(57)【要約】本発明は、Nefタンパク質から生じるペプチド混合物、および（抗HIV CD4+ Tリンパ球のインビボでの生産を刺激し、その結果AIDSに対するワクチン処置に有用な免疫原組成物での）その薬剤、またはHIVに特異的なTリンパ球用の応答診断薬、特にHIV陽性患者または抗レトロウイルス治療を受けている患者の免疫状態を評価するための応用に関する。混合物中の各々の前記ペプチドは、対立遺伝子HLA DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501(DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも３つのHLA-DR分子、ならびに対立遺伝子HLA DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に、1000nM未満の結合能で結合し、ペプチドの該混合物は前記の全ての対立遺伝子に結合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの各々が、HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 (DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも３つのHLA-DR分子、ならびにHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に、1000 nM以下の結合活性で結合し、ペプチドの混合物が全ての前記対立遺伝子に結合していることを特徴とするHIV Nefタンパク質由来のペプチドの混合物。
【請求項２】
前記ペプチドが、何れかのHIV-1株のNefタンパク質を起源とすることを特徴とする請求項1で請求したペプチドの混合物。
【請求項３】
前記ペプチドが、Bru株(13)に関して、Nefタンパク質の1〜36位に対応するペプチド、(Nef1ペプチド)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4ペプチド)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4ペプチド)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5ペプチド)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10ペプチド)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2ペプチド)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12ペプチド)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13ペプチド)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1ペプチド)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2ペプチド)、183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3ペプチド)、187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4ペプチド)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5ペプチド)からなる群から選択されることを特徴とする請求項1または請求項2で請求したペプチドの混合物。
【請求項４】
次の混合物：
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物；
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3) からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5)からなる混合物
からなる群から選択されることを特徴とする請求項3で請求のペプチドの混合物。
【請求項５】
少なくとも１つの医薬的に容認されうる賦形剤、および任意に少なくとも１つのアジュバントと組み合わせた請求項1〜4のいずれか1つで請求した少なくとも1つのペプチドの混合物を含むことを特徴とする免疫原組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、リポペプチドの形態であるか、あるいは組換えウイルス、遺伝子治療のためのウイルスベクターに組み込まれているか、またはタンパク質に含まれているか、あるいは化学的に修飾されていることを特徴とする請求項5で請求の免疫原組成物。
【請求項７】
前記ペプチドの混合物を、：
−１つ以上のCD8+エピトープを含む1つ以上のペプチドまたはリポペプチドと、および/または
−ペプチドが、HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 (DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に対して、あるいはHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に対して、1000ｎM未満の結合活性で結合するCD4+エピトープを含むその他のペプチドと、および/または、
−複合CD4+エピトープからなるその他のペプチドと、および/または
−前記エピトープに対して示される抗体によって特異的に認識される１つ以上のBエピトープを含む１つ以上のペプチドを含む1つ以上のペプチドまたはリポペプチドと
組み合わされることを特徴とする請求項5または請求項6で請求の免疫原組成物。
【請求項８】
CD4+エピトープを含むペプチドが、
HIV-1 Nefタンパク質の37-71位(Nef3)、113-128位(Nef7)、117-132位(Nef8)、132-147位(Nef9)および155-185位(Nef11)に対応するペプチドからなる群から選択されることを特徴とする請求項7で請求の免疫原組成物。
【請求項９】
有利には、請求項1〜4に規定したようなペプチドをエンコードする配列を含むことを特徴とする免疫原組成物。
【請求項１０】
請求項5〜9のいずれか1つで請求の免疫原組成物を含むことを特徴とする抗HIVワクチン。
【請求項１１】
−白人集団で支配的である少なくとも１つのHLA II分子（HLA-DR）に関して（第一および/または第二遺伝子）、1000ｎM未満の結合活性を有し、前記ペプチドに特異的なCD4+Tリンパ球にて認識されうるCD4+エピトープを含み、ならびに
