(57)【要約】【課題】本発明は油性造影剤にパクリタキセル(Paclitaxel)を可溶化させた化学塞栓用パクリタキセル油性組成物、処方物及びその製造方法に関する。【解決手段】本発明の組成物はパクリタキセルを可溶化させたもので化学塞栓術施術の際、血管造影が可能であることから化学塞栓術により抗癌剤を標的細胞に伝達できる長点がある。さらに、本発明は長期間保存できるようにパクリタキセルの沈澱形成を阻害する物質を付加的に含むパクリタキセル油性組成物、処方物及びその製造方法に関するものである。本発明の組成物はパクリタキセルを効果的に可溶化し、化学塞栓術施術の際造影が可能で、肝臓癌及び他の固形癌の治療のための動脈化学塞栓術(TACE)の際使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
油性造影剤と油性造影剤１ｍｇに対して、0.0001ｍｇ〜１０ｍｇのパクリタキセルを含有することを特徴とする化学塞栓用組成物。
【請求項２】
前記油性造影剤がリピオドールとエチオドールとを含むヨード化ケシの実油(iodized poppy seed oil)及びヨード化大豆油(iodized soybean oil)で構成される群から選ばれたヨード化オイルであることを特徴とする請求項１に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項３】
前記油性造影剤はヨード含量が３０〜５０重量％であるヨード化オイルであることを特徴とする請求項２に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項４】
前記油性造影剤はヨード含量が３５〜４８重量％のヨード化オイルであることを特徴とする請求項３に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項５】
前記油性造影剤はヨード含量が３５〜４８重量％のヨード化ケシの実油であることを特徴とする請求項１に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項６】
油性造影剤１ｍｌに対して、動物性油、植物性油又はこれらの混合物を0.01〜１ｍｌの比率で付加的に含有することを特徴とする請求項１に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項７】
前記動物性油がスクアレンであることを特徴とする請求項６に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項８】
前記植物性油が大豆油であることを特徴とする請求項６に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項９】
室温における粘度が４０〜１８０ｃＰであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかの１項に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項１０】
固形癌治療のための動脈化学塞栓用として用いられることを特徴とする請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記固形癌が肝臓癌であって肝動脈化学塞栓用として用いられることを特徴とする請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
下記の段階を含む化学塞栓用パクリタキセル油性処方物の製造方法：
−油性造影剤と油性造影剤１ｍｇに対して、0.0001mg〜１０ｍｇパクリタキセルを混合してパクリタキセルと油性組成物の混合物を得る混合段階；及び
−前記混合物を撹拌してパクリタキセルを可溶化する段階。
【請求項１３】
前記混合段階で滅菌された油性造影剤とパクリタキセルを滅菌条件下で用いることを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記製造後混合物をエチレンオキサイド（ＥＯ）ガス又はガンマ線で滅菌する段階を付加的に含むことを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記混合物を３５〜４５℃の温度に加温してパクリタキセルを可溶化することを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記混合物を超音波処理してパクリタキセルを可溶化することを特徴とする請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１７】
油性造影剤と油性造影剤１ｍｌに対して0.0001〜１３ｍｇのパクリタキセル及び0.01ｍｌ〜１ｍｌのパクリタキセルの沈澱形成を阻害する物質を含むことを特徴とする長期保存が可能な組成物。
【請求項１８】
前記油性造影剤がリピオドールとエチオドールを含むヨード化ケシの実油(iodized poppy seed oil)及びヨード化大豆油(iodized soybean oil)で構成される群から選ばれるヨード化オイルであることを特徴とする請求項１７に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項１９】
前記油性造影剤はヨード含量が３０〜５０重量％のヨード化オイルであることを特徴とする請求項１８に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項２０】
前記油性造影剤はヨード含量が３５〜４８重量％のヨード化オイルであることを特徴とする請求項１９に記載の学塞栓用組成物。
【請求項２１】
前記油性造影剤はヨード含量が３５〜４８重量％のヨード化ケシの実オイルであることを特徴とする請求項１７に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項２２】
油性造影剤１ｍｌに対して動物性油、植物性油又はこれらの混合物を0.01〜１ｍｌの比率で付加的に含むことを特徴とする請求項１７に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項２３】
前記動物性油がスクアレンであることを特徴とする請求項２２に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項２４】
前記植物性油が大豆油であることを特徴とする請求項２２に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項２５】
