(57)【要約】線維芽細胞増殖因子(FGF)、好ましくはFGF-20又はFGF-23、発生、分化、及び形態形成、例えば細胞間のシグナル伝達及び細胞増殖に関係するポリペプチドのクラスをコードする、新規核酸、ポリペプチド配列、及びその核酸制御因子を同定した。本発明のFGF、その断片、及びその誘導体は、以下の生物活性、例えば創傷治癒の促進；神経細胞の生存の促進；細胞増殖、例えば幹細胞、線維芽細胞、神経細胞、グリア、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、又はその前駆細胞の増殖の促進；細胞分化の調節；胚発生の誘発；神経突起の成長の促進；神経又は神経細胞の損傷からの回復の促進；髄鞘形成の促進；血管形成の促進；受容体の結合活性；腫瘍形成の調節などの1以上を有する。
2005506275.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脊髄損傷；脊髄外傷；虚血性の発作、梗塞形成、出血、又は動脈瘤により引き起こされる神経組織損傷；ハンチントン病；ミエロパシー；脊髄炎；又は脊髄空洞症の治療方法であって、有効量のFGF-20ポリペプチド又はその生物活性断片を治療の必要な患者に投与することを含む上記治療方法。
【請求項２】
前記FGF-20ポリペプチドがヒトのものである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、FGF-20に特異的な免疫原性活性をもつ、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、図1に示す第1アミノ酸〜第211アミノ酸を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、図1に示すヒトFGF-20の第1アミノ酸〜第211アミノ酸に95%の配列同一性を有し、かつ、上記FGF-20がFGF活性をもつ、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、図1に示すヒトFGF-20の第1アミノ酸〜第211アミノ酸に95%の配列同一性を有し、かつ、上記FGF-20がFGF活性をもつ、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
脊髄損傷；脊髄外傷；虚血性の発作、梗塞形成、出血、又は動脈瘤により引き起こされる神経組織損傷；ハンチントン病；ミエロパシー；脊髄炎；又は脊髄空洞症の治療方法であって、有効量の、FGF-20ポリペプチド又はその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を治療の必要な患者に投与することを含む上記治療方法。
【請求項８】
前記核酸がヒトのものである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が、中断されることなくFGF-20をコードする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が、図1に示すヌクレオチド配列に95%の配列同一性を有する、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、図1に示すヌクレオチド配列に95%の配列同一性を有する、請求項8に記載の方法。
【請求項１２】
副腎白質萎縮症、進行性多病巣性白質脳症、脳脊髄炎、ギリアン-バレー症候群、パラタンパク質血症、又は慢性炎症性の脱髄性多発神経障害の治療方法であって、有効量の、FGF-20ポリペプチド又はその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を治療の必要な患者に投与することを含む上記治療方法。
【請求項１３】
前記FGF-20ポリペプチドがヒトのものである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、FGF-20に特異的な免疫原性活性をもつ、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、図1に示す第1アミノ酸〜第211アミノ酸を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、図1に示すヒトFGF-20の第1アミノ酸〜第211アミノ酸に95%の配列同一性を有し、かつ、上記FGF-20がFGF活性をもつ、請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、図1に示すヒトFGF-20の第1アミノ酸〜第211アミノ酸に95%の配列同一性を有し、かつ、上記FGF-20がFGF活性をもつ、請求項13に記載の方法。
【請求項１８】
副腎白質萎縮症、進行性多病巣性白質脳症、脳脊髄炎、ギリアン-バレー症候群、パラタンパク質血症、又は慢性炎症性の脱髄性多発神経障害の治療方法であって、有効量の、FGF-20ポリペプチド又はその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を治療の必要な患者に投与することを含む上記治療方法。
【請求項１９】
前記核酸がヒトのものである、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌクレオチド配列が、中断されることなくFGF-20をコードする、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレオチド配列が、図1に示すヌクレオチド配列に95%の配列同一性を有する、請求項18に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヌクレオチド配列が、図1に示すヌクレオチド配列に95%の配列同一性を有する、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
移植片の生着を促進させる方法であって、有効量のFGF-20ポリペプチド又はその生物活性断片を治療の必要な患者に投与することを含む上記治療方法。
【請求項２４】
前記FGF-20ポリペプチドがヒトのものである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、FGF-20に特異的な免疫原性活性をもつ、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、図1に示す第1アミノ酸〜第211アミノ酸を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、図1に示すヒトFGF-20の第1アミノ酸〜第211アミノ酸に95%の配列同一性を有し、かつ、上記FGF-20がFGF活性をもつ、請求項23に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、図1に示すヒトFGF-20の第1アミノ酸〜第211アミノ酸に95%の配列同一性を有し、かつ、上記FGF-20がFGF活性をもつ、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
移植片の生着を促進させる方法であって、有効量の、FGF-20ポリペプチド又はその生物活性断片をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を治療の必要な患者に投与することを含む上記治療方法。
【請求項３０】
前記核酸がヒトのものである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヌクレオチド配列が、中断されることなくFGF-20をコードする、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヌクレオチド配列が、図1に示すヌクレオチド配列に95%の配列同一性を有する、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列が、図1に示すヌクレオチド配列に95%の配列同一性を有する、請求項30に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明の背景
線維芽細胞増殖因子は、例えば細胞増殖と分化と発生を含む生物学的機能の変化に重要な役割を担う。
【発明の開示】
【０００２】
本願は、2000年12月8日に提出された仮出願第60/251,837号の優先権を主張し、その全体を本明細書中に援用する。
本発明の説明
線維芽細胞増殖因子(FGF)、好ましくはFGF-20(この出願に対応する前記仮出願においてFGF-21と呼ばれていた)又はFGF-23(公開されたFGF-22と同じものである)、並びに発生、分化、及び形態形成、例えば細胞間のシグナル伝達及び細胞増殖に関係しているポリペプチドのクラスをコードする、新規核酸、ポリペプチド配列、及びその核酸制御因子を同定した。本発明のFGF、その断片、及びその誘導体は、これだけに制限されることなく以下の：FGF活性；及びFGFに特有な免疫原性活性を含む、1以上の生物活性を有する。本発明に従って、FGFの少なくとも2の新規クラス、例えばFGF-20とFGF-23を同定した。
【０００３】
「FGF活性」は、例えば創傷治癒の促進；神経細胞の生存の促進；細胞増殖、例えば幹細胞、線維芽細胞、神経細胞、グリア、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、又はその前駆細胞の増殖の促進；細胞分化の調節；胚発生の誘発；神経突起の成長の促進；神経又は神経細胞の損傷からの回復の促進；髄鞘形成の促進；血管形成の促進；受容体の結合活性；腫瘍形成の調節などを意味する。
【０００４】
「FGFに特有な免疫原性活性」は、例えばFGFポリペプチドがFGFについて選択的な免疫応答；例えば、哺乳動物のFGF-20について選択的な免疫応答を発現させることを意味する。このように、哺乳動物のFGF、例えば図1及び2中のFGFから選ばれたアミノ酸配列による抗体、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞などの刺激が、特定の免疫原性活性である。これらの応答は、ルーチンに計測されうる。
【０００５】
FGF、例えばFGF-20又は-23は、天然起源から得られ、かつ、前述の活性の1以上を有するアミノ酸配列をもつ完全長の哺乳動物ポリペプチドである。それは、図1及び2で示されるような配列をもち、かつ、開始コドンで始まり、そして終止コドンで終わる読み取り枠をもつ。それは、天然の正常な、天然の突然変異の、及び単一ヌクレオチド多型(SNP)などを含んでいる天然の多型の配列を含んでいる。天然起源は、例えば生細胞、例えば組織又は生体全体から得られたもの、初代及び不死化細胞系などを含む培養細胞系、生検組織を含んでいる。
【０００６】
本発明は、哺乳動物FGFの断片にも関する。前記断片は、好ましくは「生物活性であること」である。「生物活性であること」によって、前記ポリペプチド断片が生物系において活性を有すること、又は生物系の構成要素であることを意味する。生物活性は、例えばFGF活性で言及されたもの、例えばFGF受容体結合活性とFGF免疫原性活性を含んでいる。断片は、化学合成、遺伝子工学、分割産物などを含むいずれかの所望の方法により作製されうる。FGFの生物学的生物学的-断片は、このタンパク質のカルボキシ-又はアミノ末端のいずれかを欠失又は修飾されたアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。
【０００７】
全て公的に入手可能なFGF-20及びFGF-23の核酸断片、及びポリペプチド断片、又はその相同断片、例えばアフリカツメガエルから同定された類似配列g5762262は、本発明から除かれる。
【０００８】
公的に入手可能な核酸のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、公的に利用可能なデータベースを検索することによって同定する。
本発明は、図1で示されるような第1〜第211アミノ酸の推定された配列をもつFGF-20、及び図2で示されるような第1〜第169アミノ酸の推定された配列をもつFGF-23にも関する。FGF-20は、約23.5 kdalの予測分子量と約9.25の予測pIを有する。FGF-23は、約19.6 kdalの予測分子量と約12.32の予測pIを有する。
【０００９】
