(57)【要約】  本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターを含有する核酸分子、及びＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節する化合物の同定に有用なスクリーニングアッセイ、並びにＥＡＡＴ２プロモーター調節剤を投与することから成る神経疾患を治療する方法を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子がプロモーターレス（promoterless）レポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を促す機能を有する、ＥＡＡＴ２プロモーターの少なくとも一部を含む単離された核酸分子又はその相補鎖。
【請求項２】
ＥＡＡＴ２プロモーターがＰ１領域を含有する、請求項１に記載の核酸分子又はその相補鎖。
【請求項３】
ＥＡＡＴ２プロモーターがＰ２領域を含有する、請求項１に記載の核酸分子又はその相補鎖。
【請求項４】
ＥＡＡＴ２プロモーターがＰ３領域を含有する、請求項１に記載の核酸分子又はその相補鎖。
【請求項５】
ＳＰ１結合部位、Ｅ−ボックスモチーフ、ＧＡＴＡファミリー転写因子結合部位、ＮＦ−κＢ結合部位、ＷＴ１結合部位、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）領域、ｐｏｌｙ（ｄＧ：ｄＴ）領域、及びサイクリックＡＭＰ応答因子からなる群より選択される、少なくとも一つの部位若しくはモチーフを含有する、請求項１に記載の核酸分子又はその相補鎖。
【請求項６】
配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含有する単離された核酸分子。
【請求項７】
配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列に少なくとも約６０％の相同性を示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含有する単離された核酸分子であり、当該核酸分子がプロモーターレスレポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を促す機能を有する単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列の少なくとも３０個のヌクレオチドを含有する単離された核酸分子であり、当該核酸分子がプロモーターレスレポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を促す機能を有するものである単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れかに記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項１０】
ベクターが発現ベクターである請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１乃至８の何れかに記載の核酸分子及びｃＤＮＡ分子を含有してなる単離された核酸分子。
【請求項１３】
ｃＤＮＡ分子がＥＡＡＴ２のｃＤＮＡ配列を含有してなる、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
ｃＤＮＡ分子がレポーター遺伝子を含有してなる、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１５】
レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、及び蛍光タンパク質からなる群より選択されるものである、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
ルシフェラーゼが、ファイヤーフライルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼからなる群より選択されるものである、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及びシアン蛍光タンパク質からなる群より選択されるものである、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１２に記載の核酸分子を含有してなるベクター。
【請求項１９】
ベクターが発現ベクターである請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載のベクターで形質転換される宿主細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の宿主細胞を適当な培地で培養することによって、ｍＲＮＡ分子又はポリペプチドを産生する方法であって、当該ｍＲＮＡ分子又はポリペプチドが前記ｃＤＮＡ分子でコードされているものである、当該ｍＲＮＡ分子又はポリペプチドを産生する方法。
【請求項２２】
ｃＤＮＡ分子が、ＥＡＡＴ２のｃＤＮＡ配列を含有してなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ｃＤＮＡ分子が、レポーター遺伝子を含有してなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
レポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、及び蛍光タンパク質からなる群より選択されるものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ルシフェラーゼが、ファイヤーフライルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼからなる群より選択されるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及びシアン蛍光タンパク質からなる群より選択されるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１乃至８の何れかに記載の核酸分子がサンプル中に存在するのを検出する方法であり、
ａ）サンプルを、核酸分子に選択的にハイブリダイズする核酸プローブ又はプライマーに接触させ、及び
ｂ）核酸プローブ又はプライマーがサンプル中の核酸分子に結合するかどうかを測定し、それによって請求項１乃至８の何れかに記載の核酸分子がサンプル中に存在するのを検出すること、を含有する方法。
【請求項２８】
神経疾患及び精神疾患を治療することができる化合物を同定する方法であって、
ａ）請求項１２に記載の核酸分子、又は請求項１２に記載の核酸分子を含む細胞をテスト化合物と接触させ、及び
ｂ）ｃＤＮＡによってコードされるｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現が調節されているかどうかを測定し、
それによって、神経疾患及び精神疾患を治療することができる化合物として、ｃＤＮＡでコードされるｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現を調節する化合物を同定する方法。
【請求項２９】
ｃＤＮＡ分子が、ＥＡＡＴ２のｃＤＮＡ配列を含有してなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｃＤＮＡ分子がレポーター遺伝子を含有してなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ルシフェラーゼが、ファイヤーフライルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼからなる群より選択されるものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
レポーター遺伝子が、β−ガラクトシダーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
レポーター遺伝子が、蛍光タンパク質である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、強化黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及びシアン蛍光タンパク質からなる群より選択されるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ｍＲＮＡの発現が、ノーザンブロッティング、プライマー伸長法、及びヌクレアーゼプロテクションからなる群より選択される方法で測定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドの発現が、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡからなる群より選択される方法で測定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチドの発現がＥＡＡＴ２の活性を測定することによって検出される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
ＥＡＡＴ２の活性が、標準のグルタミン酸輸送アッセイを用いて測定される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチドの発現が、ルシフェラーゼの活性を測定することによって検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
ルシフェラーゼの活性が、標準のルシフェラーゼアッセイ用いて測定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチドの発現が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの活性を測定することによって検出される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの活性が、標準のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイを用いて測定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ポリペプチドの発現が、蛍光タンパク質の蛍光を測定することによって検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
ｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現を減少させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
ｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現を増加させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
神経疾患が興奮毒性のものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
神経疾患が運動ニューロン疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項５０】
神経疾患又は精神疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィー小体痴呆（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、多発性硬化症、脳腫瘍、緑内障、精神分裂病、梗塞（脳血管性の疾患）、癇癪、及びアルツハイマー病からなる群より選択される疾患である、請求項２８に記載の方法。
【請求項５１】
神経疾患又は精神疾患を患っている患者（subject）を治療する方法であって、当該患者に治療上有効な量のＥＡＡＴ２プロモーター調節剤（modulator）を投与し、それによって神経疾患又は精神疾患を患っている当該患者を治療することを含有する治療方法。
【請求項５２】
神経疾患又は精神疾患が興奮毒性のものである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
神経疾患又は精神疾患が運動ニューロン疾患である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
神経疾患又は精神疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィー小体痴呆（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、多発性硬化症、脳腫瘍、緑内障、精神分裂病、梗塞（脳血管性の疾患）、癇癪、及びアルツハイマー病からなる群より選択される疾患である、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願)
本出願は、米国特許仮出願第６０／３５７，１７９号（２００２年２月１５日出願）の優先権を主張するものであり、その全ての記載内容は、参照として本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーター及びその使用に関する。一態様に於いては、本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターを含有する新規な核酸分子に関する。関連する態様に於いて、本発明はポリヌクレオチドの同定、解析及び使用方法を提供する。更に神経疾患の治療に有用な治療薬を検出するためのスクリーニング法を提供するものである。 
【背景技術】
【０００３】
神経疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）及び運動ニューロンユニットに顕著な影響を及ぼす。例えば、ある種の中枢神経系の疾患は、脳及び関連の構造に悪影響を及ぼすことが知られている。運動ニューロンのユニットを冒す神経疾患は運動ニューロン疾患及び末梢神経障害に分類される。一般的には、Kandel, E.R. ら(1991) ,Principles of Neuroscience, Appleton & lange,  Norwalk, CT、; 及び Rowland, L.P. (ed.) (1982) Human Moor Neuron diseases, New York, Raven Press を参照されたい。
【０００４】
運動ニューロン疾患の具体例として筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）が挙げられる。ＡＬＳは臨床症状が認識されている慢性の神経筋疾患であると報告されている。例えば、皮質及び脊椎／延髄の運動ニューロンの変性が疾患を惹起させる主な要因であると言える。ＡＬＳは殆ど致命的な疾患である。ＡＬＳ全体の約９５％のケースが孤発性であるが、その他、多くのケースは常染色体優性遺伝性である。例えば、Kuncl R.W.ら (1992) Moter Neuron Diseases of the Nervous System, Asburyらeds. (Philadelphia W.B. Saunders) pp.1179-1208; Brown, R.H., (1996) Amer. Neurol. 30:145, Siddique, T. and Deng., H.X. (1996) Hum. Mol. Genetics 5:1465を参照されたい。
【０００５】
特異的なＣＮＳ（中枢神経系）疾患についての記載もある。特に、コリン作動性、ドーパミン作動性、アドレナリン作動性、セロトニン作動性の欠損、又はそれらの相互作用に起因するとされている。重篤なＣＮＳ疾患として、早発性老人性痴呆（アルツハイマー症（ＡＤ）又は早発性アルツハイマー症と称されることもある）、老人性痴呆（アルツハイマー型の痴呆）、パーキンソン病（ＰＤ）及びハンチントン病（ＨＤ、ハンチントン舞踏病と称されることもある）が挙げられる。このようなＣＮＳ疾患はヒト集団に多く見出される。一般的には、Gusella J.F.ら (1983) Nature 306: 234; Borlauer. W. 及びJprmuloewoca. P. (eds.) (1976), Adv. Parkinsonism: Biochemistry, Physiology, Treatment.  Fifth International Symposium on Parkinson's Disease (Vienna) Basel: Roche; 及び引用文献を参照されたい。
【０００６】
運動ニューロン疾患の病因の理解に多大な注目が向けられている。例えば、異常なレベルのある種の興奮毒性神経伝達物質が運動ニューロン疾患を悪化させるとの多くの報告がある。特に、グルタミン酸が介在する興奮毒がＡＬＳに於いて致命的な役割を果たすとされている。例えば、Rothstein J.D.ら、(1990) Ann. Neurol. 28:18., Rothstein J.D.ら(1992) N.Engl. Med. 326:1464, Rothstein J.D. ら(1993) PNAS (USA) 90:6591 及びLacomblez L.ら(1996) Lancet 347:1179を参照されたい。
【０００７】
神経系に於けるグルタミン酸のレベルを低下させるメカニズムの理解に向けて多大な努力がなされてきた。例えば、高親和性で、ナトリウム依存性のグルタミン酸輸送は、グルタミン酸塩を不活性化させる一つの手段であるとの報告がある。特に、アストロサイトに存在する興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）タンパク質は、グルタミン酸塩の不活性化に重要な役割を果たすと考えられている。例えば、Rothstein J.D.ら、(1994) Neuron 28:18; Rothstein J.D.ら(1995)  Ann. Neurol. 38:78 及び引用文献を参照されたい。
【０００８】
研究の結果、特に、ＥＡＡＴ２は優れたグルタミン酸塩トランスポーターであることが判明した。より具体的には、アンチセンスを用いたノックダウンの実験によりＥＡＡＴ２の欠損が興奮性神経の変性及び進行性の運動障害を惹起することが証明された。ＡＬＳ及びその他の神経疾患に関する研究によって、グルタミン酸塩の輸送が障害されることに、ＥＡＡＴ２タンパク質の欠乏が関連していることがわかった。具体的には、診察した６０％〜７０％までの弧発性のＡＬＳ患者に、３０％〜９５％のＥＡＡＴ２タンパク質の欠損がみられた。例えば、Haugetoら、上述のRothstein J.D.ら(1996)  Neuron 16:675; Bristol, L.A.及びRothstein J.D.(1996) Ann. Neurol. 39:676を参照されたい。
【０００９】
これまでにもＣＮＳ及び運動ニューロンユニットの神経疾患の治療及び予防が試みられてきたが、殆どの既存の治療法では、苦しんでいる患者の病気の進行及び重篤度を常に食い止められるというわけにはいかないのが現状である。例えば、Rowell, (1987) Adv. Behav. Biol. 31:191, Rinneら Brain Res. (1991) 54:167, U.S. Pat. No.5,210,076 to Berliner, Yurek, D.M. (1990) Ann. Rev. Neurosci. 13:415及びRowland ら（上述）、を参照されたい。
