。
【００８３】
５３．通気孔が、サンプル保持区画と空気取込みとの間に配置されたハウジングの一部を動かすことによって開口され、その結果内部通路が、少なくとも部分的に制限され、このハウジングの外側への開口が生み出される、項目４７記載のサーマルサイクリングデバイス。
【００８４】
５４．ハウジングが、サンプル保持区画への接近を可能にするための封止可能な開口部を有する、項目４７記載のサーマルサイクリングデバイス。
【００８５】
５５．反応を実施するための方法であって、この方法は、ａ）反応容器セットへ反応混合物を導入する工程であって、このセットにおける各容器は両端及び１０〜１０００ｎｌの間の内容積を有する、工程；ｂ）この反応容器の両端に変形可能なメンブレンを押圧する工程によってこの反応チャンバの末端を一時的に封止する工程；ｃ）この反応容器内で反応を達成する工程；ｄ）基板上の別個の位置に反応混合物を分配する工程；並びにｅ）この反応混合物と１．ｍｕ．ｌ以上の液体試薬混合物を合わせる工程、を含む。
【００８６】
５６．以下の工程：ｆ）終了した反応混合物と液体試薬混合物とを反応させる工程、をさらに備える、項目５５記載の方法。
【００８７】
５７．以下の工程：ｇ）工程ｆの反応された混合物と、反応試薬セットとを合わせて、第二の反応混合物セットを形成する工程；ｈ）この第二の反応混合物セットを第二の反応容器セットに導入する工程であって、各反応容器は、両端及び１０〜１０００ｎｌの間の内容積を有する、工程；ｉ）この反応容器の両端に変形可能なメンブレンを押圧する工程によってこの反応容器の末端を一時的に封止する工程；ｊ）この第二の反応容器セット内で反応を達成する工程；並びにｋ）この第二の反応容器セットから反応した混合物を分配する工程、を含む項目５６記載の方法。
【００８８】
５８．工程ｆが、等温の反応条件下で生じる、項目５７記載の方法。
【００８９】
５９．工程ａの反応混合物は、ＰＣＲ混合物であり、工程ｅの液体試薬混合物は、エキソヌクレアーゼＩ及びエビアルカリホスファターゼ、並びに第二の反応混合物を含む、項目５７記載の方法。
【００９０】
６０．工程ｃ及びｊが、温度サイクルに反応容器セットを付す工程を含む、項目５７記載の方法。
【００９１】
６１．温度サイクルに反応容器セットを付す工程が循環空気サーマルサイクラーによって達成される、項目６０記載の方法。
【００９２】
６２．第二の反応容器セットが、解析用基板上に分配される、項目５７記載の方法。
【００９３】
６３．第二の反応容器セットが、キャピラリー電気泳動アレイにおけるキャピラリーの末端中に分配される、項目５７記載の方法。
【００９４】
６４．第二反応容器セットが、マイクロプレートのウェル中に分配される、項目５７記載の方法。
【００９５】
６５．第一及び第二のサンプルから実質的に同じ量の核酸を獲得する方法であって、第一のキャピラリー管の内面にこの第一のサンプル由来の核酸を直接飽和的に結合させる工程であって、これは、この内面と核酸及びカオトロピック剤を含む溶液とを、この核酸がこの内面に飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによる、工程；並びに第二のキャピラリー管の内面にこの第二のサンプル由来の核酸を直接飽和的に結合させる工程であって、これは、この内面と核酸及びカオトロピック剤を含む溶液とを、この核酸がこの内面に飽和的に結合するのに十分な時間接触させることによる、工程を含み、ここでこの第一及び第二のキャピラリー管の内面は、それぞれこの第一及び第二のサンプルの各々由来の実質的に同じ量の核酸に飽和的に結合し得る、方法。
【００９６】
６６．第一及び第二のキャピラリー管の内面に飽和的に結合した核酸の量が約１０％未満まで異なる、項目６５記載の方法。
【００９７】
６７．結合工程が実質的に同時に達成される、項目６５記載の方法。
【００９８】
６８．第二のキャピラリー管が、第一のキャピラリー管と同じキャピラリー管であり、結合工程が繰り返して達成される、項目６５記載の方法。
【００９９】
６９．結合工程の前に、飽和的に結合される核酸をサイズ選択する工程をさらに含む、項目６５記載の方法。
【０１００】
７０．結合工程の後に、酵素反応中の第一又は第二のキャピラリー管のいずれかの核酸を用いる工程をさらに含む、項目６５記載の方法。
【０１０１】
７１．第一又は第二のキャピラリー管のいずれかの飽和的に結合した核酸がＤＮＡである、項目６５記載の方法。
【０１０２】
７２．結合工程の後に、酵素反応中に第一又は第二のキャピラリー管のいずれかのＤＮＡを用いる工程をさらに含む、項目７１記載の方法。
【０１０３】
７３．酵素反応がＤＮＡ配列決定反応である、項目７２記載の方法。
【０１０４】
７４．第一又は第二のキャピラリー管のいずれかがガラスを含む、項目６５記載の方法。
【０１０５】
７５．キャピラリー管がアレイ中に存在する、項目６５記載の方法。
【０１０６】
７６．アレイが８本以上のキャピラリー管を含む、項目７５記載の方法。
【０１０７】
７７．アレイが１６本以上のキャピラリー管を含む、項目７５記載の方法。
【０１０８】
７８．アレイが９６本以上のキャピラリー管を含む、項目７５記載の方法。
【０１０９】
７９．カオトロピック剤が、尿素、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリウム、イソチオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、塩化リチウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、テトラアミンハライド、塩化テトラエチルアミン及びトリクロロ酢酸ナトリウムからなる群から選択される、項目６５記載の方法。
【０１１０】
８０．溶液を除去する工程をさらに包含し、ここでこの除去工程を接触工程の後に行なう、項目６５記載の方法。
【０１１１】
８１．第一又は第二のキャピラリー管のいずれかの内面を洗浄する工程をさらに包含し、この洗浄工程を除去工程の後に行なう、項目８０記載の方法。
【０１１２】
８２．第一又は第二のキャピラリー管のいずれかの内面を乾燥する工程をさらに包含し、この乾燥工程を洗浄工程の後に行う、項目８１記載の方法。
【０１１３】
８３．規定量の核酸を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、この核酸の規定量を用いてキャピラリー管内でこの酵素反応を実施する工程であって、この核酸がこのキャピラリー管の内面に飽和的に結合するのに十分な時間、この内面と核酸及びカオトロピック剤を含む溶液とを接触させることによって、この核酸はこのキャピラリー管の内面に、その過剰分から直接、飽和的に結合されている工程；並びに核酸のこの過剰分がそれから除去されている工程、を含む方法。
【０１１４】
８４．過剰量の核酸がそれから除去された後に、キャピラリー管内に酵素反応混合物を導入する工程をさらに含む、項目８３記載の方法。
【０１１５】
８５．規定量の核酸を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、規定量の核酸を有するキャピラリー管に酵素反応混合物を導入する工程であって、ここでこの反応混合物は、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び１種以上のジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を含み、この核酸がこのキャピラリー管の内面に飽和的に結合するのに十分な時間、この内面と核酸及びカオトロピック剤を含む溶液とを接触させることによって、この核酸は、このキャピラリー管の内面に直接、その過剰分から飽和的に結合されている、工程；並びに核酸のこの過剰分がそれから除去されている工程；並びにこの規定量の核酸を用いてこのキャピラリー管内でこの酵素反応を実施する工程、を含む方法。
【０１１６】
８６．酵素反応混合物を１以上のサーマルサイクルに付す工程をさらに含む、項目８５記載の方法。
【０１１７】
８７．核酸の過剰分を除去する工程の後に、キャピラリー管の内面を洗浄する工程をさらに含む、項目８５記載の方法。
【０１１８】
８８．キャピラリー管の内面を洗浄する工程の後に、このキャピラリー管のこの内面を乾燥する工程をさらに含む、項目８７記載の方法。
【０１１９】
８９．酵素反応混合物が、毛管現象によってキャピラリー管に導入される、項目８５記載の方法。
【０１２０】
９０．酵素反応を実施する工程の後に、この反応生成物を排出する工程をさらに含む、項目８５記載の方法。
【０１２１】
９１．酵素反応を実施する工程の後に、未取込みのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を除去する工程をさらに含む、項目８５記載の方法。
【０１２２】
９２．反応生成物とゲル濾過媒体との接触によって、未取込みのｄｄＮＴＰを除去する、項目９１記載の方法。
【０１２３】
９３．酵素反応を実施する工程の後に、未取込みのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を不活性化する工程をさらに含む、項目８５記載の方法。
【０１２４】
９４．未取込みのｄｄＮＴＰが、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）を用いて反応生成物を処理することによって不活性化される、項目９３記載の方法。
【０１２５】
９５．酵素反応混合物に含まれるジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が、Ａ単独、Ｃ単独、Ｇ単独、Ｔ単独、ＡとＣ、ＡとＧ、ＡとＴ、ＣとＧ、ＣとＴ、ＧとＴ、ＡとＣとＧ、ＡとＣとＴ、ＡとＧとＴ、ＣとＧとＴ及びＡとＣとＧとＴからなる群から選択される、項目８５記載の方法。
【０１２６】
９６．ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）が、蛍光発色団と連結している、項目８５記載の方法。
【０１２７】
９７．蛍光発色団が塩基特異的である、項目９６記載の方法。
【０１２８】
９８．蛍光発色団が、フルオレセイン、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボキシローダミン及び５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン−６−Ｇ、テトラメチルローダミン及びローダミンＸからなる群から選択される、項目９６記載の方法。
【０１２９】
９９．蛍光発色団がエネルギー移動蛍光発色団である、項目９６記載の方法。
【０１３０】
１００．プライマーが核酸の複数の隣接ヌクレオチドに相補的であり；このプライマーがこの核酸に存在する同定すべきヌクレオチドの直前で終わる、項目８５記載の方法。
【０１３１】
１０１．プライマーが蛍光発色団と連結している、項目１００記載の方法。
【０１３２】
１０２．蛍光発色団が、フルオレセイン、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボキシローダミン及び５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン−６−Ｇ、テトラメチルローダミン及びローダミンＸからなる群から選択される、項目１０１記載の方法。
【０１３３】
１０３．蛍光発色団がエネルギー移動蛍光発色団である、項目１０１の方法。
【０１３４】
１０４．酵素反応生成物を解析して、プライマーの３’末端に取込まれたｄｄＮＴＰを同定する工程をさらに含む、項目８５記載の方法。
【０１３５】
１０５．酵素反応生成物を解析して核酸に存在する塩基を同定する工程が、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、ＳＥＬＤＩ質量分析、蛍光発光検出、走査型共焦点レーザー誘導蛍光検出、蛍光偏光（ＦＰ）及び解析用マイクロチップ解析からなる群から選択される技術を用いて達成される、項目１０４記載の方法。
【０１３６】
１０６．ｄｄＮＴＰと連結した蛍光発色団の発光スペクトルから、プライマーの３’末端に取込まれたｄｄＮＴＰを同定する工程をさらに含む、項目１０４記載の方法。
【０１３７】
１０７．プライマーの３’末端に取込まれたｄｄＮＴＰの同一性から、核酸に存在するヌクレオチドを同定する工程をさらに含む、項目１０６記載の方法。
【０１３８】
１０８．核酸におけるヌクレオチドの同一性から、第二の核酸に存在するヌクレオチドを同定する工程をさらに含む、項目１０７記載の方法。
【０１３９】
１０９．ヌクレオチドの同一性が、核酸における一塩基多型（ＳＮＰ）を規定する、項目１０７記載の方法。
【０１４０】
１１０．ＳＮＰがヘテロ接合性ＳＮＰである、項目１０９記載の方法。
【０１４１】
１１１．ＳＮＰがホモ接合性ＳＮＰである、項目１０９記載の方法。
【０１４２】
１１２．ヌクレオチドの同一性が、コンピューターデータ構造のデータとして記憶される、項目１０９記載の方法。
【０１４３】
１１３．コンピューターデータ構造がコンピューター読取可能な媒体で実現される、項目１１２記載の方法。
【０１４４】
１１４．ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性である、項目８５記載の方法。
【０１４５】
１１５．ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項目８５記載の方法。
【０１４６】
１１６．ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項目８５記載の方法。
【０１４７】
１１７．核酸が、ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ポリメラーゼ連鎖反応で生成したＤＮＡ、逆転写反応で生成したＤＮＡ、真核生物細胞から単離したＤＮＡ、原核生物細胞から単離したＤＮＡ、古細菌細胞から単離したＤＮＡ、真菌細胞から単離したＤＮＡ、植物細胞から単離したＤＮＡ、ウイルスから単離したＤＮＡ、バクテリオファージから単離したＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、エピソームのＤＮＡ、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、真核生物細胞から単離したＲＮＡ、原核生物細胞から単離したＲＮＡ、古細菌細胞から単離したＲＮＡ、真菌細胞から単離したＲＮＡ、植物細胞から単離したＲＮＡ、ウイルスから単離したＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、細菌の凍結グリセロールストックから得た核酸、及び固体増殖培地で増殖した細菌コロニーから得た核酸、からなる群から選択される、項目８５記載の方法。
【０１４８】
１１８．核酸がＤＮＡであり；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってこのＤＮＡを調製する工程をさらに含む、項目８５記載の方法。
【０１４９】
１１９．ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる鋳型がゲノムＤＮＡである、項目１１８の方法。
【０１５０】
１２０．ＰＣＲでＤＮＡを調製する工程の後に、一本鎖Ｄｎａｓｅを用いて未取込みのＰＣＲプライマーを除去する工程をさらに含む、項目１１８記載の方法。
【０１５１】
１２１．ＰＣＲでＤＮＡを調製する工程の後に、ホスファターゼを用いて未取込みのｄＮＴＰを除去する工程をさらに含む、項目１１８記載の方法。
【０１５２】
１２２．ＰＣＲでＤＮＡを調製する工程の後に、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）及びエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いてこのＤＮＡを処理する工程をさらに含む、項目１１８記載の方法。
【０１５３】
１２３．ＤＮＡが、キャピラリー管の内面に直接、その過剰分から飽和的に結合している工程及びそれからこの過剰分を除去する工程の後に、このキャピラリーのこの内面を洗浄することによって、未取込みのＰＣＲプライマー及びｄＮＴＰを除去する工程をさらに含む、項目８５記載の方法。
【０１５４】
１２４．酵素反応が約１０〜５０００ナノリットルの反応体積で実施される、項目８５記載の方法。
【０１５５】
１２５．キャピラリー管が空間的アドレス可能な複数のキャピラリー管のアレイに存在する、項目８５記載の方法。
【０１５６】
１２６．空間的アドレス可能な複数のキャピラリー管のアレイが、２個、４個、８個、１２個、１６個、２４個、３２個、４８個、６４個、９６個、１２８個、１９２個、２８８個、３８４個、４８０個、５７６個、６７２個、７６８個、８６４個、９６０個及び１５３６個のキャピラリーからなる群から選択される多数のキャピラリーを有するアレイである、項目１２５記載の方法。
【０１５７】
１２７．項目８５記載の方法によって規定量の核酸を用いて生成した酵素反応生成物。
【０１５８】
１２８．一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に有効な酵素反応に使用するため第一及び第二のサンプルから実質的に同じ量の核酸を得る方法であって、この核酸がこの第一のキャピラリー管の内面に飽和的に結合するのに十分な時間、このキャピラリーの内面と核酸及びカオトロピック剤を含む第一の溶液とを接触させることによって、この第一のキャピラリー管の内面に、この第一のサンプル由来の核酸を、直接、飽和的に結合させる工程；並びにこの核酸がこの第二のキャピラリー管の内面に飽和的に結合するのに十分な時間、このキャピラリーの内面と核酸及びカオトロピック剤を含む第二の溶液とを接触させることによって、この第二のキャピラリー管の内面に、この第二のサンプル由来の核酸を、直接、飽和的に結合させる工程であって、ここで、この第一及び第二のキャピラリー管のこの内面は、それぞれ、この第一及び第二のサンプルの各々由来のこの実質的に同じ量の核酸に飽和的に結合し得る工程；並びにこの核酸に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に有効な酵素反応中で、この第一又は第二のキャピラリー管のいずれか又は両方の核酸を用いる工程、を含む方法。
【０１５９】
１２９．酵素反応が、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ遺伝子型決定（ＯＬＡ）反応、ミニシークエンシング反応、ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子型決定反応、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ反応、色素標識オリゴヌクレオチドライゲーション反応、パイロシークエンシング反応、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応及び一塩基伸長（ＳＢＥ）反応からなる群から選択される、項目１２８記載の方法。
【０１６０】
１３０．酵素反応が一塩基伸長反応である、項目１２９記載の方法。
【０１６１】
１３１．酵素反応生成物を解析する工程をさらに含む、項目１２８記載の方法。
【０１６２】
１３２．項目１２８記載の方法によって規定量の核酸を用いて生成した酵素反応生成物。
【０１６３】
１３３．一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に有効な規定量の核酸を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、規定量のこの核酸を用いてキャピラリー管内でこの酵素反応を実施する工程、
この核酸がこのキャピラリー管の内面に飽和的に結合するのに十分な時間、このキャピラリー管の内面と核酸及びカオトロピック剤を含む溶液とを接触させることによって、このキャピラリー管の内面に、この核酸がその過剰分から、直接、飽和的に結合されている工程；並びにこの核酸のこの過剰分がそれから除去されている工程を含み、ここでこの酵素反応が、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ遺伝子型決定（ＯＬＡ）反応、ミニシークエンシング反応、ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子型決定反応、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ反応、色素標識オリゴヌクレオチドライゲーション反応、パイロシークエンシング反応、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）反応及び一塩基伸長（ＳＢＥ）反応からなる群から選択される、方法。
【０１６４】
１３４．酵素反応が一塩基伸長反応である、項目１３３記載の方法。
【０１６５】
１３５．酵素反応生成物を解析する工程をさらに含む、項目１３３記載の方法。
【０１６６】
１３６．項目１３３記載の方法によって規定量の核酸を用いて生成した酵素反応生成物。
【０１６７】
１３７．規定量の酵素を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、規定量のこの核酸を用いてキャピラリー管内でこの酵素反応を実施する工程であって、この酵素がこのキャピラリー管の内面に飽和的に結合するのに十分な時間、このキャピラリー管の内面と酵素を含む溶液とを接触させることによって、このキャピラリー管の内面に、この酵素がその過剰分から、直接、飽和的に結合されている工程；並びにこの酵素のこの過剰分がそれから除去されている工程、を含む方法。
【０１６８】
１３８．規定量の酵素を用いてキャピラリー管内で酵素反応を実施する方法であって、規定量のこの酵素を用いてキャピラリー管内でこの酵素反応を実施する工程であって、この酵素がこのキャピラリー管の修飾内面に特異的にかつ飽和的に結合するのに十分な時間、このキャピラリー管の修飾内面と酵素を含む溶液とを接触させることによって、このキャピラリー管の修飾内面に、この酵素がその過剰分から、特異的にかつ飽和的に結合されている工程；並びにこの酵素のこの過剰分がそれから除去されている工程を含む方法。
【０１６９】
１３９．キャピラリーの内面の修飾がシラン処理で達成される、項目１３８記載の方法。
【０１７０】
１４０．キャピラリー管の修飾内面が官能基で修飾される、項目１３８記載の方法。
【０１７１】
１４１．官能基が、アミノ基、ピリジルジチオ基、ジスクシンイミジルスベレート基、オキシラン基、ストレプトアビジン分子及び界面活性ヒドロゲルからなる群から選択される、項目１４０記載の方法。
【０１７２】
１４２．結合した酵素が官能基に共有結合される、項目１３８記載の方法。
【０１７３】
１４３．結合した酵素が、官能基に非共有結合的に結合される、項目１３８記載の方法。
【０１７４】
１４４．複数の酵素がキャピラリーの修飾内面に均一に配向している、項目１３８記載の方法。
【０１７５】
１４５．過剰量のチオピリドンの添加によって、飽和的に結合した酵素を遊離する工程をさらに含む、項目１３８記載の方法。
【０１７６】
１４６．酵素が、プロテアーゼ、配列特異的プロテアーゼ、トリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、ペプシン、エンドプロテイナーゼ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＰｒｏ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、Ｖ８プロテアーゼ、グリコシダーゼ、βガラクトシダーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、乳酸モノオキシゲナーゼ、リガーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、メチラーゼ、ポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ酵素、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ＤＮＡジャイレース、トポイソメラーゼ、ヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、Ｓ１エキソヌクレアーゼ、マング・ビーンヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ及びウレアーゼからなる群から選択される、項目１３８記載の方法。
【０１７７】
１４７．酵素反応を実施する工程の前に、キャピラリーを基質を含む溶液で満たす工程をさらに含む、項目１３８記載の方法。
【０１７８】
１４８．キャピラリーを基質を含む溶液で満たす工程が、毛管現象によって達成される、項目１４７記載の方法。
【０１７９】
１４９．溶液が、約１００〜２０００ナノリットルの容積を含む、項目１４７記載の方法。
【０１８０】
１５０．酵素反応が等温的に実施される、項目１３８記載の方法。
【０１８１】
１５１．キャピラリーが、空間的アドレス可能なアレイで存在する、項目１３８記載の方法。
【０１８２】
１５２．酵素反応が、１以上の追加の酵素反応と平行して実施される、項目１３８記載の方法。
【０１８３】
１５３．酵素反応を実施する工程の後に、酵素反応生成物を解析する工程をさらに含む、項目１３８記載の方法。
【０１８４】
１５４．酵素反応生成物を解析する工程が、質量分析、キャピラリー電気泳動、蛍光スキャンニング、及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）からなる群から選択される技術を用いて達成される、項目１５３記載の方法。
【０１８５】
１５５．酵素反応生成物を解析する工程の前に、生成物を蛍光標識する工程をさらに含む、項目１５３記載の方法。
【０１８６】
１５６．規定量のタンパク質を用いてキャピラリー管内でタンパク質に基づく反応を実施する方法であって、規定量のこのタンパク質を用いてキャピラリー管内でこのタンパク質に基づく反応を実施する工程であって、このタンパク質がこのキャピラリー管の内面に飽和的に結合するのに十分な時間、このキャピラリー管の内面とタンパク質を含む溶液とを接触させることによって、このキャピラリー管の内面に、このタンパク質がその過剰分から、飽和的に結合されている工程；並びにこのタンパク質のこの過剰分がそれから除去されている工程、を含む方法。
【０１８７】
１５７．規定量のタンパク質を用いてキャピラリー管内でタンパク質に基づく反応を実施する方法であって、規定量のこのタンパク質を用いてキャピラリー管内でこのタンパク質に基づく反応を実施する工程、このタンパク質がこのキャピラリー管の修飾内面に特異的かつ飽和的に結合するのに十分な時間、このキャピラリー管の修飾内面とタンパク質を含む溶液とを接触させることによって、このキャピラリー管の修飾内面に、このタンパク質がその過剰分から、特異的かつ飽和的に結合している工程；並びにこのタンパク質のこの過剰分がそれから除去されている工程、を含む方法。
【０１８８】
１５８．タンパク質が非触媒性タンパク質である、項目１５７記載の方法。
【０１８９】
１５９．非触媒性タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合フラグメント、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、プロテインＧ、プロテインＡ及びストレプトアビジンからなる群から選択される、項目１５８記載の方法。
【０１９０】
１６０．タンパク質に基づく反応が分子結合反応である、項目１５７記載の方法。
【０１９１】
１６１．分子結合反応の基質がタンパク質、酵素、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、脂質、及び他の化学物質からなる群から選択される、項目１６０記載の方法。
【０１９２】
１６２．第一及び第二のサンプルから実質的に同じ量のタンパク質を獲得する方法であって、このタンパク質がこの第一のキャピラリー管の修飾内面に飽和的かつ特異的に結合するのに十分な時間、この第一のキャピラリー管の修飾内面とタンパク質を含む溶液とを接触させることによって、この第一のキャピラリー管の修飾内面に、この第一のサンプル由来のタンパク質を飽和的かつ特異的に直接、結合させる工程；並びにこのタンパク質がこの第二のキャピラリー管の修飾内面に飽和的かつ特異的に結合するのに十分な時間、この第二のキャピラリー管の修飾内面とタンパク質を含む溶液とを接触させることによって、この第二のキャピラリー管の修飾内面に、この第二のサンプル由来のタンパク質を飽和的かつ特異的に結合させる工程；を含み、ここでこの第一及び第二のキャピラリー管のこの修飾内面は、それぞれこの第一及び第二のサンプルの各々由来の実質的に同じ量のタンパク質に飽和的かつ特異的に直接、結合し得る、方法。
【０１９３】
本発明の上記及び他の目的及び利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を考慮すれば明確になる。この図面においては、同様の数字は、全体を通して同様の部分を指している。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１９４】
本明細書で記載される本発明を完全に理解することができるように、以下の詳細な説明を示す。
【０１９５】
本発明においては、キャピラリーセグメントを、試薬を定量するため及び温度サイクリング反応を実施するための反応容器として用いることの両方が可能であることが理解された。キャピラリーの長さ及びキャピラリー管の孔の内径（Ｉ．Ｄ．）が、キャピラリー管セグメントの内側の容積を規定する。５０〜１５０μｍのＩ．Ｄ．を有するキャピラリーが共通して利用可能である。キャピラリー管の内径が小さいことによって、１μｌ未満の内容積を有する反応容器を作製することが可能になる。本発明を考慮すれば、１０〜５００ナノリットルの容積を有するキャピラリーは、ＤＮＡサイクルシークエンシング反応又は任意の他の反応の調製に適合可能である。
【０１９６】
本発明の自動システムによって実行されるプロセスは、図２のフローチャートに示される。試薬及びサンプル核酸の組み合わせによる、反応混合物のアセンブリ（ボックス５２）によってプロセスが開始する。次いで、合わせた試薬をキャピラリーカセットのキャピラリーに導入する（ボックス５４）。キャピラリーの末端を次に封止する（ボックス５６）。封止されたキャピラリーセグメントをサーマルサイクルに付し（ボックス５８）、これによってサイクリング反応を達成する。次いで、キャピラリーカセットのキャピラリーを基板上に分配する（ボックス６０）。次いで、この基板を反応混合物の解析のための解析システムに移す（ボックス６２）。このプロセス及びこのプロセスを実行するための装置の構造の詳細は、本明細書に詳述される。
【０１９７】
図１を参照すると、反応混合物のアセンブリ、化学的反応を達成する温度サイクリング、及び引き続く解析のために基板上に完了した反応混合物の容積を分配するための自動システムが示される。このシステムでは、自動ロボット１０２がステージ１１４の長さを動くことが可能で、回転することが可能であって、その結果自動ロボット１０２は、この自動システムの他の成分に対して動くことが可能である。自動ロボット１０２は、回転して、自動ロボット１０２の上の移動ヘッド１０４を、ステージ１１４に近位の全ての部位の上の物体に接近することを可能にすることができる。この反応混合物のアセンブリは、カセットホテル１０６からキャピラリーカセットを拾い上げる移動ヘッド１０４によって開始する。
【０１９８】
キャピラリーカセット１５が図３Ａに示される。このキャピラリーカセットは基板１０を通って延びる多数のキャピラリー管１２から構成される。このキャピラリーカセットは、少なくとも１列の８個のキャピラリー管を有すること、このキャピラリー管は等間隔であることが好ましい。示されるキャピラリーカセットは基板１０を有し、これは、８×１２のアレイに配置された９６個のキャピラリー管を備えているが、このアレイは９６ウェルのマイクロプレートのウェルの間隔に適合する管の間隔である。基板１０の各々の側から延びるキャピラリー管１２の長さは等しくない。キャピラリー管セグメント１２の短い方の末端はマイクロプレートウェルの深さよりも短いことが好ましい。これによって、基板１０がマイクロプレートの頂部にあるままでも、キャピラリー管１２のこの短い末端をマイクロプレートのウェルに挿入することが可能になる。
【０１９９】
キャピラリー管は、実施されるアッセイ及び調製物に適合する任意の材料から作製することができるが、好ましいキャピラリーの材料としては、限定はしないが、ガラス及びシリカのキャピラリーが挙げられ、ただしプラスチック、金属及び他の材料も用いることができる。種々の寸法のキャピラリー管、例えば、内径（ＩＤ）７５μｍのキャピラリー管又は内径１５０μｍ／外径（ＯＤ）３６０μｍのキャピラリー管を用いてもよい。
【０２００】
キャピラリー管１２は、基板１０を通って延びて、好ましくは一定のパターンで配列される。このキャピラリー管は、等しい長さの管であって、実質的に平行な配向でこの基板を通って延びており、その結果このキャピラリー管１２の両端の各々は、同一平面上であり、このキャピラリー管１２の末端によって規定される平面は、この基板１０に対して実質的に平行である。キャピラリー管の空間は、均一であって、マイクロプレート上のウェルの中心間の間隔に適合するように選択されてもよい。例えば、標準的な９６ウェルマイクロプレート上に、キャピラリー管は９ｍｍの中心間の間隔で配列され、３８４ウェルマイクロプレート上には、キャピラリー管１２は、４．５ｍｍの中心間の間隔で配列される。より高密度のキャピラリー様式であって、１５３６ウェルのマイクロプレート又はさらに高いウェル密度を有するプレートに適合する様式もまた可能であるはずである。キャピラリー管１２は好ましくは、基板１０の片側から延びるキャピラリー管１２の長さが、基板１０の反対側上のキャピラリー管の長さよりも短いように、基板内に固定される。この基板の短い側の上のキャピラリー管１２の長さは、その短い側の長さが、マイクロプレート中のウェルの深さよりも短い長さであるように、マイクロプレート中のウェルの深さに適合してもよい。この特徴によって、キャピラリーカセットはマイクロプレートに挿入されることが可能になり、その結果、基板１０は、マルチウェルプレートの頂部リップに対して静止し、この基板の一方の側のキャピラリーは、底に触れることなくマルチウェルプレート中に延びることができる。例えば、９６ウェルマイクロプレートにおいて、この基板から延びるキャピラリー管の短い側が、ウェルの底にキャピラリーが触れることなくマイクロプレート中のウェルに挿入することができるように、キャピラリー管は、基板上に配置されてもよい。これによって、ウェルに分配された液体は、キャピラリーに再進入しないように確実にキャピラリーから除かれる。
【０２０１】
キャピラリーカセット基板１０は、ファイバーガラスのボード又は他の剛直な材料もしくは半可撓性の材料から作製されてもよい。キャピラリー管１２は、基板中の等間隔のホールを通じて挿入されて接着剤で固定されてもよい。１つの実施形態では、この基板の長さ及び幅は、標準的な９６ウェルマイクロプレートの長さ及び幅と同様である。これによって、キャピラリーカセットを取り扱うためのマイクロプレートの操作のために設計された適合する自動システムが単純化される。
【０２０２】
幾つかの実施形態において、イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤のような種々の表面コーティングを用いてキャピラリーの内面をコーティングすることが有利であり得る。用いることができるコーティングとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グリセロール、ポリビニルアルコール及びＴｗｅｅｎ２０が挙げられる。このコーティングは、キャピラリーに導入されて、キャピラリー管の内面で乾燥される。或いは、シラン処理又はグリニャール反応による内面の共有結合的な修飾が所望され得る。例えば、電気浸透を低下させるキャピラリー管内面の共有結合的修飾は、キャピラリーの内面と反応混合物の成分との間の表面荷電効果を低下させるのにも有用であり得る。本明細書において全ての目的のために参考として援用されている米国特許出願第０９／３２４８９２号は、有利なアルカリ安定性を有する共有結合のキャピラリーコーティングとしてアクリロイルジエタノールアミンの使用を開示している。このコーティングに加えて、アクリルイミド又は他の公知のコーティングを用いても、キャピラリー内面を共有結合的に修飾することができる。
【０２０３】
Ａ．反応混合物のアセンブリ
図１に戻れば、自動システムによって、キャピラリーカセットを用いる反応試薬及びサンプルＤＮＡの組み合わせが可能になる。キャピラリーカセットは、カセットホテル１０６から移動ヘッド１０４によって取り出され、ａの位置でサンプルプレート中に含まれるサンプルと接触させられる。このサンプルプレートは、サンプルプレートホテル１０８から分配される。このサンプルは、毛管現象によってキャピラリーカセットのキャピラリー管内に吸引される。キャピラリー管の内容積は、キャピラリー管の長さ及びその内径によって規定される。図３Ａのキャピラリーカセットは、固定容積の平行ピペッターとして働き、これによって多数のキャピラリー管を、平行に充填することが可能になる。各々のキャピラリー管セグメントは、実質的に分配され得る液体の別個の量を定量する。
【０２０４】
一旦、各キャピラリーの一端がサンプル含有ウェルに挿入されれば、液体はキャピラリーに吸引される。この少量のサンプルは、他の液体と組み合わされて、反応混合物を形成し得る。キャピラリーアレイ電気泳動システムのような解析的装置の感度、及びサイクル反応で可能になった反応混合物生成物の増幅によって、ナノスケールの反応及び解析が可能になる。極めて小規模反応で、キャピラリーアレイ電気泳動システム、キャピラリー電気泳動チップ、質量分析計、又は他の解析装置での解析のために十分な量の反応混合物を容易に生成することが可能である。ナノスケール反応混合物が可能である場合、有意に少ない反応試薬しか必要ではない。
【０２０５】
反応混合物を調製するためには種々の方法で自動システムを用いることができる。反応混合物の生成におけるこのシステムの使用のための多くのこのような方法のうちの２〜３が以下である。
【０２０６】
反応混合物の調製例１：キャピラリーカセットを用いた試薬の定量及び基板上での混合