−Bru株に関して、Nefタンパク質の次のフラグメント：
フラグメントは、Nefタンパク質の1〜36位に対応するフラグメント(Nef1)、3〜17位に対応するフラグメント(Nef1.1)、8〜22位に対応するフラグメント(Nef1.2)、11〜25位に対応するフラグメント(Nef1.3)、14〜28位に対応するフラグメント(Nef1.4)、Nefタンパク質の37〜71位に対応するフラグメント(Nef3)、66〜94位に対応するフラグメント(Nef4)、68〜82位に対応するフラグメント(Nef4.1)、74〜88位に対応するフラグメント(Nef4.4)、77〜91位に対応するフラグメント(Nef4.5)、79〜93位に対応するフラグメント(Nef4.6)、83〜97位に対応するフラグメント(Nef4.7)、113〜128位に対応するフラグメント(Nef7)、117〜132位に対応するフラグメント(Nef8)、132〜147位に対応するフラグメント(Nef9)、137〜168位に対応するフラグメント(Nef10)、137〜151位に対応するフラグメント(Nef10.1)、139〜153位に対応するフラグメント(Nef10.2)、141〜155位に対応するフラグメント(Nef10.3)、146〜160位に対応するフラグメント(Nef10.5)、155〜185位に対応するフラグメント(Nef11)、175〜190位に対応するフラグメント(Nef12)、182〜198位に対応するフラグメント(Nef13)、178〜192位に対応するフラグメント(Nef13.1)、181〜195位に対応するフラグメント(Nef13.2)、183〜197位に対応するフラグメント(Nef13.3)、187〜201位に対応するフラグメント(Nef13.4)、189〜203位に対応するフラグメント(Nef13.5)、および191〜205位に対応するフラグメント(Nef13.6)である
からなる群から選択される
ことを特徴とするHIV Nefタンパク質由来のペプチド。
【請求項１２】
請求項1〜4のいずれか1つで請求のペプチドの混合物からなる群から選択されるか、または請求項11で請求のペプチドの１つであり、前記ペプチドが任意にラベルされるか、またはマルチマーの複合体の形態で複合化されていることを特徴とする診断薬。
【請求項１３】
請求項1〜4または請求項11で規定したようなNefペプチドに特異的なCD4+ T細胞の存在を、ELISPOTアッセイ、T細胞増殖アッセイまたはマルチマーの複合体を用いるアッセイを使って検出する工程を含むことを特徴とする個体の免疫状態を評価する方法。
【請求項１４】
少なくとも次の工程：
−分類すべき細胞の懸濁液を、請求項1〜4または請求項11で規定したようなNefペプチド/溶解性であるビオチン化されたHLAII分子の複合体から形成され、そして蛍光色素を使ってラベルされたストレプタビジンに共役した１つ以上の四量体に１〜３時間培養または接触させ、
−フローサイトメトリーにて解析し、そして
−四量体を使ってラベルされた細胞を分類する
を含むことを特徴とするHIV特異的Tリンパ球を分類する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Nefタンパク質起源のペプチド混合物、および（インビボで抗HIV CD4+ Tリンパ球の生産を刺激することができ、その結果AIDSに対するワクチンとして有用な免疫原組成物での）その薬剤、またはHIV特異的Tリンパ球を診断、特に血液反応陽性の患者または抗レトロウイルス治療を受けている患者の免疫状態を評価するための試薬としての応用に関する。
CD4+ T リンパ球は、提示細胞による抗原の分解由来であり、クラスII主要組織適合性複合体（MHCII）の分子にて提示されるペプチドフラグメントを選択的に認識させる再編成されたTレセプターを有する。これらペプチドフラグメントを持ち、Tリンパ球にて効果的に認識される決定因子を、Tエピトープと称する。
【０００２】
CD+4 Tリンパ球は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の好ましい標的であると知られており、血液循環からの完全に消失するまでひどくつづくことがありうる。
結果として、HIVに感染した患者は、不幸な感染に罹り、そしてそれらと戦うための力強い免疫応答を誘導することができない。
事実、CD4+ Tリンパ球は、免疫応答を確立する上で主要な役割を有している。それらは、エフェクター細胞、いわゆる細胞毒性のCD8+ Tリンパ球および抗体-生産性Bリンパ球の補充が要求されるほとんどのサイトカインを分泌する。それらは、また、細胞接触にて細胞を活性化することを必要とし、そして、例えばCD40を介して、抗原提示樹状細胞の活性化を誘導する。
それらの主要な役割によって、その結果、CD4+ Tリンパ球の消失は、免疫系の著しい弱体化を引き起こす：特に、CD4+ Tリンパ球の消失は、HIVに対する特異的な免疫を低下させる。事実、最近の研究では、HIV成分特異的CD4+細胞（HIV-component-specific CD4+ cell）に対して特異的な増殖応答を示す人々が、あらゆる治療なしで、ウイルス感染を制御することができることを示した（1、2）。
【０００３】
逆の相関関係は、P24タンパク質に関するCD4+ Tリンパ球の増殖と、ウイルス負荷との間でまさに認められる。この相関関係を、TH1型のCD4+ Tリンパ球のγ-IFNのような抗ウイルスサイトカインを分泌し、そして細胞毒性となる能力から直接得ることができる。それは、また、体液免疫、より好ましくは細胞免疫性を維持するそれらの能力から、直接得られるであろう。事実、細胞毒性CD8+ T細胞が、血液反応陽性の患者を非症候状態で維持するのにかなり寄与していることが知られている。
【０００４】
抗HIV化学的療法で築かれた近年の進歩は、このウイルスに感染した患者で、正常な保護免疫を確立することができるであろうことを望ませる。事実、高活性抗レトロウイルス治療（HAART）を受けている患者で、CD4+細胞のレベルがかなり低下することが観察される（3）。CD4+ Tリンパ球の数を減少させるこのことは、CD4+ Tリンパ球の補充にとって必要な条件であるが、それは、まれに、ウイルス成分に対する増殖応答を獲得させる。事実、この応答の誘導は、ワクチンのような特殊な治療を必要とする。
CD4+ Tリンパ球の活性化は、抗原提示細胞（APC）を持つHLAII分子によるウイルスペプチドの提示の効果の下で起こる。Tエピトープと称されるこれらのペプチドは、APCによるウイルス抗原のタンパク質分解様分解の結果である。それらは、一般に13〜25アミノ酸の長さに変化することができ、そして、それらをHLAII分子に結合させえる配列を有する。
