(57)【要約】本発明は、プレプロタキキニン(NKNA)遺伝子における一塩基多型と、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性とを相関付ける方法に関する。本発明は、さらに、NKNA遺伝子における少なくとも1つの一塩基多型を決定する段階を含む、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する方法に関する。本方法は、NKNA遺伝子における特異的な一塩基多型を決定し、NKNAにおける多型を参照することによって、ヒトにおける薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定することに基づいている。本発明は、さらに、本明細書で定義された多型を配列内に含む単離された核酸、このような核酸にハイブリダイズすることができる核酸プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにこのようなプライマーおよびプローブの1つまたはそれ以上を含む、NKNA遺伝子における多型を検出するための診断キット、NK-1受容体アンタゴニストおよび多型について試験されたヒトに薬物を投与するための説明書を含む薬学的パック、ならびにNKNA遺伝子における多型の配列情報が保存されているコンピュータ可読媒体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
NKNA遺伝子における一塩基多型と、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性とを相関付ける方法であり、以下の段階を含む方法:
ヒトのNKNA遺伝子における一塩基多型を決定する段階、および
NKNA遺伝子における多型を参照することによって、薬学的に活性な化合物が投与される該ヒトの状態を決定する段階。
【請求項２】
NKNA遺伝子を含む図2のヌクレオチド配列の位置、33612位、33949位、37025位、37114位、37434位、41112位、および41172位の少なくとも1つまたはそれ以上にあるヌクレオチドが決定される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
図2のヌクレオチドの位置により定義されるNKNA遺伝子の41172位のヌクレオチドが決定される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
NKNA遺伝子における一塩基多型が、
図2の33612位のCもしくはT、および/または
図2の33949位のTもしくはC、および/または
図2の37025位のCもしくはT、および/または
図2の37114位のGもしくはA、および/または
図2の37434位のAもしくはC、および/または
図2の41112位のTもしくはG、および/または
図2の41172位のGもしくはA、およびその組み合わせ、ならびにこれらの逆の相補鎖
からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
薬学的に活性な化合物がNK-1受容体アンタゴニストである、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
NK-1受容体アンタゴニストが、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-メチル-N-(6-モルホリン-4-イル-4-o-トリル-ピリジン-3-イル)-イソブチルアミド、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-[6-(1,1-ジオキソ-1λ6-チオモルホリン-4-イル)-4-o-トリル-ピリジン-3-イル]-N-メチル-イソブチルアミド、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-[6-(1,1-ジオキソ-1λ6-チオモルホリン-4-イル)-4-(4-フルオロ-2-メチル-フェニル)-ピリジン-3-イル]-N-メチル-イソブチルアミド、およびその薬学的に許容される酸添加塩からなる群より選択される化合物である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
NK-1受容体アンタゴニストが、薬物開発中のNK-1受容体アンタゴニストである指定されたGR205171、HSP-117、L703,606、L668,169、LY303241、LY306740、MK-869、R-544、スパンチド(Spantide)III、WIN-62,577、GR103,537、L758,298、NKP608、CGP49823、CP-96,345、CP-99,994、CP-122,721、FK888、GR203040、GR82334、GR94800、L732,138、L733,060、L742,694、L754,030、LY303870、MEN11149、PD154075、RP-67580、RPR100893、スペンジド(Spendide)、スパンチドII、SR140333、WIN-41,708、WIN-62,577、SR-48,968、L-659,877、MEN10627、SR144190、GR94800、SR-142,801、R820、R486、SB222200、L758,298、NK-608、CGP47899、およびMEN11467からなる群より選択される化合物、またはその薬学的に許容される酸添加塩である、請求項5記載の方法。
【請求項８】
NK-1受容体アンタゴニストが、疼痛、頭痛(特に、偏頭痛)、アルツハイマー病、中枢神経系障害(例えば、ある特定の抑欝障害、不安、および嘔吐)、精神病、多発性硬化症、モルヒネ禁断症状の低下、心臓血管の変化、浮腫(例えば、熱損傷により引き起こされる浮腫)、慢性炎症性疾患(例えば、慢性関節リウマチ、喘息/気管支の過剰反応、およびアレルギー性鼻炎を含む他の呼吸器疾患)、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む消化器の炎症性疾患、眼の損傷および眼の炎症性疾患、良性前立腺肥大、乗り物酔い、治療により引き起こされる嘔吐、癌(例えば、悪性神経膠腫)、ならびに外傷性の脳損傷からなる群より選択される疾患または障害の治療に用いられる、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
NK-1受容体アンタゴニストが、ある特定の抑欝障害、不安、および嘔吐などの中枢神経系障害の治療または予防に用いられる、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
質量分析法を用いたPCR産物の直接質量分析、インベーシブクリベッジ産物の直接分析、直接配列分析、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法、インベーダーアッセイ法、DNAチップ分析、および制限断片長多型からなる群より選択される示差的な核酸分析法を含むアッセイ法が用いられる、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
ヒトに対する薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する方法であり、以下の段階を含む方法:
ヒトから得られたNKNAゲノム配列において、薬学的に活性な化合物の効力および適合性と相関関係がある一塩基多型が存在するかを決定し、それによって、ヒトに対する薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する段階。
【請求項１２】
NKNA遺伝子を含む図2のヌクレオチド配列の位置、33612位、33949位、37025位、37114位、37434位、41112位、および41172位の少なくとも1つまたはそれ以上にあるヌクレオチドが決定される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
図2のヌクレオチドの位置により定義されるNKNA遺伝子の41172位のヌクレオチドが決定される、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
NKNA遺伝子における一塩基多型が、
図2の33612位のCもしくはT、および/または
図2の33949位のTもしくはC、および/または
図2の37025位のCもしくはT、および/または
図2の37114位のGもしくはA、および/または
図2の37434位のAもしくはC、および/または
図2の41112位のTもしくはG、および/または
図2の41172位のGもしくはA、およびその組み合わせ、ならびにこれらの逆の相補鎖
からなる群より選択される、請求項11〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
薬学的に活性な化合物がNK-1受容体アンタゴニストである、請求項11〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
NK-1受容体アンタゴニストが、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-メチル-N-(6-モルホリン-4-イル-4-o-トリル-ピリジン-3-イル)-イソブチルアミド、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-[6-(1,1-ジオキソ-1λ6-チオモルホリン-4-イル)-4-o-トリル-ピリジン-3-イル]-N-メチル-イソブチルアミド、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-[6-(1,1-ジオキソ-1λ6-チオモルホリン-4-イル)-4-(4-フルオロ-2-メチル-フェニル)-ピリジン-3-イル]-N-メチル-イソブチルアミド、およびその薬学的に許容される酸添加塩からなる群より選択される化合物である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
