(57)【要約】本発明は、新規アグレカナーゼタンパク質およびそれをコードするヌクレオチド配列ならびにそれを産生する方法を開示する。また、アグレカナーゼ酵素の同定方法および開発方法、ならびにアグレカンの分解により特徴付けられる症状の治療のための、酵素に対する抗体も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１のヌクレオチド＃１〜＃３６６３の配列；
ｂ）配列番号１のフラグメント；
ｃ）配列番号１の変異体；
ｄ）ストリンジェント条件下で配列番号１とハイブリダイゼーションする配列；および
ｅ）（ａ）〜（ｄ）の天然に生じるヒト対立遺伝子配列および同等の縮重コドン配列：
から選択されるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
その発現制御配列と作用的に結合している請求項１記載のＤＮＡ分子を含むベクター。
【請求項３】
請求項１のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
請求項２のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
単離ヒトアグリカナーゼタンパク質を産生する方法であって、
ａ）請求項１記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を培養すること；および
ｂ）培地からのＤＮＡ分子によりコードされた該アグリカナーゼタンパク質を回収し、精製すること；
を含む方法。
【請求項６】
該宿主細胞が昆虫細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ａ）配列番号２のアミノ酸＃１〜＃１２２１のアミノ酸配列；
ｂ）配列番号２のフラグメント；
ｃ）（ａ）〜（ｂ）の配列の付加、置換および欠失変異体から成るアグリカナーゼタンパク質の変異体；
から選択されるアミノ酸配列を含む単離アグレカナーゼタンパク質。
【請求項８】
下記工程：
ａ）請求項１記載のＤＮＡ分子で形質転換した細胞を培養すること；および
ｂ）配列番号２から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を、該培地から回収し、精製すること；
により産生される単離アグレカナーゼタンパク質。
【請求項９】
請求項７記載の単離アグレカナーゼタンパク質に結合する抗体。
【請求項１０】
抗体がアグレカナーゼ活性を阻害する、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
ａ）配列番号２から選択されたアグレカナーゼタンパク質またはそのフラグメントを得ること；
ｂ）アグレカナーゼタンパク質を潜在的な阻害剤と組み合わせること；および
ｃ）潜在的な阻害剤がアグレカナーゼ活性を阻害するかどうかを評価すること、
を含む、アグレカナーゼの阻害剤の同定方法。
【請求項１２】
潜在的な阻害剤と組み合わせる前に、三次元構造分析においてアグレカナーゼタンパク質を評価することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
潜在的な阻害剤と組み合わせる前に、コンピュータを用いる薬剤設計プログラムでアグレカナーゼタンパク質を評価することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
請求項９記載の抗体および医薬担体を含む、アグレカナーゼのタンパク質分解活性を阻害する医薬組成物。
【請求項１５】
哺乳類におけるアグレカナーゼの阻害方法であって、該哺乳類にアグレカナーゼ活性を阻害するのに有効な量の、請求項１４記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項１６】
組成物を、静脈内、皮下または筋肉内投与する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
組成物を約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００２年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／３０３，６８０号の優先権の利益によるものであり、これは出典明示に本発明に含まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規アグレカナーゼ(アグレカナーゼ)分子をコードしているヌクレオチド配列、アグレカナーゼタンパク質およびそのフラグメントならびにそれらを産生する方法の知見に関する。本発明はさらに、アグレカナーゼ酵素の阻害剤およびその抗体の同定および開発に関する。これらの阻害剤および抗体は、骨関節症を含む種々のアグレカナーゼ関連症状の治療に有用であり得る。
【０００３】
（発明の背景）
アグレカンは、関節軟骨の主要な細胞外成分である。それは、軟骨に圧縮性および弾力性というその機能特性を付与する原因たるプロテオグリカンである。アグレカンの喪失は、関節疾患における関節軟骨の崩壊に関与している。骨関節症は、少なくとも三千万人のアメリカ人に影響を及ぼしている衰弱性の疾患である(MacLean et al., J Rheumatol 25:2213-8 (1998))。骨関節症は、関節軟骨の崩壊および結果的に生じる慢性痛のために生活の質をかなり低下させ得る。骨関節症のプロセスの初期の、そして重要な特徴は、細胞外マトリックスからのアグレカンの喪失である（Brandt and Mankin, 骨関節炎の病因(Pathogenesis of Osteoarthritis), in Textbook of Rheumatology, WB Saunders Company, Philadelphia, PA, at 1355-1373 (1993)）。アグレカンの大部分のシュガー含有部分がそれにより細胞外マトリックスから喪失され、軟骨の生物力学な特徴の欠損を生じる。
【０００４】
「アグレカナーゼ」と呼ばれるタンパク質分解活性は、骨関節症および炎症性関節疾患に伴う軟骨崩壊において役割を有するアグレカンの切断の原因であると考えられている。ヒト骨関節症軟骨におけるアグレカンのデグラデーションの原因である酵素を同定するための研究が行われてきた。少なくとも２つの酵素切断部位が、アグレカンの球内ドメイン内に同定されている。アグレカンのドメイン（Ａｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２）内の１つの酵素切断部位が、いくつかの公知のメタロプロテアーゼにより切断されることが認められている。Flannery et al., J Biol Chem 267:1008-14 (1992); Fosang et al., Biochemical J. 304:347-351 (1994)。ＩＬ−１誘発軟骨アグレカン切断による、アグレカン（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）内の第２のアグレカン切断部位での切断により、ヒト滑液において見られるアグレカンフラグメントの形成が生じる（Sandy et al., J Clin Invest 69:1512-1516 (1992)；Lohmander et al., Arthritis Rheum 36：1214-1222 (1993); Sandy et al., J Biol Chem 266: 8683-8685 (1991)）。（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）でのアグレカン切断は、アグレカナーゼ活性に起因している（Sandy et al., J Clin Invest 69:1512-1516 (1992)）。このＧｌｕ３７３−Ａｌａ３７４切断部位は、アグレカナーゼ切断部位とも称されるだろう。
【０００５】
近年、ＩＬ−１により刺激された軟骨により合成され、（Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４）部位でアグレカンを切断する「トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン−様およびメタロプロテアーゼ」（ＡＤＡＭＴＳ）ファミリー内の２つの酵素、アグレカナーゼ−１（ＡＤＡＭＴＳ４）およびアグレカナーゼ−２（ＡＤＡＭＴＳ−１１）の同一性が同定された(Tortorella et al., Science 284:1664-6 (1999); Abbaszade et al., J Biol Chem 274: 23443-23450 (1999))。これらの酵素は骨関節症のヒト関節軟骨により合成され得る可能性がある。Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合にてアグレカンを切断することができ、骨関節症におけるアグレカン切断に寄与し得るＡＤＡＭＴＳファミリーの他の関連する酵素が存在することも予想される。種々のアグレカナーゼ酵素を同定し、そしてその酵素活性を遮断する方法を決定する必要がある。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、アグレカンを切断することができる新規アグレカナーゼタンパク質分子、アグレカナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、およびアグレカナーゼの産生のためのプロセスを指向する。これらの酵素は、タンパク質分解性アグレカナーゼ活性を有するとして特徴付けられるものとする。本発明は、これらの酵素を含む組成物をさらに含む。
【０００７】
本発明はさらに、これらの酵素に対する抗体、一態様においては、例えば、アグレカナーゼ活性を遮断する抗体を含む。加えて、本発明は、酵素のタンパク質分解活性を遮断するアグレカナーゼの阻害剤を同定および開発するための方法を含む。これらの阻害剤および抗体は、種々のアッセイおよび関節軟骨の崩壊により特徴づけられる疾患の治療のための処置に用いてよい。本発明は、新規アグレカナーゼタンパク質をコードするヌクレオチド分子を提供する。さらに、一の具体例において、本発明は、配列番号１（図１Ａおよび１Ｂ）のヌクレオチド＃１−ヌクレオチド＃３６６３；アグレカナーゼ活性を示す、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列番号１のフラグメント；アグレカナーゼ活性を示すタンパク質またはポリペプチドをコードする配列番号１の変異体およびそのフラグメント；ストリンジェント条件下で配列番号１とハイブリダイゼーションする配列；天然に生じるヒト対立遺伝子配列；および同等の縮重コドン配列：から選択されるＤＮＡ配列を含む、単離ＤＮＡ分子を特徴づける。
【０００８】
別の態様において、本発明は、配列番号２（図２）のアミノ酸＃１（メチオニン）−アミノ酸＃１２２１（イソロイシン）；アグレカナーゼ活性を示す配列番号２のフラグメント；およびタンパク質分解活性を示すアグレカナーゼタンパク質の、欠失変異体および置換変異体を含む、変異体およびフラグメントから選択されるアミノ酸配列を含む単離アグレカナーゼタンパク質を含む。さらなる態様において、本発明は、単離アグレカナーゼタンパク質を産生する方法を提供する。一のかかる方法は、（１）ＤＮＡ配列、例えば配列番号１に示されるＤＮＡ配列で宿主細胞を形質転換すること；（２）宿主細胞を培養すること；および（３）細胞培地から、ＤＮＡ配列によりコードされた配列番号２に示されるアグレカナーゼ酵素を精製することを含む。
【０００９】
また、本発明は、本発明の単離アグレカナーゼタンパク質に結合する抗体を提供する。一の具体例において、かかる抗体は、アグレカナーゼ活性を、減少させるか、阻害するか、あるいはそれに拮抗する。さらに、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントもしくは変異体から選択されるアグレカナーゼタンパク質の使用を含む、アグレカナーゼ活性の阻害剤の開発および同定方法を提供する。一の具体例において、アグレカナーゼ活性の阻害剤は、アグレカンの切断を防止する。
【００１０】
加えて、本発明は、アグレカナーゼのタンパク質分解活性を阻害する医薬組成物であって、少なくとも１つの本発明の抗体および少なくとも１つの医薬担体を含む組成物を提供する。また、本発明は、哺乳類におけるアグレカナーゼ活性の阻害方法であって、該哺乳類に、アグレカナーゼ活性を阻害するために有効な量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
さらなる態様は、記載の一部に説明されており、その部分は記載から明らかになるか、あるいは、本発明を行うことにより明らかになるだろう。本発明は、特許請求の範囲において説明し、示され、本開示は、特許請求の範囲に限定されるべきではない。下記の発明の詳細な説明は、本発明の種々の具体例の典型的な代表例であって、本発明の範囲を限定するものではない。添付する図面は、明細書の記載と共に本明細書の一部を構成し、具体例を説明するものであって、本発明を限定するものではない。
【００１２】
（図面および配列表の簡単な説明）
図１Ａおよび１Ｂは、ＡＤＡＭＴＳ−１８（ＥＳＴ１８）の全長ヌクレオチド配列を示す（配列番号１）。
【００１３】
図２は、配列番号１のヌクレオチド配列に基づく、ＡＤＡＭＴＳ−１８に関する全長アミノ酸配列を示す（配列番号２）。
【００１４】
図３Ａおよび３Ｂは、ＡＤＡＭＴＳ−１８（ＥＳＴ１８）のヌクレオチド配列を示す（配列番号３）。
【００１５】
図４は、配列番号３のヌクレオチド配列に基づく、ＡＤＡＭＴＳ−１８の予測されるアミノ酸配列を示す（配列番号４）。
【００１６】
図５Ａおよび５Ｂは、セレラ（Celera）データベース−マイニング法により同定された、ＡＤＡＭＴＳ−１８に関する仮想ヌクレオチド配列を示す（配列番号５）。
【００１７】
図６Ａは、ＥＳＴ１８ヌクレオチド配列のフラグメントの増幅に用いるＰＣＲプライマーの概略を示す。図６Ｂは、制限酵素部位を含むＥＳＴ１８の重複ヌクレオチド配列フラグメントの概略を示す。
【００１８】
図７は、ストレプトアビジンタグに結合したＡＤＡＭＴＳ−１８の切断形態をコードするヌクレオチド配列を示す（配列番号７）。
【００１９】
図８は、配列番号７に基づいて、ストレプトアビジンタグを含むＡＤＡＭＴＳ−１８の切断形態に関するアミノ酸配列を示す（配列番号８）。
【００２０】
図９は、ＧＣＧプロットストラクチャープログラムを用いて、配列番号２のタンパク質から得られた疎水性プロットの概略を示す。
【００２１】
図１０は、検出したアグレカナーゼ活性の分析の概略を示す。
【００２２】
（発明の詳細な記載）
本発明がより容易に理解できるように、ある種の用語を最初に定義する。付加的な定義は、詳細な記載全体にわたって説明される。
【００２３】
「アグレカナーゼ」なる用語は、アグレカンタンパク質を切断することができるポリペプチドのファミリーを意味する。一般的には、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４アグレカナーゼ切断部位でアグレカンを切断するタンパク質が存在する。本発明のアグレカナーゼは、限定するものではないが、配列番号２のアミノ酸配列を含む。「アグレカナーゼ」なる用語は、１つまたはそれ以上のアッセイにおいて活性である、配列番号２に示されるアミノ酸配列の天然に生じる変異体、ならびに、配列番号２のフラグメントを含む。例えば、該定義には、
