(57)【要約】乾癬は、一般的慢性の炎症性皮膚疾患である。本発明は式（Ｉ）Ｒ−ＣＯ−Ｘ（Ｉ）（式中、ＲはＣ16〜24不飽和炭化水素基であって所望により、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＳＯ、ＳＯ2から選択されたヘテロ原子又は基によりα、β、γ又はδ位でカルボニル基を遮断してもよく；前記炭化水素は、少なくとも５個の非共役二重結合を有し、そしてＸは電子抜き取りの基である）で表される化合物を乾癬の治療用の薬剤の製造に使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
Ｒ−ＣＯ−Ｘ    （Ｉ）
（式中、ＲはＣ16〜24不飽和炭化水素基であって所望により、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＳＯ、ＳＯ2から選択されたヘテロ原子又はヘテロ原子の基によりα、β、γ又はδ位でカルボニル基を遮断してもよく；前記炭化水素は、少なくとも５個の非共役二重結合を有し、そしてＸは吸電子性の基である）
で表される化合物を乾癬の治療用の薬剤の製造に使用する方法。
【請求項２】
前記炭化水素は５から７個の二重結合を有することを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
前記炭化水素は５個の二重結合を有することを特徴とする請求項２に記載の使用方法。
【請求項４】
二重結合がカルボニル基と共役でないことを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項５】
全ての二重結合がシス構造であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項６】
カルボニル基に最も近い二重結合を除いて、全ての二重結合がシス構造であることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項７】
Ｒ基が１９から２１個の炭素原子を含むことを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項８】
Ｒ基がカルボニル基に対してβ又はγ位のヘテロ原子又はヘテロ原子の基を含むことを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項９】
前記へテロ原子又はヘテロ原子の基がＯ、Ｓ又はＳＯであることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１０】
前記ＲＣＯＸが
【化１】
2005518419.tif 000004
であることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１１】
ＸがＯ−Ｃ1〜6アルキル、ＣＮ、ＣＯ2−Ｃ1〜6アルキル、フェニル、Ｃハロ3、Ｃハロ2Ｈ、ＣハロＨ2（ハロは、ハロゲンを表す）であることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の使用方法。
【請求項１２】
ＸがＣハロ3であることを特徴とする請求項１１記載の使用方法。
【請求項１３】
ＲＣＯＸが
【化２】
2005518419.tif 000005
又は
【化３】
2005518419.tif 000006
であることを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【請求項１４】
乾癬の治療方法であって、動物に有効量の式（Ｉ）
Ｒ−ＣＯ−Ｘ    （Ｉ）
（式中、ＲはＣ16〜24不飽和炭化水素基であって所望により、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＳＯ、ＳＯ2から選択されたヘテロ原子又は基によりα、β、γ又はδ位でカルボニル基を遮断してもよく；前記炭化水素は、少なくとも５個の非共役二重結合を有し、そしてＸは吸電子性の基である）
で表される化合物を投与することを含む乾癬の治療方法。
【請求項１５】
式（Ｉ）
Ｒ−ＣＯ−Ｘ    （Ｉ）
（式中、ＲはＣ16〜24不飽和炭化水素基であって所望により、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＳＯ、ＳＯ2から選択されたヘテロ原子又は基によりα、β、γ又はδ位でカルボニル基を遮断してもよい；前記炭化水素は、少なくとも５個の非共役二重結合を有し、そしてＸは吸電子性の基である）