反応混合物を調製するための１つの方法は、ピペッターを用いて反応混合物の成分を別々に定量することである。例えば、ＰＣＲ混合物については、核酸サンプル及びＰＣＲ試薬を別々に定量して、単一の容器中に分配し、ここで液体を合わせる。図１の自動システムを用いることにおいて、自動ロボット１０２は、キャピラリーカセットを備える移動ヘッド１０４を、サンプルプレートが配置されているａの位置に移動させる。キャピラリーカセットのキャピラリー管の末端は、ウェルに浸される。このキャピラリー管は、毛管現象によって充満し、サンプルの正確な量が定量される。サンプルプレートのウェルは、ＰＣＲ増幅される核酸サンプルを含む。５〜２０ｎｇのＤＮＡがキャピラリーカセット中の各々のキャピラリー管セグメントによって定量された１０〜１００００ｎＬの容積中に含まれるように、ＤＮＡサンプルは、十分に希釈すべきである。
【０２０７】
図４Ａは、マルチウェルプレート３６からキャピラリーカセット１５中へ液体サンプルを移す１６チャネルのキャピラリーカセットを示す。キャピラリーカセット１５上のキャピラリー管セグメント１２は、マルチウェルプレート３６のウェル中に延びる。マルチウェルプレート３６のウェルは、円錐状であり、このウェル中の液体は、各々のウェルの底の中央領域に流れる。これによって、ウェル内の少量の液体は、このウェルの中心及びこのウェルの底の上に挿入されたキャピラリーが液体と接触するように位置することが可能になる。次いで、このキャピラリーカセットのキャピラリー管セグメントは、ウェル中の液体での毛管現象によって充満する。このキャピラリーカセットは、ＤＮＡサンプルを含有するマルチウェルプレートのウェルと同じ中心間の間隔を有するキャピラリー管セグメントを有することが好ましい。１つの実施形態において、キャピラリーカセットは、サンプルを保持するマルチウェルプレートのウェルの数と同じ数のキャピラリー管セグメントを有する。
【０２０８】
図１に戻れば、キャピラリーカセットが、核酸サンプル含有ウェル内に浸された後、充填されたキャピラリーカセットは、移動ヘッド１０４によって分配デバイス位置１２２に移動され得る。分配デバイス位置１２２において、サンプルは基板上に分配される。次いで、透明なキャピラリーカセットが取り出されて、ＰＣＲ試薬を含有するサンプルプレートに浸される。前に示したとおり、このキャピラリーカセットは、このキャピラリーカセットに保持されるキャピラリー管の内容積によって規定される液体の正確な量を定量する。反応試薬の定量された量は、適用の要件に依存して、分配されたサンプルの容積と同じ容積であってもよいし、またそれは異なってもよい。分配デバイス位置１２２で、この反応試薬は、各キャピラリー管セグメントから、核酸サンプルを含む混合基板上の位置に分配される。
【０２０９】
本発明の反応混合物アセンブリは、多くのタイプの反応物のアセンブリについて用いることができる。ＰＣＲ反応混合物をアセンブルするために用いられる同じ基礎的な方法は、サイクルシークエンシング混合物、ローリングサイクル増幅反応混合物、酵素アッセイ、化学反応、又は他の反応混合物のアセンブリにあてはめることができる。
【０２１０】
マイクロプレートに内容物を分配する場合、同じ注意を払って、飛び散りを回避する様式でサンプル及び反応試薬を混合しなければならない。キャピラリーカセットから液体を分配するには多数の異なる方法が想定されている。
【０２１１】
キャピラリーカセット分配例１：遠心力
飛び散りを回避しながらキャピラリーカセットの内容物を分配する最初の方法は、遠心分離機を用いて、遠心力によって液体を分配することである。遠心力は、キャピラリーカセット中の全てのキャピラリーに均一にかけられ、その結果キャピラリーはマイクロプレートウェルに独立して分配する。この分配された液体は、マルチウェルプレートにおけるウェルの底に対する遠心力によって吸引される。
【０２１２】
図５Ａにおいて、遠心分離機４２が示されているが、これは挿入されたキャピラリーカセットを備えるマルチウェルプレートを含み得るスイング式のマイクロプレートバケット４３を有する。このスイング式のマイクロプレートバケットはローター４１上に保持される。
【０２１３】
図５Ｂは、スイング式マイクロプレートバケット４３の断面を示す。キャピラリーカセットのキャピラリー管１２は、マルチウェルプレート３６のウェル３６ａ中に挿入される。このカセットは、基板１０から延びるキャピラリー管１２の一部がウェル３６ａの深さよりも短いように挿入される。図５Ｂに示されるように、基板１０から延びるキャピラリー管１２は、マルチウェルプレート３６のウェル３６ａの底に達しない。マイクロプレートスイング式バケット４３は、アーム４５及びプラットフォーム４４からなる。アーム４５の上端は、ローター４１の上のラッチヘッド４２上に嵌まり合う。マイクロプレート３６は、マイクロプレートスイング式バケット４３のプラットフォーム４４上に位置する。遠心分離機が作動中である場合、プラットフォーム４４はラッチヘッド４２上で回転し、その結果マルチウェルプレートは、遠心分離機の側壁に面し、キャピラリー管内の液体に対する遠心力がこの液体をマルチウェルプレート３６の壁面３６ａの底に分配する。円錐形状のウェルを用いる場合、この遠心力は、ウェル内の液体をウェルの中心に引き出して、より正確な位置にサンプルを配置させる。この液体はかなり低い遠心分離速度でキャピラリーから移動される。
【０２１４】
図１では、低速遠心分離機は、分散デバイス位置１２２において、自動システムに必要に応じて備えられてもよい。自動ロボット１０２は、移動ヘッド１０４を使用して、マイクロタイタープレートホテル１１０によってｂの位置に分配されたマイクロタイタープレートを拾い上げる。移動ヘッド１０４は、低速の遠心分離機を有するステージへマイクロタイタープレートを移動する。キャピラリーカセットは、記載されたようにサンプル又は反応試薬で充填され、低速遠心分離のステージ上のマイクロタイタープレート上に移される。次いで、このプレート及びカセットは、遠心分離機中でスピンされて、キャピラリーからマイクロタイタープレートのウェル中に液体を分配する。一旦、液体が分配され、遠心分離が回転を停止させれば、キャピラリーカセットは、移動ヘッドによって取り出されて、カセット洗浄機１１８に移されてもよい。次いで、移動ヘッド１０４は、キャピラリーカセットホテル１０６から正常なキャピラリーカセットを拾い上げることができる。この正常なキャピラリーカセットは、遠心分離を用いてマイクロタイタープレート中に同様に分配される第二の液体反応成分を定量するために用いることができる。自動システムにおいて、遠心分離機は、移動ヘッド１０４が接近できる位置にローターを停止するためのローター制動システムと組み合わせて用いられるローターに連結されたセンサーを備える。このようなセンサーは、磁気、光学、機械的、又はローター位置を検知する他の公知の手段の使用であってもよい。
【０２１５】
キャピラリーカセット分配例２：空気置換
キャピラリーカセットのキャピラリー管セグメントに含まれた液体を分配する第二の方法は、空気置換デバイスの使用による。図１に関して、マイクロタイタープレートホテルから分配されたマイクロタイタープレートは、移動ヘッド１０４によって、分配デバイス位置１２２に移動される。この位置に、空気ディスペンサー、例えば、図４Ａ〜Ｃに図示されたものが位置する。引き続きキャピラリーカセットが移動ヘッド１０４によって回収され、サンプルマルチウェルプレートからのサンプルか、又は反応試薬のいずれかによって充填される。次いでキャピラリーカセットが分配デバイス位置１２２に移動されて、空気置換式ヘッドと接触させられる。キャピラリーカセットの基板は空気置換式ヘッド上の受容プラットフォーム上に位置する。或いは、空気置換式ヘッドは、自動移動ロボット１０２に連結されてもよい。
【０２１６】
図４Ａを参照すると、空気置換式ヘッド３０１は、底部プレート３０２上に保持されたキャピラリーカセット１５とともに示される。底部プレート３０２は、ヒンジ３１８によってマニフォールドアセンブリに連結される。キャピラリーカセット基板１０は、底部プレート３０２上に固定されている発泡体ラバーパッド３０４上に保持される。ホール３２５のアレイは、発泡体ラバーパッド３０４及び底部プレート３０２を通って延びており、これはキャピラリーカセットが底部プレート３０２上に位置するときに発泡体ラバーパッド３０４及び底部プレート３０２を通ってキャピラリー管１２が延びることを可能にするように間隔を空けられる。空気置換式ヘッドのマニフォールドアセンブリは、上部ハウジング３０６、チャンバユニット３１０及びクランプ３１４のセットから構成される。クランプ３１４は、チャンバユニット３１０の底面にメンブレン３１２を固定する。マニフォールドアセンブリがカセットの上で閉鎖されているとき、メンブレン３１２は、キャピラリーカセット１５の上面を封止する。メンブレン３１２は、キャピラリーカセット１５が底部プレート３０２上に位置しているとき、カセット中のキャピラリー位置に対応するホール３１６を有する。空気置換式ヘッド３０１の頂部マニフォールドが、底部プレート３０２に閉鎖されている場合、キャピラリー管１２は、メンブレン３１２上のキャピラリー管受容ホール３１６を通って延びて位置する。空気置換式ヘッド３０１が閉鎖されているとき、これは発泡体ラバーパッド３０４とメンブレン３１２との間でキャピラリーカセットをクランプするようにホール３２４と嵌合するラッチ３２２によって固定されてもよく、これによってカセット１５の上面とメンブレン３１２との間の封止が得られる。
【０２１７】
図４Ｂは、置換式ヘッド３０１の断面図を図示する。上部ハウジング３０６は、金属、アクリル又は他の剛直な材料から構成される。ガスインプットカプラー３０３が、上部ハウジング３０６上に位置している。加圧ガス又は減圧ライン３０５を、ガスインプットカプラー３０３に接続するとき、減圧又は圧力を、上部チャンバ３０７に導入することができる。上部ハウジング３０６とチャンバユニット３１０との間に保持されるのは、ガス不浸透性の弾性メンブレン３０８である。弾性メンブレン３０８と上部ハウジング３０６との間の領域によって上部チャンバ３０７が規定される。クランプ３１４上に固定されているのは、メンブレン３１２である。メンブレン３１２は、置換式ヘッド３０１中に挿入されたキャピラリーカセットの基板１０に押圧される。基板１０は、底部プレート３０２によって置換式ヘッド３０１内に固定される。ラバーパッド３０４は、変形可能な表面を備えており、メンブレン３１２に基板１０を押圧する均一な力を発揮する。メンブレン３１２は、ホール３１６のアレイを有しており、これによってキャピラリーカセットのキャピラリー１２がメンブレン３１２を通って延びることが可能になる。キャピラリーカセットが空気置換式ヘッド３０１中に挿入されるとき、この基板は底部チャンバ３１３を囲むホール３１６を封止する。加圧ガスがガスライン３０５によってチャンバ３０７中に導入されるとき、弾性メンブレン３０８は、底部チャンバ３１３中に押圧される。メンブレン３０８は、上部チャンバ３０７と底部チャンバ３１３との間に位置する。カプラー３０３を通して上部チャンバ３０７に圧力がかけられるとき、メンブレン３０８は、チャンバ３１３の上端及びチャンバ置換アクチュエータの両方ためのシールとして機能する。置換の程度は、かけられた圧力及びメンブレン３０８の弾性に依存する。得られた空気置換（排気）は、キャピラリーカセット１０をとおり底部チャンバ３１３に延びるキャピラリー管１２から液体を分配するように機能する。ライン３０５をとおって与えられる圧力の量を調節することによって、各々のキャピラリー管に一定の置換力が与えられる。キャピラリー管セグメントのサブマイクロリットルの容積を考慮すれば、分配圧力の量の変動は、この管からの置換に有害に影響することはないはずである。
【０２１８】
図４Ｃは、閉鎖された空気置換式ヘッド３０１を図示している。上部ハウジング３０６は、キャピラリーカセット基板の上部にメンブレン３１２を押圧するためにラッチ３２２によって底部プレート３０２に向かって引かれ、これによって封止が得られる。クランプ３１４はチャンバユニット３１０上にメンブレン３１２を固定する。空気置換式ヘッド３０１は、アーム３２０上に装着される。アーム３２０は、図１に示される自動移動ロボット１０２から延びてもよいし、又は分配位置１２２に位置してもよい。加圧ガスは、ガスインプットカップル３０３を通って上部ハウジング３０６中に導入されてもよい。
【０２１９】
この置換式ヘッドは、分配されたキャピラリーの各々のための個々の置換チャンバを備える。１６個のキャピラリーカセットが描写されているが、この置換式ヘッドは、９６個のキャピラリー又はそれより大きいキャピラリー密度のアレイを有するキャピラリーカセットを分配するように構築されてもよい。各々のキャピラリーに加えられた分配力は十分に小さく、これによって別個の位置に分散されたサンプルを用いて基板上に直接分配することが可能になる。
【０２２０】
空気置換又は遠心分離置換を用いてキャピラリーカセットにおけるキャピラリー管セグメントから液体を分配することができる。シリンジポンプのバンクを用いて、ガス透過性／液体不透過性（疎水性）メンブレンを通して圧力を加えること、電気運動学的分配を用いて、又は他の公知の分配手段を用いて、キャピラリー管から液体を分散することも可能である。空気置換式ヘッドはまた、引き続く解析のために基板上に仕上がった反応混合物を分配するためにも用いることができる。
【０２２１】
反応混合物アセンブリの実施例２：脱水試薬
反応混合物をアセンブルするための第二の方法は、キャピラリーの内部又は基板の上、例えばマルチウェルプレートのウェル内、のいずれかの脱水コーティングとして貯蔵された、反応に必要な試薬を有することである。反応試薬がキャピラリーカセットにおけるキャピラリー管セグメントの内部上で脱水された場合、このキャピラリーへのサンプルの導入は、再水和、混合及び反応混合物の形成を生じる。同様の様式で、マイクロプレートのウェルが、脱水された反応試薬でコーティングされた場合、ウェルへの核酸サンプルの添加によって、溶液へ反応試薬が入り、アッセイ混合物が形成される。このサンプルは、キャピラリーカセットで定量され、上記の方法の１つによってキャピラリーカセットから分配され得る。このサンプルは、脱水された反応試薬を溶液に入れ、拡散によって核酸を含有するサンプルと混合する。これによって、おそらく遠心分離機又は空気置換式デバイスによってキャピラリー管を分配する必要のない、極めて単純な方式で反応混合物をアセンブルする方法が得られる。これによって反応処理システムを簡単にして、かつ反応アセンブリ時間を短くすることが可能である。
【０２２２】
ＰＣＲについて、脱水された試薬混合物は商業的に入手可能であり、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）として販売されている。安定化された脱水試薬は、キャピラリーセグメントの内面、又はマルチウェルプレートのウェルの内面の上にコーティングされ得る。このＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（登録商標）という製品は、乾燥された状態で反応試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝試薬、ｄＮＴＰｓ）を安定化するために炭水化物マトリックスを使用する。溶液中の液体の核酸サンプル及びプライマーとともに溶液中にＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（登録商標）混合物に試薬を入れることによって、反応に必要な最終の反応混合物を生成する。安定化されたＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（登録商標）の化合物の組み合わせである、鋳型ＤＮＡ、プライマー及び十分な水によって最終反応混合物が生成される。チェーンターミネーション（連鎖停止、鎖伸長停止）シークエンシング（配列決定）反応及び他の反応のための試薬はまた乾燥状態で保管することが可能であると考えられる。
【０２２３】
コーティングは、多数の異なる方法によって表面に与えることができる。この方法としては、気相コーティング、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（登録商標）混合物を用いるキャピラリー充填（毛管現象、加圧充填などによる）、及びバルク相消去（減圧、加圧又は他の力のもとで）、又は試薬への基板（例えばビーズ）の浸漬及び引き続くビーズの乾燥が挙げられる。
【０２２４】
反応混合物アセンブリの例３：固相捕獲
反応混合物のアセンブリの第三の方法は、基板の表面、例えば、キャピラリー管セグメントの内部のサンプルから物質を捕獲することである。捕獲された物質は、核酸、酵素、他の生体高分子、又は化合物であってもよい。サンプルからの所望の物質は、多数の方法によって表面に結合することができる。これらの方法としては、共有結合、抗体による結合、ＤＮＡハイブリダイゼーション、疎水性相互作用、電場、磁場、又は他の化学的もしくは物理的な力が挙げられる。サンプルが一旦結合されれば、サンプルが懸濁された残りの液体は、化学的反応又は物理的な力によってキャピラリー又はマイクロチップから排出され得る。空気置換式の方法又は遠心分離分配の方法を用いて、減圧で可能なように、キャピラリーを空にすることができる。サンプル物質は基板の表面に残る。単一の工程で、サンプル物質を、実質的に精製することができる。次いで、反応試薬をサンプル物質と組み合わせて、これによって反応混合物を生成することができる。
【０２２５】
核酸については、核酸サンプルを固定する１つの方法は、表面に核酸を直接結合することである。これは、非共有結合的な修飾（例えば、ＮａＳＣＮ、ＤＭＳＯなどでの表面処理）又は共有結合によって行なうことができる。ＤＮＡについて多数の異なる共有結合の方法が当技術分野で公知である。例えば、アミノ基は、ＤＮＡのデオキシリボース骨格に結合され、合成反応の間に、例えば、ＤＮＡプラスミドインサートのＰＣＲ増幅の間に取込まれ得る。キャピラリー内部のガラス又はシリカは、シラン処理されて、修飾されたＤＮＡ上のアミノ基は、キャピラリーのシラン処理された内部に共有結合される。或いは、他の化学を利用してＤＮＡを表面に共有結合的に固定することもできる。一旦ＤＮＡをキャピラリー又は他の基板の表面に結合させれば、ＤＮＡが懸濁された液体をキャピラリーから排除してもよく、キャピラリーを反応試薬で充填してもよい。
【０２２６】
キャピラリーカセットのキャピラリーの内面に核酸を結合する別の方法は、親和性（アフィニティー）の化学による。１つの共通の親和性化学手順では、ビオチンを用いて生体分子を標識し、次いでビオチン化された生体分子をアビジン又はストレプトアビジンに結合する。アビジン／ストレプトアビジンを用いて、ビオチン化分子に連結してもよい。ビオチンで標識された核酸は、引き続いて表面、例えばキャピラリー管の内部に結合されてもよい。これは、キャピラリーの内部へのストレプトアビジンの結合によって達成することができる。
【０２２７】
キャピラリーの内部へのＤＮＡの結合のための親和性化学の使用の１つの例は、全ての目的のために本明細書において援用される、米国特許第５８４６７２７号に開示される。この引用文献は、キャピラリー管の内面へのＤＮＡの結合を記載している。この技術には、ｄＮＴＰｓと組み合わせられる、ビオチンで標識されたプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及び反応緩衝液が必要である。これは、鋳型ＤＮＡ、例えば、サブクローニングされたＤＮＡインサートを有するＤＮＡライブラリー由来のプラスミド又はＭ１３と組み合わされて、反応混合物を形成する。本発明において、マイクロプレートは、９６個又はそれ以上の反応混合物を含んでもよく、その各々が固有の鋳型とともにサブクローニングされたＤＮＡ配列を有する。この反応混合物は、反応混合物アセンブリの実施例１において言及された方法によって構築されてもよい：すなわち、反応試薬及び鋳型サンプルは、別々に定量されて３８４ウェルのマイクロタイタープレートに分配されてもよい。マイクロプレートウェルにおいて、この液体を組み合わせて、反応混合物を形成する。反応混合物は、キャピラリーカセットのキャピラリー管セグメント中に定量される。ＰＣＲ反応は、下記のように、キャピラリー管セグメントの末端を一時的に封止すること、及びキャピラリーカセットをサーマルサイクルに付すことによって達成され得る。ＰＣＲ反応の結果は、ビオチン標識されたプライマーを含有するサブクローニングされたプラスミドＤＮＡインサートの指数関数的に増幅したコピーである。
【０２２８】
次いで、ビオチン標識されたプライマーを含有するＰＣＲ増幅されたＤＮＡを、キャピラリーカセットのキャピラリー管の壁に固定してもよい。この固定キャピラリーカセットは、各々のキャピラリー管の内面にコーティングされたアビジン又はストレプトアビジンを有するキャピラリー管を有する。アビジン／ストレプトアビジンの結合のための化学は、例えば、Ｌ．Ａｍａｎｋｗａら、「Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｚｏｎｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第６５巻、２６９３〜２６９７頁（１９９３）に開示された化学であってもよい。キャピラリーを、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（３−ＡＴＰＳ）で充填し、３０分間インキュベートとて、風乾する。キャピラリーカセット中の乾燥したキャピラリーを次に、スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキソネート（ＮＨＳ−ＬＣビオチン）で充填し、これを再度インキュベートとて次に風乾する。アビジン又はストレプトアビジンを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を各々のキャピラリー管に添加する。アビジンは、各々のキャピラリーの内部に固定されたビオチンに結合する。二本鎖の増幅したビオチン化ＰＣＲ生成物を懸濁させた緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、又はＥＤＴＡとともにＮａＣｌ又はＬｉＣｌのいずれかを１〜３Ｍ、有効な結合のために添加された）をこのキャピラリー管に添加して、５〜１０分間インキュベートする。これによって、以下のように修飾されたキャピラリー壁が得られる：キャピラリー壁−Ｓｉ−Ｃ（３未満）Ｈ（６未満）−ＮＨ−ＣＯ−ビオチン−アビジン又はストレプトアビジン−ビオチンプライマーに連結された増幅されたオリゴヌクレオチド。
【０２２９】
この実施形態では、アビジン又はストレプトアビジンではなくビオチンがキャピラリーの壁に最初に共有結合される。これが、引き続く結合反応のためのキャピラリーカセットの再生を補助する。サイクルシークエンシング反応を終了した後、アビジンタンパク質も変性することなく、増幅されたビオチン化ＤＮＡを除去することは困難である。キャピラリーの内面に結合したビオチンを有することによって、６５〜９０℃でフェノール又はホルムアミド溶液を用いてキャピラリーを充填することにより、増幅されたＤＮＡは、容易に除去することができる。これによって、キャピラリーの内面に結合したビオチンを除去せずにアビジンタンパク質を変性する。次いで、この混合物を分配する。次いでキャピラリーカセットを再度、アビジン含有溶液で充填して、引き続くビオチン化された増幅された鋳型ＤＮＡを結合するために再使用することができる。
【０２３０】
一旦ＤＮＡがキャピラリーの内面に結合されれば、このキャピラリー管の内容物は、記載された方法に１つで分配することが可能であり、このＤＮＡはキャピラリーの表面に結合したまま残る。これによってＤＮＡから砕片及び他の不純物を除去するが、これはＤＮＡ精製の迅速かつ有効な方法を提示している。このキャピラリーを、さらなる精製のために緩衝液でリンスしてもよい。キャピラリーの内面の規定された領域は、ＤＮＡ結合のための既知量の結合部位を提供する。これによって、ＤＮＡ濃度の標準化のための簡便な方法が得られる。ＤＮＡ濃度の標準化は、サイクルシークエンシング反応のＣＡＥ解析の成功率を改善するのに重要である。次いで、キャピラリーカセットをサイクルシークエンシングのための試薬を含むウェル又は試薬リザーバ中に浸してもよい。このサイクルシークエンシング反応は、変形可能なメンブレンにキャピラリー管の各々の末端を押圧することによってこのキャピラリー管の末端を一時的に封止することにより実施することができる。次いで、このキャピラリーカセットは、サイクルシークエンシング反応を達成するサーマルサイクルに付すことができる。
【０２３１】
充填の前に、このキャピラリーカセットのキャピラリー管セグメントを種々の化合物でコーティングしてもよい。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はポリビニルアルコールを用いたこのキャピラリー管セグメントの内面のコーティングは、幾つかの反応、例えば、チェーンターミネーションシークエンシング反応の調製の能力を改善することが示されている。
【０２３２】
Ｂ．サーマルサイクリング
一旦反応混合物を、キャピラリーカセットのキャピラリー管セグメントに導入すれば、キャピラリーカセットのキャピラリー末端は、封止されて、キャピラリーカセットは、温度サイクルに付される。キャピラリーカセットのキャピラリーの末端は、変形可能なメンブレンにキャピラリー管の末端のいずれかを押圧することによって封止される。図１に戻れば、一旦キャピラリーカセットが反応混合物で充填されれば、このキャピラリーの末端は、封止されて、このキャピラリーは、サーマルサイクリングデバイス１１６中でサーマルサイクルに付される。
【０２３３】
図７Ａ〜７Ｃに示される、１つのサーマルサイクリングデバイスにおいて、このサーマルサイクリングデバイスは、キャピラリーの末端を封止して、このキャピラリーカセットをサーマルサイクルに付す、組み込まれたメンブレンを有する。この装置では、キャピラリーカセットにおけるキャピラリーの末端を封止する手段は、このサーマルサイクリングデバイスに組み込まれている。
【０２３４】
図７Ａ及び７Ｂを参照すると、このキャピラリーカセット１５は、変形可能なメンブレン２６４ａと２６４ｂとの間の内部通路２５６内でリップ２８０上に保持される。図７Ｂに示されるとおり、変形可能メンブレン２６４ａは、上部プラットフォーム２６１に装着される。リッド２６２は、上部プラットフォーム２６１に固定される。プラットフォーム２６１は、回転軸２８６によって基部２６５に装着される。空圧装置２８４ａ、２８４ｂは、回転軸２６３で上部プラットフォーム２６１に上端で装着される。ネジ２８２は、上部プラットフォーム２６１が、内部通路２５６を囲むハウジング２７０上に下げられるとき、上部プラットフォーム２６１を停止させるように機能する。ディフューザー２５８は、内部通路２５６中の空気循環の温度均一性を促進する。熱電対（サーモカップル）２６０は、循環する空気の温度を測定する。回転軸２７７及び底部メンブレンプラットフォーム２００の機能は、図７Ｃと組み合わせて記載されている。
【０２３５】
図７Ｃは、内部通路２５６内に挿入されたキャピラリーカセット１５を有するキャピラリーカセット保持チャンバの断面を示す。このキャピラリーカセットは、キャピラリー管セグメントをサンプル及び反応混合物で充填した後に、図１の自動ロボット１０２によってこの領域中に挿入することができる。
【０２３６】
キャピラリーカセット１５は、基板１０がレッジ２８０に置かれるように配置される。キャピラリーカセットは、上部プラットフォーム２６１が、キャピラリーカセットの上に下げられて、下のプラットフォーム２７１が上げられるとき、キャピラリー管セグメント１２の末端が上の変形可能なメンブレン２６４ａ及び底部の変形可能なメンブレン２６４ｂに押圧されるように位置する。リッド２６２は、上部プラットフォーム２６１が、下げられてフラッシュシールを提供するとき、ハウジング２７０を封止する。ネジ２８２は上部プラットフォーム２６１のための停止として機能して、キャピラリー管セグメントが曲がったり損傷したりするまで下がることからプラットフォームを防ぐ。基部プラットフォーム２６６は、ポスト２７３に固定されて、ハウジング２７０に固定される。空圧装置２８４ｂの下部末端は、下部プラットフォーム２７１に下部回転軸２７１ａで固定される。下部プラットフォーム２７１を通って伸長する段付きネジ２６８は、ハウジング２７０及び静止プラットフォーム２６６を通じて延びて、下部プラットフォーム２００に固定される。上部プラットフォーム２６１が、空圧装置２８４ｂによって下げられるとき、下部プラットフォーム２７１はまた、ハウジング２７０に向かって持ち上げられる。空圧式シリンダー２８４ｂ、２８４ａが縮められるとき、この空圧式シリンダーは、垂直方向に動く。上部プラットフォーム２６１は、下げられて、下部プラットフォーム２７１は、わずかに弧を描いて持ち上げられる。空圧式シリンダー２８４ｂが完全に縮められるとき、下部プラットフォーム２７１は、回転軸２７７上で上向きに弧を描き、上部プラットフォーム２６１に実質的に平行な位置に動く。キャピラリーカセット１５が内部チャンバ２５８に挿入されるとき、プラットフォーム２００がスプリング２７５上で「浮かぶ（ｆｌｏａｔ）」能力によって、キャピラリー管１２又はメンブレン２６４ａ、２６４ｂを損傷する過度の圧力が防がれる。プラットフォーム２６１及び２００は、キャピラリー管１２上に１平方インチ当たり４００ポンドの力を発揮して、十分な封止圧を与える。下げられた上部プラットフォーム２６１によって、キャピラリー管セグメント１２は、変形可能なメンブレン２６４ａ、２６４ｂによって各々の側で封止される。変形可能なメンブレン２６４ａ、２６４ｂは、シリコンラバー又は他の変形可能な材料で作製することができる。
【０２３７】
図７Ａにもどれば、モーター２５０は、リスカゴ（ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｃａｇｅ）ブロワー２５３を回転するシャフト２５１を回転させる。ブロワー２５３は、ディフューザー２５４を通じて内部通路２５６に流れる空気の動きをもたらす。このブロワーは、内部通路２５６を通る空気の流れが１分当たり２０００フィートで循環する、十分な循環流を生じる。ディフューザー２５４は、ブロワー２５３によって吹き出される空気の加熱が、通路２５６全体を通じて均一であることを確実にする。ディフューザー２５４上のコーン２５５は、流れる空気の混合を補助して、通路２５６全体の温度均一性を促進する。ディフューザー２５４は、キャピラリーカセットの領域中の通路２５６を通じたさらなる空気の流れを保証して、内部通路２５６における壁の損失効果から不均一性を低下させるように作用する。
【０２３８】
内部通路２５６は、外部ハウジング２７０によって規定される。外部ハウジング２７０は好ましくは、長方形の断面であって、シートの金属、プラスチック又は他の耐久性材料から構成される。外部ハウジング２７０の内面は、インレット２７８を除く全ての位置において発泡体断熱材２７２で裏打ちされる。断熱材２７２は、外部ハウジング２７０の過度の加熱を防ぎ、熱の保持を補助して、内部通路２５６を通る空気循環の温度均一性を補助する。第一のディフューザー２５４を通る流れの後、この空気は第二のディフューザー２５８を通って流れる。ディフューザー２５４及び２５８は、内部通路２５６を通る均一な空気の流れ、及び温度の均一性を促進する。通過した第一ディフューザー２５４内部通路２５６は、キャピラリーカセットの寸法に適合するように移行する。加熱された空気流は、第二のディフューザー２５８のすぐ後ろで内部通路２５６の中心に鉛直に配置される熱電対２６０を通過する。熱電対２６０は、内部通路２５６内の温度をモニターするように働く。熱電対２６０は、外部ハウジング２７０を通じ、発泡断熱材２７２を通じて延びるキャピラリー管セクション中に挿入された温度モニタリングデバイスであってもよい。或いは、熱電対２６０は、キャピラリー管の内部温度を正確に反映するように選択されてもよい。
【０２３９】
内部通路２５６を通じた空気循環は、熱電対２６０を通過して、キャピラリーカセット１５のキャピラリー管セグメント１２を流れて通過する。キャピラリー管セグメントの末端は、ハウジング２７０を用いて空気を緊密に密閉するように下げられている上部プラットフォーム２６１に装着された変形可能なメンブレン２６４ａによってその上端で封止される。キャピラリー管セグメント１２の下端は、変形可能なメンブレン２６４ｂによって封止される。変形可能なメンブレン２６４ｂは、段付きネジ２６８によって底部表面に固定されている、プラットフォーム２００上に装着される。段付きネジ２６８は、ハウジング２７０を通って延び、プラットフォーム２７１によって保持される。プラットフォーム２００とプラットフォーム２７１との間に位置するスプリング２７５は、プラットフォーム２００が浮かぶことを可能にしたままで付勢力を提供し、その結果この変形可能なメンブレン２６４ｂがキャピラリー１２の末端に付勢される。封止リッド２６２における二重作用空圧装置の機能及びプラットフォーム２７１の位置に加わる力は、図７Ｃと組み合わせて記載される。リッド２６２は、ハウジング２７０上に嵌まり込み、その結果、リッド２６２のエッジを含むシート金属又は他の物質は、ハウジング２７０の頂部に嵌まり込む。メンブレン２６４ａは、上部プラットフォーム２６１上に装着されて、好ましくは、その結果、メンブレン２６４ａは、内部通路２５６中に、このメンブレン２６４ａが断熱材２７２と一緒であっても十分な遠さまで少なくとも延びる。空気はキャピラリー管セグメント１２を通過して移動するので、基板１０の下のキャピラリー管セグメント１２の長さは、内部通路２５６を通って空気が急速に動く温度まで急速に加熱されて冷却される。
【０２４０】
モーター２７６によって制御されるドア２７４は、熱電対２６０及び加熱エレメント２５２と組み合わせて用いられて、内部通路２５６内の温度を制御する。ドア２７４が閉鎖されるとき、内部通路内で循環する空気は、外側の空気と交換されない。空気は加熱エレメント２５２を連続的に通過するので、空気が選択された温度になるまで空気は急速に加熱される。温度が選択された温度であることを熱電対２６０が一旦検知すれば、内部温度が維持されるように、加熱エレメント２５２は、下部の熱アウトプットで保持されてもよい。サーマルサイクリング反応の間のように、温度が急速に低下する必要がある場合、ドア２７４は、モーター２７６によって２７４ａの方向に動かされ、このときドア２７４は内部通路２５６へ動かされてもよく、これによってキャピラリーカセット１５を通過した全ての空気を内部通路２５６から外側へ排気することが可能になる。フィルター又は排気ダクトをドア２７４に装着して、循環する空気中の化合物が環境中に排出されることを防ぐことが可能であるということが考えられる。急速に循環する空気は、サーマルサイクラーの外側に急速に排気されるが、環境の空気は空気取込み繰り２７８を通って引き込まれる。取込み口２７８を通って内部通路２５６へ引き込まれた空気は、ヒーター２５２を通じて流れる。それを通って空気が動く領域は、内部チャンバ２５６内のヒーター２５２の上に位置するブロック２５９によって制限される。内部通路２５６内の空気の温度は再度、熱電対２６０によってモニターされて、所望の温度低下が生じたとき、ドア２７４は、ハウジング２７０に移動され、空気取込み口２７８を通って引き込まれる空気の容積が低下する。
【０２４１】
電気制御システム、例えばコンピューター制御装置に加熱エレメント２５２、熱電対２６０及びドアモーター２７６を連結することによって、このサーマルサイクラーは、空気の温度を正確に種々の順序で実施することができる。熱エレメント２５２によって必要とされ、ドア２７４を開放することによって熱が排気される場合、さらなる熱が加えられ、このとき、それぞれの作用の温度の結果が熱電対２６０によってモニターされる。ドア２７４を通じて循環する空気を排気することによって、内部通路内の空気は１秒当たり１０度より大きい速度での温度低下が可能になる。
【０２４２】
キャピラリーへの又はキャピラリーからの急速な移行と組み合わされた急速な温度変化によって、効率的な温度サイクリング反応が可能になる。例えば、耐熱性ポリメラーゼを用いる反応において、核酸鎖の変性及び各々の鋳型鎖に対するプライマーのアニーリングは、１〜５秒で生じ得る。プライマーの伸長には、達成するための時間は少ししか必要ない。なぜなら急速に循環する空気及びキャピラリーの壁が薄いことによって、キャピラリーの内容積は急速に選択された温度にされるからである。キャピラリーの壁が薄いこと及びキャピラリーの容積が小さいことによって、キャピラリーの内容積全体にわたる急速な温度変化及び熱の移行が可能である。これによって、反応の各サイクルに必要な時間は大きく低下し、これによってサンプル調製において、サーマルサイクラーのより効率的な使用及びより大きい処理能力が可能になる。現在、３０サイクルのＰＣＲ増幅を３０分で実施することができる。この時間を８分未満に短くすることが可能であるはずである。
【０２４３】
サーマルサイクル反応が一旦終了すれば、上部プラットフォーム２６１は、持ち上げられて、キャピラリーカセット１５が内部通路２５６から取り出されてもよい。温度サイクリングプロセスの間、各々のキャピラリー管セグメント内の液体は、ある程度膨張され、ある程度の液体がキャピラリーから漏れて、急速に流れる空気によって運び去られる。しかし、このような損失はキャピラリー管セグメントの容積のごく数パーセントであり、汚染の問題は存在せず、また引き続く解析に実質的に影響するほどの反応生成物の損失は生じないはずである。キャピラリー１２の小さい開口が、変形可能なメンブレン２６４ａ及び２６４ｂ上の少量の残留物質によって汚染されることを防ぐために、必要に応じて、薄いフィルムのような使い捨ての物質をこの変形可能なメンブレン上に置いてもよい。この使い捨て物質は、キャピラリー開口部が以前に用いた物質の一部に接触することを防ぐために各々の使用後に前進する物質の個々のシート又はロールであってもよい。さらに、基板１０と変形可能なメンブレン２６４ａとの間に位置するキャピラリー管セグメント１２の一部は、わずかな空気流のみを受容して、急速に変性温度に達する可能性は低い。しかし、この長さは短いので、この領域が変性温度まで急速に達することができなくても、キャピラリーの残りの部分が、引き続く解析のために十分な反応生成物を生成する能力に有害に影響することはないはずである。
【０２４４】
キャピラリーの末端を封止するための別のデバイスは、キャピラリーカセットのキャピラリー管セグメントの末端を封止するキャピラリーカセットホルダーである。図３Ｂに関して、キャピラリーカセットホルダーは、各々プラットフォーム１６ａ、１６ｂ上に固定された、一対の平行な変形可能なメンブレン１４ａ、１４ｂから構成される。この変形可能なメンブレンは、シリコンラバーシール、テフロン（登録商標）、プラスチック、又は他の弾力的な変形可能な物質であってもよい。１対の平行なポスト９が、底部プラットフォーム１６ａから上部支持プラットフォーム２４まで延び、ここでこのポストは、内側にネジ切りされたナット１８によって固定される。ポスト９は、プラットフォーム２４を貫通して、ナット１８はプラットフォーム２４の環状リップ上に保持される。段付きネジ２０は、支持体２４中のホールを通じて延びて、上部プラットフォーム１６ｂに固定される。スプリング２２は、１６ｂが浮かぶことを可能にしたままで、キャピラリー管セグメント１２の末端に上部プラットフォーム１６ｂを付勢する。キャピラリーカセット１５が、ホルダー２３内でより容易かつ確実に保持されることを可能にするように、キャピラリーカセット１５の基板１０は、ポスト１８の間隔及び寸法に一致するホールを有するように設計されてもよい。