タンパク質について、同一性の程度は、同じアミノ酸の数/タンパク質中のアミノ酸残基の総数を意味する。類似の程度は、同じアミノ酸残基の数に加え、(Lに対するVのようなものなど)保存的に置換されたアミノ酸の数/アミノ酸残基の総数を意味する。DNAについて、同一性は、類似と同様であり、そして同じヌクレオチドの数/全長を意味する。
【００１０】
図1及び2で示されるようなアミノ酸配列をもつ本発明のFGFポリペプチドは、膜貫通領域、疎水性領域を含むこのポリペプチドの他の構造的及び/又は機能的ドメインを同定するためのいずれかの好適な方法によって分析されうる。例えば、FGFポリペプチドは、例えばKyte及びDoolittle, J. Mol. Bio.,157:105, 1982; EMBL Protein Predict; Rost及びSander, Proteins, 19:55-72, 1994に開示された方法によって分析されうる。
【００１１】
本発明のFGFsの他の相同体は、様々な方法に従って哺乳動物及び哺乳動物ではない起源から得る。例えば、図1及び2から導かれたオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションを、例えばSambrook et al., Molecular Cloning Chapter 11, 1989に記載のとおり、相同体の選択のために利用する。そのような相同体は、遺伝子に対して異なる量のヌクレオチド及びアミノ酸配列の同一性及び類似性を有する可能性がある。哺乳動物は、例えば齧歯動物、マウス、ラット、ハムスター、猿、豚、雌牛などを含んでいる。哺乳動物でない生物は、例えば脊椎動物、無脊椎動物、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、ショウジョウバエ、線虫、アフリカツメガエル、酵母、例えばS.ポンブ(S.pombe)、S.セレビシア(S.cerevisiae)、カイチュウ、原核生物、植物、シロイヌナズナ、ウイルス、アルテミアなどを含んでいる。
【００１２】
本発明は、FGFに特有なアミノ酸配列、例えば図1及び2の特定の配列、すなわち本発明のFGFs中で見つかった保存されたアミノ酸モチーフに見られる規定のアミノ酸配列にも関する。関連するタンパク質、例えば他の関連するFGFsの間の比較(例えば、Venkataraman et al., Proc. Natl. Acad． Sci. 96: 3658-3663, 1999を参照のこと)は、FGFsに特有の配列を選択するために使用されうる。
【００１３】
例えば、FGF-20及び-23のタンパク質配列を、アラインし、そして図1及び2に示されている保存されたエリアの相同性に基づいてアミノ酸モチーフを作製した。本発明は、あらゆる核酸又はそのポリペプチド配列、例えば3以上の保存されるか又は相同な残基、例えば、LYGS、HFLP、VQGTR、RIEENGHNTY、QFEENWYNTY、AGTPSA、AAERSAなどを含むポリペプチドに関する。他の特有の及び/又は保存されているアミノ酸配列は、例えばBLASTセットのコンピュータ・プログラムを使った遺伝子/タンパク質データベースの検索によりルーチンで発見される。FGF-特有のアミノ酸配列又はモチーフは、それに特異的な免疫応答を生み出すための抗原としてのペプチドの製造に有用でありうる。そのような免疫処置によって得られた抗体は、診断又は調査研究目的のための哺乳動物のFGFタンパク質に対する特有のプローブとして使われる。
【００１４】
言及されるように、本発明のポリペプチドは、FGF(例えば、完全長の配列、すなわち図1及び2に示されるように開始及び終止コドンをもつもの、成熟したアミノ酸配列、すなわち、ここでFGFポリペプチドは成熟したポリペプチドへと処理される前駆物質として産生される、又はその断片)についての様々なアミノ酸配列を含む。有用な断片は、例えば前述のドメイン及び特有な、そして保存されているアミノ酸配列のいずれかを含むか、あるいは本質的にそれから成る断片を含んでいる。
【００１５】
本発明のFGFポリペプチド断片は、特有の生物活性、例えばFGF受容体結合活性又は免疫原性活性をもつように選ばれうる。
【００１６】
これらの活性測定法は、以下及び実施例に記載される。これらのペプチドは、同定され、そしてEP496162に記載のとおり作製されることもできる。有用な断片は、例えば図1及び2の約9の隣接するアミノ酸、好ましくは約10、15、20、30、40などの隣接するアミノ酸を含むか、又は本質的にそれから構成されうる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、図1及び2に記載のアミノ酸配列に対して100%以下のアミノ酸配列の同一性をも有する。以下の論議の目的のために：配列の同一性は、図1及び2に記載の配列に見られるものと同じヌクレオチド又はアミノ酸が比較されている配列の対応する位置に見られることを意味する。図1及び2に記載のアミノ酸配列に対して100%以下の配列同一性をもつポリペプチドは、相同的な及び非相同的なアミノ酸置換を含む天然配列からの様々な置換を含む。以下の相同的なアミノ酸置換の例を参照のこと。FGFポリペプチドが比較される配列全体の残基の総数によって割った同一及び相同的な残基の合計は、配列類似の割合に等しい。配列同一性と類似性を計算する目的のために、比較される配列を、アラインし、例えばFASTA、BLASTを含むいずれかの所望の方法、アルゴリズム、コンピュータ・プログラムなどにより計算する。図1及び2のアミノ酸配列に対して100%以下のアミノ酸配列同一性をもつポリペプチドは、約99%、98%、97%、95%、90.5%、90%、85%、70%、又は約60%程度までの低い配列同一性を有する。
【００１８】
本発明は、FGF-21及び-23のFGFポリペプチドの突然変異タンパク質、すなわち天然起源から得られるアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なっているアミノ酸配列をもつあらゆるポリペプチド(哺乳動物のFGFの断片はアミノ酸数に関して異なるが、天然のFGFからのアミノ酸配列に関して異なっていない)にも関連する。このように、FGFポリペプチドの突然変異タンパク質は、天然に存在しないアミノ酸を含むアミノ酸置換、挿入、及び欠失を含む。
【００１９】
本発明のFGFアミノ酸配列に対する突然変異タンパク質は、遺伝子データバンク、例えばGenbank、EMBLからの相同性検索に基づいて作製されることもできる。配列相同性検索は、BLASTファミリーのコンピュータ・プログラム、スミス-ウォーターマン・アルゴリズムなどに記載のアルゴリズムを含めて、様々な方法を使って達成される。突然変異タンパク質は、ポリペプチド間で同一及び/又は相同的なアミノ酸をドメイン内で同定し、そしてアラインして、その後そのようなアラインメントに基づきアミノ酸を修飾することにより導入する。例えば、本発明のFGFは、様々な既知のFGFs、例えばVenkataraman et al., Proc. Nail. Acad. Sci., 96:3658-3663, 1999と配列同一性を共有する。これらのポリペプチドの間のアラインメント、特にVenkataramanらの表1で同定されている保存されたアミノ酸残基でのアミノ酸置換は、その修飾がFGFの生物活性、例えば受容体の結合活性などを下げる、減少させる、又は排除するために期待される残基を同定する。例えば、アラインメントが2以上のドメイン間で保存された同じアミノ酸を明らかにする場合、アミノ酸の排除又は置換がその生物活性に不利に影響することが見込まれる。
【００２０】
アミノ酸置換は、ある相同的なアミノ酸を他のものに置き換えることによって成されうる。相同的なアミノ酸は、側鎖のサイズ及び分極化の程度に基づき定義され、以下の小さく、無極性：システイン、プロリン、アラニン、スレオニン；小さく、極性：セリン、グリシン、アスパラギン酸塩、アスパラギン；大きく、極性：グルタミン酸塩、グルタミン、リジン、アルギニン；中程度で、極性：チロシン、ヒスチジン、トリプトファン；大きく、無極性：フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、イソロイシン、バリンを含む。相同的な酸は以下のとおりグループ化することもできる：電荷をもたず極性Rグループ、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン；(陰性荷電した)酸性アミノ酸、アスパラギン酸、及びグルタミン酸；(陽性荷電した)塩基性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン。相同的なアミノ酸は、Dayhoffによりthe Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978中に、及びArgosによりEMBO J., 8, 779-7S5, 1989中に記載されるものをも含む。
【００２１】
本発明は、突然変異タンパク質のポリペプチド及びそのようなポリペプチドをコードする突然変異タンパク質の核酸に関する。このように、本発明は、図1及び2のヌクレオチド配列に関し、上記核酸は、1以上のアミノ酸位置で置換されるか又は欠失されるか、あるいはその両方が存在するポリペプチドをコードし、そして上記ポリペプチドを、核酸が、例えば神経又は神経細胞の損傷からの回復を高めるような生物活性をもつことに基づきコードした。突然変異タンパク質のポリペプチドと、その対応するヌクレオチド・コード配列は、1以上の位置が相同的なアミノ酸によって置換される、例えば1、5、10、15、又は20の置換が存在する点を除いて図1及び2に記載のアミノ酸配列をもちうる。修飾が前述の活性にどのように影響するかは、前記及び下記の、並びに当業者に知られる方法に従って計測される。例えば、神経細胞の生存、及び他の神経栄養性(neutrotropic)活性を計測するアッセイ、例えば実施例及び、Kanda et al., Int. J. Devl. Neuroscience, 12(3): 191-200, 1999に記載の方法、並びにFGF受容体結合アッセイを含めFGF活性をアッセイする様々な方法が本技術分野で知られている。
【００２２】
言及されるように、アミノ酸置換は、関連する他のFGFsへの類似性に基づいて成されることもできる。他の突然変異が、図1及び2のヌクレオチド配列を修飾するか又は突然変異させ、その活性の1以上に影響するそれらの突然変異を、例えば以下に記載の方法及び実施例に従って活性を測定して選択することによってルーチンに選択する。
【００２３】
本発明の哺乳動物のFGF、その断片、又は置換されたポリペプチドは、様々な修飾をも含むことができ、そのような修飾は、脂質修飾、メチル化、リン酸化、グリコシル化、(例えば、アミノ酸のRグループの)共有結合修飾、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、又はアミノ酸付加を含む。ポリペプチドへの修飾は、遺伝子組み換え、合成、化学的などを含む様々な方法により達成されうる。
【００２４】
本発明のポリペプチド(例えば、完全長、その断片、その突然変異型)は、様々な方法、例えばアッセイにおいて、以下に記載の免疫原として、(例えば、本発明のFGFに関連する活性の1以上をもつ)生物学的な活性成分として使われる。
【００２５】
本発明のFGFをコードするポリペプチドは、その誘導体、又はその断片は、自然には起こりえない(すなわち、天然に存在しない)配置で、1以上の構造的なドメイン、機能上のドメイン、検出可能なドメイン、抗原性のドメイン、及び/又は着目の所望のポリペプチドと組み合わせられうる。そのような機能を含むポリペプチドは、キメラであるか又は融合ポリペプチドである。そのようなキメラ・ポリペプチドは、化学的、合成、準合成、及び/又は組み換え方法を含む様々な方法により調製されうる。キメラ・ポリペプチドをコードするキメラ核酸は、連続した様々なドメイン又は所望のポリペプチド(例えば、活性を安定させるか又は高めるために複数のN末端ドメインをもつ)、又は、例えばイントロン、スプライス部位、エンハンサーなどを含む遮られた読み取り枠を含む。キメラ核酸は、様々な方法に従って製造される。例えば、米国特許番号第5,439,819号を参照のこと。
【００２６】
