(57)【要約】骨減少を治療および予防、ならびに／または骨形成を促進する方法を開示する。これらの方法は15-リポキシゲナーゼ阻害剤を使用する。これらの分子は、単独または骨吸収を阻害する物質もしくは骨からのカルシウム吸収を調節もしくは骨癒着を促進する付加的物質と併用して送達することができる。本発明は、さらに骨減少に対する素因の診断方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を含む、哺乳動物患者における骨減少を低減するための薬剤の製造のための15-リポキシゲナーゼ阻害剤の使用。
【請求項２】
骨減少が骨粗鬆症、骨関節炎、骨パジェット病、または歯周病に関連する、請求項1記載の使用。
【請求項３】
骨減少が骨粗鬆症に関連する、請求項2記載の使用。
【請求項４】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を含む、哺乳動物における骨塩量を増加させるための薬剤の製造のための15-リポキシゲナーゼ阻害剤の使用。
【請求項５】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を含む、哺乳動物における骨折の発生率を低下させるための薬剤の製造のための15-リポキシゲナーゼ阻害剤の使用。
【請求項６】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を含む、哺乳動物における骨折を治療するための薬剤の製造のための15-リポキシゲナーゼ阻害剤の使用。
【請求項７】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を含む、哺乳動物における骨粗鬆症を治療するための薬剤の製造のための15-リポキシゲナーゼ阻害剤の使用。
【請求項８】
哺乳動物がヒトである、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤のIC50が1μM未満である、請求項8記載の使用。
【請求項１０】
付加的活性物質をさらに含む、請求項1記載の使用。
【請求項１１】
付加的活性物質が骨からのカルシウム吸収の調節に有効である、請求項10記載の使用。
【請求項１２】
付加的活性物質がエストロゲン、カルシトニン、ビスホスホネートおよびIGFからなる群より選択される、請求項11記載の使用。
【請求項１３】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤が合成有機分子、天然物質および抗体からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤が3-（2-ノン-1-イニルフェニル）-プロピオン酸、6,11-ジヒドロ-5-チア-11-アザ-ベンゾ［a］フルオレン、3-アミノ-N-（3,4-ジクロロフェニル）-4-メトキシベンズアミド、トランス-3-（2-オクト-1-イニル-フェニル）-アクリル酸、および［［［5-(5,6-ジフルオロ-1H-インドール-2-イル）-2-メトキシフェニル］アミノ］スルホニル］-カルバミン酸-イソブチルエステルからなる群より選択される、請求項1〜8および請求項10〜12のいずれか一項記載の使用。
【請求項１５】
患者に15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を投与する工程を含む、哺乳動物患者における骨減少を低減するための方法。
【請求項１６】
骨減少が骨粗鬆症、骨関節炎、骨パジェット病、または歯周病に関連する、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
骨減少が骨粗鬆症に関連する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における骨塩量を増加させる方法。
【請求項１９】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における骨折の発生率を低下させる方法。
【請求項２０】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における骨折を治療する方法。
【請求項２１】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における骨粗鬆症を治療する方法。
【請求項２２】
哺乳動物がヒトである、請求項15〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤のIC50が1μM未満である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
付加的活性物質の投与をさらに含む、請求項15記載の方法。
【請求項２５】
付加的活性物質が骨からのカルシウム吸収の調節に有効である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
付加的活性物質がエストロゲン、カルシトニン、ビスホスホネートおよびIGFからなる群より選択される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤が合成有機分子、天然物質および抗体からなる群より選択される、請求項15〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤が3-（2-ノン-1-イニルフェニル）-プロピオン酸、6,11-ジヒドロ-5-チア-11-アザ-ベンゾ［a］フルオレン、3-アミノ-N-（3,4-ジクロロフェニル）-4-メトキシベンズアミド、トランス-3-（2-オクト-1-イニル-フェニル）-アクリル酸、および［［［5-(5,6-ジフルオロ-1H-インドール-2-イル）-2-メトキシフェニル］アミノ］スルホニル］-カルバミン酸-イソブチルエステルからなる群より選択される、請求項15〜22および請求項24〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
化合物を15-リポキシゲナーゼと接触させる工程、およびその化合物が15-リポキシゲナーゼ活性を阻害するか否かについて調べる工程を含む、骨塩量を増加させる化合物を同定する方法。
【請求項３０】
化合物の骨形成に対する影響を実証する機能的なアッセイ法において化合物を検査する工程をさらに含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
機能的アッセイ法が化合物をヒト間葉幹細胞と接触させる工程および骨形成細胞への細胞分化を調べる工程を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
機能的アッセイ法がヒト以外の動物に化合物を投与する工程および骨形成の指数を測定する工程を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
測定される指数が骨濃度である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
指数が骨の生体力学的パラメータである、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
細胞分化の検討がアルカリホスファターゼアッセイ法、カルシウムアッセイ法、総DNA調製アッセイ法、またはそれらの組み合わせの実施を含む、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
15-リポキシゲナーゼの阻害剤とヒト間葉幹細胞を接触させる工程、および骨形成細胞への細胞分化を調べる工程を含む、骨塩量を増加させる化合物を同定する方法。
【請求項３７】
細胞分化の検討がアルカリホスファターゼアッセイ法、カルシウムアッセイ法、総DNA調製アッセイ法、またはそれらの組み合わせの実施を含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
ヒト17番染色体における多型を検出する工程を含み、その多型が骨減少に対する素因の指標である、患者における骨減少に対する素因を診断する方法。
【請求項３９】
検出が遺伝子型同定を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子型同定がマイクロサテライトマーカーまたは1種類もしくは数種類の一塩基多型からなる、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
患者における15-リポキシゲナーゼレベルを測定する工程を含む、請求項1〜28または請求項3〜46のいずれか一項記載の使用および方法の有効性をモニターする方法。
【請求項４２】
患者の15-リポキシゲナーゼ遺伝子における多型の検出を含む、患者における骨減少に対する素因を診断する方法。
【請求項４３】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を含む、ヒトにおける間葉幹細胞の分化を促進するための薬剤の製造のための15-リポキシゲナーゼ阻害剤の使用。
【請求項４４】
ヒトにおいて骨芽細胞を増加させるために15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量をヒトに投与する工程を含む、ヒトにおいて間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を促進する方法。
【請求項４５】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤のIC50が1μM未満である、請求項43記載の使用。
【請求項４６】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤のIC50が1μM未満である、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
骨減少を防ぐための治療上活性物質としての用途のための15-リポキシゲナーゼ阻害剤。
【請求項４８】
請求項29〜41のいずれか一項記載の方法により同定される化合物。
【請求項４９】
請求項41または42記載の化合物および担体を含む、特に骨減少予防のための薬学的組成物。
【請求項５０】
骨減少に関連する15-リポキシゲナーゼ遺伝子における多型を検出するための少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを含む、骨減少に対する素因を診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に骨減少の治療および予防における15-リポキシゲナーゼ阻害剤およびその使用に関する。詳細には、本発明は骨減少の低減および／または正味の骨形成の増加のための15-リポキシゲナーゼ阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポキシゲナーゼは植物および動物において発見された非ヘム鉄を含む酵素であり、脂質およびリポタンパク質などのある種の多価不飽和脂肪酸の酸化を触媒する。複数の異なるリポキシゲナーゼ酵素が知られており、それぞれの酵素は特徴的な酸化作用を持つ。哺乳動物のリポキシゲナーゼは酸化されるアラキドン酸の位置によって命名される。5-リポキシゲナーゼ酵素はアラキドン酸を5-ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸（5-HPETE）に転換する。これは、5-ヒドロキシエイコサテトラエン酸（5-HETE）およびロイコトリエン（LT）を生成する代謝経路の第一段階である。同様に、12-リポキシゲナーゼおよび15-リポキシゲナーゼは、それぞれ、アラキドン酸を12-HPETEおよび15-HPETEに転換する。12-HPETEの生化学的還元によって12-HETEを生じ、15-HETEはリポキシンとして知られる一連の化合物の前駆物質である。
【０００３】
リポキシゲナーゼ活性の産物には様々な生物学的作用が関連し、多くは調節物質として各種疾患状態に関与する。C4およびD4のLTはヒト気管支平滑筋の強力な収縮物質であり、関節リウマチ患者の滑液中で発見されたLTB4および5-HETEは多型核白血球などの炎症性細胞に対する強力な走化因子であり（GreenおよびLambeth、Tetrahedron, 39,1687 (1983)）、12-HETEは乾癬患者の表皮組織中に高レベルで認められている。また、リポキシンは好中球からのリソソーム酵素およびスーパーオキシドイオンの放出を刺激することが示されている。このように、リポキシゲナーゼ酵素は、喘息、アレルギー、関節炎、乾癬および炎症の調節物質の生合成において重要な役割を担い、これらの酵素の阻害剤はこれらの疾患状態に関与する生化学的経路を遮断する。
【０００４】
ヒト15-リポキシゲナーゼ（15-LO）は、アラキドン酸からの15-S-ヒドロキシエイコサテトラエン酸（15-S-HETE）の生成を触媒する（KuhnおよびBorngraber、Lipoxygenases and Their Metabolites, Plenum Press, New York, (1999)）。マウスの場合、15-S-HETEの合成は12/15-リポキシゲナーゼ（Alox15）によって行われ、この酵素はヒト15-LOのマウス相同体である。マウス12/15-LOはアラキドン酸を3：1の割合で12(S)-ヒドロキシエイコサテトラエン酸および15-S-HETEに転換し、さらにリノール酸を13-ヒドロキシオクタデカジエン酸（13-HODE）に転換することができる。
【０００５】