従って、この分野に於ける、神経疾患を治療する効果的な治療方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、少なくとも部分的には、ＥＡＡＴ２プロモーターの配列を見出したことに基づくものである。従って、本発明はＥＡＡＴ２プロモーターを含有する核酸分子及びＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節する化合物の同定に有用なスクリーニングアッセイ、並びにＥＡＡＴ２プロモーターの調節剤を投与することを含んで成る神経疾患を治療する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一態様に於いて、本発明は、少なくともＥＡＡＴ２プロモーターの一部（例えば、Ｐ１領域、Ｐ２領域及び／又はＰ３領域）、又はその相補鎖からなる単離された核酸分子を提供するもので、当該核酸分子は、プロモーターの無い（promoterless）レポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を促す能力を有する。好ましい態様に於いては、ＥＡＡＴ２プロモーターは、少なくとも一つのＳＰ１結合部位、Ｅ−ボックスモチーフ、ＧＡＴＡファミリー転写因子結合部位、ＮＦ−κＢ結合部位、ＷＴ１結合部位、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）領域、ｐｏｌｙ（ｄＧ：ｄＴ）領域及び／又はサイクリックＡＭＰ応答因子を含む。
【００１２】
好ましい態様に於いて、ＥＡＡＴ２プロモーターを含有する単離された核酸分子は、配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含む。もう一つの態様として、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２５％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％の相同性を示すヌクレオチド配列又はその相補配列を含有し、当該核酸分子はプロモーターの無い（promoterless）レポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を促す能力を有する。更にもう一つの態様に於いては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、２、３若しくは４で示される少なくとも３０のヌクレオチド又はその相補配列を含有し、当該核酸分子はプロモーターの無い（promoterless）レポーターベクターからのｍＲＮＡの発現を制御する能力を有する。
【００１３】
もう一つの態様に於いては、本発明の単離された核酸分子は、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその部分、及び、例えばＥＡＡＴ２、ルシフェラーゼ（例えば、ファイヤーフライルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、又は蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、強化黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質又はシアン蛍光タンパク質）等のようなレポーター遺伝子に機能するように結合したｃＤＮＡ分子を含有する。
他の態様に於いては、本発明は、本発明の核酸分子を含有する発現ベクター及び宿主細胞を含むベクター、及びＥＡＡＴ２プロモーターによって制御されるＤＮＡ分子でコードされるｍＲＮＡ及びポリペプチド（例えば、レポーターｍＲＮＡ及びポリペプチド）を産生及び／又は検出する方法を提供する。本発明は更に、ＥＡＡＴ２プロモーターの存在を検出する方法を提供する。
【００１４】
もう一つの態様に於いて、本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節できる化合物を同定する方法を提供し、当該方法によって神経疾患及び精神疾患を治療できる化合物を同定する方法を提供する。
更に他の態様に於いて、本発明は、患者に治療上有効な量のＥＡＡＴ２プロモーター調節剤（modulator）を投与することによって、神経疾患及び精神疾患に罹患した患者を治療する方法を提供する。
本発明のその他の特性及び有効性は、後述の詳細な説明及び請求の範囲（前述）から明らかである。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも部分的には、ＥＡＡＴ２プロモーターの配列を見出したことに基づくものである。従って、本発明はＥＡＡＴ２プロモーターを含有する核酸分子及びＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節する化合物の同定に有用なスクリーニング法、ＥＡＡＴ２プロモーター調節剤の投与を含んで成る神経疾患及び精神疾患を治療する方法を提供するものである。
アミノ酸の一種であるグルタミン酸塩（Ｇｌｕ）及びアスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸は、哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）に於ける優れた興奮性神経伝達物質である。この様な興奮性アミノ酸（ＥＡＡｓ）は脳内にミリモル単位の濃度で存在するが、迅速なシナプス伝達を促進するため、及びこれらのＥＡＡｓの神経毒の電位を制限するために細胞外での濃度は、低マイクロモルの範囲に維持されている。ナトリウムイオン依存性の高親和性トランスポーターは、細胞外ＥＡＡｓの調節及びクリアランスを担っている。
【００１６】
グルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパレート（ＮＭＤＡ）、ａ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオネート（ＡＭＰＡ）及びカイニン酸塩等の作動薬にちなんで命名されたリガンドによってゲートされるイオンチャネルを活性化する。このようなイオン共役型ＥＡＡ受容体は、迅速なシナプスの脱分極に関与し、シナプスの可塑性及びシナプス形成を含む、その他多くの生理学的過程に於いて重要な役割を果たしている。ＥＡＡｓはまた、Ｇ−タンパク質を介して２次メッセンジャー系又はイオンチャネルに結合する代謝共役型受容体ファミリーをも活性化する。ＥＡＡｓが正常な脳の機能にとって非常に重要であるということは立証されていることであるが、細胞外でのＥＡＡｓの集積及びＥＡＡ受容体の過剰な活性化は、ＣＮＳの急性発作にみられる神経細胞の細胞死を引き起こすということもまた実証されている。所謂「興奮毒性」の過程は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む慢性神経変性疾患にみられる神経喪失をも引き起こす。
【００１７】
グルタミン酸塩（５〜１０ｍＭ）及びアスパラギン酸塩（１〜５ｍＭ）の細胞内濃度は、細胞外濃度（＜１〜１０μＭ）の１０００倍〜１０，０００倍も高い。他の神経伝達物質とは異なって、グルタミン酸塩又はアスパラギン酸塩が細胞外で代謝されるという確証はないが、それらがニューロンやアストロサイトへ輸送されて細胞外液中でクリアにされる。
薬学的戦略及びｃＤＮＡクローニングによって、Ｎａ＋依存性グルタミン酸トランスポーターの幾つかのサブタイプが同定されている。本明細書に記載のＮａ＋依存性高親和性グルタミン酸トランスポーターを発現する、公知の５つの識別可能なｃＤＮＡクローンは、ＧＬＴ−１／ＥＡＡＴ２、ＥＡＡＣ１／ＥＡＡＴ３、ＧＬＡＳＴ／ＥＡＡＴ１、ＥＡＡＴ４、及びＥＡＡＴ５である。異なるスプライシングによるｍＲＮＡからの他の異型のＧＬＴ−１及びＧＬＡＳＴも確認されている。
【００１８】
これら２つのトランスポーター、ＧＬＴ−１及びＧＬＡＳＴは、通常アストログリアにのみ発現する。他の２つのトランスポーター、ＥＡＡＣ１及びＥＡＡＴ４の発現は、ニューロンに限定されており、又ＥＡＡＴ５は網膜に限定されていると考えられている。前脳に見られる３つのトランスポーター（ＧＬＴ−１、ＧＬＡＳＴ及びＥＡＡＣ１）の内ＧＬＴ−１だけが、脳組織特異的なものと見られれており、そのことは、ＧＬＴ−１の発現が脳特異的なメカニズムによって制御されていることを示唆するものである。
【００１９】
従来は、シナプス前トランスポーターが、シナプス伝達の間に興奮性アミノ酸（ＥＡＡｓ）をクリアランスする重要な役割を果たしていると考えられていた。これはシナプトソーム膜調製物では活性が、ミトコンドリア又はミエリン画分に較べて２倍増強されることに基づいた考え方であった。しかし、今や、このような膜調製物は、再閉されたグリア細胞膜や非常に多くのＧＬＴ−１タンパク質を含むということは公知である。更に、例えば、皮質突起から線状体へかけての損傷が線状体シナプトソームに於ける取り込みを結果的に減少させるといった、求心性神経の損傷が、標的部位でのＮａ＋依存性の輸送を減少させることも以前から公知であった。この種の研究は、シナプス前終末への顕著な輸送が行われることを示すものであったが、最近の研究により、このような損傷は、グリア型（グルタミン酸）トランスポーターの発現を減少させるものであることが判明した。
【００２０】
幾つかの補完的な戦略により、ＣＮＳに於いてＧＬＴ−１が、ＥＡＡｓをＮａ＋依存性で輸送することに大いに介在していることが確認された。例えば、ＧＬＴ−１の薬学的な特性は、ラットの脳膜に見られる主要成分の活性と同様のものである。ＧＬＴ−１を濃縮して均質なものに精製するには、ＧＬＴ−１が脳のタンパク質全体の１％を占めている必要があると考えられる。可溶化した前脳組織から抽出したＧＬＴ−１を選択的に免疫沈降し、また、残りのタンパク質をリポソームにて再構成することにより、ＧＬＴ−１が輸送活性に９０％介在していることが判明した。アンチセンスを用いたＧＬＴ−１のノックダウンによって、幾つかの前脳領域に於いてシナプトソームトランスポーターの活性に顕著な減少がみられる。ＧＬＴ−１遺伝子欠損マウスに於けるシナプトソームの取り込みは、通常のマウスの５％である。最終的には、脳調製物に於けるトランスポーターが介在する電流の電気生理学的な記録により、幾つかの前脳領域に於いてＧＬＴ−１が、シナプス伝達中のグルタミン酸塩のクリアランスに主要な役割を果していることがはっきりと示された。
【００２１】
ＧＬＴ−１／ＥＡＡＴ２の発現はインビトロ及びインビボに於いてダイナッミクに制御されている。ＧＬＴ−１は、ラット及びヒトの両方に於いて大人のＣＮＳに於ける優れたトランスポーターではあるが、発達の初期段階では発現がかなり低く、シナプス発生時に増加するものである。上述の通り、標的の神経核へ向かう投射線維の損傷は、結果的にＧＬＴ−１及びＧＬＡＳＴの両グリア型トランスポーターの発現を減少させる。このようなデータは、ニューロンの存在がグリア型トランスポーターの発現を誘発及び／又は維持していることを示している。
【００２２】
幾つかの研究グループによって、脳梗塞及び外傷性脳損傷を含む中枢神経系急性発作のモデル動物に於いてＧＬＴ−１及び／又はＧＬＡＳＴの発現が減少していることが示された。ＧＬＴ−１発現の喪失は、ＡＬＳ患者にみられるものである。アルツハイマー病及びハンチントン病を含む慢性の神経変性疾患に罹患しているヒトに於いて、このようなトランスポーターの発現が減少していることも確認されている。ＧＬＴ−１発現の喪失はまた、致命的な脳腫瘍、多型性膠芽腫の特徴でもある。
【００２３】
ＧＬＴ−１発現はインビボで特に高いが、培養された「正常」なアストロサイトからは、基本的にｍＲＮＡ又はタンパク質は検出されない。アストロサイトをニューロン（神経細胞）と共培養（co-culture）するとＧＬＴ−１のグリア型発現を誘導するので、ニューロンはＧＬＴ−１がインビトロで発現するのを誘導及び／又は維持するといえる。こういったニューロンの作用は、少なくとも部分的には、可溶性の分泌分子により媒介されるものである。ｄｂｃＡＭＰ、上皮成長因子、下垂体アデニル酸シクラーゼ−活性化ペプチド及びイムノフィリン（immunophilin）等の小分子の幾つかは、ニューロンに類似した作用を有する。これら全ての場合、ＧＬＴ−１タンパク質発現の増加は、ＧＬＴ−１ｍＲＮＡの増加及びアストロサイトの形状の変化（分化の前兆と思われる）を伴うものである。
【００２４】
ｄｂｃＡＭＰの作用は、プロテインキナーゼＡの阻害剤よって阻害される。ｄｂｃＡＭＰ、上皮成長因子、又はニューロン（由来）のならし培地で誘発されたＧＬＴ−１の発現の増大は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ阻害剤又は転写因子ＮＦ−Ｂ阻害剤によって完全に阻害される。その他の点では、ＧＬＴ−１発現を事実上制御するメカニズムについては殆ど知られていない。従って、ＥＡＡＴ２プロモーターを同定することは、ＥＡＡＴ２の特性の理解及びその合成をコントロールするアッセイを開発するうえで有益なツールを提供するものである。
【００２５】
本明細書で用いられる、「ＥＡＡＴ２」という用語は、ヒトのアストログリア型グルタミン酸トランスポーターを意味するもので、例えば、ヒトＥＡＡＴ２のｃＤＮＡ配列を開示している米国特許第５，６５８，７８２号を参照されたい。また、その開示は本明細書に参照として取り込まれている。本明細書の「ＧＬＴ−１」という用語は、齧歯類のアストログリア型グルタミン酸トランスポーター２遺伝子を意味する。
本明細書で用いられる、「プロモーター」という用語は、一般には、ゲノムＤＮＡ上の領域のことで、通常ｍＲＮＡ転写開始部位にあたる５’末端に存在する。プロモーターは、ｍＲＮＡ転写のタイミング及びレベルの調節に関与し、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及びその他の転写因子等の細胞タンパク質が結合する結合部位を含んでいる。本明細書で互換的に用いられる、「ＥＡＡＴ２プロモーター」及び「ＥＡＡＴ２プロモーター領域」等の用語は、ＥＡＡＴ２のｍＲＮＡ転写開始部位である５’末端に見いだされるゲノムＤＮＡの領域を含むものである。好ましい態様に於いては、ＥＡＡＴ２プロモーターは配列番号１、２、３若しくは４で示される配列又はその断片を含有する。プロモーターレス（promoterless）レポーターコンストラクトに導入されると、好ましいＥＡＡＴ２プロモーターの断片は、レポーター遺伝子の転写を促すことができる。
【００２６】
ある態様に於いて、ＥＡＡＴ２プロモーターは、配列番号１で示される（即ち、配列番号１の塩基配列の１〜４６９６番目のヌクレオチド）を含んでいる。もう一つの態様に於いて、ＥＡＡＴ２プロモーターは、配列番号１で示される７３３〜３４５０番目のヌクレオチド（また、配列番号２でも示されている）を含有するＰ１領域を含んでいる。もう一つの態様に於いては、ＥＡＡＴ２プロモーターは、配列番号１で示される７３３〜３１８６番目のヌクレオチド（配列番号３でも示されている）を含有するＰ２領域を含んでいる。更にもう一つの態様に於いては、ＥＡＡＴ２プロモーターは、配列番号１で示される２５９０〜３４５０番目のヌクレオチド（配列番号４でも示されている）を含有するＰ３領域を含んでいる。
【００２７】
本発明のＥＡＡＴ２プロモーター分子は神経及び精神疾患の、新規な診断剤及び治療薬を提供する。本明細書で用いられる、「神経疾患」という用語は、神経系、例えば中枢神経系を冒す疾患、疾病若しくは症状を含んでいる。本発明によって治療される神経疾患には、興奮毒性に関連していると報告される特異的な疾患が挙げられる。特には、運動ニューロンの機能を冒す特異な神経疾患である。神経疾患としては、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、トリヌクレオチドリピート病（例えば、ハンチントン病（ＨＤ）、球脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ６及びＳＣＡ７、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、Ｍａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ病）、α−シヌクレイノパチー（例えば、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィー小体痴呆（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ））、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー症、脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）、梗塞／虚血、脳血管性の疾患、癇癪（例えば、側頭葉癇癪）、ＨＩＶ関連性の痴呆、コルサコフ病、疼痛、頭痛（例えば、偏頭痛）、ピック病、進行性核上性麻痺、クロツフェルト・ヤコブ病、ベル麻痺、先天性無水晶体症、睡眠障害、緑内障、及びメニエール病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本明細書に於いて「精神的な疾患」とは、精神の病気及び疾患であり、Amearican Psychiatric Association 発行の Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders 第４版(DSM-IV), Washington D.C.(1994) に挙げられている疾病及び疾患を含むものである。精神疾患としては、不安障害（例えば、急性のストレス性疾患である広場恐怖症、全般性不安障害、強迫性障害、パニック障害、心的障害後ストレス障害、分離不安障害、対人恐怖症、及び特定の恐怖症）、小児期疾患（例えば、注意欠陥多動障害、行為障害、及び反抗性障害）、摂食障害（例えば、拒食症及び多食症）、気分障害（鬱病、双極性障害、気分循環性障害、気分変調性障害、及び大鬱病性障害）、人格障害（例えば、反社会的人格障害、回避的人格障害、境界性人格障害、依存性人格障害、演技性人格障害、自己愛性人格障害、強迫性人格障害、妄想性人格障害、分裂性人格障害、分裂病性人格障害）、精神異常（例えば、短期精神病性障害、妄想性障害、分裂情動性障害、分裂病様障害、統合失調症、及び共有精神病障害）、物質関連障害（例えば、アルコール依存症、覚醒剤依存症、大麻依存症、コカイン依存症、幻覚剤依存症、吸入剤依存症、ニコチン依存症、オピオイド依存症、フェンシクリジン依存症、及び鎮痛剤依存症）、適応障害、自閉症、精神錯乱、痴呆、多発脳梗塞性痴呆、学習及び記憶障害（例えば、記憶喪失及び老人性健忘症）、並びにツレット症候群が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
これまで述べたように、特に興味深い神経疾患及び精神疾患は、グルタミン酸塩等の興奮性アミノ酸の異常な放出又は脱落に関連するものである。ＣＮＳの幾つかの型のニューロンは、興奮毒性のグルタミン酸塩から悪影響を受けている。例えば、Choi, D.W. (1988) Neuron 1:623、及びその引用文献を参照されたい。特に好ましい神経疾患はとしては、主には、ＡＬＳであるがそれと共にＡＤ、ＨＤ及びＰＤも含まれる。
【００３０】
Ｉ．単離された核酸分子 