で表される化合物を酵素ＩＶａ  ＰＬＡ2を抑制する薬剤の製造に使用する方法。
【請求項１６】
式（Ｉ）
Ｒ−ＣＯ−Ｘ    （Ｉ）
（式中、ＲはＣ16〜24不飽和炭化水素基であって所望により、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＳＯ、ＳＯ2から選択されたヘテロ原子又はヘテロ原子の基によりα、β、γ又はδ位でカルボニル基を遮断してもよい；前記炭化水素は、少なくとも５個の非共役二重結合を有し、そしてＸは吸電子性の基である）
で表される化合物、及び
薬学的認容可能な賦形剤
を含むことを特徴とする薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾癬の治療に所定のポリ不飽和長鎖ケトン類を使用する方法に関し、より詳しく述べると、かかる治療においてカルボニル官能基に対してα位の電子消去性置換基を有するケトンに関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、一般的な慢性の炎症性皮膚疾患である。乾癬組織は、表皮及び真皮の両方で慢性炎症を起こすことを特徴とし、この疾患は、更に表皮ケラチノサイトを過形成し、線維芽細胞を活性化し、エイコサノイド代謝を変化させ、そして白血球を浸潤することを特徴とする。
【０００３】
乾癬の有効な治療法、例えばサイウロスポリンＡ、ステロイド類、メトトレキセート及び光化学治療法は、全て免疫抑制活性を有しており、従ってこれらの副作用のために理想的な治療法ではない。従って、科学者等は、この疾患のための他の治療の可能性を研究している。
【０００４】
乾癬組織がアラキドン酸及びエイコサノイド類のレベルを上昇させる性質を有することが観察された。このことは、ホスホリパーゼＡ2（ＰＬＡ2）が乾癬の病因に関与することを提案している。
【０００５】
ホスホリパーゼ類は、膜リン脂質のｓｎ２位から不飽和脂肪酸類を放出させる酵素の群である。一度放出されると、これらの脂肪酸類は、種々の酵素によって生理学的に非常に重要な情報伝達分子に転化される。アラキドネートの放出は、エイコサノイド類、例えばプロスタグランジン類の合成を導くアラキドネートカスケードを開始する。エイコサノイド類は、種々の生理学的プロセスに重要であり、炎症の中心的役割を果たす。Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、１８、１（１９９４年）において、Ａｎｄｅｒｓｅｎ等は、乾癬ヒト皮膚に所定のリン脂質が存在することを同定している。
【０００６】
従って、ホスホリパーゼ酵素の抑制がロイコトリエン産生が上昇したための表皮過剰増殖を含む乾癬における表皮及び真皮におけるアイコサノイド産生および細胞増殖に関連した数例の炎症性の兆候の治療の可能性を有すべきであると確信する。
Ｊ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ．  Ｔｒａｎｓ．  １  （２０００年）  ２２７１〜２２７６頁において、いくつかの構造的に異なる化合物が生体内におけるｃＰＬＡ2の抑制剤として報告されている。試験された化合物は、（全Ｚ）−エイコサ−５，８，１１，１４，１７−ペンタエン酸（ＥＰＡ）及び（全Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）に基づくものであった。書面には、予備研究がこの化合物が酵素不活剤として作用することを生体外で示すことが提案されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ．  Ｔｒａｎｓ．  （２０００年）  ２２７１〜２２７６頁における化合物は、生体内試験されておらず、従ってこれらの生体内効果を予測させるものではない。加えて、疾患治療を考案する場合、選択性を確保する必要がある。数多くの公知のホスホリパーゼ酵素があり、そして医療化学が発展するのに従って、より多くのこの種の酵素が発見されている。ホスホリパーゼ類が種々の異なる細胞内機能を制御するので、その活性を変更すべき特定のホスホリパーゼに対して選択性であるこれらの酵素の抑制剤を開発する必要がある。所望の酵素抑制の利益が、望ましくない酵素抑制剤により生じる数多くの望ましくなくかつ危険性のある副作用の存在により阻害されるので、数多くのホスホリパーゼ酵素を抑制する化合物は、市場的興味が少ない。従って、ホスホリパーゼクソの高い選択性の抑制剤を提供するという要求が残る。