15-リポキシゲナーゼは、これまでに、アテローム性動脈硬化症（Haratsら、Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 2100-2105, (2000)）、喘息（Shannonら、Am. Rev. Respir. Dis., 147,1024-1028, (1993)）、癌（Shureiqiら、JNCI, 92,1136-1142, (2000)）、および糸球体腎炎（MonteroおよびBadr、Exp. Neph., 8,14-19 (2000)）を含む複数の疾患の病原に関与してきた。フェノール、ヒドロキサム酸およびアセチレン性脂肪酸を含む多くの化合物が15-リポキシゲナーゼを阻害することが確認されている（KuhnおよびBorngraber、Lipoxygenases and Their Metabolites, Plenum Press, New York, (1999)において概説される）。これらの物質の阻害活性スペクトルは様々である。例えば、ノルジヒドログアイアレチン酸は5-リポキシゲナーゼおよび15-リポキシゲナーゼの阻害剤であることが示されており、ナフチルヒドロキサム酸は5-リポキシゲナーゼ、12-リポキシゲナーゼおよび15-リポキシゲナーゼを阻害することが示されており（米国特許第4,605,669号）、またベンゾフルオレン15-リポキシゲナーゼ阻害剤であるPD146176は比較的、15-リポキシゲナーゼ酵素に対して特異的であることが報告されている（Sendobryら、Br. J. Pharm., 120,1199-1206, (1997)）。15-リポキシゲナーゼがアテローム性動脈硬化症に関与することを示す証拠は、Alox15の標的欠失（targeted deletion）を有するマウス（Alox15-/-)を用いた研究から得られている。先ず、これらのAlox15ノックアウトマウスが5-LO活性の亢進を含む軽微な表現型の相違を持つことが示された（SunおよびFunk、J. Biol. Chem. , 271,24055-24062, (1996)）。しかし、apoE欠損（apoE-/-）アテローム性動脈硬化症感受性マウスでは、Alox15の破壊によりアテローム動脈硬化性病変が著しく減少した（Cyrusら、J. Clin Invest., 103,1597-1604, (1999)）。
【０００６】
5-LOは複数の疾患の病原に関与しているが、マウスまたはヒトの15-リポキシゲナーゼの生物学的機能は確実には決定されておらず、15-リポキシゲナーゼ阻害剤のヒトでの臨床用途も確立されていない。特に、15-リポキシゲナーゼ阻害剤のヒトの骨粗鬆症および／または骨関節炎の治療のための有用性はまだ発見されていない。
【０００７】
骨粗鬆症は成長した骨の骨塩量の減少によって引き起こされて、わずかな外傷での骨折に至る。この疾患は患者数が多く、甚大な経済的影響を及ぼす。最も一般的な骨折は、椎骨、遠位橈骨および股関節に発生する。65歳よりも高齢の女性集団の推定約1/3が骨粗鬆症を一因とする椎骨骨折を起こす。さらに、超高齢者では女性の約3人に1人、男性の約6人に1人が股関節部骨折を起こす可能性が高い。
【０００８】
骨減少には異なる2つの段階が確認されている。一つは年齢に関連するゆっくりとしたプロセスであり、男女双方に発生して、35歳前後から生じる。この段階の速度は男女でほぼ等しく、皮質骨および海綿質骨（cancellous bone）（海綿状骨（spongy bone）または格子状骨（lattice like bone））のほぼ同量が減少する。皮質骨は体肢骨格に多く、海綿質骨は体軸骨格、特に椎骨ならびに長骨の末端に集中している。年齢に関連する骨減少によって引き起こされる骨粗鬆症はII型骨粗鬆症として知られている。
【０００９】
もう一方のタイプの骨減少は早められ、閉経後の女性に見られるタイプであり、かつエストロゲンの欠乏によって引き起こされる。この段階は、海綿質骨の不均衡な減少に至る。エストロゲンの欠乏を原因とする骨粗鬆症はI型骨粗鬆症として知られている。I型骨粗鬆症の主な臨床像は、椎骨、股関節および前腕の骨折である。これらの臨床像の骨格部位は多量の小柱を含む。I型骨粗鬆症では、通常、骨の代謝回転が速い。骨吸収は亢進するが、代償性の骨形成は不十分である。骨粗鬆症は、コルチコステロイドの使用、不動期間または長期の床上安静、アルコール症、糖尿病、性腺毒性化学療法、高プロラクチン血症、神経性無食欲症、原発性無月経および続発性無月経、移植免疫抑制、および卵巣摘除にも関連している。
【００１０】
骨粗鬆症において骨が減少するメカニズムは、骨格が自己再生するプロセスの不均衡を伴うと考えられている。このプロセスは骨リモデリングと呼ばれている。これは一連の独立した活性ポケットにおいて生じる。これらのポケットは、所与の骨表面にある骨マトリックス内に骨吸収部位として自然発生的に現れる。破骨細胞（骨破壊または吸収細胞）は、ほぼ一定の大きさの骨の一部の吸収を司る。この吸収プロセスに続いて骨芽細胞（骨形成細胞）が出現し、次に破骨細胞によって残された空洞に新しい骨が補充される。
【００１１】
健康な成人の場合、破骨細胞および骨芽細胞は骨形成および骨吸収が均衡するように機能する。しかし、骨粗鬆症では骨リモデリングプロセスの不均衡が生じて、その結果、骨が減少よりも遅い速度で補充される。この不均衡は大半のヒトにおいて加齢に伴ってある程度は発生するが、閉経後の骨粗鬆症、卵巣摘出術後、またはコルチコステロイドもしくは免疫抑制剤の使用に起因するような医原性状態の場合は、より重度であり、しかもより低い年齢で発生する。
【００１２】
骨粗鬆症患者の骨量を増加させるために、アンドロゲン、フッ化塩、ならびに副甲状腺ホルモンおよび改良型副甲状腺ホルモンの投与を含む様々なアプローチが示唆されている。ビスホスホネート、カルシトニン、カルシウム、1,25-ジヒドロキシビタミンD3、および／またはエストロゲンの単独投与または併用投与が既存の骨量の維持に有用である可能性があることも示唆されている。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、15-リポキシゲナーゼの阻害剤が正味の骨形成を亢進して、および／または骨癒着を促進し、ならびに骨折治癒を促進することができるという発見に基づく。これらの物質は、単独または骨吸収を阻害および／もしくは骨形成を促進する付加的物質、特にアナボリック物質と併用して投与することができる。
【００１４】
従って、一つの態様において、本発明は患者における骨減少を低減するための方法を目的とする。この方法は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤の薬学的に有効な量を患者に投与する工程を含む。
【００１５】
もう一つの態様において、本発明は骨塩量を増加させるための方法を目的とし、薬学的に許容される15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効な量を患者に投与する工程を含む。
【００１６】
もう一つの態様において、本発明は患者における骨減少の素因を診断する方法を対象とし、この方法はヒト17番染色体の多型の検出、特に15-リポキシゲナーゼ遺伝子における多型の検出を含む。
【００１７】
さらにもう一つの態様において、本発明は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤をヒト間葉幹細胞と接触させて骨形成に関与する細胞への細胞分化を調べることによって、骨減少の低減または骨塩量の増加に関して化合物をスクリーニングする方法を対象とする。
【００１８】
本発明のこれらの局面およびその他の局面は、次の詳細な説明および添付する図の参照によって明らかとなる。さらに、本明細書には一部の手順または組成物をより詳細に説明する様々な参照が引用されており、従って、それらの全体を参照として組み入れる。
【００１９】
本発明の実施では、特記する場合を除いて、当技術分野におけるタンパク質化学、生化学、組換えDNA手法および薬学の一般的方法が用いられる。これらの手法については、文献中で詳細に説明されている。例えば、 T. E. Creighton、Proteins : Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, 1993)；A. L. Lehninger、Biochemistry (Worth Publishers, Inc.、最新版)；Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual (第2版、1989)；Methods In Enzymology (S. ColowickおよびN. Kaplan（編）、Academic Press, Inc.) ；Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)；CareyおよびSundberg、Advanced Organic Chemistry 第3版 (Plenum Press)、A巻およびB巻、(1992)を参照されたい。
【００２０】
前記または後記を問わず、すべての刊行物、特許および特許出願は、参照としてその全体が本明細書に組み入れられる。
【００２１】
本発明の説明では、次の用語が用いられており、下記に示すように定義されることを意味する。
【００２２】
「骨減少」は、患者において骨が期待よりも少なくなる骨形成と骨吸収の割合の不均衡を意味する。骨減少は、骨粗鬆症、骨切り術、歯周炎、または人工装具のがたつきから生じる可能性がある。また、骨減少は、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、甲状腺機能亢進症誘発性骨粗鬆症、運動抑制誘発性骨粗鬆症、ヘパリン誘発性骨粗鬆症または免疫抑制誘発性骨粗鬆症を含む二次的骨粗鬆症に起因する可能性もある。骨減少は、例えば、以下に記載する骨塩量測定を用いてモニターすることができる。
【００２３】
「有効量」または「薬学的に有効な量」という用語は、無毒性であるが、所望の生物学的結果を提供するために十分な物質の量を意味する。その結果は、疾患の徴候、症状もしくは病因の軽減および／もしくは緩和、または生物学的な系のその他の任意の所望の変化とすることができる。例えば、治療目的の使用における「有効量」は、骨折修復における治癒速度；骨粗鬆症における骨減少の回復；軟骨の欠損または障害の回復；骨粗鬆症の発生の予防または遅延；骨折による偽関節および伸延骨生成における骨形成の刺激および／または亢進；人工装具内への骨成長の増加および／または促進；ならびに歯欠損の修復の臨床的に顕著な増大を提供するために本明細書で必要とされる活性化合物を含む組成物の量である。個々の任意の症例における適切な「有効」量は、当業者は日常的な実験から求めることができる。
【００２４】
「骨癒着の亢進」は、本発明の15-リポキシゲナーゼ阻害剤を投与された患者における骨蓄積が15-リポキシゲナーゼ阻害剤を投与されていない同等患者の骨蓄積を上回ることを意味する。このような骨癒着の亢進は、本明細書では一般的に骨塩量（BMD）を測定することによって調べられる。例えば、骨癒着は卵巣切除したマウス、およびイヌなどのような動物モデルを用いて調べることができる。動物に被験化合物を投与して、四肢骨格および／または体軸骨格の骨、特に椎骨を含む脊椎、並びに大腿骨のような長骨の末端、橈骨中央部および橈骨遠位部などのI型またはII型骨粗鬆症において通常減少する骨の骨塩量（BMD）を測定する。当技術分野では、BMDを測定するための複数の方法が知られている。例えば、BMD測定は二重エネルギーX線吸収測定法または定量的コンピュータ断層撮影法などを用いて実施することができる。（実施例を参照されたい。）同様に、骨形成の亢進は当技術分野において周知の方法を用いて調べることができる。例えば、骨形成速度（BFR）の動的測定は、定量的デジタル化形態計測法を用いて腰椎および遠位大腿骨の骨幹端から得られるテトラサイクリン標識海綿質骨について実施することができる（例えば、Ling ら、Endocrinology (1999) 140: 5780-5788を参照されたい）。または、アルカリホスファターゼ活性および血清中オステオカルシン濃度などの骨形成マーカーを測定して、骨形成の亢進が生じているかどうかを間接的に調べることができる（Looker ら、Osteoporosis International (2000) 11 (6): 467-480を参照されたい）。
【００２５】
「骨形成の亢進」は、本発明の15-リポキシゲナーゼ阻害剤を投与された患者における骨形成の量が15-リポキシゲナーゼ阻害剤を投与されていない患者の骨形成速度を上回ることを意味する。このような骨形成の亢進は、本明細書では、上記のように、その他の骨形成マーカーに加えて定量的デジタル化形態計測法などを用いて測定される。
【００２６】
「15-リポキシゲナーゼの阻害剤」は、15-リポキシゲナーゼを阻害し、IC50が1μM未満であり、好ましくは100nM未満である化合物を意味する。IC50は、標準的な方法によって測定することができる。一つの同定の方法は、推定の阻害剤を15-リポキシゲナーゼと共に約10分間、プレインキュベートした後、基質であるリノール酸を加えてさらに10分間インキュベートする比色分析である。生成物である13-HPODEは、pH 5においてヘミンの存在下で、ヒドロペルオキシル化された脂質の還元とN-ベンゾイル-ロイコメチレンブルーの酸化を連結させることによって定量する。酸化メチレンブルーの吸光度は15-リポキシゲナーゼによって生成する13-HPODEの量に直接比例し、阻害剤を加えた場合および加えない場合について測定することができる。これは、「A Spectrophotometric Microtiter−Based Assay for the Detection of Hydroperoxy Derivatives of Linoleic Acid」、Analytical Biochemistry、201、375-380 (1992)；Bruce J. Auerbach、John S. KielyおよびJoseph A. Cornicelliに詳細に記載されているエンドポイントアッセイ法である。その他のアッセイ法は、234nmにおける抱合型ジエンの生成を測定することによって分光測光法により最初の酵素反応速度を測定するアッセイ法を含む。
【００２７】
本明細書で用いられるように、「治療する」または「治療」という用語は互換的に用いられて、骨減少症状の発症の延期、および／または発症するもしくは発症することが予想されるこのような症状の程度の軽減を指すことを意味する。これらの用語は、付加的症状の予防、症状の基礎代謝原因の緩和もしくは予防、および／または骨成長の促進をさらに含む。