【０００５】
ペプチド、Tエピトープが、インビトロで、天然の抗原と同様な程度に、それに対して特異的であるCD4+ Tリンパ球を刺激、またはインビボでそれらを新規補充することができることが、現在確立されている。
それゆえ、Tエピトープは、CD4+応答を誘導するに十分である。しかし、これらエピトープの使用を制限する主要な問題の１つは、それらの配列が、抗原提示細胞（APC）で発現されるヘテロダイマーであり、そしてCD4+ Tリンパ球に対して該抗原のTエピトープを提示するHLAII分子の多形現象のために、１個体からその他まで多様であることである。
これらの分子は、それらをT細胞に対して、抗原あたり幾つかのペプチドを提示させる大変異なった配列を有するペプチドの大きなレパートリーに結合することができる。
HLAII分子の４つの異なる型が固体あたりに存在する：2つのHLA-DR、１つのHLA-DQおよび1つのHLA-DP；β鎖がDRB１遺伝子（第一遺伝子）によってエンコードされるHLA-DR分子が、最も一般的に発現される。現在、200以上の異なる対立遺伝子が、DRB１について挙げられており、その対立遺伝子は、以下の表１で要約したように様々な抗原またはタイプを定義付けている。
【０００６】
【表１】
2005506283.tif 000002
【０００７】
各々の対立遺伝子は、それ自身の結合特性を有する；HLAII分子の幅広い特異性ならびに幾つかのイソ型および多形の存在は、各々の固体が、抗原中、一組のペプチドで、それを特徴付けるHLAII分子に依存する性質を認識することを意味する。多数のHLAII対立遺伝子が存在するため、各々の対立遺伝子に特異的な多数のTエピトープは、その結果、所定の抗原に対して存在する。
所定の集団内の対立遺伝子の分布は、同質ではない；例えば、主に白人集団に対応するフランス人集団で、DRB１遺伝子座のたった７つの対立遺伝子が、５％を超える；これらは、集団の64％を示す対立遺伝子：DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501である（４）。これら同一な対立遺伝子は、また、それらの頻度が、53％（スペイン）〜82％（デンマーク）に及ぶフランス人以外の集団、および北アメリカ（55〜58％）で多数派である。
【０００８】
β鎖がDRB１遺伝子にてエンコードされていないHLA-DRB3、-DRB4および-DRB5分子（第二遺伝子）は、また、様々な白人集団で、かなりの対立遺伝子頻度（allelic frequency）で存在する：DRB3*0101 (B3)について9.2％、DRB4*0101 (B4)ついて28.4％、およびDRB5*0101 (B5)について7.9％。それゆえ、それらは、それら自身で、白人集団の対立遺伝子頻度の45％をカバーする。
ペプチドは、白人集団の大多数のTエピトープを含むこれら対立遺伝子の全てに結合するペプチド配列で存在する。
HIVに関して：
−すでに記載したエピトープのほとんどは、HLAＩ分子-制限されているものである［(5)、(6)、国際特許WO 98/50423、国際特許WO 99/27954、国際特許WO 99/40113、国際特許WO 99/51630、国際特許WO 00/75181］。それゆえ、それらはCD8+ Tリンパ球にて認識されるペプチドである。HLAＩ分子(HLA-A、-B、または-C)は、クラスII分子とは全く異なる結合特性を有する。それらは、原則的に、９アミノ酸の短いペプチドに結合し、結合モチーフは、各々の対立遺伝子に対して特異的である。HIVにとって、HLAＩ分子-制限された配列は、Env、Pol、Gag、およびNefタンパク質で発現され、最後の２つは、最も一般に認識されている（７）。
【０００９】
例えば、Gahery-Segardら[(11)および国際特許WO 99/27954]は、HLAＩ分子-制限されたTリンパ球を含むNefタンパク質由来のペプチド（Nefタンパク質のアミノ酸66〜97（N１）、117〜147（N２）、および182〜205（N３）に各々対応するペプチド）を記載している；より正確には、前記N１、N２、およびN３のペプチドで説明したTエピトープは、次のようである。
【００１０】
【表２】
2005506283.tif 000003
【００１１】
抗HIVワクチンを生産するために、Gahery-Segardら（11）は、Gagタンパク質（G１およびG２）由来の２つのペプチド、およびEnvタンパク質（E）由来のペプチドを有する前記N１、N２、およびN３のペプチドを組み合わせることを推奨している；これらペプチドの全てを、パルミトイル  リシルアミド基[（11）の表１]の付加によって、それらのC末端で修飾する。このリポペプチドワクチンの免疫原性および耐性を、血清反応陰性の有志で評価した。特異的なT応答を、T細胞増殖アッセイを用いて評価する。N１のペプチドは、ワクチン処理したドナーの5/10で、T細胞増殖を誘導し、N２ペプチドは、単一のワクチン処理したドナーでのみ増殖を誘導し、そしてN３のペプチドは、4/10のドナーで増殖を誘導する。たとえCD4+ T応答が観察されたとしても、それは、大変ランダムであり、N１、N２、およびN３のペプチドでばらついている。
−また、HLAII分子-制限されたペプチドを、記載している；これらは、Nefタンパク質に対して特異的なTクローンを使って、同定されるNefタンパク質（10）由来のペプチド配列（Tエピトープ）、より好ましくはNefペプチド13〜23、46〜53、44〜81、69〜82、180〜193、および194〜210（（10）の表４）である；ペプチドでのばらつきは、T細胞がNefタンパク質に対して応答する基本的な方法に影響を与える。次のHLAII分子[（10）の表７]について、上記のペプチドは制限されない：
【００１２】
【表３】
2005506283.tif 000004
【００１３】
今まで提唱されている全てのペプチドは、Tエピトープに対応し、様々な単離物の間で保存される能力に対して選択された；しかし、それらは、特定の個体に対してのみ特異的である；事実、AIDSに対する集団ワクチンに適した分子の選抜を困難にさせるTエピトープの個体間のばらつきが存在する；結局、上記のペプチドは、保護される個体に関係なく、それらは、処理される全ての個体で、保護CD4+ T応答を刺激しないため、抗HIVCD4+ Tリンパ球を刺激および保護免疫応答を発生させることができる免疫原およびワクチン組成物を調製するのに適していない。
この理由のため、本発明者らは、それ自体に、免疫原組成物に組み込まれ、そしてほとんどのヨーロッパ人または北アメリカの白人個体で、抗HIV CD4+ Tリンパ球を刺激することができ、ウイルス成分に対する特異的な増殖応答を効果的に誘導するように、高活性抗レトロウイルス治療（例えばトリセラピー）との組み合わせで特に有利である一組のペプチドを提供することを目的とした。