一態様に於いて本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターを含む単離された核酸分子又はその生物学的に活性な部位に関するものであるが、また、ＥＡＡＴ２プロモーター（ＥＡＡＴ２プロモーター核酸分子の増幅若しくは突然変異のためにＰＣＲプライマーとして用いる核酸分子及び断片を含む）を同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして用いるのに十分な核酸断片にも関する。本明細書で用いられる、「核酸分子」という用語は、通常ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチドを用いて作成したＤＮＡ若しくはＲＮＡの類縁体を含む。核酸分子は、一本鎖若しくは二本鎖のどちらでもよいが、二本鎖のＤＮＡが好ましい。
【００３１】
一般的に、本発明は、公知の方法を用いて最適に実施できる。例えば、この分野に於いて一般的に知られている方法としては、ｍＲＮＡを単離する技術、ｃＤＮＡライブラリーの作成及びスクリーニングする方法、核酸の精製及び解析方法、組換えベクターＤＮＡを作成する方法、ＤＮＡを制限酵素で切断、ＤＮＡのライゲーション、安定な若しくは一過性でＤＮＡを宿主細胞に導入する方法、宿主細胞の培養、ポリペプチドを単離及び精製して抗体を作成する方法等が挙げられる。例えば、Sambrook らの、Molecular Cloning（第２版、1989）、及びAusubelらの、Current Protocols in Molecular Biology,(1989)、John Wiley & Sons, New York を参照されたい。
【００３２】
「単離された核酸分子」という用語は、天然由来の核酸分子から分離された核酸分子を含むものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関しては、「単離された」という用語は、ゲノムＤＮＡが天然由来のクロモソームから分離された核酸分子を含むものである。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸の起源である生命体のゲノムＤＮＡの核酸分子の天然のフランキング配列（即ち、核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を実質的に持たない。例えば、様々な態様に於いて、単離されたＥＡＡＴ２プロモーターの核酸分子は、核酸の源である細胞のゲノムＤＮＡ中に存在する核酸分子の天然のフランキング配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂより短いヌクレオチド配列を含むことができる。更に、「単離された」核酸分子は組換え技術によって作成された場合、他の細胞内物質又は培地とは実質的に無関係であることができ、化学的に合成された場合は、化学前駆物質又は他の化学物質から実質的に無関係であることができる。
【００３３】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列を持つ核酸又はそのタンパク質は、標準の分子生物学の技術及び本明細書で提供される配列情報を用いて単離できる。配列番号１、２、３若しくは４で示されるすべての配列又は部分配列をハイブリダイゼーションのためのプローブとし、標準のハイブリダイゼーション及びクローニング技術（例えば、上述のSambrook, J.らの技術）を用いて、ＥＡＡＴ２プロモーター核酸分子を単離することができる。
【００３４】
更に、配列番号１、２、３若しくは４で示されるすべての配列又は部分配列を含む核酸分子は、配列番号１、２、３若しくは４で示される配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離できる。
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ又はそれらの代わりとしてゲノムＤＮＡをテンプレート及び適当なオリゴヌクレオチドプライマーとして用いて、標準のＰＣＲ増幅技術により増幅できる。このようにして増幅された核酸は、適当なベクターにクローニングされ、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けされる。更に、ＥＡＡＴ２プロモーターのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを用いるといった、標準の合成技術によって調製される。
【００３５】
一態様に於いて、本発明の単離された核酸分子は配列番号１（図１Ａ−１Ｂ）で示されるヌクレオチド配列を含有する。このＤＮＡ分子は、ヒトＥＡＡＴ２プロモーターをコードする配列を含有する。本発明の単離された核酸分子は、配列番号１の７３３〜３４５０番目までのヌクレオチド（配列番号２番でも示される）を含有する。このＤＮＡ配列はＥＡＡＴ２プロモーターのＰ１領域を含有する。もう一つの態様に於いて、本発明の単離された核酸分子は配列番号１の７３３〜３１８６番目までのヌクレオチド（配列番号３でも示される）を含有する。このＤＮＡ配列はＥＡＡＴ２プロモーターのＰ２領域を含有する。更にもう一つの態様に於いて、本発明の単離された核酸分子は配列番号１の２５９０〜３４５０番目までのヌクレオチド（配列番号４番でも示される）を含有する。このＤＮＡ配列はＥＡＡＴ２プロモーターのＰ３領域を含有する。
【００３６】
更にもう一つの態様に於いて、本発明の単離された核酸分子は配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列の相補配列又はそれらの部分配列を含有する。配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列の相補的な核酸分子は、配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズでき安定した二本鎖を形成する配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列に対して十分に相補的なものである。「相補的」又それに類似した用語は、例えば、二本の二本鎖ＤＮＡ分子間、又はオリゴヌクレオチドプライマーとシーケンスに付される若しくは増幅される一本鎖核酸のプライマー結合部位間などといった、ヌクオチド又は核酸間のハイブリダイゼーション又は塩基の対を意味している。相補的ヌクレオチドは、一般的にはＡとＴ（若しくはＡとＵ）、又はＣとＧである。二つの一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、適当なヌクレオチドの挿入又は削除により最適にアライメント及び比較され、もう一方の鎖のヌクレオチドと少なくとも約９５％、通常は少なくとも約９８％、より好ましくは約９９％から約１００％が対になるものが、実質的に相補的であると言える。ポリヌクレオチドの相補配列は、周知のコンピュータアルゴリズム及びソフトウエアーの使用を含む多様なアプローチによって同定することができる。
【００３７】
更に、もう一つの態様に於いて、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、２、３、若しくは４で示されるヌクレオチド配列（例えば、ヌクレオチド配列の全長）と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又はそれ以上の相同性を有するか、又は部分若しくはこの様なヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含有する。一つの態様に於いて、本発明の核酸分子は、配列番号１、２、３、若しくは４で示されるヌクレオチド配列の部分若しくは全配列、又はその相補配列を含有し、その配列は少なくとも（又は、それ以下の）２５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、１９９４、２０００、２０５０、２０７３、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、２９５０、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４４１、３４５０、３５００、３５５０、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８４１、３８５０、３９００、３９５０、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０又はそれ以上の長さのヌクレオチド（例えば、連続したヌクレオチド）を含有する。
【００３８】
二つの核酸又はアミノ酸配列の相同性の割合を測定するために、最適に比較できるように配列をアライメントする（例えば、比較する上で相同でない配列を除去してアライメントを最適なものとするために、一つの、又は一つ目及び二つ目の両方のアミノ酸若しくは核酸配列にギャップを導入してもよい）。好ましい態様に於いて、比較用にアライメントされる参照配列の長さは、参照配列（例えば、１００個のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列に対して二番目の配列をアライメントする際に、少なくとも３０個、好ましくは少なくとも４０個、より好ましくは少なくとも５０個、更により好ましくは少なくとも６０個、そして更に好ましくは少なくとも７０、８０、又は９０個の長さのヌクレオチドがアライメントされる）の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、更により好ましくは、少なくとも６０％、その上更に好ましくは、少なくとも７０％、８０％、又は９０％の長さである。次いで、アミノ酸残基又はヌクレオチドを対応するアミノ酸の位置又はヌクレオチドの位置に於いて比較する。一つ目の配列の位置が、二つ目の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められれば、それらの分子はその位置に於いて相同である（本明細書に於いてアミノ酸又は核酸の「アイデンティティー（相同性）」はアミノ酸又は核酸の「ホモロジー」と同義で用いる）。二つの配列の相同性の割合は、両配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数及び各々のギャップの長さを考慮に入れて、配列中の相同な位置の数の関数で表される。
【００３９】
配列の比較及び両配列の相同性の割合は数学的なアルゴリズムを用いて決定される。好ましい態様に於いては、両配列の相同性の割合は、ＧＣＧソフトウェアーパッケージ（Genetics Computer Group からオンラインで入手可能）のＧＡＰプログラムに取り込まれているニードルマン−ブンシュアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48):444-453(1970)）を用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス若しくはＰＡＭ２５０マトリックス、並びに１６、１４、１２、１０、８、６若しくは４などのギャップのウエイト付け、及び１、２、３、４、５若しくは６の長さのウエイト付けで決定される。もう一つの好ましい態様に於いて、両ヌクレオチド列の相同性の割合は、ＧＣＧソフトウェアーパッケージ（Genetics Computer Group からオンラインで入手可能）のＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、並びに４０、５０、６０、７０若しくは８０のギャップのウエイト付け及び１、２、３、４、５若しくは６の長さのウエイト付けで決定される。ＧＡＰプログラムで使用されるパラメーターの例としては、好ましくは、ギャップペナルティが１２点であり、拡張されたギャップペナルティが４点であり、さらにフレームシフトギャップペナルティが５点であるＢｌｏｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを含むものを例示できるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
もう一つの態様に於いて、アミノ酸又はヌクレオチドの両配列の相同性の割合は、ＡＬＩＧＮプログラム（version 2.0又はversion 2.0U）に取り込まれているマイヤー及びミラー（Comput. Appl. Biosci. 4:11-17(1988))のアルゴリズムを用いて、ギャップの長さのペナルティ１２点及びギャップペナルティ４点でＰＡＭ１２０ウエイトレシジューテーブル（PAM120 weight residue table）を用いて測定する。
本発明の核酸及びタンパク質の配列は更に、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために公共のデータベースで検索する際の「クエリー配列（query sequence)」として用いられる。このような検索は、Altschul ら(1990) J. Mol. Biol.215:403-30 のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（version 2.0）を用いて行われる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、単語長＝１２を用いて、本発明のＥＡＡＴ２核酸分子と相同なヌクレオチド配列を求めるために行われる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴ  プログラム、スコア＝５０、単語長＝３を用いて、本発明のＥＡＡＴ２タンパク質分子に相同なアミノ酸配列を求めるために行われる。比較のために、ギャップが挿入されたアライメントをもとめるには、Altschul ら(1997) Nucleic Acid Res. 25(17):3389-3402 に記載のＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴが用いられる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを使用する際には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが用いられる。National Center for Biotechnology Information のウェブサイトを参照されたい。
【００４１】
本発明の核酸分子は、配列番号１、２、３若しくは４で示される核酸配列の一部分のみ、例えばプローブ若しくはプライマーとして用いられる断片、又はＥＡＡＴ２プロモーターの一部をコードする断片を含有できる。プローブ／プライマー（例えば、オリゴヌクレオチド）は、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含有する。オリゴヌクレオチドは通常、配列番号１、２、３若しくは４で示されるセンス配列又はそれらの相補配列の少なくとも約１２又は１５、好ましくは約２０又は２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７５の連続するヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含有する。
【００４２】
プローブ若しくはプライマーの例としては、少なくとも（又はそれ以下の）１２若しくは１５、２０若しくは２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５又はそれ以上の長さのヌクレオチドであり、及び／又は本明細書に記載の単離された核酸分子の連続するヌクレオチドを含有する。また、本発明の範囲に含まれるのは、本明細書に記載の単離された核酸分子の隣接する若しくは連続するヌクレオチドを含有するプローブ若しくはプライマーであり、当該プローブ若しくはプライマーの配列に於いて相異する塩基数は１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０塩基以内である。ＥＡＡＴ２プロモーターのヌクレオチド配列に基づくプローブはゲノム配列の検出（例えば、特異的検出）に用いられる。好ましい態様に於いては、本発明のプローブは更に、例えば、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素、又は酵素のコファクターといった標識基を有する。もう一つの態様に於いて、一組のプライマー、例えば、ＥＡＡＴ２プロモーター配列の、例えば本明細書に記載されているドメイン、領域、部位又はその他の配列といった選択された領域を増幅するのに用いられる、ＰＣＲでの使用に適したプライマーが提供される。プライマー長は、少なくとも５、１０、若しくは５０塩基対であり、且つ１００、若しくは２００塩基対より短いのが好ましい。プライマーは本明細書で開示されている配列若しくは天然の変異体の配列と同じか又は相異する塩基数が１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０塩基以下であるものが好ましい。本発明のプローブは、ＥＡＡＴ２タンパク質を誤発現する細胞若しくは組織を、例えばゲノムＥＡＡＴ２プロモーターが変異させられたのか又は削除されたのかどうかを測定するために、ＥＡＡＴ２プロモーターの活性レベルを対象動物由来のサンプル細胞に於いて同定する診断テスト・キットの一部として使用できる。
【００４３】
ＥＡＡＴ２プロモーターの一部をコードする核酸の断片は、配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列の一部を単離して調整され、当該ＥＡＡＴ２プロモーターの一部をプロモーターをもたないレポーターベクター（例えば、ｐＧＬ３、Promega、Madison、WI より入手可能な、プロモーターレス・ルシフェラーゼ・レポーターベクター）に挿入し（例えば、標準の組換え法にて）、次いで当該ＥＡＡＴ２プロモーターの一部によるルシフェラーゼの発現を誘発する（即ち、一過性で細胞にトランスフェクトされるときの）活性が評価される。例示的な態様に於いては、核酸分子は、全長が少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、１９９４、２０００、２０５０、２０７３、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、２９５０、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４４１、３４５０、３５００、３５５０、３６００、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８４１、３８５０、３９００、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０又はそれ以上のヌクレオチドである。
【００４４】
もう一つの態様に於いて、本発明の核酸分子は、本明細書に開示された配列の変異体を含有することができる。核酸の変異体は、アレル変異体（同じ遺伝子座）、ホモロガス（異なった遺伝子座）、及びオルソロガス（異なった生物体、例えばマウス）のような天然のもの、又は非天然のものであってもよい。非天然の変異体は、ポリヌクレオチド、細胞又は種に適用される突然変異技術を用いて作成されてもよい。変異体はヌクレオチドの置換、削除、転換（inversions）及び挿入を含んでいてもよい。アレル変異体は、例えば、生物集団（例えば、ヒトの集団）に於けるＤＮＡ配列多型である。この様なＥＡＡＴ２プロモーターの遺伝的多型は天然のアレル変異体集団に個別に存在する。