【００２８】
「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という用語は生物学的またはその他の点で有害でない物質を意味し、即ち、その物質は何らかの望ましくない生物学的作用を惹起したり、またはその物質が含まれる組成物のいずれかの成分と有害な様式で相互作用を起こしたりすることなく個体に投与することが可能である。
【００２９】
「生理学的なpH」または「生理学的範囲のpH」は約7.2〜8.0までの範囲のpHを意味し、より一般的には約7.2〜7.6までの範囲のpHを意味する。
【００３０】
本明細書で用いられるように、「患者」という用語は哺乳動物および非哺乳動物を含む。哺乳動物の例としては、ヒト、チンパンジーなどのヒト以外の霊長類、ならびにその他の類人猿およびサル；ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの畜産動物；ウサギ、イヌおよびネコなどの家畜；ラット、マウスおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などが含まれるが、これらに限定されるものではない。非哺乳動物の例には、鳥、魚などが含まれるが、これらに限定されるものではない。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。
【００３１】
本明細書で用いられるように、「多型」は、集団内における2種類またはそれ以上の遺伝学的に決定された代替配列または対立遺伝子の出現を意味する。多型マーカーまたは多型部位は、差違を生じる遺伝子座である。好ましいマーカーは少なくとも2つの対立遺伝子を持ち、それぞれの対立遺伝子は1％よりも高い頻度で出現し、より好ましくは特定の集団の10％または20％よりも高い頻度で出現する。多型は、1個または複数個の塩基の変化、挿入、反復または欠失を含んでもよい。多型遺伝子座は1塩基対と同じくらい小さくてもよい。多型マーカーは、制限酵素断片長多型、タンデム反復回数（VNTR）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復配列、トリヌクレオチド反復配列、テトラヌクレオチド反復配列、単純反復配列、および挿入因子を含む。
【００３２】
一塩基多型（SNP）は1個のヌクレオチドによって占められる多型部位に生じ、これは対立遺伝子配列間の変異部位である。この部位は、通常、前後に対立遺伝子の高度な保存配列（例えば、集団の1/100未満または1/1000未満のメンバーにおいて変異する配列）を持つ。一塩基多型は、通常、1個のヌクレオチドが多型部位のもう1つのヌクレオチドと置換することによって生じる。塩基転位は、1個のプリンともう1個のプリン、または1個のピリミジンともう1個のピリミジンの置換である。塩基転換は、プリンとピリミジンまたはその逆の置換である。一塩基多型は、基準対立遺伝子からのヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入によっても生じることができる。
【００３３】
本明細書で用いられるように、「前駆細胞」という用語は十分に分化していないまたは分化経路に委ねられていない細胞、および一般にマーカーを発現しない、または十分に分化した成熟細胞として機能しない細胞を示す。
【００３４】
本明細書で用いられるように、「間葉細胞」または「間葉幹細胞」という用語は、多数回にわたって分裂することのできる多能性前駆細胞を示し、その子孫細胞は軟骨、骨、腱、靱帯、骨髄支質および結合組織を含む骨格組織を生じる（A. Caplan、J. Orthop. Res. (1991) 9: 641-50を参照されたい）。
【００３５】
本明細書で用いられるように、「骨形成原細胞」という用語は骨芽細胞および骨芽細胞前駆細胞を含む。
【００３６】
本明細書で用いられるように、「量的形質遺伝子座（Quantitative Trait Locus）」（QTL）は骨塩量などの表現型の尺度を示し、連続的に分布して同義遺伝子によって調べることができる。QTLは、対立遺伝子が量的形質に影響を及ぼす染色体上の位置である。
【００３７】
本発明で用いられる化合物は、15-リポキシゲナーゼの活性を阻害するまたは低下させる化合物である。この状況において、酵素活性の阻害および低下は、酵素、細胞、または被験者が被験化合物の処理を受けない対照実験に対して、活性測定レベルが低いことを意味する。特定の態様において、測定される活性の阻害または低下は、少なくとも10％の低下または阻害である。当業者は、測定される活性の少なくとも20％、50％、75％、90％もしくは100％、または10％から100％の間の任意の整数の低下または阻害が特定の出願において好ましい場合があることを理解する。一般に、本発明で用いられる15-リポキシゲナーゼ阻害剤のIC50は1μM未満であり、好ましくは100nM未満である。
【００３８】
本発明は、一部、15-リポキシゲナーゼが骨量の重要な調節物質であるという発見に基づく。特に、マウスにおける100個のマイクロサテライトマーカーに関するゲノムスキャンにより、1番、2番、4番および11番染色体上にある骨減少性疾患感受性遺伝子座が決定された。遺伝子発現における差違、特に11番染色体にコードされる遺伝子における遺伝子発現の差違は15-リポキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現における顕著な差違を明示し、これによって、15-リポキシゲナーゼの発現と骨塩量の低下が関連付けられた。
【００３９】
最大骨量は、骨粗鬆症による骨折リスクの重要な決定因子である。家族および双生児を対象とした試験は、遺伝要因が骨塩量（BMD）を調節することを示している（StewartおよびRalston、J. Endocr., (2000) 166: 235-245にて概説される）。本発明者らは、BMDを制御する遺伝子座を決定するためにマウス遺伝モデルを使用した。骨塩量を調節するゲノムの領域の特定には、2段階法を用いた。先ず、計算法およびマイクロサテライトマーカーを用いて動物の一塩基多型（SNP）データベースをスキャンして、骨格量の獲得および維持に寄与する染色体領域を予測した（実施例1）。次に、動物モデルを用いて骨格量の獲得および維持に寄与する遺伝子の突然変異を同定および確認して（実施例2）、15-リポキシゲナーゼ遺伝子の破壊がBMDの増加を惹起することを示し（実施例4）、これによって15-リポキシゲナーゼが骨量の調節に関与する遺伝子であることが確認された。
【００４０】
15-リポキシゲナーゼ活性を阻害して骨吸収を予防または骨形成を促進する化合物は、骨粗鬆症を治療する取り組みに重要な利点を提供する。15-リポキシゲナーゼ活性を阻害する化合物は、破骨細胞の骨吸収の阻害または骨芽細胞の分化の刺激および新しい骨形成の促進によって、骨粗鬆症または骨関節炎を治療するための方法において用いることができる。実施例3は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤のインビトロにおけるヒト間葉幹細胞の骨芽細胞への分化促進能を示す。実施例4は、インビボにおいて15-リポキシゲナーゼ遺伝子の完全破壊によってBMDが増加することを示す。実施例5は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤のインビボモデルにおける骨形成促進能を示す。
【００４１】
本発明によると、15-リポキシゲナーゼの阻害剤は、15-リポキシゲナーゼの阻害剤の有効量を含む哺乳動物患者における骨減少を低減するための薬剤の製造に使用することができる。従って、本発明は、哺乳動物患者に15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量の投与を含み、哺乳動物患者における骨減少を低減するための方法を提供する。好ましくは、骨減少は骨粗鬆症、骨関節炎、骨パジェット病、または歯周病に関連する。より好ましくは、骨減少は骨粗鬆症に関連する。
【００４２】
加えて、本発明によると、15-リポキシゲナーゼの阻害剤は、15-リポキシゲナーゼの阻害剤の有効量を含む哺乳動物における骨塩量を増加させるための薬剤の製造に使用することができる。従って、本発明は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することによって哺乳動物の骨塩量を増加させる方法も提供する。
【００４３】
本発明によると、15-リポキシゲナーゼの阻害剤は、15-リポキシゲナーゼの阻害剤の有効量を含む哺乳動物における骨粗鬆症を治療するための薬剤の製造に使用することができる。従って、本発明は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することによって哺乳動物の骨粗鬆症を治療する方法を提供する。
【００４４】
さらに、15-リポキシゲナーゼの阻害剤は、ヒトにおける骨芽細胞を増加させるための15-リポキシゲナーゼの阻害剤の有効量を含む、ヒトにおける間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を促進するための薬剤の製造に使用することができる。従って、本発明は、ヒトにおいて骨芽細胞を増加させるために15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量のヒトへの投与を含む、ヒトにおける間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を促進する方法を提供する。好ましくは、15-リポキシゲナーゼの阻害剤はIC50が1μM未満である。
【００４５】
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の投与は、関節および偽関節の骨折を含めて、骨折および骨切り術の治癒に使用することができる。本発明の方法によって治療可能な骨折の種類は、例えば、股関節、大腿骨頸部、手首、椎骨、脊椎、肋骨、胸骨、喉頭および気管、橈骨／尺骨、脛骨、膝蓋骨、鎖骨、骨盤骨、上腕骨、下肢、手指および足指、顔ならびに足首の骨折などの外傷性および骨粗鬆症性の骨折を含む。状況が異なれば偽関節として残る骨折における関節の治癒および癒合増進の速度はともに、本明細書に開示される方法によって促進することができる。骨折のリスクがあると同定された患者の予防的治療も、患者の骨折リスクを低減することができる。
【００４６】
従って、15-リポキシゲナーゼの阻害剤は、15-リポキシゲナーゼの阻害剤の有効量を含む哺乳動物における骨折の発生率を低下させるための薬剤の製造に使用することができる。従って、本発明は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することによって哺乳動物における骨折の発生率を低下させる方法を提供する。
【００４７】
さらに、15-リポキシゲナーゼの阻害剤は、15-リポキシゲナーゼの阻害剤の有効量を含む哺乳動物における骨折を治療するための薬剤の製造に使用することができる。従って、本発明は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤の有効量を哺乳動物に投与することによって哺乳動物における骨折を治療する方法を提供する。
【００４８】
好ましくは、前記の方法および用途の哺乳動物はヒトである。より好ましくは、前記の15-リポキシゲナーゼ阻害剤は、IC50が1μM未満である。
【００４９】
本発明の方法を用いた用途を見出すことのできる15-リポキシゲナーゼの複数の阻害剤が知られている。これらの阻害剤は、合成有機分子、植物抽出物、およびその他の天然物質、ならびに15-リポキシゲナーゼに対する抗体を含む。典型的な非限定的な例が
2005531498.tif 000002
に記載されている。 さらに、15-リポキシゲナーゼの阻害剤であるConnerらに対する米国特許第6,268,387号のチオ尿素およびベンズアミド化合物（例えば、3-アミノ-N-（3,4-ジクロロフェニル）-4-メトキシ-ベンズアミド（化合物3）に代表される）、ならびに2-フェニル-ベンゾ［d］イソセレナゾール-3-オン（エブセレン）、6,11-ジヒドロ-5-チア-11-アザベンゾ［a］フルオリン（本明細書では化合物2とする）、および3-（2-オクト-1-イニル-フェニル）-アクリル酸（化合物4）に代表されるフェニルアセチレン系化合物も本明細書に記載する方法において有用である。化合物6、［［［5-(5,6-ジフルオロ-1H-インドール-2-イル）-2-メトキシフェニル］アミノ］スルホニル］-カルバミン酸-イソブチルエステルを含む国際公開公報第01/96298号（参照として組み入れられる）に開示される化合物も有用である。
【００５０】
その他の15-リポキシゲナーゼ阻害剤は、以下に示す化合物を含む；
1）
2005531498.tif 000003
第222回 National Meeting of the American Chemical Society、Chicago、Illinois、USA、2001年8月26〜30日、ポスター、MEDI 270において発表された。
2）PD 148104
2005531498.tif 000004
第218回ACS（New Orleans）、1999年、MEDI 200にて発表された。
3）Parke Davis（現Pfizer）のPD146176
4）国際公開公報第92/1682号に記載されるA 78773（Abbott）
5）QA-208-199（Novartis）
2005531498.tif 000005
第6回Int Conf Prostaglandins (Florence)、1986年、328にて発表された。
【００５１】