ドメイン又は所望のポリペプチドは、生物学的機能、例えばシグナル伝達、成長の促進、細胞のターゲッティング(例えば、シグナル配列、例えば小胞体又は核を狙うターゲッティング配列)など、構造的機能、例えば疎水性、親水性、膜貫通など、受容体-リガンド機能、及び/又は検出可能な機能、例えば酵素、蛍光ポリペプチド、緑色蛍光タンパク質との組み合わせ(Chalfie et al., Science, 263:802, 1994; Cheng et al., Nature Biotechnology, 14:606, 1996; Levy et al., Nature Biotechnology, 14:610, 1996)などを含むいずれかの所望の性質をもつ。加えて、ポリペプチド又はその一部は、宿主細胞に導入された場合選択可能なマーカーとして使われうる。例えば本発明によるアミノ酸配列をコードする核酸は、所望のコード配列にフレーム単位で融合され、そして精製、選択、又は標識目的のためのタグとして働く。融合部位は、発現、単離、精製などを容易にするために分割部位をコードする。
【００２７】
本発明によるとポリペプチドは、本発明により、発現系、例えば生体内、生体外、無細胞、遺伝子組み換え型、細胞融合などにより製造されうる。そのような系によって与えられるポリペプチドに対する修飾は、グリコシル化、(例えば、異なるコドン使用法による)アミノ酸置換、ポリペプチド・プロセッシング、例えば消化、分割、エンドペプチダーゼ又はエクソペプチダーゼ活性、脂質及びリン酸塩を含む化学的な部分の付加などを含んでいる。
【００２８】
本発明によるポリペプチドは、天然起源、形質転換された宿主細胞(培地又は細胞)から、界面活性剤抽出法(例えば、非イオン系界面活性剤、トリトンX-100、CHAPS、オクチルグルコシド、Igepal CA-630)、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿法、酸性抽出法、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー法、ホスホセルロース・クロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー法、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフィー法、レクチン・クロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法を含む通常の方法に従って回収される。成熟型タンパク質の立体配位を完成させるために、必要であれば、タンパク質の再折り畳みステップを使用しうる。最後に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を、精製ステップのために使用する。FGFポリペプチドは、当業者が知るとおり、例えば様々なFGFsの単離を記載する以下の米国特許番号第5,604,293号、同第5,395,756号、同第5,155,214号、同第4,902,782号、及びSantos-Ocampo et al., J. Biol. Chem., 271:1726-1731, 1996(細菌宿主、例えばE.コリ(E.coli)からのFGFの精製)に記載されるように、他のFGFタンパク質について記載されるように単離されることもできる。他のアプローチは、組み換えにより親和性タグ(フラグ・エピトープ-HAエピトープ、mycエピトープ、6×His、マルトース結合タンパク質、キチナーゼなど)を有するFGFを発現させ、その後抗タグ抗体-結合アフィニティー・クロマトグラフィにより精製する。
【００２９】
本発明は、本発明のFGFポリペプチド及びその断片をコードする核酸、例えばDNAとRNAにも関する。FGF核酸(例えば、FGF-20又は-23)及びその断片は、天然起源から手に入るヌクレオチド配列をもつ核酸ある。従って、それは天然の、正常な、天然の突然変異型、及び天然の多形対立因子(例えば、SNPs)などを含んでいる。天然起源は、例えば組織及び生体全体から得られる生細胞、腫瘍、初代及び不死化された細胞系を含む培養細胞系を含んでいる。
【００３０】
本発明の核酸配列は、図1及び2に示されたような完全なコード配列、その縮重配列、及びその断片を含む。本発明による核酸は、前記又は下記のいずれかのヌクレオチド配列に対して100%の同一性をもつ、例えばアンチセンス・ヌクレオチド配列をも含む。
【００３１】
本発明による核酸は、種々の異なる起源から得られる。それは、例えば組織、細胞又は生体全体から分離されたポリアデニル化mRNAのように、DNA又はRNAから得られる。核酸は、DNA又はRNAから、又はcDNAライブラリから直接得られる。核酸は、所望の遺伝子型、表現型などを有する発生の特定の段階で(例えば、胚又は成体の心臓若しくは骨格の細胞又は組織)細胞か組織から得られる。
【００３２】
前記のFGFポリペプチドについて記載されるように、本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる核酸は、コード配列のみ；コード配列と追加のコード配列(例えば、リーダー、分泌、ターゲッティング、酸素的、蛍光、又は他の診断上のペプチド)、コード配列、及び非コード配列、例えば5'又は3'末端いずれかの非翻訳配列又はコード配列内に散在する非翻訳配列、例えばイントロンを含む。中断することなしにポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいる核酸は、ヌクレオチド配列が、コード配列中に非コード・ヌクレオチドが中断する又は挟まることなくFGFに関するアミノ酸コード配列を含むことを意味する。そのようなヌクレオチド配列は、隣接しているとも説明される。ヒト、マウス、又は他の哺乳動物のFGF遺伝子などをコードするゲノムDNAは、ルーチンに得られる。
【００３３】
本発明による核酸は、先に記載のとおり利用できるように核酸に連結された発現制御配列を含む。用語「発現制御配列」は、利用できるように連結された核酸によりコードされたポリペプチドの発現を制御する核酸配列を意味する。発現は、mRNA又はポリペプチドのレベルで制御されうる。このように、発現制御配列は、mRNA関連要素とタンパク質関連要素を含んでいる。そのような要素は、プロモーター、(ウイルス性又は細胞性)エンハンサー、リボソーム結合配列、転写ターミネータなどを含んでいる。コード配列の発現をもたらすか又は達成するために発現制御配列がそのようなやり方で配置されている場合に、発現制御配列は、ヌクレオチド・コード配列に利用できるように連結される。例えば、プロモーターがコード配列の5'側に利用できるように連結される場合、コード配列の発現はプロモーターによって行われる。発現制御配列は、正常な遺伝子に対して非相同的又は内性でありうる。
【００３４】
本発明による核酸は、核酸ハイブリダイゼーションを基に選ばれる。2の1本鎖核酸が互いにハイブリダイズを作製する能力は、それらのヌクレオチド配列相補性、例えばヌクレオチド間の塩基対形成、例えばA-T、G-Cなどの尺度である。よって、本発明は、核酸、及び図1及び2に記載のヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするそれらの相補体に関する。後者の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列は、相補的な核酸鎖を有するか、又はポリメラーゼ(すなわち、適切な核酸を合成する酵素)の存在下、その鋳型として働く。本発明は、核酸の両方の鎖、例えばセンス鎖とアンチセンス鎖を含んでいる。
【００３５】
ハイブリダイゼーション条件は、図1及び2に示されたヌクレオチド配列と所望の量のヌクレオチド相補性をもつ核酸を選ぶように選ばれる。核酸は、その配列の間に、例えば好ましくは約85%、より好ましくは90%、92%、及びより好ましくは95%、97%、又は100%の相補性をもつ前述の配列にハイブリダイズする。本発明は、特に低い又は高いストリンジェントさの条件下、図1及び2に示されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸配列に関する。
【００３６】
FGF配列にハイブリダイズする核酸は、様々な方法で選ばれる。例えば、ブロット(すなわち、核酸を含んでいる基質)、チップ・アレイ、及び着目の核酸を含む他の基質は、プレハイブリダイゼーション溶液(6XSSC、0.5%のSDS、100 μg/mlの変性サケ精子DNA、5Xデンハルト溶液、及び50%のホルムアミド)中、30℃で、一晩インキュベートされ、次に既知の手順により、ハイブリダイゼーション溶液(例えば、6XSSC、0.5%のSDS、100 μg/mlの変性サケ精子DNA、及び50%のホルムアミド)中、42℃で一晩、検出可能なオリゴヌクレオチド・プローブとハイブリダイズさせる(以下を参照のこと)。ブロットは、例えば5%未満のbpのミスマッチをもたらす(例えば、0.1%のSSCと0.1%のSDS中、65℃で30分間の洗浄を2回)、すなわち95%以上の配列同一性をもつ配列を選択する高いストリンジェントさの条件で洗浄されうる。高いストリンジェントさの条件の他の制限されることのない例は、30 mMのNaClと0.5%のSDSを含む水性緩衝液中、65℃での最後の洗浄を含む。高いストリンジェント条件での他の例は、7%のSDS、0.5 MのNaP04,pH7、1 mMのEDTA中、50℃、例えば一晩のハイブリダイゼーション、続く1%のSDS溶液による42℃での1回以上の洗浄である。
【００３７】
高いストリンジェントさの洗浄が5%未満のミスマッチをもたらす一方で、緩いか又は低いストリンジェントさの洗浄条件(例えば、0.2%のSSCと0.5%のSDS中、37℃で30分間の洗浄を2回)は、20%までミスマッチを容認しうる。制限されることのない、低いストリンジェントさの条件の他の例は、30 mM NaClと0.5%のSDSを含む緩衝液中、42℃での最後の洗浄を含む。洗浄とハイブリダイゼーションは、Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989, Chapter9に記載されるとおり実施されることもできる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションは、Sambrookらに記載されるように、プローブとそのターゲットの間で形成されたハイブリッドのメルティング温度(Tm)の計算に基づきもする。一般的に、短いオリゴヌクレオチド(18ヌクレオチド以下を含んでいる)がその標的配列から遊離する温度Tmは、以下の方程式から与えられる：Tm=(A及びTの数)×2℃+(C及びGの数)×4℃。長い分子について、Tm=81.5+16.6loglO[Na+]+0.41(%GC)-600/N、ここで、[Na+]はナトリウム・イオンのモル濃度であり、%GCはプローブ中のGC塩基対のパーセンテージであり、Nは長さである。ハイブリダイゼーションは、プローブとターゲットがハイブリダイズできることを保証するためにこの温度の数度下で行う。ミスマッチはさらに温度を下げることによってもたらされる。
【００３９】
ストリンジェント条件は、配列、及び、例えばプローブ(例えば、FGFとターゲット核酸のオリゴヌクレオチド)との間で少なくとも約95%、好ましくは97%のヌクレオチドの相補性を持つそれらの相補性を分離するために選ばれる。
【００４０】
本発明により、核酸又はポリペプチドは、図1及び2に示されるヌクレオチド又はアミノ酸配列中に1以上の相違を含む可能性がある。ヌクレオチド及び/又はアミノ酸配列への変更又は修飾は、特定の又はランダムな突然変異誘発を含む利用可能ないずれかの方法によっても達成される。
【００４１】
本発明による哺乳動物のFGF、例えばFGF-20又は-23をコードする核酸は、天然遺伝子中に生じたヌクレオチドを含むことができ、上記天然遺伝子は、例えば天然の多型、正常、又は突然変異対立因子(ヌクレオチド又はアミノ酸)、哺乳動物、例えば、ヒト、猿、豚、マウス、ラット、又はウサギの天然集団において発見された突然変異である。例えば、ヒトFGF核酸又はポリペプチドは、自然のヒト集団で生じるヌクレオチド又はアミノ酸を含む。用語「天然」によって、天然起源、例えば動物の組織及び細胞、体液、組織培養細胞、法医学的サンプルから手に入ること核酸を意味する。天然の突然変異は、ヌクレオチド配列の欠失(例えば、切り捨てられたアミノ-又はカルボキシ-末端)、置換、反転、又は付加を含む。これらの遺伝子は、当業者に知られる方法により核酸ハイブリダイゼーションによって検出され、そして分離されうる。本発明の哺乳動物FGFをコードするヌクレオチド配列は、例えば図1及び2に示される天然遺伝子、転写産物、又はcDNA中に見られるコドンを含むか、あるいは同じアミノ酸配列をコードする変性コドンを含む。例えば、所望のホストにおける発現のための配列を最適化するために配列中のコドンを変更することが望ましいかもしれない。
