(57)【要約】  本発明は、マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物において、ウイルス抗原を生成する改良方法を提供する。この方法は、培養培地の容積当たりのウイルス抗原収量の増加を提供する。本発明はまた、個々のコンフルエントな細胞培養物と比較して増加した細胞密度およびマイクロキャリア濃度を有する、接着細胞の細胞培養物バイオマスに関する。詳細には、本出願において、ウイルスまたはウイルス抗原の生成のための方法が提供され、この方法は、（ａ）マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物を提供する工程、（ｂ）この細胞培養物をコンフルエンスまで増殖させる工程、（ｃ）この細胞にウイルスを感染させる工程、ならびに（ｄ）このウイルスに感染した細胞培養物をインキュベートして該ウイルスを増殖させる工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスまたはウイルス抗原の生成のための方法であって、
（ａ）マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物を提供する工程、
（ｂ）該細胞培養物をコンフルエンスまで増殖させる工程、
（ｃ）該細胞にウイルスを感染させる工程、ならびに
（ｄ）該ウイルスに感染した該細胞培養物をインキュベートして該ウイルスを増殖させる工程、
を包含し、該コンフルエンスまで増殖した細胞培養物のバイオマスの細胞密度は、（ｉ）工程（ｃ）の前または（ｉｉ）工程（ｃ）の後に増加され、そして工程（ｄ）の間、高い細胞密度にて維持される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記コンフルエンスまで増殖した細胞培養物の密度は、少なくとも約１．３倍濃縮される、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記コンフルエンスまで増殖した細胞培養物の細胞密度が、約０．６×１０６細胞／ｍｌと約７．０×１０６細胞／ｍｌとの間にある、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記マイクロキャリアが、デキストラン製マイクロキャリア、コラーゲン製マイクロキャリア、ポリスチレン製マイクロキャリア、ポリアクリルアミド製マイクロキャリア、ゼラチン製マイクロキャリア、ガラス製マイクロキャリア、セルロース製マイクロキャリア、ポリエチレン製マイクロキャリア、およびプラスチック製マイクロキャリアからなる群より選択される、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記工程（ａ）の細胞培養物中のマイクロキャリア濃度が、約０．５ｇ／ｌと約１４ｇ／ｌとの間にある、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞が、ＶＥＲＯ接着細胞、ＢＨＫ接着細胞、ＣＨＯ接着細胞、ＲＫ接着細胞、ＲＫ４４接着細胞、ＲＫ１３接着細胞、ＭＲＣ−５接着細胞、ＭＤＣＫ接着細胞、ＣＥＦ接着細胞、または二倍体単層細胞接着細胞からなる群より選択される、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記マイクロキャリアに結合された細胞が、無血清培地中で増殖される、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記マイクロキャリアに結合された細胞が、無血清無タンパク質培地中で増殖される、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、ロス川ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルスおよびその組換え誘導体、単純疱疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスおよびそのキメラ、ライノウイルス、ならびにレオウイルスからなる群より選択される、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の方法であって、
工程（ｅ）前記増殖したウイルスを採集する工程
をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
工程（ｆ）前記採集したウイルスを精製して、精製ウイルスまたは精製ウイルス抗原を得る工程
をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の方法であって、前記生成されたウイルスが、前記細胞培養物上清から採集される、方法。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の方法であって、前記生成されたウイルスが、前記細胞バイオマスから採集される、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記生成されたウイルスまたはウイルス抗原が、インフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス抗原である、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記細胞がＶＥＲＯ細胞である、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の方法であって、前記細胞がＭＤＣＫ細胞である、方法。
【請求項１７】
