(57)【要約】  本発明は、概して、分析対象物を光学的に検出するためのマイクロチップ型のバイオセンサ、およびこのバイオセンサを用いる方法に関する。本発明は特に、時間分解ルミネセンス測定を用いて分析対象物を検出するためのバイオセンサ、および対応する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルミネセンスを用いてコレクタ／分析対象物複合体を検出するためのマイクロチップ型の光学バイオセンサであって、
（ａ）その表面内に少なくとも１種類のコレクタ分子が固定化された支持体と、
（ｂ）前記表面を通過する光を検出可能な少なくとも１つの検出器と、
（ｃ）任意の要素として、ルミネセンス光の放出を誘発可能な少なくとも１つの励起源と、を備え、
前記表面は、前記検出器の測定表面であるか、または前記励起源からの光に対する波長フィルタを何ら介在させることなく前記検出器上に配置された層の表面である、バイオセンサ。
【請求項２】
発光体を誘発してルミネセンス光を放出させることが可能な励起源を備える、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記表面と、前記検出器の測定表面との間の空間的距離が、１０μｍ未満である、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記コレクタ分子が前記表面に共有結合しており、および／または前記検出器が前記支持体内に一体化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
膜状の前記検出器が、前記支持体に接着されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記検出器が、前記マイクロチップの近傍に、前記マイクロチップから一定距離だけ離れて配置されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
少なくとも１つの検出器がフォトダイオードであり、同時に励起源としても機能することができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
少なくとも１種類のコレクタ分子が、前記表面上で、独立した検出フィールドに、またはマトリックス状もしくはパターン状に固定化された、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
複数の種類のコレクタ分子が、前記表面上に固定化された、請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
異なるコレクタ分子が、異なる検出フィールド上に、または前記マトリックスの別個の位置上に固定化された、請求項８に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記コレクタ分子が、一本鎖または二本鎖の核酸、核酸のアナログ、ハプテン、タンパク質、ペプチド、抗体またはそれらのフラグメント、糖構造、レセプタ、またはリガンドからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
制御ユニット、少なくとも１つの増幅器、１つまたは複数の信号変換器、１つまたは複数のメモリ／記憶ユニット、１つまたは複数のフィルタ、光学システム、光ガイド、および１つまたは複数の保護層からなる群から選択される１つまたは複数の要素をさらに備える、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
複数の検出器を備える、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
各検出器が、１つのフィールドまたは前記マトリックスの１つの位置に割り当てられ、好ましくはこのフィールドまたは位置の下方に配置され、前記測定表面領域のサイズが本質的に前記フィールドのサイズに対応する、請求項１３に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記コレクタ分子が、前記表面の凹部内の底面上に配置され、前記凹部の底面は、前記表面から少なくとも１００ｎｍ陥凹している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項１６】
マイクロチップ型の光学バイオセンサを用いて、時間分解ルミネセンスによって分析対象物／コレクタ複合体を検出するための方法であって、前記バイオセンサは、
（ａ）その表面内に少なくとも種類のコレクタ分子が固定化された支持体と、
（ｂ）前記表面を通過する光を検出可能な少なくとも１つの検出器と、
（ｃ）任意の要素として、ルミネセンス光の放出を誘発可能な少なくとも１つの励起源と、を備え、
コレクタ分子および／または分析対象物／コレクタ複合体に結合した発光体を、励起時間Ｔ１の間、励起状態に変換する工程（１）と、
減衰時間Ｔ２の間、本質的に励起を行わない工程（２）と、
時間Ｔ３の間、放出されたルミネセンス光を、少なくとも１つの検出器によって検出し、前記複合体を検出するために評価する工程（３）と、を含む方法。
【請求項１７】
工程（３）において、異なる波長のルミネセンス光を並行して検出することによって、種々の分析対象物／コレクタ複合体を並行して検出する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（３）で検出された波長と異なる波長で放出されたルミネセンス光を、その後の時間Ｔ４の間検出し、第２の複合体を検出するために評価する工程（４）をさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記励起が工程（１）でのみ生じる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程（１）〜（３）または工程（１）〜（４）が複数回行なわれる、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記コレクタ分子を、前記コレクタ分子のリガンドを分析対象物として含むと推定されるサンプルと接触させ、必要に応じて前記バイオセンサを洗浄する前処理の工程をさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記リガンドを発光体によって標識し、分析対象物／コレクタ複合体の形成が行なわれたときにのみ検出を行なう、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記時間Ｔ１が、１ナノ秒〜２ミリ秒である、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記時間Ｔ２が、１ナノ秒〜５００マイクロ秒である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記時間Ｔ３が、５ナノ秒〜１０ミリ秒である、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記発光体が、希土類金属またはアクチニド金属、特にユウロピウム、テルビウム、サマリウム；ＩＩ−ＶＩ、ＩＩＩ−Ｖ、ＩＶ族の半導体（ドープされていてもよい）、特にＣｄＳｅ、ＣｄＳ、またはＺｎＳ；アルカリ土類金属のフッ化物、特にＣａＦ、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記発光体を、ナノ結晶、ビーズ、またはキレートの形態で用いる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
核酸、核酸のアナログ、タンパク質、ペプチド、ハプテン、抗体、またはそれらのフラグメント、糖構造、レセプタ、またはリガンドを検出するためのものである、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のバイオセンサを用いる、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、分析対象物を光学的に検出するためのマイクロチップ型のバイオセンサ、およびこのバイオセンサを用いる方法に関する。特に本発明は、時間分解ルミネセンス測定を用いて分析対象物を検出するためのバイオセンサ、および対応する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本質的に二次元的なシステム（専門家の間ではバイオセンサまたはバイオチップ、すなわちマイクロチップ型のバイオセンサと呼ばれる）を使用して、分析すべきサンプル中の特定の物質（たとえば生体分子）の存在を定性的および／または定量的に検出することは、すでに知られている。これらのバイオチップは、一般に、表面に複数の検出フィールド（大体はマトリックス配置で）が構成された支持体を備え、個々のフィールドもしくは領域および／または領域群はそれぞれ、検出すべき特定の分析対象物に対する特異性が、互いに異なっている。ＤＮＡ分析対象物を検出する場合には、特異的な核酸プローブ（たとえば、オリゴヌクレオチド、またはｃＤＮＡであり、大体は一本鎖で、検出すべき核酸に対する個々の特異性は本質的に、その配列（プローブ・デザイン）によって予め決定されている）が、支持体表面の個々の領域内に配置され、直接または間接的に固定化されている。このようにして機能的にされたマイクロチップ表面を、検出すべきＤＮＡ分析対象物を含む可能性があるサンプルと接触させる。適切な検出方法としては、事前に検出可能に標識された標的核酸が存在する場合に、その核酸が固定化されたプローブ分子とハイブリダイズすることが保証された条件の下で、上記接触が行なわれる。特異的に形成された１つまたは複数のハイブリダイズした複合体の定性的（必要に応じて定量的）な検出をその後に行ない（ほとんどの場合、光学的ルミネセンス測定、および得られたデータの個々の検出フィールドへの割り当てによって行なう）、こうして、サンプル中のＤＮＡ分析対象物の存在を決定することおよび必要に応じてその定量化が可能になる。
