(57)【要約】本発明は、光線力学療法で用いるための方法および組成物に関する。新規のペリレンキノン誘導体、ペリレンキノン誘導体および結合剤を含む複合体、ならびに、これら組成物を用いた治療方法が開示される。本発明は、光線力学的活性を有する光増感剤の分野に関する。それらは、高い光線力学的活性と、低い暗所での毒性とを有することから、癌およびＡＩＤＳウイルスに対してＨＰＤより効力のある光線力学的薬剤とすることができる。
2005518329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造式：
【化１】
2005518329.tif 000008
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、ＯＣＨ3、ＮＨＣＨ2Ａｒ、またはＮＨＣＨ(ＣＨ2)nであり、ここでＡｒはフェニル基またはピリジル基であり、−ＣＨ(ＣＨ2)nは脂環式基であり、ｎは３、４、５、６である）
で示されるアミノ置換デメトキシル化ヒポクレリン誘導体を含む組成物。
【請求項２】
Ｒ1およびＲ2がＯＣＨ3であり、Ｒ3およびＲ4がＯＣＨ3、ＮＨＣＨ2Ａｒ、またはＮＨＣＨ2(ＣＨ2)nＡｒであり、Ａｒがフェニル、ピリジル、ナフチル、多環式芳香族、またはヘテロ環式部分であり、ｎが０〜１２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
脂肪族アミンを含む溶媒にヒポクレリンを溶解し、得られた溶液を攪拌すること；
溶媒を除去して残留物を得ること；
残留物を洗浄すること；および、
残留物を分離すること、
を含む、デメトキシル化ヒポクレリンの製造方法。
【請求項４】
残留物を分離することは、薄層クロマトグラフィーを用いて残留物を分離することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒポクレリンが、ヒポクレリンＡまたはヒポクレリンＢである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
脂肪族アミンが、シクロペンチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、３−ピリジルメチルアミンまたは４−ピリジルメチルアミンである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
脂肪族アミンが、シクロブチルアミン、ヒスタミン、２−チオフェンメチルアミン、２−ピロールメチルアミン、またはトリプタミンである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
溶媒が、ベンゼン、ピリジン、シクロヘキサンまたは１,４−ジオキサンである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
溶媒が、クロロベンゼン、トルエン、ヘキサン、石油エーテル、テトラヒドロフラン、またはＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
デメトキシル化ヒポクレリン誘導体を投与すること、および、該デメトキシル化ヒポクレリン誘導体を所定の波長の光線に曝すことにより、該デメトキシル化ヒポクレリン誘導体を活性化すること、を含む治療方法。
【請求項１１】
ヒポクレリンが、次の構造式：
【化２】
2005518329.tif 000009
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、ＯＣＨ3、ＮＨＣＨ2Ａｒ、またはＮＨＣＨ(ＣＨ2)nであり、ここで、Ａｒはフェニル基またはピリジル基であり、−ＣＨ(ＣＨ2)nは脂環式基であり、ｎは３、４、５、６）で示されるアミノ置換デメトキシル化ヒポクレリン誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4がＯＣＨ3またはＮＨＣＨ2(ＣＨ2)nＡｒであり、Ａｒがフェニル、ナフチル、多環式芳香族、またはヘテロ環式部分であり、ｎが０〜１２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒポクレリンが、２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢを含む治療用組成物。
【請求項１５】
２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢを含む組成物の有効量を投与することを含む、光力学的治療方法。
【請求項１６】
２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢを投与することを含む治療方法。
【請求項１７】
次の構造式：
【化３】
2005518329.tif 000010
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はＯＣＨ3またはブチルアミノ基である）のいずれか一つで示される化合物を含む組成物を投与することを含む、光力学的治療方法。
【請求項１８】
ｎ−ブチルアミンを含む溶媒にヒポクレリンＢを溶解すること；
溶媒を除去して残留物を得ること；
残留物を洗浄すること；および、
残留物を分離すること、
を含む、２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、新規の光力学的活性（phtodynamic activity）を有する光増感剤、すなわち脂肪族アミノ置換デメトキシル化ヒポクレリンおよびそれらの合成を開示する。
【０００２】
【背景技術】
光力学的療法（phtodynamic therapy）（ＰＤＴ）は、光線と光増感剤とを組み合わせて用いる薬物療法であって、癌の組織または他の好ましくない組織の細胞傷害効果を発生させる。ＰＤＴは、従来の化学療法に比べて、高い有効性および安全性を有する。広く受け入れられているＰＤＴメカニズムとは、放射線照射すると、光増感剤は、標的分子で継続的に高い反応性の活性酸素種を発生させることである。１度に１種の標的分子しか殺せない従来の化学薬品に比べて、ＰＤＴは顕著に高い有効性を有する。一方で、ＰＤＴは、薬物および光線に方向付けられた２重の選択性を有し、それにより正常な組織に対するダメージを防ぐか、または減少させ、薬物の安全性を高める。これは癌およびＡＩＤＳ治療に重要である。
【０００３】
光力学的療法（ＰＤＴ）は、光活性のある薬物を体内に導入すること、および、続いて可視光または近赤外光で腫瘍組織を照射することからなる。酸素の存在下では、照射により薬物が活性化され、順に組織のダメージをもたらす活性酸素種が生産される。その利益、例えば、たいていの部位における相対的な選択性、他の治療との併用可能性、再現性、供与の簡便さ等の利益のため、ＰＤＴは、徐々に、特定の型の癌または臨床症状、例えば初期段階の肺、食道、胃、頚部の癌、および頚部の形成異常等に関する有用な癌治療としての地位を確立しつつある［１］。
【０００４】
レーザーおよび光ファイバー技術の迅速な発展に伴い、ＰＤＴにおける光源の問題は解決されつつある。ＰＤＴ療法における光増感剤の選択は、より重要になってきた。現在、最も一般的な光力学的薬剤であるフォトフリンは、初期の癌、例えば膀胱、肺および胃の癌などの治療に対して明確な治療効果を示す。Lipson等は、ヘマトポルフィリン誘導体（ＨＰＤ）を、癌の成長を検出および制御するのに用い、さらに、１９６６年に初めて乳管の癌を治療するのに用いた。KellyおよびSnellは、ＨＰＤは膀胱癌に対して明らかに光線力学的治療効果を有することを、Journal of Urology（1976, 115, 150）で報告している。Dougherty等は、ＨＰＤを光増感剤として用いて、多数の大脳、頚部および目の癌等のケースに対するそれらの光線力学的活性を研究したところ、明確な治療効果が得られたことを、Journal of NATO Cancer Institute（1975, 55, 115）で報告している。１９７８年には、DoughertyがＨＰＤを光増感剤として用いて、悪性の皮膚癌および皮下の腫瘍を治療したところ、１１３ヶ所の病的な変化のうちの１１１ヶ所が完全または部分的に治癒したことが示された。ポルフィリン増感剤は、４個のピロール環と４個のメチレン架橋とで構成されるπ共役系であり、ＨＰＤおよびジヘマトポルフィリンエーテルまたはエステル（ＤＨＥ）は、臨床的療法で用いられる幅広い薬剤である。ＨＰＤが特定の濃度に達すると、インビトロおよびインビボで迅速に凝集が起こり、それによりＨＰＤの光力学的活性が減少する。El-Far等のCell Biochemistry Function（1985, 3, 15）において、ＨＰＤが親油性であり、ある程度の癌細胞局在化能力を示すことが報告されている。ＨＰＤは、癌組織中に選択的に濃縮することができ、局在化作用および光増感活性は、それらの疎水性度、凝集および電荷分布に依存する。
【０００５】
これまで、カナダ、日本、オランダおよび米国において、フォトフリン（登録商標）だけが保健当局によって承認されている［２］。フォトフリンで好ましい結果が得られているにもかかわらず、その複雑な組成、赤色スペクトルの領域における低い吸光係数、および、持続性の皮膚の光毒性などのいくつかの重要な要素が、未だにＰＤＴの効能を制限している［３］。従って、より理想的で、適切な光増感剤の探求が、切実に奨励されている。
【０００６】
光増感剤としてＨＰＤを用いるＰＤＴが多大な注目を集めてきたにもかかわらず、いくつかの深刻な不利益、すなわち複雑な構成、光力学的なウィンドー（window）（６００〜９００nm）における低い吸収、遅い代謝、毒性および副作用などが、未だに存在する。
【０００７】