【００４５】
ＥＡＡＴ２プロモーターのアレル変異体には機能性を有するものと有さないものの両方が含まれる。機能的なアレル変異体とは、例えば、ＥＡＡＴ２のｍＲＮＡの転写を促進するといった能力を保持する、ＥＡＡＴ２プロモーターの天然のヌクレオチド配列を有する変異体のことである。非機能的なアレル変異体とは、例えば、ＥＡＡＴ２のｍＲＮＡ及びＡＴＰの転写を促進又はＥＡＡＴ２の転写を通常より高いレベルで誘導するといった能力を有さない、ＥＡＡＴ２プロモーターの天然のヌクレオチド配列を有する変異体のことである。
【００４６】
本発明のＥＡＡＴ２プロモーターの核酸分子に対応する天然のアレル変異体及び同族体は、本明細書に開示される核酸配列又はその一部をハイブリダイゼーションプローブとして用い、ストリンジェントな条件下で標準のハイブリダイゼーション技術により単離される。本発明のＥＡＡＴ２プロモーターの天然のアレル変異体及び同族体に対応する核酸分子は、更に、ＥＡＡＴ２遺伝子と同一の染色体又は遺伝子座のマッピングを行こなうことによって単離される。
【００４７】
オルソロガス（orthologues)、ホモロガス及びアレル変異体は、当業者に公知の方法によって（即ち、本発明の単離された核酸分子に例えばストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションさせることによって）同定される。一態様に於いては、本発明の単離された核酸分子は少なくとも１５、２０、２５、３０個若しくはそれ以上のヌクレオチド長を有し、ストリンジェントな条件下で配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列を含有する核酸分子にハイブリダイズする。その他の態様に於いては、核酸は少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、１９９４、２０００、２０５０、２０７３、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、２９５０、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４４１、３４５０、３５００、３５５０、３６００、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８４１、３８５０、３９００、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０個又はそれ以上のヌクレオチド長を有する。  
【００４８】
本明細書で用いられる「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、お互いに著しく同一及び相同であるヌクレオチド配列がお互いにハイブリダイズしたままで洗浄されるというハイブリダイゼーションの条件を説明するものである。好ましくは、条件は、互いに同一である配列の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更に好ましくは８５％又は９０％がお互いにハイブリダイズしたままの状態を維持するというものである。このようなストリンジェントな条件は当業者には公知であり、Ausubelらの「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley&Sons, Inc.（1995）編のsections ２、４及び６に記載されている。更に、ストリンジェントな条件とは、Sambrook らの、A Laboratory Manual の「Molecular Cloning」,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)、の第７、９及び１１章に記載されている。好ましい、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約６５〜７０℃（又は、４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド、約４２〜５０℃でハイブリダイゼーションする）、次いで、１×ＳＳＣ、約６５〜７０℃で１回又はそれ以上洗浄するが、これに限定されるものではない。ストリンジェンシーが高い条件下でのハイブリダイゼションは、１×ＳＳＣ、約６５〜７０℃で（又は、１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド、約４２〜５０℃でハイブリダイゼーションする）、次いで、０．３×ＳＳＣ、約６５〜７０℃で１回又はそれ以上洗浄するが、これに限定されるものではない。好ましい、ストリンジェンシーが低下した条件でのハイブリダイゼションは、４×ＳＳＣ、約５０℃〜６０℃（又は、６×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド、約４０〜４５℃でハイブリダイゼーションする）、次いで、２×ＳＳＣ、約５０〜６０℃で１回又はそれ以上洗浄するが、これに限定されるものではない。上に示された範囲内の値、例えば６５〜７０℃又は４２〜５０℃といった値もまた、本発明に包含される。ハイブリダイゼーション及び洗浄バッファーに於いてＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥとは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＨ７．４）を、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウム）に置き換えることができ、ハイブリダイゼーション終了後毎回１５分間洗浄する。５０塩基対未満と推定されるハイブリッドに於けるハイブリダイゼーションの温度は、ハイブリッドが溶解する温度（Ｔｍ）より５〜１０℃より低い温度であるが、当該溶解温度は、下記の等式により求められる。全長が１８塩基対未満のハイブリッドに於いては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基＃）。全長が１８塩基対〜４９塩基対のハイブリッドに於いては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、此処に於いてＮは、ハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼションバッファーに於けるナトリウムイオンの濃度である。（１×ＳＳＣでの［Ｎａ＋］は、０．１６５Ｍである）。当業者に於いては、核酸分子の、例えば、ニトロセルロース又はナイロン膜といった、膜への非特異的なハイブリダイゼーションを減少させるために、追加の試薬として、阻害剤（例えば、ＢＳＡ又は鮭若しくは鰊の精子のキャリアーＤＮＡ）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール及びＰＶＰ等をハイブリダイゼーション及び／又は洗浄バッファーに添加してもよいとされるが、これらに限定はされない。特にナイロン膜を用いる場合は、更に好ましいハイブリダイゼーションに於けるストリンジェントな条件は、０．２５〜０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ、約６５℃、次いで０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳ、６５℃で１回又はそれ以上洗浄する（例えば、Church and Gilbert, (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995を参照されたい）、又は代わりの条件としては、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳであるが、これに限定されるわけではない。
【００４９】
好ましくは、ストリンジェントな条件で、配列番号１、２、３若しくは４で示される配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は天然の核酸分子に対応する。本明細書中に用いられる、「天然の」核酸分子とは、天然のヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ分子を示すものである。
生物集団に存在する天然のＥＡＡＴ２プロモーター配列のアレル変異体に加えて、ＥＡＡＴ２プロモーターの配列の機能を換えることなく、突然変異によって配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列中に変異を導入することができることは当業者には理解されているところである。一態様に於いて、単離された核酸分子は、配列番号１、２、３若しくは４で示されるヌクレオチド配列、即ち配列番号１、２、３若しくは４で示される配列の全長に対して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又はそれ以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含有する。
【００５０】
ＩＩ．組換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明のもう一つの態様は、例えば、ＥＡＡＴ２プロモーターの核酸分子を含む組換え発現ベクターに関する。本明細書で用いられる「ベクター」という用語は、別の核酸をそれを組み込むもう一方の核酸に運ぶための核酸分子のことである。ベクターのタイプの一つとして「プラスミド」が挙げられるが、ＤＮＡの断片を組み込むことができる二重鎖の環状ＤＮＡのことである。もう一つのタイプとしては、ウイルスベクターが挙げられ、ウイルスのゲノムにＤＮＡ断片を組み込むことがでる。ベクターには、宿主細胞に組み込まれて自律的な複製能を有するものがある（バクアテリア由来の複製能を有するバクテリアベクター及び哺乳動物のエピソーム性ベクター）。その他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソーム性ベクター）は、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主ゲノムの感染様式に従って複製される。更に、ベクターには、機能するように結合した、目的の遺伝子を発現させる機能を持つものがある。そのようなベクターを本発明に於いては「発現ベクター」と称する。ＤＮＡ組換え技術に於ける実用的な発現ベクターとしては、プラスミド系統が一般的である。プラスミドは、ベクターの中でもっとも一般的に用いられている形態であることから本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」が互換的な意味で用いられている。しかし、本発明には、同様の役目を果たすウイルスベクター（例えば、複製機能欠損性のレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような、他の形態のベクターも包含される。
【００５１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞に於いて核酸を発現させるのに適した形態で本発明の核酸を含有する。即ち、組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に応じて選択される、一つ又はそれ以上の発現目的の核酸配列に機能するように結合した調節配列を含む。組換え発現ベクターに於いて、「機能するように結合した」という表現は、所定のヌクレオチド配列が調節配列に、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロの転写／翻訳系に於いて、又は、ベクターが宿主細胞に導入された場合には宿主細胞に於いて）を許容するように連結されているという意味である。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現をコントロールする要素（例えば、ポリアデニレーションシグナル）を包含する配列を意味するものである。このような配列は、例えば、Goeddel (1990)Methods Enzymol. 185:3-7 に記載されている。調節配列には、様々なタイプの宿主細胞に於いてヌクレオチド配列の構成性発現を促すもの、及びある種の宿主細胞に於いてのみヌクレオチド配列の発現を促すもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。好ましい態様に於いては、本明細書中に記載されているように、本発明の発現ベクターの調節配列は、本発明のＥＡＡＴ２プロモーター由来のものであり、また、発現される核酸配列はレポーター遺伝子である。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望ましいタンパク質の発現レベル等によって異なる。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、本明細書に記載の核酸によりコードされる融合タンパク質又はペプチドを含む、タンパク質又はペプチドを産生することができる。  
【００５２】
好ましい態様に於いては、本発明の組換えベクターはプロモーターを含んでいない、プロモーターレス（promotorless )レポーターベクターである。本明細書で用いられる「プロモーターレス（promotorless )レポーターベクター」という用語は、レポーター遺伝子を含んでいるが、レポーター遺伝子のｍＲＮＡの発現を促進する機能を有するプロモーター領域を含んでいないベクター、好ましくはプラスミドを意味するものである。プロモーターレス（promotorless )レポーターベクターは、プロモーターに代えて、制限酵素によって切断され、（標準のＤＮＡ組換え方法を用いて）所定のＤＮＡ断片を挿入することができる、少なくとも一つの部位を有する。次いでベクターは、挿入されたＤＮＡ断片がレポーター遺伝子の発現を促すプロモーターとして機能する能力を有するかどうかについて試験される。プロモーターレス（promotorless )レポーターベクターの例として、ｐＧＬ３（Promega, Madison, WI）、ｐＢＢＲ  ＲＥＳＯ（MiBiTec, Gottingen, Germany)、ｐＡＭ９９０、ｐＡＭ１４１４、ｐＲＬ−ｎｕｌｌ  Ｖｅｃｔｏｒ（Promega）、ｐｈＲＧ−Ｂ、ｐＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ−１（BD Biosciences/Clontech, Palo Alto, CA)、ｐＤｓＲｅｄ２−１（BD Biosciences/Clontech）、ｐＥＣＦＰ−１（BD Biosciences/Clontech）、ｐＥＧＦＰ−１（BD Biosciences/Clontech）、ｐＥＹＦＰ−１（BD Biosciences/Clontech）、ｐＳＶＯＡＴＣＡＴ（Lok.S. ら(1989) Nucleic Acids Res. 17:3563-82 を参照されたい)、ｐＢＬＣＡＴ５、ｐＸＰ２、及びｐＰＤ９６．０４が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。このようなベクターの多くは、市販されており、購入可能である。
【００５３】
本明細書で用いられる「レポーター」又は「レポーター遺伝子」という用語は、検出可能なマーカーをコードする核酸分子を意味するものである。好ましいレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ（例えば、ファイヤーフライルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、及び蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質又はそれらの機能が強化されたものを含む、又はそれらの異形）が含まれる。もう一つの好ましい態様に於いては、好ましいレポーター遺伝子はＥＡＡＴ２遺伝子である。レポーター遺伝子とは、レポーターアッセイによって検出可能なものでなければならない。レポーターアッセイは、レポーター遺伝子の発現又は活性をレポーターｍＲＮＡのレベル、レポータータンパク質のレベル又はレポータータンパク質の活性量を測定するといった、種々の方法で測定することができる。
【００５４】
ｍＲＮＡのレベルを測定する方法は、当業者には周知のものであり、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、プライマー伸長法、及びヌクレアーゼプロテクションアッセイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。レポータータンパク質のレベルを測定する方法も、当業者には周知のものであり、ウエスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法及びＲＩＡアッセイが挙げられるが、これらに限定されるものではない。レポーター活性アッセイは、更に当業者には周知のものであり、ルシフェラーゼアッセイ、β−ガラクトシダーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッセイが含まれる。蛍光タンパク質活性は、蛍光を検出することによって測定される。ＥＡＡＴ２（即ち、ＧＬＴ−１）の活性は、標準のグルタミン酸輸送アッセイ（本明細書に記載の）を用いて測定することができる。
【００５５】
従って、ある態様に於いては、本発明は、適当な培地でＥＡＡＴ２プロモーター若しくはその断片を含有する組換え発現ベクターを含む、本発明の宿主細胞（例えば、ヒト以外の哺乳動物の宿主細胞）を培養することによって、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の分子（例えば、レポーター遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の分子）を産生する方法を提供する。
本発明の組換え発現ベクターは、好ましくは、真核細胞（例えば、哺乳動物の細胞）で発現するように設計されているものである。一方で、組換え発現ベクターは、インビトロで転写及び翻訳される。
【００５６】
本発明のもう一つの態様は、本発明のＥＡＡＴ２プロモーターの核酸分子が導入される宿主細胞、例えば、ベクター（例えば、組換え発現ベクター）中のＥＡＡＴ２プロモーターの核酸分子、若しくは、ＥＡＡＴ２プロモーター核酸分子に関するものであるが、当該ＥＡＡＴ２プロモーター核酸分子は、宿主細胞のゲノムの特異的な部位に相同組換えによってＥＡＡＴ２プロモーターの核酸分子を組み込むことができる配列を含むものである。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書中で互換的に用いられる。このような用語は、特定の対象動物の細胞のみではなくそれらの子孫又は子孫となるであろう細胞を意味するということは理解されている。なぜなら、突然変異又は環境の影響によって、次の世代にある種の修飾が起こり得るもので、このような子孫は、事実、親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で用いられる用語の範囲に含まれるものである。
【００５７】
