(57)【要約】特定の癌又は他の疾患において、発現が上方制御又は下方制御されるか、あるいは疾患において、他の様態で調節される遺伝子を本明細書中に記載した。これらの病状の診断、予後診断、及び治療のために使用される関連した方法及び組成物を開示する。選択された症状のモジュレータの同定に使用されうる方法をも本明細書中に記載した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において病的細胞の存在又は不存在を決定する方法であって、上記患者由来の生物学的サンプル中の、表2A〜表80中に記載の配列と少なくとも80％同一の配列を含む核酸を検出し、それにより上記の病的細胞の存在又は不存在を決定するステップを含む、前記方法。
【請求項２】
a)  前記病状が、癌を含み、そして表1に記載されており；及び/又は
b)  前記生物学的サンプルが、単離された核酸を含む、
請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルが、癌を含み、そして表1の前記病状に冒されている臓器由来の組織である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がmRNAである、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
a)  前記核酸を検出する前記ステップの前に、核酸を増幅するステップをさらに含むか；又は、
b)  前記検出が、前記核酸によってコードされたタンパク質の検出である、
請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が表2A〜表80に記載の配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
a)  前記検出ステップが：
i)  標識された核酸プローブを使用するか；
ii)  表2A〜表80に記載の配列と少なくとも80％同一である配列を含むバイオチップを利用するか；又は
iii)  上記核酸によってコードされたポリペプチドを検出する
ことによって実施される方法であるか；あるいは、
b）  前記患者が：
i)  表1の前記病状を治療するために治療計画を受けているか；又は
ii)  前記病状又は癌を有することを疑われる、
請求項2に記載の方法。
【請求項８】
表2A〜表80に記載の配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項９】
標識されている、請求項8に記載の核酸分子。
【請求項１０】
請求項8に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項10に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
表2A〜表80に記載の配列を含む核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項12に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
a)  エフェクター成分と結合されている；
b)  蛍光標識、放射性同位体又は細胞毒性化学物質を含む検出標識と結合されている；
c)  抗体断片であるか；あるいは
d)  ヒト化抗体である、
請求項13に記載の抗体。
【請求項１５】
患者の病的細胞に化合物を特異的にターゲッティングする方法であって、請求項13に記載の抗体を上記患者に投与し、それによって上記ターゲッティングを提供するステップを含む、前記方法。
【請求項１６】
患者について病的細胞の存在又は不存在を決定する方法であって、生物学的サンプルと、請求項13に記載の抗体とを接触させるステップを含む上記方法。
【請求項１７】
a)  前記抗体を、以下の：
i)  エフェクター成分；又は、
ii)  蛍光標識；
と結合させるか、あるいは、
b)前記生物学的サンプルが、血液、血清、尿又は便のサンプルである、
請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
病状に関係するポリペプチドを調節する化合物の同定方法であって、以下のステップ：
a)  上記化合物を、表2A〜表80に記載の配列と少なくとも80％同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる病状に関係するポリペプチドと接触させ；そして
b)  上記ポリペプチドに対する上記化合物の機能上の効果を測定する、
を含む上記方法。
【請求項１９】
以下のステップ：
a)  表1の病状を有する哺乳動物又は当該哺乳動物から分離した細胞にテスト化合物を投与し；そして
b)  処理を受けた細胞又は哺乳動物における、表2A〜表80に記載の配列と少なくとも80％同一の配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルと、対照の細胞又は哺乳動物における上記ポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルとを比較する、
を含む薬物スクリーニング・アッセイ法であって、当該ポリヌクレオチドの上記発現レベルを調節するテスト化合物が、上記病状の治療のための候補物質である前記アッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許
本願は、2001年12月14日提出の米国特許第60/340,376号；2002年2月8日提出の代理人整理番号018501-006400US；2002年1月8日提出の米国特許第60/347,211号；2001年11月29日提出の米国特許第60/334,393号；2001年11月15日提出の米国特許第60/355,394号；2002年1月10日提出の米国特許第60/347,349号；2002年3月29日提出の米国特許第60/368,809号；2002年9月9日提出の米国特許第60/409,450号；2002年2月20日提出の米国特許第60/359,077号；2002年6月5日提出の米国特許第60/386,614号；2002年2月13日提出の米国特許第60/356,714号；2002年7月22日提出の米国特許第60/397,775号；2001年11月21日提出の米国特許第60/332,464号；2002年7月22日提出の米国特許第60/397,845号；2002年4月4日提出の米国特許第60/370,110号；2002年7月16日提出の米国特許第60/396,839号；2001年11月13日提出の米国特許第60/350,666号；及び2002年4月12日提出の米国特許第60/372,246号に対して優先権を主張し、あらゆる目的について上記文献の全体を本明細書中に援用する。本出願は、PCT/US02/29560；PCT/US02/02242；及びPCT/US02/17594をも援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、癌及び他の疾患に関わる核酸及びタンパク質の発現特性、並びに核酸、作製物、及びそれに対する抗体の同定；そしてそれらの症状の診断、予後、及び治療における当該発現特性及び組成物の使用に関する。さらに、本発明は、それらの症状を調節する因子及び/又はターゲットの同定及び使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は米国における死亡率の主要要因である。例えば、米国癌学会は、1996年に、135万9千150人が悪性腫瘍の診断を受け、55万4千740人がそれらの疾病の1つにより死亡したと推定している。癌は全米の死亡者数の23.9％を占めており、心臓病のみが死亡原因としてこれを上回っている（33％）。残念なことに、癌による死亡率は増加しており、今世紀前半中には、日本ではすでにそうであるように、米国でも最大の死因となることが予測される。
【０００４】
癌には、正常な細胞分裂、成長及び分化への制御を混乱させるという性質がある。その初期の臨床病状は極めて雑多なものであり、70種類以上の癌が、事実上身体のすべての臓器及び組織に発生する。さらに、同様に分類された癌の種類が、複数の異なった分子病を表すことがある。不幸にも、癌の中にはその末期になるまで事実上無病状なものがあり、そのような場合、治療はさらに難しく、また予後も厳しくなる。
【０００５】
癌の治療には通常、外科的手術、化学療法、及び/又は放射線療法が含まれる。これらの療法により約50％の癌患者の治療が効果的に行われてはいるが、現在の治療法はどれも生活の質を下げる深刻な副作用を誘発するものである。新規治療ターゲット及び診断マーカーの同定が、癌患者の診断及び治療の改善のために重要である。
【０００６】
近年の分子医学の発達により、様々な免疫療法又は小分子ストラテジーのターゲットとなり得る、腫瘍特異的抗原に対する興味が深まっている。免疫治療ストラテジーに適した抗原は、癌組織で大いに発現されるべきであり、好ましくは脈管及び細胞の表面から得ることができ、理想的には正常な成人の組織では発現しない。しかしながら、存在しなくても生命に関わらない組織、例えば生殖器、特に一方の性別に欠けているもの、における発現は許容されることもある。特定の癌の見地及び治療のため現在使用可能な抗原の例に、Her2/neuやB細胞の抗原CD20などが含まれる。Her2/neu （Herceptin/trastuzumab）に対するヒト化モノクローナル抗体は、現在転移性乳癌の治療に使用されている。Ross and Fletcher (1998) Stem Cells （『幹細胞』）16:413-428参照。同様に、抗CD20モノクローナル抗体（Rituxin/rituximab）は、非ホジキンリンパ腫の効果的治療に使用されている。Maloney, et al. (1997) Blood （『血液』）90:2188-2195; Leget and Czuczman (1998) Curr. Opin. Oncol. 10:548-551参照。
【０００７】
治療ターゲットや診断マーカーを同定するために、疾病状態における新規タンパク質や化合物の役割を解明することは、癌患者の現行の治療を改良するために有益なことである。従って、本明細書中に、様々な所定の癌における治療介入の分子ターゲットが提供される。加えて、本明細書中に、癌の診断及び予後に使用できる方法も提供される。またさらに、癌を調節する能力のために生理活性物質候補のスクリーニングに使用される方法も提供されている。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の概要
本発明は、患者に病的細胞が存在するか否かを決定する方法であり、当該患者からの生物学的サンプル中において、表2A-80に記載されたの配列と少なくとも80％が同一である配列からなる核酸を検出し、それにより病的細胞の存在の有無を決定することを含む方法を提供する。当該方法の特定の態様において、癌を含む疾病は表1に記載されており；生物学的サンプルは単離された核酸を含み；核酸はmRNAであり；生物学的サンプルは癌を含む表1に記載された疾病に冒された臓器からの組織であり；核酸を検出するステップの前に、核酸を増幅するステップがさらにとられ；検出とは核酸によりコードされたタンパク質の検出であり；核酸は表2A-80に記載された配列を含み；検出のステップは、表2A-80に記載された配列と少なくとも80％が同一である配列からなるバイオチップを利用した標識核酸プローブを使用すること、あるいは核酸によりコードされたポリペプチドを検出することにより行われ；あるいは、患者が表1の疾病に対応する治療計画を受けている、又は当該疾病又は癌を持っている疑いがある。
【０００９】
以下の組成物も提供される：例として表2A-80に記載された配列からなる、例えば標識された、単離された核酸分子；当該核酸を含む発現ベクター；当該発現ベクターを含む宿主細胞；表2A-80に記載された配列からなる当該核酸分子によりコードされた、分離ポリペプチド；又は特に当該ポリペプチドと結合する抗体。特定の態様において、抗体は：エフェクター成分と結合し、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位体、又は細胞毒性の化学薬品を含む）と結合し、抗体フラグメントであるか、又はヒト化抗体である。
【００１０】
患者の病的細胞に対する成分を特にターゲットとする他の方法が提供されており、この方法は前記のように、患者へ抗体を投与することによってターゲットを提供することを含む。他にも、例えば、患者に病的細胞が存在するか否かを決定する方法であり、前記のように、生物学的サンプルと抗体の接触を含む方法が含まれる。より特定の方法では、前記抗体が：エフェクター成分又は蛍光標識と結合しており；また、前記生物学的サンプルが血液、血清、尿又は便のサンプルである。
【００１１】
さらに、病気に関連したポリペプチドを調節する成分を同定する方法が含まれ、その方法は以下のステップ：当該成分と病気に関連したポリペプチドで、表2A-80に記載された配列と少なくとも80％が同一な配列に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドと接触させ；そして当該成分のポリペプチドへの機能的効果を測定することを含む。他の薬物スクリーニング・アッセイは、以下のステップ：表1の疾病にかかっている哺乳動物、又はそれらから分離した細胞へのテスト成分を投与し；そして治療を受けた細胞又は哺乳動物における、表2A-80に記載された配列と少なくとも80％が同一である配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルと、対照群の細胞又は哺乳動物における前記のポリヌクレオチドの遺伝子発現レベルと比較することを含む。このときポリヌクレオチドの発現レベルを調節するテスト成分は、前記の疾病の治療薬候補である。
【００１２】
発明の詳細な説明
上記に概説された目的に基づき、本発明は、例えば血管形成、線維症、また転移癌を含む様々な所定の形態の癌など、様々な疾患の診断及び予後評価の新規方法、並びに当該状態を調節する組成物のスクリーニング方法を提供する。また、当該疾患又は癌の治療方法も提供する。
【００１３】
以下参照例：American Society of Clinical Oncology (ed. 2001) ASCO Curriculum: Symptom Management Kendall/Hunt, ISBN: 0787277851（米国臨床腫瘍学会『ASCOカリキュラム：病状の管理』）；Bonadonna, et al. (2001) Textbook of Breast Cancer （『乳癌テキストブック』）(2d ed.) Dunitz Martin, ISBN: 1853178241；Devita and Hellman (eds. 2001) Cancer Principles and Practice of Oncology（『癌の原理及び腫瘍学の実践』） (2 vols.), Lippincott Williams, ISBN: 0781723876；Howell, et al. (2001) Breast Cancer （『乳癌』）Isis Medical Media, ISBN: 1901865584；Kaye and Laws (2001) Brain Tumours: An Encyclopedic Approach （『脳腫瘍：百科事典的アプローチ』）(2d ed.) Churchill Livingstone, ISBN: 0443064261; Mihm, et al. (2001) The Melanocytic Proliferation: A Comprehensive Textbook of Pigmented Lesions（『メラニン細胞の増殖：色素病変の総合テキストブック』） Wiley-Liss, ISBN: 0471252719；Montgomery and Aaron (2001) Clinical Pathology of Soft-Tissue Tumors（『軟組織腫瘍の臨床病理学』） Marcel Dekker, ISBN: 0824702905；Petrovich, et al. (eds. 2001) Combined Modality of Central Nervous System Tumors（『中枢神経系腫瘍の複合理学療法（医用放射線学）』）(Medical Radiology) Springer Verlag, ISBN: 3540660534；Rosen (2001) Rosen's Breast Pathology（『Rosenの乳房の病理学』） Lippincott Williams and Wilkins, ISBN: 0781723795；
【００１４】
Shah, et al. (2001) Oral Cancer（『口腔癌』） Isis Medical Media, ISBN: 189906687X；Weiss and Goldblum (2001) Enzinger and Weiss's Soft Tissue Tumors（『Enzinger及びWeissの軟組織腫瘍』 ）(4th ed.) Mosby, ISBN: 0323012000；Abeloff, et al. (eds. 2000) Clinical Oncology （『臨床腫瘍学』）(2d ed.) Churchill Livingstone, ISBN: 044307545X、American Society of Clinical Oncology (ed. 2000) Cancer Genetics and Cancer Predisposition Testing Kendall/Hunt, ISBN: 0787276154（米国臨床腫瘍学会、『癌の遺伝学及び癌の素因テスト』）；Fletcher (2000) Diagnostic Histopathology of Tumors （『腫瘍の診断的組織病理学』）(2 vols. 2d ed.) Churchill Livingstone, ISBN: 0443079927；Vogelzang (ed. 2000) Comprehensive Textbook of Genitourinary Oncology （『尿生殖器腫瘍学の総合テキストブック』）(2d ed.) Lippincott Williams and Wilkins, ISBN: 0683306456；
【００１５】
Holland, et al. (eds. 2000) Holland-Frei Cancer Medicine (Book with CD-ROM 5th ed.) （『Holland-Frei癌の医学』（CD-ROM付き第5版））Decker, ISBN: 1550091131; Turrisi, et al. (2000) Lung Cancer （『肺癌』）Isis Medical Media, ISBN: 1901865428; Bartolozzi and Lencioni (eds. 1999) Liver Malignancies: Diagnostic and Interventional Radiology (Medical Radiology) （『肝臓の悪性腫瘍：放射線診断及びインターベンショナル・ラジオロジー』（医用放射線学））Springer Verlag, ISBN: 3540647562；Gasparini (ed. 1999) Prognostic Variables in Node-Negative and Node-Positive Breast Cancer（『リンパ節転移陰性及びリンパ節転移陽性乳癌の予後変数』） Kluwer, ISBN: 0792384474;
【００１６】
Hansen (ed. 1999) The LASLC Textbook of Lung Cancer: International Association for the Study of Lung Cancer （『LASLC肺癌のテキストブック：国際肺癌学会』）Dunitz Martin, ISBN: 1853177083；Raghavan, et al. (eds. 1999) Textbook of Uncommon Cancer （『稀な種類の癌のテキストブック』）(2nd ed.) Wiley, ISBN: 0471929212；Thawley, et al. (eds. 1999) Comprehensive Management of Head and Neck Tumors （『頭部及び頚部の癌の総合的な管理』）(2 vols.) Saunders, ISBN: 0721655823；Whittaker and Holmes (eds. 1999) Leukemia and Related Disorders （『白血病と関連疾患』） (3d ed.) Blackwell Science, ISBN: 0865426074；Aapro (ed. 1998) OncoMedia: Medical Oncology （『OncoMedia：臨床腫瘍学』）(CD-ROM) Elsevier Science, ISBN: 0080427480；
【００１７】
Abeloff (1998) Clinical Oncology (Library Version 2 CD-ROM Individual Version 2.0 Windows and Macintosh) Harcourt Brace, ISBN: 0443075557（『臨床腫瘍学』（図書館版2CD-ROM 個人版2.0 Windows and Macintosh）；Benson (ed. 1998) Gastrointestinal Oncology (Cancer Treatment and Research, CTAR 98) （『胃腸腫瘍学』（癌の治療及び研究、CTAR 98）Kluwer, ISBN: 0792382056；Brambilla and Brambilla (eds. 1998) Lung Tumors: Fundamental Biology and Clinical Management （『肺の腫瘍：基礎生物学及び臨床管理』）(Vol 124) Marcel Dekker, ISBN: 0824701607；Canellos, et al. (eds. 1998) The Lymphomas （『リンパ球腫』）Saunders, ISBN: 0721650309；Greenspan and Remagen (1998) Differential Diagnosis of Tumors and Tumor-Like Lesions of Bones and Joints （『腫瘍の鑑別診断と、骨及び関節の腫瘍状の病変』）Lippincott Williams and Wilkins Publishers, ISBN: 0397517106；Hiddemann (ed. 1998) Acute Leukemias VII: Experimental Approaches and Novel Therapies （『急性白血病VII：実験的アプローチ及び新規治療法』）(Haematologie Und Bluttransfusion, Vol 39), Springer Verlag, ISBN: 3540635041；
【００１８】
Husband and Reznek (1998) Imaging in Oncology （『腫瘍学のイメージング』）(2 vols.) Mosby, ISBN: 1899066489；Leibel and Phillips (eds. 1998) Textbook of Radiation Oncology （『放射線腫瘍学のテキストブック』）Saunders, ISBN: 0721653367； Maloney and Miller (eds. 1998) Cutaneous Oncology: Pathophysiology, Diagnosis, and Management （『皮膚腫瘍学：病態生理学、診断及び管理』）Blackwell Science, ISBN: 0865425175；Mittal, et al. (eds. 1998) Advances in Radiation Therapy （『放射線療法の発達』）Kluwe, ISBN: 0792399811；Oldham (ed. 1998) Principles of Cancer Biotherapy （『癌の生物学的療法の原理』） (3d ed.) Kluwer, ISBN: 0792335074；Ozols (ed. 1998) Gynecologic Oncology （『婦人科の腫瘍学』）Kluwer, ISBN: 0792380703；Parkin, et al. (eds. 1998) Cancer Incidence in Five Continents （『五大陸における癌の発生率』）(Iarc Scientific Publications, No 143) Oxford University Press, ISBN: 9283221435（オックスフォード大学出版）；Perez and Brady (eds. 1998) Principles and Practice of Radiation Oncology （『放射線腫瘍学の原理と実践』）Lippincott Williams and Wilkins, ISBN: 0397584164；Black, et al. (eds. 1997) Cancer of the Nervous System （『神経系統の癌』）Blackwell Science, ISBN: 0865423849；Bonadonna, et al. (1997) Textbook of Breast Cancer: A Clinical Guide to Therapy （『乳癌のテキストブック：治療の臨床ガイド』）Blackwell Science, ISBN: 1853173487；
【００１９】
Pollock (ed. 1997) Surgical Oncology （『外科腫瘍学』）Kluwer, ISBN: 0792399005；Sheaves, et al. (eds. 1997) Clinical Endocrine Oncology （『臨床内分泌腫瘍学』）Blackwell Science, ISBN: 086542862X；Vahrson (1997) Radiation Oncology of Gynecological Cancers（『婦人科癌の放射線腫瘍学』） Springer Verlag, ISBN: 0387567682；Walterhouse and Cohn (eds. 1997) Diagnostic and Therapeutic Advances in Pediatric Oncology （『小児癌の診断と治療の発展』）Kluwer, ISBN: 0792399781；Aisner (ed. 1996) Comprehensive Textbook of Thoracic Oncology （『胸部腫瘍学の総合テキストブック』）Lippincott, Williams and Wilkins, ISBN: 0683000624；Bertino, et al. (eds. 1996) Encyclopedia of Cancer （『癌の百科事典』）(3 vols.) Academic, ISBN: 012093230X;
【００２０】
Cavalli, et al. (1996) Textbook of Medical Oncology （『臨床腫瘍学のテキストブック』）Dunitz Martin, ISBN: 1853172901；Peckham, et al. (eds. 1995) Oxford Textbook of Oncology （『腫瘍学オックスフォードテキストブック』） (2-Vols.) Oxford University Press, ISBN: 0192616854（オックスフォード大学出版）；及び、Freireich and Kantarjian (eds. 1996) Molecular Genetics and Therapy of Leukemia (Cancer Treatment and Research, V. 84) （『分子遺伝学と白血病の治療』（癌の治療と研究、V. 84））Kluwer, ISBN: 0792339126。
【００２１】
特に、所定の癌において選択的に発現されたマーカーの同定は、診断、予後又は治療の方法にその発現を使用することを可能にする。このように、本発明は、それらのマーカーを選択的に同定するのに役立つ、例えば核酸、ポリペプチド、抗体及び小分子アゴニスト/アンタゴニストなどの様々な組成を明示する。例えば、治療方法は、（原因的疾患効果を有するマーカーに対する）機能の選択的局在化や調節、ワクチンについてのマーカーの発現、結合相手の同定、又は例えばアンチセンスやRNA干渉（RNAi）を使用したアンタゴニストを使用する、タンパク質治療の形態をとることがある。
【００２２】
当マーカーは、例えば表1に提供された疾病のサブセットの分子特徴づけに有用であり、これらのサブセットは実際に全く異なった治療を要することがある。さらに、当マーカーは、例えば、悪性ではない疾病で同様の組織に影響を与える、又は類似の誘導/管理メカニズムを有する特定の疾患や癌に関連する疾病においても重要である。転移のプロセス又は特性もまたターゲットとなることがある。診断及び予後の使用が、例えば、関連した、しかし別個の疾病、又は治療計画の決定などについて可能とされている。この検出方法は、核酸、例えばポリメラーゼ連鎖反応、又はハイブリダイゼーション技術、あるいはタンパク質、例えばELISA、画像診断、免疫組織化学等に基づいている。診断は質的あるいは量的なもので、発現レベルの増加又は減少を検出する。
【００２３】
表2B-76Bは、罹患サンプルにおいて増加又は減少した発現（表1-3を参照のこと）、特に血管形成、関節炎、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、膀胱癌、頭頸部癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、皮膚癌、睾丸癌、子宮癌、グリア芽細胞腫、ユーイング肉腫、軟部組織肉腫、及び肺線維症を含む配列を示す、遺伝子のヌクレオチド配列にUniGeneクラスタ同定番号を提供する。表2A-80はまた、UniGeneクラスタの一部であるヌクレオチド配列を提供する、代表登録番号を提供する。
【００２４】
定義
用語「癌タンパク質」、「癌ポリヌクレオチド」、又は「癌関連転写」は、核酸及びポリペプチドの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体及び種間相同体のことを言い、それらは：（1）表1-80の遺伝子の又はそれに関連するヌクレオチド配列に対し、約60％以上、65%、70%、75%、80%、85%、90%のヌクレオチド配列同一性で、好ましくは約92%、94%、96%、97%、98%、又は99％又はそれ以上のヌクレオチド配列同一性、で、好ましくは、少なくとも25、50、100、200、500、1000、又はそれ以上のヌクレオチドの範囲におよぶ、ヌクレオチド配列を有し；（2）表1-80又はそれに関連した遺伝子のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列を含むイムノゲンに対して作製された、例えばポリクローナル抗体などの抗体、及びその保存的に修飾された変異体と結合し；（3）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で特別に核酸配列、又は表1-80の相補体、及びその保存的に修飾された変異体とハイブリダイズし；あるいは（4）表1-80又はそれに関連する遺伝子のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列に対し、約60％以上、65%、70%、75%、80%、85%のアミノ酸配列同一性、好ましくは約90%、91%、93%、95％、97%、98%、又は99％、又はそれ以上のアミノ酸配列同一性で、好ましくは、少なくとも25、50、100、200、500、1000、又はそれ以上のアミノ酸の範囲にわたる、アミノ酸配列を有している。ポリヌクレオチドあるいはポリペプチドの配列は一般に、霊長類、例えばヒト；げっ歯類、例えばラット、マウス、ハムスター；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、又はその他の哺乳動物を含み、またそれらに限られない哺乳動物からのものである。「癌ポリペプチド」及び「癌ポリヌクレオチド」は、天然又は組み換えの両方の形態を含んでいる。
【００２５】
「完全長」の癌タンパク質又は核酸とは、癌のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列、あるいはそれらの変異体を言い、1つ以上の天然の野生型癌のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に通常含まれている成分を含んでいる。この「完全長」は、選択的スプライシングを含む、翻訳後プロセッシング又はスプライシングの様々な段階に先立つものか、又は後のものである可能性がある。
【００２６】
本明細書中に使用されるとき、「生物学的サンプル」は、例えば癌のタンパク質、ポリヌクレオチド、又は転写などの核酸やポリペプチドを含む、生体組織又は流体のサンプルである。これらのサンプルは、例えばヒトなどの霊長類、又は例えばマウス、ラットなどのげっ歯類から単離された組織を含み、またこれらに限るものではない。生物学的サンプルは、生検又は検死のサンプル、組織学的用途のために採取された冷凍切片、既採取サンプル、血液、血漿、血清、唾液、便、涙液、粘液、毛髪、皮膚などの、組織の断片をも含む。生物学的サンプルはまた、外植片や、患者の組織由来の初代細胞及び/又は形質転換細胞を含む。生物学的サンプルは通常、真核生物から、最も好ましくは、哺乳動物、例えばチンパンジーやヒトなどの霊長類；ウシ；イヌ；ネコ；例えばモルモット、ラット、マウスなどのげっ歯類；ウサギなど；又は、トリ；爬虫類；サカナなどから得られる。また、畜産、家畜類も対象となっている。