これらの制限を克服するため、近年、あらゆる種類の新しい光増感剤が調査された。天然に存在する多環式のキノンである、ヒポクレリン（hypocrellin）は、中国南西部に豊富に生育している真菌のhypocrella bambuase（B. Et Br）sacc.から単離された。真菌中の高いヒポクレリン含有量（３〜４％）と、分離および精製が簡単であるため、過去２０年にわたり多くの注目を集めてきた。ヒポクレリンとは、その名称はSinarundinaria種の寄生性真菌であるHypocrella bambusae sacc.に由来しており、これは、雲南省（中国）の北西部、チベットの南東部、およびスリランカのある地域に豊富に生育している。ヒポクレリンは、ペリレンキノイド（ＰＱＰ）ピグメントの一般分類に属し、ヒポクレリンＡ（ＨＡ）およびヒポクレリンＢ（ＨＢ）が挙げられる。
【０００８】
中国では、いくつかの病院が、光力学的薬剤としてヒポクレリンを用いて、ある種の皮膚病、例えば外陰部の脱色、白斑および乾癬を治療している。１９８０年には、Xiang-yi WanおよびZi-hua Luoにより、ヒポクレリンが外陰部の脱色や皮膚の瘡を治療するのに使用可能であることが、それぞれKexue Tongbao（1980, 25, 1148）（中国語）およびYunnan Yiyao（1980, 1, 20）（中国語）に報告されている。ヒポクレリンは、苔癬化、白斑および乾癬 ならびにやけどを負った頭部を治療するために、徐々に用いられてきている。Yuan-teng Chen等は、有効成分の一つである、ヒポクレリンＡ（ＨＡ）を同定した（Liebigs Ann. Chem.（1981, 1880））。Manhua ZhangおよびLi Liang等は、ヒポクレリンのもう一方の有効成分である、ヒポクレリンＢ（ＨＢ）を同定した（Kexue Tongbao（1988, 33, 518）（中国語））。Manhua Zhang等は、１０年以上もの間、ヒポクレリンの構造、光化学、光物理学（photophysics）、光生物学および細胞学を研究している。我々は、ヒポクレリンが、ＨＡ｛３,１０−ジヒドロキシル−４,９−ジオン−１,１２−（２′−ヒドロキシル−２′−メチル−３′アクチル）プロピリデン（１′,３′）−２,６,７,１１−テトラメトキシル−ペリレン｝（構造Ｉを参照）、および、ＨＢ｛３,１０−ジヒドロキシル−４,９−ジオン−１,１２−（２′−メチル−３′−アクチル−２′,３′−デヒドロ）プロピリデン（１′,３′）−２,６,７,１１−テトラメトキシル−ペリレン｝（構造IIを参照）からなることを確認した。
【０００９】
【化４】
2005518329.tif 000003
【００１０】
新しい種類の光増感剤として、これらは、調製および精製が簡便なこと、低い毒性、高い安定性、凝集が起こらないこと、迅速な代謝、低い副作用、および、癌組織における選択的な局在化などの数々の利点を有する。これらは、その特性により、次世代の光増感剤として将来有望である。Lown等は、ＨＢが、光化学および光生物学に関して明確な抗ＡＩＤＳ作用を有することを報告している（1997, 65, 352）。しかしながら、光力学的なウィンドーにおいてそれら吸収量がわずかなため、ＰＤＴにおけるその用途が制限される。ヒポクレリンは、それらの純粋な組成、好ましい赤色光線、吸収スペクトル、一重項酸素の高い量子効率、および、容易な部位特異的化学修飾により、可能性のあるＰＤＴ用光増感剤として選択されてきた［４］。親物質であるヒポクレリンＢ（ＨＢ）の多くの誘導体が、合成および研究されている。それらのいくつかは、将来有望な抗癌特性を示している［５〜１１］。これらの制限を克服するために、ヒポクレリンの多くの構造改変がなされてきた。１９９４〜１９９５年において、我々とLownは、ほぼ同時期にアミノ置換ヒポクレリンを調製した。アミノ置換ヒポクレリンは、光力学的なウィンドーにおける強い吸収を示した。レーザーの補助と共に、それらは、それらの親物質であるヒポクレリンに比べてさらに高い光力学的活性を示した。Lownは、Photochemistry and Photobiology（1997, 65, 714）において、アミノ置換ヒポクレリンによる癌細胞への光によるダメージを詳細に報告している。Lown博士によって調製されたアミノ置換誘導体は、ヒポクレリンの元のペリヒドロキシル化ペリレンキノン構造が改変されており（構造IIIおよびIVを参照、IIIおよびIVの親化合物は異性体である）、それにより、ヒポクレリンの光活性のある位置が変化する。Lownにより報告されたアミノ置換ＨＢの方法は、多数の工程を必要とすることから望ましくない。
【００１１】
【化５】
2005518329.tif 000004
【００１２】
Manhua Zhang等は、メルカプト置換ヒポクレリンは、光活性のある位置が望ましくないために、光力学的なウィンドーにおいてわずかな吸収しか示さないことを報告している。
【００１３】
【発明の開示】
本発明は、新しい種類の脂肪族アミノ（脂環式および芳香環を含む）置換デメトキシル化ヒポクレリン、および、それらの調製方法を提供する。当該ヒポクレリン誘導体は、光力学的なウィンドーにおける強い吸収を示し、ペリヒドロキシル化ペリレンキノン構造の光力学的特性を保持する。レーザー光線で照射すると、これらは、一重項酸素（1Ｏ2）、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ2-）およびヒドロキシラジカル（ＨＯ・）などの活性酸素種を発生させることができ、高い光力学的活性を有する。これらは、癌および抗ＡＩＤＳウイルスの治療に用いることができる。
【００１４】
本発明におけるヒポクレリン誘導体は、アミノ置換デメトキシル化ヒポクレリンＡおよびＢからなり、その構造はＶおよびVI:
【化６】
2005518329.tif 000005
で示され、式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、ＯＣＨ3またはＮＨＣＨ2Ａｒ（Ａｒは、フェニル基またはピリジル基である）、ＮＨＣＨ(ＣＨ2)n（ここで、−ＣＨ(ＣＨ2)nは脂環式基であり、ｎは、３、４、５、６である）である。２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの場合、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3はＯＣＨ3であり、Ｒ4は、ＮＨ(ＣＨ2)3ＣＨ3である。あるいは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、ＯＣＨ3またはＮＨＣＨ2(ＣＨ2)nＡｒでもよく、ここでＡｒは、フェニル、ナフチル、多環式芳香族またはヘテロ環式基であり、ｎは０〜１２である。
【００１５】
本発明のヒポクレリン誘導体には、２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢ（２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ）もまた含まれる。２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは、赤色スペクトルの領域において強い吸収を示す。その吸収バンドは、その親化合物であるＨＢに比べて、より長い波長へ拡張された。５８３nmにおける吸光係数（６）は、５４８nmにおけるＨＢの吸光係数の２.５倍であり、６２１nmにおける吸光係数は、５８０nmにおけるＨＢの吸光係数の３.８倍を上回った（表１）。これは、臨床的に用いられる光線の組織への透過に対してより好ましい。
【００１６】
２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは、細胞のダメージに対して優れた光増強作用を有する。ＭＴＴ比色分析結果によれば、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは、試験された最も高い濃度（１００μＭ）でも５０％致死率を引き起こさないことが示された。これは、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの暗所におけるＬＤ50が１００μＭより高いことを意味し、これは、これまで報告されたいずれのＨＢ誘導体［８〜１０］のＬＤ50にも匹敵する。しかしながら、ＨＢは、約２０μＭで５０％死亡率を引き起こす。言い換えれば、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの細胞毒性は、ＨＢの細胞毒性に比べてより低かった。一方で、線量が２４Jcm-2の場合において、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢのＬＤ50は、約０.４μＭであり、一方でＨＢのＬＤ50は、２μＭであった。従って、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは、インビトロでＨＢの２５倍を上回る光増強作用を示し、それにより薬物投与における広範な安全性マージンを得ることができる。
【００１７】
また、本発明のヒポクレリン誘導体を、所定の細胞または構造と結合する結合剤に、インビトロまたはインビボで複合させることもできる。モノクローナル抗体との複合（例えば免疫複合体）により、卵巣癌および乳癌などの多種多様な病気の治療に関して、特異性を与える。ヒポクレリンの蛍光特性、または、ヒポクレリンが強く着色されるという事実は、腫瘍および転移性の病気の診断におけるそれらの使用を容易にし、それらのスペクトルのフィンガープリントは、悪性の組織、正常な組織、炎症を起こした組織、または、物理的にダメージを受けた組織の識別を容易にする。さらに、これらの蛍光特性は、多種多様な光学的検出法により検出することができる。
【００１８】