配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸と、実質的に類似したまたは実質的に同一であるアミノ酸配列；あるいは、配列番号２またはそのフラグメントのアミノ酸と、少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。さらに、「アグレカナーゼ」なる用語は、開示した配列番号１、そのフラグメントおよび変異体の核酸配列によりコードされるタンパク質を含む。一の具体例において、本発明の核酸は、遺伝子をコードする天然のアグレカナーゼの変異体またはそのフラグメント由来のまたはその配列を有するだろう。
【００２４】
「アグレカナーゼ活性」なる用語は、アグレカンへのアグレカナーゼ酵素の結合により、中断されるか、開始される少なくとも１つの細胞プロセスを意味する。一般的には、活性は、アグレカナーゼによるアグレカンのタンパク質分解切断を意味する。アグレカナーゼ活性は、限定するものではないが、アグレカナーゼのアグレカンへの結合、およびアグレカナーゼによるアグレカンの切断を含む。また、活性は、本発明のアグレカナーゼによるアグレカンへの結合またはその切断により生じる生物学的応答を含みうる。
【００２５】
「抗体」なる用語は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントを意味し、抗原結合部位を含んでいるいずれのタンパク質を包含する。該用語は、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、モノ特異的、ポリ特異的、非特異的、ヒト化、ヒト、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、移殖およびインビボで形成された抗体を含む。該用語は、特記しない限り、抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂおよび抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントも含む。
【００２６】
「有効な量」なる用語は、少なくとも１つのアグレカナーゼ阻害剤または抗体が患者を治療するのに十分である本発明の組成物の投与量または量を意味する。
【００２７】
アグレカナーゼまたはアグレカナーゼ活性を「阻害する」または「阻害」なる用語は、アグレカナーゼまたはアグレカンの阻害剤の結合による、少なくとも１つのアグレカナーゼの活性を、低減、阻害、さもなければ減少させることを意味する。結合の低減、阻害または減少は、与えられる多くのアッセイの１つにより測定することができる。アグレカナーゼ活性の阻害は、必ずしもアグレカナーゼ活性の完全な否定を示すものではない。活性の低減は、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上であってもよい。一の具体例において、阻害は、アグレカンの切断産物の検出が減少することにより測定することができる。
【００２８】
「単離」なる用語は、実質的にその天然環境にない核酸分子またはポリペプチド分子を記載する。例えば、単離タンパク質は、細胞物質またはそれの由来である細胞または組織源から得られた他の汚染タンパク質と実質的に遊離したものである。また、「単離」なる用語は、他のプロテアーゼと結合しておらず、アグレカナーゼタンパク質分解活性を保持している、本発明のアグレカナーゼタンパク質を意味する。加えて、「単離」なる用語は、本発明のアグレカナーゼをコードし、他の細胞物質および内容物がない、核酸分子を意味する。
【００２９】
「ネオエピトープ抗体」なる用語は、タンパク質分解開裂により形成される新たなＮ−またはＣ−末端アミノ酸配列を特異的に認識するが、無傷（非切断）基質のかかるエピトープに結合しない抗体を意味する。
【００３０】
発現制御配列と「作用的に連結」なる用語は、一般的には、転写速度または配列に結合するヌクレオチド分子の能率を制御するか、またはそれに影響を与える特異的ヌクレオチド配列または配列の存在を意味する。例えば、ヌクレオチド配列をコードするアグレカナーゼの５’末端の近位に位置するプロモーター配列は、ヌクレオチド配列をコードするアグレカナーゼと作用的に連結することができる。発現制御配列は、限定するものではないが、例えばプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御配列、またはかかる要素のいずれの組み合わせ、その発現を制御するためのヌクレオチド配列をコードするアグレカナーゼの５’または３’のいずれかを含む。しかしながら、それらのすべての要素が必要なわけではない。当業者は、適当な発現制御配列を、例えば本発明のアグレカナーゼの所望の発現レベルに応じて選択することができる。
【００３１】
抗体の「特異的な結合」なる用語は、抗体が少なくとも１つの本発明の新規アグレカナーゼ分子に結合し、抗体が、少なくとも１つの新規アグレカナーゼ分子以外の分子と有意な結合を示さないことを意味する。また、該用語は、例えば、抗体の抗原結合ドメインが、多数の抗原において示される特定のエピトープに特異的であることに適用することができ、抗原結合ドメインを有する特定の結合メンバー（抗体）は、エピトープを有する種々の抗原に結合することができるだろう。したがって、多数の新規アグレカナーゼタンパク質のエピトープに希有号するだろうと考えられる。典型的には、結合は、アフィニティー定数Ｋａが１０８Ｍ−１よりも高い場合に、特異的であると考えられる。抗体は、非特異的結合が阻害されると同時に、かかる結合が実質的に阻害されない、適当に選択された条件下で、抗体に「特異的結合」すると考えられる。該条件は、通常には、抗体濃度、溶液のイオン強度、結合時間、結合反応に関係する付加的な分子の濃度（例えば、血清アルブミン、ミルク・カゼイン）等の用語で定義される。かかる条件は、当該分野でよく知られており、当業者が用いる典型的な技法により適当な条件を選択することができる。
【００３２】
「高度にストリンジェント」または「高ストリンジェンシー」なる用語は、核酸−核酸相互作用を測定するのに用いられるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載する。核酸ハイブリダイゼーションは、塩濃度、温度または有機溶媒、加えて塩基組成、相補的ストランドの長さ、およびハイブリダイゼーションする核酸間のヌクレオチド塩基不整合の数のような条件により影響を受け、これは当業者には明らかだろう。ストリンジェント条件は、核酸の長さおよび核酸の塩基組成に依存し、当該分野でよく知られた方法により決定することができる。一般的には、ストリンジェンシーは、例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄中の温度および塩濃度を操作することにより、変化させるか、または制御することができる。例えば、高温および低塩濃度の組み合わせは、ストリンジェンシーを増加させる。かかる条件は、当業者には公知のものであり、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6で見ることができる。当該分やで知られている水性および非水性条件の両方を用いることができる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例としては、約４５℃、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーション、ついで、少なくとも１回の０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで５０℃での洗浄が挙げられる。高度にストリンジェント条件の第２の例としては、約４５℃で６ＸのＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション、ついで、少なくとも１回の、０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで５５℃での洗浄が挙げられる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の他の例としては、４５℃で６ＸのＳＳＣでのハイブリダイゼーション、ついで、少なくも１回の、０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、６０℃での洗浄が挙げられる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例としては、４５℃で６ＸのＳＳＣでのハイブリダイゼーション、ついで、少なくとも１回の、０．２ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、６５℃での洗浄が挙げられる。高度にストリンジェントな条件は、６５℃、０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳでのハイブリダイゼーション、ついで、少なくとも１回の、６５℃、０．２ＸのＳＳＣ、１％のＳＤＳでの洗浄を含む。
【００３３】
「中程度にストリンジェント」または「中程度のストリンジェンシー」なハイブリダイゼーションは、核酸が、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％または少なくとも約８５％の、核酸に対する同一性を有する相補核酸に結合することができる条件を意味し；約９０％以上の、核酸に対する同一性を有することが特に好ましい。中程度にストリンジェントな条件は、限定するものではないが、例えば、４２℃で５０％のホルムアミド、５Ｘのデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ）溶液、５ＸのＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳでのハイブリダイゼーション、ついで、６５℃で０．２ＸのＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳでの洗浄を含む。（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと）。
【００３４】
「実質的に同一」または「実質的に類似」なる用語は、関連するアミノ酸またはヌクレオチド配列が、開示された配列に対して、同一であるか、あるいは、それと比較して（保持されたアミノ酸置換により）実質的に違いがないことを意味する。本発明のヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の、開示した核酸分子およびポリペプチドの配列との同一性であるものを含む。
【００３５】
ポリペプチドに関しては、少なくとも２０、３０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸が、原型のポリペプチドと原型のものと実質的に同一である変異体ポリペプチド間で比較されるだろう。ヌクレオチドに関しては、少なくとも５０、１００、１５０、３００またはそれ以上のヌクレオチドが、原型の核酸と原型のものと実質的に同一である変異体核酸間で比較されるだろう。かくして、変異体は、他が相違していても、「実質的に同一」の定義を依然として満たしている場合、ある領域において実質的に同一であり得る。２つの配列間のパーセント同一性は、例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990) に記載されているBasic Local Alignment Tool（ＢＬＡＳＴ）、Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970) のアルゴリズムまたはMeyers et al., Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)のアルゴリズムのような標準的な配列アルゴリズムにより決定される。
【００３６】
「治療する」または「治療」なる用語は、治療および予防または防止的手段を意味する。治療を必要とするものは、特定の医学的障害を有する個体、ならびに最終的に障害になりうるもの（すなわち、予防的手段を必要とるすもの）を含む。治療は、アグレカナーゼ活性またはアグレカナーゼのレベルを調整し、少なくとも１つの疾患の臨床症状を予防または軽減させる。阻害剤および／または抗体は、例えばアグレカナーゼのアグレカンへの相互作用または結合を防止することにより、またはアグレカナーゼ活性を減少させるか、または阻害することにより機能することができる。
【００３７】
「変異体」なる用語は、それぞれ、与えられたヌクレオチドおよびアミノ酸配列と、実質的に同一であるか、または類似したヌクレオチドおよびアミノ酸配列を意味する。変異体は、天然に生じることができ、例えば、アグレカナーゼまたはアグレカナーゼ−様タンパク質をコードする、天然に生じるヒトおよび非ヒトヌクレオチド配列であるか、または人工的に形成され得る。変異体の例としては、本発明のアグレカナーゼの３’および５’スプライス変異体を含むアグレカナーゼｍＲＮＡの別のスプライシング、点変異および他の変異またはアグレカナーゼタンパク質のタンパク質分解性切断を生じさせるアグレカナーゼが挙げられる。本発明のアグレカナーゼの変異体は、それぞれ、他の核酸（または最適に配列されている場合、それらの相補的ストランド）（適当な挿入または欠失を有する）またはアミノ酸配列と実質的に同一であるか、または類似している、核酸分子またはそのフラグメントおよびアミノ酸配列およびそのフラグメントを含む。一の具体例において、それぞれ、本発明の核酸分子またはタンパク質と他の核酸分子またはタンパク質間に、少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約５５％の同一性、少なくとも約６０％の同一性、少なくとも約６５％の同一性、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性または少なくとも約９９％の同一性がある。加えて、変異体は、定義したアグレカナーゼ活性を示すタンパク質またはポリペプチドを含む。
【００３８】
明細書および図面に記載した配列の同定を支援するために、配列番号、図面の場所および各配列の簡単な説明を示す、以下の表（表１）を提供する。
【表１】
2005515779.tif 000002
【００３９】
ＩＩ．新規アグレカナーゼ分子
一の具体例において、本発明のアグレカナーゼ分子のヌクレオチド配列は、配列番号１（図１Ａおよび１Ｂ）のヌクレオチド＃１−ヌクレオチド＃３６６３を含む、配列番号１に記載する。さらに、本発明は、アグレカナーゼ活性を示すタンパク質をコードする、配列番号１に記載の配列ならびにそのフラグメントおよび変異体の、等価縮重コドン配列を含む。本発明の核酸配列は、その天然に生じる配列および変異体および人工的に形成されるものを含む。本発明のアグレカナーゼ分子をコードする全長ヌクレオチド配列は、一の具体例において、例えば配列番号３に記載のヌクレオチド配列を用いることにより得ることができ、標準的な技法を用いるアグレカナーゼヌクレオチド配列のスクリーニング用のプローブを設計する。
【００４０】
単離アグレカナーゼ−様分子のアミノ酸配列を、配列番号２（図２）のアミノ酸＃１（メチオニン）−アミノ酸＃１２２１（イソロイシン）を含む、配列番号２に示す。
