(57)【要約】本発明は、核酸溶液を電気化学活性マーカーで標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、プローブが核酸溶液中に存在する相補標的配列を少なくとも部分的にハイブリッド形成可能にする条件を提供し、部分的または全体にハイブリッド形成された、あるいはハイブリッド形成されない核酸プローブの何れかを選択的に分解し、電気化学活性マーカーに関する情報を電気化学的に決定することから成る核酸を調べる方法を提供する。さらに、本発明による方法で使用される新規な分子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸溶液を電気化学的に活性なマーカーで標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、
前記プローブが核酸溶液中に存在する相補的標的配列と少なくとも部分的にハイブリッド形成する条件を用意し、
ハイブリッド形成された核酸プローブ、部分的にハイブリッド形成された核酸プローブまたはハイブリッド形成されていない核酸プローブの何れかを選択的に分解し、
電気化学的に活性なマーカーに関係する情報を電気化学的に測定することを包含する核酸の探索方法。
【請求項２】
前記のマーカーに関係する情報を、少なくとも１つの核酸種の有無に関する情報を導くために使用する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分解プローブと非分解プローブの相対的な比率の定量に電気化学的技法を使用する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
一本鎖の非ハイブリッド核酸を選択的に消化するために選ばれた酵素にて、うまくハイブリッド形成されなかった核酸プローブを消化する請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記の酵素がエンドヌクレアーゼである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記の酵素がリボヌクレアーゼである請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記の酵素がデオキシリボヌクレアーゼである請求項４または５に記載の方法。
【請求項８】
前記の酵素がＳ１デオキシリボヌクレアーゼである請求項４〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記の酵素がエキソヌクレアーゼである請求項４、５または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記の酵素がＴ７エキソヌクレアーゼである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
二本鎖ハイブリッド核酸の少なくとも一方の鎖を選択的に消化するために選ばれた酵素にて、うまくハイブリッド形成された核酸プローブを消化する請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記の酵素が５’ヌクレアーゼである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
５’ヌクレアーゼがＤＮＡポリメラーゼである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
５’ヌクレアーゼ／ＤＮＡポリメラーゼが、熱的に安定な酵素である請求項１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記の熱的に安定な酵素がタックポリメラーゼである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
反応混合物がＤＮＡポリメラーゼによる伸長に適した一対のプライマーをも含有する請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
反応条件と温度サイクルが、プローブの５’ヌクレアーゼ消化を併発させるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に適している請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
電気化学的に活性なマーカーで標識された第１オリゴヌクレオチドプローブの完全なるハイブリッド形成を、第２オリゴヌクレオチドとの競争によって阻害し、得られた部分的にハイブリッド形成した第１オリゴヌクレオチドプローブを、標的核酸とハイブリッド形成した２個のオリゴヌクレオチドの立体配置を明細に認識する酵素によって開裂することを包含し、その開裂が電気化学的に活性なマーカーが付着するオリゴヌクレオチド部分を効率的に短くする開裂である請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項１９】
第１オリゴヌクレオチドプローブの完全なるハイブリッド形成が、第２オリゴヌクレオチドとの競争によって阻害され、その結果得られる部分的にハイブリッド形成した第１オリゴヌクレオチドプローブが、標的核酸とハイブリッド形成した２個のオリゴヌクレオチドの立体配置を明細に認識する酵素によって開裂され、開裂生成物が認識カセットで認識され、その認識カセットは少なくとも１個のオリゴヌクレオチドを含み、しかも第1開裂生成物とハイブリッド形成してオリゴヌクレオチド立体配置を形成し、その立体配置は電気化学的に活性なマーカーで標識される認識カセット領域を開裂する酵素によって認識可能である請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項２０】
核酸多型を検出する先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２１】
対立遺伝子の多型性を検出する先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２２】
単一ヌクレオチド多型を検出する先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
核酸種を定量化する請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子発現を定量化する請求項１〜１９の何れかに記載の方法。
【請求項２５】
プライマーの設計および／またはプローブの設計、熱サイクルおよび／または電気化学活性マーカーの検出を、自動的に、あるいは、ソフトウェア指示によるマイクロプロセッサの力を借りて実行する請求項１６〜２４の何れかに記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質溶液を電気化学的に活性なマーカーで標識したオリゴヌクレオチドプローブと接触させ、
そのプローブが溶液中に存在する特異なタンパク質またはタンパク質群と結合できる条件を保持し、
ハイブリッド形成されない核酸プローブを選択的に分解し、
溶液中の特異な標的タンパク質またはタンパク質群の有無、あるいは、相対量または絶対量に関する情報を得るために、前記のマーカーに関する情報を電気化学的に測定することを包含する特異なタンパク質またはタンパク質群を検出する方法。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドプローブ配列が、インビボのタンパク質認識部位と実質的に類似し、検出されるタンパク質またはタンパク質群が、核酸結合タンパク質であると通常みなせる請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
オリゴヌクレオチドプローブが、特異なタンパク質またはタンパク質群に結合するように選択されたアプタマー（aptamer）を含んでいる請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ハイブリッド形成されない核酸が、酵素によって分解される請求項２４〜２８の何れかに記載の方法。
【請求項３０】
前記の酵素がエンドヌクレアーゼである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記の酵素がリボヌクレアーゼである請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記の酵素がデオキシリボヌクレアーゼである請求項２９〜３１の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
前記の酵素がＳ１デオキシリボヌクレアーゼである請求項２９〜３２の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
タンパク質多型を検出する請求項２６〜３３の何れかに記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質発現を定量化する請求項２６〜３４の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
電気化学的方法がボルタンメトリーである前記請求項の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
電気化学的技法が電流測定技法である請求項１〜３５の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
定量化方法が差分パルスボルタンメトリーである請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
電気化学的技法に、選択的に透過性の膜で機能的に囲まれた１つまたは複数の電極を使用する先行請求項の何れかに記載の方法。
【請求項４０】
前記の膜が分子の大きさを基準に選択的に透過性である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記の膜が電荷を基準に選択的に透過性である請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記の膜が疎水性または親水性に基準に選択的に透過性である請求項３９〜４１の何れかに記載の方法。
【請求項４３】
遺伝病または遺伝病担体の状態、もしくは病気の遺伝的素因の検出における前記請求項の何れかに記載の方法の使用。
【請求項４４】
試料中の病原体を検出または識別するための請求項１〜４３の何れかに記載の方法の使用。
【請求項４５】
治療薬または毒剤に対する生体反応を予測するための請求項１〜４３の何れかに記載の方法の使用。
【請求項４６】
１つまたはそれ以上の電気化学的活性マーカー原子団に共有結合した特異配列のオリゴヌクレオチドを含む核酸プローブ分子。
【請求項４７】
１つまたはそれ以上の電気化学活性マーカー原子団が、少なくとも４個の炭素原子を有する脂肪族鎖のリンカーを介してオリゴヌクレオチドと結合している請求項４６に記載のプローブ。
【請求項４８】
少なくとも１つのメタロセン原子団を含む請求項４６または４７に記載のプローブ。
【請求項４９】
少なくとも１つのフェロセン原子団を含む請求項４６〜４８の何れかに記載のプローブ。
【請求項５０】
オリゴヌクレオチド成分の長さまたは配列が、標的核酸配列とハイブリッド形成するのに適した長さまたは配列に最適化されている請求項４６〜４９の何れかに記載のプローブ。
【請求項５１】
オリゴヌクレオチド成分が、オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーのマッチドペアの中間位置で、標的ＤＮＡ配列とハイブリッド形成させるために最適化され、プライマーの伸長によってプルーブのオリゴヌクレオチド成分が、熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって消化される請求項４６〜５０の何れかに記載のプローブ。
【請求項５２】
オリゴヌクレオチド成分が、第２のハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドと重複する位置で、標的核酸配列と部分的にハイブリッド形成させるために最適化され、その重複部位がプローブの５’末端側に位置し、その５’末端が前記第２のオリゴヌクレオチドの存在により、標的核酸との完全なハイブリッド形成を妨害されている請求項４６〜５０の何れかに記載のプローブ。
【請求項５３】
前記プローブが、電気化学的活性マーカーで標識され、しかも酵素によって特異に認識可能な核酸トリプレックス領域が形成されるように、標的核酸配列とハイブリッド形成するために最適化された認識カセットであって、前記の酵素による認識が認識カセットを開裂させる請求項４６〜５２の何れかに記載のプローブ。
【請求項５４】
核酸成分の長さまたは配列が、標的タンパク質とハイブリッド形成するように最適化されている請求項４６〜４９の何れかに記載のプローブ。
【請求項５５】
アプタマーを含む請求項５４に記載のプローブ。
【請求項５６】
自然発生のタンパク質認識部位を持つ核酸配列を実質的に含む請求項５４または５５に記載のプローブ。
【請求項５７】
電気化学的活性マーカーが、オリゴヌクレオチドプローブの３’末端に付着している請求項４６〜５６の何れかに記載のプローブ。
【請求項５８】
電気化学的活性マーカーが、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に付着している請求項４６〜５７の何れかに記載のプローブ。
【請求項５９】
複数の電気化学的活性マーカーが、オリゴヌクレオチドプローブの長さに沿って付着している請求項４６〜５８の何れかに記載のプローブ。
【請求項６０】
電気化学的活性マーカーが、オリゴヌクレオチドプローブの実質的に全てのヌクレオチド残基に付着している請求項４６〜５９の何れかに記載のプローブ。
【請求項６１】
電気化学活性マーカーの原子団の１つが、式I、II、III、IV、VIIまたはVIIIで示される請求項４６〜６０の何れかに記載のプローブ。
【請求項６２】
実施例の何れかに実質的に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項６３】
オリゴヌクレオチド成分が、３’末端および５’末端の両方でリン酸化されている請求項４６〜６２の何れかに記載のプローブ。
【請求項６４】
電気化学的活性マーカーで標識されたオリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドプライマーまたは先行請求項の何れかに記載の標識されたオリゴヌクレオチドと併用できるように最適化された酵素から選択される１つまたはそれ以上の構成要素とを備えたキット。