【０２４５】
キャピラリーカセットの末端がホルダー２３中で一旦封止されれば、この合わせられたキャピラリーカセット及びホルダーを、サーマルサイクルに付してもよい。このホルダーは、１６個のキャピラリーを封止する。しかし、ホルダーは、９６個のキャピラリー又はさらに高密度のキャピラリーを有するキャピラリーカセットを保持するように設計されてもよい。キャピラリーカセットに加えて、チップ又は他の基板を反応容器として用いてもよい。図３Ｅは、２つの結合された基板層７２、７４から構成されたチップ基板７０を示す。１つの層７２は、チップの長さに沿って延びる溝７６を有する。固定された上部基板７２は、対向する開口端を備えるキャピラリー寸法の通路７６を内包する。液体反応混合物を、内包された通路中に導入することができる。これらの通路の末端は、キャピラリーカセットで行なわれるのと同様に、変形可能なメンブレンに末端を押圧することによって封止されてもよい。温度サイクリングには、チップを含むさらに大きい材料のせいで、さらに長時間必要であるかもしれないが、サイクリング時間は、従来のサイクリングよりは、やはり迅速であるはずである。
【０２４６】
等温反応、例えばローリングサイクル増幅については、温度サイクリングは、反応に影響する必要がない。一旦、等温反応混合物が合わせられて、キャピラリーカセットに導入されれば、反応温度でのカセットのインキュベーションによって、反応が生じることが可能になる。図１に関して、自動移動デバイスは、キャピラリーカセットをインキュベーター１２４に移動することが可能であり、ここでキャピラリーカセットは選択された温度でインキュベートされる。変形可能なメンブレンのセットは、インキュベーションの間、キャピラリーの末端を封止するために用いることができる。他のシステムの構成要素で分かるように、インキュベーター１２４は、他のシステム構成要素と同じ時点で用いることができる。
【０２４７】
ＰＣＲ又はチェーンターミネーションシークエンシング反応の場合、反応混合物を温度サイクルに付すことが必要である。図１では、移動ヘッド１０４は、キャピラリーカセットをサーモサイクラー１１６に移動する。このサーモサイクラーデバイスは、キャピラリーカセットのキャピラリー管セグメントを温度サイクルに付すことを可能にする任意のデバイスであってもよい。水、電場、加熱ブロック又は他の手段を用いるサーマルサイクリングデバイスを用いてもよい。或いは、空気式のサーマルサイクリングデバイスは、迅速であって、本発明の低容積サイクリングに適合可能である。
【０２４８】
温度移行媒体として空気を用いるサーマルサイクリングデバイスを、図６に示す。この反応混合物が、高い表面体容積比及び小さい材料厚を有するキャピラリー管セグメントに含まれる。これによってキャピラリーの壁を通じ、かつ液体反応混合物全体にわたって極めて急速な熱の移動が可能になる。キャピラリー中の液体全体を通じて急速に等しい温度に到達される。熱移動媒体として空気を使用することによって、反応チャンバにおける温度の急速な上昇が可能になる。空気の迅速な循環によって、キャピラリーセグメント及びその内容物の急速かつより均一な加熱又は冷却が確実になる。
【０２４９】
図６を参照すると、ホルダー８内で封止されたキャピラリーカセット１５は、開口２１５を通じて空気式のサーマルサイクラーのハウジング２０２に挿入される。ホルダー８は、サーマルサイクリングチャンバ２１０のハウジング表面２１５によって支持される。基板１０に装着されたキャピラリー管１２は、サーマルサイクリングチャンバ２１０の空気に付され、その結果その空気はキャピラリー管セグメント１２を自由に流れることができる。熱電対２１６は、キャピラリー管１２を通過して移動する空気の温度をモニターする。
【０２５０】
空気式のサーマルサイクリングデバイスにおいて、モーター２０６によって駆動されるパドル２０８は、チャンバ２１０内の空気を急速に循環させる。この空気は、キャピラリーカセット１５のキャピラリー１２を通過して急速に循環される。ハロゲン電球２２０は、熱源として作用して、サーマルサイクリングチャンバ２１０内の空気を加熱する。サーマルサイクリング反応を達成するように、循環する空気を、選択された期間、選択された温度で保持する。熱電対２１６は、キャピラリー管セグメント１２の温度をマイクロプロセッサー２１８に移動する。必要な温度変化を達成するために、このマイクロプロセッサーは、アクチュエータ２２２に指示してドア２２６を開けさせ、空気が通気孔２２４を通過することを可能にする。空気が通気孔２２４を通過するにつれて、ファンブレード２０４によって空気インレット２０３を通じ、さらなる空気が反応チャンバに引き込まれる。ファンブレード２０４は、モーター２０６によって駆動される。温かい空気の通気及び、より冷たい環境温度の空気での置換を、ファン２０８による空気の迅速な循環、比較的小さいサーマルサイクリングチャンバ２１０、及び熱電対２１６によるサンプル温度の正確な測定と組み合わせれば、急速な温度の上昇が可能になる。サーマルサイクルに影響するために必要な時間は、大きく減少する。代表的なサーマルサイクリング反応には、核酸鎖の変性、プライマーのアニーリング、及びポリメラーゼの伸長について異なる温度が必要である。変性及びアニーリングの工程は、キャピラリー管内で迅速に生じ、ここで液体のわずかな内容積は急速に平衡化するが、ＤＮＡ分子の伸長は、５００塩基対の伸長について１０秒未満しかかからない。３つの温度の各々のサーマルサイクル（アニーリング、伸長、変性）について必要な時間は、空気式のサーマルサイクリング装置の迅速な熱移行を用いることによって１５秒未満まで短くすることができる。３０サイクルのプログラムであって、各々のサイクルは種々の長さの時間３つの温度にキャピラリーを付すプログラムでは、理論的に、８分未満を達成することができる。
【０２５１】
空気式のサーマルサイクラーと組み合わせたキャピラリーカセットの使用によって、さらなる利点が可能になる。キャピラリーカセットホルダーはキャピラリーを一時的に封止して、これによって各々のキャピラリー管セグメントの迅速かつ単純な封止が可能になる。このキャピラリーカセットは、多数のキャピラリー管を平行な配列で含み、これによってサーマルサイクラーのより効率的な使用が可能になり、より大きいサンプル処理能力が可能になる。一旦サーマルサイクルが完了すれば、ホルダー８内に含まれるキャピラリーカセット１５は、開口２１５を通じて取り出される。キャピラリーカセット１５は、ホルダーから取り出されて、引き続き分配される。
【０２５２】
図６及び図７Ａ〜Ｃのサーマルサイクラーは、キャピラリーカセットとともに用いられているように図示された。同じデバイスが、両端を有する他の容器に適合可能である。例えば、チップ様基板であって、そのチップを通じて延びる複数の通路を備える基板（図３Ｅにみられるものなど）は、キャピラリーカセットと同様に、均一の間隔の対向する開口端を有する。幾つかのチップを、一時的に封止された開口端を有するサーマルサイクラー中に入れて、サーマルサイクルに付すことができる。急速な温度変化は、材料の厚みの増大に起因して少し遅くすることができる。対向する開口末端を備える他の容器もまた、いずれかの温度サイクリングデバイスとともに用いることができる。
【０２５３】
Ｃ．終了した反応混合物の分配
サーマルサイクリング又は等温反応の終了の後、調製された反応混合物を、解析的なシステムによる解析のための基板に分配する。上記のように、キャピラリーカセットは、空気置換、遠心力、減圧、又は任意の他の置換方法によって分配されてもよい。反応混合物が置換される基板は、マルチウェルプレートのウェルであっても、平面基板上の位置であっても、又は分析的チップ中に通じるウェルであってもよい。反応混合物は、少なくても、希釈が必要な十分な反応生成物を生成することができる。
【０２５４】
終了した反応混合物の分配例１：直接希釈
図１を参照して、温度サイクリングプロセスの終了後、キャピラリーカセットを、移動ヘッド１０４によって空気サーマルサイクラー１１６から取り出すことができる。このキャピラリーカセットは、移動ヘッド１０４によって取り出されて、仕上がったサンプルのホテル１１２から分配されたプレートに配置され得る。このプレートは、位置ｃに配置され、３８４ウェルのマイクロプレートのようなマルチウェルプレートであってもよい。このプレートのウェルは、ホルムアミド、水、ＴＢＥ又は他の選択された緩衝液のような希釈液を含む。この反応混合物は、能動的な置換、遠心分離、又は他の分配手段によってキャピラリーカセットのキャピラリー管セグメントから分配され得る。この反応物はまた、さらなる化学反応又は生化学反応のために溶液中に分配されてもよい。
【０２５５】
終了した反応混合物の分配例２：エタノール沈殿
エタノール沈殿は、直接の希釈手段と同様の分配手段で達成することができる。図１の移動ヘッドは、再度、空気サーマルサイクラー１１６からキャピラリーカセットを取り上げて、ｃの位置に位置するマルチウェルプレート中にキャピラリーの短い末端を置く。この場合、プレートのウェルは、アルコール、例えば４℃に冷却された９０％エタノールを含む。この反応混合物は、遠心分離によってキャピラリーカセットからエタノール中に分配される。空気置換又は他の分配方法もまた用いることができる。沈殿のための時間経過後、マルチウェルプレートを、移動ヘッド１０２によって遠心分離機に移動することが可能であり、低速遠心分離を実施して、マルチウェルプレートの底に沈殿した核酸を収集することができる。次いで、アルコールを吸引又は他の手段によって除去することができる。次いで沈殿されたＤＮＡは、ホルムアミド、水、又は他の適切な希釈液中に再懸濁することができる。サンプルプレートを直接希釈又はエタノール沈殿のいずれかによって一旦調製すれば、このプレートは移動ヘッド１０４によって解析用ステージ１２０に移動され得る。解析用ステージ１２０は、解析的デバイス、例えば、キャピラリーアレイ電気泳動システム、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  Ｃａｌｉｆ．によって製造されたＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）中にサンプルプレートを直接供給し得る。或いは、この解析用ステージは、さらなる処理のために他のシステムにこの生成物を導く。質量分析解析、熱量分析、又は他の解析的な方法のための基板上にサンプルを分配することも可能である。
【０２５６】
終了した反応混合物の分配例３：解析用システムへ直接的に分配
前の２つの実施例では、サンプルをマルチウェルプレートに分配した。次いで、これらのプレートは、解析用システムによる解析のためのステージ上に手動で又はロボット的に移動され得る。或いは、このキャピラリーカセットは、電気泳動用チップのような、解析用デバイスのウェル中に直接分配されてもよい。例えば、８個のキャピラリーの２つの平行な列で基板に配置された１６個のキャピラリーを有するキャピラリーカセットは、解析用マイクロチップの１６個のウェルとドッキングされてもよい。このようなマイクロチップは、サンプルポートと液体連絡した解析用レーンのアレイを有する。
【０２５７】
キャピラリーカセットは、キャピラリーの間隔がサンプルリザーバ入り口の間隔に適合するように設計され得る。例えば、図３Ｃに図示されたキャピラリーカセットは、可撓性ストリップ１１を通じて伸びるキャピラリー１２を備える。可撓性ストリップ１１は、単独で用いられても、他のこのようなストリップと組み合わせて用いられてもよい。キャピラリーの方向は、本質的に直線のラインで、屈曲ストリップ１１によって変更されて円弧を形成する。図３Ｄは、キャピラリー１２が円状のパターンの基板上に配置されるインプットポートと嵌合するための、ストリップ１１の屈曲を図示している。次いで、適切な電極の配列又は他の分配方法を用いる場合、キャピラリー１２中の液体は、電気運動学的に注入されるか、さもなければキャピラリー１２から解析用チップのポートに分配され得る。ストリップ１１は、湾曲した形態、例えば湾曲した金属ブロックにストリップ１１を押圧することによって湾曲した方向に位置付けることができる。これは、自動サンプル調製システム中に組み込まれた自動ストリップムーバーによって行なうことができる。このキャピラリーカセットは、空気置換、又は好ましくは飛び散り及び泡の形成を最小にするように好ましくは選択された他の分配手段によって分配されてもよい。解析のためにウェル中に調製された反応混合物を分配する前に、少量の希釈液を各々の解析用マイクロチップウェルに添加してもよい。キャピラリーカセットが分配されるとき、この希釈液は、このサンプルウェル中のサンプルを希釈する。キャピラリーカセット中で調製されたサブマイクロリットルの反応生成混合物、例えば、ＤＮＡ配列決定反応生成物混合物は、配列決定又は他の解析方法のために解析用マイクロチップに容易に取込むことができる。
【０２５８】
Ｄ．洗浄キャピラリーカセット
キャピラリーカセットの各々の使用後、キャピラリーカセットは、廃棄されてもよいし、又は洗浄されて再使用されてもよい。キャピラリーカセットの内容物が分配されるか、又はキャピラリーカセットがその他に用いられた後、キャピラリーカセットは、カセット洗浄器１１８に入れられて、ここでこのカセットは洗浄される。洗浄後、このカセットはカセットホテル１０６に戻されて、ここでこのカセットは再使用され得る。
【０２５９】
図８Ａを参照すると、キャピラリーカセット洗浄器４１０は、洗浄マニフォールド４１２及び洗浄タンクステージ４１６から構成される。洗浄マニフォールド４１２と洗浄タンクステージ４１６との間は、キャピラリーカセットプラットフォーム４１４である。洗浄タンクステージ４１６から延びるのは、脚部４１９である。この洗浄システムでは、洗浄液は、１つ以上の容器４５２、４５４、４５６、４５８から、各々の管１、２、３、４を通じて各々のローターインプット４５３、４５５、４５７、４５９にポンピングされる。このルーターは、選択された洗浄液を、ルーター流出路４５１を通じ、ライン４５１ａを通じて洗浄タンク４４０に導く。この液体は、キャピラリーカセットのキャピラリー管セグメントを通じて洗浄タンク４４０から引き込まれる。このキャピラリーカセット基板は、洗浄マニフォールド４１２と洗浄タンク４４０との間に保持され、その結果、洗浄マニフォールド４１２に吸引が加えられる場合、洗浄液は、キャピラリー管セグメントを通して洗浄タンク４４０から引き出される。洗浄液は、減圧によって、洗浄マニフォールド４１２を通じて廃棄容器４９０に引き込まれる。
【０２６０】
図８Ｅは、洗浄ステーションの作動の概略図を示す。窒素タンク４６０は、液体の流動をもたらす圧力源を提供する。開口の手動バルブ４６２によってガスは、レギュレーター４６６を通じフィルター４６８を通じて流れることが可能になる。レギュレーター４６６は、圧力源からの圧力を調節する。圧力センサー４６４は、窒素源からのガス圧をモニターして、ガス圧が選択された圧力よりも低いか否かを示す。この加圧されたガスはフィルター４６８を通ってライン４７０に流れる。加圧されたガスライン４７０は、封止された洗浄ボトル４７１、４７２、４７３、及び４７４の上に分岐する。加圧された窒素は、各洗浄ボトル内の洗浄液を、それぞれの液体ライン４７１ａ、４７２ａ、４７３ａ、及び４７４ａ中に、このそれぞれの液体ラインの各々の上の取込みフィルター４７６を通じて、ポンピングする。封止された洗浄液のボトルの各々は、異なる洗浄液、例えば、水、アルコール、緩衝液又は他の洗浄液を含んでもよい。４つの洗浄ボトルが図示されているが、このシステムは、もっと多いか又は少ない洗浄液での使用にも適合可能である。さらに、洗浄ボトルの交換は単に、バルブ４６２でボトル４７１、４７２、４７３、４７４に窒素圧を放出すること、この選択されたボトルからキャップの除去、及び加えられた圧力でのキャップの置換、及び新しいか又は再充填された洗浄液ボトルへの液体ラインを必要とするだけである。液体ライン４７１ａ、４７２ａ、４７３ａ、及び４７４ａの各々は、切り換えバルブ４７８で終わる。現行のプログラムによれば、この切り換えバルブは、選択された液体の１つをインプットラインからバルブアウトプットライン４８０へ経路を決める。次いで、このバルブアウトプットラインは、加圧された液体を洗浄タンク４４０に輸送する。
【０２６１】
キャピラリーカセットにおけるキャピラリー管は、洗浄タンク４４０から洗浄マニフォールド内部４２５への液体の輸送のための導管として機能する。減圧源４９６は、一旦バルブ４９２が開口すれば、減圧力を提供する。減圧バルブ４９８が開口すれば、減圧力が廃棄ボトル４９０中に導かれ、これがライン４９０ａ内に陰圧を生み出す。バルブ４９５が開口したとき、吸引ライン４９０ａ、吸引ライン４９５ａ及び吸引ライン４２４ａを通じて吸引が加えられる。吸引ライン４２４ａによって吸引ポート４２４を通じて吸引が加えられるので、内部洗浄マニフォールド４２５を通じた陰圧は、洗浄マニフォールド内側４２５へ延びるキャピラリー管セグメントを通じて液体を引き上げる。この液体は、吸引通路４２４を通じ、吸引ライン４２４ａへ、バルブ４９５を通過し、吸引ライン４９５ａ及び４９０ａを通じて、廃棄ボトル４９０へ移動する。
【０２６２】
図８Ｄは、洗浄マニフォールドの外観を図示する。この洗浄マニフォールドの底部はホール４２６を備え、ここにキャピラリーが挿入される。洗浄マニフォールド内部４２５は、第一の末端から吸引通路４２４へ連結され、第二の末端からパージ通路４２３へ連結されたレーンから構成される。吸引がライン４２４ａを通じて与えられるとき、液体はキャピラリーを通じて内部４２５を備えるレーンへ、通路４２４を通じ、ライン４２４ａへ引き込まれる。パージバルブが開口されれば、空気はライン４２３ａを通過し、通路４２３を通じて、内部４２５へ、通路４２４へ入り、内部４２５に残るあらゆる液体を内部４２５から取り除く。
【０２６３】
洗浄手順後、洗浄タンク４４０は、キャピラリーカセットプラットフォームに対して低く、その結果キャピラリー管セグメントの末端は洗浄タンク４４０中の液体と接触しない。洗浄タンク４４０内の液体は、ドレーン４８４を通じて排出され、これによってこの液体は、バルブ４８５が開口されて、吸引が吸引ライン４９０ａを通じて加えられるとき、ドレーンライン４８４ａに伝わる。次いで、洗浄タンク４４０内の液体は、廃棄ボトル４９０内に流出する。
【０２６４】
各溶液が洗浄タンク４４０に導入される前に、洗浄液供給ライン４８０及び洗浄タンク分配マニフォールド４８０ａは、パージされてあらゆる以前の液体をラインから空にする。これは、切り換えバルブ４７８中のバルブの１つを開口すること、及び供給ライン４８０を通じ、流出ライン４８２を通じて洗浄液を流すことによって達成される。開口バルブ４８７によって減圧力がライン４９０ａを通じライン４８８を通じて伝わることが可能になり、これによって吸引が得られ、これを液体の圧力とともに用いて、流出ライン４８２を通じた分配マニフォールドをパージする。一旦、洗浄液供給ライン４８０及び分配マニフォールドがパージされれば、バルブ４８７は閉鎖されて、洗浄タンクが持ち上げられ充填される。洗浄タンク４４０の充填レベルは、選択された洗浄液充填時間及び洗浄液圧によって制御される。オーバーフローポート４８６は、安全ドレーンとして機能して、液体のたまり過ぎを流出させる。洗浄タンク４４０内の液体レベルが高すぎれば、液体は、洗浄タンク４４０からオーバーフローポート４８６に、ライン４８６ａに流れる。バルブ４８７が開口されるとき、ライン４９０ａ及び４８８からの吸引力は、オーバーフローポート４８６から廃棄ボトル４９０へオーバーフロー液を引き込む。制限フローバルブ４４１は、ライン４８２を通る液体の流れを制限する。
【０２６５】
図８Ｆは、洗浄液タンク４４０の上部斜視図である。インプットラインは、洗浄液を洗浄液分配マニフォールド４８０ａに導く。このマニフォールドは、洗浄液をポート４８１に供給し、これがタンク４４０を満たす。洗浄液ポート４８１の間隔は、タンク４４０の幅にわたる均一な充填を補助する。充填時間及び液体圧力は、液体充填タンク４４０の量を調節する。過剰の液体がタンク４４０に入る場合、その液体はオーバーフローポート４８６から流出する。
【０２６６】
タンクを空にするために、タンクは、記載されたように空圧装置によって下げられ、ドレーン４８４が開口される。タンク４４０の形状によって、ドレーン４８４を備えるタンク４４０の末端が下げられるとき、ドレーン４８４に液体が導かれる。この構成は、タンク４４０を効率的に充填すること、空にすること及びパージすることのために設計されており、充填ラインに連結される。
【０２６７】
再度、図８Ｅを参照すると、洗浄サイクルが一旦終了すれば、マニフォールドを通じて吸引が与えられるとき、洗浄マニフォールド内部４２５内に残る全ての液体が、開口バルブ４９１によって排除され得る。バルブ４９１を開口することによって、空気の脈動は通気孔４９３を通じて引き出される。空気はパージライン４２３ａを通じて洗浄マニフォールド内部４２５内に導入されて、吸引ライン４２４ａによって除去される。マニフォールドがキャピラリーに接触している場合、キャピラリーカセット中のキャピラリーの比較的狭い孔によって、洗浄マニフォールドを通じて空気を引き込む能力が制限される。バルブ４９を開口することによって、かなり大量の空気が、マニフォールドを通じパージライン４２３ａを通じて引き込まれ得るが、これは空気を引き込むためのかなり大きい能力を有する。これによって、マニフォールドを通じた空気引き込みの突然のラッシュが生じる。これは、洗浄マニフォールド内部４２５内に残るあらゆる液体を洗浄マニフォールドから除去するように機能する。好ましくはマニフォールド内部４２５は、洗浄マニフォールドを上げる前後にパージされる。
【０２６８】
図８Ｂを参照すると、洗浄ステーション４１０が側面に示される。キャピラリーカセットプラットフォーム４１４は、支持脚部４４５に装着される。内部断面に示されるリザーバセクションは、このリザーバの後ろの下端に、ドレーンアウトレット４８４を有する。このドレーンアウトレットから上方で、このタンクの後ろの壁に、オーバーフローアウトレット４８６が位置する。このリザーバの前面に、リザーバ流出アウトレット４４６が位置する。各々のアウトレットは、図８Ｅと組み合わせて記載されるとおり、それぞれの管及びバルブに連結される。各々の管は、連結されたバルブが開口されて減圧源が加えられるとき、連結されたアウトレットからの液体の流れを伝達する。
【０２６９】
キャピラリーカセットプラットフォーム４１４は、支持脚部４４５によって固定位置に保持される。キャピラリーカセットプラットフォーム４１４の前面から、回転軸４３２によって、下方向に延びるのはヒンジ４１８である。ヒンジ４１８の下部末端に洗浄タンクステージ４１６が結合している。洗浄タンクステージ４１６の下から脚部４１９が延びており、これは回転軸４４３によって、下端で空圧式シリンダー４２９に連結される。静止キャピラリーカセットプラットフォーム４１４の後端で、洗浄マニフォールドが回転軸４２０で連結される。空圧式シリンダー４２９が下端から延びる場合、洗浄タンクステージ４１６は、静止キャピラリープラットフォームから円弧を描いて下がる。これは、圧力が４２９に加えられない場合に生じ、重力によって洗浄タンクステージは旋回して下げられる。空圧式シリンダー４２９が、加えられた圧力によって上端から伸びるとき、洗浄マニフォールド４１２は、キャピラリーカセットプラットフォーム４１４から円弧を描いて持ち上がる。
【０２７０】
キャピラリーカセットプラットフォーム４１４上に、洗浄マニフォールド４１２が位置する。この洗浄マニフォールドは、前端に位置するパージ通路４２３、及び後端に向かって位置する吸引通路４２４を有する。空気をマニフォールドへ送るか、又はマニフォールドからガスもしくは液体を取り出すそれぞれのラインは、図８Ｅと組み合わせて記載される。
【０２７１】
図８Ｃを参照すると、示される空圧式シリンダー４２９は、脚部４１９上の低部の接続回転軸４４３から、キャピラリーカセットプラットフォーム４１４中のホール３３３を通じて、洗浄マニフォールド４１２上の回転軸４２８における上部の接続まで完全に伸びている。洗浄マニフォールドの伸びた高さは、マニフォールド４１２の上に固定されているプレート４３０によって制限される。プレート４３０は、洗浄マニフォールドが選択されたレベルまで持ち上げられるとき、キャピラリーカセットプラットフォーム４１４上のピン４２２に接して、洗浄マニフォールド４１２がこのレベルを超えて持ち上げられることを防ぐ。吸引通路４２４を通じて吸引を与えることによって吸引が洗浄マニフォールド内部４２５に加えられるとき、液体は、タンク４４０からキャピラリー１２を通じて引き込まれる。
【０２７２】
キャピラリーカセットプラットフォーム４１４の前端は、回転軸４３２でヒンジ４１８及び洗浄タンクステージ４１６に接続され、キャピラリーカセットプラットフォーム４１４の後端は、マニフォールド４１２を洗浄するために回転軸４２０に接続される。キャピラリーカセットプラットフォーム４１４を通って、安全装置４３４が延びる。安全装置４３４の寸法は、キャピラリーカセット１５が、キャピラリーカセットプラットフォーム４１４に配置されたとき、キャピラリーカセットプラットフォーム４１４を通じて延びる連結されたキャピラリー管セグメント１２を有するが、このときキャピラリーカセット基板１０の４つの端が安全装置４３４の末端上のキャピラリーカセットプラットフォーム４１４上に保持されたままであるような寸法である。キャピラリーカセットを適切に位置決めするために、キャピラリーカセットプラットフォーム４１４に位置あわせピンが加えられてもよい。
【０２７３】
カセット洗浄手順を達成するために、電気的制御装置で工程の手順を実行する。電気的制御装置は、洗浄ステーションの関連した制御されたデバイスに指示して、プログラムされた洗浄手順を実行する。プログラムされた手順は、キャピラリーカセットが、ロボット的移動デバイスによってキャピラリーカセットステージ上に配置されることで開始する。この洗浄マニフォールドは、キャピラリーカセット上に下がり、それによって、キャピラリー管セグメントの短い末端が、洗浄マニフォールド中に延び、キャピラリー管セグメントの反対の末端が一旦充填された洗浄タンクの洗浄液内に入る。基板によって、洗浄マニフォールドとカセットとの間の部分的な封止が得られ、その結果洗浄マニフォールドによってキャピラリーチューセグメントに吸引が加えられるとき、液体は、キャピラリー管セグメントを通って洗浄マニフォールド中に引き込まれる。この洗浄液供給ラインは、第一の選択された溶液でパージされて、ラインから以前の溶液が除去される。図８Ｅに関して注記されるように、パージ溶液は、分配マニフォールドを通してドレーン４８４及び流出ライン４８２に取り出されて、廃棄ライン４８８及び４９０ａを洗浄し、次いで廃棄ボトル４９０に入る。次いで、洗浄タンク４４０は持ち上げられて、選択された洗浄液で充填される。
【０２７４】
減圧が洗浄マニフォールドに加えられて、洗浄タンク中の溶液は、キャピラリーカセット中のキャピラリー管セグメントの全てを通じて引き込まれる。プログラムされた洗浄期間の後、洗浄タンクは、廃液されて、下げられる。減圧力は、洗浄マニフォールドを通じて継続され、キャピラリー管セグメントを通じて空気を引き込む。キャピラリー管セグメントが一旦乾燥されれば、洗浄マニフォールドの減圧ラインは、止められる。洗浄液供給ラインは、次の洗浄液でパージされ、洗浄タンクの持ち上げ及び充填の工程、キャピラリー管セグメントを通じた洗浄液の引き込みの工程、並びに洗浄タンクを空にする工程が各々の選択溶液について繰り返される。特定の手順では、多数の洗浄液についてこれらの工程を繰り返してもよい。最終洗浄が終了しタンクが空になった後、洗浄マニフォールドに減圧を加えることによってキャピラリーを通じて空気が引き込まれ、キャピラリー管セグメントを乾燥させる。定期的に、パージバルブ４９１が開口されて、空気は通気孔４９３を通じて、パージライン４２３ａへパージインレット４２３へと引き込まれる。これが、洗浄マニフォールド内部４２５を通じて空気のブラスト（衝風）を引き込んで、あらゆる残りの液を洗浄マニフォールド内部から除去して、洗浄マニフォールド内のいかなる残りの液体もキャピラリー中に戻らないことを確実にする。次いでマニフォールドの減圧は遮断されて、マニフォールドが持ち上げられ、マニフォールドはキャピラリーカセットから取り出される。マニフォールドの減圧は再度加えられて、パージバルブ４９１は開口され、空気は通気孔４９３を通りパージライン４２３ａへパージインレット４２３へと引き込まれる。これによって、あらゆる残りの液体が洗浄マニフォールド内部から除去されることが確実になる。次いで、減圧は遮断される。次いで、洗浄され、かつ乾燥されたキャピラリーカセットは、移動ロボットによってキャピラリーカセットホテル又は他の位置へ移動されてもよい。
【０２７５】
システムの統合
システムの構成要素は、図１の完全なシステムの幾つかのエレメントを同時に操作することを可能にする組み合わせられたシステムに統合することができる。例えば、電気制御デバイス１２３は、統合されたシステムの構成要素に指示を伝達するために用いることができる。この電気制御デバイスは、プログラムされたセットの指示を達成するように種々のシステム成分に電気的シグナルを伝達するコンピューターであってもよい。このシステムのエレメントは、同時に作動して、システムの効率性を増大することができる。例えば、自動化されたロボット１０２は、カセットホテル１０６からキャピラリーカセットを回収して、ａのステージでサンプルプレート中にキャピラリーカセットを置くことができる。ある量のサンプルが、プレートから、毛管現象によってキャピラリー管に引き込まれる。次いで、キャピラリーカセットは、動かされて、マイクロタイタープレートの上に置かれてもよく、これによってキャピラリー管セグメントの短い末端が、マイクロタイタープレートのウェルに入る。次いで、ロボット１０２は、合わせられたマイクロタイタープレート／キャピラリーカセットを分配のための分配位置１２２に移動することができる。ロボット１０２、移動ヘッド１０４及び１２２の位置に位置する分配デバイスの動きは、電気的制御デバイス１２３によって制御される。
【０２７６】
反応混合物がアセンブルされるのと同時に、電気的制御デバイスはまた、電気的シグナルをサーモサイクラー１１６に伝達することができる。サーモサイクラー１１６の通気ドア、加熱エレメント、及び熱電対は、電気的制御デバイス１２３に連結することが可能であり、これによって、電気的制御デバイス１２３は、空気がサーマルサイクラー内で循環する温度を調節することによって、選択された温度サイクリング手順を達成することが可能になる。この正確なモニタリングによって、温度サイクリング手順を最小限の時間で達成することが可能になる。サーマルサイクリング手順が一旦終了すれば、電気的制御デバイス１２３は、サーマルサイクラーに電気的に指示してサーマルサイクラーのファン及び加熱エレメントを停止させ、リッドを空気圧で開口してキャピラリーカセットがサーマルサイクラーの内部から取り出されることを可能にすることができる。
【０２７７】
自動化ロボット１０２が動かされて、反応混合物をアセンブルし、サーマルサイクラーが作動されている間に、カセット洗浄器１１８はまたキャピラリーカセットを洗浄していることができる。ここでも電気的制御デバイス１２３は、カセット洗浄器１１８が洗浄手順を実施するように指示し、ここでキャピラリーカセットは、選択された順序の洗浄液で浄化され風乾される。
【０２７８】
電気的制御デバイス１２３によって、システムの各エレメントを最大の効率で用いることが可能になる。電気的制御デバイス１２３に対する単回セットの指示によって、反応混合物のアセンブリ、所望の反応を達成する反応混合物のサーマルサイクリング、分析用基板への終了した反応混合物の分配、解析用装置による処理のためのステージへの解析用基板の移動、及び用いられたキャピラリーカセットの清浄化が可能になる。
【０２７９】
サブマイクロリットルの鋳型標準化核酸反応
さらなる局面において、本発明は、少ない容積で核酸反応を実施するため、並びにこのような反応に存在する核酸鋳型の量を標準化するための方法及び装置を提供する。
【０２８０】
本発明は、一部は、核酸を捕獲すべき溶液中の核酸の濃度の先んじた決定の必要がない、引き続く反応のための鋳型として誘導された核酸の量を制御するための特定の物質による、飽和的であるが、可逆的である核酸の結合の新規な使用に基づく。特定の実施形態において、キャピラリーの内面を用いて、核酸捕獲を達成し、これによって核酸鋳型は、引き続く反応を実施するチャンバ中で直接捕獲されることが可能になる。
【０２８１】
本発明の追加の利点
本発明は、本明細書において、ＤＮＡ配列決定反応を実施するためのその使用に特に関して、本発明の方法及び装置が特に有利である、特にキャピラリー電気泳動を使用する高処理能力のサンプル処理システムの状況において、記載されている。しかし、以下により詳細に記載されるように、本発明が、基質としてＤＡＮ及びＲＮＡを用いて、多くのタイプの生化学的反応及び化学的反応を実施する経過で用いることができるということは、当業者にとっては明白である。
【０２８２】
以下に詳細に開示されるように、本発明は、ガラスキャピラリー管又はその機能的な等価物のような反応チャンバの内面に核酸を直接、可逆的に固定するための方法を提供する。固定及び他の処理工程の後、核酸は、キャピラリー管の内側で実施される化学的、生化学的又は酵素的な反応で容易に用いられる。或いは、核酸を、キャピラリーから溶出・排出して、引き続く使用のために制御された量の核酸を分配することができる。
【０２８３】
ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のような高い感受性のキャピラリー電気泳動システムを用いるＤＮＡ配列決定反応の首尾よい解析のためには、鋳型の量が少なすぎたり多すぎたりしないように、反応中で、一貫した予め決定された量の鋳型ＤＮＡを用いることが重要である。一定のＤＮＡ結合能力を有するキャピラリー管を使用することによって、全ての反応にまたがって用いた鋳型ＤＮＡの量を「標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）」することが可能であり、これによって全ての出発で同様の量の鋳型を用いることが保証される。標準化は他の方法で達成することができるが、キャピラリー管の使用により、整合性を保証するのに必要な工程を減らせることによって、時間の劇的な短縮が得られる。
【０２８４】
核酸結合は、ガラス表面の固有の特性であるが、捕獲表面を修飾することによってその結合能力又は結合選択性を変更できるということが理解される。例えば、修飾されていないＤＮＡを捕獲するために、主な結合力は、疎水性力、電荷間力（静電気力）及び水素結合である。従って、修飾されていないＤＮＡを捕獲するためには、溶液相における反応で捕獲表面にビニル基を付加してもよく、プロピルアミン基をＣＶＤによって付加してもよく、他のアミン好ましくは三級アミンを公知の反応で付加して電荷間相互作用を最大化してもよい。他の代替法では、オリゴｄ（Ｔ）をアミノ化された表面に共有結合させてもよく、これによってポリ（Ａ）ｍＲＮＡの捕獲が増大する。シリコン表面と官能基との間に一般式Ｃｎのスペーサーが加えられてもよい。これらの各々について、特徴及び／又は結合能力は、官能基の濃度を変化することによって変更することができる。
【０２８５】
本発明のさらなる利点は、特に高処理能力のサンプル処理システムの状況では、核酸を用いた反応を実行するのに伴う処理工程の数、並びにその実行に必要な核酸及び試薬の量を減らすために本発明が有用であるということである。例えば、ＤＮＡ配列決定反応については、配列決定プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ジデオキシヌクレオチド、ｄＮＴＰｓ、緩衝液、塩及び水を含む反応混合物と鋳型ＤＮＡとを、反応を活性化するサーマルサイクリングを実施する前に、合わせる必要がある。代表的には、これは、管へ反応混合物を等分することによって２０μｌの反応物を調製する工程、引き続く２００ｎｇの鋳型ＤＮＡの添加を含む。ＤＮＡを等分するために用いたピペットチップは代表的には、ＤＮＡストックの汚染を回避するために廃棄される。次いで、この成分は混合されて、サーマルサイクルされ、解析される。
【０２８６】
本発明の実施形態に従って、キャピラリー管はＤＮＡ溶液で充填され、結果としてキャピラリーの内側に５ｎｇの鋳型の可逆的固定が得られる。幾つかの処理工程の後、次いで、このキャピラリーは５００ｎｌの反応混合物で充填され、これによって鋳型は管の内側から混合物中に溶出される。次いで、このキャピラリーは封止されてサーモサイクルされ、これには引き続き高い感度のキャピラリー電気泳動システムによる反応生成物の解析を伴う。キャピラリーは、毛管現象によって充填されるピペッターとして、かつ反応チャンバとして同時に働くので、専用のピペッティングシステムを用いて、鋳型ＤＮＡ溶液又は反応混合物のいずれかを別々に等分することは不必要である。キャピラリーを充填するためにキャピラリーが浸される各々のストックを提供することだけが必要である。これによって処理の工程及び使い捨てのピペッターチップのような資材が削減される。これによって、また試薬であって、そうでなければ処理工程の間に持ち越される試薬が削減されて、反応に持ち込まれない。
【０２８７】
キャピラリー中で実施される配列決定反応は、反応体積のわずか１／１０〜１／４０で達成され、従って、試薬の費用については１／１０〜１／４０で達成できるということも明白である。まとめると、これらの利点によって、処理は減り、速度は上昇し、費用は減少する。高処理能力のサンプル処理システムの設計においては、キャピラリー又はその機能的な等価物を、当技術分野で周知の方法で平行に並べて、同時に処理できる反応物の数を増やすことができる。本明細書において開示される本発明の種々の実施形態を使用して享受される利点の大きさは、処理されるサンプルの数に比例して大きくなる。
【０２８８】
反応チャンバにおける核酸の可逆的直接固定
図１５は、フローチャートであって、図１６は、本発明の実施形態に伴う工程を示す概略図であり、ここでは核酸は、ガラスキャピラリー管のような反応チャンバの内面に可逆的に固定される。この方法で調製された反応チャンバは、次に、核酸との配列決定反応を実行するために、核酸との別のタイプの酵素反応もしくは生化学反応を達成するために、又は基板、例えばマイクロリットルディッシュウェル上に、もしくはキャピラリー電気泳動デバイスのような解析装置の中に核酸の予め決定された量を分配するために、用いることができる。