【００４１】
さらに、本発明は、アグレカナーゼ活性を示す分子をコードするアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【００４２】
本発明は、全長アグレカナーゼ分子を得る方法、該方法により得られるアグレカナーゼ分子をコードするヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質を含む。全長配列の単離方法は、例えば、スクリーニング用のプローブを構築するために配列番号３（図３Ａおよび３Ｂ）に示されるアグレカナーゼヌクレオチド配列を利用すること、または当業者に公知の標準的な方法を用いる全長ヌクレオチド配列の別のスクリーニングを含む。
【００４３】
ヒトアグレカナーゼタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号１から選択されたＤＮＡ配列で形質転換した細胞を培養し、同時に産生された他のタンパク性物質から実質的に遊離した配列番号２に示されるアミノ酸配列により特徴付けられるタンパク質を培地から回収し、精製することにより産生することができる。哺乳類の細胞における産生に関して、ＤＮＡ配列は、さらに適当なプロペプチド５’をコードし、アグレカナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列の骨格に結合する、ＤＮＡ配列を含む。
【００４４】
本発明の方法により産生されるヒトアグレカナーゼタンパク質は、アグレカンを切断する能力を有すること、および配列番号２から選択されるアミノ酸配列、天然に生じる変異タンパク質スプライス産物およびタンパク質が、アグレカナーゼタンパク質の特徴であるアグレカンを切断する能力を保持している他の変異体を含む配列番号２のアミノ酸配列の変異体を有することにより特徴付けられる。これらのタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、少なくとも約３０％の同一性、約３５％の同一性、約４０％の同一性、約４５％の同一性、約５０％の同一性、約５５％の同一性、約６０％の同一性、約６５％の同一性、約７０％の同一性、約７５％の同一性、約８０％の同一性、約８５％の同一性、約９０％の同一性、約９２％の同一性、約９４％の同一性、約９５％の同一性、約９６％の同一性、約９７％の同一性、約９８％の同一性または約９９％の同一性であるタンパク質を含有することができる。最終的に、配列番号２に示される配列の変異体を含み、変異、化学変換によるか、タンパク質の産生に用いられるＤＮＡ配列の変更により誘発さるアミノ酸変化、それによりペプチド配列が依然としてアグレカナーゼ活性を有するタンパク質も本発明に含まれる。また、本発明は、アグレカナーゼタンパク質の活性を保持する配列番号２のアミノ酸配列のフラグメントおよび同様のフラグメントの変異体を含む。
【００４５】
アグレカナーゼタンパク質およびそれをコードするＤＮＡ分子およびその変異体の同定
アグレカナーゼをコードするか、あるいは、アグレカナーゼ活性を有する関連タンパク質をコードするさらなるヒト配列が存在すること、および他の種がヒトアグレカナーゼ酵素の変異体であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を有することが期待される。したがって、本発明は、アグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびその変異体を得る方法、該方法により得られるＤＮＡ配列およびＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質またはポリペプチドを含む。一のかかる方法は、本発明のヌクレオチド配列またはその部分を用いて、他の種からの対応するヌクレオチド配列またはそのコーディング配列もしくはフラグメントに関するライブラリーを標準的な方法を用いてスクリーニングするためのプローブを設計することを含む。かくして、本発明は、アグレカナーゼまたはアグレカナーゼ−様ポリペプチドまたはその部分をコードし、ヒトアグレカナーゼヌクレオチド配列を用いて得ることができる種からのＤＮＡ配列を含んでいてもよい。また、本発明は、アグレカナーゼタンパク質の機能的フラグメント、およびかかる機能的フラグメントをコードするＤＮＡ配列ならびにアグレカナーゼまたはアグレカナーゼ−様活性を有する関連タンパク質の機能的フラグメントを含んでいてもよい。かかるフラグメントのアグレカナーゼのように機能する能力は、ポリペプチドまたはタンパク質を用いて、アグレカナーゼタンパク質の活性を測定することに関して記載された多くの生物学的アッセイの１つにより測定する。
【００４６】
例えば、図１Ａおよび１Ｂに示される配列番号１を、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑに対する質問に用いて、ヒトの類似したヌクレオチド配列を見出した。いくつかの配列は、配列番号１の全長または部分的核酸配列のいずれかと類似していることが同定された。公開された配列を、以下の受託番号により同定した：ＡＪ３１１９０３；Ａｘ３１９８５４（ＷＯ０１／１８３７８２の配列１８）；ＡＣ０２５２８４；ＡＣ０１０５４８；ＡＣ００９１３９；ＡＱ４０７９４９；ＡＱ３０９９９１；ＡＱ５４３１２５；ＡＱ０５２２４１；Ａｂｎ８９２７７（ＷＯ０２／２５０２５８に開示されている）；Ｇ６５５９１；Ｇ５３００９；ＢＤ０４０３９５；Ａｂｎ８９２７７；Ａａｓ９７１７６；Ａａｄ１６７５６；Ａａｄ１６７５９；Ａｂｑ７９９４８；Ａａｓ６５２８０；Ａａｄ１６７７１；Ａａｄ１６７７４；Ａａｓ７５２９３；Ａａｓ６５２７８；Ａａｃ１６６５０；Ａａｈ３６０７７；Ａｂａ１１５９２；Ａｂａ１５６５４；Ａｂａ１５６５３；およびＡｂａ１５６５５。
【００４７】
加えて、配列番号１を用いて、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの遺伝子の翻訳およびＧｅｎｅＳｅｑデータベースのタンパク質成分を含む、データベースＢＬＡＳＴＸをサーチした。サーチにより、下記受託番号により同定された配列を含むいくつかのヒトタンパク質配列が明らかとなった：ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＢＢ８４６０（ＷＯ０２／２５０，２５８に開示されている）；Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＡＣ８３６１２；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＵ７２８９３；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＥ０９６９６；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＥ０９６９９；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＢＢ８２１６２；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＥ０９７１１；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＢＧ１１１０６；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＢ０８９５４；およびＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＢ０８９１３。
【００４８】
同様の配列が、アグレカナーゼまたはアグレカナーゼ−様タンパク質をコードする傾向にある非ヒト種において示されることが期待される。アグレカナーゼタンパク質の種々の非ヒト変異体が、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を用いてＢＬＡＳＴＸデータベースをサーチすることにより同定された。これらは、例えばＢＡＣ３５５５６＿１（マウス）；ＡＡＨ３４７３９＿１（マウス）；ＢＡＣ２９１９０＿１（マウス）；ＡＡＯ１７３８０＿１（マウス）；ＢＡＣ３３３９１＿１（マウス）；ＡＡＧ２９８２３＿１（ラット）；ＡＡＤ３４０１２＿１（ラット）；ＢＡＡ１１０８８＿１（マウス）；ＢＡＡ２４５０１＿１（マウス）；ＡＡＨ４０３８２＿１（マウス）；ＣＡＡ６５２５３＿１（Bos. tauruas）；ＣＡＡ９３２８７＿１（シー・エレガンス（C. elegans））；ＡＡＦ４６０６５＿２（キイロショウジョウバエ（D. melanogaster））；ＡＡＮ１７３３１＿１（エクウス・キャバルス（Equus caballus））；ＡＡＭ５０１９２＿１（キイロショウジョウバエ）；ＡＡＦ５５１９９＿２（キイロショウジョウバエ）；ＡＡＦ２５８０５＿１（マウス）；ＡＡＧ３７９９５＿１（キイロショウジョウバエ）；ＡＡＧ４１９８０＿１（マウス）；ＡＡＤ５６３５６＿１（マウス）；ＡＡＦ５６７９４＿３（キイロショウジョウバエ）；ＡＡＦ５６７９５＿３；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＢＢ７１１５０（キイロショウジョウバエ）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＢ７２２８０（マウス）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＢＢ６２０４４（キイロショウジョウバエ）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＢ７２２８４（マウス）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＢ２１２６５（マウス）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＹ５３８９９（マウス）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＹ５３９００（ウシ）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＢＢ６０４１０（キイロショウジョウバエ）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＢ５０００４（ウシ）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＹ５３８９８（シー・エレガンス）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＷ４７０３０（ウシ）；ＧＥＮＥＳＥＱＰ：ＡＡＢ７２２８７（マウス）；ＮＲ：２５０５３１１３（マウス）；ＮＲ：２０８８８３６１（マウス）；ＮＲ：２３６３４３３６（マウス）；ＮＲ２７７２１０１９（ラット）；ＮＲ２７６８８２１１（ラット）；ＮＲ：２７７１２７３４；ＮＲ：２０８９８４１８（マウス）；ＮＲ：２７６８１７４３（マウス）；ＮＲ：２１２８８６９３（ガンビエハマダラカ（Anopheles gambiae））；ＮＲ：２７７０５９８２（ラット）；ＮＲ：２７６９３９３６（ラット）；ＮＲ：２７６６４３０６（ラット）；ＮＲ：２０８６１０５８（マウス）；ＮＲ：２７６８１７４７（ラット）；ＮＲ：２７７１９８３９（ラット）；ＮＲ：２５０５６８７４（マウス）；ａｎｄＮＲ：２５０５２４３１（マウス）を含む。
【００４９】
また、配列番号１のヌクレオチド配列と類似するいくつかのＥＳＴがＧｅｎｂａｎｋに公開されており、下記受託番号を含む：ＡＷ２９５４３７；ＢＦ２２４２７９；ＢＥ６７４４２５；ＢＦ５１２０７７；ＡＡ０５７０９７；ＡＡ０５７０９７；ＡＡ０５７４０８；ＡＶ７３０４２２；ＢＭ６９６２１５；ＢＭ６６４４８７；ＢＧ３９６０９０；ＢＥ２５３５４４；ＡＡ４４２５７５；およびＡＡ４３６８１９。
【００５０】
記載したＢＬＡＳＴサーチの結果に基づいて、ＥＳＴ１８ ｍＲＮＡが、カルチノイド組織、網膜芽細胞腫、網膜、睾丸、視床下部、腎臓および脳において発現されることが考えられる。加えて、ＥＳＴ１８の遺伝子は、ヒトのクロモソーム１６上に位置することが推測される。
【００５１】
配列番号１に示される全長ＥＳＴ１８配列を用いて、例えば、５’および３’スプライス変異体を含むＥＳＴ１８ ｍＲＮＡのスプライス変異体に関してＣｅｌｅｒａにより提供されたゲノム配列データベースをサーチした。予測スプライス変異体のいくつかが、受託番号：Ｇｅｎｅｓｅｑ：ａａｃ１６６５０；Ｇｅｎｅｓｅｑ：ａａｈ３６０７７；Ｇｅｎｅｓｅｑ：ａａｓ６５２７８；Ｇｅｎｅｓｅｑ：ａａｓ６５２７９；Ｇｅｎｅｓｅｑ：ａａｓ６５２８０；Ｇｅｎｅｓｅｑ：ａａｓ９７１７６；Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＪ３１１９０３；およびＧｅｎｂａｎｋ：ＡＸ３１９８５４により同定された。ＥＳＴ１８ヌクレオチド配列を有するこれらの配列の配列構造は、本明細書に記載された多くのスプライス変異体が、３’での相違を有することを示唆している。
【００５２】
Ｃｅｌｅｒａ単一ヌクレオチド多型データベースを配列番号１に記載の配列でサーチした。下記表は、かかるサーチの結果を概説し、これは例えば、あらゆる種族のヒトにわたって、ＥＳＴ１８配列内に見られる遺伝子変異を示す。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【００５３】
また、提供されるアグレカナーゼ分子は、配列番号１の配列と同様の配列であるが、天然に生じる修飾または欠失を含む配列、例えば、タンパク質または人工タンパク質のアミノ酸変更を生じさせうるヌクレオチド配列の対立変種によりコードされる因子を含む。例えば、合成タンパク質は、配列番号２のアミノ酸残基の完全または部分的に重複する連続配列であってもよい。これらの配列は、一次、二次または三次構造および配置特性がアグレカナーゼタンパク質と共通しているので、それと共通の生物学的特徴を有し得る。例えば、多くの保存的アミノ酸置換が、タンパク質の構造および配置を有意に修飾することなく可能であり、かくしてタンパク質の生物学的特性も維持されることが公知である。例えば、保存的アミノ酸置換は、の塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）およびヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）およびグルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）；非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）；無極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）およびシステイン（ＣｙｓまたはＣ）の間でなされてもよいことは明らかである。かくして、これらの天然のアグレカナーゼの修飾および欠失は、天然に生じるアグレカナーゼの生物学的活性置換として、および治療プロセスにおける阻害剤または他のタンパク質の開発に用いることができる。アグレカナーゼの変異体がアグレカナーゼの生物学的活性を維持するかどうかは、アグレカナーゼおよびアグレカナーゼの変異体ならびにその阻害剤を、実施例に記載のアッセイに付すことにより、容易に測定することができる。
【００５４】