【請求項６５】
電気化学的活性マーカーで標識されたオリゴヌクレオチドプローブとＳ１ヌクレアーゼとを含む請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
オリゴヌクレオチドプローブと、一対のＰＣＲプライマーとを含む請求項６４に記載のキット。
【請求項６７】
５’ヌクレアーゼ活性を示す核酸ポリメラーゼを含む請求項６４または６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項１〜３５、３９〜４５、９１または９２の何れか１つまたは複数の方法を実施するための装置。
【請求項６９】
１つまたはそれ以上の試料を受け取るための１つまたはそれ以上の試料受け部と、試料受け部の温度を制御する手段と、試料の電気化学的特性を測定する手段とを備えた装置。
【請求項７０】
熱サイクラーを備える請求項６９に記載の装置。
【請求項７１】
ボルタンメトリーが実施できる請求項６９または７０に記載の装置。
【請求項７２】
請求項６９〜７１の何れかに記載の装置で使用されるところの、１つまたはそれ以上の試料を保持するための１つまたはそれ以上の試料受け部を具備する容器。
【請求項７３】
前記試料の電気化学的特性を測定するための少なくとも１個の電極成分を収納できる請求項７２に記載の容器。
【請求項７４】
少なくとも１つの一体電極成分を備えた請求項７２または７３に記載の容器。
【請求項７５】
式XIで示される化合物。
Ｍｃ−ＮＲ’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ−（Ａｒ）ｎ−（Ｌ）ｍ−Ｒ        （XI）
式中、
Ｍｃは、各環が独立して置換されて差し支えないあるいは置換されていないメタロセニル基を示し、そのメタロセニル基は、鉄、クロム、コバルト、オスミウム、ルテニウム、ニッケルまたはチタンからなる群から選ばれる金属イオンＭを含み、
Ｒ’はＨまたは低級アルキル基であり、
ＸはＮＲ’またはＯの何れかであり、
Ａｒは置換または非置換のアリール基であり、
ｎは０または１であり、
Ｌはリンカー基であり、
ｍは０または１であり、
Ｒは標識される原子団あるいは脱離基を含む原子団である。
【請求項７６】
Ｍｃ基が、低級アルキル基、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステルまたはアミド基で置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステルまたはアミド基で置換された低級アルケニル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステルまたはアミド基と置換されたアリール基から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換されている請求項７５に記載の化合物。
【請求項７７】
Ｍｃ基は置換されない請求項７５に記載の化合物。
【請求項７８】
金属イオンＭが鉄イオンである請求項７５〜７７の何れかに記載の化合物。
【請求項７９】
Ｒ’がＨである請求項７５〜７８の何れかに記載の化合物。
【請求項８０】
ＸがＮＨである請求項７５〜７９の何れかに記載の化合物。
【請求項８１】
ｎ＝１である請求項７５〜８０の何れかに記載の化合物。
【請求項８２】
ｎ＝０である請求項７５〜８０の何れかに記載の化合物。
【請求項８３】
ｍ＝１である請求項７５〜８２の何れかに記載の化合物。
【請求項８４】
ｍ＝０である請求項７５〜８２の何れかに記載の化合物。
【請求項８５】
Ｒが標識された原子団であって、その原子団がアミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖質、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物またはこれらの任意の誘導体である請求項７５〜８４の何れかに記載の化合物。
【請求項８６】
Ｒが脱離基を含む原子団である請求項７５〜８４の何れかに記載の化合物。
【請求項８７】
Ｒが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを含む原子団である請求項８６に記載の化合物。
【請求項８８】
Ｒが、標的とハイブリッド形成可能な配列を持つオリゴヌクレオチドを含む請求項７５〜８５の何れかに記載の化合物。
【請求項８９】
電気化学的に活性か、部分開裂後に電気化学的に活性になる請求項７５〜８８の何れかに記載の化合物。
【請求項９０】
メタロセン基が、他の任意の電気化学的活性マーカーによって置換されている請求項７５〜８９の何れかに記載の化合物。
【請求項９１】
２個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブが使用され、各プローブが異なる電気化学的活性マーカーで標識されている請求項１〜４２の何れかに記載の方法。
【請求項９２】
２個またはそれ以上の電気化学的活性マーカーが、ボルタンモグラムトレースにおいて、互いに分解可能なピークを有する請求項９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列の特異性を検出するためのプローブとその方法に関する。本発明は、さらに、核酸結合タンパク質が認知配列を含む核酸と優先的に結合する性質を利用して、核酸結合タンパク質を検出するためのプローブとその方法に関する。より詳しく言えば、本発明は、核酸および／またはタンパク質の検出に使用して好適な標識化したオリゴヌクレオチドとその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定なＤＮＡまたはＲＮＡの配列を検出することは、食物、環境および臨床的診断などの業界や、ゲノム学、学究、薬学、薬理遺伝学などの研究分野で幅広く利用され、重要な役割を担っている。その検出は、感度が高く、配列に特異的であり、比較的迅速に且つ低コストで、しかも正確に検出でき、日常的な使用および／または自動操作に適していることが理想である。さらに、理想的には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）などの既存のＤＮＡ増幅法やその他の核酸増幅法と統合できることが望ましい。
【０００３】
ＰＣＲなどの増幅法に基づく、あるいは前記増幅法と統合した核酸検出法以外にも、核酸の配列特異を検出するための技術が知られており、その技術は、以前には必ずしも増幅する必要のなかった標的へのプローブの特異結合に基づいている。サザンブロット法およびノーザンブロット法は、この技術の代表例で例である。増幅ステージを含まない検出技術は、信号を検出するために、通常、高感度でなければならない。所要の感度を得るために、典型的には、オートラジオグラフ法または化学ルミネセンス法に基づく検出技術が利用されている。
【０００４】
サザンブロット法およびノーザンブロット法では、標的核酸を膜基質に結合させなければならないが、そうするには時間が掛かるうえ、自動操作に向かないという問題を伴う。
【０００５】
増幅に基づくＤＮＡ検出法は、通常、蛍光化学または放射性標識の較差を利用する。分析対象の標的ＤＮＡは、しばしば、例えばＰＣＲによって酵素的に増幅され、次に、これを蛍光ＤＮＡ結合色素にて着色して可視化し、ゲル電気泳動によってサイズ分離される。ゲル電気泳動を利用しない代替法も幾つか開発されている。これらの代替法は、しばしば、例えば、ＳＹＢＲグリーンまたは臭化エチジウムなどの配列特異性でない蛍光色素を用いて、ＤＮＡ増幅の即時検出を可能にする。特異ＤＮＡ配列とハイブリッドを形成する蛍光で標識した様々なオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅と、蛍光に基づく検出とを統合した検定法も開発されている。ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を利用した多くの検定法も開発されている。商業的に利用可能なヌクレアーゼ検定の例としては、インベーダー（Invader）（商標：サードウェーブテクノロジーThird Wave Technologies）、リーディット（Readit）（商標：プロメガPromega）、タックマン（TaqMan）（商標：アプライドバイオシステムズApplied Biosystems）などがある。例えば、米国特許第５，４８７，９７２号、同第５，５３８，８４８号、同第５，８０４，３７５号に開示されたタックマン検定では、Ｔａｑのポリメラーゼ活性によるプライマー伸長に付随するＴａｑポリメラーゼの固有５′ヌクレアーゼ活性によって、ハイブリッド形成オリゴヌクレオチドが消化される。
【０００６】
電気化学を利用したＤＮＡ検出は、感度と簡便さの点で他の検出システムに比べ潜在的な優位性がある。電気化学的な検出装置は、携行性、堅牢性、小型化への容易性、並びに大量生産できる可能性を秘めているので、特に、臨床診断、食品検査、環境診断などの分野に適している。
【０００７】
電気化学に基づく遺伝子プローブは、電極結合ハイブリッド形成法に焦点を合わせている。典型的には、捕獲プローブ（オリゴヌクレオチドまたはペプチド核酸）が、電極表面に固定され、核酸の複合混合体から標的の相補性核酸を抽出する。ハイブリッド形成の現象は、二次プローブを用いて標的と接触させるレドックス活性ハイブリッド形成指示薬（例えば、ルテニウム塩またはコバルト塩）を使用して測定可能な電気信号に変換されるか、あるいは、ハイブリッド形成の結果物である溶液と電極との界面における物性変化に起因する電極の静電容量の変化を直接計測することで、電気信号に変換される。こうした手法においては、十分な感度を得るために、例えばＰＣＲによって標的配列を予め増幅することがしばしば必要になる。
【０００８】
核酸結合タンパク質の検出方法は、ヌクレアーゼ保護試験法を含む。こうした試験法では、核酸プローブを溶液中で推定上の核酸結合タンパク質と混合する。適当な条件下のもとで、核酸結合タンパク質は、プローブ内に存在する核酸配列と結合可能となる。推定上の結合に続いて、非結合プローブまたはその領域が、適当なヌクレアーゼによって消化可能となる。結合したタンパク質は、ヌクレアーゼの立体障害となるので、結合した核酸プローブは、ヌクレアーゼ消化から保護される。消化された核酸プローブと消化されなかった核酸プローブは、例えばゲル濾過やゲル電気泳動法を用いて、または、未消化核酸を膜やその他の基質に結合させることによって分離され、定量される。典型的には、プローブは、放射性同位元素で標識され、プローブ自身およびその分解生成物を定量することができる。しかし、放射性同位元素の使用には、試薬の有効期限を短縮させ、人体の健康および環境に悪影響を及ぼす放射性崩壊の問題がある。
【０００９】
核酸結合タンパク質を検出するのに適した核酸プローブは、インビボで核酸結合タンパク質と結合することが知られている配列から実質的になる核酸を含む。さらに、核酸結合タンパク質を検出するのに適したプローブには、アプタマー（aptamer）が含まれるが、このアプタマーは、特異な機能を果たすようにインビトロで進化する核酸である（その詳細は、例えば、「ブロディおよびゴールドの共著、分子生体学レビュー」９巻、１９９９年、３２４〜３２９頁(Brody and Gold, Reviews in Molecular Biology 9 (1999) 324-329)、ジャスク他著、「シンレット」６巻、１９９９年、８２５〜８３３頁(Jaschke et al., Synlett 6(1999) 825-833)、グリフィスとトウフィックの共著、「生物工学における最新考察」１１巻、２０００年、３３８〜３５３頁(Current Opinion in Biotechnology 11(2000) 338-335)など参照）。アプタマーは、核酸結合タンパク質であると通常見なされるタンパク質以外のどのようなタンパク質と結合する可能性を持つように生成される。
【００１０】
本明細書において、核酸に関して使用する「ハイブリッド形成」なる用語は、第１の核酸が、相補的配列の第２の核酸と結合することを意味する。また、ハイブリッド形成には、核酸配列の相補性が完全である必要はない。ハイブリッド形成は、相補的結合を包含し、その相補的結合には、記載された方法の効率を本質的に損なわない程度で、塩基ミスマッチを含む。
【００１１】
本発明は、電気化学的に活性なマーカーで標識されたオリゴヌクレオチドプローブに、核酸溶液を接触させ、前記プローブが核酸溶液に存在する相補（標的）配列とハイブリッド形成できる条件を用意し、ハイブリッド形成された核酸プローブ又はハイブリッド形成されなかった核酸プローブの何れかを選択的に分解し、電気化学的活性マーカーに関する情報を、電気化学的に判定することを包含する核酸探索方法を提供する。前記マーカーに関する情報は、少なくとも一つの核酸種の有無に関する情報の取得に好適に使用される。好ましくは、電気化学的技法が、分解したプローブと非分解のプローブとの相対的な比率を定量するのに使用される。本明細書中では、「分解」なる用語は、例えば消化などによる酵素活性の退化をも包含する。
【００１２】
ハイブリッド形成された核酸プローブまたはハイブリッド形成されなかった核酸プローブの何れかを選択的に分解するには、幾つかの方法が採用可能であり、その方法には、酵素的手法や化学的処理が含まれる。酵素は、核酸プローブを消化によって分解するのに用いられ、リン酸‐エステル結合の開裂あるいはサッカライド結合又はグリコシド結合の開裂を生じさせる。
【００１３】
コウジカビまたは別の適当なソースから分離されたＳ１ヌクレアーゼ、あるいは類似の特異性を有する酵素は、ハイブリッド形成されない核酸の選択的消化に使用できる。Ｔａｑポリメラーゼまたは類似の酵素の５’ヌクレアーゼ活性は、核酸プローブの消化に使用することができ、その核酸プローブは、一対のＰＣＲプライマー間にある標的位置にてハイブリダイズする。この場合は、プローブの消化は、プライマーの伸張と同時に起る。
【００１４】