【００２７】
「生物学的サンプルを提供する」とは、本願発明に記載されている方法に使用するための生物学的サンプルを入手することを意味する。ほとんどの場合、これは動物から細胞サンプルを採取することによってなされるが、先に単離された（例えば、他人から、他の時に、及び/又は他の用途で単離された）細胞を使用する、又は、生体内で本発明の方法を実施することによっても達成できる。治療や効果の記録のある、既採取組織又は材料は特に有用である。
【００２８】
二つ以上の核酸又はポリペプチドの配列において、「同一の」又はパーセント「同一性」という用語は、以下に記載されるデフォルト媒介変数により、例えばBLAST又はBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを使用して測定した場合、あるいは手動アラインメント及び目視検査をした場合に（例えば、NCBIウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ その他を参照）、二つ以上の配列あるいは部分列が同一であるか、特定のパーセンテージのアミノ酸残基かヌクレオチドが（例えば、比較枠又は指定領域において最大に対応するように比較、アラインされた場合、特定の範囲にわたり約70％が同一、好ましくは75%、80%、85%、90%、91%、93%、95%、97%、98%、99%、又はそれ以上)同一であることを指す。これらの配列は、この時「実質的に同一」であるといわれる。この定義はまた、テスト配列の相補体を表し、又は適用される。この定義はさらに削除及び/又は挿入、置換された配列、及び、例えば多型又は対立遺伝子の変異体など、天然の、あるいは合成の変異体を含んでいる。以下に記載されるように、望ましいアルゴリズムはギャップ等を考慮することができる。好ましくは、少なくとも25のアミノ酸又はヌクレオチドの長さの範囲が同一であり、またさらに好ましくは、約50〜100のアミノ酸又はヌクレオチドの長さの範囲が同一である。
【００２９】
配列比較において、通常1つの配列が、テスト配列を比較するされるための基準配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する際は、テスト及び基準配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分列座標を指定し、配列アルゴリズムの媒介変数を指定する。好ましくは、デフォルト媒介変数が使用でき、また、代替の媒介変数が指定される。配列比較アルゴリズムは本明細書中で、プログラムの媒介変数に基づいて、基準配列に対するテスト配列の同一配列の比率を計算する。
【００３０】
本明細書中で使用される「比較枠」とは、一般に約20〜600、通常約50〜約200、通常約100〜約150（の配列）を含む群から選択された、連続した部位の一部分についての言及を含み、そこで二つの配列が最適にアラインされた後、ある配列が連続した位置の同数の基準配列と比較される。比較のために配列をアラインする方法は、既知である。比較のための最適なアラインメントは以下の方法を用いて実行される：the local homology algorithm of Smith and Waterman （Smith及びWatermanの局所ホモロジーアルゴリズム）(1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489；the homology alignment algorithm of Needleman and Wunsch（Needleman及びWunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム） (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453；the search for similarity method of Pearson and Lipman （Pearson及びLipmanの類似性を探索する方法）(1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444-2448；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI、Wisconsin Genetics Software Package のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA）；又は、手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ausubel, et al. (eds. 1995 and supplements（補足）) Current Protocols in Molecular Biology （『分子生物学の最新プロトコル』）Wiley参照）。
【００３１】
配列の同一性及び配列の類似性の比率を測定するのに適したアルゴリズムの好ましい例は、Altschul, et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及びAltschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている、BLAST及びBLAST 2.0アルゴリズムを含む。BLAST及びBLAST 2.0は、本明細書中に記載された媒介変数を用い、本発明の核酸及びタンパク質配列の同一性の比率を測定するために使用される。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通し公に入手が可能である。このアルゴリズムは、データベースの配列の同じ長さのワードと並べた時に、正の数の閾値スコアTと適合する又はスコアTを満たす、長さWの短いワードを照会配列において同定することにより、まず高スコア配列ペア（HSPs）を同定することを含む。Tはneighborhood word score threshold（ネーバフッドワードスコア閾値）（Altschul, et al., supra）と呼ばれる。これらの初期ネーバーフッドワードのヒットは、それらを含むより長いHSPsを見つけるための検索を開始するもととなる。
【００３２】
ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加することができる限りは、各配列に沿って両方の方向に伸ばされる。累積スコアは例えばヌクレオチド配列、媒介変数M（適合残基対のリワードスコア；常に> 0) 及びN（不適合残基のペナルティースコア；常に< 0）を使って計算される。アミノ酸配列については、累積スコアの計算のためスコアリングマトリックスが使われる。各方向へのワードヒットの延長は次の場合に停止する：累積アラインメントスコアが最大達成値からX分量だけ減少したとき；1つ以上の負のスコアの残基アラインメントが集まったことにより、累積スコアが0又はそれ以下になったとき；又はどちらかの配列の最後に達した時。BLASTアルゴリズムの媒介変数W、T、及びXは、アラインメントの感度と速度を測定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワードの長さ（W）11、期待値（E）10、M=5、N=-4、及び両方のストランドの比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムはワードの長さ3、期待値（E）10、またBLOSUM62スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-919 参照）、アラインメント（B）50、M=5、N=-4、及び両方のストランドの比較をデフォルトとして使用する。
【００３３】
BLASTアルゴリズムはまた、二つの配列の類似性の統計的解析を行う。例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照。BLASTアルゴリズムにより提供される1つの類似性の測定法は、最小合計確率（P(N)）であり、これは二つのヌクレオチド又はアミノ酸の間に、偶然適合が起こる確率の表示を提供する。例えば、核酸は、被検核酸と基準核酸を比較した確率の最小合計が約0.2以下であり、より好ましくは約0.01以下であり、そして最も好ましくは約0.001以下である時、基準配列に類似していると見なされる。対数値は、例えば5、10、20、30、40、40、70、90、110、150、170などの負の大きな数となる。
【００３４】
二つの核酸配列が実質的に同一であることの兆候は、一番目の核酸によってコードされたポリペプチドが、二番目の核酸によってコードされたポリペプチドに対抗して産出された抗体と免疫学的に交差反応することである。従って、例えば二つのペプチドが同類置換によってのみ異なる場合、1つのポリペプチドは一般に二番目のポリペプチドと実質的に同一となる。二つの核酸配列が実質的に同一であることのもう1つの兆候は、二つの分子及びその相補体がストリンジェントな条件の下で互いにハイブリダイズすることである。さらに二つの核酸配列が実質的に同一であることのもう1つの兆候は、同じプライマが当該配列を増幅するのに使用できるということである。
【００３５】
「宿主細胞」とは発現ベクターを含み、発現ベクターの複製又は発現を支持する天然の細胞又は形質転換細胞である。宿主細胞は培養細胞、外植片、生体内細胞等であることもある。宿主細胞は、大腸菌（E. Coli）などの原核細胞や、酵母、昆虫、両生類などの真核細胞、又はCHO（チャイニーズハムスター卵巣由来の樹立細胞株）、HeLa（子宮頚部癌）細胞等の哺乳動物の細胞であることもある（例えば、American Type Culture Collectionカタログ又はウェブサイトwww.atcc.org参照）。
【００３６】
「単離された」「精製された」又は「生物学的に純粋な」という用語は、自然な状態で見られる様に、通常添加している成分が実質的、基本的に存在しない物質のことを指す。純度や均質性は、通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は高性能液体クロマトグラフィーなどの、分析化学技術を使用して測定される。組織標本中に存在する優勢種であるタンパク質又は核酸は実質的に精製される。特に、単離された核酸は、遺伝子に自然に隣接して、遺伝子によってコードされた蛋白質以外の蛋白質をコードする、いくつかのオープンリーディングフレームから分離される。いくつかの態様における「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中に基本的に1つのバンドを生じることを意味する。これは好ましくは、核酸又はタンパク質が少なくとも約85％純粋であり、より好ましくは少なくとも95％純粋であり、また最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。他の態様では「精製する」又は「精製」とは、精製されるべき組成物から少なくとも1つの汚染要因又は成分を取り除くことを意味する。この意味で精製とは、精製された化合物が均質になる、例えば100％純粋になることを要していない。
【００３７】
「ポリペプチド」「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書中ではほとんど同じ意味に使われ、アミノ酸残基のポリマーを意味している。これらの用語は、修飾された残基を含む天然のアミノ酸ポリマーや、天然ではないアミノ酸ポリマーだけではなく、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の合成化学的模倣であるアミノ酸ポリマーに当てはまる。
【００３８】
「アミノ酸」という用語は天然及び合成のアミノ酸に加え、天然のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を意味する。天然のアミノ酸とは、遺伝子情報によりコードされたアミノ酸であり、同様に例えばヒドリキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸及びO-ホスホセリンなどの、後に修飾されたアミノ酸である。アミノ酸類似体とは、例えば水素と結合するα炭素、カルボキシル基、アミノ基、及び、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのR基など、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物のことをいう。当該類似体は修飾R基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然のアミノ酸のいくつかの基本的化学構造を維持している。アミノ酸模倣体とは、通常のアミノ酸の化学構造とは異なる構造ではあるが、他のアミノ酸と同様に機能する化合物のことをいう。
【００３９】
本明細書中でアミノ酸は、通常知られている3文字表記あるいは、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission（IUPAC-IUB生化学命名委員会）により推奨されている1文字表記によって表される。同様にヌクレオチドも、通常認められている1文字記号によって表される。
【００４０】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関し、保存的に修飾された変異体とは、同一又は基本的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸のことを指し、また当該核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、例えば自然に隣接している、基本的に同一であるか関連のある配列のことを指す。遺伝子コードの縮重のため、ほとんどのタンパク質は多くの機能的に同一な核酸によりコードされている。例えば、コドンGCA、GCC、GCG及びGCUはどれもアミノ酸アラニンをコードしたものである。従って、あるコドンによりアラニンが特定されているそれぞれの位置において、当該コドンを、コードされたポリペプチドを変えることなく記載されている他の対応コドンと入れ替えることができる。このような核酸の変化は「サイレント（アミノ酸置換の生じない）変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中における核酸配列はどれも、核酸のサイレント変異を表す。特定の状況において、核酸中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるAUGと、通常トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く）を修飾し、機能的に類似した分子を作製することができる。従って、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関する記載された配列において潜在的なものであるが、実際のプローブ配列に関しては必ずしもそうではない。
【００４１】
アミノ酸配列に関して、当業者は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、あるいはコードされた配列中の単一核酸又は小さなパーセンテージの核酸を変化、追加、あるいは削除するタンパク質配列への、それぞれの置換、削除、追加は、「保存的に修飾された変異体」であり、当該変更によりあるアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸と置換される結果となることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を表示する、保守的置換の表は既知のものである。このような保存的に修飾された変異体は、多様型変異体、種間相同体、及び本発明の対立遺伝子と付加的なもので、これらを除外するものではない。通常保守的な置換は以下の組み合わせを含む：1）アラニン（A）、グリシン（G）；2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；4）アルギニン（R）、リジン（K）；5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；7）セリン（S）、トレオニン（T）；及び8）システイン（C）、メチオニン（M）（例えばCreighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties Freemanを参照）。
【００４２】
ポリペプチドの構造のような高分子の構造は、構成の様々なレベルに関して記載することができる。当構成の一般的な議論については、例えば、Alberts, et al. (eds. 2001) Molecular Biology of the Cell （『細胞の分子生物学』） (4th ed.) Garland；及び、Cantor and Schimmel (1980) Biophysical Chemistry Part I: The Conformation of Biological Macromolecules『生物物理学的化学パートI：生体高分子の構造』Freemanを参照。「１次構造」とはある特定のペプチドのアミノ酸配列をさす。「2次構造」とはポリペプチド内の局所順序化された３次元構造をさす。これらの構造は通常ドメインとして知られている。ドメインとはポリペプチドの一部分であり、しばしばポリペプチドの小型ユニットを形成し、通常25〜約500のアミノ酸の長さである。通常のドメインは、β-シートとα-へリックスのストレッチのような、より小さい構成部分でできている。「３次構造」とはポリペプチドモノマーの完全な３次元構造をさす。「４次構造」とは、通常個々の３次ユニットの非共有的つながりによって形成される３次元構造をさす。異方性の用語はエネルギー用語としても知られている。
【００４３】
「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」また本明細書中で文法的に同様に使われている用語は、共有結合した少なくとも２つ以上のヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは通常、約5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50又はそれ以上のヌクレオチドの長さから、約100のヌクレオチドの長さまである。核酸及びポリヌクレオチドは、例えば、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000など、より長いものを含む、任意の長さのポリマーである。本発明の核酸は通常リン酸ジエステル結合を含むが、場合によっては、例えばホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、又はO-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach Oxford Univ. Press（『オリゴヌクレオチドと類似体：実践的アプローチ』オックスフォード大学出版）参照）など、少なくとも1つの異なった結合を有する核酸類似体；及びペプチド核酸骨格と結合を含む。他の類似核酸は、米国特許番号5,235,033及び5,034,506及び、Sanghvi and Cook (eds. 1994) Carbohydrate Modifications in Antisense Research (『アンチセンスの研究における炭水化物修飾』) ACS Symposium Series 580、第6章及び7章に記載されたものを含め、非イオン骨格、非リボース骨格などの陽性骨格を有する類似体を含む。1つ以上の炭素環式糖質を含む核酸も核酸の定義の1つに含まれる。リボース・リン酸骨格の修飾は、例えば生理的環境における、又はバイオチップのプローブとしての当該分子の安定性及び半減期を増加するためなど、様々な理由で行われる。天然の核酸と類似体の混合物をつくることができる；一方、他の核酸類似体の混合物や天然の核酸と類似体の混合物、を作ることもできる。
【００４４】
例えば以下にあげるような、多くの参考文献が当該核酸類似体について開示している：ホスホルアミデート（Beaucage, et al. (1993) Tetrahedron（『四面体』） 49:1925-1963、及びその参考文献；Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800-3803；Sprinzl, et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579-589；Letsinger, et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:3487-499；Sawai, et al. (1984) Chem. Lett. 805；Letsinger, et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470-4471；及びPauwels, et al. (1986) Chemica Scripta 26:141-149）、ホスホロチオエート（Mag, et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437-441；及び米国特許番号5,644,048）、ホスホロジチオアート（Brill, et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321-2322）、O-メチルホスホロアミダイト結合（Eckstein (1992) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford Univ. Press（『オリゴヌクレオチドと類似体：実践的アプローチ』オックスフォード大学出版）参照）、及びペプチド核酸骨格と結合（以下参照：Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895-1897；Meier, et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008-1010；Nielsen (1993) Nature 365:566-568；Carlsson, et al. (1996) Nature 380:207、上記文献の全体を本明細書中に援用する）。
【００４５】
他の核酸類似体は、陽性の骨格を有する核酸類似体 を含む（Denpcy, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097-101；非イオン骨格（米国特許番号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141、及び4,469,863；Kiedrowski, et al. (1991) Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423-426；Letsinger, et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470-4471；Letsinger, et al. (1994) Nucleoside and Nucleotide 13:1597；Sanghvi and Cook (eds. 1994) Carbohydrate Modifications in Antisense Research ACS Symposium Series 580、第2章及び3章；Mesmaeker, et al. (1994) Bioorganic and Medicinal Chem. Lett. 4:395-398；Jeffs, et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17；Horn, et al. (1996) Tetrahedron Lett. 37:743) 、及び、米国特許番号5, 235,033及び5,034,506、またSanghvi and Cook (eds. 1994) Carbohydrate Modifications in Antisense Research （『アンチセンスの研究における炭水化物修飾』）ACS Symposium Series 580、第６章及び7章に記載されたものを含む、非リボース骨格。1つ以上の炭素環式糖質を含む核酸も核酸の定義の1つに含まれる（Jenkins, et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp 169-176参照）。いくつかの核酸類似体について、Rawls (35ページ、1997年、6月2日)C&E Newsに記載されている。
【００４６】
ペプチド核酸類似体を含むペプチド核酸（PNA）は特に好まれる。天然の核酸の、高度に荷電したリン酸ジエステル骨格とは対照的に、これらの骨格は中性条件下では実質的に非イオン性である。これにより少なくとも二つの利点がもたらされる。PNA骨格は改善されたハイブリダイゼーション力学を示す。PNAは、完全適合と比較した不適合の塩基対について、より大きな融解温度（Tm）の変化を表す。DNA及びRNAは、通常内部不適合に対し、2〜4℃のTmの降下を示すが、非イオンPNA骨格では、温度降下は7〜9℃付近となる。同様に、その非イオン特性により、これらの骨格に結合している塩基のハイブリダイゼーションは、塩濃度に関して比較的鈍感である。加えて、PNAは細胞の酵素によって分解されず、そのためより安定している。
【００４７】
明確に述べられるとおり、核酸は、1本鎖のことも2本鎖のこともあり、また１本鎖と2本鎖の配列が両方ある部分を含むこともある。一本鎖の描写はまた、相補的なストランドの配列を決定する；従って本明細書中に記載される配列は相補的配列をも提供するものである。核酸がデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせと、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む、塩基の組み合わせを含む場合、当該核酸は、ゲノムDNA及びcDNA（相補DNA）の両方のDNA、RNA、又はハイブリッドとなることができる。「転写」とは通常、例えばpre-mRNA （mRNA前駆体）、hnRNA（ヘテロ核RNA）、又はmRNA（メッセンジャーRNA）など、天然のRNAについて使われる。本明細書中で使用されている「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体、及びアミノ修飾ヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドを含む。加えて「ヌクレオシド」は、天然ではない類似体構造も含む。従って、それぞれが塩基を含むペプチド核酸の個々のユニットは、本明細書中ではヌクレオシドとみなされる。
【００４８】
「標識」又は「検出可能な部分（moiety）」とは、分光器、光化学、生化学、免疫化学、生理学、化学、又はその他の物理学的方法により検出しうる組成物のことである。通常標識は3つに分類される：a）放射性又は重同位体である、同位体標識；b）抗体、抗原、エピトープタグなどの、免疫標識；そしてc）有色又は蛍光色素。これらの標識は、癌の核酸、タンパク質、及び抗体内に組み込まれる。例えば当該標識は、直接的又は間接的に、検出可能なシグナルを作り出す能力があるべきである。検出可能な部分（moiety）は、3H, 14C, 32P, 35S, or 125Iなどの放射性同位体、電子密度の高い試薬、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、又はルシフェリンなどの、蛍光又は化学発光性化合物、あるいは酵素（例えばELISAで通常使用されているような）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンやタンパク質、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又はホースラディシュペルオキシダーゼなど検出可能にできるものである。抗体を標識と結合させる方法は既知である。例えば、Hunter, et al. (1962) Nature 144:945；David, et al. (1974) Biochemistry 13:1014-1021；Pain, et al. (1981) J. Immunol. Meth. 40:219-230；及びNygren (1982) J. Histochem. and Cytochem. 30:407-412参照。
【００４９】
「エフェクター」、「エフェクター部分（moiety）」又は「エフェクター成分」とは、リンカー又は化学的結合によって共有的に、あるいはイオン、又はファン・デル・ワールス力、静電気、あるいは水素結合により非共有的に抗体と結合した（又は連結した、又は結合した）分子のことである。「エフェクター」は、例えば放射性化合物、経口化合物、酵素又は基質、エピトープタグなどのタグ、毒素などを含む検出部分；起動可能な部分（moiety）；化学療法薬；リパーゼ；抗生物質；化学誘引部分、免疫変調成分（micA/B）、また例えば「硬」ベータ線を放射する放射性同位体など、多様な分子であり得る。
【００５０】
「標識核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」とは、例えば、リンカー又は化学的結合によって共有的に、あるいはイオン、ファン・デル・ワールス力、静電気、あるいは水素結合により非共有的に標識と結合したもので、当該プローブに結合した標識の存在を検出することによって、プローブの存在が検出される。あるいは親和性の高い相互作用を使用した方法によっても、結合パートナーの1つのペアが、他のパートナー、例えばビオチン、ストレプトアビジンなどと結合する、同様の結果を得ることができる。
【００５１】
本明細書中で使われている「核酸プローブ又はオリゴヌクレオチド」とは、通常、例えば水素結合の形成による相補的塩基対を介した1つ以上のタイプの化学的結合によって、相補的配列のターゲット核酸と結合することのできる核酸のことである。本明細書中で使用されるように、プローブは自然塩基（例えばA、G、C又はT）又は修飾塩基（7-デアザグアノシン、イノシンなど）を含む。加えてプローブの当該塩基は、リン酸ジエステル結合以外のつながり、好ましくは機能的にハイブリダイゼーションを干渉しない方法で結合される。従って、例えばプローブは、構成塩基がリン酸ジエステル結合ではなく、ペプチド結合によって結合されている、ペプチド核酸であることもある。プローブは、完全な相補性を欠いたターゲット配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に依存しているプローブ配列を結合する。プローブは好ましくは、例えば同位元素、発色団、発光原子団（luminophores）、色素体などによって直接的に、あるいは、例えば、後にストレプトアビジン錯体がそれと結合する、ビオチンによって間接的に標識がつけられる。当該プローブの存在の有無を分析することにより、選択された配列又は部分列の存在の有無を検出することができる。診断及び予後は、ゲノムレベル、又はRNAレベル、あるいはタンパク質発現のレベルに基づく。
【００５２】
「組み換え」という用語は、例えば細胞、核酸、タンパク質、又はベクターに関して使われる時、異種の核酸、タンパク質、又は自然の核酸あるいはタンパク質を変更したものを取り入れることにより、当該細胞、核酸、タンパク質又はベクターが修飾されたこと、あるいは当該細胞が修飾された細胞から得られたものであることを表す。従って、例えば組み換え細胞は、当該細胞の未変性の（組み換えのない）形態では見られない遺伝子を発現したり、あるいは本来異常な発現をする、又は過小発現する、あるいはまったく発現しない、未変性の遺伝子を発現する。本明細書中で使われている「組み換え核酸」という用語は、もともと、通常は、例えばポリメラーゼやエンドヌクレアーゼを使用して、普通では自然には見られない形態で核酸を操作することにより、体外で形成された核酸のことを意味している。このようにして異なった配列の操作的な結合が可能となる。従って、線状形態の分離核酸、又は通常は結合しないDNA分子を体外でつなぎ合わせることにより形成されたベクターの発現は、両方とも本願発明の目的のための組み換えであると考えられる。ひとたび組み換え遺伝子が作られ宿主細胞又は生体に再導入されると、遺伝子は、例えば、体外操作よりも宿主細胞内の細胞機構を使用して、組み換えを起こさずに複製することが知られている。しかしながら、当該核酸は、ひとたび組み換えが行われると、後に組み換えなしで複製されたとしても、やはり本発明の目的のため、組み換えられたものとみなされる。
【００５３】
同様に、「組み換えタンパク質」とは、例えば、上記に描写された組み換え核酸の発現による組み換え技術を使用して作られたタンパク質のことである。組み換えタンパク質は、少なくとも1つ以上の特性により、天然のタンパク質から区別される。当該タンパク質は、通常その野生型の宿主に結びついているタンパク質の一部あるいはほとんどの部分及び化合物から分離又は精製され、従って実質的に純粋である。単離されたタンパク質は、その未変性の状態と通常関連している与えられたサンプル中のタンパク質の、好ましくは少なくとも約0.5重量％、より好ましくは少なくとも約5重量％を構成する、少なくともいくつかの物質を伴わない。実質的に純粋なタンパク質は総合タンパク質の少なくとも約75重量％、好ましくは少なくとも約80％、また特に好ましくは少なくとも約90％からなる。この定義は異なる生物又は宿主細胞中の1つの生物からの癌タンパク質の産生を含む。あるいは、当該タンパク質は、増加された濃度レベルのタンパク質を作るために誘導プロモーター又は高発現プロモーターを使用することにより、通常見られるよりも著しく高い濃度で産生される。あるいはまたタンパク質は、エピトープタグの追加や、下記に説明されるアミノ酸の置換、挿入及び削除などにより、通常自然には見られない形態である可能性もある。