【００４２】
本発明による核酸は、例えばDNA、RNA、合成核酸、ペプチド核酸、修飾されたヌクレオチド、又は混合物を含む。DNAは、2本又は1本鎖でありうる。核酸を含んでいるヌクレオチドは、所望の目的、例えば、RNaseHのようなヌクレアーゼへの抵抗性、生体内での安定性の改善などに依存して、既知のリンカー、例えばエステル、スルファミン酸、スルファミド、ホスホロチオエート、ホスホルアミド酸、メチルホスホン酸、カルバメートなどを介してつながれる。例えば、米国特許番号第5,378,825号を参照のこと。
【００４３】
様々な修正、例えば検出可能なマーカー(アビジン、ビオチン、放射性要素)、ハイブリダイゼーション、検出、又は安定性を改善する部分の付加が、核酸に加えられうる。核酸は、所望の方法により固形支持体、例えばニトロセルロース、磁性又は常磁性マイクロスフェア(例えば、米国特許番号第5,411,863号；同第5,543,289号に記載のとおり；例えば、強磁性体、超磁性、常磁性体、超常磁性、酸化鉄、及び多糖を含む)、ナイロン樹脂、アガロース、ジアゾ化セルロース、ラテックスの固形マイクロスフェア、ポリアクリルアミドなどに結合させることもできる。例えば米国特許番号第5,470,967号；同第5,476,925号；同第5,478,893号を参照のこと。
【００４４】
本発明の他の側面は、オリゴヌクレオチド又は核酸プローブに関する。そのようなオリゴヌクレオチド又は核酸プローブは、例えば試験サンプル中の哺乳動物FGF核酸を検出するか、定量するか、又は単離するか、あるいはFGF相同体を同定するために使用される。好ましい態様において、核酸は、例えばPCR、ディファレンシャル・ディスプレイ、遺伝子チップ(例えば、Affymetrix GeneChips；米国特許番号第5,143,854号；同第5,424,186号；同第5,874,219号；PCTWO92/10092；PCTWO90/15070)、及び他の利用可能な方法においてオリゴヌクレオチド・プローブとして利用される。検出は、調査研究、診断、及び法医学を含む種々の異なる目的のために望ましいかもしれない。診断目的のために、サンプル中の核酸配列の存在又は量を同定することが望ましい、ここで上記サンプルは、組織、細胞、体液などから得られる。好ましい方法において、本発明は、ターゲットとオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションの達成に効果的な条件下で試験サンプル中のターゲット核酸をオリゴヌクレオチドに接触させ；そしてハイブリダイゼーションを検出することを含む核酸の検出方法に関する。本発明によるオリゴヌクレオチドは、合成核酸の増幅、例えばPCR(例えば、Saiki et al., Science, 241:53, 1988;米国特許番号第4,683,202号;PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Iimis et al., eds., Academic Press, New York, 1990)；ディファレンシャル・ディスプレイ(例えば、Liang et al., Nucl. Acid. Res., 21:3269-3275, 1993;米国特許番号第5,599,672号; WO97/18454を参照のこと)にも使用することができる。
【００４５】
検出は、他の遺伝子、例えばシグナル伝達、成長、癌、アポトーシス、あるいは前記又は下記の遺伝子のいずれかに関係している遺伝子などに関するオリゴヌクレオチドとの組み合わせで達成される。オリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許番号第5,683,877号；同第5,656,430号；Wu. et al., Proc. Natl． Acad． Sci. 89:8779-8783, 1992に記載のミスマッチDNA修復技術を用いて突然変異の検査をするためにも使用される。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、図1及び2若しくはその相補体のいずれかの連続的なヌクレオチド配列、又は上記配列若しくはその相補体のいずれかをも含む。本発明によるこれらのオリゴヌクレオチド(核酸)は、いずれかの所望のサイズ、例えば10〜200ヌクレオチド、12〜100、好ましくは12〜50、12〜25、14〜16、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも25などでありうる。このオリゴヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチド、例えばイノシン、AZT、3TCなどを有する。このオリゴヌクレオチドは、図1及び2の配列に100%の同一又は相補性を有するか、あるいはミスマッチ又はヌクレオチド置換、例えば1、2、3、4、又は5つの置換を有する。例えば、このオリゴヌクレオチドは、図1又は2の配列に70〜99%の同一性、例えば90、95、又は97%の同一性を有する。本発明に従って、このオリゴヌクレオチドは、キットに含まれることができて、このキットは、(例えば、リン酸、trisなど)所望の緩衝液、検出組成物などを含む。オリゴヌクレオチドは、本技術分野で知られているように放射性又は非放射性ラベルにより標識されるか又は標識されない。
【００４７】
本発明の他の側面は、哺乳動物FGFに特有なヌクレオチド配列である。FGFに特有な配列によって、FGF中、例えば図1及び2のヌクレオチド配列中、しかし、他の核酸中にめったに又はたまにしか生じず、特に動物の核酸、好ましくは哺乳動物、ヒト、ラット、マウスなどのには生じないヌクレオチドの所定の配列を意味する。特有なヌクレオチド配列は、1及び2に、及び図1及び2に示されるアミノ酸をコードする配列又はその相補体を含んでいる。そのような配列は、本明細書中に記載の又は本明細書中に援用されるいずれかの方法にプローブとして使用される。センス及びアンチセンス・ヌクレオチド配列の両者が含まれている。本発明による特有な核酸は、ルーチンに決定されうる。そのような特有な配列を含んでいる核酸は、例えばノーザンブロットにおいて、核酸の混合物を含むサンプル中の、例えばヒト又はマウスFGFの存在を同定するためのハイブリダイゼーション・プローブとして使用される。ハイブリダイゼーションは、プローブに対して95%の同一性(すなわち、相補性)を持っている核酸(及びコード配列を含みうるそれらの相補体)を選択するために高いストリンジェント条件下で、しかしより低いストリンジェント条件を使用しても実施される。特有なFGFヌクレオチド配列は、FGFの他の部分、酵素、GFPなど、発現制御配列などについてのコード配列を含めた当該特許全体にわたって言及される様々なヌクレオチド配列に、その5'又は3'末端のいずれかでフレーム単位で融合されもする。
【００４８】
すでに議論されるように、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989中に記載のとおり、ハイブリダイゼーションが、所望の選択性に依存した異なる条件下で実施される。例えば、本発明のFGFを特異的に検出するために、オリゴヌクレオチドを、このオリゴヌクレオチドがターゲット核酸だけにハイブリダイズする条件下でそれにハイブリダイズさせる、例えば、ここで、このオリゴヌクレオチドは、ターゲットに対して100%相補的である。100%未満、例えば少なくとも99%、97%、95%、90%、86.4%、85%、70%、67%のヌクレオチド相補性をもつターゲット核酸を選ぶことが望まれれば、異なる条件が使用される。
【００４９】
本発明による核酸は、いずれかの所望の方法に従って標識される。いくつかの一般に使用されるトレーサーについて言及するために、核酸は、32P、35S、125I、3H、又は14Cのような放射性トレーサーを使って標識される。放射性標識は、例えば放射性標識したヌクレオチド、ポリヌクレオチド・キナーゼ(ホスファターゼによる脱リン酸化のあり又はなしで)、又はリガーゼ(標識される末端に依存して)を使った3'又は5'末端の末端標識するいずれかの方法に従って実施されうる。非放射性標識は、本発明の核酸を免疫学的性質(抗原、ハプテン)、特定の領域に特有の親和性(リガンド)、完成した酵素反応物が検出可能な性質(酵素か補酵素、酵素基質、又は酸素の反応に関係している他の物質)、又は独特の物理的性質、例えば、蛍光若しくは所望の波長の光などの放射又は吸収をもつ残基と結合させることもできる。
【００５０】
オリゴヌクレオチド、アンチセンス核酸などを含む本発明による核酸は、ノーザンブロット、PCR、in situハイブリダイゼーション、ディファレンシャル・ディスプレイ、核酸アレイ、ドット・ブロットなどを含む様々な技術により、生体全体、組織、細胞などの中のFGFの発現を検出するために使用されうる。このような核酸は、FGFの妨げられた発現、例えば細胞に特有な発現及び/又は細胞以下の変更の検出に特に有用かもしれない。FGFのレベルは、単独で又は他の遺伝子産物、特に神経細胞の生理機能に関係している他の遺伝子産物との組み合わせで測定される。
【００５１】
本発明による核酸は、所望の目的に従い生体外及び生体内で種々の異なる系で発現されうる。例えば、核酸は、発現ベクターに挿入されて、所望のホストに導入されて、そして核酸によってコードされるポリペプチドの発現を達成するのに有効な条件下で培養される。有効な条件は、有効温度、pH、培地、宿主細胞が培養される培地への添加剤(例えば、酪酸塩又はコード核酸がdhfr遺伝子に隣接していればメトトレキサートのような発現を誘発するか又は増加させる添加剤)、シクロヘキシミド、細胞密度、培養皿などを含む、宿主細胞によるポリペプチドの産生を成し遂げるために好適なあらゆる培養条件を含んでいる。核酸は、例えばネイキッドDNA法、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔法、注入法、DEAE-デキストランを介したトランスフェクション法、リポソームとの融合法、細胞、ウイルスのトランスフェクションにおいてその摂取を高める剤に関係する方法を含むあらゆる有効な手段により細胞内に導入される。
【００５２】
本発明の核酸が導入された細胞は、形質転換された宿主細胞である。前記核酸は、染色体外か又は宿主細胞の染色体と同化している。それは、安定しているか又は一時的であるかもしれない。発現ベクターは、宿主細胞とのその互換性で選ばれる。宿主細胞は、哺乳動物の細胞、例えばCOS、CV1、BHK、CHO、HeLa、LTK、NIH 3T3、293、PAE、ヒト、ヒト線維芽細胞、ヒト原発腫瘍細胞、精巣、グリア、神経細胞、乏突起神経膠細胞、グリア、神経芽細胞腫、グリオーマなど、昆虫細胞、例えばSf9(S.フルギペダ(S.frugipeda))及びショウジョウバエ、細菌、例えばE.コリ(E.coli)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、桿菌、酵母、例えばサッカロマイセス(Sacharomyces)、S.セレビシエ(S.cerevisiae)、真菌細胞、植物細胞、胚性幹細胞(例えば哺乳動物、例えばマウス又はヒト)、神経幹細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、心臓細胞、及びT細胞を含む。
【００５３】
発現制御配列が、宿主適合性及び所望の目的、例えば高いコピー数、多くの量、誘導、増幅、制御された発現に関して同様に選ばれる。使用されうる他の配列は、例えばSV40、CMV、RSYのようなエンハンサー、誘発可能なプロモーター、細胞タイプに特有の要素、又は選択的又は特有の細胞発現を可能にする配列を含んでいる。その発現を導くために使用されるプロモーターは、例えば内性プロモーター、細胞のシグナル伝達経路内の他の遺伝子のプロモーター、細菌宿主のためのMMTV、SV40、trp、Lac、tac、又はT7プロモーター；又は酵母のためのアルファ因子、アルコール・オキシダーゼ、又はPGHプロモーターを含む。T7又はSP6のようなRNAプロモーターがRNA転写を産生するために使用される。例えば、Melton et al., Nucleic Acid Res., 12(1S):7035-7056, 1984; Dunn and Studier. J. Mol. Bio., 166:477-435, 1984;米国特許番号第5,891,636号; Studier et al., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 85:60-89, 1987を参照のこと。