【０００３】
またこの技術は、検出反応がルミネセンス・データの測定に基づく場合は、検出可能に標識された他の分析対象物、特にタンパク質物質（ペプチド、タンパク質、抗体、およびそれらの機能的断片）の検出に用いることも可能であることが知られている。たとえば、アミノ酸であるチロシンは、約２６０ｎｍでの励起の後、半減期まで特徴的な蛍光を示すので、本発明において使用することが可能であり、この方法によれば、チロシン・ラジカルを有するタンパク質物質は付加的な標識をしなくてもよい。したがってコレクタ分子としてペプチドを用いることによって、タンパク質物質（たとえば抗体またはそれらの断片）を分析対象物として検出することが可能であり、これは好適な発光体（ｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）によってタンパク質物質を事前に標識しなくても成り立つ。
【０００４】
言い換えれば、この技術は、検出可能に標識された分析対象物（分析すべきサンプルに由来する成分）と、コレクタ分子（固定化された支持体成分）との複合体の、ルミネセンスをベースとしたどんな検出も可能にし、検出可能な固有の蛍光によって分析対象物がすでに特徴づけられているために付加的な標識を何ら必要としないシステムも含む。
【０００５】
さらにこの技術は、汚染物質（たとえば多環式炭化水素または他の有機物）の測定に適用することができる。多環式炭化水素の多くの典型が、半減期が４５０ｎｓまでの蛍光を示し、したがって付加的な標識をしなくても分析対象物として選択できることが知られている（たとえば３３６ｎｍで励起するピレン）。すなわちこれらの多環式炭化水素は、コレクタ分子として特異的に生成された抗体に分析対象物として結合し、好適な励起の後に蛍光を生じるという事実によって、検出可能となる。
【０００６】
実際のバイオチップまたはセンサ・チップに加えて、ルミネセンス検出に基づく従来から知られているシステムは、特にルミネセンス信号を取得し、伝達し、評価するための装置を備える。しかし市販の製品は、それらに付随する高度な複雑さとともに必要とされる多数のシステム・コンポーネントのために比較的高価であり、また本質的にこれ以上に小型化することはできない。
【０００７】
ＷＯ９９／２７１４０には、ルミネセンス測定を用いて多数の生物学的分析対象物を検出するために用いられる、検出器内蔵式の、また任意の要素として励起源も内蔵した、マイクロチップ型のバイオセンサが記載されている。この文献では、ルミネセンス測定の各場合において励起および測定を並行して行なうことが教示されている。この場合、励起光をマスクして、放出されるルミネセンス光を選択的に検出できるようにするために、バイオセンサ上において、発光体が固定化される表面と検出器との間に波長フィルタを配置することが避けられない。強制的に設けられるこのフィルタによって、光の収量が減少し、および/またはバイオセンサの製造コストが高くなる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって本発明の課題は、従来技術において知られているシステムの不都合点が克服された前述のタイプの新しいバイオセンサを提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる課題は、分析対象物を含むと推定されるサンプル中の１つまたは複数の分析対象物を検出および／または決定するためのより高感度な方法を提供することからなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の課題は、ルミネセンスを用いてコレクタ／分析対象物複合体を検出するためのマイクロチップ型の光学バイオセンサであって、（ａ）その表面上に少なくとも１種類のコレクタ分子が固定化された支持体と、（ｂ）表面を通過する光を検出可能な少なくとも１つの、好ましくは複数の検出器と、（ｃ）任意の要素として、ルミネセンス光の放出を誘発可能な少なくとも１つの励起源と、を備え、上記表面は、検出器の測定表面であるか、または励起源からの光もしくは励起波長に対する波長フィルタを何ら介在させることなく検出器の上に配置された層の表面であるバイオセンサによって解決される。
【００１１】
好ましくは、バイオセンサが備える１つまたは複数の励起源は、ルミネセンス光を放出する発光体を誘発可能であり、最も好ましくはバイオセンサ内に一体化されている。
【００１２】
好ましい実施形態によれば、マイクロチップはモノリシック・デザインであり、検出器は支持体内に一体化されている。あるいは、膜状の検出器を、支持体に接着しても良い。
【００１３】
あるいは、検出器を、表面の近くに、必要に応じて表面から一定距離だけ離して配置しても良い。最も好ましくは、表面（＝信号が発生し／ルミネセンス光が放出される場所）と、検出器の測定表面（＝信号が検出される場所）との間の距離が１０μｍ未満であり、より好ましくは５μｍ未満であり、最も好ましくは１μｍ未満である。
【００１４】
好ましい実施形態においては、少なくとも１種類のコレクタ分子が、表面上で、個々の検出フィールドに、またはマトリックス状に固定化される。より好ましくは、複数種類のコレクタ分子が、表面上に固定化される。最も好ましくは、異なるタイプのコレクタ分子が、異なる検出フィールド上に、またはマトリックスの別個の位置上に、固定化される。
【００１５】
好ましくは、コレクタ分子は、一本鎖または二本鎖の核酸、核酸のアナログ、ハプテン、タンパク質、ペプチド、抗体またはそれらのフラグメント、糖構造、レセプタ、またはリガンドからなる群から選択される。
【００１６】
好ましい実施形態によれば、本発明のバイオセンサは、さらに、制御ユニット、少なくとも１つの増幅器、１つ若しくは複数の信号変換器、１つ若しくは複数の記憶／メモリ・ユニット、１つ若しくは複数のフィルタ、光学システム、光ガイド（光ファイバ）、および１つ若しくは複数の保護層からなる群から選択される１つまたは複数の要素を備える。なおこれは、励起源からの光または励起波長に対する波長フィルタが、検出器とコレクタ分子が固定化される支持体表面との間に、配置も介在もされないことを条件とする。
【００１７】
本発明のバイオセンサが複数の検出器を備える場合には、好ましくは、各検出器が１つのフィールド、またはマトリックスの１つの位置に割り当てられ、より好ましくは、このフィールドまたは位置の下方に配置され、測定表面のサイズが本質的にフィールドのサイズに対応する。
【００１８】
この点において、コレクタ分子が支持表面の凹部内であり、かつその底面上に配置され、凹部の底面が、表面に対して少なくとも１００ｎｍだけ低くなっている実施形態が好ましい。
【００１９】
本発明は同様に、マイクロチップ型の光学バイオセンサを用いる時間分解ルミネセンスを用いて分析対象物／コレクタ複合体を検出するための方法であって、このバイオセンサが、（ａ）その表面上に少なくとも１種類のコレクタ分子が固定化された支持体と、（ｂ）表面を通過する光を検出可能な少なくとも１つの、好ましくは複数の検出器と、（ｃ）任意の要素として、ルミネセンス光の放出を誘発可能な少なくとも１つの励起源と、を備え、コレクタ分子および／または分析対象物／コレクタ複合体に結合した発光体を、励起時間Ｔ１の間、励起状態に変える工程（１）と、減衰（ｄｉｅ−ａｗａｙ）時間Ｔ２の間、本質的に励起を行わない工程（２）と、時間Ｔ３（測定時間）の間、放出されたルミネセンス光を、少なくとも１つの検出器によって検出し、複合体を検出するために評価する工程（３）と、を含む方法に関する。
【００２０】
一実施形態によれば、工程（３）において、たとえば異なる波長のルミネセンス光を並行して検出することによって、種々の分析対象物／コレクタ複合体を並行して検出する。同様に、本方法は、追加の工程（４）として、続く第２の測定時間Ｔ４の間、工程（３）で検出された波長と異なる波長で放出されたルミネセンス光を検出し、第２の複合体を分析するために評価する工程を含むことができる。
【００２１】
前述した全ての場合において、好ましい方法は、励起を工程（１）でのみ行なう方法である。工程（１）〜（３）または（１）〜（４）は、複数回行なうことができる。
【００２２】
加えて、前述した本発明の方法は、コレクタ分子を、コレクタ分子に対するリガンド（＝分析対象物）を含むと推定されるサンプルと接触させ、必要に応じてバイオセンサを洗浄する先行の工程を含むことができる。
【００２３】
１つの好ましい実施形態によれば、分析対象物を発光体によって標識し、分析対象物とコレクタ分子との間で複合体の形成が行なわれるまで検出を行なわない。
【００２４】
好ましくは、発光体は、希土類金属またはアクチニド金属、特にユウロピウム、テルビウム、サマリウム；ＩＩ−ＩＶ、ＩＩＩ−Ｖ、およびＩＶ族の半導体（ドープされていてもよい）、特にＣｄＳｅ、ＣｄＳ、またはＺｎＳ；アルカリ土類金属のフッ化物、特にＣａＦ、およびこれらの混合物からなる群から選択される。発光体は、ナノ結晶、ビーズ、またはキレートの形態であるのが、最も好ましい。
【００２５】
本方法は、核酸、核酸アナログ、タンパク質、ペプチド、ハプテン、抗体、またはそのフラグメント、糖構造、レセプタ、またはリガンドを検出するために、特異的に行なうことができる。
【００２６】
本発明の方法を行なうためには、全ての場合において、前述したバイオセンサを用いることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