宿主細胞は、いかなる原核細胞若しくは真核細胞であってもよい。例えば、大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞、酵母若しくは動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO; Chinese hamster ovary cells ）、COS細胞（例えばCOS7細胞）、C6グリオーム細胞、HEK 293T細胞若しくはニューロン）で、ＥＡＡＴ２プロモーターを有するベクターを増殖させ、かつ／又は、発現させることができる。その他の適した宿主細胞は、当業者に知られたものである。
通常の形質転換法若しくはトランスフェクション法により、ベクターＤＮＡを原核細胞若しくは真核細胞に導入することができる。ここで、「形質転換」及び「トランスフェクション」とは、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション等の、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための手法であって、本発明の属する技術分野で知られたさまざまな手法を意味するものである。宿主細胞を形質転換若しくはトランスフェクションするのに適した方法は、Sambrookその他著の「Molecular Cloning; A Laboratory Manucal. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989」及びその他の実験書に見出すことができる。
【００５８】
発現ベクター及び使用するトランスフェクションの手法によって異なるが、動物細胞の安定したトランスフェクションであっても、細胞のうちの少数だけが外来遺伝子をゲノムに組み込んでいることが知られている。これらの組み込み体を同定及び選別するために、通常は、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子を目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択マーカーとしては、G418、ハイグロマイシン、メトトレキサート等の薬剤に耐性を与えるものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、ＥＡＡＴ２プロモーターをコードするベクター上で宿主細胞へ導入しても、それとは異なるベクターで導入してもよい。安定にトランスフェクションされ導入核酸を有する細胞は、薬剤選抜（例えば、選択マーカー遺伝子が組み込まれた細胞は生存し、それ以外の細胞は死滅すること）により同定することができる。
【００５９】
培養した原核宿主細胞若しくは真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、機能するようにＥＡＡＴ２プロモーターと結合している核酸分子がコードするｍＲＮＡ又はタンパク質（例えば、ＥＡＡＴ２ ｍＲＮＡ若しくはタンパク質、又は、リポーターｍＲＮＡ若しくはタンパク質）を製造（例えば、発現）するために使用できる。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してｍＲＮＡ又はタンパク質を製造する方法を提供する。一つの実施態様として、この方法は、本発明の宿主細胞（ＥＡＡＴ２プロモーター及びそれと機能するように結合している核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）を含む発現ベクターが導入されている宿主細胞）を、当該機能するように結合している核酸分子によりコードされるｍＲＮＡ及び／又はタンパク質が製造されるのに適した培地中で、培養することからなる。もう一つの実施態様として、この方法は、さらに培地及び宿主細胞からｍＲＮＡ及び／又はタンパク質を単離することからなる。
【００６０】
本発明の宿主細胞は、ヒト以外のトランスジェニック動物を製造するために使用することもできる。例えば、一つの実施態様では、本発明の宿主細胞は、ＥＡＡＴ２プロモーター配列を導入した受精卵母細胞若しくは胚性幹細胞である。従ってこのような宿主細胞は、外来性のＥＡＡＴ２プロモーター配列をゲノムに導入したヒト以外のトランスジェニック動物を生み出すために使用することができ、また、内在するＥＡＡＴ２プロモーター配列を改変した相同組み換え動物を生み出すために使用することができる。このような動物はＥＡＡＴ２プロモーターの機能及び／又は活性を研究するために有用であり、そして、ＥＡＡＴ２プロモーター活性の調節因子を同定及び／又は評価するために有用である。ここで「トランスジェニック動物」とは、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットやマウスのような齧歯動物であり、その動物の一つ若しくはそれ以上の動物細胞がトランスジーンを有するものをいう。トランスジェニック動物の他の例としては、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、トリ、両生類等が挙げられる。トランスジーンとは、成長しているトランスジェニック動物からの細胞のゲノムに組み込まれた外来のＤＮＡであって、成熟した動物のゲノムに残っているものであり、それゆえ、トランスジェニック動物の一つ又はそれ以上の細胞種や組織において、コードする遺伝子産物を発現させるものである。ここで、「相同組み換え動物」とは、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであって、その動物が成長する前に、その動物の細胞、例えば、その動物の胚細胞に、外来のＤＮＡ分子を導入し、これと内在する遺伝子の間の相同組み換えを引き起こすことによって、内在するＥＡＡＴ２プロモーターを改変した動物をいう。
【００６１】
本発明のトランスジェニック動物は、ＥＡＡＴ２プロモーターをコードする核酸を、例えばマイクロインジェクション又はレトロウイルス感染によって受精卵の雄性前核に導入し、その卵を偽妊娠のメスの里親動物の中で成長させることによりつくることができる。配列番号１、２、３若しくは４で示されるＥＡＡＴ２プロモーターのｃＤＮＡ配列は、ヒト以外の動物のゲノムの中にトランスジーンとして導入することができる。或いは、ヒトＥＡＡＴ２プロモーターのヒト以外の生物由来のホモログ、例えば、ラット又はマウスのＥＡＡＴ２プロモーターをトランスジーンとして使用することができる。胚操作及びマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物を生み出す方法は、特にマウスのような動物において、通常の手段となっており、例えば次の文献に記載されている；  Lederらによる米国特許第4,736,866号及び4,870,009号、Wagnerらによる米国特許第4,873,191号、および、Hogan B.による「マウスの胚操作（Manipulating the Mouse Embryo）」（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sping Horbor, N.Y., 1986）。他のトランスジェニック動物の製造には同様の方法を使用する。初代のトランスジェニック動物は、そのゲノム中のＥＡＡＴ２プロモータートランスジーンの存在により、及び／又は、ＥＡＡＴ２プロモータートランスジーンに機能するように連結しているレポーター遺伝子の発現によって同定することが出来る。そして、初代のトランスジェニック動物はそのトランスジーンを有する動物を繁殖させるために使用することができる。そして、ＥＡＡＴ２プロモーターを含むトランスジーンを持ったトランスジェニック動物を、さらに他のトランスジーンを有するトランスジェニック動物へ育種することもできる。
【００６２】
相同組み換え動物を作成するために、欠失、付加又は置換を導入して改変（例えば機能の破壊）を行ったＥＡＡＴ２プロモーターの少なくとも一部を含むベクターを調製する。このＥＡＡＴ２プロモーターはヒトの遺伝子であってもよいが（例えば、配列番号１、２，３若しくは４で示されるｃＤＮＡ）、より好ましくは、ヒトＥＡＡＴ２プロモーターのヒト以外の生物由来のホモログである。例えば、マウスのＥＡＡＴ２プロモーター遺伝子を、相同組み換え核酸分子、例えばマウスゲノムの内在ＥＡＡＴ２プロモーター遺伝子を改変するのに適したベクター、を構築するために使用することができる。好ましい実施態様の一つは、相同組み換えによって内在するＥＡＡＴ２プロモーターの機能が破壊されるように、相同組み換え核酸分子を設計することである（例えば、機能するタンパク質をコードしないようにする；これは「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。或いは、相同組み換えによって内在するＥＡＡＴ２プロモーターが変異若しくは改変されるように、相同組み換え核酸分子を設計することもできる。相同組み換え核酸分子は、ＥＡＡＴ２プロモーターの改変部分の５’末端及び３’末端の両側にＥＡＡＴ２プロモーターの相当する領域の核酸配列を加えて配置し、相同組み換え核酸分子が持つ外来のＥＡＡＴ２プロモーターと細胞（例えば胚性幹細胞）にある内在のＥＡＡＴ２プロモーターの間で相同組み換えが生じるようにする。両側に加えて配置するＥＡＡＴ２プロモーター核酸配列は、内在遺伝子との相同組み換えが成功するのに十分な長さのものとする。一般に、数キロベースの（５’末端及び３’末端双方の）両側に配置するＤＮＡを、相同組み換え核酸分子に持たせる（例えば、相同組み換えベクターによる破壊についてのThomas K. R.及びCapecchi M.R.著, 1987, Cell, 51:503を参照）。相同組み換え核酸分子は、細胞、例えば胚性幹細胞株に（例えば、エレクトロポレーション法によって）導入し、導入されたＥＡＡＴ２プロモーターが内在するＥＡＡＴ２プロモーターと相同組み換えした細胞を選択する（Li E. et al., (1992), Cell, 69, 915を参照）。そして、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入し、集合キメラ（aggregation chimera）を形成させることができる（Bradley, A.著作、「奇形癌と胚性幹細胞：実践手法（Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach）」、Robertson E.J.編集、IRL、Oxford、1987、p.113-152を参照）。次に、キメラ胚を、適切な偽妊娠のメスの里親動物に移植し、出産まで育てる。生殖細胞に相同組み換え遺伝子を持つその子孫は、トランスジーンの生殖系列への移行（germline transmission）により全ての細胞が相同組み換えＤＮＡを有する動物を産むために使用することができる。ベクター等の相同組み換え核酸分子、又は、相同組み換え動物を作成する方法は、Bradley, A.著, 1991, Curr. Opin. Biotechnol. 2: p.823-829、Le MouellecらによるＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３５４号公報、SmithiesらによるＷＯ９１／０１１４０号公報、ZijlstraらによるＷＯ９２／０９６８号公報、および、BernsらによるＷＯ９３／０４１６９号公報にさらに記載されている。
【００６３】
ここで記載するヒト以外のトランスジェニック動物のクローンは、Wilmut I. et al., (1997), Nature, 385: p.810-813、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９７／０７６６８号公報、および、ＷＯ９７／０７６６９号公報に記載された方法によって作成することもできる。簡潔に述べると、トランスジェニック動物の細胞、例えば体細胞を単離し、それが成長周期を脱してＧ０期に入るのを誘発することができる。そして、休止状態の細胞を、例えば電気パルスを使用することによって、その休止細胞が単離されたのと同一種の動物から得られた除核卵母細胞と融合させることができる。そして、この再生された卵母細胞が桑実胚若しくは胚盤胞に成長するように培養し、次に、偽妊娠のメスの里親動物へ移植する。このメスの里親動物から生まれた子供は、細胞（例えば桑実胚）を単離した動物のクローンとなる。
【００６４】
本発明のトランスジェニック動物及び相同組み換え動物は、ＥＡＡＴ２プロモーターを有する定常発現株を作成するために使用することもできる。このような細胞株は、トランスジーンが（一過性（transient）のトランスフェクションで起こり得るような）過剰発現をしないように作成することができるので有用であり、トランスジーンの本来の細胞環境により近いものを呈するものである。このような細胞株は、トランスジェニック動物若しくは相同組み換え動物（例えば、マウス）から細胞（例えば、線維芽細胞若しくは大グリア細胞）を単離し、それを通常の方法で培養することによって作成することができる。ある実施態様では、一次細胞（不死化されていない細胞）が好ましく、また、細胞を培養により無限に繁殖させるために（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原のような遺伝子を付加することにより）不死化させることもできる。
【００６５】
ここで互換性のある用語して使用される「標準グルタミン酸アッセイ」又は「標準グルタミン酸輸送アッセイ」とは、次の一つ又はそれ以上の工程を含むものを意味する。
ａ）ＥＡＡＴ２ ｃＤＮＡを含有する組み換え発現ベクターを、COS-7細胞のような適した宿主細胞に導入する。
ｂ）検出できるように標識されたグルタミン酸を添加する。
ｃ）細胞でのグルタミン酸の輸送を検出する。
一般に、標準グルタミン酸アッセイは、ナトリウム依存のグルタミン酸輸送アッセイである。この標準グルタミン酸アッセイに適合する組み換えベクター導入は、許容し得るいかなる方法よっても実施することができ、例えば、レトロウイルスによる導入、ウイルス若しくはバクテリオファージ感染、カルシウム、リポソーム、ＤＥＡＥ若しくはポリブレンを介するトランスフェクション、遺伝子銃による導入、又は本発明の属する技術分野で知られた他の手法で実施できる。上記のSambrookらの文献、および、上記のAusubelらの文献を参照されたい。
【００６６】
標準グルタミン酸アッセイの一つの実施態様では、組み換えベクターを導入した後に試験細胞および対照細胞を洗浄し、その後、検出できるように標識された適量のグルタミン酸（例えば、３Ｈ標識のグルタミン酸（DuPont-NEN））及び適量の非標識のグルタミン酸でインキュベートする。適当なインキュベーションの間隔の後に、試験細胞および対照細胞を氷冷ＰＢＳのような適した洗浄バッファーで数回洗浄し、約０．１％のＳＤＳを含む溶液に可溶化し、その細胞の放射活性を通常のシンチレーション計数法によって決定する。
特に好ましいグルタミン酸輸送アッセイは、Rothstein et al.、(1995)、Ann.Neurol. 38: 78に記載されている。Rothstein et al.、(1992)、N.Engl.J.Med. 326: 1464も参照のこと。これらの開示は、参照して本明細書に取り入れられる。
【００６７】
III．  スクリーニングアッセイ
本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターに結合、及び／又は、例えばＥＡＡＴ２プロモーター活性に対して促進又は阻害効果を有する候補化合物、試験化合物又は薬剤（例えば、核酸、ペプチド、疑似ペプチド（peptidomimetics）、小分子又はその他の薬剤）等の調節因子を同定する方法（ここでは「スクリーニングアッセイ」とも呼ぶ）を提供するものである。
一つの実施態様として、本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節する候補化合物若しくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。もう一つの実施態様として、本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節、又はそれと結合する候補化合物又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、本発明の属する技術分野で知られたコンビナトリアルライブラリー法の数多くの手法、例えば、生物ライブラリー、位置決定可能に平行に配置された固相又は液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）、デコンボリューション（deconvolution）を要する合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物（one-bead one compound）」ライブラリー法、アフィニティークロマトグラフィーによる選択を使用した合成ライブラリー法などにより得ることができる。生物ライブラリーの手法は、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つの手法はペプチド、非ペプチドオリゴマー、若しくは小分子の化合物ライブラリーに応用できる（Lam, K.S., 1997, Anticancer Drug Des. 12:45）。
【００６８】
分子ライブラリーを合成する方法の例を、本発明の属する技術分野に見出すことができ、例えば、DeWitt et al., (1993), Proc.Natl.Acad.USA, 90, 6909; Erb et al., (1994), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 91, 11422; Zuckermann et al., (1994), J.Med.Chem., 37, 2678; Cho et al., (1993), Science, 261, 1303; Carrell et al., (1994), Angew.Chem.Int.Ed.Engl., 33,2059; Carell et al., (1994), Angew.Chem.Int.Ed.Engl., 33, 2061; 及び、Gallop et al., (1994), J.Med.Chem., 37, 1233;に見出すことができる。
化合物のライブラリーは溶液中に存在させることができ（例えば、Houghten, (1992), Biotechniques, 13, 412-421）、ビーズ（Lam, (1991), Nature, 354, 82-84）、チップ（Fodor, (1993), Nature, 364, 555-556）、バクテリア（Ladner, 米国特許第5,223,409号明細書）、胞子（Ladner, 米国特許第409号明細書）、プラスミド（Cull et al., (1992), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89, 1865-1869）、又はファージ（Scott及びSmith, (1990), Science, 249, 386-390）（Devlin, (1990), Science, 249, 404-406）（Cwirla et al., (1990), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87, 6378-6382）（Felici, (1991), J.Mol.Biol., 222, 301-310）（上記のLadnerの特許文献）上に存在させることができる。