室温における粘度が４０〜１８０ｃＰであることを特徴とする請求項１７乃至２４のいずれかの１項に記載の化学塞栓用組成物。
【請求項２６】
固形癌治療のための動脈化学塞栓用として用いられることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記固形癌が肝臓癌であって肝動脈化学塞栓用として用いられることを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記パクリタキセルの沈澱形成を阻害する物質が前記パクリタキセル分子と水素結合を形成できる物質、又はパクリタキセル分子間の水素結合を妨害する物質であることを特徴とする請求項１７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記パクリタキセル分子と水素結合を形成できる物質がアルコール、ポリオール、オイル、脂質、高分子及びペプチドで構成される群の中から選ばれることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール及び脂肪族アルコールで構成される群の中から選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ポリオールがエチレングリコール、プロピレングリコール及びポリエチレングリコールで構成される群の中から選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記オイルがトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、トコフェロール及び動物性又は植物性油から自然的に抽出し得るこれらの混合物で構成される群の中から選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
前記脂質が燐脂質、中性脂質、陽イオン性脂質、陰イオン性脂質及び脂肪酸で構成される群の中から選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３４】
前記高分子がポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、これらの共重合物、キトサン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸塩、デキストラン及びポリ（ε-カプロラクトン）で構成される群の中から選ばれることを特徴とする請求項２９に記載の組成物。
【請求項３５】
パクリタキセル分子間の水素結合を妨害する物質(chaotropic agent)がジメチルスルホキシド(dimethylsulfoxide,DMSO)又はアミドで構成される群の中から選ばれることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパクリタキセルを可溶化して動脈化学塞栓術（transcatheter arterial chemoembolization;TACE）に利用するためのパクリタキセルの油性組成物、その処方物及びその製造方法に関する。さらに、本発明は長期保存ができるように、パクリタキセルの沈澱を阻害する物質を付加的に含むパクリタキセル油性組成物、その処方物及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動脈化学塞栓術(TACE)は造影剤を用いて施術過程を造影し、腫瘍の給養動脈(feeding artery)内に抗癌剤と塞栓物質を注入して癌組織への栄養供給を遮断して癌を治療する施術法である。本発明の組成物はパクリタキセルを効果的に可溶化することにより、肝臓癌及び他の固形癌の治療のためのTACE施術に使用できる。
【０００３】
最も広く用いられる動脈化学塞栓術は肝臓癌治療のための肝動脈化学塞栓術である。造影剤は施術する間又は後で造影道具として使用され、さらに、腫瘍において塞栓を誘発する。油性造影剤にドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン、カルボプラチンのような抗癌剤を溶解又は分散して使用する。
【０００４】
動脈化学塞栓術において最も頻繁に用いられる造影剤には、リピオドール（登録商標）(Lipiodol)のようなヨード化オイル(iodized oil)である。しかしながらリピオドールと前記抗癌剤を含む分散系は物理的に不安定なため、施術の際多くの問題点を有している。従来の診断放射線科では肝臓癌の治療にアドリアマイシン、エピルビシン等の抗癌剤を広く使用してきた。しかしながら、これらの抗癌剤の大部分は水溶性であることから、TACE施術において、油性溶液の形態よりは懸濁液(suspension)状の処方物で利用されてきた(Yoshihiro Katagiri他、Cancer Chemother.Pharmacol 1989, 23, 238-242：非特許文献１)。しかしながら、このような懸濁液状の処方物は保存中に粒子の凝集が起こることから長期間保存することができなかった。
【０００５】
このような安定性の問題を克服するために、水性造影剤に抗癌剤を溶解した後、リピオドール（登録商標）のような油性造影剤に水相を分散させる方法を利用するようになった。つまり、患者に投与する直前に抗癌剤を水性造影剤に溶解させ、これを油性造影剤とポンプ法により混合させる。エマルジョンの安定性を極大化するために、リピオドールの比重(1.275〜1.290)と略似た程度の比重を有する水性造影剤であるウログラフィン(Urografin,1,328〜1,332)又はイオパミロ(Iopamiro,1,17〜1.41)を利用する(Takashi Kanematsu他、Journal of surgical oncology 1984, 25, 218-226：非特許文献２、Takafumi Ichida他、Cancer Chemother.Pharmacol 1994, 33, 74-78：非特許文献３)。
【０００６】
しかしながら、前記方法によっては一時的なエマルジョンが形成されるのみで、数分内に再び相分離が生ずる。不安定なエマルジョンシステムは十分な塞栓効果を提供することができない。実際には施術する間カテーテル内においても相分離が起こるのを観察できる。この不安定なエマルジョンが投与されるとき、アドリアマイシンは直ちに組織に吸収されてしまうので、抗癌剤の持続的な送達効果を提供することができない。
【０００７】