マイクロキャリアに結合された接着細胞の細胞培養物バイオマスであって、該細胞培養物中の細胞のバイオマスは、コンフルエンスまで増殖した細胞培養物と比較して、少なくとも約１．３倍である、細胞培養物バイオマス。
【請求項１８】
請求項１７に記載の培養物であって、前記細胞がＶＥＲＯ細胞である、培養物。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の培養物であって、該培養物は無血清培養物である、培養物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の培養物であって、該培養物は無血清無タンパク質培養物である、培養物。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のうちのいずれか１項に記載の培養物であって、前記細胞がウイルスに感染している、培養物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の培養物であって、該細胞培養物中の感染した細胞のバイオマスは、感染前のコンフルエンスまで増殖した細胞培養物と比較して、少なくとも約１．３倍である、培養物。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の培養物であって、インフルエンザウイルス、ロス川ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルスおよびその組換え誘導体、単純疱疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスおよびそのキメラ、ライノウイルス、ならびにレオウイルスからなる群より選択されるウイルスに感染している、培養物。
【請求項２４】
請求項２１〜２３のうちのいずれか１項に記載の培養物であって、前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、培養物。
【請求項２５】
請求項２１〜２３のうちのいずれか１項に記載の培養物であって、前記ウイルスがロス川ウイルスである、培養物。
【請求項２６】
請求項２１〜２３のうちのいずれか１項に記載の培養物であって、前記ウイルスがワクシニアウイルスである、培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物において、ウイルス抗原を生成する改良方法に関する。この方法は、培養培地の容積当たりのウイルス抗原収量の増加を提供する。本発明はまた、個々のコンフルエントな細胞培養物と比較して増加した細胞密度およびマイクロキャリア濃度を有する、接着細胞の細胞培養物バイオマスに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
効率的なワクチン生成には、宿主系から高収量で生成される大規模量のウイルスの増殖が必要とされる。ウイルス株が増殖される培養条件は、その株の許容できる高収量を達成することに関して、非常に重要である。従って、望ましいウイルスの収量を最大にするために、その系および培養条件の両方が、その望ましいウイルスの生成のために有利である環境を提供するために特に適合されなければならない。従って、種々のウイルス株の許容できる高収量を達成するために、多数の種々のウイルスについて最適の増殖条件を提供する系が、必要とされる。
【０００３】
経済的に価値のある唯一のプロセスは、リアクタープロセスである。なぜなら、スケールアップが、市場サイズおよび必要なワクチン用量にとって適切にされ得るからである。接着細胞について、古典的マイクロキャリアを用いるキャリアプロセスが、ウイルス増殖のために必要とされる細胞の大規模培養のための現在最良の選択肢である（Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌら、１９６７、Ｎａｔｕｒｅ  ２１６：６４〜６５；Ｖａｎ  Ｗｅｚｅｌら、１９７８、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．３：６〜８）。マイクロキャリアにおけるポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＨＳＶ、またはマレック病ウイルスの大規模プロセス生成が、記載されている（米国特許第４，５２５，３４９号；Ｗｉｄｅｌｌら、１９８４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈ．８：６３〜７１；Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｅら、１９８５、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  ６０：４２１〜４３０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９８２、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．５０：１０３〜１１０）。マイクロキャリア培養物に基づく現在のプロセスによって、１２００ｌまでの発酵槽サイズを使用するウイルス生成が可能である。
【０００４】
Ｃａｉｊら（１９８９．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１０５：１１３〜１１８）は、マイクロキャリア培養物および従来の単層培養物におけるブタコレラウイルスのウイルス力価の生成収量を比較した。彼らは、マイクロキャリアシステムを使用して、より高い培地容積当たりのウイルス収量が得られ得ることを見出した。