【００６９】
一つの好ましい実施態様では、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその一部に機能するように連結しているレポーター遺伝子を発現する（例えば、その発現はＥＡＡＴ２プロモーター又はその一部に制御される）細胞に試験化合物を接触させ、その試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節する能力を測定することにより行う。ＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節する試験化合物の能力の測定は、例えば、レポーター遺伝子の発現（例えば、レポーターｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現レベル）又は活性をモニターすることにより遂行することができる。本明細書の他の箇所で記載したように、レポーターとは如何なる検出可能なマーカーであってもよい。例えば、レポーターは核酸配列であってもよく、その発現を、例えば、ノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、プライマー伸長法若しくはヌクレアーゼプロテクションアッセイにより計測することができる。レポーターは、ポリペプチドをコードする核酸配列であってもよく、その発現を、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ若しくはＲＩＡアッセイより計測することができる。レポーターの発現は、レポーターによってコードされるポリペプチドの活性を計測することによりモニターすることもでき、例えば、標準グルタミン酸輸送アッセイ、ルシフェラーゼアッセイ、β−ガラクトシダーゼアッセイ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT; Chloramphenicol Acetyl Transferase）アッセイ、又は蛍光タンパク質アッセイを使用してモニターすることができる。
【００７０】
候補化合物の存在下におけるＥＡＡＴ２プロモーター制御下のレポーターの発現若しくは活性のレベルを、候補化合物の存在しない時のレポーターの発現若しくは活性のレベルと比較する。そして、この比較により、候補化合物をＥＡＡＴ２プロモーター活性の調節因子として同定することができる。例えば、レポーターｍＲＮＡの発現又はタンパク質の発現若しくは活性が、候補化合物が存在しないときよりも存在するときの方が大きい（統計的に有意に大きい）場合には、その候補化合物はＥＡＡＴ２プロモーターの刺激因子として同定される。逆に、レポーターｍＲＮＡ又はタンパク質の発現若しくは活性が、候補化合物が存在しないときよりも存在するときの方が小さい（統計的に有意に小さい）場合には、候補化合物はＥＡＡＴ２プロモーター活性の阻害因子として同定される。
【００７１】
試験化合物がＥＡＡＴ２プロモーターに結合する能力、及び／又は、ＥＡＡＴ２プロモーターにタンパク質（例えば、転写因子）が結合するのを候補化合物が調節する能力を測定することが可能である。試験化合物がＥＡＡＴ２プロモーターに結合する能力、及び／又は、ＥＡＡＴ２プロモーターと結合タンパク質との結合を候補化合物が調節する能力についての測定は、例えば、試験化合物、ＥＡＡＴ２プロモーター、又は結合タンパク質を放射性同位体又は酵素的手法で標識化し、試験化合物又は結合タンパク質とＥＡＡＴ２プロモーターとが結合した複合体の標識部分を検出することにより測定することができる。例えば、化合物（例えば、試験化合物、ＥＡＡＴ２プロモーター、又は結合タンパク質）を３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓ，１４Ｃ、又は３Ｈで、直接的又は非直接的な方法のいずれかで標識することができ、シンチレーション計数により放射を直接計数することによって放射性同位体を検出することができる。或いは、化合物を酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼで標識し、適切な基質が生成物に変換されるのを測定することにより酵素的標識を検出することができる。
【００７２】
反応物を標識することなしに、化合物（例えば、試験化合物又はＥＡＡＴ２プロモーター結合タンパク質）がＥＡＡＴ２プロモーターと相互作用する能力を測定することも、本発明の範囲内のものである。例えば、化合物及びＥＡＡＴ２プロモーターのどちらも標識することなく化合物とＥＡＡＴ２プロモーターの相互作用を検出するために、マイクロフィジオメーターを使用することができる（McConnell H.M. et al., (1992), Science, 257, 1906-1912）。ここで使用する、「マイクロフィジオメーター」（例えば、サイトセンサー;Cytosensor）とは光アドレス可能電位差計（LAPS; Light-Addressable Potentiometric Sensor）を使用して細胞がその周囲を酸性化する速度を測定する分析機器である。酸性化する速度の変化が、化合物とＥＡＡＴ２プロモーターとの相互作用のインディケーター（指標）として使用できる。
【００７３】
もう一つの実施態様では、アッセイは細胞を使用しないアッセイであり、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその一部を試験化合物と接触させ、試験化合物のＥＡＡＴ２プロモーター又はその一部の活性を調節（例えば、刺激若しくは阻害）する能力を測定することにより行う。ＥＡＡＴ２プロモーターの活性を調節する試験化合物の能力を測定する方法は、例えば、前記の直接結合を測定する方法の一つを使用して、ＥＡＡＴ２プロモーターがＥＡＡＴ２標的分子と結合する能力を測定することにより遂行することができる。ＥＡＡＴ２プロモーターがＥＡＡＴ２プロモーター標的分子に結合する能力を測定するには、リアルタイム生体分子相互作用分析（BIA; realtime Biomolecular Interaction Analysis）のような技術を使用して遂行することもできる。Sjolander S.及びUrbaniczky C., (1991), Anal.Chem., 63, 2338-2345、及び、Szabo et al., (1995), Curr.Opin.Struc.Biol., 5, 699-705を参照されたい。ここで使用する、「BIA」とは、反応物（例えば、BIAcore）のいずれも標識することなく、リアルタイムで生体細部の相互作用を研究する技術である。表面プラズモン共鳴（SPR; Surface Plasmon Resonance）の光学的現象の変化が、生体分子間のリアルタイム反応のインディケーター（指標）として使用できる。
【００７４】
さらなるもう一つの実施態様では、細胞を使用しないアッセイは、ＥＡＡＴ２プロモーターと結合することが既知の化合物とＥＡＡＴ２プロモーター又はその一部とを接触させて（例えば、基本転写装置の構成要素）アッセイ混合物を形成し、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させ、ＥＡＡＴ２プロモーターに優先的に結合する能力又はＥＡＡＴ２プロモーター標的分子の活性を調節する能力を測定することにより、ＥＡＡＴ２プロモーターと試験化合物が相互作用する能力を測定することを含むものである。
【００７５】
上記の本発明のアッセイ法の少なくとも１つの実施態様では、アッセイの自動化に適合させるためだけではなく、一つ又は両方の分子が複合体を形成していないものから、複合体を形成したものの分離を促進するために、ＥＡＡＴ２プロモーター又はその標的分子のどちらかを固定化することが好ましいことがある。試験化合物とＥＡＡＴ２プロモーターの結合、又は、候補化合物の存在下又は非存在下におけるＥＡＡＴ２プロモーターとその基質又は標的分子との相互作用は、反応物を保持するのに適したものであれば如何なる容器中でも遂行することができる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、テストチューブ、マイクロ遠心チューブが挙げられる。一つの実施態様として、自ら又はそれが付加されたタンパク質が基板に結合できるようにするドメインを付加して融合タンパク質とすることもできる。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／標的タンパク質の融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, Mo.）又はグルタチオンを被覆したマイクロメータープレート上に吸着させ、その後それを、試験化合物、又は、試験化合物及び吸着されない標的化合物若しくはＥＡＡＴ２プロモーターと結合させ、複合体を形成するような条件（例えば、塩又はｐＨの生理的条件）で混合物をインキュベートすることができる。インキュベーションの後、結合しない構成要素を取り除くために、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、ビーズのケースに複合体を固定し、例えば上記のように、直接的又は間接的に複合体を測定する。或いは、複合体を基板から分離し、ＥＡＡＴ２プロモーターの結合又は活性のレベルを通常の手法により測定することができる。
【００７６】
タンパク質又は核酸を基板上に固定するための他の手法を、本発明のスクリーニングアッセイで使用することもできる。例えば、ＥＡＡＴ２プロモーター、又は、ＥＡＡＴ２プロモーターの基質又は標的分子を、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。ビオチン化されたＥＡＡＴ２プロモーター、基質又は標的分子は、本発明の属する技術分野で知られた技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（N-hydroxy succinimide）から調製することができ、ストレプトアビジンを塗布した９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定することができる。或いは、ＥＡＡＴ２プロモーター又は標的分子と反応するが、ＥＡＡＴ２プロモーターがその標的分子と結合するのを阻害しない抗体を、プレートのウェルに被覆し、抗体との結合により、結合しない標的又はＥＡＡＴ２プロモーターをウェルに捕捉することもできる。このような複合体を検出する方法としては、上記に記載したＧＳＴで固定した複合体でのものに加えて、ＥＡＡＴ２プロモーター又は標的分子に係る酵素活性を検出することによる酵素結合アッセイや、ＥＡＡＴ２プロモーター又は標的分子と反応する抗体を使用した複合体の免疫検出が挙げられる。
【００７７】
本発明のさらなるもう一つの側面は、ＥＡＡＴ２プロモーターと結合又は相互作用し、ＥＡＡＴ２プロモーターの活性に関わるタンパク質（「ＥＡＡＴ２プロモーター結合タンパク質」又は「ＥＡＡＴ２プロモーター−ｂｐ」）を同定するために、ＥＡＡＴ２プロモーターをワンハイブリッドアッセイの「餌（bait）」として使用できることである（例えば、BD Matchmaker One-Hybrid System, (1995), Clontechniques X(3), 2-4; BD Matchmaker Library Construction & Screening Kit (2000) Clontechniques XV(4):5-7; BD SMART technology overview, (2002), Clontechniques XVII(1):22-28; Ausubel, F.M., et al. (1998 et seq.) Current Protocols in Molecular Biology Eds. Ausubel, F.M., et al., pp.13.4.1-13.4.10）。このようなＥＡＡＴ２プロモーター結合タンパク質は、ＥＡＡＴ２プロモーターから開始する転写の制御に関わっていることも考えられる。
本発明の他の側面としては、上記に記載したアッセイの２つ以上を組み合わせることもできる。例えば、細胞ベースのアッセイ又は無細胞のアッセイを使用して調節剤を同定することができ、その薬剤のＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節する能力をイン・ビボで、例えば、神経疾患のモデル動物のような動物において確かめることができる。
【００７８】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な薬剤に関するものである。すなわち、本明細書に記載した方法で同定した薬剤を、さらに適切なモデル動物（例えば、神経疾患のモデル動物）に使用することは、本発明の範囲内のものである。例えば、本明細書に記載した方法で同定した薬剤（例えば、ＥＡＡＴ２プロモーター調節剤又はＥＡＡＴ２プロモーター結合タンパク質）をモデル動物に使用して、その薬剤による治療の効果、毒性又は副作用を測定することができる。或いは、本明細書に記載した方法で同定された薬剤をモデル動物に使用して、その薬剤の作用メカニズムを決定することもできる。さらに、本発明は、上記のスクリーニングアッセイにより同定された薬剤を、本明細書に記載する治療法のために使用することに関するものである。
【００７９】
ＩＶ．治療方法
一つの実施態様として、本発明は、ＥＡＡＴ２プロモーターの調節剤からなる医薬組成物の治療学的に有効な量を患者（例えば、ヒトのような哺乳類）に投与することからなる、神経学的及び精神医学的疾患の治療方法を提供する。
ＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節し、それによって、ＥＡＡＴ２遺伝子の発現を調節するために、例えば、本明細書に記載された化合物又は本発明のスクリーニングアッセイによって同定された化合物を細胞又は患者に投与することができる。ＥＡＡＴ２プロモーターの調節剤を哺乳動物細胞（ヒトの細胞を含む）に投与することにより、ＥＡＡＴ２ ｍＲＮＡ及び／又はポリペプチドの発現を上流側方又は下流側で制御（up- or down-regurate）し、それにより細胞へのグルタミン酸輸送を上流側又は下流側で制御することができる。このような方法では、ＥＡＡＴ２プロモーター調節剤を既知の手法によって哺乳動物（ヒトを含む）に投与することができる。
【００８０】
本発明の好ましい治療（予防的治療を含む）方法は、一般に、治療学的に有効な量のＥＡＡＴ２プロモーター調節剤を、それを必要とする（哺乳動物、特にヒトを含む）動物に投与することからなるものである。このような治療法は、神経又は精神疾患に罹っている、罹りやすい、又はそのおそれがある患者、特にヒト、に対して好適に施されるものである。本発明のＥＡＡＴ２プロモーター調節剤は、ＥＡＡＴ２プロモーターが関与する可能性のある他のいかなる疾患の治療にも使用することができるであろう。
治療上の適用には、本発明のＥＡＡＴ２プロモーター調節剤は、哺乳動物、特にヒトのような患者に対して、それ単独で投与するか、又は、ＥＡＡＴ２プロモーターとともに、その一つ以上の許容されうる担体及び任意の他の有効成分が配合された医薬組成物の一部として、好適に投与することができるであろう。この担体は、製剤の他の成分と共用でき、かつ、その投与を受ける者に有害でないという意味で「許容されうる」ものであるべきである。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、経口的に、直腸に、鼻腔に、（口内及び舌下を含む）局所に、膣に、又は（皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む）非経口的に投与するのに適した医薬組成物を含むものである。剤型は、例えば、錠剤及び持続的に放出するカプセルのような単位投与形態及びリポソームとして簡便に提供でき、また、製薬学の分野で周知の他の如何なる方法によっても調製できる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA(17th ed. 1985)を参照。
このような調製方法としては、一つ又はそれ以上の副成分となる担体のような投与成分となる分子と会合させる工程を含むものである。一般に、組成物は、活性成分を、液状の担体、リポソーム、細かく砕いた固体の担体又はこれら二つと均一にかつ密接に会合させることにより調製され、その後、もし必要であれば製品を成形する。
【００８２】
経口投与に適した本発明の組成物は、それぞれ前もって定めた量の活性成分を、粉体又は粒体として、水溶液又は非水性の溶液に溶解又は懸濁させたものとして、水中油型の液体乳剤又は油中水型の液体乳剤として、リポソームに充填したものとして、或いは丸薬等として含む、カプセル、小袋又は錠剤のような独立した単位として提供することができる。
錠剤は、任意の一つ以上の添加成分と一緒に、圧縮又は成形することによって製造することができる。圧縮錠剤は、任意に結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤又は崩壊剤を混合し、適切な機械により活性成分を粉体又は粒体のような流動しない形態に圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性の希釈液剤で湿らせた粉状化合物の混合物を、適切な機械により成形することによって製造することができる。錠剤は、被覆又は刻印を任意に行うことができ、そこに含まれる活性成分の放出を遅くし、又は制御するように製剤することができる。
【００８３】
局所投与に適した組成物としては、通常はショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴムである風味のあるものを主成分とする成分を含んでいる口内剤（lozenge）、及び、ゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアラビアゴムのような不活性成分を主成分として、活性成分を含んでいる口内剤（pastilles）が挙げられる。
非経口投与に適した組成物としては、抗酸化剤、バッファー、抗菌剤、及び、投与を受けようとする者の血液と製剤の浸透圧を等しくする溶質、これらを含み得る水性及び非水性の滅菌注射溶液が挙げられ、また懸濁した薬剤及び混濁した薬剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、例えば、密封したアンプル及びバイアルのような１単位投与量又は複数単位投与量の容器で提供することができ、例えば、注射に使用する直前に水を加えるように、滅菌した液体の担体を添加するだけでよい凍結乾燥した状態で保管することができる。滅菌パウダー、粒体、錠剤から、用時使用の注射溶液及び懸濁液を調製することができる。
【００８４】
目的の部位に投与するために、主題の治療法の適用は、時には局所的なものになるであろう。主題の組成物を目的の部位に供給するために、注射、又は、カテーテル、トロカール（套管針）、プロジェクタイル（projectiles）、プルロニック（pluronic）ゲル、ステント、持続して薬物を放出するポリマー、又は、内部へ到達するためのその他のデバイスの使用のような、さまざまな手法を使用できる。患者から分離することにより器官又は組織が利用可能である場合には、このような器官又は組織を主題の組成物を含む培地に浸すことができ、主題の化合物をその器官に塗布することができ、又は、あらゆる簡便な方法により適用することができる。