【０２８９】
図１５及び図１６を参照すると、工程１では、核酸サンプルを適切な供給源から調製し、その後に、工程２において、核酸８０を、カオトロピックイオンを含む溶液１８に溶解する。工程３では、反応チャンバは、核酸−カオトロープ溶液で充填され、工程４において、反応チャンバ１２の内面８２に対する核酸８０の可逆的結合を可能にするのに十分な時間インキュベートされる。工程５においては、核酸−カオトロープ溶液を除去して、続いて、反応チャンバを、工程６では洗浄し、工程７では乾燥する。この時点で、反応チャンバは使用可能である。パーツ１２は、キャピラリー管をいい、またより広義には、反応チャンバをいい、これにはキャピラリー管及びその機能的に等価な構造を含む。パーツ８０は、ＤＮＡをいい、又は広義には、ＤＮＡ及びＲＮＡ並びにその誘導体を含む核酸をいう。
【０２９０】
このプロセスは、適切な供給源から、図１５の工程１の核酸を得る工程によって開始する。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であっても、リボ核酸（ＲＮＡ）であってもこれらの分子の誘導された型であってもよい。核酸は、種々の生存している生物体又は生存細胞にある自己複製システムから、当技術分野で周知の方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２０００，Ｆｒｅｄ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編．，ＩＳＢＮ  ０−４７１−５０３３８−Ｘを参照のこと）によって単離し、かつ精製することができる。細胞は真核生物細胞であってもよいが、これは、ヒト及び非ヒト哺乳動物の細胞、非哺乳動物細胞、植物細胞及び真菌の細胞を含む。さらに、真核生物細胞は、アメーバ又は他の寄生生物のような、自由生活性の単細胞の生物体であってもよい。細胞はまた、細菌及び古細菌を含む原核生物細胞であってもよい。核酸はまたウイルスから得ることもできる。ウイルスとしては、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルス、並びに動物細胞、植物細胞、真菌細胞及び細菌細胞に感染するウイルスが挙げられる。核酸はまた、当技術分野で周知の化学合成法によって生成することができる。
【０２９１】
適切な供給源から鋳型核酸を得た後、核酸（図１６の８０）は、カオトロピック剤を含む溶液に再懸濁され、及び／又は溶解される（図１５の工程２、及び図１６の８２）。このカオトロピック剤は望ましくは、本発明を実行するのにおいて溶液が供される全ての条件下で、十分高濃度（例えば、約０．５Ｍ〜８．０Ｍ）では核酸の可逆的結合を達成するが、それほど高濃度でなければ、核酸又はカオトロープ自体を溶液から沈殿させる。
【０２９２】
カオトロピック剤は、物質であって、それが水の局所構造を有するという破壊的な効果に起因して、非水相から水相への分子の分配に影響するという物質である。カオトロピック剤は、カオトロピックイオンの塩であり、水溶液中で高度に可溶性である。水溶液中で十分高い濃度では、このような塩によって提供されるカオトロピックイオンによって、核酸は二次構造又は三次構造を失い、二本鎖核酸は溶融する（すなわち、鎖の分離）。カオトロピックイオンは、水に存在する水素結合の網目状構造を破壊することによってこれらの影響を有し、核酸の変性された形態を、代表的な水性環境に存在するさらに高次の構造（例えば、二重らせん）に比べて、熱力学的にさらに安定にさせるということが仮説される。
【０２９３】
Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６，６１５〜６１９（１９７９）によって、Ｃｈｅｎ及びＴｈｏｍａｓ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，３３９〜３４１（１９８０）によって以前に記載されたように、十分に高濃度（例えば、約０．５Ｍ〜約８．０Ｍ）のカオトロピックイオンの存在下で、核酸は可逆的に、特定の物質、例えばシリカに結合する。シリカに対する核酸の結合の機構は、負に荷電されたシリカの表面での水構造のカオトロピックイオン破壊を包含し得る。これによって、陽イオン（例えば、Ｎａ＋又はＫ＋）媒介の塩架橋がシリカと核酸鎖の負に荷電されたリン酸骨格との間で形成されることが可能になる。核酸シリカ結合を達成するため、カオトロピック剤を単独で用いてもよいし、又は２つ以上のカオトロープの混合物として用いてもよい。塩架橋は、永続的な結合ではなく、その結合の近位でイオン濃度が低下するときは破壊され得る。この方法で、核酸はシリカ又は同様の物質から、水又は他の適切な低イオン強度の水性緩衝液を用いて溶出できる。
【０２９４】
カオトロピックイオンとしては、グアニジニウム、ヨード、過塩素酸塩、及びトリクロロ酢酸塩が挙げられる。カオトロピック塩としては、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、イソチオシアン酸ナトリウム、イソチオシアン酸カリウム、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、塩化リチウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、及びトリクロロ酢酸カリウムが挙げられる。カオトロピック特性を有する他の物質としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、尿素、及び塩化テトラエチルアミンを含むテトラアミンハライドが挙げられる。
【０２９５】
カオトロープの溶液中に核酸を溶解した後、核酸−カオトロープ溶液（図１６の８３）を、反応チャンバに導入する（図１５の工程３及び図１６の１２）。
【０２９６】
配列決定反応を達成するように用いる試薬の費用を削減する目的で、反応チャンバは代表的には極めて少量、望ましくは約１〜１０００ナノリットル（ｎｌ）、より望ましくは約１０〜５００ｎｌ、最も好ましくは約１００〜５００ｎｌである。
【０２９７】
ほとんどの環境では、反応チャンバは、毛管現象を利用して溶液を受動的に導入できるように構成される。毛管現象は、液体の上昇が、その液体と固体、例えば管（管）の側面が接触され、最も顕著にはキャピラリー管、すなわち極めて細い径の管（管）と接触される場所で生じる現象である。毛管現象は、表面張力によって、及びこの管の側面を湿らせることによって生じる力に依存する。液体の固体（湿潤）への付着の力が液体内の粘着力（表面張力）を超える場合、この液体は管を上昇、すなわち、静水学的なレベルを超えて上昇する。或いは、この溶液は、例えば、正の又は負の大気圧を用いるポンピングによって、能動的に反応チャンバ中に導入され得る。
【０２９８】
核酸−カオトロープ溶液を用いて反応チャンバを充填するために毛管現象を利用することは最も簡単かつ最も経済的である。この場合、キャピラリー管は、反応チャンバとして機能する。キャピラリーの孔が既知でありかつ均一な断面積であれば、この管の容積は、容易に算出され、これはその長さと直線的に比例している。従って、所定の総容積のキャピラリー管反応チャンバは、管を計算によって得られた所望の長さに切断することによって得ることができる。しかし、流体力学の法則に従って、溶液の密度がそれほど大きくなく、そのため表面張力が低く、管の直径が十分に小さくないということ、溶液のカラムが重力に打ち勝てず、従って管を充填できないということに注意を払わなければならない。
【０２９９】
充填の際に、管の１端は、核酸−カオトロープ溶液（図１６の８３）に浸される。この溶液は、通常、充填すべき任意の管の総容積を上回る容積で提供される。この様式では、この管は、１工程で充填され、インレットでの泡の形成の機会が減る。キャピラリーの反対の末端は開口されなければならない、そうでなければ管を充填することから空気を逃させることができる。
【０３００】
反応チャンバの外側は、キャピラリー管でそうであったように、細くて長いシリンダー（円筒）の形態に近づくということは必須ではない。むしろ、当業者に明確であるように、キャピラリー管の機能的等価物は、種々の方法で製造することができる。本明細書を通じて、キャピラリー管という用語は、キャピラリー管と通常呼ばれている構造だけではなく、それと機能的に等価なあるあらゆる構造にも該当する。例えば、液体がそれを毛管現象によって、又は幾つかの力、例えば陽圧もしくは陰圧、又は遠心力の直接の適用によって充填し得るように構成されるトンネル、チャネル又は溝が形成されてもよい。トンネル、チャネル又は溝は、機械的に、化学的に、熱的に、又は当業者に公知の他の手段によって形成することができる。チャネル又はトンネルは、例えば、ドリルビット、レーザー、又は化学的エッチングを用いて、マトリックスから物質を取り除くことによって、形成することができる。
【０３０１】
図３Ｅに図示されるとおり、任意の形状及び寸法のガラススライドのような、基板７２の表面の溝又はチャネル７８を、ノコで切断してもよいし、又はレーザーアブレーションもしくは化学的エッチングによって形成して、チップと呼ばれる構造、すなわちマイクロチップ７０を作製してもよい。例えば、シリコンウェーハ中の溝は、当技術分野で公知の写真平板術の方法論によって形成することが可能であり、ガラススライドの溝はフッ化水素酸を用いてエッチングすることが可能である。
【０３０２】
溝又は同様のくぼみ７８が、基板７２の表面で形成される場合、カバー７４を用いてそれを覆って、囲まれた空間を形成することが通常、有利である。溝又はくぼみ７８を覆うことによって、液体が相互作用する表面積が最大になり、それによって毛管現象が促進され、反応物質に接触する汚染物の機会が最小化され、反応温度の上昇の間、例えばサーマルサイクリングの間、反応物が蒸発する傾向を最小限にすることを保証する蒸発バリアを生み出すことが保証される。
【０３０３】
カバー７４は、溝が切断される基板７２の材料と同一である材料から構成されてもよいし、又は異なる材料から構成されてもよく、当技術分野で公知の種々の手段を用いて加えることができる。例えば、カバー７４は、エポキシ、シアノアクリレート、又は他のタイプの接着剤を用いて基板に接着されてもよい。カバーは、熱又は光の適用によって、それを溶融すること及びそれが融合するまで物質を置いておくことによって、溶着することができる。カバー７４はまた、例えば、クランプを用いるか、又は磁気さえ用いて、機械的に所定の位置に固定することができる。
【０３０４】
反応チャンバが構成される材料は、有利には、鋳型ＤＮＡ又は他の核酸が、十分に高濃度のカオトロピックイオンの存在下で、可逆的にかつ飽和的に結合する材料である。頻繁には、反応チャンバは、特にキャピラリー管として構成される場合、ガラスから構成される。高品質のガラスキャピラリー管は、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ，Ａｒｉｚｏｎａ，ＵＳＡ）を含む種々の製造業者から、ある範囲の内径で容易に入手可能である。
【０３０５】
ガラスのような脆弱な親水性の材料から構成される場合、ポリマー材料、例えばポリイミドを用いてキャピラリー管の外側をコーティングすることは有利であり得る。ポリイミドコーティングは、キャピラリー管を、屈曲による切断及び破損から保護する保護層を提供する。ポリイミドはまた、キャピラリーの外面に疎水性層を生じ、これが、キャピラリーが反応混合物に浸されることによって充填されるときの水性反応混合物の付着を防ぐことを補助し得る；この補助によって試薬の浪費が防止される。他の可能性のあるコーティングはアクリレート、シリコーン、フルオロポリマー、及びアルミニウムである。
【０３０６】
多くのタイプのガラスを用いることができるが、このガラスとしては以下が挙げられる：アルカリ−ホウケイ酸ガラス、アルミナケイ酸ガラス、バリウムフリントガラス（鉛ガラス）、バリウム−ホウ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス、Ｂ２Ｏ３を含むホウ酸ガラス、ＧｅＯ２を含むジャーミネイト（ｇｅｒｍｉｎａｔｅ）ガラス、カルコゲナイドガラス、ＳｉＯ２を含むケイ酸ガラス、シリカ（石英）ガラス、溶融シリカガラス、合成溶融シリカガラス、石英（結晶ＳｉＯ２）、溶融石英（アモルファスＳｉＯ２）、溶融合成溶融シルカ（石英）（ゲルマニウム、フッ素、ホウ素、リン及びチタンのような微量原子でドープされた）、ランタンガラス、光学ガラス、リン酸ガラス、及びソーダ石灰ガラス。
【０３０７】
或いは、反応チャンバは、ガラスのように、キャピラリー又はウェーハに造型され得る、金属又は半金属の材料から構成されてもよい。適切な純粋な金属及び合金の金属としては、マグネシウム、アルミニウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ジルコニウム、ニオビウム、モリブデン、パラジウム、金、銀、コバルト、ニオビウム、インジウム、ロジウム、スズ、鋼、ステンレス鋼及び青銅が挙げられる。適切な純粋な半金属及び合金の半金属としては、シリコン（ケイ素）、ゲルマニウム、ヒ素及びガリウムヒ素が挙げられる。
【０３０８】
反応チャンバはまた、炭素であって、その複数の同素体から構成されてもよいし、又はプラスチックのような有機化合物から構成されてもよい。炭素の同素体としてはグラファイト、ダイアモンド、Ｃ６０及び関連の同素体が挙げられ、これは例えば、ナノ管を含む。これらの物質については、カオトロピックイオンの存在下においてプラスチックに対する核酸の可逆的な結合を支持するような方式で炭素又はプラスチックを誘導体化することが必要かもしれない。
【０３０９】
反応チャンバ、例えばガラスキャピラリー（図１６の１２）を核酸カオトロープ溶液８３で充填した後、この溶液中のＤＮＡの少なくとも一部がチャンバ又は管の内面（図１６の８２）に可逆的に結合するような時間及び条件下で、この溶液をインキュベートする（図１５の工程４）。他の実施形態では、不可逆的結合を達成することができる。
【０３１０】
理論で拘束されることは望まないが、上記で考察されたように、内面がＳｉＯ２（シリカ）含有ガラスである場合、十分に高濃度のカオトロピックイオンの存在下で、核酸はリン酸骨格を介したシリカとの塩架橋型の結合を形成する可能性が最も高いと考えられる。通常、結合は、ほぼ室温（約２４℃）で進行させられるが、結合の有効性が有意に妨害されない限り、溶液からＤＮＡもカオトロープも沈殿しない限り、必要に応じて、他の温度を選択してもよい。
【０３１１】
核酸カオトロープ溶液中の核酸が反応チャンバ又は管の内面８２に結合する機会を有した後、次に未結合のＤＮＡ及びカオトロープを含有する溶液を除去し（５）、この内面を洗浄液で洗浄し（６）、次いで残りの微量の液体を洗浄液から乾燥によって除去する（７）。
【０３１２】
陽圧もしくは陰圧の空気の適用を含む種々の手段によって、又は溶液を追い出すための遠心分離によって、核酸カオトロープ溶液のかなりの割合をチャンバから除去する。
【０３１３】
洗浄を実施して、過剰の未結合の核酸、カオトロープ剤、及び核酸が夾雑しているかもしれないあらゆる不純物を除去することによって、結合した核酸を精製する。カオトロピック剤を除去することは重要である。なぜならこれらのイオンは、極めて低濃度でさえ、ほとんどの引き続く化学反応及び生化学反応を重度に妨害し得るからである。洗浄は、種々の方法で実施することができる。例えば、キャピラリー管は、毛管現象によって充填することが可能であり、その後に、核酸−カオトロープ溶液の除去と同様の様式で洗浄液を追い出す。或いは、反応チャンバは、洗浄液のポンピングによって充填したり、空にしたりすることができる。十分な容積の洗浄液を用いて、全ての夾雑物の存在を実質的に排除する。洗浄後、洗浄液をチャンバ又は管から除去する。
【０３１４】
洗浄液の組成物は、チャンバ又は管の内面に結合している核酸のかなりの部分を溶出することによってその組成物が除去されないように選択するが、代表的には、純水を用いたアルコールの溶液である。適切なアルコールとしては、低分子量のアルコールであるメタノール、エタノール及びイソプロパノールが挙げられる。アルコールの濃度は、核酸の溶出が最小限であるのに十分な高濃度であり、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％の容積比である。代表的には、エタノールを、約７０％〜８０％の容積比を上回る濃度で用いる。
【０３１５】
洗浄液はまた、塩を、好ましくは緩衝液、例えば酢酸塩緩衝液、又はｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（これは以下を含む：例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０）の形態で含んでもよい。この塩は、ｐＨが約６．５〜８．５の範囲であるようにｐＨ緩衝の効果、また洗浄の間のＤＮＡとチャンバもしくは管の内面との間の結合相互作用を安定化する効果を有してもよい。
【０３１６】
乾燥によって、チャンバ又はキャピラリー管に残る洗浄液のわずかな容積から全ての微量の液体を実質的に除去することが頻繁に所望される。この液体の幾つかの成分、例えばエタノールは低濃度では、引き続く生化学的反応を有意に妨害しない傾向であるが、高濃度では妨害し得る。乾燥はチャンバ又は管を十分大きい減圧に供することによって達成することが可能であり、その結果液体は気化されて取り除かれる。或いは、乾性ガス、例えば、空気、窒素又はアルゴンは、チャンバ又は管を通して圧力を強制して、液体の気化を促進し得る。乾性ガスを暖めてさらに気化を促進することができる。
【０３１７】
乾燥後、反応チャンバ（ここでは可逆的に固定された核酸を保有する）をただちに用いて、核酸との生化学的反応を実施してもよいし、又は将来の使用のために適切な条件下で保管してもよい。上記で考察された工程によって調製された反応チャンバを有利に用いて核酸の量を平行した反応で用いられるように標準化し、基板上に予め決定された量のＤＮＡ又はＲＮＡを分配し、ナノスケールのＤＮＡ配列決定反応、並びにＤＮＡ及びＲＮＡとの多くの他のタイプの反応を実施することができる。しかし、当業者には明白となるように、これらの特定の適用は、このような反応チャンバを用いることができる用途の範囲を限定するものではない。
【０３１８】
自動システムでの本発明の使用
キャピラリー管の形態の反応チャンバは、図１５に図示されるように処理され、単独で用いられることができるが、頻繁にはマルチキャピラリー管を平行な様式で組み合わせることが有利であり、それによって特に自動システムにおいてサンプル処理能力を増大することができる。この目的のために、キャピラリー管を、キャピラリーカセットへと便利に組織化することができる；カセット当たりのキャピラリー管の密度が大きくなるほど、潜在的なサンプル処理能力が大きくなる。同時係属の米国特許出願第０９／５７７１９９号に記載のような装置を用いて、図１に図示される処理工程、並びにキャピラリーの充填、空にすること、洗浄、乾燥及び又はサーマルサイクリングを含む、固定された核酸との反応の実行に付随する任意の引き続く工程を自動化することができる。この方法で用いられる、カセットは自動化された固定容積の平行ピペッターになり、これによって、全てのキャピラリー管を、同じプレートのウェルから毛管現象によって同時に充填することが可能になる。
【０３１９】
キャピラリーカセット１５は、図３Ａに示される。このキャピラリーカセットは、基板１０を通じて延びる多数のキャピラリー管から構成される。このキャピラリーカセットは少なくとも１列の８個のキャピラリー管を有すること、及びこのキャピラリー管は等間隔であることが好ましい。示されるキャピラリーカセットは、８×１３のアレイに配列された９６個のキャピラリー管を備える基板１０を有するが、ここでこの管の間隔は、９６ウェルのマイクロプレートのウェルの間隔に適合している。
【０３２０】
キャピラリー管１２は、基板１０を通って延び、好ましくは均一なパターンで配列される。このキャピラリー管は、等しい長さであり、実質的に平行な配向で基板を通じて延びており、その結果キャピラリー管１２の両端の各々は、同一平面上にあって、キャピラリー管１２の末端によって規定される平面は実質的に基板１０に平行である。このキャピラリー管の間隔は、均一であって、マイクロプレートの上のウェルの中心間の間隔に適合するように選択されてもよい。例えば、標準的な９６ウェルのマイクロプレート上で、キャピラリー管は、９ｍｍの中心間間隔で配列され、３８４ウェルのマイクロプレート上に、キャピラリー管１２は、４．５ｍｍの中心間間隔で配列される。より高密度のキャピラリー様式であって、１５３６ウェルのマイクロプレート又はより高いウェル密度のプレートに適合する様式もまた可能であるはずである。キャピラリー管１２は好ましくは、基板内に固定され、その結果、基板１０の一方の側から延びるキャピラリー管１２の長さは、基板１０の反対側のキャピラリー管の長さよりも短い。この基板の短い側のキャピラリー管１２の長さは、マイクロプレートのウェルの深さに適合してもよく、その結果、この短い側の長さは、マイクロプレート中のウェルの深さよりも短い。この特徴によって、キャピラリーカセットを、マイクロプレートに挿入することが可能になり、その結果、基板１０は、マルチウェルプレートの上部リップに対して止まり、この基板の一方の側のキャピラリーは、底に触れることなくマルチウェルプレート中に延びることができる。例えば、９６ウェルマイクロプレートでは、このキャピラリー管は、基板上に配置されてもよく、その結果この基板から延びるキャピラリー管の短い方の側は、キャピラリーがこのウェルの底に触れることなくマイクロプレート中のウェルに挿入され得る。これによって、ウェル中に分配された液体がこのキャピラリーに再進入することを妨げるようにキャピラリーから除去することを確実にする。
【０３２１】
キャピラリーカセット基板１０は、ファイバーガラスボード又は他の剛直な半可撓性材料から作製することができる。キャピラリー管１２は、均一に間隔の空いたホールを通じてこの基板に挿入されて、接着剤で固定され得る。１つの実施形態で、この基板の長さ及び幅は、標準的な９６ウェルのマイクロプレートの長さ及び幅と同様である。これによって、マイクロプレートの操作のために設計された自動システムを、キャピラリーカセットを取り扱うために適合させることが簡単になる。
【０３２２】
生化学的反応において使用される核酸の量の正確な制御及び標準化
核酸との生化学的反応を実行することを企図する場合、インプットした核酸の量を正確に知ることが反応を成功させるためにしばしば重要である。これによって、実験者は、他の反応成分、例えば酵素の適切な比を適切に算出することが可能になる。例えば、背景の節で考察したように、キャピラリー電気泳動システムで解析するには多すぎる鋳型ＤＮＡを配列決定反応に用いる場合、しばしば質の劣る配列決定データが得られる。ストックサンプルにおける核酸濃度は２６０ｎｍでの光吸収を測定すること、又は標準曲線に対する色素結合の量を測定することによって比較的容易に決定される。しかし、これらの方法の両方ともサンプルの一部までを使用し、いずれの方法も高処理能力サンプル処理システムの状況では実施することが容易ではない。幸運にも本発明は、種々の適用のために用いられる核酸の量を正確に制御するために有用である。
【０３２３】
結合反応が反応チャンバ中で生じている間、核酸−カオトロープ溶液を、チャンバ又は管の内面と十分な時間接触したままにさせ、核酸が溶液中で十分に高濃度である場合、核酸を用いてチャンバ又はキャピラリーの内面の利用可能な結合部位を飽和させることができる。これは飽和的結合として公知である。インキュベーションの前に溶液中の核酸の量がチャンバの内面の結合能力を超えている限り、この溶液中の最初の核酸の量にかかわらず、ある一定の、最大量の核酸が固定される。この方法では、溶液中の核酸の濃度が最小を上回る場合、正確な濃度を知る必要は無い；結合した核酸の量は、反応チャンバの結合能力によって、単独で決定される。従って、飽和的に結合したキャピラリー管内の核酸が既知の容積の液体中に溶出される場合、この液体中の核酸の濃度及び量は、高い程度の正確性で知ることができる。
【０３２４】
従って、本発明を用いて、キャピラリー管又は反応チャンバの他の構成の結合能力に基づいて、核酸の少量の不変の量を獲得するか測定して正確に知ることが可能である。例えば、１０ｎｇの核酸を用いる反応を実行することが所望される場合、全部で１０ｎｇの核酸結合能力を有するキャピラリー管又は他の反応チャンバを得ることが必要なだけである。次いで、このキャピラリーを核酸−カオトロープ溶液で充填するが、ここで両方の核酸及びカオトロープは、合理的な時間で飽和的結合を支持するのに十分高濃度である。インキュベーション工程、空にする工程、洗浄工程及び乾燥工程が終了した後、実験者は、このキャピラリーが１０ｎｇの核酸を含むことを確信する。この核酸は分配のために溶出されてもよいし、又は将来の使用のためにキャピラリー中に残されてもよい。
【０３２５】
代表的には、結合能力、又は内面に飽和的に結合できる核酸の量は実験的に決定される。例えば、既知の量の試験核酸を、当技術分野で公知の方法に従って、放射性核種、例えば35Ｓ、33Ｐ又は32Ｐで標識する。標識後、標識された核酸の比活性を決定して、核酸の１質量単位当たり、又は１単位濃度当たり、１分当たりの崩壊の速度を確認する。次いで標識された核酸を、カオトロピックイオンを含有する溶液中に、予め決定した濃度で溶解する。次いで、標準反応チャンバ（一般的補給品の代表）を試験する。例えば、予め決定された長さのガラスキャピラリー管を切断して、標識された核酸カオトロープ溶液で充填する。飽和的な結合が生じるのに十分な時間、このキャピラリーを空にして、洗浄する。次いで、管内に残った放射能の量を測定して、標識の比活性の知識を用いて、核酸の量に変換する。次いで、任意の引き続く実験において結合について同様の条件が用いられる限り、この係数を用いて、同じロットから切断された任意の長さのキャピラリー管に保持される核酸の量を算出する。
【０３２６】
予め決定された量の核酸を正確に得るために本発明を用いることの利点は、引き続く使用のために核酸の量を標準化するということである。この利点は特に、多くのサンプルを処理する必要がある場合に、重大である。例えば、当技術分野の状況では、配列決定のために異なる鋳型ＤＮＡを調製する場合、この鋳型の濃度が同じであることを確実にすることは実際的ではない。従って、先行技術の方法によれば、各々の調製においてＤＮＡ濃度を別々に決定すること、及びこのＤＮＡを各々のサンプル及びあらゆるサンプルについて適切な濃度に希釈することによって、異なる鋳型ＤＮＡサンプルを標準化することが必要であった。これは、鋳型ＤＮＡをキャピラリーに過剰にロードすることに対するその技術の感度のせいで、キャピラリー電気泳動には特に重要である。鋳型ＤＮＡの標準化のための要件のために、このシステムを用いる高品質のＤＮＡ配列データを得るための十分な時間及び費用が増えるか、又は研究者は失敗率の増大を受け入れる必要があった。
【０３２７】
しかし、本発明によって非常に急速な標準化で出発鋳型濃度の相違を最小限にすることが可能になる。異なる鋳型を予め決定された濃度に標準化するためには、既知の飽和的のＤＮＡ結合能を有する機能的に等価なキャピラリー管（各々の鋳型について１つ）、並びにキャピラリー中の全てのＤＮＡ結合部位が合理的な期間内に占有される、十分に高濃度のＤＮＡ及びイオンの両方を含む鋳型ＤＮＡ−カオトロープ溶液を提供すること必要なだけである。空にすること及び洗浄の後に、全てのキャピラリーは、ほぼ同じ量の鋳型ＤＮＡを含み、これによって標準化されている。
【０３２８】
当業者に明白であるとおり、反応チャンバの内部の全ての可能性のある核酸結合部位を飽和することが所望されない場合、可逆的に結合される核酸の量を制御することが可能である。これが可能である理由は、結合反応の反応速度論が、核酸濃度、平均核酸分子サイズ、溶液のｐＨ、カオトロピックイオンの濃度、反応チャンバの内面の利用可能な結合部位の数、及び温度を含む、多数の変数に依存するためである。従って、実証的分析によって、反応チャンバの内側の全ての利用可能な核酸結合部位を飽和しない、核酸の予め決定された量の一貫した予測可能な可逆的結合を生じる結合状態を確立することが、当業者には可能である。
【０３２９】
キャピラリー電気泳動のためのＤＮＡ配列決定
本発明の利点は、ＤＮＡ配列決定反応を実行するために、特に、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）のような高度に鋭敏なキャピラリー電気泳動システムを用いた解析のために有利に適用される。ＤＮＡ配列決定に本発明を用いるためには、鋳型ＤＮＡは、キャピラリー管、又はその機能的な等価物の中で固定されなければならない。鋳型ＤＮＡとは、構成要素の塩基の配列を決定すべきＤＮＡである。鋳型ＤＮＡは、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖では２つの相補的なＤＮＡ鎖が一緒にハイブリダイズされ、１つの鎖の配列の知識を用いて、ワトソン・クリックの塩基対相補性の法則に従えば他の鎖における塩基の配列を推測できる。
【０３３０】
鋳型ＤＮＡは代表的に、自己複製する遺伝子系であって、宿主中で増殖し、配列決定すべきＤＮＡフラグメントをここにクローニングした遺伝子系から直接得られる。或いは、この鋳型は、任意の供給源、例えばゲノムＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応、又は機能的に等価である直線もしくは指数関数的な増幅プロセスを用いて、特定のＤＮＡ配列を増幅することによって、得ることができる。
【０３３１】
自己増幅する遺伝子システムとしては、エピソームエレメント、例えば、複製起点を含むプラスミド、又はバクテリオファージ（例えば、λ又はＭ１３）が挙げられるが、この両方ともそれぞれ形質転換又は感染の後に、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌の中で複製し得る。鋳型ＤＮＡを保有するプラスミドは、そのプラスミドが十分に高いコピー数まで複製された細菌を破壊すること、及び上清からプラスミドを単離することによって得られる。宿主細菌を溶解した後に細菌の培養上清中に放出されたバクテリオファージを収集して、バクテリオファージの粒子を破壊することによってＤＮＡを単離する。哺乳動物細胞において哺乳動物の複製起点を含むエピソーム因子を増殖させて、続いてＨｉｒｔ法に従ってＤＮＡを単離することも可能である。
【０３３２】
インタクトなゲノムＤＮＡに比べて、プラスミド又は他のエピソームＤＮＡの間の分子量の実質的な相違に起因して、反応チャンバとしてのキャピラリー管の使用によって、インタクトなゲノムＤＮＡからプラスミドＤＮＡを、その両方が細菌又は他のタイプの細胞を溶解した後に放出されるとき、迅速に精製する都合のよい方法が得られる。要するに、プラスミド及びインタクトなゲノムＤＮＡの混合物をカオトロピックイオンの溶液中に合わせる。プラスミドが望ましくは固定される小径のキャピラリーを溶液に浸す。このプラスミドはその量が少ないために、キャピラリーの孔を満たすときにキャピラリーの孔を容易に通過して、それによってガラス壁と相互作用し、塩架橋を確立して固定される。対照的に、極めて大きい分子量であるインタクトなゲノムＤＮＡは、小径のキャピラリーから排除され、従ってプラスミドからサイズ排除によって分離される。
【０３３３】
言及されたとおり、鋳型ＤＮＡはまた、適切な供給源、例えばウイルス、細菌を含む原核生物細胞、又は哺乳動物、他の動物もしくは植物を含む真核生物の細胞からＤＮＡフラグメントを直接増幅することによって、クローニング工程を要することなく得ることができる。
【０３３４】
本発明の方法に従って、鋳型ＤＮＡ（図１６の８０）をガラスキャピラリー管１２の内面８２に可逆的に直接結合した後、ＤＮＡ配列決定反応に影響する配列決定反応混合物８４を用いてキャピラリーを充填する。この反応を、ＤＮＡ配列決定反応生成物が蛍光色素で標識される、当技術分野で周知の技術によって実行する。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション技術は、当技術分野で十分確立されている。要するに、鋳型ＤＮＡ分子における配列に相補的なプライマーが、鋳型にハイブリダイズすることを可能にする。次いで、ＤＮＡポリメラーゼが、成長するプライマーの３’末端にｄＮＴＰを付加することによって、鋳型中の塩基の配列を読むことにより、プライマーを伸長する。しかし、対応するｄＮＴＰの特徴である、ヒドロキシル基を欠くジデオキシヌクレオチド三リン酸は、成長する鎖に対する塩基のさらなる付加を妨げる。チェーンターミネーションの結果として、クロマトグラムにおける終止した鎖のパターンによって、実験者は、鋳型中の塩基の配列を推測することができる。伸長されるプライマーに蛍光発色団を連結することによって、或いは全てのジデオキシターミネーター（これは、成長しているＤＮＡ鎖に取込まれた場合、プライマー伸長の終結を生じる）に蛍光発色団を連結することによって、終止した反応生成物を蛍光的に標識する。
【０３３５】
近年では、エネルギー移動、色素連結蛍光発色団システム（光アクセプター色素及び蛍光エミッター色素から構成される）の使用によって、レーザー走査配列決定システムの能力が改善されている。各々のジデオキシターミネーターは２つの色素で標識される。これらの色素のうちの１つであるフルオレセインは、配列決定機においてレーザーによって生じる入射レーザー光から光エネルギーを吸収し、アクセプター色素に対する無放射線エネルギー移動を介して収集されたエネルギーを移動する。４つのチェーンターミネーターであるｄｄＧ、ｄｄＡ、ｄｄＴ及びｄｄＣの各々は、フルオレセインドナーと連結された異なるアクセプター色素を有する。次いで、このアクセプター色素、例えば、ローダミン１１０、ローダミン−６−Ｇ、テトラメチルローダミン及びローダミンＸは、その特徴的な波長で光を放射する。フルオレセインは、どのヌクレオチドがターミネーション事象を生じたかを特定することを可能にする装置によって検出される。エネルギー移動システムの使用によって、レーザーによる直接励起よりもアクセプター色素のより効率的な励起が生じ、これによってさらに高感度が得られる。ジデオキシターミネーターを蛍光的に標識するのとは別の方法として、配列決定プライマーを標識することが可能である。このシステムを用いる場合、エネルギー移動色素は、プライマードナー色素及びアクセプター色素に連結することによって同様に用いることができる。プライマーと連結しているべきドナー色素の例は、５−カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）であり、プライマーと連結しているべきアクセプター色素の例は、シトシンについてはローダミン１１０（Ｒ１１０）、アデニンについては６−カルボキシローダミン（ＲＥＧ）、グアニンについてはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、チミンについては５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）である。このエネルギー移動色素連結蛍光発色団システムは、発行された米国特許第５６８８６４８号、同第５７０７８０４号、同第５７２８５２８号、同第５８５３９９２号、同第５８６９２５５号、及び同第６０２８１９０号（その全てがその全体が参考として本明細書に援用される）にかなり詳細に考察されている。
【０３３６】
固定された鋳型ＤＮＡ  ８０を含むキャピラリー（図１６の１２）は、反応混合物で充填されたリザーバ８５中にこのキャピラリーを浸すことにより毛管現象によって充填される。この反応混合物８４は、配列決定反応を達成するのに適切な濃度で全ての成分を含む。この成分としては、水、塩、緩衝液、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ及びジデオキシターミネーターが挙げられる。理論によって拘束されることを望まないが、水性混合物がキャピラリーを上るにつれて、固定されたＤＮＡは再水和する可能性が高いということが現在、仮定されている。さらに、混合物中の塩のイオン強度は比較的低いので、ＤＮＡを固定させる塩架橋は、水分子によって破壊されて、このＤＮＡはキャピラリーの内面から溶出されて、反応混合物中に拡散する。或いは、又はさらに、このＤＮＡは、サーモサイクリング反応の間、脱着する。いかなる機構でも、この混合物へのＤＮＡの物理的混合は、この反応の能力に関しては必要ない。
【０３３７】
一旦キャピラリーを充填すれば、末端を封止して、内側に含まれる液体の蒸発を防ぎ、続いてサーマルサイクリングを行なって複数回の配列決定反応を起動させて、それによって、解析すべき蛍光標識生成物を生成する。キャピラリー及びサーマルサイクリングの封止は、当業者に明白であるように、種々の方法で達成することができる。しばしばそうであるように、多数の配列決定反応を平衡して実施することが所望される場合、実験者は、その全体が参考として本明細書に援用される、同時係属出願の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示されたように、高処理能力の装置を使用することが可能である。この開示された装置によって、カセット様式に配列された多数のキャピラリー管を封止するため、このキャピラリーに含まれる配列決定反応混合物のサーマルサイクリングを達成するための両方のための手段が提供される。
【０３３８】
配列決定反応が終了した後、反応生成物をキャピラリー管から、代表的にはキャピラリー電気泳動による解析のための調製物中に追い出す。
【０３３９】
代表的には、この反応生成物は、基板上に、又は液体のための幾つかの形態のホルダー中に、例えばマイクロタイターディッシュのウェル中に排出され、これからキャピラリー電気泳動システムは、解析用の生成物をサンプリングすることができる。しかし、反応生成物は、反応キャピラリーから電気泳動キャピラリーへ直接排出されることが可能であることを当業者は認識する。遠心力の適用によって、電気運動学的に、陽圧又は陰圧の空気の適用によって、又は当技術分野で公知の他の手段によって、反応性生物は、反応キャピラリーから追い出され得る。
【０３４０】
さらに、反応生成物は、他のタイプの解析プロセスに適合した基板上、例えば、質量分析解析のためのＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化）基板、又はＳＥＬＤＩ（表面増強レーザー脱離／イオン化）基板に排出されてもよい。
【０３４１】
