(57)【要約】ＩＬ−１／ＮＦ−Ｂ経路に属する要素の作用を阻害する物質は、前ＩＩ型糖尿病患者とＩＩ型糖尿病患者において細胞塊と機能を保護、保全するために使用することができる。具体的には、本発明は、ＩＩ型糖尿病を治療又は予防するためのインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）及び／又はピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）の使用並びにＩＩ型糖尿病を治療する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のＩＩ型糖尿病を治療又は予防するための医薬を調製するためのインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の使用。
【請求項２】
前記インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）が組換えタンパク質（ｒＩＬ−１Ｒａ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）が組換えヒトタンパク質（ｒｈＩＬ−１Ｒａ）である、先行する全請求項の何れかに記載の使用。
【請求項４】
前記医薬がピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）をさらに含む、先行する全請求項の何れかに記載の使用。
【請求項５】
前記医薬が非経口投与に適合されている、先行する全請求項の何れかに記載の使用。
【請求項６】
哺乳動物のＩＩ型糖尿病を治療又は予防するための医薬を調製するためのピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）の使用。
【請求項７】
前記医薬が非経口投与に適合されている、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制する方法であって、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制することが必要な哺乳動物に、十分な量のインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を投与すること、を含む方法。
【請求項９】
前記インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）が組換えタンパク質（ｒＩＬ−１Ｒａ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）が組換えヒトタンパク質（ｒｈＩＬ−１Ｒａ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記医薬がピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記医薬が非経口投与に適合されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制する方法であって、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制することが必要な哺乳動物に、十分な量のピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）を投与すること、を含む方法。
【請求項１４】
前記医薬が非経口投与に適合されている、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ＩＩ型糖尿病を治療又は予防するためのインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）及び／又はピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）の使用、並びにＩＩ型糖尿病を治療する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
ＩＩ型糖尿病は、インシュリン抵抗性に直面して、機能的な膵臓β細胞集団の適応が不十分となることに起因する。次いで、高血糖自体がβ細胞に対して副次的な悪影響を及ぼす。実際、血中グルコース濃度が慢性的に上昇することによってβ細胞の機能が損なわれることが、複数の研究によって明らかとなっており、「ブドウ糖毒性（ｇｌｕｃｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）」という概念が提唱されるに至っている（１−７）。さらに、グルコース濃度の上昇によって、糖尿病にかかりやすいデブスナネズミ(Psammomys obesus)（８）、ヒト膵島（９；１０）から採取した培養膵島中でβ細胞のアポトーシスが誘導され、グルコースの濃度がさらに上昇すると、げっ歯類の膵島（８；１１；１２）でもβ細胞のアポトーシスが誘導される。後生的糖化最終産物の形成（１３）、インシュリン遺伝子の転写とプロインシュリン生合成の直接的な障害（１４；１５）、膵臓十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ−１）の結合活性の減少（７）など、グルコース誘導性のβ細胞機能不全の基礎を成す様々な分子的機序が提唱されている。最近、本発明者らと共同研究者らは、グルコースレベルの上昇によるＦａｓ受容体のアップレギュレーションが関与する、ヒト膵島中でのグルコース誘導性β細胞のアポトーシスの基礎を成す機序を提唱した（９）。しかし、グルコース誘導性のＦａｓ発現を媒介する物質とブドウ糖毒性におけるその役割については、なお不明である。
【０００３】
インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は、１５２アミノ酸（ａａ）残基からなる成熟した糖タンパク質である。本タンパク質は、２５ｋＤａのネイティブ分子量を有し、該分子のＩＬ−１ａ（１９％）とＩＬ−１β（２６％）に対するａａ配列の相同性はさほど高くない。
【０００４】
ＩＬ−１ａとＩＬ−１βによってもたらされる効果は、これらの因子が２つの異なる細胞表面受容体であるＩＬ−１ＲＩ型及びＩＩ型に結合することによって生じる。最近の結果から、Ｉ型受容体はシグナルを伝達して、生物学的効果を生じ得ることが示唆されている。ＩＬ−１Ｒａの阻害的な作用は、ＩＬ−１ＲａがＩ型ＩＬ−１Ｒに結合することによって生じる。この結合は親和性が高い（Ｋｄ＝２００ｐＭ）が、この結合によって受容体の活性化（シグナル伝達）は起こらない。すなわち、この効果は、ＩＬ−１ａとＩＬ−１β上の２つの受容体結合モチーフでなく、ＩＬ−１Ｒ１上に存在する１つの受容体結合モチーフのみの存在によって起こる。Ｉ型受容体に対するＩＬ−１Ｒａの親和性は、ＩＬ−１ａ及びＩＬ−１βに対する親和性と同等なので、ＩＬ−１活性のダウンレギュレーションは、拮抗的な阻害によるものと思われる。とりわけ、ＩＬ−１Ｒａは、シグナル伝達を行わないＩＩ型ＩＬ−１Ｒにも結合するが（Ｋｄ＝７ｎＭ）、ＩＬ−１βが示す親和性（Ｋｄ＝０．３−２．０ｎＭ）に比べるとかなり低い。ＩＬ−１βの作用を阻害するようにデザインされた２つの機序（すなわち、ＩＬ−１ＲａのＩ型ＩＬ−１Ｒへの結合とＩＬ−１βのＩＩ型ＩＬ−１Ｒへの結合）が互いに拮抗しない点で、これには目的論的に意味がある。
【０００５】
自己免疫性Ｉ型糖尿病の発症過程において、膵臓β細胞の機能不全と破壊を媒介するためにＩＬ−１βを使用することが提案されている。これを裏付けるように、ＩＬ−１βでげっ歯類の膵島を処理すると、インシュリン分泌が強力に阻害された後、膵島が破壊される（１７−２３）。ヒトの膵島では、さらに、ＩＬ−１βがインシュリンの放出を損なわせるとともに、Ｆａｓ発現を誘導することにより、Ｆａｓによって惹起されるアポトーシスを生じせしめ得ることが示されている（９；２４−２８）。最後に、ＩＬ−１β誘導性のＦａｓ発現には、核転写因子ＮＦ−κＢの活性化が必要とされる（２９−３１）。これらのＩＬ−１β効果の一部は、グルコース濃度の上昇による毒性効果に類似する。
【０００６】
Ｚａｉｔｓｅｖら（６０）は、イミダゾリン化合物を用いてＩＩ型糖尿病を治療することを提案している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らと共同研究者らは、自己免疫プロセスの不在下において、グルコースがβ細胞からのＩＬ−１βの分泌を誘導し得ると考えている。本発明者らと共同研究者らは、培養ヒト膵島におけるグルコース誘導性ＩＬ−１βの細胞源としてβ細胞を同定し、ＩＩ型糖尿病患者の膵臓から得た組織切片とデブスナネズミの膵臓から得た組織切片とを用いて、このことを確認した。内因的に産生されたこのようなＩＬ−１βのβ細胞ブドウ糖毒性における役割についても調べた。
【０００８】
ＩＩ型糖尿病では、慢性的な高血糖が膵臓のβ細胞に対して有害な作用を及ぼして、インシュリン分泌障害を引き起こすと推測されている。インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は、Ｉ型糖尿病の自己免疫過程時に作用する炎症誘発性のサイトカインである。ＩＬ−１βはβ細胞の機能を阻害し、１つには転写因子ＮＦ−κＢを活性化させることによって、Ｆａｓ誘導性のアポトーシスを促進する。最近、本発明者らと共同研究者らは、グルコース濃度の上昇は、ヒトの膵島においてもＦａｓの発現とβ細胞のアポトーシスを誘導することを示した。本研究の目的は、ＩＬ−１βがヒトβ細胞に対する高グルコースの有害な効果を媒介している可能性があるという仮説を検証することであった。糖尿病でない臓器ドナーから得られた膵島を高いグルコースレベルにインビトロで曝露すると、ＩＬ−１βの産生と放出が増加した後、ＮＦ−κＢの活性化、Ｆａｓのアップレギュレーション、ＤＮＡの断片化及びβ細胞機能の障害が引き起こされた。インターロイキン−１受容体アンタゴニストであるＩＬ−１Ｒａは、これらの有害な効果からヒトの培養膵島を保護した。β細胞自体が、グルコース誘導性のＩＬ−１βを与える膵島の細胞源であることが明らかとなった。インビボでは、ＩＬ−１β産生β細胞がＩＩ型糖尿病患者の膵臓切片中に観察されたが、糖尿病でない対照被験者には観察されなかった。同様に、ＩＬ−βは、糖尿病の進行中に、スナネズミの一種であるデブスナネズミのβ細胞中でも誘導された。フロリジンで動物を処置すると血漿グルコースは正常化され、β細胞によるＩＬ−１βの発現が抑えられた。これらの知見は、ＩＩ型糖尿病におけるブドウ糖毒性の発症に炎症性プロセスが関与していることを示唆しており、ＩＬ−１β／ＮＦ−κＢ経路がこの症状においてβ細胞集団と機能を保持するための標的となることを明らかにしている。
【０００９】
このように、本発明者は、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）及び／又はＮＦ−κｂ阻害剤であるピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）が、ＩＩ型糖尿病を治療又は予防するのに有用であり得ることを見出した。
【００１０】
本発明の第一の側面は、哺乳動物のＩＩ型糖尿病を治療又は予防するための医薬を調製するためのインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の使用に関する。
【００１１】
本発明の別の側面は、哺乳動物のＩＩ型糖尿病を治療又は予防するための医薬を調製するためのピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）の使用に関する。
【００１２】
本発明の第三の側面は、哺乳動物のＩＩ型糖尿病を治療又は予防するための医薬を調製するためにインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）とピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）を併用することに関する。
【００１３】
本発明の第四の側面は、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制する方法であって、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制することが必要な哺乳動物に、十分な量のインターロイキン１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）を投与すること、を備えた方法に関する。
【００１４】
本発明の第五の側面は、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制する方法であって、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制することが必要な哺乳動物に、十分な量のピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）を投与すること、を備えた方法に関する。
【００１５】
本発明の第六の側面は、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制する方法であって、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制することが必要な哺乳動物に、十分な量のインターロイキン１受容体アンタゴニスト（Ｉｌ−１Ｒａ）とピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）とを組み合わせて投与すること、を備えた方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
ＩＩ型糖尿病が進行した段階に達すると、インシュリン療法が必要となる水準までβ細胞の機能が低下することが多い。ヒトの場合、ＩＩ型糖尿病の後期におこる膵島の崩壊は、おそらく、遺伝的要因と環境要因が組み合わさることと、高血糖によって誘発されるβ細胞の機能低下とアポトーシスをはじめとした副次的な現象により起こると思われる。Ｉ型糖尿病の特徴は、特異的且つ大規模なβ細胞の崩壊であるが、この殆どがアポトーシスによって起こる。両タイプの糖尿病の基本的な病因は異なるが、両タイプの糖尿病をつなぐ証拠が次々に明らかになり、元々ＩＩ型糖尿病と診断された患者のかなりの割合が潜在的なＩ型糖尿病であるか、又は時間と共にＩ型糖尿病状態へと移行し、抗β細胞自己免疫を示すようになる（４１−４４）。さらに、適当な条件下で、例えばアポトーシス細胞が十分に大量に存在する場合やＩＬ−１β等のサイトカインに曝露された場合（４５；４６）、アポトーシス細胞が免疫反応を誘導することができる。従って、本研究によって示されるような、又は自己免疫反応の一部としてのグルコース濃度の上昇によるＩＬ−１βの誘導が、ＩＩ型糖尿病とＩ型糖尿病とを結び付ける可能性がある。
【００１７】
自己免疫糖尿病が進行する際、膵島にはマクロファージが必ず存在する（４７；４８）。膵島に存在するマクロファージが活性化される結果、ＩＬ−１βが発現され、放出される（４９）。最近、自己免疫糖尿病において、ウイルス感染がβ細胞の損傷を仲介しうる機序として、ウイルスによって複製される二本鎖ＲＮＡが、ラット膵島β細胞のＩＬ−１産生を刺激することが示された（５０）。興味深いことに、この同じ実験から、このような刺激に続いて、ラットβ細胞が、ＩＬ−１βの活性化に必要な酵素であるＩＬ−１β変換酵素を産生することも明らかとなった。この結果から、ヒトβ細胞そのものが、ウイルス感染や免疫を介した過程とは無関係に、グルコースに反応してＩＬ−１βを産生できることが示唆される。ＩＬ−１β産生β細胞は、ＩＩ型糖尿病で高血糖の患者の組織切片にも検出されたが、正常血糖のＰｓａｍｍｏｍｙｓ  ｏｂｅｓｕｓ（デブスナネズミ）では検出されなかったという事実から、インビトロにおける観察及びこの研究の中核を成す仮設が全面的に支持される。