これまで知られている検出システム、すなわち、分析すべきサンプル中の分析対象物（リガンド）の存在をルミネセンスに基づいて検出することが、固相上に直接または間接的に固定化されたコレクタ分子に対するサンプルの特異的な結合を介して行なわれ、それに続くコレクタ／分析対象物複合体によって放出された光強度の測定が、ＣＣＤなどの複雑な結像光学系を用いることによって行なわれる検出システムと比べると、本発明は、これらの複雑な結像光学系に代えて、直接的な画像記録プロセスのための一体化された手段を用いるという事実に基づいている。
【００２８】
したがって具体的には、本発明は、ルミネセンスを用いてコレクタ／分析対象物複合体を検出するためのマイクロチップ型の光学バイオセンサであって、（ａ）その表面上に少なくとも１種類のコレクタ分子が固定化された支持体と、（ｂ）表面を通過する光を検出可能な少なくとも１つの検出器と、（ｃ）任意の要素として、ルミネセンス光の放出を誘発可能な少なくとも１つの励起源と、を備え、上記表面は、検出器の測定表面であるか、または励起源からの光すなわち励起波長に対する波長フィルタを何ら介在させることなく検出器の上に配置された層の表面であるバイオセンサに関する。本発明は同様に、マイクロチップ型の光学バイオセンサを用いる、時間分解ルミネセンスによって分析対象物／コレクタ複合体を検出するための方法であって、このバイオセンサが、（ａ）その表面上に少なくとも１種類のコレクタ分子が固定化された支持体と、（ｂ）表面を通過する光を検出可能な少なくとも１つの検出器と、（ｃ）任意の要素として、ルミネセンス光の放出を誘発可能な少なくとも１つの励起源と、を備え（好ましくは本発明による前述のバイオセンサを用いる）、コレクタ分子および／または分析対象物／コレクタ複合体に結合した発光体を、励起時間Ｔ１の間、励起状態に変換する工程（１）と、減衰時間Ｔ２の間、本質的に励起を行わない工程（２）と、時間Ｔ３の間、放出されたルミネセンス光を、少なくとも１つの検出器によって検出し、複合体を検出するために評価する工程（３）と、を含む方法に関する。
【００２９】
本発明によれば、表現「ルミネセンス」には、高温によって生じるのではなく、エネルギーの事前の吸収および励起によって生じる気体、液体、および固体物質からの励起源によって生成される全ての光の放出が含まれる（拡張した意味においては、紫外および赤外放射の放出が含まれる）。ルミネセンスを示す物質を、発光体と呼ぶ。本発明を、場合によって、用語「蛍光」および「蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）」を用いて詳細に説明するが、これらの用語は単に、本発明の好ましい実施形態を記述しているだけであり、したがって本発明を何ら限定するものではない。
【００３０】
当業者ならば知っているように、ルミネセンスは、光を用いる励起源（好ましくは短波長光に加えてＸ線、光ルミネセンス）、電子を用いる励起源（カソードルミネセンス）、イオンを用いる励起源（イオンルミネセンス）、音波を用いる励起源（音響ルミネセンス）、または放射性物質を用いる励起源（放射線ルミネセンス）、電界による励起源（電気化学ルミネセンス）、化学反応による励起源（化学ルミネセンス）、または機械的プロセスによる励起源（トリボルミネセンス）などの励起源を用いて放射することができる。これに対し、熱ルミネセンスは、加熱によって誘発または増強されるルミネセンスをいう。これらのプロセスは全て量子力学の一般的な基本法則に支配されるものであり、原子および分子の励起を引き起こし、その後原子および分子が光を放出して基底状態に戻り、この光が本発明により検出される。「固有蛍光」（自己蛍光）とは、発光体を用いて事前に標識することなく物質中または分析対象物中で励起可能なルミネセンスのことを言う。
【００３１】
したがって、好適な励起源の選択および（必要に応じて）異なる構成は、どのタイプのルミネセンス発生を用いるべきかに、および／または使用する発光体に、依存する。結果として、励起源を、たとえば電極、発光ダイオード、超音波振動などの形態で与えることができる。励起源を好ましくは、全体的または部分的に、本発明のバイオセンサ内に一体化することができる。
【００３２】
問題とされるシステムの検出の感度、つまり検出の下限は、構成材料コンポーネントに固有の自己蛍光とともに、システムに関係した光散乱によって限定されることが、長い間知られている。これによって生じるバックグラウンド・ノイズを最小限にし、および／または最適なシグナル−ノイズ比を得ようという試みがエンジニアリング産業によってなされた結果、特に、時間分解または時間遅延（時間分解）ルミネセンスまたは蛍光測定の技術につながった。この技術はすでに、種々の応用領域で適用されて成功している。
【００３３】
時間分解ルミネセンスおよび特異的な蛍光測定の一般的な原則は次の通りである。蛍光化合物の混合物を、たとえばレーザまたは閃光電球に由来する短い光パルスによって励起したときに、励起された分子は長寿命または短寿命の蛍光を放出する。どちらのタイプの蛍光も急速に減少が進行するが、短寿命の蛍光は、数ナノ秒以内に無視できる程度の値にまで減衰する。励起が起きた後のこの短時間の間に本質的に測定を行わなければ、短寿命の蛍光に由来するバックグラウンド信号は全て、加えて散乱によって引き起こされる放射パルスも全て排除され、その結果、長寿命の蛍光信号を、非常に高い感度で測定することができる。
【００３４】
したがって、本発明の方法は、次の工程（１）〜（３）を含み、工程（１）においては、コレクタ分子および／または固定化された分析対象物／コレクタ複合体それ自体に結合する発光体を、励起時間Ｔ１の間、励起状態に変換し、工程（２）においては、減衰時間Ｔ２の間、本質的に励起を全く行なわず、その後に、工程（３）において、時間Ｔ３の間、放出されたルミネセンス光を、少なくとも１つの検出器によって検出して、複合体を検出するために評価する。本発明によれば、好ましくはＴ１およびＴ２の間に検出された測定値を、評価において考慮しない。より好ましくは、これらの時間の間に検出を全く行なわない。
【００３５】
本発明においては、表現「本質的に励起しない」（翻訳では「本質的に励起を全く行なわない」）が意味するところは、励起時間Ｔ１とは対照的に、減衰時間Ｔ２の間、励起源は完全にスイッチ・オフされるか（本発明において好ましい）、またはシステムに対するエネルギーの供給が、励起時間の間に供給される単位時間（秒）当たりのエネルギーの１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは２％未満である、ということである。最も好ましくは、減衰時間Ｔ２の間、および測定時間Ｔ３の間、励起源を起動させない、すなわち励起源はシステムに対して何らエネルギーを供給しない。
【００３６】
従来技術においては、マイクロチップのバイオセンサに適用できるとはみなされていなかった時間分解ルミネセンス測定を用いた結果、驚くべきことに、波長フィルタを信号発生位置（固有ルミネセンスをそれぞれ放出する表面に結合された発光体または複合体）と検出位置（検出器の測定表面）との間に介在させなくても済むことが、好都合に可能になった。そのため、放出されたルミネセンス光の全体を測定および／または検出に用いることができ、その結果、バッテリの感度を従来技術の対応するセンサと比べて増加させることができる。信号発生点と検出器とを接近（好ましくは１０μｍ以下に）させれば、この効果にさらに寄与する。本発明によれば、複合体（たとえばチロシンを含有するタンパク質）の固有ルミネセンス、または分析すべき分析対象物中にマーカーとして事前に導入される発光体のルミネセンスを、この目的で用いることができる。後者の方が好ましい。本発明に特に適した発光体は、その半減期が５ｎｓよりも確実に長い発光体であり、それにより、これらの発光体は、蛍光バックグラウンド（前述参照）として知られるものが減衰した後でも依然として測定可能である。最も好ましいのは、その半減期がμｓ〜ｍｓの範囲の発光体であり、特に１００μｓ〜２０００μｓの範囲の発光体である。したがって本発明の方法に従う測定は、一般に、励起が起きた後、約５ｎｓ経過後に行なわれる。好ましい実施形態によれば、測定窓は、μｓ〜ｍｓの範囲にあり、１００μｓと２０００μｓとの間の範囲が特に好ましい。
【００３７】
ほとんどの有機発光体は、励起状態の半減期が短い。この効果（言葉のより厳密な意味において蛍光として知られる）は、電子が、より高い振動エネルギー・レベル（いわゆる励起一重項状態）に上げられること（励起源のエネルギーによって引き起こされる）に基づく。この状態は、ほんの数ｎｓしか安定に続かない（たとえばトリプトファンの場合には２．６ｎｓ）。そして電子が励起一重項状態から基底状態へ落ちて戻ったときに、励起エネルギーが光として放出される。一般に、このプロセスにおける放出波長は、励起源のそれよりも長い。励起波長と放出波長との違いは、ストークス・シフトとして知られる。他方で、いくつかの発光体の場合には、励起一重項状態から、三重項として知られるものへの遷移が起こる。この場合、励起状態は安定化され、ストークス・シフトは大きくなる。一般に、この三重項状態は、励起一重項状態のエネルギー・レベルのすぐ下のエネルギー・レベル上にある。三重項状態では、電子はもはや、電子の基底状態とスピン対をなしてはいない。したがって三重項から基底状態への遷移には、量子力学的な禁制遷移が含まれる。この結果、励起状態の寿命が安定化される。この効果は、燐光と呼ばれ、半減期は最大で１０ｍｓである。
【００３８】
