(57)【要約】本発明によれば、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患の、治療または予防方法を提供し、該方法は、１種以上の成長ホルモン放出ペプチド類（ＧＨＲＰｓ）を前記治療または予防を必要としている患者に投与することを含む。また、血漿コレステロールレベル低下方法類、ならびに、スカベンジャーレセプターＣＤ３６および細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現を修飾する方法類を提供する。
2005539091.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、または、アテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患の、治療または予防方法であって、該方法は１種以上のＧＨＲＰｓを前記治療または予防を必要としている患者に投与することを含む。
【請求項２】
アテローム性動脈硬化斑、高コレステロール血症または心脈管系疾患類の発生リスクを有する患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することによって、前記アテローム性動脈硬化斑、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患の発生を防止することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患を既に有している患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することによって、アテローム性動脈硬化斑、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患を治療することを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
アテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患が、冠動脈疾患、心筋梗塞または脳卒中である請求項１乃至３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
総血漿コレステロールレベル低下を必要とする患者の総血漿コレステロールレベルを低下させる方法であって、該方法は前記患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む方法。
【請求項６】
血漿非ＨＤＬコレステロールレベル低下を必要とする患者の血漿非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させる方法であって、該方法は前記患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む方法。
【請求項７】
ＣＤ３６発現をマイナス方向に調整する方法であって、該方法はＣＤ３６発現のマイナス方向調整により恩恵を受ける患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む方法。
【請求項８】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現を増大させる方法であって、該方法は前記のような遺伝子類の発現増大により恩恵を受ける患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む方法。
【請求項９】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類が、核受容体ＬＸＲとＡＢＣＡ１トランスポーターの少なくとも一方である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ３６発現と作用の少なくとも一方を調整することによってマクロファージによるｏｘＬＤＬコレステロール取り込みを低下させる方法であって、該方法はマクロファージによる酸化リポ蛋白の取り込み低下により恩恵を受ける患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む方法。
【請求項１１】
１種以上のＧＨＲＰｓがヘキサレリン（Ｈｉｓ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）またはＥＰ８０３１７（Ｈａｉｃ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）である先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、またはアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患の治療または予防用薬物の製造における１種以上のＧＨＲＰｓの用途。
【請求項１３】
薬物がアテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、またはアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患の発生を防止する請求項１２記載の用途。
【請求項１４】
薬物が既存のアテローム性動脈硬化、高コレステロール血症、またはアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患を治療するためである請求項１２記載の用途。
【請求項１５】
アテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患が、冠動脈疾患、心筋梗塞または脳卒中である請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の用途。
【請求項１６】
総血漿コレステロールレベル低下を必要とする患者の総血漿コレステロールレベルを低下させるための薬物製造における１種以上のＧＨＲＰｓの用途。
【請求項１７】
血漿非ＨＤＬコレステロールレベル低下を必要とする患者の血漿非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させるための薬物製造における１種以上のＧＨＲＰｓの用途。
【請求項１８】
ＣＤ３６発現のマイナス方向調整による恩恵を受ける患者における、前記ＣＤ３６発現調整のための薬物製造のための１種以上のＧＨＲＰｓの用途。
【請求項１９】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現増大による恩恵を受ける患者における上記遺伝子類の発現増大のために行われる薬物製造のための、１種以上のＧＨＲＰｓの用途。
【請求項２０】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類が、核レセプターＬＸＲαとＡＢＣＡ１トランスポーターの少なくとも一方である請求項１９記載の用途。
【請求項２１】
マクロファージによる酸化リポ蛋白取り込みの調整によって恩恵を受ける患者における、前記調整のための薬物製造のための１種以上のＧＨＲＰｓの用途。
【請求項２２】
１種以上のＧＨＲＰｓがヘキサレリン（Ｈｉｓ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）またはＥＰ８０３１７（Ｈａｉｃ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）である請求項１２乃至２１のいずれかに記載の用途。
【請求項２３】
アテローム性動脈硬化および高コレステロール血症の治療または予防における、ヘキサレリン族の成長ホルモン放出ペプチド類、誘導ペプチド模擬物質類およびＣＤ３６リガンド類の用途。
【請求項２４】
スカベンジャーレセプターＢ（ＣＤ３６）の発現を調整する、ＧＨＲＰ誘導体類、誘導ペプチド模擬物質類、およびＣＤ３６リガンド類の、アテローム性動脈硬化発生予防と冠動脈疾患および高コレステロール血症に関連した心臓発作および脳卒中の予防における用途。
【請求項２５】