【００１８】
糖尿病に罹患しやすいＰｓａｍｍｏｍｙｓ  ｏｂｅｓｕｓ（デブスナネズミ）は、高エネルギー食を与えた場合、糖尿病を発症する。ＩＩ型糖尿病患者の一部と同じように、この糖尿病モデル動物では、インシュリン分泌が不十分であること及び膵臓におけるインシュリン蓄積量が減少することにより、初期には高インシュリン血症を示すがこの疾患の後期には低インシュリン血症になる（５１）。長期にわたる実験において、本発明者と共同研究者らは、栄養誘導性の糖尿病におけるβ細胞のターンオーバーを解析した（８）。高血糖が進行する間、β細胞の複製が最初一時的に増加した後、アポトーシスβ細胞の数が長期にわたり増加する。本発明者と共同研究者らは、現在、この研究をさらに継続し、高血糖Ｐｓａｍｍｏｍｙｓ  ｏｂｅｓｕｓ（デブスナネズミ）の膵島におけるインシュリン低下と並行したＩＬ−１β発現β細胞の観察を行っている。フロリジンで動物を処置して血漿グルコースを正常化させると、ＩＬ−１βの発現が阻止され、膵島におけるインシュリン発現が回復したが、このことから、ＩＬ−１βが、グルコース誘導性のβ細胞のアポトーシスを仲介する物質としての役割を果たしているだけでなく、さらに膵臓インシュリン貯蔵の調節にも関与していることが示唆される。
【００１９】
本発明者らの知る限りにおいて、ＩＬ−１β単独でヒト膵島中にｉＮＯＳを誘導することはできない（５２；５３）。さらに、サイトカイン誘導性のＦａｓの発現は、ＮＯ非依存性である（５４；５５）。これらの報告と一致して、本研究においてグルコースはｉＮＯＳを誘導しなかった。従って、ＩＬ−１βが媒介する有害な影響は、おそらくＮＯ非依存性であると考えられる。しかし、ＩＬ−１β誘導性の亜硝酸塩については、過去に報告がある（２４；２５；５６）ので（しかし、他の研究者によっては観察されていない（５７））、ｉＮＯＳ非依存的にＮＯがβ細胞により産生される可能性を除外することはできない。
【００２０】
ＩＬ−１βを誘導して、ＮＦ−κＢの活性化、Ｆａｓ発現及びβ細胞の死という結果をもたらすには、最低でも２０時間、高グルコース濃度状態に曝露することが必要である。これは、高グルコース状態に持続的に曝露した場合のみにブドウ糖毒性効果が生じることと一致する。
【００２１】
リプレッサー、Ｉ−κＢをコードするアデノウイルスベクターがＮＦ−κＢの活性を抑制することにより、Ｆａｓによって引き起こされるアポトーシスが起こらないようにヒト膵島が保護され、その結果、ＩＬ−１βの存在下で正常なインシュリン反応が起こる（５６）。同様に、精製したラットβ細胞において、サイトカイン誘導性のＮＦ−κＢの活性化を抑制することにより、β細胞のアポトーシスが阻害される（５９）。従って、グルコースがＩ−κＢの発現を減少させ、ＩＬ−１βを介してＮＦ−κＢの活性化を誘導するという知見により、ＮＦ−κＢの活性を抑制してブドウ糖毒性効果を抑えることができるようになる。
【００２２】
これまで、膵島によるＩＬ−１βの産生と放出は、１型糖尿病に限定したものと考えられてきた。本研究において、本発明者と共同研究者らは、高濃度グルコース状態によりヒトβ細胞におけるＩＬ−１β産生及び分泌が誘導されて、Ｆａｓ受容体がアップレギュレートされ、ＮＦ−κＢが活性化されて、β細胞のアポトーシスと機能不全が起こることを明らかにしている。さらに、本発明者と共同研究者らは、糖尿病患者及び糖尿病のＰｓａｍｍｏｍｙｓ  ｏｂｅｓｕｓ（デブスナネズミ）において、ＩＬ−１β産生性のβ細胞を観察した。高血糖がインシュリン産生細胞の機能不全と喪失を引き起こす経路は、免疫を介した経路と共通する性質を有する。従って、炎症に関与するサイトカインＩＬ−１βが、ＩＩ型糖尿病の病因においてβ細胞のブドウ糖毒性に寄与する不可欠な要因である可能性があるということになる。本発明者は、この新たな発見が、ＩＬ−１β／ＮＦ−κＢ経路に属する要素の作用を抑制する物質を、前糖尿病状態やＩＩ型糖尿病患者におけるβ細胞集団とその機能の保護及び維持に用いることができるということに結び付くと考えている。
【００２３】
従って、本発明は、イヌまたはヒト等の哺乳動物、特にヒトのＩＩ型糖尿病を治療又は予防するための医薬の調製における、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）の使用に関する。
【００２４】
従って、本発明は、既にＩＩ型糖尿病と診断された患者の治療に適用できるだけでなく、例えば、遺伝的、環境的因子、食生活面又は社会的因子等、ＩＩ型糖尿病に罹患しやすい因子を有する哺乳動物の予防的な治療にも適用できることを理解すべきである。
【００２５】
本明細書において使用する場合、「ＩＩ型糖尿病」という語は、高血糖とグルコース、タンパク質及び脂質代謝の異常とを特徴とする代謝性疾患と定義される。ＩＩ型糖尿病は、β細胞の分泌能が不十分なために適切に代償されないインシュリン抵抗性によって起こる。
【００２６】
インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は、１５２アミノ酸（ａａ）残基からなる成熟糖タンパク質である。本タンパク質は、ネイティブの分子量が２５ｋＤａである。本明細書中で使用する場合、「インターロイキン１受容体アンタゴニスト」及び「ＩＬ−１Ｒａ」等の語には、野生型インターロイキン１受容体アンタゴニストのみならず、野生型インターロイキン１受容体アンタゴニストと実質的に同一の生物活性又は野生型インターロイキン１受容体アンタゴニストより優れた生物活性を示すポリペプチドも包含されるものとする。このようなポリペプチドには、化学的修飾を受けたインターロイキン１受容体アンタゴニスト、及び、本ポリペプチドの生物学的活性を変化させるように特定のアミノ酸配列を改変したインターロイキン１受容体アンタゴニスト変異体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、これらの語は、例えば、Ｎ末端アミノ酸の欠失又は付加を含むＮ末端の改変を行ったポリペプチド及びＣ−末端アミノ酸の欠失又は付加を含むＣ末端の改変を行ったポリペプチド等、アミノ酸配列をわずかに改変したポリペプチドを包含する。
【００２７】
例えば、ヒト、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳動物の組織又は体液からの抽出及び精製などにより天然物から、又は組換え細胞培養系により、ＩＬ−１Ｒａを得ることができる。
【００２８】
ある実施形態において、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は、組換えタンパク質（ｒＩＬ−１Ｒａ）である。より具体的な実施形態においては、前記インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は、組換えヒトタンパク質（ｒｈＩＬ−１Ｒａ）である。
【００２９】
適切なＩＬ−１Ｒａの例としては、ヒトインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ｈＩＬ−１Ｒａ）の糖側鎖のない組換え体である、Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ）（ａｎａｋｉｎｒａ）という薬物を挙げることができる。Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ）は、そのＮ末端にメチオニン残基が１個付加されているという点でネイティブのヒトＩＬ−１Ｒａとは異なる。Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ）は、１５３個のアミノ酸からなり、１７．３ｋＤａの分子量を有する。Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌発現系を用いた組換えＤＮＡ技術により産生される。Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ）は、２７ゲージ注射針が付属した使い捨て１ｍＬ詰め替えガラスシリンジで、毎日、皮下（ＳＣ）投与を行うための透明な無色から白色をした防腐剤非添加滅菌溶液として供給される。各１ｍＬの詰め替えガラスシリンジには、０．６７ｍｌ（１００ｍｇ）のａｎａｋｉｎｒａが、注射用蒸留水、ＵＳＰ中にクエン酸ナトリウム（１．２９ｍｇ）、塩化ナトリウム（５．４８ｍｇ）、ＥＤＴＡ−２ナトリウム（０．１２ｍｇ）、及びポリソルベート８０（０．７０ｍｇ）を含有する溶液（ｐＨ６．５）に溶解された状態で含有されている。
【００３０】
市販のＩＬ−１Ｒａの別の例として挙げられるのは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ；カタログ番号７８０−ＲＡの、組換えブタＩＬ−１Ｒａである。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、前記医薬には、ＩＬ−１Ｒがピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）と組み合わされて含まれている。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、イヌ又はヒト等の哺乳動物、特にヒトにおけるＩＩ型糖尿病を治療又は予防するための医薬を調製するためのＮＦ−ＫＢ阻害剤であるピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）の使用に関する。
【００３３】
ＩＬ−１Ｒａ及び／又はピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）を含む前記医薬は、皮下、筋肉内又は静脈内投与等、非経口で投与するのが好ましい。ＩＬ−１Ｒａ及び／又はピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）の一般的な処方方法は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy by Alfonso R.Gennaro（編者）、Lippincott, Williams & Wilkins；２０００年１２月１５日；ＩＳＢＮ：0683306472に記載されている。
【００３４】
ＩＬ−１Ｒａ及び／又はピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）を含む前記医薬は、例えば、皮下、筋肉内又は静脈内投与等の非経口投与に適合された担体など、薬学的に許容される担体とともに処方するのが好ましい。
【００３５】
「薬学的に許容される担体」という語には、生物学的に活性な物質をヒト等の哺乳動物に非経口投与で使用する場合に一般的に許容される媒体が包含されるものとする。薬学的に許容される担体は、通常、実際に使用する活性な薬物物質（ＩＬ−１Ｒａ及び／又はピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ））、前記物質の濃度、安定性及び意図するバイオアベイラビリティー、投与対象者、その年齢、体重及び全身状態、並びに皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内等、意図する本組成物の投与経路など（これらに限定されない）、当業者が決定し、考慮することができる範囲に属する数多くの要因に従って処方される。薬物の非経口投与において使用される典型的な薬学的に許容される担体には、例えば、Ｄ５Ｗ（５％重量／体積のデキストロースを含有する水溶液）及び生理的食塩水が含まれる。薬学的に許容される担体には、例えば、防腐剤や抗酸化剤等の有効な薬物物質の安定性を促進する成分等、さらなる成分を含有させてもよい
非経口で使用する薬物（特に皮下、静脈内、又は筋肉内投与）には、通常、０．１−１０００ｍｇの有効な薬物物質／ｋｇ（哺乳動物の体重）が含有される。
【００３６】
本発明において使用する医薬には、有効な薬物物質を滅菌注射の形態で含有させることができる。このような組成物を調製するためには、必要に応じて懸濁剤、溶解剤、安定剤、ｐＨ調整剤、及び／又は分散剤を含有させることができる薬学的に許容される担体に前記有効な薬物物質を拡散または溶解させる。使用できる許容される担体は、水、適切な量の酸（例えば、塩酸）、塩基（水酸化ナトリウム）又は適当な緩衝液を添加して適当なｐＨになるように調整した水、１，３−ブタンジオール、リンゲル液及び塩化ナトリウム等張液である。液性の調剤には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート等の、１種類ないし複数種類の防腐剤を含有させてもよい。
【００３７】
上記に照らして、本発明が、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制する方法であって、かかる治療ないし予防を必要とする哺乳動物に、十分な量のインターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）を投与することを含む方法も、提供することは自明であろう。さらに、本発明は、ＩＩ型糖尿病を治療し又は予防的に抑制する方法であって、かかる治療又は予防を必要とする哺乳動物に、十分な量のピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）を投与することを含む方法を提供する。上記の実施形態及び好ましい条件を準用する。
【００３８】
ＩＩ型糖尿病を治療又は予防するためにＩＬ−１Ｒａ及び／又はピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）を適用できることは、実施例の部に説明されているような動物モデルを用いた研究や臨床研究によって確認することができる。
【実施例】
【００３９】
＜方法＞
膵島の単離と培養  膵島は、ジュネーブ大学医学センターの外科部門で１１人の臓器ドナーの膵臓から、既述のごとく（３２−３４）単離した。ジチゾン染色によって調べたところ、膵島の純度は９５％を超えていた（通常の単離操作によってこの純度が得られなかった場合には、膵島を手で摘んだ）。ドナー（４０−７０才）は、心拍が停止していない解剖用の臓器ドナーであり、糖尿病又は代謝疾患の既往症がある者はいなかった。長期のインビトロ実験の場合、ウシの角膜内皮細胞由来の細胞外マトリックスで被覆されたプレート（Novamed Ltd., Jerusalem, Israel）上で膵島を培養して、細胞が皿に付着して増殖できるようにし、細胞の機能的な完全性を保持した（７；３５）。１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清（Gibco, Gaithersburg, MD）を含有するＣＭＲＬ  １０６６培地（以下、培地という。）中で膵島を培養した。播種から２日後に、殆どの膵島が付着して、平坦になり始めたら、５．５、１１．１又は３３．３ｍＭのグルコースを含有する培地に交換した。一部の実験では、２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１β、１０００Ｕ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮγ（ReproTech EC Ltd, London, UK）、５００  ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）(R&D Systems Inc., Minneapolis,MN)、１ｎｇ／ｍｌの膜結合型  Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）（３６）（upstate biotechnology, Lake Placid, NY）又は１００μＭのピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ；  Ｓｉｇｍａ；  ２日の培養当たり２時間）を加えてさらに膵島の培養を行った。