【００５４】
本発明の核酸又はポリペプチドは、核酸又はタンパク質電気泳動、クロマトグラフィーなどのサイズマーカーとして使用されうる。所定の制限断片は、制限部位について配列を走査し、サイズを計算し、そして対応する制限消化を実施することによって決定される。
【００５５】
本発明のFGFポリペプチド及び核酸を、「単離する」ことができる。用語「単離する」により、それが、その本来の環境又は自然に見られない、例えばより濃縮された、より精製された、異種のFGF遺伝子が発現されている細胞のライセート中に存在する成分から分離された形態で存在することを意味する。FGFがトランスフェクトされた細胞系において異種の遺伝子として発現される時、遺伝子が発現される条件下、本発明による遺伝子は、先に示したとおり細胞に導入される。用語「異種」は、遺伝子が「ヒトの手」によって細胞系に導入されたことを意味する。細胞系内への遺伝子の導入は、先に議論されている。FGF遺伝子を発現するトランスフェクトされた(又は形質転換された)細胞は、実施例に記載のとおり溶解されて、ライセートとして前記方法に使用される(すなわち「単離される」)か又はこの細胞系はもとのまま使用される。
【００５６】
一般的に、用語「有効な条件」は、例えば所望の効果が達成される環境を意味する。そのような環境は、例えば緩衝液、酸化剤、還元剤、pH、補因子、温度、イオン濃度、細胞が使われている場合の好適な細胞の年齢及び/又はステージ(例えば、特に、細胞周期の特別な部分又は特別な遺伝子が発現されている特別なステージ)、(基質、酸素、二酸化炭素などを含む)培養条件を含む。
【００５７】
安定性を高めるために、与えられる核酸は、例えば、細胞の酵素、酸化、還元、ヌクレアーゼなどに抵抗力をつけるため、又は細胞の中へのその取り込みを高めるために修飾される。例えば、ホスホチロチオエート、メチルホスホン酸、アクリジン・インターカレーション剤及び/又は疎水性テールと連結するホスホジエステル・オリゴヌクレオチド、ソラレン誘導体、2'-リボース修飾、ペントース糖誘導体、窒素塩基誘導体などを含むあらゆる好適な修飾を使用することができた。例えば、米国特許番号第5,576,208号及び同第5,744,362号を参照のこと。本発明に有用な他の誘導体、修飾などは前記を参照のこと。一般に、本発明のアンチセンス核酸は、細胞取り込み及び/又は安定性を高めるためにその天然ヌクレオチド、天然にはないヌクレオチド、及びその組み合わせ物のモノマーを含む。
【００５８】
アンチセンスは、ネイキッド核酸として処理され、細胞の中へのその取り込みを容易にする他の薬剤と混合されるか、又はそれにより封入され、細胞内にか、又はいずれかの好適なデリバリー手段に注入される。
【００５９】
本発明は、FGF-20及びFGF-23のような本発明のFGFの使用方法に関する。そのような方法は、有効量の本発明のFGF又はFGFをコードしている核酸を、1以上の下記の目的：例えば、神経細胞、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、幹細胞、特に神経幹細胞、血管内皮細胞、ケラチン生成細胞、及びFGF-20又はFGF-23に応答しうるあらゆる細胞タイプ、例えば、それらの細胞表面上に(FGFR1〜4のような)同系統の受容体又はその前駆体を発現する細胞の生存及び/又は増殖を促進する；創傷治癒を促進する；細胞の分化を調節する；胚の発生を誘発する；神経の伸長を刺激する；神経又は神経細胞の損傷からの回復を促進する；髄鞘形成を刺激する；血管形成を刺激する；受容体結合活性のために宿主に投与することを含む。
【００６０】
本発明は、本発明のFGF、例えばFGF-20及びFGF-23、又はFGFをコードしている核酸の使用の適応及び方法にも関する。そのような方法は、有効量の本発明のFGFを1以上の下記の目的：神経と軸索の損傷からの回復の促進；髄鞘形成の刺激、血管形成、創傷治癒、潰瘍治癒の刺激、骨欠損の修復の誘発、移植片の生着の促進、及び胚の発生の誘発のために宿主に与えることを伴う。先に触れた適用は、細胞の生存及び/又は増殖を促進し、特定の細胞タイプの分化を抑制及び/又は刺激する潜在的なFGF活性の結果である。FGFは、以下の源：神経細胞、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞及びいずれかのFGF受容体を発現する他の細胞タイプの細胞の幹細胞、前駆細胞(progenitor, precursor)、及び成熟細胞の生存/増殖を誘発しうる。さらに、FGFsは、神経突起の成長/伸長を誘発することによって神経細胞の前駆細胞の分化を誘発する。
【００６１】
以下の生体外、生体内のアッセイを、先に記載された細胞機能におけるFGFsの活性を計測するために実施する：
【００６２】
生体外のアッセイ：
・  生体外での乏突起神経膠細胞増殖の誘導：細胞増殖におけるのGFの効果を測るために使われた乏突起神経膠細胞は、樹立細胞系N20.1、又は齧歯動物の初代乏突起神経膠細胞である。齧歯動物(ラット)の初代乏突起神経膠細胞及び乏突起神経膠細胞前駆細胞を単離して、以下の技術のいずれか一方によって精製した：差異的な癒着技術(Mitrovic et al., 1994)；パーコール密度勾配遠心分離法(Mattera et al., Neurochem. Int. 19S4, 6(1) 41-50及びKim et al., J Neurol Sci 19S3 Dec:62(l-3):295-301)及び免疫分離法。乏突起神経膠細胞の源(初代か細胞系)又は分離及び精製の方法にかかわらず、乏突起神経膠細胞増殖アッセイを、3、5、及び7日目の時点で実施する。陽性対照はFGF-2かFGF-9のようなFGFファミリーの他のメンバーである。細胞増殖をMTTアッセイと3H-チミジン取り込み反応アッセイとして計測する。Danilenko, et al., Arch Biochem Biophys. 1999 Jan 1:361(1): 34-46の乏突起神経膠細胞増殖についてのアッセイも参照のこと。
【００６３】
・  神経突起成長の誘導：PC12アッセイ：新規FGFファミリーのメンバーを、PC-12細胞系(ラット褐色細胞腫の腫瘍由来)(Rydel, 1987 Greene, 1976)の分化の誘導及び神経突起の成長について調べる。さらに、NGFに誘発された応答の一部が自己分泌NGFによって誘発されたFGF-2産生によることが示されたので、我々は、PC12細胞のNGF産生の上方調節における新規FGFsの効果を調べる(Chevet et al., J. Biol Chem. 1999 Jul 23:274(3): 20901-8)。
【００６４】
後根神経節(DRG)の神経突起成長：DRGを、胎仔ラットDRGを解剖することによって単離し、ニューロベーサル培地中でそれらを培養する；DRGsの神経突起成長の広がりを、未処理対照と比較した場合の神経突起の数と長さの測定により視覚的に評価した。
アッセイを線維芽細胞と内皮細胞起源の細胞で実施する。線維芽細胞に関しては、NIH 3T3増殖アッセイの変法を使用する。内皮細胞増殖の誘導に対するFGFsの効果を決定するために、以下の細胞を使用する：HUVEC細胞、微小血管内皮細胞、及び大動脈内皮細胞。傷、潰瘍、又は骨損傷の治療のための有望な治療薬としてのFGFsの治療のための可能性の測定に関係する生体外アッセイを、文献に記載のとおり実施する。
【００６５】
CNS再生と関連する他のアッセイは、成長又は生存関連遺伝子発現の活性化(Meiners, et al., Dev Biol. 1993 Dec: 160(2): 480-93)、生体内に他の増殖因子の調節(Yoshida, 1992)、神経細胞の電気生理学の調節(Terlau, 1990)、乏突起神経膠細胞、シュバン細胞、又は星状細胞の分裂誘発因子又は分化因子としての活性(Genburger, 1987；Stemple, 1988；Kalcheim, Dev Biol．1989 Jul：134(1)：1-10；Murphy, 1990)、皮質、海馬、運動神経、知覚神経、交感神経、又は副交感神経細胞の生体外の生存の促進(Eckstein, 1994; Unsicker, et al., Ann N.Y. Acad Sci. 1991:638:300-5; Grothe, et al., Int J Dev Biol. 1996 Feb:40(1): 403-10)、生体外での運動神経細胞の生存の促進などのアッセイを含む。
【００６６】
生体内アッセイ：
・  新規FGFsの再髄鞘形成能力を、例えば以下のモデルにより実験することができる：a)ミエリン欠損動物モデル、例えばFGFにより処理したドナー動物からのSVZ細胞のミエリン欠損マウスへの移植及び生体内での乏突起神経膠細胞伸長の測定；b)脱髄性動物モデル、例えばPLT誘発されたCR-EAE及びMBP養子免疫細胞移入により誘発されたCR-EAE。Gumpel, 1992及びHints, et al., Mol Cell Neurosci. 1999 Aug:14(2): 153-68に記載のアッセイも参照のこと。
【００６７】
・  FGFsを、以下の生体内モデルにおける神経再生、神経保護を誘発するそれらの能力について試験する：機械的損傷/傷害(海馬采・脳弓経路、座骨神経、脊髄、視神経の切除、及びDRGの切除)；頚動脈閉塞、一時的なMCAO閉塞による脳血管の傷害、及び低酸素性虚血性脳傷害による神経細胞損傷のモデル；そしてMPTPに誘発された病変かKAに誘発された癲癇による化学的に誘発された神経変性。
【００６８】
典型的な生体内のアッセイは、例えば海馬虚血後の神経細胞損失の軽減の測定(Sasaki, 1992;MacMillan, et al., Can J Neurol Sci 1993 Feb:20(l): 37-40)、貫通線維病変後の皮質神経細胞の生存の促進(Gomez-Pinilla, 1992; Peterson, et al., J. Neurosci. 1996 Feb 1:16(3): 886-98)、変性を誘発する損傷からの基底の前脳部コリン作用性神経細胞の保護、並びにMPTP-誘発又は病変誘発された黒質ニューロンの損失の低下(Anderson, et al., Nature 1998 Mar 24: 332(6162):360-1; Otto, 1989; Gomez-Pinilla, 1992; Otto, 1990)；そして「神経領域」として生体外での神経始原細胞の長期増殖(Svendsen, et al., Trends Neurosci. 1999 Aug: 22(8): 357-64中に概説)を含んでいる。外傷性の傷害に関するモデル、例えば視神経切除(Sievers, 1987)；坐骨神経切除(Cordeiro, et. al., Plast Reconstr Surg. 19S9 June:83(6): 1013-9;Khouri, et al., Microsurgery 1989:10(3): 206-9)、切開されたDRG(Aebischer, et al., J. Neurosci Res. 1989 Jul. 23 (3):282-9)、脊髄切除(Cheng, et al., Science 1996 Jul 26:273 (5274): 510-3 1996)：そして顔面神経圧壊(Kuzis 1990)；脳血管の傷害に関するモデル、例えば低酸素性虚血性脳傷害(MacMillen, 1993)及びMCA閉塞(Kawamata, et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1997 Jul 22:94(15): 8179-84; Schabitz, 1999)；そして他の神経変性モデル、例えばキアン酸(KA)処理(Liu, et al., Brain Res 1993 Oct 29:626(l-2):335-8)又はwobblerマウスにおけるMND(Ikeda, et al., Neurol Res. 1995 Dec:17(6): 445-8)をも参照のこと。
【００６９】