【００１４】
そのようなセットは、大多数の個体で、効果的である特性を有し、対して先行技術のペプチドは、同一の決定因子を介してNefタンパク質を認識しないために幾つかの個体で活性であり、大部分のその他の個体で不活性である。
これを調査するため、発明者らは、白人集団で支配的なHLAII分子に関して、制限されるHIV Nefタンパク質由来のペプチドを選択し、かつ一緒に、選択されたペプチドが、多数の個体で、免疫原および保護応答を効果的に誘導することを見出した。
【００１５】
結局、本発明の対象は、前記ペプチドの各々が、HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 (DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも３つのHLA-DR分子、ならびにHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に、1000 nM未満の結合活性で結合し、ペプチド混合物が全ての前記対立遺伝子に結合していることを特徴とするHIV Nefタンパク質由来のペプチド混合物である。
そのようなペプチド混合物は、驚くことに、保護すべき白人集団の極めて大多数で、増殖型CD4+ T応答（CD4+ Tリンパ球の刺激）および、CTL応答の刺激も得ることができる；それゆえ、そのような混合物がワクチンで使用できる「普遍的な」免疫原組成物に対する第一歩を構成すると考えることができる。
【００１６】
前記混合物の有利な実施例に関して、前記ペプチドは、HIV-１株のNefタンパク質起源とする。
前記混合物のその他の有利な実施例に関して、前記ペプチドを、Bru株(13)関して、Nefタンパク質の1〜36位に対応するペプチド、(Nef1ペプチド)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4ペプチド)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4ペプチド)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5ペプチド)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10ペプチド)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2ペプチド)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12ペプチド)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13ペプチド)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1ペプチド)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2ペプチド)、183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3ペプチド)、187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4ペプチド)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5ペプチド)からなる群から選択する。
【００１７】
特に有利には、本発明による前記ペプチド混合物を、ペプチドの位置を、また、Bru株（13）のNefタンパク質の位置に関して特定される次の混合物：
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 1〜36位に対応するペプチド(Nef1)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、139〜153位に対応するペプチド(Nef10.2)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4)からなる混合物;
* 66〜94位に対応するペプチド(Nef4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物；
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 74〜88位に対応するペプチド(Nef4.4)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3) からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 77〜91位に対応するペプチド(Nef4.5)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および182〜198位に対応するペプチド(Nef13)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および178〜192位に対応するペプチド(Nef13.1)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および181〜195位に対応するペプチド(Nef13.2)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および183〜197位に対応するペプチド(Nef13.3)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および187〜201位に対応するペプチド(Nef13.4)からなる混合物;
* 137〜168位に対応するペプチド(Nef10)、175〜190位に対応するペプチド(Nef12)、および189〜203位に対応するペプチド(Nef13.5)からなる混合物
からなる群から選択することが有利である
特に:
-DRB1*0101、0401、0701、1101、1301および1501分子ならびにDRB5*0101分子に優れた親和性で結合するNef1、
-DRB1*0101、0401、1101および1501分子、DRB5*0101ならびにDRB4*0101分子に優れた親和性で結合するNef4、
-DRB1*0101、0401、1101および1501、DRB5*0101ならびにDRB4*0101分子に優れた親和性で結合するNef4.1、
-DRB1*0101、0401、1101および1501分子、DRB5*0101ならびにDRB4*0101分子に優れた親和性で結合するNef4.2、