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、驚くべきことにＰａｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｐａｐｅｒに同定されたものとある程度同様の構造又は同一構造の化合物がＩＶａ  ＰＬＡ2酵素に対して選択性であり、従って副作用の不存在下での乾癬の治療に有望であることを見出した。ホスホリパーゼ群に全２３種類の酵素がありそして各酵素が異なる生理学的及び病理学的機能を有すると仮定すると、このことは驚くべきことである。更に、驚くべきことに本発明の化合物が、例えばＩＶａ  ＰＬＡ2群の抑制によりアイコサノイド産生を抑制する特定の効力を有することを見出した。
【０００９】
従って、一実施態様によると、本発明は、式（Ｉ）
Ｒ−ＣＯ−Ｘ    （Ｉ）
（式中、ＲはＣ16〜24不飽和炭化水素基であって所望により、Ｓ、Ｏ、Ｎ、ＳＯ、ＳＯ2から選択されたヘテロ原子又は基によりα、β、γ又はδ位でカルボニル基を遮断してもよく；前記炭化水素は、少なくとも５個の非共役二重結合を有し、そしてＸは吸電子性の基である）
で表される化合物を乾癬の治療用の薬剤の製造に使用する方法を提供する。
【００１０】
別の実施形態によると、本発明は、動物、好ましくは哺乳類、例えばヒトに有効量の前記式（Ｉ）で表される化合物を投与することを含む乾癬の治療方法を提供する。
更に別の実施形態によると、本発明は、前記式（Ｉ）で表される化合物を酵素ＩＶａ  ＰＬＡ2を抑制する薬剤の製造に使用する方法を提供する。
更に別の実施形態によると、本発明は、前記式（Ｉ）で表される化合物を含む薬学的組成物を提供する。
【００１１】
基Ｒは、５〜７個の二重結合、好ましくは５又は６個の二重結合、例えば５個の二重結合を有しており、これらは非共役である必要がある。前記二重結合がカルボニル官能基と共役でないことが好ましい。
【００１２】
基Ｒに存在する二重結合は、シス又はトランス構造であることができるが、存在する大部分の二重結合（すなわち、少なくとも５０％）がシス構造であることが好ましい。更に有利な実施形態において、トランス構造であってもよいカルボニル基に最も近い二重結合を除いて全ての基Ｒにおける全ての二重結合がシス構造である。
【００１３】
基Ｒは１６個ないし２４個の炭素原子を有することができ、好ましくは１９個ないし２１個の炭素原子を有する。
基Ｒは、カルボニル基に対してα、β、γ又はδの位置で、好ましくはカルボニル基に対してβ又はγ位にヘテロ原子を持つことができる。好ましくは、ヘテロ原子は、Ｏ又はＳ又は硫黄誘導体、例えばＳＯである。
【００１４】
特に好ましいＲＣＯＸ基は、式
【００１５】
【化１】
2005518419.tif 000002
で表されるものである。
【００１６】
基Ｒは、ハロ又はＣ1〜6−アルキルから選択された３個までの置換基をもってもよい。存在する場合、置換基は、非極性でかつ小さい基、例えばメチル基であることが好ましい。しかしながら、Ｒ基は未置換のままであることが好ましい。
【００１７】
基Ｘは、吸電子性の基である。この点について好適な基ついて、Ｏ−Ｃ1〜6アルキル、ＣＮ、ＣＯ2−Ｃ1〜6アルキル、フェニル、Ｃハロ3、Ｃハロ2Ｈ、ＣハロＨ2（ハロは、ハロゲン、例えばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素、好ましくはフッ素を表す）が挙げられる。
好ましい実施形態において、電子抜消去性の基は、Ｃハロ3、特にＣＦ3である。
本発明に使用するのに非常に好ましい化合物は、ＥＰＡＣＯＣＦ3、ＥＰＡＳＣＯＣＦ3及び下記に示すとおりのＡＫＨ２１７である。
【００１８】
式（Ｉ）で表される化合物は、公知の化学合成ルートを用いて製造することができる。市販の化合物であるアラキドン酸、ＥＰＡ又はＤＨＡから合成を開始することが便利である。これらの酸官能基の、例えば−ＣＯＣＦ3への転化は、例えばカルボン酸をその対応する酸塩化物に転化し、これをピリジンの存在下に無水トリクロロ酢酸と反応させることによって容易に達成できる。
【００１９】
ヘテロ原子の炭素鎖への導入も容易に達成できる。便利には、例えば出発酸をアルコールへと還元し、所望により対応するチオールへと転化する。次いで、求核性のチオールを基、例えばＢｒＣＨ2ＣＯＣＦ3と反応させることによってカルボニル及び電子吸引性種を導入することができる。完全な合成プロトコールは、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  １、２０００年、第２２７１〜２２７６頁又はＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、  １９９８年、１６１、第３４２１頁に見出すことができる。