本発明の関連する局面は、骨形成を増加させるための15-リポキシゲナーゼ阻害剤と、ビスホスホネート、エストロゲン、SERMS（選択的エストロゲン受容体調節物質）、カルシトニンなどのその他の有効物質またはアナボリック療法との併用療法に関する。ビスホスホネートの例には、アレンドロネート、イバンドロネート、パミドロネート、エチドロネートおよびリセドロネートが含まれる。SERMSの例には、ラロキシフェン、ジヒドロラロキシフェンおよびラソフォキシフェンが含まれる。カルシトニンには、ヒトおよびサケのカルシトニンが含まれる。アナボリック物質には、例えばhPTH（1-34）、PTH（1-84）などの副甲状腺ホルモン（PTH）、ならびに副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrP）およびそれらの類似体が含まれる。PTHrPの特定の類似体については、「Mono- and Bicyclic Analogs of Parathyroid Hormone-Related Protein. 1. Synthesis and Biological Studies」、Michael Chorevら、Biochemistry、36: 3293- 3299 (1997)、ならびに「Cyclic analogs of PTH and PTHrP」、国際公開公報第96/40193号、ならびに米国特許第No.5,589,452号および国際公開公報第97/07815号に記載されている。その他の活性物質は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤と同時または前後に投与することが可能であり、異なる送達方法によって投与することもできる。好ましくは、先ず、15-リポキシゲナーゼ阻害剤を投与する。この投与期間は任意の長さとすることができるが、一般的には6〜24ヵ月の範囲である。次に、この投与に続いてビスホスホネート、SERM、カルシトニンまたはホルモン補充療法のような吸収抑制剤を投与する。
【００５２】
このように、好ましくは、付加的活性物質を含む15-リポキシゲナーゼの阻害剤は前記のように使用することができる。従って、前記の方法は、好ましくは付加的活性物質を含む。より好ましくは、この用途または方法に含まれる前記活性物質は骨からのカルシウム再吸収の調節に有効である。より好ましくは、前記活性物質は、エストロゲン、カルシトニン、ビスホスホネートまたはIGFからなる群より選択される。
【００５３】
好ましい態様において、前記の用途および方法についての15-リポキシゲナーゼ阻害剤は、合成有機分子、天然物質、および15-リポキシゲナーゼに対する抗体からなる群より選択される。より好ましい態様において、15-リポキシゲナーゼ阻害剤は、3-（2-ノン-1-イニルフェニル）-プロピオン酸、6,11-ジヒドロ-5-チア-11-アザ-ベンゾ［a］フルオレン、3-アミノ-N-（3,4-ジクロロフェニル）-4-メトキシベンズアミド、トランス-3-（2-オクト-1-イニル-フェニル）-アクリル酸、および［［［5-(5,6-ジフルオロ-1H-インドール-2-イル）-2-メトキシフェニル］アミノ］スルホニル］-カルバミン酸-イソブチルエステルからなる群より選択される。
【００５４】
一つの態様において、本発明の方法は、15-リポキシゲナーゼをコードするゲノムDNAまたはmRNA分子のいずれかの配列と特異的に結合して、15-リポキシゲナーゼmRNAの転写または翻訳を阻止することのできる配列を持つ治療上有効な量のアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与を含む。「アンチセンス」は、一定の核酸配列の「センス」鎖に相補的な核酸配列を含む組成物を意味する。一旦、細胞内に導入されると、相補的ヌクレオチドは細胞によって生成される内因性配列と結合して、二重鎖を形成し転写または翻訳を遮断する。例えば、 Agrawal, S.（編）、(1996) Antisense Therapeutics、Humana Press Inc.、Totawa NJ；Alamaら、(1997) Pharmacol. Res. 36: 171-178；Crooke, S. T. (1997) Adv. Pharmacol. 40: 1-49；およびLavroskyら、(1997) Biochem. Mol. Med. 62(1) : 11-22を参照されたい。アンチセンス配列は、DNA、RNA、または擬態核酸模倣体もしくは核酸類似体を含む任意の核酸物質であることができる。例えば、 Rossiら、(1991) Antisense Res. Dev. 1: 285-288；Pardridgeら、(1995) Proc. Nat. Acad. Sci. 92: 5592-5596；NielsenおよびHaaima (1997) Chem. Soc. Rev. 96: 73-78；Leeら、(1998) Biochemistry 37: 900-1010を参照されたい。アンチセンス配列の送達は、組換え型ベクターを用いた細胞内送達を介するなどの様々な方法で行うことができる。
【００５５】
約15〜25個の核酸塩基からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、合成が容易であり、所望の阻害作用を示すことができるので、一般的には好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドの分子類似体もこの目的のために使用することが可能であり、安定性、分布、または薬学的生成物において有利な限定的な毒性などの付加的利点を持つことができる。さらに、鉄結合型エチレンジアミン四酢酸（EDTA-鉄）のような化学反応性の基はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合して、ハイブリダイゼーション部位においてRNAの切断を惹起することができる。インビトロにおける遺伝子の翻訳を阻害するアンチセンス法のこれらの用途およびその他の用途は、当技術分野において周知である。例えば、Marcus-Sakura (1988) Anal. Biochem. 172: 289を参照されたい。
【００５６】
多くの15-リポキシゲナーゼ阻害剤が本明細書において記載されて周知である一方で、その他の多くの阻害剤が本発明の方法において使用できることが理解されている。本明細書で記載される方法は、現在知られている15-リポキシゲナーゼ阻害剤および今後発見される阻害剤の使用を含むことを意図する。本明細書に記載されるアッセイ法および当業者の既知のアッセイ法によって、骨減少の予防または治療に有用なその他の15-リポキシゲナーゼ阻害剤を容易に同定および開発することが可能である。
【００５７】
実施例に示すように、11番染色体には遺伝的異常または対立遺伝子が認められ、この対立遺伝子の位置が15-リポキシゲナーゼの遺伝子に相当した。従って、15-リポキシゲナーゼの阻害または誘導は様々な状況での用途がある。15-リポキシゲナーゼを細胞内で阻害することによって、骨の代謝回転を低減し、それによって骨塩量および骨の質を高めることが可能である。このように、15-リポキシゲナーゼの阻害は、骨粗鬆症および骨関節炎において生じるような過度の骨吸収を治療または予防するための方法において使用することができる。
【００５８】
本発明の15-リポキシゲナーゼ阻害剤は、骨形成細胞もしくはそれらの前駆体の成長を刺激するため、またはインビトロもしくはエキソビボにおいて骨形成細胞前駆細胞の分化を誘発するために使用することもできる。より好ましくは、15-リポキシゲナーゼ阻害剤は骨髄間葉細胞を含む細胞集団を刺激して、それによってその細胞集団の骨原性細胞数を増加させるために有用である。好ましい方法において、造血細胞は15-リポキシゲナーゼ阻害剤の投与前または投与後に細胞集団から採取される。このような方法の実施によって、骨原性細胞を増幅することが可能である。増幅した骨原性細胞は、それらを必要とする脊椎動物患者に注入（または再注入）することができる。例えば、患者自身の間葉幹細胞をエキソビボにおいて本発明の化合物に曝露することが可能であり、得られる骨原性細胞を患者の所望の部位に注入または誘導することができ、この場合、この骨原性細胞は免疫拒否反応を起こすことなくさらに増殖および／または分化することができる。または、15-リポキシゲナーゼ阻害剤に曝露される細胞集団は、不死化されたヒト胎児骨芽細胞または骨原性細胞でもよい。このような細胞が脊椎動物患者に注入または移植されると、これらの非自己細胞の免疫保護、または移植および骨もしくは軟骨の修復を促進するためのレシピエントの（好ましくは局所的な）免疫抑制に有利な場合がある。
【００５９】
治療の有効性は、患者における15-リポキシゲナーゼレベルの測定を含む、患者における前記の用途および方法の効果をモニターする方法によって追跡することが可能であり、この方法も本発明によって提供される。
【００６０】
骨減少を予防および／または骨形成を促進することもできる一連の15-リポキシゲナーゼ阻害剤類を同定するための複数の方法を用いることができる。15-リポキシゲナーゼ活性を阻害する化合物を同定するために用いられる一つの方法では、細胞、組織、または好ましくは15-リポキシゲナーゼを含む細胞抽出物もしくはその他の調製物を、15-リポキシゲナーゼ活性と対立しない緩衝液中において被験化合物の複数の既知の濃度と接触させることを含む。被験化合物の各濃度における15-リポキシゲナーゼ活性のレベルは酵素生成の定量によって測定し、被験化合物のIC50（試料調製物に認められる活性がその初期値または対照値の二分の一まで低下することが確認される被験化合物の濃度）は標準的手法を用いて測定する。15-リポキシゲナーゼに対する本発明の化合物の阻害濃度を測定するためのその他の方法は当業者に周知であり、本明細書での開示に基づいて明らかとなるので使用することができる。15-リポキシゲナーゼ阻害剤の同定に用いることができる特異的なアッセイ法は、米国特許第 6,268,387B1号および第5,958,950号（ウサギ網状赤血球アッセイ法）ならびに米国特許第4,623,661号（RBL-1細胞における放射標識アラキドン酸）に記載される方法を含む。
【００６１】
例えば、アンタゴニストは、通常、リガンドが構造的に解明されると見つけることができる。現在、潜在的リガンド類似体の試験は、生理学的に反応性の細胞を用いた高度に自動化されたアッセイ方法が開発されると可能である。特に、新たなアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書に記載されるスクリーニング手法を用いることによって発見することができる。
【００６２】
もう一つの方法において、ケモカイン、その他のエフェクターもしくは類似体、または受容体の分子形状についての構造研究に基づく論理的薬剤設計を、三次構造が15-リポキシゲナーゼの活性部位の三次構造と相補的である同定化合物に対して用いることができる。これらの化合物は、分子力学計算法、分子動力学計算法、制約条件（constraint）がNMR分光法によって求められる条件付き分子動力学計算法、距離行列がNMR分光法によってある程度解明される距離幾何学（distance geometry）法、X線回折法、または中性子回折法を含む様々な手法によって調べることができる。これらのすべての手法の場合において、構造は、15-リポキシゲナーゼと相互作用を起こすことが知られている任意のリガンドの存在下または非存在下で調べることができる。
【００６３】
このようなコンピュータプログラムには、AMBER（University of California、San Franciscoから入手可能）、CHARMM（Chemistry at HARvard Molecular Mechanics、Harvard Universityから入手可能）、MM2、SYBYL（Trypos Inc.）、CHEMX（Chemical Design）、MACROMODEL、GRID（Molecular Discovery Ltd）、およびInsight II（Accelryl）が含まれるが、これらに限定されるものではない。このようなプログラムは、分離した、もしくは水分子などの溶媒分子によって取り巻かれた2つの分子間の化学的相互作用の検討に、または相互作用を起こしている分子の溶媒和効果を概算する計算を用いる際に有用であるとして検討されている。2つの分子の相対的配向は、マニュアルで、視認による観察で、または可能性のある多くの配向を作製するその他のコンピュータプログラムを用いることによって調べることができる。コンピュータプログラムの例にはDOCKおよびAutoDOCKが含まれるが、これらに限定されるものではない。各配向は、コンピュータプログラムを用いて相補性の度合いを調べることができる。このように、15-リポキシゲナーゼ阻害能を持つ新規化合物を設計することができる。
【００６４】
15-リポキシゲナーゼを阻害することのできる化合物を同定するためのもう一つの方法は、UV／VIS分光法、旋光分析法、CDもしくはORD分光法、IRもしくはラマン分光法、NMR分光法、蛍光分光法、HPLC、ゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、透析、屈折率測定、伝導測定、原子間力顕微鏡法、ポーラログラフィー、ジエレクトメトリー（dielectometry）、熱量測定、溶解度、EPRまたは質量分析のような手法の使用を含む。これらの方法の応用は直接的であることができ、この場合は化合物と15-リポキシゲナーゼとの相互作用が直接測定される。または、これらの方法の応用は間接的であることができ、この場合は有用な分光特性を持つ特定の物質が、例えば、置換または蛍光消光によって、その他の化合物の15-リポキシゲナーゼ結合能に関するプローブとして用いられる。
【００６５】
従って、本発明は、化合物と15-リポキシゲナーゼとの接触、およびその化合物が15-リポキシゲナーゼ活性を阻害するか否かについての検討を含む、骨塩量を増加させる化合物を同定するための方法を提供する。好ましくは、この方法は、化合物の骨形成に対する影響を実証する機能的なアッセイ法における化合物の検討をさらに含む。より好ましくは、機能的アッセイ法は化合物とヒト間葉幹細胞の接触および骨形成細胞への細胞分化の検討を含む。もう一つのより好ましい態様において、機能的アッセイ法は、化合物のヒト以外の動物への投与および骨形成指数の測定を含む。最も好ましい態様において、測定される指数は骨塩量である。もう一つの最も好ましい態様において、指数は骨の生体力学的パラメータである。