-DRB1*0101、0301、0401、0701および1101、DRB5*0101ならびにDRB4*0101分子に優れた親和性で結合するNef10、
-DRB1*0101、0301、0401、0701 および1101、DRB5*0101ならびにDRB4*0101分子に優れた親和性で結合するNef10.1、
-DRB1*0701、1101および1501、DRB3*0101ならびにDRB4*0101分子に優れた親和性で結合するNef12、
-DRB1*0301、0701、1101および1301、 DRB3*0101ならびにDRB5*0101分子に優れた親和性で結合するNef13、
-DRB1*0301、0701、1101および1301、DRB3*0101ならびにDRB5*0101分子に優れた親和性で結合するNef13.1、
-DRB1*0301、0701、1101および1301、DRB3*0101ならびにDRB5*0101分子に優れた親和性で結合するNef13.2、
-DRB1*0301、0701、1101および1301、ならびにDRB5*0101分子に優れた親和性で結合するNef13.3、
-DRB1*0701、1101および1301、ならびにDRB5*0101分子に優れた親和性で結合するNef13.4、
-DRB1*0701、1101および1301、ならびにDRB5*0101分子に優れた親和性で結合するNef13.5。
【００１８】
また、本発明の対象は、少なくとも１つの医薬的に容認されうる賦形剤、および任意に少なくとも１つのアジュバントと組み合わせた先に規定したような少なくとも１つのペプチド混合物を含むことを特徴とする抗-HIV免疫原組成物である。
使用されるアジュバントは、水酸化アルミニウムまたはスクアレンのようなワクチン組成物で従来使用されている賦形剤である。
前記免疫原組成物の有利な実施例に関して、前記ペプチドは、リポペプチドの形態であるか、あるいは組換えウイルス、遺伝子治療のためのウイルスベクター（アデノウイルス（adenovirus）など）に組み込まれているか、またはタンパク質、および特に組換えタンパク質（Leclerc C.ら、 Int. Rev. Immunol.、1994、11、2、123-132、Janssen R.ら、Int. Rev. Immunol.、1994、11、2、113-121)に含まれているか、あるいは化学的に修飾されている。後者の場合、それらは、例えばDアミノ酸、擬似タンパク質結合物、もしくはCまたはN末端の修飾物のような非自然の修飾物を含む。
【００１９】
リポペプチドの脂質成分は、特に、前記ペプチドのα-アミノ酸基上に、またはペプチド成分のアミノ酸の側鎖の反応基上に脂質モチーフを付加することで得られる：それは、任意に分枝または分枝していない１つ以上のC4-20の脂肪酸由来の鎖（パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、2-アミノヘキサデカン酸、ピメラウチド、トリメクサウチド）、またはステロイドの誘導体を含んでもよい。そのようなリポペプチドを調製する方法は、特に、国際特許WO 99/40113またはWO 99/51630で記載する。好ましい脂質成分は、Nαアセチル-リジンNε(パルミトイル)基で表され、特に、Ac-K(Pam)とも称される。
【００２０】
前記免疫原組成物のその他の有利な実施例に関して、前記ペプチド混合物を、
−（細胞毒性Tリンパ球にて特異的に認識され、そしてHLA I分子にて提示される）１つ以上のCD8+エピトープ、およびより詳しくは、HIV-１タンパク質由来のCD8+エピトープ（表2参照）を含有する１つ以上のペプチドまたはリポペプチドと、および/または
−ペプチドが、HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 (DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に対して、あるいはHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101 (B3、B4およびB5)からなる群から選択される対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に対して、1000ｎM未満の結合活性で結合するCD4+エピトープを含むHIV-1 Nefタンパク質の37-71位(Nef3)、113-128位(Nef7)、117-132位(Nef8)、132-147位(Nef9)、または155-185位(Nef11)に対応するペプチドのようなその他のペプチドと、および/または、
−破傷風毒素TT（830-846位)のペプチド、インフルエンザ ヘマグルチニンHAのペプチド(307-319位)、PADRE（Pan DR Epitope、Alexandre J.ら、Immunity、1994、1、9、751-761)、HIV-1 Nefペプチド45-69、およびシュードモナス 熱帯マラリア（Plasmodium falciparum）のLSA３ペプチドのような複合CD4+エピトープからなるその他のペプチドと、および/または
−１つ以上のBエピトープ、より好ましくは前記エピトープに対する抗体によって特異的に認識されるHIV-１タンパク質由来のBエピトープを含む１つ以上のペプチドまたはリポペプチドと、
組み合わされる。
【００２１】
前記混合物に含まれる本発明によるNefペプチドは、有利には、：
−興味深いHLA-DR分子、つまりこれらは、所定の集団、および特にHLA、DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子の5％以上を含む、を精製し、
−そして、Nefタンパク質の配列を完全にカバーする重複するフラグメントの様々な濃度で、およびビオチンのような非放射能ラベルと結合され、配列が前記ペプチドとは異なるペプチドフラグメントからなる試薬R1またはトレーサーを使って、精製されたHLA-DR分子を培養し、そこで試薬R1またはトレーサーは、興味深いHLA-DR分子の1つに関して、親和性を発揮するように、200ｎM未満の濃度で使用できるように選択される、
−得られた複合体を、全てのHLA-DRに特異的な抗体を使ってプレコートされるELISA型プレート上に移送し、
−ストレプタビジン−ホスファターゼのような適切な共役体、および蛍光基質を使って、プレートの底に付着されるHLA-DR分子/試薬R1複合体を明らかにし、
−様々なエピトープ、すなわちNefタンパク質とHLA-DR分子との相互作用の様々な領域の最も代表的なものからなるエピトープを選択し、そして
−それらが、試薬R1（IC50）の結合の50％を抑制するこれらペプチドの濃度に相当する1000ｎM未満の結合活性を発揮するのに関して、対立遺伝子の頻度の作用として最も適したペプチドを選択する