【００５４】
「異種」という用語は、核酸の一部に関連して使用されるとき、通常自然には互いに同じ関係で発見されない二つ以上の部分列を含む核酸を示す。例えば核酸は通常、例えば1つの源からのプロモーターと他の源からのコーディング部分など、関係のない遺伝子をアレンジして新機能性核酸を作る二つ以上の配列を有し、組み換えをしながら産生される。同様に、異種タンパク質とは、しばしば自然には互いに同じ関係で発見されない（例えば融合タンパク質）二つ以上の部分列をさす。
【００５５】
「プロモーター」とは通常、核酸の転写を導く核酸制御列の配列のことである。本明細書中に使用されるとき、プロモーターは、ポリメラーゼIIタイプのプロモーターの場合のTATAエレメントなど、転写の開始部位近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、状況に応じ、転写の開始部位から数千塩基ペアほど離れて位置する可能性のある、遠位エンハンサー又は抑制エレメントを含む。「構成」プロモーターとは、ほとんどの環境及び発達条件の下で活性である。「誘導」プロモーターとは、環境又は発達調節の下で活性なプロモーターのことである。「操作的につながる」という用語は、核酸発現制御配列（プロモーター又は転写因子結合部位など）と、例えば発現制御列が二番目の配列に対応する核酸の転写を導く、二番目の核酸配列の間の機能的結合をさす。
【００５６】
「発現ベクター」とは、宿主細胞の特別な核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸成分により、組み換えをもってまた合成的に作製される核酸構築物のことである。発現ベクターは、プラスミド、ウィルス又は核酸断片の一部である可能性がある。通常、発現ベクターは、プロモーターとの操作的結合において転写される核酸を含む。
【００５７】
「選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする」という言い回しは、その配列が複雑な混合物中（例えば総合細胞又は収集DNA又はRNA）に存在する時の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下における特定のヌクレオチド配列への分子の選択的な結合、重複又はハイブリダイズ をさす。
【００５８】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という言い回しは、プローブが通常核酸の複合混合物中でそのターゲット部分列とハイブリダイズし、他のどの配列ともハイブリダイズしない状態のことをいう。ストリンジェントな条件とは配列依存であり、異なった環境の下では異なるものである。長い配列は特に高い温度でハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲にわたる手引きは、Tijssen (1993) Hybridization with Nucleic Probes (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) （『核プローブとのハイブリダイゼーション（生化学と分子生物学の実験技術）』）(vol. 24) Elsevierの、"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" （「ハイブリダイゼーションの原則の概要と核酸分析の方針」）に見られる。
【００５９】
通常、ストリンジェントな条件は、確定されたイオン強度ｐHにおける特定の配列の融解温度(Tm)よりも約5〜10℃低くなるように選択されている。Tmは、ターゲットに相補的なプローブの50％が平衡状態（ターゲット配列はTmにおいて過度に存在し、プローブの50％が平衡状態で塞がっている）でターゲット配列とハイブリダイズする温度（確定されたイオン強度、ｐH、及び核濃度の下における）である。ストリンジェントな条件とは、塩濃度がナトリウムイオン約1.0M以下、通常はｐH7.0〜8.3で、ナトリウムイオン濃度（あるいは他の塩）約0.01〜1.0M、また短いプローブ（例えばヌクレオチド約10〜50）の温度は少なくとも約30℃で、長いプローブ（例えばヌクレオチド約50以上）の温度は少なくとも約60℃であるような条件である。
【００６０】
ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化物質の添加によって達成されることもある。選択的又は特定のハイブリダイゼーションについて、肯定シグナルは通常少なくともバックグラウンドの2倍、好ましくはバックグラウンドの10倍のハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例示は以下の通り：65℃で0.2x SSCと0.1% SDSにより洗浄し、ホルムアミド50％、5xSSC、1% SDS（ドデシル硫酸ナトリウム水溶液）、42℃で培養、又は5xSSC、1% SDS、65℃で培養。PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）については、ストリンジェンシーの低い増幅には温度は約36℃が一般的であるが、アニーリングの温度はプライマの長さにより、約32〜48℃の間でさまざまである。ストリンジェンシーの高いPCR増幅では温度は約62℃が一般的であるが、ストリンジェンシーの高いアニーリング温度は、プライマの長さ及び選択性に基づき、約50〜65℃の範囲となる。ストリンジェンシーの高い増幅と低い増幅の両方についての通常のサイクル条件は、90〜95℃で30〜120秒間の変性段階、30〜120秒続くアニーリング段階、及び約72℃で1〜2分の延長段階を含む。ストリンジェンシーの低い又は高い増幅反応についてのプロトコル及び指針は、例えばInnis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, （『PCRプロトコル：方法及び適用のガイド』）Academic Press, NYに提供されている。
【００６１】
ストリンジェントな条件の下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、まだ実質的に同一である。これは、例えば核酸のコピーが遺伝子コードにより許容された最大限のコドンの縮重を使用して作製されたときに起こる。このような時、当該核酸は通常、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下でハイブリダイズする。典型的なな「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、37℃で、40％ホルムアミドのバッファー、1 M NaCl、1% SDS中でのハイブリダイゼーションと、45℃で1X SSCでの洗浄を含む。肯定的ハイブリダイゼーションは、通常最低バックグラウンドの2倍である。選択的なハイブリダイゼーションと洗浄の条件を使用し、同様のストリンジェンシー条件を提供することができる。ハイブリダイゼーションの媒介変数を決定するための追加的なガイドラインが、例えばAusubel, et al. (eds. 1991 and supplements) Current Protocols in Molecular Biology （『分子生物学の最新プロトコル』）Wileyなど、多数の参考文献により提供されている。
【００６２】
癌タンパク質の活性を調節する化合物をテストするアッセイの状況における「機能的な効果」という言い回しは、間接的又は直接的に、例えば生理学的、機能的、物理的、又は癌を減少させる能力などの化学的効果等の、癌タンパク質又は核酸の影響下にある媒介変数の決定を含む。媒介変数は、リガンド結合活性；細胞の生存；軟寒天上での細胞の増殖；足場依存性；接触阻止及び増殖の密度制限；細胞増殖；細胞形質転換；増殖因子又は血清依存性；腫瘍特異性マーカーレベル；マトリゲルへの侵襲性；体内での腫瘍の増殖及び転移；転移細胞のmRNAとタンパク質発現；及び癌タンパク質のその他の特性を含む。「機能的効果」はインビトロ、インビボ、及びエクスビボの活性を含む。
【００６３】
「機能的効果の測定」は、例えば生理学的、機能的、酵素の、物理的、又は化学的効果などが、間接的又は直接的に、癌タンパク質の効果下にある媒介変数を増減させる化合物についてアッセイすることを意味する。次のような機能的効果は：例えば、分光学的性質（例えば蛍光性、吸収度、屈折率）、流体力学（例えば形状）、タンパク質のクロマトグラフ又は溶解特性、誘導マーカーの測定又は癌タンパク質の転写の起動、結合活性の測定又は結合アッセイ、例えば抗体や他のリガンドとの結合、増殖の測定、細胞の増殖、細胞の生存、細胞形質転換、増殖因子又は血清依存性、腫瘍特異性マーカーレベル、マトリゲルへの侵襲性、インビボでの腫瘍の増殖及び転移、mRNAとタンパク質の発現、及びその他の癌細胞の性質の変化を測定することができる。機能的効果は多くの方法：例えば、顕微鏡による形態的特長の変化の量的又は質的測定、癌に関連する配列のRNA又はタンパク質レベルの変化の測定、RNAの安定性の測定、例えば、化学発光物、蛍光物質、比色アッセイ反応、抗体結合、誘導マーカー、及びリガンド結合アッセイなどによる、ダウンストリーム又はリポーター遺伝子発現の同定（CAT、ルシフェラーゼ、β-ガル、GFPその他）によって評価される。
【００６４】
癌のポリヌクレオチドとポリペプチド配列の「インヒビター」、「アクチベーター」及び「モジュレータ」とは、癌のポリヌクレオチドとポリペプチド配列のインビボ及びエクスビボ・アッセイを使用して、同定された分子や化合物を活性化、抑制、又は調節することをさす。抑制因子とは、例えば抑制因子などの、例えば結合することにより部分的又は完全に活性を妨害し、活性化を減少、防止、遅延し、癌タンパク質の活性又は発現を不活性化、鈍感化又は下方制御する化合物である。アンチセンス又は抑制核酸は、タンパク質の発現と後に続く機能を抑制するように見える。「アクチベーター」とは、活性化を増加、開放、始動、促進、強化し、癌タンパク質の活性を敏感にし、作動させ、又は上方制御する化合物である。インヒビター、アクチベーター又はモジュレータは、天然又は合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、化学小分子やその他同種のものに加え、例えば活性が変化された異形などの癌タンパク質の遺伝的に修飾された異形をも含む。インヒビターとアクチベーターの当該アッセイは、例えばインビトロ、細胞又は細胞膜における癌タンパク質の発現、推定モジュレータ化合物の適用、また上述のような活性に対する機能的効果の測定を含む。癌のアクチベーター及びインヒビターはさらに、癌細胞をテスト化合物と培養し、表1-80に明記されている配列によってコードされた癌タンパク質などの、1つ以上の癌タンパク質、例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50又はそれ以上の癌タンパク質の発現の増減を測定することにより、同定される。
【００６５】
潜在的アクチベーター、インヒビター、又はモジュレータにより処理された癌タンパク質を含むサンプル又はアッセイを、インヒビター、アクチベーター、モジュレータのない対照サンプル群と比較し、抑制の範囲を検査する。対照サンプル群（インヒビターで処理されていない）には相対的タンパク質活性値100％が与えられる。対照群に対する活性値が80％、好ましくは50％、より好ましくは25〜0％の時に、ポリペプチドの抑制が起こる。癌のポリペプチドの活性は、対照群（アクチベーターにより処理されていない）に対し、活性値が、約110％、より好ましくは150％、さらに好ましくは200〜500％（例えば、対照群に対し2〜5倍高い）、またさらに好ましくは1000〜3000％高い時におこる。
【００６６】
「細胞増殖の変化」という言いまわしは、細胞の生存、病巣形成、足場非依存性、半固体又は軟寒天増殖、増殖の接触抑制及び密度制限の変化、増殖要因又は血清要望の喪失、細胞形態の変化、不死化の獲得又は喪失、腫瘍特異的マーカーの獲得又は喪失、適切な動物宿主に注入された際に腫瘍を形成又は抑制する能力、及び/又は、細胞の不死化などの、インビトロ又は体内における細胞の増殖及び増殖特性のあらゆる変化をさす。例えば、Freshney (1994) Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique （『動物細胞の培養、基本技術の手引き』）(2d ed.) Wiley-Liss、231-241ページ参照
「腫瘍細胞」とは、腫瘍中の前癌細胞、癌細胞及び正常細胞をさす。
【００６７】
組織培養中の「癌細胞」、「形質転換した」細胞又は「形質転換」とは、必ずしも新しい遺伝物質の取り込みを伴わない自発的又は誘発的な表現型の変化をさす。形質転換は、ウィルスの形質転換及び新しいゲノムDNAの取り込み又は外因性DNAの取り込みを伴う感染症から発生することもあるが、自発的に又は発癌性物質へ接触の後に、内在性遺伝子を突然変異させることにより発生することもある。形質転換は、細胞の不死化、異常増殖の制御、非形態的変化、及び/又は悪性度などの表現型の変化を伴う。Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique （『動物細胞の培養：基本技術の手引き』）(4th ed.) Wiley-Liss参照。 
「抗体」とは、特に抗原を認識しそれと結合する、免疫グロブリン遺伝子の構成部分又はその断片を含んだポリペプチドをさす。認識された免疫グロブリン遺伝子は、可変領域の無数の免疫グロブリン遺伝子に加え、定常領域のκ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ遺伝子を含む。軽鎖はκ又はλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、又はεに分類され、順に免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEを定義する。通常、抗体の抗原との結合領域又は機能的にそれと同等な領域は、結合の選択性及び親和性において最も重要である。Paul (ed. 1999) Fundamental Immunology （『基本免疫学』） (4th ed.) Raven参照。
【００６８】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造ユニットは四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の二つの同一ペアからなり、それぞれのペアは「軽」鎖（約25kD）と「重」鎖（約50〜70 kD）を有している。各鎖のN末端は、約100〜110以上の、主に抗原認識を担う、アミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（VL）及び可変重鎖（VH）という用語は、それぞれ順に軽鎖又は重鎖をさす。
【００６９】
抗体は、例えば完全な免疫グロブリンとして、又は様々なペプチターゼによる消化によって産生された多くの特徴ある断片として存在する。従って例えば、ペプシンはヒンジ領域のジスルフィド結合の下で、それ自身がジスルフィド結合によりVH-CH1に連結する軽鎖である、Fabの二量体であるF(ab)'2を産生するため、抗体を吸収する。F(ab)'2は、ヒンジ領域のジスルフィド結合を壊すために穏やかな条件下で分解され、F(ab)'2二量体がFab'単量体に変換される。Fab'単量体とは、基本的にはヒンジ領域部分を有するFabのことである（Paul (ed. 1999) Fundamental Immunology （『基本免疫学』） (4th ed.) Raven参照）。様々な抗体の断片を完全な抗体の消化に関して定義する場合、当業者は、これらの断片が化学的に、又は組み換えDNAの方法論によりデノボ合成されたものであることを認識するであろう。従って本明細書中で使われている抗体という用語は、抗体全体の修飾により産生された、又は、組み換えDNA方法論を使用してデノボ合成された（例えば単鎖Fv）、あるいはファージディスプレイ・ライブラリを使用して同定された（例えばMcCafferty, et al. (1990) Nature （『ネイチャー』）348:552-554参照）抗体断片を含んでいる。
【００７０】
例えば組み換え、モノクローナル、又はポリクローナル抗体などの抗体を準備する多くの技術が知られている。例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497；Kozbor, et al. (1983) Immunology Today （『今日の免疫学』）4:72；Cole, et al. (1985) pp. 77-96 in Reisfeld and Sell (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy （『モノクローナル抗体と癌の治療』）Liss；Coligan (1991) Current Protocols in Immunology （『免疫学の最新プロトコル』）Lippincott；Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual （『抗体：実験の手引き』）CSH Press；及びGoding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice （『モノクローナル抗体：理論と実践』）(2d ed.) Academic Press参照。単鎖抗体の製造技術（米国特許4,946,778）を、本願発明のポリペプチドへの抗体の作製に適合させることができる。遺伝子導入マウスや、他の哺乳動物などの他の生物を使用してヒト化抗体を発現することもできる。一方、ファージディスプレイ技術を使用して、抗体、及び特に選択された抗原と結合するヘテロメリックFab断片を同定することができる。例えば、McCafferty, et al. (1990) Nature （『ネイチャー』）348:552-554；Marks, et al. (1992) Biotechnology （『バイオテクノロジー』）10:779-783参照。
【００７１】
「キメラ抗体」とは以下のような抗体分子のことである：（a）定常領域、又はその一部分は、抗原との結合部分（可変領域）が異なった、又は変更された分類の定常領域、及び/又は種、あるいは、例えば酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物、エフェクター機能、化学誘引物質、免疫変調成分など、キメラ抗体に新しい特性を与えるまったく異なった分子と連結するように、変更、置換、交換されている；又は（b）可変領域、又はその一部分が変更、置換、又は異なったあるいは変更された抗原特性を有する可変領域と交換されている。
【００７２】
癌関連配列の同定
1つの形態において、遺伝子の発現レベルが診断情報を必要としている別々の患者のサンプル中で測定され、発現プロフィールが提供される。特定のサンプルの発現プロフィールは、基本的にそのサンプルの状態の「指紋」である；二つの状態がある特定の遺伝子の類似した発現を有していても、多数の遺伝子を評価することにより、同時に細胞の状態の特性である遺伝子発現プロフィールの作製が可能となる。すなわち、正常な細胞を癌又は転移癌の細胞から見分けることができ、あるいは、癌組織又は転移癌組織を癌の生存患者の組織と比較することができる。既知の様々な癌の状態における組織の発現プロフィールを比較することにより、これらの状態のそれぞれについて、どの遺伝子が重要であるか（アップ及びダウンレギュレーション遺伝子の両方を含む）に関する情報が得られる。分子プロフィーリングにより、例えば癌の異なった形態など、現在集合的に指定されている疾病のサブタイプが識別される可能性がある。
【００７３】
癌組織対非癌組織中で異なって発現された配列の同定は、それによって得られた情報を、多くの方法で使用することを可能にする。例えば、特定の患者における化学療法薬の下方制御の癌への作用、及び結果としての腫瘍の増殖又は再発について、特定の治療計画が評価される。一方、ある治療ステップが、腫瘍細胞を破壊するターゲットとして使用される他のマーカーを誘発することもある。同様に、患者のサンプルを既知の発現プロフィールと比較することにより、診断や治療の結果を確認することができる。悪性の疾病を悪性でない状態と比較することもできる。例えば遠隔の原発部位からの転移など、転移組織をアッセイして組織中の癌の段階、又は原発性腫瘍の起源を測定することもできる。さらに、これらの遺伝子発現プロフィール（又は個々の遺伝子）は、特定の発現プロフィールを模倣又は変更する目的での候補物質のスクリーニングを可能にする；例えば癌の発現プロフィールを抑制する薬剤のスクリーニングを行うことができる。これは、これらのスクリーンで使用される、重要な癌遺伝子のセットを含むバイオチップを作ることによってなされる。これらの方法はタンパク質ベースでも達成することができる；すなわち、癌タンパク質のタンパク質発現レベルを、診断のため又は候補物質のスクリーンのために評価することができる。加えて、アンチセンス核酸の投与、又は癌タンパク質（抗体及びその他のモジュレータ）の治療薬としての投与を含み、癌の核酸配列を遺伝子治療の目的で投与することができる。
【００７４】
したがって本発明は、正常組織及び/又は悪性でない疾病に対する癌、又は本明細書中で「癌配列」といわれる他のタイプの関連疾病において、異なった発現をする核酸及びタンパク質の配列を提供する。以下に要約されるように、癌配列は、下方制御された（例えば低レベルで発現された）配列に加え、癌の上方制御された（例えば高レベルで発現された）配列を含む。好ましい態様では、当該癌配列はヒトのものである；しかしながら、動物モデルの疾病及び薬剤評価においては、他の生物からの癌配列が有用となる；そこで、哺乳動物、げっ歯類（ラット、マウス、ハムスター、モルモットなど）、霊長類、家畜（ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどを含む）、及びペット（例えばイヌ、ネコなど）を含む脊椎動物から他の癌配列が提供される。他の生体からの癌配列は下記に概説した方法で得られる。
【００７５】
癌配列は核酸及びアミノ酸の両方の配列を含む。好ましい態様において、皮膚癌の配列は組み換え核酸である。これらの核酸配列は、スクリーニングへの適用に加え、天然の核酸を検出する診断への適用を含む様々な用途；例えば、核酸プローブ、又は癌配列に対する選択されたプローブを備えたPCRマイクロタイタープレートを含むバイオチップで有用である。
【００７６】
癌配列は、本明細書中に要約されている癌配列と相同の、実質的な核酸及び/又はアミノ酸配列によって最初に同定されることができる。このような相同性は、総体的な核酸又はアミノ酸配列に基づいており、以下に要約されるように、例えば相同プログラム又はハイブリダイゼーション条件を使用して、一般に測定される。
【００７７】
癌に関連した配列の同定について、癌のスクリーンは、例えば、正常組織と癌組織、癌と悪性ではない状態、悪性でない状態の組織と正常な組織、又は転移性疾患を有する患者からの腫瘍組織サンプルに対する非転移性の組織、通常異なった組織中で同定された遺伝子の比較を含む。他の適切な組織の比較は、癌のサンプルと、肺、胃、胃腸癌などの他の癌の転移癌サンプルとの比較を含む。例えば生存者の組織、薬剤耐性状態及び転移を経験している組織など癌の異なった段階のサンプルが、核酸プローブを含むバイオチップに適用される。サンプルは適切であればまず顕微解剖され、mRNAの準備のため処理される。適切なバイオチップは、例えばカリフォルニア州サンタクララのAffymetrixなどにより市販されている。本明細書中に記載されている遺伝子発現プロフィールが作製され、データがアッセイされる。
【００７８】
1の態様において、正常な状態と疾病状態で異なった発現を示す遺伝子が、肺、心臓、脳、肝臓、胃、腎臓、筋肉、結腸、小腸、大腸、膵臓、骨、及び/又は胎盤などを含み、またそれらに限られない、他の正常な組織に発現した遺伝子と比較される。好ましい態様において、癌のスクリーンで同定された、他の組織（例えば重要臓器）にかなりの量で発現している遺伝子がプロフィールから削除されるが、他の態様によってはこれは必要ではない（例えば、ここで女性又は男性に特有の臓器は重要ではない）。すなわち、薬剤のスクリーニングをする場合、他の臓器に発現する可能性のある副作用を最小限に抑えるため、ターゲット発現は疾病特異性であることが通常望まれる。
【００７９】
好ましい態様において、癌の配列は癌の上方制御された配列である；すなわち、これらの遺伝子の発現は、癌でない組織又は悪性でない組織に比べて癌組織中においてより高い。本明細書中でしばしば使われる「アップレギュレーション」とは、少なくとも2倍の変化を意味し、好ましくは約3倍の変化、また少なくとも約5倍かそれ以上が望まれる。他の態様は、正常な状態に対し、悪性でない状態で上方制御された配列を示す。該当サンプル群が均一であることも望まれる。
【００８０】
本明細書中のUnigeneクラスタ同定番号及び登録番号は、GenBank配列データベース用のものであり、この登録番号の配列を明確に本明細書中に援用する。GenBankが利用可能である、例えばBenson, et al. (1998) Nuc. Acids Res. 26:1-7；及びhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/を参照のこと。配列はまた、例えばヨーロッパ分子生物学研究所（EMBL）また日本DNAデータバンク（DDBJ）などの、他のデータベースからも入手することができる。ある状況では、配列は利用可能な配列の集合から得られ、又はFGENESHなどのエクソン予測アルゴリズムを使ってゲノムDNAから予測される。Salamov and Solovyev (2000) Genome Res. 10:516-522参照。他の状況では、配列は単離された核酸のクローニング及び配列測定により得られる。
【００８１】
他の好ましい態様では、癌の配列は癌において下方制御されている；すなわちこれらの遺伝子の発現は、癌ではない組織と比べ癌組織中でより低い。本明細書中でしばしば使われる「ダウンレギュレーション」とは、少なくとも約2倍の変化を意味し、好ましくは約3倍の変化、また少なくとも約5倍かそれ以上が望まれる。
【００８２】
情報科学
癌の中で過剰発現又は過小発現している遺伝子を同定する能力により、診断学、治療学、薬剤開発、薬理遺伝学、タンパク質構造、バイオセンサー開発、及びその他の関連分野で使用できる高分解能、高感度のデータベースをさらに提供することができる。例えば、発現プロフィールは、癌又は関連した疾病を持つ患者の診断又は予後評価に使用することができる。表1及び3を参照。あるいは他の例として、細胞内の毒物学的情報が、薬剤の構成と活性の相関関係をより直接的にもたらしている（カリフォルニア州コロナド、IBCプロテオミクス会議で発表された論文、Anderson (June 11-12, 1998) Pharmaceutical Proteomics: Targets, Mechanism, and Function,（『薬学的プロテオミクス：ターゲット、メカニズム、及び機能』）参照）。化学物質暴露の毒物学的効果の可能性や、許容可能でありそうな暴露の閾値（米国特許番号5,811,231参照）を予想するため、生物学的センサー装置内で細胞内の毒物学的情報を使用することもできる。また他の生体分子及び生物活性薬剤（例えば核酸、糖類、脂質、薬剤、及びその他同種類のもの）に関連するデータセットから、同様の利点が得られる。
【００８３】
従って、他の態様では、本発明は少なくとも1セットのアッセイデータを含むデータベースを提供する。データベースに含まれているデータは、例えば配列アッセイを単独で又はライブラリフォーマットで使用することにより入手された。データベースは、データが維持、伝達できる形式であれば良いが、電子データベースであることが望まれる。本発明の電子データベースは、パーソナルコンピュータのような、データベース保存やデータベースへのアクセスが可能である、いかなる電子装置によっても維持できるが、好ましくはワールド・ワイド・ウェブなどの広域ネットワークによって配信される。
【００８４】
ペプチド配列データを含む、データベースの現部分の焦点は例証の明確化のみを目的としている。本発明のアッセイを使用して得られたアッセイデータの、同様のデータベースを構築することができる。
【００８５】
例えば本明細書中に記載される癌に関連する配列の同定など、癌を示す生物学的サンプルから多様な分子種及び高分子種の相対的及び/又は絶対的な存在を同定及び/又は測量するための組成物と方法は、病理学的状態との相関、病気の素因、薬剤テスト、治療のモニタリング、遺伝子病の原因となる結合、また中でも免疫性及び生理学的状態と相関するものの同定など、豊富な情報を提供する。本発明のアッセイから得られたデータは、マニュアル検査及び手アッセイに適応はするが、好ましい態様においては、高速のコンピュータを使用したデータプロセッシングが使用されている。
【００８６】
生体分子の情報に索引をつけ、検索する一連の方法を利用することができる。例えば米国特許第6,023,659号及び同第5,966,712号は、1つ以上のタンパク質の機能階層に基づいて配列の目録を作り検索することができるように、生体分子配列の情報を保存する相関的データベースシステムを開示している。米国特許第5,953,727号は、不完全長の配列の集合から完全長の配列を得るための1つ以上の配列計画との関連に基づいた、不完全長のDNA配列の集合の目録を作り、検索できるようにしたフォーマットで、情報を含んだ配列記録の相関的データベースを開示している。米国特許第5,706,498号は、主要配列とターゲット配列の間の類似性の程度に基づいた、遺伝子データベースの配列データ項目と類似している遺伝子配列を検索する、遺伝子データベース検索システムを開示している。米国特許第5,538,897号は、近似適合法を使って予測された質量スペクトルと実験的に得られた質量スペクトルを比較することによって、コンピュータデータベースのアミノ酸配列を同定するための、ペプチドの質量スペクトルの断片パターンを使った方法を開示している。米国特許第5,926,818号は、オンラインアッセイ処理（OLAP）として記載される多次元データアッセイの機能性を含み、1つ以上の合併方法又は規模に基づいた予測データと実際のデータの合併を伴う、多次元のデータベースを開示している。米国特許第5,295,261号は、各データベースの記録領域が、ナビゲーションデータと情報データの二つのクラスに分けられている、ハイブリッドデータベース構造を公表しており、ここでナビゲーション領域は、ツリー構造又は二つ以上のツリー構造の合併として見ることのできる、階層的位相マップに保存されている。
【００８７】
さらに、以下の：Baxevanis, et al. (2001) Bioinformatics: A Practical Guuide to the Analysis of Genes and Proteins （『生物情報学：遺伝子及びタンパク質アッセイの解説書』）Wiley；Mount (2001) Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis （『生物情報学：配列とゲノムのアッセイ』）CSH Press, NY；Durbin, et al. (eds. 1999) Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids （『生物学的配列アッセイ：タンパク質と核酸の確率的モデル』）Cambridge University Press（ケンブリッジ大学出版）；Baxevanis and Oeullette (eds. 1998) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins （『生物情報学：遺伝子及びタンパク質アッセイの解説書』）(2d. ed.) Wiley-Liss；
【００８８】
Rashidi and Buehler (1999) Bioinformatics: Basic Applications in Biological Science and Medicine （『生物情報学：生物科学及び医学における基本的適用』）CRC Press；Setubal, et al. (eds. 1997) Introduction to Computational Molecular Biology （『コンピュータを利用した分子生物学入門』）Brooks/Cole；Misener and Krawetz (eds. 2000) Bioinformatics: Methods and Protocols （『生物情報学：方法及びプロトコル』）Humana Press；Higgins and Taylor (eds. 2000) Bioinformatics: Sequence, Structure, and Databanks: A Practical Approach （『生物情報学：配列、構造、及びデータバンク：実践的アプローチ』）Oxford University Press（オックスフォード大学出版）；Brown (2001) Bioinformatics: A Biologist's Guide to Biocomputing and the Internet （『生物情報学：生物学者のためのバイオコンピューティングとインターネットの手引き』）Eaton Pub.；Han and Kamber (2000) Data Mining: Concepts and Techniques （『データマイニング：概念と技術』）Kaufmann Pub.；及びWaterman (1995) Introduction to Computational Biology: Maps, Sequences, and Genomes （『コンピュータを利用した分子生物学入門：マップ、配列及びゲノム』）Chap and Hallを参照のこと。
