(57)【要約】特に細胞および不純物などの他の成分を含有する混合物から、標的核酸を含有する細胞を濃縮、または分離する方法、組成物およびキットを開示する。この方法により、大部分が無傷の細胞を維持でき、分離(例えば、培養)後の細胞を使用でき、かつ/または細胞からの核酸回収が促進される。この方法では、ポリアミン類またはカチオン性界面活性剤などの凝集剤を使用して、細胞と複合体を形成してそれらを凝集させることにより、混合物の他の成分から分離させる。凝集細胞の分離は、磁気ビーズまたはフィルターなど、細胞を結合できる固相により達成できることが好都合である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
他の物質との混合物中に存在する、標的核酸を含有する細胞を分離する方法であって、
(a)細胞を含有する混合物を、ポリアミンまたはカチオン性界面活性剤である細胞を凝集できる凝集剤、および細胞と結合できる固相と接触させること、
(b)固相を用いて混合物から凝集細胞を分離すること、
(c)細胞から標的核酸を精製すること
を含む方法。
【請求項２】
凝集剤の添加前、添加後または添加と同時に固相を細胞と接触させる請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、分離工程後に実質的に溶解しない請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、分離工程後に生存可能である請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
凝集剤を、固相と結合させ、混合させまたは会合させて、細胞を固相上に凝集させ、混合物から該細胞を除去するために使用できる請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
凝集剤は、最初に溶解性であり、混合物中の細胞と沈殿物を形成する請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
固相が、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、フィルター、膜、粒子、シリカビーズまたはフリット、焼結物、ガラス、多糖類、または、チューブ、チップ、プローブもしくはウェルのようないずれかのプラスチック表面を含む請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
固相が、磁気ビーズである請求項7に記載の方法。
【請求項９】
固相が、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで核酸を放出できる請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
混合物に二価または多価アニオンを加えて細胞の凝集を促進させることをさらに含む請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
二価または多価アニオンが、リン酸イオンまたは硫酸イオンである請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
アニオンが、凝集剤の前または後に添加される請求項10または請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
凝集剤がポリアミンである請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリアミンが、ポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアルキルイミン、ポリエチルイミン、アミン基含有重合化生物学的緩衝剤、またはポリグルコースアミンである請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
凝集剤が、カチオン性界面活性剤である請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
カチオン性界面活性剤が、臭化ヘキサメチドリン、塩化ベンザルコニウム、DTAB、CTAB、N-ラウリルサルコシン、セトリミド、ポリミキシン類、または防腐性もしくは抗菌性化合物である請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、培養ブロスまたは生物学的サンプル中に存在する請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
混合物から分離した後に細胞を培養することをさらに含む請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程(b)後、細胞を溶解する請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞を溶解する工程後、細胞片を固相に結合する工程と、細胞片と固相とを分離して標的核酸溶液を提供する工程とをさらに含む請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
溶液から核酸を分離することをさらに含む請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
核酸を結合するためにシリカまたはその誘導体を含む固相を用いて核酸を分離する請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
標的核酸溶液を固相と接触させることにより核酸を分離し、固相は核酸が固相に結合するように、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで核酸を放出できる請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
標的核酸を放出するために溶液のpHを、より高い第2のpHに変えることをさらに含む請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
標的核酸を分析および/または増幅および/または配列決定することをさらに含む請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
標的核酸およびゲノム核酸を含有する細胞から標的核酸のサンプルを得ることをさらに含み、培養ブロスから細胞を分離すること、すなわち
標的核酸を、細胞から水性媒体に漏出させる水性媒体に細胞を懸濁するさらなる工程と、
水性媒体から核酸のサンプルを得るさらなる工程とを含み、
細胞は上記工程の間実質的に溶解せず、細胞内のゲノム核酸を実質的に保持する、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
凝集剤と混合した固相を含む組成物であって、
(a)凝集剤が、ポリアミンまたはカチオン性界面活性剤であり、
(b)固相が、磁気ビーズであるか、または固相が、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで結合核酸を放出できる物質から形成される組成物。
【請求項２８】
細胞が不純物と共に存在する混合物から細胞を分離し、かつ細胞中に存在する核酸を精製するキットであって、
ポリアミンまたはカチオン性界面活性剤である、細胞を凝集できる凝集剤と、
凝集した細胞を結合できる第1の固相と、