【００６６】
もう一つの最も好ましい態様において、機能的アッセイ法は化合物とヒト間葉幹細胞の接触および骨形成細胞への細胞分化の検討を含み、細胞分化の検討はアルカリホスファターゼアッセイ法、カルシウムアッセイ法、総DNA調製アッセイ法、またはそれらの組み合わせの実施を含む。
【００６７】
もう一つの態様において、本発明は、15-リポキシゲナーゼの阻害剤とヒト間葉幹細胞の接触および骨形成細胞への細胞分化の検討を含み、骨塩量を増加させる化合物を同定するための方法を提供する。好ましくは、細胞分化の検討はアルカリホスファターゼアッセイ法、カルシウムアッセイ法、総DNA調製アッセイ法、またはそれらの組み合わせの実施を含む。
【００６８】
このようにして同定または設計される15-リポキシゲナーゼ阻害剤は、続いて骨減少の防止および／または骨形成促進の能力について検査することができる。一つの態様において、上記のコンピュータを用いた方法が用いられる。もう一つの方法において、化合物は、例えばエストロゲン受容体、腫瘍壊死因子受容体、インテグリン受容体などのような骨減少の既知の標的を調節する能力について検査される。さらにもう一つの方法において、化合物は幹細胞を骨細胞に分化させる能力について検査される。
【００６９】
本明細書に記載される方法は、上記の分子、ならびに1種類または複数種類の薬学的に許容される担体および任意でその他の治療用成分および／または予防用成分を含む薬学的組成物を使用する。このような担体には、水、生理食塩液、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなどのような液体が含まれる。非流動性の製剤に適した担体も当業者に周知である。本発明の組成物には薬学的に許容される塩を使用することが可能であり、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などのような鉱酸塩；ならびに酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などのような有機酸の塩が含まれる。薬学的に許容される賦形剤および塩に関する詳細な解説については、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版（Easton、Pennsylvania: Mack Publishing Company、1990）に記載されている。
【００７０】
さらに、湿潤剤または乳化剤、生物学的緩衝物質、界面活性剤などの補助物質をこのような担体に加えることができる。生物学的緩衝物質は、薬学的に許容されて、かつ、所望のpH、即ち、生理学的に許容される範囲のpHの製剤を提供する実質的に任意の溶液とすることができる。緩衝液の例としては、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液、トリス緩衝生理食塩液、ハンクス緩衝生理食塩液などが含まれる。
【００７１】
意図する投与方法に応じて、薬学的組成物は例えば錠剤、坐剤、丸剤、カプセル、粉剤、液剤、懸濁剤、クリーム、軟膏、ローション剤などのような固形剤、半固形剤または液剤の形とすることが可能であり、好ましくは正確な用量の単回投与に適した単位剤形とすることが可能である。この組成物は薬学的に許容される担体と配合して特定の薬剤の有効量を含み、さらに、その他の薬学的物質、アジュバント、希釈剤、緩衝物質などを含むことができる。
【００７２】
固体組成物に関して、無毒性の一般的な固形担体には、例えばマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖、炭酸マグネシウムなどの薬学的等級品が含まれる。薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書に記載される活性化合物および任意選択の薬学的アジュバントを、例えば水、生理食塩液、デキストロース水溶液、グリセロール、エタノールなどのような賦形剤に溶解、分散させるなどして、それによって溶液または懸濁液を形成することによって調製することができる。所望するならば、投与すべき薬学的組成物は、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリル酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなどの湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの無毒性の補助物質も含むことができる。このような剤形を調製する実際の方法は当業者に周知であるか、または明らかとなる。例えば、上記において引用したRemington's Pharmaceutical Sciencesを参照されたい。
【００７３】
経口投与に関して、組成物は一般に錠剤、カプセル、ソフトカプセルの剤形をとり、または水性もしくは非水性の溶液、懸濁液もしくはシロップとすることができる。錠剤およびカプセルは好ましい経口剤形である。経口使用のための錠剤およびカプセルは、一般に、乳糖およびコーンスターチのような一般的に用いられる1種類または複数種類の担体を含む。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤も一般的に加えられる。液体懸濁剤を用いる場合は、活性物質は乳化剤および懸濁剤と配合することができる。所望ならば、香料、着色料および／または甘味料も加えることができる。本明細書において経口製剤に配合するためのその他の選択的成分には防腐剤、懸濁剤、および増粘剤などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
非経口製剤は、液体の溶液または懸濁液、注射前に液体への溶解もしくは懸濁に適した固形剤、またはエマルジョンの一般的な剤形として調製することができる。好ましくは、適切な担体、分散剤または湿潤剤、および懸濁剤を用いて当技術分野において既知の手法に従って、無菌の注入可能な懸濁液を製剤化する。無菌の注入可能な製剤は、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒中の注入可能な無菌の溶液または懸濁液とすることも可能である。使用することのできる許容可能な溶媒および溶媒は、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム液である。さらに、無菌の不揮発性油、脂肪酸エステルまたはポリオールも溶媒または懸濁媒として一般的に用いられる。さらに、非経口投与では、一定レベルの用量が維持されるような徐放性または持効性の系の使用を含むことができる。
【００７５】
または、本発明の薬学的組成物は直腸投与のための坐剤の形で投与することができる。これらは、物質を、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って直腸内で融解して薬剤を放出する適切な無刺激性の賦形剤と混合することによって調製することができる。このような材料には、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００７６】
本発明の薬学的組成物は、鼻腔エアロゾルまたは吸入により投与することもできる。このような組成物は薬学的製剤に関する当技術分野において周知の手法に従って調製され、ベンジルアルコールまたはその他の適切な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フッ化炭化水素もしくは窒素のような噴霧剤、および／またはその他の一般的な可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩液中の溶液として調製することができる。
【００７７】
局所薬剤送達のための好ましい製剤は軟膏およびクリームである。軟膏は、一般にワセリンまたはその他の石油誘導体を基剤とする半固体調製物である。特定の活性物質を含むクリームは、当技術分野において既知の通り、水中油型または油中水型の粘稠な液体または半固体のエマルジョンである。クリーム基剤は水で洗い流すことができ、油相、乳化剤および水相を含む。油相は「内」相と呼ばれることもあり、一般にワセリンおよびセチルアルコールまたはステアリルアルコールなどの脂肪アルコールからなる。水相は、必ずではないが通常は油相よりも容量が多く、一般に湿潤剤を含む。クリーム製剤の乳化剤は、一般に、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性または両性の界面活性剤である。当業者によって認められるように、使用すべき具体的な軟膏またはクリーム基剤は、至適な薬剤送達を提供する基剤である。その他の担体または溶媒と同じく、軟膏基剤は不活性、安定、無刺激性および無感作性でなければならない。
【００７８】
口腔内投与のための製剤は、錠剤、ロゼジン、およびゲルなどを含む。または、口腔内投与は当業者に周知の経粘膜送達系を用いて行うことができる。本発明の化合物は、一般的な経皮的薬剤送達系、即ち、物質が典型的には体表に貼付されるべき薬剤送達装置として用いられる薄層状の構造物内に含まれる経皮「パッチ」を用いて、皮膚組織または粘膜組織を介して送達することもできる。このような構造物において、薬剤組成物は典型的には上部の裏装相の下にある相、つまり「貯蔵器」に含まれる。この積層状装置は単一の貯蔵器を持つことができ、または多数の貯蔵器を持つことができる。一つの態様において、貯蔵器は、薬剤の送達時、この系を皮膚に貼付するために用いられる薬学的に許容される接触粘着物質の高分子マトリクスを含む。適切な皮膚接触粘着物質の例には、ポリエチレン、ポリシロキサン、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、およびポリウレタンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。または、薬剤含有貯蔵器および皮膚接触粘着剤は別々の異なる相として存在し、粘着剤は貯蔵器の下にあって、この場合、貯蔵器は上記のような高分子マトリクスとすることができる、または液体もしくはゲル貯蔵器であることができる、またはその他の形態とすることができる。この装置の上部表面として用いられるこれらの積層構造物の裏装相はこの積層構造の主要構成要素として機能し、装置に高い柔軟性を付与する。裏装相として選択される材料は、活性物質および含まれるその他のあらゆる材料に対して実質的に非浸透性でなければならない。
【００７９】
薬学的または治療上有効な量の組成物が患者に送達される。正確な有効量は患者によって異なり、また動物種、年齢、患者の体格および健康状態、治療される状態の特徴および程度、治療担当医師の助言、ならびに治療法もしくは投与のために選択される治療法の組み合わせに依存する。従って、所与の状況における有効量は日常的な経験によって決定することができる。本発明の目的に関して、治療用量は一般に少なくとも1回の投与において約0.05mg/kg〜約40mg/kg体重の範囲内であり、より好ましくは約0.5mg/kg〜約20mg/kgの範囲内である。大型哺乳動物の場合、指示される一日投与量は約1mgから100mgの1日1回または数回投与であり、より好ましくは約10mg〜50mgの範囲とすることができる。患者には問題となる疾患の徴候、症状または原因を軽減および／または緩和するために必要な投与を行うことが可能であり、または生物学的な系についてその他の何らかの所望の変更を行うことができる。
【００８０】
例えば15-リポキシゲナーゼアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するためのポリヌクレオチドの送達は、上記のいずれかの製剤を用いて、または担体のウイルスもしくは粒子と共に、またはこれを用いずに、組換え型発現ベクターを使用することによって達成することができる。このような方法は当技術分野において周知である。例えば、米国特許第6,214,804号、米国特許第6,147,055号、米国特許第5,703,055号、米国特許第5,589,466号、米国特許第5,580,859号；Slaterら、(1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102: 469-475を参照されたい。例えば、ポリヌクレオチド配列の送達は、レトロウイルスおよびアデノ関連ウイルスのベクターを含む様々なウイルスベクターを用いて達成することができる。例えば、Miller A. D. (1990) Blood 76: 271；ならびにUckertおよびWalther (1994) Pharmacol. Ther. 63: 323-347を参照されたい。アンチセンス遺伝子治療に使用することができるベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウイルスのようなRNAウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチド配列の標的細胞への送達に使用することのできるその他の遺伝子送達メカニズムには、コロイド分散系およびリポソームに誘導される系、人工ウイルスエンベロープ、および当業者が入手することのできるその他の系が含まれる。例えば、Rossi, J. J. (1995) Br. Med. Bull. 51: 217-225；Morrisら、(1997) Nucl. Acids Res. 25: 2730-2736；およびBoadoら、(1998) J. Pharm. Sci. 87: 1308-1315を参照されたい。例えば、送達系は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型のエマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む脂質を用いる系を使用することができる。