【００８９】
本発明は、例えば、そこからそれぞれの配列特異性記録が得られるターゲットを含むサンプルを特定するデータなどの、クロス集計されたアッセイデータ記録をコンピュータ検索の可能な形態で保存するコンピュータ及びソフトウェアを含む、コンピュータデータベースを提供する。
【００９０】
典型的な態様において、少なくとも1つのターゲットを含んだサンプルは、病理学的疾患がないことがわかっている対照組織サンプルからのものである。あるバリエーションでは、少なくとも1つの源が、例えば腫瘍性病変又は癌であるとアッセイされた他の組織標本などの、既知の病理学的組織標本である。他のバリエーションでは、アッセイ記録は、サンプル中の各ターゲット種の以下のパラメータ：（1）独自の同定コード、例えばターゲット分子構造及び/又は特性分離座標（例えば電気泳動座標）を含む；（2）サンプル源；及び（3）サンプル中のターゲット種の絶対量及び/又は相対量の1つ以上をクロス集計する。
【００９１】
本発明はまた、磁気ディスク、光ディスク、光磁気ディスク、DRAM、SRAM、SGRAM、 SDRAM、RDRAM、DDR RAM、磁気バブル記憶装置、及びCPUレジスタ、CPU上データ保存配列を含むその他のデータ保存装置を含む、コンピュータデータ保存装置中に集積されたターゲットデータの保存及び検索を提供する。通常、ターゲットデータ記録は、磁化できる媒体上の磁気ドメイン配列にビットパターンとして、又はDRAM装置の細胞の配列など（例えば、各細胞は、トランジスタ上にあるトランジスタ又は荷電保存領域を含む）の、荷電状態又はトランジスタゲート状態の配列として保存される。1つの態様において、本発明はこのような保存装置及びそこに作られた、ターゲット源にクロス集計された少なくとも10のターゲットデータ記録の独自の識別子を含んだ、タンパク質発現フィンガープリント記録をコードするビットパターンを含むコンピュータシステムを提供する。
【００９２】
ターゲットがペプチド又は核酸のとき、本発明は好ましくは、コンピュータ保存装置又はデータベースに保存されたあるいはそこから検索されたペプチド又は核酸配列のアッセイ記録と、少なくとも1つの他の配列との間にコンピュータ化された比較を行うことを含む、 関連ペプチド又は核酸の配列の同定方法を提供する。当該比較は配列アッセイ、比較アルゴリズム、又はそれらのコンピュータプロラムの態様（例えばFASTA、TFASTA、GAP、BESTFIT）を含み、及び/又は当該比較は、標本のポリペプチド又は核酸サンプルから測定された配列プール中での相対的な量のペプチド又は核酸配列の比較である可能性がある。
【００９３】
本発明はさらに、好ましくは、コンピュータ化された配列アッセイ、比較、又は相対的計量法における検索及び処理に適したファイルフォーマットで本発明のアッセイからのビットパターンエンコーディングデータを含む、IBM対応型（DOS、Windows、Windows95/98/2000、Windows NT、OS/2）の磁気ディスク、他のフォーマット（例えばLinux、SunOS、Solaris、AIX、SCO Unix、VMS、MV、Macintoshなど）のフロッピーディスク、又はハード（固定、Winchester）ディスクドライブを提供する。
【００９４】
本発明はさらに、イーサネットケーブル（coax又は10BaseT）、電話線、ISDNライン、ワイヤレスネットワーク、光ファイバー、又はその他の適切な信号伝送媒体などのデータリンクでリンクされた複数のコンピュータデバイスを含むネットワークも提供する；このとき、少なくとも1つのネットワークデバイス（例えばコンピュータ、ディスクアレイなど）が、磁気ドメインのパターン（例えば磁気ディスク）を含み、及び/又は、電荷ドメイン（例えばDRAMセルのアレイ）が、本発明のアッセイから得られたビットパターンエンコーディングデータを構成する。
【００９５】
本発明はさらに、アッセイデータを伝送する方法も提供する；これは、モデム、ISDNターミナルアダプタ、DSL、ケーブルモデム、ATMスイッチなど、電子通信装置の電子シグナルの発生を含み、当該シグナルは（ネイティブフォーマット又は暗号化されたフォーマットで）、本発明の方法により得られた複数のアッセイ結果を含む評価又はデータベースからのビットパターンエンコーディングデータを含む。
【００９６】
好ましい態様において、本発明はクエリーターゲットと、本発明の方法によって得られたアッセイ結果や、ターゲットデータに対する同一性の程度及びギャップ加重に基づいたデータベースターゲットの順位付けなどの、データ構成の配列を含んだデータベースを比較するコンピュータシステムを提供する。中央処理装置は、好ましくは、アッセイ結果の配列及び/又は比較をするコンピュータプログラムを取り込み、実行するために初期化される。クエリーターゲットのデータはI/O装置により中央処理装置に入力される。コンピュータプログラムを実行することにより、中央処理装置が、アッセイ結果の二値的記載を含むデータファイルからのアッセイデータを検索することが可能になる。
【００９７】
ターゲットデータ又は記録と、コンピュータプログラムは、通常ランダムアクセスメモリー（例えばDRAM、SRAM、SGRAM、又はSDRAM）である補助メモリーに転送される。ターゲットは、選択されたアッセイの特性（例えば、選択された親和性部分への結合）とクエリーターゲットの同じ特性との間の、対応の程度に基づいて順位付けされ、結果はI/O装置により出力される。例えば、中央処理装置は従来のコンピュータ（例えばIntel Pentium、PowerPC、Alpha、PA-8000、SPARC、MIPS 4400、MIPS 10000、VAXなど）であり；プログラムは商業用又は公共ドメインの分子生物学ソフトウェアパッケージ（例えば、UWGCG Sequence Analysis Software, Darwin）であり；データファイルは光ディスク、磁気ディスク、データサーバー、記憶装置（例えば; DRAM、SRAM、SGRAM、SDRAM、EPROM、バブルメモリ、フラッシュメモリなど）であり；I/O装置は、ビデオディスプレイ、キーボード、モデム、ISDN端末アダプター、イーサネットポート、パンチカードリーダー、磁気ストリップリーダー、又はその他の適切なI/O装置からなるターミナルであり得る。
【００９８】
本発明はまた、好ましくは、以下の：（1）コンピュータ；（2）本発明の方法により得られたペプチド配列特異性の記録の集合をコードする、コンピュータに保存された格納ビットパターン；（3）クエリーターゲットなどの比較ターゲット；及び（4）通常コンピュータの相似値に基づく比較結果の順位付けを備えた、配列及び比較プログラムを含む上述のコンピュータシステムの使用を提供する。例えばEwens and Grant (2001) Statistical Methods in Bioinformatics: An Introduction （『生物情報学の統計的手法：手引き』）Springer-Verlag参照。様々なサンプルによって示された遺伝子発現の類似又は相違が重要であるかどうかを結論付けるために、数学的アプローチを使用することもできる。例えば、Golub, et al. (1999) Science （『サイエンス』）286:531-537；Duda, et al. (2001) Pattern Classification （『パターンの分類』）Wiley；及びHastie, et al. (2001) The Elements of Statistical Learning: Data Mining, Inference, and Prediction （『統計的学習の要素：データマイニング、推論、そして予測』）Springer-Verlag参照。サンプルと、比較のための異なった状態を表す1つ以上のプールとの間の、与えられた状態に、サンプルがより類似しているか又は最大の類似点を有しているかを測定するための1つのアプローチ；そして比較されたプールの間の生物学的サンプルに最も類似したものとして最小のベクトル角度をもつプールが選ばれる。
【００９９】
癌関連タンパク質の特性
本発明の癌タンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク、又は細胞内タンパク質として分類される。1つの態様において、癌タンパク質は細胞内タンパク質である。細胞内タンパク質は、細胞質及び/又は核内に発見される。細胞内タンパク質は細胞の機能及び複製のすべての局面（例えばシグナル経路を含む）に関与する；これらのタンパク質の異常発現により、しばしば無秩序又は無制限な細胞処理が起こる（Alberts, et al. (eds. 1994) Molecular Biology of the Cell （『細胞の分子生物学』） (3d ed.) Garland参照）。例えば、多くの細胞内タンパク質は、プロテインキナーゼ活性、タンパク質ホスホターゼ活性、プロテアーゼ活性、ヌクレオチドシクラーゼ活性、ポリメラーゼ活性など、酵素活性を有する。細胞内タンパク質は、タンパク質複合体の組織化、又は様々な細胞内局在化へのタンパク質のターゲットに関わり、また細胞小器官の構造の完全性の維持に関わる、ドッキングタンパクとしても機能する。
【０１００】
タンパク質の特徴付けにおいてますます評価されている概念は、所定の機能がそれに起因すると考えられている、1つ以上の構造モチーフのタンパク質内での存在である。高度に保存された配列は、タンパク質の酵素ドメインで発見されるのに加え、タンパク-タンパク間の相互作用に関わるタンパク質内でも同定されている。例えば、Src-ホモロジー２領域（SH2）ドメインは、配列依存的にリン酸化チロシンターゲットと結合する。SH2ドメインとは他のPTBドメインもまたリン酸化チロシンターゲットと結合する。SH3ドメインはプロリンの豊富なターゲットと結合する。加えて、いくつかの例を挙げると、PHドメイン、テトラトリコペプチド反復ドメイン、WDドメインなどが、タンパク-タンパク間の相互関係の仲介をすることがわかっている。これらのうちのいくつかはさらに、リン脂質やその他のセカンドメッセンジャーとも結合することがある。これらのモチーフはアミノ酸配列に基づいて同定される；従ってこれらのタンパク質の配列のアッセイは分子の酵素ポテンシャル及び/又は、タンパク質が結びつく分子の両方の洞察を提供する。多重配列アラインメント及び多くの普通のタンパク質ドメインを被う隠れマルコフモデルの大きな収集であるPfam（タンパク質群）は、有用なデータベースの1つである。翻訳は、英国のWashington University in St. Louis, the Sanger Center及びスウェーデンのKarolinska Instituteから、インターネットで入手できる。例えば、Bateman, et al. (2000) Nuc. Acids Res. 28:263-266、Sonnhammer, et al. (1997) Proteins （『タンパク質』）28:405-420 ; Bateman, et al. (1999) Nuc. Acids Res. 27:260-262、and Sonnhammer, et al. (1998) Nuc. Acids Res. 26:320-322参照。
【０１０１】
他の態様において、癌配列は膜貫通タンパクである。膜貫通タンパクは、細胞のリン脂質二重層を補う分子であり、分子内ドメイン、分子外ドメイン、又はその両方を有している。このようなタンパク質の分子内ドメインは、分子内タンパク質についてすでに説明した機能を含む、多くの機能を備えている。例えば分子内ドメインは酵素活性を有し、及び/又は追加のタンパク質の結合部位としても機能する。しばしば膜貫通タンパクの細胞内ドメインは両方の役割を果たす。例えば、ある種の受容体であるチロシンキナーゼは、プロテイン・キナーゼ活性とSH2ドメインの両方を備えている。加えて、受容体分子そのものの上でのチロシンの自己リン酸化反応は、タンパク質を含む追加的SH2ドメインの結合部位を作り出す。
【０１０２】
膜貫通タンパクは、1つから多数までの膜貫通ドメインを含む。例えば、受容体チロシンキナーゼ、ある種のサイトカインレセプター、受容体グアニリルシクラーゼ、及び受容体セリン・トレオニンプロテインキナーゼなどは単一膜貫通ドメインを含む。しかしながら、チャンネル及びアデニリルシクラーゼを含む多くの他のタンパク質は、数多くの膜貫通ドメインを含む。Gタンパク質結合受容体(GPCRs)など、多くの細胞表面の重要な受容体は、7つの膜貫通領域を含んでいるため、「7回膜貫通型ドメイン」タンパク質といわれている。膜貫通ドメインの特性に、その後に荷電アミノ酸が続く、約17の連続疎水性アミノ酸が含まれる。従って特別なタンパク質のアミノ酸配列のアッセイの際、当該タンパク質内の膜貫通ドメインの位置測定と数を予測することができる（例えば、PSORTウェブサイト http://psort.nibb.ac.jp/参照）。重要な膜貫通タンパク質受容体は、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体、ヒト成長ホルモン受容体、ブドウ糖輸送担体、トランスフェリン受容体、上皮成長因子受容体、低比重リポタンパク受容体、上皮成長因子受容体、レプチン受容体、例えばIL-1受容体、IL-2受容体などのインターロイキン受容体を含み、またこれらに限られない。
【０１０３】
膜貫通タンパクの細胞外ドメインは多様である；しかしながら、保存されたモチーフは、様々な細胞外ドメイン間で繰り返し発見される。保存された構造、及び/又は機能は、異なった細胞外のモチーフであるとされている。多くの細胞外ドメインは他の分子との結合に関与している。1つの形態では、細胞外ドメインは受容体上に見られる。受容体ドメインを結合させる因子は、ペプチド、たんぱく質又はアデノシンなどの小分子である、循環リガンドを含む。例えば、EGF、FGF、及びPDGFなどの成長因子は、同族の受容体と結合して様々な細胞の応答を始動する、循環性の成長因子である。他にも、サイトカイン、マイトジェン因子、神経栄養因子などが含まれる。細胞外ドメインはまた、細胞内の分子とも結合する。このように、細胞外ドメインは細胞-細胞間の相互作用を調停する。細胞関連のリガンドは、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーにより当該細胞につながれている、あるいはリガンド自身が膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインはまた、細胞外マトリックスと結びついて、細胞構造の維持に貢献する。
【０１０４】
膜貫通性の癌タンパク質は、それらが本明細書中に説明されるように免疫治療に容易に入手できるため、本発明中で特に好まれる。加えて、以下に要約するように、膜貫通タンパクは画像診断法においても有用である。これらのそのままで容易に入手できるタンパク質に標識をつけるために、抗体が使用される。一方、抗体は細胞内のタンパク質にも標識をつけることができる。この場合、サンプルは通常、細胞内のタンパク質へのアクセスを提供するため、浸透性を持たされる。さらに、いくつかの膜タンパク質は、可溶性タンパク質を放出するように、又は残余断片を露出するために処理される。放出された可溶性タンパク質は有用な診断マーカーであり、処理された残余タンパク質断片は有用な肺の疾病のマーカーである。
【０１０５】
たとえば組み換え法により膜貫通配列を取り除くことによって、膜貫通タンパク可溶性が作られることも評価されている。さらに組み換え法により適切なシグナル配列を加えることによって、可溶性になった膜貫通タンパクが分泌されるようにすることも可能である。
【０１０６】
他の態様では、癌タンパク質は分泌性タンパク質であり；その分泌は構成的である、又は調節されている。これらのタンパク質は、 分子を分泌経路に向けるシグナルペプチド又はシグナル配列を有している。分泌されたタンパク質は数多くの生理学的事象に関与する；例えば循環した場合、それらはしばしば様々な他のタイプの細胞にシグナルを送る働きをする。分泌されたタンパク質は自己分泌方式（因子を分泌した細胞に作用する）、傍分泌方式（因子を分泌した細胞に近接した細胞に作用する）、内分泌方式（例えば血流への分泌のように、疾病時の細胞に作用する）、又は外分泌方式（例えば、汗腺、脂腺、膵管、涙腺、乳腺、耳垢腺など、管又は隣接する上皮表面を通した分泌）で機能する。従って分泌された分子はしばしば、生理学の多くの側面を調節又は変更するのに使用される。分泌性タンパク質である癌タンパク質は、例えば血液、血漿、血清又は便の検査において、診断マーカーの良いターゲットとして機能するため、本発明において特に好まれる。酵素であるもの（癌タンパク質）は抗体又は小分子のターゲットとなる。他のものは、例えばCTLメカニズムによりワクチンのターゲットとして有用である。
【０１０７】
癌核酸の使用
上述のように、癌配列は最初に、本質的な核酸及び/又は本明細書中に概説された癌配合と相同又は関連したアミノ酸配列によって同定される。このような相同性は、全体的な核酸又はアミノ酸配列に基づいており、通常以下に要約されているように、相同プログラム又はハイブリダイゼーション条件を使って測定される。通常、mRNA上に結合した配合は、同じ分子上で発見される。
【０１０８】
他で詳述されるように、同一性の比率はBLASTのようなアルゴリズムを使用して測定される。好ましいな方法では、重なり範囲及び重なり比それぞれ1と0.125で、デフォルトパラメータに設定されたWU-BLAST-2のBLASTNモジュールを使用する。アラインメントはアラインされる配列のギャップの導入を含む。さらに、記載の当該核酸よりも多くの、又は少ないヌクレオチドを含んだ配列について、相同パーセンテージは、ヌクレオチドの総数に対する相同ヌクレオチドの数に基づいて測定される。従って、例えば同定された配列よりも短い配列の相同性は、より短い配列におけるヌクレオチドの数を使用して測定される。
1つの態様において、ハイブリダイゼーションの研究により、核酸相同体が測定される。従って例えば、非常にストリンジェントな条件下で前記の核酸、又はその相補体とハイブリダイズされた、あるいはさらに天然のｍRNA 上で発見された核酸は癌配列であると見なされる。他の態様では、ハイブリダイゼーションの条件はあまり厳しくなく、例えば厳しさの程度が中程度から低い条件が使用される；Ausubel, supra, and Tijssen, supra参照。
例えば表68の配列など、本発明の癌核酸の配列は、大きな遺伝子の断片、例えば核酸の一部分である可能性もある。この文脈での「遺伝子」とは、コード領域、非コード領域、及びそれらの混合を含む。従って、本明細書中に提供された配列を使用し、長い配列又は完全長の配列をクローンする周知の技術によって癌遺伝子の配列をどちらの方向へも延長することができる；Ausubel, et al., supra参照。情報科学は多くを可能にする。そして、例えばUniGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/参照）などのシステムなど、多くの配列を集めて、単一の遺伝子に対応する多数の配列を含むことができる。
【０１０９】
ひとたび癌の核酸が同定されると、そのクローンを作ることが可能となり、必要であればその構成パーツを組み換えて完全な癌核酸のコード領域、あるいは完全なRNA配列を形成することができる。例えばプラスミドあるいは他のベクター内に含まれている、又は線状の核酸断片としてそこに摘出されている天然源からひとたび分離されると、組み換え癌核酸は、例えば延長されたコード領域など、他の癌核酸を同定及び分離するプローブとしてさらに使用される。また、修飾されたあるいは異なった癌核酸及びタンパク質を作る「前駆体」核酸として使用することもできる。
【０１１０】
本発明の癌核酸は、いくつかの方法で使用される。1つの態様では、癌核酸の核酸プローブが作られ、バイオチップと結びついて、以下に要約されたスクリーン及び診断方法として使用され、又は、例えば遺伝子治療、ワクチン、RNA干渉（RNAi）及び/又はアンチセンスの使用のために投与される。一方、癌タンパク質のコード領域を含む癌核酸を、これもスクリーン目的あるいは患者への投与のため、癌タンパク質を含む癌核酸を、癌タンパク質の発現のために発現ベクター内に投入することもできる。
【０１１１】
好ましい態様において、癌核酸（図に要約された核酸配列及び/又はそれらの相補体の両方）の核酸プローブが作られる。バイオチップに結合した核酸プローブは、ターゲット配列のハイブリダイゼーションや本発明におけるプローブのハイブリダイゼーションが起こるような、癌核酸の実質的な相補体、例えばターゲット配列（サンプルのターゲット配列又は例えばサンドイッチアッセイにおける他のプローブ配列のいずれか）となるように設計されている。以下に要約されているように、これは完全な相補体である必要はなく、ターゲット配列と本発明の1本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを妨げるような、ミスマッチ塩基対が存在することもある。しかしながら、最も緩やかな条件の下でさえもハイブリダイゼーションが起こらないほど突然変異の数が多すぎると、配列はターゲット配列の相補体とはならない。従って、本明細書中の「実質的に相補体」とは、プローブがターゲット配列の実質的な相補体であり、通常の反応条件の下、特に本明細書中に要約されているようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【０１１２】
核酸プローブは通常一本鎖であるが、一本鎖の部分と二本鎖の部分を有することがある。プローブの重鎖性は構成、組成、及びターゲット配列の特性によって測定される。通常、核酸プローブは塩基約8〜100、好ましくは塩基約10〜80、特に好ましくは塩基約30〜50の長さに及んでいる。すなわち、通常は遺伝子全体が使われることはない。態様によっては、塩基数100にいたるかなり長い核酸が使われることもある。
【０１１３】
好ましい態様において、1つの配列に対し、重なり合ったプローブや使用されたターゲットの異なった部分のプローブなど、1つ以上のプローブが使用される。すなわち、二つ、三つ、四つ又はそれ以上、好ましくは三つのプローブが使用され、特定のターゲットの反復が作られる。プローブは重なり合っていても（例えばいくつかの共通した配列を有する）離れていても良い。場合によっては、PCRプライマーを使用して、より高感度のシグナルが増幅される。
【０１１４】
核酸は固定支持体に様々な方法で結合あるいは固定される。本明細書中で「固定する」及びその文法的同義語は、核酸プローブと固定支持体の間のつながり又は結合が、要約されているような結合、洗浄、アッセイ及び除去などの条件下で安定するのに充分であることを意味する。結合は通常、共有結合か非共有結合である。「非共有結合」及びその文法的同義語は本明細書中で、1つ以上の静電気的、親水性、及び疎水性の相互作用を意味する。非共有結合には、例えばストレプトアビジンなどの分子と支持体の共有結合、ビオチニンプローブのストレプトアビジンとの非共有結合などが含まれる。「共有結合」及びその文法的同義語は本明細書中で、固体支持体とプローブの二つの部分が、シグマ結合、パイ結合及び配位結合を含む少なくとも1つの結合によって結合されることを意味する。共有結合はプローブと固体支持体との間に直接形成されることも、架橋剤により又は、固体の支持体又はプローブのいずれか、又は両方の分子上の特定の反応基を含むことにより形成されることもある。固定化もまた共有性又は非共有制の相互作用を含む。
【０１１５】
通常、プローブは様々な方法でバイオチップに結合する。本明細書中で記載されるように、核酸はまず合成され、続いてバイオチップに結合することもあるし、直接バイオチップ上に合成されることもある。
【０１１６】
バイオチップは適切な固体基質を含む。本明細書中で「基質」、「固体支持体」又はそれらの文法的同義語は、核酸プローブが結合又はつながるように修飾されることができ、少なくとも1つの検出法に反応する物質を意味する。しばしば基質は個々の分離及び同定に適した、明確な個他の部位を含んでいる。潜在的基質の数は非常に多く、ガラス及び変わりガラス又は機能性ガラス、プラスチック（アクリル系、ポリスチレン及びスチレンなどの材質の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロンJなどを含む）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリカ又はシリコンや変性シリコンを含むシリカ・ベースの物質、炭素、金属、無機ガラス、プラスチックなどを含み、またこれらに限定されない。通常基質は光学的探知が可能で、検出できるほどの蛍光発光はしない。WO 0055627参照。
【０１１７】
通常基質は平面であるが、他の形状の基質も使用されることがある。例えば、プローブが、サンプル量を最小限に抑えるためアッセイのサンプルを流す管の内表面に置かれることがある。同様に、基質が、特別なプラスチックでできた独立気泡フォームを含む軟質フォームなどのように柔軟であることもある。
【０１１８】
好ましい態様において、バイオチップ及びプローブの表面は、後に続く両者の結合のための化学的官能基により被覆されている。従って、例えばバイオチップは、特にアミノ基が望まれるが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、チオール基を含み、またこれらに限定されない化学的官能基によって被覆される。これらの官能基を使用し、プローブとプローブ上の官能基を結合させることができる。例えば、アミノ基を含む核酸は、例えば架橋剤を使用して、アミノ基を含む表面に結合することができる；例えば同一又は異なった二官能性架橋剤などが周知である（1994年版Pierce Chemical Companyカタログ、クロスリンカーのテクニカルセクション、155〜200ページ参照）。さらに、場合によってはアルキル基（置換基及びヘテロアルキル基を含む）など、追加的な架橋剤が使われることもある。
【０１１９】
この態様では、オリゴヌクレオチドが合成され、固体支持体表面に結合される。5'又は3'末端が固体支持体に結合されるか、又は内部ヌクレオチドへの結合によって結合が起こる。他の態様では、非共有性でありながら、固体支持体への固定化が非常に強いこともある。例えば、ストレプトアビジンにより被覆された表面に共有性結合する、ビオチン化オリゴヌクレオチドが作られて、結合が起こる。
【０１２０】
一方、オリゴヌクレオチドが表面上に合成されることもある。例えば、光重合化合物及び光重合技術を使用した光活性化技術が使用される。好ましい態様において、周知のフォトリソグラフィ技術を使用して、細胞内で核酸を合成することができる。これらのフォトリソグラフィ技術は、すべてが明らかなものであるとして組み込まれている、WO 95/25116；WO 95/35505；米国特許番号第5,700,637号及び同第5,445,934号；及びそれらの参考資料に記載されており；これらの結合方法はAffymetrix社のGeneChip技術の基質を作っている。
【０１２１】
しばしば、癌関連の配列の発現レベルを測定するために増幅・ベースのアッセイが行われる。これらのアッセイは通常逆転写と併せて行われる。このようなアッセイにおいて、癌関連の核酸配列は増幅反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応又はPCR）のテンプレートとして機能する。定量増幅において、増幅産物の量はオリジナルサンプルのテンプレートの量と比例する。適切な対照群との比較により、癌関連のRNA量の測定が得られる。定量増幅の方法は周知のものである。定量PCRの詳しいプロトコルは、例えばInnis, et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications （『PCRプロトコル、方法と実践のガイド』）Academic Pressに提供されている。
【０１２２】
態様によっては、TaqManベースのアッセイが、発現の測定に使用されている。TaqManベースのアッセイは、5'の蛍光染料と3'のクエンチング剤を含んだ蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用する。プローブはPCR産物とハイブリダイズするが、3'末端にある遮断剤のため、それ自身が延長することはできない。PCR産物が後続のサイクルで増幅する時、5'の、例えばAmpliTaqなどのポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により、TaqManプローブに分裂が生じる。この分裂は5'の蛍光染料と3'のクエンチング剤を引き離し、それによって増幅の機能としての蛍光発光が増加する（例えばPerkin-Elmerにより提供された文献参照。www2.perkin-elmer.comなど）。
【０１２３】
その他の適切な増幅方法は、以下の：リガーゼ連鎖反応（LCR）（Wu and Wallace (1989) Genomics （『ゲノミクス』）4:560-569、Landegren, et al. (1988) Science （『サイエンス』）241:1077-1080、及びBarringer, et al. (1990) Gene （『遺伝子』）89:117-122参照）、転写増幅（Kwoh, et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、自己維持的配列複製（Guatelli, et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、ドットPCR、架橋剤アダプタPCR、などを含み、またこれらに限定されない。
【０１２４】
核酸からの癌タンパク質の発現
好ましい態様において、例えば癌タンパク質をコードする癌核酸が、以下に記載されるように、後にスクリーニングアッセイで使用される癌タンパク質を発現する様々な発現ベクターを作るために使用される。タンパク質を発現する、発現ベクター及び組み換えDNAの技術は周知である（Ausubel, supra, and Fernandez and Hoeffler (eds. 1999) Gene Expression Systems （『遺伝子発現システム』）Academic Press参照）。発現ベクターは自己再生染色体外ベクターか、宿主ゲノムに結合するベクターのいずれかである。通常これらの発現ベクターは、癌タンパク質をコードする核酸と機能的に連結する、転写及び翻訳調節核酸を含む。「調節配列」という用語は、ある特定の宿主生物中の機能的に連結したコード配列の発現に使われるDNA配列をさす。原核生物に適している調節配列は、例えばプロモーター遺伝子や随意的に オペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０１２５】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係におかれた時「機能的に連結」している。例えば先行連鎖又は分泌先導のDNAは、ポリペプチドの分泌に携わるプレタンパクとして発現されている場合には、ポリペプチドのDNAに機能的に連結している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に効果している場合には、コード配列と機能的に連結している；リボソーム結合部位は、翻訳を促進する位置にある場合には、コード配列と機能的に連結している。通常「機能的な連結」とはDNA配列が連続的につながっており、分泌先導の場合には、連続的でかつ読み取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的でなくてもかまわない。連結は通常、適切な制限部位におけるライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の方法に基づきオリゴヌクレオチド又は架橋剤の合成が使用される。転写及び翻訳調節核酸は、通常癌タンパク質を発現するのに使用される宿主細胞に適している。様々な宿主細胞に対し、数多くの適切な発現ベクター、及び適切な調節配列が知られている。
【０１２６】
一般に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、及びエンハンサー又は活性化配列を含み、またこれらに制限されない。好ましい態様において、調節配列は、プロモーター及び転写の開始及び終止配列を含む。
【０１２７】
プロモーター配列は、構成的あるいは誘導プロモーターのいずれかである。プロモーターはまた、天然のプロモーターかハイブリッド・プロモーターのいずれかである。1つ以上のプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッド・プロモーターも知られており、本発明において有用である。
【０１２８】
発現ベクターが、他の要素を含むこともある。例えば、発現ベクターが二つの複製システムを備えることもあり、その結果、例えば発現は哺乳動物又は昆虫の細胞で、クローン及び増幅は原核生物宿主で、というように二つの生物で維持されることが可能になる。さらに、発現ベクターを統合させるため、発現ベクターはしばしば少なくとも1つの宿主細胞のゲノムと相同の配列を含み、好ましくは発現構築物と側面を接する二つの相同配列を含む。統合ベクターは、ベクターに含まれるのに適切な相同配列を選択することにより、宿主細胞の特定の位置に導かれる。統合ベクターの構成理論は入手可能である。Fernandez and Hoeffler, supra; and Kitamura, et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 92:9146-9150参照。