理想的な肝臓癌治療法の内の一つは合成高分子抗癌剤、つまりポリ（スチレン−コ−マレイン酸）−共液化されたネオカルチノスタチン［Poly(styrene-co-maleic acid)-conjugated neocarzinostatin(SMANCS)］を利用するものである。SMANCSは親水性と親油性の性質とを共に有していて、リピオドールに直接溶解されることが可能である(Konno, T. and Maeda,H., Targetting chemotherapy of hepatocellular carcinoma. Neoplasms of the liver, Eds. Okuda, K., and Ishak, K.G., Springger-Verlag, Berlin, P343-352：非特許文献４)。しかしながら、SMANCS／リピオドール処方物はアドリアマイシン／リピオドール処方物が有する安定性問題は解決したものの、高価にして深刻な毒性を示す副作用があるため広く使用はされていない。
【０００８】
一方、抗癌剤パクリタキセルは卵巣癌、乳房癌、食道癌、黒色腫、白血病に対して顕著な細胞毒性を示すものとして知られている。パクリタキセルはブリストル・マイヤーズ スクイブ社のタキソール（Taxol・登録商標）の注射剤として常用化されている。
パクリタキセルは代表的な難溶性薬物中の一つであるため、開発段階から可溶化技術の開発が同時に進行された。このような可溶化技術の一例として静脈注射等全身投与経路に利用するために、溶解補助剤を使用することが挙げられる。前記のTaxol（登録商標）はクレモフォールＥＬ(Cremophor EL:ポリオキシエチレン35キャスタ−オイル)とエタノールを溶解補助剤として使用している。Taxol（登録商標）はエマルジョンの予備濃縮剤(pre-concentrate)形にして、過量の水に分散させると自発的にマイクロエマルジョン(microemulsion)を処方物成する（米国特許第5438072号参照）。しかしながら、Taxol（登録商標）において使用された溶解補助剤は毒性の副作用を引き起こすものとして知られている。従って、高い抗癌活性と低い毒性を有する新たなパクリタキセル処方物を開発するために多様な研究が行われている。
【０００９】
【非特許文献１】
Yoshihiro Katagiri他、Cancer Chemother.Pharmacol 1989, 23, 238-242
【非特許文献２】
Takashi Kanematsu他、Journal of surgical oncology 1984, 25, 218-226
【非特許文献３】
Takafumi Ichida他、Cancer Chemother.Pharmacol 1994, 33, 74-78
【非特許文献４】
Konno, T. and Maeda,H., Targetting chemotherapy of hepatocellular carcinoma. Neoplasms of the liver, Eds. Okuda, K., and Ishak, K.G., Springger-Verlag, Berlin, P343-352
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的はパクリタキセルを可溶化させ動脈化学塞栓術にパクリタキセルを使用するものである。
従って、本発明の目的の一つはパクリタキセルを可溶化できる新たなパクリタキセル組成物を提供することである。
より具体的には、本発明の目的は固形癌治療のための動脈化学塞栓術に使用できるパクリタキセル油性処方物を提供することである。
さらに、本発明の他の目的は動脈化学塞栓術施術の間、最初の組成を安定して維持できるパクリタキセル油性処方物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は前記のパクリタキセル組成物の製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的はパクリタキセル沈澱を阻害する付加的な成分を含む動脈化学塞栓用パクリタキセル組成物を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は前記に言及した要求に応ずるために、動脈化学塞栓術に利用可能なパクリタキセルの処方物を研究中、予期しなかったパクリタキセルが油性造影剤(oily constrast medium)によく溶解され、粘度範囲４０〜１８０ＣＰ(centipoises)の単一相の均一化した高粘性油性溶液を形成するのを見出した。
【００１２】
さらに、パクリタキセル／油性造影剤組成物は化学的・物理的に安定して組成の変化が無く長期間保存できることを見出した。このパクリタキセル／油性造影剤組成物はドキソルビシンのような水溶性抗癌剤を利用する従来のリピオドール処方物に比べて遥かに向上した物性を見せ、本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物はSMANCS／リピオドール処方物と類似した物理的特性を見せた。しかしながら、SMANCS／リピオドール処方物のコストが高過ぎるとか、甚だしい毒性を副作用として有しているのに反して、本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物は比較的低廉な原料物質を使用することにより、コストが低廉でかつ製造が容易である。さらに、得られた処方物は保存安定性が優れている。
【００１３】
既存のリピオドール／イオパミロ／アドリアマイシン処方物が混合直後相分離を起こすのに対し、本発明のパクリタキセル油性処方物は動脈化学塞栓術期間の間、安定的に最初の組成を維持することができる。従って、本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物処方物は抗癌剤を腫瘍に持続放出的に伝達することができる。さらに、前記処方物は優れた安定性により長期間保存することができる。さらに、後述の通り動物モデルを利用して肝動脈化学塞栓術を実施した結果、本発明の処方物は優れた塞栓効果と抗癌活性を示した。従って、本発明の処方物は動脈化学塞栓術に広く利用されることと予想される。
【００１４】
動脈化学塞栓術は肝動脈化学塞栓術が代表的ではあるものの、肝動脈化学塞栓術以外にも、多様な種類の固形癌に適用することができる。例えば、SMANCS／リピオドール処方物は腎臓動脈(renal artery)を通じて動脈化学塞栓術を実施することにより、腎臓癌に対する標的化された治療の遂行に利用されてきた(K.Tsuchiya, Tumor-targeted chemotherapy with SMANCS in lipiodol for renal cell carcinoma:longer survival with larger size tumors.Urology.2000 Apr;55(4):495-500)。