NK-1受容体アンタゴニストが、薬物開発中のNK-1受容体アンタゴニストである指定されたGR205171、HSP-117、L703,606、L668,169、LY303241、LY306740、MK-869、R-544、スパンチドIII、WIN-62,577、GR103,537、L758,298、NKP608、CGP49823、CP-96,345、CP-99,994、CP-122,721、FK888、GR203040、GR82334、GR94800、L732,138、L733,060、L742,694、L754,030、LY303870、MEN11149、PD154075、RP-67580、RPR100893、スペンジド、スパンチドII、SR140333、WIN-41,708、WIN-62,577、SR-48,968、L-659,877、MEN10627、SR144190、GR94800、SR-142,801、R820、R486、SB222200、L758,298、NK-608、CGP47899、およびMEN11467からなる群より選択される化合物、またはその薬学的に許容される酸添加塩である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
NK-1受容体アンタゴニストが、疼痛、頭痛(特に、偏頭痛)、アルツハイマー病、中枢神経系障害(例えば、ある特定の抑欝障害、不安、および嘔吐)、精神病、多発性硬化症、モルヒネ禁断症状の低下、心臓血管の変化、浮腫(例えば、熱損傷により引き起こされる浮腫)、慢性炎症性疾患(例えば、慢性関節リウマチ、喘息/気管支の過剰反応、およびアレルギー性鼻炎を含む他の呼吸器疾患)、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む消化器の炎症性疾患、眼の損傷および眼の炎症性疾患、良性前立腺肥大、乗り物酔い、治療により引き起こされる嘔吐、癌(例えば、悪性神経膠腫)、ならびに外傷性の脳損傷からなる群より選択される疾患または障害の治療に用いられる、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
NK-1受容体アンタゴニストが、ある特定の抑欝障害、不安、および嘔吐などの中枢神経系障害の治療または予防に用いられる、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
質量分析法を用いたPCR産物の直接質量分析、インベーシブクリベッジ産物の直接分析、直接配列分析、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法、インベーダーアッセイ法、DNAチップ分析、および制限断片長多型からなる群より選択される示差的な核酸分析法を含むアッセイ法が用いられる、請求項11〜19のいずれか一項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
図2の位置により定義される33612位にTを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される33949位にCを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される37025位にTを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される37114位にAを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される37434位にCを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される41112位にGを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される41172位にGを有する図2の核酸配列;または
その相補鎖、または一塩基多型の少なくとも1つを含む少なくとも20塩基のその断片
からなる群より選択される、単離核酸分子。
【請求項２２】
請求項12記載の図2のヌクレオチド配列の位置の1つまたはそれ以上におけるNKNA遺伝子の多型を検出することができる、対立遺伝子特異的核酸プライマー。
【請求項２３】
配列番号：8、配列番号：9、配列番号：10、配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：14、配列番号：15、および配列番号：16からなる群より選択される、請求項22記載の核酸プライマー。
【請求項２４】
請求項14記載の多型を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、NKNA遺伝子における多型を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２５】
17〜50ヌクレオチドの長さを有する、請求項24記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２６】
請求項22もしくは23記載の1つもしくはそれ以上の核酸プライマー、ならびに/または請求項24もしくは25記載の1つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む、診断キット。
【請求項２７】
NK-1受容体アンタゴニスト、およびNKNA遺伝子の1つまたはそれ以上の位置の一塩基多型について試験されたヒトに薬物を投与するための説明書を含む、薬学的パック。
【請求項２８】
NK-1受容体アンタゴニスト、および請求項12記載のNKNA遺伝子の1つまたはそれ以上の位置の一塩基多型について試験されたヒトに薬物を投与するための説明書を含む、薬学的パック。
【請求項２９】
NK-1受容体アンタゴニスト、および請求項11〜20のいずれか一項記載の方法に従って一塩基多型について試験されたヒトに薬物を投与するための説明書を含む、薬学的パック。
【請求項３０】
NKNA遺伝子を含む図2のヌクレオチド配列の位置、33612位、33949位、37025位、37114位、37434位、41112位、および41172位の1つまたはそれ以上に一塩基多型があると診断されたヒトにおいてNK-1受容体リガンドに関連した疾患を治療するための薬剤を調製するためのNK-1受容体アンタゴニストの使用。
【請求項３１】
以下の位置に多型を含む、NKNA遺伝子における多型の配列情報が保存されている、コンピュータ可読媒体:
図2の位置により定義される33612位、および/または
図2の位置により定義される33949位、および/または
図2の位置により定義される37025位、および/または
図2の位置により定義される37114位、および/または
図2の位置により定義される37434位、および/または
図2の位置により定義される41112位、および/または
図2の位置により定義される41172位。
【請求項３２】
配列を同定する方法であり、以下の段階を含む方法:
請求項21記載の核酸配列を調製する段階、および
同一性を決定するために該核酸配列と少なくとも1つの他の核酸配列を比較する段階。
【請求項３３】
本明細書において(特に、実施例を参照して)説明されたものと実質的に同じ、方法、核酸分子、核酸プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、診断キットおよび薬学的パック、使用、ならびにコンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プレプロタキキニン(preprotachykinin)(NKNA)遺伝子における一塩基多型と、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性とを相関付ける方法に関する。本発明は、さらに、NKNA遺伝子における少なくとも1つの一塩基多型を決定する段階を含む、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する方法に関する。この方法は、NKNA遺伝子における特異的な一塩基多型を決定し、NKNAにおける多型を参照することによってヒトにおける薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定することに基づいている。本発明は、さらに、本明細書で定義された多型を配列内に含む単離された核酸、このような核酸にハイブリダイズすることができる核酸プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにこのようなプライマーおよびプローブの1つまたはそれ以上を含む、NKNA遺伝子における多型を検出するための診断キット、NK-1受容体アンタゴニストおよび多型について試験されたヒトに薬物を投与するための説明書を含む薬学的パック、ならびにNKNA遺伝子における多型の配列情報が保存されているコンピュータ可読媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ファーマコジェノミクスは、個体間での遺伝子変異が、しばしば薬物代謝の個人差に起因するばらつきである、薬物応答のばらつきにどのような役割を果たしているかを研究するために多型の知識を利用するアプローチである。ファーマコジェノミクスは、特定の医薬品を用いた治療に最も適している患者を特定するのに役立つ。このアプローチは医薬品研究において薬物選択プロセスを助けるために使用することができる。ファーマコジェノミクスについての詳細および多型検出の他の用途は、Linderら(1997), Clinical Chemistry, 43, 254; Marshall(1997), Nature Biotechnology, 15, 1249; 国際公開公報第97/40462号, Spectra Biomedical; およびSchaferら(1998), Nature Biotechnology, 16, 33に記載されている。
【０００３】