【００８１】
上記のように、薬学的製剤はカルシウム恒常性を有効に調節する1種類または複数種類の活性物質を含むことができる。付加的活性物質は、エストロゲン、カルシトニン、ビスホスホネート（例えば、アレンドロネート、レジドロネート、ゾレンドロネートおよびイバンドロネート）、ビタミンD3もしくはその類似体、アンドロゲン、フッ化塩、副甲状腺ホルモンもしくはその類似体、またはIGF、骨代謝に関与する自然発生性のホルモン調節因子の転写調節を変化させる物質、およびそれらの組み合わせであることが可能であるが、これらに限定されるものではない。この付加的活性物質は、本発明の15-リポキシゲナーゼ阻害剤の投与前に、同時に、または投与後に患者に投与することができる。
【００８２】
本発明のもう一つの局面は、ある多型の存在が骨塩量の減少と相関するという、15-リポキシゲナーゼ遺伝子における多型と骨塩量の間の相関関係の発見に基づく。この発見のさらなる局面は、遺伝子型は骨粗鬆症の素因と相関するということである。本発明は、遺伝子型の存在をスクリーニングすることによってこの遺伝的素因を持つ可能性を有する個体を特定することが可能であるという点で有利である。従って、本発明のさらなる局面は、骨減少に対する素因についての個体のスクリーニング、および素因が同定される場合は骨減少を遅延もしくは低減または予防するために患者の治療を含む治療方法を提供する。
【００８３】
本発明の診断および予測方法に従って、野生型15-リポキシゲナーゼ遺伝子座の、コード領域および非コード領域における欠失、挿入および点突然変異を含む変化が検出される。従って、マウスの場合は例えば好ましくは11番染色体の変化が検出されて、ヒトの場合は17番染色体の変化が検出される。さらに、この方法は、野生型15-リポキシゲナーゼ遺伝子座の検出、およびこの15-リポキシゲナーゼ遺伝子座における骨減少性疾患に対する素因の不在の確認によって実施することができる。このような突然変異は、骨減少の症状を示す個体または示さない個体に存在する可能性がある。さらに、15-リポキシゲナーゼ遺伝子座の突然変異を持たない個体に比べて、15-リポキシゲナーゼ遺伝子座に突然変異を有し、症状を示している個体の薬剤応答または予後に差違がある可能性がある。
【００８４】
従って、本発明の一つの局面は15-リポキシゲナーゼ遺伝子の遺伝子型の決定を含む診断の方法を提供する。一般的には、この方法は、個体が15-リポキシゲナーゼ遺伝子多型に関してホモ接合型またはヘテロ接合型であるか否かを決定する。一般に、本発明の方法は、個体の15-リポキシゲナーゼ遺伝子座における遺伝子型を決定するための、その個体の細胞のインビトロ分析によって実施される。
【００８５】
有用な診断手法には、マイクロアレイ分析、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）法、直接的DNA配列決定、PFGE分析、サザンブロット分析、一本鎖立体構造解析（SSCA）、RNエースプロテクションアッセイ法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）解析、ドットブロット分析、および当技術分野において周知ののPCR-SSCPが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
骨減少性疾患に対する素因は、15-リポキシゲナーゼ遺伝子の突然変異に関して、ヒトの患者のような被験者の組織を検査することによって確認することができる。例えば、生殖細胞系列の15-リポキシゲナーゼ突然変異を受け継いでいるヒトは骨減少性疾患を発症しやすい。これは、そのヒトの身体の任意の組織由来のDNAを検査することによって調べることができる。要するに、血液を採取して血液細胞からDNAを抽出することができる。さらに、胎児細胞、胎盤細胞または羊膜細胞を15-リポキシゲナーゼ遺伝子の突然変異について検査することによって生前診断を行うことができる。野生型15-リポキシゲナーゼ対立遺伝子の変化が、例えば点突然変異または欠失によるか否かは、本明細書に記載するいずれかの方法によって検出することができる。
【００８７】
DNA配列の変異の検出には、複数の方法が使用できる。手作業による配列決定または自動蛍光配列決定の直接的DNA配列決定は、配列変異を検出することができる。もう一つのアプローチは一本鎖立体構造多型（SSCA）であり、SSCAゲル上での移動度がシフトした断片を配列決定してDNA配列変異の正確な性質を調べる。2本の相補的DNA鎖間のミスマッチの検出に基づくその他のアプローチは、固定変性ゲル電気泳動（clamped denaturing gel electrophoresis）（CDGE）、ヘテロ二本鎖DNA分析（HA）および化学的ミスマッチ切断（chemical mismatch cleavage）（CMC）が含まれる。突然変異が確認されたら、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）ハイブリダイゼーションのような対立遺伝子特異的検出アプローチを用いて同一の突然変異に関して多数のその他の試料を迅速にスクリーニングすることができる（例えば、Saikiら、Proc. Nad. Acad. Sci. USA 86: 6230-6234 (1989)を参照されたい）。
【００８８】
点突然変異の検出は、当技術分野において周知の手法を用いた15-リポキシゲナーゼ対立遺伝子の分子クローニングおよび対立遺伝子の配列決定によって行うことができる。または、既知の手法を用いて組織に由来するゲノムDNA調製物から遺伝子配列を直接増幅することが可能である。続いて、増幅された配列のDNA配列を調べることができる。対立遺伝子の存在は、一本鎖立体構造解析（SSCA）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGEまたはCDGE）、RAアーゼプロテクションアッセイ法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）、対立遺伝子特異的PCR、または当技術分野において周知である一塩基伸長アッセイ法によって確認することができる。
【００８９】
好ましい方法において、対立遺伝子はマイクロチップ法を用いることによって同定される。この方法では、何千の異なるオリゴヌクレオチドプローブまたは遺伝子が合成されるか（McGallらに対する米国特許第5,412,087号）、またはシリコンチップもしくはガラスチップ上のアレイとしてスポットすることができる（Shalonらに対する米国特許第6,110,426号）。分析すべき核酸は、一般に蛍光で標識されてチップ上でプローブにハイブリダイズする。その他の標識には32Pおよびビオチンが含まれる。これらのマイクロアレイを用いて核酸-タンパク質相互作用について研究することも可能である。この手法を用いて、15-リポキシゲナーゼ遺伝子における突然変異の存在が同定される。
【００９０】
変化した（または突然変異型の）15-リポキシゲナーゼ遺伝子の存在は、骨減少性疾患のリスク増大と相関する。15-リポキシゲナーゼ遺伝子突然変異を検出するために、生物学的試料を調製して、分析する15-リポキシゲナーゼ対立遺伝子の配列と野生型15-リポキシゲナーゼ対立遺伝子の配列の相違を分析する。続いて、特定の変異型対立遺伝子の具体的な変異を同定するために、変異型対立遺伝子を配列決定することができる。次に、15-リポキシゲナーゼ遺伝子の突然変異、特にマウスにおける11番染色体およびヒトの17番染色体上の突然変異を、本発明の診断法および予測法のために使用する。
【００９１】
このように、本発明は、多型が骨減少に対する素因の指標である、ヒト17番染色体における多型の検出を含む、被験者における骨減少に対する素因の診断方法も提供する。好ましい態様において、検出は遺伝子型同定を含む。より好ましい態様において、遺伝子型同定はマイクロサテライトマーカーまたは1種類もしくは数種類の一塩基多型からなる。
【００９２】
もう一つの態様において、本発明は、被験者の15-リポキシゲナーゼ遺伝子における多型の検出を含む、被験者における骨減少症に対する素因の診断方法を提供する。
【００９３】
本発明は、15-リポキシゲナーゼ阻害剤に骨減少を予防するための治療的活性物質としての用途を提供する。また、本発明は前記の方法によって同定される化合物も提供する。さらに、特に骨減少の予防のために、前記の化合物および担体を含む薬学的組成物を提供する。骨減少に関連する15-リポキシゲナーゼ遺伝子における多型を検出するための少なくとも1種類のオリゴヌクレオチドを含む骨減少症に対する素因の診断用キットも提供する。
【００９４】
最後に、実質的に本明細書に記載される、特に後述の実施例に参照される化合物、方法、用途、組成物およびキットも主張される。
【００９５】
以下は、本発明を実施するための具体的な態様の実施例である。これらの実施例は専ら例証の目的で示すものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００９６】
2005531498.tif 000006
2005531498.tif 000007
【００９７】
化合物1、3-（2-ノン-1-イニルフェニル）-プロピオン酸は、米国特許第5,972,980号に記載されている。
【００９８】
化合物2、6,11-ジヒドロ-5-チア-11-アザ-ベンゾ［a］フルオレンは国際公開公報第97/12613号に記載されている。
【００９９】
化合物3、3-アミノ-N-（3,4-ジクロロフェニル）-4-メトキシベンズアミドは国際公開公報第99/32433号に記載されている。
【０１００】
化合物4、トランス-3-（2-オクト-1-イニル-フェニル）-アクリル酸は米国特許第4,713,486号に記載されている。
【０１０１】
化合物5、ジロイトンは米国特許第4,873,259号に記載されている。
【０１０２】
化合物6、［［［5-(5,6-ジフルオロ-1H-インドール-2-イル）-2-メトキシフェニル］アミノ］スルホニル］-カルバミン酸-イソブチルエステルは国際公開公報第01/96298号に記載されている。
【０１０３】
用いられる数値（例えば、量、温度など）に関しては正確なものにする努力が払われているが、実験上の誤差および逸脱は当然考慮されるべきである。
【０１０４】
実施例1
SNP遺伝子型同定モデル
マイクロサテライト（単純縦列反復多型または単純配列長多型とも呼ばれる）はもっとも開発されたカテゴリーの遺伝子マーカーである。これらは、高度の断片長多型を示し、それによってハイレベルな情報を提供する小さな単純配列の縦列反復（二塩基反復、三塩基反復、四塩基反復）配列構造を含む。ヒトゲノムに沿って、PCRに由来する方法によって容易に分類される5,000個よりもやや多いマイクロサテライトが順に並べられている（Dibら、Nature 380 : 152 (1996)）。
【０１０５】
一般的にGrupeら、(2001) Science 292: 1915-1918によって方法が記載される。BMDを調節する遺伝要因を特定するために、C57BL/6×DBA/2交雑種の1000匹のF2子孫（Jackson Labs、Bar Harbor、Maine）を用いて16週齢の時点でゲノムスキャンを行った。F2子孫は伴性遺伝を示さない正常なBMD分布を示した（Grupeら、Science、292,1915-1918, (2001)）。最も高いBMD（n＝145）および最も低いBMD（n＝149）を示す表現型の点で極端なF2子孫（上位および下位の15％）について、100個のマイクロサテライトマーカーを用いて個々のDNA試料を遺伝子型同定することによってBMDとの関連性に関して全ゲノムスキャンを実施した。さらに、上位および下位のBMDを示すF2世代から得られた等量のDNAを用いて2つのプールを作製した。対立遺伝子特異的キネティックPCR法を用いて、mSNPデータベースに見られる109個のSNPに関して、プールした試料における対立遺伝子の出現頻度を測定した。各マーカーの2つの極値間の対立遺伝子出現頻度の差をスコア化した。あるマーカーがBMDと関連性を持たない場合、その予想頻度は双方の極値とも50％である。z検定を用いて各対立遺伝子出現頻度の差の有意性を算出してLODスコアとしてプロットした（図1）。マイクロサテライトおよびSNP遺伝子型同定法により1番、2番、4番および11番染色体に位置づけられた4つの領域に関して、有意な関連性（LODスコア ＞3.3）が認められた。
【０１０６】
このように、SNP遺伝子型同定法を用いることによって、BMDの原因となる候補遺伝子が同定された。
【０１０７】
実施例2
動物モデル
BMDを調節する11番染色体上の同定領域内の遺伝子を同定するために、DBA/2、C57BL6/J（Jackson Labs, Bar Harbor, Maine）および共通遺伝子系統マウスの系統（D2.B6chr11, Oregon Health Sciences Universityより入手）の間の遺伝子発現の相違を、マイクロアレイを用いて分析した。D2.B6chr11共通遺伝子系統マウスは、C57BL/6Jの11番染色体のcM20からcM50までをDBA2/Jのバックグラウンドに遺伝子移入した。マウスゲノムに由来する遺伝子を含むマイクロアレイは、全腎、培養一次骨芽細胞および一次軟骨細胞から得られた標識cRNAとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、DBA/2J、C57BL/6JおよびB6.D2chr11共通遺伝子系統マウスのそれぞれから得られたcRNAを用いて実施された。mRNAの単離（2×ポリ（A）+）、cRNA合成およびハイブリダイゼーションを実施した。DBA/2JマウスおよびC57BL/6マウスの対比較、ならびにDBA/2JおよびB6.D2chr11共通遺伝子系統マウスの対比較によって差次的発現を調べた。
【０１０８】