【００１５】
本発明の目的はパクリタキセルを可溶化し動脈化学塞栓術にパクリタキセルを使用することである。
本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物を製造するとき使用される油性造影剤の例としては、ヨード化オイルがある。ヨード化オイルはリピオドール(Lipiodol:Laboratoire Guerbet,France)、エチオドール(Ethiodol:Savage Laboratories,Melville,NY)のようなヨード化ケシの実油(iodized poppy seed oil)又はヨード化大豆油(iodized soybean oil)を含む。ヨード化大豆油に対する詳細な説明はMa Tai(The effect of oral iodized oil on prevention and treatment of endemic goiter.Chienese Med.J.61(9):533,1981)を参考にできる。
【００１６】
本発明において、油性造影剤として用いられたヨード化オイルのヨード含量は３０〜５０重量％のものが好ましい。さらに好ましくはヨードの含量が３５〜４５重量％のものが良い。最も好ましくは油性造影剤としてリピオドールを用いるのが良い。
【００１７】
本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物は油性造影剤と油性造影剤１ｍｌに対してパクリタキセルが0.0001ｍｇ〜１０ｍｇの量で含まれる。この時、油性造影剤１ｍｇに対するパクリタキセルの量が１０ｍｇを超えると過量のパクリタキセルが沈澱するので好ましくない。一方、パクリタキセルの量が0.0001ｍｇ未満であれば、抗癌活性が低過ぎて好ましくない。
【００１８】
さらに、本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物にはスクアレンのような動物性油又は大豆油のような植物性油を付加的に添加することができる。油性造影剤の一部を動物性油又は植物性油、又はこれらの混合物で代替することにより、薬効や安定性を低下させること無くコストを節減することができる。油性造影剤に対する動物性油又は植物性油の比率を１：0.01〜１の容量比とする。より好ましくは前記比率は１：0.01〜0.5である。
【００１９】
本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物は、前記組成範囲がなるべく油性組成剤にパクリタキセルを添加して常温で撹拌、溶解させることにより、簡便に製造することができる。この時迅速に溶解させるため、約３５〜４５℃の温度に加温するか、又はバスタイプソニケータ(bath type sonicator)で超音波処理しても良い。このようにして製造されたパクリタキセル／油性造影剤組成物を滅菌後保存する。前記滅菌法で滅菌された原料を用いて滅菌条件下で混合することができる。又は、パクリタキセル／油性造影剤組成物を滅菌されたシリンジフィルタ（ポアサイズ２００μｍ，ＰＶＤＦ滅菌フィルタ）を通過させ注入することにより滅菌することができる。さらに、ヨード化ケシの実油(Iodized poppy seed oil)とパクリタキセルをガンマ線(gamma-ray)又はエチレンオキサイド（ＥＯ）ガス滅菌方法を用いて滅菌した後、混合するか、混合後組成物をガンマ線で又はＥＯガス滅菌法を用いて滅菌することもできる。
前記のように製造された本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物は室温で６０日以上安定した。
【００２０】
前記油性組成物において、パクリタキセルは約２ヶ月間は安定して溶解しているものの、結局は油性溶液からパクリタキセルが沈澱して析出する。沈澱はパクリタキセル分子内又は分子間の水素結合により生成される。本発明者等は前記沈澱はパクリタキセルと水素結合を形成する物質を添加することにより、又は、パクリタキセルの分子内又は分子間の水素結合を妨害する物質を添加することにより、効果的に予防することができると言う事実を見出した。パクリタキセル油性組成物に用いられる油性造影剤がパクリタキセルと水素結合を形成できる場合には２ヶ月が経過してもパクリタキセルの沈澱が生じない。
【００２１】
しかしながら、最も一般的に用いられる油性造影剤であるリピオドールを用いる場合、リピオドール分子の化学的性質上パクリタキセルと水素結合の形成ができない。このような場合、リピオドール溶液において、パクリタキセルと水素結合を形成できる物質はパクリタキセルの沈澱を防ぐことができる。例えば、トリカプリリンを前記パクリタキセル油性組成物に添加すると、パクリタキセル分子間の水素結合の代わりにパクリタキセルとトリカプリリン間の水素結合が形成され、パクリタキセルの沈澱を防ぐことができる。
【００２２】
パクリタキセルの油性組成物において、長期保存後パクリタキセル及び油性造影剤の含量は製造過程に依存する。もし、組成物が水分や酸素との接触無しに製造され、さらに、加熱する必要が無いまま製造されたとすれば、組成成分等の酸化と加水分解を最小化することができるため、組成物をより長期間安定にできる。しかしながら、前記沈澱過程は他の不安定化過程とは異なり熱力学的に安定した形態に変化する。従って、製造する間又は製造後如何なる注意を払っても、パクリタキセル油性組成物において沈澱形成は避けられない。沈澱形成速度は油性組成物内でパクリタキセルの濃度に依存する。油性組成物内におけるパクリタキセルの濃度が１０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌの場合それぞれ常温で約６０日、１２０日が経過すると沈澱が形成される。従って、パクリタキセルの沈澱形成を阻害できる物質を組成物に付加的に添加した場合にのみ、パクリタキセル油性処方物は１年以上安定化され得る。
【００２３】
従って、本発明のパクリタキセルの油性組成物はパクリタキセルの沈澱形成を阻害物質を付加的に含有することができる。この場合油性組成物内でパクリタキセルの溶解度が１３ｍｇ／ｍｌに増加する。
つまり、本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物内のパクリタキセルの含量は油性造影剤１ｍｌに対して0.0001〜１３ｍｇで、パクリタキセルの沈澱形成阻害物質の含量は0.01〜１ｍｌである。
この時、用いられる油性造影剤は前記記載の通りである。
【００２４】