第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで結合核酸を放出できる、細胞中の核酸を精製するための第2の固相と
を含むキット。
【請求項２９】
第1と第2の固相が同一である請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
第1および/または第2の固相がビーズである請求項28または請求項29に記載のキット。
【請求項３１】
ビーズが磁気ビーズである請求項30に記載のキット。
【請求項３２】
固相が、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで結合核酸を放出できる材料から形成される請求項28から231のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を分離するため、特に細胞が不純物と共に存在する混合物から細胞を分離するため、より具体的には、次いで細胞中に存在する標的核酸の精製を可能にする方法における使用のための方法、組成物およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞および望ましくない不純物を含有する混合物からの細胞分離は、当業界において挑戦的課題である。細胞が、培養ブロス中、生物学的サンプル中、または同様な複合体混合物中に存在する場合、使用される方法は、高比率の細胞を捕捉し、実質的に全ての細胞を無傷で、すなわち、混合物をさらに汚染するような細胞片の放出をもたらすと思われる細胞の死滅、または溶解なしに捕捉する必要があるため、特に問題となる。このことは、細胞濃縮工程および分離工程に用いられる試薬が、極めて効率的にかつ細胞密度の範囲から細胞を捕捉する必要があり、細胞が分離される前に細胞壁の溶解、または核酸を「漏れやすく」させることによって妨害してはならないことを意味する。また、使用される試薬は、細胞を使用し、細胞から核酸を回収し、および/または核酸の処理、例えば、PCRまたは他の分析法を実施する、下流工程を妨害するべきではない。
【０００３】
ポリエチレンイミン(PEI)のような凝集剤を用いる培養物からの細胞分離は、当業界に知られており、例えば、PEIで被覆されている綿布上での細胞捕捉を報告しているKamathおよびD'Souza、Enzym Microb. Technol.、13:935〜939頁、1991年を参照されたい。しかしながら、この文献は、細胞または細胞内に含まれている核酸の分析処理よりもむしろバイオリアクターにおける使用のために固定化細胞を得ることに関係している。実際、これらの先行技術の方法は、細胞培養物からDNAを取り出すことを意図した。
【０００４】
EP 0 515 484 A(Amersham International plc)は、溶解混合物から細胞片、蛋白質および染色体DNAなどの不純物を除去し、それによって関心対象の核酸を含有する上澄液の分離を可能にするために、酸化鉄のような磁気材料から形成される磁気ビーズ、場合によっては有機ポリマーを用いる方法を開示している。この出願はまた、上澄液から関心対象の核酸を沈殿させ、ビーズの磁気特性を利用してビーズに対し非特異的結合の核酸を得るために同じタイプのビーズの使用を開示している。ついでに言えば、この出願はまた、pH5.2での酢酸ナトリウム、および磁気ビーズ誘導の沈殿分離などの従来の沈殿剤を用いた細菌、組織培養細胞および血液細胞の沈殿を言及している。しかしながら、先行技術法におけるアルコール性沈殿の使用は、細胞死滅および溶解を引き起こす不利益を被る。
【０００５】
WO99/29703およびWO02/48164(DNA Reseach Innovations Limited)は、典型的には、第1のpHでサンプルに存在する核酸を結合でき、また、より高い第2のpHで核酸を放出できる固相形態における、広範囲の「荷電スイッチ」材料を開示している。これらの荷電スイッチ材料は、生物学的サンプルおよび溶解混合物などのサンプルからの核酸精製に使用することができる。材料は、磁気ビーズの形態であるいはピペットまたはチューブ表面に取り込まれた形態で使用できる。
【０００６】
米国特許第6,284,470号(Promega Corporation)は、2種類の磁気ビーズ、すなわち、標的拡散との溶解混合物中に存在する破壊された生物学的物質と複合体を形成する第1のビーズ、および粒子に対する核酸の特異的吸着を促進する条件下で標的核酸との複合体を形成する第2のビーズを含むキットを開示している。磁気粒子の第2の種類は、荷電スイッチ特性を有することができ、すなわち、粒子に対する核酸の結合は、pH依存性である。この特許はまた、細胞と磁気ビーズとの間で複合体を形成することによって、例えば、グリシル-ヒスチジンによって誘導体化されることにより、細菌または白血球などの細胞を濃縮し、または収穫するために磁気粒子の使用を記載している。
【特許文献１】EP 0 515 484 A(Amersham International plc)
【特許文献２】WO99/29703(DNA Reseach Innovations Limited)
【特許文献３】WO02/48164(DNA Reseach Innovations Limited)
【特許文献４】米国特許第6,284,470号(Promega Corporation)
【特許文献５】PCT/GB02/005209
【特許文献６】EP 0 389 063 A
【特許文献７】WO97/29703
【特許文献８】米国特許第4,683,195号
【非特許文献１】KamathおよびD'Souza、Enzym Microb. Technol.、13:935〜939頁、1991年
【非特許文献２】2001年Aldrichカタログ、1385頁
【非特許文献３】Ausbelら、Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons、ニューヨーク、1992年
【非特許文献４】Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol、51:263頁、(1987)、Ehrlich編、PCR Technology、Stockton Press、ニューヨーク、1989年
【非特許文献５】Ehrlichら、Science、252:1643〜1650頁、(1991)
【非特許文献６】「PCR protocols; A Guide to Methods and Applications」、Innisら編、Academic Press、ニューヨーク、(1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞を分離する新規な方法、特に細胞溶解を大いに避けることができる方法かつ容易に自動化しやすい方法に関する必要性が依然として当業界に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
概括的に本発明は、特に細胞と不純物などの他の成分とを含有する混合物から細胞を濃縮するか、または分離する方法、組成物およびキットに関する。好ましい態様において、本発明は、高比率の無傷の細胞を維持でき、したがって、分離(例えば、培養)後の細胞を使用でき、および/または細胞から核酸の回収を促進する細胞分離方法に関する。本発明は、ポリアミン類またはカチオン性界面活性剤などの凝集剤が、細胞と複合体を形成して細胞を凝集させるという知見に基づいている。混合物中に存在する細胞では、細胞の凝集により、混合物の他の成分から容易に細胞を分離できる。凝集細胞の分離は、磁気ビーズまたはフィルターなど、細胞を結合できる固相により達成できることが好都合である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