【００４０】
動物：  ヘブライ大学コロニーの糖尿病にかかりやすい系統と糖尿病にかかりにくい系統から得た両性のデブスナネズミ（２．０−３．５月齢）をHarlan(Jerusalem;Israel)から入手した。離乳後、糖尿病にかかりやすいデブスナネズミは、実験開始まで、２．３８ｋｃａｌ／ｇの低エネルギー食(Koffolk, Petach Tikva, Israel)で飼育したのに対して、糖尿病を発症した動物（糖尿病にかかりにくいコロニーに属する動物のうち約３０−４０％）を確定して研究から除外するために、糖尿病にかかりにくいデブスナネズミは２．９３ｋｃａｌ／ｇの高エネルギー食(Weizmann Institute, Rehovot, Israel)で飼育した。７．８ｍｍｏｌ／Ｌ未満のランダムな血中グルコース濃度を有する非絶食動物(Glucometer Elite, Bayer Diagnostics, Elkart, IN)はすべて、非糖尿病性であると考えた。糖尿病にかかりやすいデブスナネズミを高エネルギー食に切り替えて、０．４ｇ／ｋｇのフロリジン（Ｓｉｇｍａ）又は溶媒（４０％プロピレングリコール）を１２時間ごとに注射し、８日後に屠殺した。ケタミン(Ketalar,Park-Davis,Gwent,U.K.)でデブスナネズミに麻酔をかけ、心臓穿刺によって瀉血した。膵臓を直ちに摘出し、１０％  リン酸で緩衝化したホルマリン中に浸漬して固定した。本動物実験は、ヘブライ大学の学内の動物の取り扱いと使用に関する委員会及びハダッサ医学機構によって承認された。
【００４１】
ＩＬ−１βを発現しているβ細胞の検出：  通常の剖検によって得られた膵臓とデブスナネズミの膵臓をホルマリン中に浸漬して固定した後、パラフィンに包埋させた。切片のパラフィンを除去して、水に戻し、０．３％  Ｈ２Ｏ２に１５分間埋没させて内在性のペルオキシダーゼをブロックした。次いで、メタノール中で４分間切片をインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、培養した膵島と単離されたβ細胞を４％パラホルムアルデヒド中に固定した（３０分、室温）後、０．５％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理を行った（４分、室温）。１０％ウシ血清アルブミンに１時間暴露した後、マウス抗ＩＬ−１β抗体（１：３０希釈、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）とともにインキュベート（１時間、３７℃）して、組織切片と培養細胞の両方に対して、ＩＬ−１βとインシュリンの二重標識を行った。  検出は、ロバ抗マウスＣｙ３抱合抗体（１：１００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて行った。続いて、１：５０に希釈したモルモットの抗インシュリン抗体(Dako, Carpinteria, CA)とともに、標本を３７℃で３０分間インキュベートした後、１：２０に希釈したフルオレセイン抱合ウサギ抗モルモット抗体（Ｄａｋｏ）とともに３０分インキュベートした。ＩＬ−１β染色の陽性対照として、以前に記載したように（３７）ヒト単核細胞を単離し、１μｇ／ｍｌのリポ多糖（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＩＮ）に、２時間３７℃で曝露した。カバーガラスを風乾して、スライド上に載せ、５０％のアセトン／メタノール中にて室温で５分間、固定及び透過処理を行い、既述のごとくＩＬ−１βの染色を行った。
【００４２】
ＩＬ−１βのｍＲＮＡインシチュハイブリダイゼーションの場合、アンチセンス又はセンスプライマー中にＴ３又はＴ７プロモーターを取り込ませたポリメラーゼ連鎖反応によって、ＤＮＡテンプレートを作製した。以下のプライマーを使用した。
【００４３】
Ｔ３  ５’ＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡ３’と、
Ｔ７  ５’ＧＧＣＣＡＧＴＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＡ３’
ＰＣＲ産物の精製は、メーカーの指示書に従い、Nucleospin Extract 2 in 1TM(Machery-Nagel, Duren, Germany)を用いて行った。フェノール／クロロホルム精製を行った後、ＲＮＡ  Ｔ７−及びＴ３ポリメラーゼとＲＮＡジゴキシゲニン標識ミックス(Roche, Switzerland)を用いて、ジゴキシゲニン標識されたＲＮＡプローブを調製した。２０μｇ／ｍｌのProteinase K(Roche)で組織切片を処理し、５０％  ホルムアミド、５×塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌサケ精子（Ｓｉｇｍａ）、１×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、ウシの肝臓から採取した２５０μｇ／ｍｌ  ＲＮＡ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ（Ｓｉｇｍａ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中にて、２時間５５℃でプレハイブリダイズさせた。３０ｎｇのジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを含有する１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中において、５２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。次いで、室温で５％のミルクパウダーによって切片のブロッキングを行い、抗ジゴキシゲニン−ローダミンＦａｂ断片（２０μｇ／ｍｌ，Ｒｏｃｈｅ）とともに３７℃で１時間インキュベートした後、上述のようにインシュリンの免疫染色を行った。
【００４４】
染色後、Ｋａｉｓｅｒのグリセロールゼラチン(Merck, Darmstadt, Germany)中に試料を包埋させ、光学顕微鏡と蛍光顕微鏡(microscope Axiolab;Zeiss, Jena, Germany)によって分析した。
【００４５】
ウェスタンブロット分析：  非接着性のプラスチック皿の培地中で膵島を培養した。単離から１日後、培地を交換し、２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β又は５００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ１Ｒａを加えずに又は加えて、５．５又は３３．３ｍＭのグルコースを含有する培地中で、２００の膵島群を４４時間インキュベートした。インキュベーションが終了した時点で、ＰＢＳ中で膵島を洗浄し、１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、０．３％  ブロムフェノールブルー、１．８％  β−メルカプトエタノールを含有する５０μｌの試料緩衝液中に懸濁させ、５分間煮沸した。等量の各処理群を１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で展開した。タンパク質をニトロセルロースフィルターに電気的に転写し、ウサギ抗Ｆａｓ(C20, Santa Cruz Biotechnology Inc. , Santa Cruz, CA)、マウス抗ＩＬ−１β(R&D Systems Inc)、ウサギ抗ＩＬ−１β（ヒトＩＬ−１βの前駆体と切断型を認識する；Cell Signaling, Beverly, MA)；マウス抗ＮＦ−κＢ（ｐ６５）（Active Motif, Carlsbad, CA）、マウス抗ＮＯＳ−２（Ｃ−１１、マウス、ラットおよびヒト由来の誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）を認識する、Santa Cruz Biotechnology Inc.）又はマウス抗アクチン（C-2; Santa Cruz Biotechnology Inc.）抗体とともにインキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼを連結した抗マウス又は抗ウサギＩｇＧ（Santa Cruz Biotechnology Inc.）とともにインキュベートした。Ｌｕｍｉｇｌｏ試薬（Phototope-HRP Western blot detection kit; Biolabs, Beverly, MA）を添加した後、放射光をＸ線フィルム上に捕捉した。マーカーとして、ビオチン化したタンパク質分子量の標準（Ｂｉｏｌａｂｓ）を平行して走行させた。インキュベーションの間に、２８０μｌのβ−メルカプトエタノール、５ｍｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８及び１０％  ＳＤＳを含有する４０ｍｌの溶液中において、５０℃で３０分間、ニトロセルロース膜を剥離させた後
、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＴｒｉｓ緩衝化生理的食塩水中で１時間洗浄した。バンドの強度は、MultianalystTM(Bio Rad, Laboratories inc., Hercules, CA)を用いて分析した。
【００４６】
ＮＦ−κＢの活性化：  上記のように、懸濁液中で膵島を培養し、ＰＢＳで洗浄した。ＮＦ−κＢ複合体の活性化は、ＮＦ−κＢコンセンサス部位に結合する付着したオリゴヌクレオチドを用いて、ＥＬＩＳＡをベースとしたキットで定量し、メーカーの指示書に従って、抗ｐ６５又はｐ５０サブユニット抗体によって検出した(Trans-AMTM NFκB, Active Motif)。平行して、Ｂｏｕｉｎ溶液中で膵島を１５分間固定し、ＰＢＳ中の２％融解アガロース（４０℃）４０μｌ中に再懸濁した後、直ちに遠心とパラフィン包埋を行った。  切片のパラフィンを除去して、水に戻し、０．３％  Ｈ２Ｏ２に１５分間埋没させて内在性のペルオキシダーゼをブロックして、メタノール中で４分間切片をインキュベートした。マウス抗ＮＦ−κＢ（ｐ６５）（１：５０希釈）又はウサギ抗ＩκＢ（１：５０希釈，Ｃ−２１，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体とともに切片をインキュベートし、ロバ抗マウス又は抗ウサギＣｙ３抱合抗体によって検出し、上述のようにインシュリンを二重染色した。
【００４７】
ＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲ、及びＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定：  上記のように、懸濁液中で膵島を培養した。Ｒｎｅａｓｙミニキット(Qiagen, Basel, Switzerland)を用いて全ＲＮＡを抽出し、SuperscriptTM II Rnase H- Reverse transcriptase KITとoligo-dT(24)(Life technologies, Gibco)を使用し、メーカーの指示書に従って、ＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーは、
５’ＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＴＡＡＡＣＡＧ３’／５’ＡＧＧＴＧＣＡＴＣＧＴＧＣＡＣＡＴＡＡＧ３’（ヒトＩＬ−１β）、
５’ＧＣＡＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴ３’／５’ＣＡＧＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＣＣＣＣＡＴＴ３’（ヒトＦａｓ）及び
５’ａｃｇｔｇｃｇｔｔａｃｔｃｃａｃｃａａｃａ３’／５’ｃａｔａｇｃｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｇｃａｔｔ３’（ヒトｉＮＯＳ）であった。ＩＬ−１βとＦａｓのＰＣＲ増幅条件は、以下のとおりであった。３０秒９４℃で変性、３０秒６０℃でアニーリング、３０秒７２℃で伸長させた後、リアルタイムＰＣＲのため、８０℃で５秒定量、４５サイクル。ＰＣＲ増幅の飽和は、２２サイクルと２８サイクルの間に起こった。ＰＣＲ増幅産物のサイズは２５０ｂｐであった。精製されたＰＣＲ産物の配列を決定して、正しい遺伝子が増幅されているか確認した。ｉＮＯＳのＰＣＲ増幅条件は、以下のとおりであった。３０秒９４℃で変性、４０秒５５℃でアニーリング、３０秒７２℃で伸長、３５サイクル。定量分析を行うために、本発明者らは、Light Cycler quantitative PCR system (Roche, Basel, Switzerland)を使用し、市販のキット(Light Cycler-DNA Master SYBR Green I; Roche)を用いて定量的ＰＣＲを行った。Ｆａｓ及びＩＬ−１β  ｍＲＮＡの量は、ＧＡＰＤＨに対して標準化した（５’ＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＣ３’／５’ＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴ３’）。
【００４８】
β細胞のアポトーシス：  ＤＮＡの分解から生じた遊離の３−ＯＨ鎖の切断は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって媒介されるｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）技術（３８）によって検出した。ＰＢＳで洗浄した後、培養した膵島を４％パラホルムアルデヒド中に固定した（３０分、室温）後、０．５％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理を行った（４分、室温）。ＴＵＮＥＬアッセイは、メーカーの指示書に従って行った(In Situ Cell Death Detection Kit, AP; Boehringer Mannheim, Germany)。次いで、Ｔｒｉｓで緩衝化した生理的食塩水を用いて調製物を濯ぎ、５−ブロモ−４−クロロ−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム液体基質系（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした（１０分、室温）。次いで、上述したように、モルモットの抗インシュリン抗体とともに膵島をインキュベートした後、ストレプトアビジンービオチン−ペルオキシダーゼ複合体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて検出を行った。ＴＵＮＥＬ反応と平行して、本発明者らは、壊死に対するグルコースの効果を評価するために、ＤＮＡ結合色素であるヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を使用した。ＰＢＳを用いて、培養膵島を洗浄し（パラホルムアルデヒド固定は行わない）、ＰＢＳ中の１０μｇのヨウ化プロピジウムとともに氷上で１０分間インキュベートして、ＰＢＳで洗浄し、Dako fluorescent mounting medium(Dako)中に包埋させた。陽性染色された壊死した核の存在について、蛍光顕微鏡によって、試料を直ちに検査した。
【００４９】