【０００５】
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９８２．Ｄｅｖｅｏｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．５０：１０３〜１１０）は、細胞増殖およびＨＳＶ生成に対するマイクロキャリア濃度の影響を研究した。最適なマイクロキャリア濃度が、高細胞密度に達するためには必要であり、この最適なマイクロキャリア濃度はまた、得られるウイルス収量にも影響することが、見出された。しかし、還流システムにおけるより高いマイクロキャリア濃度は、ビーズを脱却する細胞層に起因して、細胞の損失をもたらした。
【０００６】
マイクロキャリアシステムにおけるウイルス生成プロセスの生産性は、ウイルス、細胞、マイクロキャリアの型、およびそのシステムにおいて得られる細胞密度に依存する。細胞培養物中のより高いマイクロキャリア濃度は、より高い総細胞数を可能にする。しかし、マイクロキャリアは費用がかかり、これらの条件において、このシステムにおける剪断力によりビーズを脱却する細胞層に起因して、細胞の損失が生じ得る。このことは、より高いウイルス収量のために、大容積のマイクロキャリア細胞培養物が必要とされることを意味するが、これは、そのような大容積の処理および精製のためになされる必要がある努力を増加させる。
【０００７】
ウイルス増殖について、最大ウイルス収量を得るために、最適細胞密度が達成されることが重要である。細胞へのウイルスの効率的吸着を可能にすることもまた、重要である。従って、従来の方法において、増殖培地の容積は、最低限の培養容積において細胞へのウイルスの吸着を可能にするため、およびより良好なウイルス対細胞比のために、感染前に減少される。しかし、最適なウイルス増殖を得るために、培養培地容積は、細胞に生存および／または増殖を維持させるための適切な吸着時間の後に、再び増加される。しかし、このことは、細胞および／またはウイルスを含む培養培地容積を増加させ、このことは、細胞または細胞培養培地からウイルスをさらに精製するために大容積が処理されなければならないという不利点を有する。
【０００８】
ウイルス感染の発生の場合、大量のワクチンを、時宜を得た様式で生成して、非常に短期間のうちに数百万ワクチン用量を提供することが、重要である。従って、ウイルスおよび抗原を生成するための安全かつ有効な方法について、継続している必要性が存在する。さらに、すでに利用可能な材料を使用し、最少数の時間がかかる操作（例えば、減少した細胞培養培地容積の取扱い、ワクチン生成のための精製および下流プロセスの促進）しか必要としない、ウイルス増殖に対するアプローチについての必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な要約）
マイクロキャリアに結合された接着細胞の細胞培養物において、ウイルスまたはウイルス抗原を生成するための方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
小さい細胞培養物容積にてウイルスを生成する方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１１】
コンフルエンスまで増殖させたもとの細胞培養物と比較して高い細胞密度を有する接着細胞の細胞培養物を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１２】
マイクロキャリアに結合された接着細胞の細胞培養物であって、コンフルエンスまで増殖させたもとの細胞培養物と比較して高い細胞密度を有する接着細胞の細胞培養物を提供することが、本発明の目的であり、これらの細胞はウイルスに感染している。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
これらの目的および他の目的に従って、本発明は、ウイルスまたはウイルス抗原の生成のための方法を提供し、この方法は、マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物を提供する工程、その細胞培養物をコンフルエンスまで増殖させる工程、その細胞にウイルスを感染させる工程、ならびにそのウイルスに感染した該細胞培養物をインキュベートしてそのウイルスを増殖させる工程、を包含し、この細胞培養物の細胞密度は、（ｉ）ウイルス感染の前または（ｉｉ）ウイルス感染の後に増加される。この細胞培養物中の細胞密度の増加は、その細胞培養物の濃度によりなされ、この増加は、その細胞培養物中のマイクロキャリア濃度の増加を含む。
【００１４】
一般に、マイクロキャリアに結合された接着細胞は、高細胞密度に達するために最適なマイクロキャリア濃度対細胞比を必要とする。この細胞培養物中のマイクロキャリア濃度の増加は、理論上は、培養培地容積当たりのより高い細胞密度に達するのを可能にする。しかし、マイクロキャリア濃度の増加による剪断効果、その培地における給餌源の減少および細胞の生理的ストレスに起因して、細胞培養システムにおけるキャリア濃度は、特定の濃度に制限される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９８２（上記）をまた参照のこと）。
【００１５】
本発明の方法は、最適増殖条件（マイクロキャリア濃度、供給、および最少の生理的ストレスを含む）下で細胞を増殖させて、使用したシステムについて最大の細胞密度に達することを可能にする。
【００１６】