したがって、第1の態様において、本発明は、他の物質との混合物中に存在する細胞を分離する方法を提供し、
細胞を含有する混合物を、ポリアミンまたはカチオン性界面活性剤である細胞を凝集できる凝集剤、および細胞と結合できる固相と接触させること、
固相を用いて混合物から凝集細胞を分離することを含む。
【００１０】
固相は、凝集剤の添加前、添加後または同時に細胞と接触させることができる。一実施態様において、凝集剤は、固相と結合させる(好ましくは、共有結合させる)か、混合させるか、または会合させる。これは、細胞を固相上に凝集させ、次いで混合物から細胞を分離するために使用できるという利点を有する。代わりの実施形態において、凝集剤が、細胞を含有する混合物に添加された際に最初に溶解し、細胞と不溶性沈殿物を形成する。いずれの場合にも、細胞の凝集または沈殿は、この工程を促進するか、または増強する下記の試剤を用いて増大させることができる。
【００１１】
本発明による使用に好適な固相の例としては、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、フィルター、フィルターカラム、スピンフィルターカラム、膜、粒子、ビーズ(例えば、シリカビーズ)またはフリット、焼結物、ガラスビーズまたはスライド、金属表面、繊維、多糖類またはチューブ、チップ、プローブまたはウェルのようないずれかのプラスチック表面が挙げられる。磁気ビーズは特に好ましい固相であり、好適には0.1〜20μmの間の平均径を有する。固相は、無機または有機材料またはそれらの複合材料からなる溶解性形態であってもまたは不溶性形態であってもよい。例として、固相は、プラスチック類、ガラス類、多糖類、酸化金属、水酸化/水和金属、塩類、シリケート類、粘土、リグニン類、活性炭および他の不溶性微粒子を含むことができる。
【００１２】
本発明において、かなりの比率の細胞が無傷で捕捉されることが好ましい。このことは、使用される試薬が、細胞を効率的に、すなわち、細胞密度の範囲から捕捉する必要があり、また、細胞が分離される前に細胞を死滅、または細胞壁の溶解、または核酸を「漏れやすく」させることによって妨害してはならないことを意味する。好ましい実施形態において、本発明は、細胞が分離後生存可能であり、したがって培養あるいは他に使用できるというさらなる利点を有する。また、使用される試薬は、細胞からの核酸回収に適合性であるか、または例えばPCRまたは他の方法による、下流の核酸分析を阻止することが好ましい。
【００１３】
このように、本発明の文脈において、方法の細胞分離工程における「実質的に溶解されない」とは、方法に従って処理された集団の細胞の20%未満、好ましくは10%未満、より好ましくは5%未満、より好ましくは2%未満、最も好ましくは1%未満が溶解されることを意味する。細胞溶解の程度は、例えば、顕微鏡下でサンプル中に存在する溶解細胞と非溶解細胞とをカウントすることにより容易に判定できる。上記のように、細胞のかなりの比率が、本発明による分離後生存可能であることもまた好ましい。細胞の生存率は、適切な増殖媒体上で分離細胞のサンプルを増殖させることにより容易に評価でき、また、この文脈において、「かなりの比率」とは、細胞の少なくとも50%が生存可能であり、より好ましくは細胞の少なくとも75%、より好ましくは細胞の少なくとも85%、最も好ましくは細胞の少なくとも95%が生存可能であることを意味する。
【００１４】
本発明において、「ポリアミン」である凝集剤とは、1つ以上の共有結合単位を有し、各単位が、物質が細胞分離法に用いられるpHで陽性に荷電される1つ以上のアミン基、例えば第一級、第二級、第三級、第四級、芳香族またはヘテロ環式アミン基を有する物質を意味する。好ましいポリアミン類は、複数の共有結合単位を含む。ポリアミンを形成する単位は、同一であってもまたは異なっていてもよい。アミン基に加えて、ポリアミン類は非置換であっても、または例えば、固相上の結合促進特性を修飾するために、1つ以上のさらなる官能基で置換されていてもよい。ポリアミン類の好ましい例としては、ポリアミノ酸類、ポリアリルアミン類、ポリエチレンイミン類などのポリアルキルイミン類、アミン基含有重合化生物学的緩衝剤およびポリグルコースアミン類が挙げられる。これらのクラスのポリアミンの全ては、置換されていてもまたは非置換であってもよい。好ましいポリアミン類、特にポリアリルアミン類は、約10kDaから約100kDa、より好ましくは約50kDaから約80kDaの範囲の分子量、最も好ましくは約70kDaの分子量を有する。上記のように、本発明の好ましい実施形態では、最初溶解性であり、細胞と複合体を形成して沈殿するポリアミン類を使用する。あるいは、ポリアミン類を固相に結合する、固相と混合する、または会合する。
【００１５】
ポリアミンがポリアミノ酸である本発明の実施態様において、ポリアミノ酸を形成する結合アミノ酸は、同一であっても、または異なっていてもよい。好ましい例としては、ポリリジン類またはポリヒスチジン類が挙げられる。ポリアミノ酸を形成するために用いられるアミノ酸は、DまたはLアミノ酸または双方の混合物であり得る。
【００１６】
ポリアミンがポリアリルアミンまたはポリアリルアミン.HClである本発明の実施態様において、ポリアリルアミンは、式:
ポリ(塩酸アリルアミン):[-CH2CH(CH2NH2.HCl)-]nまたは
ポリ(アリルアミン):[-CH2CH(CH2NH2)-]nによって表されることが好ましく、
式中、nは少なくとも3であり、およびポリアリルアミンは、非置換であっても、または上記の簡略式には示していない1つ以上のさらなる置換基を有してもよい。このような物質は、2-プロペン-1-アミンまたはアルケンおよびアミン官能基を含む同様のモノマーの重合化により製造できる。ポリアリルアミンの例は、固体形態、溶液形態(例えば、20重量%溶液)でAldrichにより供給されることができ、その両方が本発明により使用できる。ポリアリルアミン類の例としては、ポリ(アリルアミン)整理番号47,914-4(20重量%溶液、分子量約65,000)、ポリ(アリルアミン)整理番号47,913-6(20重量%溶液、分子量約17,000)、ポリ(塩酸アリルアミン)整理番号28,321-5(固体、分子量約15,000)およびポリ(塩酸アリルアミン)整理番号28,322-3(固体、分子量約70,000)が挙げられ、全ては、2001年Aldrichカタログ、1385頁に記載されている。
【００１７】
ポリアミンが、ポリエチルイミン(PEI)のようなポリアルキルイミンである本発明の実施態様において、例えば、式:ポリエチレンイミン:(-NHCH2CH2-)x[-N(CH2CH2NH2)CH2CH2-]yによって表される。
【００１８】
本発明の実施態様において、ポリアミンは、ポリビス-トリスのような重合化生物学的緩衝剤である。アミン基を有し、重合化でき、本発明に使用できる生物学的緩衝剤の例としては以下のものが挙げられる:
ビス-2-ヒドロキシエチルイミノトリスヒドロキシメチルメタン(ビス-トリス)、pKa 6.5。
1,3-ビストリスヒドロキシメチルメチルアミノプロパン(ビス-トリスプロパン)、pKa 6.8。
N-トリスヒドロキシメチルメチルグリシン(トリシン)、pKa 8.1。