半減期が長い古典的な発光体としては、たとえば希土類金属（ＲＥＭ）化合物またはアクチニド化合物が挙げられるが、後者は、その放射能のせいで、現在二次的な役割しか果たしていない。生物学では、ＲＥ金属イオンは主にキレート複合体として用いられる。と言うのは、好適な有機結合のパートナを選択することによって、ルミネセンスの収率を劇的に増加させることができるからである。このような化合物は、直径が数１００ｎｍの「マイクロスフェア」として知られ、市販されている（たとえばフルオスフェアズ（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ）（登録商標）・ユウロピウム・ルミネセント・マイクロスフェアズ（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）、モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））。特に好ましいＲＥ金属は、ユウロピウム、テルビウム、サマリウムである。
【００３９】
他の好適な発光体は、半導体のナノ結晶である。半導体のナノ結晶の、そのルミネセンス特性とは別の特別な特性は、比較的小さなサイズ（数ｎｍ）と高い安定性（光退色が全くない）である。ここで半減期は、選択した半導体材料とドーピングとに依存して、数１００ｎｓからｍｓ領域の幅広い範囲で調整することができる。当業者であれば容易に、適切なナノ粒子にたとえばシランをコーティングして、その後に、ナノ粒子を有機分子（たとえば核酸または抗体）に結合させることができる。好適な半導体としては、ＩＩ−ＶＩ族（ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ）、ＩＩＩ−Ｖ族（ＧａＡｓ、ＩｎＧａＡｓ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ）、およびＩＶ族（Ｇｅ、Ｓｉ）の半導体が挙げられる。この種類の半導体結晶は、半減期が約２００ｎｓ以上の範囲である。ＩＩ−ＶＩ族のナノ結晶は、「クァンタム・ドッツ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ）（登録商標）」（クァンタム・ドット・コーポレーション、米国カリフォルニア州（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ））として知られるものとして市販されている。それぞれの場合において、ある族内のナノ結晶の吸収スペクトルは同一であるが、個々の放出スペクトルは、与えられた粒子サイズの関数として異なる。そのためフィルタ光学系を用いた場合には、単一の励起波長を用いて複数の標識を並行して測定することができる。表１に、いくつかのナノ結晶の特性を示す。
【００４０】
【表１】
2005512022.tif 000002
【００４１】
本発明の状況において好適な著しいルミネセンスを有する他の物質は、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、または硫化亜鉛（マンガン、銅、または銀をドープ）の結晶である。これらの物質の自己ルミネセンスは、結晶格子中の欠陥によって引き起こされる。ドーピングに対して異なる金属イオン（Ａｇ、Ｃｕ、Ｍｎ）を選択することによって、異なる放出スペクトルを生成することができる。前記物質は水に不溶であるため、それらを本発明に用いる場合には、微粒子状で用いることが好ましい。このグループの物質のいくつかの典型における特性を、Ｍｎ２＋ドープされたＺｎＳを例として、上表１に例示する。
【００４２】
本発明により好適な他の発光体は、たとえばドーピング（異種イオン）または放射性照射によって生成可能な格子欠陥を有する、アルカリ土類ハロゲン化物である。たとえばフッ化カルシウム（ＣａＦ）粒子は、適切に（たとえばユウロピウムを）ドープしたときに、著しいルミネセンスを示す。ＣａＦの場合、たとえばルミネセンスを、放射性によって発生させた格子欠陥によって熱ルミネセンスを生成することもでき、その場合、約４０℃と低い温度でも、ルミネセンスを発生するのには十分である。
【００４３】
本発明の方法に好適に用いるために、時間分解蛍光測定のためのマーカー（標識）として従来の蛍光体と比較して一定の有利点があるため、蛍光性の希土類金属化合物またはキレート（たとえば特にユウロピウム・キレート）を選択した。蛍光性のユウロピウム・キレートは、大きな「ストークス・シフト」（約２９０ｎｍ）を、励起スペクトルと放出スペクトルとの間のわずかなオーバーラップも無い状態で有し、約６１５ｎｍでの非常に狭い（１０ｎｍバンド幅）放出スペクトルによって特徴づけられる。さらに、その蛍光半減期が長いために（従来の蛍光体の場合の５〜２０ｎｓと比較して、Ｅｕ３＋の場合に６００〜１０００μｓ）、時間分解蛍光測定をマイクロ〜ミリ秒の領域で用いることができ、その結果、上述したバックグラウンド信号を減らすことができる。
【００４４】
【表２】
2005512022.tif 000003
【００４５】
時間分解蛍光測定にユウロピウム・キレートを標識として用いることは、免疫アッセイ、加えてサザン・ブロットおよびウェスタン・ブロットの用途から、すでに長い間、知られている。分析用サンプル中に存在し得る生体分子（分析対象物）の適切な標識を、Ｅｕ３＋またはＥｕ３＋キレート剤を用いる確立されたプロトコルに基づいて行なうことができる（たとえば、Ｅ．Ｐ．ディアマンディス（Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ）およびＴ．Ｋ．クリストポウロス（Ｔ．Ｋ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ）「時間分解蛍光免疫アッセイおよびＤＮＡハイブリダイゼーション・アッセイにおけるユウロピウム・キレート標識」（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ  ｃｈｅｌａｔｅ  ｌａｂｅｌｓ  ｉｎ  ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．６２：１１４９Ａ−１１５７Ａ（１９９０））を参照のこと）。
【００４６】
本発明の方法の好ましい実施形態によれば、代替的に、分析対象物をビオチン化することができ、ストレプトアビジンに結合されたＥｕ３＋またはＥｕ３＋キレート剤を用いて検出を行なうことができる。この点において特に好ましい技術は、適切に選択された希土類金属化合物が充填された「ビーズ」として知られるものを用いることであり、こうすることで、非常に高密度のルミネセンス放出分子が保証される。このようにして最適化された蛍光測定システムの検出限界は、約１〜５ｐｇのタンパク質またはＤＮＡであることが、経験的な実験から知られている。
【００４７】
本発明によるバイオセンサは、支持体（基板）を備える。支持体の表面は好ましくは、平坦であるかまたは好適な凹部（ウェル）が設けられており、その上に、少なくとも１種類のコレクタ分子（好ましくは複数種類のコレクタ分子）が固定化されている。固定化は好ましくは、直接または間接的な（たとえば「スペーサ（Ｓｐａｃｅｒｓ）」を用いることによる）表面に対する共有結合を介して、行なわれる。適切な結合技術は、当業者には既知である。好ましくはコレクタ分子を、一本鎖または二本鎖の核酸、核酸アナログ、ハプテン、タンパク質、ペプチド、抗体、またはそれらのフラグメント、糖構造、レセプタ、またはリガンドからなる群から選択する。ＤＮＡが特に好ましい。
【００４８】
基本的に、本発明のバイオセンサの支持体は、少なくともコレクタ分子が固定化される領域において十分に透明である何らかの好適な材料から形成される。好適な材料としては、硬いおよび柔軟な材料、たとえば、プラスチック膜、ポリマー、ガラス、硬質プラスチック、シリコン、窒化ケイ素、酸化ケイ素、アルミニウム、酸化アルミニウム、および半導体技術から知られる他の材料、特に直接半導体が挙げられる。最後のものが通常、好ましい。支持体は通常、平坦な構造をなし、たとえばマイクロチップ型であり、寸法としては、最大で５ｃｍ（好ましくは１〜５ｃｍ）の幅、最大で１０ｃｍ（好ましくは２〜１０ｃｍ）の長さ、および最大で０．５ｃｍ（好ましくは０．１〜０．５ｃｍ）の厚みとすることができる。表現「マイクロチップ」はここで用いる場合、必ずしも、エレクトロニクスから知られるようなマイクロチップの特性を意味する必要はない。基本的に、この表現は第一に、平坦な構成方法とともに寸法（従来の光学系とは著しく異なる）に関する。他の本質的な特徴は、（好ましくは平坦な）表面（その上にコレクタ分子を固定化することができる）を備えることである。しかし従来の意味で「マイクロチップ」を用いることが好ましい。この種類のマイクロチップは通常、種々の半導体材料（たとえばシリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、アルミニウム、酸化アルミニウムなど）のモノリシックな組み合わせであり、すなわちこれらの半導体材料の単一片から作製される。
【００４９】
たとえば、研究すべき少なくとも１種の生体細胞のある種の生理学的および形態学的パラメータを測定するためのＥＰ−Ａ−０８８１４９０から知られる測定デバイスを、適切に変更した後に用いて、本発明の方法を行なうことができる。すでに説明したデバイスは、支持体デバイス（その上に、研究すべき材料が固定化される）の一体部分である多数のセンサおよび／または検出器を有する。
【００５０】
好ましい実施形態によれば、支持体は本質的に、光学検出器層を有する半導体材料から構成することができ、光学検出器層は、好ましくは、内蔵された複数の検出器を備え、検出器としてフォトダイオードを取り入れることが好ましい。この層は、支持体中にモノリシックに取り入れることができる（狭義のエレクトロニクス的な意味でマイクロチップ）。あるいはこの層を、支持体の裏面に粘着剤によって取り付けて、支持体の上面上にコレクタ分子を固定化することができる。
【００５１】