からなるHLA-DR/ペプチド結合アッセイを用いて選択される
【００２２】
これらアッセイは、結合できるかまたは反対に結合しないフラグメントの配列を、第１遺伝子または第２遺伝子の各々の対立遺伝子と明確に関連付けることができる。
この手法は、多数の様々なHLA-DR分子に結合し、そして有利には、例えそれらHLA分子が公知でなくとも、患者の大多数に対して保護できるペプチドを含む免疫原組成物を規定することができる。
また、この手法は、CD4+Tリンパ球を刺激するそれらの能力を基にしてペプチドを選択しようとする手法よりもHIV-1に対して著しくより特異的なペプチドを選択することができるようにする利点を有する。
培養条件は、各々のHLA-DR分子に対して特異的である（培養時間、ｐH、試薬R1、HLA-DRまたはペプチドの濃度）。
【００２３】
試薬R1は、次の配列からなる群から選択される：
・対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0401およびDRB1*1101に対して特異的なPKYVKQNTLKLAT (HA 306-318) (SEQ ID NO. 1)、
・対立遺伝子DRB1*1501に対して特異的なEAEQLRAYLDGTGVE (A3 152-166) (SEQ ID NO. 2)、
・対立遺伝子DRB1*0301に対して特異的なAKTIAYDEEARGLE (MT 2-16) (SEQ ID NO. 3)、
・対立遺伝子DRB1*0701に対して特異的なAAYAAAKAAALAA (YKL) (SEQ ID NO. 4)、
・対立遺伝子DRB1*1301に対して特異的なTERVRLVTRHIYNREE (B1 21-36) (SEQ ID NO. 5)  、
・対立遺伝子DRB3*0101に対して特異的なESWGAVWRIDTPDKLTGPFT (LOL 191-210) (SEQ ID NO. 6)、および
・対立遺伝子DRB4*0101に対して特異的なAGDLLAIETDKATI (E2/E168) (SEQ ID NO. 7)。
その他の試薬R1、特に、Southwoodら(14)で記載しているそれらを使用することができる。
変形として、前記免疫原組成物は、有利には、先に規定したようなペプチドをエンコードする配列を含む。
【００２４】
事実、免疫化のための裸のDNAの使用は、効果的なワクチン手法を構成する；それは、タンパク質抗原をエンコードする裸のDNAをワクチン化される宿主生物に注入することからなる；このDNAは、宿主細胞にて抗原の遅延合成および、免疫系に対するこの抗原の持続的提示をさせる。
また、本発明の対象は、先に規定したような免疫原組成物を含むことを特徴とするワクチンである。
また、本発明の対象は、
−先に規定したような白人集団で支配的である少なくとも１つのHLA II分子（HLA-DR）に関して、1000ｎM未満の結合活性を有し、前記ペプチドに特異的なCD4+Tリンパ球にて認識され、そして前記ペプチドに特異的なCD4+Tリンパ球を刺激しうるCD4+エピトープを含み、ならびに
−Bru株に関するNefタンパク質の次のフラグメント：
フラグメントは、Nefタンパク質の1〜36位に対応するフラグメント(Nef1)、3〜17位に対応するフラグメント(Nef1.1)、8〜22位に対応するフラグメント(Nef1.2)、11〜25位に対応するフラグメント(Nef1.3)、14〜28位に対応するフラグメント(Nef1.4)、Nefタンパク質の37〜71位に対応するフラグメント(Nef3)、66〜94位に対応するフラグメント(Nef4)、68〜82位に対応するフラグメント(Nef4.1)、74〜88位に対応するフラグメント(Nef4.4)、77〜91位に対応するフラグメント(Nef4.5)、79〜93位に対応するフラグメント(Nef4.6)、83〜97位に対応するフラグメント(Nef4.7)、113〜128位に対応するフラグメント(Nef7)、117〜132位に対応するフラグメント(Nef8)、132〜147位に対応するフラグメント(Nef9)、137〜168位に対応するフラグメント(Nef10)、137〜151位に対応するフラグメント(Nef10.1)、139〜153位に対応するフラグメント(Nef10.2)、141〜155位に対応するフラグメント(Nef10.3)、146〜160位に対応するフラグメント(Nef10.5)、155〜185位に対応するフラグメント(Nef11)、175〜190位に対応するフラグメント(Nef12)、182〜198位に対応するフラグメント(Nef13)、178〜192位に対応するフラグメント(Nef13.1)、181〜195位に対応するフラグメント(Nef13.2)、183〜197位に対応するフラグメント(Nef13.3)、187〜201位に対応するフラグメント(Nef13.4)、189〜203位に対応するフラグメント(Nef13.5)、および191〜205位に対応するフラグメント(Nef13.6)である
からなる群から選択される
ことを特徴とするHIV Nefタンパク質由来のペプチドである。
【００２５】
その様なペプチドは、HLA対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501(DR1、DR3、DR4、DR7、DR11、DR13およびDR15分子)にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子、および/またはHLA対立遺伝子DRB3*0101、DRB4*0101およびDRB5*0101(B3、B4およびB5)にてエンコードされる少なくとも１つのHLA-DR分子に、1000ｎM未満の結合活性で結合する利点を有している。
【００２６】
より正確に、以下の表７に従って、
−Nef1.2、Nef1.3、Nef1.4、Nef3、Nef4.2、Nef4.6、Nef4.7、Nef9、Nef10.5、Nef11およびNef13.6ペプチドは、1000nM未満の結合活性で、３つ以下のHLA-DRB1分子に結合する、そして
−Nef1、Nef4、Nef4.4、Nef4.5、Nef10、Nef10.2、Nef12、Nef13、Nef13.1、Nef13.2、Nef13.3、Nef13.4およびNef13.5ペプチドは、1000nM未満の結合活性で、DRB3、DRB4またはDRB5対立遺伝子にてエンコードされる少なくとも３つのHLA-DRB1分子および少なくとも１つのHLA-DR分子に結合する。
【００２７】
その様な結合活性は、前記ペプチドを使用することを可能にする：