所望のアミノ酸置換（保守的または非保守的かどうか）は、かかる置換を所望した時点で、当業者は容易に測定することができる。例えば、アミノ酸置換は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの重要なアミノ酸残基を同定するのに、または、本発明に記載のアグレカナーゼの活性を増加または減少させるのに用いることができる。代表的なアミノ酸置換を表３に示す。
【表１７】
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【００５５】
また、ある種の具体例において、保守的アミノ酸置換は、生物学的系での合成よりもむしろ化学ペプチド合成により典型的に組み入れられる天然に生じないアミノ酸残基を含む。
【００５６】
記載したアグレカナーゼタンパク質の配列他の特異的な変異は、グリコシル化部位の修飾を含む。これらの修飾はＯ−結合またはＮ−結合グリコシル化部位を含んでいてもよい。例えば、グリコシル化が存在しない、または部分的なグリコシル化だけの存在は、アスパラギン−結合グリコシル化認識部位でのアミノ酸置換または欠失に起因しうる。アスパラギン−結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、通常は、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリン（ここに、Ｘはアミノ酸でありうる）のいずれかである。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位の１つまたは両方での種々のアミノ酸置換または欠失（および／または第２位でのアミノ酸欠失）は、修飾トリペプチド配列での非グリコシル化を生じる。また、加えて、アグレカナーゼ−関連タンパク質の細菌発現も、グリコシル化部位が修飾されない場合でさえも、非グリコシル化タンパク質の産生を起こす。
【００５７】
ＩＶ．新規アグレカナーゼヌクレオチド配列
本発明の範囲内の核酸配列は、記載した天然のアグレカナーゼＤＮＡ配列と、中程度から高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする単離ＤＮＡおよびＲＮＡ配列を含む。ストリンジェント条件または高度にストリンジェントな条件は、一般的には、高温および低塩濃度を用いるハイブリダイゼーションおよび洗浄を意味する。また、加えて、ホルムアミドの含有もストリンジェンシーを増加させる。例えば、ホルムアミド非存在下５０〜６５℃のハイブリダイゼーション条件または５０％のホルムアミドと４２℃のハイブリダイゼーション条件は、両方とも高度なストリンジェンシー条件である。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、アグレカナーゼタンパク質分解活性またはアグレカナーゼの他の開示される活性を有するアグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列および遺伝子コードの縮重を除いて、配列番号１のＤＮＡ配列と同一であり、例えば配列番号２のアミノ酸配列を含むアグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその変異体を含む。
【００５９】
さらに、本発明は、高度〜中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号１のＤＮＡ配列とでハイブリダイゼーションし、アグレカンを切断する能力を有するタンパク質をコードする、ＤＮＡ配列を含む。一の具体例において、ＤＮＡ配列は、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするものを含む（Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 387-389 (1982)を参照）。かかるストリンジェントな条件は、例えば、０．１ＸのＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃が含まれる。ハイブリダイゼーションにより同定されたＤＮＡ配列は、例えば、配列番号２に示される配列と、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約９０％の同一性または少なくとも９５％の同一性であるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。また、配列番号１のＤＮＡと等価であるＤＮＡは、中程度にストリンジェントな条件下で、配列番号２のペプチド配列をコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする。
【００６０】
中程度にストリンジェンシーな条件は当該分野で公知のものであり、Sambrook et al. Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, Cold Spring Harbor Press. (1989)に定義されている。一の具体例において、例えば、中程度にストリンジェンシーな条件は、５ＸのＳＳＣ／０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予備洗浄溶液および約５５℃〜６０℃の温度でのハイブリダイゼーション条件および約５５℃で一晩５ＸのＳＳＣでの洗浄の使用を含む。当業者は、該条件が核酸配列の長さおよび組成のような因子により必要に応じて調整されうることは理解できるだろう。
【００６１】
最終的に、アグレカナーゼ活性を有する、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のペプチド配列変異体をコードする、配列番号１の配列の対立遺伝子または他の変異体も本発明に含まれる。加えて、本発明は、アグレカナーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列番号１に示されるＤＮＡ配列のフラグメントおよび配列番号１の変異体を含む。
【００６２】
また、同様に、配列番号２に示された配列を含むが、遺伝子コードの縮重または対立変種（アミノ酸変化を生じさせうるか、または生じさせることができない種における、天然に生じる塩基変化）のためにコドン配列が配列番号１と異なる、アグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列も、記載される新規因子をコードする。点突然変異により、それによりコードされるタンパク質の活性、半減期または産生を増強するための誘導修飾により引き起こされる配列番号１のＤＮＡ配列の変異も本発明に含まれる。本発明のＤＮＡ配列は、例えば、所定の細胞群におけるアグレカナーゼをコードするｍＲＮＡの検出用のプローブとして有用である。かくして、本発明は、アグレカナーゼタンパク質が関与する疾患および遺伝子障害、またはアグレカナーゼが異常に転写または発現された細胞性、器官性または組織性障害を含む障害を検出または診断する方法を含む。また、アンチセンスＤＮＡ配列は、遺伝子治療における適用のためのベクターを調製するのに有用でありうる。また、アンチセンスＤＮＡ配列は、例えば、アンチセンスＤＮＡと内因性アグレカナーゼ配列との相互作用を研究するため、およびさらにアンチセンスＤＮＡが細胞内でどれだけ産生されたかの指標としてのベクター内の安置千つＤＮＡ配列に作用的に結合したプロモーターの能力を試験するため、細胞へアンチセンスＤＮＡ配列を誘導する、細胞または器官に関与するインビボ法においても有用である。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、そのための発現制御配列に作用的に結合する上記したＤＮＡ配列を含むベクターを含む。これらのベクターは、そのための発現制御配列と作用的に結合したアグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列で形質転換した細胞を、適当な培地中で培養し、ついでアグレカナーゼタンパク質をそれから回収および精製する、本発明のアグレカナーゼタンパク質を産生するための新規方法に用いることができる。この方法は、タンパク質の発現のための宿主細胞として、原核細胞および真核細胞両方の多数の公知の細胞を用いることができる。ベクターは、遺伝子治療において用いることができる。かかる使用において、ベクターは、エキソビボで患者の細胞にトランスフェクトしてもよく、細胞を患者に再導入することもできる。別法として、ベクターは、患者にターゲットトランスフェクションによりインビボで導入することができる。
【００６４】
Ｖ．アグレカナーゼタンパク質の産生
本発明の他の態様により、新規アグレカナーゼタンパク質を産生するための方法を提供する。一の具体例において、本発明の方法は、公知の調節配列の制御下で、配列番号１に示される配列で形質転換し、配列番号２に示される本発明のアグレカナーゼタンパク質中にＤＮＡを翻訳する、適当な細胞株を培養することを含む。形質転換した宿主細胞を培養し、アグレカナーゼタンパク質を、培地から回収して、単離した。単離発現タンパク質は、同時に産生される他のタンパク質ならびに他の混入物質から実質的に分離している。回収した単離タンパク質は、アグレカンを切断すると考えられるタンパク質分解アグレカナーゼ活性を示す。かくして、本発明のタンパク質は、アグレカン変性分子の存在を測定するアッセイにおけるアグレカナーゼタンパク質分解活性を示す能力により、さらに特徴づけることができる。これらのアッセイまたはその開発は、当業者の知識の範囲内にある。かかるアッセイは、アグレカン基質をアグレカナーゼ分子と接触させ、アグレカンフラグメントの産出をモニターすることを含みうる（例えば、Hughes et al., Biochem J 305: 799-804 (1995); Mercuri et al., J Biol. Chem 274:32387-32395 (1999)を参照）。適当な細胞または細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳類細胞であってもよい。適当な哺乳類宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の産生および精製方法は、当該分野で公知である（例えば、Gething and Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981); Kaufman et al., Mol Cell Biol, 5(7):1750-1759 (1985); Howley et al., U.S. Patent 4,419,446.）を参照）。本明細書中の実施例に記載する他の適当な哺乳類細胞株は、サルの腎臓ＣＯＳ−１細胞株である。哺乳類細胞ＣＶ−１も用いることができる。
【００６５】
また、細菌細胞も本発明のタンパク質またはポリペプチドを発現するのに適当な宿主であり得る。例えば、イー・コリの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）がバイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・サブチリス（B. subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）、他のバシリ（bacilli）などの種々の株も、本発明の方法に用いることができる。細菌細胞におけるタンパク質の発現のためには、アグレカナーゼのプロペプチドをコードするＤＮＡが、一般的に必要ではない。
【００６６】
当業者に公知の多くの酵母細胞株は、本発明のタンパク質またはポリペプチドの発現のための宿主細胞として用いることができる。加えて、要すれば、昆虫細胞は、本発明の方法において、宿主細胞として用いることができる。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298（Plenum Press 1986）を参照のこと。
【００６７】
本発明の他の態様により、これら新規アグレカナーゼタンパク質の発現方法に用いるためのベクターを提供する。一の具体例において、本発明のベクターは、本発明の新規因子をコードする前記の全長ＤＮＡ配列を含む。加えて、ベクターは、アグレカナーゼタンパク質配列の発現を可能にする適当な発現制御配列を含む。別法として、上記したような修飾された配列を組み込んでいるベクターも本発明の具体例である。加えて、配列番号１の配列またはアグレカナーゼタンパク質をコードしている他の配列を操作して、合成のアグレカナーゼタンパク質を発現させることができる。かくして、本発明は、異なるアグレカナーゼタンパク質に結合している配列番号２のフラグメントを含むアグレカナーゼタンパク質を含む組み換えタンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を含む。かかる組み合えまたは融合タンパク質は、異なるアグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡで、配列番号１に示したアグレカナーゼ分子のフラグメントをコードするＤＮＡを結合させることにより産生することができる。配列番号２に示されるアグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡまたはそのフラグメントもしくは変異体は、異なるアグレカナーゼをコードするＤＮＡの３’または５’のいずれかで結合することができる。本発明のアグレカナーゼ分子の発現に用いられるベクターは、細胞株を形質転換する方法に用いることができ、一般的には、本発明のＤＮＡ配列に作用的に結合したアグレカナーゼの複製および発現を検出することができる選択された調整配列を含む。かかるベクターに関する調整配列は、当業者に公知のものであり、宿主細胞に応じて選択されうる。かかる選択は慣用的なものであり、本発明の一部を形成するものではない。
【００６８】
当業者は、例えば、配列番号１またはアグレカナーゼ−関連タンパク質をコードする他のＤＮＡ配列または他の修飾配列および公知のベクター、例えばｐＣＤ(Okayama et al., Mol Cell Biol, 2:161-170 (1982)）、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４（Goughetal., EMBOJ, 4:645-653 (1985)）およびｐＭＴ２ＣＸＭを含む配列を用いることにより、哺乳類発現ベクターを構築することができる。加えて、当業者は、アグレカナーゼタンパク質の組み換え形態、例えばｒＡ１８ＦＳを、選択した発現系で発現するのに適した発現ベクターを用いることができる。
【００６９】
ベクターの構築は、アグレカナーゼ関連ＤＮＡ配列の修飾を含んでいてもよい。例えば、アグレカナーゼｃＤＮＡは、コーディング領域の５’および３’末端における非コーディングヌクレオチドを除去することにより修飾することができる。欠失した非コーディングヌクレオチドを、発現に有益であることが公知の他の配列により置き換えても、置き換えなくてもよい。これらのベクターを、アグレカナーゼまたはアグレカナーゼ関連タンパク質の発現のために、適当な宿主細胞へと形質転換する。加えて、配列番号１の配列、またはアグレカナーゼもしくはアグレカナーゼ関連タンパク質をコードしている他の配列を操作して、プロペプチド配列をコードしているアグレカナーゼを削除し、それらを他のアグレカナーゼタンパク質の完全なプロペプチドをコードしている配列と置換することにより、成熟アグレカナーゼまたはアグレカナーゼ関連タンパク質を発現させることができる。