特に好ましい実施形態においては、信号処理を、少なくとも部分的にバイオセンサ内で行なう。本発明の一態様によれば、たとえば時間分解蛍光をマイクロチップ上で直接評価することを、アナログ回路を用いることによって、たとえば励起源をスイッチ・オフした後の各ナノ秒に対する値を記録することによって、そして、これらの（記録値）を、事前に行なわれやはりマイクロチップ上に記憶される測定の参照値と比較して、行なうことができる。さらに、この手順によって、非特異的な干渉信号（たとえば、存在し得るシステム・コンポーネントの自己蛍光など）を、算出することができる（図２も参照のこと）。一方でＧＨｚ領域（＜１ｎｓ）でさえ分解することが可能であるならば、人工的な蛍光から自己蛍光を識別することが可能である。
【００５２】
支持体表面が、複数の検出フィールドを評価するマイクロ・アレイ配置としてデザインされているならば、たとえば表面のラインまたは列の全体またはその一部を連続的に励起および検出することによって、ルミネセンス信号の検出を順次行なうことができる（多重応用（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ））。
【００５３】
たとえば検出器からの電子出力信号を、アナログ−デジタル変換の後で、好適な回路を用いて外部の評価デバイスへ伝えることができる。フォトダイオード（ｐｎ、ｐ−ｉ−ｎ、アバランシェ）に加えて、ＣＣＤセンサまたは光導電体も、本発明による好適な光学検出器またはセンサとして考慮することができ、好ましくは、線形またはアレイ配置（＝パターン）の形態のバイオセンサの半導体基板中にモノリシックに取り入れる。フォトダイオードを、時間分解ルミネセンス測定の状況において好都合に用いることができる。と言うのは、フォトダイオードは、光電子増倍管と比べて、検出表面積または測定表面積が小さいからである。
【００５４】
本発明の特に好ましい一態様によれば、励起源は、バイオセンサの一体化された構成要素（たとえば電極の形態）であり、最も好ましくは、検出器そのものとして与えられる。直接半導体材料からなるｐｎダイオードを選択することによって、以下のことが可能になる。最初の場合に、起動手段によって電圧を印加する結果、ｐｎダイオードのタイプおよび性質に依存して特定の放出波長バンドにおいて光信号が放出され（ｐｎダイオードをＬＥＤとして用いる）、このｐｎダイオードの近傍に結合される分析対象物の励起を引き起こす。ｐｎダイオードの起動を停止した後に（ｐｎダイオードをフォトダイオードとして用いる）、および一定の減衰時間が経過した後に、ｐｎダイオードを再度起動して、所要の測定を行なう。
【００５５】
前述した実施形態における励起放射を、ルミネセンス放射の収集も行なう同じコンポーネントを介して結び付けるという事実の結果、センサ表面または検出フィールドの非常に狭い領域に選択的に照射して、この領域から出るルミネセンス放射を評価するという状況を実現することができる。この方法の結果、研究下の検出フィールドを、非常に精密に結像して、研究中の領域の外からのルミネセンスによる測定との干渉を避けることができる。
【００５６】
言うまでもなく、検出器をさらに、グループで配置することができる。それによって形成される個々の検出フィールドの入力信号によって、検出フィールドごとに１個で占めたときに可能となる結果よりも信頼性の高い結果を保証することができる（図３を参照）。検出フィールドごとに多重に占有することによって、測定技術による分析対象物の結合事象（ｅｖｅｎｔ）の集中化を保証することもでき、その結果、信号処理中の感度を明確に増加させることに寄与することができる。
【００５７】
本発明によるバイオセンサの製造は、ＣＭＯＳ（相補型金属酸化膜半導体）プロセスを用いて行なうことができる。ＣＭＯＳプロセス自体は知られており、そのため信号の調整と評価とを一体化するための回路ライブラリの全てが、変更なしで利用可能であり、本発明の状況において実施することができる。総合的な説明を、たとえばＷＯ９９／２７１４０において、見出すことができる。本発明にやはり好適な他の製造プロセスの例は、ＮＭＯＳプロセスまたはバイポーラ・プロセスである。特にコストの点から魅力のある別の可能性として、本発明のバイオセンサを有機半導体に基づいて製造することが挙げられる（たとえばＥＰ−Ａ−１０８５３１９を参照）。
【００５８】
さらに好ましい実施形態によれば、あるフィールドからの光放出を他のフィールドの検出器が受け取る可能性が全くないように、個々の検出フィールドを互いに隔離する。したがって個々の検出フィールドを、通常のマイクロタイター・プレートとして知られる凹部（ウェル）内に配置することができる。本発明によれば、トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）形状の凹部、および側壁が本質的にセンサ・チップの表面に対して垂直に配置される底部を有する凹部が好ましい。このような凹部の各寸法は、予想される分析対象物／コレクタ複合体の発光体が凹部内部（好ましくはその底面上）に配置され、隣接する凹部内部へ放出光が侵入することが本質的に全く無いならば、当業者が応用分野の知識に基づいて自由に選択することができる。
【００５９】
特に好ましいある凹部においては、その底面は、少なくとも１００ｎｍだけ、好ましくは１００ｎｍ〜１０μｍだけ、より好ましくは１００〜５０００ｎｍだけ、本発明のバイオセンサの表面内から陥凹している。あるいは、本質的に平坦な表面上に、上方に向けた分離手段を配置することによって、同じ効果を実現することができる。この手段の寸法は、当業者によって、所要の応用分野の知識および予想されるコレクタ／分析対象物複合体の幾何学的寸法から、容易に選択することができる。たとえば適切な好適な分離手段の取り付けを、陽極接合によって、またはフリップ・チッププロセスとして知られるものによって、行なうことができる。
【００６０】
好ましい実施形態においては、マイクロチップ型のバイオセンサにチャネルを適用する。たとえばチャネルは、その上にコレクタ分子のアレイが結合される、検出フィールドの列をもたらすことができる。たとえば、こうすることで、校正測定を行なうことができる。さらに好ましい実施形態においては、並行測定を同一のアレイ上で（たとえば並列なサンプル上で）行なって、分析あたりのコストを劇的に下げることができる。こうするために、マイクロチップをマイクロチャネルによってサブ分割し、たとえば８つの同一のコンパートメントにする。
【００６１】
支持体材料、表面、および検出器の選択は、検出すべき発光体の放出波長に依存することが、当業者には明らかである。基本的に、検出器は、「半導体バンド・ギャップ」として知られるもののために、材料の選択（たとえばシリコンまたはゲルマニウム）に依存して、波長に対する感度が異なると言わなければならない。したがってシリコン・フォトダイオードを用いる好ましい場合においては、赤外から紫外内への波長スペクトルに及ぶ感度レンジが形成され、感度はこれらの領域の間で最大となる。
【００６２】
さらに、好ましい実施形態によれば、本発明のバイオセンサは、制御ユニット、少なくとも１つの増幅器、１つまたは複数の信号変換器、１つまたは複数の記憶／メモリ・ユニット、１つまたは複数のフィルタ、光学システム、光ガイド（光ファイバ）、および１つまたは複数の保護層からなる群からの１つまたは複数のさらなる要素を備えることができる。なおこれは、励起源からの光または励起源の波長に対する波長フィルタが、検出器とコレクタ分子が固定化される支持体表面との間に、配置も介在もされないことを条件とする。最も好ましいのは、コレクタ分子が、検出器の測定表面（たとえばｐｎダイオードの最上層）上に固定化される実施形態である。
【００６３】
モノリシックに一体化可能な半導体材料を、コレクタ分子に対する支持体および表面として用いる場合ならびに検出器を形成するために用いる場合には、モノリシックに一体化された回路を同じ基板上に構成することも可能であり、その結果、電子的な検出器出力信号の予備処理を、試験の対象（コレクタ／分析対象物の複合体）の直近で行なうことができる。こうして、本発明のこの好ましい実施形態には、全く受動的なセンサよりも相当に高い程度で実行する「知的な」バイオセンサが含まれる。たとえば電気光学検出器からの出力信号を、共一体化（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）された回路により予備処理することによって、出力信号を、出力回路および外部世界とのコネクタ接触部を介して中継して処理できる（すなわち比較的問題のない方法でそこで評価できる）ようにすることができる。さらに予備処理を、アナログ検出器信号をデジタル化すること、および信号を好適なデータ・ストリームへ変換することから構成することができる。
【００６４】
さらに信号経路が短いために、本発明によるバイオセンサにおいて実施される信号処理位置に検出器を接近させることによって、シグナル−ノイズ比を非常に大きく向上させることができる。さらに、たとえばデータ量を減らすことができるさらなる処理工程、または外部処理および表示を支援するさらなる処理工程を行なうこともできる。こうすることで、光信号の残りの評価およびその表示を、パーソナル・コンピュータによって行なうことができる。さらに本発明のバイオセンサは、データ（好ましくは圧縮および／または処理済み）を、対応して備え付けられた受信ステーション（ｒｅｃｅｐｔｉｏｎ  ｓｔａｔｉｏｎｓ）に赤外またはワイヤレス・リンクを介して送信することができるように、構成することができる。
【００６５】
基板上の関連デバイスの制御は、制御デバイスからの制御信号を介して行なうことができる。制御デバイスは、好ましくは、やはり全体的または部分的に基板上に構成されるか、または外部から接続されるものである。
【００６６】