トリスヒドロキシメチルアミノメタン(トリス)、pKa 8.1。
【００１９】
本発明の実施態様において、ポリアミンは、甲殻類の殻から誘導され、D-グルコサミンの繰り返し単位から形成される容易に入手できる物質のキトサンのようなポリグルコースアミンである。
【００２０】
細胞凝集に有用な他の物質は、臭化ヘキサメチドリン、塩化ベンザルコニウム、DTAB、CTAB、N-ラウリルサルコシン、セトリミド、ポリミキシン類などの界面活性剤、または防腐性もしくは抗菌性化合物である。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、固相および凝集剤を含む組成物を提供し、凝集剤はポリアミンまたはカチオン性界面活性剤である。上記のように、凝集剤は、固相と会合するか、混合するかまたは結合できる。ポリアミンまたは界面活性剤が固相に結合する実施態様において、共有結合が好ましい。
【００２２】
本発明のこの態様において、固相は、例えば、0.1〜20μmの間の平均径を有する好ましくはビーズ、より好ましくは磁気ビーズの形態である。例えば、WO02/48164またはWO99/29703に開示されているように、固相は、第1のpHで核酸を結合でき、また、より高い第2のpHで結合核酸を放出できる物質から形成でき、すなわち、荷電スイッチ固相である。このことは、1つの固相が、不純物からの細胞分離に、次いで細胞と共に含まれた核酸のその後の精製に使用できることを意味する。このことは、このような精製プロトコルを実施するために必要な試薬の簡便化、ならびにそれらをより自動化しやすくさせる利点を有する。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、細胞が不純物と共に存在する混合物から細胞を分離するキットを提供し、該キットは、
ポリアミンまたはカチオン性界面活性剤である、細胞を凝集できる凝集剤と、
凝集した細胞を結合できる第1の固相と、
場合によっては、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで結合核酸を放出できる、細胞中の核酸を精製するための第2の固相(すなわち、例えばWO02/48164またはWO99/29703に開示されている荷電スイッチ固相)とを含む。
【００２４】
好ましいキットにおいて、第1と第2の固相は同一であってもよく、すなわち、荷電スイッチ固相は細胞を結合するために、また、細胞と共に含まれた核酸の精製にも使用できる。
【００２５】
本発明は、限定はしないが、培養ブロス、血液および組織などの生物学的サンプル、食品、水汚染液体、宿主細胞、例えばグラム陰性およびグラム陽性細菌(例えば、大腸菌)線状菌または真菌(放線菌など)などの細胞分離、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞および植物原形質体など細胞を含有する多くの異なるタイプのサンプルに広く適用できる。
【００２６】
本発明の幾つかの好ましい実施態様において、凝集剤は、細胞の凝集を促進する試剤と協同して使用される。この試剤は、pHまたは温度の変化、二価イオンまたは多価イオン、凝集剤に対する対イオンの変化、架橋剤、濃度変化、蒸発であり得る。本発明の好ましい実施態様において、二価アニオンまたは多価アニオンを、凝集を促進するために細胞を含有する混合物に添加する。特に好ましい実施態様において、リン酸イオンを添加する。しかしながら、リン酸イオンは、限定はしないが、硫酸イオンおよびポリカルボン酸イオンなどの任意の二価アニオンまたは多価アニオンに置き換えることができる。特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、リン酸イオンなどの二価カチオンが用いられる場合細胞周囲で不溶性となる高分子電解質複合体が形成され、細胞の凝集およびこのゆえに分離を助けると考えている。
【００２７】
細胞分離を実施するために、細胞サンプルを、凝集剤と固相とに接触させる。細胞はそれらと会合して、使用される固相が溶液から複合体を除去することを可能にする。分離は、減圧ろ過、シリンジろ過、磁気分離、電気泳動、遠心分離、沈降分離または蒸発または液体除去法などの当業界によく知られた範囲で達成できる。
【００２８】
分離後、細胞を採取して培養でき、保管目的のために貯蔵するか、または核酸、蛋白質、代謝物、炭水化物または脂質成分またはこれらの複合体などの重要な生体分子を放出させるために処理できる。細胞内の生体分子が損失しないように分離中の細胞の有意な溶解を避ける。このように、さらなる実施態様において、本発明の方法は、混合物から分離された細胞を培養する工程を含み得る。
【００２９】
細胞を分離する方法に続いて、標的生体分子、特に細胞内に含まれる核酸を精製する工程が行われる。例として、標的核酸は、細胞内に保持されたゲノム核酸から分離される非ゲノム核酸であり得る。非ゲノム核酸としては、ベクター、プラスミド、自己複製サテライト核酸またはコスミドDNA、またはベクターRNAが挙げられる。標的核酸の他の形態としては、ラムダ、M13およびウィルス核酸などのバクテリオファージ類が挙げられる。好ましい実施形態において、非ゲノム核酸サンプルは、プラスミドDNAである。
【００３０】
好ましい実施形態において、前記方法は、関心対象の核酸を含有する細胞を分離するために使用され、細胞を凝集させる最初の工程は、以下により詳細に記載されるように、核酸を精製する方法の一部であり得る。したがって、本発明のこのような実施形態において、方法は、細胞サンプルに対して実施されるさらなる処理工程または精製工程を含んでもよく、例えば、
(a)標的核酸を単離する工程、または
(b)標的核酸を分析する工程、または
(c)標的核酸を増幅する工程、または
(d)標的核酸を配列決定する工程
の1つ以上の追加工程を含む。
【００３１】
これらの工程を、以下により詳細に検討する。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明は、標的核酸およびゲノム核酸を含有する細胞から標的核酸のサンプルを得ることをさらに含み、この方法は、培養ブロスから細胞を分離すること、すなわち
標的核酸を、細胞から水性媒体に漏出させる水性媒体に細胞を懸濁するさらなる工程と、
水性媒体から核酸のサンプルを得るさらなる工程とを含み、
細胞は上記工程の間実質的に溶解せず、細胞内のゲノム核酸を実質的に保持する。
【００３３】
この方法の詳細は、PCT/GB02/005209に提供されている。この方法は、細胞エンドトキシンの実質的な放出を引き起こさず、それにより、ゲノム核酸またはRNAに加えて細胞エンドトキシンからの標的核酸の分離が可能になる。この方法の好ましい実施態様において、標的核酸は、サイズが100kb以下、またはより好ましくは50kb以下、またはより好ましくは20kb以下、さらにより好ましくは10kb以下であり得る。核酸のサイズは、例えば、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルを使用するゲル電気泳動法を用いて当業者によって判定でき、例えば、Ausbelら、Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons、ニューヨーク、1992年を参照されたい。
【００３４】
あるいは、上記方法に従って分離された細胞を溶解して、例えば、上記の荷電スイッチ固相、シリカまたはその誘導体が、カオトロピック剤の存在下核酸と結合するために用いられているEP 0 389 063 Aに記載された核酸結合固相を用いて、標的核酸を溶解産物から精製した。