ＡＴＰ結合カセットＡＢＣＡ１トランスポーターおよびスカベンジャーレセプターＢ（ＣＤ３６）の発現を調整するＧＨＲＰ誘導体類および誘導ペプチド模擬物質類の、アテローム性動脈硬化病巣発生予防と冠動脈疾患および高コレステロール血症に関連した心臓発作および脳卒中の予防における用途。
【請求項２６】
請求項２３乃至２５に定義した化合物を含む体外投与のための薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および関連疾患類の治療および予防における、成長ホルモン放出ペプチド類（ＧＨＲＰｓ）の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化は、特に、喫煙、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症、血漿低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）およびトリグリセリド類増加、高フィブリノーゲン血症および高血糖症を含む、生化学的リスク因子を呈する対象中で選択的に発展する多因子疾患である。アテローム性動脈硬化病巣はヒトで何十年にもわたって発達し、冠および脳の虚血性および血栓塞栓性疾患および心筋および脳梗塞のような合併症につながる。今日まで、心脈管系疾患は工業国では病的状態および死亡の主要原因であり、発展途上国でも着々と進行しており、冠動脈硬化が主な病因である。現在、アテローム性動脈硬化の治療は、疾病進展と合併症を完璧に効果的に防止しているというわけではない。
【０００３】
アテローム性動脈硬化は、泡沫細胞分化、炎症反応と細胞増殖という少なくとも３種の過程が順次相互作用して発展する。
【０００４】
ヒトおよびさまざまな動物モデルにおいて、これらの過程の最初に検出できる最も初期事象のひとつとして、より大きな動脈のまだ元のままの損なわれていない内皮内層に対して、単核性食細胞やリンパ細胞を補充することがあげられる。最内膜への血液単球の付着と蓄積が増加すると細胞表現型に変化が起こり、そこでそれらはマクロファージに変換される。後者は、脂質を包み込みそれらを細胞質小滴として貯蔵し、従って“泡沫細胞”となる。このような泡沫細胞の形成は、初期脂肪線条病巣発生において重要段階であり、従って、アテローム発生における中心的事象である。
【０００５】
Ｂ型スカベンジャーレセプターＣＤ３６は複数の機能を有していることがわかっており、酸化された低比重リポ蛋白を単球／マクロファージ中に群集させる際、重要な役割を演じていると考えられている。
【０００６】
成長ホルモン放出ペプチド類（ＧＨＲＰｓ）は、Ｍｅｔ−エンケファリンをモデルとした小さな合成ペプチド類族から構成され、強力かつ用量依存性の成長ホルモン放出活性を示し、また、有意なプロラクチンおよびコルチコトロピン放出効果を示す（Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５１（ｓｕｐｐｌ．３）、９（１９９９）、参照。）。
【０００７】
ＧＨＲＰｓの神経内分泌活性は、視床下部および下垂体で発現するグレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）レセプターとして確認された特定のＧたんぱく質結合レセプターによって媒介される（Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５６（ｓｕｐｐｌ．１）、９３（２００１）、参照。）。しかし、ＧＨＲＰｓはまた、成長ホルモン（ＧＨ）欠乏または加齢ラットにおける心虚血に対して心臓保護効果を有する。この保護活性は、成長ホルモン機能の明確な刺激とは結びつかず、これらのペプチド類の直接的心筋作用を示唆している（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３３４、２０１（１９９７）、参照）。
【０００８】
心脈管系におけるＧＨＲＰ結合部位の研究から、ＧＨＲＰ族のヘキサペプチドであるヘキサレリンがグレリンレセプターと明確に異なる８４ｋＤの糖化膜たんぱく質に結合することがわかった（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８５，７９６（１９９９）、参照）。このたんぱく質は、後に、ＣＤ３６レセプターとして確認された（Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０，８４４（２００２）、参照）。
【０００９】
上記先行技術のいずれも、ＧＨＲＰｓまたはそれらの合成アナログ類を用いて前記レセプターＣＤ３６の脂質捕捉機能を阻害でき、それによって、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症および関連疾患の治療および予防における用途を提供できることを示唆していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＧＨＲＰｓで長期（１２週間）処置すると、ＣＤ３６スカベンジャーレセプター機能と発現を妨害し、それによって、酸化ＬＤＬ（すなわち、ｏｘＬＤＬ）の取り込みと脂質類およびコレステロールの蓄積を低下させ、その結果、ＡｐｏＥ欠乏マウスにおける脂肪線条病巣形成が低下することを見出した。
【００１１】
ＡｐｏＥ欠乏マウスは、白血球と内皮の付着相互作用の増大、単球由来マクロファージ類の泡沫細胞への変換と動脈系全体への病巣伝播、およびより進行した病巣（線維性プラーク類）の後期発達を含む、ヒトにおけるアテローム発生事象進行過程を特徴とするので、アテローム性動脈硬化実験モデルとして選択した。
【００１２】
ＡｐｏＥ欠乏マウスは、コレステロール高含量のリポ蛋白のクリアランス不全の結果として極めて高い血漿コレステロールレベルを示し、またヒトの場合には、高脂肪高コレステロール（ＨＣＨＦ）食が疾病の進行を悪化させ、血漿コレステロールレベルを顕著に増加させる（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（８），１０４９−１０５６（２０００）およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５，１０３９−１０４１（２０００）参照）。脂肪線条全てがアテロームにまで進行するというわけではないが、ヒトではアテローム斑（プラーク）発生傾向を有する剖検部位中、脂肪線条が成熟病巣の前に出現することを裏付ける証拠が蓄積されてきている（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９、２３６４−２３６７（１９９９）参照）。ヒトおよびマウスの両者において、Ｔリンパ球および泡沫細胞が脂肪線条で見られ、両方の種において長年にわたり免疫プロセスが似ていることがわかった。
【００１３】
本発明者らは、ＨＦＨＣ食を６週齢から給餌されたＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて、ＧＨＲＰｓが総血漿コレステロールおよび非ＨＤＬコレステロールを低下させ、かつ、ＨＤＬコレステロールを増加させることを見出した。血漿脂質類がこのようにうまく変化したのは、対照に比較してＧＨＲＰｓ処置ＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて脂肪線条病巣領域が有意に減少したことに関連していた。
【００１４】
本発明者らはまた、ＧＨＲＰｓがＨＦＨＣ食を１２週間給餌されたマウスにおいてＡｐｏＥ欠乏マウス由来腹膜マクロファージにおけるＣＤ３６発現を制御することを見出した。
【００１５】
本発明者らは、さらに、分化単球ＴＨＰ−１細胞由来培養マクロファージを用いて、ＧＨＲＰｓ処置がマクロファージ中における脂質貯蔵を低下させることに寄与し、それとともに、核受容体ＬＸＲαおよびＡＢＣＡ１トランスポーターの遺伝子発現を上昇させることを見出したが、この２種のたんぱく質は、細胞コレステロール流出に関与している。
【００１６】