蛍光標識配列決定反応生成物の電気泳動の間、この生成物を担持するキャピラリー中のウインドウをレーザーでスキャンし、蛍光発色団を励起させる。蛍光発色団による発光を捕獲して、コンピューターメモリに記憶されている強度及び光周波数のデータに変換する。スキャン及び読取りが終了した後、このコンピューターは、この走査システムによって検出された全ての反応生成物を提示するクロマトグラムをアセンブルする。出発する鋳型ＤＮＡにおけるヌクレオチド塩基の配列を推測するクロマトグラムを解釈するコンピューターソフトウェアによって、このクロマトグラムにおけるデータを処理する。次いで、配列アウトプットを、コンピューターデータファイルに、ランダムアクセスメモリか、又は専用の長期記憶デバイス、例えばフロッピー（登録商標）ディスク、ＺＩＰディスク、ＪＡＺディスク、ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、コンピューターテープなどに記憶する。このデータの最終使用者が便利なように、配列データを含むコンピューターファイルを、離れたクライアントのコンピューターからアクセス可能なコンピューターサーバーに記憶する。ファイルが伝えられるとき、これは銅又は光ファイバーの電話線、ケーブルテレビの線、又は電波を通じて伝えられる搬送波を伴うデータ信号として提示される。
【０３４２】
一旦、空にされれば、キャピラリー管は、新しい核酸サンプル、例えば、配列決定すべきＤＮＡ鋳型の固定のためにリサイクルされる。管のリサイクルには、以前の反応の有害な痕跡であって、反応生成物、反応混合物成分及び固定された核酸を含む痕跡を除去するための洗浄が必要である。
【０３４３】
代表的には、洗浄液は、あらゆる残りの固定された核酸が溶出されかつ持ち去られる傾向であるように、低いイオン強度の洗浄水溶液である。二回蒸留水が効果的である。この洗浄液を加熱して、洗浄の有効性を増大することが可能であり、１回の洗浄サイクル当たりの洗浄の回数及び／又は洗浄液の容積は、洗浄有効性を最大化するために必要である場合、変化することができる。キャピラリーを毛管現象によって洗浄液を用いて充填することが可能であり、次いで反応性生物の排出と同じ方法を用いて空にすることができる。洗浄が電気運動学的なポンピングによって達成されることであるならば、この洗浄液は、ほぼ最小濃度のイオンを含むべきである。或いは、機械的なポンプを用いて、キャピラリーを通じて洗浄液を駆動してもよい。
【０３４４】
洗浄はまた、その開示全体が参考として本明細書に援用される、同一人が所有する同時係属の２０００年５月２３日出願、米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示されるように、機械的なキャピラリーカセット洗浄器によって達成することができる。
【０３４５】
カセットに配列された多数のキャピラリーを洗浄するために設計されたキャピラリー管洗浄デバイスのデザインは、その全体が参考として本明細書に援用される、同時係属の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示される。
【０３４６】
水性の洗浄の後、通常高濃度のエタノールを含むアルコール洗浄を用いて、洗浄液の水及び他の成分のほとんどの痕跡を除去する。次いで、代表的にはキャピラリーを通じて温かい乾燥空気を引き込むことによって、キャピラリーを乾燥し、その後、そのキャピラリーを貯蔵又は再使用のために準備する。
【０３４７】
幾つかの適用については、キャピラリー中に以前の反応から核酸が本質的に残らないことが重要である。１例はＰＣＲであって、ここでは古い残りの鋳型ＤＮＡを指数関数的に増幅して、新しい反応の汚染をもたらすことがあり得る。このような場合、このリサイクルプロセスは、核酸の痕跡を破壊するのに有効な工程を含んでもよい。このような手段は、エキソヌクレアーゼを含む溶液を用いるキャピラリーの充填の工程、及びあらゆる核酸を消化するのに必要な時間インキュベートする工程を含む。他の手段は、例えば、高度に酸性の溶液又は塩基性の溶液を用いる洗浄；漂白剤との接触；イオン化合物放射線でのキャピラリーの照射；又は高温でのベーキングによる、核酸の化学的な分解を含む。残りの核酸を破壊した後、キャピラリーを代表的には標準的な溶液を用いて洗浄する。
【０３４８】
カセット中でキャピラリーを用いる平行処理が有用である、１つの適用（ただし決して１つだけではない）は、高処理能力の新生の配列決定のための、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）の発見のための、ＤＮＡの配列、しばしばＰＣＲの生成物の確認である。ＳＮＰ発見のためには、本発明の方法及び装置は、「深い（ｄｅｅｐ）」配列決定を可能にする。ここでは同じ遺伝子又は遺伝子座を複数の個体の配列における相違から配列決定して、配列決定された集団に存在する多形性を特定する。これらのうちで、幾つかのＳＮＰは、重要な表現型、例えば、疾患の素因、存在、又は進行能に関連することが実証される。
【０３４９】
ＳＮＰは、１０００塩基ごとにほぼ１回生じる単一の塩基変化であり、ヒトにおける遺伝子のバラツキの最も通常の形態である。このような多形性が遺伝子のコード配列又は調節配列で生じる場合、それらは、野生型の配列に比べて、遺伝子又は遺伝子産物の機能を変化し得る。遺伝子機能が改変される程度に依存して、生物体への影響は最小限であるかもしれないし、又は遺伝子疾患を含む有害な表現型を生じるかもしれない。
【０３５０】
ＳＮＰ及びそれらに関連する表現型の解析は、規定の疾患状態にかかわる遺伝子の検索において、薬理遺伝学の新しい分野で、その両方で有用である。
【０３５１】
疾患遺伝子を特定する目的で、ＳＮＰを、遺伝子連鎖解析のためのマーカーとして用いて、強力な遺伝性成分を伴う疾患を担う遺伝子を同定することを補助する。同様に、ＳＮＰ解析は、重要な表現型、例えば、薬物化合物又は他の治療レジメンに対する応答、及び疾患の素因又は疾患の進行能に関連する遺伝子の対立遺伝子改変体における変化を同定するのに有用であることが証明されている。
【０３５２】
ＳＮＰ解析はまた、患者の固有の遺伝的特徴に基づいて、個々の患者に薬物又は他の治療レジメンをカスタマイズするのにも有用である。これは、成長期にある分野である薬理遺伝学の根底にある概念である。例えば、特定の多形性又は多形性のセットは特定の薬物に対する反応性が乏しいということに関連しているかもしれない。次いで、さらなる研究によって、多形性変化が薬物を代謝することを担う酵素をコードする遺伝子に存在するということ、及びこの変化が酵素の反応速度を変更するということが示され得る。結果として、この薬物は野生型の酵素に比べてさらに迅速に代謝される。
【０３５３】
従って、ＳＮＰと酵素表現型との間の相関の知識によって、ＳＮＰを保有する患者の治療をカスタマイズするための機会が得られる。薬物投与の前に、ＳＮＰ解析に基づいて、どの形態の酵素が患者を表すかを医師が決定できれば、患者は、例えば、より大きい代謝速度を補償するためにより高用量の薬物を処方されてもよく、それによってこの患者にとって最適の治療効果が得られる。
【０３５４】
上述の方法は、薬物又は他のタイプの治療レジメンに影響する任意の遺伝子産物を含むように一般化されてもよい。実際、特定のＳＮＰの保有又はその欠失が治療結果に関連しさえすれば、野生型に比べた遺伝形質の変化が変化した表現型を生じる機構を理解する必要はない。この相関関係の知識のみで、特定の患者に適する治療レジメンを改変するように十分に医師を導くことができる。
【０３５５】
従って、ＳＮＰ解析はヒト及び非ヒト患者における治療レジメンに影響する遺伝子を特定するため、並びにＳＮＰマーカーを欠く患者集団に比べて改変された治療を要する患者を特定するための両方について有用である。しかし、ＳＮＰ解析の有用性は、医学的治療に関する適用だけには限定されない。実際、興味深い表現型に関連し得る任意の生物体の遺伝子におけるＳＮＰの同定は、特定の表現型を担う遺伝子を特定するため、及びこの表現型を改変させる遺伝的変更を特定するため、の両方についてますます有用である。このような知識によって、特定の遺伝子産物が機能する方法の理解が改善され、このような機能が有利に改変され得る方法に関する洞察が得られる。
【０３５６】
代表的には、ＳＮＰ解析は、本発明の適用が特によく適している高処理能力の方式で最も有利に理解される。得られるべき情報に依存して、１つ又は２〜３の遺伝子におけるＳＮＰの存在を、患者由来の多数のサンプル、又は非ヒトの供給源を含む、別のタイプの非遺伝的に同一の供給源から解析する。この方法は代表的には、ただし排他的ではないが、特定の表現型を有する特定のＳＮＰに関連するように大きいデータセットを得るように設計された研究に採用される。この方法はしばしば、ヒト又は動物の多数の患者の遺伝子に存在するＳＮＰを解析する施設によっても採用され、この情報は個々の患者に対する治療法をカスタマイズするために用いられる。
【０３５７】
或いは、高処理能力ＳＮＰ解析は、比較的少ないサンプルから得られた多数の遺伝子上で理解されるかもしれない。この方法は代表的には、患者に存在するＳＮＰの包括的な解析が所望される場合に有利である。このような情報は、複雑な多重遺伝子病因論を伴う疾患の状況において治療法をカスタマイズするために必要であるかもしれない。
【０３５８】
当技術分野で公知のように、公知の配列の遺伝子又は遺伝子フラグメントにおいてＳＮＰを検出するには種々の方法が有用である。このような技術のほとんどが、単一の塩基の変化の間接的な蛍光検出に依存するが、これは以下に詳細に記載される：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４７（２）：１６４〜１７２（２００１）に公開された、Ｍ．Ｓｈｉの「Ｅｎａｂｌｉｎｇ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｔｙｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ」（その全体が本明細書において参考として援用される）。例としてはオリゴヌクレオチド連結アッセイ遺伝子型決定（ＯＬＡ）；ミニシークエンシング（ｍｉｎｉｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）；ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子型決定；Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ；色素標識オリゴヌクレオチド連結；ピロシークエンシング；及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、が挙げられ、これは以下にさらに詳細に記載される：Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｗｓ  ６（２０００）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈに公開されたＺ．Ｃｌａｒｋ及びＪ．Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇの「Ｓｎｉｐｅｒ：ａ  ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｃａｌａｂｌｅ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ＳＮＰ  ｓｃｏｒｉｎｇ」（その全体が本明細書において参考として援用される）。
【０３５９】
ＳＮＰの検出の特に有用な方法は、蛍光検出を用いる一塩基伸長であって、これは一塩基伸長（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）（ＳＢＥ）としても公知である。ＳＢＥは部分的には、上記のＤＮＡ配列決定へのジデオキシターミネーター法に基づく。配列がこの配列の特定の塩基位置で１つ以上のＳＮＰを含むか否かを決定する解析のために、鋳型核酸が提供される。次いで、この鋳型において問い合わせられるべき塩基のすぐ５’側の既知の配列を特異的に認識するプライマーを、ワトソン・クリックの塩基対合を介して鋳型と接触させて結合させる。その後に、ＤＮＡポリメラーゼであって、その耐熱性バージョンを含み得るＤＮＡポリメラーゼが、問い合わせられるべき塩基で開始する鋳型鎖を読取って、反応混合物に存在する相補的なジデオキシターミネーターヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を酵素的に、プライマーの３’ヒドロキシル基に結合する。４つの塩基対Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔの各々は、反応混合物に存在するジデオキシターミネーターの中に示され、この４つの塩基の各々は、どの塩基が特定の蛍光発色団に連結されて存在するかを固有に特定する波長で、励起された光子を放射する蛍光発色団で標識されている。ジデオキシターミネーターは、それ自体は、ＤＮＡポリメラーゼによる鎖の伸長を支持できないので、伸長は、単一の相補的に標識されたジデオキシターミネーターの付加後に停止する。伸長反応が終了した後、伸長されたプライマーは、鋳型から温度によって、又は化学的に遊離され、プライマーを解析して、プライマーの３’末端に付着されたジデオキシターミネーター塩基に結合した蛍光発色団を検出する。蛍光発色団の特定によって、その発光スペクトルに基づいて、一塩基鎖伸長の間にＤＮＡポリメラーゼによって取込まれた塩基の明確な特定が可能になり、この塩基は、取込まれた位置で遺伝子に存在するＳＮＰを規定する。
【０３６０】
別の実施形態によれば、４つのｄｄＮＴＰ全てではなくサブセットを、当業者の必要性及び優先度に従って、ＳＢＥ反応混合物に含んでもよい。このようなｄｄＮＴＰサブセットは、以下の表に列挙されるサブセットを含む。
【０３６１】
【表１】
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【０３６２】
蛍光発色団の特定は、当業者の知識に従って種々の技術を用いて達成することができる。例えば、一塩基伸長反応生成物は、ＤＮＡ配列決定に用いたものと同様の変性ゲル上で、未取込みのジデオキシターミネーターヌクレオチドから分離することができる。ＳＢＥ生成物をゲル電気泳動によって分解した後、ゲル中のプライマーに結合した蛍光発色団を、適切な波長の光によって励起させ、蛍光発光を検出し、当業者の知識に従って解析する。或いは、未取込みのジデオキシヌクレオチドを、ゲル電気泳動によってＳＢＥ生成物の解析の前に除去してもよい。
【０３６３】
別の実施形態によれば、ＳＢＥ伸長生成物に取込まれた、蛍光標識されたジデオキシターミネーターヌクレオチドを、当業者の知識に従って蛍光偏光（ＦＰ）を用いて検出する。この技術によれば、偏光を用いて、蛍光発色団からの発光を刺激する。未取込みの蛍光発色団は、小さく、従って蛍光励起の際に偏光解消光を発光するが、かなり大きいＳＢＥ伸長プライマーに取込まれた蛍光発色団は、偏光を発光する。従って、偏光された蛍光発光の優先的な検出を用いて、伸長されたプライマーへの特定の蛍光発色団、従って塩基の取込みを推測することができる。ＦＰの使用によって、未取込みジデオキシターミネーターを予め除去しなくても解析をすることができる。ＳＮＰの検出に適用されるようなＦＰは、米国特許第６３２６６０５号；同第６３１０６８７号；同第６２９７０１８号；同第６１８７２６７号；同第６０９７０２５号；及び同第６０７１７４８号（その各々は、その全体が参考として本明細書に援用される）にさらに詳細に考察される。
【０３６４】
鋳型は、種々の供給源から、当技術分野で周知の技術によって獲得することができ、この供給源としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：真核生物細胞、原核生物細胞又はウイルスから得たゲノムＤＮＡ；プラスミドを含むエピソーマルＤＮＡ；及びメッセンジャーＲＮＡ又は他のタイプのＲＮＡ。鋳型は、一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡであっても、二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡであっても、又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであってもよい。鋳型が実質的にＲＮＡからなる場合、プライマーを伸長するために用いるべきＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素（ＲＴ）であって、これにはその耐熱性バージョンを含む。
【０３６５】
１つの実施形態によれば、鋳型はゲノムＤＮＡから得られるＰＣＲ生成物である。この実施形態では、一塩基伸長反応を達成する前に、ＰＣＲの鋳型として働くゲノムＤＮＡを特異的に認識するプライマーを用い、当技術分野で周知の方法を用いて、ＰＣＲ反応を実施する。その後に、ＰＣＲで生成したＤＮＡフラグメントは、ＳＢＥのための鋳型として働く。ゲノムＤＮＡ又は他の核酸から増幅された鋳型はまた、直線増幅プロセス、又はＰＣＲに機能的に等価である指数関数的増幅プロセスによっても得ることができる。
【０３６６】
ＳＢＥ反応は伝統的に、以下の実施例２２にさらに詳細に記載されたような、大きい、いわゆる「フルボリューム」反応体積中で実施されている。これらの方法によれば、ゲノムＤＮＡ鋳型を用いて複数のマイクロリットルの反応体積中でＰＣＲを実施して、引き続くＳＢＥ反応において用いるべき鋳型を生成する。その後に、ＰＣＲ生成物をＥｘｏＩ及びＳＡＰで処理して、それぞれ一本鎖ＤＮＡ及び過剰のｄＮＴＰを分解する。引き続き、ＰＣＲで生成した鋳型の一部を用いてＳＢＥを実施して、その後に、ＳＢＥ反応生成物をＣＩＡＰで処理し、次いで例えばｍＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）を用いて、キャピラリー電気泳動によって解析する。
【０３６７】
約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００又は２００マイクロリットルに及ぶ容積で、約１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０又は５マイクロリットル程度の低容積で、フルボリューム反応を実施する。
【０３６８】
記載されたとおりのフルボリューム法は有効であることが証明されているが、それらはまた試薬及び他の材料の浪費である。なぜなら高品質のデータを得るために必要なＳＢＥ生成物の量は、フルボリューム法を用いて生成する実際の量に対して極めて小さいからである。さらに、フルボリューム法は、ＰＣＲ及びＳＢＥにおいて種々のサーマルサイクリング工程を達成し、かつ工程の間に液体容積を移動するにはかなりの時間を必要とする。
【０３６９】
対照的に、ＳＢＥ及びその先行する工程に対する本発明の方法及び装置の適用は、有利なことに、試薬の使用を減少させ、酵素的反応を完了するのに必要な時間を短縮させ、液体移動工程の回数を減らす。さらなる利点が鋳型標準化によって得られ、これによって、その供給源を提供するどんな溶液中でも鋳型の濃度を、ＰＣＲ又はＳＢＥの前に予め決定することが不必要になる。
【０３７０】
結果として、ＳＢＥ、又はＳＮＰ検出の他の方法を用いる本発明の使用によって、高処理能力の方法の状況でＳＮＰの検出がかなり容易になる。
【０３７１】
部分的には、ＳＢＥ及びＳＮＰ検出の他の技術に適用されるような本発明の利点は、本発明のキャピラリーを用いてナノリットル容積（「ナノ容積（ｎａｎｏｖｏｌｕｍｅ）」とも呼ばれる）の反応の中で１つ以上の酵素反応を実施する効果である。詳細には、ナノ容積の反応の使用によって、用いられる試薬の量が減り、これによってフルボリューム反応と比べて費用が削減される。ナノ容積はまた、反応のサーマルサイクリングの間の１つの温度の別の温度への進行に必要な時間を短縮する。なぜなら、キャピラリー管を用いると、フルボリューム反応に用いられる反応管に比べて、反応混合物の総量は少なくなり、反応物の１単位容積当たりの表面積は大きくなるからである。両方の効果によって、熱移動の速度が向上し、それによってサーマルサイクルの全体のシリーズを実施するのに必要な時間が短縮される。最後に、以下にさらに詳細に考察されるとおり、鋳型捕獲、すなわち、カオトロープの存在下でのキャピラリーの内面に対する鋳型の可逆的結合によって、ＳＢＥを実施するために必要な１つ以上の工程の省略が可能になり、このアッセイを実施することに伴う試薬、費用及び時間がさらに低減される。
【０３７２】
全体を通じて用いられるとおり、ナノリットル容積の反応を、約２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、２５００、５０００以上のナノリットルに及ぶ容積中で、約２５００、２０００、１５００、１０００、７５０、５００、２５０、１００、５０、２５、１０以下のナノリットル程度の低容積で、実施する。
【０３７３】
本発明の実施形態によればカオトロープ溶液に溶解された鋳型は、毛管現象又は本明細書に記載された他の方法によって本発明のキャピラリー中に吸引され、このような鋳型の予め決定された適切な量が内面に可逆的に結合されるまでその内面に接触する。結合が終了した後、カオトロープ中の過剰の鋳型を除去して、結合した鋳型を本明細書のどこか他に説明されたように洗浄する。さらなる任意の乾燥工程後に、ＳＢＥを発効するのに必要な全ての成分を含むＳＢＥ反応混合物であって、緩衝液、塩、水、ＳＢＥプライマー、蛍光標識ｄｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼを含むＳＢＥ反応混合物を、毛管現象又は本明細書に記載の他の方法によってキャピラリーに吸引する。引き続き、ＳＢＥを達成するのに必要な場合、鋳型及びＳＢＥ反応混合物を含むキャピラリーを、サーマルサイクリングに付す。
【０３７４】
別の実施形態によれば、当業者によって決定された、反応を実施した後に検出可能なＳＢＥ生成物を生成するのに十分な鋳型の量が結合されるまで、ＳＢＥ鋳型は、カオトロープの存在下でキャピラリーの内面に可逆的に結合され得る。すなわち、ＳＢＥ鋳型の予め決定された適切な量が、実現されるべき本発明の有用性について、キャピラリーの内側に可逆的に結合される必要はない。
【０３７５】
反応が終了した後、ＳＢＥ生成物は代表的に、当技術分野で公知の方法に従って、未取込みのｄｄＮＴＰの除去を含む引き続く処理のために、例えば、ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）での処理によって、本明細書の他のいずれかで記載されるように、キャピラリーから追い出される。当業者によって理解されるとおり、ＣＩＡＰ処理はｄｄＮＴＰからリン酸基を除去して、脱リン酸化ｄｄＮＴＰは未荷電にされる。結果として、電気泳動中に、例えばＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）を用いて、処理されたｄｄＮＴＰは、荷電されたＳＢＥ生成物を篩い分けゲルに入れる強力な電場によって動かないように誘導される。この方法によってＳＢＥ生成物からの未取込みのｄｄＮＴＰの分離が容易になる。
【０３７６】
ＣＩＡＰ処理は、フルボリューム反応で、或いはナノ容積反応で達成することができる。フルボリュームＣＩＡＰ処理は、マイクロタイタープレートのウェル、例えば、１プレート当たり９６、３８４、１５３６又はより多数のウェルの中で都合よく実施される。対照的に、ナノ容積のＣＩＡＰ処理を本明細書のキャピラリー内で、ＳＢＥ生成物をＣＩＡＰ反応混合物と混合した後に、例えばマイクロタイタープレートのウェル内で実施する。
【０３７７】
ＣＩＡＰを用いたＳＢＥ生成物の処理の代替として、ＳＢＥ反応生成物とゲル濾過媒体とを、ＳＢＥ生成物からｄｄＮＴＰを分離するのに十分な時間接触させることによって、過剰の未取込みのｄｄＮＴＰを除去してもよい。完全な分離は必要ない；十分な分離の程度は、当業者の知識の範囲内である。ゲル濾過媒体は、ｄｄＮＴＰが媒体の細孔に入ることが可能であるがＳＢＥ生成物は実質的に排除されることを保証する特性によって選択される。この様式では、ｄｄＮＴＰが総容積中に含まれ、一方ＳＢＥ生成物は空隙容量内に含まれる。本発明における使用に適切な媒体の例としては、スーパーデックス（ｓｕｐｅｒｄｅｘ）、スーパーローズ（ｓｕｐｅｒｏｓｅ）、セファクリル（ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）、及びセファデックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０３７８】
最終的にＳＢＥ生成物を解析して、取込まれた塩基を特定する。本明細書において他のいずれかに記載されたように、このような方法の１つはＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）システムを用いるキャピラリー電気泳動である。マイクロ流体プラットフォームと組み合わされた電気泳動法をまた用いて、ＳＢＥの伸長生成物を分離することができる。このような方法は、その各々の全体が参考として本明細書に援用される、米国特許第６３１６２０１号；同第６３０６６５９号；同第６３０６５９０号；同第６３０３３４３号；同第６２８７７７４号；同第６２７４３３７号；同第６２６７８５８号；同第６２３５４７１号；同第６２３５１７５号；同第６１７４６７５号；同第６１５３０７３号；同第６１０７０４４号；同第６０６８７５２号；同第６０４２７１０号；同第５９７６３３６号；同第５９６５４１０号；同第５９５８６９４号；及び同第５９４８２２７号において、より詳細に考察される。
【０３７９】
或いは、ＳＢＥ生成物は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、又は表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）を含む質量分析技術を用いて解析することができる。
【０３８０】
別の実施形態によれば、ＳＢＥ反応混合物と既に混合されている本発明のキャピラリー中へＳＢＥ鋳型を吸引してもよく、この場合鋳型の標準化は行なわない。
【０３８１】
本発明の別の実施形態によれば、ＳＢＥの鋳型は、当技術分野で周知の方法に従ってＰＣＲで調製される。
【０３８２】
ＰＣＲは、フルボリューム反応で達成することができる。ＰＣＲが完了した後、以下にさらに詳細に記載されるように、この反応物を処理してプライマー及びｄＮＴＰを除去することができる。次いで、１つの実施形態に従って、上記のように、このＰＣＲ生成物をカオトロープと混合して、それを用いてＳＢＥ鋳型の鋳型標準化のために本発明のキャピラリーを充填し、続いて伸長反応を行なう。別の実施形態では、上記のように、ＰＣＲ生成物の一部を、処理後に、ＳＢＥ反応混合物に添加し、これを用いて、伸長反応の引き続く実施のために本発明のキャピラリーを充填する。
【０３８３】
ＰＣＲは、ナノリットル容積反応を用いて本発明のキャピラリー中で実施されてもよいが、この場合ＰＣＲには、ＳＢＥ鋳型について上記されたのと同様に、反応物中で用いるべき、ゲノムＤＮＡ、又は他のＰＣＲ鋳型の鋳型標準化が先行し得る。或いは、ＰＣＲ鋳型は、キャピラリーを充填する前にＰＣＲ反応混合物中に添加されてもよく、この場合、鋳型標準化は、行なわない。
【０３８４】
ＰＣＲ後に、反応生成物を代表的に、本明細書において他のいずれかに記載されるようにキャピラリーから追い出して、以下にさらに詳細に記載されるようにプライマー及びｄＮＴＰを除去するように処理する。フルボリュームＰＣＲの場合と同様に、次いで、処理されたＰＣＲ生成物をカオトロープと混合して、ＳＢＥ鋳型の鋳型標準化にために用いてもよいし、又はＳＢＥ反応混合物に添加してもよい。次いで、本明細書において他のいずれかに記載されるように伸長反応を実施する。
【０３８５】
上述のように、ＰＣＲが完了した後、ＰＣＲ反応生成物を代表的に、本明細書において他のいずれかに記載されるようにキャピラリーから追い出して、当技術分野で公知の方法に従って、それぞれ、一本鎖Ｄｎａｓｅ、例えば、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）、及びホスファターゼ、例えば、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いることによって処理して、過剰な未取込みＰＣＲプライマー及びｄＮＴＰを除去する。次いで、ＰＣＲ生成物を、ＳＢＥ鋳型として標準化してもよいし、又はＳＢＥ反応混合物に直接添加して、上記のように本発明のキャピラリー中で、ＳＢＥ中で用いてもよい。
【０３８６】
ＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理は、フルボリューム反応中で、或いはナノ容積の反応中で達成されてもよい。フルボリュームＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理を、マイクロタイタープレートであって、１プレート当たり９６、３８４、１５３６又はより多数のウェルを含み得るプレートのウェル中で都合よく実施する。対照的に、ナノ容積のＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理を本発明のキャピラリー内で、ＰＣＲ生成物をＥｘｏＩ／ＳＡＰ反応混合物と混合した後に、例えばマイクロタイタープレートのウェル内で実施する。
【０３８７】
別の実施形態に従って、ＰＣＲ後に、フルボリューム、又はナノ容積の反応のいずれで実施されようと、ＰＣＲ生成物処理工程を排除する。むしろ、過剰の未取込みのプライマー及びｄＮＴＰの除去を行なうため、ＰＣＲ生成物をカオトロープに直接添加し、その後に、その溶液を用いて、鋳型の予め決定された適切な量、又は検出可能なＳＢＥ生成物を生じるのに十分な量の鋳型がこのキャピラリーの内面に可逆的に結合される時間まで、本発明のキャピラリーを充填する。その後に、過剰の未結合ＰＣＲ生成物（すなわち、ＳＢＥ鋳型）、プライマー及びｄＮＴＰを、本明細書において他のいずれかで記載されたように、洗浄によって取り除く。次いで、任意の乾燥工程後に、ＳＢＥ反応混合物を、本明細書において他のいずれかに記載されるように、伸長反応の引き続く実施のためにキャピラリーに引き込む。
【０３８８】
本発明のキャピラリー中でナノ容積の反応物を用いる手順の各々の段階で、新しいキャピラリーを用いてもよい。或いは、１つ以上の前の工程由来の同じキャピラリーを再使用してもよいが、このとき、キャピラリーの内側を最初に洗浄するか又は洗浄しなくてもよく、さもなければこのキャピラリーを処理して、前の工程に由来してそのキャピラリー内に存在する試薬、反応物又は生成物の痕跡を除去又は不活性化してもよい。本発明のキャピラリーを洗浄又は処理する方法は、本明細書において他のいずれかに考察される。
【０３８９】
好ましい実施形態において、本発明の複数のキャピラリーを、空間的アドレス可能なアレイに配置して、平行した多数のサンプルの高処理能力の処理を容易にする。代表的には、アレイ中のキャピラリーの数及びパターン、並びにキャピラリーのアレイの寸法は、キャピラリーアレイ及びプレートのウェルが、好ましくは、自動又は半自動のロボット作業フローシステムの状況に適合できるように、１つ以上のタイプのマイクロタイタープレートのウェルの数、パターン及び寸法に対応する。しばしば、ただし必須ではないが、アレイは長方形であり、ただし円形、三角形などであってもよい。アレイ中のキャピラリーの数としては、２個、４個、８個、１２個、１６個、２４個、３２個、４８個、６４個、９６個、１２８個、１９２個、２８８個、３８４個、４８０個、５７６個、６７２個、７６８個、８６４個、９６０個、１５３６個のキャピラリー、又はそれ以上のキャピラリー数を挙げることができる。選択された数、パターン及び寸法のアレイにキャピラリーをアレンジする方法は、本明細書において他のいずれかで記載されるか、さもなければ当業者に公知である。その全体が参考として本明細書において援用される、同時係属の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示されるように、複数のＰＣＲ及びＳＢＥ反応を、高処理能力の反応を実施するための装置を用いキャピラリーのアレイを用いて平行に実施することが可能である。
【０３９０】
カセット中でキャピラリーを用いる平行な処理が有用であると証明される別の適用は、マイクロアレイを作製するために基板上にスポットされることが意図される、ＤＮＡ、しばしばＰＣＲ生成物の配列の確認である。このようなマイクロアレイは、基礎的な研究及び応用研究において用途の増大が見出されてきており、代表的には、各々のスポットにおいて異なる公知のＤＮＡ配列を有する、ガラススライドにおけるＤＮＡのスポットの長方形のアレイから構成される。次いで、実験者は、標識されたサンプル、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかを採取して、この標識された核酸とこのアレイにスポットされたＤＮＡとの間のハイブリダイゼーション事象を検出する。この方法で、実験者は、標識された核酸の同一性及び／又は部分的もしくは完全な配列を推測することができる。
【０３９１】
マイクロアレイを用いて生成したデータの完全性を確実にするためには、スポットされたＤＮＡの配列の同一性が高い信頼性で既知であることが必要である。再配列化及び他のサンプル取り扱い手順によって、検出すべきフォーマットの間違いを誘導する。さらに、しばしば、ＰＣＲを用いて、スポットすべきＤＮＡを生成する。当技術分野で周知であるとおり、Ｔａｑ及び他の耐熱性ポリメラーゼによって、このポリメラーゼが鋳型を増幅するにつれて千個当たりある特定数の誤った塩基対が導入される。誤りが導入された場合、それらは検出されなければならず、増幅された生成物は廃棄されなければならない。通常、これによって、ＰＣＲ生成物をスポットすることに伴う工程とは別の多数の処理工程が必要となる。しかし、本発明の実施形態の使用によって、配列の決定及び確認の効率が大きく向上する。
【０３９２】
スポットすべきＤＮＡサンプルは通常、カオトロピックイオン、例えばチオシアン酸ナトリウムを含む溶液中に予め決定された濃度で溶解される。このＤＮＡがそのように溶解される理由は、核酸がキャピラリー管の内側に固定される方式と同様の方式で、ガラスマイクロアレイスライドの表面にそのＤＮＡが固定されるためである。代表的には、異なるＤＮＡカオトロープ溶液は、マイクロアレイ上にスポットされる準備ができるまで、貯蔵のために３８４ウェルの容積のマイクロタイターディッシュのウェル中にアリコートされる。スポットする前に、このディッシュを、自動スポットシステムを備えるロボットによってピックアップして、スポッティングのスタイラス又はペンを一度に複数のウェル、通常１２のウェルに浸すことができる位置へ、移動させる。
【０３９３】
本発明は、スポッィングペンのためのＤＮＡ供給源として用いられる同じ３８４ウェルのディッシュの複数のウェル中でＤＮＡをサンプリングして配列決定するように適合することができる。３８４ウェルより多くを備えるディッシュ由来のサンプルに適合することが可能であることが明白である。配列決定すべきＤＮＡは、スポットすべき同じサンプル由来であるので、異なるサンプル由来のＤＮＡを配列決定する工程に伴う多くの処理工程が省略される。これによって、時間及び材料の費用の実質的な削減が得られる。本発明の実施形態に従って、このディッシュの１つ以上の行又は列におけるウェルと同じパターン及びキャピラリー内寸法で、ガラスキャピラリーをカセット中に配列する。最大能力については、全部で３８４のキャピラリーを、ディッシュ自体と同一の寸法を有するパターンに配列する。スポッティングの前に、本発明の方法に従って、キャピラリーカセットを、ＤＮＡカオトロープ溶液（通常、チオシアン酸ナトリウム）で充填する。ＤＮＡサンプルを固定して処理した後、それらを配列決定する。いずれの鋳型からも正確な配列が得られない場合、そのＤＮＡをスポットしないことが既知（又はスポットされる場合でも）のスポッティング装置のオペレーター、対応するスポットでのハイブリダイゼーションに伴うデータは、望ましくない配列に対するものであり、得られたデータセットから除去すべきである。
【０３９４】
可逆的に固定された核酸との別の生化学的反応
本発明の反応混合物アセンブリは、多くのタイプの反応のアセンブリについて用いることができる。ＰＣＲ反応混合物をアセンブルするために用いられる同じ基礎的な方法は、サイクルシークエンシング混合物、ローリングサークル増幅反応混合物、酵素的アッセイ、化学反応、又は他の反応混合物のアセンブリに適合することができる。
【０３９５】
予め決定された量の核酸の分配
容易に明白であるとおり、キャピラリー管の核酸固定された内側との反応を実行することは実験者にとって義務ではない。種々の反応について、キャピラリーの内面から固定された核酸を溶出すること、及び異なる反応チャンバ内での核酸との反応を実施するか又はキャピラリーの外側で幾つかの他の方法で核酸を処理することのいずれかが好ましいかもしれない。このような状況では、予め決定された適切な量の核酸を固定された容積の液体中で、従って、予め決定された適切な濃度で、実験者の選ぶ基板上に分配するためのピペッターとしてキャピラリーを用いることが可能である。これを行なうために、実質的に全ての可逆的に結合した核酸を溶出する溶出液でこのキャピラリーを充填する。その後に、溶出液及び核酸の溶液を、通常基板上に又は基板内に分配する。反応混合物が移される基板は、マルチウェルのマイクロタイタープレートのウェルであっても、平面の基板上の位置であっても、又は分析用チップ中へ通じるウェルであってもよい。この反応はまた、さらなる化学的反応又は生化学的反応のために溶液中に分配されてもよい。
【０３９６】
複数のキャピラリーをカセットに配列する場合、上記のように、このカセットはマルチチャネル平行ピペッターになり、多数の標準化された核酸サンプルを同時に分配することができるようになる。この分配は、さらなる反応のために、マイクロタイターウェル、マイクロチップ、及び他のチャンバ内に入れられてもよい。さらに、この核酸は、キャピラリーアレイ電気泳動マイクロチップのリザーバ中に、又はＭＡＬＤＩもしくはＳＥＬＤＩの標的上に、或いは他の分析用の様式に用いられるように適合された基板上にもしくは基板中に直接分配されてもよい。
【０３９７】
異なる方法を用いて、キャピラリー管から液体を追い出してもよいし又は分配してもよい。当業者に理解されるとおり、これらの方法は、単に溶出された核酸溶液を分配するためだけでなく、反応後に反応生成物を除去するため、又は洗浄液を除去するためなどの目的にかかわらず充填されたキャピラリーから液体を除去するためにも使用することができる。
【０３９８】
単一のキャピラリー管又はカセット形式で配列された複数の同様のキャピラリー配列の内容物を分配するための１つの方法は、遠心力によって液体を分配するために遠心分離機を使用する。この遠心力は、キャピラリーカセット中のキャピラリーの全てに均一に与えられ、その結果キャピラリーは、液体が追い出されるキャピラリーに対して開口部の下に位置された基板上にそれらの内容物を独立して分配する。基板がマイクロタイターディッシュのウェルである場合、分配された液体は、遠心力によってウェルの底に引き込まれる。遠心分離機並びにカセットを保持するための付随するローター及びバケットのためのデザインは、その全体が参考として本明細書に援用される同時係属出願の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示される。