【００３５】
いずれの場合においても、プラスミドのような標的核酸を、本発明により細胞を含有する媒体から分離でき、生じた水性媒体、すなわち、上澄液は、さらなる精製工程、例えば、PCRまたは他の分析法に係る要件なしで直接用いられる。
【００３６】
核酸を精製するために当業者に利用できる技法範囲は当業界に知られている。精製技術の例としては、イオン交換、電気泳動、カオトロピック塩抽出によるシリカ固相、沈殿、凝集、ろ過、ゲルろ過、遠心分離、アルコール沈殿および/または我々の同時係属出願WO97/29703およびWO02/48164に記載された荷電スイッチ材料の使用ならびに当業界によく知られた他の精製法または分離法が挙げられる。好ましい実施態様において、標的核酸は、例えば、固相上に存在する荷電スイッチ材料、ピペットチップ、ビーズ(特に磁気ビーズ)、多孔性膜、フリット、焼結物、プローブまたはディップスティック、チューブ(PCRチューブ、エッペンドルフチューブ)またはミクロアレイを用いて精製される。
【００３７】
標的核酸はまた、好適にはポリメラーゼ連鎖反応法を用いて増幅の対象となり得る。核酸増幅のためのPCR法は、米国特許第4,683,195号に記載されている。一般に、このような技法は、標的配列の末端からの配列情報が知られており、増幅の標的となるポリヌクレオチド配列と同一かまたは類似するように、好適な正方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマーがデザイン可能であること必要とする。PCRは、テンプレート核酸(二重鎖の場合)の変性工程、プライマーの標的へのアニーリング工程、および重合工程を含む。増幅反応におけるテンプレートとして探索されるか、または用いられる核酸は、ゲノムDNA、cDNAまたはRNAであり得る。PCRは、ゲノムDNA、特定のRNA配列およびmRNAから転写されたcDNAからの特定の配列、バクテリオファージまたはプラスミド配列を増幅するために使用できる。PCR法の一般的利用に関する引用文献としては、Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol、51:263頁、(1987)、Ehrlich編、PCR Technology、Stockton Press、ニューヨーク、1989年、Ehrlichら、Science、252:1643〜1650頁、(1991)、「PCR protocols; A Guide to Methods and Applications」、Innisら編、Academic Press、ニューヨーク、(1990)が挙げられる。
【００３８】
ここで本発明の実施態様を、実施例によってより詳細に記載するが、限定する意図はない。
〔実施例〕
（実施例１）
【００３９】
ポリアミン凝集、フィルター上の細胞捕捉および荷電スイッチ磁気ビーズを用いるDNAの精製
大腸菌/pUC19の一晩培養物0.75mlと、10μlの0.45μmのスピン-フィルターカラム中の50mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaとを1分間混合した。次にスピン-フィルターカラムを13000rpmで1分間遠心分離して、フィルターを詰まらせることなく液体を除き、流液を捨てた。スピン-フィルターカラム中のペレットを100μlの10mMトリス-HCl(pH8.5)、100μg/ml RNaseA含有1mM EDTA緩衝液に再懸濁して、1分間放置した。次にこの再懸濁細胞を、100μlの1%(w/v)SDS、0.2M NaOH溶解液と3分間混合してから、沈殿緩衝液(1.0M酢酸カリウム、0.66M KCl、pH4.0)を沈殿細胞片に徐々に混合した。スピン-フィルターカラムを13000rpmで1分間再度遠心分離して、流液を20μlのCST磁気ビーズ(25mg/ml)と混合し、室温で1分間温置した。サンプルを1分間マグネットにかけて、上澄液を捨てた。次にビーズを、100μlの蒸留水で2回洗浄し、精製プラスミドDNAをビーズから50μlの10mMトリス-HCl(pH8.5)に溶出した。精製プラスミドDNAを、臭化エチジウム含有1%寒天ゲル中のゲル電気泳動により可視化した。
（実施例２）
【００４０】
ポリアミン凝集、荷電スイッチ磁気ビーズ上の細胞捕捉および荷電スイッチ磁気ビーズを用いるDNAの精製
1.0mlの大腸菌/pUC19の一晩培養物と、1.5mlミクロ遠心分離管中で5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaと予め混合した30μlのCST磁気ビーズ(25mg/ml)とを1分間混合した。次にサンプルを1分間マグネットにかけて磁気ビーズおよび凝集細胞を採取した。上澄液を捨て、磁気ペレットを100μlの10mMトリス-HCl(pH8.5)、100μg/ml RNaseA含有1mM EDTA緩衝液に再懸濁して、1分間放置した。次にこの再懸濁細胞を、100μlの1%(w/v)SDS、0.2M NaOH溶解液と3分間混合してから、沈殿緩衝液(1.0M酢酸カリウム、0.66M KCl、pH4.0)を沈殿細胞片に徐々に混合した。サンプルを1分間マグネットにかけることにより細胞片を除去した。次いで上澄液を、20μlのCST磁気ビーズ(25mg/ml)と混合し、室温で1分間温置した。サンプルを1分間マグネットにかけて、上澄液を捨てた。次にビーズを、100μlの蒸留水で2回洗浄し、精製プラスミドDNAをビーズから50μlの10mMトリス-HCl(pH8.5)に溶出した。精製プラスミドDNAを、臭化エチジウム含有1%寒天ゲル中のゲル電気泳動により可視化した。
（実施例３）
【００４１】
ポリアミン凝集、マグネタイト粒子上の細胞捕捉および荷電スイッチ磁気ビーズを用いるDNAの精製
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaと予め混合した30μlのCST磁気ビーズ(25mg/ml)の代わりに、10mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaと予め混合した50μlのマグネタイト(50mg/ml)を用いた。
（実施例４）
【００４２】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaを用いた。
（実施例５）
【００４３】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/mlポリ-L-リジンを用いた。
（実施例６）
【００４４】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/mlポリ-DL-リジンを用いた。
（実施例７）
【００４５】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/mlポリ-L-ヒスチジンを用いた。
（実施例８）
【００４６】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約15kDaを用いた。
（実施例９）
【００４７】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(アリルアミン)、分子量=約17kDaを用いた。
（実施例１０）
【００４８】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(アリルアミン)、分子量=約65kDaを用いた。