サードウェーブテクノロジー社のインベーダー（商標）システム（米国特許第５，８４６，７１７号、同第５，８３７，４５０号、同第５，７９５，７６３号、同第５，６１４，４０２号）は、蛍光発生的核酸検出システムを提供しているが、このシステムは、図１４ａに示す本発明の電気化学的検出システムの変更例で使用できるように改変することができる。すなわち、２つの短いオリゴヌクレオチドプローブを、標的核酸とハイブリッド形成させ、両プローブが鎖長の少なくとも一部でハイブリッド形成して核酸二本鎖を形成する一方で、２つのプローブ間で重複する配列領域が存在するように、前記のプローブを消化する。こうして生成される特異構造が、酵素によって認識されるが、その酵素はプローブの１つを開裂して重複領域から"５’フラップ"を放出させる。適当な酵素の１つは、アルケオグロブス・フルギダス（Archaeoglobus fulgidus）から得られるフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ１）であって、このものは、商標「クリベースVIII」で市販されている。電気化学的に活性なマーカーはプライマーと結合し、プライマーの５’末端またはこれに向かう５’フラップを形成する。反応混合物に５’フラップが存在するかどうかは、電気化学的手法で検出される。特に、電気化学的に標識された５’フラップは、各分子のオリゴヌクレオチド部分の長さが異なるため、電気化学的に標識されたプライマーから識別することができる。
【００１５】
図１４ｂに示すように、別法では、５’フラップを電気化学的に活性なマーカーと結合させる必要がない。５’フラップの放出は、オリゴヌクレオチド認識カセットによって検出され、そのカセットは、開裂酵素によって認識かつ開裂される核酸トリプレックスを形成する。電気化学的に活性なマーカーは、認識カセットに結合し、認識カセットの開裂は、する結果、この電気化学的活性なマーカーが、全長認識カセットでなく、認識カセットの断片に結合する結果を招く。電気化学的に標識された認識カセット断片と、電気化学的に標識された全長認識カセットとは、各分子のオリゴヌクレオチド部分の長さの違いから、区別することができる。
【００１６】
本発明は、メタロセンのような電気化学的に活性なマーカーが、ヌクレオチドと結合するかどうかによって、ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドに組み入れられるかどうかによって、また、ヌクレオチドの長さによって、異なった電気化学的特性を示すことを観察することを基礎としている。
【００１７】
電気化学的に活性なマーカーと結合する分子の大きさと特性は、電気化学的マーカーの知覚特性に影響を及ぼし、例えば、電界に応じて又は拡散によって移動速度に影響を及ぼす。
【００１８】
マーカーの電気化学的活性も、マーカーが結合した分子の存在するために、立体効果の影響を受ける。例えば、立体障害はマーカーの電極への接近を邪魔し、電子の受け渡しを妨害する。
【００１９】
マーカーがオリゴヌクレオチドに結合すると、オリゴヌクレオチドの二次構造（一次配列によってほぼ決定される）がマーカーの物性に影響を及ぼす。例えば、マーカーが自己相補的な一次配列を有するオリゴヌクレオチドと結合すると、そのステム・アンド・ループ二次構造は、電気化学的に活性なマーカーを立体的な障害となり、ボルタンメトリーによって得られる信号を衰微させる。オリゴヌクレオチドの消化は、ステム・アンド・ループ構造を破壊または遊離させ、マーカーへの影響を減少または消滅させる。
【００２０】
オリゴヌクレオチドの二次構造は、温度に依存するので、電気化学的に活性なマーカーがオリゴヌクレオチドに及ぼす影響は、温度によって変化する。
【００２１】
当業者であれば、信号対暗雑音の最適比を得るために、本発明の電気化学的手法の実施に適した温度を容易に選ぶことができる。本発明の電気化学的手法を、ＰＣＲやサーマルサイクリング装置を使用するその他の技術と組合せる場合は、所望温度での計測を、ＰＣＲの温度調整における適当なポイントで平易に行うことができる。
【００２２】
本発明に従う方法の１つでは、電気化学的に活性なマーカーで標識したプローブの５’ヌクレアーゼ消化は、ＰＣＲプライマーの伸長と同時に生起する。この方法は、溶液の電気化学的活性を、ＰＣＲサイクルの間に自動的に測定するリアルタイムのＰＣＲを包含する。試料に標的が多く存在すればするほど、プライマーの伸長とプローブの消化も多く生起すると思われる。消化されたプローブは、電気化学的活性の違いから非消化プローブとから区別することができる。上述したように、計測が行われる温度（ＰＣＲ期）は、得られる信号の質に影響を及ぼす。
【００２３】
分かりやすくするために、単一の核酸種を検出する場合を例にとって、本発明を説明する。しかし、本発明はこれに限定されず、複数の核酸種を同時に検出するための方法と装置を用いる複合システムをも、本発明が包含していることは理解されよう。複合システムは、対照実験を検定実験と同一の条件のもとで同時に行える利点や、幾つかの分析を同じ条件で同時に行える利点がある。従って、複合システムを採用すれば、試薬と時間が節約できる。こうした複合システムの一例としては、２個またはそれ以上の異なる標的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの使用がある。これらのプローブは、レドックス特性が異なる電気化学的に活性なマーカーでそれぞれ標識され、従って、例えば、ディフェレンシャルパルスボルタンメトリーのような適当な電気化学的手法によって、互いに識別可能である。ここで使用する２個（またはそれ以上）のマーカーは、それぞれが分解して分析できるように、互いに十分に異なるレドックス特性を備える必要がある。例えば、ディフェレンシャルパルスボルタンメトリーを使用する場合、２個（またはそれ以上）のマーカーは、それらのボルタモグラムトレース（voltammogram traces）が、互いに分解可能な電圧にピークを有するべきである。好ましくは、２個の異なるマーカーを使用する。本発明は、新規な電気化学的マーカーを提供するが、これらは複合システムで使用することができる。新規なマーカーの提供は、利用可能なマーカーの領域を拡大し、従って、複合システムの開発を可能にする。
【００２４】
本発明の第一実施例で使用される標識されたオリゴヌクレオチドは、特異な強い電気化学的信号を発することができるが、この信号発生は、配列依存ヌクレアーゼ検定においてハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドから、フェロセン化した（ferrocenylated）モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが放出されることに由来する。前記の検定は、特異な核酸配列を認識することで強い新しい信号が発生するように、プローブを変化させるヌクレアーゼ活性に依存したものである。
【００２５】
必要に応じて、電気化学的な検出ステップは、１つ又はそれ以上の特性に基づいて分子を選択的に排除できる膜で被覆された１つ又はそれ以上の電極を使用して実施することができ、前記の特性としては、例えば、分子の大きさ、電荷、疎水性などがある。膜の使用は、例えば、荷電した核酸または非消化の標識されたオリゴヌクレオチドから生じるバックグラウンド電流を除外するのに役立つ。
【００２６】
適当な電気化学的に活性なマーカーには、メタロ炭素環式パイ複合体（metallo-carbocyclic pi complexes）が、すなわち、部分的にまたは全体的に非局在化したパイ電子（pi electrons）を有する有機複合体が含まれる。適当なマーカーには、２つの炭素環が平行であるサンドイッチ化合物や、曲がりサンドイッチ化合物（アンギュラー化合物）と、モノサイクロペンタジエニル類（monocyclopendatienyls）も含まれる。電気化学的に活性なマーカーは、メタロセニル標識であることが好ましく、フェロセニル標識であるがより好ましい。
【００２７】
本発明のプローブで使用されるフェロセニル標識およびメタロセニル標識は、Ｎ置換フェロセンまたはメタロセンカルボキサミドであることが有益である。標識部分を構成するフェロセンまたはメタロセン環は、置換されていなくてもよい。必要に応じて、フェロセンまたはメタロセン環は、１個またはそれ以上の置換基で置換することができ、置換基の種類と置換位置は、フェロセンまたはメタロセン部分のレドックス特性に好影響を及ぼすように選択される。フェロセンまたはメタロセン環は、前記の置換基で置換される代わりに、前記の置換基に加えて又は付加的に、標識の電気化学的感度を本質的に減少させることのない別の環状置換基で置換されていても差し支えなく、また、当該環状置換基と前記の置換基の両方で置換されていても差し支えない。フェロセンまたはメタロセンカルボキサミド部分は、カルボキサミドの窒素を介してヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと結合することができる。ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドへの結合は、リン酸基またはヌクレオチド塩基を介しているのが好ましい。どちらの結合方法も、オリゴヌクレオチドの長さに沿って標識をヌクレオチドに付着させる。しかし、結合がリン酸基を介している場合は、その結合は、３’または５’末端リン酸基を介しているのが望ましい。何故なら、このように結合していれば、オリゴヌクレオチドのワトソン・クリックハイブリダイゼーションを立体的に妨げ、あるいは、ヌクレアーゼ活性に悪影響を及ぼす可能性を最小限に抑えられるからである。ワトソン・クリックの塩基対形成に含まれない塩基領域を介しての結合は、こうした塩基対形成の分裂が起こりにくいと予測される。従って、塩基を介しての結合は、末端以外のヌクレオチド部位での標識化により適している。標識されたオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標識部分の間にリンカーを持つことができる。好ましくは、標識されたオリゴヌクレオチドは、リンカー部分でオリゴヌクレオチドに結合したフェロセニル標識部分を備えている。
【００２８】
任意の適当なリンカーが使用される。適当なリンカーには、脂肪族炭素鎖が含まれ、その脂肪族炭素鎖は、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、また、飽和、不飽和のいずれであっても差し支えない。リンカーは、４〜２０個の、好ましくは６〜１６個、より好ましくは８〜１４個、最も好ましくは１２個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐状の脂肪族鎖である。アルキレン鎖は、任意の置換基で置換することができるほか、任意の原子または原子団で中断されても差し支えない。但し、これらの任意の置換基、原子および原子団は、標識の電気化学的感度を本質的に低下させないことが条件である。本発明で使用可能なフェロセニル標識の具体例には、式Ｉ〜IIIで示すものがある。式Ia〜IIIaで示す分子は、対応するフェロセニル標識で標識されたオリゴヌクレオチドである。式IVはヌクレオチド塩基を介して結合できるフェロセニル標識の一例を示し、説明の都合上、式IVではアミノ変性チミン塩基が示されている。
【００２９】
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【００３０】
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【００３１】
フェロセンで標識されたプローブは、任意の適当な方法で調製することができる。一例として、アミノ変性オリゴヌクレオチドは、末端アミノ基を有する遊離基をオリゴヌクレオチドに導入することで調製可能である。こうしたアミノ変性ヌクレオチドの具体例は、式Vで示す変性ヌクレオチドである。次に、アミノ変性ヌクレオチドを、フェロセンをフェロセンカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（式VI）と反応させることでフェロセンを導入し、標識されたオリゴヌクレオチドを得る。
【化９】
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【化１０】
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【００３２】
代替法としては、オリゴヌクレオチドの固相合成の過程で、フェロセン部分を添加する方法で、フェロセンで標識されたオリゴヌクレオチドを調製することもできる。フェロセン標識は、以下に説明する２通りの一般的手法により、オリゴヌクレオチドを固相合成する過程で導入することができる。その第１は、オリゴヌクレオチドの３’末端にオリゴヌクレオチドを添加するには、適当な樹脂を用いる必要がある。その樹脂は、フェロセン誘導体で標識される。オリゴヌクレオチドの内部または５’末端に、フェロセンを付加するには、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドと、例えば、フェロセニル誘導ホスホラミダイトとをカップリングさせるためのカップリング剤を用いる必要があり、前記のフェロセニル誘導ホスホラミダイトは、例えば、式IX又は式Xで示される。
【化１１】
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【化１２】
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【００３３】
本発明は、また、電気化学的に活性な新マーカーや標識や標識部分を提供する。本発明は、式XIの化合物を提供する。
Ｍｃ−ＮＲ’−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ−（Ａｒ）ｎ−（Ｌ）ｍ−Ｒ              （XI）
式中、Ｍｃは、メタロセニル基であって、各環は個別に置換されていても無置換でも。良く、このメタロセニル基は、鉄、クロム、コバルト、オスミウム、ルテニウム、ニッケルおよびチタンからなる群から選ばれる金属イオンを含み、
Ｒ’は、Ｈまたは低級アルキルであり、
Ｘは、ＮＲ’またはＯの何れかであり、
Ａｒは、置換されたまたは無置換のアリール基であり、
ｎは、０または１であり、
Ｌは、リンカー基であり、
ｍは、０または１であり、
Ｒは、標識される原子団を示し、脱離基（a leaving group）を含む原子団である。
【００３４】
Ｍｃ基は、低級アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基）、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル、アミド、または別のメタロセン基で置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル、アミド、または別のメタロセン基で置換された低級アルケニル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル、アミド、または別のメタロセン基で置換されたアリール基から選択される１つまたはそれ以上の基で置換可能である。そして、前記別のメタロセン基は、本発明に係る化合物中のＭｃ基の総数が、好ましくは４つを超えないほかは、Ｍｃ基と同様に置換可能である。好ましくは、Ｍｃ基は無置換である。