11番染色体の区間（cM20〜cM50）内にコードされる差次的に発現する遺伝子をさらなる特徴付けのために選択した。調べた2種類の系統間では、実質的に1個の遺伝子（11番染色体上のcM40のAlox15）が差次的に発現した。DBA/2J系統はD2.B6chr11およびC57BL/6Jマウスに比べてAlox15の発現レベルが増加しており、またBMDが他の双方の系統に対して減少していた。従って、DBA/2JマウスにおけるAlox15の発現亢進が骨塩量低下の一因であった。
【０１０９】
骨芽細胞における差次的Alox15 mRNA発現を、リアルタイムPCRを用いて評価した。細胞は、DBA/2J、C57BL/6J、およびD2.B6chr11マウスから調製した（図3）。混入しているゲノムDNAを除去するために、全RNAをDNアーゼIで処理した。DNアーゼIを不活化するために、RNAを65℃で10分間、加熱した。PCR反応はすべて、100μlの容量で実施した。RNA（100ng）は、5×EZ緩衝液、Mn(OAc)（3mM）、臭化エチジウム（1μg/ul）、dNTP（200μM）、フォワードプライマー（200nM）およびリバースプライマー（200nM）を含む反応混合液中でrTH DNAポリメラーゼ（2単位）（Perkin Elmer）を用いてRT PCRを行った。cDNAは、試料を60℃で30分間、インキュベートして生成させた。続いてPCRを60サイクル（95℃、20秒；58℃、20秒）行った後、72℃で20分間、インキュベートした。各サイクルの蛍光は生成する産物の量に関連し、これはキネティックサーモサイクラーを用いて測定して、提供されるソフトウェアを用いて解析する（GermerおよびHiguchi、Genome Research, 9,72-78, (1999)）。腎に加えて、DBA/2Jマウス由来の骨芽細胞も、C57BL/6Jマウスに比較して、高い基礎レベルのAlox15 mRNAを生成した。C57BL/6マウス由来骨芽細胞では、IL-4によってAlox15 RNAがDBA/2マウスよりも多量に誘導された（図3）。
【０１１０】
Alox15発現における系統特異的な差に関する分子的根拠を調べるために、当技術分野において既知の方法を用いてDBA/2JおよびC57BL6/Jマウスに由来するAlox15遺伝子のゲノムDNAを配列決定した。2種類の系統を識別する14のDNA配列多型が同定された（下記の図4および表1に示す）。15LOのアンサンブル（Ensemble）遺伝子名は、ENSMUSG00000018924である。マウスゲノムの70929619〜70937482の位置を含む遺伝子配列を配列番号：1に示す。マウスゲノム配列における70938498の位置である表1の最初のSNPは、配列番号：2に示されるGenBankアクセッション番号U04332の配列の541の位置にある。
【０１１１】
（表１）C57BL/6Jマウスと比較した、DBA/2Jマウスにおいて同定されたAlox15のSNP
2005531498.tif 000008
【０１１２】
実施例3
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の骨形成増加能力
15-リポキシゲナーゼの阻害剤が骨形成および骨癒着を刺激する能力を調べるために、15-LO阻害剤が幹細胞の骨成長細胞（骨芽細胞）への分化の尺度を増進する能力をインビトロにおいて検査した。特に、文献の手順を用いて調製された化合物1（3-（2-ノン-1-イニルフェニル）-プロピオン酸）、化合物2（6,11-ジヒドロ-5-チア-11-アザ-ベンゾ［a］フルオレン）および化合物3（3-アミノ-N-（3,4-ジクロロフェニル）-4-メトキシベンズアミド）の3種類の阻害剤がヒト間葉幹細胞の骨芽細胞への分化を促進する能力について、骨芽細胞分化の2種類のマーカーである細胞性アルカリホスファターゼ活性および培養カルシウム含有量を測定することによって調べた。
【０１１３】
一般に、ヒト間葉幹細胞（hMSC, Poietics #PT-2501,BioWhittaker）は、12ウェルコラーゲンコーティング培養プレートを用いて1ml培地（Clonetics カタログ番号PT-4105プラス骨芽細胞インデューサー（100nM Dex、0.05mM L-アスコルビン酸-2-ホスフェート、10mM β-グリセロホスフェート）中、1cm2当たり細胞3100個で培養した。3種類の15-LO阻害剤を各培養物にそれぞれ加えて、対照のウェルには0.1％DMSO（陰性対照）または1,25-ビタミンD3の1nM（陽性対照）を加えた。阻害剤の濃度は次の通りであった：化合物1は3μMおよび30μM；化合物2は0.1μM、0.2μM、0.3μMまたは1.0μM、化合物3は3μM、10μMまたは30μM。各用量段階について、4枚〜8枚の独立した同型培養物を調製した。実験終了時に、アルカリホスファターゼ（Sigmaキット#104-LL）または細胞性カルシウム（Sigmaキット#587-M）のさらなる分析に備えて、ウェルを適切な媒質に掻き取って培養細胞を回収した。アルカリホスファターゼの評価のために回収する細胞は、細胞を掻き取ってトリス緩衝0.1％トライトン（Triton) X-100 250μLに再懸濁して回収した後、そのままアッセイするか、または凍結融解した上でアッセイした。総カルシウム含有量をアッセイする別の培養を掻き取って、0.5M HCl 250μLに再懸濁した。これらのアッセイ法の結果を総細胞DNAに対して標準化して、これによって細胞増殖の差について標準化した。アルカリホスファターゼおよびカルシウムのための培養の回収と同時に、それぞれの同型培養物は細胞を掻き取ってそれらをハンクス平衡塩類溶液250μLに再懸濁して回収し、DNAにより細胞数を調べた（DNeasy Tissue Kit、Qiagenカタログ番号69506）。
【０１１４】
インビトロにおける骨芽細胞分化の定量
アルカリホスファターゼ活性の定量のため、阻害剤を0.1％DMSOで調製して、1日目およびその後14〜16日間にわたって2〜3日毎に培養物に加えた。3回の異なる実験セットを実施した。
【０１１５】
1回目の実験セットでは、化合物1または化合物2（0.2μMまたは1μM）を阻害剤とし、溶媒（DMSO）を陰性対照として、各用量レベルについて4検体の独立した同型培養物を調製した。プレートは14日間、培養した。DNAについて標準化したアルカリホスファターゼ活性を図5にプロットする。
【０１１６】
二番目の実験セットは、15-LO阻害剤として化合物3（3μM、10μMおよび30μM）または化合物2（0.1μM、0.3μM、1.0μM）を加えた8検体の同型培養から構成された。阻害剤は1日目または11日目に添加した。DMSOを陰性対照として使用し、1,25-ビタミンD3を骨芽細胞分化誘導のための陽性対照として使用した。標準化したアルカリホスファターゼ活性およびカルシウム含有量を、それぞれ、図6および図7にプロットする。化合物2は1日目に加えた場合が最も有効であり、化合物3は11日目に加えた場合が最も有効であった。
【０１１７】
インビトロでの幹細胞の骨芽細胞分化誘導における15-LO阻害剤の特異性に関する対照として、三番目の実験セットでは、15-LO酵素よりも5-LO酵素に対してより特異的であることが分かっている8組の標準的リポキシゲナーゼ阻害剤について試験を行った。ジロイトン（1uM、10uM、50uM、Rocheにて調製）化合物5、AA-861（1uM、10uM、50uM、Sigma #A3711）およびRev-5901（15uM、Sigma #R5523）は2〜3日毎に新鮮なものを調製して、ヒト骨芽細胞の前駆細胞において検査した。それぞれ、図8および図9に見られる通り、5-LO阻害剤は9日目にはアルカリホスファターゼ活性誘導能を欠き、または16日間培養後には培養物カルシウム沈着誘発能を欠くことが示された。
【０１１８】
骨芽細胞に分化するように刺激したhMSC培養における骨芽細胞分化のマーカーであるアルカリホスファターゼ活性および培養物カルシウム含有量の定量結果は、特異的な15-リポキシゲナーゼ阻害剤の添加がインビトロにおけるヒト骨形成細胞の分化を促進することを示している。
【０１１９】
さらに、15-リポキシゲナーゼ阻害剤の骨形成および骨癒着を刺激する能力は、骨髄前駆細胞のクローン原性可能性を測定するクローン原性アッセイ法を用いることによって測定される。骨芽細胞および破骨細胞を15-リポキシゲナーゼ阻害剤で処理する。一つの方法では、細胞および阻害剤をインビトロにおいてインキュベートする。もう一つの方法では、哺乳動物に阻害剤を投与して、骨髄前駆細胞を単離し、その後、プレーティングする。いずれの方法とも、これらの骨髄細胞から得られるコロニー形成単位を測定する。化合物が骨髄の骨芽細胞クローン原性可能性を高めるか、または骨髄の破骨細胞クローン原性を低下させることを示すことができるならば、骨塩量増加能力を持つ化合物をスクリーニングすることができる。
【０１２０】
実施例4
15-リポキシゲナーゼ遺伝子の破壊によって、大腿骨の骨塩量が増加する
最初に、15-LO欠損マウスが軽微な表現型の変化を持つことが示されたが、その後、マウスモデルにおいてこれらのマウスはアテローム動脈硬化性病変からある程度保護されていることが示された（SunおよびFunk、J.Biol.Chem., 271, 24055-24062, (1996)；Cyrusら、Clin. Invest., 103, 1597-1604, (1999)）。さらに、15-LO欠損マウスではBMDが測定されなかった。15-LOの遺伝子破壊の骨塩量に対する影響を調べるために、15-LO「ノックアウト」（15-LO-KO）マウスを骨塩量に関して親マウスと比較した。骨塩量は、二重エネルギーX線吸収測定法（DEXA）により測定した。すべての検査は、Lunar PIXImusデンシトメーター（Lunar Corp., Madison, WI）を用いて実施した。成齢骨量の獲得が完了する4カ月齢の麻酔マウスについて、全身デンシトメトリー分析を実施した。グローバルウィンドウ（global window）は、全身画像から頭蓋冠、下顎骨および歯を引いた画像と定義した。屠殺後、右大腿骨を注意深く摘出して、DEXAスキャン前に付着組織を除去した。全身骨塩量は、15-LO-KOおよびC57BL/6親マウスで顕著な差違を示さなかった（49.8±0.6mg/cm2対49.5±0.4mg/cm2）。しかし、重要な点として、15-LOノックアウトマウスの大腿骨BMDはC57BL/6親系統に比べて著しく増加した（54.0±1.2mg/cm2対49.7±0.7mg/cm2）。これらの結果は、15-LOの破壊によって大腿骨の骨塩量が増加することを示す。
【０１２１】
実施例5
15-リポキシゲナーゼ阻害剤はインビボにおいて骨形成を促進する。
インビボにおける15-リポキシゲナーゼ阻害剤の骨形成促進能は、これらの阻害剤のマウス骨粗鬆症モデルにおける骨パラメータ改善能を測定することによって評価された。C57BL/6マウスにおけるLck遺伝子プロモーターに由来するインターロイキン-4導入遺伝子（Lck-IL4）の構成的発現は骨粗鬆症様の重度の骨表現型を生じるので（Lewisら、Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11618-22,(1993)）、これらのマウスを骨量に対する15-LO阻害剤投与の影響を示すために使用した。
【０１２２】
使用した4実験群を表2に示す。離乳時に、野生型C57BL/6マウスまたはトランスジェニックLck-IL4マウスに化合物2のPD146176の150mg/kgを飼料（Diet5001：タンパク質23％、脂肪10％、カルシウム0.95％、およびリン0.67％；PMI Feeds, Inc., St.Louis, MO）に混入して1日2回、84日間にわたって投与した。マウスには1日2回、約12時間毎に一日飼料摂取量の半分を摂取させて、飼料摂取量を毎日モニターした。飲水は自由に摂取させた。対照群には化合物2を含まない同一飼料を与えた。すべての群が、実験実施期間を通じて等しく十分な飼料を摂取した。
【０１２３】
（表２）インビボ阻害剤試験に使用した実験群
2005531498.tif 000009
離乳後（約28日）、マウスに15-LO阻害剤（化合物2）を加えた飼料または加えていない飼料を84日間、与えた。F（雌）およびM（雄）は実験群間で同等であった。
【０１２４】
IL4過剰発現および15-LO阻害の、全身パラメータである大腿骨のBMDおよび幾何学ならびに大腿骨の生体力学に対する影響を表3に示す。IL4の過剰発現は、全身BMD、体重およびヘマトクリットの顕著な減少、ならびに体脂肪率の上昇を招く。IL4の過剰発現はさらに、野生型C57BL/6マウスに比べて、大腿骨BMD、皮質面積、慣性モーメントおよび皮質厚を減少させた。Lck-IL4マウスにおける骨髄面積の増大は、ヘマトクリットの減少および報告されている付随性貧血と相関する。さらに、IL4の過剰発現は、破壊荷重、骨の剛性および骨強度を含む大腿骨生体力学に対して顕著な影響を及ぼした（表3）。15-LO阻害剤（化合物2）を与えたマウスでは、全身および大腿骨に対する有害作用が一部回復した（表3）。薬剤投与マウスは、Lck-IL4導入遺伝子を保有する対照マウスに比較して、全身BMD、ヘマトクリット、大腿骨BMDおよび皮質厚の顕著な増加を示した。重要な点として、15-LO阻害剤投与マウスは、破壊荷重、剛性および強度を含む大腿骨生体力学に顕著な増大を示した。このことは、骨折の発症が進行している患者において、骨強度および破壊荷重のレベルが重要な決定因子である骨粗鬆症に特に関連する。つまり、これらの結果は、骨粗鬆症の動物モデルにおいてインビボでの15-LOの阻害がBMDの増加および骨強度の増大に至ることを示している。
【０１２５】
（表３）IL4過剰発現および15-LO阻害剤の全身および大腿骨パラメータに対する影響
2005531498.tif 000010
2005531498.tif 000011
C57BL/6対照マウスと比較して、IL4の過剰発現に至るLck-IL4導入遺伝子を持つマウスの全身および大腿骨パラメータを測定した。15-LO阻害剤である化合物2を与えたLck-IL4マウスについても、無投与Lck-IL4対照マウスと比較して、これらのパラメータを測定した。NC、群間差なし。ns、p値は有意でなかった。
【０１２６】