用語「投与」により、FGF、FGFをコードする核酸、又は他の活性な薬剤がターゲット、例えば外傷、損傷した組織などにデリバリーされることを意味する。FGFは、治療すべき傷害、症状、又は病気をもつ、培養細胞及び宿主を含む、あらゆるターゲットに(例えば、生体内、生体外又はin situで)先に記載のとおり効果を達成するために好適な効果的な経路により与えられる。例えば、FGF製剤は、ターゲット部位に直接又はその付近に注入によって投与される。それは、局所的に、全身に、非経口的に、静中に、筋中に、皮下に、経口的に、経鼻的に、脳内に、心室内に、大槽内に、頭蓋内に、例えば治療されるターゲット位置に依存して、例えば神経ガイドを充填したゲル状のコラーゲンにより所望の位置に植え込まれて、投与されることもできる。FGFは、浸透性ポンプを使って連続的に投与される。FGFは、細胞による取り込みのための核酸として投与される。核酸を投与するための方法は、先に記載のもの、及び他の慣習の最先端の技術を含んでいる。
【００７０】
有効量のFGFがターゲットに投与される。有効量は、所望の効果、好ましくは有益な又は治療上の効果を達成するために有用であるような量である。例えば、所望の目的、例えば神経突起成長の刺激又は神経細胞の生存の促進を達成する有効量を決定するため異なる服用量をターゲット細胞に投与する用量応答実験を実施することにより、そのような量はルーチンに決定されることができる。量は、FGFが投与される環境(例えば、脳外傷をもつ患者、動物のモデル、組織培養細胞など)、治療される細胞の部位、患者又は治療される動物の年齢、健康状態、性別、及び体重などの様々な要素に基づいて選ばれる。
【００７１】
1つの側面において、本発明は、神経細胞の傷害、例えば神経損傷と外傷、脊髄損傷と外傷、例えば虚血性の発作、梗塞形成、出血、及び動脈瘤により産み出される神経組織に対する損傷を治療する；神経細胞の病気、例えば神経変性疾患、例えばアルツハイマー症、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、ミエロパシー、脊髄炎、及び脊髄空洞症などの、有効量の本発明のFGFを投与することを含む、治療の方法に関する。
【００７２】
本願発明からのFGFsは、神経細胞と乏突起神経膠細胞の破壊を特徴とする、CNSとPNSの神経変性及び脱髄性疾患の治療のために使用される。FGFは、多発性硬化症及びCNS又はPNSの他の一次的及び/又は二次的な脱髄性疾患の治療のための再髄鞘形成治療薬として使用される。CNSの一次的な脱髄性疾患は、副腎白質萎縮症、白質脳症(例えば、進行性多病巣性白質脳症)、 脳脊髄炎(急性散在性静脈周囲脳脊髄炎様)を含む。CNSの二次的脱髄性は、CNSの外傷、毒素(シアン化物、ヘキサクロロファン)、又は虚血(発作)による脱髄性病変の形成として表される。PNSの脱髄性疾患は、ギリアン-バレー症候群(Gillian-Barre syndrome)(GBS)、パラタンパク質血症、慢性炎症性の脱髄性多発神経障害(CIDP)のような一次的障害を含んでいる。さらに、神経の損傷が傷害/外傷(機械的、化学的、脳血管傷害、及び感染症と自己免疫反応による炎症)により、そして他の神経変性疾患の治療のためである、CNS及びPNSの神経変性疾患の治療のためにFGFが使用される。
【００７３】
本発明のFGFsは、移植片の生着を促進するために使用されもする。例えば、FGFは、種々の細胞、組織、又は臓器、例えば皮膚、神経束、腱、骨、腎臓、角膜などの移植片(例えば、他系、同系又は、自家移植)の生着を促進するために使用される。CNS又はPNS中への神経細胞、グリア、又は幹細胞起源の細胞移植が、本発明によって考慮されもする。移植される物質を、天然の起源のものから、又は生体外での、移植される細胞又は組織の増殖によるか、又は分化した又は分化していない幹細胞を用いることにより準備する。本明細書中において、用語「促進」は、FGFにより処理した細胞、組織、又は臓器が、そのように処理されていない細胞、組織、又は臓器に比べて生存及び/又は増殖を高まっていることを意味する。移植片の生存についてアッセイする方法は、慣習にある。
【００７４】
移植片の生着を計測するためのアッセイは、ルーチンであり、本技術分野で周知である。慣習の生体外アッセイは、例えばMTT、MTS、Thyの取り込み、ラ生/死細胞アッセイ(例えばカルセインAM(calcein AM)とエチジウム・ホモニ量体-EthD-1との二重染色)、例えば顕微鏡計算の使用による又は、例えば血球算定器を使用した細胞を数える物理的な方法による全体の細胞数の測定を含む。慣習の生体内の方法は、例えばCNSに関する、改善された神経学的機能の検出、又はGd増大のあり又はなしの、MTR、MRS、CT、又はMRIのような映像技術を含んでいる。
【００７５】
本発明に従って治療されうる他の症状は、MI、血管形成、創傷治癒、潰瘍治癒の促進、骨吸収の防止と新しい骨形成の誘導、移植片の生着の促進、及び胚の発生の誘発による心筋損傷に対抗する予防を含む。
【００７６】
前記疾患/症状の治療に有用なFGF活性は、以下の：細胞の生存及び/又は増殖の促進、以下の細胞タイプの分化の抑制及び/又は刺激：幹細胞、前駆細胞、及び以下の起源：神経細胞、乏突起神経膠細胞、シュワン細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、骨芽細胞、及びFGF受容体を発現するあらゆる他の細胞タイプの成熟細胞の細胞生存/増殖の誘発を含む。さらに、誘発神経突起成長/伸長を誘発することによる神経前駆細胞の分化誘導に対するFGFの効果は、全ての種類の神経細胞の傷害/損傷の治療に有用であると考えられる。
【００７７】
用語「治療」は、損傷又は疾患の改善をもたらす全て効果、例えば前記のとおり、神経細胞、グリア、乏突起神経膠細胞、星状細胞、シュワン細胞などの生存の促進、神経突起伸長の刺激、髄鞘形成の刺激、細胞増殖の刺激などを意味する。そのような傷害及び疾患を治療するために、FGFを組成物又は核酸として処方し、そして負傷又は疾患に冒されている部位に、例えば外科技術を用いて適用しうる。
【００７８】
本発明のFGFsは、例えば遺伝子治療の方法のより核酸の投与により本明細書中に開示された治療方法のいずれかのために投与されもする。遺伝子デリバリー媒体は、ウイルス又は非ウイルス起源である(一般に、Jolly, Cancer Gene Therapy 1:51-64 (1994) Kimura, Human Gene Therapy 5:845-852 (1994); Connelly, Human Gene Therapy 1:185-193 (1995);及びKaplitt, Nature Genetics 6:148-153 (1994)を参照のこと)。本発明の治療としてのコード配列を含む構築物のデリバリーのための遺伝子治療媒体は、局所的に又は全体的に投与される。これらの構築物は、ウイルス又は非ウイルス・ベクター・アプローチを介して利用されうる。そのようなコード配列の発現は、内性の哺乳動物又は異種のプロモーターを使って誘発される。コード配列の発現は、構成的であるか又は制御されているかのいずれかである。
【００７９】
本発明は、着目の選ばれた核酸分子を担持するか又は発現すように構築された組み換えレトロウイルスを利用しうる。利用しうるレトロウイルス・ベクターは、EP 0 415 731; WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234;米国特許番号第5,219,740号; WO 93/11230; WO 93/10218; Vile and Hart, Cancer Res. 53:3860-3864(1993); Vile and Kart, Cancer Res. 53:962-967 (1993); Ram et al., Cancer Res. 53:83-88 (1993); Takamiya et al., J. Nenrosci. Res. 33:493-503 (1992); Baba et al., J. Neurosurg. 79:729-735 (1993);米国特許番号第4,777,127号;英国特許番号第2,200,651号;及びEP 0 345 242に記載のものを含んでいる。好ましい組み換えのレトロウイルスは、WO91/02805に記載のものを含む。
【００８０】
先に記載されたレトロウイルス・ベクター構築物との使用に好適なパッケージ化細胞系は、容易に準備され(PCT公開WO95/30763及びWO92/05266を参照のこと)、組み換えのベクター粒子の産生のための産生細胞株(ベクター細胞系とも呼ばれる)の作製にも使われる。本発明の特に好ましい態様の範囲内において、パッケージ化細胞系は、ヒト(例えば、HT1080細胞)又はミンク親細胞系から作製され、それによってヒト血清中で不活化を切り抜けて生き残る組み換えレトロウイルスの産生を可能にする。
【００８１】
本発明は、遺伝子デリバリー媒体として機能するアルファウイルス・ベースのベクターをも利用する。そのようなベクターは、例えばシンドビス・ウイルス・ベクター、セムリキ森林熱ウイルス(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)；)、ロス川ウイルス(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)、及びベネズエラ・ウマ脳脊髄炎ウイルス(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)を含む幅広い種類のアルファウイルスから構築されうる。そのようなベクター・システムの代表的な例は、米国特許番号第5,091,309号；同第5,217,879号；及び同第5,185,440号；そしてPCT公開番号第92/10578号；同第94/21792号；同第95/27069号；同第95/27044号；及び同第95/07994号に記載のものを含む。
【００８２】
本発明の遺伝子デリバリー媒体は、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターのようなパルボウイルスを利用することもできる。代表的な例は、WO 93/09239中Srivastavaにより、Samulski et al., J. Vir. 63:3822-3828 (1989); Mendelson et al., Virol 166:154-165 (1988);及びFlotte et al., P.N.A.S. 90:10613-10617 (1993)よって開示されたAAVベクターを含んでいる。
【００８３】
アデノウイルス・ベクターの代表的な例は、Berkner, Biotechniqnes 6:616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); WO 93/19191 ;Kolls et al., P.N.A.S. 215-219(1994);Kass-Eisler et al., P.N.A.S. 90:11498-11502 (1993); Guzman et al., Circulation 88:2838-2848 (1993); Guzman et al., dr. Res. 73:1202-1207 (1993); Zabner et al., Cell 75:207-216 (1993); Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403-409 (1993); Cailaud et al., Eur. J. Neurosci. 5: 1287-1291 (1993); Vincent et al., Nat Genet. 5:130-134 (1993); Jaffe et al., Nat. Genet. 1:372-378 (1992);及び Levrero et al., Gene 101:195-202 (1992)によって記載されたものを含む。本願発明で利用可能な典型的なアデノウイルス遺伝子治療ベクターは、WO94/12649；WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO95/11984及びW0.95/D0655に記載のものをも含む。Curiel, Hum. Gene Tlier. 3:147-154 (1992)に記載の、死滅させたアデノウイルスにに連結したDNAの投与を利用する。
【００８４】