また、モノクローナル抗体との複合は、卵巣癌および乳癌などの多種多様な病気に関する光線療法の特異性を高める。この複合体は、主に細胞内標的および膜の標的とのII型の光化学反応を介して、アポトーシス細胞死による光毒性を成立させる。酸素が全くない場合、光毒性は、低酸素性の腫瘍細胞の制御に決定的な特徴のＩ型の光化学反応を介してもたらされる。それらは、６８８nmにおいて、同様に光線療法ウィンドー内で、顕著な光毒性を保持する［Estey, et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 37:343（1996）］。
【００１９】
本発明は、光力学的薬剤としてのペリレンキノン（ＰＱＰ）誘導体の使用、および、光力学的療法（ＰＤＴ）におけるヒポクレリン誘導体の使用を含む。
また、本発明は、少なくとも１種の本発明のヒポクレリン誘導体の治療上充分な量を投与すること、および、前記誘導体を光活性化することによる、病気の治療方法を含む。通常、当該ヒポクレリン誘導体は、光線の所定の波長に当該誘導体を曝すことによって活性化することができる。
また、本発明は、１またはそれ以上の本発明のヒポクレリン化合物を含む組成物を投与することを含む光線力学治療方法を含む。
【００２０】
また、本発明は、約４００nm〜約８５０nmの光波長の存在下で増強される癌の治療方法を含む。また、本発明は、一重項酸素および多種多様な毒性のフリーラジカルを発生させるため、１またはそれ以上のＰＱＰ誘導体を用いることを含む。通常、一重項酸素および／または毒性のフリーラジカルを発生させることができる化合物を、特定の病気などを治療するのに用いることができる。
また、本発明は、抗癌および／または抗ウイルス活性を有するヒポクレリン誘導体を用いること、および、当該誘導体を光活性化することによって誘導体の活性を増強することを含む。また、本発明は、ヒポクレリン誘導体を用いて、癌細胞を優先的に破壊する、または、癌細胞を優先的に標的化することを含む。
【００２１】
また、本発明は、未変性のペリレンキノン（例えばヒポクレリン）を生産する方法、ペリレンキノン誘導体（例えばヒポクレリンＡおよびヒポクレリンＢ）、放射標識したヒポクレリンＢ、および、放射標識したヒポクレリンＢ誘導体を合成する方法を含む。また、本発明は、ペリレンキノン誘導体、ヒポクレリン誘導体、放射標識したヒポクレリンＢ、および、放射標識したヒポクレリンＢ誘導体、ペリレンキノン複合体、および、ヒポクレリン複合体を含む組成物を含む。
また、本発明は、本発明のＰＱＰ誘導体を、１またはそれ以上の結合剤（例えば抗体または抗体断片）に結合させることを含む。また、本発明は、１またはそれ以上の結合剤（例えば抗体または抗体断片）に結合させたＰＱＰ誘導体を含む。また、本発明は、細胞構造（例えば細胞核）中で光毒性を達成するため、ＰＱＰ誘導体（例えばヒポクレリン誘導体）を、ＤＮＡ副溝結合剤に結合させることを含む。
【００２２】
本明細書で用いられるように、ペリレンキノン誘導体または誘導体は、未変性または天然のペリレンキノンから誘導された全てのデメトキシル化化合物を意味し、これらは所定の光線によって活性化することができる。本発明の好ましい実施形態において、当該誘導体は、天然に存在するヒポクレリンＡまたはヒポクレリンＢ、および、ヒポクレリン様化合物から誘導された化合物である。ヒポクレリン誘導体は、本明細書で用いられるように、光線により活性化することができ、光線力学的薬剤として用いることができる。また、本発明に係る誘導体は、他の活性試薬と複合化するか、または、他の活性試薬を含ませることができ、他の活性試薬としては、これらに限定されないが、化学療法剤またはアルキル化剤が挙げられる。
【００２３】
本発明の化合物は、精製した化合物もしくは実質的に精製した化合物、または、光線力学的薬剤として有用な化合物が得られるいかなる方法によって製造することができる。また、本発明の化合物は、化合物の混合物、例えば２以上の化合物の混合物を含む組成物を形成することができる。これらの方法は、当業界周知であり、例えばLiu, et al.,“Synthetic studies in novel hypocrellin B derivatives, Tetrahedron, 49:10785（1993）；および、Diwu, et al., Anti-Cancer Drug Design, 8:129-143（1993）である。ヒポクレリン誘導体は、親化合物であるヒポクレリンＢ（ＨＢ）、竹類の植物病原体である真菌Hypocrella bambusae sacc.の天然産物から容易に合成できる。また、本発明の化合物は、以下に示すように合成的に製造できる。また、当該化合物を製造する代表的な方法は、実施例でより詳細に示される。本発明は、ヒポクレリン誘導体を生産、分離または精製する方法によって限定されないものとする。
【００２４】
本発明におけるヒポクレリン誘導体の調製方法を以下に説明する。ヒポクレリン（例えばヒポクレリンＡまたはＢ）、新たに蒸留した溶媒（過量の脂肪族アミンを含む）に溶解し、得られた溶液を６〜２４時間攪拌する。減圧下で溶媒を除去する。クロロホルムを用いて残留物を３〜４回洗浄し、クロロホルム層を水で３〜４回洗浄する、クロロホルムを蒸発させ、次に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、溶離液として３：１：０.５（Ｖ：Ｖ：Ｖ）のシクロヘキサン−エチルアセテート−９５％エタノールを用いて残留物を分離する。ＴＬＣ精製を２回繰り返し、純粋なアミノ置換デメトキシル化ヒポクレリンを得る。反応には、ヒポクレリンＡおよびＢ両方が用いられる。
【００２５】
脂肪族アミンとしては、これらに限定されないが、シクロペンチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、３−ピリジル−メチルアミンおよび４−ピリジル−メチルアミンが挙げられる。また、アミンとしては、シクロブチルアミン、ヒスタミン、２−チオフェンメチルアミン、２−ピロールメチルアミン、またはトリプタミンも挙げられる。
溶媒としては、これらに限定されないが、ベンゼン、ピリジン、シクロヘキサン、または、１,４−ジオキサンが挙げられる。また、溶媒として、クロロベンゼン、トルエン、ヘキサン、石油エーテル、テトラヒドロフラン、または、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドも挙げられる。
【００２６】
本発明におけるヒポクレリン誘導体は、光力学的なウィンドーにおける強い吸収（６００〜９００nm）を示した。レーザー光線で放射線照射すると、当該ヒポクレリン誘導体は、一重項酸素（1Ｏ2）、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ2・-）およびヒドロキシラジカル（ＨＯ・）などの活性酸素種を発生させることができる。当該ヒポクレリン誘導体は、数々の利点、すなわち高い光力学的活性、および、暗所での低毒性を有し、それにより、当該ヒポクレリン誘導体は抗癌および抗ＡＩＤＳ剤として将来有望である。
【００２７】
本発明における、この種のアミノ置換デメトキシル化ヒポクレリン誘導体の光化学および光物理学に関する研究によれば、当該ヒポクレリン誘導体は、光活性のある位置（それらの親物質のヒポクレリンとして）を保存し、効率的に活性酸素種を発生させることができることが示され、ここで活性酸素種としては、例えば一重項酸素（1Ｏ2）（1Ｏ2の量子効率は、ＨＡ、ＨＢおよびＨＰＤの０.５〜０.８である）、スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ2・-）（Ｏ2・-のアミノ置換デメトキシル化ヒポクレリン誘導体に関する量子効率は、ＨＢの２〜５倍である）である。当該ヒポクレリン誘導体は、光力学的なウィンドーにおける強い吸収を示した（それらの光力学的なウィンドーにおける吸光係数は、ＨＡ、ＨＢおよびＨＰＤの１０〜１００倍である）。全ての上記結果は、本発明におけるアミノ置換デメトキシル化ヒポクレリン誘導体は、新世代の光増感剤として望ましい活性を有することを示す。
【００２８】
既存の動物実験によれば、ヒポクレリンＡおよびＢが低い毒性を有することが示された。Lownのグループは、アミノ基の導入によりヒポクレリンの塩基性度を増強することによって、それらを好ましくリソソームに局在化させることを証明している。リソソームにおける光によるダメージは、癌細胞の分解を誘発させることができる。
【００２９】
本発明におけるアミノ置換ヒポクレリンは、光力学的なウィンドーにおける強い吸収（λmax＞１０4L・mol-l・cm-1）、一重項酸素の高い量子効率（それらの親物質であるヒポクレリンと比べて）、高い電荷移動の活性（酸化電位は１.３Ｖから０.８Ｖに減少し、Ｏ2・-発生の量子効率は親物質であるヒポクレリンの３倍である）を示し、これは、当該アミノ置換ヒポクレリンが強い光力学的作用を有することを示す。本発明で提供された調製方法は、簡単で、温和で、低コストであり、簡単に規模拡大できる。
【００３０】
ここで、他の新規のヒポクレリン同族体である、２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢ（２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ）［１２］が、有効な光増感剤であることが見出されている。そのＨｅＬａ細胞に対する光毒性、および、それによるアポトーシスの開始が報告されている。
【００３１】
本明細書で用いられるように、「投与すること」とは、結果的に、１またはそれ以上の本発明のヒポクレリン誘導体を所定の細胞、細胞群、または組織（通常、哺乳動物の）に曝す、または、接触させるようないかなる行為を意味する。本明細書で用いられるように、「投与すること」は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボで行うことができる。例えば、組成物は、注射により、または、内視鏡を介して投与することができる。また、「投与すること」は、本発明に係る組成物を直接細胞に適用することも含まれる。例えば、外科手術中に、腫瘍細胞を露出させることができる。本発明の実施形態に従って、このような露出した細胞（または腫瘍）を、例えば外科処理部位および／または細胞を洗浄または潅注することによって、本発明の組成物に直接晒すことができる。