−それらがCD4+T細胞の増殖応答を誘導し、それによって大多数の白人集団で細胞毒または体液応答を誘導するのを助ける限りにおいて、先に規定した条件下で、免疫原組成物中の混合物として。それゆえ、それらを、有利には、ワクチン組成物に組み込むことができる；
−または特に、診断薬として、好ましくは四量体の形態で、健全な個体、あるいはHIVにまたはAIDSに罹っている血清陽性反応の患者の免疫状態を評価するために。例えば、これら様々なペプチドによって、増殖またはELISPOTアッセイ（質的な評価）を使って、Nef特異的CD4+ T細胞の存在を検出するか、あるいは選択される（量的な評価）し、ラベルされるペプチドを使って、フローサイトメトリーによって細胞を分類することを行うことを可能にする：例えば、フローサイトメトリーによって、血球集団に関するNefタンパク質特異細胞のレベルを評価することを可能にする。
【００２８】
結局、また、本発明の対象は、先に規定したようなペプチド混合物からなる群から選択されるか、または先に規定したようなペプチドの１つであり、前記ペプチドが任意にラベルされるか、またはマルチマーの複合体の形態で複合化されていることを特徴とする診断薬である。
好ましくは、前記診断薬は、Nef1、Nef4、Nef10、Nef12およびNef13ペプチドから得られるペプチド混合物からなる。
【００２９】
また、本発明の対象は、先に規定したようなNefペプチドに特異的なCD4+ T細胞の存在を検出する工程を含むことを特徴とする個体の免疫状態を評価する方法である；有利には、前記検出を次のアッセイの１つを使って行う：増殖アッセイ、ELISPOTアッセイ[例えば、国際出願WO 99/51630またはGahery-Segardら(11)を参照]、または前記Nefペプチドから構成されるマルチマーの複合体の存在での、フローサイトメトリー。
より正確には：
★増殖アッセイに関して：
細胞の懸濁液（PBMC、CD8+細胞を欠いたPBMC、本発明によって選択されたペプチドを使ってインビトロで培養する工程を通して前もって富化されたTリンパ球、またはクローンしたTリンパ球）を、選択されたペプチドの存在下で、樹状細胞、オートロガスまたはヘテロガスなPBMCのような適切な提示細胞、EBVウイルスを使った感染後に得られるようなリンパ芽球状の細胞、あるいは遺伝学的に修飾された細胞の要求として、３〜５日間培養する。細胞の増殖を、トリチウム化されたチミジンを細胞のDNAに取り込むことで測定する。本発明に従って選択されたペプチドは、初期懸濁液中で、これらペプチドに特異的な細胞の存在を明らかにさせることができる。
【００３０】
★ELISPOTアッセイに関して：
ELISPOTアッセイは、本発明に従って選択され、γ-IFNを分泌するペプチドに特異的なT細胞の存在を明らかにさせることができる。
さらに正確には、Gahery-Segardら、2000 (11)に記載の方法に従って、T細胞を、患者からのPMBCの培養後、本発明に従って選択されるペプチドを使ってγ-IFNの分泌を測定することで明らかにする。
【００３１】
★マルチマーの複合体および特に四量体の複合体の使用に関して：
−生物学的なサンプル、好ましくは抹消血単核細胞（PBMC）を、先に規定したようなNefペプチドの複合体から生産された四量体の複合体−先に規定したような可溶性でビオチン化されたクラスIIHLA分子と接触させるようにする、そして
−ラベルされた細胞を、フローサイトメトリーにて解析する。
【００３２】
有利には、生物学的なサンプルを前記複合体に接触させる前に、前記サンプルを富化させるために、抗CD4抗体と接触させることで、CD4+ T細胞で富化される。
四量体を、例えばE.J. Novakら(J. Clin. Investig.、1999、104、R63-R67)またはM.J. Kurodaら(J. Virol.、2000、74、18、8751-8756)で明記したように調製する。
要約すると、四量体を、溶解性でビオチン化されたHLAII分子を、10倍を越す本発明に従って同定され、そして選択されたNefペプチドと共に、0.15MのNaClを含む10ｍMのクエン酸リン酸塩緩衝液中で、ｐH4.5〜7の間で、37℃で72時間培養することで生産する。
【００３３】
四量体化形態を、HLAII分子よりも4倍未満の量（モルに対するモル）で、蛍光色素を使ってラベルされたストレプタビジン調製物に加えることで得る。混合物を、周温で、一晩培養する。
これらの四量体を使用するため、細胞（PBMC、CD8+細胞を欠いたPBMC、本発明によって選択されたペプチドを使ってインビトロで培養する工程を通して前もって富化されたTリンパ球、またはクローンしたTリンパ球）の上清を、１つ以上の四量体（10〜20mg/ml）と１〜３時間接触させる。洗浄後、上清をフローサイトメーターにて解析する：四量体を使った細胞のラベル化を、これら構築物が蛍光性であることから目視する。
【００３４】
フローサイトメーターは、ラベルされていない細胞からの四量体を使ってラベルされた細胞を分離させ、そして細胞分類を行うことを可能にする。
そして、また本発明の対象は、少なくとも次の工程：
−分類すべき細胞の懸濁液を、先に規定したようなNefペプチド/溶解性であるビオチン化されたHLAII分子の複合体から形成され、そして蛍光色素を使ってラベルされたストレプタビジンに共役した１つ以上の四量体に１〜３時間培養または接触させ、
−フローサイトメトリーにて解析し、そして
−四量体を使ってラベルされた細胞を分類する
を含むことを特徴とするHIV特異的Tリンパ球を分類する方法である。
【００３５】
実施例１：結合アッセイの原理
−ペプチド合成
選択したペプチドは、Wain-Hobsonらによって公表されたBru株のNefタンパク質の配列をカバーしている。全てのペプチドを、固層上でFmocストラテジに従って平行合成で合成し、HPLCによって精製し、そしてマススペクトロメーター（ES-MS）にて検査した。
−HLA-DR分子の精製
HLA-DR分子を、様々な相同性のEBV系統（14）から免疫親和性によって精製した。使用は、特に、Southwoodら（14）で記載された方法であってもよい。それらを特徴付けるこれらの起源と、様々な対立遺伝子を、表4に記載する。
【００３６】
【表４】
2005506283.tif 000005
【００３７】
HLA-DR分子に特異的な単一形態の抗体は、特に、Southwoodら（14）で記載されているか、またはPoschら（15）で記載されているものである。抗体を、タンパク質A-セファロースカラムで、培養物の上清から精製する。これらの抗体を、HLA-DR分子を精製するため、セファロース4Bまたはタンパク質A-セファロースカラムに結合させる。
【００３８】
−HLA-DR/ペプチド結合アッセイ