動物
インビボ実験で使用したマウスはすべて、元々はThe Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から入手したストックよりPortland VA Veterinary Medical Unitにて同一条件で飼育した。繁殖用マウスは、The Jackson Laboratoryより入手したストックからわずか三世代のみ維持された。離乳時、マウスは21±2℃、12時間明／暗周期（午前6時00分〜午後6時00分）にて群飼いした（ケージ当たり9〜10匹）。すべての手技はVA Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたものであり、National Institutes of Healthの研究における動物の管理および使用に関するガイドラインに従って実施された。
【０１２７】
骨デンシトメトリー
骨塩量は、二重エネルギーX線吸収測定法（DEXA）により測定した。すべての検査は、Lunar PIXImusデンシトメーター（Lunar Corp., Madison, WI）を用いて実施した。成齢骨量の獲得が完了する4カ月齢の麻酔マウスについて、全身デンシトメトリー分析を実施した。グローバルウィンドウは、全身画像から頭蓋冠、下顎骨および歯を引いたものと定義した。屠殺後、右大腿骨を注意深く摘出して、DEXAスキャン前に付着組織を除去した。
【０１２８】
標本の処理
成齢マウス（16週齢）をCO2吸入により安楽死させて、0.1gの単位まで体重を測定した。屠殺後直ちに心臓採血を行い、少量の全血アリコート1検体をヘマトクリット検査に備えて保存した。腰椎および左右大腿骨を直ちに回収して、リン酸緩衝生理食塩液に浸漬した無菌ガーゼで包み、後続の分析に備えて約−20℃よりも低い温度で凍結保存した。
【０１２９】
大腿骨幹の幾何学
大腿骨の骨幹中央部の横断切片の幾何学パラメータは、携帯式X線マイクロ断層撮影装置（モデル1074、Skyscan, Antwerp, Belgium）を用いて測定した。スキャンは40mm幅で行い、大腿骨中央部のスライスについて総面積（FCSA）、皮質面積（Ct Ar）および髄管面積（Ma Ar）を解析した。さらに、デジタル画像の皮質領域に含まれるピクセルを用いて、前後面における横断面の重心から外層線維までの半径、屈曲の面における面積慣性モーメント（Ixx）、および平均皮質厚（CtTh）を算出した。
【０１３０】
生体力学的研究
高解像度材料検査装置（Instron モデル4442, Canton, MA）を用いて、大腿骨の三点曲げにおける骨折を調べた。破壊荷重および剛性はシステムのソフトウェアを用いて求めた。続いて、先に求めた横断面の面積測定値を用いて曲げ強度を算出した。
【０１３１】
データ解析
すべてのデータは、JMPソフトウェアパッケージ（SAS Institute）を用いて二元配置分散分析（ANOVA）により解析した。
【０１３２】
実施例6
15-リポキシゲナーゼ阻害剤のインビボにおける骨形成増加能力
15-リポキシゲナーゼ阻害剤の骨形成および骨癒着刺激能力を調べるために、［［［5-(5,6-ジフルオロ-1H-インドール-2-イル）-2-メトキシフェニル］アミノ］スルホニル］-カルバミン酸-イソブチルエステルの化合物6を国際公開公報第0196298号に記載されている通りに調製して）、標準的エストロゲン欠損ラットOVX骨減少症アッセイ法にて検査した。
【０１３３】
3カ月齢のラットを卵巣摘出（Ovx）して、化合物6の1mg/kg/日または1,25-ジヒドロキシビタミンD3（陽性対照、表ではVit.Dと略記する）の0.1μg/kg/日を卵巣摘出術2週間後から開始して1日1回、7週間にわたって経口胃管栄養法により投与した。投与量は2mg/kg/日に増量して、11週まで継続した。シャム（卵巣摘出しなかったラット）およびOvxの双方の対照群には溶媒のみを投与した。脊椎および右股関節の骨塩量は、QDR-4500骨デンシトメーター（Hologic, Walthan, MA）にて高解像ソフトウェアパッケージを用いて測定した。動物は、右大腿骨が体幹に対して垂直であり、脛骨が大腿骨に対して垂直となるような仰臥位に保定して、スキャンした。化合物における股関節および脊椎の骨塩量（ミネラルg/cm2）を以下の表4に示す。15-LO阻害剤を投与した動物は＞3週に脊椎におけるBMDの増加を示し、＞7週に近位大腿骨のBMDの増加を示した。結果を表4に示す。
【０１３４】
（表４）
2005531498.tif 000012
括弧内の数値は、同一時点でのOVX対照に対するp値を示す。
nd＝データなし。
【０１３５】
実施例7
実験用マウスにおいて15-リポキシゲナーゼ発現を低下させるための遺伝子操作は骨量および強度を改善させる。
15-リポキシゲナーゼ発現と骨発達の関連性を調べるために、The Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入した2種類の子孫系統であるB6.129S2-Alox15tmlFun（Alox15ノックアウトまたは5LOKO）およびDBA/2（D2）から遺伝的に異種性のF2集団を構築した。B6.129S2-Alox15tmlFun（15LOKO）マウスはAlox15の標的突然変異に関してホモ接合性であり、従って、アラキドン酸15-リポキシゲナーゼを発現できない。これに対して、D2マウスはAlox15を高レベルに発現する。15LOKO-D2 F1マウスはJackson Laboratoryの親系統から試験現場で繁殖し、交雑して合計292匹の15LOKO-D2 F2マウスを得た。離乳時に、マウスは群飼いとして（ケージ当たり2〜5匹）、12時間明／暗周期（午前6時00分〜午後6時00分）、21±2℃において、飲水および実験用マウス飼料（Diet 5001：タンパク質23％、脂肪10％、カルシウム0.95％、およびリン0.67％；PMI Feeds, Inc., St.Louis, MO）を自由に与えて維持した。
【０１３６】
マウスはすべて、成齢骨量の獲得が完了する4カ月齢の時点で試験した（28）。骨塩量の測定は、ヒト腰椎のヒドロキシアパタイト模型を用いて毎日検量するペンシルビームHologic QDR 1500デンシトメーターを用いて行った。解析は、製造業者（Hologic, Waltham, MA）の厚意により提供されたマウス全身用ソフトウェア（バージョン3.2）を用いて実施した。デンシトメトリー分析は、麻酔したマウスについて実施した。（骨塩量測定に対する未消化のげっ歯類用飼料の交絡作用を排除するために）検査前夜は絶食させて、マウスの麻酔はイソフルラン吸入により行った。動物は0.1gの単位まで体重測定し、続いて、骨塩量スキャンを行った。マウスをCO2吸入により安楽死させて、脾臓および大腿骨を無菌的に摘出した後、後続の分析に備えて直ちに凍結した。すべての手技はVA Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認されたものであり、National Institutes of Healthの研究における動物の世話および使用に関するガイドラインに従って実施された。
【０１３７】
大腿骨の構造（骨幹中央部の皮質骨面積および皮質厚）は、デスクトップ型X線マイクロ断層撮影スキャナー（SkyScanモデル1074、Aartselaar, Belgium）で測定した。高解像度材料検査装置（モデル4442、Instron Corp. , Canton, MA）を用いて、左大腿骨の三点曲げにおける骨折を調べた。伸び計（モデル2630-113、Instron Corp.）を取り付けて、システムソフトウェア（Windows 95用シリーズIX、Instron Corp.）を用いて骨折が生じるまで0.5％/秒のひずみ速度でアクチュエーターを移動させた。荷重および移動（伸び計を用いて測定した）のデータを記録して、システムソフトウェアを用いて破壊荷重（F）および剛性（k、荷重対移動曲線の線形部分から算出）を求めた。
【０１３８】
塩析法を用いて、それぞれのマウスの脾臓からゲノムDNAを単離した。マウスは、Alox15遺伝子の野生型（266bp）および変異型（172bp）に関して異なるサイズの産物を得るためにデザインされた、The Jackson Laboratoryより提案されたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プロトコール（http://aretha.jax.org/pub-cgi/protocols/proto-cols.sh?objtvpe=protocol&protocol id=304）に従って遺伝子型を同定した。増幅は、Perkin-Elmer 9700サーモサイクラー（Branchburg, New Jersey）にて実施した。PCRの産物は4％アガロースゲル上で分離して、臭化エチジウム染色により可視化した。
【０１３９】
15LOKO-D2 F2集団はほぼ同数の雄（n＝141）および雌（n＝151）のマウスから構成され、以下の表5に示す通り、Alox15遺伝子型の頻度はハーディ・ワインバーグの法則の期待値に従い、ホモ接合型ノックアウトマウス（15-LO対立遺伝子なし）70匹（24％）、ヘテロ接合型マウス（D2由来の15-LO対立遺伝子1個）153匹（52％）、およびホモ接合型D2マウス（双方ともD2由来の15-LO対立遺伝子）69匹（24％）であった。体重に差はなかったが、Alox15ノックアウトについてホモ接合体のF2マウスはD2ホモ接合体またはヘテロ接合体のマウスよりも有意に高い全身BMDを示した（ANOVAによりp＝0.006）。さらに、Alox15ノックアウトのホモ接合型F2マウスは大腿骨幹皮質骨の量（皮質面積および皮質厚）の増加を示し、破壊荷重および剛性測定値の増加により示される通り、構造的能力が著しく向上した（表6）。
【０１４０】
（表５）15LOKO-D2 F2集団において、15LO遺伝子型はBMDと相関する。
2005531498.tif 000013
【０１４１】
（表６）15LOKO-D2 F2集団において15LO遺伝子型は大腿骨の骨量および強度と相関する
2005531498.tif 000014
（BMD＝全身BMD；Ct Ar＝大腿骨幹皮質面積；Ct Th＝大腿骨幹皮質厚）
【０１４２】
このように、骨減少の治療または予防、骨塩量の増加、ならびに骨形成および骨癒着の促進のための新規の方法を開示する。本発明の好ましい態様についてはある程度詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の精神および範囲から逸脱することなく明白な変化を加えることができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】骨塩量に関連する多型の検出における、プールしたDNA試料のSNPに基づく遺伝子型同定と個々のDNA試料のマイクロサテライトによる遺伝子型同定の比較を示す。すべての染色体について、z検定を用いて各対立遺伝子頻度の差の有意性を算出してLODスコアとしてプロットした。破線は、ゲノム全体の有意性についての閾値として設定した3.3のLODスコアを示す。
【図２】全腎RNAを用いたマウス腎におけるAlox15遺伝子発現の定量結果を示す。遺伝子発現はマイクロアレイで分析した。
【図３】インビトロで投与されたIL-4の漸増濃度に対する、マウス一次骨芽細胞におけるAlox15遺伝子発現の定量結果を示す。
【図４】マウスのAlox15遺伝子において同定された一塩基多型（SNP）の位置を示す。
【図５】溶媒単独（DMSO）対照と比較した、15-リポキシゲナーゼ阻害剤である化合物1または化合物2に対するヒト間葉幹細胞（hMSC）のアルカリホスファターゼ活性の定量結果を示す。
【図６】化合物3または化合物2を15-リポキシゲナーゼ阻害剤として、DMSOまたは1,25-ビタミンD3を対照とする、hMSCにおけるアルカリホスファターゼ活性の定量結果を示す。
【図７】化合物3または化合物2を15-リポキシゲナーゼ阻害剤として、DMSOまたは1,25-ビタミンD3を対照とする、hMSCにおける総カルシウム含有量の定量結果を示す。
【図８】溶媒単独（DMSO）対照と比較した、5-LO阻害剤であるジロイトン（Zileuton）、AA-861およびRev-5901を加えて9日間培養したhMSCにおけるアルカリホスファターゼ活性の定量結果を示す。15-リポキシゲナーゼ阻害剤の添加時に影響が見られたのとは対照的に、反応がない。
【図９】溶媒単独（DMSO）または1,25-ビタミンD3の対照と比較した、5-LO阻害剤であるジロイトン、AA-861およびRev-5901を加えて16日間培養したhMSCにおける総カルシウム含有量の定量結果を示す。15-リポキシゲナーゼ阻害剤の添加時に影響が見られたのとは対照的に、反応がない。
【配列表】
2005531498.tif 000015
2005531498.tif 000016
2005531498.tif 000017
2005531498.tif 000018
2005531498.tif 000019
2005531498.tif 000020
2005531498.tif 000021
2005531498.tif 000022
【図１】
2005531498.tif 000023
【図２】
2005531498.tif 000024
【図３】
2005531498.tif 000025
【図４】
2005531498.tif 000026
【図５】
2005531498.tif 000027
【図６】
2005531498.tif 000028
【図７】
2005531498.tif 000029
【図８】
2005531498.tif 000030
【図９】
2005531498.tif 000031
【国際調査報告】
2005531498.tif 000032
2005531498.tif 000033
2005531498.tif 000034
2005531498.tif 000035
2005531498.tif 000036
2005531498.tif 000037
2005531498.tif 000038