【００３２】
本明細書で用いられるように、結合剤は、標的部分を含む受容体と特定の単結合を形成する全ての試薬等を意味し、例えば、癌細胞のエピトープと結合する抗体または抗体断片、または、細胞のある部位または構造を標的化する薬剤である。本発明の好ましい実施形態において、結合剤は、癌細胞に特異的に結合する抗体または抗体断片である。本発明のより好ましい実施形態において、結合剤は、卵巣癌、乳癌、または胃腸の癌の抗原のエピトープを結合させる。
【００３３】
本明細書で用いられるように、生理学的に許容できる液体は、ヒポクレリン誘導体を含む組成物と組み合わせるのに適した全ての液体または添加剤を意味する。通常、これらの液体は、希釈剤または担体として用いられる。代表的な生理学的に許容できる液体としては、これらに限定されないが、保存溶液、食塩水、等張（約０.９％）食塩水、または、約５％のアルブミン溶液または懸濁液が挙げられる。本発明は、用いられる生理学的に許容できる液体のタイプに限定されないものとする。また、本発明の組成物は、製薬上許容できる担体を含み得る。製薬上許容される担体としては、これらに限定されないが、食塩水、滅菌水、リン酸緩衝食塩水などが挙げられる。患者への供与に適切な、他の緩衝剤、分散剤、および不活性の非毒性物質が、本発明の組成物に含まれていてもよい。本発明の組成物は、液体、懸濁液、または、投与に適切な全ての製剤が可能であり、通常は、滅菌されており、望ましくない粒子状物質を含まない。本発明の組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌することができる。
【００３４】
また、本発明の化合物は、多数の他の化合物、シグナル伝達剤、エンハンサー、および／またはターゲティング剤と、連結および結合させて用いてもよい。例えば、本発明のヒポクレリン誘導体は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体に結合させることができる。本発明に従って、結合剤としては、全てのDNA副溝ターゲティング剤、例えばレキシトロプシン（lexitropsin）またはネトロプシン（netropsin）が挙げられ、好ましくは、細胞核における光毒性の標的化を増強することができる。
【００３５】
適切なエンハンサーとしては、これらに限定されないが、ｐＫａ調節剤、低酸素性細胞の放射線増感剤増感剤、および、生体内で還元的に（bioreductively）活性化される抗新生物剤、例えばマイトマイシンＣ（好ましくは、低酸素性細胞または微生物における上記化合物の毒性を達成または増強することができるもの）が挙げられる。適切なシグナル伝達剤としては、これらに限定されないが、アポトーシス細胞死または壊死性の細胞死のマーカー、または、細胞周期の制御または遅延の際に内在する調節分子が挙げられ、好ましくは、アポトーシス細胞死または壊死性の細胞死の誘発によって、または、いかなる致命的な形態または潜在性致死損傷（ＰＬＤ）の形態を修復することを阻害することによって、上記化合物の光毒性を増強することができる。
【００３６】
上述したように、本発明の実施形態は、結合剤−ヒポクレリン複合体（または免疫複合体）と、これら複合体の治療剤用途とを含む。本発明に従って、結合剤とヒポクレリンとを結合させる全ての方法を用いることができる。例えば、抗体または抗体断片と光増感剤とを結合させる方法が周知である。例えば、Goff, et al., British Journal of Cancer, 74；1194-1198（1996）は、光増感剤とモノクローナル抗体ＯＣ１２５とをインキュベートすることによる免疫複合体の製造と、多くの卵巣癌に関連するＣＡ１２５抗原に特異的に結合する抗体とを開示する。
【００３７】
本発明の最良の実施形態
我々は、以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【００３８】
実施例１
１５０mgのヒポクレリンＢ（０.２８mmol）を、過量のシクロペンチルアミンを含む１００mLの新鮮な蒸留したベンゼンに溶解し、得られた溶液を１８時間攪拌する。減圧下で溶媒を除去し、クロロホルムを用いて残留物を３〜４回洗浄し、クロロホルム層を水で３〜４回洗浄する。クロロホルムを蒸発させ、次に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、溶離液として３：１：０.５（Ｖ：Ｖ：Ｖ）のシクロヘキサン−エチルアセテート−９５％エタノールを用いて、残留物を精製する。さらに精製するためにＴＬＣを２回繰り返し、アミノ置換デメトキシル化ヒポクレリンＢを得る。
【００３９】
生成物の特徴：
UV-vis spectra (λmax) : 466nm, 577nm, 641nm;
IR spectra (νmax) : 3419cm-1, 2922cm-1, 1680cm-1, 1608cm-1 ;
1HNMR (δ) : 6.32(s), 6.80(s), 3.08(s), 2.55(s), 1.79(s), 1.91(s), 4.01(s), 4.08(s), 4.24(s), 1.86(m), 1.68(m), 1.49(m), 1.00(m), 16.07, 15.78ppm;
Mass spectra (m/z) : 583(M+)
【００４０】
実施例２
１５０mgのヒポクレリンＢ（０.２８mmol）を、過量のシクロヘキシルアミンを含む１００mLの新鮮な蒸留したベンゼンに溶解し、得られた溶液を１６時間攪拌する。減圧下で溶媒を除去する。クロロホルムを用いて残留物を３〜４回洗浄し、クロロホルム層を水で３〜４回洗浄する。クロロホルムを蒸発させ、次に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、溶離液として３：１：０.５（Ｖ：Ｖ：Ｖ）のシクロヘキサン−エチルアセテート−９５％エタノールを用いて、残留物を精製する。さらに精製するためにＴＬＣを２回行い、アミノ置換デメトキシル化ヒポクレリンＢを得る。
【００４１】
生成物の特徴：
UV-vis spectra (λmax) : 468nm, 579nm, 642nm;
IR spectra (νmax) : 3421cm-1, 2920cm-1, 1678cm-1, 1605cm-1 ;
1HNMR (δ) : 6.12(s), 6.79(s), 3.05(s), 2.54(s), 1.76(s), 1.89(s), 4.05(s), 4.10(s), 4.21(s), 1.84(m), 1.40(m), 1.26(m), 1.01(m), 16.08, 15.79ppm;
Mass spectra (m/z) : 597(M+)
【００４２】
実施例３
１５０mgのヒポクレリンＢ（０.２８mmol）を、過量のベンジルアミンを含む１００mLの新鮮な蒸留したピリジンに溶解し、得られた溶液を１５時間攪拌する。減圧下で溶媒を除去する。クロロホルムを用いて残留物を３〜４回洗浄し、クロロホルム層を水で３〜４回洗浄する。クロロホルムを蒸発させ、次に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、溶離液として３：１：０.５（Ｖ：Ｖ：Ｖ）のシクロヘキサン−エチルアセテート−９５％エタノールを用いて、残留物を精製する。さらに精製するためにＴＬＣを２回繰り返し、アミノ置換デメトキシル化ヒポクレリンＢを得る。
【００４３】
生成物の特徴：
UV-vis spectra (λmax) : 468nm, 623nm;
IR spectra (νmax) : 3438cm-1, 2942cm-1, 1683cm-1, 1605cm-1 ;
1HNMR (δ) : 7.53(m), 7.34(m), 6.32(s), 6.80(s), 3.08(s), 2.55(s), 1.79(s), 1.91(s), 4.01(s), 4.08(s), 4.24(s), 1.86(m), 16.07, 15.78ppm;
Mass spectra (m/z) : 603(M+)
【００４４】
実施例４
１５０mgのヒポクレリンＢ（０.２８mmol）を、過量の３−ピリジルメチルアミンを含む１００mLの新鮮な蒸留したピリジンに溶解し、得られた溶液を２１時間攪拌する。減圧下で溶媒を除去する。クロロホルムを用いて残留物を３〜４回洗浄し、クロロホルム層を水で３〜４回洗浄する。クロロホルムを蒸発させ、次に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、溶離液として３：１：０.５（Ｖ：Ｖ：Ｖ）のシクロヘキサン−エチルアセテート−９５％エタノールを用いて、残留物を分離する。さらに精製するためにＴＬＣを２回繰り返し、アミノ置換デメトキシル化ヒポクレリンＢを得る。
【００４５】
生成物の特徴：
UV-vis spectra (λmax) : 471nm, 625nm;
IR spectra (νmax) : 3435cm-1, 2940cm-1, 1682cm-1, 1604cm-1 ;
1HNMR (δ) : 8.53(s), 8.29(d), 7.77(m), 7.36(d), 6.37(s), 6.59(s), 3.98(s), 2.63(s), 1.78(s), 2.28(s), 4.04(s), 4.06(s), 4.13(s), 1.90(m), 1.62(m), 1.42(m), 1.27(m), 1.00(m), 16.59, 16.80ppm;
Mass spectra (m/z) : 603(M+)
【００４６】
実施例５