ある治療に使用する本発明のあるＥＡＡＴ２プロモーターの好ましい実際の量は、利用する特定の活性化合物、製剤化した特定の組成物、適用方法、投与する特定の箇所、患者の体重、健康状態、性別など、治療する特定の症状など、及びその他、担当の医師又は獣医を含む当業者に認識される要因により変わり得ることは当然に理解されるであろう。あるプロトコルで投与するときの最適投与量は、通常の投与量決定試験を使用することにより当業者であれば容易に定めることができる。
【００８５】
Ｖ．予防医薬
本発明はまた、予後的（予測的）な目的で、診断検定、予後検定及び臨床試験のモニタリングを行い、それにより予防的に個体の手当てをする、予防医学の分野に関するものである。すなわち、本発明の一つの態様は、ＥＡＡＴ２プロモーター活性を測定する診断検定に関連するものであり、それにより、ＥＡＡＴ２プロモーターの異常な又は好ましくない発現又は活性に伴って、個体が病気又は疾患に苦しんでいるかどうか、又は、疾患に進行するおそれがあるかどうかを、生物サンプル（例えば、アストログリア細胞のサンプル）で測定するものである。本発明はまた、ＥＡＡＴ２のタンパク質、核酸の発現又は活性と関係する疾患に個体が進行するおそれがあるかどうかを測定する予後的（予測的）な検定を提供するものである。例えば、ＥＡＡＴ２プロモーター中の変異を生物サンプルで検定することができる。このような検定は、予後的又は予測的な目的で使用することができ、それにより、ＥＡＡＴ２のタンパク質、核酸発現又は活性に特徴づけられる又は関連している疾患が発生する前に個体を予防的に治療することができる。
【００８６】
本発明のもう一つの態様は、ＥＡＡＴ２の発現又は活性に対する薬剤（例えば、薬、化合物）の影響を臨床試験においてモニタリングすることに関する。
これらの及び他の薬剤については、次の節でさらに詳しく記載する。
１．診断検定
生物サンプル中にＥＡＡＴ２プロモーター核酸が存在するか否かを検出する典型的な方法は、試験対象から生物サンプルを得て、その生物サンプル中でＥＡＡＴ２プロモーター核酸の存在が検出されるように、ＥＡＡＴ２プロモーター核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物又は薬剤と生物サンプルを接触させることからなるものである。ＥＡＡＴ２プロモーターのゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい薬剤は、ＥＡＡＴ２ゲノムＤＮＡとハイブリダイズし得る標識核酸プローブである。核酸プローブは、例えば、配列番号１、２，３又は４に示されるＥＡＡＴ２プロモーター核酸、又は、ストリンジェントな条件下でＥＡＡＴ２プロモーターのゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのある、少なくとも15,30,50,100,250又は500ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのような、当該核酸の一部を使用することができる。本発明の診断検定に使用するのに適した他のプローブは、ここに記載されている。
【００８７】
本発明はまた、ＥＡＡＴ２プロモーターの異常な修飾又は変異に特徴づけられる遺伝学的変化が存在するか否を同定する診断検定を提供する。
もう一つの実施態様として、この方法はさらに、コントロール検体からコントロール生物サンプルを得て、生物サンプル中にＥＡＡＴ２プロモーターのゲノムＤＮＡの存在を検出できるように、ＥＡＡＴ２プロモーターゲノムＤＮＡを検出できる化合物又は薬剤とコントロール生物サンプルを接触させ、試験サンプルのＥＡＡＴ２プロモーターゲノムＤＮＡの存在とコントロールサンプルのＥＡＡＴ２プロモーターゲノムＤＮＡの存在を比較することからなるものである。
本発明はまた、生物サンプル中のＥＡＡＴ２プロモーターの存在を検出するキットも包含するものである。例えば、このキットは、生物サンプル中のＥＡＡＴ２プロモーターＤＮＡを検出できる化合物又は薬剤、サンプル中のＥＡＡＴ２プロモーターの量及び／又は配列を測定するための手段、及び、ＥＡＡＴ２プロモーターの量及び／又は配列をサンプルと標準とで比較する手段を含むことができる。化合物又は薬剤は、適当な容器に包装することができる。このキットは、さらに、ＥＡＡＴ２プロモーター核酸を検出するキットの使用説明書をつけることができる。
【００８８】
２．予後検定
ここに記載した診断方法はさらに、異常又は好ましくないＥＡＡＴ２プロモーター活性と関係する病気若しくは疾患を有している、又は、そのおそれがある対象を同定するために利用することができる。ここで使用する「異常」という語は、野生型のＥＡＡＴ２プロモーター活性とは逸脱したＥＡＡＴ２の発現又は活性を含むものである。異常な活性とは、野生型での発生における発現パターン又は細胞内の発現パターンには従わない活性だけでなく、増加又は減少した活性をも含むものである。例えば、異常なＥＡＡＴ２プロモーター活性とは、ＥＡＡＴ２プロモーターに生じた変異がＥＡＡＴ２遺伝子の発現の低下又は向上を引き起こすような場合や、そのような変異によって、機能しないＥＡＡＴ２タンパク質又は野生型のようには機能しないタンパク質（例えば、ＥＡＡＴ２の基質（例えば、グルタミン酸）と反応せず又はこれを輸送しないタンパク質、又は、ＥＡＡＴ２の基質ではないものと反応又はこれを輸送するタンパク質）が生じる状態を含むことを意味するものである。ここで使用する「好ましくない」という語は、制御されないグルタミン酸輸送のような生物反応に含まれる好ましくない現象を含むものである。例えば、好ましくないという語は、対象にとって望ましくないＥＡＡＴ２の発現又は活性を含むものである。
【００８９】
事前の診断検定又は次の検定のように、ここに記載する検定は、神経又は精神疾患のようなＥＡＡＴ２プロモーターの活性の誤制御と関係する疾患を持っているか、又は、それに進行するおそれがある対象を同定するために利用することができる。或いは、予後検定は、神経又は精神疾患のようなＥＡＡＴ２プロモーター活性の誤制御と関係する疾患を持っているか、又は、それに進行するおそれがある患者を同定するために利用することができる。従って、本発明は、異常又は好ましくないＥＡＡＴ２プロモーター活性と関係する病気又は疾患を同定する方法を提供する。この方法では、対象から試験サンプルを得て、ＥＡＡＴ２プロモーター核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を検出（及び／又は配列解読）し、ＥＡＡＴ２プロモーターの修飾又は変異の存在が、異常又は好ましくないＥＡＡＴ２プロモーター活性と関係する病気又は疾患を持っているか、又は、それに進行するおそれのある対象の病気の徴候となる。ここで使用する「試験サンプル」とは、目的の対象から得た生物サンプルを意味する。例えば、試験サンプルは、生物の体液、細胞サンプル又は組織であってよく、好ましくはアストログリア細胞である。
【００９０】
さらには、ここに記載した予後検定は、異常又は好ましくないＥＡＡＴ２プロモーター活性と関係する病気又は疾患を治療するための薬剤（例えば、アゴニスト（作用薬）、アンタゴニスト（拮抗薬）、疑似ペプチド（peptidomimetics）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子又は他の候補薬）を対象に投与することができるかどうかを決定するために使用することもできる。例えば、神経又は精神疾患用の薬剤で対象を効果的に治療できるかどうかを決定するために、このような方法を使用することができる。従って、本発明は、試験サンプルを得てＥＡＡＴ２プロモーター活性を検出し、異常又は好ましくないＥＡＡＴ２プロモーター活性と関係する疾患の治療剤で対象を効果的に治療できるかどうかを決定する方法を提供する。
【００９１】
本発明の方法はまた、ＥＡＡＴ２プロモーターの遺伝学的変化を検出し、それにより、変化した遺伝子を持つ対象が、神経又は精神疾患のような、ＥＡＡＴ２のタンパク質活性又は核酸発現の誤制御に特徴づけられる疾患のおそれがあるかどうかを決定するために使用することもできる。好ましい実施態様では、この方法は、対象由来の細胞のサンプル中に、ＥＡＡＴ２プロモーターの完全性に影響するような変化が少なくとも一つあることによって特徴づけられる遺伝学的変化が存在するか否かを検出することからなるものである。例えば、このような遺伝学的変化は、１）ＥＡＡＴ２プロモーターから１つ以上のヌクレオチドが欠失してる、２）ＥＡＡＴ２プロモーターに１つ以上のヌクレオチドが付加している、３）ＥＡＡＴ２プロモーターの一つ以上のヌクレオチドが置換している、４）ＥＡＡＴ２プロモーターが染色体上で転移している、５）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンのように、ＥＡＡＴ２プロモーターが異常に修飾されている、６）ＥＡＡＴ２プロモーターの対立遺伝子が欠失している、これらのうち１つ以上の存在を確認することにより検出することができる。ここで記載するように、本発明の属する分野で知られ、ＥＡＡＴ２プロモーターの変化を検出するために使用することができるアッセイが数多く存在する。好ましい生物サンプルは、通常の方法で対象から単離した組織サンプル又は血清サンプルである。
【００９２】
ある実施態様では、変化の検出は、プローブ又はプライマーを、アンカーPCR又はRACE PCRのようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（例えば、米国特許明細書第4,683,195号及び4,683,202号を参照）、或いは、ライゲース連鎖反応（LCR）（例えば、Landegran et al., (1998), Science, 241, p.1077-1080、及び、Nakazawa et al., (1994), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 91, p.360-364を参照）において使用することからなるものである。後者の方法は、ＥＡＡＴ２プロモーターのポイントミューテーションを検出するのに特に有用である（Abravaya et al., (1995), Nucleic Acids Res., 23, p.675-682参照）。この方法は、対象から細胞のサンプルを採集し、そのサンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）を単離し、（もし存在すれば）ＥＡＡＴ２プロモーターのハイブリダイズ及び増幅が生じるような条件下で、ＥＡＡＴ２プロモーターと特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと核酸サンプルを接触させ、次に、増幅産物が存在するか否かを検出し、又は、増幅産物のサイズを検出してコントロールのサンプルと長さを比較するという工程からなる。PCR及び／又はLCRは、ここに記載する変異検出のための手法のいずれかと組み合わせて、予備的に増幅するために使用するのが好ましいと考えられる。
【００９３】
他の増幅方法としては、自立的な配列複製（Guatelli J.C. et al., (1990), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87, p.1874-1878）、転写増幅システム（Kwoh D.Y. et al., (1989), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86, p.1173-1177）、Q-βレプリカーゼ（Lizardi P.M. et al., (1988), Bio-Technology, 6, 1197）、その他のあらゆる核酸増幅法を含むものであり、それに続いて、当業者に周知の手法によって増幅分子を検出する。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合に、そのような分子を検出するのに特に有用である。
制限酵素の切断パターンの変化により、遺伝学的変化を同定することもできる。例えば、サンプルＤＮＡ及びコントロールＤＮＡを単離し、（任意で）増幅し、１つ以上の制限酵素で切断し、ゲル電気泳動により断片長のサイズを測定し、それを比較する。サンプルＤＮＡ及びコントロールＤＮＡ間の断片長のサイズの違いが、サンプルＤＮＡの変異の存在を示す。さらに、配列特異的なリボザイム（例えば、米国特許明細書第5,498,531号を参照）を使用して、リボザイム切断サイトが増えること又は無くなることにより、特定の変異の存在を評価することもできる。
【００９４】
他の実施態様として、何百又は何千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度のアレイ（Cronin M.T. et al, (1996), Hum.Mutat., 7, 244-255; Kozal M.J. et al., (1996), Nat.Med., 2, p.753-759）に、サンプル及びコントロールの核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡをハイブリダイズさせることにより、ＥＡＡＴ２プロモーターの遺伝学的変異を同定することができる。例えば、ＥＡＡＴ２プロモーターの遺伝学的変異を、上記のCroninらの文献に記載された発光ＤＮＡプローブを含む２次元のアレイで同定することができる。簡潔に述べると、プローブの一次のハイブリダイゼーションアレイは、配列が重複するプローブの直線的なアレイをつくることにより、配列間の塩基変化を同定する目的でサンプルとコントロールの広範囲のＤＮＡを探査するために使用することができる。このステップにより、ポイントミューテーションを同定することができる。このステップの次に、検出する全てのバリエーション又は変異に相補的である、より小さくて特異的なプローブのアレイを使用することにより、特定の変異の評価が可能な２次のハイブリダイゼーションアレイを行う。それぞれの変異のアレイは、一つは野生型の遺伝子に相補的でありもう一つは変異遺伝子に相補的である並列のプローブのセットから構成される。
【００９５】
さらにもう一つの実施態様では、ＥＡＡＴ２プロモーターの配列を直接シークエンスする目的で、及び、サンプルのＥＡＡＴ２プロモーターの配列とそれに対応する野生型（コントロール）の配列を比較することにより変異を検出する目的で、本発明の属する技術分野で知られたさまざまなシークエンス反応のあらゆるものを使用することができる。シークエンス反応の例としては、Maxam及びGilbertにより開発された手法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, (1977), 74, 560）又はSangerにより開発された手法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, (1977), 74, 5463）に基づくものが挙げられる。診断アッセイを行うときに、自動化された様々なシークエンス手法のいかなるものも利用できるということも予期される（Naeve C.W., (1995), Biotechniques, 19, 448）。これには、マススペクトルによるシークエンスも含まれる（例えば、PCT国際公開番号WO 94/16101号公報; Cohen et al., (1996), Adv.Chromatogr., 36, 127-162; 及び、Grifffin et al., (1993), Appl.Biochem.Biotechnol., 38, 147-159を参照）。
【００９６】
ＥＡＡＴ２プロモーター中の変異を検出する他の方法としては、切断剤から保護することによりＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Myers et al., (1985), Science, 230, 1242）。一般に、「ミスマッチ切断」の技術手法は、野生型のＥＡＡＴ２プロモーター配列を含む（標識された）ＲＮＡ又はＤＮＡと、組織サンプルから得られた変異型の可能性のあるＲＮＡ又はＤＮＡをハイブリダイズさせることにより形成するヘテロ二重鎖を用意することに始まる。コントロール鎖及びサンプル鎖間の塩基対ミスマッチにより生じる二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で、二本鎖の二重鎖を処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡの二重鎖をＲＮａｓｅで処理することができ、ＤＮＡ/ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチ領域を酵素的に消化することができる。他の実施態様では、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ/ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかをヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウム、および、ピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化の後、その結果物を次に変性ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画し変異箇所を同定する。例えば、Cotton et al., (1988), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 85, 4397; Saleeba et al., (1992), Methods Enzymol., 217, 286-295を参照。より好ましい実施態様では、コントロールのＤＮＡ又はＲＮＡを検出のために標識することができる。
【００９７】
さらなるもう一つの実施態様では、細胞のサンプルから得られたＥＡＡＴ２ ｃＤＮＡのポイントミューテーションを検出及びマッピングすることに限定されたシステムで、二本鎖ＤＮＡのミスマッチ塩基対を認識するタンパク質（「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素と呼ばれる）を１つ以上ミスマッチ切断反応に使用する。例えば、大腸菌のmutY酵素はG/AミスマッチのAを切断し、HeLa細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはG/TミスマッチのTを切断する（Hsu et al., (1994), Carcinogenesis, 15, 1657-1662）。典型的な実施態様では、ＥＡＡＴ２プロモーター配列、例えば野生型のＥＡＡＴ２プロモーター配列に基づくプローブを、試験細胞由来のｃＤＮＡ又は他のＤＮＡ産物とハイブリダイズさせる。二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、その切断産物は、もしあるのであれば、電気泳動の手順又はそれに類するものにより検出することができる。例えば、米国特許明細書５，４５９，０３９号を参照されたい。
【００９８】