【０３９９】
キャピラリー管に含まれる液体を分配する第二の方法は、空気置換式デバイスの使用による。カセット中に配置された複数のキャピラリーの液体内容物を分配するように設計された空気置換式デバイスの設計は、その全体が参考として本明細書に援用される同時係属出願の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示される。
【０４００】
代替として、キャピラリーの内容物は、電気泳動チップのような解析用デバイス（図３Ｅの７０）のウェル又は同じポート（図３Ｅの７６）に直接分配されてもよい。図３Ｅに示されるように、このような解析用チップは、それらの各々のサンプルインレット又はポート７６と液体連絡して解析用レーン７８のアレイを有する。キャピラリーの間隔がチップ中のサンプルインレット７６の間隔に適合するように、マルチプルキャピラリーをカセット形式で配列してもよい。例えば、２つの平行した８個の列である１６個のキャピラリーを有するキャピラリーカセットは、解析用チップ中の１６ウェルとドッキングし得る。
【０４０１】
例えば、図３Ｃに図示されるキャピラリーカセットは、可撓性のストリップ１１を通じて延びるキャピラリー１２を備える。可撓性ストリップ１１は、単独でか、又は他のこのようなストリップと組み合わせて用いることができる。本質的に直線であるキャピラリーの配向はストリップ１１を曲げることによって変更されて、円弧を形成し得る。図３Ｄは、キャピラリー１２が、環状のパターンで基板上に位置するインプットポートに適合するように曲げられたストリップ１１を図示する。次いで、適切な電極の配列又は他の分配方法が用いられる場合、キャピラリー１２中の液体は、キャピラリー１２から解析用チップ７０のポート７６中に電気運動学的に注射されるか、さもなければ分配される。ストリップ１１は、曲げられた金属ブロックのような湾曲した形態にストリップ１１を押圧することによって湾曲した配向に配置され得る。これは、自動サンプル調製システム中に組み込まれた自動ストリップムーバーによって行なわれてもよい。
【０４０２】
キャピラリーカセットは、飛び散り及び泡の形成を最小限にするように好ましくは選択された、空気置換又は他の分配手段によって分配され得る。ウェル７６中の調製された反応混合物を解析用のウェル７６内に分配する前に、少量の希釈物を各々の解析用マイクロチップウェル７６に添加してもよい。キャピラリーカセットが分配される場合、この希釈液はサンプルウェル７６中のサンプルを希釈する。キャピラリーカセット中で調製されたサブマイクロリットルの容積の反応混合物、例えば、ＤＮＡ配列決定反応生成混合物は、配列決定又は他の解析方法のために解析用チップで容易に取込むことができる。
【０４０３】
溶出液は好ましくは、低イオン強度の水溶液、より好ましくは水、又は核酸物質が安定かつ実質的にインタクトであるおよそのｐＨ、通常約ｐＨ６．５〜８．５で低イオン強度である。１×濃度の緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．０）及び蒸留水又は脱イオン水が、本発明の使用には特に好ましい溶出溶液である。上記の溶出溶液の好ましい形態の低イオン強度は、核酸とこの物質を含むキャピラリーの内面との間で確立された塩架橋を破壊する傾向であり、これによって核酸が溶液中に溶出されることが保証される。本発明の方法での使用に適した他の溶出溶液は、当業者には容易に明白である。
【０４０４】
本発明の方法によれば、ガラスキャピラリー管の内面への核酸結合は飽和的である。適切な条件下で、任意の特定のキャピラリー内に固定された核酸の量を高い程度の正確性で制御することが可能である。従って、核酸が水溶液に溶出されて分散される場合、この溶液中の核酸の濃度は既知であり、その溶液の任意の特定の容積中の核酸の総量は既知であり得る。例えば、キャピラリーの結合能力が１０ｎｇ  ＤＮＡである場合、これは５００ｎｌの溶出液中に溶出され、溶液の濃度は１リットル当たり０．０２グラムであり、このモル濃度はＤＮＡ分子の分子量に依存する。５００ｎｌの全てが分散される場合、その液滴は１０ｎｇのＤＮＡを含む。
【０４０５】
当業者に理解されるように、異なるキャピラリー管の間のわずかなバリエーションに起因して、固定されて、溶出され得る核酸の量は、極めて一貫しているが、キャピラリー管の間で同一ではなく、同じ管の繰り返し使用の間でさえ同一ではない。この理由のために、溶出液中に溶出された予め決定された量又は質量の核酸は、近似の量又は質量である。好ましくはこの状況では、予め決定された近似の量とは、同様のキャピラリーの間、又は同じキャピラリーの繰り返し使用の間であって、他の全ての条件が等しい間で、固定されるか又は分散されることが期待される量と、正確に固定されるか又は分散された量との間の誤差が、１０％以下、より好ましくは５％、より好ましくは２％、最も好ましくは１％以下の誤差であるということを意味する。
【０４０６】
通常、本発明の分散機能は、特定のキャピラリーにおける核酸の飽和量を固定すること、及び容積全体を分散することによって利用される。従って、分散された核酸の量及び濃度を制御するために、実験者は、予め決定された結合能及び容積を有するキャピラリーを選択する。しかし、上記で考察したように、実験者は、固定された核酸の予め決定された非飽和量が結合される条件を実験的に決定することができる。従って、これらの条件を用いて、核酸の非飽和の予め決定された量が固定されて、次いでキャピラリーから溶出され得、これによって実験者は任意の所定の量の核酸を随意に分散することが可能になる。
【０４０７】
キャピラリーが予め決定された量の非飽和核酸又は飽和核酸に可逆的に結合する、両方の環境下で、実験者が、当業者に習熟された方法を用いて、このキャピラリーから追い出された核酸溶出液の量を制御するならば、その容積の知識によって、正確な量の核酸を分配することが可能になる。例えば、機械的なポンピング又は電気運動学的なポンピングによって、制御された量の液体を追い出すことができる。
【０４０８】
酵素反応のための高度に平行なサブマイクロリットルのシステム
別の局面において、本発明は、小容積中で、詳細にはサブマイクロリットルの容積中で酵素反応（詳細には、等温性反応であるが、ただし限定はしない）を実施するための方法及び装置を提供する。この反応は、高度にパラレルな様式で実施することが可能であり、パラレルでかつ、反応物質の実質的な損失なしに、解析のための高い解像能の電気泳動装置に容易にインターフェースすることが可能である。
【０４０９】
この酵素は、大規模なアッセイ中で共通して用いられるあらゆる酵素を包含するが、この酵素としては、プロテアーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、プロテイナーゼＫ、パパイン、ペプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｐｒｏ−Ｃ、Ｖ８プロテアーゼ、グリコシダーゼ、例えば、βガラクトシダーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ及びオキシゲナーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、及び乳酸モノオキシゲナーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼを含むリガーゼ、メチラーゼ、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ターミナルトランスフェラーゼ酵素、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素、ホスファターゼ酵素、キナーゼ酵素、ＤＮＡジャイレース、トポイソメラーゼ、エキソヌクレアーゼを含むヌクレアーゼ、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ又はマング・ビーンヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼ、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、他のヌクレアーゼ酵素、及びリボヌクレアーゼ酵素、並びにウレアーゼが挙げられる。
【０４１０】
サブマイクロリットルのタンパク質反応は、酵素の使用、従って化学反応の触媒に制限されない。例えば、タンパク質は、それらが他の分子に結合し、従って溶液からそれらを捕獲する能力のために用いることが可能である。例えば、タンパク質は、２〜３例を挙げると、抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ；プロテインＧ及びプロテインＡ；並びにストレプトアビジンであってもよい。
【０４１１】
タンパク質が酵素である場合、基質は選択された酵素によって指示され、従って酵素に応じて変化し、これにはＤＮＡ及びＲＮＡを含む核酸、炭水化物、脂質及び他の生物学的基質及び化学的基質が挙げられる。
【０４１２】
本明細書において実証の目的で、トリプシンプロテアーゼを用いるサブマイクロリットルのプロテアーゼアッセイ（質量分析ペプチドマッピング及び配列決定のために当技術分野で通常用いられる配列特異的プロテアーゼ）を、本明細書において用いて、プロテオーム研究において、及び薬物開発プラットフォームとして、このようなシステムの有用性を実証する。酵素としてエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを用いるサブマイクロリットルのプロテアーゼアッセイが、バイオアッセイ及び薬物開発研究におけるこのようなシステムの有用性を実証するために本明細書において提示される。理解されるとおり、他の酵素、実際には他の非触媒性タンパク質は、このマルチプレックス（多重）のサブマイクロリットル反応システムにおいて使用することができる。
【０４１３】
小容積における相同なアッセイ
第一の実施形態において、サブマイクロリットルの容積を有するキャピラリー（又はチャネル）を、小容積の酵素アッセイのための反応チャンバとして用いて、有用にはカセット又はアレイにおいて用いて、解析前の試薬又は反応物質の有意な損失なしに極めて平行（同等）な様式でこのようなアッセイを実施することができた。
【０４１４】
このキャピラリーは代表的には、５μＬ以下、しばしば約２μＬ以下、頻繁には約１μＬ以下、代表的には約７５０ｎＬ、５００ｎＬ、４００ｎＬ以下、さらに約２５０ｎＬ、２００ｎＬ以下、さらに１００ｎＬ以下の内部容積を有する。
【０４１５】
例えば、実施例２６は、相同な溶液中におけるチトクロムＣのトリプシン消化を実証する。トリプシン及びチトクロムＣの混合物を、チトクロムＣの濃度は１ｍｇ／ｍＬに固定したままで、種々のトリプシン−タンパク質比で溶液中に調製する。混合物のアリコートを、毛管現象によってキャピラリーカセットのキャピラリー内に引き込んで、３７℃で一晩インキュベートしてプロテアーゼ反応を終了させる。次いで、消化混合物を、９６ウェルのマイクロタイタープレートに平行にスピンダウンする。そのウェルの各々は、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識溶液を含む。暗野での反応後、得られた混合物を、高分解能かつ高処理能力の装置であるＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離に供する。
【０４１６】
実施例２７は、Ａｓｐ−Ｎを用いる相同なアッセイを実証しており、これはさらに現行の方法の多重化した能力を実証する。さらに、実施例２７は、解析がスキャナーを用いて平行に実施され得ることを実証する。
【０４１７】
要するに、ペプチドＣｙ（商標）５Ｑ−ＹＶＡＤＡＰＶＫ−Ｃｙ３を、アッセイ緩衝液中で再構成して、次いで種々の濃度のエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎと混合する。混合物の５００ｎＬのアリコートを、毛管現象に起因するキャピラリーカセットシステムによって捕獲し、室温でインキュベートして反応を完了させる。次いで、消化混合物を、各々のウェルが１０μＬの緩衝液を含む３８４の透明なスキャンプレートにスピンダウンした。得られた混合物をＴｙｐｈｏｏｎ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｓｉｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でスキャンして、Ｃｙ３発光を検出した。Ｃｙ３発光のシグナル強度は、Ａｓｐ−Ｎ濃度の増大につれて直線的に増大し、反応物５００ｎＬ当たり５０ピコグラムに及ぶ。それを超えれば、Ｃｙ３シグナル強度は、Ａｓｐ−Ｎ濃度とともに増大し続け、反応物５００ｎＬ当たり１８０ピコグラムに及ぶ（図３６）
多重化されたキャピラリー反応におけるビーズ固定酵素
第二の実施形態において、この酵素を粒子、又はビーズに固定したが、これはキャピラリー又はチャネル、例えば、マルチキャピラリーカセットに存在するもの、例えば図３に示されるものの内側に除去可能に適合するように寸法決めされている。
【０４１８】
好ましくは、このキャピラリー又はチャネルは、小さい内容積、望ましくは約１〜１０００ナノリットル（ｎｌ）、より望ましくは約１０〜５００ｎｌ、最も望ましくは約１００〜５００ｎｌの内容積を有する；ビーズは約７５％以下、代表的には約５０％以下、しばしば約４０％、３０％、２０％以下、さらにキャピラリー容積の１０％程度の少なさを充填するようにそれ自体寸法決めされる。しばしば、ビーズ又は粒子は、反応体積中で単に同調化（巻き込み）によって移動可能であるように、従って、単に毛管現象によるキャピラリー内への取込みに適切であるようなサイズであるように、十分小さい。
【０４１９】
酵素の表面固定に適切なビーズは、公知であり、Ｄｙｎａｌ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃなどのような種々の供給業者から市販されている。
【０４２０】
ビーズは磁性でも超常磁性でも有用であり得、有用なことに、誘導体化されてタンパク質又はそれに対する他の部分の容易な結合を可能にすることができる。
【０４２１】
さらに、ビーズは有用なことにシンチラントを含むことが可能であり、これによってシンチレーション近接アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が可能になる。このようなアッセイでは、ポリマービーズは、光を発光するように刺激され得るシンチラントを含み、目的の放射性標識された分子がこのビーズの表面に結合されるときだけ刺激を生じる。
【０４２２】
この酵素はビーズの外面に固定されてもよいし、又はビーズは多孔性であって、その細孔は、ビーズ自体の内部で、そのなかで酵素の基質が拡散することを可能にするのに十分なサイズである。
【０４２３】
以下の実施例にさらに記載された実験の１つのセットでは、磁気ビーズの表面に結合したトリプシンを用いる。小さい磁気ビーズの導入によって、解析の前に反応混合物から酵素を分離する必要性が省かれ、タンパク質分解性酵素による汚染が最小限になり、標的分子の最適の接触性について１単位容積当たり高い結合表面積が得られる。ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズＭ２８０（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）をビオチン結合したトリプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともにインキュベートすることによってビーズを調製する。次いで、これらのトリプシン固定された磁気ビーズを、キャピラリーカセットを用いるトリプシン消化のためにチトクロムＣと混合した。オーブン中において３７℃で一晩インキュベートした後、消化混合物をビーズから分離して、ＦＩＴＣ蛍光色素によって標識する。得られたタンパク質フラグメントを、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｓｉｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって解析する。
【０４２４】
ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）上でのチトクロムＣのトリプシン消化生成物のキャピラリー電気泳動分離によって、２つの方法から得たペプチドのプロフィールは、一致しておりかつ再現可能であるということが示される。キャピラリーカセット反応からのチトクロムＣ消化の代表的な電気泳動図を図３１Ｂに図示する。
【０４２５】
このナノスケールの酵素反応システムによって、フルボリューム反応システムを上回る特有の利点が得られる。この小反応体積（ナノリットル範囲）によって、必要なサンプル（ピコモル範囲）及び試薬の量、並びにサンプル調製時間が大きく低下する。それによって、また反応感度の増強が得られる。同時並行の多重様式によって、それを高処理能力の解析のための完全自動システムに組み込むこと及び生体高分子の特定、並びに手動の様式においてそれを用いることが可能になる。これらの全てによって、１アッセイ当たりの泳動時間を短く変更すること、並びに試薬及びサンプルの消費を減らすことが可能になり、その結果実質的な費用の削減が得られる。
【０４２６】
酵素反応のための反応チャンバにおけるタンパク質の固定
第三の実施形態では、酵素を反応チャンバ、有用なことにはサブマイクロリットルの容積を有するチャネル又はキャピラリーの内面に固定する。
【０４２７】
酵素の非特異的な結合は、比較的疎水性の固相上への単なる吸着によって達成することができる。酵素の受動的な吸着は、その露出した疎水性部位による。しかし、このようなプロセスは、完全には一般的ではなく、しばしば試行錯誤によって結合の最適の条件を見出さなければならない。複数のアミノ酸基を介して固相へ結合した酵素は、活性部位の変形、従って反応性を低下するという危険性がある。
【０４２８】
従って、代表的には、酵素分子を繋ぐために特定の官能基を用いて結合表面を修飾する必要性がある。
【０４２９】
１つの方法では、アミノアルカリシラン試薬を用いたシラン処理によって、アミノ基を用いて官能化される表面が得られ、これに対して広範な種々のアフィニティーリガンドが引き続いて結合され得る。
【０４３０】
従って図３に上記に示されるようなキャピラリーカセットのキャピラリー、又は小容積を有する他の種類の反応チャンバを、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシランによって、続いてＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナテルによって処理してもよい。このピリジルジチオ官能基によって、特定の−Ｓ−Ｓ−及び−ＳＨ交換反応を通じて、酵素のようなタンパク質に結合する従来の方法が得られる。さらに、必要に応じて、固定された酵素は、過剰量のチオピリドンを添加することによって遊離することが可能であり、これによって、新鮮なトリプシンを繋ぐために、誘導体化された表面を再生して、高い酵素反応性を保証する。
【０４３１】
別の表面固定法は、特定のストレプトアビジン−ビオチン反応に基づく。ストレプトアビジン修飾によって、表面がビオチン化された酵素へ結合することが可能になる。この方法では、キャピラリーカセットを、例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシランを用いて誘導体化して、次いでジスクシンイミジル基板のような二機能性のリンカーと反応させ、次にストレプトアビジンを繋ぐことが可能である；その後にこのストレプトアビジンは、反応チャンバ（代表的にはキャピラリー）の内面に任意のビオチン化酵素を結合させることができる。酵素が、特有の部位で、例えば、その酵素へと操作されたビオチン結合部位の酵素的ビオチン化によって、ビオチン化される場合、高い親和性、高い特異性のストレプトアビジンとビオチンの相互作用によって、酵素はキャピラリーの内面に均一に配向する。
【０４３２】
これらのタンパク質固定技術によって、高い表面反応性及び非特異的結合の最小化が得られる。さらに、以下の実施例にさらに記載されるとおり、本発明者らは、このような方法によって固定されたタンパク質が、反応の終了後でさえ、結合したままであり、機能的なままであるということを見出した；従って、このキャピラリーは、酵素による再充填を必要とすることなく、複数の反応に連続的に用いることができる。
【０４３３】
他の表面固定法もまた利用可能である。Ｙ−グリシドオキシプロピルシランとの反応によって、固体表面にオキシラン基が導入され、これによってリジン部位での酵素結合が可能になる。この修飾は、非特異的なタンパク質取込みを減少させるためにさらに親水性の表面を提供することが期待される。酵素と表面活性ヒドロゲルとの結合によって、酵素固定された表面を生成するなお別の都合のよい手段が得られる（Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ及びＬｉ，米国特許第５５１６７０３号）。この方法の利点は、これによってタンパク質適合性の環境及び再使用可能な表面が得られるということである。
【０４３４】
上記のプロトコールによって固定された酵素の反応性を評価するため、モデルタンパク質であるチトクロムＣを、キャピラリーカセットのトリプシンコーティングキャピラリーに接触させることによって、タンパク質消化反応を実施した。この反応を３７℃で一晩、実行した。次いで、タンパク質フラグメントをフルオレセインイトシオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識して、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）１０００装置を用いて解析した。非特異的な固定によってトリプシンでコーティングされたキャピラリーカセットを、コントロールとして用いた。
【０４３５】
所定の固定されたトリプシンカセットのために、２週間の期間にわたって３つのタンパク質消化反応を実施した。新鮮なチトクロムＣ溶液を各々の消化反応に加えて、固定されたトリプシンキャピラリーカセットを、泳動の間、４℃で０．１５Ｍリン酸緩衝化生理食塩水中において保管した。ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）上で得たキャピラリー電気泳動分離によって、これらの処理されたキャピラリーカセットの全てのキャピラリーが３つの泳動にまたがって同じペプチドマップを有することが実証された。泳動１、泳動２及び泳動３の代表的な電気泳動図を、それぞれ図３２、３３及び３４に示す。反対に、このコントロールのキャピラリーカセットによって、第一の泳動においてのみある程度のタンパク質消化が示され、ただし第二又は第三の泳動ではタンパク質消化は示されなかった。結果として、このような吸着された酵素は、繰り返しの消化反応を実行するには十分な能力を有さない。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用して、これらのタンパク質消化をさらに特徴付けた。代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図３５に示す。共有結合でコーティングされたキャピラリーカセットで得たタンパク質消化物のペプチドプロフィールは、文献での結果と一致している（Ｎｅｕｅら、ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＶＣＨ出版，１９９７）。
【実施例】
【０４３６】
以下の実施例は、本発明の方法及び装置の使用を図示しており、開示された方法で達成することができる多くの異なるタイプの生化学的又は酵素学的反応の代表である。これらの反応としては、以下が挙げられる：１）ダイ・プライマー（ｄｙｅ−ｐｒｉｍｅｒ）ＤＮＡ配列決定；２）ダイ・ターミネーター（ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）ＤＮＡ配列決定；３）ＰＣＲ増幅；４）ＰＣＲ増幅、酵素精製、及びＤＮＡ配列決定；並びに５）酵素反応。以下の実施例は、例示のために提供されるものであり、限定の目的ではない。
【０４３７】
実施例１
キャピラリー電気泳動によって解析されたダイ・プライマーＤＮＡ配列決定
９６個の未コーティングの長さ２．８ｃｍ、内径１５０μｍ、外径３６０μｍの溶融シリカキャピラリーからなるキャピラリーカセット内で、ダイ・プライマー配列決定反応を実施した。ｄｄＴ、ｄｄＡ、ｄｄＣ及びｄｄＧで終止する反応に相当する発光特異的プライマーを用いた鋳型ＤＮＡの増幅によって、ダイ・プライマー配列決定反応を実施した。各々のキャピラリー中での単一の反応として鋳型の増幅を実施して、反応後の処理及び解析のために共通のウェル中にプールした。
【０４３８】
色特異的なプライマーは、Ｍ１３−４０ＦＷＤプライマー（５’−ＦＡＭ−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴ*ＣＡＣＧＡＣＧ−３’）に基づき、これはドナー色素として５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、アクセプター色素として示されたチミン（Ｔ*）に結合したターミネーション特異的蛍光を備える。チミンは、ｄｄＣ終止反応（Ｃ−ＦＡＭ）のためにＦＡＭで、ｄｄＡ反応（Ａ−ＲＥＧ）のために６−カルボキシローダミンで、ｄｄＧ反応（Ｇ−ＴＭＲ）のためにＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−５−カルボキシロ−ダミンで、ｄｄＴ反応（Ｔ−ＲＯＸ）のためには５−カルボキシ−Ｘ−ローダミンで標識された。６５μＬの反応緩衝液（２２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、３３．２ｍＭ  ＭｇＣｌ2）、１００μＬダイ・プライマー溶液（１μＭ  Ｔ−ＲＯＸ、１μＭ  Ｇ−ＴＭＲ、０．５μＭ  Ａ−ＲＥＧ、又は０．５μＭ  Ｃ−ＦＡＭのいずれか）、１００μＬの対応するデオキシ混合物及びジデオキシヌクレオチド混合物（０．９４ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、さらに３．１μＭジデオキシヌクレオチド）、１０μＬの酵素（３２単位／μＬ、ＴｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ）及び２２５μＬの濾過脱イオン水を合わせることによって、１００個の色素−プライマー配列決定反応のためのマスター混合物を調製した。この溶液を鋳型ＤＮＡとの混合の前に、９６ウェル試薬プレート中に等量分割した。一般的な混合スキームは、２つのキャピラリーカセット及び３８４ウェルの「ミックスプレート（ｍｉｘ  ｐｌａｔｅ）」の使用を必要とした。第一のキャピラリーカセット（移動カセット）を、鋳型ＤＮＡ（２０ｎｇ／μＬ  Ｍ１３ｍｐ１８）の溶液に浸し、次いでこのウェルに挿入されたキャピラリーの短いほうの端を用いて、３８４ウェルの「ミックスプレート」の上に引っくり返した。この引っくり返された移動カセット及びミックスプレートを、卓上型遠心分離機の内側に置いた。バランスプレートを置いて、ローターのバランスをとり、３０００×ｇで５秒間遠心分離させた。遠心分離によって、移動カセットの内容物を、３８４ウェルプレートの個々のウェル中に均一に分配した。遠心分離工程の後、清浄化のために、移動カセットをキャピラリーカセット洗浄器４１０に移して、このミックスプレートを試薬添加のための引き続く遠心分離工程に用いた。
【０４３９】
試薬を添加するために、第二のキャピラリーカセット（反応カセット）を、配列決定試薬（前の段落に記載のとおり調製した）を含有するウェルに浸して、同じ３８４ウェルのプレートの同じウェルの上に引っくり返した。この反応カセット及びミックスプレートを遠心分離機に入れて、３０００×ｇで５秒間スピンして、遠心分離機から取り出した。この時点で各々のウェルは、最終反応混合物を形成するために５００ｎＬの鋳型ＤＮＡ及び５００ｎＬの配列決定試薬を含んだ。次いで、第二のキャピラリーカセット（試薬を添加するために用いた）を、このミックスプレートに含まれる１μＬの混合物中に浸して、反応カセットのキャピラリーを５００ｎＬで充填した。
【０４４０】
キャピラリーカセットを、本明細書の図７Ａ−Ｃに記載されるように、空気式のサーマルサイクラーの内部チャンバ内に挿入した。ここでは、キャピラリーセグメントの末端を、変形可能メンブレン２６４ａ及び２６４ｂに対するキャピラリーの末端の押圧によって封止する。９５℃で２秒間、５５℃で２秒間、７３℃で６０秒間の３０サイクルの後、このサーマルサイクラーを開けて、変形可能メンブレンとの接触からキャピラリーの末端を取り出す。キャピラリーカセットを取り出して、ウェル中に挿入されたキャピラリーの短い方の端を有する９６ウェルの「プールプレート（ｐｏｏｌｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）」の上に置いた。このキャピラリーカセット及びミックスプレートを、バランスプレートとともに遠心分離機に入れた。４０μＬの８０％イソプロピルアルコールを含有するマイクロタイタープレート中に、遠心力（約２５００×ｇ）によって反応生成物を分配した。最初の反応後、このキャピラリーを本明細書に記載のように洗浄した。４つのダイ・プライマー反応を、４つの個々のキャピラリーカセット中で実施して、４つのセットの生成物を９６ウェルのプールマイクロタイタープレートのウェル中にプールした後、サンプルを３０００×ｇで３０分間引き続き遠心分離した。おだやかに反転させることによってアルコールをデカントして、電気運動的注入及びＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）キャピラリーアレイ電気泳動による解析のために、サンプルを５μＬのｄｄＨ2Ｏに再懸濁した。
【０４４１】
走査共焦点レーザー誘導蛍光検出を用い、９６キャピラリーアレイ電気泳動装置であるＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、ＤＮＡ配列決定フラグメントの解析を実施した。４０ｃｍの作業分離距離を有する長さ６２ｃｍ、内径７５μｍ、外径２００μｍの溶融シリカキャピラリーで分離を実施した。キャピラリー表面に対するビニル基のグリニャール結合及びアクリルアミド重合化によって、電気浸透流を低下させた。このキャピラリーを３％の直鎖状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）（ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）Ｌｏｎｇ  Ｒｅａｄ  Ｍａｔｒｉｘ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の新鮮な溶液で充填したが、この溶液は、アノード側チャンバからカソード側チャンバに含まれる９６ウェル緩衝液プレートの個々のウェルへ、高圧下でキャピラリーを通してポンピングした。各々のウェルを１００μＬのＴｒｉｓ−ＴＡＰＳ泳動緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１００ｍＭ  ＴＡＰＳ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）で充填した。このマトリックスを２０分間平衡化して、続いて１８０Ｖ／ｃｍで５分間プレ電気泳動した。サンプル注射の前に、カソード側のキャピラリー末端及び電極を、二回蒸留した水（ｄｄＨ2Ｏ）でリンスして、サンプル注射の前に、残りのＬＰＡを除いた
特定の条件に従って９６ウェルマイクロタイタープレートから、ＤＮＡ配列決定サンプルを、一定電圧で電気運動学的に注入した；５００ｎＬのサンプルについての１つの好ましい注入条件は、２ｋＶの印加電圧で４０秒の注入である。注入後に、キャピラリー末端を水でリンスして、緩衝液プレートをカソード側チャンバに入れて、電気泳動を開始した。分離は代表的に８ｋｖで１２０分間であった。ＬａｂＢｅｎｃｈソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、コンピューター制御の自動の装置及びデータ収集を実施した。特定の注入及び泳動条件を、解析すべき反応混合物に仕立てた。
【０４４２】
サブマイクロリットルのダイ・プライマーサイクルシークエンシングのための記載された方法の再現性を図９に示す。この棒グラフは、異なる読取り長さのビン（ｂｉｎ）におけるサンプルのパーセントを示しており、この方法が極めて再現性であることを示す。配列決定されたＤＮＡインサートの８０パーセントより多くが６００塩基対を上回る読取り長さを有した。全体として、９６個のサンプルのこのプレートによって、平均読取り長さ６０５塩基で、５５０００個の高品質の「Ｐｈｒｅｄ  ２０」塩基が得られた。
【０４４３】
実施例２
キャピラリー電気泳動マイクロチップによって解析されたダイ・プライマーＤＮＡ配列決定
別の解析の実施例において、同じキャピラリーカセット内で実施したダイ・プライマー反応を、Ｓ．Ｌｉｕ、Ｈ．Ｒｅｎ、Ｑ．Ｇａｏ、Ｄ．Ｊ．Ｒｏａｃｈ、Ｒ．Ｔ．Ｌｏｄｅｒ  Ｊｒ．，Ｔ．Ｍ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ、Ｑ．Ｍａｏ、Ｉ．Ｂｌａｇａ、Ｄ．Ｌ．Ｂａｒｋｅｒ、及びＳ．Ｂ．Ｊｏｖａｎｏｖｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５−００に詳細に記載される、１６チャネルの微細加工された「チップに基づく（ｃｈｉｐ―ｂａｓｅｄ）」アナライザー中への直接注入によって解析した。この１６チャネルチップを、２つのガラスウェーハを結合することによって形成したが、この上側のウェーハは、標準的な微細加工法によってそこにエッチングされた、深さ５０μｍ×幅１００μｍのチャネルを有する。このエッチングされたパターンは、２つの８チャンネル群の組み合わせを有し、各々が共通のアノード側リザーバを備える。１６個のカソードリザーバは、一列で均しく４．５ｍｍの間隔であって、これは１６個のサンプル及び１６個の廃棄リザーバでも同様であった。このリザーバは、上部のエッチングされたウェーハを通じて穿孔された接近ホールによって形成された。１６個の２５０μｍ長の２つ組のＴ型注入器は、サンプルからのチャネルのオフセット及び主な分離チャネルに連結する廃棄リザーバによって形成された。隣接するチャネルの間（中心間）の距離は、検出領域では６００μｍであった。２つの配列ホールを用いて、チップを検出器に整列させた。
【０４４４】
本実施例では、ｄｄＴによって終止されたダイ・プライマー反応を記載のように実施して、１．５μＬのｄｄＨ2Ｏを含有するマイクロチップのサンプルウェル中に分配した。廃棄リザーバ及びカソード側リザーバに、代表的には６０秒間、それぞれ５０ボルト及び１０ボルトの電圧を印加することによって、サンプル注入を実施したが、このときサンプルリザーバ及びアノード側リザーバをアースさせた。アノード側リザーバに対する２０００ボルトの印加、サンプルリザーバ及び廃棄リザーバに対する１４０ボルトの印加によってサンプル注入後直ちに分離を実行したが、このときは、カソード側のリザーバをアースさせた。対応する分離野の強度は約２２７Ｖ／ｃｍであった。レーザー誘導蛍光を収集して、デジタル化して、図１０に示される電気泳動図に処理した。この電気泳動図によって、記載されたキャピラリーカセットシステムにおいて実施された反応のマイクロチップ解析を実証する。
【０４４５】
実施例３
アルコール沈殿精製を用いたダイ・ターミネーターサイクルシークエンシング
ダイ・ターミネーターサイクルシークエンシングは、キャピラリーカセットシステム及びキャピラリーアレイ電気泳動の前の浄化のためのアルコール沈殿を用いて実証された。本実施例において、４００μＬの配列決定試薬（Ｄｙｎａｍｉｃ  ＥＴターミネーターキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐａｒｔ  ８１６００）と、１００μＬの５ｐｍｏｌ／μＬのＭ１３−２８ＦＷＤプライマー（５’−ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ−３’）とを混合することによって、配列決定反応混合物を調製した。この反応混合物を、９６ウェルの「試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）」プレートに５μＬのアリコートに分配した。実施例１に記載の同じシリーズの工程で、鋳型ＤＮＡ及び配列決定試薬の混合を実施したが、ここでは移動カセットを用いて５００ｎＬのＤＮＡサンプルを移動し、反応カセットを用いて、５００ｎＬの配列決定試薬を試薬プレートからミックスプレートのウェルに移動した。次いで、この同じ反応カセットを、鋳型／試薬混合物を用いた毛管現象によって充填した。
【０４４６】
キャピラリーカセットを、空気式のサーマルサイクラーに移して、ここでこのサーマルサイクラー内の変形可能なメンブレンの間でこのキャピラリーを封止した。９５℃２秒間、５５℃２秒間及び６０℃６０秒間の３０サイクルを用いて、サーマルサイクリングを達成した。サーマルサイクリング後、カセットをサイクリングチャンバから取り出して、遠心力（３０００×ｇ）によって、４０μＬの８０％エタノールを含有する９６ウェルプレート中に、このキャピラリーの内容物を分配した。このサンプルを３０００×ｇで３０分間遠心分離した。穏やかに反転させることによってアルコールをデカントして、電気運動的注入及びＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）キャピラリーアレイ電気泳動による解析のために、サンプルを５μＬのｄｄＨ2Ｏに再懸濁した。アルコール沈殿によるダイ・ターミネーター反応物の清浄化、この技術の再現性、及び「現実の世界（ｒｅａｌ−ｗｏｒｌｄ）」の鋳型に対する適用は、図１１の成功パーセント対読取り長さの棒グラフとして提示される。図１１は、マウス細菌人工染色体のサブクローンライブラリーから調製したＭ１３サブクローンインサートを用いた、優れた読取り長さ及び成功率を実証する。
【０４４７】
実施例４
サイズ排除精製を用いるダイ・ターミネーターサイクルシークエンシング