パクリタキセル／油性造影剤組成物製造において、パクリタキセルの沈澱を阻害する物質には、パクリタキセルと水素結合の形成ができる物質又はパクリタキセル分子間の水素結合を妨害する物質(chaotropic agent)を用いることができる。
【００２５】
前記パクリタキセル分子と水素結合を形成できる物質にはアルコール、ポリオール、オイル、脂質、高分子又はペプチド(peptides)等がある。前記アルコールはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール及び脂肪族アルコールを含む。ポリオールはエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールを含む。前記オイルにはトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、トコフェロール、これらトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドと他の付随的な成分との混合物である動物性又は植物性油を含む。
【００２６】
前記脂質はリン脂質(phospholipid)、中性脂質、陽イオン性脂質、陰イオン性脂質及び脂肪酸を含む。前記高分子にはポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、これらの共重合物、キトサン、アルギン酸塩、ヒアルロン酸塩、デキストラン、ポリ（ε-カプロラクトン）を含む。前記パクリタキセル分子間の水素結合の形成を妨害する物質（chaotropic agent）として、ジメチルスルホキサイド(dimethylsulfoxide,DMSO)及びアミドを含む。
【００２７】
このように、パクリタキセルの沈澱を阻害する物質を添加した場合、本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物は常温で２００日以上安定であった。
本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物は４０〜１８０ｃＰの粘度を示し、固形癌治療のための動脈化学塞栓術に有用に用いられる。
【００２８】
さらに、本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物の投与量及び投与方法は患者の年齢、性別、体重、症状の重篤度等患者の個人差により、医師の裁量によって変えることができる。通常、動脈化学塞栓術は１〜４ヶ月に１回ずつ繰返し施術ができる。２〜１５ｍｌの前記処方物を固形癌の給養動脈(feeding artery)、つまり肝臓癌の場合肝動脈を通して注入する。
【００２９】
以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、下記に提示される実施例はあくまでも本発明の理解に供するためのものであって、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１：パクリタキセル／リピオドール組成物の製造
リピオドール１ｍｌ(Lipiodol Ultra-fluid,Laboratoire Guerbet,France,ヨード含量３８重量％)を油性造影剤として使用した。前記リピオドールにパクリタキセル（三養ゼネックス社、韓国）２，４，６，８，１０又は１１ｍｇを添加して試験管（安全ロック装置が具備されたマイクロ試験管、ポリエチレン製1.5ｍｌ,Eppendorf AG,Germany）に入れ、室温で撹拌して溶解した。迅速な溶解のため約３５〜４５℃に加温するか又は、バスタイプソニケータにおいて超音波処理しても良い。リピオドール１ｍｌに対してパクリタキセルが２〜１０ｍｇを添加した場合、透明な単一の液相が形成されるので、パクリタキセルがリピオドールに完全に溶解することが分った。しかしながらリピオドール１ｍｌに対してパクリタキセル１１ｍｇを添加した場合、始めは透明な液状を形成するが、室温で１日放置すると溶液の濁度が増加した。パクリタキセルの沈澱が顕微鏡で観察された。従って、リピオドールにおけるパクリタキセルの溶解度は室温（２４〜２８℃）で約１０ｍｇ／ｍｌであることが確認された。キネマチック粘度計(Cannon-Fenske Type, Calibrated, Cat. No.13-617E, Size 200, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)を用いて、液状処方物の落下時間を測定する方式でパクリタキセル／リピオドール（１０ｍｇ／１ｍｌ）処方物の粘性を測定した。測定された粘度は２５℃で６７ｃＰであった。測定された粘度は塞栓効果が最大の粘度４５ｃＰ以上であるため、パクリタキセル／リピオドール組成物は塞栓効果が優れたものと予想される。
【００３１】
実施例２：パクリタキセル／リピオドール組成物の物理的安定性
リピオドール(Lipiodol Ultra-fluid, Laboratoire Guerbet, France,ヨード含量３８重量％)１ｍｇにパクリタキセル（三養ゼネックス社、韓国）１０ｍｇを添加して試験管に入れ、室温で撹拌して溶解した。迅速な溶解のため混合物の温度を４０℃に加温した。透明な単一の液相が形成されるので、パクリタキセルがリピオドールに完全に溶解することが分かった。製造された組成物をシリンジフィルター（２００μｍポアサイズ、ＰＶＤＦフィルター）を連結した注射器を通過させ滅菌した後、室温及び４℃で６０日間保存し、物理的安定性及びパクリタキセルの化学的分解の有無を観察した。処方物の色相や匂いの変化が無かった。相分離や沈澱現象も発生しなかった。ＨＰＬＣを利用して分析した結果、パクリタキセルは全く分解されないことが分かった。ＨＰＬＣ条件は下記の通りであった。
【００３２】
−ポンプ：SP8810 precision isocratic pump (Spectra-Physics Inc.,San Jose,CA)
−カラム：Waters Bondpack C18 Column(3.9mm×300mm,Waters Corp.,Milford,MA)
−移動相：アセトニトリル及び水各々５０％（ｗ／ｗ）
−流速  ：１ｍｌ／ｍｉｎ
−検出器：Spectra 100可変波長検出器(variable wavelength detector)
(Spectra-Physics)
【００３３】
実施例３：パクリタキセル／エチオドール組成物の物理的安定性