さらに、多型は、DNAの挿入、欠失、重複、およびヌクレオチド置換に起因する2000を超えるヒトの異常症候群に関与している。個体において遺伝子多型を発見し、これらの変異を家系内で追跡することによって、臨床的診断を裏づけ、キャリアならびに症状発現前および無症状の罹患個体において素因および疾患状態を診断する手段が得られる。正確な診断に基づいてカウンセリングすることによって、患者は、起こり得る育児、進行中の妊娠、および罹患個体における早期介入について、情報を得た上で決定を下すことができる。
【０００４】
異常症候群に関連した多型は非常に変わりやすく、結果として、同定しにくい場合がある。遺伝子には複数の対立遺伝子がよくみられるので、疾患に関連した対立遺伝子を中立の(疾患に関連しない)多型と区別しなければならない。ほとんどの対立遺伝子は、区別不可能な正常に活性のある遺伝子産物を生じるか、または眼の色のような通常、一定しない性質を発現する中立の多型である。対照的に、多型対立遺伝子の中には、鎌形赤血球貧血などの臨床疾患と関連しているものもある。さらに、疾患関連多型の構造は非常に変わりやすく、鎌形赤血球貧血のように一点変異に起因しているか、または脆弱X症候群およびハンチントン舞踏病のようにヌクレオチド反復の拡大に起因している場合がある。
【０００５】
ニューロキニン-1(NK-1)すなわちサブスタンスPは、タキキニンペプチドファミリーに属する天然に生じるウンデカペプチドである。サブスタンスPは、血管外平滑筋組織に対して急速な収縮作用があるために、このような名前を付けられている。ヒトでは3つの既知のタキキニンが2つの遺伝子NKNAおよびNKNBによってコードされている。NKNA遺伝子は、サブスタンスPおよびニューロキニンAの両方を含む前駆体をコードするのに対して、NKNB遺伝子は、ニューロキニンBのみを含む前駆体をコードする(ニューロキニンAはかつてはサブスタンスKとして知られていた)。クローニングされたヒト遺伝子から得られたプローブおよびげっ歯類-ヒト体細胞ハイブリッドパネルを用いて、Bonnerら(Cytogenet. Cell Genet., 1987, 46, 584)はNKNA遺伝子を7q21-q22、NKNB遺伝子を12q13-q21に割り当てた。タキキニンの分子的特徴から、タキキニンは、タンパク質分解処理によってプレプロタキキニンとして知られる共通の前駆体分子から生じることが分かった。3種類のメッセージ(α、β、およびγ)がオルタナティブスプライシング事象によって生じる(Proc. Nat. Acad. Sci., 1987, 84, 881-885)。β型およびγ型のプレプロタキキニンはサブスタンスPおよびニューロキニンAの両方をコードするのに対して、α型はサブスタンスP配列しか含まない。
【０００６】
サブスタンスPの神経ペプチド受容体(NK-1受容体)は、Gタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーである。これは、哺乳動物神経系(特に、脳および脊髄神経節)、循環系、ならびに末梢組織(特に、十二指腸および空腸)の全体にわたって広く分布し、多くの多様な生物学的プロセスの調節に関与している。
【０００７】
哺乳動物タキキニンであるサブスタンスPの中枢および末梢での作用は、偏頭痛、慢性関節リウマチ、喘息、および炎症性腸疾患を含む非常に多くの炎症状態、ならびに嘔吐反射の仲介ならびにパーキンソン病(Neurosci. Res., 1996, 7, 187-214)、不安(Can. J. Phys., 1997, 75, 612-621)、および抑欝(Science, 1998, 281, 1640-1645)などの中枢神経系(CNS)障害の調節と関連している。
【０００８】
NK-1受容体アンタゴニストが疼痛、頭痛(特に、偏頭痛)、アルツハイマー病、多発性硬化症、モルヒネ禁断症状の低下、心臓血管の変化、浮腫(例えば、熱損傷により引き起こされる浮腫)、慢性炎症性疾患(例えば、慢性関節リウマチ、喘息/気管支の過剰反応、およびアレルギー性鼻炎を含む他の呼吸器疾患)、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む消化器の炎症性疾患、眼の損傷および眼の炎症性疾患に有用であるという証拠が、「タキキニン受容体およびタキキニン受容体アンタゴニスト(Tachykinin Receptor and Tachykinin Receptor Antagonists)」J.Auton. Pharmacol., 1993, 13, 23-93において概説されている。
【０００９】
さらに、過剰および不均衡なタキキニン(特にサブスタンスP)に関連した多くの生理学的疾患の治療のために、NK-1受容体アンタゴニストが開発されている。サブスタンスPが関与している疾患の例として、不安、抑欝、および精神病などの中枢神経系障害が挙げられる(国際公開公報第95/16679号、国際公開公報第95/18124号、および国際公開公報第95/23798号)。
【００１０】
さらに、NK-1受容体アンタゴニストは、乗り物酔いおよび治療により引き起こされる嘔吐の治療に有用である。
【００１１】
さらに、The New England Journal of Medicine, 1999, 340(3), 190-195では、選択的なNK-1受容体アンタゴニストによって、シスプラチンにより引き起こされる嘔吐が減少することが述べられている。
【００１２】
さらに、ある特定の形態の尿失禁の治療にNK-1受容体アンタゴニストが有用であることがNeuropeptides,1998,32(1),1-49およびEur.J.Pharmacol.,1999,383(3),297-303において述べられている。
【００１３】
さらに、米国特許第5,972,938号は、NK-1受容体アンタゴニストなどのタキキニン受容体アンタゴニストを投与することによって精神免疫障害または心身障害を治療する方法について述べている。
【００１４】
Life Sci.,2000,67(9),985-1001は、星状細胞が、サブスタンスPを含む非常に多くの神経伝達物質に対する機能的受容体を発現することについて述べている。サブスタンスPは、CNSの発達、感染、および損傷における反応性星状細胞とって重要な刺激である。脳腫瘍では、星状細胞に由来する悪性グリア細胞が、タキキニンによってNK-1受容体を介して、可溶性メディエーターを放出させ、増殖速度を速めるように誘導される。従って、選択的なNK-1受容体アンタゴニストは、癌治療において悪性神経膠腫を治療するための治療アプローチとして有用である可能性がある。
【００１５】
Nature(London), 2000, 405(6783), 180-183では、NK-1受容体の遺伝子が破壊されたマウスが、満足感を味わえるモルヒネの特性を消失させることが述べられている。従って、NK-1受容体アンタゴニストは、アヘン剤およびニコチンなどの依存性薬の禁断症状の治療ならびにそれらの乱用/欲求を抑えることに有用である可能性がある。
【００１６】
NK-1受容体アンタゴニストはまた外傷性の脳損傷の治療に有益な効果があることも報告されている(2000年10月17日〜20日にフランスのラグランデモッテ(La Grande Motte)において開催されたInternational Tachykinin Conference 2000でのNimmo教授によるの口頭による開示、タイトル「ニューロキニン1(NK-1)受容体アンタゴニストは外傷性脳損傷後の神経学的結果を改善する(Neurokinin 1(NK-1) Receptor Antagonists Improves the Neurological Outcome Following Traumatic Brain Injury)」(著者:A. J. Nimmo, C. J. Bennett, X. Hu, I. Cernak, R. Vink))。
【００１７】
NK-1アンタゴニストを用いた治療の別の適応症は、良性前立腺肥大(BPH)である。良性前立腺肥大は進行性で、尿貯留、感染症、膀胱結石、および腎不全につながることがあり、欧州特許第01109853.0号において報告されている。
【００１８】
臨床試験から、薬剤(例えば、NK-1受容体アンタゴニスト)を用いた治療に対する患者の応答は不均一な場合が多いことが分かっている。従って、薬剤の設計および治療に対する改善されたアプローチが必要とされる。
【００１９】
驚くべきことに、NKNA遺伝子における一塩基多型が、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物(例えば、NK-1受容体アンタゴニスト)の効力および適合性を決定するために使用可能なことが現在見出されている。
【発明の開示】
【００２０】
本発明は、NKNA遺伝子における一塩基多型と、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性とを相関付ける方法に関する。本発明は、さらに、NKNA遺伝子における少なくとも1つの一塩基多型を決定する段階を含む、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する方法に関する。この方法は、ヒト試料中のNKNA遺伝子における少なくとも1つの一塩基多型を決定することに基づいている。この方法は、図2の位置により定義されるNKNA遺伝子のイントロン1にある41172位のヌクレオチドを決定し、NKNA遺伝子における多型を参照することによってヒトの状態を決定する段階を含む。または、もしくはそれに加えて、この方法は、図2に定義されるような、NKNA遺伝子のイントロン1にある41112位、NKNA遺伝子のイントロン5にある37434位、NKNA遺伝子のイントロン6にある37114位、37025位、33949位、およびNKNA遺伝子の3'UTRにある33612位のヒトの核酸配列を決定する段階を含む。本発明は、さらに、前記で定義された位置の多型を配列内に含む単離された核酸、このような核酸にハイブリダイズすることができる核酸プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにこのようなプライマーおよびプローブの1つまたはそれ以上を含む、NKNA遺伝子における多型を検出するための診断キット、NK-1受容体アンタゴニストおよび多型について試験されたヒトに薬物を投与するための説明書を含む薬学的パック、ならびにNKNA遺伝子における多型の配列情報が保存されているコンピュータ可読媒体に関する。