別の実施例において、実施例３に記載されるように、５００ｎＬのキャピラリー中でダイ・ターミネーター反応を実施して、反応生成物を、遠心力によって１５μＬのｄｄＨ2Ｏ中に分配した。４５μＬの水和したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を含有するフィルタープレートに、１５μＬのサンプルを移した。このサンプルを、９１０×ｇで５分間、Ｓｅｐｈａｄｅｘマトリックスを通じて遠心分離させて、溶出液を、清浄な９６ウェル注入プレート中に収集した。さらなる脱水又は処理なしに、このサンプルをＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）へ電気運動学的に注入した。１６個のサンプルについて、６５０塩基の平均読みとり長さを得たが、このことは、サブマイクロリットルのダイ・ターミネーターシークエンシングとサイズ排除精製との適合性を実証する。
【０４４８】
実施例５
プラスミドインサートＤＮＡのＰｃｒ増幅
本発明の技術は、インサートＤＮＡ（例えば、ＤＮＡライブラリー由来のサブクローンインサート）のＰＣＲ増幅のための開示されたシステムを用いる。このＰＣＲ反応混合物は、５μＬの１０μＭのＭ１３−４０  ＦＷＤプライマー（５’ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＡＣ３’）及び５μＬの１０μＭ−４０ＲＥＶプライマー（５’ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧ３’）と、２５μＬの１０×ＧｅｎｅＡｍｐ緩衝液、１５μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、２．５μＬの１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び６７．５μｌのｄｄＨ2Ｏとを混合することによって調製された。この混合物を、１６個の０．２０ｍＬ管に等容積でアリコートした。
【０４４９】
この反応を、記載された２つのキャピラリーカセット及びミックスプレート法を用いて、鋳型ＤＮＡとＰＣＲカクテルとを混合することによって開始した。この移動カセットを、サブクローンライブラリーのグリセロールストック溶液中に浸して、遠心力によって３８４ウェルのプレート中に分配した。第二の「反応（ｒｅａｃｔｉｏｎ）」カセットを用い、遠心力によって、５００ｎＬのＰＣＲカクテルを同じウェルに移した。鋳型ＤＮＡ及びＰＣＲ試薬の合わせた混合物へ、反応カセットのキャピラリーを引き続いて浸して、毛管現象によってキャピラリーを充填した。キャピラリーをサイクリングチャンバへ置くこと、並びに９５℃１２分、続いて６４℃４．５分間及び９５℃５秒間の３０サイクルの活性化工程を用いるサーマルサイクリングによって増幅を達成した。
【０４５０】
アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ生成物を解析して、０．２０ｍＬの管内で実施したフルボリューム（２５μＬ）の反応物によって増幅した同じサブクローンと比較した。ナノスケールのキャピラリーカセットサンプルを、遠心力によって４．５μＬのｄｄＨ2Ｏ中に分配した。フルボリューム反応の等価な容積のアリコートを、低容積のピペッターを用いて手動で移した。各５μＬのサンプルに、１μＬの６×ローディング色素を添加して、このサンプルを定量的にアガロースゲルのウェルに移した。１×Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）を有する０．７％アガロースゲルを用いて、アガロースゲル電気泳動を実施した。４０分間、１５Ｖ／ｃｍでサンプルを分離して、Ｓｙｂｒ  ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色して、２次元の蛍光スキャナー（Ｆｌｕｏｒｌｍａｇｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて画像化した。走査されたゲル画像を図１２Ａ及び１２Ｂに示す。フルボリュームで調製したサンプル（図１２Ａ）及び５００ｎＬの容積で調製したサンプル（図１２Ｂ）は、同じ分子量分布を有することが理解できる。本実施例は、ナノスケールのサンプル調製物が、ＰＣＲ反応に用いることができるということ、及びこの生成物が、アガロースゲル電気泳動のような伝統的なマクロスケールの解析法によって解析できることを実証する。
【０４５１】
実施例６
ＰＣＲ増幅及びサイクルシークエンシング
本発明を用いてサイクルエイークエンシングサンプルを調製する好ましい様式は、キャピラリーカセット及び関連の装置中でナノスケールのＰＣＲサンプルを調製すること、マクロスケールＥｘｏＩ／ＳＡＰ反応を実施すること、次いでキャピラリーカセット及び関連の装置中でサイクルシークエンシングを実施することである。ＤＮＡ配列決定のためのナノスケールのＰＣＲ鋳型調製物は、グリセロールストックサブクローンからＰＣＲ増幅を実施することによって実証された。グリセロールストックサブクローンを、実施例５に記載のようにキャピラリーカセット及び関連のハードウェア中でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅後、４．５μＬの７．５ｍＵのエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）及び３７．５ｍＵのエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）を含有する９６ウェルプレートのウェル中に、このキャピラリーの内容物を遠心分離によって分配した。ＰＣＲ生成物及びＥｘｏＩ／ＳＡＰ溶液を３７℃で５分間インキュベートさせて、未取込みのプライマーを消化して、未取込みのヌクレオチドを脱リン酸化させた。最初のインキュベーション後、この溶液を７２℃に１５分間加熱することによって、この酵素を不活性化した。
【０４５２】
ＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理ＰＣＲ生成物を、移動キャピラリーカセット及び遠心分離分配を用いて新鮮な３８４ウェルミックスプレートにアリコートした。ダイ・ターミネーターシークエンシング試薬の等しいアリコートを、別のキャピラリーカセット、反応カセット及び遠心分離分配を用いて、５００ｎＬの精製したＰＣＲ生成物に加えた。次いで、１μＬの反応混合物にキャピラリーカセットを浸すことによって、反応カセットのキャピラリーを充填した。鋳型を実施例３に記載のように増幅して、４０μＬの８０％エタノール中に分配して、記載のように精製した。電気運動的注入を用いてＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）によって、配列決定反応の解析を実施した。グリセロールストック溶液からのナノスケールＰＣＲ増幅によって、及びナノスケールサイクルシークエンシングによって調製されたサブクローン鋳型由来の配列決定電気泳動図と呼ばれる６塩基の部分を図１３に示す。キャピラリーカセット中でＰＣＲを実施して、引き続き反応混合物をマイクロプレートに移すことによって、本発明のシステムはナノスケール（１μＬ容積未満）からナノスケールを上回る反応体積への簡単な移行を可能にする。本発明のシステムによってまた、キャピラリーカセットでのサイクルシークエンシングのためのＥｘｏＩ／ＳＡＰ反応を利用することによって示されるように、マクロスケール（１μＬを超える容積）からナノスケールの反応体積への簡単な移行が可能になる。
【０４５３】
実施例７
サブマイクロリットルキャピラリーカセットで実施した等温性の酵素
酵素反応を実施するための記載されたシステムの使用は、蛍光発色団レゾルフィンへのβ−Ｄ−β−ガラクトシダーゼのβガラクトシダーゼ加水分解の蛍光発生的な酵素アッセイを用いて実証された。９６キャピラリーカセットのキャピラリー内で、レゾルフィン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（ＲＢＧ）のβガラクトシダーゼ触媒による加水分解を実施したが、コントロールのフルボリューム反応中ではβ−ＧａｌがＲＢＧを加水分解する。
【０４５４】
３５μＭのＲＢＧストック溶液を５ｍＬの緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、２０ｍＭ  ＫＣｌ、及び２ｍＭ  ＭｇＣｌ2）中で５ｍｇのＲＢＧに調製し、激しくボルテックスして、この溶液を０．４０ミクロンのフィルターを通して濾過して、次いで等量の緩衝液を添加した。次いでＲＢＧの希釈曲線をストック溶液から作成した。０．２０ｍＬの管内で調整した各々１０μＬのＲＢＧ溶液に、２００μｇのβガラクトシダーゼを添加して、短時間の混合後に、毛管現象によってキャピラリーカセットを充填した。このカセットを空気サイクラーに入れて、３７℃で２分後、キャピラリーカセットを取り出して内容物を遠心分離してキャピラリーから、５μＬの１Ｍ炭酸ナトリウムを含む３８４ウェルのスキャンプレートへと出した。スキャンプレートのウェルを引き続き５０μＬのｄｄＨ2Ｏで充填した。平行して、０．２ｍＬの管を２分間３７℃でインキュベートして、１Ｍ炭酸ナトリウムを添加することによってフルボリューム反応を停止した。０．２０ｍＬ管において実施した酵素反応由来のコントロールのアリコートを、スキャンプレートに添加した。
【０４５５】
βガラクトシダーゼの固相捕獲はまた、このキャピラリーの表面に結合するβガラクトシダーゼの２０μｇ／ｍＬ溶液を用いてこのカセットを単に充填すること、続いて過剰の液体を除去すること、及び記載されたカセット洗浄マニフォールドを用いてこのカセットを乾燥させることによって、このシステムで実証された。βガラクトシダーゼ結合後、このキャピラリーを毛管現象によってＲＢＧ溶液で充填した。この反応を３７℃で２分間実施して、１Ｍ炭酸ナトリウムへの分配、及びスキャンプレート中の水での希釈によって解析した。
【０４５６】
一旦、３つの反応セットの全て（フルボリューム、キャピラリーカセット、及び固相捕獲を備えるキャピラリーカセット）が、スキャンプレートに添加されれば、このプレートを、蛍光プレートリーダー（Ｔｙｐｈｏｏｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって読みとった。０．２ｍＬ管（ｔｕｂｅ  ｒｘｎ）で実施した標準曲線の結果、固相捕獲なしでキャピラリーカセット中で実施した反応（キャピラリー反応）、及び固相捕獲ありでキャピラリーカセット中で実施した反応（結合ありのキャピラリー反応）を、図１４にまとめる。図１４は、管反応についての期待されるシグナル対基質濃度、並びにキャピラリーカセット中で実施した事前混合された酵素反応物について、及びキャピラリー結合βガラクトシダーゼアッセイについてのシグナルのデータポイントを示す。
【０４５７】
本実施例は、ある範囲の一般的な酵素活性及び阻害アッセイを実施するための記載されたシステムの適合性を例示するのに役立つ。さらに、固相捕獲はタンパク質及び酵素並びにＤＮＡに適用可能であることが実証される。結局、記載されたシステムは等温性反応に供することができることが示される。
【０４５８】
実施例８
鋳型精製
本実施例は、本発明の方法を用いて、配列決定反応及び高品質の配列データの取得を邪魔する夾雑物から鋳型ＤＮＡを精製することができるという有効性を実証する。
【０４５９】
溶融シリカキャピラリー管の内面に対する可逆的直接結合を用いて、鋳型捕獲によって、ＤＮＡ配列決定鋳型としてＰＣＲ生成物を清浄化する。ＥＴダイ・ターミネーターサイクルシークエンシング法を用いて、１５０μｍの内径のキャピラリー管内で、５００ｎｌ容積のシークエンス反応を実行して、２ｋＶ、３０ｓ注射を用いてＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）上で解析した。図１７Ａは、配列決定の前に反応混合物と混合したＰＣＲ生成物の配列決定の結果を示す。図１７Ｂは、最初のＰＣＲ鋳型とチオシアン酸ナトリウムとの混合、キャピラリーの内面へのＤＮＡ結合、８０％エタノールを用いたＤＮＡの洗浄、それに続く配列決定の結果を示す。
【０４６０】
実施例９
Ｍ１３、プラスミド及びＰＣＲ生成物のＤＮＡの鋳型標準化効果
本実施例は、以下の幾つかの実施例と同様、キャピラリー管の内側に直接かつ可逆的に固定された核酸の量を標準化するための本発明の方法の有用性及び有効性を実証する。
【０４６１】
図１８は、鋳型捕獲プロトコールに従って保持されたＤＮＡの量を提示する。結合したＤＮＡの量は、Ｍ１３（□）、プラスミド（□）及びＰＣＲ生成物（□）について４０ｎｇの出発鋳型より上では一定のままである。
【０４６２】
Ｍ１３ｍｐ１８及びＰＵＣ１９のＤＮＡの制限消化によって、それぞれ直鎖状一本鎖及び直鎖状二本鎖のＤＮＡを形成して鋳型ＤＮＡを調製した。これらの鋳型を、８００ｂｐのＰＣＲ生成物（標準的な増幅条件）とともに、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、32Ｐで末端標識した。標識したＤＮＡを、同じタイプの未標識の鋳型中に播種して、この播種されたＤＮＡ溶液について検量線を作成した。ストックＤＮＡと１０Ｍのチオシアン酸ナトリウムとを混合すること、及び５００ｎｌの溶融シリカキャピラリー中にローディングすることによって鋳型結合を実施した。１０分のインキュベーション及び８０％エタノール洗浄後、このキャピラリーをシンチレーション液に入れて、定量した。図１８は、鋳型ＤＮＡの３つの供給源についての最終的な標準化を示す。
【０４６３】
実施例１０
読取り長さに対する鋳型捕獲標準化の効果
図１９は、鋳型捕獲によって調製されたサンプル（□）に比べて、ＤＮＡ及び配列決定試薬を事前に混合することによって調製されたサンプル（□）の読取り長さ対出発ＤＮＡ量のプロットを示す。標準化効果は、鋳型捕獲サンプルについて得られたほぼ一定の読取り長さによって強調されるが、事前に混合されたサンプルについては、２０ｎｇを超える出発ＤＮＡにおいて、鋳型の過剰ローディング及び読取り長さの短縮が生じる。
【０４６４】
ストックＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを１０Ｍチオシアン酸ナトリウムと混合すること、及び５００ｎＬの溶融シリカキャピラリー中にロードすることによって、鋳型結合を実施した。１０分のインキュベーション及び８０％エタノール洗浄後、このキャピラリーを、Ｍ１３−４０ＦＷＤ配列決定プライマーと事前に混合したＥＴターミネーターで充填した。予め混合した試薬を、１０μｌの容積中で調製して、清浄なサンプル調製キャピラリー中にロードした。空気式のサイクルシークエンシングを以前に記載されたとおり実施して、続いて、エタノール沈殿及び２ｋｖ、３０秒注入、８ｋｖ、１２０分の泳動時間でＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）解析を実施した。
【０４６５】
実施例１１
標準化を用いた鋳型捕獲ポリメラーゼ連鎖反応
示した出発量のＭ１３ｍｐ１８の鋳型結合後に、ＰＣＲ反応を実施した。Ｍ１３−１００ＦＷＤプライマー及びＭ１３−４００ＲＥＶプライマーとの標準的なＰＣＲ増幅反応を、５００ｎｌのキャピラリーカセット中において、９５℃１０秒、５５℃１０秒、及び７２℃１２０秒で実施した。反応生成物を遠心分離によって、ローディング緩衝液中に分配して、１．５％アガロースゲルに移した。この生成物をＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素で染色して、図２０に示されるようにＦｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ装置で画像化した。
【０４６６】
実施例１２
ピーク高さ及び移動時間に対する鋳型捕獲標準化の効果、並びに事前混合したサンプルについてのピーク高さ及び移動時間
ピーク高さ及び移動時間に対する鋳型捕獲標準化の効果。図２１は、ピーク７９、ピーク３０８、及びピーク６０４（電気泳動クロマトグラムにおけるｄｄＴ終止したピークの初期、中期及び後期）の強度によって提示される、鋳型濃度の増大に伴って得られた相対シグナル強度を提示する。このピーク強度は４０ｎｇ／μｌまで増大して、平坦になり、これによってピーク高さによる鋳型捕獲技術の標準化効果及び飽和レベルが確認される。第一のピークの移動時間は、鋳型濃度にまたがって比較的一定である。
【０４６７】
予め混合されたサンプルのためのピーク高さ及び移動時間。図２２は、鋳型濃度の増大によるピーク高さの増大を示しているが、これは配列決定サンプルの過剰ローディングに起因して最大に達する。過剰の鋳型ＤＮＡは、電気運動学的な注入を阻害して、サンプル泳動の流れを低下し、結果としてキャピラリーを通るサンプルの移動時間が増大する。
【０４６８】
実施例１３
クローンのグリセロールストックからのナノスケールの直接サイクルシークエンシング
ＤＮＡ配列決定のためのサンプル調製は、細菌細胞においてクローニングされたＤＮＡから配列決定サンプルを調製することに関与する多くの工程のうちの幾つかが省略できる場合、単純化できる。代表的には、キャピラリー電気泳動解析のために細菌細胞を増殖させて溶解させ、ＰＣＲ増幅を実施して、続いてＥｘｏＩ／ＳＡＰ清浄化、次いでサイクルシークエンシングを行なう。本発明は、クローンのグリセロールストックから直接サイクルシークエンシングをすることによって、仕事の流れを単純化する方法を提供する。等容積のグリセロールストック及び１０Ｍ  ＮａＳＣＮを９６チャネルの５００ｎｌキャピラリーカセット中に吸引する。本明細書においてその全体が参考として援用される、同時継続の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示されたエアーサイクラー中で、５分の結合を６０℃で実施する。このキャピラリーカセットを、同時継続の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示されたキャピラリーカセット洗浄器中で、８０％のエタノールリンスで洗浄して、窒素流を用いて乾燥させる。次いで、このカセットを、プライマー、ＥＴターミネータープレミックス、及び水の１：４：５混合物を用いて毛管現象によって充填して、エアーサイクラー中でサイクリングした。このサイクリングプロトコールは、ＥＴターミネーターについて、上記実施例１で記載されたとおりであった。このサンプルを遠心分離（３２２０ｇ、３０分４℃）によって、８０％エタノールを含むマイクロタイタープレート中に分散することによりエタノール沈殿させた。デカントさせて、５０ｇでの３０秒の反転させたスピンでエタノールを除去した後、サンプルを５μｌの水中に再懸濁した。次いで、このサンプルを２ｋＶ、３０秒注入でＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）に注入して、続いて８ｋＶ、１４０分の分離を行なった。このデータをＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析して、続いて処理して、Ｐｈｒｅｄ  ２０塩基呼び出しスコアを決定した。図２３Ａ及びＢは、この方法によって得られたトレースを示しており、これは５６１塩基のＰｈｒｅｄ２０スコアを有した。本実施例は、細菌の凍結グリセロールストックからの直接配列決定への本発明の適用を実証する。この方法はアガープレート、又は同様の固体増殖培地上で、このプレートが新鮮であるか乾燥されているかにかかわらず、増殖する細菌のコロニーの配列決定に適用できるということが当業者に明白である。
【０４６９】
実施例１４
核酸のナノスケール一塩基伸長を用いた遺伝子型決定
本発明は、ナノスケールの遺伝子型決定反応を実施することに適用できる。
【０４７０】
一塩基伸長（ＳＢＥ）反応を、９６チャネルキャピラリーカセット中で実施した。一塩基伸長解析は、決定すべき塩基の直前に終わるＤＮＡプライマーの一塩基伸長から構成される。２５μｌのＰＣＲ反応物を調製したが、これには、５ｎｇ／μｌのゲノムヒトＤＮＡ、１μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、緩衝液、ＭｇＣｌ2及びＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄを含む。ＰＣＲサイクリングは、９６℃１２分と、９４℃２０秒、６０℃２０秒、及び７２℃３０秒の３５サイクル、続いて７２℃２分であった。２５μｌのＰＣＲ生成物に、９単位のＳＡＰ及び４５単位のＥｘｏＩを添加することによって、ＥｘｏＩ／ＳＡＰの除去を実施した。この反応物を３７℃で４５分間インキュベートして、次いで９５℃に１５分間加熱することによって、ＥｘｏＩ／ＳＡＰ酵素を変性させた。
【０４７１】
フルボリュームコントロール反応について、蛍光標識したジデオキシターミネーター、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液及び１μｌの２μＭプライマーを含有する９μｌのＳＢＥプレミックスを、１０μｌのＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理したＰＣＲ生成物に添加した。５００ｎｌのキャピラリーカセット中での反応のために、サンプルを毛管現象によってロードした。
【０４７２】
９６℃１０秒、５０℃５秒、６０℃３０秒の２５サイクルによって一塩基伸長反応を実施した。フルボリュームコントロールのためにＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｔｅｔｒａｄｓ（一種のサーマルサイクリング装置）中でか、又はキャピラリーカセットサンプルのために、その全体が参考として本明細書に援用される、同時係属出願の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示されたエアーサイクラー中かのいずれかで、サーマルサイクリングを実行した。このサンプルを、解析のために、水に分配して、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）中に注入した。
【０４７３】
図２４は、キャピラリーに基づく反応で、一塩基多型を正確に特定できるということを実証する。トレース１、３及び４は、問い合わせされる塩基で相同なサンプルから得た。トレース２は、問い合わせされる塩基で異種であるサンプルから得たものであり、対立遺伝子多形性は、ナノスケール反応を用いて検出できるということを実証する。シグナルは本質的に、フルボリューム反応で得られたシグナルと同じである。
【０４７４】
ＰＣＲからＳＢＥへのプロセス全体を、キャピラリーカセットを用いて達成した。
【０４７５】
キャピラリー中の鋳型捕獲を、本出願において記載されたとおり、このナノスケールの一塩基伸長反応の改良バージョンにおいて用いれば、さらに良好な結果さえ得られる。
【０４７６】
逆転写酵素及び蛍光標識した放射性ヌクレオチドを用いるメッセンジャーＲＮＡの一塩基伸長によって、ゲノムＤＮＡの代替としてｍＲＮＡを用いる遺伝子型決定が可能になることは当業者にはまた明白である。
【０４７７】
実施例１５
増幅されたフラグメント長の多形性を用いるナノスケールの遺伝子型決定
本発明の方法を用いて、ナノリットル容積中でＡＦＬＰ（増幅フラグメント長多形性）を実施することができる。ＡＦＬＰ反応を実施するため、ゲノムＤＮＡを制限酵素の対を用いて消化する。このフラグメントを、リンカーに連結して、特定の長さのフラグメントを、用いた２つの制限酵素によって決定される、特定の方向に増幅するように増幅するか、或いは変性プライマーを直接用いてＰＣＲで増幅する。この増幅されたフラグメントをキャピラリー電気泳動によって解析する。ＡＦＬＰ解析法を用いて、可変性フラグメント及び定常フラグメントを備える、アンプリコンとも呼ばれる、ゲノムの「提示（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）」を行う。このアンプリコンを用いて、生物体の集団の多様性を評価するか、又は配列及びマーカーの情報がほとんど利用できない生物体においてゲノムマッピングを行なう。
【０４７８】
実施例１６
直接ディスプレイ解析を用いるナノスケール遺伝子型決定
本発明の方法を用いて、ナノリットル容積で直接ディスプレイ解析を実施することができる。直接ディスプレイ解析反応を実施するため、対の制限酵素を用いて相補的ＤＮＡを消化する。このフラグメントを、リンカーに連結して、特定の長さのフラグメントを、用いた２つの制限酵素に依存する特定の方向に増幅するように増幅するか、或いは変性プライマーを直接用いてＰＣＲで増幅する。この増幅されたフラグメントをキャピラリー電気泳動によって解析する。直接ディスプレイ解析法を用いて、可変性フラグメント及び定常フラグメントを備える、トランスクリプトソームの「提示」を行う。直接ディスプレイ解析を用いて、生物体の間の発現のレベルにおける定量的変化、又は環境もしくは生理学的効果に起因する相違を評価する。
【０４７９】
実施例１７
マイクロサテライト解析によるナノスケール遺伝子型決定
本発明の方法を用いて、ナノリットル容積におけるマイクロサテライト解析により遺伝子型決定を実施することができる。マイクロサテライト解析反応で遺伝子型決定を実施するために、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｓｅｔｓのようなマーカーパネルを用いて、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅する。例えば、４色解析を用いて約３０分で１２の遺伝子型のパネルに関して、９６個のヒトサンプルを解析する。４つのプライマーセットで３つの色を用いるが、４番目の色は内部サイズ標準を提供する。
【０４８０】
プライマーパネルの製造業者によって推奨されるとおり、ＰＣＲ設定及びサーモサイクリングを実施する。
【０４８１】
ポリメラーゼ連鎖反応混合物の例は以下のとおりである：
【０４８２】
【表２】
2005525797.tif 000004
【０４８３】
このプライマー混合物は、フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方を、各々５μＭの最終濃度で含む。
【０４８４】
サーマルサイクラープログラムの例は以下のとおりである：
【０４８５】
【表３】
2005525797.tif 000005
【０４８６】
プールする工程
封止されたＰＣＲサンプルのトレイを−２０℃で保管する。
【０４８７】
最初に、１μｌの各々のＰＣＲ生成物をプールして、その後、水を用いて最終容積を約１５〜２０μｌにさせる。次いで、サンプルを透析する。透析を０．１×ＴＥ中で１５分間行ない、その後プールされたＰＣＲサンプルをＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）中にロードする。
【０４８８】
ロードする工程
以下のとおり、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）へのロードのためにサンプルを調製する：
【０４８９】
【表４】
2005525797.tif 000006
【０４９０】
実施例１８
核酸を用いたナノスケール酵素反応
本発明は、有利なことに、ナノリットル容積中で核酸とのナノスケールの酵素反応を実施することに適用される。核酸を、本発明の方法によって調製した、ガラスキャピラリーのような反応チャンバ中に固定する。このキャピラリーを、制限酵素のような１つ以上の異なる酵素を含む反応混合物で充填する。
【０４９１】
０．２〜１．５μｇの基質ＤＮＡ及びＤＮＡに２〜１０倍過剰の制限酵素を含む総容積２０μＬ中で、代表的な制限酵素消化を実施する。反応緩衝液、酵素、水及びＤＮＡを反応管内で混合して、３７℃で１〜４時間インキュベートする。本発明に従って、鋳型ＤＮＡをキャピラリー管の内面に結合する。次いで、制限酵素（例えば、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）を含有する１×ＫＧＢ緩衝液（１００ｍＭ  グルタミン酸ナトリウム、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ酢酸、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  硫酸マグネシウム、５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、及び１ｍＭ  βメルカプトエタノール）の事前混合物を毛管現象によってキャピラリー中に引き込む。この反応物を３７℃で割り当て時間インキュベートして、その後にその内容物を、アガロースゲルサイジングのためにゲルローディング緩衝液中に、又は１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する溶液中に分配する。
【０４９２】
異なる酵素を含む他の反応もまた可能である。これらの酵素としては、メチル化酵素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ターミナルトランスフェラーゼ酵素、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素、ホスファターゼ酵素、キナーゼ酵素、エキソヌクレアーゼ酵素、例えばＳ１、又はマング・ビーンヌクレアーゼ、他のヌクレアーゼ酵素、リボヌクレアーゼ酵素、又はＤＮＡもしくはＲＮＡリガーゼ酵素が挙げられるがこれらに限定されない。これらの反応のほとんどについて、酵素に対して核酸の比が上回るコントロールが、反応プロセスの成功のために重要である。
【０４９３】
本出願の使用は有利にも、核酸との濃度依存性酵素反応に伴う誤差を低下し、貴重な酵素の消費も低減する。さらに、洗浄を通して、本発明の方法の使用は、残りのイオン、例えば、酢酸アンモニウム、ＥＤＴＡ及び塩化リチウム、並びに酵素活性を妨害する他の夾雑物、例えばポリサッカライドを排除するのに有効である。
【０４９４】
実施例１９
マイクロアレイスポッティングプレートからの直接配列決定
マイクロアレイを用いて生成したデータの完全性を保証するため、スポットされたＤＮＡの配列の同一性は高い確度で既知である必要がある。ＰＣＲはしばしば、スポットすべきＤＮＡを生成するために用いられ、当技術分野で周知のように、Ｔａｑ及び関連の耐熱性ポリメラーゼによって、それが鋳型を増幅するにつれて、千塩基対当たり特定数の誤った塩基対が誘導される。過ちが導入された場合、それらは検出されなければならず、増幅された生成物又はそれに由来するデータは破棄されなければならない。通常、これには、ＰＣＲ生成物をスポットすることに伴う工程とは別の多くの処理工程を必要とする。しかし、本発明の実施形態の使用によって、配列の確認の効率は大きく向上する。
【０４９５】
以下のとおり、本発明の方法を用いて、一連のマイクロアレイスポッティングサンプルの配列の確認を達成した。
【０４９６】
マイクロアレイスポッティングサンプルを、ヒトゲノムＤＮＡ鋳型由来の、平均５００ｂｐのＰＣＲ生成物から調製した。この生成物は、標準的な塩化グアニジウムガラスフィルタープレート処理を用いて精製して、等容積の１０Ｍチオシアン酸ナトリウムと混合した。マイクロアレイスライドへの引き続くスポッティングのためにマイクロタイタープレート（「スポッティングプレート（ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）」にサンプルを並べた。
【０４９７】
ＰＣＲ生成物の配列及びマイクロアレイハイブリダイゼーションスライド上での位置的配列を確認するために、９６キャピラリーカセットの末端をスポッティングプレートに浸すこと、及びこのキャピラリーの内面に対するＤＮＡの結合によって配列決定反応を実施した。８０％エタノールを用いた洗浄工程の後、緩衝液、ポリメラーゼ、色素標識ジデオキシヌクレオチド、及び配列決定プライマーを含有する配列決定混合物を１×濃度で用いてこのキャピラリーを充填した。サーマルサイクリング（９５℃５秒、５５℃５秒、及び６０℃６０秒の３０サイクル）後に、エタノール沈殿によって配列決定反応物を精製して、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）によって解析した。
【０４９８】
本実施例では、６０サンプルによって確証的な配列を得たが、この平均読取り長さは３３５塩基（最大４５０ｂｐ）であった。アレイにスポットしたのと同じ調製及び供給源からの直接配列決定によって、本発明者らは、ＰＣＲ生成物の位置及び同一性における多義性（あいまい性）を解決した。
【０４９９】
実施例２０
ＰＣＲヌクレオチド及びプライマーの予備的な除去なしでのＰＣＲ生成物の直接配列決定
本発明の方法は、配列決定の前のＰＣＲ生成物の精製を簡略化するために用いられている。代表的には、プライマー及び過剰のｄＮＴＰｓを除去するために、エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）及びエビ由来アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を用いるＰＣＲ生成物の酵素的精製がサイクルシークエンシングの前に必要である。しかし、鋳型結合はサイズ依存性であるので、未取込みのプライマー及び残留しているヌクレオチドは、キャピラリーに対する鋳型の示差的な結合によって、続いて洗浄によるヌクレオチド及びプライマーの除去によって、鋳型から代わりに除去することができる。この方法は、ＰＣＲ生成物の酵素的な清浄化を未然に防ぎ、全体的な作業の流れを大きく簡略化する。
【０５００】
実証されたとおり、マウスサブクローンインサートを含むＭ１３  ＤＮＡの９６個のＰＣＲ生成物を、ＰＣＲ増幅後の酵素精製なしに直接配列決定した。
【０５０１】
マウスゲノムＤＮＡのサブクローンインサート（約２０００ｂｐ）を含むＭ１３鋳型を用いて、ＰＣＲ増幅反応を実施した。このＭ１３鋳型は、ポリエチレングリコール沈殿及び界面活性剤溶媒和（Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ）によって先に調製しており、これを２００倍に希釈して、９６ウェルマイクロタイタープレート中に再度並べた。
【０５０２】
２．５μＬ  １０×ＧｅｎｅＡｍｐ緩衝液、０．２μＬの２５ｍＭの各々のｄＮＴＰ、０．５μＬの１０μＭ  Ｍ１３−４０ＦＷＤ（ＧＴＴ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＡＣ）、０．５μＬの１０μＭ  Ｍ１３−４０ＲＥＶプライマー（ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＧＧ）、１．５μＬの２５ｍＭ  塩化マグネシウム、０．５μＬの５Ｕ／μＬ  ＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ、及び１７．３μＬの水を用いて調製したＰＣＲ増幅混合物に、この溶液の２μＬのアリコートを移した。このプレートを混合して封止した後、９５℃１０秒、５５℃１０秒、及び７２℃２分の３０サイクルで反応物を熱的にサイクリングした。ＰＣＲ増幅後、５μＬのアリコートを取り出して、別の９６ウェルプレート中の５μＬの１０Ｍ  チオシアン酸ナトリウムと混合した。
【０５０３】
９６キャピラリーカセットのキャピラリーを、カオトロープ−ＰＣＲ生成物の混合物中に浸して、これによってカセットを充填した。６０℃での５分のインキュベーション後、残りのカオトロープ、未結合の緩衝液成分及びＤＮＡを、減圧下でキャピラリーを通したエタノールの吸引によって加えた８０％エタノール洗浄によって、除去した。空気を１分流して内面を乾燥させた後、ＥＴターミネーター反応混合物の１×溶液及びフォワード配列決定プライマー、Ｍ１３−２１ＦＷＤ（ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ）を含有する配列決定混合物中に、このキャピラリーを浸した。
【０５０４】
空気式サーマルサイクラー中のキャピラリーの末端を封止することによって、サイクルシークエンシングを実施した。この反応を、９５℃５秒、５５℃５秒及び６０℃６０秒で３０回サイクルさせた。このサイクルシークエンシング生成物を、遠心力を用いて、４０μＬの８０％エタノールを含有するマイクロタイタープレート中に分配した。３０００×ｇで３０分の遠心分離後、このアルコールをデカントして、ペレットのＤＮＡを５μＬのｄｄＨ２Ｏに再懸濁して、サンプルをＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）によって解析した。
【０５０５】
これらの９６個のサンプルについて、５５０塩基の平均読取り長さが達成され、このとき８３％のパス率であり、合計４４０００塩基であった。この手順を、５０００を超えるサンプルについて繰り返して、フルボリューム及び酵素精製反応を上回る改善が実証された。
【０５０６】
実施例２１
ナノ容積のＰＣＲ及びフルボリュームＰＣＲの比較
鋳型特異的プライマー対と１０×ＧｅｎｅＡｍｐ緩衝液、ＭｇＣｌ2、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｄＮＴＰ及び二回蒸留水との混合によって、ＰＣＲ事前混合物を調製する。次いで、事前混合物の１５マイクロリットルを、２４ウェルのマイクロタイタープレートにアリコートする。ＰＣＲ事前混合物を含む各ウェルに、反応のための鋳型として１０μｌのゲノムＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ）を添加する。各々２３ウェルが、異なる個体から単離したゲノムＤＮＡを受容して、１つのウェルは陰性コントロールとして鋳型を受容しない。ナノ容積のＰＣＲのために、マイクロタイタープレートのウェルへキャピラリーの末端を浸すことにより、約５００ｎｌの反応混合物を用いて、毛管現象によって、反応カセットのキャピラリーを充填する。次いで、このキャピラリーカセットを、その全体が参考として本明細書に援用される同時係属の米国特許出願第０９／５７７１９９号に開示される、サーマルエアーサイクラー中に入れて、このキャピラリー末端を封止する。次いで、以下のプログラムを用いて、空気駆動式のサーマルサイクリングによって増幅を達成する：９３℃１０秒；６０℃１０秒及び７２℃６０秒の３０サイクル。フルボリュームＰＣＲについて、残りのＰＣＲ反応混合物を０．２ｍｌのＰＣＲ管に移して、以下のプログラムを用いるサーマルサイクリングによって増幅を達成する：９４℃２０秒；６０℃２０秒及び７２℃３０秒の３５サイクル；７２℃３０秒、並びに７２℃２分の１サイクル。
【０５０７】
ＰＣＲ完了後、このキャピラリーの内容物を、遠心力によって７．５μｌの１×ローディング色素中に追い出す。各々のフルボリュームＰＣＲ反応からの等価な容積を、低容積ピペッターを用いて、同じ量のローディング色素中に手動で移す。次いで、ＰＣＲ生成物を、１．５％アガロースゲルのウェル中にロードして、１×Ｔｒｉｓ−酢酸塩−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）中で１５Ｖ／ｃｍで４０分間の電気泳動に供する。電気泳動の終了後、このゲルをＤＮＡ色素Ｓｙｂｒ  ＧｒｅｅｎＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色して、２次元蛍光スキャナー（Ｆｌｕｏｒｌｍａｇｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて画像化する。