【００７０】
当業者は、コーディング配列に隣接している哺乳類調節配列を排除すること、またはそれを細菌配列と置換することにより、配列番号１の配列を操作して、細菌細胞による細胞内または細胞外発現のための細菌ベクターを作製することができる。例えば、コーディング配列をさらに操作する（例えば、他の公知のリンカーにライゲートする、またはそれから非コーディング配列を削除すること、またはその中のヌクレオチドを他の公知の方法により変化させることにより修飾する）ことができる。ついで、修飾されたアグレカナーゼ関連コーディング配列を、公知の細菌ベクターに、Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980)に開示されているような方法を用いて挿入することができる。ついで、この典型的な細菌ベクターを、細菌宿主細胞へと形質転換して、それによりアグレカナーゼ関連タンパク質を発現させることができる。アグレカナーゼ関連タンパク質の細菌細胞中での細胞外発現を生じさせるための方法に関しては、欧州特許出願ＥＰＡ１７７，３４３号を参照のこと。
【００７１】
ついで、同様の操作を、昆虫細胞中での発現を行うための昆虫ベクターの構築のために行うことができる（例えば、欧州特許出願ＥＰＡ１５５，４７６号を参照）。また、酵母ベクターを、本発明のファクターの酵母細胞による細胞内または細胞外発現のための酵母調節配列を用いて構築することもできる（例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９号および欧州特許出願ＥＰＡ１２３，２８９号を参照）。
【００７２】
哺乳類、細菌、酵母または昆虫宿主細胞系において高レベルの本発明のアグレカナーゼ関連タンパク質を産生する方法は、異種構造アグレカナーゼ関連遺伝子の多コピーを含んでいる細胞の構築を含み得る。異種構造遺伝子を、Kaufman and Sharp, J Mol Biol, 159:601-629 (1982)の方法に従って、メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を増加した場合に、増加した遺伝子のコピーを含有する細胞を増殖に対して選択することができる増幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に結合する。この手段は、多くの異なる細胞型を用いて行うことができる。
【００７３】
例えば、その発現を可能にする他のプラスミド配列と作用的に結合する本発明のアグレカナーゼ関連タンパク質に関するＤＮＡ配列を含んでいるプラスミドおよびＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３（Kaufman and Sharp, Mol Cell Biol 2:1304 (1982)）を、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩに、リン酸カルシウム共沈法およびトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合を含む種々の方法により同時導入することができる。ＤＨＦＲ発現形質転換体を、透析したウシ胎児血清を含むアルファ培地中での増殖に関して選択し、ついで、Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983)に記載されているようなＭＴＸの濃度を増加させる（例えば、０．０２、０．２、１．０、および５μＭＭＴＸの連続工程）増殖による増幅に関して選択する。形質転換体をクローン化し、生物学的に活性なアグレカナーゼの発現を上記のアッセイによりモニターする。アグレカナーゼタンパク質発現は、ＭＴＸ抵抗性のレベルの上昇と共に増すはずである。アグレカナーゼタンパク質は、３５Ｓメチオニンまたはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当該分野で公知の標準的な方法を用いて特徴付ける。同様の方法を、他の関連するアグレカナーゼ関連タンパク質を産生するために行うことができる。
【００７４】
また、本発明のアグレカナーゼタンパク質は、タンパク質配列、例えば、配列番号２に示される配列またはそのフラグメントもしくは変異体、例えば、タグ、すなわち、アグレカナーゼタンパク質のアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは変異体中のアミノ末端、カルボキシ末端、またはいずれの位置に加えられる、第２のタンパク質あるいは１つまたはそれ以上のアミノ酸、約２〜５０のアミノ酸または約５０〜約１００のアミノ酸を含む融合タンパク質として発現される。典型的には、かかるアミノ酸タグは、得られた融合タンパク質を安定化させるか、あるいは、対応するアグレカナーゼタンパク質またはかかるタンパク質のフラグメントもしくは変異体の、例えば本発明のアグレカナーゼタンパク質の切断形態を含む、発現組み換え形態精製を単純化させる。かかるタグは当該分野で公知のものである。かかるタグの代表例としては、一連のヒスチジン残基、エピトープタグＦＬＡＧ、単純ヘルペス糖タンパク質Ｄ、ベータ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、ストレプトアビジンタグまたはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードする配列が挙げられる。
【００７５】
ＶＩ．抗体の産生
本発明の単離タンパク質を用いて、アグレカナーゼおよび／または他のアグレカナーゼ関連タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナルいずれかの抗体を、当該分野で一般的に知られている抗体産生方法を用いて産生することができる。かくして、本発明は、アグレカナーゼまたは他の関連タンパク質に対する抗体も含む。抗体は、アグレカナーゼ活性を遮断する抗体および遮断しない抗体の両方を含む。抗体は、アグレカナーゼまたは関連タンパク質の検出および／または精製に有用であり、またはアグレカナーゼの作用を阻害または予防するのに有用であり得る。本発明のアグレカナーゼまたはその部分は、アグレカナーゼに特異的に結合する抗体を調製するのに利用することができる。
【００７６】
抗体は、例えば、慣用的なハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256:495-499 (1975)）、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）または抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法（Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)）により産生することができる。種々の抗体産生法に関しては、抗体：研究室マニュアル、eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照のこと。
【００７７】
タンパク質は、疎水性であるセクションおよび親水性であるセクションを含むある種の生化学的特性を有することが知られている。疎水性セクションは、折り畳みタンパク質の構造の内部に位置していることが最も多いが、親水性セクションは、折り畳みタンパク質の構造の外部に位置していることが最も多い。配列番号２に示されるタンパク質の疎水性は、プロットストラクチャー（plotstructure）と称されるＧＣＧプログラムを用いて測定した。図９に示すように、結果は、配列番号２のタンパク質が、いくつかの親水性である領域を有しており、したがって、折り畳みタンパク質の表面にまで及んでいることを示している。例えば、アミノ酸５０と１００の間には、親水性ならびに抗原性であると推測される領域が存在する。かかる抗原性領域は、抗体の産生に用いることができる。
【００７８】
本発明の抗体は、下記する疾患の治療に用いることができる。また、該抗体は、上記アッセイ法および検出法においても用いることができる。
【００７９】
ＶＩＩ．阻害剤の開発
変形性関節症のような種々の症状が、アグレカンの分解により特徴付けられることは公知のことである。したがって、アグレカンを切断する本発明のアグレカナーゼタンパク質は、アグレカナーゼの阻害剤を開発するのに有用であり得る。したがって、本発明は、アグレカナーゼ阻害剤を含有する組成物を提供する。該阻害剤は、後でアグレカンに暴露する、アグレカナーゼ活性の阻害剤を含むアグレカン基質の混合物が関与するクリーニングアッセイにおいて、アグレカナーゼ分子を用いて開発することができる。該阻害剤は、高速処理を用いて、例えば阻害剤のライブラリーをスクリーニングすることによりスクリーニングすることができる。また、該阻害剤は、三次元構造分析および／またはコンピュータ薬剤設計を用いて作成することもできる。該方法は、アグレカナーゼおよびアグレカンの三次元構造に基づく阻害剤の結合部位を決定すること、およびアグレカナーゼまたはアグレカンの結合部位に対して反応性である分子を開発することを含みうる。候補分子を阻害活性に関してアッセイする。アグレカナーゼ分子の阻害剤を開発するためのさらなる標準的な方法は、当業者に公知のものである。阻害剤に関するアッセイは、アグレカンおよび阻害剤の混合物をアグレカナーゼ分子と接触させ、ついで、アグレカナーゼ感受性部位での切断により産生されるアグレカンフラグメントを検出および測定することにより、アグレカナーゼ阻害の測定を行うことを含む。阻害剤は、タンパク質または小分子であってもよい。
【００８０】
ＶＩＩＩ．疾患の治療および診断
アグレカナーゼ活性の阻害剤は、下記疾患の治療に用いることができる。また、阻害剤は、上記アッセイおよび検出方法においても用いることができる。本発明のアグレカナーゼの阻害剤を用いることにより治療することができると考えられる種々の疾患は、限定するものではないが、変形性関節症、癌、炎症性関節疾患、関節リウマチ、敗血症性関節炎、歯周病、角膜潰瘍、タンパク尿、動脈硬化性プラーク破裂からの冠状動脈血栓症、動脈瘤性大動脈疾患、炎症性腸疾患、クローン病、気腫、急性呼吸窮迫症候群、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アルツハイマー病、脳および造血器悪性腫瘍、骨粗鬆症、パーキンソン病、偏頭痛、鬱病、末梢神経障害、ハンチントン病、多発性硬化症、眼の血管新生、黄斑変性症、大動脈瘤、心筋梗塞、自己免疫疾患、外傷性関節傷害後の変性軟骨損失、頭部外傷、ジストロフィー性表皮水疱症、脊髄損傷、急性および慢性神経変性疾患、骨骨膜炎、側頭骨顎関節疾患、神経系の脱髄性疾患、臓器移植毒性および拒絶反応、悪液質、アレルギー、組織性潰瘍、再狭窄およびアグレカナーゼ活性またはアグレカナーゼレベルの変化により特徴付けられる他の疾患を含む。
【００８１】
アグレカナーゼの活性を阻害する本発明の阻害剤および抗体および／またはアグレカナーゼの発現を低下させる化合物は、アグレカナーゼおよびアグレカナーゼ−関連タンパク質による、細胞外マトリックスタンパク質、例えばアグレカンの分解に関与する哺乳類のいずれの疾患を治療するのに用いることができることを意図する。
【００８２】
ＩＸ．投与
本発明の他の態様により、医薬上許容されるビヒクル中に治療的に有効な量の少なくとも１つのアグレカナーゼ抗体および阻害剤を含有する医薬組成物を提供する。軟骨細胞におけるアグレカンのアグレカナーゼ介在分解は、骨関節症および他の炎症性疾患に関与している。したがって、本発明のこれらの組成物は、アグレカンの分解および／またはアグレカナーゼ活性またはアグレカナーゼのレベルのアップレギュレーションにより特徴づけられる疾患の治療に用いることができる。
【００８３】
本発明は、アグレカンの分解により特徴づけられる症状を患っている患者を治療する方法を含む。これらの方法は、本発明により、かかる治療を必要としている患者に、有効量の、アグレカナーゼ抗体またはアグレカナーゼ酵素のタンパク質分解活性を阻害する阻害剤を含む組成物を投与することを含む。
【００８４】
本発明の抗体および阻害剤は、ヒトまたは動物における種々の医学的障害を診断または治療するのに有用である。一の具体例において、本発明の抗体は、同じ抗体が結合していないアグレカナーゼタンパク質と比較して、アグレカナーゼタンパク質に関連する１つまたはそれ以上の活性を阻害または低下させるのに用いることができる。一の具体例において、本発明の抗体および阻害剤は、抗体が結合していないアグレカナーゼと比較して、１つまたはそれ以上のアグレカナーゼ分子の活性を阻害または減少させることができる。ある種の具体例において、アグレカナーゼの活性は、開示する抗体の１つまたはそれ以上が結合している場合、開示する抗体の１つまたはそれ以上が結合していないアグレカナーゼタンパク質に対して、少なくとも５０％で阻害され、少なくとも６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、７８、８０、８２、８４、８６または８８％で阻害されてもよく、少なくとも９５％〜１００％で阻害されていてもよい。
【００８５】
一般的には、本発明の組成物は、抗体またはそのフラグメントが、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇまたは約５００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの投与量範囲で投与されるように、患者に投与する。また、継続注入は、最初のボーラス投与後に用いることができる。
【００８６】
別の具体例において、本発明は、アグレカナーゼ、例えばタンパク質および小分子の阻害剤の投与に関する。阻害剤の有効量とは、アグレカナーゼの活性を低下させて所望の生物学的効果を得るのに有効な投与量である。一般的には、阻害剤を投与するのに適した治療的投与量範囲は、例えば、約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１５ｍｇ〜約８５ｍｇ、約３０ｍｇ〜約７０ｍｇまたは約４０ｍｇ〜約６０ｍｇの範囲であってもよい。阻害剤は、１回で投与してもよく、または１日１回、週１回または月１回のように間隔をあけて投与することができる。アグレカナーゼ阻害剤の分解に関する投与スケジュールは、例えば、そのアグレカナーゼ標的に対する阻害剤のアフィニティー、阻害剤の半減期および患者の症状の重篤度に基づいて調節することができる。一般的には、阻害剤は、ボーラス投与として投与して、その循環レベルを最大限にする。継続注入は、最初のボーラス投与後に用いることができる。
【００８７】
かかる化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致命的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な投与量）を決定するための、細胞培養物または実験動物モデルにおいて標準的かつ医薬的な方法により、測定することができる。毒性および治療的効果の間の投与比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。大きな治療指数を示す抗体および阻害剤が、一般的には好ましい。