【００２０】
式（Ｉ）で表される化合物は、製薬化学の当業者に周知の従来の技術を用いて薬剤に調合することができる。従って、この化合物は、公知の賦形剤又は薬学的キャリアを用いて配合し得る。
【００２１】
また、本発明の薬剤は、他の従来の添加剤、例えば抗酸化剤、保存剤、着色剤、風味着加剤等を含んでも良い。
本発明の薬剤は、錠剤、丸薬、粉末、カプセル、乳化物、として配合できるが、クリーム又は軟膏として配合することが好ましい。投与の形態は、公知の形態、例えば経口、鼻腔、筋肉内、非経口、局所、皮内等であることができる。しかしながら、この薬剤を局所、すなわちヒト皮膚の感染部位に直接適用することが有利である。
【発明の効果】
【００２２】
良好な治療結果を及ぼすのに必要な薬剤の量は、もちろん患者及び乾癬の過酷さに依存する。服用量は、当業者により直ちに決定されるであろう。
本発明の化合物を、乾癬を治療するために前記目的のための他の医薬品と組合わせて使用することができ、このことは、本発明の別の実施形態を形成する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を以下の実施例及び図面を用いて更に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
図１は、市販化合物と比較した数多くの本発明の化合物に対するＩＶａ  ＰＬＡ2酵素活性の相対的抑制を示す図面である。組替えＩＶａ  ＰＬＡ2酵素を、インキュベータ（５μＭ）で１０分間予めインキュベートし、次いで混合ミセル酵素活性検定で検定した。コントロールは、抑制剤で予備処理しなかった。結果を、コントロールの％として示し４回の代表的実験のうちの１つからの二重測定の平均である。
【００２４】
図２は、混合ミセル酵素活性検定におけるＩＶａ  ＰＬＡ2酵素の抑制の濃度依存性を示す。ＥＰＡＣＯＣＦ3、ＥＰＡＳＣＯＣＦ3及びＡＡＣＯＣＦ3によりＩＶａ  ＰＬＡ2の抑制が増加することを図２Ｂに示し、そして、ＥＰＡＣＨ（ＯＨ）ＣＯＣＦ3、ＤＨＡＣＯＣＦ3、及びＭＡＥＰによりＩＶａ  ＰＬＡ2の抑制が増加することを図２Ａに示す。結果を、コントロールの％として示し４回の代表的実験のうちの２つからの二重測定の平均である。
【００２５】
図３Ａは、カルシウムイオン透過孔Ａ23187が［３Ｈ］−標識脂質の細胞外放出を濃度依存方式で刺激することを示す。ＨａＣａＴ細胞をＡ23187で１時間処理し、アラキドン酸及びエイコサノイド類をＢｏｎｄ  Ｅｌｕｔカラムを用いて細胞細胞培地から抽出し、そして培地中の［３Ｈ］−標識脂質の含有率をシンチレーションカウントにより測定した。図における各欄は、３回の代表的実験のうちの１つからの三重測定の平均を表す。
図３Ｂは、アラキドン酸（ＡＡ）のシクロオキシゲナーゼ変性の産生物であるプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）の産生も服用に依存して刺激することを示している。培地におけるＰＧＥ2蓄積をＰＧＥ2酵素免疫検定（ＥＩＡ）により検定した。
【００２６】
図４は、脂肪酸誘導体ＥＰＡＣＯＣＦ3が市販のシクロオキシゲナーゼ２−選択性抑制剤ＮＳ−３９８よりもＬＰＳ刺激ＨａＣａｔ細胞におけるＡ23187誘発ＰＧＥ2放出の抑制において服用量に依存してより強力であることを示している（ＩＣ50値は、各々１８０ｎＭ及び２４０ｎＭである）。
【００２７】
図５は、ＴＮＦα又はＩＬ−１β刺激ＮＦ−ｋＢ活性がＡＫＨ２１７により濃度に依存して抑制されることを示している（各々９１％及び８１％）。
【００２８】
（材料及び方法）
材料
カルシウムイオン透過孔Ａ23187、Ｓｉｇｍａｃｏａｔ、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）及びウシ血清アルブミンをシグマ社（米国、ミズーリ州、セントルイス、ＭＯ）より入手した。ホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−アラキドニル及び［３Ｈ］アラキドン酸はアマーシャム（英国バッキンガムシャー）からのものである。アルミニウムシートシリカゲル６０、酢酸エチル、イソオクタン及び酢酸は、メルク社（ドイツ国、ダルムスタッド）から購入した。ＴＮＦαは、ノルウェイ・ユニバーシティー・オブ・サイエンス・アンド。テクノロジー、ＮＴＮＵのＴｅｒｊｅ  Ｅｓｐｅｖｉｋ教授からの好意により寄贈されたものでり、ＩＬ−βはロッシャ  モレキュラー  ビオケミカルズ社から購入した。