サイトカインの放出：  各実験の終了前に収集した培地中でサイトカインの放出を調べた。以下のキットを使用した。ヒトＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）、ヒトＴＮＦα  ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、ヒトＩＦＮγ（Ｇｉｂｃｏ）。
【００５０】
インシュリンの放出と含量：  グルコース刺激に応じた急性のインシュリン放出を測定するために、１０％ＦＣＳが添加され、３．３ｍＭのグルコースを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で膵島を洗浄し、同じ培地中において１時間プレインキュベートした。次いで、培地を破棄し、基礎分泌を得るために、３．３ｍＭのグルコースを含有する新しい培地と１時間交換した後、１６．７ｍＭのグルコースを含有する培地中でさらに１時間インキュベートした。インキュベートしたものを収集し、インシュリンアッセイのために凍結させた。次いで、ＰＢＳで膵島を洗浄し、７０％エタノール中の０．１８Ｎ  ＨＣｌを用いて４℃で２４時間抽出した、インシュリン含量を測定するために、酸−エタノール抽出物を収集した。ヒトインシュリンＲＩＡキット(CIS bio international, Gif-Sur-Yvette, France)によって、インシュリンを測定した。
【００５１】
評価と統計解析：  処理条件を知らされていない単一の検査者（Ｋ．Ｍ．）によって、試料の評価を無作為に行った。同じようなサイズの膵島を計数するように注意を払った。サイズが大きめの膵島は完全に広からずに、複数の細胞が重なっていた。単一細胞の評価を行うには単層であることが必須なので、このようなサイズが大きめの膵島は除外した。評価を行った膵島単層の平均表面積は、それぞれ、５．５及び３３．３ｍＭのグルコースで培養した膵島において、０．０３１＋／−０．０１２ｍｍ２と０．０２９＋／−０．０１１ｍｍ２であった（有意でない）。従って、大型の膵島を除外することによって、処理とは無関係に、各培養皿が同様の含有量を有することになる。表面積を測定するためには、ＳａｉｓａｍＴＭソフトウェア(Microvision instruments, Evry, France)を使用した。多群比較のためのＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの補正を使用し、スチューデントのｔ検定又は分散分析によってデータを分析した。
【００５２】
＜結果＞
グルコースは、ヒト膵島中でＩＬ−１βの産生と放出を誘導する：  増加したグルコース濃度にヒト膵島を４日間暴露した。培地中に放出されたＩＬ−１βを測定することによって、３３．３ｍＭのグルコースで培養した膵島では、５．５ｍＭのグルコースで培養した膵島に比べて、ＩＬ−１βの放出が２．２倍増加していた（図１Ａ）。この高濃度のＤ−グルコースの非特異的影響を除外するために、５．５ｍＭ  Ｄ−グルコースとともに２７．８ｍＭのＬ−グルコースを用いて浸透圧を補正したが、５．５ｍＭ  のＤ−グルコースのみで観察された場合と同様にＩＬ−１βが放出された。未使用の培地中には、ＩＬ−１βは全く検出されなかった。他のサイトカインの放出と比較することによって、ＩＬ−１β放出の特異性を評価した。僅かな量のＩＬ−１αとＴＮＦαが観察されたが、何れもグルコースによって制御されず、有意な量のＩＦＮγ又はＩＬ−１２は検出されなかった（表１）。３３．３ｍＭのグルコースがＩＬ−１βの分泌に及ぼす効果の経時変化から、高グルコースに２０時間曝露した後でなければ有意な効果は見られず、この効果は４４時間後まで持続することが明らかとなった（図１Ｂ）。ヒト膵島中でのＩＬ−１β産生のウェスタンブロット分析と定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定によって、グルコース濃度の上昇がＩＬ−１βの放出のみならず、ＩＬ−１βタンパク質とＩＬ−１βのＲＮＡ合成も誘導することが明らかとなった（図１ＣとＤ）。但し、グルコースに応答したＩＬ−１βの増加について、ウェスタンブロットの結果にはかなりばらつきがあったことに留意されたい。これは、異なる膵島調製物中に存在する非内分泌細胞（特にマクロファージを含む）の数が一定しないことによるものである可能性がある。グルコースで刺激されないこのような付随細胞によるＩＬ−１βの産生が起こると、総ＩＬ−１β産生に対してその占める割合が大きくなると、予想されたグルコース効果が小さくなることが明らかとなっている。
【表１】
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【００５３】
ＩＬ−１βをグルコース依存的に産生する膵島細胞源の同定：  次に、本発明者らは、ＩＬ−１βを産生する膵島細胞の同定を行った。培養ヒト膵島を３３．３ｍＭのグルコースに４日間曝露すると、抗ＩＬ−１βと抗インシュリン抗体を用いて、細胞外マトリックスで被覆した皿の上に播種された膵島の二重免疫染色を行ったところによるとβ細胞のクラスター中でＩＬ−１βの発現を誘導した（６人のドナーによる６つの実験のうちの１つから得られた代表的なイメージが図２Ａ−Ｄに記されている）。各実験では、ＩＬ−１β陽性のβ細胞が、３３．３ｍＭのグルコースで培養した膵島中に観察された。他の細胞によって分泌されてβ細胞の膜に結合したＩＬ−１βに起因する偽陽性の結果を除外するために、ＩＬ−１Ｒａで膵島を処理した。これらの条件下では、ＩＬ−１Ｒａは、β細胞上に存在する表面受容体とのＩＬ−１βの相互作用をアンタゴナイズするはずである。ＩＬ−１Ｒａとの共インキュベーションによっても同様の結果が得られ、β細胞がＩＬ−１βを産生していることが確認された。
【００５４】
ＩＬ−１βは、正常なヒト膵島中には発現されない（２８）。しかし、インビトロ実験に基づけば、高血糖のために、ＩＩ型糖尿病患者の膵島中では、ＩＬ−１βが発現されている可能性があると予測された。従って、血糖値の調節がうまく行われていない５人のＩＩ型糖尿病患者（全員、空腹時の血中グルコースが８ｍＭを超えると報告されている）から得た膵臓の切片で、ＩＬ−１βの発現を調べた。ＩＬ−１βとインシュリンについて前記膵臓切片を二重染色することによって、全ての膵臓のβ細胞クラスターにＩＬ−１βが存在することが明らかとなった（膵臓当たり２２．５＋／−３．４％の膵島に、ＩＬ−１βを発現するβ細胞のクラスターが存在していた。代表的なイメージについては、図２Ｇ−Ｈを参照）。ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ転写物の存在は、糖尿病患者のβ細胞中でインシチュハイブリダイゼーションを行うことにより確認した（図２Ｋ−Ｌ）。ＩＬ−１βの発現は、非糖尿病対照（図２Ｅ−ＦとＩ−Ｊ）と外分泌膵臓のβ細胞中には検出できなかった。ジゴキシゲニン標識されたセンスプローブを対照として使用したが、シグナルは得られなかった（図２Ｎ）。
【００５５】
デブスナネズミにおける糖尿病発症時のβ細胞によるＩＬ−１βの発現はグルコース依存性である：  インビボでのＩＬ−１βの誘導もグルコースによって制御されているかどうかを調べるために、低エネルギー食又は高エネルギー食を与えた糖尿病にかかりにくい３匹のデブスナネズミと糖尿病にかかりやすい８匹のデブスナネズミを調べ、高血糖動物はさらにフロリジンで処理し、腎尿細管によるグルコースの再吸収を阻害することによって高血糖を補正した。糖尿病にかかりにくいデブスナネズミと糖尿病にかかりやすい絶食させたデブスナネズミの膵島中には、ＩＬ−１βを発現しているβ細胞が全く観察されなかった（代表的なイメージについては、図３Ａ−Ｂを参照）。高エネルギー食を８日間与えると、糖尿病にかかりやすい極めて高血糖なデブスナネズミの膵島では、多くのβ細胞中にＩＬ−１βの発現が見られ、インシュリンはほとんど発現していなかった（図３Ｃ−Ｄ）。高エネルギー食を与えた動物にフロリジンを注入して血中グルコースを正常化させることによって、インシュリンの貯蔵が回復し、ＩＬ−１βの発現が抑えられた（図３Ｅ−Ｆ）。
【００５６】
ＩＬ−１βは、グルコース誘導性のＮＦ−κＢの活性化、Ｆａｓ発現、β細胞のアポトーシスを媒介する：  ＩＬ−１Ｒａを阻害剤として用いて、グルコース誘導性ＩＬ−１βの機能的な役割を調べた。ヒト膵島では、グルコース濃度の上昇によって、ＮＦ−κＢの活性が１．９倍増加した（図４Ａ）。これは、ＩＬ−１Ｒａによって抑えられた。ＮＦ−κＢの活性化に対するグルコースの効果は、活性な核型のＮＦ−κＢ転写因子複合体のｐ６５サブユニットを専ら認識する（３９）抗ＮＦ−κＢ（ｐ６５）抗体を用いたウェスタンブロット分析によって確認された（図４Ｂ）。ＮＦ−κＢは、細胞質中で阻害的κＢ（ＩκＢ）タンパク質に結合している（４０）。ヒト膵島を３３ｍＭのグルコースに曝露すると、ＩκＢの発現が減少し（図４Ｃ）、β細胞中でＮＦ−κＢ（ｐ６５）が核内に出現する（図４Ｄ）。Ｆａｓ受容体タンパク質とｍＲＮＡのグルコース依存性の誘導も、ＩＬ−１Ｒａによって妨害された（図４Ｂ、Ｅ及びＦ）。次に、ＩＬ−１Ｒａが、グルコース誘導性のアポトーシスからβ細胞を保護できるかどうか調べた。細胞外マトリックス皿の上で培養されているヒト膵島を上昇したグルコース濃度に曝露すると、ＤＮＡの断片化が見られる核の数（ＴＵＮＥＬ陽性）が増加した（図４Ｇ、Ｈ）。しかしながら、漸増するグルコース濃度（５．５から３３．３ｍＭ）に膵島培養物を４日間暴露させても、ヨウ化プロピジウムの取り込みは起こらず、壊死は除外された。ＩＬ−１Ｒａは、５．５ｍＭのグルコースにおける基底的なアポトーシスを有意に変化させなかった。しかし、ＩＬ−１Ｒａは、３３．３ｍＭのグルコースによって誘導されたアポトーシスからβ細胞を保護した（図４Ｇ）。同様に、ＮＦ−κＢ阻害剤であるＰＤＴＣによって、グルコース誘導性のＤＮＡの断片化が阻害された（図４Ｈ）。外来ＦａｓＬを添加しても、β細胞死は顕著には増加しなかった（５．５ｍＭグルコースの対照に比べて、３３．３ｍＭのグルコース単独ではＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞が２．８＋／−０．４倍増加したのに対して、３３ｍＭのグルコース＋外来ＦａｓＬでは３．０＋／−０．４倍増加していた）。最後に、高グルコースがｉＮＯＳの発現を誘導するか否かを調べた。３３ｍＭ  グルコースおよびＩＬ−１β単独ともに、ｉＮＯＳ  ｍＲＮＡ（図５）又はタンパク質発現を誘導しなかった。
【００５７】
ＩＬ−１ＲａとＰＤＴＣは、ＩＬ−１βによって媒介される「ブドウ糖毒性」によって損なわれたβ細胞の機能を改善させる：  ヒト膵島を３３．３ｍＭのグルコース又はＩＬ−１βに４日間慢性的に曝露させると、グルコースによって刺激される急性のインシュリン放出が喪失した（図６ＡとＣ）。ＩＬ−１Ｒａ又はＰＤＴＣとともにインキュベーションを行うと、このようなグルコース刺激が部分的に回復した。高グルコースで培養された膵島のインシュリン含量は対照（５．５ｍＭ  グルコース）に比べて減少し、ＩＬ−１Ｒａによっては影響を受けなかった（図６Ｂ）。
【００５８】
動物実験、デブスナネズミ（ＩＩ型糖尿病の動物モデル）のインターロイキン１受容体アンタゴニストによる処理（研究の提案）：
ＩＩ型糖尿病患者で観察されるβ細胞集団の減少を抑えるためにＩＬ−１Ｒａを外部投与して治療に使用できる可能性をデブスナネズミで試験できるであろう。スナネズミの一種であるデブスナネズミはインシュリン抵抗性を示し、まず、高インシュリン血症を伴い、徐々に低インシュリン血症と重篤な高血糖が進行することにより、肥満と関連する食物誘導性の糖尿病を発症する。これにはβ細胞の増殖活性の一過的な増加とβ細胞死の割合の長期的な増加とを伴い、最終的には膵島構造が破壊される（８）。明白な類似性の故に、デブスナネズミはヒトのＩＩ型糖尿病の便利なモデルとなる。本発明者らは、糖尿病の発生時に見られる、高血糖によって誘導されたβ細胞のアポトーシスとデブスナネズミの膵島の増殖障害をＩＬ−１Ｒａによる処置が抑えられるかどうかを調べる予定である。現在進行中のN.Kaiser(Hadassah University Hospital, Jerusalem)のグループとの共同研究の一環として、１０ｍｇ／ｋｇ体重／日のＩＬ−１Ｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ））をデブスナネズミの腹腔内に投与する。本研究は、糖尿病にかかりやすい３群のデブスナネズミから構成されるであろう。
【００５９】
グループ１、低エネルギー食で飼育したデブスナネズミ。
【００６０】
グループ２、ＩＬ−１Ｒａで処理され、糖尿病を誘発するために低エネルギー食から高エネルギー食に切り替えたデブスネネズミ
グループ３、溶媒で処理され、糖尿病を誘発するために低エネルギー食から高エネルギー食に切り替えたデブスネネズミ
研究の第４、７、１４，２１及び２８日目に、各群から４匹の動物を屠殺する。屠殺を行ったら、血液を集めて、血漿グルコース、インシュリン、トリグリセリドを測定するために使用する。膵臓を摘出し、その後インシュリン含量を測定するために、−７０℃で頭部を凍結する。残りの尾部は、１０％のリン酸緩衝化ホルマリン中に固定した後、標準的なパラフィン包埋を行う。Ｆａｓ、ＩＬ−１β、インシュリンの発現並びにβ細胞の増殖及びアポトーシスについて、連続切片を分析する。ここに提起した動物の数と処理の期間は、デブスナネズミを用いた本研究者らの以前の研究に基づくものである（８）。
【００６１】
予想される結論
ブドウ糖毒性がＩＬ−１Ｒａによって完全にブロックされると仮定すると、プラセボ処理を行った動物に比べて、ＩＬ−１Ｒａ処理を行った動物では以下の改善が期待できる。
【００６２】
糖尿病発症の抑制又は遅延
高血糖によって誘導されるβ細胞のアポトーシス、増殖障害β細胞集団の減少からの保護
膵臓のインシュリン含量の正常化。
【００６３】
臨床研究。インターロイキン１受容体アンタゴニストによるＩＩ型糖尿病患者の治療（研究の提案）：  患者の半分はＩＬ−１Ｒａで処理し、残りの半分は生理的食塩水で処理する二重盲検プラセボ対照プロトコールに従って、７２人の患者を無作為に振り分ける。処理期間は１３週とする。この期間は、機能的なブドウ糖毒性を回復させるのに十分なものであるとともに（６１）、患者のコンプライアンスという観点からも実行可能なはずである。１３週の処置がβ細胞集団に有意な変化を生じせしめるのに十分であるかどうかは、予測できない。しかし、新しい膵島の形成とβ細胞の複製が正常な状態のまま（６２）、β細胞のアポトーシスをブロックするとβ細胞集団の拡大が開始され、これは、処理期間を超えて進行することがある。開始時と４週、１３週、２６週、３９週及び５２週後に、患者の評価を行う。１３週間経過後に、空腹時の血漿グルコースレベルが８ｍＭを超える患者又はグリコシル化されたヘモグロビンのレベル（ＨｂＡｌｃ）が８％を超える患者にインシュリン処置を施す。ＩＬ−１Ｒａによる最大の効果が期待される期間中の主要な結果に対してインシュリンが及ぼす可能性のある妨害を避けるために、これより以前にインシュリン処置を開始すべきではないであろう。インシュリン感受性に対するＩＬ−１Ｒａの効果を評価するために、４０人の患者（ＩＬ−１Ｒａ処置が２０人、プラセボ処置が２０人）の一部に、正常血糖−高インシュリンクランプを行い、処置の開始および終了時（１３週）に筋肉と脂肪の生検を行う。
【００６４】
参加基準：
−年齢＞３０
−少なくとも３ヶ月にわたってＩＩ型糖尿病（米国糖尿病協会の基準による）に罹患しており、専ら食事と運動及び／又は経口抗糖尿病薬による治療を受けている。
【００６５】
−ＨｂＡ１ｃ＞８％
−肥満度指数（ＢＭＩ）＞２７
除外基準
−ＧＡＤ２又はＩＡ−２抗体陽性
−ＨｂＡ１ｃ＞１２％、多尿と口渇（著しく代償性が損なわれた患者を除外）
−現在インシュリンで治療を行っている
−確立された抗炎症治療
−ＣＲＰ＞３０ｍｇ／ｄｌ、発熱、現在抗生物質で治療中、慢性の肉芽腫性感染症（例えば、結核）の既往歴があるか胸部Ｘ線スクリーニングで慢性の肉芽腫性感染が認められる。