【０１２９】
さらに、好ましい態様において、発現ベクターは形質転換した宿主細胞の選択を可能にする、選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子が周知であり、使用される宿主細胞により様々である。
【０１３０】
本発明の癌タンパク質は通常、癌タンパク質をコードする核酸を含んだ発現ベクターにより形質転換した宿主細胞を、癌タンパク質の発現を誘導又は引き起こすのに適した条件下で培養することによって産生される。癌タンパク質の発現に適した条件は、発現ベクターと宿主の選択によって様々であり、定期的な実験又は最適化により容易に確定することができる。例えば、誘導的プロモーターを使用するのには、誘導に適した成長条件が必要となるが、発現ベクターで構成的プロモーターを使用するには、宿主細胞の成長及び増殖を最適化する必要がある。加えて、態様によっては収穫のタイミングが重要となる。例えば、昆虫細胞での発現に使用されるバキュロウィルス組織は細胞融解ウィルスであり、そのため収穫時期の選択は産物収量に重要となる。
【０１３１】
酵母菌、バクテリア、始原細菌、菌類、また昆虫及び哺乳動物細胞を含む動物の細胞が宿主細胞に適した細胞に含まれる。サッカロマイセス・セレヴィシエ（saccharomyces cerevisiae）やその他の酵母菌、大腸菌(E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、Sf9細胞、C129細胞、293細胞、アカパンカビ(Neurospora)、BHK、CHO、COS、HeLa細胞、HUVEC（臍帯静脈内皮細胞）、THP1細胞（マクロファージ細胞核）、またその他の多様なヒトの
【０１３２】
好ましい態様において、癌タンパク質は哺乳動物の細胞に発現される。哺乳動物の発現システムが使用され、レトロウィルス及びアデノウィルス・システムが含まれる。1つの発現ベクターシステムは、通常PCT/US97/01019及びPCT/US97/01048に記載されているようなレトロウィルスベクター・システムである。ウィルス遺伝子はしばしば高度に発現され、宿主の幅も広いため、哺乳動物の遺伝子細胞からのプロモーターが哺乳動物のプロモーターとして特に使用される。SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウィルスLTRプロモーター、アデノウィルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウィルス・プロモーター、及びCMVプロモーター（Fernandez and Hoeffler, supra参照）などが例に含まれる。通常、哺乳動物細胞に認められた転写停止及びポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンから3'に位置する調節範囲にあり、従ってプロモーター因子と共に、コード配列と側面を接する。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの例として、SV40由来のものが含まれる。
【０１３３】
外因性核酸を哺乳動物宿主やその他の宿主に取り込む方法があるが、その方法は使用される宿主細胞によって多様である。デキストランを介したトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレンを介したトランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、ウィルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、及びDNAの核への直接的マイクロインジェクションなどの技術が含まれる。
【０１３４】
好ましい態様において、癌タンパク質はバクテリアシステムに発現される。バクテリオファージからのプロモーターもまた使用される。加えて、合成プロモーターやハイブリッド・プロモーターも有用である；例えばtacプロモーターは、trpとlacプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、バクテリアプロモーターは、バクテリアRNAポリメラーゼと結合して転写を開始する能力を備えた、非バクテリア起源の天然のプロモーターを含むことがある。機能するプロモーター配列に加え、効果的なリボソーム結合部位が望まれる。発現ベクターはまた、バクテリア内に癌タンパク質の分泌を提供する、シグナルペプチド配列を含む。タンパク質は成長媒体（グラム陽性バクテリア）か、細胞の内膜と外膜の間に位置するペリプラズム領域内（グラム陰性バクテリア）に分泌される。バクテリアの発現ベクターはまた、形質転換されたバクテリアの菌株の選択を可能にする、選択マーカー遺伝子を含む。適切な選択遺伝子は、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンなどの薬物に対し、バクテリア耐性を与える遺伝子を含む。選択マーカーはまた、ヒスチジン、トリプトファン、及びロイシン生合成経路中に存在する生合成遺伝子をも含む。これらの成分が組み込まれた発現ベクターができる。バクテリアの発現ベクターは周知であり、中でも枯草菌、大腸菌、 ストレプトコッカスクレモリス、及び放線菌（Streptomyces lividans？）などを含む（Fernandez and Hoeffler, supra 参照）。バクテリア発現ベクターは、塩化カルシウム処理、エレクトロポレーション、その他の技術を用いてバクテリア宿主細胞に形質転換される。
【０１３５】
1つの態様では、癌タンパク質は、例えば昆虫細胞の形質転換の発現ベクター、特にバクロウィルス・ベースの発現ベクターを用いて昆虫細胞内に作製される。
【０１３６】
好ましい態様において、癌タンパク質は酵母細胞内に作製される。酵母菌の発現システムが周知であり、サッカロマイセス・セレヴィシエ、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ（C.maltosa）、ハンセヌラ・ポリモーファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロマイセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）及びクルイベロマイセス・ラクティス（K.lactis）、ピキア・グイレリモンジイ（Pichia guillerimondii）及びピキア・パストリス（P.pastoris）、スキゾサッカロミセス・ボンベ（Schizosaccharomyces pombe）、及びヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）などの発現ベクターが含まれる。
【０１３７】
既存の技術を用いて、癌タンパク質を融合タンパク質として作ることもできる。従って、例えばモノクローナル抗体の作製について、所望のエピトープが小さい時、癌タンパク質は担体タンパク質と融合してイムノゲンを形成する。一方、癌タンパク質は発現を増加する、あるいはその他の理由で融合タンパク質として作られる。例えば、癌タンパク質が癌ペプチドである時、ペプチドをコードする核酸は、発現のために他の核酸と結合する。検出エピトープ・タグとの融合は、例えばFLAG、His6、myc、HAなどとも作ることができる。
【０１３８】
好ましい態様において、癌タンパク質は発現の後精製あるいは分離される。癌タンパク質は、サンプル中にどのような他の成分が存在するか、また例えば天然の構造又は変性のような精製される産物についての要求に依存して様々な方法で分離又は精製される。標準的精製方法は、硫酸アンモニウムの沈殿、電気泳動的、分子的、免疫学的、及び、イオン交換、疎水性、親和性、逆相HPLCクロマトグラフィ、クロマトグラフ法、及びクロマトフォーカシングを含む。例えば、標準的抗癌タンパク質抗体カラムを使用して癌タンパク質を精製することができる。限外濾過法及び濾過透析法の、タンパク質濃縮との併用もまた有用である。例えば、Walsh (2002) Proteins: Biochemistry and Biotechnology （『タンパク質：生化学及びバイオテクノロジー』）Wiley；Hardin, et al. (eds. 2001) Cloning, Gene Expression and Protein Purification （『クローニング：遺伝子発現とタンパク質精製』）Oxford Univ. Press（オックスフォード大学出版）；Wilson, et al. (eds. 2000) Encyclopedia of Separation Science （『分離科学の百科事典』）Academic Press；及びScopes (1993) Protein Purification （『タンパク質の精製』）Springer-Verlag参照。必要な精製の程度は癌タンパク質の使用により変わる。態様によってはまったく精製の必要がないこともある。
【０１３９】
ひとたび発現され必要に応じ精製されると、癌タンパク質及び核酸は多くの用途において有用である。これらは免疫選択剤、ワクチン剤、スクリーニング剤として、治療の実体に、抗体の産生用に、転写又は翻訳阻害剤として使用される。
癌タンパク質の変異体
癌タンパク質の1つの態様にはまた、本明細書中で測定されるように、自然に発生する配列のアミノ酸変異体が含まれる。好ましくは、当変異体は野生型配列に約75％以上、より好ましくは約80％、より好ましくは約85％以上、さらに好ましくは90％以上相同である。態様によっては、相同体性は約93〜95％又は98％まで高くなる。核酸に関し、この状況での相同性とは、好ましくは配列の同一性を意味する、類似性あるいは同一性である。核酸相同性について上述されたのと同様、この相同性も標準的な技術によって測定することができる。
【０１４０】
本発明の癌タンパク質は、野生型のアミノ酸配列より短いことも長いこともある。従って、好ましい態様において、野生型配列の部分又は断片も、癌タンパク質の定義の範囲内に含まれる。加えて、上記に要約されているように、本発明の癌核酸は、追加的なコード領域を得るため、ひいては追加的なタンパク質配列を得るために使用されることがある。
【０１４１】
1つの態様において、癌タンパク質は野生型の配列と比べると、癌タンパク質の誘導体あるいは変異体である。すなわち、以下により詳しく概説されるように、癌ペプチド変異体はしばしば、特に望まれるアミノ酸置換に対し、少なくとも1つのアミノ酸置換、削除、又は挿入を含んでいる。アミノ酸置換、挿入、又は削除は、癌ペプチド内の多くの残基位置で起こる。
【０１４２】
さらに、本発明の癌タンパク質の1つの態様には、アミノ酸配列の変異体が含まれている。これらの変異体は通常、次の三つの分類の1つ以上に当てはまる：置換、挿入、又は削除変異体。これらの変異体は通常、癌タンパク質をコードするDNA内のヌクレオチドの部位特異的突然変異作製により作製され、カセット法又はPCR突然変異作製又はその他の方法を使用して変異体をコードするDNAを作製し、その後、上述のように組み換え細胞培養中でDNAを発現する。しかしながら、約100〜150の残基を有する変異癌タンパク質の断片が、すでに確立した技術を使用してインビトロ合成により作製されることもある。アミノ酸配列の変異体は、前もって決められた変異体の性質、天然の対立遺伝子からそれらを区別する特性、又は癌タンパク質アミノ酸配列の種間変異体によって特徴付けられる。変異体は通常、天然の類似体と同様の質的生物学的活性を示すが、変更された性質を有する変異体が選ばれることもある。
【０１４３】
アミノ酸配列の変異体を導入する位置又は範囲はしばしば前もって決められているが、実質的変形は前もって決めておかれる必要はない。例えば、与えられた部位での変形の実施を最適化するために、ターゲットコドン又は領域で任意の変異誘発が行われ発現された癌の変異体は所望の活性の最適な組み合わせのためにスクリーンされる。既知の配列を有するDNAの既定部位において置換変異を起こす技術は、例えばM13プライマー変異誘発及びPCR変異誘発など、よく知られている。変種のスクリーニングはしばしば癌タンパク質活性のアッセイを用いて行われる。
【０１４４】
アミノ酸置換は通常1残基であり、挿入は、かなり大きなものも許容されるが、通常約1〜20程度のアミノ酸の挿入である。削除は通常約1〜20の残基で、場合によってはかなり大きな削除の場合もある。
【０１４５】
置換、削除、挿入又は組み合わせは、最終的な派生物に到達するために使用される。通常これらの変化は、分子の変化を最小限に抑えるため小数のアミノ酸において起こる。しかしながら、特定の状況下では大きな変化も許容される。癌タンパク質の特徴に小さな変化が望まれる場合、記載されたアミノ酸置換関係に基づいて置換が行われる。
【０１４６】
変異体は通常、基本的には同一の質的生物学的活性を示し、天然の類似体と同じ免疫反応を促すが、変異体は必要に応じて癌タンパク質の特性を修飾するためにも選択される。一方、変異体は、癌タンパク質の生物学的活性を変更するように設計されることもある。例えば、糖鎖形成部位が付加、変更、又は除去されることがある。
【０１４７】
上述のものよりも保守的ではない置換を選択することで、機能や免疫的同定に大きな変化を起こすことがある。例えば、以下に対してより際立った効果を及ぼす置換が行われることがある：例えばアルファ・ヘリックス又はベータシート構造などの、変更部位のポリペプチド骨格の構造；ターゲット部位の分子の電荷及び疎水性；あるいは側鎖の大部分。ポリペプチドの特性に最も大きな変化を及ぼすと考えられる置換では、（a）例えばセリン又はトレオニンなどの親水性残基が、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、アラニンなどの疎水性残基と（によって）置換される；（b）システイン又はプロリンがその他の残基と（によって）置換される；（c）例えば、リジン、アルギニン、又はヒスチジンなどの電気陽性の側鎖を有する残基が、例えばグルタミン酸又はアスパラギン酸などの電気陰性残基と（によって）置換される；（d）例えばフェニルアラニンなどの大きな側鎖を有した残基が、例えばグリシンなどの側鎖のないものと（によって）置換される；（e）プロリン残基が組み込まれ、又は置換されて、ペプチジル結合の回転の自由度が変化できる。
【０１４８】
変異体は通常、同様の質的生物学的活性を示し、天然の類似体と同じ免疫反応を促すが、変異体は必要に応じて皮膚癌タンパク質の特性を修飾するためにも選択される。一方、変異体は、癌タンパク質の生物学的活性を変更するように設計されることもある。例えば、糖鎖形成部位が変更、又は除去されることがある。
【０１４９】
癌ポリペプチドの共有結合の修飾は、本願発明の請求の範囲内に含まれる。1つのタイプの共有結合的修飾は、癌ポリペプチドのターゲットとなるアミノ酸残基と、選択された側鎖又は癌ポリペプチドのN-又はC-ターミナル残基と反応することのできる有機的誘導剤との反応を含む。二価性の薬剤による誘導体化は、例えば、以下により詳しく説明されるように、抗癌性ポリペプチド抗体の精製法、スクリーニングアッセイなどで用いられる、癌ポリペプチドと非水溶性支持気質又は表面の架橋結合において有用である。通常使用される架橋剤は、例えば1,1-ビス（ジアゾアセチル）-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシサクシンイミドエステル、例えば、4-アジドサリチル酸を伴うエステル、3,3'-ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート)などのジサクシンイミジルエステルを含む同一二価性のイミドエステル、N-マレイミド-1,8-オクタンなどの二価性マレイミド及びメチル-3-（（p-アジドフェニル)ジチオ）プロピオイミデートなどの薬剤を含む。
【０１５０】
その他の修飾には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル及びアスパラチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリジンの水酸化、セリル、トレオニル、チロシル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（例えば、79-86ページ、Creighton (1992) Proteins: Structure and Molecular Properties （『タンパク質：構造と分子特性』）Freeman）、N-末端アミンのアセチル化、及びC-末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１５１】
本願発明の請求の範囲内にある、他のタイプの癌ポリペプチドの共有制修飾は、ポリペプチドの未変性糖鎖形成パターンの変更を含む。本明細書中で「未変性糖鎖形成パターンの変更」とは、癌ポリペプチドの未変性配列に見られる1つ以上の炭水化物部分を除去し、及び/又は癌ポリペプチドの未変性配列には存在しない糖鎖形成部を1つ以上加えることを意味することを意図している。糖鎖形成パターンは多くの方法で変更することができる。癌関連の配列を発現する異なった細胞のタイプは、異なった糖鎖形成パターンをもたらす。
【０１５２】
癌ポリペプチドへの糖鎖形成部位の追加は、そのアミノ酸配列の変更によってもなされる。当変更は、例えば、1つ以上のセリン又はトレオニン残基の未変性癌ポリペプチド配列への追加又は削除（O-結合糖鎖形成部のため）によってなされる。癌アミノ酸配列は、DNAレベルにおける変化、特に癌ポリペプチドをコードするDNAを所望のアミノ酸に翻訳するようにコドンが作製された、あらかじめ選択された塩基における変形により任意的に変更される。
【０１５３】
癌ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増やす他の方法は、配糖体をポリペプチドに化学的又は酵素的に結合させることである。例えば、WO 87/05330；259-306ページ、Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem 。
【０１５４】
癌ペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、糖鎖形成のターゲットとして機能しているアミノ酸残基をコードするコドンを、化学的、酵素的、又は変異置換することによって達成される。化学的脱グリコシル化法をが適用できる。例えば、Sojar and Bahl (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52-57及びEdge, et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131-137参照。様々なendo型又はexo型のグリコシターゼの使用によってポリペプチドの炭水化物部分を酵素的に開裂させることができる。例えば、Thotakura, et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350-359参照。
【０１５５】
癌の共有結合的修飾の他のタイプは、米国特許番号第4,640,835号；同第4,496,689号；同第4,301,144号；同第4,670,417号；同第4,791,192号又は同第4,179,337号に示される方法による、癌ポリペプチドと、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンなどの、様々な非タンパク質性のポリマーの1つとの結合を含む。
【０１５６】
本発明の癌ポリペプチドはまた、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した癌ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法でも修飾される。1つの態様において、当該キメラ分子は、癌ポリペプチドと、アンチタグ抗体が選択的に結合することのできるエピトープを提供するタグ・ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは通常、癌ポリペプチドのアミノ末端、又はカルボキシル末端に位置する。このような癌ポリペプチドのエピトープ標識された形態の存在は、タグ・ポリペプチドに対する抗体を使用して検出することができる。さらに、エピトープタグの供給は、アンチタグ抗体、又はエピトープタグと結合する他のタイプの親和性基質を使用した親和性精製により、癌ポリペプチドの容易な精製を可能にする。他の態様において、キメラ分子は、癌ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合を含む。二価のキメラ分子について、この融合はIgG分子のFc領域への融合である。
【０１５７】
様々なタグ・ポリペプチドとそれらの個他の抗体が利用できる。例として以下が含まれる：ポリヒスチジン（poly-his）又はポリヒスチジングリシン（poly-his-gly）タグ；HIS6及び金属キレーションタグ、インフルエンザHAタグポリペプチド及びその抗体12CA5（Field, et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165）；c-mycタグ及びその8F9、3C7、6E10、G4、B7、及び9E10抗体（Evan, et al. (1985) Molecular and Cellular Biology （『分子及び細胞生物学』）5:3610-3616）；単純ヘルペスウィルス糖タンパク質D（gD）タグ及びその抗体（Paborsky, et al. (1990) Protein Engineering （『タンパク質光学』）3(6):547-553）。他のタグ・ポリペプチドは以下を含む：Flagペプチド（Hopp, et al. (1988) BioTechnology （『バイオテクノロジー』）6:1204-1210）；KT3 エピトープペプチド（Martin, et al. (1992) Science （『サイエンス』）255:192-194）；チューブリンエピトープペプチド（Skinner, et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:15163-15166）；及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ（Lutz-Freyermuth, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6393-6397）。
【０１５８】
さらに癌群の他の癌タンパク質、そして以下に概説される、クローンして発現された他の生物からの癌タンパク質も含まれる。従って、プローブ又は変性型ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマー配列が、ヒト又は他の生物からの関連した他の癌タンパク質を見つけるために使用される。特に有用なプローブ及び/又はPCRプライマー配列は、癌核酸配列の独特な領域を含む。好ましいPCRプライマーは、約15〜35、好ましくは約20〜30のヌクレオチド分の長さで、必要に応じイノシンを含んでいる。PCR反応の条件は、充分に説明されている（例えばInnis, PCR Protocols（PCRプロトコル）, supra）。
【０１５９】
加えて、癌タンパク質は、例えば延長配列の解明、エピトープ又は精製タグの追加、他の融合配列の追加などにより、表の核酸によってコードされたものよりも長く作られる。
【０１６０】
癌タンパク質はまた、癌核酸によりコードされたものとして同定される。従って、癌タンパク質は、本明細書中に概説されるように、配列リストの配列又はそれらの相補体とハイブリダイズする核酸によってコードされる。
【０１６１】
癌タンパク質に対する抗体
好ましい態様において、癌タンパク質が免疫治療や免疫学的診断のための抗体の産生に使われるとき、癌タンパク質は完全長タンパク質と少なくとも1つのエピトープ又は決定基を共有しなくてはならない。本明細書中で「エピトープ」又は「決定基」とは通常、MHC（主要組織適合複合体）の環境中において抗体又はT細胞受容体を作製する、及び/又はそれらと結合するタンパク質の一部分を意味する。このためほとんどの場合において、小さな癌タンパク質用に作られた抗体は、完全長のタンパク質、特に線状のエピトープと結合することができる。好ましい態様において、エピトープは独特のものである；すなわち、特異のエピトープのために作製された抗体は、交差反応性をほとんど示さない。好ましい態様において、エピトープは表に示されたタンパク質配列から選択される。
【０１６２】
ポリクローナル抗体を準備する方法が存在する（例えば、Coligan, supra；及びHarlow and Lane, supra）。免疫化剤と、必要に応じて補助薬の一度以上の注入により、ポリクローナル抗体を哺乳動物の中で育てることができる。通常、免疫化剤及び/又は補助薬は、複数回の皮下又は腹腔内への注射により哺乳動物に注入される。免疫化剤は表1〜80の核酸によりコードされたタンパク質、又はそれらの断片、又はそれらの融合タンパク質を含む。免疫を受ける哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に、免疫化剤を結合すると効果的である。このような免疫原性のタンパク質の例は、ヒザラガイ・ヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ・サイログロブリン、大豆トリプシンインヒビターを含み、またそれらに限られない。使用される可能性のある補助薬の例は、完全フロイントアジュバント（Freund's complete adjuvant）、MPL-TDM補助薬（モノホスホリル・リピドA、合成トレハロース・ジコリノマイコレート）を含む。様々な免疫プロトコルが使用される。
【０１６３】
抗体は、一方、モノクローナル抗体であることもある。モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein (1975) Nature （『ネイチャー』）256:495に説明されているように、ハイブリドーマ法によって準備される。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又はその他の適切な宿主動物が、その免疫化剤と特に結合する抗体を作製するあるいは作製する能力のあるリンパ球を発現させる免疫化剤によって通常免疫化される。一方、リンパ球はインビトロで免疫化されることもある。免疫化剤は通常表の核酸、又はその断片、又はその融合タンパク質によってコードされたポリペプチドを含む。通常、ヒト起源の細胞が望まれる場合は末梢血リンパ球（「PBLs」）が使われ、ヒト以外の哺乳動物源が望まれる場合は脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。その後リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融剤を用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（例えば、59-103ページ、Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice （『モノクローナル抗体：原理と実践』）Academic Press参照）。不死化細胞株は通常、形質転換した哺乳動物の細胞、特にげっ歯類、ウシ属、又はヒト起源の骨髄腫細胞である。通常はラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合していない不死化細胞の増殖又は生存を妨げる1つ以上の物質を含んだ、適切な培養基中で培養される。例えば、もし親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT又はHPRT）が欠けていたら、ハイブリドーマの培養基は通常、HGPRT欠乏細胞の成長を妨げる物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（“HAT媒体”）を含む。
【０１６４】
1の態様では、抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、二つ以上の異なった抗原への結合特異性を有する、又は同一抗原の二つのエピトープへの結合特異性を有する、好ましくはヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。ある態様では、結合特異性のひとつは表の核酸、又はその断片によりコードされたタンパク質に対するもので、もう1つは他の抗原のもの、好ましくは細胞表面タンパク質、又は受容体、又は受容体サブユニットで、好ましくは腫瘍特異性のものである。一方、四量体タイプの技術は多価試薬を作製する。
【０１６５】
好ましい態様において、癌タンパク質の抗体は、裸の形態又は以下に説明されているようなエフェクター部分と結合した形態で、癌タンパク質の生物学的機能を縮小又は除去することができる。すなわち、抗癌タンパク質抗体（ポリクローナル又は好ましくはモノクローナルのいずれか）を癌細胞（又は癌を含む細胞）に加えると、癌を縮小あるいは除去することができる。通常、活性、成長、サイズ、その他において少なくとも25％、特に好ましくは少なくとも約50％、さらに特に約95〜100％の減少が望まれる。
【０１６６】
好ましい態様において、癌タンパク質の抗体はヒト化抗体である（例えば、Xenerex Biosciences, Medarex, Inc., Abgenix, Inc., Protein Design Labs, Inc.）。ヒトではない（例えばネズミ）抗体のヒト化の形態は、ヒト起源ではない免疫グロブリン由来の配列を最小限に含む、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、又はその他の抗体の抗原結合物質など）のキメラ分子である。
【０１６７】
ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（受容体抗体）を含み、そこで受容体の相補性測定領域（CDR）からの残基が、所望の特性、親和性、及び能力を備えた、マウス、ラット、又はウサギなどのヒト起源ではない種類（ドナー抗体）のCDRからの残基と入れ替えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が、対応するヒト起源ではない残基と入れ替えられる。ヒト化抗体はまた、受容体抗体にも取り入れられたCDRにもフレームワーク配列にも見られない残基を含むことがある。通常、ヒト化抗体は少なくとも1つ、一般的には二つの可変領域の実質的にすべてを含み、その可変領域において、すべて又は実質的にすべてのCDR領域はヒト起源ではない免疫グロブリンの領域と対応し、すべて又は実質的にすべてのフレームワーク（FR）領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域である。
【０１６８】
ヒト化抗体は通常、最適にはさらに、少なくとも一部分の、通常はヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域（Fc）を含む（Jones, et al. (1986) Nature （『ネイチャー』）321:522-525；Riechmann, et al. (1988) Nature （『ネイチャー』）332:323-329；及びPresta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596）。ヒト化は基本的にWinter and co-workers（Winterとその同僚）の方式に従い（Jones, et al. (1986) Nature （『ネイチャー』）321:522-525；Riechmann, et al. (1988) Nature （『ネイチャー』）332:323-327；Verhoeyen, et al. (1988) Science （『サイエンス』）239:1534-1536）、げっ歯類のCDR又はCDR配列をヒト抗体の対応配列と置換することによって行われる。従って、これらのヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許番号第4,816,567号）、実質的には完全なヒトの可変領域以下が、ヒト起源ではない種の対応配列と置換される。
【０１６９】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイラブラリーを用いて（Hoogenboom and Winter (1992) J. Mol. Biol. （『分子生物学ジャーナル』）227:381-388；Marks, et al. (1991) J. Mol. Biol. （『分子生物学ジャーナル』）222:581-597）又はヒトモノクローナル抗体を用いて（例えば、77ページ、Cole, et al. Reisfeld and Sell (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy （『モノクローナル抗体と癌の治療』）Liss；及びBoerner, et al. (1991) J. Immunol. （『免疫学ジャーナル』）147:86-95）作製することができる。
【０１７０】