本発明の方法に従って普通の市販のコンピュータを介して光学／電気信号を評価するという可能性には、付加的な有利点として、好適なプログラムを介してデータ評価および記憶の大規模な自動化が可能であることと、その結果、データ分析の状況において、本発明のバイオセンサを用いる結果、従来の外部の結像光学系を用いて発生するデータと比べて、いかなる種類の制約も全くないということとがある。
【００６７】
本発明のバイオセンサからのルミネセンスを直接記録することは、次のようにして実現される。すなわち、特異的な検出に必要なコレクタ分子を、直接にまたは通常の距離保持手段（スペーサ）および／または結合マトリックスを介して、検出器の測定表面である表面上に、または波長フィルタを何ら介在させることなくこの測定表面のすぐ上に配置された層の表面である表面上に、配置する。このような配置によって、信号が発生する（ルミネセンス光が放出される）場所と検出位置との間の距離を短くすることが容易にできるため、ルミネセンス光の収率を最大にできる。
【００６８】
好ましい実施形態によれば、光学検出器を、少なくとも１つのフォトダイオードの形態で設ける。特に複数の異なる分析対象物（リガンド）を並行におよび／または順次に検出するために、これらのフォトダイオードが複数存在することが特に好ましい。しかし１種類の発光体のみを用いる場合でも、この多重配置によって、次のような有利点が得られる。すなわち検出フィールドごとに複数の検出器がある結果、コレクタ分子と分析対象物との結合事象の領域特異的な割り当てを、集中化によって改善することができるようなプロファイルを記録することができる。これらの実施形態の状況においては、それ自体はすでに既知であるマイクロ・アレイ配置を具体的に対象としているが、個々のフォトダイオードを有利に、まとめてグループ化して、規定されたグループまたは測定フィールドにすることができ、その結果、その後のルミネセンス測定の感度およびそれによって得られる測定データの再現性および信頼性を、著しく高めることができる。
【００６９】
好ましい実施形態によれば、各フォトダイオード（検出器として、また同時に励起源としてもよい）の露出されていてもよい表面（そうでない場合は、バイオセンサは、たとえば保護層によって覆われている）は、ＳｉＯ２またはＳｉ３Ｎ４からなる。さらに、コレクタ／分析対象物の結合および検出のある種のプロセス・パラメータは、マイクロチップ型のバイオセンサ用の表面材料の選択によって有益な影響を受けることが可能である。たとえば、Ｓｉ３Ｎ４をある場所で用いることができる一方で、ＳｉＯ２（もしくはたとえばＡｌ２Ｏ３）または貴金属を他の場所で用いる。その結果、たとえばより疎水性もしくはより親水性の特性を有する生体分子またはスペーサに対して好ましい領域を、センサ上にまたは個々の検出フィールド内にさえ設けて、たとえばＤＮＡをコレクタ分子として取り付けることを局所的な方法で促進または抑制することができる。加えて、本発明によれば、駆動可能な貴金属電極を取り付けることによって、好ましいバイオセンサの形成、すなわち、たとえばハイブリダイゼーション事象を加速することができるか、または異なる電位を（任意に各検出フィールドに）印加することによって電気的に励起可能な発光体から生じる蛍光（電気化学ルミネセンス）を発生させることができるバイオセンサの形成が可能になる。
【００７０】
励起源は、たとえば１つまたは複数の白色光ランプ、ＬＥＤ（発光ダイオード）、（半導体）レーザまたはＵＶチューブの形態で設けることができるもの、加えて圧電素子（超音波）によってまたは光エネルギーを放出する気体および／もしくは液体によって（化学励起）、または電極によって設けることができるものであるが、これらは十分に強力でなければならず、また好ましくは高い頻度で再現可能である。最後の特性が存在するのは、光源を起動することも短時間の間消灯することもできる場合である。光学的励起源を用いる場合、これをスイッチ・オフすることは、本質的に、スイッチ・オフした後に（たとえばアフター・グローの結果）検出器上にさらにフォトンが衝突することが全くないように、すなわち前述した意味でのエネルギーがシステムに全く供給されないように、できなければならない。必要ならば、このことは、機械的な閉鎖開口部（シャッタ）を用いることによって、加えてＬＥＤまたはレーザを光学的励起源として用いることによって、保証することができる。
【００７１】
励起源を、バイオセンサおよび検出器と光学的および機械的に、検出器の方向に放射フィールドが発生するように結合させることが好ましい。それによって、励起源と信号発生面（すなわちコレクタ分子が固定化される表面）との間の間隔距離を、できるだけ短くすることができる。しかし間隔距離は、意図される用途に対して必要なリガンド／分析対象物とコレクタ分子との間の反応が損なわれないように、十分に長くなければならない。この点において、励起源が（支持体上に設けられる複数の励起フィールドに対応して）、たとえば制御デバイスを用いて個々にまたはグループで起動することができる複数の点サイズの放射源からなることが、適切であると考えられる。ｐｎダイオードを励起源（ＬＥＤ）および検出器（フォトダイオード）として同時に用いることが、ここでは特に好ましい。励起源によって放出される光ビームがすでに高度にフォーカスされているならば、照射を直接（すなわち光学系を何ら介在させることなく）行なって、非常に小さい検出フィールドを、特にマイクロ・アレイとして知られるものを用いる状況において保証することができる。しかしその代わりに、励起源からの放射経路を好適なレンズを用いることによってフォーカスすることも、これがたとえばセンサ表面上のコレクタ分子が非常に密集した集団であるために望ましい場合には、可能である。これによって、非特異的な干渉信号（たとえば自己蛍光）を減らすさらなる手段が得られることは、当業者には明らかである。
【００７２】
点サイズの放射源を配置すること（たとえば、フォーカスされた光ファイバもしくは小型化されたＬＥＤ（発光ダイオード）から構成されるか、または他の何らかの方法で実施される）は、ラインまたはフィールドの形態であることが、したがってセンサ表面上のコレクタ分子の配置に機能的に適合することが好都合である。種々のＲＥ（希土類）金属キレートを用いる分析において使用する場合には、励起源の波長が十分に制御可能であること、または異なる波長に対する励起源が存在することが好都合であると考えられる。加えて、特定の意図された目的に対して、励起源を周波数変調することが好都合であると考えられる。これに関連して、強度変調された励起光を使用し、それによって、ナノ秒単位の半減期を測定しているときには、変調を数ＭＨｚで行なう。したがってＦＬＩＭ（蛍光寿命結像顕微鏡法；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌｉｆｅｔｉｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）という名前で当業者に知られる方法が、本発明によるさらなる好ましい実施形態に含まれる。前述したことは、コレクタ／分析対象物複合体によって放出される光エネルギーを記録するために、異なるかまたは十分にチューナブルな検出器が検出器側上に存在できることを意味する。これがフォトダイオードを含む場合には、波長特異的な光学素子（ｐｈｏｔｏｅｌｅｍｅｎｔ）を、本発明のバイオセンサに対して用いる。
【００７３】
従来のフォトダイオードを有するバイオセンサに、重ね合わせられた、塗布された、蒸着された、または一体化された波長フィルタが取り付けられたものも、本発明の方法を行なうのに適している。二酸化ケイ素とは対照的に、窒化ケイ素はＵＶ光に対して不透明であること、およびポリシリコンはＵＶ放射を吸収することが知られている。したがって窒化物またはポリシリコンを、通常のＣＭＯＳプロセスに従ってゲート酸化物層上に堆積させて、対応するフィルタをフォトダイオード上に形成することができる。たとえば、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）は、励起波長が３５０ｎｍで、放出波長が４５０ｎｍである。したがって３５０ｎｍをフィルタ除去することによって、感度を高めることができる。この効果を本発明の方法に対して用いることによって、たとえば、２つの異なる発光体を並行して用いるときに、たとえば一方だけがＵＶ領域の光を放出する場合に、差動検出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を可能にすることができる。と言うのは、このために設けられる検出器は、ＵＶに対して感度の良い構成である場合もそうでない場合もあるからである。加えてこの効果によって、必要に応じて、適切なフィルタを設けることによって、放出波長が既知の材料の存在し得る干渉性の自己蛍光を、測定プロセスから排除する機会が与えられる。
【００７４】
この例は、ユウロピウム・キレート（約６２０ｎｍで放出）と銅がドープされた硫化亜鉛（約５２５ｎｍで放出）との並行使用である。放出波長範囲が互いに十分に異なる結果、たとえば検出フィールドのある領域において、二色検出が可能になる。これはたとえば検出フィールドの検出器の半分にロー・パス・フィルタ（ｌｏｗ-ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ）を備え付け、同じフィールドの検出器の他の半分にハイ・パス・フィルタ（ｈｉｇｈ-ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ）を備え付けることによって行なう。しかし感度を向上させる最も好ましい方法は、波長フィルタの使用を省略することである。
【００７５】
加えてまたはその代わりに、それらの物理的および／または光学的特性が十分に異なるならば、異なる発光体を並行に用いることが可能である。たとえば、使用すべき２つの発光体ＡおよびＢの異なる励起波長、および／またはそれらの異なる半減期が用いられる。これはたとえば、異なるドープがされた２つのナノ結晶を用意することによって行なうことができる。後の方の場合の異なる半減期では、連続する２つの測定時間Ｔ３およびＴ４において放出を記録することができる。