１５０mgのヒポクレリンＢ（０.２８mmol）を、過量の４−ピリジルメチルアミンを含む１００mLの新鮮な蒸留したベンゼンに溶解し、得られた溶液を２１時間攪拌する。減圧下で溶媒を除去する。クロロホルムを用いて残留物を３〜４回洗浄し、クロロホルム層を水で３〜４回洗浄する。クロロホルムを蒸発させ、次に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて、溶離液として３：１：０.５（Ｖ：Ｖ：Ｖ）のシクロヘキサン−エチルアセテート−９５％エタノールを用いて、残留物を分離する。さらに精製するためにＴＬＣを２回繰り返し、アミノ置換デメトキシル化ヒポクレリンＢを得る。
【００４７】
生成物の特徴：
UV-vis spectra (λmax) : 398nm, 474nm, 596nm;
IR spectra (νmax) : 3433cm-1, 2928cm-1, 1680cm-1, 1600cm-1 ;
1HNMR (δ) : 8.56(s), 8.24(d), 7.72(m), 7.28(m), 6.47(s), 6.50(s), 5.25(s), 2.58(s), 2.80(s), 3.90(s), 3.88(s), 3.89(s), 4.02(t), 4.20(t), -16.07ppm;
Mass spectra (m/z) : 603(M+)
【００４８】
実施例６
材料および方法
化学物質
ヒポクレリンＡ（ＨＡ）を定量的に水酸化カリウムで脱水し、続いてＨａで中和し、クロロホルム抽出し、ベンゼン−石油エーテルで再結晶してヒポクレリンＢ（ＨＢ）を調製し、ピリジン中のｎ−ブチルアミンで還流し、中和し、ＨＢをクロロホルム抽出することによって、２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢ（２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ）を調製した。生成物に、溶離液として石油エーテル／エチルアセテート／エタノール（９５％）の６：１：１混合物を用いた１％クエン酸−シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、３種の化合物を得た。それらは、標的化合物（流速（Ｒｒ）＝０.６４）、および、２種の副産物（それぞれＲｒ＝０.７４および０：４０）であり、これらは、ＮＭＲ、マススペクトルおよび元素分析で良好に同定された［１２］。標的化合物をＴＬＣでさらに精製し、所望の生成物、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ、を５４％の収率で得た。純度またはＨＢおよび２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢを高性能液体クロマトグラフィーで評価したところ、９５％を超過することがわかった。２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの化学構造を以下に示し、吸収スペクトルを図１に示す。それらの吸収スペクトルパラメーターを表１に示す。その光増感剤を実験当日まで凍結乾燥状に保ち、実験当日にそれらをＤＭＳＯに溶解した。
【００４９】
【表１】
2005518329.tif 000006
【００５０】
５,５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）および９,１０−ジフェニルアントラセン（ＤＰＡ）をAldrich Chemical社（米国）から購入した。ダルベッコ改変最少培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、臭化エチジウム（ＥＢ）およびトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）をGibco-BRL社（Grand Island, NY, USA）から購入した。プロテイナーゼＫおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をMerck社（Rahway, NJ, USA）から購入した。アガロースをPromega社（Madison, WI, USA）から購入し、ＲＮアーゼＡ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２,５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）およびプロピジウムヨウ化物（propidium iodide）（ＰＩ）をSigma Chemical社（St. Lows, MO USA）から購入した。ヘキスト染料３３３４２（ＨＯ３４２）をMolecular Probes社（Eugene, OR, USA）から購入した。他の試薬は、分析用グレードである。
【００５１】
活性酸素種の収率の測定
一重項酸素の収率を、以前に報告されたように［４］、ＤＰＡ脱色法で測定した。スピントラッピング剤であるＤＭＰＯを用いた電子スピン共鳴（ＥＳＲ）測定を、ヒポクレリンによるＯ2発生を測定するのに用いた［１３］。
【００５２】
細胞培養
加湿した５％ＣＯ2インキュベーターを用いて、５％のＦＢＳと抗生物質ＰＳ（８０Ｕ／mlのペニシリンおよび１００μg／mlのストレプトマイシン）とを含むＤＭＥＭ中で、３７℃で、ＨｅＬａ細胞を単層培養した。
【００５３】
分布比
分布比または光増感剤を、［Ｓｅｎ／ｇ細胞］／［Ｓｅｎ／ml培地］と定義する。その値を前述したように測定した［１４］。指数関数的に成長する細胞を、０〜５μＭの範囲になるまで、ＨＢと共にＤＭＥＭ中で１５分間、または、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢと共に３７℃で６時間インキュベートした。それぞれの時間の後、細胞内レベルが定常状態に達した。その細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０.２％トリプシン／０.５mMのＥＤＴＡ溶液を用いて分離し、遠心分離で洗浄し、未結合の染料を除去した。洗浄したペレット（２×１０5）を、３mLの１０mMのＴｒｉｔｏｎＸ−１００界面活性剤に分散させた。これらの溶液を４６０nmで励起し、日立社製Ｆ４５００蛍光分光光度計を用いて蛍光発光スペクトルを得た。６１０nmにおける蛍光を測定し、コントロール（薬物非含有）サンプルの蛍光を修正し、既知濃度のＨＢおよび２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ溶液で調製された標準蛍光強度曲線と比較した。
【００５４】
実施例７
増感剤の局在化
ガラス上に成長した細胞を、ＤＭＥＭ中で、４μＭのＨＢと共に１５分間、または、４μＭの２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢと共に６時間、３７℃でインキュベートした。蛍光をニコン社製ＦＸＡ顕微鏡で可視化し、増感剤が位置する部位を評価した（励起＝４００〜４５０nm、放出＝６００〜６５０nm）。
【００５５】
インキュベーションおよび照射
増感剤−ＤＭＳＯのストック溶液を、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで希釈した。ＤＭＳＯの最終濃度は、１％（ｖ／ｖ）を超過せず、７５cm2のフラスコ（Costar, Cambridge, MA, USA）中の指数関数的に成長するＨｅＬａ細胞を、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢと共に暗所で６時間、または、ＨＢと共に暗所で１５分間、３７℃でインキュベートした。その細胞を、ＰＢＳ中の０.２％トリプシン／０.５mMのＥＤＴＡ溶液を用いて分離し、遠心分離で洗浄し、未結合の染料を除去した。次に、その細胞を、３５mmの培養皿（Costar）に１mL（各培養皿が３×１０5個の細胞を含む）を移し、異なる線量で照射した。光源は、赤色光線治療器具（Institute of Electronic Academia Sinica、China）を用いた。その総出力（６００〜７００nmで９０％超）は、サンプルの位置で５０mW／cm2であり、ＢＴＹ−８２０４線量計で測定された（Beijing Institute of Solar Energy, China）。放射線照射後すぐに、７.５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（２mL）を各培養皿に加えた。次に、細胞の一部を次のように生存を評価し、残りを、核染色、ＤＮＡ断片化およびフローサイトメトリー分析でチェックできるまで培地中でインキュベートした。
【００５６】
細胞の生存の研究
細胞の生存をＭＴＴ分析で評価した［１１、１５、１６］。平底の９６−ウェルプレート（Costar）の各ウェルにＰＤＴ処理細胞を１００μl（１×１０4個の細胞を含む）移し、ＣＯ2インキュベーターで、その細胞を３７℃で２０時間インキュベートした。１０μlのＭＴＴ（１０mg／mL）を各ウェルに添加することによって、生存率を測定し、その混合物を３７℃で４時間インキュベートした。次に、培地をジメチルスルホキシドで置き換え、ホルマザン結晶を溶解させた。そのプレートを室温で１０分間攪拌し、バイオラッド社製のモデル3550マイクロプレートリーダー（Richmond, CA, USA）を用いて５９５nmで即座に読み取った。サンプルを１２回反復して測定し、各実験を少なくとも２回繰り返した。ＰＤＴ処理細胞の生存を、光増感剤単独でインキュベートした細胞に対して標準化した。
１ｍの段階的な適用量で、１５分間、または、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢを６時間、細胞に曝す類似の方法に従って、各化合物の暗所における毒性特徴を別々に評価した。細胞が光増感剤に曝される期間中または光増感剤を含む期間中に、細胞が光線に曝されることを避けるため、予め注意を払った。