【００３５】
メタロセニル基中の金属イオンは、好ましくは、鉄、オスミウム、ルテニウムから選択される１つであり、最も好ましいのは、鉄イオンである。金属イオンが鉄である場合、Ｍｃはフェロセニル基である。
【００３６】
低級アルキル基は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４のアルキル基である。Ｒ’は、好ましくは水素であり、個々のＲ’は、他のＲ’とは別個の固有性を有する。
【００３７】
Ｘは、好ましくはＮＨである。
【００３８】
Ａｒ基は、低級アルキル基（例えば、Ｃ１〜Ｃ４アルキル基）、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル、またはアミド基で置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル、またはアミド基で置換された低級アルケニル基、アリール基、ヒドロキシ、ハロ、シアノ、オキソ、アミノ、エステル、またはアミド基で置換されたアリール基から選ばれる１つまたはそれ以上の置換基で置換されても差し支えないが、好ましくは、Ａｒ基は無置換である。
【００３９】
好ましくは、ｎ＝１であり、ｍ＝１である。
【００４０】
適当なリンカー基は、脂肪族鎖を含み、その炭素鎖は直鎖状であっても、分岐鎖状であっても差し支えなく、また、飽和炭素鎖であっても、不飽和炭素鎖であっても差し支えない。リンカー基は、４〜２０個の、好ましくは６〜１６個の、より好ましくは８〜１４個の、最も好ましくは１２個の炭素原子を有する直鎖状または分岐鎖状脂肪族鎖であるのが好適である。アルキレン鎖は、任意の置換基で置換することができるほか、任意の原子または原子団で中断されても差し支えない。但し、これらの任意の置換基、原子および原子団は、標識の電気化学的感度を本質的に低下させないことが条件である。
【００４１】
本発明の化合物は、複数のメタロセン基を備える。本発明の化合物においては、メタロセン基は、他の任意の電気化学的に活性なマーカーで置換されて差し支えない。本発明の化合物は、そのままで電気化学的に活性であるものと、部分開裂によって電気化学的に活性になるものの両方を含む。
【００４２】
好ましくは、標識される部位は、アミノ酸、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ヌクレオシド、糖質、炭水化物、ペプチド、タンパク質、またはこれらの分子の何れかの誘導体である。好ましい実施例において、Ｒは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。ヌクレオチドは、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、またはウリジンから選択される。好ましくは、ヌクレオチドは、ヌクレオチドのデオキシリボースまたはリボースに付着するグループを介して、例えば、２’、３’、５’位で付着する。最も好ましくは、ヌクレオチドは、３’または５’位で、例えば、５’位で付着する。２’、３’または５’位での付着は、好ましくは、酸素原子または窒素原子を介している。
【００４３】
さらに好ましい具体例では、Ｒは、脱離基を含む基であって、好ましくは脱離基を含むアルキル基またはカルボニル基である。アルキル基の中で好ましいのは、低級アルキル基（例えばＣ１〜Ｃ４アルキル基）である。脱離基としては、ヒドロキシル基、ハロゲン化物、有機酸、およびＮ−ヒドロキシジアシルアミンが挙げられる。脱離基は、例えば、塩化物、臭化物またはヨウ化物、酢酸、安息香酸、２，６−ジクロロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、マレイミド、ヨードアセトアミドまたはイソチオシアネートなどである。好ましい脱離基は、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミドである。脱離基は、固体支持体に結合した原子団とのカップリング反応に使用するのに適した活性化可能な基であって差し支えない。例えば、脱離基は、ホスホラミダイト基であって差し支えない。
【００４４】
Ｒが脱離基を含む基である場合、その化合物は、別の分子を電気化学的に標識化するのに使用できる標識試薬である。この標識試薬は、既知の方法や本発明の方法で使用される生化学的に重要な分子を、標識化するのに特に有用である。標識化の対象となる分子は、アミノ酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖質、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物およびこれら分子の任意の誘導体などであるが、これに限定されない。
【００４５】
標識試薬は、直接またはリンカーを介して付着する。そのリンカーは、初めに標識試薬または標識化される分子に付着する。リンカーが標識化される分子に最初に付着する場合、そのリンカーは、例えばアミノ基やチオール基を含むことができ、これらの基は標識化反応を補助する。この場合、アミノ基が好ましい。
【００４６】
標識される分子が、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの場合、３’末端または５’末端が標識されるのが好ましい。そのオリゴヌクレオチドは、アミノ変性されていて差し支えなく、当該変性は標識化反応をアシストする。アミノ変性したオリゴヌクレオチドは、普通の方法で合成できるほか、例えば、オズウェル・サイエンティフィック（サウスアンプトン、イギリス）（Oswel Scientific, Southampton, UK）から商業的に入手可能である。アミノ変性したオリゴヌクレオチドは、リンカーモチーフと合体することもでき、これには、例えば、５’アミノへキシル基または３’アミノへキシル基あるいは５’−Ｃ１２アミノ基の付加が含まれる。この場合、標識化される分子は、好ましくはリンカーを含む。
【００４７】
オリゴヌクレオチドの場合、分子のオリゴヌクレオチド部分の配列は、その分子が相補的標的配列とハイブリッド形成することでき、従って、分子生物学的手法でプローブとして、使用可能であることが好ましい。前記の分子生物学的手法には、本明細書に開示した核酸の検出法が含まれる。
【００４８】
本発明によって標識された生物学的分子は、消化または非消化の状態で電気化学的に活性である。理想的には、電気化学的活性度は、消化の程度によって変化する。
【００４９】
式VIIIは、電気化学的に活性な新規なマーカーがオリゴヌクレオチドへ結合した態様を図示したものである。式VIIIの分子は、５’−アミノへキシル変性オリゴヌクレオチドと、式VIIで示した分子との反応で得ることができる。
【化１３】
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【化１４】
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【００５０】
４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルの詳細と、この化合物を用いてオリゴヌクレオチドを標識化することの詳細は、実施例７および８に示す。しかし、当業者には、標識がオリゴヌクレオチドの任意の適当な位置に付着することができ、その付着がオリゴヌクレオチドの５’末端に限定されないことが理解できよう。また、新規なマーカーの付着にアミノヘキシルリンカーの介在を必要とせず、マーカーが必ずしもオリゴヌクレオチドに付着する必要がないことも理解されよう。本発明に係る新規なマーカーは、他の分子、特に、タンパク質、炭水化物、抗体などのような生物学的分子の標識化に使用することができる。
【００５１】
本発明に係る分子は、本発明の方法で特に有用である。表３に記載した条件において、置換フェロセンカルボン酸の電極電位は、ほぼ４００ｍＶである。一方、本発明に係る置換メタロセン分子は、ほぼ１５０ｍＶの電極電位を有する。電位が低いことは、バックグラウンド不純物によってデータ収集が妨害される可能性が極めて低いことを示す。従って、本発明に係る分子は、より高感度の読み取りを可能にする。図２３（a）および（b）に示すボルタモグラムは、従前のフェロセン誘導体（フェロセンカルボン酸XII）の電極電位を示し、図２３（ｃ）および（ｄ）に示すそれは、本発明に係る分子に見られるフェロセン部分を備えたフェロセン誘導体であるところの、４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸の電極電位を示す。図２３（ｂ）と（ｄ）を比較すると、本発明に係る分子に見られるフェロセン部分を備えたフェロセン誘導体のピークが、バックグラウンド信号が弱く、従って、分子をより高感度に検出できるボルタンモグラムの走査領域に移行していることが分かる。
【００５２】
本発明はさらに、本明細書に開示した方法の１つ又はそれ以上を実施するための装置を提供する。そうした装置は、適当な電極と、電気化学セルと、使い捨てのプラスチック製器物と、試験結果を検出、記録、操作および表示する器具を含み、ＰＣＲ法の場合は、適正にプログラムされた、またはプログラム可能な熱サイクラーをさらに含む。こうした装置には、プライマー、プローブ、およびサイクル条件を最適に設計するための装置が包含される。
【００５３】
本発明の装置は、１つ以上の試料を受け取るための１つ以上の試料受け部と、試料受け部の温度を制御する手段と、試料の電気化学的特性を測定する手段とを備える。本発明に係る装置の一具体例には、熱サイクラーが設けられるが、このものは従来の試料温度制御手段に、試料を電気化学的に測定できる手段を組み込んだものである。このような装置は、従来の電極セルを利用して製造することができる（例えば、本発明の実施例で使用される装置）。
【００５４】
本発明の装置はさらに、１つまたはそれ以上の試料を受け取って保持する１つまたはそれ以上の容器を備えることができる。こうした容器は、目下、ＰＣＲで使用されているポリプロピレン管または９６ウェルプレートのように設計されてよい。理想的には、こうした容器は、少なくとも１つの電極要素を受け入れることができる。電極要素を、例えば、容器の蓋部分に設ければ、蓋を閉めた際に、電極要素が試料溶液に到達する。このような容器は、熱サイクラーで使用するように設計されておらず、従って、最適な熱伝導性を備えていない従来の電気化学セルを凌ぐ利点を持つ。従来の電気化学セルは、相対的にコスト高であるため、一般には使い捨て方式ではない。使い捨て可能なプラスチック製器具の使用は、試料による汚染のリスクを減らすために、分子生物学では標準的習慣となっている。
【００５５】
本発明に係る装置は、ＰＣＲのポリプロピレン管または９６ウェルプレートで既知の設計を基本として、その基本設計に、本発明の方法で使用される１つまたはそれ以上の電極要素が組み込んだ容器が備えることもできる。こうした容器は、大量生産が可能であるので、電極要素が使い捨てになっても、そのコストを減少させることができる。
【００５６】
本発明の実施例を添付の図面を参照しながら、以下に詳述する。
【００５７】
図１において、本明細書に記載した循環式ボルタメトリー実験に使用する電気化学セル１は、酢酸アンモニウムの１００ｍM水溶液からなるバックグラウンド電解質溶液３を含む容器２を備える。溶液３にはチャンバー４が浸漬され、そのチャンバーには、試験対象の試料と、試料中に浸したガラス状カーボンの作用電極５とが収容されている。作用電極には、金電極を代用することもできる。また、溶液３には白金ワイヤの対電極６と、４Mの塩化カリウム溶液に浸漬された銀−塩化銀の参照電極７とが浸漬されており、電解質溶液３と塩化カリウム溶液とは、焼結ディスクを介して相互に連通している。
【００５８】
図１５aおよび１５ｂにおいて、Ｔ７エクソヌクレアーゼ（Ｔ７遺伝子６エクソヌクレア−ゼとも称される）は、二重鎖の特異５’〜３’エクソヌクレア−ゼである。ＤＮＡの標的部分にアニ−ルされたオリゴヌクレオチドを、前記の酵素が消化し、モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、短尺のオリゴヌクレオチドフラグメントを産出する。酵素の基質特異性により、フェロセンのような電気化学的マーカーで５’末端が標識されたオリゴヌクレオチドプローブが消化される。消化されたフェロセン標識化プローブは、例えば差分パルスボルタンメトリーなどの電気化学的手法で検出可能である。Ｔ７エクソヌクレアーゼは、熱安定性に乏しいため、ＰＣＲで通常使用される熱サイクリング条件の下では不安定である。
【００５９】
Ｔ７エクソヌクレアーゼは、ＰＣＲに基づくＤＮＡ検出において2通りに使用できる。フェロセンなどのマーカーにて５’末端が標識されたＰＣＲ生成物は、５’標識プライマーを使用して合成できる。その後、Ｔ７エクソヌクレアーゼを添加したＰＣＲ混合物が、標識されたＰＣＲ生成物を消化する。非増幅の一本鎖プライマーは消化されない（図１５ａ）。2番目の方法では、配列特異ＰＣＲ生成物を検出するために、プライマー配列間の標的核酸とハイブリッド形成するように設計されたタックマンプローブ（商標：アプライドバイオシステムズ）と同様に、電気化学的に標識されたプローブが、標識されたプライマーの代りに用いられる。このプローブは、熱サイクリング後ＰＣＲ混合物に導入され、標的にアニ−ルさせる。次いでＴ７エクソヌクレアーゼが添加され、相補性ＰＣＲ生成物とのアニ−ルによって二重鎖が形成された時のみ、プローブは消化される。
【００６０】
以下に本発明の実施例を詳述する。
材料と方法−オリゴヌクレオチドの調製と検定
オリゴヌクレオチドは、シグマジェンソシス（Sigma Gensosys）から入手した。オリゴヌクレオチドは全て脱塩されたものを用い、それ以上の精製は行わなかった。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（９９．８％Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬）および酢酸亜鉛二水和物（９９．９９９％）は、アルドリッチ（Aldrich）から入手した。
【００６１】