ＧＨＲＰｓは、したがって、マクロファージにおけるコレステロール蓄積と泡沫細胞形成を防止し、それによって脂肪線条発生を低下させるようである。理論に縛られることを望むわけではないが、こうした理由から本発明者らはＧＨＲＰｓが効率的にアテローム性動脈硬化斑と冠動脈疾患、心筋梗塞および脳卒中のようなアテローム性動脈硬化過程に関連した心脈管系疾患の発生を防止できるであろうと考えている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明の第１の局面は、アテローム性動脈硬化または高コレステロール血症の治療または予防方法を提供し、それによって、アテローム性動脈硬化に関連する心脈管系疾患の発生を防止したり治療したりすることであり、前記方法は、１種以上のＧＨＲＰｓを前記治療または予防を必要としている患者に投与することを含む。
【００１８】
用語“アテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患”は、それらがアテローム性動脈硬化病巣の結果として生じるという点で、アテローム性動脈硬化に医学的に関連している疾患を含む。アテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患として挙げられるものには、冠動脈疾患、心筋梗塞および脳卒中が含まれる。
【００１９】
本発明の第１の局面の態様において、アテローム性動脈硬化斑、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患の発生を防止する方法を提供し、前記方法は、上記アテローム性動脈硬化斑、高コレステロール血症または心脈管系疾患類の発生リスクを有する患者に対して、１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む。本発明のこの態様には、アテローム性動脈硬化斑またはそれらの前駆体類（例えば脂肪線条）の形成を予防するため、ＧＨＲＰｓにより患者を処置することを含む。
【００２０】
理論に縛られることを望むわけではないが、本発明のこの態様は、総血漿コレステロールと非ＨＤＬコレステロールを低下させることの他に、マクロファージにおけるＣＤ３６発現をマイナス方向に調整し、それによって結果的にｏｘＬＤＬ内在化を阻害し、従って、泡沫細胞形成サイクルとｏｘＬＤＬ誘発ＰＰＡＲγおよびＣＤ３６発現のフィードフォワードループを遮断することにより、脂肪線条形成とアテローム性動脈硬化発生を防止すると考えられる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．７、４１−４７（２００１）参照）。
【００２１】
本発明の第１の局面の第２の態様において、既存のアテローム性動脈硬化または高コレステロール血症を治療し、それによって、アテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患の治療と進展の防止の少なくとも一方の方法を提供し、該方法は、アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症とアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患の少なくとも一方を有する患者に対して、１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む。本発明のこの態様は、既存のアテローム性動脈硬化斑またはそれらの前駆体類（例えば、脂肪線条）の大きさを小さくするため、患者をＧＨＲＰｓで治療することを含む。
【００２２】
本発明の第２の局面によれば、総血漿コレステロールレベル低下を必要とする患者の総血漿コレステロールレベルを低下させる方法を提供し、該方法は、前記患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む。この方法のひとつの態様において、ＧＨＲＰｓは、非ＨＤＬコレステロールの血漿レベル低下のため、患者に対して投与される。
【００２３】
本発明の第３の局面によれば、ＣＤ３６発現をマイナス方向に調整する（低下させる）方法を提供し、該方法は、ＣＤ３６発現のマイナス方向調整（低下）により恩恵を受ける患者に対して、１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む。
【００２４】
本発明のこの面の好適な態様において、（単球由来）マクロファージにおけるＣＤ３６発現をマイナス方向に調整する方法が提供され、該方法は、マクロファージ中におけるＣＤ３６発現のマイナス方向調整により恩恵を受ける患者に対して、１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む。
【００２５】
本発明の第４の局面によれば、細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現を増大させる方法を提供し、該方法は、このような遺伝子類の発現増大により恩恵を受ける患者に対して、１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む。
【００２６】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類としてあげることができるのは、核受容体ＬＸＲαおよびＡＢＣＡ１トランスポーターの遺伝子類を含む。
【００２７】
ＣＤ３６発現低下およびＬＸＲαおよびＡＢＣＡ１トランスポーター発現増大は、同時に起こることもあり得る。このようなものとして、本発明のある態様は、ＣＤ３６発現と作用の少なくとも一方のマイナス調整によって、また、細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現増大によって、細胞中正味のコレステロール流動（例えば、マクロファージへおよびマクロファージから）の重要な制御因子類の調整方法に関し、該方法は、正味の細胞コレステロール流動の前記調整により恩恵を受ける患者に対して、１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む。当業者にはわかるであろうが、ＣＤ３６発現と作用の少なくとも一方のマイナス調整の結果、スカベンジャーレセプターＣＤ３６によるｏｘＬＤＬの取り込みが低下する。
【００２８】
本文では、用語“発現”は、他に断りがなければ、関連遺伝子の転写によるｍＲＮＡの産生を意味し、特に、遺伝子転写と次にｍＲＮＡ翻訳によりたんぱく質を産生させることを意味する。同様に、用語“遺伝子類の発現”とは、遺伝子転写と次のｍＲＮＡ翻訳によるたんぱく質産生を意味し、特に、関連遺伝子の転写によるｍＲＮＡ産生を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（ｉ）血液コレステロールレベル低下を必要とする：
（ｉｉ）ＣＤ３６発現のマイナス方向調整により恩恵を受ける：
（ｉｉｉ）細胞中コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現増大により恩恵を受ける；
（ｉｖ）スカベンジャーレセプターＣＤ３６によるｏｘＬＤＬ取り込み低下と細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現増大により恩恵を受ける、
といった患者は、心脈管系疾患または機能不全を引き起こすかまたは悪化させるような血中コレステロールレベルを有する患者が含まれる。このような患者には、
（ａ）冠心疾患を有するものおよび複数のリスク要因（肥満、喫煙、高血圧、糖尿病および未成熟冠心疾患の家族歴を含む）によりその発生リスクを有するもの；
（ｂ）極めて高い血漿コレステロールとトリグリセリド類の少なくとも一方の濃度を特徴とする家族性の状態を有するもの；
（ｃ）（甲状腺機能低下症、ネフローゼ症候群、肝疾患またはアルコール依存症のような）原疾患に続発性でない高脂血症を有するもの；
（ｄ）ＬＤＬ−コレステロール上昇のもの；
（ｅ）食事性高脂血症用介入治療（補充療法）を受けているもの；
が含まれる。
【００３０】