HLA-DR分子に対するペプチドの結合についてのアッセイは、最初にHLA-DR分子上でHill（16）によって開発された免疫酵素法の新事実を使った競合アッセイである。それらを、多くのサンプルを同じ実験で研究することを可能にする96穴プレート上で行った。つまり、精製されたHLA-DR分子を、トレーサーとなるビオチン化されたペプチド、および様々な濃度の試験ペプチドを使って培養する。
培養24〜27時間後、サンプルを中和し、そして各々100μlのサンプルを、HLA-DR分子に特異的な単一形態の抗体を使って保護されるELISAプレート上にトランスファーする。HLA-DR分子に特異的な単一形態の抗体を介して、プレートの底に付着されるHLA-DR分子/ビオチン化されたペプチド共役体を、ストレプタビジン−フォスファターゼ複合体と蛍光基質によって明らかにする。各々のペプチドの活性を、ビオチン化されたペプチドの結合の50％（IC50）を抑制するこのペプチドの濃度で特徴付ける。
【００３９】
−結合アッセイの選択および最適化
対立遺伝子の選択（第一遺伝子）
研究した対立遺伝子は、全てフランス人集団の人口の5％を超える頻度の対立遺伝子である。
それらは、対立遺伝子DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0401、DRB1*0701、DRB1*1101、DRB1*1301およびDRB1*1501 である(表1)。それらは、それら自身で、白人集団の対立遺伝子の53〜82％を表し、HLA-DR系列の多様な特異性の部分である。
【００４０】
対立遺伝子の選択（第二遺伝子）
研究した対立遺伝子は、最も一般的に出くわす対立遺伝子である。それらは、対立遺伝子HLA-DRB3*0101、HLA-DRB4*0101およびHLA-DRB5*0101である。
【００４１】
アッセイ特異性
ビオチン化されたペプチドの選択は、アッセイの特異性を決定する因子である。使用した細胞のほとんどは、２つの異なるHLA-DR分子（2つの対立遺伝子にてエンコードされる）を有しており、両者は、HLA-DR分子に特異的な単一形態の抗体によって精製され、そして同一の抗体で認識される。DRB1対立遺伝子に対するペプチドの結合を明確に研究するため、ビオチン化されたペプチドが、この対立遺伝子に結合し、そしてその他の対立遺伝子の産物に結合しないことを確かめることが必要である。
この目的のため、先の試薬R1として規定したようなペプチドを使用した。
【００４２】
アッセイ条件および感受性
各々のHLA-DRB1分子について、MHCII分子の濃度、ビオチン化されたペプチドの濃度、
培養ｐHおよび培養時間を、以下の表５で明記したように最適化した。
【００４３】
【表５】
2005506283.tif 000006
【００４４】
【表６】
2005506283.tif 000007
【００４５】
示した頻度は、フランス人での対立遺伝子頻度であり、白人集団の人々を代表する。それらは、Colonbani（4）由来である。
以下の表７は、先に明記した条件下で測定した本発明によるペプチドに対する結合活性を説明する。
【００４６】
【表７】
2005506283.tif 000008
【００４７】
結果を、最大結合の50％の抑制をさせる濃度の形態で表す。
単位は、ｎMである。
【００４８】
実施例２：増殖アッセイ
本発明による免疫原組成物を使って、CD4+ T細胞増殖の刺激を変化させるため、増殖アッセイをインビトロで行う。
末梢血から抽出した細胞（PBMC）を、5×105個の細胞/ウエルの割合で、最終容量200μlの完全培地で、96ウエルマイクロプレートで培養した。細胞を、本発明による20μg/mlのペプチド混合物で刺激、または刺激しなかった。37℃で72時間培養後、細胞を、0.25μCiの［3H］チミジン（Amersham、Life technologie）で一晩培養した。細胞を回収し、そして［3H］チミジンの取り込みを細胞内DNAで測定した。
CD4+  T細胞の刺激を、事実上、観察した。
その他の細胞を使用することができる：CD8+細胞が除去されたPBMC、先に規定したようなペプチドを使って、インビトロでの培養工程を介して前もって富化されたTリンパ球、またはクローンしたリンパ球。
要するに、富化工程は、次のようなである：
フィコール勾配上で分離されたPBSを、0.1〜10mg/mlのペプチドの存在で、10％のヒトの血清で補充されたRPMI培地で、37℃で培養する。培養７日目および11日目に、50ユニットの組換えヒトIL-2を培養物に加える。細胞を14日目に採取する。
【００４９】
実施例３：ELISPOT
ELISPOTは、ペプチドに特異的な細胞を検出し、そして与えられるサイトカインをスクリーニングすることを可能にする。
PBS緩衝液で4μg/mlの濃度に希釈される50μl/ウエルのマウス抗ヒトγ-IFN抗体を、湿潤なチャンバー内で、ニトロセルロース-底を付けた96ウエルプレート中で、4℃で一晩培養する。
ウエルを、PBSを使って洗浄し、そして10％ｎ仔牛血清を含むRPMI培地に37℃で2時間浸す。
必要であれば、オートロガスまたはヘテロガスなPBMC、EBVウイルスを使った感染後に得られるようなリンパ芽球状の細胞、あるいは遺伝学的に修飾された細胞のような適切な提示細胞を使い、ウエル内に散布する。そして、本発明で規定したようなNefペプチドを、様々な濃度（10、5、および1μg/ml）で加える。
エフェクター細胞（PBMC、CD8+細胞を欠いたPBMC、本発明によって選択されたペプチドを使ってインビトロで培養する工程を介して前もって富化されたTリンパ球、またはクローンしたTリンパ球）を、20 000細胞/ウエルの割合で、96ウエルプレートに加える。
【００５０】
培養物を、5％CO2を含む雰囲気内で、37℃で24時間培養する。
そして、プレートを洗浄し、ヒトγ-IFNに特異的な100μlのウサギ抗血清を使って2時間培養する。
洗浄後、ビオチンに共役した抗ウサギIgG抗体と、アルカリリン酸塩に共役したストレプタビジンを、連続して1時間加える。
最後に、スポットを、アルカリリン酸塩に対する色素基質を使って明らかにする。ネガティブコントロールを、ペプチドを含まないウエルで得る。ポジティブコントロールを、イオノマイシン（500ng/ml）およびフィトヘマグルチニン（PHA）（10μg/ml）のような有糸分裂促進剤、例えばを含むウエルで供給する。
【００５１】
引用文献参照
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2005506283.tif 000047
【国際調査報告】
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2005506283.tif 000049
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