重炭酸カリウム（Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬）、炭酸カリウム（最小値９９％）、酢酸アンモニウム（約９８％）、酢酸マグネシウム（最小値９９％）、過硫酸アンモニウム（電気泳動試薬）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）および分子生物学的グレードの水は、それぞれシグマ（Sigma）から入手した。
【００６２】
ＮＡＰ１０カラム（Ｇ２５ＤＮＡグレードセファデックス（商標））は、アマーシャムバイオサイエンシス（Amersham Biosciences）から入手した。
【００６３】
Ｓ１ヌクレアーゼ、ｄＮＴＰｓおよびヒトゲノムＤＮＡは、プロメガ（Promega）から入手した。
【００６４】
２５ｍＭの塩化マグネシウムとジーンアンプ（GeneAmp）（商標）１０Ｘ  ＰＣＲゴールド緩衝液を含むアンプリタック・ゴールド（AmpliTaq Gold）、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼ、１０Ｘストッフェル緩衝液と２５ｍＭの塩化マグネシウムを含むストッフェルフラグメントは、それぞれアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)から入手した。
【００６５】
Ｔ７エクソヌクレアーゼは、ニューイングランドバイオラボ（New England Biolabs）から入手した。
【００６６】
ＰＣＴ−１００プログラム可能熱制御装置（Programmable Thermal Controller）（ＭＪリサーチ社：MJ Research Inc.）を用いて、インキュベーションを行った。２６０ｎｍでの吸光度測定は、ケリー１００バイオ分光光度計（バリアン社：Varian Ltd.）を用いて行った。
【００６７】
ポリアクリルアミドゲルは、プロトゲル（ProtoGel）（ナショナルダイゴノスティック：National Diagnostics）で調製し、SYBRゴールド（SYBR Gold）（モレキュラープローブス社：molecular Probes Inc.）で染色した。
【００６８】
アガロースゲルは、シーケムLEアガロース（SeaKem LE agarose）（バイオウィッテーカーモレキュラーアプリケーションズ：BioWhittaker Molecular Applications）で調製し、臭化エチジウム（アルドリッチ：Aldrich）で染色した。ゲルは、０．５Xトリス／ホウ酸塩／EDTA（TBE）緩衝液（シグマ：Sigma）で電気泳動させた。溶液は全て、高圧滅菌脱イオン水（ウォータープロシステム、ラボコンコ：WaterPro system, Labconco）を用いて調製した。
【００６９】
オリゴヌクレオチド配列
ブドウ糖−６−ホスファターゼと、中位鎖のアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼプライマーとプローブのオリゴヌクレオチド配列は、２０００年刊行のクニヒロフジイ、ヨーイチマツバラ、ジュンアカヌマ、カズトシタカハシ、シゲオクレ、ヨーイチスズキ、マスエイマイズミ、カズイエイイヌマ、オサムサカツメ、ピエロ・リナルド(Piero Rinaldo)、クニアキナリサワ著、「ヒト突然変異（Human Mutation）」の１８９〜１９６頁に開示されている。
【００７０】
βアクチンプライマーとプローブのオリゴヌクレオチド配列は、２０００年刊行のＡ．Ｍ．ジョセフソン(Josefsson)、Ｐ．Ｋ．Ｅ．マグヌソン(Magnusson)、Ｎ．イリタロー(Ilitalo)、Ｐ．ソレンソン(Sorensn)、Ｐ．Ｏ．タビン(Tubbin)、Ｐ．アンダーソン(Andersen)、Ｍ．メルビー(Melbye)、Ｈ．アダミー(Adami)、Ｕ．ギレンステン(Gyllensten)著、「ランセット（Lancet）」３５５巻、２１８９〜２１９３頁に開示されている。
【００７１】
ＨＦＥ遺伝子プライマーとプローブのオリゴヌクレオチド配列は、２００２年刊行のＬ．Ａ．ウゴゾリ(Ugozzoli)、Ｄ．チン(Chinn)、Ｋ．ハンビー(Hamby)著による「分析生化学(Analytical Biochemistry)」３０７巻、４７〜５３頁に開示されている。
【００７２】
ＡＣＴＢ（βアクチン）
プローブ
BAPR：ATG  CCC  TCC  CCC  ATG  CCA  TCC  TGC  GT
C９-T１BAPR：T(C９)G  CCC  TCC  CCC  ATG  CCA  TCC  TGC  GT
(T(C９)＝Ｃ９リンカーを持つアミノ変性チミン、式IV)
プライマー
BAF：CAG  CGG  AAC  CGC  TCA  TTG  CCA  ATG  G
BAR：TCA  CCC  ACA  CTG  TGC  CCA  TCT  ACG  A
BAFR：CAG  GTC  CCG  GCC  AGC  CAG
【００７３】
C２８２Y（ＨＦＥ遺伝子、Ｃ２８２Ｙ突然変異）
プローブ
C282YP：ATA  TAC  GTG  CCA  GGT  GGA  
プライマー
C282YF：CTG  GAT  AAC  TTG  GCT  GTA  C
C282YR：TCA  GTC  ACA  TAC  CCC  AGA  T
【００７４】
Ｈ６３Ｄ（ＨＦＥ遺伝子、Ｈ６３Ｆ突然変異）
プローブ
H63DP：ATA  TAC  GTG  CCA  GGT  GGA  
プライマー
H63DF：CTT  GGT  CTT  TCC  TTG  TTT  GAA  G
H63DR：ACA  TCT  GGC  TTG  AAA  TTC  TAC  T
【００７５】
ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）
プライマー
CFT01：AGG  CCT  AGT  TGT  CTT  ACA  GTC  CT
CFT03：TGC  CCC  CTA  ATT  TGT  TAC  TTC
【００７６】
Ｇ６ＰＣ（ブドウ糖−６−ホスファターゼ）
プローブ
GSDPR：TGT  GGA  TGT  GGC  TGA  AAG  TTT  CTG  AAC
プライマー
GSDw：CCG  ATG  GCG  AAG  CTG  AAC
GSDcom：TGC  TTT  CTT  CCA  CTC  AGG  CA
【００７７】
ＡＣＡＤＭ（中位鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ）
プローブ
MC11PR：CTA  GAA  TGA  GTT  ACC  AGA  GAG  GAG  CTT  GG  
プライマー
MC11w：GCT  GGC  TGA  AAT  GGC  AAT  GA
MC11com：CTG  CAC  AGC  ATC  AGT  AGC  TAA  CTG  A
【００７８】
ヘアピンオリゴヌクレオチド
reHP：CAG  AAT  ACA  GCA  GGT  GCT  CGC  CCG  GGC  GAG  CAC
CTG  TAT  TCT  G
【００７９】
一本鎖オリゴヌクレオチド
reBAF：CAG  AAT  ACA  GCA  GGT  TCA  CCC  ACA  CTG  TGC  CCA
TCT  ACG  A
【００８０】
実施例７および８で使用したオリゴヌクレオチドは、５’末端がＣ１２アミノ変性されたものである。他の実施例で使用したオリゴヌクレオチドは変性されていない。
【００８１】
材料および方法−電気化学的検出
以下の電極と小容量セルは、英国、チェシャー、コンレントン（Congleton, Cheshire,UK）のＢＡＳから入手した。
【００８２】
実施例４と５では、ガラス状カーボンの作用電極（カタログ番号ＭＦ−２０１２）を用いた。実施例８〜１０では、金の作用電極（カタログ番号ＭＦ−２０１４）を使用した。
【００８３】
銀−塩化銀参照電極は、カタログ番号ＭＦ−２０７９を用いた。
【００８４】
白金ワイヤの対電極（補助）は、カタログ番号ＭＷ−４１３０を用いた。
【００８５】
小容量のセル（カタログ番号ＭＦ−２０４０）は、ガラス製ボルタンメトリー瓶と、先端部に交換可能な耐熱ガラス（vycor）を設けたガラス製試料チャンバーを備える。
【００８６】
オートラボ（AutoLab）電気化学ワークステーションは、ウインザーサイエンティフィックリミテッド(Windsor Scientific Limited)から入手した。このワークステーションは、エコケミBV(Eco Chemie B.V.)製のPGSTAT３０を備えた周波数応答分析機またはμオートラボタイプIIの何れかを備えている。
【００８７】
実施例１
本実施例は、以下の実施例３〜５および８〜１０で採用する循環式ボルタンメトリー法（cyclic voltammetry method）を説明する。
【００８８】
図１の小容量セルを、約１０ｍｌの酢酸アンモニウム溶液（１００ｍM）で満たした。
【００８９】
分析用試料のアリコット２００μｌを、ガラス製試料チャンバー４に収め、これを参照電極７および対電極６と共に、小容量セル内に設置した。電極をオートラボ電気化学ワークステーションに接続し、以下に記載するパラメーターを用いて差分パルスボルタンメトリーを実行した。実験に先立ち、作用電極を研磨し（BASのカタログ番号MF−２０６０の研磨セットを使用）し、次いでコンディショニングした。電極のコンディショニングは、適当なバックグラウンド緩衝液中において、±１ボルトの範囲でスイーピングする循環ボルタンメトリーから成る。
【００９０】
差分パルスボルタンメトリーのパラメーター
【００９１】
【表１】
2005518810.tif 000016
【００９２】
【表２】
2005518810.tif 000017
【００９３】
【表３】
2005518810.tif 000018
【００９４】
実施例２−フェロセンカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル合成
フェロセンカルボン酸（３０３ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１７０ｍｇ、１．４７ｍｍｏｌ）をジオキサン（１５ｍｌ）に溶解し、この溶液を、ジオキサン（３ｍｌ）にジシクロヘキシルカルボジイミド（３０５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を溶かした溶液に攪拌下に加える。得られた混合物を室温で２４時間攪拌して沈殿物を生成させた。沈殿物を濾過して除去し、濾液から溶剤を真空除去し、残った固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに掛け、ワセリン対酢酸エチル＝８：２で溶離させて精製した。収量は３２０ｇで、収率は７４％であった。
【００９５】
実施例３−フェロセニルオリゴヌクレオチドの合成
凍結乾燥させたアミノ変性オリゴヌクレオチドを正確な量のＫ２ＣＯ３／ＫＨＣＯ３緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）で再水和し、オリゴヌクレオチド濃度を０．５ｎｍｏｌ／μｌとした。このアミノ変性オリゴヌクレオチド（４０μｌ、０．５ｎｍｏｌ／μｌ）を、フェロセンカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのＤＭＦ（４０μｌ、３７５ｍＭ）溶液に、渦状にゆっくり添加した。次に、この溶液を室温で一晩振盪した。その後、これを酢酸アンモニウム（９２０μｌ、１００ｍＭ、ｐＨ７．０）で稀釈し、２個のＮＡＰ１０カラムを使用し、最初に酢酸アンモニウム（１００ｍＭ、pH７．０）で溶離し、次に高圧滅菌脱イオン水で溶離することで精製した。フェロセニルオリゴヌクレオチドをＮＡＰ１０カラムで部分的に精製して、塩類と低分子量フェロセン種を除去し、フェロセン標識されたオリゴヌクレオチドと、標識されていないオリゴヌクレオチドの混合物を得た。使用前にこれ以上の精製を行わなかった。
構造および付着部位が異なる４種のリンカー構造、すなわち、Ｃ７、Ｃ６、Ｃ１２、Ｔ（Ｃ９）を有するアミノ変性オリゴヌクレオチドを、標識化反応に使用した。Ｃ６、Ｃ１２およびＴ（Ｃ９）リンカーは、末端のリン酸エステルまたは塩基を介して、オリゴヌクレオチドの５’末端に付着した。Ｃ７リンカーは、末端のリン酸エステルを介してオリゴヌクレオチドの３’末端に付着した。それらの構造を式Ｉ〜IVに示す。溶出液のオリゴヌクレオチド濃度は、２６０ｎｍでの吸光度を計測して測定した。フェロセン標識の存在は、ボルタンメトリック分析で確認された。
【００９６】
実施例４
Ｓ１ヌクレア−ゼの消化
オリゴヌクレオチドの消化反応液（１００μｌ）には、オリゴヌクレオチド（３．５〜９μＭ、濃度は後述）、酢酸アンモニウム（２５０ｍＭ、ｐＨ６．５）、酢酸亜鉛（４．５ｍＭ）およびＳ１ヌクレア−ゼ（０．４Ｕ／μｌ）が含まれていた。消化反応は、３７℃で１時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの完全消化は、粗製の反応混合物のアリコット１０μｌをポリアクリルアミドゲルで分析して確認した。ボルタンメトリック分析に先立って、複数回の反応液を蓄積し、最終容量を２００μｌとした。
比較のため、反応混合物からＳ１ヌクレア−ゼを除去した以外は、上と同様な"無酵素"の消化実験を行った。また、予め９５℃で１５分間加熱して熱変性させたＳ１ヌクレア−ゼを使用した上と同様な比較実験も行った。
【００９７】
以下に反応物と条件を、上記と同じように記載する。ボルタンメトリー条件は、特に記載しない限り、表１と同一である。
【００９８】
実施例４（ａ）
オリゴヌクレオチド：７炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって、３’末端が標識化されたＢＡＰＲオリゴヌクレオチド（式Ｉ）
オリゴヌクレオチドの濃度：７．０μＭ
ボルタンメトリー条件：間隔時間を０．０９ｓ、変調時間が０．５ｓと変更した以外は、表１と同じ。
【００９９】
実験結果を図２ａ〜図２ｄに示す。図２ａは"無酵素"実験での陰極掃引を、図２ｂはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陰極掃引を、図２ｃは"無酵素"実験での陽極掃引を、図２ｄはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陽極掃引をそれぞれ示す。Ｓ１ヌクレア−ゼ（すなわち、消化オリゴヌクレオチド）含有溶液のピーク値、ピーク位置、ピークエンハンスメント（％）の測定結果を、"無酵素"の比較実験と対比して表４に記す。
【０１００】
実施例４（ｂ）