【００８８】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトにおいて用いるための投与量の範囲を計算するのに用いることができる。かかる化合物の投与量は、ほとんどまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を示す循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投与形態および用いられる投与経路に応じてこの範囲内で変化してもよい。本発明により用いられるいずれの抗体および阻害剤に関して、治療的に有効な投与量は、最初に細胞培養アッセイから見積もることができる。投与量を動物モデルにおいて処方して、細胞培養物により測定されるＩＣ５０（即ち、症状の最大限の阻害の半分を達成する試験抗体の濃度）を示す循環血漿濃度範囲を得ることができる。血漿におけるレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。いずれかの特定の投与量の効果は、適当な生物学的アッセイによりモニターすることができる。適当なバイオアッセイの例としては、ＤＮＡ複製アッセイ、転写に基くアッセイ、ＧＤＦタンパク質／受容体結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前肥満細胞の分化に基くアッセイ、肥満細胞におけるグルコースの取り込みに基くアッセイおよび免疫学的アッセイが挙げられる。
【００８９】
本発明の治療法は、アグレカナーゼ阻害剤組成物を、局所、全身またはインプラントまたはディバイスのような局所投与することを含む。投与計画は、アグレカナーゼタンパク質の活性を修飾する種々の因子、病理部位、疾患の重篤度、患者の年齢、性別および食事、いずれの炎症の重篤度、投与回数および他の臨床因子に基づいて主治医の判断により決定される。一般的には、全身または注射可能な投与は、最低限有効である投与量で開始され、投与量は、ポジティブな効果が認められるまで、予め選択した時間経過に渡って増加するだろう。続いて、投与量の相対的な増加は、効果の対応する相対的な増加を生じるようなレベルに制限するが、生じ得るいずれの副作用を考慮に入れて為す。他の公知の因子を最終組成物に加えることにより投与量は影響されうる。
【００９０】
進行は、疾患の進行の定期的な評価によりモニターすることができる。進行は、例えば、Ｘ−線、ＭＲＩまたは他の画像化モダリティ、滑液分析、患者の認知および／または臨床試験によりモニターすることができる。
【００９１】
Ｘ．検出のアッセイおよび方法
本発明の阻害剤および抗体は、サンプル中のアグレカナーゼの存在または不在を測定するための、またはそれを定量するためのアッセイおよび検出方法に用いることができる。本発明の阻害剤および抗体を用いて、インビボまたはインビトロでアグレカナーゼタンパク質を検出することができる。これらのタンパク質の存在またはレベルを疾患と関連づけることにより、当業者は、関連する疾患を診断し、その重篤度を決定することができる。開示される阻害剤および抗体により診断され得る疾患は上記した。
【００９２】
抗体との使用に関する検出方法は当該分野でよく知られており、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット、ウェスタンブロット、免疫蛍光法、免疫沈降法および他の匹敵する方法を含む。さらに、抗体は、タンパク質（例えば、アグレカナーゼタンパク質）を検出するためのこれらの方法の１つまたはそれ以上を組み込む診断キットに与えられてもよい。かかるキットは、アグレカナーゼタンパク質の検出を補助する他の成分、パッケージング、説明書または他の物質およびキットの使用に関する説明書を含んでいてもよい。タンパク質阻害剤をかかる診断アッセイに用いる場合、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイを用いることができる。
【００９３】
抗体および阻害剤が診断を目的とする場合、例えば、リガンド群（例えば、ビオチン）または検出可能なマーカー群（例えば、蛍光群、放射性同位元素または酵素）でそれらを修飾することを所望することができる。所望により、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれか）は、慣用的な方法を用いて標識化することができる。適当な標識は、フルオロフォア、クロモフォア、放射活性原子、電子密度試薬、酵素および特異的結合パートナーを有するリガンドを含む。酵素は、典型的にはその活性により検出される。例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼは、スペクトロフォトメーターを用いて定量可能な、テトラメチルベンズイジン（ＴＭＢ）を青色色素に変換するその能力により検出することができる。他の適当な結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびタンパク質Ａおよび当該分野で公知の多くの受容体リガンド結合体を含む。
【００９４】
実施例
実施例１：ＤＮＡの単離
潜在的な新規アグレカナーゼファミリーメンバーを、データベーススクリーニング法を用いて同定した。アグレカナーゼ−１（Science 284:1664-1666 (1999)）は、少なくとも６つのドメイン：シグナル、プロペプチド、触媒ドメイン、ディスインテグリン、ｔｓｐ（トロンボスポンジン）およびｃ−末端を有する。触媒ドメインは、亜鉛結合特性領域、ＴＡＡＨＥＬＧＨＶＫＦ（配列番号６）および「ＭＥＴターン」を含み、これらがプロテアーゼ活性の原因である。多くの位置における亜鉛結合領域内での置換により、プロテアーゼ活性が許容されるが、ヒスチジン（Ｈ）およびグルタミン酸（Ｅ）残基は存在しなければならない。また、アグレカナーゼ−１のトロンボスポンジンドメインは、基質の認識および切断に重要なドメインである。これら２つのドメインは、新規アグレカナーゼファミリーメンバーの分類を決定する。アグレカナーゼ−１ＤＮＡ配列のコーディング領域を用いて、ヒトＥＳＴに関してGeneBank ESTに、TBLASTNを用いて問い合わせた。得られた配列は、潜在的なファミリーメンバーの配列を同定する試みにおける開始点であった。本発明のアグレカナーゼの特定のヌクレオチド配列を、ＡＤＡＭＴＳ−１８またはＥＳＴ１８と呼ばれ、図１Ａおよび１Ｂ（配列番号１）に示す。
【００９５】
仮想ＥＳＴ１８配列を図５Ａおよび５Ｂ（配列番号５）に示す。最初の仮想配列に基づいて、ＰＣＲプライマーのセットは、ＥＳＴ１８のプロおよび触媒ドメインに及ぶ約１２００塩基対を増幅するように設計した。このプライマーセットを、異なる型の組織からのｃＤＮＡ分子をスクリーンして、アグレカナーゼ分子の組織源を同定するために用いた。組織源を同定すると、ＥＳＴ１８の２つのオーバーラップフラグメントを、ｃＤＮＡ分子を用いるＰＣＲにより増幅し、増幅したフラグメントを、配列決定のためのベクターにクローン化した。クローン化した配列は予想した配列とは異なり、したがって、各々の反応の多数のレプリカーゼをクローン化し、３つの別個の組織源から配列決定した。すべてのクローンの配列分析に基づいて、３２１９塩基対のコンセンサスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を決定した（配列番号３）。この３２１９ｂｐ ＯＲＦフレームは、さらに下記するように、全長遺伝子を意味するものではないと考えられる。得られた配列は、全長配列をスクリーニングおよび単離するのに利用することができる。ＰＣＲ条件を、エラーの導入が促進されたＥＳＴ１８配列を増幅するのに用いるので、３２１９ｂｐ ＯＲＦは、多数のオーバーラップフラグメントを増幅し、それらを特異的な制限酵素で消化し、ついで、ｐＥＤと称される哺乳類の発現ベクターに最終的にライゲーションすることにより構築されなければならない。
【００９６】
特に、マラソン−レディー（marathon-ready（登録商標））ｃＤＮＡ、脳、胃および胸腺（Clontech, PaloAlto, CA）を、すべてのＰＣＲクローニング反応のテンプレートとして用いた。すべてのＰＣＲ反応を、下記サイクリングパラメータを用いてPerkin-Elmer 9600 thermocycler (Wellesley, MA）で行った：９４℃で３０秒、９４℃で５秒を５サイクル、７２℃で４分、９４℃で５秒を５サイクル、７０℃で４分、９４℃で５秒を３０サイクル、６８℃で４分。ClontechのAdvantage（登録商標）ＧＣ２ポリメラーゼを、最終濃度０．５ＭのＧＣ−ｍｅｌｔで、業者の指示に従って用いた（Clontech, Palo Alto, CA）。ＥＳＴ１８の推定全長ヌクレオチドの各々のフラグメントを増幅するのに用いられる種々のプライマーセットを、配列番号９、１０、１１および１２に示す配列として、図６Ａに示す。
【００９７】
ＰＣＲ産物を、図６Ｂに示した異なる酵素で消化し、ついで、１または１．５％のアガロースゲルに分画した。特定の消化された大きさに対応するＤＮＡバンドを、ゲルから回収した。ライゲーション反応は、等モル比の消化されたＤＮＡフラグメントとベクターｐＥＤをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで予備消化することを含む。種々の増幅フラグメントを用いる特定のｃＤＮＡ構築は、ＤＮＡ配列により確認し、図３に示した（配列番号３）。
【００９８】
本発明のアグレカナーゼの推定アミノ酸配列（配列番号４）を図４に示す。クローン化した配列は、３ＴＳＰサブ−モチーフを有することが明らかである。ＡＴＳＰサブ−モチーフは、約５０のアミノ酸として記載され、これは、シグニチャーＷＸＸＸＸＷで開始され、６つのシステイン残基を含有する。図４に示される配列におけるこの第３のサブ−モチーフは、４１のアミノ酸からなり、ＷＸＸＸＸＷで開始され、４システインを含有する。したがって、少なくとも１０の付加的なアミノ酸があると考えられ、付加的なＴＳＰサブモチーフは存在しないと推測される。本発明の多数のアグレカナーゼは、３つの組織源：脳、胃および胸腺において見られる。
【００９９】
図４に示される本発明のアグレカナーゼ分子は、以下のように特徴付けられる：プレ−プロ領域シグナル配列：
【化１】
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は、３つの保存システイン残基およびフリン部位を含有する。触媒ドメインは、典型的な亜鉛結合モチーフにより特徴付けられる。亜鉛結合配列のアップストリームに５つの保存システイン残基および亜鉛結合配列のダウンストリームに３つの残基を含有する。また、亜鉛結合配列のダウンストリームに保存メチオニン「Ｍｅｔ−ｔｕｒｎ」を含有する。ディスインテグリン−様ドメインは、８つのシステイン残基を含有する。ＴＳＰモジュールは、ヘパリン結合ドメイン（ＷＸＸＷＸＸＷ）；ＣＤ３６−結合モチーフ（ＣＳＲＴＣＧＧ）（配列番号１５）；および６つの保存システイン残基を含有する。システインに富むドメインは、１０の保存システインを含有することにより特徴付けられる。このスペーサードメインは、２つ半がクローン化されている、ＴＳＰ−リピートにより特徴付けられる。アグレカナーゼのＮ−末端部位は、上記の配列を用いてクローン化することができる。ＴＳＰサブ−モチーフは、シグニチャーＷＸＸＸＸＷにより開始され、６つのシステインを含有する。図４の第３のモチーフは、４つのシステインを有する。
【０１００】
ＡＤＡＭＴＳ−１８ヌクレオチド配列は、５’および３’ＲＡＣＥの本来の配列全体に及んだ。胸腺Marathon-Ready（登録商標）ｃＤＮＡは、ＰＣＲクローニング反応のテンプレートとして使用するために、Clontech（Palo Alto, CA）から購入した。アンチセンスプライマー５’ＴＧＧＴＡＴＧＡＴＴＣＡＣＧＡＣＧＧＡＧＡＡＧＧＧ（配列番号１６）は、第１回目の５’ＲＡＣＥ反応に用いられ、センスプライマー５’ＣＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＣＡＣＧＴＡＣＴＧＴＡ（配列番号１７）は、第１回目の３’ＲＡＣＥ反応に用いられ、その両方はＡＰ−１末端プライマーと組み合わせて、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡｓに特異的である。Clontech Advantage（登録商標）ＧＣ２ポリメラーゼ試薬（Clontech, Palo Alto, CA）を、業者の指示に従って用いた。すべての増幅を、Perkin-Elmer９６００サーモサイクラー（Perkin Elmer, Wellesley, MA）で行った。サイクリングパラメータは、９４℃で３０秒、９４℃で５秒を５サイクル、７２℃で４分、９４℃で５秒を５サイクル、７０℃で４分、９４℃で５秒を３０サイクル、６８℃で４分である。第１回目の反応物をＴＥで１０倍希釈し、５μｌの反応混合物を、第２回のＰＣＲのテンプレートとして用いた。アンチセンスプライマー５’ＡＡＣＣＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＣＡＡＧ（配列番号１８）を、第２回の５’ＲＡＣＥに用い、センスプライマー５’ＴＣＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＣＧＣＣＣＧＡＡＧＣＡＴ（配列番号１９）を第２回の３’ＲＡＣＥに、ＡＰ−２末端プライマーがＭａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡに特異的であることを除いて、第１回目に記載と同一のパラメータを利用して用いた。各々の反応物のアリコートを、１％のアガロースゲル上に分画し、ついで、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析に対してニトロセルロースに移した。ニトロセルロース員を、業者の指示に従って、Clontech ExpressHyb（登録商標）（Clontech, Palo Alto, CA）中に３７℃で３０分間予備ハイブリダイゼーションした。ついで、メンバーを１×１０６ＣＰＭのα−ＡＴＰ末端−標識オリゴ５’ＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＣＧＧＴＣＧＣ（配列番号１１）（５’ＲＡＣＥ）または５’ＧＡＴＡＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＧＣ（配列番号２０）（３’ＲＡＣＥ）と、３７℃で１時間インキュベーションした。未結合プローブを、２ＸのＳＳＣ／０．０５％のＳＤＳにより室温で２回洗浄し、ついで、さらに０．１ＸのＳＳＣ／０．１％のＳＤＳにより室温で洗浄して除去した。複製アガロースゲルを行い、自動放射線写真での陽性シグナルに一致するＰＣＲ生成物を、アガロースゲルの外に除去し、ＤＮＡを、ＢｉｏＲａｄのＰｒｅｐ−Ａ−ＧｅｎｅＤＮＡ精製系によりゲルマトリックスから回収した（Biorad, Hercules, CA）。回収したＤＮＡを、業者の指示に従って、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ａｍｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Stratagene, La Jolla, CA）にライゲーションした。
【０１０１】