本発明において、ウイルス感染の前または後の培養培地容積の減少により、細胞培養物バイオマスにおける細胞密度およびマイクロキャリア濃度が増加し、そのことは、細胞の生産性に影響しないことが、見出される。対照的に、１細胞につき得られるウイルス収量が、もとのコンフルエントな細胞培養物と同じ細胞密度で維持される細胞と比較して増加され得ることもまた、驚くべきことに見出される。このことは、非常に予想外であった。なぜなら、細胞培養物中のマイクロキャリア濃度の増加に起因して、細胞生存の減少、マイクロキャリアからの細胞の脱却およびウイルス生成の間のより高い細胞密度に起因する生理的ストレスが、予測されていたからである。
【００１７】
本発明の方法は、さらなるウイルス精製プロセスの間に処理されなければならない培養培地容積を減少することを可能にすると同時に、１細胞当たりのウイルス生産性は元の細胞培養物と比較して同様であるかまたは増加さえされる。このシステムは、６０００ｌ発酵槽容積までスケールアップされ得、これにより、ワクチンのためのウイルス生成プロセスが、より効率的かつ時間を食うものになる。
【００１８】
本方法の一実施形態によると、足場依存性細胞は、Ｒｅｕｖｅｎｙら（１９８５．Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ．６０：２４３〜２５３）により記載されるようなＶＥＲＯ接着細胞、ＢＨＫ接着細胞、ＣＨＯ接着細胞、ＲＫ接着細胞、ＲＫ４４接着細胞、ＲＫ１３接着細胞、ＭＲＣ−５接着細胞、ＭＤＣＫ接着細胞、ＣＥＦ接着細胞、または二倍体単層細胞接着細胞、および当該分野で周知の他の接着細胞からなる群より選択される。
【００１９】
マイクロキャリアに結合された接着細胞が、血清を含む従来の培養培地において増殖され得る。本発明の好ましい実施形態によると、その細胞は、Ｋｉｓｔｎｅｒら（１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：９６０〜９６８）、Ｍｅｒｔｅｎら（１９９４．Ｃｙｔｏｔｅｃｈ．１４：４７〜５９）、Ｃｉｎａｔｌら（１９９３．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔ．１７：８８５〜８９５）、Ｋｅｓｓｌｅｒら（１９９９．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９８：１３〜２１）、ＷＯ  ９６／１５２３１、米国特許第６，１００，０６１号により記載される無血清培地または無血清無タンパク質培地、または当該分野で公知の他の任意の無血清培地または無血清無タンパク質培地において、増殖される。その細胞は、好ましくは、無血清培地または無血清無タンパク質培地においてアンプルから大規模へバイオマスへと増殖される。
【００２０】
本発明の一実施形態によると、マイクロキャリアに結合された接着細胞の培養物が、コンフルエンスまで増殖され、そしてそのコンフルエントな細胞培養物の細胞バイオマスの細胞密度およびマイクロキャリア濃度が増加した後、ウイルス感染される。
【００２１】
本発明の一実施形態によると、マイクロキャリアに結合された接着細胞の培養物が、コンフルエンスまで増殖され、そしてそのコンフルエントなバイオマスの細胞密度およびマイクロキャリア濃度が増加する前に、ウイルス感染される。いずれの場合でも、容積当たりのより高い細胞密度およびマイクロキャリア濃度を有する細胞培養物が、バイオマス中の培養物の濃度、細胞密度、マイクロキャリア濃度がウイルス増殖プロセスおよびウイルス生成プロセスの間に一定に維持される前または後のいずれかにウイルス感染される場合、一方、その培地の容積は再びは増加されない。ウイルスに感染していないかまたはウイルスに感染しているかのいずれかである細胞培養物バイオマス中の細胞密度およびマイクロキャリア濃度を増加させるために使用される方法は、細胞培養物を濃縮するために当該分野で公知の任意の方法であり得る。これは、例えば、沈降、遠心分離、濾過、還流デバイスを用いる濃縮、作業容積の減少を可能にする篩などの方法によってか、または２つ以上のバイオリアクターシステムをプールすることによって、行われ得る。
【００２２】
コンフルエンスまで増殖された細胞培養物の細胞培養物密度およびマイクロキャリア濃度は増加され、その増加は、コンフルエンスまで増殖された元のバイオマスと比較して少なくとも１．３倍であるべきである。コンフルエンスまで増殖した元の出発細胞培養物の細胞密度は、約０．６×１０６細胞／ｍｌと約７．０×１０６細胞／ｍｌとの間にあり得る。この場合、その出発培養物バイオマスと比較して増加した細胞密度を有するバイオマスは、少なくとも０．８×１０６細胞／ｍｌと少なくとも９．０×１０６細胞／ｍｌとの間の細胞密度を有し得る。
【００２３】
その出発細胞培養物中のマイクロキャリア濃度は、好ましくは、約０．５ｇ／ｌ〜約７．０ｇ／ｌの範囲にある。コンフルエントなバイオマスの濃縮後のマイクロキャリア濃度は、好ましくは、約０．６５ｇ／ｌ〜約２１ｇ／ｌの範囲にある。
【００２４】
本発明の方法により使用されるマイクロキャリアは、好ましくは、デキストランに基づくマイクロキャリア、コラーゲンに基づくマイクロキャリア、ポリスチレンに基づくマイクロキャリア、ポリアクリルアミドに基づくマイクロキャリア、ゼラチンに基づくマイクロキャリア、ガラスに基づくマイクロキャリア、セルロースに基づくマイクロキャリア、ポリエチレンに基づくマイクロキャリア、およびプラスチックに基づくマイクロキャリア、ならびにＭｉｌｌｅｒら（１９８９．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ．／Ｂｉｏｔｅｃｈ．３９：７３〜９５）およびＢｕｔｌｅｒ（１９８８．ＳｐｉｅｒおよびＧｒｉｆｆｉｔｈ，Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：２８３〜３０３）により記載されるマイクロキャリアからなる群より選択される。