油性造影剤としてリピオドールの代わりにエチオドール(Savage Laboratories,Melville,NY)を用いたことを除いては、実施例２に記載された方法で、パクリタキセル油性組成物を製造した。透明な単一液相が形成されるので、パクリタキセルがエチオドールに完全に溶解することが判った。製造された組成物の物理的安定性を実施例２に記載された方法で試験した。製造された組成物を滅菌した後、室温及び４℃で６０日間保存して物理的安定性及びパクリタキセルの化学的分解の可否を観察した。処方物の色相や匂いの変化は無かった。相分離や沈澱現象も発生しなかった。ＨＰＬＣを利用して分析した結果、パクリタキセルは全く分解しないことが分かった。
【００３４】
実験例１：肝臓癌動物モデルの製作
ドイツのDeutsches Krebsforschungszentrum Tumorbankより提供されたＶＸ２癌種をウサギ(New zealand White)の大腿部に移植した。２週間後、直径１〜２ｃｍの腫瘍を有するウサギを１０ｍｌをペントタールナトリウム(pentothal sodium)溶液(62.5ｍｇ／ｋｇ)の静脈注射により致死させた。腫瘍周辺の毛を除去し、ヨード溶液とアルコールで皮膚を消毒し、腫瘍部位の皮膚を切開した後、腫瘍を周囲の組織と剥離して摘出した。摘出した腫瘍を切開して中心部の壊死部分を除去した。生きている周辺部の腫瘍組織をカルシウムとマグネシウムを含有していないハンクス平衡塩（calcium and magnesium-free Hank's balanced salt）溶液(Grand Island Biological Co.,Grand Island,New York)と混合した後、鋏と手術ナイフで細切した。この腫瘍溶液を５ｍｌのRMPI-1640(Rosewell Park Memorial Institute,Rosewell Park,New York)培養液と混合した。腫瘍細胞の濃度が１×１０６個／ｍｍ３となるように希釈した。
【００３５】
腫瘍細胞溶液のウサギの肝臓内注入：
先ず、耳の静脈に２３Ｇの針で５００ｍｌのリン酸緩衝食塩水（phosphate buffered saline;PBS）を投与した。５００ｍｇのペントタールナトリウムを４０ｍｌのリン酸緩衝食塩水（phosphate buffered saline）に混合した混合液を毎分ｍｌの速度でこの静脈を通じて注射してウサギを麻酔した。前記溶液の全体の投与量は1.5ｍｌ／ｋｇであった。腹部の毛を除去してヨード溶液とアルコールで皮膚を消毒した。超音波誘導下で腫瘍組織溶液0.1ｍｌを２２Ｇの針が装着された１ｍｌの注射器で左葉の肝実質(parenchyma)内に注入した。腫瘍組織溶液はウサギの肝臓の５個の葉(lobe)の内、超音波観察が最も容易な左葉に注入した（図１，Ａ〜Ｃ）。２次感染を防止するために抗生剤(PenbrexR（登録商標），２５０ｍｇ)を静脈注射した。腫瘍組織溶液を注入した後、ウサギ等はウサギの飼育箱で正常な飼料で飼育した。腫瘍細胞の移植後２週目から超音波及びＣＴにより腫瘍を発見することができた。腫瘍の成長速度は成長曲線を利用して、概略的に予測することができた。移植後、２週目から３日間隔で超音波観察を行い、１週間隔でＣＴを施行して腫瘍の位置と大きさを追跡した。
【００３６】
実施例４：パクリタキセル／リピオドール組成物を利用した肝臓癌動物モデルにおける動脈化学塞栓術
リピオドール１ｍｌにパクリタキセル（三養ゼネックス社、韓国）3.33ｍｇ又は１０ｍｇを各々添加して試験管に入れ、室温で撹拌して溶解させた。迅速な溶解のため混合物の温度を４０℃に加温した。透明な単一の液相が形成されるのでパクリタキセルがリピオドールに完全に溶解することが分かった。製造された組成物をシリンジフィルター（２００μｍポアサイズ、ＰＶＤＦフィルター）を連結した注射器を通過させて滅菌した。実験例１において、準備された肝臓癌動物モデルから微細導管を利用して、本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物0.3ｍｌを腫瘍の給養動脈(feeding artery)内に注入して動脈化学塞栓術を実施した。従って、実験群におけるパクリタキセルの投与量は各々１ｍｇ又は３ｍｇに該当する。陰性対照群として肝臓癌動物モデルにリピオドールのみを0.3ｃｃを注入して比較した。手術１週間後ＣＴ撮影をした結果、図１のＡおよびＢで見られるように肝臓癌組織にのみ選択的にリピオドールが観察された。
【００３７】
実施例５：パクリタキセル／リピオドール組成物で動脈化学塞栓術を実施した後の肝臓癌組織におけるパクリタキセルの濃度分析
実施例４において、動脈化学塞栓術実施１週間後、前記ウサギより肝臓を摘出した。リピオドールが視認される組織、リピオドールが視認されない組織、及び肝臓癌周辺に位置した正常組織とに区分して組織内のパクリタキセル濃度を測定した。各肝臓組織を溶解緩衝溶液(lysis buffer solution)［62.5ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ6.8），２％ドデシル硫酸ナトリウム，５％β−メルカプトエタノール，１０％グリセロール］と混合した後、均質化した。均質化された混合物を遠心分離して上層液を収得した後、ＨＰＬＣを利用して、パクリタキセルの濃度を測定した。ＨＰＬＣの条件は実施例２における場合と同一であった。実施例４において説明した通り、１ｍｇ又は３ｍｇのパクリタキセルに該当する処方物を投与したウサギの肝臓組織におけるパクリタキセルの濃度を各々図２Ａ及び２Ｂに示した。リピオドールが視認される肝臓癌組織において、パクリタキセル濃度が最も高いことを確認した。リピオドールが視認されない肝臓癌組織でも比較的高い濃度のパクリタキセルが検出された。反面、肝臓癌組織の近くの正常な肝臓組織ではパクリタキセルの濃度は無視できるレベルであった。従って、本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物で動脈化学塞栓術を実施して１週間後にも、パクリタキセルは癌組織にのみ選択的に分布することが分かった。
【００３８】
実施例６：リピオドール／パクリタキセル組成物で動脈化学塞栓術実施後生存している腫瘍の測定