単独で死滅させたアデノウイルスに連結させた又は連結させていないポリカチオン縮合されたDNA、例えばCuriel, Hum. Gene Ther 3:147-154 (1992)；リガンド連結DNA、例えばWu、J. Biol. Chem, 264:16985-16987(1989)を参照のこと；真核生物の細胞デリバリー媒体、例えば1994年5月9日に提出の米国登録番号第08/240,030号及び同第08/404,796号；光重合ハイドロゲル材料の沈着；米国特許番号第5,149,655号に記載の携帯型遺伝子導入粒子銃；米国特許番号第5,206,152号及びWO92/11033に記載の電離放射線；核の荷電の中和又は細胞膜との融合を含む他の遺伝子デリバリー媒体及び方法を利用しうる。さらなるアプローチは、Philip, Mol. Cell Biol. 14:2411-2418 (1994)及びWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:1581-1585 (1994)に記載される。
【００８５】
ネイキッドDNAが利用されもする。典型的なネイキッドDNA導入法は、WO90/11092及び米国特許番号第5,580,859号中に記載される。生物分解性ラテックス・ビーズを使って取り込み効率が改善されうる。ビーズによるエンドサイトーシス開始後、DNAコートしたラテックス・ビーズは、細胞内に効率よく運ばれる。疎水性を高める、そしてそれによってエンドソームの分裂及び細胞質中へのDNAの放出を容易にするために、前記方法はビーズ処理によりさらに改良されうる。遺伝子デリバリー媒体として働くリポソームが、米国特許番号第5,422,120号、PCT特許公開番号第95/13796号、同第94/23697号及び同第91/14445号、並びにEPNo.0524968に記載されている。
【００８６】
使用に好適なさらなる非ウイルス・デリバリー・システムは、機械的なデリバリー・システム、例えばWoffendin et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(24):11581-11585 (1994)に記載のアプローチを含んでいる。しかも、コード配列及びその発現産物が、光重合したハイドロゲル材料の沈着を通してデリバリーされうる。コード配列のデリバリーのために使用しうる遺伝子デリバリーのための他の慣用法は、例えば米国特許番号第5,149,655号に記載の携帯型遺伝子導入粒子銃の使用；米国特許番号第5,206,152号及びPCT特許公開番号第WO92/11033号に記載の移入された遺伝子を活性化するための電離放射線の使用を含んでいる。
【００８７】
本発明は、有効量のFGF-9(例えば、Kanda et al.,前記)、FGF-20又はFGF-23、あるいはその生物学的に活性な断片を投与することを含む、細胞増殖を刺激する方法にも関する。用語「細胞増殖の刺激」により、投与されたFGFが細胞分裂か有鎖分裂をもたらすことを意味する。このFGFは、いずれかの効果的な形態(核酸又はポリペプチド)でいずれか好適な宿主に投与されうる。
【００８８】
例えば、1の態様において、この方法は、FGFのアゴニスト及びアンタゴニストを同定に有用である。そのような場合において、脊髄運動神経細胞のような確立された及び初代細胞を含めむ細胞系にFGFを投与することは有用でありうる。確立されている系は、例えばDBTRG-05MG、PFSK-1、MSTO-211H、NCI-H37S、NCI-N417、NCI-H526、HCN-1A、HCN-2、CATH.a、NG108-15、NCI-H446、NCI-H209、NCI-H146、NCI-H82;NCI-H345、NCI-H510A、D283Med、D341Med、C6、IMR-32、Neuro-2a、NB41A3、BC3H1、A172、Mpf、T98G[T98-G]、SCP、CCF-STTG1、DI TNC1、CTX TNA2、PG-4(S+L-)、G355-5、SW598[SW-598;SW598]、C6/LacZ、9L/lacZ、N1E-115、SH-SY5Y、BE(2)-M17、BE(2)-C、MC-IXC、SK-N-BE(2)、CHP-212、C6/IacZ7、M059K、M059J、F98、RG2[D74]、NCI-H250、NCI-H1915、OA1、TE615.T、SVGp12、TE671サブラインNo.2、MBr Cl1、SK-N-MC、SW 1088[SW-1088;SW1088]、SW 1783[SW-1783；SW1783]、U-87 MG、U-118 MG、U-138 MG、MDA-MB-361、DU 145、Hs 683、H4、293、PC-12、P19、NTERA-2 cl.D1[NT2/D1]、BCE C/D-1b、SK-N-AS、SK-N-FI、SK-N-DZ、SK-N-SH、Daoy、好ましくはN20.1細胞を含むATCC(atccc.org)で保存されている細胞系のいずれかを含んでいる。
【００８９】
FGFの推定上のアゴニスト及びアンタゴニストが、FGFが投与された細胞、例えば先に記載の細胞系に生体内で投与されうるか、あるいは推定上の薬剤が、本来FGFを産生する細胞に生体外で又は生体内で投与されうる。そのような薬剤のアゴニストの又はアンタゴニストの効果は、本明細書中の他の場所に記載のような、種々の本技術分野によって認められたアッセイのいずれかにより計測されうる。
【００９０】
神経幹細胞は、本発明のFGFによって増殖するように刺激されもする。得られた細胞は、拒絶のような同種間移植に関係するあらゆるよく知られた問題を排除する、それらを誘導したのと同じ患者に戻す移植(すなわち、自家移植)のための神経細胞の起源として使用されうる。よって、本発明の方法は、神経幹細胞の増殖と分化を刺激する有効量のFGFを投与すること、及び上記幹細胞を植え戻すことに関する。
【００９１】
本発明は、特に本発明のFGFを認識する抗体に関しもする。FGFに特異的な抗体は、抗体がFGF、例えば図1及び2の配列内の、又はそれを含むアミノ酸の所定の配列を認識することを意味する。このように、特異的な抗体は、例えばイムノブロット・アッセイ又は他の慣例の免疫学的測定法により検出及び/又は計測されるように、異なるエピトープ(s)よりアミノ酸配列、すなわち図1及び2に見られるエピトープに対しより高い親和性で一般に結合するであろう。よって、ヒトFGF-21のエピトープについて特異的な抗体は、サンプル、例えばヒトFGF-21遺伝子産物を含む組織サンプル中のエピトープの存在を検出しそのエピトープが不存在のサンプルと区別するのに有用である。そのような抗体は、Santa Cruz Biotechnology, Inc., Research Product Catalogに記載のとおり有用であり、適宜に配合されうる。
【００９２】
抗体、例えばポリクローナル、モノクローナル、組み換え、キメラ、ヒト化された抗体を、いずれかの所望の方法に従って調製することもできる。組み換え免疫グロブリン・ライブラリのスクリーニング(例えば、Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:3833-3837, 1989; Huse et al., Science, 256:1275-1281, 1989)；リンパ球集団の生体外刺激；Winter and Milstein, Nature, 349: 293-299, 1991をも参照のこと。例えば、モノクローナル抗体の産生のために、図1及び2によるポリペプチドを、マウス、ヤギ、又はウサギに皮下に及び/又は、腹腔内に、アジュバントと一緒に又はそれなしに、免疫応答の誘導有効量で投与する。抗体は、1本鎖か又はFAb断片である可能性もある。抗体は、IgM、IgG、サブタイプ、IgG2a、IgG1などである可能性がある。抗体及び免疫応答は、ネイキッドDNAを投与することによっても産み出される。例えば、米国特許番号第5,703,055号；同第5,589,466号；同第5,580,859を参照のこと。
【００９３】
抗体の誘導に使用されるFGF又はその断片は、生物活性を有する必要がない；しかし、それらは、単独又は担体との組み合わせのいずれかで免疫原性活性を持たなければならない。FGFに特異的な抗体の誘導に使用するためのペプチドは、少なくとも5のアミノ酸、好ましくは少なくとも10のアミノ酸から成るアミノ配列を有する。FGFアミノ酸の短いつながり、例えば5のアミノ酸は、他のタンパク質、例えばキーホール・リンペット・ヘモシアニンか、又は他の有用な担体と融合させ、このキメラ分子を抗体産生に使用しうる。抗体の作製に有用なFGFの領域は、経験的に選ばれるか、又は高い免疫原性の部位を決定するために、例えばcDNAから推定される、例えば遺伝子のアミノ酸配列をアッセイする。好適なエピトープを選択するための解析は、例えばAusubel FMらによって(1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol 2. John Wiley & Sons)記載されている。
【００９４】
抗体を産生するために有用な配列は、図1及び2に示されるアラインされた配列を含む。そのような配列に対する抗体は、FGFの異なる転写どうしを区別するために有用であるかもしれない。前記を参照のこと。
【００９５】
特定のFGF抗体は、前病理学的状態、並びにFGFの量又は分布の相違によって特徴づけられる慢性又は急性疾患の診断に有用である。FGFに関する診断試験は、ヒト(又はマウスなどを使う場合にはマウスなど)の体液、組織、又はそのような組織の抽出物中のFGFを検出するための抗体及び標識を利用する方法を含む。
【００９６】
本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾を伴うか又はそれなしに使用される。しばしば、前記ポリペプチド及び抗体は、共有的に又は非共有的に、検出可能なシグナルを提供する物質とそれらとを結合することにより標識される。幅広い種類の標識及び結合技術が知られていて、科学的な文献でも特許文献でも広く報告された。好適な標識は、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害薬、蛍光物質、化学発光物質、磁性粒子などを含む。そのような標識の使用を教示する特許は、米国特許番号第3,817,837号；同第3,850,752号；同第3,939,350号；同第3,996,345号；同第4,277,437号；同第4,275,149号；及び同第4,366,241号を含んでいる。
【００９７】
FGFに結合する抗体及び他のリガンドは、例えば動物、組織、細胞などの中のFGFポリペプチドのレベルを定量するために、その細胞局在及び/又は分布を同定するために、それを精製するために、あるいはその機能を調節するために、ウェスタン・ブロット、ELISA、免疫沈降、RIAなどにおいて治療、診断、及び商業的な調査研究の道具を含む様々な方法において使用される。本発明は、そのようなアッセイ、組成物、及びそれらを実施するためのキットなどに関する。これらと他の方法を利用するとき、本発明による抗体は、組織、細胞、体液、血液、尿、脳脊髄液を含む様々なサンプル中のFGFポリペプチド又はその断片を検出するために使用される。
【００９８】
さらに、本発明によるFGFポリペプチドに結合するリガンドか、その誘導体を、例えば合成ペプチド・ライブラリ又はアプタマーを使って調製することもできる(例えばPitrung et al.,米国特許番号第5,143,854号; Geysen et al., J. Immunol. Methods, 102:259-274, 1987; Scott et al., Science, 249:386, 1990; Blackwell et al., Science, 250:1104, 1990; Tuerk et al., 1990, Science, 249: 505)。
【００９９】
本発明は、例えば米国特許番号第5,434,050号により開示されるような所望の方法により調製されるFGFポリペプチドに関しもする。標識したポリペプチが、例えば生体外、生体内、又はin situの系などで、細胞中のFGFの動きを調べるために、例えばFGFに結合するか又は付着する物質を同定するための結合アッセイに使用されうる。
【０１００】
本発明による核酸、ポリペプチド、抗体、リガンドなどは、単離されうる。用語「単離された」は、物質が、その本来の環境又は天然では見られない、例えばより濃縮された、より精製された、成分から分離された形態で存在することを意味する。単離された核酸は、例えば生きた動物で見られる染色体DNA、例えば完全な遺伝子、転写産物、又はcDNAから分離されたFGFの配列をもつ核酸を含む。この核酸は、ベクターの一部であるか又は(特有の遺伝子を狙うことによるか又はその通常の位置とは別の位置でのランダムな組み込みにより)染色体中に挿入され、そしてその自然環境においてそれが見られる形態ではなく単離されたままで存在することができる。本発明の核酸又はポリペプチドは、実質的に精製されもする。実質的に精製されるにより、核酸又はポリペプチドが単離され、そして他の核酸又はポリペプチドを本質的に含まない、すなわち上記核酸又はポリペプチドが腫瘍で、有効成分であることを意味する。