【００２５】
本発明の方法の一実施形態によると、そのウイルスは、インフルエンザウイルス、ロス川ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルスおよび組換えワクシニアウイルス、単純疱疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスおよびそのキメラ、ならびにライノウイルスおよびレオウイルスからなる群より選択される。接着宿主細胞およびこの宿主に対して感受性であるウイルスを選択すること、ならびに望ましいウイルスのウイルス収量の増加を得るための本発明の方法を使用することは、当業者の知識の範囲内にある。
【００２６】
個々のマイクロキャリアの型、出発培養物中のマイクロキャリア濃度、ウイルスに対して感受性である接着細胞、ならびに培地条件および最適増殖条件（酸素濃度、培地の補充物、温度、ｐＨ、圧力、攪拌速度、および供給制御など）を、この方法により細胞密度およびマイクロキャリア濃度の増加を有する細胞バイオマスを得るために使用され得るコンフルエントな細胞培養物バイオマスを得るために選択することは、当業者の知識の範囲内にある。より高い細胞密度を柚須得る細胞培養物は、その後、有効なウイルス増殖およびウイルス生成のために使用され得る。細胞培養物がコンフルエンシーに達した後、本発明の方法は、少なくとも１．３倍〜１０倍までのマイクロキャリア濃度の細胞密度の増加を有する細胞培養物を得ること、および培養物容積当たりのより高いウイルス収量を得ることを可能にし、このことは、ｉ）減少した培養物容積、およびｉｉ）増加した１細胞当たりの生産性に起因する。
【００２７】
ウイルス生成プロセスおよび生成のためのタイムスパンは、使用されるシステムに依存する。個々の系において到達可能な最大ウイルス収量は、標準的方法により決定され得る。最大ウイルス生成収量に到達した場合、そのウイルスおよび／またはそのウイルスを含む細胞が、採集される。従って、本発明の方法は、増殖されそして生成されたウイルスを採集する工程をさらに包含する。
【００２８】
本発明の別の局面は、精製ウイルスまたは精製ウイルス抗原の生成のための方法を提供し、この方法は、マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物を提供する工程、その細胞培養物をコンフルエンスまで増殖させる工程、その細胞培養物にウイルスを感染させる工程、そのウイルスに感染した該細胞培養物をインキュベートしてそのウイルスを増殖させる工程、（ｆ）生成したウイルスを採集する工程、および（ｇ）この採集したウイルスを精製する工程、を包含し、この細胞培養物中の細胞密度は、（ｉ）ウイルス感染の前または（ｉｉ）ウイルス感染の後に増加される。
【００２９】
感染および増殖のために使用されるウイルスの性質に依存して、生成されるウイルスは、細胞培養物の上清において見出されるか、そして／または細胞バイオマスに付随しているかのいずれかである。溶菌ウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）は、感染後の適切な時間の後、その細胞を溶解し、そしてそのウイルスは、細胞培養培地中に放出される。細胞培養培地において生成され放出されるウイルスは、従来の方法（例えば、遠心分子（超遠心分離、密度勾配遠心分離を含む）、微細濾過、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィーなど）により、細胞バイオマスまたは他の細胞断片から分離され得、そして精製され得る。
【００３０】
非溶菌ウイルスは、細胞中で増殖し、そして依然としてそのバイオマスの細胞に付随する。これらのウイルスは、そのバイオマスを収集し、その細胞を従来の方法により処理すること（例えば、その細胞を、界面活性剤、熱、凍結／融解、超音波処理、フレンチプレス、または他の細胞溶解法で処理すること）によって溶解することによって、採集され得る。この細胞から放出されたウイルスは、採集され、濃縮され、そして精製される。このウイルスの精製は、当該分野で公知の任意の方法（例えば、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、または等密度遠心分離など）により行われ得る。
【００３１】
インフルエンザウイルスは、細胞株（最も効率的なＭＤＣＫ細胞、ならびにヒトワクチンの製造における使用について承認されている細胞株、Ｖｅｒｏ細胞を含む）において増殖され得る。バイオリアクター中のマイクロキャリアビース上の哺乳動物細胞培養物における、無血清培地または無血清無タンパク質培地におけるインフルエンザウイルスの大規模生成、およびインフルエンザウイルスワクチンの開発は、記載されている（Ｍｅｒｔｅｎら、１９９９、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９８：２３〜３７；Ｋｉｓｔｎｅｒら、１９９８．Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：９６０〜９６８；Ｋｉｓｔｎｅｒら、１９９９、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９８：１０１〜１１０およびＷＯ  ９６／１５２３１）。
【００３２】