リピオドール１ｍｌにパクリタキセル（三養ゼネックス社、韓国）3.33ｍｇ又は１０ｍｇを各々添加して試験管に入れ、常温で撹拌して溶解した。迅速な溶解のため混合物の温度を４０℃に加温した。透明な単一の液相が形成されるので、パクリタキセルがリピオドールに完全に溶解されることが分かった。製造された組成物をシリンジフィルター（２００μｍポアサイズ、ＰＶＤＦフィルター）を連結した注射器を通過させて滅菌した。実験例１で準備された肝臓癌動物モデルにおいて、微細導管を利用して本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物0.3ｍｌ（3.33又は１０ｍｇ／ｍｌ処方物）又は0.4ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ処方物）を腫瘍の給養動脈(feeding artery)内に注入して動脈化学塞栓術を実施した。従って、パクリタキセルの投与量は各々１ｍｇ、３ｍｇ又は４ｍｇに該当する。この際、陰性対照群として、肝臓癌動物モデルにリピオドールのみを0.3ｃｃ注入して比較した。手術１週間後ＣＴ撮影をした結果、図１で見られるように肝臓癌組織にのみ選択的にリピオドールが観察された。動脈化学塞栓術実施１週間後、ウサギ等より肝臓を摘出した。パクリタキセル／リピオドール処方物を投与した実験群の場合、腫瘍の大きさは３２±５ｍｍ程度であり、リピオドールのみを投与した陰性対照群の場合と似ていた。肝臓癌組織の中で壊死性腫瘍(necrotic tumor)と生存している腫瘍(viable tumor)とを区分するために、病理学的検査を行った。全体の肝臓癌組織の中で生存している腫瘍の百分率を図３に示した。陰性対照群では生存している腫瘍が３０％以上である反面、パクリタキセルを各々１ｍｇ、３ｍｇ及び４ｍｇを投与した実験群の場合、生きている腫瘍が各々13.2％、10.4％、及び0.6％であった。このような実験結果はパクリタキセル／リピオドール処方物のパクリタキセルが効果的に癌細胞を破壊することを示す。
【００３９】
実施例７：リピオドール／大豆油／パクリタキセル組成物の製造
１ｍｌのリピオドールと0.2ｍｌの大豆油(soybean oil)にパクリタキセル１０ｍｇを添加して試験管に入れ、室温で撹拌して溶解させた。迅速な溶解のため、バスタイプソニケータで超音波処理した。透明な単一液状が形成されるのでパクリタキセルがリピオドールに完全に溶解されることが分かった。
【００４０】
実施例８：リピオドール／スクアレン／パクリタキセル組成物の製造
大豆油の代わりにスクアレン(squalene)を用いて迅速な溶解のため４０℃に加温した点を除いては、実施例６と同一な製造方法でリピオドール／スクアレン／パクリタキセル組成物を製造した。透明な単一の液相が形成されるので、パクリタキセルがリピオドールに完全に溶解されることが分かった。
【００４１】
実施例９：パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン組成物の製造及び物理的安定性の測定
１ｍｌのリピオドール(Lipiodol Ultra-fluid,Laboratoire Guerbet,France,ヨード含量３８重量％)と0.01ｍｌのトリカプリリン（シグマ社）にパクリタキセル（三養ゼネックス社、韓国）１０ｍｇを添加した油性混合物を試験管に入れ室温で撹拌溶解させた。迅速な溶解のため、バスタイプソニケータで超音波処理した。透明な単一の液相が形成されるのでパクリタキセルがリピオドール／トリカプリリンの油性混合物に完全に溶解されることが分かった。製造された組成物をシリンジフィルター（２００μｍポアサイズ、ＰＶＤＦフィルター）を連結した注射器を通過させて滅菌し、２００日間室温及び４℃で保存し、物理的安定性及びパクリタキセルの化学的分解の有無を観察した。処方物の色相や匂いの変化が無かった。相分離や沈澱現象もやはり発生しなかった。ＨＰＬＣを利用して分析した結果、パクリタキセルは全く分解しないことが分かった。実施例１のパクリタキセル／リピオドール処方物の場合、常温で２００日保存後パクリタキセルの沈澱により濁ることが観察された（図５Ａ）。パクリタキセルの沈澱は偏光顕微鏡下でも観察された（図５Ｂ）。これに対し、パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン組成物はパクリタキセルの沈澱が形成されず（図５Ｄ）、透明に維持される（図５Ｃ）ことも確認した。従って、パクリタキセルの沈澱形成を阻害する成分としてトリカプリリンを添加することにより、パクリタキセル／リピオドール組成物を長期間安定して保存することができる。
【００４２】
実施例１０：パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン組成物の製造及び物理的安定性の測定
１ｍｌのリピオドール(Lipiodol Ultra-fluid,Laboratoire Guerbet,France,ヨード含量３８重量％)と0.01ｍｌのトリカプリリン（シグマ社）にパクリタキセル（三養ゼネックス社、韓国）１２ｍｇを添加した混合物を試験管に入れ室温で撹拌溶解させた。迅速な溶解のため、バスタイプソニケータで超音波処理した。透明な単一の液相が形成されるのでパクリタキセルがリピオドール／トリカプリリンの油性混合物に完全に溶解されることが分かり、パクリタキセルの溶解度がリピオドール単独の場合よりも、リピオドール／トリカプリリンの油性混合系でさらに高いことが分かった。
【００４３】
実験例２：黒色腫動物モデルの製作
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから自然発生した黒色腫細胞株であるＢ１６−Ｆ１０細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC,USA)から得た。前記細胞を１０％ウシ胎仔血清（fetal bovine serum；FBS,Gibco）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Penicillin/Streptomycin；Gibco）が添加されたダルベッコ変法イーグル培地（Dulbeccos Modified Eagle Medium；ＤＭＥＭ，Gibco BRL/Life Technologies,New York,NY)にて培養した。１×１０６個の細胞を１００μｌのＤＭＥＭに分散して８週令のC57BL/Jマウス（韓国サムタコ，Samtaco）の左の後足の足裏に接種して黒色腫動物モデルを製作した。
【００４４】
実施例１１：パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン組成物を注入した後黒色腫の大きさの測定