ライゲーション混合物のアリコートを、Gibco Technologies Electromax ＤＨ１０Ｂ細胞に、業者の指示に従って形質転換した（Carlsbad, CA）。続いて、プラスミドＤＮＡを、得られた組み換え細菌から単離し、ＤＮＡの配列を決定した。一の具体例において、５’ＲＡＣＥ反応により、総じて１０６５塩基、１５６塩基の５’ＵＴＲ、ついで、第２回のアンチセンスプライマーに記載した配列（配列番号１８）のオープンリーディングフレームで停止する９０９塩基対を開始させるメチオニンを得た。３’ＲＡＣＥ反応により、総じて２３６８の塩基、形質転換停止コドン、１００７塩基対の３’ＵＴＲで停止する、第２回のセンスプライマー（配列番号１９）として記載した配列で開始される配列をコードする１３５８の塩基を得た。
【０１０２】
実施例２：ＥＳＴ１８組織発現
Ｃｌｏｎｔｅｃｈヒトマルチプル組織発現アレイＭＴＥＴＭ（Clontechカタログ番号：７７７６−１）を、評者の指示に従って、５３３塩基対α−３２ＰｄＣＴＰ−標識ｃＤＮＡプローブで精査した。プローブ標識化およびハイブリダイゼーションは、下記のように行った：５μｇのＡ１８ＦＳプラスミド（下記する）を、業者の説明に従って、その適当な緩衝液中ＥｃｏＲＩ酵素で消化した。制限消化物を、１％のアガロースゲル上に分画し、配列番号２のアミノ酸＃１（メチオニン）〜アミノ酸＃１７４（アスパラギン）を含むＥＳＴ１８タンパク質配列をコードする５３３塩基対フラグメントを、上記したようにアガロースゲルから回収した。α−３２Ｐ ｄＣＴＰ−標識化プローブを、Amersham PharmaciaのＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ ｋｉｔ（カタログ番号：２７−９２４０−０１、Pharmacia）を利用して作成した。簡単には、３０ｎｇの心臓変性ＤＮＡを３７℃で１５分間、５０μＣｉのα−３２Ｐ ｄＣＴＰおよび一の標識ビーズとインキュベーションした。インキュベーション後、反応混合物を、予備平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ ＮＩＣＫカラム（カタログ番号：１７−０８５５−０２）に付して、組み込まれていないα−３２Ｐ ｄＣＴＰを標識プローブから除去した。脱塩したプローブをアッセイし、１５×１０６ｃｐｍを、５ｍｌの予備加熱した発現Ｈｙｂに加えた。ついで、ハイブリダイゼーション混合物を、予備ハイブリダイゼーション化ＭＴＥに移した。ハイブリダイゼーションを、６５℃で一晩撹拌して進行させた。
【０１０３】
プローブ検出：ハイブリダイゼーションに続いて、ＭＴＥを、業者の指示に従って一連の緩衝液で洗浄した。ついで、ＭＴＥを、Ｋｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＳフィルム（Ｋｏｄａｋ）および１つの増感スクリーンを有するＸ−線カセットに置いた。ついで、カセットを−７０℃で貯蔵した。別個のフィルムを、２０または７６時間後のいずれかで現像した。いずれの暴露後の結果も同一であった。発現は、左右の小脳、脳梁および胎座に制限された。
【０１０４】
実施例３：切断形態のアグレカナーゼタンパク質の発現
ＥＳＴ１８ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の切断形態を、融合タンパク質として発現した。一のかかる切断タンパク質、Ａ１８ＦＳは、ＥＳＴ１８ヌクレオチド配列によりコードされる最初の６５０のアミノ酸、アミノ酸＃１（メチオニン）〜アミノ酸＃６５０（フェニルアラニン）を意味する。発現の構成は２工程からなる。最初に、ＥＳＴ１８ヌクレオチド配列の５’末端を、５’ＲＡＣＥにより同定される付加的なコーディングヌクレオチド配列を含むように修飾する。第２に、構成にはフェニルアラニンのコドンで停止するようにオープンリーディングフレームがある。ストレプトアビジンタグ配列を、組み換えタンパク質の精製を補助するために加えた。
【０１０５】
５’末端の修飾：下記する６つの合成オリゴヌクレオチドを、アニーリングして、５’末端上のＥｃｏＲＩ部位および３’末端のＳａｃＩＩ部位の側面に位置するＤＮＡ配列を形成するように設計する。クローン化ＥＳＴ１８配列を、ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩＩ酵素で消化した。消化したベクターを１％のアガロースゲルに分画し、回収したＤＮＡを合成オリゴヌクレオチドとライゲーションした。オリゴヌクレオチドを以下に示す：
5' AATTCCCACCATGGAGTGCGCCCTCCTGCTCGCGTGTGCCT 3'（配列番号２１）；
5' CCCACCATGGAGTGCGCCCTCCTGCTCGCGTGTGCCTTCCCGGCTGCG 3'（配列番号２２）；
5' TCCCGGCTGCGGGTTCGGGCCCGCCGAGGGGCCTGGCGGGACTGGGGCGCGTGGCCAAG 3'（配列番号２３）；
5' GGTTCGGGCCCGCCGAGGGGCCTGGCGGGACTGGGGCGCGTGGCCAAGGCGCTCCAGCT 3'（配列番号２４）；
5' GCGCTCCAGCTGTGCTGCCTCTGCTGTGCGTCGGTCGCCGC 3'（配列番号２５）；および
5' GTGCTGCCTCTGCTGTGCGTCGGTCGCC 3'（配列番号２６）。
ライゲーション混合物のアリコートを、Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥｌｅｃｔｒｏＭａｘ ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換し、組み換えプラスミドの配列を配列決定により確認した。
Ａ１８ＦＳ切断およびストレプトアビジンタグ化：Ａ１８ＦＳを、下記のプライマー対：
フォワードプライマー5' CTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCG 3'（配列番号２７）および
リバースプライマー5'CCCTTGCAATGAAAATAGCTTGGATTTTGGAAGCGCTTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAATAAGGCGGCCGCCGCAAA 3'（配列番号２８）、
およびテンプレートとしてＥＳＴ１８ヌクレオチド配列を用いてＰＣＲ増幅した。フォワードプライマーは、独自の制限部位ＢｇｌＩＩを含有し、リバースプライマーは、独自の制限部位ＮｏｔＩを含有し、予備消化発現ベクターに直接クローニングが可能であった。また、リバースプライマーは、エピトープタグとして機能する得られたタンパク質配列ＧＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号２９）を含む。
【０１０６】
ＰＣＲ増幅は、５μｌの１０Ｘ ＰＣＲ反応緩衝液；最終濃度０．２ｍＭまでの１μｌのｄＮＴＰ混合物；１０ｐｍｏｌのフォワードプライマー（配列番号２７）；１０ｐｍｏｌのリバースプライマー（配列番号２８）；１ｎｇの配列番号１に記載のＥＳＴ１８全長ヌクレオチドテンプレート；２．５ユニットのＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ Ｈｏｔｓｔａｒｔポリメラーゼ（カタログ番号６００３２０）；および５０μｌまでの蒸留水を含有する５０μの容量の反応で行う。増幅反応条件は、９４℃２分；９４℃で１５分；合計２２サイクルの間、７０℃で３分増幅；７２℃で５分伸張、ついで、４℃で冷却する。ストレプトアビジンタグを含有するアグレカナーゼタンパク質の切断形態をコードするヌクレオチド配列を配列番号７に示す。
【０１０７】
実施例４：ＣＨＯ細胞でのアグレカナーゼの発現
ネズミ、ヒトまたは他の哺乳類アグレカナーゼ−関連タンパク質を産生するために、アグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターにクローン化し、哺乳類細胞または昆虫細胞培養系を含む他の好ましい真核細胞もしくは原核細胞宿主に、慣用的な遺伝子工学法を用いて導入した。生物学的に活性な組み換えヒトアグレカナーゼの発現系は、安定に形質転換された哺乳類、昆虫、酵母または細菌細胞を含むことを意図する。
【０１０８】
哺乳類の発現ベクターｐＭＴ２ ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂ）の誘導体であり（Wong et al., Science 228:810-815 (1985)）、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を含み、かつさらにｃＤＮＡ分子をベクターに挿入するためのＸｈｏＩ部位を含む点で後者と異なる。ｐＭＴ２ＣＸＭの機能エレメントが開示されており（Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693 (1985)）、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含む複製ＳＶ４０起源、５’スプライス部位およびアデノウイルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス三つ組リーダー配列の大部分を含んでいるアデノウイルス主要後期プロモーター、３’スプライスアクセプター部位、ＤＨＦＲインサート、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）およびイー・コリの増殖に必要なｐＢＲ３２２配列が含まれる。
【０１０９】
プラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭは、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）、Rockville, MD（ＵＳＡ）に受託番号67122の下で寄託されているｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化により得られる。ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ２−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡインサートが切り出され、線状のｐＭＴ２が得られ、これをライゲートして用いて、イー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５を形質転換し、アンピシリン耐性とすることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡは、慣用的な方法により調製することができる。ついで、ｐＭＴ２ ＣＸＭを、ループアウト／イン変異形成法を用いて構築する（Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)）。これにより、複製のＳＶ４０起源の近傍のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびｐｍＴ２のエンハンサー配列に関連する塩基１０７５〜１１４５が除去される。加えて、これにより、以下の配列：５’ＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧ３’（配列番号３０）がヌクレオチド１１４５に挿入される。この配列は、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を含む。ｐＭＴ２３と称されるｐＭＴ２ ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を含む。プラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡは、慣用的な方法いより調製することができる。
【０１１０】
また、ｐＭＴ２１から誘導されるｐＥＭＣ２β１も本発明での実施に適当であり得る。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦから誘導されるｐＭＴ２から誘導される。上記したように、ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡインサートが切り出され、鎖状形態のｐＭＴ２が得られ、これをライゲートして用い、イー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５を形質転換し、アンピシリン耐性とすることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡは、慣用的な方法により調製することができる。
【０１１１】
ｐＭＴ２１は、以下の２つの修飾によりｐＭＴ２から誘導した。最初に、Ｇ／Ｃテイリングから１９Ｇ残基のストレッチを含んでいる７６ｂｐのＤＨＦＲｃＤＮＡの５’非翻訳領域を削除する。この操作において、ＸｈｏＩ部位を挿入して、ＤＨＦＲからすぐ上流に以下の配列を得る：
5' CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG 3'  （配列番号３１）
PstI        Eco RI XhoI
【０１１２】
第２に、ユニークなＣｌａＩ部位を、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａｌでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理、およびＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）へのライゲーションにより導入した。これにより、アデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から２５０ｂｐのセグメントが削除されるが、ＶＡＩ ＲＮＡ遺伝子の発現または機能は干渉しない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を誘導するのに用いた。
【０１１３】
ＥＭＣＶリーダーの部分を、ＰＭＴ２−ＥＣＡＴ１（S.K. Jung, et al, J. Virol 63:1651-1660 (1989））から、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により得、２７５２ｂｐのフラグメントを得た。このフラグメントをＴａｑＩで消化し、５０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得、これを低融点アガロースゲル上での電気泳動により単離した。６８ｂｐのアダプターおよびその相補鎖を、以下の配列：
5 CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTT
TaqI
GAAAAACACGATTGC 3' (配列番号 32)
XhoI
を有する５’ＴａｑＩ突出末端および３’ＸｈｏＩ突出末端を用いて合成する。
【０１１４】
この配列は、ヌクレオチド７６３〜８２７のＥＭＣウイルスリーダー配列に適合する。また、ＥＭＣウイルスリーダー内のポジション１０ではＡＴＧがＡＴＴに変化しており、ＸｈｏＩ部位が続く。ｐＭＴ２１ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントおよび６８ｂｐのオリゴヌクレオチドアダプターＴａｑＩ−ＸｈｏＩアダプターの３工程のライゲーションにより、ベクターｐＥＭＣ２β１が得られる。