【００２１】
本発明は、NKNA遺伝子において一塩基多型が発見されたことに基づいている。
【００２２】
「多型」という用語は、核酸配列において生じることが知られている全ての変異を含むと広く定義される。変異として、挿入、欠失、置換、および反復配列(重複を含む)が挙げられる。
【００２３】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」とは一本鎖または二本鎖の分子を意味し、ヌクレオチド塩基A、T、C、およびGを含むDNAでもよく、または塩基A、U(Tの代わり)、C、およびGを含むRNAでもよい。ポリヌクレオチドはコード鎖でもその相補鎖でもよい。ポリヌクレオチド分子は天然に生じる配列と配列が同一でもよく、または天然に生じる配列で見られるものと同じアミノ酸をコードする別のコドンを含んでもよい(Lewin「Genes V(遺伝子V)」Oxford University Press 第7章, 1994, 171-174を参照のこと)。さらに、ポリヌクレオチド分子は、記載のアミノ酸の保存的置換に相当するコドンを含んでもよい。ポリヌクレオチドはゲノムDNAでもcDNAでもよい。
【００２４】
本明細書で定義される「NKNA遺伝子」は、ヒト染色体7q21.1-q31.1に位置する、図2および配列番号：1に示される核酸配列内に存在する配列である。NKNA遺伝子は、7つのエキソン領域、エキソン配列の間にある6つのイントロン配列、ならびに3'および5'非翻訳領域(3'UTRおよび5'UTR)(図1に示したNKNA遺伝子のプロモーターエレメントを含む)を含む。最初のインフレームのATGはエキソン2(または図2の41031位)に生じるのに対して、TAG停止コドンはエキソン7(または図2の33724位)に生じる(推定129アミノ酸のタンパク質)。
【００２５】
本発明は、NKNA遺伝子における一塩基多型と、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性とを相関付ける方法に関する。この方法は、ヒトのNKNA遺伝子における一塩基多型を決定し、NKNA遺伝子における多型を参照することによって薬学的に活性な化合物が投与されるヒトの状態を決定する段階を含む。
【００２６】
本発明のさらなる局面によれば、NKNA遺伝子における一塩基多型と、ヒトに投与される薬学的に活性な化合物の効力および適合性とを相関付ける方法が提供される。この方法は、ヒトのNKNA遺伝子における一塩基多型を決定し、33612位、33949位、37025位、37114位、37434位、41112位および/または41172位を含む、NKNA遺伝子を含む図2における少なくとも1つまたはそれ以上の位置の多型を参照することによって薬学的に活性な化合物が投与されるヒトの状態を決定する段階を含む。
【００２７】
ヒトの状態は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つ全ての位置にある対立遺伝子変異を参照することによって決定することができる。ヒトの状態はまた、本明細書で同定された特異的多型の1つまたはそれ以上と、1つまたはそれ以上の他の一塩基多型の組み合わせでも決定することができる。
【００２８】
ヒトの状態は、生理学的応答および心理学的応答を含む、薬物療法に対するヒトの任意の応答を含む。
【００２９】
「ヒト」という用語は、NK-1受容体リガンドに関連した疾患を有するヒト、またはNK-1受容体リガンドに関連した疾患を有すると疑われるヒトを含む。ヒトは、それぞれの位置で対立遺伝子がホモ接合でもよく、対立遺伝子がヘテロ接合でもよい。
【００３０】
対立遺伝子変異は、薬物治療に対する個体の応答に直接影響を及ぼすことがある。従って、本発明の方法は、このような薬剤に対する臨床応答を予測するのに、および治療用量を決定するのに有用であり得る。
【００３１】
薬学的に活性な化合物はNK-1受容体アンタゴニストのグループに属してもよい。ニューロキニン受容体アンタゴニストはExp. Opin. Ther. Patents, 1996, 6, 367-378およびExp. Opin. Ther. Patents, 1997, 7, 43-54において概説されている。本明細書で使用される「NK-1受容体アンタゴニスト」という用語は、NK-1受容体へのサブスタンスPの結合を阻害する任意の天然または合成の化合物を意味する。このような多くの受容体アンタゴニストが知られており、記載されている。NK-1受容体アンタゴニストは、欧州特許第1035115号、国際公開公報第0050401号、国際公開公報第0050398号、国際公開公報第0053572号、国際公開公報第0073279号、国際公開公報第0073278号、欧州特許第1103546号、欧州特許第1103545号、および国際公開公報第0206236号に記載の、4-フェニル-ピリジン誘導体、3-フェニル-ピリジン誘導体、2-フェニル-置換ベンゼン誘導体、ビフェニル誘導体、4-フェニル-ピリミジン誘導体、5-フェニル-ピリミジン誘導体、1,4-ジアゼパン-2,5-ジオン誘導体、1,3,8-トリアザ-スピロ[4.5]デカン-4-オン誘導体、およびピペリジン誘導体からなる群より選択されてもよい。これらの文献ならびに以下で言及される全ての文献がその全てが参照として本明細書に組み入れられる。
【００３２】
本発明に関して有用なさらに好ましいNK-1受容体アンタゴニストは、現在、薬物開発中の以下のNK-1受容体アンタゴニストである。
【００３３】
GR205171:3-ピペリジンアミン,N-[[2-メトキシ-5-[5-(トリフルオロメチル)-1H-テトラゾール-1-イル]フェニル]メチル]-2-フェニル-,(2S-cis)-(Gardnerら、Regul. Pep. 65: 45, 1996)
HSP-117:3-ピペリジンアミン,N-[[2,3-ジヒドロ-5-(1-メチルエチル)-7-ベンゾフラニル]メチル]-2-フェニル-,ジヒドロクロリド,(2S-cis)-
L703,606:1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン-3-アミン,2-(ジフェニルメチル)-N-[(2-ヨードフェニル)メチル-,(2S-cis)-,オキサレート(Cascieriら, Mol. Pharmacol. 42, 458, 1992)
L668,169:L-フェニルアラニン,N-[2-[3-[[N-[2-(3-アミノ-2-オキソ-1-ピロリジニル)-4-メチル-1-オキソペンチル]-L-メチオニル-L-グルタミニル-D-トリプトフィル-N-メチル-L-フェニルアラニル]アミノ]-2-オキソ-1-ピロリジニル]-4-メチル-1-オキソペンチル]-L-メチオニル-L-グルタミニル-D-トリプトフィル-N-メチル-,環状(8->)-ペプチド,[3R-[1[S*[R*(S*)]],3R*]]-
LY303241:1-ピペラジンアセトアミド,N-[2-[アセチル[(2-メトキシフェニル)メチル]アミノ]-1-(1H-インドール-3-イル-メチル)エチル]-4-フェニル-,(R)-
LY306740:1-ピペラジンアセトアミド,N-[2-[アセチル[(2-メトキシフェニル)メチル]アミノ)-1-(1H-インドール-3-イル-メチル)エチル]-4-シクロヘキシル-,(R)-
MK-869:3H-1,2,4-トリアゾール-3-オン,5-[[2-[1-[3,5-bis(トリフルオロメチル)フェニル]エトキシ]-3-(4-フルオロフェニル)-4-モルホリニル]メチル]-1,2-ジヒドロ-,[2R-[2α(R*),3α]-
R-544:Ac-Thr-D-Trp(FOR)-Phe-N-MeBzl
スパンチド(Spantide)III:L-ノルロイシンアミド,N6-(3-ピリジニルカルボニル)-D-リジル-L-プロリル-3-(3-ピリジニル)-L-アラニル-L-プロリル-3,4-ジクロロ-D-フェニルアラニル-L-アスパラギニル-D-トリプトフィル-L-フェニルアラニル-3-(3-ピリジニル)-D-アラニル-L-ロイシル-
WIN-62,577:1H-ベンズイミダゾ[2,1-b]シクロペンタ[5,6]ナフト[1,2-g]キナゾリン-1-オール,1-エチニル-2,3,3a,3b,4,5,15,15a,15b,16,17,17a-ドデカヒドロ-15a,17a-ジメチル-,(1R,3aS,3bR,15aR,15bS,17aS)-
GR103,537
L758,298:ホスホン酸,[3-[[2-[1-[3,5-bis(トリフルオロメチル)フェニル]エトキシ]-3-(4-フルオロフェニル)-4-モルホリニル]メチル]-2,5-ジヒドロ-5-オキソ-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル]-,[2R-[2α(R*),3α]]-
NKP608:(2R,4S)-N-[1-{3,5-bis(トリフルオロメチル)-ベンゾイル}-2-(4-クロロ-ベンジル)-4-ピペリジニル]-キノリン-4-カルボキサミド
CGP49823:(2R,4S)-2-ベンジル-1-(3,5-ジメチルベンゾイル)-N-[(4-キノリニル)メチル]-4-ピペリンアミン)ジヒドロクロリド
CP-96,345:2S,3S)-cis-(2(ジフェニルメチル)-N-[(2-メトキシフェニル)メチル]-1-アザビシクロ[2.2.2]オクタン-3-アミン(Sriderら,Science 251:435,1991)
CP-99,994:((2S,3S)-cis-3-(2-メトキシベンジルアミノ)-2-フェニル-ピペリジン)ジヒドロクロリド(Desaiら, J. Med. Chem. 35: 4911, 1992)
CP-122,721:(+)-2S,3S)-3-(2-メトキシ-5-トリフルオロメトキシベンジル)アミノ-2-フェニルピペリジン