光増強作用は、インビトロで暗所でＬＤ50を達成するのに必要な化合物の、ＭＴＴ分析において２４Jcm-2の赤色光線でＬＤ50を達成するのに必要な化合物に対するモル濃度比率として定義される［８］。
【００５７】
アポトーシスを起こした核の同定
処理細胞およびコントロール細胞を、ＤＭＥＭ中で、５％ＦＢＳと共に、３７℃で２４時間インキュベートし、次に、分離することによって回収し、遠心分離し、５μＭのＨＯ３４２を含む増殖培地（ＦＢＳ非含有）中で、３７℃で５分間インキュベートした。核の断片化を、ニコン社製ＦｘＡ顕微鏡を用いた蛍光顕微鏡検査によって評価した。ＥＸ波長は３３０〜３８０nmであり、ＥＭを４２０〜４５０nmでモニターした［１４］。生細胞および死細胞の両方の核は、蛍光を示した；アポトーシスを起こした細胞は、核の凝集または断片化の明るい蛍光部位が出現することによって同定できる［１７］。
【００５８】
ＤＮＡ電気泳動
ＤＮＡを、前述の方法をいくらか改変して抽出した［１８］。細胞（２×１０6）を０.２％トリプシン／０.５mMのＥＤＴＡ溶液を用いて分離し、ＰＢＳで洗浄し、遠心分離で沈殿させた。その細胞ペレットを溶解緩衝液に懸濁した（当該溶解緩衝液は、０.５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２mMのＥＤＴＡ、１００mg／mlのプロテイナーゼＫ、および、５０mMのとリス−ＨＣ緩衝液（ｐＨ８.０）からなる）。３７℃で２４時間溶菌させた後、等量の水で飽和したフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）でＤＮＡを抽出した。水相を回収し、０.５体積のアンモニウムアセテートと、２.５体積の冷無水エタノールとでＤＮＡを沈殿させ、−２０℃で一晩保存した。ＤＮＡをＴＥ（１Ｍのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）中の、０.５ＭのＥＤＴＡ）に溶解し、ＤＮアーゼ非含有ＲＮアーゼＡ（１００mg／mL）で３７℃で１時間インキュベートした。０.５μg／mLの臭化エチジウムを含む１.５％アガロースゲルを用いて、そのサンプルを６０Ｖで３時間電気泳動し、ＵＶ透照により可視化した。
【００５９】
ＤＮＡ断片化のフローサイトメトリー検出
プロピジウムヨウ化物（ＰＩ）染色法を用いて、細胞ＤＮＡの状態を評価した［１９］。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に、透過性にし（permeabilized）、８０％エタノール中で４℃で２４時間固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＲＮアーゼＡ（１００mg／mL）を含むＰＢＳ中に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。この段階で、ＰＩ溶液（ＰＢＳ中、１０mg／mL）を、ＲＮアーゼ溶液中の細胞に加え、４℃で３０分間インキュベーションを続けた。その後、その細胞を、ＥｐｉｃｓＸＬフローサイトメーター（Coulter, USA）で分析した。結果は、ほぼ２倍（subdiploid）量（＜２Ｎ）のＤＮＡを示す細胞を、分析された総細胞数に対するパーセンテージとして表した。
【００６０】
実施例８：結果
活性酸素種の収率
一重項酸素の収率は、ＤＰＡ脱色法により、ＨＢ（０.７６）および２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ（０.４４）と測定され、結果を表２に示す。
【表２】
2005518329.tif 000007
【００６１】
ここで、ＤＭＰＯスピントラッピングＥＳＲ測定を用いて、ＨＢおよび２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの光感作で発生したスーパーオキシドアニオンラジカルの生成を検証した。その結果によれば、２−ＢＡ−２ＤＭＨＢによるＯ2発生能力が、ＨＢによるＯ2発生能力より高いことが示された（表２）。
【００６２】
分布比および局在化
我々が細胞外薬物の濃度を０〜５μＭの様々な濃度にすることによって分布比を調べたところ、ＨＢは４９.１±２.２、および、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは１０７.２±４.３であることがわかった。この結果により、等モル量の薬物が用いられた場合、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの細胞内量が、ＨＢの細胞内量のほぼ２倍であることが示された。
蛍光顕微鏡検査によれば、ＨＢに関しては、顕著なリソソームでの取込み、および、小胞体（ＥＲ）染色が明らかである一方で、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの分布は主にＥＲであったことが示された（図２）。
【００６３】
光細胞毒性および致死量
暗所または明るい所で５０％細胞毒性（ＬＤ50）を達成する光増感剤の用量を、各光増感剤の生存曲線から概算した。インビトロで、暗所における毒性の生存曲線と、ＨＢおよび２−ＢＡ−２ＤＭＨＢの光毒性とを、図３に示す。暗所でのＨＢのＬＤ50は、約２０μＭであり、暗所での２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢのＬＤ50は、１００μＭを超過していた（図３ａ）。従って、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは、ＨＢよりかなり低い細胞毒性を有する。
ＨｅＬａ細胞に赤色光線を単独で照射しても細胞毒性は誘発されず（図３ｂ、ｃ）、対応するＭＴＴ光学密度は１００％の細胞生存を示した。我々の結果とEsteyの結果［８］とを比較するため、我々は、試験線量として２４Jcm-2を選択する。この光線量において、ＨＢのＬＤ50は、約２μＭであり、その光増強作用ファクターは、１０であり、この値は、ＥＭＴ６Ｅｄマウス腫瘍細胞におけるＨＢの光増強作用ファクターに等しい［８］。しかしながら、この光線量では、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは、０.２５〜０.５μＭ範囲の濃度（約０.０４Ｍ）で５０％細胞毒性を引き起こした。それゆえに、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは、２５０倍を超過する光増強作用ファクターを特徴とする。
【００６４】
ヘキスト３３３４２による核染色
ヘキスト３３３４２による核染色を用いて、死細胞の形態学を調べた。放射線照射を行わない条件下だと、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ処理ＨｅＬａ細胞の核は、無損傷のままであり、正常細胞と類似していた（図４ａ、ｂ）。しかしながら、２４時間の放射線照射後、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢで光増感した細胞（ＬＤ70）にアポトーシスを起こした核が検出された（図４ｃ）。
【００６５】
ゲル電気泳動
サイズが１８０〜２００塩基対の倍数である断片が得られる、ヌクレオソーム間のリンカー領域でのＤＮＡ断片化は、アポトーシスの典型的な特徴である。アガロースゲル電気泳動を用いて、アポトーシスを起こしたＤＮＡ断片産物を試験した。図５は、ＨＢおよび２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢで、それぞれＬＤ70およびＬＤ90で２４時間連続して処理したＨｅＬａ細胞で観察された特徴的なＤＮＡラダーを示す（図５、レーン２、３およびレーン５、６）。細胞が光増感剤単独に晒された場合は、ＤＮＡラダーは観察されなかった（図５、レーン１および４）。放射線照射してから３および６時間後では、明確なＤＮＡラダーは検出されなかった（データは示さず）。
【００６６】
フローサイトメトリー分析
ＨＢおよび２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢで処理した細胞をフローサイトメトリーで分析した。その結果によれば、光増感細胞における低数性の細胞集団の出現が示された（図６）。アポトーシスを起こしたＨｅＬａのパーセンテージは、放射線照射後のインキュベーション時間と同調して増加した（図７）。２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは、ＨＢより迅速にアポトーシスを誘発させた。また、アポトーシスを起こしたＨｅＬａのパーセンテージが２０％を超過した場合のみ、明確なＤＮＡラダーを検出できることもわかった。
【００６７】
結果
一重項酸素は、主に、光力学的作用によって誘発される細胞死を引き起こすと考えられている［２２、２３］。しかしながら、この研究において、一重項酸素の収率（表２）は、光増強作用と強く相関していなかったことは、興味深い。２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの一重項酸素の収率がＨＢの一重項酸素の収率の半分を超過していた一方で、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＤのＯ2-の収率は、ＨＢのＯ2-の収率の２.７倍であり、Ｏ2-は、ヒポクレリン光感作で誘発される細胞死で重要な役割を果す可能性がある。さらに、等モル量の薬物が用いられた場合、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの細胞内の量は、ＨＢの細胞内の量のほぼ２倍であり、これは、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢがＨＢより優れた光感作を有する理由の一つであり得る。