他の実施態様では、電気泳動での移動性の変化を、ＥＡＡＴ２プロモーターの変異を同定するために使用する。例えば、変異型と野生型の核酸間の電気泳動での移動性の違いを検出するために、一本鎖高次構造多型（SSCP; Single Strand Conformation Polymorphism）を使用することができる（Orita et al., (1989), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86, 2766、及び、Cotton, (1993), Mutat.Res., 285, 125-144、及び、Hayashi, (1992), Genet.Anal.Tech.Appl., 9, 73-79も参照）。サンプル及びコントロールのＥＡＡＴ２プロモーター核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性し、再生させる。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変動し、結果として生じた電気泳動での移動性の変化により、単一塩基の変化でさえ検出することができる。ＤＮＡ断片は、標識することができ、又は、標識されたプローブにより検出することができる。このアッセイは、（ＤＮＡよりも）二次構造がより配列の変化に影響を受けやすいＲＮＡを使用することにより、感度を向上させることができる。好ましい実施態様では、主題の方法は、電気泳動の移動性の変化に基づき二本鎖の二重鎖分子を分離するヘテロ二重鎖解析を利用する（Keen et al., (1991), Trends Genet., 7, 5）。
【００９９】
さらなるもう一つの実施態様では、変性に勾配のあるゲル電気泳動（DGGE; Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）を使用し、変性剤に勾配のあるポリアクリルアミドゲル中で変異型又は野生型の断片の動きを検定する（Myers et al., (1985), Nature, 313, 495）。DGGEが分析手法として使用される場合、完全に変性しないことを確実にするために、例えば、ＰＣＲによって高温融解であるＧＣリッチなＤＮＡの約４０塩基対からなるＧＣクランプを付加することにより、ＤＮＡを修飾するであろう。さらなる実施態様では、コントロールＤＮＡ及びサンプルＤＮＡの移動性の違いを同定するために、変性の勾配にかえて、温度勾配を使用する（Rosenbaum及びReissner, (1987), Biophys.Chem., 265, 12753）。
【０１００】
ポイントミューテーションを検出する他の手法の例としては、これらに限定されるわけではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅又は選択的プライマー伸長が挙げられる。例えば、ある変異が中央に配置されるようにオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次に、完全一致が見出される場合にだけにハイブリダイズするような条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることができる（Saiki et al., (1986), Nature, 324, 163; Saiki et al., (1989), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86, 6230）。このような対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにより増幅した標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることができ、或いは、複数のオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションメンブレンに付着させて標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズさせる場合には、多数の異なる変異とハイブリダイズさせることができる。
【０１０１】
もう一つには、この発明と組み合わせて、選択的ＰＣＲ増幅による対立遺伝子に特異的な増幅技術を用いることができる。特異的増幅のプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、（増幅が差別的ハイブリダイゼーションに依存するように）その分子の中央に目的の変異を持たせることができ（Gibbs et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17, 2437-2448）、或いは、適当な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨害又は減少させるように一つのプライマーの３´最末端側に目的の変異を持たせることができる（Prossner, (1993), Tibtech, 11, 238）。さらに、切断による検出を生み出すために、変異領域に新たな制限酵素サイトを導入することも好ましいであろう（Gasparini et al., (1992), Mol.Cell Probes, 6,1）。ある実施態様では、増幅にＴａｑリガーゼを用いて行うことも考えられる（Barany, (1991), Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 88, 189）。この場合には、５´側配列の３´末端で完全に一致する場合にのみライゲーションが起こり、増幅があるか無いかを見ることにより特定の部位のある変異の存在を検出することを可能にする。
【０１０２】
ここに記載した方法は、例えば、ここに記載した核酸プローブ又は抗体試薬の少なくとも一つを含む、あらかじめ包装された診断キットにより行うことができる。このキットは、例えば、ＥＡＡＴ２プロモーターが関与する疾病又は病気の家族歴を持つ患者又は症状が現れた患者を検査する臨床現場で簡便に使用できる。
さらに、ＥＡＡＴ２を発現するあらゆる種類の細胞又は組織（例えば、アストログリア細胞）を、ここに記載した予後検定に利用することができる。
【０１０３】
３．臨床試験での効果のモニタリング
ＥＡＡＴ２プロモーター活性に対する薬剤（例えば、薬）の影響をモニタリングすることは、基礎段階のドラッグスクリーニングだけでなく臨床試験にも応用できる。例えば、ここに記載したスクリーニングアッセイにより同定された薬剤のＥＡＡＴ２プロモーター活性を増強する効果は、ＥＡＡＴ２プロモーター活性が弱まっている対象の臨床試験によりモニタリングすることができる。或いは、スクリーニングアッセイにより同定された薬剤のＥＡＡＴ２プロモーター活性を減少させる効果は、ＥＡＡＴ２プロモーター活性が強まっている対象の臨床試験によりモニタリングすることができる。このような臨床試験では、ＥＡＡＴ２プロモーター、好ましくはこれに加えて、例えば、神経又は精神疾患に関係する他の遺伝子の発現又は活性を、特定の細胞の表現型の「送信情報（read out）」又はマーカーとして使用することができる。
【０１０４】
例えば、これらに限定されるわけではないが、ＥＡＡＴ２プロモーター活性を調節する（例えば、ここに記載したスクリーニングアッセイにより同定される）薬剤（例えば、化合物、薬又は低分子）の処方により細胞内で調節される（ＥＡＡＴ２を含む）遺伝子を同定することができる。従って、例えば臨床試験において、神経又は精神疾患に対する薬剤の効果を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製して、ＥＡＡＴ２及びその他疾患に関係する遺伝子の発現のレベルをそれぞれ解析することができる。遺伝子発現のレベル（例えば、遺伝子の発現パターン）は、ここに記載したようなノーザンブロット解析又はRT-PCRにより、或いはここに記載した方法のうちの一つによってタンパク質生産量を測定することにより、又は、ＥＡＡＴ２又は他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量することができる。この方法では、遺伝子の発現パターンは、細胞の薬剤に対する生理学的反応を示すマーカーとして使用することができる。従って、この反応の状態を、薬剤で個体を治療する前及び治療のあらゆる時点で測定する。
【０１０５】
より好ましい実施態様として、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト（作用薬）、アンタゴニスト（拮抗薬）、疑似ペプチド（peptidomimetics）、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、又はここに記載したスクリーニングアッセイにより同定された他の候補薬）による対象の治療効果をモニタリングする方法であって、以下の工程からなる方法を提供する：（ｉ）薬剤を投与する前に対象から投与前サンプルを得る；（ii）投与前サンプルから、ＥＡＡＴ２タンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現又は活性レベルを検出する；（iii）対象から１以上の投与後サンプルを得る；（iv）投与後サンプルから、ＥＡＡＴ２タンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現又は活性を検出する；（v）投与前サンプルのＥＡＡＴ２タンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベルと、投与後サンプルのＥＡＡＴ２タンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現又は活性のレベルとを比較する；（vi）対象に従って薬剤の投与を変更する。例えば、検出されたものよりも高いレベルへＥＡＡＴ２プロモーターの発現又は活性を増加させるため、例えば、薬剤の効果を高めるために、薬剤の投与を増やすことが好ましい。或いは、検出されたものよりも低いレベルへＥＡＡＴ２プロモーターの発現又は活性を減少させるため、例えば、薬剤の効果を減少させるためには、薬剤の投与を減らすことが好ましい。このような実施態様に従って、ＥＡＡＴ２プロモーターの発現又は活性を、観察可能な表現型の反応が無いときも含めて、薬剤の効果の指標として使用することができる。
本発明をさらに次の実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。配列表及び図だけでなく、本願に引用された全ての引用文献、特許及び公開特許出願の内容は、引用によりここに含まれるものである。
【実施例１】
【０１０６】
ＥＡＡＴ２プロモーターの同定及びクローニング
ＢＬＡＳＴ検索からＥＡＡＴ２遺伝子の５´末端を含むことが判ったゲノムＤＮＡのＰＡＣクローンをSanger Institute、Cambridge、英国から得た。供給元の使用説明書に従ってこのクローンを生育し、ＤＮＡを単離してＥｃｏＲＩにより消化した。断片を0.8％アガロースゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。ランダムプライミングにより増幅したＥＡＡＴ２のエキソン１を含む130塩基対のＰＣＲ産物で、ブロットを探索した。８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片がポジティブなハイブリダイゼーションシグナルを生じ、続いてこの断片をＴＡベクターにサブクローニングした。配列解読データから、この断片がエクソン１及びエクソン１上流の追加配列（８ｋｂのうち２．８ｋｂ）を持つことが明らかとなり、これを得てプロモーターモチーフを解析した。
【実施例２】
【０１０７】
ＥＡＡＴ２プロモーターの解析
ＥＡＡＴ２プロモーター及びその近傍のＤＮＡの配列を図１Ａ−１Ｂに示し、配列番号１として記載する。Dan Prestridge博士により開発され、一次配列データから推測される真核ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーター配列を見つけるために設計されたＰＲＯＳＣＡＮ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．７  ソフトウェアプログラム一式（Prestridge D.S., (1995), J.Mol.Biol., 249, 923-932）を使用して、この配列を解析した。この分析により同定されたプロモーター因子となる可能性のあるものには、ＣＣＡＡＴボックス、Ｓｐ１結合サイト（ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ又はＣＣＣＣＧＣＣＣＣ）、Ｅボックスモチーフ（ＣＡＣＣＴＧ、ＣＡＹＧＴＧ又はＣＡＮＮＴＧ）、転写因子ＧＡＴＡファミリー由来の因子の結合サイト（腎臓組織での発現に影響するモチーフ）、ＮＦ−κＢ、及び、ＷＴ１の結合サイト（ＧＮＧＧＧＮＧＮＧ）がある。ＤＮＡ構造の立体構造変化により転写に影響すると考えられるヌクレオチドの繰り返し領域、ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）及びｐｏｌｙ（ｄＧ：ｄＴ）も、近傍領域に見出された。注目すべきことに、この最初の２．８ｋｂの断片に、サイクリックＡＭＰ反応因子（ＣＲＥＢ結合ドメイン）も同定された。本明細書の他の箇所で記載したように、ＧＬＴ−１／ＥＡＡＴ２は、サイクリックＡＭＰ反応因子（ＣＲＥＢ）を通じて転写を顕著に活性化するサイクリックＡＭＰにより上流制御（アップレギュレート）されることが知られている。いくつかのＣＲＥＢプロモーターモチーフと思われるものも、ＥＡＡＴ２プロモーター内に見つかった。同定されたプロモーター因子を示すＥＡＡＴ２プロモーター領域の図解を、図２に示す。ＰＲＯＳＣＡＮ解析の全結果は以下の表１〜６に記載する。
【０１０８】
【表１】
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【０１０９】
【表２】
2005517449.tif 000003
【０１１０】
【表３】
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【０１１１】
【表４】
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【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
プロモーターＥＡＡＴ２の５´側近傍領域を異なる制限酵素により消化して得られた３つの領域（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）を同定した：一つは、２．８ｋｂ以下のＫｐｎＩ−ＮｃｏＩ断片（Ｐ１）、一つは、２．５ｋｂ以下のＫｐｎＩ−ＳａｌＩ断片（Ｐ２）、一つは、０．８６ｋｂ以下のＳｍａＩ−ＳａｌＩ断片（Ｐ３）である。Ｐ１、Ｐ２及びＰ３断片をＰＣＲにより増幅し、プロモーターの無いルシフェラーゼレポーターベクター（ｐＧＬ３、Promega, Madison, WI）にクローニングした。コンストラクトを、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ７細胞及びＣ６グリオーマ細胞等の様々な細胞株に、一過性にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性を測定した。最も高い発現レベルは、ＣＯＳ７細胞から得られた。トランスフェクションの効率をコントロールするために、ルシフェラーゼ活性をウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ活性又はβガラクトシダーゼ活性で標準化した（図３）。予備的な試作として、２．８ｋｂの上流ＥＡＡＴ２プロモーター断片を機能するようにＥＡＡＴ２ ｃＤＮＡと結合させた。一過性のトランスフェクションにより、このコンストラクトを持つＣＯＳ−７細胞でＥＡＡＴ２タンパク質を検出した。
【実施例３】
【０１１５】
ＥＡＡＴ２トランスジェニックマウスの製造
ＥＡＡＴ２プロモーターに基づいた２つの独立した系統のトランスジェニックマウスを生み出した。１つ目の系統は、eGFP（enhanced Green Fluorescent Protein）と結合したP1断片を持つ。このＤＮＡコンストラクトを、修飾されたＰ転移因子（米国特許明細書第6,291,243号を参照）を持つStealthGeneベクター（Tosk,Inc., Santa Cruz, CA）にサブクローニングした。このベクターを成熟したマウス（C57）に注入したところ、生殖細胞を含む全細胞の約４０％が導入された活性ｃＤＮＡを持っていた。「初代」のコロニーを生み出すために、このマウスを野生型のマウスと交配した。これらのマウスは交配されてトランスジェニック発現が確立したものである。
【０１１６】
トランスジェニックマウスの２つ目の系統は、ＢＡＣクローンを用いて生み出した。ＢＡＣの遺伝子組み換え手法は、Yang X.W.et al., (1997), Nat.Biotechnol., 15(9), 859-865に記載されており、引用によりここに含まれる。図４に示されるＢＡＣクローンは、ＥＡＡＴ２遺伝子と判断されたものを含む少なくとも120kbのものだけでなく、ＥＡＡＴ２／ＧＬＴ−１をコードする配列の約100kb上流を含むものとして選ばれた。目的の特定の遺伝子（例えば、ＥＡＡＴ２）を含むBACクローンを標的として改変し、次にトランスジェニックマウスの生殖系列へ移行（germline transmission）させ、特に同定されたプロモーター制御因子無しにこの遺伝子プロモーターによって開始される発現を研究するために、レポーターカセットを使用することができる。BAC ＤＮＡを扱うために開発された一つの具体的な戦略では、上記のYang et al.(1997)に記載されたように、ＲｅｃＡタンパク質を介して、遺伝子改変カセットを含むＲｅｃＡ＋シャトルベクター及びＲｅｃＡ−宿主細菌中のBAC ＤＮＡ間の相同組換えを使用する。ｅＧＦＰレポーター遺伝子はシャトルベクターを用いてコード配列の開始部位に挿入する。マウスを生み出すための手順を図解したものを図５に示す。
本発明は、その好ましい実施態様を引用して詳細に記載されている。しかしながら、前に列記した請求項に記載された本発明の意図及び目的の範囲内で、本願の開示から当業者が変更及び改良をなすことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１Ａ−１ＢはＥＡＡＴ２プロモーター領域（配列番号１）のヌクレオチド配列を示すものである。
【図２】図２は、ＥＡＡＴ２プロモーター領域を模式的に表したもので、同定されたプロモーターの要素を示すものである。
【図３】ＥＡＡＴ２プロモーターのＰ１、Ｐ２及びＰ３領域を用いたルシフェラーゼレポーター活性アッセイの結果を示すものである。
【図４】ＥＡＡＴ２プロモーターを含むＢＡＣを導入したトランスジェニックマウスを作成するためのＢＡＣクローンを示すものである。
【図５】ＥＡＡＴ２プロモーターを含むＢＡＣを導入したトランスジェニックマウスを作成するための手順を模式的に示すものである。
【図１−Ａ１】
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【図１−Ａ２】
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【図１−Ａ３】
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【図１−Ｂ】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2005517449.tif 000019