【０５０８】
ＰＣＲ生成物の各々のバンドからの蛍光シグナル強度を、ＤＮＡ量に変換してグラフで提示する。本実験の結果を図２５に示しているが、ここではキャピラリーカセット中でのナノ容積の反応中でのゲノムＤＮＡのＰＣＲ（図２５Ａ）によってフルボリュームＰＣＲ反応と匹敵する量の生成物（図２５Ｂ）が得られるということが実証される。
【０５０９】
実施例２２
ナノ容積及びフルボリュームＳＢＥの比較
ＳＢＥのための鋳型として働く、ゲノムＤＮＡから生成したＰＣＲ生成物を用いて、フルボリューム及びナノ容積のＳＢＥ反応を実施する。実施例２１に記載のとおりフルボリューム反応中でＰＣＲを実施する。ＰＣＲの完了後、過剰のＰＣＲプライマーをＥｘｏＩで消化して、未取込みのｄＮＴＰをＳＡＰでの処理によって不活性化する。２５μｌのＰＣＲ容積に、１４μｌのＥｘｏＩ／ＳＡＰ溶液（１．０Ｕ／μｌの９μｌのＳＡＰ、及び１０Ｕ／μｌの５μｌのＥｘｏＩからなる）を添加して混合し、その後、その混合物を３７℃で４５分間インキュベートして反応を達成して、その後９５℃１５分間によってこの酵素を熱不活性化する。
【０５１０】
フルボリュームＳＢＥのために、マイクロタイタープレートのウェル中で、１０μｌのＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理ＰＣＲ生成物に、９μｌのＳＢＥ事前混合物及び１μｌの２μＭ  ＳＢＥプライマー溶液（プライマーＮＣＢＩ  ４２２又はプライマーＮＣＢＩ  ４２５）を添加する。ＳＢＥ事前混合物は、プライマー対が除外されて、ｄＮＴＰが蛍光標識されたジデオキシターミネーターで置換されている以外は、ＰＣＲ事前混合物と同様である。成分の混合後、この反応混合物は、０．２μｌの管に移されて、以下のプログラムを用いて、ＰＣＲについてと同様に、サーマルサイクリングによってＳＢＥを実施する：９６℃１０秒；５０℃５秒；６０℃３０秒の２５サイクル。
【０５１１】
フルボリュームＳＢＥが終了した後、未取込みのｄｄＮＴＰをＣＩＡＰ処理によって脱リン酸化する。各々のＳＢＥ反応生成物の１０マイクロリットルを、マイクロタイタープレートのウェルに移して、０．１Ｕ／μｌのＣＩＡＰ及び１×ＣＩＡＰ緩衝液を含有する２５μｌのＣＩＡＰ溶液と混合する。次いでこの混合物を３７℃で６０分間インキュベートして反応を達成し、次いで７２℃１５分によってＣＩＡＰ酵素を熱不活性化する。
【０５１２】
次いで、各々のＣＩＡＰ処理したフルボリュームＳＢＥ反応の５μｌを５μＬのＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）ローディング液と混合し、９５℃で１分間変性させて、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）を用いて解析する（注入：６ｋＶで１５秒間。泳動：６ｋＶで６０分間）。
【０５１３】
フルボリュームＳＢＥによって解析された４つのサンプル由来の結果を図２６に示す。図２６Ａ及び２６Ｃは、問い合わせられた塩基でのヘテロ接合性のヌクレオチド多形性を示すが、図２６Ｂは、ホモ接合性の多形性を示す。図２６Ｄは、ＤＮＡを含まない陰性コントロールは、一ヌクレオチドシグナルを生じなかったことを示す。
【０５１４】
ナノ容積のＳＢＥについては、フルボリュームＳＢＥについて調製された同じＳＢＥプライマープレミックス溶液反応混合物中にキャピラリー管を浸して、約５００ナノリットルの混合物を用いて毛管現象によって充填する。その後にこのキャピラリーカセットをエアーサーマルサイクラー装置に移して、以下のプログラムを用いて、ＰＣＲについてと同様に、ＳＢＥを実施する：９５℃５秒；５５℃５秒；６０℃３０秒の３０サイクル。
【０５１５】
ナノ容積のＳＢＥが終了した後、キャピラリー管から遠心分離によって、上記のＣＩＡＰ溶液の２０μｌを含むマイクロタイターディッシュのウェル中に反応生成物を排出させる。この反応生成物を３７℃で６０分間のインキュベーションによってＣＩＡＰを用いて処理して反応を達成し、次いで７２℃１５分によってＣＩＡＰ酵素を熱不活性化する。
【０５１６】
次いで、各々のＣＩＡＰ処理したナノ容積のＳＢＥ反応物のうちの５マイクロリットルを５μＬの水と混合し、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）を用いて解析する（注入：２ｋＶで４５秒間。泳動：６ｋＶで６０分間）。
【０５１７】
図２７は、同じヘテロ接合性サンプルのフルボリューム（図２７Ａ）及びナノ容積のＳＢＥ（図２７Ｂ）を比較する実験の結果を示す。この結果によって、ナノ容積のＳＢＥ生成物がフルボリュームＳＢＥと同様の質のデータを生じることが実証される。
【０５１８】
フルボリューム及びナノ容積のＳＢＥの両方を用いて、２３個の異なるサンプルを解析したが、ここでは２つの別個のプライマー（ＮＣＢＩ  ４２２及びＮＣＢＩ  ４２５）を用いて多形性ヌクレオチドの検出の確度が１００％であった。
【０５１９】
実施例２３
鋳型捕獲と組み合わせたナノ容積ＳＢＥ
５μｌのゲノムＤＮＡ鋳型を７．５μｌのＰＣＲ事前混合物とマイクロタイタープレートのウェル中で混合し、次いで毛管現象によってキャピラリー管に引き込むこと以外は、実施例２１に記載したのと同様にナノ容積ＰＣＲを実施する。反応の完了後、キャピラリーから遠心分離によって、９．７Ｍのチオシアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）の５００ナノリットルを含むマイクロタイタープレートのウェル中にＰＣＲ生成物を排出させる。混合後、この溶液の約５００ナノリットルを毛管現象によって新しいキャピラリーに引き込み、６０℃で５分間インキュベートして、ＳＢＥ生成物をキャピラリーの内面に結合させる。その後、この溶液を遠心分離によって排出させ、このキャピラリーを８０％エタノール／２０％二回蒸留水で洗浄して、窒素を流して乾燥させた。ＥｘｏＩ／ＳＡＰを用いたナノ容積のＰＣＲ生成物の処理は実施されない。
【０５２０】
次いで、ナノ容積のＳＢＥ及びＳＢＥ生成物のＣＩＡＰ処理を実施例２２に記載のとおり実施して、その後に、これも記載のとおりＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）を用いてこの生成物の解析を続ける。
【０５２１】
図２８は、同じヘテロ接合性サンプルのフルボリュームＰＣＲでＥｘｏＩ／ＳＡＰで処理し、続いてフルボリュームＳＢＥで処理したもの（図２８Ａ）及びナノ容積のＰＣＲで鋳型捕獲を用い、続いてナノ容積ＳＢＥしたもの（図２８Ｂ）を比較する実験の結果を示す。この結果によって、鋳型捕獲と組み合わせたナノ容積のＳＢＥが、ＳＢＥ鋳型として機能するＰＣＲ生成物のＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理と組み合わせたフルボリュームＳＢＥと同様の質のデータを生じることが実証される。
【０５２２】
実施例２４
ＳＢＥ生成物清浄化方法の比較
ナノ容積のＳＢＥを実施例２３に記載のとおり実施して、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）を用いる解析の前に未取込みのｄｄＮＴＰを除去又は不活性化するためにＳＢＥ生成物を処理する異なる方法を効力について比較する。ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）への注入は、２ｋＶで４５秒間実施し、サンプルの泳動は６ｋＶで６０分間実施する。図２９Ａに示されるとおり、ｄｄＮＴＰが注入の前に除去も不活化もされない場合、それらは強力なシグナルを生じる。図２９Ｂ及び図２９Ｃによって、ｄｄＮＴＰがＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）ゲルベッドに入ることを防ぐのにおけるＣＩＡＰ処理の有効性が実証される。注入の前の９５℃１分間の脱イオン水中でのＳＢＥ生成物の変性によって、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）ローディング液中での生成物の変性（図２９Ｂ）に比べて、約４倍大きいシグナル強度が得られる（図２９Ｃ）。
【０５２３】
しかし、ｄｄＮＴＰの除去及びシグナル強度の増大の最も有効なのは、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）を用いたＳＢＥ生成物の精製（図２９Ｄ）であり、ここではシグナル強度のさらに２倍の増大が得られる。マイクロタイタープレートのウェルへアリコートされたセファデックスを、１５０μｌの脱イオン水を用いて事前に４回洗浄する。洗浄の間、９１０ｇで５分間の遠心分離によって、ｓｅｐｈａｄｅｘをウェル中にペレット化する。ナノ容積のＳＢＥ反応物を遠心分離によって２０μｌの水中に排出して、その後に希釈した反応物を、セファデックスを含有するマイクロタイタープレートのウェルに移す。ｄｄＮＴＰがセファデックスの細孔に入るのに十分な時間のインキュベーション後、このセファデックスを遠心分離によってペレット化する。次いで、各々のウェル由来のサンプルをＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）中に直接注射する。
【０５２４】
実施例２５
ナノ容積ＳＢＥの検証
２３個の関連しないヒトゲノムＤＮＡサンプル、及び１２個の非ＤＮＡ陰性コントロールを用いて、実施例２３に記載のとおりナノ容積ＳＢＥを実施する。１２個のプライマーを用いて異なる塩基位置を問い合わせる。実施例２４に記載のとおり、ＳＢＥ生成物を、セファデックスを用いて精製する。同じサンプル及びプライマーを用いるフルボリュームＳＢＥを実施例２２に記載のとおり実施する。
【０５２５】
図３０は、ナノ容積及びフルボリュームＳＢＥの結果を比較しており、これは９つのプライマーについての結果を示している。ナノ容積のＳＢＥの平均の正確性（９８％）は、フルボリュームＳＢＥの正確性（９９％）に匹敵する。
【０５２６】
以下の実施例は、ある範囲の一般的酵素活性及び阻害アッセイを実施するための本発明の方法の有用性及び有効性を実証する。さらに、それらは、固相固定がタンパク質及び酵素並びにＤＮＡに適用できることを実証する。最終的に、記載されたシステムは等温性反応に適用することができるということがそれによって示される。以下の実施例で使用されるマルチプレックスキャピラリーシステムは、１６個、９６個又は３８４個のキャピラリーを含む。
【０５２７】
実施例２６
トリプシンを用いる溶液中のタンパク質消化
サブマイクロリットルのタンパク質を含有する溶液を処理するための記載されたマルチプレックスシステムの使用をチトクロムＣのトリプシン消化を用いて実証した。キャピラリーカセットのキャピラリー内で相同な溶液中でこの消化を実施した。
【０５２８】
トリプシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）及びチトクロムＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の混合物を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ８）を用い、トリプシン−タンパク質の比を１：１０、１：２０、１：５０及び１：１００で用いて調製し、タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍＬに保った。混合物の５００ｎＬのアリコートを、毛管現象によってキャピラリーカセット中にロードして、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、消化混合物を、９６ウェルのＲｏｂｂｉｎプレート中にスピンダウンした（２７００Ｇで１分の遠心分離による）が、このプレートの各々のウェルは、ジメチルスルホキシド中にフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を１ｍｇ／ｍＬ含む。このプレートを暗野で室温に４時間保持した。次いで、得られた混合物をｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を用いて２０〜２０００倍に希釈して、ＭｅｇａＢＡＣＥＬＰＡ緩衝液及び長い読取りマトリックスを用いるＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上でのキャピラリー電気泳動（ＣＥ）分離に供した。サンプルは、１ＫＶで５秒間注入して、９ＫＶで５０分間分離した。
【０５２９】
上記の実験条件を少なくとも１６回行なった。タンパク質消化の代表的な電気泳動図を、図３１Ａに図示する。消化されたチトクロムＣの得られたペプチドプロフィールは、各々の泳動の間で一定かつ再現可能であり、フルボリューム反応で得られたデータに匹敵している。
【０５３０】
実施例２７
エンドプロテイナーゼ、Ａｓｐ−Ｎを用いるプロテアーゼアッセイ
ポリペプチドのエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ消化をここで、さらなる実施例として例示する。これは、サブマイクロリットルの酵素反応物を処理するための、記載されたマルチプレックスシステムの使用をさらに実証する。エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ消化についての酵素−生成物の相関関係、及び至適の酵素濃度を確立した。
【０５３１】
ペプチドＣｙ（商標）５Ｑ−ＹＶＡＤＡＰＶＫ−Ｃｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を反応基質として用いた。ペプチドがインタクトである場合、Ｃｙ５Ｑは効率的にＣｙ３をクエンチし、Ｃｙ３波長での励起によって、わずかな残りのバックグラウンドシグナルが生じる。一旦このペプチドが切断されれば（Ａｓｐ−Ｎは、アスパラギン酸残基のＮ末端でペプチドを切断する）、色素はもはや緊密には近接しておらず、Ｃｙ３波長での励起によってＣｙ３発光が生じる。Ｃｙ３発光のシグナル強度は、切断されているペプチドの量に直線的な比率である。
【０５３２】
相同な溶液中で、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ反応を実施した。２０μＬのジメチルスルホキシドを用いて５μｇのペプチドを再構成し、次いで９８０μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、＋０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（商標））と混合した。５００μＬのガラス蒸留水を用い、最終濃度４μｇ／ｍＬで、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を再構成した。一連の希釈は、５００ｎＬの反応物中のＡｓｐ−Ｎの最終量が５〜１８０ピコグラムであるように、酵素で実施した。６つの濃度のＡｓｐ−Ｎを、１：２０希釈のペプチド基質と、３８４ウェルのマイクロタイタープレート中にスピンして混合した。この混合物の５００ｎＬのアリコートを、毛管現象によって３８４個のキャピラリーカセット中にロードして、室温で１０分間インキュベートして反応を完了させた。次いで、消化混合物を３８４ウェルの透明なプレート（Ｎａｇｌｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）中にスピンダウンしたが、その各々のウェルは１０μＬのアッセイ緩衝液を含む。蛍光プレートリーダー（Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標），Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって、５３２ｎｍで６５０Ｖにおいて、Ｃｙ３  ５５５  ＢＰ２０発光フィルターを用いて、このプレートを読みとった。
【０５３３】
各々のＡｓｐ−Ｎ濃度での反応を平行に２４回繰り返した。図３６は、これらの反応の結果をまとめる。Ｃｙ３発光のシグナル強度は、Ａｓｐ−Ｎ濃度が増大するにつれて、直線的に、５００ｎＬの反応物当たり約５０ピコグラムのＡｓｐ−Ｎにまで増大する。その上に、Ｃｙ３シグナル強度は増大し続け（遅いペースではあるが）Ａｓｐ−Ｎ濃度の増大につれて、５００ｎＬの反応物当たり１８０ピコグラムに及んで増大する。５００ｎＬの反応体積中のＡｓｐ−Ｎの最適量は約５０ピコグラムである。これらの結果によって、高処理能力のナノスケール反応において潜在的な薬物標的をアッセイするため、及び応答曲線を決定するためのナノプレップの使用が実証される。高処理能力の薬物スクリーニングへのナノプレップの適用によって、標的、化合物のライブラリー及び天然の生成物のライブラリーの消費が最小化される。
【０５３４】
実施例２８
トリプシン固定ビーズでのタンパク質消化
サブマイクロリットルのタンパク質を含有する溶液を処理するための記載されたマルチプレックスシステムの使用をチトクロムＣのトリプシン消化を用いて実証した。キャピラリーカセットのキャピラリー内で、磁気ビーズに固定された酵素を用いて消化を実施した。小さい磁気ビーズの導入によって効率的な分離ツールが得られ、標的分子の最適の接近性のための単位容積当たりの高い結合表面積が得られる。当業者に容易に理解されるとおり、ビーズはまた、磁気でなくてもよいし、もしくはシンチレーション近似アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）であってもよく、又は他の表面特性を有してもよい。
【０５３５】
ストレプトアビジンコーティングした磁気ビーズＭ２８０（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）と、ビオチン結合したトリプシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とを、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中において、ビーズ−トリプシンの比が１０：１（重量／重量）でインキュベートすることによって、トリプシン固定磁気ビーズを調製した。室温で絶えず上下逆さまに振盪しながら２４時間インキュベーションした後、トリス緩衝液を用いて未結合の酵素を洗浄して除くことによって、Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−９６磁気デバイスでビーズを清浄化した。次いで、これらのトリプシン固定磁気ビーズをチトクロムＣ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と、ビーズ−タンパク質の比が１０：１（重量／重量）で混合した。次いで、ビーズ溶液中にキャピラリーカセットを浸して、毛管現象によって充填することによって、混合物の５００ｎＬのアリコートを、このキャピラリーカセットに移した。オーブン中で３７℃で一晩のインキュベーションした後、次に消化混合物を、９６ウェルのＲｏｂｂｉｎプレート中にスピンダウンした（２７００Ｇで１分の遠心分離による）が、このプレートの各々のウェルは、１ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識溶液を含む。この混合物を、磁力によってビーズから分離して、ビーズから離れた得られた上清を別のプレートに移した。暗野で４時間の反応後、標識されたタンパク質フラグメント（ペプチド）を、実施例２６に記載のとおり、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって解析した。
【０５３６】
上述の実験条件を少なくとも１６回行なった。キャピラリー電気泳動の特徴づけによって、この方法及び実施例２６に記載された方法から得られた消化されたチトクロムＣのペプチドプロフィールが一定かつ再現性であることが示された。タンパク質消化の代表的な電気泳動図を図３１Ｂに図示する。
【０５３７】
酵素固定した磁気ビーズはまた、基質がキャピラリーカセットの様式でＤＮＡもしくはＲＮＡの分子、タンパク質、糖タンパク質、脂質、ペプチド、又は他の生体高分子を含む生化学的反応に適用することができる。
【０５３８】
実施例２９
表面修飾されたキャピラリーカセットでのタンパク質消化
固定された酵素リアクターを用いる異種反応によって、反応混合物から酵素を分離するための必要性を省き、タンパク質分解性酵素による消化物の混入を最小限にすることができる。本実施例は、キャピラリーカセットの内面に共有結合した酵素がその活性を保持しており、このようなシステムを酵素アッセイにおいて用いることができることを実証している。当業者に理解されるとおり、固定された酵素はまた、サンドイッチアッセイ、基質の生成物への変換、バイオアッセイ、又は他の反応を含む、多くの他の反応において用いることができる。
【０５３９】
アミノアルキルシラン試薬を用いたシラン処理によって、広範な種々のアフィニティーリガンドが引き続き結合され得るアミノ基官能化表面が得られる。この方法では、キャピラリーカセット（又は他の種類の反応チャンバ）を３−アミノプロピルトリエトキシシランによって、続いてＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナテルによって処理した。このピリジルジチオ官能基によって、特定の−Ｓ−Ｓ−及び−ＳＨ交換反応を通じて、トリプシンに結合する従来の方法が得られる。、必要に応じて、固定された酵素は、過剰量のチオピリドンを添加することによって遊離することが可能である（Ｃａｒｓｓｏｎ，Ｊ．；Ｄｒｅｖｉｎ  Ｈ．；Ａｘｅｎ，Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７８，１７３，７２３）。従って、新鮮なトリプシンを繋ぐために、同じキャピラリー表面を再生して、高い酵素反応性を保証することができる。
【０５４０】
別の表面固定法は、特定のストレプトアビジン−ビオチン反応に基づく。ストレプトアビジン修飾によって、表面がビオチン化された酵素へ結合することが可能になる。この方法では、キャピラリーカセットを、３−アミノプロピルトリエトキシシランを用いて誘導体化して、次いで、ストレプトアビジンを繋ぐために、二機能性のリンカーであるジスクシンイミジル基質と反応させ、これによって、ビオチン化したトリプシンをその後に、キャピラリー表面に結合させることが可能である。ストレプトアビジンとビオチンの相互作用の高い特異性を利用して、キャピラリーの内面に均一に配向した酵素が得られる（Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．；Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０，１８４）。
【０５４１】
これらの２つの酵素の固定技術は、高い表面反応性を得て、非特定の結合を最小化することが目的である。当業者に理解されるとおり、他の表面固定法もまた利用可能である。例えば、Ｙ−グリシドオキシプロピルシランとの反応で、固体表面にオキシラン基が導入され、これによってリジン部位での酵素結合が可能になる。この修飾は、非特異的なタンパク質取込みを減少させるために親水性表面を提供することが期待される。表面活性ヒドロゲルとの酵素の結合によって、酵素固定された表面を生成する都合のよい手段が得られる（Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ及びＬｉ，米国特許第５５１６７０３号，１９９６年）。この方法の利点は、これによってタンパク質適合性の環境及び再使用可能な表面が得られるということである。
【０５４２】
チトクロムＣ（１ｍｇ／ｍＬ）を、毛管現象によって、ストレプトアビジン−ビオチン固定トリプシンキャピラリーマイクロリアクターに直接導入し、続いて３７℃で一晩インキュベーションすることによって、タンパク質消化反応を実行した。次いで、タンパク質フラグメントを、スピンアウトして、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識して、全て実施例２６に記載されたとおり、この標識されたタンパク質消化物をＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）解析に引き続き供した。トリプシンでコーティングした（単なる吸着による）２つの未処理のキャピラリーカセットを、コントロールとして用いた。
【０５４３】
所定の固定されたトリプシンキャピラリーカセットのために、新鮮なチトクロムＣ溶液を用いて、２週間の期間にわたって３つのタンパク質消化反応を実施した。第一の反応は、０日目に、第二の反応は７日目に、第三の反応は１４日目に実施した。トリプシン固定されたキャピラリーカセットは、泳動の間、０．１５Ｍ  リン酸緩衝化生理食塩水（４℃）に保管した。ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）上で得られたキャピラリー電気泳動分離によって、これらの処理されたカセットの全てのキャピラリーが３つの泳動にまたがって同じペプチドマップを有することが実証された。これは、それぞれ泳動１（０日目）、泳動２（７日目）及び泳動３（１４日目）の代表的な電気泳動図（図３２、３３及び３４）に示される。反対に、このコントロールのキャピラリーカセットによって、第一の泳動においてのみある程度のタンパク質消化が示され、ただし第二又は第三の泳動ではタンパク質消化は示されなかった。これは予想通りである。なぜなら、物理的な吸着を介した非特異的な結合はおそらく酵素の活性を低下し、その結合は、共有結合ほど安定ではないからである。結果として、このような固定された酵素は、繰り返しの消化反応を実行するには十分な能力を有さない。本実施例は、この酵素が高処理能力のナノスケールリアクターの表面に結合され得、上記のように、繰り返しの酵素反応、例えば、タンパク質分解性消化を実施するために用いることができるということを実証する。
【０５４４】
上記のＣＥ技術に加えて、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用して、これらのタンパク質消化をさらに特徴付けた。フラクションコレクターＦｒａｃ−９５０及びオートサンプラーＡ９００を備えるＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィーシステム１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で実験を実施した。ストレプトアビジン−ビオチン固定されたトリプシンキャピラリーカセットで調製されたチトクロムＣのトリプシン消化物のサンプルを、逆相カラムＳＯＵＲＣＥ  ５ＲＰＣ  ＳＴ４．６／１５０（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中に注入して、勾配（溶出液Ａ：０．０５％トリフルオロ酢酸含有２％アセトニトリル；溶出液Ｂ：０．０５％トリフルオロ酢酸含有８０％アセトニトリル）によって溶出させた。代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図３５に示す。キャピラリーカセットで得られたチトクロムＣ消化物のプロフィールは、文献での結果と一致している（Ｎｅｕｅ，Ｕ．Ｄ．；Ｚｏｕｂａｉｒ，Ｍ．；Ｆａｌｌａｈ  ＥＩ、ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９７）。
【０５４５】
本明細書において言及された全ての特許、特許刊行物、及び他の公開された引用文献は、各々が個々にかつ詳細に本明細書において参考として援用されるかのように、その全体が参考として本明細書に援用される。本発明の好ましい例示的な実施形態が記載されているが、本発明は、例示の目的のみで提示されており限定のためではない、記載された実施形態以外によっても実施可能であることが当業者には理解される。本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０５４６】
【図１】サイクルシークエンシング反応生成物の調製のための統合されたシステムの概略図であって、このシステムは本発明の方法を有利に使用することができる。
【図２】サイクリング反応の生成における工程を例示するフローチャートであって、その第一の工程は、本発明の方法の使用によって有利に改善することができる。
【図３Ａ】本発明の高処理能力の実施形態において用いられるキャピラリーカセットの斜視図である。
【図３Ｂ】本発明の方法の高処理能力適用のためのシステムにおけるキャピラリーカセットホルダー中に挿入された図３Ａのキャピラリーカセットの斜視図である。
【図３Ｃ】本発明の方法を有利に使用することができる可撓性のキャピラリーカセットである。
【図３Ｄ】キャピラリー末端が屈曲したパターンであるように屈曲された配向に曲げられた図３Ｃのキャピラリーカセットを図示している。
【図３Ｅ】本発明に従う、核酸の直接の可逆的な固定を含む、サンプル調製のための、キャピラリー管に機能的に等価である、チャネルを備えるマイクロチップデバイスである。
【図４Ａ】本発明における使用のための、図３のキャピラリーカセットから液体を分配するための分配ヘッドを図示する。
【図４Ｂ】図４Ａの空気置換式分配ヘッドの内部断面を示す。
【図４Ｃ】図４Ａの分配ヘッドを示しており、ここで分配ヘッドは閉鎖されている。
【図５Ａ】図３Ａのキャピラリーカセットから液体を分配するために用いることができる遠心分離機の上面図を図示する。
【図５Ｂ】スイング式マイクロプレートバケットを保持している図５Ａのローターアームの断面図を図示しており、このマイクロプレートバケットはマイクロタイタープレート中に挿入されたキャピラリーカセットを含む。
【図６】空気式のサーマルサイクリングデバイスの概略図を示しており、このデバイスは、本発明の温度捕獲及び標準化方法を有利に使用することができるパラレルな反応を実施するために、この温度サイクリングデバイスに挿入された図３Ｂに示されるキャピラリーカセット及びホルダーを備えている。
【図７Ａ】キャピラリーカセットを封止するメンブレンを備える空気式のサーマルサイクラーの内部断面を示している。このサーマルサイクラーは、本発明の温度捕獲方法で有利に用いることができる。
【図７Ｂ】図７Ａの空気式サーマルサイクラーの斜視詳細図を示しており、これはキャピラリーカセットが挿入されるチャンバを図示するために持ち上げられたリッドを備えている。
【図７Ｃ】カセット区画の断面を示しており、ここには図７Ａのサーマルサイクラーの内部チャンバ中に挿入されたキャピラリーカセットを備える。
【図８Ａ】本発明の高処理能力の方法で有用なキャピラリーカセット洗浄ステーションの前面である。
【図８Ｂ】図８Ａのキャピラリーカセット洗浄ステーションの側面であって、ここには下げられた洗浄マニフォールド及び持ち上げられた洗浄タンクを伴う。
【図８Ｃ】図８Ａ及び８Ｂのキャピラリー洗浄ステーションのさらなる図面であって、ここには持ち上げられた洗浄マニフォールド及び下げられた洗浄タンクを伴う。
【図８Ｄ】洗浄マニフォールドの内部断面である。
【図８Ｅ】洗浄ステーションの概略的な配管図である。
【図８Ｆ】洗浄タンクの上部斜視図である。
【図９】実施例１の配列決定解析のためのウインドウの成功パーセント対読取り長さの棒グラフを示す。
【図１０】実施例２の反応生成物の電気泳動図である。
【図１１】実施例３の配列決定解析のためのウインドウの成功パーセント対読取り長さの棒グラフを示す。
【図１２Ａ】フルボリュームで調製した電気泳動的に分離したＰＣＲ生成物のスキャンしたゲル画像を示す。
【図１２Ｂ】ナノスケール容積（５００ｎＬ）で調製した電気泳動的に分離したＰＣＲ生成物のスキャンしたゲル画像を示す。
【図１３】５００ｎＬの容積でＰＣＲを実施し、フルボリュームで清浄化反応を実施し、続いて５００ｎＬで実施したサイクルシークエンシング反応で調製した配列決定混合物の解析の電気泳動図である。
【図１４】管、キャピラリー及び表面結合を用いるキャピラリー中で調製した生成物のための等温性反応のシグナル強度を比較するグラフである。
【図１５】核酸が可逆的に直接固定されるキャピラリー管を調製するための方法論を説明するフローチャートである。
【図１６】本発明の方法の実施形態を図示する。
【図１７Ａ】配列決定の前に反応混合物と混合されたＰＣＲ生成物の配列決定の結果を示す。
【図１７Ｂ】ＰＣＲ鋳型とチオシアン酸ナトリウムとの最初の混合、キャピラリーの内面へのＤＮＡの結合、８０％エタノールでのＤＮＡの洗浄、引き続く配列決定の結果を示す。
【図１８】鋳型捕獲プロトコールに従いＤＮＡの保持された量を示す。
【図１９】鋳型捕獲によって調製されたサンプル（●）に比べた、ＤＮＡ及び配列決定試薬を事前混合することによって調製されたサンプル（▲）についての、読取り長さ対出発ＤＮＡ量のプロットを示す。
【図２０】示した出発量のＭ１３ｍｐ１８の鋳型結合後のＰＣＲ反応生成物であって、１．５％アガロースゲルを通して電気泳動し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ色素で染色し、Ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ装置で画像化したものを示す。
【図２１】漸増する鋳型濃度で得られた相対シグナル強度を提示する。
【図２２】漸増する鋳型濃度で得られた相対シグナル強度を提示しており、これは鋳型濃度の増大とともに増大するピーク高さを示している。
【図２３Ａ】グリセロールストックからナノスケールの直接サイクルシークエンシングによって得られた５６１塩基のＰｈｒｅｄ２０スコアを有したトレースを示す。
【図２３Ｂ】グリセロールストックからナノスケールの直接サイクルシークエンシングによって得られた５６１塩基のＰｈｒｅｄ２０スコアを有したトレースを示す。
【図２４】鋳型捕獲なしの、４つのナノスケール一塩基伸長反応からのＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）トレースであり、これはトレース２において異型接合性を実証している。
【図２５】フルボリュームＰＣＲ生成物（図２５Ａ）の定量的解析と比較したナノ容積のＰＣＲ生成物（図２５Ｂ）の定量的解析の結果を示す。
【図２６】フルボリュームＳＢＥ反応及び陰性コントロールの結果を示す。
【図２７】フルボリュームＰＣＲ及びＰＣＲ生成物のＥｘｏＩ／ＳＡＰ処理由来の（Ａ）フルボリューム一塩基伸長反応；及び（Ｂ）ナノ容積一塩基伸長反応のＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）トレースを提示する。
【図２８】ナノ容積ＰＣＲ及びＰＣＲ生成物の鋳型捕獲由来の（Ａ）フルボリューム一塩基伸長反応；及び（Ｂ）ナノ容積一塩基伸長反応のＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）トレースを提示する。
【図２９】（Ａ）ナノ容積ＰＣＲ及びＰＣＲ生成物の鋳型捕獲由来であるが、ＳＢＥ生成物の引き続く清浄化なしでのナノ容積一塩基伸長反応；（Ｂ）ナノ容積のＳＢＥ反応物であってＣＩＡＰ清浄化を行い、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）ローディング液をＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）に注射したもの；（Ｃ）ナノ容積のＳＢＥ反応物であってＣＩＡＰ清浄化を行い、脱イオン水をＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）に注射したもの；及び（Ｄ）ナノ容積のＳＢＥ反応物であってＳｅｐｈａｄｅｘ清浄化を行い、脱イオン水をＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）に注射したもの；のＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）トレースを提示する。
【図３０】フルボリューム及びナノ容積のＳＢＥを比較するバリデーション実験の結果を示す。
【図３１】キャピラリーカセット中でのトリプシンによるプロテアーゼ消化後のチトクロムＣの代表的なペプチドプロフィールを図示する。このプロフィールは、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）解析によって生成された。トリプシンは、溶液中（図３１Ａ）であるか、又は磁気ビーズ上に固定される（図３１Ｂ）かのいずれかである。
【図３２】マルチキャピラリーカセット中のキャピラリーの内面に共有結合されるトリプシンによるプロテアーゼ消化後のチトクロムＣの代表的な最初の泳動のペプチドプロフィールを示す。内部キャピラリー表面は、アミノアルカリシラン試薬又はストレプトアビジン修飾のいずれかによって修飾した。このプロフィールは、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）解析によって生成された。
【図３３】表面に共有結合したトリプシンによるプロテアーゼ消化後のチトクロムＣの代表的な第二の泳動のペプチドプロフィールを図示する。キャピラリー表面は、アミノアルカリシラン試薬又はストレプトアビジン修飾のいずれかによって修飾した。このプロフィールは、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）解析によって生成された。
【図３４】表面に共有結合したトリプシンによるプロテアーゼ消化後のチトクロムＣの代表的な第三の泳動のペプチドプロフィールを図示する。キャピラリー表面は、アミノアルカリシラン試薬又はストレプトアビジンのいずれかによって修飾した。このプロフィールは、ＭｅｇａＢＡＣＥ（商標）解析によって生成された。
【図３５】表面に共有結合したトリプシンによるプロテアーゼ消化後のチトクロムＣの代表的なＨＰＬＣプロフィールを示す。キャピラリー表面は、アミノアルカリシラン試薬又はストレプトアビジン修飾のいずれかによって修飾した。
【図３６】Ａｓｐ−Ｎ濃度と消化されたポリペプチドの量との間の関係を示しており、ここでは消化されたペプチド由来のＣｙ３発光のシグナル強度によって提示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図２０】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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