【００７６】
特定のコレクタ／分析対象物に対する複合体を検出または決定および任意に定量化するためには、少なくとも１種類、好ましくは複数種類のコレクタ分子を、バイオセンサ支持体の表面上に固定、好ましくは固定化することが必要である。好ましい実施形態によれば、この固定化は、表面上に層として堆積される結合物質を用いて行なうことができる。こうするために、通常は、金属または半金属の酸化物（たとえば酸化アルミニウム）、石英ガラスまたはガラスから形成されるバイオセンサ表面を、支持体表面に結合するたとえばハロゲン−シラン（たとえばクロロシラン）またはアルコキシシラン基を有する二官能性分子（「リンカー」として知られる）の溶液中に浸す。その結果、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）が形成され、それを介して、センサ表面とレセプタとの間の共有結合が生じる。たとえば、グリシジルトリエトキシシランを用いてコーティングを行なうことができる。これはたとえば、シランの１％トルエン溶液中に浸し、ゆっくり取り出した後、１２０℃での「ベーキング」により固定化することによって行なうことができる。このようにして作製されたコーティングは一般に、厚みが数オングストロームである。リンカーとコレクタ分子との間の結合は、好適なさらなる官能基（たとえばアミノまたはエポキシ基）を介して行なわれる。多数の異なるレセプタ分子（特に生物起源のものを含む）を、複数の支持体表面に結合させるのに適した二官能性リンカが、当業者には良く知られている。
【００７７】
検出すべき生体分子が核酸を含む限りにおいて、コレクタ分子としての好適なＤＮＡプローブを、現在利用可能な印刷機器を用いて、後で塗布して固定化することができる。
【００７８】
たとえばビオチン化されたＤＮＡとのハイブリダイゼーションを、このようにして製造されたバイオセンサ上で、確立された方法を用いることによって行なうことができる。たとえばこれらは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）とビオチン−ｄＵＴＰの取り込みとを用いることによって生成することができる。ハイブリダイゼーションの間に、ビオチン化ＤＮＡは、バイオセンサ上の個々の検出フィールドにおいて固定化された相補鎖（存在する場合）と結合する。そして陽性（成功した）ハイブリダイゼーション事象は、ストレプトアビジン／アビジンと発光体とのコンジュゲートを添加することによって、実証することができる。本発明によれば、以下のものが発光体コンジュゲートとして特に適している。ユウロピウム、テルビウム、およびサマリウム・キレート、ならびにアビジン／ストレプトアビジンを介してＥｕ、Ｓｍ、および／またはＴｂキレートが充填されたマイクロスフェア（「ビーズ」）。この点で特に好適なのは、ルミネセンスのマイクロスフェア（たとえばフルオスフェアズ・ユウロピウム（モレキュラー・プローブスＦ−２０８８３など）である。と言うのは、これらは、多数の蛍光色素を、単一の結合事象によって固定化することができるからである。また本発明により好適なのは、たとえばクァンタム・ドット・コーポレーションによって「クァンタム・ドッツ（登録商標）」という名前で提供される種類のナノ結晶である。未結合の標識された分析対象物および／または浮遊するルミネセンス染料（ｄｙｅｓｔｕｆｆｓ）を除去するために洗浄した後で、好適な励起と励起光源をスイッチ・オフした状態での時間分解蛍光の測定とによって、結合の測定を行なう。
【００７９】
本発明によれば、励起期間（励起時間）をＴ１と表現し、励起と測定との間の時間（減衰時間）をＴ２と表現し、測定時間（測定継続時間）をＴ３と表現し、必要に応じて、第２の測定期間をＴ４と表現する。好ましくは時間Ｔ１は１ナノ秒〜２ミリ秒であり、時間Ｔ２は１ナノ秒〜５００マイクロ秒、好ましくは１〜５ｎｓであり、時間Ｔ３は５ナノ秒〜１０ミリ秒、好ましくは５ｎｓ〜２ｍｓである。
【００８０】
本発明の方法は、コレクタ分子を、コレクタ分子用のリガンドを含むと推定されるサンプルと接触させ、必要に応じてバイオセンサを洗浄する追加の前置き工程を含むことができる。好ましくは、分析対象物を発光体によって標識し、分析対象物とコレクタとの間で複合体の形成が行なわれるまで検出を行なわない。
【００８１】
検出器からの信号は、記録ユニットによって記録される。記録ユニットは、アナログ検出器信号を、記憶されるデジタル値に変換する非常に速いコンバータを有する。デジタル値の評価はリアル・タイムで行なうことが好ましいが、一定時間遅らせた後に行なうこともできる。普通のマイクロプロセッサを用いてデジタル値を評価することができる。この評価が行なわれるのは、測定時間Ｔ３、必要に応じてＴ４の間のみである。
【００８２】
ルミネセンス信号が弱すぎて明瞭な検出ができない場合には、検出感度の増大を、複数の個々の測定を統合することによる検出の好ましい実施形態の状況において行なうことができる。こうする際、同じ測定を複数回行なって（工程（１）〜（３）または（１）〜（４）を複数回往復する）、測定結果を合計する。これは、センサ・チップ上で直接行なうか、または測定後に好適なソフトウェアを介して行なうことができる。
【００８３】
たとえば、工程（１）〜（３）を含む個々の測定は、以下のように現れる。励起時間Ｔ１の間、検出器としてのフォトダイオードは、励起状態に対して無感度のモードになっている。この時間の間、励起源は動作中である。時間Ｔ２の間、励起源およびフォトダイオードの両方とも非動作状態にある。バックグラウンド・ルミネセンスは、この時間の間に減衰することができる。時間Ｔ３の間、フォトダイオードが動作し、発光体からの１ないし複数個の入射フォトンを検出する。検出プロセスは、フォトダイオードをリセットして非動作モードにすることによって繰り返すことができる。個々の時間間隔は、たとえば２ｍｓ（Ｔ１）、５ｎｓ（Ｔ２）、および２ｍｓ（Ｔ３）と選ぶことができる。信号強度が適切であるならば、時間間隔Ｔ３を、使用する発光体の励起状態の半減期よりも著しく短くすることもできる。
【００８４】
繰り返し励起する場合に特に好ましい実施形態によれば、時間間隔Ｔ３において（任意にデジタル化およびさらなる電子処理をした後に）得られる検出器の値を、個々の時間間隔に対して割り当てられたメモリ・セル内に記憶する。たとえばこの種の記憶メモリは、連続する時間間隔に対して割り当てられる１００以上のメモリ・セルを有する。このような時間間隔は好ましくは、１〜１００ナノ秒の範囲である。
【００８５】
特に好ましいこととして、検出器から得られた信号を信号強度に関して分析して、信号を発生させる個々の分子の数（コレクタ／分析対象物複合体の数）について決定を下すこともできる。こうして、定性的な分析だけでなく定量的な分析も可能になる。発光体の数に対応する単位値（ｕｎｉｔ  ｖａｌｕｅ）の倍数が、メモリ・セル内に記憶される。
【００８６】
前述したメモリ記憶プロセスは、それぞれの個々の測定ごとに新たに行なわれ、繰り返し励起が必要な場合には合計を行なう（すなわち工程（１）〜（３）を複数回往復する）。このプロセスでは、測定後に特定のメモリ・セル内に記憶される単位値（または必要に応じてその倍数）が、セル内にすでに存在する値に加えられる。特定の検出フィールドに対する測定によってこのようにして得られる合計の曲線を評価して、どのルミネセンス分析対象物および／またはいくつのルミネセンス分析対象物が検出フィールド内に結合しているかを確認することができる。原理的に、複数の異なる分析対象物によって得られる信号曲線に対しても使用される評価方法を、合計の曲線に適用することができる。数ピコ秒の精度でルミネセンス事象を完全に記録することによって、フォトン統計の全体的な分析が可能になる。全体的なフォトン分布における特有の蓄積または中断を、認識して決定することができる。こうすることによって、システムの三重項の時間（ｔｒｉｐｌｅｔ  ｄｕｒａｔｉｏｎ）を測定することおよび反応動力学を決定することができる。同様に、このようにして、検出体積を通る拡散時間を測定することができ、その結果、分析対象物分子のサイズに関して推論することができる。全体的なフォトン収集効率として、入力放射におけるフォトン数に対して５〜１０％を、このようなシステムによって実現することができる。これは、発光体吸収効率が約８０％、放出確率が約９０％、検出器感度が最大７０％ということに起因する。この応用例においては、制御ユニットを好ましくは、励起源を時間間隔Ｔ１の間だけ起動させ、時間間隔Ｔ２の経過後、検出器を時間間隔Ｔ３の間だけ起動させるようにデザインする。この種の制御ユニットによって、時間分解ルミネセンス測定が可能になる。励起源が起動される時間間隔Ｔ１の目的は、分析対象物上に固定化されしたがって複合体中に束縛される発光体を、励起状態へ移すことである。発光体は、励起状態から、ルミネセンス光の放出を伴う低エネルギー状態への遷移を経る。減衰時間Ｔ２の目的は、測定値から、サンプルおよび／または支持体材料のわずかな自然発生的なルミネセンス（検出すべき分子のグループから発するのではない）を排除することである。
【００８７】
検出器は、少なくとも測定時間Ｔ３（および任意にＴ４）の間だけ起動され、コレクタ／分析対象物複合体からのルミネセンス放射を受け取る。時間Ｔ３は、好ましくは５ｎｓ〜２ｍｓとする。この時間Ｔ３の間、検出器信号は、その信号強度およびタイミングに関して記録ユニットによって取得され、その後評価される。個々のまたは少なくとも非常に少数の分子について測定を行なう場合、時間間隔Ｔ３の間に得られるものは、古典的なルミネセンス減衰曲線ではなく、たとえば単一分子の場合には、それは、個々の分子が放射を放出する瞬間または時間間隔を特徴づける信号ピークである。測定を繰り返して行なう結果、ルミネセンス寿命を確定することができる統計的な評価を行なうことができる。