【０１１５】
このベクターは、複製のＳＶ４０起源およびエンハンサー、アデノウイルス主要後期プロモーター、アデノウイルス三つ組リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小ハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲおよびβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含み、哺乳類細胞における所望のｃＤＮＡの高レベルの発現を指向する。
【０１１６】
一の具体例において、配列番号１で示される本発明のアグレカナーゼヌクレオチド配列は、発現ベクターｐＥＤ６にクローン化することができる（Kaufman et al., Nucleic Acid Res 19:44885-4490 (1991)）。ＣＯＳおよびＣＨＯ ＤＵＫＸ Ｂ１１細胞を、一時的に、本発明のアグレカナーゼ配列（分離ｐＥＤ６プラスミド上のＰＡＣＥの＋／−同時トランスフェクション）で、リポフェクション（LF2000, Invitrogen, Carlsbad, CA））によりトランスフェクトした。２倍のトランスフェクション：（ａ）活性アッセイのために、条件付けた培地を回収するための一つと（ｂ）３５−Ｓ−メチオニン／システイン代謝標識化のための一つを、目的の各遺伝子に関して行う。
【０１１７】
１日目に培地を、（ａ）活性アッセイのために回収するための、ＤＭＥ（ＣＯＳ）またはアルファ（ＣＨＯ）培地＋１％熱不活性化ウシ胎児血清＋／−１００μｇ／ｍｌへパリンに変更した。４８時間（４日）後、条件付けた培地を活性アッセイのために回収する。
【０１１８】
３日目に、トランスフェクションの二重のセットの細胞用の培地を、（ｂ）をＭＥＭ（メチオニン−不含／システイン不含）培地＋１％熱不活性化ウシ胎児血清＋１００μｇ／ｍｌへパリン＋１００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニン／システイン（Redivue（登録商標） Pro mix, Amersham）に変更する。３７℃で６時間インキュベーションした後、条件付けた培地を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上還元条件下に流す。タンパク質をオートラジオグラフィーにより視覚化する。
【０１１９】
別の具体例において、配列番号１で示される本発明のアグレカナーゼヌクレオチド配列は、発現ベクターｐＨＴｏｐ、ｐＥＤの誘導体（Kaufman et al., 1991 NAR 19:4485-4490）にクローン化することができ、アデノウイルス後期プロモーターのほとんどは、ｔｅｔオペレーターの６つの繰り返しにより置き換わった（Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551に記載されている）。このベクターはジヒドロ葉酸還元遺伝子を含有し、細胞株ＣＨＯ／Ａ２導入される場合（下記を参照）、機能は非常に効果的であり、高エクスプレッサー（ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ）を、高濃度のメトトレキサートを存続させる細胞を単離することにより選択することができる。
【０１２０】
同様に、配列番号８に示し、上記した方法を用いて発現される組み換えアグレカナーゼタンパク質は、ｐＨＴｏｐベクターにクローン化することができる。
【０１２１】
ＣＨＯ安定細胞株の確立：ＣＨＯ／Ａ２細胞株を、ＣＨＯ ＤＵＫＸ Ｂ１１（Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220）から、転写悪値ベーター（ｔＴＡ）、ＴｅｔリプレッサーおよびヘルペスウイルスＶＰ１６転写ドメイン（Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551）間の融合タンパク質を安定に結合させることにより誘導した。細胞外ＡＤＡＭＴＳ−１８を発現するＣＨＯ細胞株を、ｐＨＴｏｐＡＤＡＭＴＳ８−ストレプトアビジンタグＤＮＡを、ＣＨＯ／Ａ２細胞にトランスフェクション（リポフェクション）することにより確立し、０．０２、０．０５および０．０１μＭのメトトレキサート中のクローンを選択した。
【０１２２】
ＣＨＯ安定細胞株のスクリーニング：マルチプルクローンを、ストレプトアビジンＨＲＰ抗体を用いて、ウエスタン・ブロット（Western Blot）によりスクリーニングした。最もよいクローンをその高発現性の効力により決定し、それは得られた０．０２μＭのＭＴＸセレクションであり、ローラー・ボトル条件化培地産生（４リットル）に大規模化するために選択された。細胞株を大規模産生とした。
【０１２３】
実施例５：  発現したアグレカナーゼの生物学的活性
発現したアグレカナーゼ関連タンパク質、例えば、上記実施例４で得たタンパク質の生物学的活性を測定するために、タンパク質を細胞培養物から回収し、ついでアグレカナーゼ関連タンパク質を、同時産生される他のタンパク質物質ならびに他の混入物質から単離することにより精製した。精製は、当業者に公知の標準的な方法を用いて行う。単離タンパク質は、以下のアッセイに従ってアッセイすることができる。
【０１２４】
タンパク質が、アグレカナーゼ切断部位でアグレカンを切断することができる酵素であるかを特異的に決定するためのアッセイ：
【０１２５】
１．蛍光ペプチドアッセイ：発現されたタンパク質を、アグレカンのアグレカナーゼ切断部位のアミノ酸を含む、合成ペプチドと共にインキュベートする。合成ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかはフルオロフォアで標識し、他方の末端はクエンチャーを含む。ペプチドの切断により、フルオロフォアとクエンチャーが分かれ、蛍光が顕現化する。このアッセイから、発現されたアグレカナーゼタンパク質が、アグレカナーゼ部位でアグレカンを切断することができることを決定することができ、相対的蛍光が、発現されたタンパク質の相対的活性を示す。
【０１２６】
２．ネオエピトープウェスタン：発現されたタンパク質を完全なアグレカンと共にインキュベートする。得られたサンプルをいくつかの生化学的操作（透析、コンドロイチナーゼ処理、凍結乾燥、および再構築）に供した後、サンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに流す。ゲルを、アグレカナーゼ切断後に露出するアグレカン上における部位のみに特異的である抗体と共にインキュベートする。ゲルをニトロセルロースに移し、二次抗体を用いて展開し（ウェスタンアッセイと呼ばれる）、続いて、アグレカンのアグレカナーゼにより作製される切断産物と一致する分子量のところに走っているバンドパターンを得る。このアッセイにより、発現されたアグレカナーゼタンパク質がアグレカナーゼ切断部位でネイティブのアグレカンを切断したことが示され、また、切断産物の分子量も得ることができる。バンドの相対密度により、相対アグレカナーゼ活性に関するいくつかの見解を得ることができる。
【０１２７】
発現されたタンパク質が、タンパク質のいずれかの場所でアグレカンを切断することができるかを決定するためのアッセイ（アグレカナーゼ部位に特異的でない）：
【０１２８】
３．アグレカンＥＬＩＳＡ：発現されたタンパク質を、プラスチックウェルに予め固着させた完全なアグレカンと共にインキュベートする。ウェルを洗浄し、ついで、アグレカンを検出する抗体と共にインキュベートする。ウェルを、二次抗体を用いて展開する。アグレカンの当初の量がウェルに残っている場合、抗体はウェルを濃厚に染色する。一方、発現されたアグレカンタンパク質のアグレカナーゼ活性によりアグレカンが消化された場合、アグレカンはプレートから除去され、抗体によりアグレカンコートされたウェルの染色は減少する。このアッセイは、発現されたタンパク質がアグレカンを（アグレカナーゼ部位だけでなく、タンパク質中のいずれかの場所で）切断することができるかどうかを示し、さらに、相対的なアグレカンの切断を測定することができる。
【０１２９】
単離タンパク質のタンパク質分析を、銀で染色した（Oakley, et al., Anal Biochem. 105:361 (1980)）ＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド（Laemmli, Nature 227:680 (1970)）、および免疫ブロット（Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)）によるなどの標準的な方法を用いて行う。上記したアッセイを用いて、発現されたアグレカナーゼ関連タンパク質を、その活性に関して評価し、有用なアグレカナーゼ関連分子を同定する。
【０１３０】
実施例６：ＡＤＡＭＴＳ−１８のアグレカナーゼ活性
ウシ関節軟骨を、単離ＡＤＡＭＴＳ−１８と一緒に１６時間３７℃で、１００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．３）中でインキュベートした。消化産物を、２時間３７℃で、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Seikagaku America, Falmouth, ＭＡ；１ｍＵ／μｇのアグレカン）、ケラチナーゼ（Seikagaku, １ｍＵ／μｇのアグレカン）およびケラチナーゼＩＩ（Seikagaku；０．０２ｍＵ／μｇのアグレカン）の存在下、インキュベートすることにより脱グリコシル化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、消化産物を、ニトロセルロースに移し、アグレカンのＧ１およびＧ２ドメインの間に位置するアグレカナーゼ−感受性Ｅ３７３−Ａ３７４ペプチド結合を開裂することにより産生されるＣ末端ネオエピトープ配列−ＮＩＴＥＧＥ３７３（配列番号３３）を認識する、ネオエピトープ（モノクローナル）抗体ＡＧＧ−Ｃ１で、ウェスタン免疫ブロッティングにより検出した（図１０）。
【０１３１】
実施例７：抗体の調製
新規アグレカナーゼ分子に対する抗体を調製する。アグレカナーゼ活性を阻害することができる抗体を開発するために、マウスの１群を、最初の２回の免疫化のためにはフロイント完全アジュバントに、およびその後は不完全フロイントアジュバント中に混合した新規アグリカナーゼタンパク質で、２週間ごとに免疫化する。免疫期間を通じて、血液をサンプル化し、循環抗体の存在に関して試験する。９週目に、循環抗体を有する動物を選択し、その後３日間免疫化し、ついで屠殺する。脾臓を取り出し、細胞中に均質化した。脾臓細胞を骨髄腫融合パートナー（細胞株Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と、５０％のＰＥＧ１５００を用いる確立された方法を用いて（Oi & Herzenberg, 細胞免疫学における選択された方法(Selected Methods in Cellular Immunology）, W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, at 351 (1980)）融合する。融合細胞を９６−ウェルのマイクロタイタープレートに、２×１０５細胞／ウェルの密度で蒔く。２４時間後、細胞をＨＡＴ選択に供し（Littlefield, Science, 145: 709 (1964)）、効果的にあらゆる非融合性および非増殖性融合骨髄腫細胞を殺滅する。
【０１３２】
抗−アグレカナーゼ抗体を分泌している首尾よく融合したハイブリドーマ細胞を、固相および液相ＥＬＩＳＡにより同定する。新規なアグレカナーゼタンパク質を、上記したようにＣＨＯ細胞から調製し、（固相アッセイのために）ポリスチレン上にコートするか、または（液相アッセイのために）ビオチン化する。また、中和アッセイを用い、この場合は、アグレカンをポリスチレンプレート上にコートし、ハイブリドーマ上清を添加することによりビオチンアグレカナーゼ活性を阻害する。結果から、アグレカナーゼ抗体を発現しているハイブリドーマが同定される。これらの陽性クローンを培養し、さらなる研究のために増殖させる。これらの培養物は、増殖させる場合安定性を維持し、細胞株を、希釈法を制限することによりクローン化し、ついで低温保存する。
【０１３３】
これらの細胞培養物から、アグレカナーゼタンパク質を特異的に認識する抗体のパネルを開発する。抗体のアイソタイプを、マウス免疫グロブリンアイソタイピングキット（Zymed（登録商標） Laboratories, Inc., San Francisco, CA）を用いて測定する。
【０１３４】
実施例８：アグレカナーゼのレベルの検出方法
上記した本発明に従って調製される抗−アグレカナーゼ抗体を用いて、サンプル中のアグレカナーゼのレベルを検出することができる。抗体をＥＬＩＳＡで用いて、例えば、サンプル中のアグレカナーゼの存在または不在を同定すること、またはその量を定量することができる。抗体は、蛍光タグで標識することができる。一般的には、サンプル中のアグレカナーゼのレベルは、上記したアッセイのいずれかを用いて測定することができる。
【０１３５】
実施例９：患者の治療方法
上記した方法に従って開発した抗体は、アグレカンの欠損またはアグレカナーゼ活性の増加に関連する疾患または障害を患っている患者に投与することができる。患者は、その疾患または障害の症状および徴候が改善するまで、一度、または一日一回というように間隔をあけて組成物を摂取する必要があり得る。例えば、本発明の組成物を患者に投与した後、アグレカンの欠損が減少するか、またはなくなり、関節軟骨の崩壊が減少するか、またはなくなる。骨関節症の症状が低下するかまたは排除されることが期待される。これにより、本発明の組成物が、アグレカンの欠損またはアグレカナーゼのレベルおよび／または活性の増加に関連する疾患または障害の治療に有用であることが示されるだろう。また、抗体は、該疾患のファミリーヒストリーまたはマーカーを有するが、その作用は未だ被り始めていない人など、骨関節症に感受性のある患者に用いることもできる。下記の結果は、患者の治療を期待させるだろう。
【表１８】
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【０１３６】
上記記載は、本発明の好ましい具体例を詳細に記載したものである。その実施における多くの修飾および変更が、これらの記載を考慮して、当業者は予想することができる。これらの修飾および変更は、本明細書に添付する請求の範囲内に包含される。本願に記載のすべての文献は、出典明示により本明細書に組み入れる。さらに、データベースおよびすべての引用文献に記載されるすべての配列は出典明示により本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
（本文に記載なし）
【配列表】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年9月30日(2004.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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