（実施例１１）
【００４９】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/mlポリ(エチレンイミン)を用いた。
（実施例１２）
【００５０】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/mlポリミキシンB(Sigma-Aldrichカタログ番号P-1004)を用いた。
（実施例１３）
【００５１】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/ml塩化ベンザルコニウムを用いた。
（実施例１４）
【００５２】
実施例2のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、10mg/ml臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム(「セトリミド(Cetrimide)」、「CTAB」)を用いた。
（実施例１５）
【００５３】
哺乳動物細胞の分離
赤血球(RBC)溶解液=10mM NH4HCO3、0.1% Tween(登録商標) 20。
白血球(WBC)消化緩衝液=1% SDS、1mM EDTA、10mM トリスHCl pH8
ゲノム沈殿緩衝液= 6M 酢酸アンモニウム。
【００５４】
10mlのヒツジ血液を、30mlの「RBC溶解液」に混合し、室温で10分間温置した。次いでサンプルを2000rpmで10分間遠心分離し、上澄液を捨てて細胞ペレットを10mlの50mMリン酸緩衝液に再懸濁した。次いで細胞懸濁液の500μlの一定分割量を、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaで予め混合した30μlのCST磁気ビーズ(25mg/ml)に混合し、2分間温置した。次にサンプルをマグネットに対して2分間保持すると、細胞懸濁液の透明化が見られ、細胞が懸濁液から除去されたことを示した。上澄液を捨て、ペレットを、500μlの「WBC消化懸濁液」に再懸濁し、ピペットの上下操作により1分間混合した。次に150μlの「ゲノム沈殿緩衝液」を添加し、混合物を20秒間ボルテックスし、生じた沈殿物は、サンプルをマグネットに2分間かけることにより除去した。次に500μlの上澄液を500μlのイソプロパノールで静かに混合すると、ゲノムDNAの沈殿形成が見られた。
（実施例１６）
【００５５】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ-L-リジンを用いた。
（実施例１７）
【００５６】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ-DL-リジンを用いた。
（実施例１８）
【００５７】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ-L-ヒスチジンを用いた。
（実施例１９）
【００５８】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約15kDaを用いた。
（実施例２０）
【００５９】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(アリルアミン)、分子量=約17kDaを用いた。
（実施例２１）
【００６０】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(アリルアミン)、分子量=約65kDaを用いた。
（実施例２２）
【００６１】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(エチレンイミン)を用いた。
（実施例２３）
【００６２】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリミキシンB(Sigma-Aldrichカタログ番号P-1004)を用いた。
（実施例２４）
【００６３】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/ml塩化ベンザルコニウムを用いた。
（実施例２５）
【００６４】
実施例15のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/ml「セトリミド」(臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム)を用いた。
（実施例２６）
【００６５】
実施例15のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaを除き、ポリ-トリス被覆磁気ビーズのみを用いた。
（実施例２７）
【００６６】
200μlのヒツジ血液を、600μlの「RBC溶解液」に混合し、室温で10分間温置した。次いでサンプルを1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaで予め混合した50μlのCST磁気ビーズ(25mg/ml)に混合し、2分間温置した。次にサンプルを2分間マグネットにかけて上澄液を捨てた。磁気ペレットを200μlの10mM NaOHに再懸濁して、室温で1分間温置した。次にこの再懸濁ペレットを、2分間マグネットに保持して磁気粒子を除去した。抽出DNAを、臭化エチジウム含有1%寒天ゲル中のゲル電気泳動により可視化した。
（実施例２８）
【００６７】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ-DL-リジンを用いた。
（実施例２９）
【００６８】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ-L-ヒスチジンを用いた。
（実施例３０）
【００６９】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約15kDaを用いた。
（実施例３１）
【００７０】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(アリルアミン)、分子量=約17kDaを用いた。
（実施例３２）
【００７１】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(アリルアミン)、分子量=約65kDaを用いた。
（実施例３３）
【００７２】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(エチレンイミン)を用いた。
（実施例３４）
【００７３】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリミキシンB(Sigma-Aldrichカタログ番号P-1004)を用いた。
（実施例３５）
【００７４】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/ml塩化ベンザルコニウムを用いた。
（実施例３６）
【００７５】
実施例27のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/ml「セトリミド」(臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム)を用いた。
（実施例３７）
【００７６】