実施例９で製造したパクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン組成物をシリンジフィルター（２００μｍポアサイズ、ＰＶＤＦフィルター）を連結した注射器を通過させて滅菌した。実験例２と同様にして黒色腫を接種した後、５日経過したマウスの左の後足の足裏の接種部位に前記組成物２０μｌを注入した。陰性対照群としてリピオドール／トリカプリリン（１００：１容積比）のみを２０μｌ注入した群と何等の処理も施さない群を使用した。黒色腫の大きさは足裏の厚みを測定して定量化し、その結果を図６に示した。何等の処理も施さない群では黒色腫が接種１８日経過後から大きくなり始め、リピオドール／トリカプリリンのみを処理した群の場合、２２日経過後から大きくなり始めた。反面、パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリンで処理した群では黒色腫が全く大きくならず、本発明の組成物が顕著な抗癌活性を示したことを確認した。
【００４５】
実施例１２：パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン組成物注入後の生存期間の測定
実施例９で製造したパクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン組成物をシリンジフィルター（２００μｍポアサイズ、ＰＶＤＦフィルター）を連結した注射器を通過させて滅菌した。実験例２と同様にして黒色腫を接種した後、５日経過したマウスの左の後足の足裏の接種部位に前記組成物２０μｌを注射した。陰性対照群には何等の処理も施さない群を使用した。生存しているマウスの個体数を時間経過に伴って図７に示した。何等の処理も施さない群では黒色腫が接種後２０日経過後からマウスが死に始めて、４８日経過時全ての個体（ｎ＝６）が致死した。
これに対し、パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリンを処理した群では全ての個体が健康に生存していて、本発明の組成物が顕著な抗癌活性を示したことを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のパクリタキセル／油性造影剤組成物は単一相の高粘性液状である。本発明の組成物は従来主に静脈注射で投与されてきた、パクリタキセルに対して新たな投与経路を提示するものである。本発明の組成物は動脈化学塞栓術による肝臓癌治療に使用できる。本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物は製造及び滅菌が容易で、従来のドキソルビシン／リピオドール処方物より物理的にさらに化学的に安定している。従って、本組成物は固形癌の治療のための動脈化学塞栓術の実施中及び実施後にも安定であって、室温で少なくとも６０日間安定性を維持することができる。さらに、パクリタキセルの沈澱を阻害する物質を付加的に添加することにより、パクリタキセル／リピオドール組成物でパクリタキセルの溶解度を増加させ、少なくとも２００日以上安定性を維持することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物0.3ｃｃを肝動脈化学塞栓術でウサギの肝臓癌組織に選択的に投与し、１週間経過後のＣＴ写真である。投与されたパクリタキセルの量はＡ）１ｍｇ，Ｂ）３ｍｇ及びＣ）０ｍｇに該当する。
【図２】本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物0.3ｃｃを肝動脈化学塞栓術でウサギの肝臓癌組織に選択的に投与し、１週間経過後、肝臓癌組織及び周辺の正常組織におけるパクリタキセルの濃度を示したグラフである。パクリタキセルの定量的な分析はＨＰＬＣで行われた。投与されたパクリタキセルの量はＡ）１ｍｇ及びＢ）３ｍｇに該当する。
【図３】本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物0.3ｃｃ（パクリタキセル１ｍｇ投与群及びパクリタキセル３ｍｇ投与群）、0.4ｃｃ(パクリタキセル４ｍｇ投与群)を肝動脈化学塞栓術でウサギの肝臓癌組織に選択的に投与し、１週間経過後、全体の肝臓癌組織の内、生存癌組織の比率を表わすグラフである。陰性対照群の場合リピオドール0.3ｃｃのみを投与した。
【図４】本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物0.4ｃｃ（パクリタキセル４ｍｇ投与群）を肝動脈化学塞栓術でウサギの肝臓癌組織に選択的に投与し１週間の間、肝臓癌組織、左葉、右葉におけるパクリタキセルの濃度を示すグラフである（- ● - ;肝臓癌組織におけるパクリタキセルの濃度、- ○ - ;左葉におけるパクリタキセルの濃度、- ▼ - ;右葉におけるパクリタキセルの濃度。）。
【図５】本発明のパクリタキセル／リピオドール処方物とパクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン処方物を常温で２００日保存した後の写真である（Ａ；パクリタキセル／リピオドール処方物の写真、Ｂ；パクリタキセル／リピオドール処方物の偏光顕微鏡下の写真、Ｃ；パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン処方物の写真、Ｄ；パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン処方物の偏光顕微鏡下の写真。）。
【図６】黒色腫細胞を接種して５日経過後、パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン処方物２０μｌ（パクリタキセル２００μｇ投与群）を注入した後、足裏の厚さを測定したグラフである。リピオドール／トリカプリリン２０μｌを投与した群を対照群とし、陰性対照群として何等の処理もしていない群を使用した（- ● - ;パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン処方物２０μｌ（パクリタキセル  ２００μｇ）を投与した群、- ○ - ；リピオドール／トリカプリリン処方物２０μｌを投与した群、- ▼ - ;何等の処理もしていない群。）。
【図７】黒色腫細胞を接種して５日経過後、パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン処方物２０μｌ（パクリタキセル２００μｇ）を注入した後の生存マウス個体数を示したグラフである。陰性対照群としては何等の処理もしていない群を使用した（- ● - ;パクリタキセル／リピオドール／トリカプリリン処方物２０μｌ（パクリタキセル  ２００μｇ）を投与した群、- ○ - ;何等の処理もしていない群。）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2005504070.tif 000048
2005504070.tif 000049