【０１０１】
本発明は、トランスジェニック動物、例えばFGFを含むマウスのようなヒト以外の哺乳動物にも関する。トランスジェニック動物は、例えば1-cell胚の前核内への組み換え遺伝子の入った前核の注入、合成酵母染色体の胚性幹細胞内への組み込み、遺伝子ターゲッティング法、胚性幹細胞方法論を含む既知の方法により調製されうる。
【０１０２】
例えば、米国特許番号第4,736,866号；同第4,873,191号；同第4,873,316号；同第5,082,779号；同第5,304,489号；同第5,174,986号；同第5,175,384号；同第5,175,385号；同第5,221,778；Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 77:7380-7384, 1980; Palmiter et al., Cell, 41:343-345, 1985; Palmiter et al., Ann. Rev. Genet., 20:465-499, 1986; Askew et al., Mol. Cell. Bio., 13:4115-4124, 1993; Games et al., Nature, 373:523-527, 1995; Valancius and Smithies, Mol. Cell. Bio., 11:1402-1408, 1991; Stacey et al., Mol. Cell. Bio., 14:1009-1016, 1994; Hasty et al., Nature, 350:243-246, 1995; Rubinstein et al., Nucl. Acid Res., 21:2613-2617,1993を参照のこと。
【０１０３】
本発明による核酸は、マウス(Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986)、豚(Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985)、羊(Hammer et al., Nature, 315:343-345, 1985)、牛、ラット又は霊長類を含む全てのヒト以外の哺乳動物に組み込まれることができる。例えば、Church, 1987, Trends in Biotech. 5:13-19; Clark et al., Trends in Biotech. 5:20-24, 1987);及びDePamphilis et al., BioTechniques, 6:662-680, 1988をも参照のこと。
【０１０４】
さらに、例えば慣習のトランスジェニック・ラット及びマウスの製造は、市販されている。これらのトランスジェニック動物(すなわち、FGF-21、-23、又はその断片が挿入されている場合)は、ヘビの餌として、菌株の起源の検出のための遺伝標識としてなどの遺伝子機能について試験するための有用な動物モデルでありうる。そのようなトランスジェニック動物は、さらに他の導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物は、いずれかの好適な方法に従って調整され、そして使用されうる。
【０１０５】
前記核酸の他の側面について、分子生物学の標準的な教科書を参照文献とする。例えば、Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, 1986; Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985; Sambrook et al., Molecular Cloning, CSH Press, 1989; Howe, Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press, 1995を参照のこと。
【実施例】
【０１０６】
実施例1
乏突起神経膠細胞の増殖と生存：
細胞増殖に対する増殖因子(GF)の効果を計測するために使われた乏突起神経膠細胞は、N20のような樹立細胞系又は齧歯動物の初代乏突起神経膠細胞のいずれかである。齧歯動物(ラット)の初代乏突起神経膠細胞及び乏突起神経膠細胞前駆細胞を、分離し、そして差異的な吸着技術(Mitrovic, 1994)及びパーコール密度勾配遠心分離(Mattera, et al., Neurochem. Int. 1984, 6(1) 41-50; Kirn, et al., J Neurol Sci 1983 Dec:62(1-3): 295-301)によって精製する。96ウェル・プレート中に2.5×104細胞/mlで蒔くことにより乏突起神経膠細胞増殖アッセイを実施した。細胞を増殖因子により3、5及び7日間刺激する。陽性対照は、FGF-2又はFGF-9のようなFGFファミリーの他のメンバーである。細胞増殖を、MTTアッセイ及び3H-チミジン取り込みアッセイによって計測する。
【０１０７】
図4、5及び6は、FGF20が時間及び用量応答様式で、N20.1の乏突起神経膠細胞の乏突起神経膠細胞増殖を刺激することを示す。N20.1細胞を、不十分にしか精製されていないFGF-20のヘパリン・アガロース・クロマトグラフィー・サンプルにより処理する。増殖をMTT染色によって決定する。FGF-20は、乏突起神経膠細胞の増殖を誘発して(図4A)、そしてタンパク質の煮沸により活性は無効にされる(図4B)。
【０１０８】
前述の観測は、ヘパリン及びSカラムからの不十分にしか精製されていない物質の準備により確認される(図5)。N20.1細胞を、ヘパリン又はSカラムからのFGF-20により処理する。細胞をFGF-20と一緒に5日間インキュベートし、未処理対照を上回る増殖の増加をMTT染色により決定する。FGF-9を陽性対照として使用し、適当な対応の緩衝液(H及びS)を陰性対照として使用する。不十分にしか精製されていない物質の活性が、FGF-9に匹敵する。
【０１０９】
さらに、FGF-20は、ラット初代乏突起神経膠細胞の増殖を誘発する(図6B)。乏突起神経膠細胞を、FGF-2(図6A)とFGF-20(図6B)で処理する。細胞をGFsと一緒に3日間インキュベートし、未処理対照を上回る増殖の増加をMTT染色により測定する。不十分にしか精製されていない物質の活性が、FGF-2に匹敵する。FGF-20は、乏突起神経膠細胞増殖の強力なインデューサーであり、その活性はFGF-2及びFGF-9のようなFGFファミリーの他のメンバーに匹敵する。
【０１１０】
実施例2
神経細胞の生存の誘導：
神経細胞の生存アッセイを、低血清培地中、96ウェル・プレートに2.5×104細胞/mlで蒔くことによって実施する。これらの条件下、細胞は、増殖因子の禁断によるアポトーシスを経験する。細胞を、3日〜12日の範囲の異なる期間、増殖因子により刺激する。陽性対照は、FGF-2又はFGF-9のようなFGFファミリーの他のメンバーである。神経細胞の生存をMTTによって計測する。
【０１１１】
図7及び9は、FGF-20が神経細胞起源の細胞の生存を刺激する強力な神経栄養因子であることを示す。
【０１１２】
PC12細胞を、低血清培地(1%のNu血清)の存在下、96ウェル・プレートに蒔く。FGF-20を含む異なる増殖因子を、0.0025〜2500 ngs/mlの範囲の濃度で添加する。7及び10日後の相対的な生存をMTTアッセイにより計測し、未処理対照と比較する。FGF-20に関するデータを、図7Aに、そしてFGF-2、FGF-9、及びFGF-20について図7B.に示す。
【０１１３】
実施例3
神経突起成長の誘導
FGF-20は、PC12細胞の成長に対する活性を示す。この活性はNGF前処理に依存していない(表1及び2、並びに図9を参照のこと)。
【０１１４】
このアッセイにおける不完全にしか精製されていないFGF-21の挙動は、配列が非常に類似しているFGF-9について観察されるものと似ている。さらに、PC12細胞の神経突起成長の誘導に対するFGFファミリーの別のメンバー(FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9、FGF-10、FGF-16、FGF-16、FGF-17、FGF-18)(表2を参照のこと)の活性を比較する。この系の神経突起成長の誘発において最も強力なFGFSは、FGF-2、FGF-9及びFGF-20/21である。2種類のFGFs、FGF-7及びFGF-10は、ヘパリンの存在又は不存在にかかわらずこのアッセイにおいて不活性であることが判明した。
【０１１５】
初代ラット胎児皮質神経細胞を、胚ラット脳(El6)から単離する。この皮質を顕微鏡下で解剖し、そしてハンク溶液で6回洗浄し、酸素処理なしに機械的に分離する。神経細胞を以下の：10%のウマ血清、10%のFCS、2 mMのL-グルタミン、HEPES緩衝液を補ったDMEMから成る培地中で培養する。24時間後、1O μMのFdU及び1 μMのシトシン・アラビノシドから成る阻害薬混合物を、神経細胞を除く全ての他の細胞タイプの増殖を抑えるために3日間添加する。培養8日後に、神経細胞を採取し、そして低血清培地(2%の血清)の存在下96ウェル・プレートに蒔く。FGF-20を含む別の増殖因子を、0.0025〜2500 ngs/mlの範囲の濃度で添加する。5日後、相対的な生存をMTTアッセイにより計測し、未処理対照と比較する。
【０１１６】
表1：FGF-20は、PC12細胞の神経突起成長の強力なインデューサーである：
PC12細胞を蒔き、図7に示す実験のとおり処理する。FGF-9及びFGF-20を、0.0025〜2500 ngs/mlの範囲の濃度で添加する。処理の7及び12日後に、神経突起伸長を、Wright染色による細胞染色、続く顕微鏡的検査により測定する。その成長の%は、処理を受けた細胞のおよその数を表す。
【０１１７】
FGF-9及びFGF-20/21処理による神経突起成長の誘導に関する観察の概要を以下に示す。最も高濃度の不十分にしか精製されていない物質は、細胞に有毒であって、生存データ(図7Bを参照のこと)にも神経突起成長(以下を参照のこと)にも影響する。
【表１】
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【０１１８】
表3．神経突起成長-別のFGFファミリー・メンバーの比較：
培養PC12細胞を、FGFsに処理し、そして神経突起成長を視覚的にスコア化する。FGF-20は、試験したFGFファミリー・メンバーからの最も強力な神経栄養GFの1つである。
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】FGF-20のヌクレオチド及びアミノ酸配列(配列番号1及び2)を示す。
【図２】FGF-23のヌクレオチド及びアミノ酸配列(配列番号3及び4)を示す。
【図３】既知のFGFファミリーのメンバーとFGF-20タンパク質とのアラインされたアミノ酸配列を示す。xfgf-20はアフリカツメガエル由来である。
【図４】乏突起神経膠細胞増殖を示す。図4Aは、乏突起神経膠細胞の増殖を示す。図4Bは、タンパク質の煮沸により活性が無効にされることを示す。
【図５】N20.1乏突起神経膠細胞増殖に対するFGF-20の効果を示す。
【図６】ラット初代乏突起神経膠細胞(PRO)の増殖に対するFGFsの効果を示す。図6Aは、FGF-2により処理した細胞を示す。図6Bは、FGF-20により処理した細胞を示す。
【図７】神経細胞起源の細胞系の生存/増殖に対するFGFsの効果を示す。図7Aは、FGF-20の効果を示す。図7Bは、FGF-2、FGF-9、及びFGF-20の効果を示す。
【図８】神経突起成長を示す。培養PC12細胞を、組み換えFGF-20とヘパリン(左のパネル)、又はヘパリン単独(右のパネル)により6日間処理する。細胞を固定し、そしてβIIIチューブリンについて染色し、核を7-AADにより画像化する。神経突起成長は、ヘパリン単独により処理した細胞では観察されない。
【図９】FGF-20が皮質の神経細胞のための強力な生存要素であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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