実施例27のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaを除き、ポリ-トリス被覆磁気ビーズのみを用いた。
（実施例３８）
【００７７】
200μlのヒツジ血液を、600μlの「RBC溶解液」に混合し、室温で10分間温置した。次いでサンプルを1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約65kDaで予め混合した50μlのCST磁気ビーズ(25mg/ml)に混合し、2分間温置した。次にサンプルを2分間マグネットにかけて上澄液を捨てた。磁気ペレットを500μlの「WBC消化懸濁液」に再懸濁し、ピペット操作により1分間混合した。次に150μlの「ゲノム沈殿緩衝液」を添加し、20秒間ボルテックスして混合し、チューブをマグネットに対し2分間置いた。500μlの上澄液を除去し、500μlのイソプロパノールと混合し、DNAを全て沈殿させた。次にサンプルを-20℃で20分間温置し、次いで13000rpmで10分間遠心分離した。上澄液を捨て、ペレットを500μlの70%(v/v)エタノールで1回洗浄した。ペレットを風乾してから、10mM トリス-HClに一晩溶解した。次に精製ゲノムDNAを、臭化エチジウム含有1%寒天ゲル中のゲル電気泳動により可視化した。
（実施例３９）
【００７８】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ-L-リジンを用いた。
（実施例４０）
【００７９】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ-DL-リジンを用いた。
（実施例４１）
【００８０】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ-L-ヒスチジンを用いた。
（実施例４２）
【００８１】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約15kDaを用いた。
（実施例４３）
【００８２】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(アリルアミン)、分子量=約17kDaを用いた。
（実施例４４）
【００８３】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(アリルアミン)、分子量=約65kDaを用いた。
（実施例４５）
【００８４】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリ(エチレンイミン)を用いた。
（実施例４６）
【００８５】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/mlポリミキシンB(Sigma-Aldrichカタログ番号P-1004)を用いた。
（実施例４７）
【００８６】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/ml塩化ベンザルコニウムを用いた。
（実施例４８）
【００８７】
実施例38のとおりであるが、1mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaの代わりに、1mg/ml「セトリミド」(臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム)を用いた。
（実施例４９）
【００８８】
実施例38のとおりであるが、5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaを除き、ポリ-トリス被覆磁気ビーズのみを用いた。
（実施例５０）
【００８９】
本発明を用いて分離した細胞は培養できる
大腸菌/pUC19の一晩培養物1mlと、30μlの50mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaとを混合した。沈殿反応から形成されて生じた凝集粒子を、滅菌接種用ループによりブロスから除き、50μg/mlアンピシリン含有LBAプレート上に線状接種した(pUC19プラスミドに対しβ-ラクタマーゼ遺伝子を選択するために)。プレートを37℃で一晩温置した。良好な細菌増殖が見られ、凝集反応は細菌を死滅させないことが示された。
（実施例５１）
【００９０】
大腸菌/pUC19の一晩培養物1mlと、30μlの5mg/mlポリ(塩酸アリルアミン)、分子量=約70kDaで予め混合したCSTビーズとを混合した。生じた磁気沈殿物を、マグネットに対して1分間チューブを保持することにより採取して上澄液を捨てた。次にペレットを滅菌接種用ループを用いて、50μg/mlアンピシリン含有LBAプレート上に線状接種した(pUC19プラスミドに対しβ-ラクタマーゼ遺伝子を選択するために)。次いでプレートを37℃で一晩温置した。良好な細菌増殖が見られ、凝集反応は細菌を死滅させないことが示された。
（実施例５２）
【００９１】
実施例2に記載された方法を用いて精製されたプラスミドDNAは、制限エンドヌクレアーゼ(HindIIIなど)を用いて消化でき、DNAが分子生物学的応用に使用できることが示された。
（実施例５３）
【００９２】
大腸菌/pUC19の一晩培養物1.0mlと、1.5mlミクロ遠心分離管中の1mg/mlキトサンで予め混合された50μlのマグネタイト(50mg/ml)とを1分間混合した。次にサンプルを1分間マグネットにかけて磁気ビーズおよび凝集細胞を採取した。上澄液を捨て、磁気ペレットを100μlの10mMトリス-HCl(pH8.5)、100μg/ml RNaseA含有1mM EDTA緩衝液に再懸濁して、1分間放置した。次にこの再懸濁細胞を、100μlの1%(w/v)SDS、0.2M NaOH溶解液に3分間混合してから、沈殿緩衝液(1.0M酢酸カリウム、0.66M KCl、pH4.0)を沈殿細胞片に静かに混合した。細胞片は、サンプルを1分間マグネットにかけることにより除去した。次いで上澄液を、20μlのCST磁気ビーズ(25mg/ml)と混合し、室温で1分間温置した。サンプルを1分間マグネットにかけて、上澄液を捨てた。次にビーズを、100μlの蒸留水で2回洗浄してから、精製プラスミドDNAをビーズから50μlの10mMトリス-HCl(pH8.5)に溶出した。精製プラスミドDNAを、臭化エチジウム含有1%寒天ゲル中のゲル電気泳動により可視化した。
（実施例５４）
【００９３】
酵母ベクター類の精製
ベクターESC-Leu含有酵母YPH501の一晩培養物を調製し、1mlをポリアミンに吸着させた30μlの磁気ビーズと混合した。細胞をマグネットにより分離した後、上澄液を除去し、細胞を、ソルビトール、メルカプトエタノールおよびリチカーゼ(lyticase)を含有する標準的なスフェロプラスト溶液に30分間再懸濁した。次にスフェロプラストを1% SDSを有する300μlの0.2M NaOHに溶解し、次いで30μlの1.5M酢酸カリウム緩衝液pH4を加えることにより透明化した。細片と結合し、マグネットで分離するために混合物中にまだ存在する磁気ビーズを用いることにより細胞片の除去が達成された。
【００９４】
本明細書中の全ての引用文献は、参照として明白に組み込まれている。
【手続補正書】
【提出日】平成16年8月16日(2004.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
他の物質との混合物中に存在する、標的核酸を含有する細胞を分離する方法および該細胞から標的核酸を精製する方法であって、