【００６８】
実施例９
現在、申し分のないＰＤＴによる癌の治療において、迅速なアポトーシス反応を誘発させる能力が重要であると考えられている［２５］。上記実施例によれば、ヘキスト３３３４２による核染色、ＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動およびフローサイトメトリー検出で証明されているように（図４〜６）、ＨＢおよび２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢが、ＨｅＬａ細胞でアポトーシスを誘発させていることが示される。アポトーシスを起こしたＨｅＬａのパーセンテージは、放射線照射後のインキュベーション時間と同調して増加した。放射線照射後３および６時間では、一般的なＤＮＡラダーは明確ではなかったが、放射線照射後２４時間では非常に鮮明であり、すなわち、ＤＮＡへの直接的な光化学ダメージよりむしろ、酵素的な過程によって、ＤＮＡ断片化が起こったことを示す［１１、２６］。また、実施例は、ＨＢは主にリソソームおよび小胞体に局在し、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢは主に小胞体に局在したことも示す。小胞体とミトコンドリアとはいずれも、細胞のＣａ2+貯蔵庫である［２７］。細胞中の活性酸素種は、ＥＲおよびミトコンドリア内に位置するＣａ2+輸送系にダメージを与え、細胞内のＣａ2+恒常性の破壊を導き、Ｃａ2+増加を維持し、最終的にアポトーシスを起こさせる［２８］。
【００６９】
参考文献
(1) T. J. Dougherty, Photodynamic therapy: partII, Semin. Surg. Oncol. tl (1995), 333-334.
(2) T. Reynolds, Photodynamic therapy expands its horizons, J. Natl. Cancer Inst. 89 (1997), 112-114.
(3) C. J. Gomer, Preclinical of first and second generation photosensitizers used in photodynamic therapy, Photochem. Photobiol. 54 (1991),1093-1107.
(4) ZJ. Diwu, J. W. Lown, Photosensitization with anticancer agents 12,  Perlyenequinoid pigments, a novel type of singlet oxygen sensitizer, J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 64 (1992), 273-287.
(5) J. C. Yue, S. Z. Pang, M. H. Zhang, W. L. Xia, Photosensitized damage of ethanolamine-HB on murine ascitic hepatoma cells, Acta Biophys. Sin. 10 (1994), 485-492.
(6) S. Z. Pang, J. F. Qing, J. C. Yue, J. Y. An, Photosensitizing damage to morphology of HeLa cells by bromide of hypocrellin B (5-Br-HB), Acta Biophys. Sin. 10 (1994), 651-656.
(7) J. C. Yue, T. D. Wang, S. Z. Pang, J. Y. An, L. J. Jiang, Sulphonated hypocrellin B sensitized photodamage to ascitic hepatoma cells, J. Radiat.  Res. Radiat. Process. 12 (1994), 100-104.
(8) E.P. Estcy, K. Brown, Z. J. Diwu, J. X. Liu, J. W. Lown, G. G. Miller,  R.B. Moore, J. Tulip, M. S. Mcphee, Hypocrellins as photosensitizers for photodyamic therapy: a screening evaluation and pharmacokinetic study, Cancer Chemother. Pharmacol. 37 (1996), 343-350.
(9) Z. J. Diwu, R. P. Haugland, J. Liu, J. Lown, G. G. Miller, R. B. Moore, K. Brown, J. Tulip, M. S. Mcphee, Photosensitization by anticancer agents 21:new perylene- and amino- naphthoquinones, Free Radic. Bio. Med. 20 (1996), 589-593.
(10) G. G. Miller, K. Brown, A. M. Ballangrud, O. Barajas, Z. Xiao, J. Tulip, J. W. Lown, J. M. Leithoff, M. J. AllalunisTurner, R. D. Mehta, R. B.  Moore, Preclinical assessment of hypocrellin B and hypocrellin B derivatives as sensitizers for photodynamic therapy of cancers: progress update, Photochem. Photobiol. 65 (1997), 714-722.
(11) W. G. Zhang, M. Weng, S. Z. Pang, M. H. Zhang, H. Y. Yang, H. X. Zhao, Z. Y. Zhang, A novel photosensitizer, 2-butylamino-2-demethoxy hypocrellin A (2-BA-2-DMHA) 1. Synthesis of 2-BA-2-DMHA and its phototoxicity to MGC803 cells, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 44 (1998), 21-28.
(12) T. Wu, S. J. Xu, J. Q. Shen, A. M. Song, S. Chen, M. H. Zhang, T. Shen, New potential photodynamic therapeutic anti-cancer agents: synthesis and characterization of demethoxy amino substituted hypocrellins, Anti-cancer Drug Design 15 (2000), 287-293.
(13) J. R. Harbour, M. L. Hair, Detection of superoxide ions in non-aqueous media generation by photolysis of pigment dispersion, J. Phys. Chem. 82 (1978), 1397-1399.
(14) Y Luo, D. Kessel, Initiation of apoptosis versus necrosis by photodynamic therapy with chloroaluminum phthalocyanine, Photochem.  Photobiol. 66 (1997), 479-483.
(15) A. M. Richter, E. Waterfield, A. K. Jain, E. D. Stenberg, D. Dolphin, J. G. Levy, In vitro evaluation of phototoxic properties of four structurally related benzoporphyrin derivatives, Photochem. Photobiol. 52 (1990), 495 500.
(16) A. M. R. Fisher, K. Danerberg, D. Banerjee, J. R. Bertino, P. Danenberg, C. J. Gormer, Increased photosensitivity in HL60 cells expressing wild-type p53, Photochem. Photobiol. 66 (1997), 265-270.
(17) D. Kessel, Y. Luo, Delayed oxidative photodamage induced by photodynamic therapy, Photochem. Photobiol. 64 (1996), 601-604.
(18) D. Leszczynski, S. Fagerholm, K. Leszczynski, The effect of the broadband UVA radiation of myeloid leukemia cells: the possible role of protein kinase C in mediation of UVA-induced effects, Photochem.  Photobiol. 64 (1996), 936-942.