一局面によると、本発明は、インフルエンザウイルスの生成のための方法を提供し、この方法は、マイクロキャリアに結合された接着細胞培養物を提供する工程、その細胞培養物をコンフルエンスまで増殖させる工程、その細胞にインフルエンザウイルスを感染させる工程、ならびにそのインフルエンザウイルスに感染したその細胞培養物をインキュベートしてそのウイルスを増殖させる工程、を包含し、この細胞培養物中の細胞密度は、（ｉ）このウイルス感染の前または（ｉｉ）ウイルス感染の後に増加される。インフルエンザウイルスに感染される細胞は、ＶＥＲＯ細胞もしくはＭＤＣＫ細胞、またはインフルエンザウイルスに対して感受性である任意の細胞であり得る。本発明の好ましい実施形態によると、ＶＥＲＯ細胞が使用され、そしてインフルエンザウイルスに感染される。好ましい実施形態によると、このＶＥＲＯ細胞は、元のアンプルからバイオマスまで、無血清培地または無血清無タンパク質培地において増殖される。マイクロキャリアに結合されたＶＥＲＯ細胞は、個々の培地においてコンフルエンスまで増殖され、そして細胞密度およびマイクロキャリア濃度は、少なくとも１．３倍増加される。この細胞は、培養物容積の細胞密度増加の前または後のいずれかに、インフルエンザウイルスにより感染され得る。感染した高細胞密度バイオマスのインキュベーションおよびウイルス生成の後に、生成されたインフルエンザウイルスまたはインフルエンザウイルス抗原が、採集される。採集されたウイルスは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｋｉｓｔｎｅｒら、１９９８（上記）または米国特許６，０４８，５３７号に記載される方法）によって、さらに精製される。
【００３３】
本発明の別の局面は、高細胞密度を有するマイクロキャリアに結合された接着細胞の細胞培養物バイオマスを提供し、この細胞培養物中の細胞バイオマスの細胞密度は、コンフルエンスまで増殖された細胞培養物と比較して、少なくとも１．３倍である。マイクロキャリアに結合された接着細胞の培養物は、ＶＥＲＯ足場依存性細胞、ＢＨＫ足場依存性細胞、ＣＨＯ足場依存性細胞、ＲＫ足場依存性細胞、ＲＫ４４足場依存性細胞、ＲＫ１３足場依存性細胞、ＭＲＣ−５足場依存性細胞、ＭＤＣＫ足場依存性細胞、ＣＥＦ足場依存性細胞、または二倍体単層細胞足場依存性細胞からなる群より選択される細胞である。高細胞密度を有する細胞培養物バイオマスは、好ましくは、ＶＥＲＯ細胞培養物である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によると、この細胞培養物バイオマスは、無血清培地において増殖され、血清に由来するいかなる物質も因子も含まない。別の好ましい実施形態によると、このバイオマスは、無血清無タンパク質であり、培地に添加されるいかなる血清由来物質も血清由来タンパク質も含まない。好ましくは、この細胞は、元のアンプルからバイオマスまで、無血清培地または無血清無タンパク質培地において増殖された。高細胞密度を有するバイオマスは、ウイルス増殖プロセスおよびウイルス生成プロセスの間、無血清培地または無血清無タンパク質培地において維持される。
【００３５】
本発明の別の実施形態によると、コンフルエンスまで増殖された細胞培養物と比較して高い細胞密度を有するバイオマスの細胞が、ウイルスに感染される。ウイルスに感染した高細胞密度バイオマスの培養培地の細胞密度および容積は、ウイルス増殖プロセスの間維持される。
【００３６】
本発明の別の局面は、マイクロキャリアに結合されたＶＥＲＯ細胞の細胞培養物バイオマスを提供し、その細胞培養物中のＶＥＲＯ細胞のバイオマスおよび細胞密度は、コンフルエンスまで増殖されたＶＥＲＯ細胞培養物と比較して、少なくとも１．３倍である。この細胞培養物はまた、コンフルエンスまで増殖された細胞と比較して高いマイクロキャリア濃度を有する。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態によると、より高い細胞密度を有する細胞培養物バイオマスは、ＶＥＲＯ細胞のバイオマスである。好ましくは、この細胞は、無血清培地において増殖され、このバイオマスは、無血清である。本発明の別の好ましい実施形態によると、このバイオマス培養物は、無血清無タンパク質である。
【００３８】
本発明の別の局面は、ウイルスに感染したマイクロキャリアに結合された接着細胞の細胞培養物の細胞培養物バイオマスを提供し、この細胞培養物中の感染した細胞のバイオマスは、コンフルエンスまで増殖した感染前の細胞培養物と比較して、少なくとも約１．３倍であり、より高い細胞密度を有する。一実施形態によると、細胞の細胞培養物バイオマスは、無血清である。本発明の別の好ましい実施形態によると、その細胞培養物バイオマスは、無血清無タンパク質である。その細胞は、好ましくはＶＥＲＯ細胞である。ウイルスに感染した高細胞密度バイオマスの細胞密度は、ウイルス増殖プロセスの間に減少されない。
【００３９】
本発明の別の局面は、マイクロキャリアに結合されておりかつマイクロキャリアに結合された高い細胞密度を有する、ＶＥＲＯ細胞の細胞培養物バイオマスを提供し、この細胞培養物中のＶＥＲＯ細胞のバイオマスは、コンフルエンスまで増殖されたＶＥＲＯ細胞培養物と比較して少なくとも１．３倍であり、このＶＥＲＯ細胞は、ウイルスに感染している。このＶＥＲＯ細胞は、インフルエンザウイルス、ロス川ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ワクシニアウイルスおよびその組換え誘導体、単純疱疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルスおよびそのキメラ、ライノウイルス、ならびにレオウイルスからなる群より選択されるウイルスに、感染している。
【００４０】