【００６６】
−好中球減少症又は貧血（白血球数＜２．０×１０９／ｌ、男性の場合、ヘモグロビンが１１ｇ／ｄｌ未満、女性の場合、１０ｇ／ｄｌ未満）
−妊娠中又は授乳中
−重い肝疾患又は腎疾患（ＡＳＴ又はＡＬＴが通常の検査域の上限の３倍を超える、血清クレアチン＞１３０μＭ）
−悪性新生物が進行している
−本研究への参加から３０日以内又は治験薬の半減期の５倍以内（何れか長い方）に何らかの治験薬を使用した者
主要な評価項目：
−刺激されたＣペプチド及びインシュリン（下記参照）
−ＨｂＡ１ｃ
−空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）
副次的評価項目：
−インシュリン要求性
−血清サイトカインレベル、ＣＲＰ
−インシュリンとグルコースを測定するＯＧＴＴ（経口ブドウ糖負荷試験）から得られたインシュリン分泌とインシュリン感受性の指標
−患者の一部については、クランプ技術及び筋肉と脂肪の生検によってインシュリン感受性を評価する。
【００６７】
患者の評価
患者の評価は以下のように行われる。
【００６８】
−肥満度指数、ウエストとヒップの比、血圧（立位と臥位）、心拍数などの身体検査
−ＨｂＡ１ｃ、遊離脂肪酸、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロールなどの脂質プロファイル、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＣＲＰ、ナトリウム、カリウム、クレアチニン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、及びヘマトグラムを測定するための血液試料。
【００６９】
−アルブミン尿とクレアチニンクリアランスを得るために２４時間尿を収集（ベースラインと研究の終了時のみ）
−立体的眼底写真を含む眼科学的検査（ベースラインと研究の終了時のみ）
−０、３０、６０、９０及び１２０分に血漿グルコース、インシュリン及びＣペプチドを測定する標準的な経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）。１２０分の時点で、０．３ｇ／ｋｇのグルコース＋０．５ｍｇのグルカゴン＋５ｇのアルギニンを静脈内注射した後、０，３、６、９及び１２分に血漿グルコースとインシュリンを測定。
【００７０】
−患者自身が自宅で毎週完全な血糖プロファイルを実施。
【００７１】
−正常血糖−高インシュリンクランプと生検：−４０人の患者（ＩＬ−１Ｒａ処置が２０人、プラセボ処置が２０人）に、正常血糖−高インシュリンクランプ及び筋肉と脂肪の生検を行う。この技術は、ＳＤＣのＡ．Ｖａａｇのグループが一般的に使用している（６３−６５）。Ｍ．ＦａｕｌｅｎｂａｃｈがＳＤＣで本技術を習得し、ＵＳＺにこれを導入する予定である。注入のために肘正中静脈に、血液採取のために反対側の背側腕または肘正中静脈にポリエチレンカテーテルを配置する。静脈血試料の動脈血化を確保するために、加熱したプレクシグラスボックスの中にこの「試料採取」腕を置く。最初に４０分の基礎期間を置いた後、準備刺激されたインシュリンの継続的な注入（４０ｍＵ・ｍ−２・ｍｉｎ−１）を開始し、３時間継続する。基礎定常状態期間とインシュリン刺激下での定常状態期間は、４０分の基礎定常期間のうち最後３０分と３時間のクランプ期間のうち最後３０分と定義される。グルコース（１８０ｇ／ｌ）を不定的に注入することにより、インシュリン注入時に正常な血糖が維持されるであろう。自動化されたグルコース酸化法を用いて、基礎期間及びクランプ期間中に、５ないし１０分ごとに血漿グルコース濃度をモニターする。基礎定常期間とクランプ定常期間中に、インシュリンを測定するため、１０ないし３０分ごとに血液試料を採取する。外側広筋や同じ領域の皮下脂肪及び腹部領域から、基礎状態（０分時）に、針による生検試料を得る。サイトカインの発現（例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１α及びβ、ＩＬ−１Ｒａ、ＩＬ−６、アジポネクチン及びレプチン）やインシュリンの作用にとって重要と思われるその他の遺伝子及びタンパク質を分析するまで、生検試料は直ちに液体窒素中で凍結させ、−８０℃で保存する。
【００７２】
−両試験（ＯＧＴＴとクランプ実験）の前に、激しい運動を２４時間控え、９−１０時間絶食するように、患者に指示を与える。患者には、実験日に試験薬を注射するが、他の抗糖尿病薬は与えない。クランプを行ってから、２ないし７日の期間を置いて、ＯＧＴＴを行う。試験薬は、全ての評価が終了するまで継続する。
【００７３】
基本的な薬物治療：
試験中には、患者の現在の治療法を一切変更すべきでない。
【００７４】
試験的な薬物治療：
Ａｎａｋｉｎｒａ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（Ｒ））は、Ｎ末端のメチオニンを有する組換え非グリコシル型のＩＬ−１Ｒａであり、Ａｍｇｅｎによって製造されている。  インターロイキン−１のＩ型受容体に拮抗的に結合することによって、ａｎａｋｉｎｒａは、ＩＬ−１の活性を阻害する。６ヶ月間、皮下注射により１００ｍｇの用量を与えることにつき、ＦＤＡから２００１年１１月に認可が得られた。ａｎａｋｉｎｒａの半減期は４−６時間で、１−２ｍｇ／ｋｇを皮下投与してから３−７時間後に血漿濃度が最大となる。
【００７５】
ａｎａｋｉｎｒａは、２４時間おきに１００ｍｇの用量を朝に単回投与する。ａｎａｋｉｎｒａ又はプラセボ（生理的食塩水）は、腹部又は大腿上部の皮膚に皮下注射する。試験担当の看護婦は、患者が自分で注射を行う方法について教える。健康その他の問題について、１人の医師が２４時間常駐するようにする。
【００７６】
倫理面の検討：
−有害な反応
紅斑、斑状出血、掻痒、炎症、痛み、腫れを特徴とする注射部位の反応は、慢性関節リウマチ患者における皮下処置の副作用として最も報告が多い。反応は、通常、穏やか且つ一過性であり、数週以内に消散するが、最大５％の患者では、治療の中断が必要となる。慢性関節リウマチの臨床試験では、プラセボを対照とした試験において、ＩＬ−１Ｒａを投与された患者の０．３％に、好中球の絶対数が１×１０９／ｌ以下となる好中球減少症が発症した。ＩＬ−１Ｒａを投与された患者の４０％、プラセボを投与された患者の３５％に感染症が起きた（有意でない）。６ヶ月の間に、ＩＬ−ＬＲａ群の１．８％とプラセボ群の０．６％に重篤な感染症が起きた（有意でない）。重篤な感染症は、日和見、真菌、又はウイルスによるものではなく、主に細菌によるものであった（蜂巣炎、肺炎、骨や関節の感染症）。
【００７７】
−侵襲的な検査（クランプと生検）
正常血糖−高インシュリンクランプは、インシュリン感受性を評価するための最も標準的な技法である。必要なカテーテルは全て、末梢静脈のみを使用する。血中グルコースは５ないし１０分おきにモニターするが、低血糖を回避するのに十分であろう。
【００７８】
筋肉と脂肪の生検からは、インシュリン感受性組織に対するＩＬ−１Ｒａの効果について、独自の識見が得られるであろう。局所麻酔によって、著しい不快さが一切回避されるであろう。試料のサイズは最大０．５ｃｍ３であろう。
【００７９】
−試験薬の注射
参加した患者の多くは、最終的にインシュリンの注射を受けることになるであろう。従って、自己皮下注射を習得して、これに慣れる負担を負うことが、長い目で見ると、多くの患者にとって有益となるであろう。
【００８０】
−１３週までインシュリン治療の開始が遅れること
本研究からは、重篤な高血糖患者が除外されるので、インシュリンの使用を開始するのが１３週まで遅れることがあっても、糖尿病の長期合併症を発症するリスクを著しく増大させることはないはずである。
【００８１】
−研究からの離脱
患者は、いつでも、理由なしに、研究から離脱する権利を有する。研究担当医は、何らかの副作用が生じ若しくは予期せぬ治療経過が認められた場合、又は患者の利益となる場合には、治療を中断又は中止することができる。この場合には、研究担当医は、以下の治療的措置について決定を行う。研究から離脱しても、後の治療において不利益を受けることはない。
【００８２】
−インフォームドコンセント
各患者から、書面によるインフォームドコンセントを得る。
【００８３】
統計
刺激されたインシュリンについて期待される３０％の変化、５０％のＳＤ、８０％の倍率（１−β）、α＝０．０５の有意度などの検出力の算出を基にすると、７２の標本サイズ（プラセボ：ＩＬ−１Ｒａ  １：１）が必要であると推定される。
【００８４】
平均の比較には、スチューデントの両側ｔ検定を使用する。経時的に得られた多重測定値を、反復測定のための一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって分析する。対応のある対（ベースラインの測定値とその後の測定値の比較）は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定によって検定を行う。
【００８５】
盲検と無作為化は、チューリッヒのＫａｎｔｏｎｓａｐｏｔｈｅｋｅによって行われる。
【００８６】
予想される結論
ブドウ糖毒性がＩＬ−１Ｒａによって完全にブロックされると仮定すると、ベースライン又はプラセボ処理を行った患者に比べて、ＩＬ−１Ｒａ処理を行った患者では以下の改善が期待できる。
【００８７】
−刺激を受けたＣ−ペプチド及びインシュリンレベルが６０％（又はそれ以上）増加する。
【００８８】
−ＨｂＡ１ｃの改善：ベースラインのＨｂＡ１ｃに応じて、１％（ベースライン８％）ないし４％（ベースライン１２％）のＨｂＡ１ｃが減少する。
【００８９】
−空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）：ベースラインのＦＰＧに応じて、ＦＰＧが１３％（ベースライン  ８ｍＭ  グルコース）ないし２７％（ベースライン  １５ｍＭ  グルコース）減少する。
【００９０】
−ＩＬ−１Ｒａ処理群ではインシュリンが不要であるのに対して、プラセボ処理群では、０．８ＩＵ／ｋｇのインシュリンが必要。
【００９１】
−インシュリン感受性が６０％（又はそれ以上）増加する。
【００９２】
−血清サイトカインとＣＲＰレベルが正常化。
【００９３】
ＩＩ型糖尿病におけるＩＬ−１Ｒａの役割についてのさらなる研究
本発明は、肥満とＩＩ型糖尿病との分子的な関連、特にＩＬ−１Ｒａの役割についての以下の研究結果からさらに支持される。
【００９４】
肥満は、糖尿病の発症リスクの増加と関連しているが、この進行の機序は不明である。肥満者の多くはインシュリン抵抗性であり、インシュリン分泌を増加させることによって適応しなければならないβ細胞集団自体が、分泌可能なインシュリンの量を決める主要な因子でありβ細胞集団は肥満時に増加する（６６；６２）。インシュリン抵抗性に直面して、正常血糖を維持するのに十分な量のインシュリンを産生できない個体では、ＩＩ型糖尿病が発症する（６７）。β細胞機能のみならず、β細胞集団の段階的な減少がこれに寄与していることを示唆する証拠が増大しつつある（６２；６８；６９）。ＩＩ型糖尿病の発症においてβ細胞集団が欠損するのは、β細胞のアポトーシスの増大によるものと思われる（６２；７０）β細胞を破壊する工程を媒介している可能性があるのは、細胞栄養素の血清濃度の増加である。現に、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）レベルの増加自体はβ細胞に対して毒性があることが知られており、脂質毒性の概念が提唱されている（１２；７１−７５）。しかし、肥満個体又は前ＩＩ型糖尿病患者の全員が異脂肪血症を発症するわけではない。このため、脂質毒性はβ細胞破壊の工程において重要な役割を果たしている可能性があるが、単独で作用しているのではないと推測される。グルコース濃度の上昇によって、糖尿病にかかりやすいデブスナネズミ（ＩＩ型糖尿病の動物モデル（７０））から採取した培養膵島中及びヒト膵島（９−１０；７６−７７）中で、β細胞のアポトーシスが誘導され、さらに濃度が高くなると、げっ歯類の膵島中でもβ細胞のアポトーシスが誘導される（１１−１２）。ヒト膵島では、グルコース誘導性のβ細胞のアポトーシスと機能不全は、β細胞の産生とＩＬ−１βの分泌によって媒介される（７６）。おそらく、前ＩＩ型糖尿病段階において既に、インシュリン抵抗性によってグルコースの取り込みが減弱しているために、食後、一過性に高血糖の変動が生じるものと思われるが、これはブドウ糖毒性仮説を支持するものである（３−７；３５；７８−８０）。この一過性の高血糖は、糖尿病が発生する以前又は糖尿病の極めて初期段階でもβ細胞に対して作用し得るが、肥満から糖尿病への進行を誘発するのに十分であるか否かは不明である。
【００９５】
レプチンは、主として、脂肪組織中に発現されており、従って、脂肪細胞の最も明白な指標である（８１）。β細胞はレプチン受容体を発現し、レプチンは、インビボとインビトロでインシュリンの分泌を阻害する（８２−８５）。げっ歯類の膵島では、レプチンはβ細胞の増殖を誘導し、ＦＦＡ誘導性のβ細胞のアポトーシスから保護する（８６−８９）。しかし、ヒトβ細胞のアポトーシスに対するレプチンの効果は不明である。ヒトのβ細胞は、アポトーシスの刺激に関して、げっ歯類の膵島に比べ、反応性が異なることが多いので、これは特に興味深い。例えば、生理的濃度である５．５ｍＭから１１．１ｍＭへと周囲のグルコース濃度を増加させると、げっ歯類の膵島ではβ細胞のアポトーシスの速度が減少するのに対して、ヒトの膵島ではアポトーシスが誘導される（９；１１）。
【００９６】
インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）は抗炎症性のサイトカインであり、ＩＬ−１αとβの天然に存在するアンタゴニストである（９０；９１）。ＩＬ−１βと同様に、ＩＬ−１Ｒａは１型ＩＬ−１受容体に結合するが、第二の結合ドメインを欠いているため、受容体複合体の第二鎖であるＩＬ−１受容体補助タンパク質を動員しない。ＩＬ−１Ｒａには３つの型が報告されており、そのうち２つは細胞内タンパク質（ｉｃＩＬ−１ＲａＩとＩＩ）であり、１つは分泌される。ｉｃＩＬ−Ｒａの機能は不明である（９３）。外来性の組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ−１Ｒａは、グルコース誘導性ＩＬ−１β媒介性のβ細胞のアポトーシスから培養ヒト膵島を保護しβ細胞の機能を改善させる（７６）。興味深いことに、レプチンは、単球中でＩＬ−１Ｒａの分泌を誘導する（９３）。しかしながら、ヒト膵島におけるＩＬ−１Ｒａの発現と制御は調査されていない。
【００９７】
従って、非糖尿病患者と糖尿病患者のヒト膵臓β細胞におけるＩＬ−１Ｒａを研究し、レプチンによるＩＬ−１Ｒａの制御を明らかにした。ＩＬ−１Ｒａ発現の変化によっても媒介されるＩＬ−１β産生及びヒトβ細胞の生存と機能に対するレプチンの効果についても調べた。
【００９８】
＜方法＞