ＡＡＣＯＣＦ3は、バイオモル社（米国、ペンシルベニア州、プリマウスミーティング）からそしてＭＡＦＰはキャイマン（米国、ミシシッピー州アンアルバー）からのものである。全ての脂肪酸はＮ2雰囲気下−８０℃で保存した。
【００２９】
細胞培養
自然発生免疫化ヒト皮膚ケラトモサイト細胞培養細胞株ＨａＣａＴを、Ｎ．Ｅ．フセニグ教授（ドイツ国ハイデルベルグ）により親切にも提供してもらった。細胞を、１ｇグルコース／ｌ（ギブコＢＲＬ、ライフテクノロジーズ社、スコットランド、パイスレイ）を有し、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ハイクローン  ラボラトリーズ社、米国、ユタ）、０．３ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−グルラミン（シグマ社）及び１μｇ／ｍｌ  フンギゾーン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（ギブコ社）で捕捉したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成長さた。集密的細胞を収集前に１時間０．５％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ中Ａ23187、Ｉｌ−１β（１０ｍｇ／ｍｌ）又はＴＮＦα（１０ｍｇ／ｍｌ）刺激した。細胞の継代４０〜８０を使用した。転写因子ＮＦ−ｋＢの過酷な制御下でのＨａＣａｔ形質移入体発現ルシフェラーゼの発生は、別の文献に記載されている（アントンセン等、Ｊ．Ｂｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．２００１年、２７６、第３０５２７頁）。レポータプラスミドｐＢＩＩＸは、フォチナスピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子のマウスホスプロモータ推進発現の上流でクローンされた２コピーのＨＩＶ  ＮＦ−ｋＢを含む。
【００３０】
ＥＩＡ検定を、製造者の記載、キャイマン・ケミカルズ米国ミズーリ州に従って行った。１：１０の稀釈液をＰＧＥ2測定用に使用した。マイクロプレートマネージャーソフトウェア（バイオ−ラッド・ラボラトリー社）によりサンプルデータを計算した。
【００３１】
ルシフェラーゼ検定
細胞を２４丸孔プレート（２．８×１０5細胞／孔）に播種した。処理した細胞を二度リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、そして溶解し、そしてルシフェラーゼレセプター検定システム（プロメガ社）及びターナー・ルミノメータメータモデルＴＤ−２０／２０（ターナーデザインズ社）を用いて製造者により記載の通りにルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３２】
（全Ｚ）−アイコサ−５，８，１１，１４，１７−ペンタエン酸（ＥＰＡ）及び（全Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサエン酸（ＤＨＡ）誘導体の合成
酵素検定に使用した誘導体を以下に示す。ＢＰＡＣＯＣＦ3は、Ｊ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ．  Ｔｒａｎｓ．  １  （２０００年）  ２２７１〜２２７６頁に記載の通りに調整した。ＡＡＣＯＣＦ3及びＭＡＦＰは、上記の供給者より購入した。残りの誘導体は、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ  １、２０００年、第２２７１〜２２７６頁に記載の通り調製した。
【００３３】
【化２】
2005518419.tif 000003
【００３４】
ｃＰＬＡ2の混合ミセル酵素活性検定