別の一局面によると、本発明は、マイクロキャリアに結合しておりかつ高細胞密度を有する、ＶＥＲＯ細胞の細胞培養物バイオマスを提供し、この細胞は、インフルエンザウイルスに感染しており、この細胞培養物中のＶＥＲＯ細胞のバイオマスは、コンフルエンスまで増殖されたＶＥＲＯ細胞培養物と比較して、少なくとも１．３倍である。
【００４１】
別の一局面によると、本発明は、マイクロキャリアに結合しておりかつ高細胞密度を有する、ＶＥＲＯ細胞の細胞培養物バイオマスを提供し、この細胞は、ロス川ウイルスに感染しており、この細胞培養物中のＶＥＲＯ細胞のバイオマスは、コンフルエンスまで増殖されたＶＥＲＯ細胞培養物と比較して、少なくとも１．３倍である。
【００４２】
別の一局面によると、本発明は、マイクロキャリアに結合しておりかつ高細胞密度を有する、ＶＥＲＯ細胞の細胞培養物バイオマスを提供し、この細胞は、Ａ型肝炎ウイルスに感染しており、この細胞培養物中のＶＥＲＯ細胞のバイオマスは、コンフルエンスまで増殖されたＶＥＲＯ細胞培養物と比較して、少なくとも１．３倍である。
【００４３】
ここで本発明を一般的に記載してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによって理解される。これらの実施例は、例示のみのために本明細書中に提供され、他のように特定されない限りは、限定するものであることは意図されない。
【実施例】
【００４４】
（実施例１）
（濃縮Ｖｅｒｏ細胞バイオマスにおけるウイルス抗原生成）
（ａ）細胞培養物の増殖）
ＶＥＲＯ細胞（アフリカミドリザル、Ｃｅｒｃｏｐｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ、腎臓）を産生細胞株として使用した。この細胞を、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８１の名称の下、継代数１２４で、Ａｍｅｎｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから得た。この細胞を、Ｋｉｓｔｎｅｒら、１９９８（上記）、ＷＯ９６／１５２３１または米国特許第６，１００，０６１号に記載されるような無血清培地または無血清無タンパク質培地中で増殖するように適合させた。無血清培地中での増殖のために、無機塩、アミノ酸、重炭酸ナトリウム（２ｇ／ｌ）および酵母抽出物または大豆抽出物（０．１〜１０ｇ／ｌ）を補充した、基本ＤＭＥＭ  ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培地を、使用する。作業細胞バンクを、いかなる動物由来の培地成分も使用することなく調製した。
【００４５】
作業細胞バンクの細胞を、分割比１：６または１：８にてＴ型フラスコおよびローラーボトルにおいて増殖させた。その細胞のさらなる増殖を、接着基材としてＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）を使用して、１００ｌ攪拌タンクバイオリアクターにて実施した。この細胞を、３７℃にて６日間〜８日間増殖させた。酸素飽和２０％±１０％およびｐＨ７．２５±０．３５の培養条件を、一定に維持した。バイオマス生成の最後に、細胞がコンフルエンス増殖に達した場合、そのバイオマスリアクター容積の一部を、沈降によって２倍に濃縮し、未濃縮細胞培養物および濃縮細胞培養物の細胞密度を決定した。
【００４６】
（ｂ）バイオマスの細胞密度の決定）
バイオマス生成の終わりの細胞培養物のバイオマスの細胞数を、Ｓｃｈａｒｆｅら（１９８８．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  ｉｎ  ＬａｂｏｒＰｒａｘｉｓ  １０：１０９６〜１１０３）により記載されるように、その細胞をトリプシン処理し、ＣＡＳＹ（登録商標）細胞計数器を用いて計数すること（方法Ａ）、またはＳａｎｆｏｒｄら（１９５１．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．１１：７７３〜７９５）により記載されるように、クエン酸およびクリスタルバイオレット処理した後、血球計を用いて係数すること（方法Ｂ）のいずれかによって、決定した。バイオマス生成の終わりのＶｅｒｏ細胞についての細胞密度およびキャリア濃度、ならびにコンフルエントバイオマスの濃縮後（感染前）のＶｅｒｏ細胞についての細胞密度およびキャリア濃度を、方法Ａおよび方法Ｂによって計算した。データを表１に示す。
【００４７】
（表１）
（バイオマス生成の終わりのコンフルエント細胞培養物中の細胞数、およびコンフルエント細胞培養物の濃縮後の細胞数の決定）
【００４８】
【表１】
2005512564.tif 000002
（実施例２）
（コンフルエントバイオマスと濃縮したコンフルエントバイオマスとの、ウイルス抗原生成の比較）
規定した継代数のＶｅｒｏ細胞を、液体窒素から融解し、そしてルー（ｒｏｕｘ）およびローラーボトルに通して、１．５リットルバイオリアクターに接種するために十分な細胞を生成した。最終細胞密度１．５×１０６細胞／ｍｌのコンフルエンシーに達した後、その細胞をトリプシン処理し、１０リットルバイオリアクターに移した。その後、これを、マイクロキャリア濃度１．５ｇ／ｌを有する１００リットルバイオリアクターへの接種物として使用する。１０７細胞を含む作業細胞バンクアンプルから出発して、約３０世代が、最終コンフルエントＶｅｒｏ細胞バイオマスに達するために必要とされる。この培養物を、最終細胞密度１．９×１０６／ｍｌのコンフルエンシーに達するように増殖させた。ウイルス感染の前に、２つの１０リットルバイオリアクターシステムに、異なる総細胞数を有する細胞培養物バイオマスを充填した。発酵槽Ａに、１．９×１０１０細胞を充填し、発酵槽Ｂに、合計細胞数３．８×１０１０を充填する。発酵槽Ｂに充填するためのより高いバイオマス濃度およびキャリア濃度を達成するために、コンフルエンシーまで増殖させた細胞培養物を、このバイオマスを２倍濃縮に達するように沈降することによって濃縮した。発酵槽Ａは、コンフルエンシーまで増殖させた元の細胞培養物の１００％の細胞バイオマスを含み、発酵槽Ｂは、コンフルエンシーまで増殖させた元の細胞培養物の２００％のバイオマスを含む。