同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン部位を、例えば、内生免疫グロブリン遺伝子が部分的あるいは完全に不活性化されたマウスなどの、形質転換動物に取り込むことによって作製することができる。正当性を疑われたことによって、遺伝子再構成、組み立て、及び抗体の範囲などを含む、人のほぼすべての状況に見られるものと酷似している、ヒト抗体の作製が観察された。このアプローチは例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び以下の科学出版物で説明されている：Marks, et al. (1992) Bio/Technology （『バイオ・テクノロジー』）10:779-783；Lonberg, et al. (1994) Nature （『ネイチャー』）368:856-859；Morrison (1994) Nature （『ネイチャー』）368:812-13；Fishwild, et al. (1996) Nature Biotechnology （『ネイチャー・バイオテクノロジー』）14:845-851；Neuberger (1996) Nature Biotechnology （『ネイチャー・バイオテクノロジー』）14:826；及びLonberg and Huszar (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93）。
【０１７１】
免疫治療とは、癌タンパク質に対抗して育てられた抗体による癌の治療を意味する。本明細書中で使用されるように、免疫治療とは、受動的にも能動的にもなり得る。本明細書中で受動的免疫治療と定義されるのは、受容者（患者）への受動的な抗体の転移のことである。能動的免疫法は、受容者（患者）への抗体及び/又はT細胞反応の誘導である。免疫反応の誘導は、抗体がそれに対して育てられた抗原源を受容者に提供した結果生じる。抗原は、それに反して抗体が育てられることが望まれるポリペプチドを受容者に注入することにより、又は、抗原を発現することができ、抗原の発現の条件下で免疫反応を起こすことのできる核酸を受容者に接触させることにより、提供される。
【０１７２】
好ましい態様において、それに対して抗体が育てられた癌タンパク質は、上述の通り、分泌タンパク質である。理論に拘束されることなく、治療に使用される抗体は、分泌されたタンパク質と結合しそれが受容体と結合するのを妨げる、それによって例えば自己分泌シグナルにおいて、分泌癌タンパク質を不活化させることを妨げる。
【０１７３】
他の好ましい態様において、それに対して抗体が育てられた癌タンパク質は、膜貫通タンパク質である。理論に拘束されることなく、治療に使用される抗体は癌タンパク質の細胞外領域と結合して、循環リガンドや細胞関連の分子など、他のタンパク質と結合することを妨げる。抗体は膜貫通癌タンパク質のダウンレギュレーションの原因となる。抗体は、癌タンパク質の細胞外領域に結合したタンパク質の、競合的、非競合的、又は競合できない阻害剤であり得る。抗体はまた、癌タンパク質の拮抗剤である可能性もある。さらに、抗体は膜貫通癌タンパク質の活性化を妨げたり、あるいは特定の細胞経路を誘発又は抑制する。1つの形態において、抗体が他の分子の癌タンパク質との結合を妨げる時、抗体は細胞の成長を妨げる。抗体はまた、TNF-α、TNF-β、IL-1、INF-γ、及びIL-2を含み、またそれらに限られない細胞毒性薬、又は5FU、ビンブラスチン、アクチノマイシンD、シスプラチン、メトトレキサート等を含む化学療法薬に対し、細胞をターゲットする、又は細胞がそれらに対し敏感になるようにするために使用される。いくつかの例において、抗体は、膜貫通タンパク質と複合し、それにより細胞毒性や抗体依存性の細胞毒性（ADCC）を調節する時、血清補体価を活性化するサブタイプに属する。従って、癌は膜貫通性癌タンパク質に向けられた抗体を患者に投与することによって治療される。抗体の標識付けは、毒素補体を活性化し、毒素のペイロードを局在化し、毒物含有リポソームを標的化するか、又は部分的に細胞を削除する方法を提供する。
【０１７４】
他の好ましい態様において、抗体はエフェクター部分と結合する。エフェクター部分は、放射性標識又は蛍光標識などの標識部分を含む様々な分子であったり、あるいは治療部分である可能性がある。1つの形態において、治療部分は癌タンパク質の活性を調停する小分子である。他の形態において、治療部分は、癌タンパク質に関係する又は隣接している分子の活性を調停する。治療部分は癌に関連するプロテアーゼ、又はコラゲナーゼ、又はプロテインキナーゼの活性などの、酵素又はシグナル活性を抑制し、あるいはNK細胞などの他の細胞の誘導薬となる。例えば、米国特許第09/544,494号を参照のこと。
【０１７５】
好ましい態様において、治療部分は細胞毒性薬である。この方法では、細胞毒性薬を癌組織又は細胞にターゲットすることで、癌に冒されている細胞の数が減少され、それにより癌に関連した病状が低減する。細胞毒性薬は多種多様であり、細胞毒性の薬剤、毒素、又はそれらの毒素の活性断片を含み、またこれらに限られない。適切な毒素及びそれらの対応断片は、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロタン、フェノマイシン、エノマイシン、サポリン、オーリスタチンなどを含む。細胞毒性薬はまた、放射性同位体を癌タンパク質に対して育てた抗体に結合することによってまた放射性核種を結合させることによってできる放射化学物質を含む。治療部分の膜貫通タンパク質へのターゲットには、癌に冒された領域の治療部分の局所的濃度を増加する機能があるだけでなく、ターゲットとされていない治療部分に関わる有害な副作用を低減する機能がある。抗体断片が、毒物含有リポソームの標的化に使用される。
【０１７６】
他の好ましい態様において、それに対する抗体が産生されている癌タンパク質は細胞内タンパク質である。この場合、抗体は細胞内への侵襲を助長するタンパク質と結合している。1つの事例では、抗体はエンドサイトーシスにより細胞内に侵襲する。他の態様では、抗体をコードする核酸が、個体又は細胞に投与される。さらに、癌タンパク質は細胞、例えば核の中でターゲットされるが、それに対する抗体は、例えば核局在化シグナルなど、ターゲットを局在化するシグナルを含んでいる。
【０１７７】
本発明の癌抗体は、特に癌タンパク質と結合する。本明細書中において、「特異的に結合する」とは、抗体が少なくとも約0.1 mMのKd、より一般的には少なくとも1 μM、好ましくは0.1 μM、そしてさらに好ましくは0.01 μM又はそれ以上のKdを有するタンパク質と結合することを意味する。関連配列ではなく特定のターゲットとの結合の選択性も、しばしば重要である。
【０１７８】
診断及び治療の適用のための癌配列の検出
一面において、RNAの遺伝子発現レベルは、癌の表現型における異なった細胞の状態により測定される。正常組織（例えば、癌に冒されていない）、癌組織（またいくつかの事例によっては、以下に概説するように、予後に関連する様々な癌の重症度について）、又は悪性でない疾病における遺伝子発現レベルが、発現特性の提供のために評価される。特定の細胞の状態、又は発達の時点の遺伝子発現特性は、基本的に当該細胞の状態の「フィンガープリント」である。二つの状態が、特定の遺伝子を同様に発現しているとしても、数多くの遺伝子を同時に評価することにより、細胞の状態を反映する遺伝子発現特性の作製が可能になる。異なった状態における細胞の発現特性を比較することで、それらの状態の各々についてどの遺伝子が重要であるか（アップレギュレーション及びダウンレギュレーションの両方の遺伝子を含む）に関する情報が得られる。そこで診断がなされ、あるいは確認され、組織サンプルの遺伝子発現特性が正常組織のものか、癌性組織のものであるかが測定される。これにより関連した状態の分子的診断が提供される。
【０１７９】
「差別的発現」又は本明細書中で使用されるその文法的同意語は、細胞及び組織中又はそれらの間での、一時的及び/又は細胞の遺伝子発現パターンの、質的又は量的な差をさしている。したがって、差別的に発現された遺伝子は、例えば、正常組織対癌組織において、活性化又は不活性化を含め、質的にその発現を変更することができる。遺伝子はある状態において、他の状態と対応してオン又はオフになり、それによって二つ以上の状態の比較が可能となる。質的に調節された遺伝子は、ある状態又は細胞のタイプで発現パターンを表し、それは標準的な技法で検出することができる。遺伝子によっては、状態か細胞のタイプの1つで発現され、両方では発現されない。
【０１８０】
一方、発現の違いは、例えば発現が増加又は減少するなど、量的なこともある；例えば、遺伝子発現は、上方制御で、転写の量が増加することもあるし、下方制御で転写量が減少することもある。発現の差の程度は、以下に概説される、Affymetrix社のGeneChip発現配列の使用など、標準特性技法による測定のために充分なだけ大きければよい。Lockhart (1996) Nature Biotechnology （『ネイチャー・バイオテクノロジー』）14:1675-1680参照。他の技術は、量的逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ）PCR、ノーザンアッセイ、及びリボヌクレアーゼ（RNase）プロテクションなどを含み、またこれらに限られない。上に概説されるように、好ましくは発現の変化（例えばアップレギュレーション又はダウンレギュレーション）は少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約100％、さらに好ましくは少なくとも約150％、より好ましくは少なくとも約200％、特に好ましくは300〜少なくとも1000％である。
【０１８１】
評価は遺伝子転写又はタンパク質レベルで行われる。遺伝子発現の量は遺伝子転写のRNA又はDNA等価物への核酸プローブを使用して、また遺伝子発現レベルの測量によりモニターされる。また選択的には、例えば、癌タンパク質への抗体、標準免疫アッセイ（ELISAなど）又は質量アッセイ、2Dゲル電気泳動アッセイなどを含むその他の方法により、  最終的遺伝子産物（タンパク質）そのものがモニターされる。例えば、癌又は疾病の表現型で重要であると同定された、癌遺伝子に対応するタンパク質は、癌の診断テストにより評価される。好ましい態様では、遺伝子発現のモニターは多くの遺伝子で同時に行われる。複数タンパク質の発現モニターもまた行われる。
【０１８２】
この態様では、癌核酸プローブは、特定の細胞における癌配列の検出及び測量のため、本明細書中に概説されるようにバイオチップに結合される。アッセイ法は以下に、例によってさらに詳しく説明される。PCR法はよりよい感受性を提供するために使われる。
【０１８３】
好ましい態様において、癌タンパク質をコードする核酸が検出される。癌タンパク質をコードするDNA又はRNAが検出されるが、癌タンパク質をコードするmRNAを検出する方法が、特に興味深い。mRNAを検出するプローブは、mRNAの相補体であり、またmRNAとハイブリダイズする、そしてオリゴヌクレオチド、cDNA、又はRNAを含み、それらに限らない、ヌクレオチド・デオキシヌクレオチドプローブである。プローブはまた、本明細書中に定義されるように、検出可能な標識を含んでいるべきである。1つの方法で、mRNAは、検査される核酸をナイロン膜などの固体支持体上に固定し、サンプルとプローブをハイブリダイズしてから検出される。不特定に結合したプローブを取り除くために洗浄した後、標識が検出される。他の方法では、mRNAの検出はもとのままで行われる。この方法で、浸透性を与えられた細胞又は組織サンプルは、検出可能なように標識された核酸プローブと充分な時間接触し、プローブとターゲットmRNAをハイブリダイズさせる。不特定に結合したプローブを取り除くために洗浄した後、標識が検出される。例えば、癌タンパク質をコードするmRNAの相補体である、ジゴキシゲニン標識リボプローブ（RNAプローブ）が、ジゴキシゲニンとアンチジゴキシゲニン二次抗体を結合することによって検出され、ニトロブルーテトラゾリウム及び5-ブロモ-4-クロモ-3-インドイルホスフェートによって現像される。
【０１８４】
好ましい態様において、本明細書中に説明される三つの分類のタンパク質（分泌、膜貫通、又は細胞内タンパク質）からの多様なタンパク質が診断アッセイに使用される。癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、及び癌配列を含む細胞が診断アッセイに使用される。これは個々の遺伝子又は対応するポリペプチド・レベルで行われる。好ましい態様において、発現特性が使用され、好ましくはハイスループット・スクリーニング技術と併せて、遺伝子及び/又は対応ポリペプチドの発現特性のモニターを可能にする。
【０１８５】
本明細書中に説明され、定義されるように、細胞内、膜貫通、又は分泌タンパク質を含む癌タンパク質が、例えば予後、又は診断目的のための癌のマーカーとして見られる。推定癌組織中のこれらのタンパク質の検出は、癌又は類似の疾病の検出、予後、又は診断及び治療方法の選択を可能にする。1つの態様において、癌タンパク質の検出に、抗体が使用される。好ましい方法はゲル（通常変性及び還元タンパク質ゲル、しかし等電点電気泳動ゲルなどを含む他のタイプのゲルでも良い）の電気泳動によりタンパク質をサンプルから分離する。タンパク質の分離に続いて、例えば癌タンパク質に対して産出された抗体による免疫ブロット法により、癌タンパク質が検出される。
【０１８６】
他の好ましい態様において、癌タンパク質に対する抗体は、例えば組織学におけるin situイメージング技術で使用される。例えばAsai, et al. (eds. 1993) Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology （『細胞生物学の手法：細胞生物学における抗体』）（vol. 37） Academic Press参照）。 この方法で、細胞は癌タンパク質に対する1つ以上、多数の抗体と接触する。不特定な抗体の結合を取り除くための洗浄の後、抗体の存在又は抗体が検出される。1つの態様において、抗体は、検出可能な標識を含んだ二次的抗体と培養されることによって検出される。他の方法では、癌タンパク質に対する一次抗体は、例えば基質に作用する酵素マーカーなどの、検出可能な標識を含む。他の好ましい態様では、複数の一次抗体のそれぞれが別々の検出可能な標識を含む。この方法は複数の癌タンパク質を同時にスクリーンする際に特に使用される。他にも多くの組織学的イメージング技術が本発明により提供される。
【０１８７】
好ましい態様において、標識は異なった波長の放出を検出、識別する能力を備えた蛍光光度計で検出される。加えて、蛍光活性化細胞選別装置（FACS）が当方法で使用される。
他の好ましい態様において、抗体は血液、血清、血漿、便、及びその他のサンプルからの癌の診断に使用される。これらのサンプルは、従って、癌タンパク質の存在を調査、テストされるサンプルと同様に有用である。抗体は、ELISA、免疫ブロット法（ウェスタンブロット）、免疫沈降、BIACORE技術その他を含む、前記の免疫学的アッセイ技術によって、癌タンパク質を検出するのに使用される。逆に、抗体の存在は、内性癌タンパクに対し、免疫反応を示す。
【０１８８】
好ましい態様において、標識癌核酸プローブの組織配列へのin situハイブリダイゼーションが行われる。例えば、癌組織及び/又は正常組織の組織を含むサンプルの配列が作られ、in situハイブリダイゼーションが（例えばAusubel, supra参照）行われる。個体と標準のフィンガープリントを比較し、診断、予後、又は予測は所見に基づいている。診断を示す遺伝子は、予後を示すものとは異なり、細胞の状態の分子特性は反応を示す又は不応性状態の識別又は結果の予測をもたらすことがさらに理解されている。
【０１８９】
好ましい態様において、癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、及び癌配列を含む細胞が予後アッセイに使用される。上記のように、遺伝子発現特性が、長期的予後に関して、癌、臨床、病理、又はその他の情報と相関して作製される。これもまた、タンパク質又は遺伝子レベルでなされるが、遺伝子の使用が望まれる。単一あるいは複数の遺伝子が多様な組み合わせで使用される。上述のように、癌のプローブが、組織又は患者の癌配列を検出、定量するためにバイオチップに結合される。アッセイは上述の診断で概説されたように進められる。PCR法は、より高感度で正確な定量を提供する。
【０１９０】
治療用化合物のアッセイ
好ましい態様において、本明細書中に記載されているタンパク質、核酸、抗体が、薬剤スクリーニングアッセイにおいて使用される。癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、及び癌配列を含んだ細胞は、薬剤スクリーニング・アッセイで、又は「遺伝子発現特性」又はポリペプチドの発現特性における候補物質の効能を評価するのに使用される。好ましい態様において、発現特性は、好ましくはハイスループット・スクリーニング技術と併せて使用され、候補物質による治療後の遺伝子発現特性のモニターを可能にする（例えば、Zlokarnik, et al. (1998) Science （『サイエンス』）279:84-88；Heid (1996) Genome Res. （『ゲノムRes.』）6:986-994）。
【０１９１】
好ましい態様において、癌タンパク質、抗体、核酸、修飾タンパク質、及び未変性又は修飾癌タンパク質を含んだ細胞が、スクリーニング・アッセイに使用される。すなわち、本発明は癌の表現型又は癌タンパク質の同定された生理学的機能を調節する組成物をスクリーニングする、新規方法を提供している。上述のように、これは個々の遺伝子のレベルでも、候補物質の「遺伝子発現特性」への効果の評価によってもなされる。好ましい態様において、発現特性は、好ましくはハイスループット・スクリーニング技術と併せて使用され、候補物質による治療後の遺伝子発現特性のモニターを可能にする。Zlokarnik, supra参照。
【０１９２】
差別的に発現された遺伝子が本明細書中に同定され、様々なアッセイが実行される。好ましい態様において、アッセイは個々の遺伝子又はタンパク質レベルで行われる。すなわち、癌において特定の遺伝子を上方制御されたものとして同定し、被検化合物が、遺伝子発現を調節する能力、又は癌タンパク質との結合についてスクリーンされる。「調節」とは従って、遺伝子発現の増加及び減少の両方を含む。好ましい調節量は、正常組織対癌にかかっている組織の遺伝子発現の最初の変化に基づき、変化は少なくとも10％、好ましくは50％、より好ましくは100〜300％、態様によっては300〜1000％あるいはそれ以上である。すなわち、遺伝子が、正常組織に比べ癌組織で4倍の増加を示したら、約4倍の減少がしばしば望まれ；同様に、正常組織に比べた癌組織中での10倍の減少は、しばしばテスト化合物によるターゲット値10倍の発現増加の誘導を提供する。
【０１９３】
遺伝子発現の量は、核酸プローブを使用し、遺伝子発現レベルの定量化によってモニターされるか、選択的に、遺伝子産物そのものが、例えば癌タンパク質に対する抗体及び標準免疫学的鑑定の使用によってモニターされる。プロテオミクス及び分離技術もまた発現の定量を可能にする。
好ましい態様において、遺伝子発現又は数のタンパク質がモニターする実在物、例えば、発現特性が、同時にモニターされる。このような特性は通常、本明細書中に記載されている複数の実在物を含む。
【０１９４】
この態様では、癌核酸プローブは、特定の細胞における癌配列の検出及び測量のため、本明細書中に概説されるようにバイオチップに結合される。一方PCRが使用されることもある。従って例えば一連のマイクロタイタープレートなどが、所望のセルに分注されたプライマーとともに使用される。次にPCR反応が行われ、各セルがアッセイされる。
【０１９５】
癌のモジュレータ
例えば表に示されたポリヌクレオチド配列など、1つ以上の癌関連の配列の発現を修飾する化合物を同定するために、発現モニターが行われる。通常、好ましい態様において、アッセイに先立ち、テストモジュレータが細胞に加えられる。さらに、癌を調節し、癌タンパクを調節し、癌タンパク質と結合し、又は癌タンパク質が抗体やその他の結合パートナーと結合するのを妨害する物質を同定するスクリーンもまた提供される。
【０１９６】
本明細書中で使われている用語、「テスト化合物」「候補物質」「モジュレータ」又はそれらの文法的同義語は、癌の表現型又は、例えば核酸又はタンパク質配列などの癌配列の発現を、直接的又は間接的に変更する能力がテストされる、例えばタンパク質、オリゴペプチド、小有機分子、多糖類、ポリヌクレオチドなどの分子を記載している。好ましい態様において、モジュレータは発現特性、あるいは本明細書中に提供されている核酸又はタンパク質の発現特性を変更する。1つの態様では、モジュレータは、癌の表現型を、例えば正常又は悪性でない組織のフィンガープリントに抑制する。他の態様では、モジュレータは癌の表現型を誘起する。通常、様々な濃度の異なった反応を得るために、複数のアッセイの組み合わせが、異なった薬剤濃度で並行して行われる。通常、例えば濃度0又は検出レベル以下などの、これらの濃度の1つが負の制御として機能する。
【０１９７】
候補物質は多様な化学分類を含むが、通常は有機分子、好ましくは分子量100ダルトン以上2500ダルトン以下の小有機分子である。所望の小分子は2000D以下、又は1500D以下、又は1000D以下、又は500D以下である。候補物質は、タンパク質との構造的相互作用に必要な官能基を含み、特に水素結合、また通常アミノ基、カルボニル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、好ましくは化学官能基の少なくとも二つを含む。候補物質はしばしば、上記官能基の1つ以上と置換された、環状炭素、複素環構造及び/又は芳香又は複素芳香族構造を含む。候補物質はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、派生物、構造相同体、又はそれらの組み合わせなどの生体分子中にも見られる。特にペプチドが好まれる。
【０１９８】
1つの状況で、モジュレータは癌タンパク質の効果を中和する。「中和する」とはタンパク質の活性が抑制あるいは妨害されそして結果としての細胞への効果を意味する。
特定の態様において、潜在的モジュレータの組み合わせライブラリの、癌ポリペプチドと結合する又は活性を調節する能力がスクリーンされる。従来より、例えば活性の抑制、リード化合物の変異体の作製、及びそれらの変異化合物の特性又は活性の評価など、望ましい特性又は活性を備えた化学的化合物（「リード化合物」と呼ばれる）を同定することにより、有用な性質を持つ新しい化学実在物が作製される。しばしば、これらのアッセイにハイスループット・スクリーニング（HTS）法が使用される。例えば、Janzen (2002) High Throughput Screening: Methods and Protocols （『ハイスループット・スクリーニング：方法及びプロトコル』）Humana；Devlin (ed. 1997) High Throughput Screening: The Discovery of Bioactive Substances （『ハイスループット・スクリーニング：生物活性物質の発見』）Dekker；及びMei and Czarnik (eds. 2002) Integrated Drug Discovery Techniques （『総合的薬剤発見技術』）Dekker参照。
【０１９９】
1つの態様において、ハイスループット・スクリーニング法は、多数の潜在的治療化合物（候補化合物）を含むライブラリを提供することを含む。これらの「組み合わせ化学ライブラリ」は、次に、所望の特徴的活性を表すこれらのライブラリの構成要素（特に化学種又はサブクラス）を同定する、1つ以上のアッセイによりスクリーンされる。このようにして同定された化合物は、従来の「リード化合物」として、又はそれ自身が潜在的又は事実上の治療薬として機能する。
【０２００】
組み合わせ化学ライブラリとは、試薬などの数多くの化学的「基本構成要素」を組み合わせることによる、化学合成又は生物学的合成のいずれかによって作製された多様な化学的化合物の収集である。例えば、ポリペプチド（例えばムテイン）ライブラリなどの線状の組み合わせ化学ライブラリは、与えられた化合物の長さ（例えばポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）で可能な限りの方法で、アミノ酸と呼ばれる化学的基本構成要素のセットを組み合わせることにより形成される。このような化学的基本構成要素の組み合わせ混和により、膨大な数の化学化合物が合成される（Gallop, et al. (1994) J. Med. Chem. （『医化学ジャーナル』）37:1233-1251）。
【０２０１】
組み合わせ化学ライブラリの準備及びスクリーニングは周知である。このような組み合わせ化学ライブラリは以下を含み、またこれらに限られない：ペプチドライブラリ（例えば、米国特許番号5,010,175、Furka (1991) Pept. Prot. Res. 37:487-493、Houghton, et al. (1991) Nature （『ネイチャー』）354:84-88参照）、ペプトイド（PCT公開番号WO 91/19735）、コードされたペプチド（PCT公開WO 93/20242）、任意バイオオリゴマー（PCT公開WO 92/00091）、ベンゾジアゼピン（米国特許番号5,288,514）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドなどの多様体（Hobbs, et al. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913）、ビニロガスポリペプチド（Hagihara, et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. （『米国化学学会ジャーナル』）114:6568-570）、ベータ-D-グルコース結合物を伴うノンペプチドペプチドミメティック（Hirschmann, et al. (1992) J. Amer. Chem. Soc. （『米国化学学会ジャーナル』）114:9217-9218）、小化合物ライブラリの類似的有機合成（Chen, et al. (1994) J. Amer. Chem. Soc. （『米国化学学会ジャーナル』）116:2661-662）、オリゴカルバミン酸（Cho, et al. (1993) Science （『サイエンス』）261:1303-1305）、及び/又はホスホン酸ペプチジル（Campbell, et al. (1994) J. Org. Chem. （『有機化学ジャーナル』）59:658）。通例はGordon, et al. (1994) J. Med. Chem. （『医化学ジャーナル』）37:1385-1401参照、
【０２０２】
核酸ライブラリ（例えばStratagene, Corp.参照）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第5,539,083号参照）、抗体ライブラリ（例えばVaughn, et al. (1996) Nature Biotechnology （『ネイチャー・バイオテクノロジー』）14(3):309-314、及びPCT/US96/10287参照）、炭水化物ライブラリ（例えばLiang, et al. (1996) Science （『サイエンス』）274:1520-1522、及び米国特許番号5,593,853参照）及び小有機分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、33ページ、Baum (Jan 18, 1993) C&EN；イソプレノイド、米国特許番号第5,569,588号；チアゾリジノン及びメタチアザノン、米国特許番号5,549,974；ピロリジン、米国特許番号5,525,735及び5,519,134；モルホリノ化合物、米国特許番号5,506,337；ベンゾジアゼピン、米国特許番号第5,288,514号；その他）。
【０２０３】
組み合わせライブラリを準備する装置は、市販されている（例えばMPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY（ケンタッキー州）, Symphony, Rainin, Woburn, MA（マサチューセッツ州）, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA（カリフォルニア州）, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA（マサチューセッツ州）参照）。
【０２０４】
多くの周知のロボティックシステムも、溶液化学のために開発されている。これらのシステムは、Takeda Chemical Industries, LTD（武田薬品工業株式会社）（日本国大阪府）により開発された自動合成装置などの自動ワークステーションや、化学者により行われる手動合成操作を模倣したロボティックアーム（Zymate II、Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.；Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.）を利用した、多くのロボティックシステムを含む。上述の装置は本発明での使用に適している。本明細書中で記載されているように操作するための、これらの装置への変更（もしあれば）の性質及び達成は、明白である。加えて、多くの組み合わせライブラリはそれ自体が市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, N.J.（ニュージャージー州）, Asinex, Moscow, Ru（モスクワ、ロシア）, Tripos, Inc., St. Louis, MO（ミズーリ州）, ChemStar, Ltd, Moscow, RU（モスクワ、ロシア）, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA（ペンシルバニア州）, Martek Biosciences, Columbia, MD（メリーランド州）参照）。
【０２０５】
モジュレータ同定のアッセイは、ハイスループット・スクリーニングの効果を受けやすい。好適アッセイは、従って、癌遺伝子転写の増加又は抑制、ポリペプチド発現の抑制又は強化、そしてポリペプチド活性の抑制又は増加を検出する。
【０２０６】
特定の核酸又はタンパク質産物の存在、不在、定量、又はその他の特徴の、本発明でのハイスループット・アッセイが周知である。同様に、結合アッセイ及びレポーター遺伝子アッセイも同程度に周知である。例えば米国特許番号第5,559,410号はタンパク質のハイスループット・スクリーニング法を開示し、米国特許番号第5,585,639号は核酸結合の（例えば、配列）ハイスループット・スクリーニング法を開示し、一方米国特許番号第5,576,220号及び同第5,541,061号は、リガンド/抗体結合のハイスループット・スクリーニング法を開示している。
【０２０７】
さらに、ハイスループット・スクリーニング法は市販されている（例えば、Zymark Corp., Hopkinton, MA（マサチューセッツ州）；Air Technical Industries, Mentor, OH（オハイオ州）；Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA（カリフォルニア州）；Precision Systems, Inc., Natick, MA（マサチューセッツ州）等、参照）。これらのシステムは通常、サンプル及び試薬の分注、液体の分注、時限培養、アッセイに適した検出器のマイクロプレートの最終測定を含む工程全体を自動化する。これらの設定可能なシステムは、高度な柔軟性とカスタマイズ機能と同様に、ハイスループット及び高速スタートアップを提供する。これらのシステムの製造業者は様々なハイスループット・システムの詳しいプロトコルを提供している。例えば、Zymark社は、遺伝子転写、リガンド結合その他の調節を検出するためのスクリーニングシステムの説明をする技術告示を提供している。
1つの態様において、モジュレータはタンパク質であり、しばしば天然のタンパク質又は天然のタンパク質の断片である。従って、例えばタンパク質を含んだ細胞抽出物、又はタンパク性細胞抽出物の任意あるいは有向消化物が使用される。このようにして、タンパク質のライブラリが、本発明の方法によりスクリーニング用に作られる。この態様で特に望まれるのは、バクテリア、真菌、ウィルス、及び哺乳動物のタンパク質ライブラリで、後者ほど望まれ、特にヒトのタンパク質が望まれる。特に有用なテスト化合物は、例えば、酵素又はリガンド及び受容体の基質など、ターゲットが属しているタンパク質分類に方向付けられている。
【０２０８】
好ましい態様において、モジュレータは約5〜30のアミノ酸、好ましくは5〜20のアミノ酸、特に好ましくは7〜15のアミノ酸のペプチドである。ペプチドは天然のタンパク質、ランダムペプチド、又は「偏った(biased)」ランダムペプチドの消化物である。「ランダム化された」又はその文法的同義語は本明細書中で、各核酸及びペプチドが、基本的にそれぞれランダムなヌクレオチド及びアミノ酸からなることを意味する。通常これらのランダムペプチド（又は以下に説明される核酸）は化学的に合成されたものであるため、ヌクレオチド又はアミノ酸をどの位置にでも組み込むことができる。合成プロセスは、ランダム化されたタンパク質あるいは核酸を作製するように設定され、配列の長さに渡って、全てのあるいはほとんどの組み合わせの可能性の形成を許容し、それによって、ランダム化された生物活性のタンパク性候補物質のライブラリを形成する。
【０２０９】