ＩＶ  ＰＬＡ2酵素活性源は、発現組替えヒトＩＶ  ＰＬＡ2（１０μｇ  ＩＶ  ＰＬＡ2蛋白質／１０6細胞；バック  パック  バキュロウイルス  発現システム；クローンテック・ラボラトリーズ社、米国カリフォルニア州パロオルト）上の昆虫ウイルスとした。昆虫細胞のサイトゾル部分を、Ｓｃｈａｌｗｉｊｋ等（１９９２年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１０、第１６９〜１７６頁い記載の通りに調製した。標準としてウシ血清アルブミンを用いてバイオ−ラッド蛋白質検定（バイオラッド  ラボラトリーズＧｍｂＨ、ドイツ国マンニッヒ）によりサイトゾル部分の蛋白質含有率を測定した。基質添加１０分前に抑制誘導体を添加した。抑制剤の予備インキュベーションを室温で行った。Ｗｉｊｋａｎｄｅｒ等（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２、第８７３〜８８０頁、１９９１年）に従って、基質として［１４Ｃ］−Ｌ−３ホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−アラキドニルを使用して、ＩＶ  ＰＬＡ2酵素活性を検定した。３０分後、反応を停止し、そして遠心分離し、ＣＨＣｌ3相をＮ2ガスにより蒸発乾固し、次いでＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ（９：１、ｖ／ｖ）に再懸濁させた。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により、酢酸エチル：イソオクタン：酢酸：水（５５：７５：８：１００、ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）で展開したアルミニウムシートシリカゲル６０上のリン脂質から遊離アラキドン酸を分離した（Ｇｒｏｎｎｉｃｈ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９３、第１２２４〜１２３３頁、１９９４年）。リン−イメージャーにより遊離アラキドン酸及びリン脂質を定量し、そしてＩＶ  ＰＬＡ2活性を、抑制剤のないものと比較した抑制剤による酵素インキュベーションにより減少したアラキドン酸放出量として表した。
【００３５】
アラキドン酸及びアイコサノイド測定
細胞誘導及び抑制２４時間前に０．５％（ｖ/ｖ）ＦＣＳで捕捉した培地中の１μＣｉ／ｍｌ［3Ｈ］アラキドン酸で集密的細胞を標識した。放射線活性アラキドン酸の約９０％が細胞膜に導入された。細胞を培地中で３度洗浄することによって細胞外［3Ｈ］アラキドン酸を除去した。次いで、ＨａＣａＴ細胞を抑制剤で１時間予備インキュベートし、１時間カルシウムイオン透過孔で刺激した。細胞培地を回収し、そして遠心分離により清澄した。Ｐｏｗｅｌｌ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４、第１１７〜１３１頁、１９８７年に記載の通りかつ先に記載のＢｒｅｋｋｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、４、第２６９〜２８０頁、１９９２年により変更して、アラキドン酸及びアイコサノイド類を、Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔ  Ｃ１８オクタデシルカラム（５００ｍｇ）（Ｖａｒｉａｎ  ＳＰＰ、カリフォルニア州、ハーバーシティー）を使用して培地から抽出した。シグマコートで予備被覆したガラス管にサンプルを回収した。サンプルの酢酸エチル溶液をＮ2で完全に乾燥し、０．５ｍｌの新鮮な酢酸エチルで再溶解し、そしてアリコートの５０μｌ（三つ組）サンプルを、５ｍｌレディープロテイン（Ｒｅａｄｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）液（ベックマン）中で液体βシンチレーションカウントした（ベックマン  ＬＳ  １７０１）。
【００３６】
酵素免疫検定（ＥＩＡ；キャイマン）を使用して、カルシウムイオン透過孔で刺激したＨａＣａｔ細胞からの細胞培養培地中のＰＧＥ2の量を測定した。この検定は、制限した量のＰＧＥ2モノクローナル抗体に対する遊離ＰＧＥ2とＰＧＥ2−アセチルクロリンステアラーゼとの競合に基づくものである。培地は、ＰＧＥ2含有率の検査前に１：１０に稀釈する。マイクロプレートマネージャーソフトウェア（バイオ−ラッドラボラトリー社）によりサンプルデータを計算した。
【００３７】
ＭＴＴ検定
集密的細胞を１時間血清不含培地中の抑制剤で予備処理し、次いで１時間刺激剤で処理した。基質［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド］の転化を、モンマン［Ｍｏｓｍａｎｎ  Ｔ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５、第５５〜６３頁、１９８３年］に従って４時間５８０ｎｍで吸光度として測定した。各濃度の抑制剤について、９組のパラレルを測定した。