本文では、用語“ＧＨＲＰｓ”は、下垂体−視床下部軸を活性化させ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５３，３０３（１９９３）参照）非成長ホルモン放出ホルモン（非ＧＨＲＨ）、非アヘン製剤およびソマトスタチン分泌経路によって、下垂体のソマトトロフに直接作用できる（合成）ペプチド化合物類に関連するものを含む。前記用語はまた、（ａ）他のＧＨＲＰｓによるＧＨ放出を阻害できそれ自体ＧＨＲＨアゴニズムには全く効果を有していないものと、（ｂ）ＧＨ放出活性を欠損しかつＧＨＲＨアゴニズムに全く効果を有していない構造関連（ペプチド模擬）化合物類に関連するものの少なくとも一方を含む。ＧＨＲＰｓ（それらのアンタゴニスト類を含めて）の例は、“Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅｓ”、Ｂ．Ｂｅｒｃｕ＆Ｒ．Ｆ．Ｗａｌｋｅｒ著，９−２８ページおよび８５−１０２ページ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）；Ｊ．Ｐｅｄ．Ｅｎｄ．Ｍｅｔａｂ．８、３１１−３１３（１９９６）；Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｐｐｌ．４２３、８５−８７（１９９７）；Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５０、１１４９−１１５５（１９９２）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３６、４４５−４６０（１９９７）；Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６、２１−３１（１９９３）；Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８、１７７−１８６（１９９３）；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １０６、６６３−６６７（１９８０）；同上  １０８、３１−３９（１９８１）；同上  １１４、１５３１−１５３６および１５３７−１５４５（１９８４）；Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１９（１）、４７−７２（１９９８）；Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５４（１２）、１３１６−１３２９（１９９８）；ＷＯ  ８９／０７１１０；ＷＯ  ８９／０７１１１；ＷＯ  ９３／０４０８１；ＷＯ  ９６／１５１４８；ＵＳ  ４，４１１、８９０；およびＵＳ  ６，０２５，４７１に記載されている。
【００３１】
本発明の上述の面のいずれかに関して、挙げることができるＧＨＲＰｓには、ＨＥＸ（Ｈｉｓ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）およびＥＰ８０３１７（Ｈａｉｃ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）のようなヘキサレリン（ＨＥＸ）族のそれらが含まれ、後者ペプチドは、インビボにおけるＧＨ分泌活性を欠損している。好適なＧＨＲＰｓは、ヘキサレリンおよびＥＰ８０３１７である。特に、好適なＧＨＲＰｓは、ＥＰ８０３１７のようにインビボでＧＨ分泌活性を欠損しているものである。
【００３２】
本発明の第１の局面の方法のような本発明の方法類は、特に、ＧＨＲＰの全身投与段階を含み、保護量の薬物を循環させることができる。極めて特定の態様において、ヘキサレリン、ＥＰ８０３１７および全てのＧＨＲＰアナログは、体外から投与される。本発明の方法類を用いて、好適にはヒトである動物類を治療できる。
【００３３】
本発明の好適な面には、本発明の上述の局面全てによる方法類を含むが、ＧＨＲＰｓの代わりに、ＨＥＸおよびＥＰ８０３１７の関連合成アナログ類、およびそれらの化合物類のレセプター（類）またはＧＨＲＰｓのレセプター（類）に結合する全てのリガンド類を使用することはこの限りではない。ＧＨＲＰｓのレセプター（類）に結合するリガンド類にはＣＤ３６リガンド類が含まれ、それらは、ＣＤ３６上の（ＧＨＲＰ）結合部位の分子モデル化を要するインシリシオ技術を用いて同定することもできる。
【００３４】
さらに本発明ではまた、下記を含む：
１）ヘキサレリン族の成長ホルモン放出ペプチド類、誘導ペプチド模擬物質類およびＣＤ３６リガンド類の、アテローム性動脈硬化および高コレステロール血症の予防および治療における用途。
【００３５】
２）スカベンジャーレセプターＢ（ＣＤ３６）の発現を調整する、ＧＨＲＰ誘導体類、誘導ペプチド模擬物質類、およびＣＤ３６リガンド類の、アテローム性動脈硬化病巣発生予防および冠動脈疾患および高コレステロール血症関連心臓発作および脳卒中の予防における用途。
【００３６】
３）スカベンジャーレセプターＢ（ＣＤ３６）の発現を調整する、ＡＴＰ結合カセットＡＢＣＡ１トランスポーターとＧＨＲＰ誘導体類および誘導ペプチド模擬物質類の、アテローム性動脈硬化病巣の発生予防および冠動脈疾患および高コレステロール血症関連心臓発作および脳卒中の予防における用途。
【００３７】
４）上記１）から３）に定義した化合物を含む体外投与用薬剤組成物。
【００３８】
上記１）の態様において、ヘキサレリン族の成長ホルモン放出ペプチド類、誘導ペプチド模擬物質類およびＣＤ３６リガンド類の、アテローム性動脈硬化および高コレステロール血症の予防および治療における用途が提供される。
【００３９】
さらに、上記３）の態様において、ＧＨＲＰ誘導体類およびＡＴＰ結合カセットＡＢＣＡ１トランスポーターの発現を調整する誘導ペプチド模擬物質類の、アテローム性動脈硬化病巣の発生予防および冠動脈疾患および高コレステロール血症関連心臓発作および脳卒中の予防における用途が提供される。
【００４０】
アテローム性動脈硬化、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化関連心脈管系疾患治療において、ＧＨＲＰｓは、異なる作用機作を有し、かつ、血中脂質レベルに有益な効果をもたらす他の物質類と併用投与することもできる。
【００４１】
したがって、さらに本発明の他の面において、下記：
（ｉ）ＧＨＲＰ；
（ｉｉ）血中脂質レベルに有益な効果をもたらす物質
を含む組み合わせ産物が提供され、ここで、成分（ｉ）および（ｉｉ）のそれぞれは、薬剤学的に許容できる補助薬、希釈剤または担体と混合して製剤化される。
【００４２】
本発明のこの面による組み合わせ産物は、血中脂質レベルに有益な効果をもたらす物質とともに、ＧＨＲＰを投与することができるように、つまり、別々の製剤としても提供することができるし、ここで、それらの製剤類の少なくともひとつはＧＨＲＰを含み、少なくともひとつは、血中脂質レベルに有益な効果をもたらす物質を含むか、または組み合わせ調剤として提供（すなわち、製剤化）（すなわち、ＧＨＲＰと血中脂質レベルに有益な効果をもたらす物質を含む単一製剤として提供）することもできる。
【００４３】
したがって、さらに、
（１）薬剤学的に許容できる補助薬、希釈剤または担体と混合したＧＨＲＰと血中脂質レベルに有益な効果をもたらす物質を含む薬剤製剤；と、
（２）以下の（ａ）、（ｂ）の成分類を含むパーツのキットを提供し、
（ａ）薬剤学的に許容できる補助薬、希釈剤または担体と混合したＧＨＲＰを含む薬剤製剤；
（ｂ）薬剤学的に許容できる補助薬、希釈剤または担体と混合した血中脂質レベルに有益な効果をもたらす物質を含む薬剤製剤、
ここで、成分類（ａ）と（ｂ）は、それぞれ、他と併用して投与するために適している形状で提供される。
【００４４】
本文では、用語“血中脂質レベルに有益な効果をもたらす物質”には、ＧＨＲＰｓではないが、患者に投与すると血中総コレステロールとトリグリセリドレベルの少なくとも一方を低下する効果、血中ＬＤＬコレステロールレベルを低下する効果と血中ＨＤＬコレステロールを増加させる効果の少なくとも一方を有する、薬剤学的に活性な物質類に関連するものを含む。このようなものとして、この用語には、下記の活性物質類のいずれに関連するものを含む。
【００４５】
（Ｉ）アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシムバスタチンのようなスタチン類（すなわち、３−ハイドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ）；
（ＩＩ）ベクロブレート、ベザフィブレート、シプロフブレート、クリノフィブレート、クロフィブレート、クロフィブリド、エトフィリンクロフィブレート、フェノフィブレート、ゲムフィブロジル、ピリフィブレート、プラフィブリド、シムフィブレートおよびトコフィブレートのようなフィブレート類（すなわち、フィブリン酸類の誘導体類および関連化合物類）；