1つの態様において、ライブラリは完全にランダム化されており、どの位置にも配列の選択や定数はない。好ましい態様において、ライブラリは偏向されている。すなわち、配列内の位置のいくつかは一定に保たれるか、限られた可能性のなかから選択される。例えば、好ましい態様において、ヌクレオチド又はアミノ酸残基は、核酸結合領域の作製、システインの作製、クロスリンク、SH-3領域のプロリン、セリン、トレオニン、チロシン、又はリン酸化反応部位などのヒスチジン、又はプリンなどに対し、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏った（大小いずれか）残基など明確な分類の範囲内でランダマイズされている。
【０２１０】
癌のモジュレータは上述のように核酸であることもある。
上述のように、通常タンパク質について、薬剤を調節する核酸は天然の核酸、ランダム核酸、又は「偏った」ランダム核酸である。例えば原核又は真核ゲノムの消化物は、上記タンパク質について概説されたように使用される。
【０２１１】
好ましい態様において、候補化合物は有機化学的部分であり、その多様性が文献により利用可能である。
候補物質が加えられ、細胞がある程度の時間培養された後、アッセイされるターゲット配列を含んだサンプルがバイオチップに加えられる。必要であれば、既知の技術を用いてターゲット配列が準備される。例えば、サンプルは、必要に応じて行われたPCRなどの精製及び/又は増幅に併せ、既知の溶解バッファ、エレクトロポレーションなどを使用し、細胞を溶解するように処理される。例えば、ヌクレオチドに標識が共有結合され、インビトロ転写が行われる。通常、核酸はビオチン-FITC又はPE、あるいはcy3又はcy5で標識付けされる。
【０２１２】
好ましい態様では、ターゲット配列は例えば蛍光性、化学発光性、化学的、又は放射性のシグナルで標識され、ターゲット配列のプローブへの特別な結合を検出する手段を提供する。標識は、アルカリホスファターゼやホースラディシュペルオキシダーゼなどの、適切な基質を提供された時に、検出可能な産物を作製する酵素であっても良い。一方、標識は、結合はするが酵素によって触媒作用を起こしたり変更されたりしない酵素阻害剤などの、標識のついた化合物又は小分子でも良い。標識はまた、エピトープタグやビオチンなど、ストレプトアビジンに特に結合する部分又は化合物でも良い。ビオチンの例で、ストレプトアビジンは上述のように標識され、それによって結合したターゲット配列の検出可能なシグナルを提供する。結合していない標識ストレプトアビジンは通常、アッセイに先立って除去される。
【０２１３】
これらのアッセイは直接的ハイブリダイゼーションアッセイであることも「サンドイッチアッセイ」を含むこともある。サンドイッチアッセイは複数のプローブの使用を含み米国特許番号第5,681,702号、同第5,597,909号、同第5,545,730号、同第5,594,117号、同第5,591,584号、同第5,571,670号、同第5,580,731号、同第5,571,670号、同第5,591,584号、同第5,624,802号、同第5,635,352号、同第5,594,118号、同第5,359,100号、同第5,124,246号、及び同第5,681,697号におおむね概説され、上記文献の全体を本明細書中に援用する。この態様において、通常、ターゲット核酸は上記に概説されたように準備され、ハイブリダイゼーション複合体の形成を許容する条件下で、複数の核酸プローブを含むバイオチップに加えられる。
【０２１４】
本発明において、上記に概説された非常にストリンジェントな条件、中程度の条件、及び厳しくない条件などを含む、様々なハイブリダイゼーション条件が使用される。アッセイは通常、ターゲットの存在する時のみにハイブリダイゼーション複合体の標識プローブの形成を許容するストリンジェントな条件の下で行われる。厳しさの程度は、温度、ホルムアミドの濃度、塩濃度、カオトロピック塩濃度、pH、有機溶剤の濃度などを含み、これらに限られない熱力学的変数である段階媒介変数の変更によりコントロールされる。
【０２１５】
これらの媒介変数は、米国特許番号5, 681,697におおむね概説されている、非特異性結合の対照に使用されることもある。従って、非特異性結合を減少させるには、特定のステップをストリンジェントな条件で行うことが望ましい。
【０２１６】
本明細書中に概説されている反応は様々な方法で達成することができる。反応の要素は、後述の好ましい態様で、同時に又は別々の順で順次に加えられる。加えて、反応には他の様々な試薬が含まれる。これらは、最適なハイブリダイゼーション及び検出を促進し、及び/又は非特異性又は背景の相互作用を抑える、塩、バッファ、例えばアルブミン、合成洗剤などの中性タンパク質が含まれる。タンパク質分解酵素インヒビター、核酸分解酵素インヒビター、抗菌薬などの、アッセイの効果を高める他の試薬も必要に応じ、サンプルの準備法やターゲットの純度に基づいて使用される。
【０２１７】
アッセイデータは、発現レベルの測定、及び各々の遺伝子の状態の間で遺伝子発現特性を作る際の発現レベルの変化を測定するために検討される。
【０２１８】
癌の表現型のモジュレータを同定するためのスクリーニングが行われる。1つの態様において、特定の発現特性を促進又は抑制し、それによって好ましくは関連の表現型を作製することのできるモジュレータを同定するスクリーニングが行われる。他の態様では、例えば診断への適用などについて、特定の状態において重要な差別的に発現された遺伝子を同定して、個々の遺伝子の発現を偏向するモジュレータを同定するためにスクリーニングが行われる。他の態様では、差別的に発現された遺伝子の発現産物の生物学的機能を変更するモジュレータを同定するスクリーニングが行われる。ここでも特定の状態における遺伝子の重要性を同定して、遺伝子産物に結合する、及び/又は遺伝子産物の生物学的活性を調節する薬剤を同定するスクリーニングが行われる。
【０２１９】
加えて、候補物質又は治療工程に対応して誘導される遺伝子のスクリーニングが行われることもある。正常な発現パターンに導く癌の発現パターン（あるいはその反対）を抑制する、又は正常組織の遺伝子発現を模倣するように1つの癌遺伝子の発現特性を調節する能力に基づいたモジュレータを同定した後、上述のスクリーニングが行われ、薬剤に対応して特異的に調節された遺伝子が同定される。正常な組織と薬剤処理された癌組織の発現特性を比較することにより、正常組織や癌組織では発現されず、薬剤処理を受けた組織で発言される遺伝子が明らかになる。これらの薬剤特異的配列は、同定され、本明細書中に記載される癌遺伝子又はタンパク質の方法に使用される。特にこれらによってコードされた配列やタンパク質は、薬剤処理を受けた細胞のマーキング又は同定に役立つ。さらに、薬剤に誘導されたタンパク質に対する抗体を産出し、新規治療法、例えば毒物含有リポソームを処理された癌組織サンプルに標的化するのに使用することができる。
【０２２０】
従って、1つの態様において、テスト化合物が関連した癌発現特性を有する癌細胞の集団に投与される。本明細書中で「投与」又は「接触」とは、摂取及び細胞内の活性によってであれ、細胞表面の活性によってであれ、薬剤が細胞に作用することを許容する方法で、候補物質が細胞に投与されることを意味する。いくつかの態様において、タンパク性の候補物質（例えばペプチド）をコードする核酸が、アデノウィルス又はレトロウィルス構造などのウィルス構造に注入され、細胞に投与され、例えばPCT US97/01019のようにペプチド薬剤の発現が達成される。調節可能な遺伝子治療システムも使用される。
【０２２１】
ひとたびテスト化合物が細胞に投与されると、細胞は、必要に応じて洗浄され、好ましくは生理学的条件の下である程度の時間培養される。その後細胞は収集され、本明細書中に概説されるように新しい遺伝子発現特性が作製される。
【０２２２】
従って、例えば癌組織や悪性ではない組織が、例えば癌の表現型を誘導する又は抑制するなどの調節をする薬剤についてスクリーンされる。少なくとも1つ、好ましくは多くの遺伝子の発現特性の変化により、薬剤が癌の活性に効果を持つことが示唆される。このような癌の表現型の指標を定義することにより、表現型を改正する新しい医薬剤のスクリーニングが考察される。この方法だと、薬剤のターゲットが既知である必要も最初の発現スクリーニング基盤に表示されている必要もなく、またターゲットタンパク質の転写レベルを変える必要もない。
【０２２３】
好ましい態様において、上述のように、個々の遺伝子及び遺伝子産物（タンパク質）のスクリーニングが行われる。すなわち、特定の差別的に発現された遺伝子を特定の状態で重要なものと同定して、遺伝子発現か遺伝子産物そのもののいずれかのモジュレータのスクリーニングが行われる。差別的に発現された遺伝子の遺伝子産物は、本明細書中で時に「癌タンパク質」又は「癌修飾タンパク質」と呼ばれる。癌の修飾タンパク質はタンパク質の断片であるか、表の核酸によりコードされた断片の完全長のタンパク質である。好ましくは癌修飾タンパク質は断片である。好ましい態様において、配列の同一性又は類似性を測定するのに使用される癌核酸は、表の核酸によりコードされる。他の態様では配列は、表の核酸によりコードされた、タンパク質の天然の対立遺伝子の変異体である。他の態様において、配列は本明細書中でさらに記載されるような配列変異体である。
【０２２４】
好ましくは、癌修飾タンパク質は14〜24のアミノ酸の長さの断片である。より好ましくは当該断片は溶解性の断片である。好ましくは断片は非膜貫通性の領域を含む。好ましい態様において、当該断片は溶解性を助けるN-端末Cysを有する。1つの態様では、断片のC-端末は遊離酸として保たれ、N-端末は例えばシステインなどとの結合に役立つ遊離アミンである。
【０２２５】
1つの態様で、癌タンパク質は本明細書中に記載されるように、免疫原性の薬剤と結合する。1つの態様において、癌タンパク質はBSAと結合する。
癌ポリペプチド活性、癌、又は癌の表現型の測定は、多様なアッセイ法を用いて行うことができる。例えば、テスト化合物の癌ポリペプチドの機能への効果は、上述の試験媒介変数により測定できる。活性に効果する適切な生理学的変化が、本願発明のポリペプチド状のテスト化合物の効果をアッセイするのに使用される。無傷の細胞又は動物を使用して機能配列が測定されると、以下のような多様な効果を測定することもまた可能になる：癌が腫瘍と関係している場合、腫瘍の成長、腫瘍の転移、新血管形成、ホルモン放出、既知のまた特徴付けられていない遺伝子マーカーへの転写の変化（例えばノーザンブロット）、細胞増殖又はpH などの細胞の代謝作用の変化、及びcGMPなどの細胞内の第二のメッセンジャーの変化。本発明のアッセイでは例えばマウスや、好ましくはヒトなどの、哺乳動物の癌ポリペプチドが特に使われる。
【０２２６】
調節活性のある化合物を同定するアッセイはインビトロで行うことができる。例えば、癌ポリペプチドは、まず潜在性モジュレータと接触し、例えば0.5〜48時間など適切な長さの時間培養される。1つの態様において、癌ポリペプチドレベルは、タンパク質又はmRNAのレベルを測定することにより、インビトロで測定される。タンパク質レベルは、癌ポリペプチド又はその断片に選択的に結合する抗体と共に通常ウェスタンブロット、ELISA、その他の免疫学的アッセイにより測定される。mRNAの測定には、例えばPCR、LCRを使用した増幅、例えばノーザンハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションアッセイ、RNA分解酵素（リボヌクレアーゼ）プロテクション、ドットブロッティングが望まれる。タンパク質又はmRNAのレベルは通常、本明細書中に記載されるように、例えば、蛍光標識又は放射活性標識された核酸、放射活性標識又は酵素標識された抗体などの標識検出剤を直接又は間接的に使用することにより検出される。
【０２２７】
一方、レポーター遺伝子システムは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、CAT、又はβ-galなどのレポーター遺伝子と操作的に結合している癌タンパク質プロモータを使用して考案される。レポーター構成は通常細胞に形質移入される。潜在的モジュレータによって処理された後、レポーター遺伝子の転写、翻訳又は活性の量は、標準的技法に基づいて測定される。
【０２２８】
好ましい態様において、上述のように、個々の遺伝子及び遺伝子産物（タンパク質）のスクリーニングが行われる。すなわち、特定の差別的に発現された遺伝子をある特定の状態で重要であると同定して、遺伝子発現又は遺伝子産物発現のモジュレータのスクリーニングが行われる。差別的に発現された遺伝子の遺伝子産物は、本明細書中で時に「癌タンパク質」と呼ばれる。癌タンパク質はタンパク質の断片であるか、本明細書中に示される断片の完全長のタンパク質である。
【０２２９】
1つの態様において、特定の遺伝子発現のモジュレータのスクリーニングが行われる。通常、1つあるいは少数の遺伝子のみの発現が評価される。他の態様において、スクリーニングはまず、差別的に発現したタンパク質に結合する化合物を発見するように設定される。これらの化合物は次に、差別的に発現された活性を調節する能力について評価される。さらに、最初の候補化合物が同定されると、変異体はよりよい構造活性関係の評価のために、さらにスクリーニングを受ける。
【０２３０】
好ましい態様において、結合アッセイが行われる。通常、精製された又は単離された遺伝子産物が使用される；すなわち、1つ以上の差別的に発現された核酸の遺伝子産物が作られる。例えば、タンパク質遺伝子産物に対する抗体が作製され、存在するタンパク質の量を測定する為に標準免疫学的アッセイがなされる。一方、癌タンパク質を含む細胞がアッセイにおいて使用される。
【０２３１】
従って、好ましい態様において、癌タンパク質と候補化合物の結合方法、及び癌タンパク質への化合物の結合の測定方法が含まれる。好ましい態様はヒトの癌タンパク質を用いるが、例えばヒトの疾病の動物モデルを開発するために、他の哺乳動物のタンパク質が使用されることもある。いくつかの態様においては、上述のように、癌タンパク質の変異体又は派生物が使用される。
【０２３２】
通常、この方法の好ましい態様において、好ましくは単離されたサンプル受け入れ領域（例えば、マイクロタイタープレート、配列その他）を備え、癌タンパク質又は候補物質は不溶性の支持体に拡散しないように結合する。不溶性の支持体は、そこに組成物が結合するような組成物でできており、可溶性の物質から容易に分離され、さもなければスクリーニング法全体に互換性のあるものである。当該支持体の表面は、固体又は多孔性で、適切な形状をしている。適切な不溶性の支持体の例として、マイクロタイタープレート、配列、膜及びビーズを含む。これらは通常、ガラス、プラスチック（例えばポリスチレン）、多糖、ナイロン又は ニトロセルロース、テフロンなどでできている。マイクロタイタープレートと配列は、少量の試薬及びサンプルを使用して、多数のアッセイを同時に行うことができるため特に便利である。本発明の試薬及び全面的な方法と互換性をもち、組成物の活性を維持し、非拡散性である限り、組成物の特別な結合方法は、通常重要ではない。好ましい結合方法は、抗体の使用（タンパク質が支持体に結合された時に、リガンド結合部又は活性化配列を立体的に遮らないもの）、「スティッキー（粘着性のあるもの）」又はイオン支持体への直接的結合、化学的架橋結合、 表面上でのタンパク質又は薬剤の合成などを含む。タンパク質又は薬剤の結合に続き、余分な結合しなかった物質が洗浄により取り除かれる。サンプル受け取り領域はその後、ウシ血清アルブミン（BSA）、カゼイン、又はその他の無害なタンパク質あるいは他の部分での培養により遮蔽される。
【０２３３】
好ましい態様において、癌タンパク質は支持体に結合し、テスト化合物がアッセイに加えられる。一方、候補物質は指示体に結合し、癌タンパク質が加えられる。新規結合剤は、特別な抗体、化学ライブラリのスクリーンで同定された自然でない結合剤、ペプチド類似体などを含む。ヒトの細胞に対し毒性の低い薬剤のスクリーニングアッセイは特に興味深い。標識インビトロタンパク質/タンパク質結合アッセイ、電気泳動の移動性の変化アッセイ、タンパク質結合の免疫学的アッセイ、機能アッセイ（リン酸化反応のアッセイなど）などを含む、多様なアッセイがこの目的で使用されている。
【０２３４】
テスト調節化合物と癌タンパク質の結合の測定は、多くの方法で行われる。好ましい態様において、化合物は標識されており、例えば、癌タンパク質のすべて又は一部を固体の支持体に結合させ、標識候補物質（例えば蛍光標識）を加え、余分な試薬を洗い流し、固体支持体上に標識が存在するかどうかを測定することにより、結合が直接測定される。様々な遮蔽及び洗浄ステップが必要に応じて使用される。
【０２３５】
いくつかの態様では、例えばタンパク質（又はタンパク性候補化合物）など、化合物の1つだけが標識付けされる。一方、タンパク質には125I、化合物には蛍光など、1つ以上の化合物が異なった標識により標識付けされる。近接試薬、例えばクエンチング剤又はエネルギー伝達剤も有用である。
【０２３６】
1つの態様において、テスト化合物の結合は競争結合アッセイにより測定される。競合物質は、抗体、ペプチド、結合パートナー、リガンドなどの、ターゲット分子（例えば癌タンパク質）に結合することが知られている結合部分である。特定な状況の下で、結合部分が化合物と置換される、化合物と結合部分の競争結合がある。1つの態様において、テスト化合物は標識されている。化合物か競合物質のいずれか又は両方が、存在するならば、まず結合を許容するのに充分な時間、タンパク質に加えられる。通常約4〜40℃の間の、最適な活性を促進する温度で培養が行われる。培養時間は通常、例えば高速ハイスループット・スクリーニングの促進などのため最適化される。通常0.1〜1時間で充分である。余分な試薬は通常除去又は洗い落とされる。次に二番目の化合物が加えられ、結合を指示するために標識化合物の存在又は不在が続く。
【０２３７】
好ましい態様において、競合物質がまず加えられ、テスト化合物がそれに続く。競合物質の置換は、テスト化合物が癌タンパク質と結合し、従って癌タンパク質と結合が可能であり、癌タンパク質の活性を調節することができることを示す。この態様で、いずれかの化合物を標識することができる。従って例えば、もし競合物質が標識されれば、洗浄溶液中の標識の存在は薬剤による置換を示す。一方、テスト化合物が標識されれば、支持体上の標識の存在は置換を示す。
【０２３８】
選択的態様において、培養、洗浄によりテスト化合物が最初に加えられ、競合物質が続く。競合物質による結合の不在は、テスト化合物がより高い親和性で癌タンパク質と結合したことを示す。従って、もしテスト化合物が標識されていれば、競合物質の結合の不在を伴う支持体上の標識の存在は、テスト化合物が癌タンパク質に結合する能力があることを示す。
【０２３９】
好ましい態様において、方法は癌タンパク質の活性を調節する能力のある薬剤を同定する差別的スクリーニングを含む。1つの態様において、当該方法は癌タンパク質と競合物質を1つ目のサンプル中で結合させることを含む。二番目のサンプルはテスト化合物、癌タンパク質、及び競合物質を含む。競合物質の結合は両方のサンプルについて測定され、二つのサンプル間の結合の変化、又は違いは癌タンパク質と結合しその活性を調節する能力のある薬剤の存在を示す。すなわち、二番目のサンプル中の競合物質の結合が一番目のサンプルと比べて異なる場合、薬剤には癌タンパク質と結合する能力がある。
【０２４０】
一方、差別的スクリーニングは、未変性の癌タンパク質とは結合するが、修飾癌タンパク質とは結合できない候補物質の同定に使用される。癌タンパク質の構造のモデルが作られ、合理的な薬剤のデザイン中でその部位と相互作用する薬剤を合成するために使用された。癌タンパク質の活性に影響する候補物質も、タンパク質の活性を促進又は抑制する能力のいずれかについての薬剤のスクリーニングによって同定される。
【０２４１】
アッセイにおいて、ポジティブコントロールとネガティブコントロールが使用される。好ましくは対照群とテストサンプルは、統計的に有効な結果を得るため、少なくとも3回テストされる。すべてのサンプルの培養は薬剤がタンパク質と結合するのに充分な時間だけ行われる。培養の後、サンプルは非特異的に結合した物質を洗い流し、結合量、通常標識された薬剤の量が測定される。例えば、放射標識が使われた場合、結合した化合物の量を測定するのに、シンチレーションカウンターでサンプルが測量される。
【０２４２】
多様な他の試薬がスクリーニングアッセイに含まれる。これらは、塩や、例えばアルブミン、合成洗剤などの中性たんぱく質など、最適なタンパク質/タンパク質結合を促進し、及び/又は非特異的又は背景の相互作用を抑制する試薬を含む。さらに、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌薬など、アッセイの能率を高める試薬も使用される。混合組成物が必要な結合を提供する順番で加えられる。
【０２４３】
好ましい態様において、本発明は癌タンパク質の活性を調節することのできる化合物のスクリーニング方法を提供する。当該方法はテスト化合物を、上述のように癌タンパク質を含む細胞に加えることを含む。好ましい細胞のタイプはほぼすべての細胞である。細胞は、癌たんぱく質をコードする組み換え核酸を含む。好ましい態様において、候補物質のライブラリが複数の細胞についてテストされる。
【０２４４】
1つの状態で、アッセイが、例えばホルモン、抗体、ペプチド、抗原、サイトカイン、成長因子、活動電位、化学治療、放射線、発癌性、その他の細胞（例えば細胞/細胞接触）を含む薬物などの、生理学的シグナルの存在、不在、又は以前のあるいは継続的露出について評価される。他の例では、細胞周期工程の他の段階で測定が行われる。
【０２４５】
癌薬剤を調節する化合物はこのようにして同定される。薬理活性のある化合物は癌タンパク質の活性を促進又は抑制することができる。類似の構造は、ひとたび同定されると、化合物の重要な構造上の特徴を同定するため評価される。
【０２４６】
1つの態様において、癌細胞の分裂を抑制する方法が提供される。当該方法は癌のインヒビターの投与を含む。他の態様においては、癌を抑制する方法が提供される。当該方法は癌のインヒビターの投与を含む。更なる態様において、例えば癌のインヒビターの投与を含む、癌を伴う細胞又は個体を治療する方法が提供される。
【０２４７】
1つの態様において、癌のインヒビターは上述のように抗体である。他の態様では、癌のインヒビターはアンチセンス分子である。
以下に記すように、様々な細胞の成長、増殖、生存性、及び転移のアッセイが利用できる。
【０２４８】
軟寒天成長又は検査液中のコロニー形成
正常な細胞は、接着、成長するために固体基質を必要とする。細胞は形質転換されると、その表現型を失い、基質から離れて成長する。例えば、形質転換された細胞は撹拌された検査液培地で成長する、又は半固体あるいは軟寒天などの半固体のメディア中に浮遊していることができる。形質転換細胞は、腫瘍抑制遺伝子により形質移入されると、正常な表現型を再生し、接着、成長のために固体基質を必要とする。軟寒天成長又はアッセイ検査液中のコロニー形成は、宿主細胞中で発現されると異常な細胞増殖及び形質転換を抑制する、癌配列のモジュレータを同定するのに使用される。治療用の化合物は、宿主細胞が撹拌された検査液培地で成長したり、半固体又は軟寒天などの半固体メディア中に浮遊する能力を低減又は除去する。
【０２４９】
軟寒天成長又は検査液中のコロニー形成アッセイの技術は例えばFreshney (1998) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique （『動物細胞の培養：基本技術の手引き』） (3d ed.) Wiley-Liss；Freshney (2000) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique （『動物細胞の培養：基本技術の手引き』） (4th ed.) Wiley-Liss；及びGarkavtsev, et al. (1996) Nature Genet. 14:415-20に説明されている。
【０２５０】
接触の抑制及び成長の濃度の限界
正常な細胞は通常、ペトリ皿中で他の細胞と接触するまでは平らな系統的なパターンで成長する。細胞は接触阻止性であり、互いに接触すると成長が停止する。しかしながら形質転換すると、細胞は接触阻止性ではなくなり、高密度にまとまりのない巣状に成長を続ける。従って形質転換細胞は正常な細胞に比べ、高い飽和濃度で成長する。これは方向性のない細胞の単層形成、又は周囲の正常細胞の規則的パターン内の巣中における円形細胞により、形態学的に検出される。一方、飽和濃度での(3H)-チミジンによる標識率が、成長の濃度限界の測定に使用される。Freshney (2000), supra参照。形質転換された細胞は、腫瘍抑制遺伝子により形質移入されると、正常な表現型を再生し、接触阻止性となり低濃度に成長する。
【０２５１】
このアッセイで、飽和濃度での (3H)-チミジンによる標識率は、成長の濃度限界を測定する好適方法である。性質転換された宿主細胞は、癌関連の配列により形質移入され、制限のないミディアムの条件において飽和濃度で24時間育てられる。(3H)-チミジンによる標識率はオートラジオグラフィーにより測定される。Freshney (1998), supra参照。
【０２５２】
成長因子又は血清依存性
形質転換細胞は通常、それらに対応する正常細胞に比べ血清依存性が低い（例えば、Temin (1966) J. Natl. Cancer Insti. （『国立癌研究所ジャーナル』）37:167-175；Eagle, et al.(1970) J. Exp. Med. （『Exp.Med.ジャーナル』）131:836-879）；Freshney, supra参照。これは1つには、形質転換細胞による様々な成長因子の放出に起因する。宿主細胞の成長因子又は血清依存性を、対照群のそれと比較することができる。
【０２５３】
腫瘍特異性マーカーレベル
腫瘍細胞は、対応する正常細胞に比べ、多量の特定因子（以後「腫瘍特異性マーカー」とする）を放出する。例えば、プラスミノゲン活性化因子（PA）は、正常な脳細胞に比べ、ヒトグリオーマからより高いレベルで放出される（例えばMihich (ed. 1985) Biological Responses in Cancer （『癌の生物学的反応』）Plenum中178-184ページ、Gullino "Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth" （「血管新生、腫瘍の脈管化、及び腫瘍の成長との潜在的干渉」）参照）。同様に、腫瘍血管新生因子（TAF）が腫瘍細胞から、対応する正常細胞に比べ高レベルで放出される。Folkman (1992) Sem. Cancer Biol. （『癌生物学セミナー』）3:89-96参照。
【０２５４】
これらの因子の放出を測定する様々な技法がFreshney (1998), supraに説明されている．さらに、Unkeless, et al. (1974) J. Biol. Chem. （『生化学ジャーナル』）249:4295-4305；Strickland and Beers (1976) J. Biol. Chem. （『生化学ジャーナル』）251:5694-5702；Whur, et al. (1980) Br. J. Cancer （『Br. J. 癌』）42:305-312；Mihich (ed. 1985) Biological Responses in Cancer （『癌の生物学的反応』）Plenum中178-184ページ、Gullino "Angiogenesis, tumor vascularization, and potential interference with tumor growth" （「血管新生、腫瘍の脈管化、及び腫瘍の成長との潜在的干渉」）；Mihich (ed. 1985) Biological Responses in Cancer Plenum（『癌プレナムの生物学的反応』）178−184ページ；  Freshney (1985) Anticancer Res. （『抗癌Res.』）5:111-130参照。
【０２５５】
マトリゲルへの侵襲性
マトリゲルあるいは他の細胞外基質構造への侵襲性の程度は、癌関連配列を調節する化合物を同定するアッセイとして使用される。腫瘍細胞は、細胞の悪性度とマトリゲルあるいは他の細胞外基質構造への侵襲性の間の充分な相関関係を示す。このアッセイで、発癌性の細胞が通常宿主細胞として使用される。これらの宿主細胞における腫瘍抑制遺伝子の発現は、宿主細胞の侵襲性を低下させる。
【０２５６】
Freshney (1994), supraに記載された技術が使用される。簡単に言うと、宿主細胞の侵襲レベルはマトリゲルあるいは他の細胞外基質構造により被覆されたフィルターを使用して測定される。ゲル中への侵襲、又はフィルターの遠位側への貫通が、侵襲性として評定され、また細胞数及び移動した距離により、あるいは細胞をあらかじめ125Iにより標識し、フィルターの遠位側又はディッシュの底での放射性を測定することにより、組織学的に評定される。例えばFreshney (1984), supra参照。
【０２５７】
インビボの腫瘍の成長
癌関連配列の細胞の成長への影響は、遺伝子導入マウス又は免疫力の弱ったマウスでテストされる。癌遺伝子が分裂された、あるいは癌遺伝子が挿入されたノックアウト遺伝子導入マウスが作られる。ノックアウト遺伝子導入マウスは、マーカー遺伝子あるいはその他の異種の遺伝子を、マウスゲノムの内生癌遺伝子部位に相同の組み換えを介して挿入することによりつくられる。これらのマウスはまた、癌の遺伝子の変異型と内生癌遺伝子を置換することによって、又は例えば発癌性物質に接触させて内生癌遺伝子を突然変異させることによってつくることもできる。
【０２５８】
DNA構築物は胚幹細胞核に導入される。新しく作り出された遺伝的損傷を含む細胞が、宿主マウスの胚に注入され、メスの受容体に再移植される。これらの胚のいくつかは発達して、変異細胞株から部分的に由来した生殖細胞を有するキメラ・マウスになる。従って、キメラ・マウスを交配することにより、導入された遺伝子損傷を含む新しいマウスの種類を得ることができる。（例えばCapecchi, et al. (1989) Science （『サイエンス』）244:1288-1292参照）。キメラターゲットマウスは以下に基づいて得ることができる：Hogan, et al. (1988) Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual （『マウスの胚の操作：実験の手引き』）CSH Press; and Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach （『奇形癌と胚幹細胞：実践アプローチ』）IRL Press, Washington, D.C。
【０２５９】
一方、様々な免疫力の低下した、あるいは免疫不全の宿主動物が使用される。例えば、遺伝的に胸腺欠損の「ヌード」マウス（例えばGiovanella, et al. (1974) J. Natl. Cancer Inst. （『国立癌研究所ジャーナル』）52:921-930参照）、SCID（重症複合型免疫不全症）マウス、胸腺摘出されたマウス、又は放射線照射されたマウス（例えばBradley, et al. (1978) Br. J. Cancer （『Br. J.癌』）38:263-272；Selby, et al. (1980) Br. J. Cancer （『Br. J.癌』）41:52-61参照）が、宿主として使用される。同質遺伝子の宿主に注射された移植性腫瘍細胞（通常約106細胞 ）は、非常に比率の高い事例で侵襲性の腫瘍を作製するが、同様の起源の正常細胞はこれらを作製しない。侵襲性の腫瘍を生み出した宿主において、癌関連の配列を発現する細胞が皮下注射される。適切な期間、好ましくは約4〜8週間後に、腫瘍の成長が測定され（体積により、又はその二つの最も大きな寸法により）、対照群と比較される。統計的に有効な減少のあった腫瘍（例えばStudent's T test（T検定）使用）は、成長抑制があったといわれる。
【０２６０】
癌のポリヌクレオチド・モジュレータ
アンチセンス及びRNAi（RNA干渉）ポリヌクレオチド
特定の態様において、癌関連タンパク質の活性は、インヒビター又は、例えば癌タンパク質mRNA又はその続きなどの核酸配列のコーディングmRNAと核酸相補体で、それと好ましくは特異的にハイブリダイズする、アンチセンス・ポリヌクレオチドの使用により下方制御されている、又は完全に抑制されている。アンチセンス・ポリヌクレオチドをmRNAに結合することによりmRNAの翻訳及び/又は安定性が低下する。
【０２６１】
本願発明の状況において、アンチセンス・ポリヌクレオチドは自然に生じたヌクレオチド、又は自然に生じたサブユニットあるいはそれに非常に近い同属体から形成された合成種を含むことができる。アンチセンス・ポリヌクレオチドはまた、糖部分あるいは糖内結合を変えることもある。これらの例示はチオリン酸その他の硫黄含有種である。類似体は、癌タンパク質mRNAとハイブリダイズするように効果的に機能する限り、本願発明に包含される。例えばIsis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA；Sequitor, Inc., Natick, MA参照。
【０２６２】
これらのアンチセンス・ポリヌクレオチドは組み換え法により容易に合成でき、またインビトロで合成できる。当該合成に必要な機材はApplied Biosystems社を含むいくつかの専門業者により販売される。チオリン酸及びアルキレート派生物などの他のオリゴヌクレオチドの準備も周知である。
【０２６３】