FK888:(N2-[(4R)-4-ヒドロキシ-1(1-メチル-1H-インドール-3-イル)カルボニル-L-プロピル-N-メチル-N-フェニルメチル-L-3-(2-ナフチル)-アラニンアミド(Fujiiら, Br. J. Pharm. 107: 785, 1992)
GR203040:(2S,3Sおよび2R,3R)-2メトキシ-5-テトラゾール-1-イル-ベンジル-(2-フェニル-ピペリジン-3-イル)-アミン
GR82334:[D-Pro9,]スピロ-γ-ラクタム]Leu10,Trp11]フィザレミン-(1-11)
GR94800:PhCO-Ala-Ala-DTrp-Phe-DPe-DPro-Pro-NIe-NH2
L732,138:N-アセチル-L-トリプトファン
L733,060:((2S,S)-3-((3,5-bis(トリフルオロメチル)フェニル)メチルオキシ)-2-フェニルピペリジン
L742,694:(2-(S)-(3,5-bis(トリフルオロメチル)ベンジルオキシ)-3-(S)-フェニル-4-(5-(3-オキソ-1,2,4-トリアゾロ)メチルモルホリン
L754,030:2-(R)-(1-(R)-3,5-bis(トリフルオロメチル)フェニルエトキシ)-3-(S)-(4-フルオロ)フェニル-4-(3-オキソ-1,2,4-トリアゾール-5-イル)メチルモルホリン
LY303870:(R)-1[N-(2-メトキシベンジル)アセチルアミノ]-3-(1H-インドール-3-イル)-2-[N-(2-(4-(ピペリジニル)ピペリジン-1-イル)アセチル)アミノ]プロパン
MEN11149:2-(2-ナフチル)-1-N-[(1R,2S)-2-N-[2(H)インドール-3-イルカルボニル]アミノシクロヘキサンカルボニル]-1-[N'-エチル-N'-(4メチルフェニルアセチル)]ジアミノエタン(Cirilloら, Eur. J. Pharm. 341: 201, 1998)
PD154075:(2-ベンゾフラン)-CH2OCO]-(R)-α-MeTrp-(S)-NHCH(CH3)Ph
RP-67580:(3aR,7aR)-7,7-ジフェニル-2[1-イミノ-2(2-メトキシフェニル)エチル]+++パーヒドロイソインドール-4-オンヒドロクロリド(Garretら,PNAS 88:10208,1991)
RPR100893:(3aS,4S,7aS)-7,7-ジフェニル-4-(2-メトキシフェニル)-2-[(S)-2-(2-メトキシフェニル)プロピオニル]パーヒドロイソインドール-4-オール
スペンジド:Tyr-D-Phe-Phe-D-His-Leu-Met-NH2
スパンチドII:D-NicLys1,3-PaI3,D-CI2Phe5,Asn6,D-Trp7.0,NIe11-サブスタンスP
SR140333:(S)-1-[2-[3-(3,4-ジクロルフェニル)-1(3-イソプロポキシフェニルアセチル)ピペリジン-3-イル]エチル]-4-フェニル-1アザニアビシクロ[2,2,2]オクタン(Edmontsら, Eur. J. Pharm. 250: 403, 1993)
WIN-41,708:(17β-ヒドロキシ-17α-エチニル-5α-アンドロスタノ[3.2-b]ピリミド[1,2-a]ベンズイミダゾール
WIN-62,577:1H-ベンズイミダゾ[2,1-b]シクロペンタ[5,6]ナフト[1,2-g]キナゾリン-1-オール,1-エチニル-2,3,3a,3b,4,5,15,15a,15b,16,17,17a-ドデカヒドロ-15a,17a-ジメチル-(1R,3aS,3bR,15aR,15bS,17aS)-
SR-48,968:(S)-N-メチル-N[4-(4-アセチルアミノ-4-[フェニルピペリジノ)-2-(3,4-ジクロロフェニル)-ブチル]ベンズアミド
L-659,877:シクロ[Gln,Trp,Phe,Gly,Leu,Met]
MEN10627:シクロ(Met-Asp-Trp-Phe-Dap-Leu)シクロ(2β-5β)
SR-144190:(R)-3(1-[2-(4-ベンゾイル-2-(3,4-ジフルオロフェニル)-モルホリン-2-イル)エチル]-4-フェニルピペリジン-4-イル)-1-ジメチル尿素
GR94800:PhCO-Ala-Ala-D-Trp-Phe-D-Pro-Pro-NIe-NH2
SR-142,801:(S)-(N)-(1-(3-(1-ベンゾイル-3-(3,4-ジクロロフェニル)ピペリジン-3-イル)プロピル)-4-フェニルピペリジン-4-イル)-N-メチルアセトアミド
R820:3-インドリルカルボニル-Hyp-Phg-N(Me)-Bzl
R486:H-Asp-Ser-Phe-Trp-β-Ala-Leu-Met-NH2
SB222200:(S)-(-)-N-(a-エチルベンジル)-3-メチル-2-フェニルキノリン-4-カルボキシイミド
L758,298:ホスホン酸,[3-[[2-[1-[3,5-bis(トリフルオロメチル)フェニル]エトキシ]-3-(4-フルオロフェニル)-4-モルホリニル]-2,5-ジヒドロ-5オキソ-1H-1,2,4-トリアゾール-1-イル-],[2R-[2a(R*),3a]]-
NK-608:(2R,4S)-N-[1-{3,5-bis(トリフルオルメチル)-ベンゾイル}-2-(4-クロロ-ベンジル)-4-ピペリジニル]-キノリン-4-カルボキサミド
CGP47899:Shillingら,Pers.Med.Chem.207,1993
MEN11467:Evangelistaら,XXXIX Nat.Congr.of the Ital.Pharmacological Soc.,Florence 20-23.06.1999
【００３４】
上記において具体的に名前を付けられた化合物の本明細書中の如何なる言及にも、その薬学的に許容される酸添加塩が含まれる。
【００３５】
薬物開発中のこれらのNK-1受容体アンタゴニストに関するさらなる情報は公開された文献に記載されている。
【００３６】
さらに適切なNK-1受容体アンタゴニストは以下の公開された特許および特許出願に記載されている。
【００３７】
米国特許第5,990,125号(特に、化合物Ia〜Ie、XおよびXVI〜XXI、ならびに米国特許第5,990,125号のカラム33に記載のサブスタンスP受容体アンタゴニストとしての活性を示すキヌクリジン、ピペリジンエチレンジアミン、ピロリジン、およびアザボルナン誘導体、ならびに関連化合物を含む他のアンタゴニスト)。これらのアンタゴニストは、好ましくは、米国特許第5,990,125号のカラム34において特定された投与量で用いられる。
【００３８】
さらに適切なNK-1受容体アンタゴニストは以下の刊行物に記載されている。
米国特許番号(USP)
2005515788.tif 000002
欧州特許出願公開番号(EP-A-)
2005515788.tif 000003
PCT国際特許公開番号(WO)
2005515788.tif 000004
英国特許公開番号(GB)
2005515788.tif 000005
【００３９】
前記NK-1受容体アンタゴニストの適応症は、疼痛、頭痛(特に、偏頭痛)、アルツハイマー病、中枢神経系障害(例えば、ある特定の抑欝障害、不安、および嘔吐)、精神病、多発性硬化症、モルヒネ禁断症状の低下、心臓血管の変化、浮腫(例えば、熱損傷により引き起こされる浮腫)、慢性炎症性疾患(例えば、慢性関節リウマチ、喘息/気管支の過剰反応、およびアレルギー性鼻炎を含む他の呼吸器疾患)、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む消化器の炎症性疾患、眼の損傷および眼の炎症性疾患、良性前立腺肥大、乗り物酔い、治療により引き起こされる嘔吐、癌(例えば、悪性神経膠腫)、ならびに外傷性の脳損傷の治療である。
【００４０】
好ましくは、NK-1受容体アンタゴニストは、欧州特許第1035115号において開示される2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-[6-(1,1-ジオキソ-1λ6-チオモルホリン-4-イル)-4-o-トリル-ピリジン-3-イル]-N-メチル-イソブチルアミドまたは2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-[6-(1,1-ジオキソ-1λ6-チオモルホリン-4-イル)-4-(4-フルオロ-2-メチル-フェニル)-ピリジン-3-イル]-N-メチル-イソブチルアミドである。
【００４１】
最も好ましくは、NK-1受容体アンタゴニストは、欧州特許第1035115号において開示される2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-メチル-N-(6-モルホリン-4-イル-4-o-トリル-ピリジン-3-イル)-イソブチルアミドである。
【００４２】
これらのNK-1受容体アンタゴニストの好ましい適応症は、中枢神経系障害を含むもの(例えば、ある特定の抑欝障害、不安、または嘔吐の治療または予防)である。主要な抑鬱エピソードは少なくとも2週間と定義されている。この間、一日の大半、ほぼ毎日、憂鬱な気分であるか、全く面白くも楽しくもなく、ほぼ全ての活動が無くなる。
【００４３】
別の局面において、本発明は、ヒトに対する薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する方法を提供する。この方法は、ヒトから得られたNKNAゲノム配列において、薬学的に活性な化合物の効力および適合性と相関関係がある一塩基多型が存在するかを決定し、それによって、ヒトに対する薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する段階を含む。
【００４４】
好ましくは、本発明は、ヒトに対する薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する方法に関する。この方法は、ヒトから得られたNKNAゲノム配列において、NKNA遺伝子を含む図2のヌクレオチド配列の位置、33612位、33949位、37025位、37114位、37434位、41112位、および/または41172位の少なくとも1つまたはそれ以上にあるヌクレオチド(この一塩基多型は薬学的に活性な化合物の効力および適合性と相関関係がある)を決定し、それによって、ヒトに対する薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する段階を含む。