【００３８】
結果
ＩＶ  ＰＬＡ2酵素活性
脂肪酸誘導体のＩＶａ  ＰＬＡ2の抑制剤としての作用を調査するために、本発明者等は、原料及び方法に記載の通り酵素源として組替えＩＶ  ＰＬＡ2を用いて混合ミセル検定でＩＶ  ＰＬＡ2活性を測定した。本発明者等が作成した合成脂肪酸誘導体を、比較用に使用した市販の抑制剤と共に先に掲載した。ＥＰＡＣＯＣＦ3、ＥＰＡＳＣＯＣＦ3及びＡＫＨ２１７は、ＡＡＣＯＣＦ3と同様なＩＶ  ＰＬＡ2抑制剤としての効力（すなわち７５〜８０％抑制）を有していると思われる（図１）。ＭＡＦＰ及びＤＨＡＣＯＣＦ3は、効果が不足している抑制剤である（各々５０％及び３０％）。化合物ＥＰＣＨ（ＯＨ）ＣＦ3も試験したが、その結果抑制効果は極めて劣っていた（１０％抑制）。ＥＰＡＣＯＣＨ3を、トリフルオロメチル（ＣＦ3）基の代わりにメチル基を有するコントロール化合物として製造した。ＥＰＡＣＯＣＨ3は、抑制を示さなかった（図１）。ＥＰＡＣＯＣＦ3、ＥＰＡＳＣＯＣＦ3及びＡＡＣＯＣＦ3のＩＣ50値は、各々２．９±１．９、３．５±０μＭ及び５．８±１．９μＭであると測定された（図２Ｂ）。一方、ＤＨＡＣＯＣＦ3、ＭＡＦＰ及びＥＰＡＣＨ（ＯＨ）ＣＦ3のＩＣ50値は、各々２１．３±１．５μＭ、２４±１．４μＭ及び４３±７．１μＭであると測定された（図２Ａ）。
【００３９】
時間経過が直線的であるか観察するために混合ミセル検定における抑制剤を用いて動的研究を行った。ピークは、２分後に達成し（図示せず）、これらの抑制剤が非常に即効性であることを示している。
【００４０】
要するにＥＰＡＣＯＣＦ3、ＥＰＡＳＣＯＣＦ3及びＡＫＨ２１７は、市販の化合物であるＡＡＣＯＣＦ3と同様なあるいは若干高いＩＶａ  ＰＬＡ2抑制剤としての効力を有していると思われる。
【００４１】
アラキドン酸及びエイコサノイド測定
より多くの生物学的システム系におけるＥＰＡ又はＤＨＡ誘導体の効果を評価するために、本発明者等は、モデルシステムとしてＨａＣａＴ細胞を利用した［Ｓｊｕｒｓｅｎ等、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１２、８、第１１８９〜１１９４頁、２０００年］。カルシウムイオン透過孔Ａ23187が、数多くの細胞種において、恐らく細胞外Ｃａ２+−濃度が増加することによってｃＰＬＡ2と細胞膜との会合を誘発することによってアラキドン酸放出を誘発することが示されている［Ｋｒａｍｅｒ及びＳｈａｒｐ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、４１０、第４９〜５３頁、１９９７年］。ＨａＣａＴ細胞において、イオン透過孔が［３Ｈ］−標識化アラキドン酸の服用応答放出を誘発した（図３Ａ）。
１０μＭよりも高い濃度のＡ23187は、ＭＴＴ検定により測定された通りに毒性であった。
【００４２】
本発明者等の合成脂肪酸抑制剤を評価する次の段階は、ＨａＣａＴ細胞におけるＡ23187に対して応答してＰＧＥ2の細胞外放出を減少する能力を検査することであった。細胞実験を行うのに先立って、本発明者等は、抑制剤の毒性を評価した。ＭＴＴ検定は、２５μＭ以上の濃度の脂肪酸化合物がＨａＣａＴ細胞に対して毒性であることを示した（結果示さず）。
【００４３】
ＨａＣａＴ細胞は、ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ、５％ヒト血清）で３０分間処理した際にシクロオキシゲナーゼ２メッセージの発現を上方制御する（未公開結果）。１時間イオン透過孔刺激した際に、ＰＧＥ2が培地中に蓄積する（図３Ｂ）。脂肪酸誘導体ＥＰＡＣＯＣＦ3を、ｃｏｘ−２選択性誘導体でありその前駆体ＡＡの放出を防止することによってＰＧＥ2を産生するのを減少するＮＳ−３９８と比較した。ＨａＣａｔ細胞をＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ、５％ヒト血清）で３０分間予備処理し、異なる濃度（０．２〜２５μＭ）で更に３０分間いずれかで処理しそして３０分間Ａ23187で刺激した。最後に、ＰＧＥ2  ＥＩＡを、細胞培地上行った。服用量−応答曲線を抑制剤なしのＰＧＥ2産生百分率に対して作図した。図４に観察される通り、ＥＰＡＣＯＣＦ3は、ＰＧＥ2産生の抑制においてＮＳ−３９８よりもはるかに強力であり（各々１８０ｎＭ、２４０ｎＭのＩＣ50）、そして基質剥離がシクロオキシゲナーゼに対する活性抑制よりもより強力であることを示している。
【００４４】