(a)細胞を含有する混合物を、ポリアミンまたはカチオン性界面活性剤である細胞を凝集できる凝集剤、および細胞と結合できる固相と接触させること、
(b)固相を用いて混合物から凝集細胞を分離すること、
(c)細胞から標的核酸を精製すること
を含む方法。
【請求項２】
凝集剤の添加前、添加後または添加と同時に固相を細胞と接触させる請求項1に記載の方法。
【請求項３】
細胞が、分離工程後に実質的に溶解しない請求項1または請求項2に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、分離工程後に生存可能である請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
凝集剤を、固相と結合させ、混合させまたは会合させて、細胞を固相上に凝集させ、混合物から該細胞を除去するために使用できる請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
凝集剤は、最初に溶解性であり、混合物中の細胞と沈殿物を形成する請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
固相が、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、フィルター、膜、粒子、シリカビーズまたはフリット、焼結物、ガラス、多糖類、または、チューブ、チップ、プローブもしくはウェルのようないずれかのプラスチック表面を含む請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
固相が、磁気ビーズである請求項7に記載の方法。
【請求項９】
固相が、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで核酸を放出できる請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
混合物に二価または多価アニオンを加えて細胞の凝集を促進させることをさらに含む請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
二価または多価アニオンが、リン酸イオンまたは硫酸イオンである請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
アニオンが、凝集剤の前または後に添加される請求項10または請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
凝集剤がポリアミンである請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリアミンが、ポリアミノ酸、ポリアリルアミン、ポリアルキルイミン、ポリエチルイミン、アミン基含有重合化生物学的緩衝剤、またはポリグルコースアミンである請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
凝集剤が、カチオン性界面活性剤である請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
カチオン性界面活性剤が、臭化ヘキサメチドリン、塩化ベンザルコニウム、DTAB、CTAB、N-ラウリルサルコシン、セトリミド、ポリミキシン類、または防腐性もしくは抗菌性化合物である請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、培養ブロスまたは生物学的サンプル中に存在する請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
混合物から分離した後に細胞を培養することをさらに含む請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程(b)後、細胞を溶解する請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
細胞を溶解する工程後、細胞片を固相に結合する工程と、細胞片と固相とを分離して標的核酸溶液を提供する工程とをさらに含む請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
溶液から核酸を分離することをさらに含む請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
核酸を結合するためにシリカまたはその誘導体を含む固相を用いて核酸を分離する請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
標的核酸溶液を固相と接触させることにより核酸を分離し、固相は核酸が固相に結合するように、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで核酸を放出できる請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
標的核酸を放出するために溶液のpHを、より高い第2のpHに変えることをさらに含む請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
標的核酸を分析および/または増幅および/または配列決定することをさらに含む請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
標的核酸およびゲノム核酸を含有する細胞から標的核酸のサンプルを得ることをさらに含み、培養ブロスから細胞を分離すること、すなわち
標的核酸を、細胞から水性媒体に漏出させる水性媒体に細胞を懸濁するさらなる工程と、
水性媒体から核酸のサンプルを得るさらなる工程とを含み、
細胞は上記工程の間実質的に溶解せず、細胞内のゲノム核酸を実質的に保持する、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
凝集剤と混合した固相を含む組成物であって、
(a)凝集剤が、ポリアミンまたはカチオン性界面活性剤であり、
(b)固相が、磁気ビーズであるか、または固相が、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで結合核酸を放出できる物質から形成される組成物。
【請求項２８】
細胞が不純物と共に存在する混合物から細胞を分離し、かつ細胞中に存在する核酸を精製するキットであって、
ポリアミンまたはカチオン性界面活性剤である、細胞を凝集できる凝集剤と、
凝集した細胞を結合できる第1の固相と、
第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで結合核酸を放出できる、細胞中の核酸を精製するための第2の固相と
を含むキット。
【請求項２９】
第1と第2の固相が同一である請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
第1および/または第2の固相がビーズである請求項28または請求項29に記載のキット。
【請求項３１】
ビーズが磁気ビーズである請求項30に記載のキット。
【請求項３２】
固相が、第1のpHで核酸と結合でき、より高い第2のpHで結合核酸を放出できる材料から形成される請求項28から31のいずれか一項に記載のキット。
【国際調査報告】
2005531304.tif 000002
2005531304.tif 000003
2005531304.tif 000004