【００４５】
好ましくは、本発明は、ヒトに対する薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する方法に関する。この方法は、ヒトから得られたNKNAゲノム配列において、NKNA遺伝子を含む図2のヌクレオチド配列の33612位のCもしくはT、図2の33949位のTもしくはC、図2の37025位のCもしくはT、図2の37114位のGもしくはA、図2の37434位のAもしくはC、図2の41112位のTもしくはG、図2の41172位のGもしくはA、およびその組み合わせ、ならびにこれらの逆の相補鎖からなる群より選択される一塩基多型(この一塩基多型は薬学的に活性な化合物の効力および適合性と相関関係がある)が存在するかを決定し、それによって、ヒトに対する薬学的に活性な化合物の効力および適合性を決定する段階を含む。
【００４６】
この方法では、薬学的に活性な化合物はNK-1受容体アンタゴニストでもよい。NK-1受容体アンタゴニストは、前記の任意のNK-1受容体アンタゴニストでもよい。
【００４７】
本発明による方法は、一塩基変異を検出するための任意の適切な方法(例えば、質量分析法を用いたPCR産物の直接質量分析、インベーシブクリベッジ(invasive cleavage)産物の直接分析、直接配列分析、対立遺伝子特異的増幅(すなわち、ARMS(商標)-対立遺伝子特異的増幅;ARMSはamplification refractory mutation systemを意味する)、ALEX(商標)(amplification refractory mutation system linear extension)、およびCOPS(competitive oligonucleotide priming system)、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(ASH)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法(OLA)、インベーダーアッセイ法、DNAチップ分析、ならびに制限断片長多型(RFLP)(概説についてはGenome Research, 1998, 8, 769-776; Pharmacogenomics, 2000, 1, 95-100; Human Mutation, 2001, 17, 475-492を参照のこと))を用いて行うことができる。
【００４８】
多型を有する核酸の試験試料は、都合よく、血液、気管支肺胞洗浄液、痰、尿、または個体から得られる他の体液もしくは組織である。同様に、試験試料は、試験試料中の配列に対応する核酸配列でもよいことが理解されると思われる。すなわち、対立遺伝子変異を分析する前に、まず最初に、試料核酸中の領域の全てまたは一部が、任意の簡便な技法(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはリガーゼ連鎖反応(LCR))を用いて増幅されてもよい。
【００４９】
NKNA遺伝子における多型は、患者の核酸試料を配列決定し、この配列と対照を比較することによって、または人種が異なる血縁関係のない個体のDNAにおいて400〜600塩基対の断片(NKNA遺伝子のコード領域および調節領域をカバーする)をPCR増幅することによって同定することができる。断片は、これらの試料中でフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて配列決定することができる。多型は、ポリフレッド(PolyPhred)ソフトウェア(ワシントン大学からライセンス供与)を用いて検出することができ、変異体の対立遺伝子頻度を立証することができる(Human Mutation, 2001, 17, 243-254)。
【００５０】
本発明の1つまたはそれ以上の多型位置にある変異ヌクレオチドの有無を検出するために使用することができる多数の分析手順があることは当業者に明らかであると思われる。一般的に、対立遺伝子変異を検出するには、変異を識別する技法、選択的に増幅反応、選択的にシグナルを発生するシステムが必要とされる。国際特許出願である国際公開公報第00/06768号は多数の増幅法および変異検出法(一部はPCRに基づいている)を列挙している。これらは多数のシグナルを発生するシステムと共に使用することができ、シグナルの選択もまた国際公開公報第00/06768号に列挙されている。対立遺伝子変異を検出する多くの現行法はNollauら, Clin. Chem., 1997, 43, 1114-1120ならびに標準的な教科書(例えば、「変異検出の実験プロトコール(Laboratory Protocols for Mutation Detection)」U. Landegren編, Oxford University Press, 1996および「PCR」第2版, NewtonおよびGraham編, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997)により概説されている。
【００５１】
本発明は、さらに、以下の多型を含む配列から選択される単離された核酸分子を提供する:
図2の位置により定義される33612位にTを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される33949位にCを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される37025位にTを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される37114位にAを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される37434位にCを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される41112位にGを有する図2の核酸配列;
図2の位置により定義される41172位にGを有する図2の核酸配列;または
その相補鎖、または多型の少なくとも1つを含む少なくとも20塩基のその断片。
【００５２】
「単離された」NKNA核酸分子は、NKNA核酸の天然供給源において通常結合している少なくとも1つの混入核酸分子から同定および分離された核酸分子である。単離されたNKNA核酸分子は、天然で見られる形状または状態とは異なるものである。従って、単離されたNKNA核酸分子は、天然の細胞中で存在するNKNA核酸分子とは区別される。しかしながら、単離されたNKNA核酸分子は、NKNAを普通に発現する細胞(この細胞中では、例えば、NKNA核酸分子は天然の細胞とは異なる染色体位置に存在する)に含まれるNKNA核酸分子を含む。
【００５３】
さらに、本発明は、図2の33612位、図2の33949位、図2の37025位、図2の37114位、図2の37434位、図2の41112位、および図2の41172位の多型を配列内に含む核酸にハイブリダイズすることができる、NKNA遺伝子における多型を検出するための診断プライマーとして使用することができる対立遺伝子特異的核酸プライマーに関する。
【００５４】
本発明の別の局面は、以下からなる群より選択される以下の配列を含む核酸プライマーである:
配列番号：8により定義される核酸配列;
配列番号：9により定義される核酸配列;
配列番号：10により定義される核酸配列;
配列番号：11により定義される核酸配列;
配列番号：12により定義される核酸配列;
配列番号：13により定義される核酸配列;
配列番号：14により定義される核酸配列;
配列番号：15により定義される核酸配列; または
配列番号：16により定義される核酸配列; およびそれらの逆の相補鎖。
【００５５】
対立遺伝子特異的プライマーは、一般的に、PCR反応などの増幅反応においてコンスタントプライマー(constant primer)と共に用いられ、例えば、ARMS(商標)アッセイ法に用いられるように特定の配列位置の対立遺伝子を選択的に増幅することによって対立遺伝子を識別する。対立遺伝子特異的プライマーの長さは、好ましくは、17〜50ヌクレオチド、より好ましくは、約17〜35ヌクレオチド、最も好ましくは、約17〜30ヌクレオチドである。
【００５６】
好ましくは、対立遺伝子特異的プライマーは、検出しようとする対立遺伝子に正確に対応するが、対立遺伝子の誘導体も意図される。ここで、3'末端のヌクレオチドの約6〜8個が、検出しようとする対立遺伝子に対応し、プライマーの性質に重大な影響を及ぼさなければ、残りのヌクレオチドの10個まで(例えば、8、6、4、2、または1個まで)が異なってもよい。特異的なプライマー結合および正しい対立遺伝子識別プライマーのみからの優先的な伸長を最適化するために、(3'末端を基準にして)-2および/または-3位置にあるヌクレオチドを一致させない場合が多い。
【００５７】
本発明はまた、図2の33612位、図2の33949位、図2の37025位、図2の37114位、図2の37434位、図2の41112位、および図2の41172位の多型を配列内に含む核酸に特異的にハイブリダイズすることができる、NKNA遺伝子における多型を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブに関する。
【００５８】
「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、ヒトNKNA遺伝子の一部または全てに対応する、好ましくは、多型を発現するヒトNKNA遺伝子の一部に対応する長さが少なくとも17ヌクレオチドのヌクレオチド配列を意味する。17〜50の長さのヌクレオチドが好ましい。一般的に、このようなプローブは、遺伝子の対応する野生型または変異遺伝子座に完全に相補的な塩基配列を含む。しかしながら、オリゴヌクレオチドプローブの識別能力に過度に影響を及ぼさなければ、必要に応じて、1つまたはそれ以上のミスマッチを導入することができる。本発明のプローブは、検出を容易にする1つまたはそれ以上の標識(例えば、分子ビーコン)を有してもよい。