ＩＶａ  ＰＬＡ2の抑制が生物学的成果を示すかを決定するため、ＨａＣａＴ細胞を炎症誘発性サイトカイン類ＩＬ−β又はＴＮＦαで刺激した。炎症の尺度として、転写因子ＮＦ−ｋＢの活性化を分析した。本発明者等は、先にＩＬ−β又はＴＮＦαがＨａＣａＴ細胞におけるＮＦ−ｋＢを活性することを示している（ＴＨｏｍｍｓｅｎ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８年、１６１、第３４２１頁）。ＮＦ-ｋＢ活性化はルシフィナーゼ発現として検定される。ＴＮＦα又はＩＬ−βによる安定な形質移入ＨａＣａＴ−ｐＢＩＩＸ細胞の１時間の処理はＮＦ−ｋＢ依存発現を増加した（示さず）。抑制剤ＡＫＨ２１７の存在下、ＩＬ−β刺激ルシフェナーゼ発現は、服用量に依存して８１％まで抑制された。ＴＮＦα刺激ＮＦ−ｋＢ活性は、ＡＫＨ２１７の服用量に依存して９１％まで抑制され（図５）、従って本発明者等の合成脂肪さん抑制剤が炎症応答を抑制するのに有効であることが確認される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、市販化合物と比較した数多くの本発明の化合物に対するＩＶａ  ＰＬＡ2酵素活性の相対的抑制を示す図面である。
【図２】図２は、混合ミセル酵素活性検定におけるＩＶａ  ＰＬＡ2酵素の抑制の濃度依存性を示す。
【図３】図３Ａは、カルシウムイオン透過孔Ａ23187が［３Ｈ］−標識脂質の細胞外放出を濃度依存方式で刺激することを示す。図３Ｂは、アラキドン酸（ＡＡ）のシクロオキシゲナーゼ変性の産生物であるプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）の産生も服用に依存して刺激することを示す。
【図４】図４は、脂肪酸誘導体ＥＰＡＣＯＣＦ3が市販のシクロオキシゲナーゼ２−選択性抑制剤ＮＳ−３９８よりもＬＰＳ刺激ＨａＣａｔ細胞におけるＡ23187誘発ＰＧＥ2放出の抑制において服用量に依存してより強力であることを示している。
【図５】図５は、ＴＮＦα又はＩＬ−１β刺激ＮＦ−ｋＢ活性がＡＫＨ２１７により濃度に依存して抑制されることを示している。
【図１】
2005518419.tif 000007
【図２Ａ】
2005518419.tif 000008
【図２Ｂ】
2005518419.tif 000009
【図３Ａ】
2005518419.tif 000010
【図３Ｂ】
2005518419.tif 000011
【図４】
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【図５】
2005518419.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月28日(2003.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
前記へテロ原子又はヘテロ原子の基がＯ、Ｓ又はＳＯであることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の使用方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
前記ＲＣＯＸが
【化１】
2005518419.tif 000014
であることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の使用方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
ＸがＯ−Ｃ1〜6アルキル、ＣＮ、ＣＯ2−Ｃ1〜6アルキル、フェニル、Ｃハロ3、Ｃハロ2Ｈ、ＣハロＨ2（ハロは、ハロゲンを表す）であることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の使用方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
ＸがＣハロ3であることを特徴とする請求項１１記載の使用方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
ＲＣＯＸが
【化２】
2005518419.tif 000015
又は
【化３】
2005518419.tif 000016
であることを特徴とする請求項１に記載の使用方法。
【国際調査報告】
2005518419.tif 000017
2005518419.tif 000018
2005518419.tif 000019
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