（ＩＩＩ）コレスベラム、コレスチポル、コレスチラミンおよびジビスチラミンのような胆汁酸結合レジン類；
（ＩＶ）アシピモックス、ビニフィブレート、エトフィブレート、ニセリトロール、ニコフィブレート、ピロザジル、ロニフィブレート、ソルビニケートおよびトコフェリルニコチネートのようなニコチネート類（すなわち、ニコチン酸およびその誘導体類）；
（Ｖ）オメガ−３−酸エチルエステル類およびオメガ−３−マリントリグリセリド類のようなオメガ−３−トリグリセリド類；
（ＶＩ）アバシミベのようなアシル−コエンザイムＡコレステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）阻害剤類；
（ＶＩＩ）ピオグリタゾンのようなＰＰＡＲγアゴニスト類；
（ＶＩＩＩ）エゼチミベのようなコレステロール吸収阻害剤類；および
（ＩＸ）オルリスタットのようなリパーゼ阻害剤類。
【００４６】
血中脂質レベルに有益な効果をもたらす好適な物質類には、上記（Ｉ）で具体的に述べたもののようなスタチン類を含む。
【００４７】
本発明の具体的局面には、前記併用産物がさらに１種以上のＧＨＲＰｓと血中脂質レベルの少なくとも一方に有益な効果をもたらす、１種以上の物質類を含む態様類が含まれる。前記組み合わせ産物の必須成分類について、ＧＨＲＰまたは血中脂質レベルに有益な効果をもたらす物質それぞれは、別々に製剤化することもできるし、または前記組み合わせ産物の他の成分類のいずれかひとつと併用して製剤化することもできる。
【００４８】
本発明をさらに、特定の態様実施例と付属図面を説明しながら下記で説明するが、その目的は、発明の範囲を限定するというよりはむしろ発明を例示するためである。
【００４９】
一般に、本発明が説明されるが、その好適な実施態様を例示によって示す添付の図面が参照される。
【００５０】
実施例
実施例１
成長ホルモン放出ペプチド類は、脂肪線条形成を防止する
動脈疾患であるアテローム性動脈硬化とその合併症の結果である重篤な病的状態は、心筋梗塞および脳卒中であり、西欧諸国ではありふれた死亡原因となったままである（Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１０（１），２７−４２（２００１）参照）。現在のアテローム性動脈硬化管理方針には、健康的な食生活と運動の勧めのようなライフスタイルへの介入が含まれ、主に、血圧管理と抗血小板薬剤の使用の他に脂質低下薬物療法を用いることが挙げられる。高脂血症用薬物には肝ハイドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡレダクターゼ阻害剤類またはスタチン薬剤類があり、それらは肝コレステロール代謝に干渉し、結果としてＬＤＬレセプター類が補完的に増加し、さらに、これらのレセプター類によるコレステロールクリアランスが上昇することになる。対照的に、フィブレート類およびニコチン酸は主に、循環ＶＬＤＬを低下させ、一方胆汁酸結合レジン類は、胆汁酸再吸収に干渉し、それによって糞便からのコレステロール排泄を増加させる。しかし、単独療法および別の脂質低下薬物と併用使用されるスタチン類は、重篤な副作用であるミオパシーおよび横紋筋融解症に関連していた（Ｔｅｘａｓ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊ．  ２８，１４２−１４５（２００１）参照）。たとえば、セリバスタチン療法は、非常に多くのミオパシー患者や何十という死亡に関連していた（Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．１２８、１５９−１６８（２００２）参照）。したがって、これらの薬剤類の使用を再検討すべきである（Ｃａｎ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓ．４８、４８６−４８９（２００２）参照）。
【００５１】
ＧＨＲＰｓがアテローム性動脈硬化発生を低下させるかどうかを調べるため、我々は、ＡｐｏＥ欠乏マウス系統とそれらのＣ５７ＢＬ／６対照同腹子を用いて、脂肪高含量食を給餌したマウスにおける脂肪線条形成におよぼすＧＨＲＰｓの長期（１２週間）投与効果を評価した。マウスのオイルレッド−Ｏ染色動脈の表面積をプラーク発生の指標として用いて、血漿脂質レベル変化を低脂血症にする効果の指標として用いた。これら最終結果を一緒にあわせて用い、インビボにおけるＧＨＲＰｓの抗動脈硬化能を評価した。
【００５２】
方法
薬物類
ＨＥＸおよびＥＰ８０３１７は、Ｒ．Ｄｅｇｈｅｎｇｈｉ博士、Ｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｒｇｅｎｔｅｕｉｌ、Ｆｒａｎｃｅが寛大にも分けて下さった。ＨＥＸおよびＥＰ８０３１７原液は、無菌０．９％ＮａＣｌで調製した。
【００５３】
動物
ＣＤ３６欠損およびＡｐｏＥ欠損マウスならびにそれらの対照同腹子を、モントリオール大学の動物施設で飼育した。ＡｐｏＥ欠損マウスは、ヒトに見られるアテローム性動脈硬化の一連の進行事象を特徴としており、これらには、白血球と内皮の付着性相互作用増大、単球誘導マクロファージ類の動脈系全体に分布した病巣を有する泡沫細胞への変換、さらにより進行した病巣（線維性プラーク類）の後期発達が含まれる。ＡｐｏＥ欠乏マウスは、コレステロール高含量のリポ蛋白クリアランス不全の結果極めて高い血漿コレステロールレベルを示し、ヒトについては、ＨＣＨＦ食が、疾患進行を悪化させ血漿コレステロールレベルを顕著に上昇させる（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５（８）、１０４９−１０５６（２０００）およびＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５、１０３９−１０４１（２０００）を参照）。しかし、ヒトに見られるような複雑病巣は、約４２週齢マウスの名称不明の動脈を除き観察されず、一方、線維性キャップの中断、病巣肩部における黄色腫断裂およびプラーク内出血が見られる（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２０、２５８７−２５９２（２０００）参照）。アテローム性プラーク発生傾向のある剖検部位中脂肪線条がヒトにおける成熟病巣に先行することを裏付ける証拠が蓄積してきているが、ただし、脂肪線条が全てアテロームにまで進行するわけではない（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１９、２３６４−２３６７（１９９９）参照）。ヒトおよびマウスの両者において、Ｔリンパ球と泡沫細胞が脂肪線状に見られ、両方の種において長年にわたり免疫プロセスが同様であることが明らかになっている。
【００５４】
動物はケージに入れ（ケージ当たり５匹未満）、正常食と水を自由摂取させた。６週齢において、雄性Ｃ５７ＢＬ／６、ＣＤ３６およびＡｐｏＥ欠乏マウスを群１から群３にまで振り分けた（ｎ＝マウス１２匹／群）：群１には、０．９％ＮａＣｌ（１μＬ／ｇ）を毎日注射し、群２は、ＨＥＸ（１００μｇ／ｋｇ、１μＬ／ｇ）を毎日注射、群３は、ＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ、１μＬ／ｇ）を毎日注射した。３群のマウス全てに対して、６週齢からＨＦＨＣ食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ社（Ｄ．１２１０８）から購入）を給餌した。ＨＥＸ、ＥＰ８０３１７または担体による毎日皮下投与は、６週齢から開始し、１２週間継続した。屠殺４日前に、群１から３のマウス６匹に対してｏｘＬＤＬ（Ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（ＴＢＡＲＳ）アッセイにより決定した最小限しか酸化されていない３−６ｍｍｏｌ／ｍｇたんぱく質）を腹腔内注射した。１８週齢において、マウスを一晩絶食させ、前記の検討下薬物を朝の投与量だけ皮下投与してから２時間後、ケタミン−キシラジン（９０：１０  ｍｇ／ｋｇ）により麻酔した。