【００８８】
特に好ましい実施形態においては、コレクタ分子としてまだハイブリダイズされていないＤＮＡからの信号、および／またはコレクタ分子が全く固定化されていない検出器からの信号（バックグラウンド・ルミネセンス）、および／または未標識のコレクタ／分析対象物複合体（すなわち発光体を何ら示していないもの（たとえば発光体が無いハイブリダイズされたＤＮＡ））からの信号を、参照または対照値としてメモリ内に記憶して、記録された「干渉信号」を発光体による実際の検出事象中の検出信号から計算できるように、備えることができる（図４を参照）。
【００８９】
統計的な評価の状況において、Ｔ３内の規定された時間間隔において得られた強度を合計することができる。
【００９０】
本方法の使用方法は当業者には明らかである。補足として、ＷＯ９８／０９１５４の記載に留意されたい。本発明を、実施例を用いておよび添付の図面を参照して、以下に詳細に説明する。
【実施例】
【００９１】
本発明によるマイクロチップ型バイオセンサの製造
センサは、６”（インチ）のウェハを用いて、０．５μｍＣＭＯＳプロセスによって作製される。各ｐｎフォトダイオードを、ｐ基板上のｎトラフで配置する。フィールド酸化の後、フォトダイオードのｐ領域の規定、および１０ｎｍ厚みのゲート酸化物層の塗布を行なう。この後、二酸化ケイ素層の重ね合わせと構築を行なう。最後に、他の通常のＣＭＯＳ工程、たとえば配線層の塗布および表面パッシベーション（スクラッチ保護）などを行なう。
ＣＭＯＳバイオセンサのコーティング
前述のように作製したＣＭＯＳセンサに、シランをコーティングする。これは、ＣＭＯＳセンサを、１％ＧＯＰＳ（グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン）および０．１％トリエチルアミンのトルエン溶液中に、約２時間の間、浸すことによって行なう。その後、マイクロチップを溶液から取り出し、短時間乾かした後に、マイクロチップを乾燥キャビネット内で１２０℃で約２時間の間、固定した。このようにしてコーティングされたマイクロチップは、水分の無い状態で、バイオコンジュゲーションまで保管することができる。
オリゴヌクレオチド・プローブとのバイオコンジュゲーション
前述のようにコーティングされたマイクロチップに、従来の技術を用いて、非接触プロセスによって、５’アミノ修飾オリゴヌクレオチド・プローブをプリントする。このために、オリゴヌクレオチド・プローブを、ＰＢＳバッファ中の５μＭ濃度の溶液として用意する。プリンティング後、結合反応を、５０℃において湿度室（ｈｕｍｉｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）内で続ける。次にマイクロチップを、蒸留水ですすいだ後に、メタノールで洗浄することによって乾燥させる。残っている溶媒残留物はすべて、後で、換気フードの下で蒸発させることによって取り除く。
サンプルの取得
ヘモクロマトーシス遺伝子の断片を、単離されたヒトＤＮＡから、ＰＣＲ（＝ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて増幅する。増幅では好適なプライマー配列を使用する（たとえば米国特許第５，７１２，０９８号明細書に記載されている）。
【００９２】
反応混合物には、以下の標準的な試薬（プライマー：０．５μＭ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ：０．１ｍＭ、ｄＴＴＰ０．０８ｍＭ、ＰＣＲバッファ、ＭｇＣｌ２：４ｍＭ、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（パーキン・エルマー社製）２単位／５０μｌ）が含まれており、これに加えてビオチン−１１−ｄＵＴＰ（０．０６ｍＭ）が添加される。ＰＣＲ反応の間に（３５周期、５分間９５℃、３０秒間９５℃、３０秒間６０℃、３０秒間７２℃、７分間７２℃）、ビオチン−ｄＵＴＰが新たな合成ＤＮＡ内に取り込まれる。その後、Ｔ７Ｇｅｎ６エキソヌクレアーゼ（１００単位／５０μｌのＰＣＲ混合物）を添加して、その混合物を加熱（３７℃で３０分間、８５℃で１０分間）することによって、一本鎖ＤＮＡを発生させる。
ハイブリダイジング
上記反応バッチを、マイクロチップ上で、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ（１２μｌ）のバッファ中で、顕微鏡のカバー・ガラス下で、２時間の間、５０℃において、湿度室内でハイブリダイズさせる。次に、これを２×ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳによってすすぎ、次いでマイクロチップを水中で洗浄することでクリーニングする。
標識
５％ＢＳＡ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０、および４×ＳＳＣバッファからなる標識溶液に、０．００１％固体マイクロスフェア（ユウロピウム・ルミネセンス・マイクロスフェア、ニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）がコートされた０．０４μＭ、モレキュラー・プローブスＦ２０８８３）を懸濁したものを、マイクロチップ上に注ぎ、標識を行なう。反応を、３０分間、偏心したタンブラ・ミキサにより攪拌しながら行なう。次に、存在し得る未結合マイクロスフェアを混合物から、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを洗浄することによって取り除く。
抗ジゴキシゲニンＩｇＧコートされたマイクロスフェアの調製
０．０４μＭのフルオスフェアズ・プラチナ・ルミネセント・マイクロスフェアズ（Ｆｌｕｏｓｐｈｅｒｅｓ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）（Ｆ２０８８６）を、モノクローナルの抗ジゴキシゲニンＩｇＧ抗体（ヤギ（ｇｏａｔ））を用いて修飾することを、マイクロスフェアの製造業者（モレキュラー・プローブス）からの取り扱い説明書に従って行なう。コートされたマイクロスフェアをその後に、排除サイズが３００ｋＤの透析スリーブ内で、ＰＢＳに対して透析し、その際、バッファを５回取り替える。
センサ・チップ上での二色検出
２つのＰＣＲ生成物を前述のようにして調製する。それによって、一方の生成物において、ビオチン−１１−ｄＵＴＰを、等モル量のジゴキシゲニン−ｄＵＴＰで置換する。両方の反応バッチを同じ様に処理した後、マイクロチップ上で１：１混合物にてハイブリダイズする。標識を、上記固体マイクロスフェア（ユウロピウム・ルミネセンス・マイクロスフェアズ、ニュートラアビジンでコートした０．０４μＭ、モレキュラー・プローブスＦ２０８８３）と、そこに記載される標識バッファ中の抗体修飾されたスフェアとの１：１混合物を用いて、行なう。プラチナ・スフェアの励起を４００ｎｍで行ない（光源：キセノン・ランプおよびモノクロメータ）、一方で、ユウロピウム・スフェアの励起を３７０ｎｍで行なう（キセノン・ランプおよびモノクロメータ）。マイクロチップの照明を光ファイバを介して行ない、染料のルミネセンス・スペクトルを別個に記録する。あるいは、照明をＵＶ−ＬＥＤを用いて行ない（フィルタなし）、両方の染料のルミネセンスを記録して、その後に、ルミネセンス減衰動力学のプロファイルを介して評価する。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＣＭＯＳプロセスによって製造される本発明に係るバイオセンサ（１）の機能部分を示す図である。光学検出器（たとえばｐｎダイオード）（２）は、絶縁物（たとえばフィールド酸化膜）（４）によって覆われている。光学検出器および／または検出器フィールドの領域では、スクラッチ保護（３）が、エッチングされて鋭いエッジまたは階段状になっていて、コレクタ分子（たとえばＤＮＡプローブ）（６）が、沈下領域内に配置されるようになっている。センサ・チップのスクラッチ保護表面（検出それ自体には全く関与しない）は、たとえば貴金属または疎水性／親水性材料（５）を塗布することによって、変更することができる。
【図２】本発明により、バイオセンサ（１）上に、たとえばＤＮＡプローブ（６）などのコレクタ分子のプリントもコーティングもされていない検出器および／または検出器フィールド（例図の左側部分に示す）を設けることが可能であることを示す図である。この目的は、ハイブリダイズしたＤＮＡ（例図の右側部分）の特異的な検出信号から、干渉信号（たとえば、システム・コンポーネントの固有蛍光によって生じ得るもの）を算出することである。
【図３】本発明のバイオセンサ（１）が、検出フィールドごとに複数のフォトダイオード（２）を取り付けられることを示す図であり、同じ種類のコレクタ分子がこのフィールドの各検出器上に固定化されている。これにより、所定の分析対象物／コレクタ複合体に対して多重測定を行なうことが可能となり、特異的な測定信号の統計的な評価を得ることができる。たとえば、これにより、非特異的な信号と特異的な信号との識別が可能になる。
【図４】１つの検出フィールドが、複数の検出器（２）上に渡って展開されていることを示す図であり、こうすることによって、本発明に係るバイオセンサ（１）の表面上にコレクタ分子（６）を固定化する際の不規則さを相殺することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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