【００４９】
（ａ）インフルエンザウイルスの生成）
発酵槽Ａおよび発酵槽Ｂにおける細胞培養物に、インフルエンザウイルス株Ｈ３Ｎ２Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７を、感染多重度０．０１にて感染させた。同一のプロセスパラメーターである３２℃、ｐＯ２  ２０％およびｐＨ７．１を適用した。ウイルス増殖のためにインフルエンザウイルスを活性化するために、プロテアーゼ（例えば、トリプシン、プロナーゼ、またはそのトリプシン様部分）を添加した。
【００５０】
異なるバイオマス濃度を含む発酵槽Ａおよび発酵槽Ｂの２つの異なる細胞培養物のウイルス抗原生産性を、決定し、そしてインフルエンザウイルス力価（ＨＡＵ／ｍｌ）および抗原含量（密度勾配精製した抗原）に基づいて比較した。そのピーク面積は、感染後３日目の溶菌サイクルの終わりの全抗原濃度に対応する。データを表２に示す。
【００５１】
（表２）
（コンフルエントＶＥＲＯ細胞培養物および濃縮したコンフルエントＶＥＲＯ細胞バイオマスにおける、インフルエンザウイルス力価および抗原の決定）
【００５２】
【表２】
2005512564.tif 000003
（ｂ）ロス川ウイルスの生成）
ＶＥＲＯ細胞を、最終密度１．６×１０６／ｍｌのコンフルエンシーに達するように、上記のように増殖させた。ウイルス感染の前に、２つの５０リットルバイオリアクターシステムに、異なる総細胞数を有する細胞培養物バイオマスを充填した。発酵槽Ａに、１．６×１０６細胞／ｍｌを充填し、発酵槽Ｂに、２．３×１０６細胞／ｍｌ（これは、コンフルエント細胞培養物バイオマスの１．５倍の濃度である）を充填する。発酵槽Ａおよび発酵槽Ｂに、ロス川ウイルスを感染させた。発酵槽Ａおよび発酵槽Ｂのウイルス抗原生産性を、上記のように決定した。表３は、ウイルス増殖のために異なるバイオマス濃度を使用することにより得られたウイルス収率の結果を示す。
【００５３】
（表３）
（ロス川ウイルス力価および抗原生成の決定）
【００５４】
【表３】
2005512564.tif 000004
（実施例３）
（ＲＫ細胞の濃縮バイオマスにおけるウイルス抗原生成）  
（ａ）細胞培養物の増殖）
ウサギ腎細胞ＲＫ−１３またはＨｏｌｚｅｒら（１９９７．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４９９７〜５００２）により記載されるその補完誘導株ＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４を、生成細胞株として使用した。細胞を、２％血清を含む従来の培地において増殖させた。
【００５５】
作業細胞バンクからの細胞を、分割比１：６にてＴ型フラスコおよびローラーボトルにおいて増殖させた。その細胞のさらなる増殖を、接着基材としてＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）マイクロキャリアを使用して、１０ｌ攪拌タンクバイオリアクターにて実施した。
【００５６】
（ｂ．欠損ワクシニアウイルスの生成）
ＲＫ−１３細胞またはＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４細胞が、タンクバイオリアクターにおいてコンフルエンスおよび最終密度に達した後、このバイオマスに、Ｈｏｌｚｅｒら、１９９７（上記）により記載されるように、ワクシニアウイルスＷＲまたは欠損ワクシニアウイルスｖＤ４−ＺＧ＃２を、感染多重度０．０１にて感染させた。感染後、２つの１０リットルバイオリアクターシステムに、異なる総細胞数を有する感染細胞培養物バイオマスを充填した。発酵槽Ａに、１．２×１０１０細胞を充填し、発酵槽Ｂに、２．４×１０１０細胞を充填する。発酵槽Ｂのためにより高いバイオマス濃度およびキャリア濃度を達成するために、コンフルエンシーまで増殖させた感染細胞培養物を、より高濃度に達するようにバイオマスを沈降することによって濃縮した。発酵槽Ａは、コンフルエンシーまで増殖させた元の細胞培養物の１００％の細胞バイオマスを含み、発酵槽Ｂは、コンフルエンシーまで増殖させた元の細胞培養物の２００％の細胞バイオマスを含む。感染細胞の培地容積当たり異なるバイオマス濃度を含む２つの異なる細胞培養物発酵槽Ａおよび発酵槽Ｂのウイルス抗原生産性を、決定した。その結果を、表４にまとめる。
【００５７】
（表４）
（ＲＫ細胞におけるワクシニアウイルス力価の決定）
【００５８】
【表４】
2005512564.tif 000005
上記実施例は、本発明を例示するために提供され、本発明の範囲を限定するためには提供されない。本発明の他の改変形は、当業者にとって容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲によって包含される。本明細書中に引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために参考として本明細書中に援用される。
【国際調査報告】
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