血液（１ｍＬ）を心臓から採血し、ＥＤＴＡ前塗布ミクロコンテナー（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ，ＵＳＡ）に入れた。マウスを屠殺後、心臓に０．９％ＮａＣｌを２０ｍＬ潅流した。ｏｘＬＤＬを腹腔内注射したマウス腹腔をヘパリン化生理食塩水（１０単位／ｍＬ）で洗浄した。血球計および染色したサイトスピン調製物（Ｄｉｆｆ  Ｑｕｉｃｋステイン、Ｄａｄｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐ．Ｒ．社、Ａｇｕａｄａ、ＰＲ）を用いて、腹腔洗浄液についてそれぞれ総および分化白血球数を調べた。腸管動脈の幹分枝から後方に５−１０ｍｍ伸び鎖骨下の右および左の総頚動脈を含む心臓から伸びる全動脈を除去し、切除し、エンフェースオイルレッド−Ｏ染色とソフトウェアシオンイメージ（Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅｓ）（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｄｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いたスキャンイメージの形態検査によって病巣発生を評価した。動物研究プロトコールをモントリオール大学の動物倫理委員会が検討承認し、実験動物使用についてのカナダ動物ケアガイド委員会ガイドラインに従って実施した。
【００５５】
血漿脂質分析
総血漿コレステロール、トリアシルグリセロールおよびＨＤＬコレステロールは、酵素キット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて調べた。適切なスタンダードとコントロールを、各アッセイに含ませた。
【００５６】
統計分析
データは平均±標準偏差により表す。群間の比較は、ワンウェイバリアンス解析（ＡＮＯＶＡ）を用い、その後に、ペアワイズ複数比較をＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法を用いて行った。差は、ｐ＜０．０５で有意と判定した。
【００５７】
結果
最も驚くべき観察事項は、ＨＦＨＣ食を投与したマウスをＨＥＸ（１００μｇ／ｋｇ）とＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ）とでそれぞれ毎日処置すると、ＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて病巣領域をそれぞれ２８％、５１％だけ低下させたことである（図１）。ＣＤ３６欠乏マウスとそれらの野生型Ｃ５７ＢＬ／６対照同腹子は、ＨＦＨＣ食でも（６週齢から開始し、１２週間）有意な脂肪線条病巣を発生しなかった。
【００５８】
ＨＦＨＣ食を給餌しかつＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ）を毎日（６週齢から）１２週間投与したＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、毎日ＨＥＸ（１００μｇ／ｋｇ）で処置したＡｐｏＥ欠乏マウスに比較して、縮小した病巣領域では、総血漿コレステロールが３０％低下し、非ＨＤＬ血漿コレステロールが３１％低下していた（図２のＡおよび図２のＤ）。対照的に、ＨＤＬコレステロールは、ＨＦＨＣ食の（０．９％ＮａＣｌ投与）対照に比較して、ＨＥＸまたはＥＰ８０３１７で処置したＨＦＨＣ食（６週齢から１２週間）のＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて、ＨＥＸ処理が６５％増加、ＥＰ８０３１７処理が７３％増加する傾向があった（図２のＣ）。血漿トリグリセリド類は、有意な変化を示さなかった（図２のＢ）。ＧＨＲＰｓは、６週齢から１２週間ＨＦＨＣ食を給餌したＣＤ３６欠乏またはＣ５７ＢＬ／６対照における総血漿コレステロールレベルを調整しなかった（データは図示せず）。
【００５９】
ＥＰ８０３１７は、ＨＦＨＣ食を給餌された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよび正常食を給餌されたＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて、それぞれ３７％および３９％だけ、ｏｘＬＤＬ誘発腹膜マクロファージ蓄積を低下させた（図３のＡおよび図３のＢ）。ＥＰ８０３１７は、ＣＤ３６欠乏マウスにおいてマクロファージ蓄積を調整しなかった（図３のＡ）。ＣＤ３６たんぱく質発現は、ＨＥＸとＥＰ８０３１７のそれぞれで処置したＨＦＨＣ食給餌ＡｐｏＥ欠乏マウスから採取した腹膜マクロファージにおいて、それぞれ、対照の５７％、２７％にまで低下した（図４）。
【００６０】
ＧＨＲＰ療法は、ＨＦＨＣ食（図５のＡ）または正常食（図５のＢ）給餌の、ＡｐｏＥ欠乏マウスにおける成長曲線に全く影響を及ぼさず、また、これらのマウスにおける餌摂取量にも影響を及ぼさなかった（図６のＡおよび図６のＢ）。
【００６１】
考察
我々は、本研究で、アテローム性動脈硬化発生の予防効果におけるＧＨＲＰｓの寄与を評価した。主な知見は：
１）ＧＨＲＰｓを長期処置すると、脂肪線条病巣が発生しないようＨＦＨＣ食給餌マウスを保護すること；
２）これらのＧＨＲＰｓ保護効果は、総血漿コレステロールと非ＨＤＬコレステロールが低下している限りにおいて、血漿脂質類の好適な調整に関連しており、ＨＤＬ血漿コレステロールは、ＨＦＨＣ食給餌ＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて増加していること；
３）ＧＨＲＰｓの動脈保護効果は、ＣＤ３６発現と機能の少なくとも一方のマイナス方向調整とマクロファージ中におけるＬＸＲαとＡＢＣＡ１のｍＲＮＡレベル増加の少なくとも一方に関連している。
【００６２】
これらの知見は、ＧＨＲＰ療法が、アテローム性動脈硬化発生低下を介して心臓発作および脳卒中に対する保護を付与することができることを示唆している。したがって、ＧＨＲＰｓおよびそれらの合成アナログ類は、冠心脈管系疾患の治療または予防に非常に有用であるらしい。たとえば、それらは、高コレステロール血症およびアテローム性動脈硬化の予防に有用であり、それによって、本疾患に関連する合併症を低下させるのであろう。現在、これらの目標を達成する能力を有する薬物は極めてわずかであり、しかもこれらは、極めて重要な副作用に関連していた。
【００６３】
実施例２
成長ホルモン放出ペプチド類は、脂肪線条形成を変調する。
【００６４】
ＧＨＲＰｓが脂肪線条の発生を遅延させることができるか、または脂肪線条退行を調整できるかどうかを調べるため、我々は、ＡｐｏＥ欠乏マウスを用いて、６週齢から開始してＨＦＨＣ食によって誘発したアテローム性動脈硬化病巣発生後における脂肪線条進行に及ぼすＧＨＲＰｓ処置期間の効果を評価した。
【００６５】
方法
薬物類
ＨＥＸおよびＥＰ８０３１７溶液は、上記実施例１に関して説明したようにして調製した。
【００６６】
動物
雄性ＡｐｏＥ欠損マウス（ｎ＝３５）を、ケージに入れた（１ケージ当たり５匹未満）。４週齢までに離乳させた後、マウスに正常食と水を自由に摂取させた。これらマウスに６週齢から開始し、ＨＦＨＣ食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ社（Ｄ．１２１０８）から購入）を給餌した。動物は、３群に分けた。
【００６７】
群１（ｎ＝１０）はさらに２つの小群に分け、１０週齢から１８週齢まで（すなわち、８週間）毎日ＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）または０．９％ＮａＣｌ（ｎ＝５）を注射した。
【００６８】
群２（ｎ＝１０）はさらに２つの小群に分け、１２週齢から１８週齢まで（すなわち、６週間）毎日ＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）または０．９％ＮａＣｌ（ｎ＝５）を注射した。
【００６９】
群３（ｎ＝１５）はさらに３つの小群に分け、１４週齢から１８週齢まで（すなわち、４週間）毎日ＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）またはヘキサレリン（１００μｇ／ｋｇ／日）（ｎ＝５）または０．９％ＮａＣｌ（ｎ＝５）を注射した。