膵島の単離及び細胞培養：  記載の通り（３２−３４）、Department of Surgery, University of Geneva Medical Centerで、１０名の臓器ドナーの膵臓から膵島を単離した。ジチゾン染色によって調べたところ、膵島の純度は９５％を超えていた（通常の単離操作によってこの純度が得られなかった場合には、膵島を手で摘んだ）。４０−６５歳のドナーは、心拍が停止していない解剖用の臓器ドナーであり、糖尿病又は代謝性疾患の既往症がある者はいなかった。長期のインビトロ実験の場合、ウシの角膜内皮細胞由来の細胞外マトリックスで被覆されたプレート(Novamed Ltd., Jerusalem, Israel)上で膵島を培養して、細胞が皿に付着して増殖できるようにし、細胞の機能的な完全性を保持した（７；３５）。１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０％ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation, Paisley, U.K.)を含有するＣＭＲＬ  １０６６培地（以下、培地という。）中で膵島を培養した。播種から２日後に、殆どの膵島が付着して、平坦になり始めたら、５．５、１１．１又は３３．３ｍＭのグルコースを含有する培地に交換した。一部の実験では、下記のように、５、１０又は５００ｎＭのｒｈレプチン（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、５００ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−１Ｒａ(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)又は５０ｎＭのsmall interfering RNA(siRNA)とともに膵島をさらに培養した。
【００９９】
以前に記載したように（３７）、ヒト血液単球を単離し、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、及び１０％  ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養して、１０又は５００ｎＭのレプチンに曝露した。
【０１００】
ＲＮＡ干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）：  ヒトＩＬ−１Ｒａ（５’ＡＵＣＵＧＣＡＧＡＧＧＣＣＵＣＣＧＣＡｔｔ３／５’ＵＧＣＧＧＡＧＧＣＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵｔｔ３‘）を標的にするように設計した２１ヌクレオチドからなるＲＮＡ及びスクランブルｓｉＲＮＡを、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）に委託して合成した。ＳｉＰｏｒｔＡｍｉｎｅＴＭを用いて、メーカーの指示書に従い（Ａｍｂｉｏｎ）、ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。
【０１０１】
ＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１β発現細胞の検出：  通常の剖検により摘出した膵臓をホルマリンで浸漬固定した後、パラフィンで包埋した。これと並行して、単離したヒトを懸濁液中で４８時間培養し、１０ｎＭのレプチン又は３３．３ｍＭのグルコースに曝露し、ブアン溶液中で１５分間、膵島を固定し、４０μｌの２％融解アガロース／ＰＢＳ液（４０℃）で再懸濁した後、速やかに遠心し、パラフィンに包埋した。切片を脱パラフィンし、再水和してから、メタノール中で４分間インキュベートした。細胞外マトリックス上で４日間培養を行ったヒト膵島をＰＢＳで洗浄し、４％  パラホルムアルデヒドで固定（３０分間、室温）した後、０．５％  ｔｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した（４分間、室温）。１０％  ウシ血清アルブミンに１時間曝露した後、ビオチン化ヤギ抗−ＩＬ−１Ｒａ又はマウス抗−ＩＬ−１β抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）とともにインキュベート（１時間、３７℃）することにより、膵臓及び膵島切片及び培養細胞を、ＩＬ−１Ｒａ又はＩＬ−１β及びインシュリン、ＣＤ６８、グルカゴン又はソマトスタチンで二重染色した。ｃｙ３−(Jackson, ImMunoResearch Laboratories, West Grove, PA)又はｃｙ２−(Transduction Lab., Lexington, KY)抱合ストレプトアビジンを用いて、検出を行った。次に、モルモット（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）又はマウス（Ｓｉｇｍａ）抗−インシュリン、ウサギ−抗−ソマトスタチン（Ｄａｋｏ）、ウサギ抗−グルカゴン（Ｄａｋｏ）又はマウス抗−ＣＤ６８(Biosource, Nivelles, Belgium)抗体とともに、３７℃で３０分間、標本をインキュベートした後、ＦＩＴＣ抱合ウサギ抗モルモット（Ｄａｋｏ）、ｃｙ３抱合ロバ抗マウス、ｃｙ３抱合ロバ抗ウサギ、又はｃｙ２抱合ロバ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともに３０分間インキュベートした。
【０１０２】
電子顕微鏡：  非接着性のプラスチック皿の培養液中で培養したヒト膵島を、用時調製した２．５％  パラホルムアルデヒド、０．１％  グルタルジアルデヒド及び０．０１％  ピクリン酸を含有する溶液中で、およそ４時間、室温にて固定した。その後、段階的にエタノール濃度を上げて標本を脱水して、通常どおり、LR White(Polysciences, Warrington, PA, USA)中に包埋した。０．２ｇ  ＢＳＡを含有する、５０ｍＭ  ゼラチン／１０ｍｌ  ＰＢＳで超薄切片を処理し、ＰＢＳでリンスした。モルモット抗ブタインシュリン（ｃｏｄｅ：Ａ５６４；１：４００；Ｄａｋｏ）とともに、室温にて一晩、切片をインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、抗モルモットＩｇＧを金５ｎｍ複合体（１：５０、Amersham Int., Little Chalfont, UK）と、３０分間結合させた。その後、切片を超純水でリンスし、風乾させて、上述のようにビオチン化ヤギ抗−ＩＬ−１Ｒａ抗体とともにインキュベートして、ＰＢＳで洗浄した後、ストレプトアビジン−金−５ｎｍ複合体（１：５０、Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに、室温で１時間、インキュベートした。酢酸ウラニルで４分間、切片を対比染色し、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＥＭ  ４２０  電子顕微鏡で観察及び写真撮影を行った。
【０１０３】
ウェスタンブロット分析：  非接着性のプラスチック皿の培養液中でヒト膵島を培養した。単離から１日後、その培地を交換し、１０若しくは５００ｎＭのレプチン又は５０ｎＭのｓｉＲＮＡを加えた又は加えない、５．５  グルコースを含有する培養液中で２００個の膵島のグループをインキュベートした。インキュベーションが終了した時点で、膵島をＰＢＳで洗浄し、１２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、０．３％  ブロモフェノールブルー、１．８％  β−メルカプトエタノールを含有する４０μｌの試料緩衝液中に懸濁させ、５分間煮沸した。等量の各処理群を１５％  ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で展開した。タンパク質をニトロセルロースフィルターに電気的に転写し、ビオチン化ヤギ抗ＩＬ−１Ｒａ、マウス抗カスパーゼ３（プロカスパーゼ−３と活性化カスパーゼ−３の両方に結合する。Pharmingen, San Diego, CA）、又はマウス抗アクチン（Ｃ−２；Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA）抗体とともにインキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼを連結した抗マウス（Santa Cruz Biotechnology Inc.）又はストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ）とともにインキュベーションを行った。Lumi-Light Western Blotting Substrate(Roche, Basel, Switzerland)を添加した後、放射光をＸ線フィルム上に捕捉した。マーカーとして、Kaleidoscope Prestained Standards(Bio Rad, Laboratories inc., Hercules, CA)を平行して走行させた。インキュベーション間に、ニトロセルロース膜を３０分間、５０℃にて、２８０μｌのβ−メルカプトエタノール、５ｍｌの０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）及び１０％  ＳＤＳを含有する４０ｍｌの溶液中で処理して抗体を剥離させ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴｒｉｓ−緩衝塩類溶液で１時間洗浄した。
【０１０４】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ：  上記の懸濁液中で膵島を培養した。Rneasy mini kit(Qiagen, Basel, Switzerland)を用いて、全ＲＮＡを抽出し、SuperscriptTMII Rnase H- Reverse transcriptase kIT及びオリゴ(dT)(7)(Life technologies, Gaithersburg, Maryland, USA)を用いて、メーカーの指示書に従い、ＲＴ−ＰＣＲを行った。以下のプライマー、５’ＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＡＧ３’／５’ＡＧＧＴＧＧＡＡＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡＡＧ３’（ヒトＩＬ−１Ｒａ）及び５’ＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＴＡＡＡＣＡＧ３’／５’ＡＧＧＴＧＣＡＴＣＧＴＧＣＡＣＡＴＡＡＧ３’（ヒトＩＬ−１β）を用いた。ＰＣＲ条件としては、９４℃にて３０秒間、変性を行い、６０℃にて３０秒間アニーリングを行い、７２℃にて３０秒間伸長反応を行い、８２℃にて５秒間定量を行うというサイクルを４０回繰り返し、リアルタイムＰＣＲを行うという条件を用いた。ＰＣＲ産物の生成は、１９回から３３回の間に飽和した。ＰＣＲ増幅産物のサイズは２５０ｂｐであった。定量分析を行うために、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ定量的ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、市販のキット(LightCycler-DNA Master SYBR Green1;Roche)を用いて定量的ＰＣＲを行った。ＩＬ−１ＲａのｍＲＮＡ量は、α−チューブリン（５’ＡＧＡＧＴＣＧＣＧＣＴＧＴＡＡＧＡＡＧＣ３’／５’ＴＧＧＴＣＴＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＣＡＴＣ３’）及びＧＡＰＤＨ（５’ＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＣ３’／５’ＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴ３’）によって標準化し、同じような結果を得た。
【０１０５】
β細胞のアポトーシス：  ＤＮＡの分解から生じた遊離の３−ＯＨ鎖の切断は、７０；７６；７７に詳述されているように、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって媒介されるｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）技術を用いて検出した。その後、上記のように、モルモット抗インシュリン抗体とともに膵島をインキュベートし、ストレプトアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体(Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, California, USA)を用いて検出した。ＴＵＮＥＬ反応と並行して、上記のようにして（ウェスタンブロット分析）カスパーゼ３の活性化を検出してアポトーシスを確認した。
【０１０６】
サイトカインの放出：  各実験終了前に回収した培養液中で、ヒトＩＬ−１β及びＩＬ−１Ｒａ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いてサイトカインの放出を調べた。
【０１０７】
インシュリン放出と含量：  グルコース刺激に応じた急性のインシュリン放出を測定するために、３．３ｍＭ  グルコースを含有するクレブズリンゲル重炭酸緩衝液（ＫＲＢ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、４．８ｍＭ  ＫＣｌ、１３４ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５％  ＢＳＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）で膵島を洗浄し、同じ緩衝液で３０分間、プレインキュベーションを行った。次に、ＫＲＢを捨て、３．３ｍＭ  グルコースを含有する新鮮な緩衝液に置き換え、１時間、基礎分泌を行わせるために、インキュベーションを行った後、１６．７ｍＭのグルコースを含有するＫＲＢ中でさらに１時間インキュベーションを行った。上清を回収して、インシュリンアッセイのために凍結させた。次いで、ＰＢＳで膵島を洗浄し、７０％  エタノール中の０．１８Ｎ  ＨＣｌを用いて４℃で２４時間抽出反応を行った。インシュリン含量を測定するために、酸−エタノール抽出物を収集した。ヒトインシュリンＲＩＡキット(CIS bio international, Gif-Sur-Yvette, France)によって、インシュリンを測定した。
【０１０８】
評価と統計解析：  処理条件を知らされていない単一の研究者（Ｋ．Ｍ）によって、試料の評価を無作為に行った。同じようなサイズの膵島を計数するように注意を払った。サイズが大きめの膵島は完全に広がらずに、複数の細胞が重なっていた。単一細胞の評価を行うには単層であることが必須なので、このようなサイズが大きめの膵島は除外した。５．５ｍＭ及び３３．３ｍＭのグルコースで培養した膵島において、それぞれ、評価を行う膵島−単層の表面の平均を予め調べたところ、同様であることが分かった（７６；７７）。従って、大型の膵島を除外することによって、処理とは無関係に、各培養皿が同様の含有量を有することになる。スチューデントのｔ検定又は、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いた分散分析によりデータを解析した。
【０１０９】
＜結果＞
ヒト膵臓β細胞によりＩＬ−１Ｒａが発現され、ＩＩ型糖尿病がダウンレギュレートされる：  非糖尿病患者由来のヒト膵臓切片を免疫検出した結果、β細胞に局在してＩＬ−１Ｒａが存在することが明らかとなった（図７Ａ及びＢ）。さらに、非β細胞がＩＬ−１Ｒａを発現していたが、これは膵臓常在性のマクロファージ（ＣＤ６８陽性、図７Ｅ及びＦ）であることが確認された。それぞれ、抗ＩＬ−１Ｒａと抗グルカゴン又は抗ソマトスタチン抗体とを用いた二重免疫染色で調べたところ、ＩＬ−１Ｒａで特異的に染色された細胞はα及びδ細胞中には観察されなかった。ＩＬ−１Ｒａは、外分泌腺組織でも検出されなかった。単離されたヒト膵島由来の切片を電子顕微鏡で観察することによって、β細胞自身によるＩＬ−１Ｒａの発現を確認した（図７Ｇ）。次に、血糖値の調節がうまく行われておらず、空腹時血糖値が８ｍＭを超えていると報告されている６名のＩＩ型糖尿病患者から得た膵臓切片におけるＩＬ−１Ｒａの発現を調べた（表２）。全ての膵臓において、非糖尿病の対照と比較して、ＩＬ−１Ｒａタンパク質の発現が低下していた（代表的な結果については、図７Ｃ及びＤ参照）。