オリゴヌクレオチド：６炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって５’末端で標識化されたＢＡＰＲオリゴヌクレオチド（式II）
オリゴヌクレオチドの濃度：７．０μＭ
ボルタンメトリー条件：間隔時間を０．０９ｓ、変調時間を０．５ｓとした以外は、表１と同じ。
【０１０１】
結果を図３ａ〜図３ｄに示す。図３ａは"無酵素"実験の陰極掃引を、図３ｂはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陰極掃引を、図３ｃは"無酵素"実験の陽極掃引を、図３ｄはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陽極掃引をそれぞれ示す。"Ｓ１ヌクレア−ゼ（すなわち、消化オリゴヌクレオチド）を含む溶液のピーク値、ピーク位置、ピークエンハンスメント（％）の測定結果を、無酵素"実験と比較して表２に記す。
【０１０２】
実施例４（ｃ）
オリゴヌクレオチド：９炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって３’末端で標識化されたＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチド（式IV）
オリゴヌクレオチドの濃度：８．８μＭ
ボルタンメトリー条件：表１と同じ
【０１０３】
結果を図４ａ〜図４ｄに示す。図４ａは"無酵素"実験の陰極掃引を、図４ｂはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陰極掃引を、図４ｃは"無酵素"実験の陽極掃引を、図４ｄはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陽極掃引をそれぞれ示す。Ｓ１ヌクレア−ゼ（すなわち、消化オリゴヌクレオチド）を含む溶液のピーク値、ピーク位置、ピークエンハンスメント（％）の測定結果を、"無酵素"実験と対比して表４に記す。
【０１０４】
実施例４（ｄ）
オリゴヌクレオチド：１２炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって５’末端で標識化されたＢＡＰＲオリゴヌクレオチド（式III）
オリゴヌクレオチドの濃度：７．０μＭ
ボルタンメトリー条件：間隔時間を０．０９ｓ、変調時間を０．５ｓとした以外は表１と同じ
【０１０５】
結果を図５ａ〜図５ｄに示す。図５ａは"無酵素"実験の陰極掃引を、図５ｂはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陰極掃引を、図５ｃは"無酵素"制御の陽極掃引を、図５ｄはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陽極掃引をそれぞれ示す。Ｓ１ヌクレア−ゼ（すなわち、消化オリゴヌクレオチド）を含む溶液のピーク値、ピーク位置、ピークエンハンスメント（％）の測定結果を、"無酵素"実験と対比して表４に記す。
【０１０６】
実施例４（ｅ）
オリゴヌクレオチド：１２炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって５’末端で標識化されたＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチド（式III）
オリゴヌクレオチドの濃度：３．５μＭ
ボルタンメトリー条件：表１と同じ
【０１０７】
結果を図６ａ〜図６ｄに示す。図６ａは"無酵素"実験の陰極掃引を、図６ｂはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陰極掃引を、図６ｃは"無酵素"実験の陽極掃引を、図６ｄはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陽極掃引をそれぞれ示す。Ｓ１ヌクレア−ゼ（すなわち、消化オリゴヌクレオチド）を含む溶液のピーク値、ピーク位置、ピークエンハンスメント（％）の測定結果を、"無酵素"実験と対比して表４に記す。
【０１０８】
実施例４（ｆ）
オリゴヌクレオチド：１２炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって５’末端で標識化されたＭＣｌｌＰＲオリゴヌクレオチド（式III）
オリゴヌクレオチドの濃度：３．５μＭ
ボルタンメトリー条件：表１と同じ
【０１０９】
結果を図７ａ〜図７ｄに示す。図７ａは"無酵素"実験の陰極掃引を、図７ｂはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陰極掃引を、図７ｃは"無酵素"実験の陽極掃引を、図７ｄはＳ１ヌクレア−ゼを含む溶液の陽極掃引をそれぞれ示す。Ｓ１ヌクレア−ゼ（すなわち、消化オリゴヌクレオチド）を含む溶液のピーク値、ピーク位置、ピークエンハンスメント（％）の測定結果を、"無酵素"実験と対比して表４に記す。
【０１１０】
実施例４（ｇ）（比較例）
オリゴヌクレオチド：無標識のＢＡＦＲ
オリゴヌクレオチドの濃度：８．８μＭ
ボルタンメトリー条件：表１と同じ
【０１１１】
結果を図８ａ（陰極掃引）と図８ｂ（陽極掃引）に記す。何れの掃引にもピークは認められなかった。
【０１１２】
実施例４（ｈ）（比較例）
オリゴヌクレオチド：９炭素スペーサー原子団を持つフェロセンによって５’末端で標識化されたＴｌＢＡＰＲオリゴヌクレオチド（式IV）
オリゴヌクレオチドの濃度：８．８μＭ
ボルタンメトリー条件：表１と同じ
【０１１３】
結果を図９ａ（"無酵素"制御の陽極掃引）と図９ｂ（Ｓ１ヌクレア−ゼを含む加熱酵素制御の陽極掃引）に記す。図９ａにおいて６０．６μＡのピーク値（ピーク位置は４２４ｍＶ）が記録され、図９ｂにおいては３９．９μＡのピーク値（ピーク位置は４０９ｍＶ）が記録された。
【０１１４】
フェロセン関連のピークは、３００〜５００ｍＶで観察された。フェロセン化されない（non-ferrocenylated）オリゴヌクレオチドを分析した時にはこの電位範囲でのピークは観察されなかった（図８ａおよび８ｂ）。消化したフェロセニル標識オリゴヌクレオチドと無酵素の比較実験を対比すると、オリゴヌクレオチドを消化することでピーク値が上昇することが分かる（表４）。
【０１１５】
観察された変化が酵素または酵素貯蔵緩衝液成分の存在によるものでないことを確認するために、加熱変性された酵素を使用した実験を行った（実施例４（ｈ））。加熱変性酵素実験と無酵素実験との間には、フェロセン信号に有意な変化は認められなかった。
【０１１６】
Ｃ１２フェロセンオリゴヌクレオチドリンカーを備えた２つのオリゴヌクレオチド配列、すなわち、フェロセン−Ｃ１２−ＭＣｌｌＰＲおよびフェロセン−Ｃ１２−ＧＳＤＰＲについて、さらに別の消化実験を行った（図６および１０）。それぞれの配列において、消化オリゴヌクレオチドのフェロセン関連信号において、ピーク高さの上昇が認められた。
【０１１７】
【表４】
2005518810.tif 000019
【０１１８】
2005518810.tif 000020
【０１１９】
実施例５−ＰＣＲ
ヒトゲノムＤＮＡ（１００μｌ反応につき４０ｎｇ）またはゲル精製ＰＣＲアンプリコンからＰＣＲ増幅を行った。後続の増幅に使用したＰＣＲアンプリコンは、提供されている手順書に従い、ヌクレオスピン抽出セット（Nucleospin Extract kits）（マチェリー・ナゲル：Macherey-Nagel）を用いてアガロースゲルで精製した。全てのフェロセニルオリゴヌクレオチドプローブは、３’位でリン酸エステル化されていた。
【０１２０】
個々の反応に使用されたプライマー、テンプレート、プローブを以下に示す。
【０１２１】
１００μｌの反応液は、トリスＨＣＬ（１５ｍＭ、ｐＨ８．０）、塩化カリウム（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（３．５ｍＭ）、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（各２００μＭ）、フォワードプライマー（１．０μＭ）、リバースプライマー（１．０μＭ）、フェロセニルオリゴヌクレオチドプローブ（０．９μＭ）、アンプリタックゴールド（０．０４Ｕμｌ−１）を含んでいた。各試料を９５℃で１０分間インキュベートし（初期変性と酵素の活性化）、その後、９５℃で１５秒間の変性を40回繰り返し,さらに、プライマーのアニーリングおよび伸長を６０℃で１分間行った。
【０１２２】
１００μｌの反応液を１５個調製してプールした。ボルタンメトリック分析に先立って、粗製の反応混合物を濃縮して総量を２００μｌとした。
【０１２３】
以下に反応物と条件を、上記と同じように記載する。ボルタンメトリー条件は、特に記載しない限り、表１と同一である。
【０１２４】
実施例５（ａ）
オリゴヌクレオチド：１２炭素スペーサー原子団の５’末端が標識化されたＢＡＰＲオリゴヌクレオチド（式III）
陽性反応：（βアクチン）テンプレート：βアクチンＰＣＲアンプリコン；プライマー：ＢＡＦ、ＢＡＲ
陰性反応：（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）テンプレート：嚢胞性線維症ＰＣＲアンプリコン；プライマー：ＣＦＴ０１、ＣＦＴ０３
ボルタンメトリー条件：表１と同じ
【０１２５】
結果は以下のとおりである：
図１０ａ    陰性反応、陰極掃引、ピークは観察されなかった
図１０ｂ    陽性反応、陰極掃引、ピーク位置：４９３ｍＶ、ピーク高さ：１９．４ｎＡ
図１０ｃ    陰性反応、陽極掃引、ピークは観察されなかった
図１０ｄ    陽性反応、陽極掃引、ピーク位置：３７３ｍＶ、ピーク高さ：２７．３ｎＡ
【０１２６】
実施例５（ｂ）
オリゴヌクレオチド：１２炭素スペーサー原子団の５’末端が標識化されたＭＣｌｌＰＲオリゴヌクレオチド（式III）
陽性反応：（中位鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ）テンプレート：ＭＣＡＤＰＣＲアンプリコンまたはゲノムテンプレート；プライマー：ＭＣ１１ｗ、ＭＣ１１ｃｏｍ
陰性反応：（グルコース−６−リン酸ホスファターゼ）テンプレート：グルコース−６−リン酸ホスファターゼＰＣＲアンプリコン；プライマー：ＧＳＤｗ、ＧＳＤｃｏｍ
【０１２７】
結果は以下のとおりである：
図１１ａ    陰性反応、陽極掃引、ピーク位置：４２９ｍＶ、ピーク高さ：１．８４ｎＡ
図１１ｂ    陽性反応（ＰＣＲアンプリコンテンプレート）、陽極掃引、ピーク位置：３８８ｍＶ、ピーク高さ：７．６２ｎＡ
図１１ｃ    陽性反応（ゲノムテンプレート）、陽極掃引、ピーク位置：４０９ｍＶ、ピーク高さ：８．１１ｎＡ
【０１２８】
実施例５（ｃ）
オリゴヌクレオチド：９炭素スペーサー原子団の５’末端が標識化されたＴｌＢＡＰＲオリゴヌクレオチド
陽性反応：（βアクチン）テンプレート：ヒトゲノムＤＮＡ；プライマー：ＢＡＦ、ＢＡＲ
陰性反応：（グルコース−６−リン酸ホスファターゼ）テンプレート：ヒトゲノムＤＮＡ；プライマー：ＧＳＤｗ、ＧＳＤｃｏｍ
ボルタンメトリー条件：表１と同じ
【０１２９】
結果は以下のとおりである：
図１２ａ    陰性反応、陽極掃引
図１２ｂ    陽性反応、陽極掃引、ピーク位置：４２９ｍＶ、ピーク高さ：３６ｎＡ
図１２ｃ    陰性反応、陰極掃引
図１２ｄ    陽性反応、陰極掃引、ピーク位置：４９８ｍＶ、ピーク高さ：１４ｎＡ
【０１３０】
実施例５（ｄ）
オリゴヌクレオチド：１２炭素スペーサー原子団の５’末端が標識化されたＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチド
陽性反応：（グルコース−６−リン酸ホスファターゼ）テンプレート：ヒトゲノムＤＮＡ；プライマー：ＧＳＤｗ、ＧＳＤｃｏｍ
陰性反応：（βアクチン）テンプレート：ヒトゲノムＤＮＡ；プライマー：ＢＡＦ、ＢＡＲ
【０１３１】
結果は以下のとおりである：
図１３ａ    性反応、陽極掃引
図１３ｂ    陽性反応、陽極掃引、ピーク位置：４３９ｍＶ、ピーク高さ：２３ｎＡ
図１３ｃ    陰性反応、陰極掃引
図１３ｄ    陽性反応、陰極掃引
【０１３２】
この実施例では、フェロセニルオリゴヌクレオチドプローブを用いたＰＣＲ生成物の配列特異検出を説明するために、予め最適化した蛍光発生的な（fluorogenic）５’ヌクレアーゼ検定からのプローブとプライマー配列を用いた。βアクチングルコース−６−リン酸ホスファターゼおよび中位鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子からのＰＣＲ増幅は、精製アンプリコンまたはヒトゲノムＤＮＡテンプレートの何れかを用いて実施した。ＰＣＲ実験で使用されたプローブは、全て５’末端にＣ１２フェロセンリンカーが付着したプローブを使用した。ＰＣＲ実験で使用されたプローブの３’末端は、全てリン酸化によって伸長がブロックされている。
【０１３３】
フェロセニルオリゴヌクレオチドプローブを、相補的標的（陽性反応）および非相補的標的（陰性反応）を増幅したＰＣＲ混合物に添加した。フェロセン種の検出を向上させるため、ボルタンメトリック分析に先立って、反応を組合せて濃縮した。
【０１３４】
ボルタンメトリック分析は、粗製のＰＣＲ混合物について行った（図１０および１１）。各々の分析で、フェロセン関連信号は、陽性反応（消化プローブを含有）で観察される。陰性反応（非消化プローブを含有）では、信号が観察されない。
【０１３５】
実施例６（ａ）  フェロセンカルボニルアジドの合成
フェロセンカルボン酸を塩化オキサリルとアジ化ナトリウムに反応させてフェロセンカルボニルアジドを調製した。
【０１３６】
実施例６（ｂ）  ４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
【化１５】
2005518810.tif 000021
【０１３７】
清浄にした丸底フラスコに、窒素下でフェロセンカルボニルアジド（３００ｍｇ、１．１８mmol、１．００当量）、４−アミノ安息香酸（２４４ｍｇ、１．７８mmol、１．５０当量）、１，４−ジオキサン（４０ｍｌ）を窒素雰囲気中で収容した。この混合物を窒素下で１００℃の湯煎を行いながら２時間５０分間攪拌して室温まで冷ました。２Ｍの塩酸（１００ｍｌ）を反応混合物に加え、生成物を酢酸エチル（１５０ｍｌ）に抽出した。この相を２Ｍの塩酸（１００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空内で濃縮して生成物を得た。これを真空乾燥器でさらに乾燥して、結晶を得た（４１３ｍｇ、９６％）。１Ｈ−ＮＭＲδ（３００ＭＨｚ、ｄ６−ＤＳＭＯ）、３．９６（２Ｈ，ｂ，Ｈｃ），４．１４（５Ｈ，ｓ，Ｈａ），４．５３（２Ｈ，ｂ，Ｈｂ），７．５４（２Ｈ，ｍ，Ｈｆ），７．８５（２Ｈ、ｍ、Ｈｇ）、７．９８（１Ｈ，ｓ，Ｈｄ）、８．８７（１Ｈ，ｓ，Ｈｅ）、１２．５７（１Ｈ、ｓ、Ｈｈ）、１３Ｃ−ＮＭＲδ（７５．５ＭＨｚ、ｄ６−ＤＳＭＯ），６１．０，６４．１，６６．７，６８．１（Ｃａ，ｄ），１１７．２（Ｃｇ），１２３．５（Ｃｊ），１３０．９（Ｃｈ），１４４．６（Ｃｆ），１５２．８（Ｃｅ）。