【００５９】
本発明はまた、図2の33612位のCまたはT、図2の33949位のTまたはC、図2の37025位のCまたはT、図2の37114位のGまたはA、図2の37434位のAまたはC、図2の41112位のTまたはG、および図2の41172位のGまたはA、およびその組み合わせ、ならびにその逆の相補鎖からなる群より選択されるNKNA遺伝子の一塩基多型を含む、1つもしくはそれ以上の核酸プライマーおよび/または1つもしくはそれ以上のオリゴヌクレオチドプローブを含む診断キットを含む。
【００６０】
本発明は、さらに、NK-1受容体アンタゴニストおよびNKNA遺伝子の1つまたはそれ以上の位置にある一塩基多型について試験されたヒトに薬物を投与するための説明書を含む薬学的パックを提供する。
【００６１】
本発明は、さらに、NK-1受容体アンタゴニスト(好ましくは、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-メチル-N-(6-モルホリン-4-イル-4-o-トリル-ピリジン-3-イル)-イソブチルアミド)、および本発明の方法に従うNKNA遺伝子の1つまたはそれ以上の位置にある一塩基多型について試験されたヒトに薬物を投与するための説明書を含む薬学的パックを提供する。
【００６２】
本発明は、さらに、NKNA遺伝子を含む図2の位置、33612位、33949位、37025位、37114位、37434位、41112位、および41172位の1つまたはそれ以上に一塩基多型があると診断されたヒトにおいてNK-1受容体リガンドに関連した疾患を治療するための薬剤を調製するためのNK-1受容体アンタゴニストの使用を提供する。
【００６３】
本発明はまた、図2の33612位、図2の33949位、図2の37025位、図2の37114位、図2の37434位、図2の41112位、および図2の41172位の多型を含む、NKNA遺伝子における多型の配列情報が保存されているコンピュータ可読媒体を含む。
【００６４】
配列を同定する方法も本発明において提供される。この方法は、33612位にTを有する図2の核酸配列;33949位にCを有する図2の核酸配列;37025位にTを有する図2の核酸配列;37114位にAを有する図2の核酸配列;37434位にCを有する図2の核酸配列;41112位にGを有する図2の核酸配列;41172位にGを有する図2の核酸配列;またはその相補配列、または多型の少なくとも1つを含む少なくとも20塩基のその断片からなる群より選択される核酸配列を調製する段階、ならびに同一性を決定するために前記核酸配列と少なくとも1つの他の核酸配列またはポリペプチド配列を比較する段階を含む。
【００６５】
本発明を大まかに説明したが、特定の実施例と以下の図面を参照することによってさらに詳細に理解されると思われる。実施例は例示のためだけに本明細書に含まれ、特に定めのない限り限定することを意図しない。
【００６６】
実施例
特に定めのない限り製造業者の説明書に従って、実施例において言及した市販の試薬を使用した。
【００６７】
実施例1:多型の検出
一塩基多型の発見は全て、ABIキャピラリーシーケンサーおよびビッグダイ(Big Dye)化学(ABI)を用いた二本鎖DNA配列決定によって行った。まず最初に、NKNA mRNA(EMBLデータベースのアクセッション番号U37529.1)を用いたBLAST検索によってEMBLデータベースにおいて発見されたPACクローン(アクセッション番号EM_HUM1:AC004140.1)から、NKNA遺伝子のゲノム構造を入手した。図1に示したようにエキソン-イントロン境界が得られ、遺伝子の全てのコード領域および調節領域を増幅するようにプライマーを設計した。全てのエキソンを増幅するために使用したプライマーを以下に示し、これらを配列決定用プライマーとしても使用した。これらのプライマー対のセットで全ての多型を標的化した。
【００６８】
（表１）多型検出用オリゴヌクレオチドプライマーの表
2005515788.tif 000006
【００６９】
多型を検出するために、5つの異なる人種の47人の血縁関係のない個体からNKNA遺伝子をPCR増幅した。断片特異的プライマー対(18〜27bpの長さ)を用いて、200〜700bpの断片が増幅された(例えば、プライマー対5および6を用いて519bpのPCR産物が生成された)。NKNA遺伝子のコード領域および調節領域をカバーする断片を設計した。PCR産物をカラム精製した後、ABIダイターミネーター化学(蛍光に基づく配列決定)を用いたABIキャピラリーシーケンサーによってDNAを配列決定した。DNA配列中の多型はポリフレッド(polyphred)ソフトウェア(Nickerson, D. ら1997: NAR 25(14):2745-2751)を用いて検出した。ポリフレッドソフトウェアは、Phred、Phrap、およびConsed(プログラムは全て米国のワシントン大学からライセンス供与されている)に基づいて作動する。このプログラムは、蛍光に基づく配列決定によって、ヘテロ接合性の一塩基置換の存在を自動検出することができる。前記の例では、以下の2つの多型が519bp断片中に検出された。
2005515788.tif 000007
*アクセッション番号EM_HUM1:AC004140.1における位置により定義される。
【００７０】
図3に示すように、全部で7つの一塩基多型がNKNA遺伝子において検出された。
【００７１】
実施例2:ジェノタイピング
a)被験者の選択
実験プロトコールおよびインフォームドコンセントの書面を認可のために地元の倫理委員会に提出した。血液試料をジェノタイピングに使用することについて、全ての被験者からインフォームドコンセントが書面で得られた。被験者の考えが変わった場合は、1ヶ月後まで、この同意を取り消すことができる。
【００７２】
試料には全て新たな独立したコードが割り当てられ、臨床データベース閉鎖後6ヶ月以内に、新しいコードと元のコードとの関係が消去された。これは、患者の秘密を保護するための追加手段であった。しかしながら、結果として、患者の名前または最初の臨床試験で用いられた番号に基づいて遺伝子型情報を検索することはできない。約15年で全ての血液およびDNA試料が破棄される。
【００７３】
b)ジェノタイピングアッセイ法
血液試料(9ml)をEDTAチューブに集めた。これらを凍結し、-20℃〜-70℃で保存した後、スイス、バーゼル(Basel)にあるロシュ(Roche)のセントラルサンプルオフィス(Central Sample Office:CSO)に送った。ここで、試料を分けて3つのチューブに入れ、患者の匿名を確実なものにするためにバーコードラベルで新たな独立したコードを割り当てた。2つの血液試料(1mlおよび4ml)はカリフォルニア州アラメダ(Alameda)にあるロシュモレキュラーシステムズ(Roche Molecular Systems:RMS)のロシュサンプル貯蔵所(Roche Sample Repository:RSR)に送り、-80℃で保存した。残りの4mlアリコートはスイス、バーゼルにあるCSOで-80℃で保存した。RSRにおいて試料に対して行った全ての手順は、GCPガイドラインに準拠する確立した標準的な操作手順に従って行った。
【００７４】
シリカ膜に基づく抽出法(キアンプ(QiaAmp)96 DNA血液キット,Valencia,CA)を用いて、DNAを全血400μlから抽出した。対照は、10mM Tris pH8.0、0.1mM EDTA(TE)緩衝液、およびDNA収量が既知の血液単位からの全血を含んだ。
【００７５】
NKNA遺伝子における多型発見からの結果に基づいて、3つの遺伝子マーカーを選択した。プールした試料の代わりに1つの試料を各反応に使用するという改良を加えた、Germerら,Genomic Res.(2000),10,258-266に記載のキネティックPCR(kinetic PCR)法によって、試料をこれらの一塩基多型についてジェノタイピングした。この方法は、蛍光プローブを使用することなく一塩基多型を識別することができる。
【００７６】
キネティックサーマルサイクラー(kinetic thermal cycler:KTC)形式では、二本鎖増幅産物の生成は、DNA挿入色素および蛍光検出用CCDカメラが付属しているサーマルサイクラー(PE-バイオシステムズ(PE-Biosystems)ジーンアンプ5700配列検出システム(GeneAmp 5700 Sequence Detection System))を用いてモニターされる。PCR増幅プレートの各ウェル中の蛍光がアニーリングおよび変性の各サイクルで測定される。PE-バイオシステムズのSDSソフトウェアを用いて相対的な蛍光が0.5の閾値に達したサイクルをCtと定義した。
【００７７】
増幅反応は、対立遺伝子が存在すれば増幅反応が陽性になり、対立遺伝子が存在しなければ増幅反応が陰性になるように、対立遺伝子特異的であるように設計した。それぞれの二対立遺伝子(bi-allelic)多型の場合、増幅プレートの一方のウェルを対立遺伝子1に特異的になるように設定し、他方のウェルを対立遺伝子2に特異的になるように設定した。検出しようとするそれぞれの多型について、3つのプライマー(対立遺伝子特異的プライマーが2つ、共通プライマーが1つ)を設計した(表2)。対立遺伝子1の反応には対立遺伝子1特異的プライマーおよび共通プライマーが含まれ、対立遺伝子2の反応には対立遺伝子2特異的プライマーおよび共通プライマーが含まれた。各対のウェルのCt値を用いてΔCtを計算し、ΔCtを用いて対立遺伝子コール(allele call)を求めた。
【００７８】
（表２）多型スクリーニングに使用したオリゴヌクレオチドプライマーの表
2005515788.tif 000008
【００７９】