【表２】
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【０１１０】
ヒト膵島では、レプチンによりβ細胞のＩＬ−１Ｒａ産生が低下し、ＩＬ−１βの放出が誘導される：  高濃度グルコースがＩＬ−１Ｒａ発現の制御にインビボで関与しているという仮説を、ヒト膵島のインビトロでの初代培養で検証した。膵島を３３．３ｍＭのグルコースに４８時間曝露させても、５．５ｍＭ  グルコースに曝露した対照と比較して、ＩＬ−１Ｒａタンパク質発現（図８Ａ−１からＡ−４）にも、ＩＬ−１Ｒａ放出又はｍＲＮＡ発現（図９Ａ）にも影響を与えなかった。単球では、レプチンがＩＬ−１Ｒａ分泌を制御しているので（９３）、本発明者らは、レプチンがβ細胞におけるＩＬ−１Ｒａの制御因子であるかもしれないという仮説を立てた。１０ｎＭのレプチンに４８時間、培養ヒト膵島を曝露したところ、免疫二重染色で示されるように、殆どのβ細胞においてＩＬ−１Ｒａの発現が低下していた（図８Ａ−５及びＡ−６）。ヒト膵島のＩＬ−１Ｒａのウェスタンブロット分析により、レプチンが、曝露から１５時間の時点で既にＩＬ−１Ｒａを低下させることが明らかとなった（図８Ｂ）。興味深いことに、１０−５００ｎＭのレプチンに短時間（１５時間）曝露した後、培養液に放出されたＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１ＲａのｍＲＮＡが増加したが、これより長い４８時間にわたって曝露すると、顕著に減少した（図８Ｃ−１及びＣ−２）。対照として用いた末梢血単球でも、同様の二元的な効果が観察された（図８Ｃ−３及びＣ−４）。
【０１１１】
ＩＬ−１Ｒａの作用はＩＬ−１βに依存しているので、レプチンによるＩＬ−１βの制御についても調べた。ＩＬ−１Ｒａの制御と同様に、ヒト膵島をレプチンに１５時間曝露することにより、培養液へのＩＬ−１βの放出が増加した（図８Ｄ−１）。曝露４８時間後にレプチンによってＩＬ−１Ｒａの放出の低下が誘導されるのとは対照的に、ＩＬ−１βの放出は４８時間曝露した後も上昇し続けた。さらに、末梢血単球をレプチンに１５時間曝露させたところ、ＩＬ−１のβ放出が上昇したが、曝露時間を４８時間まで延長してもＩＬ−１βの放出に対する顕著な影響はなかった（図８Ｄ−２）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ測定により、膵島のＩＬ−１β  ＲＮＡの発現はレプチンによって有意には変化しないことが明らかになった。それにもかかわらず、抗１βと抗インシュリン抗体とＴＵＮＥＬアッセイによる膵島の免疫三重染色で示されるように、培養ヒト膵島を１０ｎＭのレプチンに４８時間曝露することにより、ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞にＩＬ−１βの発現が誘導された（図８Ｅ）。
【０１１２】
内生的に産生されるＩＬ−１Ｒａはβ細胞が生き残るために必要な因子であり、β細胞機能を維持させる：  次に、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを用いてヒトβ細胞におけるＩＬ−１Ｒａの機能的役割を調べた。ヒト膵島をＩＬ−１Ｒａに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＩＬ−１Ｒａ）に曝露してから２日後に、５．５ｍＭ  グルコースのみを含有する条件でインキュベートした膵島と比較して、内因性ＩＬ−１ＲａのＲＮＡ発現が６９．４±６．５％減少したが、スクランブルｓｉＲＮＡの場合には、そのような影響は見られなかった（図９Ａ）。ＩＬ−１Ｒａの拮抗は、低濃度（５．５ｍＭ）及び高濃度（３３．３ｍＭ）グルコースで同様であった（図９Ａ）。ｓｉＩＬ−１Ｒａにより、ＩＬ−１Ｒａタンパク質の発現が顕著に低下し、カスパーゼ３の活性化（図９Ｂ）及びβ細胞のＤＮＡ断片化（ＴＵＮＥＬ陽性の核、図９Ｃ及びＤ）により示されるアポトーシス過程が誘導され、外因性のｒｈＩＬ−１Ｒａを添加することにより、ＤＮＡ断片化に対するｓｉＩＬ−１Ｒａの作用が阻害され、このＲＮＡが特異的に干渉を行うことが明らかとなった（図９Ｃ及びＤ）。培養ヒト膵島に曝露するグルコース濃度を上げていくと、ＤＮＡ断片化を呈するβ細胞の数が増加した（図９Ｄ）。このグルコースの影響は、ｓｉＩＬ−１Ｒａとともにインキュベーションを行うことにより促進されるが、外からｒｈＩＬ−１Ｒａを添加することにより、３３．３ｍＭグルコースのみの条件下で誘導されるβ細胞のアポトーシスが保護され、３３．３ｍＭ  グルコース及びｓｉＩＬ−１Ｒａを含有する条件下で誘導されるアポトーシスも部分的に保護された。
【０１１３】
次に、β細胞における外因性ＩＬ−１Ｒａの役割を調べた。ｓｉＲＮＡによりＩＬ−１Ｒａを拮抗すると、５．５ｍＭ  グルコースで培養したヒト膵島において、グルコース刺激による急性のインシュリン放出に対する基底値の比が顕著に減少した（図９Ｅ−１）。外因性のｒｈＩＬ−１Ｒａとともにインキュベートすることにより、グルコース刺激が回復した。１１．１ｍＭのグルコースにヒト膵島を慢性的に曝露すると、グルコース刺激による急性のインシュリン放出が顕著に鈍化し、ｓｉＩＬ−１Ｒａの存在下で１１．１ｍＭのグルコースに曝露した場合、又は３３．３ｍＭ  グルコースのみに曝露した場合には、インシュリンの放出が完全に喪失した。外因性のｒｈＩＬ−１Ｒａにより、このような影響は一部抑制される。ｓｉＩＬ−１Ｒａ及び／又は高濃度グルコースに曝露された膵島のインシュリン含量は、対照（５．５ｍＭ  グルコース）と比較して低下したが、ｒｈＩＬ−１Ｒａにより部分的に回復した（図９Ｅ−２）。
【０１１４】
レプチンがβ細胞アポトーシスを誘導し、ＩＬ−１βシグナル伝達を介してβ細胞の機能を低下させる：  １０ｎＭ  レプチンに４日間曝露した培養ヒト膵島において、ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞の数が増加した（図１０Ａ）。さらに、レプチンは、３３．３ｍＭのグルコースによって誘導されるアポトーシスを促進した（図１０Ａ）。アポトーシス過程を明らかにするために、ＴＵＮＥＬアッセイと並行して、カスパーゼ３の活性化を検出した。レプチンに１５時間曝露したヒト膵島では、カスパーゼ３のベースラインは変化しなかったが、４８時間後には上昇が明白となった（図１０Ｂ）。さらに、４日間レプチンに曝露すると、５．５ｍＭ  グルコースでは、培養期間中、長期的なインシュリン分泌が４１．６５％（ｐ＜０．０１）低下し、グルコース刺激によるインシュリン分泌機能が損なわれて、インシュリン含量が低下したが、これは高濃度グルコースの有害な効果にさらに加算される効果である（図１０Ｃ）。最後に、レプチン誘導性のＤＮＡの断片化、β細胞の機能低下、及びインシュリン含有の減少がＩＬ−１β及びＩＬ−１Ｒａのバランスの不均衡を介して起こることを示すために、レプチン及び外因性ｒｈＩＬ−１Ｒａと共にヒト膵島をインキュベートした。レプチンに曝露したヒト膵島では、ｒｈＩＬ−１Ｒａを添加することにより、レプチン誘導性のβ細胞のアポトーシスが妨げられ、β細胞の機能とインシュリン含量を回復させた（図１０Ｄ）。
【０１１５】
慢性的に上昇する血糖値により、膵臓のβ細胞機能が損なわれる（３−７；３５；７８−８０）。この現象の基礎を成す機序を研究する際に、本発明者らは、以前、培養膵島に曝露するグルコース濃度を上げていくと、β細胞によるＩＬ−１β産生と放出が起こり、その後β細胞機能が低下して死に至るという現象を観察していた（７６）。本データにより、ＩＬ−１β経路がブドウ糖毒性に関与するだけではなく、肥満に関連する糖尿病をも媒介することが示される。まさに、ｏｂ遺伝子がコードするタンパク質であるレプチンによって、β細胞のＩＬ−１Ｒａ発現が低下する。同時に、ヒト膵島をレプチンに曝露することにより、ＩＬ−１β放出が誘導される。レプチンによって、ＩＬ−１β／ＩＬ−１Ｒａ比の変化が誘導され、β細胞機能が低下し、β細胞のアポトーシスが促進される。外因性のＩＬ−１Ｒａを供給することにより、ブドウ糖毒性を軽減できることと同様に、レプチンの悪影響を緩和することができる。
【０１１６】
本発明者らの知る限りにおいて、これはβ細胞によるＩＬ−１Ｒａの発現を示す初めての研究である。主として免疫系に属しない内分泌器官であることを考えると、この事実は極めて興味深いといえる。β細胞におけるＩＬ−１βの発現を示す以前の発見（７６；５０）に加えて、本観察は、糖尿病の病因に局所的な炎症媒介物質が関与していることを示す証拠となる（９４）。
【０１１７】
内因性β細胞をｓｉＲＮＡによって中和することにより、β細胞の機能低下とアポトーシスが引き起こされる。スクランブルｓｉＲＮＡは毒性を示さなかったことから、これはｓｉＲＮＡの非特異的な効果ではない。培養ヒトβ細胞が生き残るためには、ある一定量のＩＬ−１Ｒａが必要であると考えられる。ＩＬ−１Ｒａが発現されている限り、非処理培養ヒト膵島の上清に存在するＩＬ−１β（７６）は効果を発揮できないが、バランスがある一定の状態になると直ちに有害な影響を及ぼすと思われる。インビボでは、生来の免疫系等、他の産生源によって産生されたＩＬ−１βからＩＬ−１Ｒａがβ細胞を保護している可能性や（９４）、レプチンがその発現を低下させた場合、β細胞が特に不安定になる可能性がある。
【０１１８】
膵島のレプチン誘導性ＩＬ−１βの細胞源は明らかではない。レプチンに曝露した膵島に対するＩＬ−１β、インシュリン及びＴＵＮＥＬアッセイの免疫三重染色により、ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞のみがＩＬ−１βを産生することが分かった。これらの細胞は、おそらく、レプチン誘導性ＩＬ−１βを産生する唯一の産生源ではないであろう。現に、ｒｈＩＬ−１Ｒａはレプチン誘導性のアポトーシスを遮断した。従って、レプチン誘導性のＩＬ−１βの一部はアポトーシスの過程に先行する。あるいは、以前の研究で示され（９３）、本研究でも確認されているように、レプチンは末梢血単球においてＩＬ−１βの分泌を誘導するため、膵島常在性のマクロファージがレプチンの産生に寄与すると考えられる。
【０１１９】
正常人において、内分泌腺である膵臓は、その機能と質量を向上させることにより、インシュリン需要の亢進に反応する（６２；６６；９５）。糖尿病の場合に適応が不能となる１つの原因は、レプチン及び制御不能な高濃度のグルコースに慢性的に曝露されることによる悪影響であると説明できる。膵島内でのＩＬ−１β産生とＩＬ−１Ｒａの発現低下は、β細胞の機能低下とアポトーシスに必須の終局的な共通経路であると考えられる。すなわち、この経路を抑制する治療法により、レプチンとブドウ糖毒性を抑制して、β細胞集団の漸進的な減少を防ぎ、β細胞の機能を回復させることができる。ＩＬ−１Ｒａは、この目的に適した治療薬であると考えられる。
【参考文献】
【０１２０】
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2005534677.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】グルコースが、ヒト膵島においてＩＬ−１βの発現と放出を誘導する。Ａ：５．５、１１．１又は３３．３ｍＭ  Ｄ−グルコース、又は５．５ｍＭ  Ｄ−グルコース＋２７．８ｍＭ  Ｌ−グルコース存在下において、細胞外マトリックスでコートした培養皿上で４日間培養を行ったヒト膵島からのＩＬ−１βの分泌。各バーは、選択した８名のドナーの組織を用いて行った８回の実験の平均値±ＳＥを示す。＊は、Ｐ＜０．０１、  ５．５ｍＭ  グルコース存在下での実験に対する比較である。Ｂ：５．５又は３３．３ｍＭ  Ｄ−グルコースの懸濁液における、４４時間の培養期間中のヒト膵島からのＩＬ−１βの分泌。２名のドナー由来の組織を用いた、２つの別個の実験において、各処理あたり４本の試験管からデータを回収した。データは、平均値±ＳＥとして示す。＊は、ｐ＜０．０１、５．５ｍＭ  グルコース存在下での実験との比較である。Ｃ：プロＩＬ−１β、ＩＬ−１β及びアクチンのイムノブロッティング。５．５又は３３．３ｍＭ  Ｄ−グルコースの懸濁液中で培養したヒト膵島を、インキュベーション４４時間後に分析した。１１名のドナー由来の臓器を用いた、１１例の実験から１例を示す。７例でグルコースがＩＬ−１βを誘導し、３例ではＩＬ−１βが変化せず、１例で減少した。Ｄ：ＩＬ−１β  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる検出及び定量。５．５又は３３．３ｍＭ  グルコースを含有する培地中で４４時間培養を行ったヒト膵島から全ＲＮＡを単離した。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ定量的ＰＣＲシステムにおいて、ＧＡＰＤＨを用いてＩＬ−１β発現レベルを標準化し、５．５ｍＭの対照インキュベーションに対する相対的なｍＲＮＡレベルとして結果を表した。結果は、６名のドナー由来の組織を用いた、６例の独立した実験に対する＋／−ＳＥとして示し、＊は、ｐ＜  ０．０５、  ５．５ｍＭ  グルコース存在下での膵島との比較である。
【図２】糖尿病的環境に曝露したヒトβ細胞によるＩＬ−１βの発現。
【０１２２】
細胞外マトリックスでコートした培養皿上で培養し、５．５ｍＭ  グルコース（Ａ、Ｂ）又は３３．３ｍＭ  グルコースを含有する培地に４日間曝露したヒト膵島における、ＩＬ−１β（Ｂ、Ｄ）、及びインシュリン（Ａ、Ｃ）に対する免疫二重染色。非−糖尿病患者由来（Ｅ、Ｆ）及びＩＩ型糖尿病患者由来（Ｇ、Ｈ）の膵臓の組織切片における、ＩＬ−１β（Ｆ、Ｈ）、及びインシュリン（Ｅ、Ｇ）の免疫二重染色。ＩＬ−１β  ｍＲＮＡのインシチュハイブリダイゼーション（Ｊ、Ｌ、Ｎ）、インシュリン（Ｉ、Ｋ、Ｍ）免疫二重染色。ＩＩ型糖尿病患者由来の膵臓組織切片に対するアンチセンスプローブ（Ｌ）、及びセンスプローブ（陰性対照）（Ｎ）、非−糖尿病患者由来組織に対するアンチセンスプローブを用いたインシチュハイブリダイゼーション（Ｊ）。リポ多糖類（ＬＰＳ）処理を行ったマクロファージ（陽性対照）（Ｏ）のＩＬ−１βの免疫染色。拡大倍率は２５０倍である。
【図３】Ｐｓａｍｍｏｍｙｓ  ｏｂｅｓｕｓ（デブスナネズミ）における、糖尿病進行中のβ細胞によるＩＬ−１βの発現。
【０１２３】
低エネルギー食で飼育した絶食Ｐｓａｍｍｏｍｙｓ  ｏｂｅｓｕｓ（デブスナネズミ）（血糖値  ４ｍＭ）由来（Ａ、Ｂ）、高エネルギー食で８日間飼育し、グルコース欠乏促進剤であるフロリジン（ｐｈｌｏｒｉｚｉｎ）を投与しない動物由来（血糖値  １３．６ｍＭ）（Ｃ、Ｄ）、グルコース欠乏促進剤であるフロリジンを投与した動物由来（血糖値  ５．６ｍＭ）（Ｅ、Ｆ）由来の膵臓組織切片における  ＩＬ−１β（Ｂ、Ｄ、Ｆ）及びインシュリン（Ａ、Ｃ、Ｅ）の免疫二重染色。拡大倍率は２５０倍である。
【図４−１】グルコースが、β細胞のＩＫＢ発現を低下させ、ＩＬ−１βを介してＮＦ−ＫＢ活性化、Ｆａｓ発現及びＤＮＡの断片化を誘導する。
【０１２４】