(19) W. G. Telford, L. E. King, P. J. Fraker, Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cytometry, J. Immunol. Methods 172 (1994), 1-16.
(20) B. C. Wilson, Photodynamic therapy: light delivery and dosage for second generation photosensitizers, in: G. Bock, S. Harnett (Eds.), Ciba Foundation Symposium 146: Photosensitizing Compounds: Their Chemistry, Biology and Clinical Use, Wiley, New York, 1989, pp. 61-73.
(21) E. Profio, A. R. Doiron, Transport of light in tissue in photodynamic therapy, Photochem. Photobiol. 46 (1987), 591-599.
(22) K. R. Weishaupt, C. J. Gomer, T. J. Dougherty, Identification of singlet oxygen as the cytotoxic agent in photoinactivation of a murine tumor, Cancer Res. 36 (1976), 2326-2329.
(23) C. J. Gomer, N. Rucker, A. Ferrario, S. Wong, Properties and applications of photodynamic therapy, Radiat. Res. 120 (1989), 1-18.
(24) M. L. Agarwal, M. E. Clay, E. J. Harvey, H. H. Evans, A. R. Antonez, N. L. Oleinick, Photodynamic therapy induces rapid cell death by apoptosis in L5178 lymphoma cells, Cancer Res. 51 (1991), 5993-5996.
(25) Y. Luo, C. K. Chang, D. Kessel, Rapid initiation of apoptosis by photodynamic therapy, Photochem, Photobiol. 63 (1996), 528-534.
(26) X. Y. He, R. A. Sikes, S. Thomsen, L. W. K. Chung, S. L. Jacques, Photodynamic therapy with photofrin II induces programmed cell death in carcinoma cell lines, Photochem. Photobiol. 59 (1994), 468-473.
(27) L. Missiaen, F. Wuytack, L. Raeymakers, H. De Smedt, G. Droogmans, 1.  Declerck, R. Casteels, Ca2+ extrusion across plasma membrane and Ca2+ uptake by intracellular stores, Pharmacol Ther. 50 (1991), 191-232.
(28) D. J. McConkey, S. Orrenius, The role of calcium in regulation of apoptosis, Biochem. Biophys. Res. Commun. 239 (1997), 357-366.
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＢおよび２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの吸収データを示す。
【図２】
ＨＢ（左）および２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ（右）の局在化を示す。
【図３】
ＨＢおよび２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢの細胞毒性（図３ａ）および光毒性（それぞれ図３ｂおよび３ｃ）を示す。
【図４】
ヘキスト３３３４２で染色したＨｅＬａ細胞の蛍光イメージを示す。細胞を、４μＭの２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ中で６時間インキュベートし、ＬＤ70で照射した。図４ａは、未処理コントロール細胞を示し、図４ｂは、暗所でのコントロール細胞（光線量＝０）を示し、図４ｃは、放射線照射後２４時間を示す。
【図５】
ＨｅＬａ細胞における、ＰＤＴで誘発されたＤＮＡ断片化を示し、レーン１は、ＨＢインキュベーションのみ（４μＭ、１５分）；レーン２および３は、それぞれＬＤ70およびＬＤ90でのＨＢ光感作後、２４時間；レーン４は、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢインキュベーションのみ（４μＭ、６時間）；レーン５および６は、それぞれＬＤ70およびＬＤ90での２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ光感作後、２４時間；レーン７は、マーカー（ＰＵＣ−Ｍｓｐｌでの酵素消化）である。
【図６】
ＰＤＴで処理したＨｅＬａ細胞のＤＮＡヒストグラムを示す。図６ａは、２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢでのインキュベーションを示し、図６ｂは、ＬＤ90での２−ＢＡ−２−ＤＭＨＢ光感作後、６時間；図６ｃは、ＨＢインキュベーションのみ；および、図６ｄは、ＬＤ90でのＨＢ光感作後、２４時間である。
【図７】
放射線照射後（ＬＤ90）に様々な時間でインキュベートした場合の、アポトーシスを起こしたＨｅＬａ細胞のパーセンテージを示す。
【図１】
2005518329.tif 000011
【図２】
2005518329.tif 000012
【図３】
2005518329.tif 000013
【図４】
2005518329.tif 000014
【図５】
2005518329.tif 000015
【図６】
2005518329.tif 000016
【図７】
2005518329.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月14日(2003.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造式：
【化１】
2005518329.tif 000018
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、ＯＣＨ3、ＮＨＣＨ2Ａｒ、またはＮＨＣＨ(ＣＨ2)nであり、ただし、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つは、ＮＨＣＨ2ＡｒまたはＮＨＣＨ(ＣＨ2)nであり、ここでＡｒはフェニル基またはピリジル基であり、−ＣＨ(ＣＨ2)nは脂環式基であり、ｎは３、４、５、６である）
で示されるアミノ置換デメトキシル化ヒポクレリン誘導体を含む組成物。
【請求項２】
Ｒ1およびＲ2がＯＣＨ3であり、Ｒ3およびＲ4がＯＣＨ3、ＮＨＣＨ2Ａｒ、またはＮＨＣＨ2(ＣＨ2)nＡｒであり、ただし、Ｒ3およびＲ4の少なくとも一つは、ＮＨＣＨ2ＡｒまたはＮＨＣＨ2(ＣＨ2)nＡｒであり、Ａｒがフェニル、ピリジル、ナフチル、多環式芳香族、またはヘテロ環式部分であり、ｎが０〜１２である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
脂肪族アミンを含む溶媒にヒポクレリンを溶解し、得られた溶液を攪拌すること；
溶媒を除去して残留物を得ること；
残留物を洗浄すること；および、
残留物を分離すること、
を含む、デメトキシル化ヒポクレリンの製造方法。
【請求項４】
残留物を分離することは、薄層クロマトグラフィーを用いて残留物を分離することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒポクレリンが、ヒポクレリンＡまたはヒポクレリンＢである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
脂肪族アミンが、シクロペンチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、３−ピリジルメチルアミンまたは４−ピリジルメチルアミンである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
脂肪族アミンが、シクロブチルアミン、ヒスタミン、２−チオフェンメチルアミン、２−ピロールメチルアミン、またはトリプタミンである、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
溶媒が、ベンゼン、ピリジン、シクロヘキサンまたは１,４−ジオキサンである、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
溶媒が、クロロベンゼン、トルエン、ヘキサン、石油エーテル、テトラヒドロフラン、またはＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
デメトキシル化ヒポクレリン誘導体を投与すること、および、該デメトキシル化ヒポクレリン誘導体を所定の波長の光線に曝すことにより、該デメトキシル化ヒポクレリン誘導体を活性化すること、を含む治療方法。
【請求項１１】
ヒポクレリンが、次の構造式：
【化２】
2005518329.tif 000019
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4は、ＯＣＨ3、ＮＨＣＨ2Ａｒ、またはＮＨＣＨ(ＣＨ2)nであり、ここで、Ａｒはフェニル基またはピリジル基であり、−ＣＨ(ＣＨ2)nは脂環式基であり、ｎは３、４、５、６）で示されるアミノ置換デメトキシル化ヒポクレリン誘導体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4がＯＣＨ3またはＮＨＣＨ2(ＣＨ2)nＡｒであり、Ａｒがフェニル、ナフチル、多環式芳香族、またはヘテロ環式部分であり、ｎが０〜１２である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒポクレリンが、２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢを含む治療用組成物。
【請求項１５】
２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢを含む組成物の有効量を投与することを含む、光力学的治療方法。
【請求項１６】
２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢを投与することを含む治療方法。
【請求項１７】
次の構造式：
【化３】
2005518329.tif 000020
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はＯＣＨ3またはブチルアミノ基である）のいずれか一つで示される化合物を含む組成物を投与することを含む、光力学的治療方法。
【請求項１８】
ｎ−ブチルアミンを含む溶媒にヒポクレリンＢを溶解すること；
溶媒を除去して残留物を得ること；
残留物を洗浄すること；および、
残留物を分離すること、
を含む、２−ブチルアミノ−２−デメトキシ−ヒポクレリンＢの製造方法。
【国際調査報告】
2005518329.tif 000021
2005518329.tif 000022
2005518329.tif 000023
2005518329.tif 000024
2005518329.tif 000025