【０１３８】
実施例６（ｃ）  ４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの合成
ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１９４ｍｇ、０．９３９ｍｍｏｌ、１．１４当量）を、無水１，４−ジオキサン（２ｍｌ）に溶解し、これを窒素雰囲気下で清浄な丸底フラスコに収め、さらに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０８ｍｇ、０．９３９ｍｍｏｌ、１．１４当量）を加えた。４−（３’−フェロセニルウレイド）−１−安息香酸（３００ｍｇ、０．８２３ｍｍｏｌ、１．０当量）を、無水１，４−ジオキサン（１３ｍｌ）に溶解し、前記のフラスコに滴下し、溶液を２３時間室温で攪拌した。赤／オレンジの反応混合物からブフナー濾過で少量の薄褐色結晶を除去した。反応混合物に水（１００ｍｌ）と酢酸エチル（５０ｍｌ）を加え、酢酸エチル相を分離し、水相を酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。２つ酢酸エチル相を併せて、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空で濃縮することで、オレンジ色のオイル状粗製生成物を得た。シリカフラッシュクロマトグラフィーを用い、酢酸エチル６０／石油エーテル（ｂｐ４０〜６０℃）４０から酢酸エチルへの勾配系にて、前記の粗製生成物を精製した。真空乾燥により、４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、オレンジ色の微細結晶（２３７ｍｇ、６６％）の形で得た。Ｒｆ（酢酸エチル／石油エーテル５：１（ｂｐ＝４０〜６０℃）＝０．４１、１Ｈ−ＮＭＲδ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＳＭＯ）、２．８８（４Ｈ，ｓ，Ｈｈ）、３．９８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈｃ）、４．１６（５Ｈ，ｓ，Ｈａ）、４．５５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈｂ）、７．６８（２Ｈ，ｍ，Ｈｆ）、８．００（２Ｈ，ｍ，Ｈｇ）、８．１１（１Ｈ，ｓ，Ｈｄ）、９．１６（１Ｈ，ｓ，Ｈｅ）、１３Ｃ−ＮＭＲδ（７５．５ＭＨｚ，ｄ６−ＤＳＭＯ）、２５．９（Ｃｌ）、６１．１、６４．２（ＣｂとＣｃ）、６９．１（Ｃａ）、１１７．７（Ｃｇ）、１３１．９（Ｃｈ）、１７０．９（Ｃｋ）、ＭＳ（ＦＡＢ＋ｍ／ｚ）４６２．０７[Ｍ＋Ｈ]。
【０１３９】
実施例６（ｄ）  ３，５−ジ（３’−フェロセニルウレイド）−１−安息香酸の合成
【化１６】
2005518810.tif 000022
【０１４０】
清浄な丸底フラスコに、フェロセンカルボニルアジド（８００ｍｇ、３．１４mmol、２．５当量）、３，５−ジアミノ安息香酸（１９４ｍｇ、１．２５mmol、１．００当量）、１，４−ジオキサン（６０ｍｌ）を窒素雰囲気で収容した。窒素下でこの反応混合物を１００℃の湯煎で１時間攪拌し、室温まで冷却した。冷却した反応混合物に水（３００ｍｌ）と酢酸エチル（１５０ｍｌ）を添加した。分離を促進するため水相に塩酸を加えた。酢酸エチル相を水（１００ｍｌ）で洗浄後、静置して固体を沈殿させた。液相を真空濃縮してオレンジ色のオイル状粗製生成物を得た後、トルエン（１００ｍｌ）と共沸させて乾燥し、薄オレンジ色の固体を得た。シリカフラッシュクロマトグラフィーを使用し、ＤＣＭ９０／ＭｅＯＨ１０からＤＣＭ５０／ＭｅＯＨ５０の勾配系にて、前記の固体生成物を精製した。真空乾燥によりオレンジ色の結晶（２０５ｍｇ、２７％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲδ（３００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＳＭＯ）、３．９５（４Ｈ，ｂ，Ｈｅ）、４．１４（１０Ｈ，ｓ，Ｈａ）、４．５４（４Ｈ，ｂ，Ｈｂ）、７．６９（２Ｈ，ｓ，Ｈｆ）、７．８１（１Ｈ，ｓ，Ｈｇ）、８．０８（２Ｈ，ｓ，Ｈｄ）、８．９４（２Ｈ，ｓ，Ｈｅ）、ＭＳ（ＦＡＢ＋ｍ／ｚ）６０７．０７[Ｍ＋Ｈ]。
【０１４１】
実施例７  ４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸オリゴヌクレオチドの合成
５ｎｍｏｌ／μｌ濃度のオリゴヌクレオチドを得るのに適量のＫ２ＣＯ３／ＫＨＣＯ３緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ９．０）にて、凍結乾燥したアミノ変性変異オリゴヌクレオチドを再水和した。アミノ変性オリゴヌクレオチド（４０μｌ、０．５ｎｍｏｌμｌ−１）を、フェロセン活性エステルのＤＭＳＯ溶液（４０μｌ、３７５ｍＭ）に、渦巻状に徐々に添加した。得られた溶液を室温で一晩攪拌し、その後、酢酸アンモニウム（９２０μｌ、１００ｍＭ、ｐＨ７．０）で稀釈し、２個のＮＡＰ１０カラムを使用して精製（提示された手順に従う）し、初めに酢酸アンモニウム（１００ｍＭ、pH７．０）で溶離させ、次に加圧滅菌した脱イオン水で溶離させた。溶離液のオリゴヌクレオチド濃度は２６０ｎｍで吸光度を測定した。ボルタンメトリック分析でフェロセン標識の存在を確認した。
【０１４２】
実施例８  ４−（３’−フェロセニルウレイド）−１−安息香酸で標識化させた基質／プローブを用いたＳ１ヌクレア−ゼおよびＰＣＲ
４−（３’−フェロセニルウレイド）−１−安息香酸標識化基質／プローブと、表２に記載のボルタンメトリーパラメーターを用いて、実施例４と実施例５を繰り返した。試薬濃度は全て、実施例４、５に記載したものと同じである。４−（３’−フェロセニルレウイド）−１−安息香酸ヌクレオチドのピーク電位は、フェロセン標識化ヌクレオチドと比較して低い。これにより電気化学的マーカーの検出感度が高まる。実施例８の実験では、従って、実施例４と５で行った試料の濃縮を行う必要はなく、手順は大幅に簡素化された。実施例８の結果（記載省略）は、試料の濃縮プロセスを省いても、高感度であることを示すものであった。
【０１４３】
実施例９  Ｔ７エクソヌクレアーゼの基質特異性
２００μｌのヘアピンオリゴヌクレオチドと、２００μｌの一本鎖オリゴヌクレオチドを、それぞれ濃度７μＭの１ｘＴ７反応緩衝液を充填した別々の反応チューブに添加した。Ｔ７酵素を各チューブに添加し（５μｌ、２Ｕ／μｌ）、混合物を２５℃で1時間インキュベートした。オリゴは両方とも予めＣ１２リンカーを介してフェロセンで標識化されている。
【０１４４】
結果は以下のとおりである：
図１６ａのラインＡ    ヘアピンオリゴヌクレオチド二本鎖の消化
図１６ａのラインＢ    ヘアピンオリゴヌクレオチド、無酵素対照
図１６ｂのラインＡ    一本鎖オリゴヌクレオチドの消化
図１６ｂのラインＢ    一本鎖オリゴヌクレオチドの無酵素対照
【０１４５】
実施例１０  Ｔ７エクソヌクレアーゼ消化を用いるＰＣＲ増幅
実施例１０（ａ）  ５’フェロセン化プライマー及びＴ７エクソヌクレアーゼ消化を用いるＰＣＲ増幅
ヒトゲノムＤＮＡ（１００μｌ反応につきｌ４０ｎｇ）からＰＣＲ増幅を実行した。個々の反応で使用するプライマー、テンプレートおよびプローブは、結果の欄に詳述する。１００μｌの反応液に含まれたのは、トリスＨＣｌ（１５ｍＭ、ｐＨ８．０）、塩化カリウム（５０ｍＭ）、塩化マグネシウム（３．５ｍＭ）、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（各２００μＭ）、５’フェロセン化フォワードプライマー（０．５μＭ）、リバースプライマー（０．５μＭ）、アンプリタックゴールドポリメラーゼ（０．１Ｕμｌ−１）、ＢＳＡ（０．１ｍｇμｌ−１）である。各試料は９５℃で１０分間インキュベートされ（初期変性および酵素活性）、その後、９５℃で１５秒間の変性と、６０℃で１分間のプライマーのアニーリングおよび伸長を４０サイクル繰り返した。試料を即座に２５℃に冷却し、２５℃で５分間インキュベートした。Ｔ７エクソヌクレアーゼ（５μｌ、２Ｕμｌ−１）を粗製のＰＣＲ混合物に添加してさらに２０分間インキュベートした。
１００μｌ反応液を２つ調製し、ボルタンメトリック分析に先駆けてプールした。
【０１４６】
結果は以下のとおりである：
フォワードプライマー：Ｃ１２リンカーを介してフェロセン化されたＭＷ１１ｗ
リバースプライマー：ＭＣ１１ｃｏｍ
図１７ａのラインＡ    ＭＣＡＤ  ＰＣＲ増幅陽性
図１７ａのラインＢ    ＭＣＡＤ  ＰＣＲ無タック陰性対照
図１７ｂのラインＡおよびＢ    基線修正データを付した以外は、図１７ａと同じ
【０１４７】
実施例１０（ｂ） 非変性プライマー、終末点プローブアニーリング、Ｔ７エクソヌクレアーゼ消化を用いるＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅を上述したとおりに行った。ＰＣＲを完成させるのに、試料を９５℃で２分間加熱し、この間にフェロセン化したオリゴヌクレオチドプローブを添加した（最終濃度０．５μＭ）。試料を２５℃に冷却し、２５℃で５分間インキュベートした。Ｔ７エクソヌクレアーゼ（５μｌ、２Ｕμｌ−１）を粗製ＰＣＲ混合物に添加し、試料をさらに２０分間インキュベートした。
１００μｌ反応を２つ調製し、ボルタンメトリック分析に先駆けてプールした。
【０１４８】
結果は以下のとおりである：
βアクチンＰＣＲ増幅
ラインＡは、陽性ＰＣＲ標的増幅反応を示し、ラインＢは、全て無標的増幅対照を示す。
プローブ：Ｃ１２リンカーを介してフェロセン化したＢＡＰＲ
フォワード標的増幅プライマー：ＢＡＦ
リバース標的増幅プライマー：ＢＡＲ
フォワード無標的増幅プライマー：ＧＳＤＦ
リバース無標的増幅プライマー：ＧＳＤＲ
図１８ａ    標準データ、陽極掃引
図１８ｂ    基線修正データ、陽極掃引
【０１４９】
ＨＦＥ遺伝子ＰＣＲ増幅
ラインＡは、陽性ＰＣＲ標的増幅反応を示し、ラインＢは、全て無標的増幅対照を示す。
プローブ：Ｃ１２リンカーを介してフェロセン化したＨ６３ＤＰ
フォワード標的増幅プライマー：Ｈ６３ＤＦ
リバース標的増幅プライマー：Ｈ６３ＤＲ
フォワード無標的増幅プライマー：Ｃ２８２ＹＦ
リバース無標的増幅プライマー：Ｃ２８２ＹＲ
図１９ａ    標準データ、陽極掃引
図１９ｂ    基線修正データ、陽極掃引
【０１５０】
ＨＦＥ遺伝子ＰＣＲのＣ２８２Ｙ突然変異増幅
ラインＡは、陽性ＰＣＲ標的増幅反応を示し、ラインＢは全て、無標的増幅対照を示す。
プローブ：Ｃ１２リンカーを介してフェロセン化したＣ２８２ＹＰ
フォワード標的増幅プライマー：Ｃ２８２ＹＦ
リバース標的増幅プライマー：Ｃ２８２ＹＲ
フォワード無標的増幅プライマー：Ｈ６３ＤＦ
リバース無標的増幅プライマー：Ｈ６３ＤＲ
図２０ａ    標準データ、陽極掃引
図２０ｂ    基線修正データ、陽極掃引
【０１５１】
実施例１０（ｃ） 非変性プライマー、終点プローブアニーリング、Ｔ７エクソヌクレアーゼ消化を用いるＰＣＲ増幅：シュトッフェルフラグメント
アンプリタックゴールドＤＮＡポリメラーゼおよび供給緩衝液を、アンプリタックＤＮＡポリメラーゼシュトッフェルフラグメントおよび供給緩衝液に変更した以外、前項で述べたとおりにＰＣＲ、プローブアニーリングおよびＴ７エクソヌクレアーゼ消化を行った。
【０１５２】
結果は以下のとおりである：
ＨＦＥ遺伝子ＰＣＲ増幅
ラインＡは陽性、ＰＣＲ標的増幅反応を示し、ラインＢは全て、無標的増幅対照を示す。
プローブ：Ｃ１２リンカーを介してフェロセン化したＣ２８２ＹＰ
フォワード標的増幅プライマー：Ｃ２８２ＹＦ
リバース標的増幅プライマー：Ｃ２８２ＹＲ
フォワード無標的増幅プライマー： Ｈ６３ＤＦ
リバース無標的増幅プライマー：Ｈ６３ＤＲ
図２１ａ    標準データ、陽極掃引
図２１ｂ    基線修正データ、陽極掃引
【０１５３】
実施例１０（ｄ） 非変性プライマー、終末点プローブアニーリング、Ｔ７エクソヌクレアーゼ消化を用いるＰＣＲ増幅：Ｔ７エクソヌクレアーゼの対照なし
アンプリタックゴールドＤＮＡポリメラーゼを使用して実施例９ｃで述べたとおりにＰＣＲおよびプローブアニーリングを行った。Ｔ７エクソヌクレアーゼはＰＣＲ混合物に添加しなかった。
結果は以下のとおりである：
ＨＦＥ遺伝子ＰＣＲ増幅
ラインＡは、陽性ＰＣＲ標的増幅反応を示し、ラインＢは全て、無標的増幅対照を示す。
プローブ：Ｃ１２リンカーを介してフェロセン化したＣ２８２ＹＰ
フォワード標的増幅プライマー：Ｃ２８２ＹＦ
リバース標的増幅プライマー：Ｃ２８２ＹＲ
フォワード無標的増幅プライマー： Ｈ６３ＤＦ
リバース無標的増幅プライマー：Ｈ６３ＤＲ
図２２ａ    標準データ、陽極掃引
図２２ｂ    基線修正データ、陽極掃引
【０１５４】
実施例１１  フェロセンカルボン酸および４−（３’−フェロセニルウレイド）−１−安息香酸の差分パルスボルタンモグラム分析
１０％のＤＭＳＯを含む１００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液を使用して、濃度１０μＭと濃度１μＭのフェロセンカルボン酸溶液を調製し、同様にして、濃度１０μＭと、濃度１μＭの４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸溶液を調製した。各試料２００μｌについて、金の作用電極を用い、実施例１に記載した装置にて差分パルス分析を行った。差分パルスの条件は表３に示したものと同じである。ボルタンモグラムを図２３に示すが、図２３（ａ）および図２３（ｂ）はそれぞれ、１０μＭおよび１μＭのフェロセンカルボン酸のボルタンモグラムである。図２３（ｃ）および２３（ｄ）はそれぞれ、１０μＭおよび１μＭの４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸のボルタンモグラムを示す。
【０１５５】
実施例１２  フェロセン化オリゴヌクレオチド混合物のＳ１ヌクレア−ゼ消化の差分パルスボルタンモグラム分析