増幅条件は以下の通りであった:各ウェルにつき85μlの体積で、10mM Tris pH8.0、40mM KCl、2mM MgCl2、各50μmのdATP、dCTP、およびdGTP、25μm dTTPおよび75μm dUTP、4％DMSO、0.2×SYBR Green I(モレキュラープローブ(Molecular Probe),Eugene,OR)、2％グリセロール、2単位のウラシルN-グリコシラーゼ(UNG)、15単位のソフテルゴールド(Stoffel Gold)DNAポリメラーゼ(参考としてNature(1996), 381, 445-6を参照のこと)、ならびにプライマー。各アッセイに使用したプライマーの濃度を表2に示した。次いで、15μl体積中に30ngのDNAを各ウェルに添加した。
【００８０】
既存の増幅産物による混入の可能性を低減させるために、アッセイ手順には、増幅産物へのdUTPの混合、および既存のdU含有産物のUNG分解のためのインキュベーション段階が含まれた(Longoら, Gene(1990), 93, 125-128)。
【００８１】
増幅反応は、アリコーティングロボット(aliquoting robot)(パッカード(Packard)マルチプローブ(Multiprobe)II, Meriden, CT)を用いて、実験管理データベースにより作成されたバーコードラベルにより識別される96ウェル増幅プレート中で調製された。ロボットにより行われる手順のパラメータは交差汚染の可能性が最小限になるように設定した。81個の試料の各プレートについて、5つの試料は同一試料を2つ作成して実験し、この2つの結果を分析して、結果が一致するのを確かめた。
【００８２】
サーマルサイクリング条件は以下の通りであった:50℃2分(既に汚染しているPCR産物のUNG分解)、95℃12分(ソフテルゴールドポリメラーゼ活性化)、55サイクルの95℃20秒の変性および58℃20秒のアニーリング、続いて0.57分、60℃〜95℃の間で1℃刻みで上昇する解離段階。増幅反応は、PE-バイオシステムズジーンアンプ5700配列検出システム(SDS)装置(Foster City,CA)において行った。解離曲線の一次導関数をSDSソフトウェアによって作成し、ある特定の反応における蛍光が非特異的なプライマー-二量体ではなく明確な解離ピークを有する特異的な産物の増幅によるものであることを確認するために必要に応じて調べた。K. M. Ririeら, Anal. Biochem. (1997), 245, 154-160の方法に従ってPCR間のDNA融解曲線を分析することによって、産物を区別した。
【００８３】
各増幅反応のCtを求め、対立遺伝子1のCtと対立遺伝子2のCtの差(ΔCt)をアッセイ結果として使用した。ΔCtが-3.0〜3.0の試料をヘテロ接合体(A1/A2)とみなした。ΔCtが-3.0未満の試料はA1ホモ接合体(A1/A1)とみなした。ΔCtが3.0を上回る試料をA2ホモ接合体(A2/A2)とみなした。ほとんどの場合において、これらの遺伝型グループ間の差ΔCtははっきりしており、Ct値が3.0に近い試料は矛盾しているとして再試験した。
【００８４】
各アッセイプレートでの対照として使用するのに適した遺伝子型(A1/A1、A1/A2、およびA2/A2)を有する細胞株を同定するために、各アッセイを20個の細胞株のDNAパネルにおいて行った。細胞株DNAはR＆Dサービス(R＆D Service)、ロシュモレキュラーシステムズ(RMS)、Alameda、CAのカルチャーコレクションから入手し、キアゲン(Qiagen)抽出キット(キアンプDNA血液キット, Valencia, CA)を用いて抽出した。細胞株DNAの遺伝子型はDNA配列決定によって確認した。3つの細胞株DNA(A1/A1、A1/A2、およびA2/A2)を、それぞれの臨床試験試料プレートでの対照とし、プレート間のばらつきを確かめるために使用した。対照細胞株について得られたCt値を分析して、臨床試験試料について得られたΔCt値のカットオフを求めた。
【００８５】
各プレートについて各ウェルのCt値を含むデータファイルをSDSソフトウェアによって作成し、実験管理データベースに入力した。臨床試験のために行った全てのSNPアッセイについて、独立したコードにより識別される全試料のCt値を含むデータファイルをデータベースから抽出し、社内で開発したプログラムによって最終的な遺伝子型に翻訳(interpret)した。遺伝子型の結果を統計学者に送り、臨床データと対応させた(これも統計解析用の独立したコードにより識別された)。
【００８６】
実施例3:嘔吐試験
説明される嘔吐試験は2つの試験で行った。単回増加量試験(Single Ascending Dose:SAD)試験および複数回増加量(Multiple Ascending Dose:MAD)試験である。SADでは、嘔吐試験は、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-メチル-N-(6-モルホリン-4-イル-4-o-トリル-ピリジン-3-イル)-イソブチルアミドを摂取した6時間後および/または24時間後に行った。MADでは、嘔吐試験は、14日、毎日一回摂取し、最後に摂取した6時間後または24時間後に行った。
【００８７】
SAD
SADでは、試験1日目に、5mg、10mg、20mg、40mg、80mg、160mg、230mg、および400mg用量の2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-メチル-N-(6-モルホリン-4-イル-4-o-トリル-ピリジン-3-イル)-イソブチルアミドを被験者に飲用乳剤として経口投与した。薬物を投与した6時間後または24時間後に、被験者に50μg/kgのアポモルヒネを下腹部に皮下注射した。アポモルヒネ投与の時間を記録した。注射後すぐに、被験者を、まっすぐに座った姿勢にした。吐き気を催すまで、またはアポモルヒネ注射の後、少なくとも1時間、被験者をこの姿勢のままにした。約25ml以上の胃内容物を戻したら、嘔吐とみなす。戻した胃内容物がそれより少ない、または無ければ、吐き気とみなす。
【００８８】
吐き気および/または嘔吐は、注射後平均して10分以内に催すと予想した。50μg/kgのアポモルヒネを皮下投与した後の吐き気および/または嘔吐の持続時間は約5〜30分であった。嘔吐および吐き気の回数を記録した。
【００８９】
試験群を、「嘔吐試験時の血漿中濃度」の順番に従って順位付けした。遮断により達したプラトーには、平均3回の吐き気および嘔吐があった。これが、効力が到達する点であると仮定すると、この試験から有効なレベルは20ng/mlの血漿中濃度で到達すると予測される。
【００９０】
血漿中濃度と吐き気および嘔吐の回数との相関についてのスペルマン相関検定は非常に統計的に有意な関係を示唆している(p＜0.01)。
【００９１】
MAD
被験者に、2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-メチル-N-(6-モルホリン-4-イル-4-o-トリル-ピリジン-3-イル)-イソブチルアミドを14日間投与した。14日目に、SADに記載のように試験を行った。
【００９２】
MADはSADと一致する結果を示した。
【００９３】
ジェノタイピング
SADおよびMADの参加者全員を、図2の位置により定義されるNKNA遺伝子の41172位の一塩基多型について試験した。
【００９４】
効力を得るための最小濃度は20ng/ml血漿中濃度であることが分かったので、好ましくは、血漿中濃度が＞20ng/mlであり、治療に応答した(吐き気および嘔吐が3回以下の)個体において、一塩基多型が見出されるかどうかを試験した。結果を図4に示す。
【００９５】
ゲノム中に図2の位置により定義されるNKNA遺伝子の41172位に一塩基多型Gを含む被験者は、一塩基多型を含まない被験者またはヘテロ接合体でしかない被験者より高い効力で治療に応答した。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】NKNA遺伝子のゲノム構造およびNKNA遺伝子に見られる多型。図2に示した配列(アクセッション番号EM_HUM1:AC004140.1のDNA配列の一部に対応する)に関してエキソン-イントロンの境界を示す。多型の位置を矢印で示す。
【図２】プレプロタキキニン遺伝子を含むアクセッション番号EM_HUM1:AC004140.1により定義されるPACクローンDJ0841B21のゲノム配列の一部。エキソン-イントロンの境界は図1に示す。この配列は配列番号：1に対応しているが、33301位は配列番号：1の1位に対応し、41800位は配列番号：1の8500位に対応する。
【図３】NKNA遺伝子における同定された一塩基多型と図2において定義された位置。
【図４】29の41172位遺伝子型試験結果と嘔吐試験前濃度＞20ng/mlの2-(3,5-bis-トリフルオロメチル-フェニル)-N-メチル-N-(6-モルホリン-4-イル-4-o-トリル-ピリジン-3-イル)-イソブチルアミドの2×2分割表。効果=あり:嘔吐および吐き気の回数≦3。フィッシャーの正確検定(両側検定):p=0.033。被験者の遺伝子型は以下のカテゴリーに従って分類した:「0-2」は、対立遺伝子2(ヌクレオチドG)ホモ接合体(2コピーの対立遺伝子2、コピー無しの対立遺伝子1)である。「0-2でない」は、対立遺伝子1(ヌクレオチドA)ホモ接合体2-0(2コピーの対立遺伝子1、コピー無しの対立遺伝子2)、およびヘテロ接合体1-1(1コピーの対立遺伝子1、1コピーの対立遺伝子2)を含む。
【図１】
2005515788.tif 000009
【図２−１】
2005515788.tif 000010
【図２−２】
2005515788.tif 000011
【図２−３】
2005515788.tif 000012
【図３】
2005515788.tif 000013
【図４】
2005515788.tif 000014
【配列表】
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【国際調査報告】
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