【００７０】
マウスは、１８週齢で安楽死させた。腸管動脈の幹分枝の後方から５−１０ｍｍ伸び鎖骨下の右および左の総頚動脈を含む心臓から伸びる全動脈を除去し、切除し、エンフェースオイルレッド−Ｏ染色とソフトウェアシオンイメージ（Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅｓ）（Ｓｃｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｄｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いたスキャンイメージの形態検査によって病巣発生を評価した。
【００７１】
結果
ＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ）を毎日それぞれ６週間および８週間処置した後のＡｐｏＥ欠乏マウス動脈において、３１．３％および３９．２％だけ病巣の有意縮小が観察された。さらに、（対照群における変動が大きかったために）有意というわけではなかったが、ＡｐｏＥ欠乏動脈の病巣領域の３６％縮小が、ＮａＣｌ処置対照に比較して、４週間毎日ＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ）処置した後に観察できた。
【００７２】
動脈中病巣百分率の観点からの有意差は、０．９％ＮａＣｌ処置対照に比較して、４週間ヘキサレリン（８％）処置した後では、観察できなかった。
【００７３】
考察
本研究では、我々は、アテローム性動脈硬化病巣発生におよぼすその保護効果ばかりでなくその治癒効果について、ＧＨＲＰ誘導体、ＥＰ８０３１７の寄与を評価した。
【００７４】
ＥＰ８０３１７は、ＨＦＨＣ食によって誘発された脂肪線条発生を遅延できるのかも知れない。このペプチドはまた、アテローム性動脈硬化プロセスを６週齢で開始し、ＨＦＨＣ食で誘発したＡｐｏＥ欠乏マウスの動脈中のこれらの脂肪線条退行を調整するのかも知れない。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ＨＦＨＣ食を（６週齢から）１２週間給餌したＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、ＧＨＲＰｓは脂肪線条形成を予防する。（６週齢から）１２週間皮下投与した、ＨＥＸ（１００μｇ／ｋｇ／日）とＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ／日）の効果。  Ａ；ＡｐｏＥ欠乏マウス動脈の病巣領域（総動脈領域に対する％）は、ＨＥＸ、ＥＰ８０３１７でそれぞれ治療すると、治療後、０．９％ＮａＣｌ投与の対照に比較して、それぞれ、２８％、５１％だけ減少した。白色の棒グラフは、担体（０．９％ＮａＣｌ）処置マウスを示し、黒色の棒グラフは、ＨＥＸ処置マウスを示し、網かけ棒グラフは、ＥＰ８０３１７処置マウスを示す。星印は、担体に比べてＰ＜０．０５（＊＊，Ｐ＜０．０１）であることを示し、＃は、ＨＥＸに比較してＰ＜０．０５であることを示す。  Ｂ；オイルレッドＯ（シグマ−アルドリッチから購入）で染色した担体（上段）、ＨＥＸ（中段）およびＥＰ８０３１７（下段）で処置したＡｐｏＥ欠乏マウスから得た代表的マウス動脈の写真である。
【図２】ＨＦＨＣ食を（６週齢から）１２週間給餌したＡｐｏＥ欠損マウスにおいて、ＧＨＲＰｓは、総血漿コレステロールおよび非ＨＤＬコレステロールを低下させ、ＨＤＬコレステロールを増加させる傾向が見られた。ＨＦＨＣ食を給餌したＥＰ８０３１７処置ＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて、総血漿コレステロールは、対照に比較して３０％低下し、非ＨＤＬコレステロールは、対照に比較して３１％低下した。ＨＤＬコレステロールは、ＨＥＸ処置を施したＨＦＨＣ給餌ＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて、６５％増加し、ＥＰ８０３１７処置を施したＨＦＨＣ給餌ＡｐｏＥ欠乏マウスにおいて、７３％増加した。  Ａ；ＨＦＨＣまたは正常食給餌マウスにおける、総血漿コレステロールに及ぼす効果。０．９％ＮａＣｌ（白色の棒グラフ）、１００μｇ／ｋｇ／日のＨＥＸ（黒色の棒グラフ）、３００μｇ／ｋｇ／日のＥＰ８０３１７（網かけ棒グラフ）により、それぞれ、（６週齢から）１２週間処置した。  Ｂ；血漿トリグリセリドに及ぼす、上記処置の効果。  Ｃ；ＨＤＬコレステロールに及ぼす、上記処置の効果。  Ｄ＋非ＨＤＬコレステロールに及ぼす、上記処置の効果。  図２のそれぞれにおいて、星印は、担体に比べてＰ＜０．０１であることを示し、＃は、ＨＥＸに比較してＰ＜０．０１であることを示す。
【図３】ＧＨＲＰｓは、（６週齢から）１２週間ＨＦＨＣ食を給餌された、野生型マウスとＡｐｏＥ欠乏マウスのそれぞれにおいて、ｏｘＬＤＬ誘発腹膜マクロファージ蓄積を低下させた。  Ａ；ＨＦＨＣ食を給餌した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＤ３６欠乏マウスのそれぞれにおいて、腹腔中ｏｘＬＤＬ（腹腔投与２５０μｇ＜６ｎｍｏｌ  ＭＤＡ／ｍｇリポ蛋白）誘発マクロファージ蓄積に及ぼす効果を示す。０．９％ＮａＣｌ（白色の棒グラフ）、１００μｇ／ｋｇ／日のＨＥＸ（黒色の棒グラフ）、３００μｇ／ｋｇ／日のＥＰ８０３１７（網かけ棒グラフ）により、それぞれ、（６週齢から）１２週間処置した効果を示す。野生型マウスにおける腹膜マクロファージ蓄積は、３７％だけ低下する傾向があった。  Ｂ；ＨＦＨＣ食または正常食を給餌されたＡｐｏＥ欠乏マウスの腹腔中ｏｘＬＤＬ誘発マクロファージ蓄積に及ぼす効果であり、０．９％ＮａＣｌ（白色の棒グラフ）、１００μｇ／ｋｇ／日のＨＥＸ（黒色の棒グラフ）、３００μｇ／ｋｇ／日のＥＰ８０３１７（網かけ棒グラフ）により、それぞれ（６週齢から）１２週間処置した効果を示す。正常食を給餌されたマウスにおける腹膜マクロファージ蓄積は、３９％だけ低下した。
【図４】ＧＨＲＰｓは、ＨＦＨＣ食を１２週間給餌されたＡｐｏＥ欠乏マウス由来の腹膜マクロファージにおける、ＣＤ３６およびＡＢＣＡ１たんぱく質レベルを調整する。図４は、ＨＦＨＣ食を給餌し、かつ、ＧＨＲＰｓ（１００μｇ／ｋｇ／日のＨＥＸまたは３００μｇ／ｋｇ／日のＥＰ８０３１７）で（６週齢から）１２週間処置したＡｐｏＥ欠乏マウスから採取したｏｘＬＤＬ（２５０μｇ腹腔投与＜６ｎｍｏｌ  ＭＤＡ／ｍｇリポ蛋白）惹起腹膜マクロファージのウェスタンブロット分析を示している。ＣＤ３６であるＡとＡＢＣＡ１であるＢについての相対的たんぱく質レベルをβ−アクチンに対して正規化し、１００％に設定した担体（０．９％ＮａＣｌ）処置対照に比較しての変化百分率として表す。データは、２回の独立した実験の平均を示している。
【図５】ＧＨＲＰｓは、ＨＦＨＣ食（または正常食）を（６週齢から）１２週間給餌されたＡｐｏＥ欠乏マウスにおける成長曲線を調整しなかった。  Ａ；ｍＨＦＨＣ食を給餌したマウスの体重に及ぼす効果、Ｂ；正常食を給餌したマウスの体重に及ぼす効果であり、０．９％ＮａＣｌ（ひし形）、ＨＥＸ  １００μｇ／ｋｇ／日（正方形）、ＥＰ８０３１７  ３００μｇ／ｋｇ／日（三角形）により、（６週齢から）１２週間処置した効果である。
【図６】ＧＨＲＰｓは、ＨＦＨＣ食（または正常食）を（６週齢から）１２週間給餌されたＡｐｏＥ欠乏マウスにおける食餌摂取量を調整しなかった。  Ａ；ＨＦＨＣ食を給餌したマウスの食餌摂取量に及ぼす効果、Ｂ；正常食を給餌したマウスの食餌摂取量に及ぼす効果であり、０．９％ＮａＣｌ（ひし形）、ＨＥＸ  １００μｇ／ｋｇ／日（正方形）、ＥＰ８０３１７  ３００μｇ／ｋｇ／日（三角形）により、（６週齢から）１２週間処置した効果である。