実施例４に詳述したところに従って、３つのオリゴヌクレオチド消化反応を実施した。反応（ａ）では、１２炭素スペーサー原子団（２．５μＭ）を持つフェロセンによって５’末端が標識化されたＢＡＰＲオリゴヌクレオチドと、１２炭素スペーサー原子団（１．５μＭ）を持つ４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸によって５’末端が標識化されたＭＣ１１ｗオリゴヌクレオチドとを基質に使用した。反応（ｂ）では、１２炭素スペーサー原子団（２．５μＭ）を持つフェロセンによって５’末端が標識化されたＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを基質に用いた。反応（ｃ）では、１２炭素スペーサー原子団（１．５μＭ）を持つ４−（３’−フェロセニルウレイド）−１−安息香酸によって５’末端が標識化されたＭＣｌｌｗオリゴヌクレオチドを基質に使用した。
【０１５６】
各消化反応が完遂した後、最終電位を０．５Ｖとした以外は表３に示す条件で、差分パルスボルタンメトリーによる反応混合物の分析を行った。ボルタンモグラムを、図２４（ａ）、２４（ｂ）、２４（ｃ）にそれぞれ示す。データは基線修正と共に提示されている。図から明らかなように、４−（３’−フェロセニルウレイド）−１−安息香酸の標識では、差分パルスボルタンモグラムのピークが１３０ｍＶ近くであるが、フェロセン標識のピークは３７０ｍＶの辺りである。図２４（ａ）に示すように、ピークは混合物内で分割できる程度に十分離れている。２つのピークが分割可能なため、この２つの標識は、同じ反応混合物内の２個の異なる標的配列を同時に調べる多重実験で使用するのに適している。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】実施例で記載した差分パルスボルタンメトリー測定に使用される電気化学セルの概略図。
【図２ａ】実施例４（ａ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図２ｂ】実施例４（ａ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図２ｃ】実施例４（ａ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図２ｄ】実施例４（ａ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図３ａ】実施例４（ｂ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図３ｂ】実施例４（ｂ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図３ｃ】実施例４（ｂ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図３ｄ】実施例４（ｂ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図４ａ】実施例４（ｃ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図４ｂ】実施例４（ｃ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図４ｃ】実施例４（ｃ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図４ｄ】実施例４（ｃ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図５ａ】実施例４（ｄ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図５ｂ】実施例４（ｄ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図５ｃ】実施例４（ｄ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図５ｄ】実施例４（ｄ）に記載したフェロセン標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図６ａ】実施例４（ｅ）に記載したフェロセン標識ＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図６ｂ】実施例４（ｅ）に記載したフェロセン標識ＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図６ｃ】実施例４（ｅ）に記載したフェロセン標識ＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図６ｄ】実施例４（ｅ）に記載したフェロセン標識ＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図７ａ】実施例４（ｆ）に記載したフェロセン標識ＭＣ１１ＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図７ｂ】実施例４（ｆ）に記載したフェロセン標識ＭＣ１１ＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図７ｃ】実施例４（ｆ）に記載したフェロセン標識ＭＣ１１ＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図７ｄ】実施例４（ｆ）に記載したフェロセン標識ＭＣ１１ＰＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図８ａ】実施例４（ｇ）に記載した無標識ＢＡＦＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図８ｂ】実施例４（ｇ）に記載した無標識ＢＡＦＲオリゴヌクレオチドの差分パルスボルタンモグラム。
【図９ａ】実施例４（ｈ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの制御反応の差分パルスボルタンモグラム。
【図９ｂ】実施例４（ｈ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドの制御反応の差分パルスボルタンモグラム。
【図１０ａ】実施例５（ａ）に記載した標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１０ｂ】実施例５（ａ）に記載した標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１０ｃ】実施例５（ａ）に記載した標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１０ｄ】実施例５（ａ）に記載した標識ＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１１ａ】実施例５（ｂ）に記載したフェロセン標識ＭＣ１１ＰＲオリゴヌクレオチドを含む別のＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１１ｂ】実施例５（ｂ）に記載したフェロセン標識ＭＣ１１ＰＲオリゴヌクレオチドを含む別のＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１１ｃ】実施例５（ｂ）に記載したフェロセン標識ＭＣ１１ＰＲオリゴヌクレオチドを含む別のＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１１ｄ】実施例５（ｂ）に記載したフェロセン標識ＭＣ１１ＰＲオリゴヌクレオチドを含む別のＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１２ａ】実施例５（ｃ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１２ｂ】実施例５（ｃ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１２ｃ】実施例５（ｃ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１２ｄ】実施例５（ｃ）に記載したフェロセン標識ＴＩＢＡＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１３ａ】実施例５（ｄ）に記載したフェロセン標識ＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１３ｂ】実施例５（ｄ）に記載したフェロセン標識ＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１３ｃ】実施例５（ｄ）に記載したフェロセン標識ＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１３ｄ】実施例５（ｄ）に記載したフェロセン標識ＧＳＤＰＲオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ混合物の差分パルスボルタンモグラム。
【図１４ａ】本発明の方法で使用されるインベーダー・蛍光発生的核酸検出システムの概略図。
【図１４ｂ】本発明の方法で使用されるインベーダー・蛍光発生的核酸検出システムの概略図。
【図１５ａ】Ｔ７エクソヌクレアーゼ検定における本発明の方法の説明図。
【図１５ｂ】ＰＣＲ生成物にアニールされる標識オリゴヌクレオチドプローブのＴ７エクソヌクレアーゼ消化を組合せた検定における本発明の方法の説明図。
【図１６ａ】Ｔ７エクソヌクレアーゼ基質特異性を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例９）。
【図１６ｂ】Ｔ７エクソヌクレアーゼ基質特異性を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例９）。
【図１７ａ】５’フェロセン化プライマーで標識されたＰＣＲ生成物のＴ７エクソヌクレアーゼ消化を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ａ））。
【図１７ｂ】５’フェロセン化プライマーで標識されたＰＣＲ生成物のＴ７エクソヌクレアーゼ消化を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ａ））。
【図１８】ＰＣＲ生成物にアニールされるタックマン（商標：アプライドバイオシステムズ）プローブのＴ７エクソヌクレアーゼ消化を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ｂ））。
【図１９】ＰＣＲ生成物にアニールされるタックマン（商標：アプライドバイオシステムズ）プローブのＴ７エクソヌクレアーゼ消化を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ｂ））。
【図２０】ＰＣＲ生成物にアニールされるタックマン（商標：アプライドバイオシステムズ）プローブのＴ７エクソヌクレアーゼ消化を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ｂ））。
【図２１ａ】シュトッフェルフラグメントを用いたＰＣＲ増幅を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ｃ））。
【図２１ｂ】シュトッフェルフラグメントを用いたＰＣＲ増幅を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ｃ））。
【図２２ａ】Ｔ７エクソヌクレアーゼを使用しない実験を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ｄ））。
【図２２ｂ】Ｔ７エクソヌクレアーゼを使用しない実験を示す差分パルスボルタンモグラム（実施例１０（ｄ））。
【図２３ａ】濃度がそれぞれ１０μＭおよび１μＭのフェロセンカルボン酸の電極電位を示す差分パルスボルタンモグラム。
【図２３ｂ】濃度がそれぞれ１０μＭおよび１μＭのフェロセンカルボン酸の電極電位を示す差分パルスボルタンモグラム。
【図２３ｃ】濃度がそれぞれ１０μＭおよび１μＭの４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸の電極電位を示す差分パルスボルタンモグラム。
【図２３ｄ】濃度がそれぞれ１０μＭおよび１μＭの４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸の電極電位を示す差分パルスボルタンモグラム。
【図２４】基質が下記の（ａ）〜（ｃ）であるヌクレア−ゼ消化反応による生成物の差分パルスボルタンモグラム。  （ａ）１２炭素スペーサー原子団（２．５μＭ）を持つフェロセンによって５’末端が標識されたＢＡＰＲオリゴヌクレオチドと、１２炭素スペーサー原子団（１．５μＭ）を持つ４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸によって５’末端が標識されたＭＣ１１ｗオリゴヌクレオチド、  （ｂ）１２炭素スペーサー原子団（２．５μＭ）持つフェロセンによって５’末端が標識されたＢＡＰＲオリゴヌクレオチド、  （ｃ）１２炭素スペーサー原子団（１．５μＭ）を持つの４−（３’−フェロセニルレイド）−１−安息香酸によって５’末端が標識されたＭＣ１１ｗオリゴヌクレオチド、
【図１】
2005518810.tif 000023
【図２ａ】
2005518810.tif 000024
【図２ｂ】
2005518810.tif 000025
【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１ａ】
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【図２１ｂ】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３ａ】
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【図２３ｂ】
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【図２３ｃ】
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【図２３ｄ】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【国際調査報告】
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2005518810.tif 000095