本明細書中で使用されるアンチセンス分子は、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む。センス・オリゴヌクレオチドは、例えばアンチセンス鎖と結合して転写を遮るために使用されることができる。アンチセンス及びセンス・オリゴヌクレオチドは、癌分子がターゲットmRNA（センス）又はDNA（アンチセンス）と結合することのできる、一本鎖の核酸配列（RNAかDNAのいずれか）を含む。好ましいアンチセンス分子は、表の癌配列、又はリガンドあるいはそのアクチベーターのためのものである。本発明によると、アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、通常少なくとも約14のヌクレオチド、好ましくは約14〜30のヌクレオチドの断片を含む。与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づいた、アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドを抽出する能力については、例えばStein and Cohen (1988) Cancer Res. （『癌Res.』）48:2659-2668；及びvan der Krol, et al. (1988) BioTechniques （『バイオテクニック』）6:958-976に説明されている。
【０２６４】
RNA干渉は配列特異な方法で遺伝子発現を抑制するメカニズムである。例えば、Brumelkamp, et al. (2002) Sciencexpress （『サイエンスエクスプレス』）(21March2002)；Sharp (1999) Genes Dev. （『遺伝子Dev.』）13:139-141；及びCathew (2001) Curr. Op. Cell Biol. （『Curr. Op.細胞生物学』） 13:244-248参照。哺乳動物の細胞において、例えば21nt、二本鎖の短いRNA干渉（siRNA）が、RNA干渉応答を誘導するのに効果的であることが示されている。例えばElbashir, et al. (2001) Nature （『ネイチャー』）411:494-498参照。当メカニズムは、例えば疾病の治療又は関連性の確認など、同定された遺伝子の発現レベルを下方制御するのに使用される。
【０２６５】
リボザイム
アンチセンスヌクレオチドに加えて、リボザイムが癌関連のヌクレオチド配列をターゲットにする、又はその転写を抑制するのに使用される。リボザイムは他のRNA分子を触媒的に分裂させるRNA分子である。グループIリボザイム、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、RNase P（リボヌクレアーゼP）、及びアックスヘッド型リボザイムなどを含む、様々な種類のリボザイムについて説明がされている（例えば、様々なリボザイムの特性の総合的見直しには、Castanotto, et al. (1994) Adv. in Pharmacology （『Adv.薬理学』）25: 289-317参照）。
【０２６６】
ヘアピン型リボザイムの総合的特性は、例えばHampel, et al. (1990) Nucl. Acids Res. （『核酸Res.』）18:299-304；欧州特許公開番号0 360 257；米国特許番号5,254,678に記載されている。準備方法は、例えばWO 94/26877；Ojwang, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA （『Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 』）90:6340-6344；Yamada, et al. (1994) Human Gene Therapy （『ヒト遺伝子治療』）1:39-45；Leavitt, et al.(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA （『Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 』）92:699-703；Leavitt, et al. (1994) Human Gene Therapy （『ヒト遺伝子治療』）5:1151-120；及びYamada, et al. (1994) Virology （『ウィルス学』）205: 121-126に記載されている。
【０２６７】
WO91/04753に記載されるように、リガンド結合分子との結合を形成することで、ターゲットヌクレオチド配列を含んだ細胞に、ポリヌクレオチド癌モジュレータが導入される。適切なリガンド結合分子は、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面受容体と結合する他のリガンドを含み、またこれらに限られない。好ましくはリガンド結合分子の結合は、リガンド結合分子がその対応分子又は受容体と結合する能力を実質的に干渉せず、またセンスあるいはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその結合種が細胞に侵襲することを遮らない。一方、ポリヌクレオチド癌モジュレータは、例えばWO 90/10448に記載されるよう、ポリヌクレオチド/脂質複合体を形成することにより、ターゲット核酸配列を含む細胞内に導入される。アンチセンス分子、ノックアウトモデル、又はノックインモデルが、治療法に加え上述のようなスクリーニングアッセイにおいても使用されることがわかっている。
【０２６８】
従って、1つの態様において、細胞又は生物内の癌を調節する方法が提供される。1つの態様において、当該方法は、内性癌タンパク質の生物学的活性を低下あるいは除去する、抗癌抗体の細胞への投与を含む。一方当該方法は、癌タンパク質をコードする組み換え核酸の細胞又は生物への投与を含む。これは多数の方法により達成することができる。好ましい態様において、例えば癌において癌配列が下方制御されている場合、このような状況は細胞中の癌遺伝子産物の量を増加することによって逆転できる。これは、既知の遺伝子治療技術を用い、例えば内性癌遺伝子を過剰発現したり、癌配列をコードする遺伝子を投与することによって達成される。好ましい態様において、遺伝子治療技術は、例えばPCT/US93/0386に説明されるように、外因性の遺伝子を強化同族組み換え（HER）により合併することを含む。一方、例えば癌において癌配列が上方制御されている場合、例えば癌のアンチセンス又はRNA干渉などのインヒビターを投与することによって、内性癌遺伝子の活性が減少される。
【０２６９】
1つの態様において、本発明の癌タンパク質は、癌タンパク質のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を作製するのに使用される。同様に、癌タンパク質は、標準的技術の使用により、親和性クロマトグラフィ・カラムに結合する。そして、これらのカラムは製造、診断又は治療目的で有用である癌抗体を精製するために使用される。好ましい態様において、当該抗体は癌タンパク質に特有のエピトープに作製される；すなわち、抗体は他のタンパク質に対しほとんどまったく交差反応性を示さない。癌抗体は、標準親和性クロマトグラフィ・カラムに結合され、癌タンパク質を精製するのに使用される。抗体はまた、癌たんぱく質と特異的に結合するため、上述のように、ポリペプチドを遮るために使用される。
【０２７０】
変異癌関連配列の同定方法
理論に拘束されることなく、変異癌配列の発現は、癌と関連している。従って、突然変異又は変異癌遺伝子に基づいた疾患を測定することができる。1つの態様において、本発明は変異癌遺伝子を含む細胞の同定方法、例えば細胞中の少なくとも1つの内性癌遺伝子配列のすべて又は一部分を測定する方法、を提供する。これは通常個体の少なくとも1つの組織においてなされ、多くの組織又は同組織の異なったサンプルの評定を含む。当該方法は、配列された癌遺伝子と既知の癌遺伝子、例えば野生型遺伝子との配列の比較を含む。
【０２７１】
癌遺伝子のすべて又は一部の配列は、次に、既知の癌遺伝子と比較され、違いがあるかどうかが測定される。これはBestfitなど、既知の相同プログラムを使用して行われる。好ましい態様において、本明細書中に概説されるように、患者の癌遺伝子と既知の癌遺伝子間の配列の差の存在は、疾病の状態あるいは疾病状態の傾向と関連する。
【０２７２】
好ましい態様において、癌遺伝子はゲノム中の癌遺伝子のコピー数を測定するプローブとして使用される。
他の好ましい態様において、癌遺伝子はその染色体の局所性を測定するプローブとして使用される。染色体の局所性などの情報は、転座などの染色体異常が癌遺伝子座で同定されたとき、特に診断又は予後を提供するのに使用される。
【０２７３】
薬剤及びワクチン製剤の投与
1つの態様において、治療上効果的な投与量の癌タンパク質又はそのモジュレータが患者に投与される。本明細書中で「治療上効果的な投与量」とは、その投与が効果を表すだけの投与量を意味する。正確な投与量は治療の目的によるもので、既知の技術を使用して確認することができる。例えばAnsel, et al. (1999) Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery （『薬剤投与形式及び薬物デリバリー』）Lippincott；Lieberman (1992) Pharmaceutical Dosage Forms （『薬剤投与形式』）(vols. 1-3) Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981；Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding （『薬剤調合の技術、科学及びテクノロジー』）Amer. Pharmaceut. Assn.；及びPickar (1998) Dosage Calculations （『投与量の計算』）Thomson参照。癌の悪化、全身デリバリー対局所デリバリー、新しいプロテアーゼ合成の比率と共に、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食生活、投与時間、薬物間相互作用及び 疾病の重症度に対する調節が必要である。米国特許出願番号09/687,576が、組成物の使用と癌の診断及び治療方法についてさらに開示している。 
【０２７４】
本発明の目的で「患者」とは、ヒト及び特に哺乳動物である他の動物を含む。従って当該方法はヒトの治療及び獣医科における適用の両方に適応できる。好ましい態様において、患者は哺乳動物、好ましくは霊長類であり、最も好ましい態様において、患者はヒトである。
【０２７５】
本発明の癌タンパク質及びそのモジュレータの投与は、経口、皮下、静脈注射、鼻腔内、経皮、腹膜内、筋肉注射、肺臓内、経膣、経肛門、眼内を含み、またこれらに限らない様々な方法で行われる。例えば外相及び炎症の治療などの場合には、癌タンパク質及びモジュレータが液体又はスプレーで、直接塗布されることもある。
【０２７６】
本発明の医薬組成物は、患者への投与に適した形状の癌タンパク質を含む。好ましい態様において、医薬組成物は、酸、塩基の両方が加わった塩を含む、調薬上容認できる塩など、水溶性形態である。「薬学的に容認できる酸添加塩」とは、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、生物学的その他に望ましくない塩で以下のものから形成される：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸その他の無機酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、 琥珀酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸その他の有機酸。「薬学的に容認できる塩基添加塩」とはナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などの無機塩基から得られた塩を含む。アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム及びマグネシウム塩が特に好まれる。薬学的に容認できる有機非毒性塩基由来の塩は、第1、第2、及び第3アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、及びエタノールアミンなどの、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂などの塩を含む。
【０２７７】
医薬組成物はまた、以下の1つ以上を含む：血清アルブミンなどの担体タンパク質；バッファ；微結晶性セルロース、乳糖、コーンスターチその他のでんぷんなどの賦形剤；結合剤；甘味料などの香料添加剤；着色剤；及びポリエチレングリコール。
医薬組成物は投与方法に基づき、様々な単位投与形式で投与することができる。例えば、経口投与に適した単位投与形式は、粉末、錠剤、丸薬、カプセル及びトローチを含み、またそれらに限られない。癌タンパク質モジュレータ（例えば抗体、アンチセンス構築物、リボザイム、有機小分子など）は、経口投与されるとき、消化から保護されなくてはならないことが認められている。これは通常、酸性又は酵素加水分解への耐性を与えるため分子を組成物と複合する、又は分子を、リポソーム又は保護バリアなどの、適切な耐性のあるキャリア内に装填することにより達成される。薬剤を消化から守る方法が存在する。
【０２７８】
投薬用の組成物は通常、薬学的に容認できるキャリアで、好ましくは水溶性のキャリアに溶解した癌タンパク質モジュレータを含む。例えば緩衝生理食塩水など、様々な水溶性キャリアが使用される。これらの溶液は滅菌され、通常望ましくない物質は混ざっていない。これらの組成物は従来の既知の消毒技術により殺菌される。組成物は必要に応じ、生理学的条件に近づくように、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、pH調節剤及びバッファ剤、毒性調節剤、その他などの薬学的に容認できる補助物質を含む。これらの製剤中のアクチベーターの濃度は広範囲にわたり、選択された投与と患者のニーズの特別な形態に合わせ、液体の容積、粘度、重さなどに基づいてまず選択される（例えば、(1980) Remington's Pharmaceutical Science （『Remingtonの薬学』） (18th ed.) Mack及びHardman and Limbird (eds. 2001) Goodman and Gilman: The Pharmacologial Basis of Therapeutics （『Goodman及びGilman：治療の薬理学的基本』） (10th ed.) McGraw-Hill）。
【０２７９】
従って、通常の静脈内投与用の医薬組成物は、患者一人に付き一日0.1〜10mgである。特に薬剤が血液中にではなく、体腔又は臓器の内腔などの隔離された部位に投与される場合、患者一人に付き一日0.1〜約100mgまでの投与量が使用されることもある。局所性投与において、実質的により量の多い投与が可能である。非経口投与組成物の実際の準備方法は、既知又は明らかである。
【０２８０】
癌タンパク質のモジュレータを含む組成物は、治療又は予防的治療用に投与される。治療的適用において、組成物は疾病（例えば癌）に苦しむ患者に、当該疾病及びその合併症を治療する又は少なくとも部分的に停止するのに充分なだけの量投与される。これを達成するのに充分な量は「薬学的に効果的な投与量」と定義される。この使用法で効果のある量は、疾病の重症度と患者の総合的健康状態によって決まる。この組成物の単一又は複数回の投与が、患者に必要とされ耐えられるだけの投与量及び回数で投与される。どんな場合にも、当該組成物は、患者を効果的に治療するために、本願発明の薬剤を充分な量提供するべきである。哺乳動物において、癌の進行を予防する又は遅延することのできるモジュレータの量は、「予防的に効果的な投与量」と呼ばれる。予防的治療に必要とされる特別な投薬量は、哺乳動物の病状及び病歴、予防されるべき特定の癌と共に、年齢、体重、性別、投与経路、効果などの他の因子によって測定される。このような予防的治療は、例えば以前に癌を患った哺乳動物において癌の再発を予防するため、又は少なくとも部分的に遺伝子発現特性に基づき、癌が発生する著しい可能性を持つと疑われる哺乳動物において使用される。ワクチン法は、DNAワクチン又はタンパクワクチンのいずれかを使用する。
【０２８１】
現在の癌タンパク質調節化合物が、単一でも、追加的癌調節化合物、又は例えば他の抗癌抗体や治療などの他の治療薬と併用しても投与できることが評価される。
数多くの態様において、RNA干渉、アンチセンスポリヌクレオチド、又はリボザイムなどの表に示された核酸配列を含む、例えばポリヌクレオチドなどの1つ以上の核酸が、エクスビボ、又はインビボで細胞内に導入される。本発明は、エクスビボ（無細胞）、エクスビボ、又はインビボ（細胞又は生体ベース）の組み換え発現システムを使用して、癌関連のポリペプチド及び核酸の発現に役立つ方法、試薬、ベクター及び細胞を提供する。
【０２８２】
タンパク質及び核酸発現のため、核酸を宿主細胞に導入する特定の手段は、応用特異性のものである。宿主細胞に異質のヌクレオチド配列を導入する多くの手段が使用される。これらは、リン酸カルシウムの形質移入、スフェロプラスト、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、血漿ベクター、ウィルスベクター、及びその他の、ゲノムDNAクローン、cDNA、合成DNA、又は他の異質の遺伝子物質を宿主に導入する、周知の方法を含む（例えば、Berger and Kimmel (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques from Methods in Enzymology （『酵素学における方法』から『分子クローン技術の手引き』）(vol. 152) Academic Press；Ausubel, et al. (eds. 1999 and supplements) Current Protocols （『最新プロトコル』）Lippincott；及びSambrook, et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual （『分子クローニング：ラボマニュアル』）(3d ed., Vol. 1-3) CSH Press参照）。
【０２８３】
好ましい態様において、癌タンパク質及びモジュレータは、治療薬として投与され、上述のように形成される。同様に癌遺伝子（完全長配列、部分配列の両方、又は癌コード領域の調節塩基配列）が、遺伝子治療用に投与される。これらの癌遺伝子は、例えば抑制RNAのような抑制用途、遺伝子治療（例えばゲノム中への取り込み）、又はアンチセンス構築物を含む。
【０２８４】
癌ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、HTL、CTL、及び抗体反応を刺激するためのワクチン組成物としても投与される。これらの組成物は以下を含む：例えば脂質化された（lipidated）ペプチド（例えばVitiello, et al. (1995) J. Clin. Invest. （『臨床試験ジャーナル』）95:341-349参照）、ポリ（DL-ラクチコグリコリド）（「PLG」）小球体に被包されたペプチド組成物（例えば、Eldridge, et al. (1991) Molec. Immunol. （『分子免疫学』）28:287-294；Alonso, et al. (1994) Vaccine （『ワクチン』）12:299-306；Jones, et al. (1995) Vaccine （『ワクチン』）13:675-681参照）、免疫刺激性複合物（ISCOMS）中に含まれたペプチド組成物（例えば、Takahashi, et al. (1990) Nature （『ネイチャー』）344:873-875；Hu, et al. (1998) Clin Exp Immunol. （『臨床Exp免疫学』）113:235-243参照）、複数抗原ペプチドシステム（MAPs）（例えば、Tam (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5409-5413；Tam (1996) J. Immunol. Methods （『免疫方法ジャーナル』）196:17-32参照）、多価ペプチドとして形成されたペプチド；
【０２８５】
衝撃デリバリーシステムに使われるペプチド、通常は結晶化したペプチド、ウィルスデリバリーベクター（Perkus, et al., p. 379, in Kaufmann (ed. 1996) Concepts in Vaccine Development （『ワクチン開発の概念』）de Gruyter；Chakrabarti, et al. (1986) Nature （『ネイチャー』）320:535-537；Hu, et al. (1986) Nature （『ネイチャー』）320:537-540；Kieny, et al. (1986) Bio/Technology （『バイオ・テクノロジー』）4:790-795；Top, et al. (1971) J. Infect. Dis. （『伝染病ジャーナル』）124:148-154；Chanda, et al. (1990) Virology （『ウィルス学』）175:535-547参照）、
【０２８６】
ウィルス又は合成起源の粒子（例えば、Kofler, et al. (1996) J. Immunol. Methods （『免疫方法ジャーナル』）192:25-35；Eldridge, et al. (1993) Sem. Hematol. 30:16-24；Falo, et al. (1995) Nature Med. （『自然Med.』）1:649-653参照）、アジュバント（Warren, et al. (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:369-388；Gupta, et al. (1993) Vaccine （『ワクチン』）11:293-306）、リポソーム（Reddy, et al. (1992) J. Immunol. （『免疫学ジャーナル』）148:1585-1589；Rock (1996) Immunol. Today （『今日の免疫学』）17:131-137）、又は、裸の又は粒子の吸収されたcDNA（Ulmer, et al. (1993) Science （『サイエンス』）259:1745-1749；Robinson, et al. (1993) Vaccine （『ワクチン』）11:957-960；Shiver, et al., p 423, in Kaufmann (ed. 1996) Concepts in Vaccine Development （『ワクチン開発の概念』）de Gruyter；Cease and Berzofsky (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:923-989；and Eldridge, et al. (1993) Sem. Hematol. 30:16-24）。Avant Immunotherapeutics社（マサチューセッツ州Needham）の技術など、受容体調停ターゲットとしても知られる毒素ターゲットのデリバリー技術も使用される。 
【０２８７】
ワクチン組成物はしばしばアジュバントを含む。多くのアジュバントは、水酸化アルミニウム又はミネラルオイルなど、抗原を高速異化作用から守るようにデザインされた物質及び、脂質A、Bortadella百日咳、又はヒト型結核菌由来のタンパク質など、免疫反応の促進剤 を含む。特定のアジュバントは市販されている：例えばFreund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant（Freundの不完全アジュバント及び完全アジュバント） (Difco Laboratories, Detroit, MI)；Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ)；AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA)；水酸化アルミニウムゲル（alum）又はリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；カルシウム、鉄、又は亜鉛の塩；アシル化されたチロシンの不溶性の懸濁；アシル化された糖；負イオン性又は陽イオン性に由来する多糖類；ポリフォスファーゼン；生分解性小球体；モノホスホリル脂質A及び羽軸Aなど。GM-CSF、インターロイキン-2、-7、-12及びその他の類似した成長要因などのサイトカインもまたアジュバントとして使用される。
【０２８８】
ワクチンは核酸組成物として投与されることができ、そこで1つ以上のポリペプチド又はその断片をコードするDNA又はRNAが患者に投与される。このアプローチは例えばWolff et. al. (1990) Science （『サイエンス』）247:1465-1468、及び米国特許番号5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647；WO 98/04720で説明され、以下に詳細が説明される。DNAベースのデリバリー技術の例は、「裸のDNA」、促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド調停された）デリバリー、陽イオン脂質複合体、及び粒子調停された（「遺伝子ガン」）又は圧力調節されたデリバリーを含む（米国特許番号5,922,687参照）。
【０２８９】
治療及び予防免疫目的で、本発明のペプチドはウィルス又はバクテリアベクターにより発現される。発現ベクターの例は、ワクチン又は鶏痘など、弱力化したウィルス宿主を含む。このアプローチは例えば癌ポリペプチド又はポリペプチド断片をコードする核酸配列を発現するベクターとしての、ワクチンウィルスの使用を含む。いったん宿主に導入されると、組み換えワクチンウィルスは免疫原生ペプチドを発現し、免疫応答を引き出す。ワクチンベクター及び免疫プロトコルに有用な方法は、例えば米国特許番号4,722,848で説明されている。もう1つのベクターはBCG（Bacille Calmette Guerin）である。BCGベクターについては、Stover, et al. (1991) Nature （『ネイチャー』）351:456-460で説明されている。例えばアデノ及びアデノ関連ウィルスベクター、レトロウィルスベクター、チフス菌ベクター、解毒された炭疽毒素ベクターなど、広範囲にわたるベクターが治療用投与及び免疫用に使用可能である。例えば、Shata, et al. (2000) Mol Med Today （『今日の分子医学』）6:66-71；Shedlock, et al. (2000) J. Leukoc. Biol. （『Leukoc. Biol.ジャーナル』）68:793-806；Hipp, et al. (2000) In Vivo （『In Vivo』）14:571-85参照。
【０２９０】
遺伝子をDNAワクチンとして使用する方法が周知であり、癌患者中の発現の制御可能なプロモーター又は組織特異的プロモーターのコントロールの下で、癌遺伝子又は癌遺伝子の一部を位置づけることを含む。DNAワクチンに使用される癌遺伝子は、完全長の癌タンパク質をコードすることができるが、より好ましくは癌タンパク質に由来したペプチドを含む、癌タンパク質の一部分をコードする。1つの態様において、患者は、癌遺伝子に由来した複数のヌクレオチド配列を含むDNAワクチンによる予防接種を受ける。例えば、癌タンパク質の選択的断片をコードする癌関連遺伝子又は配列は、発現ベクター中に導入され、Class I MHCに関する免疫原生及び細胞毒性のT細胞応答を作製する能力についてテストされる。この工程は、細胞内エピトープを含む抗原を有する細胞に対する、細胞毒性のT細胞応答の作製を提供する。
【０２９１】
好ましい態様において、DNAワクチンは、DNAワクチンを伴うアジュバント分子をコードする遺伝子を含む。このようなアジュバント分子は、DNAワクチンによりコードされた癌ポリペプチドへの免疫原生対応を増加するサイトカインを含む。追加的又は選択的なアジュバントも使用可能である。
【０２９２】
他の好ましい態様において、癌遺伝子は癌の動物モデルを作製するのに使用される。同定された癌遺伝子が、癌組織中で抑制又は減少されるとき、癌遺伝子に向けられた抑制RNA又はアンチセンスRNAなどの遺伝子治療技術は遺伝子の発現も減少又は抑制する。癌の動物モデルは癌関連配列のモジュレータ又はガンのモジュレータのスクリーニングに使用される。同様に、例えば適切な遺伝子のターゲットベクターとの同族組み換え結果としての、遺伝子のノックアウト技術を含む、動物の遺伝子組み換え技術は、癌タンパク質の発現の不在又は増加を招く。希望により、組織特異的発現又は癌タンパク質のノックアウトが必要となる。
【０２９３】
癌タンパク質が癌において過剰発現することも可能である。このような場合、癌タンパク質を過剰発現する形質転換動物が作製される。所望の発現レベルにより、様々な強度のプロモーターを導入遺伝子の発現に使用することができる。また総合的導入遺伝子のコピー数を測定し、導入遺伝子の発現レベルの測定のために比較することも可能である。このような方法で作製された動物は、癌の動物モデルとして使用され、癌治療のモジュレータのスクリーニングにおいても有用である。
【０２９４】
診断及び/又は予後の用途に使用されるキット
上記で示唆された診断、研究、及び治療用の使用のためのキットも本発明により提供される。診断及び研究用において、これらのキットは以下の少なくとも1つを含む：アッセイ試薬、バッファ、癌特異的核酸又は抗体、ハイブリダイゼーションプローブ及び/又はプライマー、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、優勢陰性癌ポリペプチド又はポリヌクレオチド、癌関連配列の小分子インヒビターなど。治療用製品は無菌生理食塩水又はその他の薬学的に受容された乳剤性基剤及び懸濁塩基を含む。
【０２９５】
加えて、キットには、本願発明の方法を実施するための説明書（例えばプロトコル）を含んだ教材が含まれる。通常教材は記載又は印刷された資料を含むが、これらには限られない。そのような説明書を格納し、エンドユーザーにそれらを伝達することができる媒体が、本願発明により検討されている。このような媒体は、電子記憶媒体（例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばCDROM）などを含み、それらに限られない。当該媒体は、当該教材を提供するインターネットサイトのアドレスを含むこともある。
【０２９６】
本発明はまた癌関連の配列のモジュレータをスクリーンするキットも提供する。これらのキットは容易に入手できる物質及び試薬から準備することができる。例えば、当該キットは以下の物質のひとつ以上を含む：癌関連のポリペプチド又はポリヌクレオチド、試薬チューブ、及び癌関連の活性テストの説明書。オプションとして、キットは生物活性のある癌タンパク質を含む。広範囲にわたるキット及び構成要素が、本発明に従い、キットの使用目的及びユーザーの特別なニーズに基づいて準備される。診断は通常複数の遺伝子又は産物の評価を含む。当該遺伝子は通常、歴史的データ又は結果データ中に同定される、疾病の重要なパラメータとの相関関係に基づいて選択される。
【実施例】
【０２９７】
実施例1：遺伝子チップアッセイ
遺伝子チップを使用し、様々な正常及び癌性組織の分子特性が測定、アッセイされる。RNAが分離され、記載に従い遺伝子チップアッセイが行われる（Glynne, et al. (2000) Nature （『ネイチャー』）403:672-676；Zhao, et al. (2000) Genes Dev. （『遺伝子Dev.』）14:981-993）。
【０２９８】
【化１】
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【０２９９】
【化２】
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【化１２４】
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【０４２２】
【化１２５】
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【０４２３】
【化１２６】
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【０４２４】
【化１２７】
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【０４２５】
【化１２８】
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【０４２６】
【化１２９】
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【化１２９５】
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【化１２９６】
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【１５９４】
【化１２９７】
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【１５９５】
上述の例が、本願発明の範囲を限定するためのものではなく、例示目的のために示されたものであることは明らかである。すべての出版物、配列の登録番号、及び特許出願を、個々の出版物、登録番号、又は特許出願が本明細書中に援用されるように具体的、かつ、個別に示されるように、本明細書中に援用する。
【国際調査報告】
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