【図７Ａ】ＧＨＲＰｓは、分化ヒトマクロファージにおける脂質蓄積を低下させる。脂質蓄積を誘発するため、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞を５ｎｇ／ｍＬＰＭＡで４８時間マクロファージに分化させ、その後、図示したようにホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）存在下で１０μＭ  ＨＥＸまたはＥＰ８０３１７により２４時間処置した。非分化細胞（ＰＭＡなし）もまた、分析した。オイルレッドＯを染色細胞から抽出した後、脂質蓄積を光学分析によって５１０ｎｍで定量した。ＨＥＸとＥＰ８０３１７でそれぞれ処置したマクロファージ中において、脂質染色は、未処置細胞に比較して、それぞれ３５％、２８％だけ低下した。
【図７Ｂ】ＧＨＲＰｓは、１３週齢から１８週齢までＨＦＨＣ食を給餌されたＡｐｏＥ欠乏マウスから単離した腹膜マクロファージにおける脂質蓄積を低下させた。ＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ）は、１３週齢から１８週齢まで皮下投与した。脂質染色（オイルレッドＯ抽出によって評価）は、１３週齢からＨＦＨＣ食を給餌されたが、ＥＰ８０３１７処置はしなかったＡｐｏＥ欠乏マウスから単離した腹膜マクロファージに比較して）５７％だけ低下した。
【図８】ＧＨＲＰｓは、細胞コレステロール除去に関与する遺伝子発現を増大させる。  Ａ；ＰＭＡ分化ＴＨＰ−１マクロファージは、図７に関して述べたように、ＨＥＸまたはＥＰ８０３１７により処置し、ＲＴ−ＰＣＲによって選択した遺伝子についてｍＲＮＡ発現を分析した。この操作には、細胞から総ＲＮＡを抽出し、このＲＮＡをその後、ｃＤＮＡに逆転写し特定プライマーによりＰＣＲ反応において増幅することを含む。使用したプライマー類は、  ＬＸＲα  フォワード  ＣＣＴＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＣＣＧＣ  ＬＸＲα  リバース  ＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＴＧＧＴＣＣ  ＡＢＣＡ１  フォワード  ＧＧＴＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＡＧＧＴＧＣ  ＡＢＣＡ１  リバース  ＧＧＡＧＴＣＧＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧ  ＧＡＰＤＨ  フォワード  ＧＧＴＣＴＴＡＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＴ  ＧＡＰＤＨ  リバース  ＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣＡＡＣＴＡＣＡ  Ｂ；Ａに記載の実験から、アルファイメージャー分析システムを用いてシグナル強度の測定を行い、結果は、未処置分化細胞に比較しての応答倍率により表した。ＧＡＰＤＨは、データ正規化のために対照として用いた。
【図９】ＧＨＲＰｓは、ＨＦＨＣ食を６週齢から開始して１２週間にわたり給餌されたＡｐｏＥ欠乏マウスにおける脂肪線条の発生の予防または遅延またはその脂肪線条の退行を調整する。  ８週間（１０週齢から１８週齢まで）、６週間（１２週齢から１８週齢まで）および４週間（１４週齢から１８週齢まで）皮下投与したＥＰ８０３１７（３００μｇ／ｋｇ／日）の効果を記録し、４週間（１４週齢から１８週齢まで）投与したヘキサレリン（１００μｇ／ｋｇ／日）の効果も記録した。  Ａ；ＡｐｏＥ欠乏動脈の病巣域（総動脈領域に対する％）が、０．９％ＮａＣｌ処置対照に比較して、ＥＰ８０３１７を８週間処置した後、３９．２％だけ低下した。  Ｂ；ＡｐｏＥ欠乏動脈の病巣域（総動脈領域に対する％）が、０．９％ＮａＣｌ処置対照に比較して、ＥＰ８０３１７を６週間処置した後３１．３％だけ低下した。  Ｃ；ＡｐｏＥ欠乏動脈の病巣域（総動脈領域に対する％）が、０．９％ＮａＣｌ処置対照に比較して、ヘキサレリンおよびＥＰ８０３１７を４週間処置した後それぞれ８％および３６％だけ低下した。  図９において、白色の棒グラフは、担体（０．９％ＮａＣｌ）処置マウスを示し、黒色の棒グラフはヘキサレリン処置マウスを示し、網かけ棒グラフは、ＥＰ８０３１７処置マウスを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成16年8月23日(2004.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化の治療または予防方法であって、該方法は１種以上のＧＨＲＰｓを前治療または予防を必要としている患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
アテローム性動脈硬化斑、高コレステロール血症または心脈管系疾患類の発生リスクを有する患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することによって、アテローム性動脈硬化斑の発生を防止することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
アテローム性動脈硬化を既に有している患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することによって、前記アテローム性動脈硬化を治療することを含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現を増大させる方法であって、該方法は前記遺伝子類の発現の増大により恩恵を受ける患者に対して１種以上のＧＨＲＰｓを投与することを含む方法。
【請求項５】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類が、核受容体ＬＸＲαとＡＢＣＡ１トランスポーターの少なくとも一方である請求項４記載の方法。
【請求項６】
１種以上のＧＨＲＰｓがヘキサレリン（Ｈｉｓ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）またはＥＰ８０３１７（Ｈａｉｃ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）である先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
アテローム性動脈硬化の治療または予防用薬物の製造における１種以上のＧＨＲＰｓの用途。
【請求項８】
薬物がアテローム性動脈硬化斑の発生を防止する請求項７記載の用途。
【請求項９】
薬物が既存のアテローム性動脈硬化を治療するためである請求項７記載の用途。
【請求項１０】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類の発現増大による恩恵を受ける患者における上記遺伝子類の発現を増大させるために行う薬物製造のための、１種以上のＧＨＲＰｓの用途。
【請求項１１】
細胞コレステロール流出に関与する遺伝子類が、核レセプターＬＸＲαとＡＢＣＡ１トランスポーターの少なくとも一方である請求項１０記載の用途。
【請求項１２】
１種以上のＧＨＲＰｓがヘキサレリン（Ｈｉｓ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）またはＥＰ８０３１７（Ｈａｉｃ−（Ｄ）−（Ｍｅ）Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−（Ｄ）−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）である請求項７乃至１１のいずれかに記載の用途。
【請求項１３】
アテローム性動脈硬化の治療または予防における、ヘキサレリン族の成長ホルモン放出ペプチド類、誘導ペプチド模擬物質類およびＣＤ３６リガンド類の用途。
【請求項１４】
スカベンジャーレセプターＢ（ＣＤ３６）の発現を調整する、ＧＨＲＰ誘導体類、誘導ペプチド模擬物質類、およびＣＤ３６リガンド類の、アテローム性動脈硬化病巣の発生予防における用途。
【請求項１５】
ＡＴＰ結合カセットＡＢＣＡ１トランスポーターおよびスカベンジャーレセプターＢ（ＣＤ３６）の発現を調整する、ＧＨＲＰ誘導体類および誘導ペプチド模擬物質類の、アテローム性動脈硬化病巣発生予防における用途。
【国際調査報告】
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