Ａ：相対的ＮＦ−ＫＢ活性。５．５ｍＭ又は３３．３ｍＭ  グルコースのみの懸濁液、又はＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ又は両方を含有する懸濁液中で４４時間、ヒト膵島を培養した。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１αで刺激したＨｅＬａ細胞を陽性対照として用いた。各バーは、３名の別個のドナー由来の組織を用いた、３例の実験の平均値±ＳＥを示し、＊は、ｐ＜０．０５、５．５ｍＭ  グルコース存在下における膵島との比較である。Ｂ：ＮＦ−ＫＢ（ｐ６５）、Ｆａｓ及びアクチンのイムノブロッティング。５．５又は３３．３ｍＭグルコース懸濁液中で、ＩＬ−１β又はＩＬ−１Ｒａの存在下ないし非存在下で培養したヒト膵をインキュベーション４４時間後に分析した。抗体剥離後に各抗体を同じ膜にブロットした。３名のドナー由来の組織を用いた３例の実験のうち１例を示す。各実験で同様の結果が得られた。Ｃ：５．５ｍＭ（１、２）又は３３．３ｍＭ（３、４）グルコースを含有する培地に４４時間曝露した培養ヒト膵島の切片におけるＩＫＢ（１、３）及びインシュリン（２、４）の免疫二重染色。Ｄ：５．５ｍＭ（１、２）又は３３．３ｍＭ（３、４）グルコースを含有する培地に４４時間曝露したヒト膵島におけるＮＦ−ＫＢ（ｐ６５）（１、３）及びインシュリン（２、４）の免疫二重染色。矢印は、ＮＦ−ＫＢで陽性染色されたβ細胞の核を示す。拡大倍率は７５０倍である。Ｅ：ＲＴ−ＰＣＲによるＦａｓ  ｍＲＮＡ発現の検出と定量。５．５又は３３．３ｍＭ  グルコースのみ、又はさらにＩＬ−１Ｒａを含有する培地中で４４時間培養を行ったヒト膵島から全ＲＮＡを単離した。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ定量的ＰＣＲシステムにおいて、ＧＡＰＤＨを用いてＦａｓ発現レベルを標準化し、５．５ｍＭの対照インキュベーションに対する相対的ｍＲＮＡレベルとして結果を表した。結果は、６名のドナー由来の組織を用いた、６例の独立した実験に対する＋／−ＳＥで表す。＊は、ｐ＜０．０５、５．５ｍＭ  グルコース存在下での膵島との比較、＊＊は、ｐ＜０．０５、３３．３ｍＭ  グルコース存在下での膵島との比較である。
【図４−２】グルコースが、β細胞のＩＫＢ発現を低下させ、ＩＬ−１βを介してＮＦ−ＫＢ活性化、Ｆａｓ発現及びＤＮＡの断片化を誘導する。
【０１２５】
Ｆ：ＩＬ−１βの非存在下（１、２）、ＩＬ−１βの存在下でＩＬ−１Ｒａ非存在下（３、４）、ＩＬ−１β及びＩＬ−１Ｒａ両方の存在下（５、６）で５．５ｍＭ  グルコースを含有する培地、又はＩＬ−１Ｒａの非存在下（７、８）、ＩＬ−１Ｒａ存在下（９、１０）、又はＩＬ−１β存在下（１１、１２）で３３．３ｍＭグルコースを含有する培地に４日間曝露したヒト膵島における、Ｆａｓ（１、３、  ５、７、９、１１）、及びインシュリン（２、４、６、８、１０、１２）の免疫二重染色。拡大倍率は２５０倍である。Ｇ：５．５ｍＭ及び３３．３ｍＭ  グルコースのみ、又はＩＬ−１β及び／又はＩＬ−１Ｒａの存在下、又はＰＤＴＣの存在下及び非存在下（Ｈ）でヒト膵島を４日間培養した。結果は、ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞のパーセンテージの平均値±ＳＥで表す。各ドナーで計数した膵島の平均数は、各処理条件について４９個（３５−６３個の範囲）であった。５名の器官ドナーから膵島を単離した。＊は、ｐ＜０．０１、５．５ｍＭ  グルコース存在下での膵島との比較、＊＊は、ｐ＜０．０１、３３．３ｍＭ  グルコース存在下での膵島との比較、＋は、ｐ＜  ０．０１、５．５ｍＭ  グルコース＋ＩＬ−１βにおける膵島との比較である。
【図５】ヒト膵島における、グルコース及びＩＬ−１βによるｉＮＯＳ  ｍＲＮＡ発現誘導の阻害。
【０１２６】
５．５ｍＭ  及び３３．３ｍＭ  グルコース中、又は、ＩＬ−１βのみ、ないしＩＦＮγと組み合わせた条件下（陽性対照）で４４時間培養した膵島によるｉＮＯＳ発現をＲＴ−ＰＣＲ  により分析した。ＧＡＰＤＨを対照として用いた。３名のドナー由来組織を用いた３例の実験のうち１例を示す。
【図６】高濃度グルコースに曝露されたヒト膵島において、ＩＬ−１Ｒａ及びＰＤＴＣがグルコース刺激によるインシュリン分泌を回復させる。
【０１２７】
細胞外マトリックスでコートされた培養皿で、４日間、５．５及び３３．３ｍＭ  グルコース（対照）を含有する培地、又はさらにＩＬ−１Ｒａ、ＰＤＴＣ、ＩＬ−１βを組み合わせるかあるいはいずれか１種類を添加した培地中で、膵島を培養した。Ａ、Ｃ：４日間培養後に、３．３ｍＭ及び１６．７ｍＭグルコースで１時間、連続的にインキュベーションを行っている間の、基底値及びインシュリン分泌刺激における分泌量をそれぞれ示す。Ｂ：インシュリン含有量。３名の別個のドナー由来組織を用いた３例の実験の平均値±ＳＥとしてデータを示す。各実験において、各処理あたり３枚のプレートからデータを回収した。＊は、ｐ＜０．０１、５．５ｍＭ  グルコース存在下での膵島との比較、＊＊は、ｐ＜０．０１、３３．３ｍＭ  グルコース存在下での膵島との比較、＃は、ｐ＜０．０１、５．５ｍＭ  グルコース＋ＩＬ−１βにおける膵島との比較である。
【図７】ヒト膵島によりＩＬ−１Ｒａが発現され、ＩＩ型糖尿病が抑制される。
【０１２８】
非糖尿病患者由来（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）及びＩＩ型糖尿病患者由来（Ｃ、Ｄ）の膵臓組織切片における、ＩＬ−１Ｒａ（Ａ、Ｃ）又はｒｅｄ（Ｅ）及びインシュリン（Ｂ、Ｄ）又はＣＤ６８（Ｆ）の免疫二重染色。拡大倍率：ｘ２５０。（Ｇ）培養ヒト膵島の、インシュリン（小さな粒子）及びＩＬ−１Ｒａ（大きな粒子）の、金を用いた２重免疫ラベルによる電子顕微鏡観察。
【図８−１】ヒト膵島において、レプチンによりβ細胞のＩＬ−１Ｒａ産生が減少し、ＩＬ−１β放出が誘導される。
【０１２９】
（Ａ）５．５ｍＭ  グルコースのみ（１、２）、３３．３ｍＭグルコース（３、４）、又は、５．５ｍＭ  グルコース及び１０ｎＭ  レプチン（５、６）を含有する培地に４８時間曝露した培養ヒト膵島の切片における、  ＩＬ−１Ｒａ（１、３、５）及びインシュリン（２、４、６）の免疫二重染色。（Ｂ）ＩＬ−１Ｒａ及びアクチンのイムノブロッティング。１０ｎＭ又は５００ｎＭレプチンの存在ないし非存在懸濁液中で培養したヒト膵島を、インキュベーションを１５時間又は４８時間行った後に分析した。抗体剥離後に各抗体を同じ膜にブロットした。３名のドナー由来の組織を用いた３例の実験のうち１例を示す。各実験で同様の結果が得られた。
【図８−２】（Ｃ）ＩＬ−１Ｒａの分泌（１、３）、及び、ＩＬ−１ＲａのｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる検出及び定量（２、４）。培地のみ、又は１０ｎＭあるいは５００ｎＭレプチンの存在下で、１５及び４８時間培養したヒト膵島（１、２）及びヒト血液単球（３、４）から上清及び全ＲＮＡを回収した。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ定量的ＰＣＲシステムにおいて、チューブリンを用いてＩＬ−１Ｒａ発現レベルを標準化し、対照インキュベーションに対する相対的ｍＲＮＡレベルとして結果を表した。５名の膵島ドナー由来の組織を用いた、５例の別個の実験における各処理あたり３本の試験管、及び３名のドナー由来の血液単球を用いた、３例の別個の実験における各処理あたり３本の試験管からデータを回収した。対照インキュベーションに対するパーセンテージの平均値±ＳＥとして結果を示す（１００％、膵島−ＩＬ−１Ｒａ放出の絶対値：７．４３±０．６９ｐｇ／膵島／２４時間及び、単球−ＩＬ−１Ｒａ放出の絶対値：４８．２±０．９  ｎｇ／ｍｌ／２４時間）。＊は、ｐ＜０．０１、対照との比較である。
【図８−３】（Ｄ）培地のみ、又は１０ｎＭあるいは５００ｎＭレプチンの存在下で、１５時間及び４８時間培養したヒト膵島から（１）、及び上記と同条件で培養したヒト血液単球から（２）のＩＬ−１βの分泌。５名のドナー由来の膵島を用いた、５例の別個の実験における各処理あたり３本の試験管、及び３名のドナー由来の血液単球を用いた３例の別個の実験における各処理あたり３本の試験管からデータを回収した。対照と比較したパーセンテージの平均値±ＳＥとして結果を示す（１００％、膵島−ＩＬ−１β放出の絶対値：  ０．１１±０．０４ｐｇ／膵島／２４時間及び、単球−ＩＬ−１Ｒａ放出の絶対値：２２８．２±４４．３ｎｇ／ｍｌ／２４時間）。＊は、ｐ＜０．０１、対照との比較である。（Ｅ）ＩＬ−１β（１）、インシュリン（２）、及びＴＵＮＥＬアッセイによるＤＮＡ断片化（黒）（３）に対する免疫三重染色。矢印は、ＩＬ−１β、インシュリン及びＴＵＮＥＬ反応により陽性染色されたβ細胞を示す。
【図９−１】ｓｉＩＬ−１Ｒａを用いてＩＬ−１Ｒａを拮抗することによってβ細胞のアポトーシスが誘導され、β細胞の機能が低下する。
【０１３０】
（Ａ）  ＩＬ−１Ｒａ  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲによる検出及び定量。５．５又は３３．３ｍＭ  グルコースのみ（対照）を含有する培地中で４８時間培養を行った、又は、５０ｎＭ  ｓｉＩＬ−１Ｒａでトランスフェクションを行うか、又は５０ｎＭの混合ＲＮＡ配列（ｓｉＳｃｒａｍｂｌｅ）でトランスフェクションを行った後、５００ｎｇ／ｍｌの外因性ｒｈ−ＩＬ−１Ｒａの存在下ないし非存在下で、上記条件下で４８時間培養を行ったヒト膵島から全ＲＮＡを単離した。Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ定量的ＰＣＲシステムにおいて、チューブリンによりＩＬ−１β発現レベルを標準化し、５．５ｍＭの対照インキュベーションと比較したｍＲＮＡレベルとして結果を表した。５名のドナー由来の組織を用いた５例の独立した実験に対する平均値±ＳＥとして結果を示した。＊は、ｐ＜０．０１、同じグルコース濃度の対照膵島での実験との比較である。（Ｂ）プロカスパーゼ−３、活性化カスパーゼ−３、ＩＬ−１Ｒａ及びアクチンのイムノブロッティング。５．５ｍＭグルコースを含有する培地中で４８時間、又は５０ｎＭのｓｉＩＬ−１Ｒａないし５０ｎＭのｓｉＳｃｒａｍｂｌｅでトランスフェクションした後に上記培地で４８時間、ヒト膵を培養した。抗体剥離後に各抗体を同じ膜にブロットした。４名のドナー由来の組織を用いた４例の実験のうち１例を示す。各実験で同様の結果が得られた。（Ｃ、Ｄ、Ｅ）５．５、１１．１又は３３．３ｍＭ  グルコース存在下において、細胞外マトリックスでコートした培養皿上で４日間（対照）、又は、５０ｎＭのｓｉＩＬ−１Ｒａないし５０ｎＭのｓｉＳｃｒａｍｂｌｅでトランスフェクション後に５００ｎｇ／ｍｌの外因性ｒｈＩＬ−１Ｒａの存在下ないし非存在下で、対照と同条件でヒト膵島を培養した。（Ｃ）５．５ｍＭ  グルコースのみ含有する培地（１、２、３）、又は、５．５ｍＭ  グルコースにｓｉＩＬ−１Ｒａを添加した培地（４、５、６）、又は、５．５ｍＭ  グルコースにｓｉＩＬ−１Ｒａ及びｒｈＩＬ−１Ｒａを添加した培地（７、８、９）に曝露した膵島における、ＩＬ−１Ｒａ（１、４、７）、インシュリン（２、５、８）、及びＴＵＮＥＬアッセイによるＤＮＡ断片化（黒）（３、６、９）の免疫三重染色。矢印は、ＩＬ−１β、インシュリン及びＴＵＮＥＬ反応により陽性染色されたβ細胞を示す。ＴＵＮＥＬ−陽性β細胞がＩＬ−１Ｒａに対してネガティブであることに注意すること。（Ｄ）５．５ｍＭ  グルコースのみを含有する培地でインキュベーションを行った対照に対する、ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞のパーセンテージの平均値±ＳＥとして結果を示す（１００％、絶対値：０．３３±０．０３％  ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞）。各処理条件に対して、各ドナーで数えた膵島数の平均値は、４４（２４−８０の範囲）であった。５名の器官ドナーから膵島を単離した。＃は、ｐ＜０．０５、同じグルコース濃度の対照との比較、＊は、ｐ＜０．０５  ５．５ｍＭ  グルコースのみを含有する培地で培養した膵島との比較、＋は、ｐ＜０．０５、ｓｉＩＬ−１Ｒａをトランスフェクションしただけで同じグルコース濃度で培養した膵島との比較である。
【図９−２】（Ｅ）１：４日間の培養後に３．３ｍＭ（基底値）及び１６．７ｍＭ（刺激）グルコース濃度で１時間、連続的にインキュベーションを行っている間の、基底値及びインシュリン分泌刺激における分泌量。２：インシュリン含有量。３名の別個のドナー由来の組織を用いた、３例の実験の平均値±ＳＥとしてデータを示す。各実験において、各処理あたり３枚のプレートからデータを回収した。＃は、ｐ＜  ０．０５  、同じグルコース濃度の対照膵島との比較、＊は、ｐ＜  ０．０５、  ５．５ｍＭ  グルコースのみ存在下での膵島との比較、＋は、ｐ＜０．０５  ｓｉＩＬ−１Ｒａをトランスフェクションしただけで同じグルコース濃度で培養した膵島との比較である。
【図１０−１】レプチンは、β細胞のアポトーシスを誘導し、ＩＬ−１βシグナル伝達を介してβ細胞機能を低下させる。
【０１３１】
（Ａ）５．５及び３３．３ｍＭ  グルコース（対照）において、又は５及び１０ｎＭ  レプチンの存在下で、細胞外マトリックスでコートされた培養皿にて、４日間ヒト膵島を培養した。  ５．５ｍＭ  グルコースのみ含有の培地でインキュベーションを行った対照に対する、ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞のパーセンテージの平均値±ＳＥとして結果を示す（１００％、絶対値：０．３５±０．０４％  ＴＵＮＥＬ陽性の％β細胞）。各処理条件に対して、各ドナーで数えた膵島数の平均値は、３１（２１−４５の範囲）であった。５名の器官ドナーから膵島を単離した。＊は、ｐ＜  ０．０１  ５．５ｍＭ  グルコースのみ含有培地の膵島との比較、＊＊は、ｐ＜０．０１  ３３．３ｍＭグルコースのみ含有する培地の膵島との比較である。（Ｂ）プロカスパーゼ−３、活性化カスパーゼ３、及びアクチンのイムノブロッティング。５．５ｍＭ  グルコースのみ（対照）含有、又はさらに１０あるいは５００ｎＭ  レプチンを含有する培地中で、１５又は４８時間、ヒト膵島を培養した。抗体剥離後に各抗体を同じ膜にブロットした。４名のドナー由来の組織を用いた４例の実験のうち１例を示す。各実験で同様の結果が得られた。（Ｃ、Ｄ）５．５又は３３．３ｍＭ  グルコースのみの存在下において（対照）、又はさらに５及び１０ｎＭ  レプチンの存在下若しくは非存在下で、又はさらに５００ｎｇ／ｍｌの外因性ｒｈＩＬ−１Ｒａを添加して、細胞外マトリックスでコートした培養皿上で４日間ヒト膵島を培養した。（Ｃ）１：４日間の培養後に３．３ｍＭ（基底値）及び１６．７ｍＭ（刺激）グルコース濃度で１時間、連続的にインキュベーションを行っている間の基底値及びインシュリン分泌刺激における分泌量をそれぞれ示す。２：インシュリン含有量。３名の別個のドナー由来の組織を用いた３例の実験の平均値±ＳＥとしてデータを示す。各実験において、各処理あたり３枚のプレートからデータを回収した。＊は、ｐ＜０．０１、５．５ｍＭ  グルコースのみ含有する培地で処理した膵島との比較、＊＊は、ｐ＜０．０１、３３．３ｍＭ  グルコースのみ含有する培地で処理した膵島との比較である。
【図１０−２】（Ｄ）１：５．５ｍＭ  グルコースのみを含有する培地でインキュベーションを行った対照に対する、ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞のパーセンテージの平均値±ＳＥとして結果を示す（１００％、絶対値：０．３７±０．０６％  ＴＵＮＥＬ陽性のβ細胞）。各処理条件に対して、各ドナーで数えた膵島数の平均値は、２９（２５−３２の範囲）であった。２：４日間培養後に３．３ｍＭ（基底値）及び１６．７ｍＭ（刺激）グルコース濃度で１時間、連続的にインキュベーションを行っている間の、基底値及び、インシュリン分泌刺激における分泌量をそれぞれ示す。３：インシュリン含有量。３名の別個のドナー由来の組織を用いた３例の実験の平均値±ＳＥとしてデータを示す。各実験において、各処理あたり３枚のプレートからデータを回収した。＊は、ｐ＜  ０．０１、  ５．５ｍＭ  グルコースのみ含有する培地で処理した膵島との比較、＃は、ｐ＜  ０．０５、レプチン処理した膵島との比較である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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